(57)【要約】本発明は、動物、特にヒトを含む霊長類および非ヒト霊長類に対してNTを実用的手順で行うための種々の方法に向けられる。さらに、本発明によって提供される方法および分子成分は、所望の特徴を有する胚を作製するのための実用的な手段を提供する。特定の態様において、本発明の方法は、卵に1つまたは複数の分子成分と共に核を導入することと、前記卵を培養して生存可能な胚を作製することと、前記胚を雌性の卵管へ移すことと、およびクローン化された動物を作製することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法：
卵に1つまたは複数の分子成分と共に核を導入することと；
前記卵を培養して生存可能な胚を作製することと；
前記胚を雌性の卵管へ移すことと；および、
クローン化された動物を作製すること。
【請求項２】
前記核が所望の特徴を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記所望の特徴が特定の疾患または障害に関連している、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記特定の疾患または障害が心臓血管疾患、神経系疾患、生殖障害、癌、眼疾、内分泌障害、肺疾患、代謝異常、自己免疫不全、および老化からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記導入工程がSCNTを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
SCNTの後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記SCNTに続いて第2の核移植を行う工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記導入工程が紡錘体崩壊を行うことをさらに含む、請求項に１記載の方法。
【請求項９】
前記導入工程に続いて卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記卵細胞質の補充が卵細胞質体（ooplast）電気融合によって行われる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記卵細胞質の補充が微量注入によって行われる、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記1つまたは複数の分子成分が、精子中心体に通常存在する中心体成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記1つまたは複数の分子成分が有糸分裂のモーター・タンパク質および中心体タンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記有糸分裂モーター・タンパク質がキネシンを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物が霊長類である、請求項１記載に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物が非ヒト霊長類である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記非ヒト霊長類がサルである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記霊長類がヒトである、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
前記生存可能な胚がトランスジェニックである、請求項１記載に記載の方法。
【請求項２２】
前記生存可能な胚から胚幹細胞を作製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記胚幹細胞がヒトであり、かつ前記生存可能な胚がヒトである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項1の方法によって作製される動物。
【請求項２５】
前記動物が霊長類である、請求項24に記載の動物。
【請求項２６】
前記霊長類が非ヒト霊長類である、請求項25に記載の動物。
【請求項２７】
前記霊長類がヒトである、請求項25に記載の動物。
【請求項２８】
以下の工程を含む方法：
卵に1つまたは複数の分子成分と共に核を導入することと；
前記卵を培養して生存可能な胚を作製することと；
前記胚から割球を分離することと；および、
前記割球を培養して幹細胞を作製すること。
【請求項２９】
前記核が所望の特徴を有する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記所望の特徴が特定の疾患または障害に関係している、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記特異的疾患または障害が心臓血管疾患、神経系疾患、生殖障害、癌、眼疾、内分泌障害、肺疾患、代謝異常、自己免疫不全、および老化からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記導入工程がSCNTを行うことを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
前記SCNTの後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記SCNTに続いて第2の核移植を行う工程をさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
前記導入工程が紡錘体崩壊を行うことをさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３６】
前記導入工程に続いて卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３７】
前記卵細胞質の補充が卵細胞質体（ooplast）電気融合によって行われる、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記卵細胞質の補充が微量注入によって行われる、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
前記1つまたは複数の分子成分が精子中心体に通常存在する中心体成分を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項４０】
前記1つまたは複数の分子成分が有糸分裂のモーター・タンパク質および中心体タンパク質を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項４１】
前記有糸分裂のモーター・タンパク質がキネシンを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
前記幹細胞が霊長類胚幹細胞である、請求項28に記載の方法。
【請求項４５】
前記胚幹細胞がトランスジェニック霊長類胚幹細胞である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記トランスジェニック胚幹細胞がトランスジェニック非ヒト霊長類胚幹細胞である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
請求項28の方法によって産生される胚幹細胞。
【請求項４８】
前記胚幹細胞が遺伝子治療のために使用される、請求項47に記載の胚幹細胞。
【請求項４９】
前記胚幹細胞がヒト疾患のための治療として使用される、請求項47に記載の胚幹細胞。
【請求項５０】
以下の工程を含む方法：
卵に1つまたは複数の分子成分と共に核を導入することと；
前記卵を培養して生存可能な胚を作製することと；および、
前記胚を雌性の卵管へ移すこと。
【請求項５１】
前記核が所望の特徴を有する、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記所望の特徴が特定の疾患または障害に関係している、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記特異的疾患または障害が心臓血管疾患、神経系疾患、生殖障害、癌、眼疾、内分泌障害、肺疾患、代謝異常、自己免疫不全、および老化からなる群より選択される、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記導入工程がSCNTを行うことを含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５５】
SCNTの後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記SCNTに続いて第2の核移植を行う工程をさらに含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
前記導入工程が紡錘体崩壊を行うことをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５８】
前記導入工程に続いて卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５９】
前記卵細胞質の補充が卵細胞質体（ooplast）電気融合によって行われる、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
前記卵細胞質の補充が微量注入によって行われる、請求項58に記載の方法。
【請求項６１】
前記分子成分が精子中心体に通常存在する中心体の成分を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項６２】
前記分子成分が有糸分裂のモーター・タンパク質および中心体タンパク質を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項６３】
前記有糸分裂のモーター・タンパク質がキネシンを含む、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項62に記載の方法。
【請求項６６】
前記生存可能な胚がトランスジェニックである、請求項50に記載の方法。
【請求項６７】
前記生存可能な胚から胚幹細胞を作製する工程をさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項６８】
前記胚幹細胞がヒトであり、かつ前記生存可能な胚がヒトである、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
以下の工程を含む方法：
卵に1つまたは複数の分子成分と共に核を導入することと；
前記卵を培養して生存可能な胚を作製することと；および、
前記胚から割球を分離すること。
【請求項７０】
前記核が所望の特徴を有する、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記所望の特徴が特定の疾患または障害に関係している、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
前記特定の疾患または障害が心臓血管疾患、神経系疾患、生殖障害、癌、眼疾、内分泌障害、肺疾患、代謝異常、自己免疫不全、および老化からなる群より選択される、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
前記導入工程がSCNTを行うことを含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７４】
前記SCNTの後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
前記SCNTに続いて第2の核移植を行う工程をさらに含む、請求項73に記載の方法。
【請求項７６】
前記導入工程の前に紡錘体崩壊を行う、請求項69に記載の方法。
【請求項７７】
前記導入工程に続いて卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７８】
前記卵細胞質の補充が卵細胞質体（ooplast）電気融合によって行われる、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
前記卵細胞質の補充が微量注入によって行われる、請求項77に記載の方法。
【請求項８０】
前記分子成分が精子中心体に通常存在する中心体の成分を含む、請求項69に記載の方法。
【請求項８１】
前記分子成分が有糸分裂のモーター・タンパク質および中心体タンパク質を含む、請求項69に記載の方法。
【請求項８２】
前記有糸分裂のモーター・タンパク質がキネシンを含む、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項81に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦によって支援された研究に関する記載
本発明は、少なくとも部分的に、NIHによって与えられる助成金番号NIH R37 HD 12913および2 R24RR013632-06下で合衆国政府支援によってなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有するであろう。
【０００２】
関連出願の説明  
本出願は、35U. S. C. 119の下で、2003年4月9日に出願された U. S. Provisional Patent Application Serial Number 60/461,139の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
技術分野
本発明は、霊長類を含む動物のクローンの繁殖のための方法に関する。また、本発明は、胚幹細胞、トランスジェニック胚幹細胞、およびヒトを含む霊長類に由来する免疫性のマッチした胚幹細胞を作製するための方法に関する。さらに、本発明は、核移植と関係する紡錘体欠損を修正するために使用されるであろう種々の方法および分子成分を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景  
同一の霊長類は、分子医薬にとって、並びに絶滅危険種の保存および不妊症にとって計りしれない重要性を有する。クローン化された動物間では、遺伝的多様性が欠如していることにより、実験精度が比例的に増大し、これにより、薬物、遺伝子治療、およびワクチンの試行、並びに老化、環境、またはその他の影響による疾患および障害のために、完全な対照と共に、統計学的に有意なデータを得るために必要な動物の数が減少する。健康および挙動に対する母系性の環境またはエピジェネティックな影響を含む、遺伝的対環境的な影響に関する「発生的特質（nature）対遺伝素因修飾因子（nurture）」の問題にも答えられるであろう。従って、異なった出生日であっても、第1の子孫の平均余命を越えた細胞老化に立ち向かうために；並びに同時遡及的に（年上の双生児において）および将来の治療プロトコルを試験するために、遺伝的に同一の子孫を調査してもよい（たとえば、動物生産前の表現型の解析などの研究において；および生殖系列細胞（雄生殖細胞などの）の系列導入において、Brinster et al. , 9 SEMIN. CELL DEV. BIOL. 401-09 (1998)）。エピジェネティック調査では、たとえば、低体重児または胎児の発育のその他の側面が生涯の成り行きとなるであろうこと（Leese et al. ,13 HUM. REPROD. 184-202 (1998)）、児童のIQの減少が妊娠中の母系の甲状腺機能低下症に関連すること（Haddow et al. ,341 N. ENGL. J. MED. 549-55 (1999)）、または免疫遺伝病（immunogenetics）では、子宮拒絶を生じること（Gerard et al. ,23 NAT. GENET. 199-202 (1999) ; Clark et al. ,41 AM. J. REPROD. IMMUNOL. 5-22 (1999) ; and Hiby et al. ,53 TISSUE ANTIGENS 1-13 (1999)）を証明するために、同一の代理母に連続的に移植した本発明の同一の胚を使用して試験してもよい。
【０００５】
成人の体細胞核移植によって動物をクローン化することは、ヒツジ（Wilmut et al. ,385 NATURE 810-13 (1997)）、ウシ（Kato et al. ,282 SCIENCE 2095- 98 (1998)）、マウス（Wakayama et al. ,394 NATURE 369-74（1998））、ブタ、ネコ、ウサギ、およびヤギ（Baguisi et al. ,17 NATURE BIOTECH. 456-61 (1999)）の作製でリードされてきた。クローニングのために最も関心を引く科学的な理論的根拠の一つは、疾患モデルの作製である。疾患のためのモデルとしてのクローン化された動物は、それぞれのクローンの遺伝現象（genetics）が不変であるので、多大な期待を示す。
【０００６】
幹細胞系は、ヒトおよびサル胚から作製されている（Shamblott et al. , 95 PRoc. NATL. ACAD. Sci. USA 13726-31 (1999) and Thomson et al. ,282 SCIENCE 1145-47 (1999)）。ヒトまたは霊長類の完全に非近交系の集団に由来する幹細胞が不変の遺伝現象を有する選択された近交系マウス株に由来するものの完全な全能性を有するかどうかは、まだ知られていない。これは、たとえば、複数の1つから治療的な幹細胞を作製し、それ以後は、その同一の同胞で試験して、そうする際に、幹細胞が癌様の奇形癌腫を生じるかもしれないかどうかを知ることによって、今回の本発明の状況内で評価することができる。
【０００７】
理論的には、体細胞核移植（SCNT）は、無制限に同一の子孫を生じる潜在的を有するが；しかし、遺伝子のキメラ現象、胎児および新生児の死亡率（Wilmut et al. ,419 NATURE 583-7 (2002) ; Humpherys et al. , 99 PROC. NATL. ACAD. Sci. USA 12889-94 (2002) ; Cibelli et al. ,20 NAT. BIOTECHNOL. 13-4 (2002) ; and Kato et al. ,282 SCIENCE 2095-8 (1998)）、短くなったテロメア（Shields et al. ,399 NATURE 316-7（1999））、および一貫しない成功率により、これを即座に役立てることができなくなる。マカクのSCNTでは、割球核でうまくいったが、成体、胎児、または胚幹性（ES）細胞ではまだうまくいっていない。これらの関心事にもかかわらず、SCNTによって生じる矛盾およびパラドックスにより、SCNTによる哺乳類クローニングの分子調節に関する新たな研究を刺激した。
【０００８】
図1は、SCNTの間に活性化された除核された卵母細胞内で体細胞核において極点に達する操作および発生のイベントを図示する。これらの工程は、除核または中期II停止された紡錘体の除去、体細胞の選択および調製、核移植または細胞質内の核注射（ICNI）、紡錘体除去および核移入による創傷治癒および薬物回復、並びに卵母細胞活性化を含むが、これらに限定されない。しかし、これらの工程に付随した限界もある。たとえば、霊長類卵母細胞（非ヒトおよびヒト様）の紡錘体除去は、現在は除核された卵母細胞に対して思いがけない結果を有する。マウスの飼育種に由来する卵母細胞とは異なり、重要な微小管モーター（キネシン）および中心体分子（NuMA）は、met-II紡錘体上でほぼ排他的に濃縮される。この紡錘体と共に卵DNAを除去することにより、大部分のこれらのモーターおよび紡錘体極タンパク質を除去して、その結果、SCNT再構成された卵母細胞は、第1有糸分裂において機能的な双極性の紡錘体を形成する能力をもはや有さなくなる。
【０００９】
加えて、これらの工程のいくつかに関連した基礎科学的な知識も不足している。例えば、体細胞の調整および選択（Wilmut et al. ,385 NATURE 810-3（1997）；Wilmut et al. ,419 NATURE,583-7（2002）；およびWakayama et al. ,394 NATURE 369-74（1998））は、少数の種で調査されただけであり、電気融合と直接注射（細胞質内の核注射（ICNI））の間の比較は、完全には調査されておらず、微量注入後の創傷治癒、細胞融合、および「除核」は、これから調査される。
【００１０】
核移植（NT；「ドリー」アプローチ）による（Wilmut etal.,419 NATURE 583-7（2002）；
Polejaeva et al. ,407 NATURE 86-90（2000）；およびCampbell et al. ,380 NATURE 64-6（1996））、およびICNI（ホノルル方法：Honolulu method）（Wakayama et al. ,394 NATURE 369-74（1998）およびDominko et al.,1 CLONING 143-152（1999））による、SCNTは両方とも、同一の霊長類を繁殖させる見込みを有するが、霊長類のみにおいて見いだされる、事前に予期されない生物学的ハードルが存在する。さらに、ヒト胚幹細胞能に関する重要な調査は、非ヒト霊長類で調査されている。遺伝的に同一の霊長類の子孫のセットは、生物医学的および行動的調査のために非常に貴重であろうが、それでもまだ何も生まれていない。従って、本発明は、同一のトランスジェニック動物、特に霊長類を繁殖させるための信頼でき、かつ有効な方法を提供する。さらに、本発明はまた、NTと関係する紡錘体欠損を修正するために使用されるであろう種々の方法および分子成分を提供する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要  
本発明は、動物、特に霊長類のために実用的な手順でNTを行うための種々の方法に向けられる。さらに、本発明によって提供される方法および分子成分は、所望の特徴を有する胚を作製するための実用的な手段を提供する。一つの態様において、本発明は、卵、たとえば除核された卵内に1つまたは複数の分子成分と共に核を導入することと、卵を培養して生存可能な胚を作製することと、胚を雌性の卵管へ移すことと、およびクローン化された動物を作製することを含む。
【００１２】
特定の態様において、所望の特徴を有する核を選択によって、または設計によって得て、卵、たとえば除核された卵に導入してもよい。特定の態様において、通常存在する核は、遺伝的に宿主に対して適合性または相補性なものを選択してもよく、または所望の特徴をもつドナーに由来し、もしくは設計してもよい。本発明のもう一つの態様において、所望の特徴は、特定の疾患または障害に関連していてもよい。特に、疾患または障害は、心臓血管疾患、神経系疾患、生殖障害、癌、眼疾、内分泌障害、肺疾患、代謝異常、自己免疫不全、および老化を含んでもよい。選択された核は、精子中心体に通常存在する中心体成分を含む分子成分と共に卵に導入してもよい。もう一つの態様において、分子成分は、それぞれキネシン（たとえば、HSET）およびNuMAなどの、有糸分裂のモーター・タンパク質および中心体タンパク質を含む。
【００１３】
特に、本発明の方法は、二重核移植；紡錘体崩壊、母系性のDNA除去および回復；NTおよび受精または人為的活性化後の前核の除去；並びに細胞質の導入または卵細胞質補充含んでもよい。本発明のもう一つの態様において、動物は、哺乳類、鳥、爬虫類、両生類、または魚であってもよい。この方法のもう一つの側面において、動物は、非ヒト霊長類、および特にサルであってもよい。この方法の別の側面において、動物は、霊長類、特にヒトであってもよい。本発明の特定の態様において、動物は、トランスジェニックでもよい。
【００１４】
本発明の特定の態様において、移植前遺伝子診断法を代理母の卵管に移転する前に胚から単離された割球に対して行ってもよい。この着床前遺伝子診断のために使用する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）、蛍光インシチューハイブリダイゼイション（FISH）、1本鎖高次構造上の多型（SSCP）、制限断片長多型（RFLP）、プライムド・インサイチュウ・ラベリング（primed in situ labeling:PRINS）、比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）、単細胞ゲル電気泳動（COMET）解析、ヘテロ二重鎖解析、サザン分析、および変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）解析を含む。
【００１５】
また、本発明の範囲内には、本発明の方法によって作製された胚幹細胞およびトランスジェニック胚幹細胞がある。特定の態様において、SCNT胚は、クローンの子孫を作製するために使用され、また単離された割球は胚幹細胞系を作製するために使用される。さらなる態様においてSCNT胚は、トランスジェニックであり、これらのSCNTトランスジェニック胚は、クローンのトランスジェニック子孫を作製するために使用され、単離されたトランスジェニック割球は、トランスジェニック胚幹細胞系を作製するために使用される。
【００１６】
また、本発明は、胚幹細胞を作製する方法であって、割球を胚から分離し、次いでこれらの細胞を培養して幹細胞株を作製する方法に関する。特定の態様において、本明細書に記載されている方法は、霊長類胚幹細胞を作製するために使用される。本発明の別の態様において、本明細書に記載されている方法は、トランスジェニック胚幹細胞、たとえばトランスジェニック霊長類胚幹細胞を作製するために使用される。
【００１７】
また、本発明は、本明細書に記載されている方法によって作製される胚幹細胞に向けられる。特定の態様において、胚幹細胞は、霊長類胚幹細胞である。さらなる態様において、胚幹細胞は、トランスジェニック、たとえばトランスジェニック霊長類胚幹細胞である。さらにもう一つの態様において、トランスジェニック胚幹細胞は、ヒト・トランスジェニック胚幹細胞である。
【００１８】
また、本発明は、胚の着床前遺伝子診断のための方法に関する。特定の態様において、割球は、胚から分離され、遺伝分析は、単一の割球で行われる。本発明のさらなる態様において、残りの割球を培胎児段階まで養して、その後に雌代理母に移植する。割球の遺伝分析のために使用する方法は、PCR、FISH、SSCP、RFLP、PRINS、CGH、COMET解析、ヘテロ二重鎖解析、サザン分析、およびDGGE解析を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な説明  
本発明は、本明細書に記載されている特定の方法、プロトコル、および試薬、その他に限定されず、同様にこれらを変更してもよいことが理解される。また、本明細書に使用される用語法は、特定の態様のみを記載するために使用され、本発明の範囲を限定することは企図されないことが理解される。本明細書および添付の態様に使用されるものとして、単数形「一つ」、「ある」および「本」は、前後関係から他に明らかに述べない限り、複数の参照を含むことに留意しなければならない。
【００２０】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって当前記技術分野において共通に理解されるものと同じ意味を有する。好ましい方法、装置、および材料が記載されているが、本明細書に記載されているものと同様のまたは均等ないずれの方法および材料も、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書において引用される全ての参照は、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。
【００２１】
定義  
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の態様に使用される一定の用語および表現の意味を下記に提供してある。
【００２２】
「動物」の用語は、哺乳類（たとえば、齧歯類、マウス、およびラット）、霊長類（たとえばサル、類人猿、およびヒト）、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ、両生類、爬虫類、魚、および鳥などの全ての脊椎動物を含む。また、胚および胎児の段階を含む全ての発生段階の個体動物を含む。
【００２３】
「霊長類」の用語は、本明細書に使用されるものとして、サル、類人猿、およびヒトを含むが、これらに限定されない、哺乳類の群の任意の動物をいう。
【００２４】
「全能性の」の用語は、本明細書に使用されるものとして、胚、胎児、および動物などの発生中の細胞集団における全ての細胞を生じる細胞をいう。特定の態様において、「全能性の」の用語は、また、動物の全ての細胞を生じる細胞をいう。全能性の細胞は、1つまたは複数の核移植工程によって胚を作製するための手順に利用されるときに、発生中の細胞集団における全ての細胞を生じることができる。動物は、子宮外（ex utero）で機能する動物であってもよい。動物は、たとえば生きている天然の動物として存在することができる。また、全能性の細胞は、器官収集のために有用なもの、たとえば、ホメオティック遺伝子の操作になどにより、頭部またはその他の器官の増殖をなくすための遺伝子改変を有するものなどの不完全な動物を作製するために使用してもよい。
【００２５】
「全能性の」の用語は、本明細書において使用されるものとして、「多能性の」の用語とは区別される。後者の用語は、発生中の細胞集団において細胞の亜集団に分化する細胞をいうが、その発生中の細胞集団において全ての細胞を生じないであろう細胞をいう。従って、「多能性の」の用語は、生きている天然の動物の全ての細胞を生じることができない細胞をいうことができる。
【００２６】
また、「全能性の」の用語は、本明細書において使用されるものとして、「キメラの」または「キメラ」の用語とは区別される。後者の用語は、その細胞集団のその他の細胞の核DNAとはかなり異なるヌクレオチド塩基配列を有する核DNAを収容する細胞の亜属を含む発生中の細胞集団をいう。発生中の細胞集団は、たとえば、胚、胎児、および／または動物として存在することができる。
【００２７】
「胚幹細胞」の用語は、本明細書に使用されるものとして、たとえば、インビトロでの細胞培養において維持されるであろう胚から単離された多能性の細胞を含む。胚幹細胞は、フィーダー細胞と共に、または伴わずに培養してもよい。胚幹細胞は、胚盤胞段階の胚およびプレ胚盤胞段階の胚を含む、発生いずれの段階の胚から単離された胚細胞からも確立することができる。胚幹細胞およびこれらの使用は、当業者に周知である。たとえば、U. S. Patent No. 6,011,197およびWO 97/37009、表題" Cultured Inner Cell Mass Cell-Lines Derived from Ungulate Embryos, " SticeおよびGolueke（これらは両方とも、その全ての図、表、明細書を含む全体が、参照により本明細書に援用される）並びにYang & Anderson,38THERIOGENOL. 315-35 (1992)を参照されたい。
【００２８】
本発明のために、「胚」または「胚の」の用語は、本明細書に使用されるものとして、母系宿主の子宮膜に移植されていない発生中の細胞集団を含む。それゆえに、「胚」の用語は、本明細書に使用されるものとして、受精した卵母細胞、細胞質雑種、プレ胚盤胞段階の発生している細胞集団、および／または母系宿主の子宮膜に移植する前の発生段階であるその他のあらゆる発生中の細胞集団をいうことができる。本発明の胚は、生殖隆起を示してはならない。それゆえに、「胚細胞」は、胚から単離されるか、および／または生じたものである。
【００２９】
胚は、細胞発生の複数の段階を表すことができる。たとえば、一つの細胞胚は、接合体と称することができ、切断された胚から生じる細胞の固体の球状集団は、桑実胚と称することができ、胞胚腔を有する胚は、胚盤胞と称することができる。
【００３０】
「胎児」の用語は、本明細書に使用されるものとして、母系宿主の子宮膜に移植された発生中の細胞集団をいう。胎児は、たとえば、生殖隆起などの特徴を定義するものを含むことができる。生殖隆起は、当業者によって容易に同定される特徴であり、ほとんどの動物種の胎児において認識できる特徴である。「胎児の細胞」の用語は、本明細書に使用されるものとして、胎児から単離されたか、および／または生じたか、または胎児に由来する任意の細胞をいうことができる。「非胎児細胞」の用語は、胎児に由来しないか、またはから単離されない細胞である。
【００３１】
「内部細胞集団」の用語は、本明細書に使用されるものとして、固有の胚を生じる細胞をいう。胚盤胞の外側を裏打ちする細胞は、胚の栄養膜といわれる。胚からの内部細胞集団を単離するための方法は、当業者に周知である。Sims & First, 91 PROC. NATL. ACAD. Sci. USA 6143-47 (1994) and Keefer et al. ,38 MOL. REPROD. DEV. 264-268 (1994)を参照されたい。「プレ胚盤胞」の用語は、当該技術分野において周知である。
【００３２】
「トランスジェニック胚」は、1つまたは複数の細胞がヒトの介入を介して導入された異種核酸を含む胚をいう。導入遺伝子は、細胞の前駆体に導入することによって、慎重な遺伝子操作を解して、または組換えウイルスへの感染によって、直接または間接的に細胞に導入してもよい。本明細書に記載されているトランスジェニック胚では、導入遺伝子により、関心対象の構造遺伝子の発現が細胞に生じる。しかし、導入遺伝子がサイレントであるトランスジェニック胚も含まれる。
【００３３】
「トランスジェニック細胞」の用語は、導入遺伝子を含む細胞をいう。「生殖細胞系列トランスジェニック動物」の用語は、遺伝子の変化または遺伝情報が生殖系列細胞に導入されることにより、遺伝情報を子孫に伝達する能力を与えるトランスジェニック動物をいう。このような子孫が、実際にその遺伝情報の変化のいくつかまたは全てを有する場合は、これらは、同様にトランスジェニック動物である。
【００３４】
「遺伝子」の用語は、ポリペプチドまたは前駆体の産生のために必要な制御配列およびコード配列を含むDNA配列をいう。ポリペプチドは、全長コード配列によって、または所望の酵素活性が保持される限り、コード配列の任意の一部によってコードされることができる。
【００３５】
「導入遺伝子」の用語は、おそらくゲノムに通常存在しない配列を有する遺伝子もしくはDNA、存在するが所与のゲノムにおいて通常転写および翻訳（「発現」）されない遺伝子、またはゲノムに導入することが望まれるその他の任意の遺伝子もしくはDNAを含む（しかし、限定されない）広く動物のゲノムに導入される任意の核酸をいう。これは、非トランスジェニック・ゲノムに通常存在するであろうが、発現が変更されたることが望まれるか、または変更されたか、もしくは変種の形態で導入することが望まれる遺伝子を含んでいてもよい。導入遺伝子は、定義された遺伝子座に特異的にターゲットされてもよく、染色体中にランダムに組み込まれてもよく、またはこれは、染色体外で複製するDNAであってもよい。導入遺伝子は、イントロンなどの、選択された核酸の最適な発現のために必要とされるであろう1つまたは複数の転写制御配列およびその他の何らかの核酸を含んでいてもよい。導入遺伝子は、コード配列もしくは非コード配列、またはこれらの組み合わせであることができる。導入遺伝子は、適切な条件下で1つまたは複数の導入遺伝子の発現を駆動することができる調節エレメントを含んでいてもよい。
【００３６】
「関心対象の構造遺伝子」の句は、構造遺伝子をいい、たとえば関心対象の生物学的に活性なタンパク質またはアンチセンスRNAを表す。構造遺伝子は、植物、真菌、動物、細菌ゲノムもしくはエピソーム、成熟核、核もしくはプラスミドDNA、cDNA、ウイルスDNA、または化学的に合成されたDNAを含む、全体的にまたは部分的に、当該技術分野において既知のいずれの供与源に由来する既知の任意の供与源に由来してもよい。構造遺伝子配列は、ポリペプチド、たとえば受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞シグナリングタンパク質、膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、またはリポータータンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）をコードしてもよい。加えて、構造遺伝子は、心臓血管疾患、神経系疾患、生殖障害、癌、眼疾、内分泌障害、肺疾患、代謝異常、自己免疫不全、および老化などの特定の疾患または障害（例えば）に関連した遺伝子であってもよい。
【００３７】
構造遺伝子は、コード領域または非翻訳の領域に、生物活性または発現産物の化学構造、発現率、または発現調節の方法に影響を及ぼすことができる1つまたは複数に修飾を含んでもよい。このような修飾は、1つまたは複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、および置換を含むが、これらに限定されない。構造遺伝子は、連続的なコード配列を構成してもよく、または適切なスプライス部位によって結合された1つまたは複数のイントロンを含んでもよい。また、構造遺伝子は、融合タンパク質をコードしてもよい。
【００３８】
核および細胞質の成分が同一の霊長類は、たとえば、疾患の遺伝的およびエピジェネティックな基礎についての前臨床の調査のための理想的な科学モデルを表す。ここで、本発明は、SCNTを使用して双子およびより高い桁の複数の、遺伝的に同一の霊長類を作製することに関する。さらに、本発明は、ヒトおよび非ヒト霊長類の生殖能の機能不全を修正するためのいくつかの方法、並びにNT技術の適用後の胚から誘導される細胞および組織の治療的価値を想定する。有効なNTのためには、体細胞または胎児の核に由来する二倍体核の導入により、最初の有糸分裂において機能的な双極性の紡錘体器官にこれらの複製された染色体を凝縮し、整列させることができるべきである。これは、最初の分裂終了後に整列された染色体を正確な分離を伴うであろう。機能的な双極性紡錘体の構築は、次に、2つの重要なイベント：（i）核膜の破壊後に紡錘体微小管を核とする核移植の間に導入された細胞の微小管形成中心（すなわち、体細胞または胚の中心体）および（ii） 一組の構造成分の作用（すなわち、核分裂装置タンパク質（たとえば、NuMA）および分子モータータンパク質（キネシンモータータンパク質を含む）を含む）に依存し、これらは主に卵細胞による寄与を受け、複製された染色体を整列させ、分離するための双極性の紡錘体装置を架橋し、組織し、形作る。以前には、核移植後に双極性紡錘体の構築の役割を果たす中心体または構造／分子モータータンパク質の評価はなされていなかった。本発明は、機能障害性中心体、並びにNuMAおよびHSETキネシンの喪失により、核移植後にきちんと配置されていない染色体および異数体の胚を有する有糸分裂多極紡錘体を生じることを例証する。本発明の以下の態様は、NTに関係した紡錘体欠損を修正するための種々の技術に関する。本発明によって提供される方法は、以前には効果的に検出しにくかった、第1の有糸分裂のエラーに関連した潜在的核移植不全の機構を評価することができる。
【００３９】
再生と、双極性の紡錘体を構築する能力との間には直接的な相互関係があり、正確に、かつ忠実に複製された染色体を分離する役割を担っている。一般に、霊長類では、精子が機能的な中心体の構築に重要である中心小体を提供する。中心体の構築に続いて、中心体は、第1の紡錘体微小管の構築に関与する。卵母細胞は、対照的にキネシン・スーパーファミリおよびダイニンのメンバーなどの種々のモータータンパク質を提供し、紡錘体の微小管上で合体する。種々のモータータンパク質の機能は、双極性の紡錘体の構築に関与して、維持することである。
【００４０】
紡錘体は、生存可能なヒトおよび非ヒト霊長類胚の生成に必須である。染色体の紡錘体組織および正確な分離は、これらの分子に依存するであろうことは予期されなかった。これらの成分が必要なことは、精子中心体から構造またはモーター分子を欠いたNTによって調製された胚が非生育であることによって証明される。従って、NTの有用な成功率および選択された特徴をもつ細胞、組織、または動物を産生することが企図される胚の実際的な産生を生じるためには、精液に存在する紡錘体を組織化する原理が必要とされるであろう。
【００４１】
本発明は、中心体の成分の導入により、NTに関係した紡錘体欠損を修正するであろうことなる成分を提供する。特に、これらの成分は、NuMAおよびHSETキネシン含んでもよいが、これらに限定されない。
【００４２】
また、本発明は、動物、特にヒトまたは非ヒト霊長類にNTを行うであろう種々の方法の実施手順を想定する。特に、所望の特徴を有する核は、選択によって、または設計によって得られ、卵に導入されるであろう。天然に存在する核を、宿主に対する遺伝子の適合性または相補性に関して選択してもよく、または望ましい特徴をもつドナーに由来しても、もしくは設計してもよい。選択された核は、精子の中心体に通常存在する成分と共に卵に導入されるであろう。中心体成分の付加は、生存可能な胚の生産のために必要であろう。本発明によって提供されるこれらの方法および分子の有用性により、所望の特徴をもつ胚を産生するための実用的な手段を生じる。
【００４３】
本発明の特定の態様は、SCNTおよび受精（ICS/NI-2PN）後の前核の除去に関する。図2A〜2Gでは、SCNTおよび受精（ICS/NI-2PN）後の前核の除去の実現可能性および利益を証明する。従来の卵母細胞除核を伴わないICNIは、受精を伴う。体細胞には、第一極体から遠位に導入して雌の前核と倍数体核との間を地理的に分離させてもよい。精子は、たとえば生体染料Mito Trackerでそのミトコンドリアを前標識することによって、または組み入れられた精子の尾部をイメージングすることによって、いずれかで同定してもよい。第1の間期において、2つの前核を抽出して、精子で活性化された卵母細胞にある体細胞核を再プログラムして、再構築し、卵細胞質のタンパク質の完全な補完により、第2の減数分裂の完成後に回復する。核プログラミングに関する議論については、一般にWakayama et al. ,5（3） CLONING AND STEM CELLS 181-89（2003）；Dinnyes et al.,4（1） CLONING AND STEM CELLS 81-90（2002）；およびJaenisch et al. ,4（4） CLONING AND STEM CELLS 389-96（2002）を参照されたい。
【００４４】
さらに、本発明はまた、体細胞核がNT（二重NT）の間に再プログラムして、再構築されるであろう第2のNTを想定する。しかし、核は、その翌日に、事前に卵細胞質内精子注入法（ICSI）によって受精した別の卵に移入されてもよい。接合体の雄性および雌性の前核（それぞれ、精子および卵核）を顕微操作によって除去してもよい。第1の間期NTから新たに除核された接合体への第2の核移植は、精子によって活性化された間期細胞質内に再プログラムされた体細胞の倍数体核を挿入し、事前に紡錘体上で隔離された全ての卵細胞質成分を含む。通常、紡錘体に結合したモーターは、第二極体形成の後に二重NTストラテジーによって、卵細胞質に戻され、これらは、完全に補完される。二重NTは、ブタのSCNTの間のその良好な適用を含むいくつかの利点をもたらす。しかし、これは、2倍の卵粒数および間期核移植と合わせた前核の抽出を含む多くのより厳しい複雑な手順を必要とする。
【００４５】
本発明のもう一つの態様は、紡錘体微小管を減少させる、または除去するためにノコダゾールまたは冷却のいずれかによる可逆的な微小管分解を使用する紡錘体崩壊を想定する。動的なDNAイメージングにより、減数分裂染色体がモーターまたは中心体分子を捨てずに抽出することができるようにそれらを同定する。特に、卵母細胞の回復が完全かつ迅速である場合に、紡錘体崩壊は、効率的な改善を約束する。
【００４６】
そのうえ、本発明のもう一つの態様は、ウシ/クローンニングおよび臨床的ART（CT）のために使用されてきた（Barritt et al. ,5 MOL. HUM. REPROD. 927-33 （1999））卵細胞質体（ooplast）電気融合（SCNT+OF）または微量注入によって卵細胞質の補完を使用することを想定する（細胞質の転移およびICNI；CT+ICNI）。ここで、同じクラッチの卵母細胞に由来するさらなる卵細胞質が、除核の間に失われたものを補完する。別の態様では、たとえば、同じ卵母細胞内で完全に回復することは困難であるとことが分かる場合に、冷却またはノコダゾール回復の卵母細胞からの卵細胞質を使用してもよい。卵細胞質の補完は、ヒトおよびウシですでに成功しており、臨床ICSI+CTのようにICNIと組み合わせたときに（すなわち、ICNI+CT）、特に明瞭である。ICS/NI-2PN（すなわち、ICNI、ICSI、および次いで前核の除去）は、二重NTの半分の卵母細胞を使用する。これは、第2日めに除核を必要とするが、天然の活性化を使用して、サイトカラシンおよび紡錘体破壊を回避する。
【００４７】
本発明は、生体臨床医学研究コミュニティーのためにいくつかの重要な利益を有する。トランスジェニックおよびSCNT能力を含むように動物および特に霊長類の再生を拡大することによって、必須かつ緊急の前臨床治験のためのこのモデルの有用性は、非常に増強されるであろう。SCNTでは、特別な適用を見いだす可能性があり、これにより、非常に貴重な霊長動物モデルを繁殖するための信頼できる、ルーチンのアプローチが開発された。種々の疾患のために齧歯類モデルを作製することは、通常利用できる技術にも関わらず、多くの深刻なヒト障害は、これらのより下等な哺乳類において適切に研究されていない。ヒト疾患のための最も臨床的に関連したモデルとしてのトランスジェニック霊長類の作製は、全ての臨床研究コミュニティーに重要である。さらに、これらのアプローチの組み合わせは、研究モデル化として非常に貴重なトランスジェニック霊長類を繁殖させるための信頼できる効率的な適用をさらに生じさせるかもしれない。最後に、安全かつ有効な遺伝子治療プロトコルの約束は、調査のための適切な系が、トランスジェニック・マウスと重病の患者との間のギャップを満たすことが見いだされるまで、完全に実現することができない。その結果、遺伝子改変された霊長類、特にヒトおよび非ヒト霊長類を作製するための信頼でき、かつ有効な方法を開発することに関し、強力な正当性がある。従って、本発明は、細胞療法（神経、脳、および脊髄幹細胞適用、肝臓幹細胞適用、膵臓幹細胞適用、心臓幹細胞適用、腎臓幹細胞適用、血液幹細胞適用、網膜幹細胞適用、糖尿病-幹細胞適用、整形外科-幹細胞適用、研究のための同一の霊長動物モデル、創薬、創薬のための胚幹細胞）、薬学的および医学的な装置（創薬および試験、薬理学的標的の識別、創薬、薬効試験、医療用具の生体適合性のための疾患の動物モデルを含む）、農業、珍しい危機に瀕した種、および毒物学評価を含む（しかし、これらに限定されない）臨床および治験に適用されてもよい。
【００４８】
さらに、本発明は、また、ヒト疾患を治療するために胚幹細胞およびトランスジェニック胚幹細胞を使用する方法に関する。特に、本発明に記載されている霊長類、特にヒトおよび非ヒト霊長類のクローン繁殖のための方法を胚幹細胞およびトランスジェニック胚幹細胞を作製するために使用してもよい。
【００４９】
胚の内部細胞塊に由来する細胞（すなわち、胚盤胞）を胚幹細胞系を引き出すために使用してもよく、これらの細胞を組織培養において維持してもよい（たとえば、Schuldiner et al., 97 PROC. NATL. ACAD. IOL. 271-78 （2000） ；U. S. Patent No. 5,843,780；およびU. S. Patent No. 5,874,301を参照されたい）。一般に、幹細胞は相対的に未分化であるが、分化した機能的な細胞を生じてもよい。たとえば、造血幹細胞は、赤血球および白血球などの末端分化した血液細胞を生じるであろう。
【００５０】
図3は、このような手順の基本的概略を提供し、特に胚幹細胞は、脊髄損傷などの患者の傷害を治癒するための新たな神経に増殖させることができる（図3A）。卵を患者の卵巣から除去し（図3B）、シャーレに置く。卵に張り付いている細胞を除去する（図3C）。卵内には核があり（図ED）、これをクローン化された胚を作製するために取り出す。たとえば、卵を細針またはピペットで突き通して（図3E）、核を放出するように穏やかにしぼり出し、または吸引して（図3F）、核を取り出す（図3G）。事前に卵から取り出した細胞のうちの1つ（図3C）を卵に注射する（図3H）。電流により卵を活性化する（図3I）。注射された細胞の遺伝物質が卵の発生を誘導する（図3J）。細胞分裂が開始する（図3K）。特に、遺伝物質は、これを2つの新たな細胞間に等しく分配することができるように分けられる。細胞は、4細胞分裂の時期に再び分かれた（図3L）。幹細胞を含む、内部細胞塊と呼ばれる多くの細胞分裂後の領域が目に見える（図3M）。幹細胞を取り出して増殖培地に置く（図3N）。幹細胞をコロニーに増殖させて（図3O）、これを分けて、繰り返し増殖させて、何百万もの幹細胞を生じさせることができる（図3P）。これらの細胞は、霊長類の体の任意のいずれの組織にも、たとえば、筋肉、神経、膵臓、および骨細胞に成長することができる（図3Q）。分化した細胞を、傷害または疾患の部位に新たに機能する細胞が増殖するように、、ヒト患者に戻してもよい（図3R）。
【００５１】
また、本発明の方法を使用して、特定の疾患に関連した遺伝子を発現するトランスジェニック霊長類胚幹細胞を作製してもよい。たとえば、トランスジェニック霊長類胚細胞は、ドーパミンの生合成経路に含まれる酵素であるチロシン水酸化酵素を発現するように設計してもよい。パーキンソン病では、脳の基底神経節領域においてこの神経伝達物質が減少する。従って、チロシン水酸化酵素を発現するトランスジェニック霊長類胚細胞は、パーキンソン病に罹患している患者の基底核領域に移植して、強力にドーパミンの神経レベルを回復させてもよい（たとえば、Bankiewicz et al. ,144 Exp. NEUROL. 147-56 （1997）を参照されたい）。従って、本発明に記載されている方法は、多数のヒト疾患および障害を治療するために使用してもよい（たとえば、Rathjen et al. ,10 REPROD。FERTIL.DEV. 31-47の（1998）；Guan et al. ,16 ALTEX 135-41（1999）；Rovira et al., 96のBLOOD 4111-117（2000）；Muller et al. ,14 FASEB J. 2540-48（2000）を参照されたい）。
【００５２】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の具体例から明らかになるだろう。実施例は、本発明の特異的な態様を示しているが、例示のみによって提供される。従って、本発明は、また、本発明の精神および範囲内の、この詳細な記載から当業者に明らかとなるであろう種々の改変および変更態様を含む。
【実施例】
【００５３】
実施例1：卵母細胞収集および核移入法  
赤毛猿卵の超刺激、卵母細胞ステージング、および受精のための方法は、Hewitsonet al.（77 FERTIL. STERIL. 794-801（2002））によって記載されている。7.5μg/mlサイトカラシンD（CCD）および1μg／mlのヘキスト33342 DNA染料（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO）を含むTALP-Hepesに簡単に曝露した、成熟した受精してない卵母細胞の除核は、30μMのIDピペット（Humagen、Charlottsville、VA）を使用して行い、第1極体および下にある第2紡錘体を含む細胞質を吸引する（Meng et al. ,57 BIOL. REPROD. 454-9 （1997））。母系性のクロマチンの除去は、ヘキスト・イメージングによって確認した。胚細胞核移植（ECNT）のために、ドナー割球を透明帯除去後に0.5%のプロナーゼ（Boehringer Mannheim）と共に4-および32-細胞胚から単離し、Ca2+-およびMg2を含まないTALP-Hepesをそれぞれ1mMのEDTAおよびEGTAと共に培養した。単一の割球を除核した卵母細胞の囲卵腔にピペットで移して、回復の30〜60分後に、BTX Cell Manipulator 2001（Genentronics、Inc.、San Diego,CA）の0.3Mのソルビトール、0.1 mm酢酸カルシウム、0.1 mm酢酸マグネシウム、および0.5mg/ml FFA-BSA（Sigma）溶液を使用して2回の直流パルス（1.2kV／cm、30μsec）で融合させた。ECNTは、2〜4時間後に割球融合の前の活性化、並びにレシピエント細胞質体のために老齢または間期の卵母細胞を使用して行った。SCNTのためには、除核した卵母細胞を単一のドナー細胞と共に直接注射するか、または透明帯下でドナー細胞の移入後に融合した。細胞核ドナー供与源には、分離された顆粒膜細胞、アカゲザルの臍帯から収集した内皮細胞、単離された、アカゲザルの胚盤胞（2〜3継代）に由来する培養されたICM細胞、およびアカゲザルの線初代維芽細胞株化細胞を含んだ。
【００５４】
活性化プロトコル。NT構築物は、細胞融合後に1〜4時間の間活性化して、120mMのKCl、20mM HEPES、100μM EGTA、10mMグリセロールリン酸ナトリウム（Wilmut et al. ,419 Nature 583-87（2002））に調整し、滅菌のために0.22μmのSpinXフィルター（Costar、Cambridge、MA）を通した120〜240pgml-1のアカゲザルの精子抽出物の微量注入によって、または約5μM〜約10μMイオノマイシン（5分；室温）、および4時間の1.9mMのDMAP（Chanet al.,287 SCIENCE 317-19（2000））を経時的に処置することによって、核を再プログラムさせた。DMAPの後に、卵を広範に洗浄し、TALP中で培養した。FertClonesを除核された卵母細胞と除去された母系性のクロマチンを含む細胞質体を融合することによって作製し、次いで2〜3時間後にICSIで受精させた。全てをTALP中で24時間、次いでバッファローラット肝細胞（BRL）単一層のCMRL培地中で培養した。
【００５５】
微量注入。抗体阻害研究は、一次抗体を前面装填した9μmマイクロピペット（Humagen）を使用して行った。卵体積（〜700pl）の4〜6%の間を、2-10mg ml-1 で抗体と共に微量注入した。最終的な抗体濃度は、卵母細胞につき70〜350pgの総Igタンパク質の間であった。微量注入された卵母細胞および卵のイメージングのために、一次抗体を除去した。
【００５６】
胚移植。胚移植のためには、代わりのアカゲザルの雌を血清エストラジオールおよびプロゲステロン・レベルに基づいて選択した。妊娠を内分泌学的なプロフィールによって確認し、胎児の超音波を24〜30日間行った（Wilmut et al., 385 NATURE 810-3（1997））。
【００５７】
イメージング。 卵母細胞およびNTの固定および免疫細胞化学のための方法は、記載されている通りに行ったMitalipov et al., 66のBIOL。REPROD.1449-55 （2002）。中心体は、g-チューブリンまたはペリセントリン（pericentrin）ポリクローナル・ウサギ抗体（それぞれDr. T. Steams [ Stanford ] and S. Doxsey [ U. of Mass ]から寄贈）によって検出したThomson et al., 92 PROC. NATL.ACAD.Sci. USA7844-48 (1995) and Thomson et al.,282 SCIENCE 1145-47 (1998) 。NuMA、HSET、およびEg5は、記載されているように、ウサギ・ポリクローナル抗体を使用して検出した。Wilmut et al.（1997）、およびHumpherys et al.（2002）。微小管は、E7マウス・モノクローナル抗体によって免疫標識した。Wilmut et al. ,385 NATURE 810-3（1997）。一次抗体は、観察共焦点顕微鏡観察によって観察するために、Alexa二次抗体を使用して検出した（Alexa-546ヤギ抗マウスIgG；Alexa-488ヤギ抗ウサギIgG；Molecular Probes, Eugene, OR）。それぞれの一次および二次抗体は、37℃で40分間適用した；リンスは、0.1%、PBS +トリトンによって行った。DNAは、最後から2番目のリンスに添加した5μg／mlのヘキスト33342（Sigma）およびICM Toto-3（Molecular Probes）で蛍光性に検出した。カバーガラスは、Vectashield antifade（Vector Labs、CA）にマウントした。対照には、非免疫および二次抗体単独を含め、これらでは、紡錘体微小管または中心体を検出しなかった。スライドは、従来の免疫蛍光およびレーザー走査共焦点顕微鏡観察を使用して検査した。従来の蛍光顕微鏡では、最初に高開口数対物レンズを有するニコンEclipse E1000顕微鏡を使用して行った。データは、冷却CCDカメラ（Hamamatsu Instruments Inc. , Japan）を使用して、メタ・モルフ・ソフトウェアを使用して（Universal Imaging, West Chester, PA）デジタル的に記録した。レーザー操作共焦点顕微鏡観察は、Alexa結合二次抗体およびToto-3 DNA染色の同時の励起のためのArgonおよびHelium Neon レーザーを備えているライカSP-2を使用して行った。
【００５８】
免疫ブロッティング。マウスの卵母細胞およびヒト卵巣タンパク質抽出物（Clontech、Inc.、Palo Alto、CA）は、Humpherys et al.（2002）によって記載されているように、直線濃度勾配SDS-PAGEゲルおよびウエスタンブロットで分離した。
【００５９】
実施例2。胚幹細胞の作製。
【００６０】
ES細胞は、以下の方法によって胚から確立される。SCNTに続いて、2〜4割球を、マウス胚線維芽細胞（MEF）またはヒトまたは非ヒトのいずれかの霊長類胚線維芽細胞（PEF）に由来するフィーダー細胞の単層を含むマイクロウェル中で培養する（Richards et al. ,21（5） Stem Cell 546-56（2003）；Richards et al. ,20 Nature Biotech。933-36 （2002））。次いで、残りの胚を実施例1に記載したとおりに、胚の再建のために空の透明帯へ移す。
【００６１】
ES株化細胞を単離および培養するためのこの共培養系は、当前記技術分野において周知である（たとえば、Thomson et al., 92 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7844-48（1995）；Ouhibi et al. ,40 Mol。Reprod.Dev. 311-24（1995）を参照されたい）。これは、フィーダー細胞が、幹細胞分化を阻害する成長因子様白血病阻害因子（LIF）を提供することを示唆した。マイクロウェルは、5〜10μlの培地（基礎培地として80％ DMEM、20％ FBS、1mM βメルカプトエタノール、1000ユニット／mlのLIF、非必須アミノ酸、およびグルタミン）を含む。次いで、細胞を5％ CO2と共に37℃でインキュベートして、鉱油でカバーする。新鮮な培地に毎日取り替えて、割球の生存を細胞分裂によって決定した。最初の培養の間に、細胞のMEF単層に対する付着およびコロニー形成が観察されるまで、細胞凝集塊を機械的に分離する。次いで、安定な株化細胞が確立されるまで、培養液を徐々に拡大するために、コロニーを4ウェルプレートにまいて、その後に35mmディッシュに継代する。分離した割球培養液に加えて、再構築された胚も、割球段階に達するまで培養する。透明帯をもたない孵化胚盤胞また胚盤胞を、上記したとおりにマイクロウェルのMEF単層状で培養する。割球を分離する代わりに、胚盤胞をMEF単相に付着させることができる。一旦胚盤胞がMEFに付着すれば、ICM細胞を機械的に単離して、同様に新鮮な培養液に移す。肺細胞を上記したとおりに培養して、個々のコロニーが観察されるまで細胞の増殖を続けさせる。個々のコロニーをクローン増殖のために選択する。クローン株化細胞が確立されるまで、このクローン増殖および増殖工程を続ける。
【００６２】
受精されていない卵母細胞の偽レトロウイルスベクターによる感染を使用して、トランスジェニックヒヒと霊長類が首尾よく作製された。これらの方法は、同時係属中の米国特許出願番号第09/736,271号および第09/754,276号に記載されており、参照により本明細書に明白に援用される。導入遺伝子の存在は、トランスジェニック・サルの全ての組織において証明されており、おそらく、受精前の成熟染色体において早期の組み込みイベントが生じていることを示唆する。トランスジェニック胚幹株化細胞を作製するためには、次いで偽感染によって作製されたトランスジェニック胚を使用して、クローン胚産生プロセスにおいて上記したとおりに分離する。次いで、これらの分割胚を使用して、クローン子孫を作製し、その胚の対応物を使用して、トランスジェニック胚幹株化細胞を作製する。従って、トランスジェニック子孫およびトランスジェニック胚幹株化細胞は、卵母細胞段階で達成される同じ遺伝子改変を共有する。
【００６３】
本発明に記載されている実施例および系の種々の修正変更も、本発明の範囲および精神から離れることなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特異的な態様に関して記載してあるが、請求される本発明は、このような特異的な態様に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、本発明を行うための記載されている種々の方法の修飾が、関連分野野当業者に明らかであり、以下の態様の範囲内であることガキとされる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】SCNTの間に生じる操作およびイベントの概略図を提供する。本工程は、除核または中期II停止された紡錘体の除去、体細胞の選択および調製、核移植または細胞質内の核注射（ICNI）、紡錘体除去および核移入による創傷治癒および薬物回復、並びに卵母細胞活性化を含む。
【図２−１】図2A-2Gは、不完全な紡錘体が霊長類NT後に異数体の胚を生じることを図示する。図2Aは、減数分裂時に誤整列された染色体中心体のNuMAを有する欠損があるNT紡錘体を図示する。図2Bは、有糸分裂時に誤整列された染色体中心体のNuMAを有する欠損があるNT紡錘体を図示する。図2Cは、有糸分裂時に誤整列された染色体中心体のNuMAを有する欠損があるNT紡錘体がNT生じないことを図示する。図2Dは、中心体のキネシンHSETもNT後になくなることを図示する。
【図２−２】図2A-2Gは、不完全な紡錘体が霊長類NT後に異数体の胚を生じることを図示する。図2Eは、動原体Eg5がNT後になくならないことを図示する。図2Fは、双極性の紡錘体が受精卵にNT後に整列された染色体および中心体のNuMAと共にあることを図示する。図2Gは、DNA微小管、NuMA、およびキネシンのイメージングを提供する。
【図３−１】図3A-3Rは、治療的クローニングの間に生じる操作およびイベントの概略図を提供する。これらの工程は、本明細書に記載されており、一般に、卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂および分化、並びにび患者に対する導入を含む。
【図３−２】図3A-3Rは、治療的クローニングの間に生じる操作およびイベントの概略図を提供する。これらの工程は、本明細書に記載されており、一般に、卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂および分化、並びにび患者に対する導入を含む。
【図３−３】図3A-3Rは、治療的クローニングの間に生じる操作およびイベントの概略図を提供する。これらの工程は、本明細書に記載されており、一般に、卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂および分化、並びにび患者に対する導入を含む。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【国際調査報告】
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