(57)【要約】本発明は、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）の活性が、異常な瘢痕の形成についての原因として知られている過度のコラーゲン沈積を抑制するという発見に関するものである。これらの異常な瘢痕には、限定されるわけではないが、ケロイド、癒着、肥厚性瘢痕、皮膚の外観を損なう状態、線維症、線維性嚢胞状態、拘縮および強皮症があり、これらは全て創傷治癒過程における過度のコラーゲン沈積に伴うかまたはそれに誘発される。したがって、本発明の局面は、ＰＡＩ−１活性の低減化により、過度のコラーゲン蓄積を減少させ、異常な瘢痕の形成を阻止し、および／または過度のコラーゲン蓄積から生じる異常な瘢痕を処置することである。ＰＡＩ−１活性は、限定されるわけではないが、例えばＰＡＩ−１中和性抗体、ジケトピペラジンに基く化合物、テトラミン酸に基く化合物、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ミフェプリストン(ＲＵ４８６)、およびスピロノラクトンを含むＰＡＩ−１阻害剤により低減化され得る。本発明の別の局面は、創傷治癒過程におけるＰＡＩ−１活性を測定し、異常瘢痕形成の傾向を測定する方法に関するものである。
2006507297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＩ−１活性を低減化する段階を含む、創傷治癒過程における過度のコラーゲン蓄積を低減化する方法。
【請求項２】
ＰＡＩ−１活性をＰＡＩ−阻害剤により低減化させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＰＡＩ−１阻害剤が、間接的ＰＡＩ−１阻害剤または直接的ＰＡＩ−１阻害剤である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
間接的ＰＡＩ−１阻害剤が、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル、Ｌ１５８８０９、エプロサルタン、トログリタゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ペリンドルプリル、ミフェプリストン(ＲＵ４８６)、スピロノラクトンおよびＲＣＬペプチドから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
直接的ＰＡＩ−１阻害剤が、ＰＡＩ−１中和性抗体、ジケトピペラジンに基く化合物、テトラミン酸に基く化合物、ヒドロキシキノリノンに基く化合物、および１１−ケト−９(Ｅ),１２(Ｅ)−オクタデカジエン酸から成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＰＡＩ−１阻害剤を、創傷治癒過程にある対象に投与する、請求項２記載の方法。
【請求項７】
ＰＡＩ−１阻害剤を、表皮投与、経皮投与、肺投与、鼻投与、眼投与、頬側投与、経口投与、直腸投与、膣投与および非経口投与から成る群から選択される経路により投与する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
過度のコラーゲン蓄積が、ケロイド、癒着、肥厚性瘢痕、皮膚の外観を損なう状態、線維症、線維性嚢胞状態、拘縮、強皮症、デュピュイトラン病、ペーロニー病および関節の硬直から成る群から選択される異常な瘢痕に至る、請求項１記載の方法。
【請求項９】
線維症が、間質性線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症、心臓線維症、網膜および硝子体網膜症から成る群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
過度のコラーゲン蓄積から生じる異常な瘢痕の形成を阻止する方法であって、ＰＡＩ−１活性を低減化する段階を含む方法。
【請求項１１】
ＰＡＩ−１活性をＰＡＩ−阻害剤により低減化する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＰＡＩ−１阻害剤が、間接的ＰＡＩ−１阻害剤または直接的ＰＡＩ−１阻害剤である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
間接的ＰＡＩ−１阻害剤が、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル、Ｌ１５８８０９、エプロサルタン、トログリタゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ペリンドルプリル、ミフェプリストン(ＲＵ４８６)、スピロノラクトンおよびＲＣＬペプチドから成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
直接的ＰＡＩ−１阻害剤が、ＰＡＩ−１中和性抗体、ジケトピペラジンに基く化合物、テトラミン酸に基く化合物、ヒドロキシキノリノンに基く化合物、および１１−ケト−９(Ｅ),１２(Ｅ)−オクタデカジエン酸から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ＰＡＩ−１阻害剤が対象に投与され、過度のコラーゲン蓄積が対象において観察されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
ＰＡＩ−１阻害剤を、表皮投与、経皮投与、肺投与、鼻投与、眼投与、頬側投与、経口投与、直腸投与、膣投与および非経口投与から成る群から選択される経路により投与する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
異常な瘢痕が、ケロイド、癒着、肥厚性瘢痕、皮膚の外観を損なう状態、線維症、線維性嚢胞状態、拘縮、強皮症、デュピュイトラン病、ペーロニー病および関節の硬直から成る群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
線維症が、間質性線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症、心臓線維症、網膜および硝子体網膜症から成る群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
過度のコラーゲン蓄積から生じる異常な瘢痕の処置方法であって、ＰＡＩ−１活性を低減化する段階を含む方法。
【請求項２０】
ＰＡＩ−１活性をＰＡＩ−阻害剤により低減化させる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＰＡＩ−１阻害剤が、間接的ＰＡＩ−１阻害剤または直接的ＰＡＩ−１阻害剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
間接的ＰＡＩ−１阻害剤が、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル、Ｌ１５８８０９、エプロサルタン、トログリタゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ペリンドルプリル、ミフェプリストン(ＲＵ４８６)、スピロノラクトンおよびＲＣＬペプチドから成る群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
直接的ＰＡＩ−１阻害剤が、ＰＡＩ−１中和性抗体、ジケトピペラジンに基く化合物、テトラミン酸に基く化合物、ヒドロキシキノリノンに基く化合物、および１１−ケト−９(Ｅ),１２(Ｅ)−オクタデカジエン酸から成る群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
異常な瘢痕を有する対象にＰＡＩ−１阻害剤を投与する、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
ＰＡＩ−１阻害剤を、表皮投与、経皮投与、肺投与、鼻投与、眼投与、頬側投与、経口投与、直腸投与、膣投与および非経口投与から成る群から選択される経路により投与する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
異常な瘢痕が、ケロイド、癒着、肥厚性瘢痕、皮膚の外観を損なう状態、線維症、線維性嚢胞状態、拘縮、強皮症、デュピュイトラン病、ペーロニー病および関節の硬直から成る群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
線維症が、間質性線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症、心臓線維症、網膜および硝子体網膜症から成る群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
異常な瘢痕の形成傾向を測定する方法であって、
ａ)創傷部位の位置を確認し、そして
ｂ)ＰＡＩ−１活性のレベルを測定する
段階を含む方法。
【請求項２９】
さらに、標準ＰＡＩ−１活性とＰＡＩ−１活性を比較し、異常な瘢痕を形成する可能性を測定する段階を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＥＬＩＳＡ、色素原検定法、フィブリンオーバーレイ検定法、または逆フィブリンオーバーレイ検定法によりＰＡＩ−１活性のレベルを測定する、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
異常な瘢痕が、ケロイド、癒着、肥厚性瘢痕、皮膚の外観を損なう状態、線維症、線維性嚢胞状態、拘縮、強皮症、デュピュイトラン病、ペーロニー病および関節の硬直である、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
線維症が、間質性線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症、心臓線維症、網膜および硝子体網膜症から成る群から選択される、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００２年５月１３日付の米国仮出願第６０／３８０６９６号の利益を主張するもので、これについては図面を含む本明細書全体において出典明示で援用する。
【０００２】
政府認可との関係
本発明は、米国立総合医科学研究所による認可ＧＭ５５０８１のもと政府の支援により為された。米国政府は、この発明においてある種の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、異常瘢痕形成の処置または予防に関するものである。具体的には、本発明は、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１の活性の低減化による、ケロイド、肥厚性瘢痕、癒着および他の皮膚または内部創傷または病変を含む異常な瘢痕を誘発する創傷治癒過程における過度のコラーゲン沈積の減少に関するものである。
【０００４】
発明の背景
創傷治癒は、一般に４つの別々の相：１)凝固、２)炎症、３)遊走および増殖、および４)リモデリングに分割される連続過程である。
【０００５】
対象における創傷発生直後に、創傷治癒過程がフィブリンおよびフィブロネクチンの凝固により開始され、創傷部位においてマトリックスまたは血餅および血小板の凝集を形成する。血小板が凝固すると、炎症細胞、例えば好中球、リンパ球およびマクロファージもまた創傷部位に誘引され、創傷治癒因子を放出する。例えば、マクロファージは、サイトカインおよび成長因子、例えば線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、腫瘍壊死増殖因子(tumor necrosis growth factors)(ＴＮＦ−α)、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、インターフェロン−ガンマ(ＩＮＦ−γ)、および上皮増殖因子様物質を分泌する。活性化された血小板はまた、上皮増殖因子(ＥＧＦ)、ＰＤＧＦ、トランスフォーミング増殖因子α、β１およびβ２(それぞれＴＧＦ−α、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β)、血小板由来上皮増殖因子(ＰＤＥＧＦ)、血小板活性化因子(ＰＡＦ)、インスリン様増殖因子−１(ＩＮＦ−１)、フィブロネクチンおよびセロトニンを放出する。これらの生物学的因子は合わさって、ケラチノサイト、線維芽細胞および内皮細胞の浸潤、増殖および遊走に関与する。炎症相の終結に向かって、タンパク質、脂肪および架橋新生コラーゲンは、一緒に凝集し、一時的スカホールドを形成する。
【０００６】
遊走および増殖相の間、創傷部位へ遊走した細胞では急速な有糸分裂および分化が行なわれる。これらの細胞には、ケラチノサイトおよび線維芽細胞が含まれる。一方では、ケラチノサイトで上皮形成過程が行なわれ、細胞は層化および分化して上皮被膜を形成する。ケラチノサイトはまた、新脈管形成を刺激するケラチノサイト増殖因子(ＫＧＦ)およびＶＥＧＦ、化学誘引物質としてのＴＧＦ−α、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)形成を促進するＰＤＧＦ、および生育不能組織およびフィブリンバリアーを溶かすプロテアーゼを放出する。他方、遊走した線維芽細胞は、コラーゲンおよびプロテオグリカンを合成および沈積させ、増殖因子、例えばＫＧＦ、結合組織増殖因子(ＣＴＧＦ)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１(ＰＡＩ−１)およびＴＧＦ−βを放出する。ケラチノサイト同様、線維芽細胞もまた、後続のリモデリング過程を促進するプロテアーゼを放出する。遊走および増殖相におけるこれらの細胞活性、例えば遊走、増殖、分化、一時的スカホールドの分解、および新生マトリックスの合成は全て、線維増殖過程として記載されることが多い。
【０００７】
創傷治癒の最終段階には、マトリックス成分の沈積パターンを変えるリモデリング過程が必然的に含まれる。記載した通り、初期マトリックスは、ホメオスタシスから生じるフィブリンおよびフィブロネクチンの血餅である。線維芽細胞の増殖および遊走に伴い、プロテアーゼからの助けにより初期マトリックスを置き換え、再配置しながらコラーゲンが合成され、沈積される。コラーゲン線維は徐々に厚みが増し、創傷のストレス線に沿って整列する。正常な瘢痕形成の最後に、最終瘢痕は、表皮とほとんど平行であるコラーゲン線維を示す。(概説については、Hunt et al.、Physiology of Wound Healing、Adv.Skin Wound Care １３：６−１１(２０００)；Ferguson et al.、Scar Formation: The Special Natur of Fetal and Adult Wound Repair、Plas.Reconstr.Surg.９７：８５４−６０(１９９６)；Gailit & Clark、Wound Repair in the Context of Extracellular Matrix、Curr.Opin.Cell Biol.６：７１７−２５(１９９４)参照)。
【０００８】
すなわち、創傷治癒過程は、増殖および分解間で微妙にバランスのとれた平衡状態である。この過程で異常が生じると、創傷治癒における病理学的異常または瘢痕形成組織の過度の沈積に向かってバランスが傾き得る。例えば、創傷治癒過程中の皮膚における瘢痕組織の過度の沈積は、例えばケロイドまたは肥厚性瘢痕を生じさせ得る。ケロイドは創傷治癒における疾患であって、過度の瘢痕組織がもともとの創傷の境界を越えて増殖する。対照的に、肥厚性瘢痕は、外傷または傷害が深層の真皮に至るときに生じる。しかしながら、瘢痕組織の過度の沈積は、もともとの創傷の縁部に制限される。両方の場合において、コラーゲンの過剰蓄積または発現が原因であると考えられている。Tuan & Nichter、The Molecular Basis of Keloid and Hypertrophic Scar Formation、Mol.Med.Today ４：１９−２４(１９９８)。
【０００９】
皮膚において異常形成された瘢痕の存在は、多くの場合罹患個体にとって美容上許容でいないものである。事実、創傷治癒における異常または異常瘢痕を避けるかまたは処置するための治療戦略は、化粧品業界における推進力の一つである。さらに、異常な瘢痕は、苦痛であるかまたは掻痒症を起こし得、ある種の運動範囲を制限し得る。深刻な症例では、創傷が生じたとき、それが組織または臓器の機能不全に至り得る。すなわち、創傷治癒における異常および異常な瘢痕により、臨床研究および医学的処置が正当化される。
【００１０】
異常な瘢痕形成の細胞および分子原因論は、徹底的な研究が為されている対象である。研究者らは、増殖因子が異常な瘢痕形成の病理に関与していることを示した。特に、ＴＧＦ−βファミリーの要員は、重要な生物学的役割を演じる。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、正常な皮膚線維芽細胞培養物と比べると高レベルでケロイド線維芽細胞培養物において同定されることから、それらは異常な瘢痕形成および線維症に伴うものであると報告されている。Lee et al.、Expression of Transforming Growth Factor β1,２and 3 Proteins in Keloids、Ann.Plast.Surg.４３：１７９−１８４(１９９９)。
【００１１】
異常形成された瘢痕についての慣用的予防または処置には、創傷部位への直接的コルチコステロイド注入による線維芽細胞増殖の阻止、シリコーンゲルシートによるケロイドに伴う掻痒症の処置、熱傷またはケロイド死を誘発する冷凍療法(cyrotherapy)、外科的切除による過剰増殖瘢痕組織の除去、およびＩＦＮ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＦＮ−γの使用によるインターフェロン療法による、皮膚線維芽細胞における細胞メッセンジャーリボ核酸合成を低減化することによるコラーゲン合成の阻止がある。しかしながら、異常な瘢痕形成についての根本的原因が認識されていないため、これらの処置は深刻な副作用または異常瘢痕の再発を伴うことを示している。現在までのところ、異常な瘢痕を軽減または予防する一般に許容された処置は存在しない。Alster & West、Treatment of Scars: A Review、Ann.Plast.Surg. ３９：４１８−４３２(１９９５)。
【００１２】
従って、依然として創傷治癒における異常または異常瘢痕の新規処置または予防方法が要望されている。
【００１３】
発明の要約
本発明の一局面は、異常な瘢痕の形成に至り得る創傷治癒過程におけるコラーゲンの過度の蓄積または沈積を低減化する方法であって、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１(ＰＡＩ−１)の活性を低減化する段階を含む方法に関するものである。
【００１４】
本発明の別の局面は、異常な瘢痕の形成を予防する方法であって、ＰＡＩ−１活性を低減化する段階を含む方法に関するものである。
【００１５】
本発明のさらに別の局面は、ＰＡＩ−１活性の低減化を通して異常な瘢痕を処置する方法に関するものである。
【００１６】
本発明のさらに別の局面は、ＰＡＩ−１活性のレベルを測定することによる創傷治癒過程における異常な瘢痕形成の傾向を測定する方法に関するものである。
【００１７】
本発明の一態様では、ＰＡＩ−１活性をＰＡＩ−１阻害剤により低減化する。ＰＡＩ−１阻害剤の例としては、限定される訳ではないが、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル、Ｌ１５８８０９、エプロサルタン、トログリタゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ペリンドルプリル、ミフェプリストン(ＲＵ４８６)、スピロノラクトンおよび反応性中心ループペプチド、ＰＡＩ−１中和性抗体、ジケトピペラジンに基く化合物、テトラミン酸に基く化合物、ヒドロキシキノリノンに基く化合物、および１１−ケト−９(Ｅ),１２(Ｅ)−オクタデカジエン酸がある。
【００１８】
本発明の別の態様では、ＰＡＩ−阻害剤は、限定されるわけではないが、経口、腸溶、頬側、鼻、局所、直腸、膣、エーロゾル、経粘膜、表皮、経皮、眼、肺、および／または非経口投与を含む投与経路を通して対象に投与される。
【００１９】
本発明の別の態様では、ＰＡＩ−１活性は、例えば色素原検定法、酵素結合イムノソルベント検定法、フィブリンオーバーレイ検定法、および逆フィブリンオーバーレイ検定法により測定される。
【００２０】
本発明の別の態様では、異常な瘢痕は、過度のコラーゲン蓄積から生じる創傷治癒過程における異常である。異常な瘢痕の例には、限定されるわけではないが、ケロイド、外科的癒着、肥厚性瘢痕、皮膚の外観を損なう状態、例えばざ瘡およびしわ状セリュライト形成、新形成線維症、線維症、線維性嚢胞状態、拘縮、強皮症、デュピュイトラン病、ペーロニー病および関節の硬直がある。
【００２１】
図面の簡単な説明
添付図面は、本発明の実例を提供し、本発明の原理を説明すべく明細書に組み入れられ、その一部を形成している。図面は、本発明がいかに為され、使用され得るかの好ましい代替的態様を説明することを目的としているに過ぎない。勿論、図面は、本発明の概念を表し、説明することを意図したものであると理解すべきである。図面は、発明を制限するものではなく、説明的な実例に過ぎないものとしてみなされる。本発明の様々な利点および特徴は、記載された明細書および添付図面について熟考することにより明らかになるはずである。
【００２２】
図１は、正常皮膚、正常瘢痕およびケロイドにおけるｕＰＡおよびＰＡＩ−１発現の免疫組織化学試験を示す。メラニン細胞が免疫組織化学的に暗褐色を表すアフリカ系アメリカ人患者からケロイドおよび正常皮膚標本を採取した。Ｃｔｒｌ：一次抗体を伴わない対照。「＊」：表皮。「Ｊ」、「ｋ」および「ｌ」は、ケロイド瘢痕の深層皮膚領域からである。パネル「ｂ」および「ｃ」における黒矢印のヘッドは血管を示す。パネル「ｈ」、「ｋ」、「ｉ」および「ｌ」における白矢印のヘッドは線維芽細胞を示す。写真画像を１００×倍率で撮影した。
【００２３】
図２は、正常皮膚、正常瘢痕またはケロイド由来の線維芽細胞からのＰＡＩ−１のメッセンジャーＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。正常皮膚(Ｎ６５およびＮ７７)、正常瘢痕(ＮＳ７０およびＮＳ７５)、およびケロイド(Ｋ７６およびＫ８０)線維芽細胞を、８×１０３細胞／ｃｍ２の密度で培養し、ノーザンブロット分析用に抽出した。２０μｇの全ＲＮＡを各レーンにローディングした。試料をβ−アクチンのレベルに標準化した。
【００２４】
図３は、１６日の期間にわたってフィブリンゲルで培養した正常およびケロイド線維芽細胞を比較するコラーゲン蓄積の時間推移試験を示す。正常またはケロイド線維芽細胞のいずれかにより合成されたコラーゲンを、本明細書記載の手順に従って精製した。各時点での精製コラーゲンの量をｃｐｍ／細胞で表す。
【００２５】
図４は、正常およびケロイド線維芽細胞を比較する１４日の期間にわたるｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現を示す。上方パネル：ｕＰＡ活性を立証するフィブリンオーバーレイ検定法。下方パネル：ＰＡＩ−１活性を立証する逆フィブリンオーバーレイ検定法。２本鎖ｕＰＡは、５０ｋＤａまでの分子量で存在する。１本鎖ｕＰＡは３０ｋＤまでの分子量で存在する。高分子量タンパク質(〜１１０ｋＤ)は、ｕＰＡ／ＰＡＩ−１複合体である。ヒトＰＡＩ−１は、５０ｋＤ前後の分子量を示す。
【００２６】
図５は、１３日の培養期間にわたるドナー‐および解剖部位‐適合正常(Ｎ８６)およびケロイド(Ｋ８６)線維芽細胞からのｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現を示す。上方パネル：ｕＰＡ活性を立証するフィブリンオーバーレイ検定法。下方パネル：ＰＡＩ−１活性を立証する逆フィブリンオーバーレイ検定法。２本鎖ｕＰＡは、５０ｋＤａまでの分子量で存在する。１本鎖ｕＰＡは３０ｋＤまでの分子量周囲に存在する。高分子量タンパク質(〜１１０ｋＤ)は、ｕＰＡ／ＰＡＩ−１複合体である。ヒトＰＡＩ−１は、５０ｋＤ前後の分子量を示す。
【００２７】
図６は、フィブリン、フィブリン−コラーゲンまたはコラーゲンゲルで培養された正常またはケロイド線維芽細胞のｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現を示す。上方パネル：ｕＰＡ活性を立証するフィブリンオーバーレイ検定法。下方パネル：ＰＡＩ−１活性を立証する逆フィブリンオーバーレイ検定法。２本鎖ｕＰＡは、５０ｋＤａまでの分子量で存在する。１本鎖ｕＰＡは３０ｋＤまでの分子量周囲に存在する。ヒトＰＡＩ−１は、５０ｋＤ前後の分子量を示す。
【００２８】
図７は、フィブリンまたはコラーゲンゲルで培養された正常またはケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積を示す。線維芽細胞により合成されたコラーゲンを本明細書記載の要領で精製し、ｃｐｍ／細胞として表す。
【００２９】
図８は、フィブリンゲルで培養されたケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積に対する抗ＰＡＩ−１中和性抗体の効果を示す。線維芽細胞により合成されたコラーゲンを、本明細書記載の手順に従って精製し、ｃｐｍ／細胞として表す。挿入：ＰＡＩ−１活性を示す逆フィブリンオーバーレイ。
【００３０】
図９は、ケロイド線維症の主たる発見を要約し、組織損傷修復の鍵となる事象／要素にそれらを結び付ける概略図を示す。プラスミノーゲン活性化因子／プラスミンおよびＰＡＩ−１系は、マトリックスリモデリングにとって中心である。それはフィブリン分解を調節し、ＴＧＦ−ベータおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)活性に影響を及ぼし、そして細胞外マトリックス(ＥＣＭ)への細胞接着／遊走を調節する。ケロイド線維芽細胞は、ＴＧＦ−βへの曝露時にさらに増強され得る、高いレベルのコラーゲン蓄積だけでなく、それらのＰＡＩ−１活性増加およびｕＰＡ活性減少に起因するフィブリン分解における欠損を呈した。ＰＡＩ−１中和性抗体が、正常線維芽細胞と同等のレベルまでケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積を低減化することが観察されたとき、またはコラーゲン含有マトリックスゲルにおいてケロイド線維芽細胞を培養することによりｕＰＡ活性が増強されたとき、ＰＡＩ−１活性増加およびケロイド線維芽細胞の過度のコラーゲン蓄積間の関係が確立された。黒塗り矢印は、活性レベルを示す。
【００３１】
発明の詳細な記載
本発明は、異常形成瘢痕からの線維芽細胞が過度のコラーゲン蓄積を呈し、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１(ＰＡＩ−１)の高い活性を表すこと、およびＰＡＩ−１活性を減少させることにより、異常瘢痕からの線維芽細胞におけるコラーゲンの過度の沈積が減じられるという発見に関するものである。
【００３２】
特に、正常形成瘢痕および異常形成瘢痕(例えば、ケロイド)の皮膚線維芽細胞は、両方ともウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(ｕＰＡ)およびＰＡＩ−１を発現するが、異常形成瘢痕からの線維芽細胞はかなり高いＰＡＩ−１発現性を有することが、免疫組織化学試験を通して発見されている。長期三次元フィブリンゲル培養物は、正常線維芽細胞が、ｕＰＡおよびＰＡＩ−１の中程度の調節された活性レベルを表すことを示す。対照的に、ケロイド線維芽細胞は、一貫して高レベルのＰＡＩ−１および低レベルのｕＰＡを表した。ケロイド線維芽細胞の高いＰＡＩ−１活性は、フィブリンゲル培養物におけるそれらの高いコラーゲン蓄積と相関関係を示す。さらに、抗ＰＡＩ−１中和性抗体でフィブリンゲル培養物におけるＰＡＩ−１活性を減少させることにより、ケロイド線維芽細胞における高い蓄積が低減化されることが観察されている。
【００３３】
いかなる理論にも結び付けられることは望まないが、これらの発見は、ＰＡＩ−１過剰発現または高いＰＡＩ−１活性が、インビトロおよびインビボの両方における異常形成瘢痕からの線維芽細胞の永続的な特徴であることを示唆している。ＰＡＩ−１活性の減少が過度のコラーゲン蓄積の低減化をまねくと仮定すれば、ＰＡＩ−１は、異常形成瘢痕からの線維芽細胞の高いコラーゲン蓄積において原因となる役割を演じると思われる。したがって、本発明の一局面は、異常瘢痕または創傷治癒における異常の線維芽細胞におけるコラーゲンの過度の沈積または蓄積を予防または低減化する方法であって、ＰＡＩ−１活性を低減化させる段階を含む方法に関するものである。
【００３４】
フィブリンマトリックスのタンパク質加水分解およびそれに続く線維芽細胞により産生されるコラーゲンの置換は、創傷治癒過程の特に線維増殖およびリモデリング段階での本質的特徴であることは、当業界では公知である。また、コラーゲンの過度の沈積または過剰発現は、異常瘢痕をもたらす創傷治癒過程における異常を誘発することも報告されている。Tuan & Nichter、The Molecular Basis of Keloid and Hypertrophic Scar Formation、Mol.Med.Today ４：１９−２４(１９９８)。いかなる理論にも結び付けられることは望まないが、ＰＡＩ−１活性の低減化により、過度のコラーゲン沈積により誘発される創傷治癒過程における異常が予防され得ると思われる。さらに、ＰＡＩ−１活性を減少させることにより、異常瘢痕形成の病理学的推移が覆され、創傷治癒過程がその正常な経過に引き戻され得ると思われる。従って、本発明の別の局面は、過度のコラーゲン沈積から生じる創傷治癒における異常または異常瘢痕の予防および／または低減化方法であって、ＰＡＩ−１活性を低減化する段階を含む方法に関するものである。
【００３５】
ＰＡＩ−１の活性は、当業界で公知の方法、例えば本明細書に記載されている色素原検定法、フィブリンオーバーレイ検定法および逆フィブリンオーバーレイ検定法により測定され得るため、正常な創傷治癒経過または正常な瘢痕形成中におけるＰＡＩ−１活性のレベルが決定され、標準ＰＡＩ−１活性として示され得る。創傷治癒過程の通常の経過における標準ＰＡＩ−１活性は、創傷治癒過程にある創傷部位でのＰＡＩ−１活性のレベルとの比較に使用され得る。通常の創傷治癒過程における標準ＰＡＩ−１活性は、創傷部位でのＰＡＩ−１活性を測定する公知方法または検定法、またはGaffney & Edgell、The international standard for plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)activity、Thromb.Haemost.７６：８０−８３(１９９６)で示された方法を用いて確立され得る。過度のコラーゲン沈積により誘発される異常形成瘢痕は、持続的に高レベルのＰＡＩ−１を表すため、創傷治癒過程における創傷部位で示される高レベルのＰＡＩ−１活性は、過度のコラーゲン蓄積の可能性または異常瘢痕または創傷治癒過程における異常を形成する傾向を表し得る。したがって、本発明の別の局面は、過度のコラーゲン沈積の可能性または異常瘢痕形成の傾向を測定する方法であって、創傷部位の位置を確認し、創傷部位におけるＰＡＩ−１活性のレベルを測定する段階を含む方法に関するものである。さらに、上記方法は、正常な創傷治癒過程における標準ＰＡＩ−１活性と創傷部位でのＰＡＩ−１活性を比較し、異常な瘢痕を形成する可能性を測定する段階を含む。
【００３６】
プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１(ＰＡＩ−１)
本明細書で使用されているＰＡＩ−１は、セリンプロテアーゼ阻害剤(ＳＥＲＰＩＮ)ファミリーの一員であり、セリンプロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(ｕＰＡ)および組織型プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)の両方にとっての主たる阻害剤である。プラスミノーゲン活性化因子のＰＡＩ−阻害は、プラスミノーゲン活性化因子についての天然基質、プラスミノーゲンを模倣する、ＰＡＩ−１タンパク質のベイトペプチド結合(＃３４６(Ａｒｇ)および＃３４７(Ｍｅｔ)間のアミノ酸残基)を通して伝達されることが見出された。
【００３７】
ｕＰＡおよびｔＰＡは両方とも、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する酵素である。そしてプラスミンは、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)における他の糖タンパク質の分解、マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)の活性化、およびトランスフォーミング成長因子ＴＧＦ−Ｂの放出に関与する。Rifkin et al.、Plasminogen/plasminogen activator and growth factor activation、Ciba.Found.Symp. ２１２：１０５−１１５(１９９７)。したがって、インビボでのプラスミノーゲン活性化の一次調節因子として、ＰＡＩ−１は、創傷治癒過程中における細胞外マトリックス代謝に関与すると思われる。インビボでのＰＡＩ−１の発現が増加すると、組織の正常な線維分解系が抑制され、組織損傷部位におけるフィブリンの病的沈積をもたらし得る局所前血栓状態が形成されることが報告されている。Yamamoto & Saito、A Pathological Role of Increased Expression of Plasminogen Activator Inhibitor-1 in Human or Animal Disorders、Int'l.J.Hematol. ６８：３７１−３８５(１９９８)。
【００３８】
ＰＡＩ−１についての分子基盤は、充分に特性確認されている。特に、ヒトおよび動物由来の完全長ＰＡＩ−１をコードするＤＮＡ配列がクローン化および配列決定されている。例えば、ヒトＰＡＩ−１のｃＤＮＡ配列およびそのエンコーディングアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０４７４４４で列挙されている。マウスＰＡＩ−１のｃＤＮＡ配列およびそのエンコーディングアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ３３９６０で列挙されている。本発明で使用されているＰＡＩ−１は、ヒトＰＡＩ−１をいう。
【００３９】
ＰＡＩ−１の特徴の一つは、ＰＡＩ−１が自発的にその活性立体配座から、プラスミノーゲン活性化因子に結合し得ず、そしてそれを阻害し得ない潜在的不活性立体配座へ変換し得ることである。Sancho,et al.、Conformational studies on plasminogen activator inhibitor(PAI-1) in active,latent,substrate,and cleaved forms、Biochem. ３４：１０６４−１０６９(１９９５)。反応性中心ループとも呼ばれている、ＰＡＩ−１の＃３３３(Ｓｅｒ)から＃３４６(Ｌｙｓ)までのアミノ酸残基は、プラスミノーゲン活性化因子に対するＰＡＩ−１の阻害効果に関与していることが報告されている。Eitzman et al.、Peptide-mediated inactivation of recombinant and platelet plasminogen activator inhibitor-1 in vitro、J.Clin.Invest. ９５：２４１６−２４２０(１９９５)。ＰＡＩ−１の活性形態では、反応性中心ループ(ＲＣＬ)は、タンパク質の表面から突出し、偽基質としてプラスミノーゲン活性化因子にベイトペプチド結合(Ａｒｇ３４６−Ｍｅｔ３４７)を露出させている。しかしながら、潜在性不活性立体配座では、反応性中心ループは、β−シートＡへ中心鎖として挿入されている。同上。さらに、ＰＡＩ−反応性中心ループに対応する１４アミノ酸ペプチド(ＲＣＬペプチド)は、ＰＡＩ−１機能および活性を弱めることが示された。同上。
【００４０】
ＰＡＩ−１活性の低減化
ＰＡＩ−１の低減化は、ＰＡＩ−１の発現、活性または存在を縮小、減少、排除または除去する方法により達成され得る。例えば、ＰＡＩ−１活性は、ＰＡＩ−１遺伝子またはタンパク質の除去を通して減らされ得る。好適に製造されたＰＡＩ−１ノックアウトマウスは、ブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護されていると思われると報告されている。Hattori et al.、Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Fibrinogen-Null Mice、J.Invest.Invest. １０６：１３４１−１３５０(２０００)。ＰＡＩ−１活性はまた、本明細書に記載された通りコラーゲンまたはフィブリン‐コラーゲンゲルで線維芽細胞をインビトロ培養することにより増加しているｕＰＡ活性を通して低減化され得る。
【００４１】
本発明の一実施態様では、ＰＡＩ−１活性は、ＰＡＩ−１阻害剤により低減化される。ＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１の活性を直接的または間接的に阻害(抑制またはダウンレギュレーション)する分子または高分子である。
【００４２】
好ましい実施態様では、ＰＡＩ−１阻害剤は、直接的にＰＡＩ−１と相互作用するかまたはそれに結合することにより、ＰＡＩ−１の活性を低減化する直接ＰＡＩ−１阻害剤である。さらに好ましい実施態様において、直接ＰＡＩ−１阻害剤には、限定されるわけではないが、１)ジケトピペラジンＸＲ３３０およびＸＲ３３４、Bryans et al.、Inhibition of plasminogen activator inhibitor-1 activity by two diketopiperazines produced by Streptomyces sp.、J.Antibiot.４９：１０１４−１０２１(１９９６)；２)ジケトピペラジンＸＲ１８５３およびＸＲ５０８２、Charlton et al.、Evaluation of a low molecular weight modulator of human plasminogen activator inhibitor-1 activity、Thromb.Haemost. ７５：８０８−１５(１９９６)；３)ＸＲ５１１８およびＸＲ５１１８から誘導されたジケトピペラジンに基く化合物、例えばFolkes et al.、Synthesis and In Vitro Evaluation of a Series of Diketopiperazine Inhibitors of Plasminogen Activator Inhibitor-1、Bioorg.Medicinal Chem.Lett. １１：２５８９−２５９２(２００１)に報告されている、化合物＃２４、２５、３３、３４、３５、３６、３７および３８、４)Folkes et al.、Design,synthesis,and in vitro evaluation of potent,novel,small molecule inhibitors of plasminogen activator inhibitor-1、Bioorg.Med.Chem.Lett. １２：１０６３−１０６６(２００２)に報告されているテトラミン酸に基く化合物およびヒドロキシキノリノンに基く化合物、および５)１１−ケト−９(Ｅ),１２(Ｅ)−オクタデカジエン酸、Chikanishi et al.、Inhibition of plasminogen activator inhibitor-1 by 11‐keto-9(E),12(E)-octadecadienoic acid, a novel fatty acid produced by Trichodermasp.、J.Antibiot. ５２：７９７−８０２(１９９９)がある。また、ＰＡＩ-１の活性を阻害する低分子量化学的化合物については、米国特許第５９０２８１２号、米国特許第５８９１８７７号、および米国特許第５７５０５３５号参照、これらについては出典明示で援用する。
【００４３】
本発明の別のさらに好ましい実施態様において、直接ＰＡＩ−１阻害剤には、本明細書に記載されているＰＡＩ−１中和性抗体、およびＰＡＩ−１阻害性モノクローナル抗体、例えば限定されるわけではないが、ヒトＰＡＩ−１ ＭＡ−４４Ｅ４、ＭＡ−４２Ａ２Ｆ６、ＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０、ＭＡ−３３Ｂ８に対するネズミモノクローナル抗体がある。Verhamme et al.、Accelerated conversion of human plasminogen activator inhibitor-1 to its latent form by antibody binding、J.Biol.Chem.、２７４：１７５２２−１７５１７(１９９９)；Bijnens et al.、The distal hinge of the reactive site loop and its proximity: A target to modulate plasminogen activator inhibitor-1 activity、J.Biol.Chem.、２７６：４４９１２−４４９１８(２００１)参照。反応性中心ループ(ＰＡＩ−１のＳｅｒ３３３−Ｌｙｓ３４６)はＰＡＩ−１構造の表面から突出し、プラスミノーゲン活性化因子へのベイトペプチド結合(Ａｕｇ３４６-Ｍｅｔ３４７)を呈するため、反応性中心ループに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、直接ＰＡＩ−１阻害剤であると考えられる。ＰＡＩ−１中和性または阻害性抗体は、ＰＡＩ−１に結合し、プラスミノーゲン活性化因子とのその相互作用を阻害することによりその活性を遮断し得る。別法として、ＰＡＩ−１中和性または阻害性抗体は、ＰＡＩ−１の活性立体配座から潜在性不活性形態への変換を促進することによりＰＡＩ−１活性を抑制し得る。Verhamme、前出参照。
【００４４】
本発明の別の実施態様において、ＰＡＩ−１阻害剤は、間接的にＰＡＩ−１の活性を阻害(抑制またはダウンレギュレーション)する分子または高分子である間接的ＰＡＩ−１阻害剤である。例えば、細胞および分子レベルでは、間接的ＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１遺伝子の転写または発現を特異的に阻害する因子または化合物、ＰＡＩ−１の発現を遮断するＰＡＩ−１配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＡＩ−１ ｍＲＮＡの分解についてのＲＮＡ干渉を誘導するポリヌクレオチド構築物、または順次ＰＡＩ−１のｍＲＮＡを分解するｓｉＲＮＡを生産するダイサー、プラスミノーゲン活性化因子との酵素反応においてＰＡＩ−１と競合する分子であり得る。ＰＡＩ−１の発現が、因子、例えば内毒素、トロンビン、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−β、インターロイキン−１、インシュリン、デキサメタゾン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、リポタンパク質およびアンギオテンシンIIにより高められ得ることは、当業界では公知である。従って、間接的ＰＡＩ−１阻害剤は、間接的にＰＡＩ−１の発現を低減化するその因子に対する阻害剤であり得る。
【００４５】
間接的ＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１の発現を抑制する化合物であることがさらに好ましい。ＰＡＩ−１の発現を抑制または弱化する間接的ＰＡＩ−１阻害剤としては、限定されるわけではないが、アンギオテンシン変換酵素阻害剤(例、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル)、アンギオテンシンII受容体アンタゴニスト(Ｌ１５８８０９、エプロサルタン)、トログリタゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ペリンドプリル、ミフェプリストン(ＲＵ４８６)およびスピロノラクトンが挙げられることは、当業界では公知である。Eitzman et al.、Peptide-mediated inactivation of recombinant and platelet plasminogen activator inhibitor-1 in vitro、J. Clin. Invest. 95:2416-2420 (1995); Pawlowska et al., Natriuretic peptides reduce plasminogen activator inhibitor-1 expression in human endothelial cells、 Cell Biol. Lett. 7:1153-1157 (2002); Mitsui et al.、Imidapril, an angiotensin-converting enzyme inhibitor, inhibits thrombosis via reduction in aortic plasminogen activator inhibitor type-1 levels in spontaneously hypertensive rats、 Biol. Pharm. Bull. 22:863-865 (1999); Brown et al.、Aldosterone modulates plasminogen activator inhibitor-1 and glomerulosclerosis in vivo、Kidney Int. 58:1219-1227 (2000); Wong et al.、Gene expression in rats with renal disease treated with the angiotensin II receptor antagonist, Eprosartan、Physiol. Genomics 4:35-42 (2000); Papp et al.、Biological mechanisms underlying the clinical effects of mifepristone (RU 486) on the endometrium、Early Pregnancy 4:230-239 (2000); Oikawa et al.、Modulation of plasminogen activator inhibitor-1 in vivo: a new mechanism for the anti-fibrotic effect of renin-angiotensin inhibition、Kidney Int. 51:164-172 (1997); Fogari et al.、Losartan and perindopril effects on plasma plasminogen activator inhibitor-1 and fibrinogen in hypertensive type 2 diabetic patients、Am. J. Hypertens. 15:316-320 (2002); Pahor et al.、Fosinopril versus amlogipine comparative treatments study: a randomized trial to assess effects on plasminogen activator inhibitor-1、Circulation 105:457-461 (2002); Orge et al.、Vitamins C and E attenuate plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) expression in a hypercholesterolemic porcine model of angioplasty、Cardiovasc. Res. 49:484-492 (2001); Gottschling-Zeller et al.、Troglitazone reduces plasminogen activator inhibitor-1 expression and secretion in cultured human adipocytes、Diabetologia 43:377-383 (2000); Katoh et al.、Angiotensin-converting enzyme inhibitor prevents plasminogen activator inhibitor-1 expression in a rat model with cardiovascular remodeling induced by chronic inhibition of nitric oxide synthesis、J. Mol. Cell Cardiol. 32:73-83 (2000)参照。
【００４６】
別のさらに好ましい実施態様では、間接的ＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１およびプラスミノーゲン活性化因子間の反応を妨げることにより、間接的にＰＡＩ−１活性を低減化させるペプチドである。例えば、ＰＡＩ−１の反応性中心ループの配列を含むペプチド(ＲＣＬペプチド)は、ＰＡＩ−１活性を阻害することが知られている。Verhamme、前出。
【００４７】
分子または高分子がＰＡＩ-１阻害剤であるか否かを決定する場合、当業者に公知の色素原検定法を実施して、分子または高分子の存在下におけるＰＡＩ−１活性を測定することが多い。色素原検定法では、まず、分子を、ＰＡＩ−１含有溶液またはＰＡＩ−１を分泌する細胞を含む細胞培養物に混合する。次いで、一定量の組織プラスミノーゲン活性化因子を生成した混合物に加え、ＰＡＩ−１と反応させる。中性ｐＨのＧｌｕ−プラスミノーゲン、ポリＤ−リシンおよび色素原基質の混合物を反応物に加えることにより、残留ｔＰＡを測定する。残留ｔＰＡ活性は、プラスミノーゲンからさらに色素原基質を加水分解するプラスミンへの変換を触媒する。現われた色の度合は、分子の阻害性および有効性を順次表すｔＰＡの量と比例の相関関係を示す。色素原検定法は、Wysocki et al、Temporal Expression of Urokinase Plasminogen Activator, Plasminogen Activator Inhibitor and Gelatinase-A in Chronic Wound Fluid Switches from a Chronic to Acute Wound Profile with Progression to Healing, Wound Repair Regen.  7: 154-165 (1999)に詳述されている。さらに、分子がＰＡＩ−１の発現を抑制するか否かはまた、フィブリンオーバーレイ検定法、逆フィブリンオーバーレイ検定法、酵素結合イムノソルベント検定法(ＥＬＩＳＡ)により測定され得、これらは全て当業界では公知であるか、および／または本明細書に記載されている。
【００４８】
ＰＡＩ−１阻害剤により誘発される過度のコラーゲン蓄積の低減化の有効性を調べるため、インビトロ三次元フィブリンマトリックスゲル培養系を使用する。３−Ｄフィブリンマトリックスゲル培養系は、創傷治癒過程中の細胞および細胞外マトリックス間における相互作用を試験すべく確立されたインビトロ線維増殖モデルである。Tuan et al.、In vitro Fibroplasia: Matrix Contraction, Cell Growth and Collagen Production of Fibroblasts Cultured in 3-Dimensional Fibrin Matrix、Exp. Cell Res. 223: 127-134 (1996)。３−Ｄフィブリンマトリックスゲル培養系は、線維増殖の鍵となる特徴を呈する。特に、この系は、細胞増殖、フィブリン再組織および分解、および創傷治癒におけるコラーゲン合成および沈積を模倣する。従って、この系は、インビボ線維増殖過程を効果的に表す。３−Ｄフィブリンマトリックスゲル培養系におけるＰＡＩ−１阻害剤の存在は、ＰＡＩ−１活性の低減化およびそれに続いてコラーゲン合成の低減化を誘発する。コラーゲン合成レベルは、当業界で公知の方法を用いて測定され得る。Tuan et al.、In vitro Fibroplasia: Matrix Contraction, Cell Growth and Collagen Production of Fibroblasts Cultured in 3-Dimensional Fibrin Matrix、Exp. Cell Res. 223: 127-134 (1996)。
【００４９】
ＰＡＩ−１活性は色素原検定法を用いて測定され得るため、通常の瘢痕形成経過中におけるＰＡＩ−１活性のレベルは、異常な瘢痕形成経過におけるＰＡＩ−１活性と比較される標準ＰＡＩ−１活性として測定され、示され得る。従って、異常な瘢痕形成の傾向は、各瘢痕形成段階で測定され得、ＰＡＩ−１阻害剤は、異常な瘢痕形成を予防するかまたは異常瘢痕を形成する可能性を減らすのに適切な治療有効量で投与され得る。
【００５０】
創傷治癒における異常
上述した通り、本発明の一局面は、異常な瘢痕形成を回避するかまたは過度のコラーゲン沈積により誘発される創傷治癒における異常を処置する方法であって、ＰＡＩ−１活性を低減化する段階を含む方法に関するものである。本明細書で使用されている「創傷」の語については、少なくとも身体または身体組織または臓器、例えば皮膚、肺、腎臓、肝臓、心臓、消化管、骨、腱、眼または神経の内部および外部表面の粘膜または上皮層への傷害、損傷または外傷を例として挙げることができるが、これらに限定はされない。創傷は、外傷、手術、切開、感染、火傷、剥離、穿刺、打撃、水疱、汚染物質または毒素により誘発され得る。一旦創傷が生じると、創傷領域または創傷部位では、通常、損なわれた組織または臓器を修復するための創傷治癒過程が進行する。通常の創傷治癒過程は、創傷部位の組織または臓器を可能な限り傷の無い状態に戻す。しかしながら、創傷治癒過程は、多くの段階に掛かり合い、上記の多くの因子により影響される、専ら特定目的のために進行する過程である。何らかの逸脱があると、この過程は乱され、正常な創傷治癒からの逸脱として異常または異常瘢痕形成が誘発され得る。
【００５１】
本明細書で使用されている「異常(な)瘢痕」、「異常(な)瘢痕形成」、「創傷治癒における異常」または「創傷治癒における障害」または「創傷治癒障害」の語は、過度のコラーゲン沈積または蓄積により誘発される通常の創傷治癒過程からの逸脱をいう。異常瘢痕または創傷治癒における異常には、限定されるわけではないが、線維症、線維腫症、ケロイド症、癒着(例、外科的癒着)、肥厚性瘢痕、線維性嚢胞状態、および関節の硬直がある。異常瘢痕または創傷治癒における異常はまた、創傷が生じている組織型に基いた様々な状態に分類され得る。皮膚における異常瘢痕形成は、例えばケロイド、肥厚性瘢痕、拘縮、または強皮症に至り得る。消化管での創傷治癒における異常は、例えば狭窄、癒着または慢性膵炎に至り得る。創傷治癒における異常は、例えば、腎臓における糸球体腎炎、眼における水晶体後線維増殖症、肝臓における肝硬変および胆道閉鎖症、肺における間質性線維症または気管支肺異形成症、および心臓におけるリウマチ心疾患または心室瘤を誘発し得る。Sabiston Textbook of Surgery: The Biological Basis of Modern Surgical Practice、１２章(第１６版、2001)参照。
【００５２】
好ましくは、皮膚に伴う創傷治癒障害または異常瘢痕には、限定されるわけではないが、肥厚性瘢痕、ケロイド、皮膚の外観を損なう問題、例えばざ瘡、しわ、セリュライト形成および新形成線維症、デュピュイトラン病、ペーロニー病、および他の皮膚または内部創傷または皮膚病変が含まれる。さらに好ましくは、異常瘢痕形成は、肥厚性瘢痕、ケロイドおよび皮膚の外観を損なう問題を含む。ケロイドは、もともとの創傷の境界を越えて増殖する瘢痕組織の過度の沈積から生じる。瘢痕組織の過度の沈積がもともとの創傷の周辺に制限されているとき、肥厚性瘢痕が形成される。ケロイドおよび肥厚性瘢痕の両方において、過度の瘢痕がコラーゲンの病的に過剰な発現および蓄積により誘発されることは当業界では公知である。Haverstock, Hypertrophic Scars and Keloids, Clin. Podiatr. Med. Surg. 18: 147-159 (2001)。
【００５３】
さらに好ましくは、創傷治癒障害は線維症である。線維症は、過度のコラーゲン蓄積を示し、組織における創傷部位が異常瘢痕に取って代わられたとき、組織または臓器の機能を損なう。線維症の例には、心臓のポンプ機能を損なう心臓発作後の瘢痕組織の形成、腎機能の進行性喪失に至る糖尿病からの腎臓における異常な瘢痕形成、並びに拘縮および疼痛を誘発する術後の臓器間の線維性癒着があるが、これらに限定はされない。主要臓器または組織に基く線維症には、糖尿病または高血圧により誘発される腎臓線維症、アルコールまたはウイルス性肝炎により誘発される肝臓線維症、肺線維症、心臓線維症、黄斑変性および網膜および硝子体網膜症があるが、これらに限定はされない。
【００５４】
本明細書で使用されている「過度のコラーゲン蓄積」、「過度のコラーゲン沈積」または「コラーゲンの過剰発現」の語は、通常の治癒過程が進行している創傷部位または正常に形成された瘢痕におけるコラーゲンの通常レベルより高い創傷部位または瘢痕における高レベルのコラーゲンをいう。好ましくは、コラーゲンの高レベルとは、通常レベルよりも少なくとも約２０％高いことをいう。さらに好ましくは、コラーゲンのレベルとは少なくとも約３０％高いことをいう。コラーゲン蓄積レベルは、インビボ検定法およびインビトロ検定法を用いて測定され得る。インビボ検定法では、創傷部位または瘢痕に存在するコラーゲンの量を、当業界でよく知られているパンチ生検を用いることによる形態学的評価または生化学的評価により測定する。インビトロ検定法では、創傷部位からの線維芽細胞を集め、インビトロ三次元フィブリンマトリックス培養系へ導入する。通常の瘢痕または正常組織からの線維芽細胞(対照線維芽細胞)を対照として使用する。これらの線維芽細胞から新たに合成されたコラーゲンを精製し、標識アミノ酸を用いることにより測定する。Tuan et al.、In vitro fibroplasia: matrix contraction, cell growth and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels、Exp.Cell.Res.２２３：１２７−１３４(１９９６)参照。新たに合成されたコラーゲンのレベルが対照線維芽細胞のレベルよりも高い、好ましくは少なくとも約２０％高い、さらに好ましくは少なくとも約３０％高い場合、創傷部位または瘢痕は、過度のコラーゲン沈積または蓄積を有するものと見なされ得る。
【００５５】
ＰＡＩ−１阻害剤の投与
本発明の一態様は、創傷を負った対象にＰＡＩ−１阻害剤組成物を投与することによる異常な瘢痕形成の予防または異常瘢痕の処置方法に関するものである。ＰＡＩ−１阻害剤組成物は、ＰＡＩ−１阻害剤そのものまたはＰＡＩ−１阻害剤および医薬上許容される担体を含むＰＡＩ−１阻害剤医薬のいずれかである。
【００５６】
ＰＡＩ−１阻害剤組成物は、限定する訳ではないが、経口、腸溶、頬側、鼻、局所、直腸、膣、エーロゾル、経粘膜、表皮、経皮、眼、肺および／または非経口投与を含む、当業界で公知の投与経路により対象に投与され得る。表皮または局所投与とは、創傷部位へのＰＡＩ−１阻害剤の直接的送達をいう。結膜投与とは、角膜および結膜表面から眼および／または身体の残部および創傷部位へのＰＡＩ−１阻害剤の送達をいう。鼻投与は、鼻粘膜上皮から末梢循環系へのＰＡＩ−１阻害剤の送達をいう。頬側投与とは、頬または舌上皮から末梢循環系への送達をいう。経口投与とは、頬上皮を経るが主に嚥下され、胃および消化管で吸収されるＰＡＩ−１阻害剤の送達をいう。直腸投与とは、下部消化管粘膜を介した末梢循環系へのＰＡＩ−１阻害剤の送達をいう。膣投与とは、末梢循環系への膣粘膜を通したＰＡＩ−１阻害剤の送達をいう。末梢循環系は、ＰＡＩ−１阻害剤を創傷部位へ運ぶ。非経口投与とは、限定されるわけではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内および／または胸骨内注射および／または注入を含む典型的には注射に関する投与経路をいう。
【００５７】
本明細書で使用されている「医薬上許容される担体」の語は、ＰＡＩ−１阻害剤を身体の一組織、臓器または一部から身体の別の組織、臓器または一部へ運ぶかまたは輸送する際に必要とされる医薬上許容される材料、組成物または賦形剤、例えば液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を包含する。各担体は、処方物の他の成分、例えばＰＡＩ−１阻害剤と適合性があり、ヒトおよび動物の組織または臓器と接触させた状態での使用に適切であり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または他の問題または合併症を伴うことが無く、利点／危険性が妥当な比率で釣り合っているという意味で「医薬上許容される」ものでなくてはならない。医薬上許容される担体としての機能を果たし得る材料の例には、(１)糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース、(２)澱粉、例えばトウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉、(３)セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、(４)粉末状トラガカントゴム、(５)麦芽、(６)ゼラチン、(７)タルク、(８)賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤蝋、(９)油脂類、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油、(１０)グリコール類、例えばプロピレングリコール、(１１)ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール、(１２)エステル類、例えばエチルオレエートおよびエチルラウレート、(１３)寒天、(１４)緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、(１５)アルギン酸、(１６)発熱物質不含有水、(１７)等張食塩水、(１８)リンゲル溶液、(１９)エチルアルコール、(２０)リン酸緩衝液、および(２１)医薬処方物で使用される他の非毒性適合性物質がある。
【００５８】
典型的には、ＰＡＩ−１阻害剤組成物は、各投与経路に適切な処方物または調製物形態で対象に与えられる。本発明方法において有用な処方物は、１種またはそれ以上のＰＡＩ−１阻害剤、そのための１種またはそれ以上の医薬上許容される担体、および所望による他の治療成分を含む。処方物は、好都合には単位用量形態で提供され得、医薬業界で公知の方法により製造され得る。単一用量形態を製造するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、処置されている対象および特定投与方式により異なる。医薬有効量を製造するために担体材料と組み合わされ得るＰＡＩ−１阻害剤の量は、一般的に治療効果を生じるＰＡＩ−１阻害剤の量である。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセントから約９９パーセントの割合のＰＡＩ−１阻害剤、好ましくは約５パーセントから約７０パーセントの範囲である。
【００５９】
これらの処方物または組成物の製造方法は、ＰＡＩ−１阻害剤を１種またはそれ以上の医薬上許容される担体および所望により１種またはそれ以上の副成分と合わせる工程を含む。一般に、処方物は、ＰＡＩ−１阻害剤を液状担体、または微細分割固体担体、またはその両方と均一および緊密に合わせ、次いで必要ならば生成物を成型することにより製造される。
【００６０】
経口投与に適切な処方物は、カプセル剤、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ(味付けした基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを用いる)、散剤、顆粒剤、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油または油中水エマルションとして、またはエリキシルまたはシロップとして、またはトローチ剤(不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを用いる)として、および／または口腔洗浄液などとしての形態を取り得、各々予め定められた量のＰＡＩ−１阻害剤を有効成分として含有する。化合物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与され得る。
【００６１】
経口投与用固体用量形態(例、カプセル剤、錠剤、丸薬、糖衣錠、散剤、顆粒剤など)では、ＰＡＩ−１阻害剤を１種またはそれ以上の医薬上許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下の成分：(１)増量剤またはエキステンダー、例えば澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／または珪酸、(２)結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア、(３)湿潤(希釈)剤、例えばグリセリン、(４)崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のシリケートおよび炭酸ナトリウム、(５)溶解遅延剤、例えばパラフィン、(６)吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、(７)湿潤剤、例えばアセチルアルコールおよびグリセリンモノステアレート、(８)吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土、(９)滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物、および(１０)着色料のいずれかと混合する。カプセル剤、錠剤および丸薬の場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含み得る。また類似タイプの固体組成物は、賦形剤、例えばラクトースまたは乳糖類、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを用いることにより、ゼラチン軟および硬カプセル剤における増量剤として使用され得る。
【００６２】
錠剤は、所望により１種またはそれ以上の副成分と共に、圧縮または成型により製造され得る。圧縮錠剤は、結合剤(例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、澱粉グリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、表面活性または分散剤を用いて製造され得る。成型錠剤は、適切な機械において不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状ペプチドまたはペプチドミメティックの混合物を成型することにより製造され得る。
【００６３】
錠剤、および他の固体用量形態、例えば糖衣錠、カプセル剤、丸薬および顆粒剤には、所望により割線を入れるか、またはコーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよび製薬業界で公知の他のコーティングを施すことによりそれらを製造し得る。それらはまた、例えば、所望の放出プロフィール、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを提供する様々な比率でのヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いることによりそこに含まれるＰＡＩ−１阻害剤の放出が遅延または制御されるように処方され得る。それらは、例えば、細菌捕捉(bacteria-retaining)フィルターによる濾過により、または使用直前に滅菌水に溶解され得る無菌固体組成物形態の滅菌剤、または他の滅菌注射可能媒質を組入れることにより滅菌され得る。これらの組成物はまた、所望により遮光(opacifying)剤を含み得、ＰＡＩ−１阻害剤(複数も可)のみを、または優先的に消化管のある部分で、所望により遅延方式で放出する組成物に属し得る。使用され得る埋封組成物の例には、ポリマー物質および蝋がある。ＰＡＩ−１阻害剤はまた、適切な場合、上記賦形剤の１種またはそれ以上によるマイクロカプセル化形態であり得る。
【００６４】
経口投与用液体用量形態には、医薬上許容されるエマルション、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルがある。ＰＡＩ−１阻害剤に加えて、液体用量形態は、当業界で常用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、油類(特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびごま油)、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤以外に、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、調味料、着色料、香料および保存剤を含み得る。
【００６５】
懸濁液は、ＰＡＩ−１阻害剤に加えて、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、並びにそれらの混合物を含み得る。
【００６６】
直腸または膣投与用処方物は坐剤として提供され得、それらは１種またはそれ以上のＰＡＩ−１阻害剤を、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤蝋またはサリチラートを含む１種またはそれ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより製造され得、室温では固体であるが体温では液状であるため、直腸または膣腔で溶解し、有効成分を放出する。また膣投与に適切な処方物には、当業界で適切であることが知られている上記担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡沫またはスプレー処方物がある。
【００６７】
ＰＡＩ−１阻害剤組成物の局所または経皮または表皮投与用処方物には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチおよび吸入剤がある。活性成分は、無菌条件下で医薬上許容される担体、および必要とされ得る保存剤、緩衝剤または高圧ガスと混合され得る。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、ＰＡＩ−１阻害剤組成物に加えて、賦形剤、例えば動物および植物脂肪、油類、蝋、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルクおよび酸化亜鉛またはそれらの混合物を含み得る。粉末およびスプレーは、ＰＡＩ−１阻害剤組成物に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含み得る。スプレーは、さらに常用高圧ガス、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含み得る。
【００６８】
別法として、ＰＡＩ−１阻害剤組成物はエーロゾルにより投与され得る。これは、ＰＡＩ−１阻害剤を含有する水性エーロゾル、リポソーム調製物または固体粒子を製造することにより達成される。非水性(例、フルオロカーボン高圧ガス)懸濁液が使用され得る。超音波ネブライザーもまた使用され得る。水性エーロゾルは、慣用的な医薬上許容される担体および安定剤と一緒に薬剤の水溶液または懸濁液を処方することにより製造される。担体および安定剤は、特定化合物の必要条件により異なるが、典型的には非イオン性界面活性剤(トウィーン、プルロニクス、またはポリエチレングリコール)、無害のタンパク質様血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、アミノ酸、例えばグリシン、緩衝液、塩類、糖類または糖アルコールを含有する。エーロゾルは、一般的に等張溶液から調製される。
【００６９】
また経皮パッチは、ＰＡＩ−１阻害剤組成物を異常瘢痕に送達するのに使用され得る。上記処方物は、薬剤を適切な媒質に溶解または分散させることにより製造され得る。また、皮膚におけるペプチドミメティックのフラックスを高めるために吸収促進剤が使用され得る。上記フラックス速度は、速度制御膜を設けるかまたはペプチドミメティックをポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることにより制御され得る。
【００７０】
眼用処方物、眼用軟膏、粉末、液剤などもまた、本発明の範囲内に含まれるものとみなされる。
【００７１】
非経口投与に適切な処方物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、処方物を意図したレシピエントの血液と等張性にする溶質または懸濁もしくは増粘剤を含み得る、１種またはそれ以上の医薬上許容される滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散液に再構成され得る滅菌粉末と組合わせてＰＡＩ−１阻害剤を含む。
【００７２】
非経口投与に適切な処方物で使用され得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(例、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばエチルオレエートがある。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。
【００７３】
非経口投与に適切な処方物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含ませることにより確実にされ得る。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを組成物に含ませるのが望ましい場合もあり得る。さらに、注射可能医薬形態の長時間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより達成され得る。
【００７４】
場合によっては、ＰＡＩ−１阻害剤の効果を長引かせるため、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を減速させることが望ましいこともある。これは、水に対する溶解度が低い結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用により達成され得る。また、薬剤の吸収速度はその溶解速度により変化し、その速度は、結晶サイズおよび結晶形態により左右され得る。別法として、非経口投与処方物の吸収遅延は、ＰＡＩ−１阻害剤組成物を油性賦形剤に溶解または懸濁することにより達成される。
【００７５】
注射可能デポー形態は、ＰＡＩ−１阻害剤のマイクロカプセル化マトリックスを形成するかまたは生物分解性ポリマー、例えばポリラクチド‐ポリグリコリドを用いることにより製造される。ＰＡＩ−１阻害剤対ポリマーの割合、および使用される特定ポリマーの性質によって、薬剤放出速度が制御され得る。他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)がある。デポー注射可能処方物はまた、身体組織と適合し得るリポソームまたはマイクロエマルジョンにＰＡＩ−１阻害剤を包括させることにより製造される。
【００７６】
本発明の好ましい実施態様では、ＰＡＩ−１阻害剤組成物を治療有効量で創傷部位に送達する。本明細書で使用されている「医薬有効量」の語は、所望の治療効果を生じさせるのに有効であるか、または異常瘢痕の形成に至る創傷治癒における過度のコラーゲン蓄積または発現を低減化することにより、または創傷治癒での異常においてコラーゲン蓄積レベルを通常の創傷治癒の場合のレベルに低下させることにより、またはＰＡＩ−１阻害剤が投与されない場合には異常な瘢痕を形成する傾向を示す創傷部位で通常の瘢痕形成が観察されることにより、または異常形成瘢痕の鎮静が観察されることにより反映される、ＰＡＩ−１阻害剤、ＰＡＩ−１阻害剤組成物、またはＰＡＩ−１阻害剤医薬の量をいう。薬理学業界で公知の通り、所定の患者における処置効力に関して最も有効な結果を生じるＰＡＩ−１阻害剤の医薬有効量の正確な量は、少し例を挙げれると、例えば、特定ＰＡＩ−１阻害剤の活性、特定の性質、薬物動態学、薬力学および生物学的利用能、対象の生理学的条件(人種、年齢、性別、体重、食餌療法、病気のタイプおよび段階、全般的体調、所定の医薬用量およびタイプに対する応答性を含む)、処方物における医薬上許容される担体の性質、使用されている投与経路および頻度、並びに創傷または異常瘢痕形成の重症度または傾向により異なる。しかしながら、上記指針は、処置を微調整する、例えば最適投与量を決定するための基礎として使用され得、対象のモニタリングおよび用量の調節から成る常用手順での実験法をもはや必要とはしない。Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro編、第２０版、Williams & Wilkins、ペンシルベニア、米国)(２０００)。
【００７７】
本発明について概説したが、説明を目的として下記に示した具体的な実施例によりさらに本発明についての理解を深めることができるはずである。
【実施例】
【００７８】
材料および方法
細胞単離：外植片(エクスプラント)方法を用いて、ヒト正常皮膚、瘢痕およびケロイドのドナーから線維芽細胞を確立した。皮膚および瘢痕収集についてのプロトコールは、チルドレンズ・ホスピタル・ロスアンゼルスおよびCharles R. Drewユニヴァーシティー・オブ・メディシン・アンド・サイエンスの両方により承認された。生じたケロイド瘢痕のコア領域を線維芽細胞単離用に使用した。１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％胎児牛血清(ライフ・テクノロジーズ、インコーポレイテッド)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)(ライフ・テクノロジーズ、インコーポレイテッド、グランドアイランド、ニューヨーク)において線維芽細胞を増殖させた。培養物を、５％ＣＯ２および９５％空気の雰囲気中、加湿インキュベーター中でインキュベーションした。ハンクス溶液中に０.０５％エチレンジアミン四酢酸を含む０.２５％トリプシン(ライフ・テクノロジーズ、インコーポレイテッド)を用いて線維芽細胞を培養物から採取し、週に１回継代した。線維芽細胞の初期継代(２〜１０)を、実験で使用した。細胞継代を、一次培養物からの週１回の細胞増殖として定義する。本発明で使用する線維芽細胞の各株の供給源を表１に列挙する。これらの標本は、８年の期間を通じて為された試料獲得における研究努力を表すものであった。本発明で提示した各実験を実施し、可能なときは必ずドナー年齢および解剖学的部位を対で適合させながら正常およびケロイド線維芽細胞の多株間で比較した。
【００７９】
フィブリンゲルの調製：ヒトフィブリノーゲン(カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア)を、フィブリンゲル調製用に使用した。フィブリノーゲンを蒸留Ｈ２Ｏ中で再構成し、１０ｍｇ／ｍｌに調節し、−２０℃で貯蔵した。１〜５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを１〜２単位／ｍｌのヒトトロンビンと混合し、３７℃で３０分間インキュベーションすることにより、フィブリノーゲンの凝血能を測定した。形成された血餅を試験管の壁から分離させた。管を１５分間１２０００ｇでの遠心分離にかけることにより、血餅を沈降させ、可溶性フィブリノーゲンを集めた。上清に残存する可溶性非凝血性フィブリノーゲンを、ＯＤ２８０でのタンパク質濃度により測定した。使用したフィブリノーゲンは全て９５〜９８％凝血性であった。
【００８０】
フィブリンゲル調製方法は、以前の出版物に記載されている。Tuan & Grinnell、Fibronectin and fibrinolysis are not required for fibrin gel contraction by human skin fibroblasts、J.Cell Physiol. １４０：５７７−５８３(１９８９)。簡単に述べると、ＤＭＥＭ中のヒト皮膚線維芽細胞を、２４℃のフィブリノーゲン溶液に加えた。フィブリノーゲンおよび線維芽細胞の最終濃度は、それぞれ２.５ｍｇ／ｍｌおよび０.５×１０６細胞／ｍｌであった。線維芽細胞／フィブリノーゲン混合物のアリコート(１８０ｍｌ)を、１試料当たり１単位のトロンビンと共に２４ウェル組織培養プレート(コスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ)のウェルに導入した。各アリコートは、ウェル内の１６ｍｍ直径の円形切り込み線で輪郭を描いた領域を占めた。調製物を、５％ＣＯ２含有加湿インキュベーター中１時間３７℃でインキュベーションすることにより、フィブリンの重合を確実にした。インキュベーション期間の最後に、１０％ＦＣＳを含む１.０ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えることにより、ゲルを覆った。
【００８１】
ｕＰＡおよびＰＡＩ−１試験用に選択した試料を、まずＤＭＥＭにより充分にすすぎ(５回)、ＤＭＥＭ中でさらに２４時間インキュベーションした。条件培養培地を集め、フィブリンオーバーレイおよび逆フィブリンオーバーレイ検定法にかけた。
【００８２】
コラーゲンゲルの調製：Tuan et al.、Dermal fibroblasts activate keratinocyte outgrowth on collagen gels、J.Cell.Sci. １０７：２２８５−２２８９(１９９４)で以前に報告された方法に従って、コラーゲンゲルを調製した。ビトロジェン(コヒージョン・テクノロジーズ、インコーポレイテッド、パロアルト、カリフォルニア)という、主にＩ型コラーゲンの製品を使用した。簡単に述べると、４℃で１０×最少必須培地(ＭＥＭ)(シグマ・ケミカル・カンパニー)および０.１ＮのＮａＯＨによりコラーゲンを生理学的イオン強度およびｐＨに調節した。最終コラーゲン濃度は１.５ｍｇ／ｍｌであった。線維芽細胞を、０.５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で再構成コラーゲン中に組込んだ。コラーゲン／線維芽細胞懸濁液の試料を、２４ウェル培養プレートへ分配した。各１８０μｌアリコートを、ウェルの基部へ切込み線を入れた１６ｍｍ直径の円内に含ませた。次いで、培養プレートを、４５分間５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中に置いて、コラーゲンを重合させた。
【００８３】
フィブリンおよびコラーゲン混合物ゲル：フィブリノーゲンおよびコラーゲンを異なる比率(フィブリン：コラーゲン；１００％：０％、５０％：５０％、０％：１００％)で混合することにより、ゲルを調製した。線維芽細胞を０.５×１０６細胞／ｍｌの最終密度でマトリックス中に組込ませた。アリコート(１８０μｌ)のゲル−線維芽細胞混合物を、上記の類似フォーマットに従って１試料当たり１単位のトロンビンと共に２４ウェル組織培養プレートのウェルに入れた。
【００８４】
フィブリンオーバーレイおよび逆オーバーレイ：簡単に述べると、アリコート(２５μｌ)の血清不含有条件培養培地を、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ、シグマ)含有１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。ゲルを室温で１時間２.５％トリトンＸ−１００中で洗浄することにより、ＳＤＳを除去した。蒸留水中で簡単にすすいだ後、１％低温ゲル化アガロース、ヒトプラスミノーゲン(９μｇ／ｍｌ、シグマ、セントルイス、ミズーリ)、トロンビン(０.７Ｕ／ｍｌ、シグマ)およびフィブリノーゲン(２ｍｇ／ｍｌ)を含むインジケーターゲル層(プラスミノーゲン活性化因子(ＰＡ)検出用フィブリンオーバーレイ検定法)上にゲルを置いた。ＰＡＩを検出するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを２.５％トリトンＸ−１００中室温で１時間洗浄し、インジケーターゲル(上記)と類似した基質ゲルの上部に置き、ｕＰＡ(０.２Ｕ／ｍｌ、シグマ)を加えた(逆フィブリンオーバーレイ検定法)。両調製物を３７℃の加湿チャンバー中に置いた。ＰＡの活性は、線維素溶解を示す不透明フィブリンインジケーター層における透明ゾーンとして現われた。ＰＡＩの活性は、線維素溶解の阻害を示す透明逆オーバーレイ基質層における不透明ゾーンとして現われた。結果を写真撮影した。
【００８５】
色素原基質検定法：２段階間接的酵素検定法、スペクトロライズ(ｐＬ)ＰＡＩ(アメリカン・ダイアグノスティカ＃１０１２０１)を、血漿中におけるＰＡＩ−１活性の定量的測定に使用した。段階１では、一定量の組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)を、試料に加え、存在するＰＡＩ−１と反応させた。次いで、試料を酸性化して、α−２−抗プラスミンおよび別な形でｔＰＡ検定法を妨げる他の潜在的プラスミン阻害剤を破壊した。段階２では、中性ｐＨでＧｌｕ−プラスミノーゲン、ポリＤ−リシンおよび色素原基質から成る混合物に試料を加えることにより、残留ｔＰＡ活性を測定した。試料中の残留ｔＰＡ活性は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を触媒し、次いでこれが色素原基質を加水分解する。発生した色の量は、試料中におけるｔＰＡ活性の量と比例している。ポリＤ−リシンは、プラスミノーゲンからプラスミンへのｔＰＡ触媒変換の刺激因子である。次いで、試料のＰＡＩ含有量は、加えられたｔＰＡの量および回収されたｔＰＡの量間の差異として認識される。１ＵのＰＡＩ活性(Ｕ)は、英国ロンドン、ホリーヒルのＮＩＢＳＡＣにより分類されたｔＰＡロット８６／６７０についての国際標準に対して換算した１ＩＵのヒト１本鎖ｔＰＡを阻害するＰＡＩの量として定義される。
【００８６】
コラーゲン合成、精製、および表現型分析：［３Ｈ］プロリンを用いて、線維芽細胞により新たに合成されたコラーゲンを標識した。トリプリケイトの試料を、４８時間β−アミノプロプリオニトリル（６２.５μｇ／ｍｌ）を補ったＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中のＬ−(５−［３Ｈ］プロリン)（５０μＣｉ／ｍｌ）（アマーシャム、アーリントン・ハイツ、イリノイ）により標識した。標識付けの最後に、全試料を０.５Ｍ酢酸に調節し、４℃で２４時間１ｍｇ／ｍｌのペプシン（ＰＭグレード、ワーシントン、フリーホールド、ニュージャージー）で処理することにより、無傷コラーゲン以外のタンパク質を消化した。トリスを加えて５０ｍＭにし、ｐＨ７.４に滴定することにより、ペプシンを不活化した。以前に記載された連続中性塩および酸性塩沈澱によりコラーゲンを精製した。Tuan et al.、In vitro fibroplasia: matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels、Exp Cell. Res. 223: 127-134 (1996)。最終コラーゲンペレットを５０ｍＭのトリスおよび４０％エタノール中ですすぎ、０.５Ｍ酢酸に溶かした。試料をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、蛍光光度法を行った。細胞計数用に指定された試料をトリプシンおよびコラーゲンで処理し、そしてトリパンブルーの存在下血球計を用いて生存できる細胞の数を推定した。精製コラーゲンをｃｐｍ／細胞として表した。提示されたデータは、３反復試料の平均であった。群間および群内での統計的差異を、一方向分散分析を用いて評価した。
【００８７】
ノーザンブロット：標準ノーザンブロット分析を用いて、ＲＮＡ発現を試験した。Sambrook et al.、Molecular Cloning.  A Laboratory Manual.(ニューヨーク・コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、1989)。簡単に述べると、グアニジニウムチオシアネートを用いてＲＮＡ試料を抽出し、塩化セシウムによる遠心分離により分離した。全ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）を、電気泳動により分離し、ナイロンフィルターに移し、そして真空下８０℃で２時間焼いた。プレハイブリダイゼーション後、放射性標識ＤＮＡプローブを４０℃で２０時間フィルターとハイブリダイゼーションさせ、洗浄し、−７０℃でのｘ線フィルムへの曝露により視覚化した。Feinberg & Vogelstein, A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity, Addendum, Anal. Biochem. 137: 266-267 (1984)に記載された方法に従って、ｃＤＮＡプローブを標識した。全試料を、各細胞株におけるβ−アクチンの発現レベルに標準化した。ｕＰＡヌクレオチド６２３〜１０３９およびＰＡＩ−１ ｃＤＮＡ（完全長）に特異的なヒトｃＤＮＡプローブを、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。Laug et al., Complex expression of the genes coding for plasminogen activators and their inhibitors in HeLa-smooth muscle cell hybrids, Cell Growth Differ. 3: 191-197 (1992)。
【００８８】
免疫組織化学：採取したばかりの皮膚および瘢痕試料を、氷冷ＰＢＳ中ですすぎ、４℃で２４時間４％パラホルムアルデヒド（シグマ、ｐＨ７.５）に固定した。試料を脱水前に２４時間７０％エタノールで処理した。脱水後、試料をパラフィン（６０℃）中に埋封し、そしてミクロトームを用いて５μｍ厚さの切片を調製した。切片を再水和し、Ｈ２Ｏ２で処理した。非特異的結合を最小限にするため、まず切片を室温で３０分間１.５％ＢＳＡ／ＰＢＳにより処理した。１：５０希釈率でのヒトｕＰＡに対するマウスモノクローナル抗体（＃３６９８および＃３９４、アメリカン・ダイアグノスティカ・インコーポレイテッド、グリーンウィッチ、コネティカット）および１：２５希釈率でのヒトＰＡＩ−１に対するネズミモノクローナル抗体（＃３７８５、アメリカン・ダイアグノスティカ・インコーポレイテッド）を、それぞれｕＰＡおよびＰＡＩ−１検出に使用した。一次抗体処理後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・リミテッド、バッキンガムシャー、英国）と５０分間インキュベーションした。ＰＢＳで充分にすすいだ後、切片を３,３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、シグマ）で処理すると、抗体−抗原反応が示された。また切片を核染色用ヘマトキシリンで軽く染色した。
【００８９】
結果
ＰＡＩ−１発現は、ケロイド病変の線維芽細胞では高い
ケロイド線維芽細胞は、培養において高いＰＡＩ−１発現を呈する。Tuan et al., Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 may account for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts, J. Invest. Dermatol. 106: 1007-1011 (1996)。ＰＡＩ−１過剰発現がインビボでも起こるか否かを調べるため、ＰＡＩ−１およびｕＰＡの両方のタンパク質発現を、免疫組織化学におけるＰＡＩ−１またはｕＰＡに対する抗体を用いてケロイド病変（ｎ＝５）で試験した。結果を正常皮膚（ｎ＝３）および通常瘢痕（ｎ＝３）試料と比較した。ケロイドは真皮におけるコラーゲン沈積の過剰を特徴とするため、本試験はまた、ケロイド病変の深層皮膚領域を包含する（図１、ケロイド深層皮膚(Keloid Deep Dennis)：ｊ、ｋおよびｌ）。コラーゲン以外に、線維芽細胞および様々なサイズの血管は、真皮における主たる可視構造成分であった（図１）。正常皮膚において、ＰＡＩ−１およびｕＰＡの染色は血管に局在していた(図１ｂおよび１ｃ)。通常瘢痕およびケロイドでは、血管および線維芽細胞は両方ともｕＰＡおよびＰＡＩ−１について陽性染色を示したが、それらの染色強度は全く異なっていた。ＰＡＩ−１染色は、正常瘢痕線維芽細胞よりもケロイド線維芽細胞における方がかなり強く現われ（図１ｈおよび１ｋ対１ｅ）、ｕＰＡ染色は、ケロイド線維芽細胞よりも正常瘢痕線維芽細胞における方が強かった（図１ｆ対１ｉおよび１Ｌ）。５（８０％）ケロイド試料のうち４試料において高レベルのＰＡＩ−１染色が観察された。表皮もまたｕＰＡおよびＰＡＩ−１について陽性であり（図１「＊」）、またケロイドの表皮は正常皮膚または通常瘢痕の場合よりも強いＰＡＩ−１染色を示した（図１ｈ対１ｅおよび１ｂ）。ケロイドおよび正常皮膚試料を、表皮の基底層におけるメラニン細胞が免疫組織化学では暗褐色を表すアフリカ系アメリカ人患者から集めた。染色は全対照群において陰性であった（図１、対照：ａ、ｄ、ｇおよびｊ）。
【００９０】
ＰＡＩ−１過剰発現がｍＲＮＡレベルでも起こるか否かを測定するため、皮膚線維芽細胞を正常皮膚、通常瘢痕およびケロイド試料から単離し、ノーザンブロット技術を用いて分析した。結果は、ＰＡＩ−１が２つのＲＮＡメッセージ、それぞれ３.０ｋｂおよび２.２ｋｂを有することを示した（図２）。ケロイド線維芽細胞における２.２ｋｂ ＰＡＩ−１ ｍＲＮＡは、正常皮膚および正常瘢痕線維芽細胞の両方よりも一貫して高かった。従って、ＰＡＩ−１過剰発現は、インビトロおよびインビボの両方におけるケロイド線維芽細胞の終始一貫した特徴である。
【００９１】
ケロイド線維芽細胞は、長期フィブリンゲル培養物において高いコラーゲン蓄積および持続的に高いＰＡＩ−１活性を呈する
ケロイド線維芽細胞におけるＰＡＩ−１過剰発現がそれらのコラーゲン過剰産生と相関関係を示すか否かを調べるため、インビトロ線維増殖モデルを用いて、ＰＡ／ＰＡＩおよびコラーゲン産生を２週間にわたって試験した。Tuan et al., In vitro fibroplasia: matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels, Exp. Cell Res. 223: 127-134 (1996)。毎回一ケロイドおよび一正常株の線維芽細胞を用いて実験を実施し、最小限６ケロイドおよび６正常株の線維芽細胞を調べた。
【００９２】
線維芽細胞により産生される全コラーゲンを、本明細書の記載に従って精製した。フィブリンゲルでは、ケロイド線維芽細胞は正常線維芽細胞と類似した速度で成長した。少量のIII型(γ)およびＶ型(ν)コラーゲンが検出されたが、Ｉ型コラーゲン(α１およびα２)がケロイドおよび正常線維芽細胞により産生される主たるコラーゲンであった。典型的実験結果を図３に示す。全コラーゲンの量を細胞数に正規化し、ｃｐｍ／細胞として表した。２週間試験では、コラーゲン蓄積の全般的パターンは、各細胞型の種々の株間で高い再現性を示した。正常線維芽細胞については、コラーゲン蓄積は最初の１０日で徐々に増加した。それは１３〜１５日あたりでピークに達し、培養期間の最後(１６日目)には減少した（図３、正常）。他方、ケロイド線維芽細胞は、コラーゲン蓄積における同様の増加を示した。しかしながら、レベルは、正常線維芽細胞の場合よりも持続的に２〜３倍高かった（図３、ケロイド）。正常線維芽細胞におけるコラーゲンレベルよりも高い、高レベルのコラーゲンが、過度のコラーゲン蓄積を指す。
【００９３】
μＰＡおよびＰＡＩおよびそれらの活性を検出するため、条件培地を指定された時点で培養物から集め、フィブリンオーバーレイおよび逆オーバーレイ検定法にかけた。各々最小限４株の正常およびケロイド線維芽細胞を調べた。典型的実験の結果を図４に示す。フィブリンオーバーレイ検定法は、正常線維芽細胞が、ｕＰＡの２本鎖形態（５０ｋＤ）および触媒的フラグメント１本鎖形態（３０ｋＤ）の両方を発現することを明らかにした（図４、正常：上方パネル）。５０ｋＤのｕＰＡは、初期培養期間（３〜５日間）で発現され、後期培養期間（１２日後）で再び現われた。３０ｋＤのｕＰＡは、培養期間のほとんどの間終始低レベルで発現され、後の培養期間に高レベルに増加した（図４、正常：上方パネル）。対照的に、ケロイド線維芽細胞は、中程度のレベルの３０ｋＤ ｕＰＡを呈し、後期培養期間に現われただけであった（図４、ケロイド：上方パネル）。
【００９４】
逆フィブリンオーバーレイ検定法は、正常線維芽細胞が、可変活性レベルでＰＡＩ−１を発現することを明らかにした（図４、正常：下方パネル）。極めて対照的に、ケロイド線維芽細胞は、全培養期間を通じて持続的に高いレベルのＰＡＩ−１を表した（図４、ケロイド：下方パネル）。
【００９５】
また、色素原基質検定法（アメリカン・ダイアグノスティカ）を用いてＰＡＩ−１活性を測定した。この検定法において、ケロイド線維芽細胞は、典型的には正常線維芽細胞よりも２〜３倍高いレベルでＰＡＩ活性を示した（３独立測定値で、Ｋ：Ｎ、４５：１０；８０：４５；４０：１６ＩＵ／ｍｌ）。少量のｕＰＡ／ＰＡＩ−１複合体が、正常およびケロイド線維芽細胞の両方の培養物から検出された（図４、上方パネル：ｕＰＡ／ＰＡＩ−１複合体）。複合体はその場では(in situ)触媒的に不活性であり、フィブリンオーバーレイで現われるその線維素溶解活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順中におけるＳＤＳ処理の人工産物によるものであった。Granelli-Piperno & Reich, A study of proteases and protease-inhibitor complexes in biological fluids, J. Exp. Med. 148: 223-234 (1978)。
【００９６】
また、ｕＰＡおよびＰＡ１の活性を、ドナーおよび解剖部位を適合させた試料、Ｎ８６およびＫ８６の対で調べた。結果を図５に示す。発現時間およびレベルの僅かな差異はあるが、他の正常線維芽細胞と比較した時（図４、正常：上方パネル）、Ｎ８６はｕＰＡ発現の非常に類似したパターンを呈した（図５、Ｎ８６：上方パネル）。しかしながら、Ｎ８６はそのＰＡＩ−１発現が異なっており、培養期間の前半では非常に高いレベルで出現し、後半には消失した（図５、Ｎ８６：下方パネル）。Ｋ８６によるｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現パターンは他のケロイド線維芽細胞と非常に類似しており、３０ｋＤ形態のｕＰＡが１１日目に中程度の量で出現し、そしてＰＡＩ−１が全培養期間を通しては過剰発現された（図５、Ｋ８６）。ケロイド試料におけるｕＰＡ／ＰＡＩ−１複合体（〜１１０ｋＤ）の存在（図４および５）は、ケロイド線維芽細胞により分泌されたｕＰＡがＰＡＩ−１により主として結合されていることを示していた。従って、長期フィブリンゲル培養物では、正常線維芽細胞はｕＰＡおよびＰＡＩ−１の調節された発現を呈し、ケロイド線維芽細胞は低レベルのｕＰＡおよび持続的に高いレベルのＰＡＩ−１を呈する。さらに、ケロイド線維芽細胞によるＰＡＩ−１過剰発現は、高コラーゲン蓄積と相関関係を示す。
【００９７】
高いＰＡＩ−１活性は、ケロイド線維芽細胞の高コラーゲン蓄積の原因となる
フィブリンマトリックスにおける線維芽細胞は、活発にマトリックスを再編成し、コラーゲンを産生してフィブリンと置き換える。Tuan et al., In vitro fibroplasia: matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels, Exp. Cell Res. 223: 127-134 (1996)。フィブリンゲルにおける線維芽細胞によるｕＰＡまたはＰＡＩ−１の発現パターンが変化する細胞外マトリックス(ＥＣＭ)環境（すなわち、フィブリンからコラーゲンへ）により影響されたか否かを測定するため、フィブリン、フィブリン‐コラーゲン、またはコラーゲンゲルを細胞培養で使用することにより、インビトロ線維増殖中における初期、中期または後期段階のマトリックス表現型を模倣した。結果は、正常線維芽細胞では、ｕＰＡ発現が、コラーゲンの存在下(フィブリン−コラーゲンおよびコラーゲンゲル)において５０ｋＤ２本鎖形態から５０ｋＤおよび３０ｋＤ形態へトランジション(変化)することを示していた（図６、正常、上方パネル）。興味深いことに、ゲルマトリックスにおけるコラーゲンの濃度が５０％から１００％へ増加すると、ＰＡＩ−１発現レベルは減少した（図６、正常、下方パネル）。ケロイド線維芽細胞は、３０ｋＤのｕＰＡを発現することによりマトリックスにおけるコラーゲンの存在に応答した。しかしながら、それらのＰＡＩ−１レベルに顕著な変化は無かった（図６、ケロイド）。したがって、正常線維芽細胞のｕＰＡおよびＰＡＩ−１の両方の発現はＥＣＭにより調節され、ケロイド線維芽細胞のｕＰＡ発現のみがＥＣＭによる調節を受けた。フィブリン、コラーゲンまたはフィブリン‐コラーゲンハイブリッドゲルの培養物間で細胞生長に差異は無かった。従って、ＰＡＩ−１過剰発現は、ＥＣＭにおけるコラーゲンレベルに関係の無い、ケロイド線維芽細胞固有の特徴である。
【００９８】
また、正常またはケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積を試験し、フィブリンおよびコラーゲンゲルの培養物間で比較した。結果は、正常線維芽細胞によるコラーゲン蓄積レベルは、フィブリンおよびコラーゲンゲルの培養物間で類似していることを示した（図７、正常）。対照的に、ケロイド線維芽細胞をコラーゲンゲルで培養したとき、フィブリンゲルで観察されるそれらの通常高レベルのコラーゲン蓄積は、正常線維芽細胞と同等のレベルまで低減化された（図７、ケロイド）。コラーゲン蓄積における同様の低減化は、ケロイド線維芽細胞をフィブリン‐コラーゲンゲルで培養したときのそれらの細胞でも見出された。同様のデータは、ケロイド線維芽細胞の２種の追加株でも得られた。これらの結果は、コラーゲンまたはフィブリン‐コラーゲンハイブリッドゲルでケロイド細胞を培養することによるｕＰＡ活性の増加がケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積の低減化をまねくため、高いＰＡＩ−１活性が、ケロイド線維芽細胞による高コラーゲン蓄積を維持するのに必要であることを示している。
【００９９】
高いＰＡＩ−１活性がコラーゲン蓄積の増加をまねくか否かをさらに試験するため、フィブリンゲルの培養物におけるケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積を、ＰＡＩ−１中和性抗体の存在下で試験した。製造業者によると、抗体（ウサギ抗ＰＡＩ−１抗体、＃３９５Ｒ、アメリカン・ダイアグノスティカ）は、ヒトＰＡＩ−１の全形態と反応する。５０％阻害点で、この抗体１ｍｇは、１０００ＩＵ以下のＰＡＩ−１を阻害し得る。結果は、非免疫ＩｇＧではなく、抗ＰＡＩ−１抗体がＰＡＩ−１活性を減少させ（図８、挿入）、ケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積を低減化することを示していた（図８、「フィブリンゲル＋抗ＰＡＩ−１におけるケロイド」）。また、ケロイド線維芽細胞の２種の追加株を、コラーゲン蓄積に対する抗ＰＡＩ−１中和性抗体の効果について試験した。正常線維芽細胞のフィブリンゲル培養物またはケロイド線維芽細胞のコラーゲンゲル培養物におけるコラーゲン蓄積の試験も比較するため同時に実施した（図８、「フィブリンゲルにおける正常」および「コラーゲンゲルにおけるケロイド」）。
【０１００】
検討
本発明における実施例は、ＰＡＩ−１過剰発現が、インビトロおよびインビボの両方におけるケロイド線維芽細胞の一貫した特徴であることを立証している。長期フィブリンゲル培養物では、正常線維芽細胞が調節されたレベルのｕＰＡおよびＰＡＩ−１並びにコラーゲン蓄積を呈し、ケロイド線維芽細胞は持続的に高いレベルのＰＡＩ−１およびコラーゲン蓄積を呈する。ＰＡＩ−１活性を低減化する条件は、ケロイド線維芽細胞の高いコラーゲン蓄積を廃するものである。これらの条件として挙げられるのは、コラーゲンまたはフィブリン‐コラーゲンゲルで線維芽細胞を培養することによりｕＰＡを高めるか、またはフィブリンゲル培養物において線維芽細胞に対するＰＡＩ−１中和性抗体を加えるかまたは本明細書記載の他の方法によりＰＡＩ−１活性を減少させることである。したがって、ケロイド線維芽細胞のＰＡＩ−１活性増加は、フィブリンゲル培養物におけるそれらの高いコラーゲン蓄積の原因であり得る。
【０１０１】
線維増殖は、関与する細胞、ＥＣＭおよび可溶性伝達物質間に一定の相互作用およびフィードバックを組込む動的過程である。Clark, Wound Repair: Overview and General Considerations, The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair,22-32頁 (編集Clark RA. ニューヨーク、プレナム・プレス、1996)。正常皮膚線維芽細胞がフィブリンマトリックスを活発に再編成し、それをコラーゲン含有瘢痕様組織へ再モデリングすることは以前に示された。Tuan et al., In vitro fibroplasia: matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels, Exp. Cell Res. 223: 127-134 (1996)。本発明における実施例から、正常線維芽細胞はコラーゲンを合成し、フィブリンマトリックスへ沈積させるため、ｕＰＡおよびＰＡＩ−１の活性レベルもまた調節されていることが証明されている（図４および５）。ｕＰＡおよびＰＡＩ−１発現においてこのＥＣＭが介する変化は、フィブリン、フィブリン‐コラーゲン混合物、またはコラーゲンゲルを用いた後続の実験で証明されている（図６）。ＥＣＭからのインテグリン関与または離脱により、細胞の表現型におけるインテグリン種特異的変化が伝達され得るため、インテグリンは、線維芽細胞およびＥＣＭ間での上記動的相互作用の伝達における有望な候補である。Xu & Clark, Extracellular matrix alters PDGF regulation of fibroblast integrins, J. Cell Biol. 132: 239-249 (1996)。さらにコラーゲンゲルの試験からも証拠が誘導され得る。コラーゲンゲルにおいて、コラーゲンへのα２β１インテグリンの結合により、細胞生存およびＥＣＭ産生は増加する。対照的に、コラーゲンへのα２β１結合の破壊により、ＭＭＰ２産生／活性化、したがってマトリックス分解が誘導される。Ellerbroek et al.、Functional interplay between type I collagen and cell surface matrix metalloproteinase activity, J. Biol. Chem. 276: 24833-24842 (2001)。線維芽細胞は、ανサブユニットを含むインテグリンを用いてフィブリンに結合できることが示されている。Gailit et al., Human fibroblasts bind directly to fibrinogen at RGD sites through integrin alpha(v)beta3, Exp. Cell Res. 232: 118-126 (1997)。しかしながら、試験で使用されるフィブリノーゲンが痕跡量のフィブロネクチン（＜０.１μｇ／ｍｇのフィブリノーゲン）を含み、そして１０％ＦＣＳ（フィブロネクチンを含む）がコラーゲン合成検定法で使用されたため、フィブロネクチンが、α５β１インテグリンを通したフィブリンゲルマトリックスへの線維芽細胞の結合に関与し得ることは、現行試験では排除されない。Clark, Wound Repair: Overview and General Considerations, The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair、22-32頁(編集 Clark RA.、ニューヨーク、プレナム・プレス、1996)。従って、フィブリンおよびコラーゲンゲル間でのｕＰＡおよびＰＡＩ−１発現の差異は、フィブリン／フィブロネクチンへのαν含有インテグリンまたはα５β１結合および／またはコラーゲンへのα２β１結合により伝達され得る。
【０１０２】
ＰＡＩ−１活性の増加は、組織および臓器線維症の顕著な特徴である。ＰＡＩ−１発現の遺伝学的測定レベルおよび炎症性肺損傷の結果として起こるコラーゲン蓄積程度間に直接的な相関関係が存在するという証拠がある。この証拠は、トランスジェニックマウスにおけるブレオマイシン誘導肺線維症の試験から導き出された。Eitzman et al., Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in transgenic mice that either lack or overexpress the murine plasminogen activator inhibitor-1 gene, J. Clin. Invest. 97: 232-237 (1996)。これらの試験は、過度のＰＡＩ−１活性がフィブリン蓄積をまねき、次いで肺修復に対する線維形成誘導効果を誘発するという根本的理由に基づいていた。フィブリンは、プラスミンの最もよく知られている基質であり、その分解産物は炎症細胞に対し走化性である。Clark, Wound Repair: Overview and General Considerations、前出。従って、組織損傷部位におけるフィブリンの蓄積は、組織線維症の原因である。さらに、正常およびケロイド線維芽細胞間におけるｕＰＡ：ＰＡＩ−１比の差異は、フィブリンマトリックス分解度合に反映されており、短時間検定法では、正常線維芽細胞はフィブリンマトリックス分解を誘発するが、ケロイド線維芽細胞は誘発しなかった。Tuan et al., Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 may account for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts, J. Invest. Dermatol. 106: 1007-1011 (1996)。さらに、ＴＧＦ−β、すなわちＰＡＩ−１の強力な誘導物質（Keski-Oja et al., Regulation of mRNAs for type-1 plasminogen activator inhibitor, fibronectin, and type I procollagen by transforming growth factor-beta.  Divergent responses in lung fibroblasts and carcinoma cells, J. Biol. Chem. 263: 3111-3115 (1988)）により正常線維芽細胞を処理すると、フィブリン分解が阻止された。臨床観察は、ケロイド形成前に罹患領域では長い炎症反応が先行することを明らかにしている。さらに、ほとんどのケロイドは、３つの特有領域：紅斑性外縁(拡大／成長領域)、非紅斑性隆起内側縁(古典的ケロイド)、および中心後退領域を有する。フィブリンは炎症に関与するため、ケロイド病変、特に外縁は、フィブリンの多大な蓄積を含み得ると当業界では考えられている。
【０１０３】
にもかかわらず、フィブリンが線維症の原因あるという意見は、肺損傷修復試験で最近攻撃された。フィブリノーゲンのαまたはγ鎖を欠き、循環系に無傷フィブリノーゲンを含まない突然変異体マウスでは、ブレオマイシン処理後の肺線維症の程度は野生型マウスと同等であった。Wilberding et al., Development of pulmonary fibrosis in fibrinogen-deficient mice, Ann. N. Y. Acad. Sci. 936: 542-548 (2001)。これらの試験は、フィブリンは線維症を促進し得るが、線維症の先行必要条件であるとは思われないことを示している。本発明実施例から、ＰＡＩ−１中和性抗体をフィブリン培養物に加えるかまたは細胞をフィブリン‐コラーゲンまたはコラーゲンゲル（ｕＰＡ発現を誘発する）で培養することによるケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積の低減化は、フィブリンではなくＰＡＩ−１の過剰発現が、ケロイド線維症における過度のコラーゲン蓄積の鍵を握るものであり得ることを強く示唆している。ＰＡＩ−１過剰発現（図２）（また、Tuan et al., Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 may account for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts, J. Invest. Dermatol. 106: 1007-1011 (1996); Higgins et al., Differential regulation of PAI-1 gene expression in human fibroblasts predisposed to a fibrotic phenotype、 Exp. Cell Res. 248: 634-642 (1999)参照）およびコラーゲン過剰産生（Uitto et al., Altered steady-state ratio of type VIII procollagen mRNAs correlates with selectively increased type I procollagen biosynthesis in cultured keloid fibroblasts、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 5935-5939 (1985)）が両方とも、フィブリンの非存在下での普通の細胞培養表面におけるケロイド線維芽細胞培養物で見出されるという事実は、ケロイド線維症におけるＰＡＩ−１の関与をさらに裏付けるものである。
【０１０４】
ペプシン処理による本発明実施例で使用されるコラーゲン精製プロトコールは無傷のコラーゲンのみを回収し、コラーゲン蓄積を反映するということは注目に値する。Epstein, Alphal-3 human skin collagen. Release by pepsin digestion and preponderance in fetal life、 J. Biol. Chem. 249: 3225-3231 (1974)。コラーゲン産生はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのプロテアーゼにより翻訳後調節され得るため（Rossert & Crombrugghe, Structure, Synthesis, and Regulation of Type I Collagen.  Principles of Bone Biology、サンディエゴ・アカデミック・プレス、 pp. 127-142 (1996)）、コラーゲンまたはフィブリン‐コラーゲンゲルで培養されたケロイド線維芽細胞によるコラーゲン蓄積の低減化は、プラスミン伝達ＭＭＰ活性化（図９で概説されている経路）により誘発されたコラーゲン分解によるものであるという可能性がある。別法として、ＰＡＩ−１は、細胞生長およびアポトーシスに対するその効果に加え、ｕＰＡおよびビトロネクチンへのその結合を通してインテグリン伝達による細胞接着および遊走を調節できるため、インテグリン伝達による機構も関与し得る。Stefansson & Lawrence, The serpin PAI-1 inhibits cell migration by blocking integrin alpha V beta 3 binding to vitronectin, Nature 383: 441-443 (1996)。したがって、上記条件下でのケロイド線維芽細胞のｕＰＡ：ＰＡＩ−１比の変化は、ゲル‐マトリックスへのケロイド線維芽細胞の結合に影響を及ぼし、それに続いて、線維芽細胞分化およびコラーゲン合成状態を改変させ得る。Ellerbroek et al., Functional interplay between type I collagen and cell surface matrix metalloproteinase activity, J. Biol. Chem. 276: 24833-24842 (2001); Streuli, Extracellular matrix remodelling and cellular differentiation, Curr. Opin. Cell Biol. 11: 634-640 (1999)。これらの動きは、インビトロ線維増殖モデルを用いることによりさらに試験され得る。
【０１０５】
コラーゲンゲルでの培養時、正常線維芽細胞はｕＰＡの増加およびＰＡＩ−１レベルの減少を呈するが、コラーゲン蓄積レベルに変化はないという結果は興味深いものであった（図６および７）。これは、ゲルの線維芽細胞収縮中にマトリックスで展開される等長性緊張に起因し得る。細胞−マトリックス相互作用の結果としてＥＣＭマトリックスで展開される等長性緊張が細胞の代謝状態を決定し得ることは以前に示されている。Nakagawa et al., Extracellular matrix organization modulates fibroblast growth and growth factor responsiveness, Exp. Cell Res. 182: 572-582 (1989)。従って、比較的小さな緊張下で線維芽細胞がコラーゲンマトリックスを収縮させ得る、組織培養皿から分離されたコラーゲンゲルにおける線維芽細胞は、コラーゲンをごく僅かしか産生しない。対照的に、結合したコラーゲンゲルにおける線維芽細胞は、マトリックスを収縮させ、緊張増加を誘発するため、基底コラーゲン合成が維持される。Nakagawa et al.、前出。本発明実施例では、フィブリンおよびコラーゲンゲルは両方とも培養皿に結合されていた。したがって、コラーゲン蓄積における差異は全く観察されなかった。
【０１０６】
ケロイドの表皮もまた、正常皮膚および通常瘢痕の場合よりも強いＰＡＩ−１発現を示した（図１）。成人ケラチノサイトは通常ＰＡＩ−１を発現しないため、これもまた臨床的推測であり得る。その発現は、表皮移動を伴い、創傷修復中に起こるだけである。Li et al., Targeted inhibition of wound-induced PAI-1 expression alters migration and differentiation in human epidermal keratinocytes, Exp. Cell. Res. 258: 245-253 (2000)。他のセリンまたはＭＭＰプロテアーゼ阻害剤、例えばアルファ−１抗トリプシン、アルファ−２マクログロブリン、および組織アルファ−グロブリンもまた、ケロイド病変で検出された。Diegelmann et al., Tissue alpha-globulins in keloid formation, Plast. Reconstr. Surg. 59: 418-423 (1977)。ケロイド線維芽細胞に対するこれらのタンパク質の効果はまた、インビトロモデルシステムを用いて将来的に試験され得る。結論として、三次元マトリックスゲル系を用いることにより、本発明実施例は、ＰＡＩ−１過剰発現がケロイド線維芽細胞による高いコラーゲン蓄積と相関関係を示すことを立証した。ＰＡＩ−１活性が阻害または低減化されるとき、異常なコラーゲン蓄積が廃されるため、２者間の原因となる関係をもたらす。ケロイド線維芽細胞における主たる発見を描き、それらを組織損傷修復の鍵となる事象／成分と結び付ける概略図は、図９に示されている。
【０１０７】
本開示で引用されている出版物および特許については、出典明示で援用する。本記述、具体的実施例および図面は、好ましい態様を示し、説明および実例を挙げて与えられており、本発明を制限する意図はないものとする。本発明の範囲内における様々な変化および修正は、本明細書に含まれている開示から当業者にとっては容易に理解できるものである。従って、請求の範囲の精神および範囲は、本明細書に含まれている好ましいものの記載に限定されるべきではない。
【０１０８】
【表１】
2006507297.tif 000003
*NK = 不明
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、正常皮膚、正常瘢痕およびケロイドにおけるｕＰＡおよびＰＡＩ−１発現の免疫組織化学試験を示す。
【図２】図２は、正常皮膚、正常瘢痕またはケロイド由来の線維芽細胞からのＰＡＩ−１のメッセンジャーＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図３】図３は、１６日の期間にわたってフィブリンゲルで培養した正常およびケロイド線維芽細胞を比較するコラーゲン蓄積の時間推移試験を示す。
【図４】図４は、正常およびケロイド線維芽細胞を比較する１４日の期間にわたるｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現を示す。
【図５】図５は、１３日の培養期間にわたるドナー‐および解剖部位‐適合正常(Ｎ８６)およびケロイド(Ｋ８６)線維芽細胞からのｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現を示す。
【図６】図６は、フィブリン、フィブリン−コラーゲンまたはコラーゲンゲルで培養された正常またはケロイド線維芽細胞のｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現を示す。
【図７】図７は、フィブリンまたはコラーゲンゲルで培養された正常またはケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積を示す。
【図８】図８は、フィブリンゲルで培養されたケロイド線維芽細胞のコラーゲン蓄積に対する抗ＰＡＩ−１中和性抗体の効果を示す。
【図９】図９は、ケロイド線維症の主たる発見を要約し、組織損傷修復の鍵となる事象／要素にそれらを結び付ける概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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