(57)【要約】本発明は、鳥類の始原生殖細胞の生殖系列転移効率の改善方法、これを用いた鳥類キメラ及び形質転換体の製造方法に関するものであって、さらに詳細には、(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞(gonadal primordial germ cells, gPGCs)を分離する段階、及び(ｂ)前記始原生殖細胞を少なくとも５日間インビトロ(in vitro)培養する段階を含む鳥類の始原生殖細胞の生殖系列転移効率の改善方法に関するものであって、本発明の方法は、ｇＰＧＣｓの生殖系列転移効率を改善するにおいて、その方法の実施が簡易でありながらも、それにより達成される生殖系列転移効率の改善の程度が非常に大きい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞を分離する段階、及び
(ｂ)前記始原生殖細胞を少なくとも５日間インビトロ(in vitro)培養する段階、を含む、
鳥類の始原生殖細胞の生殖系列転移効率を改善する方法。
【請求項２】
(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞を分離する段階、
(ｂ)前記始原生殖細胞を少なくとも５日間インビトロ培養する段階、
(ｃ)前記培養された始原生殖細胞を受容体胚子に注入する段階、及び
(ｄ)前記受容体胚子を含む卵を培養及び孵化し、生殖系列キメラ鳥類個体を収得する段階、を含む、
生殖系列転移効率の改善された鳥類の生殖系列キメラの製造方法。
【請求項３】
(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞を分離する段階、
(ｂ)前記始原生殖細胞に外来遺伝子を転移する段階、
(ｃ)前記外来遺伝子の転移された始原生殖細胞を少なくとも５日間インビトロ培養する段階、
(ｄ)前記培養された始原生殖細胞を受容体胚子に注入する段階、及び
(ｅ)前記受容体胚子を含む卵を培養及び孵化し、鳥類形質転換体を産生する段階、を含む、
生殖系列転移効率の改善された鳥類形質転換体の製造方法。
【請求項４】
前記鳥類は、ニワトリ、鶉、七面鳥、鴨、鵞鳥、雉または鳩であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。 
【請求項５】
前記始原生殖細胞(PGCs)は、胚子の始原生殖腺から分離されたことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、少なくとも８日間実施されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、少なくとも１０日間実施されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、細胞成長因子及び分化抑制因子の含まれた培地で実施されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞成長因子は、肝細胞因子、繊維芽細胞成長因子、インターロイキン−１１、インシュリン様成長因子−１及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化抑制因子は、白血病抑制因子であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、鳥類血清、哺乳類血清及びそれらの混合物からなる群から選択される血清を含む培地で実施されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、始原生殖腺由来基底細胞層上で実施されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記段階(ｂ)でインビトロ培養された始原生殖細胞は、ステージ特異胚子抗原−１(SSEA-1)を発現することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記始原生殖細胞を受容体胚子に注入する段階は、始原生殖細胞を受容体胚子の大動脈に注入して実施されることを特徴とする、 請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記始原生殖細胞に外来遺伝子を転移する段階は、リポソーム媒介形質感染または電気穿孔法(electroporation)により実施されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記外来遺伝子は、選択マーカーとして抗生剤耐性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記外来遺伝子は、選択マーカーとして抗生剤耐性遺伝子を含み、前記(ｃ)段階の後に、抗生剤耐性を示す始原生殖細胞を選択する段階がさらに含まれて、前記(ｄ)段階は、抗生剤耐性を示す始原生殖細胞を用いて実施することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類の生殖系列転移効率を改善する方法に関するものであって、さらに詳細には、鳥類の始原生殖細胞の生殖系列転移効率の改善方法、これを用いた鳥類キメラ及び形質転換体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
鳥類の始原生殖細胞の移動パターンは、哺乳動物とは非常に差があり、このような独特の移動パターンは、始原生殖細胞を受容体胚子の血管に注入することにより、生殖系列キメラを製造することを可能にする。性の成熟後、生殖細胞の前駆細胞である始原生殖細胞は、胚盤葉の外胚葉から由来されて、明域の杯盤葉下層に移動する(１、２)。その後、始原生殖細胞は、血管系を循環して、最終的に始原生殖腺原基に定着し、コロニーを形成する(３)。先行の研究によると、生殖半月(４、５)または胚子血管(６)から収集した始原生殖細胞を受容体胚子に転移すると、生殖系列キメラを形成することができる。しかし、移植に提供される始原生殖細胞を胚子組織から収集する場合、その数にかなりの制限がある。
【０００３】
始原生殖腺に定着した(settling down)後は、移動能力を失うと知られている(３)。しかし、チャンら(Chang et al.)(７)は、胚子始原生殖腺から得られた移動段階の過ぎた始原生殖細胞を、移動段階にある受容体胚子に転移した場合、生殖系列転移を誘導することができることを発表した。
【０００４】
一方、生物反応器として、形質転換鳥類は、生命工学及び医学分野において形質転換哺乳動物より大きな応用性を有する(８)。鳥類生殖細胞は、血管系を通じて胚子の始原生殖腺に移動するため、生殖細胞を媒介とした生殖系列キメラは、形質転換鳥類を誘導するに最も効率的な手段の一つとして見なされている。今まで、ニワトリの生殖系列キメラを提供するための数多い試みがあって(６、９、１０)、始原生殖腺由来の始原生殖細胞(gonadal primordial germ cells, gPGCs)の移植システムは、形質転換家禽の産生における数多い難点を克服するために開発された(７、１１、１２)。本発明者らの先行の研究で、最初に、ニワトリｇＰＧＣｓの転移を通じて生殖系列キメラを製造した結果を発表し(７)、この実験で、受容体胚子の初期段階に移植されて胚子の始原生殖腺に転移された始原生殖細胞は、移動能力を回復した。しかし、前記研究結果によると、生殖系列転移効率は、依然として低い水準に止まっており、これを向上させる必要があった。
【０００５】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されてその引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、鳥類の始原生殖細胞の生殖系列転移効率を改善して、効率的に鳥類キメラを産生するために鋭意研究した結果、始原生殖細胞をインビトロ(in vitro)培養すると、生殖系列転移効率が大きく向上し、これを用いてキメラを産生する場合は、生殖系列キメラを高い効率で産生することができることを確認し、本発明を完成した。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、鳥類始原生殖細胞の生殖系列転移効率を改善する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、生殖系列転移効率の改善された鳥類生殖系列キメラの製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、生殖系列転移効率の改善された鳥類形質転換体の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によりさらに明白になる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一様態によると、本発明は、(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞を分離する段階、及び(ｂ)前記始原生殖細胞を少なくとも８日(→５日)間インビトロ培養する段階を含む鳥類始原生殖細胞の生殖系列転移効率を改善する方法を提供する。
【００１２】
本発明者らは、始原生殖細胞を用いた形質転換鳥類またはキメラ鳥類の産生において、最終的に産生された形質転換体またはキメラの生殖系列転移効率(germline transmission efficiency)を改善するために多様な試みをして、その結果、適合な期間インビトロ培養された始原生殖細胞を利用する場合、産生されたキメラ鳥類の生殖系列転移効率が驚くほど著しく増加することを確認した。
【００１３】
本明細書の用語‘生殖系列転移’は、他の個体の胚子に注入された始原生殖細胞が世代を経て子孫に伝達される様相を意味する。
【００１４】
本発明の方法が適用できる対象は、鳥類に該当する動物であって、好ましくはニワトリ、鶉、七面鳥、鴨、鵞鳥、雉及び鳩であり、より好ましくは、ニワトリ及び鶉であり、最も好ましくは、ニワトリである。
【００１５】
本発明に利用できる始原生殖細胞は、多様なソースから得られるが、最も好ましくは、鳥類の胚子の始原生殖腺(embryonic gonad)から分離されたものである。始原生殖細胞のソースとして胚子を利用する場合、本発明で利用される供与体胚子は、多様な段階に進入したものが利用できて、好ましくは、胚発達ステージ約２４〜３６(約４日齢〜１０日齢)、最も好ましくは、胚発達ステージ約２８(約５．５日齢)の胚子が利用される。始原生殖腺から始原生殖細胞を収得する方法は、多様であって、本発明者らの大韓民国特許第３０５７１５号及び大韓民国特許第２６７６３３号に開示されている。例えば、卵黄の除去された胚子から始原生殖腺を回収して、始原生殖腺にタンパク質分解酵素(例えば、トリプシン)を処理し、始原生殖腺細胞を分離する。このような始原生殖腺細胞は、多様な細胞種の群集であって、始原生殖細胞の他にも基底細胞(stroma cells)などが含まれている。本明細書の用語‘始原生殖腺細胞(gonadal cells)’は、始原生殖腺に存在するあらゆる細胞種の群集を意味し、用語‘始原生殖腺由来の始原生殖細胞(gonadal primordial germ cells)’は、後に生殖細胞となる始原生殖腺細胞の一種を指すもので、‘ｇＰＧＣｓ’とも略称する。
【００１６】
本発明の最も大きな特徴は、適合な期間、即ち、少なくとも５日間インビトロ培養された始原生殖細胞を利用することである。本発明の好ましい具現例によると、前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、少なくとも８日間実施して、より好ましくは、少なくとも１０日間実施する。このように、インビトロ培養されたｇＰＧＣｓを用いて産生された鳥類キメラまたは形質転換体は、著しく増加した生殖系列転移効率を示す。
【００１７】
本発明のインビトロ培養に利用される培地は、動物細胞の培養に用いられる通常的な培地が利用できるが、本発明の好ましい具現例によると、前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、細胞成長因子及び分化抑制因子の含まれた培地で実施される。本発明の培地に利用される前記細胞成長因子は、肝細胞因子(stem cell factor)、繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor)、インターロイキン−１１(interleukin-11)、インシュリン様成長因子−１またはそれらの混合物を含む。本発明の培地に利用される前記分化抑制因子は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)を含む。また、本発明のインビトロ培養に利用される培地は、鳥類血清(例えば、ニワトリ血清)、哺乳類血清(例えば、牛胎児血清)及びそれらの混合物を含む、その他にも、始原生殖細胞のインビトロ培養に利用される培地は、ピルビン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノールなどを含む。  
【００１８】
本発明の好ましい具現例によると、前記始原生殖細胞のインビトロ培養は、始原生殖腺由来の基底細胞層上で実施される。始原生殖細胞は、基底細胞層に付着されて増殖し、コロニーを形成する。
【００１９】
本発明の方法により処理された始原生殖細胞は、始原生殖細胞に特異性を示すステージ特異胚子抗原−１(SSEA-1)を発現する。
【００２０】
上述の本発明の方法により生殖系列転移効率が大きく改善された始原生殖細胞は、鳥類キメラまたは形質転換体において生殖系列転移効率を大きく向上させる。即ち、本発明の要旨は、鳥類キメラまたは形質転換体の産生効率を向上させることではなく、鳥類キメラまたは形質転換体において生殖系列転移効率を向上させるために始原生殖細胞を処理する方法にある。一方、このような生殖系列転移効率の改善は、インビトロ培養されたｇＰＧＣｓが転移された始原生殖腺環境に適応するように再プログラム化された結果で判断される。
【００２１】
本発明の方法は、ｇＰＧＣｓの生殖系列転移効率を改善するにおいて、その方法の実施が簡易でありながらも、それにより達成される生殖系列転移効率の改善程度が非常に大きい。また、本発明の方法は、当業界で未だに解決できなかった、ｇＰＧＣｓを用いた効率的な生殖系列キメラ産生システムの構築を最初に可能にしたものである。
【００２２】
本発明の他の様態によると、本発明は、(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞を分離する段階、(ｂ)前記始原生殖細胞を少なくとも５日間インビトロ培養する段階、(ｃ)前記培養された始原生殖細胞を受容体胚子に注入する段階、及び(ｄ)前記受容体胚子を含む卵を培養及び孵化し、生殖系列キメラ鳥類個体を収得する段階を含む、生殖系列転移効率の改善された鳥類生殖系列キメラの製造方法を提供する。
【００２３】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、(ａ)鳥類の胚子の始原生殖腺から始原生殖細胞を分離する段階、(ｂ)前記始原生殖細胞に外来遺伝子を転移する段階、(ｃ)前記外来遺伝子の転移された始原生殖細胞を少なくとも５日間インビトロ培養する段階、(ｄ)前記培養された始原生殖細胞を受容体胚子に注入する段階、及び(ｅ)前記受容体胚子を含む卵を培養及び孵化し、鳥類形質転換体を産生する段階を含む、生殖系列転移効率の改善された鳥類形質転換体の製造方法を提供する。
【００２４】
上記本発明の二つの方法は、上述したような本発明の始原生殖細胞の生殖系列転移効率を改善する方法を利用するため、その共通する事項は、本明細書の複雑性を引き起こす過度な重複を避けるために、その記載を省略する。
【００２５】
本発明の好ましい具現例によると、始原生殖細胞は、ＳＳＥＡ−１を発現するため、受容体胚子に注入する前に、前記インビトロ培養された始原生殖細胞が始原生殖細胞であるか否かを確認する段階を実施する。このような確認過程は、免疫染色(immunostaining)を通じて行われて、ＳＳＥＡ−1を用いた免疫染色方法は、Solter及びKnowlesの文献(１３)に開示されている。
【００２６】
始原生殖細胞を受容体胚子に注入する方法は、多様な方法により実施できるが、好ましくは、胚子の大動脈に注入する。例えば、適合した数の始原生殖細胞を含む細胞懸濁液を胚子の背側大動脈に微細針で注入し、密封した後、適切な時間培養して実施する。一方、受容体胚子は、多様な発達段階にあるものが利用できるが、好ましくは、胚発達ステージ約１３〜１９(約２日齢〜２．５日齢)、最も好ましくは、胚発達ステージ約１９(約２．５日齢)のものである。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、前記始原生殖細胞に外来遺伝子を転移する段階は、リポソーム媒介形質感染または電気穿孔法により実施される。前記電気穿孔法は、本発明者らが開発した方法により実施することが最も好ましい(参照：大韓民国特許第３０５７１５号)。
【００２８】
一方、受容体胚子への効率的な注入のために、始原生殖細胞のポピュレーション比率を増加させるにフィコール濃度勾配による分離が利用できる(１４)。また、先行の研究によると、フィコール処理が始原生殖細胞の分離に効率的であって、始原生殖細胞の生存性には影響を及ぼさないと報告されている。しかし、下記実施例に記載の本発明者らの実験によると、フィコールによる始原生殖細胞の分離は、本発明のシステムにおいて、始原生殖細胞の生殖系列転移効率にポジティブな効果を奏しなく、却って生殖系列転移効率を低下させる可能性がある。従って、本発明は、フィコール処理に対する要求を完全に排除することができるという長所があり、生殖系列キメラ及び形質転換体の製造過程をより単純且つ便利にすることができる。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によると、前記外来遺伝子は、選択マーカーとして抗生剤耐性遺伝子を含み、前記(ｃ)段階の後に、抗生剤耐性を示す始原生殖細胞を選択する段階がさらに含まれて、前記(ｄ)段階は、抗生剤耐性を示す始原生殖細胞を用いて実施される。本発明に利用できる選択マーカーは、真核細胞に抗生剤を付与する遺伝子であれば何でもよく、例えば、ネオマイシン、プロマイシン及びゼオマイシン耐性遺伝子を含む。選択マーカーを利用する場合は、前記インビトロ培養に利用される胚子は、その耐性遺伝子に該当する抗生剤を含む。
【００３０】
本発明の方法によると、ｇＰＧＣｓを用いたキメラまたは形質転換体鳥類の産生システムにおいて、生殖系列転移効率を大きく改善することができる。
【発明の効果】
【００３１】
以上、詳述したように、本発明は、鳥類の始原生殖細胞の生殖系列転移効率を改善する方法、生殖系列転移効率の改善された鳥類生殖系列キメラの製造方法及び生殖系列転移効率の改善された鳥類形質転換体の製造方法を提供する。本発明の方法は、ｇＰＧＣｓの生殖系列転移効率を改善するにおいて、その方法の実施が簡易でありながらも、それにより達成される生殖系列転移効率の改善の程度が非常に大きい。また、本発明の方法は、当業界で未だに解決できなかった、ｇＰＧＣｓを用いた効率的な生殖系列キメラ産生システムの構築を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００３３】
実験方法
I．ｇＰＧＣｓの回収及び培養
始原生殖細胞は、韓国烏骨鶏(Korean Ogol Chicken : KOC)から得たステージ２８(５．５日孵化)の胚子の始原生殖腺から回収した。ステージ２８の胚子をカルシウム−及びマグネシウム−欠如ＰＢＳ(phosphate buffered saline)で洗浄し卵黄を除去した後、胚子の腹部位を実体顕微鏡下で鋭いピンセットで切断し、始原生殖腺を回収した。回収した始原生殖腺に０．５３ｍＭ ＥＤＴＡの含有された０．０５％(v/v)トリプシン溶液を添加し、これを柔らかくピペッティングして始原生殖腺組織を分離した。２００×ｇで５分間遠心分離した後、本発明者らの提示した一般的なプロトコルによって(１５)、始原生殖腺組織から分離した１×１０4細胞を９６ウェルプレートにシーディングした。初期データによると、シーディングされた始原生殖腺細胞の約１％がｇＰＧＣであるため、一つのウェルにシーディングされたｇＰＧＣｓの数は、１００〜１２０であった。１０％(v/v)牛胎児血清(FBS、Gibco BRL)、２％(v/v)ニワトリ血清(Gibco BRL)、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム(Sigma Co, St Louis, MO)、５５μＭ β−メルカプトエタノール(Sigma)、２０ｎｇ/ｍｌコンアルブミン(Sigma)、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco BRL)、１×抗生剤−antimycotics(Sigma)、５ｎｇ/ｍｌヒト肝細胞因子(hSCF、Sigma)、５ユニット/ｍｌマウス白血病抑制因子(mLIF、Sigma)及び１０ｎｇ/ｍｌ牛の塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF、Sigma)、０．０４ｎｇ/ｍｌヒトインターロイキン−１１(hIL-11、Sigma)及び１０ｎｇ/ｍｌヒトインシュリン様成長因子−Ｉ(hIGF-I、Sigma)が含有されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最小必須培地(Gibco BRL, Grand Island, NY)で、前記シーディングされた細胞を培養した。次いで、分離されたｇＰＧＣｓをＣＯ2培養器で３７℃で５〜１０日間維持した。
【００３４】
II．ｇＰＧＣｓの同定
ステージ特異胚子抗原−１(SSEA-1)染色を用いてｇＰＧＣｓを鑑別した。ＮＩＣＨＤの後援により設立され、アイオワ大学校により維持されるDevelopmental Studies Hybridoma Bank'から、Solter及びKnowles(１３)により開発されたＳＳＥＡ−１抗体を手配した。細胞懸濁液内のｇＰＧＣｓを１％(v/v)グルタルアルデヒドで５分間固定し、１×ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ内に１：１０００の比率で稀釈されたａｎｔｉ−ＳＳＥＡ−１腹水液を添加し、次いでDAKO universal LSABTMキット及びペロキシダーゼ(DAKO, USA)を用いて製造者の提示方法により後続段階を実施した。
【００３５】
III．ｇＰＧＣｓの受容体胚子内への移植
インビボで生殖細胞系列(lineage)に分化する能力を検査するために、０日、５日及び１０日間培養されたＫＯＣ ｇＰＧＣｓを、白色レグホーン(WL)のステージ１７(２．５日齢)胚子の背側大動脈に注入した。実験デザインに従い、移植をする前に、１０％(v/v)及び１６％(v/v)濃度勾配を用いてフィコール分離を実施した。ｇＰＧＣ注入のために、小さいウィンドーを受容体卵の尖端部に作り、１５０〜２００個のｇＰＧＣｓを含む細胞懸濁液約２〜３ｌを胚子の背側大動脈に微細針で注入した。受容体胚子の卵ウィンドーをパラフィンフィルムで２回密封し、孵化が成されるまで、尖端部が下方に向かうようにして培養した。
【００３６】
IV．検定交配分析
本発明者らの標準管理プログラムにより(７)、孵化されたニワトリを６ヶ月まで維持した。次いで、それぞれのニワトリの群が卵または精液を産生できるかどうかの基準により、孵化されたニワトリの性的成熟をモニタリングした。その後、性的に成熟した全てのニワトリに対して検定交配分析をするために、成熟ＫＯＣｓに人為的授精を行った。ＫＯＣの羽の色相は、劣性色素遺伝子(i/i)により黒色であり、ＷＬの羽の色相は、優性色素抑制遺伝子(I/I)により白色である。従って、検定交配で操作されたＷＬから孵化された黒色羽を有する子孫の誕生は、注入されたＫＯＣ ｇＰＧＣｓが受容体ＷＬ胚子で正常的に増殖及び分化するということを証明する。
【００３７】
V．実験デザイン
それぞれの処理効果を評価するために、将来的分析(培養期間及びフィコール処理)または遡及的分析(キメラ性)を実施した。将来的分析をするために、ステージ２８(５．５日齢)のＫＯＣ胚子から収集したｇＰＧＣｓを無作為的に５個の処理群に分けた：１)収集及びフィコール分離後、直ちに受容体胚子に転移(０日培養)、２)５日間培養し、フィコール処理後転移、３)５日間培養し、フィコール処理無しに転移、４)１０日間培養し、フィコール処理後転移、そして５)１０日間培養し、フィコール処理無しに転移。収集後、基底細胞組織からｇＰＧＣを分離することは、収集された組織で１％未満という低いポピュレーションのため、専らフィコール処理後に実施することができるため、将来的分析において、フィコール処理無しで０日培養されたｇＰＧＣｓの転移は排除した。
【００３８】
生殖系列キメラの産生及び生殖系列転移効率に対するそれぞれの処理効果を評価するにおいて、検定交配キメラ産生システムが利用された。キメラ性に対する遡及的データを将来的実験と統合させた。実験変数の全体セットから得られた値を、ＳＡＳプログラムで一般的線形モデル(PROC-GLM)を利用するＡＮＯＶＡに適用した(１６)。それぞれの実験変数で主効果の有意性が検出される場合、処理効果を最小二乗法により比較した。Ｐ値が０．０５未満である時、処理間の有意的差異が決定された。
【００３９】
実験結果
I．始原生殖腺由来の基底細胞とのｇＰＧＣ培養の一般的側面
ｇＰＧＣｓを培養するために、ニワトリ始原生殖腺由来の基底細胞をフィーダー細胞層として利用し、胚子始原生殖腺内にある基底細胞及びｇＰＧＣｓの混合されたポピュレーションを培養容器に同時にシーディングした。基底細胞は、迅速に増殖し、シーディング後５日以内にコンフルエント単一層を形成した反面、ｇＰＧＣｓは、基底細胞のフィーダー細胞層上で遅く増殖し、培養後７日目にコロニーを形成した(図１)。前記コロニーは、コンフルエント基底細胞層に固く結合されており、例えば、細胞層からの分離のような細胞退化信号は、培養の間に観察されなかった。ｇＰＧＣコロニーは、ステージ特異胚子抗原(SSEA)−１エピトープを培養の間に発現したが、これは、始原生殖細胞の典型的な特性を示すものである。
【００４０】
II．生殖系列キメラ産生に対する処理効果
受容体当たり１５０〜２００個のｇＰＧＣｓを注入して、ｇＰＧＣ注入後、総６８３匹のニワトリが孵化した。６ヶ月までの管理後、３０１匹(４４．１％)は性成熟して、これらは後の検定交配実験に提供された。
【００４１】
【表１】
2006514836.tif 000003
【００４２】
上記表１において、生殖系列キメラの数に対する処理のモデル効果は、ｐ値で示して０．６８３１であった。
【００４３】
表１から分かるように、２７匹のニワトリ(雄性１５匹及び雌性１２匹)は、子孫実験で生殖系列キメラと立証された。キメラに対する性成熟したニワトリの比率は、９．０％(２７/３０１)であった。それぞれの処理において、生殖系列キメラ産生の範囲は、５．１％〜１４．４％であって、キメラ産生において有意的処理効果は見つからなかった(ｐ＝０．６８３１)。上記実験結果から、生殖系列キメラの産生効率は、上述の実験的処理による影響を受けないことが分かる。
【００４４】
III．性成熟したキメラにおいて生殖系列転移の効率に対する処理効果
次いで、本発明者らは、生殖系列転移の効率に及ぼす処理効果を比較実験として実施した。将来的分析及び遡及的分析により構成されたそれぞれの処理群のデザインが作られたが、総処理群は９個であって、０日培養群は、フィコール処理群のみを含み、０日培養されたｇＰＣＧｓのフィコール処理後の転移によっては、専ら雄性キメラのみが産生された。上述した不完全なファクトリアル配分のため、完全なブロックデザインが統計的分析に利用された。
【００４５】
【表２】
2006514836.tif 000004
【００４６】
表２から分かるように、有意的(p＜0.0001)モデル効果が確認された。生殖系列転移の効率は、培養期間が増加するほど大きく向上された(0日、5日及び10日培養で、それぞれ0.6％、1.5〜7.8％及び10.7〜49.7％)。同一なインビトロ培養期間において、生殖系列転移は、フィコール処理群よりフィコール非処理群で改善された効率を示した。上記した効果は、１０日培養群でより明白に現れて、キメラ性に関係なく生殖系列転移の有意的(p＜0.0001)増加が確認された(44.7〜49.7％vs. 10.7〜25.4％)。ＳＳＥＡ−１抗体を利用した免疫組織学的分析は、細胞懸濁液内のｇＰＧＣポピュレーションがフィコール処理群と非処理群で差がないことを示した。従って、ｇＰＧＣｓポピュレーションの増加のように、移植のための十分な数のｇＰＧＣｓ回収のための追加的な処理は、フィコール非処理群では不要であった。キメラ性は、転移効率に影響を与えず、フィコール処理された１０日培養群を除いて、同一な培養期間とフィコール処理下で、相異なる性間の有意的差異は見つからなかった(p＝0.6011)。相異なるｇＰＧＣ準備システムから由来のそれぞれのキメラにおける生殖系列転移の誘導は、表３に整理されている。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な技術はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ニワトリ始原生殖腺由来の基底細胞層上に培養された始原生殖腺由来の始原生殖細胞(gonadal primordial germ cells : gPGCs)を示す写真である。パネル(Ａ)は、培養後フィコール処理のないｇＰＧＣｓ、パネル(Ｂ)は、５日間培養したｇＰＧＣｓ、パネル(Ｃ)は、１０日間培養したｇＰＧＣｓをそれぞれ示している。培養されたｇＰＧＣｓは、培養後７日目からコロニーを形成し始めて、培養末期から基底細胞層上に細胞クラスターが定着された。ｇＰＧＣコロニーの同定は、ＳＳＥＡ−１染色を通じて実施した(矢印)。細胞退化を示す典型的な特徴は観察されず、ｇＰＧＣコロニーは、培養の間、コンフルエント基底細胞層に沿って継続的に遅い速度で成長した(倍率×３００)。
【図２】パネル(Ａ)は、５．５日齢韓国烏骨鶏(Korean Ogol Chicken, KOC)胚子の始原生殖腺由来の始原生殖細胞を１０日間培養後転移し産生された白色レグホーン(White Leghorn, WL)を示す写真である。雄性のＷＬは、検定交配(雌性のKOCと交配)結果、生殖系列キメラとして立証された。パネル(Ｂ)は、検定交配において、生殖系列キメラから孵化された子孫を示す。ＷＬから孵化された黒色羽のニワトリは、自ら転移された供与体烏骨鶏ｇＰＧＣｓから由来されたものであることを示し、白色羽のニワトリは、ＷＬとＫＯＣとのハイブリッドであることを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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