(57)【要約】本発明の実施の形態は、安定化した被覆組成物を備えた分析物センサ（１００）と、そのようなセンサの製造法とを提示する。例示的な実施の形態は、例えば、スピンコーティング法により生成した、安定化グルコースオキシダーゼ被覆（１１０）を備えた電気化学的グルコースセンサ（１００）を含む。
2006502810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体内に埋め込むためのセンサであって、
前記センサは、
ベース層と、
前記ベース層上に配置したセンサ層と、
前記センサ層上に配置した酵素層と、
カバー層と、
を含み、
前記センサ層は複数のセンサ素子を含み、
前記酵素層の厚さは２μｍ以下であり、
更に、前記酵素層は、前記センサ層上の複数の感知素子を全て覆うことを特徴とするセンサ。
【請求項２】
請求項１に記載のセンサであって、
前記酵素層はグルコースオキシダーゼを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項３】
請求項２に記載のセンサであって、
前記酵素層は、前記グルコースオキシダーゼと共にほぼ一定した比のキャリヤ蛋白を更に含むことを特徴とするセンサ。
【請求項４】
請求項３に記載のセンサであって、
前記グルコースオキシダーゼ及び前記キャリヤ蛋白は、配置した前記酵素層全体にほぼ均一に分散していることを特徴とするセンサ。
【請求項５】
請求項３に記載のセンサであって、
前記キャリヤ蛋白はアルブミンを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項６】
請求項５に記載のセンサであって、
前記アルブミンの含有量は約５重量％であることを特徴とするセンサ。
【請求項７】
請求項１に記載のセンサであって、
前記カバー層は分析物接触層であり、
前記分析物接触層は、前記酵素層に接触可能な分析物の量を調節するよう前記センサ上に配置されることを特徴とするセンサ。
【請求項８】
請求項１に記載のセンサであって、
前記酵素層の厚さは、１、０．５、０．２５、及び０．１μｍ以下から成る群より選ばれることを特徴とするセンサ。
【請求項９】
請求項７に記載のセンサであって、
更に、前記酵素層と前記分析物接触層との間に配置した接着促進剤層を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１０】
電気化学的分析物センサであって、
前記センサは、
ベース層と、
前記ベース層上に配置したセンサ層と、
前記センサ層上に配置した酵素層と、
分析物接触層と、
を含み、
前記センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極と少なくとも１つの参照電極とを含み、
前記酵素層の厚さは２μｍ以下であり、
前記分析物接触層は、前記酵素層に接触する分析物の量を調節することを特徴とするセンサ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のセンサであって、
前記作用電極の被覆面は前記対電極の被覆面より大きいことを特徴とするセンサ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のセンサであって、
前記酵素層はグルコースオキシダーゼを含み、
更に、前記グルコースオキシダーゼは、一定の比のキャリヤ蛋白と結合させて前記作用電極と前記対電極と前記参照電極の上に被覆することにより安定化されることを特徴とするセンサ。
【請求項１３】
請求項１０に記載のセンサであって、
前記酵素層は前記センサ層の大部分を覆っていることを特徴とするセンサ。
【請求項１４】
請求項１０に記載のセンサであって、
更に、前記酵素層と前記分析物接触層との間に配置した接着促進剤層を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１５】
体内に埋め込むためのグルコースセンサであって、
前記センサは、
ベース層と、
前記ベース層上に配置したセンサ層と、
前記センサ層上に配置したグルコースオキシダーゼ層と、
グルコース制限層と、
を含み、
前記グルコースオキシダーゼは、特定の比のアルブミンと結合させることにより安定化され、
更に、前記グルコースオキシダーゼ及び前記アルブミンは、配置した層全体にほぼ均一に分散し、
前記グルコース制限層は、前記グルコースオキシダーゼ層に接触するグルコースの量を調節することを特徴とするセンサ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のセンサであって、
前記センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含む複数のセンサ素子を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１７】
請求項１５に記載のセンサであって、
前記グルコースオキシダーゼ層の厚さは、１、０．５、０．２５、及び０．１μｍ以下から成る群より選ばれることを特徴とするセンサ。
【請求項１８】
請求項１５に記載のセンサであって、
前記アルブミンの含有量は約５重量％であることを特徴とするセンサ。
【請求項１９】
請求項１５に記載のセンサであって、
更に、前記グルコースオキシダーゼ層と前記グルコース制限層との間に配置した接着促進剤層を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２０】
過酸化水素再循環能を持つ電気化学的グルコースセンサであって、
前記センサは、
ベース層と、
前記ベース層上に配置したセンサ層と、
前記センサ層上に配置したグルコースオキシダーゼ層と、
グルコース制限層と、
を含み、
前記センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含み、
前記グルコースオキシダーゼ層は、グルコースオキシダーゼがグルコースと反応して生じた過酸化水素を、前記作用電極が酸化するよう、前記作用電極の少なくとも一部と前記対電極の少なくとも一部とを覆い、
前記グルコース制限層は、前記グルコースオキシダーゼ層に接触可能なグルコースの量を調節するよう、前記センサ上に配置され、
更に、前記グルコース制限層は、前記センサの置かれた環境中への過酸化水素の拡散を抑制するよう前記センサ上に配置されていることを特徴とするセンサ。
【請求項２１】
請求項２０に記載のセンサであって、
更に、前記グルコースオキシダーゼ層と前記グルコース制限層との間に配置した接着促進剤層を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のセンサであって、
前記接着促進剤層はシラン化合物を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２３】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記センサは更に、前記ベース層と前記グルコースオキシダーゼ層との間に絶縁層を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２４】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記絶縁層はポリイミドを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２５】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記電極は白金黒を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２６】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記グルコースオキシダーゼ層は、前記センサ層上に蒸気架橋されることを特徴とするセンサ。
【請求項２７】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記グルコースオキシダーゼ層は、一定の比のキャリヤ蛋白と結合させて前記センサ層上に被覆することにより安定化されることを特徴とするセンサ。
【請求項２８】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記ベース層はポリイミドを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２９】
請求項２０に記載のセンサであって、
前記グルコース制限層は親水性ポリマーを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項３０】
ベース層を準備する工程と、
前記ベース層上にセンサ層を形成する工程と、
前記センサ層上に酵素層をスピンコーティングする工程と、
前記センサ上に分析物接触層を形成する工程と、
を含み、
前記分析物接触層は、前記酵素層に接触可能な分析物の量を調節することを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、
更に、前記酵素層を蒸気架橋する工程を含むことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、
更に、前記センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含むことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、
前記酵素層は、前記作用電極の少なくとも一部と前記対電極の少なくとも一部との上に形成されることを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３４】
請求項３０に記載のセンサであって、
前記センサ層上に形成された前記酵素層の厚さは、１、０．５、０．２５、及び０．１μｍ以下から成る群より選ばれることを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３５】
請求項３０に記載の方法であって、
前記酵素層は、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、又はラクトースデヒドロゲナーゼを含むことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
前記酵素層はグルコースオキシダーゼを含み、
更に、前記グルコースオキシダーゼは、一定の比のキャリヤ蛋白と結合させて前記センサ層上に被覆することにより安定化されることを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、
前記キャリヤ蛋白はアルブミンであり、
更に、前記グルコースオキシダーゼ及び前記アルブミンは、配置した酵素層全体にほぼ均一に分散していることを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３８】
請求項３０に記載の方法であって、
更に、前記グルコースオキシダーゼ層と前記分析物接触層との間に配置した接着促進剤層を形成する工程を含むことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、
前記分析物接触層の形成前に、前記接着促進剤層に硬化処理を行うことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項４０】
ベース層を準備する工程と、
前記ベース層上にセンサ層を形成する工程と、
前記センサ層上にスピンコーティング法によりグルコースオキシダーゼ層を形成する工程と、
前記グルコースオキシダーゼ層に接触可能なグルコースの量を調節するよう、前記グルコースセンサ上にグルコース制限層を形成する工程と、
を含み、
前記センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含み、
前記グルコースオキシダーゼ層は、前記作用電極の少なくとも一部と前記対電極の少なくとも一部とを覆うことを特徴とするグルコースセンサの製造法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記センサ層上に形成した前記グルコースオキシダーゼ層の厚さは、１、０．５、０．２５、及び０．１μｍ以下から成る群より選ばれることを特徴とするセンサの製造法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、
更に、前記グルコースオキシダーゼ層を蒸気架橋する工程を含むことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、
前記グルコースオキシダーゼ層は、グルコースオキシダーゼを一定の比のアルブミンと結合することにより安定化されることを特徴とするセンサの製造法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法であって、
更に、前記グルコースオキシダーゼ層と前記分析物接触層との間に配置した接着促進剤層を形成する工程を含むことを特徴とするセンサの製造法。
【請求項４５】
少なくとも１つの電極の表面に、安定化したグルコースオキシダーゼの約２μｍ以下の被覆を形成する方法であって、
前記方法は、
約２万単位のグルコースオキシダーゼに対し約５重量％のアルブミンの比で、グルコースオキシダーゼとアルブミンとを結合する工程と、
グルコースオキシダーゼとアルブミンとの混合物を、スピンコーティング法、浸漬及び乾式法、ミクロデポジション（microdeposition）法、ジェットプリンタ沈着法、スクリーン印刷法、又はドクターブレード法から成る群より選ばれる工程によって電極表面に塗布する工程と、
を含むことを特徴とする被覆の製造法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、
前記安定化グルコースオキシダーゼの被覆は、スピンコーティング法によって電極表面に塗布することを特徴とする被覆の製造法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、
前記安定化グルコースオキシダーゼ被覆は、少なくとも２つの電極の表面に形成することを特徴とする被覆の製造法。
【請求項４８】
請求項４５に記載の方法であって、
前記アルブミンの含有量は、約５重量％であることを特徴とする被覆の製造法。
【請求項４９】
請求項４５に記載の方法であって、
前記センサ層に形成した前記安定化グルコースオキシダーゼ層の厚さは、１、０．５、０．２５、及び０．１μｍ以下から成る群より選ばれることを特徴とする被覆の製造法。
【請求項５０】
電極表面に被覆するための安定化したグルコースオキシダーゼ層であって、
前記グルコースオキシダーゼは、前記層中において一定の比のキャリヤ蛋白と混じり合い、
前記グルコースオキシダーゼ及び前記キャリヤ蛋白は、前記層全体にほぼ均一に分散し、
前記層の厚さは２μｍ以下であることを特徴とする安定化グルコースオキシダーゼ層。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許第６，４１３，３９３号、“SENSOR INCLUDING UV-ABSORBING POLYMER AND METHOD OF MANUFACTURE”、米国特許第６，３６８，２７４号、“REUSABLE ANALYTE SENSOR SITE AND METHOD OF USING THE SAME”、米国特許第５，７８６，４３９号、“HYDROPHILIC, SWELLABLE COATINGS FOR IMPLANTABLE DEVICES”、米国特許第５，７７７，０６０号、“SILICON CONTAINING BIOCOMPATIBLE MEMBRANES”、米国特許第５，３９１，２５０号、“METHOD OF FABRICATING THIN FILM SENSORS”、ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ０１／５８３４８号、“IMPROVED ANALYTE SENSOR AND METHOD OF MAKING THE SAME”、及び米国特許第５，３９０，６７１号、“TRANSCUTANEOUS SENSOR INFUSION SET”に関する。各特許の内容は本件に引用して援用する。
【０００２】
本発明は、グルコースなどの分析物の検出及び測定のためのセンサ類と、その製造法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電気化学的センサなどの分析物センサは、数多くの分化したセンサの実用的用途に応じて様々な方法で製造される。例えば、一般に電気化学的センサは、当該技術で公知の薄膜形成法を用いて製造される。このような薄膜センサは一般に、薄膜形成法により導体を塗布し、次に、ポリイミドフィルムなどの非伝導性薄膜材料の層と組み合わせてフォトリソグラフマスク及び／又はエッチング法でパターンを形成した、１つ以上の薄い導体を含む。導体は通常、その上に適当な電極材料を載せた遠端センサチップと、それと組み合わせる適当な電子モニタ装置に導電接続させた近端接触パッドとなるよう形成する。このようなセンサには通常、様々な機能特性を持つ被覆層を更に加える。近年、この一般的なタイプの薄膜センサは、医療用の経皮的センサとして使用するため設計されている。一例として、糖尿病患者の血中グルコース濃度の監視に使用するために設計した薄膜センサがある。
【０００４】
血中グルコース濃度などの身体特性の計測用に設計されたセンサセットに使用されるようなセンサを製造する様々な方法は当該技術で公知である。このようなセンサ、センサセット、及びその製造法の例は、その内容を全て本件に引用して援用する、例えば、同一出願人による、米国特許第５，３９０，６９１号、米国特許第５，３９１，２５０号、米国特許第５，４８２，４７３号、米国特許第５，２９９，５７１号、米国特許第５，５６８，８０６号、更にＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ０１／５８３４８号に述べられている。
【０００５】
多くのセンサ構造とそのようなセンサ類の製造法は当該技術で公知であるが、より良好な寿命、直線性、及び規則性（regularity）、更に最適なＳ／Ｎ（信号／ノイズ）比などの優れた特性を備えたセンサ類が求められている。また、このように最適とした品質を備えたセンサ類の製造を可能とする方法及び操作の明示も求められている。本発明はこのような要求を満たし、更に関連する長所を提示するものである。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，３９０，６９１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３９１，２５０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４８２，４７３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，２９９，５７１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５６８，８０６号明細書
【特許文献６】国際公開第ＷＯ０１／５８３４８号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本件に開示の本発明の実施の形態では、例えば、糖尿病患者の血中グルコース濃度の皮下又は経皮的モニタに用いる種類のセンサの製造法を提示する。より詳細には、本件に提示の明細は、このような種類のセンサに非常に薄い酵素被覆を塗布する方法と、更にこのような方法で製造されたセンサを教示する。本発明のセンサの望ましい製造法は被覆工程を含む。驚いたことに、このような方法で作った酵素被覆を持つセンサは、より良好な寿命、直線性、及び規則性、更に優れたＳ／Ｎ比など、多くの優れた品質を備えている。更に、このような方法で作ったグルコースオキシダーゼ被覆を用いた、本発明のあるセンサの実施の形態を、過酸化水素を再循環する構造として、そのようなセンサの生体適合性を向上させる。
【０００８】
本発明の例示的な実施の形態は、体内埋め込み用に設計したセンサであって、このセンサは、ベース層と、ベース層上に設けた、複数のセンサ素子を含むセンサ層と、センサ層上に設けた、センサ層上の感知素子を覆う酵素層（望ましくは厚さ２μｍ以下）と、カバー層とから成る。一般に酵素層は、グルコースオキシダーゼを含み、望ましくはほぼ一定の比のキャリヤ蛋白も含む。一般にキャリヤ蛋白はアルブミンから成り、その量は、望ましくは約５重量％である。本発明の望ましい実施の形態では、カバー層は、酵素層に接触可能な分析物の量を調節するよう、センサ上に設けた分析物接触層である。望ましくは分析物接触層は、センサ上のグルコースオキシダーゼ被覆に接触可能なグルコース分析物の量を制限するグルコース制限層である。特に望ましい実施の形態では、センサは、酵素層とグルコース制限層との間に設けた接着促進剤層を含む。
【０００９】
本発明の別の実施の形態は、過酸化水素再循環能を持つ電気化学的グルコースセンサである。一般にこのようなセンサは、ベース層と、ベース層上に設けたセンサ層と、センサ層上に設けたグルコースオキシダーゼ層と、センサ上に設けたグルコース制限層とを含み、センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含み、グルコースオキシダーゼ層は、グルコースオキシダーゼがグルコースと反応して生じる過酸化水素を作用電極が酸化するよう、作用電極の少なくとも一部と対電極の少なくとも一部を覆い、グルコース制限層は、グルコースオキシダーゼ層に接触可能なグルコースの量を調節し、またセンサの置かれた環境中に過酸化水素が拡散するのを防ぐ。必要に応じて、このようなセンサの実施の形態は更に、センサ層上に参照電極を含み、このときグルコースオキシダーゼ層は、参照電極の少なくとも一部を覆うようセンサ層上に配置される。
【００１０】
本明細書は、本発明の実施の形態のセンサを製造する方法を提示する。本発明の望ましい実施の形態は、ベース層を準備する工程と、ベース層上にセンサ層を形成する工程と、センサ層上に酵素層をスピンコーティングする工程と、次にセンサ上に分析物接触層を形成する工程と、によるセンサの製造法であって、分析物接触層は、酵素層に接触可能な分析物の量を調節する。非常に薄い酵素被覆の塗布に望ましい方法はスピンコーティング法であるが、このように非常に薄い被覆は、浸漬及び乾式法、低剪断スプレー法、インクジェット印刷法、シルクスクリーン法などでも塗布できる。望ましい方法では、酵素層をセンサ層上に蒸気架橋（vapor crosslinked）する。本発明の代表的な実施の形態では、センサ層を、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極を含むように形成する。特に望ましい実施の形態では、酵素層を、作用電極の少なくとも一部と対電極の少なくとも一部の上に形成する。一般に、センサ層上に形成された酵素層の厚さは、２、１、０．５、０．２５、又は０．１μｍ以下である。望ましくは、酵素層は、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、又はラクトースデヒドロゲナーゼを含む。特定の方法では、酵素層は、一定の比のキャリヤ蛋白と結合させてセンサ層上に被覆することにより安定化したグルコースオキシダーゼを含む。一般にキャリヤ蛋白はアルブミンである。望ましくはこのような方法は、グルコースオキシダーゼ層と分析物接触層との間に設けた接着促進層の形成工程を含む。必要に応じて、分析物接触層の形成前に、接着促進層に硬化処理を行う。
【００１１】
本発明はまた、センサセット及びキットなどの製造についても更に提示する。本発明のこのような実施の形態のあるものでは、上記の分析物の検出に有用なキット及び／又はセンサセットを提示する。キット及び／又はセンサセットは通常、容器と、ラベルと、上記の極薄酵素被覆を備えたセンサとを含む。
【００１２】
本発明のその他の目的、特徴、及び長所は、以下の詳細な記述より当業者には明らかとなろう。この詳細な記述及び具体例は本発明の望ましい実施の形態を示しているが、これは説明のためであって、制限するものではないことは理解されたい。本発明の意図から外れることなく、本発明の範囲内で多くの変更及び変形を行うことができ、また本発明はこのような変形も全て含む。
【００１３】
段階的に示されているように、この反応には、水中における、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）とグルコースと酸素が関与している。反応の還元側では、２つのプロトンと電子がβ−Ｄ−グルコースから酵素へ移動して、Ｄ−グルコノラクトンが生じる。反応の酸化側では、分子状酸素によって酵素が酸化されて過酸化水素が生じる。次にＤ−グルコノラクトンは水と反応し、ラクトン環が加水分解してグルコン酸が生成する。本発明の典型的な電気化学的センサでは、この反応で生じた過酸化水素を作用電極で酸化する。（Ｈ2Ｏ2  →  ２Ｈ+  ＋  Ｏ2  ＋  ２ｅ-）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
特に定義のない限り、本明細書で使用する全ての技術用語、表記、及びその他の科学用語又は専門用語は、本発明の関わる技術の当業者に一般的に知られている意味を持つものとする。場合により、明確にするため及び／又は参照を容易にするため、一般に理解されている意味を持つ用語を本明細書で定義する。本明細書のそのような定義の内容は、当該技術で一般に理解されているものとの実質的な差異を示しているとは必ずしも解釈すべきではない。本明細書に示し、又は参照とした技術及び手法の多くは良く理解されており、また当業者により従来の方法論を用いて一般的に使用されている。適当であれば、市販のキット及び試薬の使用を伴う操作を、特に記載のない限り、製造者の定めたプロトコル及び／又はパラメータに従って一般に行う。
【００１５】
本件に開示の本発明の実施の形態では、例えば、糖尿病患者の血中グルコース濃度の皮下又は経皮的モニタに使用する種類の電気化学的センサの製造法を提示する。より詳細には、本件に提示の明細は、これらのセンサ中の特定の要素に非常に薄い酵素被覆を塗布する方法を教示する。本明細書は更に、このような方法で製造したセンサを提示する。本発明のセンサの製造法には、スピンコーティング法、浸漬及び乾式法、低剪断スプレー法、インクジェット印刷法、シルクスクリーン法、等が含まれる。驚くべきことに、このような方法で製造した薄い酵素被覆を備えたセンサは、より良好な寿命、直線性、規則性、更に優れたＳ／Ｎ比など、多くの優れた品質を備えている。
【００１６】
本発明の望ましい実施の形態はグルコースセンサに関するものであるが、このように薄い酵素被覆は、当該技術で公知の様々なセンサのいずれにも適用することができる。多くの酵素センサ（例えば、グルコースと酸素との反応に影響を及ぼす酵素であるグルコースオキシダーゼを用いたグルコースセンサ）は当該技術において公知であり、その製造には技術を要する。例えば、その内容を全て本件に引用して援用する、米国特許第５，１６５，４０７号、米国特許第４，８９０，６２０号、米国特許第５，３９０，６７１号、及び米国特許第５，３９１，２５０号を参照されたい。糖尿病のグルコース濃度を監視するセンサについては更に、シチリら,“In Vivo Characteristics of Needle-Type Glucose Sensor-Measurements of Subcutaneous Glucose Concentrations in Human Volunteers”, Horm. Metab. Res., Suppl. Ser. 20: 17-20 (1988); ブルッケルら,“In Vivo Measurement of Subcutaneous Glucose Concentrations with an Enzymatic Glucose Sensor and a Wick Method”, Klin. Wochenschr. 67: 491-495 (1989)、及び、ピックアップら,“In Vivo Molecular Sensing in Diabetes Mellitus: An Implantable Glucose Sensor with Direct Electron Transfer”, Diabetologia 32: 213-217 (1989)に述べられている。その他のセンサは、例えば、本件に引用して援用する、ADVANCES IN IMPLANTABLE DEVICES, A. ターナー編, JAI Press, London, Chap. 1, (1993)の中でリーチらにより述べられている。本発明特有の態様については、以下の章で詳細に論じる。
【００１７】
Ａ．本発明の極薄酵素被覆
本発明の重要な態様は、良好な物性を持つ優れた電極化学被覆（electrode chemistry coatings）（例えば、厚さ２μｍ以下の酵素被覆）を備えたセンサの製造法に関するものである。本発明の極薄酵素被覆の製造法には、スピンコーティング法、浸漬及び乾式法、低剪断スプレー法、インクジェット印刷法、シルクスクリーン法、等が含まれる。一般にこのような被覆は、塗布後蒸気架橋させる。驚くべきことに、このような方法で製造したセンサは、電着により製造した被覆を備えたセンサより優れた物性、例えば、優れた寿命、直線性、規則性、更に良好なＳ／Ｎ比などを備えている。更に、このような方法で形成したグルコースオキシダーゼ被覆を用いた、本発明のあるセンサの実施の形態を、過酸化水素を再循環するよう設計して、このようなセンサの生体適合性を向上させる。
【００１８】
特定の科学的理論に結びつけるものではないが、このような方法で製造したセンサが、電着で製造したものと比べて驚くほど良好な特性を持つのは、電着では３〜５μｍの厚い酵素層ができ、その中では被覆層内の反応性酵素のほんの一部しか検出すべき分析物に接触できないためと考えられる。グルコースオキシダーゼを用いるセンサにおいては、電着で製造した厚い被覆は、３〜５μｍの厚い酵素層の反応性境界面で発生した過酸化水素が、センサ表面に接触して信号を発生するの妨げると考えられる。更に、このような厚い被覆のためセンサ表面に到達できなかった過酸化水素は、センサからセンサの置かれている環境中へ拡散して、このようなセンサの生体適合性を低下させるおそれがある。
【００１９】
更に、特定の科学的理論に結びつけるものではないが、このような方法で製造したセンサの予想外の性質は更に、スピンコーティング等の方法であると、酵素被覆全体のグルコースオキシダーゼとアルブミン（酵素層中のグルコースオキシダーゼを安定化させるキャリヤ蛋白として用いる ）との比を正確に制御できるという事実によるものと考えられる。詳細には、グルコースオキシダーゼとアルブミンは異なる等電位点を持つため、電着法で生成した表面被覆中では、最適としてあった酵素とキャリヤ蛋白との比が電着操作中に崩れてしまい、更に、グルコースオキシダーゼとキャリヤ蛋白とが、配置した酵素層全体にほぼ均一に分散していない。
【００２０】
この点において、本発明の望ましい実施の形態は、電極などのマトリックスの表面に安定化したグルコースオキシダーゼの約２μｍ以下の被覆を形成する方法であって、この方法は、グルコースオキシダーゼを一定の比（一般に、グルコースオキシダーゼの安定性を最良とする比）のアルブミンと結合する工程と、グルコースオキシダーゼとアルブミンとの混合物を、スピンコーティング法、浸漬及び乾式法、ミクロデポジション（microdeposition）法、ジェットプリンタ沈着法、スクリーン印刷法、又はドクターブレード法から成る群より選ばれる方法により、マトリックス表面に塗布する工程とを含む。望ましくは、安定化グルコースオキシダーゼ被覆を、スピンコーティング法で電極表面に塗布する。最も望ましい実施の形態では、グルコースオキシダーゼ／アルブミンは、約５重量％の量のアルブミンを加えた生理的溶液（例えば、中性ｐＨのリン酸緩衝塩類液）中で調製する。必要に応じて、センサ層上に形成した安定化グルコースオキシダーゼ層の厚さは、２、１、０．５、０．２５、又は０．１μｍ以下である。本発明に密接に関連した実施の形態は、電極表面に被覆するための安定化グルコースオキシダーゼ層であって、グルコースオキシダーゼは層中において一定の比のキャリヤ蛋白と混じり合っており、グルコースオキシダーゼとキャリヤ蛋白はこの層全体にほぼ均一に分散している。望ましくは、この層の厚さは２μｍ以下である。
【００２１】
Ｂ．本発明の分析物センサ
本件に開示の発明は、非常に薄い酵素被覆を備えたセンサを含む、多くの実施の形態を含んでいる。本件に開示のセンサの実例となる一般的な実施の形態は、ベース層と、カバー層と、ベース及びカバー層の間に設けた、電極などのセンサ素子を備えた少なくとも１つのセンサ層とを含む。典型的に、１つ以上のセンサ素子（例えば、作用電極、対電極、参照電極、等）の露出部を、適当な電極化学を備えた素材の非常に薄い層で覆う。例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、又はヘキソキナーゼなどの酵素を、カバー層に定めた開口部又はアパーチャの中のセンサ素子の露出部上に配置することができる。図１は、本発明の典型的なセンサ構造体１００の断面を示す。このセンサは、本発明の方法に従い、様々な伝導性又は非伝導性成分の複数の層を交互に重ねてセンサ構造体１００としたものである。
【００２２】
本発明の望ましい実施の形態を図１に示す。この実施の形態は、センサ１００を支える電気絶縁性ベース層１０２を含む。この電気絶縁性ベース層１０２は、ポリイミド基板などの材料から成るもので良く、自己支持であり、あるいは更に当該技術で公知の他の材料によって支えられている。ある実施の形態では、電気絶縁層１０２は、リールから解いたポリイミドテープから成る。この形で層１０２を準備すると、清浄かつ高密度の大量生産が行い易くなる。更に、このようなポリイミドテープを用いる一部の製造法では、センサ１００をテープの両面に形成することができる。
【００２３】
本発明の典型的な実施の形態は、ベース層１０２上に設けたセンサ層を含む。図１に示すような望ましい実施の形態では、センサ層は、絶縁性ベース層１０２上に設けた伝導層１０４を含む。望ましくは、伝導層１０４は１つ以上の電極を含む。伝導層１０４は、以下に述べるような多くの公知の手法と材料を用いて塗布できるが、センサ１００の電気回路は通常、被覆した伝導層１０４を、所望のパターンの導電経路にエッチングして形成する。センサ１００の典型的な電気回路は、近端部に接触パッドを形成し、遠端部にセンサ電極を形成した、２つ以上の隣接する導電経路を含む。一般に、伝導層１０４の一部の上に、ポリマー被覆などの電気絶縁性保護層１０６を設ける。絶縁性保護層１０６として使用できるポリマー被覆としては、ポリイミドなどの毒性のない生体適合性ポリマー類、生体適合性はんだマスク、エポキシ−アクリラート共重合体、等を挙げることができるが、これらに限定するものではない。更に、伝導層１０４を貫くアパーチャ１０８をフォトリソグラフによって形成し易くするため、これらの被覆は、光によって画像形成可能なものであっても良い。
【００２４】
本発明のセンサでは、保護層１０６から伝導層１０４まで突き抜けた、１つ以上の露出部又はアパーチャ１０８を形成して、センサ１００の接触パッド及び電極を定めることができる。フォトリソグラフによる現像に加え、アパーチャ１０８は、レーザアブレーション、ケミカルミリング、又はエッチングなど多くの手法で形成可能である。第２のフォトレジストを保護層１０６に塗布して除去すべき保護層の領域を定め、アパーチャ１０８を形成しても良い。作動するセンサ１００は通常、互いに電気的に絶縁しているが通常互いに極めて接近して置かれた、作用電極及び対電極などの複数の電極を含む。その他の実施の形態では参照電極も含む。更にその他の実施の形態では、センサ上に形成されていない独立した参照を用いる。露出した電極及び／又は接触パッドにも、アパーチャ１０８を通して追加のメッキ処理などの第２の加工を行って、表面を形成し、及び／又は伝導部を強化することができる。
【００２５】
薄いセンサ化学層１１０は一般に、アパーチャ１０８を通して伝導層１０４の１つ以上の露出電極上に配置される。望ましくは、センサ化学層１１０は酵素層である。最も望ましくは、センサ化学層１１０は酵素グルコースオキシダーゼを含む。このような実施の形態では、センサ化学層１１０は、グルコースと反応して過酸化水素を発生し、生じた過酸化水素は電極への電流を変調する。これを監視すれば存在するグルコースの量を求めることができる。センサ化学層１１０は、センサ層の一部の上、又は図１に示すように保護層１０６を含むセンサ層全体に塗布することができる。望ましくは、センサ化学層１１０は、センサ層を成す作用電極と対電極の部分の上に配置する。薄いセンサ化学層１１０を形成する望ましい方法としては、スピンコーティング法、浸漬及び乾式法、低剪断スプレー法、インクジェット印刷法、シルクスクリーン法、等が挙げられる。最も望ましくは、スピンコーティング法を用いて薄いセンサ化学層１１０を塗布する。
【００２６】
一般に、薄いセンサ化学層１１０を１つ以上のカバー層で被覆する。本発明の望ましい実施の形態では、カバー層は、センサ層の酵素に接触可能な分析物の量を調節することのできる膜から成る。例えば、カバー層は、電極上のグルコースオキシダーゼ酵素層に接するグルコースの量を調節するグルコース制限膜から成るものでも良い。このようなグルコース制限膜は、この目的に適うことが知られている様々な材料、例えば、シリコーン、ポリウレタン、ポリ尿素−酢酸セルロース、ナフィオン（Nafion）、ポリエステルスルホン酸（コダック（Kodak AQ））、ヒドロゲル、又は当業者に公知のその他の膜のいずれから作ることができる。
【００２７】
本発明の望ましい実施の形態では、カバー層は、センサ化学層１１０に接触するグルコースを調節するため、センサ化学層１１０上に設けたグルコース制限膜層１１２である。本発明の一部の実施の形態では、図１に示すように、その接触及び／又は接着を良くするため、膜層１１２とセンサ化学層１１０との間に接着促進剤層１１４を設ける。接着促進剤層１１４は、このような層間の結合を強めることが当該技術で知られる様々な材料のいずれから作ることができる。望ましくは、接着促進剤層１１４はシラン化合物を含む。これに代わる実施の形態では、センサ化学層１１０中の蛋白又はこれに類似の分子を、十分に架橋させ、あるいは、接着促進剤層１１４を用いず、センサ化学層１１０に膜層１１２を直接設けられるように調製しても良い。
【００２８】
本発明のセンサは、例えば平板状又は円筒状など、どのような所望の形状にもすることができる。ベース層１０２は、堅いポリマー層などの自己支持、あるいは可撓性フィルムなどの非自己支持であっても良い。例えば、ポリマーフィルムのロールを用い、これを連続的に解してその上にセンサ素子とカバー層と機能性被覆層とを連続的に塗布し、センサを連続的に製造する場合には、後者の実施の形態が好ましい。
【００２９】
先に言及したように、本発明の実施の形態は一般に、１つ以上のセンサ素子を備えたセンサ層を含む。本発明によれば、有用なセンサ素子（本件では伝導性素子と呼ぶ）としては、薄膜伝導体又はその他の検出可能な電気信号を生ずる導体素子が挙げられる。望ましくは、このような導体素子は電極である。望ましくは、グルコースオキシダーゼなどの酵素を、センサ素子上に設けたアパーチャ１０８中に配置する。
【００３０】
特定の望ましい実施の形態によれば、センサ素子は導電性センサ素子である。しかし本発明のセンサ素子は導体素子に限らない。その他有用なセンサ素子は、その存在を検出すべき所定の分析物と反応して検出可能な信号を発生することのできるどのような材料（本件では反応性素子と呼ぶ）からも作ることができる。検出可能な信号は、例えば、色の変化や、所望の分析物（例えば細胞）の目に見える蓄積など、光学的に検出可能な変化でも良い。材料の例としては、特定の種類の細胞と結合するポリマー類、一本鎖ＤＮＡ、抗原、抗体とその反応性フラグメント、等が挙げられる。センサ素子はまた、本質的に非反応性の材料（すなわち対照）から作ることもできる。例えば、細胞淘汰評価（cell-sorting assays）、及びウィルス（ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、等）、細菌、原生動物、等の病原性微生物の存在の評価に用いられるセンサにおいては、前述のいずれかのセンサ素子を含むことは有益である。
【００３１】
本発明の実施の形態は、１つ以上の機能性被覆層を含むことができる。ここでいう“機能性被覆層”とは、センサの少なくとも１つの面の少なくとも一部、より望ましくはセンサのほぼ全面を覆い、またセンサを置いた環境中の、化学物質、細胞及びそれらのフラグメントなどの１種類以上の分析物と反応することのできる層を指す。機能性被覆層の例としては、センサ化学層（例えば酵素層）、分析物制限層、生体適合層、センサを滑り易くする層、センサへの細胞付着を促す層、センサへの細胞付着を抑える層、等が挙げられるがこれらに限定するものではない。典型的な分析物制限層は、グルコースなどの１種類以上の分析物がこの層を通って拡散するのを防ぐ、又は制限するよう働く。必要に応じて、このような層を、ある種類の分子（例えば、グルコース）がこの層を通って拡散するのを防ぐ、又は制限するが、同時にその他の種類の分子（例えば、Ｏ2）がこの層を通って拡散するのは妨げない、又はより促すように形成することができる。例示的な機能性被覆層は、その内容を全て本件に引用して援用する、米国特許第５，７８６，４３９号及び米国特許第５，３９１，２５０号に開示されているようなヒドロゲルである。本件に述べるヒドロゲルは、周囲を取り巻く水層の形成が有利な、様々な埋め込み用デバイスに特に有用である。
【００３２】
本件に開示のセンサの実施の形態は、ＵＶ吸収性を持つポリマーを有する層を含むことができる。本発明のある態様に従って、ＵＶ吸収ポリマーを含む少なくとも１つの機能性被覆層を含むセンサを提示する。望ましい実施の形態では、ＵＶ吸収ポリマーは、ポリウレタン、ポリ尿素、又はポリウレタン／ポリ尿素共重合体である。より望ましくは、使用するＵＶ吸収ポリマーは、ジイソシアナート、少なくとも１種類のジオール、ジアミン、又はそれらの混合物と、多官能ＵＶ吸収モノマーとを含む反応混合物より生成する。
【００３３】
ＵＶ吸収ポリマーは、その内容を全て本件に引用して援用する、ロードらによる米国特許第５，３９０，６７１号、標題“Transcutaneous Sensor Insertion Set”；ウィルソンらによる米国特許第５，１６５，４０７号、標題“Implantable Glucose Sensor”；及び、ゴーによる米国特許第４，８９０，６２０号、標題“Two-Dimensional Diffusion Glucose Substrate Sensing Electrode”に述べられているような、様々なセンサ製造法での使用に有益である。しかし、センサ素子の上又は下にＵＶ吸収ポリマー層を形成する工程を含むセンサ製造法は全て、本発明の範囲内にあると考える。特に、本発明の方法は薄膜製造法に限定されるものではなく、ＵＶレーザカッティングを用いる他のセンサ製造法にも用いることができる。この実施の形態は、厚い被覆、平板状又は円筒状センサなど、またレーザカッティングを必要とする他のセンサ形状も扱うことができる。
【００３４】
本件に開示のように、本発明のセンサは特に、糖尿病患者の血中グルコース濃度監視用の皮下又は経皮的グルコースセンサとして用いるよう設計する。通常各センサは、複数のセンサ素子、例えば、下引絶縁性薄膜ベース層と、上掛絶縁性薄膜カバー層との間に形成した、伸長した薄膜伝導体などの導電性素子を含む。
【００３５】
所望ならば、１つのセンサ中に複数の異なるセンサ素子むこともできる。例えば、伝導性及び反応性のふたつのセンサ素子を、必要に応じて、それぞれのセンサ素子をベース層の異なる位置に置いて、１つのセンサ中で結合しても良い。１つ以上の対照素子を設けることもできる。このような実施の形態では、センサはそのカバー層中に設けた複数の開口部又はアパーチャを持つことができる。ベース層と、センサの置かれる環境中の１種類以上の分析物との反応のため、ベース層の一部の直上のカバー層に１つ以上の開口部を設けても良い。ベース層及びカバー層は、様々な材料、一般にポリマー類を含むことができる。より詳細な実施の形態では、ベース層及びカバー層は、ポリイミドなどの絶縁材料から成る。開口部は一般に、遠端電極と近端接触パッドとを露出するためカバー層中に形成する。グルコース監視用としては、例えばセンサを経皮的に置き、遠端電極を患者の血液又は細胞外液と触れさせ、接触パッドを、モニタ装置に接続し易いよう外部に設ける。
【００３６】
本発明の例示的な実施の形態は、ベース層と、ベース層上に設けた、複数のセンサ素子を含むセンサ層と、センサ層上に設けた、センサ層上の複数の感知素子を全て覆う酵素層（望ましくは厚さ２μｍ以下）と、カバー層とを含む、体内埋め込み用に設計されたセンサである。一般に酵素層はグルコースオキシダーゼを、望ましくはほぼ一定の比のキャリヤ蛋白と共に含む。詳細な実施の形態では、グルコースオキシダーゼとキャリヤ蛋白とは、配置した酵素層全体にほぼ均一に分散している。一般にキャリヤ蛋白はアルブミンから成り、望ましくはその量は約５重量％である。ここでいう“アルブミン”とは、一般に当業者がポリペプチド組成物の安定化に用いる、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、等のアルブミン蛋白を指す。本発明の特に望ましい実施の形態では、カバー層は、酵素層に接触可能な分析物の量を調節するようセンサ上に設けた分析物接触層である。更に特に望ましい実施の形態では、センサは、酵素層と分析物接触層との間に設けた接着促進剤層を含み、また酵素層の厚さは１、０．５、０．２５、又は０．１μｍ以下である。
【００３７】
本発明の関連する実施の形態は、ベース層と、ベース層上に設けた、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含むセンサ層と、センサ層上に設けた、厚さ２μｍ以下の酵素層と、酵素層に接する分析物の量を調節する分析物接触層とを含む、電気化学的分析物センサである。本発明の詳細な実施の形態においては、作用電極及び／又は作用電極の被覆面は、対電極及び／又は対電極の被覆面より大きい。望ましい実施の形態では、酵素層は、一定の比のキャリヤ蛋白と結合させて、作用電極及び対電極上に被覆することにより安定化されたグルコースオキシダーゼを含む。特に望ましい実施の形態では、酵素層はセンサ層の大部分を覆っている。センサ層全体を覆う均一な被覆としてグルコースオキシダーゼ酵素層を配置した実施の形態は、複数の異なる被覆を１つの層の上に設けたセンサに起こる問題、例えば、異なる物性を持つ種々の被覆が選択的に剥離するなどの問題を回避できるため、望ましい。必要に応じてセンサは、酵素層と分析物接触層との間に設けた接着促進層を含む。
【００３８】
本発明の関連する実施の形態は、ベース層と、ベース層上に設けた、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの参照電極と少なくとも１つの対電極とを含むセンサ層と、センサ層上に設けた酵素層と、酵素層に接触する分析物の量を調節する分析物接触カバー層とを含む電気化学的分析物センサである。望ましい実施の形態では、酵素層の厚さは２μｍ以下であり、酵素層は、作用電極と参照電極と対電極の少なくとも一部の上を覆っている。特に望ましい実施の形態では、酵素層は、作用電極と参照電極と対電極の大部分を覆っている。必要に応じて、酵素層は、一定の比のキャリヤ蛋白（例えばアルブミン）と結合させたグルコースオキシダーゼを含む。一般にセンサは、酵素層と分析物接触層との間に設けた接着促進層を含む。
【００３９】
本発明の更にもう一つの実施の形態は、ベース層と、ベース層上に設けたセンサ層と、センサ層上に設けたグルコースオキシダーゼ層と、グルコースオキシダーゼ層に接触するグルコースの量を調節するグルコース制限層とを含み、グルコースオキシダーゼを、特定の比のアルブミンと結合させて安定化し、更に、グルコースオキシダーゼとアルブミンとが、設けた層全体にほぼ均一に分散している、体内埋め込み用グルコースセンサを含む。望ましい実施の形態では、センサ層は、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含む複数のセンサ素子を含む。このようなセンサの実施の形態では、グルコースオキシダーゼ層の厚さは、望ましくは、２、１、０．５、０．２５、又は０．１μｍ以下であり、層中のアルブミンの含有量は約５重量％である。望ましくは、センサは、グルコースオキシダーゼ層とグルコース制限層との間に設けた接着促進層を含む。
【００４０】
本発明の特に望ましい実施の形態は、過酸化水素再循環能を持つ電気化学的グルコースセンサである。一般にこのようなセンサは、ベース層と、ベース層上に設けた、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含むセンサ層と、センサ層上に設けたグルコースオキシダーゼ層と、センサ上に設けたグルコース制限層とを含み、グルコースオキシダーゼがグルコースと反応して生じた過酸化水素を、作用電極が酸化するよう、グルコースオキシダーゼ層は作用電極の少なくとも一部と対電極の少なくとも一部とを覆い、グルコース制限層は、グルコースオキシダーゼ層に接触可能なグルコースの量を調節し、またセンサの置かれた環境中への過酸化水素の拡散を防ぐ。一般にこのようなセンサは、グルコースオキシダーゼ層とグルコース制限層との間に設けた接着促進層を含む。更にこのようなセンサは通常、ベース層とグルコースオキシダーゼ層との間に絶縁層を含む。過酸化水素再循環能を備えた電気化学的グルコースセンサに関する本発明の実施の形態は、過酸化水素分子の再循環により、センサからその置かれている環境中へ漏れ出る過酸化水素の量が少なくなるため、特に望ましい。このように、過酸化水素などの組織刺激物の放出を少なくするよう設計された埋め込み可能なセンサは、生体適合性が向上すると考えられる。従って、本発明の更にもう一つの実施の形態は、本件に開示の過酸化水素再循環素子を組み込むようセンサを設計することによって、グルコースオキシダーゼセンサの生体適合性を向上する方法である。
【００４１】
本件に開示の本発明のある実施の形態（例えば、過酸化水素再循環能を持つもの）では、センサ層は、作用電極及び対電極などの複数の電極を含み、そのいずれもグルコースオキシダーゼの層で覆われている。このようなセンサ構造では、感度が上がるなど驚くべき特性を持つ。特定の理論に結びつけるものではないが、これらの特性は、電極表面での過酸化水素の酸化が促進され、これによりグルコース検出反応（例えば、図２参照）で使用できる酸素が更に発生するためと考えられる。故に、この再循環効果は、このようなセンサの酸素による制限を小さくすることができる。更に、この構造では、有効な過酸化水素を容易に少なくできるため、電極電位のより低い対電極を備えたセンサとなる。このような種類のセンサにおいて電極電位が高いと、気体を発生する加水分解反応が起きてセンサが不安定になる（加水分解反応で生じた気体の泡によってセンサ層が破裂するため）おそれがあるため、より低い電極電位で作動するよう設計されたセンサは、本発明の好ましい実施の形態である。更に、対電極をグルコースオキシダーゼの非常に薄い層で被覆した構造のセンサの実施の形態では、グルコースがグルコースオキシダーゼと反応した際に生じる過酸化水素は、対電極の反応面に非常に接近している。これはセンサ全体の効率を高めることができ、例えば、より小さい反応面を持つ対電極を含む小型設計のセンサを製造することができる。
【００４２】
このようなセンサの製造には、様々な技術的に容認された方法及び材料を用いることができる。例えば、当該技術においては様々な接着促進化合物が知られているが、一般にこの層はシラン化合物を含む。本発明の望ましい実施の形態では、ベース層はポリイミドを含み、絶縁層はポリイミドを含み、電極は白金黒（platinum black）を含み、グルコース制限層は親水性ポリマーを含む。望ましくは、グルコースオキシダーゼ層をセンサ層上に蒸気架橋する。
【００４３】
Ｃ．本発明の分析物センサの製造法
本件に提示の明細では、非常に薄い酵素被覆をこのような種類のセンサに塗布する方法と、更にこのような方法で製造されたセンサを教示する。これに関連して、本発明の望ましい実施の形態は、技術的に容認された方法に従って基板上にこのようなセンサを形成する方法を含む。ある実施の形態では、基板は、フォトリソグラフマスク及びエッチング法での使用に適した、堅く平板な構造体から成る。この場合、基板は一般に高度の一様な平面度を備えた上面とする。研磨したガラス板を用いて滑らかな上面としても良い。これに代わる基板材料としては、例えば、ステンレススチール、アルミニウム、またデルリン（delrin）などのプラスチック材料、等が挙げられる。別の実施の形態では、基板は堅牢ではなく、それに似た、基板として用いられる、例えば、ポリイミド等のプラスチックスなどの絶縁体の薄膜の層であっても良い。
【００４４】
本発明の製法の最初の工程は一般に、センサのベース層の形成を含む。ベース層は、所望のいずれの手段、例えば、制御したスピンコーティングにより基板上に設けることができる。更に、基板層とベース層との接着が十分でなければ接着剤を用いる。絶縁材料から成るベース層は、一般にベース層材料を液体の形で基板に塗布し、次に基板を回転させて、薄く、ほぼ均一な厚さのベース層として基板上に形成する。ベース層が十分な厚さとなるまでこの操作を繰り返した後、一連のフォトリソグラフ及び／又は化学マスク及びエッチング工程を行って、以下に述べる導体を形成する。望ましい形としては、ベース層は、膜厚約０．００３インチ（約７６．２μｍ）程度の、ポリイミドなどの絶縁材料の薄膜シートを含む。
【００４５】
本発明の方法は更に、１つ以上のセンサ素子を備えたセンサ層の形成を含む。一般にこのようなセンサ素子は、フォトレジスト、エッチング、及び濯ぎ（rinsing）などを行って活性電極の結合構造を作る方法など、当該技術で公知の様々な方法の一つで生成した電極である。次にこの電極を、例えば、作用電極及び対電極用には白金黒を、参照電極上に銀、次に塩化銀を電着して、電気化学的に活性とすることができる。次にセンサ層上に、電気化学的被着以外の方法で酵素層を設け、次に、例えばジアルデヒド（グルタルアルデヒド）又はカルボジイミドを用いて蒸気架橋する。
【００４６】
本発明の例示的な実施の形態では、電着、表面スパッタリング、又は他の適当な処理工程により、まずベース層に薄膜伝導層を被覆する。望ましい形では、この伝導層を、複数の薄膜伝導層として製造し、例えば、ポリイミドベース層への化学的接着に適したクロムをベースとした最初の層の次に、金をベースとした薄膜の層とクロムをベースとした薄膜の層を順次形成する。これに代わる実施の形態では、他の電極層構造又は材料を用いても良い。次に、適当な光画像形成を行うため、従来のフォトリソグラフ法に従って、選定したフォトレジスト被覆で伝導層を被覆し、フォトレジスト被覆上に接触マスク（contact mask）を塗布しても良い。接触マスクは一般に、フォトレジスト被覆を適当に露光するための１つ以上の導体図形パターンを含み、次にエッチング工程を行って、ベース層上に複数の伝導性センサ図形を残す。皮下グルコースセンサとして使用するために設計した例示的なセンサ構造では、各センサ図形は、作用電極、対電極、及び参照電極の３つの独立した電極に対応する３つの平行したセンサ素子を含むことができる。
【００４７】
伝導性センサの部分は、望ましくはポリイミドなどの材料から成る絶縁層で通常覆われている。この絶縁層はどのような所望の方法でも塗布可能である。その方法の一例は、絶縁層をセンサ図形上に液体の層として塗布し、その後基板を回転させて、センサ図形を覆い、ベース層との封入接点中のセンサ図形の周縁を越えるまで伸びた薄膜として液状の材料を広げるものである。次にこの液状材料に、当該技術で公知の適当な放射及び／又は化学的及び／又は熱的硬化工程の１つ以上を行うことができる。これに代わる実施の形態では、スプレー法又はその他の所望の塗布手段のいずれかを用いて、液状材料を塗布しても良い。光画像形成が可能なエポキシアクリラートなど、様々な絶縁層材料が使用されるが、望ましい材料は、ニュージャージー州ウェストパターソン、ＯＣＧ・インク（OCG, Inc.）より製品番号７０２０として入手可能な、光画像形成性ポリイミドを含むものである。
【００４８】
必要に応じて、開口部を通してセンサチップを露出させた後、遠端電極となる適当な電極化合物をセンサチップに塗布することができる。グルコースセンサとして使用される３つの電極を備えた例示的なセンサの実施の形態では、開口部の一つの中に酵素（望ましくはグルコースオキシダーゼ）を置き、こうしてセンサチップの一つを被覆して作用電極とする。その他の電極の１つ又は両方に、作用電極と同じ被覆を置いても良い。あるいは、他の２つの電極には、別の酵素など他の適当な化学物質を被覆し、被覆しないままとし、又は電気化学的センサ用の参照電極及び対電極となる化学物質を被覆しても良い。
【００４９】
本発明の重要な態様は、優れた物性を備えた、電極化学層用の極薄被覆（例えば、厚さ２μｍ以下の酵素被覆）を備えたセンサの製造法を含む。本発明の極薄酵素被覆の製造法としては、スピンコーティング法、浸漬及び乾式法、低剪断スプレー法、インクジェット印刷法、シルクスクリーン法、等が挙げられる。当業者ならば当該技術の方法で塗布した酵素被覆の厚さを容易に測定できるため、本発明の極薄被覆を製造できるこれらの方法を容易に確認できる。一般に、このような被覆は塗布後に蒸気架橋を行う。驚いたことに、このような方法で製造したセンサは、電着で製造した被覆を備えたセンサより優れた物性、例えば、良好な寿命、直線性、規則性、また優れたＳ／Ｎ比などを備えている。更に、このような方法で形成したグルコースオキシダーゼ被覆を用いた本発明の実施の形態を、過酸化水素を再循環するように設計構造して、このようなセンサの生体適合性を向上させる。
【００５０】
特定の科学的理論に結びつけるものではないが、このような方法で製造したセンサが、電着で製造したものに比べて驚くほど優れた特性を持つのは、電着では３〜５μｍの厚い酵素層ができ、その中では反応性酵素のほんの一部しか検出すべき分析物に接触できないためと考えられる。更に、グルコースオキシダーゼを用いるセンサでは、電着で製造した厚い被覆は、反応性境界面で発生した過酸化水素がセンサ表面に達して信号を発生するのを妨げると考えられる。更に、このような厚い被覆のためにセンサ表面に到達できなかった過酸化水素は通常、センサからセンサの置かれている環境中へ拡散して、これらのセンサの生体適合性を低下させる。更に、グルコースオキシダーゼとアルブミンは異なる等電位点を持つため、電着法で生成した表面被覆中では、最適としてあった酵素とキャリヤ蛋白との比が崩れてしまい、更に、グルコースオキシダーゼとキャリヤ蛋白とが、配置した酵素層全体にほぼ均一に分散していない。本件に開示のセンサの製造に用いる薄膜製造法は、電着に関わるこれらの問題を解決する。
【００５１】
スピンコーティング法などの方法で製造されるセンサは、電着に関わるその他の問題、例えば、電着処理の間にセンサにかかる材料応力に関わる問題なども解決する。詳細には、電着工程では、センサ上に機械的応力、例えば引張力及び／又は圧縮力から生じる機械的応力の発生が認められる。場合によってこのような機械的応力が、多少割れ又は剥離し易い被覆を持つセンサを生じることがある。スピンコーティングやその他の応力の低い方法でセンサ上に設けた被覆ではこのようなことは見られない。従って、本発明の更にもう一つの実施の形態は、電着法に起こりやすいセンサ上の被覆のひびや層剥離の無い、スピンコーティング法で被覆を塗布する工程を含む方法である。
【００５２】
センサ素子の処理後、次に１つ以上の追加の機能性被覆又はカバー層を、当該技術で公知の様々な方法のいずれか、例えば、スプレー、浸漬などで塗布することができる。本発明の望ましい実施の形態では、センサ層の酵素に接触可能な分析物の量を調節できる親水性膜被覆を含むカバー層を塗布する方法でセンサを製造する。例えば、本発明のグルコースセンサに加えるカバー層はグルコース制限膜であっても良く、この膜は、電極上のグルコースオキシダーゼ酵素層に接触するグルコースの量を調節する。このようなグルコース制限膜は、この目的に適うことが知られている様々な素材、例えば、シリコーン、ポリウレタン、酢酸セルロース、ナフィオン、ポリエステルスルホン酸（コダックＡＱ）、ヒドロゲル、又は当業者に知られるその他の膜のいずれからも作ることができる。過酸化水素再循環能を持つセンサに関わる本発明のある実施の形態では、グルコースオキシダーゼ酵素層の上に膜層を設けて、センサの置かれている環境中への過酸化水素の放出を防ぎ、過酸化水素分子と電極の感知素子との接触を良くする。
【００５３】
本発明の方法の一部の実施の形態では、カバー層とセンサ化学層との接触を良くするため、その間に接着促進剤層を設ける。接着促進剤層は、このような層の結合性を高めることが当該技術で知られている様々な材料のいずれからも作成でき、また当該技術で公知の様々な方法のいずれでも塗布可能である。望ましくは、接着促進剤層はシラン化合物を含む。センサの他の層のあるもののように、次に接着促進剤層に、当該技術で公知の適当な放射及び／又は化学的及び／又は熱的硬化工程の１つ以上を行うことができる。これに代わる実施の形態では、酵素層を十分に架橋させ、あるいは接着促進剤層を用いず、膜カバー層をセンサ化学層に直接設けられるように酵素層を調製しても良い。
【００５４】
本発明の望ましい実施の形態は、ベース層を準備する工程と、ベース層上にセンサ層を形成する工程と、センサ層上に酵素層をスピンコーティングする工程と、次にセンサ上に分析物接触層を形成する工程と、によるセンサの製造法であって、分析物接触層は、酵素層に接触可能な分析物の量を調節する。望ましい方法では、酵素層をセンサ層上に蒸気架橋させる。本発明の代表的な実施の形態では、センサ層を、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含むように製造する。特に望ましい実施の形態では、酵素層を、作用電極の少なくとも一部と対電極の少なくとも一部の上に形成する。一般に、センサ層上に形成された酵素層の厚さは、２、１、０．５、０．２５、又は０．１μｍ以下である。望ましくは、酵素層は、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクトースオキシダーゼ，ヘキソキナーゼ、又はラクトースデヒドロゲナーゼを含む。特定の方法では、酵素層は、一定の比のキャリヤ蛋白と結合させてセンサ層上に被覆することにより安定化したグルコースオキシダーゼを含む。一般にキャリヤ蛋白はアルブミンである。望ましくはこのような方法は、グルコースオキシダーゼ層と分析物接触層との間に設けた接着促進剤層の形成工程を含む。必要に応じて、分析物接触層の形成前に、接着促進剤層に硬化処理を行う。
【００５５】
本発明の関連の実施の形態は、ベース層を準備する工程と、ベース層上に、少なくとも１つの作用電極と少なくとも１つの対電極とを含むセンサ層を形成する工程と、スピンコーティング法によりセンサ層上にグルコースオキシダーゼ層（望ましくは、グルコースオキシダーゼを一定の比のアルブミンと結合させて安定化した層）を形成する工程と、次に、グルコースオキシダーゼ層に接触可能なグルコースの量を調節するよう、グルコースセンサ上にグルコース制限層を形成する工程と、によるグルコースセンサの製造法であって、グルコースオキシダーゼ層は、作用電極の少なくとも一部と対電極の少なくとも一部とを覆うものである。この方法において、センサ層上に形成されたグルコースオキシダーゼ層の厚さは、望ましくは、２、１、０．５、０．２５、又は０．１μｍ以下である。一般にグルコースオキシダーゼ被覆を、センサ層上に蒸気架橋する。必要に応じて、グルコースオキシダーゼ被覆はセンサ層全体を覆う。本発明の特に望ましい実施の形態では、グルコースオキシダーゼ層と分析物接触層との間に接着促進剤層を設ける。
【００５６】
このような方法で製造した完成したセンサは一般に、例えば、基板上の各センサを囲む線に沿って切断することにより、支持基板（もし使用されている場合）から素早く容易に取り外す。この切断工程には、ＵＶレーザ切断装置を用いる方法など、当該技術で一般的に使用される方法を用いることができ、これを用いて、一般に、十分な相互接続ベースと、完成したセンサの側縁を密閉するためのカバー層材料を残すよう、伝導性素子から少なくとも僅かに外側に設けた各センサを囲む又は区切っている線に沿って、ベース及びカバー層と機能性被覆層の端から端までを切断する。ベース層は通常、下引支持基板に物理的に結合しておらず、又は僅かに直に付着しているだけであるので、特に処理工程を更に行わずに、あるいは、付着したセンサを支持基板から物理的に引っ張り又は剥ぐことで生じる応力によるダメージの心配なく、センサを素早く容易に支持基板から持ち上げることができる。支持基板はその後清浄にして再利用しても良く、あるいは廃棄する。代わりに、ベース層とセンサ素子とカバー層とを含むセンサを、切断によって支持基板から取り外した後に、１つ又は複数の機能性被覆層を塗布しても良い。
【００５７】
Ｄ．本発明のキット及びセンサセット
本発明のもう一つの実施の形態では、上記のような検出物の検知に有用なキット及び／又はセンサセットを提示する。このキット及び／又はセンサセットは通常、容器と、ラベルと、上記のような極薄酵素被覆を備えたセンサとを含む。適当な容器としては、例えば、金属ホイルなどの材料から成る開け易いパッケージ、瓶、バイアル、注射器、試験管などが挙げられる。容器は、金属（例えば、ホイル）、紙製品、ガラス、又はプラスチックスなど様々な材料から作ることができる。容器は、望ましくは、厚さ２μｍ以下のグルコースオキシダーゼの層で被覆したグルコースセンサを保持している。容器に貼付の又は同封のラベルには、このセンサが選定した分析物の定量用であることが示されている。 キット及び／又はセンサセットには更に、分析物環境にセンサを入れ易くするよう設計した要素又はデバイス、他の緩衝液、希釈液、フィルタ、針、注射器、また使用説明書と共にパッケージに入れられるものなど、市販のため及び使用者の立場から必要とされるその他のものが含まれる。
【００５８】
本明細書においては様々な引用が参照されている。更に、本発明の様々な実施の形態をより明確に述べるため、本件には背景技術からの文献が若干再掲されている。本明細書中に引用されている全ての文献の内容は特に本件に引用して援用する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明のグルコースセンサを示す線図である。
【図２】グルコースオキシダーゼ存在下での、グルコースと酸素との公知の反応を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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