(57)【要約】ヒト４−１ＢＢに結合し、ヒト４−１ＢＢのヒト４−１ＢＢリガンドへの結合を可能にするヒト化抗体。一つの側面において、該抗体はＩｇＧ４抗体である。患者の癌を処置する方法であって、治療学的有効量の該抗体を該患者に投与することを含む方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト４−１ＢＢに結合し、ヒト４−１ＢＢのヒト４−１ＢＢリガンドへの結合を可能にするヒト化抗体。
【請求項２】
軽鎖および重鎖を含み、
該重鎖が、配列番号５のアミノ酸５０〜５４を含むＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸６９〜８５を含むＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸１１８〜１２２を含むＣＤＲ３を含み、
該軽鎖が、配列番号８のアミノ酸４４〜６０を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸７６〜８２を含むＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸１１５〜１２３を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＩｇＧ４抗体である、請求項２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
配列番号５および配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
患者の癌を処置する方法であって、治療学的有効量の請求項１に記載の抗体を該患者に投与することを含む方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号３のヌクレオチド６９３〜２０７２、および
（ｂ）配列番号６のヌクレオチド６３３〜１０３４および１４０９〜１７２６
よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化抗体、さらに詳細にはヒト４−１ＢＢに対するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大な証拠が、癌に対してある程度の免疫がヒトおよび動物に存在することを疑いの余地なく示している。癌患者では、免疫系の細胞成分は、腫瘍細胞によって発現される抗原、たとえば分化または癌胎児性抗原、あるいは突然変異した遺伝子産物を認識することができる（S. Rosenberg, Nature, 411:380 (2001)）。多くの臨床研究は、腫瘍浸潤性のリンパ球が有利な予後的意義を有することを示している（E. Halapi, Med. Oncol., 15:203 (1998); J. Resserら、Curr. Opin. Oncol., 10:226 (1998); D. Elder, Acta Oncol., 38:535 (1999); L. Zhangら、New Engl. J. Med., 348:203-213(2003)）。さらに、イムノモデュレーター（細菌産物またはサイトカインなどの生物学的応答の修飾因子（modifiers））を用いた臨床結果は、多くの患者で腫瘍の退縮に導いた（S. A. Rosenberg, Cancer J. Sci. Am. 6 (S):2 (2000); P. Bassi, Surg. Oncol. 11:77 (2002); Fishman M,およびS. Antonia, Expert Opin Investig Drugs. 12:593 (2003)）。これら応答にもかかわらず、癌に対する免疫はしばしば腫瘍細胞を有効に排除することができない。免疫の失敗の既知の原因に腫瘍上でのコスティミュラトリー分子の欠如があり、これが腫瘍細胞がＴ細胞を有効に刺激することができないという結果となる。腫瘍抗原認識および免疫エフェクター機能に対する要件についての本発明者らの理解の最近の進歩は、抗腫瘍免疫応答を促進する可能な成功した戦略が補助分子によりコスティミュレーションを提供していることを示している。
【０００３】
現在のＴ細胞活性化のモデルは、全活性化の誘発のためにはナイーブなＴ細胞が２つのシグナルを必要とすることを仮定している：すなわち、Ｔ細胞レセプターに提示されたプロセシングされた抗原の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子による結合により提供されるシグナル（シグナル１）；およびＴ細胞表面上のコスティミュラトリー分子と抗原提示細胞上のそのリガンドとの相互作用により提供されるさらなるシグナル（シグナル２）（D. Lenschowら、Annu. Rev. Immunol., 14:233-258, (1996); C. Chambersら、Curr. Opin. Immunol., 9:396-404 (1997)）。ナイーブなＴ細胞による抗原の認識は、それ自体ではＴ細胞活性化を引き起こすには不十分である。第二のコスティミュラトリーシグナルなしでは、Ｔ細胞はその死を促進することによってまたはアネルギーを誘発することによって排除されてしまう（A. Abbasら、Cellular and Molecular Immunology, 第３版、139-170, (1997)）。
【０００４】
４−１ＢＢはＣＤ１３７とも称されるが、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）遺伝子ファミリー（細胞増殖、分化、およびプログラムされた細胞死の制御に関与するタンパク質を含む）の一員である（A. Ashkenazi, Nature, 2:420-430, (2002)）。４−１ＢＢは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫ Ｔ細胞を含む活性化されたＴ細胞上で優先的に発現される（B. Kwonら、Mol. Cell, 10:119-126, (2000); J. Hurtadoら、J. Immunol. 155:3360-3365, (1995); L. Meleroら、Cell. Immunol. 190:167-172, (1998)）。加えて、４−１ＢＢは、樹状細胞（T. Futagawaら、Int. Immunol. 14:275-286, (2002); R. Wilcoxら、J Immunol. 168:4262-4267, (2002); M. Lindstedtら、Scand. J. Immunol. 57:305-310, (2003)）、マクロファージ、活性化された好酸球、および上皮内リンパ球（K. Pollokら、J. Immunol. 150:771-781 (1993); D. Vinayら、Semin. Immunol. 10:481-489, (1998)）で検出されている。ナイーブな休止しているＴ細胞は該レセプターを発現せず、これは活性化によりアップレギュレーションされる。４−１ＢＢによるシグナル伝達は、マウスおよびヒトのＴ細胞においてＴ細胞増殖、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）合成の誘発、および活性化細胞の死の抑制を誘発することが示されている（Y. Kimら、Eur. J. Immunol. 28:881-890, (1998); J. Hurtadoら、J. Immunol., 158:2600-2609, (1997); C. Takahashiら、J. Immunol., 162:5037, (1999)）。４−１ＢＢの天然リガンドである４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）はＴＮＦスーパーファミリーの一員であり、主としてＢ細胞、マクロファージ、および樹状細胞などの活性化された抗原提示細胞で検出されるが（M. Aldersonら、Eur. J. Immunol., 24:2219-2227 (1994); K. Pollokら、Eur. J. Immunol. 24:367-374 (1994)）、マウスのＢ細胞リンパ腫、活性化されたＴ細胞、および上皮由来のヒト癌腫株でも検出されている（M. DeBenedetteら、J. Immunol. 158:551-559 (1997); H. Salihら、J. Immunol. 2903-2910 (2000)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マウスでのインビボ効能試験は、抗４−１ＢＢ抗体処理が複数の腫瘍モデルで腫瘍の退縮に導いたことを示していることから、癌の処置のためのこの療法の使用の可能性が示されている。注目すべきことに、抗マウス４−１ＢＢ抗体は、殆ど免疫原性がないかまたは非免疫原性の腫瘍に対して免疫応答を誘発することが示されている（I. Meleroら、Nat Med. 3:682-685, (1997); R. Wilcoxら、J. Clin. Invest. 109:651-659, (2002)）。抗腫瘍活性を示す抗マウス４−１ＢＢ抗体は、インビトロでＩＦＮ−ガンマ合成を促進することが示されている。多くの報告は、抗４−１ＢＢ抗体処理によるＩＦＮ−ガンマのインビボ誘発が有効な抗腫瘍免疫応答の生成にとって重要であることを疑いの余地なく示している（R. Wilcoxら、Cancer Res.  62:4413 (2002); R. Millerら、J Immunol. 169:1792 (2002)およびその中で報告されている研究）。ＩＦＮ−ガンマ活性の中和は幾つかの腫瘍モデルで抗４−１ＢＢ抗体を用いて観察される抗腫瘍作用を有意に低減させたことから、インビトロでの機能性の作用、すなわちＩＦＮ−ガンマの誘発とインビボでの抗腫瘍作用との相関関係が明らかとなった。ヒト４−ＢＢのその天然リガンドまたは抗ヒト４−１ＢＢ抗体への結合が抗マウス４−１ＢＢ抗体を用いて観察されるものと同様の機能性の作用を生成するという充分なインビトロでの証拠が存在する（Y. Kimら、Eur. J. Immunol. 28:881 (1998); Y. Wenら、J. Immunol. 168:4897 (2002)）。しかしながら、これまでに報告されている抗ヒト４−１ＢＢ抗体の殆どは齧歯類で生成されており、そのためヒトの治療には不適切なものである。一つの報告は、ヒト化抗ヒト４−１ＢＢ抗体の投与が非ヒト霊長類でＴ細胞依存性免疫の抑制をインビボで誘発したことを示しており、これは抗マウス４−１ＢＢ抗体を用いた場合にも観察される作用である（H. Hongら、J Immunother. 23:613-621 (2000)）。
【０００６】
従って、免疫応答をモデュレートするうえでの４−１ＢＢの役割およびマウス腫瘍モデルでの効能が示されたことに基づき、ヒトの癌のような疾患の処置または予防に用いることのできるアゴニスト活性を備えた抗ヒト４−１ＢＢ抗体を産生することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト４−１ＢＢ（Ｈ４−１ＢＢ）に結合し、Ｈ４−１ＢＢのヒト４−１ＢＢリガンド（Ｈ４−１ＢＢＬ）への結合を可能にするヒト化抗体を提供する。それゆえ、本発明は、Ｈ４−１ＢＢに結合するがＨ４−１ＢＢのそのＨ４−１ＢＢＬへの結合を阻止せず、それによって本発明の抗体およびＨ４−１ＢＢＬの両者のＨ４−１ＢＢへの結合を可能とする抗体に関する。本発明の抗体はＨ４−１ＢＢに高親和性にて結合し、および／またはインターフェロンガンマ合成（ＩＦＮ−γ）を誘発する、すなわちアゴニスト活性を有するが、Ｈ４−１ＢＢとＨ４−１ＢＢＬとの相互作用を阻止することはない。これら抗体は、抗腫瘍免疫応答のイムノエンハンサー（immuno-enhancers）として用いることができる。
【０００８】
一つの側面において、本発明の抗体は軽鎖および重鎖を含み、その際、該重鎖は、配列番号５のアミノ酸５０〜５４を含むＣＤＲ１（相補性決定領域１）、配列番号５のアミノ酸６９〜８５を含むＣＤＲ２（相補性決定領域２）、および配列番号５のアミノ酸１１８〜１２２を含むＣＤＲ３（相補性決定領域３）を含み、該軽鎖は、配列番号８のアミノ酸４４〜６０を含むＣＤＲ１（相補性決定領域１）、配列番号８のアミノ酸７６〜８２を含むＣＤＲ２（相補性決定領域２）、および配列番号８のアミノ酸１１５〜１２３を含むＣＤＲ３（相補性決定領域３）を含む。
【０００９】
他の側面において、本発明のヒト化抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００１０】
さらに他の側面において、本発明の抗体は配列番号５および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
他の側面において、本発明のヒト化抗体はｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４である。このヒト化抗体はＨ４−１ＢＢに対して高い親和性を表す、すなわちＨ４−１ＢＢに特異的に結合しＩＮＦ−γ合成を有効に誘発するが、Ｈ４−１ＢＢのその対応リガンドであるＨ４−１ＢＢＬへの結合に影響を及ぼすことはなく、補体を結合しない、すなわちＩｇＧ４イソ型である。それゆえ、ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を誘発することのできる、非ブロッキングアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体である。
【００１２】
本発明はまた、本発明の抗体、またはその抗原結合部分、および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物をも提供する。本発明の医薬組成物は、単独で、または治療剤、たとえば化学療法剤やワクチンなどの癌治療剤とともに投与することができる。
【００１３】
本発明の抗体は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患などの疾患のイムノモデュレーターとして広範な治療用途を有する。エフェクターＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞上で認められるＨ４−１ＢＢの発現のため、抗Ｈ４−１ＢＢ抗体の腫瘍学的応用の可能性は明らかである。本発明はさらに、患者において癌を処置する方法であって、該患者に治療学的有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。一つの側面において、この方法はワクチンを投与することをさらに含む。適当なワクチンとしては、たとえば、腫瘍細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ改変腫瘍細胞ワクチン、または抗原含有（antigen-loaded）樹状細胞ワクチンが挙げられる。癌は、たとえば、前立腺癌、黒色腫、または上皮癌であってよい。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６９３〜２０７２、および（ｂ）配列番号６のヌクレオチド６３３〜１０３４および１４０９〜１７２６よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチドをも提供する。本発明はさらに、配列番号３または配列番号６のヌクレオチド配列を含む単離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、配列番号５および配列番号８よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドをも提供する。
【００１６】
本発明はさらに、Ｈ４−１ＢＢに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン（該免疫グロブリンは非ヒト由来の抗原結合領域を含む）を提供する。一つの側面において、該免疫グロブリンはヒト由来の部分をさらに含む。他の側面において、該免疫グロブリンは本発明の抗体のＦａｂフラグメント（抗原結合フラグメント）である。
【００１７】
本発明はまた、Ｈ４−１ＢＢ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をも提供する。一つの側面において、該ハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−５３２６を有するラットハイブリドーマ３９Ｅ３である。本発明はさらに、Ｈ４−１ＢＢに特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００１８】
本明細書で言及するすべての寄託はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナサス、バージニア、２０１１０米国になされ、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとに維持されるであろう。これら寄託は当業者の便宜のためにのみ提供されるものであって、そのような寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２のもとで必要とされることを認容するものではない。寄託された材料に含まれるポリヌクレオチドの配列並びにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参照のため本明細書に引用され、本明細書中の配列の記載と矛盾する場合は優先される。寄託した材料を製造、使用、または販売するにはライセンスが必要であり、そのようなライセンスはここでは許容されない。
【００１９】
本発明は、癌の処置に使用するためのヒト化免疫グロブリンの調製および特徴付けに関し、該免疫グロブリンはＨ４−１ＢＢに特異的に結合することができる。本発明のヒト化抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４は、その親ラットｍＡｂ（３９Ｅ３）と同様、Ｈ４−１ＢＢに対して高い親和性を表し、コスティミュラトリーアッセイにおいてＩＮＦ−γ産生を有効に誘発するが、Ｈ４−１ＢＢのその対応リガンドであるＨ４−１ＢＢＬへの結合に影響を及ぼすことはなく、補体を結合しない。本発明の抗体は２対の軽鎖／重鎖複合体を含み、少なくとも１の鎖がヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結した１またはそれ以上のラット相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２０】
本発明の免疫グロブリンはその結合フラグメントおよび他の誘導体を含めて、様々な組換えＤＮＡ法により容易に製造することができ、トランスフェクションした細胞、好ましくはミエローマ細胞やハイブリドーマ細胞などの不死化した真核細胞で最終的に発現される。ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第一の配列および所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二の配列セットを含むポリヌクレオチドは、合成により、または適当なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡセグメントを結合することにより、製造することができる。
【００２１】
本発明のヒト化抗体は、実質的に純粋な形態にて単独で、または他の治療剤、たとえば放射線療法、ホルモン療法、細胞毒性剤、ワクチン、および他の免疫調節剤、たとえばサイトカインおよび生物学的応答の修飾因子とともに用いることができる。これら化合物は、癌または他の免疫−増殖性疾患の処置に特に有用であろう。本発明のヒト化抗体の複合体は、薬理学的に許容しうる剤形にて調製することができ、該剤形は投与法によって様々であろう。
【００２２】
本明細書において「ヒト化」抗体は、ドナーのマウスまたはラット免疫グロブリンからのＣＤＲと組み合わせたヒトフレームワークを有する抗体を含む（たとえば、米国特許第５,５３０,１０１号を参照）。本発明の範囲に包含されるのは、本明細書に開示する齧歯類の可変鎖由来のＣＤＲを含むヒト化抗体である。
【００２３】
本明細書において使用する「処置」なる語は、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候の開始を防御または遅延させ、該症状を軽減しまたは該疾患、状態、または障害（たとえば、癌）のさらなる進行を阻止または抑制すべく、本発明の化合物または薬剤を投与することを含む。処置は、予防的（疾患の発症を遅延させるためまたは疾患の臨床的または亜臨床的（subclinical）症状の現出を防ぐため）であるかまたは疾患が現れた後の症状の治療的抑制または軽減であってよい。
【００２４】
本明細書において使用する「特異的結合」とは、前もって決定した抗原に結合する抗体をいう。ペプチドについて言及する場合は、この語は標的分子に対して中くらいまたは高い結合親和性を有するペプチド分子をいう。「特異的に結合する」とは、タンパク質や他の生物学的分子の不均一集団の存在下で標的タンパク質の存在を決定できる結合反応をいう。それゆえ、所定のアッセイ条件下で、特定した結合残基は特定の標的タンパク質に優先的に結合し、被験試料中に存在する他の成分には有意の量で結合しない。
【００２５】
「組換えヒト化抗体」なる語は、組換え手段により調製、発現、創成または単離した本発明のすべてのヒト化抗体を含み、たとえば、動物（たとえば、マウス）からの抗体単離物；宿主細胞中にトランスフェクションした組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する他の手段により調製、発現、創成または単離した抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（もし存在するなら）を有する。しかしながら、そのような抗体はインビトロ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物を用いる場合はインビボ体細胞突然変異誘発）に供することができ、それゆえ組換え抗体のＶＨ（抗体の重鎖可変領域）およびＶＬ（抗体の軽鎖可変領域）のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞のＶＨおよびＶＬ配列に由来するものの、ヒト抗体生殖細胞には天然には存在しない配列である。
【００２６】
抗体をヒト化する最も直接的なアプローチは、ヒトフレームワークにドナーｍＡｂからのＣＤＲを移植することからなる（P. Jonesら、Nature 321:522-525 (1986)）。しかしながら、ある種のフレームワーク残基はＣＤＲ構造を支えており、それゆえヒトフレームワーク鋳型への齧歯類ＣＤＲの全抗原移植は、その結果得られるヒト化ｍＡｂの結合活性を弱めることがある（J. Footeら、J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992)）。この理由から、抗体の構造および親和性に対する特定のフレームワーク残基の寄与の可能性を構造モデリングにより評価することができる。
【００２７】
本発明は、Ｈ４−１ＢＢ結合に対して実質的な影響を及ぼさないさらなる保存的なアミノ酸置換を有するヒト化抗体を包含する。保存的な置換は、典型的に一つのアミノ酸の類似の特性を有する他のアミノ酸による置換、たとえば、以下の群内での置換を含む：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００２８】
本発明にはまた、開示した重鎖および軽鎖の可変領域およびその活性なまたは機能性の部分も包含される。該タンパク質の免疫学的にコンピテントなまたは機能性の形態またはその一部もまた、本明細書において「重鎖／軽鎖可変領域またはその生物学的に活性な部分」として言及される。本発明では、その生物学的に活性な部分は、軽鎖または重鎖の一部であって抗体に導入したときに依然として該抗体のＨ４−１ＢＢへの結合を可能とするものを含む。
【００２９】
本発明に具体的に包含されるのは、本発明の抗体の可変重鎖（配列番号３）および可変軽鎖（配列番号６）をコードする核酸である。また、配列番号３および配列番号６に示すポリヌクレオチドを含み、ＡＴＣＣ受託番号がそれぞれＡＴＣＣ−ＰＴＡ−５３２５およびＡＴＣＣ−ＰＴＡ−５３２４のプラスミドもまた本発明の範囲に包含される。
【００３０】
Ｈ４−１ＢＢに結合し、本明細書に開示する可変軽鎖および重鎖配列に実質的に相同であるかまたは実質的な配列同一性を示すポリペプチドを含むヒト化抗体もまた本発明により包含される。たとえば、配列番号８に示す軽鎖領域と少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに一層好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を示す軽鎖領域を含むヒト化抗体が本発明の範囲に包含される。さらに、配列番号５に示す重鎖領域と少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに一層好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を示す重鎖領域を含むヒト化抗体が本発明の範囲に包含される。
【００３１】
ＤＮＡセグメントは、典型的にヒト化抗体のコード配列に作動可能に連結した発現調節ＤＮＡ配列（天然に関連したまたは異種のプロモーター領域を含む）をさらに含む。好ましくは発現調節配列は真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることのできるベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主のための調節配列をも用いることができる。ベクターが適当な宿主に導入されたら、この宿主をヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下に維持し、所望なら可変軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体または完全抗体、結合フラグメントまたは他の免疫グロブリン形態の回収および精製を引き続き行う（S. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y. (1979)を参照）。一本鎖抗体もまた、本明細書に開示したＶＬ領域およびＶＨ領域をコードする核酸配列をポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡと連結することにより製造することができる。
【００３２】
大腸菌などの原核生物宿主および酵母などの他の微生物を用いて本発明の抗体を発現させることができる。微生物に加えて、哺乳動物組織の細胞培養を用いて本発明の抗体を発現および製造することもできる。真核生物細胞は、完全な免疫グロブリンを分泌することのできる適当な宿主細胞が多数当該技術分野で開発されていることから好ましく、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株、種々のＣＯＳ（アフリカミドリザル繊維芽細胞株）細胞株、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞株、およびハイブリドーマが含まれる。これら細胞の発現ベクターは、発現調節配列、たとえばプロモーターおよびエンハンサー、および必要なプロセシング情報部位、たとえばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写停止配列（すべて当該技術分野で知られている）を含んでいてよい。
【００３３】
目的とするＤＮＡセグメント（たとえば、重鎖および／または軽鎖のコード配列および発現調節配列）を含むベクターは、よく知られた方法（細胞宿主の種類により様々である）により宿主細胞に移すことができる。たとえば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞において一般的に用いられており、一方、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に用いることができる（たとえば、T. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)を参照）。
【００３４】
発現されたら、本発明の全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、当該技術分野の標準法（硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む）に従って精製することができる。医薬に使用するには、少なくとも９０〜９５％の均質性の純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。
【００３５】
本発明の抗体は、典型的に抗体媒体および／またはＴ細胞媒体疾患の処置に使用を見出すであろう。処置に適した典型的な疾患状態としては、癌、感染性疾患および自己免疫疾患、たとえば多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および重症筋無力症が挙げられる。
【００３６】
本発明は、薬理学的に許容しうる担体を用いて製剤化した本発明のヒト化抗体を少なくとも１つ含む医薬組成物を提供する。幾つかの組成物は、癌の治療に使用する他の薬剤、たとえば化学療法剤、感染性疾患または上記自己免疫疾患の治療に使用する他の薬剤との組み合わせを含む。あるいは、本発明の医薬組成物は、他の薬剤（第二の抗体、コスティミュラトリー分子またはイムノモデュレーターを含む）を含むかまたは同時に投与することができる。
【００３７】
本発明の抗体および医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、皮内または静脈内投与に特に有用である。非経口投与のための医薬組成物は、一般に許容しうる担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体の溶液を含む。様々な水性担体を用いることができ、これらはすべて当該技術分野で知られたものであって、たとえば、水、緩衝水、食塩水、グリシンなどを用いることができる。これら溶液は滅菌してあり、一般に粒状物質を含まない。これら医薬組成物は、通常のよく知られた滅菌法により滅菌することができる。本発明の組成物は、生理状態を最適化するため必要に応じてｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤などの薬理学的に許容しうる添加剤を含んでいてよく、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、ヒトアルブミンなどを含んでいてよい。
【００３８】
担体材料と組み合わせて単一の剤形を形成することのできる活性成分の量は、一般に治療効果を奏する組成物の量であるだろう。投与の容易および投与量の均一のため、非経口組成物を単位投与剤形にて製剤化するのが特に有利である。当業者は、活性化合物の独特の特性および達成すべき特定の治療効果および個体の感受性の治療のための活性化合物などの化合物の技術分野に固有の制限によって指令されおよび直接依存する標準の公知法に従って単位投与剤形を製剤化することができるであろう。
【００３９】
本明細書に記載した癌、感染性疾患および自己免疫疾患の処置のための本発明の組成物の有効投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、投与した他の医薬および処置が予防的なものか治療的なものかを含む多くの種々の因子によって様々である。これら因子にもかかわらず、本発明の抗体を投与するには、投与量の範囲は約１.０〜１０.０ｍｇ／ｋｇである。抗体は典型的に複数回投与する。個々の投与間の間隔は、患者の個々の必要に応じて１週間おき、１ヶ月おき、または隔週であってよい。当業者であれば、標準的な薬理学的方法を用い、必要な処置レジメを特定の疾患および処置すべき状態の重篤度に応じて決定することができるであろう。
【００４０】
本発明の抗体を含む組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的な適用に際しては、すでに疾患に罹患している患者に該疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに充分な量にて組成物を投与する。このことを達成するのに適した量を「治療学的に有効な投与量」と定義する。この使用に有効な量は、疾患状態の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するであろうが、当業者により決定することができる。
【００４１】
予防的な適用に際しては、本発明の抗体を含む組成物を疾患状態に未だ至っていない患者に患者の抵抗性を促進する（免疫応答を促進する）ために投与する。そのような量は「予防的に有効な投与量」と定義される。この使用でも正確な量は患者の健康状態および一般的な免疫レベルによる。好ましい予防的使用は腫瘍の再発の予防のためのものである。
【００４２】
以下の実施例は説明のためだけのものであって本発明の範囲（特許請求の範囲によってのみ定められる）を限定するものではない。
【００４３】
実施例
実施例Ｉ．免疫およびスクリーニングプロトコール
Ａ．免疫
Sprague Dawleyラットを、ヒトＩｇＧ１抗体の定常ドメインに融合したＨ４−１ＢＢの細胞外ドメインからなる組換え融合タンパク質で免疫した。このｈｕ４−１ＢＢＩｇ融合タンパク質は、プロテアーゼトロンビンによる開裂部位を含んでおり、該部位は該分子の４−１ＢＢとＩｇ部分との間に位置していた。動物をＲＩＢＩアジュバント（RIBI Immunochemical）中の４０μｇのＨ４−１ＢＢで腹腔内にて免疫し、その後、２０〜４０μｇのｈｕ４−１ＢＢ−ＩｇまたはＨ４−１ＢＢ（該分子のＩｇ部分をトロンビン消化により開裂したもの）を腹腔内にてブースター投与した。融合する３日前に動物に２０μｇのｈｕ４−１ＢＢを腹腔内および静脈内にてブースター投与した。融合のため、脾臓およびリンパ節を免疫動物から回収し、標準プロトコール（J. Kearneyら、J. Immunol. 123:1548-1550 (1979); J. Lane, Immunol. 81:223-228 (1985)）を用いてＸ６３−Ａｇ８.６５３マウスミエローマ細胞株と融合させた。各融合からの細胞浮遊液を９６ウエル細胞培養プレートにウエル当たり１００,０００細胞にて接種した。
【００４４】
Ｂ．スクリーニングおよびクローニング
ヒト４−１ＢＢに対するｍＡｂの特異性を決定するため、細胞培養の上澄み液をＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）法によりスクリーニングした。細胞培養の上澄み液を精製ｈｕ４−１ＢＢＩｇ融合タンパク質（０.２μｇ／ｍｌ）をコーティングしたプレート上、または同様に構築した無関係の融合タンパク質ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（０.２μｇ／ｍｌ）に対して試験した。抗ヒトＩｇ反応をブロックするため、可溶性のヒトＩｇ（５０μｇ／ｍｌ）を加えた。細胞培養の上澄み液を周囲温度で２時間インキュベートし、ウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ抗体により抗体の結合が検出された。この上澄み液がＨ４−１ＢＢとは反応性を示しＣＴＬＡ４−Ｉｇとは反応性を示さなかったことにより、ヒト４−１ＢＢに特異的な抗体の存在が明らかとなった。陽性のマスターウエルを限界希釈法によりクローニングした。
【００４５】
モノクローナル抗体をさらに特徴付けてそれが４−１ＢＢ−４−１ＢＢＬ相互作用を阻止する能力およびインビトロでＩＦＮ−γ合成を誘発する能力を決定した。これら研究は、コスティミュラトリーアッセイでＩＦＮ−γ合成を誘発したＩｇＧ１の非ブロッキングｍＡｂであるｍＡｂ ３９Ｅ３の選択に導いた。本発明はまた、ｍＡｂ ３９Ｅ３を産生するハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−５３２６）をも包含する。ｍＡｂ ３９Ｅ３を標準法（Gammabind Plus、ファルマシア、ミシガン）によりプロテインＧ上で精製し、Immunopure Ig Elution緩衝液で溶出した。溶出した抗体を使用前にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に対して透析した。インビトロコスティミュラトリーアッセイで使用した精製材料の内毒素濃度は＜０.５ＥＵ／ｍｇであった。
【００４６】
実施例II．ヒト化３９Ｅ３抗体の構築
ヒトに投与したときのラット抗ヒト４−１ＢＢ抗体の免疫原性を最小にするため、該抗体のラット超可変領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク配列に移植した該抗体のヒト化形態を作製した。加えて、この抗体はそのイソ型の低減したエフェクター機能のためにＩｇＧ４イソ型からなっていた。ジスルフィド結合の不均質性を低減するため、ＩｇＧ４のヒンジ領域に突然変異を導入した（S. Angalら、Molec. Immunol.vol.30, 105-108, 1993）。
【００４７】
Ａ．抗Ｈ４−１ＢＢ ｍＡｂ ３９Ｅ３の可変領域のヒト化
１．ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅
ｍＲＮＡ単離キット（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）を用いてＲＮＡを３９Ｅ３ハイブリドーマ細胞から単離した。このＲＮＡからSuperScript RT-PCRキット（Gibco, BRL、ロックビル、メリーランド）を用いてｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡの作製をＩｇＧ１特異的なまたはＣ［カッパ］特異的な抗センスプライマーを用いて行ってそれぞれＶＨ領域およびＶＬ領域を得た。プライマーはマウスおよびラット免疫グロブリンの公開された配列からデザインした。このｃＤＮＡをGENECLEAN.（Bio101、ラジョラ、カリフォルニア）を用いて精製し、ついで１０ｍＭのｄＧＴＰおよびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）で３７℃にて１時間ポリＧテール化した。ポリＧテール化したｃＤＮＡをGENECLEANを用いて精製した。２μｌの各ｃＤＮＡを、２０μモルの各ｄＮＴＰ、１００ピコモルのセンスおよびアンチセンスプライマー、および２ＵのＴａｑポリメラーゼを用いて全量１００μｌにてアンカーＰＣＲ（Saikiら、1988. Science 239:487-491）により増幅した。センスプライマーはポリＧテールに相補的な領域を含んでいた（Lohら、1989. Science 243:217-220）。反応は、Perkin-Elmer Cetusサーマルサイクラー（Norwalk、コネチカット）にて、９４℃で３０秒の変性、４５℃で９０秒のアニーリング、および７２℃で９０秒の伸長からなるプログラムを３３サイクル行った。
【００４８】
ＰＣＲ増幅したＶＬおよびＶＨフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＵＣ１８ベクター中にライゲートし、ＤＨ５α大腸菌（Gibco, BRL、ロックビル、メリーランド）に形質転換した。
【００４９】
２．親抗体の可変軽鎖および重鎖配列
ＶＬおよびＶＨを含むクローンを標準ＤＮＡシークエンシング法により同定した。クローン３９Ｅ３のＶＬおよびＶＨの誘導アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２に示してある。
【００５０】
Ｂ．３９Ｅ３ ＶＬおよびＶＨのためのヒト鋳型の決定
ラット３９Ｅ３ ＶＬ（カッパ）およびＶＨ配列を用い、３９Ｅ３ ＶＬに最も近接したホモロジーを有するラット生殖細胞ヌクレオチド配列のため、成熟ペプチドをコードするヌクレオチドのみを用いたＦＡＳＴＡにより、ＩｇＧｅ（生殖細胞）データセットをサーチした。このサーチにより高ホモロジーの２つのラット配列が得られ、最良のマッチングを示したものを「ＲＮＩＧＫＹ３」（ジーンバンクアクセッション番号Ｘ１６１２９）と称した。
【００５１】
３９Ｅ３ ＶＬに最も近接したホモロジーを有するヒト生殖細胞アミノ酸配列を、ＩｇＰ（タンパク質）データセット上でＦＡＳＴＡサーチを行うことによって決定した。このデータセットには生殖細胞の配列および再編成した配列の両者が含まれていた。再編成した配列を廃棄した後、最良のホモロジーマッチングが「ＨＫＶ４−１」（ジーンバンクアクセッション番号Ｚ０００２３）と称する生殖細胞配列で見出された。
【００５２】
３９Ｅ３ ＶＨに最も近接したホモロジーを有するラットヌクレオチド配列もまた、成熟ペプチドをコードするヌクレオチドのみを質問配列（query sequence）として用いたラットｃＤＮＡデータのＢＬＡＳＴサーチを行うことによって決定した。このサーチは、他のラット配列よりも有意に良好なホモロジーを示すラット免疫グロブリン可変領域配列（ジーンバンクアクセッション番号Ｍ８７７８５）という結果となった。
【００５３】
３９Ｅ３ ＶＨに最も近接したホモロジーを有するヒト生殖細胞アミノ酸配列は、ＩｇＰデータセット上でＦＡＳＴＡサーチを行うことによって決定した。最良のマッチングは「ｈｈｖ３−７」（ジーンバンクアクセッション番号Ｚ１２３５４）生殖細胞配列で見出された。
【００５４】
Ｃ．３９Ｅ３ ＶＬおよびＶＨヒト化鋳型の精緻化（Refinement）
ＶＬドメインの抗原結合ループＬ１、Ｌ２およびＬ３およびＶＨドメインのＨ１およびＨ２のカノニカル（canonical）ループ構造が同定され、構造上の抗原決定基（structural determinants）として定められた保存残基（C. Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901 (1987); A. Leskら、In Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Co., pp 1-38 (1992)）をラット残基として保持した。
【００５５】
精緻化したＶＬおよびＶＨヒト化鋳型を用いて相同配列のためにBrookhavenデータバンクをサーチし、結晶構造を解析した。
【００５６】
Ｄ．Ｊ領域鋳型の決定
最良のヒトＪカッパ配列を、E. Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第４版、U.S. Health and Human Services, Washington, D.C. (1987)でのラットＪカッパ配列へのホモロジーにより選択した。同様に、最良のヒトＪＨ配列を、上記E. KabatらでのラットＪＨ配列へのホモロジーにより選択した。ついで、提唱された配列を用い、三次元構造の利用できる抗体で可能な最も近接したマッチングを有するものを同定した。この情報を用いて可能な両立しない接触空間（ドメイン−ドメイン相互作用およびフレームワーク−ループ相互作用）を探索したが見出されなかった。
【００５７】
Ｅ．３９Ｅ３ ＶＬのヒト化
３９Ｅ３ ＶＬのヒト化に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを表１に列記してある。
表１
【表１】
2006500921.tif 000002
【００５８】
ついで、増幅したヒト化３９Ｅ３ ＶＬ ＤＮＡをｐＵＣ１９中にライゲートし、標準法に従って大腸菌（ＤＨ５０α株）を形質転換するのに用いた。個々のクローンからのプラスミドＤＮＡをシークエンシングしてヒト化３９Ｅ３ ＶＬが正しくアセンブリーされていることを確認した。
【００５９】
Ｆ．３９Ｅ３ ＶＨのヒト化
３９Ｅ３ ＶＨのヒト化に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを表２に列記してある。
表２
【表２】
2006500921.tif 000003
【００６０】
ついで、増幅したヒト化３９Ｅ３ ＶＨ ＤＮＡをｐＵＣ１９中にライゲートし、標準法に従って大腸菌（ＤＨ５０α株）を形質転換するのに用いた。個々のクローンからのプラスミドＤＮＡをシークエンシングしてヒト化３９Ｅ３ ＶＨが正しくアセンブリーされていることを確認した。
【００６１】
Ｇ．ヒト化３９Ｅ３.Ｇ４抗体を産生する細胞株の作製
チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ ＤＧ−４４）を、３９Ｅ３の重鎖および軽鎖をコードするプラスミド発現ベクターでトランスフェクションした。３９Ｅ３の重鎖および軽鎖をそれぞれｐＤ１７およびｐＤ１６発現ベクターにクローニングした。両ベクターはｐｃＤＮＡ３由来であり、エンハンサーのないＳＶ４０プロモーターの制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含んでいる。トランスフェクタントを増殖させ、メトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を増大させて選択した。インビトロアッセイを行い、ヒト化手順が３９Ｅ３抗体の特性を変化させないことを確認した。
【００６２】
図１は、ｐＤ１７−Ｈ３９Ｅ３−２.ｈ４ａのプラスミドマップを示しており、このものは４６０アミノ酸の重鎖アミノ酸配列（配列番号５）をコードする７０３３ヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号３）を含む。
【００６３】
図２Ａ〜２Ｇは、プラスミドｐＤ１７−Ｈ３９Ｅ３−２.ｈ４ａのヌクレオチド配列（コード鎖（配列番号３）および相補鎖（配列番号４））およびコード鎖（配列番号３）のヌクレオチド配列およびコード鎖のヌクレオチド６９３〜２０７１によってコードされる重鎖アミノ酸配列（配列番号５）を示す。図２Ａ〜２Ｇに示すように、重鎖アミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸５０〜５４を含むＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸６９〜８５を含むＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸１１８〜１２２を含むＣＤＲ３を含む。
【００６４】
図３は、ｐＤ１６−Ｈ３９Ｅ３.Ｌ１のプラスミドマップを示しており、このものは２４０アミノ酸の軽鎖アミノ酸配列（配列番号８）をコードする８８７４ヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号６）を含む。図４Ａ〜４Ｈは、プラスミドｐＤ１６−Ｈ３９Ｅ３.Ｌ１のヌクレオチド配列（コード鎖（配列番号６）および相補鎖（配列番号７））およびコード鎖（配列番号６）のヌクレオチド６３３〜１０３４および１４０９〜１７２６によってコードされる軽鎖アミノ酸配列（配列番号８）を示す。図４Ａ〜４Ｈに示すように、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸４４〜６０を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸７６〜８２を含むＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸１１５〜１２３を含むＣＤＲ３を含む。
【００６５】
単離した一本鎖ＤＮＡおよび本発明のヒト化抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域遺伝子を、蛍光ジデオキシヌクレオチドターミネーション法（Perkin-Elmer、フォスターシティー、カリフォルニア）によりシークエンシングした。
【００６６】
実施例III．ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４のインビトロ特徴付け
インビトロ研究を３９Ｅ３のヒト化形態であるｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４で行い、その活性を親のｍＡｂ ３９Ｅ３と比較した。
【００６７】
Ａ．抗４−１ＢＢ抗体の動力学的分析
４−１ＢＢへのｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４の結合親和性を示すための動力学的結合研究を表面プラズモン共鳴を用いて行い、ｍＡｂ ３９Ｅ３およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４の動力学的特性を調べた。これら研究は、BIAcore 3000装置（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）で行った。抗体の希釈液を同一の条件下で固定化Ｈ４−１ＢＢのセンサーチップ表面に注入した。
【００６８】
ヒト４−１ＢＢレセプターを、低密度にてBIAcoreセンサーチップ（BIAcore Inc、ピスカタウエイ、ニュージャージー）のカルボキシメチル化デキストラン表面に共有結合により固定化した。融合タンパク質（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５.０中、２μｇ／ｍＬ）は、第一級アミノ基によりＥＤＣ／ＮＨＳ活性化表面に結合した。ついで、占有されなかった活性エステルは、過剰のエタノールアミンの注入によりブロッキングした。１０ｍＭグリシン、ｐＨ２.０で再生した後、表面は結合研究のために準備完了した。抗体３９Ｅ３およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて１０ｎＭ〜１００ｎＭの濃度に希釈した。すべてのｍＡｂの希釈液を２５μｌ／分の流速にて２つのフローセル（ＦＣ）に注入した。ＦＣ１は負の対照とし、ＦＣ２は低密度のヒト４−１ＢＢ（５５７ＲＵ）を有していた。結合した抗ヒト４−１ＢＢ ｍＡｂを、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１.７５を用いた再生により除去した。
【００６９】
動力学的パラメーターは、BIAevaluationプログラム（バージョン3.1）（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）を用いて計算した。グローバルカーブフィット分析（global curve fit analysis）をBivalent Analyte Model（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）を用いて行った。図５に示すように、BIAevaluationソフトウエアのグローバルフィット分析アルゴリズムは、会合および解離データのすべてに同時に最も良く適合する動力学定数ｋａおよびｋｄの単一のセットを見出した。親ｍＡｂである３９Ｅ３およびヒト化抗Ｈ４−１ＢＢ ｍＡｂの結合親和性を下記表３に示す。
【００７０】
表３
【表３】
2006500921.tif 000004
【００７１】
総合すると、これら研究は、ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４がその親抗体３９Ｅ３と同様に断続的な速度（on- and off-rate）でＨ４−１ＢＢに結合することを示し、親和性はｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４については５.３ｎＭ、親形態については６.７ｎＭであった。
【００７２】
Ｂ．フローサイトメトリー分析
活性化ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ２２６５）上に発現されたｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４および３９Ｅ３の結合性を決定するため、フローサイトメトリー分析を行った。ＣＥＭ細胞上での４−１ＢＢのアップレギュレーションを、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で１８時間活性化することにより得た。活性化された細胞は４−１ＢＢＬには結合しタンパク質対照には結合しなかったが、刺激されていない細胞はそうではなかった。これらの研究で、１×１０６の活性化したＣＥＭ細胞を１〜１０μｇの抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４および３９Ｅ３で染色した。氷上で４５分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フルオレセインコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ抗体またはフルオレセインコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧとともにインキュベートしてそれぞれｍＡｂ ３９Ｅ３またはｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４の結合を検出した。図６に示すように、これら分析の結果は、これら抗体が刺激されていない細胞への結合は示さないことを示しており、これら抗体のＰＭＡ−イオノマイシン活性化ＣＥＭへの結合性は同程度であった。
【００７３】
Ｃ．ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４は４−１ＢＢ−４−１ＢＢＬ相互作用を阻止しない
これら抗体を、４−１ＢＢレセプター−リガンド相互作用に影響を及ぼすその能力についてさらに特徴付けた。実験はすべてBIAcore 3000装置（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）で行った。Ｈ４−１ＢＢをBIAcoreセンサーチップ（BIAcore Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー）のカルボキシ−メチル化デキストラン表面上に高密度で共有結合により固定化した。注入を１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５.０中、２μｇ／ｍＬにて行った。ついで、占有されていない活性エステルを過剰のエタノールアミンの注入によりブロッキングした。表面の再生を１０ｍＭグリシン、ｐＨ２.０を用いて行った。
【００７４】
抗４−１ＢＢ抗体の精製した試料を、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび０.００５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）を添加したＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７.４を用いて２００〜１０００ｎＭの濃度に希釈した。Ｈ４−１ＢＢリガンド−ＣＤ８融合タンパク質（Ｈ４−１ＢＢＬ）をＨ４−１ＢＢＬ源として用いた。ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４またはｍＡｂ ３９Ｅ３がＨ４−１ＢＢＬのＨ４−１ＢＢへの結合に対して何らかの影響を及ぼすか否かを調べるため、抗４−１ＢＢ抗体の前にＨ４−１ＢＢＬを注入するか、または逆にＨ４−１ＢＢＬを添加する前に抗体を注入する実験を行った。注入は５μｌ／分の流速で行った。結合リガンドおよび抗体は、１０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２.０を用いた再生により除去した。下記表４に示すように、ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４およびｍＡｂ ３９Ｅ３のいずれもＨ４−１ＢＢＬのＨ４−１ＢＢへの結合に影響を及ぼさなかった。
【００７５】
表４
【表４】
2006500921.tif 000005
【００７６】
Ｄ．インビトロコスティミュラトリーアッセイ
ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４がアゴニスト抗体であることを証明するため、インビトロコスティミュラトリーアッセイを行って、該抗体をヒトＴ細胞に添加したときにＴ細胞がＣＤ３の最適下濃度で刺激されＩＦＮ−γの合成を促進することを示した。
【００７７】
このことは、抗ヒト４−１ＢＢ ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４およびｍＡｂ ３９Ｅ３がサイトカイン合成をインビトロで誘発する能力を評価することにより証明された。ヒトＰＢＭＣをHistopaque-1077（Sigma、セントルイス、ミズーリ）密度勾配遠心分離により健常な志願者から単離し、Ｔ細胞をヒツジ赤血球とのロゼット形成によりさらに精製した。Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を０.１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＨＩＴ３ａ、Pharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア）の存在下で培養し、抗ヒト４−１ＢＢ ｍＡｂ ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４または３９Ｅ３（２０μｇ／ｍｌ）または対照抗体でコスティミュレートした。上澄み液を７２時間後に回収し、ＩＦＮ−γについて市販のＥＬＩＳＡキット（Pharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア）によりアッセイした。図７に示すように、この研究により、ＩＦＮ−γの産生が最適下濃度の抗ＣＤ３の存在下、抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４および３９Ｅ３の存在下で促進されることが明らかとなった。上澄み液中のサイトカイン濃度は、３つのウエルの平均±ＳＤとして表してある。
【００７８】
実施例IV．抗マウス４−１ＢＢ抗体ｍＡｂ １Ｄ８を用いた抗腫瘍効能研究
ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４がマウス４−１ＢＢを認識しないという点で、この抗体の抗腫瘍作用はマウス腫瘍モデルで評価することはできなかった。それゆえ、ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４の特性に近接してマッチングしたマウス４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｄ８を用いてこの抗体の抗癌剤としての適格性を評価した。モノクローナル抗体１Ｄ８は、マウス４−１ＢＢに結合するがＨ４−１ＢＢとは交差反応しないラットＩｇＧ２ａ抗体である。モノクローナル抗体１Ｄ８は、ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４と同様、マウスで免疫原性ではなく、４−１ＢＢ−４−１ＢＢリガンド相互作用を阻止することなく、コスティミュラトリーアッセイでＩＦＮ−γの合成を誘発し、補体を結合しない。
【００７９】
インビボ抗腫瘍効能を２つの異なるセッティング、すなわち単独療法およびその後の放射線処理した腫瘍細胞の移植（細胞ベースのワクチン）として評価した。これら効果を２つの腫瘍モデル、すなわちＭ１０９肺癌腫およびルイス肺／ＬＭ癌腫で試験した。
【００８０】
Ａ．Ｍ１０９肺癌腫モデル
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８〜１０週齢）にＭ１０９腫瘍の１％食塩水（brie）を皮下移植した。３日後、マウスを無作為化し、各群１０匹の３つの群に分けた。処置群は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、対照ビヒクル）を与えた対照群、ｍＡｂ １Ｄ８と同じ投与量でイソ型のマッチングした免疫グロブリンを与えた群、およびｍＡｂ １Ｄ８を２００μｇ／マウスで与えた第三の群（各群、３つの投与量について７日毎）からなっていた。ワクチン接種プロトコールとして、マウスの反対側の脇腹に生きた腫瘍細胞を移植（１％食塩水）する２週間前に放射線処理したＭ１０９細胞（２％食塩水、３０Ｇｙ、２３分）を皮下でワクチン接種した。処置は腫瘍細胞の移植の１日後に投与した。
【００８１】
図８Ａに示すように、ｍＡｂ １Ｄ８は単独療法として用いたときに腫瘍増殖に対して穏当だが有意の抑制作用を誘発した。しかしながら、細胞ベースのワクチンと組み合わせた場合には、ｍＡｂ １Ｄ８は、図８Ｂに示すように１Ｄ８処置したマウスの大部分でＭ１０９腫瘍が増殖しなかったという点で腫瘍の発生率の有意の低減をもたらした。
【００８２】
Ｂ．ルイス肺／ＬＭ癌腫
同様の実験をルイス肺／ＬＭ癌腫でも行った。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに１×１０５のルイス肺／ＬＭ細胞を皮下移植した。ワクチン接種プロトコールとして、マウスに放射線処理したルイス肺／ＬＭ細胞（１×１０５のルイス肺／ＬＭ細胞、３０Ｇｙ、２３分）を皮下注射した。抗体処理（２００μｇ／マウス）は３つの投与量について毎週静脈内投与した。ｍＡｂ １Ｄ８を単独の薬剤として投与した場合にはｍＡｂ １Ｄ８は腫瘍増殖に対して何ら作用を及ぼさなかった（図９Ａ）。しかしながら、放射線処理した腫瘍細胞を２週間前に前もって与えたマウスでは、ｍＡｂ １Ｄ８は腫瘍増殖を有意に抑制した（図９Ｂ）。
【００８３】
Ｃ．抗４−１ＢＢ抗体の抗腫瘍活性はＩＦＮ−γの産生に依存する
抗４−１ＢＢ抗体はインビトロコスティミュラトリーアッセイでＩＦＮ−γの合成を誘発したので、ＩＦＮ−γが抗４−１ＢＢ ｍＡｂの抗腫瘍活性において何らかの役割を果たしているのか否かを決定する研究を行った
。
【００８４】
ＤＢＡマウスにＰ８１５細胞（１×１０５細胞）を第０日目に皮下移植した。３日後、マウスに１００または４００μｇ／マウスの中和抗ＩＦＮ−γ抗体（ＲＡ４６Ａ２）を単独または有効な投与量の抗４−１ＢＢ抗体ｍＡｂ １Ｄ８（２００μｇ／マウス）とともに与えた。対照群は、ビヒクル（ＰＢＳ）、イソ型対照抗体（２００μｇ／マウス）、ｍＡｂ １Ｄ８単独（２００μｇ／マウス）、およびｍＡｂ １Ｄ８（２００μｇ／マウス）とイソ型対照抗体（２００μｇ／マウス）、で処理したマウスからなっていた。この研究の結果（図１０）は、ＩＦＮ−γ中和抗体の添加がｍＡｂ １Ｄ８の抗腫瘍作用を部分的に低減したことを示しており、ＩＦＮ−γの誘発が抗４−１ＢＢ ｍＡｂがその抗腫瘍作用を発揮するメカニズムの一つであることが示唆された。ｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４は、ｍＡｂ １Ｄ８で観察される抗腫瘍活性を有するであろうことが予期される。
【００８５】
以上、本発明を明瞭および理解を目的として説明および実施例により若干詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲内である種の変更および改変をなし得ることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ｐＤ１７−Ｈ３９Ｅ３−２.ｈ４ａのプラスミドマップを示す。
【００８７】
【図２】図２Ａ〜２Ｇは、プラスミドｐＤ１７−Ｈ３９Ｅ３−２.ｈ４ａのヌクレオチド配列（コード鎖（配列番号３）および相補鎖（配列番号４））およびコード鎖（配列番号３）のヌクレオチド６９３〜２０７１によってコードされる重鎖アミノ酸配列（配列番号５）を示す。図２Ａ〜２Ｇに示すように、重鎖アミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸５０〜５４を含むＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸６９〜８５を含むＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸１１８〜１２２を含むＣＤＲ３を含む。
【００８８】
【図３】図３は、ｐＤ１６−Ｈ３９Ｅ３.Ｌ１のプラスミドマップを示す。
【００８９】
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、プラスミドｐＤ１６−Ｈ３９Ｅ３.Ｌ１のヌクレオチド配列（コード鎖（配列番号６）および相補鎖（配列番号７））およびコード鎖（配列番号６）のヌクレオチド６３３〜１０３４および１４０９〜１７２６によってコードされる軽鎖アミノ酸配列（配列番号８）を示す。図４Ａ〜４Ｈに示すように、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸４４〜６０を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸７６〜８２を含むＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸１１５〜１２３を含むＣＤＲ３を含む。
【００９０】
【図５】図５は、１００ｎＭ濃度の抗ヒト４−１ＢＢ抗体の固定化Ｈ４−１ＢＢへの結合親和性を示す。
【００９１】
【図６】図６は、ｍＡｂ３９Ｅ３（親抗体）（Ａ）およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４抗体（Ｂ）がＰＭＡおよびイオノマイシン刺激したＣＥＭ細胞に結合することを示す。
【００９２】
【図７】図７は、抗ＣＤ３および抗４−１ＢＢ ｍＡｂ ３９Ｅ３およびｈｕ３９Ｅ３.Ｇ４を用いたヒトＴ細胞のコスティミュレーションによるＩＦＮ−γの誘発を示す。
【００９３】
【図８Ａ】図８は、単独の剤としてか（図８Ａ）、または放射線照射したＭ１０９腫瘍細胞で前もって免疫したマウスでの（図８Ｂ）、Ｍ１０９肺癌腫モデルに対する抗体１Ｄ８の抗腫瘍作用を示す。
【００９４】
【図８Ｂ】図８は、単独の剤としてか（図８Ａ）、または放射線照射したＭ１０９腫瘍細胞で前もって免疫したマウスでの（図８Ｂ）、Ｍ１０９肺癌腫モデルに対する抗体１Ｄ８の抗腫瘍作用を示す。
【００９５】
【図９Ａ】図９は、単独の剤としてか（図９Ａ）、または放射線照射したルイス肺／ＬＭ肺癌腫細胞で前もって免疫したマウスでの（図９Ｂ）、ルイス肺／ＬＭ肺癌腫細胞モデルに対する抗体１Ｄ８の抗腫瘍作用を示す。
【００９６】
【図９Ｂ】図９は、単独の剤としてか（図９Ａ）、または放射線照射したルイス肺／ＬＭ肺癌腫細胞で前もって免疫したマウスでの（図９Ｂ）、ルイス肺／ＬＭ肺癌腫細胞モデルに対する抗体１Ｄ８の抗腫瘍作用を示す。
【００９７】
【図１０】図１０は、ｍＡｂ １Ｄ８の抗腫瘍作用がＩＦＮ−γ中和抗体の存在下で低減することを示している。
【配列表】
2006500921.tif 000006
2006500921.tif 000007
2006500921.tif 000008
2006500921.tif 000009
2006500921.tif 000010
2006500921.tif 000011
2006500921.tif 000012
2006500921.tif 000013
2006500921.tif 000014
2006500921.tif 000015
2006500921.tif 000016
2006500921.tif 000017
2006500921.tif 000018
2006500921.tif 000019
2006500921.tif 000020
2006500921.tif 000021
2006500921.tif 000022
2006500921.tif 000023
2006500921.tif 000024
2006500921.tif 000025
2006500921.tif 000026
2006500921.tif 000027
2006500921.tif 000028
2006500921.tif 000029
2006500921.tif 000030
2006500921.tif 000031
2006500921.tif 000032
2006500921.tif 000033
【図１】
2006500921.tif 000034
【図２Ａ】
2006500921.tif 000035
2006500921.tif 000036
2006500921.tif 000037
2006500921.tif 000038
2006500921.tif 000039
2006500921.tif 000040
2006500921.tif 000041
【図３】
2006500921.tif 000042
2006500921.tif 000043
2006500921.tif 000044
2006500921.tif 000045
2006500921.tif 000046
2006500921.tif 000047
2006500921.tif 000048
2006500921.tif 000049
2006500921.tif 000050
【図５】
2006500921.tif 000051
【図６】
2006500921.tif 000052
【図７】
2006500921.tif 000053
【図８Ａ】
2006500921.tif 000054
【図８Ｂ】
2006500921.tif 000055
【図９Ａ】
2006500921.tif 000056
【図９Ｂ】
2006500921.tif 000057
【図１０】
2006500921.tif 000058
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月30日(2005.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006500921000001.app
【国際調査報告】
2006500921.tif 000059
2006500921.tif 000060