(57)【要約】本発明は、ＺＡＰ−７０タンパク質チロシンキナーゼの三次元構造に関するものであり、ＺＡＰ−７０の結晶の製造および結晶化で使用されるＺＡＰ−７０の触媒ドメインの精製方法について記載している。本発明はまた、ＺＡＰ−７０の生物学的機能を阻害するリガンドの同定および設計を目的とするＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ＝３５.７７±５オングストローム、ｂ＝５７.５６±５オングストローム、ｃ＝８０.２０±５オングストローム、α＝６８.９７±５°、β＝８９.８３±５°、γ＝８９.９５±５°の単位格子サイズを有するＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶。
【請求項２】
触媒ドメインが表１の原子構造座標を含む三次元構造を有する、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶。
【請求項３】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが配列番号２の配列、またはそのフラグメントまたは相同体を含む、請求項１または２記載の結晶。
【請求項４】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが少なくともＡＴＰ−結合部位を含む、請求項３記載の結晶。
【請求項５】
少なくとも１個のリガンドまたは低分子量化合物に結合した請求項１〜４のいずれかに記載の結晶。
【請求項６】
コンピューター可読性データでコード化されたデータ記憶材料を含むコンピューター可読性媒体であって、データが、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含む表１の原子座標を含む媒体。
【請求項７】
ＺＡＰ−７０キナーゼの結晶の製造方法であって、
（ｉ）配列番号１の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの精製、
（ii）タンパク質加水分解ドメイン特定
（iii）ＺＡＰ−７０の所望のドメインのタンパク質加水分解的放出を容易にするためプロテアーゼ認識配列を両端に隣接させた配列番号１の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（iv）適切な宿主細胞における工程（iii）の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（ｖ）プロテアーゼ認識部位における所望のドメインの制御されたタンパク質加水分解
（vi）所望のＺＡＰ−７０ドメインの迅速な精製
の工程を含む方法。
【請求項８】
ドメインが配列番号２のＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＺＡＰ−７０、そのフラグメントまたは相同体の触媒ドメインが、結晶化に先行するいずれかの工程で少なくとも１個のリガンドまたは低分子量化学的化合物と結合されている、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
ＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶化
（ii）全体的または部分的に表１の原子座標を用いることによる、ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体の三次元構造の決定
を含む方法。
【請求項１１】
少なくとも１個のリガンドに結合したＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含む複合体の三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）複合体の結晶についてのｘ線回折データを得、
（ii）全体的または部分的に表１の原子座標を用いて複合体の三次元構造を測定する
ことを含む方法。
【請求項１２】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、
（ｉ）表１の原子座標のセットから全体的または部分的に誘導されたＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインの三次元構造を用いることにより、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合する可能なリガンドまたは低分子量化合物を選択し、
（ii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項１３】
請求項１１記載のＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが上記ドメインの少なくともＡＴＰ−結合部位を含む方法。
【請求項１４】
ＺＡＰ−７０キナーゼの生物活性を阻害するリガンドの選択で使用される請求項１２〜１３記載の方法。
【請求項１５】
ＺＡＰ−７０触媒ドメインに結合し得るリガンドまたは低分子量化合物の設計方法であって、
（ｉ）全体的または部分的に表１の原子座標を用いてＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造を測定し、
（ii）候補リガンドまたは低分子量化合物でＺＡＰ−７０の触媒ドメインをプローブすることにより、どれがＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するかを測定し、
（iii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択し、
（iv）結合することにより物理的結合特性、たとえば溶解性、親和力、特異性または有効性を最大化するようにリガンドまたは低分子量化合物を修飾する
工程を含む方法。
【請求項１６】
候補リガンドまたは低分子量化合物をインシリコ・スクリーニングにかける、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＺＡＰ−７０キナーゼの生物活性を阻害するリガンドの設計で使用される請求項１５〜１６記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞およびリンパ球活性化を伴う疾患および状態の処置で使用される請求項１２〜１４記載の方法により同定されるリガンドを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＺＡＰ−７０タンパク質チロシンキナーゼ、特にＺＡＰ−７０タンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインの三次元構造に関するものである。本発明はまた、リガンドまたは非リガンド性ヒトＺＡＰ−７０触媒ドメインの結晶形態に関するものである。さらに、本発明は、ＺＡＰ−７０を含む結晶の製造方法および結晶化で使用されるＺＡＰ−７０の触媒ドメインの精製について述べている。本発明はまた、ＺＡＰ−７０の生物学的機能を阻害するリガンドまたは低分子量化合物の同定および設計を目的とするＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインの三次元構造の使用に関するものである。
【０００２】
発明の背景
タンパク質チロシンキナーゼＺＡＰ−７０（７０ｋＤａのゼータ鎖会合タンパク質）は、Ｔ細胞活性化において中枢的役割を演じる。Ｔ細胞は、移植拒絶、自己免疫疾患および炎症応答の開始に関与している。Ｔ細胞の活性化は、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与を必要とし、若干のシグナル変換経路の活性化をまねく初期膜近位事象を誘発する。
【０００３】
Ｔ細胞活性化の初期事象の一つは、ＴＣＲゼータ鎖のリン酸化およびＴＣＲによるその２つのＳＨ２ドメインを介したＳｙｋファミリータンパク質チロシンキナーゼＺＡＰ−７０の特異的会合および活性化である。ｓｒｃファミリーのキナーゼＬｃｋによるトランスホスホリレーションと同時のゼータ鎖結合により、ＺＡＰ−７０の活性化が誘導される。ＺＡＰ−７０は、アダプター分子である、その特異的基質ＬＡＴ（Ｔ細胞活性化リンカー）をリン酸化し、次いで若干の下流エフェクター分子を補充する。結局これによって、初期Ｔ細胞遺伝子の活性化、サイトカインの産生および細胞増殖が誘導される。ＺＡＰ−７０／ＬＡＴ−伝達シグナルを妨げることにより、機能的Ｔ細胞が不活化されるという充分な証拠がある。
【０００４】
ＺＡＰ−７０の欠損は、ＣＤ−８型Ｔ細胞の選択的欠如を特徴とする高度複合型免疫欠損の常染色体劣性形態である、選択的Ｔ細胞（ＳＴＤ）の原因である。
【０００５】
ＴＣＲゼータ鎖から誘導されたペプチドと複合したヒトＺＡＰ−７０の縦列ＳＨ２ドメインの結晶構造は、Hatada et al.（１９９５）により以前に報告されている。ＳＨ２ドメインのこの三次元結晶構造はまた、米国特許第６２５１６２０号の対象でもある。このＳＨ２ドメインの開示により、ＺＡＰ−７０ ＳＨ２ドメイン／ゼータ鎖相互作用の遮断に努力が向けられた。しかしながら、現在までのところ、ＺＡＰ−７０の経口活性阻害剤については報告されていない。
【０００６】
ＡＴＰ結合部位での触媒活性は直接阻害され得るため、本発明は、ＺＡＰ−７０を阻害するためのＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造に焦点を絞っている。本発明の開示以前に、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元結晶構造は無かった。ヒトＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造により、触媒ドメインの三次元構造に基づいたＺＡＰ−７０の阻害剤の同定および設計は今や可能となった。
【０００７】
発明の要旨
本発明の目的は、ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインの三次元構造を提供することにより、ＺＡＰ−７０キナーゼを特異的に阻害するリガンドまたは低分子量分子の同定および設計を可能にすることである。
【０００８】
本発明は、
（ｉ）リガンドまたは低分子量化合物と共にまたはそれを伴わずにＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶
（ii）ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶の製造方法
（iii）触媒ドメインを含む上記ＺＡＰ−７０キナーゼ結晶およびその構造座標の使用方法
に関するものである。
【０００９】
ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインの結晶から明らかにされた三次元構造情報は、構造に基づく薬剤発見についてＺＡＰ−７０キナーゼの阻害剤をスクリーニングし、同定および設計するのに使用され得る。
【００１０】
発明の詳細な記載
ヒトＺＡＰ−７０キナーゼの完全長配列は公知であり、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０５１４８およいＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ４３４０３に示されており、それらについては出典明示により援用する。
【００１１】
本発明は、結晶形態でのＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインを提供する。特に、本発明は、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインおよび複合体としてＺＡＰ−７０に結合したリガンドを含む結晶を提供する。
【００１２】
本発明の一実施態様では、ａ＝３５.７７±５オングストローム、ｂ＝５７.５６±５オングストローム、ｃ＝８０.２０±５オングストローム、α＝６８.９７±５°、β＝８９.８３±５°、γ＝８９.９５±５°の単位格子サイズを含むＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインの結晶が提供される。特定結晶化条件により、単位格子を特性検定するパラメーターは限られた範囲で変動し得、たとえば、ａ、ｂ、ｃは各々５オングストローム以下で変動し、α、β、γは各々５°以下で変動し得る。本発明の空間群はＰ１単純三斜晶である。
【００１３】
本発明による「単位格子」の語は、基本形状ブロックをいう。結晶の全体積は、上記ブロックの規則的な組立により構築され得る。各単位格子は完全表示のパターン単位を含み、その反復により結晶が構築される。
【００１４】
本発明による「空間群」の語は、結晶の対称要素の配置をいう。
【００１５】
本発明の別の実施態様では、リガンドと複合したＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶が提供され、その場合結晶は表１の原子構造座標を特徴とする三次元構造を有する。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様において、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインは、配列番号２の配列、そのフラグメントまたは相同体を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の実施態様では、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインは少なくともＡＴＰ−結合部位を含む。
【００１８】
さらに、本発明は、少なくとも１個のリガンドまたは低分子量化合物に結合したＺＡＰ−７０の触媒ドメインを含む結晶を提供する。
【００１９】
本発明による「リガンド」の語は、ＺＡＰ−７０の１個またはそれ以上の特異部位、好ましくはＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、最も好ましくは上記触媒ドメインのＡＴＰ結合部位に結合する一分子または分子群をいう。本発明によるリガンドは、好ましくは低分子量分子である。
【００２０】
本発明による「低分子量化合物」の語は、好ましくは一般的に約１０００未満、さらに好ましくは約５００未満の分子量を有する有機化合物をいう。最も好ましくは、上記低分子量化合物またはリガンドは、ＺＡＰ−７０生物活性を阻害する。
【００２１】
ＺＡＰ−７０阻害剤に関する場合、「ペプチド」または「ペプチド誘導体」の語は、ＺＡＰ−７０キナーゼの結合部位の三次元構造を補うか、または本発明で提供されているようにＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインの三次元結合部位と結合するように物理または化学特性が改良された形で設計され得る「ペプチドミメティック」または「ペプチド類似体」を包含するものとする。
【００２２】
「突然変異体」の語は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０５１４８またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ４３４０３に示されたＺＡＰ−７０キナーゼの野生型配列における１個またはそれ以上の選択されたアミノ酸の欠失、挿入または好ましくは置換による差異をいう。
【００２３】
本発明によると、「突然変異体」の語はまた、アミノ酸配列が、１個またはそれ以上の選択されたアミノ酸の欠失、挿入または好ましくは置換により配列番号２に示された野生型配列とは異なるポリペプチドをいう。たとえば、本発明の触媒ドメインのＺＡＰ−７０突然変異体は、好ましくは配列番号２と少なくとも５０％の相同性、さらに好ましくは配列番号２と少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは配列番号２と少なくとも９０％の相同性を示す。
【００２４】
本発明によるＺＡＰ−７０触媒ドメインの「フラグメント」は、配列番号２によるＺＡＰ−７０触媒ドメインの完全長配列の５０％より大、さらに好ましくは配列番号２によるＺＡＰ−７０触媒ドメインの完全長配列の少なくとも８０％、最も好ましくは配列番号２によるＺＡＰ−７０触媒ドメインの完全長配列の少なくとも９０％を含む。
【００２５】
本発明の一実施態様では、触媒ドメインのＺＡＰ−７０突然変異体は、少なくとも１個のリガンドを伴い、または伴わずに結晶化され得る。
【００２６】
本発明の別の実施態様では、触媒ドメインのＺＡＰ−７０フラグメントは、少なくとも１個のリガンドを伴い、または伴わずに結晶化され得る。
【００２７】
本発明のさらに別の実施態様では、ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体が、結晶化に先行するいずれかの工程で少なくとも１個のリガンドに結合される方法が提供される。
【００２８】
本発明によると、ＺＡＰ−７０結晶は、適切な条件下に保たれた場合、少なくとも１ヶ月間は安定している。Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.２が、沈澱を生じないＺＡＰ−７０の濃縮に適切なものとして同定されている。最初に精製する間、高濃度のグリセリン（３０〜５０％ｖ／ｖ）が好ましく、５〜１０ｍｇ／ｍｌ過剰のタンパク質濃度で迅速な沈澱が生じる。最終濃縮工程中では、１％ｖ／ｖエチレングリコールをグリセリンと置き換えることにより、３０ｍｇ／ｍｌ過剰の濃度に到達され得る。追加的カチオン交換工程も、濃縮および結晶化工程を妨げる不正確に折りたたまれたかまたは不安定なＺＡＰ−７０を除去するのに推奨される。
【００２９】
配列番号２の精製タンパク質ＺＡＰ−７０触媒ドメイン、その相同体またはフラグメントは、プロテアーゼ認識配列が両端に隣接する完全長ＺＡＰ−７０配列番号１を最初に発現させることによる本発明方法により有利に得られる。この方法は、所望のドメインを典型的には完全長タンパク質から単離し、次いで発現させる当業界で公知の標準的方法よりも好ましい。
【００３０】
ニッケル−キレート化アフィニティーカラムを用いたＮ−末端標識完全長ＺＡＰ−７０の精製により、追加の「標準的」クロマトグラフィー手順、たとえばイオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーでは、容易には精製され得ない純度が限られたタンパク質が生じる。本発明によると、γ−アミノフェニル−ＡＴＰセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーは、高純度のＺＡＰ−７０タンパク質をもたらす好ましい精製手段である。所望のＺＡＰ−７０触媒ドメインの同定は、好ましくは免疫化学的方法、たとえばウエスタン−ブロッティングを用いる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、以下の工程を含むＺＡＰ−７０キナーゼの結晶の製造方法が提供される：
（ｉ）完全長ＺＡＰ−７０キナーゼ（配列番号１）の精製、
（ii）タンパク質加水分解ドメインの特定
（iii）ＺＡＰ−７０の所望のドメインのタンパク質加水分解的放出を容易にするためプロテアーゼ認識配列を両端に隣接させた配列番号１の完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（iv）適切な宿主細胞における工程（iii）からの完全長ＺＡＰ−７０キナーゼの発現
（ｖ）プロテアーゼ認識部位における所望のドメインの制御されたタンパク質加水分解
（vi）所望のＺＡＰ−７０ドメインの迅速な精製。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、上記結晶製造方法は、配列番号２のＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体を含むＺＡＰ−７０キナーゼドメインの所望のドメインを含む。
【００３３】
本発明によると、ＺＡＰ−７０は、天然供給源、たとえば培養ヒト細胞から単離により、または好ましくは組換え異種発現により製造され得る。組換えＺＡＰ−７０の発現は、真核生物または原核生物系で達成され得る。たとえば、組換えヒトＺＡＰ−７０は、適切な組換えバクロウイルス系を用いることにより昆虫細胞、たとえばＳｆ９細胞で、または細菌で発現され得る。
【００３４】
キナーゼは、融合タンパク質、たとえばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン標識融合タンパク質として発現され得る。所望ならば、融合パートナーを結晶化前に除去する。結晶化に使用される異種生産ＺＡＰ−７０は、生物学的活性を示す。上記能力は、当業界で公知の形態学的、生化学的または生存能力分析により測定され得る。
【００３５】
ＺＡＰ−７０突然変異体の製造方法は、当業界では公知である。たとえば、ＺＡＰ−７０突然変異体は、オリゴ−ヌクレオチド指定突然変異導入法によりそのコーディング領域に予め修飾が加えられたＺＡＰ−７０ ＤＮＡの発現により製造され得る。
【００３６】
本発明では、精製ＺＡＰ−７０は、好ましくは少なくとも９０％均一である。タンパク質均一性は、当業界でよく知られている分析方法、たとえば配列分析、電気泳動、分光分析またはクロマトグラフィー技術により測定され得る。精製タンパク質は酵素活性を有する。当業界で公知の適切な基質、たとえば天然基質または合成基質に対するＺＡＰ−７０キナーゼ活性を測定するための適切な検定法がある。
【００３７】
本発明の一実施態様では、結晶化に先行して、ＺＡＰ−７０を、ＺＡＰ−７０触媒ドメイン部位へ適切に結合し得る低分子量化合物またはリガンドと反応させ得る。好ましいのは、ＺＡＰ−７０活性を阻害する化合物である。キナーゼ阻害は当業界で公知の検定法を用いて測定され得る。適切な阻害剤には、触媒ドメインに作用してＺＡＰ−７０活性を阻害するＡＴＰ−競合的キナーゼ阻害剤がある。
【００３８】
蒸気拡散、透析またはバッチ結晶化を含む様々な結晶化方法が本発明では使用され得る。蒸気拡散結晶化では、少量（すなわち数マイクロリットル）のタンパク質溶液を、沈澱剤含有溶液と混合する。少量、すなわち約１ｍｌの沈澱剤を含むウェルにこの混合容量を懸濁させる。ドロップからウェルへの蒸気拡散により、ドロップに結晶が形成される。
【００３９】
結晶化の透析方法は、タンパク質を保持するが小分子（すなわち、緩衝剤および沈澱剤）を内外に拡散させ得るサイズ排除半透膜を使用する。透析では、タンパク質および沈澱剤を蒸発により濃縮するのではなく、膜を通して沈澱剤をゆっくりと拡散させ、タンパク質濃度を一定に保ちながらタンパク質の溶解度を低下させる。
【００４０】
バッチ法では、一般的に、タンパク質の水溶液へ沈澱剤をゆっくりと加え、ついに溶液が混濁し始めると、この時点で容器は密閉され、結晶化が起こるまで一定期間平静な状態で放置され得る。バッチ技術では、沈澱剤および標的分子溶液を単に混合するだけである。過飽和は、拡散によるのではなく直接的に達成される。バッチ技術は、油下で実施されることが多い。油は蒸発を阻止し、極微小滴が使用され得る。このため、「ミクロバッチ」の語が使用される。この技術に加えられた修正は、パラフィン油（蒸発を完全に阻止する）を使用するのではなく、緩速な蒸発が可能となるようにシリコーン油またはシリコーン油およびパラフィン油の混合物を使用することである。
【００４１】
本発明は、いかなる結晶化方法でも全て包含し得る。当業者であれば、上記方法のいずれかを選択し、選択された方法により所望の結晶が得られるようにパラメーターを変え得るはずである。
【００４２】
ＺＡＰ−７０の好ましい一結晶化方法では、ＺＡＰ−７０溶液を「レザーバー緩衝液」と混合し、結晶形成に必要な低濃度の沈澱剤を用いる。結晶を形成させるためには、沈澱剤の濃度を、たとえば沈澱剤をたとえば滴定によって加えることにより、または沈澱剤の濃度を拡散により結晶化緩衝液およびレザーバー緩衝液間で釣り合わせることにより増加させなければならない。適切な条件下、沈澱剤の上記拡散は、沈澱剤の勾配に沿って、たとえば沈澱剤の濃度が高いレザーバー緩衝液から沈澱剤の濃度が低い結晶化緩衝液中へ行なわれる。拡散は、たとえば、標準気相で水を拡散させる蒸気拡散技術により達成され得る。公知技術は、たとえば蒸気拡散方法、たとえば「ハンギング・ドロップ」または「シッティング・ドロップ」方法である。蒸気拡散方法では、タンパク質を含む結晶化緩衝液のドロップが、かなり大量のレザーバー緩衝液のプールの天井に張りつくかまたは床に張りついている。別法として、沈澱剤の均衡は、レザーバー緩衝液から結晶化緩衝液を分離し、レザーバー緩衝液中へのタンパク質の希釈を阻止する半透膜を通して達成され得る。
【００４３】
ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメイン結晶の形成は、本質的に以下のパラメーターにより決定される様々な条件下で達成され得る：ｐＨ、塩および添加物の存在、沈澱剤、タンパク質濃度および温度。ｐＨは、たとえば約４.０〜９.０の範囲であり得る。
【００４４】
本発明はまた、ＺＡＰ−７０触媒ドメイン結晶構造モデルを記憶させたコンピューター可読性媒体に関するものである。好ましい実施態様において、上記モデルは、表１の原子座標に示されたＸ線回折データの全部または一部から構築される。
【００４５】
本発明は、ヒトＺＡＰ−７０触媒ドメインの構造座標を提供する。「構造座標」または「原子座標」の語は、ＺＡＰ−７０触媒ドメインを含む結晶の原子（散乱中心）によりＸ線の単色ビームの回折で得られたパターンに関連した数学の等式から誘導される数学的座標をいう。回折データを用いて、結晶の反復単位の電子密度マップを算出する。電子密度マップを用いて、結晶の単位格子内における個々の原子の位置を確立する。
【００４６】
本発明結晶性組成物の構造座標は、機械可読性記憶媒体、たとえばコンピューターハードドライブ、ディスケット、ＤＡＴテープなどにおいて機械可読性形態で記憶され得、三次元形状として画面に表示されるか、または他に構造座標またはそれらが特定する三次元構造のコンピューター支援による操作またはそれに基づいたコンピューター操作に使用され得る。たとえば、ＺＡＰ−７０ファミリーのタンパク質、または上記タンパク質の一部分または構造上類似した相同体の三次元構造を特定するデータは、機械可読性記憶媒体に記憶され得、そして典型的には上記記憶媒体からデータを読取り得るコンピューターを用いることにより、タンパク質構造のグラフィカル三次元表示として画面に表示され、上記データからの表示作製についての命令によりプログラム化され得る。
【００４７】
本発明の一実施態様では、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含むＺＡＰ−７０キナーゼを結晶化し、
（ii）ｘ線回折データを上記結晶についての原子座標形態で集め、
（iii）表１の原子座標を全体的または部分的に用いることにより、ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体の三次元構造を測定する
ことを含む方法が提供される。
【００４８】
本発明の別の実施態様では、少なくとも１個のリガンドに結合したＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメイン（配列番号２）、そのフラグメントまたは相同体を含む複合体の三次元構造の測定方法であって、
（ｉ）複合体の結晶についてのｘ線回折データを得、
（ii）全体的または部分的に表１の原子座標を用いて複合体の三次元構造を測定する
ことを含む方法が提供される。
【００４９】
本発明によると、三次元ＺＡＰ−７０モデルは、ＺＡＰ−７０の触媒ドメイン、そのフラグメントまたは相同体を含むＺＡＰ−７０結晶から得られる。かかるモデルは、ｘ線回折座標、特に表１の原子構造座標を用いることにより、本発明のＺＡＰ−７０キナーゼ構造データの全部または一部から構築または精密化され得る。
【００５０】
ＺＡＰ−７０の触媒結合部位の三次元モデルから得られた知識は様々な方法で使用され得る。たとえば、それを用いることにより、ＺＡＰ−７０に結合し、好ましくはＺＡＰ−７０伝達または関連プロセスまたは事象を遮断または阻止するか、またはＺＡＰ−７０アゴニストとして作用する化学物質、たとえば小有機および生体有機分子、たとえばペプチドミメティクスおよび合成有機分子が同定され得る。ＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造を用いることにより、当業者であればＺＡＰ−７０のモデルを構築できるはずである。たとえば、あらゆる分子が適切なファンデルワールス半径の球体として描かれ得、ＺＡＰ−７０触媒ドメインの詳細な表面マップが構築され得る。
【００５１】
ＺＡＰ−７０の触媒結合部位の接近可能表面を模倣する表面を有する化学物質は、当業者により構築され得る。例を挙げると、当業者であれば、化合物の三次元構造データベースをスクリーニングすることにより、類似した三次元構造配置に適切な官能基を配置させた化合物を同定し、次いで上記化学物質をめぐるコンビナトリアルケミストリーライブラリーを構築することにより、ＺＡＰ−７０の触媒結合部位に対して高い親和力を有するものを同定し得る。
【００５２】
本発明の一実施態様では、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、
（ｉ）表１における原子座標のセットから全体的または部分的に誘導された触媒ドメインの三次元構造を用いることにより、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合する可能なリガンドまたは低分子量化合物を選択し、
（ii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択する
工程を含む方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の実施態様では、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物の同定方法であって、ＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインが上記ドメインの少なくともＡＴＰ−結合部位を含むものである方法が提供される。
【００５４】
本発明のさらに別の実施態様では、ＺＡＰ−７０キナーゼの生物活性を阻止するリガンドの同定方法が提供される。
【００５５】
リガンドまたは小分子化合物は、化合物データベースまたはライブラリーをスクリーニングし、コンピューター手段を用いてＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインにおける結合部位へのフィッティングオペレーションを形成させることから同定され得る。表１の構造座標により全体的または部分的に本発明で提供されるＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造は、様々なドッキングプログラムと一緒に使用され得る。
【００５６】
ＺＡＰ−７０に対する化学物質の潜在的阻害または結合作用は、その実際の合成およびコンピューターモデリング技術の使用による試験前に分析され得る。所定の化学物質の理論的構造がそれとＺＡＰ−７０間における不十分な相互作用および会合を示唆する場合、化学物質の合成および試験についての必要性は回避される。しかしながら、コンピューターモデリングが強い相互作用を示す場合、分子が合成され、そのＺＡＰ−７０への結合能力について試験され得る。すなわち、費用がかかり、時間の浪費である効力のない化合物の合成が回避され得る。
【００５７】
ＺＡＰ−７０の阻害性または他の結合性化合物は、コンピューターにより評価され、化学物質またはフラグメントをスクリーニングし、ＺＡＰ−７０の個々の結合部位との会合能力について選択する一連の工程を通して設計され得る。すなわち、当業者であれば、幾つかの方法の一つを用いることにより、ＺＡＰ−７０とのその会合能力について化学物質またはフラグメントをスクリーニングし得る。このプロセスは、たとえば、全体的または部分的に表１の構造座標に基づいたコンピュータースクリーンで結合部位を視覚的に観察することから開始され得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学物質を様々な配向で配置させるか、またはＺＡＰ−７０の触媒結合部位内で「ドッキング」させ得る。ドッキングは、ソフトウェア、たとえばＱｕａｎｔａおよびＳｙＬｙｌ、次いでエネルギー最小化および標準分子力学力場による動力学法、たとえばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲを用いて実施され得る。専門のコンピュータープログラムは、興味深いフラグメントまたは化学物質を選択するのに有用であり得る。これらのプログラムには、たとえば、英国オックスフォードのオックスフォード・ユニバーシティーから入手され得るＧＲＩＤ、マサチューセッツ、バーリントンのモレキュラー・シミュレーションズから入手され得る５ＭＣＳＳまたはＣＡＴＡＬＹＳＴ、カリフォルニア、ラジョラのスクリップス・リサーチ・インスティテュートから入手され得るＡＵＴＯＤＯＣＫ、カリフォルニア、サンフランシスコのユニバーシティー・オブ・カリフォルニアから入手され得るＤＯＣＫ、英国、ユニバーシティー・カレッジ・オブ・ロンドンから入手され得るＸＳＩＴＥがある。
【００５８】
分子置換法を用いて一連の座標、たとえば本発明の表１の座標を利用することにより、結晶性ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインまたはその一部分の構造を、たとえば、１個またはそれ以上のリガンドまたは低分子量化合物に結合させることにより複合体を形成させ得る。
【００５９】
「分子置換」の語は、構造座標が既知である分子を配向および配置させることにより、構造座標が未知である結晶の予備構造モデルを作製することを含む方法をいい、たとえば、未知結晶の単位格子内におけるＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメイン座標のように、未知結晶の観察された回折パターンの最善の説明を求める。次いで、このモデルから位相を計算し、観察された振幅に付加することにより、座標が未知である構造の近似したフーリエ合成が得られる。次いで、これを幾つかの精密化形態のいずれかにかけることにより、未知結晶の正確な最終構造が提供され得る。本発明により提供される構造座標を用いて、分子置換法を用いることにより、結晶性共複合体、未知リガンド、突然変異体または相同体、またはＺＡＰ−７０キナーゼの異なる結晶形態の構造座標が測定され得る。さらに、要求された結晶およびその座標を用いることにより、ＺＡＰ−７０と会合する化学物質の構造座標が測定され得る。
【００６０】
本発明による「ホモロジー・モデリング」では、１個またはそれ以上の関連タンパク質、タンパク質ドメインおよび／または一サブドメイン、たとえばＺＡＰ−７０キナーゼの触媒ドメインの構造座標を用いて未知構造のモデルを構築する。ホモロジー・モデリングは、三次元構造を解明すべきタンパク質またはペプチドの共通または相同部分を、相同的構造要素の三次元構造にフィッティングさせることにより実施され得る。ホモロジー・モデリングは、アミノ酸または他の成分を解明すべき関連構造のものと置換することにより三次元構造の一部または全部を再構築することを含み得る。
【００６１】
本発明による分子置換は、既知構造を有する分子を使用する。データキャリヤでの機械可読性形態をした表１で全体的または部分的に提供されたＺＡＰ−７０の触媒ドメインの三次元構造は、未知結晶試料の構造をモデリングするための出発点として使用され得る。この技術は、単位格子において類似構造、配向および位置を有する２個の分子は同様に回折するという原理に基づいている。分子置換では、未知構造と同じ位置および配向で単位格子における既知構造を配置させる。一旦配置させると、単位格子における既知構造の原子を用いて、仮定的回折実験から生じる構造因子を計算する。この場合、実験データとの既知構造のアラインメントが達成されるまで、六次元（三角度および三空間的次元）で既知構造を回転させる。この近似構造を微調整することにより、様々な精密化技術を用いてさらに正確で、多くの場合解像能が高い構造を得ることができる。たとえば、実験データにより特定された構造について作製されたモデルを剛体精密化にかけ得、その場合モデルを６次元で制限された追加回転にかけることにより、約５％未満の位置決めシフトが得られる。次いで、他の公知精密化方法を用いることにより、精密化モデルをさらに精密化し得る。本発明はまた、ＺＡＰ−７０触媒ドメインの相同体および突然変異体およびそれらの結晶構造の解明を可能にする。本発明で提供されているＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造に基き、そして全体的または部分的に表１の原子座標を用いることにより、部位特異的突然変異の効果が予測され得る。さらに具体的には、本明細書で提供されている構造情報により、アミノ酸修飾、特に置換、挿入または欠失変異型を生じさせるアミノ酸突然変異にとって望ましい部位が同定され得る。上記変異型は、特殊な特性、特に野生型ＺＡＰ−７０触媒ドメインとは区別される特性、たとえば改変された触媒活性を有するように設計され得る。置換、欠失および挿入を組合わせることにより、所望の変異型が達成され得る。上記変異型は、当業界でよく知られた方法により、たとえば野生型ＺＡＰ−７０触媒ドメインから出発して、または新たな合成により製造され得る。
【００６２】
ＺＡＰ−７０触媒ドメインはまた、本明細書に開示されたものとは異なる形態で結晶化し得る。たとえば配列番号２および全体的または部分的に表１で提供されている構造情報もまた、他の結晶形態の構造を解明するのに有用である。さらに、それは、ＺＡＰ−７０触媒ドメイン突然変異体、ＺＡＰ−７０触媒ドメイン共複合体または充分な相同性タンパク質の構造を解明するのに役立ち得る。
【００６３】
本明細書で提供されているＺＡＰ−７０触媒ドメイン構造情報は、ＺＡＰ−７０触媒ドメインと選択的に相互作用することにより、ＺＡＰ−７０の生物活性を特異的に調節し得るリガンドまたは小分子化合物の設計に有用である。さらに、この情報は、ＺＡＰ−７０突然変異体、たとえば触媒活性が改変された突然変異体の設計および製造、三次元構造のモデリングおよびたとえば分子置換を含む、タンパク質、たとえばＺＡＰ−７０触媒ドメイン相同体、ＺＡＰ−７０触媒ドメイン突然変異体またはＺＡＰ−７０触媒ドメイン共複合体の結晶構造の解明に使用され得る。
【００６４】
本発明は、ＺＡＰ−７０触媒ドメインに結合し得るリガンドまたは低分子量化合物の設計方法であって、
（ｉ）全体的または部分的に表１の原子座標を用いてＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造を測定し、
（ii）候補リガンドまたは低分子量化合物でＺＡＰ−７０触媒ドメインの三次元構造をプローブすることにより、どれがＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するかを測定し、
（iii）ＺＡＰ−７０の触媒ドメインに結合するリガンドまたは低分子量化合物を選択し、
（iv）所望により、結合することにより物理的結合特性、たとえば溶解性、親和力、特異性または有効性を最大化するリガンドまたは低分子量化合物を修飾してもよい
工程を含む方法を提供する。
【００６５】
好ましいのは、触媒結合部位で相互作用するＺＡＰ−７０阻害剤の設計方法ある。本発明はまた、上記方法により同定される化学物質またはリガンドに関するものである。本発明により可能となる一方法では、ＺＡＰ−７０触媒ドメインの構造座標の使用により、ＺＡＰ−７０キナーゼと結合または会合する化学物質を設計し、種々の点で化学物質の物理特性を改変させる。すなわち、特性、たとえば可溶性、親和力、特異性、有効性、オン／オフ割合、または他の結合特性が全て、改変および／または最大化され得る。種々の物質のライブラリーで触媒ドメインを含むＺＡＰ−７０結晶をプローブして、候補化学物質およびＺＡＰ−７０間における相互作用に最適な部位を決定することにより、所望の化学物質が設計され得る。たとえば、溶媒で飽和させた結晶から収集された高解像能ｘ線回折データにより、各タイプの溶媒分子が付着する場所が測定され得る。次いで、それらの部位に堅固に結合する小分子を設計し、合成し、所望の活性について試験し得る。一旦所望の活性が得られると、分子はさらに望ましい特性を最大化するように改変され得る。
【００６６】
本発明はまた、小分子データベースのコンピュータースクリーニングまたはＺＡＰ−７０触媒ドメインに全体的または部分的に結合し得る化学物質の設計に関するものである。それらはまた、突然変異体、共複合体、またはＺＡＰ−７０キナーゼの少なくとも一部分と相同性であるかまたはそれと会合し得る他のいずれかの分子の結晶性形態の結晶構造の解明に使用され得る。この目的に使用され得る一方法が分子置換である。未知構造であり得る未知結晶構造、たとえばＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインの別の結晶形態、ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメイン突然変異体またはペプチド、またはＺＡＰ−７０キナーゼとの共複合体、または興味の対象であるＺＡＰ−７０と会合する化学物質の他のいずれかの未知結晶は、表１に示された構造座標の全部または一部を用いて測定され得る。この方法は、本発明によらずに上記情報の測定を試みる場合より迅速かつ有効に未知結晶についての正確な構造形態を提供する。
【００６７】
本発明の好ましい一実施態様では、候補リガンドをインシリコでスクリーニングする。すなわち、得られた情報を用いることによりＺＡＰ−７０の最大有効阻害剤またはアゴニストが得られる。ＺＡＰ−７０を阻害またはそれに対してアゴニスト作用を示す化学物質の設計では、一般的に少なくとも２つの因子を考慮に入れる。第一に、化学物質は、物理的または構造的にＺＡＰ−７０と、好ましくはＺＡＰ−７０の触媒部位で会合し得るものでなくてはならない。会合は、物理的、構造的または化学的会合、たとえば共有または非共有結合、またはファンデルワールス、疎水性、または静電性相互作用であり得る。第二に、化学物質は、ＺＡＰ−７０と、優先的にはＺＡＰ−７０の触媒部位で会合させ得る立体配座を呈し得るものでなくてはならない。化学物質の全部が必ずしもＺＡＰ−７０との会合に関与するわけではないが、それらの非関与部分も依然として分子の全体的立体配座に影響を及ぼし得る。これはまた、化学物質の望ましさに対して著しい悪影響を有し得る。上記立体配座要件は、結合部位の全部または一部に関して化学物質の総合的三次元構造および配向を包含する。
【００６８】
一旦化合物が上記方法により設計または選択されると、その化合物がＺＡＰ−７０に結合し得る有効性が、コンピューターまたは実験的評価法を用いることにより最大所望特性（複数も可）について試験および修正され得る。様々なパラメーターが所望の結果により最大化され得る。これには、特異性、親和力、オン／オフ割合、疎水性、溶解性、および当業者により容易に同定され得る他の特徴があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６９】
本発明はまた、ＺＡＰ−７０を調節する化合物の同定に関するものである。好ましいのは、ＺＡＰ−７０活性を阻害する化合物であり、たとえばＴ細胞およびリンパ球活性化を伴う疾患および状態の処置に有用な可能性がある。
【００７０】
本発明は、分子設計技術、特に合理的薬剤設計方法を使用することにより、ＺＡＰ−７０活性を不可逆的または可逆的に調節し得る、ＺＡＰ−７０阻害剤を含む、新規または改良された化学物質および化合物の製造を可能にする。改良された化学物質または化合物とは、インビボ投与についての適合性を含む治療用途に関連性のある特性、たとえば細胞取込、溶解性、（酵素的）分解に対する安定性、結合親和力または特異性などに関してこれらの物質または化合物が、それらの由来する「原初の」または親化合物よりも優れていることを意味する。たとえば、本明細書で提供された情報に基づくと、共有結合的または好ましくは非共有結合的にＺＡＰ−７０に結合するＺＡＰ−７０阻害剤を特別に設計することが可能である。上記阻害剤は、競合的または非競合的に作用し、ＺＡＰ−７０の活性部位でまたはその付近で結合するかまたはアロステリック的に作用し得る。
【００７１】
ＺＡＰ−７０モジュレーターの設計においては、以下の局面を考慮すべきである：（ｉ）候補化合物が、物理的および構造的にＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインと会合し得るかどうか、および／または（ii）化合物が、ＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメインとの会合を可能にする立体配座をとるかどうか。有利には、モジュレーターの全体としてまたはそのフラグメントとしてのこれらの能力を評価するプロセスでコンピューターモデリング技術を使用することにより、非有効的候補化合物の合成または試験に要する努力を最小限にする。専門的コンピューターソフトウェアは当業界ではよく知られている。
【００７２】
別の設計方法では、様々な異なる化学物質でＺＡＰ−７０触媒ドメイン結晶をプローブすることにより、候補ＺＡＰ−７０阻害剤および標的酵素間における相互作用に最適な部位を決定する。本発明から生じるさらに別の可能性は、ＺＡＰ−７０触媒ドメインに全体的または部分的に結合し得る化学物質または化合物についての小分子データベースをコンピューターでスクリーニングすることである。結合部位への適合の質は、たとえば形状相補性により、または推定される相互作用エネルギーにより判定され得る。次いで、修飾の三次元配置に関する知識は、新規ＺＡＰ−７０リガンドまたは低分子量化合物、たとえば選択的阻害剤の設計に利用され得る。
【００７３】
ＺＡＰファミリー要員と会合し得る化学物質は、タンパク質の天然リガンドとのその相互作用を阻害し得、上記相互作用が伝達する生物機能を阻害し得る。ＺＡＰ−７０の場合、上記生物機能には免疫応答中におけるＴ細胞の活性化が含まれる。上記化学物質は潜在的薬剤候補である。
【００７４】
上記手段のいずれかにより選択または設計された構造の化合物は、ＺＡＰファミリータンパク質へ結合し、ＺＡＰファミリータンパク質のその天然または非天然リガンドへの結合を阻害し、および／またはＺＡＰファミリー要員が伝達する生物学的機能を阻害するそれらの能力について試験され得る。
【００７５】
以下の実施例は、本発明を説明する役割を果たすもので、それに対する制限とみなすべきではない。本発明は、特にこれらの実施例に記載された実施態様に関するものである。本明細書に記載された方法のいずれかにより初めに同定された化合物もまた本発明に包含される。
【００７６】
実施例
実施例１：完全長ＺＡＰキナーゼの初回精製
ＺＡＰ−７０キナーゼの完全長アミノ酸配列は、配列番号１に与えられている。Ｎ−末端Ｈｉｓ６標識完全長ＺＡＰキナーゼはＳｆ９細胞で発現され、これは、Ｎ−末端がＮ−末端メチオニンおよびプロリン（２位）間におけるヘキサ−ヒスチジン配列の挿入により修飾されており、その結果このプロリンが８位にあるという点で野生型配列とは異なっている。細胞ペレットを採取し、必要時まで−８０℃で冷凍する。３９ｇの湿った細胞ペレットを、３５０ｍｌの氷冷緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ８、１２ＥＤＴＡ不含有コンプリート（登録商標）プロテアーゼ阻害剤錠剤含有、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０％ｖ／ｖグリセリン、０.１ｍＭのＭｎＣｌ２、１０ｍＭのイミダゾールおよび３００ｍＭのＮａＣｌ）に懸濁する。ヘイドルフ−ディアックス組織粉砕機を用いて、細胞を３分間氷上で溶菌した後、ガラス−テフロン製ホモジナイザーで１０ストロークによりホモジナイズする。生成したライゼートを４℃、４３０００ｇで４５分間遠心分離にかけ、それに続いて連続グラスファイバー１.２μＭおよび０.４３μＭ濾過膜により濾過する。この澄明化上清を、緩衝液Ａにより平衡させた２０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（キアゲン）アフィニティー樹脂を含むＸＫ１６／２０クロマトグラフィーカラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ）に２ｍｌ／分の流速でローディングする。一旦全材料がローディングされると、フロー−スルー材料のＵＶ−吸光度がもう一度基準レベルにもどるまでカラムを緩衝液Ａで洗浄する（４ｍｌ／分の流速で）。この時点（同じ流速を使用）で、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、１０％ｖ／ｖグリセリン、５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５０ｍＭのイミダゾール）をカラムに適用し、溶離するタンパク質のピークを集める。この物質を、２ｍｌ／分の流速で緩衝液Ｃ（２５ｍＭのトリス ｐＨ８.０、３０％ｖ／ｖグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ２および５０ｍＭのＮａＣｌ含有）により平衡させたγ−アミノフェニル−ＡＴＰセファロースの１６ｍｌカラムへ直接ローディングする。７カラム容量において緩衝液Ｃ中で０〜１ＭのＮａＣｌの勾配を適用することにより、カラムを溶離する。溶離ピークを、３００００Ｍｒカットオフ膜（アミコン）を用いる限外濾過により約７ｍｌに濃縮し、緩衝液Ｃ（ただし５０ｍＭのＮａＣｌ不含有）により平衡させたスーパーデックス７５（ＸＫ１６／６０）サイズ排除カラムを用いてさらに精製する。ＺＡＰ−７０モノマー含有フラクションを集め、プールした後、２.５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、それに続いて限定タンパク質加水分解的消化を行う。
【００７７】
完全長ＺＡＰ−７０は、還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されたところによると約６０％の純度でＮＴＡ−アガロースカラムから溶離される。それに続くγ−アミノフェニル−ＡＴＰセファロースの１６ｍｌカラムでのクロマトグラフィーにより、濃縮され得るかなり高い純度の幾分広いピークが得られる。このピークの詳細な分析結果は、初期に溶離するフラクションの方が主に凝集物質を含むこと、およびプロファイルの最後に向かう分離したピークが高純度のモノマーＺＡＰの大部分を含むことを明らかにしている。サイズ排除クロマトグラフィーにより、〜９０％の割合でタンパク質を含む主要ピークが得られ、残りは、二量体または凝集タンパク質が溶離すると予測される位置で僅かに早く溶離している。この段階で、調製物の純度は９０％より多く、微小キナーゼドメインの限定タンパク質加水分解的特定での使用に適切である。この段階で、タンパク質加水分解的消化後に存在する追加配列の数を最小限にするために極めて高い純度が非常に重要である。
【００７８】
実施例２：タンパク質加水分解的触媒ドメインの特定
ＺＡＰ−７０を室温で２０時間１：１００濃度比で以下のプロテアーゼとインキュベーションする：サーモリシン、カルボキシペプチダーゼＡ、トロンビン、Ａｒｇ Ｃ、Ｇｌｕ Ｃ、Ｘａ因子、カルボキシペプチダーゼＹ、キモトリプシン、Ｌｙｓ Ｃ、Ａｓｐ Ｎ、エラスターゼ、トリプシンおよびズブチリシン（１：１比）。インキュベーション後、試料を除去し、還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（ノヴェックス４〜２０％ゲル、インビトロゲン）にかけ、非消化対照と比較する。速く移動する方のバンドが観察され、それらが触媒ドメインを含むのに充分なサイズ（〜３０ｋＤａ）を有する場合、試料を再びＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｈｉｓ６抗体（シグマ、Ｈ−１０２９）を用いるウエスタン・ブロッティングを行う。これは、Ｎ−末端およびＣ−末端ＺＡＰ−７０フラグメント（Ｈｉｓ６標識はＮ−末端にあり、したがって抗Ｈｉｓ６免疫反応性を示す形態はＣ−末端が先端切除されており、興味の対象ではない）を同定するためである。非免疫反応性フラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、電気泳動的にＰＶＤＦ膜へ移動させ、バンドを視覚化し、切除し、それらのＮ−末端配列を解析する。
【００７９】
サーモリシン、トリプシン、Ｇｌｕ Ｃ、Ａｓｐ Ｎおよびエラスターゼにより消化後、触媒ドメインを含むのに充分な大きさ（〜３０ｋＤａ）を有する、速く移動するバンドが観察される。（Ｈｉｓ）６Ｎ−末端標識に対するウエスタン・ブロッティング時、非免疫反応性フラグメントをトリプシン、エラスターゼおよびサーモリシン消化により製造し、それによって原初のＣ−末端であるものとして特定する。これらのフラグメントを配列決定する。トリプシンおよびサーモリシンの両消化により、Ｎ−末端としてイソロイシン２９９をもつフラグメントを得る。エラスターゼはアルギニン２９８フラグメントを生じさせ、サーモリシンは追加的ロイシン２７７フラグメントを生じさせる。これらの結果に基づき、ロイシン２７７およびアルギニン２９８から始まるＺＡＰ触媒ドメインは、潜在的に結晶化に適切なものとして同定される。
【００８０】
実施例３：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ＩおよびＩＩ構築物のクローニング
若干の触媒ドメイン構築物を精製するという以前の試みは、可溶性タンパク質の発現レベルが低く、これらのタンパク質が不安定である故に困難であることがわかった。この不安定性は、一つには、分離されたドメインのインビボ折りたたみが不正確であること、そして一つには構築物の長さが最適ではないことに起因し得る。したがって、所望のドメインの有効なタンパク質加水分解的放出が容易になるようにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ認識配列を両端に隣接させた、完全長ＺＡＰ−７０を発現させる。ＺＡＰ−７０の完全長版の限定タンパク質加水分解から得られた結果に基づき、２種の構築物を製造した：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）Ｉ、ロイシン２７７（構築物における残基２８５）の直前にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ部位が挿入されたＣ−末端Ｈｉｓ６−標識ＺＡＰ−７０およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）II、２個の上記部位、すなわちアルギニン２９８（構築物における残基３０６）の上流に１個およびＣ−末端Ｈｉｓ６標識の上流に１個を含み、結果的にこれは同時に除去され得る。オリゴヌクレオチドＭＧ４７４およびＲＳ３６６（それぞれ配列番号３および４参照）および野生型完全長ＺＡＰ−７０遺伝子をコード化するプラスミドＮＰＬ２１７３（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号Ｌ０５１４８）により、原初ＮＰＬ２１７３へ組込まれたとき、アラニン２９７およびアルギニン２９８間にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位を導入させ得るＤＮＡフラグメントを増幅する。別の開裂部位をアラニン６１９の後に付加し、（Ｈｉｓ）６標識に先行させる。以前に報告された要領（Geiser et al. Biotechnology ２００１）でＰＣＲフラグメントの組込みを行う。生成したプラスミドを配列決定し、正確なクローンをｐＸＩ３４７（ＰｌａｓＮｏｖａ ＮＰＬ００３７９２）と命名する。同様に、オリゴヌクレオチドＭＧ４７５およびＭＧ４７９（配列番号５および配列番号６）と共にＮＰＬ２１７３プラスミド鋳型から得られたＰＣＲフラグメントを組込むことにより、プラスミドｐＸＩ３４５（ＮＰＬ００３７９３）を構築する。ｐＸＩ３４５では、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位をトレオニン２８２およびロイシン２７７間に組込み、（Ｈｉｓ）６標識の前にあるＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位を除去する。次いで、線状化バクロウイルスＤＮＡと一緒に昆虫細胞へトランスフェクションすることにより、２つのプラスミドを導入する。アミノ酸の番号付けは、精製標識を含み、プロテアーゼ認識配列が挿入されていることによって、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０５１４８の場合とは異なる配列に基づいている。
【００８１】
完全サイズＺＡＰ−７０の限定タンパク質加水分解の結果に基づき、２７６、２９７位の後およびアミノ酸６１９位の後にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位を導入した。ＺＡＰ−７０の新規突然変異体をコード化するプラスミドをそれぞれｐＸＩ３４５およびｐＸＩ３４７と称する。これらのプラスミドは、タンパク質ＺＡＰ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ＩおよびＺＡＰ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ＩＩをそれぞれコード化する。突然変異の結果として、完全長タンパク質の完全および高特異的タンパク質加水分解は、ＺＡＰ−７０の触媒ドメインの高い定量的収率を伴う形で実施され得る。
【００８２】
実施例４：バクロウイルスにおけるＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ II ＺＡＰの発現および中規模発酵
１０％胎児牛血清を含むエクセル４０１培地で増殖させたＳｆ２１細胞を、トランスフェクション試薬としてバクフェクチンを用いたリポフェクションにより５００ｎｇの各組換え体導入ベクターおよび５μｌの線状ＡｃＮＰＶウイルスＤＮＡ（ＢａｃＰＡＫ６）でトランスフェクションする（両試薬ともＢＤ／クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）。５日間のインキュベーション後、トランスフェクション上清を採取し、プラーク検定にかけて、均一ウイルス集団を誘導する。選別したウイルスプラークを単離し、両ウイルスの充分な作業ウイルスストックが発現されるまで、ローラー培養においてエクセル４０１＋１％ＦＣＳ中で懸濁培養したＳｆ２１細胞の感染によりさらに増幅させる。これらを再びプラーク検定により滴定する。
【００８３】
１０ ｌの作業容量でのウェーブ・バイオリアクター（ウェーブ・バイオテックＡＧ、ターゲルスバンゲン、スイス国）を用いて大規模生産を実施する。ＳＦ９００II培地（ギブコ／ライフ・テクノロジーズ）で成長しているＳｆ９細胞を、ウェーブ・バッグに接種し、連続３日間成長させて、約５×１０６細胞・ｍｌの最大細胞密度に到達させる。培養および感染プロセス中、ウェーブリアクターサーモプレートの気流、揺動速度および揺動角度を監視および調節する。Ｓｆ９細胞を、１.６〜４.９×１０６細胞／ｍｌの細胞密度および０.５、１および２ｍ.ｏ.ｉ.間の異なる感染多重度（ｍ.ｏ.ｉ.）で感染させる。ウイルス添加と同時に、イーストレート（ギブコ／ライフ・テクノロジーズ）を、４ｇ／ｌの最終濃度で培養物に供給する。感染期間中細胞密度および細胞生存能を注意深く記録する。
【００８４】
増幅させた作業ウイルスストックのプラーク検定法により、ＺＡＰ７０ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）Ｉ構築物については５.６×１０７ｐｆｕ／ｍｌおよびＺＡＰ−７０ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）II 構築物については１.７×１０８ｐｆｕ／ｍｌの力価が得られる。それに続いて２種のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ＺＡＰ構築物の１０リットル大規模生産に両方を使用する。両タンパク質とも充分に発現され、少なくとも部分的に可溶性である。しかしながら、ＮＴＡスーパーフロー精製ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）IIのＬＣ−ＭＳは、非−、一、二および三リン酸化完全長キナーゼと対応すると考えられる質量７２４０４、７２４７８、７２５５７および７２６３５による幾つかのピークを示したが、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）Ｉ構築物は、質量を割当てるのが不可能であるほど不均一なＬＣ−ＭＳスペクトルを与えたため、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）II 構築物の生産に発現努力を全て集中させた。
【００８５】
実施例５：Ｓｆ９培養物採取の最適化方法
バクロウイルス発現系は溶菌系である。感染が進行すると、細胞は死亡し、溶解し、それらの内容物を培地へ放出する。細胞内発現されるタンパク質、たとえばＺＡＰの発現の場合、細胞溶解を通してこれが失われる前に最大タンパク質発現が行なわれる発現の小さな「ウインドウ」がある。典型的には、ウエスタン・ブロッティングを、感染の時間経過および感染多重度（ｍ.ｏ.ｉ.）の変動と連係的に使用することにより、この時点を測定する。しかしながら、ＺＡＰ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）IIの場合、発現レベルの増加が不溶性タンパク質レベルの増加をも伴うという観察が為された。したがって、１ｇ量の細胞を溶解する迅速な小規模精製は、「精製可能」ＺＡＰの「オンライン」リードアウトをもたらす。
【００８６】
１ｇの細胞ペレットを、発酵中における異なる時点で除去し、以前に報告された要領（ただし、１コンプリート（登録商標）ＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤錠剤を含む、１５ｍｌの溶菌緩衝液を使用）で溶解する。規模縮小故に、０.５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロースカラムを使用し、溶菌から分離されたタンパク質内容物の分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ評価までを通した全過程を３〜４時間に減らす。４８時間の最適化採取時間で、可溶性ＺＡＰの収率は、約０.７５ｍｇの精製可能なＺＡＰ／ｇ（細胞）または〜７.５ｍｇ／リットル（培養物）へと４倍増加され得る。
【００８７】
実施例６：ＺＡＰキナーゼ触媒ドメインに結合しているスタウロスポリン
限定タンパク質加水分解により特定されたＺＡＰ−７０キナーゼ触媒ドメイン（Ｒ２９８−Ａ６１９；配列番号２）を、Ｃ末端Ｈｉｓ６−アフィニティー標識を伴うが、２個のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ部位が両端に隣接した完全長ＺＡＰ−７０キナーゼとして再クローン化する。１０リットルのウェーブ（登録商標）バイオリアクター（０.４５ｍ.ｏ.ｉ.；４８時間）で成長させたＳＦ９細胞を用いて、発現を実施する。コンプリート（登録商標）ＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷緩衝液Ａ（５０ｍＭのＮａＰＯ４、１０％ｖ／ｖグリセリン、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ８.０）中で細胞を溶解する。ライゼートを２０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロースカラムに通し、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、次いで緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリス、１０％ｖ／ｖグリセリン、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ８.０）により溶離する。クロマトグラフィー工程は全て、氷上または被覆した冷却カラムを用いて実施する。タンパク質を、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、３０％ｖ／ｖのグリセリンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのトリスｐＨ８.０中へ直ちに脱塩し、（５０ｍｌのセファデックスＧ−２５脱塩カラム使用；ＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／１０アマシャム・バイオサイエンシーズ）、濃縮し、スタウロスポリンを加えて２モル過剰とする（ＤＭＳＯに溶かしたスタウロスポリンの正確な量の添加により２ｍｇ／ｍｌとする）。
【００８８】
タンパク質溶液（６０ｍｌ）を必要時まで−８０℃で冷凍し、次いで３００００Ｍｒカットオフ限外濾過膜（アミコン）を用いて１０〜１５ｍｌに濃縮した後、スーパーデックス７５（登録商標）を充填し、２５ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび３０％ｖ／ｖグリセリンにより平衡させたＸＫ２６／９０カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにかける。フラクションを集め、モノマー物質に対応するもの（約４０ｍｌ）をプールし、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼとインキュベーションすることにより、分子の残りから触媒ドメインを切除する。典型的には、４２ｍｇのＺＡＰ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）II を含む、４０ｍｌの溶液を、４２０μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ溶液により室温で１３５分間消化する。開裂反応を逆相ＨＰＬＣによりモニターしたところ、反応は、緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＮａＰＯ４、５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２：ｐＨ７.２）へ即座に脱塩することにより可能な限り迅速に停止され得る。典型的には、３×１４ｍｌ分量として、５ｍｌ／分の流速でＨｉＬｏａｄ（登録商標）２６／１０カラムに適用する。一リン酸化（２５％）および非リン酸化（７５％）ＺＡＰの混合物を含む脱塩タンパク質を、緩衝液Ｃ中で平衡させたＨＲ１０／８カチオン交換カラム（モノＳ（登録商標）アマシャム・バイオサイエンシーズ）に適用する。カラムを１ｍｌ／分の流速でローディングし、５１２ｍｌに対し０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて２ｍｌ／分で溶離する。
【００８９】
主要ピークが溶離され、一リン酸化タンパク質は約８０ｍＭのＮａＣｌで溶離し、非リン酸化タンパク質は約１００ｍＭのＮａＣｌで僅かに遅れて溶離する。非−および一リン酸化ＺＡＰキナーゼ触媒ドメインピークを別々に集め、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７.２（５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％ｖ／ｖのエチレングリコール含有）中へ脱塩（ＨｉＬｏａｄ２６／１０カラム）する。スタウロスポリンを、再び１０モル過剰として両形態に加え、それに続いて結晶化するためそれらを１０〜４０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。この脱塩工程により、クロマトグラフィーに要求されるグリセリン（それが無ければタンパク質が沈澱する）が除去され、濃縮工程を通してタンパク質を充分に安定させるが、後続の結晶化を妨げることはない低濃度のエチレングリコールと置き換えられるため、この工程は重大である。他方、３０％ｖ／ｖグリセリンは、蒸発性シッティング・ドロップ工程に対して大きすぎる影響を有するため、結晶化に適切ではない。非リン酸化タンパク質の場合、溶離したピークの半分、３６ｍｌを１３０μｌに濃縮し、３６ｍｇ／ｍｌの最終濃度とする。
【００９０】
発酵および採取条件の最適化により、ＮＴＡカラムから溶離されるＺＡＰ ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）II の純度が７５％を超え、開裂前にサイズ排除クロマトグラフィー工程により充分に精製され得るようにＺＡＰ発現レベルが高められる。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼにより開裂後、分子のキナーゼおよびＮ末端部分を表す類似質量の２つのバンドが観察される。カチオン交換クロマトグラフィーを適用することにより、２形態を分離する。Ｎ−末端部分は使用条件下でカラムを通過する。カラムから溶離される２つのピークは、２種の異なるリン酸化形態を表していた：約８０ｍＭのＮａＣｌで溶離する一リン酸化タンパク質および約１００ｍＭのＮａＣｌで僅かに遅れて溶離する非リン酸化タンパク質。これらの異なる形態を結晶化させるため別々に集める。非リン酸化形態の収率は、一リン酸化形態より約４倍高いため、大部分の結晶学的努力は非リン酸化形態に集中される。
【００９１】
実施例７：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ II ＺＡＰの結晶化
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０％グリセリンおよびスタウロスポリン中の９ｍｇ／ｍｌのＺＡＰ−７０非リン酸化触媒キナーゼドメインを、９６ウェルのシッティング・ドロップ結晶プレートを用いた初回結晶化スクリーニングに使用する。最初の有望な微結晶は１０℃での結晶化スクリーンにより得られる。これらの結晶化条件の最適化をハンギング・ドロップ蒸気拡散法により実施する。１０℃での結晶化スクリーンは以下の結晶化条件を有する：０.１ＭのトリスｐＨ７.５、０.１ＭのＫＣｌ、１８％ＰＥＧ５０００モノメチルエーテル。この結晶化条件の最適化を、タンパク質調製物の処方の最適化と一緒にすることにより大きな結晶が得られる。ハンギング・ドロップ蒸気拡散を最適化に使用する。回折する単結晶は、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のエチレングリコールおよびスタウロスポリン中の２９ｍｇ／ｍｌのＺａｐ７０非リン酸化キナーゼドメインにより得られる。最適成長条件は、０.１ＭのトリスＨＣｌ ｐＨ７.５、０.２ＭのＫＣｌ、２０％のＰＥＧ５０００モノメチルエーテル、１０℃の結晶化温度である。結晶は１〜２日後に現われ、最適結晶サイズには１〜２週間後に達する。単結晶の中には成長するものもあるが、別個のクラスターを破壊することにより大部分の単フラグメントが得られる。
【００９２】
実施例８：タンパク質生産およびヒトＺＡＰ−７０プロテインキナーゼ触媒ドメインの結晶化
ヒトＺＡＰ−７０プロテインキナーゼ触媒ドメイン（非リン酸化）の配列番号２を結晶化に使用する。構築物は、ＺＡＰ−７０残基２９８〜６１９に加えてＮ末端にあるＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位からの２個の追加残基およびＣ末端にあるＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位からの６残基を含む。小さいが充分に回折する単結晶は、２９ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度および１％エチレングリコールの調製物により得られる。最適成長条件は、２０％ＰＥＧ５０００モノメチルエーテル、０.１ＭのトリスＨＣｌ ｐＨ７.５、２００ｍＭのＫＣｌである。結晶は１〜２日後に現われ、最適結晶サイズには１〜２週間後に達する。単結晶も形成されるが、別個のクラスターを破壊することにより大部分の単フラグメントが得られる。
【００９３】
凍結保護
結晶をドロップから、結晶化溶液（ウェル溶液）に加えて２０％（ｖ／ｖ）のグリセリンおよび１ｍＭの阻害剤から成る溶液中へ移す。０.０５μｍのクライオループに載せた結晶をこのクライオバッファーに約１０〜１５秒間浸漬し、次いで液体プロパン中へ浸す。
【００９４】
データ収集
結晶を液体プロパン中で凍結させ、スイス国ビリンゲンにおけるＳＬＳでのＭＡＲ ＣＣＤカメラにより８０Ｋで回折データを集める。０.９８０３オングストロームの波長を使用する。各々振動１.０°で、１フレームにつき６秒の曝露時間および１４０ｍｍの結晶−検出器距離を用いて３４０画像を集める。未処理回折データを処理し、ＨＫＬプログラムパッケージバージョン１.９６.６（OtwinowskiおよびMinor、１９９６）によりスケーリングする。結晶データおよびデータ統計を表２に示す。
【００９５】
構造決定および精密化
触媒Ｚａｐ７０キナーゼドメインの構造を、検索モデルとしてＬＣＫキナーゼドメインｘ線構造（ｐｂｄ：３ＬＣＫ、YamaguchiおよびHendrickson、１９９６）の座標を用いて、分子置換により測定する。ＬＣＫの残基２４５〜５０１を使用し、ホスホ−Ｔｙｒ残基３９４を配列類似性比較のために除去する。
【００９６】
４.０オングストロームの最大解像能までのデータを用いて、ＣＣＰ４における自動分子置換スクリプトにより分子置換を実施する。インプット構造および非対称単位における２分子との５０％フラクション類似性をもつモデルの８０％フラクション完全性が予測される。澄明溶液が見出され、標準スクリプトｒｅｆｉｎｅ.ｉｎｐを用いたＣＮＸにおける初回精密化後、構造は４１.７％のＲ因子を有する（ＲＦｒｅｅ４３.５％）。プログラムＯバージョン７.０（Jones et al.、１９９１）によるσＡ−秤量Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップを調べると、Ｃ−アルファトレースの大部分および側鎖の大部分についての強い密度が明らかになる。電子密度の外側に見出され、手動で補正しなくてはならない幾つかの挿入および欠失および若干のループが存在する。
【００９７】
ヒトＺＡＰ−７０プロテインキナーゼ触媒ドメインのモデルを構築し、必要な場合調節して密度にフィットさせる。挿入、突然変異および欠失がそれに応じて加えられる。ＺＡＰ−７０についてのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ４３４０３エントリーの番号付けを用いて番号付けを変更した。モデル再構築工程により散在させた、ねじれ角力学的調整およびエネルギー最小化の若干のサイクルにより構造を精密化する。精密化については、ＣＮＸ２０００の「ｒｅｆｉｎｅ．ｉｎｐ」スクリプトを、以下の（ノン−デフォルト）オプション：バルク溶媒補正（マスク方法に基づく）と共に使用する。
【００９８】
反射の５％を含む試験セットを用いて、精密化について終始交差検定を使用する。水分子が、ＣＮＸスクリプトｗａｔｅｒ＿ｐｉｃｋ．ｉｎｐで同定され、ピーク高差異（３.０σより大）、水素結合および距離基準に基づいて選択される。ＮＣＳ束縛を、非対称単位における２分子について使用する。
【００９９】
最終精密化モデルの質を、プログラムＣＮＸ２０００（Brunger、１９９８）により評価する（図７参照）。画像をＯ（Jones et al.、１９９１）またはＷｅｂＬａｂ ＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ３.５（モレキュラー・シミュレーションズ、インコーポレイテッド）で作製する。
【０１００】
結果
ヒトＺａｐ７０キナーゼドメインの小さな単結晶が、ｐＨ７.５のＰＥＧＭＭＥにより得られる。結晶は、１非対称単位につき２モノマーで空間群Ｐ１において成長する。分子置換により構造を決定する。最終モデルは、２つのキナーゼドメイン（残基３３１〜６０３）、１キナーゼドメインにつきスタウロスポリン１分子および２６１個の水分子を含む。それは、結合長に関して０.０１１オングストロームおよび結合角に関して１.３°のｒｍｓ偏差をもつ良好な幾何を有する。最終Ｒ因子は、１９.２６オングストロームおよび１.９０オングストローム間の全反射について０.１８２（Ｒｆｒｅｅ＝０.２０９）であった。
【０１０１】
全体的構造
結晶構造は非常に明確に特定され、残基３３１および６０３間の完全ｃ−アルファが特定されている。全ループおよび重要な残基は、良好な電子密度を有する。Ｂ−因子分布は予想通りである。スタウロスポリン結合部位およびキナーゼドメインとの全相互作用は詳細に報告され得る。モデルの品質は良好であり、最終Ｒ因子は１８.２％である（Ｒ−ｆｒｅｅ２０.９％）。
【０１０２】
ＺＡＰ−７０キナーゼドメインは典型的キナーゼドメインフォールドに折りたたまれる。残基の大部分は、僅かな例外を伴うが電子密度により明確に特定されている：Ｎ末端残基２９６〜３３０およびＣ末端残基６０４〜６２５は、完全に乱れているため、ｘ線構造では見られない。明確に特定された電子密度を示さない分子の表面には僅かな側鎖がある。若干の側鎖は、側鎖の位置の改変を明白に示す。それらは精密化されなかった。スタウロスポリン結合部位に近い立体配座の改変を伴う唯一の側鎖があり、それは重要なものであり得る：ＳＥＲ４７８。
【０１０３】
β５およびαＤ間にリンカー領域の電子密度がある。この領域は、稀な配列（Ａｌａ４１７−Ｇｌｙ４１８−Ｇｌｙ４１９−Ｇｌｙ４２０−Ｐｒｏ４２１）を有し、スタウロスポリン結合部位の一部を形成する。この領域は秩序正しく、電子密度は明確に特定されている。２つの重要な接触がある（Ｇｌｕ４１５Ｏ−Ｎ１、Ａｌａ４１７Ｎ−Ｏ５）。
【０１０４】
スタウロスポリン結合部位
スタウロスポリン結合部位は、以下の残基の疎水性側鎖によりほぼ形成されている：Ｌｅｕ３４４、Ｐｈｅ３４９、Ｖａｌ３５２、Ｖａｌ３９９、Ｍｅｔ４１４、Ｍｅｔ４１６、Ａｌａ４１７、Ｌｅｕ４６８。結合ポケットの深部で、２つの極性相互作用がスタウロスポリン結合の誘因となる。すなわち、残基Ｇｌｕ４１５の主鎖カルボニル酸素はスタウロスポリンの窒素Ｎ１に結合し、残基Ａｌａ４１７の主鎖ペプチド窒素はスタウロスポリンのカルボニル酸素Ｏ５と相互作用する。スタウロスポリン分子の他端には、糖部分とタンパク質間の極性相互作用が僅かに存在する。スタウロスポリンメトキシ基はファンデルワールス接触のみを形成するが、−Ｎ−Ｍｅｔ基は、若干の溶媒分子および残基Ｌｙｓ４２４、Ｈｉｓ４２３、Ａｒｇ４６５（ペプチド結合のカルボキシ酸素も含む）、Ａｓｐ４７９、Ａｓｎ４６６の側鎖により形成される水素架橋ネットワークを通してタンパク質と相互作用する。
【０１０５】
若干のよく知られているキナーゼ構造によるアラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ）は、配列変動性が幾分高いことを示している。それにも拘わらず、ｃ−アルファトレースを重ね合わせた場合、通常比較的良好なフィットが認められる（５３〜５９％）。
【０１０６】
アラインメントから、Ｚａｐ７０と比べて、多くのキナーゼは挿入または欠失を有するため、構造を細部にわたってことごとくモデリングすることは非常に困難である。それにも拘わらず、ＡＴＰ−結合部位は、比較的保存された構造を有し、キナーゼドメインの残りの大部分よりモデリングし易い。
【０１０７】
リン酸化部位
活性化セグメントにおける残基のリン酸化は、基質結合残基および触媒残基を正確に位置決めする触媒キナーゼドメインにおける立体配座の変化を誘発し、そして立体的遮断の除去により触媒部位へ基質を接近させ得る。
【０１０８】
ここで結晶化されたキナーゼドメインはリン酸化されていない。しかしながら、Ｚａｐ７０は、若干のチロシン残基を含んでおり、それらはインビボでリン酸化され、キナーゼ活性の調節およびアダプター分子結合の誘因となり得る。我々がＡＴＰ結合部位を標的としているという事実故に、我々が非活性化／リン酸化キナーゼドメインの構造しか有していないことは、当然大した欠点ではない。
【０１０９】
リン酸化部位４７４、４９２、４９３、５９７および５９８は、ｘ線構造で特定されている。チロシン４９２および４９３は、両方とも活性化ループに位置する。Ｌｃｋによるチロシン４９３のトランスホスホリレーションは、Ｚａｐ７０の活性化を導く（Chan et al.１９９５、Wange et al、１９９５、Mege et al.１９９６）。このチロシン残基は、トランスホスホリレーション時に活性化ループの主要立体配座変化を誘発するインスリン受容体キナーゼドメインのチロシン１１６３に対応する（Hubbard、１９９７）。すなわち、チロシン４９３がリン酸化されたＺＡＰ−７０の対応する活性化ループの構造は、本明細書に示されたものとは異なると思われる。チロシン４９２の役割はそれほど明確ではない。負の調節機能が提案されている（Chan et al.１９９５）。チロシン４７４は、Ｒａｓ経路へＴ細胞受容体シグナルをカップリングする、Ｓｈｃアダプターとの会合に必要とされる（Pacini,et al.１９９８）。表面露出チロシン４７４は、以後の活性化セグメントに近い、β８セグメントの始まりに位置する。Ｃ−末端に近いタンパク質の表面に位置するチロシン５９７および５９８は、恐らくは阻害性タンパク質によるＺＡＰ−７０の機能的活性の調節に関与していると思われる（Zeitlmann et al.１９９８）。
【０１１０】
【表１】
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【表２】
2006500059.tif 000003
【表３】
2006500059.tif 000004
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
2006500059.tif 000069
【表６９】
2006500059.tif 000070
【表７０】
2006500059.tif 000071
【表７１】
2006500059.tif 000072
【表７２】
2006500059.tif 000073
【表７３】
2006500059.tif 000074
【０１１１】
【表７４】
2006500059.tif 000075
【０１１２】
【表７５】
2006500059.tif 000076
【０１１３】
【表７６】
2006500059.tif 000077
【配列表】
2006500059.tif 000078
2006500059.tif 000079
2006500059.tif 000080
2006500059.tif 000081
2006500059.tif 000082
2006500059.tif 000083
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月25日(2005.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006500059000001.app
【国際調査報告】
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