(57)【要約】酵素類に対する末端リン酸標識ヌクレオチド類の基質性を高める方法、核酸検出方法類及び末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類の提供。【課題】  本発明はマンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を用いてさまざまな酵素類に対するそれらの基質性を高める方法類が記載される。特に、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を核酸ポリメラーゼ類の基質類として用いることに基づくサンプル中の核酸検出方法類が記載される。さらに、末端リン酸標識ヌクレオチド類ならびに基質性を高め新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類が提供される。【解決手段】  マンガン塩を存在させることにより末端リン酸標識ヌクレオチド類の酵素基質性を高め、それを利用したサンプル中の核酸検出方法類及びそのための新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類を提供する。
2006524040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法で、
ａ）マンガン塩を含む反応緩衝液中における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応から前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を行なわせ、それによって、マンガン不在下における反応速度を上回るように前記反応速度を高めること
を含む、方法。
【請求項２】
前記酵素が核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、テロメラーゼ、プリマーゼ又はヌクレオチドハイドロラーゼから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又は末端トランスフェラーゼ類から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウｅｘｏ−、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｅ６８１Ｍ、Ｔ．ｈｙｐｏｇｅａ（ＴｈｙＢ）、Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）、Ｔ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ（Ｔｓｕ）、Ｔ．ｂａｒｏｓｓｉｉ（Ｔｂａ）、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＮＥＢ  Ｖｅｎｔ）、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、Ｐ．ＧＢ−Ｄ（ＮＥＢ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌ  ｂｅｔａ，Ｔｓｐ  ＪＳ１，ＡＭＶ−逆転写酵素、ＭＭＬＶ−逆転写酵素及びＨＩＶ−逆転写酵素から選択される請求項２記載の方法。
【請求項５】
マンガン塩の濃度が以上０．０１ｍＭである請求項１記載の方法。
【請求項６】
マンガン塩濃度が、０．０１乃至５０ｍＭの間である請求項１記載の方法。
【請求項７】
マンガン塩濃度が、０．１乃至１０ｍＭの間である請求項１記載の方法。
【請求項８】
マンガン以外に他の金属塩もまた末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸とともに存在する請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記他の金属塩が、マグネシウム又はカルシウム塩である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記他の金属塩が、０．０１ｍＭ乃至５０ｍＭの濃度で存在する請求項８記載の方法。
【請求項１１】
さらに金属イオン緩衝液存在下で前記反応を行なわせ遊離金属イオン濃度を調節することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記金属イオン緩衝液がジカルボン酸である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
核酸配列の存在を検出する方法で、
ａ）マンガン塩存在下で請求項３記載の核酸ポリメラーゼ反応を行なわせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記ポリメラーゼ反応が、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類を反応させること及び標識ポリリン酸を生成させることを含み、
ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及び
ｃ）前記検出可能な種の存在を検出すること
を含む、方法
【請求項１４】
段階（ａ）がさらにホスファターゼ存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸配列がＲＮＡである請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
段階ａ）がさらに、明確な標識類を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類の存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記標識類が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される酵素活性化可能な標識類である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが前記ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
さらに前記核酸配列を定量化する段階を含む請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記検出可能な種が核酸配列量に実質的に比例する量で産生される請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸配列が天然又は合成オリゴヌクレオチドである請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸配列が染色体又は染色体の一部である請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸配列がＤＮＡである請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリメラーゼ反応がさらに、１種以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの存在下で核酸配列をインキュベーションする段階を含む請求項１３記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記ポリメラーゼ反応において１種以上の他の検出試薬類を含む段階を含む請求項１３記載の方法。
【請求項２６】
前記他の検出試薬類が、前記検出可能な種と検出可能な程異なる応答が可能である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記他の検出試薬が抗体である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記検出可能な種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、還元／酸化電位及びその組合せから構成される群から選択された性質により検出可能である請求項１３記載の方法。
【請求項２９】
前記検出可能な種によって産生されたスペクトルを公知のスペクトルと比較することによって前記核酸配列を定量化する段階をさらに含む請求項１３記載の方法。
【請求項３０】
核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定確認する方法で、
ａ）請求項１３記載のポリメラーゼ反応を行なわせること、及び
ｂ）取り込まれたヌクレオシドを同定すること
を含む、方法。
【請求項３１】
前記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の１種以上が４個以上のリン酸基を含む請求項１３記載の核酸配列存在検出方法。
【請求項３２】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、式Ｉ：
【化１】
2006524040.tif 000044
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である）によって表される請求項１３記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素活性化可能な標識が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記リン酸化標識が、２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセインジホスフェート、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光源性部分である請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記リン酸化標識が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された発色源性部分である請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記化学発光化合物がホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物である請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記１，２−ジオキセタン化合物が、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、クロロアダマンチ−２′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン及びその誘導体類から構成される群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
ａ）式Ｉ
【化２】
2006524040.tif 000045
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である）による１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素の１種以上、
ｃ）ホスファターゼ、及び
ｄ）マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項４１】
ａ）式Ｉ
【化３】
2006524040.tif 000046
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である）による１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）１種以上のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
ｃ）ホスファターゼ、
ｄ）マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
ｅ）金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項４２】
前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボシル、２′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項４０又は４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４３】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項４０又は４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４４】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項４０又は４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４５】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、式
【化４】
2006524040.tif 000047
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、ＬとＰの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である）によって表わすことができる請求項１３記載の方法。
【請求項４６】
前記標識が、蛍光色素類、着色色素類、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類又はその組合せから構成される群から選択される請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記標識が、フルオロセイン類、ローダミン類、シアニン類、ピレン類、ダンシル類、クマリン類、テキサスレッド、アレキサ色素類、ロドール色素類、オレゴングリーン類及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光部分である請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
ａ）式Ｉ
【化５】
2006524040.tif 000048
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、ＬとＰの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である）による１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）１種以上のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素、及び
ｃ）マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項５１】
ａ）式Ｉ
【化６】
2006524040.tif 000049
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、ＬとＰの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である）による１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）１種以上のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
ｃ）マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
ｄ）金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項５２】
前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アチドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボシル、２′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項５０又は５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５３】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項５０又は５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項５０又は５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
式：
【化７】
2006524040.tif 000050
（式中、
Ｌは、検出可能部分であり、
ｘ及びｙは、独立してＣＨ２、ＮＨ，Ｏ又はＳから選択され、
Ｚは、１個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ塩基である）
の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項５６】
単位としてのｘ−Ｚ−ｙが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、ｐ−アミノフェノール、９−（２−アミノエチル）−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、エチレン又は高級グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は２−（２−アミノエトキシ）エタノールから構成される群から選択される請求項５５記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項５７】
前記糖部分が、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項５５記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項５８】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項５５に記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項５９】
下記構造：
【化８】
2006524040.tif 000051
（式中、
Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）
の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項６０】
ｘが１又は１０である請求項５９記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項６１】
前記ヌクレオシドポリリン酸が天然又は修飾ヌクレオシドである請求項５９記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項６２】
Ｌが、構造ｘ−Ｚ−ｙのリンカーを介してＮＰＰに結合している請求項５９記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項６３】
単位としてのｘ−Ｚ−ｙが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、ｐ−アミノフェノール、９−（２−アミノエチル）−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は２−（２−アミノエトキシ）エタノールから構成される群から選択される請求項６２記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項６４】
ａ）式ＩＩ：
【化９】
2006524040.tif 000052
（式中、
Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、
ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の１種以上のマンガン錯体、及び
ｂ）核酸ポリメラーゼ、
を含む核酸検出キット。
【請求項６５】
ａ）式ＩＩ：
【化１０】
2006524040.tif 000053
（式中、
Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、
ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の１種以上のマンガン錯体、
ｂ）核酸ポリメラーゼ、及び
ｃ）金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項６６】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項６４又は６５のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、活性増強のための補因子としてのＭｎ＋＋存在下において核酸ポリメラーゼ類を含む種々の酵素類の基質としての３個以上のリン酸類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の用途に関する。使用した標識類は、化学発光、蛍光、電気化学的及び発色源部分ならびに質量タグ類であり、直接検出可能なものならびに酵素活性化後又は他のプロセスに投入して異なるシグナルを産生させた後に検出可能なものを含む。これらの末端リン酸標識ヌクレオチド類は、特定の遺伝子型又は遺伝子配列を同定することを含めて均質系アッセイで使用できるであろう。さらに、標識をヌクレオチド類の末端リン酸に連結してそれらの基質性を高める、すなわち異なる酵素類によるそれらの利用速度を高めるリンカー類を有する新規末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類が提供される。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの酵素類は、ヌクレオシド三リン酸及びそれらのアナログ類を利用するか又はそれらに作用する。これらの酵素類には、リガーゼ類、核酸ポリメラーゼ類、ホスホジエステラーゼ類、ホスホリラーゼ類、キナーゼ類及びホスファターゼ類が含まれる。これらの酵素類は全て、ある金属イオン類を補因子として必要とし、これらの酵素類の多くが異なる金属イオン類の存在下で作用できるが、一般的に、あるひとつの金属が他よりも好適である。
【０００３】
核酸ポリメラーゼ類は、ヌクレオシド５′−三リン酸類の重合を触媒しＤＮＡ又はＲＮＡを形成させる酵素類である。それらには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ類、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ類及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ類が含まれる。これらの酵素類は、典型的にはＭｇ２＋である二価金属イオンの存在を補因子として必要とするが、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋さえも時にはＭｇ２＋の代わりとなり得ることが知られている。正常ヌクレオチド類では、他の金属イオンよりもＭｇ２＋を利用すると反応速度が速い。
【０００４】
例えば蛍光標識類を有する化合物を含むいくつかのヌクレオチドアナログ類が作製されており、それらは核酸ポリメラーゼ類のための基質としても作用できる。これらの標識類は、前記ヌクレオチドの塩基部分に結合されてきたが、ヌクレオチドの糖部分に結合される場合もまれにある。これらは、同一二価金属イオン補因子類によるほとんど同一反応条件下で、正常な非置換ヌクレオチド類としてポリメラーゼ類の基質類として作用してきた。
【０００５】
また、ガンマリン酸位に標識したヌクレオチド類の利用にも関心が向けられている。いくつかのγ−リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（米国特許６，３２３，１８６）から市販されている。これらのヌクレオチド類において、ホスホロチオアート結合を介して色素（ボディピ）を前記のγ−リン酸に結合する。標題「γ−ホスホエステルヌクレオシド三リン酸類」の米国特許６，３９９，３３５は、γ−ホスホエステル結合ヌクレオシド三リン酸を用いてポリメラーゼにより特定のヌクレオチド類を重合させるための方法類及び組成物類を提供している。ＬＩ−ＣＯＲ社（米国特許６，２３２，０７５、米国特許２００３／０１９４７４０、ＷＯ  ０１／９４６０９、及び米国特許２００３／０１８６２５５）からのいくつかの他の特許出願は、異なる塩基及びγ−リン酸標識ヌクレオシド−５′−三リン酸の合成とその使用方法を記載している。これらのヌクレオチド類をＤＮＡポリメラーゼとともに使用することで、前記ヌクレオチド塩基がＲＮＡ又はＤＮＡに取り込まれると放出される標識ピロリン酸を同定することによって、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列中の特定ヌクレオチド類を同定できる。
【０００６】
サンプル中の特定核酸類すなわち分析物質類を高い特異性と感度で検出するための方法類が公知である。このような方法では、一般的に、最初に特定標的配列又は分析物質の存在に基づき核酸配列を増幅することが必要である。増幅後、増幅配列を検出し定量する。従来の核酸類検出系には、蛍光標識類の検出、蛍光酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出が含まれる。
【０００７】
これら方法類のひとつの欠点は、前記標識出発物質から前記標識生成物のなんらかの分離を必要とするばかりでなく、前記標識が生成物に結合しているので、同定すべき天然産物とは異なっていることがあげられる。したがって、修飾されていない生成物を形成することと同時に起こった反応に特徴的なシグナルを生ずる方法類及び基質類を使用することが有益であろう。さらに、もし前記の生成したシグナルが前記出発物質からの分離を必要としなければそれは有益であるし、さらに、もし分離が必要であるにしても非修飾生成物を産生することの利点は、圧倒的である。
【特許文献１】米国暫定出願６０／４４５，１８９
【特許文献２】米国特許６，３２３，１８６
【特許文献３】米国特許６，３９９，３３５
【特許文献４】米国特許６，２３２，０７５
【特許文献５】米国特許２００３／０１９４７４０
【特許文献６】ＷＯ  ０１／９４６０９
【特許文献７】米国特許２００３／０１８６２５５
【特許文献８】ＷＯ  ０３／０２０８９１
【特許文献９】ＷＯ  ０３／０２０９８４
【特許文献１０】ＷＯ  ０３／０２０７３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ガンマリン酸標識ヌクレオチド類は、このような機会を現実に提供する。たとえば、ガンマリン酸標識ヌクレオチド類をＤＮＡ又はＲＮＡに核酸ポリメラーゼにより取り込ませると、非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡが産生され、また同時に、産生した標識ピロリン酸は標的を検出し、特性解析し及び／又は定量するために使用される。しかし、これらのヌクレオチド類はさまざまな核酸ポリメラーゼ類にとっては極めて良好でない基質類であり、従って、これらの末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込み速度を改善することは有益であろう。先にも述べたように（ＷＯ  ０３／０２０８９１、ＷＯ  ０３／０２０９８４、ＷＯ  ０３／０２０７３４）、前記標識とヌクレオチドの間のポリリン酸鎖を長くすることによって、速度増強が一部達成することができる。この速度増強はいくつかの適用では有用であるが、現実的理由により数百のヌクレオチド類を短時間に付加しなければならない例えばＰＣＲのような多くの適用では、未だに不十分である。
【０００９】
したがって、末端リン酸標識ヌクレオチド利用速度をさらに高めることが有益であろう。これについて及び他の問題についても下記で述べる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオチド類（また、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とも称される）の使用方法類、ならびにその有用性を高めるための組成物類を提供する。本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチド類とともにマンガン塩類を使用し、たとえ他の金属塩類が存在しているにしてもマンガンがない状況で観察される酵素利用をはるかに上回るように酵素類によるそれらの利用を高める方法類を提供する。また、末端リン酸標識ヌクレオチド類の形状でそれらの基質性を高めるリンカーを有する重要な新規組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め、前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法を提供し、前記方法は、マンガン塩を含む反応緩衝液中において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からの前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を実行させ、それによって、もし他の二価金属塩類が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガンが存在していない状況下における反応速度を上回るように、反応速度を高めることを含む。
【００１２】
本発明は、核酸配列の存在を検出する方法を提供し、前記方法は、ａ）マンガン塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高めること、ここで、前記ポリメラーゼ反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び標識ポリリン酸を産生させることを含み、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びｃ）前記検出可能種の存在を検出することを含む。本発明においてホスファターゼの定義は、リン酸モノエステル類、ポリリン酸類及びヌクレオチド類を切断して、無機リン酸を放出する酵素を全て含む。本発明の文脈において、この酵素は、末端標識ヌクレオシドリン酸を切断しない（すなわち、前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、実質的にホスファターゼに反応性でない）。ここで述べたホスファターゼ定義は  具体的には、アルカリホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１）及び酸ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２）を含むがそれらに限定されない。ヌクレオチドの本発明における定義は、天然又は修飾ヌクレオシドリン酸を含む。
【００１３】
本発明はさらにＤＮＡ配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下においてＤＮＡポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びｃ）検出可能な種の存在を検出することを含む。
【００１４】
また、核酸配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基を有する少なくとも１個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、及びｂ）前記標識ポリリン酸を検出することを含む。
【００１５】
さらに、本発明は、核酸配列存在を検出する方法に関し、本方法は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基を有する少なくとも１個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びｃ）前記検出可能種の存在を検出することを含む。
【００１６】
本発明のさらに別の面は、核酸定量化方法に関し、前記方法は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記反応には、末端リン酸標識ヌクレオチドが含まれ、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、核酸量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、ｃ）前記検出可能な種を測定すること、及びｄ）公知の標準物質を用いて前記測定値を比較し、核酸量を決定することを含む。
【００１７】
本発明はさらに、ＤＮＡ配列定量化方法に関し、前記方法は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、ＤＮＡ配列量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、ｃ）前記検出可能な種を測定すること、及びｄ）公知の標準物質を用いて前記測定値を比較し、ＤＮＡ量を決定することを含む。
【００１８】
本発明はさらに別の面において、核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定し決定する方法に関し、この方法は、ａ）少なくとも１個の末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、ｃ）前記検出可能な種の存在を検出すること、及びｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。
【００１９】
また、核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定し決定する方法を提供し、この方法は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基類を有する少なくとも１個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、ｃ）前記検出可能な種の存在を検出すること、及びｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。
【００２０】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
ａ）式Ｉ：
【００２１】
【化１】
2006524040.tif 000003
【００２２】
（式中、Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでＬは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である）による１種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素の１種以上、
ｃ）ホスファターゼ、及び
ｄ）マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【００２３】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
ａ）下記の式Ｉ：
【００２４】
【化２】
2006524040.tif 000004
【００２５】
（式中、Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、Ｐ−Ｌは、ＬとＰの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでＬは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である）による１種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素の１種以上、及び
ｃ）マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【００２６】
本発明はさらに、リンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を提供し、それらは、ポリメラーゼにとってより優れた基質類である。これらのヌクレオチド類は、下記の構造：
【００２７】
【化３】
2006524040.tif 000005
【００２８】
（式中、Ｌは、検出可能部分であり、ｘ及びｙは、独立してＣＨ２、ＮＨ，Ｏ又はＳから選択され、Ｚは、１個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ塩基である）によって表される。
【００２９】
本発明はまた、式ＩＩ：
【００３０】
【化４】
2006524040.tif 000006
【００３１】
（式中、Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類のマンガン錯体類を提供する。
【００３２】
さらに核酸検出キットが提供され、
ａ）式ＩＩ：
【００３３】
【化５】
2006524040.tif 000007
【００３４】
（式中、Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の１種以上のマンガン錯体、及び
ｂ）核酸ポリメラーゼを含む。
【００３５】
また、核酸検出キットが提供され、
ａ）式ＩＩ：
【００３６】
【化６】
2006524040.tif 000008
【００３７】
（式中、Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の１種以上のマンガン錯体、
ｂ）核酸ポリメラーゼ、及び
ｃ）金属イオン結合緩衝液を含む。
【００３８】
本発明の前記目的と特徴は、下記の発明の詳細な説明と付属の図面を参照すればより充分に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
用語「ヌクレオシド」は、本文で、１′位又は同等の位置における環式炭素又は非環式部分のような糖又は糖置換物に結合したプリンデアザプリン、ピリミジン又は修飾塩基を含む化合物として定義され、２′−デオキシ及び２′−ハイドロキシ、及び２′、３′−ジデオキシ形状ならびに他の置換物類を含む。
【００４０】
用語「ヌクレオチド」は、本文で、ヌクレオシドのリン酸エステルを称するものとして使用し、前記エステル化部位が典型的には、５炭糖のＣ−５位に結合した水酸基に対応する。
【００４１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド類又はその誘導体類の直線状オリゴマー類を含み、デオキシリボヌクレオシド類、リボヌクレオシド類等を含む。本明細書全体において、オリゴヌクレオチドが文字配列によって表されている場合にはすべて、前記ヌクレオチド類は、左から右に５′→３′方向にあり、他に断りがなければ、Ａはデオキシアデノシンを示し、Ｃはデオキシシチジンを示し、Ｇはデオキシグアノシンを示し、及びＴはチミジンを示す。
【００４２】
用語「プライマー」は、特定の核酸配列に特定の方法でアニーリングしその特定配列の増幅を可能にする直線状オリゴヌクレオチドを称する。
【００４３】
句「標的核酸配列」等は、配列のアイデンテティ（内容）又はヌクレオシド類の順序又は位置が本発明の１種以上の方法類によって決定される核酸を称する。
【００４４】
用語「金属イオン緩衝液」とは、Ｍｎ２＋のような溶液中遊離金属イオンの濃度を制御する物質を意味する。
【００４５】
本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチド類とともにマンガン塩類を使用し、たとえ他の金属塩類が存在するにしてもマンガン不在下で観察される酵素類による利用を上回るように酵素類によるそれらの利用を高める方法類を提供する。いくつかの酵素類は、それらの活性のために二価金属イオン類を補因子類として使用することが公知である。多くの場合、これらの金属イオン類は、他の金属イオン類により置換できるが、しかしこの置換の結果、酵素活性が低下することになる。本発明者らは、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸ではこれが真実ではなく、異なる金属イオンたとえばこの場合マンガンを添加すると、実際に、ヌクレオシド一リン酸移動を触媒する酵素類によるそれらの利用速度が高まることを見出した。
【００４６】
したがって、本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め、前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法を提供し、前記方法は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からのマンガン塩を含む反応緩衝液中における前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を実行させ、それによって、もしたとえ他の二価金属塩類が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガン不在下における前記反応速度を上回るように前記反応速度を高めることを含む。
【００４７】
本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドを検出する方法類に関し、従来のアッセイを用いて、核酸ポリメラーゼ活性によりＲＮＡ又はＤＮＡ合成をモニタリングする。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼ類は、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３′水酸基へのヌクレオシド一リン酸の移動により、オリゴヌクレオチド類を合成する。この反応を進める力となっているのは、無水物結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端リン酸の構造的修飾がポリメラーゼ反応で機能するその能力を完全に破壊することはないという知見を利用している。前記のオリゴヌクレオチド合成反応では、ヌクレオチドのα−及びβ−ホスホリル基においてのみの直接変化を伴い、末端リン酸位におけるヌクレオチド類の修飾により核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重となっている。しかし、これらの末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類は、ポリメラーゼにとって非常に貧弱な基質類である。本発明者らは、それらの基質性を、マンガン塩を添加することによって実質的に高めることができることを見出した。
【００４８】
したがって、本発明は、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を使用する方法を提供し、この存在により、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類がより優れた酵素基質類として作用する能力が生まれる。マンガン塩類は、過去において配列決定方法類（ＷＯ  ９９／３７８１０）ならびに核酸増幅方法類において使用されてきた。前者の場合、マンガンの使用は、異なる塩基で終止する断片の配列決定によるシグナル強度を均一にすることであり、それにより、配列分析が簡易になった。しかし、図３に示したように、マンガン塩存在下における塩基標識ヌクレオチド類の取り込み速度は、実際には、マグネシウム存在下における速度よりも遅い。核酸増幅方法類の場合、マンガン存在により、より長いＤＮＡ断片増幅が可能となったが、そのプロセスにおいてまた、複製エラーが増加する原因となった。末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類上でのポリメラーゼ利用に及ぼすマンガンの効果は、極めて異なっている。図４に示したように、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む反応混合物に０．０５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加すると、その結果、活性が増強され４０倍を超えるようになる。さらに、取り込みエラーがＭｎＣｌ２により増加するという証拠もない（図６）。反応速度のこのような向上に必要なマンガンの量はわずかで１０μＭであり、好適な濃度は、０．０１から５０ｍＭの範囲である。さらに好適には、前記濃度は、０．０５から１０ｍＭの間である。また、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のような他の塩類の存在は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の基質性に及ぼすマンガンの効果を妨害しない。
【００４９】
ある態様において、前記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩ、又はＤＮＡポリメラーゼα、β、γのようなＤＮＡポリメラーゼ、又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はテロメラーゼである。他の態様において、適切なポリメラーゼ類にはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、プリマーゼ、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）が含まれるが、それらに限定されない。
【００５０】
本発明が提供する方法類は、デオキシヌクレオシドポリリン酸、リボヌクレオシドポリリン酸、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸、又は電気化学的標識、質量タグ、又は比色色素、化学発光標識又は末端リン酸に結合した蛍光標識を有する非環式ヌクレオシドポリリン酸アナログが含まれる。核酸ポリメラーゼがこのアナログを基質として利用する時、酵素活性化可能な標識が、ホスホリル移動の無機ポリリン酸副産物上に存在するであろう。ホスホリル移動のポリリン酸産物をホスファターゼにより切断すると、それに結合した標識に検出可能な変化が生じる。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼ類が修飾された末端ホスホリル基を有するヌクレオチド類を認識できる一方、本発明者らは、この出発物質がホスファターゼ類のテンプレートではないと決定したことに注意されたい。下記の図は、本発明の方法に最も関連する分子類を示しており、すなわち、末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副産物及び酵素活性化標識を示している。
【００５１】
【化７】
2006524040.tif 000009
【００５２】
上記図において、ｎは１以上であり、Ｒ１とＲ２は、独立してＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、ＯＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ３、ＮＨＲ又はＮＨ２であり、Ｂは、ヌクレオチド塩基又は修飾複素環塩基であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２又はＮＨであり、Ｙは、Ｏ、Ｓ又はＢＨ３であり、及びＬは、リンカーを有していても有していなくてもよいホスファターゼが活性化可能な標識であり、それは、着色又は蛍光色素、発色源、蛍光源又は化学発光分子、質量タグ又は電気化学的タグであることができる。質量タグは、質量差により他の成分から容易に識別可能な質量分析に適した低分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化可能であるか又は還元可能な種である。ｎが２以上である時、前記ヌクレオチド類は、ｎが１である時よりもポリメラーゼ類にとって有意に優れた基質であることがわかった。したがって、好適な態様において、ｎは２、３又は４であり、Ｒ１とＲ２は、独立してＨ又はＯＨであり、ＸとＹはＯであり、Ｂは、ヌクレオチド塩基であり、及び、Ｌは、発色源、蛍光源又は化学発光分子であることができる標識である。
【００５３】
本文に示した核酸配列存在を検出する方法の１態様において、前記工程は、ａ）Ｍｎ塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高めること、ここで、前記反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び前記ポリメラーゼ反応の結果標識ポリリン酸が産生し、ｂ）前記標識ポリリン酸を前記リン酸エステルの加水分解に適したホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びｃ）適切な手段により前記検出可能種の存在を検出することを含む。本態様において、核酸ポリメラーゼ反応に使用したテンプレートは、ヘテロポリマー又はホモポリマーのテンプレートであることができる。末端リン酸標識ヌクレオチドとは、本明細書全体において、成長するヌクレオチド鎖へのヌクレオシド一リン酸の取り込み後同時に放出された標識ポリリン酸が、それ自体として分離してもしなくても検出できるか、又はホスファターゼと反応させ検出可能な種を産生させることを意味する。他のヌクレオチド類も本反応に含めることができ、それらは、実質的にホスファターゼに対して非反応性であり、例えば、検出可能種を産生しない部分により末端リン酸でブロックされたヌクレオチド類がある。この特定の態様における検出のための核酸には、ＲＮＡ、天然又は合成オリゴヌクレオチド、ミトコンドリア又は染色体ＤＮＡが含まれる。
【００５４】
本発明はさらに、ＤＮＡ配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下においてＤＮＡポリメラーゼ反応を起こさせ、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びｃ）前記検出可能な種の存在を検出することを含む。検出用ＤＮＡ配列には、細胞から単離したＤＮＡ、ビスルファイト処理メチル化ＤＮＡのような化学的に処理したＤＮＡ、又は当該技術で公知の方法により化学的に又は酵素的に合成したＤＮＡが含まれる。このような方法には、ＰＣＲ及び本文で参考として引用したＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ、Ｊ．Ｅ．（編著）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１１、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載のものが含まれる。さらに、前記ＤＮＡ配列には、染色体ＤＮＡ及び天然又は合成オリゴヌクレオチド類が含まれる。前記ＤＮＡは、二重鎖又は一重鎖である。
【００５５】
本発明の方法類はさらに、前記ポリメラーゼ反応において１個以上の追加検出試薬類を含む。前記の追加検出試薬類は、前記の検出可能な種とは検出可能なほど異なる応答ができる。たとえば、前記追加検出試薬は、抗体であってもよい。
【００５６】
ポリメラーゼ反応における基質として付加するための適切なヌクレオチド類は、ヌクレオシドポリリン酸類を含み、それらには、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸類、リボヌクレオシドポリリン酸類、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸類、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸類及び非環式ヌクレオシドポリリン酸類及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。末端リン酸が標識されている三、四、五又は六リン酸基類を前記のポリリン酸鎖中に含むヌクレオチド類が特に好適である。
【００５７】
ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸類を含む末端リン酸標識ヌクレオチド類を含む態様において、ホスホリル移動の標識ポリリン酸副産物がホスファターゼ処理を行わずに検出できることも本発明の範囲内であることに注意されたい。たとえば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基類、特にグアニンは、蛍光マーカー類クエンチングの原因となることが公知である。したがって、末端リン酸標識ヌクレオチドにおいて、前記標識は前記塩基によって部分的に消失することもある。前記ヌクレオシド一リン酸が取り込まれると、標識ポリリン酸副産物を、その蛍光増強により検出することもできる。これとは別に、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出により同定する前に、前記の標識ポリリン酸産物をクロマトグラフィで物理的に分離することも可能である。さらに、質量分析を用いて質量差により前記産物類を検出することもできるであろう。
【００５８】
本発明の方法類には、１種以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を行うことを含むことができる。適切な核酸ポリメラーゼ類にはまた、プリマーゼ類、テロメラーゼ類、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ類、及び逆転写酵素類が含まれる。核酸テンプレートは、ポリメラーゼ反応が起こるために必要であろうし、ポリメラーゼ反応溶液に添加することもできる。本発明の検出方法における段階ａ）、ｂ）及びｃ）のすべてを単一の、均質反応混合物を用いて同時に行わせることもできるし、また、順次行わせることもできる。
【００５９】
本発明の範囲内で、核酸ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼ類を利用する増幅方法を含むこともできる。このような方法類の例として、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。前記標的分子がＤＮＡのような核酸ポリマーである場合、アデニン、チミン、シトシン、グアニン又は他の窒素複素環塩基類のようなガンマ−リン酸標識ヌクレオチド塩基類のＤＮＡ分子中への取り込みを、ＰＣＲによって検出することもできる。前記ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）方法は、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２３９、４８７ページ、１９８８、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許４，６８３，１９５によって、及び、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（編著）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８０），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編著）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９９）及びＷｕ，Ｒ．（編著）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ＩＩ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｚｕｍｕｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９５）によって記載されている。ＰＣＲを用いて、ＤＮＡのような検出用標的核酸を直接、ＰＣＲ試薬類及び適切なプライマー類を含む反応容器に入れ、それを増幅させる。典型的には、前記標的核酸の少なくとも一部に配列が相補性であるプライマーを選択する。
【００６０】
本発明の方法類の段階ａ）を実施するために適した核酸ポリメラーゼ反応類には、さらに、さまざまな核酸配列増幅ＲＣＡ方法類を含めることができる。たとえば、本文で参考として引用するＬｉｚａｒｄｉ，Ｐａｕｌ  Ｍ．、米国特許５，８５４，０３３に開示されたものは、有用である。ポリメラーゼ反応にはさらに、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を含めることができ、この系では、ＤＮＡではなくＲＮＡの増幅を伴い、この増幅は等温性であり、ひとつの温度（４１℃）で起こる。標的ＲＮＡのＮＡＳＢＡによる増幅には、逆転写酵素、Ｒｎａｓｅ  Ｈ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼという酵素３種の活性がサンプルである標的ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー類と共同して作用することが必要になる。これらの酵素類は、４つの段階：伸長、分解、ＤＮＡ合成及び環式ＲＮＡ増幅で標的一重鎖ＲＮＡの指数対数的増幅を触媒する。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ及びＮＡＳＢＡの方法類では、一般に、標的核酸の当初の量が増幅産物の定量によって間接的に測定されることが必要となる。増幅産物類は最初に、アガロースゲル上での電気泳動により出発物質から分離され増幅がうまくいったことを確認し、その後、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識検出のような核酸用の従来の検出系のいずれかを用いて、定量する。対照的に、本方法では、ポリメラーゼ反応の産物を出発物質から分離してこれらの産物を検出するという必要性がなくなる。たとえば、本発明では、レポーター分子（蛍光、化学発光又は発色源）又は他の有用分子を、リン酸結合によってマスキングした時にある条件下でそれが検出できるようにヌクレオチドに結合させる。しかし、成長するオリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドが取り込まれ前記反応物をホスファターゼ処理すると、前記標識がそれらの条件下で検出可能である。たとえば、もし１，３−ジクロロ−９，９−ジメチル−アクリジン−２−オン（ＤＤＡＯ）の３重環構造側の水酸基をヌクレオチドの末端リン酸位に結合させると、このＤＤＡＯは、６５９ｎｍで蛍光を発しない。ヌクレオシド一リン酸がＤＮＡにいったん取り込まれると、他の産物ＤＤＡＯポリリン酸（６５９ｎｍで同様に蛍光を発しない）がホスファターゼの基質となる。いったん脱リン酸されＤＤＡＯを形成すると、色素部分が６５９ｎｍで蛍光を発するようになり、従って検出可能となる。ポリリン酸産物の具体的分析は、ポリメラーゼ反応溶液中で行うことができ、出発物質類から反応産物を分離する必要がなくなる。このスキームにより、分光光度計のような通常の機器類を用いて、ポリメラーゼ反応中に形成された核酸類の検出と適宜その定量が可能となる。
【００６２】
上述の方法類において、ポリメラーゼ反応段階はさらに、ホスファターゼ存在下においてポリメラーゼ反応を実行することを含み、標識ポリリン酸副産物を検出可能な標識に変換する。このようなものとして、検出可能な種の形成を連続的にモニタリングでき核酸配列の存在を検出するために便利なアッセイが確立される。このことは、それが一本の試験管で行うことができるという点において、均質アッセイ様式の代表である。
【００６３】
上記アッセイ方法類のひとつの様式には、検出可能な種を産生できる末端リン酸標識単一種ヌクレオチドの存在下ポリメラーゼ反応を実行することを含むが、これに限定されない。たとえば、末端リン酸修飾ＡＴＰでは他のヌクレオチド類全てが実質的にホスファターゼ類に非反応性であるが、非検出可能種を産生する。
【００６４】
別のアッセイ様式では、ポリメラーゼ反応を１種を超える末端リン酸標識ヌクレオチド存在下で実施できるが、このヌクレオチド類のそれぞれは、独自に検出可能な種を産生可能である。たとえば、前記アッセイには、酵素的に無機ポリリン酸から放出されるとホスホリル移動の副産物が第１波長で光を放出する第１標識に結合した第１ヌクレオチド（例  アデノシンポリリン酸）と第２波長で光を放出する第２標識に結合した第２ヌクレオチド（例  グアノシンポリリン酸）が含まれる。望ましいのは、前記第１及び第２波長における発光が、実質的にほとんどあるいは全く重ならないことである。ヌクレオチド配列情報に基づく複数の同時アッセイ類がその後、前記ポリリン酸から放出された特定標識に基づいて誘導できることも、本発明の範囲内である。
【００６５】
本発明の別の面では、反応媒体中におけるマンガンイオン類濃度を制御する金属イオン緩衝液類が提供される。希釈に応答して又は溶液からのイオンの添加又は除去に応答する遊離イオンの濃度変化に対抗することによって、緩衝液は、溶液中の種（例  金属イオン）の濃度を制御する。このような緩衝液には例えば、酒石酸のようなアルキルジカルボン酸のようなカルボン酸が含まれるが、前記アルキルは、炭素原子１−８個の直鎖又は分枝状鎖である。ジカルボン酸の他の例には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸及びフタル酸が含まれる。他の金属イオン緩衝液には、例えば、クエン酸、Ｎ−ハイドロキシエチルイミノニ酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ジチオスレイトール、及びＮ，Ｎ−ビスハイドロキシエチルグリシンが含まれる。金属イオン緩衝液をｐＨ緩衝液（すなわち、溶液中遊離Ｈ＋濃度を制御する化合物）の存在下、使用することもできる。前記マンガンイオンは通常は、例えば硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）又は酢酸マンガンのような塩から生成するであろう。
【００６６】
「ジカルボン酸」とは、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、グルタミン酸、アジピン酸、フマル酸、フタル酸、グルタル酸、又はアスパラギン酸のような２個のカルボン酸基を含む低級アルキル、ハイドロキシアルキル又はアミノアルキル化合物を全て意味する。
【００６７】
上述の方法類にはさらに、核酸配列を定量する段階が含まれる。関連する面において、前記検出可能な種は、増幅核酸配列量に実質的に比例する量で産生させることができる。核酸配列を定量する段階は、望ましくは、公知のスペクトルと検出可能種が生成したスペクトルを比較することによって行われる。
【００６８】
本発明は、１態様において、核酸配列を定量する方法を提供し、本方法は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、前記ポリメラーゼ反応は、少なくとも１個の末端リン酸標識ヌクレオチドの他にホスファターゼに実質的に反応しないヌクレオチドの反応を含み、前記反応の結果、標識ポリリン酸類が生成し、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、定量すべき核酸量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、ｃ）前記検出可能種を測定すること、及びｄ）前記測定値を公知の標準物質を用いて比較し、核酸量を求めることを含む。核酸定量方法のこの態様において、定量すべき核酸はＲＮＡであることができる。核酸はさらに、天然又は合成オリゴヌクレオチド、染色体ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。
【００６９】
本発明はさらに、ＤＮＡ配列を定量する方法を提供し、本方法は、ａ）マンガン塩存在下においてＤＮＡポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸類が生成し、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、定量すべきＤＮＡ配列量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、ｃ）前記検出可能種を測定すること、及びｄ）前記測定値を公知の標準物質を用いて比較し、ＤＮＡ量を求めることを含む。この態様において、定量すべきＤＮＡ配列には、天然又は合成オリゴヌクレオチド、又は染色体ＤＮＡを含む細胞から単離したＤＮＡを含むことができる。
【００７０】
上述の核酸配列定量化のためこれら方法のそれぞれにおいて、ポリメラーゼ反応段階にはさらに、ホスファターゼ存在下においてポリメラーゼ反応を行うことが含まれる。先に本明細書で述べたように、これにより、核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングが可能となり、従って、定量する標的核酸配列のリアルタイム検出が可能となる。
【００７１】
本文に述べた核酸配列定量化方法類に有用な末端リン酸標識ヌクレオチドは、上記の式Ｉによって表される。最も有用な例には、酵素活性化可能な標識を有するものが挙げられる。この酵素活性化可能な標識は、標識と天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸の間のリン酸エステル結合を検出可能な種を産生するように変化させるホスファターゼの酵素活性を介して、検出可能となる。検出可能種は、色、蛍光発光、化学発光、質量差又は電気化学的電位のいずれか又は組合せの存在下において検出可能となる。先にも既に述べたように、酵素活性化可能な標識は、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色源性色素、質量タグ又は電気化学的タグ又はその組合せであることができる。適切な標識は、上記に述べたものと同じである。
【００７２】
実施例のセクションでさらに詳細に述べるが、本発明は、標的核酸配列中の１個のヌクレオチドがなんであるかそのアイデンテティを決定する方法類を提供する。これらの方法類は、ａ）マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と少なくとも１個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、ｃ）前記検出可能な種の存在を検出すること、及びｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。好適な態様において、前記末端リン酸標識ヌクレオチドは、４個以上のリン酸類をポリリン酸鎖中に含む。
【００７３】
核酸配列の存在を検出する上述の方法類のひとつの面において、末端リン酸標識ヌクレオチドは、式Ｉ：
【００７４】
【化８】
2006524040.tif 000010
【００７５】
（式中、Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、ここで、Ｌは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である）によって表すこともできる。
【００７６】
核酸配列の存在を検出する上述の方法類のもうひとつの面において、末端リン酸標識ヌクレオチドは、式Ｉ：
【００７７】
【化９】
2006524040.tif 000011
【００７８】
（式中、Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、Ｐ−Ｌは、ＬとＰの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である）によって表すこともできる。
本発明の別の態様では、ヌクレオシドポリリン酸（テトラ−（四）、ペンタ−（五）、ヘキサ−（六））を本発明に用いた標識に連結しそれらをポリメラーゼのためのよりすぐれた基質とするリンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオチド類を提供する。これらの化合物は、式
【００７９】
【化１０】
2006524040.tif 000012
【００８０】
（式中、Ｌａｂｅｌは、検出可能な部分であり、ｘ及びｙは、独立してＣＨ２、ＮＨ，Ｏ又はＳから選択され：Ｚは、１個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ塩基である）によって表される。
【００８１】
本発明の好適な態様において、リンカーであるｘ−Ｚ−ｙは、３−１００個の原子を含み、正又は負の荷電を含むことができる。より好適な態様において、前記リンカーｘ−Ｚ−ｙは、アルカンジオール類、ジアミン類、アミノアルコール類、ジメルカプタン類、アミノ酸類、ペプチド類、アミノメルカプタン類、及びその組合せから選択される。
【００８２】
本発明はまた、式ＩＩ：
【００８３】
【化１１】
2006524040.tif 000013
【００８４】
（Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、ｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類のマンガン錯体類を述べている。
【００８５】
これらの錯体類は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類をマンガン塩類と混合することによって容易に調製でき、ポリリン酸鎖中のリン酸類の数に応じて、ヌクレオチドに錯化したマンガンイオン類の数が変化できる。好適な組成物類において、反応性末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸は、少なくとも１個のマンガンイオンを有している。
本発明の方法類及び新規組成物類のため、有用な環式炭素部分が、Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｍ．及びＧｏｔｏｒ，Ｖ．によってＣｈｅｍ  Ｒｅｖ．２０００、第１００巻、４３１９−４８に記載されている。適切な糖部分は、Ｊｏｅｎｇ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．１９９３、第３５６巻、２６２７−３８、Ｋｉｍ  Ｈ．Ｏ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９３、第３６巻、３０−７、及びＥｓｃｈｅｎｍｏｓｓｅｒ  Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９、第２８４巻、２１１８−２１１４によって記載されている。さらに、有用な非環式部分が、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９，ｖｏｌ．２７，１２７１−１２７４によって、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９７，ｖｏｌ．７、３０１３−３０１６によって、及びＴｒａｉｎｅｒ，Ｇ．Ｌ．の米国特許５，５５８，９１において記載されている。これらの部分の構造類を下記に示したが、全ての部分について、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｆ、Ｎ３、ＳＨ、ＳＲ、ＯＲ低級アルキル及びアリルであり、糖部分について、Ｘ及びＹは独立して、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、非環式部分について、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲである。
【００８６】
【化１２】
2006524040.tif 000014
【００８７】
ある態様において、式中の糖部分は、下記から選択することができる：リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′−又は３′−アルコキシリボシル、２′−又は３′−アミノリボシル、２′−又は３′−フルオロリボシル、２′−又は３′−メルカプトリボシル、２′−又は３′−アルキルチオリボシル、非環式、環式炭素及び他の修飾糖類。
【００８８】
さらに上記式中、前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそのアナログ類が含まれる。
【００８９】
末端リン酸標識ヌクレオチド中の末端リン酸位において結合した標識は、１，２−デオキセタン化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類及び電気化学的タグ類から構成される群から選択することができる。これによる検出可能種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、電気化学的検出又はその組合せのいずれの存在によって検出可能な種とすることができる。
【００９０】
直接又はリンカーを介して末端リン酸基に結合できる標識類の例を下記の表１−２に示し、直接結合した標識を有し、リン酸類の除去後検出可能となる末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類ならびにリン酸類を除去しないでも検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のいくつかの例をそれぞれ表３と４に示した。
【００９１】
【表１】
2006524040.tif 000015
【００９２】
【表２】
2006524040.tif 000016
【００９３】
さらに、ドナー色素とアクセプター色素を結合させることによって調製したエネルギー移動色素類もまた、本発明で有用である。
表３：標識がポリリン酸鎖に直接結合している標識ヌクレオシドポリリン酸類の例
アデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちＡ３Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちＧ３Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちＣ３Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちＴ３Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちＵ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄＡ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄＧ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄＣ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄＴ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄＵ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄｄＡ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄｄＧ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄｄＣ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄｄＴ３Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわちｄｄＵ３Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわち３′−ｄＡ３Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわち３′−ｄＧ３Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわち３′−ｄＣ３Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわち３′−ｄＴ３Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））三リン酸すなわち３′−ｄＵ３Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわちｄｄＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわち３′−ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわち３′−ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわち３′−ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわち３′−ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））四リン酸すなわち３′−ｄＵ４Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄｄＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄｄＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわちｄｄＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわち３′−ｄＡ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわち３′−ｄＧ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわち３′−ｄＣ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわち３′−ｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））五リン酸すなわち３′−ｄＵ５Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
グアノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
シチジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
チミジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
ウリジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄｄＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄｄＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄｄＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄｄＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわちｄｄＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわち３′−ｄＡ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわち３′−ｄＧ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわち３′−ｄＣ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわち３′−ｄＴ６Ｐ−ＤＤＡＯ
３′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）））六リン酸すなわち３′−ｄＵ６Ｐ−ＤＤＡＯ
アデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちＡ３Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）））三リン酸すなわちＧ３Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちＣ３Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちＴ３Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちＵ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄＡ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄＧ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄＣ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄＴ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄＵ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄｄＡ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄｄＧ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄｄＣ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄｄＴ３Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわちｄｄＵ３Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわち３′−ｄＡ３Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわち３′−ｄＧ３Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわち３′−ｄＣ３Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわち３′−ｄＴ３Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）三リン酸すなわち３′−ｄＵ３Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）））四リン酸すなわちＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄｄＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄｄＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄｄＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわちｄｄＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわち３′−ｄＡ４Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわち３′−ｄＧ４Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわち３′−ｄＣ４Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわち３′−ｄＴ４Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−ウンベリフェロン）四リン酸すなわち３′−ｄＵ４Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄｄＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄｄＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄｄＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわちｄｄＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわち３′−ｄＡ５Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわち３′−ｄＧ５Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわち３′−ｄＣ５Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわち３′−ｄＴ５Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−ウンベリフェロン）五リン酸すなわち３′−ｄＵ５Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
グアノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
シチジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
チミジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
ウリジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄｄＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄｄＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄｄＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄｄＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわちｄｄＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわち３′−ｄＡ６Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわち３′−ｄＧ６Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわち３′−ｄＣ６Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわち３′−ｄＴ６Ｐ−Ｕｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−ウンベリフェロン）六リン酸すなわち３′−ｄＵ６Ｐ−Ｕｍｂ
アデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちＡ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））））三リン酸すなわちＧ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちＣ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちＴ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちＵ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄＡ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄＧ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄＣ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄＴ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄＵ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄｄＡ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄｄＧ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄｄＣ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄｄＴ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわちｄｄＵ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわち３′−ｄＡ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわち３′−ｄＧ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわち３′−ｄＣ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわち３′−ｄＴ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））三リン酸すなわち３′−ｄＵ３Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））））四リン酸すなわちＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄｄＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄｄＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄｄＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわちｄｄＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわち３′−ｄＡ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわち３′−ｄＧ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわち３′−ｄＣ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわち３′−ｄＴ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−（４−メチルウンベリフェロン））四リン酸すなわち３′−ｄＵ４Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄｄＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄｄＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄｄＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄｄＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわちｄｄＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわち３′−ｄＡ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわち３′−ｄＧ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわち３′−ｄＣ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわち３′−ｄＴ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−（４−メチルウンベリフェロン））五リン酸すなわち３′−ｄＵ５Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
グアノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
シチジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
チミジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
ウリジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄｄＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄｄＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄｄＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄｄＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわちｄｄＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわち３′−ｄＡ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわち３′−ｄＧ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわち３′−ｄＣ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわち３′−ｄＴ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
３′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−（４−メチルウンベリフェロン））六リン酸すなわち３′−ｄＵ６Ｐ−ＭｅＵｍｂ
アデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちＡ３Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）））三リン酸すなわちＧ３Ｐ−ＲＲ
シチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちＣ３Ｐ−ＲＲ
チミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちＴ３Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちＵ３Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄＡ３Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄＧ３Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄＣ３Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄＴ３Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄＵ３Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄｄＡ３Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄｄＧ３Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄｄＣ３Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄｄＴ３Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわちｄｄＵ３Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわち３′−ｄＡ３Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわち３′−ｄＧ３Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわち３′−ｄＣ３Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわち３′−ｄＴ３Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）三リン酸すなわち３′−ｄＵ３Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちＡ４Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）））四リン酸すなわちＧ４Ｐ−ＲＲ
シチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちＣ４Ｐ−ＲＲ
チミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちＴ４Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちＵ４Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄＡ４Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄＧ４Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄＣ４Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄＴ４Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄＵ４Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄｄＡ４Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄｄＧ４Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄｄＣ４Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄｄＴ４Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわちｄｄＵ４Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわち３′−ｄＡ４Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわち３′−ｄＧ４Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわち３′−ｄＣ４Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわち３′−ｄＴ４Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−７−レゾルフィン）四リン酸すなわち３′−ｄＵ４Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちＡ５Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちＧ５Ｐ−ＲＲ
シチジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちＣ５Ｐ−ＲＲ
チミジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちＴ５Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちＵ５Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄＡ５Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄＧ５Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄＣ５Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄＴ５Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄＵ５Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄｄＡ５Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄｄＧ５Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄｄＣ５Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄｄＴ５Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわちｄｄＵ５Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわち３′−ｄＡ５Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわち３′−ｄＧ５Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシシチジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわち３′−ｄＣ５Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシチミジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわち３′−ｄＴ５Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシウリジン−５′−（ε−７−レゾルフィン）五リン酸すなわち３′−ｄＵ５Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちＡ６Ｐ−ＲＲ
グアノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちＧ６Ｐ−ＲＲ
シチジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちＣ６Ｐ−ＲＲ
チミジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちＴ６Ｐ−ＲＲ
ウリジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちＵ６Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄＡ６Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄＧ６Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄＣ６Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄＴ６Ｐ−ＲＲ
２′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄＵ６Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄｄＡ６Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄｄＧ６Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄｄＣ６Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄｄＴ６Ｐ−ＲＲ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわちｄｄＵ６Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわち３′−ｄＡ６Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわち３′−ｄＧ６Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシシチジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわち３′−ｄＣ６Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシチミジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわち３′−ｄＴ６Ｐ−ＲＲ
３′−デオキシウリジン−５′−（ζ−７−レゾルフィン）六リン酸すなわち３′−ｄＵ６Ｐ−ＲＲ
アデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちＡ３Ｐ−ＦｌＥｔ
グアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））））三リン酸すなわちＧ３Ｐ−ＦｌＥｔ
シチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちＣ３Ｐ−ＦｌＥｔ
チミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちＴ３Ｐ−ＦｌＥｔ
ウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちＵ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄＡ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄＧ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄＣ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄＴ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄＵ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄｄＡ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄｄＧ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄｄＣ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄｄＴ３Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわちｄｄＵ３Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわち３′−ｄＡ３Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわち３′−ｄＧ３Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわち３′−ｄＣ３Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわち３′−ｄＴ３Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））三リン酸すなわち３′−ｄＵ３Ｐ−ＦｌＥｔ
アデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちＡ４Ｐ−ＦｌＥｔ
グアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））））四リン酸すなわちＧ４Ｐ−ＦｌＥｔ
シチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちＣ４Ｐ−ＦｌＥｔ
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ウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちＵ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシアデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄＡ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシグアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄＧ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシシチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄＣ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシチミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄＴ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄＵ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄｄＡ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄｄＧ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄｄＣ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄｄＴ４Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわちｄｄＵ４Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシアデノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわち３′−ｄＡ４Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシグアノシン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわち３′−ｄＧ４Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシシチジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわち３′−ｄＣ４Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシチミジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわち３′−ｄＴ４Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシウリジン−５′−（δ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））四リン酸すなわち３′−ｄＵ４Ｐ−ＦｌＥｔ
アデノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちＡ５Ｐ−ＦｌＥｔ
グアノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちＧ５Ｐ−ＦｌＥｔ
シチジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちＣ５Ｐ−ＦｌＥｔ
チミジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちＴ５Ｐ−ＦｌＥｔ
ウリジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちＵ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄＡ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄＧ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシシチジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄＣ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシチミジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄＴ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシウリジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄＵ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄｄＡ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄｄＧ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄｄＣ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄｄＴ５Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわちｄｄＵ５Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわち３′−ｄＡ５Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわち３′−ｄＧ５Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシシチジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわち３′−ｄＣ５Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシチミジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわち３′−ｄＴ５Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシウリジン−５′−（ε−３′−（６′−エチルフルオロセイン））五リン酸すなわち３′−ｄＵ５Ｐ−ＦｌＥｔ
アデノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちＡ６Ｐ−ＦｌＥｔ
グアノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちＧ６Ｐ−ＦｌＥｔ
シチジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちＣ６Ｐ−ＦｌＥｔ
チミジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちＴ６Ｐ−ＦｌＥｔ
ウリジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちＵ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄＡ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄＧ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシシチジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄＣ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシチミジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄＴ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′−デオキシウリジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄＵ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシアデノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄｄＡ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシグアノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄｄＧ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシシチジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄｄＣ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシチミジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄｄＴ６Ｐ−ＦｌＥｔ
２′、３′−ジデオキシウリジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわちｄｄＵ６Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシアデノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわち３′−ｄＡ６Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシグアノシン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわち３′−ｄＧ６Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシシチジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわち３′−ｄＣ６Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシチミジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわち３′−ｄＴ６Ｐ−ＦｌＥｔ
３′−デオキシウリジン−５′−（ζ−３′−（６′−エチルフルオロセイン））六リン酸すなわち３′−ｄＵ６Ｐ−ＦｌＥｔ
表４：リン酸を除去せずに検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の例
ＦＡＭ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ＲＯＸ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ＲＥＧ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
Ｒ１１０−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ＲＯＸ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＲＥＧ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
Ｒ１１０−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＲＯＸ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
ＲＥＧ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
Ｒ１１０−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
ＲＯＸ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシンン−三リン酸
ＲＥＧ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
Ｒ１１０−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ＲＯＸ−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ＲＥＧ−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
Ｒ１１０−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドプロピル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドドデシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドシクロヘキシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドキシレン−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ＦＡＭ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
ＲＯＸ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
ＲＥＧ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
Ｒ１１０−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
Ｃｙ３−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
Ｃｙ５−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
アレキサ（Ａｌｅｘａ）−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
ＦＡＭ−アミド−トリエチレングリコール−デオキシアデノシン−５′−三リン酸
ＦＡＭ−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−三リン酸
ＲＥＧ−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−三リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−三リン酸
ＲＯＸ−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−三リン酸
Ｃｙ３−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−三リン酸
Ｃｙ５−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−三リン酸
Ｃｙ５−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
ＲＯＸ−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
Ｃｙ３−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
ＴＡＭＲＡ−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−５′−五リン酸
ＴＡＭＲＡ−（Ｌｙｓ）ｎ−アミドへプチル−アミド−デオキシグアノシン−５′−四リン酸
ＴＡＭＲＡ−（Ｌｙｓ）ｎ−アミドへプチル−アミド−チミジン−５′−四リン酸
式Ｉ中のリン酸化標識が蛍光源部分である時、それは、望ましくは、下記（全て、ホスホモノエステルとして記載）のひとつから選択される：ＥＬＦ９７の名称で市販されている２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、フルオレセインジホスフェート（四アンモニウ塩）、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸（ニアンモニウム塩）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（遊離酸）、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びその誘導体類。これらの色素類の構造を下記に示した。
【００９４】
【化１３】
2006524040.tif 000017
【００９５】
【化１４】
2006524040.tif 000018
【００９６】
【化１５】
2006524040.tif 000019
【００９７】
上記式Ｉ中のリン酸化標識部分が発色源部分であるとき、それは、下記から選択される：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドキシルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びその誘導体類。これらの発色源色素類の構造を、下記にホスホモノエステル類として示した。
【００９８】
【化１６】
2006524040.tif 000020
【００９９】
末端リン酸位における部分はさらに、化学発光化合物であることができ、それは、ホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物であることが望ましい。この１、２−ジオキセタン化合物には、ＣＤＰ−Ｓｔａｒの名称で市販されている２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸ニナトリウム塩（Ｔｒｏｐｉｘ社，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、ＣＳＰＤの名称で市販されているクロロアダマンチ−２′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン（Ｔｒｏｐｉｘ）、及びＡＭＰＰＤの名称で市販されている３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（Ｔｒｏｐｉｘ）が含まれるが、それらに限定されない。これらの市販ジオキセタン化合物類の構造は、米国特許５，５８２，９８０、５，１１２，９６０及び４，９７８，６１４にそれぞれ開示されており、本文で参考として引用している。
【０１００】
リン酸を除去せずに検出可能でマンガン塩存在下でポリメラーゼによりＤＮＡ中によく取り込まれる色素を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の数例を、下記の構造式に示した。
【０１０１】
【化１７】
2006524040.tif 000021
【０１０２】
【化１８】
2006524040.tif 000022
【０１０３】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
ａ）式Ｉ：
【０１０４】
【化１９】
2006524040.tif 000023
【０１０５】
（式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である）による１種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素の１種以上、
ｃ）ホスファターゼ、及び
ｄ）マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【０１０６】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
ａ）式Ｉ：
【０１０７】
【化２０】
2006524040.tif 000024
【０１０８】
（式中、Ｐ＝リン酸（ＰＯ３）とその誘導体類であり、ｎは２以上であり、Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、Ｐ−Ｌは、ＬとＰの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでＬは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である）による１種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素の１種以上、及び
ｃ）マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【０１０９】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
ａ）下記の式ＩＩ：
【０１１０】
【化２１】
2006524040.tif 000025
【０１１１】
（式中、Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の少なくとも１個のマンガン錯体、及び
ｂ）核酸ポリメラーゼを含む。
【０１１２】
さらに核酸検出キットが提供され、
ａ）式ＩＩ：
【０１１３】
【化２２】
2006524040.tif 000026
【０１１４】
（式中、Ｌａｂｅｌは、リンカーを有していても有していなくてもよいＮＰＰに結合した検出可能部分であり、ＮＰＰは、４個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びｘは１以上である）の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の１種以上のマンガン錯体、
ｂ）核酸ポリメラーゼ、及び
ｃ）金属イオン結合緩衝液を含む。
【０１１５】
前記キットに含まれる末端リン酸標識ヌクレオチド又はそのマンガン錯体中の糖部分には、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′、３′−ジデオキシリボシル、２′、３′−ジデハイドロジデオキシリボシル、２′−又は３′−アルコキシリボシル、２′−又は３′−アミノリボシル、２′−又は３′−フルオロリボシル、２′−又は３′−メルカプトリボシル、２′−又は３′−アルキルチオリボシル、非環式、環式炭素及び他の修飾糖類が含まれるが、それらに限定されない。
前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１６】
さらに、上記にも述べたように、酵素活性化可能な標識には、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色源色素、質量タグ、電気化学的タグ又はその組合せであることができる。前記ヌクレオチドの末端リン酸位における結合に適した化合物類は、上記に述べたものと同じである。さらに、前記標識は、ホスファターゼによる活性化を必要としない検出可能な標識であることもできる。
本発明の化合物類は、下記の図に示した方法類によって合成することもできる。
末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類の合成：
【０１１７】
【化２３】
2006524040.tif 000027
【０１１８】
式中、Ｘは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ２であり、
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＮＨ、ＣＨ２、ＣＯ又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びＰがＨ又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−５′−四リン酸類の合成：
【０１１９】
【化２４】
2006524040.tif 000028
【０１２０】
式中、Ｘは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ２であり、
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＮＨ、ＣＯ、ＣＨ２又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びＰがＨ又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−５′−五リン酸類の合成：
【０１２１】
【化２５】
2006524040.tif 000029
【０１２２】
式中、Ｘは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ２であり、
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＮＨ、ＣＨ２、ＣＯ又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びＰがＨ又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
【０１２３】
本発明をさらに、下記の実施例を引用して説明する。
【実施例】
【０１２４】
下記の実施例は本発明の好適な態様類を示すが、それらは、全ての態様を例示することを意図していない。これらの実施例は、付属の請求の範囲及び／又は本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２５】
実施例１
γ−（４−トリフルオロメチルクマリニル）ｄｄＧＴＰ（γＣＦ３クマリン−ｄｄＧＴＰ）の調製
ｄｄＧＴＰ（純度９６％を超える４６．４ｍＭ溶液２００μｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２×０．５ｍｌ）とともに共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、９．６ｍｇ、５当量）を添加し、混合物を再度、無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）とともに共蒸発した。残渣を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に取り、混合物を一晩、攪拌した。約２０％の環化されていない三リン酸がまだ存在していた（おそらく、カラム上での環状三メタリン酸の加水分解によるのであろう）。この混合物に対して、さらにＤＣＣ  ２当量を添加し、２時間攪拌後、７−ハイドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（４−トリフルオロメチルウンベリフェロン、４２．７ｍｇ、２０当量）とトリエチルアミン（２６μｌ、２０当量）を添加し、混合物を室温で攪拌した。２日後、ＨＰＬＣ（０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）中０−３０％のアセトニトリルにより１５分間、３０−５０％のアセトニトリルにより５分間及び５０−１００％のアセトニトリルにより１０分間、Ｃ１８  ３．９×１５０ｍｍカラム、流速１ｍｌ／分）により、９．７分のところに新規産物が示され、出発環式三リン酸が示された（２５４ｎｍにおいて、７７対５）。混合物をさらにもう１日攪拌した。Ｐ−３１  ＮＭＲにより、反応混合物の主成分としてガンマ標識ヌクレオシド−三リン酸が示された。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を水で抽出した（５×１ｍｌ）。ＨＰＬＣにより、２５４ｎｍにおいて純度８２％及び３３５ｎｍにおいて８１％が示された。水溶液をまとめ、ロータリエバポレータで濃縮し、水で再度溶解させた（１ｍｌ）。流速１５ｍｌ／分で０．１Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネート（ＴＥＡＢ，ｐＨ８．３）中０−３０％アセトニトリルを３０分間、３０−５０％アセトニトリルを１０分間用いて、１インチ×３００ｃｍのＣ１８カラムで精製した。生成物ピークを、３個の分画で採取した。分画１は、上記と同じ調製ＨＰＬＣ方法により再度精製したが、ただしＴＥＡＢ緩衝液のｐＨはＣＯ２を通気することにより６．７に低下させた。生成物ピークを濃縮し、ＭｅＯＨ（２回）と水（１回）で共蒸発させた。サンプルを水１ｍｌに溶解させた。ＨＰＬＣは、２５４ｎｍと３３５ｎｍにおいて９９％を超える純度を示した。ＵＶにより、３２２ｎｍにおける吸光係数１１，０００を示す濃縮物２．２ｍＭ（７−ハイドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリンのベータガラクトシド誘導体について報告、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ）が示された。ＭＳ：Ｍ−＝７０２．１８（理論値７０２．３１）、ＵＶλＡ＝２５３，２７６＆３２２ｎｍ。ｄｄＧＴＰのガンマリン酸に結合したトリフルオロクマリン色素は、３２２ｎｍの励起最大値を有しかつ約４１５ｎｍの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約３８５ｎｍの励起最大と約５０２ｎｍの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Ａｒｚｕｍａｎｏｖ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９６）、１０月４日、２７１（４０）：２４３８９−９４に記載されている。
【０１２６】
【化２６】
2006524040.tif 000030
【０１２７】
γ−（４−トリフルオロメチルクマリニル）ジデオキシグアノシン−５′−三リン酸（γＣＦ３クマリン−ｄｄＧＴＰ）
実施例２
γ−（３−シアノクマリニル）ｄｄＡＴＰ（γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ）の調製
ｄｄＡＴＰ（純度９６％を超える８９ｍＭ溶液１００μｌ）を、無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）とともに共蒸発した。これに、ＤＣＣ（９．２ｍｇ、５当量）を添加し、混合物を再度、無水ＤＭＦ（１ｍｌ）とともに共蒸発した。残渣を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に取り、反応物を室温で攪拌した。一晩した後、７−ハイドロキシ−３−シアノクマリン（３３．３ｍｇ、２０当量）とＴＥＡ（２５μｌ、２０当量）を添加し、混合物を室温で攪拌した。１日後、主成分（２５４ｎｍにおいて５５％）が８．１分後に観察され、別のマイナーな産物（約１０％）が１０分で観察された。もう１日しても有意な変化が起こらなかった。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮し、残渣を水３×２ｍｌで抽出した後、ろ過した。水溶液を濃縮し、流速１５ｍｌ／分で０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ６．７）中０−３０％アセトニトリルを３０分間、３０−５０％アセトニトリルを１０分間用いて、Ｃ−１８カラムで精製した。主ピークを、３個の分画で採取した。主ピーク（分画２）のＨＰＬＣは、２５４ｎｍにおいて純度９５．６％及び３３５ｎｍにおいて９８．１％の純度を示した。それをロータリエバポレータで（室温で）濃縮し、ＭｅＯＨ（２×）と水（１×）で共蒸発した。残渣を水０．５ｍｌに溶解させた。サンプル５μｌを希釈し、ＵＶ分析用に１ｍｌに希釈した。Ａ３４６ｎｍ＝０．７８４。吸光係数２０，０００（７−エトキシ−３−シアノクマリンについて報告されている、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ）を想定すると、濃度は７．８４ｍＭであった。収率＝３．９２μＭ、４４％。サンプルは、再度、上記と同一方法を用いてＣ−１８カラムで精製した。サンプルピークは、３個の分画で採取した。分画２＆３は２５４ｎｍにおいて９８％を超える純度を有しており、３４０ｎｍにおいては９９．５％を超えており、それらをまとめた。濃縮後、残渣をＭｅＯＨ（２×）と水（１×）で共蒸発した。サンプルを水（１ｍｌ）に溶解させ、２．７７ｍＭ溶液を得た。ＭＳ：Ｍ−＝６４２．９８ａｕ（理論値６４３．００ａｕ）、ＵＶλＡ＝２６３＆３４６ｎｍ。ｄｄＡＴＰのガンマリン酸に結合したシアノクマリン色素は、３４６ｎｍの励起最大値を有しかつ約４１１ｎｍの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約４０８ｎｍの励起最大と約４５０ｎｍの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Ａｒｚｕｍａｎｏｖ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９６）、１０月４日、２７１（４０）：２４３８９−９４に記載されている。
【０１２８】
【化２７】
2006524040.tif 000031
【０１２９】
γ−（３−シアノクマリニル）ジデオキシアデノシン−５′−三リン酸（γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ）
実施例３
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシチミジン−５′−四リン酸（ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）の調製
ｄｄＴＴＰ（８０ｍＭ溶液１００μｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２×１ｍｌ）とともに共蒸発した。これに、ジシクロゲキシルカルボジイミド（８．３ｍｇ、５当量）を添加し、混合物を再度、無水ＤＭＦ（１ｍｌ）とともに共蒸発した。残渣を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）に取り、反応物を室温で一晩、攪拌した。ＨＰＬＣにより、ほとんどが環化された三リン酸（約８２％）を示していた。この反応混合物を濃縮し、残渣を無水ジエチルエーテルで３回洗浄した。それを再度、無水ＤＭＦに溶解させ、ロータリエバポレータで乾燥するまで濃縮した。残渣を、２００μｌの無水ＤＭＦ中にＤＤＡＯ−一リン酸アンモニウム塩（５ｍｇ、１．５当量）とともに入れ、週末中ずっと４０℃で攪拌した。ＨＰＬＣは、所望のＵＶ特徴を１１．９６分に有する新規生成物が形成されたことを示していた。（ＨＰＬＣ法：  ０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸（ｐＨ７）中０．３０％のアセトニトリルにより１５分間、３０−５０％のアセトニトリルにより５分間、Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ−１８  ３．９×１５０ｍｍカラム、流速１ｍｌ／分）。ＬＣＭＳ（ＥＳ−）はまた、Ｍ−１ピークについて主要マスピーク８３４を示した。反応混合物を濃縮し、Ｄｅｌｔａｐａｋ  Ｃ１８、１９×３００ｍｍカラムで０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（ｐＨ６．７）とアセトニトリルを用いて精製した。生成物を有する分画を、上記と同様の方法を用いてＨＰＬＣによって精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、ＭｅｏＨ（２×）と水（１×）で共蒸発させた。残渣を水（１．２ｍｌ）に溶解させ、１．２３ｍＭ溶液を得た。２５４ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度は、９７．５％を超えており、４５５ｎｍにおいては、９６％を超えていた、ＵＶλＡ＝２６７ｎｍと４５５ｎｍ、ＭＳ：Ｍ−１＝８３４．０４（理論値８．３３．９５）。δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシシチジン−５′−四リン酸（ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）、δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）−ジデオキアデノシン−５′−四リン酸（ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）、及びδ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−イル）−ジデオキシグアノシン−５′−四リン酸（ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）を、同様に合成し精製した。これらの精製化合物類の分析により、下記のデータを得た：ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλＡ＝２６８ｎｍと４５４ｎｍ、ＭＳ：Ｍ−１＝８１９．３２（理論値８１８．９６）、ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλＡ＝２６３ｎｍと４５７ｎｍ、ＭＳ：Ｍ−１＝８４３．３０（理論値８４２．９７）、ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλＡ＝２５７ｎｍと４５７ｎｍ、ＭＳ：Ｍ−１＝８５９．４０（理論値８５８．９７）。
【０１３０】
【化２８】
2006524040.tif 000032
【０１３１】
実施例４
ε−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシチミジン−５′−五リン酸ＤＤＡＯ−ｄｄＴ−五リン酸（ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ）
Ａ．ＤＤＡＯピロリン酸の調製
ＤＤＡＯ−リン酸ジアンモニウム塩（１１．８μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３×１０．２５ｍｌ）とともに共蒸発し、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解させた。これに、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、９．６ｍｇ、５当量）を添加し、混合物を室温で一晩、攪拌した。過剰のＣＤＩをＭｅｏＨ（５μｌ）を添加し３０分間攪拌することによって分解した。この混合物に対し、トリブチルアンモニウムジハイドロゲンリン酸（１０当量、０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液２３６ｍｌ）を添加し、この混合物を室温で４日間攪拌した。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を緩衝液Ａとして０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）及び緩衝液Ｂとして１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）を用いて０−１００％Ｂを用いるＨｉＰｒｅｐ  １６．１０  Ｑ  ＸＬカラムで精製した。主ピーク（ＨＰＬＣ純度９８％）を採取し、濃縮しメタノール（２×）で共蒸発した。残渣を水１ｍｌに溶解させ、５．９ｍＭ溶液を得た。ＵＶ／ＶＩＳλｍａｘ＝４５６ｎｍ。
Ｂ．ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯの調製
ｄｄＴＴＰ（４７．５ｍＭ水溶液１００μｌ）を無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）とともに共蒸発した。これに対して、ＤＣＣ（５当量、４．９ｍｇ）を添加し、混合物をＤＭＦ（１×１ｍｌ）とともに共蒸発した。残渣を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）にとり、室温で３時間攪拌した。これに対して、別に無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）とともに共蒸発したＤＤＡＯピロリン酸１．０３当量をＤＭＦ溶液として添加した。この混合物を乾燥するまで濃縮し、その後、無水ＤＭＦ２００μｌに取った。混合物を３８℃で２日間加熱した。反応混合物を濃縮し、水で希釈し、ろ過し、２段階勾配を用いて０−１００％Ａ−ＢによりＨｉＴｒａｐ  ５ｍｌ  イオン交換カラムで精製した。溶媒Ａ＝０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）及び溶媒Ｂ＝１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）。生成物の大半を含む分画１２×１３をまとめ、濃縮しメタノール（２×）で共蒸発した。残渣を５カラム容量の０．３０％アセトニトリルの０．１ＭＴＥＡＢ溶液と２カラム容量の３０−５０％アセトニトリルを用いて、流速１０ｍｌ／分でＸｔｅｒｒａ  ＲＰ  Ｃ−１８  ３０−１００ｍｍカラムで再度精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、メタノール（２×）と水（１×）で共蒸発した。４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度は９９％を超えていた。ＵＶ／ＶＩＳ＝２６８ｎｍ及び４５５ｎｍ。ＭＳ：Ｍ−１＝９１４．０３（理論値９１３．９３）。
【０１３２】
これらのポリリン酸類の末端リン酸に結合したＤＤＡＯ色素は、励起最大４５５ｎｍ及び発光最大約６０８ｎｍにおいて蛍光性である。リン酸エステルを加水分解させ遊離色素を放出させると、前記スペクトルが変化し、励起最大約６４５ｎｍ及び発光最大約６５９ｎｍであった。この変化は、単純に蛍光測定値又は色変化によって容易に検出される。
【０１３３】
【化２９】
2006524040.tif 000033
【０１３４】
実施例５
Ａ）ｄＣＴＰ−ジアミノヘプチル−ＲＥＧ（ｄＣＴＰ−ＮＨ（ＣＨ２）７−ＮＨ−ＲＥＧ又はｄＣＴＰ−ＤＡＨ−ＲＥＧの合成
【０１３５】
【化３０】
2006524040.tif 000034
【０１３６】
ａ：ｄＣＴＰ−トリエチルアンモニウム塩１０μｍｏｌをトリブチルアミン４０μｍｏｌと混合し、乾燥するまで蒸発させた。残渣を乾燥するまで２回、無水ＤＭＦと共蒸発させた。これをＤＭＦ１ｍｌに再度溶解させ、ＤＣＣ５０μｍｏｌを添加し、乾燥するまで蒸発させた。この混合物を無水ＤＭＦ１ｍｌに溶解させ、室温で一晩、攪拌した。
ｂ：ジアミノへプタン５００μｍｏｌを無水ＤＭＦ５ｍｌに溶解し、乾燥するまで蒸発させた。この後、乾燥ＤＭＦによる共蒸発を２回行った。残渣を乾燥ＤＭＦ２ｍｌに溶解させた。この溶液をＤＣＣ−ｄＣＴＰ反応物（１６時間のＤＣＣ−ｄＣＴＰ反応後）とまとめた。４時間後、ＨＰＬＣは、ジアミノヘプチルｄＣＴＰに８６％が変換したことを示していた。
【０１３７】
反応物を水で２５ｍｌに希釈しＮａＯＨによりｐＨ１２に調整した。この混合物をジエチルエーテルで２回、抽出した。水相を蒸発させ、エーテルを除去した。化合物を、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル勾配を用いてＤｅｌｔａ  ｐａｋカラム１９×３００で精製した。純粋なｄＣＴＰ−ＮＨ（ＣＨ２）７ＮＨ２を示す分画をまとめて、乾燥するまで濃縮した。残渣をエタノールで２回、共蒸発させた。化合物を水（２ｍｌ）に再度溶解させた。ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析による収率は６．４μｍｏｌであった。Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ  Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍカラム、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／ＭｅＣＮ勾配（０−１５％ＭｅＣＮ）１５分によるＨＰＣＬ分析：滞留時間４．５５分。λｍａｘ２７０ｎｍ。
ｃ：ｄＣＴＰ−ジアミノへプタン（上記より）１μｍｏｌを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３ｐＨ９．３により４００μｌに希釈した。これに対して、２００μｌＤＭＦ中５−ＲＥＧ  ＮＨＳエステル２μｍｏｌを添加した。反応は、室温で２時間進行させた。反応物を水で１０ｍｌに希釈し、ＨＲ１０／１０Ｍｏｎｏ  Ｑカラムに載せた。カラムを０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／２５％  アセトニトリルから１Ｍ  ＴＥＡＢ／２５％アセトニトリルまでの勾配により溶出した。ｄＣＴＰ−ＤＡＨ−ＲＥＧを含む分画をまとめ、乾燥するまで濃縮し、エタノールによる共蒸発を２回、行った。生成物を水で溶解し、収量１９０ｎｍｏｌを得た。
Ｂ）ｄＡ４Ｐ−ジアミノヘプチル−ＴＡＭＲＡ（ｄＡ４Ｐ−ＮＨ（ＣＨ２）７−ＮＨ−ＴＡＭＲＡの合成
【０１３８】
【化３１】
2006524040.tif 000035
【０１３９】
ａ：ｄＡ４Ｐの合成：ＴＥＡ  ｄＡＴＰ２００μｍｏｌをトリブチルアミン１ｍＭと混合し、乾燥するまで濃縮させた。残渣を無水ピリジンで１回共蒸発させ、乾燥ＤＭＦでもう１回行った。ｄＡＴＰを乾燥ＤＭＦ５ｍｌに再度溶解させ、カルボニルジイミダゾール１ｍＭを添加した。反応物を４時間攪拌した。４時間後、メタノール８μｌを添加し３０分間攪拌した。次に、ＴＢＡ−Ｈ２ＰＯ４１ｍＭを添加し、反応物を室温で一晩、攪拌した。
【０１４０】
反応物を水で２５ｍｌに希釈し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ１６／１０カラムで０．１Ｍ  ＴＥＡＢから１Ｍ  ＴＥＡＢの勾配ｐＨ６．８を用いて精製した。生成物を含む分画を、Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ  Ｃ１８  １９×１００カラムにのせ、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで２回、共蒸発させた。ｄＡ４ＰをＨＰＣＬでアッセイした（Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ  Ｃ１８  ４．６×１５０  ０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／ＭｅＣＮ  ０−４０％、１２分間）。純度９８％。滞留時間４．９５分。収量１１０μＭ。
ｂ：ｄＡ４−ジアミノヘプチルの合成：下記の試薬類をまとめた：
水２ｍｌ中ｄＡ４Ｐ  ５０μｍｏｌ、０．２Ｍ  １−メチルイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ６を２．５ｍｌ、ＥＤＡＣ９６ｍｇ、及びジアミノへプタン１６２ｍｇ。ｐＨは、ＨＣｌで６に調整し、反応を５時間進行させた。反応物を水で５０ｍｌに希釈し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ１６／１０カラムにのせ、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／１Ｍ  ＴＥＡＢの０−１００％勾配で溶出させた。純粋な生成物を含む分画をまとめて、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで２回、共蒸発させた。ＨＰＬＣ：Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ  Ｃ１８  ０−８０％  ０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／アセトニトリル１２分。純度８５％。滞留時間４．４分。収量７μＭ。
ｃ：ｄＡ４Ｐ−ジアミノへプチル−ＴＡＭＲＡの合成：ｄＡ４Ｐ−ジアミノヘプチル２．５μＭを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．２  ５００μｌに溶解させ、ＤＭＦ４００μｌに溶解させたＴＡＭＲＡ５−ＮＨＳエステル３．５ｍｇと混合した。反応は、室温で一晩進行させた。反応物を水で１０ｍｌに希釈し、ＨＲ１０／１０Ｍｏｎｏ  Ｑカラムで０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／２５％  ＭｅＣＮから１Ｍ  ＴＥＡＢ／２５％ＭｅＣＮまでの勾配により精製した。生成物を含む分画を濃縮し、アセトニトリルを除去し、Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ  Ｃ１８  １９×１００カラムに載せ、０−４０％の０．１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を乾燥するまで濃縮し、メタノールで２回、共蒸発させた。ＨＰＬＣ：Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ  ４．６×１５０ｍｍ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配。純度９９％。収量４５０ｎＭ。
【０１４１】
上記実施例１−５に記載のものに類似の方法を用いて、末端リン酸に結合した色素類又は他の検出可能部分を有する類似のヌクレオチド化合物類もまた、作製できたことに注意されたい。これらには、リボヌクレオチド類、デオキシリボヌクレオチド類、ヌクレオシド−四リン酸類、天然塩基類（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン及びウラシル）ならびに修飾塩基類又は修飾糖類のいずれかを有するヌクレオチド類が含まれる。
【０１４２】
下記の実施例６及び７では、末端リン酸に結合した色素誘導体を有するジデオキシヌクレオチド類が基質類として、成長する核酸中に核酸検出のためのテンプレート特異的プロセスにおいて核酸ポリメラーゼによって効果的に取り込まれることを示す。
【０１４３】
実施例６
ガンマリン酸標識ｄｄＧＴＰのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例（１）のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温（２３℃）で組み立てた。反応物は、ｄＣ又はｄＴのいずれかにより、プライマーの３′末端に隣接する次のテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号２及び配列番号３に対応する２つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー（配列番号１によって表される）を有するプライマー−テンプレート組合せを含有していた。
【０１４４】
【化３２】
2006524040.tif 000036
【０１４５】
ここで図１について説明すると、本実施例におけるテンプレート１（配列番号２）について、ＤＮＡポリメラーゼはこのプライマーを標識ｄｄＧＴＰにより伸長させると考えられる。同様に、図１のテンプレート２（配列番号３）について、ＤＮＡポリメラーゼはこのプライマーを標識ｄｄＧＴＰではなくｄｄＡＴＰにより伸長させると考えられる
反応条件：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、５％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、０．０１％  ｔｗｅｅｎ−２０、０．２５単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレート（次のテンプレートヌクレオチドは、示したようにｄＣＭＰ又はｄＴＭＰのいずれかである）にアニーリングさせた１００ｎＭプライマー、及び２μＭ  ｄｄＧＴＰ−ＣＦ３−クマリンを含む反応物７０μｌを、ＬＳ−５５ルミネセンススペクトロメータ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、３９０ｎｍと５００ｎｍであった。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍとし、発光スリットについて１５ｎｍであった。反応を、３′、５′エキソヌクレアーゼ活性、５′、３′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたＤＮＡポリメラーゼＩを０．３５μｌ（１１単位）と０．２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加し、開始させた。
【０１４６】
図１に示したように、ガンマ標識ｄｄＧＴＰを含む反応について、色素発光は、プライマー：テンプレート１によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、ｄＣであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル移動のピロリン酸生成物を切断すると、ＣＦ３−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー：テンプレート２では、得られなかった。
【０１４７】
実施例７
ガンマリン酸標識ｄｄＡＴＰのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例（２）のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温（２３℃）で組み立てた。反応物は、ｄＣ又はｄＴのいずれかによりプライマーの３′末端に隣接するテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号２及び配列番号３に対応する２つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー（配列番号１）を有するプライマー：テンプレート組合せを含有していた。
【０１４８】
ここで図２について説明すると、本実施例におけるテンプレート２（配列番号３）について、ＤＮＡポリメラーゼはこのプライマーを標識ｄｄＡＴＰにより伸長させると考えられる。同様に、図２のテンプレート１（配列番号２）について、ＤＮＡポリメラーゼはこのプライマーを標識ｄｄＡＴＰではなくｄｄＧＴＰにより伸長させると考えられる
反応条件：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、０．０１％  ｔｗｅｅｎ−２０、０．２５単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレートにアニーリングさせた１００ｎＭプライマー、及び２μＭ  ｄｄＡＴＰ−ＣＮ−クマリンを含む反応物７０μｌを、ＬＳ−５５ルミネセンススペクトロメータ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、４１０ｎｍと４５０ｎｍであった。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍとし、発光スリットについて１５ｎｍであった。反応を、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたＤＮＡポリメラーゼＩを０．３５μｌ（１１単位）と０．２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加し、開始させた。
【０１４９】
図２に示したように、ガンマ標識ｄｄＡＴＰを含む反応について、色素発光は、プライマー：テンプレート２によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、ｄＴであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル移動のピロリン酸生成物を切断すると、ＣＮ−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー：テンプレート１により得られなかった。
【０１５０】
実施例８−１３は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を用いた核酸ポリメラーゼ反応におけるマンガンの重要性を示している。
【０１５１】
実施例８
マグネシウム又はマンガンを含有する緩衝液中におけるリン酸標識ヌクレオチド類対塩基標識ヌクレオチド類の相対的取り込み速度
反応物（１０μｌ、５０℃、１０分）は、１×反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ８．５、０．０１％ｔｗｅｅｎ−２０）、活性化ＤＮＡ３μｇ（染色体ＤＮＡ）、５ｍＭのＭｎＣｌ２（丸）又はＭｇＣｌ２（四角）のいずれか、ＦＡＭ−ＴＡＭ−１１−ｄｄＴＴＰ（点線）又はｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ（実線）のいずれか１μＭと、１回の反応当たり１０単位から１回の反応当たり０．０１単位としたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｉ（商標）  ＤＮＡポリメラーゼを４倍ずつ希釈した溶液を含んでいた。結果（図３）を、線型及び対数スケールの両者でプロットし、酵素と相対的取り込み効率に対して両者とも直線性であることを示している。この結果、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液における塩基標識ヌクレオチドの取りこみ効率が１．４倍低下したが、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液中でリン酸標識ヌクレオチドの取りこみ効率が２８倍増加したことを示している。
【０１５２】
実施例９
５ｍＭ塩化マグネシウム存在下におけるｄＧＴＰ−ＤＡＨ−ＲＥＧの取りこみに及ぼす種々の濃度の塩化マンガンの効果
下記の反応混合物を調製した：２００ｎＭ  ｄＧＴＰ−ＤＡＨ−ＲＥＧ（ＤＡＨ＝ジアミノヘプチルリンカー）、１００ｎＭ  プライマー／テンプレート、０．０１ｍｇ／ｍｌ  Ｐｈｉ  ２９  ｅｘｏ−、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ベータメルカプトエタノール、エビアルカリホスファターゼ０．２５単位、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び種々の濃度のＭｎＣｌ２。取りこみ速度は、ＲＥＧ−ピロリン酸放出に伴うＲＥＧ蛍光の傾きの変化を測定することによって測定した。図４は、検討した濃度範囲でＭｎＣｌ２添加により有意に速度が大きくなることを明らかにしている。
【０１５３】
【化３３】
2006524040.tif 000037
【０１５４】
実施例１０
ＭｇＣｌ２を添加しないＭｎＣｌ２存在下における核酸合成
上記の操作を用いて、ｄＧＴＰ−ＤＡＨ−ＲＥＧの取りこみ速度を、プライマー（配列番号１）と正確及び正確でないテンプレート１と２（それぞれ、配列番号２と配列番号３）を用いて測定した。図５に示したように、正確なテンプレートによる速度がミスマッチテンプレートによる速度よりもはるかに速いことを示している。
【０１５５】
実施例１１
ｄＣＴＰ−ＤＡＨ−ＲＯＸの取りこみの忠実性
実施例９と同じプライマー及びテンプレート（配列番号４）を用いて、反応開始後さまざまな時点におけるｄＣＴＰ−ＤＡＨ−ＲＯＸの取り込みを調べた。アッセイ条件は下記のようであった：総反応容量：３０μｌで、１００ｎＭプライマー／テンプレート、１００ｎＭ  Ｐｈｉ  ２９  ｅｘｏ−ポリメラーゼ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、７５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ。反応は、濃縮物２５μＭに対してＲＯＸ−ｄＣＴＰを添加することによって開始した。生成物をゲル上で分離し、それらは明らかに、単一塩基の伸長とｄＣＴＰ−ＤＡＨ−ＲＯＸのそれ以上の取り込みがないことを示しており、強制条件下においてさえも取りこみミスが起こらないことを示唆している。
【０１５６】
【化３４】
2006524040.tif 000038
【０１５７】
実施例１２
さまざまなポリメラーゼ類による末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みに及ぼすＭｎＣｌ２の効果
オリゴｄＴ（３５ｍｅｒ）は、各等量を２０μＭ濃度で混合し８０℃で４分間インキュベーションし氷上で急激に冷却することによって、ポリｄＡによりアニーリングした。この溶液１μｌを２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ８．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，１０μＭ  ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ，０．００５ｕ／μｌＢＡＰ、図７に示した濃度のポリメラーゼ及び種々の濃度のＭｎＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含む反応物２０μｌに混合した。反応物を、図７に示したように６０℃で１５分又は３０分間インキュベーションした。図７は、試験したすべてのポリメラーゼについて、ＭｎＣｌ２は単独又はＭｇＣｌ２存在下において取りこみ速度に大きな正の効果を及ぼすことを明らかにしている。実際、ＭｎＣｌ２が存在していないと、速度は非常に遅い。
【０１５８】
実施例１３
４種のガンマ標識ｄＮＴＰ類をすべて用いた伸長合成
実施例９と同一のプライマー／テンプレート（配列番号１及び配列番号２）を用いて、下記の反応を組み立てた。反応容量：７０μｌで、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．００５単位／μｌ  ＳＡＰ、それぞれ７５ｎＭのプライマー及びテンプレート、それぞれ１μＭのＤＤＡＯ−ｄＮＴＰ（ここで、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）及び０．１２ｍｇ／ｍｌのＰｈｉ  ２９  ｅｘｏ−ポリメラーゼを６μｌ含んで反応を開始した。図８に示したように、核酸合成は、およそ３０分で完了した。マンガン不在下でほとんどか又は全く合成は起こらなかった。
【０１５９】
実施例１４
標識と末端リン酸の間にリンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の取りこみ速度に及ぼすリンカー類の効果
さまざまなリンカーを有する下記末端リン酸標識ヌクレオチド類を調べた：ＴＡＭＲＡ−ＮＨ−リンカー−ＮＨ−ｄＴＴＰ（２′−デオキシチミジン誘導体）及びＲＥＧ−ＮＨ−リンカーｄＡＴＰ。リンカーは図９に示し、さらに得られたデータも示した。プライマー及びテンプレート配列は、実施例９に述べたものであるが、ただし、取りこみ部位のテンプレート塩基は、入ってくるヌクレオチドの塩基に依存して、さまざまであった（ＳＥＱ  ＩＤ  １，３及び５）。
【０１６０】
【化３５】
2006524040.tif 000039
【０１６１】
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５％  グリセロール、１ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、０．２５単位のＳＡＰ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１００ｎＭプライマー／テンプレート、１μＭヌクレオチド及び１５０ｎＭΔＴｔｓ  ポリメラーゼを含む７０μｌのサンプルを調製し、３０℃でインキュベーションした。反応混合物を異なる時点でゲル上に流し、取りこみ量を求めた。明らかなように、短いリンカー（ジオキシプロパン）を有する末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸は、このポリメラーゼには余りよく受け入れられていない。程度は異なるものの残りは受け入れられ、ヘプチルが最良である。
【０１６２】
実施例１５
異なるＤＮＡポリメラーゼによる取りこみ速度に対して末端リン酸と色素部分の間のリンカーにポリペプチドを添加することが有する効果
ｄＮＴＰに結合させた最適リンカー（末端リン酸と色素部分の間のＮＨ（ＣＨ２）７ＮＨ）の取りこみ速度を、さらにペンタリシンを結合させたｄＮＴＰと比較した。いくつかの異なるＤＮＡポリメラーゼ類を本研究に用いて、ヌクレオチド取り込みに及ぼすリンカー中のリシン部分の効果を確認した。反応は、下記に示したように実施し、結果を下記の表５に示した。
【０１６３】
【表３】
2006524040.tif 000040
【０１６４】
【化３６】
2006524040.tif 000041
【０１６５】
反応混合物は、１０ｎＭ  Ｃｙ５−２０ｍｅｒプライマー（配列番号１）と４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドテンプレート（上記に示した配列番号５）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，バクテリアルアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）及び１００ｍＭの末端リン酸標識ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。
ａ．ＤＮＡポリメラーゼを除いて全成分を混合し０．００１５Ｕ／μｌのＢＡＰ存在下２５℃で５分間インキュベーションし、標識されていないヌクレオチドをすべて加水分解した。
ｂ．反応混合物１μｌを時点ゼロで取り除き、９５％ホルムアミド／２５ｍＭ  ＥＤＴＡ４μｌ中でクエンチングさせた。
ｃ．ＤＮＡポリメラーゼ１μｌを添加し反応を開始させた。異なる時点でアリコット２μｌを取り（短い時間コースでは、１５、３０及び６０秒）、９５％ホルムアミド／２５ｍＭ  ＥＤＴＡ８μｌ中でクエンチングさせた。
ｄ．サンプルを沸騰水中で４分間変性させ、氷で急激に冷却し、２μｌを２５％（１９：１−アクリルアミド：ビスアクリルアミド）、８Ｍ尿素、１×ＴＢＥ  ＰＡＧＥに載せた。ゲルを約１時間、５００Ｖで流した。
ｅ．ＤＮＡ生成物をＳｔｏｒｍ８６０で可視化し、２１ｍｅｒ生成物に変換された２０ｍｅｒプライマーの総量分画を計算することによって定量した。
【０１６６】
上記表５から、ペンタ−リシン結合ヌクレオチドが、異なるポリメラーゼ類によってＣ７結合ヌクレオチドよりもはるかに効率的に取り込まれることが明らかである。
【０１６７】
実施例１６
リンカーを有していない三、四、及び五リン酸類と色素と末端リン酸の間にＣ７又はＴＥＧリンカーを有する上記リン酸類とのＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いた取り込み速度の比較
下記のプライマー／テンプレートを使用した  Ａ（デオキシグアノシンアナログ用、配列番号１及び配列番号２）及びＢ（チミジンアナログ用、配列番号１及び配列番号５）
【０１６８】
【化３７】
2006524040.tif 000042
【０１６９】
上記実施例１５で報告したものと同じ操作を用いた。結果を下記の表１６に示した。
【０１７０】
【表４】
2006524040.tif 000043
【０１７１】
これらのデータは、リンカー中にさらにリン酸類があると取りこみ速度を高めることを明確に示しており、例えば、化合物３対１でわかる。さらに、ＴＥＧリンカーがジアミノヘプチル（ＮＨ（ＣＨ２）７ＮＨ）リンカーよりも優れており、化合物２対１及び化合物５対４でわかる。
【０１７２】
色素上にさらに負の電荷があると、取りこみ速度を高め、それは、化合物４対３（色素上に負の電荷）でわかる。
【０１７３】
上記に記載の本発明の教示の恩恵を受ける当該技術の当業者は、それに対して数多くの変更を行うことができる。これらの変更も、付属の請求の範囲に示したような本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】ホスファターゼ存在下テンプレート特異的プロセスにおけるガンマ−リン酸標識ｄｄＧＴＰのポリメラーゼ利用によって得られた蛍光を示すグラフである。
【図２】ホスファターゼ存在下テンプレート特異的プロセスにおけるガンマ−リン酸標識ｄｄＡＴＰのポリメラーゼ利用によって得られた蛍光を示すグラフである。
【図３】補因子としてのＭｇ＋＋又はＭｎ＋＋の存在下における塩基標識ジデオキシヌクレオチド類とリン酸標識ジデオキシヌクレオチド類の取り込みを示したグラフである。
【図４】５ｍＭ固定濃度のＭｇＣｌ２存在下、エキソヌクレアーゼ欠乏Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いたγ−ローダミン−６Ｇ標識ＧＴＰの取り込みに及ぼすＭｎＣｌ２の効果を示したグラフである。
【図５】異なる濃度でＭｎＣｌ２のみが存在している時の末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みを示すグラフである。
【図６】ＭｎＣｌ２単独存在下、エキソヌクレアーゼ欠乏Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによるｄＣＴＰ−γ−ＲＯＸの取り込みを示したグラフである。Ｍｎ単独存在下では、取り込みミスは観察されなかった。
【図７Ａ−Ｅ】Ｍｇ＋＋単独存在、Ｍｎ＋＋単独存在及びＭｇ＋＋及びＭｎ＋＋塩類混合物存在下におけるポリＡテンプレート上での異なるＤＮＡポリメラーゼによる末端リン酸標識−ｄｄＴ４Ｐ（ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）の取り込みを示す一連のグラフである。
【図８】ＭｎＣｌ２存在下、４種の末端リン酸標識ヌクレオチド類を全て用い、テンプレートとして２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマーと４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いた４０ｍｅｒのＤＮＡ合成を示すゲルファイルである。
【図９】リンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込み量に及ぼす種々のリンカー類の効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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