(57)【要約】病虫害に対する植物病害耐性を強化または生成するための方法および組成物を提供する。本発明の新規イネＰｉ２様耐病性遺伝子によって植物を形質転換することで、該植物の耐病性を高める。耐病性が高まった形質転換植物細胞、組織、および種子も提供する。本発明の組成物は、イネからクローニングされた新規Ｐｉ２様耐病性遺伝子ホモログのヌクレオチド配列であり、それによってコードされるタンパク質もしくは部分的長さのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３、７、もしくは１１に示される配列、またはその相補体を含む核酸分子、
（ｂ）配列番号４、８、または１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｃ）配列番号３、７、または１１に示される配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有し、植物に対して耐病性を与えるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｄ）植物に対して耐病性を与える能力を保持し、かつ配列番号４、８、または１２の少なくとも４０個の隣接したアミノ酸を含む、配列番号４、８、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子、および
（ｅ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の配列にハイブリダイズし、植物に対して耐病性を与えるポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項２】
植物細胞中での発現を駆動するプロモーターに作動可能に結合する請求項１記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡ構築物を含むベクター。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡ構築物をゲノムに安定的に組み込んだ植物細胞。
【請求項５】
請求項２記載のＤＮＡ構築物をゲノムに安定的に組み込んだ植物。
【請求項６】
植物中で耐病性を生成または増強するための方法であって、該方法は、植物細胞中でのコード配列の発現を駆動するプロモーターに作動可能に結合する核酸分子を含むＤＡＮ構築物で該植物を形質転換することと、安定的に形質転換された植物を再生することとを含み、該核酸分子が
（ａ）配列番号３、７、または１１に示される配列を含む核酸分子、
（ｂ）配列番号４、８、または１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｃ）配列番号３、７、または１１に示される配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有し、植物に対して耐病性を与えるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｄ）植物に対して耐病性を与える能力を保持し、かつ配列番号４、８、または１２の少なくとも４０個の隣接したアミノ酸を含む、配列番号４、８、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子、および
（ｅ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の配列の相補体にハイブリダイズし、植物に対して耐病性を与えるポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される、方法。
【請求項７】
前記植物が双子葉類である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記植物が単子葉類である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記単子葉類がトウモロコシ、モロコシ、オオムギ、イネ、およびコムギからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
植物細胞中でのコード配列の発現を駆動するプロモーターに作動可能に結合する核酸分子を含むＤＮＡ構築物で安定的に形質転換される植物であって、前記核酸分子が
（ａ）配列番号３、７、もしくは１１に示される配列、またはその相補体を含む核酸分子、
（ｂ）配列番号４、８、または１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｃ）配列番号３、７、または１１に示される配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有し、植物に対して耐病性を与えるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｄ）植物に対して耐病性を与える能力を保持し、かつ配列番号４、８、または１２の少なくとも４０個の隣接したアミノ酸を含む、配列番号４、８、または１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子、および
（ｅ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の配列にハイブリダイズし、植物に対して耐病性を与えるポリペプチドをコードする核酸分子、
からなる群から選択される、植物。
【請求項１３】
前記植物が双子葉類である、請求項１２記載の植物。
【請求項１４】
前記植物が単子葉類である、請求項１２記載の植物。
【請求項１５】
前記単子葉類がトウモロコシ、モロコシ、オオムギ、イネ、およびコムギからなる群から選択される、請求項１４記載の植物。
【請求項１６】
前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項１２記載の植物。
【請求項１７】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１２記載の植物。
【請求項１８】
請求項１２記載の植物のトランスジェニック種子。
【請求項１９】
請求項１３記載の植物のトランスジェニック種子。
【請求項２０】
請求項１４記載の植物のトランスジェニック種子。
【請求項２１】
請求項１５記載の植物のトランスジェニック種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に植物分子生物学に関する。より詳しくは、本発明は核酸と植物での該核酸の発現を調整するための方法とに関し、さらに耐病性を高めるために植物に導入される形質転換遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
イネいもち病は、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａという真菌）によって引き起こされ、イネにとって最も破壊的な疾患の１つであり、世界中の稲作地帯の大部分で発生する。植物の被害に関して、イネいもち病はイネ植物生長の栄養期間において一般に葉いもちを生じ、生殖期間に植物が感染した場合（穂および節いもち）は不稔性となる。この後者がもたらす影響は、農家にとって年間約５０億ドルの経済的損失と推定される劇的な収率および品質の低下が生ずることである（Ｍｏｆｆａｔ  （１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１８０４−１８０５）。
【０００３】
稲作農業者は一般に経済力が限られており、多くの場合、その疾患に対して自然耐性を示すイネ栽培品種を用いることでイネいもち病の制御をおこなっている。しかし、これらの栽培品種によって示される耐病性は、耐性として公表された栽培品種が広範囲にわたる栽培をわずか２、３シーズンおこなった後で罹病性を示すことから、一般に不安定である。この不安定性にもかかわらず、抵抗性栽培品種の使用は、依然として、イネいもち病を抑制する上で最も経済的かつ効果的な方法である。したがって、そのような耐病性栽培品種がいまだ求められている。
【０００４】
抵抗性栽培品種が自然に起こるにもかかわらず、最近の研究は高耐病性植物の生成または改良のための遺伝学的方法に集中している。したがって、この４０年の間、そのような永続的耐性の栽培品種を開発するために、イネ遺伝学者および育種家によって、いもち耐性生殖細胞質の遺伝学が研究されている。いもちに対する耐性を遺伝学的に分析する方法は、Ｇｏｔｏが日本でイネいもち病菌（Ｍ．  ｇｒｉｓｅａ）の複数の系統に対して異なる系を確立した１９６０年代初頭を起源とする（Ｏｕ  （１９８５）  Ｒｉｃｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｍｍｏｎｗｅｌｔｈ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｉｔｕｔｅ，  Ｓｌｏｕｇｈ，  Ｕ．Ｋ）。
【０００５】
特に重要な１つのいもち耐性遺伝子は、Ｐｉ２遺伝子である。この遺伝子は、いもち病分離株の多種多様な集団に対する広範囲にわたって有効性の高い耐性を示すことから、１０年以上にわたって使用した後でも広範囲のイネ栽培品種で効果が保たれる。イネ・ゲノムでのこの遺伝子の位置が決定されているにもかかわらず（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：４７１−４７６；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍ．  ２６７：４７２−４８０）、そのＤＮＡ配列は未知のままである。耐病性を生成または改善するための技術がそのような配列の知識に依存していることから、Ｐｉ２遺伝子の実際のＤＮＡ配列を得ることがとても必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
病虫害に対する耐性を生成または強化するための組成物および方法を提供する。組成物は、イネからクローニングされた新規Ｐｉ２様耐病性遺伝子ホモログのヌクレオチド配列であり、それによってコードされるタンパク質もしくは部分的長さのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列である。本発明の方法は、植物細胞内のヌクレオチド・コード配列の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に結合したこれらの新規耐病性Ｐｉ２様遺伝子ホモログを１つ以上によって、植物を安定的に形質転換させることを伴う。新規ヌクレオチド配列の発現は、侵入植物病原菌によって植物体内に放出された相補的な植物病原体非病原性遺伝子産物と相互作用することによって、耐病性が植物に与えられる。本発明の方法は、菌類病原体、ウイルス、線虫、昆虫等を含む病虫害の抑制に用途が見いだされる。
【０００７】
形質転換植物および種子とそのような植物および種子を作る方法とがさらに提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明の組成物は、耐病性に関与するＰｉ２および関連（Ｐｉ２様）遺伝子を含む。特に、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２に示す単離核酸をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。さらに提供するものは、本明細書に記載される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列、例えば配列番号１、３、５、７、９、および１１に示すアミノ酸配列を持つポリペプチドである。
【０００９】
本発明は、配列番号１、３、６、７、９、および１１として、ＮＢＳ１〜ＮＢＳ６のそれぞれの核酸配列を開示する。本発明は、また配列番号２、４、６、８、１０、および１２として、ＮＢＳ１〜６のそれぞれに対応するアミノ酸配列も開示する。配列番号１３は、実施例３で得られたＰｉ２領域にある９９，０９０ｂｐの連続した配列を開示する。配列番号１４および１５は、それぞれ実施例６のｃＤＮＡ−４５およびｃＤＮＡ−２１に対応、すなわち終止コドンを過ぎてのびるＮＢＳ４の部分的にシークエンシングされた２つの３’フラグメントに対応し、ＮＢＳ４遺伝子の３’末端をフランキングするＤＮＡフラグメントが含まれる。
【００１０】
本発明は、単離または実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を含む。「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」された核酸分子またはタンパク質、あるいはその生物学的活性のあるタンパク質は、その天然に生ずる環境で見いだされる核酸分子またはタンパク質と通常伴うまたは相互作用する構成要素から実施的にまたは本質的に自由である。したがって、単離または精製された核酸分子もしくはタンパク質が、組換え技術によって生産された場合、他の細胞材料、あるいは培地から実質的に自由であり、あるいは化学的に合成された他の化学物質または化学物質前駆体から実質的に自由である。好ましくは、「単離」された核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにある核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置した配列）を自然にフランキングする配列（好ましくは、タンパク質コード化配列）から自由である。例えば、種々の実施形態では、単離された核酸分子は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡにある核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置した配列）を自然にフランキングするヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満の核酸を含むことができる。細胞材料から実質的に自由であるタンパク質として、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量あたり）未満の不純タンパク質を含むタンパク質の製剤が挙げられる。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性のあるタンパク質が組換え的に生成された場合、好ましくは、培地は約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量あたり）の化学的前駆体または重要な非タンパク質化学物質を表す。
【００１１】
開示したヌクレオチド配列およびそれによってコードされるタンパク質のフラグメントおよび変異体もまた、本発明によって包含される。「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」によって意図するものは、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部であり、それによってタンパク質がコードされる。ヌクレオチド配列のフラグメントは、天然タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質フラグメントをコードするものであってもよく、それによって耐病性が与えられる。あるいは、ハイブリダイゼーション・プローブとして有用であるヌクレオチド配列のフラグメントは、植物に対する生物学的活性を保持するフラグメント・タンパク質を一般にコードしていない。したがって、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、さらに最大で、本発明のタンパク質をコードする完全長ヌクレオチド配列の範囲であってもよい。
【００１２】
本発明のＰｉ２様ポリペプチドの生物学的活性部分をコードするＰｉ２様ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６６０、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００の連続したアミノ酸、あるいは最大で本発明の完全長Ｐｉ２様タンパク質に存在するアミノ酸総数（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、および１２に関してはそれぞれ９９３、１０３２、６６０、１０３２、４９、および９９８アミノ酸）までをコードすることができる。ハイブリダイゼーション・プローブまたはＰＣＲプライマーとしてＰｉ２様ヌクレオチド配列のフラグメントは、一般にＰｉ２様タンパク質の生物活性部分をコードする必要がない。
【００１３】
したがって、Ｐｉ２様ヌクレオチド配列のフラグメントは、Ｐｉ２様タンパク質の生物活性部分をコードすることが可能であり、あるいは以下に説明する方法を用いてハイブリダイゼーション・プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いることができるフラグメントであってもよい。Ｐｉ２様タンパク質の生物活性部分の調製は、本発明のＰｉ２様ヌクレオチド配列のうちの１つの一部分を単離し、Ｐｉ２様タンパク質のコード部分を発現させ（例えば、生体内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での組換え発現によって）、さらに、Ｐｉ２様タンパク質のコード部分の活性を評価することによって、なされる。Ｐｉ２様ヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子は、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６６０、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６６０、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、１９５０、３０００、または３０５０のヌクレオチド、あるいは最大で、本明細書に開示した完全長Ｐｉ２様ヌクレオチド配列の総数（例えば、配列番号１、３、５、７、９、および１１に関してそれぞれ２９８２、３０９９、４１４７、３０９９、１３８９、および２９９７ヌクレオチド）を含む。
【００１４】
「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」は、実質的に類似した配列を意図している。ヌクレオチド配列に関して、保守的変異体として、遺伝子コードが縮退することから、本発明のＰｉ２様ポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。それらのような天然に生ずる対立遺伝子多型は、周知の分子生物学的技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術（概要を以下に示す））を用いて同定することができる。変位ヌクレオチド配列として、合成由来のヌクレオチド配列（例えば、部位特異的突然変異誘を用いて生成されるが、本発明のＰｉ２様タンパク質をいまだコードするもの）も挙げられる。一般に、本発明の特定のヌクレオチド配列の変異体は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、概ね少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、さらに好ましくは少なくとも約９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有することができ、該配列同一性は、その特定のヌクレオチド配列に対して、本明細書中に別記され、かつデフォルト・パラメータを用いた配列アラインメント・プログラムによって決定される。
【００１５】
「変異体」タンパク質は、天然タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対して１つ以上のアミノ酸の欠失（所謂トランケーション）または付加をおこなうこと、天然タンパク質中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸の欠失または付加をおこなうこと、あるいは天然タンパク質の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸の置換をおこなうことによって、天然タンパク質から誘導されるタンパク質を意図している。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物活性があり、すなわち、天然タンパク質の所望の生物活性（すなわち本明細書に記載するＰｉ２様活性）を有し続ける。そのような変異体として、例えば、遺伝的多型または人為的操作によって生じたものも考えられる。生物活性のある本発明の天然Ｐｉ２様タンパク質変異体は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、概ね少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することができ、該配列同一性は、その天然タンパク質のアミノ酸配列に対して、本明細書中に別記され、かつデフォルト・パラメータを用いた配列アラインメント・プログラムによって決定される。生物活性がある本発明のタンパク質変異体は、そのタンパク質とわずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、またはたったの１アミノ酸残基だけが異なるものであってもよい。
【００１６】
本発明のタンパク質を種々の方法で改変させることが可能であり、該方法としてアミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入が挙げられる。そのような操作のための方法は、一般に公知である。例えば、Ｐｉ２様タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって調製される。突然変異誘発およびヌクレオチド配列改変の方法は、周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，  ｅｄｓ．  （１９８３）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびこれらの文献に引用された参考文献を参照せよ。目的とするタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルに見いだすことが可能であり、該文献を本明細書では援用する。保守的置換（例えば、１つのアミノ酸を類似の性質を持つ別のアミノ酸と交換すること）が好ましいと考えられる。
【００１７】
したがって、本発明の遺伝子およびヌクレオチド配列は、自然発生的な配列と突然変異体形態との両方を含む。同様に、本発明のタンパク質は、自然発生的なタンパク質とその変異体および修飾形態との両方を含む。そのような変異体は、所望のＰｉ２様活性を有し続けることができる。明らかに、変異体をコードするＤＮＡに生ずる突然変異は、リーディング・フレームの外に配列を配置してはならず、好ましくはｍＲＮＡ二次構造を生産しうる相補的領域を生成するものではない。ＥＰ特許出願公報第７５，４４４号を参照せよ。
【００１８】
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、および置換は、該タンパク質の特性が急激に変化することを期待するものではない。しかし、置換、欠失、または挿入をおこなう前にその影響が正確には予測することが困難である場合、当業者はその影響がルーチンのスクリーニング・アッセイによって評価できることを理解する。すなわち、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍ．  ２６７：４７２−４８０（本明細書で援用）に記載されているようなアッセイを用いて、上記活性を評価することができる。
【００１９】
変異体ヌクレオチド配列およびタンパク質も、ＤＮＡシャフリング等の突然変異誘発的および遺伝子組換え的手法によって得られる配列およびタンパク質を包含する。そのような手法によって、１種類以上の異なるＰｉ２様コード配列を操作して、所望の特性を持つＰｉ２様ポリペプチドをコードする新規Ｐｉ２様配列を生成することができる。このようにして、組換えポリヌクレオチド・ライブラリーが、実質的配列同一性を有し、かつ生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で相同的に組換えうる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から生成される。例えば、このアプローチを用いて、目的とするドメインをコードする配列モチーフを、本発明のＰｉ２様遺伝子と他の既知のＰｉ２様遺伝子とのあいだでシャフルすることで、目的とする改善された特性（例えば、酵素の場合はＫｍ値の増加）を持つタンパク質をコードする新規遺伝子を得ることが可能である。そのようなＤＮＡシャフリングのための戦略は、公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１、Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：４３６−４３８、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７２：３３６−３４７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１、および米国特許第５，６０５，７９３号および第５，８３７，４５８号を参照せよ。
【００２０】
本発明のヌクレオチド配列は、多々の生物、特に他の植物（単子葉類および双子葉類を含む）から対応配列を単離することに用いることができる。このように、そのような配列の単離は、本明細書に述べた配列との配列相同性にもとづいて、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、その他の方法を用いておこなうことができる。本明細書に示したＰｉ２様配列全体またはそのフラグメントに対する配列同一性にもとづいて単離された配列は、本発明に包含される。そのような配列として、開示した配列のオルソログスである配列が挙げられる。「オルソログス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）」は、共通の先祖遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種に見いだされる遺伝子を意図している。異なる種に見いだされる遺伝子は、そのヌクレオチド配列および／またはコード化されたタンパク質が本明細書に別記したように実施的な同一性を共有する場合、オルソログスと考えられる。オルソログスの機能は、しばしば種間で高度に保存されている。したがって、本発明は、Ｐｉ２様タンパク質をコードし、かつストリンジェントな条件下で本明細書に開示されたＰｉ２様ヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントとハイブリダイズする単離配列を、包含する。
【００２１】
ＰＣＲアプローチでは、オリゴヌクレオチド・プライマーは、ＰＣＲ反応で用いられるように設計されており、目的とする任意の植物から抽出されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の対応ＤＮＡ配列を増幅する。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は、一般に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９５）  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９９）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照せよ。既に知られているＰＣＲ法として、限定されるものではないが、対のプライマー、ネステッド・プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチ・プライマー等が挙げられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション技術では、公知ヌクレオチドの全てまたは一部を、選択された生物由来のクローン化ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）に存在する他の対応ヌクレオチド配列に対して選択的にハイブリダイズするプローブとして、用いられる。ハイブリダイゼーション・プローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、また検出可能な基、例えば３２Ｐまたは任意の他の検出可能なマーカーによって標識されることも可能である。したがって、例えば、ハイブリダイゼーション用プローブの作製は、本発明のＰｉ２様配列にもとづいた合成オリゴヌクレオチドを標識することによって、おこなうことができる。ハイブリダイゼーション用プローブを調製する方法とｃＤＮＡおよびゲノム・ライブラリーを構築するための方法とは、一般に公知であり、またＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．）に開示されている。
【００２３】
例えば、本明細書に開示された完全なＰｉ２様配列の１つまたはその１つ以上の部分を、対応Ｐｉ２様配列および伝令ＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるプローブとして使用してもよい。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブとして、Ｐｉ２様配列間ではユニークで、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは約２０ヌクレオチドの長さである配列が挙げられる。そのようなプローブは、ＰＣＲによって、選択された植物由来の対応Ｐｉ２様配列を増幅するために使われる。この技術は、所望の植物から追加のコード配列を単離するために、植物でのコード配列の存在を決定する診断アッセイとして、用いられることが可能である。
【００２４】
そのような診断アッセイの一例として、マーカーを用いた選択がある。この技術では、Ｐｉ２遺伝子の一部に対応するマーカー・ヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーション・プローブとして、またはＰｉ２遺伝子の存在について植物をスクリーニングするために植物から、ＰＣＲ等によって核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマーの土台として、用いることができる。一実施形態において、この技術はＰｉ２遺伝子配列を含む野生型植物を選択するために用いることが可能である。別の実施形態では、この技術は植物育種プログラムで得たかけ合わせから生じたＰｉ２含有植物の同定に用いることも可能である。例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：４７１−４７６，  およびＨｉｔｔａｌｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １００：  １１２１−１１２８を参照せよ。
【００２５】
ハイブリダイゼーション技術として、プレーテッドＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション・スクリーニングが挙げられる（プラークまたはコロニーのいずれか、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．）。そのような配列のハイブリダイゼーションを、ストリンジェントな条件下でおこなうことが可能である。「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、他の配列よりも検出可能なほど大きな度合い（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、プローブがその標的配列とハイブリダイズする条件を意図している。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、環境が異なるとその条件も異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同的プロービング）。あるいは、より低い度合いの類似性が検出されるように、ストリンジェントな条件を調節して配列内のいくつかのミスマッチを許すようにする（非相同的プロービング）。一般に、プローブの長さは１，０００ヌクレオチド未満、好ましくは５００ヌクレオチド未満である。
【００２６】
概して、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５ＭＮａイオン未満である条件であり、通常、ｐＨ７．０ないし８．３で約０．０１ないし１．０ＭＮａイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）では温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）では約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の脱安定化剤を添加することによっても達成可能である。ストリンジェンシーが低い典型的な条件として、３０ないし３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いて３７℃でハイブリダイゼーションをおこない、５０ないし５５℃で１Ｘないし２ＸＳＣＣ（２０ＸＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）で洗浄することが含まれる。ストリンジェンシーが中程度の典型的な条件として、４０ないし４５％ホルムアミド、１．０ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でハイブリダイゼーションをおこない、５５ないし６０℃で０．５Ｘないし１ＸＳＣＣで洗浄することが含まれる。ストリンジェンシーが高い典型的な条件として、５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でハイブリダイゼーションをおこない、６０ないし６５℃で０．１ＸＳＣＣで洗浄することが含まれる。任意に、洗浄用緩衝液は約０．１％ないし約１％のＳＤＳを含むものであってもよい。ハイブリダイゼーションの継続時間は、一般に約２４時間未満、通常は約４ないし約１２時間である。
【００２７】
特異性は、概してハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、最終洗浄液のイオン強度および温度が重要な要素である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して、Ｔｍ値はＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの等式から概算される（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ  （１９８４）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３８：２６７−２８４）。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌ、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン・ヌクレオチドとシトシン・ヌクレオチドとの割合、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアルデヒドの割合、さらにＬは塩基対でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全一致のプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ）である。Ｔｍは１％のミスマッチング毎に約１℃低くなる。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列に対してハイブリダイズするように調整することができる。例えば、もし９０％以下の同一性が求められるならば、Ｔｍは１０℃減少することになる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨ下で特定の配列およびその相補体の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、ストリンジェンシーが厳しい条件では融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、ストリンジェンシーが中程度の条件では融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、ストリンジェンシーが低い条件では融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍ値を用いることで、当業者はハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に記載されていることを理解することができる。もし所望の度合いのミスマッチングが４５℃未満（水溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍをもたらすとするならば、より高い温度が利用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ  （１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −    Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  （Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見いだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌ���ｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照せよ。
【００２８】
本発明は、病虫害に対する植物の耐性を誘発するための組成物および方法に関する。したがって、組成物および方法も菌類病原体、ウイルス、線虫、昆虫等から植物を守るのに有用である。
【００２９】
「耐病性（ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」は、植物病原体相互作用の結果である症状を植物が回避することを意図している。すなわち、植物病害および関連症状を病原体が引き起こすことを防止されており、あるいは病原体によって引き起こされる症状が最小化または少なくされている。
【００３０】
「抗病原性組成物（ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」は、本発明の組成物が抗病原活性を有することから、侵入病原性生物を抑制、制御、および／または殺すことが可能である。本発明の抗病原性組成物は、少なくとも約５％ないし約５０％、少なくとも約１０％ないし約６０％、少なくとも約３０％ないし約７０％、少なくとも約４０％ないし約８０％、または少なくとも約５０％ないし約９０％以上、病原体攻撃誘発による症状を減少させることができる。したがって、本発明の方法は、病気、特に植物病原体によって引き起こされる病気から植物を守ることに、利用することができる。
【００３１】
抗病原活性を測定するアッセイは、一般に公知であり、病原体感染後の植物で耐病性を定量化するための方法である。例えば本明細書で援用される米国特許第５，６１４，３９５号を参照せよ。そのような技術は、病変の平均直径、病原体生物量、および分解した植物組織の全体的割合を、時間経過にとともに測定することが含まれる。例えば、抗病原性ポリペプチドを発現することまたはその表面に適用された抗病原性組成物を持つことのいずれかをおこなう植物では、抗病原体組成物処理されていない対照植物と比較した場合、組織壊死の減少を示したり（すなわち、病変直径）、あるいは病原体攻撃後の植物死を減少させることが示されている。あるいは、抗病原活性は病原体生物量の減少によって測定することができる。例えば、抗病原体ポリペプチドを発現するか、もしくは抗病原性組成物にさらされる植物体が、目的とする病原体によって攻撃される。時間とともに、病原体接種組織由来の組織試料を得てＲＮＡの抽出をおこなった。植物の特異的転写産物濃度に対する特異的病原体ＲＮＡ転写産物の割合が、病原体生物量のレベルが決定されるのを可能とする。例えば、本明細書で援用するＴｈｏｍｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９５：１５１０７−１５１１１を参照せよ。  
【００３２】
さらに、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抗病原性アッセイでは、例えば、種々の濃度の抗病原性組成物を濾紙円板に付加し、目的とする病原体の懸濁液を含む寒天に該円板を置くことが含まれる。インキュベーション後、有効量の抗病原性ポリペプチドを含む円板のまわりに透明な阻害帯が生ずる  （Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９１：１８８８−１８９２、本明細書で援用）。さらに、顕微分光測光分析を用いて、組成物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抗病原特性の測定に用いることができる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４：９４９−９５９および  Ｃａｍｍｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：  ２２２８−２２３３、両方とも本明細書で援用する）。  
【００３３】
本発明の病原体として、限定されるものではないが、ウイルスまたはウイロイド、細菌、昆虫、線虫、および菌類が挙げられる。ウイルスとして、任意の植物ウイルス、例えば、タバコまたはキュウリ・モザイク・ウイルス、斑点ウイルス、壊死ウイルス、およびトウモロコシ萎縮ウイルスが挙げられる。主要な農作物に対する特異的菌類およびウイルス病原体として、大豆：Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ  ｆｓｐ．  ｇｌｙｃｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．  ｓｏｊａｅ  （Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｏｊａｅ）、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．  ｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｔｓｉｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｅｍａｔｉｕｍ  （Ｃｏｌｌｅｔｏｔｉｃｈｕｍ  ｔｒｕｎｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｓｏｊｉｃｏｌａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．  ｇｌｙｃｉｎｅａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．  ｐｈａｓｅｏｌｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｄｉｆｆｕｓａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ、大豆モザイク・ウイルス、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ、タバコ斑点ウィルス、タバコ条斑病ウイルス、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｍｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、  トマト・スポッテッド・ウイルト・ウイルス、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ；  カノーラ：  Ａｌｂｕｇｏ  ｃａｎｄｉｄａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｂｒａｓｓｉｃｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ；アルファルファ：  Ｃｌａｖｉｂａｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｍｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ｐｈｏｍａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｐｓｅ��ｄｏｐｅｚｉｚａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｏｃｈｉｌａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．  ａｌｆａｌｆａｅ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ａｌｆａｌｆａｅ；  小麦：  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．  ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｇｒｏｐｙｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｃｏｌｌｏｔｅｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ  ｆ．ｓｐ．  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ａｖｅｎａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｍｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、オオムギ黄色萎縮ウイルス、ブロム・モザイク・ウィルス、土壌コムギ・モザイク・ウイルス、小麦縞モザイク病ウイルス、小麦紡錘縞ウイルス、アメリカ小麦縞ウイルス、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｌａｅｖｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｍｉｄｅｒｍａｔｕｍ、高原ウイルス、ヨーロッパ小麦縞ウイルス；ヒマワリ：  Ｐｌａｓｍｏｐｈｏｒａ  ｈａｌｓｔｅｄｉｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、アスター萎黄病、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｚｉｎｎｉａｅ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｈｏｍａ  ｍａｃｄｏｎａｌｄｉｉ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒ��ｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｐｖ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ、Ａｌｂｕｇｏ  ｔｒａｇｏｐｏｇｏｎｉｓ；  トウモロコシ：  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ  ｖａｒ．  ｓｕｂｇｌｕｔｉｎａｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  （Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉ  （Ｄｉｐｌｏｄｉａ  ｍａｙｄｉｓ）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｍｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ  Ｏ、Ｔ  （Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎｕｍ  Ｉ、ＩＩ  ＆  ＩＩＩ  （Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ  Ｉ、ＩＩ  ＆  ＩＩＩ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐｅｄｉｃｅｌｌａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｐｏｌｙｓｏｒａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ  ｏｒｙｚａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｐａｌｌｅｓｃｅｎｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、トウモロコシ萎縮モザイク病ウイルスＡおよびＢ、小麦縞モザイク病ウイルス、トウモロコシ萎黄病ウイルス、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ  ａｖｅｎａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｐｖ．  ｚｅａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｃｏｒｎ  ｓｔｕｎｔ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｒｅｉｌｉａｎａ、Ｐｈｙｓｏｐｅｌｌａ  ｚｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍａｙｄｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、トウモロコシ萎黄病斑点ウイルス、ト���モロコシ・ラヤド・フィノ・ウイルス、トウモロコシ縞ウイルス、トウモロコシ・ストライプ・ウイルス、トウモロコシ・ラウフ萎縮ウイルス；ソルガム：  Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ  （Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｏｒｇｈｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．  ｈｏｌｃｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｐｅｒｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ、Ｐｈｏｍａ  ｉｎｓｉｄｉｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｎａｅ  （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｓ）、Ｒａｍｕｌｉｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｒａｍｕｌｉｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｐｈｙｌｌａｃｈａｒａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍ  ｒｅｉｌｉａｎｕｍ  （Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｒｅｉｌｉａｎａ）、Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｃｒｕｅｎｔａ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍ  ｓｏｒｇｈｉ、砂糖きびモザイクＨ、トウモロコシ萎縮モザイク・ウイルスＡおよびＢ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｔｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｎａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ、Ｐｙｔｈ
ｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ等が挙げられる。
【００３４】
線虫類として、根瘤、包嚢、および病変線虫類、例えばＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．、およびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．が挙げられ；  特にシスト線虫類の仲間として、限定されるものではないが、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ  （大豆包嚢線虫類）；  Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ  （ビート包嚢線虫類）；  Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ  （穀類包嚢線虫類）；  およびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓならびにＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ  （ポテト包嚢線虫類）が挙げられる。病変線虫類として、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐが挙げられる。
【００３５】
害虫として、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、ハジラミ目、同翅目、半翅目、直翅目、総翅目、革翅目、等翅目、シラミ目、ノミ目、トビケラ目、その他から選択される昆虫、特に甲虫目および鱗翅目が挙げられる。主要な農作物に対する本発明の害虫として、トウモロコシ：  Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、アワノメイガ；  Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、クロイロヨトウムシ；  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、オオタバコガ；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、シロナヤガ；  Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ，トウモロコシノメイガ；  Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、マダラメイガ；  Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ，サトウキビメイガ；  Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、西洋ハムシ；  Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ  ｂａｒｂｅｒｉ、ハムシモドキ（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；  Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ、ハムシモドキ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；  Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｓｐｐ．、ハリガネムシ；  Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、コガネムシ（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｈａｆｅｒ）  （地虫）；  Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｉｍｍａｃｕｌａｔａ、コガネムシ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｈａｆｅｒ）  （地虫）；  Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、マメコガネ；  Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ、トウモロコシトビハムシ；  Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシ・ゾウムシ；  Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシアブラムシ；  Ａｎｕｒａｐｈｉｓ  ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ、北米産オマルアブラムシ；  Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ナガカメムシ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、渡りバッタ；  Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ、種トウモロコシ・ウジ；  Ａｇｒｏｍｙｚａ  ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ、コーン・ブロット潜葉性昆虫；  Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ  ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ、草アザミウマ；  Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｍｉｌｅｓｔａ、盗賊アリ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；  ソルガム：  Ｃｈｉｌｏ  ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、ソルガム・アナアケムシ；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、シロナガヤ；  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、オオタバコガ；  Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、マダラメイガ；  Ｆｅｌｔｉａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、粒状ヨトウムシ（ｇｒａｎｕｌａｔｅ  ｃｕｔｗｏｒｍ）；  Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｃｒｉｎｉｔａ、地虫；  Ｅｌｅｏｄｅｓ、Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ、およびＡｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．、ハリガネムシ；  Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、クビボソハムシ；  Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ、トウモロコシ・ノミトビヨロイムシ；  Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシ・ゾウムシ；  Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ��  トウモロコシアブラムシ；  Ｓｉｐｈａ  ｆｌａｖａ、キイロサトウキビアブラムシ；  Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ナガカメムシ；  Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、ソルガムミジ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、カーミンハダニ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；  小麦：  Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ、ヨトウムシ；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、シロナヤガ（ｆａｌｌ  ａｒｍｙｗｏｒｍ）；  Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、マダラメイガ；  Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、西洋ハムシ；  Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、マダラメイガ；  Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、キアシクビボソハムシ；  Ｈｙｐｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ、クローバ葉ゾウムシ；  Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ、ハムシモドキ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；  ロシア小麦アブラムシ；  Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ、緑色アブラムシ；  Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ａｖｅｎａｅ、イングリッシュ・グレイン・アブラムシ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ディファレンシャル・グラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、渡りバッタ；  Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、コムギタマバエ；  Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｍｏｓｅｌｌａｎａ、マバエ；  Ｍｅｒｏｍｙｚａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、小麦穀果ウジ；  Ｈｙｌｅｍｙａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ、小麦ハナアブ；  Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ、タバコアザミウマ；  Ｃｅｐｈｕｓ  ｃｉｎｃｔｕｓ、小麦穀果ハバチ；  Ａｃｅｒｉａ  ｔｕｌｉｐａｅ、コムギ・カール・ダニ；  ヒマワリ：  Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、ヒマワリ芽ガ；  Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、ヒマワリガ；  ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ、ヒマワリ甲虫；  Ｂｏｔｈｙｒｕｓ  ｇｉｂｂｏｓｕｓ、ニンジン甲虫；  Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ  ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ、ヒマワリ種ミジ；綿：  Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、綿青虫；  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、綿オオタバコガ幼虫；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、シロイチモジヨトウガ幼虫；  Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、ワタキバガ幼虫．；  Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、ワタミハナゾウムシ；  Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、ワタアブラムシ；  Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ、ワタノミハムシ；  Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ、バンデッドウイングド・コナジラミ（ｂａｎｄｅｄｗｉｎｇｅｄ  ｗｈｉｔｅｆｌｙ）；  Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、ミドリメクラガメ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ディファレ��シャル・グラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；  Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ、タマネギアザミウマ；  Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ、タバコアザミウマ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、カーミンハダニ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；イネ：  Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、サトウキビアナアケムシ；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、シロナヤガ（ｆａｌｌ  ａｒｍｙｗｏｒｍ）；  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、オオタバコガ；  Ｃｏｌａｓｐｉｓ  ｂｒｕｎｎｅａ、グレープ・コラスピス（ｇｒａｐｅ  ｃｏｌａｓｐｉｓ）；  Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ、重湯ゾウムシ；  Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、コメゾウムシ；  Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ、コメヨコバイ；  Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、コバネナガカメ；  Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、ミドリイロカメムシ；大豆：  Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、ダイズシャクトリムシ；  Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ハッショウマメ毛虫；  Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ、ミドリヤガ幼虫；  Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、アワノメイガ；  Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、クロイロヨトウムシ；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、シロイチモンジョトウガ幼虫；  Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ワタ芽毛虫；  Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、ワタ実毛虫；  Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、マダラテントウムシ（Ｍｅｘｉｃａｎ  ｂｅａｎ  ｂｅｅｔｌｅ）；  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ、モモアカアブラムシ；  Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ、ジャガイモヨコバイ；  Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、ミドリイロカメムシ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；  Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ディファレンシャル・グラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；  Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ、種トウモロコシ・ウジ（ｓｅｅｄ  ｃｏｒｎ  ｍａｇｇｏｔ）；  Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ダイズアザミウマ；  Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ、タマネギアザミウマ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ、イチゴハダニ；  Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；  大麦：  Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、アワノメイガ；  Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、クロイロヨトウムシ；  Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ、ミドリイロアオムシ；  Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ナガカメムシ；  Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、ミドリイロカメムシ；  Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ、褐色カメムシ；  Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ、種トウモロコシ・ウジ（ｓｅｅｄ  ｃｏｒｎ  ｍａｇｇｏｔ）；  Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、コムギタマバエ；  Ｐｅｔｒｏｂｉａ  ｌａｔｅｎｓ、褐色コムギダニ；アブラナ：  Ｂｒ��ｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、キャベツアブラムシ；  Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｉｕｃｉｆｅｒａｅ、ノミハムシ；  Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、バーサ・ヨトウムシ；  Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、コナガ；  Ｄｅｌｉａ  ｓｓｐ．、根食い虫が挙げられる。
【００３６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド間の配列相互関係を説明するために、以下の用語、すなわち（ａ）「  基準配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、（ｂ）「比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、（ｄ）「配列同一性の割合（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、および（ｅ）「実質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を用いた。
【００３７】
（ａ）本明細書で用いられるように、「基準配列」は配列比較の基準として用いられる所定の配列である。基準配列は、特定の配列のサブセットまたは全体であってもよく、例えば、完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメント、あるいは完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列としてある。
【００３８】
（ｂ）本明細書で用いられるように、「比較窓」はポリヌクレオチド配列の隣接または特定のセグメントを参照にするもので、比較窓内のポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントについて基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失を含む。一般に、比較窓のヌクレオチド長は、連続した少なくとも２０個のヌクレオチドであり、任意に３０、４０、５０、または１００以上の長さにすることもできる。当業者は、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれることによる基準配列との高い類似性を回避するために、一般的にはギャップ・ペナルティを導入して、一致した数からそれを減算することを理解する。
【００３９】
比較のための配列のアラインメント方法は、周知である。したがって、任意の２つの配列間の配列同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的例が、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  （１９８８）  ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３の相同性アラインメント・アルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）、さらにＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のように改変されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７２２６のアルゴリズムである。  
【００４０】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューター・インプリメンテーションを配列の比較のために用いて、配列同一性を決定することができる。そのようなインプリメンテーションとしては、限定はされないが、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆｒｎｉａから入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）、ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア・パッケージ・バージョン８中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。これらのプログラムを使用するアラインメントを、デフォルト・パラメータを用いて実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４  （１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３３１によって十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  （１９８８）（上掲）のアルゴリズムにもとづく。アミノ酸配列を比較する際、ＰＡＭ１２０加重値留数テーブル、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップ・ペナルティをＡＬＩＧＮプログラムとともに用いることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９０）（上掲）のアルゴリズムにもとづく。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２で実行して、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３で実行して、本発明のタンパク質またはポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップがあるアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中の）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９に記載されるように用いることができる。または、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中の）を用いて、分子間の隔たった関係を検出する反復検索を実行することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）（上掲）を参照せよ。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる際、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメータ（例えば、ヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質に対してはＢＬＡＳＴＸ）���用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．−  ｇｏｖを参照せよ。検査によって、アラインメントを手動で実行することも可能である。  
【００４１】
特に明記しないかぎり、本明細書で与えられる配列同一性／類似性値とは、以下のパラメータを用いたＧＡＰバージョン１０を使用して得られる値を指す。すなわち、５０のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔを用いた％同一性；１２のＧａｐ  Ｗｅｉｇｈｔおよび４のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔを用いた％類似性、または任意の等価なプログラムである。「等価なプログラム（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）」によって、ＧＡＰバージョン１０によって生じた対応するアラインメントと比較すると、問題の任意の２つの配列に対して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基一致および同一の％配列同一性を有するアラインメントを生じる任意の配列比較プログラムが意図される。
【００４２】
ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３のアルゴリズムを用いて、一致数を最大にし、かつギャップ数を最小にする２つの完全配列のアラインメントを見つける。ＧＡＰは、全ての考えられるアラインメントおよびギャップ位置を考慮して、最も多数の一致した塩基および最も少ないギャップを持つアラインメントを生じる。ＧＡＰは、一致した塩基の単位で、ギャップ生成ペナルティおよびギャップ拡大ペナルティの提供を可能にする。ＧＡＰは、それが挿入する各ギャップに対する一致のギャップ生成ペナルティ数の利を得なければならない。０より大きいギャップ拡大ペナルティが選択される場合、ＧＡＰは、さらに、挿入された各ギャップに対して、ギャップの長さ倍のギャップ拡大ペナルティの利を得なければならない。タンパク質配列に対するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア・パッケージのバージョン１０中のデフォルト・ギャップ生成ペナルティ値およびギャップ拡大ペナルティ値は、それぞれ８および２である。ヌクレオチド配列に対しては、デフォルト・ギャップ生成ペナルティは５０であり、一方で、デフォルト・ギャップ拡大ペナルティは３である。ギャップ生成ペナルティおよびギャップ拡大ペナルティを、０ないし２００からなる整数の群から選択される整数として表すことができる。したがって、例えば、ギャップ生成ペナルティおよびギャップ拡大ペナルティは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５以上でありうる。
【００４３】
ＧＡＰは、最良のアラインメントのファミリーの１つのメンバーを提示する。このファミリーの多くのメンバーがありうるが、より良い特性を持つ他のメンバーはない。ＧＡＰは、アラインメントに対するメリットの４つのデータを表示する。すなわち、特性、比率、同一性、および類似性である。特性は、配列をアラインするために最大にされた計量である。比率は、より短いセグメント中の塩基数で割った特性である。％同一性は、実際に一致する記号の％である。％類似性は、類似する記号の％である。ギャップの向かいにある記号は無視される。記号対に対するスコアリング行列値が類似性閾値である０．５０以上であるとき、類似性はスコアリングされる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア・パッケージのバージョン１０で用いられるスコアリング行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照せよ）。
【００４４】
（ｃ）本明細書で使用するように、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈での「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」」とは、特定の比較窓にわたって最大相関性についてアラインされる際同じものである２つの配列中の残基に言及する。配列同一性の割合がタンパク質に関連して用いられる際、同一でない残基位置は、しばしば保守的アミノ酸置換によって異なることが認識され、この際、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基と置換されるので、分子の機能的特性を変化させない。配列が保守的置換で異なる際、％配列同一性を上方調整して、置換の保守的性質を補正することが可能である。そのような保守的置換によって異なる配列は、「配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」または「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を持つと言われる。この調整をおこなうための手段は、当業者に周知である。通常、これは、保守的置換を、完全ミスマッチよりむしろ部分的ミスマッチとしてスコアリングすることによって、配列同一性の割合を増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保守的置換にスコア０が与えられる場合、保守的置換には０ないし１のスコアが与えられる。例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でインプリメントされるように、保守的置換のスコアリングを算出する。
【００４５】
（ｄ）本明細書で使用するように、「配列同一性の百分率」とは、比較窓にわたって２つの任意にアラインされた配列を比較することによって決定される値を意味し、この際、比較窓中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントに対する基準配列（付加または欠失を含まない）と比べると、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。両配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致した位置の数を生じ、一致した位置の数を比較窓中の位置の全数で割って、結果を１００で倍数化して配列同一性の百分率を生じることによって、百分率を算出する。
【００４６】
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の用語「実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを用いた記載されるアラインメント・プログラムの１つを用いて、基準配列と比べて、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％配列同一性を持つ配列を含むことを意味する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディング・フレーム位置決め等を考慮することによって、これらの値を適当に調整して、２つのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを認識するだろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性とは、通常、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００４７】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の表示は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、特異的な配列に対して、熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書で特に限定される場合、ストリンジェンシーの所望の程度に応じて、Ｔｍより約１℃ないし約２０℃低い範囲の温度を包括する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を用いて、核酸のコピーが生成されるときに生じうる。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの表示は、第１の核酸にコードされるポリペプチドが、第２の核酸にコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるときである。
【００４８】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの文脈では用語「実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、ペプチドが、特定の比較窓にわたって、基準配列に対して少なくとも７０％配列同一性、好ましくは、基準配列に対して８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％配列同一性を持つ配列を含むことを示す。好ましくは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３のホモロジー・アラインメント・アルゴリズムを用いて、最適アラインメントをおこなう。２つのペプチド配列が実質的に同一であることの表示は、１つのペプチドが、第２のペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保守的置換のみで異なる場合、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ）」のペプチドは、同一でない残基位置が保守的アミノ酸変化で異なりうること以外は、上記に示したように配列を共有する。
【００４９】
本発明のＰｉ２様配列を、対象の植物中での発現のための発現カセット中で提供する。該カセットは、本発明のＰｉ２様配列に作動可能に結合する５′および３′調節配列を含むだろう。「作動可能に結合する（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」によって、プロモーターと第２の配列との間の機能的結合が意図され、この際、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般に、作動可能に結合するとは、結合している核酸配列が隣接していることと、２つのタンパク質コーディング領域を連結するために必要である場合は隣接しており、かつ同じリーディング・フレーム中にあることとを意味する。カセットは、任意で、生体中に共形質転換されるべき少なくとも１つの付加的な遺伝子を含有することが可能である。または、付加的な遺伝子（複数の付加的な遺伝子）を、複数の発現カセット上で提供することができる。
【００５０】
そのような発現カセットに、調節領域の転写調節下にあるためのＰｉ２様配列の挿入用の複数の制限部位を提供する。発現カセットは、任意で、選択可能マーカー遺伝子を含有することが可能である。
【００５１】
発現カセットは、転写の５′から３′への方向で、植物中で機能的な転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＰｉ２様ＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳停止領域（すなわち、停止領域）含むだろう。プロモーターは、植物宿主に対して、かつ／または本発明のＰｉ２様ＤＮＡ配列に対して、ネイティブまたは類似であるか、あるいは外来または異種である。さらに、プロモーターは、天然配列または代わりに合成配列でよい。プロモーターが植物宿主に対して「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」または「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」であるとき、プロモーターが、該プロモーターが導入されるネイティブな植物中に見出されないことが意図される。プロモーターが本発明のＰｉ２様ＤＮＡ配列に対して「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」または「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」であるとき、プロモーターが、本発明の作動可能に結合するＰｉ２様ＤＮＡ配列に対するネイティブなプロモーターまたは天然に生じるプロモーターではないことが意図される。本明細書で使用するように、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に結合するコード配列を含む。
【００５２】
異種プロモーターを用いて、配列を発現させることが好ましい一方で、ネイティブなプロモーター配列を用いてもよい。そのような構築物は、植物または植物細胞中で、本発明のＰｉ２様タンパク質の発現レベルを変化させるだろう。したがって、植物または植物細胞の表現型が変化する。
【００５３】
停止領域は、転写開始領域に対してネイティブでよく、対象の作動可能に結合するＰｉ２様ＤＮＡ配列に対してネイティブでよく、植物宿主に対してネイティブでよく、または別のソース（すなわち、プロモーター、対象のＰｉ２様ＤＮＡ配列、植物宿主、またなそれらの任意の組み合わせに対して外来または異種のソース）に由来してよい。簡便な停止領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能であり、例えばオクトピン・シンターゼおよびノパリン・シンターゼ停止領域がある。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６２：１４１−１４４；  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  （１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；  Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：１４１−１４９；  Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；  Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；  Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １５：９６２７−９６３９も参照せよ。  
【００５４】
適当である場合、遺伝子（複数の遺伝子）を、形質転換植物中での発現の増加に対して最適化することが可能である。すなわち、向上された発現に対する植物に好ましいコドンを用いて、遺伝子を合成することができる。宿主に好ましいコドンの使用の考察については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９２：１−１１も参照せよ。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法が当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：４７７−４９８（本明細書に援用）を参照せよ。
【００５５】
付加的な配列修飾は、細胞宿主中での遺伝子発現を強化することが知られている。これらは、偽ポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロン・スプライシング部位シグナル、トランスポゾン様リピート、および遺伝子発現に有害でありうる他の十分に特徴付けられた配列をコードする配列の除去を含む。配列のＧ−Ｃ含有量を、宿主細胞中で発現する既知の遺伝子に対する基準によって算出されるような、所定の細胞宿主対して平均的なレベルに調整することが可能である。可能であるときは、配列を修飾して、予測ヘアピン２次ｍＲＮＡ構造を避ける。
【００５６】
発現カセットは、任意で、発現カセット・構築物中で５′リーダー配列を含有することが可能である。そのようなリーダー配列が作用して、翻訳を強化することができる。翻訳リーダーは、当該技術分野で公知であり、ピコルナウイルス・リーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ５′非コーディング領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルス・リーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ））（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイク・ウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）、およびヒト・免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファ・モザイク・ウイルスのコート・タンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコ・モザイク・ウイルス・リーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，  ｅｄ．  Ｃｅｃｈ  （Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  ２３７−２５６）；ならびにトウモロコシ硫黄病モザイク病ウイルス・リーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８４：９６５−９６８も参照せよ。翻訳を強化することが知られている他の方法、例えば、イントロン等を用いることもできる。  
【００５７】
発現カセットを調製する上で、種々のＤＮＡフラグメントを、適切な配向で、かつ必要に応じて適切なリーディング・フレーム中でＤＮＡ配列を提供するように操作することが可能である。この末端に向かって、アダプターまたはリンカーを用いて、ＤＮＡフラグメントを連結することが可能であるか、あるいは他の操作を伴って、簡便な制限部位に対して、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を提供することが可能である。この目的のために、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）突然変異生成、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジションおよびトランスバージョンを含むことが可能である。
【００５８】
一般に、発現カセットは、形質転換細胞の選択のための選択可能マーカー遺伝子を含むだろう。形質転換細胞または組織の選択のために、選択可能マーカー遺伝子を用いる。マーカー遺伝子としては、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの等の抗生物質耐性をコードする遺伝子と、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）等の除草性化合物に対する耐性を与える遺伝子とが挙げられる。一般的には、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ  （１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３：５０６−５１１；  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８；  Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２；  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：２４１９−２４２２；  Ｂａｒｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  （１９８０）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，  ｐｐ．  １７７−２２０；  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ  （１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２；  Ｆｉｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２；  Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ａｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５４００−５４０４；  Ｆｕｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：２５４９−２５５３；  Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−４８３；  Ｇｏｓｓｅｎ  （１９９３）  Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；  Ｒｅｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１；  Ｌａｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ  （１９９０）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３３４３−３３５６；  Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６；  Ｂａｉｍ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６；  Ｗｙｂｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４６４７−４６５３；  Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ  （１９８９）  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ  １０：１４３−１６２；  Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３５：１５９１−１５９５；  Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；  Ｂｏｎｉｎ  （１９９３）  Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；  Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５��１；  Ｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３６：９１３−９１９；  Ｈｌａｖｋａ  ｅｔ  ａｌ  （１９８５）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ７８  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）；  Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−７２４を参照せよ。該開示を本明細書に援用する。  
【００５９】
選択可能マーカー遺伝子の上記リストは限定することを意味するものではない。任意の選択可能マーカー遺伝子を本発明で用いることができる。
【００６０】
本発明を実施する上で、多数のプロモーターを用いることができる。所望の結果にもとづいて、プロモーターを選択することができる。
【００６１】
本発明の核酸を、構成性プロモーター、組織に好ましいプロモーター、または植物中での発現用の他のプロモーターと組み合わせることができる。構成性プロモーターとしては、例えば、ＷＯ  ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号に開示されるＲｓｙｎ７プロモーターのコア・プロモーターおよび他の構成プロモーター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；イネ・アクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  １２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）等が挙げられる。他の構成性プロモーターとしては、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号、第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号、第５，６０８，１４２号、および第６，１７７，６１１号を含む。
【００６２】
一般に、誘導性プロモーターから、特に病原体誘導性プロモーターから遺伝子を発現させることが有用だろう。そのようなプロモーターとしては、病原体による感染後に誘導される感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）由来のもの；例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ等が挙げられる。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｎｅｔｈ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．  ８９：２４５−２５４；  Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：６４５−６５６；およびＶａｎ  Ｌｏｏｎ  （１９８５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４：１１１−１１６を参照せよ。ＷＯ  ９９／４３８１９（本明細書に援用）も参照せよ。  
【００６３】
病原体感染の部位で、または該部位の近くで局所的に発現するプロモーターが対象となる。例えば、Ｍａｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９：３３５−３４２；  Ｍａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ２：３２５−３３１；  Ｓｏｍｓｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：２４２７−２４３０；  Ｓｏｍｓｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２：９３−９８；およびＹａｎｇ  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１４９７２−１４９７７を参照せよ。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １０：９５５−９６６；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２５０７−２５１１；  Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：１９１−２０１；  Ｓｉｅｂｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６１−９６８；米国特許第５，７５０，３８６号（線虫誘導性）；および該明細書に引用される参考文献も参照せよ。発現が病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅによって誘導されるトウモロコシＰＲｍｓ遺伝子に対する誘導性プロモーターは特に対象となる（例えば、Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．  ４１：１８９−２００を参照せよ）。
【００６４】
さらに、病原体は、外傷または昆虫による損傷を介して植物に侵入するので、外傷誘導性プロモーターを本発明の構成で用いることが可能である。そのような外傷誘導性プロモーターとしては、ジャガイモ・プロテイナーゼ阻害剤（ｐｉｎ  ＩＩ）遺伝子（Ｒｙａｎ  （１９９０）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．  ２８：４２５−４４９；  Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：４９４−４９８）；ｗｕｎ１およびｗｕｎ２（米国特許第５，４２８，１４８号）；ｗｉｎ１およびｗｉｎ２（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１５：２００−２０８）；システミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）（ＭｃＧｕｒｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：１５７０−１５７３）；ＷＩＰ１（Ｒｏｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２：７８３−７９２；  Ｅｃｋｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２３：７３−７６）；ＭＰＩ遺伝子（Ｃｏｒｄｅｒｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６（２）：１４１−１５０）等（本明細書に援用）が挙げられる。
【００６５】
化学的調節プロモーターを用いて、外因性化学的レギュレーターの適用を介して植物中での遺伝子の発現を調節することができる。目的に応じて、該プロモーターは、化学の適用が遺伝子発現を誘導する場合は化学的誘導性プロモーターでよく、または化学の適用が遺伝子発現を抑制する場合は化学的抑制性プロモーターでよい。化学的誘導性プロモーターは、当該技術分野で公知であり、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、雑草発芽前に用いられる除草剤として用いられる疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターが挙げられる。対象となる他の化学的調節プロモーターとしては、ステロイド応答性プロモーター（例えばＳｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １４（２）：２４７−２５７中のグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照せよ）、ならびにテトラサイクリン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２７：２２９−２３７、ならびに米国特許第５，８１４，６１８号および第５，７８９，１５６号を参照せよ）（本明細書に援用）が挙げられる。
【００６６】
組織に好ましいプロモーターを用いて、特定の植物組織内でのＰｉ２様タンパク質の発現の強化を標的することができる。組織に好ましいプロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２（２）：２５５−２６５；  Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３８（７）：７９２−８０３；  Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  ２５４（３）：３３７−３４３；  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ６（２）：  １５７−１６８；  Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（３）：１３３１−１３４１；  Ｖａｎ  Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（２）：５２５−５３５；  Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（２）：５１３−５２４；  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５（５）：７７３−７７８；  Ｌａｍ  （１９９４）  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２０：１８１−１９６；  Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３（６）：１１２９−１１３８；  Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４（３）：４９５−５０５を含む。必要であれば、そのようなプロモーターを微弱な発現のために改変することができる。  
【００６７】
葉特異的プロモーターが当該技術分野で公知である。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２（２）：２５５−２６５；  Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０５：３５７−６７；  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５（５）：７７３−７７８；  Ｇｏｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：５０９−１８；  Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３（６）：１１２９−１１３８；およびＭａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０を参照せよ。  
【００６８】
根に好ましいプロモーターが既知であり、文献から入手可能な多くのものから選択することができるか、または様々な適合種から新規に単離することができる。例えば、Ｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０（２）：２０７−２１８（ダイズ根特異的グルタミン・シンテターゼ遺伝子）；  Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１０）：１０５１−１０６１（インゲンマメのＧＲＰ１．８遺伝子中の根特異的制御エレメント）；  Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４（３）：４３３−４４３（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のマンノピン・シンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子の根特異的プロモーター）；およびＭｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１）：１１−２２  （ダイズの根および根粒で発現する、サイトゾル・グルタミン・シンテターゼ（ＧＳ）をコードする完全長ｃＤＮＡクローン）を参照せよ。Ｂｏｇｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２（７）：６３３−６４１（ここでは、窒素固定化非マメ科植物Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉおよび関連非窒素固定化非マメ科植物Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ由来のヘモグロビン遺伝子から単離された２つの根特異的プロモーターについて記載される）も参照せよ。これらの遺伝子のプロモーターを、β−グルクロニダーゼ・レポーター遺伝子に結合させ、非マメ科植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍおよびマメ科植物Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ両方に導入し、両方の例で、根特異的プロモーター活性を保存した。ＬｅａｃｈおよびＡｏｙａｇｉ（１９９１）は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の高発現ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ根誘導遺伝子のプロモーターのそれらの分析について記載している（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）  ７９（１）：６９−７６を参照せよ）。彼らは、エンハンサーおよび組織に好ましいＤＮＡデターミナントがそれらのプロモーター中で解離されると結論づけた。Ｔｅｅｒｉ他（１９８９）は、ＬａｃＺへの遺伝子融合を用いて、殺虫性または殺幼虫性遺伝子と使用するための特性の特に望ましい組み合わせである、オクトピン・シンターゼをコードするアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡ遺伝子が、根端の表皮中で特に活性であることと、ＴＲ２′遺伝子がインタクトな植物中で根特異的であり、葉組織中で外傷によって促進されることとを示した（ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８（２）：３４３−３５０を参照せよ）。ｎｐｔＩＩ（ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ）に融合されたＴＲ１′遺伝子は、類似の特性を示した。付加的な根に好ましいプロモーターとしては、ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーター（Ｋｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９（４）：７５９−７７２）；およびｒｏｌＢプロモーター（Ｃａｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５（���）：６８１−６９１）が挙げられる。米国特許第５，８３７，８７６号、第５，７５０，３８６号、第５，６３３，３６３号、第５，４５９，２５２号、第５，４０１，８３６号、第５，１１０，７３２号、第５，０２３，１７９号も参照せよ。
【００６９】
「種子に好ましい（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」プロモーターとしては「種子特異的（ｓｅｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」プロモーター（種子貯蔵タンパク質のプロモーター等の種子成長中に活性なプロモーター）と、「種子発芽（ｓｅｅｄ−ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）」プロモーター（種子発芽中に活性なプロモーター）との両方が挙げられる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８（本明細書に援用）を参照せよ。そのような種子に好ましいプロモーターとしては、限定はされないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導伝令）；ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）；およびｃｅ１Ａ（セルロース・シンターゼ）が挙げられる（ＷＯ  ００／１１１７７（本明細書に援用）を参照せよ）。ガンマ−ゼインは、好ましい胚乳特異的プロモーターである。Ｇｌｏｂ−１は、好ましい胚特異的プロモーターである。双子葉類については、種子特異的プロモーターとしては、限定はされないが、マメβ−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、ダイズ・レクチン、クルシフェリン等が挙げられる。単子葉類については、種子特異的プロモーターとしては、限定はされないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ  １、ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ２、グロブリン１等が挙げられる。ｅｎｄ１およびｅｎｄ２遺伝子由来の種子に好ましいプロモーターについて開示するＷＯ  ００／１２７３３（本明細書に援用）も参照せよ。  
【００７０】
低レベル発現が所望される場合、微弱なプロモーターが用いられるだろう。一般に、「微弱なプロモーター（ｗｅａｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」によって、低レベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターが意図される。低レベルによって、約１／１０００回の転写ないし約１／１００，０００回の転写ないし約１／５００，０００回の転写のレベルであることが意図される。または、微弱なプロモーターは、少数の細胞のみで発現し、他では発現せずに、発現の全低レベルを与えるプロモーターも包括することが認識される。プロモーターが受け入れられない高レベルで発現する場合、プロモーター配列の部分を消失または修飾して、発現レベルを減少させることができる。
【００７１】
そのような微弱な構成性プロモーターとしては、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコア・プロモーター（ＷＯ  ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号）、コア３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター等が挙げられる。他の構成性プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号、第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第５，２６８，４６３号、および第５，６０８，１４２号を含む。米国特許第６，１７７，６１１号（本明細書に援用）も参照せよ。
【００７２】
本発明の方法は、ヌクレオチド・構築物を植物中に導入することを含む。「導入ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ」することによって、ヌクレオチド・構築物を、該構築物が植物の細胞の内部へのアクセスを増やすような様式で植物に与えることが意図される。本発明の方法は、ヌクレオチド・構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを増やすというだけのヌクレオチド・構築物を植物に導入するための特定の方法に依存しない。ヌクレオチド・構築物を植物に導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、限定はされないが、安定的形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介法が挙げられる。
【００７３】
形質転換プロトコールと、ヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコールとは、形質転換のための標的となる植物または植物細胞の種類、すなわち単子葉類または双子葉類によって変わりうる。ヌクレオチド配列を植物細胞に導入する適当な方法および植物ゲノムへの以降の挿入の方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、電気穿孔法（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５６３，０５５号；  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，９８１，８４０号）、直接遺伝子送達（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：２７１７−２７２２）、および弾道粒子促進（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，９４５，０５０号；  Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，８７９，９１８号；  Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，８８６，２４４号；  Ｂｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，９３２，７８２号；  Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ，  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｅｄ．  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）；  ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照せよ）；およびＬｅｃ１形質転換（ＷＯ  ００／２８０５８）が挙げられる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２：４２１−４７７；  Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）；  Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８７：６７１−６７４（ダイズ）；  ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）；  Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ  （１９９１）  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９６：３１９−３２４（ダイズ）；  Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；  Ｔｏｍｅ���、米国特許第５，２４０，８５５号；  Ｂｕｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，３２２，７８３号および第５，３２４，６４６号；  Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ，  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｅｄ．  Ｇａｍｂｏｒｇ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；  Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；  Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ３１１：７６３−７６４；  Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；  Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；  Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，  ｅｄ．  Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｌｏｎｇｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  １９７−２０９（花粉）；  Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；  Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（電気穿孔）；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５  およびＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ  （１９９５）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（イネ）；  Ｏｓｊｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を解したトウモロコシ）（それらの全てを本明細書に援用する）も参照せよ。  
【００７４】
「安定的形質転換（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」によって、植物中に導入されたヌクレオチド・構築物が該植物のゲノム中に組み込まれ、その子孫に遺伝することが可能であることが意図される。「一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」によって、植物中に導入されたヌクレオチド・構築物が該植物のゲノム中に組み込まれないことが意図される。
【００７５】
植物をウイルスまたはウイルス核酸に接触させることによって、本発明のヌクレオチド・構築物を植物に導入することが可能である。一般に、そのような方法は、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に本発明のヌクレオチド・構築物を組み込むことを含む。本発明のＰｉ２様タンパク質を初めにウイルス・ポリタンパク質の一部として合成することが可能であり、その後、該ウイルス・ポリタンパク質を生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でプロテオリシスによって処理して所望の組み換えタンパク質を生産することが可能であることが認識される。さらに、本発明のプロモーターは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写のために用いられるプロモーターも包括することが認識される。ヌクレオチド・構築物を植物に導入して、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を伴ったそこでコードされるタンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号、および第５，３１６，９３１号（本明細書に援用）を参照せよ。
【００７６】
従来の方法にしたがって、形質転換された細胞を植物中で成長させることが可能である。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照せよ。その後、これらの植物を成長させ、同じ形質転換菌株か、または異なる菌株で受粉して、所望の表現型特性の構成性発現を有する得られた雑種を同定することが可能である。２つ以上の世代を成長させ、所望の表現型特性の発現が安定的に維持され遺伝子していることを確認し、その後、種子を収穫して、所望の表現型特性の発現が達成されたことを確認することが可能である。この方法では、本発明は、ゲノムに安定に組み込まれた本発明のヌクレオチド・構築物、例えば、本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｅｅｄ）」とも呼ぶ）を提供する。  
【００７７】
本発明を、限定はされないが、単子葉類および双子葉類を含む任意の植物種の形質転換のために用いることが可能である。対象の植物種の例としては、限定はされないが、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種油の原料として有用なＢｒａｓｓｉｃａ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀類（例えば、トウジンヒエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ種）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類植物（Ｃｉｔｒｕｓ種）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカデミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられる。  
【００７８】
野菜としては、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、インゲンの緑莢種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウマメ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ種）、ならびにＣｕｃｕｍｉｓ属のメンバー（例えば、キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ））が挙げられる。観賞植物としては、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ種）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ種）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ種）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ種）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキクが挙げられる。  
【００７９】
本発明を実施する上で用いることが可能な針葉樹としては、限定はされないが、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）等のマツ；アメリカトガサワラ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；モミ（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）等のモミ属；ならびにベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカスギ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）等のヒマラヤスギが挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、作物植物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ピーナッツ、モロコシ、コムギ、雑穀類、タバコ等）であり、より好ましくはトウモロコシおよびダイズ植物、さらにより好ましくはトウモロコシ植物である。
【００８０】
本発明の導入されたＰｉ２様遺伝子の発現に対する形質転換の効果を様々な方法でアッセイすることが可能である。例えば、形質転換されていない状態と植物がＰｉ２様遺伝子を含有している形質転換状態との間の特異的遺伝子の発現での相違を、遺伝子発現プロファイリングを用いて決定することが可能である。米国特許第５，８７１，６９７号（本明細書に援用）に記載されるように、遺伝子発現プロファイリング・プロセス（ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（商標））を用いて、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを分析することができる。
【００８１】
以下の実施例は、説明目的で提供するものであり、限定するものではない。
【００８２】
（実験）
（概要）
最近、２つの耐性遺伝子ＰｉｂおよびＰｉ−ｔａを単離することに成功した。Ｐｉｂを、２つのインドネシア栽培品種および２つのマレーシア栽培品種から種々のＯｖｉｚａ  ｓａｔｉｖａ種ｊａｐｏｎｉｃａ栽培品種へと独立的に遺伝子移入した（Ｙｏｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｂｒｅｅｄ．  ２８：３５９−３８５）。Ｐｉｂ遺伝子の推定アミノ酸配列は、ヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）およびロイシン・リッチ・リピート（ＬＲＲ）を含有（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １９：５５−６４）し、ともに、多くのクローニングされた植物耐性遺伝子の共通の特徴である（Ｂｅｎｔ  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：１７５７−１７７１）。興味深いことに、Ｐｉ−ｔａは、Ｃ末端に中央局在化ヌクレオチド結合部位およびロイシン・リッチ・ドメイン（ＬＲＤ）を含有するためＰｉｂに類似している。ＡＶＲ−Ｐｉ−ｔａ（１７６）タンパク質は、分泌配列およびプロタンパク質配列を持たず、酵母ツー・ハイブリッド・システムおよび生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）結合アッセイ両方で、Ｐｉ−ｔａタンパク質のＬＲＤに特異的に結合することができ、ＡＶＲ−Ｐｉ−ｔａ（１７６）タンパク質が植物細胞内部のＰｉ−ｔａ  ＬＲＤ領域に直接結合してＰｉ−ｔａ媒介防御応答を開始することを示唆される（Ｂｒｙａｎ  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：２０３３−４６；  Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９：４００４−１４）。Ｐｉ−ｔａの６つの耐性対立遺伝子と５つの感受性対立遺伝子との配列の比較は、特異性を決定する唯一の単一アミノ酸を持つ全体的なアミノ酸多型を明らかにした。
【００８３】
Ｐｉ２遺伝子を、高耐性Ｏ．ｓａｔｉｖａ種ｉｎｄｉｃａ栽培品種５１７３から感受性栽培品種ＣＯ３９へと遺伝子移入し、派生した同質遺伝子系統をＣ１０１Ａ５１と名づけた（Ｍａｃｋｉｌｌ  ａｎｄ  Ｂｏｎｍａｎ  （１９９２）  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８２：７４６−７４９）。Ｃ１０１Ａ５１は、フィリピンの異なる領域から採集された２００個を上回る単離物に耐性であり、系統４４に属する少数の単離物のみに感受性であることが見出された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｒｉｃｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓ．  ８０：５２−５６）。複数の他の国での広範な接種試験も、Ｐｉ２が最も広域性のいもち病耐性遺伝子の１つであることを示した（Ｈ．  Ｌｅｕｎｇ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＩＲＲＩ）。Ｐｉ２遺伝子は、イネ染色体６に位置づけられ、ＲＦＬＰマーカーＲＧ６４（２．１ｃＭ）に密接に連鎖することが見いだされた（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：４７１−４７６）。Ｐｉ９を、四倍体野生イネＯｒｙｚａ  ｍｉｎｕｔａ（ＢＢＣＣゲノム）からエリート育種系統ＩＲ３１９１７中に遺伝子移入した（Ａｍａｎｔｅ−Ｂｏｒｄｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８４：３４５−３５４）。その遺伝子も、染色体６上に位置づけられ、Ｐｉ２に密接に連鎖する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍ．  ２６７：４７２−４８０）。Ｐｉ９マーカーの全てを用いて、Ｐｉ２遺伝子座にまたがる高分解能マップおよびＢＡＣ／ＴＡＣコンティグを構築した。コンティグ中の９９ｋｂフラグメントの配列分析は、該領域に存在する６つのＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子（ＮＢＳ１ないし６）を示した。遺伝分析および突然変異分析は、候補遺伝子の１つＮＢＳ２がＰｉ２遺伝子であることを示唆した。  
【実施例】
【００８４】
（実施例１：大きいＦ２集団でのＰｉ９連鎖マーカーを用いたＰｉ２領域の高分解能マッピング）
Ｐｉ２遺伝子座での高分解能マップを構築するために、Ｐｉ２同質遺伝子系統Ｃ１０１Ａ５１と感受性栽培品種ＣＯ３９との間の交雑種由来の２０００個を上回るＦ２植物にいもち病単離物ＰＯ６−６を接種した。接種後７日目に、０〜５採点法にもとづいて、植物を感染に対して採点した。通常の感受性病変を持つ合計５０５個の植物を温室中の鉢に移植した。移植後２週間目に、少量ＤＮＡ抽出のために、若葉（３ないし４ｃｍ長）を各植物から収穫した。ＤＮＡを、全ての感受性植物から抽出した。ＤＮＡ特性および濃度をアガロース・ゲル上で調べ、ＴＥ緩衝液で約２０ｎｇ／μｌに調整した。ＤＮＡ２μｌをＰＣＲ増幅に用いた。  
【００８５】
【表１】
2006507840.tif 000002
Ｐｉ９領域のゲノム配列にもとづいて、５つのプライマー対（ＲＧ６４、ＮＢＳ１、ＮＢＳ２、ＮＢＳ４、およびＮＢＳ６）（表１）を設計した。初めに、これらのプライマーを用いて、Ｃ１０１Ａ５１とＣＯ３９との間の多型をスクリーニングした。ＮＢＳ１およびＮＢＳ６プライマーは、ＣＯ３９からの特異的なバンドを増幅できず、一方で、ＮＢＳ２プライマーは、Ｃ１０１Ａ５１からの特異的なバンドを増幅できただけであった。ＮＢＳ４プライマーは、Ｃ１０１Ａ５１およびＣＯ３９両方からのバンドを増幅したが、ＰＣＲ産物は異なるサイズであった。ＲＧ６４プライマーについては、多型は、制限酵素ＨａｅＩＩＩでのＰＣＲ産物の消化後のみに２つの親間で認められた（Ｈｉｔｔａｌｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １００：１１２１−１１２８）。したがって、我々は、ＮＢＳ２、ＮＢＳ４、およびＲＧ６４プライマーを用いて、合計５０５個の感受性植物をスクリーニングした。１５個の組み換え体がＲＧ６４遺伝子座で見出され、これは、該マーカーとＰｉ２遺伝子との間の２．８ｃＭ距離のＲＦＬＰマッピング結果に整合している（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：４７１−４７６）。ＲＦＬＰマーカーＲ２１３１間の別の４２６個のＦ２植物中で、８つの組み換え体を同定し、Ｐｉ２遺伝子からの２．７ｃＭの距離が示された。５０５個の感受性植物中のＰｉ２とＮＢＳ２またはＮＢＳ４マーカーとの間で見出された組み換え体はなかった。これらの結果は、Ｐｉ２がＮＢＳ２およびＮＢＳ４両方に高度に連鎖することを示す。
【００８６】
（実施例２：Ｐｉ２ＢＡＣおよびＴＡＣライブラリの構築）
ＢＡＣおよびＴＡＣライブラリを構築するために、高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡをＰｉ２同質遺伝子系統Ｃ１０１Ａ５１から単離し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化した。その後、パルス・フィールド・ゲル電気泳動装置を用いて、該ＤＮＡをサイズによって分画（１００ないし２００ｋｂ）した。低融点アガロースから精製したＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化・脱リン酸化ＢＡＣおよびＴＡＣベクターにそれぞれライゲートした。Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒシステムを用いて、ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞中に電気穿孔した。部分的に消化したＤＮＡに対して、１サイズ選択のみを実行したので、２つのライブラリの平均インサート・サイズは約４０ｋｂであった。約２００，０００個のＢＡＣクローンおよび１５０，０００個のＴＡＣクローンを回収し、８０個のＢＡＣプール（一プール当たり約５０００個のクローン）および４５個のＴＡＣプール（一プール当たり約３０００個のクローン）に別々に保存した。ＰＣＲおよびサザン分析のために、ＢＡＣ／ＴＡＣプラスミドＤＮＡを各プールから単離した。
【００８７】
３つのプライマー対（硝酸塩誘導タンパク質遺伝子、ならびにＮＢＳ２およびＮＢＳ４マーカー）を用いて、２つのライブラリから陽性ＢＡＣおよびＴＡＣクローンをスクリーニングした。硝酸塩誘導タンパク質遺伝子から得たプライマーは、Ｐｉ９配列中のＮＢＳ遺伝子クラスタの上流にあるので、該プライマーを用いた。３つのプライマー対に対して、予測バンドを３つのＢＡＣプールおよび２つのＴＡＣプールから増幅した。コロニーおよびサザン・ハイブリダイゼーション後に、これら３つのフラグメントを含有する３つの個々のＢＡＣ（ＢＡＣ６、２３、および７０）を得た。ＴＡＣライブラリから得た２つの陽性クローン（ＴＡＣ３９およびＴＡＣ４０）は、同じクローンであり、それらの制限消化およびサザン・ハイブリダイゼーション・パターンにしたがって、ＢＡＣ７０、ＢＡＣ２３、およびＢＡＣ６とオーバーラップすることが確認された。さらに、ＢＡＣ６のフォワード末端をコロニー・ハイブリダイゼーション用プローブとして用いて、ＴＡＣライブラリから得たＴＡＣ４０およびＢＡＣ６とオーバーラップするＴＡＣ１０を同定した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ消化バンドからの推定によれば、コンティング全体の隣接した長さは約１３５ｋｂである（図１）。これらのクローン間では、ＢＡＣ７０が硝酸塩誘導タンパク質遺伝子を含有することが確認され、ＢＡＣ２３がＮＢＳ２およびＮＢＳ４マーカーを含有し、ＢＡＣ６がＮＢＳ４マーカーを含有する（図２Ａ）。
【００８８】
（実施例３：Ｐｉ２遺伝子座にまたがるＢＡＣおよびＴＡＣクローンのショットガン・ライブラリ）
上記の結果にもとづいて、ショットガン法を用いたシーケンシングのために、最小限のオーバーラップを持つ３つのクローン（ＢＡＣ７０、ＴＡＣ４０、ＴＡＣ１０）を選択した。酢酸アンモニア沈降法を用いて少量調製したＢＡＣおよびＴＡＣ  ＤＮＡを超音波処理によって切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによって修復した。修復したＤＮＡをアガロース・ゲル上でサイズによって選択し、ＧＦＸカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。精製したＤＮＡをＳｍａＩ消化・脱リン酸化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（＋）ベクターにライゲートした。Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒシステムを用いて、ライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞に電気穿孔した。３つのライブラリのインサート・サイズは、１．５ｋｂないし２．５ｋｂであった。白色コロニーを選択して、シーケンシングのために、−８０℃で９６穴プレートに保存した。ＴＡＣ４０ショットガン・ライブラリから得た約９００個の個々のクローンおよびＢＡＣ７０ショットガン・ライブラリから得た７００個の個々のクローンを両末端からシーケンシングした。プログラムｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄを用いて、ＴＡＣ４０およびＢＡＣ７０両方から得た配列データ全てを集めた。集められた配列データは、ＴＡＣ４０に関して５８ｋｂおよびＢＡＣ７０に関して４６ｋｂの長さを示した。Ｐｉ２領域の隣接した配列の全長は、ＢＡＣ７０とＴＡＣ４０との間のオーバーラップ配列の除去後、９９，０９０ｂｐであった（配列番号１３）。
【００８９】
（実施例４：Ｐｉ２配列中のＮＢＳ−ＬＲＲ相同遺伝子クラスタ）
ゲノム配列からオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を正確に同定するために、２つの異なる手法を用いた。第１に、遺伝子予測プログラムＧｅｎＳｃａｎ１．０を用いて、９９ｋｂ領域中のコード配列の骨格を得た。第２に、ＢＬＡＳＴプログラム使用したホモロジー検索を用いて、遺伝子予測結果を改変した。硝酸塩誘導タンパク質（ＮＩＰ）遺伝子の耐性遺伝子様クラスタ下流を９９ｋｂ配列中で同定した。植物種中でクローニングされたＮＢＳ／ＬＲＲ型耐病性遺伝子に高度に相同である６つの遺伝子（ＮＢＳ１ないしＮＢＳ６と命名）を遺伝子クラスタ中で同定した（図２Ｂ）。６つのＰｉ２候補遺伝子間では、関連ｃＤＮＡの部分配列を用いてＮＢＳ２（配列番号３）およびＮＢＳ４（配列番号７）が確認された。イネ・ジプシー型レトロトランスポゾンＲＩＲＥ８のＬＴＲにヌクレオチド配列で８６％同一性を示す単独ＬＴＲの挿入によって、ＮＢＳ３（配列番号：５）をトランケートする。この単独ＬＴＲは、通常、ＧＡＣＣＧの複製標的配列およびＴＧＴＣＡＣの反転反復配列を含む典型的な特徴を示す。大きな消失がコード配列中に見出せるので、ＮＢＳ５（配列番号９）は別のトランケートされた遺伝子であるように思われる。ＮＢＳ６（配列番号１１）は、配列の右端にあり、右側方向への配列の伸張が進行している。
【００９０】
（実施例５：６つのＰｉ２候補遺伝子の配列比較分析）
６つの推定ＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子をタンパク質配列中に翻訳した。ＮＢＳ３、ＮＢＳ５、およびＮＢＳ６は、トランケートされた遺伝子であるか、または不完全な遺伝子であるので、ＢＬＡＳＴ２を用いて、それらの遺伝子の相同フラグメントで配列比較をおこなった（表２）。６つのＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子間では、ＮＢＳ２は、ＮＢＳ４およびＮＢＳ６に対して、それぞれ９４％および９５％同一性を示す。ＮＢＳ４およびＮＢＳ６は互いに９７％同一性を示す。
【００９１】
【表２】
2006507840.tif 000003
＊  ＮＢＳ５およびＮＢＳ６両方は、トランケートされているか、または不完全であるので、それらのヌクレオチド配列を用いて、他の遺伝子と比較した。
＊＊  ＮＢＳ５およびＮＢＳ６は、それらのヌクレオチド配列と比較した。
【００９２】
（実施例６：候補Ｐｉ２遺伝子のｃＤＮＡのスクリーニング）
いもち病単離物ＰＯ６−６での感染後１２時間および２４時間目に、葉組織から単離したＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリを構築した。これら２つの時間点からの等量のＲＮＡを混合し、ｍＲＮＡ精製に用いた。精製されたｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリを構築した。２０個の個々のクローンを調べた後でサイズは０．７ｋｂないし２．８ｋｂに配置しており、ｃＤＮＡクローンの平均サイズは１．５ｋｂである。ｃＤＮＡライブラリを５０個のプールに保存し、合計で約５００，０００個のｃＤＮＡクローンになる。各プールのＥｃｏＲＩ消化プラスミドＤＮＡへのプローブとしてのＮＢＳ２マーカーを用いたハイブリダイゼーションによって、複数の候補プールを同定した。コロニー・ハイブリダイゼーションを用いて、ｃＤＮＡ−４５（配列番号１４）およびｃＤＮＡ−２１（配列番号１５）を最終的に同定し、配列確認によってＮＢＳ４に一致した。
【００９３】
ｃＤＮＡプールからのＰＣＲ増幅およびＲＴ−ＰＣＲを適用して、ＮＢＳ２およびＮＢＳ４の完全なコード配列をクローニングした。Ｐｉ２領域のゲノム配列にもとづいて、ＮＢＳ２およびＮＢＳ４両方由来の特異的プライマーを設計した（表３、図３）。ＮＢＳ２−ｐ２およびＭ１３フォワード・プライマーを用いて、ｃＤＮＡ−ｆ３をｃＤＮＡプールから得た。ＮＢＳ２−ｐ１／ＢＡＣ８４ＲおよびＮＢＳ２−ｐ３／ｐｉ２−ｐ５のプライマー対を別々に使用したＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ｃＤＮＡ−５１、ｃＤＮＡ−５２、およびｃＤＮＡ−４を増幅した。これらのｃＤＮＡのシーケンシングは、ｃＤＮＡクローンのうち３つ（ｃＤＮＡ−ｆ３、ｃＤＮＡ−５１、およびｃＤＮＡ−４）がＮＢＳ２遺伝子に一致し、ｃＤＮＡ−５２がＮＢＳ４遺伝子に一致することを確認した。これら３つのｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ−ｆ３、ｃＤＮＡ−５１、およびｃＤＮＡ−４）間のオーバーラップを除去することによって、ＮＢＳ２の完全コード配列を得た。この配列を配列番号３として提示する。
【００９４】
【表３】
2006507840.tif 000004
（実施例７：より多くのマーカーを持つＰｉ２領域の精密なマッピング）
ＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子アラインメント中の相違がＰｉ２とＰｉ９領域との間で見出された（図４）。Ｐｉ２遺伝子マッピングのために用いた、ＮＢＳ４から設計したプライマーは、Ｐｉ２中のＮＢＳ３に一致することが確認された。Ｐｉ９由来の別のマーカーＢＡＣ３Ｒ末端もＰｉ２中の同じＮＢＳ３遺伝子に一致した。Ｐｉ２領域中には、Ｐｉ９との相違であるＮＢＳ３遺伝子の１つのみのコピーがある。ＰＣＲ法を用いて、５０５個の感受性植物中のＮＢＳ２またはＮＢＳ３とＰｉ２との間で組み換え体は見出されなかった。ハイブリダイゼーション法を用いて、１つの組み換え体が別の４２６個のＦ２植物中のＮＢＳ３とＰｉ２との間で見出された。ＮＢＳ３へのＰｉ２の方向を決定するために、ＮＢＳ１ないしＮＢＳ６領域由来の配列にもとづいて、より多くのＰＣＲプライマー対を設計した。ＢＡＣ６フォワード末端由来の配列にもとづいて設計されたプライマー対を用いて５０５個の感受性植物をスクリーニングした際、３つの組み換え体を同定した。したがって、ＢＡＣ６フォワード末端は、ＮＢＳ３に対して下流であるので、Ｐｉ２遺伝子は、ＮＢＳ３に対する上流にあるべきである。ＮＢＳ１に対して上流の領域に多型が見出されなかったという先の結果とまとめると、これらの結果は、Ｐｉ２が、Ｐｉ２領域中のＮＩＰとＮＢＳ３との間の唯一の２つの遺伝子であるＮＢＳ１またはＮＢＳ２のいずれかであるということを確立した（図２Ａ）。  
【００９５】
（実施例８：Ｐｉ２植物からの突然変異体生成）
Ｐｉ２遺伝子のクローニングを促進するために、我々は、Ｐｉ２保持栽培品種Ｃ１０１Ａ５１から突然変異系統を生成した。Ｃ１０１Ａ５１種子をガンマ線で処理して、１０，０００個より多いＭ１系統を回収した。個々のＭ２種子を土壌に植え付け、３週間後に該種子にＰＯ６−６を接種した。典型的な感受性徴候を持つ植物を温室中の鉢に移植した。２週間後に、ＰＣＲおよびサザン分析のために、ＤＮＡを各植物から抽出した。３つの特異的プライマー対（Ｎｉｐ、ＮＢＳ２、およびＢＡＣ６フォワード末端）をＰＣＲスクリーニングのために用いた（表３）。ＰＣＲ分析は、Ｎｉｐ遺伝子が全てのＭ２植物中で欠失していなかったが、一方で、ＮＢＳ２およびＢＡＣ６フォワード末端は、全ての感受性突然変異植物中で消失していたことを示した。興味深いことに、２つの異なるファミリーの２つの耐性遺伝子（２５−４および４１−２）は、３つの標的領域内で欠失を持たなかった。
【００９６】
【表４】
2006507840.tif 000005
連続のＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション分析のために用いて、Ｃ１０１Ａ５１の感受性突然変異系統中の欠失領域を決定した（表４）。１つの領域は、ＮＢＳ１の３′末端からＮＢＳ２のプロモーター領域へとまたがる４２３６１ｂｐないし４５３０１ｂｐ由来のフラグメントを含有する（図２Ｂ）。ＰＣＲ分析に用いた突然変異植物の同じセットをサザン分析で用いた。ＮＢＳ１フラグメントをプローブとして用いた際、全ての感受性突然変異体および耐性突然変異体は、野生型耐性植物Ｃ１０１Ａ５１と同じハイブリダイゼーション・パターンを示した。２つのハイブリダイジング・バンドのサイズは、配列の制限マップから決定されたものと同一であった。しかし、５３２２１ｂｐおよび５４０２３ｂｐ由来のＮＢＳ２遺伝子の３′領域は、全ての感受性Ｍ２植物で欠失していたが、耐性植物では欠失していなかった（図２Ｂ）。５１８９４ｂｐおよび５４０２３ｂｐ由来の別のＮＢＳ２プローブを用いて、ＮＢＳ２遺伝子領域での欠失部位を決定した（図２Ｂ）。野生型耐性植物Ｃ１０１Ａ５１および突然変異系統由来の耐性植物両方は、同じハイブリダイゼーション・パターンを示した。すなわち、配列の制限マップから決定されたものとサイズで同一のハイブリダイジング・バンドである。突然変異系統由来の感受性植物は、野生型植物Ｃ１０１Ａ５１中の２．８ｋｂのバンド外で、１．６ｋｂのより小さなバンドを示した。ＮＢＳ２遺伝子中の欠失部位が５２８９１ｂｐないし５５６７４ｂｐに局在し、これが２．８ｋｂのバンドが１．６ｋｂになることの理由であることが推定された。インバースＰＣＲを用いて、欠失領域にまたがるフラグメントもクローニングした。欠失接合部の配列から、欠失領域がＮＢＳ２遺伝子の中央で始まることが確認された。ＰＣＲ分析結果とまとめると、既知の突然変異体の欠失領域がＮＢＳ２とＢＡＣ６フォワード末端との間にあり、ＮＢＳ１が全ての感受性突然変異植物中でインタクトであったためＰｉ２候補遺伝子の１つではないことが推定された。  
【００９７】
高分解能マッピングおよび突然変異分析結果を組み合わせると、ＮＢＳ２がＰｉ２候補遺伝子であることが結論付けられた。
【００９８】
（実施例９：ＮＢＳ−１とＰｉｂとの間の配列保存およびＮＢＳ２（Ｐｉ２）内の保存エレメント）
前述の実験で得られた６つのＮＢＳ遺伝子ＮＢＳ１ないしＮＢＳ６を鑑みて、これらの遺伝子とクローニングしたいもち病耐性遺伝子Ｐｉｂとに対して得られた予測アミノ酸配列間で多重タンパク質配列アラインメントを実行した。図４は、このアラインメントの結果を示し、これは、高度の配列保存の領域を示す。  
【００９９】
ＮＢＳ２（Ｐｉ２）遺伝子内の保存エレメントも図１０に示し、これは、ＮＢ−ＡＲＣドメインがアミノ酸１４４付近からアミノ酸４６５付近由来のこの遺伝子に存在し、一方で、ＬＲＲドメインがアミノ酸５３４付近からアミノ酸９５１付近由来のこの遺伝子に存在することを示す。
【０１００】
（実施例１０：トランスジェニック植物の形質転換および再生）
温室ドナー植物由来の未成熟トウモロコシ胚を、適当なプロモーターに作動可能に結合する本発明のＰｉ２様ＤＮＡ配列と、除草剤ビアラホスに対する耐性を与える選択可能なマーカー遺伝子ＰＡＴ（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ７０：２５−３７）とを含有するプラスミドで打ち込む（ボンバードする）。または、該選択可能なマーカー遺伝子を別のプラスミド上で与える。形質転換を次のように実行する。培地レシピが後に続く。
【０１０１】
（標的組織の調製）
穂の皮をむき、３０％クロロックス漂白剤と０．５％Ｍｉｃｒｏ洗剤とで２０分間表面殺菌し、減菌水で２回すすぐ。未成熟胚を切除して、５６０Ｙ培地上で一プレート当たり２５個の胚で胚軸側を下（胚盤側を上）にして４時間入れ、その後、打ち込み（ボンバードメント）のための準備で、２．５ｃｍ標的ゾーン内でアラインする。  
【０１０２】
（ＤＮＡの調製）
適当なプロモーターに作動可能に結合するＰｉ２様ＤＮＡを含むプラスミド・ベクターを作製する。次のようにＣａＣｌ２沈降手順を用いて、このプラスミドＤＮＡと、ＰＡＴ選択可能マーカーを含有するプラスミドＤＮＡとを１．１μｍ（平均直径）タングステン・ペレット上に沈降させる。すなわち、
水中で調製したタングステン粒子１００μｌ
Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ緩衝液中ＤＮＡ１０μｌ（１μｇ）（全ＤＮＡ１μｇ）
２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  １００μｌ
０．１Ｍスペルミジン１０μｌ。
【０１０３】
多管ボルテクサー上に維持しながら、各試薬をタングステン粒子懸濁物に順次添加する。最終混合物を短時間超音波処理し、一定のボルテックス下で１０分間インキュベートする。沈降期間後、管を短時間遠心し、液体を除去して、１００％エタノール５００ｍｌで洗浄し、３０秒間遠心する。再び液体を除去して、１００％エタノール１０５μｌを最終タングステン粒子ペレットに添加する。粒子銃ボンバードメントのために、タングステン／ＤＮＡ粒子を短時間超音波処理し、１０μｌを各マクロキャリアの中心にスポットして、ボンバードメント前に約２分乾燥させる。
【０１０４】
（粒子銃処理）
粒子銃第ＨＥ３４−１番または第ＨＥ３４−２番で、第４レベルで試料プレートをボンバードする。全ての試料は、調製した粒子／ＤＮＡの各管から得た合計１０個のアリコートで、６５０ＰＳＩで１回のショットを受ける。
【０１０５】
（以降の処理）
ボンバードメントに続いて、胚を５６０Ｙ培地上で２日間維持し、その後、ビアラホスを３ｍｇ／ｌ含有する５６０Ｒ選択培地に移し、２週間ごとに継代培養する。選択の約１０週間後に、選択耐性カルス・クローンを２８８Ｊ培地に移し、植物再生を開始する。体細胞胚突然変異（２ないし４週）に続いて、十分に成長した体細胞胚を発芽用培地に移し、明るい培養室に移す。約７ないし１０日後に、成長している苗木を、苗木が十分に樹立するまで７ないし１０日間、管中の２７２Ｖ無ホルモン培地に移す。その後、植物を、鉢植え用土を含有するフラット中のインサート（２．５”鉢に相当）に移し、成長チャンバ中で１週間成長させ、続いて温室中でさらに１ないし２週間成長させ、その後、典型的な６００個の鉢（１．６ガロン）に移して、成熟するまで成長させる。植物をモニタリングして、Ｐｉ２様ＤＮＡ活性についてスコアリングする。
【０１０６】
（ボンバードメントおよび培地）
ボンバードメント培地（５６０Ｙ）は、Ｎ６基本塩４．０ｇ／ｌ（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、Ｅｒｉｋｓｓｏｎのビタミン・ミックス１．０ｍｌ／ｌ（１０００Ｘ  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、チアミンＨＣｌ  ０．５ｍｇ／ｌ、スクロース１２０．０ｇ／ｌ、２，４−Ｄ  １．０ｍｇ／ｌ、およびＬ−プロリン２．８８ｇ／ｌ（ＫＯＨでのｐＨ５．８への調整に続いてＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）；ゲルライト２．０ｇ／ｌ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にした後に添加）；ならびに８．５ｍｇ／ｌ硝酸銀（培地を殺菌し、室温まで冷却した後に添加）を含む。選択培地（５６０Ｒ）は、Ｎ６基本塩４．０ｇ／ｌ（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、Ｅｒｉｋｓｓｏｎのビタミン・ミックス１．０ｍｌ／ｌ（１０００Ｘ  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、チアミンＨＣｌ  ０．５ｍｇ／ｌ、スクロース３０．０ｇ／ｌ、および２，４−Ｄ  ２．０ｍｇ／ｌ（ＫＯＨでのｐＨ５．８への調整に続いてＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）；ゲルライト３．０ｇ／ｌ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にした後に添加）；ならびに硝酸銀０．８５ｍｇ／ｌおよびビアラホス３．０ｍｇ／ｌ（培地を殺菌し、室温まで冷却した後両方を添加）を含む。
【０１０７】
植物再生培地（２８８Ｊ）は、ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、ＭＳビタミン・ストック溶液５．０ｍｌ／ｌ（精製Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏでニコチン酸０．１００ｇ、チアミンＨＣＬ  ０．０２ｇ／ｌ、ピリドキシンＨＣＬ  ０．１０ｇ／ｌ、およびグリシン０．４０ｇ／ｌを容量にする）（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  （１９６２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５：４７３）、ミオイノシトール１００ｍｇ／ｌ、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌ、スクロース６０ｇ／ｌ、および０．１ｍＭアブシジン酸１．０  ｍｌ／ｌ（ｐＨ５．６に調整した後、精製Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）；ゲルライト３．０ｇ／ｌ（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にした後に添加）；ならびにインドール酢酸１．０ｍｇ／ｌおよびビアラホス３．０ｍｇ／ｌ（培地を殺菌し、６０℃まで冷却した後に添加）を含む。無ホルモン培地（２７２Ｖ）は、ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、ＭＳビタミン・ストック溶液５．０ｍｌ／ｌ（精製Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏでニコチン酸０．１００ｇ、チアミンＨＣＬ  ０．０２ｇ／ｌ、ピリドキシンＨＣＬ  ０．１０ｇ／ｌ、およびグリシン０．４０ｇ／ｌを容量にする）、ミオイノシトール０．１ｇ／ｌ、およびスクロース４０．０ｇ／ｌ（ｐＨ５．６に調整した後、精製Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）；ならびに殺菌し６０℃まで冷却したバクト・アガー６ｇ／ｌ（精製Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にした後に添加）を含む。
【０１０８】
（実施例１１：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換）
本発明のＰｉ２様遺伝子でのトウモロコシのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換のために、好ましくはＺｈａｏの方法を用いる（米国特許第５，９８１，８４０号およびＰＣＴ特許明細書ＷＯ９８／３２３２６、それらの内容を本明細書に援用する）。要約すると、未成熟胚をトウモロコシから単離して、該胚を、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁物と接触させ、この際、該細菌は、未成熟胚のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの細胞にＰｉ２様遺伝子を送達することが可能である（ステップ１：感染ステップ）。このステップでは、接種の開始のために、好ましくは、未成熟胚をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁物に浸漬させる。胚をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と一時の間共培養する（ステップ２：共培養ステップ）。好ましくは、感染ステップに続いて、未成熟胚を固形培地上で培養する。この共培養期間に続いて、任意の「静止（ｒｅｓｔｉｎｇ）」ステップを考慮する。この静止ステップでは、植物形質転換体に対する選択剤を添加せずに、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を阻害することが知られている少なくとも１つの抗生物質の存在下で胚をインキュベートする（ステップ３：静止ステップ）。好ましくは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の除去のため、かつ感染細胞に対する静止期のために、抗生物質を含むが選択剤を含まない固形培地上で未成熟胚を培養する。次に、選択剤を含有する培地上で接種した胚を培養して、増殖している形質転換カルスを回収する（ステップ４：選択ステップ）。好ましくは、形質転換細胞の選択的増殖を生じる選択剤を含む固形培地上で未成熟胚を培養する。その後、カルスを植物中に再生し（ステップ５：再生ステップ）、好ましくは、選択培地で増殖させたカルスを固形培地上で培養して、植物を再生する。  
【０１０９】
（実施例１２：ダイズ胚形質転換）
適当なプロモーターに作動可能に結合する本発明のＰｉ２様遺伝子を含有するプラスミドでダイズ胚を次のようにボンバードする。体細胞胚を誘導するために、ダイズ栽培品種Ａ２８７２の表面殺菌した未成熟種子から全裂した長さ３ないし５ｍｍの子葉を、２６℃で６ないし１０週間、明所または暗所で、適当な寒天培地上で培養する。その後、２次胚を産生する体細胞胚を切除して、適当な液体培地中に入れる。初期の球状期胚として多重化した体細胞胚のクラスタに対する反復選択の後に、懸濁物を下記のように維持する。  
【０１１０】
ダイズ胚形成懸濁物カルチャーを、１６：８時間昼／夜スケジュールで、蛍光照明を用いて、回転式振盪器（１５０ｒｐｍ）上の液体培地３５ｍｌ中に２６℃で維持することができる。組織約３５ｍｇを液体培地３５ｍｌ中に接種することによって、カルチャーを２週間ごとに継代培養する。
【０１１１】
その後、粒子銃ボンバードメント法によって、ダイズ胚形成懸濁物カルチャーを形質転換することが可能である（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ３２７：７０−７３、米国特許第４，９４５，０５０号）。Ｄｕ  Ｐｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ１０００／ＨＥ機器（ヘリウム・レトロフィット）をこれらの形質転換のために用いることができる。
【０１１２】
ダイズ形質転換を促進するために用いることができる選択可能マーカー遺伝子は、カリフラワー・モザイク・ウイルス由来の３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２２５由来のハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来；Ｇｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｇｅｎｅ  ２５：１７９−１８８）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ由来のノパリン・シンターゼ遺伝子の３′領域から構成される導入遺伝子である。適当なプロモーターに作動可能に結合するＰｉ２様遺伝子を含む発現カセットを制限フラグメントとして単離することができる。その後、このフラグメントを、マーカー遺伝子を保持するベクターの固有の制限部位に挿入することができる。  
【０１１３】
６０ｍｇ／ｍｌ  １μｍ金粒子懸濁物の５０μｌに、ＤＮＡ  ５μｌ（１μｇ／μｌ）、スペルミジン２０μｌ（０．１Ｍ）、およびＣａＣｌ２  ５０μｌ（２．５Ｍ）を添加する（順番どおりに）。その後、粒子懸濁物を３分間撹拌して、微量遠心管中で１０秒間スピンし、上清を除去する。その後、ＤＮＡ被覆粒子を７０％エタノール４００μｌで１回洗浄し、無水エタノール４０μｌ中で再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁物を３回、各１秒間超音波処理する。その後、ＤＮＡ被覆金粒子５μｌを各マクロキャリア・ディスク上に積載する。  
【０１１４】
２週齢の懸濁物カルチャー約３００ないし４００ｍｇを空の６０ｘ１５ｍｍペトリ皿に入れ、ピペットを用いて、残留液体を組織から除去する。各形質転換実験に対して、通常、組織の約５ないし１０個のプレートをボンバードする。膜破裂圧力を１１００ｐｓｉに設定し、チャンバを２８インチ水銀柱の真空度まで真空にする。組織を、保持スクリーンから約３．５インチ隔てて置き、３回ボンバードする。ボンバードメントに続いて、組織を半分に分割して、液体中に戻し入れ、上述のように培養することができる。  
【０１１５】
ボンバードメント後５ないし７日目に、液体培地を新たな培地と交換し、ボンバードメント後１１ないし１２日目に、ハイグロマイシン５０ｍｇ／ｍｌを含有する新たな培地と交換することが可能である。この選択培地を毎週新たにすることができる。ボンバードメント後７ないし８日目に、緑色の形質転換組織が、形質転換されていない壊死性胚形成クラスタから増殖することが認められうる。単離緑色組織を取り出し、個々のフラスコ中に接種して、新規のクローン的に増殖した形質転換胚形成懸濁物カルチャーを生成する。各新系統を独立した形質転換事象として処理することが可能である。その後、これらの懸濁物を継代培養して、未成熟胚のクラスタとして維持するか、または成熟および個々の体細胞胚の発芽によって植物全体中に再生することができる。  
【０１１６】
（実施例１３：ヒマワリ分裂組織形質転換）
適当なプロモーターに作動可能に結合する本発明のＰｉ２様遺伝子を含有する発現カセットでヒマワリ分裂組織を次のように形質転換する（欧州特許第ＥＰ  ０  ４８６２３３号（本明細書に援用）、およびＭａｌｏｎｅ−Ｓｃｈｏｎｅｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０３：１９９−２０７も参照せよ）。単一のコムギ穂先脱穀機を用いて、成熟ヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）を脱穀する。溶液５０ｍｌ当たりＴｗｅｅｎ２０を２滴添加した２０％クロロックス漂白剤溶液中で、種子を３０分間表面殺菌する。種子を減菌蒸留水で２回すすぐ。
【０１１７】
Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒ他に記載の手順（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ９：５５−６０）の改変版によって、分裂胚軸外植体を調製する。表面殺菌手順に続いて、種子を蒸留水中で６０分間吸収させる。その後、各種子の子葉をもぎとり、胚軸の面にきれいな裂け目を生成する。根端の切除に続いて、外植体を原葉間で長軸方向に二分する。ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ無機養素（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５：  ４７３−４９７）、Ｓｈｅｐａｒｄのビタミン添加（Ｓｈｅｐａｒｄ  （１９８０）  ｉｎ  Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｒｏｐｓ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、硫酸アデニン４０ｍｇ／ｌ、スクロース３０ｇ／ｌ、６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡＰ）０．５ｍｇ／ｌ、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）０．２５ｍｇ／ｌ、ジベレリン酸（ＧＡ３）（ｐＨ５．６）０．１ｍｇ／ｌ、およびＰｈｙｔａｇａｒ  ８ｇ／ｌからなるＧＢＡ培地上で、２つの半分を断面を上にして置く。
【０１１８】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）処理前に、外植体を微粒子銃ボンバードメントにかける（Ｂｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：３０１−３１３）。この処理のために、３０ないし４０の外植体を６０Ｘ２０ｍｍプレートの中心にある円に置く。１．８ｍｍタングステン微粒子銃約４．７ｍｇを無菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２５ｍｌ中で再懸濁し、１．５ｍｌアリコートを一ボンバードメントに対して用いる。ＰＤＳ  １０００（商標）粒子促進装置中で、試料の２ｃｍ上に置かれた１５０ｍｍナイテクス（ｎｙｔｅｘ）スクリーンを介して、各プレートを２回ボンバードする。
【０１１９】
無害にしたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＥＨＡ１０５を全ての形質転換実験で用いる。適当なプロモーターに作動可能に結合するＰｉ２様遺伝子を含有する発現カセットを含むバイナリー・プラスミド・ベクターを、Ｈｏｌｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６３：１８１−１８７に記載されるように、冷凍・解凍を介してアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＥＨＡ１０５中に導入する。このプラスミドは、カナマイシン選択可能マーカー遺伝子（すなわち、ｎｐｔＩＩ）をさらに含む。細菌菌株およびバイナリー・プラスミド維持に要する適当な抗生物質を添加した液体ＹＥＰ培地（酵母抽出物１０ｇｍ／ｌ、Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ  １０ｇｍ／ｌ、およびＮａＣｌ  ５ｇｍ／ｌ、ｐＨ７．０）中で、植物形質転換実験用の細菌を一晩増殖させる（２８℃および１００ＲＰＭ連続撹拌）。懸濁物が約０．４ないし０．８のＯＤ６００に達するとき、該懸濁物を用いる。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞をペレット化し、１２．５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇｍ／ｌ、およびＭｇＳＯ４  ０．３ｇｍ／ｌから構成される接種培地中で、０．５の最終ＯＤ６００で再懸濁する。
【０１２０】
新たにボンバードした外植体をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁物中に入れ、混合し、３０分間静置する。その後、外植体をＧＢＡ培地に移し、断面を下にして２６℃で１８時間昼で共培養する。共培養の３日後、外植体を、セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／ｌを添加した３７４Ｂ（増殖レギュレーターおよび１％の還元スクロース・レベルを持たないＧＢＡ培地）に移す。外植体を２ないし５週間選択下で培養し、その後、連続した成長の１ないし２週間、カナマイシンを含まない新たな３７４Ｂ培地に移す。切除に適した新芽を生じなかった増殖の分化している抗生物質耐性領域を持つ外植体を、第２の３日間の植物ホルモン処理の間、セフォタキシム２５０ｍｇ／ｌを含有するＧＢＡ培地に移す。緑色のカナマイシン耐性新芽から得た葉試料を、ＥＬＩＳＡによってＮＰＴＩＩの存在に関して、かつＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  （２０００）  ２６７：４７２−４８０に記載されるもの等のアッセイを用いたＰｉ２様タンパク質活性のアッセイによって導入遺伝子発現の存在に関してアッセイする。
【０１２１】
ＮＰＴＩＩ陽性新芽を、Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）ハイブリッド６４４０生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）増殖苗木台木に移植する。表面殺菌した種子を、４８−０培地（半濃度のＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ塩、０．５％スクロース、０．３％ゲルライト、ｐＨ５．６）中で発芽させ、外植体培養について記載される条件下で増殖させる。苗木の上部を除去して、１ｃｍ垂直切片を胚軸中で作製し、形質転換新芽を切り口に挿入する。全領域をパラフィルムで包み、新芽を防護する。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養の１週間後に、移植した植物を土壌に移すことができる。土壌中での移植片を高湿度条件下で維持した後、温室環境へ徐々に順化させる。温室中で成熟しているＴ０植物（親世代）の形質転換部分を、ＮＰＴＩＩ  ＥＬＩＳＡおよび／または葉抽出物のＰｉ２様タンパク質活性分析によって同定し、一方で、ＮＰＴＩＩ陽性Ｔ０植物から収穫したトランスジェニック種子を、乾燥種子子葉の小部分のＰｉ２様タンパク質活性分析によって同定する。
【０１２２】
代替的なヒマワリ形質転換プロトコールは、化学的選択圧を用いずに、トランスジェニック子孫の回収を可能にする。種子を脱穀し、溶液１００ｍｌ当たりＴｗｅｅｎ２０を２ないし３滴添加した２０％クロロックス漂白剤溶液中で２０分間表面殺菌し、その後、蒸留水で３回すすぐ。殺菌した種子を、水で湿らせた濾紙上で、２６℃で２０時間暗所で吸収させる。子葉および根小根を除去し、３７４Ｅ（ＭＳ塩、Ｓｈｅｐａｒｄビタミン、硫酸アデニン４０ｍｇ／ｌ、３％スクロース、６−ＢＡＰ  ０．５ｍｇ／ｌ、ＩＡＡ  ０．２５ｍｇ／ｌ、ＧＡ  ０．１ｍｇ／ｌ、および０．８％Ｐｈｙｔａｇａｒ（ｐＨ５．６で）からなるＧＢＡ培地）上で、分裂組織外植体を暗下で２４時間培養する。１次葉を除去して、頂端分裂組織をさらし、約４０個の外植体を、３７４Ｍ（１．２％Ｐｈｙｔａｇａｒを含むＧＢＡ培地）の中心にある２ｃｍ円に頂端穹窿を上に向けて置き、その後、暗所で２４時間該倍地上で培養する。  
【０１２３】
１．８μｍタングステン粒子約１８．８ｍｇを絶対エタノール１５０μｌ中で再懸濁する。超音波処理後に、その８μｌをマクロキャリアの表面の中心に滴下する。各プレートを、Ｈｇヘリウム銃真空の２６ｍｍにある第１の棚中の６５０ｐｓｉ破裂ディスクで２回ボンバードする。
【０１２４】
対象のプラスミドを、先述したように冷凍・解凍を介してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＥＨＡ１０５中に導入する。カナマイシン５０μｇ／ｌの存在下で液体ＹＥＰ培地（酵母抽出物１０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ  １０ｇ／ｌ、およびＮＡＣｌ  ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）中で、２８℃で一晩増殖させた細菌のペレットを、接種培地（１２．５ｍＭ  ２−ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ＭＥＳ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／ｌ、およびＭＧＳＯ４  ０．３  ｇ／ｌ（ｐＨ５．７で））中で再懸濁して、ＯＤ６００で最終濃度４．０に到達させる。粒子でボンバードした外植体をＧＢＡ培地（３７４Ｅ）に移し、細菌懸濁物の液滴を分裂組織の上部に直接置く。外植体を該培地上で４日間共培養し、その後に、外植体を、３７４Ｃ培地（１％スクロースを含み、ＢＡＰ、ＩＡＡ、ＧＡ３は含まず、かつセフォタキシム２５０μｇ／ｍｌを添加したＧＢＡ）に移す。苗木を、該培地上で、１６時間昼および２６℃インキュベーション条件下で約２週間培養する。
【０１２５】
当該技術分野で公知のアッセイ（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  （２０００）  ２６７：４７２−４８０に記載されるもの等のアッセイを参照せよ）を用いて、３７４Ｃ培地中での２週間の培養から得た外植体（約２ｃｍ長）を、Ｐｉ２様タンパク質活性に関してスクリーニングする。陽性（すなわち、Ｐｉ２様タンパク質発現に対して）外植体を同定した後、Ｐｉ２様タンパク質活性を示さないそれらの新芽を破棄して、全ての陽性外植体を結節外植体に細分する。１つの結節外植体は、少なくとも１つの潜在的節を含有する。結節セグメントをＧＢＡ培地上で３ないし４日間培養して、各節から補助の芽の形成を促進する。その後、それらを３７４Ｃ培地に移し、さらに４週間成長させる。成長している芽を分離して、３７４Ｃ培地上でさらに４週間培養する。適当なタンパク質活性アッセイによって、各新規回収新芽由来のプールした葉試料を再びスクリーニングする。このとき、単一の節から回収した陽性新芽は、一般に、結節培養前の初期のアッセイで検出されたトランスジェニック領域で豊富になっているだろう。
【０１２６】
Ｐｉ２様タンパク質発現に対して陽性の回収した新芽を、Ｐｉｏｎｅｅｒハイブリッド６４４０生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）増殖ヒマワリ苗木台木に移植する。台木を以下の方法で調製する。種子を脱穀し、溶液１００ｍｌ当たりＴｗｅｅｎ２０の２ないし３滴を添加した２０％クロロックス漂白剤溶液中で２０分間表面殺菌し、蒸留水で３回すすぐ。殺菌した種子を、水で湿らせた濾紙上で３日間発芽させ、その後、それらを４８培地（半濃度のＭＳ塩、０．５％スクロース、０．３％ゲルライト、ｐＨ５．０）に移し、暗下で３日間２６℃で増殖させ、その後、１６時間昼培養条件でインキュベートする。選択した苗木の上部を除去して、垂直切片を各胚軸中で作製し、形質転換種子をＶ切れ目に挿入する。切れ目部分をパラフィルムで包む。培地上での培養１週間後に、移植した植物を土壌に移す。最初の２週間、それらを高湿度条件下で維持し、温室環境に順化させる。
【０１２７】
（実施例１４：安定イネ形質転換によるＰｉ２の機能分析）
約１００，０００個のクローンを持つＴＡＣライブラリを、Ｐｉ２保持系統Ｃ１０１Ａ５１の葉組織から作製した。Ｐｉ２候補遺伝子配列を含有する複数の陽性クローンを同定した。該クローンのうちの１つＴＡＣ４０をＡｓｃＩで消化し、自己ライゲートした。３２ｋｂフラグメントを含有する、Ｃ２構築物として設計されたサブクローンを得て、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介方法を介して感受性栽培品種ＴＰ３０９の形質転換のために用いた。このフラグメントは、ＮＢＳ２およびＮＢＳ３と、ＮＢＳ１およびＮＢＳ４の部分配列とを含有する。合計１２個の独立したＴ０トランスジェニック系統を成長させ、４つの系統は、イネいもち病単離物ＰＯ−６−６に対する３：１分離比（耐性対感受性）で観察された（データ図示せず）。耐性表現型も、サザンブロット分析でのＰｉ２導入遺伝子で完全に共分離した。高分解能マッピング、突然変異およびトランスジェニック分析から得た結果を用いて、我々はＮＢＳ２がＰｉ２遺伝子であることを結論付けた。
【０１２８】
本明細書で記載される全ての刊行物および特許明細書は、この発明が属する当該技術分野の当業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許明細書を、個々の刊行物または特許明細書それぞれが明確かつ個々に援用されることが示されるのと同程度に本明細書に援用する。
【０１２９】
理解を明確にする目的で説明および例によって、前述の発明をある程度詳細に記載してきたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更および改変を実行することが可能であることが明らかであるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、Ｐｉ２遺伝子座の物理的地図を示す。ＴＡＣおよびＢＡＣクローンが棒で示されている。ＢＡＣ７０、ＴＡＣ４０、およびＴＡＣ１０クローンを、シークエンシングに用いた。対応するＢＡＣおよびＴＡＣクローン上でのプライマーＮＩＰ、ＮＢＳ２、ＮＢＳ４、およびＢＡＣ６Ｆを上記ＢＡＣ／ＴＡＣコンティグの上に示す。
【図２】図２のＡおよびＢは、Ｐｉ２遺伝子座の遺伝的地図および物理的地図を示す。Ａ．Ｐｉ２遺伝子のマッピングで使用されるマーカーをボックス内に示す。これらを、対応するゲノム配列に矢印を用いて一致させている。対応するマーカーとＰｉ２との遺伝的距離を上記マーカーの上に示す。Ｂ．Ｐｉ２領域内のＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子クラスター。ＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子クラスターに対して上流にあるＮＩＰ遺伝子を、陰影をつけた最も左側のボックスに示す。６つのＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子（ＮＢＳ１〜ＮＢＳ６）の命名を、ゲノム配列でのそれらの出現順によっておこなった。それぞれ、数字が付けられたＮＢＳ１〜ＮＢＳ６の６つのボックスとして示されている。これらの遺伝子の各々の転写方向を、遺伝子名の下の矢印で示す。遺伝子ＮＢＳ１〜ＮＢＳ６のエクソンを軽く陰影を付けた箱として示す。すなわち、ＮＢＳ３遺伝子の左側部分にある暗く陰影を付けたボックスは、この遺伝子のレトロポゾン・インサートを表す。
【図３】図３は、ＮＢＳ２の完全なコード配列（ＣＤＳ）をクローニングするための構成図である。
【図４】図４は、Ｐｉ９およびＰｉ２遺伝子座の両方にあるＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子のアラインメントを示す。ゲノム配列は、太いストリングで特定し、またＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子はベタ塗りの円によって特定する。Ｐｉ２とＰｉ９との間のオルソロガスな遺伝子を、両方向矢印で示す。
【図５−１】図５は、図は、ＮＢＳ１、ＮＢＳ２、ＮＢＳ４、ＮＢＳ６、およびクローン化いもち耐性遺伝子Ｐｉｂの予測アミノ酸配列間のマルチプル・タンパク質アラインメントを示す。
【図５−２】図５は、図は、ＮＢＳ１、ＮＢＳ２、ＮＢＳ４、ＮＢＳ６、およびクローン化いもち耐性遺伝子Ｐｉｂの予測アミノ酸配列間のマルチプル・タンパク質アラインメントを示す。
【図５−３】図５は、図は、ＮＢＳ１、ＮＢＳ２、ＮＢＳ４、ＮＢＳ６、およびクローン化いもち耐性遺伝子Ｐｉｂの予測アミノ酸配列間のマルチプル・タンパク質アラインメントを示す。
【図６】図６は、ＮＢＳ２（Ｐｉ２）遺伝子内の保守的ＮＢ−ＡＲＣおよびＬＲＲドメインを示す。ＮＢ−ＡＲＣドメインはこの遺伝子内で約アミノ酸１４４から約アミノ酸４６５までに存在し、一方ＬＲＲドメインはこの遺伝子内で約アミノ酸５３４から約アミノ酸９５１に存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年11月22日(2005.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【国際調査報告】
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