(57)【要約】本発明は、活性剤、特に食品用細菌によるカゼインの加水分解によって得られたカゼイン由来ペプチドを含むメタロプロテイナーゼ阻害剤に関する。本発明はまた、ラクトバチルスヘルヴェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）属の食品用細菌をカゼインと接触させることによって、加水分解が行われ、メタロプロテイナーゼ阻害特性を示すカゼイン由来ペプチドが得られる、薬剤の製造に関する。本発明はまた、前記細菌によるカゼインの加水分解によって得られた単離及び精製した阻害ペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品用細菌によるカゼインの加水分解によって得られたカゼイン由来ペプチドを含む、メタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤。
【請求項２】
メタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の製造方法であって、
−  カゼイン及び食品用細菌の溶液を調製するステップ、
−  前記カゼインを部分的に加水分解してカゼイン由来ペプチドを含有するメタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を提供するのに有効な条件下で前記溶液を保持するステップ、
−  前記加水分解を停止させるステップ、
−  任意選択で前記溶液から前記阻害剤を回収するステップ
を含む方法。
【請求項３】
前記食品用細菌が乳酸桿菌及び桿菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記食品用細菌がラクトバチルスヘルヴェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ｓｓｐ、及びラクトバチルスヘルヴェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
好ましい食品用細菌の単離したタンパク質分解酵素を細菌の代わりに又は細菌と併せて使用することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
メタロプロテイナーゼ阻害剤、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含有する発酵乳製品の製造方法であって、
−  乳酸菌を牛乳と接触させるステップ、
−  牛乳のカゼインをカゼイン由来ペプチドに部分的に加水分解してメタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含有する発酵乳製品を提供する条件下で、得られた混合物を発酵させて発酵乳製品を得るステップ
を含む方法。
【請求項７】
以下のアミノ酸配列：
2006507221.tif 000022
を有する、配列番号１〜８で示される単一ポリペプチド鎖ペプチドからなる群から選択されるメタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害物質。
【請求項８】
以下のアミノ酸配列：
2006507221.tif 000023
を有する、配列番号９〜１６で示される単一ポリペプチド鎖ペプチドからなる群から選択されるメタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害物質。
【請求項９】
メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを系統的、局在的又は局所的に阻害するための、請求項１に記載の阻害剤の使用。
【請求項１０】
メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを系統的、局在的又は局所的に阻害するための、請求項７及び８に記載の阻害物質の使用。
【請求項１１】
歯磨き粉、洗口液、又はヨーグルト若しくは発酵乳飲料のような発酵及び非発酵乳製品、チューインガム、キャンディー、ペットフード及び経口サプリメントなどの食品における、請求項７及び８に記載の阻害物質又は請求項１に記載の阻害剤の使用。
【請求項１２】
ネコ破歯細胞性歯牙吸収病巣を減少させる薬物を製造するための、請求項７及び８に記載の阻害物質又は請求項１に記載の阻害剤の使用。
【請求項１３】
メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの活性及び／又は機能を低下させるための、有効量の請求項７及び８に記載の阻害物質又は請求項１に記載の阻害剤を含む薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性剤、特にプロテイナーゼ阻害剤に関する。より詳細には、本発明は、カゼイン由来ペプチドを含むメタロプロテイナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解は、極めて複雑なプロセスであり、多くの病理学的及び生理学的プロセスの一部である。したがって、細胞外マトリックスのタンパク質分解は、非腫瘍性組織再構築プロセスの場合と同様に、癌浸潤において非常に重要な役割を果たす。腫瘍細胞媒介細胞外マトリックスタンパク質分解におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）酵素の役割は、十分に確立されている。したがって、ＥＣＭの組成及び保全性を調節することによって、ＭＭＰは、マトリックス分子によって誘発されるシグナルを制御する上で重要な役割を果たし、細胞増殖、分化及び細胞死を調節する。ＭＭＰは、遍在性酵素であり、前立腺、呼吸、骨並びに大腸腫瘍細胞系が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＭＰを分泌することがわかっている。ＭＭＰファミリーには、例えばフィブロネクチン、ゼラチン及びコラーゲンのように様々な成分を切断する２０を超えるメンバーがある。ＭＭＰファミリーのうち、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９が癌細胞中で確認されており、その活性型が良性よりも悪性の乳癌でより頻繁に認められていた。したがって、ＭＭＰ−２は、腫瘍浸潤及び転移に関与するＥＣＭ再構築における重要な酵素と考えることができる。
【０００３】
癌及び腫瘍浸潤の他に、ＭＭＰは、マトリックス分解及び再構築を伴う多種多様な正常及び病理学的な症状にも関連している。したがって、ＭＭＰは、胎児発育、血管形成、骨形成及び吸収のようないくつかの生理学的プロセスに関与している。事実、骨吸収モデルは、ＭＭＰ−９が、骨幹のコアを充填している不連続に鉱化した肥大性軟骨中への破骨細胞及び内皮細胞の浸潤に特に必要とされることを示した。ＭＭＰは、アテローム性動脈硬化症、関節炎、自己免疫疾患、歯周炎、組織潰瘍並びに言うまでもなく癌浸潤及び転移のような病理学的プロセスに関与していることも報告されている。
【０００４】
ＥＣＭ分解に関与しているＭＭＰのタンパク質分解活性は、それらの内因性阻害物質、すなわちメタロプロテアーゼ組織阻害因子（ＴＩＭＰ）によって調節できることも知られている。これらの阻害物質は、特に組織再構築及び炎症性プロセス中にメタロプロテアーゼの活性化に影響し、ＥＣＭのタンパク質分解を調節するように作用する。例えばＩＣ５０がマイクロモル範囲にあるブタンジアミド誘導体のマリマスタットのような合成阻害物質もある。ＭＭＰの阻害物質は、一般に３つの薬理学的カテゴリー：コラーゲンペプチド擬態物質及び非ペプチド擬態物質、テトラサイクリン誘導体並びに二リン酸エステルに分類される。
【０００５】
したがって、ＭＭＰ阻害物質は、局所浸潤の抑制及び腫瘍血管形成の阻害によって腫瘍成長を抑制する潜在能力を有するはずである。現在の既存の非内因性阻害物質には、不十分な経口生体利用率並びに高コストの欠点がある。さらに、これらは合成分子なので、合成経路は一般に面倒であり、機能性混合物を回収するために精製ステップを必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、調製するのが安価で容易であり、食品中で又は栄養補助食品としても使用できるメタロプロテイナーゼ阻害剤を得るための簡単な手順が依然として必要とされる。
【０００７】
メタロプロテイナーゼ、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する方法を提供することも本発明の目的である。
【０００８】
メタロプロテイナーゼ、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに有効な薬剤を提供することが本発明の別の目的である。
【０００９】
メタロプロテイナーゼ、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに有効な薬剤を調製する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、食品用細菌によるカゼインの加水分解によって得られたカゼイン由来ペプチドを含むメタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤に関する。
【００１１】
本発明はまた、メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するための系統的、局在的又は局所的な本発明による阻害剤の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の他の一態様により、以下のステップ：
−  カゼイン及び食品用細菌の溶液を調製するステップ、
−  カゼインを部分的に加水分解してカゼイン由来ペプチドを含有するメタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を提供するのに有効な条件下で前記溶液を保持するステップ、
−  加水分解を停止させるステップ、
−  任意選択で溶液から阻害剤を回収するステップ
を含む、メタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の製造が可能である。
【００１３】
「食品用細菌」という表現は、ヒトの健康に有害な影響を与えない、又はＧＲＡＳ（一般に安全と認められる食品）と認定されている任意の細菌を意味する。こうした細菌は、乳酸桿菌及び桿菌からなる群から選択することができる。本発明によるプロセスの目的に特に適した好ましい細菌は、ラクトバチルスヘルヴェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ｓｓｐ、より具体的には２００２年４月２９日に番号Ｉ−２８６４でＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ、Ｐａｒｉｓに寄託されたラクトバチルスヘルヴェティクスであってよい。
【００１４】
本発明の他の態様は、好ましい食品用細菌の単離したタンパク質分解酵素を細菌の代わりに又は細菌と併せて使用する、メタロプロテイナーゼ阻害剤の製造に関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、以下のステップ：
−  乳酸菌を牛乳と接触させるステップ、
−  牛乳のカゼインをカゼイン由来ペプチドに部分的に加水分解してメタロプロテイナーゼ阻害剤、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含有する発酵乳製品を提供する条件下で、得られた混合物を発酵させて発酵乳製品を得るステップ
を含む、メタロプロテイナーゼ阻害剤、好ましくはマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含有する発酵乳製品の製造に関する。
【００１６】
単一ポリペプチド鎖ペプチドの形のメタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害物質を提供することも本発明の他の目的である。したがって、本発明による特に好ましい阻害物質は、以下のアミノ酸配列：
2006507221.tif 000002
又は実質的に相同のものを有する、配列番号１〜８で示される単一ポリペプチド鎖ペプチドからなる群から選択される。
【００１７】
本発明による他の特に好ましい阻害物質は、以下のアミノ酸配列：
2006507221.tif 000003
又は実質的に相同のものを有する、配列番号９〜１６で示される単一ポリペプチド鎖ペプチドからなる群から選択される。
【００１８】
ここで使用している「実質的に相同」という表現は、７０％を超える、好ましくは８０％を超える相同性の程度を表す。
【００１９】
前述の略語によって表されるアミノ酸は、好ましい実施形態の説明で記載されている。
【００２０】
本発明はまた、メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するための系統的、局在的又は局所的な本発明による阻害物質の使用に関する。
【００２１】
このようなメタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの活性及び／又は機能を低下させるのに有効な、ある量のメタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害物質を含む薬剤組成物を提供することが、本発明のさらに他の態様である。
【００２２】
さらに、本発明のメタロプロテイナーゼ阻害物質の他の生物活性な改良された類似体は、阻害物質のアミノ酸配列中の様々な他のアミノ酸を置換することによって得ることができる。
【００２３】
この状況では、「メタロプロテイナーゼ」という用語には、どんな種類の金属依存性タンパク質分解酵素も含まれる。したがって、この用語には、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＭＭＰ−２１、ＭＭＰ−２２、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−２５、ＭＭＰ−２６、ＭＭＰ−２７、及びＭＭＰ−２８など本出願の序論に記載されているマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれる。しかし、これらすべての酵素が同様の化学メカニズムによって働くので、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、内皮変換酵素（ＥＣＥ）及び中性エンドペプチターゼのような他の金属依存性プロテイナーゼとも関係がある。
【００２４】
したがって、こうした薬剤が、メタロプロテイナーゼ活性、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ活性に関して顕著なタンパク質分解阻害作用を示すことが驚くべきことに発見されている。本発明はまた、メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するための、本発明による阻害物質又は乳酸菌によるカゼインの加水分解によって得られたカゼイン由来ペプチドを含む組成物の使用を含む。
【００２５】
本発明による阻害物質及び阻害剤は、メタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに使用でき、したがって、癌浸潤及び転移、組織潰瘍、関節炎及び歯周炎の阻害並びに破骨細胞の阻害に適用することができる。
【００２６】
このような薬剤は、例えば、ヨーグルトのような発酵及び非発酵乳製品又は発酵乳飲料などの食品への使用に特に適している。
【００２７】
こうした薬剤はまた、歯周炎に関連するメタロプロテイナーゼ、特にマトリックスメタロプロテイナーゼの局所阻害のために、例えば、チューインガム、キャンディー又は経口サプリメントに使用することができる。同様の方法の使用では、本発明による薬剤を同じ目的で、例えば歯磨き粉又は洗口液に使用することもできる。この薬剤は、有利には例えばペットフード又はペット用おやつに使用することもできる。事実、ネコ破歯細胞性歯牙吸収病巣と呼ばれる特定のペット疾患は、ネコの顎における局所的な過敏性又はマトリックスメタロプロテアーゼの活性化によって誘発されると思われている。このように活性化されたプロテアーゼは顎骨の吸収を誘導し、最後にはペット、特にネコの歯がなくなり、また歯が不能になる。したがって、ネコ破歯細胞性歯牙吸収病巣を減少させるために本発明による阻害物質又は阻害剤の局所使用は、本発明の好ましい態様を表す。
【００２８】
材料と方法
ＨＰＬＣ／質量分析計
−  フィニガンマットイオントラップＬＣＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）
−  フィニガンマットスペクトルシステムＰ４０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）
−  フィニガンマットスペクトルシステムＡＳ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）
−  ワシントン大学でＪｏｈｎ  Ｙａｔｅｓ及びＪｉｍｍｙ  Ｅｎｇによって開発され、米国特許第５，５３８，８９７号によって保護されているＳＥＱＵＥＳＴ
−  アジレント１０５０シリーズのＨＰＬＣ用モジュール及びシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）
【００２９】
ＨＰＬＣ／ＭＳ用のカラム
−  スーパーデックス７５ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スイス、Ｄｕｅｂｅｎｄｏｒｆ）
−  カラムＣ８、２０８ＴＰ５４、孔径：３００Å、粒径：５μｍ、内径：４．６ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ（Ｖｙｄａｃ、米国カリフォルニア州Ｈｅｓｐｅｒｉａ）
−  ヌクレオシルＣ１８、孔径：１００Å、粒径：５μｍ、内径：１ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＡＧ、スイス、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ）
−  分離用Ｃ１８、２１８  ＴＰ１５２０５０、孔径：３００Å、粒径：１０〜２０μｍ、内径：５０ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ（Ｖｙｄａｃ、米国カリフォルニア州Ｈｅｓｐｅｒｉａ）
【００３０】
ペプチド合成
−  ＡＣＴ３４８オメガマルチペプチド合成機（Ｏｍｅｇａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ、米国ケンタッキー州Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ）
【００３１】
乳酸菌の培養
細菌を無菌ＭＲＳブロス中で、水浴中４０℃で撹拌しないで終夜増殖させた。終夜ＭＲＳ培養物からＵＨＴ脱脂乳を２％で播種し、３７℃で発酵が起こった。発酵乳のｐＨが４．５未満になったので、最終的に細菌を回収した。発酵乳のｐＨをＮａＯＨを用いて５．２に再調整し、２％のクエン酸三ナトリウムを加えてカゼインを可溶化させた。発酵溶液を室温で１０分間そのままにした。
【００３２】
続いて、細菌を１０分の間４℃で３’７００ｇで遠心分離し、３回洗浄し、トリス−マレイン酸緩衝液中に再懸濁させた。
【００３３】
６００ｎｍにおける吸光度１．０単位の細胞懸濁液濁度の増加が１０８細胞／ｍｌに相当すると仮定して、この懸濁液の吸光度を測定した。
【００３４】
−  緩衝液：トリス−マレイン酸（３０ｍＭ）：トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン３．６３ｇ、マレイン酸３．４８及び塩化カルシウム２．９４をＨ２Ｏ  １リットルに加え、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．５に調整した。
【００３５】
乳酸菌によるカゼイン加水分解
ＯＤ＝８０相当物又は１ｍｌ当り８＊１０９細胞（最終濃度）の細菌を３０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液に溶かしたカゼイン酸ナトリウム（４ｍｇ／ｍｌ）と一緒に水浴中３７℃でインキュベートした。試料を時間に応じて採取した（最大：５時間）。１４’０００ｇにおける遠心分離でタンパク質分解を停止させ、上清を回収した。その後の分析のために、これらの試料を−２０℃で凍結保存した。
【００３６】
−  緩衝液：トリス−マレイン酸（３０ｍＭ）：トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン３．６３ｇ、マレイン酸３．４８及び塩化カルシウム２．９４を混合し、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．５に調整し、この溶液をＨ２Ｏを用いて１リットルにした。
【００３７】
カゼイン抗原性ＥＬＩＳＡ試験
マイクロタイトレーションプレートを５０μｇ／ｍｌ濃度のカゼイン塩のコーティング緩衝液でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。
【００３８】
リン酸緩衝生理食塩水−ツイーン２０溶液を用いた４つの洗浄ステップを行ってから、各試薬を連続して加えた。魚ゼラチン緩衝液で空サイトを３０分間ブロックした。試験試料希釈液及び標準液をウサギ抗カゼインＩｇＧポリクローナル抗体（希釈１：１０’０００）と一緒に混合し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ペルオキシダーゼ標識第２抗体（希釈１：２’０００）を加え、３０分間インキュベートした。続いて、反応基質（ｏ−フェニレンジアミン、ＯＰＤ）を５〜１０分間加え、５％Ｈ２ＳＯ４（最終濃度）を用いて反応を停止させた。プレートを４９０ｎｍで読み取った。
【００３９】
−  コーティング緩衝液：Ｎａ２ＣＯ３  ７９５ｍｇ及びＮａＨＣＯ３  １．４６５ｇをＨ２Ｏ  ５００ｍｌに加えた（ｐＨ９．６）。
−  ＰＢＳ緩衝液：ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２００ｍｇ、ＫＣｌ  ２００ｍｇ及びＮａ２ＨＰＯ４十二水和物２．９をＨ２Ｏ  １リットルに加えた。
−  ＰＢＳ−ツイーン２０：ツイーン２０  ０．２５ｇをＰＢＳ  １リットルに加えた。
−  魚ゼラチン緩衝液：０．５％魚ゼラチンのＰＢＳ緩衝液。
−  基質緩衝液：クエン酸一水和物０．５１ｇ及びＮａ２ＨＰＯ４  １．８４ｇをＨ２Ｏ  １００ｍｌに加えた。使用する１５分前にＯＰＤ  ４０ｍｇ、最後にＰｅｒｈｙｄｒｏｌ（登録商標）４０μｌを加えた。
【００４０】
ロイシンアミノペプチダーゼ活性試験
Ｓａｒａｔｈら（Ｓａｒａｔｈ，Ｇ．、Ｒ．Ｄｅ  Ｌａ  Ｍｏｔｔｅ、及びＦ．Ｗ．Ｗａｇｎｅｒ．１９８９．「タンパク質分解酵素におけるプロテアーゼアッセイ法：実用的な手法（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．）」Ｒ．Ｊ．Ｂｅｙｎｏｎ及びＪ．Ｓ．Ｂｏｎｄ編．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ．２５〜５６頁）によって記載されている手順を少し手直ししてロイシンアミノペプチダーゼ活性を測定した。このアッセイをマイクロタイタープレート中で行った。各ウェル中で、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、１８０μｌ、酵素溶液１０μｌ及びＨ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）１０μｌを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。４０５ｎｍにおける吸光度を時間に応じて測定した（モル吸収係数、ε＝１０’５００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００４１】
初速は酵素濃度に比例する。吸光度の差ΔＡ４００は、酵素反応中に読み取った吸光度からブランク反応の吸光度（負の対照）を引き算したものと等しい。
【００４２】
結果は、１分当りの酵素溶液１ｍｌ当りで形成したｐ−ニトロアニリンのμｍｏｌ［Ｕ／ｍｌ］で表す。
【００４３】
１ロイシンアミノペプチダーゼ単位（ＬＡＰＵ）は、３７℃で１分当りにｐ−ニトロアニリン１マイクロモルを遊離させるのに必要な酵素の量と定義される。
【００４４】
カゼイン酸ナトリウム加水分解物からの活性画分の酵素加水分解
抗増殖特性を示す画分を、第１のステップで１％アルカラーゼを用いて５５℃で１時間サーモミキサー中６００ｒｐｍで加水分解した。第２のステップでは、加水分解物を１％酸性プロテイナーゼＡと一緒に５０℃で１時間サーモミキサー中６００ｒｐｍでインキュベートした。試料を９５℃で５分間加熱して酵素反応を停止させた。１０’０００Ｄａの基準分子量制限があるウルトラフリー（登録商標）−０．５遠心フィルターユニットを用いて最後に酵素を加水分解物から除去した。
【００４５】
ここに示した酵素のパーセント値は、酵素タンパク質含有量対加水分解物タンパク質含有量を表す。
【００４６】
ヒト腸上皮細胞（ＩＥＣ）の培養及び増殖アッセイ
−  米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得たヒトコロニー結腸腺癌細胞系ＨＴ２９（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８）。
−  安定なグルタミンを含むＤＭＥＭ、高グルコース（４．５ｇ／ｌ）（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ、ＡＭＩＭＥＤ、スイス、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ）
【００４７】
未分化細胞（継代４５〜７８）を１０％ＦＣＳを補充したグルコース含有ＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２／空気インキュベーター中３７℃で維持した。細胞単層が５０％飽和に達するまで培地を１日おきに交換した。刺激アッセイでは、ＨＴ−２９細胞を１．２＊１０４細胞／ウェルで９６ウェル平底プレート中に播いた。４日間インキュベーションした後、試料と一緒にインキュベーションする前にウェル中に存在する細胞の量を、ニュートラルレッド溶液を４つのウェルに加えてプレートを４５分間インキュベートすることによって評価した。次いで、無血清培地を用いてＨＴ−２９細胞を２回洗浄した（ニュートラルレッド溶液でウェルを満たす）。ニュートラルレッドで着色したウェルは、その後任意の培地を含まないままであった。
【００４８】
次いで、ＤＭＥＭ  ２００μｌ、無血清培地（ブランク）２００μｌ、血清を含む培地（正の対照）２００μｌ又は０．９％食塩水（負の対照）中に溶かした（加水分解した）カゼイン酸ナトリウム試料８０μｇの存在下で、ＨＴ−２９細胞をそれぞれ２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いでニュートラルレッド溶液を加え、細胞を４５分間インキュベートした。すべてのウェルを塩水で３回洗浄し、プレートをティッシュ上で軽く叩いて残留溶液を除去した。最後に抽出溶液１００μｌで色素を抽出し、５４０ｎｍで吸光度を測定した。測定した吸光度は、ウェル中に存在する細胞数と相関関係がある。
【００４９】
増殖は、カゼイン酸ナトリウム試料、無血清培地、血清含有培地又は０．９％食塩水と一緒に２４時間インキュベートした細胞の吸光度と、インキュベーション前の細胞の吸光度との差によって計算した。
【００５０】
ブランク（無血清培地でインキュベートした細胞）との吸光度の差ΔＡ５４０を標準化した。次いで結果をブランクに対するパーセント値で表した。
【００５１】
−  血清を含む培地：ＤＭＥＭに１０％非働化ＦＣＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した。この溶液を無菌ろ過（φ２２μｍ）した。
−  培地、無血清：ＤＭＥＭに１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した。この溶液を無菌ろ過（２２μｍ）した。
−  抽出溶液：１％酢酸、５０％ＥｔＯＨ水溶液。
−  ニュートラルレッド保存溶液：ニュートラルレッド６１７ｍｇを０．９％ＮａＣｌ溶液１００ｍｌ中に溶解した。この溶液を１２０℃で１５分間オートクレーブにかけ、遮光ボトル中４℃で保存した。
−  ニュートラルレッド溶液：ニュートラルレッド保存溶液を３：１０で無血清ＤＭＥＭ中に希釈する。この溶液をアッセイに用いる。
【００５２】
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を５６℃で３０分間非働化した。
【００５３】
乳酸デヒドロゲナーゼ細胞毒性試験
製造業者の推奨基準（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にしたがって細胞生存度を厳密に測定した。この試験は、上清中の損傷した細胞の細胞質ゾルから放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の測定に基づいている。
【００５４】
ゲルパーミエーションによる加水分解物の分画
定組成溶出によりスーパーデックス７５カラムを用いて、溶媒として５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７を用いて６５分間試料を分析した。流速は１７〜１９バールの圧力で０．５ｍｌ／分であった。２８０及び２１５ｎｍで検出を実施した。
【００５５】
分離する前に、試料を９０℃で５分間加熱し、ベンチ遠心機中で１４’０００ｇで遠心分離した。次いで、上清１００μｌを分析及び分離用に注入した。画分をそれらの分子量に応じて捕集した。
【００５６】
最後に、捕集した画分の凍結乾燥及びＨ２Ｏへの再懸濁を２回行ってから最終的な凍結乾燥を行った。この手順によって、どんな微量の酢酸アンモニウムも確実になくなるはずである。
【００５７】
ＨＰＬＣ溶媒を無菌ろ過（φ２２μｍ）し、少なくとも５分間超音波処理して気泡を除去した。
【００５８】
Ｃ８カラムを用いた逆相クロマトグラフィーによる加水分解物の分画
カゼイン塩加水分解物１００μｌをスーパーデックス７５カラム上で分画したので、得られた凍結乾燥ゲルパーミエーション画分をＨ２Ｏ  １００μｌに再懸濁して、細胞増殖の阻害試験を行った。したがって、画分中の各ペプチド濃度は、最初の加水分解物試料中のペプチド濃度と比較することができた。
【００５９】
分子量が５’０００〜１’０００Ｄａの試料（１００μｌ）を、Ｃ８カラムを用いて以下のように溶媒Ａ中で溶媒Ｂの濃度勾配を直線的に増大させて分析した：定組成溶出を０％Ｂで５分、０〜５０％Ｂで６０分、５０〜１００％Ｂで１分、１００％Ｂで４分、１００％Ａに替えて１分、また最後に１００％Ａで９分間再平衡化させた。
【００６０】
分子量が１’０００Ｄａ未満の試料（１００μｌ）を、Ｃ８カラムを用いて以下のように溶媒Ａ中で溶媒Ｂの濃度勾配を直線的に増大させて分析した：定組成溶出を０％Ｂで５分、０〜３５％Ｂで６０分、３５〜１００％Ｂで１分、１００％Ｂで４分、１００％Ａに替えて１分、また最後に１００％Ａで９分間再平衡化させた。
【００６１】
両方の分析を行った合計時間は８０分であり、流速は１０５〜１２０バールの圧力で０．８ｍｌ／分に達した。注入量は１００μｌであった。クロマトグラフ分離に続いて、画分を２．５分毎に捕集した（体積２ｍｌ）。捕集した画分の凍結乾燥及びＨ２Ｏへの再懸濁を２回行ってから最終的な凍結乾燥を行った。この手順によって、どんな微量のトリフルオロ酢酸も確実になくなるはずである。
【００６２】
最後に、凍結乾燥した画分をＨ２Ｏ  １００μｌ中に再懸濁して、分画前と分画後の各ペプチド濃度を確実に同じにする。
【００６３】
ＨＰＬＣ溶媒を無菌ろ過（φ２２μｍ）し、少なくとも５分間超音波処理して気泡を除去した。
−  溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液
−  溶媒Ｂ：０．０４５％ＴＦＡ、８０％アセトニトリル水溶液
【００６４】
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
ＧＰＣ法によって分離したペプチドを、ＳｐｅｃｔｒａＳｙｓｔｅｍ  ＨＰＬＣを用いて、ＥＳＩソースを備えたフィニガンＬＣＱイオントラップ質量分析計につないだＣ８又はＣ１８カラムで特徴付けた。ＨＰＬＣシステムは、４個１組のポンプ（ＴＳＰ  Ｐ４０００）、オートサンプラー（ＴＳＰ  ＡＳ３０００）及び高圧フローセル（容積１．６μｌ、経路長２ｍｍ）を備えたＵＶ／ＶＩＳ検出器（Ｌｉｎｅａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のＵＶ／ＶＩＳ  ２０５）で構成されている。ＨＰＬＣフローは、マイクロフロースプリッタにつないだ０．００５”ＩＤ  ＰＥＥＫによって誘導され、１０％がＭＳに行き、９０％が画分コレクターに捕集された。製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いてＭＳ装置を調整し較正した。ＥＳＩソースを４．５ｋＶで操作し、界面キャピラリーヒーターを２００℃に設定した。シースガスフローの流速を５０ｍｌ／分に維持した。
【００６５】
すべてのスペクトルを正モードで得て、単位質量分解能で記録した。３５％でプリセットしたＣＩＤに対する相対衝突エネルギー及び単離幅１ｍ／ｚ単位で自動ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。自動運転中、特定の閾値より上でスキャン中にイオンが存在した場合、生成イオンスペクトルが得られた。最も豊富なイオンの２つの生成イオンスペクトルをスキャンした後、さらなるＭＳ／ＭＳスキャンを開始するためにそれを除去した（Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアパッケージの「ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ」オプション）。特定の閾値よりも依然として高い場合、２番目に豊富なイオンによって、生成イオンスペクトル獲得が再度開始され得る。ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎにより、クロマトグラフィーによって完全に分解されていないピークのペプチド混合物のＭＳ／ＭＳスペクトルの生成が可能になる。質量分析計は、イオン強度が閾値未満に低下するまで、ＭＳとＭＳ／ＭＳモードとの間で交互に切り替え続けた。スキャン範囲は、ｍ／ｚ１５０．０〜２０００．０に設定した。
【００６６】
データ分析
フルスキャンＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータ獲得並びに分析を、ＳＥＱＵＥＳＴ（商標）データベースサーチ用のＢｉｏｗｏｒｋｓ  Ｖ１．０ソフトウェアパッケージを含むＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアＶ１．０  ＳＲ１（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）で行った。
【００６７】
実験で得たペプチドの質量を、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈにおけるＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘＰＡＳｙ分子生物学サーバーからアクセス可能なＰｅｐｔＩｄｅｎｔ（ペプチド質量フィンガープリント法）及びＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓプログラムを用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質データベースと比較した。
【００６８】
ＳＥＱＵＥＳＴ（商標）プログラムを用いてＭＳＭＳスペクトル分析を行った。これは、ペプチドの解釈されていないＭＳＭＳスペクトルをタンパク質及びヌクレオチドデータベースからのアミノ酸配列と関連付ける。この相関関係に基づいてアミノ酸配列を決定し、したがって質量スペクトルに対応するタンパク質が分析される。より多くの情報を、ＳＥＱＵＥＳＴ（商標）インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｔｈｏｍｐｓｏｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔで得ることができる。
【００６９】
ペプチド合成手順
すべてのペプチド（４００〜５００ｍｇ）をＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈペプチド合成機ＡＣＥ  ３４８オメガで合成した。アミノ酸のα−アミノ官能基は、塩基不安定性フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）並びに酸不安定性保護基を有する三官能性アミノ酸の側鎖、すなわちＡｒｇ（Ｂｏｃ）２、Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）及びＡｓｎ（Ｍｔｔ）で保護されている。
【００７０】
一般に、ペプチド合成の前に、樹脂を３０分間ジクロロメタン（ＤＣＭ）中に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−ストラテジー１８０を適用したＳａｓｒｉｎ樹脂への逐次アミノ酸カップリングによってペプチドを構築した。公表されている自動ペプチド合成の手順によれば、脱保護／カップリングサイクルには、Ｉ）カップリング試薬としてベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ、２．５ｅｑ）及び塩基としてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、５ｅｑ）を含むＤＭＦ中のＦｍｏｃアミノ酸誘導体（２ｅｑ）の１０分間の脱保護が含まれる。
【００７１】
樹脂からのペプチドの切断は、２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＤＣＭ溶液で２０分間行った。処理後、樹脂をろ過によって分離し、ろ液を真空で濃縮した。側鎖保護を完全に除去するために、ペプチドをＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水（９０：５：５、ｖ／ｖ）のカクテルで処理した。１時間後、冷ジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって捕集し、水／アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）溶液から凍結乾燥して無色の固体を得た。
【００７２】
凍結乾燥後、２０％Ａ〜６０％Ａ（Ａ：０．９％ＴＦＡのアセトニトリル溶液、Ｂ：１０％Ａの水溶液）の直線勾配を流速８０ｍｌ／分で３０分間にわたって使用してＣ１８カラムで分離用ＲＰ−ＨＰＬＣによって粗製生成物を精製した。溶出液を波長２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニターし、適切な画分を捕集し凍結乾燥させた。ペプチドを電気スプレー電離質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）及び分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。
【００７３】
アンギオテンシン変換酵素阻害試験
この手順は、合成トリペプチド基質Ｎ−［３−（２−フリル）アクリロイル］−Ｌ−フェニルアラニルグリシルグリシン（ＦＡＰＧＧ）を利用した高速分光光度法である。Ｋｍ値：０．３ｍＭ。
【００７４】
ＦＡＰＧＧを加水分解してフリルアクリロイルフェニルアラニン（ＦＡＰ）とグリシルグリシンを得た。ＦＡＰＧＧの加水分解の結果、３４０ｎｍにおける吸光度が減少した。
【００７５】
製造業者の推奨にしたがってＡＣＥ試薬及びＡＣＥ標準物質を溶解させた。
【００７６】
このアッセイは、石英キュベットで行った。ＡＣＥ試薬溶液０．０５ｍｌ、カゼイン加水分解物０．０５ｍｌ及びＡＣＥ標準物質０．０５ｍｌを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
【００７７】
３４０ｎｍにおける吸光度を時間に応じて測定した。
【００７８】
試料の反応速度とＡＣＥ標準物質で得た反応速度を比較することによって、試料中のＡＣＥ活性を決定した。この結果は、対照に対するパーセント値で表す。
【００７９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害試験
このアッセイは、マイクロタイタープレートで行った。各単一ウェル中で、酵素１μｌ、所望の濃度の阻害物質及び最後に基質５μｌをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）に加えた、最終体積：２００μｌ。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。蛍光の増大を連続的に記録した。４８５ｎｍで励起し、発光を５３０ｎｍで読み取って、増加が４０であった。
【００８０】
−  阻害物質：−  ｏ−フェナントロリン：ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）２５μｌに９．９ｍｇ溶かす  →  １μｌ加える（最終濃度：１０ｍＭ）
−  異なる濃度の合成阻害物質
−  基質：    ＤＱゼラチン：ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ  →  反応物（反応体積：２００μｌ）に５μｌを加える（最終濃度：２５ｍＭ）
−  酵素：−  ＭＭＰ−７：保存溶液：１Ｕ／μｌ
−    ＭＭＰ−２：保存溶液：０．０５μｇ／μｌ
−    ＭＭＰ−９：保存溶液：０．０５μｇ／μｌ
【００８１】
結果と考察
Ｌｂ．ヘルヴェティクス（Ｌｂ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４を用いたペプチドライブラリの生成
乳製品で使用される様々なＬＡＢを代表するいくつかのＬＡＢを用いた先行試験の後、Ｌｂ．ヘルヴェティクスＮＣＣ  ６１９株を選択して緩衝系でカゼイン酸ナトリウムを加水分解した。カゼイン塩加水分解は、３７℃で５時間起こった。時間に応じて試料を採取し、細菌の遠心分離及び上清の回収によってタンパク質分解を停止した。異なる時間に採取したカゼイン塩加水分解物が、以下で研究するペプチドライブラリを構成していた。
【００８２】
ロイシンアミノペプチダーゼ試験
この試験は、カゼイン塩加水分解が細胞外ＬＡＢプロテイナーゼの作用であって、ペプチダーゼ活性の結果ではないことをチェックするために行った。ＬＡＢは、タンパク質の分解における最初のステップを行う特異的な細胞壁関連プロテイナーゼを示す。しかし、多くのペプチダーゼは、細菌の細胞質ゾルに見られ、発酵培地中へのそれらの放出の原因が膜漏出の可能性がある。
【００８３】
ロイシンアミノペプチダーゼによって触媒されるロイシンｐ−ニトロアニリンのｐ−ニトロアニリンへの変換を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡによってあらかじめ分析した試料について測定した。
【００８４】
この分析から、カゼイン塩加水分解中にアミノペプチダーゼは細菌の細胞質ゾルから培地へほとんど放出されなかったことが実証された。
【００８５】
アミノペプチダーゼによるカゼインの全加水分解はかなり少なく、発酵５時間後で約１％に達した。したがって、カゼインの加水分解は、ほぼ独占的にセリン型細胞外細菌プロテイナーゼからもたらされていた。
【００８６】
ペプチドライブラリの特徴付け
質量分析と併せて液体クロマトグラフィーを用いて、Ｌｂ．ヘルヴェティクスＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４によって生成したカゼイン由来ペプチドライブラリを特徴付けた。
【００８７】
ＨＰＬＣによる分画
カゼイン塩加水分解物の分画のために選択したストラテジーを２つのステップで設定した。
【００８８】
第１の分画は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって分子量ベースで生じた。第２の分画は、Ｃ８逆相クロマトグラフィーカラムとのカゼイン由来ペプチドの疎水性相互作用に基づいていた。
【００８９】
・スーパーデックス７５ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
分子量標準を用いて、スーパーデックス７５について保持時間を実験した。
【００９０】
最後に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いたカゼイン塩加水分解物の分離後に７つの画分を捕集した。
【００９１】
【表１】
2006507221.tif 000004
表１：スーパーデックス７５ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で実施した第１の分画ステップの結果
【００９２】
・Ｃ８逆相クロマトグラフィー
逆相クロマトグラフィーを用いてＧＰＣから得た画分６（５’〜１’０００Ｄａ）及び７（＜１’０００Ｄａ）をさらに分画した。
【００９３】
試料の特徴付けのために、質量分析と併せて逆相クロマトグラフィーを使用した。ＨＰＬＣフローは、マイクロフロースプリッタに誘導され、１０％がＭＳに行き、９０％が画分コレクターに捕集された。したがって、質量分析及び画分の捕集は、同じ実験で行われ、捕集した各画分の正確な定性的なペプチド組成の決定が可能になる。時間に応じて２．５分毎に３２個の画分を捕集した。
【００９４】
逆相分離によって、約５００個のペプチドの同定がもたらされた。質量分析及び特にＭＳ／ＭＳデータを用いてすべてのペプチドを分析し特徴付けた。
【００９５】
加水分解物の低分子量ペプチド画分の質量分析による特徴付け
ＧＰＣから得た画分６及び７中のカゼイン由来ペプチドのＥＳＩ−ＭＳ検出と併せた逆相ＨＰＬＣによって、５００個以上のペプチドの同定がもたらされた。
【００９６】
ペプチドの断片化パターンは、最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ分析によって得られた。タンパク質同定を行うために、質量分析断片化パターンを用いてタンパク質データベースをサーチした。この作業は、ＳＥＱＵＥＳＴブラウザー（登録商標）ソフトウェアを用いて行った。このツールにより、タンパク質データベース中の文字ベースで表現されたアミノ酸配列を断片化パターンに変換でき、それを標的ペプチドについて生成したＭＳ／ＭＳスペクトルと比較した。
【００９７】
アルゴリズムによって、測定したペプチドの質量と適合したデータベース中のアミノ酸配列が最初に同定され、ＭＳ／ＭＳスペクトルに対して断片イオンが比較され、各アミノ酸配列について予備スコアが生成された。次いで、実験スペクトルに対して理論的な、再構築したスペクトルを相関させることによって、上位５００個の予備スコアリングペプチドについて相互相関分析を行った。次いで最も優れたスコア及び対応するペプチドを提案した。
【００９８】
断片化パターンは、ｍ／ｚ１０５３．３及びｍ／ｚ７３０．８における生成イオンの優性を示す。これらの２つの強いシグナルは、プロリン付近の内部切断から生じる断片に対応し；最も強いシグナルは、プロリンからＣ末端の方向への伸展に対応する。さらに、我々は、ｂ型（ｂ２；ｍ／ｚ２９２．２、ｂ３；ｍ／ｚ４２１．４、ｂ５〜ｂ７；ｍ／ｚ６１７．７、７３０．８、７８７．９、ｂ９〜ｂ１１；ｍ／ｚ９８４．、１１４０．３、１１９７．４及びｂ１３；ｍ／ｚ１４４１．７）及びｙ型（ｙ３−ｙ１４；ｍ／ｚ３４２．５、４８９．６、５８６．８、６４３．８、８００．０、８９９．１、９９６．２、１０５３．３、１１６６．５、１２５６．６、１３６２．７、１４９１．８）イオンの両方の生成を確認した。これらのタイプのイオンは、低エネルギー衝突誘導性解離で優性に生じる。
【００９９】
これらすべての情報は、提案したペプチド配列の有効性を実証している。これは、特徴付けたすべてのペプチドについて類似の方法で処理した。明らかに特定できるｂ又はｙ型イオンがない断片化パターンを排除した。
【０１００】
質量分析を用いたペプチドライブラリの特徴付けにより、５００個の低分子量ペプチドの同定が可能になった。
【０１０１】
結論として、我々は、Ｌｂ．ヘルヴェティクスＮＣＣ  ６１９株が、上記の表で示したような生物活性を示すペプチドを生成し得る確証がある。この株は、質量分析によってすべて特徴付けた５０００個以上の低分子量ペプチドも生成した。２〜２８アミノ酸のペプチドを含むこのペプチドライブラリは、後述に示すような新しい生物活性の潜在能力も示した。
【０１０２】
この研究で作成したペプチドライブラリは、ランダムな合成ペプチドライブラリほど広くなく、或いはファージディスプレイライブラリほどでもない。しかし、同定したペプチドは、カゼインの完全なタンパク質配列を包含する。広範な特異性を示す酵素によって得たタンパク質分解ペプチドライブラリは、重複するアミノ酸配列をもつ様々な長さのペプチドを生成する利点があり、したがって正しいヒットの機会が増加する。
【０１０３】
カゼイン塩加水分解物の生物学的活性
細胞増殖試験
ヒト大腸癌細胞系ＨＴ−２９に対するカゼイン塩加水分解物の作用を調べた。この実験構成は、細胞に対する直接的な、発酵乳又は発酵乳画分の作用を研究するのが可能な実験モデルを提供する。
【０１０４】
第１のスクリーニングでは、Ｌｂ．ヘルヴェティクスＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４と共に１、２及び５時間発酵したカゼイン塩加水分解物と一緒にＨＴ−２９細胞を２４時間インキュベートした（表２）。すべてのアッセイを三通り行った。カゼイン塩加水分解物と一緒にインキュベーションした前後に細胞数を測定し、細胞増殖の阻害と細胞死の誘導の区別を可能にした。
【０１０５】
血清を含まない細胞培地中のＨＴ−２９で観察された細胞増殖を標準化した。正の対照として、細胞をウシ胎児血清の存在下で培養した。この血清は様々な増殖因子を含んでいる。最後に、負の対照として、細胞を任意の細胞培地を含まない生理食塩水中で２４時間インキュベートした。試料と一緒に２４時間インキュベーションした後、ニュートラルレッドを用いて細胞を染色した。
【０１０６】
事実、超生体染色ニュートラルレッドは、弱カチオン性であり、したがってアニオン性サイトと結合することによって細胞質内液胞及び顆粒の生細胞によって活発に濃縮される。これは、９６ウェルプレート中で細胞増殖を測定するのに好都合で再現性のあるアッセイとして記載されている。
【０１０７】
【表２】
2006507221.tif 000005
表２：ＨＴ−２９細胞の増殖に対するカゼイン塩加水分解物の効果。結果は、対照（−血清）に対するＯＤ（５４０ｎｍで測定したＯＤ）のパーセント値で表す。
【０１０８】
相補対照として、最初の基質のカゼイン酸ナトリウムも、カゼイン塩加水分解中に使用した緩衝液のトリス−マレイン酸も、ＨＴ−２９細胞増殖に対して任意の負の効果がなかったことをチェックした。
【０１０９】
表２からわかるように、カゼイン酸ナトリウム並びにトリス−マレイン酸は、細胞増殖に対して活性を示さなかった。
【０１１０】
しかし、１及び２時間発酵させたカゼイン塩加水分解物は、高い抗増殖性活性を示した。この活性は、５時間加水分解をした後消失した。
【０１１１】
この個々の特徴は、抗増殖因子にはカゼイン塩加水分解中に生成するものもあることを示している。次いで、それらはそれらの順番（ａｔ  ｔｈｅｉｒ  ｔｕｒｎ）で消化され、それらの生物活性を失くし、５時間の発酵でのカゼイン塩加水分解物の抗増殖特性の消失が説明される。したがって、加水分解物中に存在する抗増殖因子は、おそらくタンパク質起源である。
【０１１２】
この仮説を調べた（表３）。抗増殖活性を示す画分を、２種類の市販されている酵素であるアルカラーゼ及びプロテイナーゼＡによって連続的に消化した同一画分と平行して試験した。
【０１１３】
【表３】
2006507221.tif 000006
表３：ＨＴ−２９細胞の増殖に対するカゼイン塩加水分解物の効果。結果は、対照（−血清）に対するＯＤ（５４０ｎｍで測定したＯＤ）のパーセント値で表す。ＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４、１ｈ：Ｌｂ．ヘルヴェティクスＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４と一緒に１時間発酵させたカゼイン塩加水分解物；ＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４  １ｈ、ΔＴ：熱処理したカゼイン塩加水分解物；（Ｅ、ΔＴ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４  １ｈ：熱不活性化酵素を加えた無処置カゼイン塩加水分解物；（ＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４  １ｈ＋Ｅ）ΔＴ：さらに酵素で加水分解し、最後に酵素不活性化のために熱処理したカゼイン塩加水分解物。
【０１１４】
表２に示したデータは、活性画分の大腸癌細胞系ＨＴ−２９の増殖に対する効果を示し、この画分は、市販されている酵素によってさらに消化される。酵素は加熱によって阻害した。
【０１１５】
この特定の実験では、Ｌｂ．ヘルヴェティクスＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４と一緒に１時間発酵させたカゼイン塩画分は、７２％（これまでは７７％）の増殖阻害を伴う再現可能な阻害作用を示した（表２及び表３）。
【０１１６】
アルカラーゼ及びプロテイナーゼＡでさらに酵素処理された同一の画分は、その抗増殖特徴を失った。
【０１１７】
この結果を確立するために、我々は、最終加熱ステップが生物活性の損失の原因でないことをチェックした。
【０１１８】
原因因子がタンパク質起源であると仮定した場合、試料の加熱により活性蛋白質の立体構造に変化が誘導され、細胞増殖メカニズムに関与していると見なされている受容体によって言及した蛋白質が認識されない可能性がある。したがって、活性画分は酵素処理を受けずに加熱された。この加熱画分の細胞増殖に対する効果は、すべての点で非加熱加水分解物のものと類似していた。この試験中に熱不活性化酵素の任意の干渉を排除するために、活性画分を熱不活性化酵素と混合し、試料の活性を影響されないままにした。
【０１１９】
この段階では、我々は、カゼイン塩加水分解中に乳酸菌株によって生成された活性タンパク質因子又はカゼイン由来ペプチドを識別することができなかった。試料の質量分析を行ったときにこの識別をすることになる。
【０１２０】
カゼイン由来加水分解物は細胞毒性ではない
ヒト大腸癌細胞系で観察された抗増殖効果が、ネクローシスの誘導の観察結果ではないことを確かめるために、細胞毒性試験を行った。細胞毒性を測定するための最新のアッセイは、通常生細胞によって排除される原形質膜透過性の変化及びその結果として生じる細胞質酵素の放出又は色素の取り込みに基づいている。我々はここで、損傷した細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の測定を選択した（表４）。
【０１２１】
【表４】
2006507221.tif 000007
表４：カゼイン塩加水分解物のＨＴ−２９細胞に対する細胞毒性能力の測定。
結果は、対照（溶解産物）に対するＯＤ（４９０ｎｍで測定したＯＤ）のパーセント値で表す。
【０１２２】
カゼイン塩加水分解物と一緒に２４時間インキュベートした細胞の任意の培地中でＬＤＨ活性は検出されなかった。この試験に基づいて、我々は、カゼイン酸ナトリウム加水分解物が細胞透過性を変化させることもネクローシスを誘導することもないことを主張することができる。
【０１２３】
しかし、細胞を生理食塩水だけでインキュベートした場合ＬＤＨ活性はほとんど観察されず、厳しい培養条件の結果としてわずかな膜変化が起こったことを示す。
【０１２４】
したがって、これらの最後の結果を考慮すると、我々は、減少した大腸癌細胞系増殖を誘導するカゼイン酸ナトリウム加水分解物が細胞毒性ではないことを知っていた。
【０１２５】
ＧＰＣ画分による細胞増殖の阻害
最初の増殖試験の結果を考慮すると、Ｌｂ．ヘルヴェティクスＣＮＣＭ  Ｉ−２８６４と一緒に１及び２時間発酵させた加水分解物は抗増殖特徴を有することがわかった。
【０１２６】
表５では、我々は、２時間発酵させて分子量ベースで分離したカゼイン塩加水分解物の画分を試験したときに経験した細胞増殖を示す。
【０１２７】
【表５】
2006507221.tif 000008
表５：ＨＴ−２９細胞の増殖に対するカゼイン塩加水分解物のゲルクロマトグラフィー画分（２時間発酵）の効果。結果は、対照（−血清）に対するＯＤ（５４０ｎｍで測定したＯＤ）のパーセント値で表す。
Ｆ１：４５’〜４０’０００Ｄａペプチド；Ｆ２：４０’〜３５’０００Ｄａ；Ｆ３：３５’〜２５’０００Ｄａペプチド；Ｆ４：２５’〜１５’０００Ｄａペプチド；Ｆ５：１５’〜５’０００Ｄａペプチド；Ｆ６：５’〜１’０００Ｄａペプチド；Ｆ７：ペプチド＞１’０００Ｄａ。Ｃ２  Ｒｅｃｏｎｓｔ．：Ｆ１〜Ｆ７のベースで再構築した画分。
【０１２８】
ＧＰＣから得た画分Ｆ１〜Ｆ５は、４５’〜５’０００Ｄａの範囲の分子量を有するペプチドを現す。これらの画分は、抗増殖因子を含まず、或いはこれらは検出に不十分な量で存在していた。
【０１２９】
これに反して、ＧＰＣから得たＦ６（ペプチド：５’〜１’０００Ｄａに対応）及びＧＰＣから得たＦ７（ペプチド＜１’０００Ｄａ）は、重要な抗増殖活性を示し、さらに調査した。
【０１３０】
中性酢酸アンモニウム溶液を用いた定組成分画が、生物学的活性を確実に保存する温和な技術であることについて我々はさらに注目している。事実、我々は、再構築した画分（Ｃ２  Ｒｅｃｏｎｓｔ．）が分離前と同一の活性を示したように、加水分解物の分離によって生物学的活性を失わなかった（表４）。
【０１３１】
質量分析によって試料を分析した。我々は、各サブ画分の正確なペプチド含有量を知っていた。質量分析を用いて、抗増殖能力を示すが、不活性画分でもある画分を特徴付けた。したがって、我々は、抗増殖性活性を示した試料由来のわずかに活性なすべてのサブ画分中に存在するが、説明した生物活性を示さない試料中に不在のペプチド配列を調査した。
【０１３２】
この調査を行い、その結果を図１に示す。２つの候補が同定された。一方の配列はα−Ｓ１由来であり、もう一方はβカゼイン由来であった。
【０１３３】
不活性画分中に回収した候補領域のペプチドは黒色で示すが、サブ画分２４〜２７に特徴付けられ、活性を示すペプチドは、灰色で示す。
【０１３４】
候補活性領域を化学的に合成するための決定を行った。
【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
ペプチド合成
ＥＰＦＬ、ＬａｕｓａｎｎｅのＤｒ．Ａ．Ｒａｚａｎａｍｅによって、Ｆｍｏｃ−固相ペプチド合成ストラテジーを用いてペプチド配列ＶＥＮＬＨＬＰＬＰＬＬ、ＥＮＬＨＬＰＬＰＬＬ、ＮＬＨＬＰＬＰＬＬ及びＬＮＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ、ＮＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ、ＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ、ＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧが化学的に合成された。
【０１３７】
α−Ｓ１カゼイン配列をＣ末端でフェニルアラニンからグリシンに伸張したのは、化学的な実用的な目的のためであった。
【０１３８】
合成ペプチドによる増殖の阻害
ＨＴ−２９細胞系について試験した合成ペプチドは、それらの抗増殖能力を裏付けた。
【０１３９】
試験したペプチドＬＮＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ（αＳ１  ３１〜４８）は、増殖を強く阻害した（表６）。前述のペプチドの短いバージョン：ＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ（αＳ１  ３３〜４８）を用いて同じ実験を行った。最も優れた抗増殖性の結果は、２〜４マイクロモル濃度で得られ、ＬＮＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ（データを示さず）について観察されたものと類似の抗増殖性パターンを示す。このデータに基づいたこの特定の配列では、Ｎ末端伸張が生物学的活性を保存することがわかった。
【０１４０】
【表７】
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表６：ＨＴ−２９細胞の増殖に対するα−Ｓ１由来合成ペプチド：ＬＮＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ（αＳ１  ３１〜４８）の効果。結果は、対照に対するカウントのパーセント値で表す。
【０１４１】
ＭＭＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
我々は、ＭＭＰ−２、−７及び−９に着目することを選択した。第１に、ＭＭＰ−９は、乳腺、結腸直腸、肺、前立腺、脾臓及び卵巣腫瘍に関与している。その発現は、放射状の増殖期から垂直方向の増殖期への変換及びその後の転移に密接に関連している。第２に、ＭＭＰ−２は、乳腺、結腸直腸、肺、前立腺、脾臓及び卵巣腫瘍に関与している。その発現の増大は進行性腫瘍の程度を示唆する。最後に、ＭＭＰ−７は、乳腺、結腸直腸、肺及び前立腺腫瘍に関与している。ＭＭＰ−７は、腫瘍発生の初期段階に関与している。
【０１４２】
合成ペプチドの両方のファミリー：カゼインα−Ｓ１由来の４種類のペプチド及びβカゼイン由来の３種類を、ＭＭＰ阻害物質としてのそれらの潜在能力について試験した。
【０１４３】
正の対照として、我々は、広範なメタロプロテイナーゼ阻害物質であるｏ−フェナントロリンを試験し、それは完全なＭＭＰ阻害を１０ｍＭ濃度で示した（データを示さず）。
【０１４４】
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７及びＭＭＰ−９阻害に関する阻害データ（表７）から、βカゼイン由来のペプチドのＮ末端長が増大すると共に阻害活性が増大することがわかった。
【０１４５】
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７について、我々は、ＥＮＬＬＲＦＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧ配列のＮ末端伸長に伴って阻害能力が増大したことを観察している。しかし、この傾向はＭＭＰ−９の場合に確認されていない。さらに、ＦＶＡＰＦＰＥＶＦＧは、試験した３種類すべてのＭＭＰについて同等の阻害能力を示した。
【０１４６】
一般に、我々は、比較的高いＩＣ５０値の差をＭＭＰ−７とＭＭＰ−９又はＭＭＰ−２の間で観察する可能性がある。これらの差は、これらの酵素の間の構造の違いによって説明できるかもしれない。実際に、ＭＭＰ−７は、ヘモペキシン様ドメインを欠乏している。このドメインは、基質結合及び／又は特異的ＭＭＰタンパク質阻害物質のファミリーであるメタロプロテイナーゼの阻害物質（ＴＩＭＰ）との相互作用で機能的な役割を果たすことがわかっている。
【０１４７】
【表８】
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表７：フルオレセイン結合ゼラチンを用いたＭＭＰの阻害についてのＩＣ５０［μＭ］
【０１４８】
ＡＣＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
ＡＣＥが、マトリックスメタロプロテイナーゼも含むファミリーである、ＨＥＸＸＨ短結合コンセンサス配列を含有するプロテイナーゼのｚｉｎｃｉｎファミリーに属することに注意することは重要である。
【０１４９】
したがって、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害物質は、他の亜鉛メタロプロテイナーゼと干渉するかもしれない。我々は、ＭＭＰ−阻害ペプチドをそれらのＡＣＥ阻害能力について
試験することに決定した。
【０１５０】
【表９】
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表８：合成トリペプチド基質Ｎ−［３−２（フリル）アクリロイル］Ｌ−フェニルアラニルグリシルグリシンを用いたＡＣＥの阻害についてのＩＣ５０［μＭ］。
【０１５１】
表７及び表８のデータから、我々は、ＡＣＥとＭＭＰ−９の両方の阻害に関するα−Ｓ１由来ペプチドの類似の挙動に気が付いた。
【０１５２】
βカゼイン配列由来のペプチドによってＭＭＰ−９及びＡＣＥの阻害についての同一の挙動が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】共通のアミノ酸配列を示すＧＰＣで得られた画分６のＲＰ−ＨＰＬＣサブ画分２４〜２７のペプチド配列を示す図である。不活性画分中に回収した候補領域のペプチドは黒色で示すが、サブ画分２４〜２７に特徴付けられ、活性を示すペプチドは、灰色で示す。Ａは、α−カゼインを意味し、Ｂは、β−カゼインを意味する。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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