(57)【要約】サンプル中の目的の化合物を検出、同定、及び定量するための方法及び組成物が提供される。上記組成物及び方法は、目的の化合物に結合する代替抗体の集合を含むアレイ及びキットを含む。上記代替抗体は、上記代替抗体中に含まれる認識ヌクレオチド配列と上記固体支持体に付着した捕捉プローブ中に含まれる捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いて固体支持体上に固定することができる。さらに、研究及び臨床診断、薬物開発、環境試験、食物試験、及び生物戦争及び化学戦争の薬剤の使用のための試験のためにアレイを用いる方法が提供される。
2006518469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験リガンドの集合において１つ以上の目的のリガンドを検出するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記代替抗体分子の少なくとも１つと目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体の形成を可能にする条件下で試験リガンドの集合と代替抗体分子の集合とを接触させるステップであって、前記代替抗体分子が、
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、を含むステップ、
ｂ）少なくとも１つの結合パートナー複合体を形成するステップ、
ｃ）固体支持体に付着する捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、前記捕捉プローブが、前記固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
ｄ）前記代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、前記対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記結合パートナー複合体と前記アレイとを接触させるステップ、及び
ｅ）前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出して、目的のリガンドを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記安定化鎖及び前記特異性鎖が非連続鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定化鎖がアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記安定化鎖がヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記認識ヌクレオチド配列が約４〜約１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、
ａ）前記代替抗体分子に付着した蛍光基からのシグナルを検出する方法、
ｂ）前記目的のリガンドに付着した蛍光基からのシグナルを検出する方法、
ｃ）前記代替抗体分子に付着した発光基からのシグナルを検出する方法、
ｄ）前記目的のリガンドに付着した発光基からのシグナルを検出する方法、
ｅ）前記代替抗体分子に付着した色素産生基からのシグナルを検出する方法、
ｆ）前記目的のリガンドに付着した色素産生基からのシグナルを検出する方法、
ｇ）蛍光シグナルの変化を検出する方法であって、前記蛍光シグナルの変化は、前記代替抗体分子上に見いだされる蛍光基及び前記目的のリガンド上に見出される蛍光改質基の物理的近接性から生じる方法、
ｈ）蛍光シグナルの変化を検出する方法であって、前記蛍光シグナルの変化は、前記目的のリガンド上に見いだされる蛍光基及び前記代替抗体分子上に見出される蛍光改質基の物理的近接性から生じる方法、
ｉ）前記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、前記第２の分子が検出可能な標識を含有し、前記代替抗体分子に特異的に結合する、方法、
ｊ）前記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、前記第２の分子が検出可能な標識を含有し、前記目的のリガンドに特異的に結合する、方法、
ｋ）前記代替抗体分子に付着した放射性標識基の存在を検出する方法、
ｌ）前記目的のリガンドに付着した放射性標識基の存在を検出する方法、
ｍ）前記代替抗体分子に付着した酵素標識基の存在を検出する方法、
ｎ）前記目的のリガンドに付着した酵素標識基の存在を検出する方法、
ｏ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる屈折率の変化を検出する方法、
ｐ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電導度の変化を検出する方法、
ｑ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電位の変化を検出する方法、及び
ｒ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる抵抗性の変化を検出する方法、からなる群より選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、
ａ）結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、前記第２の分子が検出可能な標識を含有する第２の代替抗体分子であり、前記結合パートナー複合体中で前記代替抗体分子に特異的に結合する、方法、及び
ｂ）前記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させるステップであって、前記第２の分子が、検出可能な標識を含有し、前記目的のリガンドに特異的に結合する第２の代替抗体である、方法
からなる群より選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記結合パートナー複合体が、前記目的のリガンド上で別個のエピトープに結合した少なくとも２つの異なる代替抗体分子を含み、前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、
ａ）前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電導度の変化を検出する方法、
ｂ）前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電位の変化を検出する方法、及び
ｃ）前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる抵抗性の変化を検出する方法
からなる群より選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、結合していない試験リガンド及び結合していない代替抗体分子の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験リガンドの集合が、
ａ）細胞抽出物、
ｂ）組織溶解物
ｃ）臨床サンプル、
ｄ）水サンプル、
ｅ）産業サンプル、
ｆ）食物サンプル、及び
ｇ）薬学的サンプル
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的のリガンドが、
ａ）ハプテン、
ｂ）非天然の環境化学物質又は生物学的薬剤、
ｃ）病原体、
ｄ）炭水化物、
ｅ）糖タンパク質、
ｆ）ムコ多糖類、
ｇ）酵素、
ｈ）細菌又は細菌から誘導される分子、
ｉ）ウイルス又はウイルスから誘導される分子、
ｊ）原生生物又はウイルスから誘導される分子、
ｋ）生物戦争又は化学戦争において使用される薬剤、
ｌ）乱用基質、
ｍ）治療薬物、
ｎ）ホルモン、
ｏ）ペプチド、
ｐ）ポリペプチド、
ｑ）プリオン、及び
ｒ）核酸を含む分子
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試験リガンドの集合中で目的のリガンドを検出するための方法であって、
ａ）捕捉プローブの集合を有するアレイを提供するステップであって、前記捕捉プローブが固体支持体上の別個の、既知の領域に付着し、前記捕捉プローブが既知の捕捉ヌクレオチド配列を含み、代替抗体分子の集合が、前記代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に構成される前記捕捉ヌクレオチド配列と前記認識ヌクレオチド配列との間の相互作用によって前記捕捉プローブに結合し、前記代替抗体分子はさらに
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドテール、を含み、
ｂ）前記アレイに結合した前記代替抗体分子の少なくとも１つと目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下で試験リガンドの集合と前記アレイとを接触させるステップ、及び
ｃ）前記結合パートナー複合体を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
前記安定化鎖及び前記特異性鎖が非連続鎖である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定化鎖がアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記安定化鎖がヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記認識ヌクレオチド配列が約４〜約１００ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、
ａ）前記代替抗体分子に付着した蛍光基からのシグナルを検出する方法、
ｂ）前記目的のリガンドに付着した蛍光基からのシグナルを検出する方法、
ｃ）前記代替抗体分子に付着した発光基からのシグナルを検出する方法、
ｄ）前記目的のリガンドに付着した発光基からのシグナルを検出する方法、
ｅ）前記代替抗体分子に付着した色素産生基からのシグナルを検出する方法、
ｆ）前記目的のリガンドに付着した色素産生基からのシグナルを検出する方法、
ｇ）蛍光シグナルの変化を検出する方法であって、前記蛍光シグナルの変化は、前記代替抗体分子上に見いだされる蛍光基及び前記目的のリガンド上に見出される蛍光改質基の物理的近接性から生じる、方法、
ｈ）蛍光シグナルの変化を検出する方法であって、前記蛍光シグナルの変化は、前記目的のリガンド上に見いだされる蛍光基及び前記代替抗体分子上に見出される蛍光改質基の物理的近接性から生じる、方法、
ｉ）前記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、前記第２の分子が検出可能な標識を含有し、前記代替抗体分子に特異的に結合する、方法、
ｊ）前記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、前記第２の分子が検出可能な標識を含有し、前記目的のリガンドに特異的に結合する、方法、
ｋ）前記代替抗体分子に付着した放射性標識基の存在を検出する方法、
ｌ）前記目的のリガンドに付着した放射性標識基の存在を検出する方法、
ｍ）前記代替抗体分子に付着した酵素標識基の存在を検出する方法、
ｎ）前記目的のリガンドに付着した酵素標識基の存在を検出する方法、
ｏ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる屈折率の変化を検出する方法、
ｐ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電導度の変化を検出する方法、
ｑ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電位の変化を検出する方法、及び
ｒ）前記アレイ上で前記捕捉プローブに対する前記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる抵抗性の変化を検出する方法、からなる群より選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、
ａ）結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、前記第２の分子が検出可能な標識を含有する第２の代替抗体分子であり、前記結合パートナー複合体中で前記代替抗体分子に特異的に結合する、方法、及び
ｂ）前記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させるステップであって、前記第２の分子が、検出可能な標識を含有し前記目的のリガンドに特異的に結合する第２の代替抗体である、方法
からなる群より選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップが、結合していない試験リガンド及び結合していない代替抗体分子の存在下で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験リガンドの集合が、
ａ）細胞抽出物、
ｂ）組織溶解物
ｃ）臨床サンプル、
ｄ）水サンプル、
ｅ）産業サンプル、
ｆ）食物サンプル、及び
ｇ）薬学的サンプル
からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的のリガンドが、
ａ）ハプテン、
ｂ）環境有害物質、
ｃ）病原体、
ｄ）炭水化物、
ｅ）糖タンパク質、
ｆ）ムコ多糖類、
ｇ）酵素、
ｈ）細菌又は細菌から誘導される分子、
ｉ）ウイルス又はウイルスから誘導される分子、
ｊ）原生生物又はウイルスから誘導される分子、
ｋ）生物戦争又は化学戦争において使用される薬剤、
ｌ）乱用基質、
ｍ）治療薬物、
ｎ）ホルモン、
ｏ）ペプチド、
ｐ）ポリペプチド、
ｑ）プリオン、及び
ｒ）核酸を含む分子
からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
アレイを製造する方法であって、
ａ）固体支持体を提供するステップ、
ｂ）前記固体支持体に捕捉プローブの集合を付着させるステップであって、前記捕捉プローブが、前記固体支持体の別個の既知の領域に付着し、既知の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
ｃ）代替抗体分子の集合を提供するステップであって、前記代替抗体分子が、
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の、捕捉ヌクレオチド配列に結合する認識ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドテール、を含み、
ｄ）少なくとも１つの捕捉ヌクレオチド配列と対応する認識ヌクレオチド配列とをハイブリダイズ可能な条件下で前記固体支持体と代替抗体の集合とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
ａ）捕捉プローブが前記固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、既知の捕捉ヌクレオチド配列を含む、捕捉プローブの集合、及び
ｂ）前記捕捉ヌクレオチド配列と前記代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列との間の相互作用によって前記捕捉プローブに結合する、代替抗体分子の集合、前記代替抗体分子は、
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、及び
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、
をさらに含む、アレイ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のアレイを含むキット。
【請求項２５】
ａ）前記代替抗体分子が、
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する少なくとも１つの特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、を含む代替抗体分子の集合、
ｂ）それらに取り付けられた捕捉プローブの集合を有する固体支持体を含むアレイ、前記捕捉プローブが前記固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、前記捕捉プローブが既知の捕捉ヌクレオチド配列を含み、前記捕捉ヌクレオチド配列が代替抗体分子内に含まれる認識配列に対して相補性であり、ハイブリダイズが可能である、アレイ
を含むキット。
【請求項２６】
前記キット中の代替抗体分子の集合が凍結乾燥される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記キットが第２の分子の集合をさらに含み、前記第２の分子が検出可能な標識を含み、目的のリガンドに特異的に結合する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記キットが第２の分子の集合をさらに含み、前記第２の分子が検出可能な標識を含み、１つ以上の代替抗体分子に特異的に結合する、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記第２の分子の集合が凍結乾燥される、請求項２７又は請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記第２の分子の集合が代替抗体分子である、請求項２７又は請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
サンプルについてリガンドプロフィールを作成するための方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）前記代替抗体分子の少なくとも１つとサンプル中の目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下で前記サンプルと代替抗体分子の集合とを接触させるステップであって、前記代替抗体分子が、
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、を含むステップ、
ｂ）固体支持体に付着する捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、前記捕捉プローブが、前記固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
ｃ）前記代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、前記対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ステップａ）において形成される任意の結合パートナー複合体と前記アレイとを接触させるステップ、及び
ｄ）前記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
ｅ）前記サンプルについて前記リガンドプロフィールを作成するステップであって、前記リガンドプロフィールが、前記サンプル中に存在する１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項３２】
サンプルについてリガンドプロフィールを作成するための方法であって、前記方法が、
ａ）捕捉プローブの集合を有するアレイを提供するステップであって、前記捕捉プローブが、固体支持体の別個の既知の位置に付着され、前記捕捉プローブが既知の捕捉ヌクレオチド配列を備え、前記捕捉ヌクレオチド配列と代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列との相互作用によって代替抗体分子の集合が前記捕捉プローブに結合し、前記代替抗体分子がさらに
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドテール、を含むステップ、
ｂ）前記サンプル中の前記アレイに結合した前記代替抗体分子の少なくとも１つと目的のリガンドの少なくとも１つとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下で前記サンプルと前記アレイとを接触させるステップ、
ｃ）前記結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
ｄ）前記サンプルについて前記リガンドプロフィールを作成するステップであって、前記リガンドプロフィールが、前記サンプル中に存在する１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項３３】
試験サンプルを同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）１つ以上の参照プロフィールを提供するステップであって、各参照プロフィールがサンプルの特定の型に特徴的であり、前記サンプル中の目的の少なくとも１つのリガンドのレベルを表す値を含む、ステップ、
ｂ）試験サンプルについてリガンドプロフィールを提供するステップであって、前記リガンドプロフィールが請求項３１又は請求項３２に記載の方法に従って作成され、目的の１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含み、これらの値が前記参照プロフィール内にも含まれる、ステップ、及び
ｃ）前記試験サンプルからの前記リガンドプロフィールが１つ以上の参照プロフィールと類似であるか否かを決定し、それによって前記試験サンプルを同定するステップ
を含む、方法。
【請求項３４】
前記サンプル中に異なるレベルで存在する少なくとも１つのリガンドを同定するために２つ以上のサンプルをスクリーニングするための方法であって、前記方法は、
ａ）各サンプルと代替抗体分子の集合とを別個に接触させるステップであって、前記代替抗体分子が、
ｉ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｉｉ）前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｉｉｉ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、を含むステップ、
ｂ）各サンプルについて、前記サンプルが抗体の集合中に１つ以上の代替抗体によって結合するリガンドを含有する場合、代替抗体とリガンドとの間の１つ以上の結合パートナー複合体を形成するステップ、
ｃ）各サンプルについて、固体支持体に付着した捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、前記捕捉プローブが、前記固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
ｄ）各サンプルについて、前記代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、前記対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でステップｂ）において形成される任意の結合パートナー複合体とアレイとを接触させるステップ、
ｅ）各サンプルについて、前記アレイに結合した任意の結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
ｆ）各サンプルにおいて検出した前記結合パートナー複合体のレベルを比較して、前記サンプル中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドを同定するステップ
を含む、方法。
【請求項３５】
前記方法が、前記サンプルの１つ以上についてリガンドプロフィールを作成する更なるステップを含み、前記リガンドプロフィールが、前記サンプル中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドのレベルを表し、比較される値を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
試験サンプルを同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験サンプルについてリガンドプロフィールを提供するステップであって、前記リガンドプロフィールが請求項３３に記載の方法に従って作成される、ステップ、
ｂ）１つ以上の参照プロフィールを提供するステップであって、各参照プロフィールがサンプルの特定の型に特徴的であり、前記試験サンプルについての前記リガンドプロフィール及び各参照プロフィールが前記試験リガンドの集合中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドのレベルを表し、比較される値を含む、ステップ、及び
ｃ）前記試験サンプルについてのリガンドプロフィールに最も類似する前記参照プロフィールを選択して、前記試験サンプルを同定するステップ
を含む、方法。
【請求項３７】
１つ以上のサンプルを同定するためのキットであって、前記キットは
ａ）請求項２３に記載のアレイ、及び
ｂ）１つ以上のデジタルコード化された参照プロフィールを有するコンピューター読み取り可能な媒体であって、複数の各参照プロフィールが複数の値を有し、各値が前記アレイによって検出されたリガンドのレベルを表す、媒体
を含む、キット。
【請求項３８】
前記キットが、１つ以上のデジタルコード化された参照プロフィールを有するコンピューター読み取り可能な媒体であって、複数の各参照プロフィールが複数の値を有し、各値が前記アレイによって検出されたリガンドのレベルを表す、媒体を含む、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の目的の化合物の並行検出、同定、及び定量に関する。さらに特に、本発明は、代替抗体分子のアレイ及びそれらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複合混合物中の分子の検出、同定、及び定量は、臨床診断、薬学的研究及び薬物開発、軍事適用、例えば、生物戦争及び化学戦争において使用される薬剤の検出及び同定、法的強制適用、例えば、火薬及び違法な麻薬の検出、食物及び水の安全性のモニタリング、及び環境汚染物質及び病原体のための試験を含む、多くの適用において必須の役割を果たす。これらの適用のそれぞれにおいて、特定の検体又は検体のグループの同定及び定量が決定される必要がある。
【０００３】
サンプル中の複合混合物において特定の検体を検出するための現在の方法は、一般的に、サンプルを有機溶媒中で抽出し、ガスクロマトグラフィー又は液体クロマトグラフィーを用いた分析又は質量分析を行う必要がある。しかし、これらの方法は時間がかかり、高価である。従って、並行して複数の異なる検体を迅速かつ安価に検出、同定及び定量するために使用可能な組成物及び方法の開発は顕著な利点を提供する。
【０００４】
多くの適用において、異なる種類の検体を同時に検出することも有利である。例えば、特定の病原体又は生物学的薬剤の存在について環境サンプルをモニタリングする場合、病原体又は生物学的薬剤の存在に関連する異なる種類の分子の存在を同時に検出することが有利である。従って、サンプル中の複数の種類の検体の並行した検出、同定及び定量のための方法が当分野で必要とされる。
【０００５】
従って、並行して検体の複合混合物をアッセイするための方法及び組成物、混合物中の個々の検体を同定するための方法及び組成物、及び目的の１つ以上の化合物を含む特定の分子認識事象を同定するための方法及び組成物の必要性がなおも存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、サンプル中の化合物を検出、同定及び定量するための方法及び組成物を提供する。上記方法及び組成物は、研究及び臨床診断、薬物開発、環境試験、食物試験、及び生物戦争及び化学戦争の薬剤使用のための試験を含む、多くの適用において有用である。
【０００７】
本発明の方法は、試験リガンドの集合において目的のリガンドを検出するための方法を含む。上記方法は、上記代替抗体分子の少なくとも１つと試験リガンドの少なくとも１つとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下で試験リガンドの集合と代替抗体分子の集合とを接触させ、それにより上記試験リガンドと少なくとも１つの代替抗体との結合複合体を形成するステップを含む。本方法において使用される上記代替抗体分子は、特異性鎖と安定化鎖との相互作用によって形成される結合ポケットを含む。いくつかの実施形態において、代替抗体は、認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテールをさらに含み、上記認識ヌクレオチド配列は公知であり、特定の代替抗体に固有である。
【０００８】
目的のリガンドと、１つ以上の特異的に結合する代替抗体分子とを含む上記結合パートナー複合体を、捕捉プローブの集合を含むアレイと接触させる。上記捕捉プローブを、固体支持体の別個の既知の位置に付着させ、上記捕捉プローブは、少なくとも１つの代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む。上記結合パートナー複合体を、前記代替抗体のオリゴヌクレオチドテールの認識ヌクレオチド配列と、固体支持体上に前記対応する捕捉プローブの相補性捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でアレイと接触させる。いくつかの実施形態において、上記結合パートナー複合体を、結合していない試験リガンド及び結合していない代替抗体分子の存在下で上記アレイと接触させる。他の実施形態において、結合していない代替抗体分子及び結合していない試験リガンドは、結合パートナー複合体とアレイとが接触する前に除去される。次いで、上記捕捉プローブに結合した上記結合パートナー複合体を検出する。
【０００９】
代替の実施形態では、試験リガンドの集合において目的のリガンドを検出するための方法は、１）固体支持体上の別個の既知の位置に付着した捕捉プローブの集合であって、上記捕捉プローブが既知及び固有の捕捉ヌクレオチド配列を含み、及び２）認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテールを有する代替抗体分子であって、上記認識ヌクレオチド配列が既知であり、特定の代替抗体に対して固有であり、上記認識ヌクレオチド配列が補足ヌクレオチド配列に対して相補性であり、それらと二本鎖を形成する、代替抗体分子を有するアレイを提供するステップを含む。本方法において使用される代替抗体分子は、特異性鎖と安定化鎖との相互作用によって形成される結合ポケットを含む。上記アレイに付着した代替抗体分子の少なくとも１つと目的のリガンドの少なくとも１つとの間の結合パートナー複合体を形成可能な条件下で、上記アレイを試験リガンドの集合と接触させる。上記結合パートナー複合体を検出して、それにより目的のリガンドを検出する。
【００１０】
本発明の代替抗体分子の特異性鎖は、第１の一定領域及び第２の一定領域を両側に有する特異性ドメインを含む。上記安定化鎖は、上記特異性鎖の第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び上記特異性鎖の第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記特異性鎖及び上記安定化鎖は別個の非連続鎖であることがわかっている。本発明の他の実施形態において、上記特異性ドメイン、第１の一定領域及び第２の一定領域、及び第１の安定化ドメイン及び第２の安定化ドメインは、同じ連続鎖内に含まれる。いくつかの実施形態において、上記安定化鎖は、アミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記安定化鎖はヌクレオチド配列を含む。なお他の実施形態において、上記安定化鎖は、ヌクレオチドに特異的に結合する化合物のポリマーを含む。
【００１１】
目的のリガンドは、目的のリガンドと代替抗体分子との相互作用によって形成される結合パートナー複合体を検出することによって検出される。いくつかの実施形態において、上記アレイに結合した結合パートナー複合体は、以下からなる群より選択される方法によって検出される。ａ）前記代替抗体分子に付着した蛍光基からのシグナルを検出する方法、ｂ）前記目的のリガンドに付着した蛍光基からのシグナルを検出する方法、ｃ）蛍光シグナルの変化を検出する方法であって、上記蛍光シグナルの変化は、上記代替抗体分子上に見出される蛍光基及び上記目的のリガンド上に見出される蛍光改質基の物理的近接性から生じる、方法、ｄ）代替抗体との結合複合体を形成する際に、目的のリガンドに接合したリポーター基（例えば、蛍光体、発色団）によって発光されるシグナルの変化を検出する方法、ｅ）上記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、上記第２の分子が検出可能な標識を含有し、上記代替抗体分子に特異的に結合する方法、ｆ）上記結合パートナー複合体と第２の分子とを接触させる方法であって、上記第２の分子が検出可能な標識を含有し、上記目的のリガンドに特異的に結合する、方法、ｇ）上記代替抗体分子に付着した放射性標識基の存在を検出する方法、ｈ）上記目的のリガンドに付着した放射性標識基の存在を検出する方法、ｉ）上記代替抗体分子に付着した酵素標識基の存在を検出する方法、ｊ）上記目的のリガンドに付着した酵素標識基の存在を検出する方法、ｋ）前記捕捉プローブに対する上記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる屈折率の変化を検出する方法、ｌ）前記捕捉プローブに対する上記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電導度の変化を検出する方法、ｍ）上記捕捉プローブに対する上記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる電位の変化を検出する方法、及びｎ）上記アレイ上で上記捕捉プローブに対する上記結合パートナー複合体のハイブリダイゼーションによって生じる抵抗性の変化を検出する方法。
【００１２】
本発明はさらに、目的のリガンドを検出及び同定するのに有用なアレイ、及び診断において有用なアレイを製造する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、固体支持体を提供するステップと、捕捉プローブの集合を上記固体支持体に付着させるステップとを含み、上記捕捉プローブが固体支持体上の別個の、既知の位置に付着し、上記捕捉プローブが既知の固有の捕捉ヌクレオチド配列を含む。次いで、既知の認識ヌクレオチド配列を含み、上記認識配列が特定の代替抗体に固有であり、上記認識配列が少なくとも１つの捕捉ヌクレオチド配列に対して相補性であり、それらとハイブリダイズ可能であることを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテールを有する上記固体支持体を代替抗体と接触させる。上記捕捉プローブを含む上記固体基板を、捕捉ヌクレオチド配列及び認識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で代替抗体と接触させる。
【００１３】
本発明の組成物は、試験リガンドを検出又は同定する方法において使用するためのアレイ及びアレイを含むキット、及び指示を含む。１つの実施形態において、上記アレイは、１）捕捉プローブの集合を付着させた固体支持体であって、上記捕捉プローブは既知の固有の捕捉ヌクレオチド配列を含む、固体支持体、及び２）既知の認識配列を有するオリゴヌクレオチドテールを有し、認識配列が特定の代替抗体特異性に対して固有であり、固体支持体上の少なくとも１つの捕捉ヌクレオチド配列に対して相補性であり、それらと二本鎖を形成する、代替抗体を含む。
【００１４】
更なる組成物は代替抗体分子の集合を含む。上記代替抗体分子は、特異性領域を含み、認識ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドテールをさらに含み、認識ヌクレオチド配列は既知であり、特定の代替抗体特異性に対して固有である。
【００１５】
更なる組成物は、１）代替抗体分子の集合が各代替抗体の集合上で固有の既知のオリゴヌクレオチドテールを有するものとして特徴付けられる、代替抗体分子の集合、及び２）基板に取り付けられるものがヌクレオチド配列の集合であり、集合中の各ヌクレオチド配列が固有である、基板を含み、相補性オリゴヌクレオチドテールを含み、上記基材の別個の既知の位置に付着し、上記代替抗体分子の集合と基材とが接触した際に、上記代替抗体のオリゴヌクレオチドテール及び上記支持体の相補性のオリゴヌクレオチドテールのハイブリダイゼーションが起こる、キットを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、添付の図面を参照して以下にさらに完全に記載されるが、それぞれのいくつかにおいて、本発明の全ての実施形態が示されるわけではない。実際に、これらの発明は、多くの異なる形態中に包含される場合があり、本明細書中で記載される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない、むしろ、これらの実施形態はこの開示が適用可能な法的な要求を満たすように提供される。同じ数は全体的に同じ要素を指す。
【００１７】
本明細書中に記載される本発明の多くの改変及び他の実施形態は、これらの発明が上述の記載及び関連する図面において存在する教示の利益を有することを当業者に想像させる。従って、本発明が開示される特定の実施形態に限定されず、改変及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書中で使用されるが、それらの用語は、一般的及び記載的な意味においてのみ使用され、限定の目的のためには使用されない。
【００１８】
本発明は、サンプル中の検体を検出、同定、及び／又は定量するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、広範囲の検体及びリガンドに結合可能な代替抗体の使用に依存する。上記サンプルを、代替抗体がサンプル中の１つ以上のリガンドに結合可能な条件下で代替抗体の集合と接触させ、結合パートナー複合体を形成させる。サンプル中のリガンドのレベルを検出、同定、及び／又は定量する目的で、代替抗体中の「認識」ヌクレオチド配列とアレイ中の別個の既知の位置で付着した「捕捉」ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いて、結合パートナー複合体をアレイ上に固定する。サンプル中の多様な種類の検出におけるそれらの使用に加えて、アレイをさらに使用してサンプルの特定の種類に特徴的な「リガンドプロフィール」を作成してもよく、特定のサンプルを同定するために使用してもよい。本発明のアレイはさらに、スクリーニングアッセイにおいて有用である。
【００１９】
本発明の方法において使用されるサンプル又は「試験リガンドの集合」は、任意のサンプル又は目的物の集合であってもよい。例えば、試験リガンドの集合は、環境サンプル、食物サンプル、薬学的サンプル、水サンプル、又は産業サンプルから誘導されてもよい。あるいは、試験リガンドの集合は、生物学的サンプル、例えば、ウイルス、細胞、組織、臓器、又は限定されないが、細胞抽出物、組織又は臓器溶解物又は均質物を含む有機体、又は体液サンプル、例えば、血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、大便、羊膜液、又は創傷滲出液から誘導されてもよい。試験リガンドの集合は、任意の数の種類の試験リガンドを含んでもよい。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、試験リガンドの集合は、単一の種類の試験リガンドを含有するが、他の実施形態において、試験リガンドの集合は多くの種類の試験リガンドを含有する複合混合物である。
【００２０】
本発明の組成物及び方法において利用される代替抗体は、広範囲のリガンドを結合することができる。したがって、本発明の目的のリガンドは、本発明の代替分子と相互作用する任意のリガンドであってもよい。目的のリガンドの例としては、限定されないが、有機分子、無機分子、免疫ハプテン、環境汚染物及び毒素（例えば、多塩素化ビフェニル、ジオキシン、ポリ芳香族炭化水素）、ガソリン中の汚染物、生物戦争及び化学戦争において使用される薬剤、天然又は代理のポリマー、炭水化物、多糖類、ムコ多糖類、糖タンパク質、酵素、抗原、任意の供給源、例えば、細胞、真核細胞、細菌、又はウイルスから誘導される分子（例えば、タンパク質、核酸分子、炭水化物、又は代謝物）、治療薬剤、違法な薬物及び乱用基質（例えば、麻薬）、ホルモン、ペプチド、ポリペプチド、プリオン、及び核酸が挙げられる。リガンドはさらに、細胞又はその構築物、例えば、病原体、１つ以上の細胞オルガネラであることも可能である。上記リガンドはさらに、任意の発達段階で種々の表現型を有する目的の任意の細胞型であることが可能である。例えば、上記代替抗体は、限定されないが、直腸腫瘍細胞、乳癌細胞、前立腺腫瘍細胞等を含む種々の腫瘍細胞に結合するように開発することができる。目的のリガンドが病原体である場合、病原体の特定の株を特異的に認識する代替抗体を使用してもよい。更なる目的のリガンドとしては、そのレベルが腫瘍中で変化する分子（すなわち、増殖因子レセプター、細胞周期レギュレーター、血管新生因子、及びシグナリング因子）が挙げられる。したがって、本発明の代替抗体分子は、目的の任意のリガンドを検出するために製造することができる。
【００２１】
したがって、上記組成物及び方法は、環境試験、食物試験、及び生物戦争及び化学戦争の研究の火薬又は薬剤のための試験を含む、サンプル中に特定の検体の存在を必要とする多くの適用における使用を発見する。本発明の方法及び組成物はさらに、臨床診断、薬学的研究及び薬物開発においても有用である。
【００２２】
組成物
Ｉ．代替抗体分子
本発明の方法は、代替抗体分子の集合を使用する。このような代替抗体分子の詳細な記載は、例えば、米国仮出願番号第６０／３５８，４５９号（２００２年２月１９日出願）、及び米国実用出願「Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（本出願と同時出願）中に見出すことができ、これら両方は、それら全体において参考として本明細書中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本発明の集合における代替抗体分子は、特定の代替抗体特異性に対して固有の既知の認識配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテールを含む。本発明の方法において使用するための代替抗体分子及び代替抗体分子の集合の構造のさらに詳細な記載は、以下に提供される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、代替抗体とは、標的分子に選択的に結合可能な別個の核酸構造又はモチーフを含有する分子の種類を指す。１つの実施形態では、代替抗体は、特異性鎖及び安定化鎖を含む。特異性鎖は、両端に第１の一定領域及び第２の一定領域を含む特異性領域を有する核酸配列を含む。安定化鎖は、第１の一定領域と相互作用する第１の安定化領域及び第２の一定領域と相互作用する第２の安定化領域を含む。安定化鎖及び特異性鎖の相互作用は、所望のリガンドと相互作用可能な分子の形成を生じる。特異性ドメインの配列（最終的な代替抗体分子の一次構造及び二次構造の両方）は、抗体のリガンド結合特異性に影響を与える。
【００２４】
代替抗体の特異性ドメイン及び安定化ドメインは、大量の配列及び形状を有する代替抗体の形成を可能にする。作成可能な結合ポケットの非常な多様性は、所望の機能及び結合アフィニティーを作成可能にする。すなわち、代替抗体は、ほとんどの標的に対して緊密かつ特異的に結合するのに十分な物理的多様性及び化学的多様性を提供する。
【００２５】
本発明は、単離された代替抗体組成物又は実質的に単離された代替抗体組成物を包含する。「単離された」代替抗体分子は、実質的に他の細胞物質、又は培地、化学前駆体、又は化学的に合成される場合に他の化学物質を含まない。実質的に細胞物質を含まない代替抗体は、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満（乾燥重量による）の汚染タンパク質又は核酸を有する代替抗体の調製物を含む。それに加えて、代替抗体分子が天然の配列に対して相同性の核酸配列を含む場合、「単離された」代替抗体分子は、代替抗体が相同性を有する有機体のゲノムＤＮＡ中に、天然に核酸の両端に位置してもよい配列（すなわち、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＴＮＡ、一本鎖又は二本鎖のもの、及びそれらの任意の化学修飾されたものを意味する。代替抗体は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の組み合わせ、ハイブリッドＴＮＡ−ＤＮＡ、ハイブリッドＴＮＡ−ＲＮＡ、ハイブリッドアミノ酸／ＲＮＡ、アミノ酸／ＤＮＡ、アミノ酸／ＴＮＡ又はそれらの任意の組み合わせで構成されることができ、ただし、１つ以上のループ構造を安定化可能な相互作用領域で構成される。上記核酸配列は天然に生じるヌクレオチド及び代理に改変されたヌクレオチドを含むことがさらに認識される。
【００２７】
Ａ．特異性鎖
本明細書中で使用される場合、代替抗体の特異性鎖は、両端に２つの一定領域を有する特異性領域を有する核酸分子を含む。句「両端に有する」とは、一定領域が特異性領域にすぐに隣接しているか、又はスペーサー配列によって分離されているが特異性領域の５’領域及び３’領域に見出されるかのいずれかであると意図される。特異性領域は、リガンド結合ドメインとして機能し、一方、定常領域は安定化鎖上に見出される安定化ドメインと相互作用し、その結果、特異性ドメインがリガンド結合空洞を形成することができる。
【００２８】
特異性鎖は、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、（３’，２’−α−Ｌ−スレオース核酸（ＴＮＡ）、修飾ＴＮＡ又はそれらの任意の組み合わせで構成される核酸配列を含む。例えば、Ｃｈａｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：８５６−８５７（本明細書中に参考として組み込まれる）を参照。可能な修飾としては、ヌクレオチド配列に対して機能性部分又は機能性分子を付着することが挙げられる。修飾は、配列の５’末端又は３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方で行うことができる。機能性部分はさらに、鎖中のどこかに個々のヌクレオチド又はアミノ酸残基を付加してもよく、鎖中に存在するピリミジン又はプリンの全て又は一部分に付着してもよく、又は所与の種類のヌクレオチドの全て又は一部分に付着してもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡ残基に対する種々の修飾は当分野で公知であるが、本発明の代替抗体に対するいくつかの目的の修飾例は、以下にさらに詳細に議論される。
【００２９】
特異性鎖及びそれぞれのドメイン（すなわち、定常領域及び特異性ドメイン、及び、いくつかの実施形態において、スペーサー領域）は、鎖が本明細書中のどこかに記載されるような代替抗体を形成可能である限り、任意の長さであることが可能である。例えば、特異性鎖は、約１０、５０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、８０００ヌクレオチド又はそれ以上の長さであることが可能である。あるいは、特異性鎖は、約１５〜８０、８０〜１５０、１５０〜６００、６００〜１２００、１２００〜１８００、１８００〜３０００、３０００〜５０００又はそれ以上であることが可能である。定常領域及び特異性ドメインは、約２ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１０〜約９０ヌクレオチド長、約１０〜約８０ヌクレオチド長、約１０〜約６０ヌクレオチド長、又は約１０〜約４０ヌクレオチド長であることが可能である。
【００３０】
代替抗体分子は特異性領域中のスペーサー領域を必要としないが、スペーサー領域が存在する場合、スペーサー領域は任意の長さであることが可能である。例えば、スペーサー領域は、約２ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１０〜約９０ヌクレオチド長、約１０〜約６０ヌクレオチド長、又は約１０〜約４０ヌクレオチド長であることが可能である。なお他の実施形態では、スペーサー領域は、１つ以上のヌクレオチド以外の基を含む。任意の基は、代替抗体分子を形成するための所望の空間を形成する限り、使用することができる。例えば、スペーサー領域はリン酸部分を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、特異性鎖又はその成分（一定領域又は特異性領域）は、天然に生じる核酸配列に対して顕著な類似性を有する。他の実施形態では、核酸配列は、天然における配列に対してほとんど又は全く配列同一性を持たない場合がある。なお他の実施形態では、核酸残基は、本明細書中のどこかで記載されるように修飾されてもよい。
【００３２】
Ｂ．安定化鎖
代替抗体はさらに、安定化鎖を含む。安定化鎖は、特異性鎖の定常領域と相互作用可能な安定化ドメインを含み、それにより特異性ドメインのリガンド結合空洞を安定化する。従って、安定化鎖は、例えば、アミノ酸配列、核酸配列、又は任意のカチオン性ポリマー、シクロデキストリンポリマーを含む種々のポリマーのいずれか、又は例えば臭化リチウム又は臭化エチジウムを含む適切に荷電した挿入薬剤を含むことができる。
【００３３】
代替抗体中の安定化ドメインが、各安定化領域が特異性鎖中の対応する一定領域と相互作用する限り、同一であり得る（すなわち、同じヌクレオチド配列又はペプチド配列）か、又は同一でないことがあり得ることが理解される。それに加えて、一定領域と安定化領域との相互作用は、直接的又は間接的であってもよい。この相互作用は、所望のリガンド結合条件下を含む、さらに種々の条件下で起こることが可能である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、代替抗体の成分（すなわち、安定化鎖及びそれぞれのドメイン）は、天然中に天然に生じない。他の実施形態では、それらは天然に生じる核酸配列又はアミノ酸配列と顕著に類似性を有する場合があるか、又は実際に天然に生じる配列であってもよい。安定化ドメインの長さは特異性鎖の定常領域で必要とされる相互作用の種類に応じて変動することを当業者は理解する。このような相互作用は、本明細書中のいずれかでさらに詳細に議論される。
【００３５】
安定化ドメインは、特異性鎖の定常領域の核酸配列と相互作用可能な任意のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、ＤＮＡ結合活性を有するアミノ酸配列（すなわち、亜鉛フィンガー結合ドメイン（Ｂａｌｇｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：７１５８−７１６３；Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１９６３１−９；Ｄｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９４６６−７９；Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−８１（これら全ては本明細書中に参考として組み込まれる）、ヘリックス−ターンドメイン、及びロイシンジッパーモチーフ（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１６９３−９））又はレクチン活性（例えば、単糖類結合活性又はオリゴ糖活性）を有するポリペプチドは安定化ドメインの１つ以上として使用されてもよい。したがって、転写因子、制限酵素、テロメラーゼ、ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼ、誘発因子／抑制因子、又は核酸結合活性を保持するそれらのフラグメント及び改変体を含む、種々のポリペプチド。例えば、Ｇａｄｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：６０７−２４を参照。他の実施形態では、安定化鎖は、配列特異性のＤＮＡ結合小分子を含む。例えば、ポリアミド（Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：６８８−９３及びＷｉｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６：６７０−８１）；抗生物質、例えば、アミノグリコシド（Ｙｏｓｈｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：６２６３−７０）、キノキサリン抗生物質（Ｂａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ３７：６８７４−６８８３；ＡＴに特異的に結合する分子（Ｗａｇｎａｒｏｃｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５８７：３００−８）；ロジウム錯体（Ｔｅｒｂｒｕｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３３０：８１−７）。例えば、亜鉛フィンガー結合ドメインが安定化鎖として使用される場合、対応する核酸結合部位が特異性鎖の所望の一定領域中に存在することを当業者は理解する。同様に、レクチン活性を有するポリペプチドが安定化鎖中で使用される場合、対応する特異性鎖の定常領域は、所望の相互作用を可能にするために必要な修飾を有する。安定化ドメインがアミノ酸配列を含む場合、アミノ酸残基のいずれかは機能性部分を含有するように修飾することができる。このような修飾は、本明細書中のどこかでさらに詳細に議論される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、安定化ドメインは、核酸分子を含み、及び特異性鎖の定常領域が安定化ドメインに対して相補性である。この実施形態では、安定化鎖及び特異性鎖が共にハイブリダイズされ、安定化ドメインと定常領域との適切な相互作用を可能にする場合、代替抗体が形成される。
【００３７】
１つの実施形態では、安定化鎖は特異性鎖よりも長い。
【００３８】
安定化鎖は、例えば、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の種類のヌクレオチドを含むことができる。
【００３９】
Ｃ．オリゴヌクレオチドテール
本発明の方法及び組成物のいくつかの実施形態では、代替抗体は少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテールを含む。オリゴヌクレオチドテールは、捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列に対して相補性の認識ヌクレオチド配列を含む。捕捉プローブを固体基材に付着する。オリゴヌクレオチドテールは、例えば、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ＴＮＡ、修飾ＴＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意のヌクレオチド塩基で製造することができる。認識ヌクレオチド配列は十分な長さを有し、捕捉ヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド組成物は対応する捕捉プローブ中に見出される。したがって、認識ヌクレオチド配列は、約４〜約５００ヌクレオチドを含む、任意の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、認識ヌクレオチド配列は約４〜約１００ヌクレオチドである。
【００４０】
オリゴヌクレオチドテールは、代替抗体分子の任意の領域に付着してもよい。例えば、テールは特異性鎖、安定化鎖、又は特異性鎖及び安定化鎖の両方（すなわち、５’末端又は３’末端）に付着することができる。安定化鎖に対して付着する方法及び位置は、鎖の組成物に依存して変動する。例えば、安定化鎖がアミノ酸配列を含む場合、テールはアミノ末端又はカルボキシ末端又はそれらの間の任意のアミノ酸に付着することができる。安定化ドメインが核酸である場合、テールは５’末端又は３’末端に付着してもよい。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、代替抗体は、既知の固有の認識配列を含むオリゴヌクレオチドテールを含む。「固有の」は、試験リガンドの集合中の異なるリガンドを認識する集合中の各代替抗体が新規又は重複しない認識ヌクレオチド配列を有することが意図される。従って、認識配列は代替抗体分子のリガンド特異性に対して固有である。「既知の」は、代替抗体分子のオリゴヌクレオチドテール中に含まれる認識ヌクレオチド配列の配列が既知であり、特定の代替抗体分子及び結合パートナー複合体を同定可能であることを意図する。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、代替抗体分子は、捕捉プローブとの相互作用によってアレイに固定される。捕捉プローブは、アレイ上の別個の既知の位置に付着し、代替抗体のオリゴヌクレオチドテール中に見出される認識ヌクレオチド配列に対して相補性であり、これらとハイブリダイズする捕捉ヌクレオチド配列を含む。したがって、アレイ上の特定のアドレスでシグナルを測定することにより、特定のリガンド特異性を有する１つ以上の代替抗体分子を含有する結合パートナー複合体を検出、同定、及び定量することが可能である。さらに、代替抗体のリガンド特異性が既知である場合、リガンドは、結合パートナー複合体を検出することによって、検出、同定及び定量されてもよい。
【００４２】
Ｄ．代替抗体分子の形成
本発明の代替抗体分子は、特異性鎖及び安定化鎖を提供し、第１の安定化ドメインが第１の定常領域と相互作用し、第２の安定化ドメインが第２の定常領域と相互作用することが可能な条件下で、特異性鎖と安定化鎖とを接触させることにより形成される。安定化ドメイン及び定常領域の安定な相互作用を可能にする条件下で特異性鎖及び安定化鎖を接触させる。代替抗体の集合は、これらの方法を用いて形成することができる。
【００４３】
以下に議論されるように、代替抗体分子を形成するための条件は、目的のリガンド及び意図される適用に応じて変える。当業者は所望の適用のための適切な条件を経験的に決定することができる。例えば、意図される適用が生理的条件下で起こる場合、抗体の形成は、生理塩濃度（すなわち、２８０〜３００ミリオスモル）でｐＨ７．４で約３７℃の温度で行われてもよい。
【００４４】
安定化ドメインが核酸配列を含む場合、定常領域及び安定化ドメインのヌクレオチド配列は、所望の条件下（例えば、リガンド結合条件下）でハイブリダイゼーション可能である。さらに、安定化ドメイン及び定常領域は、第１の定常領域が優先的に第１の安定化ドメインとハイブリダイズし、第２の安定化ドメインが優先的に第２の定常領域とハイブリダイズするようなアセンブリを可能にするように設計される。従って、特異性鎖及び安定性鎖の相互作用は、代替抗体の配列指向性自己アセンブリを促進する。
【００４５】
１つの実施形態では、代替抗体分子は、意図される適用（すなわち、所望のリガンド結合条件）の温度を約１５〜約２５℃を超える各安定化／定常領域相互作用のためのＴｍを生じるように設計される。従って、意図される適用が治療適用又は生理学的条件下で行われる任意の適用である場合、Ｔｍは、約３７℃＋約１５℃〜約３７℃＋２５℃（すなわち、４９℃、５０℃、５２℃、５４℃、５５℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、又はそれより高い温度）であることが可能である。意図される適用が室温で行われる診断アッセイである場合、Ｔｍは、（２５℃＋約１５℃）〜約（２５℃＋約２５℃）（すなわち、３８℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５３℃又はそれより高い温度）であることが可能である。Ｔｍを測定するための式は当分野で公知である。Ｔｍ計算のための好ましいプログラムは、ＩＤＴ  ＢｉｏＴｏｏｌｓ（ｃ）２０００からのＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０を含む。任意の温度が本発明の方法に使用可能であることが理解される。従って、リガンド結合条件の温度は約５℃、１０℃、１５℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３８℃、４０℃、４２℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃又はそれより高い温度であることが可能である。
【００４６】
あるいは、安定化ドメイン及びそれぞれの定常領域は、約４０％〜約９９％、約４０％〜約５０％、又は約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％以上の代替抗体集合が意図されるリガンド結合条件下でアニーリングを維持可能なように設計される。ゲル電気泳動を含む種々の方法を代替抗体の形成パーセントを決定するために使用することができる。実験の項を参照。それに加えて、この種類の決定のための計算は、例えば、Ｍａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：１６０１−１６２０及びＰｅｔｅｒｓｔｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：２５６−２６３（これら両方は参考として本明細書中に組み込まれる）中に見出すことができる。
【００４７】
特異性鎖及び安定化鎖の相対濃度は、その比率が代替抗体の形成に望ましい限り、変動させることができる。このような状態は過剰の安定化鎖を提供することを含む。
【００４８】
定常領域及び安定化ドメインは、例えば、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のグアニン／シトシンを含む、任意の所望のグアニン／シトシン含量を有することができる。
【００４９】
安定化鎖の安定化ドメイン、及び適用可能な場合スペーサー領域は、安定化鎖が本明細書中に記載されるように代替抗体を形成可能な限り、任意の長さを有することができる。例えば、安定化鎖は、その間に約８、１０、５０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、８０００ヌクレオチド又はそれより長いヌクレオチド長を有することができる。あるいは、安定化鎖は、約１５〜８０、８０〜１５０、１５０〜６００、６００〜１２００、１２００〜１８００、１８００〜３０００、３０００〜５０００又はそれより大きい長さであることが可能である。
【００５０】
安定化ドメインは、約２ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１０〜約９０ヌクレオチド長、約１０〜約６０ヌクレオチド長、又は約１０〜約４０ヌクレオチド長であることが可能である。スペーサー領域が安定化鎖中に存在する場合、この領域は、約１ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約１０〜約９０ヌクレオチド長、約１０〜約６０ヌクレオチド長、又は約１０〜約４０ヌクレオチド長であることが可能である。あるいは、本明細書中のどこかで記載されるように、スペーサーは、例えば、リン酸部分を含む１つ以上の分子を含むことが可能である。各ドメインの長さ及びグアニン／シトシン含量は、定常領域と安定化ドメインとの間の相互作用が抗体構造を安定化し、安定な結合ループ（特異性領域）を生成可能にするのに十分な限り、変動可能である。それに加えて、安定化鎖は、直鎖、環状又は球状であることが可能であり、複数の（２、３、４、５、６、もしくはそれ以上）特異性鎖が相互作用可能な安定化ドメインをさらに含有することが可能である。
【００５１】
非ワトソン−クリック型相互作用が関与しない既知のオリゴヌクレオチド構造又はモチーフ、例えば、ヘアピンループ、対称及び非対称湾曲、擬似ノット及びそれらの組み合わせは、当分野では、３０ヌクレオチド未満の核酸配列から形成されることが示唆される。しかし、より大きなループ構造が本明細書中に記載される代替抗体中で安定化可能であることがわかった。特異性領域は、約１０〜９０ヌクレオチド、約１０〜８０、１０〜６０、又は１０〜４０ヌクレオチドを含むことができる。これらの安定化した結合空洞は、疎水性結合のための部位を提供し、天然の抗体結合において関係する主要な力を模倣する様式で増加した結合アフィニティーに役立つ。それ自体、代替抗体のリガンドに結合する空洞は、１つ以上のヘアピンループ、非対称の湾曲したヘアピンループ、対称のヘアピンループ、及び擬似ノットを含むことができる。
【００５２】
各安定化ドメイン及び対応する定常領域は、好ましくは所望の条件下での相互作用の安定性を最大にし、代替抗体の構造を維持するように設計することができることを当業者は理解する。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：８５５−８６１及びＮａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１９３５−１９４０を参照。代替抗体分子の安定性又は構造を測定するための方法は既知である。例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用して、代替抗体分子の形成のための速度論値を決定することができる（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ）。例えば、米国特許第５，９５５，７２９号、同第６，２０７，３８１号、及び同第６，２８９，２８６号（それぞれ本明細書中にその全体が参考として組み込まれる）を参照。使用される他の技術としては、ＮＭＲ分光法及び電気泳動移動性シフトアッセイが挙げられる。Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：１９３５−１９４０（本明細書中に参考として組み込まれる）を参照。しかし、安定化ドメイン及び定常領域は互いに１００％の配列同一性を有する必要がないことが理解される。これらのこと全てが、リガンド結合条件にさらされる場合にそれらが直接的な様式で結合し、安定な構造を形成することが必要とされる。一般的に、このことは、安定化ドメイン及び定常領域の対応する相補体が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有することを必要とする。それに加えて、安定化ドメインと定常領域との間の相互作用は、安定化ドメイン及び対応する定常領域中で少なくとも５つの保存的な相補性ヌクレオチド残基が必要とされる場合がある。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウインドウ全体にわたって最大限一致するように整列させた場合に、２つの配列において同じであるヌクレオチドを指す。「配列同一性の割合」は、比較ウインドウ全体にわたって最適に整列された配列２つを比較することによって決定された値を意味し、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列を最適に整列させるために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。この割合は、両方の配列において生じる同一の核酸塩基の位置の数を決定してマッチした位置の数が得られ、マッチした位置の数を比較ウインドウの位置の数全体で割り、その結果に１００を乗じることによって計算され、１００に対する配列同一性の割合が得られる。
【００５４】
配列を整列させ、配列間の同一性を決定するための方法は当分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）中のＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８））を参照。２つのヌクレオチド配列の最適な整列に関して、定常領域又は安定化ドメインの連続セグメントは、対応する一定／安定化ヌクレオチド配列に対して更なるヌクレオチドを有していてもよいし、ヌクレオチドが欠失していてもよい。参照ヌクレオチド配列に対して比較するために使用される連続セグメントは、少なくとも５、１０、１５、２０、又は２５連続ヌクレオチドを含むか、３０、４０、５０、１００以上のヌクレオチドであってもよい。２つの配列間の同一性の割合は、２つの配列の最適な整列のために導入されることが必要であるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、２つの配列に共通して同一の位置の数の関数である。
【００５５】
２つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。ヌクレオチド配列の同一性の割合は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを用いて、ギャップオープンペナルティー２５及びギャップエクステンションペナルティー５を用いて決定される。このような配列同一性の決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃからのＤｅＣｙｐｈｅｒ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを用いて行うことができる。
【００５６】
代替抗体の特異性鎖及び安定化鎖が核酸配列を含む場合、代替抗体は第１及び第２の鎖を溶液中で配置し、溶液を加熱し、冷却時に第１及び第２の鎖がアニーリングし、抗体を形成するような条件下で冷却することによって形成することができる。２つの第１の鎖又は２つの第２の鎖間で生じる任意のハイブリダイゼーションは、特異性領域及び対応する定常領域のそれぞれ内で設計された複数のヌクレオチド相補結合と比較して顕著に弱いアフィニティー係数を有するために安定ではない。
【００５７】
Ｅ．代替抗体の多様な構造
代替抗体は、リガンドに対する構造的相補性、及び共有疎水性結合、静電力、ファンデルワールス力、及び／又は水素結合を介して特定のリガンド結合を提供する安定な結合空洞を形成するように配列された核酸配列を有する種類の分子であり、例外的に標的／リガンドが核酸組成物である場合、ワトソン／クリック塩基対又は三重らせん会合による結合が望ましい。例えば、Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４４２−４４３を参照。従って、多様な数の代替抗体の構造が形成可能である。１つの実施形態では、本明細書中で記載される代替抗体は、１つ以上の特異性ドメインを有する１つ以上の別個の特異性鎖を含むことができ、ここで、各特異性ドメインは両端に定常領域を有する。従って、本発明の代替抗体は、１、２、３、４、５以上の特異性ドメインを有することができる。従って、代替抗体分子は複数のオリゴヌクレオチドを用いて形成することができる。例えば、図２及び図３を参照。従って、代替抗体は「複数の価数」であることができ、従って、１つの特異性鎖上又は複数の別個の鎖上に含有される複数の特異性ドメインを含有することができる。従って、複数の価数の代替抗体の特異性ドメインは、同じヌクレオチド配列、同じ大きさであることができ、同じリガンドエピトープを認識することができる。他の実施形態では、特異性ドメインは、異なっていることができ、「複数の特異的な」代替抗体を形成することができる。複数の特異的な抗体は、異なるリガンド又は同じリガンドの異なる領域／エピトープに結合する。従って、各特異性ドメインは、同じ標的／リガンド又は異なる標的／リガンドに結合するように設計することができる。この様式で、代替抗体は、１個の細胞上の２つの通常の決定要素に同時に結合することができるか、又は２個の別個の位置において化合物に結合することができる。例えば、抗体は、好ましい結合部位及びアロステリックな位置で、さらに特定のレセプターに結合することができる。あるいは、代替抗体は、所定の細胞表面上の特定のレセプター対に結合し、共有結合相互作用を介してアフィニティーを増加させるか、又は分子若しくは細胞間の架橋を形成することができる。
【００５８】
別の実施形態では、代替抗体分子は、安定化鎖又は特異性鎖のいずれか上に、分子中の応力を排除し、及び／又は隣接する標的に対する結合を立体的に最適化し、及び／又は特異性ドメインの大きさ及び／又は構造を改変するスペーサー領域を含むことが可能である。従って、スペーサー領域は、分子中の結合応力を排除するために使用することができ、結合空洞の大きさ及び形状の多様性を提供することができる。従って、代替抗体分子は、共通の数の残基及び配列又は異なる数の残基及び配列を有する１つ以上のスペーサー領域を含むことができる。
【００５９】
安定化鎖及び特異性鎖が核酸配列を含む場合、これらの鎖が同じ連続した（共有結合した）核酸の鎖上に含有可能であるか、又は別個の非連続の（共有結合していない）核酸の鎖上に含有可能であることがさらに理解される。従って、いくつかの実施形態では、代替抗体は、ａ）第１の定常領域、特異性ドメイン、第２の定常領域、第１のスペーサー領域、第２の定常領域にハイブリダイズ可能な第２の安定化ドメイン、第２のスペーサー領域、及び第１の定常領域にハイブリダイズ可能な第１の安定化ドメインを含む１個の核酸鎖から形成される。１つの実施形態では、各ドメインは、約１〜約２０ヌクレオチドを含有する。核酸鎖は、安定化ドメイン及び定常領域がハイブリダイズされる場合に特異性領域がループ構造を形成する限り、直鎖又は環状でもよい。
【００６０】
あるいは、特異性鎖及び安定化鎖は、共有結合性相互作用によって結合している必要はない。いくつかの実施形態では、特異性鎖及び安定化鎖は、非連続又は別個の（共有結合していない）核酸鎖に含有可能であり、非共有結合性相互作用を介して（直接的又は間接的に）相互作用する。この実施形態では、特異性鎖及び安定化鎖の両方は３’末端及び５’末端を有する。従って、本発明は、２つ以上の一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖、２つ以上の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖、ＴＮＡ、２つ以上のＴＮＡオリゴヌクレオチド鎖、又は２つ以上の一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はＴＮＡ鎖の組み合わせの集合を含む、リガンドに結合する代替抗体分子に関する。
【００６１】
種々の種類の代替抗体分子の代表例は図１に示される。図２は、複数の特異性領域を含む代替抗体分子の２つの実施形態を示す。１つの実施形態では、代替抗体分子は、多次元のリガンド結合を全体として提供する複数の特異性ドメイン（ＳＰ）、安定化ドメイン（ＳＴ）及びスペーサー領域（Ｓ）を含む。これらの種類の分子は、例えば図３ａ〜３ｄに示される。
【００６２】
安定化鎖及び特異性鎖は、天然に生じるヌクレオチド及びアミノ酸残基又は代替的に改変されたヌクレオチド及び残基を含有してもよい。本発明に包含される改変としては、１つ以上の機能性部分の付着が挙げられる。以下でさらに詳細に議論されるように、機能性部分は、共有結合又は非共有結合の相互作用を介して安定化鎖又は特異性鎖に付着することができる。ヌクレオチドの可能な改変としては、限定されないが、アミン、ジオール、チオール、ホホロチオエート、グリコール、フッ素、ヒドロキシル、蛍光化合物（例えばＦＩＴＣ）、アビジン、ビオチン、芳香族化合物、アルカン、及びハロゲンの付着が挙げられる。目的物の更なる改変としては、限定されないが、シトシン環外アミンでの改変、５−ブロモ−ウラシル（Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８１：１６７−１７８）の置換、骨格改変、メチル化、特異な塩基対の組み合わせ等が挙げられる。総説として、Ｊａｙａｓｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１６２８−１６５０を参照。
【００６３】
ヌクレアーゼによる開裂に耐性を持たせるヌクレオチド及び隣接するヌクレオチド間のホスフェート結合に対する多くの改変に当業者は気づく（Ｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．９０：５４３−９８及びＡｇｒａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１４７−９及びＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  １０６：１１９７−１２０２）。このような機能性部分としては、例えば、糖の２’位での改変（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−４５及びＰｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−７）が挙げられる。例えば、改変されたヌクレオチドは、２’位でアミノ及びフルオロ官能基で置換される。それに加えて、目的物の更なる機能性部分としては、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド及びホスホロチオエート修飾ヌクレオチドが挙げられる（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６８３−６９５；Ｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１３６８２−１３６８３；Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７：２８５５５−２８５６１；及びＳｅｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７−７０）。従って、別の実施形態では、代替抗体分子は、血清ヌクレアーゼの存在下で分子を安定化する修飾ヌクレオチドを含む機能性部分を含む。
【００６４】
目的物の他の修飾としては、特異性鎖の特異性ドメイン中の１つ以上のヌクレオチドに対する化学的修飾が挙げられ、ここで、この修飾ヌクレオチドは、特異性ドメイン内に疎水性結合能力を導入する。特定の実施形態では、この化学修飾はヌクレオチド糖又はホスフェート分子の２’位で起こる。このような修飾は当分野で既知であり、例えば、非極性の非水素結合形状の模倣、例えば、６−メチルプリン及び２，４−ジフルオロトルエン（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１７：１８６３−７２及びＧｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５：９５０−９（これら両方は本明細書中に参考として組み込まれる））が挙げられる。更なる改変としては、イミダゾール、フェニル、プロリン及びイソロイシルの付加が挙げられる。
【００６５】
他の実施形態では、代替抗体分子の特異性鎖を優先的に増幅させることが望ましい。「優先的に増幅する」とは、代替抗体分子の特異性鎖が、対応する安定化鎖の増幅レベルと比較した場合に高い頻度で増幅ステップ中に増幅されることを意図する。従って、目的物の改変としては、代替抗体分子の特異性鎖の優先的増幅を可能にする修飾が挙げられる。代替抗体を増幅させる方法は本明細書中以下にさらに詳細に議論されるが、この種類の増幅を可能にする改変の種類は当分野で公知であり、例えば、ＰＣＲ反応におけるポリメラーゼ活性に対する耐性を増加させる安定化鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドの修飾が挙げられる。このような修飾としては、例えばビオチンを含む、増幅を中断させる任意の機能性部分が挙げられる。
【００６６】
目的物の更なる修飾としては、例えば、検出可能な標識の付着が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「検出可能な標識」は、それに付着する代替抗体の検出を可能にする分子を指す。従って、別の実施形態では、機能性部分としての検出可能な標識の組み込み又は付着は、代替抗体及び複雑な標的リガンドの検出を可能にする。このような検出可能な標識としては、例えば、ポリペプチド；放射能標識（例えば、32Ｐ）ヌクレオチド；蛍光分子（Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：２４６９−２４７３、発光分子、及び発色団（例えば、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＴＲＩＴＣ、メチルウンビリフェロン（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｕｍｂｉｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルミノール、ルシフェリン、及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｓｕｍｅｄｈａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１６２８−１６４９、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：８６−９１、及びＨｅｎｅｇａｒｉｕ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４９）；酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ等）、ランタニド族の元素（例えば、ユーロピウム、テルビウム、イットリウム）、及び微小球（例えば、サブミクロンポリスチレン、乾燥又は未乾燥）、及び本明細書中のどこかに記載される他の検出可能な標識が挙げられる。このような検出可能な標識は直接的な定性検出又は定量検出を可能にする。
【００６７】
１つの実施形態では、検出可能な標識を含む機能性部分はジゴキシゲニンである。この機能性部分の検出は、いくつかの異なる蛍光色素又は酵素に直接カップルングするか又は間接的な免疫蛍光による抗−ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベーションすることによって達成される。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．及びＣｅｌｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：９８−１０２（これらは両方、本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。検出可能な標識として作用可能な更なる分子としては、ビオチン及びポリＡテールが挙げられる。
【００６８】
別の実施形態では、抗体は、固体支持体又は溶液中の他の分子に代替抗体を付着するために使用可能なアフィニティータグの付着によって修飾される。従って、リガンド結合代替抗体複合体の単離は、代替抗体にカップリングするアフィニティータグの使用によって容易に行うことができる。本明細書中で使用される場合、アフィニティータグは、代替抗体分子に付着可能で、アフィニティータグを有さない分子からアフィニティータグを有する代替抗体を分離するために使用可能な、又は代替抗体に化合物を付着させるために使用可能な任意の化合物である。好ましくは、アフィニティータグは、別の化合物、例えば、リガンドに結合する分子又は抗体に結合するか又はそれらの化合物と相互作用する化合物である。アフィニティータグと捕捉する成分との間のこのような相互作用が特異的な相互作用であることも好ましい。例えば、代替抗体分子がカラムに付着する場合、固定化ストレプトアビジン、ビオチン化プライマーを用いて調製された代替抗体分子を含有するマイクロプレートウェル又はチューブは、固体相に結合するストレプトアビジンに対するそれらの結合を生じる。この様式で使用される他のアフィニティータグは、ポリＡ配列、タンパク質Ａ、レセプター、抗体分子、キレート化剤、アンチセンス配列によって認識されるヌクレオチド配列、シクロデキストリン、及びレクチンを含んでもよい。更なるアフィニティータグは、Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５０３７によって記載されている。好ましいアフィニティータグとしては、核酸配列に組み込み可能であり、ストレプトアビジン又はビオチン特異的な抗体を用いて捕捉される、ビオチンが挙げられる（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３）。アフィニティータグとして使用するのに好ましいハプテンは、ジゴキシゲニンである（Ｋｅｒｋｈｏｆ（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４）。特異的な抗体が知られているか、又は特異的な抗体を生成可能な多くの化合物が、アフィニティータグとして使用可能である。アフィニティータグとして有用な抗体は、商業的に得ることができるか、又は十分に確立された方法を用いて製造することができる。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）３０−８５を参照。
【００６９】
他のアフィニティータグは、抗−抗体抗体である。このような抗−抗体抗体及びそれらの使用は周知である。例えば、特定の種類の抗体又はイソ型又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、又は特定の種類の抗体（例えば、抗−ウサギ抗体）に特異的な抗−抗体抗体は、他の群の抗体を検出又は他の群の抗体に結合するために一般に使用される。すなわち、これらはアフィニティータグに対する抗体を有することができ、この抗体：アフィニティータグ：代替活性複合体は、複合体の抗体部分に対して抗体を結合させることによって精製することができる。
【００７０】
他のアフィニティータグとしては、選択した他の分子との選択可能で開裂可能な共有結合を形成し得るものが挙げられる。例えば、このようなアフィニティータグとしては、硫黄原子を含有するものが挙げられる。このアフィニティータグと関連する核酸分子は、チオプロピルセファロースカラム上の保持によって精製することができる。このカラムは、結合していない分子を除去するために洗浄されてもよく、次いでβ−メルカプトエタノールを用いて減らされ、比較的穏やかな条件下で精製後に所望の分子を収集可能にする。
【００７１】
なお別の実施形態では、遺伝子コードを拡張するために、機能性部分は特異性鎖内に組み込まれる。このような部分としては、例えば、ＩｓｏＧ／ＩｓｏＣ対及び２，６−ジアミノピリミジン／キサンチン塩基対（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：５３７−９及びＴｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１５：４４６１−７）；メチルｉｓｏＣ及び（６−アミノヘキシル）ｉｓｏＧ塩基対（Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：２８１７−２２）、ベンゾイル基（Ｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１７：８４７４−５及びＥａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １：１０−６）及びアミノ酸側鎖が挙げられる。
【００７２】
目的物の他の機能性部分としては、架橋分子（すなわち、光架橋又は化学架橋のいずれかのためのヨウ素又は臭素；化学架橋のための−ＳＨ）；治療薬剤（すなわち、癌、関節炎、敗血症、心筋層の不整脈及び梗塞、ウイルス感染及び細菌感染、自己免疫疾患及びプリオン疾患の処置において使用される化合物）；生体分布、薬物動態学及び組織浸透、又はそれらの任意の組み合わせを変更する化学修飾が挙げられる。このような改変は、ピリミジン残基のＣ−５位で行うことができる。
【００７３】
代替抗体（安定化鎖又は特異性鎖のいずれか又は両方）に組み込まれる機能性部分は、複数の機能性を有していてもよい（すなわち、この部分が標識及びアフィニティー送達、ヌクレアーゼ安定化可能であり、及び／又は所望の複数の治療効果又は毒性効果を生成可能である）。本発明の改変された代替抗体は、例えば、蛍光活性化細胞並べ替え（Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：３０１８−３０２６及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：７０２−７０３）、酵素結合型オリゴヌクレオチドアッセイ（Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：１０２１−１０２５）、及び他の診断アッセイのような適用のための検出の補助における用途が見い出されており、これらのいくつかは本明細書中で議論される。
【００７４】
それに加えて、例えば、セルロース（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５４６２−５４６７）又はＳｅｐｈａｄｅｘ（Ｓｒｉｓａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９）に結合することが知られているアプタマーは同定されている。これらのアプタマーは、代替抗体に付着し、代替抗体分子を単離又は検出するための手段として使用される。
【００７５】
代替抗体構造に対して機能性部分を付着させるための種々の方法は、当分野で知られている。例えば、ポリペプチド又は種々の目的の他の化合物を代替抗体に対して接合するために提供する生体接合反応を見い出すことができ、例えば、Ａｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｔ  ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ，Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：８０−８５；Ｓｏｕｋｃｈａｒｅｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍ．６：４３−５４；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：６４８−５２及びＷｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ（これらの全ては本明細書中で参考として組み込まれる）中に見い出すことができる。
【００７６】
機能性部分は、特異性鎖又は安定化鎖又はそれらの任意の組み合わせの任意の領域に対して付着することができる。１つの実施形態では、機能性部分は、定常領域及び／又は安定化ドメインの１つ以上に付着する。他の実施形態では、機能性部分は、特異性ドメインに付着する。機能性部分の付着部位が所望の機能性部分に依存し、その機能性部分が標的リガンドに対するその代替抗体分子の結合を妨げない様式で付着することを当業者は理解する。
【００７７】
代替抗体構造内に組み込むために選択される機能性部分は、代替抗体がそのリガンド又は電位リガンドと接触する環境条件に依存して選択することができる。例えば、イオン化可能な基を有する分子を含有する代替抗体ライブラリーの生成は、塩に感受性の代替抗体を提供してもよく、金属キレート基の存在は、特定の金属イオンに感受性の代替抗体を導き得る。例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：５２２９−３４及びＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１０４４−８を参照。
【００７８】
本明細書中に記載される種々の方法及び組成物のいずれかにおいて、種々の機能性部分を、抗体を形成する１つ以上の鎖上の鎖の１つ以上の位置において接合することができる。代替抗体分子の鎖は、１つ以上、又は３つ以上、異なる種類の部分に共有結合することができる。機能性部分は、安定化鎖又は特異性鎖のいずれかの末端のいずれか又は両方に存在することができ、ヌクレオチドの全て又は一部分（すなわち、ピリミジン又はプリン）いずれかの鎖におけるいずれかの場所で個々の残基に付加することができるか、又はヌクレオチドの所与の種類（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）の全て又は一部分に付着することができ、及び／又は残基のいずれかの領域（すなわち、糖、ホスフェート、又は窒素性塩基）に付着することができる。
【００７９】
ＩＩ．アレイ
本発明は、サンプル中の目的のリガンドを検出するのに有用な組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、目的のリガンドの検出、同定、及び定量のためのアレイを含む。アレイは、サンプル中の目的のリガンドに結合する代替抗体の集合の使用に依存して、結合パートナー複合体を形成する。結合パートナー複合体は、目的のリガンドの検出、同定、及び／又は定量を可能なように固体支持体上に固定される。「代替抗体の集合」とは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１×１０6、少なくとも１×１０7、又は少なくとも１×１０8の代替抗体を含むグループ又は集合を意図する。代替抗体の集合としては、例えば、ランダム化された特異性領域を有する代替抗体の集合を含む代替抗体のライブラリーが挙げられる。いくつかの実施形態では、代替抗体の集合のメンバーは混合物中に見い出され、一方、他の実施形態では、集合のメンバーはいくつかの他の手段によって分離されたアレイ上の別個の位置（例えば、マルチウェルプレートの別個のウェル中）に付着することができる。いくつかの実施形態では、代替抗体の集合における代替抗体のリガンド結合特異性は知られていないが、他の実施形態では、集合中の１つ以上の代替抗体は、特定の目的のリガンドに結合するそれらの能力に基づいて選択されてもよい。特定の目的のリガンドに結合する代替抗体を選択するための方法は、本明細書中のどこかに提供される。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態では、アレイは、固体支持体又は基材上の別個の既知の位置に付着する捕捉プローブの集合を含む。捕捉プローブは、代替抗体分子のオリゴヌクレオチドテール中に含まれる認識ヌクレオチド配列との相互作用を介して、本発明の代替抗体分子に結合可能な捕捉ヌクレオチド配列を含む。更なる実施形態では、本発明のアレイはさらに、代替抗体のオリゴヌクレオチドテールにおいて見い出される認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉プローブにおいて見い出される捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いて、捕捉プローブに結合する１つ以上の代替抗体を含む。
【００８１】
本発明の他の実施形態では、代替抗体は、捕捉プローブを使用することなく、固体支持体に直接的に付着してアレイを生成する。固体支持体に核酸分子を付着する方法は当業者に周知であり、本明細書中のどこかで記載される。代替抗体が固体支持体に捕捉プローブを使用することなく直接的に付着する場合、代替抗体は認識ヌクレオチド配列を含む１つのオリゴヌクレオチドテールを含む必要がない。
【００８２】
Ａ．固体支持体
本発明のアレイは、固体支持体又は基材上の別個の既知の位置に付着する捕捉プローブの集合を含む。本明細書中で使用される場合、「固体支持体」は、共有結合又は非共有結合のいずれかを介して付着してもよい分子に対する任意の表面として定義される。固体支持体としては、限定されないが、膜、微小球粒子、例えばＬｕｍａｖｉｄｉｎ．ＴＭ．又はＬＳ−ビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、荷電した紙、ナイロン、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｏｄｇｅｔｔフィルム、機能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、砒化ガリウム、金、及び銀が挙げられる。その表面に官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール又はヒドロキシルを有することができる当分野で公知の任意の他の物質もまた含まれる。固体支持体としては、限定されないが、球状表面及び溝のある表面を含む、任意のトポロジーを有する表面が挙げられる。
【００８３】
本発明の固体支持体又は基材はさらに有機ポリマーであってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「有機ポリマー」は、最も好ましくは生体ポリマー合成のために適切な条件下で化学的に不活性であり、限定されないが、水素、炭素、酸素、フッ素、塩素、臭素、硫黄及び窒素を含む、種々の元素置換基を含む骨格を含む支持物質を意味することが意図される。代表的なポリマーとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリドン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレン−ビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、及びそれらのブレンド及びコポリマー。
【００８４】
平滑なアレイ表面が好ましいが、アレイは、実質的に任意の形状又は複雑な表面の固体支持体に加工されてもよい。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー性表面、光ファイバーのようなファイバー、ガラス又は任意の他の適切な基材上の核酸であってもよい。米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第５，８００，９９２号、及び第６，０４０，１９３号（これらそれぞれは本明細書中でその全体が組み込まれる）を参照。
【００８５】
本発明のアレイは、複数の別個の位置又はアドレスを有する固体支持体を含み、ここで、捕捉プローブ又は代替抗体はアドレスで固定される。アレイは低密度アレイ又は高密度アレイであってもよく、４以上、８以上、１２以上、１６以上、２０以上、２４以上、３２以上、４８以上、６４以上、７２以上、８０以上、９６以上のアドレス、又は１９２以上、２８８以上、３８４以上、７６８以上、１５３６以上、３０７２以上、６１４４以上、９２１６以上、１２２８８以上、１５３６０以上、又は１８４３２以上のアドレスを含有してもよい。いくつかの実施形態では、基材は、１２以下、２４以下、４８以下、９６以下、又は１９２以下、又は３８４以下のアドレス、５００以下、６００以下、７００以下、８００以下、又は９００以下のアドレス、又は１０００以下、１２００以下、１６００以下、２４００以下、又は３６００以下のアドレスを有する。
【００８６】
各アドレスによって覆われる基材の表面積は、好ましくは約０．２５ｍｍ2以下である。好ましくは、各アドレスによって覆われる基材の表面積は、約１ｍｍ2〜約１０，０００μｍ2である。例えば、各アドレスは、約１００μｍ2〜約２，５００μｍ2の基材表面積を覆ってもよい。代替の実施形態では、アレイ上のアドレスは、約２，５００ｎｍ2の基材表面積を覆ってもよい。
【００８７】
アレイのアドレスは、任意の幾何学形状を有していてもよい。例えば、アドレスは、長方形又は環状であってもよい。アレイのアドレスはさらに、不規則な形状であってもよい。アレイのアドレスを分割する距離は変動させることができる。例えば、アレイのパッチは隣接するパッチから約１μｍ〜約５００μｍ分割されている。典型的には、パッチを分割する距離は、アドレスが約１０μｍを超える直径を有する場合、アレイ上のアドレスの直径又は側面の長さにおおよそ比例する。アドレスサイズがさらに小さい場合、パッチを分割する距離は、典型的にはパッチの直径よりも大きい。
【００８８】
典型的には、１種類の捕捉のみがアレイの１個のアドレス上に存在する。１種類より多い種類の捕捉プローブが１個のアドレス上に存在する場合、捕捉プローブの全ては共通の結合パートナーを分け合う代替抗体と相互作用しなければならない。
【００８９】
本発明のアレイ構成は、種々の異なる種類のデバイス中に含まれてもよい。用語「デバイス」は、固体支持体を取り付け可能な任意のデバイス、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、無機シート、オイルゲージ等を意味することが意図される。固体支持体が固体支持体又はそれらに吸着する任意の生体ポリマーの機能的挙動に影響を与えることなくそれらに取り付け可能であり、デバイスが導入される任意の物質（例えば臨床サンプルなど）に対してデバイスが安定である限り、任意のデバイスを使用してもよい。
【００９０】
Ｂ．捕捉プローブ
いくつかの実施形態では、本発明のアレイは、アレイを作成するために固体支持体上に固定される複数の捕捉プローブを含む。捕捉プローブは、固体支持体上の別個の位置又は「アドレス」で固定される。捕捉プローブは、対応する代替抗体の認識ヌクレオチド配列と相互作用可能な既知の「捕捉ヌクレオチド配列」を含む。典型的には、各アドレスに付着する捕捉ヌクレオチド配列の配列が知られている。捕捉プローブは、固体支持体に付着するためのスペーサー又はリンカーとして役立つ更なるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００９１】
アレイは、典型的には、異なる種類の捕捉プローブを含む。「異なる種類」の捕捉プローブとは、異なる捕捉ヌクレオチド配列、すなわち、１つ以上のヌクレオチドによって変動する捕捉ヌクレオチド配列を有する捕捉プローブを意図する。いくつかの実施形態では、アレイは、少なくとも２つ又は少なくとも５つの異なる種類の捕捉プローブを含む。他の実施形態では、アレイは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、又は少なくとも８０の異なる種類の捕捉プローブを含む。なお他の実施形態では、アレイは、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、又は少なくとも５０，０００の異なる種類の捕捉プローブを含んでもよい。アレイのアドレスの数は、アレイが意図する目的に伴い変動してもよい。例えば、アレイが患者における腫瘍の状態又は他の疾患状態の評価における診断ツールとして使用される場合、約１００未満、約６０未満、約３０未満、約１５未満、又は約１０未満の異なるアドレスを含むアレイは、発現が疾患状態の指標であることが知られているアレイ上の捕捉プローブの必要な結合パートナー複合体がそれらのタンパク質のみに限定されているため、十分である場合がある。しかし、アレイが細胞の全タンパク質含量の顕著な部分を測定するために使用される場合、アレイは、少なくとも約１，０００又は少なくとも約１０，０００の異なる種類の捕捉プローブを含んでもよい。
【００９２】
アレイの１つの実施形態では、アレイの各アドレスは、異なる種類の捕捉プローブを含む。例えば、１００アドレスを有するアレイは、約１００の異なる種類の捕捉プローブを含む。同様に、約１０，０００アドレスを有するアレイは、約１０，０００の異なる捕捉プローブを含む。代替の実施形態では、それぞれの異なる種類の捕捉プローブは、アレイ上の１つより多い別個のアドレス上で固定される。例えば、それぞれの異なるタンパク質を補足する薬剤は、場合により、２、３、４、５、６以上の異なるアドレスで存在してもよい。従って、本発明のアレイは、それぞれの異なる種類の捕捉プローブは３つの別個のアドレス上に存在するため、約１０００の異なる種類の捕捉プローブを含むだけではなく、約３０００の異なるアドレスを含んでもよい。このような構造は、目的のリガンドを定量するための測定の精度を高めるのに有用である場合がある。複製アドレスの使用は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１５に記載され、及びＣｈｕｒｃｈｉｌｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３２：４９０−９５及びＱｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３２：４９６−５０１（それらはそれぞれ本明細書中でその全体を参考として組み込まれる）によって総括される。
【００９３】
本発明の捕捉プローブ中に含まれる捕捉ヌクレオチド配列は、対応する代替抗体の認識ヌクレオチドにハイブリダイズする限り、任意の長さを有することができる。任意の所与の捕捉ヌクレオチド配列について、特定のスクリーニング条件下で特定の認識ヌクレオチド配列で使用するための最適長さは、実験により決定することができる。従って、アレイ中の各捕捉ヌクレオチド配列の長さ及び組成物は、特定の条件下で（例えば、所定の温度、ｐＨ、浸透圧、又は溶媒）特定の標的物質をスクリーニングするために最適化されてもよい。捕捉プローブの長さは、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも４０００、又は少なくとも８０００ヌクレオチド長であることが可能である。例えば、捕捉プローブは、約１０〜１５、約１５〜２０、約２０〜２５、約２５〜３５、約３５〜５０、約５０〜７５、約７５〜１００、約１００〜１５０、約１５０〜３００、約３００〜６００、約６００〜１０００、約１０００〜１５００、約１５００〜２５００、又は約２５００〜５０００ヌクレオチド長であることが可能である。
【００９４】
Ｃ．アレイの合成
アレイ（これはまた「マイクロアレイ」又は口語的に「チップ」として記載される）、及びアドレス可能な（別個及び既知の位置）位置で既知のヌクレオチド配列を含むアレイを生成するための方法は、一般的に当分野に記載される。例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，４４５，９３４号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号、第６，０４０，１９３号、第５，４２４，１８６号、第６，３２９，１４３号、及び第６，３０９，８３１号、及びＦｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７（これらそれぞれは本明細書中にその全体を参考として組み込まれる）を参照。これらのアレイは、一般的に、フォトリソグラフィー方法及び固相合成方法の組み合わせを組み込む、機械的合成方法又は光による合成方法を用いて製造されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、捕捉プローブは別個に合成され、固体支持体に付着してアレイを生成する。他の実施形態では、捕捉プローブの配列は、所望のアレイを作成するために支持体上で直接的に合成される。固体支持体に対してオリゴヌクレオチドを共有的にカップリングするための好適な方法及びオリゴヌクレオチドを直接的に合成するための好適な方法は、当分野で公知である。好適な方法の総説は、例えば、Ｍａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：３０６−３１０（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。また、ＰＣＴ出願ＷＯ  ８５／０１０５１及びＷＯ  ８９／１０９７７及び米国特許第５，３８４，２６１号、第５，４２９，８０６号、第５，９８１，１８５号、及び第６，４９２，１１８号（これはそれぞれ本明細書中に参考として組み込まれる）を参照。
【００９５】
Ｄ．アレイ上での代替抗体の固定化
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の代替抗体は、代替抗体のオリゴヌクレオチド内に含まれる認識ヌクレオチド配列とアレイの対応する捕捉プローブ内に含まれる捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いて、本発明のアレイ上に固定される。更なる実施形態では、代替抗体の集合は、試験リガンドの集合と接触する前にアレイ上に固定される。他の実施形態では、代替抗体の集合は、試験リガンドの集合と接触して、アレイ上に固定される前に結合パートナー複合体の形成を可能にする。なお他の実施形態では、代替抗体は、試験リガンドの集合の存在下でアレイ上に固定される。
【００９６】
代替抗体の集合及び捕捉プローブを含むアレイは、代替抗体のオリゴヌクレオチドテール中に含まれる認識ヌクレオチド配列及び捕捉プローブ中に含まれる捕捉ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させてもよい。ハイブリダイゼーションを行う条件は、異なるポリヌクレオチドの固有の溶融温度及びハイブリダイゼーション性能に起因して、認識ヌクレオチド配列及び捕捉ヌクレオチド配列とともに変動する。溶融温度（Ｔm）は、相補性を有する領域の長さ、相補性を有する領域中のミスマッチの塩基対の数、ハイブリッド中のハイブリダイズするグアニン−シトシン塩基対の数、及びハイブリダイゼーションステップが行われる溶液の組成及び温度によって主に決定される。一般的に、低い温度及び高いイオン強度は、ハイブリダイゼーションに好ましい。しかし、さらに高い温度及びさらに低いイオン強度も感受性を下げた状態で特異性を増加させるために使用することができる。というのは、これらの条件は、非特異的なハイブリッドを不安定化させるからである。二本鎖の安定性についての塩基組成物の効果は、特定の溶液中、例えば、高濃度の三級アミン又は四級アミンの存在下でハイブリダイゼーションを行うことによって減る場合がある。予想されるＴmに近い温度でハイブリダイゼーションを行うことによって、ある種類の二本鎖が捕捉プローブと代替抗体のオリゴヌクレオチドテールとの間で形成されると予想され、ミスマッチの二本鎖の形成速度は実質的に減らされる場合がある。
【００９７】
カオトロピックハイブリダイゼーション溶媒、例えば、三級又は四級アミンもまた使用されてもよい。この点において、約２Ｍ〜約５．５Ｍの範囲の濃度でのテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣｌ）が特に好適であり、約３．５〜４ＭのＴＭＡＣｌ濃度で、ヌクレオチド組成物に関するＴm依存は実質的に減らされる。
【００９８】
それに加えて、ハイブリダイゼーション塩の選択は、最終的なハイブリダイゼーション収率に主要な影響を有する、例えば、５Ｍまでの濃度でのＴＭＡＣｌは、３０以上までの因子によって（ヌクレオチド組成物についていくらかの程度に依存して）、１Ｍ  ＮａＣｌと比較して、全般的なハイブリダイゼーション収率を増加させることができる。最終的に、以前に注記したように、アレイに付着するオリゴヌクレオチドの長さは、使用される特定の条件下でハイブリダイゼーションを最適化する限り、変動し得る。従って、ハイブリダイゼーション条件は、一般的に、実際にマッチしたオリゴヌクレオチドとミスマッチのオリゴヌクレオチドとの区別を可能にするものである。
【００９９】
好ましいハイブリダイゼーション条件は、本発明の代替抗体と化合物又は目的のリガンドとの間に形成される結合パートナー複合体の安定性を維持する。認識ヌクレオチド配列及び捕捉ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを行う条件下で目的のリガンドに結合する代替抗体分子は、本明細書中のどこかに記載される方法を用いて製造されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションのために使用される条件は、目的のリガンドに結合する代替抗体を選択するために使用される。
【０１００】
一般的に、捕捉プローブの濃度は、代替抗体の濃度に対して捕捉プローブと代替抗体との間の検出可能なハイブリダイゼーションを生成するのに十分であるべきであり、このようなハイブリダイゼーションは、例えば、モル過剰の捕捉プローブを用いることによって適切である。
【０１０１】
ＩＩＩ．キット
本発明は、本発明のアレイを含むキットを提供する。これらのキットは、本明細書中のどこかで記載される検出方法、定量方法、及びスクリーニング方法において有用である。キットはさらに、２つ以上のサンプル中で異なるレベルで存在する分子を同定する方法において使用するために設計されてもよい。他の実施形態では、このキットは、特定の種類のサンプルを同定するために設計され、２つ以上のサンプル中に異なるレベルで存在するリガンドに結合する代替抗体を含有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、キットは、代替抗体のオリゴヌクレオチドテール中に見い出される認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉プローブ中に見い出される捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いてアレイ上に固定される本発明の１つ以上の代替抗体分子とともに、固体支持体又は基材上に別個の既知の位置に付着する捕捉プローブの集合を有するアレイを含む。他の実施形態では、キットは、固体支持体又は基材上に別個の既知の位置に付着する捕捉プローブを有するアレイを含み、捕捉プローブは、代替抗体分子のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列との相互作用を用いて、本発明の代替抗体分子に結合可能な捕捉ヌクレオチド配列を含む。キットのいくつかの実施形態では、代替抗体の集合は、好ましくは、別個のキット成分として提供される。このキットは、結合パートナー複合体の検出において使用するための第２の分子をさらに含んでもよい。代替抗体の集合及び第２の分子の集合は、溶液中で提供されてもよいか、又は固体相として提供されてもよい（例えば、凍結乾燥されたもの）。
【０１０３】
更なる組成物は、本発明のキット中に含まれてもよい。このような組成物としては、試験化合物と代替抗体分子の集合とを接触させて、試験化合物と代替抗体との結合パートナー複合体を形成可能な１つ以上のバッファーが挙げられる。このキットはさらに、検出方法又は目的のリガンドの定量において使用するための指示書を含んでもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、１つ以上のデジタルコード化された参照リガンドプロフィールを含むコンピューター読み取り可能な媒体であって、複数の各参照プロフィールが複数の値を有し、各値が本発明の前記アレイによって検出されたリガンドのレベルを表す、媒体を含む。これらのキットは、本明細書中のどこかに記載される方法を用いて、試験サンプルが参照サンプルと同じサンプルであるか否かを決定するのに有用である。
【０１０５】
方法
Ｉ．目的のリガンドを検出する方法
本発明は、試験リガンドの集合において１つ以上の目的のリガンドを検出するための方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、以下のステップを含む。
【０１０６】
１）代替抗体分子の少なくとも１つと目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下で試験リガンドの集合と代替抗体分子の集合とを接触させるステップであって、代替抗体分子が、
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｂ）上記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び上記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｃ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、を含むステップ、
２）少なくとも１つの結合パートナー複合体を形成するステップ、
３）固体支持体に付着する捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、上記捕捉プローブが、上記固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
４）上記代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、上記対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で上記結合パートナー複合体と上記アレイとを接触させるステップ、及び
５）上記アレイに結合した前記結合パートナー複合体を検出して、目的のリガンドを検出するステップ。
【０１０７】
別の実施形態では、試験リガンドの集合中で目的のリガンドを検出するための方法は、以下のステップを含む。
１）捕捉プローブの集合を有するアレイを提供するステップであって、上記捕捉プローブが固体支持体上の別個の、既知の位置に付着し、上記捕捉プローブが既知の捕捉ヌクレオチド配列を含み、代替抗体分子の集合が、上記代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に構成される上記捕捉ヌクレオチド配列と上記認識ヌクレオチド配列との間の相互作用によって上記捕捉プローブに結合し、上記代替抗体分子はさらに
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、及び
ｂ）上記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び上記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、を含み、
２）上記アレイに結合した代替抗体分子の少なくとも１つと目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下で試験リガンドの集合と上記アレイとを接触させるステップ、及び
３）上記結合パートナー複合体を検出するステップ。
【０１０８】
Ａ．試験リガンドの集合と代替抗体との接触
本発明は、１つ以上の目的のリガンドを検出、同定、及び／又は定量するための方法を提供する。この方法において、試験リガンドの集合は、試験リガンドの少なくとも１つと代替抗体の少なくとも１つとの間の結合パートナー複合体の形成を可能にする条件下で代替抗体分子の集合と接触する。本発明のいくつかの実施形態では、代替抗体の集合は、試験リガンドの集合と接触する前に、アレイ上に固定される。次いで、試験リガンドの集合中で、アレイ上の１つ以上の代替抗体と試験リガンドの集合において対応する目的のリガンドとの間の特異的結合パートナー複合体の形成を促進する条件下で、試験リガンドの集合をアレイと接触させる。
【０１０９】
他の実施形態では、試験リガンドの集合を、代替抗体の集合と接触させ、代替抗体の集合がアレイと接触する前に結合パートナー複合体が形成される。いくつかの実施形態では、試験リガンドの集合及び結合パートナー複合体が、液体中で提供される。他の実施形態では、代替抗体の集合は、固体相として提供され、１つ以上の結合パートナー複合体の形成を促進する条件下で、試験リガンドの集合は代替抗体の集合に添加される。例えば、代替抗体は、試験リガンドの集合と接触する前に、乾燥又は凍結乾燥されてもよい（すなわち、迅速凍結及び減圧下での乾燥によって調製される）。次いで、少なくとも１つの代替抗体と対応する目的のリガンドとの間の結合パートナー複合体の形成を促進する条件下で、試験リガンドの集合を代替抗体に添加する。次いで、代替抗体のオリゴヌクレオチドテール中に含まれる認識ヌクレオチド配列の相互作用が対応する捕捉プローブ中に含まれる捕捉ヌクレオチド配列と相互作用可能である条件下で、結合パートナー複合体を捕捉プローブのアレイと接触させる。アレイは、好ましくは、結合パートナー複合体における代替抗体と試験リガンドとの相互作用の安定化を維持する条件下で行われる。認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用は、アレイ上の別個の位置又はアドレスで結合パートナー複合体を固定する。
【０１１０】
なお他の実施形態では、試験リガンドの集合は、捕捉プローブのアレイの存在下で、代替抗体の集合と接触する。試験リガンドの集合は、少なくとも１つの代替抗体と対応する目的のリガンドとの結合パートナー複合体の形成を促進する条件下で代替抗体の集合と接触する。好ましくは、条件はさらに、代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列の相互作用を可能にし、アレイ上の対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列と接触する。認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用は、アレイ上の別個の位置（アドレス）で結合パートナー複合体を固定する。
【０１１１】
試験リガンドの集合は、代替抗体と目的のリガンドとの結合パートナー複合体の形成を可能にするのに十分な時間間隔で、代替抗体の集合と接触する。典型的には、約３０秒〜約２時間の時間、試験リガンドの集合は代替抗体の集合と接触する。いくつかの実施形態では、試験リガンドの集合は、約６０秒〜約３０分の時間、代替抗体の集合と接触する。試験リガンドの集合が抽出物と接触する温度は、特定の試験リガンド及び選択される代替抗体の関数である。典型的には、試験リガンドは、生理的な温度条件下で代替抗体と接触するが、いくつかのサンプルについて、改変された温度（典型的には４℃〜５０℃）が望ましい場合があり、当業者によって実験的に決定可能である。
【０１１２】
従来の検出技術を超える本発明の１つの利点は、本発明が、非常に少量のサンプルのみを用いて行われる多くの異なる目的のリガンドの検出を可能にすることである。一般的に、約５〜約２００μｌを含有するサンプルの体積は、目的のリガンドを検出するのに十分である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、結合パートナー複合体は、均一の反応条件下で検出され、その結果、結合パートナー複合体の検出の前に、結合パートナー複合体から結合していない試験リガンド（すなわち、代替抗体に結合していない試験リガンド）又は結合していない代替抗体（すなわち、目的のリガンドに結合していない代替抗体）を除去する必要性がない。本発明の他の実施形態では、結合していない試験リガンド、結合していない代替抗体、又は結合していない試験リガンド及び結合していない代替抗体の両方を、結合パートナー複合体を検出する前に、結合パートナー複合体を含有する混合物から除去することが好ましい。例えば、結合パートナー複合体の検出が試験リガンドの集合を標識することによって達成される場合、検出ステップの前に結合していない試験リガンドを除去することが必要である場合がある。
【０１１４】
当分野で既知の任意の方法は、結合パートナー複合体から結合していない試験リガンド又は結合していない代替抗体を除去するために使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、結合していない試験リガンドは、結合パートナー複合体が固定されているアレイを洗浄することによって、結合複合体から除去される。洗浄ステップの条件は、アレイから結合していない試験リガンドを除去しながら、特定の結合パートナー複合体の安定性及び代替抗体の認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用の安定性を維持するように設計される。アレイ上で代替抗体を固定化する前の結合パートナー複合体の他の実施形態では、結合していない試験リガンドは、分配によって、本明細書中のどこかに記載される方法を用いて、結合パートナー複合体から除去されてもよい。分配ステップの後、結合パートナー複合体は本発明のアレイと接触して検出可能になる。
【０１１５】
Ｂ．結合パートナー複合体の検出
結合パートナー複合体が本発明のアレイに固定された後に、アレイ上の別個の位置に関連する複合体依存のシグナルを測定することによって、複合体が検出及び定量されてもよい。多くの検出方法が複合体依存シグナルを生成するために本発明において使用されてもよく、検出ステップは、定性（すなわち、検出のみの目的のため）又は定量（すなわち、アレイ上に固定された結合複合体の量を測定する）のいずれかであってもよい。アレイ上に固定された分子の検出のための方法は、当分野において公知である。非標識検出方法の例としては、光導波路、表面プラズモン共鳴、表面電荷センサー、及び表面力センサーに基づくものが挙げられ、これらは本発明の多くの実施形態と適合性である。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／２６４３２及び米国特許第５，６７７，１９６号（これら両方は本明細書中においてその全体を参考として組み込まれる）を参照。あるいは、例えばＢｒｅｗｓｔｅｒ  Ａｎｇｌｅ顕微鏡（ＢＡＭ）及び偏光解析法に基づく技術が適用可能である。例えば、Ｓｃｈａａｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ３：１１３１−１１３５；米国特許第５，１４１，３１１号及び第５，１１６，１２１号；及びＫｉｍ（１９８４）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２２：２６８２−２６８５（これらそれぞれは本明細書中にその全体を参考として組み込まれる）を参照。石英結晶微量天秤及び脱着プロセスは、本発明のアレイの少なくともいくつかの実施形態に好適なさらに他の代替的な検出手段を提供する。例えば、米国特許第５，７１９，０６０号（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。表面プラズモン共鳴、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ  Ａｎｇｌｅ顕微鏡、光導波路ライトモード分光法（ＯＷＬＳ）、表面電荷測定、及び偏光解析法を含む本発明のいくつかのアレイ及び種々の非標識検出原理の両方に適合する光学バイオセンサーシステムの例は、米国特許第５，３１３，２６４号に見い出すことができる。
【０１１６】
検出は、試験リガンド、代替抗体、又は試験リガンドと代替抗体の両方を検出可能な標識にカップリング（すなわち、物理的な架橋）することによって容易に行うことができる。検出可能な標識は、典型的には、アレイに結合した結合パートナー複合体の量を検出し、定量するために使用可能な測定可能なシグナル、例えば、蛍光シグナル、発色シグナル、又は放射性シグナルを生成する。検出可能な標識の使用に基づくアレイの検出方法の例は、当分野で周知である。例えば、米国特許第６，２１５，８９４号、第６，３２９，６６１号、第６，３６２，００４号、第６，３９９，３５号、第６，４０６，８４９号、第６，４４７，７２３号、及び第６，４７１，９１６号（これらのそれぞれは本明細書中に参考として組み込まれる）を参照。このような方法としては、限定されないが、可視光範囲又は赤外線範囲における吸収；化学ルミネッセンス；及び寿命蛍光、分極、蛍光消光、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、及び蛍光−レゾナンスエネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を含む蛍光）が挙げられる。蛍光消光及びＦＲＥＴのような検出方法の使用は、検出が均一反応条件下で行うことを可能にし、その結果、検出ステップ前にアレイから結合していない標識化号物を除去することは必要でない。このような方法は、典型的には、蛍光基の使用に依存する。選択された波長を有する光で励起された場合、異なる波長の光を発し、蛍光基の蛍光シグナルを改変し得る蛍光改変基の光を発する。蛍光基は、結合複合体の１つの成分に付着する一方、蛍光改変基は、結合パートナー複合体の別の成分に付着する。結合パートナー複合体が形成される場合、蛍光基は蛍光改変基と物理的近接性をもたらし、検出可能な蛍光シグナルの対応する変化を生じる。例えば、米国特許第６，１７７，５５５号（本明細書中でその全体が参考として組み込まれる）を参照。
【０１１７】
検出方法の選択は、使用される標識基に基づく。蛍光及び発光を検出可能な標識の例としては、限定されないが、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ、５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリンウンビリフェロン（ｕｍｂｉｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルミノール、イクオリン、及びルシフェリンが挙げられる。酵素に基づいて検出可能な標識の非限定的な例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及び他のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びプロテアーゼが挙げられる。例えば、不活性なβ−ガラクトシダーゼモノマー及び誘発ペプチドを目的のリガンドに接合してもよく、活性なβ−ガラクトシダーゼテトラマーの形成及び基質変換を生じる。目的のリガンドに特定的な代替抗体の添加は、β−ガラクトシダーゼ重合及び基質変換と相互作用する。好適な放射性の検出可能な標識の例としては、限定されないが、32Ｐ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ又は3Ｈが挙げられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、標識基は、試験リガンドの集合に結合する。１つ以上の結合パートナー複合体が目的のリガンドと代替抗体との間で形成された後、結合していない試験リガンドは、結合していない試験リガンド又は非特異的に結合した試験リガンドから結合パートナー複合体を分配することによって、又は結合パートナー複合体を含むアレイを洗浄して結合していない試験リガンドを除去することによって除去される。結合していないリガンド又は非特異的に結合したリガンドから結合パートナー複合体を分配する方法は、本明細書中のどこかに記載される。次いで、検出可能な標識によって作成されるシグナルをアッセイすることによって結合パートナー複合体を検出してもよい。いくつかの実施形態では、アレイ上の特定の捕捉プローブと相互作用する代替抗体のための結合パートナーが知られており、それにより、アレイ上の特定のアドレスに結合した複合体を検出することによって特定の目的のリガンドを同定することができる。
【０１１９】
他の実施形態では、結合パートナー複合体は第２の分子を用いて間接的に検出される。この方法では、第２の分子は検出可能な標識を含有し、結合パートナー複合体は、２サイト結合又はサンドイッチ型アッセイを用いて検出される。典型的には、サンドイッチアッセイを用いる検出は、固体支持体に固定された標的分子又は標的複合体に対する標識された第２の分子の特定の結合に基づく。結合していない第２の分子が除去され（例えば、洗浄により）、次いで第２の分子上の検出可能な標識からのシグナルが測定され、それにより第２の分子によって結合する標的分子又は標的複合体の検出及び定量を可能にする。例えば、米国特許出願番号２００２００３７５０６（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。
【０１２０】
従って、本発明は、試験リガンドの集合において目的のリガンドの存在を検出するための方法を提供し、この方法は以下のステップを含む。（１）結合パートナー複合体が少なくとも１つの目的のリガンドと代替抗体との間で形成される条件下で、試験リガンドの集合と本発明の代替抗体の集合とを接触させるステップであって、上記代替抗体が、代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉プローブ内に含まれる捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いて本発明のアレイ上に固定される、ステップ、（２）アレイ上に固定された結合パートナー複合体と１つ以上の第２の分子とを接触させるステップであって、ここで、第２の分子が検出可能な標識を含み、目的のリガンド又は代替抗体のいずれか上の結合パートナー複合体において見出される結合部位に特異的に結合可能である、ステップ、（３）結合していない第２の分子を除去するステップ、及び（４）第２の分子上に見いだされる検出可能な標識からシグナルを検出して目的のリガンドを検出するステップ。
【０１２１】
本発明において使用される第２の分子は、目的のリガンド又は代替抗体に結合可能な任意の分子であってもよい。使用されてもよい第２の分子の例としては、限定されないが、抗体、代替抗体（すなわち、本発明の代替抗体）、及び核酸プローブが挙げられる。いくつかの実施形態では、代替抗体又は試験リガンドは第２の分子の結合を可能にするように改変される。例えば、代替抗体又は試験リガンドは、ビオチンと共に接合してもよく、検出可能な標識を含有するストレプトアビジン分子は第２の分子として使用されてもよい。例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：７０２−７０６を参照。代替抗体又は試験リガンドはさらに、第２の分子によって特異的に認識される任意のタンパク質又は部分を添加することによって改変されてもよい。例えば、Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１０２１−１０２５を参照。他の実施形態では、第２の分子は特定の代替抗体又は特定の試験リガンドに特異的に結合するように設計又は選択される。例えば、第２の分子は第２の代替抗体であってもよい。特定の標的化合物に特異的に結合する代替抗体について選択するための方法は、本明細書中のどこかに記載される。第２の代替抗体が検出のための第２の分子として使用される場合、第２の代替抗体が認識ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドテールを含むことは必要とされない。
【０１２２】
第２の分子が結合パートナー複合体の検出のために使用され、例えば、目的のリガンドの結合を阻害する様式で代替抗体のリガンド結合ドメインに対して結合することによって、結合パートナー複合体の形成を阻害しないように第２の分子が設計又は選択されるべきであることが認識される。従って、試験リガンド及び対応する代替抗体の間の相互作用に関与する部位から区別される目的のリガンド又は対応する代替抗体上の部位を認識する第２の分子が好ましい。
【０１２３】
Ｃ．目的のリガンドの定量
本発明の方法は、試験リガンドの集合内の目的のリガンドの定量を可能にする。試験リガンドの集合は、１つ以上の目的のリガンドと対応する代替抗体との間の結合パートナー複合体の形成を可能にする条件下で、本発明の代替抗体の集合と接触する。結合パートナー複合体は、本明細書中のどこかで記載される方法を用いて検出され、アレイに結合した結合パートナー複合体の量に対応する生の値を生じる。形成しアレイに結合した結合パートナー複合体の量は、サンプル中の目的のリガンドのレベルと相関し、目的のリガンドの定量を可能にする。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、別個の実験から得られた結果又は異なるサンプルから得られた結果を比較するように、アレイ上の結合パートナー複合体を検出することによって得られる値を正規化することが好ましい。例えば、検出データを、異なる試験リガンドの集合において同じレベルで存在する「コントロールリガンド」を参照して正規化することができる。それに加えて、所定の種類の捕捉プローブは、アレイ上の１つより多いアドレスでアレイ上に付着し、その結果、対応する結合複合体がアレイ上の複数の別個の位置で検出されるようにしてもよい。形成した結合パートナー複合体の量に対応する複数の生の値を得ることによって、検出及び定量の精度を増大させることができる。定量の精度を増大させるためのアレイ実験を設計するための方法、及びアレイ結果を分析し正規化するための方法、及びアレイ結果を実証するための方法は当分野で公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｌｌｏｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．３２：４８１−８９，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．３２：４９０−９５，Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．３２：４９６−５０１；Ｓｌｏｎｉｍ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．３２：５０２−０８；及びＣｈｕａｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．３２：５０９−５１４；（これらはそれぞれその全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に総括される。
【０１２５】
ＩＩ．リガンドプロフィールを作成し、使用する方法
本発明は、サンプルについてリガンドプロフィールを作成する方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は以下のステップを含む。
１）代替抗体分子の少なくとも１つとサンプル中の目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下でサンプルと代替抗体分子の集合とを接触させるステップであって、代替抗体分子が、
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｂ）第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｃ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、を含むステップ、
２）固体支持体に付着した捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、捕捉プローブが、固体支持体の別個の、既知の領域に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
３）代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ステップ（ａ）で形成される結合パートナー複合体とアレイとを接触させるステップ、
４）アレイに結合した結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
５）サンプルについてのリガンドプロフィールを作成するステップであって、リガンドプロフィールは、サンプル中に存在する１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含む、ステップ。
【０１２６】
別の実施形態では、サンプルについてリガンドプロフィールを作成する方法は以下のステップを含む。
１）捕捉プローブの集合を有するアレイを提供するステップであって、捕捉プローブが固体支持体上の別個の既知の位置に付着し、捕捉プローブが既知の捕捉ヌクレオチド配列を含み、捕捉ヌクレオチド配列と代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列と間の相互作用によって代替抗体分子の集合が捕捉プローブに結合し、ここで、代替抗体分子はさらに以下を含む、ステップ：
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｂ）第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｃ）オリゴヌクレオチドテールが特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチドを含み、
２）アレイに結合した代替抗体分子の少なくとも１つとサンプル中の目的のリガンドの少なくとも１つのリガンドとの間に結合パートナー複合体を形成可能な条件下でサンプルとアレイとを接触させるステップ、
３）結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
４）サンプルについてリガンドプロフィールを作成するステップであって、上記リガンドプロフィールは、サンプル中に存在する１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含む、ステップ。
【０１２７】
本発明はさらに、２つ以上のサンプル中に異なるレベルで存在する代替抗体リガンドを同定するための方法を提供する。この方法は以下のステップを含む。
１）各サンプルと代替抗体分子の集合とを別個に接触させるステップであって、ここで、代替抗体分子は以下を含む、ステップ：
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｂ）第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｃ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、
２）各サンプルについて、サンプルが抗体の集合中に１つ以上の代替抗体によって結合するリガンドを含有する場合、代替抗体とリガンドとの間の１つ以上の結合パートナー複合体を形成するステップ、
３）各サンプルについて、固体支持体に付着した捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、捕捉プローブが、固体支持体の別個の、既知の位置に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
４）各サンプルについて、代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、前記対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でステップｂ）において形成される任意の結合パートナー複合体とアレイとを接触させるステップ、
５）各サンプルについて、アレイに結合した任意の結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
６）各サンプルにおいて検出した結合パートナー複合体のレベルを比較して、それによりサンプル中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドを同定するステップ。
【０１２８】
本発明はさらに、１つ以上のサンプルについてリガンドプロフィールを作成するための方法を包含する。この方法は、上記のようなサンプル中に異なるレベルで存在するリガンドを同定するステップを含み、１つ以上のサンプルについてリガンドプロフィールを作成する更なるステップを含み、ここで、リガンドプロフィールは比較されるサンプル中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含む。いくつかの実施形態では、サンプルについて作成されるリガンドプロフィールは、参照プロフィールを作成するために使用されるサンプルと同じ種類の試験リガンドを有する他の試験リガンドの集合を同定するための参照プロフィールとして使用されてもよい。
【０１２９】
例えば、１つの実施形態では、本発明は、サンプルを同定する方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む。
１）１つ以上の参照プロフィールを提供するステップであって、ここで、各参照プロフィールがサンプルの特定の型に特徴的であり、サンプル中の目的のリガンドのレベルに対応する値を含む、ステップ、
２）試験サンプルについてリガンドプロフィールを提供するステップであって、ここで、リガンドプロフィールが上述の方法の１つに従って作成され、それぞれの値がさらに参照プロフィール内に含まれる１つ以上の目的のリガンドのレベルを表す値を含む、ステップ、及び
３）試験サンプルからのリガンドプロフィールが１つ以上の参照プロフィールと類似するか否かを決定し、それにより試験サンプルを同定するステップ。
【０１３０】
他の実施形態では、２つ以上のサンプル中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドのレベルを表す値を含む参照プロフィールを作成してもよい。このような参照プロフィールは、参照プロフィール中に含まれる値と試験リガンドの集合中にリガンドについて得られる値とを比較することによって異なるサンプルを識別可能にする。従って、別の実施形態では、本発明は、試験サンプルを同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下を含む。
１）試験サンプルについてリガンドプロフィールを提供するステップであって、リガンドプロフィールが上に記載される方法に従って作成される、ステップ、
２）１つ以上の参照プロフィールを提供するステップであって、各参照プロフィールがサンプルの特定の型に特徴的であり、試験サンプルについての前記リガンドプロフィール及び参照プロフィールが前記試験リガンドの集合中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドのレベルを表し、比較される値を含む、ステップ、及び
３）前記試験サンプルについてのリガンドプロフィールに最も類似する前記参照プロフィールを選択して、前記試験サンプルを同定するステップ。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、２つ以上の試験リガンドの集合中に異なるレベルで存在するリガンドが、試験リガンドの集合中で異なる濃度で存在する。他の実施形態では、リガンドは１つ以上の試験リガンドの集合中に存在するが、他の試験リガンドの集合には存在しない。リガンドが試験化合物の集合に存在しない場合、結合パートナー複合体は試験化合物の集合中で観察されない。なお他の実施形態では、リガンドは試験リガンドの集合中によく似た濃度で存在するが、比較される試験化合物の集合中で異なる状態に改変されていてもよい。特定の改変を含有するリガンド対して特異的に結合する代替抗体は、本明細書中のどこかで記載される方法を用いて同定されてもよい。
【０１３２】
レベルを測定する異なる目的のリガンドの数が多い場合、アルゴリズムを使用して各試験リガンドの集合中のレベルを比較して、試験リガンドの集合中に異なるレベルで存在するリガンドのパターンを同定してもよい。このようなアルゴリズムは当分野で既知であり、例えば、Ｓｌｏｎｉｍ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．３２：５０２−５０８（本明細書中でその全体を参考として組み込まれる）に総括される。
【０１３３】
２つ以上の試験リガンドの集合中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドを同定する方法は、特定のサンプルに特徴的なリガンドプロフィールを作成するために使用されてもよい。特定の種類の試験リガンドの集合（サンプル）に特徴的なリガンドプロフィールは、「参照プロフィール」と呼ばれる。特定の参照サンプルについての参照プロフィールが確立されると、この参照プロフィールを試験サンプルが参照サンプルと同じ種類のサンプルであるか否かを決定するために使用してもよい。試験サンプルからのリガンドプロフィールを参照プロフィールと比較して、試験サンプルのリガンドプロフィールが参照プロフィールと十分に類似しているか否かを決定する。あるいは、試験サンプルのリガンドプロフィールを複数の参照発現プロフィールと比較して、試験サンプルのリガンドプロフィールと最も類似する参照リガンドプロフィールを選択する。
【０１３４】
２つ以上のサンプル中で異なるレベルで存在するリガンドのレベルと特定の種類のサンプルの同定との相関の強さは、統計的な有意性試験によって決定されてもよい。このような統計的な試験は、リガンドのレベルとサンプルの種類の同定との相関の強さを示すスコアを提供する。このようなスコアは、リガンドプロフィールの診断精度又は予後精度を高める目的で、又はリガンドプロフィールの診断精度又は予後精度を維持しつつリガンドプロフィール中に含有される値の数を減らす目的で、特定の種類のサンプルとの相関が最も大きいリガンドを選択するために使用されてもよい。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、参照プロフィールは、既知の目的のリガンドに結合する代替抗体分子を用いて確立される。しかし、特定の種類のサンプルに特徴的又は診断的な（すなわち、同定可能な）参照プロフィールが、その同一性が知られていないリガンドを用いて開発されてもよいことが理解される。従って、他の実施形態では、代替抗体の集合はランダム化されており、目的のリガンドは、比較を受けるサンプル間で異なって表される任意のリガンドである。
【０１３６】
参照プロフィールは、広範囲のサンプルを同定するために使用されてもよい。例えば、参照プロフィールは、生物戦争又は化学戦争の薬剤を含有するサンプル（例えば、野兎病菌、エルジニア属ペスト、炭疸菌、エボラウイルス、マルブルクウイルス、ハンタウイルス）を同定するために使用されてもよい。このような適用における本発明の１つの利点は、特定の目的のリガンドに結合する代替抗体を迅速に生成する能力により、使用者が新規の遺伝子操作された生物戦争の薬剤に応答し、検出することができることである。本発明の参照プロフィールはさらに、例えば、ＰＣＢ、石油炭化水素、ダイオキシンを含有する環境サンプルを同定するために、及び、例えば、アフラトキシン、ＰＣＢ、ダイオキシン、サルモネラ、Ｏ１５７大腸菌、シガ毒素、リステリアを含有する食物サンプルを同定するために、又は遺伝子改変された有機体を含有するサンプルを同定するために使用されてもよい。
【０１３７】
代替抗体が広範囲のリガンドに結合可能であることが本発明の利点である。従って、本発明の参照プロフィールは、化合物、細胞、及びウイルスを含む、多くの異なる種類のリガンドのレベルを表す値を含んでもよい。
【０１３８】
生物学的サンプルにおいて、例えば、翻訳後の改変を介する転写からのタンパク質発現の任意の段階での違いから、リガンドの異なる発現を生じる。生物学的サンプル中の特定の核酸分子又はポリペプチドのレベルを定量するために使用されることに加えて、本発明の代替抗体は、特定の翻訳後の改変を含有するタンパク質に結合するように設計又は選択されてもよい。このような改変の例としては、限定されないが、ホスフェートの付加（リン酸化）、炭水化物の付加（グリコシル化）、ＡＤＰ−リボシルの付加（ＡＤＰリボシル化）、脂肪酸の付加（プレニル化、限定されないが、以下を含む。ミリストイル化及びパルミチル化）、ユニキチンの付加（ユビキチン化）及びセントリン（セントリン化；ユビキチン化に類似したタンパク質改変）又はタンパク質のタンパク質分解消化（タンパク質分解）が挙げられる。本発明の代替抗体を用いて検出され得るタンパク質改変の更なる例としては、メチル化、アセチル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、及びフラビン結合が挙げられる。
【０１３９】
この方法は、２つの細胞型の間で異なって発現される分子を検出するために使用されてもよい。２つの細胞型は、正常細胞対病原細胞、例えば、癌細胞又は発達又は分化の異なるレベル又は異なる段階での細胞、又は細胞サイクルの異なる部分における細胞であることが可能である。しかし、この方法は、さらに異なる条件にさらされた同じ型の２つの細胞を試験することにおいて有用である。例えば、この方法は、細胞中の遺伝子発現を調整する能力について、毒物及び試験化合物をスクリーニングする場合において有用である。このような方法では、１つの生物学的サンプルが試験化合物にさらされ、他の細胞はさらされない。次いで、サンプルのリガンドプロフィールが比較される。
【０１４０】
この方法はさらに、疾患の診断マーカーを同定するのに有用である。患者サンプル又は正常サンプルまたは細胞と比較して異常な培養細胞において異なって発現するタンパク質は、診断マーカーであり得る。概して、統計学的に有意な患者の集合と正常サンプルとをサンプル比較することが最良である。この様式において、情報がプールされ、病理を示す個々の全て又は有意な数に共通の診断マーカーを同定することができる。
【０１４１】
リガンドプロフィールはさらに、サンプル中の特定の病原体又は病原体株の存在を示し得るか、又は特定の疾患又は所与の治療に対する応答における所望でない副作用に対する感受性と相関し、それらを予想するために使用し得る。「リガンドプロフィール」は、２つ以上のサンプル中に異なるレベルで存在する１つ以上のリガンドの絶対値又は相対値を表す値の集合である。好ましくは、リガンドプロフィールは、そのプロフィールを１つのサンプルを他のサンプルと識別するのに使用可能なように、又は別のリスクグループにおいてそれらから１つのリスクグループにおける被検体を識別可能なように十分な数の値を含有する。いくつかの実施形態では、１個の値が、１つの試験化合物のサンプルを別のサンプルと識別するのに十分である場合がある。
【０１４２】
Ｃ．スクリーニングアッセイにおいてアレイを使用する方法
本発明の組成物及び方法は、特定の目的のリガンドと相互作用する標的化合物、細胞、又はウイルスを同定するために試験化合物をスクリーニングするのに使用されてもよい。これらのスクリーニングアッセイは、標的化合物が目的のリガンドと対応する代替抗体分子との間の結合パートナー複合体の形成を妨げるか又は破壊する能力に依存する。
【０１４３】
１つの実施形態では、本発明は、試験化合物、試験細胞、又は試験ウイルスをスクリーニングして、目的のリガンドと相互作用する１つ以上の標的化合物、標的細胞、又は標的ウイルスを同定する方法を提供し、この方法は以下を含む。
１）捕捉プローブの集合を有するアレイを提供するステップであって、ここで、捕捉プローブが固体支持体の別個の既知の位置に付着し、捕捉プローブが既知の捕捉ヌクレオチド配列を含み、代替抗体分子の集合が、捕捉ヌクレオチド配列と代替抗体のオリゴヌクレオチドテール内に含まれる認識ヌクレオチド配列との間の相互作用によって捕捉プローブに結合し、代替抗体分子がさらに以下を含む、ステップ：
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、及び
ｂ）第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、
２）リガンド−試験化合物複合体、リガンド−試験細胞複合体又はリガンド−試験ウイルス複合体を形成可能な条件下で目的のリガンドと１つ以上の試験化合物、試験細胞又は試験ウイルスとを接触させるステップ、
３）アレイに結合した少なくとも１つの代替抗体分子と目的のリガンドとの間の結合パートナー複合体を形成可能だが、代替抗体分子とリガンド−試験化合物複合体、リガンド−試験細胞複合体又はリガンド−試験ウイルス複合体との間の結合パートナー複合体を形成可能ではない条件下でステップ２）の目的のリガンドとアレイとを接触させるステップ、
４）任意の結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
５）試験化合物の存在下及び非存在下で形成される結合パートナー複合体のレベルを比較して、試験化合物が目的のリガンドと相互作用する標的化合物であるか否かを決定するステップ。
【０１４４】
別の実施形態では、目的のリガンドに結合する標的化合物を同定するために試験化合物をスクリーニングする方法は、以下のステップを含む。
１）リガンド−試験化合物複合体、リガンド−試験細胞複合体又はリガンド−試験ウイルス複合体を形成可能な条件下で目的の１つ以上のリガンドと試験化合物、試験細胞又は試験ウイルスとを接触させるステップ、
２）少なくとも１つの代替抗体分子と目的のリガンドとの間の結合パートナー複合体を形成可能だが、代替抗体分子とリガンド−試験化合物複合体、リガンド−試験化合物複合体又はリガンド−試験ウイルス複合体との間の結合パートナー複合体を形成可能ではない条件下でステップ（２）の目的のリガンドと代替抗体分子の集合とを接触させるステップであって、代替抗体分子が、以下を含む、ステップ：
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｂ）第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｃ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドテール、
３）固体支持体に付着する捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、捕捉プローブが、固体支持体の別個の既知の位置に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
４）代替抗体の認識ヌクレオチド配列と対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ステップ（２）において形成される任意の結合パートナー複合体とアレイとを接触させるステップ、
５）アレイに結合した任意の結合パートナー複合体を検出して目的のリガンドを検出するステップ、及び
６）試験化合物、試験細胞又は試験ウイルスの存在下及び非存在下で形成される結合パートナー複合体のレベルを比較して、試験化合物、試験細胞又は試験ウイルスが目的のリガンドと相互作用する標的化合物、試験細胞又は試験ウイルスであるか否かを決定するステップ。
【０１４５】
本発明はさらに、目的のリガンドのレベルを調整する標的化合物を同定するために試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、以下のステップを含む。
１）目的のリガンドを含有する第１のサンプルと試験化合物とを接触させるステップ、
２）目的のリガンドを含有する第２のサンプルを提供するステップであって、ここで、第２のサンプルが試験化合物と接触しない、ステップ、
３）第１のサンプル及び第２のサンプルと目的の分子との結合パートナー複合体を形成可能な代替抗体分子とを接触させるステップであって、ここで、代替抗体分子は、以下を含む、ステップ：
ａ）第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを有する特異性鎖、
ｂ）第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む安定化鎖、及び
ｃ）特定の代替抗体分子に固有の認識ヌクレオチド配列を含む１つのオリゴヌクレオチドテール、
４）結合パートナー複合体を形成するステップ、
５）固体支持体に付着する捕捉プローブの集合を含むアレイを提供するステップであって、捕捉プローブが、固体支持体の別個の既知の領域に付着し、少なくとも１つの認識ヌクレオチド配列に対して相補性の捕捉ヌクレオチド配列を含む、ステップ、
６）代替抗体の認識ヌクレオチド配列と、対応する捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で結合パートナー複合体とアレイとを接触させるステップ、
７）アレイに結合した結合パートナー複合体を検出するステップ、及び
８）第１のサンプル中及び第２のサンプル中の目的のリガンドのレベルを比較して、試験化合物が目的のリガンドのレベルを調整する標的化合物であるか否かを決定するステップ。
【０１４６】
本方法において使用される試験化合物は、当分野で公知の、生物学的ライブラリー法；立体的にアドレス可能な平行固体相又は溶液相のライブラリー法；デコンボルーションを必要とする代替ライブラリー法；「１ビーズ−１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー方法；及びアフィニティークロマトグラフィー選別を用いる代替ライブラリー方法を含むコンビナトリアルライブラリー方法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５を参照。
【０１４７】
分子ライブラリを合成するための方法の例は、当分野で見出すことができ、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３中に見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中に存在してもよく（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、又はビーズ中に存在してもよく（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ中に存在してもよく（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌中に存在してもよく（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子中に存在してもよく（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド中に存在してもよく（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）又はファージ中に存在してもよい（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）。
【０１４８】
候補化合物としては、例えば、１）ペプチド、例えば、Ｉｇ−テール化融合ペプチドを含む可溶性ペプチド、及びランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照）及びＤ−及び／又はＬ−体アミノ酸で作成されるコンビナトリアルケミストリーにより誘導された分子ライブラリー；２）ホスホペプチド（例えば、ランダム及び部分的に変性した、直接的なホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照）；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗−イディオタイプ抗体、キメラ抗体、及び一本鎖抗体、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）有機及び無機の小分子（例えば、コンビナトリアルライブラリー及び天然産物ライブラリーから得られる分子）；５）亜鉛アナログ；６）ロイコトリエンＡ4及び誘導体；７）古典的なアミノペプチダーゼインヒビター及びこのようなインヒビターの誘導体、例えば、ベスタチン及びアルファメニン（ａｒｐｈａｍｅｎｉｎｅ）Ａ及びＢ及び誘導体；８）及び人工ペプチド基質及び他の基質、例えば、本明細書中に開示されるもの及びそれらの誘導体が挙げられる。
【０１４９】
この方法は、例えば、特定の薬物標的に結合するか、又はそれらの標的のレベルを調整する候補薬物を同定するために使用されてもよい。本発明の方法はさらに、候補薬物をスクリーニングして、それらが既知の標的以外の分子と相互作用するか否かを決定するために使用されてもよい。このような方法は、薬物標識に高度に選択的であり、薬物治療において望ましくない副作用をほとんど有さない候補薬物を同定するのに有用である。従って、本発明の方法は、特定の分子標識に特異的に結合する新規な候補薬物を同定するために、及び既知薬物又は候補薬物の分子選択性を決定するために有用である。
【０１５０】
代替抗体ライブラリーを作成する方法
本発明の方法は、代替抗体分子の集合を使用する。いくつかの実施形態では、代替抗体の集合はライブラリーを含む。代替抗体分子のライブラリーは、安定な、予め形成された異なる配列を有する代替抗体分子の混合物であり、このライブラリーから、所望のリガンドに結合可能な抗体分子が捕捉される。本明細書中で使用される場合、代替抗体分子のライブラリーは、特異性鎖及び安定化鎖を含む分子の集合を含む。特異性鎖は、第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性領域を有する核酸配列を含み；安定化鎖は第１の一定領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の一定領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む。それに加えて、この集合中の特異性鎖の第１の定常領域のそれぞれは同一であり；この集合中の特異性鎖の第２の定常領域のそれぞれは同一であり；この集合中の特異性鎖の特異性ドメインのそれぞれはランダム化されており；この集合中の安定化鎖のそれぞれは同一である。本明細書中のどこかで記載される多様な構造のいずれかを有する代替抗体分子のライブラリーをアセンブリ可能であることが理解される。
【０１５１】
本明細書中で使用される場合、ライブラリーは、典型的には、少なくとも２から少なくとも１×１０14代替抗体を有する集合を含む。あるいは、選択のために使用される代替抗体ライブラリーは、各結合空洞中に少なくとも１０ヌクレオチド長の連続したランダム化配列（すなわち、特異性ドメイン）を有する、約２〜約１０18、約１０9〜約１０14、約１０9〜約１０24、約２〜１０27以上の代替抗体の混合物を含むことができる。なお他の実施形態では、ライブラリーは、ランダム化又は半ランダム化された特異性ドメインを有する、少なくとも１０、１００、１０００、１００００、１×１０5、又は１×１０6、１×１０7、１×１０10、１×１０14、１×１０18、１×１０22、１×１０25、１×１０27それ以上の代替抗体分子を含む。ライブラリー中に含まれる分子は、１個のクローン又はクローンのプールの集合において（例えば、マルチウェルプレートのウェルにおいて）又は本明細書中のどこかで記載されるようなアレイ上で、混合物中に共に見出すことができる。
【０１５２】
用語「代替抗体の集合」は、１つ以上の選択された特徴を有する、ポリクローナル又はモノクローナル代替抗体の本発明の調製物を指すために使用されてもよい。ポリクローナル代替抗体ライブラリー又は「ポリクローナル抗体の集合」は、標的リガンドに対する結合が高められた、ポリクローナルライブラリーを作成するためにアセンブリされた代替抗体の個々のクローンの集合を含む。代替抗体又は複数の別個の代替抗体クローンが標的性能（例えば、目的のタンパク質のような目的のリガンドに結合する性能）の基準を満たすことがわかったら、それらは、複数のエピトープ認識及び標的リガンドの検出におけるさらに大きな感受性及び／又は抗体結合力を提供するポリクローナル試薬にアセンブリ可能である。ポリクローナル代替抗体の集合が、所望のリガンドに対する以下の捕捉ステップ及び増幅ステップに従って得られる分子のプールを表し得ることが理解される。あるいは、ポリクローナル代替抗体の集合は、所望のリガンド結合特性を有する少なくとも２個の個々のモノクローナル代替抗体クローンを混合することによって形成することができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、代替抗体の集合の１つ以上のメンバーの結合特異性は知られていない。例えば、特定の種類のサンプルに特徴的なリガンドプロフィールを作成するために、未知の結合アフィニティーを有する抗体の集合が使用されてもよい。他の実施形態では、代替抗体の集合中の１つ以上の代替抗体は、既知の結合アフィニティーを有する。「既知の結合特異性」とは、代替抗体が結合するリガンドが同定されていることを意図する。特定の目的のリガンドについて既知の結合特異性を有する代替抗体分子を、本発明の方法及び組成物において使用することができる。目的のリガンドに結合する代替抗体分子は、代替抗体分子のライブラリーをスクリーニングすることによって、及び所望の結合パートナー又はリガンドと相互作用する能力に基づいて集合中の代替抗体分子を捕捉することによって同定可能である。
【０１５４】
代替抗体分子のライブラリーは、特異性鎖及び安定化鎖を含む分子の集合を含む。特異性鎖は、第１の一定領域及び第２の一定領域を両側に有する特異性領域を有する特異性領域を有する核酸配列を含み、および安定化鎖は第１の一定領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の一定領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む。それに加えて、集合中の特異性鎖の第１の一定領域のそれぞれは同一であり、集合中の特異性鎖の第２の一定領域のそれぞれは同一であり、集合中の特異性鎖の特異性領域のそれぞれはランダム化されており、集合中の安定化鎖のそれぞれは同一である。本明細書中のどこかで記載される多様な構造のいずれかを有する代替抗体分子のライブラリーをアセンブリ可能であることが理解される。化合物又は目的のリガンドに結合する代替抗体分子を同定する目的で、代替抗体のライブラリーは、所望の結合パートナー又はリガンドと相互作用する１つ以上の代替抗体を同定及び捕捉可能な一連の反復するインビトロ選別ステップを受ける。各選別ラウンドは、以下にさらに詳細に記載されるように、増加した結合アフィニティー、増加した結合特異性、又は増加した結合アフィニティー及び化合物若しくは目的のリガンドに対する特異性を有する代替抗体分子の集合を製造する。
【０１５５】
Ａ．特異性領域のランダム化された集合の形成
ランダム化された特異性ドメインを有する特異性鎖の集合を製造する方法は当分野で公知である。例えば、特異性ドメインは、ランダム化された核酸配列の合成によって、又はランダムに開裂した細胞核酸の選択によって調製することができる。あるいは、完全又は部分的な配列ランダム化は、特異性ドメイン（又はそれらの部分）の直接化学合成によって、又は特異性ドメイン（又はそれらの部分）が適切な酵素を用いて調製されるテンプレート合成によって、容易に達成可能である。例えば、Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙ  １８３：２８１−３０６；  Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６４：７６３−７９７；Ｐｅｒｓｐｅｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９８）及びＢｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．３．３．１−３．３．２０（これら全ては、本明細書中でその全体を参考として組み込まれる）を参照。あるいは、オリゴヌクレオチドは、天然供給源（ゲノムＤＮＡ又は細胞ＲＮＡ調製物）から開裂し、一定領域間を結合させることによって可能である。
【０１５６】
ライブラリーは、最大数の潜在的な結合配列が確実に同定されるような選択のために現実的であるため、多数の特異性ドメインを含むことができる。例えば、特異性ドメイン中のランダム化された配列が３０ヌクレオチドを含む場合、ライブラリーは４つの天然に生じるデオキシリボヌクレオチドを用いて約１０18（すなわち、４30）の配列順列を含み、改変されたヌクレオチドが含まれる場合、これより大きな数の配列順序を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、偏りは、例えば、合成反応の前駆体ヌクレオシド（又はデオキシヌクレオシド）トリホスフェートのモル比を変更することによって、ランダム化配列に意図的に組み込むことができる。意図的な偏りは、例えば、所与の有機体中の個々の塩基の比率に近づけること、又は二次構造に影響を与えることが所望である場合がある。Ｈｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  ８４：１４３−１５１及びＢａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：５２９−５３６（それらの両方は本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。さらに、特定のステムループ構造を含む偏りを有するランダム化集合を作成する、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１１６１６−１１６２１も参照。従って、本明細書中で使用される場合、特異性ドメインのランダム化された集合は、ドメインの一次配列及び／又は二次配列において所望な偏りを含むように作成されてもよい。他の実施形態では、ライブラリー内の個々のメンバーの特異性領域の長さは、実質的に同じか又は異なっていることができる。反復ライブラリーを使用することができ、ここで、特異性ドメインは、特定の標的リガンドについて最適ループサイズを同定する目的のために、各ライブラリーにおいてサイズが変動するか、又は混合ループサイズのライブラリーを形成するように組み合わせられる。
【０１５８】
上記のように、特異性鎖は種々の機能性部分及び改変を含有してもよい。特異性鎖のランダム化集合を形成する方法は、鎖上に含有される機能性部分に依存して変動する。例えば、１つの実施形態では、機能性部分は改変されたアデノシン残基を含む。この例では、特異性鎖は特異性ドメイン中にのみアデノシン残基を含有するように設計された。増幅の際に使用されるヌクレオチド混合物は、所望の機能性部分（すなわち、疎水性結合特性を増加させる部分）を有するアデノシンを含有する。他の例では、機能性部分は、代替抗体に付着した後に合成反応を行うことができる。
【０１５９】
Ｂ．代替抗体ライブラリーの作成
代替抗体分子ライブラリーの作成は、以下を含む。ａ）特異性鎖の集合を提供するステップであって、ここで、ｉ）特異性鎖が第１の定常領域及び第２の定常領域を両側に有する特異性ドメインを含み、ｉｉ）集合中の特異性鎖の第１の定常領域が同一であり、ｉｖ）集合中の特異性鎖の第２の定常領域が同一である。特異性鎖の集合を安定化鎖と接触させ；ここで、安定化鎖は、特異性鎖の第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び特異性鎖の第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む。第１の安定化ドメインが第１の定常領域と相互作用可能で、第２の安定化ドメインが第２の定常領域と相互作用可能な条件下で、特異性鎖の集合を安定化鎖と接触させる。いくつかの実施形態において、特異性鎖及び安定化鎖は同じ連続する核酸鎖内に含まれ、一方、他の実施形態では、特異性鎖及び安定化鎖は非連続の核酸鎖内に含まれる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、長さが変動するランダム化特異性ドメインを有する代替抗体の集合を製造することが好ましい場合がある。これにより、代替抗体開発の「マルチ−フィット」プロセスにおいて使用されるライブラリーが、任意の所与の標的について使用する最適な代替リガンド結合空洞の大きさを規定することができる。このプロセスにより、代替抗体の結合が、パラトープ（結合部位）の大きさが全てのリガンドについて大きさに関わらず有限である天然の抗体分子の結合特性よりも高められる。「マルチ−フィット」プロセスは、代替抗体−リガンド複合体の適合性、特異性、及びアフィニティーを高める空間特性を有する空洞の大きさを同定する。理想的な結合ループ／空洞は進化及び遺伝子学の指示によって大きさ又は寸法において制限されないため、「マルチ−フィット」プロセスは同定可能である。このように、代替抗体分子はエピトープの大きさ又は天然の抗体分子の性質に対する科学及び研究の依存によって形成されるような決定事項に関する従来のパラダイムに挑戦する。予備的な「マルチ−フィット」リガンド捕捉ラウンドは、種々の大きさ及び構造を有する特異性ドメインを含有する代替抗体の異種集合を用いて行われる。代替ライブラリー調製のための最適な空洞サイズは、制限された数の捕捉及び増幅サイクルの後に最も高いリガンド結合度を示す空洞サイズを有するサブ集合によって示される。
【０１６１】
Ｃ．代替抗体ライブラリーをスクリーニングする方法
代替抗体ライブラリー又は選択された代替抗体の集合がスクリーニングされ、所望のリガンド結合特性を有する代替抗体又は代替抗体の集合を同定又は「捕捉」可能な方法が提供される。この様式において、代替抗体分子は、ランダム特異性領域及び溶液中の分子構造を安定化する安定化領域を含有する前合成された複数鎖の分子のライブラリーから後に続くクローニングのために選択される。
【０１６２】
一般的に、特定の標的／リガンドに結合する代替抗体は、１つ以上のリガンドとライブラリーとを接触させ、リガンドに１つ以上の代替抗体が結合し、リガンドに結合した代替抗体を結合していない代替抗体から分離し、結合したリガンド及び／又は結合した代替抗体を同定することによって、出発の代替抗体ライブラリーから捕捉される。
【０１６３】
例えば、１つの実施形態では、代替抗体分子のライブラリーは、以下の方法によってスクリーニングすることができる。
１）少なくとも１つの目的のリガンドと代替抗体分子のライブラリーとを接触させて、結合パートナー複合体が少なくとも１つの代替抗体分子と目的のリガンドとの間で形成可能な方法；
２）結合していないリガンド及び代替抗体分子の集合の結合していないメンバーをリガンドに結合した代替抗体複合体から分割する方法；及び
３）リガンドに結合した代替抗体複合体の集合の特異性鎖を増幅させて、目的のリガンドに結合する代替抗体分子を同定する方法。
【０１６４】
この方法は、所望の目的のリガンドと相互作用する代替抗体分子の選択又は捕捉を可能にする。それにより、この方法は、代替抗体分子のライブラリーからの選択を使用した後、選択を段階にわけて繰り返し、増幅させて、目的のリガンドについて所望の結合アフィニティー及び／又は選択性を有する代替抗体分子の同定を可能にする。本明細書中で使用される場合、「選択された代替抗体分子の集合」は、リガンド結合及び分割の少なくとも１つのラウンドを受けた分子の集合を意図する。
【０１６５】
別の実施形態では、代替抗体を捕捉する方法は、代替抗体の選択された集合と目的のリガンドとを接触させるステップを含む。この実施形態では、代替抗体抗体は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０以上の選択及び増幅のラウンドによって、目的のリガンドについて増加したアフィニティー、増加した特異性、又は増加したアフィニティー及び増加した特異性について選択された特異性ドメインを含む。次いで、目的のリガンドに結合する代替抗体分子を、以下の方法によって捕捉してもよい。
【０１６６】
１）目的のリガンドと１つ以上の代替抗体分子との間の結合パートナー複合体を形成可能な条件下で目的のリガンドと代替抗体分子の集合とを接触させる方法、
２）結合していない目的のリガンド及び代替抗体分子の集合の結合していないメンバーを結合パートナー複合体から分割する方法、及び
３）結合パートナー複合体中に含まれる代替抗体分子の特異性鎖を増幅させる方法。
いくつかの実施形態では、選択された代替抗体分子の集合は、安定化鎖の第１の安定化ドメインが特異性鎖の第１の定常領域と相互作用可能で、安定化鎖の第２の安定化ドメインが特異性鎖の第２の定常領域と相互作用可能な条件下で、増幅された特異性鎖と安定化鎖とを接触させることによって、増幅された特異性鎖から製造される。
【０１６７】
Ｄ．代替抗体分子と目的のリガンドとを接触させて結合パートナー複合体を形成する方法
本発明の方法のいくつかの実施形態では、代替抗体分子は、代替抗体分子とリガンド又は化合物との間で結合パートナー複合体を形成可能な条件下で、リガンド又は化合物と接触する。種々の条件が結合パートナー複合体を形成可能にするために使用されることを当業者は理解する。いくつかの実施形態では、目的のリガンドに結合する代替抗体分子は、目的のリガンドがインビボで見出されるか、又はインビトロ適用において予想される環境において見出される条件と類似の条件下で選択される。インビボ又はインビトロ結合環境を正確に反映するように調整することのできる条件としては、限定されないが、温度、全イオン強度（浸透圧）、ｐＨ、酵素組成（たとえば、ヌクレアーゼの存在）、金属タンパク質（例えば、ヘモグロビン、セルロプラスム）の存在、及び関連性のない化合物の存在が挙げられる。例えば、Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ２６４：２６８−２７８；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：５８８３−７；Ｂｒｉｄｏｎｎｅｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ９：１−１１；Ｈｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  ９８：２６８８−９２；及びＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２７１：４４６−８（これらは全て本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。例えば、本発明の方法において使用される代替抗体を選択する場合、代替抗体の認識ヌクレオチド配列と捕捉プローブの捕捉ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが起こる条件下で選択することが望ましい場合がある。
【０１６８】
目的のリガンドは、本発明の代替分子と相互作用する任意のリガンドであってもよい。目的のリガンドの例としては、限定されないが、免疫ハプテン、環境汚染物質、及び毒素（例えば、ポリ塩化ビフェニール、ダイオキシン、ポリ芳香族炭化水素）、火薬、アレルゲン、毒、天然又は代替ポリマー、炭水化物、多糖類、ムコ多糖類、糖タンパク質、酵素、抗原、細菌から誘導される分子（例えば、タンパク質、核酸分子、炭水化物、又は代謝物）、ウイルスから誘導される生体分子（例えば、タンパク質、核酸分子、又は炭水化物）、治療薬剤、違法な麻薬及び乱用基質（例えば、麻薬）、ホルモン（例えば、サイロキシン）、ペプチド、ポリペプチド、プリオン、及び核酸が挙げられる。リガンドはさらに、細胞又はその構成要素、例えば、病原体又は１つ以上の細胞オルガネラであることが可能である。更なる目的のリガンドとしては、腫瘍においてレベルが変わる分子（例えば、増殖因子レセプター、増殖因子レセプター、細胞サイクル調整剤、脈管形成因子、及びシグナリング因子）が挙げられる。従って、本発明の代替抗体分子は、目的のリガンドを検出するために作成することができる。
【０１６９】
目的のリガンド及び代替抗体を接触させるための適切な条件は、反応化学に基づいて実験的に決定することができる。概して、適切な条件は、１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、８０％〜９０％、又は９０％〜１００％の抗体分子の集合がリガンドと相互作用するのに十分である。
【０１７０】
Ｅ．結合していないリガンド及び結合していない代替抗体分子から結合パートナー複合体を分割する方法
「分割」は、標的リガンド（目的のリガンド）に結合した代替抗体（リガンドに結合した代替抗体複合体又は結合パートナー複合体と称される）が、標的に結合していない代替抗体又は結合していないリガンドから分割される任意のプロセスを意図する。分割により、標的リガンドに対する相対アフィニティーに基づく少なくとも２つのプール内の代替抗体を分割することができる。分割するための方法は当分野で公知である。例えば、目的のリガンドに結合した代替抗体は表面に固定することができるか、又は結合パートナー複合体を保持するが、結合していない代替抗体分子又は結合していないリガンドを保持しない分子ふるいを介してろ過してもよい。リガンドに結合した代替抗体を特異的に保持するカラムを分割のために使用することができる。液−液分割も、ろ過ゲルリターデイション、及び密度勾配遠心分離と同様に使用することができる。分割方法の選択は、標的／リガンドの性質及びリガンドに結合した代替抗体の性質に依存し、当業者に公知の原理及び性質に従ってなすことができる。
【０１７１】
１つの実施形態では、分割は、結合していないリガンド、結合していない代替抗体分子の集合、及びリガンドに結合した代替抗体複合体の集合を含む混合物をろ過システムを介してろ過するステップを含み、ここで、ろ過システムは、濃縮物中にリガンドに結合した代替抗体複合体を保持し、結合していない代替抗体はろ液内に通過させる。このようなろ過システムは当分野で公知である。例えば、サイズ、電荷、疎水性、キレート化、又は包接に基づいて分割するろ過膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）、Ｐａｌｌ  Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標））を使用してもよい。
【０１７２】
サイズ排除ろ過において使用される孔径は、目的のリガンドの大きさ及び代替抗体の代替抗体分子の集合の大きさによって決定される。例えば、７〜１０ミクロンの直径を有する細胞リガンドは、７ミクロンを排除する膜によって保持される。このような膜を使用する場合、複合体化していない場合に１２０ヌクレオチドのビオリゴヌクレオチド構造を有する代替抗体分子は、膜を通過するため、容易に排除される。リガンドに結合したものは、保持液中に捕捉され、後に続く選択された集合のアセンブリのために使用される。ＢＳＡ−ハプテン接合体に対する代替抗体の調製は、代替抗体に接合した複合体を排除する孔を使用しなければならない。５０，０００又は１００，０００ダルトンを排除する膜は、遊離の代替抗体から接合体に結合する場合、この代替抗体を効果的に分画化する。少量の、例えば酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼに対して調製される代替抗体は、複合体化していない代替抗体はフィルターを浸透しつつ、約５０，０００ダルトン以上の分子を排除する膜を必要とする。標的リガンドは、さらに大きなキャリア分子に化学的に接合するか、又はそれらの大きさ又はサイズ排除特性を高めるために重合体化することができる。
【０１７３】
標的リガンドに結合した代替抗体を結合していない代替抗体及び結合していないリガンドから分割するために使用されてもよい代替のプロトコルは当分野で公知である。例えば、溶液中に存在するリガンドに結合した代替抗体分子及び遊離の代替抗体分子の分割は、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除／分子ふるいろ過、アフィニティークロマトグラフィー、固相クロマトグラフィー（Ｃ18、ヒドロキシアパタイト、キレート化、吸着した金属）、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、可溶性改変（例えば、硫酸アンモニウム又はメタノール沈殿）、免疫沈降、タンパク質変性、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、密度勾配遠心分離を用いて達成することができる。リガンドに結合した代替抗体分子及び結合していない代替抗体分子は、ＨＰＬＣ及び蛍光活性化細胞選別のような分析方法によって分割することができる。
【０１７４】
固体相に対する選択的固定化を用いるアフィニティークロマトグラフィー手順は、標的リガンドに結合した代替抗体を結合していない代替抗体分子から分割するために使用することができる。このような方法は、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ガラス、ナイロン、セルロースアセテート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、又はシリコンチップで構成される吸収剤に対する標的リガンドの固定化を含む。
【０１７５】
代替抗体の特異性鎖を増幅させる方法を以下に記載するが、標的リガンドに結合した代替抗体がＰＣＲ増幅に使用され、アフィニティーマトリックスからの分割の有無に関わらず一体的な特異性領域を有する１つ以上のオリゴヌクレオチド鎖を生成することが理解される。
【０１７６】
溶液相及び固相分離の組み合わせは、代替抗体結合によって生じる物理化学的効果に基づいて単離される、微小球に接合したリガンドに対する代替抗体の結合を含む。別個の微小球の集合は、異なる標的リガンド又は同じリガンドの異なる位置に接合する発色団、蛍光体、磁気でそれぞれ標識化される。それぞれの微小球の集合に結合した代替抗体分子は、微小球リポーター分子の特性に基づいて単離され、異なるリガンドに対する複数の代替集合の同時作成を可能にする。
【０１７７】
Ｆ．特異性鎖を増幅する方法
代替抗体分子の特異性鎖を増幅する方法が提供される。「増幅」とは、分子又は分子の種類の複製の量又は数を増加させる、分子の１つ以上のステップを意図する。ＲＮＡ分子は、一連の３つの反応によって増幅することができる。選択されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作成して、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて各ｃＤＮＡのコピー数を増加させるステップ、及びｃＤＮＡコピーを転写して、選択されたＲＮＡと同じ配列を有するＲＮＡ分子を得るステップ。当業者によって認識されるように、適切な場合、直接的なＤＮＡ複製、直接的なＲＮＡ増幅等を含む、当分野で公知の任意の反応又は反応の組み合わせを使用することができる。増幅方法は、最初の混合物中の異なる構成配列の比率を本質的に表す、増幅された混合物の比率を生じるべきである。代替抗体分子中の特異性領域のいずれか片側上の一定領域が特異性領域の構造を安定化しながら、これらの領域はさらに、代替抗体の増幅を容易にするために使用することができる。
【０１７８】
この様式において、特異性鎖の集合は生成される。従って、増幅された特異性鎖が適切な安定化鎖と接触する場合、所望のリガンド結合アフィニティー及び／又は特異性を有する代替抗体の集合を形成することができる。リガンド相互作用の特異性を選択的に高める方法及び集合の結合アフィニティーを高めるための方法は以下に提供される。
【０１７９】
所望の代替抗体又は一セットの代替抗体が同定されると、１つ以上のモノクローナル代替抗体クローンを同定し、モノクローナル又はアセンブリされたポリクローナル代替抗体試薬のいずれかを大量に作成することがしばしば望ましい。モノクローナル代替物の捕捉は、少なくとも１つの特異性鎖を増幅された特異性鎖からクローニングするステップを含む。クローン化された特異性鎖は、通常の方法を用いた後、第１の安定化ドメインが第１の一定領域と相互作用可能で、第２の安定化ドメインが第２の一定領域と相互作用可能な条件下で、適切な安定化鎖と接触させ、モノクローナル代替抗体の集合を作成することによって増幅することができる。
【０１８０】
核酸配列（例えば、特異性鎖を有するもの）を増幅する方法は知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸を増幅するための例示的な方法である。ＰＣＲ方法は、例えば、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６；Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１０７６−１０７８；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：９４３６−９４４０；及び米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号（それらのそれぞれの内容は本明細書中にその全体が組み込まれる）に記載される。
【０１８１】
ＰＣＲ増幅は、一本鎖ＤＮＡの３’末端及び５’末端に対して相補性の特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、所望の一本鎖ＤＮＡ（又はＲＮＡのｃＤＮＡコピー）の複製、ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長、及びＤＮＡ変性の繰り返しサイクルを含む。１つのプライマーから伸長によって作成される産物は、他のプライマーからの伸長のためのテンプレートとして役立つ。ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０１０５０に記載された関連する増幅方法は、二本鎖中間体を得るために、増幅される配列の上流にプロモーター配列の存在又は導入を必要とする。次いで、中間体を含有する二本鎖プロモーターの複数のＲＮＡコピーがＲＮＡポリメラーゼを用いて作成される。得られたＲＮＡコピーを逆転写を用いて処理し、ＲＮＡポリメラーゼを用いた増幅の別のラウンドに供され得る中間体を含有する更なる二本鎖プロモーターを作成する。増幅の代替の方法としては、とりわけ、選択されたＤＮＡ又は選択されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーの適切なベクターへのクローニング、及びベクター及びクローン化ＤＮＡが複製され増幅される宿主有機体へのベクターの組み込みが挙げられる（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４）。概して、選択された核酸配列の信頼できる有効な増幅を可能にする任意の手段を使用することができる。増幅後の配列の比率は、増幅前の混合物における配列の相対比率を少なくとも大雑把には反映していることが必要である。また、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：  ４１１０（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照。この方法は、場合により、適切な核酸生成ステップを含むことができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、代替抗体分子の安定化鎖は、効果的に増幅されないように改変される。このような改変は、抗体の特定性鎖の優先的増幅を可能にする。
【０１８３】
他の実施形態では、安定化鎖及び特異性鎖は、適切なプライマーと組み合わせて、使用可能な同一性を有さない領域を含有し、安定化鎖の増幅を防ぐ。この実施胃形態の非限定的な例は、図７及び実験セクションの実施例４に表される。簡単に言うと、この非限定的な例において、安定化鎖及び特異性鎖は、特異性ドメインの５’に位置する約２、３、４、５、６、８又はそれ以上のヌクレオチドにおいて同一性を喪失している。図７の網掛け四角を参照のこと。特異性鎖のポジティブ鎖を増幅するために使用されるプライマーは、特異性鎖の配列に対して相補性を有する。しかし、ミスマッチ設計に起因して、このプライマーは安定化鎖の配列に対して３’末端で同一性を喪失している。この同一性の喪失により、全長ネガティブ安定化鎖の増幅を防ぐ。従って、この方法は、特異性鎖の優先的増幅を可能にする。
【０１８４】
代替抗体が安定化鎖及び核酸配列を含む特異性鎖を含む場合、安定化配列、一定領域、特異性配列及び／又はスペーサー配列の直鎖アレイを含有するそれぞれの鎖（すなわち、並列した代替抗体鎖）は、最初にＤＮＡ合成機によって調製される。１つの実施形態では、特異的で、高いアフィニティーの代替抗体試薬を捕捉及び増幅させるための選択プロセスは、ＰＣＲによって配列される特異性領域を含有する鎖のみを優先的に増幅させる。上記にさらに詳細に述べられるように、代替分子は、これらの鎖と、定常領域及び安定化ドメインの相互作用の際に適切な整列を確保する適切な安定化鎖とを混合することによって、アセンブリされる。並列した鎖を混合し、溶液を加熱すると、温度が低下するにつれてハイブリダイズする。他の実施形態では、代替抗体は加熱することなく形成されてもよい。
【０１８５】
Ｇ．選択された代替抗体分子のステージング
目的のリガンドに結合する代替抗体分子は、選択された標的分子に高いアフィニティーで選択的に結合する代替抗体要素の反復選択のプロセスによって選択されてもよい。標的リガンドに結合する代替抗体分子を捕捉及び増幅するためのこのプロセスは、本明細書中で「ステージング」と称される。ステージングプロセスは、所望のアフィニティー及び特異性を有する代替抗体の同定を可能にする種々の様式で改変可能である。例えば、「特異性向上」を可能にし、捕捉された集合から関連性のないか又は所望でない代替抗体分子の数を完全に無くすか減らすことができるステップを行うことができる。それに加えて、「アフィニティー向上」を行うことができ、それによって、標的リガンドに対して高アフィニティーの代替抗体分子を選択することができる。ステージングプロセスは、標的分子／リガンドに対して高アフィニティー及び特異性を有する代替抗体の迅速単離及び増幅において特に有用である。例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：４４１０を参照。
【０１８６】
特異的な結合は、ケースバイケースの基本に基づいて定義される用語である。所与の代替抗体分子と所与の標的との間の所与の相互作用の内容において、代替抗体と標的との優先的な結合相互作用が代替抗体と関連性のない及び／又は所望でない標的との間に観察される相互作用よりもかなり大きい場合に、高められた結合特異性を生じる。本明細書中で記載される代替抗体分子は、「ステージング」プロセスを用いて特定の分子を捕捉し、単離し、増幅するのに必要とされるのと同様の選択性で選択することができる。
【０１８７】
従って、本発明はさらに、以下を含む代替抗体の結合特異性を高める方法を提供する。
ａ）非特異的な部分に結合した代替抗体複合体の集合を形成可能な条件下で、目的のリガンドと結合可能な代替抗体分子の集合と非特異的な部分とを接触させるステップであって、ここで、代替抗体の集合の代替抗体分子は特異性鎖及び安定化鎖を含み、特異性鎖は第１の一定領域及び第２の一定領域を両側に有する核酸配列を含み；安定化鎖は第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む、ステップ；
ｂ）非特異的部分及び非特異的部分に結合した代替抗体複合体を結合していない代替抗体分子から分割するステップ；及び
ｃ）結合していない代替抗体分子の集合の特異性鎖を増幅させるステップ。
【０１８８】
更なる実施形態では、結合アフィニティーを向上させる方法はさらに、第１の安定化ドメインが第１の一定領域と相互作用可能で、第２の安定化ドメインが第２の一定領域と相互作用可能な条件下で上述のステップｃ）の特異性鎖の集合と安定化鎖とを接触させるステップを含む。
【０１８９】
更なる実施形態では、代替抗体の集合は、代替抗体のライブラリー及び／又は選択された抗体の集合を含む。
【０１９０】
この実施形態では、代替抗体の集合の結合特異性は、非特異的部分に結合した代替抗体複合体の形成を可能にする条件下で、代替抗体の集合と非特異的部分とを接触することによって高められる。この様式で、標的リガンド及び種々の非特異的部分の両方と相互作用する代替抗体は、所望のリガンドに対してさらに高いレベルの特性を有する代替抗体の集合から分割することができる。
【０１９１】
「非特異的部分」とは、所望の標的リガンドではない、任意の分子、細胞、有機体、ウイルス、化学化合物、ヌクレオチド、又はポリペプチドを意図する。作成される所望の代替抗体の集合に依存して、当業者は使用される最も適切な非特異的部分を理解する。例えば、所望の標的がタンパク質Ｙに対して９５％の配列同一性を有するタンパク質Ｘである場合、タンパク質Ｘに対する代替抗体の集合の結合特異性は、非特異的部分としてタンパク質Ｙを用いることによって高められる。この様式では、タンパク質Ｘに対して高められた相互作用を有する代替抗体の集合が作成される。例えば、Ｇｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：５５０９−５５１６及びＪｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９０：１１２２７−１１２３１を参照。
【０１９２】
結合アフィニティーは、代替抗体とリガンドとの間の結合相互作用の強度を記載する用語である。結合アフィニティーの向上は、標的リガンドと代替抗体との間の結合相互作用を増大させる。代替抗体及び標的リガンドの相互作用の結合アフィニティーは、代替抗体が達成可能な検出の感受性に直接的に相関する。実際的な適用のもとで結合アフィニティーを評価する目的で、結合反応の条件は、意図される使用の条件に匹敵するものでなければならない。最も正確な比較のために、溶液中で代替抗体と標的リガンドとの間の相互作用を反映して、意図される適用の条件下で測定は行われる。
【０１９３】
従って、本発明は、以下を含む、代替抗体の結合アフィニティーを向上させる方法を提供する。
ａ）リガンドに結合した代替抗体複合体の集合を形成可能なストリンジェントな条件下でリガンドと代替抗体分子の集合とを接触させるステップであって、
ここで、代替抗体の集合の代替抗体分子は特異性鎖及び安定化鎖を含み、
特異性鎖は第１の一定領域及び第２の一定領域を両端に有する特異性領域を有する核酸配列を含み、及び
安定化鎖は第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメイン及び第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む、ステップ、
ｂ）リガンド、代替抗体分子の集合を、リガンドに結合した代替抗体複合体の集合から分割するステップ、及び
ｃ）リガンドに結合した代替抗体複合体の集合の特異性鎖を増幅させるステップ。
【０１９４】
更なる実施形態では、結合アフィニティーを向上させる方法は、第１の安定化ドメインが第１の一定領域と相互作用可能で、第２の安定化ドメインが第２の一定領域と相互作用可能な条件下で、上述のステップ（ｃ）の特異性鎖の集合と安定化鎖とを接触させるステップをさらに含む。
【０１９５】
更なる実施形態では、代替抗体の集合は、代替抗体のライブラリー及び／又は選択された代替抗体の集合を含む。
【０１９６】
この実施形態では、リガンドに結合した代替抗体複合体の集合を形成可能なストリンジェントな条件下で所望のリガンドと代替抗体分子の集合とを接触させるステップは、所望のリガンドに対する増加した結合アフィニティーを有する代替抗体の選択を可能にする。「ストリンジェントな条件」とは、集合中で所望のリガンドと代替抗体との相互作用を強制する任意の条件を意図する。このような条件は、目的のリガンド及び代替抗体とリガンドが相互作用する好ましい条件に依存して変動する。選択されたストリンジェントな条件は代替抗体構造を形成するために続けることが理解される。このようなストリンジェントな条件の例としては、浸透圧、ｐＨ、溶媒（有機又は無機）、温度、界面活性剤、又はそれらの任意の組み合わせの変化が挙げられる。ストリンジェントな条件を作り出す更なる成分としては、疎水性、水素結合、静電力、及びファンデルワールス相互作用をもたらす成分が挙げられる。例えば、１０％メタノール又はエタノールは水素結合をもたらし、水溶性である。
【０１９７】
条件の過酷さはさらに、代替抗体対リガンドの比率によって操作することができる。条件の過酷さの増加は、代替抗体の増加又は標的リガンドの減少によって起こり得る。例えば、Ｉｒｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：７３９−７６１を参照。結合条件の過酷さを増加させる更なる代替法としては、塩濃度、結合平衡時間、結合バッファーの希釈及び洗浄の量及び組成の改変が挙げられる。条件の過酷さは、全集合の１％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９９％まで結合した抗体の割合を減らすのに十分である。
【０１９８】
なお他の実施形態では、所望なリガンド結合特異性を有するモノクローナル代替抗体の同定及び単離の後に、当業者は、特異性領域を突然変異誘発させ、強固に結合する突然変異株についてスクリーニングすることによって所望の目的のために、さらに分子のアフィニティーを向上させる。例えば、Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：１３７２０−１３７２５を参照。なお他の実施形態では、所望なリガンド結合特異性を有するモノクローナル代替抗体の同定及び単離の後に、当業者は、特異性領域を突然変異誘発させ、目的胃のリガンドに対して最も高いアフィニティーを有する突然変異株についてスクリーニングすることによって所望の目的のために、さらに分子のアフィニティーを向上させる。例えば、Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ  ９７：１３７２０−１３７２５を参照。
〔実施例１〕
【０１９９】
リガンドに結合した代替抗体試薬を作成するためのプロセス
市販の（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）あらかじめ規定された配列の２つのオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズすることによって、「代替抗体」（ＳＡｂ）分子の初期のライブラリーをアセンブリした。「（５’）ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＣＧＡ−ＣＧＧ−ＣＣＡ−ＧＴ−ランダム４０ｎｔ−ＴＣＣ−ＴＧＴ−ＧＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＧ−ＴＴＡ−ＴＣＣ（３’）」の配列（配列番号５）を有する７８ｎｔオリゴヌクレオチド鎖２μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）及び「（５’）ビオチン−ＧＧＴ−ＴＡＡ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＣＡＣ−ＡＣＡ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−ＣＴＧ−ＧＣＣ−ＧＴＣ−ＧＴＴＴＴＡ−Ｃ（３’）」の配列（配列番号６）を有する４０ｎｔオリゴヌクレオチド鎖２μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）を、改変されたＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０、ＭｇＳＯ4含有）中で混合した。この溶液をサーマルサイクラーを用いて９６℃に加熱し、溶液を室温に冷却するにつれてハイブリダイズさせた。配列番号５は特異性鎖を含む。第１の一定領域は下線部分であり、第２の一定領域は二重下線部分である。配列番号６は安定化領域鎖を表す。第１の安定化ドメインは一本の下線で示される。第２の安定化ドメインは二重下線で示される。
【０２００】
１．２×１０14の代替抗体分子のライブラリーを、改変されたＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０、１０％メタノール含有）中に懸濁したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ポリ塩素化ビフェニール（ＰＣＢ）接合体２０ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）に添加した。この溶液を室温／２５℃でインキュベートし、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−ＰＣＲろ過デバイス（ミリポア）に移した。このろ過デバイスは、ＢＳＡ−ＰＣＢ接合体に結合したＳＡｂを保持し、結合していないＳＡｂ分子を保持しないことをあらかじめ決定しておいた。インキュベーション溶液を１０００ｇ／１０分／室温で遠心分離することによって、接合体に結合したＳＡｂを結合していない分子から分割した。濃縮物中のＢＳＡ−ＰＣＢに結合したＳＡｂを改変されたＴｒｉｓバッファー２００ｍｌで３回洗浄した。
【０２０１】
洗浄した濃縮物中のＳＡｂをフィルターから吸引し（約４０μｌ）、ＰＣＲエッペンドルフチューブに移した。回収したＳＡｂ−ＢＳＡ−ＰＣＢ複合体を使用して、あらかじめ接合体から解離せずに７８ｎｔ鎖を増幅させた。ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、バッファー、及び出発のポジティブ鎖に特異的で、配列（５’）ビオチン−ＧＧＡ−ＴＡＡ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＣＡＣ−ＡＣＡ−ＧＧＡ（３’）（配列番号７）を有するＭ１３Ｒ４８プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応において使用して、７８ｎｔネガティブ鎖の増幅された集合（すなわち、特異性鎖）を最初に作成した。サーマルサイクラーをプログラムし、９６℃、４８℃、及び７２℃の温度で３０〜３００秒の４０サイクルの増幅を行った。
【０２０２】
ポジティブな７８ｎｔ鎖の増幅された集合を、不斉ＰＣＲを用いて、増幅した７８ｎｔネガティブ鎖物質から作成した。増幅した７８ｎｔネガティブ鎖の約５％をＤＩ  Ｈ2Ｏ  ４０ｍｌと共にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＰＣＲチューブに添加した。ポリメラーゼ、ＮＴＰ、バッファー、及びネガティブ鎖に特異的で、配列（５’）ビオチン−ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＣＧＡ−ＣＧＧ−ＣＣＡ−ＧＴ（３’）（配列番号８）を有するＭ１３−２０プライマーを添加し、ＰＣＲ増幅のために使用した。以前に引用された温度サイクルを再び使用した。増幅した集合の４％未満が７８ｎｔネガティブ鎖又は４０ｎｔポジティブ鎖のいずれかを含有することがわかった。ポリメラーゼ、ＮＴＰ、プライマー及び４０ｎｔオリゴマーを除去するための精製を市販の製品（キアゲン  ＰＣＲ精製キット）を用いて行った。
【０２０３】
１２０ｎｔの二本鎖ＳＡｂの再アセンブリを、捕捉し、増幅し、精製した７８ｎｔ鎖（すなわち、特異性鎖）と４０ｎｔ出発オリゴヌクレオチド（すなわち、安定化鎖）とをハイブリダイズすることによって行った。この再アセンブリプロセスは、リガンドに結合したＳＡｂ分子の豊富なライブラリーを作成する。豊富なＳＡｂライブラリーは、後に続く選択の各ラウンドを始める前にアセンブリされる。これらの後に続くサイクルは、標的リガンドに対するＳＡｂ集合の平均特異性及びアフィニティーを向上させるポジティブ選択プロセスを使用する。
【０２０４】
約８０％（４０μｌ）の精製した７８ｎｔ物質を、改変されたＴｒｉｓバッファー及び４０ｎｔ鎖５μｌ（１０ｐｍｏｌｅ／ｕｌ）を含有する２００μｌのエッペンドルフチューブに添加した。脱イオン水（３５ｍｌ）を添加し、混合物を９６℃／５分、６５℃／５分、６０℃／５分、及び５６℃／５分加熱した。次いで、室温に到達するまで、この溶液を１℃／分の速度で３０分間冷却した。溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ろ過デバイス（５’／１０００ｇ／ＲＴ）を介してろ過し、ろ液を、後に続く選択サイクルにおいて使用するために集めた。
【０２０５】
それぞれ７８ｎｔオリゴヌクレオチド鎖の増幅、精製、及びＳＡｂアセンブリを含む数回の捕捉及び増幅選択サイクル（すなわち、２〜６回）使用して、ＢＳＡ−ＰＣＢに結合したＳＡｂ分子の豊富なライブラリーを作成した。捕捉及び増幅サイクルを完結させた後、豊富なＳＡｂライブラリーを行い、標的リガンドに特異的なＳＡｂ分子を捕捉し、増幅するために処理した。
【０２０６】
特異性選択のサイクルを使用して、キャリアタンパク質、誘導体化学物質、又は交差反応化合物に結合する集合中のＳＡｂ分子を排除した。標的リガンドに特異的に結合する分子の豊富なＳＡｂ集合を作成した。新生物形成組織上の固有の決定因子に特異的に結合可能なＳＡｂ集合を作成する場合、特異性選択は、正常な細胞構成要素に結合するＳＡｂ分子を排除する。
【０２０７】
ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）ろ過デバイスを用いて結合していないＳＡｂから結合したＳＡｂを分割するプロセスを、以前に説明したように私用した。捕捉及び増幅段階中に作成した豊富なＳＡｂライブラリーを接合していないＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（２０μｇ／ｍｌ）の溶液で６０分／室温でインキュベートした。次いで、この溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ろ過デバイス（５’／１０００ｇ／ＲＴ）を介してろ過した。フィルターはＢＳＡに結合したＡＳｂを保持する。ろ液中のＳＡｂを回収し、７８ｎｔ鎖を増幅させるのに使用し、アセンブリし、新規なＳＡｂライブラリーを精製した。ＳＡｂを標的化されていないＰＣＢ同族体（例えば、ＢＺ５４、ＢＺ１８等）、ダイオキシン、ポリ芳香族炭化水素（例えば、ナフタレン、フェナントレン）及び他の関連性のないハプテンを含有する溶液でインキュベートした後、標的ＰＣＢ（ＢＺ１０１）−ＢＳＡ接合体とともにインキュベートした。ＳＡｂ、関連性のないリガンド、及び標的接合体を含有するインキュベートした溶液をＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）ろ過デバイスを介してろ過した。溶液中の交差反応するリガンドに対して結合する非特異的なＳＡｂ分子は、フィルターの孔によって排除されず、ろ液内にとおり、廃棄される。ＰＣＢ−ＢＳＡ接合体に結合した分子は、潜在的に交差反応する化合物にさらされた後、膜に保持され、新規なＳＡｂ集合へと加工される。これらの分子は７８ｎｔ鎖を増幅させるために使用され、ＳＡｂ分子の特異的な集合をアセンブリし、次いで、最も高い結合アフィニティー分子を捕捉するための感受性選択のサイクルにおいて使用される。
【０２０８】
感受性選択のためのサイクルは、特異的な、高アフィニティーのポリクローナルＳＡｂライブラリーを調製する目的のために、特定の結合分子のライブラリーから最も高いアフィニティーを有するＳＡｂ分子を捕捉するために使用される。特異性選択のサイクルの後に作成されたＳＡｂライブラリーを、標的リガンド及び薬剤の濃度を減らし、疎水性、静電力、水素結合、ファンデルワールス結合相互作用をもたらす条件で加工する。このような薬剤及び条件としては、溶媒（例えば、メタノール）、ｐＨ改変、カオトロピック薬剤（例えば、グアニジン塩酸塩）、高い塩濃度、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ）が挙げられ、これらは単独又は組み合わせて使用することができる。このプロセスは、リガンド結合及び最も高い結合アフィニティーを有する分子の選択をもたらす。選択されたこれらの分子を７８ｎｔ鎖を増幅させるテンプレートとして使用し、豊富なポリクローナル集合をアセンブリする。
【０２０９】
感受性選択は、「捕捉及び増幅」及び「特異性選択」を完結させた後に得られる豊富なＳＡｂ集合を用いて行われる。リガンドに対するそれらの結合に基づくＳＡｂの捕捉、又は脱離の溶液相プロセス、及び分子ふるいろ過デバイスを用いる捕捉を再び使用した。ＳＡｂを接合していないＰＣＢ分子と共にインキュベートした後、ＢＳＡ−ＰＣＢ（ＢＺ１０１）接合体を６０分／室温で添加した。インキュベーション溶液をＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）ろ過デバイスに入れ、１０００ｇ／１０分／室温で遠心分離した。接合していないＰＣＢ分子に結合したＳＡｂはろ液に入り、これらを集めて、７８ｎｔ鎖を増幅させ、結合していないリガンドに結合する分子の豊富な集合をアセンブリするために使用した。豊富な集合をＰＣＢ−ＢＳＡ接合体と共に低濃度（０．４μｇ／ｍｌ）でインキュベートし、接合体に結合したＳＡｂをＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）デバイス（１０００ｇ／１０分／ＲＴ）を用いたろ過の後に回収し、改変したＴｒｉｓバッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用いて３回洗浄した。濃縮物中の回収したＳＡｂを増幅させて７８ｎｔ鎖を作成し、ＳＡｂ分子にアセンブリした。メタノール（１０％ｖ／ｖ）及びＴｗｅｅｎ２０（０．０５％）の存在下でＰＣＢ−ＢＳＡ（０．４％）接合体と共にＳＡｂライブラリーをインキュベートすることによってこのプロセスを繰り返した。接合体に結合したＳＡｂを濃縮物中で回収し、７８ｎｔ鎖を増幅させるために使用した。ポリクローナルＳＡｂ集合を上に記載されるようにアセンブリした。ポリクローナルＳＡｂ集合は、以下の手順を用いて別個のモノクローナルＳＡｂ試薬に分画化することができる。
〔実施例２〕
【０２１０】
モノクローナルＳＡｂ調製
ポリクローナルＳＡｂ集合をＰＣＲによって増幅し、特定のプライマーを用いて二本鎖７８ｎｔ及び二本鎖４０ｎｔ分子を作成する。増幅アーティファクト及びＰＣＲエラーを高い厳密性を有するポリメラーゼ及び少ない回数のＰＣＲサイクル（２５サイクル）を用いて最小化する。ＰＣＲ産物を３1/2の高解像度のアガロースゲル中で電気泳動し、７８ヌクレオチドフラグメントを回収し、キアゲン  ゲル抽出キットによって精製する。精製した７８ｎｔ二本鎖ＤＮＡをＰＣＲクローニングベクター（例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ）内にクローン化し、ｄｓ７８ｎｔフラグメントの個々のコピーを含有するプラスミドを作成する。Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（例えば、ＪＭ１０９株、プロメガ）をエレクトロポレーションによりプラスミドを用いて形質転換する。
【０２１１】
形質転換された細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ／寒天プレートで培養する。７８ｎｔフラグメントを含有する細菌は白色コロニーを形成し、７８ｎｔフラグメントを含有しない細菌は１３ｇａｌを発現し、青色のコロニーを形成する。個々の白色コロニーをマイクロウェル中の液体増殖培地（例えば、ＳＯＣ培地、プロメガ）に移し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２１２】
各ウェルからＰＣＲマイクロプレートにアリコートを移した後、ウェルの成分を増幅させた。ＰＣＲ産物を精製することは、適切なプライマー及びＰＣＲ条件を用いることによって必要ではなくなる。４０ｎｔフラグメントを添加し、サーマルサイクラー中で規定された加熱及び冷却サイクルを用いてハイブリダイゼーションを行う、以前に引用したプロセスを用いて、ＳＡｂ分子をマイクロプレート中でアセンブリする。
〔実施例３〕
【０２１３】
分析及びデータベース構築
モノクローナルＳＡｂクローンの反応性パネルプロファイリングを使用して、市販の適用のための試薬の選択において使用される結合特性を比較する。分析される特性は、以下を含むことができる。
１）標的リガンドの認識、
２）相対的なタイター及びアフィニティー、
３）感受性、
４）特異性、
５）マトリックスの影響、
６）温度の影響、
７）安定性、及び
８）商業的な優位性の他の変数（例えば、溶解、エフェクター機能）。
【０２１４】
標準的な試験プロトコルを使用し、各クローンから集めたデータを関係データベースに入れた。
【０２１５】
特性決定アッセイを分析のための特定の特性決定に対してアセンブリされたモノクローナルＳＡｂ試薬のアリコートに移す。アフィニティー及び滴定アッセイを相対アフィニティー（Ｋａ）及び各試薬の濃度と比較する。感受性アッセイを低濃度の標的リガンドを検出する能力と比較し、最少検出量（Ｌｅａｓｔ  Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｏｓｅ）の概算値を与える。特異性アッセイを関係性のない／所望でないリガンドのＳＡｂ認識と比較する。マトリックス干渉試験を、ＳＡｂの結合に関して予想されるマトリックス構成の影響について評価する。温度効果を結合に対する関係について評価する。安定性について、最も安定なクローンを同定し、さらに評価が必要となる問題を同定する。予想される適用に対して関連する他の特性をさらに、既知の手段を用いて評価することができる。
【０２１６】
ＳＡｂ結合のための標的リガンドとしては、原核細胞（例えば、細菌）、ウイルス、真核細胞（例えば、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、感覚細胞、分泌細胞、悪性腫瘍細胞、赤血球細胞及びリンパ球細胞、幹細胞、原生動物、菌類）、タンパク質、プリオン、核酸、及び接合したろ過可能な化合物が挙げられる。ＳＡｂ結合のための標的リガンドは、フィルター膜／分子ふるいによって保持可能な十分な大きさの任意のリガンドであることが可能である。
〔実施例４〕
【０２１７】
非増幅可能な安定化鎖を用いるＰＣＢ同族体ＢＺ１０１に対する代替抗体８７／４８の調製
自己集合性のオリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を用いて代替抗体（ＳＡｂ）分子を作成し、隣接する一定ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔランダム特異性ドメイン配列を有する二量体分子を形成する。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合体／遊離体分割、及び再アセンブリ／再アニーリングのサイクルを使用して、ＢＳＡ−アジポイル−ＢＺ１０１接合体に結合する分子及びＢＺ１０１（２，２’，４，５，５’−ペンタクロロビフェニール）ハプテンに接合しない分子を含む豊富なＳＡｂ集合を作成する。
【０２１８】
方法
Ａ．代替抗体のライブラリーの形成：
ランダム４０ｎｔ配列、及びＦＩＴＣ（Ｆ）及びビオチニル化（Ｂ）プライマーを含有する８７ｎｔ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＩＤＴから購入した。８７ｎｔ  ｓｓＤＮＡを、両端に可変領域を有する一定配列領域中のヌクレオチドの数を反映して、＃２２−４０−２５（８７ｇ２）と命名した。代替抗体分子の特異性鎖及び８７マーの配列を以下に示す（上側の鎖；配列番号９）、一方、４８ｎｔオリゴヌクレオチド（安定化鎖）を以下に示す（下側の鎖；配列番号１０）。
【０２１９】
可変配列のいずれかの側の２つの一定領域ヌクレオチド配列は、並列した４８ｎｔ安定化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して相補性を有している。安定化鎖は、ＦＩＴＣ−標識された５’−であり、オリゴヌクレオチド（＃Ｆ２１−１０−１７）（太字の塩基は８７ｎｔ特異性鎖上の塩基に対して相補性でない）と称される。
【０２２０】
オリゴを０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）になるまでＤＩ水中で再構築し、２ｍｌのスクリュートップバイアル中でストック溶液として−２０℃で保存した（製造業者は再構築した安定性について６ヶ月以上であると主張している）。それぞれ２０μｌの操作用アリコートをＰＣＲ反応チューブに分注し、−２０℃で保存した。
【０２２１】
Ｂ．選択；サイクル１
０．１ｍＭのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドＡ２２−４０−２５（すなわち、「＋８７」）ライブラリー（２．４×１０14分子）４μｌを、５’末端でＦＩＴＣ標識される０．１ｍＭのＦ２１−１０−１７（すなわち、「−４０」）４μｌ及び５×ＴＮＫＭｇ５（すなわち、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含有するＴＮＫバッファー）２μｌと混合した。ＴＮＫバッファーは、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ８．０である。５倍のストックは、２５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、６９０ｍＭ  ＮａＣｌ、１３．５ｍＭ  ＫＣｌを含み、作業（１倍）バッファーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２．７ｍＭ  ＫＣｌを含む。ＴＮＫ５Ｍｇは、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4（１Ｍ  ＭｇＳＯ4ストックの１：２００希釈）を含むＴＮＫであり、５×ＴＮＫ５Ｍｇは２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4（１Ｍ  ＭｇＳＯ4ストックの１：４０希釈）を含む５×ＴＮＫである。
【０２２２】
ＳＡｂ分子のアニーリングは、ＨＹＢＡＩＤ  ＰＣＲ  ＥＸＰＲＥＳＳサーマルサイクラーを用いて行った。オリゴ混合物を９６℃で５分加熱し、この温度を２℃／秒の速度で６５℃まで下げ、この温度で２０分維持した。次いで、この温度を２℃／秒で６３℃まで下げ、この温度を３分間維持した。次いで、この温度を２℃／秒で６０℃まで下げ、この温度で３分間維持した。次いで、この温度を２℃／秒で３０℃に下げ、温度が２０℃に到達するまで、各温度で３分間維持した。６０℃から２０℃までの全時間は４０分である。全アニーリング時間は１．５時間である。
【０２２３】
代替抗体電気穿孔の形成についてのアッセイを行った。各分取ゲルに、ＦＡＭ−８７及びＦ−４８を入れ、対応するバンド及びＳＡｂの位置を示した。並行ゲル（又は分取ゲルの他の半分）に、１０ｂｐのラダー、４８ｓｓ、８７ｓｓ及び固定ＰＣＲ産物を各アニーリングしたＳＡｂのアリコート（０．５ｍｌ）の隣に入れた。上述の反応混合物１０ｍｌを７ｍｌの６０％ｗ／ｖショ糖と混合した。混合物を２０％アクリルアミドゲルに入れた。４８ｎｔ（Ｆ２１−１０−１７）及びｄｓＳＡｂは緑色の蛍光バンドとして現れた。４８バンドは約５０塩基対で操作され、ｄｓＳＡｂは約３０４塩基対で操作される。Ｓａｂを抽出した後、ゲルをＥｔＢｒ（１０ｍｌバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを１μｌ）で染色する。８７バンドは、標準的な分子量関数を用いて、約１５７ｂｐに出現しているであろう。
【０２２４】
ＳＡＢ８７／４８バンドを含有するゲルフラグメントを切断し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れる。ゲルフラクションを滅菌ピペットチップを用いて細断し、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する４００μｌのＴＮＫＭｇ５バッファーを添加し、次いでサンプルを低速で回転プラットフォームで２時間／室温で攪拌する。ゲルスラリーを吸引し、Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  ３００Ｋに添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１７Ｒ中１−５０００×ｇ（７０００ｒｐｍ）で３分間回転させた。０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する４００μｌのＴＮＫＭｇ５バッファーを４４０μｌ未満の体積になるまで添加し、３分遠心分離した。
【０２２５】
ろ液の体積を測定し、ろ液の１０μｌアリコート及び９０μｌのバッファー、及びＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ２、ｍｄｌ  １４２０（プログラム名「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ」（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ、１秒）を用いて、形成されたＳａｂのＲＦＵ（相対蛍光単位）を測定した。バッファーのみのブランクも測定した。バックグラウンドを引き、適切な希釈因子及び体積を乗じることによって全蛍光を計算した。
【０２２６】
２０μｌのＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１接合体（１０％ＭｅＯＨｖ／ｖを含有するＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５  において１μｇ／μｌ接合体濃度）に従って、１／１０体積（４０μｌ）のＭｅＯＨをろ液に添加した。ＢＳＡ−ＡＡ−ＢＺ１０１体、合成、特性決定を実施例５に記載されるように行った。サンプルを１時間／室温でインキュベートした。
【０２２７】
反応混合物を吸引し、新しいＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイスに添加し、１０００ｇ／３分遠心分離した（Ｎａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ及び３００Ｋ  ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイスはＰＡＬＬ−Ｇｅｌｍａｎ  Ｃａｔ  ＃ＯＤ１００Ｃ３３から購入し、オメガ低タンパク質及びＤＮＡ結合と共に遠心ろ過し、ポリエチレン基質に対してポリエーテルスルホン改変した）。フィルターを使用して、ＢＳＡ−ＡＤ−ＢＺ１０１に結合したＳＡｂを結合していないＳａｂから分画化した。接合体に結合したＳＡｂを濃縮物中で回収し、一方、結合していないＳＡｂはろ液中に残った。ろ液を吸引し、新しい１．５ｍｌ  エッペンドルフチューブに添加した。混合物１００μｌを除去し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩを用いてＲＦＵをマイクロウェルプレート中で定量した。濃縮物をサイクル１の時に１０００ｇ／３〜８分、４００ｍｌのＴＮＫＭｇ５バッファーのアリコート（Ｔｗｅｅｎ及びＭｅＯＨを含まない）を用いて一度だけ洗浄した（サイクル２について２回、サイクル３〜６について３回）。回転時間はフィルターごとに変動する（一般的に３〜８分）。濃縮物はＳＡｂを含んでおり、ろ液を貯めておき、蛍光×体積を測定し、濃縮物のＲＦＵと一致した。ろ液を捨てた。
濃縮物中のＳＡｂ（ＳＡｂが接合体に結合する場合、ＭＷ＞１００ＫＤ）を、ＤＩ  Ｈ  
【０２２８】
2Ｏの１００μｌアリコートを添加し、回転させ、吸引することによって回収した。全ＲＦＵを回収した物質について計算した。回収された全量対接合体とともにインキュベートされたＳＡｂの最初の量を計算することによって、回収率％を計算した。
【０２２９】
Ｂ．ＰＣＲ増幅
濃縮物から回収したＤＮＡを４０サイクルＰＣＲ増幅プログラム及びプライマーＦ２２−５を２μＭ、及びプライマーＢｉｏ２１−４を２ｕＭを用いて増幅した。Ｂｉｏ２１−４を−８７オリゴヌクレオチドの５’末端に対してビオチンに付加する。
【０２３０】
ＰＣＲプライマー。８７鎖（特異性鎖）を増幅し、−４８鎖（安定化鎖）を増幅しないようにプライマーを設計した。これは、８７鎖に相補性であるが４８鎖に相補性ではない、３’末端上に４〜５塩基を有することによって達成された。図７を参照。非相補性の４〜５の塩基は、伸長を阻害するのに十分であった。
【０２３１】
ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマー配列を以下に示した。プライマーＦ２２−５は、−８７鎖を増幅せず、新規な＋８７鎖を作成し、以下の配列を含む。５’ＦＡＭ  −  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  Ｃ  ３’（配列番号１１）。プライマーＢｉｏ−２１−４は、＋８７を増幅せず、ビオチン標識された−８７を作成し、いくつかの実施形態では、−４８にアニーリングしない−８７鎖を抽出するために使用可能である。Ｂｉｏ−２１−４の配列は、５’  ｂｉｏ−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  Ｔ  ３’（配列番号１２）である。
【０２３２】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＥＢ）〜０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）中でプライマーを再構築し、２ｍｌのスクリュートップバイアル中で−２０℃でストック溶液として保存した（再構築された安定性についての要求は＞６ヶ月である）。操作用アリコート２０μｌをＰＣＲ反応チューブ内に分注し、−２０℃で凍結保存した。
【０２３３】
ＰＣＲ反応：濃縮物１０μｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに添加した。それぞれ４つのヌクレオチド１０ｍＭの混合物（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、５Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−０３００）１２μＬ及び各プライマー１０ｐｍｏｌｅ／μｌを１０μｌ含有する、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  １０×バッファー５ｍｌｂｕｆｆｅｒ、１ｍｌ  ＮＴＰストック溶液（ＰＣＲ  ｄＮＴＰ、ヌクレオチドトリホスフェート１０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １８４２７．０１３）を添加した。ＤＩ  Ｈ2Ｏを４９．５ｍｌになるまで添加した。以下のパラメーターを用いてプログラムをランさせた：３分、９４℃−６５℃−７２℃  それぞれ３０秒×３５、１０℃で保持。ＰＣＲ機が９６℃の時、５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ  ｃａｔ＃  ＭＯ２６７Ｓ）５Ｕ／μＬ）を添加し、反応物を混合し、ＰＣＲ機に入れる。
【０２３４】
ＰＣＲ反応の後、１０ｂｐラダー及びｓｓオリゴのコントロールと共に５μＬのＰＣＲ産物を３％  アガロース１０００ゲル、又は４％Ｅ−ゲル上で流し、バンドの増幅およびサイズを確認した。残った増幅ＤＮＡを１００％エタノールを用いた塩沈によって精製する。詳細には、１／３体積（１００μｌ）の８Ｍ酢酸アンモニウムを増幅ＤＮＡ２００μｌに添加する。混合した（ＤＮＡ＋酢酸アンモニウム）の体積（約７８０〜８００ｕｌ）の２．６倍の冷却無水エタノール（−２０℃）をチューブに添加する。このチューブを回転させ、氷上で１時間保存する。冷蔵遠心において、サンプルを１５分／１４，０００ｇで４０℃で遠心分離する。ペレットを接触又は破壊することなく、上清液を除去する。０．５ｍｌの７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを添加する。サンプルを穏やかに混合し、５分／１４，０００ｇで遠心分離する。ペレットを破壊することなく上清を除去し、空気にさらしながら室温で乾燥するまで蒸発させる。
【０２３５】
濃縮物から選択したＤＮＡを増幅する場合、以下のコントロールも同時に増幅させる。ＤＮＡなし、８７単独、及び４８単独。これにより、濃縮物からのバンドが正しい大きさであり、プライマーダイマーに起因するものではないことを確認する。４８鎖がＳＡｂ管中で増幅しないことも示す。それ自身によって、−４８が増幅し、−４８コントロール管中で検出可能である。これにより、増幅される場合、ＳＡｂ管中のｄｓ４８の位置を同定する。
【０２３６】
再アニーリング：４μｌの滅菌超純水＋４μｌの０．１ｍＭ  −４８ｎｔオリゴヌクレオチド（Ｆ２１−１０−１７）を含有する８μｌの溶液を添加することによって、ペレットを再構築した。サンプルを０．２ｍｌＰＣＲチューブに移し、２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５バッファーを添加した。（注記；過剰のＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔ）プライマーの添加は、所望の＋８７／−４８ＳＡｂ分子の形成をもたらす）
【０２３７】
Ｂ．サイクル２〜６：ＳＡｂのアニーリング
アニーリングのために以前に特定した温度プログラムを用いて再構築した物質を０．２ｍｌＰＣＲチューブ中で加熱することによってｄｓＳＡｂをアニーリングした。第１のサイクルの後、複数のバンドが現れる。並行ＳＡｂアリコートをその対応するＰＣＲ出発鎖と共に反応させ、切断されたバンドが実際に新規のＳＡｂであることを確認した。ＳＡｂバンドがｄｓ８７／４８であることを確認するために、アリコートを除去し、変性ゲル（１６％、２×尿素サンプルバッファー中で沸騰）上で泳動させ、分取ゲルからのバンドが８７鎖及び４８鎖の両方を含有することを確認した。
【０２３８】
電気泳動を１２０ｖで４０分行った。７μｌの６０％ｗ／ｖショ糖を１０μｌのＤＮＡと混合し、サンプルを入れた。５’末端にＦＩＴＣを有する任意のＤＮＡ成分（すなわち、ＳＡｂ７８／４８、ｄｓ４８及びｓｓ４８）は、ゲル上で長波長の緑色の蛍光バンドとして現れる。利用可能なレーンに５ｐＭｏｌのＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔプライマー）をサイズマーカーとして泳動させた。ＳＡｂは、２０％アクリルアミドネイティブゲル中で２５０〜３００ｎｔ  ｄｓＤＮＡと共に移動するのが観察されるであろう。ＳＡｂ−ゲル片を切断し、２５０μｌのＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５バッファー中で細断した。最低速で回転プラットフォーム上で攪拌しながら、サンプルを２時間／室温でインキュベートした。
【０２３９】
ゲル懸濁物をＰａｌｌ  ３００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイスに移し、１−５０００ｇ／３分遠心分離し、ポリアクリルアミドを除去した。５０μｌのバッファーのアリコートを添加することによって濃縮物を洗浄し、１０００ｇ／３分遠心分離した。後に続く選択サイクルにおいて使用するために、ＳＡｂをろ液から回収した。
【０２４０】
１００ｕｌのろ液のアリコートを用いて、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ２上でＳＡｂ及びバッファーブランクのＲＦＵを上に記載されるように測定した。
【０２４１】
Ｃ．選択サイクル２〜７
１／１０体積のＭｅＯＨを添加し、２０μｌのＢＺ１０１−ａａ−ＢＳＡ（１μｇ／μｌ）をサイクル１におけるように添加した。サンプルを１時間インキュベートし、Ｐａｌｌ  １００Ｋ  フィルターを用いて選択した。サイクル２について２回洗浄後、サイクル３〜６について３回洗浄後の濃縮物のＲＦＵ測定を行った。バックグラウンドＲＦＵを引き、回収率％を決定した。
【０２４２】
ネガティブ選択。この例では、ＢＳＡを用いるネガティブ選択は、サイクル＃１〜６で行わなかった。
【０２４３】
ネガティブ選択が望ましい場合、２５０μｌのＳＡｂ８７／４８ろ液（ＦＩＴＣによって２〜２０ｐＭｏｌ）を、２０μｌの１μｇ／μｌ（２０μｇ）ＢＳＡ溶液と混合した。サンプルを３０分／室温でインキュベートする。１００ｕｌのアリコート中でＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩ  プログラムを用いてＲＦＵを測定した。
【０２４４】
上述の反応混合物２５０ｕｌ（２０μｌは８Ｍ尿素を用いた１６％未変性ＰＡＧＥ及び８％変性ＰＡＧＥのために保存される）をＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ  遠心濃縮機に添加した。フィルターを１０００ｇ／１５分／室温で遠心分離した。ろ液中の全体積は約２４０μｌであった。ろ液を吸引し、新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。１００μｌのＲＦＵを検査した。
【０２４５】
２００μｌのＴＮＫＭｇ５バッファーを添加することによってフィルターを洗浄し、遠心分離し（１０００ｇ／１０分／ＲＴ）、遠心分離の後にさらに同じバッファー２００μｌを添加し、再び遠心分離し、１００μｌの同じバッファーを添加し、再び遠心分離した。１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏを添加し、ろ過し、攪拌し、濃縮物を吸引した。濃縮物を吸引することによってＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩでＢＳＡに結合したＳＡｂのＲＦＵを決定し、回収率％を決定した。
【０２４６】
２００μｌのネガティブに選択されたろ液を、ＴＮＫＭｇ５バッファーに懸濁した２０μｌ（１μｇ／μｌ）のＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０接合体と混合した。混合物を全体積約２２０μｌで１時間／室温でインキュベートした。反応溶液を新しいＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイスに入れ、１０００ｇ／３分遠心分離した。洗浄をＴＮＫＭｇ５バッファーを用いて３回行った。１００μｌのろ液のアリコートのＲＦＵを測定し、結合していない（遊離）ＳＡｂの割合を決定した。
【０２４７】
１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、攪拌し、濃縮物を吸引した。サンプル全体をマイクロタイタープレートウェルに入れた。サンプルのＲＦＵを測定し、バックグラウンドを測定し、回収率％を計算した。
【０２４８】
追加のステップ。１００μｌのアリコート中の回収した結合ＳＡｂの１〜２０％をプライマーを用いたＰＣＲ増幅のために使用した。上に記載されるように、それぞれ５０μｌを含有する４つの管においてｄｓＤＮＡを再び作成する。回収率％がＳＡｂ集合において観察されなくなるまで、ネガティブ選択及びポジティブ選択のサイクルを繰り返した。
【０２４９】
接合体を添加する前に、遊離ハプテンとポリクローナルＳＡｂライブラリーとをプレインキュベートし、その後の増幅のためにろ液を集めることによって更なるサイクルを行うことができる。アフィニティー向上のサイクルは、ＭｅＯＨの量を増やし、界面活性剤、ｐＨを下げ、及び／又は塩を増加させた状態で、ＳＡｂ及び接合体をインキュベートすることによって行うことができる。接合体に結合したままの高アフィニティーＳＡｂ  を増幅する。ポリクローナルＳＡｂ産生のプロセスは、モノクローナルＳＡｂクローンの産生前に、１．結合、２．特異性向上、３．アフィニティー向上によって進む。
【０２５０】
計算。回収した接合体に結合したアリコートにおけるＲＦＵの全体量対接合体とともにインキュベートされる場合に存在するＲＦＵの全量を決定した。ネガティブ選択について；回収したＢＳＡに結合するアリコートにおけるＲＦＵの量対ＢＳＡと共にインキュベートした場合に存在するＲＦＵの全量を決定した。ろ液から定量されたＲＦＵは、結合していないＳＡｂ及びフィルターデバイス上の損失を示す支持的なデータ及び情報を提供する。
【０２５１】
注記：サイクル＃２−５におけるＤＮＡ／接合体及びＤＮＡ／ＢＳＡ比は、１０〜１００ｎＭ  ＤＮＡ／２，０００ｎＭタンパク質、すなわち、接合体又はＢＳＡ２０〜２００分子に対してＳＡｂ１分子である。この計算により、接合体が、タンパク質１モル当たり報告された２０ｍｏｌｅのＢＺ１０１を有することを推定する。（ＳＡｂ  ８７／４８−−ＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１）複合体の分子量＝（Ａ２２−４０−２５＝２７．４Ｋｄ）＋（ＦＭ２１−１０−１７＝１５．４Ｋｄ）＋（ＢＳＡ＝６７Ｋｄ）＋（２０  ＢＺ１０１＝７Ｋｄ）。全体＝約１１６．８Ｋｄ；２ＳＡｂ：１  接合体＝約１５９．６Ｋｄ。
〔実施例５〕
【０２５２】
ＰＣＴ同族体ＢＺ１０１に対する代替抗体７８／４８の調製
自己集合性のオリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を用いて代替抗体（ＳＡｂ）分子を作成し、隣接する一定ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔランダム配列結合ループを有する二量体分子を形成した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合体／遊離体分割、及び再アセンブリ／再アニーリングのサイクルを使用して、ＢＳＡ−アジポイル−ＢＺ１０１接合体に結合する分子及びＢＺ１０１（２，２’，４，５，５’−ペンタクロロビフェニール）ハプテンに接合しない分子を含む豊富なＳＡｂ集合を作成する。
【０２５３】
Ａ．バックグラウンド
ＰＣＢは、２０９の異なる分子構造（同族体）で存在可能な塩素化芳香族化合物である。より高次に塩素化された種類は高温で比較的酸化に安定であり、１９２９〜１９７７まで熱移動薬剤として使用された。この期間中、１４億ポンドが製造され、混合同族体Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）製品として市販され、１２炭素のビフェニール核及び塩素の平均％を反映して命名された（例えば、Ａｒｏｃｌｏｒ  １２４２、１２４８、１２５４等）。今日、これらの化合物は、変圧器、産業機械及び家庭用器具コンデンサ、圧縮機、塗料、絶縁体、接着剤、及び化学加工装置において使用される、至るところに存在する環境汚染物質である。有害物質規制法（ＴＳＣＡ）では、それらの排除について法的な枠組みが１９７６年に確立されたが、以前の公害、新規な漏洩、及び汚染された物質の連続した廃棄が続いている。ＰＣＢは、持続的な有機汚染物質（ＰＯＰ）として分類され、それらの撲滅を協同で行う国際条約の調印への努力がなされている。
【０２５４】
多塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）は、エンドクリン破壊剤に分類される。それらはエストロゲン（キセノエストロゲン）に類似した症状を呈し、エンドクリンホルモンのバランスを崩す。雄の性的発達は、アンドロゲンに依存し、ＰＣＢによってもたらされるアンドロゲン／エストロゲンの比率の不均衡が遺伝的発達を阻害すると考えられる。ＰＣＢは子宮内の神経発達欠陥に関係し、ＰＣＢで汚染された魚を消費する母親において胎児の健康に関わる関心が存在する。ＰＣＢはさらに、母乳において見いだされ、新生児において顕著な暴露源となる。ＰＣＢに対する出生前暴露が精神及び身体に異常性を生じるという研究が示された。他の影響は、出生時の体重を下げ、甲状腺及び免疫機能を変え、神経に悪影響を与えることである。他の研究は、ＰＣＢに対する新生児の持続的な暴露が成人男性のアンドロゲン機能の低下を生じることを示唆する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ  ３３：１６９−７７）。
【０２５５】
特に懸念される健康に対する影響は、甲状腺に依存する脳発達の重要な時期にＰＣＢにより改変された甲状腺機能により生じる神経毒性である。この時期は、分娩前〜分娩後２年間にわたる。甲状腺機能は、神経成長に必要な細胞骨格系のアセンブリ及び安定性を制御し、大脳皮質及び海馬のコリン作用性及びドーパミン作用性のシステムの発達を制御する。ＰＣＢに対する暴露は、循環するチロキシン（Ｔ４）レベルの減少を伴う甲状腺の拡大を生じる。同様の原因が、選択された同族体と甲状腺ホルモンとの間に存在する構造的類似性、及びＰＣＢが高いアフィニティーで輸送タンパク質（例えば、トランスサイレチン）に結合する能力である。ＰＣＢは、甲状腺レセプターに結合する場合、アゴニスト及びアンタゴニストとして作用することが示された。甲状腺疾患から生じる神経への影響、及びＰＣＢ又はダイオキシン暴露後に報告された影響は、著しい類似性を有し、共通のメカニズムを示唆する。
【０２５６】
ＥＰＡ参照方法において列挙される３つの同族体（ＢＺ１３８、１５３、１８０）は、２つの核レセプターに対する結合について天然リガンドと競争することによって、性ホルモン制御と干渉する。これらの同族体はさらに、エストロゲン及びアンドロゲンレセプターに対して異なるアフィニティーを有し、細胞増殖（ｎＭ）及び阻害（ｉＭ）の両方を誘発し得る。ＰＣＢは、子宮内膜症の成長において疑われる薬剤であり、免疫抑制的であることが示されているが、発癌性でもあり得る。発癌性は、ポーランドによって記載される同じ経路及びダイオキシンについて他の経路を介して、Ａｈレセプター（アリール炭化水素）に対する結合を介して媒介されると考えられている。
【０２５７】
ＰＣＢアレイのために開発される本発明の代替分子は、アプタマー及び天然抗体の属性を組み合わせる。これらの分子は核酸組成物を有し、一定領域及び疎水性結合空洞を有する安定な二次構造を保持する。あらかじめ形成され、結合−空洞配列のランダムアソートを有する分子の順々に豊富なライブラリーを分画化し、標的に結合するものを増幅させる。モノクローナル抗体手順は、特性決定、同定、配列決定及び合成のために均一分子を産生する。調製プロセスは、開発時間を顕著に減らすことが予想される。分子は、複数の標識を単純に付着可能なように設計される。動物は使用されず、免疫応答の誘発は必要ではない。製造はＰＣＲ又は直接合成によって行われる。代替抗体分子は、環境からのＰＣＢの排除を容易にし、永続的な公共の健康病原体を除去する。
【０２５８】
Ｂ．物質及び方法
Ｉ．選択；サイクル１
代替抗体の形成：以下の実験において使用される代替抗体のライブラリーを以下のように形成した。ランダム４０ｎｔ配列、及びＦＩＴＣ（Ｆ）及びビオチニル化（Ｂ）プライマーを含有する７８ｎｔ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。両端に可変領域を含む一定配列領域中のヌクレオチドの数を反映して、７８ｎｔ  ｓｓＤＮＡを＃１７−４０−２１と命名した。７８ｍｅｒ（すなわち、特異性鎖；配列番号１３）の配列を４８  ｎｔ  オリゴヌクレオチド（すなわち、安定化鎖；配列番号１４）に沿って以下に示す。
（７８ｎｔオリゴヌクレオチド。上側の鎖として示される）
（４８ｎｔオリゴヌクレオチド。下側の鎖として示される）
【０２５９】
可変配列のいずれかの端における２つの一定領域ヌクレオチド配列は、並列した４８ｎｔ安定化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して相補性を有する。ＦＩＴＣ−標識された５’−オリゴヌクレオチド（＃Ｆ２１−１０−１７）の太字の塩基は、７８ｎｔ鎖上の塩基に対して非相補性である。オリゴを０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）になるまでＤＩ水中で再構築し、２ｍｌスクリュートップバイアル中でストック溶液として−２０℃で保存した。
【０２６０】
０．１ｍＭ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドＡ１７−４０−２１（すなわち、「＋７８」）ライブラリー（２．４×１０14分子）（すなわち、特異性鎖）４μｌを、５’末端でＦＩＴＣ標識される０．１ｍＭのＦ２１−１０−１７（すなわち、「−４０」）４μｌ及び５×ＴＮＫＭｇ５（すなわち、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含有するＴＮＫバッファー）２μｌと混合した。ＴＮＫ  Ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ８．０である（１×ストックは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ  ＫＣｌを含む）。ＴＮＫＭｇ５バッファーは、ＴＮＫバッファー及び５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む。
【０２６１】
ＳＡｂ分子をＨＹＢＡＩＤ  ＰＣＲ  ＥＸＰＲＥＳＳサーマルサイクラーを用いてアニーリングした（プログラム名：「プライマー」）。オリゴ混合物を９６℃で５分加熱し、この温度を２℃／秒の速度で６５℃まで下げ、この温度で２０分維持した。次いで、この温度を２℃／秒で６３℃まで下げ、この温度を３分間維持した。次いで、この温度を２℃／秒で６０℃まで下げ、この温度で３分間維持した。次いで、この温度を２℃／秒で３０℃に下げ、温度が２０℃に到達するまで、各温度で３分間維持した。６０℃から２０℃までの全時間は４０分である。
【０２６２】
１０μｌの上述の反応混合物を、７ｍｌの６０％ｗ／ｖショ糖と混合し、１ｍｍの１６％アクリルアミドゲル（１９：１比  アクリルアミド：メチレンビスアシルアミド）に流した。ゲルを長波長ＵＶ−３６６ｎｍ  ＢＬＡＫ−ＲＡＹ  ＬＡＭＰモデルＵＶＬ−５６を用いて試験した。４０ｎｔ（Ｆ２１−１０−１７）及びｄｓＳＡｂは緑色蛍光バンドとして現れる。
【０２６３】
「ＳＡｂ７８／４８」バンドをゲルから切断し、ゲル分画を、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する４００ｍｌ  ＴＮＫＭｇ５バッファー中で細断した。ゲル片を最も低速で２時間／室温でボルテックスで振とうした。
【０２６４】
ゲルスラリーを吸引し、ゲル懸濁物をＡｍｉｃｏｎ（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイスに添加し、１０００ｇ／１０分で回転した。０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎを含有するＴＮＫＭｇ５バッファー４０ｍｌを添加し、サンプルを１０００ｇ／１０分で遠心分離した。全体積≦４４０ｍｌ。
【０２６５】
４０μｌのＭｅＯＨをろ液に添加した。抗体の量を定量するために、ろ液のアリコート１００ｍｌ及びＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ２，モデル１４２０（プログラム名「フルオロセイン」（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ，１”）を用いてＲＦＵ（相対蛍光単位）を測定した。
【０２６６】
全てのＳＡｂろ液をＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイス（Ｐａｌｌ−Ｇｅｌｍａｎ）に添加し、１０００ｇ／１５分遠心分離した。ＲＦＵを上述のようなろ液のアリコート１００ｍｌを用いて定量した。
【０２６７】
ＩＩ．代替抗体の選択
上述のろ液を、ＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５（１０％ＭｅＯＨｖ／ｖ含有）中のＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１接合体（１ｍｇ／ｍｌ接合体濃度）２０ｍｌを含有する０．２ｍｌＰＣＲチューブに添加する。ＢＳＡ−ＡＡ−ＢＺ１０１接合体を以下に記載されるように合成した。メタノールを１０％ｖ／ｖ最終濃度になるまで添加した。Ｔｗｅｅｎ  ２０を０．０５％ｗ／ｖ最終濃度になるまで添加した。サンプルを１時間／室温でインキュベートした。
【０２６８】
反応混合物を吸引し、新しいＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイスに添加し、１０００ｇ／１０分で遠心分離した。使用されるＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイス（Ｃａｔ  ＃ＯＤ１００Ｃ３３  ＰＡＬＬ−Ｇｅｌｍａｎ，オメガ低タンパク質及びＤＮＡ結合、ポリエチレン基質上で改変されたポリエーテルスルホンを有する遠心分離フィルター）は、ＢＳＡ−ＡＤ−ＢＺ１０１に結合したＳＡｂを結合していないＳＡｂから分画化が可能であった。接合体に結合したＳＡｂを濃縮物中で回収し、一方、結合していないＳＡｂはろ液中にとどまっていた。ろ液を吸引し、新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加した。１００ｍｌを取り、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩを用いてＲＦＵをマイクロウェルプレート中で定量した。濃縮物をＴＮＫＭｇ５バッファー（ｔｗｅｅｎ及びＭｅＯＨなし）の２００ｍｌアリコートを用いて１０００ｇ／１０分で３回洗浄した。ろ液を捨てた。
【０２６９】
ＳＡｂ（ＳＡｂが接合体に結合する場合、ＭＷ＞１００ＫＤ）を、ＤＩ  Ｈ2Ｏの１００μｌアリコートを添加し、回転させ、吸引することによって回収した。全ＲＦＵを回収した物質について計算した。回収された全量対接合体とともにインキュベートされたＳＡｂの最初の量を計算することによって、回収率％を計算した。
【０２７０】
ＩＩＩ．ＰＣＲ増幅
濃縮物から回収したＤＮＡを４０サイクルＰＣＲ増幅プログラム及びプライマーＦ２２−５  ２μＭ及びプライマーＢｉｏ２１−４  ２ｕＭを用いて増幅した。ＢｉｏＭ１３Ｒ４８を＋７８オリゴヌクレオチドの５’末端に対してビオチンに付加する。ＰＣＲ反応は＋７８ｎｔ、−４８ｎｔ、−７８ｎｔ及び＋４８ｎｔ鎖を増幅し、ＳＡｂの理論収率を下げる。
【０２７１】
ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマー配列を以下に示す：
プライマー＃ＦＭ１３−２０（配列番号１５）は、配列５’ＦＩＴＣ−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ  ３’を有し、ＦＩＴＣがフルオロセインイソシアネートであり、プライマー＃ＢｉｏＭ１３Ｒ４８（配列番号１６）は、配列５’  Ｂｉｏ−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ３’を有し、Ｂｉｏはビオチンである。０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）になるようにＤＩ水中でプライマーを再構築し、２ｍｌのスクリュートップバイアル中で−２０℃でストック溶液として保存した。
【０２７２】
濃縮物１００μｌを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに添加した。２０μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ  １０×バッファー、４μｌ  ＮＴＰストック溶液、それぞれのプライマー１００ｐｍｏｌｅ／μｌを４μｌ添加した。最終体積はＤＩ  Ｈ2Ｏで２００μｌにした。サンプルを混合し、ＰＣＲ機に置いた。温度が９６℃に達したら、プログラムを休止させ、２ｍｌ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソヌクレアーゼネガティブ）ＤＮＡポリメラーゼストック溶液（２ｕｎｉｔｓ／μｌ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｃａｔ  ＃Ｍ０  ２５９Ｓ）を１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応バッファーと共に添加した。１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーは、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８，２℃）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。反応混合物を、あらかじめ機械中で９６℃に加熱しておいた空の５０μｌＰＣＲチューブに分注した。全増幅時間は約２．５〜３時間であった。
【０２７３】
増幅したＤＮＡを、同体積のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１  ｖ／ｖ）を用いた抽出によって精製した。増幅したＤＮＡ２００μｌを１．５ｍｌ  Ｅｐｐｉｎｄｏｒｆ管に移した。抽出溶液２００μｌをこの管に添加した。この管を回転させ、５’／１２，０００ｇで遠心分離した。上清（バッファー層）を球因子、新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。
【０２７４】
吸引したＤＮＡ溶液を１００％エタノールを用いて塩沈させる。吸引したＤＮＡ約２００μｌに、８Ｍ酢酸アンモニウム１００μｌを添加した。混合した（ＤＮＡ＋酢酸アンモニウム）の体積（約７８０〜８００ｕｌ）の２．６倍の冷却無水エタノール（−２０℃）を管に添加した。この管を混合し、氷上で３０分間保存した。サンプルを５分／１２，０００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、捨てた。０．５ｍｌの７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを添加し、サンプルを５分／１２，０００ｇで遠心分離した。ペレットを破壊することなく上清を除去し、空気にさらしながら室温で乾燥するまで蒸発させた。滅菌超純水  ４μｌ＋  ４  ｍｌ  ｏｆ  ０．１ｍＭ  プライマー（Ｆ２１−１０−１７）４μｌを含有する溶液８μｌを添加することによってペレットを再構築した。サンプルを０．２ｍｌＰＣＲチューブに移し、５×ＴＮＫＭｇ５バッファー２μｌを添加する。所望の＋７８／−４８ＳＡｂ分子の形成を好む過剰のＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔ）プライマーを添加することによって代替抗体を再形成した。
【０２７５】
ＩＶ．ＳＡｂのアニーリング
アニーリングのために以前に特定した温度プログラムを用いて再構築した物質を０．２ｍｌＰＣＲチューブ中で加熱することによってｄｓＳＡｂをアニーリングした。７μｌの６０％ｗ／ｖショ糖を１０μｌのＤＮＡと混合し、１６％アクリルアミドゲルにサンプルを置いた。５’末端にＦＩＴＣを有する任意のＤＮＡ成分（すなわち、ＳＡｂ７８／４８、ｄｓ４８及びｓｓ４８）は、ゲル上で長波長の緑色の蛍光バンドとして現れる（ＵＶ−３６６ｎｍ  ＢＬＡＫ−ＲＡＹ  ＬＡＭＰモデルＵＶＬ−５６）。５ｐＭｏｌのＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔプライマー）をサイズマーカーとして泳動させた。ＳＡｂ７８／４８は５００〜６００ｎｔ  ｄｓＤＮＡと共に移動するのが観察される。ＳＡｂ−ゲル片を切断し、細断し、ＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５バッファー２５０μｌをサンプルに添加した。次いで、最も低速で回転プラットフォーム上で攪拌しながら、サンプルを２時間／室温でインキュベートした。
【０２７６】
ゲル懸濁物をＡｍｉｃｏｎ  ＰＣＲ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌデバイスに移し、１０００ｇ／１０分で遠心分離し、ポリアクリルアミドを除去した。５０μｌのバッファーのアリコートを添加することによって濃縮物を洗浄し、１０００ｇ／１０分遠心分離した。後に続く選択サイクルにおいて使用するために、ＳＡｂをろ液から回収した。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２上でろ液の１００μｌのアリコートを用いてＦＵによってＳａｂを定量した。
【０２７７】
Ｖ．選択サイクル２〜７
ＢＳＡを用いたネガティブ選択は、サイクル＃１で実施されなかった。ネガティブ選択混合物は、２５０μｌのＳＡｂ７８／４８ろ液（ＦＩＴＣによって２〜２０ｐＭｏｌ）と、２０μｌの１μｇ／μｌ（２０μｇ）ＢＳＡ溶液とを含む。サンプルを３０分／室温でインキュベートし、１００μｌアリコート中でＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩ  プログラムを用いてＲＦＵを測定した。
【０２７８】
上述の反応混合物２５０μｌ（２０μｌは８Ｍ尿素を用いた１６％未変性ＰＡＧＥ及び８％変性ＰＡＧＥのために保存される）をＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ濃縮機に添加した。フィルターを１０００ｇ／１５分／室温で遠心分離した。液中の全体積は約２４０μｌであった。ろ液を吸引し、新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。１００μｌのＲＦＵを決定した。
【０２７９】
２００μｌのＴＮＫＭｇ５バッファーを添加することによってフィルターを洗浄し、遠心分離し（１０００ｇ／１０分／ＲＴ）、遠心分離の後にさらに同じバッファー２００μｌを添加した。サンプルを再び遠心分離し、１００μｌの同じバッファーを添加した。サンプルを再び遠心分離した。１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、攪拌し、濃縮物を吸引した。濃縮物を吸引することによってＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩでＢＳＡに結合したＳＡｂのＲＦＵを決定し、回収率％を決定した。
【０２８０】
２００μｌのネガティブに選択されたろ液を、ＴＮＫＭｇ５バッファーに懸濁した２０μｌ（１μｇ／μｌ）のＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０接合体と混合した。サンプルを１時間／室温でインキュベートした。反応の全体積は２２０μｌであった。
【０２８１】
反応溶液を新しいＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイスに入れ、１０００ｇ／１５分遠心分離した。フィルターをＴＮＫＭｇ５バッファーを用いて３回洗浄した。１００μｌのろ液のアリコートのＲＦＵを測定し、結合していない（遊離）ＳＡｂの割合を決定した。
【０２８２】
１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、攪拌し、濃縮物を吸引した。サンプル全体をマイクロタイタープレートウェルに入れ、ＲＦＵ及び回収率を測定した。
【０２８３】
ＰＣＲ増幅のための１００μｌアリコート中で回収された結合ＳＡｂの１〜２０％がプライマー＃ＢｉｏＭ１３Ｒ４８（１００ｐＭｏｌ）及びＦＭ１３−２０（１００ｐＭｏｌ）と共に使用された。上に記載されるように、それぞれ５０μｌを含有する４つの管においてｄｓＤＮＡを再び作成する。回収率％がＳＡｂ集合において観察されなくなるまで、ネガティブ選択及びポジティブ選択のサイクルを繰り返した。
【０２８４】
接合体を添加する前に、遊離ハプテンとポリクローナルＳＡｂライブラリーとをプレインキュベートし、その後に続く増幅のためにろ液を集めることによって更なるサイクルを行うことができる。アフィニティー向上のサイクルは、ＭｅＯＨの量を増やし、界面活性剤、ｐＨを下げ、及び／又は塩を増加させた状態で、ＳＡｂ及び接合体をインキュベートすることによって行うことができる。接合体に結合したままの高アフィニティーＳＡｂ  を増幅する。ポリクローナルＳＡｂ産生のプロセスは、モノクローナルＳＡｂクローンの産生前に、（１）結合、（２）特異性向上、（３）アフィニティー向上によって進む。
【０２８５】
ＶＩ．計算
回収した接合体に結合したアリコートにおけるＲＦＵの全量対接合体とともにインキュベートされる場合に存在するＲＦＵの全量を結合した代替抗体の％として表す。
【０２８６】
ネガティブ選択について、回収したＢＳＡに結合するアリコートにおけるＲＦＵの量対ＢＳＡと共にインキュベートした場合に存在するＲＦＵの全量を決定する。
【０２８７】
更なる計算は、結合していないＳＡｂ及びフィルターデバイス上の損失を示す支持的なデータ及び情報を提供するろ液から定量されたＲＦＵを含む。
【０２８８】
サイクル＃２−５におけるＤＮＡ／接合体及びＤＮＡ／ＢＳＡ比１０〜１００ｎＭ  ＤＮＡ／２，０００ｎＭタンパク質、すなわち、接合体又はＢＳＡ２〜２００分子に対してＳＡｂ１分子であることをさらに注記する。この計算により、接合体が、タンパク質１モル当たり報告された２０ｍｏｌｅのＢＺ１０１を有することを推定する。それに加えて、（ＳＡｂ７８／４８−−ＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１）複合体の分子量は約１１３．４Ｋｄである（Ａ１７−４０−２１＝２４Ｋｄ）＋（ＦＭ２１−１０−１７＝１５．４Ｋｄ）＋（ＢＳＡ＝６７Ｋｄ）＋（２０  ＢＺ１０１＝７Ｋｄ）。２ＳＡｂ：１接合体の分子量は約１５２．８Ｋｄであり、１ＳＡｂ：２接合体の分子量は約１８９．４Ｋｄである。
【０２８９】
Ｃ．結果
図１に示される代替抗体を製造は、ステム−ループ構造を有するアプタマーよりも可変性のコア分子を提供するために開始された。その設計は、特異性ドメインにひとまとまりで結合する一定領域ドメインを組み込む。複数のオリゴヌクレオチド構造は、同じであっても同じでなくてもよい複数の標識（例えば、ＦＩＴＣ、ビオチン）の単純な付着を可能にする。複数の自己指向型及び自己形成する結合空洞を容易に組み込むことができる。結合鎖から分離した安定化鎖は、必要な場合、化学修飾のための簡便な部位を与える。
【０２９０】
代替抗体は、標的とのインキュベーション前に、「安定化鎖」に対する「特異性鎖」のアニーリングによって形成される。結合する分子は、「特異性鎖」に優先的に豊富な不斉ＰＣＲを用いて増幅される。一定配列「安定化鎖」を添加し、代替分子を別の選択サイクルのためにアニーリングする。
【０２９１】
代替抗体は、結合ループ中のヌクレオチドの数において変動する「結合鎖」を用いてアセンブリ可能である。これらの分子のそれぞれは、異なる結合空洞サイズを有し、固有の結合構造を有する。図８は、「特異性」及び「安定化」プライマーの異なる組み合わせを用いてアセンブリされる代替抗体の電気泳動移動性を示す。フルオロセイン標識された「安定化鎖」（プレフィックス「Ｆ」）及び標識されていない「特異性鎖」（プレフィックス「Ａ」）をこれらの分子の製造に使用した。この組み合わせは、フルオロセイン標識された「安定化」鎖及びアニーリングされた分子の電気泳動移動性を顕著にシフトさせる。図８中のレーンを以下に示す：レーン１  プライマーＡ７８、レーン２  プライマーＦ４０、レーン３  代替抗体「Ａ５８／Ｆ４０」、レーン４  代替抗体「Ａ５８／Ｆ４８」、レーン５  代替抗体「Ａ８８／Ｆ４０」、レーン６  代替抗体「Ａ８８／Ｆ４８」、レーン７  プライマーＦ４８、レーン８  プライマーＡ８８、レーン９  代替抗体「Ａ７８／Ｆ４０」、レーン１０  代替抗体「Ａ７８／Ｆ４８」、レーン１１  代替抗体「Ａ７８／Ｆ４０」、レーン１２  ｄｓＤＮＡマーカー（各鎖中のヌクレオチドの数は右側に示される）、レーン１３  プライマーＦ４０。
【０２９２】
非変性アクリルアミドゲル電気泳動を用いて特性決定された代替抗体を、変性ゲル（８％アクリルアミド、８Ｍ尿素）を用いて再特性決定し、分子の二本鎖性及び「特異性」及び「安定化」鎖の約１：１化学量論量を確認した（図９）。図９中のレーンを以下に示す：レーン１  Ａ７８／Ｆ４０、レーン２  Ａ７８／Ｆ４８、レーン３  Ａ７８／Ｆ４０、レーン４  プライマーＦ４８、レーン５  Ａ８８、レーン６  Ｆ４８、レーン７  Ａ８８／Ｆ４８、レーン８  Ａ８８／Ｆ４０、レーン９  Ａ５８／４８、レーン１０  Ａ５８／Ｆ４０、レーン１１  Ｆ４０、レーン１２  Ａ７８。
【０２９３】
図１０は、８、９及び１０サイクルを介して接合するＢＳＡ−ＰＣＴ（ＢＺ１０１同族体）に対する代替抗体の選択及び濃縮を示す。シグナル／陰性コントロールは、標的に結合した代替抗体の量対標的が存在しない場合に回収された代替抗体の量（陰性コントロール）の％として表す。
【０２９４】
Ｄ．観察及び結論
非極性のＢＺ１０１同族体についての代替抗体結合アフィニティーは、分子内に設計され疎水性相互作用を有する結合ループ／空洞の結果であると考えられる。観察結果は、ＰＣＢ同族体がβシクロデキストリンによって高いアフィニティー結合を示す他の実験に類似する。得られた予想感受性よりもよい結果はさらに、疎水性、水素結合、静電力、及び  ファンデルワールス結合の共同した影響を示唆する。ＢＺ１０１−ＢＳＡ接合体の結合、及び比較的低濃度の遊離ＢＺ１０１によって誘発される結合の効果的な阻害は、特別の目的を有していた。このデータは、選択の間に使用される、同じ架橋化学が最終的な免疫アッセイのためのリポーター分子において使用される、リガンドの限定された優先的な結合を示唆する。このことは、典型的には、ハプテン特異的な免疫アッセイを開発する場合に、利用可能なオプションではなく、優先的な抗体結合、及び減少したアッセイ感受性は、リポーター分子及び免疫源が同じ架橋化学を分け合う場合に起こる。この観察は、選択方法の多様性及びＳＡｂライブラリーから架橋を排除し、キャリア結合分子を排除する能力を示す。このデータは、制御作用限界未満の濃度でＥＰＡ特異的なＰＣＢ同族体に優先的に結合する、新規な結合試薬の迅速な製造を示す。
〔実施例７〕
【０２９５】
アレイ中の代替抗体の使用
同族体に対する５つのモノクローナル代替抗体試薬を表１に命名し、Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）免疫アッセイアレイのために調製する。
【０２９６】
【表１】
2006518469.tif 000003
【０２９７】
それぞれＭｅｔｈｏｄ８０８２特異的な同族体の１つを標的化する５つの免疫アッセイを開発する。５つの試験によって作成される固有の応答プロフィールは、存在するＡｒｏｃｌｏｒを同定するために使用される。作成されるコンポジットシグナルは、Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）濃度を定量するために使用される。１個のウェルの「全ＰＣＢ」アッセイは、作成された５つのモノクローナル代替抗体からのポリクローナル試薬を用いて処方される。
【０２９８】
提案された試験特性：
Ｆｒａｍｅ（Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ  ４６８Ａ−４７５Ａ）及びＥＰＡ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｖ（Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  １９：６５７−６８８）によって公開されたＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）組成物データを使用して、固有の予想可能な、及び検出可能な応答プロフィールを全体として提供する標的同族体を選択した。表２は、５つのＥＰＡ特異的なＡｒｏｃｌｏｒｓ（登録商標）のそれぞれにおける同族体の重量組成％を示す。
【０２９９】
【表２】
2006518469.tif 000004
【０３００】
表３は、サンプル中の全Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）濃度が１０ｐｐｍである場合、それぞれの同族体のモル濃度、固体廃棄物のＥＰＡ−ＯＳＷＥＲ制御作用レベルを示す。
【０３０１】
【表３】
2006518469.tif 000005
【０３０２】
この濃度は、免疫アッセイのそれぞれのＫａに近く、代替抗体は、それらのそれぞれの用量−応答曲線の中央（Ｂ５０）において同族体の検出を達成するために必要である。試験のための引用された適用のいくつかは、２ｐｐｍの特定の定量限界を必要とし、この濃度は２〜４倍大きなアフィニティーを要求する。ＢＺ１０１免疫アッセイデータ及びアプタマーのアフィニティーについて引用される文献に基づいて、代替抗体を用いて開発された免疫アッセイは、追加の分析前濃縮ステップを必要とせず、必要とされる実用的な検出限界を達成すべきである。表４は、各Ａｒｏｃｌｏｒｓ（登録商標）において、選択された同族体の相対分布を示し、図１１は、アレイが選択されたＡｒｏｃｌｏｒｓ（登録商標）のために産生する固有の同族体応答プロフィールを示す。
【０３０３】
【表４】
2006518469.tif 000006
【０３０４】
代替抗体の開発：
表１において同定された５つの同族体は、代替抗体の開発のために、以下に基づいて選択された；
１．予想された代替抗体結合定数と適合性の濃度（注記；開発されたサンプル加工化学は、ＰＣＢが濃縮され、結合Ｋａ及び必要とされるアッセイ検出範囲との間のばらつきを克服する）、
２．固有のＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）分布プロフィール（注記；免疫アッセイの固有の応答プロフィールはガスクロマトグラフィーの参照方法が使用される様式において、Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）に対して使用される）、
３．ＥＰＡ参照方法８０８２におけるそれらの引用、
４．Ａｒｏｃｌｏｒ１２４８ａ及び１２４８ｇ中、及び１２５４ａ及び１２５４ｇ中でほぼ同じ濃度を有する同族体（注記；第１の生成産物はこれらのサブ集合と異ならない）
【０３０５】
代替抗体分子は、標識されていないか又はビオチンプライマーを用いて標識されていてもよい１つの鎖と、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で５’末端で標識されている他の鎖とを有する二本鎖オリゴヌクレオチド内に、各選択サイクルの前にアセンブリされる（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＮＡＲ  ２８：１９６３−１９６８）。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２の複数標識リーダーは、ＦＩＴＣ標識された鎖及びアセンブリされたＳＡｂの濃度を同定するために使用される。非変性アクリルアミドゲル（１６％）は、アニーリングされていないＦＩＴＣ標識された鎖対アニーリングされたＦＩＴＣ標識された鎖における移動性の変化を注記することによってＳＡｂ’のアセンブリを確認するために使用される。８％アクリルアミドゲル及び８Ｍ尿素を用いた電気泳動は、アニーリングされた二本鎖分子の同定を確認するために使用される。アセンブリされたＳＡｂの収率及び回収率％は、成分の全蛍光に対する励起されたＳＡｂゲルフラクションにおけるＳＡｂに関連する蛍光の量を決定することによって定量される。
【０３０６】
初期の選択されていない集合は、同族体−ＢＳＡ接合体と共にインキュベートされ、増幅された結合集合を生成する。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）デバイスを用いる「サイズ排除」ろ過法は、接合体に結合したＳＡｂ分子を結合していないＳＡｂから分割するために使用される。結合していない分子は、ろ液内を通過する。体積及び蛍光が定量され、フラクションは捨てられる。濃縮物中の分子は、体積及び蛍光について同様に定量され、ＰＣＲ増幅のために使用される。濃縮物中の蛍光対開始時の全蛍光の相対量は、回収率％（結合％／全体）として計算される。
【０３０７】
ＰＣＲは、２つのプライマーを用いて行われ、１つはＦＩＴＣで標識される。ＦＩＴＣプライマーは、ポジティブ同族体−結合鎖を作成するために使用される。標準的なＰＣＲは、増幅、Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼが存在しない）、及びＮＴＰの４０サイクルを用いて行われる。ＰＣＲ産物は、フェノール／クロロホルム抽出で精製され、ＮａＡｃ：ＥｔＯＨ沈殿によってタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を除去され、生成物が濃縮される。「安定化」プライマー（ビオチン存在下／非存在下）は、精製されたＰＣＲペレットの「結合」鎖に４〜１０モル過剰濃度で添加される。混合物は、サーマルサイクラーを用いて９５℃／５分、６５℃／２０分、６０℃／５分、５５℃／５分でアニーリングされ、室温まで１℃／１分の速度で冷却される。６５℃のアニーリング温度は、８０℃の範囲のＴｍを有する二本鎖ＳＡｂ’の形成を容易にするために使用される。ショ糖バッファー（７μｌ，６０％）は、ＳＡｂに添加され、電気泳動前に密度を高める。非変性電気泳動（１６％アクリルアミド，１００Ｖ，ＲＴ）は、ＳＡｂを他の成分からフラクション化するために使用される。ＦＩＴＣ標識されたＳＡｂは、蛍光スキャニング及び移動性（Ｒｆ）によってゲル上で位置決定され、選択において使用するために切断される。ＳＡｂは、バッファーを添加した後に細断されたゲルから抽出され、２時間インキュベートし、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ろ過される。
【０３０８】
同族体−ＢＳＡ接合体は、最初に、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）カラムを介してろ過される。ろ液中に現れる接合体は捨てられ、濃縮物中の接合体は選択において使用するために回収される。処理された接合体（１０〜２０μｌ）は、精製されたＳＡｂと共にインキュベートされ、室温／６０分でインキュベートされる。インキュベートされた溶液はろ過され、濃縮物中のＳＡｂが回収され、ＦＩＴＣについて定量され、増幅される。結合％／全ＳＡｂを再び計算する。エキソヌクレアーゼＩを用いたインキュベーションは、二本鎖構造の形成及び使用を示すために使用される（注記；ＳＡｂ分子は、この酵素による分解に耐性を持つべきである）。選択サイクルは、％Ｂ／Ｔにおける更なる濃縮がおこらない状態で続けられる。
【０３０９】
特異性の向上は、誘導体化されたＢＳＡキャリアを認識する代替抗体を除去する。高められた結合集合は、接合していないＢＳＡを用いたインキュベーションサイクルを受け、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）ろ過される。濃縮物中の非特異的オリゴヌクレオチドは捨てられ、ろ液中の非特異的オリゴヌクレオチドはベースラインタンパク質結合が得られるまで再処理される。標的接合体を添加する前にネガティブ土壌サンプルのメタノール抽出物を添加することによって、同様のサイクリングが行われる。接合体に結合した代替抗体を増幅のために回収する。接合していない標的同族体を用いたインキュベーション、濾過及びろ液中のＳＡｂの増幅の最終サイクルは、誘導体認識を行わないポリクローナル試薬を提供する。選択バッファー中の１０％ＭｅＯＨの一致した使用は、アフィニティーを高め、より高いＰＣＢ濃度を最終免疫アッセイにおいて達成可能にする。ＭｅＯＨの使用について公開されたデータは、水と比較して、二重らせんの限定された不安定化を示し（Ａｌｂｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０：１４１３−８）、このことは疎水性結合が二本鎖安定性の主な部分ではないことを示唆する（Ｈｉｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９：２０８６−９４）。
【０３１０】
モノクローナル代替抗体は、豊富なポリクローナル試薬から製造される。３’末端に１つのデオキシアデノシン（Ａ）を有する分子は、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて結合される。１つの配列挿入物が各ベクターに結合され、１個の配列を有する個々の細菌コロニーを産生する。ベクター配列中のα−ペプチドの存在は、指示薬プレート上で組み換えクローンの直接色スクリーニングを可能にする。ＰＣＲフラグメントを含有するクローンは、白色又は淡青色のコロニーを作る。以前に使用されたＰＣＲ増幅及びアニーリングプロトコルを再び使用して、モノクローナル代替抗体を含有する個々のウェルを作成する。各ウェルは次いで特性決定される。
【０３１１】
特性決定及び方法の開発：
蛍光検出に好適な黒色のマイクロプレートは、同族体−ＢＳＡ接合体で受動的にコーティングされ、選択のために使用される。接合体は、ＳＡｂの優先的な接合体の結合が観察される場合、塩素原子の位置又は数を変更するように改変される。標準的な実証プロトコルは、アフィニティー、同属体交差反応性、関連する化合物又は存在し得る他の化合物に対する交差反応性、及びマトリックス干渉に基づいて分子を選択するために使用される。データベースは、ＳＡｂの性能を比較するために調製され、アレイ中で使用するために１つ以上を選択される。試験のために複数のモノクローナル試薬をポリクローナル試薬に組み合わせることによって得られる性能の利点は、もしあれば、総括され、考慮される。選択された代替抗体分子は、配列決定され、必要なアレイ開発物質を提供するために合成される。
【０３１２】
特性決定方法は、一本又は二本のＦＩＴＣ標識された代替抗体の検出に依存する。免疫アッセイプロトコルは、溶液中で、標準、サンプル、またはコントロールと共に代替抗体分子をインキュベートする。反応混合物は、標的接合体でコーティングされ、２％ＢＳＡでブロックされたマイクロタイタープレートウェルに添加される。１５〜３０分後、内容物を除去し、ウェルをＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するバッファーで洗浄する。シグナルは、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ複数標識リーダーを用いて定量される。代替抗体タイターは、１０％  ＭｅＯＨ−Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー中で二重希釈を試験することによって定量される。用量−応答特性決定は、代替抗体希釈物及び１０ｐｐｍの同族体で構成される、５０％結合阻害（Ｂ５０／ＥＤ５０）を示すアッセイを用いて計算される。用量−応答曲線は、５つの同族体標準を用いて作成される。この曲線は、データのロジット−ログ変換を用いて線形化され、データのｙ＝ｍｘ＋ｂ外挿法を可能にする。競争結合アッセイの定量範囲は、典型的には、Ｂ80（すなわち、８０％接合体結合）〜Ｂ20（２０％結合）の範囲である。濃度範囲は、代替抗体のＫａに依存して１又は２のログまで広がる。標準曲線の線形度は、ロジット−ログ線（ｒ2）の相関係数から評価される。＞０．９５の相関係数を有し、二重標準＜１５％のエラー％を有する標準曲線が、実証パラメーター（例えば、感受性、交差反応性％）を計算するために使用される。
【０３１３】
予備的な交差反応性％は、標的同族体に結合する代替抗体の５０％を阻害するのに必要な非標的同族体の濃度を規定する。この比率は、交差反応性％として表される。図１３において示される特性を有するアレイを開発するために、＜１０％の交差反応性を有する代替抗体が選択される。同様の研究が、可能な交差反応剤として「仕様シート」に列挙される化合物を用いて行われる。種々のサンプルマトリックスを用いるスパイク−回収研究は、相対的なマトリックス効果を評価する。最少の検出可能用量（ＬＤＤ）、最少検出限界（ＭＤＬ）、実際の定量限界（ＰＱＬ）として表される感受性は、複数のネガティブサンプルの同時試験から得られるシグナル標準偏差の倍数（例えば、ＬＤＤ＝２σ）と等しい、挿入された同族体濃度として計算される。Ａｒｏｃｌｏｒｓ（登録商標）は、＜１０ｐｐｍの濃度で試験され、検出能力及び予想された応答プロフィールとの一致を確認する（図１１）。
【０３１４】
各同族体を検出するための代替抗体試薬は、組み合わされ、隣接するウェル中に固定された５つの接合体を有するマイクロタイタープレートと共に使用される。接合していないＢＳＡは、別個のウェルに固定され、コントロールとして使用される。アッセイはＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）標準を試験し、マトリックスを固定するために使用される。プロフィールアレイデータは相関付けられ、ピーク高さ対Ａｒｏｃｌｏｒ相関試験が行われ、集められる。Ａｒｏｃｌｏｒ同定アッセイフォーマットとは対照的に、全ＰＣＢは、５つの同族体の接合体の混合物を個々のマイクロタイターウェルに固定することによって評価される。サンプルは、代替抗体試薬の混合物と共にインキュベートされ、混合した接合体ウェル及びＢＳＡコントロールウェルに添加される。標準的なＦＤＡ及びＥＰＡ実証プロトコルは、予備的な感受性、交差反応性、マトリックス干渉、及び回収率％の特性を評価するために行われる。
〔実施例８〕
【０３１５】
ＩｇＧを認識するリガンドに結合する代替抗体試薬を作成する方法
実施例５に記載されるように、自己集合性のオリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を用いて代替抗体（ＳＡｂ）分子を作成し、隣接する一定ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔランダム特異性ドメイン配列を有する二量体分子を形成する。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合体／遊離体分割、及び再アセンブリ／再アニーリングのサイクルを使用して、ＩｇＧポリペプチドに結合する分子を有するＳＡｂ集合を豊富にするために使用した。選択のための方法は、実施例１に詳細に議論される。
【０３１６】
図１２は、ＩｇＧに対する代替抗体の選択及び濃縮を示す。シグナル／陰性コントールは、標的に結合した代替抗体の量対標的が存在しない場合に回収された代替抗体の量（陰性コントロール）の％として表す。
【０３１７】
以下の参考文献は、本明細書中に全ての目的のためにその全体が組み込まれる。参考文献：
Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（２２）：４５８１−４５８８、
Ｐｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ，３７７（１）：６７−７０、
Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７０２（１−２）：６９−７６、
Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １（４）：２３５−４２、
Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ６：５１９−２３、
Ｊａｙａｓｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４５；９：１６２８−１６５０、
Ｄｏｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２７（３）：２８９−９７、
Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ。
【０３１８】
明細書中に述べられる全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの刊行物又は特許出願が詳細かつ個々に参考として組み込まれているかのような程度まで、本明細書中に参考として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】リガンドに結合する空洞を形成するヌクレオチド配列で構成される１つ以上の特異性領域（ＳＰ）を囲む、並列するオリゴヌクレオチド鎖（Ａ、Ａ’、Ｄ、及びＤ’）で構成される１つ以上の安定化領域（ＳＴ）を含有する代替抗体（ＳＡｂ）分子を表す図である。この実施形態において、上側の鎖（特異性鎖）は両側に２つの一定領域（Ａ及びＤ）を有する特異性領域（ＳＰ）を含む。下側の鎖（安定化鎖）は、それぞれの一定領域（Ａ及びＤ）と相互作用する両側に２つの安定化領域（Ａ’及びＤ’）を含むスペーサー領域を含む。
【図２】複数の特異性領域（ＳＰ領域ループ）、安定化領域（ＳＴ）、及びスペーサー領域（Ｓ）を含む代替抗体分子の２つの実施形態を表す図である。
【図３】複数の特異性領域（ＳＰ領域ループ）、安定化領域（ＳＴ）、及びスペーサー領域（Ｓ）を含み、全体的に多次元のリガンド結合を提供する、代替抗体分子の４つの実施形態を表す図である。
【図４】種々の大きさのＳＰ領域を含有する代替抗体分子に対する標的リガンドの結合を示す模式図である。
【図５】天然抗体と比較して結合アフィニティー及び特異性を向上した代替抗体能力を示す模式図である。
【図６】代替抗体を調製する１つの方法の模式図である。
【図７】代替抗体を増幅するための非限定的な方法を提供する。この実施形態において、「Ｆ４８」は安定化鎖（配列番号１）を含み、「Ｆ２２−４０−２５（８７）」は特異性鎖（配列番号２）を含む。上記安定化鎖は、特異性鎖に対して５つのヌクレオチドミスマッチ（網掛けの四角）を含む。適切なプライマー（Ｂ２１−４０、配列番号３；及びＦ１７−５０，配列番号４）と組み合わせたこのミスマッチは、ＰＣＲ増幅中に安定化鎖の増幅を防ぐ。この方法に関する更なる詳細は実施例４に見出される。
【図８】異なる特異性及び安定性のプライマーの組み合わせを用いてアセンブルした代替抗体の電気泳動移動性を示す。
【図９】分子の二本鎖性を照合するために変性ゲルを用いて代替抗体を特徴決定したものである。
【図１０】８、９及び１０サイクルを介して接合するＢＳＡ−ＰＣＴ（ＢＺ１０１同族体）に対する代替抗体の選択及び濃縮を示す。シグナル／陰性コントロールは、標的に結合した代替抗体の量対標的が存在しない場合に回収された代替抗体の量（陰性コントロール）の％として表す。
【図１１】アレイが選択されたＡｒｏｃｌｏｒｓ（登録商標）のために産生する固有の同族体応答プロフィールを示す。
【図１２】ＩｇＧに対する代替抗体の選択及び濃縮を示す。シグナル／陰性コントールは、標的に結合した代替抗体の量対標的が存在しない場合に回収された代替抗体の量（陰性コントロール）の％として表す。
【図１３】目的のリガンド上の２個の別個のエピトープに結合する目的のリガンドが２個の代替抗体と接触する本発明の実施形態を示す。各代替抗体は、代替抗体中に含まれる認識配列と捕捉プローブ内に含まれる捕捉ヌクレオチド配列との間の相互作用を用いて、目的のリガンドと本発明のアレイ上に固定される代替抗体との間で結合パートナー複合体を形成可能であり、アレイの別個の既知の領域に付着する、同じ認識配列を含有する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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