(57)【要約】糖化最終産物受容体のリガンド結合要素（ＲＡＧＥ−ＬＢＥ）と免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質を開示する。また、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと二量化ドメインとを含む融合蛋白質も開示する。また、このような融合蛋白質をコードする核酸、及び開示される核酸と蛋白質を使用して、例えば、ＲＡＧＥ関連疾患を治療するための方法も開示する。また、追加の組成物及び方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化最終産物受容体のリガンド結合要素（ＲＡＧＥ−ＬＢＥ）と免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質。
【請求項２】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥがＲＡＧＥの細胞外部分を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが図７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３４４を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが図７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３０を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが図７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３２１を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが図７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２３０を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが図７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１１８を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥがＩｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３ドメインを含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥがＩｇ１及びＩｇ２ドメインを含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥがＩｇ１ドメインを含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが、糖化最終産物受容体の結合相手（ＲＡＧＥ−ＢＰ）に対する該ＲＡＧＥ−ＬＢＥの結合親和性を増大させる１個以上の点変異を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン要素が免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン要素がＦｃドメインを含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＡ重鎖よりなる群から選択される、請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
前記免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α及びＩｇＧ３重鎖よりなる群から選択される、請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
前記免疫グロブリン要素がＣＨ１及びＦｃドメインを含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
前記免疫グロブリン要素が第１免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン及び第２免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメインを含み、しかも該第１及び第２免疫グロブリンクラスが同一ではない、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
二量化ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の融合蛋白質と薬剤として許容できるキャリヤーとを含む組成物。
【請求項２０】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、第２ドメインであって二量化ポリペプチド、精製ポリペプチド、安定化ポリペプチド及び標的化ポリペプチドよりなる群から選択されるものとを含む融合蛋白質。
【請求項２１】
前記二量化ポリペプチドが両親媒性ポリペプチドを含む、請求項２０に記載の融合蛋白質。
【請求項２２】
前記両親媒性ポリペプチドが５０個までのアミノ酸を含む、請求項２１に記載の融合蛋白質。
【請求項２３】
前記両親媒性ポリペプチドが３０個までのアミノ酸を含む、請求項２２に記載の融合蛋白質。
【請求項２４】
前記両親媒性ポリペプチドが２０個までのアミノ酸を含む、請求項２２に記載の融合蛋白質。
【請求項２５】
前記両親媒性ポリペプチドが１０個までのアミノ酸を含む、請求項２２に記載の融合蛋白質。
【請求項２６】
前記二量化ポリペプチドがペプチドヘリックスバンドルを含む、請求項２０に記載の融合蛋白質。
【請求項２７】
前記二量化ポリペプチドがロイシン・ジッパーを含む、請求項２０に記載の融合蛋白質。
【請求項２８】
前記ロイシン・ジッパーがｊｕｎジッパーである、請求項２７に記載の融合蛋白質。
【請求項２９】
前記ロイシン・ジッパーがｆｏｓジッパーである、請求項２７に記載の融合蛋白質。
【請求項３０】
前記二量化ポリペプチドが正又は負に荷電した残基を有するポリペプチドを含み、しかも該ポリペプチドが逆の電荷を有する別のペプチドに結合している、請求項２０に記載の融合蛋白質。
【請求項３１】
請求項２０〜３０のいずれかに記載の融合蛋白質と薬剤として許容できるキャリヤーとを含む組成物。
【請求項３２】
図３Ａのアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含む融合蛋白質。
【請求項３３】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含むポリペプチド融合体をコードする核酸配列。
【請求項３４】
図３Ａに示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３５】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥが前記免疫グロブリン要素にＣ末端又はＮ末端アミノ基又はカルボキシ基を介して融合する、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３６】
請求項３３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３７】
原核細胞及び真核細胞のうちの一つで複製する、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載の発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３９】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質を産生させる方法であって、該融合蛋白質の発現に好適な細胞培養培地中で請求項３８に記載の細胞を培養することを含む、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質を産生させる方法。
【請求項４０】
前記融合蛋白質の純度を増大させるための精製手順をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
図３Ａに示されるようなアミノ酸配列のエピトープと特に免疫反応性のある単離された抗体又はそのフラグメント。
【請求項４２】
１種以上の融合蛋白質を含む蛋白質複合体において、該融合蛋白質が、
（ａ）ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質、及び
（ｂ）ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、第２ドメインであって二量化ドメイン、安定化ドメイン、精製ドメイン及び標的化ドメインよりなる群から選択されるものとを含む融合蛋白質
よりなる群から選択される、１種以上の融合蛋白質を含む蛋白質複合体。
【請求項４３】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＴＮＦ−α阻害剤とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及び免疫グロブリン要素を含む融合蛋白質とＴＮＦ−α阻害剤とを含む医薬組成物。
【請求項４５】
次の段階：
（ａ）（ｉ）Ｓ１００又はアンホテリンのＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド、（ii）ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体の受容体ポリペプチド及び（iii）試験化合物を含む反応混合物を、該試験化合物の非存在下で該ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと該受容体ポリペプチドとが相互作用する条件下で形成させ、
（ｂ）該ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと該受容体ポリペプチドとの相互作用を検出すること
を含む、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドであってＳ１００及びアンホテリンよりなる群から選択されるものと、受容体ポリペプチドであってＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及びＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体よりなる群から選択されるものとの相互作用を阻害する化合物の同定方法において、
該試験化合物の存在下での該ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと該受容体ポリペプチドとの相互作用の、該試験化合物の非存在下での該相互作用レベルに対する低下が、該試験化合物についての阻害活性を示す
ことを特徴とする、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと受容体ポリペプチドとの相互作用を阻害する化合物の同定方法。
【請求項４６】
ＲＡＧＥ−ＢＰがＳ１００である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＲＡＧＥ−ＢＰがアンホテリンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
次の段階：
（ａ）ある種の細胞とＳ１００又はアンホテリンのＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドとを接触させ、
（ｂ）該細胞と試験化合物とを、該試験化合物の非存在下で該ＲＡＧＥのシグナル伝達活性が正常に生じる条件下で接触させ、
（ｃ）ＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導されるＲＡＧＥのシグナル伝達活性を検出することを含む、Ｓ１００及びアンホテリンよりなる群から選択されるＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドによって誘導されるＲＡＧＥシグナル伝達活性を阻害する化合物の同定方法において、
該試験化合物の存在下での該ＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導されるＲＡＧＥのシグナル伝達活性の、該試験化合物の非存在下での該シグナル伝達活性レベルに対する低下が、該試験化合物についての阻害活性を示す
ことを特徴とする、ＲＡＧＥシグナル伝達活性を阻害する化合物の同定方法。
【請求項４９】
ＲＡＧＥ−ＢＰがＳ１００である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＲＡＧＥ−ＢＰがアンホテリンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
シグナル伝達活性がＮＦ−ｋＢ転写活性の活性化である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
シグナル伝達活性がマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性の活性化である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）とＲＡＧＥの結合相手（ＲＡＧＥ−ＢＰ）との間の相互作用を阻害する方法であって、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を投与することを含む、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害する方法。
【請求項５４】
請求項４１に記載の抗体を投与することを含む、糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）とＲＡＧＥの結合相手（ＲＡＧＥ−ＢＰ）との間の相互作用を阻害する方法。
【請求項５５】
請求項４５又は請求項４８に記載の方法によって同定された化合物を投与することを含む、糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）とＲＡＧＥの結合相手（ＲＡＧＥ−ＢＰ）との間の相互作用を阻害する方法。
【請求項５６】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を投与することを含む、内因性ＲＡＧＥの活性を低下させる方法。
【請求項５７】
請求項４１の抗体を投与することを含む、内因性ＲＡＧＥの活性を低下させる方法。
【請求項５８】
請求項４５又は請求項４８に記載の方法によって同定された化合物を投与することを含む、内因性ＲＡＧＥの活性を低下させる方法。
【請求項５９】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患の治療方法。
【請求項６０】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を、アミロイド症、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、心臓血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーよりなる群から選択される病状のうち１つ以上の治療に有用な薬剤の１種以上と共に投与することを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項４１に記載の抗体を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患の治療方法。
【請求項６２】
前記抗体を、アミロイド症、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、心臓血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーよりなる群から選択される病状のうち１つ以上の治療に有用な薬剤の１種以上と共に投与することを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項４５又は４８に記載の方法によって同定された化合物を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患の治療方法。
【請求項６４】
前記化合物を、アミロイド症、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、心臓血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーよりなる群から選択される病状のうち１つ以上の治療に有用な薬剤の１種以上と共に投与することを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記薬剤が抗炎症剤、抗酸化剤、β遮断剤、抗血小板剤、ＡＣＥ阻害剤、脂質低下剤、抗血管新生剤及び化学療法剤よりなる群から選択される、請求項６０、６２又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記薬剤がメトトレキセートである、請求項６０、６２又は６４に記載の方法。
【請求項６７】
急性炎症性疾患が敗血症である、請求項６０、６２又は６４に記載の方法。
【請求項６８】
心臓血管疾患が再狭窄である、請求項６０、６２又は６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＡＧＥ−ＬＢＥがＲＡＧＥの細胞外部分を含む、請求項５３、５６又は５９に記載の方法。
【請求項７０】
ＴＮＦ−α阻害剤と、少なくとも１種のＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ及び免疫グロブリンを含む融合蛋白質とを含む組成物を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患の治療方法。
【請求項７１】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を少なくとも含む組成物を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患の治療方法。
【請求項７２】
前記ＲＡＧＥ関連疾患がアミロイド症、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、心臓血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーよりなる群から選択される、請求項５９〜６４又は請求項７０〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
ＲＡＧＥ関連疾患がアルツハイマー病である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
慢性炎症性疾患がリウマチ様関節炎である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
慢性炎症性疾患が変形性関節症である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
慢性炎症性疾患が過敏性腸疾患である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
慢性炎症性疾患が多発性硬化症ある、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
慢性炎症性疾患が乾癬である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
慢性炎症性疾患が狼瘡又は任意の他の自己免疫疾患である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
急性炎症性疾患が敗血症である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
心臓血管疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
心臓血管疾患が再狭窄である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
Ｓ１００がＳ１００Ｂである、請求項４６又は４９に記載の方法。
【請求項８４】
Ｓ１００がＳ１００ａ１２である、請求項４６又は４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＡＧＥ関連疾患の治療用組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の深刻なヒトの疾患は、糖化最終産物受容体のリガンド（ＲＡＧＥリガンド）の産生量の増加又はＲＡＧＥ自体の産生量の増加に関連している。例えば、多くの癌、慢性炎症性疾患、糖尿病、アミロイド症及び心臓血管疾患を含め、これらの疾患の多くについては、一貫して有効な治療法を利用することができない。ＲＡＧＥ関連疾患を治療することが有益であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概略
ある種の態様では、本願は、糖化最終産物受容体のリガンド結合要素（ＲＡＧＥ−ＬＢＥ）と免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質に関する。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥの細胞外部分を含む。ある種の態様では、このＲＡＧＥ−ＬＢＥは、図７に示すようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３４４、１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０又は１〜１１８を含む。さらなる具体例では、本願の融合蛋白質は、図７に示すアミノ酸配列のＩｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３ドメイン、Ｉｇ１及びＩｇ２ドメイン又はＩｇ１ドメインを含むＲＡＧＥ−ＬＢＥを含む。さらなる具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、糖化最終産物受容体の結合相手（ＲＡＧＥ−ＢＰ）に対する該ＲＡＧＥ−ＬＢＥの結合親和性を増大させる１個以上の点変異を含む。
【０００４】
ある態様では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、免疫グロブリン重鎖を含む免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質に関する。ある具体例では、免疫グロブリン要素は、Ｆｃドメインを含む。ある例では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＡの重鎖よりなる群から選択される。さらなる態様では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α及びＩｇＧ３の重鎖よりなる群から選択される。免疫グロブリン要素は、ある具体例ではＣＨ１及びＦｃドメインを含み得る。ある例では、免疫グロブリン要素は、第１免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン及び第２免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン（ここで、該第１及び第２免疫グロブリンクラスは同一ではない。）を含む。
【０００５】
追加の具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含み、二量化ポリペプチドをさらに含む融合蛋白質に関する。
【０００６】
ある具体例では、本願は、本発明の融合蛋白質と薬剤として許容できるキャリヤーとを含む組成物に関するものでもある。
【０００７】
さらに、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、第２ドメインであって二量化ポリペプチド、精製ポリペプチド、安定化ポリペプチド及び標的化ポリペプチドよりなる群から選択されるものとを含む融合蛋白質に関する。ある具体例では、二量化ポリペプチドは、両親媒性ポリペプチドを含む。該両親媒性ポリペプチドは、５０個までのアミノ酸、３０個のまでのアミノ酸、２０個までのアミノ酸又は１０個までのアミノ酸を含むことができる。ある具体例では、該二量化ポリペプチドは、ペプチドヘリックスバンドルを含む。ある具体例では、該二量化ポリペプチドは、ロイシン・ジッパーを含む。このロイシン・ジッパーは、ｊｕｎジッパー又はｆｏｓジッパーであることができる。ある具体例では、二量化ポリペプチドは、正又は負に荷電した残基を有するポリペプチドであって逆の電荷を有する別のペプチドに結合するものを含む。
【０００８】
さらなる具体例では、本願は、図３Ａのアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含む融合蛋白質に関する。ある態様では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含むポリペプチド融合体をコードする核酸配列に関する。ある具体例では、本願は、図３Ａに示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するポリペプチドをコードする核酸配列に関する。ある具体例では、該核酸配列は、免疫グロブリン要素にＣ又はＮ末端アミノ又はカルボキシ基を介して融合するＲＡＧＥ−ＬＢＥをコードする。該ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥの細胞外部分を含むことができる。ある具体例では、本願の核酸配列は、図７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３４４、１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０又は１〜１１８を含むＲＡＧＥ−ＬＢＥをコードする。さらなる具合例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、Ｉｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３ドメイン、Ｉｇ１及びＩｇ２ドメイン又はＩｇ１ドメインを含む。追加の具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＢＰに対するＲＡＧＥ−ＬＢＥの結合親和性を増大させる１個以上の点変異を含むＲＡＧＥ−ＬＢＥポリペプチドをコードする核酸配列に関する。ある具体例では、核酸配列は、ＲＡＧＥ−ＢＰに対するＲＡＧＥ−ＬＢＥの結合親和性を増大させる１個以上の点変異を含むＲＡＧＥ−ＬＢＥをコードする。
【０００９】
ある態様では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、免疫グロブリン重鎖を含む免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質をコードする核酸配列に関する。ある具体例では、免疫グロブリン要素は、Ｆｃドメインを含む。ある例では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＡ重鎖よりなる群から選択される。さらなる態様では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α及びＩｇＧ３重鎖よりなる群から選択される。免疫グロブリン要素は、ある具体例ではＣＨ１及びＦｃドメインを含むことができる。ある例では、免疫グロブリン要素は、第１免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン及び第２免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン（ここで、該第１及び第２免疫グロブリンクラスは同一ではない。）を含む。
【００１０】
追加の具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含み、二量化ポリペプチド、安定化ポリペプチド、精製ポリペプチド及び標的化ポリペプチドよりなる群から選択される第２ドメインをさらに含む融合蛋白質をコードする核酸配列に関する。
【００１１】
さらなる具体例では、本願の核酸は、該核酸を発現ベクターとして使用するのに好適にさせるように該ヌクレオチド配列に機能的に連結した転写調節配列をさらに含む。ある具体例では、該核酸は、ほ乳類細胞内で該核酸分子の発現を高めるプロモーターをさらに含む。さらに、本願は、本願の核酸を含む発現ベクターに関する。ある具体例では、該発現ベクターは、原核細胞及び真核細胞のうち少なくとも１つで複製する。さらに、本願は、本願の発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞に関する。さらに、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質の製造方法であって、本願の宿主細胞を該融合蛋白質の発現にとって好適な細胞培養培地中で培養することを含み、及び随意として該融合蛋白質の純度を増大させるための精製手順をさらに含むものを提供する。
【００１２】
ある具体例では、本願は、図３Ａに示されるようなアミノ酸配列のエピトープと特に免疫反応性のある単離された抗体又はそのフラグメントを提供する。ある具体例では、該抗体は、図７に示されるようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０又は１〜１１８のエピトープと特に免疫反応性がある。ある具体例では、該抗体は、ＲＡＧＥが１種以上のＲＡＧＥ−ＢＰに結合するのを抑制する。ある具体例では、本願は、図３Ａに示されるようなアミノ酸配列のエピトープと特に免疫反応性のある単離抗体又はそのフラグメントを提供し、ここで、該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント及び単鎖抗体よりなる群から選択される。随意として、該抗体は、検出可能な標識で標識される。さらに、本願は、本願のポリクローナル抗体の精製製剤に関する。
【００１３】
さらなる具体例では、本願は、（ａ）ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質及び（ｂ）ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、第２ドメインであって二量化ドメイン、安定化ドメイン、精製ドメイン及び標的化ドメインよりなる群から選択されるものとを含む融合蛋白質よりなる群から選択される１種以上の融合蛋白質を含む蛋白質複合体に関する。
【００１４】
さらに、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及びＴＮＦ−α阻害剤を含む医薬組成物に関する。ある具体例では、本願は、融合蛋白質とＴＮＦ−α阻害剤を含む医薬組成物であって該融合蛋白質がＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含むものに関する。さらに、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質を含む医薬組成物に関する。ある態様では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥの細胞外成分を含む。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、図７に示されるようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３４、１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０又は１〜１１８を含む。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、Ｉｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３ドメイン、Ｉｇ１及びＩｇ２ドメイン又はＩｇ１ドメインを含む。
【００１５】
ある態様では、本願の医薬組成物のＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥ−ＢＰに対する該ＲＡＧＥ−ＬＢＥの結合親和性を増大させる１個以上の点変異を含む。ある具体例では、本願の医薬組成物は、小分子、抗体、ペプチドミメティック及びＴＮＦＲII−Ｆｃ融合蛋白質よりなる群から選択されるＴＮＦ−α阻害剤を含む。
【００１６】
ある具体例では、本願の医薬組成物は、免疫グロブリン重鎖を含む免疫グロブリン要素を含む。ある具体例では、免疫グロブリン要素はＦｃドメインを含む。ある例では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＡ重鎖よりなる群から選択される。さらなる態様では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α及びＩｇＧ３重鎖よりなる群から選択される。免疫グロブリン要素は、ある具体例ではＣＨ１及びＦｃドメインを含むことができる。ある例では、免疫グロブリン要素は、第１免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン及び第２免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン（ここで、該第１及び第２免疫グロブリンクラスは同一ではない。）を含む。追加の具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥを含み、二量化ポリペプチドをさらに含む医薬組成物に関する。
【００１７】
ある具体例では、本願は、次の段階：
（ａ）（ｉ）Ｓ１００又はアンホテリンのＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド、（ii）ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体及び（iii）試験化合物を含む反応混合物を、該試験化合物の非存在下で該ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと該受容体ポリペプチドとが相互作用する条件下で形成させ、
（ｂ）該ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと該受容体ポリペプチドとの相互作用を検出すること
を含む、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドであってＳ１００及びアンホテリンよりなる群から選択されるものと、受容体ポリペプチドであってＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及びＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体よりなる群から選択されるものとの相互作用を阻害する化合物の同定方法において、該試験化合物の存在下での該ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと該受容体ポリペプチドとの相互作用の、該試験化合物の非存在下での該相互作用レベルに対する低下が、該試験化合物についての阻害活性を示すことを特徴とする、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドと受容体ポリペプチドとの相互作用を阻害する化合物を同定する方法に関する。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰはＳ１００（Ｓ１００Ｂ若しくはＳ１００ａ１２のような）又はアンホテリンである。
【００１８】
さらに、本願は、次の段階：
（ａ）ある種の細胞とＳ１００又はアンホテリンのＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドとを接触させ、（ｂ）該細胞と試験化合物とを、該試験化合物の非存在下でＲＡＧＥのシグナル伝達活性が正常に生じる条件下で接触させ、そして（ｃ）該ＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導される該ＲＡＧＥのシグナル伝達活性を検出すること
を含む、Ｓ１００及びアンホテリンよりなる群から選択されるＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドによって誘導されるＲＡＧＥシグナル伝達活性を阻害する化合物の同定方法において、該試験化合物の存在下での該ＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導される該ＲＡＧＥのシグナル伝達活性の、該試験化合物の非存在下での該シグナル伝達活性レベルに対する低下が、該試験化合物についての阻害活性を示すことを特徴とする、ＲＡＧＥシグナル伝達活性を阻害する化合物の同定方法に関する。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰはＳ１００（Ｓ１００Ｂ若しくはＳ１００ａ１２のような）又はアンホテリンである。ある態様では、ＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導されるＲＡＧＥシグナル伝達活性を阻害する化合物は、ＮＦ−ｋＢ転写活性の活性化又はマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性の活性化を阻害する。
【００１９】
追加の具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を投与することを含む、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害する方法を提供する。追加の具体例では、本願は、図３Ａに示されるアミノ酸配列のエピトープと特に免疫反応性のある抗体又はそのフラグメントを投与することを含む、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害する方法に関する。さらに、本願は、本願の方法によって同定された化合物を投与することを含む、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害する方法に関する。
【００２０】
ある具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を投与することを含む、内因性ＲＡＧＥの活性を低下させる方法を提供する。ある態様では、本願は、図３Ａに示されるアミノ酸配列のエピトープと特に免疫反応性のある抗体又はそのフラグメントを投与することを含む、内因性ＲＡＧＥの活性を低下させる方法に関する。さらなる具体例では、本願は、本願の方法によって同定された化合物を投与することを含む、内因性ＲＡＧＥの活性を低下させる方法に関する。
【００２１】
ある具体例では、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリンとを含む融合蛋白質を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患を治療する方法に関する。ある具体例では、本願は、図３Ａに示されるアミノ酸配列のエピトープと特に免疫反応性のある抗体又はそのフラグメントを投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患を治療する方法に関する。さらに別の具体例では、本願は、本願の方法によって同定された化合物を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患を治療する方法に関する。ある態様では、本願の組成物は、アミロイド症、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、心臓血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーよりなる群から選択される病状のうち一つ以上の治療に有用な薬剤の１種以上と共に投与される。随意として、該薬剤は、抗炎症剤、抗酸化剤、β遮断剤、抗血小板剤、ＡＣＥ阻害剤、脂質低下剤、抗血管新生剤及び化学療法剤よりなる群から選択される。一具体例では、該薬剤はメトトレキセートである。別の具体例では、急性炎症性疾患は敗血症である。さらに別の具体例では、心臓血管疾患は再狭窄である。
【００２２】
ある態様では、上に列挙した方法におけるＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥの細胞外部分を含む。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、図７に示されるようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３４４、１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０又は１〜１１８を含む。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、Ｉｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３ドメイン、Ｉｇ１及びＩｇ２ドメイン又はＩｇ１ドメインを含む。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥ−ＢＰに対する該ＲＡＧＥ−ＬＢＥの結合親和性を増大させる１個以上の点変異を含む。
【００２３】
上に挙げた方法における免疫グロブリン要素は、ある具体例では、免疫グロブリン重鎖を含む。ある具体例では、該免疫グロブリン要素はＦｃドメインを含む。ある態様では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＡ重鎖よりなる群から選択される。さらなる態様では、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α及びＩｇＧ３重鎖よりなる群から選択される。免疫グロブリン要素は、ある具体例ではＣＨ１及びＦｃドメインを含むことができる。ある例では、免疫グロブリン要素は、第１免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン及び第２免疫グロブリンクラスのＣＨ１ドメイン（ここで、該第１及び第２免疫グロブリンクラスは同一ではない。）を含む。
【００２４】
追加の具体例では、本願は、ＴＮＦ−α阻害剤と、少なくとも１種のＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ及び免疫グロブリンを含む融合蛋白質とを含む組成物を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患を治療する方法を提供する。さらに、本願は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及び免疫グロブリンを含む融合蛋白質を少なくとも含む組成物を投与することを含む、ＲＡＧＥ関連疾患の治療方法に関する。
【００２５】
本願の方法によって治療できるＲＡＧＥ関連疾患としては、アミロイド症、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患、心臓血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーが挙げられる。ある態様では、ＲＡＧＥ関連疾患は、アルツハイマー病である。本願の方法によって治療できる慢性炎症性疾患としては、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、過敏性大腸症、多発性硬化症、乾癬、狼瘡又は任意の他の自己免疫疾患が挙げられる。本願の方法によって治療できる急性炎症性疾患としては、敗血症が挙げられる。本願の方法によって治療できる心臓血管疾患としては、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
図面の簡単な説明
図１Ａは、ネズミの可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合蛋白質のヌクレオチド配列を示している。
図１Ｂは、ネズミの可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
図２Ａは、ネズミの可溶性ＴＮＦＲIIのヌクレオチド配列を示している。
図２Ｂは、ネズミの可溶性ＴＮＦＲIIのアミノ酸配列を示している。
図３Ａは、変異ＩｇＧ１重鎖のＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域に融合するヒトＲＡＧＥのアミノ酸配列を示している。
図３Ｂは、変異ＩｇＧ１重鎖のＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域に融合するヒトＲＡＧＥのヌクレオチド配列を示している。
図４は、ＣＩＡを発症させるように誘発され、且つ、ＣＩＡの誘発後数日目にＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体、ｓＴＮＦＲII又は空のベクターで処理されたマウスの全身体スコアを示している。
図５は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質の様々な例を示す図である。
図６は、ＲＡＧＥリガンドに結合しているＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ融合蛋白質を示している。
図７は、ヒトＲＡＧＥについてのアミノ酸配列を示している。
図８は、ヒトＲＡＧＥについての核酸配列を示している。
図９は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−ＦｃがＣＨＯ細胞によって分泌されることを示している。状態調整された培地をＮ−グリカナーゼと共に又はそれなしで一晩インキュベートし（Ｎ末端結合オリゴ糖を除去するため）、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）に付した。ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃは、Ｆｃドメインに対して特異的な抗体を使用して検出した。分子量のシフトは、Ｎ末端結合オリゴ糖の存在を示している。多数のｈＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ種は、追加的な翻訳後修飾の可能性を示唆している。
図１０は、ヒトＲＡＧＥの配列分析を示している。ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃの分析から、（１）Ｎ末端残基がグルタミン（Ｑ）であること（これは環状化してピログルタミン酸を形成した）及び（２）成熟ペプチドの２位のアスパラギン（Ｎ）にＮ末端結合修飾があることが示された。
【００２７】
詳細な説明
１．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付した請求の範囲において使用される所定の用語をここにまとめる。特に指示がない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術の分野において通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同一の意味を有する。
【００２８】
ここでは、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、該冠詞の文法上の対象が１又は１以上（即ち少なくとも１）であることをいうために使用する。例として、「要素」（a element）は、１つの要素又は１つ以上の要素を意味する。
【００２９】
用語「二量化ポリペプチド」又は「二量化ドメイン」には、別のポリペプチドと共に２量体（又は３量体、４量体などのように、それよりも大きい複合体）を形成する任意のポリペプチドが含まれる。随意として、この二量化ポリペプチドは、他の同一の二量化ポリペプチドと会合し、それによってホモマルチマーを形成する。ＩｇＧＦｃ要素が、ホモマルチマーを形成する傾向にある二量化ドメインの例である。随意として、該二量化ポリペプチドは、他の異なる二量化ポリペプチドと会合し、それによってヘテロマルチマーを形成する。Ｊｕｎロイシン・ジッパードメインは、Ｆｏｓロイシン・ジッパードメインと二量体を形成するため、ヘテロマルチマーを形成する傾向にある二量化ドメインの例である。二量化ドメインは、ヘテロマルチマー及びホモマルチマーの両方を形成し得る。
【００３０】
「発現構築物」とは、好適な宿主細胞内で発現を仲介するのに十分な発現性核酸と調節要素とを含む任意の組換え核酸である。
【００３１】
用語「融合蛋白質」及び「キメラ蛋白質」は互換性があり、２種以上の蛋白質からのアミノ酸配列に相当する部分を有するアミノ酸配列を有する蛋白質又はポリペプチドをいう。この２種以上の蛋白質からの配列は、該蛋白質の全部又は一部（即ち、フラグメント）であることができる。また、融合蛋白質は、該蛋白質の部分に相当する部分の間にアミノ酸の連結領域をも有し得る。このような融合蛋白質は、相当する核酸をヌクレアーゼ及びリガーゼによる処理で結合させ、そして発現ベクターに取り入れる組換え方法によって調製できる。融合蛋白質の調製法は、一般的に、当業者であれば理解されている。
【００３２】
用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び、しかるべき場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドをいう。また、この用語は、均等物として、核酸アナログから作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログ、並びに、説明してきた具体例に当てはまるものとして、１本鎖（センス又はアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドを包含するものとする。
【００３３】
ここで使用するときに、用語「又は」（「若しくは」、「或いは」）は、文脈に特に指示がない限り、用語「及び／又は」を意味し、且つ、該用語と交換できるように使用する。
【００３４】
用語「一致率」とは、２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の配列の一致性をいう。一致率は、比較する目的のために整列され得るそれぞれの配列内での所定の位置を比較することによって決定できる。同一性のパーセンテージとしての表現は、比較される配列が共有する位置での同一のアミノ酸又は核酸の数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含め、様々なアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムが使用できる。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学，ウィスコンシン州マジソン）の一部分として入手でき、且つ、例えば、デフォルト設定で使用できる。ＥＮＴＲＥＺは、全米バイオテクノロジー情報センター、米国医療図書館、米国国立保健研究所（メリーランド州ベセスダ）経由で入手できる。一具体例では、２つの配列の一致率は、ＧＣＧプログラムによって１のギャップウェイトで（例えば、それぞれのアミノ酸ギャップは、あたかも２つの配列間で単一のアミノ酸又は核酸ミスマッチが存在したかのように荷重される。）決定できる。
【００３５】
アラインメントのための他の技術が、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第２６６巻：高分子配列分析のためのコンピュータ方法（１９９６），Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ著，アカデミックプレス社，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．の一部門，米国カリフォルニア」に記載されている。好ましくは、配列内のギャップを許容するアラインメントプログラムを利用して該配列を整列させる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント内のギャップを許容するアルゴリズムの一型式である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることもできる。別の検索ストラテジーとしては、ＭＡＳＰＡＲコンピュータで動くＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して大規模並列処理コンピュータ上で配列を採点する。このアプローチは、それほど関連性のない一致をピックアップする能力を改善し、且つ、特に、小さなギャップ及び核酸配列のエラーに寛容である。核酸コードアミノ酸配列を使用して蛋白質データベース及びＤＮＡデータベースの両方を検索することができる。
【００３６】
ここでは、用語「ポリペプチド」及び「蛋白質」は、交換可能に使用される。
【００３７】
「糖化最終産物受容体のリガンド結合要素」又は「ＲＡＧＥ−ＬＢＥ」には、ＲＡＧＥリガンドを結合させる能力を保持する膜貫通ＲＡＧＥポリペプチド（例えば、可溶性ＲＡＧＥ）及びそのフラグメントの任意の細胞外部分が含まれる。
【００３８】
「糖化最終産物受容体の結合相手」又は「ＲＡＧＥ−ＢＰ」には、生理的環境中で、ＲＡＧＥ蛋白質（ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質のような受容体ポリペプチド）の細胞外部分に結合する任意の基質（例えば、ポリペプチド、小分子、炭水化物構造など）が含まれる。
【００３９】
「ＲＡＧＥ関連疾患」には、冒された細胞又は組織がＲＡＧＥ若しくは１種以上のＲＡＧＥリガンドの発現及び／又は活性の上昇又は低下を示す任意の疾患が含まれる。また、ＲＡＧＥ関連疾患には、ＲＡＧＥ機能の低下によって治療（例えば、ＲＡＧＥ：ＲＡＧＥ−ＢＰ相互作用を破壊する薬剤の投与を含む）できる（即ち、一つ以上の症状を解消でき又は改善できる）任意の疾患も含まれる。
【００４０】
用語「組換え核酸」には、天然には存在しない少なくとも２種の配列を含む任意の核酸配列が含まれる。組換え核酸は、例えば、分子生物学の方法を使用することによって試験管内で、又は、例えば、相同若しくは非相同組換えによる新規な染色体部位での核酸の挿入によって生体内で生成され得る。
【００４１】
ある被検体に関して、用語「治療する」とは、該被検体の病気又は疾患の少なくとも一つの症状を改善させることをいう。治療は、病気若しくは病状を治癒させ又はそれを改善させることであることができる。
【００４２】
用語「ベクター」とは、ある種の核酸分子であってそれに結合した別の核酸を運ぶことのできるものをいう。ベクターの一つのタイプは、エピソーム、即ち、染色体外で複製し得る核酸である。ベクターの別のタイプは、宿主細胞の遺伝物質と組換わるようにデザインされた組込型ベクターである。ベクターは、自律複製型及び組込型の両方であることができ、またベクターの特性は、細胞の状況によって異なり得る（即ち、ベクターは、あるタイプの宿主細胞では自律複製型であり、且つ、別のタイプの宿主細胞では単に組込型であり得る）。ここでは、機能的に結合した発現性核酸の発現を誘導することができるベクターを「発現ベクター」という。
【００４３】
融合蛋白質
ある態様では、糖化最終産物受容体のリガンド結合要素（ＲＡＧＥ−ＬＢＥ）を含む融合蛋白質が提供される。ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質が提供される（例えば、図１Ｂ又は３Ａに示されるようなもの）。さらなる具体例では、該融合蛋白質は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと、第２ドメインであって二量化ドメイン、標的化ドメイン、安定化ドメイン及び精製ドメインよりなる群から選択されるものとを含む。
【００４４】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥリガンドに結合する能力を保持するＲＡＧＥ蛋白質の任意の細胞外部分であることができる。多くの生物では、該ＲＡＧＥ蛋白質は、その細胞の内部に位置する蛋白質の部分（細胞内部分）と、該細胞の外部に位置する蛋白質の部分（細胞外蛋白質）とを有する膜貫通蛋白質である。用語「ＲＡＧＥリガンド」とは、生理的環境中でＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥに結合する任意の基質を包含することを意図する。代表的なＲＡＧＥリガンドとしては、非酵素的に糖化した付加物（糖化最終産物）、Ｓ１００／カルグラニュリンファミリーの前炎症性サイトカイン様分子、アンホテリン（ＨＭＧ−１又はＨＭＧＢ−１としても知られている）及びアミロイド構造内に見出されるようなβシート型フィブリルが挙げられる。
【００４５】
ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥリガンドに結合する能力を保持するＲＡＧＥのフラグメントを含む。ある態様では、本発明の融合蛋白質は、ＲＡＧＥリガンド及び免疫グロブリン要素に結合する能力を保持するＲＡＧＥフラグメントを含む。さらなる具体例では、該融合蛋白質は、ＲＡＧＥリガンドと、第２ドメインであって二量化ドメイン、標的化ドメイン、安定化ドメイン及び精製ドメインよりなる群から選択されるものとに結合する能力を保持するＲＡＧＥフラグメントを含む。
【００４６】
上で議論したように、ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥリガンドに結合する能力を保持するＲＡＧＥの細胞外部分を含む。ある態様では、該ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、Ｉｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３ドメインを含む。別の態様では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、Ｉｇ１及びＩｇ２ドメインを含む。他の態様では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、ＲＡＧＥのＩｇ１ドメインを含む。さらに別の側面では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、図７に示されるようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３４４、１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０又は１〜１１８を含む。
【００４７】
さらに別の具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥのアミノ酸配列の変異型を含む。これらのＲＡＧＥ−ＬＢＥの変異型は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥのそのリガンドに対する親和性を増大させること、結合相手の安定性、精製及び調製を促進させること、その血漿半減期を改変させること、治療効果を改善させること及びここに記載される組成物の治療としての使用中に副作用の度合い又は発生を減少させることのような様々な目的を念頭において調製される。例示の具体例では、変異ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質は、図３Ａのアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含む。
【００４８】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥのアミノ酸配列変異型は、次の３つのクラス：組込、置換又は欠失変異型の一つ以上に分類される。これらの変異型は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥをコードするＤＮＡへのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発のような当業者の認識範囲内にある方法によって調製され、それによって該変異をコードするＤＮＡが得られ、その後組換え細胞用培地中で該ＤＮＡを発現させる。しかしながら、約１００〜１５０個のアミノ酸残基を有するフラグメントは、試験管内合成で調製するのが便利である。
【００４９】
このＲＡＧＥ−ＬＢＥアミノ酸配列の変異型は、自然界には見出されない所定の変異型であることができ、又は天然型の対立遺伝子であることができる。ＲＡＧＥ−ＬＢＥ変異型は、典型的には、天然型内因性ＲＡＧＥと同一の定性的生物学的特性、例えばリガンド結合活性を示す。
【００５０】
アミノ酸配列の変異型を導入するための部位は予め決定できるが、変異自体は予め決定する必要はない。例えば、所定の部位での変異の実行を最適化させるために、ランダム変異導入又は飽和変異導入（この場合には、全２０個の見込まれる残基が挿入される）を標的コドンで実施し、そして発現したＲＡＧＥ−ＬＢＥ変異型を所望の活性の最適な組み合わせとしてスクリーニングする。このようなスクリーニングは、当業者の知識内にある。
【００５１】
アミノ酸の挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基であろう。置換は、典型的には、単一の残基に対して導入される。そして、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲であろう。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接する対、即ち、２個の残基の欠失又は２個の残基の挿入で行われる。これは、最終構築物を達成するために、置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組み合わせを導入することができ又は組み合わせることができるという次の議論から十分に明らかになるであろう。
【００５２】
ＲＡＧＥ−ＬＢＥの挿入アミノ酸配列変異型は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥとは無関係の１個以上のアミノ酸残基が標的ＲＡＧＥ−ＬＢＥ内の所定の部位に導入され、且つ、前から存在する残基を置換させたものである。
【００５３】
保存性の低い置換を選択することによって、即ち、（ａ）該置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はらせんコンフォメーション、（ｂ）標的部位での該分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の大部分を保持することに及ぼすそれらの影響の点で、より有意に異なる残基を選択することによって、機能上の実質的な変化を生じさせることができる。一般にＲＡＧＥ−ＬＢＥ特性の最も大きな変化を生じさせることが予期される置換は、（ａ）親水性の残基、例えばセリル若しくはトレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリニル若しくはアラニルで置換され（又は疎水性残基が親水性残基で置換される）、（ｂ）システイン若しくはプロリンが任意の他の残基で置換され（又は任意の他の残基がシステイン若しくはプロリンで置換される）、（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル若しくはヒスチジルが、負電荷の残基、例えばグルタミル若しくはアスパルチルで置換され（又は負電荷の残基が正電荷の側鎖を有する残基で置換される）、或いは（ｄ）嵩高側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有しないもので、例えばグリシンで置換される（又は側鎖を有しない残基が嵩高側鎖を有するもので置換される）ようなものであろう。
【００５４】
一般には、例えば、イソロイシン若しくはバリンによるロイシンの孤立置換、グルタメートによるアスパラテートの該置換、セリンによるトレオニンの該置換又は構造的に関連するアミノ酸によるある種のアミノ酸の置換（即ち、保存的変異）は、得られる分子の生物活性にさほど大きな影響を及ぼさないであろう。保存的置換は、側鎖の点で関連のあるアミノ酸のファミリー内で生ずるようなものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、次の４種のファミリー：（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられ得る。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時として芳香族アミノ酸として一緒に分類される。同様の方法で、該アミノ酸のレパートリーは、（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン（ここで、セリンとトレオニンは、随意に、脂肪族ヒドロキシルとして別々に分類される）、（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン、並びに（６）硫黄含有＝システイン及びメチオニンとして分類できる（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ著，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１を参照されたい）。ポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的ホモログを生じさせるかどうかは、該変異型ポリペプチドが有する、野生型蛋白質と同様の態様で細胞内応答を生じさせる能力を評価することによって容易に決定できる。例えば、このようなＲＡＧＥ−ＬＢＥ変異型は、例えば、このれらのものがＲＡＧＥリガンドに結合する能力について評価できる。１個以上の置換が生じたポリペプチドは、同一の態様で容易に試験できる。
【００５５】
議論したように、いくつかの欠失、挿入及び置換は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ分子の特徴を根本的には変化させないであろう。しかしながら、該置換、欠失又は挿入を行う前にこれらの正確な効果を予測することが困難であるとき、例えば、免疫エピトープを修飾させるときには、当業者であれば、該効果は日常的なスクリーニングアッセイ法によって評価できることが分かるであろう。例えば、変異型は、典型的には、ＲＡＧＥ−ＬＢＥをコードする核酸の部位特異的変異導入、組換え細胞用培地中での該変異核酸の発現、及び、随意として、例えばポリクローナル抗ＲＡＧＥ−ＬＢＥカラムへの免疫親和性吸着（少なくとも１種の免疫エピトープによって該変異体を吸着させるための）による該細胞用培地からの精製によって作られる。次いで、この細胞溶解物又は精製ＲＡＧＥ−ＬＢＥ変異型の活性が、好適なスクリーニングアッセイ法で所望の特性についてスクリーニングされる。
【００５６】
また、ＲＡＧＥ−ＬＢＥの置換変異型としては、上に特定したＲＡＧＥ−ＬＢＥドメインを機能的に同等の他の蛋白質のドメインでルーチン法で置換した変異型も挙げられる。該変異型がＲＡＧＥ−ＬＢＥの特定のドメインのフラグメントである場合には、相当するＲＡＧＥ−ＬＢＥドメインに対して少なくとも約７０％の相同性を有することが好ましいが、必須ではない。同様の置換を、シグナル配列、Ｉｇ１、Ｉｇ２又はＩｇ３ドメインについて行うことが望ましいかもしれない。
【００５７】
上に議論したように、本発明は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥと免疫グロブリン要素とを含む融合蛋白質を提供する。免疫グロブリン要素は、ある種の免疫グロブリンの任意の部分であることができる。ある具体例では、免疫グロブリン要素は、ＩｇＧ重鎖の１個以上のドメインを含む。例えば、免疫グロブリン要素は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＭからの重鎖又はその一部分を含むことができる。免疫グロブリン重鎖の定常領域ドメインとしては、γ、α、ε、μ及びδクラスを含む免疫グロブリン重鎖の任意のクラスのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４が挙げられる。特に好ましい免疫グロブリン重鎖の定常領域ドメインは、ヒトＣＨ１である。免疫グロブリンの可変領域としては、ＶＨ、Ｖκ又はＶγが挙げられる。
【００５８】
一具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、免疫グロブリンの可変領域の代わりに、その定常領域のＮ末端に対してＣ末端で融合するが、該結合相手のＮ末端融合体も構築できる。典型的には、このような融合体は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に活性なヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。また、融合体は、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に又は重鎖のＣＨ１のＮ末端に直接に若しくは軽鎖の相当する領域にも作られる。これは、通常、好適なＤＮＡ配列を構築し、そしてこのものを組換え細胞用培地中で発現させることによって達成される。しかしながら、別法では、本発明のポリペプチドは、知られた方法に従って合成できる。
【００５９】
いくつかの具体例では、このハイブリッド免疫グロブリンは、単量体又はヘテロ若しくはホモマルチマーとして、具体的には二量体若しくは三量体として会合する。一般に、これらの会合免疫グロブリンは、以下の図表によって表されるように、既知の単位構造を有するであろう。４つの基本鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する形態である。４つの鎖単位は、さらに高分子量の免疫グロブリンで反復される。ＩｇＭは、一般に、ジスルフィド結合によって互いに保持された４つの基本鎖単位の五量体として存在する。また、ＩｇＡグロブリン及び、場合によってはＩｇＧグロブリンは、血清中ではマルチマー形態でも存在する。マルチマーの場合には、それぞれ４つの鎖単位は同一又は異なっていてよい。
【００６０】
ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、二量化ドメインに融合される。二量化ドメインは、本質的には、任意のポリペプチドであって別のポリペプチドと共に二量体（又はそれ以上の複合体、例えば三量体、四量体など）を形成するものであることができる。随意として、該二量化ポリペプチドは、他の同一の二量化ポリペプチドと会合し、それによってホモマルチマーを形成する。ＩｇＧのＦｃ要素がホモマルチマーを形成する傾向のある二量化ドメインの例である。随意として、該二量化ポリペプチドは、他の異なる二量化ポリペプチドと会合し、それによってヘテロマルチマーを形成する。Ｊｕｎロイシン・ジッパードメインは、Ｆｏｓロイシン・ジッパードメインと共に二量体を形成するため、これがヘテロマルチマーを形成する傾向のある二量化ドメインの例である。二量化ドメインは、ヘテロマルチマー及びホモマルチマーの両方を形成し得る。
【００６１】
融合蛋白質の異なる要素は、所望の官能価と一致する任意の態様で配列され得る。例えば、ＲＡＧＥ−ＬＢＥは、免疫グロブリン要素に対してＣ末端に配置され得、或いは、免疫グロブリン要素は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥに対してＣ末端に配置され得る。ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及び免疫グロブリン要素又は二量化ポリペプチドは、融合蛋白質内で隣接する必要はなく、そして追加のドメイン又はアミノ酸配列は、いずれかのドメインに対してＣ末端若しくはＮ末端に又はドメインの間に含まれ得る。
【００６２】
本発明のＲＡＧＥ−ＬＢＥ蛋白質又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質は、プロセシング及び他の翻訳後修飾のような自然過程又は斯界に周知の化学的修飾技術のいずれかによって修飾できることが分かるであろう。本発明の蛋白質中に存在し得る既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、沃素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解性プロセシング、燐酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、蛋白質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ仲介付加、例えば、アルギニル化、及びユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。このような修飾は当業者に周知であり、科学論文に非常に詳しく説明されている。グリコシル化、脂質結合、硫酸化、ヒドロキシル化及びＡＤＰリボシル化を含め、特に共通するいくつかの修飾は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク，１９９３年のような最も基本的な教科書に記載されている。また、この主題についての詳しい書評も入手できる。例えば、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，「翻訳後蛋白質修飾：展望及び予想（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓの１〜１２頁）」，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｏｎｓｏｎ著，アカデミック・プレス社，ニューヨーク，１９８３、Ｓｅｉｆｔｅｒ外，「蛋白質修飾及び非蛋白質補因子の分析」，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９０年，１８２：６２６−６４６及びＲａｔｔａｎ外，「蛋白質合成：翻訳後修飾及び老化」，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２年，６６３：４８−６２を参照されたい。
【００６３】
３．核酸
ある態様では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン要素融合蛋白質及びＲＡＧＥ−ＬＢＥ−二量化ドメイン融合蛋白質のような、上記の例示の融合蛋白質の全てを含め、ここに開示される融合蛋白質をコードする核酸を提供する。一具体例では、本発明の融合蛋白質をコードする核酸は、ヒトＲＡＧＥをコードする図８の核酸又は該核酸の一部分を含む。
【００６４】
また、融合蛋白質をコードする核酸としては、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ、免疫グロブリン要素又は二量化ドメインの変異型をコードする核酸も挙げられる（例えば、図１Ａ又は３Ｂに表されるような核酸）。変異核酸配列としては、１個以上の核酸の置換、付加又は欠失によって異なる、対立遺伝子変異型のような配列が挙げられ、従って、ＲＡＧＥ、免疫グロブリン又は二量化ドメインの核酸配列とは異なるコード配列が挙げられるであろう。随意として、変異型は、基準配列（例えば、図３Ｂに示されるよな配列）に、少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％一致するであろう。また、変異型としては、ストリンジェントな条件（即ち、約１Ｍの塩で形成されるＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）以下の約２０〜２７℃と同等の）下で適切な基準核酸配列にハイブリダイズする核酸配列も挙げられる。例示具体例では、変異核酸は、図３Ａのアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質をコードする。
【００６５】
当業者であれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させる好適なストリンジェント条件は変更できることを容易に理解するであろう。例えば、当業者であれば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でハイブリダイゼーションを実行し、次いで５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄を実行することができよう。例えば、該洗浄段階の塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェントさ〜５０℃で約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェントさから選択できる。さらに、該洗浄段階の温度は、室温（約２２℃）での低いストリンジェント条件から約６５℃の高いストリンジェント条件に上昇できる。温度及び塩の両方は変更でき、又は温度若しくは塩濃度は、その他の変数を変更しつつ一定に保持できる。一具体例では、本発明は、室温で６×ＳＳＣの低ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、次いで室温で２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。
【００６６】
本発明の別の態様では、主題の核酸は、主題の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター内に与えられ、且つ、少なくとも１個の調節配列に機能的に連結される。「機能的に連結した」とは、該核酸配列が調節配列に該核酸配列の発現を可能にする態様で連結したことを意味するものとする。調節配列は当業者には周知であり、そして融合ポリペプチドの発現を誘導するために選択される。従って、用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現調節要素が含まれる。代表的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，「遺伝子発現技術」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミック・プレス社，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記載されている。例えば、ある種のＤＮＡ配列に機能的に結合したときに該ＤＮＡ配列の発現を調節する様々な発現調節配列のうち任意のものをこれらのベクターに使用して融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルス又はサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、発現がＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって誘導されるＴ７プロモーター、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコート蛋白質のための調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ又はその他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼ、例えばＰｈｏ５のプロモーター、酵母のａ−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体のプロモーター及び原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子発現を調節することが知られている他の配列並びにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。この発現ベクターのデザインは、形質転換されるべき宿主細胞の選択及び／又は発現されるべき所望の蛋白質のタイプのような因子に依存し得ることを理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、該コピー数を調節する能力及び抗生物質耐性マーカーのような該ベクターがコードする任意の他の蛋白質の発現も考慮すべきである。
【００６７】
明らかなように、主題の遺伝子構築物を使用して、主題の融合ポリペプチドを培地中で増殖する細胞内で発現させること、例えば、融合蛋白質又はポリペプチドを含め、蛋白質又はポリペプチドを精製のために産生させることができる。
【００６８】
また、本発明は、主題の融合蛋白質のうち１種以上のためのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関するものでもある。該宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であることができるが、本発明は、ヒトの一部である細胞を包含しない。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｅ．Ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用して）、酵母又はほ乳類細胞内で発現できる。好ましいほ乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である。その他の好適な宿主細胞は、当業者に周知である。
【００６９】
従って、本発明は、さらに主題の融合ポリペプチドを製造する方法に関する。例えば、融合蛋白質をコードする発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を好適な条件下で培養してポリペプチドの発現を生じさせることができる。該ポリペプチドは分泌され、そして細胞と該ポリペプチドを含有する培地との混合物から単離できる。別法では、該ポリペプチドを細胞質に保持しておき、そして該細胞を集め、溶解させ、そして該蛋白質を単離できる。細胞培養液は、宿主細胞、培地及びその他の副産物を含む。細胞培養のための好適な培地は斯界に周知である。ポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞又はその両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及び該ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製を含め、蛋白質を精製するための斯界に周知の技術を使用して単離できる。ある具体例では、融合蛋白質は、その精製を促進させるドメイン、例えば、ＧＳＴ部分又はヘキサヒスチジン部分を含有する。好ましくは、該精製部分は、融合蛋白質の残部から容易に開裂できる。
【００７０】
本発明の融合蛋白質は、適切なクローン遺伝子又はその一部分を原核細胞、真核細胞又はその両方での発現にとって好適なベクターに連結させることによって作製できる。組換え融合蛋白質の作製用の発現ビヒクルとしては、プラスミド及びその他のベクターが挙げられる。例えば、融合蛋白質の発現用の好適なベクターとしては、次のタイプのプラスミド：Ｅ．Ｃｏｌｉのような原核細胞内発現用のｐＢＲ３３２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。
【００７１】
酵母内で組換え蛋白質を発現させるための多数のベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２及びＹＲＰ１７は、遺伝子構築物のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの導入に有用なクローニング用及び発現用ビヒクルである（例えば、Ｂｒｏａｃｈ外，「遺伝子発現の実験操作」（１９８３），Ｍ．Ｉｎｏｕｅ著，アカデミック・プレス，ｐ．８３を参照されたい。ここに引用して説明に代える。）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２のｏｒｉの存在のためにＥ．ｃｏｌｉで複製でき、しかも酵母の２μプラスミドの複製決定因子ためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでも複製できる。さらに、アンピシリン耐性のような薬剤耐性マーカーも使用できる。
【００７２】
好ましいほ乳類発現用ベクターは、細菌でのベクターの複製を促進させるための原核細胞の配列及び真核生物で発現する１個以上の真核細胞転写単位の両方を含有する。ｐｃＤＡＮＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来ベクターが真核細胞のトランスフェクションに好適なほ乳類細胞発現ベクターの例である。これらのベクターのうちいくつかは、原核細胞及び真核細胞の両方で複製及び薬剤耐性選択を促進させるために、ｐＢＲ３２２のような細菌プラスミドからの配列で修飾されている。或いは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）又はＥＢウイルスのようなウイルス誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）を真核細胞での蛋白質の一時的な発現のために使用できる。その他のウイルス（レトロウイルスを含む。）発現系の例は、以下の遺伝子治療薬送達系の説明において見出され得る。プラスミドの調製及び宿主生物の形質転換に使用される様々な方法は斯界に周知である。原核細胞及び真核細胞の両方のために好適な他の発現系並びに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版，１９８９）第１６章及び１７章を参照されたい。場合によっては、融合蛋白質をバキュロウイルス発現系の使用によって発現させることが望ましいかもしれない。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１のような）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１のような）及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃIIIのような）が挙げられる。
【００７３】
別の具体例では、組換え蛋白質の所望の部分のＮ末端にあるポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位配列のような精製リーダー配列についての融合遺伝子コードは、Ｎｉ2+金属樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、発現した融合蛋白質の精製を可能にし得る。次いで、該精製リーダー配列をエンテロキナーゼ処理によって取り除いて精製された融合蛋白質を与えることができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ外，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７（１９８７）、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ外，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２（１９９１）を参照されたい。）。
【００７４】
融合遺伝子を作るための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列についての様々なＤＮＡフラグメントコードの連結は、連結反応のための平滑末端化又は付着末端化された末端、好適な末端を与えるための制限酵素消化、適宜付着末端のフィルイン、望ましくない連結を防止するためのアルカリホスファターゼ処理及び酵素的連結反応を使用する慣用技術に従って実行される。別の具体例では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用技術によって合成できる。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２種の連続する遺伝子フラグメント（これらはその後アニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成する）間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ外著，ジョン・ウイリー＆ソンズ，１９９２を参照されたい。）。
【００７５】
クローンＤＮＡ配列は、電気穿孔法、リポフェクション法及び燐酸カルシウム仲介トランスフェクション法を含め、斯界に知られた様々な方法によって培養ほ乳類細胞に導入できる。
【００７６】
４．抗体及びそのための使用
本発明の別の態様は、図３Ａに示されるようなＲＡＧＥアミノ酸配列の１個以上のエピトープと特に免疫反応性のある単離された抗体に関する。好ましくは、該抗体が特に免疫反応性のあるエピトープは、図７で表されるようなＲＡＧＥアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３０、１〜３２１、１〜２３０及び１〜１１８から選択される。
【００７７】
ある具体例では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント及び単鎖抗体から選択される。例えば、抗蛋白質／抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体は、標準的なプロトコルによって作られ得る（例えば、抗体：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ著（コールド・スプリング・ハーバー出版：１９８８）を参照されたい。）。随意として、該抗体は、検出可能な標識で標識される。
【００７８】
ある具体例では、本発明の抗体は、ＲＡＧＥが１種以上のＲＡＧＥ−ＢＰに結合するのを抑制する。例えば、図７のＲＡＧＥアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３０のエピトープと特に免疫反応性のある抗体は、ＲＡＧＥが、糖化最終産物（ＡＧＥ）、アミロイド発生ペプチド／ポリペプチド、アンホテリン及びＳ１００／カルグラニュリンのようなそのリガンドの少なくとも一つに結合するのを阻害する。
【００７９】
また、本発明は、図３Ａに示されるようなＲＡＧＥアミノ酸配列の１個以上のエピトープと特に免疫原性のあるポリクローナル抗体の精製調製物をも意図する。
【００８０】
マウス、ハムスター又はウサギのような動物に、該ペプチドの免疫原性の形（例えば、図７のＲＡＧＥアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜３３０又は抗体応答を誘導できる免疫原性フラグメント又は上記のような融合蛋白質）で免疫性を与えることができる。ある種の蛋白質又はペプチドに免疫原性を付与するための技術としては、キャリヤーへの結合又は斯界に周知の他の技術が挙げられる。ポリペプチドの免疫原性の部分をアジュバントの存在下に投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によって監視できる。標準的なＥＬＩＳＡ法その他の免疫定量法を抗原としての免疫源と共に使用して抗体のレベルを評価することができる。
【００８１】
主題のポリペプチドの抗原性調製物で動物を免疫化させた後に、抗血清を得、そして所望ならば、該血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を作製するためには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から採取し、そして標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞のような不死化細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生み出すことができる。このような技術は斯界に周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（元々Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）によって開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒ外，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３））及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ外、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６（１９８５））が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＲＡＧＥポリペプチドのエピトープと特に反応性のある抗体及びこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養液から単離されたモノクローナル抗体の作製のために免疫化学的にスクリーニングできる。
【００８２】
ここで使用するときに、用語「抗体」には、ＲＡＧＥポリペプチドのエピトープと特に反応性のあるそれらのフラグメントをも含むものとする。抗体は、慣用技術を使用してフラグメント化でき、そして該フラグメントは、抗体全体について上記したのと同一の態様で実用のためにスクリーニングできる。例えば、Ｆ（ａｂ）2フラグメントは、抗体をペプシン処理することによって生成できる。得られたＦ（ａｂ）2フラグメントをジスルフィド架橋を減少させるために処理してＦａｂフラグメントを生じさせることができる。
【００８３】
本発明の抗体は、さらに、該抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域によって与えられる、主題のポリペプチドのうち１種に対して親和性を有する二重特異性分子、単鎖分子、キメラ及びヒト化分子を含むものとする。好ましい具体例では、該抗体は、それに結合し且つ検出できる標識をさらに含む（例えば、この標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子であることができる。）。
【００８４】
ある具体例では、本発明の抗体は、組合わせ治療の一部分として他の薬剤と共に投与できる。例えば、炎症性状態の場合には、該主題の抗体は、炎症性疾患又は状態の治療に有用な他の１種以上の薬剤と共に投与できる。心臓血管疾患状態、具体的にはかなりの炎症性成分を有すると考えられるアテローム斑に起因するような該疾患状態の場合には、主題の抗体は、心臓血管疾患の治療に有用な１種以上の他の薬剤と共に投与できる。癌の場合には、主題の抗体は、１種以上の抗脈管形成因子、化学療法剤と共に、又は放射線治療のためのアジュバントとして投与できる。さらに、該主題の抗体の投与は、多くの異なる癌治療剤を組み合わせることのできる癌治療法の一部分として役立つであろうと考えられる。ＩＢＤの場合には、主題の抗体は、１種以上の抗炎症剤と共に投与でき、且つ、さらに修正食事療法と組み合わせることができる。
【００８５】
主題の抗体の投与は、ＲＡＧＥ関連疾患を治療するために使用でき、又はＲＡＧＥ関連疾患を治療するための他の薬剤及び治療法と併用できる。
【００８６】
５．ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害するための方法
本発明のある態様は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害するための方法に関する。好ましくは、このような方法は、ＲＡＧＥ関連疾患を治療するために使用される。
【００８７】
好ましい具体例では、このような方法は、ここに開示されるＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質を投与することを含む。別の具体例では、このような方法は、図３Ａに示されるようなＲＡＧＥアミノ酸配列の１個以上のエピトープと特に免疫反応性のある上記のような抗体を投与することを含む。さらに別の具体例では、このような方法は、１種以上のＲＡＧＥ−ＢＰへのＲＡＧＥの結合を阻害する化合物を投与することを含む。このような化合物を同定する代表的な方法は、以下の６節で議論する。
【００８８】
ある具体例では、該相互作用は、試験管内で、例えば精製蛋白質、細胞、生物学的試料、組織、人工組織などを含む反応混合物中で阻害される。ある具体例では、該相互作用は、例えば、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体を投与し又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体を生体内で産生させることによって、生体内で阻害される。
【００８９】
ある態様では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を抑制することによってＲＡＧＥ関連疾患を治療するための方法に関する。このような方法としては、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質、上記のような抗ＲＡＧＥ抗体、又は１種以上のＲＡＧＥ−ＢＰへのＲＡＧＥの結合を阻害する同定された化合物を投与することが挙げられる。
【００９０】
６．ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＢＰの発現を阻害するための方法
本発明のある態様は、ＲＡＧＥ若しくはＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、Ｓ１００若しくはアンホテリン）又はその両方の発現を阻害する方法を意図する。好ましくは、このような方法は、ＲＡＧＥ関連疾患を治療するために使用できる。
【００９１】
一具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＢＰの発現を低減させるためにアンチセンス核酸を使用することに関する。このようなアンチセンス核酸は、例えば、細胞内で転写されたときに、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドをコードする細胞性ｍＲＮＡのうち少なくとも１種のユニークな部分に相補的なＲＮＡを生じさせる発現プラスミドとして与えられ得る。別法では、該構築物は、オリゴヌクレオチドであって、生体外で生成され、且つ、細胞に導入されたときに、バイオマーカーポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現を阻害するものである。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに対して抵抗性があり、しかして生体内で安定である随意として修飾されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための代表的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホチオエート及びメチルホスホネートアナログである（例えば、米国特許第５１７６９６６号、同５２６４５６４号及び同５２５６７７５号も参照されたい。）。さらに、核酸治療に有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプローチは、例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ外，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６及びＳｔｅｉｎ外，（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８：２６５９−２６６８に概説されている。
【００９２】
別の具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＢＰ遺伝子のノックダウンをもたらすためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用することに関する。ＲＮＡｉ構築物は、標的遺伝子の発現を特異的にブロックし得る二重鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的且つ転写後の態様で遺伝子発現をブロックする植物及び蠕虫類で観察される現象に対して最初に適用された用語である。ＲＮＡｉは、試験管内又は生体内で遺伝子発現を阻害する有用な方法を与える。ＲＮＡｉ構築物は、標的核酸配列と一致する若しくは実質的に一致する長いｄｓＲＮＡ又は標的核酸配列の領域のみと一致する若しくは実質的に一致する短いｄｓＲＮＡのいずれかを含むことができる。
【００９３】
随意として、該ＲＮＡｉ構築物は、細胞の生理的条件下で、阻害されるべき遺伝子（例えば、「標的」遺伝子）に対するｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を含有する。二重鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを仲介することのできる自然ＲＮＡに十分に類似することのみが必要である。従って、本発明は、遺伝子突然変異、株多形性又は進化的分岐のために予期され得る配列変異を許容することができるという利点を有する。標的配列とＲＮＡｉ構築物配列との間の許容される核酸ミスマッチは、５塩基対中１個以下又は１０塩基対中１個以下又は２０塩基対中１個以下又は５０塩基対中１個以下である。ｓｉＲＮＡ二重鎖の中心でのミスマッチが最も重要であり、そしてこれは標的ＲＮＡの開裂を本質的に無効にすることができる。対照的に、標的ＲＮＡに相補的なｓｉＲＮＡ鎖の３'末端での核酸は、さほど標的認識の特異性に寄与しない。配列の一致性は、斯界に知られている配列の比較及びアラインメントアルゴリズムによって（例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１及び本明細書において引用した文献を参照されたい。）及び、例えば、デフォルトパラメーターを使用するＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラム（例えばウィスコンシン大学遺伝子コンピューティンググループ）により実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって該核酸配列間の差（％）を算出することによって最適化できる。抑制ＲＮＡと標的遺伝子の部分との間の配列一致性は、９０％以上又はさらに１００％であることが好ましい。別法では、該ＲＮＡの二重鎖領域は、機能的には、標的遺伝子転写物の一部分とハイブリダイズできる核酸配列であると定義できる（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ，５０℃又は７０℃で１２〜１６時間にわたるハイブリダイゼーション、その後の洗浄）。
【００９４】
二重鎖構造は、単鎖自己相補ＲＮＡ又は相補ＲＮＡ二重鎖によって形成され得る。ＲＮＡ二重鎖の形成は、細胞の内部又は外部のいずれかで開始され得る。このＲＮＡは、１個の細胞当たり少なくとも１コピーを与える量で導入できる。さらに多数（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）の二重鎖材料は、より効果的な抑制を生じさせ得るが、それより少ない数も特定の用途には有用であり得る。抑制は、該ＲＮＡの二重鎖領域に相当するヌクレオチド配列が遺伝子抑制のための標的となるという点で配列特異的である。
【００９５】
主題のＲＮＡｉ構築物は、「小さなＲＮＡ（small interfering RNA）」又は「ｓｉＲＮＡ」であることができる。これらの核酸は、ほぼ１９〜３０ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドの長さである。このｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を強化し、且つ、該複合体を特定の配列への対合により標的ｍＲＮＡに導くと考えられる。結果として、該標的ｍＲＮＡは、該蛋白質複合体中のヌクレアーゼによって分解する。特定の具体例では、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は、３'ヒドロキシル基を含む。ある具体例では、ｓｉＲＮＡ構築物は、例えば、酵素ダイサーの存在下で、より長い二重鎖ＲＮＡのプロセシングによって生成できる。この混合物は、該ｄｓＲＮＡが約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセシングされる条件下で保持される。該ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に周知の多数の技術を使用して精製できる。例えば、ゲル電気泳動法を使用してｓｉＲＮＡを精製できる。別法では、非変性カラムクロマトグラフィーのような非変性法を使用してｓｉＲＮＡを精製できる。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセリン勾配遠心分離法、抗体との親和性精製法を使用してｓｉＲＮＡを精製できる。
【００９６】
ＲＮＡｉ構築物の作製は、化学的合成法又は組換え核酸技術によって実施できる。処理細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは生体内で転写を仲介することができ、又はクローン化ＲＮＡポリメラーゼは試験管内転写のために使用できる。ＲＮＡｉ構築物は、例えば、細胞性ヌクレアーゼへの感受性を低下させ、生物学的利用能を改善させ、処方特性を改善させ、及び／又は他の薬物動態を変化させるために、ホスフェート−糖骨格又はヌクレオシドのいずれかに修飾を包含し得る。例えば、自然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子を少なくとも１個含むように修飾できる。ＲＮＡ構造内での修飾は、ｄｓＲＮＡに対する一般的な応答を回避しつつ特異的な遺伝子抑制を可能にするように適合できる。同様に、塩基を修飾してアデノシンデアミナーゼの活性を阻害できる。該ＲＮＡｉ構築物は、酵素的に又は部分的な／全体的な有機合成によって作製でき、任意の修飾リボヌクレオチドは、試験管内での酵素的に又は有機合成によって導入できる。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法は、ＲＮＡｉ構築物を修飾するのにも適用できる（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ外．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：７７６−７８０、Ｗｉｌｓｏｎ外（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ  ７：８９−９８、Ｃｈｅｎ外（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６６１−２６６８、Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ外（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７：５５−６１を参照されたい。）。単なる例示であるが、ＲＮＡｉ構築物の骨格は、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマー又は糖修飾物（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、α型配置）で修飾され得る。
【００９７】
また、ＲＮＡｉ構築物は、長い二重鎖ＲＮＡの形態にあることもできる。ある具体例では、該ＲＮＡｉ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。ある具体例では、該ＲＮＡｉ構築物は、４００〜８００塩基の長さである。該二重鎖ＲＮＡは、細胞内で消化されて、例えば、該細胞内でｓｉＲＮＡ配列が生じる。しかしながら、長い二重鎖ＲＮＡを生体内で使用するのは、おそらく配列依存性ｄｓＲＮＡ応答に起因し得る悪影響のため、必ずしも実用的ではない。このような具体例では、インターフェロン若しくはＰＫＲの影響を低減させる局部送達系及び／又は薬剤を使用することが好ましい。
【００９８】
別法として、該ＲＮＡｉ構築物は、ヘアピン構造の形態にある（ヘアピンＲＮＡと呼ぶ。）。該ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成でき、又は、生体内でＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターから転写することによって形成できる。このようなヘアピンＲＮＡをほ乳類細胞内での遺伝子抑制のために作り且つ使用する例が、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎ外，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，２００２，１６：９４８−５８、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ外，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：３８−９、ＭｃＭａｎｕｓ外，ＲＮＡ，２００２，８：８４２−５０、Ｙｕ外，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２，９９：６０４７−５２に記載されている。好ましくは、このようなヘアピンＲＮＡを細胞内又は動物内で設計して所望の遺伝子の連続的で安定な抑制を保証する。ヘアピンＲＮＡを細胞内でプロセシングすることによってｓｉＲＮＡを作製できることが斯界に知られている。
【００９９】
ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０には、真核細胞内で導入遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ転写の両方を生じさせるための該導入遺伝子の二方向転写用の代表的なベクターが記載されている。従って、ある具体例では、本発明は、次のユニークな特性を有する組換えベクターを提供する：このものは、対立する方向に配置された２個の重複転写単位を有し、且つ、問題のＲＮＡｉ構築物に対して導入遺伝子を両側に配置するウイルスレプリコンを含み、ここで、該２個の重複転写単位は、宿主細胞内で該遺伝子導入フラグメントからセンス及びアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を生じさせる。
【０１００】
別の具体例では、本願は、ＲＡＧＥポリペプチド又はＲＡＧＥ−ＢＰの活性に影響を与える（例えば、それを阻害する）ためにアプタマーを使用することに関する。アプタマーは、所望の分子構造に特異的に結合するように選択されるオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、典型的にはＲＮＡであるが、ＤＮＡ若しくはアナログ又はその誘導体、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）及びホスホロチオエート核酸（これに限定されない）であってもよい。本明細書において使用するときに、用語「アプタマー」、例えば、ＲＮＡアプタマー又はＤＮＡアプタマーには、標的分子に特異的に結合する単鎖オリゴヌクレオチドが含まれる。アプタマーは、標的分子にきつく且つ特異的に結合する。蛋白質に対して、大部分のアプタマーは、１ｐＭ〜１ｎＭの範囲のＫｄ（平衡解離定数）で結合する。
【０１０１】
アプタマーは、典型的には、ファージディスプレイ（試験管内分子進化としても知られている）の親和性選択に類似する親和性選択プロセスの産物である。このプロセスは、親和性分離のいくつかの縦列反復を実行すること、例えば、所望の免疫源が結合している固体担体を使用し、次いで該免疫源に結合した核酸を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することを伴う。これによって、親和性分離のそれぞれのラウンドが、所望の免疫源にうまく結合する分子についての核酸ポピュレーションを高める。この態様では、核酸の無作為プールは、標的分子に特異的に結合するアプタマーを生じさせるように「教育」できる。アプタマー配列は、例えば、次の文献：米国特許第５４７５０９６号、同５５９５８７７号、同５６７０６３７号、５６９６２４９号、同５７７３５９８号、同５８１７７８５号に記載されたＳＥＬＥＸ法を含め、当業者に周知の方法に従って生成できる。また、アプタマー及びそれらの調製方法は、例えば、Ｅ．Ｎ．Ｂｒｏｄｙ他（１９９９）  Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３８１−３８８に記載されている。所望ならば参照されたい。
【０１０２】
別の具体例では、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、ｍＲＮＡ転写物を触媒によって開裂させるようにデザインされたリボザイム分子を使用することに関する（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３６４、Ｓａｒｖｅｒ外，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５及び米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい。）。ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で開裂させるリボザイムを使用して特定のｍＲＮＡ分子を破壊させることができるが、ハンマーヘッドリボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと共に相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される部位でｍＲＮＡを開裂させる。標的ｍＲＮＡが次の２塩基配列：５'−ＵＧ−３'を有することが唯一の条件である。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び作製は斯界に周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１に十分に記載されている。また、本発明のリボザイムとしては、ＲＮＡリボヌクレアーゼ（以下、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」という。）、例えばテトラヒメナ・テルモフィラ内で天然に生じるもの（ＩＶＳ又はＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）及び広範囲にわたって広く記載されてきたもの（Ｚａｕｇ外，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８、Ｚａｕｇ及びＣｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０−４７５、Ｚａｕｇ外，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９−４３３、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．による国際公開Ｗ０８８／０４３００、Ｂｅｅｎ及びＣｅｃｈ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６を参照されたい。）が挙げられる。
【０１０３】
さらなる具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＢＰ遺伝子の発現を抑制させるためにＤＮＡ酵素を使用することに関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス技術及びリボザイム技術の両方の力学的特徴のいくつかを取り入れている。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによく似ている一方でリボザイムにもよく似ている特定の標的核酸配列を認識すると同時に、該標的核酸を触媒的且つ特異的に開裂させるようにデザインされている。簡単に言えば、ある種の標的核酸を特異的に認識し且つ開裂させる理想的なＤＮＡ酵素をデザインするために、当業者は、まずユニークな標的配列を同定しなければならない。好ましくは該ユニーク配列又は本質的配列は、１８〜２２ヌクレオチドのＧ／Ｃリッチ配列である。高Ｇ／Ｃ含量は、ＤＮＡ酵素と標的配列との間の強力な相互作用を保証するのに役立つ。該ＤＮＡ酵素を合成するときに、特異的なアンチセンス認識配列であって該酵素の標的が該遺伝情報となるものは、このものが該ＤＮＡ酵素の２個のアームを含み、しかも該ＤＮＡ酵素のループが該２個の特異的アームの間に位置するように分割される。ＤＮＡ酵素の作製方法及び投与方法は、例えば、米国特許第６１１０４６２号に見出すことができる。
【０１０４】
７．治療方法
本発明のある具体例は、ＲＡＧＥ関連疾患を治療する方法に関する。ＲＡＧＥ関連疾患は、一般的に、冒された細胞がＲＡＧＥ又は１種以上のＲＡＧＥリガンドの発現の増加を示す任意の疾患を含むものとして特徴付けられ得る。また、ＲＡＧＥ関連疾患は、ＲＡＧＥ機能の低下によって治療できる（即ち、一つ以上の症状を消失又は改善できる）任意の疾患としても特徴付けられ得る。例えば、ＲＡＧＥ機能は、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を破壊する薬剤の投与によって低下し得る。別法として、ＲＡＧＥ機能は、上記のようなＲＡＧＥ又はＲＡＧＥ−ＢＰ遺伝子の発現を抑制する薬剤（例えば、アンチセンス核酸又はＲＮＡｉ構築物）の投与によって低下し得る。
【０１０５】
ＲＡＧＥの発現の増加は、糖尿病血管症、腎症、網膜症、ニューロパシー、並びに、アルツハイマー病及び血管壁の免疫／炎症反応を含めその他の疾患のような、いくつかの病理学的状態と関連がある。ＲＡＧＥリガンドは、関節炎（リウマチ様関節炎のような）を含め、多くの炎症性疾患に冒された組織内で産生される。糖尿病組織では、ＲＡＧＥの産生は、糖化最終産物の過剰産生に起因すると思われる。これは、糖尿病における血管疾患に至る酸化ストレス及び内皮細胞機能障害を生じさせる。
【０１０６】
組織内でのアミロイドの付着は細胞に様々な毒性作用を生じさせ、そしてこれはアミロイド症と呼ばれ得る一組の病気の特徴である。ＲＡＧＥは、アミロイド−βペプチド、Ａｂｅｔａ、アミリン、血清アミロイドＡ及びプリオン誘導ペプチドで見出されるようなβシート型繊維状物質に結合する。また、ＲＡＧＥは、アミロイド構造を有する組織内でも高レベルで発現する。従って、ＲＡＧＥは、アミロイド疾患に関わっている。このＲＡＧＥ−アミロイド相互作用は、ニューロン変性に至る酸化ストレスを生じさせると思われる。
【０１０７】
様々なＲＡＧＥリガンド、特にＳ１００／カルグラニュリンファミリーのリガンドは、炎症を起こした組織内で産生される。この観察は、リポ多糖攻撃に対する応答で見られるような急性炎性（敗血症のような）及び関節炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患などの様々な形態で見られるような慢性炎性の両方については事実である。また、心臓血管疾患、特にアテローム斑から生じるものは、実質的な炎症性成分を有すると思われる。このような疾患としては、閉塞性、血栓性及び塞栓性疾患、例えば、それぞれ狭心症、脆弱斑疾患及び塞栓性脳卒中が挙げられる。これらの全てがＲＡＧＥ関連疾患であるとみなすことができる。
【０１０８】
また、腫瘍細胞も、ＲＡＧＥリガンド、特にアンホテリンの発現の増加を示すが、これは、癌もまたＲＡＧＥ関連疾患であることを示している。さらに、慢性炎症性の酸化の影響及びその他の様相は、ある種の腫瘍の発生に寄与する影響を及ぼし得る。
【０１０９】
従って、本発明の組成物で治療できるＲＡＧＥ関連疾患のリストとしては、アミロイド症（アルツハイマー病のような）、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患（リウマチ様関節炎、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸炎、多発性硬化症、乾癬、狼瘡及びその他の自己免疫疾患のような）、急性炎症性疾患（敗血症のような）、ショック（例えば、敗血症ショック、出血性ショック）、心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、脆弱斑疾患、狭心症及び再狭窄）、糖尿病（特に糖尿病の心臓血管疾患）、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、癌、脈管炎及びその他の血管炎症候群、例えば、壊死性脈管炎、腎症、網膜症及びニューロパシーが挙げられる。
【０１１０】
ある好ましい具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質を投与することを含む、関節炎の治療方法に関する。随意として、該融合蛋白質は、ポリペプチドとして、例えば医薬組成物の一部分として投与できる。特に好ましい具体例では、該融合蛋白質は、該融合蛋白質をコードし且つ被検体の細胞内で該融合蛋白質を発現するようにデザインされた核酸を投与することによって投与できる。
【０１１１】
ある態様では、本発明は、主題の融合蛋白質の投与を提供する。主題の融合蛋白質は、試験管内又は生体内で投与でき、そして該主題の融合蛋白質の発現は、主題の融合蛋白質それ自体を投与することによって、又は該主題の融合蛋白質をコードする核酸を投与することによって達成できる。ある具体例では、該主題の融合蛋白質又は核酸は、医薬組成物として投与される。他の具体例では、該主題の融合蛋白質又は核酸は、１種以上の追加の薬剤と共に投与される。本発明のさらに別の態様では、該主題の融合蛋白質の投与は、特定の症状を治療するための治療形態の一部分である。主題の蛋白質／核酸を単独で投与することによって、又は主題の蛋白質／核酸を他の薬剤と共に投与することによって治療できる状態としては、ＲＡＧＥ関連疾患が挙げられる。ＲＡＧＥ関連疾患の例としては、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、脈管炎及びその他の血管炎症候群、例えば、壊死性血管炎、アルツハイマー病、癌、糖尿病性網膜症のような糖尿病の合併症、乾癬及び狼瘡のような自己免疫疾患が挙げられる。ＲＡＧＥ関連疾患としては、さらに、急性炎症性疾患（例えば敗血症）、慢性炎症性疾患及び炎症によって悪化する他の状態（即ちこれらの症状は、炎症を低減させることによって改善され得る。）が挙げられる。
【０１１２】
特定の蛋白質をコードする核酸（例えば、主題の融合蛋白質をコードする核酸）を送達するための様々な方法は、斯界に周知である。試験管内又は生体内投与のために使用される発現構築物は、任意の生物学的に有効なキャリヤー（例えば、該発現構築物を効果的に送達することのできる任意の処方物又は組成物）中で投与できる。アプローチとしては、細胞に直接トランスフェクトすることによって機能するウイルスベクターに主題の遺伝子を挿入することが挙げられる。代表的なウイルスベクターとしては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１及びレンチウイルスが挙げられる。追加のアプローチとしては、組換え細菌プラスミド又は真核生物プラスミドの使用が挙げられる。プラスミドＤＮＡの送達は、例えば、陽イオン性リポソーム（リポフェクチン）又は誘導体化されたもの（例えば、抗体結合体）、ポリリシン結合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ又は他のそのような細胞内キャリヤー及びＣａＰＯ4沈殿によって促進できる。場合によっては、発現構築物は、発現が望まれる特定の細胞又は組織への注入によって直接送達できる。当業者であれば、これらの送達系の中から、発現が望まれる細胞又は組織に応じて、投与を全身的にすべきか又は局所的にすべきかどうか及び発現の所望量を容易に選択することができる。
【０１１３】
主題の融合蛋白質を発現する核酸（発現構築物）を投与するための一つの特定のアプローチは、主題の融合蛋白質をコードする核酸を含有するウイルスベクターを使用することによる。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的細胞集団の大部分が該核酸を受容し得るという利点を有する。さらに、例えば、ウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡによってウイルスベクター内にコードされた分子は、該ベクターを取り入れた細胞内で効率的に発現する。
【０１１４】
レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターは、一般に、特にヒトへの外来遺伝子の試験管内転移についての選り抜きの組換え遺伝子送達系であると理解される。これらのベクターは、効率的な細胞への遺伝子送達を与え、転移された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれ得る。レトロウイルスの使用についての主な必須条件は、それらの使用の安全性を、特に細胞集団内での野生型ウイルスの伝播の可能性に関して保証することである。複製欠損レトロウイルスのみを産生する分化細胞系統（「パッケージ細胞」と呼ばれる）の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの実用性が高まり、そして欠損レトロウイルスは、遺伝子治療の目的での遺伝子転移の用途のためによく特徴付けられている（概要については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照されたい。）。従って、レトロウイルスコード配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部分が主題の融合蛋白質をコードする核酸で置換され、レトロウイルス複製が欠損した組換えレトロウイルスが構築できる。次いで、この複製欠損レトロウイルスは、標準的な技術によりヘルパーウイルスの使用によって標的細胞に感染させるたために使用できるビリオンにパッケージ化される。組換えレトロウイルスを作製するためのプロトコル及び細胞に試験管内又は生体内でこのようなウイルスを感染させるプロトコルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．外．（著者）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），９．１０−９．１４節及びその他の標準的なラボマニュアルに見出すことができる。好適なレトロウイルスの例としては、当業者であれば周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭが挙げられる。環境栄養性及び両栄養性レトロウイルス系の両方を調製するための好適なパッケージウイルス系統の例としては、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２及びψＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、上皮細胞を含め多くの異なる細胞型に様々な遺伝子を試験管内及び／又は生体内で導入するために使用されてきた（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，外（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ外（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ外（１９９０）Ｐｌｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６１４１−６１４５、Ｈｕｂｅｒ外（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ外（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ外（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ外（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４、Ｋａｙ外（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７、Ｄａｉ外（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９��、Ｈｗｕ外（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４８６８１１６号、同第４９８０２８６号、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０７１３６、ＷＯ８９／０２４６８、ＷＯ８９／０５３４５及びＷＯ９２／０７５７３を参照されたい。）。
【０１１５】
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージ蛋白質を修飾することによって、レトロウイルスの感染範囲及び結果としてレトロウイルスをベースとするベクターの感染範囲を制限することが可能であることが示された（例えば、ＷＯ９３／２５２３４及びＷＯ９４／０６９２０を参照されたい。）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲を改変させるための戦略としては、細胞表面の抗原に対して特異的な抗体をウイルスｅｎｖ蛋白質に結合させること（Ｒｏｕｘ外（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：９０７９−９０８３、Ｊｕｌａｎ外（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２５１−３２５５及びＧｏｕｄ外（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１−２５４）、又は細胞表面受容体のリガンドを該ウイルスのｅｎｖ蛋白質に結合させること（Ｎｅｄａ外（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１４１４３−１４１４６）が挙げられる。結合は、蛋白質又は他の受容体−リガンド薬剤との化学的な架橋の形であることができ、並びに融合蛋白質（例えば、単鎖抗体／ｅｎｖ融合蛋白質）を生じさせることによって行うことができる。
【０１１６】
本発明に有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、このものが対象の遺伝子産物をコードし且つ発現する一方で、通常の溶菌ウイルス生活環において複製するその能力については不活性化されないように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ外（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ外（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ外（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２４又は他のアデノウイルス株（Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄｚなど）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。そのウイルス粒子は、精製及び濃縮に対して比較的安定であり且つそれらを受けやすく、しかも上記のように感染性の範囲に影響を与えるように改変できる。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、エピソームの状態を保持し、それによって、導入されたＤＮＡが宿主のゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ）に組み込まれるようになる位置での挿入突然変異の結果として起こり得る見込まれる問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの保持容量は、他の遺伝子送達ベクターに対して大きい（８キロ塩基まで）（先に引用したＢｅｒｋｎｅｒ外、Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ及びＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されており、そのため本発明にも好ましい大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１及びＥ３遺伝子の全部又は一部について欠失しているが、アデノウイルス遺伝材料の８０％程度を保持している（Ｊｏｎｅｓ外（１９７９）Ｃｅｌｌ  １６：６８３、Ｂｅｒｋｎｅｒ外，前出及びＧｒａｈａｍ外，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの方法，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ著（Ｈｕｍａｎａ，  Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９９１）第７巻ｐｐ．１０９−１２７を参照されたい。）。挿入された遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主後期プロモーター（ＭＬＰ）及び関連するリーダー配列、Ｅ３プロモーター又は外因的に付加されたプロモーター配列の調節下で行うことができる。
【０１１７】
主題の遺伝子及び主題の融合蛋白質をコードする遺伝子の送達のために有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルス又はヘルペスウイルスのような別のウイルスを、効率的な複製及び産生生活環のためのヘルパーウイルスとして必要とする天然型の欠損ウイルスである。概要については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ外，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｑ  （１９９２）１５８：９７−１２９を参照されたい。また、これは、そのＤＮＡを非分裂細胞を組み込むことができ、且つ、高頻度の安定な組み込みを示すことができる数種のウイルスのうちの１種でもある（Ｆｌｏｔｔｅ外（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６、Ｓａｍｕｌｓｋｉ外（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６３：３８２２−３８２８及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ外（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照されたい。）。３００塩基対程度を含有するＡＡＶのベクターがパッケージ化され且つ組み込むことができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ外（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載されたようなＡＶＶベクターを使用して主題の遺伝子又は主題の融合蛋白質をコードする核酸を細胞に導入することができる。様々な核酸がＡＡＶベクターを使用して異なるタイプの細胞に導入されてきた（例えば、ｅｘａｍｐｌｅ  Ｈｅｒｍｏｎａｔ外（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ外（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１、Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ外（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ外（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９及びＦｌｏｔｔｅ外（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照されたい。）。
【０１１８】
発現構築物を投与する際に用途を有し得る他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス及びいくつかのＲＮＡウイルスに由来する。
【０１１９】
上に例示されるようなウイルス転移方法に加えて、非ウイルス法を使用して細菌及び真核生物発現構築物を含む発現構築物を投与することもできる。遺伝子転移の大部分の非ウイルス法は、高分子の取り込み及び細胞内輸送のためにほ乳類細胞が使用する通常の機構に依存している。好ましい具体例では、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞による主題の遺伝子又は主題の融合蛋白質をコードする核酸の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存する。このタイプの代表的な遺伝子送達系としては、リポソーム由来系、ポリリシン結合体及び人工ウイルスエンベロープが挙げられる。
【０１２０】
例示具体例では、主題の遺伝子又は主題の融合蛋白質をコードする核酸は、表面上に正電荷を保持するリポソーム（例えばリポフェクチン）であって（随意として）細胞表面抗原に対する抗体又はリガンドで標識されるものの中に閉じ込められ得る（Ｍｉｚｕｎｏ  外（１９９２）脳神経外科，第２０巻：５４７−５５１、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９、特開平１０−４７３８１号公報及び欧州特許出願ＥＰ−Ａ−４３０７５号）。別の例では、該リポソームは、関節内に存在する抗原に対して特異的なモノクローナル抗体で標識できる（例えば、軟骨及び／又は関節の関節炎及び他の状態を治療することを目的として）。同様に、この方法を主題の蛋白質を任意の組織に対して特異的な標的とするように改変して、該組織に影響を及ぼす状態（例えば、特定の組織の癌、ＩＢＤ、リウマチ様関節炎、脈管炎など）をさらに特異的に治療することができる。
【０１２１】
外来遺伝子送達系のうち任意のものの実際の投与は、それぞれが斯界になじみのある多数の方法のうち任意のものによって行うことができる。例えば、遺伝子送達系の医薬製剤は、例えば静脈注射によって全身的に導入でき、そして標的細胞への蛋白質の特異的な形質導入は、主として受容体遺伝子の発現を調節する転写調節配列に起因する遺伝子送達ビヒクル、細胞型又は組織型の発現又はそれらの組合せによって与えられるトランスフェクション特異性によって生じる。他の具体例では、組換え遺伝子の初期の送達は、動物への導入が完全に局所化された状態でさらに制限される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテルによって（米国特許第５３２８４７０号参照）、定位注入法によって（例えばＣｈｅｎ外（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７）、又は電気穿孔法によって（Ｄｅｖ外（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ２０：１０５−１１５）特定の組織に導入できる。
【０１２２】
遺伝子治療用構築物の医薬製剤は、本質的に、許容できる希釈剤中の遺伝子送達系からなることができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。別法では、完全な遺伝子送達系が組換え細胞から、例えばウイルスベクターから巧みに産生され得る場合に、該医薬製剤は、該遺伝子送達系を産生する１種以上の細胞を含むことができる。
【０１２３】
核酸ベース又は蛋白質ベースの組成物の投与方法は、斯界に周知の多数の方法のうち任意のものによって行うことができる。これらの方法としては、局所又は全身投与が挙げられ、またさらに、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口及び鼻腔内経路の投与が挙げられる。さらに、本発明の医薬組成物を、心室内及び髄腔内注入を含め、任意の好適な経路によって中枢神経系に導入することが望ましいかもしれない。心室内注入は、例えば、オマヤレザバーのようなレザバーに取り付けられた心室内カテーテルによって促進できる。また、導入方法は、再装填式装置又は生体分解性装置によっても与えられ得る。さらに、ある種の装置、移植片、ステント又は補綴物を被覆することによって投与を行うこともできることが意図される。
【０１２４】
例えば、リウマチ様関節炎及び変形性関節症のような関節の病気によってひどく損傷を受けた軟骨が、様々な補綴物によって全体的に又は部分的に置換できる。様々な好適な移植可能な材料が、コラーゲン−グリコサミノグリカン鋳型をベースとするもの（Ｓｔｏｎｅ外（１９９０）Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｄ  ２５２：１２９）、単離軟骨細胞（Ｇｒａｎｄｅ外（１９８９）Ｊ  Ｏｒｔｈｏ  Ｒｅｓ  ７：２０８及びＴａｋｉｇａｗａ外（１９８７）Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  ２：４４９）及び天然又は合成重合体に結合した軟骨細胞（Ｗａｌｉｔａｎｉ外（１９８９）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｔ  Ｓｕｒｇ  ７１Ｂ：７４、Ｖａｃａｎｔｉ外（１９９１）Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ８８：７５３、ｖｏｎ  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ外（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２５：３２９、Ｆｒｅｅｄ外（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２７：１１及びＶａｃａｎｔｉ外米国特許第５０４１１３８号）を含めて存在する。例えば、軟骨細胞は、培地中で、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル又は重合体骨格の加水分解の関数として時間経過と共に無害の単量体に分解する他の重合体のような重合体から形成された生体分解性で生体適合性の非常に多孔性の足場上で成長できる。そのマトリックスは、移植を行うまで該細胞に十分な栄養物及びガス交換を与えるようにデザインされている。該細胞は、該細胞を移植するのに十分な細胞量及び細胞密度が生じるまで試験管内で培養できる。該マトリックスの一つの利点は、これらのマトリックスを個々に所望の形状に注型し若しくは成形することができるため、最終製品が患者自身の耳や鼻（例示）に非常に類似することであり、又は移植時に操作することを可能にする柔軟なマトリックスを関節のように使用することができることである。
【０１２５】
これらの及びその他の移植物及び補綴物は、主題の融合蛋白質又は主題の融合蛋白質を発現する核酸を含有する発現構築物で処理できる。この方法では、主題の融合蛋白質は、特定の冒された組織に（例えば、損傷を受けた組織に）直接投与できる。
【０１２６】
本発明の別の具体例では、主題の融合蛋白質又は抗体は、他の薬剤と共に組み合わせ治療の一部分として投与できる。組み合わせ治療とは、予め投与された治療化合物が体内でなお有効である間に第２化合物を投与するような、２種以上の異なる治療化合物の組み合わせの投与のうち任意の形態をいう（例えば、この２種の化合物は患者に同時に有効であり、これには該２種の化合物の相乗効果が含まれ得る。）。例えば、異なる治療化合物は、同一の処方物で又は別個の処方物で付随して又は連続して投与できる。従って、このような治療を受ける個体は、異なる治療化合物の合わさった（共同）効果を有し得る。
【０１２７】
例えば、炎症性の病気の場合には、主題の蛋白質又は抗体は、炎症性疾患又はその状態の治療に有用な１種以上の他の薬剤と共に投与できる。炎症性疾患又は状態の治療に有用な薬剤としては、抗炎症剤又は消炎剤が挙げられるが、これらに限定されない。消炎剤としては、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソン、プレドニソロン、フルオルコルトロン、トリアムシノロン、メチルプレドニソロン、プレドニリデン、パラメタゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、フルプレドニリデン、デオキシメタゾン、フルオシノロン、フルメタソン、ジフルコルトロン、クロコルトロン、クロベタゾール及びフルオコルチンブチルエステルのようなグルココルチコイド；抗ＴＮＦ剤（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ）及びＩＬ−１阻害剤のような免疫抑制剤；ペニシラミン；サリチル酸、セレコキシブ、ジフニサル及び置換フェニル酢酸塩又は２−フェニルプロピオン酸塩から誘導されるものような抗炎症薬、鎮痛薬及び解熱薬を包含する非ステロイド系抗炎症薬、例えば、アルクロフェナック、イブフェナック、イブプロフェン、クリンダナック、フェンクロラック、ケトプロフェン、フェノプロフェン、インドプロフェン、フェンクロフェナック、ジクロフェナック、フルルビプロフェン、ピルプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン及びシクロプロフェン；ピロキシカムのようなオキシカム誘導体；メフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸及びメルコフェナム酸のようなアントラニル酸誘導体、フェナメートミフルム酸、クロニキシン及びフルニキシンのようなアニリノ置換ニコチン酸誘導体；インドメタシン、オキシメタシン、イントラゾール、アセメタジン、シンメタシン、ゾメピラック、トルメチン、コルピラック及びチアプロフェン酸のようなヘテロアリール酢酸であってヘテロアリールが２−インドール−３−イル又はピロール−２−イル基であるもの；スリンダク型のインデニル酢酸；ベンザダックのような鎮痛剤として活性なヘテロアリールオキシ酢酸；フェニルブタゾン；エトドラック；ナブメトン；並びにメトトレキセート、金塩、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、シクロスポリン、アザチオプリン及びレフルノミドのような抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）が挙げられる。
【０１２８】
炎症性疾患又は状態の治療に有用な他の治療剤としては、抗酸化剤が挙げられる。抗酸化剤は、天然でも合成でもよい。抗酸化剤は、例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、２１−アミノステロイド／アミノクロマン、ビタミンＣ又はＥなどである。他の抗酸化剤の多くは当業者に周知である。
【０１２９】
主題の蛋白質又は抗体は、炎症性状態のための治療法の一部分として役立ち、そしてこれは多くの異なる抗炎症剤と組み合わせることができる。例えば、主題の融合蛋白質又は抗体は、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ又は免疫抑制剤のうち１種以上と共に投与できる。本願の一具体例では、主題の融合蛋白質は、メトトレキセートと共に投与できる。別の具体例では、主題の融合蛋白質は、ＴＮＦ−α阻害剤と共に投与できる。
【０１３０】
心臓血管疾患の状態、特に、かなりの炎症成分を有していると思われるアテローム斑から生じるものの場合には、主題の蛋白質又は抗体は、心臓血管疾患の治療に有用な１種以上の他の薬剤と共に投与できる。心臓血管疾患の治療に有用な薬剤としては、カルベジロール、メトプロロール、ブシノドロール、ビソプロロール、アテノロール、プロプラノロール、ナドロール、チモロール、ピンドロール及びラベタロールのようなβ遮断剤；アスピリン及びチクロピジンのような抗血小板剤；カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル及びモエキシプリルのようなアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；並びにメバスタチン、ロバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン及びロスバスタチンのような脂質低下剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
癌の場合には、主題の蛋白質又は抗体は、１種以上の抗脈管形成因子、化学療法剤と共に、又は放射線治療に対するアジュバントとして投与できる。さらに、主題の蛋白質又は抗体は、多くの異なる癌治療剤と組み合わせることができる癌治療法の一部分として役立つことが考えられる。ＩＢＤの場合には、主題の融合蛋白質又は抗体は、１種以上の抗炎症剤と共に投与でき、そしてさらに改善食事療法と組み合わせてもよい。
【０１３２】
主題の融合蛋白質（蛋白質組成物又は主題の蛋白質をコードする核酸組成物のいずれかとしての）は、ＲＡＧＥ関連疾患を治療するために使用でき、又はＲＡＧＥ関連疾患を治療するために他の薬剤及び治療法と併用できる。
【０１３３】
８．薬剤スクリーニングアッセイ法
ある具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）が受容体ポリペプチド（例えば、上記のようなＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質）に結合するのを阻害する試験化合物を同定するためのアッセイ法を提供する。
【０１３４】
ある具体例では、このアッセイ法は、Ｓ１００及びアンホテリンよりなる群から選択されるＲＡＧＥ−ＢＰによって誘導されるＲＡＧＥ受容体のシグナル伝達活性を調節する試験化合物を検出する。このようなシグナル伝達活性としては、他の細胞成分への結合、マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のような酵素の活性化、ＮＦ−ｋＢの転写活性の活性化などが挙げられるが、これらに限定されない。様々なアッセイ法の形式はこの開示に照らせば十分であろう。それにもかかわらずここに明確に説明されていないものも、当業者であれば理解されるであろう。蛋白質複合体の形成、酵素活性のような条件を接近させるアッセイ法の形式は、多くの異なる形態で生じ、そして細胞を含まない系、例えば精製蛋白質又は細胞溶解物をベースとするアッセイ法並びにそのままの細胞を使用する細胞ベースのアッセイ法が挙げられる。簡易な結合アッセイ法を使用してＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）と受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質）との間の相互作用を阻害する化合物を検出することができる。試験されるべき化合物は、例えば、細菌、酵母又はその他の生物によって生産され（例えば、天然産物）、又は化学的に製造され（例えば、ペプチドミメティックを含め、小分子）、又は組換えによって生産され得る。
【０１３５】
多くの具体例では、細胞は、候補化合物と共にインキュベートした後に操作され、且つ、ＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）によって誘導されるＲＡＧＥ受容体のシグナル伝達活性について検定される。ある具体例では、このような活性についてのバイオアッセイ法としては、ＮＦ−ｋＢ活性アッセイ法（例えば、ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼ又はＧＦＰレポーター遺伝子アッセイ法）を挙げることができる。
【０１３６】
代表的なＮＦ−ｋＢルシフェラーゼ又はＧＦＰレポーター遺伝子アッセイ法は、Ｓｈｏｎａ外（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．５１５：１１９−１２６に記載されるように実施できる。簡単に言えば、細胞にＮＦ−ｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトされた細胞を候補化合物と共にインキュベートする。その後、ＮＦ−ｋＢ刺激ルシフェラーゼ活性を該化合物で処理された細胞又は該化合物で処理されていない細胞で測定する。別法としては、細胞にＮＦ−ｋＢ−ＧＦＰレポーター遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をトランスフェクトすることができる。次いで、このトランスフェクト細胞を候補の化合物と共にインキュベートする。その後、ＮＦ−ｋＢ刺激遺伝子活性を、ＧＦＰの発現を蛍光／可視光顕微鏡構成で又はＦＡＣＳ分析によって監視する。
【０１３７】
ある具体例では、本発明は、受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質）及び１種以上のＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）を含む再構成蛋白質調製物を提供する。本発明のアッセイ法としては、標識 in vitro 蛋白質−蛋白質結合アッセイ法、蛋白質結合のための免疫アッセイ法などが挙げられる。また、精製された蛋白質は、分子間相互作用をモデリングするために使用できる３次元結晶構造決定のためにも使用できる。
【０１３８】
このアッセイ法のある具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）又は受容体蛋白質（例えば、ＲＡＧＥ）は、該アッセイ法を支持するために選択される細胞に対して内因性であることができる。別法では、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド又は受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質）は、外因性源に由来し得る。例えば、融合蛋白質は、組換え技術（発現ベクターの使用によるような）によって、並びに融合蛋白質自体又は該融合蛋白質をコードするｍＲＮＡのミクロ注入によって細胞に導入できる。
【０１３９】
該アッセイ法のさらなる具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰと受容体ポリペプチドとの複合体は、主題のアッセイ法を支持するための細胞培養技術の利点を得つつ、全細胞内で生成できる。例えば、以下に説明するように、ほ乳類及び酵母細胞を含め真核細胞培養系内で、ある種の複合体が構成され得る。主題のアッセイをそのままの細胞内で行う利点としては、化合物が細胞に入り込むことができることを含め、化合物の治療使用に必要な環境に非常に近い環境において機能的である化合物を検出することができることが挙げられる。さらに、以下に与えられる例のように、該アッセイ法の生体内での具体例のうちのいくらかは、候補化合物の高処理能力分析に適している。
【０１４０】
このアッセイ法の試験管内での具体例では、再構成複合体は、少なくとも半精製の蛋白質の再構成混合物を含む。半精製とは、再構成混合物に使用される蛋白質が他の細胞性蛋白質から予め分離されたことを意味する。例えば、細胞溶解物とは異なり、複合体形成に関わる蛋白質は、該混合物中に、該混合物中の他の全ての蛋白質に対して少なくとも５０％の純度まで存在し、より好ましくは、９０〜９５％の純度で存在する。主題の方法の具体例では、再構成蛋白質の混合物は、該再構成混合物が複合体の会合及び／又は脱会合を測定するのを妨害し又はさもなくば該測定能力を改変させるその他の蛋白質（細胞由来のような）を実質的に欠失するように高度に精製された蛋白質を混合することによって得られる。
【０１４１】
ある具体例では、候補化合物の存在下及び非存在下でのアッセイは、反応体を収容するのに好適な任意の容器内で達成できる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管及び微小遠心管が挙げられる。
【０１４２】
ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰ（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）と受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質）との複合体の会合、安定性又は機能を妨害する試験化合物の能力に基づき該化合物を検出する薬剤スクリーニングアッセイ法を行うことができる。代表的な結合アッセイ法では、問題の化合物を、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合ポリペプチド及びＳ１００又はアンホテリンのようなＲＡＧＥ−ＢＰを含む混合物と接触させる。該複合体の検出及び定量化は、該複合体の２成分間の相互作用を阻害することに対する該化合物の有効性を決定するための手段を与える。該化合物の有効性は、該試験化合物の様々な濃度を使用して得られるデータから用量反応曲線を作成することによって評価できる。さらに、対照アッセイ法も実行して比較のための基準線を与えることができる。この対照アッセイ法では、複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。
【０１４３】
ある具体例では、複合体中の２種のポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ−ＢＰ及び受容体ポリペプチド）間の会合は、様々な技術で検出できるが、その多くはだいだい上で説明した。例えば、複合体形成の調節は、例えば、検出可能に標識された蛋白質（例えば、放射線同位元素標識、蛍光標識又は酵素標識）を使用して、免疫アッセイ法又はクロマトグラフィー検出によって定量できる。また、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（スウェーデン王国ウプサラ）から入手できるような表面プラスモン共鳴システムを使用して蛋白質−蛋白質相互作用を検出することもできる。
【０１４４】
ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰ及び受容体ポリペプチドを含む複合体中の１種のポリペプチドを固定化してその他のポリペプチドの非複合体形態からの該複合体の分離を促進させることができ、並びに該アッセイ法の自動操作に対応することができる。例示具体例では、融合蛋白質であって該融合蛋白質が不溶性マトリックスに結合するのを可能にするドメインを付加したものを与えることができる。例えば、ＧＳＴ−ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（シグマ・ケミカル社，ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでこれを見込まれる相互作用蛋白質（例えば、35Ｓ標識Ｓ１００ポリペプチド）と混合し、そして試験化合物を複合体形成に資する条件下でインキュベートする。インキュベーション後に、該ビーズを洗浄して結合していない任意の相互作用蛋白質を除去し、そして該マトリックスビーズに結合した放射線同位元素標識を直接（ビーズをシンチラント内に置く）決定し、又は、例えばマイクロタイタープレートを使用するときには該複合体を溶解させた後に上澄み液中で決定する。別法では、結合していない蛋白質を洗い流した後に、複合体を該マトリックスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、そしてマトリックスに結合した画分中に見出される相互作用ポリペプチドのレベルを、標準的な電気泳動技術を使用して該ゲルから定量化する。
【０１４５】
別の具体例では、２ハイブリッドアッセイ（相互作用捕捉アッセイともいう。）を、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ及びＲＡＧＥ−ＢＰの複合体中の２種のポリペプチドの相互作用を検出するために（米国特許第５２８３３１７、Ｚｅｒｖｏｓ外（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２、Ｍａｄｕｒａ外（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４、Ｂａｒｔｅｌ外（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４及びＩｗａｂｕｃｈｉ外（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６も参照されたい）、及び、その後にＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質とＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を検出するために使用できる。このアッセイ法は、宿主細胞、例えば、酵母細胞（好ましい）、ほ乳類細胞又は細菌細胞型を与えることを含む。宿主細胞は、「餌」としての蛋白質に使用される転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を有するレポーター遺伝子を、該レポーター遺伝子が該遺伝子の転写を活性化させるときに検出可能な遺伝子産物を発現するように含有する。宿主細胞内で発現でき且つ「餌」の融合蛋白質をコードする第１キメラ遺伝子が与えられる。また、宿主細胞内で発現でき且つ「魚」としての融合蛋白質をコードする第２キメラ遺伝子も与えられる。一具体例では、該第１及び第２キメラ遺伝子の両方は、プラスミドの形で宿主細胞に導入される。しかしながら、好ましくは、該第１キメラ遺伝子は、宿主細胞の染色体中に存在し、そして該第２キメラ遺伝子はプラスミドの一部分として宿主細胞に導入される。
【０１４６】
ある具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（例えば、Ｓ１００及びアンホテリン）と受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体）との結合を阻害する試験化合物を同定するための２ハイブリッドアッセイ法を提供する。例示すると、受容体ポリペプチドを含む「餌」蛋白質及びＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（Ｓ１００又はアンホテリンのような）を含む「魚」蛋白質を宿主細胞に導入する。細胞を、該「餌」及び「魚」融合蛋白質がそのレポーター遺伝子を活性化させるのに十分な量で発現する条件に付す。該２種の融合ポリペプチドの相互作用は、該レポーター遺伝子の発現によって生じる検出可能なシグナルを生じさせる。従って、試験化合物の存在下及び試験化合物の非存在下での該２種の融合蛋白質間の相互作用のレベルは、該レポーター遺伝子の発現のレベルをそれぞれの場合に検出することによって評価できる。様々なレポーター構築物を本発明の方法に従って使用でき、その例としては、酵素シグナル、蛍光シグナル、燐光シグナル及び薬剤耐性よりなる群から選択されるような検出可能なシグナルを生じさせるレポーター遺伝子が挙げられる。
【０１４７】
化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、所定時間内に調査される化合物の数を最大化させるために、高処理能力アッセイ法が望ましい。精製若しくは半精製蛋白質又は溶解物で作製できるような細胞を含まない系で実行される本発明のアッセイ法は、多くの場合、迅速な作製及び試験化合物によって仲介される分子標的の改変の比較的容易な検出を可能にするために行うことができるという点で「一次」スクリーニングと呼ばれる。さらに、試験化合物の細胞毒性及び／又は生物学的利用能の影響は、一般に in vitro 系では無視できるが、該アッセイ法は、その代わりに、主として他の蛋白質との結合親和性の変化又は分子標的の酵素特性の変化となって現れ得るような該分子標的に及ぼす該薬剤の影響に焦点を合わせている。
【０１４８】
ある具体例では、ＲＡＧＥ−ＢＰと受容体との間の複合体形成は、免疫沈降法及び共免疫沈降蛋白質の分析又は親和性精製法及び共精製蛋白質の分析によって評価できる。また、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）をベースとするアッセイ法を使用してこのような複合体形成を決定することができる。互いに非常に近似した適度な発光及び励起スペクトルを有する蛍光分子がＦＲＥＴを示し得る。該蛍光分子は、一方の分子（供与体分子）の発光スペクトルが他方の分子（受容体分子）の励起スペクトルと重複するように選択される。該供与体分子は、該供与体の励起スペクトル内の適切な強さの光によって励起する。そのときに、該供与体は、該吸収エネルギーを蛍光として放射する。これを生じさせる該蛍光エネルギーは、該受容体分子によって消光する。ＦＲＥＴは、供与体からの蛍光シグナルの強度の減少、その励起状態の寿命の減少及び／又は該受容体のさらに長い波長（より低いエネルギー）特性での蛍光の再放射として現れ得る。該蛍光蛋白質が物理的に分離するときに、ＥＲＦＥの効果は減少し又はなくなる（例えば、米国特許第５９８１２００号を参照されたい。）。
【０１４９】
またＦＲＥＴの発生により、供与体の蛍光部分の蛍光寿命が減少する。この蛍光寿命の変化は、蛍光寿命画像化技術（ＦＬＩＭ）と呼ばれる技術を使用して測定できる（Ｖｅｒｖｅｅｒ外（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５６７−１５７０、Ｓｑｕｉｒｅ  外（１９９９）Ｊ  Ｍｉｃｒｏｓｅ．１９３：３６、Ｖｅｒｖｅｅｒ外（２０００）Ｂｉｏｐｌｘｙｓ．Ｊ．７８：２１２７）。ＦＬＩＭデータを分析するためのグローバルな分析技術が開発されている。これらのアルゴリズムは、供与体の蛍光部分が別個の蛍光寿命をそれぞれ有する限られた数の状態でのみ存在するという知見を使用する。それぞれの状態の定量マップがピクセルずつを基準に作成できる。
【０１５０】
ＦＲＥＴをベースとするアッセイ法を実行するために、ＲＡＧＥ−ＢＰポリペプチド（例えば、Ｓ１００又はアンホテリン）及び受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体）の両者が蛍光標識される。本明細書からみて好適な蛍光標識は、斯界に周知である。以下に実施例を与えているが、具体的に議論されていない好適な蛍光標識も当業者であれば利用できる。蛍光標識は、ポリペプチドを蛍光蛋白質、例えばクラゲ、サンゴ及びその他の腔腸動物から単離された蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させることによって達成できる。代表的な蛍光蛋白質としては、Aequoria victoria の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の多くの変種が挙げられる。変種は、より明るいもの若しくは二量体であることができ、又は異なる励起スペクトル及び／又は発光スペクトルを有することができる。ある変種は、もはや緑色を生じず、且つ、青色、青緑色、黄色又は赤色を生じ得るように改変されている（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ及びＲＦＰと呼ばれる。）。蛍光蛋白質は、ペプチド結合（例えば、融合蛋白質としての発現）、化学的架橋及びビオチン−ストレプタビジン結合を含め、様々な共有結合及び非共有結合を介してポリペプチドに安定して結合できる。蛍光蛋白質の例としては、米国特許第５６２５０４８、同５７７７０７９号、同６０６６４７６号、同６１２４１２８号、Ｐｒａｓｈｅｒ外（１９９２）Ｇｅｎｅ，１１１：２２９−２３３、Ｈｅｉｍ外（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：１２５０１−０４、Ｗａｒｄ外（１９８２）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３５：８０３−８０８、Ｌｅｖｉｎｅ外（１９８２）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７２Ｂ：７７−８５、Ｔｅｒｓｉｋｈ外（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５８５−８８を参照されたい。
【０１５１】
ＦＲＥＴベースアッセイ法は、細胞ベースアッセイ法及び細胞フリーアッセイ法で使用できる。ＦＲＥＴベースアッセイ法は、蛍光活性化細胞ソーティング法及びマイクロタイターアレイの蛍光スキャン法を含む高処理量スクリーニング法に適する。
【０１５２】
一般に、スクリーニングアッセイ法が結合アッセイ法（蛋白質−蛋白質結合、化合物−蛋白質結合などを問わない。）である場合には、これらの分子の一つ以上を標識に結合させることができ、この場合には該ラベルは標識可能なシグナルを直接的に又は間接的に与える。様々な標識としては、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプタビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどの対が挙げられる。特異的結合構成要素について、その相補的な構成要素は、通常、既知の手順に従って、検出用の分子で標識されよう。
【０１５３】
このスクリーニングアッセイ法には様々な他の試薬が含まれ得る。これらのものとしては、最適な蛋白質−蛋白質結合を促進させ及び／又は非特異的な若しくはバックグラウンドの相互作用を低減させるために使用される塩、中性蛋白質、例えばアルブミン、洗剤などのような試薬が挙げられる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などのような該アッセイの高率を改善させる試薬が使用できる。該成分の化合物は、必須の結合を与える任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の好適な温度、典型的には４℃〜４０℃で実行される。インキュベーション時間は、最適な活性に対して選択されるが、迅速な高処理量スクリーニングを促進させるために最適化してもよい。
【０１５４】
ある具体例では、本発明は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質のような、複合体の単一ポリペプチドに向けられる複合体依存アッセイ法を提供する。このようなアッセイ法は、受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ又はＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合蛋白質）へのＲＡＧＥ−ＢＰの結合の候補阻害剤である試験化合物を同定することを含む。
【０１５５】
代表的な具体例では、受容体ポリペプチドに結合する化合物は、受容体ＲＡＧＥ−ＬＢＥポリペプチドを使用することによって同定され得る。例示の具体例では、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリンの融合蛋白質であって該蛋白質が不溶性マトリックスに結合するのを可能にする追加のドメインを付加したものが提供され得る。例えば、ＧＳＴ蛋白質と共に融合したＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリンを、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ・ケミカル社，ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン由来マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでこれらのものを見込まれる標識結合化合物と結合させ、そして結合に資する条件下でインキュベートする。インキュベーション後に、これらのビーズを洗浄して結合していないいかなる化合物も除去し、そして該マトリックス結合標識を直接、又は、該結合化合物が解離した後の上澄み液中で決定する。
【０１５６】
ある具体例では、標識は、検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に与え得る。各種標識としては、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプタビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのような対が挙げられる。特異的結合構成要素について、その相補的な構成要素は、通常、既知の手順に従って検出に供する分子で標識されていよう。ある具体例では、このような方法は、その混合物を試験管内で形成させることを含む。ある具体例では、このような方法は、その混合物を生体内で形成させることによる細胞ベースのアッセイ法を含む。ある具体例では、該方法は、受容体ポリペプチド（例えば、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ若しくはＲＡＧＥ−ＬＢＥ−免疫グロブリン融合体）又はその変異型を発現する細胞と試験化合物とを接触させることを含む。
【０１５７】
ある具体例では、アッセイ法は、細胞を含まない系、例えば精製蛋白質又は細胞溶解物に基づき、並びにそのままの細胞を使用する細胞ベースのアッセイ法である。単純な結合アッセイ法を使用して受容体ポリペプチドと相互作用する化合物を検出することができる。試験されるべき化合物は、例えば、細菌、酵母又はその他の生物によって作られ（例えば、天然産物）、化学的に製造され（例えば、ペプチドミメティックを含めて小分子）又は組換えで製造され得る。
【０１５８】
随意として、これらのアッセイ法から同定された試験化合物を使用してＲＡＧＥ関連疾患を治療することができる。
【０１５９】
９．医薬製剤
本発明の主題の蛋白質又は核酸は、最も好ましくは、好適な組成物として投与される。好適な組成物としては、薬剤を全身的に又は局所的に投与するために通常使用される全ての組成物を挙げることができる。薬剤として許容できるキャリヤーは、活性成分と共に作用しないように実質的に不活性であるべきである、好適な不活性キャリヤーとしては、水、アルコール、ポリエチレングリコール、鉱油又は石油ゲル、プロピレングリコールなどが挙げられる。該医薬製剤（主題の融合蛋白質又は該主題の融合蛋白質をコードする核酸を含む）は、ヒトに使用するために又は動物薬の用途のために、任意の便利な方法で投与するために処方され得る。
【０１６０】
従って、本発明の別の態様は、１種以上の薬剤として許容できるキャリヤー（添加剤）及び／又は希釈剤と共に処方される、有効量の主題の融合蛋白質を含む薬剤として許容できる組成物を提供する。以下に詳しく説明するように、本発明の医薬組成物は、次に適合するもの：（１）経口投与、例えばドレンチ（水溶液若しくは非水溶液又は水分散体若しくは非水分散体）、錠剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に塗るための泥膏、（２）例えば、滅菌溶液又は懸濁液としての皮下、筋肉内又は静脈注射による非経口投与、（３）例えば、肌に塗布されるクリーム、軟膏又はスプレーとしての局所適用又は（４）ペッサリー、クリーム又は泡としての膣内適用又は直腸内適用を含め、固体状又は液状で投与するために特に処方できる。しかしながら、ある具体例では、主題の薬剤は、滅菌水に単に溶解又は懸濁するだけでよい。ある具体例では、医薬製剤は、非発熱性、即ち、患者の体温を上昇させない。
【０１６１】
本明細書において使用するときに、語句「有効量」とは、動物においていくつかの望ましい効果を生じさせるのに有効な、１種以上の薬剤、材料、又は本発明の１種以上の薬剤を含む組成物の量を意味する。ある薬剤がある種の治療効果を達成させるために使用されつつあるときに、この「有効量」を含む実際の投与量は、治療されるべき特定の症状、病気の深刻度、患者の大きさ及び健康状態、投与経路などを含め、多数の条件によって変化することが分かる。当業者であれば、医療分野に周知の方法を使用して好適な投与量を容易に決定できる。
【０１６２】
本明細書において、用語「薬剤として許容できる」は、正しい医療判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症を有しないヒト及び動物組織と接触した状態で使用するのに好適で、適度な利益／危険性の比に見合った化合物、材料、組成物及び／又は投薬形態をいうために使用する。
【０１６３】
本明細書において使用するときに、用語「薬剤として許容できるキャリヤー」とは、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化用材料のような薬剤として許容できる材料、組成物又はビヒクルであって、主題の薬剤をある種の器官若しくは身体の一部から別の器官若しくは身体の一部に運ぶ又は輸送することに関わるものを意味する。それぞれのキャリヤーは、該処方物のその他の成分と相容性があるという意味において「許容できる」ものでなければならない。薬剤として許容できるキャリヤーとして作用し得る材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖質、（２）トウモロコシ澱粉及び馬鈴薯澱粉のような澱粉、（３）セルロース並びにナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバター及び座剤ワックスのような賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油のような油、（１０）プロピレングリコールのようなグリコール類、（１１）グリセリン、ソルビット、マンニット及びポリエチレングリコールのようなポリオール類、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル類、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）燐酸塩緩衝液及び（２１）その他の医薬処方物に使用される非毒性相容性物質が挙げられる。
【０１６４】
ある具体例では、１種以上の薬剤は、アミノ又はアルキルアミノのような塩基性官能基を含有することができるため、薬剤として許容できる酸と共に薬剤として許容できる塩を形成することができる。この点において、用語「薬剤として許容できる塩」とは、本発明の化合物の比較的非毒性の無機及び有機酸付加塩をいう。これらの塩は、本発明の化合物の最後の単離及び精製中にその場で、又は、遊離塩基の形態にある本発明の精製化合物と好適な有機又は無機酸とを別々に反応させ、そしてこのようにして形成された塩を単離することによって調製できる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩及びラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ外（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｐｈａｒｅ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。
【０１６５】
薬剤の薬剤として許容できる塩としては、例えば、非毒性有機又は無機酸からの、これらの化合物の慣用型の非毒性塩又は第四アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような慣用型の非毒性塩としては、塩素酸、臭素酸、硫酸、スルファミン酸、燐酸、硝酸などのような無機酸から誘導されるもの、及び、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、蓚酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩が挙げられる。
【０１６６】
その他の場合には、該１種以上の薬剤は１種以上の酸性官能基を含有することができ、しかして薬剤として許容できる塩基と共に薬剤として許容できる塩を形成することができる。これらの塩は、同様に、該化合物の最後の単離及び精製中にその場で、或いは遊離酸の形態にある該精製化合物と、薬剤として許容できる金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩のような好適な塩基とを、アンモニアとを、又は薬剤として許容できる有機第一、第二若しくは第三アミンとを別々に反応させることによって製造できる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩及びアルミニウム塩が挙げられる。塩基付加塩の形成のために有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ外（前出）を参照されたい。）。
【０１６７】
また、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤及び滑剤並びに着色料、離型剤、コーティング剤、甘味料、香料及び香味剤、防腐剤及び酸化防止剤も組成物中に存在し得る。
【０１６８】
薬剤として許容できる酸化防止剤としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩素酸塩、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性酸化防止剤、（２）アスコルビン酸パルミチン酸エステル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどのような油溶性酸化防止剤及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビット、酒石酸、燐酸などのような金属キレート化剤が挙げられる。
【０１６９】
本発明の処方物としては、経口、経鼻、局所（口腔内及び舌下を含む）、直腸内、膣内及び／又は非経口投与に好適なものが挙げられる、これらの処方物は、単位剤形で与えるのが便利であり、また薬学分野に周知の任意の方法によって製造できる。単一剤形を生じさせるためにキャリヤー材料と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療されるべき宿主、投与の特定の形態によって変化するであろう。単一剤形を生じさせるためにキャリヤー材料と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般には、治療効果を生じさせる化合物の量であろう。一般に、１００％以外では、この量は、約１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲にあるであろう。
【０１７０】
これらの処方物又は組成物の製造方法は、ある薬剤とキャリヤー及び随意として１種以上の副成分とを会合させる工程を含む。一般に、これらの処方物は、本発明の薬剤と液状キャリヤー若しくは細かく分割された個体キャリヤー又はその両方とを均一且つ密接に会合させ、次いで、必要ならば、該製品を成形することによって製造される。
【０１７１】
経口投与に好適な本発明の処方物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、舐剤（香り付き基材、通常はスクロース及びアラビアガム又はトラガカントを使用した）、粉剤、顆粒剤、又は水溶液若しくは非水溶液、又は水中油型又は油中水型エマルジョン、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤、又は香錠（ゼラチン及びグリセリン若しくはスクロース若しくはアラビアガムのような不活性基材を使用した）、及び／又は洗口剤などの形態にあることができ、それぞれは活性成分として所定量の本発明の化合物を含有する。また、本発明の化合物は、ボーラス、舐剤又は泥膏としても投与できる。
【０１７２】
経口投与のための本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤、顆粒剤など）では、活性成分は、クエン酸ナトリウム若しくは燐酸二カルシウムのような１種以上の薬剤として許容できるキャリヤー及び／又は次のうち任意のもの：（１）澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニット及び（若しくは）珪酸のような充填剤若しくは増量剤、（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び（若しくは）アラビアゴムのような粘結剤、（３）グリセリンのような湿潤剤、（４）寒天−寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯澱粉若しくはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種の珪酸塩及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤、（５）パラフィンのような溶解遅延剤、（６）第四アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（７）例えばセチルアルコール及びグリセリンモノステアレートのような浸潤剤、（８）カオリン及びベントナイトクレーのような吸湿剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの２種以上の混合物のような滑剤並びに（１０）着色剤と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、該医薬組成物は緩衝剤も含み得る。また、類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して軟及び硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用できる。
【０１７３】
錠剤は、随意として１種以上の副成分と共に圧縮又は成形することによって作られ得る。圧縮錠剤は、結着剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムスターチグリコレート又は架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性剤又は分散剤を使用して調製できる。成形錠剤は、好適な機械で、不活性液状希釈剤で加湿された粉末化合物の混合物を成形することによって作られ得る。
【０１７４】
本発明の医薬組成物の錠剤及び糖衣錠、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤のようなその他の固体剤形は、随意として、腸溶コーティング及び医薬処方分野に周知の他のコーティングのような、コーティング及びシェルで分割され又は製造され得る。また、これらのものは、例えば、所望の放出プロフィルを与えるための変動する割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他の重合体マトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用して、中の活性成分の徐放又は制御された放出を与えるように処方することもできる。これらのものは、例えば、使用直前に、細菌保持フィルターによる濾過によって又は滅菌剤を滅菌水若しくはいくつかの他の滅菌注射用媒体に溶解し得る滅菌固体組成物の形で取り入れることによって滅菌できる。また、これらの組成物は、随意として乳白剤を含有することができ、且つ、活性成分のみを又はそれを優先的に、消化管のある部分で、随意として遅効性の態様で放出させる組成物であることができる。使用できる埋封組成物の例としては、重合体物質及びワックスが挙げられる。また、活性成分は、しかるべき場合には、上記の賦形剤のうち１種以上と共にミクロカプセル化された形態にあることができる。
【０１７５】
本発明の化合物の経口投与のための液体剤形としては、薬剤として許容できるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤及びエリキシルが挙げられる。活性成分の他に、液体剤形は、例えば、水又は他の溶媒のような斯界で一般的に使用される不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及び胡麻油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル並びにこれらの２種以上の混合物を含有することができる。
【０１７６】
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香料、着色料、香味剤及び防腐剤を含むことができる。
【０１７７】
懸濁液は、活性化合物の他に、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビット及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカント並びにそれらの２種以上の混合物のような懸濁剤を含有し得る。
【０１７８】
直腸内又は膣内投与のための本発明の医薬組成物の処方は、本発明の１種以上の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座剤ワックス若しくはサリチレートを含む１種以上の好適な刺激性の少ない賦形剤又はキャリヤーとを混合させることによって製造でき、しかも室温では固体であるが体温では液体であるため直腸又は膣腔内で融解しそして薬剤を放出する座剤として与えられ得る。
【０１７９】
また、膣内投与のために好適な本発明の処方としては、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又は斯界において好適であることが知られているようなキャリヤーを含有するスプレー処方物を挙げることができる。
【０１８０】
本発明の化合物の局所又は経皮投与のための剤形としては、粉剤、スプレー剤、軟膏、泥膏、クリーム、ローション剤、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬剤として許容できるキャリヤーと、及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤又は噴射剤と混合できる。
【０１８１】
この軟膏、泥膏、クリーム及びゲルは、本発明の活性化合物の他に、動物性及び植物性の脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク及び酸化亜鉛又はこれらの２種以上の混合物のような賦形剤を含有し得る。
【０１８２】
粉剤及びスプレー剤は、本発明の化合物の他に、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム及びポリアミド粉末又はこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレー剤は、クロルフルオル炭化水素並びにブタン及びプロパンのような揮発性の非置換炭化水素のような慣用の噴射剤をさらに含有することができる。
【０１８３】
経皮貼付は、本発明の化合物の身体への制御された送達を与えるという追加の利点を有する。このような剤形は、該薬剤を適当な媒体に溶解又は分散させることによって作られ得る。また、吸収向上剤を使用して該薬剤が皮膚を横切るフラックスを増大させることもできる。このようなフラックスの速度は、速度制御膜を与えることによって、又は該化合物を重合体マトリックス若しくはゲルに分散させることによって制御できる。
【０１８４】
また、眼科用の処方物、眼軟膏、粉剤、溶液なども本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１８５】
非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、本発明の１種以上の化合物と共に、１種以上の薬剤として許容できる滅菌等張水溶液若しくは非水溶液、分散体、懸濁液若しくはエマルジョン又は使用直前に注射用の滅菌溶液若しくは分散液に再構成され得る滅菌粉剤を含み、また、これらのものは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、該処方物を血液と等張にさせる、意図される賦形剤又は懸濁剤又は増粘剤の溶質を含有してもよい。
【０１８６】
本発明の医薬組成物に使用できる好適な水性又は非水性キャリヤーの例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような）及びそれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油並びにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レクチンのようなコーティング用材料の使用によって、分散体の場合には必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。
【０１８７】
また、これらの処方物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバントを含有することもできる。微生物の活動の阻害は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロルブタノール、フェノールソルビン酸などを含ませることによって保証できる。また、糖類、塩化ナトリウムなどを該組成物に含ませることも望ましい。さらに、注射用薬剤形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含ませることによってもたらされ得る。
【０１８８】
場合によっては、ある薬剤の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの該薬剤の吸収を遅らせることが望ましい。これは、貧弱な水溶性を有する結晶質又は非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成できる。そのときに、該薬剤の吸収速度は、順に、結晶寸法及び結晶形に依存し得るその溶解速度に依存する。別法として、非経口投与される剤形の遅延吸収は、該薬剤をオイルビヒクルに分散し又は懸濁することによって達成される。
【０１８９】
注射用のデポー剤形は、主題の化合物のポリラクチド−ポリグリコリドのような生体分解性重合体へのミクロカプセル化マトリックスを形成させることによって作られる。薬剤対重合体の比及び使用される特定の重合体の性質に応じて、薬剤放出速度を制御することができる。その他の生体分解性重合体の例としては、ポリオルトエステル及びポリ無水物が挙げられる。また、デポー注射用処方物は、該薬剤を身体組織と適合性のあるリポソーム又はミクロエマルジョン中に閉じこめることによって調製することもできる。
【０１９０】
本発明の化合物がヒト及び動物に薬剤として投与されるときに、これらのものは、そのものとして、又は、例えば、薬剤として許容できるキャリヤーと共に０．１〜９９．５％（好ましくは０．５〜９０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えられ得る。
【０１９１】
上記組成物の他に、好適な量の治療剤を含有する覆い、例えば、硬膏剤、バンデージ、包帯、ガーゼパッドなどを使用することができる。上に詳しく説明したように、医薬組成物は、ステント、装置、補綴物及び移植物上で投与／送達できる。
【実施例】
【０１９２】
例示
本発明を一般的に説明してきたが、本発明のある種の態様及び具体例を単に例示する目的のために挙げられる次の実施例を参照すればさらに容易に理解されるであろう。この実施例は、本発明を限定するものではない。
【０１９３】
例１：リウマチ様関節炎を有する患者で上方又は下方調節される遺伝子の同定
この例は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）を有する被検体の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）内で、正常の被検体のＰＢＭＣ内での発現に対して上方又は下方調節されるいくつかの遺伝子の同定を説明する。
【０１９４】
ＰＢＭＣを、ＲＡを有する９人の患者及び１３人の正常のボランティアから次のように単離した。８ｍＬの血液をＣＰＴバキュテイナーチューブに吸い込み。これを数回反転させた。このチューブを室温で水平ローター内で１５００×ｇ（２７００ｒｐｍ）で遠心分離した。血清を除去し、そしてＰＢＭＣを１５ｍＬの円錐遠心分離用チューブに移した。これらの細胞を燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の添加で洗浄し、そして４５０ｇ（１２００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。上澄み液を捨て、そして該洗浄手順を１回以上繰り返した。上澄み液の除去後に、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ国ヒデン）を使用してメーカーの手順に従って単離した。
【０１９５】
ＲＮＡを６８００及び１２０００個のヒト遺伝子からなるオリゴヌクレオチドアレイ（それぞれ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕ６８００及びＨｇＵ９５Ａチップのセット）で、次のように分析した。
【０１９６】
ハイブリダイゼーション用の標的核酸を次のように調製した。全ＲＮＡを、ＰＢＭＣからの全ＲＮＡの５ｐｇを１０分間にわたって７０℃で変性させることによって、１００ｐＭのＴ７／Ｔ２４標識オリゴｄｔプライマー（マサチューセッツ州ケンブリッジのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社で合成された）とのハイブリダイゼーションのために調製し、そして氷上で冷却した。第１鎖ｃＤＮＡの合成を次の緩衝液条件下で実行した：１×第１鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，カリフォルニア州カールズバッド）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、４００単位のスーパースクリプトＴＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び４０単位のＲＮアーゼ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースチン）。反応を４７℃で１時間にわたって進行させた。第２鎖ｃＤＮＡを、次の試薬を次の最終濃度で添加することによって合成した：１×第２鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、追加の２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、４０単位のＥｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２単位のＥ．ｃｏｌｉＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び１０単位のＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ。反応を１５．８℃で２時間にわたって進行させ、そしてこの反応の最後の５分間に、６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州ビバリー）を添加した。得られた二重鎖ｃＤＮＡをＢｉｏＭａｇカルボキシ末端粒子を使用して次のように精製した：０．２ｍｇのＢｉｏＭａｇ粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社，ペンシルバニア州ウォリントン）を、０．５ＭのＥＤＴＡで３回洗浄することによって平衡化させ、そして０．５ＭのＥＤＴＡに２２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁した。この二重鎖ｃＤＮＡ反応物を１０％のＰＥＧ／１．２５ＭのＮａＣｌの最終濃度にまで希釈し、そしてビーズ懸濁液を０．６１４ｍｇ／ｍＬの最終ビーズ濃度にまで添加した。この反応物を室温で１０分間インキュベートした。ｃＤＮＡ／ビーズ複合体を３００μＬの７０％エタノールで洗浄し、このエタノールを除去し、このチューブを空気乾燥させた。ｃＤＮＡを２０μＬの１０ｍＭＴｒｉｓ−アセテート，ｐＨ７．８で溶出させ、２〜５分間インキュベートし、そしてｃＤＮＡを含有する上澄み液を取り出した。
【０１９７】
次いで、１０μＬの精製二重鎖ｃＤＮＡを、１×試験管内転写（ＩＶＴ）緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースチン）、５０００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，ウィスコンシン州マジソン）、３ｍＭのＧＴＰ、１．５ｍＭのＡＴＰ、１．２ｍＭのＣＩＰ及び１．２ｍＭのＵＴＰ（Ａｍａｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、０．４ｍＭの各ビオ−１６ＵＴＰ及びビオ−１１ＣＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ニューヨーク州ファーミンデール）並びに８０単位のＲＮアーゼ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースチン）を含有するＩＶＴ溶液に添加した。反応を３７℃で１６時間進行させた。標識されたＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して精製した。このＲＮＡの収量を２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量化した。
【０１９８】
アレイハイブリダイゼーション及び蛍光検出を次のように実行した。１２μｇのＩＶＴを４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート（ｐＨ８．０）、１００ｍＭの酢酸カリウム及び３０ｍＭの酢酸マグネシウム中で３５分にわたって９４℃でフラグメント化した。このフラグメント化された標識ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーション用緩衝液で１×２−Ｎのモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ（緩衝液（ｐＨ６．５）、５０ｐＭのＢｉｏ９４８（該プローブアレイ上の目印となる主要部にハイブリダイズする対照のビオチニル化オリゴ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社，マサチューセッツ州ケンブリッジ））、１００μｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，ウィスコンシン州マジソン）、５００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び１μＬ／μｇの標準曲線試薬（ミッドランド州ゲーサーズバーグのＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社が供給する特許試薬））の最終濃度で希釈した。このハイブリダイゼーション溶液を２個のガラスビーズ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，ペンシルバニア州ピッツバーグ）に４５℃で一晩プレハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション溶液を透明なチューブに取り出し、９５℃で１〜２分間加熱し、そして２分間にわたって高速で微量遠心分離して不溶性の破片をペレット化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドアレイのカートリッジ（ヒト６８００アレイＰ／Ｎ９００１８３及びヒトＵ９５Ａ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社，カリフォルニア州サンタクララ））を非ストリンジェント洗浄用緩衝液（０．９ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭの燐酸ナトリウム、６ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）で予備浸潤させ、そして５〜１０分にわたって回転させつつ４５℃でインキュベートした。緩衝液をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘカートリッジから取り除き、そして該アレイを該ハイブリダイゼーション溶液の１８０μＬと４５℃で一晩４５〜６０ｒｐｍで回転させつつハイブリダイズさせた。一晩のインキュベーション後に、該ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてそのカートリッジを非ストリンジェント洗浄用緩衝液で満たした。このアレイカートリッジを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルイディクスステーションを使用して、２５℃での１０サイクルの２混合／サイクル非ストリンジェント洗浄用緩衝液、その後４サイクルの１５混合／サイクルストリンジェント洗浄用緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ、０．１ＭのＮａ+、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．００５％の消泡剤）に従って洗浄した。次いで、プローブのアレイをまずＳＡＰＥ溶液（１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａ+、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．００５％の消泡剤、２ｍｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び１０μｇ／ｍＬのＲフィコエリトリンストレプタビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社，オレゴン州ユージーン））中で２５℃で１０分間にわたって染色した。第１染色後に、該プローブアレイを２５℃での非ストリンジェント洗浄用緩衝液による１０サイクルの４混合／サイクルにわたって洗浄した。次いで、該プローブアレイを抗体溶液��１００ｍＭのＭＥＳ、１ＭのＮａ+、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．００５％の消泡剤、２ｍｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１００μｇ／ｍＬのヤギＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社、ミズーリ州セントルイス）及び３μｇ／ｍＬのビオチニル化抗ストレプタビジン抗体（ヤギ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社））中で２５℃で１０分間にわたって染色した。該第２染色後に、該プローブアレイを再度ＳＡＰＳ溶液中で２５℃でさらに１０分間染色した。最後に、該プローブアレイを３０℃での非ストリンジェント洗浄用緩衝液により１５サイクルの４混合／サイクルにわたって洗浄する。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社，カリフォルニア州サンタクララ）を使用してスキャンした。このスキャナーは、走査共焦点顕微鏡を含み、且つ、励起光源のためにアルゴンイオンレーザーを使用し、そして発光は、５３０ｎｍバンドパスフィルター（フルオレセイン０又は５６０ロングパスフィルター（フィコエリトリン））で光電子倍増管によって検出する。
【０１９９】
データ分析を、ＧＥＮＣＨＩＰ３．０又は４．０ソフトフェアを使用して内部対照に対して標準化／基準化しつつ実行した。それぞれの患者について、２種のパラメーターを使用してデータをフィルターした：（１）所定のＲＮＡ試料内に遺伝子のＲＮＡが存在すること（Ｐ）又は存在しないこと（Ａ）を示す「絶対決定」、（２）ＲＮＡ試料内の所定のＲＮＡのコピー数を測定する「頻度」（この値は、１００万個の転写物当たりのコピー数として表される。）。ある遺伝子が「存在しない」とコールされた場合には、その頻度を使用して該遺伝子の平均頻度を算出することはしなかった。ある遺伝子がＨｕ６８００データにおいて４人以上の患者（ＨｇＵ９５Ａデータにおいては２人以上の患者又は６個体以上の動物）について「存在しない」とコールされた場合には、平均頻度は全く算出しなかった。正常のボランティアのみについての平均頻度を有する遺伝子を「正常」と標識すると共に、患者のみについての平均頻度を有するものを「病気」と標識した。遺伝子発現のフォールド・チェンジを、該患者の平均遺伝子頻度を正常者の平均遺伝子頻度で割ることによって算出した。分析のために選択される遺伝子は、次の基準を満たした：（１）１．９５以上又は１．９５未満のフォールド・チェンジ及び（２）「正常」又は「病気」のいずれかとして標識される遺伝子。
【０２００】
特に注意すべきことは、ＲＡＧＥリガンドのＳ１００ａ９及びＳ１００ａ１２がリウマチ様関節炎にかかった被検体の細胞内で過剰発現したことである。
【０２０１】
例２：リウマチ様関節炎の動物モデルで上方調節又は下方調節される遺伝子の同定
この例は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を有するマウス内で正常なマウスに対して上方調節又は下方調節されるいくつかの遺伝子の同定を説明する。遺伝子発現は、マウスの肢、ＰＢＭＣ及び滑膜で測定した。
【０２０２】
ＣＩＡは、リウマチ様関節炎の受容動物モデルである。この病気をマウスで次のように誘発させた。雄のＤＢＡ／１（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，メイン州バーハーバー）マウスを全ての実験のために使用した。関節炎を、ニワトリコラーゲンII型（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）又はウシコラーゲンII型（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社，ワシントン州レッドモンド）のいずれかを使用して誘発させた。ニワトリコラーゲンを０．０１Ｍの酢酸に溶解させ、そして１ｍｇ／ｍＬのミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（Ｈ３７ＲＡ株）を含有する等容量のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ：Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｓ社，ミシガン州デトロイト）で乳化させた。２００μｇのニワトリコラーゲンを０日目に尾の基部に皮内注射した。２１日目に、マウスに１００μｇのニワトリコラーゲンIIを含有するＰＢＳ溶液を腹腔内注射した。ウシコラーゲンII型（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社，ワシントン州レッドモンド）を０．１Ｍの酢酸に溶解し、そして１ｍｇ／ｍＬのミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（Ｈ３７ＲＡ株）を含有する等容量のＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ社）で乳化させた。２００μｇのウシコラーゲンを０日目に尾の基部に皮下注射した。２１日目に、マウスの尾の基部に、２００μｇのウシコラーゲンを含有してなる０．１Ｍ酢酸溶液であって等容量のフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社）と混合されたものを皮下注射した。実験を受けたことのない動物は、コラーゲンなしの同セットの注射を受けた。マウスを病気の進行について１週間当たり少なくとも３回は監視した。個々の肢に、次の指数：
０＝正常、Ｐ＝指先での局所性紅斑によって特徴付けられる前炎症、１＝１〜２本の指の腫れを伴う明らかな紅斑、２＝足の腫れ及び／又は複数の指の腫れによって特徴付けられる顕著な紅斑、３＝足関節又は手関節にわたる大きな腫れ、４＝肢を使うことの困難さ又は関節の硬直
に基づき臨床スコアをあてがった。任意の所定のマウスについての全肢のスコアの合計は、１６の最大全身体スコアをもたらすことができた。
【０２０３】
様々な病期で、動物を安楽死させ、そして組織を採取した。一方の実施例系列では、それぞれの動物からの少なくとも２本の肢をＲＮＡ分析のために液体窒素中で瞬間凍結させた。凍結したマウスの肢を、乳鉢と乳棒と液体窒素とを使用して細かな粉末に粉砕した。ＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲＮＡｇｅｎｔ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，ウィスコンシン州マジソン）を使用して精製した。このＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキットを使用してさらに精製した。残りの肢を組織分析のために１０％のホルマリンで固定した。
【０２０４】
他方の実施例系列では、遺伝子発現をマウスのＰＢＭＣで決定した。血液を心臓穿刺によってＥＤＴＡコート採取管に採取した。血液試料を同様の全身体スコア（正常、前炎症、スコア１、３、４、５、６及び７〜９）に従って１５ｍＬの円錐管にプールした。この血液を２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで１：１に希釈し、そして等容量のＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ  Ｌａｂｓ社，カナダ国オンタリオ州ホーンビー）上に重層化した。この混合物をＳｏｒｖａｌｌ遠心分離器（型式ＲＴ６０００Ｄ）で１８５０ｒｐｍで２０分間にわたってブレーキをかけることなく遠心分離した。境界面での細胞を採取し、そして新たな管に添加した。この細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＬのＰＢＳの添加によって洗浄し、そして１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この洗浄を２回繰り返した。残りの赤血球細胞を溶解させるために、細胞ペレットを２ｍＬの冷却０．２％ＮａＣｌに分散させ、そして氷上で４５〜６０秒間インキュベートした。２ｍＬの１．６％ＮａＣｌを添加することによって溶解を停止させ、そして該細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、そしてカウントした。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上澄み液をＲＮＡの単離に備えて捨てた。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社，ドイツ国ヒデン）を使用してＰＢＭＣから単離した。
【０２０５】
さらに別の実施例系統では、ＲＮＡを、病気にかかった動物の単離された滑膜から得た。関節の滑膜を病気の動物及び対照の動物から解剖視野下で解剖した。同様の病気スコアを有する５個体以上の動物からの組織をプールし、そしてＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社，ドイツ国ヒデン）を使用して単離した。
【０２０６】
遺伝子発現を、２個のチップ上の１１０００個のネズミ遺伝子、ネズミ１１ＫｓｕｂＡ  Ｐ／Ｎ  ９００１８８及びネズミ１１ＫｓｕｂＢ  Ｐ／Ｎ９００１８９から構成されたオリゴヌクレオチドアレイＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘネズミ１１Ｋチップセットで分析した。
【０２０７】
これらのチップにハイブリダイズさせるための標識標的核酸を先の例に記載されるように５μｇのＰＢＭＣのＲＮＡ又は７μｇの肢又は滑膜組織由来ＲＮＡで調製した。
【０２０８】
データ分析を、ＧＥＮＥＣＨＩＰ３．０ソフトウェアを使用して、内部対照に対して標準化／基準化しつつ実行した。それぞれの実験試料を２つのファイル分析において時間が一致した対照と比較した。次いで、このデータをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社，カリフォルニア州レッドウッドシティー）分析プログラムに入力した。このデータを階層方式でフィルターした。まず、このデータを肢のスコアに従って分類した。それぞれのスコアについて、所定のスコア群内での全ての試料及び対照に「存在する」とコールされた遺伝子のリストを作成する。これらのリストを、各スコア群内での該試料の少なくとも大部分において「増加する」又は「減少する」とコールされなかった全ての遺伝子を排除することによってさらに定義した（プログラムで定義した）。次いで、これらのリストを該試料の全て（５個以下の試料が存在した場合）又は該試料の７０％以上のいずれかで１．９５以上又は−１．９５以下のフォールドチェンジを示した遺伝子についてフィルターした。
【０２０９】
特に注意すべきことは、ＲＡＧＥリガンドであると考えられているＳａａ３蛋白質が関節炎マウスからのＰＢＭＣで過剰発現したことである。
【０２１０】
例３：ネズミの可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃの生化学的評価
（ａ）ＲＡＧＥリガンドＳ１００Ｂのビオチニル化
Ｓ１００Ｂ（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）をＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ'−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ：Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）緩衝液に５０μＭの最終濃度にまで溶解させた。このＥＰＰＳ緩衝液は、２５ｍＭのＥＰＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2、２ｍＭのＭｇＣｌ2から構成されていた（ｐＨ＝７．５）。ビオチン（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン：Ｐｉｅｒｃｅ社，イリノイ州ロックフォード）を該Ｓ１００Ｂ溶液に室温で３０分にわたって２５０ｍＭの最終濃度にまで添加した。このビオチニル化反応を、該溶液が３５００ダルトンの分子量カットオフを有するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ社，イリノイ州ロックフォード）を使用して４℃で燐酸緩衝生理食塩水に対して透析されたときに停止させた。透析後に、Ｓ１００Ｂ蛋白質の濃度をＢｉｏＲａｄ蛋白質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して決定した。
【０２１１】
（ｂ）ネズミＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ蛋白質の調製
ＨｅＬａ細胞を使用してＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ蛋白質を発現させ且つ細胞用培地にそれを分泌させた。細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ社製変性イーグル培地中で〜８０％の集密度まで培養した。この培地を除去し、そしてこれを２％のＦＢＳと、細胞当たりほぼ１００００個のウイルス粒子の濃度のＡｄ−ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ又はＡｄ−ＧＦＰとを含有するＤＭＥで置き換えた。３７℃で２時間放置後、１０％のＦＢＳを含有する追加のＤＭＥを２６時間にわたってこの細胞の単層に添加した。状態調整した培地を集め、そして遠心分離して細胞の破片を除去した。アプロチニン（１７μｇ／ｍＬ）を該状態調整培地に添加し、次いでこれを−８０℃で保存した。Ｆｃ特異的ＥＬＩＳＡを使用して決定される、該状態調整培地中のＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ濃度は、約６μｇ／ｍＬであった。
【０２１２】
（ｃ）ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ：Ｓ１００Ｂ結合の評価
ビオチニル化Ｓ１００Ｂ蛋白質（０．３〜３μＭ）を、上記のようにＡｄ−ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ又はＡｄ−ＧＦＰのいずれかを感染させたＨｅＬａ細胞からの２００μＬの状態調整培地に添加した。この反応の容量をＥＰＰＳ緩衝液の添加によって０．３ｍＬに増加させ、そして室温で１．５時間インキュベートした。必要ならば、いくつかの反応物は、４５μＭの高移動度群−１蛋白質（ＨＭＧ−１）又は非標識Ｓ１００Ｂ蛋白質（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）のいずれかを含有していた。架橋剤のスベリン酸ビス（スルホスクシニミジル）（ＢＳ3：Ｐｉｅｒｃｅ社，イリノイ州ロックフォード）を、必要ならば５ｍＭの最終濃度にまで添加し、そして該反応体を室温でさらに４５分間インキュベートした。架橋を、Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）を２００ｍＭの最終濃度にまで添加することによって停止させた。ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃを、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｐｔｅｃｈ社，ニュージャージー州ピスカタウェイ）を室温で１．５時間にわたって添加して該溶液から沈殿させた。セファロースペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０からなる洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ、ｐＨ＝７．５）で５×１ｍＬで洗浄した。捕らえられた蛋白質を、２００ｍＭのジチオトレイトール（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）及び４Ｍの尿素（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）を含有する４×ＮｕＰａｇｅ（商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，カリフォルニア州カールズバッド）を添加することによって該セファロースから放出させた。蛋白質を、４〜１２％勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰａｇｅ（商標）Ｂｉｓ−ｉｒｉｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，カリフォルニア州カールズバッド）で分離させ、そしてタンクトランスファー装置（Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，カリフォルニア州サンフランシスコ）を使用してニトロセルロースに移した。ニトロセルロースを、５％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を含有するＴＢＳＴでブロックし、次いで５％のＮＦＤＭを含有するＴＢＳＴで１：１００００に希釈されたストレプタビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ；Ｐｉｅｒｃｅ社，イリノイ州ロックフォード）で調査した。ストレプタビジン−ＨＲＰ：ビオチン複合体を、化学発光強化溶液（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｉｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州ボストン）を使用して検出した。
【０２１３】
代表的な免疫ブロット法からの結果を図６に示している。＞１７６キロダルトン（ライン４〜８）のバンドは、ｓＲＡＧＥ−Ｆｃに架橋したビオチニル化Ｓ１００Ｂに相当する。このバンドは、Ａｄ−ＧＦＰを感染した細胞からの状態調整培地（レーン１及び２）を評価したときには存在しなかった。さらに、このバンドは、架橋剤ＢＳ3を除外したときにはＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ状態調整培地に存在しなかった（レーン３）。ＢＳ3の存在下で、Ｓ１００Ｂ−ビオチンが濃度依存の態様でＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃに結合した（レーン４〜６）。さらに、この相互作用は、過剰のＨＭＧ−１（別のＲＡＧＥリガンド）及び非標識Ｓ１００Ｂの存在下で抑制された（レーン７と８をそれぞれレーン５と比較）。まとめると、これらの結果は、Ａｄ−ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ発現ベクターが溶液の状態でＲＡＧＥリガンドを結合させることのできる分泌性ＲＡＧＥ−Ｆｃをコードしていることを示している。
【０２１４】
例４：ＣＩＡ（コラーゲン誘発関節炎）を有するマウス内でｍＲＡＧＥｍＲＮＡを発現する細胞の同定
この例は、ＣＩＡを有するマウス内でｍＲＡＧＥ遺伝子を発現する細胞の同定を説明する。
【０２１５】
例２に記載したように誘発されたＣＩＡを有するマウスの肢及び対照のマウスの肢を２４時間にわたって４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、次いでＥＤＴＡで脱石灰した。それらの組織をトリミングし、処理し、パラフィンに包埋し、そして in situ ハイブリダイゼーションのために５μｍに切片化した。in situ ハイブリダイゼーションの方法は、例３で説明したのと同一であった。ｍＲＡＧＥについてのセンス及びアンチセンスプローブを次のように調製した。
【０２１６】
アンチセンスネズミＲＡＧＥ及びセンスネズミＲＡＧＥリボプローブを、相当する転写産物からの２個の独立ＰＣＲ産物を生成させることによって作製した。オリゴヌクレオチド５'−ＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴ  ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ  ＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡ  ＴＧＣＣＡＧＣＧＧＧ  ＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧ−３'（配列番号２９）及び５'−ＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡ  ＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴ  ＣＴＧＧＣＴＴＣＣＣ  ＡＧＧＡＡＴ−３'（配列番号３０）を使用してネズミＲＡＧＥセンスプローブを生成し、そして５'−ＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴ  ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ  ＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡ  ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＴ  ＣＣＡＣＡＡＴＴＴＣ  ＴＧＧＣＴＴ−３'（配列番号３１）及び５'−ＡＴＧＣＣＡＧＣＧＧ  ＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣ  ＴＡＧＡＧＣＣＴＧＧ  ＧＴＧＣＴＧＧＴＴ−３'（配列番号３２）を使用してネズミＲＡＧＥアンチセンスプローブを生成した。
【０２１７】
ＰＣＲ増幅後に、プローブを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び試験管内転写を使用して生成した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をこれらのオリゴヌクレオチドに導入してセンスリボプローブについては該ＰＣＲ産物の５'末端に又はアンチセンスプローブについては該ＰＣＲ産物の３'末端にＴ７結合部位を挿入した。ジゴキシゲニン標識プローブを、ＤＩＧ  ＲＮＡラベリングミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，ドイツ国マンハイム）及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用してその説明書に記載されるように調製した。
【０２１８】
これらのプローブを例３で説明したようにジゴキシゲニンで標識した。標識したプローブを、２％の正常ヒツジ血清／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１：５０に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体結合抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ）で２時間にわたって検出した。標識プローブを３，３'−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社，カリフォルニア州バーリンゲーム）で１５分間展開し、水で洗浄し、マイヤーヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）で簡単に染色し、段階アルコールからキシレンまでで脱水し、そしてＤＰＸマウンタントに取り付けてから顕微鏡試験を行った。
【０２１９】
ハイブリダイゼーションの結果を表Ｉに示している。ｍＲＡＧＥで染色されたそれぞれの組織について、特定の染色が存在するか存在しないかを決定した。ｍＲＡＧＥの場合であって特定の染色が検出されたときに、この反応性の強さを、弱、中及び強と採点した。正の染色は、この（これらの）細胞が正の対照切片及び負の対照切片のうち十分な反応性を持つ褐色の顆粒状細胞質染色（ＤＡＢクロモゲン）を有していたときに特異的であるとみなされた。本研究では、センス対照切片（負の対照）を、ｍＲＡＧＥで染色されたそれぞれの組織について調製した。
【０２２０】
【表１】
2006512900.tif 000002
【０２２１】
誘発関節炎を有するマウスの肢でｍＲＡＧＥについて同定された陽性細胞は、マクロファージ、活性化軟骨細胞、成熟及び未成熟繊維芽細胞、活性化軟骨細胞、濾胞及び脂線を有する表皮並びに動脈平滑筋であった。
【０２２２】
濾胞及び脂線を有する表皮、成熟繊維芽細胞及び含脂肪細胞は、関節炎を有する肢及び関節炎を有しない肢で陽性であった。
【０２２３】
例５：ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体の投与はマウスでＣＩＡを低減させる
この例は、ＣＩＡを有するマウスへの可溶性ＲＡＧＥの投与は、可溶性の腫瘍壊死因子受容体II（ＴＮＦＲII）Ｆｃ融合蛋白質の作用と同様に、該疾患を有意に低減させることを示す。
【０２２４】
ネズミＲＡＧＥを、ＰＣＲによって、コラーゲン誘発関節炎を有するＤＢＡ／１マウスの肢から単離した。ネズミＲＡＧＥのＡＴＧからのコード領域（１〜１０２９）をネズミＩｇＧ２ａ変異Ｆｃに融合させた。Ａｄｒｉｌ−１  ｍＲＡＧＥ  Ｆｃを、ｍＲＡＧＥ−ＩＧ２ａ  Ｆｃ配列（配列番号３７及びコード蛋白質は、配列番号３８を有する。図１も参照されたい。）をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化されたアデノウイルスベクターＡｄｏｒｉ  １〜２にクローン化させることによって誘導した。ネズミＴＮＦＲIIの１〜７７４の細胞外ドメインを、ＰＣＲを使用してＤＢＡ／１マウス由来のＣＩＡを発症した肢から単離し、そしてネズミＩｇＧ２ａ変異Ｆｃに融合させた。ネズミＩｇＧ２ａ変異Ｆｃ（配列番号３９及びコード蛋白質は配列番号４０を有する。図２も参照。）に融合したマウスＴＮＦＲIIの細胞外部分を含むｃＤＮＡをＡｄｏｒｉ−２のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにクローン化し、そして得られたプラスミドをＡｄｏｒｉｌ−２ｍｓｏｌＴＮＦＲII  Ｆｃと命名した。Ａｄｏｒｉ  １１のないベクターは、挿入物を含まない。全ての構築物を、広範囲にわたる制限消化分析及び該プラスミド内部のｃＤＮＡ挿入物の配列決定によって確認した。これらのｃＤＮＡの全ての発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター及びエンハンサーで誘導される。
【０２２５】
ＲＡＧＥ−ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ又はｓＴＮＦＲII−ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（「ｓＴＮＦＲII  Ｆｃ」及び「ｍｓｏｌＴＮＦＲII  Ｆｃ」とも呼ばれる。）を有する又はこれらを有しないＡｄ５  Ｅｌａ欠失（ｄ１３２７）組換えアデノウイルス（Ａｄ−欠失ベクター、Ａｄ−ＲＡＧＥ  Ｆｃ及びＡｄ−ｍｓＴＮＦＲII  Ｆｃ（ＣＩＡモデルで使用したベクター）とも呼ばれる）を、ヒト胎生期腎細胞系統２９３内での相同組換えによって生成した。組換えアデノウイルスを単離し、そしてその後２９３細胞で増幅させた。このウイルスを、３サイクルの凍結解凍によって、感染した２９３細胞から放出させた。さらに、このウイルスを２回の塩化セシウム遠心分離勾配によって精製し、そして４℃の燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に対して透析した。透析後に、グリセリンを１０％の濃度まで添加し、そして該ウイルスを使用まで−８０℃で保存した。これらのウイルスを、導入遺伝子の発現、２９３細胞でのプラーク形成単位、粒子／ｍＬ、エンドトキシン測定並びに該ウイルスのＰＣＲ分析及び該ウイルス内のコード領域の配列分析によって特徴付けた。
【０２２６】
該可溶性ｍＲＡＧＥ−Ｆｃがコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）のネズミモデルの症状を改善させることができるかどうかを試験した。雄のＤＢＡ／１（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，メイン州バーハーバー）マウスを全ての実験のために使用した。関節炎は、ウシコラーゲンII型（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社，ワシントン州レッドモンド）を使用して誘発した。ウシコラーゲンII型を０．１Ｍの酢酸に溶解させ、そして１ｍｇ／ｍＬのミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（Ｈ３７ＲＡ株）を含有する等容量のＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ社）中で乳化させた。１００μｇのウシコラーゲンを０日目に尾の基部に皮下注射した。２１日目に、マウスの尾の基部に等容量のフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社，ミズーリ州セントルイス）と混合された１００μｇのウシコラーゲンを含有する０．１Ｍ酢酸溶液を皮下注射した。マウスは、２０日目に５×１０10個の粒子の欠失ウイルス、ｍｓｏｌＴＮＦＲII又はｍＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃの投与量を受容した。
【０２２７】
マウスを１週間に少なくとも３回病気の進行について監視した。個々の肢に、次の指数：
０＝正常、Ｐ＝指先での局所性紅斑によって特徴付けられる前炎症、１＝１〜２本の指の腫れを伴う明らかな紅斑、２＝足の腫れ及び／又は複数の指の腫れによって特徴付けられる顕著な紅斑、３＝足関節又は手関節にわたる大きな腫れ、４＝肢を使うことの困難さ又は関節の硬直
に基づき臨床スコアをあてがった。従って、任意の所定のマウスについての全肢のスコアの合計は、１６の最大全身体スコアをもたらした。
【０２２８】
図４に示すこの結果は、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体の投与が全身体スコアを非常に低く保持することを示しており、そしてこれは、ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体の投与がＣＡＩを有意に低減させ且つ予防することを示している。
【０２２９】
例６：ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ蛋白質を安定して発現し且つ分泌する細胞系統
安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞  をネズミ及びヒトＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ蛋白質を発現するように操作した。ネズミ及びヒトＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃをほ乳類発現ベクターにクローン化し、線状化し、そしてリポフェクチンを使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトした（方法（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７−６６、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｎｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１、Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｄ．他．（１９９３），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２２：２３６）。細胞を２０ｎＭ及び５０ｎＭのメトトレキセートでさらに選択し、そして状態調整した培地を個々のクローンから採取し、そしてＳＤＳドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＡ−ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット法によって分析して発現を確認した。
【０２３０】
ヒト及びネズミＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃを発現するＣＨＯ細胞を培養して蛋白質精製用の状態調整培地を採取した。蛋白質を標準法を使用して精製した。精製した蛋白質を還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そしてその蛋白質をクマシーブルー染色によって視覚化した（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。この分析結果は、精製された蛋白質が予期される分子量のものであることを示している。
【０２３１】
引用
ここで言及した全ての刊行物及び特許文献は、それぞれ個々の刊行物又は特許文献が引用によってあたかも具体的・個別的に表示されているかのようなそれらの全体の参照として示されている。
均等
本発明の特定の具体例を議論してきたが、本明細書は例示であり、これに限定されない。当業者であれば、本明細書及び請求の範囲の検討に基づき、本発明の多くの変形例が明らかになるであろう。本発明の全範囲は、請求の範囲とそれらの均等の全範囲及び明細書とこのような変形例とを参照することによって決定すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１Ａ】ネズミの可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合蛋白質のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ｂ】ネズミの可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ａ】ネズミの可溶性ＴＮＦＲIIのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２Ｂ】ネズミの可溶性ＴＮＦＲIIのアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ａ】変異ＩｇＧ１重鎖のＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域に融合するヒトＲＡＧＥのアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｂ】変異ＩｇＧ１重鎖のＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域に融合するヒトＲＡＧＥのヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】ＣＩＡを発症させるように誘発され、且つ、ＣＩＡの誘発後数日目にＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合体、ｓＴＮＦＲII又は空のベクターで処理されたマウスの全身体スコアを示す図である。
【図５】ＲＡＧＥ−ＬＢＥ融合蛋白質の様々な例を示す図である。
【図６】ＲＡＧＥリガンドに結合しているＲＡＧＥ−ＬＢＥ−Ｆｃ融合蛋白質を示す図である。
【図７】ヒトＲＡＧＥについてのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ヒトＲＡＧＥについての核酸配列を示す図である。
【図９】ＲＡＧＥ−ＬＢＥ−ＦｃがＣＨＯ細胞によって分泌されることを示す図である。
【図１０】ヒトＲＡＧＥの配列分析を示す図である。
【図１Ａ】
2006512900.tif 000003
【図１Ｂ】
2006512900.tif 000004
【図２Ａ】
2006512900.tif 000005
【図２Ｂ】
2006512900.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
2006512900.tif 000009
【図５】
2006512900.tif 000010
【図６】
2006512900.tif 000011
【図７】
2006512900.tif 000012
【図８】
2006512900.tif 000013
【図９】
2006512900.tif 000014
【図１０】
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【国際調査報告】
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