(57)【要約】本発明の組成物は、新規な単離されたポリペプチド、このようなペプチドをコードする新規な単離されたポリヌクレオチドを含み、これに含まれるものとして、組み換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはそれらの変性改変体、特に天然に発生する改変体、例えば、対立遺伝子改変体、アンチセンスポリヌクレオチド分子、およびこのようなポリペプチド上に存在する１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗体、ならびにこのような抗体を生み出すハイブリドーマが挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６８４から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
生体活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
生体活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドと約９９％より大きい配列同一性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが相補的な配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を調節する調節配列と作動可能に会合した請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項１０】
単離されたポリペプチドであって：
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つによってコードされるポリペプチド、および
（ｂ）配列番号１〜６８４のいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
から成る群より選択される、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１３】
サンプル中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出するための方法であって：
ａ）該サンプルと、請求項１に記載のポリヌクレオチドに結合して該ポリヌクレオチドとの複合体を形成する化合物とを、複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程と；
ｂ）該複合体を検出して、その結果、ある複合体が検出される場合、請求項１に記載のポリヌクレオチドが検出される工程と；
を包含する、方法。
【請求項１４】
サンプル中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出するための方法であって：
ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該サンプルと、請求項１に記載のポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーとを、このような条件下で接触させる工程と；
ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む産物を増幅する工程と；
ｃ）該産物を検出しこれによってサンプル中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する工程と、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子であり、前記方法がアニーリングされたＲＮＡ分子をｃＤＮＡポリヌクレオチドに逆転写する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中の請求項１０に記載のポリペプチドを検出するための方法であって：
ａ）該サンプルと、該ポリペプチドに結合して該ポリペプチドとの複合体を形成する化合物とを、該複合体を形成するのに十分な条件下および時間で接触させる工程と；
ｂ）該複合体の形成を検出して、その結果、ある複合体の形成が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドが検出される工程と；
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって：
ａ）該化合物と、請求項１０に記載のポリペプチドとを、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程と；
ｂ）該複合体を検出し、この結果該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が同定される工程と、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって：
ａ）該化合物と請求項１０に記載のポリペプチドとを、細胞中で、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な条件下で接触させ、該複合体が該細胞におけるレポーター遺伝子配列の発現を駆動する工程と；
ｂ）レポーター遺伝子配列発現を検出することによって該複合体を検出し、その結果、該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が同定される工程と、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載のポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）請求項１〜６８４由来の任意のポリヌクレオチドのいずれかから成る群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、該細胞において該ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養する工程と；
ｂ）工程（ａ）の細胞培養物または細胞から該ポリペプチドを単離する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２０】
ポリペプチド配列番号６８５〜１３６８のいずれか１つから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがポリペプチドアレイで提供される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１〜６８４のうち少なくとも１つから成る、ポリヌクレオチドのコレクション。
【請求項２３】
前記コレクションが核酸アレイ上で提供される、請求項２２に記載のコレクション。
【請求項２４】
前記アレイが前記コレクションにおけるポリヌクレオチドのいずれか１つに対する完全マッチングを検出する、請求項２３に記載のコレクション。
【請求項２５】
前記アレイが前記コレクションにおけるポリヌクレオチドのいずれか１つに対するミスマッチを検出する、請求項２３に記載のコレクション。
【請求項２６】
前記コレクションがコンピューター読み取り可能な形式で提供される、請求項２２に記載のコレクション。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、以下の出願において以前に開示された物質を含む「Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された２００２年１０月２日出願の米国仮特許出願第６０／４１６，１８６号の優先権の利益を主張する：代理人整理番号２１２７２−５０２「Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された２００２年２月２６日出願の米国仮特許出願第１０／０８４，６４３号；代理人整理番号７８４ＣＩＰ３Ａ／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２０００年１２月２２日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／３５０１７号；代理人整理番号７８５ＣＩＰ３／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２００１年１月２５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０２６２３号；代理人整理番号７８７ＣＩＰ３／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２００１年２月５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０３８００号；代理人整理番号７８８ＣＩＰ３／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２００１年２月２６日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４９２７号；代理人整理番号７８９ＣＩＰ３／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２００１年３月５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４９４１号；代理人整理番号７９０ＣＩＰ３／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２００１年３月３０日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０８６３１号；代理人整理番号７９１ＣＩＰ３／ＰＣＴ「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｉｇｓ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」と題された２００１年４月１８日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０８６５６号（その全てが本明細書においてその全体が参考として援用される）。
【０００２】
２．発明の背景
２．１  技術分野
本発明は、新規なポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質、ばらびにそれらのポリヌクレオチドおよびタンパク質の使用、例えば、治療、診断および研究方法における使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
２．２  背景
タンパク質因子（例えば、サイトカイン、例えば、リンホカイン、インターフェロン、循環する可溶性因子、ケモカインおよびインターロイキンを含む）の発見を目的とする技術は、過去１０年間にわたって急速に成熟している。現在慣用的なハイブリダイゼーションクローニングおよび発現クローニング技術は、新規なポリヌクレオチドを、それらが発見されたタンパク質に直接関連する情報（すなわち、ハイブリダイゼーションクローニングの場合には部分的なＤＮＡ／タンパク質のアミノ酸配列；発現クローニングの場合にはタンパク質の活性）に依存するという意味で、「直接的に（ｄｉｒｅｃｔｌｙ）」クローニングする。さらに最近では、「間接的な（ｉｎｄｉｒｅｃｔ）」クローニング技術、例えばシグナル配列クローニング（これは、現在の周知の分泌リーダー配列モチーフの存在、ならびに種々のＰＣＲベースのまたは低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションベースのクローニング技術に基づいてＤＮＡ配列を単離する）が、生体活性を有することが公知のタンパク質について利用可能な多数のＤＮＡ／アミノ酸配列を作成することによって、例えば、リーダー配列クローニングの場合はその分泌性質によって、ＰＣＲベースの技術の場合はそれらの細胞または組織供給源によって、または公知の生体活性の他の遺伝子に対する構造的類似性のおかげで、この技術の状況を前進させている。
【０００４】
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、例えば、診断、科学捜査、遺伝子マッピングにおいて多く適用されている；遺伝的障害または他の形質を担う変異の同定、生物学的多様性を評価するため、ならびにＤＮＡおよびアミノ酸配列に依存する多くの他のタイプのデータおよび産物を生成するため。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
３．発明の要旨
本発明の組成物は、新規な単離されたポリペプチド、このようなペプチドをコードする新規な単離されたポリヌクレオチドを含み、これに含まれるものとして、組み換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはそれらの変性改変体、特に天然に発生する改変体、例えば、対立遺伝子改変体、アンチセンスポリヌクレオチド分子、およびこのようなポリペプチド上に存在する１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗体、ならびにこのような抗体を生み出すハイブリドーマが挙げられる。
【０００６】
本発明の組成物はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターなどのベクター、このようなポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された細胞、およびこのようなポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された細胞を含む。
【０００７】
本発明は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によって主に単離された発現配列タグ（ＥＳＴ）からアセンブルされた少なくとも１つの新規な核酸配列のコレクションまたはライブラリー、およびある場合には１つ以上の公表されているデータベースから得られた配列に関する。本発明はまた、このようなポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、ならびに、これらのポリヌクレオチドおよびタンパク質の治療上、診断上および研究上の有用性に関する。これらの核酸配列は、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６と名付けられて、配列表に提供される。この配列表に提供される核酸では、Ａはアデニンであり、Ｃはシトシンであり；Ｇはグアニンであり；Ｔはチミンであり；そしてＮは４つの塩基のいずれかまたは未知の物質である。この配列表に示されるアミノ酸では、アスタリスク（＊）は停止コドンに相当する。
【０００８】
本発明の核酸配列はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜６８４または配列番号１３６９〜１９６６の相補体にハイブリダイズする核酸配列；上述の核酸配列のいずれかの対立遺伝子改変体もしくは種ホモログである核酸配列、または配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６によってコードされるペプチドの特異的なドメインもしくは短縮を含むペプチドをコードする核酸配列を含む。配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の同一の配列またはそれらの変性改変体もしくはフラグメントに対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。同定する配列は１００塩基対の長さであってもよい。
【０００９】
本発明の核酸配列はまた、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の核酸配列由来の配列情報を含む。この配列情報は、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の配列情報を固有に同定するかまたはそれに相当する、配列番号１〜６８４または配列番号１３６９〜１９６６のうちのいずれか１つのセグメントであってもよい。
【００１０】
本出願で用いられるようなコレクションは、1つだけのポリヌクレオチドのコレクションであってもよい。各々の配列の配列情報または同定情報のコレクションは、核酸のアレイ上に設けられてもよい。１実施形態では、配列情報のセグメントが核酸のアレイ上に提供され、そのセグメントを含むポリヌクレオチドを検出するようになっている。そのアレイはそのセグメントを含むポリヌクレオチドに対する完全なマッチまたはミスマッチを検出するように設計されてもよい。このコレクションは、コンピュータで読み取り可能な形式で提供されてもよい。
【００１１】
本発明はまた、上記のような任意の核酸配列の逆相補体または直接の相補体；この核酸配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクター；およびこれらの発現ベクターで形質転換された宿主細胞または生物体を含む。本発明による核酸配列（またはそれらの逆相補体もしくは直接相補体）は、分子生物学の当業者に公知の種々の技術において多くの用途、例えば、ハイブリダイゼーションプローブのような用途、ＰＣＲのプライマーのような用途、アレイにおける用途、コンピューター読み取り可能な媒体における用途、全長遺伝子を配列決定のための用途、染色体および遺伝子マッピングの用途、タンパク質の組み換え産生における用途、ならびにアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、それらの化学的アナログの生成における用途などに適用される。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明の配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の核酸配列、またはこの核酸の新規なセグメントもしくは一部を当該分野で周知の発現アッセイにおけるプライマーとして用いる。特定の好ましい実施形態において、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の核酸配列または本明細書に提供されるこの核酸の新規なセグメントもしくは一部を、当該分野で周知のように、そしてＶｏｌｌｒａｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：５２〜５９（１９９２）に例示されるように、発現された遺伝子を同定するための診断において、ヒトゲノムの物理的マッピングのための発現配列タグとして用いる。
【００１３】
本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチド；配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の配列をコードする全長タンパク質のいずれかを含むポリヌクレオチド；および配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の成熟タンパク質コード配列のヌクレオチド配列のいずれかを含むポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、（ａ）配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つの相補体；（ｂ）配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）上記のいずれかのポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｄ）上記のタンパク質のいずれかの種ホモログ（例えば、オーソログ）をコードするポリヌクレオチド；あるいは（ｅ）配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４、または表３Ａ、３Ｂ、５、７もしくは８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのいずれかの特定のドメインもしくは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
本発明の単離されたポリペプチドとしては、配列表に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むポリペプチド；または対応する全長タンパク質もしくは成熟タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のポリペプチドはまた、（ａ）配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に示されるヌクレオチド配列を有する任意のポリヌクレオチド；または（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、によってコードされる生体活性を有するポリペプチドを含む。配列表におけるポリペプチド配列のいずれかの生物学的に活性な改変体、および好ましくは生体活性を保持するそれらの「実質的な等価物（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）」（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有する）も意図される。本発明のポリペプチドは、全体的にまたは部分的に化学的に合成され得るが、好ましくは本発明の遺伝子操作された細胞（例えば宿主細胞）を用いて組み換え方法によって生成される。
【００１５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のポリペプチド組成物は受容可能なキャリア、例えば、親水性のもの、例えば、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含んでもよい。
【００１６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法に関するが、この方法は、所望のポリペプチドの発現を可能にし、培養物からまたは宿主細胞からのポリペプチドの精製を可能にする条件下で、適切な培養培地中で本発明の宿主細胞の培養物を増殖する工程を包含する。好ましい実施形態としては、このようなプロセスによって生成されるタンパク質がこのタンパク質の成熟型であるという実施形態が挙げられる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、分子生物学の分野において当業者に公知の種々の技術において多く適用されている。これらの技術としては、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途、オリゴマーとしての用途、またはプライマー、ＰＣＲのため、染色体および遺伝子マッピングのための用途、タンパク質の組み換え生成における使用、およびアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡそれらの化学的アナログの生成における用途などが挙げられる。例えば、ｍＲＮＡの発現が特定の細胞または組織タイプに対して大きく限定される場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションを用いる、サンプルにおける特定の細胞または組織ｍＲＮＡの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。
【００１９】
他の例示的な実施形態では、このポリヌクレオチドは診断において、発現された遺伝子を同定するための発現配列タグとして、または当該分野で周知のように、そしてＶｏｌｌｒａｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：５２〜５９（１９９２）に例示されるように、ヒトゲノムの物理的マッピングのための発現配列タグとして用いられる。
【００２０】
本発明によるポリペプチドは、他のタンパク質に対して現在適用されている種々の従来の手順および方法において用いられ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成するために用いられ得る。このような抗体、詳細にはモノクローナル抗体は、組織においてポリペプチドを検出または定量するために有用である。本発明のポリペプチドはまた分子量マーカーとして、および食物サプリメントとして用いられてもよい。
【００２１】
また本発明のペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む治療的に有効な量の組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を含む、医学的な条件における予防、治療、または寛解のための方法も提供される。
【００２２】
詳細には、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、異常なタンパク質発現または生体活性に関与する障害の予防および／または治療のための方法において、利用され得る。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在をサンプル中で検出するための方法に関する。このような方法は、例えば、本明細書に言及されるような障害の予測および診断評価の一部として、ならびにこのような状態に対する素因を示す被験体の同定のために利用され得る。本発明は、本発明のポリヌクレオチドをサンプル中で検出するための方法を提供するが、この方法は、このサンプルと、目的のポリヌクレオチドに結合してこのポリヌクレオチドとの複合体を形成する化合物とを、この複合体を形成するのに十分な時間かつ複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程と、この複合体を検出して、その結果、複合体が検出される場合、目的のポリヌクレオチドが検出される工程とを包含する。この方法はまた、本発明のポリペプチドをサンプル中で検出するための方法を提供するが、この方法は、このサンプルと、このポリヌクレオチドに結合してこのポリヌクレオチドと複合体を形成する化合物とを、複合体を形成するのに十分な条件かつ時間で接触させる工程と、この複合体の形成を検出して、その結果、複合体が形成される場合、このポリペプチドが検出される工程とを包含する。
【００２４】
この発明はまた、本発明の方法を行うための、ポリヌクレオチドのプローブおよび／またはモノクローナル抗体、ならびに必要に応じて定量的な基準を備えるキットを提供する。さらに、本発明は上記のような障害の治療のための臨床試験に関与する、薬物の有効性を評価して患者の進行をモニタリングするための方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現または活性を調節する（すなわち、増大または低下させる）化合物の同定のための方法を提供する。このような方法は、例えば、本明細書に記載のような障害の症状を改善し得る化合物の同定のために利用され得る。このような方法としては、本発明のポリペプチドと相互作用する（例えば結合する）化合物および他の物質を同定するためのアッセイを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明は本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法を提供するが、この方法は、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、細胞においてこの化合物と本発明のポリペプチドとを接触させる工程であって、この複合体がこの細胞においてレポーター遺伝子配列の発現を駆動する工程と；このレポーター遺伝子配列発現を検出することによってこの複合体を検出して、その結果このレポーター遺伝子の発現が検出される場合、本発明のポリペプチドに結合する化合物が同定される工程とを包含する。
【００２６】
本発明の方法は、症状または性向を示す個体に対する本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与を含む治療のための方法をもまた提供する。さらに、本発明は、本明細書に挙げられるような疾患または障害を治療するための方法を包含し、この方法は、標的遺伝子産物の全体的活性を調節する化合物および他の物質を投与する工程を包含する。化合物および他の物質は、標的遺伝子／タンパク質の発現または標的タンパク質の活性のレベルのいずれかに対してこのような調節を発揮し得る。
【００２７】
本発明のポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドはまた、相同性（表２Ａおよび２Ｂに示される）を有するか、サイン領域（表３Ａおよび３Ｂに示される）を有するか；またはある遺伝子ファミリーに対して相同性（表４Ａおよび４Ｂに示される）を有する、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと当業者に公知の同じ機能に関して有用である。配列について相同性が示されない場合、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、検出のためのアレイにおける使用を含む、本明細書に記載されるような種々の適用において有用である。
【００２８】
４．発明の詳細な説明
４．１  定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形である１つの、この、その（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は特に文面において明確に他に示すものがない限り、複数の場合を包含するということに注意のこと。
【００２９】
「活性」という用語は天然に発生する任意のポリペプチドの生物学的および／または免疫活性を保持するポリペプチドの形態を指す。本発明によれば、「生物学的に活性な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」または「生体活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、天然に発生する分子の構造的、調節的または生化学的な機能を持つタンパク質またはペプチドを指す。同様に、「免疫学的に活性な（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」または「免疫学的活性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、適切な動物または細胞において特異的な免疫応答を誘導し、特定の抗体と結合する天然、組み換えまたは合成のポリペプチドの能力を指す。
【００３０】
「活性化された細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」という用語は、本出願において使用された場合、正常または疾患の過程の一部としての分泌分子細胞または酵素分子の搬出を含む、細胞外または細胞内膜の輸送に携わる細胞である。
【００３１】
「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」または「相補性（ｃｏｍｐlｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」という用語は、塩基対形成によるポリヌクレオチドの天然の結合を意味する。例えば、５’−ＡＧＴ−３’という配列は相補配列３’−ＴＣＡ−５’と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のごく一部分のみが結合するような「部分的（ｐａｒｔｉａｌ）」相補性であってもよいし、または一本鎖分子間に全体的相補性が存在するような「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な影響を及ぼす。
【００３２】
「胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（ＥＳ）」という用語は、胚または成体において生殖細胞を含む多くの分化した細胞タイプを発生させ得る細胞を指す。「生殖系列幹細胞（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（ＧＳＣ）」という用語は、配偶子の産生のために胚細胞を安定して連続的に供給する始原幹細胞由来の幹細胞を指す。「始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）（ＰＧＣ）という用語は、生殖細胞およびその他の細胞に分化する能力を有する、他の細胞系列、特に卵黄嚢、腸間膜、または生殖巣堤から胚形成中に分離される小集団の細胞を指す。ＰＧＣはＧＳＣおよびＥＳ細胞が由来する供給源である。ＰＧＣ、ＧＳＣおよびＥＳ細胞は自己再生機能を持っている。従って、これらの細胞は生殖系列を増殖させ、成体の特殊な器官を形成する最終分化細胞を複数発生させるだけでなく、それら自体を再生することもできる。
【００３３】
「発現調節フラグメント（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、ＥＭＦという用語は、作動可能に連結されたＯＲＦまたは別のＥＭＦの発現を調節する一連のヌクレオチドを意味する。
【００３４】
本明細書において用いる場合、ＥＭＦが存在することによって配列の発現が変更される場合、配列は「作動可能に連結された配列の発現を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と言われる。ＥＭＦとしては、プロモーター、およびプロモーター調節配列（誘導性エレメント）が挙げられるがこれらに限定されない。ＥＭＦの１つのクラスは、特定のモジュレータまたは生理事象に応答して作動可能に連結されたＯＲＦの発現を誘導する核酸フラグメントである。
【００３５】
「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」または「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、互換的に用いられ、これは、ヌクレオチドまたはこれらのヌクレオチド配列のヘテロ多量体を指す。これらの句はまた、１本鎖であっても２本鎖であってもよく、そしてセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい、ゲノムもしくは合成に由来するＤＮＡもしくはＲＮＡを指し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を指し、または任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様物質を指す。本明細書の配列では、Ａはアデニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧもしくはＴ（Ｕ）であるかまたは未知の物質である。ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、本明細書に提供される配列中のＴ（チミン）は、Ｕ（ウラシル）で置換されると考えられる。一般に、本発明によって提供される核酸セグメントは、ゲノムのフラグメントおよび短鎖オリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから、または個々のヌクレオチドからアセンブルして、合成核酸を得ることが可能であり、この核酸は微生物もしくはウイルスオペロン、または真核生物遺伝子由来の調節エレメントを含む組み換え転写単位において発現され得る。
【００３６】
「オリゴヌクレオチドフラグメント（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「ポリヌクレオチドフラグメント（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」または「セグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）」または「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」または「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」という用語は互換的に使用され、そして少なくとも約５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約９個のヌクレオチド、さらに好ましくは好ましくは少なくとも約１１個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約１７個のヌクレオチドであるヌクレオチド残基の配列を指す。フラグメントとは、好ましくは約５００個未満のヌクレオチド、好ましくは約２００個未満のヌクレオチド、さらに好ましくは約１００個未満のヌクレオチド、さらに好ましくは５０個未満のヌクレオチド、そして最も好ましくは約３０個未満のヌクレオチドである。好ましくは、プローブは、約６ヌクレオチド〜約２００個のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個〜３０個のヌクレオチド、そして最も好ましくは、約２０個〜２５個のヌクレオチドである。好ましくはフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、種々のハイブリダイゼーション手順またはマイクロアレイ手順において、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子の同一または関連部分の同定または増幅に用いられ得る。フラグメントまたはセグメントは、本発明の各ポリヌクレオチド配列を明確に同定することができる。好ましくは、フラグメントは配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれか１つに対して実質的に類似の配列を含む。
【００３７】
プローブは、例えば、細胞や組織の中に特定のｍＲＮＡ分子が存在するか否かを決定するため、またはＷａｌｓｈらによって記載された染色体ＤＮＡから類似の核酸配列を単離するために用いられ得る（Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓら、１９９２、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  １：２４１〜２５０）。それらは、当業者に周知のニックトランスレーション、クレノウ・フィルイン反応、ＰＣＲなどの方法で標識できる。本発明のプローブ、その調製および／または標識は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、によって詳述されており、その両方ともその全体が参考として本明細書に援用される。
【００３８】
本発明の核酸配列はまた、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の核酸配列からの配列情報を含む。この配列情報は、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の配列の配列情報を固有に同定するかまたはそれに相当する、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれか１つのセグメント、あるいは表３Ａ、３Ｂ、５、７もしくは８に同定されるセグメントであってもよい。このようなセグメントの１つは２０マーの核酸配列であってもよい。なぜなら、ヒトのゲノムにおいて２０マーが完全にマッチする確率は３００分の１であるからである。ヒトのゲノムにおいては、１組の染色体の中に３０億個の塩基対がある。４２０個の２０マーが存在し得ることから、１組のヒトの染色体に存在する塩基対の数の３００倍もの２０マーが存在することになる。同じ分析を用いた場合、１７マーがヒトのゲノムにおいて完全にマッチする確率はおよそ５分の１である。これらのセグメントを発現研究にアレイとして用いる場合は、１５マーセグメントを用いてもよい。１５マーが発現された配列において完全にマッチする確率はまた、発現された配列が全体のゲノム配列の約５％未満から構成されているので、ほぼ５分の１である。
【００３９】
同様に、単一のミスマッチを検出するために配列情報を用いる場合、１つのセグメントは２５マーであってもよい。ヒトのゲノムにおいて２５マーがミスマッチ１個だけを示す確率は、完全マッチの確率（１÷４２５）に各ヌクレオチド位置におけるミスマッチの確率の増大（３×２５）を掛けることによって算出される。１つのミスマッチを有する１８マーが発現研究について１つのアレイで検出され得る確率は約５分の１である。１つのミスマッチを有する２０マーがヒトのゲノムの中で検出され得る確率は約５分の１である。
【００４０】
「オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）」、ＯＲＦという用語は、終止コドンを持たないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドの3つ組みを意味し、タンパク質に転写可能な配列である。
【００４１】
「作動可能に連結する（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に会合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、機能的に関連している核酸配列を指す。例えば、あるプロモーターがあるコード配列の転写を制御する場合、そのプロモーターはそのコード配列に対して作動可能に会合されるか、または作動可能に連結されている。作動可能に連結された核酸配列が隣接しており、同一のリーディングフレーム内にあるとき、特定の遺伝的エレメント、例えばリプレッサー遺伝子はコ−ド配列に隣接して連結されていな位場合でもやはりコード配列の転写／翻訳を制御することができる。
【００４２】
「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、成体の器官に存在する多数の分化した細胞タイプに分化する細胞の能力をいう。多能性細胞とは、全能性細胞に比較すると、分化能力が制限されている。
【００４３】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」または「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」または「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列またはそれらのフラグメントを指し、天然に発生する分子または合成分子を指す。ポリペプチドの「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、または「セグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）」は、少なくも約５個のアミノ酸，好ましくは少なくとも約７個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約９個のアミノ酸、あるいは最も好ましくは少なくとも約１７個以上のアミノ酸の一連のアミノ酸残基のストレッチである。ペプチドは好ましくは、約２００個以下のアミノ酸、より好ましくは１５０個未満のアミノ酸、そして最も好ましくは１００個未満のアミノ酸である。好ましくは、ペプチドは約５個〜２００個のアミノ酸である。活性であるためには、ポリペプチドは生物学的および／または免疫的活性を示すための十分な長さを有していなければならない。
【００４４】
「天然に発生するポリペプチド（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、遺伝子工学的に作成されていない細胞によって生成されたポリペプチドを指し、特に、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸エステル化、脂質化、およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチドの翻訳後の修飾から生じる種々のポリペプチドを特異的に意味する。
【００４５】
「翻訳されたタンパク質コード部分（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語は、完全長のタンパク質をコードする配列であって、任意のリーダー配列または任意のプロセシング配列を含み得る配列を指す。
【００４６】
「成熟型タンパク質コード配列（ｍａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、シグナルまたはリーダー配列なしのペプチドまたはタンパク質をコードする配列を意味する。この「成熟タンパク質部分（ｍａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、シグナル配列もリーダー配列も含まないタンパク質の一部を意味する。このペプチドは、リーダー／シグナル配列を除去する細胞内のプロセシングによって生成されていてもよい。この成熟タンパク質は最初のメチオニン残基を含んでも含まなくてもよい。このメチオニン残基は、細胞におけるプロセシングの間にタンパク質から除去され得る。ペプチドは、合成的に生成されてもよく、またはタンパク質は成熟タンパク質コード配列のみをコードするポリヌクレオチドを用いて生成されていてもよい。
【００４７】
「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、ユビキチン結合、標識（例えば、放射性核種または各種の酵素に関して）、共有結合的ポリマー付加、例えばペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）（ポリエチレングリコ−ルによる誘導）およびオルニチンのようなアミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技術によって化学的に修飾されたポリペプチドであって、ヒトのタンパク質において天然には存在しないものを指す。
【００４８】
「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」（または「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」）という用語は、天然に発生するポリペプチドとはアミノ酸の挿入、欠失、および置換によって異なるポリペプチドであって、例えば組み換えＤＮＡ技術を用いて生成されたポリペプチドを指す。目的とする活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基が置換、付加または欠失されてもよいか決定するためのガイドは、特定のポリペプチドの配列を相同なペプチドの配列と比較すること、および相同性の高い領域（保存領域）に生じたアミノ酸配列変化数を最小にすることによって、またはコンセンサス配列でアミノ酸を置換することによって見出すことができる。
【００４９】
あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組み換え突然改変体は、遺伝子コードの「冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」を利用することによって、合成されても選択されてもよい。種々のコドン置換、例えば種々の制限部位を作り出すサイレントな変化を、特定の原核生物または真核生物系において、プラスミドまたはウイルスベクターまたは発現に導入してクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列における変異は、ポリペプチドまたはそのポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映されて、ポリペプチドのいずれかの部分の特性が修飾され、リガンド結合親和性、鎖間親和性または分解／代謝回転率のような特性が変化される。
【００５０】
好ましくは、アミノ酸の「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」とは、１つのアミノ酸を同様な構造的および／または化学的特性、すなわち保存的なアミノ酸置換を有する別のアミノ酸で置換した結果である。「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似に基づいて行われ得る。例えば、無極性（疎水性）のアミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中立のアミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）のアミノ酸としてはアルギン、リシンおよびヒスチジンが挙げられ；そして負電荷（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）」または「欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）」は好ましくは、アミノ酸約１個〜２０個、より好ましくは１個〜１０個のアミノ酸の範囲である。許容される変動は、組み換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行うこと、および得られた組み換え改変体を活性についてアッセイすることによって実験的に決定され得る。
【００５１】
あるいは、機能の変更が所望される場合は、挿入、欠失または非保存的な変更によって、改変ポリペプチドを工学的に作ることができる。このような変更は、例えば、本発明のポリペプチドの１つ以上の生体機能または生化学的特性を変更し得る。例えば、このような変更はリガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転率のようなポリペプチド特性を変化させ得る。さらに、このような変更は、発現のために選ばれた宿主細胞での発現、スケールアップなどのためにより適したポリペプチドを発生するように選択することができる。例えば、ジフルフィド架橋を除去するために、システイン残基は除去されてもよいし、または別のアミノ酸残基と置換されてもよい。
【００５２】
「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」または「実質的に精製された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は本明細書において、指定された核酸またはポリヌクレオチドが、他の生物学的高分子、例えばポリヌクレオチド、タンパク質などの実質的な非存在下で存在することを意味する。１実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する指定された生物学的高分子の少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％であるように精製される（ただし、水、緩衝液、および他の低分子、特に１０００ダルトン未満の分子量を有する分子が存在してもよい）。
【００５３】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は本明細書において用いる場合、核酸またはポリペプチドがその天然の供給源の場合はともに存在する少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを意味する。１つの実施例では、核酸またはポリペプチドは、溶剤、緩衝液、イオン、またはその溶液に通常存在する他の成分のみが存在する（もし存在するならば）ところに見出される。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は、天然の供給源中に存在する核酸またはポリペプチドを包含しない。
【００５４】
「組み換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｎｔ）」という用語は、本明細書においてポリペプチドまたはタンパク質に関連して用いる場合、組み換え体（例えば、微生物、昆虫、または哺乳類の）の発現系由来のポリペプチドまたはタンパク質であることを意味する。「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」とは、細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系で生成される組み換えのポリペプチドまたはタンパク質を指す。生成物としては、「組み換え微生物（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｃｒｏｂｉａｌ）」とは天然の内因性物質が本質的に存在せず、関連する天然のグリコシル化をともなわないポリペプチドまたはタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたポリペプチドまたはタンパク質にはグリコシル化の修飾はない；酵母に発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳類の細胞に発現されているものと一般的に異なるグリコシル化パターンを有する。
【００５５】
「組み換え体発現ビヒクルまたはベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ＤＡＮ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現するためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを指す。発現ビヒクルは、（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝的エレメント（単数または複数）、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造的またはコード配列、および（３）適切な転写開始および終止配列、のアセンブリを含む転写ユニットを含んでもよい。酵母または真核生物の発現系での使用が意図される構造ユニットは好ましくは、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組み換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなしに発現される場合は、アミノ末端メチオニン残基を含んでいてもよい。最終生成物を得るためには、残基は発現された組み換え体タンパク質からその後切断されてもされなくてもよい。
【００５６】
「組み換え発現系（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、組み換え体転写ユニットを染色体ＤＮＡに安定的に組み込んでいるか、または染色体外に組み換え体転写ユニットを担持する宿主細胞を意味する。本明細書において定義されている組み換え発現系は、発現されるべきＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントの導入時に異種のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。この用語はまた、遺伝子発現において調節的役割を有する組み換え遺伝エレメント（単数または複数）例えばプロモーターまたはエンハンサーを安定的に組み込んでいる宿主細胞をも意味する。本明細書に定義される組み換え発現系とは、発現されるべき内因性のＤＮＡセグメントまたは遺伝子に連結された調節エレメントの導入の際に、細胞に内因性であるポリペプチドまたはタンパク質を発現するものである。その細胞は原核生物であってもまたは真核生物であってもよい。
【００５７】
「分泌された（ｓｅｃｒｅｔｅｄ）」という用語は、膜を横切ってまたは通して輸送されるタンパク質であり、この輸送としては、適切な宿主細胞にそれが発現される場合にそのアミノ酸配列におけるシグナル配列の結果としての輸送が挙げられる。「分泌された（ｓｅｃｒｅｔｅｄ）」タンパク質としては、限定はしないが、それが発現される細胞から完全に（例えば、可溶性タンパク質）または部分的に（例えば、レセプター）分泌されたタンパク質が挙げられる。「分泌された（ｓｅｃｒｅｔｅｄ）」タンパク質としてはまた限定はしないが、小胞体の膜を横切って運搬されるタンパク質が挙げられる。「分泌された」タンパク質はまた、非典型的なシグナル配列を含むタンパク質をも包含することが考えられる（例えば、インターロイキン−１β、Ｋｒａｓｎｅｙ，Ｐ．Ａ．およびＹｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．（１９９２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４（２）：１３４〜１４３を参照のこと）および破壊された細胞から遊離される因子（例えば、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、Ａｒｅｎｄ、Ｗ．Ｐら（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２７〜５５を参照のこと）。
【００５８】
必要に応じて、発現ベクターはポリペプチドを細胞の膜を通して導く「シグナル配列またはリーダー配列（ｓｉｇｎａｌ  ｏｒ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を含むように設計されていてもよい。このような配列は、本発明のポリペプチドに天然に発生していてもよいし、または組み換えＤＮＡ技術によって異種のタンパク質供給源から提供されてもよい。
【００５９】
「ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）」という用語を用いれば、当業者によって通常理解されているストリンジェントである条件を指す。ストリンジェントな条件としては、高度にストリンジェントな条件（すなわち、フィルター固定したＤＮＡに対する０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡにおけるハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳでの洗浄）、および中程度にストリンジェントな条件（すなわち、４２℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳでの洗浄）を挙げることができる。他の例示的なハイブリダイゼーション条件は本明細書において実施例に記載している。
【００６０】
デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドに対して）および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドに対して）での６×ＳＳＣ／０．０５％  ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【００６１】
本明細書において用いる場合、「実質的に等価（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」または「実質的に類似（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ）」とは、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方であって、例えば、参照配列から１つ以上の置換、欠失または付加によって変化し、その正味の効果によってこの参照配列と被験配列との間に有害な機能的な相違点を生じない突然改変体の配列を指してもよい。代表的には、このような実質的に等価な配列は、本明細書に列挙された配列の１つより約３５％しか変化しない（すなわち、対応する参照配列と比較した場合、実質的に等価な配列における個々の残基の置換、付加、および／または欠失の数を、実質的に等価な配列の全残基数で除した値が約０．３５以下である）。このような配列は列挙された配列に対して６５％の配列同一性を有すると言われる。１実施形態では、本発明の実質的に等価な、例えば、突然改変体配列は、列挙された配列と３０％しか変らない（７０％の配列同一性）；本実施形態のある変異では、２５％しか変らない（７５％の配列同一性）；そして本実施形態のさらなる変異では、２０％しか変らない（８０％の配列同一性）；そして本実施形態のさらなる変異では、１０％しか変らない（９０％の配列同一性）、そして本実施形態のさらなる変異では、５％しか変らない（９５％の配列同一性）。本発明による実質的に等価な、例えば、突然改変体のアミノ酸配列は好ましくは、列挙されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。本発明の実質的に等価なヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子コードの冗長性または縮重性を考慮して、有する配列同一性がさらに低いパーセントであってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも約６５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約７５％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。本発明の目的については、実質的に等価な生物活性および実質的に等価な発現特性を有する配列は、実質的に等価なものとみなされる。等価性を決定する目的のためには、成熟した配列の切断（例えば、新規な停止コドンを生成する突然改変体を介して）は除外すべきである。配列の同一性は例えば、Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ（ジョタン・ハイン）法（Ｈｅｉｎ，Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６〜６４５））を用いて決定することができる。配列間の同一性はまた、例えば、ハイブリダイゼーション条件を変更することによって、当該分野で公知の他の方法でも決定できる。
【００６２】
「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、成体の器官の全ての細胞タイプに分化できる細胞の能力をいう。
【００６３】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語は、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、または染色体組み込みのいずれかによって再製可能であるように、適切な宿主細胞にＤＮＡを導入する工程を意味する。「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、コード配列が実際に発現されているかどうかにかかわらず、適切な宿主細胞によって発現ベクターを取り込むことを意味する。「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、ウイルスまたはウイルスベクターの使用による適切な宿主細胞への核酸の導入をいう。
【００６４】
本明細書において用いる場合、「取り込み調節フラグメント（ｕｐｔａｋｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」ＵＭＦとは、リンクされたＤＮＡフラグメントの細胞への取り込みを媒介する一連のヌクレオチドを意味する。ＵＭＦは、公知のＵＭＦを標的配列または標的モチーフとして、以下に説明するようなコンピュータベースのシステムとともに用いて容易に同定することができる。ＵＭＦの存在および活性は、マーカー配列に対して疑わしいＵＭＦを結合させることによって確認することができる。次いで、得られた核酸分子を適切な条件下で、適切な宿主細胞とともにインキュベートし、マーカー配列の取り込みを決定する。上記のように、ＵＭＦは連結されたマーカー配列の取り込みの頻度を増大する。
【００６５】
上述の各々の用語は、その文脈が他を示さない限り、各々について記載されている全ての意味を包含することを意味する。
【００６６】
４．２  本発明の核酸
本発明のヌクレオチド配列は、配列表に示される。
【００６７】
本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のペプチド配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド；および配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれか１つのポリヌクレオチドの成熟タンパク質コード配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、以下に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない：（ａ）配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の任意のヌクレオチド配列の相補体；（ｂ）配列表もしくは表７に示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）上述の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｄ）上述のタンパク質のいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４（例えば、表３Ａ、３Ｂ、５、７もしくは８に示される）のポリペプチドの特定のドメインもしくは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。目的のドメインは、コードされたポリペプチドの性質に依存し得る；例えば、レセプター様ポリペプチドのドメインは、リガンド結合、細胞外、膜貫通、または細胞質ドメイン、またはそれらの組合せを含む；免疫グロブリン様タンパク質のドメインは、可変の免疫グロブリン様ドメインを含む；酵素様ポリペプチドのドメインは、触媒および基質結合ドメインを含む；そしてリガンドポリペプチドのドメインはレセプター結合ドメインを含む。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドとしては、天然に発生するＤＮＡ、または全部もしくは部分的に合成されたＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、ならびにＲＮＡ、例えばｍＲＮＡが挙げられる。このポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡのコード領域全体を含んでもよいし、またはｃＤＮＡのコード領域の一部であってもよい。
【００６９】
本発明はまた、本明細書において開示したｃＤＮＡの配列に対応した遺伝子も提供する。この対応する遺伝子は、本明細書において開示した配列情報を用い公知の方法に従って単離できる。このような方法は、適切なゲノムのライブラリー、またはゲノムの材料の他の供給源において、遺伝子を同定および／または増幅するための開示された配列情報からのプローブまたはプライマーの調製を包含する。当業者に公知の方法を用いてさらに５’および３’の配列を得ることができる。例えば、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の任意のポリヌクレオチドに対応する全長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のポリヌクレオチドのいずれかまたはその一部分をプローブとして用いて適切なハイブリダイゼーション条件下で、適当なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングすることによって獲得できる。あるいは、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のポリヌクレオチドは、適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリ−における遺伝子の同定および／または増幅を可能にする適切なプライマー（単数または複数）の基礎として用いることができる。
【００７０】
本発明の核酸配列は、一個以上の公的なデータベース、例えばｄｂＥＳＴ、ｇｂｐｒｉおよびＵｎｉＧｅｎｅから取得したＥＳＴおよび配列（ｃＤＮＡおよびゲノム配列を含む）からアセンブルされてもよい。ＥＳＴの配列によって、全長の遺伝子に関する、配列情報同定、代表的なフラグメントもしくはセグメントの情報、または新規なセグメントの情報を得ることができる。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドと実質的に等価であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明によるポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、さらに代表的には少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、さらに代表的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、そしてさらにより代表的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有してもよい。
【００７２】
本発明における核酸の配列の範囲に含まれるものは、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列のいずれかに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列フラグメント、またはその相補体であり、このフラグメントは約５個のヌクレオチドより大きく、好ましくは７個のヌクレオチド、さらに好ましくは９個のヌクレオチドより大きく、最も好ましくは１７個のヌクレオチドより大きい。例えば、１５、１７または２０個以上のヌクレオチドのフラグメントであって、本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つに対して選択性である（すなわち、それに特異的にハイブリダイズする）フラグメントを意図している。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズできるプローブは、同じファミリーの遺伝子における他のポリヌクレオチド配列から本発明のポリヌクレオチド配列を識別し得、または他種の遺伝子からヒト遺伝子を識別し得、そして好ましくは固有のヌクレオチド配列に基づく。
【００７３】
本発明の範囲内におさまる配列は、これらの特定の配列に限定されず、その対立遺伝子の変異および種の変異をも含む。対立遺伝子および種の変異は、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に提供される配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６と少なくとも９０％同一、好ましくは９５％同一のヌクレオチド配列を、同種の別の単離物由来の配列と比較することによって慣用的に決定できる。さらに、コドンの変異性にあわせて、本発明は本明細書に開示された特定のＯＲＦと同様に同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。換言すれば、あるＯＲＦのコード領域において、１つのコドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドンで置換することが明白に意図される。
【００７４】
配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６を含む、本発明の核酸の最も近い近似物または相同性の結果は、アルゴリズムまたはプログラムを用いてデータベースを検索することにより取得できる。好ましくはＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））プログラムを用いて、局在配列のアラインメントを検索する（Ａｌｔｓｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．Ｊ  Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６  ２９０〜３００（１９９３）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４０３〜４１０（１９９０））。あるいは、ＦＡＳＴＸＹアルゴリズムを用い、Ｇｅｎｐｅｐｔに対するＦＡＳＴＡバージョン３検索を行ってもよい。
【００７５】
開示されたポリヌクレオチドおよびタンパク質の種のホモログ（またはオーソログ）も本発明によって提供される。種のホモログは、本明細書に提供された配列から適切なプローブまたはプライマーを作成することおよび所望の種から適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離および同定され得る。
【００７６】
本発明はまた、開示したポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子の改変体も包含する；すなわち、天然に発生する、単離されたポリヌクレオチドの代替形態であって、またポリヌクレオチドによってコードされたものと同一であるか、相同であるか、または関連するタンパク質をコードするもの。
【００７７】
本発明の核酸配列は、記載の核酸の改変体をコードする配列にさらに関する。これらのアミノ酸配列の改変体は、ネイティブまたは改変体のポリヌクレオチドに適切なヌクレオチドの変化を導入することによって当業者に公知の方法で調製できる。アミノ酸配列改変体の構成には２つの変数がある：すなわち、変異の位置および変異の性質。アミノ酸配列改変体をコードする核酸は、好ましくは、天然に発生しないアミノ酸配列をコードするように、ポリヌクレオチドを変異させることによって構築される。これらの核酸の改変は、異なる種（可変位置）とは核酸が異なる部位で、または高度に保存された領域（定常領域）で行われてもよい。このような位置の部位は、例えば、まず保存的な選択での置換によって（例えば、疎水性アミノ酸を異なる疎水性アミノ酸に）、それからさらに離れた選択での置換によって（例えば、疎水性アミノ酸を荷電されたアミノ酸に）、代表的には連続して修正され、その後、標的部位で欠失または挿入が行われてもよい。アミノ酸配列の欠失は一般には、ほぼ１から３０の残基、好ましくはほぼ１から１０の残基に及び、代表的には連続している。アミノ酸の挿入としては、長さが１から１００以上の残基におよぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入は、一般に約１から１０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜５の残基におよんでもよい。末端挿入の例としては、異なる宿主細胞における分泌または細胞内の標的化に必要な、異種のシグナル配列、およびＦＬＡＧ、または発現したタンパク質の精製に役立つポリヒスチジン配列のような配列が挙げられる。
【００７８】
好ましい方法では、新規なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、部位指向性突然変異誘発を介して変化される。この方法は、オリゴヌクレオチド配列を用いてポリヌクレオチドを変化させ、所望のアミノ酸改変体、そして変化されているアミノ酸の両隣の十分な隣接するヌクレオチドをコードし、変換される部位のいずれかの側で安定な２重鎖を形成させる。一般に、部位指向性突然変異誘発の技術は、当業者に周知であり、この技術はＥｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）のような刊行物によって例示される。ポリヌクレオチド配列における部位特異的変化を創り出すための、多様で効率的な方法は、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００（１９８２）によって公開されている。ＰＣＲも、新規な核酸のアミノ酸配列改変体を作成するために用いることができる。出発物質として少量のテンプレートＤＮＡを用いる場合、テンプレートＤＮＡ内の対応する領域から配列がわずかに異なるプライマー（単数または複数）によって、所望のアミノ酸改変体を作成できる。ＰＣＲの増幅によって、そのプライマーによって特定された位置でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドテンプレートとは異なるＤＮＡのフラグメント生成物の集団が生じる。このＤＮＡのフラグメントの生成物はプラスミド内の対応する領域で置き換わり、これによって所望のアミノ酸改変体をコードするポリヌクレオチドが得られる。
【００７９】
アミノ酸改変体を生成するさらなる技術は、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）に記載されるカセット突然変異誘発技術（ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）；ならびに、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の技術およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら）のような当該分野で周知の他の変異誘発技術である。遺伝子コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、あるいは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、これらの新規な核酸のクローニングおよび発現のために本発明の実施に用いてもよい。このようなＤＮＡ配列は、ストリンジェントな条件の下、適切な新規な核酸配列にハイブリダイズ可能な配列を含む。
【００８０】
本発明の好ましいポリペプチドの切断部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の１個以上のドメインを含むキメラまたは融合タンパク質、および異種のタンパク質の配列をコードするポリヌクレオチドを生成するために用いられ得る。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドはさらに、上記ポリヌクレオチドのいずれかの相補体も含む。このポリヌクレオチドはＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅したもの、または合成したもの）であってもＲＮＡであってもよい。このようなポリヌクレオチドを取得するための方法およびアルゴリズムは、当業者には周知であり、そしてこれには、例えば、所望の配列が同一のポリヌクレオチドを慣用的に単離し得るハイブリダイゼーション条件を決定する方法を挙げることができる。
【００８２】
本発明に従って、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれか１つに対応する成熟型タンパク質コード配列、またはその機能的等価物を含むポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞内で、その核酸の発現を指向する組み換えＤＮＡ分子、またはその機能的等価物を生成するために用いられ得る。また、本明細書に同定されたクローンのいずれかのｃＤＮＡ挿入物も含まれる。
【００８３】
本発明によるポリヌクレオチドは、十分に確立された組み換えＤＮＡの技術により種々の他のヌクレオチド配列のいずれかに結合できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹを参照のこと）。ポリヌクレオチドに結合する有用なヌクレオチド配列としては、当該分野で周知である、様々なベクター、例えば、プラスミド、コスミド、λファージの誘導体、ファージミドなどが挙げられる。従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一般に、そのベクターは、少なくとも１つの生物体において機能する複製起点、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞の選択マーカーを含む。本発明によるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列ベクターが挙げられる。本発明による宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよく、単細胞生物、または多細胞生物の一部であってもよい。
【００８４】
本発明はさらに、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列、そのフラグメントのいずれかを有する核酸、または本発明の他のポリヌクレオチドのいずれかを含む、組み換え構築物を提供する。1つの実施形態では、本発明の組み換え構築物は、プラズミドまたはウイルスのようなベクターを含み、その中に、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列、またはそのフラグメントのいずれかを有する核酸が前向きまたは後ろ向きに挿入される。本発明のまたはＯＲＦの１つを含むベクターの場合、そのベクターはさらに調節配列を含んでもよい、この調節配列としては、例えば、ＯＲＦに作動可能に連結されたプロモーターが挙げられる。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当業者には公知であり、本発明の組み換え生成物を生成するために市販されている。下記のベクターを例として挙げる：細菌類：ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核生物類：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００８５】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、タンパク質を組み換え的に産生するために、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４４８５〜４４９０（１９９１）で開示された、ｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのような発現調節配列に作動可能に連結することができる。多数の適切な発現制御配列が当該分野で公知である。組み換えタンパク質の一般的な発現方法も公知であり、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１８５，５３７〜５６６（１９９０）に例証されている。本明細書に定義したとおり、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび発現制御配列が、ベクターまたは細胞の中に配置され、そのタンパク質が、連結したポリヌクレオチド／発現制御配列を形質転換（トランスフェクト）されている宿主細胞によって発現される様になっていることを意味する。
【００８６】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、または選択マーカーを含む他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２個の適当なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の名前がついた細菌プロモーターとしてはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ，およびｔｒｃが挙げられる。真核生物のプロモーターとしては、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期のＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、充分に当業者の水準の範囲内である。一般に、組み換え体発現のベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＲＰ１の遺伝子、ならびに、下流の構造配列の転写を指示する高度に発現した遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは、なかでも、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質のような糖分解酵素をコードするオペロンから誘導され得る。異種構造の配列は、適当な段階で翻訳開始配列および終止配列とともに、そして好ましくは、細胞膜周辺腔または細胞外培地への翻訳タンパク質の分泌を指向し得るリーダー配列とともにアセンブルされる。必要に応じて、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組み換え産物の安定化または単純な精製を付与するアミノ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードできる。細菌に用いるために有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを有する作動可能な読取りの段階で、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、所望のタンパク質をコードする構造的なＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。ベクターは、１個以上の表現型の選択マーカーおよび複製起点を含み、ベクターの維持を確保し、所望の場合、宿主内で増幅する。形質転換に適した原核生物の宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々の種が挙げられるが、他の宿主も選択できる物体として使用できる。
【００８７】
代表的なものとして限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングのベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の細菌の選択マーカーおよび複製起点を含んでもよい。このような市販のベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ  １（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２の「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」の部分は、適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主菌株の形質転換およびこの宿主株の適切な細胞密度への増殖の後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）で誘導または抑制して、細胞をさらにある期間、培養する。細胞を代表的には、遠心分離によって収集し、物理的または化学的方法で破壊し、そして得られた粗抽出液をさらなる精製のために保存する。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドはまた、免疫応答の誘導に用いることができる。例えば、参考として本明細書に援用されるＦａｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８７０〜８７２（１９９９）に記載されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列は、裸のプラスミドＤＮＡの局所的投与後または注射の後に、そして好ましくは、ＤＮＡの筋肉内注射の後に、コードしたポリペプチドに対する抗体を生成するために用いられ得る。核酸配列は、好ましくは組み換え発現ベクターに挿入され、裸のＤＮＡの形態であってもよい。
【００８９】
４．３  アンチセンス
本発明の別の局面は、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズ可能であるかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関与する。「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）」核酸は、タンパク質をコードする「センス（ｓｅｎｓｅ）」核酸に相補的である、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード配列に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、アンチセンス核酸分子は、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０もしくは５００のヌクレオチド、またはコード鎖全体に対して、あるいはその一部に対して相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれかのタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６の核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【００９０】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’および３’の配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【００９１】
本明細書に開示された核酸をコードするコード鎖の配列（例えば、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６を考慮する場合、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリック、またはフーグスティーンの塩基対の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であり得るが、より好ましいものは、ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部分にだけアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチド長であってもよい。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成、または当該分野で公知の手順を用いる酵素結合反応を用いて構築されてもよい。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に発生するヌクレオチド、または分子の生物安定性を向上するためもしくはアンチセンスとセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を向上するために設計された多様に修飾されたヌクレオチドを用いて、化学合成されてもよい。例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。
【００９２】
アンチセンス核酸を生成するために用いることができる修飾ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシルハイドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシルプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生成できる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションで詳述される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向となる）。
【００９３】
本発明のアンチセンス核酸分子は代表的には、被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果、細胞のｍＲＮＡおよび／または本発明のタンパク質をコードするゲノムのＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害してタンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、適切な二重鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によってでもよいし、または、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの大きな溝内での特異的な相互作用によってでもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位への直接注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的するように修飾され、次いで全身的に投与されてもよい。例えば、全身投与の場合、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面のレセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることによって、レセプターまたは選択された細胞の表面に発現した抗原に特異的に結合するようにアンチセンス分子を修飾してもよい。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載されたベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物が好ましい。
【００９４】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補性ＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは通常のαユニットとは異なり、鎖がお互いに平行になっている（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６１３１〜６１４８）、またはキメラのＲＮＡ−ＤＮＡのアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１５：３２７〜３３０）を含んでもよい。
【００９５】
４．４  リボザイムおよびＰＮＡ部分
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡ分子であり、それに対して相補的な領域を有するｍＲＮＡのような１本鎖の核酸を切断することができる。従って、リボザイム（例えば、ハマーヘッドリボザイム；（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５〜５９１）に記載）は、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、これによってｍＲＮＡの翻訳を阻害するために利用できる。本発明の核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示したＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる（すなわち配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６）。例えば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列がｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるように構築されてもよい。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許番号４，９８７，０７１、およびＣｅｃｈら、米国特許番号５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、本発明のｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的なＲＮＡを選択してもよい。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００９６】
あるいは、調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的して、標的細胞内の遺伝子の転写を妨げる３重らせんの構造を形成することによって、遺伝子の発現は阻害され得る。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ.  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７〜１５を参照のこと。
【００９７】
種々の実施形態では、本発明の核酸は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するように、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されてもよい。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するように修飾されてもよい（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書において用いる場合、「ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」または「ＰＮＡ」という用語は、核酸模倣物、例えばＤＮＡ模倣物をいい、ここではデオキシリボースリン酸骨格は、シュードペプチドの骨格に置き換えられ、４個の天然の核酸塩基だけが保持される。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡとＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーション可能であることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）（上記）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：１４６７０−６７５に記載されているとおり標準固相ぺプチド合成プロトコールを用いて実行可能である。
【００９８】
本発明のＰＮＡは、治療および診断の適用に用いることができる。例えば、ＰＮＡは、転写もしくは翻訳停止を誘導すること、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異性調節のアンチセンスまたはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）因子として用いることができる。本発明のＰＮＡは、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングにより、遺伝子における一塩基対の変異の分析において；他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼと組合わせて用いる場合、人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）、上記）；または、ＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６），上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）用いることができる。
【００９９】
別の実施形態では、本発明のＰＮＡは、例えば、安定性や細胞取り込みを改善するために、親油性または他の補助基のＰＮＡへの付加によって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームの使用もしくは当該分野で公知の薬剤送達の他の技術の使用によって、修飾可能である。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得るＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成してもよい。このようなキメラによって、ＤＮＡ認識酵素、例えばＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用することが可能になり、このとき同時にＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、塩基核酸間の結合数、および配向を考慮に入れて選択された適当な長さのリンカーを用いて連結されてもよい（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７〜６３に説明されているように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準のホスホラミダイト結合化学を用いて固体支持体上で合成されてもよく、修飾されたヌクレオシドアナログ、例えば、５’−（４−メチオキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトは、ＰＮＡとＤＮＡの５’端との間に用いることができる（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的な方式で連結して、５’  ＰＮＡセグメントおよび３’  ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、キメラ分子は５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成してもよい。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１００】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドとしては、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的とするため）のような他の付加基、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断因子（例えば、Ｋｒｏｌら，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で修飾されてもよい。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘発性切断因子などと結合体化させてもよい。
【０１０１】
４．５  宿主
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを包含するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えば、このような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染の方法を用いてこの宿主細胞に導入された本発明の核酸を含んでもよい。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供するが、このようなポリヌクレオチドは、細胞内でこのポリヌクレオチドの発現を駆動する、宿主細胞に対して異種の調節配列と作動可能に会合している。
【０１０２】
核酸配列の知識によって、内因性ポリペプチドの発現を可能にするかまたは増加するように細胞を修飾することができる。細胞は、この細胞がこのポリペプチドをより高いレベルで発現するように、天然に発生するプロモーターの全部または一部を、異種のプロモーターの全部または一部で置換することによって、ポリペプチドの発現を増大するように修飾（例えば、相同的な組み換えによって）することが可能である。異種のプロモーターは、コード配列に作動可能に連結されるような様式で挿入される。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０８０８、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／０９９５５を参照のこと。また、異種のプロモーターＤＮＡの他に、増幅可能なマーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ，ｄｈｆｒ，およびカルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼをコードする多機能性のＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡが異種のプロモーターＤＮＡと共に挿入されてもよいということが考慮される。もしコード配列に連結される場合、標準選択方法によるマーカーＤＮＡの増幅は、細胞内で所望のタンパク質コード配列の同時増幅をもたらす。
【０１０３】
宿主細胞は、哺乳類の細胞のような高等な真核生物の宿主細胞、酵母細胞のような下等な真核生物の宿主細胞であってもよく、または宿主細胞は、細菌の細胞のような原核生物細胞であってもよい。組み換え構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポーレーションによって実行され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリヌクレオチドの１つを有する宿主細胞を従来の方式で用いて、単離されたフラグメントによってコードされた遺伝子産物を生成することが可能であり（ＯＲＦの場合）、またはこれを用いて、ＥＭＦの制御下で異種のタンパク質を生成することが可能である。
【０１０４】
任意の宿主／ベクター系を、本発明のＯＲＦを１個以上を発現するのに用いることができる。これらとしては限定はしないが、真核生物の宿主、例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞およびＳｆ９細胞、ならびに原核生物の宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。最も好ましい細胞は、通常、特定のポリペプチドもしくはタンパク質を発現しない細胞、またはポリペプチドまたはタンパク質を天然の低レベルで発現する細胞である。成熟型タンパク質は、哺乳類細胞、酵母、細菌、または他の細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞の翻訳システムを使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を生成することもできる。原核生物と真核生物の宿主とともに用いるための適切なクローニングおよび発現のベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されており、その開示は参考として本明細書に援用される。
【０１０５】
種々の哺乳類細胞の培養系を使用しても、組み換えタンパク質を発現することができる。哺乳類細胞の発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）に記載された、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株が挙げられる。他の細胞系で適合性のベクターを発現可能なものは、例えば、Ｃ１２７、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ  ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、その他の形質転換された霊長類細胞株、正常２倍体細胞、原発性組織のインビトロ培養由来細胞株、初代外植体、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞である。哺乳類細胞の発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよび任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’に隣接する非転写配列を含む。ＳＶ４０のウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化の部位を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。細菌培養で生成された組み換えポリペプチドおよびタンパク質は、通常、細胞ペレットからの最初の抽出によって、続いて１回以上の塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離される。必要に応じて、成熟型タンパク質の高次構造を完了するのに、タンパク質を再度折り畳む工程を用いてもよい。最後に、最終の精製工程として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してもよい。タンパク質の発現に使用する微生物の細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な方法によって破壊してもよい。
【０１０６】
あるいは、下等な真核生物、例えば、酵母もしくは昆虫において、または原核生物例えば細菌においてタンパク質を生成することが可能である場合がある。可能性として適切な酵母株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株，Ｃａｎｄｉｄａ、または異種のタンパク質を発現できる任意の酵母株が挙げられる。可能性として適切な細菌株には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種のタンパク質を発現できる任意の細菌株が挙げられる。もしそのタンパク質が酵母か細菌で作成される場合、機能的なタンパク質を得るためには、例えば、適切な部位のリン酸エステル化、またはグリコシル化によって、そこで生成されたタンパク質を修飾する必要がある場合がある。このような共有結合の付加は、公知の化学的または酵素的な方法を用いて達成できる。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、細胞と組織は、誘導性の調節エレメントの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように設計可能であるが、この場合、内因性遺伝子の調節配列は相同組み換えで置き換えられ得る。本明細書において記載されるように、遺伝子の標的化を用いて、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離された調節配列、または遺伝子工学的方法によって合成された新規な調節配列で置き換えることができる。このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場付着領域、負の調節エレメント、転写開始部位、および調節タンパク質結合部位、またはこのような配列の組合せで構成されてもよい。あるいは、生成されたＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響する配列は、置換、除去、付加されてもよく、さもなければ標的することによって修飾されてもよい。これらの配列としては、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性エレメント、スプライス部位、タンパク質の輸送または分泌の特性を増強もしくは修飾するためのリーダー配列、またはタンパク質もしくはＲＮＡ分子の機能もしくは安定性を変更もしくは改善する、その他の配列が挙げられる。
【０１０８】
この標的事象が、調節配列の単なる挿入、遺伝子を新しい調節配列の制御下に置くこと、例えば、新しいプロモーターもしくはエンハンサーまたは両者をある遺伝子の上流に挿入することであってもよい。あるいは、標的事象とは、調節エレメントの単なる欠失、例えば、組織特異的な負の調節エレメントの欠失であってもよい。あるいは、標的事象は、既存のエレメントを交換し得る；例えば、組織特異的なエンハンサーは、天然に発生するエレメントよりも広範であるかまたはそれとは異なった細胞タイプ特異性を有するエンハンサーで置き換えられてもよい。ここでは、天然に発生する配列は欠失され、新しい配列が加えられる。全ての場合において、標的事象の識別は、標的ＤＮＡと隣接している１つ以上の選択マーカー遺伝子の使用によって容易になり、これによって外因性ＤＮＡを宿主細胞ゲノムに組み込んでいる細胞の選択が可能になる。標的事象の識別はまた、ネガティブ選択マーカーが外因性ＤＮＡに隣接するような、ただしこのネガティブ選択マーカーが標的配列の隣接して構成されるような、そして宿主細胞ゲノムの中の配列との正しい相同組み換えがこのネガティブ選択マーカーの安定な組み込みを生じないような、ネガティブな選択の特性を示す１つ以上のマーカー遺伝子の使用によっても容易にすることができる。この目的に有用なマーカーとしては、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、または細菌性キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０１０９】
本発明のこの局面に従って用いることができる遺伝子標的または遺伝子活性化技術は、以下にさらに詳しく記載されている：Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許番号５，２７２，０７１号；Ｓｈｅｒｗｉｎらの米国特許第５，５７８，４６１号；Ｓｅｌｄｅｎらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）；およびＳｋｏｕｌｔｃｈｉらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６（ＷＯ９１／０６６６７）（その各々がその全体が参考として本明細書に援用される）。
【０１１０】
４．６  本発明のポリペプチド
本発明の単離されたポリペプチドとしては以下を含むポリペプチドが挙げられるがそれらに限定されない：配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４のいずれか１つとして示されるアミノ酸配列、または配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされたアミノ酸配列、または対応する全長もしくは成熟型のタンパク質。本発明のポリペプチドとしてはまた、以下によってコードされた好ましくは生物学的もしくは免疫学的な活性を有するポリペプチドが挙げられる：（ａ）配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に示されたヌクレオチド配列のいずれか1つを有するポリヌクレオチド、または（ｂ）配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４に示されたアミノ酸配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、または（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド。本発明はまた、配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４と示されたアミノ酸配列のいずれかの生物活性もしくは免疫活性の改変体、または対応する全長または成熟型のタンパク質；ならびに生体活性を保持する、それらの「実質的な等価物（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、代表的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、より代表的には少なくとも約９８％または最も代表的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有するもの）を提供する。対立遺伝子改変体によりコードされたポリペプチドは、配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４を含むポリペプチドと比較して、活性が同様か、より高いか、またはより低くてもよい。
【０１１１】
生物活性を示す能力がある本発明のタンパク質のフラグメントも本発明に包含される。このタンパク質のフラグメントは、直線形状であってもよいし、または例えば、その両方とも参考として本明細書に援用される、Ｈ．Ｕ．Ｓａｒａｇｏｖｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７３〜７７８（１９９２）およびＲ．Ｓ．ＭｃＤｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，９２４５〜９２５３（１９９２）に記載されるように、それらは公知の方法を用いて環状にされてもよい。このようなフラグメントは、タンパク質の結合部位の原子価を上げるなど多くの目的のために、免疫グロブリンのようなキャリア分子と融合されてもよい。フラグメントはまた表３Ａ、３Ｂ、５、７または８において識別される。
【０１１２】
本発明はまた開示されたタンパク質の全長および成熟型（例えば、シグナル配列も前駆配列もない）の両方を提供する。タンパク質コード配列は、開示されたヌクレオチド配列の翻訳により配列表において同定される。推定のシグナル配列は表５に示す。このようなタンパク質の成熟型は、適切な哺乳動物細胞、または他の宿主細胞の中で全長のポリヌクレオチドを発現すること、および切断された産物の配列決定によって得られて確認され得る。当業者は、実際の切断部位が表５で推測される切断部位とは異なってもよいということを認識する。このタンパク質の成熟型の配列はまた、全長型のアミノ酸配列からも決定できる。本発明のタンパク質が膜と結合している場合、このタンパク質の可溶型もまた提供される。このような形態では、タンパク質を膜と結合させる領域の一部または全部は、このタンパク質がその発現される細胞から完全に分泌されるように欠失される（例えば、参考として本明細書に援用される、Ｓａｋａｌら、Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００），３０（２）、１０７〜２３頁を参照のこと）。
【０１１３】
本発明のタンパク質の組成物はさらに、例えば、薬学的に受容可能な親水性のキャリアのような受容可能なキャリアを含んでもよい。
【０１１４】
本発明はさらに、本発明の核酸フラグメントによって、または本発明の核酸フラグメントの縮重改変体によってコードされた単離ポリペプチドを提供する。「縮重改変体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とはヌクレオチド配列が異なっているが、遺伝子コードの縮重に起因して同一のポリヌクレオチド配列をコードしているヌクレオチドフラグメントを意味する。本発明の好ましい核酸フラグメントはタンパク質をコードするＯＲＦである。
【０１１５】
当該分野で公知の種々の方法論を利用して、本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを得ることができる。最も単純なレベルでは、アミノ酸配列は、市販のペプチドシンセサイザーを用いて合成できる。合成して構築されたタンパク質配列は、一次、二次、または三次構造および／または高次構造の特徴をタンパク質と共有するので、タンパク質の活性を含む生物学的な特質を共通して保有する場合がある。この技術は、小さいペプチドおよび大きなポリペプチドのフラグメントを生成するのに特に有用である。フラグメントは、例えば、天然のポリペプチドに対する抗体を生成するのに有用である。従って、これらを天然で精製されたタンパク質の、生物学的に活性な、または免疫学的な代用品として、治療用の化合物のスクリーニングにおいて、および抗体開発の免疫学的なプロセスにおいて用いることができる。
【０１１６】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更された細胞から代替的に精製されてもよい。本明細書において用いる場合、遺伝子操作によって、細胞が通常は生成しない、または通常は低いレベルでしか生成しないポリペプチドまたはタンパク質を生成するようになった場合、この細胞は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するために変更されているという。当業者は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の１つを生成する細胞を生成するために、組み換えまたは合成配列のいずれかを真核細胞または原核細胞に導入し発現するために手順を容易に調整することができる。
【０１１７】
本発明はまた、ポリペプチドを生成する方法にも関するが、この方法は、適切な培養培地で本発明の宿主細胞の培養物を増殖させる工程、および細胞または細胞が増殖する培養物からタンパク質を精製する工程を包含する。例えば、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを有する宿主細胞を、コードされたポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するというポリペプチドを生成するためのプロセスを包含する。このポリペプチドは、培養物から、都合により培養培地から、または宿主細胞から調製された溶解物から回収されてさらに精製されてもよい。好ましい実施形態としては、このようなプロセスによって生成されるタンパク質がこのタンパク質の全長または成熟型である実施形態が挙げられる。
【０１１８】
別の方法では、天然にポリペプチドまたはタンパク質を生成する細菌の細胞から、このポリペプチドまたはタンパク質が精製される。当業者なら、本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質の１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質の分離のための公知の方法を容易に利用できる。これらには、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと。生物学的／免疫学的な活性を保持するポリペプチドフラグメントは、約１００個を超えるアミノ酸、または約２００個を超えるアミノ酸で構成されるフラグメント、そして特定のタンパク質のドメインをコードするフラグメントを含む。
【０１１９】
精製されたポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子を同定するための当該分野で周知のインビトロ結合アッセイにおいて用いることができる。これらの分子としては、例えば低分子、コンビナトリアルライブラリー由来の分子、抗体または他のタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。次いで、結合アッセイで同定された分子を、当該分野で周知であるインビボの組織培養または動物モデルにおいて、アンタゴニストまたはアゴニスト活性について試験する。要するに、分子を複数の細胞培養物または動物の中に滴定して、次いで細胞／動物の死亡または動物／細胞の長期の生存のいずれかについて試験する。
【０１２０】
さらに、本発明のペプチドまたはこのペプチドに結合できる分子は、毒素、例えばリシンもしくはコレラと、または細胞に有毒な他の化合物と複合体化されてもよい。次いで、毒素結合分子複合体は、配列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４についての結合分子の特異性によって腫瘍または他の細胞に対して標的され得る。
【０１２１】
本発明のタンパク質はまた、このタンパク質をコードしたヌクレオチド配列を含む体細胞、または生殖細胞によって特徴付けられるトランスジェニック動物の産生物、例えば、トランスジェニックのウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの成分として発現されてもよい。
【０１２２】
本明細書に提供されるタンパク質としては、精製されたタンパク質のアミノ酸配列に類似であるが天然に修飾されているかまたは人為的に設計されたものであるアミノ酸配列を特徴とするタンパク質も挙げられる。例えば、ペプチドまたはＤＮＡ配列での修飾は、公知の技術を用いて当業者によって行うことができる。タンパク質配列における目的の修飾としては、コード配列における選択アミノ酸残基の変更、置換、置き換え、挿入または欠失を挙げることができる。例えば、分子の高次構造を変えるために、１つ以上のシステイン残基を欠失するかまたは別のアミノ酸で置き換えてもよい。このような、変更、置換、置き換え、挿入または欠失の技術は当業者に公知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照のこと）。好ましくは、このような変更、置換、置き換え、挿入または欠失は、タンパク質の所望の活性を保持する。タンパク質の機能に重要なタンパク質の領域は当該分野において周知である、アラニンスキャンニング法を含む種々の方法によって決定され得る。アラニンスキャンニング法は、１個のまたは連なったアミノ酸をアラニンで系統的に置き換え、その結果生じたアラニンを含む改変体を生体活性について試験する工程を包含した。このタイプの分析によって、置換されたアミノ酸（単数または複数）の生物活性における重要性を決定する。タンパク質の機能に重要なタンパク質の領域は、ｅＭＡＴＲＩＸプログラムによって決定されてもよい。
【０１２３】
タンパク質の配列の他のフラグメントおよび誘導体であって、タンパク質の活性の全部または一部を保持すると期待され、スクリーニングまたは他の免疫学的な方法に有用であるものはまた、本明細書の開示を考慮して当業者によって容易に作ることができる。このような修飾は、本発明によって包含される。
【０１２４】
本発明の単離されたポリヌクレオチドを１つ以上の昆虫発現ベクター内の適切な制御配列に作動可能に連結すること、および昆虫発現系を使用することによって、タンパク質をまた生成できる。バキュウロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．のキット（ｔｈｅ  ＭａｘＢａｔＴＭ  ｋｉｔ）として市販されており、このような方法は、本明細書において参考として援用されるＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載のとおり当該分野において周知である。本明細書において用いる場合、、本発明のポリヌクレオチドを発現する能力がある昆虫細胞は「形質転換されている（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」。
【０１２５】
本発明のタンパク質は、組み換えタンパク質を発現するのに適切な培養条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって調製できる。次いで、得られたタンパク質は、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーのような公知の精製プロセスを用いて、このような培養物（すなわち、培養培地由来または細胞抽出物）から精製され得る。また、タンパク質の精製としては以下の物質を挙げることができる。それらはタンパク質に結合する薬剤を含むアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、へパリン−トヨパール（ｈｅｐａｒｉｎ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＴＭまたはＣｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭのような親和性樹脂上での１つ以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いる疎水性の相互作用クロマトグラフィーを含む１つ以上の工程；またはイムノアフィニティークロマトグラフィー。
【０１２６】
あるいは、本発明のタンパク質はまた、精製を促進する形態で発現されてもよい。例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）もしくはチオレドキシン（ＴＲＸ）、またはＨＩＳタグなどの融合タンパク質として、またはＨｉｓタグとして発現されてもよい。このような融合タンパク質の発現と精製用のためのキットは、それぞれＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。このタンパク質はまた、エピト−プでタグ化され、引き続きこのようなエピト−プに対する特異的な抗体を用いることによって精製されてもよい。このようなエピト−プの１つ（「ＦＬＡＧ（登録商標）」）はＫｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。
【０１２７】
最後に、１回以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＱ）工程（疎水性ＲＰ−ＨＰＣＬ媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する）を使用してタンパク質をさらに精製することができる。上記の精製工程のいくつかまたは全てを種々の組合せで使用することによっても、実質的に相同な単離された換えタンパク質を得ることができる。このように精製されたタンパク質は、他の哺乳類のタンパク質を実質的に含まず、そして本発明では「単離されたタンパク質（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」と定義される。
【０１２８】
本発明のポリペプチドは、アナログ（改変体）を包含する。これは、フラグメント、ならびに１つ以上のアミノ酸が欠失、挿入または置換されているペプチドを包含する。また、本発明のポリペプチドのアナログは、このポリペプチドの融合、または本発明のポリペプチドの修飾を包含し、ここでこのポリペプチドまたはアナログは、別の部分（単数または複数）、例えば、標的部分または別の治療剤へ融合されている。このようなアナログは、活性および／または安定性のような特性の改善を示してもよい。ポリペプチドまたはアナログに融合され得る部分の例としては、例えば、膵臓細胞へのポリペプチドの送達を行う標的部分、例えば、膵臓細胞に対する抗体、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球などに対する抗体、ならびに膵臓または免疫細胞で発現されたレセプターおよびリガンドが挙げられる。ポリペプチドに融合され得る他の部分としては、治療のために用いられる治療剤、例えば、免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリン、ＳＫ５０６、アザチオプリン、ＣＤ３抗体およびステロイドが挙げられる。また、ポリペプチドは、免疫モジュレータ、および他のサイトカイン、例えばαインターフェロンまたはβインターフェロンに融合されてもよい。
【０１２９】
４．６．１  ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの同一性および類似性の決定
好ましい同一性および／または類似性は、試験された配列間で最大のマッチングを得るように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムにおいて体系化され、コンピュータープログラムとしては限定はしないが以下が挙げられる：ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（本明細書において参考として援用される、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻，３３８９〜３４０２頁）、ｅＭａｔｒｉｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（本明細書において参考として援用される、Ｗｕら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．第６巻，２１９〜２３５（１９９９））、ｅＭｏｔｉｆ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（本明細書において参考として援用される、Ｎｅｖｉｌ−Ｍａｎｎｉｎｇら，ＩＳＭＢ−９７，第４巻，２０２〜２０９頁）、Ｐｆａｍソフトウェア（本明細書において参考として援用されるＳｏｎｎｈａｍｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２６巻（１）３２０〜３２２頁（１９９８））、およびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性予測アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１５７，１０５〜３１頁（１９８２）、ＧｅｎｅＡｔｌａｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．（ＭＳＩ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（本明細書において参考として援用される、ＳａｎｃｈｅｚおよびＳａｌｉ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５，１３５９７〜１３６０２；Ｋｉｔｓｏｎ  ＤＨら（２０００）「Ｒｅｍｏｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ−ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」提出分；ＦｉｓｃｈｅｒおよびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５，９４７〜９５５），Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ））。ポリペプチド配列は、独自のアルゴリズムＳｅｑＬｏｃによって検討され、このアルゴリズムがタンパク質を３セットの位置（細胞内、膜、または分泌）に分ける。この予測は、各々のポリペプチドの３つの特徴に基づくが、この特徴としては、システイン残基の割合、各々のタンパク質の最初の２０アミノ酸のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスコア、およびこのタンパク質の最長の疎水性ストレッチを算出するＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスコアを含む。推定タンパク質の値をＳｗｉｓｓｐｏｒｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ）から公知の細胞局在の１セットの５９２個のタンパク質からの値に対して比較する。予測は、最大尤度推定に基づ���。
【０１３０】
膜貫通領域（単数または複数）の存在をＴＭｐｒｅｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて検出した。
【０１３１】
ＢＬＡＳＴプログラムは  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら．ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））から公的に入手可能である。
【０１３２】
４．７  キメラタンパク質および融合タンパク質
本発明はまたキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において用いる場合、「キメラタンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、別のポリペプチドに作動可能に連結された本発明のポリペプチドを含む。融合タンパク質の内部で、本発明のポリペプチドは、本発明によるタンパク質の全部または一部に対応し得る。一実施形態では、融合タンパク質は、本発明によるタンパク質の少なくとも１つの生体活性を有する部分を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明によるタンパク質の少なくとも２つの生体活性を有する部分を含む。融合タンパク質の内部で、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、本発明のポリペプチドと他のポリペプチドが枠内でお互いに融合されていること示すことを意図する。ポリペプチドは、Ｎ−端末、Ｃ−端末、または真中に融合できる。
【０１３３】
例えば、１つの実施形態では、融合タンパク質は、第二タンパク質の細胞外のドメインに作動可能に連結された本発明のポリペプチドを含む。
【０１３４】
別の実施形態では、融合タンパク質はＧＳＴ−融合タンパク質であり、本発明のポリペプチド配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されている。
【０１３５】
別の実施形態では、融合タンパク質は免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここでは本発明によるポリペプチド配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合された１つ以上のドメインを含む。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に取り入れられて、被験体に投与されて、細胞の表面でのリガンドと本発明のタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのシグナル伝達を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、同族リガンドのバイオアベイラビリティーに影響することができる。リガンド／タンパク質の相互作用の阻害は、増殖および分化の障害、例えばガンの治療、ならびに細胞の生存の調節（例えば、促進または抑制）の両方において治療上有用であり得る。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫源として用いられて、被験体において抗体を作り、リガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、本発明のポリペプチドとリガンドとの相互作用を阻害する分子を識別する。
【０１３６】
本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば，異なったポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、例えば、連結のためにブラントエンドまたはスタッガーエンド（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）の末端を使用すること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結よって、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動的なＤＮＡシンセサイザーを含む、従来の技術によって合成してもよい。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて行われ得、このアンカープライマーは２個の連続した遺伝子フラグメントの間に相補的なオーバーハングを生じ、これが実質的にアニーリングして再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、多くの発現ベクターは、融合部分をすでにコードしたものが市販されている（例：ＧＳＴポリペプチド）。本発明のポリペプチドをコードする核酸を、融合部分が本発明のタンパク質にインフレームで連結されるようにこのような発現ベクターの中にクローニングしれもよい。
【０１３７】
４．８  遺伝子治療
本発明の遺伝子のポリヌクレオチドにおける変異は、コードされたタンパク質の正常機能の損失を生じ得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの正常な活性を回復するか；または本発明のポリペプチドに関連した疾患状態を治療するための遺伝子治療を提供する。本発明のポリペプチドをコードする機能遺伝子の適切な細胞への送達は、ベクター、さらに詳細にはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用によってエキソビボ、インサイチュ、もしくはインビボで、または物理的なＤＮＡ移入方法の使用（例えば、リポソームまたは化学療法）によってで実行される。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ．第３９２巻の補遺，ｎｏ．６６７９，２５〜２０頁（１９９８）を参照のこと。遺伝子治療技術の追加の概説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５〜１２８１（１９８９）；Ｖｅｒｍａ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８〜８４（１９９０）；およびＭｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５〜４６０（１９９２）を参照のこと。本発明のヌクレオチドまたは本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のいずれか１つの導入はまた、染色体外の基質（一過性発現）または人工染色体（安定発現）を用いて達成することもできる。また、細胞を増殖するかまたは、このような細胞に所望の効果もしくは活性を与えるために、本発明のタンパク質の存在下でエキソビボで細胞を培養することもできる。次いで、処理された細胞は治療目的でインビボで導入され得る。あるいは、他のヒト疾患状態では、本発明のポリペプチドの発現を防ぐか、またはその活動を阻害することはこの疾患状態を治療するのに有用であると考えられる。本発明のポリペプチドの発現を負に調節するためにアンチセンス治療または遺伝子治療を適用することも考慮される。
【０１３８】
タンパク質の発現を阻害する他の方法は、本発明の核酸へのアンチセンス分子、それらの相補体、または翻訳されたＲＮＡ配列を、当該分野で公知の方法によって導入することを含む。さらに、本発明のポリペプチドは、標的欠失法を用いて、または組織特異性のあるサイレンサーのような負の調節エレメントの挿入によって阻害され得る。
【０１３９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するために、インビボで遺伝子工学的に設計された細胞を提供するが、ここでこの様なポリヌクレオチドは、細胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞に対して異種である調節配列と作動可能に会合している。これらの方法は、本発明のポリペプチドの発現を増大または減少するために用いることができる。
【０１４０】
本発明によって提供されるＤＮＡ配列の知識によって、細胞の修飾が内因性ポリペプチドの発現を可能にし、増大し、または減少させることができる。細胞を修飾して（例えば、相同組み換えによって）天然に発生するプロモーターの全部か一部を、異種のプロモーターの全部か一部で置換して、それによって細胞がより高いレベルでタンパク質を発現するようにポリペプチドの発現を増大することができる。この異種のプロモーターは、配列をコードする所望のタンパク質に作動可能に連結される様な方式で挿入される。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０８０８、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／０９９５５を参照のこと。また、異種のプロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能なマーカーＤＮＡ（例えば、カルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼをコードするａｄａ、ｄｈｆｒおよび多機能性ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡが異種のプロモーターＤＮＡと共に挿入され得ることも考慮されている。所望のタンパク質のコード配列に連結されると、標準選択方法によるマーカーＤＮＡの増幅は、細胞内の所望のタンパク質コード配列の同時増幅をもたらす。
【０１４１】
本発明の別の実施形態では、細胞および組織を、誘導性の調節エレメントの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように設計してもよいが、その場合、内因性遺伝子の調節配列は、相同組み換えによって置換することができる。本明細書において記載されるように、遺伝子の標的化を用いて、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離された調節性配列、または遺伝子工学の方法により合成された新規な調節配列で置換してもよい。この様な調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場付着領域、負の調節エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、またはこのような配列の組合せで構成されてもよい。あるいは、生成されたＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響する配列は、標的法によって置換、除去、付加または修飾されてもよい。これらの配列は、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定エレメント、スプライス部位、タンパク質の輸送または分泌特性を改善または修正するためのリーダー配列、あるいは、タンパク質またはＲＮＡ分子の機能または安定性を変更または改良する他の配列を含む。
【０１４２】
標的事象は、調節配列の単なる挿入、遺伝子を新しい調節配列の制御下に置くこと、例えば、新しいプロモーターもしくはエンハンサーまたはその両者を遺伝子の上流に挿入することであってもよい。あるいは、標的事象は、調節エレメントの単なる欠失、例えば、組織特異性の負の調節エレメントの欠失であってもよい。あるいは、標的事象は、既存のエレメントを置き換えてもよい；例えば、組織特異性のエンハンサーは、天然に発生するエレメントよりも広範なまたは異なる細胞タイプ特異性を有するエンハンサーで置換されてもよい。ここでは、天然に発生する配列は欠失され、新しい配列が加えられる。いずれの場合でも、標的事象の識別は、標的のＤＮＡと隣接している１つ以上の選択マーカー遺伝子の使用によって容易になり得、これによって外因性ＤＮＡが細胞ゲノムに組み込まれた細胞を選択できる。標的事象の識別はまた、負の選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるような、ただしこの負の選択マーカーが標的配列に隣接するように構成されるような、そして宿主細胞ゲノムの中の配列との正しい相同組み換えが、この負の選択マーカーの安定な組み込みを生じないような、負の選択の特性を示す１つ以上のマーカー遺伝子の使用によって容易にされ得る。この目的に有用なマーカーとしては、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、または細菌性キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０１４３】
本発明のこの局面に従って用いることができる遺伝子標的化または遺伝子活性化技術は、その各々が本明細書においてその全体が参考として援用される、Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号；Ｓｈｅｒｗｉｎらの米国特許第５，５７８，４６１号；Ｓｅｌｄｅｎらの国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）；そしてＳｋｏｕｌｔｃｈｉらの国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６（ＷＯ９１／０６６６７）にさらに詳細に記載される。
【０１４４】
４．９  トランスジェニック動物
インビボで本発明のポリペプチドの生体機能を決定する好ましい方法では、本発明が提供する１つ以上の遺伝子は、相同組み換えを用いて、動物の生殖系において、過剰発現されているか、または不活性化されているかのいずれかである［Ｃａｐｅｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２（１９８９）］。外因性または内因性のプロモーターエレメントの調節制御下で遺伝子が過剰発現されている動物は、トランスジェニック動物として公知である。相同組み換えによって内因性の遺伝子が不活性化されている動物は「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」動物と呼ばれる。ノックアウト動物は好ましくはヒト以外の哺乳類であるが、それについては本明細書に参考として援用される米国特許第５，５５７，０３２号に記載のとおり、調製できる。トランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドが生物学的なプロセス、好ましくは疾患状態で果たす役割を決定するのに有用である。トランスジェニック動物は、脂質代謝を調節する化合物を同定するモデルシステムとして有用である。トランスジェニック動物は、好ましくはヒト以外の哺乳類であるが、本明細書に参考として援用される米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載された方法を用いて作成される。
【０１４５】
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターの全部または一部が活性化または不活性化されて、本発明のポリペプチドの発現のレベルが変更されれば、トランスジェニック動物を作成することができる。不活性化は、上記の相同組み換え方法を用いて行うことができる。活性化は、タンパク質発現を増大するために、相同性プロモーターを補充するか、または置き換えることによって達成できる。相同性プロモーターは、特定の組織にプロモーター活性を与えることが公知である１つ以上の異種のエンハンサーエレメントの挿入によって補充され得る。
【０１４６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドを発現できない動物、または種々のポリペプチドを発現する動物の、例えば相同組み換えまたはノックアウトストラテジーによって開発できる。このような動物は、ポリペプチドのインビボ活性を研究するため、および本発明のポリペプチドのモジュレータを研究するためのモデルとして有用である。
【０１４７】
インビボでの本発明のポリペプチドの生体機能を決定するために好ましい方法では、本発明によって提供される１つ以上の遺伝子は、相同組み換えを用いて動物の生殖細胞系で過剰発現されるかまたは不活性化される［Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２（１９８９）］。外因性または内因性プロモーターエレメントの調節制御の下で遺伝子が過剰発現されている動物は、トランスジェニック動物として公知である。相同組み換えによって内因性の遺伝子が不活性化されている動物は「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」動物と呼ばれる。ノックアウト動物は好ましくは、ヒト以外の哺乳類であるが、それについては本明細書に参考として援用される米国特許第５，５５７，０３２号に記載のとおり調製することができる。トランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドが生物学的なプロセス、好ましくは疾患状態で果たす役割を決めるのに有用である。トランスジェニック動物は、脂質代謝を調節する化合物を識別するモデルシステムとして有用である。トランスジェニック動物は好ましくは、ヒト以外の哺乳類であるが、本明細書に参考として援用される米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載された方法を用いて作り出される。
【０１４８】
本発明のプロモーターのポリヌクレオチドの全部または一部が活性化または不活性化されて、本発明のポリペプチドの発現のレベルが変更されているトランスジェニック動物を準備することができる。不活性化は、上記の相同組み換え方法を用いて行うことができる。活性化は、タンパク質発現を増大するために、相同なプロモーターを補充するか、または置き換えることによって達成できる。相同なプロモーターは、特定の組織にプロモーター活性を付与することが公知の１つ以上の異種のエンハンサーエレメントを挿入して補充できる。
【０１４９】
４．１０  用途および生体活性
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書に特定された１つ以上の用途または生体活性（本発明に挙げたアッセイに関連するものを含む）を示すことが期待される。本発明のタンパク質について説明された用途または活性は、このようなタンパク質、またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与または使用によって提供され得る（例えば、ＤＮＡの導入に適した遺伝子治療またはベクターなど）。特定の状態または病理学の背景にある機構が、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらのモジュレータ（活性化因子またはインヒビター）が、治療を必要とする被験体に有益であるか否かを決める。従って、「本発明の治療用組成物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」としては、単離されたポリヌクレオチド（組み換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子およびその変性改変体を含む）を含む組成物、または本発明のポリペプチド（全長タンパク質、成熟型タンパク質およびそれらの短縮型もしくはドメインを含む）、または標的遺伝子／タンパク質の発現または標的タンパク質活性のレベルのいずれかにおいて、標的遺伝子生成物の全体的活性を調節する化合物および他の物質が挙げられる。このようなモジュレータとしては、ポリペプチド、アナログ、（改変体）であって、フラグメントおよび融合タンパク質を含むもの、抗体および他の結合タンパク質；本発明のポリペプチドを直接または間接的に活性化または阻害する化合物（本明細書に記載されるような、例えば薬剤スクリーニングアッセイを介して識別される化合物）；三重らせん形成に適したアンチセンスポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド；そして詳細には、本発明のポリペプチドの１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗体または他の結合パートナーが挙げられる。
【０１５０】
本発明のポリペプチドは、同様に細胞の活性化に関与しているかも知れないし、または本明細書に記載された、他の生理学的な経路の１つに関与しているかも知れない。
【０１５１】
４．１０．１  研究用途および有用性
本発明によって得られるポリヌクレオチドは、研究団体によって種々の目的に使用され得る。このポリヌクレオチドは、以下の目的に用いることができる：分析、特性付け、または治療用途に組み換えタンパク質を発現させるため；対応するタンパク質が優先的に発現される組織のマーカーとして（構造的に、または組織分化もしくは発達もしくは疾患状態における特定の段階で）；ゲルの分子量マーカーとして；染色体を識別するかまたは関連遺伝子の位置のマップマップを作成するための染色体マーカーまたはタグ（標識される場合）として；潜在的な遺伝子障害を特定するために患者の内因性ＤＮＡ配列と比較するため；新規な関連のＤＮＡ配列にハイブリダイズしてこれによって発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティング法のためにＰＣＲプライマーを導く情報源として；他の新規なポリヌクレオチドを発見する過程で、公知の配列を「除外（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」するためのプローブとして；発現パターンの試験のためを含む、「遺伝子チップ（ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ）」または他の支持体への付着用にオリゴマーをスクリーニングおよび作成するため；ＤＮＡ免疫技術を用いて、抗タンパク質抗体を惹起させるため；そして、抗ＤＮＡ抗体を惹起するかまたは別の免疫応答を誘発するための抗原として。別のタンパク質に結合するかまたは結合する可能性のあるタンパク質をポリヌクレオチドがコードする場合（例えば、レセプターとリガンドの相互作用においてのように）、そのポリヌクレオチドを相互作用トラップアッセイに用いて（例えば、Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ  ７５：７９１〜８０３（１９９３）で記載されたもの）、結合相手の他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを識別することも、または結合相互作用のインヒビターを同定することもできる。
【０１５２】
本発明が提供するポリペプチドは同様に、以下を含む、生体活性を決めるためのアッセイで用いることができる：ハイスループットスクリーニングのための複数タンパク質パネルで；抗体を惹起するためまたは別の免疫反応を誘導するため；生物学的な液体中のタンパク質（またはそのレセプター）のレベルを定量的に決定するように設計されたアッセイにおける試薬（標識試薬を含む）として；対応するポリペプチドが優先的に発現される組織のマーカーとして（構造的に、または組織分化、発達もしくは疾患状態における特定の段階で）；そして当然ながら、相関したレセプターまたはリガンドを単離するため。これらの結合の相互作用に関与するタンパク質は、結合相互作用のペプチドまたは小分子のインヒビターまたはアゴニストのスクリーニングにも用いることができる。
【０１５３】
これらの研究の有用性のいずれかまたは全てを、研究製品としての市販のための試薬等級またはキットの形態に開発することができる。
【０１５４】
上記のような用途を実施するための方法は、当業者に周知である。このような方法を開示する引用文献としては、限定はしないが、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編，１９８９、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編、１９８７が挙げられる。
【０１５５】
４．１０．２  栄養面での用途
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、栄養源または栄養補助剤としても用いることができる。このような用途としては限定はしないが、タンパク質またはアミノ酸栄養補助剤としての使用、炭素源としての使用、窒素源としての使用および炭水化物としての使用が挙げられる。その場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特定の生物体の飼料に添加してもよく、または別々の固体もしくは液体調製物として、例えば、粉末、錠剤、溶液、縣濁液もしくはカプセルの形態で投与されてもよい。微生物の場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、微生物が培養される培地に添加されてもよい。
【０１５６】
４．１０．３  サイトカインおよび細胞増殖／分化活性
本発明のポリペプチドは、サイトカイン、細胞増殖（誘導または阻害のいずれか）、または細胞分化（誘導または阻害のいずれか）に関連する活性を示してもよいし、または特定の細胞集団において他のサイトカインの生成を誘導してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、このような特質を示すポリペプチドをコードすることができる。全ての公知のサイトカインを含めて、これまで発見された多くのタンパク質因子は、１つ以上の因子依存性細胞増殖アッセイで活性を示しており、これによってこのアッセイはサイトカイン活性の確認方法として便利である。本発明の治療用組成物の活性は、限定はしないが３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、ＣＭＫ、ＨＵＶＥＣ、およびＣａｃｏを含む細胞株についての多数の慣用的な因子依存性細胞増殖アッセイのいずれか１つによって立証されている。本発明の治療用組成物は以下の場合において用いることができる：
Ｔ−細胞または胸腺細胞の増殖アッセイであって、限定はしないが以下に記載されたものを含むもの：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，編集Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４〜３５００，１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６〜１７１２，１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７〜３４１，１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８〜３７８３，１９９２；Ｂｏｗｍａｎら、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６〜１７６１，１９９４。
【０１５７】
サイトカイン生成および／または膵臓細胞、リンパ腺細胞もしくは胸腺細胞の増殖についてのアッセイであって、限定はしないが以下に述べられたものを含むもの：Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ａ．Ｍ．およびＳｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｎｅｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．第Ｉ巻、３．１２．１−３．１２．１４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４；ならびにＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−γ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻６．８．１−６．８．８頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４。
【０１５８】
造血性細胞およびリンパ球産生細胞の増殖および分化のアッセイであって、限定はしないが以下に記載されたものを含むもの：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４，Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｋ．，Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｓ．およびＬｉｐｓｋｙ  Ｐ．Ｅ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．第１巻．６．３．１〜６．３．１２頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５〜１２１１，１９９１；Ｍｏｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０〜６９２，１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１〜２９３８，１９８３；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６−Ｎｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．第１巻  ６．６．１〜６．６．５頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７〜１８６１，１９８６；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １１−Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｆ．，Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ，Ｊ．，Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．およびＴｕｒｎｅｒ、Ｋ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．第１巻  ６．１５．１頁  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ９−Ｃｉａｒｌｅｔｔａ，Ａ．，Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ，Ｊ．，Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編．第１巻  ６．１３．１頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１。
【０１５９】
抗原に対するＴ−細胞クローンの応答のアッセイ（これは特に、増殖およびサイトカイン生成を測定することによって、ＡＰＣ−Ｔ細胞の相互作用および直接的なＴ細胞の効果に影響を与えるタンパク質で識別する）であって、限定はしないが以下に記載されたものを含むもの：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，編集：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第６章、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０９１〜６０９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１１：４０５〜４１１，１９８１；Ｔａｋａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４〜３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８〜５１２，１９８８。
【０１６０】
４．１０．４  幹細胞増殖因子活性
本発明のポリペプチドは、幹細胞増殖因子活性を示し得、そして始原生殖細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、および／または生殖系列幹細胞を含む多能性および全能性の幹細胞の増殖、分化および生存に関係し得る。本発明のポリペプチドをインビボまたはエキソビボで幹細胞に投与すると、全能性または多能性の状態で細胞集団を維持し、かつ増殖させることが期待され、これは、損傷、または疾患状態の組織の再構築、移植、生物製剤の製造、およびバイオセンサーの開発に有用である。大量のヒト細胞を製造する能力は、次のような面で重要な応用範囲を持っている：現在ではヒト以外の供給源またはドナーからとらなければならないヒトタンパク質の生成、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患のような疾患を治療するための細胞の移植；移植用の組織、例えば骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉（心筋を含む）、血管、網膜、神経細胞、胃腸の細胞など；そして移植用の器官、例えば、腎臓、肝臓、膵臓（膵島細胞を含む）、心臓および肺。
【０１６１】
本明細書に列挙した任意の増殖因子、他の幹細胞維持因子を含む、そして詳細には幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、任意のインターロイキン、ＩＬ−６に融合された組み換え可溶性ＩＬ−６レセプター、マクロファージ炎症タンパク質１−α（ＭＩＰ−１−α）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板第四因子（ＰＦ−４）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子、および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、複数の異なる増殖因子および／またはサイトカインが、所望の効果を達成するために本発明のポリペプチドと組み合わせて投与されてもよいということが考えられる。
【０１６２】
全能性幹細胞は、実質的に任意の成熟細胞タイプを生じ得るので、培養液中でこれらの細胞を増殖すれば、大量の成熟細胞の生産を促進できる。幹細胞の培養技術は当該分野で公知であり、本発明のポリペプチドは、必要に応じて他の増殖因子および／またはサイトカインと共に投与され、幹細胞集団の生存率および増殖を向上させることが期待される。これは、本発明のポリペプチドを培養培地に直接投与することによって達成できる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションされた間質細胞は、培養液またはインビボの幹細胞集団の支持細胞層として用いることができる。支持細胞層の間質支持細胞は、胚性骨髄線維芽細胞、骨髄間質細胞、胎児の肝臓細胞、または培養された胚の線維芽細胞を含んでもよい（米国特許第５，６９０，９２６号を参照のこと）。
【０１６３】
幹細胞自体が、本発明のポリペプチドの自己分泌発現を誘導するために本発明のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクションできる。これによって、分化されていない全能性／多能性の幹細胞株の生成が可能となり、その細胞株はそのままでも有益であり、その後、所望の成熟細胞タイプに分化することもできる。これらの安定した細胞株はまた分化されていない全能性／多能性のｍＲＮＡの供給源として、ポリメラーゼ連鎖反応実験用のｃＤＮＡのライブラリーおよびテンプレートの作成に利用できる。これらの研究によって、幹細胞増殖および／または維持を調節する幹細胞集団において示差的に発現された遺伝子の単離および同定が可能になる。
【０１６４】
全能性幹細胞集団の増殖および維持は、多くの病的症状の治療に有用である。例えば、本発明のポリペプチドは、培養物中の幹細胞を操作して神経上皮細胞を作り、それを病気、自己免疫疾患、事故による傷害、または遺伝障害によって損傷を受けた細胞を補充するかあるいは置き換えるのに用いることができる。本発明のポリペプチドは、神経細胞の増殖を誘導するため、ならびに神経および脳の組織の再生のために有用であり得、すなわち、中枢神経および末梢神経系の疾病および神経障害、ならびに神経細胞または神経組織の変性、死滅もしくは傷害を伴う機械的および外傷性の障害の治療のために有用であり得る。さらに、増殖した幹細胞集団は、遺伝子療法のため、そしてグラフトや移植の後、置換組織の宿主拒否反応を軽減するために、遺伝学的に変更することもできる。
【０１６５】
本発明のポリペプチドの発現および幹細胞へのその影響によってまた、幹細胞の管理された分化をさらに分化された細胞タイプに操作することができる。分化されていない幹細胞集団から特定の分化された細胞タイプの純粋な集団を得るのに広範に応用可能な方法は、選択マーカーを駆動する細胞タイプ特異的なプロモーターの使用を包含する。選択マーカーは、所望のタイプの細胞だけを生存させることができる。例えば、幹細胞は心筋細胞（Ｗｏｂｕｓら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８：１７３〜１８２，（１９９１）；Ｋｌｕｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、９８（１）：２１６〜２２４，（１９９８））または骨格筋肉細胞（Ｂｒｏｗｄｅｒ，Ｌ．Ｗ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ編．Ｌａｎｚａら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７））に分化するように誘発することができる。あるいは、レチノイン酸のような分化因子および内因性幹細胞因子の活性の効果を阻害して分化を進めさせる本発明ポリペプチドのアンタゴニストの存在下おいて幹細胞を培養することによって、この幹細胞の配向された分化を達成することができる。
【０１６６】
幹細胞のインビトロ培養体を用いて、本発明のポリペプチドが幹細胞の成長因子活性を示すか否かを決定することができる。幹細胞は種々の細胞供給源（造血幹細胞および胚体幹細胞を含む）のいずれか１つから単離されて、本発明ポリペプチドのみの存在下で、または他の成長因子もしくはサイトカインとの組み合わせによって、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：７８４４〜７８４８（１９９５）で記載されているように、支持細胞層で培養される。本発明のポリペプチドが幹細胞の増殖を誘導する能力は、例えばＢｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｂｌｏｏｄ、７７：２３１６〜２３２１（１９９１）に記載されているように、半固体支持体上でのコロニー形成によって決定される。
【０１６７】
４．１０．５  造血性調節活性
本発明のポリペプチドは造血の調節に、従って、骨髄またはリンパ細胞障害の治療に関与し得る。コロニー形成細胞の支持または因子依存性細胞株の支持においてわずかでも生物活性があれば、造血の調節における、例えば、赤血球前駆細胞単独で、または他のサイトカインと共に成長および増殖を支持における関与が示され、これによって、以下の場合において有用性が示される：例えば、種々の貧血治療において、または赤血球前駆体および／または赤血球の産生を刺激するための照射／化学療法と併用して使用するため；例えば、引き続く骨髄抑制の予防または治療のための、化学療法と組み合せて有用な顆粒球および単球／マクロファージ（すなわち、伝統的なＣＳＦ活性）のような骨髄細胞の成長および増殖の支持において；例えば、骨髄抑制を予防または治療する化学療法と併せて、巨核球および引き続く血小板の成長および増殖を支持し、それによる血小板減少症のような種々の血小板障害の予防または治療を可能にすることにおいて、そして一般には血小板輸血の代わりに、または補助としての使用のために；そして／あるいは、上述の造血細胞のいずれか、またはすべてへの成熟を可能にする造血幹細胞の成長および増殖の支持において、従って、種々の幹細胞障害（通常、限定はしないが再生不良性貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症を含む、移植によって通常治療される疾患など）、ならびに、インビボまたはインビトロ（すなわち、骨髄移植、または末梢前駆細胞移植（相同または異種）と併せて）のいずれかにおいて、放射線／化学療法後の幹細胞分画を正常細胞として、または遺伝子療法用に遺伝子操作された細胞として再増殖させることにおいて治療上の有用性を見出す。
【０１６８】
本発明の治療用組成物は以下の場合において使用できる：
種々の造血細胞株の増殖および分化に適したアッセイは上に引用している。
【０１６９】
胚性幹細胞分化についてのアッセイ（胚性分化造血に影響を及ぼすタンパク質を他から同定する）としては、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１４１〜１５１，１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３〜４８６，１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎ  ら，Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３〜２９１５，１９９３に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７０】
幹細胞の生存および分化のためのアッセイ（リンパ−造血を調節するタンパク質を他から同定する）としては、メチルセルロースコロニー形成アッセイ（Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ），Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｍ．Ｇ．Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ら、編、Ｖｏｌ  ２６５〜２６８頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５９０７〜５９１１，１９９２；Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｒｎａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｒｉｄｄｅｌｌ，Ｒ．Ａ．Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ、．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ  ２３〜３９頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｎｅｂｅｎら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：３５３〜３５９，１９９４；Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ  １〜２１頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｓｐｏｏｎｃｅｒ，Ｅ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍ．およびＡｌｌｅｎ，Ｔ．Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｐｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ｖｏｌ  １６３〜１７９頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ら編、Ｖｏｌ  １３９〜１６２頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７１】
４．１０．６  組織増殖活性
本発明のポリペプチドはまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織の成長もしくは再生、ならびに創傷治癒および組織修復および置換において、そして火傷、切開および潰瘍の治癒にも関与し得る。
【０１７２】
骨が正常に形成されていない場合において、軟骨および／または骨の成長を誘導する本発明のポリペプチドは、ヒトおよび他の動物における骨折および靭帯損傷あるいは欠損の治癒において適用される。本発明のポリペプチド、抗体、結合パートナーまたは他のモジュレータの組成物は、皮下骨折および開放骨折の整復において予防的に使用可能であり、そして人工関節の固定の改善においても使用可能である。骨形成物質によって誘導される新規の骨形成は、先天性、外傷誘導性、または腫瘍切除による頭蓋顔面欠損の修復に寄与し、また美容整形外科手術においても有用である。
【０１７３】
本発明のポリペプチドはまた、骨形成細胞の誘引、骨形成細胞の成長刺激、または骨形成細胞前駆体の分化の誘導に関与し得る。骨および／または軟骨の修復の刺激によるかあるいは炎症過程により媒介される炎症または組織破壊の過程（コラゲナーゼ活性化、破骨細胞活性化など）をブロックすることによる方法などの、骨粗しょう症、変形性関節炎、骨変性障害、または歯周病の治療もまた、本発明の組成物を用いて可能な場合がある。
【０１７４】
本発明のポリペプチドが関与し得る組織再生活性の別のカテゴリーは、腱／靭帯の形成である。腱／靭帯様の組織または他の組織形成の誘導は、このような組織が正常に形成されていない場合には、ヒトおよび他の動物における、腱または靭帯の損傷、奇形および他の腱または靭帯の欠損の治癒において適用される。腱／靭帯様組織誘導性タンパク質を使用するこのような調製は、腱または靭帯の組織への損傷を防止する場合における予防的な用途、ならびに腱または靭帯の骨または他の組織への固定の改善における用途、および腱または靭帯組織の欠損を修復する場合における用途を有し得る。本発明の組成物によって誘導された新規な腱／靭帯様の組織形成は、先天性、外傷誘導性、または他の原因の他の腱または靭帯欠損の修復に寄与し、そしてまた腱または靭帯の接合または修復のための美容整形手術にも有用である。本発明の組成物は、腱または靭帯形成細胞を誘引し、腱または靭帯形成細胞の成長を刺激し、腱または靭帯形成細胞の前駆体の分化を誘導し、あるいは、組織修復に作用するようインビボに戻すためのエキソビボでの腱／靭帯細胞または前駆体の成長を誘導するような環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、手根管症候群および他の腱または靭帯の欠損症の治療にも有用であり得る。本組成物はまた、当該分野で周知であるキャリアのような適切な基質および／または隔離物質を含んでもよい。
【０１７５】
本発明の組成物はまた、神経細胞の成長ならびに神経および脳組織の再生に、すなわち、中枢神経および末梢神経系の疾患および神経障害の治療に有用であり得るだけでなく、神経細胞または神経組織の変性、死亡または外傷を含む機械的障害および外傷的障害にも有用であり得る。さらに詳細には、末梢神経系の疾患、例えば、末梢神経損傷、末梢神経障害および限局性神経障害、ならびに中枢神経の疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症およびシャイ・ドレーガー症候群の治療にもこの組成物を用いることができる。さらに、本発明によって治療され得る状態としては、機械的および外傷性の障害、例えば、脊髄障害、頭部外傷および脳血管疾患、例えば脳卒中が挙げられる。化学療法または他の医学的治療から生じる末梢神経障害はまた、本発明の組成物を用いて治療可能であり得る。
【０１７６】
本発明の組成物はまた、限定はしないが褥瘡、血管機能不全に関連する潰瘍、手術創傷および外傷性創傷などを含む非治癒性創傷のより良好であるかまたはより速い閉合を促進するのにも有用である場合がある。
【０１７７】
本発明の組成物はまた、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋肉または心筋）および血管（血管内皮を含む）の組織のような他の組織の生成または再生に、あるいは、このような組織を含む細胞の増殖を促進することにも関与し得る。所望の効果の一部は、正常組織の再生を可能にし得る線維性瘢痕の阻害または調節による場合がある。本発明のポリペプチドはまた、血管形成性の作用を示す場合もある。
【０１７８】
本発明の組成物はまた、腸の保護もしくは再生、および肺もしくは肝臓線維症の治療、種々の組織の再灌流障害、ならびに全身性のサイトカイン損傷から生じる状態にも有用であり得る。
【０１７９】
本発明の組成物はまた、前駆体組織もしくは前駆体細胞からの、上記の組織の分化を促進もしくは阻害するために；または上記の組織の成長を阻害するためにも有用であり得る。
【０１８０】
本発明の治療用組成物は以下の場合において使用できる：
組織産生活性についてのアッセイとしては、国際特許公開番号ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；国際特許公開番号ＷＯ９５／０５８４６（神経、神経細胞）；国際特許公開番号ＷＯ９１１０７４９１（皮膚、内皮）に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８１】
創傷治癒活性についてのアッセイとしては、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，７１〜１１２頁（Ｍａｉｂａｃｈ，Ｈ．Ｉ．およびＲｏｖｅｅ，Ｄ．Ｔ．，編、），Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，のＥａｇｌｓｔｅｉｎによって改良されたもの、およびＭｅｒｔｚ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７１：３８２〜８４（１９７８）に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８２】
４．１０．７  免疫刺激または抑制の活性
本発明のポリペプチドはまた、限定はしないが本明細書に記載のアッセイによる活性を含む、免疫刺激または免疫抑制活性を示し得る。本発明のポリヌクレオチドはこのような活性を示すポリペプチドをコードできる。タンパク質は、種々の免疫不全および免疫障害（重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）など）の治療において、例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の成長および増殖の調節（上方、または下方）において、ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性への作用においても有用であり得る。これらの免疫不全は遺伝的であるか、もしくはウイルス（例えば、ＨＩＶ）ならびに細菌または真菌感染によって生じる場合もあり、または自己免疫障害から生じる場合もある。さらに詳細には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染症によって生じる感染性疾患には、本発明のタンパク質を用いて治療できるものもあり、この感染性疾患としては、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、放線菌、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ（リーシュマニア属）、マラリア種、およびカンジタのような種々の真菌感染による感染症が挙げられる。当然ながら、この点に関して、本発明のタンパク質は、免疫系に対するブーストが一般に所望され得る場合、すなわち癌の治療においても有用であり得る。
【０１８３】
本発明のタンパク質を用いて治療され得る自己免疫疾患としては、例えば、結合組織疾患（膠原病）、多発性硬化病、全身性エリテマトーデス、関節リューマチ、自己免疫性肺炎、ギラン・バレー症候群、自己免疫甲状腺炎、インシュリン依存性糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主疾患、および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられる。このような本発明のタンパク質（または抗体を含むそのアンタゴニスト）はまた、アレルギー反応および状態（例えば、アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒液アレルギー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、過敏性肺炎、蕁麻疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多型性紅疹、スティーヴンス・ジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性病性角結膜炎、巨大乳頭状結膜炎、および接触アレルギー）、例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸器系障害の治療にも有用であり得る。免疫抑制が所望される他の状態（例えば、臓器移植を含む）もまた、本発明のタンパク質（またはそのアンタゴニスト）を用いて治療することができる場合がある。ポリペプチドまたはそのアンタゴニストのアレルギー反応に対する治療効果は、累積接触感作試験（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｔｅｓｔ）（Ｌａｓｔｂｏｍら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２５：５９〜６６，１９９８）、皮膚プリック試験（ｓｋｉｎ  ｐｒｉｃｋ  ｔｅｓｔ）（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ａｌｌｅｒｇｙ  ５４：４４６〜５４，１９９９）、モルモット皮膚感作試験（Ｖｏｈｒら、Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｏｃｏｌ．７３：５０１〜９）、およびマウス局部リンパ節アッセイ（Ｋｉｍｂｅｒら、Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  ５３：５６３〜７９）などのインビボ動物モデルによって評価できる。
【０１８４】
本発明のタンパク質を用いる場合、また、多くの方法で免疫反応を調節することも可能である。下方制御は、すでに進行中の免疫反応を阻害するか、またはブロックするやり方で行われてもよいし、あるいは、免疫応答の誘導の防止に関与してもよい。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞応答の抑制によるか、またはＴ細胞における特異的寛容（トレランス）の誘導によって、あるいはその両方によって阻害され得る。Ｔ細胞反応の免疫抑制は一般に活性な非抗原特異的過程であり、これはＴ細胞の抑制物質への持続的曝露を必要とする。Ｔ細胞での非反応性またはアネルギー（無反応）の誘導に関連する寛容は、それが一般に抗原特異的であり、寛容化物質への曝露が中止された後にも持続するという点で免疫抑制と識別可能である。操作的には、寛容は、寛容化物質の非存在状態における特定抗原への再曝露時にＴ細胞応答が起こらないことによって実証され得る。
【０１８５】
１つ以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７など）をこれに限らず含む）の下方制御または防止、例えば、活性Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成の防止は、組織、皮膚および臓器移植の状態において、ならびに移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは、組織移植において組織破壊を減少させるはずである。代表的には、組織移植において移植の拒絶反応は、Ｔ細胞がそれを外来物として認識することによって開始され、その後に移植片を破壊する免疫応答が続く。本発明の治療用組成物の投与は、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカインの合成を妨げ、これによって、免疫抑制剤として作用し得る。さらに、同時刺激がないことは、Ｔ細胞がアネルギー化（無反応化）されるのに十分であり、これによって、被験者における寛容が誘導される場合もある。Ｂリンパ球抗原ブロック試薬による長期寛容の誘導によって、これらのブロッキング剤の反復投与の必要性を回避することができる。被験者において十分な免疫抑制または寛容を得るには、Ｂリンパ球抗原の組合せの機能をブロックする必要がある場合がある。
【０１８６】
臓器移植拒絶反応またはＧＶＨＤの予防における特定の治療用組成物の効力は、ヒトにおいて有効性を予測する動物モデルを用いて評価することができる。用いることができる適切なシステムの例としては、ラットにおける同種心臓移植片、およびマウスにおける異種間膵島細胞移植片が挙げられるが、これらのいずれもが、Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：７８９〜７９２（１９９２）およびＴｕｒｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１１１０２〜１１１０５（１９９２）に記載のとおりインビボでＣＴＬＡ４Ｉｇ  融合タンパク質の免疫抑制効果を検査するために用いられている。さらに、ＧＶＨＤのマウスモデル（Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，８４６〜８４７頁を参照のこと）は、この疾患の進行時の本発明の治療用組成物の効果を測定するために用いることができる。
【０１８７】
抗原機能のブロックはまた、自己免疫疾患の治療のために治療的に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、自己組織に反応性であるＴ細胞の不適切な活性化の結果であり、その疾患の病態に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は病状を軽減するか、またはなくすことができる。Ｔ細胞の刺激をブロックする試薬の投与を用いることによって、Ｔ細胞活性化の阻害、およびこの疾患の経過に関与し得る自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産生の防止ができる。さらに、ブロッキング試薬によって、自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容が誘導される場合があり、これによって、この疾患からの長期的緩解がもたらされ得る。自己免疫障害の予防または緩解におけるブロッキング試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患の十分に特徴付けされた多数の動物モデルを用いて測定できる。この例としては、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＥＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、ならびにマウス実験的重症筋無力症（Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ．８４０〜８５６を参照のこと）が挙げられる。
【０１８８】
免疫応答を上方制御する手段としての抗原機能の上方制御（例えば、Ｂリンパ球抗原機能）はまた、治療においても有用であり得る。免疫応答の上方制御は既存の免疫応答を増強する様式か、または初回の免疫応答を惹起する様式で行われ得る。例えば、免疫応答の増強は、インフルエンザ、感冒、および脳炎のような全身性ウイルス疾患を含むウイルス感染の場合に有用な場合がある。
【０１８９】
あるいは、抗ウイルス性免疫応答は、感染した患者において患者からＴ細胞を除去すること、本発明のペプチドを発現するか、または本発明の可溶性ペプチドの刺激性形態のものと一緒に、ウイルス抗原を捕らえた（pursed）ＡＰＣを用いてインビトロでＴ細胞を同時刺激すること、およびインビトロで活性化されたＴ細胞を患者に再び導入することによって、増強され得る。抗ウイルス免疫応答を増強させる別の方法は、患者から感染細胞を単離し、この細胞がその表面にタンパク質のすべてまたは一部を発現するように、本明細書に記載される本発明のタンパク質をコードする核酸を用いてそれらの細胞をトランスフェクトして、このトランスフェクトされた細胞を患者に再導入することである。ここで、この感染細胞は同時刺激シグナルを伝達することができ、それによってインビボでＴ細胞を活性化できる。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは、トランスフェクションされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘導するために必要な刺激シグナルをＴ細胞に提供し得る。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠く、または、十分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現できない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質およびβ２ミクログロブリンタンパク質またはＭＨＣクラスＩＩα鎖タンパク質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質のすべてまたは一部（例えば、細胞質内ドメイン切断部分）をコードする核酸でトランスフェクションして、それによって、その細胞表面にＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現させることができる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと共に、適切なクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣを発現させることによって、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答が誘導される。必要に応じて、不変鎖のようなＭＨＣクラスＩＩ結合タンパク質の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子をまた、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡとともに同時トランスフェクトして、腫瘍関連抗原の提示を促進し腫瘍特異的免疫を誘導することができる。このように、ヒト被験者におけるＴ細胞媒介免疫応答の誘導によって、被験者における腫瘍特異的寛容を十分克服することができる。
【０１９１】
本発明のタンパク質の活性は、他にも方法はあるが、以下の方法によって測定できる。
【０１９２】
胸腺または脾細胞の細胞毒性についての適切なアッセイとしては、限定はしないが、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第３章，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２４８８〜２４９２，１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８〜１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４〜１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉら、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４〜３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８〜５１２，１９８８；Ｂｏｗｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１９９２〜１９９８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７〜３４１，１９９１；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３０７９〜３０９２，１９９４に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９３】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチ（Ｔ細胞依存性抗体応答を調節し、Ｔｈｌ／Ｔｈ２  プロフィールに影響するタンパク質を他から識別する）についてのアッセイとしては、限定はしないが、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８〜３０３３，１９９０；およびＡｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｏｎｄ，Ｊ．Ｊ．およびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｍ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ  編、Ｖｏｌ  １  ｐｐ．３．８．１〜３．８．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９４】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（主にＴｈ１およびＣＴＬ応答を生じるタンパク質を他から識別する）としては、限定はしないが、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編集，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第３章，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１〜３．１９；第７章，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４〜３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８〜５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８〜３７８３，１９９２に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９５】
樹状突起細胞依存性アッセイ（ナイーブなＴ細胞を活性化する樹状細胞によって発現されるタンパク質を他から識別する）としては限定はしないが、Ｇｕｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｉｍｍｏｌ．１３４：５３６〜５４４，１９９５；Ｉｎａｂａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７３：５４９〜５５９，１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５４：５０７１〜５０７９，１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８２：２５５〜２６０，１９９５；Ｎａｉｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：４０６２〜４０６９，１９９３；Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１〜９６５，１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：１２５５〜１２６４，１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９４：７９７〜８０７，１９９４；ならびにＩｎａｂａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７２：６３１〜６４０，１９９０に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９６】
リンパ球生存／アポトーシスについてのアッセイ（スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐタンパク質およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を他から識別する）としては、限定はしないが、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５〜８０８，１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９〜６７０，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５〜１９５１，１９９３；Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ  ６６：２３３〜２４３，１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４５：４０３７〜４０４５，１９９０；Ｚａｍａｉら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１〜８９７，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：６３９〜６４８，１９９２に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９７】
Ｔ細胞の方向付けおよび発達の初期段階に影響するタンパク質のアッセイとしては、限定はしないが、Ａｎｔｉｃａら、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１〜１１７，１９９４；Ｆｉｎｅら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１１１〜１２２，１９９４；Ｇａｌｙら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０〜２７７８，１９９５；Ｔｏｋｉ，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７５４８〜７５５１，１９９１に記載のアッセイが挙げられる。
【０１９８】
４．１０．８  アクチビン／インヒビンの活性
本発明のポリペプチドはまた、アクチビンまたはインヒビン関連活性を示してもよい。本発明のポリヌクリオチドは、このような特性を示すポリペプチドをコードし得る。インヒビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の遊離を阻害する能力によって特徴づけられており、一方、アクチビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の遊離を刺激する能力によって特徴づけられている。このように、本発明のポリペプチドは、単独で、またはインヒビンファミリーのメンバーとのヘテロダイマー（ヘテロ二量体）として、インヒビンが雌性の哺乳動物の受精能を低下させ、雄性哺乳動物の精子形成を減少させる能力に基づいた避妊薬として有用であり得る。十分な量の他のインヒビンを投与することによって、これらの哺乳動物において不妊を誘導できる。あるいは、本発明のポリペプチドは、ホモダイマーとして、またはインヒビングループの他のタンパク質サブユニットとのヘテロダイマーとして、脳下垂体前葉細胞からのＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）放出の刺激におけるアクチビン分子の能力に基づいて、受精能誘導治療剤として有用であり得る。例えば、米国特許第４，７９８，８８５号を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、ウシ、ヒツジおよびブタに限らず、このような家畜類の生涯生殖能を向上するように、性的に未熟な哺乳動物の受精の開始を早めるためにも有用であり得る。
【０１９９】
本発明のポリペプチドの活性は、他にも方法はあるが、以下の方法によって測定できる。
【０２００】
アクチビン／インヒビン活性のアッセイとしては、限定はしないが、Ｖａｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ９１：５６２〜５７２，１９７２；Ｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７９〜７８２，１９８６；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６〜７７９，１９８６；Ｍａｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９〜６６３，１９８５；Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３０９１〜３０９５，１９８６に記載のアッセイが挙げられる。
【０２０１】
４．１０．９  走化性／化学運動性活性
本発明のポリペプチドは例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞を含む哺乳動物細胞の走化性または化学運動性の活性に関与し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードすることができる。走化性および化学運動性のレセプターの活性を用いて、作用の所望の部位へ所望の細胞集団を動員するか、誘引することができる。走化性または化学運動性の組成物（例えば、タンパク質、抗体、結合パートナー、または発明のモジュレータ）は、組織に対する創傷および他の外傷の治療において、ならびに局所性感染症の治療においても特定の利益を与える。例えば、リンパ球、単球または好中球の、腫瘍または感染部位への誘引によって、腫瘍または感染物質に対する免疫応答が改善され得る。
【０２０２】
タンパク質またはペプチドは、特定の細胞集団の方向または運動を直接または間接的に刺激できる場合、このような細胞集団に対して走化性活性を有する。好ましくは、このタンパク質またはペプチドは、細胞の有向運動を直接刺激する機能を有する。特定のタンパク質が細胞集団に対する走化性活性を有するか否かは、このようなタンパク質またはペプチドを、任意の公知の細胞走化性のアッセイにおいて使用することによって容易に決定できる。
【０２０３】
本発明の治療用組成物は以下の場合において用いることができる：
走化性活性のアッセイ（走化性を誘導するかまたは妨げるタンパク質を同定する）は、タンパク質が膜内で細胞の遊走を誘導する能力、ならびにタンパク質が１つの細胞集団の別の細胞集団への付着を誘導する能力をも測定するアッセイから構成される。移動および付着の適切なアッセイとしては、限定はしないが、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編集，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第６．１２章，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ６．１２．１−６．１２．２８；Ｔａｕｂら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３７０〜１３７６，１９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０〜１４６，１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１７４４〜１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５８６０〜５８６７，１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１７６２〜１７６８，１９９４に記載のアッセイが挙げられる。
【０２０４】
４．１０．１０  止血性および血栓溶解の活性
本発明のポリペプチドはまた、止血または血栓溶解または血栓症にも関与する場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードしてもよい。組成物は種々の凝固障害（血友病のような遺伝的障害を含む）の治療において、または外傷、手術または他の原因から生じる創傷の治療において凝固および他の止血を強化するために有用であり得る。本発明の組成物はまた、血栓の溶解または形成の阻害のために、そしてそれから生じる状態（例えば、心臓および中枢神経系の血管の梗塞（例えば、脳卒中）など）の治療および予防のためにも有用であり得る。
【０２０５】
本発明の治療用組成物は、以下の場合において使用できる：
止血および血栓溶解活性のアッセイとしては、限定はしないが、Ｌｉｎｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１〜１４０，１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．４５：４１３〜４１９，１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１〜７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７〜４７４，１９８８に記載のアッセイが挙げられる。
【０２０６】
４．１０．１１  癌の診断および治療
本発明のポリペプチドは、癌細胞の産生、増殖または転移にも関与し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在または量の検出は、１種以上の癌の診断および／または予測に有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの存在または発現の増大によって、癌の遺伝的リスク、前癌状態または進行性悪性腫瘍が示される場合がある。逆に、遺伝子の欠損、またはこのポリペプチドの非存在は、癌状態に関連する場合がある。癌または癌の素因に関連する一塩基遺伝子多型の同定はまた、診断または予測にも有用な場合がある。
【０２０７】
癌の治療は、腫瘍細胞増殖の阻害、血管新生（腫瘍増殖の補助に必要な新生血管の成長）の阻害および／または腫瘍細胞の運動性または侵襲性を軽減して転移を妨げることによって腫瘍の退縮を促進する。本発明の治療用組成物は成人および小児の腫瘍において有効であり得るが、この腫瘍としては、固性腫瘍／悪性腫瘍、局所進行性腫瘍、ヒト軟部組織肉腫、リンパ性転移などの転移性癌、多発性骨髄腫、急性および慢性の白血病、およびリンパ腫などの血球悪性腫瘍、口癌、喉頭癌および甲状腺癌を含む頭部および頸部の癌、小細胞癌および非小細胞癌を含む肺癌、小細胞癌および管性癌を含む乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、結腸直腸および結腸直腸新生物に合併するポリープを含む消化管癌、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌および前立腺癌を含む泌尿器の癌、卵巣癌、子宮（子宮内膜を含む）癌および卵胞固形腫瘍を含む雌性生殖器官の悪性腫瘍、腎細胞癌を含む腎臓癌、内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、アストロサイト（星状細胞）脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞侵襲を含む脳腫瘍、骨腫を含む骨癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、血管外皮細胞腫およびカポジ肉腫を含む皮膚癌が挙げられる。
【０２０８】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのモジュレータ（本発明のポリペプチドの生物活性のインヒビターおよび刺激物質を含む）は、癌の治療のために投与されてもよい。治療用組成物は、単独で、または手術、化学療法、放射線療法、温熱療法およびレーザー療法のような癌の補助的療法と併せて治療上有効な投与量で投与することが可能であり、そして癌を根絶する必要はないが、有利な効果、例えば、腫瘍のサイズを減少すること、腫瘍の成長速度を低下すること、転移の阻害、または全体的な臨床状態の改善を提供する場合がある。
【０２０９】
本組成物は抗癌カクテルの一部として治療上有効な量で投与されてもよい。抗癌カクテルは、薬剤学的に許容される送達用キャリアに加えて、本発明のポリペプチドまたはモジュレータと1つ以上の抗癌剤との混合物である。癌の治療として抗癌カクテルを使用することは、慣用的である。本発明のポリペプチドまたはモジュレータと組み合わせて治療として使用できる当該分野で周知の抗癌剤としては、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、塩酸シタラビン（シトシン・アラビノシド）、ダカルバジン、ダクチノマイシンン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、酢酸リュープロライド（ＬＨＲＨ−遊離因子アナログ）、ロムスチン、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェン・マスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン−２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシド、およびビンデシン硫酸が挙げられる。
【０２１０】
さらに、本発明の治療用組成物は、癌の予防的治療に用いることができる。個体が癌を発症する素因があるという、当該分野で公知の遺伝的状態および／または環境的状態（例えば、発癌物質への曝露）がある。これらの状況のもとで、癌を発症するリスクを少なくするために、治療上有効な量の本発明のポリペプチドを用いてこれらの個人を治療することが、有利である場合がある。
【０２１１】
インビトロモデルを用いて、可能性のある癌の治療としての本発明のポリペプチドの有効量を測定することができる。これらのインビトロモデルとしては、培養腫瘍細胞の増殖アッセイ、軟寒天における培養腫瘍細胞の増殖（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｗｉｌｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  第１８章および第２１章を参照のこと）、Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ，５２：９２１−３０（１９７４）に記載のヌードマウスにおける腫瘍システム、Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７：４１０７〜９（１９９７）に記載のＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおける腫瘍細胞の移動性および侵襲性の可能性、ならびに、Ｒｉｂａｔｔａら、Ｉｎｔｌ，Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，４０：１１８９〜９７（１９９９）およびＬｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１７：４２３〜９（１９９９）に各々記載された鶏絨毛尿膜の血管新生の誘導、または血管内皮細胞遊走の誘導のような血管形成のアッセイが挙げられる。適切な腫瘍細胞株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログから入手できる。
【０２１２】
４．１０．１２  レセプター／リガンドの活性
本発明のポリペプチドはまた、レセプター、レセプターリガンド、またはレセプター／リガンド相互作用のインヒビターもしくはアゴニストとしての活性を示し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような特性を示すポリペプチドをコードし得る。このようなレセプターおよびリガンドの例としては、サイトカインレセプターとそのリガンド、レセプターキナーゼとそのリガンド、レセプターホスファターゼとそのリガンド、細胞間相互作用に関与するレセプターとそのリガンド（セレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンドのような）細胞接着分子を含むがこれに限定されない）、そして抗原提示、抗原認識ならびに細胞性および体液性免疫応答の発達に関与するレセプター／リガンド対が挙げられるがこれらに限定されない。レセプターおよびリガンドはまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の可能性があるペプチドまたは小分子インヒビターのスクリーニングにも有用である。本発明のタンパク質（レセプターのフラグメントおよびリガンドをこれらに限らず含む）はそれ自体がレセプター／リガンド相互作用のインヒビターとして有用であり得る。
【０２１３】
本発明のポリペプチドの活性は、他に方法もあるが、以下の方法によって測定できる。
【０２１４】
レセプターリガンド活性の適切なアッセイとしては、限定はしないが、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編集，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（第７．２８章，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ７．２８．１−７．２８．２２）、Ｔａｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８６４〜６８６８，１９８７：Ｂｉｅｒｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５〜１１５６，１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９〜１６０  １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９〜６８，１９９４；Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ  ８０：６６１〜６７０，１９９５に記載のアッセイが挙げられる。
【０２１５】
例えば、本発明のポリペプチドは、リガンド（単数または複数）のレセプターとして用いられてもよく、それによってそのリガンド（単数または複数）の生物活性が伝達される。リガンドは、結合アッセイ、アフィニティークロマトグラフィ、ダイハイブリッドスクリーニングアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ゲルオーバレイアッセイまたは当該分野で公知の他の方法によって同定できる。
【０２１６】
薬物またはタンパク質が、アゴニストか、またはアンタゴニストか、あるいは部分的アゴニストか、または部分的アンタゴニストかを特徴付ける研究には、競合的リガンドとしての他のタンパク質を用いる必要がある。本発明のポリペプチドまたはそのリガンド（単数または複数）は、従来の方法によって放射性同位元素、比色定量分子または毒素分子に結合されて標識されてもよい（「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（編）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。放射性同位元素の例としては、トリチウムおよび炭素−１４が挙げられるが、これらに限定されない。比色定量分子の例としては、フルオレサミンのような蛍光分子、またはローダミンもしくは他の比色定量分子が挙げられるがこれらに限定されない。毒素の例としては、リシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１７】
４．１０．１３  薬物スクリーニング
本発明は様々な薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、新規なポリペプチドまたはその結合フラグメントを用いることによって、化合物をスクリーニングするのに特に有用である。このような試験に使用されるポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中に遊離しても、固体支持体に固定されても、細胞表面に生じても、または細胞内に位置してもよい。薬物スクリーニングの１つの方法では、このポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組み換え核酸で安定的に形質転換されている真核生物または原核生物の宿主細胞を利用する。薬物は結合タンパク質競合測定法で、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。生存能力のある、または固定された形態のこのような細胞は、標準結合アッセイに用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドもしくはフラグメントと試験される因子との間の複合体の形成を測定するか、または新規なポリペプチドと当該分野で周知の適切な細胞株との間の複合体形成における減少を調べることができる。
【０２１８】
本発明のポリペプチドに対する結合能力またはその活性を調節する（すなわち、増大または減少させる）能力をスクリーニングできる試験化合物の供給源としては、（１）無機および有機化合物のライブラリー、（２）天然物ライブラリーおよび（３）ランダムまたは模倣のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子から成るコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【０２１９】
ケミカルライブラリーは、多くの市販の供給源から容易に合成または購入可能であり、これには公知の化合物の構造的アナログ、または天然物スクリーニングを介して「ヒット（ｈｉｔ）」または「リード（ｌｅａｄｓ）」として同定されている化合物を挙げることができる。
【０２２０】
天然物ライブラリーの供給源は、微生物（細菌および真菌を含む）、動物、植物もしくは他の植生または海洋生物であり、そしてスクリーニング用混合のライブラリーは、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵および抽出、または（２）微生物自体からの抽出によって作成できる。天然物ライブラリーには、ポリケチド、非リボソーム・ペプチドおよびその（非天然性発生）改変体が挙げられる。総説については、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３〜６８（１９９８）を参照のこと。
【０２２１】
コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物からなり、伝統的な自動合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは独自開発の合成方法によって容易に調製することができる。特に重要なのは、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーである。なお、この他に興味深いライブラリーとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多平行型合成コレクション、リコンビナトリアル、およびポリペプチドのライブラリーが挙げられる。コンビナトリアルケミストリーおよびそれから作成されたライブラリーの総説については、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１〜７０７（１９９７）を参照のこと。ペプチド模倣物のライブラリーの総説および例については、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９（３）：２０５〜２３（１９９８）；Ｈｒｕｂｙら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｏｉｌ，１（１）：１１４〜１９（１９９７）：Ｄｏｒｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，４（５）：７０９〜１５（１９９６）（アルキル化ジペプチド）を参照のこと。
【０２２２】
本明細書に記載される種々のライブラリーを用いてモジュレータを同定することによって、本発明のポリペプチドに結合する「ヒット（ｈｉｔ）」の能力を最適化するための候補の「ヒット（ｈｉｔ）」（または「リード（ｌｅａｄ）」）の修飾が可能になる。次に、結合能アッセイで同定された分子を、当該分野で周知のインビボ組織培養または動物モデルにおいてアンタゴニストまたはアゴニスト活性について試験する。要するに、分子を多数の細胞培養または動物に滴定して、次に細胞／動物の死亡または動物／細胞の生存延長について試験する。
【０２２３】
このようにして同定された、結合分子は、毒素、例えば、リシンまたはコレラと複合体化されてもよいし、または放射性同位元素のような細胞に毒性である他の化合物と複合体化されてもよい。次いで、毒素結合分子複合体は、本発明のポリペプチドに対する結合分子の特異性によって腫瘍または他の細胞を標的する。あるいは、結合分子は標的化および画像化の目的のための画像化剤と複合体化されてもよい。
【０２２４】
４．１０．１４  レセプター活性のアッセイ
本発明はまた、ポリペプチド、例えばリガンドまたはレセプターの特異的結合を検出する方法をも提供する。この技術によって、以前は未知であった本発明のレセプターポリペプチドの結合パートナーを同定するために特に有用な多くのアッセイが提供される。例えば、哺乳類または細菌の細胞、あるいはダイハイブリッドスクリーニングアッセイを用いる発現クローニングは、結合パートナーをコードするポリヌクレオチドの同定に用いることができる。別の例として、適切に固定化された本発明のポリペプチドを用いたアフィニティ・クロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドを認識し、結合するポリペプチドを単離するために用いることができる。本発明のポリペプチドの生物活性を調節する（すなわち、増大または減少する）化合物、特に低分子の同定に用いられる多くの異なったライブラリーがある。本発明のレセプターポリペプチド用リガンドはまた、外来性リガンドまたは、リガンドのカクテルを本発明のレセプターの発現以外は遺伝学的に同一の２種の細胞集団に加えることによって同定できる：１種の細胞集団は本発明のレセプターを発現するが、他の細胞集団は発現しない。次いで、リガンド（単数または複数）の付加に対する２種の細胞集団の応答を比較する。あるいは、発現ライブラリーは、細胞内で本発明のポリペプチドと同時発現させることができ、可能性のあるリガンド（単数または複数）を同定するための自己分泌応答をアッセイすることができる。さらに、別の例として、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ゲルオーバーレイアッセイ、または当該分野で公知の他の方法を用いて結合パートナーのポリペプチドを同定することができるが、これには、（１）有機および無機化学のライブラリー、（２）天然物ライブラリーおよび（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子から成るコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【０２２５】
下流の細胞内シグナル伝達分子の、本発明のポリペプチドのシグナル伝達カスケードにおける役割は決定できる。例えば、本発明のポリペプチドの細胞質内ドメインが、リガンドが同定されているタンパク質の細胞外部分に融合しているキメラタンパク質は、宿主細胞内で生成される。次に、この細胞をキメラタンパク質の細胞外部分に特異的なリガンドとともにインキュベートし、それによってキメラレセプターを活性化する。次いで、細胞内シグナル伝達に関与する公知の下流タンパク質を、予測される修飾、すなわち、リン酸化についてアッセイが可能になる。当該分野で公知の他の方法もまた、レセプター活性に関与するシグナル伝達分子の同定に使用できる。
【０２２６】
４．１０．１５  抗炎症活性
本発明の組成物はまた、抗炎症活性をも示す。抗炎症活性は、炎症応答に関与する細胞に刺激を与えるか、細胞間相互作用（例えば、細胞接着など）を阻害もしくは促進するか、炎症過程に関与する細胞の走化性を阻害もしくは促進するか、細胞の血管外遊走を阻害もしくは促進するか、または炎症応答をより直接的に阻害もしくは促進する他の因子の産出を刺激もしくは抑制することによって得ることができる。このような活性を有する組成物は、慢性または急性の条件を含む炎症性状態感染であって限定はしないが感染（例えば、敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））を含むもの、虚血性再灌流傷害、内毒素致死、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、またはＴＮＦもしくはＩＬ−１のようなサイトカインの過剰産出によるものを治療するために用いることができる。本発明の組成物はまた、抗原性物質または抗原性材料に対するアナフィラキシーまたは過敏症の治療にも有用であり得る。本発明の組成物は、限定はされないが敗血症、急性膵炎、エンドトキシンショック、サイトカイン誘導性ショック、関節リューマチ、慢性炎症性関節炎、１型糖尿病による膵臓細胞障害、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、肺疾患に合併する炎症、他の自己免疫疾患もしくは炎症性疾患のような状態を予防または治療するために、急性、慢性骨髄性白血病などのための抗増殖性剤として、または子宮内感染症の二次的な早産の予防において利用することができる。
【０２２７】
４．１０．１６  白血病
白血病および関連障害は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの機能を促進または阻害する治療剤を投与することによって治療または予防することができる場合がある。このような白血病および関連障害としては、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球（顆粒球）性白血病、および慢性リンパ性白血病（これらの疾患の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第２版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２８】
４．１０．１７  神経系障害
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの活性を調節する化合物による介入の効力を試験できる細胞タイプに関与し、従って治療的有用性の指標を観察しながら治療できる神経系障害としては、軸索の連絡切断、ニューロンの退縮もしくは変性、または脱髄のいずれかを生じる神経系障害および疾患または障害が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従って患者（ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む）において治療され得る神経系病変としては、以下の、中枢（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるがこれらに限定されない：
（ｉ）物理的傷害によって生じるかまたは手術に伴う病変、例えば、神経系の一部を切断する病変、または圧迫損傷を含む外傷性病変
（ｉｉ）脳梗塞もしくは脳虚血、または脊髄の梗塞もしくは虚血を含む、神経系の一部における酸素欠乏から生じる神経細胞損傷または死亡にいたる虚血性病変
（ｉｉｉ）感染の結果として、例えばヒト免疫不全症ウイルス、帯状疱疹、単純疱疹ウイルスによる感染がないかもしくはそれらにともなって、または、ライム病、結核、梅毒をともなって神経系の一部が、破壊されるか、または損傷を受ける感染性病変；
（ｉｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症に伴う変性が挙げられるがこれらに限定されない変性過程の結果として、神経系の一部が破壊または損傷されている変性病変
（ｖ）栄養障害または代謝障害によって神経系の一部が破壊または損傷されている、栄養上の疾患、または栄養障害に関連する病変であって、これにはビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウエルニッケ病、タバコ・アルコール性弱視、マルキャファーヴァ・ビニャミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール性小脳変性が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２９】
（ｖｉ）糖尿病（糖尿病性神経障害、顔面麻痺）、全身性エリトマトーデス、癌または肉腫症が挙げられるがこれらに限定されない、全身性疾患に関連する神経性病変。
【０２３０】
（ｖｉｉ）アルコール、鉛または特定の神経毒を含む毒性物質によって生じた病変；ならびに
（ｖｉｉｉ）脱髄疾患によって神経系の一部が破壊または損傷されている脱髄病変であって、多発性硬化症、ヒト免疫不全症ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症、または種々の病因論、進行性多病巣性白質脳障害、および中央脳橋ミエリン溶解が挙げられるがこれらに限定されない脱髄病変。
【０２３１】
本発明による有用な神経系障害の治療のための治療剤は、ニューロンの生存または分化の促進における生物活性を試験することによって選択できる。例えば、限定はしないが、次の作用のいずれかを誘発する治療剤は本発明によると有用であり得る。
【０２３２】
（ｉ）培養物におけるニューロンの生存時間の延長。
【０２３３】
（ｉｉ）培養物中またはインビボにおけるニューロンの出芽の増大。
【０２３４】
（ｉｉｉ）培養物中またはインビボにおける、神経細胞関連分子、例えば、運動ニューロンに関連するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼの産生の増大；あるいは
（ｉｖ）インビボでのニューロン機能不全の症状の軽減。
【０２３５】
このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によっても測定できる。好ましくは、実施形態に限らず、ニューロンの生存率の増大は、Ａｒａｋａｗａら、（１９９０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７〜３５１５）に示される方法によって測定可能であり；ニューロンの出芽の増大は、Ｐｅｓｔｒｏｎｋら、（１９８０，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２）またはＢｒｏｗｎら、（１９８１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２）に示される方法によって検出可能であり；ニューロン関連分子の産生の増大は、測定されるべき分子に依存して、バイオアッセイ、酵素学的アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって測定可能であり；そして運動ニューロン機能不全は、運動ニューロン障害、例えば、脱力感、運動ニューロン伝達速度または機能的能力障害などの物理的症状の評価によって測定可能である。
【０２３６】
特定の実施形態において、本発明によって治療できる運動ニューロン障害としては、梗塞、感染症、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、変性疾患または運動ニューロンおよび神経系の他の構成要素に影響し得る悪性腫瘍のような障害、ならびに筋萎縮性側索硬化症のようなニューロンに選択的に影響する障害が挙げられるがこれらに限定されず、これには、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、乳児性および若年性筋萎縮、幼児期の進行性球麻痺（ファチオ・ロンデ症候群）、灰白髄炎およびポリオ後症候群、および遺伝性運動感覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・トゥース病）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３７】
４．１０．１８  その他の活性
本発明のポリペプチドはまた、さらに、以下のようなさらなる活性または作用のうちの１つ以上を示し得る：限定はしないが細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫を含む感染性因子の増殖、感染もしくは機能を阻害することまたは殺傷すること；限定はしないが身長、体重、髪の色、眼の色、皮膚、体脂肪比率もしくは他の組織色素沈着、または臓器もしくは身体部分のサイズもしくは形状（例えば、乳房の増大または縮小、または骨の形態および形状における変化など）を含む身体的特徴に作用すること（抑制または亢進）；バイオリズムまたは日内の周期もしくはリズムに作用すること；男性または女性の被験者の受精能に作用すること；食餌脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子または他の栄養的因子または成分（単数または複数）の代謝、異化、同化、処理、利用、保存または排出に影響すること；限定はしないが食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、抑うつ（抑うつ障害を含む）および凶暴性を含む行動性特徴に作用すること；鎮痛効果または他の疼痛軽減作用を与えること；造血系以外の系における胚性幹細胞の分化および成長を促進すること；ホルモンまたは内分泌の活性；酵素の場合、酵素の欠乏症を修正し、欠乏関連性疾患を治療すること；過剰増殖障害（例えば、乾癬のような）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体を結合する能力など）；ならびにワクチン成分において抗原として作用して、このようなタンパク質、または、このようなタンパク質と交差反応する別の物質もしくは実体に対して免疫応答を促進する能力。
【０２３８】
４．１０．１９  多形性の定義
多形性を証明することによって、ヒトの被験者におけるこのような多形の同定が可能になり、この遺伝薬理学的情報を診断および治療に用いることができる。このような多形性は、例えば、種々の疾患状態（炎症または免疫応答に関与する疾患など）に対する示差的な素因もしくは感受性、または薬物投与に対する示差的な応答に関連し得、そしてこの遺伝情報を用いて、予防的または治療を適切に仕立てることができる。例えば、炎症または自己免疫疾患の素因に関連する多形が存在すれば、この多形の存在を同定することによって、ヒトにおけるこの状態を診断することができる。
【０２３９】
多形性は、当該分野で公知の様々の方法において同定することが可能であるが、この方法は全てが一般に、患者からサンプルを得る工程、このサンプル由来のＤＮＡを分析する工程、必要に応じて、このＤＮＡの単離または増幅を含む工程、およびこのＤＮＡにおける多形性の存在を同定する工程を包含する。例えば、ＰＣＲを用いて適切なゲノムＤＮＡのフラグメントを増幅し、次にそれを配列決定することができる。あるいは、このＤＮＡを対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（一塩基ミスマッチの検出が可能な条件下で適切なオリゴヌクレオチドがＤＮＡにハイブリダイズされる）に供するか、または単一ヌクレオチド伸長アッセイ（多形の位置のすぐ隣に直接ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが１つ以上の標識ヌクレオチドで伸長している）に供してもよい。さらに、伝統的な制限酵素フラグメント長多形分析（多形性の有無に依存するゲノムＤＮＡの示差的な消化をもたらす制限酵素を用いて）を行ってもよい。本発明のヌクレオチド配列のアレイは、多形性の検出に用いることができる。このアレイは本発明のヌクレオチド配列を検出するために本発明の修飾されたヌクレオチド配列を含んでもよい。代替的には、本発明のヌクレオチド配列のいずれか１つをこのアレイ上で置き換えて、これらの配列の変化を検出できる。
【０２４０】
あるいは、アミノ酸配列の変化を生じる多形性はまた、タンパク質のアミノ酸配列の対応する変化を検出することによって、例えば、変異配列に特異的な抗体によっても検出できる。
【０２４１】
４．１０．２０  関節炎および炎症
関節リューマチに対する本発明の組成物の免疫抑制効果は、実験用の動物モデルシステムで決定される。実験用モデルシステムは、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎である。そのプロトコールはＨｏｌｏｓｈｉｔｚら、１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：５６によって、または、Ｂ．Ｗａｋｓｍａｎら、１９６３，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１２９により記載されている。この疾患の誘導は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に含まれる殺傷した結核菌懸濁液の一般には皮内注射による一回投与により行うことができる。注射の経路は変化し得るが、ラットでは、アジュバントの混合液を尻尾の付け根に注射してもよい。ポリペプチドはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で約１〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。コントロールはＰＢＳだけの投与から構成する。
【０２４２】
試験化合物の効果を試験する手順は、ＣＦＡに含まれる殺傷された結核菌を皮内注射する工程と、その後すぐ試験化合物を投与し、引き続き２４日まで１日おきの投与から構成される。マイコバクテリアＣＦＡを注射後１４、１５、１８、２０、２２、そして２４日目に、上記Ｊ．Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚにより記載されているとおり関節炎の全体的スコアが得られる。データ分析の結果によって、試験化合物は関節の腫れに劇的な効果を及ぼすことが、関節炎スコアの低下を測定することにより判明する。
【０２４３】
４．１１  治療方法
本発明の組成物（ポリペプチドフラグメント、アナログ、改変体および抗体、または他の結合パートナーまたはアンチセンス・ポリヌクレオチドのようなモジュレータを含む）は種々の治療方法において多く適用される。治療適用の例としては本明細書に例示されるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【実施例】
【０２４４】
４．１１．１  実施例
本発明の１実施例は、本発明のペプチドを調節することによって調節できる疾患または障害に罹患している個体に対する、本発明のポリペプチドまたは他の組成物の有効量の投与である。投与形態は特に重要ではないが、非経口投与が好ましい。模範的な投与形態は静脈内ボーラスを送達することである。本発明のポリペプチドまたは他の組成物の投与量は、通常処方医により決定される。投与量は、患者の年令、体重、状態および応答によって変化すると予想される。代表的には、１用量あたりに投与されるポリペプチド量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、約０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量であることが好ましい。非経口投与については、本発明のポリペプチドは、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと組み合わせて注射可能な形態に処方される。このようなビヒクルは、当該分野で周知であり、この例としては水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、少量のヒトの血清アルブミンから成る溶液が挙げられる。ビヒクルは、ポリペプチドまたは他の活性成分の等張性および安定性を維持する少量の添加物を含んでもよい。このような溶液の調製は当該分野の範疇に属する。
【０２４５】
４．１２  医薬処方物および投与の経路
本発明のタンパク質または他の組成物（何に由来する供給源かにかかわらず、限定はしないが組み換え体および非組み換え体供給源を含み、本発明のポリペプチドの抗体および他の結合パートナーを含む）は、それ自体で、または種々の障害を治療または寛解させるのに必要な用量で、適切なキャリアまたは賦形剤（単数または複数）と混合した医薬組成物としてその必要な患者に投与されてもよい。このような組成物は必要に応じて、（タンパク質または他の活性成分およびキャリアに加えて）、希釈液、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該分野で周知の他の物質を含んでもよい。「薬学的に受容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」という用語は、活性成分（単数または複数）の生体活性の有効性を干渉しない非毒性の物質を意味する。キャリアの特徴は投与の経路に依存する。本発明の医薬組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ−１、ＴＮＦ−２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ等、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンを含んでもよい。さらなる組成物では、本発明のタンパク質は、該当の疾患または障害の治療に有利な他の因子と組み合わせてもよい。これらの因子としては、種々の増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）および本明細書に記載のサイトカインが挙げられる。
【０２４６】
医薬組成物はさらに、このタンパク質または他の活性成分の活性を増強するか、または治療における活性または使用を補完する他の因子を含んでもよい。このようなさらなる要素および／または因子が、本発明のタンパク質または他の活性成分との相乗効果を生じするかまたは副作用を最小化するために医薬組成物中に含まれてもよい。逆に凝固因子、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子、もしくは抗血栓因子、または抗炎症薬（例えば、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１Ｈｙ１、ＩＬ−１Ｈｙ２、抗ＴＮＦ、コルチコステロイド、免疫抑制剤）の副作用を最小限にする目的で、本発明のタンパク質または他の活性成分を特定の凝固因子、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓因子、または抗炎症薬の処方物の中に含んでもよい。本発明のタンパク質は、多量体（例えばヘテロダイマーまたはホモダイマー）で活性かも知れないし、あるいはそれ自身または他のタンパク質との複合体として活性かも知れない。結果として、本発明の医薬組成物は、多量体または複合体の形態などで本発明のタンパク質を含んでもよい。
【０２４７】
第１タンパク質を含む本発明の医薬組成物の中に含む代わりに、第２タンパク質または治療薬を第１タンパク質と一緒に投与することもできる（例えば同時に、または組み合わせる物質の治療濃度が治療部位で実現される条件では異なる時点で）。即時的な適用の化合物の処方および投与技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最終版にみることができる。さらに言えば、治療上有効な投与量とは、症状の回復、例えば、関連の医学的状況での治療、治癒、予防もしくは寛解、またはそのような状態の治療、治癒、予防または寛解率の増大をもたらすのに十分な化合物の量である。個々の活性成分が単独で投与される場合には、治療上有効な用量とは、その活性成分単独のことをいう。組み合わせて使用する場合は、治療上有効な用量とは、投与が併用であろうと連続であろうと同時であろうと、治療効果をもたらす活性成分の総合量を意味する。
【０２４８】
本発明の治療方法または使用方法の実践においては、本発明のタンパク質または他の活性成分の治療上有効な量を、治療されるべき状態を有している哺乳動物に投与する。本発明のタンパク質または他の活性成分は、本発明の方法に従って、単独で投与してもよいし、他の治療方法、例えばサイトカイン、リンホカイン、その他の造血因子を使った治療と組み合わせて投与してもよい。サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子のうち１つ以上と組み合わせて同時投与する場合は、本発明のタンパク質または他の活性成分は、サイトカイン（単数または複数）、リンホカイン（単数または複数）、その他の造血因子（単数または複数）、血栓溶解因子、または抗血栓因子と同時に投与しても、または連続的に投与してもよい。連続的に投与する場合は、本発明のタンパク質または他の活性成分をサイトカイン（単数または複数）、リンホカイン（単数または複数）、他の造血因子（単数または複数）、血栓溶解因子、または抗血栓因子と組み合わせて投与する適切な順序については、担当医が決定する。
【０２４９】
４．１２．１  投与経路
投与の適切な経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸内投与；筋肉内、皮下、髄内注射を含む非経口的送達、ならびにくも膜下、直接心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を挙げることができる。医薬組成物において用いる本発明のタンパク質もしくは他の活性成分の投与、または本発明の方法の実践は、種々の従来方法、例えば、経口摂取、吸入、局所適用または皮膚の適用、皮下、腹腔内、非経口注射または静脈内注射で行うことができる。患者への静脈内投与が好ましい。
【０２５０】
あるいは、全身ではなく局所に化合物を投与するのも可能である。例えば、関節炎を患っている関節または線維組織への化合物の直接注射を介し、その場合、多くはデポ剤か徐放性の処方物である。緑内障手術の合併症として生じがちな瘢痕化を防ぐため、化合物を局所的に、例えば目薬として投与することも可能である。さらに薬物を、薬物標的送達システムを用いて、例えば、関節炎または線維組織を標的として、特定の抗体で、例えばリポソームでコーティングして投与することもできる。リポソームは、罹患している組織を標的とし、選択的に吸収される。
【０２５１】
本発明のポリペプチドは、所望の作用部位に対して有効量を送達する任意の経路によって投与される。特定の適応についての投与の適切な経路および有効投与量の決定は、当該技術水準の範囲内である。好ましくは創傷治療については、治療化合物をその部位に直接投与する。本発明のポリペプチドの適切な投与量の範囲は、これらの投与量から、または適切な動物モデルでの同様の研究から推定できる。次いで、最大の治療効果を得るため、投与量は臨床医が必要に応じて調整すればよい。
【０２５２】
４．１２．２  組成物／処方物（製剤）
従って、本発明による使用のための医薬組成物は、活性な化合物を薬学的に利用できる調製物に成形することを助ける賦形剤および補助剤を含む、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いる従来の方法で処方できる。これらの医薬組成物は、それ自体公知の方法、例えば、混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、微粒子化、乳化、カプセル化、エントラッピングまたは凍結乾燥処理のような従来の方法で製造できる。適切な処方は選択される投与経路に依存する。本発明のタンパク質または活性成分の治療上有効な量を経口的に投与する場合、本発明のタンパク質または活性成分は、錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシル剤の形態である。錠剤の形態で投与する場合、本発明の医薬組成物は、さらにゼラチンまたは補助剤のような固形のキャリアを含んでもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、本発明のタンパク質または他の活性成分を約５％〜９５％、好ましくは、本発明のタンパク質または活性成分を約２５％〜９５％含む。液体の形態で投与する場合は、液体キャリア、例えば、水、石油、動物性もしくは植物性の油、例えばピーナッツオイル、鉱油、ダイズ油、もしくはゴマ油、または合成油を追加してもよい。液状の医薬組成物は、さらに生理塩水、ブドウ糖または他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコール類を含んでもよい。液状で投与する場合は、この医薬組成物は、本発明のタンパク質または他の活性成分を約０．５〜９０重量％、好ましくは本発明のタンパク質または他の活性成分を約１〜５０重量％含む。
【０２５３】
本発明のタンパク質または他の活性成分の治療上有効な量を静脈、皮膚、または皮下注射により投与する場合は、本発明のタンパク質または他の活性成分は、発熱物質を含まず、非経口的に容認可能な水溶液の形態である。このような非経口的に受容可能なタンパク質または他の活性成分の溶液をｐＨ、等浸透圧性、安定性などに配慮して調製することは、当該分野の範疇に属する。静脈内注射、皮膚注射、または皮下注射のために好ましい医薬組成物は、本発明のタンパク質または他の活性成分に加えて、等浸透圧性のビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射、ブドウ糖注射、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液、または当該分野で公知の他のビヒクルも含むべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加物を含んでもよい。注射の場合、本発明の物質は水溶液で、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス液、リンゲル液または生理塩水に処方されてもよい。経粘膜投与については、浸透すべき障壁に適切な浸透剤がこの処方物に用いられる。このような浸透剤は、当該分野で一般に公知である。
【０２５４】
経口投与については、化合物は、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとこの活性化合物とを組み合わせることにより、容易に処方化できる。このようなキャリアによって、本発明の化合物を、治療されるべき患者による経口摂取のための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに処方化することが可能になる。経口使用のための医薬調製物は、必要に応じて、錠剤または糖衣錠の核を得るために、適切な補助剤を添加した後に、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、固体の賦形剤から得ることができる。適切な賦形剤は、詳細には、増量剤、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて、橋架したポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を加えてもよい。糖衣錠の核には適切なコーティングが提供される。この目的のために、濃縮糖液を用いてもよいが、その中にはアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を必要に応じて含んでももよい。活性化合物の用量の種々の組み合わせを同定するため、または特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を加えてもよい。
【０２５５】
経口的に用いることができる薬学的な調製物としては、ゼラチン製のプッシュ・フィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリコールまたはソルビトールのような可塑剤製の軟性の密閉カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、活性成分をラクトースのような増量剤、澱粉のような結合剤、および／または滑石もしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および必要に応じて安定剤と混合して含んでもよい。軟性のカプセルの場合は、活性な化合物を、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解するか懸濁させるかしてもよい。さらに安定剤を加えてもよい。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投与量でなければならない。口腔内投与については、この組成物は、従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【０２５６】
吸入投与の場合は、本発明による使用のための化合物は加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルフプレー調製物の形態で、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他適切なガスを用いて都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量の単位は、一定量を送るバルブを設けることにより決定できる。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）に用いるためのゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、ラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤と化合物との粉末混合物を含むように処方してもよい。この化合物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による注射による非経口投与のために処方されてもよい。注射用処方物は、例えば、アンプルまたは多用量容器中に、防腐剤を添加した、単位投与量形態であってもよい。この組成物は、油状または水性のビヒクル中の懸濁剤、溶液、またはエマルジョンのような形態をとってもよいし、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。
【０２５７】
非経口投与用の医薬処方物としては、活性化合物を水溶性の形で含む水溶液が挙げられる。さらに活性化合物の懸濁液を、適切な油状の注射用の懸濁液として準備してもよい。適切な脂質親和性の溶媒またはビヒクルとしては、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。液状注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。必要に応じて、懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製を可能にする、化合物の溶解度を増大する適切な安定剤または因子を含んでもよい。あるいは、活性成分を粉末状にしておき、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水と使用前に組み合わせてもよい。
【０２５８】
この化合物はまた、通常の座薬基剤、例えばココアバターまたは他のグリセリドを例えば含む坐剤または貯留浣腸のような直腸用の組成物に処方することも可能である。上述の製剤法の他に、デポ調製物として化合物を処方してもよい。このような長時間作用性の処方物は、インプラント（例えば皮下にまたは筋肉内に）または筋肉内注射により投与できる。従って、例えば、適切なポリマー物質または疎水性の物質（例えば受容可能な油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂、またはわずかに溶解性の誘導体として、例えば、わずかに可溶性の塩として化合物を処方できる。
【０２５９】
本発明の疎水性化合物用の医薬用キャリアは、ベンジルアルコール、非極性の界面活性剤、水混和性の有機ポリマー、および水相を含む補助溶剤システムである。補助溶剤システムはＶＤＰ補助溶剤システムであってもよい。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの無極性表面活性剤ポリソルベート８０、そして６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の溶液であって、無水エタノール中で作成したものである。ＶＰＤ補助溶剤システム（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％のブドウ糖水溶液で１：１に希釈したＶＰＤから成る。この補助溶剤システムには疎水性の化合物を十分に溶解させ、これ自体は全身投与の場合に生じる毒性が少ない。当然、補助溶剤システムの割合は、その溶解性および毒性の特徴を壊すことなくかなり変化することができる。さらに補助溶剤の構成成分の同一性は変化してもよい：例えば、他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いてもよい；ポリエチレングリコールのフラクション・サイズは変化してもよい；他の生物適合性のポリマーを、ポリエチレングリコール、例えばポリビニルピロリドンと置き換えてもよい；そしてブドウ糖の代わりに他の糖類またはポリサッカリドを置き換えてもよい。あるいは、疎水性の医薬用化合物のための他の送達システムを使用してもよい。疎水性の薬物のための送達ビヒクルまたはキャリアの周知の例はリポソームおよびエマルジョンである。ジメチルスルフォキシドのような特定の有機溶媒も使用可能であるが、通常は毒性のコストが大きい。さらに、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透過性基質のような徐放性システムを用いて化合物を送達してもよい。種々のタイプの徐放性物質が確立されており、当業者には周知である。徐放性カプセルは、その化学的性質次第であるが、化合物を２〜３週間から１００日にわたって放出する。治療用試薬の化学的性質および生体の安定性次第であるが、タンパク質または他の活性成分の安定のためにさらなるストラテジーを使用してもよい。
【０２６０】
医薬組成物はまた、適切な固体またはゲル状の相のキャリアまたは賦形剤を含んでもよい。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の活性成分の多くは、薬学的に適合する対イオンを有する塩として提供されてもよい。このような薬学的に受容可能な塩基付加塩は、生物学的な有効性および遊離酸の性質を保持する塩であり、これは水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなどのような無機または有機の塩基との反応により得られる。
【０２６１】
本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質（単数または複数）または他の活性成分（単数または複数）とタンパク質またはペプチド抗原との複合体の形態であってもよい。タンパク質および／またはペプチド抗原は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方に刺激シグナルを伝える。Ｂリンパ球は、その表面にある免疫グロブリンレセプターを通して抗原に対して応答する。Ｔリンパ球は、ＭＨＣタンパク質による抗原の提示後、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して抗原に応答する。ＭＨＣおよび構造的に関連のあるタンパク質（宿主細胞上のクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子によりコードされているものを含む）は、ペプチド抗原（単数または複数）をＴリンパ球に提示する働きをする。抗原成分はまた、精製されたＭＨＣペプチド複合体単独で、またはＴ細胞に直接シグナルを伝えることができる同時刺激分子とともに供給され得る。あるいは、表面免疫グロブリンおよびＢ細胞上の他の分子に結合可能な抗体、ならびにＴＣＲおよびＴ細胞上の他の分子に結合可能な抗体を、本発明の医薬組成物と組み合わせてもよい。
【０２６２】
本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であってもよいが、ここで本発明のタンパク質を、薬学的に受容可能な他のキャリアに加えて、脂質のような両親媒性の物質と組み合わせてもよく、この脂質はミセル、不溶性の単層、液晶または水溶液中の層状相として凝集した形態で存在している。リポソーム処方に適切な脂質としては限定しないが、モノグリセリド、ジグリセリド、サルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、全てが参考として本明細書に援用される米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および４，７３７，３２３号に開示されているとおり、当該分野の技術水準内である。
【０２６３】
本発明の医薬組成物における本発明のタンパク質または他の活性成分の量は、治療されている症状の性質およびその重篤度に、そして患者が受けた事前治療の性質に依存する。最終的には、各々の個々の患者の治療にあたって、担当医が本発明のタンパク質または他の活性成分の量を決定する。担当医は最初、本発明のタンパク質または他の活性成分を少量投与し、患者での反応を観察する。患者にとって治療上最高の効果が得られるまで、本発明のタンパク質または他の活性成分の用量を増やして投与していき、その時点ではもはや投与量を増やすことはしない。本発明の方法を実践するのに使われる種々の医薬組成物は、本発明のタンパク質または他の活性成分を体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは０．１μｇから約１ｍｇ）含むべきであると考えられる。骨、軟骨、腱、または靭帯の再生に有用である本発明の組成物については、治療方法は、局部的、全身的、またはインプラントもしくはデバイスとして局所的にこの組成物を投与する工程を包含する。投与にあたり、本発明における使用のための治療用組成物は当然ながら、発熱物資を含まない生理学的に受容可能な形態である。さらに、この組成物は望ましくは、骨、軟骨、または組織の損傷の部位に送達するために粘稠性の形態でカプセル化されても、または注射されてもよい。創傷の治癒および組織の修復には局部投与が適切である場合がある。本発明のタンパク質または他の活性成分以外の治療に有用な物質（これも必要に応じて上記組成物の中に含んでもよい）を本発明の方法における組成物の代わりに、またはその追加として、同時または連続的に投与してもよい。好ましくは、骨および／または軟骨の形成については、タンパク質を含むかまたは他の活性成分を含む組成物を骨および／または軟骨の損傷部位に送ることが可能であり、骨および軟骨の発達のための構造備えることが可能であり、かつ好ましくは体に再吸収され得る基質をこの組成物は含む。このような基質は、他の移植に医学的適用で現在使われている材料で形成されてもよい。
【０２６４】
基質材料の選択は生体適合性、生物分解性、機械的性質、外見および相互作用的特性に基づいている。この組成物の特定の適用によって適切な処方が決まる。この組成物の基質になる可能性のあるのは、生物分解性でありかつ化学的に明確な合成硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ無水物であり得る。この他に可能性のある物質は、生物分解性がありかつ生物学的に明確な例えば骨または皮膚のコラーゲンなどである。他の基質は純粋のタンパク質または細胞外基質成分から構成されている。他に可能性のある基質は、生物分解性がなく、かつ化学的に明確な、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、またはその他のセラミックである。基質は任意の上述のタイプの物質の組み合わせ、例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムから構成されてもよい。バイオセラミックは組成を、例えばカルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩で変更して処理して孔の大きさ、粒子の大きさ、粒子の形状および生物分解性を変えることも可能である。現在好ましいものは、直径１５０〜８００ミクロンを有する多孔性粒子の形態である乳酸とグリコール酸の５０：５０（分子量）のコポリマーである。いくつかの適用では、タンパク質組成物が基質から解離することを防ぐのに、金属イオン封鎖剤、例えば、カルボキシルメチルセルロースまたは自家凝血を利用することが有用である。
【０２６５】
金属イオン封鎖剤の好ましいファミリーは、アルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースも含む）のようなセルロース材料であり、これには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられ、最も好ましいものがカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレン酸化物、カルボキシビニルポリマー、およびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本明細書において有用な金属イオン封鎖剤の量は、全処方物の重量あたり０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、これはタンパク質のポリマー基質からの脱離を防ぐこと、および組成物の適切な取り扱いのために必要な量であって、ただし始原細胞が基質に侵入することを妨げる程の量ではなく、これによってタンパク質が始原細胞の骨形成活動を助ける量にあたる。さらなる組成物では、本発明のタンパク質または他の活性成分を、骨および／または軟骨の欠損、創傷、または問題のある組織の治療に有益な他の物質と組み合わせてもよい。このような物質としては、種々の成長因子、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）が挙げられる。
【０２６６】
治療用組成物はまた、獣医学的な適用についても現在有益である。本発明のタンパク質または他の活性成分を用いたこのような治療は、ヒト以外にも、特に家畜およびサラブレッドのウマが所望される患者である。組織再生に用いられるタンパク質を含む医薬組成物の投与レジメンは、このタンパク質の作用を改変する種々の要因、例えば、形成すべき所望の組織重量、損傷部分、損傷を受けた組織の状態、創傷の大きさ、損傷を受けた組織の種類（例えば骨）、患者の年令、性別および食事、感染の重篤度、投与時間、および他の臨床的要因を考慮して担当医によって決定される。投与量は再生に使われる基質の種類によって、そして医薬組成物の中に含まれる他のタンパク質によっても変化してもよい。例えば、最終組成物にＩＧＦ  Ｉ（インシュリン様成長因子Ｉ）のような他の公知の成長因子を加える場合も、投与量に影響が及ぶ場合がある。組織／骨の成長および／または修復を例えばＸ線、組織形態計測決定法、およびテトラサイクリン標識法での定期的な評価により、進行をモニタリングすることができる。
【０２６７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子療法に用いることもできる。このようなポリヌクレオチドは、哺乳類被験体における発現のために、インビボまたはエキソビボのいずれかで細胞に導入できる。本発明のポリヌクレオチドはまた、核酸を細胞または生物体（限定はしないが、ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形態を含む）に導入する他の公知の方法によって投与されてもよい。細胞は、増殖させるためまたはこのような細胞に対する所望の効果または活性を得るために、本発明のタンパク質の存在においてエキソビボで培養することも可能である。次いで、治療された細胞を、治療目的のためインビボに導入することができる。
【０２６８】
４．１２．３  有効投与量
本発明の使用に適切な医薬組成物は、活性成分を目的達成のために有効な量で含む組成物を含む。より詳細には、治療上有効量とは、治療されている被験体の現在の症状の進行を防止するかまたは緩和するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、本明細書に示される詳細な開示に特に照らせば、当業者の能力の十分に範囲内である。本発明の方法に用いられる任意の化合物について、治療上有効な用量は、まず適切なインビトロアッセイから推定できる。例えば動物モデルを用いて、ある用量を処方して、循環濃度の範囲を決め、これを用いてヒトで有用な用量をより正確に決定する。例えば動物モデルを用いてある用量を処方して、循環濃度の範囲を決めるが、この中に細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわちタンパク質の生体活性の最大半分阻害を得る試験化合物の濃度）が含まれる。このような情報を用いて、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２６９】
治療上有効な用量とは、症状の回復または患者の生存期間の延長を実現する化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療上の有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死ぬ用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有用な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性と治療上の効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比で表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。この細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを用いて、ヒトでの使用の投与量の範囲を処方することができる。このような化合物の投与量は、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内におさまり、毒性が全くあるいはほとんどないのが好ましい。投与量は使用される投与形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化してもよい。正確な処方、投与経路、および用量は、患者の状態を見ながら、個々の医師によって選択することができる。例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」の第１章第１頁を参照のこと。投与の量および間隔は、活性部分の血漿レベルが所望の効果を維持するかまたは最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持にするのに十分であるように個々に調節することができる。ＭＥＣは各々の化合物について異なるが、インビトロデータに基づいて推測可能である。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は個人の特徴および投与経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて血漿濃度を決定することができる。
【０２７０】
投与の間隔もＭＥＣの値を用いて決定できる。化合物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％において、血漿値をＭＥＣより高く維持するレジメンを用いて投与されるべきである。局所投与または選択的取り込みの場合は、この薬物の有効局所濃度は血漿濃度とは関係ない場合がある。
【０２７１】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物の例示的な投与量のレジメンは、大人と子供では異なり、毎日体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲になり、好ましい用量は、毎日患者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与は１日１回であってもよく、または等用量であればその送達の間隔を短くしても長くしてもよい。
【０２７２】
当然ながら、組成物の量は、治療される被験体、被験体の年齢および体重、症状の重篤度、投与方法、ならびに処方医の診断に依存する。
【０２７３】
４．１２．４  包装（パッキング）
組成物は、所望の場合には、その中に活性成分を含有する１単位以上の投与形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置で投与することも可能である。パックは例えば金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための構築物によって達成され得る。本発明の化合物を含む組成物を、薬学的に適合性のあるキャリア中に処方し、これを調製して、適切な容器に入れ、適応条件の治療について表示してもよい。
【０２７４】
４．１３  抗体
また本発明の中には、本発明のタンパク質、またはタンパク質のフラグメントに対する抗体も含まれている。本文書で使われている「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のうち免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を有している分子を指す。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般的にヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかのクラスに関係しているが、これらの分子は、この分子に存在する重鎖の性質により互いに異なっている。あるクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのようなサブクラスを有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であってもよい。本明細書において抗体と言う場合は、このようなクラス、サブクラス、そしてヒトの抗体種のタイプの全てについてを包含する。
【０２７５】
本発明のタンパク質に関連する単離されたタンパク質を、抗原として、またはその一部もしくはフラグメントとして用いることも考えられ、そしてそれをさらに免疫原として用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技術を用いて、免疫特異的に抗原に結合する抗体を生成することもできる。全長タンパク質を用いることもできるし、あるいは、本発明は免疫原として使われる抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列配、例えば、列番号６８５〜１３６８もしくは１９６７〜２５６４または表３Ａ、３Ｂ、５、７もしくは８に示されているアミノ酸配列のうち少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、そしてそのエピトープを取り囲んでおり、その結果、このペプチドに対して惹起される抗体は、全長タンパク質と、またはエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性のペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、または少なくとも１５のアミノ酸残基、または少なくとも２０のアミノ酸残基、または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。抗原性のペプチドによって囲まれている好ましいエピトープは、その表面に位置しているのタンパク質の領域であり；これは通常親水性領域である。
【０２７６】
本発明の特定の実施形態では、抗原性のペプチドにより囲まれているエピトープの少なくとも１つは、タンパク質の表面領域、例えば親水性領域である。ヒトの関連タンパク質配列の疎水性分析によって、関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って抗体生産を標的するために有用な表面残基をコードする可能性が高いかが示される。抗体生産を標的するための方法として、親水性および疎水性の領域を示す疎水性親水性指標プロットは、当該分野で周知の任意の方法によって作成可能であり、これには例えば、Ｋｙｔｅ  ＤｏｏｌｉｔｔｅｌまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓの方法（フーリエ変換を用いる場合も使わない場合も）が挙げられる。例えば、その各々の全体が参考として本明細書に援用されるＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４〜３８２８；Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１４２を参照のこと。抗原タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログの中の１つ以上のドメインに特異的な抗体も、本明細書において提供される。
【０２７７】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオーソログは、これらタンパク質構成成分へ免疫特異的に結合する抗体の産生において、免疫抗原として利用することができる。
【０２７８】
「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ）」という用語は、本発明の抗体の可変領域が本発明のポリペプチドを排他的に認識して結合する（すなわち、ポリペプチドのファミリーにおいて見られる配列同一性、相同性、類似性にもかかわらず、他の類似のポリペプチドから本発明のポリペプチドを識別することができる）がまた、抗体の可変領域の外の配列、詳細には分子の定常領域における配列との相互作用によって他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術におけるＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡまたは他の抗体）とも相互作用し得るということを示す。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは当該分野において周知であり、慣用的に実施されている。このようなアッセイの総合的考察については、Ｈａｒｌｏｗら、（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），第６章を参照のこと。前述のように、抗体がまず第一に本発明の全長のポリペプチドに特異的である条件では、本発明のポリペプチドのフラグメントを認識し、結合する抗体も考えられる。本発明の全長ポリペプチドに特異的な抗体と同様に、フラグメントを認識する本発明の抗体は、タンパク質のファミリーにおいて見られる固有の配列同一性、相同性、類似性にもかかわらず、同じファミリーのポリペプチドからポリペプチドを識別できる抗体である。
【０２７９】
本発明の抗体は、例えば、治療目的（本発明のポリペプチドの活性を調節することによって）、本発明のポリペプチドの検出または定量するための診断目的、および本発明のポリペプチドの精製に有用である。本明細書に記載される任意の目的のために本発明の抗体を備えるキットもまた包含される。一般に、本発明のキットはまた、抗体が免疫特異的であるコントロール抗原も含む。さらに、本発明は本発明による抗体を産生するハイブリドーマを提供する。本発明の抗体は本発明のポリペプチドの検出および／または精製に有用である。
【０２８０】
本発明のタンパク質に結合するモノクローナル抗体は、タンパク質の免疫検出のための有用な診断薬であり得る。タンパク質に結合する中和モノクローナル抗体はまた、タンパク質関連症状にも、またタンパク質の異常発現が関与するいくつかの形態の癌の治療にも有用な治療薬であり得る。癌細胞または白血病細胞の場合には、タンパク質に対する中和モノクローナル抗体は、タンパク質によって媒介され得る癌細胞の転移的な伝播を検出および防止するのに有用であり得る。
【０２８１】
本発明の標識された抗体は、目的のポリペプチドのフラグメントが発現される細胞または組織を同定するためのインビトロ、インビボおよびインサイチュのアッセイに使用できる。この抗体はまた、治療または他の診断に直接用いることもできる。さらに、本発明は固体支持体上に固定された上記の抗体を提供する。このような固体支持体の例としては、プラスチック、例えば、ポリカーボネート、複合糖質、例えば、アガロースおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、アクリル樹脂および例えば、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが挙げられる。このような固体支持体への抗体の結合技術は、当業者に周知である（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．ら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，第１０章（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定された抗体はインビトロ、インビボ、インサイチュのアッセイのために、ならびに本発明のタンパク質の免疫アフィニティー精製にも用いることができる。
【０２８２】
本発明のタンパク質、またはそのアゴニスト誘導体、フラグメント、アナログホモログもしくはオーソログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産には、当該分野で公知の種々の手順を用いることができる（例えば、本文書に参考として援用される、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＬａｎｅ  Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。）これらの抗体のいくつかを以下に考察している。
【０２８３】
４．１３．１  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産のために、天然のタンパク質、その合成改変体、またはそれらの誘導体とともに１回以上注射することにより、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を、免疫してもよい。適切な免疫原の調製は、例えば、天然に発生する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成されたポリペプチド、または組み換え発現された免疫原タンパク質を含むことができる。さらに、このタンパク質を、免疫されている哺乳動物において免疫原性であることが公知の第二のタンパク質に対して結合体化してもよい。このような免疫原性タンパク質の例としては限定はしないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、および大豆のトリプシンインヒビターが挙げられる。この調製物はさらにアジュバントを含んでもよい。免疫学的応答を高めるために用いられる種々のアジュバントとしては、限定はしないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、ミネラル・ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトで有用なアジュバント、例えばカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍまたは類似の免疫刺激物質が挙げられる。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロース・ジコリノミコール酸）が挙げられる。
【０２８４】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば血液から）単離し、そしてさらにプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような周知の技術で精製することが可能であり、これによって主に免疫血清のＩｇＧ画分を得る。その後、または代替的には、探究された免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープをカラム上で固定し、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製することも可能である。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎによって考察される（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ，第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）２５〜２８頁）。
【０２８５】
４．１３．２  モノクローナル抗体
本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物から成る１分子種の抗体分子のみを含む抗体分子の集団を指している。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全分子において同一である。従ってＭＡｂは、ある抗原に固有の結合親和性によって特徴付けられる、その抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
【０２８６】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製できる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を代表的には免疫剤で免疫して、その免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を惹起させる。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。
【０２８７】
免疫剤としては代表的には、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞が所望される場合には末梢血リンパ球が用いられ、またはヒト以外の哺乳動物供給源が所望される場合には脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が用いられる。次いでリンパ球をポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて不死化した細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９〜１０３頁）。不死化した細胞株は通常、形質転換した哺乳動物の細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト由来のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地で培養することができるが、この培地は好ましくは、融合しなかった不死化細胞の成長や生存を阻害する物質を１つ以上含む。例えば、親細胞に酵素であるヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠けている場合は、ハイブリドーマ用の培養培地は代表的には、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地（ＨＡＴ  ｍｅｄｉｕｍ）」）を含む。
【０２８８】
好ましい不死化細胞株とは、効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体発現を安定した高いレベルで支持し、ＨＡＴ培地などの培地に敏感な株である。さらに好ましい不死化細胞株は、マウスのミエローマ細胞株であり、これは例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手できる。ヒトのミエローマおよびマウス−ヒトのへテロミエローマ細胞株も、ヒトのモノクローナル抗体生産に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）５１〜６３頁）。
【０２８９】
次いで、ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地を抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降反応により、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定する。このような技術およびアッセイは当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）により決定できる。好ましくは、標的抗原に高い程度の特異性をおよび高い結合親和性を有する抗体を単離する。
【０２９０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングして、標準的な方法によってそれを増殖させてもよい。この目的に適切な培養培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物で腹水としてインビボで増殖させてもよい。
【０２９１】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
【０２９２】
モノクローナル抗体は、米国特許番号４，８１６，５６７に記されているような組み換えＤＮＡ法によっても作成できる。本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離して配列決定することができる（例えば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されれば、このＤＮＡを発現ベクターに載せて、次いでこれを、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞のような、普通は免疫グロブリンタンパク質を生産しない宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞の中でモノクローナル抗体を合成する。このＤＮＡは例えば、相同なマウスの配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２〜１２（１９９４））により、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部を共有結合させることによって改変することも可能である。このような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常ドメインの代わりに、または本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、キメラ二価抗体を作成することも可能である。
【０２９３】
４．１３．３  ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、ヒト化抗体またはヒトの抗体をさらに含んでもよい。これらの抗体は、免疫グロブリンを投与してもヒトに免疫反応を起こさせることがなく、ヒトへの投与に適している。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗原結合配列）であり、これらは主にヒトの免疫グロブリンの配列で構成され、そしてヒト以外の免疫グロブリンから得られた配列を最小限含んでいる。抗体のヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅsら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従い、げっ歯類のＣＤＲ配列の代わりにヒトの抗体の相当する配列を用いることにより行うことができる。（米国特許第５，２２５，５３９号も参照のこと）。ある場合には、ヒトの免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、それに対応するヒト以外の残基で置き換える。ヒト化された抗体はまた、レシピエントの抗体にも、移入されたＣＤＲにも、フレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般的に、ヒト化された抗体は、実質的に少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの全てを含み、ここではＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト以外の免疫グロブリンに対応しており、そしてフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒトの免疫グロブリンのコンセンサス配列のそれである。ヒト化された抗体は、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、代表的にはヒトの免疫グロブリンのそれを含む（Ｊｏｎｅｓら  １９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｇｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２））。
【０２９４】
４．１３．４  ヒトの抗体
完全ヒト化抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の実質的に全体の配列がヒト遺伝子起源である抗体分子に関係している。このような抗体は、本明細書では「ヒトの抗体（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」または「完全ヒト化抗体（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」と呼ばれる。ヒトのモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトのＢ細胞のハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術によって調製してヒトのモノクローナル抗体を産生する（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁を参照のこと）。ヒトのモノクローナル抗体は、本発明の実施に際して利用可能であり、そしてヒトのハイブリドーマ細胞を用いることにより（Ｃｏｔｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０を参照のこと）、またはヒトのＢ細胞をインビトロでエプスタイン・バー・ウイルスにより形質転換させることにより（Ｃｏｌｅら，１９８５  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁を参照のこと）産生することができる。
【０２９５】
さらに、ヒトの抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））を含むさらなる技術を用いても生産できる。同様に、ヒトの抗体は、ヒトの免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性の免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活性化しているマウスに導入することによっても作成できる。チャレンジの際、ヒトの抗体産生を観察したが、これは遺伝子の再配列、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含むあらゆる面で、ヒトの体内でみられるものと酷似している。これは例えば以下に記載されている：米国特許第５，５４５，８０７；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９〜７８３（９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６〜８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５〜５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３,  ６５〜９３（１９９５））。
【０２９６】
ヒトの抗体はさらに、抗原によるチャレンジに応答してその動物の内因性抗体でなく完全ヒト化抗体を生産するように改変されたトランスジェニックの非ヒト動物を用いて生産することも可能である（ＰＣＴ出版ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主において免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする内因性遺伝子を不能化しており、重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードした活性な遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入している。ヒトの遺伝子は、例えば、ヒトＤＮＡセグメントの必要な部分を含む酵母の人工染色体を用いて導入する。次いで、改変部分を完全には含まない中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより、所望の改変部分を全て提供する動物を子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に記載されるようなＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全ヒト化免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えばポリクローナル抗体の準備として、目的の免疫原を用いた免疫後に、この動物から直接得てもよいし、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることも可能である。さらに、ヒトの可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収して、発現させて、直接抗体を得てもよいし、あるいはさらに改変して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体のアナログを得ることもできる。
【０２９７】
内因性の免疫グロブリン重鎖の発現が欠如しているヒト以外の宿主、例えばマウスを産生する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。それは、胚性幹細胞の中にある少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させる工程であって、この遺伝子座の再配列を防ぎ、再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防ぐ工程であり、この欠失は、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターにより行われる工程と；選択マーカーをコードする遺伝子を体細胞および生殖細胞に含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産する工程とを包含する方法によって得ることが可能である。
【０２９８】
ヒトの抗体のような目的の抗体を産生する方法は、米国特許第５．９１６，７７１号に開示されている。それは、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程と、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程と、その２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成する工程とを包含する。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０２９９】
この手順でのさらなる改良法では、免疫原の臨床的に関連のあるエピトープを同定する方法、およびその関連エピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する関連する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０３００】
４．１３．５  ＦＡＢフラグメントおよび単鎖抗体
本発明による技術は、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適応可能である（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログに対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にするようにＦａｂ発現ライブラリーの構築に方法を適応させることも可能である（例えばＨｕｓｅら，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）。あるタンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野では公知の技術によって生産可能であるがこの抗体フラグメントとしては、限定はしないが以下が挙げられる：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより産生されるＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０３０１】
４．１３．６  二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。本発明の場合は、結合特異性の１つは、本発明の抗原タンパク質である。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、有利には、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットである。
【０３０２】
二重特異性抗体の作成方法は、当該分野では公知である。伝統的には、二重特異性抗体の組み換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づいており、この場合この２つの重鎖は、異なる特異性を有している（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖はランダムに組み合わされるので、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、その中で１つだけが、正しい二特異性の構造を有する。その正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行う。同じような手順が、１９９３年５月１３日公開、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９に記載されている。
【０３０３】
所望される結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体の可変ドメインは、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合されてもよい。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合が好ましい。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、そして所望の場合は免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物体に同時トランスフェクションする。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０３０４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されている別のアプローチによれば、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするように、一対の抗体分子の間のインターフェースを操作することも可能である。好ましいインターフェースは、抗体の定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。この方法では、最初の抗体分子のインターフェース由来の１つ以上の低分子アミノ酸側鎖を、それより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きいアミノ酸側鎖をそれより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより、大きい側鎖（単数または複数）に対して同じまたは類似の大きさの、代償となる「腔（ｃａｖｉｔｙ）」を、第２の抗体分子の接合部分上に作る。これによって、ホモダイマーのような望ましくない最終産生物以上にヘテロダイマーの産生を増大するための機構が提供される。
【０３０５】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体のフラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順について記載している。これらのフラグメントは、ジチオール複合剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接するジチオールが安定化されて、分子間ジスルフィド結合の形成が阻害される。次いで、生成されたＦａｂ’のフラグメントは、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンで還元してＦａｂ’−チオールに再び変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化剤として用いることができる。
【０３０６】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収して、化学的に結合させて二重特異性抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載している。各々のＦａｂ’フラグメントはＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、インビトロで直接的な化学結合に供されて、二重特異性抗体が形成される。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合可能であり、それと同時に、ヒトの乳癌標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発する。
【０３０７】
組み換え細胞培養物から直接二重特異性抗体のフラグメントを作成して単離する種々の技術がまた記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体へテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４〜６４４８（１９９３）に記されている「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異性抗体のフラグメントを作るための代替機構を提供している。このフラグメントは、短過ぎるため、同じ鎖上の２つのドメイン間で対になることはない、リンカーにより互いに結合された重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインを、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対にさせて、これによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメントを作成するための別のストラテジーも報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０３０８】
３価以上の抗体も考えられる。例えば、三重特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体も調製できる。Ｔｕｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：５０（９９１）。
【０３０９】
代表的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープと結合できるが、そのうちの少なくとも１つは本発明のタンパク質抗原に由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性のアームを、白血球上の誘発分子、例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）、またはＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと連結させて、これによって、細胞の防御機構を、特定の抗原を発現する細胞に集中させることも可能である。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に細胞毒性物質を向けるために用いることが可能である。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞毒性物質または放射性核種キレート剤、例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＡＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡと結合するアームを保有している。目的の別の二重特異性抗体は、本明細書で記載されているタンパク質抗原に結合し、さらに組織因子（ＴＦ）にも結合する。
【０３１０】
４．１３．７  ヘテロ結合抗体
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合をした抗体で構成されている。このような抗体は、例えば、免疫系細胞で望ましくない細胞を攻撃するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染の治療（ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）について提案されている。この抗体は、合成タンパク質化学で公知の方法（架橋剤に関与するものを含む）を用いて、インビトロで調製できると考えられている。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することにより構築できる。この目的に適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、および例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示される試薬が挙げられる。
【０３１１】
４．１３．８  エフェクター機能工学
本発明の抗体をエフェクター機能に関して改変し、これによって例えば、ガンの治療における抗体の有効性を増強することが所望され得る。例えば、例えば、システイン残基（単数または複数）をＦｃ領域に導入し、これによってこの領域において鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このように生成されたホモダイマーの抗体は、インターナリゼーション能力を向上させるか、および／または補体媒介性の細胞殺傷および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増大させることができる。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１１９１〜１１９５（１９９２）；およびＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８〜２９２２（１９９２）を参照のこと。抗腫瘍活性を増強されたホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０〜２５６５（１９９３）に記載されているように、ヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製することも可能である。あるいは、二重のＦｃ領域を有する抗体を操作して、これによって補体溶解およびＡＤＣＣ能力を向上することも可能である。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９〜２３０（１９８０）を参照のこと。
【０３１２】
４．１３．９  免疫複合体
本発明はまた、細胞毒性物質、例えば、化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素学的に活発な毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）に結合された抗体を含む免疫複合体とも関係している。
【０３１３】
このような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は、上記されている。用いることが可能である酵素学的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。放射性結合抗体の生成には、種々の放射性核種が利用可能である。例えば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０３１４】
抗体と細胞毒性物質との結合は、種々の二機能性タンパク質結合剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの二作用性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベリン酸塩）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（Ｐ−アジドベンゾイル）へキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（Ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアン酸塩（例えば、トリエン２，６−ジイソシアン酸塩）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて行われる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製可能である。炭素１４標識の１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン・トリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性核種の結合用の代表的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０３１５】
別の実施形態では、腫瘍の事前標的化に利用するために、抗体を「レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」（ストレプトアビジンのような）と結合体化させることも可能であるが、ここでは抗体−レセプター結合体を患者に投与して、その後に結合しなかった結合体を清澄剤を用いて循環系から除去し、その後に「リガンド（ｌｉｇａｎｄ）」（例えば、アビジン）を投与しこれが次に細胞毒性薬に結合する。
【０３１６】
４．１４  コンピューター読取り可能な配列
本実施形態の１つの適用例では、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読取り可能な媒体に記録できる。本明細書において用いる場合、「コンピューター読取り可能な媒体（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｒｅａｄａｂｌｅ  ｍｅｄｉａ）」とは、コンピューターにより直接読取りおよびアクセスが可能な任意の媒体をいう。このような媒体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスクのような磁気記憶媒体、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；ＣＤ−ＲＯＭのような光学記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電子記憶媒体；ならびに磁気／光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリーのハイブリッド。現在公知のコンピューター読取り媒体の中のいずれをどのように用いれば、本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読取り可能な媒体を含む製品を製作できるかは当業者には容易に理解できる。本明細書において用いる場合、「記録される（ｒｅｃｏｒｄｅｄ）」とは、コンピューター読取り可能な媒体に情報を保存するプロセスをいう。当業者であれば、コンピューター読取り可能な媒体に情報を記録するための現在公知の方法のいずれかを採用して、本発明のヌクレオチド配列情報を含む製品を容易に製作できる。
【０３１７】
本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読取り可能な媒体を作製するために、当業者は種々のデータ記憶構築物を利用できる。データ記憶構造体の選択は一般に、記録された情報にアクセスする選択された手段に基づく。さらに、種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットを用いて、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター読取り可能な媒体上に記録できる。この配列情報は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄのような市販のソフトウェアにフォーマットされたワープロのテキストファイルで表すこともできるし、またはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなどのようなデータベースアプリケーションに記憶されたＡＳＣＩＩファイルの形式で表すことも可能である。当業者であれば、任意の多数のデータプロセッサストラクチャリングのフォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を適合させて、本発明のヌクレオチド配列情報を記録しているコンピューター読取り可能な媒体を得ることが容易に可能である。
【０３１８】
配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６、またはその代表的なフラグメントのヌクレオチド配列；または配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列のいずれかを、コンピューター読取り可能な形式で提供することにより、当業者は、種々の目的のためにその配列情報に慣用的にアクセスできる。コンピューター読取り可能な媒体として提供される配列情報を当業者にアクセス可能にするコンピューターソフトウェアは、公的に入手可能である。以下の例によって、Ｓｙｂａｓｅシステム上でＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら，Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３〜２０７（１９９３））検索アルゴリズムを実行するソフトウェアを用いて、核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定する方法が示される。このようなＯＲＦは、タンパク質をコードしたフラグメントであってもよく、そして発酵反応において、および市販品として有用な代謝産物の産生において用いられる酵素のような商業的に重要なタンパク質の生産に有用である場合がある。
【０３１９】
本明細書において用いる場合、「コンピューターベースのシステム（ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するのに用いられるハードウェア、ソフトウェア、およびデータ記憶の手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムにとって最低限必要なハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、インプット装置、アウトプット装置、およびデータ記憶装置を備える。当業者であれば、現在入手可能なコンピューターベースのシステムのいずれが本発明の使用に適しているかを容易に理解できる。上述のとおり、本発明のコンピューターベースのシステムは、本発明のヌクレオチド配列を記録しているたデータ記憶装置と、検索手段を支援しかつ実行するために必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段とを備える。本明細書において用いる場合、「データ記憶装置（ｄａｔａ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅａｎｓ）」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を記録できる記憶装置（メモリー）かまたは、本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製品にアクセスできるメモリーアクセス装置のいずれかをいう。
【０３２０】
本明細書において用いる場合、「検索手段（ｓｅａｒｃｈ  ｍｅａｎｓ）」とは、標的配列または標的構造モチーフと、データ記憶装置に記録した配列情報とを比較するために、コンピューターベースのシステム上で実行される１つ以上のプログラムをいう。検索手段は、特定の標的配列または標的モチーフに一致する既知の配列のフラグメントまたは領域を同定するのに使用される。種々の公知のアルゴリズムが公的に開示されおり、本発明のコンピューターベースのシステムには、検索手段実行のため種々の市販のソフトウェアが、使用可能である。このようなソフトウェアの例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮ、およびＢＬＡＳＴＡ（ＮＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＩＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。当業者であれば、相同性の検索を行うために利用可能なアルゴリズムまたは実行用ソフトパッケージのうちいずれが、本発明のコンピューターベースのシステムにおける使用に適合できるかを容易に理解できる。本明細書において用いる場合、「標的配列（ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、６つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸のうちの任意の核酸配列またはアミノ酸配列であってもよい。標的配列が長いほど、標的配列はデータベースの中でランダムには起きにくいということが、当業者には容易に理解できる。標的配列のうち最も好ましい配列の長さは、約１０〜３００のアミノ酸、より好ましくは約３０〜１００のヌクレオチド残基である。しかし既によく知られているように、遺伝子発現およびタンパク質処理に関与する配列フラグメントのような商業的に重要なフラグメントについての検索は、さらに短い長さで行える場合がある。
【０３２１】
本明細書において用いる場合、「標的構造モチーフ（ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆ）」または「標的モチーフ（ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｔｉｆ）」とは、任意の合理的に選択された配列または配列の組み合わせのことであり、その配列（単数または複数）は、標的モチーフの折り畳みの際に形成される３次元構造に基づいて選択される。当該分野では種々の標的モチーフが公知である。タンパク質の標的モチーフとしては、酵素の活性部位およびシグナル配列が挙げられるがこれらに限定されない。核酸の標的モチーフとしては、プロモーター配列、ヘアピン構造、および誘導性発現エレメント（タンパク質結合配列）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２２】
４．１５  三重らせん形成
さらに、本発明のフラグメントは、広い意味では、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用できるが、この両方の方法とも、ポリヌクレオチド配列のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。これらの方法に適切なポリヌクレオチドは好ましくは、塩基の長さが２０〜４０であり、そして転写に関与する遺伝子の領域（三重らせん  −  Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５２４１：４５６（１９８８）に対して；およびＤｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｌｍｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））に対して相補的であるように設計されている。三重らせん形成は好ましくは、ＤＮＡからのＲＮＡ転写を最適条件で遮断するが、アンチセンスＲＮＡハイブリディゼーションは、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。両技術とも、モデル・システムにおいて有効であることが実証されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドの設計に必要である。
【０３２３】
４．１６  診断用アッセイおよびキット
本発明はさらに、本発明の核酸プローブまたは抗体（必要に応じて適切な標識と結合体化されるかまたは会合する）を用いて、本発明の１つのＯＲＦまたはそのホモログの存在または発現を、試験サンプル中で同定する方法も提供する。
【０３２４】
本発明のポリヌクレオチドを検出する方法は一般に、ポリヌクレオチドに結合して複合体を形成する化合物をその複合体の形成に十分な時間、サンプルと接触させる工程と、その複合体を検出して、その結果、もし複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチドがサンプルの中に検出されることになる工程とを包含してもよい。このような方法はまた、ストリンジェントなハイブリディゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーとサンプルとを接触させる工程と、アニーリングされたポリヌクレオチドを増幅させて、その結果もしポリヌクレオチドが増幅されれば、本発明のポリヌクレオチドがサンプル中に検出されることになる工程とを包含してもよい。
【０３２５】
本発明のポリペプチドを検出する方法は一般には、ポリペプチドに結合して複合体を形成する化合物をその複合体の形成に十分な時間サンプルと接触させる工程と、その複合体を検出して、その結果、もし複合体が検出される場合、本発明のポリペプチドがサンプル中で検出されることになる工程とを包含してもよい。
【０３２６】
詳細には、このような方法は、試験サンプルを本発明の抗体の１つ以上、または核酸プローブの１つ以上とインキュベートさせる工程と、この試験サンプル内の成分に対するこの核酸プローブまたは抗体の結合をアッセイする工程とを包含する。
【０３２７】
核酸プローブまたは抗体を試験サンプルと共にインキュベートするための条件は様々である。インキュベーションの条件は、アッセイに使用される形式、使用される検出方法、アッセイに用いられる核酸プローブまたは抗体のタイプおよび性質に依存する。当業者は、通常入手可能なハイブリディゼーション、増幅、または免疫学的アッセイフォーマットのうちのいずれか１つが、本発明の核酸プローブまたは抗体を使用するのに容易に適合できることを認識する。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｅｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ、第１巻（１９８２）、第２巻（１９８３）、第３巻（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｎｐｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に見出すことができる。本発明の試験サンプルとしては、細胞、細胞のタンパク質もしくは膜抽出物、または生物学的液体（例えば、痰、血液、血清、血漿、または尿）が挙げられる。上述の方法に用いられる試験サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、ならびにアッセイされるべきサンプルとして用いられる組織、細胞、または抽出物によって異なる。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は当該分野では周知であり、利用されるシステムに適したサンプルを得るように容易に適合可能である。
【０３２８】
本発明の別の実施形態では、本発明のアッセイを実行するのに必要な試薬を含むキットが提供される。詳細には本発明は、１つ以上の容器を閉鎖して受容する区画キットを提供するがこのキットには以下のものが含まれる：（ａ）本発明のプローブまたは抗体のうちの１つを含む第一の容器；および（２）以下の１つ以上を含む１つ以上の他の容器：洗浄試薬、結合したプローブまたは抗体の存在を検出できる試薬。
【０３２９】
詳細には、区画キットとしては、試薬を別の容器に含む任意のキットが挙げられる。このような容器ととしては、小さいガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙の切れ端が挙げられる。このような容器によって、試薬を１つの区画から別の区画に効率的に移すことが可能になり、その結果サンプルおよび試薬は、交差汚染されず、各容器の物質または溶液を、定量的に１つの区画から別の区画へ加えることも可能である。このような容器としては、試験サンプルを入れる容器、アッセイに使用される抗体を入れる容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を入れる容器、結合抗体またはプローブを検出するのに用いられる試薬を入れる容器が挙げられる。検出試薬のタイプとしては、標識された核酸プローブ、標識された二次抗体、あるいは一次抗体が標識されている場合は、標識された抗体と反応可能な酵素または抗体の結合試薬が挙げられる。本発明の開示されたプローブおよび抗体は、当該分野で周知の確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることが当業者には容易に理解される。
【０３３０】
４．１７  医用画像
本発明の新規なポリペプチドおよび結合パートナーは、本発明の分子を発現する部位の医用画像にとって（例えば、本発明のポリペプチドが免疫応答に関与している場合、炎症または感染部分の画像部分のために）有用である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌら、米国特許第５，４１３，７７８号を参照のこと。このような方法は、標識薬または画像化剤の化学的結合、薬学的に受容できるキャリア中の対象へ標識ポリペプチドの投与、およびインビボの標的部位での標識ポリペプチドの画像化を包含する。
【０３３１】
４．１８  スクリーニングアッセイ
本発明の単離されたタンパク質およびポリヌクレオチドを用いることにより、本発明は、配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６に示されるヌクレオチド配列のいずれかに対応するＯＲＦによりコードされているポリペプチドに結合する物質、またはその核酸によりコードされたポリペプチドの特定のドメインに結合する物質を獲得および同定する方法をさらに提供する。詳細には、上記方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）本発明のＯＲＦ、または本発明の核酸によりコードされる単離タンパク質をある物質と接触させる工程と；
（ｂ）その物質が上記タンパク質または上記核酸と結合するか否かを決定する工程。
【０３３２】
従って一般には、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物を同定するためのこのような方法は、本発明のポリヌクレオチドと化合物とをポリヌクレオチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程と、その複合体を検出して、その結果、もしポリヌクレオチド／化合物複合体が検出される場合、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が同定される工程とを包含し得る。
【０３３３】
従って同様に一般的には、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するためのこのような方法は、本発明のポリペプチドと化合物とをポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程と、この複合体を検出して、その結果、もしポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が同定される工程を包含し得る。
【０３３４】
本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法はまた、本発明のポリペプチドとある化合物とを、細胞中でポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程であって、ここで、この複合体が細胞においてレセプター遺伝子配列の発現を駆動する工程と、レポーター遺伝子配列の発現を検出することによってこの複合体を検出して、その結果、もしポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、本発明のポリペプチドに結合する化合物が同定される工程とを包含し得る。
【０３３５】
このような方法を介して同定される化合物としては、本発明のポリペプチドの活性を調整する（すなわちその化合物がない場合に観察される活性に比べて、その活性を増大させるかまたは減少させる）化合物を挙げることができる。あるいは、このような方法で同定される化合物としては、本発明のポリヌクレオチドの発現を調整する（すなわちその化合物がない場合に観察される発現レベルに対して発現を増大させるかまたは減少させる）化合物を挙げることができる。本発明の方法を介して同定されるような化合物を、当業者に周知の標準的なアッセイを用いて、活性／発現の調整能力について試験することが可能である。
【０３３６】
上述のアッセイでスクリーニングされる因子としては、限定はしないが、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、または他の薬学的な因子を挙げることができる。このような因子は、ランダムに選択してもスクリーニングしてもよく、またはタンパク質モデリング技術を用いて、合理的にスクリーニングしても設計してもよい。
【０３３７】
ランダムなスクリーニングの場合、ペプチド、炭水化物、医薬物質などの因子を無作為に選択して、本発明のＯＲＦによりコードされているタンパク質へ結合する能力についてアッセイする。あるいは、物質は合理的にスクリーニングまたは設計されてもよい。本明細書において用いる場合、ある因子が特定のタンパク質の構造に基づいて選択される場合、その因子は「合理的にスクリーニングまたは設計される（ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ）」といわれる。例えば、当業者は、現在利用可能な手順を容易に適用して、特定のペプチド配列に結合することができるペプチド、薬学的因子などを生成して、合理的に設計されたアンチペプチドペプチド（例えばＨｕｒｂｙら、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ（１９９２）２８９〜３０７頁、およびＫａｓｐｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９２３０〜８（１９８９）を参照のこと）、または薬学的な因子などを生成することができる。
【０３３８】
前述の内容に加えて、本発明のあるクラスの因子は、広義の意味で、本発明のＯＲＦまたはＥＭＦの１つへの結合を通して、遺伝子発現を制御するために用いることができる。上述のとおり、このような因子は無作為にスクリーニングしてもよいし、または合理的に設計／選択してもよい。ＯＲＦまたはＥＭＦを標的することによって、当業者は、配列特異性またはエレメント特異性の因子を設計して、これによって単一のＯＲＦまたは複数のＯＲＦ（いずれも発現コントロールについては同じＥＭＦに依存）のいずれかの発現を調整することができる。あるクラスのＤＮＡ結合因子は、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合することにより三重らせんにハイブリダイズするかまたはこれを形成する塩基の残基を含んでいる因子である。このような物質は、古典的なホスホジエステル、リボ核酸骨格に基づいてもよいし、または塩基付着能力を有する種々のスルフヒドリル誘導体またはポリマー誘導体であってもよい。
【０３３９】
これらの方法における使用に適切な因子は好ましくは、２０〜４０塩基を含み、そして転写に関与する遺伝子の領域（三重らせん  −  Ｌｅｅら，Ｎｕｅｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）に対して、またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス  −  Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））に対して相補的であるように設計されている。三重らせん形成はＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断に最高の結果をもたらし、一方アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。両技術とも、モデル・システムに於いて有効であることが実証されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重らせん・オリゴヌクレオチド、および他のＤＮＡ結合物質の設計にとって必要である。
【０３４０】
本発明のＯＲＦの１つによりコードされているタンパク質に結合する因子は、診断薬として用いることができる。本発明のＯＲＦの１つによりコードされているタンパク質に結合する因子は、医薬組成物を生成するための公知の技術を用いて処方できる。
【０３４１】
４．１９  プローブとしての核酸の使用
本発明の別の局面は、天然に発生するヌクレオチド配列とハイブリダイズできるポリペプチド特異的な核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列である配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれかに由来し得る。対応する遺伝子は限られた数の組織でしか発現されないので、ヌクレオチド配列である配列番号１〜６８４もしくは１３６９〜１９６６のいずれかに由来するハイブリダイゼーションプローブは、サンプル中のこのような組織の細胞タイプのＲＮＡの存在を示す指標として用いることができる。
【０３４２】
例えば、インサイチュハイブリダイゼーションのような任意の適切なハイブリダイゼーション技術を使用してもよい。米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，９６５，１８８号に記載されたＰＣＲによって、ヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別な用途が得られる。ＰＣＲに用いられるこのようなプローブは組み換え由来であってもよいし、化学的に合成されてもよいし、またはその両方の混合であってもよい。このプローブは、同一配列の検出のための異なるヌクレオチド配列、または密接に関係したゲノム配列の同定のための可能性のある配列の縮重プールを含む。
【０３４３】
核酸に特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生する他の方法は、ｍＲＮＡプローブの生成のために核酸配列をベクターの中にクローニングする工程を包含する。このようなベクターは、当該分野で公知であり、市販されており、Ｔ７として適切なＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼおよび適切に放射性標識されたヌクレオチドを添加することによって、インビトロでＲＮＡプローブを合成するのに使用できる。このヌクレオチド配列を用いて、各々のゲノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、周知の遺伝子および／または染色体のマップ作成技術を用いてある染色体または染色体の特定領域に対してマッピングすることができる。これらの技術としては、インサイチュハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖解析、公知の染色体に特異的なライブラリーまたはフロー分類が施された染色体調製物を用いるハイブリダイゼーションスクリーニングなどが挙げられる。染色体分布の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの技術は、他にもあるがＶｅｒｍａら（１９８８）Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ．に記載されている。
【０３４４】
染色体調製物の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションおよび他の物理的な染色体のマップ作成技術は、さらなる遺伝子マップのデータと相関し得る。遺伝子マップデータの例は、１９９４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）にみることができる。物理的な染色体マップ上の核酸の位置と特定の疾患（または特定の疾患に対する素因）との間の相関性は、その遺伝子疾患と関連するＤＮＡの領域を限定するのに役立つであろう。本発明のヌクレオチド配列は正常者、キャリアまたは罹患した個体の間の遺伝子配列の違いを検出するのに用いることができる。
【０３４５】
４．２０  支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド、すなわち、小さい核酸のセグメントは、例えば、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて一般的に行われているとおり、化学的な手段によってオリゴヌクレオチドを直接合成することによって、容易に調製できる。
【０３４６】
支持体固定されたオリゴヌクレオチドは、ガラス、ポリエチレンまたはＴｅｆｌｏｎのような任意の適切な支持体を用いて、当業者に公知の任意の方法によって調製できる。１つのストラテジーは、標準的なシンセサイザーによって合成されたオリゴヌクレオチドを正確にスポットすることである。固定は、受動的吸着（ＩｎｏｕｙｅおよびＨｏｎｄｏ、１９９０  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２８（６）１４６９〜７２）を用いて；紫外線（Ｎａｇａｔａら、１９８５；Ｄａｈｌｅｎら、１９８７、ＭｏｒｒｉｓｓｅｙおよびＣｏｌｌｉｎｓ（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １９８９  ３（２）１８９〜２０７）を用いて、または塩基を修飾したＤＮＡの共有結合（Ｋｅｌｌｅｒら、１９８８；１９８９）によって行うことができる；全ての引用文献は本明細書において詳細に援用されている。
【０３４７】
使用できる別のストラテジーは、リンカーとして強力なビオチン−ストレプトアビジン相互作用を使用することである。例えば、Ｂｒｏｕｄｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（８）３０７２〜６は、ビオチン化プローブの使用について記載しているが、それらは二重プローブであり、ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズに固定されている。ストレプトアビジンコーティングしたビーズは、Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏから購入することができる。もちろん、この同じ結合化学は、ストレプトアビジンを有する任意の表面のコーティングに適用できる。ビオチン化プローブは、例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）のような種々の業者から購入できる。
【０３４８】
Ｎｕｎｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）からも使用できる適切な材料が販売されている。Ｎｕｎｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、Ｃｏｖａｌｉｎｋ  ＮＨと呼ばれるマイクロウェル表面にＤＮＡが共有結合することができる方法を開発した。ＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨは、更なる共有結合のための橋頭堡となる第２アミノ基（＞ＨＮ）が移植されたポリスチレン表面である。ＣｏｖａＬｉｎｋ  Ｍｏｄｕｌｅｓは、Ｎｕｎｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入してもよい。ＤＮＡ分子はホスホラミダイト結合によりＣｏｖａＬｉｎｋの５’末端にのみ結合されることが可能であり、これによって１  ｐｍｏｌを超えるＤＮＡの固定が可能になる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（１９９１）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｒｎ  １９８（ｌ）１３８〜４２）。
【０３４９】
ＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨのストリップを５’へのＤＮＡ分子の共有結合のために使用することは公開されている（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９９１）。この技術においては、ホスホラミダイト結合が使用されている（Ｃｈｕら、（１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １１（１８）６５１３〜２９）。これは、共有結合を１個だけ用いて固定することが好ましいという利点がある。ホスホラミデート結合によって、長さ２  ｎｍのスペーサーアームを介して、ポリスチレン表面に共有結合的に移植されているスペーサーアームの末端部に位置しているＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨ  第２アミノ基にＤＮＡが結合される。ホスホラミデート結合を介してＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨに対してオリゴヌクレオチドを連結するためには、オリゴヌクレチド末端は５’端リン酸基を持っていなければならない。おそらくビオチンをＣｏｖａＬｉｎｋに共有結合し、次いでストレプトアビジンを用いてプローブに結合させることも可能である。
【０３５０】
より詳細には、この連結方法は、ＤＮＡを水（７．５ｎｇ／μｌ）に溶解する工程と、１０分間９５℃で変性する工程と、氷で１０分間冷却する工程とを包含する。次いで、氷冷０．１  Ｍ  １−メチルイミダゾール、ｐＨ  ７．０（１−ＭｅＩｍ７）を加えて、最終的な濃度を１０ｍＭ  Ｉ−ＭｅＩｍ７とする。次いでｓｓ  ＤＮＡ溶液を、氷上に置いたＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨ  ストリップ（７５μｌ／ウェル）に供給する。
【０３５１】
カルボジイミド０．２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を１０ｍＭ  １−ＭｅＩｍ７に溶解したものを新たに作り、１ウェルあたり２５μｌを加えた。ストリップを５０℃で５時間インキュベートさせた。インキュベーション後、ストリップを例えばＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｗａｓｈを用いて洗浄した。最初に、ウェルを３回洗浄し、次いで５分間洗浄液に浸漬し、最終的に３回洗浄する（そのとき、洗浄液は５０℃に加熱した０．４Ｎ  ＮａＯＨ，０．２５％  ＳＤＳである）。
【０３５２】
本発明にとってさらに適した方法は、本明細書において参考として援用される、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０３３８２（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｍａｓｋｏｓ）で記載されたものであると考えられる。支持体に固定されたオリゴヌクレオチドを調製するこの方法は、ヌクレオシド３’−試薬を、共有結合ホスホジエステル連結によってリン酸基を介して、支持体によって担持される脂肪族ヒドロキシル基に対して付加する工程を包含する。次いで、このオリゴヌクレオチドを、支持されたヌクレオシド上で合成して、支持体からオリゴヌクレオチドを切断しない標準的な状態の下で、合成オリゴヌクレオチド鎖から保護基を外す。適切な試薬としては、ヌクレオシドホスホラミダイトおよびヌクレオシド水素ホスホレートが挙げられる。
【０３５３】
ＤＮＡプローブアレイの調製のために、ＤＮＡプローブ調製のためのチップ上の操作を行うことができる。例えば、アドレス可能なレーザー起動フォトデプロテクションを、本明細書において参考として援用されるＦｏｄｏｒら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１（４９９５）７６７〜７３に記載されたとおり、ガラス表面上で直接オリゴヌクレオチドの化学合成に使用可能である。プローブをまた、Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１２）３３４５〜５０に記載されたようにナイロン支持体の上に固定してもよく；また、プローブを、ＤｕｎｃａｎおよびＣａｖａｌｉｅｒ（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６９（ｌ）１０４〜８の方法を用いてＴｅｆｌｏｎに連結してもよい；すべての引用文献は、本明細書に詳細に援用されている。
【０３５４】
オリゴヌクロチドをナイロン支持体に連結するには、Ｖａｎ  Ｎｅｓｓら（１９９１）に記載されるように、ナイロン表面をアルキル化によって活性化し、塩化シアヌル酸でオリゴヌクレオチドの５’−アミンを選択活性化する必要がある。
【０３５５】
支持体に固定されたオリゴヌクレオチドを調製する特別な方法の１つは、本明細書において参考として援用された、Ｐｅａｓｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（１１）５０２２〜６に記載された光生成合成を利用することである。これらの著者は、固定されたオリゴヌクレオチドのプローブ（ＤＮＡチップ）のアレイを生成するために現在の写真平板技術を用いている。高密度の小型化されたアレイの中で光を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成するこれらの方法では、光不安定性５’−保護Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシドホスホアラミダイト表面リンカー化学および多様なコンビナトリアル合成ストラテジーを利用する。この方法により、空間的に２５６個に分けられたオリゴヌクレオチドプローブの行列を作成することができる。
【０３５６】
４．２１  核酸フラグメントの調製
核酸は、任意の適切な供給源、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、マイクロ切断染色体バンド、コスミドまたはＹＡＣ挿入片、および増幅段階のないｍＲＮＡを含むＲＮＡから得ることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）は、高分子量ＤＮＡを哺乳類細胞から単離するための３つのプロトコールを記載している（ｐ．９．１４〜９．２３）。
【０３５７】
ＤＮＡフラグメントは、Ｍ１３、プラスミドまたはλベクターにおけるクローンとして調製されてもよく、そして／またはゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡからＰＣＲまたは他の増幅方法によって直接調製されてもよい。サンプルは、マルチウェルプレート中に調製しても取り分けてもよい。約１００〜１０００ｎｇのＤＮＡサンプルを最終容積２〜５００ｍｌで調製してもよい。
【０３５８】
次いで、核酸を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の９．２４〜９．２８に記載の制限酵素を用いる工程、超音波による剪断およびＮａＯＨ処理を含む当業者に公知の任意の方法によって断片化する。
【０３５９】
低圧せん断法もまた、Ｓｃｈｒｉｅｆｅｒらが本明細書において参考として援用される（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２４）７４５５〜６に記載したとおり適切である。この方法では、小型のフレンチプレスセルに低圧から中圧の種々の圧力をかけてＤＮＡサンプルを通す。細胞に対する低圧から中圧の圧力調節はレバー装置で制御できる。これらの研究の結果、低圧せん断が、音波および酵素によるＤＮＡ断片化方法の代替として有用であることが示される。
【０３６０】
ＤＮＡを断片化するのに適した特別な方法の１つとしては、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら（１９９２）のＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（１４）３７５３〜６２によって記載された２塩基識別エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩを用いる方法が考えられている。これらの著者は、彼らがショットガンクローニングおよび配列決定に適切であると考えた特定のサイズへのＤＮＡの急速断片化および分画のためのアプローチを記載している。
【０３６１】
制限エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩは通常、認識配列ＰｕＧＣＰｙをＧとＣとの間で切断してブラントエンドを残す。この酵素（ＣｖｉＪＩ＊＊）の特異性を変化させる特殊な反応条件によって、準無作為分布したＤＮＡフラグメントが小型の分子ｐＵＣ１９（２６８８個の塩基対）から発生する。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら（１９９２）は、このフラグメントストラテジーの無作為性を、急速ゲル濾過法によってサイズ分画されたｐＵＣ１９のＣｖｉＪＩ＊＊消化物を用い、末端修復することなく、ｌａｃＺマイナスＭ１３クローニングベクターに直接連結することにより、定量的に評価した。７６個のクローンの配列分析によって、ＣｖｉＪＩ＊＊がＰｕＧＣＰｙ部位に加えてｐｙＧＣＰｙおよびＰｕＧＣＰｕを制限消化すること、および新しい配列データは無作為な断片化と一致する速度で蓄積されることが示された。
【０３６２】
文献に報告されているとおり、このアプローチの利点は、音波処理およびアガローズゲル分画法に比べて以下が挙げられる：ＤＮＡの必要量が少ないこと（２〜５μｇの代わりに０．２〜０．５μｇ）；および処理工程が少ないこと（プレライゲーション、末端修復、化学的抽出、またはアガローズゲル電気泳動および溶出などが不要）。
【０３６３】
核酸フラグメントの入手または調製の方法にかかわらず、ＤＮＡを変性してハイブリダイゼーションのために利用可能な一本鎖を得ることが重要である。これはＤＮＡ溶液を８０〜９０℃で２〜５分間インキュベートすることによって達成される。次いで、この溶液を２℃まで急冷して、ＤＮＡフラグメントがチップに接触する前に復元することを妨げる。リン酸基も当業者に公知の方法でゲノムＤＮＡから除去されなければならない。
【０３６４】
４．２２  ＤＮＡアレイの調製
アレイは、例えばナイロン膜のような支持体の上にＤＮＡサンプルをスポットすることによって調製することができる。スポットは、金属製ピンのアレイ（その位置はマイクロタイタープレートのウェルのアレイに相当する）を用いて、約２０ｎｌのＤＮＡ溶液をナイロン膜に繰り返し移すことによって行うことができる。オフセット印刷により、ウェルの密度以上のドット密度が得られる。使用される標識のタイプに応じて１ｍｍ２あたり１〜２５個のドットを設けることができる。いくつかの予め選択した数の行および列にスポットするのを避けることにより、別のサブセット（サブアレイ）を形成することができる。１つのサブアレイ中のサンプルは、異なる個体由来のＤＮＡの同じゲノムセグメント（または同じ遺伝子）であってもよいし、または異なる重複したゲノムクローンであってもよい。各々のサブアレイは同じサンプルのレプリカスポッティングに対応し得る。ある例では、選択された遺伝子セグメントは、６４例の患者から増幅されてもよい。各患者について、増幅された遺伝子セグメントを１つの９６ウェルプレートに入れてもよい（全９６ウェルが同じサンプルを含んでいる）。６４人の患者の１人１人に１枚のプレートを準備する。９６ピンの装置を用いることにより、すべてのサンプルを１枚の８×１２ｃｍの膜にスポットしてもよい。サブアレイは各患者から１つの６４サンプルを含んでもよい。９６のサブアレイが同一である場合、ドットのスパンは１ｍｍ２であってもよく、サブアレイ間に１ｍｍの間隔があってもよい。
【０３６５】
別のアプローチとしては、物理的なスペーサー、例えば、膜の上に成形されたプラスチックの格子、マルチウェルプレートの底部に設けられる膜の分類と同様である格子、または疎水性ストリップで区分できる膜またはプレート（ＮＵＮＣ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能）を用いることである。固定された物理的スペーサーは、平坦なリン貯蔵スクリーン、またはＸ線フィルムを露出することによって画像化するのには好ましくない。
【０３６６】
本発明を以下の例で説明する。この開示を考慮すれば、当業者には、本発明の範囲の中で、多くの他の実施形態および変形を行うことができるということが明らかである。従って、本発明の広範囲な局面は以下の実施例の開示に限定されないということが考えられる。本発明は、本発明の１つの局面のみを示すことを意図した例示的な実施形態によって制限されるべきではなく、そして機能的に同等な組成物および方法は発明の範囲内にある。事実、本発明の好ましい実施形態を考察すれば、当業者には本発明の実施において多くの改変および変形が生じることが予想される。従って、本発明の範囲における唯一の制限は、添付の特許請求の範囲に表されるものである。
【０３６７】
本明細書中に引用される全ての引用文献は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０３６８】
５．０  実施例
５．１  実施例  １
種々のライブラリーから得た新規な核酸配列
複数の新規な核酸を、種々のヒト組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得て、ある場合には、標準的なＰＣＲ、ＳＢＨ配列特徴分析およびサンガー配列決定技術を用いてヒト染色体由来のゲノムライブラリーから単離した。ライブラリーの挿入部は、挿入部に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ｃＤＮＡライブラリー由来のクローンをナイロン膜フィルターにスポットして、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、７マー）を用いてスクリーニングして、特徴的な配列を得た。このクローンを類似のあるいは同一の配列の群に分類した。配列決定のために代表的なクローンを選択した。
【０３６９】
ある場合には、次いで、増幅された挿入部の５’配列を典型的なサンガー配列プロトコールを用いて推定した。ＰＣＲ産物を精製して、蛍光色素ターミネータサイクル配列決定に供した。シングルパスゲル配列決定を、３７７Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサーを用いて行い、新規な核酸配列を行った。
【０３７０】
５．２  実施例２
新規な核酸のアセンブリッジ
配列番号１３６９〜１９６６と名付けられた本発明のコンティグまたは核酸をシードとしてＥＳＴ配列を用いてアセンブルした。次いで、循環アルゴリズムを用いてシードＥＳＴを伸長アセンブリッジに伸長させ、ここでは、このアセンブリッジに属する異なるデータベース（すなわち、ＨｙｓｅｑのＥＳＴ配列を含むデータベース、ｄｂＥＳＴ、ｇｂ  ｐｒｉ、およびＵｎｉＧｅｎｅ、ならびにＧｅｎＳｃａｎによって推定される公的なドメインのゲノム配列由来のエキソン）から追加配列を引き出すことによって行った。アセンブリッジを伸長する追加配列が上述のデータベースからそれ以上得られなくなったところで、アルゴリズムは停止した。さらに、成分配列のアセンブリッジへの組み入れは、伸長するアセンブリッジに対するＢＬＡＳＴＮヒットはＢＬＡＳＴスコアが３００より多く、そして同一性割合が９５％より多いことに基づいた。
【０３７１】
表７は、新規な予想ポリペプチド（タンパク質を含む）、配列番号１９６７〜２５６４、（本発明の新規なポリヌクレオチド（配列番号１３６９〜１９６６）によってコードされる）、および配列番号１３６９〜１９６６の各々に対するそれらの対応する翻訳開始および終止ヌクレオチドの位置を示す。表７はまた、ポリペプチドを予想した方法も示す。方法Ａは、公知のポリヌクレオチドに対する翻訳された新規なポリヌクレオチドの比較に基づいてポリペプチドを選択する、ＦＡＳＴＹと呼ばれるソフトウェアプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ，ｅｄｕから入手可能）を用いることによって得られたポリペプチドを指す（本明細書において参考として援用される、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３〜９８（１９９０））。方法Ｂは、遺伝子構造／構成上の特性の確率的モデルに基づいてポリペプチドを予想する、ヒト／脊椎動物配列のためのＧｅｎＳｃａｎと呼ばれるソフトウェアプログラム（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇから入手可能）を用いることによって得られたポリペプチドを指す（本明細書において参考として援用される、Ｃ．ＢｕｒｇｅおよびＳ．Ｋａｒｌｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：７８〜９４（１９９７））。方法Ｃは、新規なポリヌクレオチドおよびその相補鎖を６つの可能性のあるアミノ酸配列（フォワードおよびリバースのフレーム）に翻訳し、最長のオープンリーディングフレームを有するポリペプチドを選択する、Ｈｙｓｅｑの独自のソフトウェアプログラムを用いることによって得られたポリペプチドを指す。
【０３７２】
５．３  実施例３
新規な核酸
本発明の新規な核酸を、上記の実施例１に記載の方法によりｃＤＮＡライブラリーから得られた配列から、そしてある場合には、１つ以上の公的データベースから得た配列からアセンブリした。シードとしてＥＳＴ配列を用いて核酸をアセンブルした。次いで、循環アルゴリズムを用いて、シードＥＳＴを伸長アセンブリッジに伸長させ、ここでは、このアセンブリッジに属する異なるデータベース（ＨｙｓｅｑのＥＳＴ配列を含むデータベース、ｄｂＥＳＴ、ｇｂ  ｐｒｉ、およびＵｎｉＧｅｎｅ）から追加配列を引き出すことによって行った。アセンブリッジを伸長する追加配列が上述のデータベースからそれ以上得られなくなったとき、アルゴリズムは停止した。成分配列のアセンブリッジへの組み入れは、伸長するアセンブリッジに対するＢＬＡＳＴＮヒットはＢＬＡＳＴスコアが３００より多く、そして同一性割合が９５％より多いことに基づいた。
【０３７３】
ＰＨＲＡＰ（ワシントン大学）またはＣＡＰ４（Ｐａｒａｃｅｌ）を用いて、全長遺伝子ｃＤＮＡ配列およびその対応するタンパク質配列をこのアセンブリッジから生成した。任意のフレームシフトおよび不正確な終止コドンを手による編集によって修正した。編集の間、Ｇｅｎｅｂａｎｋ（すなわち、ｄｂＥＳＴ、ｇｂ  ｐｒｉ、およびＵｎｉＧｅｎｅおよびＧｅｎｐｅｐｔ）およびＧｅｎｅｓｅｑ（Ｄｅｒｗｅｎｔ）に対してＦＡＳＴＹおよび／またはＢＬＡＳＴを用いて配列をチェックした。編集プロセスに用いられている可能性のある他のコンピュータープログラムは、ｐｈｒｅｄＰｈｒａｐおよびＣｏｎｓｅｄ（ワシントン大学）およびｅｄ−ｒｅａｄｙ、ｅｄ−ｅｘｔおよびｃｇ−ｚｉｐ−２（Ｈｙｓｅｑ，Ｉｎｃ．）であった。これらの手順から得られるスプライシングバリアントを含む全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号１〜１３６８として配列表に示す。
【０３７４】
ＴＭｐｒｅｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて、本発明の核酸配列が少なくとも１つの膜貫通ドメインを有することを確認した。当業者は、本発明のタンパク質が膜結合標的または可溶性タンパク質のいずれかとして利用できることを認識する。
【０３７５】
表１は、配列番号１〜６８４の種々の組織供給源を示す。
【０３７６】
ヌクレオチド配列である配列番号１〜６８４に相当するポリペプチド配列番号６８５〜１３６８のホモログは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてＧｅｎｅｐｔおよびＧｅｎｅｓｅｑ（Ｄｅｒｗｅｎｔ）に対してＢＬＡＳＴのバージョン２．０ａ１  １９ＭＰ−ＷａｓｈＵ検索によって得た。配列番号６８５〜１３６８のホモログを示す結果を表２Ａおよび２Ｂに示す。
【０３７７】
ｅＭａｔｒｉｘソフトウェアパッケージ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）（本明細書において参考として援用される、Ｗｕら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．，第６巻２１９〜２３５（１９９９），ｈｔｔｐ：／／ｍｏｔｉｆ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｅｍａｔｒｉｘ−ｓｅａｒｃｈ／）を用いて、全てのポリペプチド配列を試験して、それらが同定可能な兆候領域を有したか否かを決定した。ｅＭａｔｒｉｘソフトウェアパッケージのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＰＦＡＭ、ＰＲＯＤＯＭおよびＤＯＭＯデータベース由来である。表３Ａおよび３Ｂは、示されたポリペプチド配列において見出される相同なｅＭａｔｒｉｘサインのアクセッション番号、その説明および、アクセッション番号サブタイプを含む得られた結果；生のスコア；ｐ値；ならびにアミノ酸配列におけるサインの位置を示す。
【０３７８】
Ｐｆａｍソフトウェアプログラム（本明細書において参考として援用されるＳｏｎｎｈａｍｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，第２６巻（１）、３２０〜３２２頁（１９９８））を用いて、特定のペプチドドメインに対して相同性を有するドメインについて全てのポリペプチド配列を試験した。表４Ａおよび４Ｂは、見出されたＰｆａｍモデルの名称、説明、ｅ値および配列内の同定されたモデルについてのＰｆａｍスコアを示す。さらにＰｆａｍモデルのさらなる説明は、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／に見ることができる。
【０３７９】
表５は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、各々のポリペプチドにおけるシグナルペプチドの位置ならびにそのシグナルペプチドと関連する最大スコアおよび平均スコアを示す。原核生物および真核生物のシグナルペプチドならびにそれらの切断部位を同定するためのプロセスはまた、本明細書に参考として援用される、Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｊａｃｏｂ  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｓｏｒｅｎ  Ｂｒｕｎａｋ，およびＧｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第１０巻、１号、１〜６頁（１９９７）に開示されている。Ｎｉｅｌｓｏｎらの引用文献に記載されるとおり、最大Ｓスコアおよび平均Ｓスコアをポリペプチド配列について得た。
【０３８０】
表６は、割り当て可能な場合、特定の染色体位置に対する本発明のヌクレオチド配列に関する。
【０３８１】
表８は、ＴＭｐｒｅｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ_ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いて、５００以上のＴＭＰｒｅｄスコアを有する配列番号６８５〜１３６８の各々についての膜貫通領域の数、その位置（単数または複数）および得られたＴＭＰｒｅｄスコアを示す。
【０３８２】
表９は、新規なポリヌクレオチド配列である配列番号１〜６８４、その対応するポリペプチド配列である配列番号６８５〜１３６８、その対応する優先コンティグヌクレオチド配列である配列番号１３６９〜１９６６、その対応する優先コンティグポリペプチド配列である配列番号１９６７〜２５６４、ならびにコンティグ配列がファイルされている、優先出願（この全てがその全体が参考として本明細書に援用される）のＵＳ出願番号の相関表である。
【０３８３】
【表１−１】
2006517094.tif 000002
【０３８４】
【表１−２】
2006517094.tif 000003
【０３８５】
【表１−３】
2006517094.tif 000004
【０３８６】
【表１−４】
2006517094.tif 000005
【０３８７】
【表１−５】
2006517094.tif 000006
【０３８８】
【表１−６】
2006517094.tif 000007
【０３８９】
【表１−７】
2006517094.tif 000008
【０３９０】
【表１−８】
2006517094.tif 000009
【０３９１】
【表１−９】
2006517094.tif 000010
【０３９２】
【表１−１０】
2006517094.tif 000011
【０３９３】
【表１−１１】
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【０３９４】
【表１−１２】
2006517094.tif 000013
【０３９５】
【表１−１３】
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【０３９６】
【表１−１４】
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【０３９７】
【表１−１５】
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【０３９８】
【表１−１６】
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【０３９９】
【表１−１７】
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【０４００】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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