(57)【要約】本発明は、ＴＲＸの発現を改変するためのＴＲＸ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の組成物は、ＴＲＸをコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＴＲＸ発現の改変のため、およびＴＲＸの過剰発現もしくは突然変異ＴＲＸの発現のいずれかまたはその両方に関係する疾患の処置のための、これら化合物の使用方法を提供する。疾患としては例えば、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、脳癌、精巣癌、胃癌、腸菅癌、腸癌、脊髄癌、洞癌、膀胱癌、尿路癌、または卵巣癌である。該オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドもしくは核酸アナログ（例えば、ロックト核酸）またはその組み合わせから構成され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
総計８〜５０のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む化合物であって、
少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、ここで、該サブ配列は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選ばれる配列内にある、該化合物。
【請求項２】
チオレドキシンの発現を改変する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ＴＲＸをコードする核酸分子を標的とする総計８〜５０個のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む化合物であって、
ＴＲＸをコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、ＴＲＸの発現を抑制し、そして少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、ここで、該サブ配列は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選ばれる配列内にある、該化合物。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項５】
少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも１個のロックト核酸（ＬＮＡ）単位を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項７】
ロックト核酸（ＬＮＡ）は、一般式：
【化１】
2006518999.tif 000013
［式中、
ＸおよびＹは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ(Ｈ)−、Ｎ(Ｒ)−、−ＣＨ2−、または−ＣＨ−（二重結合の部分の場合）、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ2−Ｎ(Ｈ)−、−ＣＨ2−Ｎ(Ｒ)−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、または−ＣＨ2−ＣＨ−（二重結合の部分の場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−の群から選ばれて、ここで、Ｒは水素またはＣ1〜4−アルキルから選ばれ；
ＺおよびＺ*は独立して、存在しないか、またはヌクレオシド間連結、末端基もしくは保護基から選ばれ；
Ｂは、天然または非天然の核酸塩基を構成し；そして、
不斉基はいずれかの配向で存在し得る］
で示される構造式を有する、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
少なくとも１個のヌクレオチドは、式：
【化２】
2006518999.tif 000014
［式中、
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ(ＲH)であり；
ＺおよびＺ*は独立して、存在しないか、またはヌクレオシド間連結、末端基もしくは保護基から選ばれ；そして、
Ｂは、天然または非天然の核酸塩基を構成する］
のいずれかに記載のロックト核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項６または７のいずれか記載の化合物。
【請求項９】
ヌクレオチドアナログは、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ-、−Ｓ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｓ)2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)2−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ(ＲH)−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ3)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＲH)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｒ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＢＨ3)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＨＲH)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−ＮＲH−、−ＮＲH−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−からなる群から選ばれるヌクレオチド連結を含み、ここで、ＲHは水素またはＣ1〜4−アルキルから選ばれる、請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１０】
ヌクレオチドアナログは、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選ばれる修飾核酸塩基を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１１】
ＬＮＡは、Ｄ−βまたはＬ−αのいずれかまたはそれらの組み合わせの立体配置であるオキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡである、請求項５〜１０のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１２】
ＴＲＸをコードする核酸分子を標的とする総計８〜５０個のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む化合物であって、該化合物はＴＲＸをコードする核酸と特異的にハイブリダイズし、そしてＴＲＸの発現を抑制し、ここで、該化合物は配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８の少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含む、該化合物。
【請求項１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、図１に提示するいずれかのデザインに記載するデザインである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ｍｅｒである、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１６】
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のＬＮＡ単位などの少なくとも２個のＬＮＡ単位を含む、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１７】
サブ配列は配列番号：２ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１８】
サブ配列は配列番号：３ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１９】
サブ配列は配列番号：４ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２０】
サブ配列は配列番号：５ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２１】
サブ配列は配列番号：６ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２２】
サブ配列は配列番号：７ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２３】
サブ配列は配列番号：８ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２４】
サブ配列は配列番号：９ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２５】
サブ配列は配列番号：１０ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２６】
サブ配列は配列番号：１１ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２７】
サブ配列は配列番号：１２ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２８】
サブ配列は配列番号：１３ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２９】
サブ配列は配列番号：１４ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項３０】
サブ配列は配列番号：１５ａである、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項３１】
３'末端ＬＮＡを対応する天然ヌクレオシドによって置き代える、請求項５７〜７２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項３２】
配列番号：２ａを含む、化合物。
【請求項３３】
配列番号：３ａを含む、化合物。
【請求項３４】
配列番号：４ａを含む、化合物。
【請求項３５】
配列番号：５ａを含む、化合物。
【請求項３６】
配列番号：６ａを含む、化合物。
【請求項３７】
配列番号：７ａを含む、化合物。
【請求項３８】
配列番号：８ａを含む、化合物。
【請求項３９】
配列番号：９ａを含む、化合物。
【請求項４０】
配列番号：１０ａを含む、化合物。
【請求項４１】
配列番号：１１ａを含む、化合物。
【請求項４２】
配列番号：１２ａを含む、化合物。
【請求項４３】
配列番号：１３ａを含む、化合物。
【請求項４４】
配列番号：１４ａを含む、化合物。
【請求項４５】
配列番号：１５ａを含む、化合物。
【請求項４６】
原文なし。
【請求項４７】
原文なし。
【請求項４８】
原文なし。
【請求項４９】
原文なし。
【請求項５０】
３'末端ＬＮＡを対応するヌクレオチドによって置き代える、請求項３４〜４５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項５１】
請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物を含有し、そして、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド分子は該化合物と共有結合する、接合体。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか１つに記載の化合物または請求項５９記載の接合体、および医薬的に許容し得る希釈物、担体またはアジュバントを含有する、医薬組成物。
【請求項５３】
更に、少なくとも１つの化学療法薬を含む、請求項５１記載の医薬組成物。
【請求項５４】
化学療法用化合物は、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン）；アルトレタミン（へキサレン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ））；アミフォスチン（エチロール）；アミノグルテチミド（シタドレン）；アムサクリン（Ｍ−ＡＭＳＡ）；アナストロゾール（アリミデックス）；アンドロゲン（例えば、テストステロン）：アスパラギナーゼ（エルスパル）；バシラスカルメッテ−グリン；ビカルタミド（カソデックス）；ブレオマイシン（ブレオキサン）；ブスルファン（ミレラン）；カルボプラチン（パラプラチン）；カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）；クロラムブシル（ルークラン）；クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ、クラドリビン、ロイスタチン）；シスプラチン（プラチノール）；シトシンアラビノシド（シタラビン）；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン）；ダウノルビシン（セルビジン）；ドセタキセル（タキソテール）；ドキソルビシン（アドリアマイシン）；エピルビシン；エストラムスチン（ｅｍｃｙｔ）；エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ））；エトポシド（ＶＰ−１６、ベプシド、エトホホス）；フルダラビン（フルダラ）；フルタミド（ユーレクシン）；５−ＦＵＤＲ（フロキシウリジン）；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ)；ゲムシタビン（ジェムザール）；ゴセレリン（ゾダレックス）；ハーセプチン（トラスツズマブ）；ヒドロキシ尿素（ハイドレア）；イダルビシン（イダマイシン）；イホスファミド；ＩＬ−２（プロリュウキン、アルデスリュウキン）；インターフェロンアルファ（イントロンＡ、ロフェロンＡ）；イリノテカン（カンプトスター）；ロイプロリド（ループロン）；レバミソール（エルガミソール）；ロムスチン（ＣＣＮＵ）；メクロラタミン（ムスタルゲン、ナイトロジェンマスタード）；メルファラン（アルケラン）；メルカプトプリン（ピュリネソール、６−ＭＰ）；メトトレキセート（メキセート）；マイトマイシン−Ｃ（ムタムシン）；ミトキサントロン（ノバントロン）；オクトレオチド（サンドスタチン）；ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン、ニペント）；プリカマイシン（ミトラマイシン、ミタラシン）；プロロカルバジン（マツラン）；ストレプトゾシン；タモキシフェン（ノルバデックス）；タキソール（パクリタキセル）；テニポシド（ブモン、ＶＭ−２６）；チオテパ；トポテカン（ハイカムチン）；トレチノイン（ベサノイド、オールトランスレチノイン酸）；ビンブラスチン（バルバン）；ビンクリスチン（オンコビン）；および、ビノレルビン（ナベルビン）からなる群から選ばれる、請求項５２記載の医薬組成物。
【請求項５５】
更に医薬的に許容し得る担体を含む、請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項５６】
医薬的に許容し得る塩で使用する、請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項５７】
プロドラッグを構成する、請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項５８】
更に、抗炎症化合物および／または抗ウイルス化合物を含む、請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項５９】
癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物または請求項５１に記載の接合体の使用。
【請求項６０】
癌は固形癌の形態である、請求項５９記載の使用。
【請求項６１】
癌は癌腫である、請求項５９または６０のいずれかに記載の使用。
【請求項６２】
癌腫は、悪性黒色腫、基底細胞腫、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部異形成、喉頭乳頭腫症、大腸癌、結腸大腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選ばれる、請求項６１記載の使用。
【請求項６３】
癌腫は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、および腎細胞癌からなる群から選ばれる、請求項６２記載の使用。
【請求項６４】
悪性黒色腫は、表在拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性メラノーマ、メラニン欠乏性黒色腫、および線維形成性黒色腫からなる群から選ばれる、請求項６３記載の使用。
【請求項６５】
癌は肉腫である、請求項６０または６１のいずれかに記載の使用。
【請求項６６】
肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選ばれる、請求項６５記載の使用。
【請求項６７】
癌は神経膠腫である、請求項６０または６１のいずれか記載の使用。
【請求項６８】
癌の処置方法であって、請求項１〜５０のいずれか１つ記載の化合物、請求項５１記載の接合体、または請求項５２〜５８のいずれか１つに記載の医薬組成物を該処置が必要な患者に投与することを含む、該方法。
【請求項６９】
癌は固形腫瘍の形態である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
癌は癌腫である、請求項６８または６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
癌腫は、悪性黒色腫、基底細胞腫、卵巣癌、乳癌、非細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部異形成、喉頭乳頭腫症、大腸癌、結腸大腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選ばれる、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
癌腫は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、および腎細胞癌からなる群から選ばれる、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
悪性黒色腫は、表在拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性メラノーマ、メラニン欠乏性黒色腫、および線維形成性黒色腫からなる群から選ばれる、請求項１２４記載の方法。
【請求項７４】
癌は肉腫である、請求項６８記載の方法。
【請求項７５】
肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、アテローム硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、喘息、いぼ、アレルギー性皮膚炎、およびカポジ肉腫からなる群から選ばれる、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
癌は神経膠腫である、請求項６８記載の方法。
【請求項７７】
細胞または組織中のＴＲＸの発現を抑制するための方法であって、該細胞または組織を請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物と接触させて、ＴＲＸの発現を抑制することを含む、該方法。
【請求項７８】
遺伝子発現を改変することによる、癌疾患に関与する遺伝子の発現を改変するための方法であって、該遺伝子または該遺伝子由来のＲＮＡをオリゴマー化合物と接触させることを含み、ここで、該化合物は配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７の少なくとも８個の核酸塩基部分を含有する配列を有する、該方法。
【請求項７９】
化合物は１個以上のＬＮＡ単位を含む、請求項７７記載の方法。
【請求項８０】
化合物を該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡと一緒にハイブリダイズしてその発現を抑制する、請求項７７または７８のいずれか記載の方法。
【請求項８１】
癌疾患を患っているかまたは患い易い哺乳動物を処置するための方法であって、該哺乳動物に１個以上のＬＮＡ単位を含むＴＲＸを標的とするオリゴヌクレオチドの治療学的に有効な量を投与することを含む、該方法。
【請求項８２】
癌疾患は、肺、乳、大腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸菅、腸、脊髄、洞、膀胱、尿路、または卵巣の癌である、請求項７７〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８３】
赤血球の増殖、細胞増殖、鉄代謝、グルコースおよびエネルギー代謝、ｐＨ改変、またはマトリックス代謝を改変するための方法であって、細胞を請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物と接触させて、該細胞を改変することを含む、該方法。
【請求項８４】
細胞の増殖を抑制するための方法であって、インビトロで細胞を請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物の有効な量と接触させて、該細胞の増殖を抑制することを含む、該方法。
【請求項８５】
細胞は癌細胞である、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
ヒトの細胞または組織中でのＴＲＸの発現を抑制するための方法であって、ヒトの細胞または組織を請求項１〜５０のいずれか１つに記載の化合物と接触させて、ＴＲＸの発現を抑制することを含む、該方法。
【請求項８７】
ＴＲＸに関係する疾患または病気を有する動物を処置するための方法であって、ＴＲＸに関係する疾患または病気を有する動物に治療学的にまたは予防学的に有効な量の請求項１記載のアンチセンス化合物を投与して、その結果ＴＲＸの発現を抑制することを含む、該方法。
【請求項８８】
疾患または病気は過剰増殖性疾患である、請求項８６記載の方法。
【請求項８９】
過剰増殖性疾患は癌である、請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
アポトーシスの減少を特徴とする疾患または病気を有するヒトを処置するための方法であって、アポトーシスの減少を特徴とする疾患または病気を有するヒトに、予防学的にまたは治療学的に有効な量の請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物を投与することを含む、該方法。
【請求項９１】
細胞中のアポトーシスを改変するための方法であって、細胞を請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物と接触させて、アポトーシスを改変することを含む、該方法。
【請求項９２】
細胞中の細胞質分裂を改変するための方法であって、細胞を請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物と接触させて、細胞質分裂を改変することを含む、該方法。
【請求項９３】
細胞中の細胞周期を改変するための方法であって、細胞を請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物と接触させて、細胞周期を改変することを含む、該方法。
【請求項９４】
細胞の増殖を抑制するための方法であって、細胞を請求項１〜５０のいずれか１つに記載のアンチセンス化合物の有効な量と接触させて、細胞の増殖を抑制することを含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ＴＲＸの発現を改変するための組成物、および方法を提供する。特に、本発明は、ＴＲＸをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴマー化合物（該オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドが好ましい）に関する。該オリゴヌクレオチド化合物はＴＲＸの発現を改変することが分かり、そしてその医薬製剤および癌疾患の処置としてのそれらの使用を開示する。
【０００２】
（背景技術）
本発明は、ヒトチオレドキシン（ＴＲＸ）推定オンコジーンに対して相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＮＡを含有する）に関するものであって、このものは、様々なヒト癌において腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスの抑制を改変することを見出した。ＴＲＸはまた、癌の処置における薬物耐性に密接にも関連する（Yokomizoらによる, 1995. Cancer Res. 55: 4293-4296; Kahlosらによる, 2001. Int. J. Cancer 20; 95: 198-204）。T. C. Laurentは最初に、大腸菌由来のＴＲＸを１９６４年に記載している。そのものは、原核生物および真核生物の両方において存在する、広範に分布しそしてかなり保存されている約１２ｋＤａ酸化還元酵素である（Holmgrenによる, 1989, J. Biol. Chem., 264; 13963-13966）。ＴＲＸは、可逆的なジスルフィド結合の形成によってレドックス反応に関与し、そしてＮＡＤＰＨ−依存性酵素チオレドキシン還元酵素によって可逆的なチオール還元を受ける、ジチオールジスルフィド活性部位を含む。該活性部位は非常に保存されており、そしてこのものはＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む（Holmgrenによる, 1985, Annu. Rev. Biochem. 54: 237-71；237-271）。哺乳動物のチオレドキシンファミリーは、ＴＲＸ−１およびＴＲＸ−２を含む。該前者はサイトゾルで且つ核形態であって、そして後者はミトコンドリア形態である。ＴＲＸ−１は最も広範に記載されており、そしてこのものは細胞中でいくつかの突然変異形態で表されると予測される１０４アミノ酸タンパク質である（Powisらによる, 2001. Annu. Rev. Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-55: 421-455）。ヒトＴＲＸ／ＴＲＸ−１（１１．５ｋＤａ）（このものは、成人Ｔ−細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）としても知られる）（Gasdaskaらによる, 1994. Biochim. Biophys. Acta. 1218: 292-296）または好酸球細胞毒性刺激因子(Eosinophil cytotoxicity stimulating factor)（Silbersteinらによる, 1993, J. Biol. Chem. 268: 9138-9142）は、５個のシステイン残基（３個以上が細菌中に存在する）を有する（Silbersteinらによる, 1993, J. Biol. Chem. 268: 9138-9142）。これらの余分なシステインは、ヒトＴＲＸの特異的な性質に関与する（Gasdaskaらによる, 1994. Biochim. Biophys. Acta. 1218: 292-296）。ＴＲＸは、レドックスコントロールによって転写因子のＤＮＡとの結合を改変し、その結果、遺伝子転写を制御することが分かっている。ＴＲＸコントロール下であると記載されている転写因子はＮＦ−κＢ（Matthewsらによる, 1992, Nucleic Acids Res. 20: 3821-3830）、ＴＦＩＩＩＣ（Cromlishらによる, J. Biol. Chem. 264: 18100-18109）、ＢＺＬＦ１（Bannisterらによる, 1991, Oncogene 6: 1243-1250）、ｐ５３（Uenoらによる, 1999, J. Biol. Chem. 274: 35809-35815）、グルココルチコイド受容体（Grippoらによる, 1983, J. Bio. Chem. 258: 13658-13664）および間接的なＡＰ−１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎヘテロ二量体）（Abateらよる, 1990, Science, 249: 1157-1161）である。ＴＲＸはまた、ＡＰ−２、エストロゲン受容体およびＰＥＢＰ２／ＣＢＦのＤＮＡとの結合をも増大する（Powisらによる, 2001, Annu. Rev. Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-55: 421-455）。低酸素誘導因子１アルファ（ＨＩＦ−１α）は、ＴＲＸ上昇時に増大することが分かっており（Welshらによる, 2002, Cancer Res. 62: 5089-5095）、このことにより、抗腫瘍血管新生標的としてＴＲＸを増強することができる。その上、ヌクレオチドをデオキシヌクレオチドに変換することを触媒する際に、��なわち増殖にとって必須であるＤＮＡ合成における第１の工程に関与する。ＴＲＸは、おそらく増殖因子の自己分泌活性を増大させることによって癌細胞増殖のシグナルとして機能することができる（Gasdaskaらによる, 1995, Cell Growth Differ. 6: 1643-1650）。ＴＲＸはＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ−細胞中の高いアフィニティーのＩＬ−２受容体のアルファサブユニットを上方調節することが示唆されており（Schenkらによる, 1996, J. Immunol. 156: 765-771）、ここで、ＩＬ−２は１００倍以上にまで増大し得る（Powisらによる, 2001, Annu. Rev. Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-455; 421-455）。ＴＲＸはまた、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αに似たサイトカインをも増大させ（Schenkらによる, 1996, J. Immunol. 156: 765-771）、その結果、免疫疾患（例えば、ヒト関節リウマチ）に影響を及ぼす。ストレス（例えば、低酸素症、リポ多糖類、Ｏ2、過酸化水素、ホスボールエステル、ウイルス感染症、および感染性物質、Ｘ−線放射およびＵＶ照射、ホルモンおよび化学品）はＴＲＸを誘発する（Powisらによる, 2001, Annu. Rev. Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-455; 421-455）。ＴＲＸをコードする遺伝子のプロモーター領域は、ストレス応答性要素の一群を含む（Taniguchiらによる, 1996, Nucleic Acids Res. 24: 2746-2752）。ＴＲＸ−１は、多数のヒト原発腫瘍中で過剰発現し、そして癌細胞はＥＲ−ゴルジ独立性様式によるリーダーレス(leaderless)分泌経路によってＴＲＸ−１を分泌することができることが知られる（Rubartelliらによる, 1992, J. Biol. Chem. 267: 24161-24164）。ヒトＴＲＸは、抗アポトーシスおよび様々な癌における抗増殖処置のための可能な標的であることが提案されており、並びにそのものは様々なヒトの疾患において重要な役割を果たし得る（Powisらによる, 2001, Annu. Rev. Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-455; 421-455）。アポトーシスは、インビトロおよびインビボの両方でＴＲＸの過剰発現によって抑制される（Barkerらによる, 1997, Cancer Res. 57: 5162-5167）。組換えヒトＴＲＸは、正常な細胞および様々な固形腫瘍由来の培養癌細胞の増殖を刺激し（Gasdaskaらによる, 1995, Cell Growth Differ. 6: 1643-1650; Oblongらによる, J. Biol. Chem. 269: 11714-11720）、そしてＴＲＸ  ｍＲＮＡは、ヒト腫瘍細胞中で過剰発現することが分かっている。一方で、レドックス不活性なＴＲＸは、細胞増殖を刺激しない（Oblongらによる, J. Biol. Chem. 269: 11714-11720）。驚くべきことに、ヒト原発腫瘍細胞の悪性度は正常な組織と比較してＴＲＸを発現するかまたは過剰発現するかのいずれかであることが分かっている。例えば、胃癌（Groganらによる, 2000, Hum. Pathol. 31: 475-481）、悪性胸膜中皮腫（Kahlosらによる, 2001, Int. J. Cancer 20; 95: 198-204）、非小細胞肺癌（Soiniらによる, Clin. Cancer Res., 7: 1750-1757）、肝臓癌（Nakamuraらによる, Cancer 69: 2091-2097）、子宮頚部癌（Fujiiらによる, cancer 68: 1583-1591）、膵臓癌（Nakamuraらによる, Cancer Detect. Rrev. 24: 53-60）、大腸癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病および骨髄腫（Powisらによる, 2001, Annu. Rev Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-55; 421-455）において知られる。
【０００３】
ＴＲＸが多数の原発腫瘍中で過剰発現しそして関与するという発見に加えて、多数の抗癌薬物によって引きこされるＴＲＸ−１の増殖刺激性効果および抗アポトーシス効果（総説として、Powisらによる, 2001, Annu. Rev. Biophys. Biochem. Struct. 30: 421-455; 421-455を参照）は、ＴＲＸ特異的薬物を用いるＴＲＸの改変を薬物開発のための魅力的な標的とする。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＲＸ  ｍＲＮＡおよびタンパク質を特異的に改変することが知られる（Saitohらによる, EMBO J. 17: 2596-2603）（WO 9938963）。これらのホスホロチオエートは全て、長さが２０または２３ｂｐであった（１つの例外は１７−ｍｅｒである）。
【０００４】
現行の臨床治験におけるオリゴヌクレオチドのほとんどは、１９８８年からのホスホロチオエート化学をベースとしており、このものは開発された第１の有用なアンチセンス化学であった。しかしながら、最近明白になってきた通り、この化学は臨床的な使用を制限する重大な欠点を有する。これらとしては例えば、それらの標的ｍＲＮＡに対する低いアフィニティを含み、これは効力に負の影響を及ぼし、そしてその結果、小さい活性なオリゴヌクレオチドがどれほど複雑な製造物であり、そして処置費用を増大させるかの点で制限を与える。また、それらの低いアフィニティーは、標的ｍＲＮＡに対する接近の乏しさに翻訳され、その結果、活性化合物の同定を複雑とする。最後に、ホスホロチオエートオロゴヌクレオチドは、それらの治療学的なウィンドウを狭める広範囲の副作用を被る。
【０００５】
これらおよび他の問題を扱うために、より大きな努力が改善された性質を有する新規なアナログを創製するのに費やされている。以下の反応式１中で示す通り、これらは完全に人工的なアナログ（例えば、ＰＭＡおよびモルホリノ）、およびより便利なＤＮＡアナログ（例えば、ボラノホスフェート、Ｎ３'−Ｐ５'ホスホラミデートおよびいくつかの２'修飾アナログ（例えば、２'−Ｆ、２'−Ｏ−Ｍｅ、２'−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）および２'−Ｏ−(３−アミノプロピル））（ＡＰ）を含む。より最近には、ヘキシトール核酸（ＨＭＡ）、２'−Ｆ−アラビノ核酸（２'−Ｆ−ＡＮＡ）およびＤ−シクロヘキセニルヌクレオシド（ＣｅＮＡ）が紹介されている。
【０００６】
これらのアナログの多数は、相補的な核酸との結合の改善、生物学的な安定性における改善を示し、あるいはそれらは細胞酵素であるＲＮＡｓｅＨ（このものは、多数のアンチセンス化合物の作用様式に関与する）を補充する能力を保持する。しかしながら、それらのいずれもこれらの利点を合わせておらず、そして多くの場合には、該性質の１個の改善は１個以上の他の性質を損なう。また、多くの場合に、いくつかのアナログの商業的な価値を大きく制限する新規な合併症が記載されている。これらとしては例えば、低い溶解度、複雑なオリゴマー化の化学、非常に低い細胞の取り込み、他の化学品との不適合性などを含む。該ＭＯＥ化学は、いくつかの制限を有する。これは、いくつかのＭＯＥがオリゴ中へエンブロック挿入する場合にだけ、顕在化する。ＭＯＥは２'−修飾のファミリーに属し、そして該アンチセンス活性がインビトロでのＲＮＡ結合アフィニティーと直接的に相関するこの化合物群はよく知られる。ｃ−ｒａｆを標的とするＭＯＥ２０ｂｐギャップマー（５ＭＯＥ／ＰＯ−１０ＰＳ−５ＭＯＥ／ＰＯ）は、Ｔ２４細胞中で約２０ｎｍのＩＣ50を有することが報告されており、そしてＰＫＣ−ａを標的とするＭＯＥギャップマーがＡ５４９細胞中で２５ｎｍのＩＣ50を有することが報告されている。比較のために、アンチセンス実験において使用されるホスホチオエート化合物は典型的に、ＩＣ50を１５０ｎｍの範囲で示す（Stein, Kreigによる, Applied Antisense Oligonucleotide Technology, Wiley-Liss, 1988, 頁87-90）。
【０００７】
本発明の実際的な目的は、サバイビンｍＲＮＡに対する新規なオリゴマー化合物を提供することである。本発明の化合物は、ＩＣ50の低下（従って、活性の増大）を示し、その結果、サバイビンの発現が原因または関連物質として関与する様々な癌疾患の有効な処置を促進することを見出した。以下で説明する通り、この目的は、ＬＮＡ（ロックト核酸）と呼ばれる非常に高いアフィニティーの利用によって最もよく達成される。
【０００８】
本発明は、オリゴマー化合物（特に、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド）に関するものであって、このものは、サバイビンをコードする核酸を標的とし、そして該サバイビンの発現を改変する。この改変は、サバイビンｍＲＮＡの特に非常に強力な下方改変、並びにアポトーシス反応の誘発である。該ＬＮＡ含有オリゴマー化合物は、８−ｍｅｒと同程度に低く、そして１６−ｍｅｒと同程度に確かに非常に活性であり、このものはサバイビンを標的とする報告されているアンチセンス化合物よりもかなり短い。これらの１６−ｍｅｒオリゴマー化合物は、ナノモル範囲以下のＩＣ50を有する。本発明により、薬理学的な活性に必要なアフィニティーを損なうことなく、アンチセンスオリゴマーの通常の長さ（２０〜２５ｍｅｒから、例えば８〜１６ｍｅｒに）のかなりの短縮が可能となる。オリゴの内因性の特異性はその長さに逆に相関するので、該短縮はそのＲＮＡ標的に対するアンチセンス化合物の特異性を優位に増大させるであろう。更に、より短いオリゴマー化合物はより長いオリゴマー化合物よりもより高い生物学的安定性および細胞透過性を有すると見積もられる。少なくともこれらの理由で、本発明は当該分野に対するかなりの貢献である。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、オリゴマー化合物、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するものであって、このものは、ＴＲＸをコードする核酸を標的とし、そして該ＴＲＸの発現を改変する。本発明のオリゴマー化合物を含有する医薬組成物および他の組成物をも提供する。
【００１０】
本発明の中心的な態様は、総計８〜５０個のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む化合物を提供することであり、ここで、該化合物は少なくとも８個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのサブ配列を含み、該サブ配列は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群から選ばれる配列内にある。
【００１１】
更に、細胞または組織中でのＴＲＸの発現を改変するための方法を提供し、該方法は該細胞または組織を１個以上の本発明のオリゴマー化合物または組成物と接触させることを含む。治療学的にまたは予防学的に有効な量の１個以上の本発明のオリゴマー化合物または組成物を投与することによって、ＴＲＸの発現に関係する疾患または病気を患っているかまたは患い易い動物またはヒトを処置する方法をも開示する。更に、ＴＲＸの発現を抑制するためのおよびＴＲＸ活性に関係する疾患を処置するためのオリゴマー化合物の使用方法を提供する。該疾患としては例えば、異なるタイプの癌、例えば肺、乳、大腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸菅、腸、脊髄、洞、膀胱、尿路、または卵巣の癌を挙げられる。
【００１２】
（発明の記載）
本明細書中、用語「標的核酸」とは、チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼ（ヒトチオレドキシン１（ＴＲＸ１）が好ましい（以下、ＴＲＸと呼ぶ））および該ＤＮＡから転写されるＲＮＡ（例えば、プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）をコードするＤＮＡ、並びにまた該ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを包含する。
【００１３】
本明細書中、用語「遺伝子」とは、エキソン、イントロン、非コード５'および３'領域、調節要素、並びに全ての現在知られるその変異型およびいずれかの更なる変異型（このものは、解明され得る）を含む遺伝子を意味する。
【００１４】
本明細書中の用語「ヌクレオシド」とはその通常の意味で使用し、すなわち、そのものは、２−デオキシリボース単位またはリボース単位を含み、これは、窒素性塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはグアニン（Ｇ）の１つとその番号１の炭素原子によって結合する。
【００１５】
同様に、用語「ヌクレオチド」とは２−デオキシリボース単位またはＲＮＡ単位を意味し、これは、窒素性塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはグアニン（Ｕ）、ウラシル（Ｕ）とその番号１の炭素原子によって結合し、そしてヌクレオシド間のホスフェート基または末端基とその番号５の炭素原子によって結合する。
【００１６】
本明細書中で使用する用語「ヌクレオチドアナログ」とは非天然ヌクレオチドを意味し、ここでは、リボース単位が２−デオキシリボースもしくはＲＮＡとは異なるか、および／または該窒素性塩基がＡ、Ｃ、ＴおよびＧとは異なるか、および／または該ヌクレオシド間ホスフェート連結基が異なるかのいずれかである。ヌクレオシドアナログの具体例は、例えばFreier & Altmannによる, Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmannによる, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213によって記載されている。
【００１７】
用語「対応するヌクレオシドアナログ」および「対応するヌクレオシド」は、ヌクレオシドアナログ中の核酸塩基およびヌクレオシドが同一であると示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンと連結する場合には、「対応するヌクレオシドアナログ」は、アデニンと連結したペントース単位（２−デオキシリボースとは異なる）を含む。
【００１８】
用語「核酸」とは、２個以上のヌクレオチドの共有結合によって生成する分子と定義する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で相互交換可能に使用する。
【００１９】
用語「核酸アナログ」とは、非天然核酸と結合する化合物を意味する。
【００２０】
ヌクレオチドアナログおよび核酸アナログは、例えばFreier & Altmannらによる, Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443、およびUhlmannらによる, Curr. Opinion in Drug & Development 2000, 3(2): 293-21）中に記載されている。反応式１は、核酸を製造するのに適当なヌクレオチドアナログの選択例を例示する。
【００２１】
用語「ＬＮＡ」とは、１個の二環式のヌクレオシドアナログを含有するヌクレオチドを意味し、このものはまた、ＬＮＡモノマーまたは１個以上の二環式のヌクレオシドアナログを含有するオリゴヌクレオチドをも意味する。ＬＮＡモノマーは、WO 9914226、およびその後の出願、WO 0056746、WO 0056748、WO 0066604、WO 00125248、WO 0228875、WO 2002094250およびPCT/DK02/00488中に記載されている。チミジンＬＮＡモノマーの１具体例は、(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｓ)−７−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−５−メチル−３−(チミン−１−イル)−２,５−ジオキサ−ビシクロ[２：２：１]ヘプタンである。
【００２２】
本明細書中、用語「オリゴヌクレオチド」とは、オリゴマー（これはまた、オリゴと呼ばれる）、核酸ポリマー（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））もしくは当該分野において知られる核酸アナログ（ロックト核酸（ＬＮＡ）が好ましい）、またはそれらの混合物を意味する、本用語は、天然核酸塩基、糖類、およびヌクレオシド間（骨格）連結を含むオリゴヌクレオチド、並びに非天然部分（これは、同様に機能したりまたは特定の改善された機能を有する）を有するオリゴヌクレオチドを含む。完全または部分的な修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、それらオリゴヌクレオチドのいくつかの望ましい性質（例えば、細胞膜を透過する能力、細胞外および細胞間のヌクレアーゼに対する良好な耐性、該核酸標的に対する高いアフィニティーおよび特異性）のために、天然の形態よりも好ましいことが多い。上記の性質を示す該ＬＮＡアナログが、特に好ましい。
【化１】
2006518999.tif 000002
【００２３】
用語「単位」とは、モノマーであると理解する。
【００２４】
用語「少なくとも１つ」とは、１以上の整数を含み、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７などが挙げられる。
【００２５】
用語「チオ−ＬＮＡ」とは、反応式２中のＸおよびＹの少なくとも１つがＳまたは−ＣＨ2−Ｓから選ばれる、ロックトヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−の両方の立体配置であり得る。
【００２６】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、反応式２中のＸまたはＹの少なくとも１つが−Ｎ(Ｈ)−、Ｎ(Ｒ)−、ＣＨ2−Ｎ(Ｈ)−、−ＣＨ2−Ｎ(Ｒ)−であって、該Ｒは水素またはＣ1〜4−アルキルから選ばれる、ロックトヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−の両方の立体配置であり得る。
【００２７】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、反応式２中のＸまたはＹの少なくとも１つが−Ｏ−または−ＣＨ2−Ｏ−である、ロックトヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−の両方の立体配置であり得る。
【００２８】
用語「エナ−ＬＮＡ」は、反応式２中のＹが−ＣＨ2−Ｏ−である、ロックトヌクレオチドを含む。
【００２９】
用語「アルファ−Ｌ−ＬＮＡ」は、反応式３（右の構造式）中に示す通りであるロックトヌクレオチドを含む。
【００３０】
用語「ＬＮＡ誘導体」は、ベータ−Ｄ−メチレンＬＮＡ（例えば、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、およびエナ−ＬＮＡ）を除く、反応式２中の全てのロックトヌクレオチドを含む。
【００３１】
用語「連結基」とは、２個のヌクレオシド、２個のヌクレオシドアナログ、ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログなどと共有的にカップリングすることができる基を意味すると意図する。具体的で且つ好ましい例としては、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。
【００３２】
本明細書中、用語「接合体」とは、本明細書中に記載する化合物（すなわち、ヌクレシドまたはヌクレオシドアナログの配列を含有する化合物）と１個以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド分子との共有結合によって生成する、外来分子を意味すると意図する。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド分子としては例えば、マクロ分子薬物（例えば、タンパク質、脂肪酸鎖、糖類残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの組み合わせ）を含む。典型的なタンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的なポリマーは、ポリエチレン(polyethelene)グリコールであり得る。
【００３３】
用語「癌腫」とは、上皮起源の悪性腫瘍を示すと意図する。上皮組織は、身体の内側および外側の体表の身体表面を覆いまたは沿う。上皮組織とは例えば、身体腔および内部臓器（腸菅、膀胱、子宮など）に沿う皮膚、粘膜および漿膜である。上皮組織はまた、腺（例えば、粘液分泌の腺）からより深い組織層にまでも拡張し得る。
【００３４】
用語「肉腫」とは、結合組織（例えば、軟骨、脂肪、筋肉、腱および骨）から増殖する悪性腫瘍を意味すると意図する。
【００３５】
本明細書中で使用する用語「神経膠腫」とは、膠細胞起源の悪性腫瘍を包含することを意図する。
【００３６】
ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などについて使用する用語「ａ」とは、１個以上を意味すると意図する。特に、「---からなる群から選ばれる成分（例えば、ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号など）」は、該引用成分の１個以上が選ばれ得ることを意味すると意図する。従って、表現「Ａ、ＢおよびＣからなる群から選ばれる成分」とは、Ａ、ＢおよびＣの全ての組み合わせ（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃ）を含むと意図する。
【００３７】
本明細書中で使用する用語「Ｃ1〜4アルキル」とは、鎖が１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝の飽和炭化水素鎖を意味すると意図し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルを挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用する用語「標的核酸」とは、サバイビンをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡから転写されるＲＮＡ（例えば、プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびまた該ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを包含する。
【００３９】
本明細書中で使用する用語「オリゴマー化合物」とは、例えば標的遺伝子「キメラプラスト」および「ＴＦＯ」；標的遺伝子「アンチセンスインヒビター」、「ｓｉＲＮＡ」、「リボザイム」および「オリゴザイム(oligozymes)」のＲＮＡ転写物；または、標的遺伝子「アプタマー」、「スピゲルマー(spiegelmer)」もしくは「デコイ(decoy)」によってコードされるタンパク質のいずれかとの水素結合による結合によって、ヒトにおいて所望する治療学的な効果を誘発することができるオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「ｍＲＮＡ」とは、標的遺伝子の現在知られるｍＲＮＡ転写物、およびいずれか更なる転写物（このものは、解明され得る）を意味する。
【００４１】
本明細書中で使用する用語「改変」とは、遺伝子の発現の増大（刺激）または減少（抑制）のいずれかを意味する。本発明において、抑制は遺伝子発現の改変の好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡは好ましい標的である。
【００４２】
本明細書中で使用する用語、アンチセンス化合物をある標的核酸に「標的（指向化）する」とは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを、該アンチセンス化合物がその意図する標的と結合しそして機能を改変することができるような様式で、細胞、動物またはヒトに供することを意味する。
【００４３】
本明細書中で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間の、ワトソン−クリック，ホルステイン(Holstein)であり得る水素結合、逆転ホルステイン水素結合などであり得る水素結合を意味する。ワトソンおよびクリックは、約５０年前に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が二本鎖中の反対の相補的な核酸塩基の間で形成する水素結合によってヘリカル立体配置に共に保持された二本鎖から構成されることを示した。ＤＮＡ中に通常見られる４個の核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であり、その内、Ｇ核酸塩基はＣと対形成し、そしてＡ核酸塩基はＴと対形成する。ＲＮＡの場合は、該核酸塩基チミンは、核酸塩基ウラシル（Ｕ）によって置き代えられ、このものはＴ核酸塩基と同様にＡと対形成する。標準二本鎖形成に関与する核酸塩基中の化学的な基は、ワトソン−クリック面(face)を構成する。フーグステン(Hoogsteen)は数年後に、ワトソン−クリック面に加えて、プリン核酸塩基（ＧおよびＡ）がフーグステン面（これは、二本鎖の外側から認識し、そして水素結合によってピリミジンオリゴヌクレオチドと結合するのに使用して、その結果、三重へリックス構造を形成することができる）を有することを示した。
【００４４】
本明細書中の「相補的」とは、２個のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列間で相互に正確な対形成する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置でのヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の対応する位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合には、該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡまたはＲＮＡは、該位置で互いに相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の対応ヌクレオチドと水素結合を形成することができて、安定な複合体を形成することができる場合には、該ＤＮＡまたはＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドは互いに相補的であると考えられる。インビトロまたはインビボで安定であるためには、アンチセンス化合物の配列はその標的核酸分子に対して１００％相補的である必要はない。従って、用語「相補的」および「特異的にハイブリダイズ可能」とは、アンチセンス化合物が該標的分子と十分に強く且つ特異的に結合して、該標的の通常の機能との所望する干渉を与える一方で、非標的ｍＲＮＡの機能に影響を及ぼさないことを意味する。
【００４５】
本発明は、ＴＲＸをコードする核酸分子の機能を改変するのに使用するための、オリゴマー化合物（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を使用する。該改変は結局、産生するＴＲＸの量の変化である。１実施態様において、これは、ＴＲＸをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を供することによって達成される。該改変は、ＴＲＸの発現の抑制であることが好ましく、これにより産生する多数の機能性タンパク質の減少を生じる。
【００４６】
本発明のアンチセンス化合物および他のオリゴマー化合物（このものは、該標的の発現を改変する）は、実験または該標的における配列情報に基づく合理的なデザイン、および所望する標的に対するオリゴマー化合物を設計するのに最もよい方法に関するノウハウによって同定する。これらの化合物の配列は、本発明の好ましい実施態様である。同様に、これらの好ましいオリゴマー化合物が相補的である該標的中の配列モチーフ（これは、「ホットスポット」と呼ばれる）は標的指向のための好ましい部位である。
【００４７】
好ましいオリゴマー化合物は、少なくとも８個の核酸塩基部分を含み、該サブ配列は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７から選ばれ、そしてそれらの配列を表２中に提示する。本発明に記載するオリゴマー化合物は、標的の強力な改変物質である。例えば、標的のインビトロ抑制は、リアルタイムＰＣＲによって測定される表２に示す。オリゴマー化合物の低いＩＣ５０を、表３に示す。図２および３は、ノーザンブロット法によって測定される本発明のオリゴマー化合物のインビトロ効力を示す。図６および７は、ウェスタンブロット法によって測定される、本発明のオリゴマー化合物のインビトロ効力を示す。図８は、別の標的を用いて追跡した場合の、ＬＮＡオリゴマー化合物の特異的な抑制を示す。本発明の化合物はまた、アポトーシスを誘発する（図９）。図１０は、本発明のオリゴマー化合物のインビボ効力を示す。全ての上記の実験的な観察は、本発明の化合物が医薬組成物中の活性化合物を構成し得ることを示す。
【００４８】
１実施態様において、該核酸塩基部分は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５から選ばれる。
【００４９】
本発明の好ましいオリゴマー化合物は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７であり、そしてそれらの配列は表２中に提示する。
【００５０】
本発明の別の実施態様において、該ヌクレオシドはホスホロチオエート基によって互いに連結する。本発明の関心ある実施態様は、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７の化合物に関し、ここで、各化合物内の各連結基はホスホロチオエート基である。該改変は、下付きＳによって示す。言い換えれば、本発明の１態様は、配列番号：５A、６A、７A、８A、９A、１０A、１１A、１２A、１３A、１４A、１５A、１６A、１７A、１８A、１９A、２０A、２１A、２２A、２３A、２４A、２５A、２６A、２７A、２８A、２９A、３０A、３１A、３２A、３３A、３４A、３５A、３６A、３７A、３８A、３９A、４０A、４１A、４２A、４３A、４４A、４５A、４６A、４７A、４８A、４９A、５０A、５１A、５２A、５３A、５４A、５５A、５６Aおよび５７Aの化合物に関する。
【００５１】
本発明の更なる態様は、配列番号：５B、６B、７B、８B、９B、１０B、１１B、１２B、１３B、１４B、１５B、１６B、１７B、１８B、１９B、２０B、２１B、２２B、２３B、２４B、２５B、２６B、２７B、２８B、２９B、３０B、３１B、３２B、３３B、３４B、３５B、３６B、３７B、３８B、３９B、４０B、４１B、４２B、４３B、４４B、４５B、４６B、４７B、４８B、４９B、５０B、５１B、５２B、５３B、５４B、５５B、５６Bおよび５７Bの化合物に関する。
【００５２】
本発明の更なる態様は、配列番号：５C、６C、７C、８C、９C、１０C、１１C、１２C、１３C、１４C、１５C、１６C、１７C、１８C、１９C、２０C、２１C、２２C、２３C、２４C、２５C、２６C、２７C、２８C、２９C、３０C、３１C、３２C、３３C、３４C、３５C、３６C、３７C、３８C、３９C、４０C、４１C、４２C、４３C、４４C、４５C、４６C、４７C、４８C、４９C、５０C、５１C、５２C、５３C、５４C、５５C、５６Cおよび５７Cの化合物に関する。
【００５３】
本発明の１実施態様において、該オリゴマー化合物は、少なくとも１個の化学的な意味のＬＮＡ（ロックト核酸）を含有する。
【００５４】
ＬＮＡモノマーは典型的に、国際特許出願WO 99/14226、およびその後の出願であるWO 0056746、WO 0056748、WO 0066604、WO 00125248、WO 0228875、WO 2002094250およびPCT/DK02/00488（これらは全て本明細書の一部を構成する）中に記載される二環式ヌクレオシドアナログを意味する。好ましいＬＮＡモノマー構造を、反応式２に例示する。
【化２】
2006518999.tif 000003
上記式中、ＸおよびＹは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ(Ｈ)−、Ｎ(Ｒ)−、−ＣＨ2−、または−ＣＨ−（二重結合の部分の場合）、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ2−Ｎ(Ｈ)−、−ＣＨ2−Ｎ(Ｒ)−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、または−ＣＨ2−ＣＨ−（二重結合の部分の場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−の群から選ばれて、ここで、Ｒは水素またはＣ1〜4−アルキルから選ばれる。不斉の基は、いずれかの配向で存在することができる。
【００５５】
反応式２中、４個のキラル中心は、固定化された立体配置で示される。しかしながら、反応式２中の立体配置は、必ずしも固定化されない。本発明においては、一般的な反応式２の化合物をも含む。ここで、該キラル中心は異なる立体配置（例えば、反応式３または４中に示すもの）で存在する。従って、反応式２の例示の意図は、キラル中心の立体配置を限定するものではない。反応式２中の各キラル中心は、ＲまたはＳのいずれかの立体配置で存在し得る。Ｒ（左旋性）およびＳ（右旋性）の定義は、IUPAC 1974 Recommendations, Section E, Fundamental Stereochemistry: The rules can be found in Pure Appl. Chem. 45, 13-30, (1976)および「Nomenclature of organic Chemistry」 pergamon, New York, 1979中に記載されている。
【００５６】
ＺおよびＺ*は独立して存在しないか、またはヌクレオシド間連結、末端基または保護基から選ばれる。
【００５７】
該ヌクレオシド間連結は、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ-、−Ｓ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｓ)2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)2−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ(ＲH)−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ3)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＲH)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｒ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＢＨ3)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＨＲH)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−ＮＲH−、−ＮＲH−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−ＮＲH−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲH−、−ＮＲH−ＣＯ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−、−ＣＯ−ＮＲH−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＮＲH−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−ＣＯ−、−ＣＨ2−ＮＣＨ3−Ｏ−ＣＨ2−からなる群から選ばれ得て、ここで、ＲHは水素またはＣ1〜4−アルキルから選ばれる。
【００５８】
該末端基は独立して、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ａｃｔ−Ｓ−、Ｃ1〜6−アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲH)−、Ａｃｔ−Ｎ(ＲH)−、モノ−もしくはジ−(Ｃ1〜6−アルキル)アミノ、場合により置換されたＣ1〜6アルコキシ、場合により置換されたＣ1〜6アルキル、場合により置換されたＣ2〜6アルケニル、場合により置換されたＣ2〜6アルケニルオキシ、場合により置換されたＣ2〜6アルキニル、場合により置換されたＣ2〜6アルキニルオキシ、モノホスフェート、モノチオホスフェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート、トリホスフェート、トリチオホスフェート、ＤＮＡインターカレーター(intercalators)、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、受容体基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ2−、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ2−、アミノメチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲH)−ＣＨ2−、Ａｃｔ−Ｎ(ＲH)−ＣＨ2−、カルボキシメチル、スルホノメチル（ここで、Ｐｒｏｔはそれぞれ−ＯＨ、ＳＨ、および−ＮＨ(ＲH)についての保護基であり、Ａｃｔはそれぞれ−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ(ＲH)についての活性化基であり、そしてＲHは水素またはＣ1〜6アルキルから選ばれる）から選ばれる。
【００５９】
ヒドロキシ置換基の保護基は、置換トリチル、例えば４,４'−ジメトキシトリチルオキシ（ＤＭＴ）、４−モノメトキシトリチルオキシ（ＭＭＴ）、およびトリチルオキシ、場合により置換された９−(９−フェニル)キサンテニルオキシ（ピクシル(pixyl)）、場合により置換されたメトキシテトラヒドロピラにルオキシ（ｍｔｈｐ）、シリルオキシ（例えば、トリメチルシリルオキシ（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシ（ＴＩＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アセタール（２個のヒドロキシ基を含む）、アシルオキシ（例えば、アセチル）またはハロゲン置換のアセチル（例えば、クロロアセチルオキシ、またはフルオロアセチルオキシ）、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、および置換ベンゾイル、メトキシメチルオキシ（ＭＯＭ）、ベンジルエーテルまたは置換ベンジルエーテル（例えば、２,６−ジクロロベンジルオキシ（２,６−Ｃｌ2Ｂｚｌ）を含む。或いは、ＺまたはＺ*がヒドロキシルである場合には、それらは場合により連結基によって固体担体と結合することによって保護し得る。
【００６０】
ＺまたはＺ*がアミノ基である場合には、該アミノ保護基の例示的な例としては、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ（ＢＯＣ）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（ａｌｌｏｃ、ＡＯＣ）、Ｚ−ベンジルオキシカルボニルアミノ（Ｃｂｚ）、置換ベンジルオキシカルボニルアミノ（例えば、２−クロロベンジルオキシカルボニルアミノ（２−ＣｌＺ））、モノメトキシトリチルアミノ（ＭＭＴ）、ジメチルオキシトリチルアミノ（ＤＭＴ）、フタロイルアミノ、および９−(９−フェニル)キサンテニルアミノ（ピクシル）が挙げられる。
【００６１】
上記の実施態様において、Ａｃｔはそれぞれ、−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ(ＲH)についての活性基を意味する。該活性基は、例えば場合により置換されたＯ−ホスホラミダイト、場合により置換されたＯ−ホスホトリエステル、場合により置換されたＯ−ホスホジエステル、場合により置換されたＨ−ホスホネート、および場合により置換されたＯ−ホスホネートから選ばれる。
【００６２】
本明細書中、用語「ホスホラミダイト」とは、式−Ｐ(ＯＲx)−Ｎ(Ｒy)2（式中、Ｒxは、場合により置換されたアルキル基（例えば、メチル、２−シアノエチル、またはベンジル）であり、そして各Ｒyは場合により置換されたアルキル基（例えば、エチルまたはイソプロピル）であるか、または基−Ｎ(Ｒy)2（モルホリノ基（−Ｎ(ＣＨ2ＣＨ2)2Ｏを形成する）を意味する。Ｒxは、２−シアノエチルであることが好ましく、そして該２個のＲyは同じであって、そしてイソプロピルであることが好ましい。従って、特に関連するホスホラミダイトは、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−(２−シアノエチル)ホスホラミダイトである。
【００６３】
Ｂは、天然または非天然の核酸塩基であって、そしてこのものは、アデニン、シトシン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６−フルオロウラシル、５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デアザグアニン、および２−クロロ−６−アミノプリンから選ばれる。
【００６４】
特に好ましい二環式構造を、以下の反応式３：
【化３】
2006518999.tif 000004
に示す。式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ(ＲH)であり；そして、
ＺおよびＺ*は独立してヌクレオシド間連結、末端基もしくは保護基から選ばれる。
【００６５】
該ヌクレオシド間連結は、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｓ)2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ(Ｓ)2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ,Ｓ)−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ(Ｏ)2−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ(ＲH)−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ3)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＲH)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｒ)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＢＨ3)−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ(ＮＨＲH)−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)2−ＮＲH−、−ＮＲH−Ｐ(Ｏ)2−Ｏ−、−ＮＲH−ＣＯ−Ｏ−であり得て、ここで、ＲHは水素またはＣ1〜4アルキルから選ばれる。
【００６６】
該末端基は独立して、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏ−Ｓ−、Ａｃｔ−Ｓ−、Ｃ1〜6アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ(ＲH)−、Ａｃｔ−Ｎ(ＲH)−、モノもしくはジ−(Ｃ1〜6−アルキル)アミノ、場合により置換されたＣ1〜6アルコキシ、場合により置換されたＣ1〜6アルキル、場合により置換されたモノホスフェート、モノチオホスフェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート、トリホスフェート、トリチオホスフェートから選ばれ、ここで、Ｐｒｏｔはそれぞれ−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ(ＲH)についての保護基であり、そしてＲHは水素またはＣ1〜6−アルキルから選ばれる。
【００６７】
ヒドロキシ置換基の保護基は、置換トリチル（例えば、４,４'−ジメトキシトリチルオキシ（ＤＭＴ）、４−モノメトキシトリチルオキシ（ＭＭＴ）、場合により置換された９−(９−フェニル)キサンテニルオキシ（ピクシル）、場合により置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ（ｍｔｈｐ）、シリルオキシ（例えば、トリメチルシリルオキシ（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシ（ＴＩＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アセタール（２個のヒドロキシ基を含む）、アシルオキシ（例えば、アセチル）を含む。或いは、ＺまたはＺ*がヒドロキシである場合には、それらは場合により連結基によって固体の担体と結合することによって保護され得る。
【００６８】
ＺまたはＺ*がアミノ基である場合には、該アミノ保護基の例示的な例としては、フルオレニル−メトキシ−カルボニルアミノ（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ（ＢＯＣ）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（ａｌｌｏｃ、ＡＯＣ）、モノメトキシトリチルアミノ（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチルアミノ（ＤＭＴ）、フタロイルアミノを挙げられる。
【００６９】
上記の実施態様において、Ａｃｔは、それぞれ−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ(ＲH)についての活性化基を示す。それら活性化基としては例えば、場合により置換されたＯ−ホスホラミダイト、場合により置換されたＯ−ホスホトリエステル、場合により置換されたＯ−ホスホジエステル、場合により置換されたＨ−ホスホネート、または場合により置換されたＯ−ホスホネートから選ばれる。
【００７０】
本明細書中、用語「ホスホラミダイト」とは、式：−Ｐ(ＯＲx)−Ｎ(Ｒy)2の基を意味し、ここで、式中、Ｒxは、場合により置換されたアルキル基（例えば、メチル、２−シアノエチルである）であり、そして各Ｒyは、場合により置換されたアルキル基であり、Ｒxは２−シアノエチルであることが好ましく、そして２個のＲyは同一であってそしてイソプロピルであることが好ましい。従って、特に関連するホスホラミダイトは、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−(２−シアノエチル)ホスラミダイトである。
【００７１】
Ｂは、天然または非天然の核酸塩基を構成し、そしてアデニン、シトシン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンから選ばれる。
【００７２】
特に好ましいＬＮＡ単位を反応式４に示す。
【化４】
2006518999.tif 000005
【００７３】
（治療学的な原理）
当該分野の当業者は、ＬＮＡを含有するオリゴマー化合物を用いて、多数の異なる原理によってＴＲＸ関連疾患と闘うことができ、従ってこのことは本発明の精神の範囲内であると評価するであろう。
【００７４】
例えば、ＬＮＡオリゴマー化合物はアンチセンスインヒビターとして設計することができ、このものはｍＲＮＡレベルでのインターベンションによって疾患の原因となるタンパク質の産生を防止する一本鎖核酸である。それらはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるリボザイムまたはオリゴザイムとして設計することができ、このものは標的結合ドメインに加えて、標的ｍＲＮＡ（リボザイム）を分解する触媒活性を含んだり或いは内在性酵素（ＲＮａｓｅ  Ｐ）（このものは、標的ｍＲＮＡ（オリゴザイム）を分解する）を補充する外部ガイド配列(external guide sequence)（ＥＧＳ）を含む。
【００７５】
同様に、該ＬＮＡオリゴマー化合物はｓｉＲＮＡ'ｓとして設計することができ、このものは、未だに理解に乏しい「アンチセンス様」メカニズムによって特定の内因性または外因性の遺伝子をサイレンスするために細胞によって使用される小さい二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００７６】
ＬＡＮオリゴマー化合物はまた、分子内水素結合によって三次元構造を採る核酸であるアプタマー（および、その改良物、このものはスピゲルマー(Spiegelmers)と呼ばれる）として設計し得る。これにより、それらは高いアフィニティーおよび特異性で生物学的な標的と結合しそしてブロックすることが可能である。また、ＬＮＡオリゴマー化合物は、デコイ(Decoys)として設計し得る。このものは、ＤＮＡ結合部位を選択的にブロックすることによって、細胞転写因子をそれらの標的遺伝子をトランス活性化することから防止する小さい二本鎖核酸である。
【００７７】
その上、ＬＮＡオリゴマー化合物はキメラプラストとして設計し得て、このものは、標的遺伝子配列と特異的に対形成しそして改変することができる小さい一本鎖核酸である。従って、この原理を利用するＬＮＡ含有オリゴマー化合物は、ＴＲＸ遺伝子における変異によって生じるＴＲＸ関連疾患を処置するのに特に有用であり得る。
【００７８】
最後に、ＬＮＡオリゴマー化合物は、ＴＦＯ'ｓ（三重形成性オリゴヌクレオチド）として設計することができる。このものは、二本鎖ＤＮＡと結合しそしてＲＮＡ転写レベルでのインターベンションによって疾患原因タンパク質の産生を防止する核酸である。
【００７９】
オリゴヌクレオチドを操作することを意図する治療学的な原理によるものといくぶん示す場合には、本発明に記載する該ＬＮＡオリゴマー化合物は、約８〜約６０個の核酸塩基、すなわち約８〜約６０個の連結ヌクレオシドを含むことが好ましい。特に好ましい化合物は、約１２〜約３０個の核酸塩基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（約１２〜２０個の核酸塩基を含有するアンチセンス化合物が最も好ましい）である。
【００８０】
ＬＮＡオリゴマー化合物がその治療学的な作用を顕現化することができる上記の原理について言う場合に、本発明の標的は、ＴＲＸ遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質であり得る。最も好ましい実施態様において、該ＬＮＡオリゴマー化合物は、ＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡまたはＴＲＸｍＲＮＡに対するアンチセンスインヒビターとして設計する。
【００８１】
該オリゴヌクレオチドは、ＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに沿ったいずれかの部位（例えば、５'−非翻訳リーダー、エキソン、イントロン、および３'非翻訳末端内の部位）とハイブリダイズすることができる。
【００８２】
好ましい実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、翻訳−開始部位を含むヒトＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの部分とハイブリダイズする。該ＴＲＸオリゴヌクレオチドはＣＡＴ配列（このものは、ＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡまたはＲＮＡのＡＵＧ開始配列と相補的である）を含むことがより好ましい。別の実施態様において、該ＴＲＸオリゴヌクレオチドは、ヒトＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡのスプライスドナー部位の部分とハイブリダイズする。更なる別の実施態様において、ＴＲＸオリゴヌクレチドは、ヒトＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡのスプライス受容体部位の部分とハイブリダイズする。別の実施態様において、該ＴＲＸオリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化、輸送または分解に関与するヒトＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの部分とハイブリダイズする。
【００８３】
当該分野の当業者は、好ましいオリゴヌクレオチドは、配列が非関連遺伝子由来の転写物中には一般的には起こらないＴＲＸのプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの部分とハイブリダイズして、処置の特異性を保つものであると認めるであろう。
【００８４】
本発明のオリゴマー化合物は、該標的と十分に相補的であるように設計して、所望する臨床的な応答を得て、例えば該オリゴマー化合物はその標的と十分な強さおよび特異性を持って結合して、所望する効果を与えなければいけない。１実施態様において、ＴＲＸを改変する化合物は、ＴＲＸをコードしない他の特異的な核酸を改変するようにも設計される。
【００８５】
本発明のオリゴマー化合物は、分子内および分子間のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを避けるように設計することが好ましい。
【００８６】
多数の場合に、インビボでまたは臨床的にＴＲＸ活性を改変するのに有効なＬＮＡオリゴマー化合物の同定は、標的遺伝子に関する配列情報に基づく。しかしながら、当該分野の当業者は、該オリゴマー化合物もまた経験的な試験によって同定することができることを認めるであろう。例えば、好ましい実施態様のものと比較して、配列相同性が劣り、またはより大きくかもしくは小さく修飾されたヌクレオチド、またはより長いかもしくは短い長さを有するが、しかしそれにも関わらず臨床的な処置において応答を示すＴＲＸオリゴマー化合物もまた、本発明の範囲内である。
【００８７】
（アンチセンス薬物）
本発明の１実施態様において、該オリゴマー化合物は、適当なアンチセンス薬物である。強力で且つ安全なアンチセンス薬物は、多数のパラメータ（例えば、アフィニティー／特異性、生物学的な液体中の安定性、細胞取り込み、作用様式、薬物動態学的な性質、および毒性）の良好な調整を必要とする。
【００８８】
（アフィニティーおよび特異性）
オキシメチレン２'−Ｏ,４'−Ｃ連結基を有するＬＮＡ（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡの標的配列に対する前例のない結合性質を示す。同様に、ＬＮＡ誘導体（例えば、アミノ−、チオ−、およびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）は、相補的なＲＮＡおよびＤＮＡに対する前例のないアフィニティーを示し、そしてチオ−ＬＮＡの場合には、ＲＮＡに対するアフィニティーは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡの場合よりも良い。
【００８９】
これらの著しいハイブリダイズの性質に加えて、ＬＮＡモノマーはＤＮＡおよびＲＮＡモノマー、並びに他の核酸分子アナログ（例えば、２'−Ｏ−アルキル修飾ＲＮＡモノマー）と混合し、そして協同的に作用することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレチドは、完全にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーから構成され得て、あるいはそのものは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびＤＮＡ、ＲＮＡまたは相補的な核酸分子アナログ（このものは例えば、アミノ−、チオ−、およびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡなどのＬＮＡ誘導体を含む）とのいずれかの組み合わせで構成され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列に対するＬＮＡの前例のない結合アフィニティー、およびＤＮＡ、ＲＮＡと自由に混合するその能力、並びに広範囲の現在の核酸アナログは、有効で且つ安全なアンチセンス化合物の開発のために、広範囲の本発明の重要な結果を有する。
【００９０】
第１に、本発明の１実施態様において、薬物動態学的な活性に必要とされるアフィニティーを損なうことなく、アンチセンスオリゴの通常の長さのかなりの短縮（２０〜２５ｍｅｒから、例えば１２〜１５ｍｅｒへ）が可能となる。オリゴの内在的な特異性はその長さに逆に相関するので、そのような短縮は、アンチセンス化合物のそのＲＮＡ標的に対する特異性を有意に増大するであろう。本発明の１実施態様は、入手可能なヒトゲノムの配列および速く進行する遺伝子のアンテーションにより、標的ｍＲＮＡにおける最も短いあり得る特異的な配列を同定することである。
【００９１】
別の実施態様において、オリゴの大きさを低下させるためにＬＮＡを使用することは、製造の方法および目的物(prize)を有意に容易とし、従って多様な疾患に対する商業的な競合的処置となるアンチセンス療法に対する基礎を与える。
【００９２】
別の実施態様において、ＬＮＡの前例のないアフィニティーを用いて、アンチセンスオリゴの効力がその標的ｍＲＮＡとインビボでハイブリダイズすることができる能力を実質的に増大し、その結果、他の化学品を用いる状況と比較して活性化合物を同定するのに要する時間および労力を有意に軽減することができる。
【００９３】
別の実施態様において、ＬＮＡの前例のないアフィニティーを用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を増大し、その結果、臨床的な治験における現行のものよりも優れた治療学的なウィンドウを有する化合物の開発が可能となる。
【００９４】
アンチセンスインヒビターとして設計される場合には、本発明のオリゴヌクレオチドは該標的核酸と結合し、そしてその同族タンパク質の発現を改変する。該改変は、正常な発現レベルと比較して少なくとも１０％または２０％の発現の抑制を生じることが好ましく、正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の抑制がより好ましい。
【００９５】
典型的に、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ以外の他の残基（例えば、天然のＤＮＡモノマー、ＲＮＡモノマー、Ｎ３'−Ｐ５'ホスラミデート、２'−Ｆ,２'−Ｏ−Ｍｅ−、２'−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２'−Ｏ−(３−アミノプロピル)（ＡＰ）、ヘキシトール(hexitol)核酸（ＨＮＡ）、２'−Ｆ−アラビノ核酸（２'−Ｆ−ＡＮＡ）およびＤ−シクロヘキセニルヌクレオシド（ＣｅＮＡ）を含む。また、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ−修飾オリゴヌクレオチドはまた、オキシ−ＬＮＡ基に加えてまたはそれに代えて、他のＬＮＡ単位を含み得る。特に、好ましい別のＬＮＡ単位は、Ｄ−βもしくはＬ−αまたはそれらの組み合わせのいずれかの立体配置でのチオ−ＬＮＡもしくはアミノ−ＬＮＡモノマー、またはエナ−ＬＮＡを含む。通常、ＬＮＡ修飾オリグヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドに基づいて、少なくとも約５、１０、１５または２０％のＬＮＡ単位を、より典型的にはオリゴヌクレオチドの全塩基に基づいて少なくとも約２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０％のＬＮＡ単位を含む。
【００９６】
（生物学的な液体中での安定性）
本発明の１実施態様は、生物学的な液体中での得られたオリゴマー化合物の安定性を増大させるために（例えば、ヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）に対する耐性の増大による）、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド中にＬＮＡモノマーを導入することを含む。安定性の大きさは、使用するＬＮＡモノマーの数、オリゴヌクレオチド中のそれらの位置、および使用するＬＮＡモノマーのタイプに依存する。ＤＮＡおよびホスホロチオエートと比較して、核酸(nucleolytic)分解に対してオリゴヌクレオチドを安定化する能力の以下の順序を確立することができる。ＤＮＡ＜＜ホスホロチオエート〜オキシ−ＬＮＡ＜α−Ｌ−ＬＮＡ＜アミノ−ＬＮＡ＜チオ−ＬＮＡ。
【００９７】
ＬＮＡが標準的なＤＮＡ合成と適合し得て、そしてこのものは多数の現行の核酸アナログと自由に混合するという事実を考えると、ＬＮＡ−オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼ安定性の増大を示す他のアナログを導入することによって、またはヌクレアーゼ−耐性のヌクレオシド間連結（例えば、ホスホロモノチオエート、ホスホロジチオエート、およびメチルホスホネート連結など）を利用することによって、本発明に従って、更に増大することができる。
【００９８】
（作用様式）
本発明に記載のアンチセンス化合物は、様々な機構によってそれらの治療学的な作用を発揮することができ、そしてこのものは、同一の化合物におけるこれらのいくつかと組み合わせることができる。１シナリオにおいて、該オリゴヌクレオチドのその標的（プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）との結合は、標的の適当な機能に必要な他の因子（タンパク質、他の核酸分子など）との結合を防止するように作用する（すなわち、立体障壁によって機能する）。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかの配列モチーフ（これは、認識、スプライシングに関与するトランス作用(transacting)因子との結合、ポリ−アデニル化、細胞輸送、ＲＮＡ中のヌクレオシドの転写後の改変、５'−末端のキャッピング、翻訳などにとって重要である）と結合し得る。プレ−ｍＲＮＡスプライシングの場合には、オリゴヌクレオチドおよびその標的との間の相互作用の結果は、所望しないタンパク質の発現の抑制もしくは所望するタンパク質をコードする別のスプライシングｍＲＮＡの発生のいずれかまたはその両方であり得る。
【００９９】
別の実施態様において、オリゴヌクレオチドとその標的との結合は、リボソームの仕組みに対する物理学的なブロックを作ることによって翻訳プロセスを無能とする（すなわち、翻訳停止）。
【０１００】
別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドとその標的との結合は、２次およびより高次の構造（これは、その適当な機能、すなわち構造的な妨害(interference)にとって重要である）に適合する該ＲＮＡの能力を妨害する。例えば、該オリゴヌクレオチドは、異なる機能（例えば、該ＲＮＡに対する更なる安定性を供すること、または異なるタンパク質にとっての必須の認識モチーフを適合させること）において重要な役割を果たすステム−ループ(stem-loop)構造の形成を妨害し得る。
【０１０１】
更に別の実施態様において、該オリゴヌクレオチドの結合は、ｍＲＮＡを分解する細胞酵素を補充することによって更なる細胞代謝プロセスに対する標的を失活する。例えば、該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解するリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を補充する能力を有するヌクレオシドのセグメントを含み得る。同様に、該オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡａｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＩＩＩ）を補充するセグメントを含め得て、あるいはそのものは、標的ｍＲＮＡを分解する内在性酵素（ＲＮａｓｅ  Ｐ）を補充する外部ガイド配列（ＥＧＳ）を含み得る。また、該オリゴヌクレオチドはＲＮＡｓｅ触媒活性を示す配列モチーフを含み得て、あるいは分子は、ハイブリダイズ事象によって標的と近接にある場合に更なる代謝活性から標的を無能とする該オリゴヌクレオチドと結合することができる。
【０１０２】
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡは、ＲＮａｓｅＨ活性を支持しないことが分かった。しかしながら、このことは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびＤＮＡを構成するキメラオリゴヌクレオチド（このものは、ギャップマー(gapmers)と呼ばれる）を作ることによって、本発明に従って変えることができる。ギャップマーは、４〜１２ｎｔのＤＮＡの中心ストレッチ(stretch)、認識可能で且つＲＮＡａｓｅＨ（ギャップ）によって切断可能な修飾モノマー（これは、典型的にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡの１〜６個の残基によってフランキング(flanked)される）（フランク）をベースとする。該フランクはまた、ＬＮＡ誘導体と一緒に構成することもできる。ＲＮＡａｓｅ媒介性の機構で作用することができる本発明の他のキメラ構成物が存在する。ヘッドマー(headmer)は、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡまたは５'−末端でのＬＮＡ誘導体の近接ストレッチ、続いてＤＮＡの近接ストレッチまたは認識可能で且つ３'末端に対してＲＮＡａｓｅＨによって切断可能な修飾モノマーによって画定される。そして、テイルマー(tailmer)は、ＤＮＡの近接ストレッチまたは認識可能で且つ５'末端でＲＮＡａｓｅＨによって切断可能な修飾モノマー、続いてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡまたは３'末端に対するＬＮＡ誘導体の近接ストレッチによって画定される。本発明の他のキメラ（これは、ＤＮＡの別の構成成分、または認識可能で且つＲＮＡａｓｅＨによって切断可能な修飾モノマー、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよび／またはＬＮＡ誘導体から構成されるミックスマー(mixmers)と呼ばれる）はまた、ＲＮＡａｓｅＨの結合および切断を媒介可し得る。α−Ｌ−ＬＮＡはＲＮＡａｓｅＨ活性をある程度までに補充するので、ＤＮＡのより小さいギャップ、または認識可能で且つギャップマー構成物についてＲＮＡａｓｅＨによって切断可能な修飾モノマーは必要であり得て、そして該ミックスマー構成物におけるより大きなフレキシビリティーを導入することができる。図１は、本発明の異なるデザインの概略を示す。
【０１０３】
（薬物動態学的性質）
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的な有用性は、それらの薬物動態学（例えば、吸収、分配、細胞取り込み、代謝および分泌）に有意な大きさで依存する。これらのパラメータは、該オリゴヌクレオチドの根底にある化学並びに大きさおよび三次元構造によって有意に誘導される。
【０１０４】
本発明の上記のＬＮＡは１つではなくいくつかの関連する化学であるために（分子的には異なるが）、全ては、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対するスタンニング(stunning)アフィニティーを示す。従って、化学のＬＮＡファミリーは、目的に合わせた薬物動態学的な性質（活性化合物の大きさを改変するためにＬＮＡのより大きなアフィニティーを利用したりまたは該活性化合物の正確な分子組成を改変するために異なるＬＮＡ化学を利用する）を有する本発明のオリゴの開発にユニークに適合する。後者の場合には、例えばオキシ−ＬＮＡよりもむしろアミノ−ＬＮＡの使用はオリゴの全荷電を変え、そして取り込みおよび分配の挙動に影響を及ぼすであろう。同様に、オキシ−ＬＮＡの代わりにチオ−ＬＮＡを使用することは、該オリゴヌクレオチドの親油性を増大し、従って親油性バリヤー（例えば、細胞膜）を通過するその能力に影響を及ぼす。
【０１０５】
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドの薬物動態学的な性質を改変することは、更に様々な異なる分子の連結によって達成し得る。例えば、オリゴヌクレオチドの細胞膜を通過する能力は、例えば脂質分子（例えば、コレステロール分子、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質またはオリゴヌクレオチドに対するポリアミン）と連結することによって増大し得る。同様に、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの細胞中への取り込みは、膜中の分子と相互作用するオリゴヌクレオチドと分子とを接合することによって増大し得て、これにより、細胞質中への運搬を媒介する。
【０１０６】
（薬力学的な性質）
本発明に従って、オリゴマー取り込みを改善し、生物学的安定性を増大し（例えば、分解に対するオリゴマー耐性の増大）、および／または標的配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ性質の特異性やアフィニティーを増大する基を用いて、該薬力学的な性質は増大することができる。
【０１０７】
（毒物学）
基本的には、アンチセンスオリゴに関係する２種類の毒性；配列依存性の毒性（これは、塩基配列に関係する）、および配列非依存性クラス関連の毒性が存在する。天然のＣｐＧ配列モチーフによる免疫刺激に関連する問題を除いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの開発において最も顕著である毒性は配列と独立のものであって、例えばオリゴヌクレオチドの化学、並びに投与の用量、様式、回数および期間に関連する。オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートクラスは特に十分に確認されており、そしてこのものは多数の副作用（例えば、補体の活性化、長期間のＰＴＴ（部分トロンボプラスチン時間）、血小板減少症、肝毒性（肝臓酵素の増大）、心毒性、細網内皮細胞の脾腫大および肥厚化）を発揮することが分かった。
【０１０８】
上記の通り、該化学のＬＮＡファミリーは、前例のないアフィニティー、非常に高い生物学的安定性、および該オリゴヌクレオチドの正確な分子組成を改変する能力を与える。本発明の１実施態様において、ＬＮＡを含有する化合物は、いずれかのホスホロチオエート連結基と結合する場合にはほとんどない高い力価を合わせて有し、従って相補的なアンチセンス化合物よりもより良い効力および安定性を示すであろうオリゴヌクレオチドの開発を可能とする。
【０１０９】
（製造）
本発明のオリゴおよびポリヌクレオチドは、有機化学の分野における当業者にとってよく知られる核酸化学の重合方法を用いて得ることができる。一般的に言えば、ホスホロアミダイト方法の標準的なオリゴマー化サイクル（S. L. BeaucageおよびR. P. Iyerによる, Tetrahedron, 1993, 49, 6123；S. L. BeaucageおよびR. P. Iyerによる, Tetrahedron, 1992, 48, 2223）を用いるが、例えばＨ−ホスホネート化学、ホスホトリエステル(phosphortriester)化学もまた使用することができる。
【０１１０】
本発明のいくつかのモノマーの場合には、より長いカップリング時間、および／または新しい試薬との繰り返しカップリング、および／またはより濃縮されたカップリング試薬の使用を用いた。使用するホスホラミダイトは、十分な＞９５％の逐次カップリング収率でカップリングする。該ホスフェートのチオール化は通常、例えばヨウ素／ピリジン／Ｈ2Ｏ、ブケージ(Beaucage)試薬（商業的に入手可能）を用いる酸化によるホスホジエステルオリゴマーの合成に使用する酸化を拡張することによって行ない、他の満足すべき試薬をも含む。該ホスホロチオエートＬＮＡオリゴマーは、逐次カップリング法を用いて効率よく合成して、＞９８％を得た。
【０１１１】
β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡオリゴヌクレオチド、α−Ｌ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−メチルアミノ−ＬＮＡオリゴヌクレオチドはまた、ホスホラミダイト方法を用いる逐次カップリング法を用いて効率よく合成して、９８％以上の収率を得た。
【０１１２】
ＬＮＡオリゴマー化合物の精製は、使い捨ての逆相精製カートリッジおよび／または逆相ＨＰＬＣおよび／またはエタノールもしくはブタノールからの沈降を用いて行なった。キャピラリーゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、およびＥＳＩ−ＭＳを用いて、該合成したオリゴヌクレオチドの純度を確認した。更に、場合により保護された核酸塩基および場合により５'−ＯＨ保護されたＬＮＡを固定化した固体の担体物質は、ＬＮＡモノマーが３'末端で含まれるＬＮＡ含有オリゴマー化合物の合成のための物質として特に興味深い。この場合に、該固体の担体物質は、ＣＰＧ、例えば容易に（商業的に）入手可能なＣＰＧ物質またはポリスチレンであることが好ましい。ここで、３'−官能化のポリスチレン、場合により保護された核酸塩基、および場合により５'−ＯＨ保護されたＬＮＡを、ある物質についての供給者によって述べられた条件を用いて、このものの上に連結する。
【０１１３】
（指標）
ＴＲＸは、多数の基本的な生物学的機構（例えば、赤血球の増殖、細胞増殖、鉄代謝、グルコースおよびエネルギーの代謝、ｐＨ改変、マトリックスの代謝を含む）に関与する。本発明の方法は、癌が原因の疾患に対する治療もしくは予防、特に組織（例えば、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、脳癌、精巣癌、胃癌、腸癌、腸菅癌、腸癌、脊髄癌、洞癌、尿路癌または卵巣癌）中で起こり得る癌の処置のために使用することが好ましい。
【０１１４】
本明細書中に記載する本発明は、癌を予防しまたは治療するための方法を包含し、該方法は、ＴＲＸを改変するオリゴマー化合物の治療学的に有効な量（例えば、高用量のオリゴマーを含むが、これに限定されない）を該処置が必要なヒトに投与することを含む。本発明は更に、ＴＲＸ改変オリゴマー化合物の短期間の投与の使用を包含する。正常な非癌性の細胞は、細胞タイプにとって特徴的な頻度で分裂する。細胞が癌性状態に形質転換する場合には、非制御性の細胞増殖および細胞死の低下が起こり、従って乱交雑の細胞分裂または細胞増殖は、癌性細胞タイプの特徴である。癌のタイプとしては例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫）、大腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓細胞癌、肝癌、胆菅癌、絨毛癌、頚癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭頚部癌、脳癌、未知の原発部位の癌、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭子宮腺癌(papillary adenocarcinomas)、嚢胞腺癌(cystadenocarcinoma)、髄様癌、気管支原性肺癌、精上皮腫、胎児性癌、ウイルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経鞘腫(acoustic neuroma)、乏突起細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）、Ｈ鎖病、転移、または非制御性のもしくは異常な細胞増殖を特徴とするいずれかの疾患もしくは障害を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
（医薬組成物）
本発明はまた医薬組成物に関するものであって、このものは、活性成分として少なくとも１つの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド構成物を含む。本発明の医薬組成物は場合により医薬的な担体を含み、そして該医薬組成物は場合により更にアンチセンス化合物、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および／または免疫改変化合物を含む、と理解されるべきである。
【０１１６】
（塩）
本発明に包含されるオリゴマー化合物は、様々な医薬的に許容し得る塩で使用することができる。本明細書中で使用する該用語は、本明細書中で同定する化合物の所望する生物学的な活性を保持し、そして最小の所望しない毒物学的な影響を示す塩を呼称する。該塩の非限定的な例は、有機アミノ酸と共に形成することができ、そして塩基付加塩は金属カチオン（例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなど）またはアンモニア、Ｎ,Ｎ−次ベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウムもしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンなどと形成される塩；または、（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組み合わせ；例えば、タンニン酸亜鉛塩(zinc tannate salt)などとを含む。
【０１１７】
（プロドラッグ）
本発明の１実施態様は、プロドラッグ形態のオリゴマー化合物であり得る。オリゴヌクレオチドは、負に荷電したイオンでもある。細胞膜の親油性の性質のために、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、天然または親油性の等価物と比較して低下する。この極性「障害」は、プロドラッグ方法（例えば、Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, 131巻, 103-140頁を参照）を用いることによって回避することができる。この方法において、該オリゴヌクレオチドは、投与する場合にオリゴが中性となるような保護様式で製造する。これらの保護基は、それらが除去され、次いでオリゴが細胞によって摂取され得るように設計する。該タンパク質基は例えば、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）を挙げられる。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であって、そしてこのものは細胞内で選択的に除去される。
【０１１８】
（接合体）
本発明の１実施態様において、該オリゴマー化合物はリガンド／接合体と連結する。そのものは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増大する方法である。この接合は、末端位置５'／３'−ＯＨで起こり得るが、しかし該リガンドはまた、糖類および／または塩基で起こり得る。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが接合し得る増殖因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含み得る。トランスフェリン−ポリリシン−オリゴヌクレオチド複合体または葉酸−ポリリシン−オリゴヌクレオシド複合体は、高レベルのトランスフェリンまたは葉酸受容体を発現する細胞による取り込みのために製造することができる。接合体／リガンドの他の例としては、コレステロール分子、二重インターカレーター（例えば、アクリジン、ポリ−Ｌ−リシン、１個以上のヌクレアーゼ耐性連結基（例えば、ホスホロモノチオエートなど）を有する「末端−キャッピング」を挙げられる。
【０１１９】
（製剤）
本発明はまた、本明細書中に開示する１個以上のオリゴヌクレオチド化合物の製剤化を含む。医薬的に許容し得る結合剤およびアジュバントは、製剤化される薬物の部を含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤などは、例えば以下の化合物を含み得る：結合剤としての微結晶性セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤としてのデンプンまたはラクトース；滑沢剤としてのステアリン酸；様々な甘味剤または芳香剤。カプセル剤の場合には、用量単位は、液体担体似脂肪油を含み得る。糖または腸内薬物の同様なコーティング剤は、該用量単位の部であり得る。該オリゴヌクレオチド製剤はまた、活性な医薬成分の乳剤および液体形成性のミセル乳剤であり得る。
【０１２０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、所望する作用を損なわないいずれかの物質、または所望する作用を補充するサプリメント、と混合し得る。これらは、他のヌクレオシド化合物を含有する他の薬物を含み得る。
【０１２１】
非経口、皮下、皮内または局所の投与の場合には、該製剤は、減菌性の希釈物、緩衝化剤、毒性および抗菌性の改変物質を含み得る。該活性化合物は、分解または身体からの速効性の排除を防止する担体（例えば、徐放性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む）を用いて製造することができる。静脈内投与の場合には、好ましい担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水である。
【０１２２】
オリゴマー化合物は、単位製剤（例えば、医薬的に許容し得る担体または希釈物）中に、処置する患者において重大な副作用を引き起こすことなく、治療学的に有効な量を患者に運搬するのに十分な量で含むことが好ましい。
【０１２３】
（投与）
本発明の医薬組成物は、局所または全身性の処置が望まれるかどうかの点におよび処置する領域に依存する多数の方法で投与することができる。投与は、（ａ）経口（ｂ）肺（例えば、粉剤もしくはエアロゾル（噴霧器によることを含む）の吸入もしくはガス注入による）；気管内、鼻腔内；（ｃ）上皮、経皮、眼を含む局所および粘膜（例えば、例えば、膣および直腸運搬を含む）；または、（ｄ）非経口（例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射もしくは注入；または、頭蓋内（例えば、クモ膜下腔内もしくは脳室内の投与）であり得る。１実施態様において、該活性オリゴは、静脈内、腹腔内、経口、局所もしくはボーラス注射によって投与されるか、または標的臓器に直接に投与される。
【０１２４】
局所投与のための医薬的な組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点剤、スプレー剤、坐剤、液剤および散剤を含み得る。通常の医薬的な担体、水剤、散剤または油状の基剤、増粘剤などは必要でありまたは望まれ得る。コーティングコンドームおよびグローブなどはまた、有用であり得る。好ましい局所製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドを局所用運搬剤（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤）と一緒に混合する。経口投与のための組成物および製剤としては例えば、散剤または顆粒剤、マイクロ粒子(microparticulates)、ナノ粒子、水性もしくは非水性の媒質中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤(minitablets）を含むが、これらに制限されない。非経口、クモ膜下腔内または脳室内の投与のための組成物および製剤は減菌水性液剤を含み、このものはまた、緩衝化剤、希釈物および他の適当な添加物（例えば、浸透エンハンサー、担体化合物、および他の医薬的に許容し得る担体または賦形剤を含むが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１２５】
（運搬）
本発明の医薬組成物として例えば、液剤、乳剤、およびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、様々な構成成分（例えば、予め生成した(preformed)液体、半乳化固体、および半乳化半固体を含むが、これらに限定されない）から得ることができる。腫瘍組織への薬物の運搬は、担体−媒介性運搬（例えば、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含むが、これらに限定されない）によって増大し得る（Dass CR.による, J Pharm Pharmacol 2002; 54(1): 3-27)。
【０１２６】
本発明の医薬製剤は通常、１回剤形で供され得て、製薬業界においてよく知られる通常の技術に従って製造することができる。該技術は、活性成分を医薬的な担体または賦形剤と一緒に組み合わせる工程を含む。通常、該製剤は、該活性成分を液体担体もしくは細かく分けられた固体担体またはその両方と均一におよび密に組み合わせ、次いで必要ならば該生成物を成型することによって製造する。
【０１２７】
本発明の組成物は、いずれかの多数の可能な剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤および坐剤を含むが、これらに限定されない）に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性もしくは非水性または混合の媒質中での懸濁剤としても製剤化し得る。水性懸濁剤は更に、懸濁剤の粘性を増大する特定の物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む）を含み得る。該懸濁剤はまた、安定化剤を含み得る。
【０１２８】
（組み合わせ薬物）
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬物物質（例えば、アスピリン、イブプロフェン、スルファ(sulfa)薬物、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質）と接合することもできる。
【０１２９】
ＬＮＡ含有オリゴマー化合物は、上で示す通り多数の治療学的な利用法にとって有用である。通常、本発明の治療学的な方法は、治療学的に有効な量のＬＮＡ−修飾オリゴヌクレオチドを哺乳動物（特に、ヒト）に投与することを含む。
【０１３０】
ある実施態様において、本発明は、（ａ）１個以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）１個以上の他の化学療法薬（このものは、非−アンチセンス機構によって機能する）を含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物と一緒に使用する場合、該化学療法薬は、別個に（例えば、ミトラマイシンおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、ミトラマイシンおよびオリゴヌクレオチドを一定期間、続いて別の薬物およびオリゴヌクレオチド）、または１個以上の他のそれら化学療法薬と組み合わせてもしくは放射線療法と組み合わせて、使用することができる。当該分野の当業者にとって知られる全ての化学療法薬を、本発明の化合物との組み合わせ処置として包含する。
【０１３１】
抗炎症薬（例えば、非ステロイド性抗炎症薬を含むが、これらに限定されない）、コルチコステロイド、抗ウイルス薬、および免疫改変薬はまた、本発明の組成物と組み合わせることができる。２個以上の組み合わせ化合物を、一緒にまたは連続して使用することができる。
【０１３２】
別の実施態様において、本発明の組成物は、１個以上のアンチセンス化合物、特に第１の核酸を標的とするオリゴヌクレオチド、および第２の核酸分子標的を標的とする１個以上の別のアンチセンス化合物を含み得る。２個以上の組み合わせ化合物は、一緒にまたは連続して使用することができる。
【０１３３】
（用量）
該用量は、処置する疾患状態の激しさおよび応答性、並びに処置期間（数日間から数ヶ月間、あるいは治癒が有効となりまたは該疾患状態の減少が達成されるまで続く）に依存する。最適な投与スケジュールは、患者の身体中での薬物蓄積の測定から算出することができる。
【０１３４】
最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に依存して変わり得る。通常、そのものはＥＣ５０（これは、インビトロおよびインビボでの動物モデルにおいて有効であることが分かる）に基づいて見積もることができる。通常、用量は体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１ｇであり、そしてこのものは毎日、毎週、毎月もしくは毎年１回以上、２〜１０年毎に１回、または連続注入によって数時間から数ヶ月まで、与えることができる。投与の反復の割合は、測定する滞留時間および身体の液もしくは組織中での薬物濃度に基づいて見積もることができる。十分な処置後に、患者は疾患状態の再発を予防するために維持療法を受けることが所望され得る。
【０１３５】
（使用）
本発明のＬＮＡ含有オリゴマー化合物は、診断、治療および予防のための研究試薬として使用することができる。研究において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細胞および実験動物中でのＴＲＸ遺伝子の合成を特異的に抑制し、その結果、標的の機能分析もしくは治療学的なインターベンションのための標的としてのその有効性の評価を容易とすることができる。診断学において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細胞および組織中でのＴＲＸ発現をノーザンブロット、インシチューハイブリダイゼーションまたは同様な方法によって検出しそして定量化することができる。治療のために、疾患もしくは障害を有すると予想される動物またはヒト（このものは、ＴＲＸの発現を改変することによって処置することができる）は、本発明に従ってアンチセンス化合物を投与することによって処置する。更に、ＴＲＸの発現に関係する疾患または病気を有しているかまたは患い易いと予想されるマウス、ラットおよびヒトを、１個以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物の治療学的にまたは予防学的に有効な量を投与することによって、処置する方法を提供する。
【０１３６】
（実施例）
（実施例１：モノマー合成）
該ＬＮＡモノマービルディングブロックおよびその誘導体は、以下に公知の方法およびそれらの中に引用されている刊行物に従って製造した。以下を参照。
WO 03/095467 A1；
D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Kochによる, (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808；
M. D. Sorensen, L. Kvaerno, T. Bryld, A. E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengelによる, (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-l-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176；
S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengelによる, (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079；
C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Kochによる, (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663。
【０１３７】
２'−チオＬＮＡリボチミジンホスホラミダイトの合成。試薬および条件：ｉ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ2、アセトン、ＭｅＯＨ；ｉｉ）ＢｚＣｌ、ピリジン、ＤＭＦ；ｉｉｉ）０．２５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4（水溶液）、ＤＭＦ、８０℃（４から７９％；３工程）；ｉｖ）Ｔｆ2Ｏ、ＤＭＡＰ、ＣＨ2Ｃｌ2、０℃；ｖ）Ｎａ2Ｓ、ＤＭＦ（７から７２％、２工程）；ｖｉ）ＮａＯＢｚ、ＤＭＦ、１００℃（８１％）；ｖｉｉ）ＮＨ3、ＭｅＯＨ（７６％）；ｖｉｉｉ）ＤＭＴ−Ｃｌ、ピリジン（８８％）；ｉｘ）Ｐ(ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ)（Ｎ(ｉＰｒ）2)2、４,５−ジシアノイミダゾール、ＣＨ2Ｃｌ2（９９％）。ＤＭＴ＝４,４'−ジメトキシトリチル、ＰＮ2＝２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノイル(phosphinoyl)。
【０１３８】
１−(３−Ｏ−ベンゾイル−５−Ｏ−メタンスルホニル−４−Ｃ−メタンスルホニルオキシメチル−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル)チミン（７、図４）
無水ヌクレオシド４（C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Kochによる, (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663）（３０．０ｇ、５８．１ｍｍｏｌ）を、メタノール（１０００ｃｍ3）およびアセトン（１０００ｃｍ3）の混合物中で７０℃まで加熱して、透明な溶液を得て、そして該溶液を室温まで達成させた。該反応フラスコをアルゴンを用いてフラッシュし、そしてＰｄ／Ｃ（１０重量％、Ｐｄ／Ｃ、６．２ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物を水素ガスの雰囲気下で（バルーン）激しく撹拌した。２３時間後に、該スラリーをセライトのパッドを通してろ過した。該触媒をセライトから回収し、そしてＤＭＦ（１０００ｃｍ3）中で１時間還流した。該熱ＤＭＦスラリーをセライトのパッドを通してろ過し、そして該有機相を合わせて、真空下で蒸発させて、黄色粉末のヌクレオシド５を得た。残留溶媒を高真空ポンプを用いて終夜除去した。
【０１３９】
粗ヌクレオシド５（２３ｇ）をＤＭＦ（３００ｃｍ3）中で７０℃まで加熱して、透明黄色溶液を得て、このものを室温まで冷却した。塩化ベンゾイル（８１．７ｇ、５８１ｍｍｏｌ、６７．４ｃｍ3）を加え、続いてピリジン（７０ｃｍ3）を加えた。１８時間後に、該反応液をメタノール（２００ｃｍ3）を用いてクエンチし、そして過剰量のメタノールを真空下で除去した。ヌクレオシド６の暗褐色溶液に、Ｈ2ＳＯ4水溶液（０．２５Ｍ、４００ｃｍ3）を加えた。該溶液を油浴上で８０℃まで加熱した（約５０℃で沈降が起こる。該溶液は８０℃で再び透明になる）。８０℃で２２時間後に、該溶液を室温まで冷却した。該反応混合物を酢酸エチル（１０００ｃｍ3）を有する分液ろうとに移した。該有機相を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（２×１０００ｃｍ3）を用いて洗浄した。該水相を合わせて酢酸エチル（１０００＋５００ｃｍ3）を用いて抽出した。該有機相を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１０００ｃｍ3）を用いて洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4を使用）、ろ過し、そして真空下で蒸発させて黄色液体を得た。残留溶媒を高真空ポンプを用いて終夜除去して、黄色シロップを得た。該生成物を乾燥カラム真空(Dry Column Vacuun)クロマトグラフィー（id  １０ｃｍ；１００ｃｍ3画分；５０〜１００容量％のＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン−１０％ずつ増加；２〜２４容量％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ−２％ずつ増加）によって精製した。該生成物を含有する画分を合わせて、そして真空下で蒸発させて、白色発泡体のヌクレオシド７（２５．１ｇ、７９％）を得た。
Rf = 0.54 (5容量% MeOH／EtOAc)；
ESI-MS m/z 実測値 549.0（[MH]+、計算値 549.1）；
1H NMR (DMSO-d6) δ 11.39 (br s, 1H, NH), 8.10-8.08 (m, 2H, Ph), 7.74-7.70 (m, 1H, Ph), 7.60-7.56 (m, 2H, Ph), 7.51 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H6), 6.35 (d, J = 4.9 Hz, 1H, H1'), 6.32 (d, J = 5.3 Hz, 1H, 2'-OH), 5.61 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H3'), 4.69 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.59 (m, 1H, H2'), 4.55 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 10.6 Hz, 1H) (H5'およびH1''), 3.28 (s, 3H, Ms), 3.23 (s, 3H, Ms), 1.81 (s, 3H, CH3)；
13C NMR (DMSO-d6) δ 164.5, 163.6 (C4, PhC(O)), 150.3 (C2), 137.7 (C6), 133.8, 129.6, 128.7, 128.6 (Ph), 108.1 (C5), 84.8 (C1'), 81.1 (C4'), 78.0 (C3'), 73.2 (C2'), 68.0, 67.1 (C5', C1''), 36.7, 36.6 (2×Ms), 11.9 (CH3)；
元素分析（C20H24N2O12S2・0.33 H2Oとして計算）(％)；計算値：C, 44.34; H, 4.65; N, 4.85。実測値：C, 44.32; H, 4.58; N, 4.77。
【０１４０】
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｒ)−７−ベンジルオキシ−１−メタンスルホニルオキシメチル−３−(チミン−１−イル)−２−オキサ−５−チアビシクロ[２：２：１]ヘプタン（９）
１−(３−Ｏ−ベンゾイル−５−Ｏ−メタンスルホニル−４−Ｃ−メタンスルホニルオキシメチル−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル)チミン（７）（１０．００ｇ、１８．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｃｍ3）中に溶解し、そしてこのものを０℃まで冷却した。ピリジン（１５ｃｍ3）およびＤＭＡＰ（８．９１ｇ、７２．９ｍｍｏｌ）を加え、続いて無水トリフルオロメタンスルホン酸（１０．３０ｇ、３６．５ｍｍｏｌ、６．０ｃｍ3）を滴下した。１時間後に、該反応液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（５００ｃｍ3）を用いてクエンチし、そしてこのものを分液ろうとに移した。該有機相を１．０Ｍ塩酸（５００ｃｍ3）、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（５００ｃｍ3）およびブライン（５００ｃｍ3）を用いて洗浄した。該有機相を真空下でトルエン（１００ｃｍ3）と一緒に蒸発させて、黄色粉末の１−(３−Ｏ−ベンゾイル−５−Ｏ−メタンスルホニル−４−Ｃ−メタンスルホニルオキシメチル−２−Ｏ−トリフルオロメタンスルホニル−β−トレオ−ペントフラノシル)チミン（８）を得た。
【０１４１】
該粗ヌクレオシド８をＤＭＦ（２５０ｃｍ3）中に溶解し、そしてＮａ2Ｓ（１．５７ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）を加えて暗緑色スラリーを得た。３時間後に、該反応液を半飽和のＮａＨＣＯ3水溶液（５００ｃｍ3）を用いてクエンチし、そしてジクロロメタン（５００＋２×２５０ｃｍ3）を用いて抽出した。該有機相を合わせてブライン（５００ｃｍ3）を用いて洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4を使用）、ろ過し、そして真空下で濃縮して、黄色液体を得た。残留溶媒を高真空ポンプを用いて終夜除去して黄色ガムを得て、このものを乾燥カラム真空クロマトグラフィー（ｉｄ  ６ｃｍ；５０ｃｍ3の画分；５０〜１００容量％のＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン−１０％ずつ増加；２〜２０容量％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ−２％ずつ増加）によって精製して、黄色発泡体のヌクレオシド９（６．１５ｇ、７２％）を得た。
Rf = 0.27（２０容量％のｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃ）；
ESI-MS m/z実測値：469.0（[MH]+、計算値：469.1）；
1H NMR (CDCl3) δ 8.70 (br s, 1H, NH), 8.01-7.99 (m, 2H, Ph), 7.67 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H6), 7.65-7.61 (m, 1H, Ph), 7.50-7.46 (m, 2H, Ph), 5.98 (s, 1H, H1'), 5.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H3'), 4.66 (d, J = 11.7 Hz, 1H, H5'a), 4.53 (d, J = 11.5 Hz, 1H, H5'b), 4.12 (m (残留EtOAcと重なり）, 1H, H2'), 3.15-3.13 (m, 4H, H1''aおよびMs), 3.06 (d, J = 10.6 Hz, 1H, H1''b), 1.98 (d, J = 1.1 Hz, 3H, CH3)；
13C NMR (CDCl3) δ 165.2, 163.5 (C4, PhC(O)), 149.9 (C2), 134.1, 133.9, 129.8, 128.7, 128.3 (C6, Ph), 110.7 (C5), 91.1 (C1'), 86.8 (C4'), 72.6 (C3'), 65.8 (C5'), 50.5 (C2'), 37.9 (Ms), 35.1 (C1''), 12.5 (CH3)；
元素分析（C19H20N2O8S20.3・3 EtOAcとして計算）(％)；計算値：C, 49.21; H, 4.72; N, 5.47。実測値：C, 49.25; H, 4.64; N, 5.48。
【０１４２】
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｒ)−７−ベンゾイルオキシ−１−ベンゾイルオキシメチル−３−(チミン−１−イル)−２−オキサ−５−チアビシクロ[２：２：１]ヘプタン（１０）
ヌクレオシド９（１．９２ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１１０ｃｍ3）中に溶解した。安息香酸ナトリウム（１．２ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を加え、そして該混合物を１００℃まで２４時間加熱した。該反応混合物を半飽和のブライン（２００ｃｍ3）を有する分液ろうとに移し、そしてこのものを酢酸エチル（３×１００ｃｍ3）を用いて抽出した。該有機相を合わせて乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4を使用）、ろ過し、そして真空下で蒸発させて褐色液体を得た。該生成物を高真空ポンプ下に置いて、残留溶媒を除去した。得られた褐色ガムを乾燥カラム真空クロマトグラフィー（ｉｄ  ４ｃｍ；５０ｃｍ3の画分；０〜１００容量％のＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン−１０％ずつ増加；２〜１０容量％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ−２％ずつ増加）によって精製して、わずかに黄色発泡体のヌクレオシド１０（１．６４ｇ、８１％）を得た。
Rf = 0.57（２０容量％のｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃ）；
ESI-MS m/z  実測値  495.1（[MH]+、計算値  495.1）；
1H NMR (CDCl3) δ 9.02 (br s, 1H, NH), 8.07-7.99 (m, 4H, Ph), 7.62-7.58 (m, 2H, Ph), 7.47-7.42 (m, 5H, PhおよびH6), 5.95 (s, 1H, H1'), 5.46 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H3'), 4.93 (d, J = 12.8 Hz, 1H, H5'a), 4.60 (d, J = 12.8 Hz, 1H, H5'b), 4.17 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H2'), 3.27 (d, J = 10.6 Hz, 1H, H1''a), 3.16 (d, J = 10.6 Hz, 1H, H1''b), 1.55 (d, J = 1.1 Hz, 3H, CH3)；
13C NMR (CDCl3) δ 165.8, 165.1, 163.7 (C4, 2×PhC(O)), 150.0 (C2), 133.9, 133.7, 133.6, 129.8, 129.6, 129.0, 128.8, 128.6, 128.5 (C6, 2×Ph), 110.3 (C5), 91.3 (C1'), 87.5 (C4'), 72.9 (C3'), 61.3 (C5'), 50.6 (C2'), 35.6 (C1''), 12.3 (CH3)；
元素分析（C25H22N2O7Sとして計算）(％)；計算値：C, 60.72; H, 4.48; N, 5.66。実測値：C, 60.34; H, 4.49; N, 5.35。
【０１４３】
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｒ)−７−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−(チミン−１−イル)−２−オキサ−５−チアビシクロ[２：２：１]ヘプタン（１１）
ヌクレオシド１０（１．５０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をアンモニアで飽和としたメタノール（５０ｃｍ3）中に溶解した。該反応フラスコを封し、そしてこのものを周囲温度で２０時間撹拌した。該反応混合物を真空下で濃縮して黄色ガムを得て、このものを乾燥カラム真空クロマトグラフィー（ｉｄ  ４ｃｍ、５０ｃｍ3画分；０〜１６容量％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ−１％ずつ増加）によって精製して、透明針状晶ヌクレオシド１１（０．６５ｇ、７６％）を得た。
Rf = 0.31（１０容量％MeOH／EtOAc）；
ESI-MS m/z  実測値  287.1（[MH]+、計算値  287.1）；
1H NMR (DMSO-d6) δ 11.32 (br s, 1H, NH), 7.96 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H6), 5.95 (s, 1H, H6), 5.70 (d, J = 4.2 Hz, 1H, 3'-OH), 5.62 (s, 1H, H1'), 4.49 (t, J = 5.3 Hz, 1H, 5'-OH), 4.20 (dd, J = 4.1および2.1 Hz, 1H, H3'), 3.77-3.67 (m, 2H, H5'), 3.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H2'), 2.83 (d, J = 10.1 Hz, 1H, H1''a), 2.64 (d, J = 10.1 Hz, 1H, H1''b), 1.75 (d, J = 1.1 Hz, 3H, CH3)；
13C NMR (DMSO-d6) δ 163.8 (C4), 150.0 (C2), 135.3 (C6), 107.5 (C5), 90.2, 89.6 (C1'およびC4'), 69.4 (C3'), 58.0 (C5'), 52.1 (C2'), 34.6 (C1''), 12.4 (CH3)；
元素分析（C11H14N2O5Sとして計算）(％)；計算値：C, 46.15; H, 4.93; N, 9.78。実測値：C, 46.35; H, 4.91; N, 9.54。
【０１４４】
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｒ)−１−(４,４’−ジメトキシトリチルオキシメチル)−７−ヒドロキシ−５−メチル−３−(チミン−１−イル)−２−オキサ−５−チアビシクロ[２：２：１]ヘプタン（１２）
ヌクレオシド１１（０．６０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｃｍ3）中に溶解した。４,４'−ジメトキシトリチルクロリド（０．８８ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、そして該反応液を周囲温度で３時間撹拌した。該反応混合物を水（１００ｃｍ3）を有する分液ろうとに移し、そしてこのものを酢酸エチル（１００＋２×５０ｃｍ3）を用いて抽出した。該有機相を合わせて飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１００ｃｍ3）、ブライン（１００ｃｍ3）を用いて洗浄し、そして真空下で乾固するまで蒸発させて粘性黄色液体を得た。該生成物をトルエン（５０ｃｍ3）中に再溶解し、そしてこのものを真空下で濃縮して黄色発泡体を得た。該発泡体を高真空ポンプを用いて終夜乾燥して、そして乾燥カラム真空クロマトグラフィー（ｉｄ  ４ｃｍ；５０ｃｍ3画分；１０〜１００容量％のＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン−１０％ずつ増加）によって精製して、白色発泡体のヌクレオシド１２（１．０８ｇ、８８％）を得た。
Rf = 0.24（２０容量％のｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃ）；
ESI-MS m/z  実測値  587.1（[M-H]+、計算値  587.2）；
1H NMR (CDCl3) δ 8.96 (br s, 1H, NH), 7.74 (d, J = 1.1 Hz, 1H, H6), 7.46-7.44 (m, 2H, Ph), 7.35-7.22 (m, 9H, Ph), 7.19-7.15 (m, 2H, Ph), 6.86-6.80 (m, 2H, Ph), 5.82 (s, 1H, H1'), 4.55 (dd, J = 9.3および2.1 Hz, 1H, H3'), 3.79 (s, 6H, OCH3), 3.71 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H2'), 3.50 (s, 2H, H5'), 2.81 (d, J = 10.8 Hz, 1H, H1''a), 2.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H, H1''b), 2.69 (d, J = 9.2 Hz, 1H, 3'-OH), 1.42 (s, 3H, CH3)；
13C NMR (CDCl3) δ 158.7 (C4), 150.1 (C2), 144.1, 135.2, 135.1, 130.1, 129.1, 128.1, 128.0, 127.1, 127.0, 113.3 (C6, 3×Ph), 110.0 (C5), 90.2 (C(Ph)3), 89.6 (C1'), 87.0 (C4'), 71.7 (C3'), 60.9 (C5'), 55.2 (C2'), 34.7 (C1''), 12.2 (CH3)；
元素分析（C32H32N2O7S・0.5H2Oとして計算）(％)；計算値：C, 64.31; H, 5.57; N, 4.69。実測値：C, 64.22; H, 5.67; N, 4.47。
【０１４５】
(１Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,７Ｒ)−７−(２−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)−１−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシメチル)−３−(チミン−１−イル)−２−オキサ−５−チアビシクロ[２.２.１]へプタン（１３）
公知の方法（D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Kochによる, (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis, 6, 802-808）に従って、ヌクレオシド１２（０．７８ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｃｍ3）中に溶解し、そしてアセトニトリル中の４,５−ジシアノイミダゾールの１．０Ｍ溶液（０．９３ｃｍ3、０．９３ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．４４ｃｍ3、１．３３ｍｍｏｌ）を滴下した。２時間後に、該反応液をジクロロメタン（４０ｃｍ3）を有する分液ろうとに移し、そしてこのものをＮａＨＣＯ3水溶液（２×２５ｃｍ3）およびブライン（２５ｃｍ3）を用いて洗浄した。該有機相を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4を使用）し、ろ過し、そして真空下で蒸発させて白色発泡体のヌクレオシド１３（１．０４ｇ、９９％）を得た。Ｒf＝０．２９および０．３７−２個のジアステレオマー（２０容量％のｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃを使用）；ESI-MS m/z  実測値  789.3（[MH]+、計算値  789.3）；31P NMR (DMSO-d6) δ 150.39, 150.26。
【０１４６】
（実施例２）：オリゴヌクレチド合成
オリゴヌクレオチドを、Expedite 8900/MOSSシンセサイザー（多重オリゴヌクレオチド合成システム）を用いるホスホラミダイト方法を用いて１または１５μｍｏｌで合成した。合成の最後には（ＤＭＴ−オン）、該オリゴヌクレオチドをアンモニア水溶液を用いて室温で１時間、固体担体から切断し、そして更にこのものを６５℃で３時間脱保護した。該オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。ＤＭＴ−基を除去後に、該オリゴヌクレオチドをＩＥ−ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣによって確認した。該オリゴヌクレオチドの同一性は、ＥＳＩ−ＭＳによって確認する。より詳細については、以下を参照。
【０１４７】
（ＬＮＡスクシンニルへミエステルの製造）
５'−Ｏ−Ｄｍｔ−３'−ヒドロキシ−ＬＮＡモノマー（５００ｍｇ）、無水コハク酸（１．２当量）およびＤＭＡＰ（１．２当量）をＤＣＭ（３５ｍＬ）中に溶解した。該反応液を室温で終夜撹拌した。ＮａＨ2ＰＯ4  ０．１Ｍ  ｐＨ５．５（２×）およびブライン（１×）を用いて抽出後に、該有機相を更に無水Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥し、ろ過し、そして蒸発させた。該へミエステル誘導体を９５％収率で得て、このものをいずれかの更なる精製することなく使用した。
【０１４８】
（ＬＮＡ−担体の製造）
上で製造したヘミエステル誘導体（９０μｍｏｌ）を最少量のＤＭＦ、ＤＩＥＡ中に溶解し、そしてｐｙＢＯＰ（９０μｍｏｌ）を加え、そして１分間一緒に混合した。この予め活性化した混合物をＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５００Å、８０〜１２０メッシュサイズ、３００ｍｇ）と一緒に手動式シンセサイザー中で混合し、そして撹拌した。室温で１．５時間後に、該担体をろ過して除き、そしてＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨを用いて洗浄した。乾燥後に、該ロードが５７μmol／ｇであることを測定した（Tom Brown, Dorcas J. S. Brownによる,「Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis」, in: F.Eckstein編, Oligonucletide and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14を参照）。
【０１４９】
（オリゴヌクレオチドの伸張）
ホスホラミダイト（Ａ(ｂｚ)、Ｇ(ｉｂｕ)、５−メチル−Ｃ(ｂｚ)またはＴ−β−シアノエチル−ホスホラミダイト）のカップリング反応は、アセトニトリル中の５'−Ｏ−ＤＭＴ−保護アミダイトの０．１Ｍ溶液、および活性化剤としてのアセトニトリル中のＤＣＩ（４,５−ジシアノイミダゾール）溶液（０．２５Ｍ）を用いて行なった。該チオール化（thiolation)は、塩化キサンタン（０．０１Ｍアセトニトリル：ピリジン１０％）を用いることによって実施する。該試薬の残りは、典型的にオリゴヌクレオチド合成のために使用するものである。
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
カラム：ＸＴｅｒｒａ、ＲＰ１８、５μｍ、７．８×５０ｍｍカラム。
溶出液：溶出液Ａ：０．１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ：１０。
溶出液Ｂ：アセトニトリル。
流速：５ｍＬ／分。
【表１】
2006518999.tif 000006
【０１５０】
(ＩＥ−ＨＰＬＣによる分析)
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ、ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００、２×２５０ｍｍカラム。
溶出液：溶出液Ａ：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；１ｍＭ  ＥＤＴＡ：１０ｍＭ  ＮａＣｌＯ4。
溶出液Ｂ：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１Ｍ  ＮａＣｌＯ4。
流速：０．２５ｍＬ／分。
【表２】
2006518999.tif 000007
【０１５１】
略語
ＤＭＴ：ジメトキシトリチル；
ＤＣＩ：４,５−ジシアノイミダゾール；
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；
ＤＣＭ：ジクロロメタン；
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；
ＤＩＥＡ：Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート；
Ｂｚ：ベンゾイル；
Ｉｂｕ：イソブチリル。
【０１５２】
（実施例３：オリゴマー化合物の設計の試験）
我々の関心は、ＴＲＸを標的とするオリゴヌクレオチドについての最善のデザインを選択する重要性を証明するために、異なるデザインを有するオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を評価することであった。この目的のために、我々は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる下方改変後に、ホタル（北アメリカホタル(Photinus pyralis)）ルシフェラーゼの活性を測定することによって、多数の異なるオリゴヌクレオチドデザインをスクリーニングすることができるインビトロアッセイを設定した。図１は、本明細書中に記載するデザインのイラストを含む。
【０１５３】
第１のスクリーンにおいて、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡを含有するデザイン（これは、ｍＲＮＡ内の同じモチーフを全て標的とする）を評価した。異なるギャップサイズを有するギャップマー(gapmer)、異なるロード量のホスホロジオエートヌクレオシド間連結、および異なるロード量のＬＮＡから構成されるデザインを試験した。異なるロード量のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、異なるロード量のホスホロチオエートヌクレオシド間連結、および異なるロード量のＤＮＡを有するヘッドマー(headmer)およびテイルマー(tailmer)を製造した。様々な組成物のミックスマー(mixmer)（これは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡおよびＤＮＡの別の数の単位を有することを意味する）をまた、インビトロアッセイにおいて分析した。その上、異なるデザインのＬＮＡ誘導体をも含み、そしてそれらのアンチセンス活性を評価した。良好なデザインの重要性は、ルシフェラーゼアッセイにおいて得ることができるデータによって影響を受ける。該ルシフェラーゼ発現レベルは％単位で測定し、そしてこのものはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびＬＮＡ誘導体を含有する異なるデザインのアンチセンス活性の指標を与える。我々は、いくつかのデザインが強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、一方で他の物が中位から低い下方改変レベルを示すことを容易に知ることができる。従って、良好なアンチセンス活性および最適なデザインのオリゴヌクレオチドの間の密な相関は、非常に明白である。我々は、様々なデザインを用いて下方改変の良好なレベルを認めた。７〜１０ｎｔのＤＮＡおよび骨格全般にわたるチオール化を有しまたは該フランクにおけるギャップおよびＰＯにおける排他的なチオール化を有するギャップマーは、良好な結果を示した。これらのデザインは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡまたはＬＮＡ誘導体を含む。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結が全骨格全般にわたるかまたはＤＮＡ−セグメント中にのみ存在する場合には、６ｎｔおよび８ｎｔのβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡのヘッドマーはまた、良好なレベルの下方改変をも示した。異なるミックスマーは、ルシフェラーゼアッセイにおいて良好なアンチセンス活性を示した。各々α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡまたはＤＮＡ組成物の別の数の単位は、ミックスマーを定義する（図１を参照）。ミックスマー３−９−３−１（これは、３'末端にデオキシヌクレシド残基を有する）は、有意なレベルの下方改変を示した。ミックスマー４−１−１−５−１−１−３の場合に、我々は、ギャップを中断する２個のα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ残基（フランクβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである）を置いた。その上、我々は、２個のα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ残基でギャップを中断し、そして両方のフランクをα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡで置換した。両方のデザインは、有意なレベルの下方改変を示した。α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡの存在は、デオキシヌクレオチド残基中にスパイクすることによってノース−ロックフランク（オキシ−ＬＮＡ）およびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ残基の間にフレキシブルなトランジション(transition)を導入し得る。α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ残基がＤＮＡストレッチを中断するデザイン４−３−１−３−５を研究することにも関心が持たれる。該ギャップ内��α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡに加えて、我々はまた、該フランクの端での２個のオキシ−ＬＮＡ残基を２個のα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ残基で置換した。ギャップ中のＤＮＡのストレッチを中断するたった１個のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ残基の存在により（デザイン４−３−１−３−５）、下方改変の劇的な低下を生じる。単に代わりにα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡを用いることによって、該デザインは、５０ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度で有意な下方改変を示す。ジャンクション中のα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡおよびギャップの中間での１個のα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡの設置はまた、下方改変を示した。
【０１５４】
α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡは、異なるミックスマーの構築を可能とする強力なツールであることを示し、このものは、高レベルのアンチセンス活性を示すことが可能である。他のミックスマー（例えば、４−１−５−１−５および３−３−３−３−３−１）をも示すことができる。我々は、いくつかのデザインが強力なアンチセンスオリゴヌレオチドであって、一方で他の物は中位から低い下方改変レベルを示すことを容易に知ることができる。従って、再び、良好なアンチセンス活性およびオリゴヌクレオチドの最適なデザインの間の密な相関は非常に明白である。他の好ましいデザインは、ＤＮＡ残基が該ギャップの各片側で３−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを有するフランク中に位置する、（１−３−８−３−１）である。更に好ましいデザインは、Ｄ−オキシ−ＬＮＡフランクおよび３'末端にＤＮＡを持つ９ギャップを有する、（４−９−３−１）である。
【０１５５】
（実施例４：インビトロモデル：細胞培養）
アンチセンス化合物が標的核酸に及ぼす影響は、該標的核酸が測定可能なレベルで存在するとの条件で、様々な細胞タイプのいずれかで試験することができる。標的は、内因的にまたは該核酸をコードする核酸の一時的なもしくは安定なトランスフェクトによって、発現することができる。標的核酸の発現レベルは、例えばノーザンブロット分析、リアルタイムＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、ルーチンに測定することができる。以下の細胞タイプを例示目的で提示するが、該標的が選ばれた細胞タイプ中で発現するとの条件で、他の細胞タイプをルーチンに使用することができる。
【０１５６】
細胞を、以下に記載する通り適当な培地中で培養し、そしてこのものを３７℃で９５〜９８％湿度および５％ＣＯ2で維持した。細胞を、週に２〜３回ルーチンに継代させた。
【０１５７】
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌セルライン１５ＰＣ３は、Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, The Netherlandsによって親切に寄付され、そしてこのものをＤＭＥＭ（シグマ製）＋１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）＋グルタマックス(Glutamax)Ｉ＋ゲンタマイシン中で培養した。
Ａ５４９：ヒト非小細胞肺癌セルラインＡ５４９は、ATCC, Manassasから購入し、そしてこのものをＤＭＥＭ（シグマ社製）＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＭＤＦ７：ヒト乳癌セルラインＭＣＦ７は、ATCCから購入し、そしてこのものをイーグルＭＥＭ（シグマ社製）＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＳＷ４８０：ヒト大腸癌セルラインＳＷ４８０は、ATCCから購入し、そしてこのものをＬ−１５  Leibovitz（シグマ社製）＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＳＷ６２０：ヒト大腸癌セルラインＳＷ６２０は、ATCCから購入し、そしてこのものをＬ−１５  Leibovitz（シグマ社製）＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＨＴ２９：ヒト前立腺癌セルラインＨＴ２９は、ATCCから購入し、そしてこのものをMcCoy's 5a MM（シグマ社製）＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＮＣＩ  Ｈ２３：ヒト非細胞肺癌セルラインはATCCから購入し、そしてこのものをグルタマックスＩ（ギブコ社製）＋１０％ＦＢＳ＋ＨＥＰＥＳ＋ゲンタマイシンを有するＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。
ＨＣＴ−１１６：ヒト大腸癌セルラインＨＣＴ−１１６は、ATCCから購入し、そしてこのものをMcCoy's 5a MM＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：ヒト乳癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ATCCから購入し、そしてこのものをＬ−１５  Leibovitz＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ：ヒト乳癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓは、ATCCから購入し、そしてこのものをＬ−１５  Leibovitz＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックスＩ＋ゲンタマイシン中で培養した。
ＤＭＳ２７３：ヒト小細胞肺癌セルラインＤＭＳ２７３は、ATCCから購入し、そしてこのものをグルタミン（ギブコ社製）＋１０％ＦＢＳ＋ゲンタマイシンを有するWaymouth中で培養した。
ＰＣ３：ヒト前立腺癌セルラインＰＣ３は、ATCCから購入し、そしてこのものをグルタミン（ギブコ社製）＋１０％ＦＢＳ＋ゲンタマイシンを有するF12 Coon's中で培養した。
Ｕ３７３：ヒト膠芽腫星細胞腫セルラインＵ３７３は、ECACCから購入し、そしてこのものをＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋グルタマックス＋ＮＥＡＡ＋ピルビン酸ナトリウム(sodiumpyrovate)＋ゲンタマイシン中で培養した。
【０１５８】
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯静脈内皮細胞を、ATCCから購入した。
ＨＵＶＥＣ−Ｃヒト臍帯静脈内皮細胞を、ATCCから購入し、そしてこのものを製造主の指示に従って増殖させた。
ＨＭＶＥＣ−ｄ（ＤＭＶＥＣの真皮ヒト微小血管内皮細胞）をCloneticsから購入し、そしてこのものを製造主によって記載される通りに培養した。
ＨＭＶＥＣヒト微小血管内皮細胞は、Clonetics社から購入し、そしてこのものを製造主によって述べられている通りに培養した。
ヒトの胎仔の肺線維芽細胞はATCCから購入し、そしてこのものを製造主によって記載されている通りに培養した。
ＨＭＥＣ−１ヒト乳房上皮細胞を、Clonetics社から購入し、そしてこのものを商業主によって推奨されている通りに保った。
【０１５９】
（実施例５：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処置）
該細胞を、トランスフェクションビヒクルとしてカチオン性リポソーム製剤LipofectAMINE 2000（ギブコ社製）を用いて、オリゴヌクレオチドで処置した。細胞を１２−ウェル細胞培養プレート（ＮＵＮＣ）中に播種し、そして８０〜９０％集密時に処置した。使用するオリゴ濃度は、１２５ｎＭ〜０．２ｎＭの最終濃度の範囲とする。オリゴ−脂質複合体の製剤化は、本質的にDeanらによる（Journal of Biological Chemistry 1994, 269, 16416-16424）中に記載する通り、血清なしのオプチＭＥＭ（ギブコ社製）および最終脂質濃度が１０μｇ／ｍＬのLipofectAMINE 2000を総量５００μＬで用いて実施した。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、そして処置を、オリゴ−含有培地の除去によって終止させた。細胞を洗浄し、そして血清含有培地を加えた。オリゴ処置後に、細胞を１８時間回収し（図の説明文中で記載する場合を除く）、その後にそれらをＲＮＡまたはタンパク質の分析のために収集した。
【０１６０】
（実施例６：インビトロモデル：ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成の抽出）
（全ＲＮＡ単離）
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen社カタログ番号74104）またはトリゾール試薬（Life technologies社カタログ番号15596）のいずれかを用いて単離した。セルラインからのＲＮＡ単離の場合には、ＲＮｅａｓｙは好ましい方法であり、組織試料の場合には、トリゾールは好ましい方法である。全ＲＮＡは、Qiagen RNA OPF Robot - BIO Robot 3000を用いて、製造主によって提示されるプロトコールに従って、セルラインから単離した。組織試料をUltra Turrax T8ホモジナイザー（IKA Analysen technik社製）を用いてホモジナイズし、そして全ＲＮＡを製造主によって提示されたトリゾール試薬プロトコールを用いて単離した。
【０１６１】
(一本鎖の製造)
一本鎖合成は、OmniScript逆転写酵素キット（カタログ番号205113, Qiagen社製）を用いて、製造主の指示に従って実施した。各試料０．５μｇについて、全ＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリーＨ2Ｏを用いて各１２μＬにまで改変し、そして２μＬのポリ(ｄＴ)12-18（２．５μｇ／ｍＬ）（Life Technologies社製, GibcoBRL, Roskilde, DK）、２μＬのｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰ  ５ｍＭ）、２μＬの１０×緩衝液ＲＴ、１μＬのRNAguard（登録商標）Rnase INHIBITOR（３３．３Ｕ／ｍＬ）（カタログ番号27-0816-01, Amersham Pharmacia Biotech社製, Horsholm, DK）および１μＬのOmniScript逆転写酵素（４Ｕ／μＬ）と一緒に混合し、続いて３７℃で６０分間インキュベートし、そして酵素の熱失活を９３℃で５分間行なった。
【０１６２】
（実施例７：インビトロモデル：リアルタイムＰＣＲによるＴＲＸ発現のオリゴヌクレオチド抑制の分析）
ＴＲＸ発現のアンチセンス改変は、当該分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、ＴＲＸｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲによって定量化することができる。リアル−タイム定量的ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡを用いて実施することができる。
【０１６３】
ＲＮＡ単離およびＲＮＡ分析の方法（例えば、ノーザンブロット分析）は当該分野においてルーチンであり、そしてこれは、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons中で教示されている。
【０１６４】
リアル−タイム定量（ＰＣＲ）は、商業的なiQマルチ−カラー(Multi-Color)リアルタイムPCR検出システム（BioRAD社から入手可能）を用いて容易に達成することができる。
【０１６５】
（ＴＲＸｍＲＮＡのレベルのリアル−タイム定量的ＰＣＲ分析）
ｍＲＮＡレベルの定量は、製造主の指示に従ってiQマルチ−カラーリアルタイムPCR検出システム（BioRAD社製）を用いてリアル−タイム定量的ＰＣＲによって測定した。リアル−タイム定量的PCRは、当該分野においてよく知られる方法であり、そしてこのものは例えば、Heidらによる, Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994中に教示されている。
【０１６６】
プラチナ定量的PCRSuperMix UDG 2×PCRマスター(master)ミックスは、インビトロゲン社カタログ番号11730から得た。プライマーおよびTaqMan（登録商標）プローブを、MWG-Biotech AG, Ebersberg（独国）から得た。
【０１６７】
ヒトＴＲＸに対するプローブおよびプライマーは、公知の配列情報（ジェーンバンク寄託番号NM 003329、これは配列番号１として本明細書の一部を構成する）を用いて、ヒトＴＲＸ配列にハイブリダイズするように設計した。
【０１６８】
ヒトＴＲＸの場合、ＰＣＲプライマーは以下の通りである。forwardプライマー：5' aagcctttctttcattccctctc 3'（アッセイにおける最終濃度：０．３μＭ reverseプライマー：5' cttcttaaaaaactggaatgttggc 3'（アッセイにおける最終濃度：０．３μＭ）（配列番号８１）であり、そしてＰＣＲプローブは5'FAM-gatgtggatgactgtcaggatgttgcttc-TAMRA 3'（アッセイにおける最終濃度：０．１μＭ）である。
【０１６９】
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートのデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ定量は、試料調製におけるいずれかの分散を正規化するための内因コントロールとして使用した。
【０１７０】
ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの試料含有量を、ヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqManアッセイ試薬（Applied Biosystems社カタログ番号4310884E）を用いて、製造主の指示に従って定量化した。
【０１７１】
マウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの定量化の場合には、以下のプライマーおよびプローブを設計した。センス(Sense)プライマー5'aaggctgtgggcaaggtcatc 3'（最終濃度：０．３μＭ）、アンチセンスプライマー5' gtcagatccacgacggacacatt（最終濃度：０．６μＭ）、TaqManプローブ5'FAM-gaagctcactggcatggcatggccttccgtgtt c-TAMRA 3'（最終濃度：０．２μＭ）。
【０１７２】
（リアルタイムＰＣＲ）
実施例８に記載する通りに実施した一本鎖合成からのｃＤＮＡを２〜２０倍に希釈し、そしてこのものをリアルタイム定量的PCRによって分析した。該プライマーおよびプローブを、２×プラチナ定量(Platinum Quantitative) SuperMix UDG（カタログ番号11730, インビトロゲン社製）と一緒に混合し、そしてこのものを３．３μＬのｃＤＮＡに加えて最終容量を２５μＬとした。各試料を３回分析した。２倍希釈のｃＤＮＡ（このものは、関心あるＲＮＡを発現するセルラインから精製する物質について調製する）は、アッセイのための標準曲線を与えた。減菌Ｈ2Ｏを、非テンプレートコントロールのために、ｃＤＮＡの代わりに使用した。ＰＣＲプログラム：５０℃で２分間、９５℃で１０分間；続いて、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。標的ｍＲＮＡ配列の相対量は、iCycler iQリアルタイム検出システムソフトウェアを用いて、算出された閾値サイクルから測定した。
【０１７３】
（実施例８：インビトロ分析：ＴＲＸｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析）
ノーザンブロット分析は、本質的にCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sonsに記載されている通り当該分野においてよく知られる方法によって実施した。該ハイブリダイズプローブは、実施例８に記載する逆転写酵素ＰＣＲによって得られるＴＲＸ  ｃＤＮＡ由来のＴＲＸｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅によって得た。該反応は、各々０．５μＭ  最終濃度で、プライマー5' ggatccatttccatcggtcc 3'（forward）および5' gcagatggcaactggttatgtct 3'（reverse）、２００ｎＭ  各ｄＮＴＰ、１,５ｍＭ  ＭｇＣｌ2およびプラチナ(Platinum)Taq DNAポリメラーゼ（インビトロゲンカタログ番号10966-018）を用いて実施した。該ＤＮＡを、パーキンエルマー9700サーモサイクラー(thermocycler)で、以下のプログラムを用いて４０サイクルで増幅した。９４℃で２分間；次いで、９４℃で３０秒間そして７２℃で３０秒間を４０サイクル（サイクル毎に０．５℃低下）、続いて７２℃で７分間。
【０１７４】
増幅ＰＣＲ産物を、Ｓ−４００MicroSpinカラム（Amersham Pharmacia Biotech社カタログ番号27-5140-01）を用いて製造主の指示に従って精製し、そして分光光度法によって定量化した。
【０１７５】
該ハイビリダイズプローブを、Redivue（登録商標）[α-32P]dCTP  ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（Amersham Pharmacia Biotech社カタログ番号AA 0005）およびプライム(Prime)-It RmT標識キット（ストラタジーンカタログ番号300392）を用いて、製造主の指示に従って標識化し、そして放射性標識プローブを、S-300 MicroSpinカラム（Amersham Pharmacia Biotech社カタログ番号27-5130-01）を用いて精製した。使用前に、該プローブを９６℃で変性し、そして直ぐに氷上に置いた。
【０１７６】
実施例７中に記載する通りに精製した全ＲＮＡの試料（１〜５μｇ）を変性し、そして２．２Ｍ  ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳアガロースゲルを用いてサイズ分離した。ＲＮＡを、ターボブロッター(TurboBlotter)（Schleicher & Schuell）を用いる下向き(downward)キャピラリートランスファーによって正に荷電したナイロン膜に移し、そして該ＲＮＡを、ストラタジーンクロスリンカー(crosslinker)を用いるＵＶ架橋によって膜に固定化した。該膜を、ExpressHybハイブリダイズ溶液（Clontech社カタログ番号8015-1）中、６０℃で予めハイブリダイズし、そして該プローブをハイブリダイズのために引き続いて加えた。ハイブリダイスは６０℃で行ない、そして該ブロットを低いストリンジェントな洗浄用緩衝液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて室温で、および高ストリンジェントな洗浄用緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて５０℃で洗浄した。該ブロットをコダック保存用蛍光体(phosphor)スクリーンに曝露し、そしてこのものをBioRAD FX分子画像処理物質(imager)中でスキャンした。ＴＲＸｍＲＮＡレベルは、クオリティーワンソフトウェア(Quantity One software)（BioRAD社製）によって定量化した。
【０１７７】
等量のＲＮＡ試料ロード量は、該ブロットを０．５％ＳＤＳ／Ｈ2Ｏ中、８５℃でストリップし、そして本質的に上記の通り標識ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）プローブを用いてプライマー5' aac gga ttt ggt cgt att 3'（foroward）および5'taa gca gtt ggt ggt gca 3'（reverse）を用いてリプローブ(reprobing)することによって評価した。
【０１７８】
図２および３は、ＧＡＰＤＨに対して正規化したＴＲＸ抑制を示す。強度を、ホスホイメージャー・バイオラッド・ＦＸ−スキャナー(phosphoimager Biorad, FX-scanner)を用いて追跡した（表１を参照）。被験オリゴマー化合物を、実施例１０で供する。
【表３】
2006518999.tif 000008
【０１７９】
（実施例９：インビトロアッセイ：ＴＲＸタンパク質レベルのウェスタンブロット分析）
ＴＲＸのタンパク質レベルを、当該分野においてよく知られる様々な方法（例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析（イムノブロット）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（ラジオムノアッセイ）、または蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ））中で定量することができる。ＴＲＸに対する抗体は、様々な供給源（例えば、Upstate Biotechnologies社（Lake Placid, USA）、Novus Biologicals社（Littleton, Colorado）、Santa Cruz Biotechnology社（Santa Cruz, California））から同定しそして得ることができ、あるいは通常の抗体産生方法によって製造することができる。
【０１８０】
（ウェスタンブロット）
ＴＲＸに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処置の影響を測定するために、処置および非処置の細胞中でのＴＲＸのタンパク質レベルを、ウェスタンブロットを用いて測定した。実施例５に記載するオリゴヌクレオチドを用いた処置後に、細胞を氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ６．８、１０ｍＭ  ＮａＦ、１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、０．１ｍＭ  オルトバナジウム酸(orthovanadate)ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、１０ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、完全(Complete)タンパク質インヒビターカクテル（Boehringer Mannheim社製））中で収集した。更に使用するまで、該溶解液を−８０℃で保存した。
【０１８１】
該タンパク質溶解液のタンパク質濃度を、製造主によって記載される通り、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce社製）を用いて測定した。
【０１８２】
（ＳＤＳゲル電気泳動）
上記の通りに調製したタンパク質試料を氷上で解凍し、そしてこのものを９６℃で３分間変性した。試料を、１．０ｍｍの４〜２０％NuPageトリス−グリシンゲル（イントロゲン社製）上にロードし、そしてゲルをXcell IIミニ細胞電気泳動モジュール（インビトロゲン社製）内のＴＧＳランニングバッファー（BioRAD社製）中で操作した。
【０１８３】
（セミドライブロッティング）
電気泳動後に、分離したタンパク質を、セミドライブロッティングによってポリビニリドジフルオリド（ＰＶＤＦ）に移した。該ブロット方法を、セミ−ドライトランスファーセル（CBS Scientific Co.社製）中で製造主の指示に従って実施した。膜をアミドブラック(amidoblack)を用いて染色して、移動したタンパク質を視覚化し、そしてこのものを更に使用するまで４℃で保存した。
【０１８４】
（免疫検出）
所望するタンパク質を検出するために、該膜を、該タンパク質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートした。
該膜を、ブロック用緩衝液（ＰＢＳＴ−緩衝液（ＰＢＳ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス塩基、ｐＨ７．４、０．１％ツウィーン−２０）中に溶解した５％脱脂乳粉末）中でブロックし、ＰＢＳ−緩衝液中で簡単に洗浄し、そして室温でブロック緩衝液中、１次抗体と一緒にインキュベートした。以下の１次抗体および２次抗体、並びに濃度／希釈を使用した。
モノクローナルマウス抗−ヒトチオレドキシン抗体クローン２Ｇ１１（カタログ番号559969、Pharmingen社製）１:５００；
モノクローナルマウス抗−ヒトチューブリンＡｂ−４（カタログ番号MS-719-P1、NeoMarkers社製）；
ペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン（コード番号P0447, DAKO社製）１：１０００。
【０１８５】
１次抗体と一緒にインキュベートした後に、該膜をＰＢＳ中で簡単に洗浄し、室温でペルオキシダーゼ接合２次抗体と一緒にインキュベートした。次いで、該膜をＰＢＳ中で洗浄し、続いて室温で撹拌しながらＰＢＳＴ中で３回の更なる１０分間の洗浄を行なった。最後の洗浄後に、該膜をＥＣＬ+プラス試薬（Amersham社製）と一緒にインキュベートし、そして化学ルミネッセンスをVersaDoc化学ルミネッセンス検出システム（BioRAD社製）またはX-omatフィルム（コッダク社製）を用いて検出した。該膜を、９６℃で１分間インキュベートすることによって、ｄｄＨ2Ｏ中でストリップした。ストリップ後に、該膜をＰＢＳ中に置き、そしてこのものを４℃で保存した（図６および７を参照。化合物は実施例１０を参照）。
【０１８６】
（実施例１０：インビトロ分析：オリゴマー化合物によるヒトＴＲＸ発現のアンチセンス抑制）
本発明によれば、一群のオリゴヌクレオチドを、公知の配列（ジェーンバンク寄託番号BD132005（配列番号１として本明細書中の一部を構成する）；NM 003329（配列番号２として本明細書中の一部を構成する）；D28376（配列番号３として本明細書中の一部を構成する）；AF 548001（配列番号４として本明細書中の一部を構成する））を用いて、ヒトＴＲＸＲＮＡの異なる領域を標的とするように設計した（図５を参照）。長さが１６ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを、ＣＵＲ番号および配列番号を有する表２中に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合した特定の標的配列上の第１ヌクレオチド数を示す。表３は、４つの化合物についてのＩＣ50を示す。
【０１８７】
表２：本発明のオリゴマー化合物
オリゴマー化合物は、１５ＰＣ３細胞中でＴＲＸｍＲＮＡをノックダウンするそれらの能力について評価した。該データは、偽(mock)トランスフェクト細胞に対する相対的な下方調節パーセントとして示す。転写定常状態(Transcript steady state)は、リアル−タイムＰＣＲによって追跡し、そしてこのものをＧＡＰＤＨ転写定常状態に正規化した。全ＬＮＡ Ｃは５'−メチル−シトシンであることに注意する。
【表４】
2006518999.tif 000009
【表５】
2006518999.tif 000010
【表６】
2006518999.tif 000011
【０１８８】
表３：異なる起源の２個のセルライン中でのＩＣ50（ｎＭ）
オリゴマー化合物を、１５ＰＣ３細胞中でのＴＲＸｍＲＮＡをノックダウンするそれらの能力について評価した。転写定常状態を、リアル−タイムＰＣＲによって追跡し、そしてこのものをＧＡＰＤＨ転写定常状態に正規化した。全ＬＮＡ Ｃは５'−メチル−シトシンであることに注意する。
【表７】
2006518999.tif 000012
【０１８９】
表２および３中に示す通り、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７および１８は、２５ｎＭでサバイビン発現の少なくとも３０％抑制を示し、従ってこれらのものは好ましい。
【０１９０】
特に関心ある化合物は、低いＩＣ50を示した８Ａ、９Ａ、１０Ａおよび１４Ａである。
【０１９１】
ＴＲＸを標的とするＬＮＡオリゴマー化合物の特異性もまた試験した。１５ＰＣ３細胞を、ヒトサバイビン（４ＬＮＡ／ＰＳ＋８ＰＳ＋４ＬＮＡ／ＰＳ）（ＬＮＡサバイビンと呼ぶ）またはヒトチオレドキシン（ＣＵＲ２７６６）のいずれかを標的とするＬＮＡオリゴを５ｎＭおよび２５ｎＭで用いてトランスフェクトした（図８を参照）。
【０１９２】
（実施例１１：ＴＲＸを標的とするＬＮＡアンチセンスオリゴマー化合物によるアポトーシス誘発）
BD(登録商標)サイトメトリックビーズアレイ(cytometric bead array)（ＣＢＡ）（カタログ番号557816）を用いるアポトーシスの測定
細胞を、上記の通り（実施例５を参照）、リポフェタミン２０００を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後に、該上清由来の細胞をスピンダウンし、そして接着細胞をトリプシン処理し、そしてスピンダウンした。該細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し／洗浄し、そしてカウントして細胞濃度を２×１０6細胞／プロテアーゼインヒビター含有溶解緩衝液のｍＬとした。該方法を、製造主によって記載されている通り、以下の改変で進めた。細胞を溶解した後に、それらを４０分間溶解し、そして１０分間隔で渦巻いた。１×１０5細胞を、カスパーゼ３ビーズと一緒にインキュベートし、簡単に混合し、そして室温で１時間インキュベートし、その後に、それらをフローサイトメトリーによって分析した。該データをＢＤ(登録商標)ＣＢＡソフトウェアを用いて分析し、エクセル（ここで、全データは偽に対する（１つにセットする））に移した（図９を参照）。
【０１９３】
（実施例１２：増殖性癌細胞におけるＴＲＸのアンチセンスオリゴヌクレオチド抑制）
細胞は、トランスフェクトの前日にＤＭＥＭ内の白色９６ウェルプレート（Nunc 136101）中で密度がウェル当たり１２０００細胞にまで播種した。翌日に、細胞を予め温めたオプチＭＥＭ中で１回洗浄し、続いて更に５μｇ／ｍＬのリポフェクタミン2000（インビトロゲン社製）を含有する７２μＬのオプチＭＥＭを加えた。細胞を７分間インキュベートし、その後に、オプチＭＥＭ中に希釈した１８μＬのオリゴヌクレオチドを加えた。最終的なオリゴヌクレオチド濃度は、５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲であった。処置の４時間後に、細胞をオプチＭＥＭ中で洗浄し、そしてＤＭＥＭを含有する１００μＬの血清を加えた。オリゴ処置の後に、細胞を示唆期間の間回収し、生存可能な細胞を２０μＬのテトラゾリウム化合物［３−(４,５−ジメチル−２−イル)−５−(３−カルボキシメトキシフェニル)−２−(４−スルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩；ＭＴＳ］およびエレクトロンカップリング試薬（フェナジンエトスルフェート；ＰＥＳ）（CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega社製）を加えることによって測定した。生存可能な細胞をパワーウェーブ(Powerwave)（Biotek Instruments社製）中、４９０ｎｍで測定した。増殖速度（ΔＯＤ／時間）を、オリゴ濃度に対してプロットした。
【０１９４】
（実施例１３：ＴＲＸを標的とするオリゴマー化合物を用いる処置後の、細胞の倍数関係(Ploidy)（細胞周期）およびＤＮＡ分解（アポトーシス）の測定）
アポトーシスカスケードにおける後期の段階は、多数の小さいＤＮＡフラグメントを生じ、このものは細胞のヨウ化プロピジウム染色によって分析することができ、更にヨウ化プロピジウム染色を用いて、処置細胞中での倍数関係を評価することができる。ＴＲＸに対するオリゴマー化合物を用いて処置した細胞の倍数関係／アポトーシスを評価するために、細胞をＰＢＡ中で洗浄し、そしてこのものを７０％ＥｔＯＨ中、４℃で１時間固定化した。５０μｇ／ｍＬ  ＲＮＡｓｅ（シグマ社製）を用いて室温で２０分間処置後に、細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、そして４０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（シグマ社製またはＢＤ社製）と一緒に３０分間インキュベートした。全試料を、蛍光標示式細胞分取器（FACSCalibur, Becton Dickinson社製）およびセルクエストソフトウェア(Cell Quest software)を用いて分析した。ＤＮＡヒストグラムにおいて、低二倍体またはサブ−Ｇ１ピークはアポトーシス細胞について示す。
【０１９５】
（実施例１４：ＴＲＸを標的とするオリゴマー化合物を用いた処置後の、細胞のミトコンドリア膜ポテンシャルにおける変化の測定）
ミトコンドリア膜ポテンシャルにおける変化を測定するために、ミトセンサー(MitoSensor)(登録商標)試薬方法（Becton Dickinson社製、カタログ番号K2017-1）を使用した。ミトセンサー(登録商標)試薬を健康な細胞によって溶かし、このものは赤い蛍光を放射する凝集物を形成する。アポトーシス後に、該ミトコンドリア膜ポテンシャルは変化し、そしてこれにより、該試薬はミトコンドリア内で凝集し、従ってそのものは細胞質中でモノマー形態のままであり、緑色蛍光を放射する。ＴＲＸに対するオリゴマー化合物を用いて処置した細胞を洗浄し、そしてこのものを製造主によって記載される通り、インキュベート用緩衝液中で希釈したミトセンサー試薬中でインキュベートした。オリゴ処置後の膜ポテンシャルの変化は、蛍光標示式細胞分取器（FACSCalibur, Becton Dickinson社製）およびセルクエストソフトウェアの使用によって検出した。
【０１９６】
（実施例１５：アンチセンスオリゴ処置後の内皮細胞のキャピラリー形成の抑制）
内皮単層細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）を、サバイビンに対するアンチセンスオリゴと一緒にインキュベートした。チューブ形成は、２個の以下の方法のいずれかによって分析した。第１の方法は、BDバイオコート血管形成チューブ形成システム(BioCoat angiogeneis tube formation system)である。細胞を、上記の通り（実施例５）、オリゴを用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、マトリゲル重合BDバイオコート血管形成プレート上で２×１０4細胞／９６ウェルで播種した。該プレートを、ＰＭＡ（５〜５０ｎＭ）、ＶＥＧＦ（２０〜２００ｎｇ／ｍＬ）、スラミンまたはビヒクルがあるなしで、示す時間／日数の間インキュベートした。該プレートを、製造主によって記載される通り、カセイン(Cacein)AMを用いて染色し、そして画像処理を行なった。全チューブの長さを、メタモルフ(MetaMorph)を用いて測定した。
【０１９７】
別法として、０．１容量の１０×ＤＭＥＭ中のラットテイルタイプＩコラーゲン（３ｍｇ／ｍＬ、Becton Dickinson社製）中に細胞を播種し、減菌１Ｍ  ＮａＯＨを用いて中和し、そしてこのものを氷またはマトリゲル上に保った。細胞をコラーゲン懸濁液中に、最終濃度：１×１０6細胞／コーラーゲンのｍＬで加えた。該細胞−コーラーゲン混合物を６−ウェルまたは３５ｍｍプレートに加え、そしてこのものを加湿インキュベーター中、３７℃で置いた。ゲル化培地（３ｍＬ）＋余分な１０％ＦＢＳを加え、そして細胞を、ＰＭＡ（１６ｎＭ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）のあるなしで示唆期間の間、キャピラー様血管を形成させた。ゲルのクリオスタット切片化後にチューブの形成を定量化し、そして位相差顕微鏡によって切片の検査を行なった。
【０１９８】
（実施例１６：ＴｒＸを標的とするオリゴマー化合物を用いた処置後の、インビトロ細胞毒性の測定）
細胞を播種し（０．３〜１．２×１０4）、そして上記の通り（例えば、実施例１２のＭＴＳアッセイ）アンチセンスオリゴを用いて処置した。示唆する時間に、アンチセンス処理した細胞由来の培地（２０〜５０μＬ）を９６ウェルプレートに移し、該培地へのＬＤＨの放出を測定した。等量のＬＤＨ基質を製造主によって記載される通り加えた。放出されるＬＤＨを、３０分の結合酵素的アッセイ(coupled enzymatic assay)を用いて測定し、これにより、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の赤色ホルマザン生成物への変換を生じる。生成する着色の量は、溶解細胞の数に比例する。可視波長吸収データ（４９０ｎｍで測定）は、標準的な９６ウェルプレートリーダー（Powerwave, Bio-Tek Instruments社製）を用いて収集した。同様に、正コントロール細胞を０．９％トリトンＸ−１００（＝１００％溶解）を用いて約４５分間処理した。細胞毒性を、偽およびトリトン−ｘ１００処理細胞（１００％溶解＝１００％細胞毒性）に対してプロットした。
【０１９９】
（実施例１７：インビボモデル；アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた全身処置によるインビボで増殖したヒト腫瘍細胞の腫瘍増殖抑制）
６週齢の雌性ＮＭＲＩ胸腺欠損ヌードマウスをM&B（デンマーク国）から購入し、そしてこのものを参加(entering)実験前の少なくとも１週間順化させた。３００μＬマトリゲル（BD Bioscience社製）中に懸濁させた典型的に１０6細胞のヒト癌細胞を、７〜８週齢のＮＭＲＩ胸腺欠損雌性ヌードマウスの側腹部中に皮下注射した。腫瘍増殖が確立した後に、典型的には腫瘍細胞注射の７〜１２日後に、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、皮下インプラントしたＡＬＺＥＴ浸透性ポンプを用いて２８日までの間、５ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。背部のインプラント前に、該ポンプを室温で終夜、減菌ＰＢＳ中でインキュベートして、該ポンプを始動させた。コントロール動物は、生理食塩水のみを同じ期間で与えた。各実験群は少なくとも５マウスを含む。抗腫瘍活性を、腫瘍の大きさの抑制によって見積もった。腫瘍増殖は、２垂直方向の直径を測定することによって定期的に追跡した。腫瘍の大きさは、式（π×Ｌ×Ｄ2／６）（式中、Ｌは最大直径であり、そしてＤはＬに対して垂直方向の腫瘍の直径である）に従って算出した。処置の最後に、該動物に麻酔をかけ、そして腫瘍の重量を測定した。群の平均的な腫瘍の大きさおよび重量を、マン・ホイトニー(Mann-Whitney)検定を用いて比較した。全ての分析は、ウィンドウズがＳＰＳＳバージョン１１．０で行なった。
【０２００】
最適には、ウェスタンブロット分析はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質レベルに及ぼす抑制効果を有するかどうかを測定するために実施することができる。従って、処置期間の最後に、マウスに麻酔をかけ、そして該腫瘍を切除し、そしてこのものを液体窒素中に直ぐに凍結した。該腫瘍を溶解緩衝液（すなわち、２０ｍＭトリス−Ｃｌ［ｐＨ７．５］；２％トリトンＸ−１００；１／１００容量）中でホモジナイズした。プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（カルビオケム社製）；１／１００容量。プロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩ（カルビオケム社製）、４℃、モーター駆動ホモジナイザーを使用する。１００ｍｇの腫瘍組織当たり５００μＬの溶解緩衝液を適用した。マウスの各群由来の腫瘍ライセートを貯蔵し、そしてこのものを４℃で５分間遠心分離（１３,０００ｇ）して、組織デブリを除去した。腫瘍エキスのタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce社製, Rockford）を用いて測定した。
【０２０１】
該タンパク質エキス（５０〜１００μｇ）を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルスパニング（４〜２０％）を用いて分画し、ＰＶＤＦ膜に移し、そしてアミノブラック染色によって視覚化した。ＴＲＸの発現は、抗−ヒトＴＲＸ抗体、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合抗−ヤギＩｇＧ（ＤＡＫＯ社製）によって検出した。免疫反応性を、ＥＣＬプラス（Amersham biotech社製）によって検出し、そしてこのものをベルサドック(Versadoc)5000ライテ(lite)システム（Bio-Rad社製）によって定量化した。
【０２０２】
（実施例１７ａ：インビボモデル；ＬＮＡオリゴマー化合物を用いて処置したヌードマウスにおけるＨＴ２９ヒト大腸癌異種移植片モデル中での腫瘍増殖抑制）
６週齢の雌性ＮＭＲＩ胸腺欠損ヌードマウスをM&B（デンマーク国）から購入し、そしてこのものを参加(entering)実験前の少なくとも１週間順化させた。３００μＬマトリゲル（BD Bioscience社製）中に懸濁させた３×１０6細胞のヒト癌細胞を、７〜８週齢のＮＭＲＩ胸腺欠損雌性ヌードマウスの側腹部中に皮下注射した（０日目）。各実験群は少なくとも５マウスを含んだ。本研究は、ヌードマウスにおけるＨＴ２９ヒト大腸癌異種移植片モデル中でのチオレドキシン標的Ｃｕｒ２６８１の単独効果を試験するために実施した。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、浸透性ミニポンプによって１０および２０ｍｇ／ｋｇを７〜２０日間、ｓ．ｃ．投与した。効力を、２１日の処置期間中、腫瘍の大きさを測定することによって評価した。ＨＴ２９ヒト大腸癌異種移植片、ＢＡＬＢ／ｃ雌性ヌードマウス。平均値／ＳＥＭ。異なる処置群において観察される平均的な腫瘍の大きさおよび平均的な腫瘍の重量を、マン・ホイトニー(Mann-Whitney)検定を用いることによって統計学的に比較した（図１０を参照）。
【０２０３】
（実施例１８：インビボモデル：ＬＮＡオリゴマー化合物を用いる腹腔内処置後の、ヌードマウス中に移植されるヒト腫瘍断片の腫瘍増殖抑制）
ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの腫瘍増殖抑制活性は、Oncotest's（Freiburg社製, 独国）繁殖コロニー由来の異物移植胸腺欠損ヌードマウス、ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ中で試験した。乳癌（MDA MB 231）、前立腺癌（PC3）または肺癌（LXFE 397, Oncotest）由来のヒト腫瘍断片を、ヌードマウスにおける連続継代での異種移植片から得た。ドナーマウスから腫瘍を除去した後に、それらはカットして断片（直径１〜２ｍｍ）とし、そしてこのものを皮下インプラントまで、ＲＰＭＩ １６４０培地中に置いた。レシピエントマウスを、イソフルランの吸入によって麻酔をかけた。小さい切開を、該背中の皮膚に作った。該腫瘍断片（マウス当たり２断片）を、ピンセットを用いて移植した。MDA MB 231およびLXFE 397腫瘍を雌性マウス中に移植し、PC3腫瘍は雄性マウス中に移植した。平均的な腫瘍直径が４〜６ｍｍに達した後に、動物をランダム化し、そしてオリゴヌクレオチドを２０ｍｇ／ｋｇで用いて、週末を除く３週間、１日１回腹腔内処置した。ビヒクル（生理食塩水）および正コントロール群（タキソール、２０ｍｇ／ｋｇ／日）は全実験中に含んだ。全ての群は、６マウスで構成した。該腫瘍の大きさを、ランダム化の日（０日目）、次いで１週間に２回、ノギスを用いる２方向測定によって測定した。腫瘍の大きさを、式（ａ×ｂ2）×０．５（式中、ａは最大腫瘍の直径であり、そしてｂは垂直方向の腫瘍の直径である）に従って算出した。腫瘍の大きさが２倍になるまで、ランダム化後の２８日間、マウスを毎日観察した。腫瘍の直径が１．６ｃｍを超えた後に、マウスを殺生した。腫瘍の抑制の統計学的な有意性の評価のために、ウィルコクスン・マン・ホイトニー(Mann-Whitney-Wilcoxon)によるＵ−検定を実施した。慣習によって、ｐ−値＜０．０５は、腫瘍の抑制の有意性を示す。
【０２０４】
（実施例１９：マウスにおけるオリゴヌクレオチドの体内分布）
６週齢の雌性ＮＭＲＩ胸腺欠損ヌードマウスをM&B（デンマーク国）から購入し、そしてこのものを参加実験前の少なくとも１週間順化させた。３００μＬマトリゲル（BD Bioscience社製）中に懸濁させた典型的な１０6細胞のヒト癌細胞を、７〜８週齢のＮＭＲＩ胸腺欠損雌性ヌードマウスの側腹部中に皮下注射した。腫瘍増殖が確立した後に、トリチウム標識オリゴヌクレオチドを、皮下インプラントしたＡＬＺＥＴ浸透性ポンプを用いて１４日間、５ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。該オリゴヌクレオチドを、Graham MJらによる（J Pharmacol Exp Ther 1998; 286(1): 447-458）によって記載される通り、トリチウム標識した。オリゴヌクレオチドを、全ての主要な臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、胃、肺、小腸、大腸、リンパ節、皮膚、筋肉、脂肪、骨、骨髄）由来の組織エキスおよび皮下移植したヒト腫瘍組織のシンチレーションカウントによって定量化した。
【０２０５】
本発明は、好ましい実施態様により具体的に記載する。従って、実施例は本発明を例示するためにだけ役立ち、本発明を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、本発明の異なるデザイン：ギャップマー、ヘッドマー、およびテイルマー、並びに異なる組成のミックスマーのイラストを示す図面である。ミックスマーについて、番号は、ＤＮＡ、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡまたはα−Ｌ−ＤＮＡの別の近接ストレッチを示す。図面中、線はＤＮＡであり、灰色の影はα−Ｌ−ＬＮＡ残基に相当し、そして四角形はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。１５ＰＣ３由来の全ＲＮＡについてのＴＲＸノーザンロット。
【図２】図２は、０．２、１、５、２５ｎＭのＣＵＲ２６７５、ＣＵＲ２６７６、ＣＵＲ２６７７、ＣＵＲ２６８１をそれぞれ用いて処置した１５ＰＣ３細胞由来の全ＲＮＡのＴＲＸノーザンブロットを示す図面である。各３個のトランスフェクション由来のインデュプロでのＲＮＡ試料を貯蔵し、そして２μｇの全ＲＮＡをゲル上にロードした。全ての化合物は有効なインヒビターであることを示す。該抑制は非常に低い化合物の濃度で起こることにも注目すべきである。
【図３】図３は、本発明の４個のオリゴマー化合物を用いて処置したＭＣＦ７細胞由来の全ＲＮＡのＴＲＸサザーンブロットを示す図面である。各３個のトランスフェクション由来のインデュプロでのＲＮＡ試料を貯蔵し、そして２μｇの全ＲＮＡをゲル上にロードした。全ての化合物は有効なインヒビターであることを示す。該抑制は非常に低い化合物の濃度で起こることにも注目すべきである。
【図４】図５は、チオ−ＬＮＡの合成の一般的な反応式を示す図面である。
【図５】図５は、本発明の標的配列：ジェーンバンク寄託番号ＢＤ１３２００５（これは、配列番号１として本明細書の一部を構成する）；ＮＭ００３３２９（これは、配列番号２として本明細書の一部を構成する）；Ｄ２８３７６（これは、配列番号３として本明細書の一部を構成する）；ＡＦ５４８００１（これは、配列番号４として本明細書の一部を構成する）を示す図面である。
【図６】図６は、ＣＵＲ２６７５トランスフェクトした１５ＰＣ３細胞中でのチオレドキシンタンパク質の還元の時間経過（ウェスタンブロット）がタンパク質の一定の低レベルを示す一方で、偽トランスフェクトした細胞がチオレドキシンの大きな増大を示す、ことを示す図面である（上方のパネル）。トランスフェクト後に、細胞を血清含有培地中で２４、４８および７２時間インキュベートした。下方のパネルは、ウェスタンブロットシグナルからのチオレドキシンの相対的な定量を示す。チオレドキシンデータは、対応するチューブリンデータを用いて正規化した。
【図７】図７は、ＣＵＲ２６７６トランスフェクトした１５ＰＣ３細胞中でのチオレドキシンタンパク質の還元の時間経過（ウェスタンブロット）がタンパク質の一定の低レベルを示す一方で、偽トランスフェクトした細胞がチオレドキシンの大きな増大を示す、ことを示す図面である（上方のパネル）。トランスフェクトした１５ＰＣ３細胞由来のタンパク質エキスのウェスタンブロット。トランスフェクト後に、細胞を血清含有培地中で２４、４８および７２時間インキュベートした。下方のパネルは、ウェスタンブロットシグナルからのチオレドキシンの相対的なな定量を示す。チオレドキシンデータは、対応するチューブリンデータを用いて正規化した。
【図８】図８は、ＴＲＸを標的とするＬＮＡオリゴマー化合物の特異性を示す図面である。１５ＰＣ３細胞を、ヒトサバイビン（４ＬＮＡ／ＰＳ＋８ＰＳ＋４ＬＮＡ／ＰＳ）（ＬＮＡサバイビンと呼ぶ）またはヒトチオレドキシン（ＣＵＲ２７６６）のいずれかを標的とするＬＮＡオリゴを５ｎＭおよび２５ｎＭで用いてトランスフェクトした。ＴＲＸおよびサバイビンについての転写物定常状態。転写物定常状態はリアルタイム−ＰＣＲによって追跡し、そしてＧＡＰＤＨ転写物定常状態に対して正規化した。このことは、サバイビンを標的とするアンチセンスオリゴのＴＲＸ発現に及ぼす影響が全くないことを示し、その逆もまた同じである。
【図９】図９は、ＬＮＡアンチセンスオリゴマー化合物である、ＴＲＸを標的とするＣＵＲ２６７５、ＣＵＲ２７６８、ＣＵＲ２７６６およびＣＵＲ２７６６による、アポトーシスの抑制を示す図面である。
【図１０】図１０は、浸透性ミニポンプによって１０および２０ｍｇ／ｋｇを７〜２０日間ｓ．ｃ．投与した、ＣＵＲ２６８１による、腫瘍増殖のインビボ抑制を示す図面である。ＨＴ２９、ヒト大腸癌異種移植片、ＢＡＬＢ／ｃ雌性ヌードマウス。平均値／ＳＥＭ。
【図１】
2006518999.tif 000015
【図２】
2006518999.tif 000016
【図３】
2006518999.tif 000017
【図４】
2006518999.tif 000018
【図５】
2006518999.tif 000019
2006518999.tif 000020
2006518999.tif 000021
2006518999.tif 000022
2006518999.tif 000023
2006518999.tif 000024
2006518999.tif 000025
2006518999.tif 000026
【図６】
2006518999.tif 000027
【図７】
2006518999.tif 000028
【図８】
2006518999.tif 000029
【図９】
2006518999.tif 000030
【図１０】
2006518999.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月7日(2005.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006518999000001.app
【国際調査報告】
2006518999.tif 000032
2006518999.tif 000033
2006518999.tif 000034
2006518999.tif 000035
2006518999.tif 000036
2006518999.tif 000037
2006518999.tif 000038
2006518999.tif 000039