(57)【要約】ＶＥＧＦ共調節ケモカイン−１（ＶＣＣ−１）の発現を変調させるためのアンチセンス化合物、組成物、及び方法を提供する。この組成物は、ＶＣＣ−１をコードする核酸へ標的指向するアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＶＣＣ−１発現の変調及びＶＣＣ−１の発現に関連した疾患の治療にこれらの化合物を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＣＣ−１をコードする核酸分子へ標的指向する８〜３０ヌクレオ塩基の長さのアンチセンス化合物であって、ＶＣＣ−１と特異的にハイブリダイズしてＶＣＣ−１の発現を阻害する、前記アンチセンス化合物。
【請求項２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１のアンチセンス化合物。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号１０９９の少なくとも８つのコンティグ塩基からなる群より選択される核酸配列を含んでなる、請求項２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号１０９９からなる群より選択される核酸配列を含んでなる、請求項２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、請求項２、３、又は４のアンチセンス化合物。
【請求項６】
修飾ヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結である、請求項５のアンチセンス化合物。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２、３、又は４のアンチセンス化合物。
【請求項８】
修飾糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項７のアンチセンス化合物。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオ塩基を含む、請求項２、３、又は４のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
修飾ヌクレオ塩基が５−メチルシトシンである、請求項９のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２、３、又は４のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
請求項１のアンチセンス化合物と製剤的に許容される担体又は希釈剤とを含んでなる組成物。
【請求項１３】
コロイド分散系をさらに含んでなる、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
ＶＣＣ−１の発現を細胞又は組織において阻害する方法であって、ＶＣＣ−１の発現が阻害されるように、請求項１のアンチセンス化合物と前記細胞又は組織を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
ＶＣＣ−１に関連した疾患又は状態を有するヒトを治療する方法であって、ＶＣＣ−１の発現が阻害されるように、請求項１のアンチセンス化合物の治療又は予防有効量を前記動物へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
疾患又は状態が糖尿病である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
疾患又は状態が免疫障害である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
疾患又は状態が心臓血管障害である、請求項１６の方法。
【請求項２０】
疾患又は状態が神経障害である、請求項１６の方法。
【請求項２１】
疾患又は状態が虚血／再灌流損傷である、請求項１６の方法。
【請求項２２】
疾患又は状態があらゆる形態の癌である、請求項１６の方法。
【請求項２３】
疾患又は状態が血管新生障害である、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法（Ｕ．Ｓ．Ｃ．）３５条１１９項の下で、本明細書における記載のように参照によりそのまま組み込まれる、２００２年８月１９日出願の米国仮特許出願第６０／４０４，４８４号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＶＥＧＦ共調節ケモカイン（Co-regulated chemokine）−１（ＶＣＣ−１）の発現を変調させるための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＶＥＧＦ共調節ケモカイン−１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。こうしたオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦ共調節ケモカイン−１の発現を変調させることが示された。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、既存の血管及び毛細血管からの新たな毛細血管の増殖であり、創傷治癒、胚発生、固形腫瘍の増殖といった多数のプロセスにきわめて重要である。新血管形成において、内皮細胞は、移動、伸張、増殖、及び方向定位を行って、内腔形成、基底膜の再確立、そして最終的には他の血管との融着をもたらす（Patan S. et al., (2000), J. Neurooncol. 50: 1-15）。
【０００４】
サイトカインは、細胞表面受容体へ結合して多様な細胞の活性を変調させる小さなタンパク質である。ＶＣＣ−１は、タンパク質のＮ末端付近の保存されたＣｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓ配列により命名された、サイトカインのサブファミリーであるＣＸＣケモカインであるらしい。ファミリーメンバーは、２つの追加の保存システイン残基も含有し、ほぼ７０〜１３０アミノ酸の大きさである。それらは、放出前に切断される２０〜２５アミノ酸のリーダー配列がある、分泌タンパク質である。ケモカインの特徴的な三次元折り畳みは、保存されたシステイン１及びシステイン２の間とシステイン３及びシステイン４の間に形成されるジスルフィド結合によって安定化する（Baggiolini, M., 2001 J. Int. Med. 250: 91-104 に概説される）。
【０００５】
既知のＣＸＣケモカインには、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、γ−インターフェロン誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、血小板因子４（ＰＦ４）、γ−インターフェロンにより誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）、上皮好中球活性化タンパク質（ＥＮＡ−７８）、増殖関連腫瘍遺伝子ペプチド（ＧＲＯ）ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β及びＧＲＯ−γ、等がある。これらのタンパク質は、好中球の活性化、化学走性の誘導、血管新生及び腫瘍形成の誘導、並びに血管新生及び腫瘍形成の阻害が含まれる、多種多様な活性に仲介する（Belperio, J. A., et al., 2000 J. Leuk. Bio. 68: 1-8）。
【０００６】
ケモカインの生物学的効果は、いずれも細胞表面受容体との相互作用を介して発揮される。これまでに６種のＣＸＣケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）が同定されている（Horuk et al., 2001 Cytokine Growth Factor Rev. 12: 313-335 に概説される）。ＣＸＣＲは、ヘテロ三量体のＧタンパク質を介してシグナル伝達するヘビ状（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）タンパク質のスーパーファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、多数のケモカインと高いアフィニティーで結合する能力を保有することが示された。
【０００７】
血管新生の調節は、少なくとも一部は血管抑制（angiostatic）ケモカインと血管新生ケモカインにより制御される。ＩＬ−８は、内皮細胞の化学走性及び増殖活性を in vitro で仲介することが示された（Strieter R. M., et al., 1992, Am. J. Pathol. 141: 1279-1284 及び Koch, A. E., et al., 1992 Science 258: 1798-1801）。対照的に、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、及びＰＦ４は、in vitro と in vivo の両方で血管抑制特性を有することが見出された（Maione, T. E., et al., 1990, Science 247: 77-79; Strieter R. M., et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 210(1): 51-57; 及び Arenberg, DA, et al., 1997 Methods Enzymol 283: 190-220）。
【０００８】
腫瘍増殖は血管新生に依存しているので、ＣＸＣケモカインは腫瘍の増殖及び転移にある役割を担うことになる。腫瘍形成及び増殖を変調させる血管新生ケモカインの最も明瞭な例は、in vitro における足場非依存性増殖の表現型及びヌードマウス中 in vivo で腫瘍を形成する能力をもたらす、ヒトメラニン細胞におけるＧＲＯ−α、β及びγの過剰発現により示された（Luan, J., et al., 1997, J. Leukoc. Bio. 62: 588-597 及び Owen, J. D., et al., 1997 Int. J. Cancer 73: 94-103）。さらに、ＩＬ−８とＥＮＡ−７８の両方の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における発現は、いずれも腫瘍血管新生に関連していた（Yatsunami, J., et al., 1997, Cancer Lett. 120: 101-108 及び Arenberg, DA, et al., 1998 J. Clin. Invest. 102: 465-472）。
【０００９】
他のＣＸＣケモカインは、腫瘍細胞増殖を阻害するか、又は腫瘍細胞の壊死を誘導するらしい。バーキット腫瘍を皮下に埋め込んだヌードマウスに組換えＭＩＧを毎日接種した。これにより、血管損傷を伴う腫瘍壊死が一貫して引き起こされた（Sgadari, C., et al., 1997 Blood 89(8): 2635-）。ＩＰ−１０で処置した、バーキット腫瘍を担うヌードマウスでも同じことが見られた（Sgadari, C., et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 13791-13796）。ＮＳＣＬＣ腫瘍を担い、ＭＩＧで処置されたＳＣＩＤマウスも、増殖阻害、転移数の減少、及び腫瘍由来の血管密度の減少を示す（Addison, C. L., et al., 2000 Hum. Gene Ther. 11: 247-261）。
【００１０】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を抑えるのに有効な手段として登場し、それ故に、ＶＣＣ−１発現の変調へのいくつかの治療、診断、及び研究上の応用に特に有用であることが判明するかもしれない。
【００１１】
発明の要約
本発明は、ＶＣＣ−１をコードする核酸へ標的指向して、ＶＣＣ−１の発現を変調させるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドへ向けられる。本発明のアンチセンス化合物を含んでなる医薬組成物や他の組成物も提供される。さらに提供されるのは、本発明の１以上のアンチセンス化合物又は組成物と細胞又は組織を接触させることを含んでなる、前記組織又は細胞におけるＶＣＣ−１の発現を変調させる方法である。さらに提供されるのは、本発明の１以上のアンチセンス化合物又は組成物の治療又は予防有効量を投与することによって、ＶＣＣ−１の発現に関連した疾患又は状態を有するか又はそれに罹りやすいことが疑われる動物、特にヒトを治療する方法である。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＶＣＣ−１をコードする核酸分子の機能を変調させること、最終的にはＶＣＣ−１の産生量を変調させることに使用のために、オリゴマーのアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを利用する。ＶＣＣ−１をコードする１以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって、このことを達成する。本明細書に使用する用語「標的核酸」及び「ＶＣＣ−１をコードする核酸」には、ＶＣＣ−１をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡより転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれる）、並びにそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも含まれる。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、その核酸の正常な機能に干渉する。標的核酸の機能をそれへ特異的にハイブリダイズする化合物によって変調させることは、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。干渉されるＤＮＡの機能には、複製と転写が含まれる。干渉されるＲＮＡの機能には、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからタンパク質の翻訳、１以上のｍＲＮＡ種を産生するＲＮＡのスプライシング、並びにＲＮＡが関与するか又はそれにより促進される可能性がある触媒活性といった、すべての生命機能が含まれる。標的核酸の機能へのこうした干渉の全体効果は、ＶＣＣ−１の発現の変調である。本発明の文脈において、「変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、遺伝子の発現における増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈では、阻害が遺伝子発現の変調の好ましい形態であり、ｍＲＮＡがその好ましい標的である。
【００１３】
特定の核酸をアンチセンスに標的指向させることが好ましい。アンチセンス化合物をある特定の核酸へ「標的指向する」ことは、本発明の文脈において、多工程の方法である。この方法は、通常、その機能を変調させるべき核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、その発現が特別な障害又は病態に関連づけられる細胞の遺伝子（又はその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であっても、感染病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明において、標的は、ＶＣＣ−１をコードする核酸分子である。標的指向の方法には、所望の効果、例えばこのタンパク質の発現の検出又は変調が生じるように、アンチセンス相互作用が起こるためのこの遺伝子内の単数若しくは複数の部位の決定をすることも含まれる。本発明の文脈では、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドンが含まれる領域である。当該技術分野で知られているように、翻訳開始コドンは、典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。少数の遺伝子は、５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧのＲＮＡ配列を有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧは in vivo で機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」には、それぞれの場合で開始のアミノ酸が通常メチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、多くのコドン配列が含まれる場合がある。当該技術分野では、真核生物と原核生物の遺伝子が２種以上の代替可能な開始コドンを有する場合があり、特定の細胞種又は組織において、又は特定の条件セットの下ではそのうちの１つが翻訳開始に選好的に利用され得ることも知られている。本発明の文脈において、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列に拘らず、ＶＣＣ−１をコードする遺伝子より転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始させるのに in vivo で使用される単数若しくは複数のコドンを意味する。
【００１４】
当該技術分野では、遺伝子の翻訳終止コドン（又は「停止コドン」）が、３種の配列、即ち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）の１つを有し得ることも知られている。用語「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンより両方向（即ち、５’又は３’）にある約２５〜約５０個のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ヌクレオチドが含まれるようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。同様に、用語「停止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンから両方向（即ち、５’又は３’）にある約２５〜約５０個のコンティグヌクレオチドが含まれるようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。
【００１５】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コード領域」は、当該技術分野では翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を意味することが知られているが、有効に標的指向され得る領域でもある。他の標的領域には、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）［当該技術分野では、翻訳開始コドンより５’方向にあるｍＲＮＡの部分であり、従って、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドが含まれる部分を意味する］、及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）［当該技術分野では、翻訳終止コドンより３’方向にあるｍＲＮＡの部分であり、従って、ｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’端との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドが含まれる部分を意味する］が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップは、ｍＲＮＡの５’末端残基に５’−５’三リン酸連結を介して結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域には、この５’キャップ構造そのものだけでなく、このキャップに隣接した最初の５０個のヌクレオチドも含まれると考えられる。５’キャップ領域も好ましい標的領域であってよい。
【００１６】
真核ｍＲＮＡ転写物のなかには直接翻訳されるものもあるが、多くは、翻訳される前に転写物より切除される、「イントロン」として知られる１以上の領域を含有する。残りの（従って、翻訳される）領域は「エクソン」として知られ、一緒にスプライスされて連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡのスプライス部位、即ちイントロン−エクソン連結部も好ましい標的領域であってよく、異常なスプライシングが疾患に関連している可能性があるか、又は特別なｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関連している可能性がある状況では、特に有用である。再配置や欠失による異常な融合連結部も好ましい標的である。イントロンもまた、有効であり得ることが見出され、故に、例えばＤＮＡ又はプレｍＲＮＡへの標的指向したアンチセンス化合物に好ましい標的領域である。
【００１７】
１以上の標的部位を同定したならば、この標的に対して十分相補的である、即ち十分強くて十分な特異性をもってハイブリダイズして所望の効果をもたらすオリゴヌクレオチドを選択する。
【００１８】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン型の水素結合であり得る、相補的なヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは相補的なヌクレオ塩基であり、水素結合の形成を介して対合する。本明細書に使用される「相補的」は、２つのヌクレオチド間の正確な対合の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置にあるヌクレオチドと水素結合することが可能であるならば、このオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡはその位置で互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡが互いに相補的であるのは、各分子中の十分な数の対応位置が互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められているときである。このように、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間に安定で特異的な結合が起こるほど十分な度合いの相補性又は正確な対合を示すために使用する用語である。当該技術分野では、アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないと理解されている。アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズ可能であるのは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対するこの化合物の結合が標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常機能に干渉して有用性の損失を引き起こすとき、そして特異的な結合が所望される条件、即ち in vivo アッセイ又は治療処置の場合や in vitro アッセイの場合の生理学的条件、つまりそのようなアッセイを実施する条件の下で、非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性があるときである。
【００１９】
アンチセンス化合物は、研究試薬及び診断薬として通常使用される。例えば、ごく強い特異性をもって遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特別な遺伝子の機能を解明するために、当業者によってしばしば使用される。アンチセンス化合物はまた、例えばある生物学的経路の様々なメンバーの諸機能を区別するためにも使用される。故に、アンチセンス変調は研究使用にも利用されている。
【００２０】
アンチセンスの特異性及び感度はまた、当業者によって治療上の使用にも利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物及びヒトの病態の治療において治療用成分として利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに対して安全かつ有効に投与され、数多くの臨床試験が現在進行している。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療の治療方式に有用であるように組立て得る有用な治療モダリティーであり得ることが確立されている。本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそれらの模倣体のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語には、天然に存在するヌクレオ塩基、糖及びヌクレオシド間（骨格）連結の共有結合からなるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドがネイティブな形態よりしばしば好ましいのは、例えば、強められた細胞取込み、核酸標的に対する強められたアフィニティー、及びヌクレアーゼ存在下での高められた安定性のような、望ましい特性のためである。
【００２１】
本明細書に記載の心臓血管系、血管新生、及び内皮のアッセイにおいて活性を有するような、及び／又はその遺伝子産物が心臓血管系へ局在化していることが見出されているような、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、真正糖尿病のような、血管に影響を及ぼす全身障害を含む多様な心臓血管系、内皮、及び血管新生の障害において治療的使用法を有する可能性がある。その治療有用性には、動脈、毛細血管、静脈、及び／又はリンパ管の疾患が含まれる可能性がある。ここでの治療の例には、筋肉消耗疾患を治療すること、骨粗鬆症を治療すること、インプラント固定を支援してインプラント周囲の細胞の増殖を刺激して、企図される部位へのその付着を促進すること、適用可能ならば、組織又は血清中のＩＧＦ安定性を高めること、並びにＩＧＦ受容体への結合を高めること（ＩＧＦは、ヒト骨髄赤血球系及び顆粒球前駆細胞の増殖を in vitro で高めることが示されているので）が含まれる。
【００２２】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、創傷治癒又は肺線維症の間の過剰な結合組織の産生を、ＶＣＣ−１がそのような産生を促進するならば、阻害するために使用することができる。これには、急性心筋梗塞及び心不全の治療が含まれる場合がある。
【００２３】
さらに、本発明は、根底にある原因に拘らず、治療有効量のＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによる心肥大の治療を提供する。
心肥大の治療は、心筋梗塞、高血圧、肥大性心筋症、及び弁膜性逆流が含まれる多種多様な病理学的状態より生じる可能性がある、その様々な段階のどこでも実施してよい。この治療は、その根底にある心臓障害に拘らず、心筋の構造的損傷を伴うか又は伴わない、心肥大の進行のすべての段階へ拡張される。
【００２４】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管新生を制限するか又は予防することが所望される障害の治療に有用であろう。そのような障害の例には、血管腫のような血管腫瘍、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症又は未熟幼児網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体症に関連した網膜、脈絡膜、又は角膜における新血管形成、慢性関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化症、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管形成に関連した子宮内膜症、バルーン血管形成術に後続する再狭窄、焼焦組織過剰産生（例えば、術後に生じるケロイドに見られるもの）、心筋梗塞後の線維症、又は肺線維症に関連した線維症病巣が含まれる。
【００２５】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが血管関連の薬物標的指向に有用なものとして、又は障害の治療又は予防の治療標的として役立つ可能性がある、特定の種類の疾患を以下に記載する。
【００２６】
アテローム性動脈硬化症は、脂質の蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内での線維組織の形成による、脈管内膜の肥厚化プラークの動脈中での蓄積を特徴とする疾患である。この疾患は、あらゆる臓器中の大、中、小動脈に影響を及ぼす可能性がある。内皮及び血管平滑筋細胞の機能の変化は、これらプラークの蓄積及び退縮を変調させるのに重要な役割を担うことが知られている。
【００２７】
高血圧は、全身動脈、肺動脈、又は門脈静脈の系における上昇血圧を特徴とする。上昇血圧は、損傷した内皮機能及び／又は血管新患より生じるか又はそれをもたらす可能性がある。
【００２８】
炎症性脈管炎には、巨細胞動脈炎、高安動脈炎、結節性多発動脈炎（微小血管障害型が含まれる）、川崎病、微視的多発動脈炎、ウェジナー肉芽腫症、及び、多様な１０１種の感染症に関連した血管障害（ヘノッホ−シェーンライン紫斑病が含まれる）が含まれる。これらの疾患では、改変した内皮細胞の機能が重要であることが示されている。レイノー疾患とレイノー現象は、寒気に曝された四肢を介した循環の異常な間欠性損傷を特徴とする。この疾患でも、改変した内皮細胞の機能が重要であることが示されている。
【００２９】
脈瘤は、改変した内皮細胞及び／又は血管平滑筋細胞に関連した、動脈又は静脈の樹状構造の小嚢状又は紡錘状の拡張症である。
動脈再狭窄（動脈壁の再狭窄）は、内皮及び血管平滑筋の細胞の機能改変及び増殖の結果として、血管形成術後に生じる場合がある。
【００３０】
血栓性静脈炎とリンパ管炎は、改変した内皮細胞機能より生じる、及び／又はそれをもたらす場合がある、静脈及びリンパ管それぞれの炎症性障害である。同様に、リンパ管浮腫は、内皮細胞機能より生じる損傷したリンパ管の関与する状態である。
【００３１】
良性及び悪性の血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞要素の異常な増殖及び成長を特徴とする。例えば、リンパ管腫はリンパ系の良性腫瘍であり、通常は新生児に起こる、リンパ管の先天性でしばしば嚢胞性の形成異常である。
【００３２】
嚢胞性腫瘍は、近隣の組織中へ増殖する傾向がある。嚢胞性腫瘍は、通常、頚部及び腋窩部において起こる。それらはまた、四肢の柔組織に起こる場合もある。その主症状は、結合組織に囲まれたリンパ管及びリンパ球が拡張して、時に矩形の構造となることである。
【００３３】
リンパ管腫は、不適切に結合した胚性リンパ管又はその不足により引き起こされると仮定されている。その結果は、損傷した局部リンパ漏洩である。
ＶＣＣ−１アンチセンスアンタゴニストの別の使用は、腫瘍の増殖及び／又は転移を可能にする腫瘍の血管形成が伴う、腫瘍血管新生の予防である。このプロセスは、新たな血管の成長に依存する。腫瘍血管新生を伴う新生物及び関連状態の例には、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、頚部癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頚部癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポシ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、膠芽腫、シュワン細胞腫、乏突起膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿道癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関連した異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連したもののような）、及びメイグス症候群が含まれる。
【００３４】
創傷治癒及び組織修復のような外傷の治癒もＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的指向される使用である。新血管の形成及び退縮は、組織の治癒及び修復に必須である。このカテゴリーには、骨、軟骨、腱、靭帯、及び／又は神経組織の増殖又は退縮、並びに熱傷、切開、及び潰瘍の処置における、創傷治癒と組織修復及び置換が含まれる。
【００３５】
骨が正常に形成されない環境において軟骨及び／又は骨の成長を引き起こすＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドには、ヒトや他の動物における骨折や軟骨の損傷若しくは欠損の治癒における応用がある。ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用するそのような調製物には、閉鎖並びに開放骨折の抑制と、人工関節の改善固定における予防的な使用があるかもしれない。骨形成剤により引き起こされる de novo 骨形成は、先天性、外傷誘発性、又は腫瘍切除誘発性の頭蓋と顔の欠損の修復へ貢献し、また美容整形術にも有用である。
【００３６】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、臓器（例えば、膵臓、肝臓、小腸、腎臓、皮膚、又は内皮が含まれる）、筋肉（平滑筋、骨格筋、又は心筋）、及び血管（血管内皮が含まれる）組織のような他の組織の産生又は再生の活性、又はそのような組織を含んでなる細胞の増殖を促進する活性を明示し得ることが期待される。所望される効果の一部は、正常組織が再生することを可能にする、線維性瘢痕形成の阻害又は変調による場合がある。
【００３７】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腸の保護又は再生と、肺又は肝臓の線維症、様々な組織における再灌流損傷、並びに全身性のサイトカイン損傷に由来する状態の治療にも有用であるかもしれない。また、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記に記載の組織の前駆体組織若しくは細胞からの分化を促進するか又は阻害すること、又は上記の組織の増殖を阻害することに有用であるかもしれない。
【００３８】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、歯周疾患の治療や他の歯修復法に使用してもよい。そのような薬剤は、骨形成細胞を誘引する、骨形成細胞の増殖を刺激する、又は骨形成細胞の前駆体の分化を誘導する環境をもたらす可能性がある。ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、骨及び／又は軟骨修復の刺激によるか、又は、炎症又は炎症プロセスにより仲介される組織破壊（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性、等）のプロセスを遮断することによるように、骨粗鬆症又は骨関節炎の治療に有用であるかもしれない。これは、骨の代謝及び成長の調節に血管が重要な役割を担うからである。
【００３９】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが貢献する可能性がある別の組織再生活性のカテゴリーは、腱／靭帯形成である。腱／靭帯様組織や他の組織の形成を、そのような組織が正常には形成されない環境において引き起こすタンパク質には、ヒトや他の動物における腱又は靭帯の裂傷、変形、及び他の腱又は靭帯欠損症を治癒することに適用がある。そのような調製物は、腱又は靭帯組織への損傷を予防することにおける予防的使用、並びに腱又は靭帯の骨や他の組織への固定改善と腱又は靭帯組織への欠損の修復における使用を有するかもしれない。ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの組成物により引き起こされる de novo 腱／靭帯様組織形成は、先天性、外傷誘発性、又は他の起源の他の腱又は靭帯欠損の修復に貢献し、腱又は靭帯の付着又は修復のための美容整形外科にも有用である。本明細書に記載の組成物は、腱又は靭帯形成細胞を誘引する、腱又は靭帯形成細胞の増殖を刺激する、腱又は靭帯形成細胞の前駆体の分化を誘導する、又は腱／靭帯細胞又は前駆体の増殖を誘導する環境を ex vivo で提供し、次いで in vivo で組織修復をもたらす可能性がある。本明細書の組成物は、腱炎、手根管症候群、及び他の腱又は靭帯欠損症の治療にも有用であるかもしれない。この組成物には、当該技術分野でよく知られているように、適切なマトリックス及び／又は封鎖剤を担体として含めてよい。
【００４０】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、心肥大の患者へ、この状態の進行を妨げ、突然死（無症候性患者の死が含まれる）を回避するために予防的に投与してもよい。このような予防療法は、塊状左心室心肥大（成人では３５ｍｍ以上の最大壁厚、又は小児ではそれに匹敵する値）と診断された患者の症例、又は心臓に対する血行力学的負荷が特に強い事例において特に保証される。
【００４１】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、肥大性心筋症と診断された患者の実質的な割合で発症する、心房細動の管理にも有用であるかもしれない。さらなる適応症には、狭心症、急性心筋梗塞のような心筋梗塞、並びに鬱血性心不全のような心不全が含まれる。追加の非新生物状態には、乾癬、糖尿病と他の増殖性網膜症（未熟児網膜症が含まれる）、水晶体後線維増殖症、血管新生性緑内障、甲状腺過形成（グレイヴス病が含まれる）、角膜や他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜滲出液（心膜炎に関連したもののような）、及び胸膜滲出液が含まれる。
【００４２】
上記に照らして、内皮細胞の機能、増殖、及び／又は形態を改変するか又はそれに影響を及ぼすことが示されている、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記に注目した障害の多く又はすべての病因及び病態形成において重要な役割を担う可能性があり、そのものとして、上記プロセスを亢進させるか又は阻害するための治療標的として、又はこれらの障害の血管に関連した薬物標的指向のために役立つ可能性がある。
【００４３】
組合せ療法
問題の障害を予防するか又は治療することにおけるＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、その目的に有効である別の薬剤と、同じ組成物においてか又は別々の組成物としてのいずれかで、連続してか又は組み合わせてこの有効成分を投与することによって改善される可能性がある。例えば、心肥大の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンス療法薬を、既知の心筋細胞肥大因子の阻害剤、例えば、フェニレフリンのような共アドレナリン作用アゴニストの阻害剤；ＢＯＳＥＮＴＡＮＴＭ及びＭＯＸＯＮＯＤＩＮＴＭのようなエンドセリン−１阻害剤；ＣＴ−１への阻害剤（米国特許第５，６７９，５４５号）；ＬＩＦへの阻害剤；ＡＣＥ阻害剤；ｄｅｓ−アスパラギン酸−アンジオテンシンＩ阻害剤（米国特許第５，７７３，４１５号）、及びアンジオテンシンＩＩ阻害剤の投与と組み合わせることができる。
【００４４】
高血圧に関連した心肥大の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｐ−アドレナリン作用性受容体遮断剤（例えば、プロプラノロール、チモロール、テルタロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカルベジロール）；ＡＣＥ阻害剤（例えば、キナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、ホシノプリル、又はリシノプリル）；利尿剤（例えば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロロチアジド、ベンズチアジド、ジクロルフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド）；及び／又はカルシウムチャネルブロッカー（例えば、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、又はニカルジピン）と組み合わせて投与してよい。本明細書においてその一般名により確認される治療薬剤を含んでなる医薬組成物は、市販されていて、投与量、投与法、副作用、禁忌、等についての製造業者の説明書に従って投与するべきである。例えば、「医師必携（Physician's Desk Reference）」（メディカル・エコノミクス・データ・プロダクション（Medical Economics Data Production）社、Montvale, N. J., 1997）第５１版、を参照のこと。肥大性心筋症の治療に好ましい組合せ療法の候補薬は、Ｐ−アドレナリン作用性遮断薬（例えば、プロプラノロール、チモロール、テルタロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカルベジロール）、ベラパミル、ジフェジピン、又はジルチアゼムである。高血圧に関連した肥大症の治療には、カルシウムチャネルブロッカー（例えば、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、又はニカルジピン）；Ｐ−アドレナリン作用性遮断剤；利尿剤（例えば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ベンズチアジド、ジクロルフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド）；及び／又はＡＣＥ阻害剤（例えば、キナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、ホシノプリル、又はリシノプリル）を使用する、降圧薬療法の使用が必要とされる場合がある。
【００４５】
他の適応症には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、問題の骨及び／又は軟骨の欠損、創傷、又は組織の治療に有益な他の薬剤と組み合わせてよい。これらの薬剤には、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、及びＣＴＧＦのような様々な増殖因子が含まれる。
【００４６】
さらに、癌を治療するために使用するＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記に確認されるような細胞傷害剤、化学療法剤、又は増殖阻害剤と組み合わせてよい。また、癌の治療では、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、放射線照射、又は放射活性物質投与を伴ってもまたはいなくてもよく、放射線治療と連続して、又は組み合わせて好適に投与される。
【００４７】
ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与される治療薬剤の有効量は、医師又は獣医師の判断によるものとなる。投与量の投与及び調整は、治療する状態の最高の管理を達成するために行われる。例えば、高血圧の治療では、これらの量は、理想的には、利尿剤又はジギタリス製剤の使用、高血圧又は低血圧のような状態、腎障害、等を考慮する。用量は、使用する治療薬剤のタイプや治療される患者の特性といったような要因にさらに依存する。典型的には、利用する量は、所与の治療薬剤がＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを伴わずに投与される場合に使用されるのと同じ用量であろう。
【００４８】
乳癌の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、化学療法剤と一緒のトラスツツマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、パクリタキセル、ドセタキセル、エピルビシン、ミトザントロン、トポテカン、カペシタビン、ビノレルビン、チオテパ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルボプラチン又はシスプラチン、プリカマイシン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、トレミフィン、又はプロゲスチンと組み合わせて投与することができる。
【００４９】
急性リンパ球性白血病の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、ドキソルビシン、シタラビン、シクロホスファミド、エトポシド、テニポシド、アロプリノール、又は自己骨髄移植と組み合わせて投与することができる。
【００５０】
急性骨髄球性及び骨髄単球性白血病の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、ジェムツツマブ、オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、ミトザントロン、イダルビシン、エトポシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザシチジン、アムサクリン、メトトレキセート、ドキソルビシン、トレチノイン、アロプリノール、ロイカフェレーシス、プレドニゾン、又は急性前骨髄球性白血病に対する三酸化ヒ素と組み合わせて投与することができる。
【００５１】
慢性骨髄球性白血病の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、ブスルファン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、プリカマイシン、メルファラン、自己骨髄移植、又はアロプリノールと組み合わせて投与することができる。
【００５２】
慢性リンパ球性白血病の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、クラドリビン（２−クロロデオキシアデノシン；ＣｄＡ）、同種骨髄移植、アンドロゲン、又はアロプリノールと組み合わせて投与することができる。
【００５３】
多発性骨髄腫の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、エトポシド、シタラビン、α−インターフェロン、デキサメタゾン、又は自己骨髄移植と組み合わせて投与することができる。
【００５４】
肺癌（小細胞及び非小細胞）の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、マイトマイシン、イホスファミド、パクリタキセル、イリノテカン、又は放射線療法と組み合わせて投与することができる。
【００５５】
結腸及び直腸癌の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、カペシタビン、メトトレキセート、マイトマイシン、カルムスチン、シスプラチン、イリノテカン、又はフロクスウリジンと組み合わせて投与することができる。
【００５６】
腎臓の癌の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、α−インターフェロン、プロゲスチン、注入用ＦＵＤＲ、又はフルオロウラシルと組み合わせて投与することができる。
【００５７】
前立腺癌の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、ケトコナゾール、ドキソルビシン、アミノグルテチミド、プロゲスチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、スラミン、ＰＣ−ＳＰＥＳ、又はリン酸エストラムスチンと組み合わせて投与することができる。
【００５８】
黒色腫の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、チオテパ、シスプラチン、パクリタキセル、タモキシフェン、又はビンクリスチンと組み合わせて投与することができる。
【００５９】
卵巣癌の治療には、ＶＣＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを、限定されないが、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、又はリポソーム・ドキソルビシンと組み合わせて投与することができる。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明には、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体が限定されずに含まれる、他のオリゴマーアンチセンス化合物も含まれる。本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約３０のヌクレオ塩基（即ち、約８〜約３０の連結ヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、なおより好ましくは、約１２〜約２５のヌクレオ塩基を含んでなるものである。当該技術分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の最も一般的な２つのクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基がさらに含まれるヌクレオシドである。ペントフラノシル糖が含まれるヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかへ連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成するときは、リン酸基により隣接ヌクレオシドが互いに共有結合されて、直鎖のポリマー化合物を形成する。次いで、この直鎖ポリマー構造の両端は、さらに結合して環状構造を形成する場合があるが、開いた直鎖の構造が概して好ましい。オリゴヌクレオチド構造の内部では、リン酸基がオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると一般に言われる。ＲＮＡとＤＮＡの正常なI連結又は骨格は、３’−５’ホスホジエステル連結である。
【００６１】
本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義されるように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持するものと、骨格にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的からすれば、そして当該技術分野で時々参照されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなしてよい。
【００６２】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、正常な３’−５’連結を有する、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルなホスホネートが含まれるメチルや他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートが含まれるホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェート、上記の２’−５’連結類似体、及びヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’へ、又は２’−５’から５’−２’へ連結している逆の極性を有するものが含まれる。様々な塩、混合塩、及び遊離酸の型も含まれる。
【００６３】
上記のリン含有連結の製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；及び５，６２５，０５０号が含まれ、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
リン原子がそこに含まれない、好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキル又はシクロアルキルの混合したヌクレオシド間連結、又は１以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分より一部形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホンの骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及びＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の混合部分を有する他の骨格が含まれる。
【００６５】
上記オリゴヌクレオシドの製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；及び５，６７７，４３９号が含まれ、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体では、糖とヌクレオシド間連結の両方、即ちヌクレオシド単位の骨格を新規な基で置換する。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣体であり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置き換わっている。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９，２６２号が含まれ、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500 に見出すことができる。
【００６７】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエート骨格のあるオリゴヌクレオチドとヘテロ原子骨格のあるオリゴヌクレオシドであり、特に、上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここでネイティブなホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表される］と、上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格のあるものである。また好ましいのは、上記参照の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６８】
修飾オリゴヌクレオチドは、１以上の置換糖部分も含有してよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ、Ｓ又はＮ−アルキル；Ｏ、Ｓ又はＮ−アルケニル；Ｏ、Ｓ又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は未置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２である（ここでｎ及びｍは、１〜約１０である）。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０、（低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル）、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、並びに、同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、以下の実施例に記載される、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基と、やはり以下の実施例に記載される、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
【００６９】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の部位、特に３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位と５’末端ヌクレオチドの５’位で行なってよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣体を有してよい。そのような修飾糖構造の製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；及び５，７００，９２０号が含まれ、これらのいずれも参照により本明細書にそのまま組み込まれる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドには、ヌクレオ塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾又は置換も含まれる場合がある。本明細書に使用されるように、「未修飾」又は「天然の」ヌクレオ塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）とピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチルや他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピルや他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルや他の８位置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルや他の５位置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンといった、他の合成及び天然のヌクレオ塩基が含まれる。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、「ポリマー科学・工学事典（The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering）」858-859 頁, Kroschwitz, J. I.（監修）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（1990）に開示されるもの、Englisch et al.「応用化学（Angewandte Chemie）」国際版（International Edition），1991, 30, 613 に開示されるもの、並びに、Sanghvi, Y. S.「第１５章：アンチセンスの研究と応用（Chapter 15, Antisense Research and Applications）」289-302 頁, Crooke, S. T. and Lebleu, B.（監修）ＣＲＣプレス（1993）に開示されるものが含まれる。これらヌクレオ塩基のあるものは本発明のオリゴマー化合物の結合アフィニティーを高めるのに特に有用である。これらには、５位置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及び、Ｎ−２、Ｎ−６及びＯ−６位置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシンの置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示され（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T., and Lebleu, B.（監修）「アンチセンスの研究と応用（Antisense Research and Applications）」ＣＲＣプレス、ボカラトン（1993），276-278 頁）、現行では好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるときは特により好ましい。
【００７１】
上記の注目すべき修飾ヌクレオ塩基、並びに他の修飾ヌクレオ塩基のいくつかの製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、上記に注目したＵ．Ｓ．３，６８７，８０８号、並びにＵ．Ｓ．４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１；５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；５，７５０，６９２；及び５，６８１，９４１号が含まれ、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布又は細胞内取込みを亢進する１以上の部分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドへ化学的に連結することを伴う。そのような部分には、限定されないが、コレステロール部分のような脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族の鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又は１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）が含まれる。
【００７３】
このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１；５，３９１，７２３；５，４１６，２０３；５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８；及び５，６８８，９４１号が含まれ、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
所与の化合物のすべての位置が一様に修飾される必要はなく、実のところ、上記の１より多い修飾をある単一化合物中に、又はオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにさえ取り込めばよい。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、本発明の文脈において、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位（即ち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）からなる、２以上の化学的に別個の領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。典型的には、これらオリゴヌクレオチドは、増加したヌクレアーゼ分解抵抗性、増加した細胞内取込み、及び／又は標的核酸への増加した結合アフィニティーをオリゴヌクレオチドへ与えるようにオリゴヌクレオチドを修飾する、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質として役立つ場合がある。例を挙げると、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。故に、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大いに高める。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用するときにより短いオリゴヌクレオチドを用いれば、同一の標的領域へハイブリダイズするホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドと比較して、同等な結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、そして必要ならば、当該技術分野で知られている関連した核酸ハイブリダイゼーション技術によって定型的に検出することができる。
【００７５】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、上記のようなオリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成される場合がある。そのような化合物は、当該技術分野ではハイブリッド又はギャップマーと呼ばれている。そのようなハイブリッド構造の製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；及び５，７００，９２２号が含まれ、このうちあるものは本出願とともに共有され、そのいずれも参照により本明細書にそのまま組み込まれる。
【００７６】
本発明に従って使用するアンチセンス化合物は、固相合成のよく知られた技術により簡便かつ定型的に作製することができる。そのような合成用の装置は、例えばアプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）が含まれる、ベンダー数社により販売されている。当該技術分野で知られているそのような合成用の他のどの手段も、追加的に又は代替的に利用してよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造することもよく知られている。
【００７７】
本発明のアンチセンス化合物は in vitro で合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物も、アンチセンス分子のin vivo 合成を指令するように設計された遺伝子ベクター構築体も含まれない。本発明の化合物はまた、取込み、分布及び／又は吸収を促進するために、例えばリポソーム、受容体標的指向分子、経口、直腸、局所又は他の製剤といった他の分子、分子構造、又は化合物の混合物と混合、被包、コンジュゲートさせるか、他のやり方で会合させてよい。そのような取込み、分布及び／又は吸収を促進する製剤の製法を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、Ｕ．Ｓ．５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；及び５，５９５，７５６号が含まれ、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本発明のアンチセンス化合物には、ヒトが含まれる動物への投与時に、生物学的に活性な代謝物又はその残基を（直接的又は間接的に）提供することが可能である、あらゆる製剤的に許容される塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、又はあらゆる他の化合物が含まれる。従って、例えば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグと製剤的に許容される塩、そのようなプロドラッグの製剤的に許容される塩、並びに他の生物学的同等物へも引用される。
【００７９】
用語「プロドラッグ」は、生体又はその細胞の内部で、内因性の酵素や他の化学品及び／又は条件の作用により活性型（即ち、薬物）へ変換される不活性型で製造される治療薬剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、Gosselin et al．へのＷＯ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日公開）又は Imbach et al．へのＷＯ９４／２６７６４に開示される方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸塩］誘導体として製造する。
【００８０】
用語「製剤的に許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的及び製剤的に許容される塩、即ち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、所望されない毒性学的効果をそれへ与えない塩を意味する。
【００８１】
製剤的に許容される塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンのような金属又はアミンとともに形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、等である。好適なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインである（例えば、Berge et al.「製剤塩（Pharmaceutical Salts）」J. of Pharma Sci. 1977, 66: 119 を参照のこと）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来のやり方で塩を産生するために、十分量の所望される塩基と遊離酸型を接触させることによって製造する。遊離酸型は、従来のやり方で酸とこの塩型を接触させて遊離酸を単離することによって再生することができる。遊離酸型は、極性溶媒における溶解度といった、ある種の物理的性質においてそれぞれの塩型とやや異なるが、他の点では、本発明の目的にとって、その塩はそれぞれの遊離酸と同等である。本明細書に使用されるように、「医薬付加塩」には、本発明の組成物の成分の１つの酸型の製剤的に許容される塩が含まれる。これにはアミンの有機又は無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩である。他の好適な製剤的に許容される塩は当業者によく知られていて、例えば塩酸、臭酸、硫酸又はリン酸といった無機酸；有機の、カルボン酸、スルホン酸、スルホ又はホスホ酸、又はＮ−置換スルファミン酸（例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸）；及び、天然のタンパク質合成に関わる２０種のα−アミノ酸のようなアミノ酸（例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸）；さらに、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２又は３−ホスホグリセリン酸塩、グルコース−６−リン酸塩、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成とともに）；又はアスコルビン酸のような他の酸性有機化合物とのような、多種多様な無機酸及び有機酸の塩基性塩が含まれる。製剤的に許容される化合物の塩はまた、製剤的に許容されるカチオンで製造してもよい。製剤的に許容される好適なカチオンは当業者によく知られていて、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、及び４級アンモニウムのカチオンが含まれる。炭酸塩又は炭酸水素塩も可能である。
【００８２】
オリゴヌクレオチドについて、製剤的に許容される塩の好ましい例には、限定されないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン及びスペルミジンのようなポリアミン、等のようなカチオンとともに形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭酸、硫酸、リン酸、硝酸、等とともに形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、等のような有機酸とともに形成される塩；及び（ｄ）塩素、臭素、及びヨウ素のような元素アニオンより形成される塩が含まれる。
【００８３】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防法、及び研究試薬やキットとして利用することができる。治療薬について言えば、ＶＣＣ−１の発現を変調させることによって治療することができる疾患又は障害を有する疑いのある動物、好ましくはヒトを本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって治療する。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を好適な製剤的に許容される希釈剤又は担体へ加えることによって医薬組成物において利用することができる。本発明のアンチセンス化合物及び方法の使用は、例えば感染、炎症、又は腫瘍形成を例えば予防するか又は遅延するために、予防的に有用であるかもしれない。
【００８４】
本発明のアンチセンス化合物が研究や診断薬に有用であるのは、これら化合物がＶＣＣ−１をコードする核酸へハイブリダイズするので、そのことを利用して、サンドイッチ法や他のアッセイを容易に構築し得るからである。ＶＣＣ−１をコードする核酸と本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で知られている手段により検出することができる。そのような手段には、酵素のオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射標識化、又は他の好適な検出手段が含まれる場合がある。そのような検出手段を使用して試料中のＶＣＣ−１のレベルを検出するキットも製造することができる。
【００８５】
本発明には、本発明のアンチセンス化合物が含まれる医薬組成物及び製剤も含まれる。本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のどちらが所望されるかということや処置される部位に依存して、いくつかの方法で投与することができる。投与は、局所投与（眼への投与、膣及び直腸への送達が含まれる粘膜への投与が含まれる）でも、肺への投与（ネブライザーによることが含まれる、粉末又はエアゾールの吸入又は通気による）でも、気管内、鼻腔内、表皮内及び経皮、経口又は非経口でもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入、又は頭蓋内、例えば鞘内又は脳室内の投与が含まれる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾のあるオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられている。
【００８６】
局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、及び散剤を含めてよい。慣用の製剤用担体、水性、粉末又は油状の基剤、濃化剤、等が必要であるか又は所望される場合がある。被覆されたコンドーム、グラブ、等も有用であり得る。
【００８７】
経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒剤、懸濁液剤、水又は非水性媒体に溶けた溶液剤、カプセル剤、サシェ剤（sachets）、又は錠剤が含まれる。濃化剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい場合もある。
【００８８】
非経口、鞘内又は脳室内投与用の組成物及び製剤には、無菌の水溶液剤が含まれる場合があり、これは、緩衝剤、希釈剤、並びに、限定されないが、浸透エンハンサー、担体化合物や他の製剤的に許容される担体又は賦形剤といった他の好適な添加剤も含有してよい。
【００８９】
本発明の医薬組成物には、限定されないが、溶液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤が含まれる。これら組成物は多様な成分より産生してよく、それには、限定されないが、予調製（preformed）液剤、自己乳化性の固形剤、及び自己乳化性の半固形剤が含まれる。
【００９０】
本発明の医薬製剤は、簡便にも単位剤形で提示してよく、製薬業界でよく知られた慣用技術に従って調製することができる。そのような技術には、医薬用の担体又は賦形剤と有効成分を複合する工程が含まれる。一般に、この製剤は、液状担体か又は微細化した固形担体、又はその両方と均一かつ緊密に有効成分を複合すること、そしてその後、必要ならばその生成物を成型することによって調製する。
【００９１】
本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤、及び浣腸剤のような多くの可能な剤形のいずれへ製剤化してもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合の媒体中の懸濁液剤として製剤化してもよい。水性懸濁液剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランが含まれる、懸濁液剤の粘度を高める物質をさらに含有してよい。懸濁液剤は、安定化剤も含有してよい。
【００９２】
本発明の１つの態様において、医薬組成物はフォームとして製剤化して、使用することができる。医薬フォームには、限定されないが、乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤、及びリポソーム剤のような製剤が含まれる。上記の諸製剤は性質において基本的に似ているが、最終産物の成分及びコンシステンシーにおいて異なる。そのような組成物及び製剤の製法については製薬及び製剤技術分野の当業者に概ね知られていて、本発明の組成物の製剤化に適用することができる。
【００９３】
乳剤：本発明の組成物は乳剤として調製及び製剤化することができる。乳剤は、典型的には、一方の液体が別の液体に、直径０．１μｍを通常越える液滴の形態で分散した異種成分系である（Idson,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、199 頁中；Rosoff,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、245 頁中；Block,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第２巻、335 頁中；Higuchi et al.「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」マック・パブリッシング社、ペンシルヴェニア州イーストン（1985）301 頁中）。乳剤は、しばしば、緊密に混合して互いに分散している２種の混合し得ない液相を含んでなる二相系である。一般に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）又は水中油型（ｏ／ｗ）のいずれでもよい。水相が細分されて多量の油相の中へ微小の液滴として分散している場合、生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が細分されて多量の水相の中へ微小の液滴として分散している場合、生じる組成物は水中油型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相及び有効成分に加えて追加の成分を含有してよく、これは水相、油相のいずれの溶液としても、それ自身が分離した相としても、存在してよい。乳化剤、安定化剤、色素、及び抗酸化剤のような医薬賦形剤も、必要に応じ、乳剤中に存在してよい。医薬乳剤はまた、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のように、２より多い相からなる多相乳剤であってよい。そのような複合製剤は、単純な二相乳剤が提供しないある種の利点をしばしば提供する。ｏ／ｗ乳剤の各油滴が小さい水滴を包む多相乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に、油性の連続層の中で安定化した水球に油滴が包まれている系は、ｏ／ｗ／ｏ乳剤を提供する。
【００９４】
乳剤は、熱力学的安定性がほとんどないか、又はまったくないことを特徴とする。しばしば、乳剤の分散相又は不連続相は、外部相や連続相へ十分分散し、乳化剤の手段又は製剤の粘性によりこの形態で維持される。乳剤の諸相のいずれかは、乳剤形式の軟膏基剤及びクリーム剤の場合のように、半固体でも固体でもよい。乳剤を安定化させる他の手段は、乳剤のいずれかの相へ取り込むことができる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は概ね４種のカテゴリーへ分類し得る：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、及び微分散固形物である（Idson,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、199 頁中）。
【００９５】
界面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤化において広汎な応用可能性が見出されていて、文献に解説されている（Rieger,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、285 頁中；Idson,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、199 頁中）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性と疎水性の部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、製剤の調製において界面活性剤を分類して選択するときの貴重なツールとなる。界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、及び両性といった、親水基の性質に基づいて異なるクラスへ分類することができる（Rieger,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、285 頁中）。
【００９６】
乳剤製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、ミツロウ、ホスファチド、レシチン、及びアラビアゴムが含まれる。吸収基剤は、無水ラノリン及び親水ワセリンのように、水に浸っても、ｗ／ｏ乳剤を形成しても、その半固体コンシステンシーを保持するような親水性を保有する。微分割固形物も、特に界面活性剤との組合せや粘稠な調製物において、良好な乳化剤として使用されている。これには、重金属水酸化物のような極性の無機固形物、ベントナイト、アッタプルガイト（attapulgite）、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイト（montmorillonite）、ケイ酸アルミニウムコロイド及びケイ酸マグネシウムアルミニウムコロイドのような非膨潤性の粘土、色素、及び炭素又はトリステアリン酸グリセリルのような非極性固形物が含まれる。
【００９７】
乳剤製剤には多種多様な非乳化材料も含まれ、乳剤の諸特性に貢献する。これには、脂肪、オイル、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤、及び抗酸化剤が含まれる（Block,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、335 頁中；Idson,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、199 頁中）。
【００９８】
親水性コロイド又はヒドロコロイドには、多糖（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーゴム、カラヤゴム、及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）のような天然に存在するゴムや合成ポリマーが含まれる。これらは水に分散するか又は膨潤してコロイド溶液を形成し、分散相の液滴の周囲に強い界面膜を形成し、外部相の粘度を高めることによって乳剤を安定化させる。
【００９９】
乳剤は、炭水化物、タンパク質、ステロール、及びホスファチドといった、微生物の増殖を容易に支援し得るいくつかの成分をしばしば含有するので、上記製剤は、保存剤をしばしば取り込む。乳剤製剤に含まれる通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた製剤の劣化を防ぐためによく乳剤製剤へ加えられる。使用する抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのようなフリーラジカル捕捉剤でも、アスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤やクエン酸、酒石酸及びレシチンのような抗酸化相乗剤でもよい。
【０１００】
皮膚、経口及び非経口の経路を介した乳剤製剤の適用とそれらの製造の方法については文献に概説されている（Idson,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、199 頁中）。経口送達用の乳剤製剤は、製剤化の容易さ、吸収からの効力、及びバイオアベイラビリティの観点のために、きわめて広く使用されている（Rosoff,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、245 頁中；Idson,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、199 頁中）。鉱油ベースの緩下剤、脂溶性ビタミン製剤、及び高脂肪栄養調製剤は、通常、ｏ／ｗ乳剤として経口投与されている材料の１つである。
【０１０１】
本発明の１つの態様において、オリゴヌクレオチド及び核酸の組成物をマイクロエマルジョンとして製剤化する。マイクロエマルジョンは、水、オイル、及び両親媒性化合物の系として定義することが可能であり、光学的に単等方性で熱力学的に安定な液体溶液剤である（Rosoff,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、245 頁中）。典型的には、マイクロエマルジョンは、先ず界面活性剤の水溶液にオイルを分散させてから、十分量の第四成分、一般的には中鎖長のアルコールを加えて透明な系とすることによって調製する系である。故に、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面膜により安定化している、２種の混和しない液体の熱力学的に安定で、等方的に澄明な分散液としても記載された（Leung and Shah,「薬物の制御放出：ポリマーと集塊系（Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems）」 Rosoff, M.（監修）（1989）ＶＣＨパブリッシャーズ、ニューヨーク、1852-5 頁中）。通常、マイクロエマルジョンは、オイル、水、界面活性剤、界面活性助剤（cosurfactant）及び電解質が含まれる、３〜５種の成分の組合せにより調製する。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるか又は水中油型（ｏ／ｗ）のいずれであるかは、使用するオイル及び界面活性剤の性質と、界面活性分子の極性ヘッド及び炭化水素テールの構造及び幾何学的パッキングに依存する（Scott,「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」マック・パブリッシング社、ペンシルヴェニア州イーストン（1985）271 頁中）。
【０１０２】
相図を利用する現象的アプローチは詳しく研究され、マイクロエマルジョンを製剤化する方法に関する包括的な知識を当業者へもたらしてきた（Rosoff,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、245 頁中；Block,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、335 頁中）。慣用の乳剤と比べると、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に水に不溶性の薬物を可溶化するという利点を提供する。
【０１０３】
マイクロエマルジョンの調製に使用する界面活性剤には、限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）の単独又は界面活性助剤との組合せが含まれる。通常はエタノール、１−プロパノール及び１−ブタノールのような短鎖アルコールである界面活性助剤は、界面膜中へ浸透し、その結果、界面活性分子間に生じた隙間のために無秩序な膜を創出することによって界面の流動性を高めることに役立つ。しかしながら、マイクロエマルジョンは、界面活性助剤を使用せずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化性マイクロエマルジョン系が当該技術分野で知られている。水相は、典型的には、限定されないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体であり得る。油相には、限定されないが、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油のような材料が含まれる場合がある。
【０１０４】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化と薬物吸収の増加という観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）は、ペプチドが含まれる薬物の経口バイオアベイラビリティを亢進させると提唱されている（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390；Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205）。マイクロエマルジョンは、薬物可溶化の改善、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜の流動性及び透過性における界面活性剤誘発性の改変による薬物吸収の可能な亢進、調製の容易さ、固形剤形に優る経口投与の容易さ、臨床効力の改善、並びに毒性の減少といった種々の利点を提供する（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385；Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その諸成分が周囲温度で一緒にされると自発的に形成される場合がある。これは、熱に弱い薬物、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを製剤化するときに特に有利であるかもしれない。マイクロエマルジョンはまた、化粧品と医薬品の応用のいずれにおいても、有効成分の経皮送達に効果的である。本発明のマイクロエマルジョンの組成物及び製剤は、オリゴヌクレオチド及び核酸の胃腸管からの全身吸収の増加を促進するばかりでなく、胃腸管、膣、頬腔、及び他の投与領域内におけるオリゴヌクレオチド及び核酸の局所的な細胞内取込みを改善する可能性がある。
【０１０５】
本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸の吸収を亢進するために、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、及び浸透エンハンサーのような追加成分及び添加剤も含有してよい。本発明のマイクロエマルジョンに使用する浸透エンハンサーは、５つの広いカテゴリー（界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤）の１つに属するものとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。上記クラスのそれぞれについては上記に論じた。
【０１０６】
リポソーム：
これまで研究されてきて薬物の製剤化に使用されている、マイクロエマルジョン以外の多くの組織化された界面活性構造がある。これには、単層、ミセル、二層、及び小胞が含まれる。リポソームのような小胞が多大な関心を惹いてきたのは、薬物送達の観点からそれらが提供するその特異性と作用時間のためである。本発明中において使用する用語「リポソーム」は、球状の二層（群）に配置された両親媒性の脂質からなる小胞を意味する。
【０１０７】
リポソームは、親油性材料と水性内部より形成される膜を有する単層又は多層の小胞である。水性部分が送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは細胞壁へ融合することが可能である利点を保有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的には融合し得ないが、in vivo でマクロファージにより取り込まれる。
【０１０８】
哺乳動物のインタクトな皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径５０ｎｍ未満の連続した微細な空孔を通過しなければならない。故に、きわめて変形しやすくて、そのような微細空孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【０１０９】
リポソームのさらなる利点には以下が含まれる：天然のリン脂質より得られるリポソームは生体適合性であり、生物分解性である；リポソームは広範囲の水溶性及び脂溶性薬物を取り込むことができる；リポソームはその内部コンパートメント中の被包薬物を代謝及び分解から保護することができる（Rosoff,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」Lieberman, Rieger and Banker (監修)（1988）マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、245 頁中）。リポソーム製剤の調製における重要な考察事項は、脂質表面の電荷、小胞のサイズ、及びリポソームの水分量である。
【０１１０】
リポソームは、有効成分の作用部位への輸送及び送達に有用である。リポソーム膜が生体膜と構造的に似ているので、リポソームを組織へ適用するとき、リポソームは細胞膜と合体し始める。リポソームと細胞の合体が進行するにつれて、リポソームの中身は細胞のなかへ入り、そこで有効薬剤が作用する場合がある。
【０１１１】
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達形式として詳細な研究の焦点となってきた。局所投与についてはリポソームが他の製剤に優るいくつかの利点を提示するという証拠が増えつつある。そのような利点には、投与薬物の高い全身吸収に関連した副作用の軽減、投与薬物の所望の標的における蓄積の増加、並びに、親水性と疎水性、両方の多様な薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。
【０１１２】
いくつかの報告論文は、高分子量ＤＮＡが含まれる種々の薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力を詳しく述べている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、及び高分子量ＤＮＡが含まれる化合物群が皮膚へ投与されている。この適用の大部分では、上部表皮を標的指向した。
【０１１３】
リポソームは２つのクラスに大別される。カチオン性リポソームは陽電荷のリポソームであり、陰電荷のＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。陽電荷のＤＮＡ／リポソーム複合体は陰電荷の細胞表面へ結合し、エンドソームのなかに内部化される。リポソームは、エンドソーム内の酸性ｐＨにより破壊され、その中身を細胞の細胞質へ放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985）。
【０１１４】
ｐＨ感受性であるか又は陰電荷であるリポソームは、ＤＮＡと複合するというよりそれを捕捉する。ＤＮＡと脂質はいずれも似たように荷電しているので、複合体形成よりは反発が起こるものである。それでも、あるＤＮＡはこれらリポソームの水性内部の内側に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層へ送達するために使用された。この外来遺伝子の発現が標的細胞において検出された（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）。
【０１１５】
リポソーム組成物の１つの主要タイプには、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）より形成することができる。アニオン性リポソーム組成物が一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールより形成されるのに対し、アニオン性の融合産生（fusogenic）リポソームは主にジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）より形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆のＰＣや卵のＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）より形成される。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物より形成される。
【０１１６】
いくつかの研究でリポソーム性薬物製剤の皮膚への局所送達が評価されている。インターフェロン含有リポソームをモルモットの皮膚へ適用すると皮膚ヘルペス潰瘍の低下を生じたが、他の手段（例えば、溶液剤又は乳剤として）を介したインターフェロンの送達は無効であった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410）。さらに、追加の研究では、水系を使用するインターフェロンの投与に対してリポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効力が試験され、リポソーム製剤が水系の投与に優ると結論された（du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265）。
【０１１７】
非イオン性のリポソーム系（特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含んでなる系）も、薬物の皮膚への送達におけるその有用性を判定するために試験された。ＮｏｖａｓｏｍｅＴＭＩ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅＴＭＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮へ送達した。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が皮膚の様々な層へのシクロスポリン−Ａの沈着を促進するのに有効であることを示した（Hu et al., S. T. P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466）。
【０１１８】
リポソームにはまた、「立体的に安定した」リポソームが含まれるが、この用語は、本明細書に使用されるように、１以上の特化した脂質を含んでなるリポソームを意味し、これがリポソームに取り込まれると、そのような特化した脂質を欠いているリポソームに比べて循環寿命の亢進をもたらす。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１のような１以上の糖脂質を含むか、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１以上の親水性ポリマーで誘導されるものである。特定の理論に縛られることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導化脂質を含有する立体的に安定したリポソームについては、これらの立体的に安定したリポソームの循環半減期が亢進することは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取込みの低下に由来すると当該技術分野では考えられている（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42；Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765）。
【０１１９】
１以上の糖脂質を含んでなる様々なリポソームが当該技術分野で知られている。Papahadjopoulos et al.（Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善させる能力について報告した。上記の知見は、Gabizon et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1988, 85, 6949）により詳しく解釈された。米国特許第４，８３７，０２８号及びＷＯ８８／０４９２４（いずれも Allen et al., へ）は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧｊ又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含んでなるリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Webb et al.）は、スフィンゴミエリンを含んでなるリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含んでなるリポソームがＷＯ９７／１３４９９（Lim et al.）に開示されている。
【０１２０】
１以上の親水性ポリマーで誘導した脂質を含んでなる多くのリポソームとその調製法は、当該技術分野で知られている。Sunamoto et al.（Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤である２Ｃ１２１５Ｇを含んでなるリポソームについて記載した。Illum et al.（FEBS Lett., 1984, 167, 79）は、高分子グリコールでポリスチレン粒子を親水コーティングすると血中半減期が有意に増すことに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基を付けることにより修飾した合成リン脂質が Sears（米国特許第４，４２６，３３０号及び４，５３４，８９９号）に記載されている。Klibanov et al.（FEBS Lett., 1990, 268, 235）は、ＰＥＧ又はステアリン酸ＰＥＧで誘導したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んでなるリポソームが血液循環半減期の有意な増加を有することを実証する実験について記載した。Blume et al.（Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91）は、そのような観察事実を他のＰＥＧ誘導化リン脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組合せより形成される、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）へ拡張した。共有結合したＰＥＧ部分をその外部表面に有するリポソームがヨーロッパ特許第ＥＰ０  ４４５  １３１  Ｂ１号とＦｉｓｈｅｒへのＷＯ９０／０４３８４に記載されている。ＰＥＧで誘導したＰＥを１〜２０モル％含有するリポソーム組成物とその使用の方法が Woodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号及び５，３５６，６３３号）と Martin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号及びヨーロッパ特許第ＥＰ  ０  ４９６  ８１３  Ｂ１号）により記載されている。他のいくつかの脂質−ポリマーコンジュゲートを含んでなるリポソームがＷＯ９１／０５５４５及び米国特許第５，２２５，２１２号（いずれも Martin et al. へ）とＷＯ９４／２００７３（Zalipsky et al.）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含んでなるリポソームがＷＯ９６／１０３９１（Choi et al.）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al.）及び５，５５６，９４８号（Tagawa et al.）は、その表面上の官能基部分でさらに誘導化し得るＰＥＧ含有リポソームについて記載する。
【０１２１】
核酸を含んでなる限定数のリポソームが当該技術分野で知られている。Thierry et al. へのＷＯ９６／４００６２は、高分子量の核酸をリポソームに被包化する方法を開示する。Tagawa et al. への米国特許第５，２６４，２２１号はタンパク質に結合したリポソームを開示し、そのようなリポソームの中身にアンチセンスＲＮＡが含まれる可能性があることを主張する。Rahman et al. への米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに被包化する特定の方法を記載する。Love et al. へのＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子へ標的指向したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるリポソームを開示する。
【０１２２】
トランスファーソーム（transfersome）はさらに別のタイプのリポソームであり、きわめて変形しやすい脂質の集塊であって、薬物送達運搬体の魅力的な候補である。トランスファーソームは脂質の液滴として記載される場合があり、きわめて変形しやいので、その液滴より小さい空孔を容易に貫通することができる。トランスファーソームはそれを使用する環境に適合している、例えば、それらは自己最適化し（皮膚の空孔の形状に適合する）、自己修復し、断片化せずにその標的に頻繁に到達し、しばしば自己負荷性（self-loading）である。トランスファーソームを作製するには、界面境界活性化剤、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物へ加えることが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するのに使用されたことがある。トランスファーソーム仲介性の血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液剤の皮下注射と同じくらい有効であることが示された。
【０１２３】
界面活性剤は乳剤（マイクロエマルジョンが含まれる）やリポソームのような製剤に広く応用されている。天然と合成の両方の多種多様なタイプの界面活性剤の性質を分類して順位づける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用される様々な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、1988、285 頁中）。
【０１２４】
界面活性分子がイオン化されていなければ、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は医薬品及び化粧品に広く応用され、広範囲のｐＨ値にわたり使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８に及ぶ。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルのような非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーのような非イオン性のアルカノールアミド及びエーテルもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
【０１２５】
界面活性分子が水に溶けるか又は分散するときに陰電荷を担うならば、この界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石けんのようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキル及び硫酸エトキシル化アルキルのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸及びスルホコハク酸アシル、及びリン酸エステルが含まれる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、硫酸アルキルと石けんである。
【０１２６】
界面活性分子が水に溶けるか又は分散するときに陽電荷を担うならば、この界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、４級アンモニウム塩とエトキシル化アミンが含まれる。４級アンモニウム塩がこのクラスで最も使用されるメンバーである。
【０１２７】
界面活性分子が陽電荷か陰電荷のどちらもを担う能力を有するならば、この界面活性剤は両親媒性として分類される。両親媒性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、及びホスファチドが含まれる。
【０１２８】
医薬品、製剤及び乳剤における界面活性剤の使用が概説されている（Rieger,「医薬剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）」マルセルデッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、1988、285 頁中）。
【０１２９】
浸透エンハンサー：
１つの態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの動物の皮膚への効率的な送達をもたらす様々な浸透エンハンサーを利用する。ほとんどの薬物は、イオン化型と非イオン化型の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、細胞膜を容易に通過するのは脂溶性又は親油性の薬物だけである。通過される膜を浸透エンハンサーで処理すれば、非親油性の薬物でも細胞膜を通過し得ることが発見された。非親油性薬物の細胞膜通過の拡散を助けることに加えて、浸透エンハンサーは親油性薬物の透過性も高める。
【０１３０】
浸透エンハンサーは５つの広いカテゴリー、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の１つに属するものとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。上記の浸透エンハンサー群のそれぞれにつき、以下により詳しく記載する。
【０１３１】
界面活性剤：本発明に関連すると、界面活性剤（又は「界面活性薬剤」）は、水溶液に溶けるときに、溶液の表面張力、又は水溶液と別の液体間の界面張力を低下させ、その結果、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を高める化学物質（entities）である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加え、これらの浸透エンハンサーには、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）；及びＦＣ−４３のようなペルフルオロケミカル乳剤（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）が含まれる。
【０１３２】
脂肪酸：浸透エンハンサーとして作用する様々な脂肪酸とその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール−１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）エステル、及びそれらのモノ及びジグリセリド（即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート、等）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1-33；El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654）。
【０１３３】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（Brunton, 38 章「グッドマン・ギルマンの薬理書（Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics）」第９版、Hardman et al.（監修）マックグローヒル、ニューヨーク、1996, 934-935 頁中）。様々な天然の胆汁酸塩とその合成誘導体が浸透エンハンサーとして作用する。このように、用語「胆汁酸塩」には、天然に存在する胆汁のあらゆる成分、並びにそのあらゆる合成誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩には、例えば、コール酸（又はその製剤的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92 頁；Swinyard, 39 章「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第１８版、Gennaro（監修）、マック・パブリッシング社、ペンシルヴェニア州イーストン（1990）782-783 頁中；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25；Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583）。
【０１３４】
キレート剤：キレート剤は、本発明に関連して使用されるように、金属イオンと複合体を形成することによってそれを溶液から除去し、その結果、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を高める化合物として定義することができる。本発明における浸透エンハンサーとしての使用に関して言えば、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても役立つという追加の利点を有する。これは、ほとんどの特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために２価金属イオンを必要とするので、キレート剤により阻害されるためである（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。本発明のキレート剤には、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92 頁；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51）。
【０１３５】
非キレート非界面活性剤：本明細書に使用されるように、非キレート非界面活性剤の浸透亢進化合物は、キレート剤としても界面活性剤としてもさしたる活性を示さないが、それでも消化管粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を高める化合物として定義される（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33）。このクラスの浸透エンハンサーには、例えば、不飽和の環式尿素、1−アルキル及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92 頁）；及び、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンのような非ステロイド性抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）が含まれる。
【０１３６】
オリゴヌクレオチドの細胞レベルでの取込みを高める薬剤も本発明の薬物や他の組成物へ加えてよい。例えば、リポフェクチン（Junichi et al., 米国特許第５，７０５，１８８号）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジン（Lollo et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）のようなポリカチオン性分子も、オリゴヌクレオチドの細胞取込みを高めることが知られている。
【０１３７】
エチレングリコールやプロピレングリコールのようなグリコール、２−ピロールのようなピロール、アゾン、並びにリモネン及びメントンのようなテルペンが含まれる他の薬剤も、投与する核酸の浸透を高めるために利用してよい。
【０１３８】
担体：
本発明のある組成物は、製剤中に担体化合物も取り込む。本明細書に使用する「担体化合物」又は「担体」は、不活性である（即ち、それ自身は生物学的活性を保有しない）が、例えば生物学的に活性のある核酸を分解するか又はその循環からの除去を促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させる in vivo プロセスにより核酸として認知される核酸又はその類似体を意味する場合がある。核酸及び担体化合物の同時投与は、典型的には後者の物質が過剰であるが、肝臓、腎臓又は他の循環外レザバーにおいて回収される核酸の量の実質的な低下をもたらす場合があり、これは恐らく共通の受容体に対する担体化合物と核酸の競合によるものであろう。例えば、部分ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの肝臓組織における回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸又は４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与されるとき、低下する場合がある（Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121；Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
【０１３９】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、製剤的に許容される溶媒、懸濁剤、又は１以上の核酸を動物へ送達するための他の薬理学的に不活性な担体である。賦形剤は、液体でも固体でもよく、計画された投与の方法に基づいて、所与の医薬組成物の核酸や他の成分と組み合わせたときに、所望される大きさ、コンシステンシー、等をもたらすように選択する。典型的な医薬担体には、限定されないが、結合剤（例、ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース、等）；充填剤（例、乳糖や他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウム、等）；滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化シリコン、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、等）；崩壊剤（例、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、等）；及び、湿潤剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム、等）が含まれる。
【０１４０】
核酸とは有害に反応しない、非腸管外投与に適した製剤的に許容される有機又は無機の賦形剤も本発明の組成物を製剤化するために使用してよい。製剤的に許容される好適な担体には、限定されないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、等が含まれる。
【０１４１】
核酸の局所投与用の製剤には、滅菌及び非滅菌の水溶液剤、アルコールのような一般溶媒中の非水性溶液剤、又は液体又は固体のオイル基剤中の核酸の溶液剤が含まれる場合がある。これら溶液剤は、緩衝液、希釈剤、及び他の好適な添加剤も含有してよい。核酸とは有害に反応しない、非腸管外投与に適した製剤的に許容される有機又は無機の賦形剤も使用してよい。
【０１４２】
製剤的に許容される好適な賦形剤には、限定されないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、等が含まれる。
【０１４３】
他の成分：
本発明の組成物は、医薬組成物に慣用的に見出される他の付加成分を、その現行技術で確立された使用レベルで、追加的に含有してよい。従って、例えば、本組成物は、例えば止痒剤、収斂薬、局所麻酔剤又は抗炎症剤のような適合性のある追加の医薬活性材料を含有しても、着色剤、芳香剤、保存剤，抗酸化剤、混濁剤、濃化剤及び安定化剤のような、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加の材料を含有してもよい。しかしながら、そのような材料は、添加したときに、本発明の組成物の成分の生物学的活性に不当に干渉してはならない。製剤は、滅菌して、所望されるならば、製剤の核酸とは有害に反応しない助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、芳香剤及び／又は芳香性物質、等と混合してよい。
【０１４４】
水性懸濁液剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランが含まれる、懸濁液剤の粘度を高める物質を含有してよい。この懸濁液剤は、安定化剤も含有してよい。
【０１４５】
本発明のある態様は、（ａ）１以上のアンチセンス化合物、及び（ｂ）非アンチセンス機序によって機能する１以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、限定されないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）のような抗癌剤が含まれる。一般論としては、「メルクマニュアル（The Merck Manual of Diagnosis and Therapy）」第１５版、Berkow et al.（監修）（1987）、ニュージャージー州ラーウェイ、1206-1228 頁を参考のこと。非ステロイド抗炎症薬及びコルチコステロイドが限定せずに含まれる抗炎症薬と、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルが限定されずに含まれる抗ウイルス薬も、本発明の組成物に組み合わせてよい。一般論としては、「メルクマニュアル（The Merck Manual of Diagnosis and Therapy）」第１５版、Berkow et al.（監修）（1987）、ニュージャージー州ラーウェイ、2499-2506 頁及び46-49 頁をそれぞれ参照のこと。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内にある。２以上の組合せ化合物は、一緒に使用しても、連続的に使用してもよい。
【０１４６】
別の関連した態様において、本発明の組成物は、第一の核酸へ標的指向する１以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第二の核酸標的へ標的指向する追加のアンチセンス化合物を含有してよい。アンチセンス化合物の数多の例が当該技術分野で知られている。２以上の組合せ化合物は、一緒に使用しても、連続的に使用してもよい。
【０１４７】
治療用組成物の製剤化とその後続の投与は、当業者の技術の範囲内にあると考えられる。投薬は、治療される病態の重症度と応答性に依存し、治療のクールは数日から数ヶ月、又は治癒がもたらされるか、又は病態の減衰が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値より算出することができる。当業者は、最適投与量、投薬方法、及び反復率を容易に決定することができる。最適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて変動する場合があるが、一般には in vitro 及び in vivo の動物モデルにおいて有効と判定されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投与量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週、１月又は１年につき１回又はそれ以上与えても、２〜２０年に１回だけ投与してもよい。当業者は、体液又は組織中の薬物の測定滞留時間及び濃度に基づいて投薬の反復率を容易に推定することができる。治療がうまくいけば、患者に維持療法を実施させ、病態の再発を予防することが望ましい場合があり、ここでオリゴヌクレオチドは、１日１回又は数回〜２０年に１回まで、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇに及ぶ維持用量で投与する。
【０１４８】
本発明をその好ましい態様のあるものに準じて具体的に記載してきたが、以下の実施例は、本発明を例示するためにのみ役立ち、それを制限することを企図していない。
実施例
【実施例１】
【０１４９】
オリゴヌクレオチド合成用ヌクレオシドホスホロアミダイト：デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシ及び２’−メトキシ−β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは市販品より入手可能である（例えば、ケムジーンズ（Chemgenes）、マサチューセッツ州ニーダム、又はグレン・リサーチ社、バージニア州スターリング）。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５０６，３５１号に記載のように製造する。２’−アルコキシアミダイトを使用して合成するオリゴヌクレオチドについては、未修飾オリゴデオキシヌクレオチドの標準サイクルを利用するが、テトラゾール及び塩基のパルス送達後の待ち工程は３６０秒に高める。
【０１５０】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、市販のホスホロアミダイト（グレン・リサーチ社、バージニア州スターリング、又はケムジーンズ、マサチューセッツ州ニーダム）を使用する公知の方法により合成する［Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203］。
【０１５１】
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドは、先述［Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841］のように、そして参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６７０，６３３号のように合成する。簡略に言うと、市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発材料として利用し、文献の手順の改変によって２’−β−トリチル基のＳＮ２置換により２’−α−フルオロ原子を導入して、保護化ヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを合成する。このようにして、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを、中等度の収率で３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として選択的に保護化する。ＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイル基の脱保護は、標準的な方法を使用して達成し、標準法を使用して５’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイト中間体を得る。
【０１５２】
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護化９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発材料として使用して達成し、中間体のジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへ変換する。ＴＰＤＳ基の脱保護に続き、ＴＨＰでヒドロキシル基を保護して、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフル化（triflation）に続き、粗生成物をフッ化物で処理してから、ＴＨＰ基を脱保護する。標準法を使用して、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイトを得る。
【０１５３】
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−無水−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジンで処理する、文献の手順の改変により達成する。標準法を使用して、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホロアミダイトを得る。
【０１５４】
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化により２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを合成し、それに続く選択的な保護化により、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得る。標準法を使用して、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホロアミダイトを得る。
【０１５５】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、下記のように、あるいは代わりにMartin, P., Helvetica Chimica．Acta, 1995, 78，486-504 の方法に従って製造する。
【０１５６】
２，２’−無水−［１−（β−D−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子、日本の市販品）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）及び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）へ加える。この混合物を撹拌しながら加熱して還流させ、発生する二酸化炭素ガスを制御されたやり方で放出させる。１時間後、やや黒ずんだ溶液を減圧下で濃縮する。結果として得たシロップを、撹拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）へ注ぐ。生成物はゴムを形成する。エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶かす。この溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）へ注ぐと、堅いゴムを生じる。エーテルをデカントし、このゴムを真空オーブン（６０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）中で乾燥させて固形物を得て、これを粉砕し淡褐色の粉末にする。この材料をそのまま以後の反応に使用して（又は、酢酸エチル中のメタノール（１０〜２５％）勾配液を使用するカラムクロマトグラフィーによってさらに精製してよい）、白い固形物を得る。
【０１５７】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−無水−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸エステル（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレススチール圧力容器へ加え、１６０℃に予熱した油浴中に置く。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後で、この容器を開き、この溶液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩砕する。残渣を温アセトン（１Ｌ）に懸濁する。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液を蒸発させる。残渣（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）に溶かし、蒸発させる。０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含有するＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）にシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填する。先の残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶かし、カラムへのロードに先立ってシリカ（１５０ｇ）に吸着させる。充填溶媒で生成物を溶出させて、表題生成物を得る。低純度分画を再処理することによって、追加の材料を入手することができる。
【０１５８】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸発させ、乾燥残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶かす。塩化ジメトキシトリチルの第一アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この混合物を室温で１時間撹拌する。塩化ジメトキシトリチルの第二アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この反応物をさらに１時間撹拌する。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）を加えて反応を止める。溶媒を蒸発させて、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）で摩砕する。残渣をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）に溶かし、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３と２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出する。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して、蒸発させる。０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填して溶出させる３．５ｋｇのシリカゲルカラムでこの残渣を精製する。純粋な分画を蒸発させて、表題生成物を得る。
【０１５９】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦと１８８ｍＬのピリジンより調製する、３：１混合物を７５０ｍＬ）及び無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を合わせて室温で２４時間撹拌する。最初にＴＬＣ試料をＭｅＯＨの添加で不活性化（ｑｕｅｎｃｈ）することによって、ＴＬＣにより反応をモニターする。ＴＬＣにより判定される、反応の完了時にＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、この混合物を３５℃で蒸発させる。残渣をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）に溶かし、２ｘ２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムと２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出する。水層を２００ｍＬのＣＨＣｌ３で戻し抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、残渣とする。この残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出させる。純粋な生成物の分画を蒸発させて、表題化合物を得る。
【０１６０】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）に溶かすことによって第一の溶液を調製し、取って置く。トリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）溶液へトリエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）を加え、−５℃へ冷やし、オーバーヘッド撹拌子を使用して０．５時間撹拌する。０〜１０℃に維持した撹拌溶液へＰＯＣｌ３を３０分の時間にわたり滴下して、生じる混合物をさらに２時間撹拌する。後者の溶液へ第一の溶液を４５分の時間にわたり滴下する。生じる反応混合物を冷室に一晩保存する。反応混合物より塩を濾過し、溶液を蒸発させる。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶かし、不溶性の固形物を濾過により除去する。濾過物を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ３と２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。残渣をＥｔＯＡｃで摩砕し、表題化合物を得る。
【０１６１】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）中溶液を室温で２時間撹拌する。このジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸混合させる。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶かし、２リットルのステンレススチール加圧容器へ移す。ＮＨ３ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器を１００℃で２時間加熱する（ＴＬＣは完全な変換を示した）。容器の中身を蒸発乾固させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄する。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて、表題化合物を得る。
【０１６２】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶かし、無水安息香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加える。３時間撹拌した後で、ＴＬＣはこの反応がほぼ９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸混合させる。残渣をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３（２ｘ３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて残渣を得る。この残渣を、０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリカカラムでクロマトグラフ処理する。純粋な生成物分画を蒸発させて、表題化合物を得る。
【０１６３】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶かす。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）と２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下、撹拌しながら加える。生じる混合物を室温で２０時間撹拌する（ＴＬＣは反応が９５％完了していることを示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出する。水性の洗液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で戻し抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮する。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇのシリカゲルカラムでクロマトグラフ処理する。純粋な分画を合わせて、表題化合物を得る。
【０１６４】
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野では２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］は、以下のパラグラフに記載のように製造する。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトはチミジン（５−メチルウリジン）と同様に製造するが、但し、環外アミンは、アデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル部分で、グアノシンの場合はイソブチリルで保護する。
【０１６５】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン
Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．，Ｖａｒｅｓｅ，イタリア、１００．０ｇ，０．４’６ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ，０．０１３当量、０．００５４ミリモル）をアルゴン雰囲気下に機械的に撹拌しながら周囲温度で乾燥ピリジン（５００ｍｌ）に溶かす。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ，１１９．０ｍＬ，１．１当量、０．４５８ミリモル）を１ポーションで加える。この反応物を周囲温度で１６時間撹拌する。ＴＬＣ（Ｒｆ  ０．２２，酢酸エチル）は完全な反応を示した。この溶液を減圧で濃縮して、濃厚なオイルとする。これをジクロロメタン（１Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ１Ｌ）及び塩水（１Ｌ）の間に分配する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で濃縮して、濃厚なオイルとする。このオイルを酢酸エチル及びエチルエーテルの１：１混合物（６００ｍＬ）に溶かし、この溶液を−１０℃へ冷やす。生じる結晶性の生成物を濾過により採取し、エチルエーテル（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（４０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）させて白い固形物とする。
【０１６６】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌのステンレススチール製、固定式（ｕｎｓｔｉｒｒｅｄ）加圧反応器にテトラヒドロフラン中のボラン（１．０Ｍ，２．０当量、６２２ｍＬ）を加える。換気フードにおいて手動で撹拌しながら、エチレングリコール（３５０ｍＬ，過剰）を、初めは慎重に、水素ガスの発生が静まるまで加える。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０．３’１モル）と重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ，０．００３当量）を手動撹下で加える。この反応器を密封し、１６０℃の内部温度に達するまで油浴で加熱してから、１６時間維持する（気圧＜１００ｐｓｉｇ）。この反応容器を周囲温度まで冷やしてから開放する。ＴＬＣ（Ｒｆ  ０．６７：所望の生成物、Ｒｆ  ０．８２：ａｒａ−Ｔの副生成物、酢酸エチル）は、生成物への約７０％の変換を示した。さらなる副生成物の形成を避けるために、この反応を止め、減圧（１０〜１ｍｍＨｇ）で温水浴（４０〜１００℃）により、より極端な条件を使用して、エチレングリコールを除去して濃縮する［あるいは、低沸点溶媒を除去したら、残る溶液を酢酸エチルと水との間に分画してよい。生成物は有機相にある］。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２ｋｇ，１：１〜４：１の酢酸エチル−ヘキサン勾配液）により残渣を精製する。適切な分画を集め、ストリッピングして、乾燥させて白色のカリカリとしたフォームとして、出発材料が混在した生成物と、純粋な再使用可能な出発材料を得る。
【０１６７】
２’−Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ，３６．９８ミリモル）をトリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ，４４．３６ミリモル）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ，４４．３６ミリモル）と混合する。次いで、高真空下に４０℃で２日間、Ｐ２Ｏ５で乾燥させる。この反応混合物にアルゴンを通し、乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ，アルドリッチ、密封ボトル）を加えて澄明な溶液を得る。この反応混合物へアゾジカルボン酸ジエチル（６．９８ｍＬ，４４．３６ミリモル）を滴下する。添加の速度は、生じる深赤の発色が消えたらすぐに次の一滴を加えるように維持する。この添加が完了した後で、この反応物を４時間撹拌する。そのときまでに、ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）は、反応の完了を示した。真空において溶媒を蒸発させる。得られる残渣をフラッシュカラムにかけ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させて、２’−Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白いフォームとして得る。
【０１６８】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ，４．５ミリモル）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）に溶かし、メチルヒドラジン（３００ｍＬ，４．６４ミリモル）を−１０℃〜０℃で滴下する。１時間後、この混合物を濾過し、濾過物を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、合わせた有機相を水、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。この溶液を濃縮して、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得て、次いでこれをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶かす。これへホルムアルデヒド（２０％水溶液（ｗ／ｗ）、１．１当量）を加え、生じる混合物を１時間撹拌する。溶媒を真空で除去し、残渣をクロマトグラフ処理して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白いフォームとして得る。
【０１６９】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ，３．１２ミリモル）を乾燥ＭｅＯＨ中１Ｍ  ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）溶液（３０．６ｍＬ）に溶かす。この溶液へ不活性雰囲気下に１０℃で水素化シアノホウ素ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）を加える。この反応混合物を１０℃で１０分間撹拌する。その後、この反応容器を氷浴から外し、室温で２時間撹拌して、反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％  ＭｅＯＨ）によりモニターする。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％，１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２ｘ２０ｍＬ）で抽出する。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させる。ＭｅＯＨ中の１Ｍ  ＰＰＴＳの溶液（３０．６ｍＬ）に残渣を溶かす。ホルムアルデヒド（２０％（ｗ／ｗ），３０ｍＬ，３．３７ミリモル）を加え、この反応混合物を室温で１０分間撹拌する。反応混合物を氷浴で１０℃へ冷やし、シアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）を加え、反応混合物を１０℃で１０分間撹拌する。１０分後、反応混合物を氷浴から取り出し、室温で２時間撹拌する。この反応混合物へ５％  ＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２ｘ２５ｍＬ）で抽出する。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させる。得られる残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ＣＨ２Ｃｌ２中５％  ＭｅＯＨで溶出させて、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白いフォームとして得る。
【０１７０】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ，２４．０ミリモル）を乾燥ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２ミリモル、乾燥品、ＫＯＨ上に保存）に溶かす。次いで、このトリエチルアミン−２ＨＦの混合物を５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ，２．４ミリモル）へ加え、室温で２４時間撹拌する。反応はＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％  ＭｅＯＨ）によりモニターする。溶媒を真空で除去し、残渣をフラッシュカラムにかけ、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％  ＭｅＯＨで溶出させて、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得る。
【０１７１】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ，２．１７ミリモル）を、高真空下に４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させる。次いで、これを無水ピリジン（２０ｍＬ）と共蒸発させる。得られる残渣をアルゴン雰囲気下にピリジン（１１ｍＬ）に溶かす。この混合物へ４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ，２．６０ミリモル）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ，２．６０ミリモル）を加え、この反応混合物を出発物質がすべて消失するまで室温で撹拌する。ピリジンを真空で除去し、残渣をクロマトグラフ処理し、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％  ＭｅＯＨ（数滴のピリジンを含有する）で溶出させて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得る。
【０１７２】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ，１．６７ミリモル）をトルエン（２０ｍＬ）と共蒸発させる。この残渣へＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ，１．６７ミリモル）を加え、高真空下に４０℃で一晩、Ｐ２０で乾燥させる。次いで、この反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶かし、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホロアミダイト（２．１２ｍＬ，６．０８ミリモル）を加える。この反応混合物を不活性雰囲気下に周囲温度で４時間撹拌する。反応の進行はＴＬＣ（へキサン：酢酸エチル、１：１）によりモニターする。溶媒を蒸発させてから、残渣を酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶かし、５％  ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄する。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濃縮する。得られる残渣をクロマトグラフ処理し（溶出液：酢酸エチル）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］をフォームとして得る。
【０１７３】
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野では２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］は、以下のパラグラフに記載のように製造する。アデノシン、シチジン及びチミジンのヌクレオシドアミダイトも同様に製造する。
【０１７４】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化により得ることができる。数グラム量のジアミノプリンリボシドはＳｃｈｅｒｉｎｇＡＧ（ベルリン）より購入して、微量の３’−Ｏ−異性体を含む２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを提供することができる。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼでの処理により分解して２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンへ変換することができる（McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., ＷＯ９４／０２５０１  Ａ１  ９４０２０３）。標準的な保護法により、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンが提供され、還元して２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得ることができる。従来のように、ヒドロキシル基を光延（Mitsunobu）反応によりＮ−ヒドロキシフタルイミドに置き換えて、この保護化ヌクレオシドを通常のように亜リン酸塩化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］を得ることができる。
【０１７５】
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分野では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２、又は２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても知られる）は、以下のように製造する。他のヌクレオシドアミダイトも同様に製造する。
【０１７６】
２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシエタノール（アルドリッチ、６．６６ｇ，５０ミリモル）を、１００ｍＬボンベにおいて撹拌しながら、ボランのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ミリモル）へゆっくり加える。この固形物が溶けるときに水素ガスが発生する。Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン（１．２ｇ，５ミリモル）と重炭酸ナトリウム（２．５ｍｇ）を加え、このボンベを密封し、油浴に入れ、１５５℃で２６時間加熱する。ボンベを室温へ冷やし、開放する。粗製溶液を濃縮し、残渣を水（２００ｍＬ）とヘキサン（２００ｍＬ）の間に分配する。過剰のフェノールをヘキサン層へ抽出する。水層を酢酸エチル（３ｘ２００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濃縮する。メタノール／塩化メチレン（１：２０）（２％トリエチルアミンを有する）を溶出液として使用するシリカゲルで残渣をカラム処理する。このカラム分画を濃縮すると無色の固形物を生じ、これを採取して表題化合物を白い固形物として得る。
【０１７７】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
無水ピリジン（８ｍＬ）中の０．５ｇ（１．３ミリモル）の２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジンへ、トリエチルアミン（０．３６ｍＬ）と塩化ジメトキシトリチル（ＤＭＴ−Ｃｌ，０．８７ｇ，２当量）を加え、１時間撹拌する。この反応混合物を水（２００ｍＬ）へ注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ２００ｍＬ）で抽出する。合わせたＣＨ２Ｃｌ２層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液に続いて飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒の蒸発に続き、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％トリエチルアミン入り）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより、表題化合物を得る。
【０１７８】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶かした５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ，３ミリモル）の溶液へアルゴン雰囲気下にジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（１．１ｍＬ，２当量）を加える。この反応混合物を一晩撹拌し、溶媒を蒸発させる。生じる残渣を、酢酸エチルを溶出液とするシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得る。
【実施例２】
【０１７９】
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素酸化による標準的なホスホロアミダイト化学を使用して、自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、モデル３８０Ｂ）で合成する。
【０１８０】
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、亜リン酸連結の段階的チオエート化（thiation）のために標準酸化ボトルを３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えることを除けば、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成する。チオエート化の待ち工程を６８秒まで延ばし、次いでキャッピング工程に移る。ＣＰＧカラムからの切断と、濃水酸化アンモニウムにおける５５℃（１８時間）での脱ブロックの後で、２．５倍量のエタノールで０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液より２回沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドを精製する。オリゴヌクレオチドのホスフィン酸塩は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５０８，２７０号に記載のように製造する。
【０１８１】
アルキルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように製造する。
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホン酸オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１０，２８９号又は米国特許第５，６２５，０５０号に記載のように製造する。
【０１８２】
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５６，７７５号又は第５，３６６，８７８号に記載のように製造する。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４９９に記載のように製造する。
【０１８３】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７６，９２５号に記載のように製造する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０２３，２４３号に記載のように製造する。
【０１８４】
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、いずれも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，３０２号及び第５，１７７，１９８号に記載のように製造する。
【実施例３】
【０１８５】
オリゴヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ連結オリゴヌクレオシドとしても認められる）、メチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ連結オリゴヌクレオシドとしても認められる）、及びメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド（アミド−３連結オリゴヌクレオシドとしても認められる）、及びメチレンアミノカルボニル連結オリゴヌクレオシド（アミド−４連結オリゴヌクレオシドとしても認められる）、並びに、混合骨格化合物（例えば交替的なＭＭＩとＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ連結を有する）は、いずれも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３７８，８２５号；第５，３８６，０２３号；第５，４８９，６７７号；５，６０２，２４０号；及び第５，６１０，２８９号に記載のように製造する。
【０１８６】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２６４，５６２号及び５，２６４，５６４号に記載のように製造する。
【０１８７】
酸化エチレン連結オリゴヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２３，６１８号に記載のように製造する。
【実施例４】
【０１８８】
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、「ペプチド核酸（ＰＮＡ）：合成、特性、及び潜在応用（Peptide Nucleic Acids (PNA) : Synthesis, Properties and Potential Applications）」Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 523 に参照される様々な手順のいずれかに従って製造する。これらはまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号；５，７００，９２２号；及び第５，７１９，２６２号に従って製造してもよい。
【実施例５】
【０１８９】
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又は混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプであり得る。これには、連結ヌクレオシドの「ギャップ」切片（segment）が連結ヌクレオシドの５’及び３’「ウィング」切片の間に位置する第一のタイプと、「ギャップ」切片がオリゴマー化合物の３’又は５’末端のいずれかに位置する第二の「オープンエンド」タイプが含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ギャップマー」又はギャップのあるオリゴヌクレオチドとしても知られる。第二のタイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒｓ）」又は「ウィングマー（ｗｉｎｇｍｅｒｓ）」としても知られる。
【０１９０】
［２’−Ｏ−Ｍｅ］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの切片は、上記のようにアプライド・バイオシステムズの自動ＤＮＡ合成機、Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを用いて合成する。この自動合成機を使用して、ＤＮＡ部分は２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト、５’及び３’ウィングは５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトのオリゴヌクレオチドを合成する。テトラゾール及び塩基の送達後の待ち工程を６００秒に高めることによって標準合成サイクルを改変して、ＲＮＡについては４回、２’−Ｏ−メチルについては２回繰り返す。完全保護化オリゴヌクレオチドを支持体より切断し、３：１アンモニア水／エタノール中において室温で一晩リン酸基を脱保護化してから、凍結乾固させる。次いで、メタノール性アンモニアにおける室温で２４時間の処理を行ってすべての塩基を脱保護し、試料を再び凍結乾固させる。ペレットをＴＨＦ中１Ｍ  ＴＢＡＦにて室温で２４時間再懸濁して、２’位を脱保護する。次いでこの反応を１Ｍ  ＴＥＡＡで止めてから、試料を真空回転（rotovac）により１／２容量まで減少させた後で、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する。次いで、回収したオリゴについて、分光測定により収量を、毛管電気泳動と質量分析法によって純度を分析する。
【０１９１】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記手順と同じように製造し、ホロチオエートオリゴヌクレオチドの置換は２’−Ｏ−メチルアミダイトについての２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトについての上記手順と同じように製造する。
【０１９２】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシホスホロチオエート］−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシホスホロチオエート］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを２’−Ｏ−メチルアミダイトに置き換えて、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記手順と同じように製造する。ヨウ素での酸化によりキメラ構造のウィング部分内にホスホジエステルのヌクレオチド間連結を産生し、３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用する硫化により中央ギャップにホスホロチオエートのヌクレオチド間連結を産生する。
【０１９３】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、及び混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２３，０６５号に従って合成する。
【実施例６】
【０１９４】
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム（アプライド・バイオシステムズ）からの切断と濃水酸化アンモニウムにおける５５℃で１８時間の脱ブロッキングの後で、２．５倍量のエタノールで０．５Ｍ  ＮａＣｌから２回の沈殿によりオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドを精製する。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析し、少なくとも８５％は完全な長さの材料であることを判定する。合成において得られるホスホロチオエート及びホスホジエステルの連結の相対量を３１Ｐ核磁気共鳴分光法によって定期的にチェックし、試験によっては、Chiang et al．，J．Biol．Chem. 1991, 266, 18162-18171 に記載のように、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製する。
【実施例７】
【０１９５】
オリゴヌクレオチド合成−９６穴プレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは、標準９６穴フォーマットにおいて９６の配列を同時に組み立てることが可能な自動合成機で固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学を介して合成する。ホスホジエステルのヌクレオチド間連結は、水性ヨウ素を用いた酸化によって提供される。ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結は、無水アセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用する硫化により産生する。塩基が保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトの標準品は市販ベンダー（例えば、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ、又はファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）より購入することができる。非標準ヌクレオシドは、既知の文献又は特許の方法により合成する。それらは塩基保護化β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして利用する。
【０１９６】
オリゴヌクレオチドを支持体より切断し、上昇温度（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、濃ＮＨ４ＯＨで脱保護化してから、遊離した生成物を真空で乾燥させる。次いで、乾燥した生成物を滅菌水に再懸濁して、これよりすべての分析及び試験プレート試料を、次いでロボットピペッターを利用して希釈する、マスタープレートを得る。
【実施例８】
【０１９７】
オリゴヌクレオチド解析−９６穴プレートフォーマット
各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈とＵＶ吸収分光法により評価する。各生成物の全長の完成度を９６穴フォーマット（ベックマン  Ｐ／ＡＣＥＴＭ  ＭＤＱ）で、又は個別に製造した試料については、市販のＣＥ装置（例、ベックマン  Ｐ／ＡＣＥＴＭ  ５０００，ＡＢＩ  ２７０）のいずれかにおいて、毛管電気泳動法（ＣＥ）により評価する。塩基と骨格の組成は、エレクトロスプレー質量分析法を利用する化合物の質量分析によって確認する。すべてのアッセイ試験プレートは、単数／複数チャンネルロボットピペッターを使用してマスタープレートより希釈する。プレート上の化合物の少なくとも８５％が少なくとも８５％完全な長さであれば、そのプレートは許容されると判定する。
【実施例９】
【０１９８】
細胞培養とオリゴヌクレオチド処理
標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能レベルで存在していれば、多種多様な細胞型のいずれでも試験することができる。これは、例えばＰＣＲ又はノーザンブロット解析を使用して定型的に判定することができる。以下の６種の細胞型を説明の目的に提供するが、選択した細胞型において標的が発現されていれば、他の細胞型も定形的に使用してよい。これは、当該技術分野における定型的な方法、例えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護化アッセイ、又はＲＴ−ＰＣＲにより容易に決定することができる。
【０１９９】
Ｔ−２４細胞：
ヒトの移行細胞である膀胱癌細胞系、Ｔ−２４は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア州）より入手する。Ｔ−２４細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）、ペニシリン１００単位／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍＬ（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を補充した完全マッコイ５Ａ基底培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）において定型的に培養する。細胞は、９０％の集密度に達したとき、トリプシン処理と希釈をし、定型的に継代培養する。ＲＴ−ＰＣＲ解析における使用には、７０００細胞／ウェルの密度で細胞を９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）へ播く。
【０２００】
ノーザンブロッティングや他の解析には、１００ｍｍや他の標準組織培養プレート上に細胞を播いて、適量の培地とオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理してよい。
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞系、Ａ５４９は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナッサス）より入手することができる。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）、ペニシリン１００単位／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を補充したＤＭＥＭ基底培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）において定型的に培養する。細胞は、９０％の集密度に達したとき、トリプシン処理と希釈をし、定型的に継代培養する。
【０２０１】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、クローンティクス・コーポレーション（メリーランド州ウォーカーズビル）より入手することができる。ＮＨＤＦは、サプライヤーにより推奨されるように補充した線維芽細胞増殖培地（クローンティクス・コーポレーション、メリーランド州ウォーカーズビル）において定型的に維持する。サプライヤーにより推奨されるように、１０回までの継代培養で細胞を維持する。
【０２０２】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胚ケラチノサイト（ＨＥＫ）は、クローンティクス・コーポレーション（メリーランド州ウォーカーズビル）より入手することができる。ＨＥＫは、サプライヤーの推奨のように製剤化したケラチノサイト増殖培地（クローンティクス・コーポレーション、メリーランド州ウォーカーズビル）において定型的に維持する。サプライヤーの推奨のように、１０回までの継代培養で細胞を維持する。
【０２０３】
ＭＣＦ−７細胞：
ヒト乳癌細胞系、ＭＣＦ−７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナッサス）より入手する。ＭＣＦ−７細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を補充したＤＭＥＭ低グルコース培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）において定型的に培養する。細胞は、９０％の集密度に達したとき、トリプシン処理と希釈をし、定型的に継代培養する。ＲＴ−ＰＣＲ解析における使用には、７０００細胞／ウェルの密度で細胞を９６穴プレート（ファルコン−プリマリア  ＃３８７２）へ播く。
【０２０４】
ノーザンブロッティングや他の解析には、１００ｍｍや他の標準組織培養プレート上に細胞を播いて、適量の培地とオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理してよい。
ＬＡ４細胞：
マウス肺上皮細胞系、ＬＡ４は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナッサス）より入手する。ＬＡ４細胞は、１５％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を補充したＦ１２Ｋ培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）において定型的に培養する。細胞は、９０％の集密度に達したとき、トリプシン処理と希釈をし、定型的に継代培養する。ＲＴ−ＰＣＲ解析における使用には、３０００〜６０００細胞／ウェルの密度で細胞を９６穴プレート（ファルコン−プリマリア  ＃３８７２）へ播く。
【０２０５】
ノーザンブロッティングや他の解析には、１００ｍｍや他の標準組織培養プレート上に細胞を播いて、適量の培地とオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理してよい。
アンチセンス化合物での処理：
細胞が８０％の集密度に達したとき、それをオリゴヌクレオチドで処理する。９６穴プレートで増殖した細胞については、２００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ−１減血清培地（ギブコＢＲＬ）でウェルを１回洗浄してから、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（ギブコＢＲＬ）３．７５μｇ／ｍＬ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ−１の１３０μＬと所望濃度のオリゴヌクレオチドで処理する。４〜７時間の処理の後、この培地を新鮮な培地に取り替える。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に細胞を採取する。
【０２０６】
使用するオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞系ごとに変動する。特定の細胞系に最適なオリゴヌクレオチドの濃度を決定するために、ある範囲の濃度のポジティブコントロールオリゴヌクレオチドで細胞を処理する。
【実施例１０】
【０２０７】
ＶＣＣ−１発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
ＶＣＣ−１発現のアンチセンス変調は、当該技術分野で知られている様々なやり方でアッセイすることができる。例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＶＣＣ−１のｍＲＮＡレベルを定量することができる。現時点で好ましいのは、リアルタイム定量的ＰＣＲである。ＲＮＡ解析は、全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに基づいて実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第１巻 4.1.1-4.2.9 及び 4.5.1-4.5.3 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1993）に教示されている。ノーザンブロット解析は当該技術分野において定型的であり、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第１巻 4.2.1-4.2.9 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1996）に教示されている。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００配列検出システム（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティより入手可能、製造業者の指示書に従って使用する）を使用して、簡便に達成することができる。定量的ＰＣＲ解析に先立って、測定する標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブのセットについて、ＧＡＰＤＨ増幅反応で「多重反応する（multiplexed）」能力を評価する。多重反応においては、標的遺伝子と内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの両方を単一試料中で同時に増幅する。この解析では、未処理細胞より単離したｍＲＮＡを系列希釈する。ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「単一反応（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）、又は両方（多重反応）に特異的なプライマー−プローブセットの存在下に各希釈物を増幅する。ＰＣＲ増幅に続いて、ＧＡＰＤＨ及び標的ｍＲＮＡのシグナルを希釈の関数とする標準曲線を単一反応の試料と多重反応の試料の両方より作成する。多重反応試料より生じるＧＡＰＤＨ及び標的のシグナルの傾き及び相関係数の両方が、単一反応試料より生じるその対応値の１０％以内に入れば、その標的に特異的なプライマー−プローブのセットを多重反応可能であるとみなす。他のＰＣＲの方法も当該技術分野で知られている。
【０２０８】
ＶＣＣ−１のタンパク質のレベルは、免疫沈降法、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ又は蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）のような当該技術分野でよく知られている様々なやり方で定量することができる。ＶＣＣ−１へ向けられた抗体は、ＭＳＲＳの抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ・コーポレーション、ミシガン州バーミンガム）のような様々な供給元から確認して入手しても、慣用の抗体産生法により調製してもよい。ポリクローナル抗血清の調製法は、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第２巻 11.12.1-11.12.9 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1997）に教示されている。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第２巻 11.4.1-11.11.5 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1997）に教示されている。
【０２０９】
免疫沈降法は当該技術分野の標準法であり、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第２巻 10.16.1-10.16.11 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1998）に見出すことができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）解析は当該技術分野の標準法であり、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第２巻 10.8.1-10.8.21 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1997）に見出すことができる。酵素結合性免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）は当該技術分野の標準法であり、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第２巻 11.2.1-11.2.22 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1991）に見出すことができる。
【実施例１１】
【０２１０】
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764 に従って単離する。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離の他の方法は、例えば、Ausubel, F. M. et al.「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第１巻 4.5.1-4.5.3 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（1993）に教示されている。簡略に言うと、９６穴プレートで増殖した細胞について、増殖培地を細胞より除去し、各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄する。６０μＬのリーシス（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％  ＮＰ−４０，２０ｍＭ  バナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルへ加え、プレートを穏やかに揺り動かしてから、室温で５分間インキュベートする。オリゴｄ（Ｔ）でコートした９６穴プレート（ＡＧＣＴ社、カリフォルニア州アーヴィン）へ５５μＬの溶解液を移す。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄する。最終洗浄の後で、プレートをペーパータオルに吸い取らせて過剰な洗浄緩衝液を除去してから、５分間空気乾燥させる。７０℃へ予熱した６０ｐＬの溶出緩衝液（５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６）を各ウェルへ加え、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートしてから、この溶出液を新鮮な９６穴プレートへ移す。
【０２１１】
１００ｍｍや他の標準プレート上で増殖した細胞は、すべての溶液の適量を使用して、同様に処理してよい。
【実施例１２】
【０２１２】
全ＲＮＡの単離
キアジェン（Qiagen）社（カリフォルニア州バレンシア）より購入するＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭのキット及び緩衝液を使用し、製造業者の推奨手順に従って全ｍＲＮＡを単離する。簡略に言うと、９６穴プレートで増殖した細胞について、増殖培地を細胞より除去し、各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄する。１００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを各ウェルへ加え、プレートを２０秒間激しく揺り動かす。次いで、１００μＬの７０％エタノールを各ウェルへ加え、吸ったり出したりのピペッティング操作を３回することによって中身を混合する。次いで、排液回収トレイが付いて真空源とつながっているＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドを取り付けたＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭ穴プレートへ試料を移す。真空を１５秒かける。ＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭプレートの各ウェルへ１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を加え、再び真空を１５秒かける。次いで、ＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭプレートの各ウェルへ１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを加え、真空を１５秒の時間の間かける。次いでＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥの洗浄を繰り返し、真空をさらに１０分間かける。次いでＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドよりプレートを取り出し、ペーパータオルで吸い取って乾燥させる。次いで、１．２ｍＬ回収管を含有する回収管ラックが付いたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドへプレートを再び付ける。水６０μＬを各ウェルへピペッティングし、１分インキュベートし、次いで真空を３０秒かけることによってＲＮＡを溶出させる。さらに水６０μＬを用いて溶出工程を繰り返す。
【０２１３】
この反復的なピペッティング及び溶出の工程は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４（キアジェン社、カリフォルニア州バレンシア）を使用して自動化することができる。本質的には、細胞を培養プレート上で溶解した後で、プレートをロボットデッキへ移し、ここでピペッティング、ＤＮアーゼ処理、及び溶出の工程を行う。
【実施例１３】
【０２１４】
ＶＣＣ−１  ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ解析
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００配列検出システム（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用するリアルタイム定量的ＰＣＲによって、製造業者の指示書に従ってＶＣＣ−１  ｍＲＮＡレベルの定量を決定する。これは封管の、非ゲルベースの蛍光検出システムであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のリアルタイムでのハイスループット定量を可能にする。ＰＣＲが完了した後で増幅産物を定量する標準ＰＣＲとは反対に、リアルタイム定量的ＰＣＲの産物は、蓄積すると同時に定量される。このことは、前進及び逆進ＰＣＲプライマーの間で特異的にアニールし、２種の蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に含めることによって達成される。プローブの５’端へレポーター色素（例、ＪＯＥ又はＦＡＭＴＭ、又はＶＩＣ；オペロン・テクノロジー社、カリフォルニア州アラメダ又はＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティのいずれかより入手する）を付け、プローブの３’端へはクエンチャー（quencher）色素（例、ＴＡＭＲＡ；オペロン・テクノロジー社、カリフォルニア州アラメダ又はＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティのいずれかより入手する）を付ける。プローブと色素がインタクトであるとき、３’クエンチャー色素が近傍にあるためにレポーター色素の放出が抑制される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングにより、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エクソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質が創出される。ＰＣＲ増幅サイクルの伸張期の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断により、プローブの残り部分から（同時にクエンチャー部分からも）レポーター色素が放出され、配列特異的な蛍光シグナルが産生される。各サイクルで、それぞれのプローブから追加のレポーター色素分子を切断し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００配列検出システムに組込まれたレーザー光により一定間隔で蛍光強度をモニターする。それぞれのアッセイにおいて、未処理対照試料からのｍＲＮＡの系列希釈を含有する一連の並行反応より標準曲線を作成し、これを使用して、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害率を定量する。
【０２１５】
ＰＣＲ試薬は、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティより入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５μＬのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含有する９６穴プレートへ２５μＬのＰＣＲカクテル（１ｘＴＡＱＭＡＮＴＭ緩衝液Ａ，５．５ＭＭ  ＭｇＣｌ２，各３００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ，６００μＭのｄＵＴＰ，各１００ｎＭの前進プライマー、逆進プライマー及びプローブ、２０単位のＲＮアーゼ阻害剤、１．２５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤＴＭ、及び１２．５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素）を加えることにより行った。ＲＴ反応は、４８℃で３０分間のインキュベーションにより行った。９５℃で１０分間のインキュベーションでＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤＴＭを活性化した後で、４０サイクルの２工程ＰＣＲプロトコールを以下のように実行した：９５℃、１５秒間（変性化）に続く６０℃、１．５分間（アニーリング／伸張）。
【０２１６】
ヒトＶＣＣ−１に対するプローブ及びプライマーは、公知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  ＸＭ＿０５８９４５，図１として本明細書に組み込まれる）を使用して、ヒトＶＣＣ−１配列へハイブリダイズするように設計した。ヒトＶＣＣ−１では、ＰＣＲプライマーは以下の通りであった：
前進プライマー：ＣＧＡＣＡＧＴＴＧＣＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＣＴ（配列番号：１１００）
逆進プライマー：ＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＴＡＧ（配列番号：１１０１）。そして、ＰＣＲプローブは、ＦＡＭＴＭ−ＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣ（配列番号：１１０２）−ＴＡＭＲＡであり、ここで、ＦＡＭＴＭ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）は蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）はクエンチャー色素である。ヒトのシクロフィリンでは、ＰＣＲプライマーは以下の通りであった：
前進プライマー：ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＴ（配列番号：１１０３）  逆進プライマー：ＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＴ（配列番号：１１０４）。そして、ＰＣＲプローブは、５’ＪＯＥ−ＣＧＣＧＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡ（配列番号：１１０５）−ＴＡＭＲＡ３’であり、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）は蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）はクエンチャー色素である。
【実施例１４】
【０２１７】
２’−ＭＯＥウィング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＶＣＣ−１発現のアンチセンス阻害
本発明により、公知の配列（ＸＭ＿０５８９４５，図１として本明細書に組み込まれる）を使用して、ヒトＶＣＣ−１  ＲＮＡの様々な領域へ標的指向するように一連のオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドを表１〜３５に示す。「位置」は、このオリゴヌクレオチドが結合する特別な標的配列の最初の（５’末端）ヌクレオチドの番号を示す。各オリゴについて示す変数は、David H. Mathews, Michael Zuker, and Douglas H. Turner による「ＲＮＡ構造３．７（ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３．７）」を使用して予測した。この変数は、自由エネルギー（反応が起きる時に放出されるエネルギー。この数字がより負であるほど、反応がより起こりやすい。自由エネルギーの単位は、いずれもｋｃａｌ／モルである）又は融解温度（ポリ核酸の２つのアニール鎖が分離するときの温度。この温度が高いほど、２つの鎖間のアフィニティーが大きい）のいずれかとして記載する。高いアフィニティーで結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するときは、標的ＲＮＡ鎖及びアンチセンスオリゴマーの構造を考察することが望ましい。具体的に言うと、緊密に結合する（表では、「二本鎖形成」と記載する）オリゴマーでは、それは、自己構造（表では、その自由エネルギーを「標的構造」と記載する）をほとんど有さない標的ＲＮＡのストレッチに相補的であるべきである。また、このオリゴマーは、分子内（表では、その自由エネルギーを「分子内オリゴ」と記載する）又は二分子の（表では、その自由エネルギーを「分子間オリゴ」と記載する）いずれの自己構造もほとんど有してはならない。どの自己構造を壊しても、結合ペナルティになる。表１〜３５の化合物はいずれもいずれも長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域と、その両側（５’及び３’方向）に隣接する４個のヌクレオチド「ウィング」より構成される。ウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間（骨格）連結は、オリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は、５−メチルシチジンである。シチジン残基は、いずれも５−メチルシチジンである。
【０２１８】
【表１】
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【０２１９】
【表２】
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【０２２０】
【表３】
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【０２２１】
【表４】
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【０２２２】
【表５】
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【０２２３】
【表６】
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【０２２４】
【表７】
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【０２２５】
【表８】
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【０２２６】
【表９】
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【０２２７】
【表１０】
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【０２２８】
【表１１】
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【０２２９】
【表１２】
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【０２３０】
【表１３】
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【０２３１】
【表１４】
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【０２３２】
【表１５】
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【０２３３】
【表１６】
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【０２３４】
【表１７】
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【０２３５】
【表１８】
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【０２３６】
【表１９】
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【０２３７】
【表２０】
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【０２３８】
【表２１】
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【０２３９】
【表２２】
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【０２４０】
【表２３】
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【０２４１】
【表２４】
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【０２４２】
【表２５】
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【０２４３】
【表２６】
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【０２４４】
【表２７】
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【０２４５】
【表２８】
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【０２４６】
【表２９】
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【０２４７】
【表３０】
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【０２４８】
【表３１】
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【０２４９】
【表３２】
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【０２５０】
【表３３】
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【０２５１】
【表３４】
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【０２５２】
【表３５】
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【実施例１５】
【０２５３】
ＶＣＣ−１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析（イムノブロット解析）は標準法を使用して行う。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２０時間後に細胞を採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００ｕＬ／ウェル）に懸濁させ、５分間煮沸して、１６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする。１５０Ｖで１．５時間ゲルを泳動し、ウェスタンブロッティング用の膜へ移す。ＶＣＣ−１に対する適切な一次抗体、並びにこの一次抗体種に対する放射標識又は蛍光標識の二次抗体を使用する。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（モレキュラーダイナミクス、カリフォルニア州サニーヴェール）を使用してバンドを視覚化する。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】図１は、ｃＤＮＡ配列とそれよりコードされるＶＣＣ−１タンパク質の配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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