(57)【要約】哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を減少させる、または肝自己調節を回復する方法が提供される。これらの方法は、視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを上昇させるステップ、または迷走神経の肝分枝における遠心性線維を刺激するステップを含む。さらにまた、哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を増加する方法が提供される。これらの方法は、哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを低下させるステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を減少させる方法であって、前記方法が前記哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを上昇させるステップを含み、
前記哺乳動物が肥満症、２型糖尿病、レプチン耐性、インスリン耐性、ゴナドトロピン欠損症、無月経、および多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される少なくとも１つの状態を有する方法。
【請求項２】
前記ＬＣ−ＣｏＡが視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させるステップによって増加させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子がカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ、カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２−エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−オキシアシルＣｏＡチオラーゼ、およびアシルＣｏＡヒドラーゼからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子がＣＰＴ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＰＴ１がカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の肝アイソフォーム（ＣＰＴ１Ｌ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が医薬組成物を哺乳動物の脳へ投与するステップによって減少させられ、前記医薬組成物がＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させることのできる小分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記医薬組成物が脳への前記組成物の直接投与によって前記哺乳動物の脳へ投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記小分子が前記医薬組成物中に存在する場合は血液脳関門を通過することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が抗体または抗体結合部位を含む抗体フラグメントを哺乳動物の脳へ投与するステップによって減少させられ、前記抗体または抗体フラグメントがＬＣ−ＣｏＡ減少性分子へ結合して前記分子の活性を阻害することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が前記哺乳動物の脳への阻害性核酸もしくはミメティックを投与するステップによって減少させられる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害性核酸またはミメティックがリボザイム、アンチセンス化合物、アプタマーおよびｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害性核酸またはミメティックがリボザイムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子がＣＰＴ１であり、そして前記リボザイムが配列５’−ＡＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＣＡＣＧＵＵＣＵＵＣＧＵＣ−３’を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＣ−ＣｏＡレベルが視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を増加させるステップによって増加させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸トランスポーター分子、アシルＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ、およびアシルＣｏＡチオエステラーゼからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性が医薬組成物を前記哺乳動物の脳へ投与するステップによって増加させられ、前記医薬組成物は前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の産生または活性を刺激することのできる小分子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が脳への直接投与によって前記哺乳動物の脳へ投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物が血液脳関門を通過することができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性が前記分子または前記分子をコードするベクターを視床下部へ投与するステップによって増加させられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記分子が医薬上許容される担体中で視床下部へ投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子をコードするベクターが視床下部へ投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＬＣ−ＣｏＡがＬＣ−ＣｏＡを脳へ直接投与するステップによって増加させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物が齧歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が糖尿病性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物が正常体重を少なくとも５％超えている、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物が正常体重を少なくとも２０％超えている、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
摂食量が少なくとも５％減少させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
摂食量が少なくとも２０％減少させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
摂食量が少なくとも４０％減少させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
不十分な摂食量またはグルコース産生量を特徴とする状態に陥っている哺乳動物において摂食量およびグルコース産生量を増加させる方法であって、前記方法が哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを低下させるステップを含む方法。
【請求項３３】
前記ＬＣ−ＣｏＡレベルが視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を減少させるステップによって減少させられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸トランスポーター分子、アシルＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ、およびアシルＣｏＡチオエステラーゼからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性が医薬組成物を哺乳動物の脳へ投与するステップによって減少させられる、前記医薬組成物が前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を阻害することのできる小分子を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記医薬組成物が哺乳動物の脳への前記組成物の直接投与によって前記哺乳動物の脳へ投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記小分子が前記医薬組成物中に存在する場合は血液脳関門を通過することができる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性が抗体または抗体結合部位を含む抗体フラグメントを哺乳動物の脳へ投与するステップによって減少させられ、前記抗体または抗体フラグメントが前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子へ結合して前記分子の活性を阻害することができる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性が哺乳動物の脳への阻害性核酸もしくはミメティックを投与するステップによって減少させられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記阻害性核酸またはミメティックがリボザイム、アンチセンス化合物、アプタマーおよびｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記阻害性核酸またはミメティックがリボザイムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＬＣ−ＣｏＡレベルが視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を増加させるステップによって減少させられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子がカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ、カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２−エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−オキシアシルＣｏＡチオラーゼ、およびアシルＣｏＡヒドラーゼからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子がＣＰＴ１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＰＴ１がカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の肝アイソフォーム（ＣＰＴ１Ｌ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が医薬組成物を哺乳動物の脳へ投与するステップによって増加させられ、前記医薬組成物がＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を増加させることのできる小分子を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記医薬組成物が脳への直接投与によって脳へ投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記医薬組成物が血液脳関門を通過することができる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性が前記分子または前記分子をコードするベクターを視床下部へ投与するステップによって増加させられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記分子が医薬上許容される担体中で視床下部へ投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記分子をコードするベクターが視床下部へ投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物が齧歯類である、請求項３２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物が正常体重を少なくとも１０％下回っている、請求項３２に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物が正常体重を少なくとも２０％下回っている、請求項３２に記載の方法。
【請求項５７】
摂食量が少なくとも５％増加させられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項５８】
摂食量が少なくとも２０％増加させられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項５９】
摂食量が少なくとも４０％増加させられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物が不十分な摂食量またはグルコース産生量を誘導する治療を受けている、請求項３２に記載の方法。
【請求項６１】
前記治療が癌化学療法の適用である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物が不十分な摂食量またはグルコース産生量を誘導するウイルス感染症を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項６３】
前記哺乳動物がヒトであり、前記感染症がＨＩＶ−１感染症である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物が低血糖症性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項６５】
肝自己調節が不十分である哺乳動物における肝自己調節を回復する方法であって、前記方法が哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを上昇させるステップを含む方法。
【請求項６６】
前記ＬＣ−ＣｏＡが視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させるステップによって増加させられる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子がＣＰＴ１である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣＰＴ１がカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の肝アイソフォーム（ＣＰＴ１Ｌ）である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が医薬組成物を哺乳動物の脳へ投与するステップによって減少させられる、前記医薬組成物がＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させることのできる小分子を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が抗体または抗体結合部位を含む抗体フラグメントを哺乳動物の脳へ投与するステップによって減少させられ、前記抗体もしくは抗体フラグメントが前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子へ結合して前記分子の活性を阻害することができる、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性が哺乳動物の脳への阻害性核酸もしくはミメティックを投与するステップによって減少させられる、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記阻害性核酸またはミメティックがリボザイムである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＬＣ−ＣｏＡレベルが視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を増加させるステップによって増加させられる、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＬＣ−ＣｏＡがＬＣ−ＣｏＡを脳へ直接投与するステップによって増加させられる、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記哺乳動物が齧歯類である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７７】
前記哺乳動物が糖尿病性である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７８】
哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を減少させる方法であって、前記方法が遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップを含み、
このとき前記哺乳動物が肥満症、２型糖尿病、レプチン耐性、インスリン耐性、ゴナドトロピン欠損症、無月経、および多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される少なくとも１つの状態を有する方法。
【請求項７９】
前記遠心性肝迷走神経線維が電気的に刺激される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記求心性肝迷走神経線維が刺激されない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記遠心性肝迷走神経線維が肝臓を直接刺激するステップによって刺激される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
肝自己調節が不十分である哺乳動物において肝自己調節を回復させる方法であって、前記方法が遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年２月１３日に提出された米国仮特許出願第６０／４４７，１３８号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述
米国政府は、本発明における一括払いライセンスおよび限定された状況において国立保健研究所によって授与されたＤＫ４８３２１、ＤＫ４５０２４、ＤＫ２０５４１、Ｒ０１−４５０２４およびＲ０１−４８２３１によって規定された穏当な条件で特許権者に他者へ使用を許諾することを要求する権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に摂食量およびグルコース産生量を調節する方法に関する。より詳細には、本発明は視床下部における脂質代謝を操作することによる摂食量およびグルコース産生量の調節に関する。
【背景技術】
【０００４】
本明細書で言及する参考文献
Ａｈｉｍａ，Ｒ．Ｓ．，Ｐｒａｂａｋａｒａｎ，Ｄ．，Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ，Ｃ．，Ｑｕ，Ｄ．，Ｍａｒａｔｏｓ−Ｆｌｉｅｒ，Ｅ．，＆  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｆａｓｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，２５０−２５２（１９９６）．
Ａｉｒ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１７９−８３（２００２）．
Ａｕｓｍａｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｎａ，Ｄ．Ｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２４１，Ｒ３１６−Ｒ３２１（１９８１）．
Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｍａｓｓｉｌｏｎ，Ｄ．，Ｖｕｇｕｉｎ，Ｐ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １００，３１０５−３１１０（１９９７）．
Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ，Ｂ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １０５，１４６−１５１（１９７９）．
Ｂｉｒｉｋｈ，Ｋ．Ｒ．，Ｈｅａｔｏｎ，Ｐ．Ａ．＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４５，１−１６（１９９７）．
Ｂｌａｚｑｕｅｚ，Ｃ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｃ．，Ｄａｚａ，Ａ．，Ｇａｌｖｅ−Ｒｏｐｅｒｈ，Ｉ．＆  Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．ｔｈｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  Ｄｅｆｉｎｅｓ  Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ  ａｓ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７２，１７５９−１７６８（１９９９）．
Ｂｏｄｅｎ，Ｇ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｒｕｉｚ，Ｊ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９３，２４３８−２４４６（１９９４）．
Ｂｏｕｓｓｉｆ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ：  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，７２９７−７３０１（１９９５）．
Ｂｒｉｅｆ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｄ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．１２，５７１−５７５（１９８４）．
Ｂｒｕｎｉｎｇ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｂｏｄｙ  Ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，２１２２−２５（２０００）．
Ｃｉｎｔｉ，Ｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ，Ｒ．Ｃ．，Ｚｉｎｇａｒｅｔｔｉ，Ｍ．Ｃ．，Ｄｅ  Ｍａｔｔｅｉｓ，Ｒ．，Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｌｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８，７９７−８０４（１９９７）．
Ｃｌｏｒｅ，Ｊ．Ｎ．，Ｈｅｌｍ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｂｌａｃｋａｒｄ，Ｗ．Ｇ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９６，１９６７−１９７２（１９９５）．
Ｃｏｍｂｓ，Ｔ．Ｐ．，Ｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．，Ｏｂｉｃｉ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｐ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １０８，１８７５−１８８１（２００１）．
Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １４，１４１−１４８（１９７８）．
Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０３，６６３−６６５（１９７９）．
Ｄｉ  Ｍａｒｚｏ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｐｔｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  Ａｒｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔａｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，８２２−８２５（２００１）．
Ｅｓｓｅｒ，Ｖ．，Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｅｉｓ，Ｂ．Ｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．＆  ＭｃＧａｒｒｙ，Ｊ．Ｄ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｔｈａｔ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５８１７−５８２２（１９９３）．
Ｆｌｅｇａｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｍ．Ｄ．，Ｏｇｄｅｎ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．ＪＡＭＡ  ２８８，１７２３−１７２７（２００２）．
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ，Ｒ．Ｃ．，Ｈａｍａｎｎ，Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｌｏｌｌｍａｎｎ，Ｂ．，Ｌｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１，１３１１−１３１４（１９９５）．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，６３２−６３４（２０００）．
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Ｇｉａｃｃａｒｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８９，３６−４５（１９９２）．
Ｇｏｔｏ  Ｍ．，Ｓｐｉｔｚｅｒ  Ｊ．Ｊ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ．Ｐｒｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１３６，１２９４−１２９６（１９７１）．
Ｇｏｕｌａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｚｅ，Ｄｉｆｆｕｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｎｅａｒ  ＰＥＩ／ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５，７１２−７１７（１９９８）．
Ｈａｌａａｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｏｏｚｅｒ，Ｃ．，Ｂｌａｉｒ−Ｗｅｓｔ，Ｊ．，Ｆｉｄａｈｕｓｅｉｎ，Ｎ．，Ｄｅｎｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９４，８８７８−８８８３（１９９７）．
Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｒａｎｄｓ，Ｍ．Ｗ．，Ｚａｐｐｅ，Ｄ．Ｈ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｗ．Ｎ．，Ｍｉｚｅｌｌｅ，Ｈ．Ｌ．，Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ｄ．Ａ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２５，９９４−１００２（１９９５）．
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Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｊ．，Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｊ．，＆  Ｍｏｂｂｓ，Ｃ．Ｖ．Ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ  Ｍｉｍｉｃｓ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒａｔｅ，Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔａｋｅ，ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｂｕｔ  Ｕｎｌｉｋｅ  Ｌｅｐｔｉｎ，Ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ  Ｆａｉｌｓ  ｔｏ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆａｓｔｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，７３３−７３９（２００１）．
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Ｍａｓｓｉｌｌｏｎ，Ｄ．，Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｎ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｍ．，Ｐｒｕｓ−Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，１５３−１５７（１９９７）．
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ＮＨＬＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ−Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．００−４０８４（２０００）．  Ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ａｔ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｈｌｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｏｂｅｓｉｔｙ／ｐｒｃｔｇｄ＿ｂ．ｐｄｆ．
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Ｒａｖｕｓｓｉｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ．２３  Ｓｕｐｐｌ  １，３７−４１（１９９９）．
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Ｒｏｄｅｎ，Ｍ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｔ．Ｂ．，Ｐｅｒｓｅｇｈｉｎ，Ｇ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｆ．，Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｃｌｉｎｅ，Ｇ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｒｏｍｓｏｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｌｅｖｅｉｌｌｅ，Ｇ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１５７，５２８−５３０（１９７８）．
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Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．，Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｏｇｌｅｒ，Ｃ．Ｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２０３−２０８（１９９６）．
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Ｓｃｈｅｍｍｅｌ，Ｒ．，Ｍｉｃｋｅｌｓｅｎ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｌ，Ｊ．Ｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１００，１０４１−１０４８（１９７０）．
Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｗ．，Ｓｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｃａｍｐｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ａ．，Ｂｕｒｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｇ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９８，１１０１−１１０６（１９９６ａ）．
Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｗ．，Ｂａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｒ．，Ｋｕｉｊｐｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．，Ｌａｓｓｅｒ，Ｇ．，Ｐｒｕｎｋａｒｄ，Ｄ．Ｅ．，Ｐｏｒｔｅ，Ｄ．，Ｊｒ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｇｌｅ，Ｄ．Ｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５，５３１−５３５（１９９６ｂ）．
Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｗ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｏｒｔｅ，Ｄ．Ｊｒ．，Ｓｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｂａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｇ．Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔａｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，６６１−６７１（２０００）．
Ｓｃｌａｆａｎｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ．１７，４６１−４７１（１９７６）．
Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１４４，３４３−３５２（１９７８）．
Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｔ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １２，６５−６６（１９９６）．
Ｓｈｉｍｏｋａｗａ，Ｔ．，Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｖ．，＆  Ｌａｎｅ，Ｍ．Ｄ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，６６−７１（２００２）．
Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｉ．，Ｈａｍｍｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｉｋｅｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，７３−７６（１９９９）．
Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９７，２８５９−２８６５（１９９６）．
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｃｅｌｌ  １０４，５３１−５４３（２００１）．
Ｔｈｕｐａｒｉ，Ｊ．Ｎ．，Ｌａｎｄｒｅｅ，Ｌ．Ｅ．，Ｒｏｎｎｅｔｔ，Ｇ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｋｕｈａｊｄａ，Ｆ．Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９，９４９８−９５０２（２００２）．
Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｂｉｎｇ，Ｃ．，Ａｌ  Ｂａｒａｚａｎｊｉ，Ｋ．，Ｍｏｓｓａｋｏｗａｓｋａ，Ｄ．Ｅ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｍ．，ＭｃＢａｙ，Ｄ．Ｌ．，Ｎｅｖｉｌｌｅ，Ｗ．Ａ．，Ｔａｄｄａｙｏｎ，Ｍ．，Ｐｉｃｋａｖａｎｃｅ，Ｌ．，Ｄｒｙｄｅｎ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｅ．，ＭｃＨａｌｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｇｌｏｙｅｒ，Ｉ．Ｓ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｒ．，Ａｒｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｒａｙｈｕｒｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，３３５−３４１（１９９７）．
Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｍ．，Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｎ．，Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ａ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｌｅｐｔｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  Ｆａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６８４−６８８（１９９８）．
Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｏｂｉｃｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｋ．，Ｂａｒｚｉｌａｉ，Ｎ．，Ｆｅｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，２７８６−２７９１（２００１）．
Ｗｅｓｔ，Ｄ．Ｂ．，Ｂｏｏｚｅｒ，Ｃ．Ｎ．，Ｍｏｏｄｙ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ａｍ．Ｊ  ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６２，Ｒ１０２５−Ｒ１０３２（１９９２）．
Ｗｅｓｔ，Ｄ．Ｂ．，Ｗａｇｕｅｓｐａｃｋ，Ｊ．，ａｎｄ  ＭｃＣｏｌｌｉｓｔｅｒ，Ｓ．Ａｍ．Ｊ  ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８，Ｒ６５８−Ｒ６６５（１９９５）．
Ｗｉｄｄｏｗｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｕｐｔｏｎ，Ｒ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｒ．，Ａｒｃｈ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，１７８２−１７８５（１９９７）．
Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｏｔｔｅｒ，Ｅ．Ｃ．，  ＭｃＫａｙ，Ｄ．Ｌ．，＆  Ｐｏｒｔｅ，Ｄ．Ｊｒ．．Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｂａｂｏｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２８２，５０３−５（１９７９）．
Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｏｒｔｅ，Ｄ．，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１３７８−１３８３（１９９８）．
Ｙａｋｓｈ，Ｔ．Ｌ．，Ｊａｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｂｒａｕｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｒｏ，Ｓ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．４８，６２３−６３３（１９９１）．
Ｚａｍｍｉｔ，Ｖ．Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏｎｅ  Ｂｏｄｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｖ．２，１３２−１５５（１９９４）．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｐｒｏｅｎｃａ，Ｒ．，Ｍａｆｆｅｉ，Ｍ．，Ｂａｒｏｎｅ，Ｍ．，Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７２，４２５−４３２（１９９４）．
【０００５】
肥満症および２型糖尿病などの複合代謝性疾患は、遺伝子と環境の多重相互作用の結果である（Ｈｉｌｌ  ＆  Ｐｅｔｅｒｓ，１９９８；Ｋｏｐｅｌｍａｎ  ＆  Ｈｉｔｍａｎ，１９９８）。視床下部中枢は、一部にはレプチンおよびインスリンなどの冗長な栄養素誘導性末梢シグナル（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｂｒｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２０００；Ａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ａｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を介して、および例えば視床下部へのオレイン酸の添加による直接的代謝シグナリング（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｍａｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を介して栄養素の末梢性利用率を検知する。これに関連して、選択的視床下部ニューロンにおける脂質代謝は栄養素の利用率についての主要な生化学的センサーであり、これは順に摂食量（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｍａｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｃ；Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）および内因性グルコース産生量（ＧＰ）（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）への負のフィードバックに影響を及ぼすと仮定されてきた。だがこの理論の妥当性はこれまで確認されておらず、過剰摂食した動物ではこの負のフィードバックが有効ではないという証拠もある（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００６】
そこで、視床下部代謝シグナリングの中心的メカニズムをさらに解明する必要がある。本発明はその必要を満たすものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明者らは、哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを変調させることにより、哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を変調できることを見いだした。
【０００８】
そこで、本発明は哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を減少させる方法に向けられる。これらの方法は、視床下部内のＬＣ−ＣｏＡレベルを上昇させるステップを含む。これらの方法では、哺乳動物は、好ましくは肥満症、２型糖尿病、レプチン耐性、インスリン耐性、ゴナドトロピン欠損症、無月経、および多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される少なくとも１つの状態を有する。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を増加させる方法に向けられる。これらの方法は、哺乳動物の視床下部内のＬＣ−ＣｏＡレベルを低下させるステップを含む。これらの方法では、哺乳動物は、好ましくは不十分な摂食量またはグルコース産生量を特徴とする状態に陥っている。
【００１０】
本発明はさらに、肝自己調節が不十分である哺乳動物における肝自己調節を回復する方法に向けられる。これらの方法は、哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを上昇させるステップを含む。
【００１１】
また別の実施形態では、本発明は哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を減少させる方法に向けられる。これらの方法は、遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップを含む。
【００１２】
本発明はさらにまた、肝自己調節が不十分である哺乳動物における肝自己調節を回復する方法に向けられる。これらの方法は、遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、一部には哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを変調させるステップによって哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を変調できるという発見に基づいている。実施例１および２を参照されたい。
【００１４】
そこで一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を減少させる方法に向けられる。これらの方法は、哺乳動物の視床下部内のＬＣ−ＣｏＡレベルを上昇させるステップを含む。
【００１５】
本明細書で使用するように、ＬＣ−ＣｏＡは補酵素Ａの飽和もしくは不飽和Ｃ１４−Ｃ２２エステルである。好ましい実施形態では、ＬＣ−ＣｏＡはＣ１６もしくはＣ１８であり、一価不飽和である。
【００１６】
当業者は、これらの方法が肥満症、２型糖尿病およびインスリン耐性などの状態を治療することに有効であろうことを理解するであろう。さらに、ＣＰＴ１阻害が弓状核内のＮＰＹおよびアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）関連タンパク質（ＡｇＲＰ）レベルに及ぼす作用は、これらの方法がＬＨサージ、無月経症、および多嚢胞性卵巣症候群を含むゴナドトロピン不全症に関連するその他の生殖器機能不全症などを制御するレプチン耐性にとって、ならびにインスリンおよびレプチン耐性の作用にとって有効な治療法であろうことを確証している。
【００１７】
これらの方法の一部の態様では、ＬＣ−ＣｏＡは視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させることによって増加させられる。本明細書で使用するように、ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子は、ＬＣ−ＣｏＡの産生を阻害する、もしくは代謝を促進する作用を有する脂質代謝に影響を及ぼす分子である。これに含まれるのは、酵素または担体タンパク質であり、脂質代謝をＬＣ−ＣｏＡの産生から駆逐する、またはＬＣ−ＣｏＡの代謝に向かわせることが現在知られている、または後に見いだされる。これらの酵素には、ＬＣ−ＣｏＡを直接的に代謝する酵素が含まれるがそれらに限定されない。これらの実施形態に含まれる酵素の非限定的例には、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ、カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２−エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−オキシアシルＣｏＡチオラーゼ、およびアシルＣｏＡヒドラーゼである。
【００１８】
本明細書で使用する分子の「活性を減少させるステップ」は、ＬＣ−ＣｏＡの産生もしくは代謝に関連する既存分子の作用（例、酵素活性またはＬＣ−ＣｏＡなどのリガンドへ結合する活性）を減少させるステップ、もしくはそのような分子の量を減少させるステップのどちらか、またはそれらの組み合わせを意味する。これらの分子の量は、分子の分解もしくは除去速度を増加させるステップおよび／または分子の生合成を減少させるステップによって減少させることができることを理解されたい。これとは逆に、「活性を増加させるステップ」は、それがＬＣ−ＣｏＡの産生もしくは代謝に関連する既存分子の作用を増加させる方法、またはそのような分子の量を増加させるステップ、またはそれらの組み合わせを含む。分子の量は、分子の分解もしくは除去速度を減少させるステップおよび／または分子の生合成を増加させる、および／または分子を添加するステップによって増加させることができる。
【００１９】
さらにまたはＬＣ−ＣｏＡ減少性分子として、ＬＣ−ＣｏＡの産生または蓄積を促進する酵素の産生を直接的もしくは間接的に阻害する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）またはその他の分子（例、サイトカインおよび阻害剤）が含まれる。周知のように、ｓｉＲＮＡ、サイトカイン、阻害剤およびその他の分子は、酵素もしくは担体タンパク質の産生もしくは活性を調節することに強力な影響を及ぼすことができる。
【００２０】
一部の実施形態では、ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子はＣＰＴ１であるが、それはこの酵素がＬＣ−ＣｏＡのβ酸化において重要な速度限定ステップに含まれるからである。さらに、視床下部および肝臓内のＣＰＴ１の形態であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の肝アイソフォーム（ＣＰＴ１Ｌ）は筋肉内のＣＰＴ１の形状（ＣＰＴ１Ｍ）とは相違することが知られており、これはＣＰＴ１Ｌの阻害剤の使用を許容するがＣＰＴ１Ｍ形の阻害剤の使用を許容せず、したがって本方法によって誘導される副作用が限定される。本発明者らは、さらに既に本発明の方法における視床下部ＣＰＴ１Ｌの活性を減少させるステップの有用性を証明している。例えば、実施例１および２を参照されたい。しかし、ＣＰＴ１Ｌを標的とする有効性は、いずれか他のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の阻害も摂食量およびグルコース産生量を減少させると予想されることを強力に示している。
【００２１】
より好ましい実施形態では、ＣＰＴ１はＣＰＴ１Ｌであり、この療法はその変異体の活性を選択的もしくは特異的に減少させるが、ＣＰＴ１Ｍの活性を減少させないので、ＣＰＴ１Ｍの阻害の副作用を最小限に抑える。
【００２２】
一部の実施形態では、ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性は、哺乳動物の脳へ医薬組成物を投与するステップによって減少させられる。本明細書で使用するように、医薬組成物は医薬上許容される賦形剤中の、ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させることのできる少なくとも１つの小分子からなる組成物である。本明細書で使用するように、「小分子」はオリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドではない分子量が約２０００未満の分子である。オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、各々少なくとも２つのペプチドもしくはヌクレオチドからなる非分岐状鎖である。これらの実施形態において有用な小分子の例は、ＣＰＴ１Ｍの知られている阻害剤であるＳＴ１３２６および２−テトラデシルグリデート（ＴＤＧＡ）を含むＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の阻害剤である。
【００２３】
これらの実施形態では、医薬組成物は小分子が視床下部内に進入するように（例、第３脳室内（ＩＣＶ）への投与）、または小分子が血液脳幹門を通過することのできる部位での組成物の投与によって直接的に脳へ投与される。ここで、小分子は単独で、および／または医薬組成物中に存在する少なくとも１つの賦形剤を用いて血液脳関門を通過することができる。
【００２４】
また別の実施形態では、ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性は、抗体または抗体結合部位を含む抗体フラグメントを哺乳動物の脳（例えば、ＩＣＶ）へ投与するステップによって減少させられる。これらの実施形態では、抗体または抗体フラグメントはＬＣ−ＣｏＡ減少性分子へ結合してこの分子の活性を阻害することができる。ここで、これらの抗体または抗体フラグメントは特定の形状（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ＦＡｂフラグメントなど）に限定されない、またはいずれかの特定の方法（例えば、動物もしくは動物から作製されたハイブリドーマ細胞からの抗体の刺激および採取、またはファージもしくは組み換え酵母もしくは細菌などの組み換え方法による生成）によって作製できる。
【００２５】
ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性は、さらにまた哺乳動物の脳への阻害性核酸もしくはミメティックの投与によって減少させることができる。本明細書で使用するように、ミメティックは、相補的な核酸と塩基対合する能力を有することにより核酸と同様に作用することが現在知られている、または後になって見いだされる人工化合物である。既知のミメティックの非限定的例には、ペプチド核酸およびホスホロチオネートミメティックが含まれる。
【００２６】
阻害性核酸もしくはミメティックの例には、標的ｍＲＮＡ（アンチセンス）に結合する、もしくは内因性メカニズムがｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を分解することを指示する、またはｍＲＮＡ（リボザイム）を開裂して標的タンパク質の翻訳を防止するリボザイム、アンチセンス化合物およびｓｉＲＮＡが含まれる。阻害性核酸もしくはミメティックのまた別の例は、抗体もしくは小分子阻害剤に類似する方法で標的分子に結合して阻害するアプタマーである。
【００２７】
一部の実施形態では、阻害性核酸もしくはミメティックはリボザイムである（ラットＣＰＴ１Ｌ−特異的リボザイムを生じさせる実施例１を参照されたい）。ＬＣ−ＣｏＡ減少性分子はヒトＣＰＴ１Ｌであり、これらの方法に使用するためのリボザイムの例は配列５’−ＡＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＣＡＣＧＵＵＣＵＵＣＧＵＣ−３’（配列番号１）を含むが、このとき太字体の配列はハンマーヘッドリボザイムの触媒コアである。
【００２８】
阻害性核酸は、好ましくは哺乳動物の脳に、最も好ましくは第３脳室内に投与される。あるいは、阻害性核酸をコードするベクターを投与することもできるが、ベクターは、阻害性核酸が視床下部内に存在するように阻害性核酸が合成されるようにプロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなどの制御要素に機能的に連結した阻害性核酸をコードする。そのようなベクターを産生する方法は、当分野において周知である。ウィルスベクター（例、レンチウィルスベクターまたはアデノウィルスベクター）はこれらの実施形態において特に有用であることが知られている。
【００２９】
これらの方法のまた別の態様では、ＬＣ−ＣｏＡは視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を増加させることによって増加させられる。本明細書で使用するように、ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子は、ＬＣ−ＣｏＡの産生を促進する、または代謝を減少させる作用を有する脂質代謝に影響を及ぼす分子である。これに含まれるのは酵素または担体タンパク質であり、脂質代謝をＬＣ−ＣｏＡの産生に向かわせる、またはＬＣ−ＣｏＡの代謝から駆逐することが現在知られている、または後に見いだされる。これらの酵素には、ＬＣ−ＣｏＡを直接的に産生する酵素が含まれるがそれらに限定されない。これらの実施形態に含まれる酵素の非限定的例は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸トランスポーター分子、アシルＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ、およびアシルＣｏＡチオエステラーゼである。
【００３０】
これらの方法の一部の実施形態では、ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性は医薬組成物を哺乳動物の脳へ投与するステップによって増加させられるが、該医薬組成物はＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の産生または活性を刺激することのできる小分子を含む。
【００３１】
先行実施形態と同様に、該医薬組成物は小分子が視床下部内に進入するように（例えば、第３脳室内（ＩＣＶ）への投与）、または小分子が血液脳幹門を通過することのできる部位での組成物の投与によって直接的に投与される。
【００３２】
ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性は、さらにまたこれらの方法において医薬上許容される担体中の該分子を、該分子が視床下部に進入できるように哺乳動物へ投与するステップによって増加させることができる。好ましい実施形態では、該分子は視床下部付近（例えば、第３脳室内）で該哺乳動物の脳へ直接投与される。
【００３３】
あるいは、ＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性は、さらにまたこれらの方法において医薬上許容される担体中の該分子をコードするベクターを、該ベクターが視床下部に進入でき、そしてそれから該分子を生成できるように該哺乳動物へ投与するステップによって増加させることができる。先行実施形態と同様に、該分子をコードするベクターの部分は、好ましくは視床下部内での該ベクターからの該分子の産生を指示する制御配列に機能的に連結している。
【００３４】
これらの方法の追加の態様では、ＬＣ−ＣｏＡはＬＣ−ＣｏＡを哺乳動物の脳へ、好ましくは第３脳室内へ直接投与するステップによって増加させられる。
【００３５】
上記の方法は、齧歯類およびヒトを含むあらゆる哺乳動物において摂食量およびグルコース産生量を減少させるために有用である。
【００３６】
これらの方法は、２型糖尿病および肥満症を治療するために特に有用である。あらゆる程度の肥満症の治療が想定されている。好ましくは、哺乳動物は正常体重を少なくとも５％超えている。他の実施形態では、哺乳動物は正常体重を少なくとも２０％超えている。本明細書で使用するように、ヒト正常体重はＢＭＩ指数が１８．５−２４．９ｋｇ／ｍ2（ＮＨＬＢＩ，２０００）であると規定されている。本明細書では２４．９ｋｇ／ｍ2を超えるＢＭＩ指数を肥満と見なす。
【００３７】
これらの方法は摂食量を少なくとも５％減少させると予想されるが、少なくとも１０％、２０％、３０％、または４０％の摂食量の減少もまた予想外ではないであろう。
【００３８】
本発明は、さらに不十分な摂食量またはグルコース産生量を特徴とする状態に陥っている哺乳動物において摂食量およびグルコース産生量を増加させる方法に向けられる。これらの方法は、哺乳動物の視床下部内の長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）レベルを低下させるステップを含む。
【００３９】
これらの方法は、哺乳動物がその摂食量またはグルコース産生量を増加させることが望ましい任意の状態において有用である。そのような状態の例は、哺乳動物が例えば癌化学療法のような不十分な摂食量またはグルコース産生量を誘導する治療を受けている場合、または哺乳動物が不十分な摂食量もしくはグルコース産生量を誘導するウイルス感染症（例、ＨＩＶ−１感染症）などの感染症を有する場合である。これらの方法は、低血糖症性の哺乳動物においても有効である。
【００４０】
これらの実施形態の一部の態様において、ＬＣ−ＣｏＡレベルは、視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ増加性分子（例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸トランスポーター分子、アシルＣｏＡシンテターゼ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ、およびアシルＣｏＡチオエステラーゼ）の活性を減少させることによって減少させられる。上記で考察したように、分子の活性を減少させることができる方法の例は、（ａ）該哺乳動物の脳へ医薬組成物を投与するステップであって、該医薬組成物がＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を阻害できる小分子を含むステップと、（ｂ）抗体または抗体結合部位を含む抗体フラグメントを該哺乳動物の脳への投与するステップであって、該抗体または抗体フラグメントがＬＣ−ＣｏＡ増加性分子へ結合して該分子の活性を阻害することができるステップと、および／または（ｃ）該哺乳動物の脳へ阻害性核酸もしくはミメティック（例、リボザイム、アンチセンス化合物、アプタマーもしくはｉＲＮＡ）を投与するステップと、による方法である。
【００４１】
これらの実施形態のまた別の態様では、ＬＣ−ＣｏＡレベルは視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子（例、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）、マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ、カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２−エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−オキシアシルＣｏＡチオラーゼ、およびアシルＣｏＡヒドラーゼ）の活性を増加させるステップによって減少させられる。同様に、上記で考察したように、分子の活性を増加させることができる方法の例は、（ａ）該哺乳動物の脳へ医薬組成物を投与するステップであって、該医薬組成物がＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を増加させることのできる小分子を含むステップと、（ｂ）視床下部へ該分子を投与するステップと；および（ｃ）該分子をコードするベクターを視床下部へ投与するステップと、による方法である。
【００４２】
これらの方法は、任意の哺乳動物、特に齧歯類またはヒトのための摂食量およびグルコース産生量を増加させるために有用である。一部の実施形態では、哺乳動物の体重は正常体重を少なくとも１０％または２０％下回る。
【００４３】
これらの方法は、哺乳動物における摂食量を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％もしくは４０％増加させると予想されるであろう。
【００４４】
本発明者らは、肝自己調節が視床下部内のＬＣ−ＣｏＡレベルによって媒介され得ることを見いだすことにも成功した。実施例４を参照されたい。そこで、一部の実施形態では、本発明は、肝自己調節が不十分な哺乳動物における肝自己調節を回復する方法に向けられる。これらの方法は、哺乳動物の視床下部内のＬＣ−ＣｏＡレベルを上昇させるステップを含む。
【００４５】
本明細書で使用するように、「肝自己調節」は、基底インスリンレベルの存在下では、脂質注入による遊離脂肪酸の血中濃度の上昇は、糖新生を刺激するが、肝グリコーゲン分解における代償性減少のために内因性糖産生量は変化しない現象を説明している。この現象は、糖尿病患者では高血漿グルコースレベルに起因して機能しない可能性がある（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照されたい）。
【００４６】
これらの実施形態では、視床下部内のＬＣ−ＣｏＡレベルは先行実施形態について記載した方法と同一方法、例えば視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させるステップ（例えばＬＣ−ＣｏＡ減少性分子は例えばＣＰＴ１、特にＣＰＴ１Ｌである）、例えば、哺乳動物の脳へ医薬組成物を投与するステップであって、該医薬組成物はＬＣ−ＣｏＡ減少性分子の活性を減少させることのできる小分子を含むステップ、哺乳動物の脳へ抗体または抗体結合部位を含む抗体フラグメントを投与するステップであって、抗体または抗体フラグメントはＬＣ−ＣｏＡ減少性分子に結合して該分子の活性を阻害することができるステップによって、哺乳動物の脳へ阻害性核酸もしくはミメティック（例えば、リボザイム）を投与するステップによって増加させられる。これらの実施形態におけるＬＣ−ＣｏＡレベルは、上述したように視床下部内のＬＣ−ＣｏＡ増加性分子の活性を増加させるステップによって、またはＬＣ−ＣｏＡを脳へ直接投与するステップによっても増加させることができる。先行実施形態におけると同様に、これらの方法は例えば齧歯類またはヒトなどのあらゆる哺乳動物、特に糖尿病性哺乳動物のために有用である。
【００４７】
さらに、本発明者らは、視床下部ＬＣ−ＣｏＡにおける増加は迷走神経の肝臓枝の遠心性線維の刺激を介する摂食量およびグルコース産生量の減少を誘導することを見いだした。実施例４を参照されたい。当業者であれば、摂食量およびグルコース産生量の減少は遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップによって達成できることを理解するであろう。
【００４８】
そこで、本発明はさらに哺乳動物における摂食量およびグルコース産生量を低下させる方法にも向けられる。これらの方法は、哺乳動物において遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップを含む。これらの実施形態では、哺乳動物は肥満症、２型糖尿病、レプチン耐性、インスリン耐性、ゴナドトロピン欠損症、無月経、および多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される少なくとも１つの状態を有する。
【００４９】
迷走神経は、当分野において、副交感神経系およびその分枝、ならびにコリン作用性神経としても知られている。遠心性肝迷走神経線維は、当分野において知られているいずれかの手段によって刺激できる。非限定的例には、針、超音波、もしくは振動などの機械的手段、赤外線、可視光線もしくは紫外線などの電磁放射線、熱、またはいずれかその他のエネルギー源が含まれる。好ましい実施形態では、迷走神経は、例えばＣｙｂｅｒｏｎｉｃｓ  ＮＣＰ（登録商標）、または電気プローブなどの市販の迷走神経刺激装置を用いて電気的に刺激される。遠心性迷走神経は、迷走神経全体（すなわち、求心性神経および遠心性神経の両方）を刺激することによって、または遠心性神経を分離してそれらを直接的に刺激することによって刺激できる。後者の方法は、両方のタイプの線維が存在する神経の領域において求心性線維を遠心性線維から分離することによって達成できる。あるいは、肝遠心性神経は例えば求心性線維が存在しない場所、例えば肝臓の付近で刺激される。遠心性線維は、肝臓を直接的に、例えば電気的に刺激するステップによって、すなわちその肝臓のために機能する遠心性線維を刺激するステップによって刺激できる。迷走神経は切断して、遠位端を刺激することが可能である。すなわち遠心性迷走神経線維だけを刺激することができる。
【００５０】
摂食量およびグルコース産生量を阻害するために有用な刺激の量は、当業者であれば必要以上の実験を行わずに決定することが可能である。迷走神経を刺激するために知られている電気刺激の例は、２ｍｓおよび１Ｈｚ、１０分間にわたる１Ｖから５Ｖの定電圧刺激である。
【００５１】
関連する実施形態では、本発明は、肝自己調節が不十分である哺乳動物における肝自己調節を回復するまた別の方法に向けられる。これらの方法は、遠心性肝迷走神経線維を刺激するステップを含む。遠心性迷走神経線維を刺激する方法は、摂食量およびグルコース産生量の減少に関してすぐ上の実施形態に記載したとおりである。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態について下記の実施例で記載する。本明細書に記載の請求項の範囲内に含まれる他の実施形態は、当業者には本明細書に開示した本発明の明細書または実践を考察することで明白になるであろう。実施例を含む本明細書は単に例示と見なすことが意図されており、本発明の範囲および精神は請求項に記載されている。
【実施例１】
【００５３】
視床下部内カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の阻害は摂食量およびグルコース産生量を減少させる
本実施例の要約
酵素カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１は、それらがβ酸化を受けることのできるミトコンドリア内で長鎖脂肪酸の進入を調節する。脂質の中枢性代謝がエネルギーバランスを変調できる１つ以上の新規メカニズムを試験するために、我々は視床下部内の脂質酸化を選択的に減少させることを目指した。このため、この酵素の発現を特異的に減少させるために設計されたリボザイム含有プラスミドの投与によって、または第３脳室内におけるその活性の薬理学的阻害剤の注入によって、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の活性を減少させた。視床下部内カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１活性の遺伝的もしくは生化学的阻害はどちらも摂食量および内因性グルコース産生量を顕著に減少させるために十分であった。これらの結果は、選択的視床下部ニューロン内の脂質酸化速度における変化が栄養素の利用率を視床下部へシグナリングでき、順に循環中への栄養素の外因性および内因性流入量を変調させることを示している。
【００５４】
本実施例では、視床下部内脂質酸化の役割を試験することによって脂質依存性シグナルの原因となるメカニズムに向けられた実験結果を報告する。酵素カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ１）は、それらがβ酸化を受けることのできるミトコンドリア内で長鎖脂肪酸の進入を調節する（ＭｃＧａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７；Ｚａｍｍｉｔ，１９９４）。次の２件の観察所見から、我々は視床下部内ＣＰＴ１について考えられる役割に関心を抱いた。ａ）摂食量に脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の阻害剤が及ぼす抑制作用は、ＣＰＴ−１活性の強力な阻害剤であるマロニルＣｏＡのレベル上昇を必要とする（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）（図１ａ）；およびｂ）第３脳室内（ＩＣＶ）に送達された長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）であるオレイン酸が摂食量およびＧＰに及ぼす抑制性作用は、ミトコンドリア内に進入するためにＣＰＴ１を必要としない短鎖脂肪酸であるオクタン酸の等モル投与によっては再現されなかった（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。これらの以前の所見に基づいて、我々は、ニューロン内ＬＣ−ＣｏＡレベルにおける上昇が栄養素の利用率についての視床下部シグナルであると仮定した。この上昇は、ＬＣＦＡ（オレイン酸など）（Ｉｄ．）のＩＣＶ投与またはマロニルＣｏＡのレベル上昇に起因するミトコンドリア内のＬＣ−ＣｏＡ進入の阻害のどちらかによって発生させることができよう（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この仮説を試験するために、我々は視床下部内のＣＰＴ−１活性における主要な減少が摂食挙動およびＧＰの両方を阻害するために十分であるかどうかを調べた。
【００５５】
結果
ＣＰＴ１阻害のための分子学的および薬理学的アプローチ。ミトコンドリア内へのＬＣ−ＣｏＡの進入を阻害するために、我々は薬理学的および分子学的アプローチを追求した。我々は最初に、ノーザン分析により視床下部内のＣＰＴ１の一般的形態が筋（ＣＰＴ１Ｍ）アイソフォームではなくむしろ肝（ＣＰＴ１Ｌ）アイソフォームであることを証明した（図１ｂ）。そこで、ＣＰＴ１ＬのｍＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム（ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏ；図１ｃ）を設計し、これを哺乳動物発現ベクター内に導入した（図１ｄ）。次に、この構築体がステーブルにトランスフェクトされたＡｔＴ２０細胞内でのＣＰＴ１Ｌ発現を減少させる能力を試験した（図１ｅおよび１ｆ）。さらに、ＣＰＴ１阻害剤の全身性注入が肝臓および骨格筋内のＬＣ−ＣｏＡ濃度を有意に増加させることができることも証明した（図１ｇ）。そこで、哺乳動物細胞内でのＣＰＴ１発現を減少させるためのＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏの使用について妥当性を確認し、ＣＰＴ１活性の阻害自体がＬＣ−ＣｏＡの組織濃度を増加させるために十分であるという証拠を提供した。
【００５６】
これらの結果に基づいて、視床下部内のＣＰＴ１活性を減少させてＬＣ−ＣｏＡを増加させるために、ＣＰＴ１活性の２種の特異的阻害剤であるＳＴ１３２６および２−テトラデシルグリデート（ＴＤＧＡ）、またはＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏを意識のあるラットのＩＣＶに注入した。各実験群におけるラットのベースライン時の身体測定学的および生化学的特徴は、適切なコントロール群と比較して類似していた（表１）。注目すべきことに、同一量を摂食させたコントロール群と比較して、３日間にわたりＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏを用いてＩＣＶ処置したラットではより低い空腹時血漿インスリンおよびレプチンレベルに向かう傾向が見られた（表１）。
【００５７】
【表１】
2006519229.tif 000002
【００５８】
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに定位脳手術によってＩＣＶカテーテルを植え込んだ（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。この手術からの完全な回復の３週間後に、生化学的もしくは分子学的分析、代謝もしくは摂食実験を実施した（図２ａ）。実験実施日の３日前にＣＰＴ１Ｌ−ＲｉｂｏをＩＣＶへ送達した（図２ａ）。慢性カテーテルを留置したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、ＣＰＴ１阻害剤もしくはビークル（ＣＯＮ）を短時間で注射した、または６時間かけてＩＣＶへ注入した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）（図２ａ）。我々は最初に、マイクロパンチによって採取した選択した視床下核内のＣＰＴ１ＬのｍＲＮＡレベル（図２ｂ）およびＣＰＴ１ＭのｍＲＮＡレベル（図２ｃ）にＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏが及ぼした作用を試験した。定量的リアルタイムＰＣＲ（β−アクチンのコピー数について調整）を使用して、我々は弓状核（ＡＲＣ）内ではＣＰＴ１ＬのｍＲＮＡの顕著な減少が見られるが、例えば室傍核（ＰＶＮ）もしくは外側視床下部（ＬＨＡ）などの視床下部のより外側の領域ではこの減少が見られないことを証明した。これとは逆に、ＣＰＴ１ＭのｍＲＮＡは特にＡＲＣでははるかに低いレベルで発現したが、その発現はＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏによって検知できるほど変化しなかった。ＣＰＴ１ＬのｍＲＮＡにおける顕著な減少が重要な生物学的作用を有するのであれば、さらにＡＲＣにおけるＣＰＴ１活性の減少も引き起こすはずである。そこで我々は次に、ＡＲＣおよび視床下部全体におけるＣＰＴ１活性を測定した。ＡＲＣ内ではＣＰＴ１活性の顕著な減少（図２ｄ）がＣＰＴ１Ｌ−ＲｉｂｏのＩＣＶ投与後に観察されたが、視床下部全体では観察されず（図２ｅ）、これはＣＰＴ１ＬのｍＲＮＡに対して観察された選択的作用（図２ｂ）と一致していた。我々はさらに、ＡＲＣ（図２ｄ）および視床下部全体（図２ｅ）におけるＣＰＴ１活性へ不可逆性ＣＰＴ１阻害剤であるＴＤＧＡが及ぼす作用についても確認した。最後に、我々はＣＰＴ１Ｌ活性の阻害剤のＩＣＶ投与がＡＲＣ内のＬＣ−ＣｏＡを増加させるという仮説を試験することを目指した。このためには可逆性ＣＰＴ１Ｌ阻害剤であるＳＴ１３２６およびコントロールとしてその不活性立体異性体であるＳＴ１３４０を使用した。ＩＣＶ  ＳＴ１３２６の投与はＡＲＣ内のステアロイルＣｏＡ（図２ｆ）およびオレイルＣｏＡ（図２ｇ）レベルの顕著な増加を引き起こしたが、ＰＶＮおよびＬＨＡ内の増加は引き起こさなかった。他のＬＣ−ＣｏＡ（図示していない）もまたＩＣＶ  ＳＴ１３２６投与によって有意に増加した。そこで、ＣＰＴ１の分子学的および薬理学的阻害剤のＩＣＶ送達はＡＲＣ内のＣＰＴ１活性を効果的に減少させ、ＣＰＴ１Ｌ活性の阻害は特異的ＬＣ−ＣｏＡの濃度を有意に上昇させた。これらの所見に基づいて、ＣＰＴ１活性の視床下部性阻害が摂食挙動およびインスリン作用に及ぼす作用を試験するために２セットの実験を設計した。
【００５９】
ＣＰＴ１の視床下部性阻害は摂食量を減少させる。まず第一に、我々はＣＰＴ１の分子学的および薬理学的アンタゴニストの中枢投与が意識のあるラットにおける摂食挙動を変調させるかどうかを試験した（図３）。このために、暗周期開始３時間前に対のラット群に留置ＩＣＶカテーテルを介してコントロールベクターもしくはＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏ、またはＳＴ１３２６の不活性立体異性体であるＳＴ１３４０、またはＣＰＴ１Ｌ阻害剤（ＳＴ１３２６）いずれかのボーラス投与を実施した。ＩＣＶ注射前および注射７２時間後まで、代謝ケージ内で摂食量を監視した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。ＣＰＴ１Ｌ−ＲｉｂｏのＩＣＶ注射によるＡＲＣ内でのＣＰＴ１Ｌ発現および活性における選択的減少（図２ｂおよびｄ）は、ＩＣＶ投与後の最初の夜に始まる急速な食欲抑制の開始（図３ａ〜ｃ）を生じさせた（平均摂食量、１３．０±１．９対２３．０±３．２ｇ／日；ｐ＜０．０１）。ＩＣＶ  ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏが摂食量に及ぼす顕著な作用は、コントロールベクターまたは非関連性コントロールリボザイムのいずれと比較しても有意であった（図３ｃ）。同様に、ＣＰＴ１Ｌの強力かつ特異的阻害剤（ＳＴ１３２６）の短時間ＩＣＶ注射はラットの摂食量を顕著に阻害したが、不活性立体異性体（ＳＴ１３４０）は摂食挙動を修正することができなかった（図３ｄ、ｅ）。中枢性ＣＰＴ１阻害の食欲抑制作用は、単回ＩＣＶ投与後少なくとも４８時間持続した。摂食量におけるこれらの減少はベースライン時およびビークル／コントロール群のどちらと比較しても有意であった（図３ａ〜ｅ）。ＣＰＴ１阻害によって誘導されたベースライン時からの変化は、ＣＰ１Ｌ−Ｒｉｂｏおよび高用量ＳＴ１３２６各々のＩＣＶ投与の２４時間後（−１７．６±２．０ｇおよび−１２．４±３．９ｇ）、ならびに４８時間後（−１３．４±１．８ｇおよび−７．８±３．８ｇ）に統計的有意であった（図３ｂおよびｅ）。これは１日摂食量の〜５０％減少を表していたが、１日摂食量は７２時間後までにベースライン時に向かって回復した。
【００６０】
ＡＲＣ  ＣＰＴ１阻害の食欲抑制作用特性の原因となるメカニズムの調査を開始するために、我々は次に重要なＡＲＣペプチドの遺伝子発現にＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏが及ぼす作用について分析した。リアルタイムＰＣＲによる定量的分析によって、コントロール−Ｒｉｂｏと比較してＩＣＶ  ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏにより処置したラットのＡＲＣ内のＡｇＲＰおよびＮＰＹ  ｍＲＮＡの顕著な減少が明らかになった（図３ｆ）。これとは逆に、ＡＲＣ内のＰＯＭＣの発現はＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏ投与によって有意に変化しなかった（図３ｆ）。これらをまとめると、これらの食欲抑制作用は、ニューロン内ＬＣ−ＣｏＡレベルにおける変化が離散性視床下部中枢へのそれらの作用を介して摂食量を直接的に制御する可能性があるとの見解を支持している。さらに、選択的視床下部ニューロン内のＬＣ−ＣｏＡレベルの増加は、おそらくオレイン酸およびＦＡＳ阻害剤が摂食量に及ぼす強力な作用の原因であると思われる（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｍａｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００６１】
ＣＰＴ１の視床下部性阻害はグルコース産生を阻害する。ＣＰＴ−１の中枢性阻害が身体全体のインスリン作用に及ぼす作用を試験するための実験もまた設計した（図４ａ、ｂ）。インスリン作用は、ＩＣＶ注入と全身性膵−インスリンクランプ試験との組み合わせによって評価した（図４ｂ）。これらの試験では、１日摂食量はＩＣＶベクター群およびＩＣＶ  ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏを摂取するラット群において適合させた（表１）。全ラットには、さらにまたＩＣＶ注入の最終４時間にわたり［３−3Ｈ］−グルコースの動脈内注入を実施し、試験の最終２時間中には膵／インスリンクランプ（インスリン１ｍＵ／ｋｇ．ｍｉｎ；ソマトスタチン３μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）を実施した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。基底循環中インスリンレベルの存在下で予想されたように（クランプ法；表１）、正常血糖を維持するために必要とされたグルコース注入速度（ＧＩＲ）はＩＣＶコントロール試験においてほんのわずかであった（ベクター、ＳＴ１３４０またはビークル注入動物；〜０．８ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）。これとは対照的に、ＣＰＴ−１発現または活性の阻害剤のＩＣＶ注入後に低血糖症を防止するためには、グルコースを〜５ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの速度で注入しなければならなかった。すなわち、一定および基底インスリン濃度の存在下におけるＣＰＴ−１活性の中枢性阻害は、グルコースホメオスタシスへのインスリン作用を刺激する。
【００６２】
我々は次に、それによりＣＰＴ−１アンタゴニストのＩＣＶ投与が全身性インスリン作用を強化する潜在的メカニズムについて試験した。我々は、ＣＰＴ１の中枢性アンタゴニストによって誘導されたＧＩＲ上昇の原因がグルコース取り込みの刺激にあるのか、あるいは内因性グルコース産生（ＧＰ）の抑制にあるのかを確証するためにトレーサー希釈法（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によってグルコース動態について評価した。グルコース取り込み速度は、ＩＣＶ処置によって有意な影響を受けなかった（図４ｃ、ｅ、ｇ）。これとは逆に、基底の等しいインスリンレベル（〜２０μＵ／ｍｌ）の存在下では、ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏ（３０±３％まで；ｎ＝５）、ＳＴ１３２６（４４±７％まで；ｎ＝８）、およびＴＤＧＡ（４７±６％まで；ｎ＝７）のＩＣＶ投与によってＧＰは有意に減少した（図４ｄ、ｆ、ｈ）。これらのグルコース分泌量における減少は、完全にＣＰＴ１の中枢性阻害が全身性グルコース代謝に及ぼす作用の原因であった。
【００６３】
考察
これらの結果に基づいて、我々はＣＰＴ１活性の中枢性阻害は食物摂取量および内因性グルコース産生量を顕著に抑制するために十分であると結論する。さらに、我々はＣＰＴ１活性の中枢性阻害が選択的視床下部ニューロン内のＬＣ−ＣｏＡレベルの増加をもたらすことを提案する。この増加は「栄養素富裕」の中枢性シグナルを表しており、このシグナルは順に炭水化物から脂質への燃料源の切り替えを促進し、そして循環中の外因性および内因性栄養素がそれ以上進入するのを制限するために設計された一連のニューロン事象を活性化する。
【００６４】
長鎖脂肪酸であるオレイン酸とＦＡＳ阻害剤の中枢性送達の強力な作用（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｍａｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を考慮すると、本所見は、視床下部ニューロン内の細胞ＬＣ−ＣｏＡレベルの増加は栄養素の利用率の上昇にとって重要なセンサーであるという見解を支持している（図１ａ）。これは順に、エネルギーホメオスタシスおよび肝インスリン作用の両方の調節に関係する中枢性ニューロン経路を活性化する。肝臓によるグルコース産生は内因性燃料の主要起源であるので、中枢性神経回路は外因性および内因性エネルギー源を同時に調節する（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これはそれらの利用率における変化に応答して循環中の栄養素の流入量を監視かつ調節するために設計された負のフィードバックシステムと一致している。
【００６５】
循環中遊離脂肪酸は中枢神経系に迅速に接近できるので（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｇｏｔｏ  ＆  Ｓｐｉｔｚｅｒ，１９７１）、視床下部内脂肪酸酸化における変化はニューロンＬＣ−ＣｏＡレベルの変化を介してエネルギーバランスおよびインスリン作用の制御を調節させると思われる。生理学的条件下では、視床下部内ＣＰＴ１活性の阻害は、おそらくマロニルＣｏＡのニューロン中レベルが上昇すると発生すると思われる。細胞内マロニルＣｏＡレベルの増加は、概して炭水化物の代謝増加によって誘導される。そこで、この仮説的「中枢性脂質シグナル」は、ＬＣＦＡの利用率が炭水化物の利用率の上昇（マロニルＣｏＡの増加）と結び付いたときに生成されるであろう。視床下部内ＣＰＴ１活性自体の阻害が摂食量およびグルコース産生量へのＬＣＦＡオレイン酸のＩＣＶ投与が及ぼす作用を再現したので（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）、ＬＣ−ＣｏＡがミトコンドリア内に流入するよりむしろ蓄積するかどうかが視床下部脂質検知の重要な成分であると思われる。これは、短鎖脂肪酸であるオクタン酸の利用率の顕著な増加がグルコース産生量（Ｉｄ．）へのオレイン酸の強力な作用を再現できなかったという観察所見とも一致している。ここでマロニルＣｏＡは視床下部内ＣＰＴ１活性の生理学的調節において重要な役割を果たすと思われるが、マロニルＣｏＡレベルの増加はＣＰＴ１活性の遺伝的もしくは薬理学的阻害の存在下で発生するとは思われないことに留意されたい。実際に、ＣＰＴ１活性の阻害はＬＣ−ＣｏＡのレベル上昇を生じさせるが、これは順にＡＣＣの阻害を介してマロニルＣｏＡレベルを低下させる（Ｌｕｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。
【００６６】
最後に、カンナビノイドの強力な食欲促進性（食欲刺激性）作用およびＣＢ1受容体拮抗の強力な食欲抑制作用（Ｂｌａｚｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）もまた一部には視床下部内ＣＰＴ−１活性およびＬＣ−ＣｏＡレベルの変調を介して媒介される可能性がある。実際に、内在性カンナビノイドは、マロニルＣｏＡとは独立して、およびＣＢ１受容体との相互作用を介して培養星状細胞内のＣＰＴ１活性および脂肪酸酸化を刺激する（Ｄｉ  Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。したがって脂肪酸酸化の中枢性阻害は肥満症および２型糖尿病の予防および治療に対する革新的アプローチを表す可能性がある。
【００６７】
方法
ＣＰＴ１Ｌリボザイムの設計およびクローニング。２つの相補的５１塩基長オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、５’−ＣＴＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡ−３’（配列番号２）、および５’−ＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡ−３’（配列番号３）が合成されたが（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ）、これはカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の肝アイソフォーム（ＣＰＴ１Ｌ）由来の１３ヌクレオチド長配列によって挟まれたハンマーヘッドリボザイム配列の触媒性コア（上記では太字で示した、さらに図１ｃも参照されたい）を含有していた（Ｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｂｉｒｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。２つのＯＤＮのアニーリングの結果として生じた二本鎖フラグメントを哺乳動物発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のｐＴａｒｇｅＴ）内に挿入した。ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏカセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏの上流にあるイントロン要素、および下流のシミアンウイルス４０後期ポリアデニル化部位を含有する。（図１ｄ）。得られたＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏ構築体は、ＣＰＴ１ＬのｍＲＮＡに対して特異的なハンマーヘッド触媒性ＲＮＡの転写を指示するであろう（図１ｅ）。コントロール試験は、ｐＴａｒｇｅｔベクター単独、もしくは指示された場合はＣＰＴ−特異的配列がランダム配列５’−ＧＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号４）によって置換されたリボザイムコントロールプラスミド（ＲｉｂｏＣ）のどちらかを用いて実施した。
【００６８】
ＣＰＴ１Ｌリボザイムの発現。以前に記載されたように（Ｂｏｕｓｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、ポリエチルエニミン（ＰＥＩ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、分子量２５，０００）を用いてＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏプラスミドもしくはベクター単独をＡｔＴ２０細胞内へトランスフェクトした。ノーザン分析を１プールにつき２００個までのの独立クローンについて実施した。インビボ発現させるために、以前に記載されたように（Ｇｏｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）ＣＰＴ１Ｌ−ＲｉｂｏプラスミドをＰＥＩと錯体形成させ、ＩＣＶ注射した。手短には、５μｇのプラスミドを含有する５μＬのＤ５Ｗ（５％グルコース溶液）をＤ５Ｗ中に溶解した５μＬの１８ｍＭのＰＥＩ溶液と混合した。室温での１０分間のインキュベーション後、１μＬ／ｍｉｎの速度で１０μＬの混合液をＩＣＶ注入した。
定位脳手術によるマイクロパンチ。個々の視床下核の脳マイクロパンチは以前に記載されたように（Ｐａｌｋｏｖｉｔｓ，１９７３；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）調製した。
【００６９】
ノーザン分析およびリアルタイムＰＣＲによるＣＰＴ１および神経ペプチドｍＲＮＡの定量。肝および筋アイソフォーム（各々、ＣＰＴ１ＬおよびＣＰＴ１Ｍ）に対して特異的なＣＰＴ１プローブは、テンプレートとしてラット視床下部ＲＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、ｐＴａｒｇｅｔ内にクローン化した。ＣＰＴ１ＬプローブはＣＰＴ１ＬのｃＤＮＡの１０位から７６５位の７５５ヌクレオチドに及んだ（ＧｅｎｅＢａｍｋ登録番号Ｌ０７７３６）。ＣＰＴ１ＭプローブはＣＰＴ１ＭのｃＤＮＡの６８８位から１２３３位の５４５ヌクレオチドに及んだ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３２００）。
【００７０】
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて個々の視床下核（すなわち、弓状核、ＰＶＮなど）から全ＲＮＡを単離した。一本鎖ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ反応は以前に記載されたように（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）実施した。ＣＰＴ１ＬおよびＣＰＴ１ＭのｍＲＮＡ特異的プライマーは次の配列を含有していた。ＣＰＴ１Ｌフォワード（Ｆ）プライマー、５’−ＣＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号５）およびリバース（Ｒ）プライマー、５’−ＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号６）；ＣＰＴ１ＭのＦプライマー、５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣ−３’（配列番号７）およびＲプライマー、５’−ＧＴＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＴＡＣ−３’（配列番号８）。視床下部内神経ペプチド発現は、次のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによって実施した。ＮＰＹ−Ｆプライマー、５’−ＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＧ−３’（配列番号９）、Ｒプライマー、５’−ＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）、ＰＯＭＣ−Ｆプライマー、５’−ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１１）、Ｒプライマー、５’−ＴＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＴＧＣ−３’（配列番号１２）、ＡｇＲＰ−Ｆプライマー、５’−ＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１３）、Ｒプライマー、５’−ＴＧＧＣＴＡＧＧＴＧＣＧＡＣＴＡＣＡＧＡ−３’（配列番号１４）、およびβ−アクチン−Ｆプライマー、５’−ＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１５）、Ｒプライマー、５’−ＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１６）。転写レベルは、β−アクチンについてのコピー数へ正規化した各遺伝子のコピー数として表示した。各転写体についてのコピー数は、標的テンプレート配列を含有するプラスミドの連続希釈を用いた各プライマーセットのＰＣＲランによって得られた標準曲線に対して測定した。
【００７１】
インビボ実験のための動物の調製。我々は９３匹の１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州、ウィルミントン）を対象に試験した。ラットは個別ケージ内に収容し、標準明暗周期に曝露させた。インビボ試験の３週間前に、長期カテーテルを定位脳手術によって第３脳室内に留置した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。膵−インスリンクランプ試験プロトコールの１週間前に、我々は右内頸静脈および左頸動脈内に追加のカテーテルを留置した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。全ＩＣＶ溶液は人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中に溶解した。摂食量を１日１回監視した。
【００７２】
ＣＰＴ１の中枢性阻害作用および食物摂取。我々はＣＰＴ１Ｌ−ＲｉｂｏおよびＳＴ１３２６のＩＣＶ注入が摂食量に及ぼす作用について試験した。暗周期の開始３時間前に、ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏもしくはベクターコントロール、ＳＴ１３２６もしくはＳＴ１３４０を第３脳室内に植え込んだ留置カテーテルを介してボーラス注射した。摂食試験では、ラットに２５ｐｍｏｌのＳＴ１３４０または２種の用量（５および２５ｐｍｏｌ）のＳＴ１３２６の単回ボーラス注射を実施した。ラットを代謝ケージに順応させ、１日摂食量はＩＣＶ注射前の少なくとも連続３日間は一定であった（変化率＜１０％）。その後７２時間にわたり摂食量を連続的に監視した。
【００７３】
インビボグルコース動態の測定および膵−インスリンクランプ試験方法。注入試験は計３６０分間継続した（図３ａ）。手短には、ＣＰＴ１阻害剤またはコントロール溶液どちらかの初回負荷−持続ＩＣＶ注射をｔ＝０ｍｉｎで開始し、これを試験の残り期間にわたって維持した。２−テトラデシルグリデート（ＴＤＧＡ、Ｄｒ．Ｍａｎｕｅｌ  Ｇｕｚｍａｎより寄贈）をＤＭＳＯ中に溶解させ、ａＣＳＦ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）中に希釈し、５０ｐｍｏｌ／ｈの速度でＩＣＶ注入した。ＳＴ１３２６［（Ｒ）−Ｎ−（テトラデシルカルバモイル）−アミノカルニチン］およびＳＴ１３４０（ＳＴ１３２６の不活性立体異性体）［（Ｓ）−Ｎ−（テトラデシルカルバモイル）−アミノカルニチン］をａＣＳＦ中に溶解し、５０ｐｍｏｌ／ｈの速度で注入した。膵−インスリンクランプ試験の前に、クランプ試験方法の３日前にＣＰＴ１Ｌ−ＲｉｂｏまたはベクターコントロールどちらかのＩＣＶ注射を受けたラットを２つの同一量摂食実験群に無作為割り付けした。ＨＰＬＣ精製［３−3Ｈ］−グルコース（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州ボストン；４０μＣｉボーラス、０．４μＣｉ／ｍｉｎ）の初回負荷−持続注入をｔ＝１２０ｍｉｎに開始し、試験期間を通して持続した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。最後に、膵−インスリンクランプ試験（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）をｔ＝２４０ｍｉｎに開始し、２時間継続した。この方法は、ソマトスタチン（３μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）、インスリン（１ｍＵ／ｋｇ／ｍｉｎ）、および低血糖症を防止するための必要に応じてグルコース、またはＣペプチド（Ｌｉｎｃｏ）およびメラノコルチン（Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）２型受容体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する抗体の注入を含んでいた。インスリン注入速度は、後吸収性ラットにおける正常基底レベルに戻るように設計した。
【００７４】
血漿中グルコースおよびインスリン濃度ならびにグルコース比活性にとっての定常状態条件は、全実験においてクランプ試験法の最後の６０分間中に達成された。血漿中の［3Ｈ］グルコースの放射性は、トリチウム水を除去するために乾燥するまで蒸発させた後にＢａ（ＯＨ）2およびＺｎＳＯ4の上清から測定した（Ｓｏｍｏｇｙｉペレット）。血漿中のトリチウム水（Ｓｏｍｏｇｙｉ濾液）の比活性は、乾燥するまで蒸発させる前および後にタンパク質無含有上清の総数から決定した。血漿中グルコース濃度についての定常状態条件下では、グルコースの消失速度（Ｒｄ）はグルコース出現速度（Ｒａ）に等しい。Ｒａは、定常状態条件下で［3Ｈ］グルコースの注入速度（１分間当たりの分解）と血漿中［3Ｈ］グルコースの比活性（１分当たり１ｍｍｏｌのグルコース当たりの分解）との比率から決定した。グルコース産生（ＧＰ）速度は基底条件下ではＲａに等しかったが、それは膵クランプ試験中のＲａとグルコース注入速度との差から得られた。
【００７５】
全数値は平均値±ＳＥとして表示した。群間の比較は、分散分析または対応のないスチューデントのｔ検定を用いて実施した。本試験のプロトコールは、アルバート・アインシュタイン医科大学（Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の施設内動物実験委員会によって精査かつ承認された。
【実施例２】
【００７６】
視床下部内の長鎖ＣｏＡレベル（ＬＣ−ＣｏＡ）の変調は摂食量およびグルコース産生量を調節する。
本実施例では、実施例１に記載した方法を用いた実験について記載する。
【００７７】
食餌誘導性肥満症は視床下部内ＬＣ−ＣｏＡの顕著な減少を引き起こす。視床下部内「脂質シグナル」における減少が食餌誘導性肥満症において重要な役割を果たせるかどうかを試験するために、我々は３日間にわたり高美味食を摂食させたラットの弓状核（ＡＲＣ）内のＬＣ−ＣｏＡレベルを測定した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。後者は、単一遺伝子欠損に基づいていないために、ヒト肥満症および食餌誘導性インスリン耐性に対する優れたモデルである。飽和脂肪酸が極めて富裕な飼料を摂取していたにもかかわらず、過剰摂食ラットにおけるＡＲＣ内ＬＣ−ＣｏＡのレベルは標準食を摂食しているラットまたは標準食を摂食しているラットと同一量で摂食させた高脂肪食レジメンのラットのどちらと比較しても〜６０％減少した。これらの驚くべき試験結果は、体重増加の素因を有する動物における循環中栄養素と視床下部エネルギーセンターとの間の欠陥のある負のフィードバックの存在を支持している。
【００７８】
視床下部内ＣＰＴ−１の阻害は、食餌誘導性肥満症およびインスリン耐性を有するラットにおける肝インスリン作用を顕著に改善する。ここで我々は、視床下部内ＣＰＴ−１の阻害が過剰摂食ラットにおけるグルコース産生量（ＧＰ）を減少させることができるという仮説を立てた。すなわち、我々はＬＣの視床下部内酸化の減少がとても味のよい高脂肪食（カロリーの３３％が脂肪由来）を摂取しているラットにおいてＧＰを急速に抑制するかどうかを試験した。ＬＣがミトコンドリア内に進入するのを阻害するために、意識のあるラットにＣＰＴ−１活性（ＣＰＴＩ）の選択的阻害剤またはその不活性立体異性体（ＣＯＮ）をＩＣＶ注入した。ＣＰＴＩまたはＣＯＮは長期カテーテルを留置したラットにおいて６時間にわたり短時間ＩＣＶ注入した。基底インスリンレベルの存在下では、ＣＰＴＩ（４．２±０．４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）群では低血糖症を防止するためにグルコース注入を必要としたが、ＣＯＮ（０．５±０．２ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）群では必要としなかった。ＧＰは、ＣＰＴＩ（−３７±５％；ｐ＜０．０１；ｎ＝４）によって顕著かつ有意に減少したが、ＩＣＶ  ＣＯＮ（＋３±７％；ｎ＝５）によっては減少しなかった。我々は、過剰摂食ラットにおけるＬＣの中枢投与に対する代謝反応の欠如はニューロンＣＰＴ−１の活性上昇に起因すると推定した。
【００７９】
ＣＰＴ１活性の中枢性阻害は食餌誘導性インスリン耐性にとって有効な治療法のはずである。これらをまとめると、上記に提示したデータは、ＬＣ−ＣｏＡのＡＲＣ内濃度を増加させるいずれかの薬理学的手段は肥満症および２型糖尿病の予防および治療にとって妥当かつ新規のアプローチであるという見解の妥当性を確認している。ＣＰＴ−１活性または発現の選択的阻害剤に加えて、ＬＣ−ＣｏＡ代謝を減少させるために他の酵素を標的とすることができる。例えば、ＡＲＣ内ＬＣ−ＣｏＡヒドロラーゼまたはチオエステラーゼの阻害もまたＬＣ−ＣｏＡを増加させ、ＧＰおよび摂食量を減少させると予想される。同様に、マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼの阻害またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの刺激を介する視床下部内マロニル−ＣｏＡのレベルの上昇もまた摂食量およびグルコース分泌量を阻害すると思われる。最後に、脂肪酸トランスポータータンパク質またはＬＣ−ＣｏＡシンテターゼのニューロン活性の上昇は、さらにまたＬＣ−ＣｏＡの視床下部内レベルを上昇させ、このためグルコース産生量および摂食量を阻害するはずである。
【００８０】
結論として、この実施例ではＬＣ−ＣｏＡの視床下部内レベルを上昇させると摂食量およびグルコース産生量が減少することを確証した。
【実施例３】
【００８１】
長鎖脂肪酸に対する視床下部性反応は栄養によって調節される
本実施例の要約
長鎖脂肪酸であるオレイン酸の中枢投与はラットにおける摂食量およびグルコース産生量を阻害する。そこで我々は、栄養素の利用率における短期的変化がこれらのオレイン酸の代謝作用および挙動作用を変調できるかどうかについて試験した。ラットは、１日カロリーレベルを上昇させるとても味のよい高エネルギー密度食を（標準食を摂食したラットの平均を下回って、同様に、または上回って）摂取する３群に分けた。指定食レジメンを３日間実施した後、第３脳室内へのオレイン酸の注入に対する急性期生物学的反応についてラットを試験した。３日間の過剰摂食は、オレイン酸の中枢投与の代謝作用および食欲抑制作用を実質的に取り除いた。さらに、第３脳室内へのオレイン酸の注入は、短期間過剰摂食後に視床下部内の神経ペプチドＹおよび肝臓内のグルコース−６−ホスファターゼの発現を減少させることができなかった。短期間過剰摂食後のオレイン酸に対する視床下部反応の欠如は、おそらくこの動物モデルにおける体重増加および肝インスリン耐性の迅速な開始の原因になると思われる。
はじめに
【００８２】
肥満症および２型糖尿病（ＤＭ２）は幾つかの代謝性特徴を共有するが、それにはインスリン耐性が含まれる（Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，２０００；Ｋｏｐｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｉｔｍａｎ，１９９８；Ｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。肥満症およびＤＭ２の発生率は、先進国および開発途上国において有意に上昇してきた。例えば、米国内だけでも過去数十年間にわたり小児および成人のどちらの間でも肥満症罹患率の有意な増加が生じている（Ｆｌｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｏｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。高カロリー食の消費および座っていて運動しないライフスタイルがこの傾向に重要な役割を果たしている（Ｋｏｐｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｉｔｍａｎｌ  Ｆｌｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２０００）。同様に、高カロリー密度を備える味のよい食餌（高脂肪食）への曝露は、マウス（Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、ラット（Ｋｒａｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓｃｈｅｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０；Ｓｃｌａｆａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９７６）、ブタ（Ｒｏｍｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）、イヌ（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびサル（Ａｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）において様々な程度の体重増加およびインスリン耐性を誘導する。
【００８３】
進化的圧力は、食物の利用率が高い場合にエネルギー貯蔵を最大化する遺伝子の選択に有利に働いてきた（Ｃｏｌｅｍａｎ，１９７８；Ｃｏｌｅｍａｎ，１９７９；Ｎｅｅｌ，１９９９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。他の研究者らや我々は、カロリー摂取量の急速な増加が末梢性「タンパク同化シグナル」（Ｋｅｒｓｔｅｎ，２００１）と視床下部性「異化シグナル」（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；２００２ｄ；２００２ｅ；２００２ｆ；２００３）との間の「主導権争い」を開始すると提案してきた。レプチン（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ；１９９６ｂ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃｉｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）およびインスリン（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｅ；２００２ｆ；Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｂｒｉｅｆ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８４）などのホルモン、ならびに脂肪酸（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）などの栄養素の作用は、視床下部内で負のフィードバックを開始するが、これには摂食量の制限、エネルギー消費の刺激、および内因性起源（主として肝臓）からの栄養素の分泌量の減少が含まれる。動物およびヒトは、この負のフィードバックが崩壊していると体重の増加および代謝調節の変化を生じ易い可能性がある。自発的過剰摂取の齧歯類モデルにおけるレプチン耐性の迅速な開始はこの理論を最初に支持している（Ｈａｌａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｗｉｄｄｏｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００８４】
そこで我々は、カロリー摂取量の短期的増加が長鎖脂肪酸であるオレイン酸（ＯＡ）の中枢性作用に対する耐性を急速に誘導するという仮説について試験した。そこで、栄養状態における変化が摂食挙動およびグルコース産生量にＯＡが及ぼす中枢性作用における変化をもたらすかどうかを試験した。
【００８５】
略語
ＩＣＶ、第３脳室内；ＯＡ、オレイン酸；ＮＰＹ、神経ペプチドＹ；ＤＭ２、２型糖尿病；ＰＥＰＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅ、グルコース−６−ホスファターゼ；ＨＰＢ、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；ＳＣ、標準食；ＨＦ、高脂肪食；ＬＣＦＡ、長鎖脂肪酸。
【００８６】
実験方法
動物および実験デザイン。１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｓ−Ｄ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、マサチューセッツ州ウィルミントン）を個別ケージに収容し、標準明暗周期（０６００−１８００／１８００−０６００）に曝露させた。インビボ試験の１４日前に、全ラットへ以前に記載されたように（３６）定位脳手術によってＩＣＶカテーテルの植え込みを実施した。全インビボ試験の開始前に、ラットを完全に回復させた。動物には、標準食（ＳＣ；製品番号５００１、Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ  Ｌｔｄ、カロリー配分：炭水化物５９％、タンパク質２８％および脂肪１２％、３．３ｋｃａｌ／ｇ）、高ショ糖食（ＨＳ；動物に標準食に加えて２０％スクロース溶液を自由に摂取させた）、または１０％ラードを含むＳＣ食を補給することによって設計したとても味のよい高脂肪食（ＨＦ；製品番号９３８９；Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ  Ｌｔｄ．、カロリー配分：炭水化物４５％、タンパク質２２％および脂肪３３％、５．３２ｋｃａｌ／ｇ）を摂食させた。ラードは、２％ミリスチン酸、２４％パルミチン酸、１３％ステアリン酸、４６％オレイン酸、および１２％リノール酸を含有していた。ＨＦ食中の脂肪の全組成は、重量で５．２％の飽和脂肪、６．２％の一価不飽和脂肪、および２．７％の多価不飽和脂肪であった。ＳＣ食は、重量で各々１％、１．５％、および１．６％の飽和脂肪、一価不飽和脂肪、および多価不飽和脂肪を含有していた。３日間にわたる次の食餌レジメン後の摂食試験および代謝試験（下記で説明する）には５群の動物を含めた（表２）。１）任意ＳＣ群（ＳＣ；〜８０ｋｃａｌ／日）；２）任意ＨＳ群（ＨＳ；〜９５ｋｃａｌ／日）；３）任意ＨＦ群（ＨＦ１４０；〜１４０ｋｃａｌ／日）；４）カロリー制限ＨＦ群（ＨＦ５５；〜５５ｋｃａｌ／日）；および５）ＳＣと摂食量を揃えたＨＦ群（ＨＦ８０；〜８０ｋｃａｌ／日）。
【００８７】
ＯＡの中枢性送達。ＯＡをポリマーのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢ、ＣＴＤ  Ｉｎｃ）と錯体形成させた。後者は、脂肪酸の中枢性送達のための優れたビークルを提供することが証明されている（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｙａｋｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｐｉｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＯＡを最終濃度が１７ｍＭとなるように４５％  ＨＰＢ中に溶解させた。ＨＰＢ−ＯＡ溶液を人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で各ＩＣＶ注射のために使用される適切な濃度へ希釈した（３０または３００ｎｍｏｌ／５μＬ）。全ビークルコントロール試験では、ＯＡ試験と類似濃度でＨＰＢ単独を使用した。
【００８８】
摂食挙動試験。この実験プロトコールは、標準食（ＳＣ）、高ショ糖食（ＨＳ９５）および高脂肪食（ＨＦ１４０）を摂食させた３つの実験群においてＩＣＶ  ＯＡが摂食量に及ぼす急性期作用を試験するために設計した。ＳＣ群およびＨＦ１４０群動物には飼料を任意に摂食させた。ＨＳ群の動物には、３日間にわたり標準食に加えて２０％スクロース溶液を自由に摂取させた。全群における３日間にわたる任意の摂食後、ラットには試験第０日（図５ａ）に、暗周期の開始１時間前に気密性シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｒｐ）を用いて５ｍＬのＯＡ（３０ｎｍｏｌ）もしくはビークルのどちらかのＩＣＶボーラス注射を１μＬ／ｍｉｎの速度で投与した。注射後３日間にわたり１日１回同一時刻に摂食量を測定した。
【００８９】
ＮＰＹ発現試験。ＮＰＹ発現の解析のため、我々は２つのラット群であるＨＦ５５群およびＨＦ１４０群について試験した。各食餌レジメンを３日間実施した後、ＩＣＶビークル（ａＣＳＦ中の１０％ＨＰＢ）またはＩＣＶ  ＯＡ（３０ｎｍｏｌ）を暗周期の開始１時間前に第３脳室内へのボーラス注射した。飼料を取り除き、注射１６時間後に視床下部を採取した。
【００９０】
インスリン作用試験。この場合の実験プロトコールは、視床下部内の長鎖脂肪酸が炭水化物代謝を変調する能力に栄養状態が及ぼす作用を試験するために設計した。ラット（ｎ＝４３）には、以前に記載されたように（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）長期カテーテルを植え込んだ。カテーテル挿入から完全に回復した後、動物はＨＦ５５群（ｎ＝１６）、ＨＦ８０群（ｎ＝９）、またはＨＦ１４０群（ｎ＝１８）の３群に無作為割り付けし、それらに割り付けられた飼料を３日間にわたり消費させた。インビボ試験の前夜に、全ラットには代謝試験の開始時に同様の栄養状態にあることを保証するために５５ｋｃａｌを摂取させた。全試験は、覚醒していて負荷のかけられていない、長期カテーテルが挿入されたラットにおいて実施した。ｔ＝−１２０では（図７ａ）、ＩＣＶ  ＯＡ（総用量、３０もしくは３００ｎｍｏｌ）またはビークル（ａＣＳＦ中でＨＢＰ  １０％）の初回負荷−持続注入を開始し、全試験期間を通して維持した。血漿中グルコース値はＩＣＶ注入の開始時（ｔ＝−１２０）から始めて全試験期間を通して定期的に測定した。インスリン、レプチン、および非エスエル化脂肪酸濃度を測定するための血漿サンプルは試験開始時（ｔ＝−１２０）および試験中に３０分間隔で入手した。ｔ＝０に、ＨＰＬＣ精製［３−3Ｈ］−グルコース（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州ボストン；４０μＣｉボーラス、試験期間を通して０．４μＣｉ／ｍｉｎ）の初回負荷−持続注入を開始し、試験の最終４時間にわたって維持した。3Ｈ−グルコース比活性を測定するためのサンプルは、注入期間を通して１０分間隔で入手した。最後に、ｔ＝１２０に膵−インスリンクランプ試験を開始し、２時間にわたって維持した。この試験方法中、レギュラーインスリンの初回負荷−持続注入（１ｍＵ／ｋｇ／ｍｉｎ）を実施し、ｔ＝１２０に２５％グルコース溶液の可変性注入を開始し、〜７ｍＭで血漿中グルコース濃度をクランプするために定期的に調整した。インスリン注入速度は、後吸収性ラットにおける〜平均基底レベルでの血漿中インスリン濃度に置換するように設計した。ＩＣＶ注射が膵内分泌機能に及ぼす可能性がある作用を制御するために、内因性インスリン分泌を阻害する目的でソマトスタチン（３μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）をインスリンと共注入した。インビボ試験の終了時に、ラットに麻酔をかけ（ペントバルビタール５５ｍｇ／ｋｇ（体重）、静脈内）、液体窒素中で事前に冷却したアルミニウム製トングを用いて組織サンプルをインサイチューで凍結クランプした。全組織サンプルは、その後の分析のために−８０℃で保存した。
【００９１】
分析方法および計算。血漿中グルコース値は、グルコースオキシダーゼ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州フラートン）によって測定した。血漿中インスリンおよびレプチンレベルはＲＩＡ（ｒａｔ  Ｌｅｐｔｉｎ  ＲＩＡ  ｋｉｔ，Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントチャールズ）によって決定した。血清アジポネクチンはＲＩＡ（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントチャールズ）によって測定した。血漿中非エステル化脂肪酸濃度は自動キット（Ｗａｃｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．、日本国大阪府）を使用する酵素法によって製造業者の取扱説明書にしたがって決定した。血漿中の［３−3Ｈ］グルコースの放射性は、トリチウム水を除去するために乾燥するまで蒸発させた後にＢａ（ＯＨ）2およびＺｎＳＯ4沈殿（Ｓｏｍｏｇｙｉ法）の上清から測定した。肝ウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）濃度および比活性は、以前に記載されたように２回の連続的クロマトグラフィー分離によって入手した（Ｇｉａｃｃａｒｉ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，１９８９；１９９２；Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；１９９６）。計算は以前に記載されたとおりに（Ｂａｒｚｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）実施した。
【００９２】
ノーザンブロット分析。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、米国カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを視床下部および肝臓から単離した。ＮＰＹ、Ｇｌｃ−６−ＰａｓｅまたはＰＥＰＣＫ発現はノーザンブロット分析によって測定した。視床下部内ＲＮＡはプレプロ−ＮＰＹおよびβ−アクチンのためのプローブを用いて分析した。ＩＣＶ  ＯＡが肝酵素の発現に及ぼす作用を評価するために、インスリンクランプ試験を受けたラット由来の凍結クランプ肝組織から全ＲＮＡを単離した。Ｇｌｃ−６−ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫ  ｃＤＮＡは以前に記載されたとおりに（Ｃｏｍｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａｓｓｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；１９９８）実施した。プローブは、ランダムプライマーキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して［α−32Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識した。定量は、負荷変動性について補正するためにβ−アクチンシグナルおよび１８ＳリボソームＲＮＡについて正規化するスキャニング・デンシトメトリーによって実施した。
【００９３】
群間の比較は変動分析によって実施し、全数値は平均値±ＳＥ（標準偏差）として表示した。詳細には、図５に提示した摂食データについてビークルおよびオレイン酸についての２本の曲線を最初に反復測定についての変動分析を用いて相互に比較した。統計上の有意差（曲線間）が明らかになった場合は、各時点間の差はスチューデントのｔ検定を用いて推定した。
【００９４】
本試験のプロトコールは、アルバート・アインシュタイン医科大学の施設内動物実験委員会によって精査かつ承認された。
【００９５】
結果
任意過食症を誘導するために、雄性Ｓ−Ｄ系ラットに３日間にわたり高美味食を任意に摂食させた（表２）。それらの摂食量および食餌中のカロリー含量上昇への適応を１日１回監視した。高レプチン血症および高インスリン血症にもかかわらず、この群の動物は食餌中のカロリー含量増加に適応することができず、１日エネルギー摂取量を〜７０％から〜１４０ｋｃａｌ／日へ増加させた。同一実験方法を受けた同腹子は標準食を与えられたときに〜８０ｋｃａｌ／日を消費したので、我々はさらに任意に摂食させたラットを１群の同一量の８０ｋｃａｌ／日を摂取したラット群および同一の高美味食を５５ｋｃａｌ／日摂取したカロリー制限ラット群と比較した。このアプローチによって、中等度のカロリー制限、同一量の摂食、および過剰摂食を反映している３つのレベルの１日カロリー摂取量でのＯＡの中枢性作用を調査することができた。同一量の摂食群について下記に報告したデータは標準食を摂食したラットにおいて入手されたデータと極めて類似することに留意されたい（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。そこで、この実験アプローチによって我々は、摂食量およびインスリン作用にオレイン酸（ＯＡ）が及ぼす中枢性作用がカロリー摂取量における短期的変化によって変調されるかどうかを試験することができた。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
任意過剰摂食は、中枢性ＯＡが摂食挙動および視床下部内ＮＰＹ発現に及ぼす作用を急速に抑える。我々は、ＩＣＶ  ＯＡが３日間の任意過剰摂取後の動物における摂食挙動を変調するかどうかを試験した。ＩＣＶ注射前３日間にわたり過食症を誘導するための高美味食（ＨＦ１４０）または標準食（ＳＣ群；カロリー摂取量７８±３ｋｃａｌ／日）のどちらかを任意に摂取した動物において摂食量を１日１回監視した。飼料中の多量要素組成（すなわち、高脂肪対高炭水化物）がＯＡ感受性に及ぼす作用を試験するために、我々は標準食に加えて２０％スクロース溶液を任意に摂取させた追加の動物群（ＨＳ群；カロリー摂取量：９３±４ｋｃａｌ／日、ＳＣ動物群に比較して〜２０％の総カロリー摂取量の増加を反映する）についても試験した。指定されたレジメンの実施３日後に、全動物には暗周期開始１時間前に留置ＩＣＶカテーテルを介してＯＡ（３０ｎｍｏｌ）またはビークル（ＨＰＢ）のどちらかのボーラスを投与した。摂食量をＩＣＶ注射後の計３日間にわたり測定し（図５ａ）、ＯＡに及ぼす作用を各実験群間でビークル単独によって引き出された作用と比較した。ＩＣＶ  ＯＡは、ＩＣＶ注射後第１日および第２日にＳＣ群動物へ投与したときに注射前基底レベルと比較して摂食量における各々４８％および５２％の減少を生じさせた（図５ｂ、ｅ）。しかし、３日間にわたる中等度の過剰摂食（ＨＳ９５）後には、ＩＣＶ  ＯＡは１日摂食量を第１日には２１％および第２日には１７％減少させた（図５ｄ、ｅ）。最後に、３日間にわたる顕著な任意の過剰摂食（ＨＦ１４０）後には、ＩＣＶ  ＯＡは１日摂食量を第１日には１１％しか減少させず、第２日には２％増加させた（図５ｃ、ｅ）。ＨＳ９５群およびＨＦ１４０群において観察された控えめな減少はビークル単独のＩＣＶ注射後に観察された減少と統計的有意に相違していなかった（図５ｃ、ｄ）。全群は、ＯＡ注射の３日後にベースライン時摂食量に回復した（図５ｂ〜ｅ）。
【００９８】
我々は次に、それによって視床下部内ＯＡに対する耐性が発生する潜在的メカニズムについて試験した。我々は以前に、長時間（１６時間）絶食後に標準食を摂食させたラットにおけるＩＣＶビークルと比較してＩＣＶ  ＯＡ後に視床下部内ＮＰＹ  ｍＲＮＡが減少する（〜５０％）ことを報告した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。ここで我々は、栄養状態の変化が、ＩＣＶ  ＯＡがＮＰＹの視床下部内発現を抑制する能力を変調させるかどうかを調べた。このために、我々は３日間にわたる高美味食の任意の摂食（〜１４０ｋｃａｌ／日）または５５ｋｃａｌ／日での同一飼料の摂食後に、ノーザンブロット分析によって視床下部内のＮＰＹ  ｍＲＮＡの存在度を評価した。どちらの実験群にも３０ｎｍｏｌ  ＯＡまたはビークル（ＨＰＢ）の単回ボーラス注射を実施し、その後に一晩絶食させた。視床下部組織を翌朝採取し、ノーザンブロット分析を実施した（図６ａ）。参照転写体としてβ−アクチンを利用するデンシトメトリーによる定量は、平均ＮＰＹ  ｍＲＮＡレベルがＨＦ５５群およびＨＦ１４０群において類似であることを証明した（図６ｃ）。ＩＣＶ  ＯＡは５５ｋｃａｌ／日群におけるＮＰＹ  ｍＲＮＡ発現を〜６０％抑制した（図６ｄ）。この減少は、長時間絶食後に〜７０ｋｃａｌ／日の標準食を摂食したラットにおいて以前に報告された減少（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）と類似である。しかし、ＩＣＶ  ＯＡは３日間にわたる任意過剰摂食後に絶食させた動物では視床下部内ＮＰＹ  ｍＲＮＡを２８％しか減少させなかった（図６ｃ、ｄ）。これらのデータは、高美味食を任意に摂食させた動物で示された過食症が一部には視床下部内でのＮＰＹ発現の欠陥のある調節に起因するという証拠を提供する。
【００９９】
任意過剰摂食は中枢性ＯＡがインスリン作用および肝グルコース産生量に及ぼす作用を急速に鈍化させる。我々は次に、栄養状態における短期的変化がインビボインスリン作用にＯＡが及ぼす作用を変化させるに十分であるかどうかを試験した（図７ａ）。ＩＣＶ  ＯＡがインスリン作用に及ぼす作用は、ＩＣＶ注入および膵−インスリンクランプ試験を併用して意識のあるラットにおいて評価した（図７ｂ）。３つの実験群（ＨＦ５５、ＨＦ８０、およびＨＦ１４０）はＩＣＶ  ＯＡまたはビークル（ＨＰＢ）処置のどちらかを受けるように無作為割り付けした（表２および図７ｂ）。基底血漿中ＦＦＡおよびグルコース濃度は全群において類似であった（表２）。膵−正常血糖試験の前日に、代謝測定前に類似の後吸収性状態を保証するために、全ラットに同一量のカロリー（５５ｋｃａｌ）を摂取させた（図７ａ）。ＩＣＶビークルおよびほぼ基底レベルの循環中インスリンの存在下で、３実験群において正常血糖を維持するためには限界速度のグルコース注入（ＧＩＲ）が必要とされた（ＨＦ５５群−２．４、ＨＦ８０群−１．２、およびＨＦ１４０群−１．４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）（図３ｃ）。これとは対照的に、ＨＦ５５群およびＨＦ８０群のどちらにおいても、ＯＡ（３０ｎｍｏｌ）のＩＣＶ注入後に、正常血糖を維持するために必要とされたＧＩＲは顕著に増加した（各々、９．５５および４．６４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）。しかし、同一用量のＯＡのＩＣＶ注入は、任意摂食群においてＧＩＲを増加させることができなかった。実際に、１０倍以上の高用量のＯＡ（３００ｎｍｏｌ）の注入さえこの群におけるＧＩＲを有意に増加させることはできなかった（図７ｃ）。ＩＣＶ  ＯＡがＧＩＲに及ぼす刺激作用はＨＦ８０群におけるよりＨＦ５５群における方が有意に（〜２倍）高かったので、この増加は正常から低いカロリー摂取量範囲内でさえ動物の先行栄養状態に高度に依存すると思われる。血漿中ＦＦＡ濃度はクランプ試験期間中には変化せず（表２）、これはＩＣＶ  ＯＡによって誘導された代謝作用が中枢神経系（ＣＮＳ）内でのその作用によって開始されることを示していた。
【０１００】
基底インスリンレベルの存在下でのＯＡのＩＣＶ投与によって誘導される外因性グルコースに対する要求の増加は、グルコース取り込みの刺激および／または外因性グルコース産生（ＧＰ）の抑制に起因するであろう。しかし、グルコース消失速度（図７ｄにおけるＲｄ）は３つの実験群において類似であり、最も重要なことにＩＣＶ  ＯＡはそれらを有意に修飾しなかった。そこで、ＨＦ５５群およびＨＦ８０群においてＩＣＶ  ＯＡによって誘導された全身性インスリン作用の上昇は末梢性グルコース取り込みの増加を反映していなかった（図７ｄ）。他方、ＩＣＶ  ＯＡ（３０ｎｍｏｌで）はＨＦ５５群およびＨＦ８０群においてＧＰを顕著に阻害したが、任意摂食ラット群（ＨＦ１４０）では阻害しなかった。実際に、ＯＡの１０倍以上の中枢性注入もまた任意摂食群におけるＧＰを有意に減少させることはできなかった（図８ａ）。ＧＩＲに関して観察された作用と一致して、ＩＣＶ  ＯＡによるＧＰの阻害は、ＨＦ８０群（ベースライン値から〜４５％の減少）におけるよりＨＦ５５群（ベースライン値から７１％の減少）における方が顕著であった（図８ｂ）。最後に、ＩＣＶ  ＯＡによって誘導されたＧＰの阻害は完全にＧＩＲの刺激の原因であった。さらにＩＣＶ  ＯＡの作用を変調させる際に栄養状態が代謝流量に及ぼす影響を試験するために、我々は体重（図８ｃ）および１日摂食量（図８ｄ）における減少率の関数としてＩＣＶ  ＯＡまたはビークルによって誘導されたＧＰの変化をプロットした。ＩＣＶ  ＯＡの阻害作用は、１日摂食量および体重増加における減少と正比例していた。重要なことに、ＩＣＶビークル摂取群においてＧＰおよびＧＩＲにおける変化と摂食量／体重における変化との間で有意な相関は見られなかった（データは示していない）。ＧＰのＯＡ誘導性阻害との類似の相関は、さらにまた様々なレベルのカロリー摂取量で標準食を任意に摂食したラットだけをプロットすることによって見いだされた（データは示していない）。そこで、ＯＡの中枢投与に反応したＧＰの阻害度は、カロリー摂取量および／または体重における短期的変化に高度に依存すると思われる。
【０１０１】
ＩＣＶ  ＯＡはＧｌｃ−６−Ｐａｓｅを介するインビボ流量を顕著に減少させる。ＧＰは、糖新生およびグリコーゲン分解に由来するグリコシルユニットの正味寄与を表している。しかし、グルコキナーゼによるリン酸化を介して肝臓に進入するグルコースの一部分はＧｌｃ−６−Ｐａｓｅを介する脱リン酸化のための基質でもある。グルコキナーゼとＧｌｃ−６−Ｐａｓｅとの間のこの無益なサイクルは、一般にはグルコースサイクリングと呼ばれており、総グルコース分泌量（Ｇｌｃ−６−Ｐａｓｅを介する流量）とＧＰとの間の差の原因となる（図９ａ）。
【０１０２】
ＩＣＶ  ＯＡ注入が肝グルコース産生に及ぼす作用の原因となるメカニズムをさらに描写するために、我々はＧｌｃ−６−Ｐａｓｅを介するインビボ流量およびグルコースサイクリングのグルコース分泌量への相対寄与を推定した（表３；図９ｂ、ｃ）。図９ｂ、ｃは、膵−インスリンクランプ試験法中にＩＣＶ  ＯＡおよびＩＣＶビークルが肝内のグルコースの流動速度に及ぼす作用を描出している。類似の血漿中インスリン濃度の存在下では、グルコース産生速度（図８ａに示した）はＩＣＶ  ＯＡによってＨＦ５５群およびＨＦ８０群では減少したが、任意摂食ラット群（ＨＦ１４０）では減少しなかった。表３は、［3Ｈ］−ＵＤＰ−グルコース、および血漿中グルコース（表３中の直接的経路率（％））の肝グルコース−６−リン酸塩プールへの寄与率を計算するために使用された［3Ｈ］−グルコース比活性を示している。これらのデータによって、我々は全群におけるＧｌｃ−６−Ｐａｓｅを介するインビボ流量（図９ｂにおける総グルコース分泌量）およびグルコースサイクリング速度（図９ｃ）を推定することができた。図９ｂに示したように、ＩＣＶ  ＯＡはＨＦ５５群動物におけるＧＰへの作用と並行してＧｌｃ−６−Ｐａｓｅを通る流量を顕著に減少させた。総グルコース分泌量における顕著な減少と一致して、グルコースサイクリング速度もまたＩＣＶビークル群と比較してＩＣＶ  ＯＡを摂取したラット群においても減少した（図９ｃ）。しかしグルコースサイクリング速度の低下はＧｌｃ−６−Ｐａｓｅ流量の低下よりはるかに顕著ではなく、実際に統計的有意差には達しなかった。直接的経路率（％）の中等度の増加と結び付けた後者の所見（表３）は中枢性ＯＡが肝グルコースリン酸化に及ぼす刺激作用と一致している。そこで、ＯＡの短期的中枢性注入はグルコース−６−ホスファターゼからグルコースへの正味脱リン酸化における顕著な減少を引き起こすが、その大部分はグルコキナーゼを介するインビボ流量の中等度の刺激と結合したＧｌｃ−６−Ｐａｓｅを介するインビボ流量の低下に起因する。これらのＩＣＶ  ＯＡの作用は、３日間にわたる任意過剰摂食後には鈍化する。
【０１０３】
【表３】
2006519229.tif 000004
【０１０４】
ＩＣＶ  ＯＡがＧｌｃ−６−ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫの肝発現に及ぼす作用。ＯＡの中枢投与が肝内グルコース流量に及ぼす強力な作用に鼓舞されて、我々は重要な代謝酵素の肝内ｍＲＮＡレベルにおける変化が一部にはこれらの作用の原因であるかどうかを試験した。そこで我々は次に、カロリー制限ラット群および過剰摂食ラット群においてＯＡまたはビークルいずれかのＩＣＶ注入後に得た組織サンプル中の１８ＳリボソームＲＮＡ（図９ｄ）またはβ−アクチンｍＲＮＡ（図示していない）の関数としてＧｌｃ−６−ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫのｍＲＮＡの肝内存在度を測定した。ＩＣＶ  ＯＡは、カロリー制限ラット群におけるグルコース−６−ホスファターゼ遺伝子発現を顕著に減少させた。対照転写物としてβ−アクチンを利用するデンシトメトリー（図９ｅ、ｆ）による多重プロットの定量は、ＩＣＶ  ＯＡがＨＦ５５群においてはＧｌｃ−６−Ｐａｓｅ  ｍＲＮＡ発現を〜７３％抑制したが、ＨＦ１４０群では変化が検出されないことを証明した。これとは逆に、ＩＣＶ  ＯＡはいずれの群においてもＰＥＰＣＫの肝発現を有意に変化させることができなかった。ＩＣＶ  ＯＡが肝Ｇｌｃ−６−ｐａｓｅ発現に及ぼす顕著な阻害作用は、カロリー制限ラット群においてグルコース−６−ホスファターゼを介するインビボ流量の強力な阻害に寄与すると思われる。
【０１０５】
考察
肥満症およびＤＭ２の発生は、環境的および遺伝的要素の複雑な相互作用によって影響を受ける（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２００３；Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓ，１９９８；Ｒａｖｕｓｓｉｎ  ａｎｄ  Ｇａｕｔｉｅｒ，１９９９）。他の研究者や我々は、一般中枢性経路が摂食挙動および代謝プロセスの両方における変化を含む栄養素の利用率に対する反応を引き出せるという見解を前進させてきた（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｅ；２００２ｆ；Ｂａｒｚｉｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，２００１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これに関連して、栄養素依存性シグナル（例、レプチンおよびインスリン）は生物の栄養状態を視床下部へ伝え、視床下部ではメッセージが統合されて、循環中への外因性および内因性栄養素の流入を制限することを目的とする遠心性シグナルに変換される。さらに近年、選択的視床下部ニューロン内の脂質代謝は、栄養素の利用率にとっての主要な生化学的センサーであり、これは順に摂食量（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；２００３）および内因性グルコース産生（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；２００３）（ＧＰ）への負のフィードバック発揮すると仮定されてきた。実際に、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）阻害剤（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ−１）アンタゴニスト（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、またはＬＣＦＡオレイン酸（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）の中枢投与は、摂食量の減少（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｄ；２００２ｅ；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）および内因性グルコース産生の阻害（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｅ；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）をもたらす。これらの所見に基づいて、我々はこれらの中枢性食欲抑制作用薬の一般的作用は、視床下部の弓状核内でのＬＣＦＡ−ＣｏＡの細胞内濃度を増加させることであると仮定した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。後者の増加は順に、それらの利用率における変化に反応して循環中の栄養素の量を調節することを目的とする負のフィードバックシステムに寄与することができる（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１０６】
ここで我々は、長鎖脂肪酸であるオレイン酸の中枢投与が摂食量および視床下部内ＮＰＹ発現を阻害する能力はラットにおける３日間にわたる任意の過剰摂食後には鈍化すると報告する。同様に、過食症を引き起こす高美味食への暴露は、高感受性動物モデルにおける視床下部内のレプチンおよびインスリンの食欲抑制性および代謝性作用に対する耐性を誘導する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２０００；Ｃｏｌｅｍａｎ，１９７９；Ｎｅｅｌ，１９９９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。強力な外因性神経ペプチドである神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）は、視床下部内のレプチンおよびインスリン両方の下流標的であり、それらがＮＰＹを抑制する失敗は、一般的形態の肥満症が血漿中レプチンおよびインスリンレベルが上昇しているにもかかわらず正常もしくは上昇した摂食量を示すことを特徴とする理由を一部は説明できる。重要なことに、ＮＰＹはさらにまたオレイン酸、ＦＡＳもしくはＣＰＴ１阻害剤いずれかの中枢投与が絶食によって誘導された視床下部内ＮＰＹ  ｍＲＮＡの上昇を防止するのでＬＣＦＡ−ＣｏＡの下流標的でもある（Ｌｏｆｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；２００３）。過剰摂食ラット群において観察された脂肪酸による視床下部内ＮＰＹ発現の抑制損傷は、循環中脂肪酸が上昇して血漿レプチンおよびインスリンレベルが低い絶食期間後の過食症の程度を決定することに特に重要な役割を果たすことができる。しかし、視床下部内の脂肪酸の細胞内代謝はさらにまたこの栄養素シグナルを変調させることに重要な役割を果たすと思われることもまた留意されたい（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。これに関連して、細胞内炭水化物および脂質代謝間の安定した生化学的結合は特に重要な役割を果たす可能性がある。実際に、我々は、ＬＣＦＡ−ＣｏＡの細胞内レベルが脂肪酸の利用率上昇に反応して生成された重要なシグナルを表す可能性があるという仮説を立てた。同様に、単純な炭水化物（ショ糖など）の利用率における増加は、脂肪酸酸化の阻害をもたらす（解糖によって引き出される）マロニルＣｏＡのレベル上昇を介してＬＣＦＡ−ＣｏＡの細胞内レベルを顕著に増加させることができる。そこで、この中枢性栄養素検知メカニズムは脂質または炭水化物の利用率上昇に反応できると思われる。これは順に、細胞内ＬＣＦＡ−ＣｏＡにおける持続性増加は細胞内脂質代謝における適合性変化をもたらすと考えられる（例、マロニルＣｏＡの生成減少を引き起こすＡＣＣの阻害）。この仮定に沿って、我々は高脂肪食または高ショ糖食のいずれかを介する１日カロリー摂取量の増加が摂食量にＩＣＶ  ＯＡが及ぼす作用を同様に鈍化させることを見いだしたが、これは食餌の主要栄養組成におけるよりむしろ１日カロリー摂取量における変化がこの作用の原因であると思われることを示唆している。これに関連して、ＦＡＳ阻害剤Ｃ７５の食欲抑制作用がマウスにおける食餌誘導性および遺伝性肥満症において維持されることは興味深い（Ｔｈｕｐａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これとは対照的に、過剰摂食ラット群におけるＩＣＶ  ＯＡに対する不良な反応はアシルＣｏＡシンターゼの活性減少またはアシル−チオエステラーゼの活性上昇に起���するＬＣＦＡのエステル化減少および／またはＣＰＴ１の活性上昇またはマロニルＣｏＡの枯渇に起因するＬＣＦＡ−ＣｏＡの代謝促進に続発性である可能性がある。食餌誘導性肥満症の他のモデルと同様に（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，２０００；Ｃｏｌｅｍａｎ，１９７９；Ｎｅｅｌ，１９９９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、食欲抑制薬に対する反応の欠如は、摂食挙動の作用損傷および／または高脂肪食および高ショ糖食の高度の美味に対する能力の低下、（オレイン酸の）を示す可能性がある。
【０１０７】
摂食量における短期的増加はなぜ視床下部反応の損傷を引き起こすのであろうか？おそらく、これは食物の利用率上昇に対する「適合性」反応として効率的エネルギー貯蔵を促進する試みである。このメカニズムは、Ｎｅｅｌの節約型の遺伝子型仮説（Ｎｅｅｌ’ｓ  ｔｈｒｉｆｔｙ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ）と一致して進化的圧力の結果として発達してきたと思われる（Ｎｅｅｌ，１９９９）。過剰摂食への類似の逆説的適合がさらにまた、その刺激が栄養素の利用率上昇に反応してミトコンドリア機能およびエネルギー消費量を減少させると思われる末梢性栄養検知経路について証明されてきたことは興味深い（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｄ）。
【０１０８】
インスリン（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｅ）、レプチン（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、メラノコルチン（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、および遊離脂肪酸の中枢投与の代謝作用に関する近年の試験は、これらの中枢性視床下部経路がさらに肝グルコース分泌量およびインスリン作用の調節にも関係しているという見解を支持している。肝臓によるグルコース産生は内因性燃料の主要起源であるので、我々は中枢性神経回路が循環中の栄養素の流入を監視および調節するために設計された負のフィードバックシステムと一致してエネルギーの外因性および内因性起源を付随して変調すると仮定した（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。循環中脂肪酸は、その大部分がアルブミンに結合しており、主として未結合形での単純な拡散によって血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。未結合脂肪酸は、さらにまた血液内または脳毛細管床でリポタンパク質リパーゼによるリポタンパク質の加水分解を介して誘導され得る。そこで、キロミクロンは食後状態における脳中脂肪酸の主要な循環起源であると思われるが、他方未結合脂肪酸および局所的に加水分解されたリポタンパク質の組み合わせは絶食状態における脳中脂肪酸プールに寄与する。脳内への脂肪酸の少ない部分の進入は、さらにまた脳血管内皮の内腔面におけるリポタンパク質受容体によって媒介されるリポタンパク質粒子の直接的取り込みを介しても発生することがある（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，２００１；Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これらをまとめると、循環内遊離脂肪酸の中枢神経系へのアクセスは一般にそれらの血漿濃度に比例しており（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｒａｐｏｐｏｒｔ，１９９６）、絶食させて麻酔をかけたイヌにおけるそれらの脳脊髄液中濃度は血漿中濃度の〜６％である（Ｇｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｐｉｔｚｅｒ，１９７１）。そこで、ＩＣＶオレイン酸が生理的状態に及ぼす作用を単純に外挿することはできないが、我々の所見は栄養によって誘導された強力な挙動変化および視床下部内の脂肪酸の代謝作用がエネルギーバランスおよびインスリン作用の両方の調節に寄与できる可能性を提起している。他方、カロリー摂取量における変化はインスリンがグルコース代謝に及ぼす作用に劇的な影響も及ぼすことは長年にわたり認識されてきた（Ｐａｇｌｉａｓｓｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。これに関連して、肝インスリン耐性は動物およびヒトにおいて過剰摂食後に数日間および／または数週間に発生する（Ｃｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１０９】
ここで我々は、ＩＣＶ  ＯＡによって誘導されたＧＰの阻害と動物の栄養状態（すなわち、体重／カロリー摂取量）との間の強力な相関について報告する。基底インスリンレベルの存在下で、視床下部インスリンシグナリング（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｅ）またはＯＡの中枢投与（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）の刺激は内因性グルコース産生の阻害をもたらす。このＬＣＦＡの「インスリン様」中枢性作用は末梢組織内で明確に確立されたそれらの作用とは反対であるように思われる（Ｂｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｅｂｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。例えば、循環中および肝内ＦＦＡレベルの上昇は内因性グルコース産生のインスリン抑制を減少させる（すなわち、肝インスリン耐性を誘導する）が、他方中枢性脂肪酸のレベル上昇は基底インスリンの存在下でさえ、内因性グルコース産生の抑制を増強する。同様に、脂肪酸の利用率上昇は肝臓内でのＧｌｃ−６−Ｐａｓｅの発現を誘導するが（Ｍａｓｓｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、他方ＯＡの中枢投与は同一酵素の肝発現を減少させる。脂肪酸の中枢性作用は肝グルコース流量に及ぼすそれらの末梢作用に対する重要な制限を提供することは考えられる。ＯＡの中枢投与は過剰摂食ラット群におけるＧＰを阻害できなかったので、我々は、ＯＡに肝グルコース産生およびＧｌｃ−６−Ｐａｓｅ発現を阻害する能力がないことがそれらの中枢性作用によって対抗されない脂肪酸の末梢性作用を残していると仮定している。このため、視床下部内のＬＣＦＡに対する反応の欠如がグルコース分泌の速度上昇をもたらし、このモデルにおいて観察される肝インスリン耐性に寄与できると考えられる。
【０１１０】
この視床下部内栄養素検知は、さらにまた燃料分配においても重要な役割を果たすことができる。正常条件下では、視床下部内の脂肪酸の利用率上昇は、筋肉およびその他の末梢性組織内での脂質の優先的利用を促進するために肝臓からのグルコースの分泌量減少を生じさせる（Ｏｂｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；２００３）。しかし、脂肪酸の利用率上昇が維持された場合、それはエネルギー貯蔵（トリグリセリド）部位内への効率的な流入を促進するために設計された「節約型」代謝メカニズムの活性化を引き起こす。過剰摂食ラット群における肝臓からのグルコース産生量の上昇は酸化のための代替燃料を提供することによってこの目的に機能できる。
【０１１１】
ＯＡが肝グルコース流量を変調する１つ以上の下流メカニズムは未だ説明されていない。しかし、ＩＣＶ  ＯＡによって誘導されたグルコース−６−ホスファターゼを介するインビボ流量およびグルコース−６−ホスファターゼ触媒単位の肝発現両方における顕著な減少はおそらく重要な役割を果たすと思われる。視床下部内の脂質検知は肝グルコース流量および遺伝子発現をどのように変調させるのであろうか？自律神経系産生における急速な変化が主導的役割を果たすと思われる。ＩＣＶレプチン投与は様々な局所部位における自立産生を増加させる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。交感神経系および副交感神経系の両方が肝臓、膵臓、および脂肪組織の直接神経支配（各々、内臓神経および迷走神経を介して）を提供することは周知である。実際に、視床下部腹内側部病変は急性および慢性高インスリン血症を引き起こすが、これは横隔膜下迷走神経切断術によって逆転させることができる（Ｂｅｒｔｈｏｕｄ  ａｎｄ  Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ，１９７９；Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｙ，１９７７）。他方、外側視床下部の電気刺激はインスリン分泌を増加させることができない、または血漿中グルカゴン濃度を変化させることができない（Ｂｅｒｔｈｏｕｄ  ａｎｄ  Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ，１９７９；Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｙ，１９７７；Ｓｈｉｍａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）。しかし、ここに示した全ての試験は膵クランプ状態の存在下で実施されたことを指摘しておきたい。そこで、これらの膵ホルモンのレベルにおける変化はＩＣＶ  ＯＡが肝グルコース流量に及ぼす作用の原因となることはありそうもない。注目すべきことに、視床下部腹内側部の電気刺激は、重要な糖新生酵素であるＰＥＰＣＫおよびＧｌｃ−６−Ｐａｓｅの活性の増加、そしてラット肝における重要な解糖酵素であるピルビン酸キナーゼの顕著な抑制を引き起こす（Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｙ，１９７７；Ｓｈｉｍａｚｕ，１９９６）。他方、外側視床下部の刺激はＰＥＰＣＫ活性における減少をもたらす。最後に、様々な脂肪貯蔵所は自律神経系からの流入を受入れる。後者は脂肪由来ホルモンおよびサイトカインの遺伝子発現および分泌を順に調節することが証明されており（Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，２０００において精査された）、インスリン作用に強力な作用を有する（Ｃｏｍｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｒａｊａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。このために、ＩＣＶ  ＯＡが肝グルコース−６−ホスファターゼ発現および肝グルコース流量に及ぼす作用は、マウスにおける組み換えアジポネクチンの注入によって誘導される作用を暗示している（Ｃｏｍｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかし、我々は実験群のいずれにおいてもＩＣＶ注射中に血漿中レプチンおよび血漿中アジポネクチン（表２）レベルにおける変化を検出しなかった。
【０１１２】
結論として、我々は摂食量およびＧＰに長鎖脂肪酸が及ぼす中枢性作用が栄養素によって調節されることを証明してきた。正常な状況下では、生物学的反応（すなわち、摂食量およびグルコース分泌量における変化）は密な範囲内で体脂肪およびグルコースホメオスタシスを維持する。しかし、栄養素の利用率における持続性増加は（短期的カロリー制限が増強される間に）この視床下部性栄養素検知システムの急速な麻痺を誘導した。我々は、レプチン、インスリン、およびおそらく脂肪酸などの複数の栄養シグナルへの視床下部耐性の急速な開始が素因のある個人および動物における肥満症およびインスリン耐性に対する感受性に寄与すると見なしている。
【実施例４】
【０１１３】
グルコース産生量の視床下部性調節におけるＡＴＰ依存性カリウムチャンネルおよび迷走神経の役割
視床下部内脂質酸化の減少は、Ｋ−チャンネル（ＫATP）および迷走神経の刺激を介して内因性グルコース産生（ＧＰ）を阻害する。第３脳室内（ＩＣＶ）への長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）であるオレイン酸（ＯＡ）またはＣＰＴ−１活性の阻害剤（ＣＰＴｉ）のいずれかの投与はＧＰを阻害する。ここで、我々はＣＰＴｉを用いた視床下部内脂質酸化の阻害はＡＴＰ依存性カリウムチャンネル（ＫATP）の中枢性活性化を介してＧＰを減少させ、肝臓への迷走神経流入の増加を引き起こすという仮説を立てる。ミトコンドリア内へのＬＣＦＡの進入を阻害するために、我々は長期カテーテルを挿入したＳ−Ｄ系ラットにおいてＣＰＴｉまたはその不活性立体異性体（ＣＯＮ）を、ＩＣＶグリベンクラミド（ＧＬＹ、ＫATP「ブロッカー」）を含めて（ＣＰＴｉ−ＧＬＹおよびＣＯＮ−ＧＬＹ）、または含まずに（ＣＰＴｉおよびＣＯＮ）短時間で（６時間）ＩＣＶ注入した。全ラットには、さらにまたＩＣＶ注入の最終４時間にわたり［３−3Ｈ］−グルコースの動脈内注入を実施し、各試験の最終２時間中には膵／インスリンクランプ（インスリン１ｍＵ／ｋｇ．ｍｉｎ；ソマトスタチン３μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）を実施した。基底インスリンレベルの存在下では、低血糖症を防止するためにＣＰＴｉ（４．９±０．４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）群ではグルコース注入（ＧＩＲ）を必要としたが、ＣＯＮ（２．１±０．４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）群およびＣＰＴｉ−ＧＬＹ（１．４±０．５ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）群では必要としなかった。ＧＰは、ＣＰＴｉ群（基底値に対対して−４７±５％；ｐ＜０．０１；ｎ＝７）では顕著かつ有意に減少したが、ＣＯＮ群（−１５±６％；ｎ＝６）またはＣＰＴｉ−ＧＬＹ群（−１１±８％；ｎ＝６）では減少しなかった。ＩＣＶ  ＧＬＹは、ＣＯＮ注入ラット群においてＧＩＲおよびＧＰを変化させなかった（図示していない）。この神経経路が迷走神経の肝分枝を介して作用するかどうかを調査するために、肝選択的迷走神経切断術（ＬＶ）または疑似手術（ＳＨ）を受けたラットにおいてもＩＣＶ  ＣＰＴｉまたはＣＯＮ注入を実施した。ＧＩＲは、ＣＯＮ−ＳＨ群（１．３±０．４ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）およびＣＰＴｉ−ＬＶ群（０．８±０．５ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の両方と比較してＣＰＴｉ−ＳＨ群（４．７±１．３ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）において顕著に高かった。ＧＩＲにおけるこれらの差はＣＰＴｉ−ＳＨ群においてはＧＰにおける顕著な減少（−４８±２％；Ｐ＜０．０１；ｎ＝５）が完全に原因であったが、ＣＯＮ−ＳＨ群（−５±３％；ｎ＝６）またはＣＰＴｉ−ＬＶ（−１１±４％；ｎ＝７）群においては原因ではなかった。ＬＶ自体（ＣＯＮ−ＬＶ）はＧＩＲおよびＧＰに影響を及ぼさなかった。そこで、視床下部内脂質検知は、肝臓へのＫATPおよび迷走神経流入の活性化を必要とする神経回路を介してＧＰを強力に変調する。
【０１１４】
脂質注入に反応した肝「自己調節」はＫ−チャンネル（ＫATP）および肝迷走神経インターベンションの中枢性刺激を必要とする。基底インスリンレベルの存在下で、脂質注入を介しての血漿中遊離脂肪酸のレベル（ＬＣＦＡ）の上昇は糖新生（ＧＮＧ）を刺激するが、肝グリコーゲン分解（ＧＬＧ）（肝「自己調節」）における代償性減少のために内因性糖産生量（ＧＰ）を変化させない。第３脳室内（ＩＣＶ）へのＬＣＦＡオレイン酸の投与はＫATPの刺激を介してＧＰを阻害するので、我々は、１）ＬＣＦＡによるＫATPの中枢性活性化が脂質注入中のＧＰを抑制する、および２）この作用は肝迷走神経流入を必要とする、という仮説を試験した。このために、５時間絶食させたＳ−Ｄ系ラットを６時間にわたるＩＣＶグリベンクラミド（Ｇ）［ＫATPの阻害剤］またはビークル（Ｃ）の投与と組み合わせて：ＩＶイントラリピッド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）＋ヘパリン（ＩＬ）（ＬＣＦＡレベルを〜３倍に増加させた）または食塩液（Ｓ）を摂取する群に無作為割り付けした。全ラットには最終４時間にわたり［３−3Ｈ］−グルコースのＩＶ注入およびＩＣＶ注入の最終１０分間にわたる［Ｕ−14Ｃ］−乳酸塩の投与を実施し、そして各試験の最終２時間中には膵クランプを実施した。クランプ期間中には、ほぼ基底インスリンレベル（〜２７μＵ／ｍｌ）の存在下で、ＧＰ（〜６ｍｇ／ｋｇ．ｍｉｎ）はＳ＋ＩＣＶＣ群、Ｓ＋ＩＣＶＧ群またはＩＬ＋ＩＣＶＣ群において変化しなかった。ＩＣＶＣまたはＩＣＶＧのどちらかと併用する脂質注入はＧＮＧを増加させたが、ＩＬ＋ＩＣＶＧ群はＧＬＧを阻害することができず、ＧＰの上昇をもたらした（９．８±０．３へ；Ｐ＜０．００１）。ＬＣＦＡがＧＰに及ぼす中枢性作用が迷走神経刺激によって媒介されるかどうかを試験するために、我々は次に選択的肝迷走神経切断術を実施した（ＨＶ）ラットにおいて脂質注入試験を繰り返した。膵クランプ試験中に、ＧＰ（〜６ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）はＳ処置ＨＶ群およびＳもしくはＩＬ処置疑似手術ラット群において類似であった。重要なことに、ＩＬはＨＶ群においてＧＰを９．７±０．５へ増加させ（Ｐ＜０．００１）、ＩＣＶＧの作用を再現している。グルコース利用は全群において類似であった。
【０１１５】
これらを要約すると、末梢性ＬＣＦＡ誘導性肝グルコースの「自己調節」のために視床下部内ＫATPおよび肝迷走神経が必要とされる。そこで我々は、全身性高脂質血症は中枢性脂質検知経路を活性化し、この経路は神経回路を介してＧＰを強力に変調するが、このためには中枢性ＫATPの活性化および肝臓への下行性迷走神経遠心性流入を必要とすると仮定している。
【０１１６】
上記を考慮すると、本発明の一部の長所が達成され、そして他の長所が実現されることは明らかであろう。
【０１１７】
上記の方法および組成物は本発明の範囲から逸脱することなく様々な変化を加えることができるので、上記の説明に含まれ、添付の図面に示した全ての問題は例示であって限定的意味を有していないと解釈すべきであると意図されている。
【０１１８】
本明細書で言及した全ての参考文献は、これにより全体として参照して組み込まれる。本明細書での参考文献の考察は、著者らが行った主張を単に要約することを意図しており、参考文献が先行技術をなすと認められているものではない。本出願人らは、言及した参考文献の正確度および適切さを批判する権利を保持している。
【０１１９】
別紙−配列番号
配列番号１−リボザイム
ＡＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＣＡＣＧＵＵＣＵＵＣＧＵＣ
配列番号２−リボザイム
ＣＴＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡ
配列番号３−リボザイム
ＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡ
配列番号４−Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＧＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＧＧ
配列番号５−ＣＰＴ１Ｌ  フォワードプライマー
ＣＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧ−３’
配列番号６−ＣＰＴ１Ｌ  リバースプライマー
ＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧ
配列番号７−ＣＰＴ１Ｍ  フォワードプライマー
ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣ
配列番号８−ＣＰＴ１Ｍ  リバースプライマー
ＧＴＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＴＡＣ
配列番号９−ＮＰＹ  フォワードプライマー
ＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＣＧ
配列番号１０−ＮＰＹ  リバースプライマー
ＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧ
配列番号１１−ＰＯＭＣ  フォワードプライマー
ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣ
配列番号１２−ＰＯＭＣ  リバースプライマー
ＴＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＴＧＣ
配列番号１３−ＡｇＲＰ  フォワードプライマー
ＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴ
配列番号１４−ＡｇＲＰ  リバースプライマー
ＴＧＧＣＴＡＧＧＴＧＣＧＡＣＴＡＣＡＧＡ
配列番号１５−β−アクチン  フォワードプライマー
ＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣ
配列番号１６−β−アクチン  リバースプライマー
ＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧ
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】視床下部内カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）の阻害に関連する脂質代謝および実験の特徴を説明している図式、ノーザンブロット法およびグラフを示している。パネルＡは、視床下部による摂食量調節においてＣＰＴ１が果たす役割について提案されたモデルを示している。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）阻害剤などの強力な食欲抑制薬は、酵素アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）によるアセチルＣｏＡのカルボキシル化から引き出されるマロニルＣｏＡのレベルを上昇させる。高レベルのマロニルＣｏＡは順に、長鎖脂肪アシルＣｏＡ（ＬＣ−ＣｏＡ）のＣＰＴ１依存性酸化を阻害する。同様に、外因性脂肪酸（ＬＣＦＡ）のＩＣＶ投与は、ＬＣ−ＣｏＡの細胞内レベルを直接的に増加させる。どちらの場合でも、結果として生じる細胞内ＬＣ−ＣｏＡ濃度の上昇は接触挙動の阻害をもたらす。パネルＢは、ラット視床下部全体におけるＣＰＴ１発現のノーザンブロット分析を示している。左：ＣＰＴ１の肝アイソフォーム（ＣＰＴ１Ｌ）に対して特異的なプローブは、肝臓（Ｌ）および視床下部（Ｈ）中で〜４．３Ｋｂのバンドを検出したが、後肢筋（Ｍ）中では検出しなかった。右：筋特異的ＣＰＴ１プローブ（ＣＰＴ１Ｍ）を用いたハイブリダイゼーションは、肝臓（Ｌ）および筋（Ｍ）中で〜３Ｋｂのバンドを検出したが、視床下部中では検出しなかった。各レーンは１．５μｇのｍＲＮＡを含有していた。パネルＣはＣＰＴ１Ｌ  ｍＲＮＡに対して選択的なリボザイムのデザインを示している。ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏ転写体（下方の配列）は、標的ＣＰＴ１Ｌ  ｍＲＮＡ（上方の配列）へハイブリダイズする配列によって挟まれた、ハンマーヘッドリボザイムに典型的なステムループ構造を備える中心配列を含有する。矢印は、予想開裂部位を印している。パネルＤは、ＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏプラスミドの構造を示している。ＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏフラグメントはＣＭＶプロモーターの制御下のイントロンカセットのすぐ下流およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ａn）の上流で哺乳動物発現ベクター（ｐＴａｒｇｅｔ）内へクローン化された。パネルＥは、ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏを発現するＡｔＴ２０細胞がＣＰＴ１Ｌ  ｍＲＮＡのレベルを低下させたことを示している。ネオマイシン耐性のために約２００個の安定性クローンを選択し、ノーザンブロットによって解析した。各レーンは、ベクター単独（レーンＡ）、ＣＰＴ１Ｌ−Ｒｉｂｏプラスミドを用いてトランスフェクトされた（レーンＢ）、またはトランスフェクトされていない（レーンＣ）ＡｔＴ２０由来の１．０μｇのポリアデニル化ＲＮＡを含有していた。ブロットは、ＣＰＴ１Ｌプローブ（上方のパネル）またはβ−アクチン（下方のパネル）を用いてハイブリダイズさせた。パネルＦは、ＡｔＴ２０ノーザンブロットの定量を示している。ＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏを発現する細胞（黒四角）は、ベクター単独（□）でトランスフェクトしたコントロール細胞より〜５０％少ないＣＰＴ１Ｌ  ｍＲＮＡを含有する。データは、β−アクチン発現を用いた正規化後のコントロールの％として表示した。パネルＧは、ＣＰＴ１阻害剤の全身性投与がＬＣ−ＣｏＡの細胞内レベルを上昇させることを示している。ＬＣ−���ｏＡのレベルは、ビークル（黒四角）またはＣＰＴ１阻害剤（□）がＩＶ注入されたラットの肝臓および骨格筋組織内でＨＰＬＣによって測定した。
【図２】弓状核内のＣＰＴ１の遺伝的もしくは薬理学的阻害がＣＰＴ１活性を減少させ、ＬＣ−ＣｏＡのレベルを上昇させることを確定した実験結果をまとめたグラフを示している。パネルＡは、実験方法を略図で示している。ＩＣＶカニューレの外科的植え込みは第１日（インビボ試験の〜３週間前）に実施した。体重および摂食量の完全回復は第７日に達成された。第１７日には、リボザイム処置について無作為割り付けしたラットにＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏ、ＣＰＴ阻害剤またはコントロールのＩＣＶ注射を実施した。ＴＤＧＡを用いて処置した実験群には、第２１日に阻害剤のＩＣＶ注射を実施し、その６時間後に脳を採取した。パネルＢおよびＣは、リアルタイムＰＣＲによるＣＰＴ１Ｌ（Ｂ）およびＣＰＴ１Ｍ（Ｃ）ｍＲＮＡの定量を示している。ＲＮＡは、ｐＴａｒｇｅｔコントロール（黒四角；Ｎ＝４）またはＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏ（□；Ｎ＝５）のＩＣＶ注射３日後にマイクロパンチ法によって入手した個々の視床下核（ＰＶＮ、ＬＨＡ、および弓状核）から精製した。ＣＰＴ１  ｍＲＮＡのコピー数はβ−アクチンコピー数×１０6で正規化されている。パネルＤおよびＥは、個々の弓状核（Ｄ）または視床下部全体（Ｅ）中のＣＰＴ１活性を示している。脳はＴＤＧＡもしくはＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏ各々のＩＣＶ注射の６時間もしくは３日前に採取し、そして弓状核を打ち抜いた。ＣＰＴ１活性は、ＩＣＶコントロール注射（黒四角；Ｎ＝６、ａＣＳＦ＋２％  ＤＭＳＯもしくはコントロールＲｉｂｏ）、ＴＤＧＡ（□；Ｎ＝６）、またはＣＰＴＬ−Ｒｉｂｏ（□；Ｎ＝５）を用いて処置した動物からのタンパク質抽出液の特定分画中で測定した。パネルＦおよびＥは、ＣＰＴ１阻害剤のＩＣＶ投与が弓状核内のＬＣ−ＣｏＡのレベルを上昇させることを確証している。ステアロイルＣｏＡ（Ｆ）およびオレイルＣｏＡ（Ｅ）のレベルは各々、コントロール化合物（黒四角；ＳＴ１３４０）またはＳＴ１３２６（□）をＩＣＶ注射したラットの弓状核中でＨＰＬＣによって測定した。
【図３】遺伝的もしくは薬理学的手段による視床下部内ＣＰＴ１Ｌの阻害が摂食量を減少させることを確証した実験データをまとめたグラフである。パネルＡ。第０日に、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットにＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏプラスミド（□）もしくはコントロールベクター（黒四角）のどちらかの単回ＩＣＶ注射を実施した。１日摂食量は、ＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏのＩＣＶ注射後の第１日から第３日にかけて有意に抑制された。パネルＢは、ＩＣＶ  ＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏ（□）対ベクター（黒四角）のＩＣＶ注射によって誘導された摂食量における変化を示している。ベースライン時およびベクターのどちらに比較しても有意な変化が検出された。パネルＣは、ベクターコントロール（黒四角）もしくはリボザイムコントロール（□）のＩＣＶ注射に比較してＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏ（□）のＩＣＶ注射が２４時間摂食量に及ぼす作用を示している。パネルＤは、ＳＴ１３２６（各々、５ｐｍｏｌ（−○−）および２５ｐｍｏｌ（−●−））、または不活性立体異性体ＳＴ１３４０（２５ｐｍｏｌ（−○−））いずれかの第０日における単回ＩＣＶ注射後の１日摂食量を示している。ＳＴ１３２６は、どちらの用量でも第１および２日に統計的有意な摂食量の阻害を誘導した。第３日には、高用量のＳＴ１３２６だけがコントロール群に比較して摂食量を有意に低下させた。パネルＥは、ＳＴ１３２６（各々、５ｐｍｏｌ（黒四角）および２５ｐｍｏｌ（□））、またはコントロールＳＴ１３４０（黒四角）のＩＣＶ注射によって誘導された摂食量における変化を示している。ＳＴ１３２６のＩＣＶ注射を用いると、ベースライン時およびＳＴ１３４０のどちらに比較しても有意な変化が検出された。*コントロール群およびベースライン時に対してＰ＜０．００１。＃コントロール群に対して高用量ＳＴ１３２６群についてのみＰ＜０．０１。パネルＦは、ＩＣＶ  ＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏによるＣＰＴ１ＬのダウンレギュレーションがＡＲＣ内のＮＰＹおよびＡｇＲＰ発現を増加させることを示している。ベクターコントロール（黒四角）もしくはＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏ（□）で処置されたラットのＡＲＣ内のＮＰＹおよびＡｇＲＰ（上方のパネル）ならびにＰＯＭＣ（下方のパネル）のリアルタイムＰＣＲによる定量解析。神経ペプチドｍＲＮＡレベルはβ−アクチンのコピー数当たりのコピー数×１０3として表示した。
【図４】視床下部内ＣＰＴ１の阻害が肝インスリン作用を改善するが末梢性インスリン作用を改善しないことを確証した実験結果をまとめたグラフである。パネルＡは、実験方法を略図で示している。ＩＣＶカニューレの外科的植え込みは第１日（インビボ試験の〜３週間前）に実施した。完全に回復した後、第１４日にＩＶカテーテルを留置し、第１７日にＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏまたはコントロールベクターのＩＣＶ注射を実施した。最後に、第２１日にクランプ試験を実施した。パネルＢは、膵インスリンのクランプ法を略図で示している。注入試験は、計３６０分間継続した。クランプ試験前３日間にわたり、ラットにＣＰＴｌＬ−Ｒｉｂｏまたはベクターコントロールをボーラス注射した（図１１に示したとおり）。その他の全群にはｔ＝０にビークルまたはＣＰＴ１阻害剤のどちらかの初回負荷−持続ＩＣＶ注射を実施し、これを試験の残り期間にわたって維持した。ｔ＝１２０で標識グルコース（ＨＰＬＣ精製［3Ｈ−３］−グルコース；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州ボストン）の注射を開始し、これを本試験の最後の４時間にわたって維持した。最後に、膵インスリンのクランプ試験をｔ＝１２０ｍｉｎで開始し、２時間持続した。この方法は、ソマトスタチン（３μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）、インスリン（１ｍＵ／ｋｇ／ｍｉｎ）、および低血糖症を防止するための必要に応じてグルコースの注入を含んでいた。インスリン注入速度は、後吸収性ラットにおける正常基底レベルに置換するように設計した。パネルＢ、Ｄ、およびＦは、それらの適切なコントロールに比較してＴＤＧＡ、ＳＴ１３２６およびＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏのＩＣＶ注射で処置されたラットにおける膵インスリンのクランプ試験の前（黒四角）および中（□）のグルコース消失速度（Ｒｄ）を示している。Ｒｄは、ＩＣＶ処理による有意な影響を受けなかった。パネルＣ、Ｅ、およびＧは、それらの適切なコントロールに比較してＴＤＧＡ、ＳＴ１３２６およびＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏのＩＣＶ注射で処置されたラットにおける膵インスリンのクランプ試験の前（黒四角）および中（□）のグルコース産生速度（ＧＰ）を示している。ＧＰは、膵インスリンのクランプ試験の開始時前（黒四角）は全処理群において類似であった。膵クランプ試験中、〜基底インスリン濃度の存在下（□）では、ＴＤＧＡ、ＳＴ１３２６およびＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏのＩＣＶ投与は、各ＩＣＶビークルコントロールと比較してＧＰを顕著に阻害した（ｐ＜０．０１）。パネルＨは、〜基底インスリン濃度に反応したＧＰの阻害（後吸収性レベルからの減少率（％））がそれらの各ビークルコントロール（ａＣＳＦ＋２％  ＤＭＳＯ、ＳＴ１３４０、コントロールベクター）に比較してＴＤＧＡ、ＳＴ１３２６およびＣＰＴｌＬ−ＲｉｂｏのＩＣＶ注射によって顕著に増強されることを示している。
【図５】標準食、高脂肪食、または高ショ糖食を摂取させた動物における１日摂食量にＩＣＶオレイン酸（ＯＡ）が及ぼす作用を示している実験プロトコールの略図および実験結果のグラフである。パネルａは、食餌実験のための実験デザインを略図で示している。ＩＣＶ植え込み手術からの回復後、全ラットに標準食を任意に摂食させた。ＩＣＶ注射前の３日間（第〜３日）、１群の動物は高美味食（高脂肪食または高ショ糖食）に切り替えたが、もう１つの群は標準食で維持した。全群のラットに任意に摂食させ、１日摂食量を記録してベースライン値を入手した。第０日に、ＯＡ（３０ｎｍｏｌ）またはビークル（ＨＰＢ）をＩＣＶボーラスとして注射した。全群において注射後３日間にわたり１日摂食量を監視した。パネルｂは、標準食を摂食した動物ではＩＣＶ  ＯＡ（●）が迅速な食欲抑制の開始を生じさせ、これが４８時間持続することを示している。ＩＣＶビークル（黒三角）は、摂食挙動を有意に修飾しなかった。パネルｃは、高脂肪食を摂食した動物では、ＩＣＶ  ＯＡ（●）もＩＣＶビークル（黒三角）も１日摂食量に有意な影響を及ぼさなかったことを示している。パネルｄは、高ショ糖食を摂食した動物では、ＩＣＶ  ＯＡ（●）がＩＣＶビークル（黒三角）に比較して食物摂取を有意に変化させさなかったことを示している。パネルｅは、ベースライン時（第−２日、第−１日および第０日の平均値）、標準食（黒四角）、高ショ糖食（□）、または高脂肪食（□）を摂食した動物におけるＩＣＶ  ＯＡの注射後１日間、２日間、および３日間からの減少率として表示した、１日摂食量における変化を示している。ＩＣＶ  ＯＡは標準食を摂食していたラットでは２日間にわたり摂食量を顕著に減少させたが（〜５０％まで）、しかしＩＣＶ  ＯＡは高ショ糖食または高脂肪食を摂取していたラットでは摂食挙動を有意に変化させることができなかった。数値は平均値±ＳＥＭである。*ビークル群に対してＰ＜０．００１。**ビークル群に対してＰ＜０．０００１。＃標準食群に対してＰ≦＜０．０５。
【図６】ＩＣＶ  ＯＡが視床下部内ＮＰＹ発現に及ぼす作用が栄養によって変調させられることを示している実験プロトコールの略図、ならびに実験結果の写真およびグラフである。パネルａは、視床下部内ＮＰＹ発現を決定するための実験デザインを略図で示している。全実験動物のＩＣＶカテーテルの外科的植え込みおよび完全回復１０日後に、ラットに５５ｋｃａｌ／日（５５）または任意（１４０）のいずれかで３日間にわたり高脂肪食を摂食させた。次に第１３日に、ＯＡ（パネルｂにおいて＋；ｎ＝６／群）またはビークル（−；ｎ＝６／群）を暗周期の開始１時間前にＩＣＶボーラスとして注射した。ＩＣＶ注射後、飼料を取り除き、注射１６時間後に視床下部を採取した。パネルｂは、視床下部内ＮＰＹ  ｍＲＮＡのノーザン解析からの代表的ブロットの写真を示している。この解析は、ＩＣＶビークルに比較して５５ｋｃａｌ／日で摂食したラットにおけるＩＣＶ  ＯＡ後の視床下部内ＮＰＹ  ｍＲＮＡの減少を証明した。しかし、ＩＣＶ  ＯＡは任意に摂食したラットにおけるＮＰＹ  ｍＲＮＡを有意に変化させなかった。パネルｃは、ＩＣＶオレイン酸（□）が５５ｋｃａｌ／日を摂食した動物においてＩＣＶビークル（黒四角）と比較して視床下部内ＮＰＹ発現を有意に減少させることを証明した、デンシトメトリーによるノーザンブロット解析の定量を示している。ＩＣＶ  ＯＡは、任意に摂食させた動物における視床下部内ＮＰＹ発現を有意に修飾することはできなかった。パネルｄは、５５ｋｃａｌ／日（左のバー）または任意（右のバー）に摂食した動物においてＩＣＶビークルと比較したＩＣＶ  ＯＡによって誘導された視床下部内ＮＰＹ  ｍＲＮＡにおける減少率として表示したデータを示している。全データはβ−アクチンに対して正規化されている。＃５５ｋｃａｌ／日群に対してＰ＜０．０５。
【図７】ＩＣＶ  ＯＡが全身インスリン作用に及ぼす作用が１日カロリー摂取量によって変調されることを示している、実験プロトコールの略図ならびに実験結果のグラフである。パネルａは、膵インスリンのクランプ試験の実験デザインを略図で示している。ＩＣＶカテーテルの外科的植え込みは、適正な回復期間を許容するために規定食インターベンションの少なくとも２週間前に実施した。同様に、静脈内カテーテルの植え込みは、食餌介入法の４日前に完了した。第０日までは、ラットには３日間にわたり５５ｋｃａｌ／日、８０ｋｃａｌ／日、または任意（〜１４０ｋｃａｌ／日）に高脂肪食を摂取させた。クランプ試験法の前夜には、全ラットが代謝実験の開始時に匹敵する後吸収性状態にあることを保証するために、一定部分の飼料（５５ｋｃａｌ）を摂取させた。パネルｂは、膵インスリンのクランプ方法を略図で示している。ＩＣＶ  ＯＡまたはビークル注入は試験開始時（ｔ＝−１２０）に開始し、全クランプ試験方法の全期間を通して継続した。標識グルコースの注入はｔ＝０に開始し、本試験の最後４時間まで継続した。最後に、ソマトスタチンおよびインスリンの注入はｔ＝１２０で開始し、残り２時間にわたって持続した。血漿中グルコース濃度における低下を防止するために、必要に応じて２５％グルコース溶液を注入した。パネルｃは、膵インスリンのクランプ試験中のグルコース注入速度（ＧＩＲ）を示している。ＨＰＢ（黒四角）および〜ベースラインインスリン濃度のＩＣＶ注射の存在下では、ＧＩＲは全群においてごくわずかであった。しかし、各々５５および８０ｋｃａｌ／日を摂食していた群における低血糖症を防止するためには、ＯＡ（□）のＩＣＶ注射中に〜４．５および９ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎの速度での外因性グルコースを必要とした。任意に摂食した群（１４０）では、ＧＩＲはＩＣＶビークル、低用量（３０ｎｍｏｌ、□）および高用量（３００ｎｍｏｌ、□）のＯＡ注入の存在下では２ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ未満であった。パネルｄは、膵インスリンのクランプ試験中のグルコース消失速度（Ｒｄ）を示している。Ｒｄは、いずれの実験群においてもＩＣＶ  ＯＡによる誘導によって有意な影響を受けなかった。**ビークル注入群に対してＰ＝０．０００１。*ビークル注入群に対してＰ＜０．０３。
【図８】ＩＣＶ  ＯＡが肝インスリン作用に及ぼす作用が１日カロリー摂取量によって変調されること、そして体重増加および１日カロリー摂取量の関数であることを示している実験結果のグラフである。パネルａは、グルコース産生（ＧＰ）速度を示している。〜ベースラインインスリン濃度の存在下で、ＯＡのＩＣＶ投与（□）は、対応するビークル（黒四角）と比較して５５および８０ｋｃａｌ／日群においてＧＰの速度を顕著に阻害した。これとは対照的に、低用量（３０ｎｍｏｌ、□）および高用量（３００ｎｍｏｌ、□）でのＩＣＶ  ＯＡは、ビークル群および高ＯＡ群と比較して過剰摂食ラット群（１４０）におけるＧＰを有意に変化させることができなかった。パネルｂは、ＩＣＶ  ＯＡおよびビークル処置中のＧＰにおける変化を示している。ＧＰにおける変化は、ベースライン時からの阻害率（％）として表示されている。５５もしくは８０ｋｃａｌ／日のどちらかを摂取したラットは、対応するビークル（黒四角）と比較して膵クランプ試験中のＩＣＶ  ＯＡ（□）注入後に劇的な減少を示した。しかし、任意摂食群（１４０）では、３０ｎｍｏｌ（□）もしくは３００ｎｍｏｌ（□）でのＩＣＶ  ＯＡによって誘導されたＧＰにおける変化はビークルによって誘導された変化に類似していた。**ビークル注入群に対してＰ＜０．００１。*ビークル注入群に対してＰ＝０．０５。パネルｃおよびｄは、ＩＣＶビークルおよびＯＡによって誘導された内因性グルコース産生（ＧＰ）における変化率を、ＩＣＶ注射前の３日間中の体重および１日摂食量における減少率に対してプロットしたグラフを示している。パネルｃは、ＩＣＶ  ＯＡの存在下で、ＧＰにおける阻害率が体重の減少率と直接相関したことを証明している。パネルｄは、ＩＣＶ  ＯＡの存在下で、ＧＰにおける阻害率が１日カロリー摂取量における減少率と直接相関したことを証明している。
【図９】ＩＣＶ  ＯＡが肝グルコースの流れおよびグルコース−６−Ｐａｓｅ／ＰＥＰＣＫ遺伝子発現に及ぼす作用を示している略図、写真およびグラフである。パネルａは、肝グルコースの流れを略図で示している。ＧＰは、糖新生（大部分はホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）および肝グルコース−６−リン酸塩（グルコース−６−）プールへのグリコーゲンの分解から引き出されるグリコシル単位の正味寄与を表している。しかし、グルコキナーゼ（ＧＫ）によるリン酸化を介して肝臓に進入するグルコースの一部分はグルコース−６−Ｐａｓｅ（Ｇ６Ｐａｓｅ）を介する脱リン酸化のための基質でもある。グルコキナーゼとグルコース−６−Ｐａｓｅとの間のこの無益なサイクルは、一般にはグルコースサイクリングと呼ばれており、総グルコース分泌量（グルコース−６−Ｐａｓｅを通る流れ）とＧＰとの間の差の原因となる。パネルｂは、ビークル（黒四角）に比較してＩＣＶ  ＯＡ（□）が５５もしくは１４０ｋｃａｌ／日を摂食しているラット群における総グルコース分泌量（グルコース−６−ホスファターゼを通るインビボ流量）に及ぼす作用を示している。ＩＣＶ  ＯＡは、カロリー制限されたラット群では総グルコース分泌量を顕著に抑制したが、過剰摂食ラット群では抑制しなかった。パネルｃは、５５もしくは１４０ｋｃａｌ／日を摂食しているラット群における総グルコースサイクリングにＩＣＶ  ＯＡが及ぼす作用を示している。ＩＣＶ  ＯＡ（□）は、ビークル（黒四角）に比較してカロリー制限されたラット群および過剰摂食ラット群におけるグルコースサイクリングを控えめかつ同様に減少させた。パネルｄは、ＩＣＶ  ＯＡ（＋）またはビークル（−）注入前３日間にわたり５５もしくは１４０ｋｃａｌ／日を摂食した動物における糖新生酵素であるグルコース−６−ＰａｓｅおよびＰＥＰＣＫのノーザンブロット解析の写真を示している。パネルｅは、デンシトメトリーによるＧ６Ｐａｓｅに対するノーザンブロットの定量を示している。ＩＣＶ  ＯＡ（□）は、５５ｋｃａｌ／日摂食動物群ではＩＣＶビークル（黒四角）に比較して肝Ｇ６Ｐａｓｅ発現を有意に減少させたが（７３％）、１４０ｋｃａｌ／日摂食動物群では減少させなかった。パネルｆは、デンシトメトリーによるＰＥＰＣＫに対するノーザンブロットの定量を示している。ＩＣＶ  ＯＡ（□）は、ＩＣＶビークル（黒四角）に比較して５５もしくは１４０ｋｃａｌ／日群においてＰＥＰＣＫ発現を有意に減少させなかった。*ビークル群に対してＰ＜０．０５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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