(57)【要約】本発明は、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善および／または保護するための美容処置方法に関する。該方法は、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する少なくとも１種の物質を含有する製剤を局所適用することを含んで成る。本発明はまた、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質を、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善保護するための化粧用製剤の製造に使用すること、皮膚を老化および酸化的ストレスから保護するための化粧用製剤の製造に使用すること、環境有害物質およびＵＶ線の有害作用から保護するための化粧用製剤の製造に使用することにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善および／または保護するための美容処置方法であって、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する少なくとも１種の物質を含有する製剤を局所適用することを含んで成る方法。
【請求項２】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質の、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善および／または保護する化粧用製剤の製造のための使用。
【請求項３】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質の、皮膚を老化から保護する化粧用製剤の製造のための使用。
【請求項４】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質の、皮膚、頭皮および粘膜を有害な環境的影響から保護する化粧用製剤の製造のための使用。
【請求項５】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質の、皮膚、頭皮および粘膜をＵＶ線から保護する化粧用製剤の製造のための使用。
【請求項６】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質の、酸化的ストレスに抗する化粧用製剤の製造のための使用。
【請求項７】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質の、脱毛に抗し、毛髪の性質を改善する化粧用製剤の製造のための使用。
【請求項８】
前記物質が、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する植物抽出物である請求項２〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
抽出物が、植物のPisum sativum、Ruscus aculeatus、Centella asiatica、Calendula officinalis、Aesculus hippocastanumおよび／またはHibiscus esculentusから得られる請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記物質が、マンニトール、シクロデキストリン、酵母エキス、パンテノール、プロピレングリコール、アンモニウム、グリチルリチン酸塩およびコハク酸二ナトリウム、低分子量ポリペプチドから成る群から選択される請求項２〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する少なくとも１種の物質、ＵＶ保護剤および／または抗酸化剤を含有する化粧用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して化粧用製剤に関し、とりわけ、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善および／または保護し、並びにヒト皮膚を老化、酸化的ストレス、および環境有害物質およびＵＶ線の有害作用から保護する方法に関する。本発明はまた、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質を、真皮／表皮接合部の改善および／または保護のための化粧用製剤の製造に使用することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
基底膜は、形態学的に異なる組織の間の結合セル構造物である。それは皮膚において、血管を取り巻き、真皮と表皮の間にある組織として主として見られる。真皮と表皮の間の部分は、表皮およびその付属器と真皮とを隔てるもので、従って真皮／表皮接合部（ＤＥＪ）として知られている。ＤＥＪは、ヘミデスモソーム、中間径フィラメント、アンカリングフィラメント、緻密層およびアンカリング線維から成る複雑な構造物である。その中に主として存在する生化学的成分は、透明層に存在するラミニン−５；ヘミデスモソームに存在する抗原ＡgＢＰ２３０およびＡgＰＢ１８０並びにプレクチン／ＨＤ１；透明層および緻密層に存在するエンタクチン／ナイドジェンおよびプロテオグリカンであるパールカン；緻密層に存在するIV型コラーゲン、並びに緻密層下に存在するアンカリング線維の構成成分としてのプロテオグリカンであるVII型コラーゲンを包含する。これらの成分は相互作用ネットワークを形成する。
【０００３】
ＤＥＪは皮膚の最も重要な構造物である。ＤＥＪは、表皮とその下の真皮の間の接着を確立し、ヘミデスモソーム、フィラメントおよび線維から成る特殊な結合セル複合体によって細胞と細胞外マトリックスとを係留することにより上皮組織の統合性を維持している。
ＤＥＪは一方では、特定の分子の流通に対するフィルターの役割を果たし、他方では、ケラチノサイトと真皮との間の情報（例えば成長因子に関する情報）の交換を可能にする。
【０００４】
加齢によってもたらされるＤＥＪの変化は、接合部の厚さの減少、および真皮における基底ケラチノサイトから成る細胞質細胞ストランドの減少を包含する。その結果、ＤＥＪ面が減少し、それが組織の抵抗力の低下、皮膚弾力の低下、およびしわの増加を招く。また、他の老化徴候、例えば緻密層の多重化、アンカリング線維の老化、またはＤＥＪのセル成分の変化は、加齢につれて、表皮系中の係留の緩みをもたらす。また、VII型コラーゲンの加齢による減少が、メタロプロテイナーゼによるコラーゲンの加水分解によって説明される。VII型コラーゲンは、加齢と共にプロテアーゼ抵抗性が弱まるようである。
【０００５】
ＵＶ誘発性の損傷（アンカリング線維中のVII型コラーゲン含量の低下を招く）も、真皮と表皮の間の接着の緩みをもたらし、それ故、皮膚の弾力性を低下させ、しわを増やす。
ＤＥＪを損う多くの疾患は、表皮下の大きさの増加を招く。それは共通する特徴として真皮と表皮の間の接着の弱まりを示し、これはＤＥＪレベルでは凹みの形状となって現れる。
【０００６】
真皮／表皮接合部の機能を改善するために、とりわけＤＥＪの成分、例えばラミン（ＦＲ２８１３０１８、ＷＯ９７／４８４１５）またはカリニン（ＷＯ９２／１７４９８）が、化粧用および皮膚用製剤中に用いられている。抗老化、抗しわおよび皮膚弾性化用の化粧用製剤を製造するために、アスパラギン酸マグネシウム（ＷＯ９９／６２４８１）、サポニン（ＦＲ２７７９０５８）または植物抽出物（ＥＰ６６８０７２）によるIV型コラーゲン刺激、およびエラグ酸（ＷＯ９９／１６４１５）、Potentilla erecta植物抽出物（ＷＯ９８／１９６６４）またはBertholletia抽出物（ＵＳ６００４５６８）によるVII型コラーゲンの刺激も開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
環境的に誘発される老化から皮膚を有効に保護することが依然必要とされている。すなわち、本発明の課題は、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善する新しいメカニズムを提供することである。このメカニズムは、皮膚老化の遅延に寄与し、環境的影響、酸化的ストレス、有害物質またはＵＶ線からの皮膚、頭皮および粘膜の保護に寄与し、したがって、局所適用する化粧用製剤中に有効に使用し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善および／または保護するための美容処置方法であって、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する少なくとも１種の物質を含有する製剤を局所適用することを含んで成る方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質を、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を改善および／または保護するための化粧用製剤の製造に使用すること、皮膚を老化から保護するための化粧用製剤の製造に使用すること、酸化的ストレス、環境有害物質およびＵＶ線の有害作用から保護するための化粧用製剤の製造に使用することにも関する。
【００１０】
驚くべきことに、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンのような分子の調節は、皮膚、頭皮および粘膜の真皮／表皮接合部を維持および改善をもたらすことがわかった。ＤＥＪの機能は、健康のために本質的に必要であるだけでなく、美容的ケアのためにも必要である。これは、表皮とその下の真皮組織との良好な接着をもたらし、従って皮膚の弾力性と張りを維持し、しわを防ぐことができる。更に、ＤＥＪは一方で、表皮と真皮の間の重要分子の通過によって皮膚の有効な栄養補給を確実なものとし、他方では、比較的深い皮膚層への有害分子の侵入からの保護を提供する。
【００１１】
プレクチン／ＨＤ１、エンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンを、それらの物質を刺激する製剤の局所適用によって調節すると、真皮／表皮接合部またはＤＥＪの複雑なネットワーク全体が強化され得ることがわかった。その結果、皮膚が弾力性となり、しわの形成が抑制される。老化の徴候（ＵＶ線により引き起こされるものを含む）を、ＤＥＪ成分間の係留の改善並びにそれに関連する組織安定性向上および弾力性向上によって、有効に防止することができる。
【００１２】
分子輸送機能の改善の故に、ケラチノサイトと真皮の間の交換、および皮膚の栄養補給が最適化されるので、皮膚は、老化から保護されるだけでなく、栄養改善によって有害分子からの防御も強化されるので、ＵＶ線および毒性の環境的影響の有害作用からも保護される。
【００１３】
ＤＥＪは頭皮の毛包を取り巻いており、毛包保護をも提供するので、この部分におけるＤＥＪの強化は、毛髪の性質の改善を導き、とりわけ脱毛または毛髪損傷に対して効果的である。
【００１４】
すなわち、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する少なくとも１種の物質を含有する化粧用局所製剤は、皮膚の老化、並びに皮膚、頭皮、毛髪および粘膜に対する酸化的ストレス、環境有害物質およびＵＶ線の有害作用を予防するのに有効である。予防的効果に加えて、前記特定分子の調節は、損傷を受けた後の皮膚、頭皮および粘膜の再生促進を導く。
【００１５】
植物抽出物、特にPisum sativum、Ruscus aculeatus、Centella asiatica、Calendula officinalis、Aesculus hippocastanumおよび／またはHibiscus esculentusの抽出物が、特に適当な調節剤であることがわかった。しかし、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンは、ＤＥＪ成分の生成に必要な低分子量ペプチド、およびプレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの構成成分と同様の配列を有する低分子量ペプチドの投与によっても調節できる。
【００１６】
マンニトール、シクロデキストリン、酵母エキス、パンテノール、プロピレングリコール、アンモニウム、グリチルリチン酸塩およびコハク酸二ナトリウムから成る群から選択する少なくとも１種の物質が前記分子を調節することもわかっている。特にこのような成分の組み合わせは、真皮／表皮接合部に対する有利な作用に寄与する。
【００１７】
ＤＥＪは多くの異なるプロテアーゼによる分解を非常に受け易いので、植物抽出物、ペプチドおよび他の活性物質（抗プロテアーゼ活性を有する）の使用は、構造維持に顕著に寄与する。抗プロテアーゼ活性を有する活性物質は、プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質との組み合わせとして、平均以上の効果の向上に寄与し得る。
【００１８】
本発明の化粧用製剤は、上記物質または植物抽出物のほか、ＵＶ保護剤および／または抗酸化剤をも含有し得る。プレクチン／ＨＤ１および／またはエンタクチン／ナイドジェンおよび／またはパールカンの調節に作用する物質と、ＵＶ保護剤および／または抗酸化剤との組み合わせは、関連する様々なメカニズムによって相乗的な作用をもたらし、ＵＶ光による有害作用および皮膚老化からの優れた保護を提供する。
【００１９】
プレクチン／ＨＤ１
プレクチンおよびＨＤ１は、同一分子を意味する同義語である。これはヘミデスモソーム内に存在し、分子量が約５００ダルトンであり、細胞骨格のタンパク質、例えばケラチン、ビメンチンまたは微小管タンパク質を係留するよう機能する。
【００２０】
エンタクチン／ナイドジェン
エンタクチンおよびナイドジェンも、同一分子の別称である。これは、長鎖構造によって連結された二つの末端球状部分から成る、分子量約１５０ダルトンの糖タンパク質である。この糖タンパク質は、ラミニンとIV型コラーゲンの間の連結を確立し、多くの他の成分（例えばフィブリンまたはパールカン）の係留に寄与することによって、ＤＥＪの構造安定性に非常に重要な役割を果す。
【００２１】
パールカン
すべての基底膜がプロテオグリカンを含む。ＤＥＪに存在するプロテオグリカンは主として、真皮線維芽細胞によって合成されるヘパラン硫酸であるパールカンである。パールカンは、大きなコアタンパク質と、３本のヘパラン硫酸鎖から成る。その機能はとりわけ、ラミニン−６とナイドジェンの間の結合を安定化することである。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、係留機能を有するほか、拡散分子、例えば酵素および成長因子を結合し、従って細胞の挙動および性質にも影響を及ぼし得る。
【００２２】
ＵＶ保護剤および抗酸化剤
本発明においてＵＶ保護剤とは、例えば、室温で液状または結晶であり、紫外線または赤外線を吸収して、その吸収したエネルギーをより長波長の放射線（例えば熱）として放出することのできる有機物質（光フィルター）である。ＵＶ−Ｂフィルターは、油溶性または水溶性であり得る。油溶性物質を以下例示する：
【００２３】
・３−ベンジリデンカンファーまたは３−ベンジリデンノルカンファーおよびそれらの誘導体、例えば３−（４−メチルベンジリデン）−カンファー；
・４−アミノ安息香酸誘導体、好ましくは４−（ジメチルアミノ）−安息香酸−２−エチルヘキシルエステル、４−（ジメチルアミノ）−安息香酸−２−オクチルエステル、および４−（ジメチルアミノ）−安息香酸アミルエステル；
・桂皮酸エステル、好ましくは４−メトキシ桂皮酸−２−エチルヘキシルエステル、４−メトキシ桂皮酸プロピルエステル、４−メトキシ桂皮酸イソアミルエステル、２−シアノ−３,３−フェニル桂皮酸−２−エチルヘキシルエステル［オクトクリレン（Ｏctocrylene）］；
・サリチル酸エステル、好ましくはサリチル酸−２−エチルヘキシルエステル、サリチル酸−４−イソプロピルベンジルエステル、サリチル酸ホモメンチルエステル；
【００２４】
・ベンゾフェノン誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４'−メチルベンゾフェノン、２,２'−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン；
・ベンザルマロン酸エステル、好ましくは４−メトキシベンザルマロン酸ジ−２−エチルヘキシルエステル；
・トリアジン誘導体、例えば２,４,６−トリアニリノ−（ｐ−カルボ−２'−エチル−１'−ヘキシルオキシ）−１,３,５−トリアジン、およびオクチル・トリアゾン（Octyl Triazone）、またはジオクチル・ブタミド・トリアゾン（Dioctyl Butamido Triazone）［Uvasorb（登録商標）HEB］；
・プロパン−１,３−ジオン、例えば１−（４−ｔ−ブチルフェニル）−３−（４'−メトキシフェニル）−プロパン−１,３−ジオン；
・ケトトリシクロ（５.２.１.０）デカン誘導体。
【００２５】
適当な水溶性物質は、次のような物質である：
・２−フェニルベンゾイミダゾール−５−スルホン酸並びにそのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、アルカノールアンモニウム塩およびグルカンモニウム塩；
・ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸およびその塩；
・３−ベンジリデンカンファーのスルホン酸誘導体、例えば４−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）−ベンゼンスルホン酸および２−メチル−５−（２−オキソ−３−ボルニリデン）−スルホン酸並びにそれらの塩。
【００２６】
通常のＵＶ−Ａフィルターはとりわけ、ベンゾイルメタン誘導体、例えば１−（４'−ｔ−ブチルフェニル）−３−（４'−メトキシフェニル）−プロパン−１,３−ジオン、４−ｔ−ブチル−４'−メトキシジベンゾイルメタン（Ｐarsol（登録商標）１７８９）または１−フェニル−３−（４'−イソプロピルフェニル）−プロパン−１,３−ジオン、およびエンアミン化合物である。
【００２７】
ＵＶ−ＡフィルターとＵＶ−Ｂフィルターを混合物として使用しても当然よい。特に好ましい組み合わせは、ベンゾイルメタン誘導体、例えば４−ｔ−ブチル−４'−メトキシジベンゾイルメタン（Ｐarsol（登録商標）１７８９）および２−シアノ−３,３−フェニル桂皮酸−２−エチルヘキシルエステル（オクトクリレン）と、桂皮酸エステル、好ましくは４−メトキシ桂皮酸−２−エチルヘキシルエステルおよび／または４−メトキシ桂皮酸プロピルエステルおよび／または４−メトキシ桂皮酸イソアミルエステルとの組み合わせから成る。好ましくは、そのような組み合わせは、水溶性フィルター、例えば２−フェニルベンゾイミダゾール−５−スルホン酸並びにそのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、アルカノールアンモニウム塩およびグルカンモニウム塩と組み合わせる。
【００２８】
上記可溶性物質のほかに、不溶性遮光顔料、すなわち、微分散金属酸化物または塩を、この目的のために使用してもよい。適当な金属酸化物の例は、とりわけ、酸化亜鉛、二酸化チタン、および鉄、ジルコニウム、ケイ素、マンガン、アルミニウムおよびセリウムの酸化物、並びにそれらの混合物である。塩としては、ケイ酸塩（タルク）、硫酸バリウムおよびステアリン酸亜鉛を使用し得る。このような酸化物および塩は、皮膚の手入れおよび保護用エマルジョン並びに装飾的化粧品中に、顔料として使用される。
【００２９】
このような粒子の平均直径は、１００nm未満、好ましくは５〜５０nm、より好ましくは１５〜３０nmとすべきである。粒子は球形であり得るが、楕円形粒子または他の非球形粒子を使用してもよい。顔料は、表面処理（すなわち、親水化または疎水化）してもよい。その例は、コーティングした二酸化チタン、例えばＴitandioxid  Ｔ８０５（Degussa）またはＥusolex（登録商標）Ｔ２０００（Merck）である。適当な疎水性コーティング材料はとりわけ、シリコーンおよび特にトリアルコキシオクチルシランまたはシメチコンである。日焼け止め製剤中には、いわゆるマイクロピグメントまたはナノピグメントを使用することが好ましい。微粉化した酸化亜鉛を使用することが好ましい。
【００３０】
上記二群の主な日焼け止め剤のほかに、抗酸化剤タイプの副次的日焼け止め剤をも使用し得る。抗酸化剤タイプの副次的日焼け止め剤は、ＵＶ線が皮膚に侵入すると開始される光化学反応鎖を断つ。その例を次に挙げる：アミノ酸（例えばグリシン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン）およびその誘導体、イミダゾール（例えばウロカニン酸）およびその誘導体、ペプチド、例えばＤ,Ｌ−カルノシン、Ｄ−カルノシン、Ｌ−カルノシンおよびそれらの誘導体（例えばアンセリン）、カロチノイド、カロテン（例えばα−カロテン、β−カロテン、リコペン）およびその誘導体、クロロゲン酸およびその誘導体、リポン酸およびその誘導体（例えばジヒドロリポン酸）、アウロチオグルコース、プロピルチオウラシルおよび他のチオール（例えばチオレドキシン、グルタチオン、システイン、シスチン、シスタミン、それらのグリコシル、Ｎ−アセチル、メチル、エチル、プロピル、アミル、ブチル、ラウリル、パルミトイル、オレイル、γ−リノレイル、コレステリルおよびグリセリルエステル）およびそれらの塩、ジラウリルチオジプロピオネート、ジステアリルチオジプロピオネート、チオジプロピオン酸およびその誘導体（エステル、エーテル、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび塩）、スルホキシミン化合物（例えばブチオニンスルホキシミン、ホモシステインスルホキシミン、ブチオニンスルホン、ペンタ−、ヘキサ−およびヘプタ−チオニンスルホキシミン）（例えばピコモルないしマイクロモル／kg程度の極く少ない適合量で）、
【００３１】
（金属）キレート剤（例えばα−ヒドロキシ脂肪酸、パルミチン酸、フィチン酸、ラクトフェリン）、α−ヒドロキシ酸（例えばクエン酸、乳酸、リンゴ酸）、フミン酸、胆汁酸、胆汁抽出物、ビリルビン、ビリベルジン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびそれらの誘導体、不飽和脂肪酸およびその誘導体（例えばγ−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸）、葉酸およびその誘導体、ユビキノン、ユビキノールおよびそれらの誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体（例えばアスコルビルパルミテート、Ｍgアスコルビルホスフェート、アスコルビルアセテート）、トコフェロールおよび誘導体（例えばビタミンＥアセテート）、ビタミンＡおよび誘導体（ビタミンＡパルミテート）、ベンゾイン樹脂のコニフェリルベンゾエート、ルチン酸およびその誘導体、α−グリコシルルチン、フェルラ酸、フルフリリデングルシトール、カルノシン、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ノルジヒドログアヤク樹脂酸、ノルジヒドログアヤレト酸、トリヒドロキシブチロフェノン、尿酸およびその誘導体、マンノースおよびその誘導体、スーパーオキシド−ジスムターゼ、亜鉛およびその誘導体（例えばＺnＯ、ＺnＳＯ4）、セレンおよびその誘導体（例えばメチオニンセレン）、スチルベンおよびその誘導体（例えば酸化スチルベン、酸化トランススチルベン）、並びに本発明の目的に適当な上記活性物質の誘導体（塩、エステル、エーテル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチドおよび脂質）。
【実施例１】
【００３２】
プレクチン発現
試薬
モノクローナル抗体の抗プレクチン、および二次抗体であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体ＩｇＧを、TebuおよびClinisciencesから入手した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２）およびエバンスブルーをBioMerieuxから、ＴＧＦをSigmaから入手した。
【００３３】
ＥＫＩＮ再構成ヒト皮膚
Episkin（Ekinキット）からの再構成ヒト皮膚は、コラーゲンで作られた真皮基部から成る。ケラチノサイトを、この基部から除去した。ケラチノサイトの除去、および空気に曝露した培養物中での分化によって、ヒト皮膚等価物を得た。
【００３４】
試験物質
ＴＧＦβを正の対照として使用した。使用した試験物質は、プロピレングリコール、Ruscus aculeatus根抽出物、Centella asiatica抽出物、パンテノール、水、Calendula officinalis花抽出物、加水分解酵母タンパク質、Aesculus hippocastanum抽出物およびグリチルリチン酸アンモニウムを様々な重量含有率で含有する製剤であった。この製剤０．０１％またはＴＧＦβ１０ng／mlで、再構成ヒト皮膚を３日間毎日局所的に処理した。これは、再構成皮膚当たり総量１００μlの製剤に相当する。この処理の直後に生検試料を採り、評価するまで液体窒素中に保管した。
【００３５】
免疫組織化学
１０μmの低温切片（液体窒素中に保管した生検試料）を顕微鏡スライドガラスに固定し、冷アセトン中に１０分間置いた。その後、切片をＰＢＳで洗い、風乾した。
切片を、モノクローナル抗体の抗プレクチンと共に、１／１５０溶液中、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、切片をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体と共に、１／４０溶液中、４５分間インキュベートした。一次抗体を省くことによって負の対照を得た。ＰＢＳでよく洗浄した後、免疫処理切片をエバンスブルーで１０分間処理した。切片をZeiss共焦点レーザー顕微鏡で調べた。
【００３６】
定量
共焦点レーザー顕微鏡により得た画像を、数学的形態学的ソフトウェア（Quantimet Q 500、Leica）によって変換および分析した。結果を、プレクチン（ＦＩＴＣ）によって覆われた再構成皮膚面の割合として表した。
【００３７】
結果
【表１】
2006507257.tif 000002
処理なしでは、再構成皮膚においてＤＥＪ成分プレクチンの発現はわずかに観察されたに過ぎない。
試験物質の製剤で局所処理した場合、再構成皮膚におけるプレクチンの発現は著しい増加を示す。正の対照のＴＧＦも、再構成皮膚におけるプレクチン発現の増加を示す。
【実施例２】
【００３８】
パールカン発現
試薬
モノクローナル抗体の抗パールカン、および二次抗体であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体ＩｇＧを、TebuおよびClinisciencesから入手した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２）およびエバンスブルーをBioMerieuxから、ＴＧＦをSigmaから入手した。
【００３９】
ヒト線維芽細胞初代培養
形成外科手術により得られた成人真皮から標準的なコラゲナーゼ分解によって、ヒト線維芽細胞の細胞懸濁液を調製した。線維芽細胞を、インキュベーション室内のガラス皿に入れ、培地中で増殖させて結合させた。
【００４０】
試験物質
ＴＧＦβを正の対照として使用した。加水分解Hibiscus esculentus抽出物を試験物質として使用した。
培地中、試験物質０．１％またはＴＧＦβ１０ng／mlの存在下に、ヒト線維芽細胞を６日間培養した。その後、免疫細胞化学によってパールカン発現を評価した。
【００４１】
免疫組織化学
ガラス皿中の線維芽細胞培養物を冷メタノール中で１０分間固定し、ＰＢＳで洗った。その後、線維芽細胞培養物を、モノクローナル抗体の抗プレクチンと共に、１／１５０溶液中、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、切片をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体と共に、１／４０溶液中、４５分間インキュベートした。一次抗体を省くことによって負の対照を得た。ＰＢＳでよく洗浄した後、免疫処理切片をエバンスブルーで１０分間処理した。切片をZeiss共焦点レーザー顕微鏡で調べた。
【００４２】
定量
共焦点レーザー顕微鏡により得た画像を、数学的形態学的ソフトウェア（Quantimet Q 500、Leica）によって変換および分析した。結果を、パールカン（ＦＩＴＣ）によって覆われた線維芽細胞培養物の面積の割合として表した。
【００４３】
結果
【表２】
2006507257.tif 000003
処理なしでは、線維芽細胞培養物においてＤＥＪ成分パールカンの発現はわずかに観察されたに過ぎない。
試験物質で局所処理した場合、線維芽細胞培養物におけるパールカンの発現は増加を示す。正の対照のＴＧＦも、線維芽細胞培養物におけるパールカン発現の増加を示す。
実施例１および２の結果は、試験物質（Laboratories Serobiologiques の生成物）がプレクチンおよびパールカンの発現を増加し得ることを示している。
【国際調査報告】
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