(57)【要約】対象物質の細胞に対する作用を調べるためのスクリーニングアッセイにおいて分裂停止細胞を使用する。分裂停止細胞は、薬物スクリーニングアッセイ、シグナル伝達アッセイ、に利用可能であり、特に、大規模ハイスループットアッセイにおいて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある細胞タイプに対する対象物質の作用を測定する方法であって、前記対象物質を前記細胞タイプのサンプルに接触させる工程、ここで、前記サンプル中の前記細胞はその分裂が停止されているものである、そして、前記物質との接触後における前記細胞の前記サンプル中の変化を、前記物質の前記細胞タイプに対する作用の測定として測定する工程、とを有する方法。
【請求項２】
前記細胞が、真核細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、原核細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の分裂が、有糸分裂中に停止されている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の分裂が、減数分裂中に停止されている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、対象のタンパク質を発現する核酸分子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、組換えウィルスによってトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、ＲＮＡによってトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、アンチセンス核酸分子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、タンパク質、ペプチド、又はタンパク質含有分子を形質導入されている請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、更に、Ｃａ２＋固定化（immobilization）の誘導を測定する工程を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、５ＨＴ２ｃを産生するようにトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、Ｇ−タンパク質共役レセプターを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、イオンチャンネルを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｇ−タンパク質共役レセプターが、ムスカリン性アセチルコリンレセプターである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、β２アドレナリンレセプターを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、レポーター分子をコードする核酸分子によって、トランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が、前記細胞中に発現される分子の活性化を介して活性化される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記レポーター分子が、ルシフェラーゼ又は緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、前記対象物質を、前記細胞に作用することが知られている化合物と混合され、その既知の作用に於ける変化を、前記対象物質の前記細胞に対する作用の測定として測定する競合アッセイを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
対象の細胞タイプに対するその作用を測定するために対象物質をスクリーニングするのに有用なキットであって、以下の要素それぞれのポーション、
（i）前記細胞の細胞分裂を停止させる物質、そして
（ii）前記細胞と相互作用し、既知の作用を誘発させることが知られている物質、を有するキット。
【請求項２４】
請求項２３に記載のキットであって、更に、下記の要素のポーション、
（iii）前記細胞の細胞分裂以外の作用に影響する物質、を有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象物質をスクリーニングするための方法に関する。詳細には、本発明は、分裂停止状態にある細胞を利用するものでありながら、通常であれば分裂中の細胞が使用されるアッセイにおいて、効果的に機能するスクリーニングアッセイに関する。本システムの利点は、以下の開示から理解されるであろう。
【背景技術】
【０００２】
細胞系スクリーニングアッセイ（cell based screening assay）は、生物学者に周知のツールである。それらのアッセイにおいて、対象化合物を、例えば、その化合物が対象の単数又は複数の生物学的プロセスを調節するものであるか否かを判断するために調べる。
【０００３】
使用される細胞系システムとして、レポーター活性、カルシウム活性アッセイ、等がある。これら及びその他全ての細胞系アッセイが本発明に含まれる。
【０００４】
細胞系スクリーニングアッセイが広く受け入れられている１つの分野は、薬剤として使用される物質のハイスループット分析である。これらのアッセイは、最初、生化学アッセイにおいて同定された化合物が、後の開発段階になって薬剤候補としては失格であることが判ることがあったので有用かつ望ましい。その理由は多数ある。いくつかのケースにおいては、その化合物は細胞に容易に浸透しない。又、標的結合能力が、標的調節作用、即ち、最終的に薬剤作用の要件である特徴、を予測させるものではないケースもある。細胞系スクリーニングアッセイは、それらによって、動物モデル実験に関連する多数の問題（例えば、高コスト、高労働集約性、長いアッセイ期間、等）が対応される点で有用である。ハイスループットの細胞系スクリーニングアッセイは、“ＦＬＩＰＲ”，“Ｌｅｅｄｓｅｅｋｅｒ”，“ＶＩＰＲ”及び蛍光高速細胞画像処理技術、等の技術によって大規模化が可能である。
【０００５】
上述したもののようなアッセイに加えて、その他の一般的に使用されている細胞系アッセイには、酵素−レポーターシステム、蛍光又は比色定量読み取りによる細胞活性アッセイ、等がある。そのようなアッセイの一例は、色素“Ｆｌｕｏ−４”によってＧ−タンパク質共役レセプター活性を測定するためのＣａ２＋動員（mobilization）アッセイである。
【０００６】
上述した利点の他に、細胞系アッセイには、それらによって、ユーザーは化合物の使用の機能的結果を判断することが可能となる、という明白な利点を有する。適切に設計されたアッセイによって、当業者は、活性化合物をスクリーニングする時に、毒性を有する化合物を選択しないことも可能となる。
【０００７】
ハイスループット細胞系アッセイを行うことは、ユーザーにとって独特の問題を提供する。酵素、タンパク質及び膜レセプター製剤などの純粋な生化学試薬と異なり、細胞は、生きているダイナミックな存在である。その調製と培養を実際のスクリーニング処理に結び付けなければならない。
【０００８】
活動的に管理された細胞培養サイクルは、それらは、近傍のコンフルエントな培養培地から分離されたときに、回復期を有し、その後、初期対数増殖期、中期対数期、後期対数期、が続き、もしもその培養がコンフルエントとなることが許容される場合には、静止期にいたる。これらの種々の成長及び複製の段階における細胞プロセス及びタンパク質成分の変動が、有糸分裂を通した細胞周期として、これらの細胞培養中に常時起こる。これらの変動は、生物学的アッセイに影響を与え、ハイスループットアッセイに於ける変動性の共通の現象における一因であると予想されなければならない。このことの一例は、但し、それの唯一のものではないが、アッセイが行われる時間の長さに関係する。アッセイが行われる細胞の播種に続く時間は一般的に８−３６時間である。その特定の培養培地中の細胞は、この期間中、それらの培養サイクルの様々な段階を通り、複数の細胞が同時にサイクルの同じポイントにあることは珍しいことではない。
【０００９】
更に、使用される細胞の数が益々少なくなる細胞系スクリーニングアッセイの小型化が進行しつつある。これが起こると、アッセイの変動性に対する感度が急速かつ劇的に増大する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
優れた細胞系スクリーニングアッセイの決定的要素は、（i）良く確認された標的、（ii）感度の高い読み取り、そして（iii）使用される細胞の極めて高い一貫性、である。以下の開示に記載される本発明は、この第３番目の問題に対処するものである。アッセイにおける細胞の一定のパフォーマンスは、細胞の継代数増加の結果として、標的発現のレベルの変化によって大きく影響されうる。更に、良好に特徴付けられた細胞の集団を、分裂停止し、細胞バンクとして冷凍保存し、それらの細胞を更に継代することなく、アッセイのためにプレーティング（plating）することができる。事実、分裂停止した細胞を、それらの細胞を何ら追加処理することなく、そして、細胞に基づく応答の大きな変化無く、５日間に及ぶ期間に渡って、プレーティング（plating）し使用することができる。
【００１１】
分裂停止細胞は、既に当該技術において使用されている。その具体例は、チョウ（Cho）他，Biochem. Mol. Biol. Int. 42(5); 949-56(1997); ヤオ（Yao）他，Mol. Pharmacol57(3): 422-30 (1997); フューガー（Fueger）他，J. Nucl. Med. 42 (12): 1856-62(2001); マラー（Muller）他，J. Exp. Med. 188(11): 2033-45(1998),及びカルバンダ（Kharbanda）他，Nature 376(6543): 785-8(1995)である。これらの文献のすべてをここに参考文献として合体させる。これら及びその他の文献を参照すれば、これらの研究は、特にこれらが工業用途において必要とされるような大規模ハイスループット系で実施される場合には、創薬、スクリーニングアッセイ、および／又はシグナル伝達アッセイ、等のここに記載されるタイプのアッセイにおけるそれらの使用ではなく、細胞の特徴付けに関するものであることが理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の、特に、対象物質のスクリーニングの方法に関する特徴を記載するものである。この方法は、対象物質を分裂停止細胞のサンプルと接触させる工程と、前記分裂停止細胞と対象物質との間の相互作用を測定して、その単数又は複数の特性を調べる工程とを含む。このようにすることにより、対象物質が細胞のアンタゴニスト、アゴニスト、インヒビター、刺激物質、又はモジュレーターとしての作用を有するか否か、細胞に対して毒性であるか否か、等、を判断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のこれらの特徴及びその他の特徴を、以下の開示において詳述する。
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は、例１に記載の分裂停止細胞に対するＣａ＋＋動員のセロトニン誘導を示すＦＡＣＳスキャンを示している。
図２は、例２に詳細に記載される実験結果を図示している。同図は、誘導された細胞に導入されたＦｕｒａ２の蛍光発光率に於ける変化を通じて観察されるカルバコール誘導Ｃａ２＋動員を図示している。
図３は、その分裂が照射によって停止され、かつ、イソプロテレノールによって処理された細胞に関し、レポーター遺伝子変化が測定された、例３に記載の実験の結果を要約している。
【００１５】
本発明において、分裂停止とは、使用される細胞が、公知の手段によって処理されて、それらの有系分裂又は減数分裂サイクルが停止され、もはや細胞分裂が起こることができない状態にあることを意味する。細胞分裂の停止を達成するために利用可能な多くの化学的、放射線学的、その他の方法が存在し、それらについてここで繰り返す必要はない。なぜなら、本発明の最重要点は、細胞分裂の停止を起す行為にあるのではなく、停止細胞のここに記載のアッセイに於ける利用にあるからである。
【００１６】
１以上の追加の生物学的過程を停止する追加的な方法で細胞を処置することが可能であるが、これは必要ではなく、そして、実際に、多くの適用では、通常、他のすべての方法にかかわらず、細胞分裂における停止において細胞機能を有していることが望ましいであろう。
【００１７】
当業者は、細胞のタイプは様々でありうることを理解するであろう。対象物質の対象の細胞タイプに対する作用を調べるための、いかなる細胞系アッセイにおいて、いかなる原核細胞又は真核細胞を使用することができる。
【００１８】
使用される細胞のタイプの性質は、行われるアッセイの特定のタイプに依存するものとなるであろう。この目的のために、自然に特定の単数又は複数の分子を発現する細胞、又は、対象の単数又は複数の分子を発現するようにトランスフェクト又はトランスフォームされた細胞を使用することができる。真核細胞レセプターをコードするものなどの、核酸分子によってトランスフォーム可能なＥ．ｃｏｌｉ等の原核細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、等の真核細胞、を全て使用することができる。いずれかの対象タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、及び、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを含む、アンチセンス分子等、他のタイプの核酸分子も使用可能である。核酸分子を宿主細胞に導入する方法は、組換えウィルスベクターや、対象の細胞タイプ用に適合されたその他のベクターなどによる方法、等、多くの方法が知られている。更に、前記細胞は、ペプチド、および／又は、タンパク質糖タンパク質、リポタンパク質等の分子を含有するタンパク質のような対象の分子を予め形質導入された細胞であってもよい。
【００１９】
本発明の一実施例において、使用される前記細胞は、ＳＥＡＰ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）等のレポーター機能を果たす核酸分子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされる。当業者が、それに対してレポーター分子が操作可能にリンクされるプロモーターを機能させるためのレセプター等の活性化を必要とする発現ベクターによって細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトすることができることは周知である。レセプター分子のそのような活性化は、リガンドレセプター相互作用に依存するので、レポーター分子作用を測定し、それを、コントロールと比較することによって、推定リガンド又は「抗リガンド」の作用を判定することができる。
【００２０】
勿論、当業者にとって、前述の諸例によって示したように、レセプター機能を直接的に測定することも可能であることは自明である。多数のレセプターが公知であり、リガンド分子とリンクした場合のそれらの作用も同様である。これらの機能の１つ又は複数の測定を、対象物質の作用の測定として利用することができる。
【００２１】
対象物質は、直接テストすることも可能であるし、又、それは、対象のレセプター又は他分子の公知のアンタゴニスト又はアゴニストを使用して、競合アッセイでテストすることも可能である。例えば、抗体は、その分子のアンタゴニストとしての効力を、それをその分子に対するリガンドと混合し、標的分子の特性を、その抗体が有る場合と無い場合とで比較することによってテストすることができる。その抗体の機能が知られており、対象分子が抗体ではないか、又は、実際には第２の抗体である場合には、このタイプの逆のアッセイも行うことが可能である。
【００２２】
本発明の特徴構成は、ユーザーに対して、対象物質をスクリーニングするのに有用なキットも提供する。そのようなキットは、例えば、（i）細胞の分裂の停止を起す物質と、対象標的分子と相互作用することが知られている物質、とのそれぞれのポーションを含むことができる。前記キットは、更に、対象分子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞、又は、トランスフォーム又はトランスフェクトされる細胞、トランスフォーメーション／トランスフェクションのために使用される物質（例えば、発現ベクター）に、又は、対象の標的分子又はその他の要素（items）を自然に発現する細胞、も含むことができる。ここに記載した全てのバリエーションをこれらのキットに使用することが可能である。細胞の追加の機能が記載される場合においては、その物質もキットに含ませることができる。
【実施例】
【００２３】
例１
これらの実験は、成長が停止されたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるセロトニンによるＣａ２＋動員の誘導を測定するように構成されたスクリーニングアッセイを記載するものである。 
【００２４】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、標準方法を使用して、公知のレセプター”５ＨＴ２ｃ”をコードするｃＤＮＡで安定的にトランスフェクトした。前記レセプターに関する情報は、ここに参考文献として合体させるジュリアス（Julius）他，Proc. Natl. Acad. Sci USA 87(3):928-32(1990)を参照。トランスフェクション、および、トランスフェクションが成功したことを確認するための予備スクリーニングとの後、前記レセプターを発現したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｌ−グルタミン添加、NaPyruvate無添加、Ｌ−グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）添加のＤＭＥＭと、１Ｘ−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）との中で成長させた。この細胞ラインを、“ＮＩＨ３Ｔ３−ＰＯＰ”と称する。
【００２５】
前記細胞の成長を停止させるために、それらを、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣに、２．５時間暴露させた。マイトマイシンＣは、微小管移動性を阻止しそれによって細胞分裂を停止させる能力によってよく知られている。前記細胞を、標準プロトコルを使用して、処理の２．５時間後に凍結した。
【００２６】
コントロールとして、マイトマイシンＣに対して暴露されなかった細胞を、同じ手順を使用して凍結した。処理された細胞とコントロール細胞との両方のサンプルを、標準方法を使用して解凍し、収集前に、２４時間プレーティングした。収集は、７ｍｌの無酵素細胞解離溶液（例えば、EnzymeFree Cell Dissociation Solution, Specialty media, カタログ番号Ｓ−０１４）を、又は０．５ｍＭのＥＤＴＡと共に細胞に添加することによって行われた。各実験に使用された細胞の数は、４×１０５細胞／ｍｌ又は４−４．５×１０６総細胞であった。そのような溶液は広く入手可能であり、当業者にとって周知である。この処理によって細胞をフラスコから解離し、次に、単一細胞の良好な集団を得るため、凝集塊をフラスコ内で上下に懸濁液を繰返しピペッティング操作することによって分解した。なぜなら、これは、後のＦＡＣＳ分析のために必要であるからである。
【００２７】
細胞をペレット化（pelleted）し、その後、６ｍｌのヨード−１ローディングバッファー中で再懸濁させた。
【００２８】
細胞に、ＤＭＳＯ中で、２ｍｇ／ｍｌのヨード−１  ＡＭストックを前記細胞懸濁液に最終濃度１０μｇ／１．２ｍｌまで添加することによってヨード−１  ＡＭ色素を導入した。細胞を、ヨード−１  ＡＭに対して室温で７時間曝露させ、その後、ヨード−１ローディングバッファーで最終量１０ｍｌにまで希釈し、ペレット化した。
【００２９】
Ｃａ２＋動員を測定し分析するために、市販のセルソーターを使用した。励起を３６０ｎｍに設定し、発光を４００（±５ｎｍ）と５００（±２０）ｎｍとの両方に設定した。発光を同時にモニターし、４００ｎｍ／５００ｎｍでの発光率を、Ｃａ２＋濃度の細胞内増加を報告するために使用した。未処理の細胞を使用してベースライン率を設定した。
【００３０】
細胞をバッファー中で再懸濁し、シリンジに導入した。細胞を、サンプリングしベースライン値を提供するために、フローサイトメータ内に連続的に注入した。アンタゴニスト等の物質を、細胞を前処理するために使用することができ、アゴニスト等の第２の物質を、標準Ｙ−コネクターなどの接続手段を介して、第２シリンジ等を通して連続的かつ同時に注入することができる。次に、細胞を、テスト物質に対して曝露し、分析し、ベースラインからの変化を測定する。
【００３１】
前記実験のデータを図１に要約する。分裂が停止された細胞（図１のＰＯＰ  Ａｒ  １０ｕＭ  ５ＨＴパネル）は、停止されなかったもの（図１のＰＯＰ  Ｇｒ  １０ｕＭ  ５ＨＴパネル）に類似の応答を示した。要約すると、“％陽性”を、陽性領域（即ち、未刺激細胞のベースラインＣａ＋＋濃度よりも高い細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加を示す細胞）における率を取ることによって計算した。前記 “％陽性”値を使用して、セロトニンによって誘導された活性の程度を測定した。
【００３２】
５ＨＴ２ｃを発現する活発に成長しているＮＩＨ３Ｔ３細胞は、５０％Ｃａ２＋応答を示したのに対して、成長停止細胞は、それに匹敵する６１．９％  Ｃａ＋＋応答を示した。コントロール実験は、その応答がレセプター特異的であることを示した。詳述すると、トランスフェクションされなかった親ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、セロトニンによって処理された時、蛍光変化を示さなかった（データ図示せず）のに対して、アンタゴニスト（１０ｕＭのメスレルギン（mesulergine）又は表中の”ＭＥＳ）での前処理はセロトニン誘導を完全に阻止した。（図１のＰＯＰ  Ａｒ  １０ｕＭ  ５ＨＴ，１０ｕＭ  Ｍｅｓパネル）。メスレルギン前処理された細胞のうちの僅か０．１％だけがＣａ＋＋動員においてセロトニンに対して応答した。
【００３３】
例２
これらの実験は、上述の例１において証明された原理が、他のＧｑ共役レセプター等、他のレセプターに対しても適用可能であるか否かを調べるために行われた。これをテストするために、細胞ラインＭ１ＷＴ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １９８５）を選択した。この細胞ラインは、ムスカリン性アセチルコリンレセプターを発現する。既知のアゴニストが成長停止後のこれらの細胞内においてＣａ２＋動員を誘導するか否かを調べるために実験を設計した。
【００３４】
Ｍ１ＷＴ３細胞を、上述の例１に記載のように成長させ処理した。それらを更に、記載したようにマイトマイシンＣで処理し、コントロールも全く同様に調製した。
【００３５】
Ｃａ２＋画像処理装置を使用して、Ｃａ２＋動員を視覚的に調べた。これを行うために、細胞に、“Ｆｕｒａ−２”、蛍光剤、Ｃａ２＋指示薬を投入した。細胞を３４０及び３８０ｎｍの波長で励起し、発光率を４５０ｎｍでモニターした。個々の細胞での約０．９４から１．０３へ上昇する蛍光発光率の変化（図２）を通じて、Ｍ１ＷＴ３細胞中において、カルバコール誘導Ｃａ２＋動員が観察された。分裂停止されなかった細胞と比較して、マイトマイシンＣ前処理は、細胞のカルバコール誘導Ｃａ２＋動員応答に対してなんらマイナスの作用を与えなかった（データ図示せず）。大きな割合の分裂停止細胞がカルバコールに対して応答する（データ図示せず）ことが示されたが、これは、分裂停止から生じるより均一な細胞集団と一致する。
【００３６】
上に報告した結果は、分裂停止細胞がスクリーニングアッセイにおいて時間の経過と共により一貫したものとなる可能性があることを示唆するものであった。これを、経時的細胞画像処理実験によってテストした。分裂停止され冷凍された細胞を、細胞の解凍後、１，３，５及び７日目にセロトニンによって刺激した状態を画像処理した。これらの異なる日において、Ｆｕｒａ２蛍光３４０／３８０比の変化による測定で、同程度の比率及び程度のＣａ２＋応答が見られたのに対して、これらの異なる日において成長する集団ではＣａ２＋レベルの大きな変化が見られた。
【００３７】
例３
Ｇ−タンパク質共役レセプターは、それらが共役するＧ−タンパク質に応じて、異なる経路を引き出すことは周知である。以下の実験は、Ｇｑ共役レセプター以外の７回膜貫通レセプターが成長停止細胞において正常に機能することを証明するために設計された。
【００３８】
これを行うために、安定的に予めトランスフェクトされ、β２アドレナリンレセプター（“β２ＡＲ”）（これは、Ｇｓ共役７回膜貫通レセプターである）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、イソプロテレノールがＣＲＥ−ＳＥＡＰレポーター活性を誘導するか否かを調べるように設計された実験に使用した。
【００３９】
前記安定トランスフェクション細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で成長させ、その後、レポータープラスミド、即ちｐＣＲＥ−ＳＥＡＰで一時的にトランスフェクトした。それらの細胞を、トランスフェクションの２４時間後、２時間マイトマイシンで処理した。前記プラスミドは、その活性がｃＡＭＰによって高められ、ｃＡＭＰを第２メッセンジャーとして使用する、ＧＰＣＲの活性時に、高レベルの分泌アルカリホスファターゼ（“ＳＥＡＰ”）を発現する、ＣＲＥプロモーターを含んでいた。
【００４０】
マイトマイシンＣ処理の２４時間後、β２ＡＲを、１００μＭのイソプロテレノールによって活性化し、ＳＥＡＰ活性のレベルを、２４時間後に、市販の製品を使用して測定した。
【００４１】
活発に成長しているβ２アドレナリンレセプター発現細胞は、ＳＥＡＰ活性の増大（約２５％）によって測定されたように、１００μＭのイソプロテレノールでの一晩の処理に対して応答した。成長停止β２ＡＲ発現細胞は、遥かに低いバックグランドＳＥＡＰ活性を示したが、これは、マイトマイシンＣの毒性に帰されるものであるかもしれない。その低いバックグランドレベルにも拘わらず、イソプロテレノールでの一晩の刺激によって、ＳＥＡＰ活性の２．５倍の増加が誘導され、従って、成長停止細胞が、転写反応への無傷のシグナル伝達経路をまだ概してそのまま伝達するものであり、分裂停止細胞において酵素レポーターアッセイを行うことが可能であることを示している。
【００４２】
マイトマイシン処理は、β２ＡＲ発現細胞に対して大きな毒性を引き起こした。従って、細胞分裂を停止させるための別の方法、即ち、ガンマ照射、をテストした。
【００４３】
細胞を照射せずコントロールとして作用させるか、若しくは、２ＧＹ（Ｇｒａｙ）又は３Ｇｙの範囲の放射線量で照射した。次に、それらを、前述したようにして、１００ｕＭのイソプロテレノールで処理した。レポーターＳＥＡＰ活性を測定し、ベースライン活性（即ち、イソプロテレノールによって処理されない細胞）と比較した。
【００４４】
その結果を図３に示す。４ｇｒ以上のガンマ照射で処理された細胞は、遥かに大きな分裂停止を示し、約１週間に渡って顕著な細胞増殖は無かった。これらの細胞は正常な細胞形態を示し、イソプロテレノールで刺激された時、ＳＥＡＰ応答は、ベースラインレベルの４−６倍の範囲であった。これらの結果は、イソプロテレノールでの刺激でベースラインの５．２倍で応答した、分裂停止されなかった細胞に匹敵するものであった。
【００４５】
以上の説明は、本発明の、特に、対象物質のスクリーニングの方法に関する特徴を記載するものである。この方法は、対象物質を分裂停止細胞のサンプルと接触させる工程と、前記分裂停止細胞と対象物質との間の相互作用を測定して、その単数又は複数の特性を調べる工程とを含む。このようにすることにより、対象物質が細胞のアンタゴニスト、アゴニスト、インヒビター、刺激物質、又はモジュレーターとしての作用を有するか否か、細胞に対して毒性であるか否か、等、を判断することができる。
【００４６】
本発明において、分裂停止とは、使用される細胞が、公知の手段によって処理されて、それらの有系分裂又は減数分裂サイクルが停止され、もはや細胞分裂が起こることができない状態にあることを意味する。細胞分裂の停止を達成するために利用可能な多くの化学的、放射線学的、その他の方法が存在し、それらについてここで繰り返す必要はない。なぜなら、本発明の最重要点は、細胞分裂の停止を起す行為にあるのではなく、停止細胞のここに記載のアッセイに於ける利用にあるからである。
【００４７】
１以上の追加の生物学的過程を停止する追加的な方法で細胞を処置することが可能であるが、これは必要ではなく、そして、実際に、多くの適用では、通常、他のすべての方法にかかわらず、細胞分裂における停止において細胞機能を有していることが望ましいであろう。
【００４８】
当業者は、細胞のタイプは様々でありうることを理解するであろう。対象物質の対象の細胞タイプに対する作用を調べるための、いかなる細胞系アッセイにおいて、いかなる原核細胞又は真核細胞を使用することができる。
【００４９】
使用される細胞のタイプの性質は、行われるアッセイの特定のタイプに依存するものとなるであろう。この目的のために、自然に特定の単数又は複数の分子を発現する細胞、又は、対象の単数又は複数の分子を発現するようにトランスフェクト又はトランスフォームされた細胞を使用することができる。真核細胞レセプターをコードするものなどの、核酸分子によってトランスフォーム可能なＥ．ｃｏｌｉ等の原核細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、等の真核細胞、を全て使用することができる。いずれかの対象タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、及び、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを含む、アンチセンス分子等、他のタイプの核酸分子も使用可能である。核酸分子を宿主細胞に導入する方法は、組換えウィルスベクターや、対象の細胞タイプ用に適合されたその他のベクターなどによる方法、等、多くの方法が知られている。更に、前記細胞は、ペプチド、および／又は、タンパク質糖タンパク質、リポタンパク質等の分子を含有するタンパク質のような対象の分子を予め形質導入された細胞であってもよい。
【００５０】
本発明の一実施例において、使用される前記細胞は、ＳＥＡＰ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）等のレポーター機能を果たす核酸分子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされる。当業者が、それに対してレポーター分子が操作可能にリンクされるプロモーターを機能させるためのレセプター等の活性化を必要とする発現ベクターによって細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトすることができることは周知である。レセプター分子のそのような活性化は、リガンドレセプター相互作用に依存するので、レポーター分子作用を測定し、それを、コントロールと比較することによって、推定リガンド又は「抗リガンド」の作用を判定することができる。
【００５１】
勿論、当業者にとって、前述の諸例によって示したように、レセプター機能を直接的に測定することも可能であることは自明である。多数のレセプターが公知であり、リガンド分子とリンクした場合のそれらの作用も同様である。これらの機能の１つ又は複数の測定を、対象物質の作用の測定として利用することができる。
【００５２】
対象物質は、直接テストすることも可能であるし、又、それは、対象のレセプター又は他分子の公知のアンタゴニスト又はアゴニストを使用して、競合アッセイでテストすることも可能である。例えば、抗体は、その分子のアンタゴニストとしての効力を、それをその分子に対するリガンドと混合し、標的分子の特性を、その抗体が有る場合と無い場合とで比較することによってテストすることができる。その抗体の機能が知られており、対象分子が抗体ではないか、又は、実際には第２の抗体である場合には、このタイプの逆のアッセイも行うことが可能である。
【００５３】
本発明の特徴構成は、ユーザーに対して、対象物質をスクリーニングするのに有用なキットも提供する。そのようなキットは、例えば、（i）細胞の分裂の停止を起す物質と、対象標的分子と相互作用することが知られている物質、とのそれぞれのポーションを含むことができる。前記キットは、更に、対象分子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞、又は、トランスフォーム又はトランスフェクトされる細胞、トランスフォーメーション／トランスフェクションのために使用される物質（例えば、発現ベクター）に、又は、対象の標的分子又はその他の要素（items）を自然に発現する細胞、も含むことができる。ここに記載した全てのバリエーションをこれらのキットに使用することが可能である。細胞の追加の機能が記載される場合においては、その物質もキットに含ませることができる。
【００５４】
本発明のその他の特徴は当業者にとって明白であり、ここに繰り返される必要はない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】例１に記載の分裂停止細胞に対するＣａ＋＋動員のセロトニン誘導を示すＦＡＣＳスキャンを図示する図
【図２】例２に詳細に記載される実験結果を図示し、誘導された細胞に導入されたＦｕｒａ２の蛍光発光率に於ける変化を通じて観察されるカルバコール誘導Ｃａ２＋動員を図示する図
【図３】その分裂が照射によって停止され、かつ、イソプロテレノールによって処理された細胞に関し、レポーター遺伝子変化が測定された、例３に記載の実験の結果を要約する図
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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