(57)【要約】治療的に有効な量の糖脂質を被験体に投与することによって、被験体のボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)に対する免疫応答を誘導するために使用することができる特有の化合物を提供する。このような投与は、被験体のライム病を予防または治療するために特に有用である。本発明の化合物および治療的に許容される塩を、薬学的または免疫原性組成物に製剤化することができる。
2006522808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Aの化合物が、
2006522808.tif 000012
を含む、式Aの化合物またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは錯体：
式中、
R1は、アジド、アミノ、置換アミノ、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジドまたはカルボヒドラジドから選択され；
R2は、1〜25個の炭素原子を含む飽和もしくは不飽和の炭素鎖、または1〜25個の炭素原子を含む飽和から不飽和の置換炭素鎖から選択され；および
Lは、O、N、S、Pまたはアルキレン基から選択される。
【請求項２】
R1が、アジド、アミノまたはヒドラジドから選択され；R2が5〜20個の炭素原子を含む飽和または不飽和の炭素鎖であり；およびLがOである、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
化学的に合成される、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
LがOである、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
請求項1記載の化合物と少なくとも1つのタンパク質担体とを含む複合物であって、該請求項1記載の化合物が該タンパク質担体に共有結合されている複合物。
【請求項６】
請求項2記載の化合物と少なくとも1つのタンパク質担体とを含む組成物であって、該請求項2記載の化合物が該タンパク質担体に共有結合されている複合物。
【請求項７】
請求項1の化合物が、R1基を介してタンパク質担体に共有結合されている、請求項5記載の複合物。
【請求項８】
請求項2の化合物が、R1基を介してタンパク質担体に結合されている、請求項6記載の複合物。
【請求項９】
タンパク質担体が、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、ジフテリアトキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)トキソイド、クロストリジウム(Clostridium)トキソイド、志賀(Shiga)毒素、B型肝炎抗原、またはボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項5記載の複合物。
【請求項１０】
タンパク質担体が、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、ジフテリアトキソイド、緑膿菌トキソイド、クロストリジウムトキソイド、志賀毒素、B型肝炎抗原またはボレリア・ブルグドルフェリポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項6記載の複合物。
【請求項１１】
R1がアジドであり、且つLがOであり、
ガラクトシルハライドとコレステロールを反応させて、ガラクトシル-コレステロールを提供する段階；および
アジドアシル酸と該ガラクトシル-コレステロールを反応させて、請求項1記載の化合物を提供する段階
を含む、請求項1記載の化合物を製造する方法。
【請求項１２】
治療的に有効な量の請求項1記載の化合物と薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
治療的に有効な量の請求項2記載の化合物と薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
治療的に有効な量の請求項5記載の複合物を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
治療的に有効な量の請求項6記載の複合物と薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
被験体のB. ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)に対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的に有効な量の請求項1記載の化合物を被験体に投与し、それによって免疫応答を誘導する段階を含む方法。
【請求項１７】
被験体のライム病を予防または治療する方法であって、治療的に有効な量の請求項1記載の化合物を被験体に投与し、それによって該被験体のライム病を予防または治療する段階を含む方法。
【請求項１８】
下記式Bの化合物が、
2006522808.tif 000013
を含む、式Bを有する精製化合物またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは錯体：
式中、「16」は、式に示すパルミトイル基における炭素原子数を示す。
【請求項１９】
B. ブルグドルフェリから単離される、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
治療的に有効な量の請求項18記載の精製化合物と薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
少なくとも1つのタンパク質担体に結合されている治療的に有効な量の請求項18記載の精製化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
被験体のB. ブルグドルフェリに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的に有効な量の請求項18記載の精製化合物を被験体に投与し、それによって免疫応答を誘導する段階を含む方法。
【請求項２３】
被験体のライム病を予防または治療する方法であって、治療的に有効な量の請求項18記載の精製化合物を被験体に投与し、それによって該被験体のライム病を予防または治療する段階を含む方法。
【請求項２４】
被験体のB. ブルグドルフェリに対する免疫応答を誘導するための請求項1記載の化合物の使用であって、治療的に有効な量の請求項1記載の化合物を被験体に投与し、それによって免疫応答を誘導する段階を含む使用。
【請求項２５】
被験体のライム病を予防または治療するための請求項1記載の化合物の使用であって、治療的に有効な量の請求項1記載の化合物を被験体に投与し、それによって該被験体のライム病を予防または治療する段階を含む使用。
【請求項２６】
被験体においてB. ブルグドルフェリに対する免疫応答を誘導するための製剤を製造するための請求項1記載の化合物の使用。
【請求項２７】
被験体においてライム病を予防または治療するための製剤を製造するための請求項1記載の化合物の使用。
【請求項２８】
被験体のB. ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)に対する免疫応答を誘導するための請求項18記載の精製化合物の使用であって、治療的に有効な量の請求項18記載の精製化合物を被験体に投与し、それによって免疫応答を誘導する段階を含む使用。
【請求項２９】
被験体のライム病を予防または治療するための請求項18記載の精製化合物の使用であって、治療的に有効な量の請求項18記載の精製化合物を被験体に投与し、それによって該被験体のライム病を予防または治療する段階を含む使用。
【請求項３０】
被験体においてB. ブルグドルフェリに対する免疫応答を誘導するための製剤を製造するための請求項18記載の精製化合物の使用。
【請求項３１】
被験体においてライム病を予防または治療するための製剤を製造するための請求項18記載の精製化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本明細書の開示は、コレステロール含有脂質の分野と、B. ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)に対する免疫応答を形成する際のこれらのコレステロール含有脂質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ライム病は、ダニ-媒介性スピロヘータであるB. ブルグドルフェリによって生じる動物由来感染症である(Steere et al., N. Engl. J. Med., 308:733-740, 1983)。罹病性宿主がダニのマダニ(Ixodes)に咬まれると、B. ブルグドルフェリ生物が皮膚に侵入する。B. ブルグドルフェリスピロヘータは、細胞質、細胞壁、内側の細胞膜および細胞表面ではなく、外側の細胞膜と原形質円柱((プロトプラズミックシリンダー(protoplasmic cylinder))の間の細胞膜周辺腔に位置する鞭毛からなる、原形質円柱複合体(protoplasmic cylinder complex)を取り囲む外側細胞膜を有するらせん形の運動性細胞である。外側細胞膜および鞭毛は、疾患発症中の宿主-寄生虫相互作用において重要な役割を果たすと思われており、いくつかの検討が実施されており、主要な表面露出タンパク質を重要な免疫原と同定している(Barbour et al., J. Clin. Invest. 72:504-515, 1983)。
【０００３】
ヒトでは、初期の皮膚発現は慢性遊走性紅斑(ECM)と呼ばれるが、皮膚の長期間の感染症は慢性萎縮性肢端皮膚炎を生ずる(Asbrink et al., Acta Derm. Venereol. 64:506-512, 1984)。ボレリア(Borrelia)生物はまた、宿主の循環系に侵入して、脳および関節を含む種々の器官に分布する(Barbour et al., Microbiol. Rev. 50:381-400, 1986)。病原体の二次的な拡散は、リンパ球性髄膜神経根炎(Pfister et al., J. Neurol. 118: 1-4, 1984)、心筋炎(Steere et al., Ann. Intern. Med. 93:8-10, 1980)および慢性関節炎(Steere et al., Ann. Intern. Med. 90:286-291, 1979)を含む種々の臨床症状を生じる。多数の患者において、一部の組織、特に脳および関節の感染症は数年間持続し、重症の障害を生じることがある。これらの形態の慢性ライム病は、宿主が感染菌を除去することができず、自己免疫反応を発症する結果である(Steere et al., Ann. Intern. Med. 99:76-82, 1983)。
【０００４】
1983年にアクセッション番号ATCC 35210でアメリカン・タイプカルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に寄託されたB. ブルグドルフェリ株B31の抗原に対して形成される最も早期のIgM抗体は、分子量41 kd(Craft et al., J. Clin. Invest. 78: 934-939, 1986)で、モノクローナル抗体H9724と反応する(Barbour et al., Infect. Immun. 52:549-554, 1986)フラゲリンと呼ばれる属特異的鞭毛ポリペプチドに対することが示されている。IgG抗体も最初は41 kdのフラゲリンに対して誘導されるが、進行性疾患の場合には、IgG抗体は、他の免疫原、特に分子量31 kdおよび34 kdの2つの豊富なタンパク質に対して形成する。OspA(31 kd)およびOspB(34 kd)と称されているこれら2つのタンパク質は、B. ブルグドルフェリ表面に位置し、外側の流動性の細胞膜に埋め込まれていることが見出されている(Barbour et al., J. Clin. Invest. 72:504-515, 1983)。
【０００５】
米国特許第4,721,617号は、ライム病に対するワクチンとしての不活性化B. ブルグドルフェリスピロヘータ全体の使用を開示している。また、米国特許第6,203,798号は、ワクチン候補としてのタンパク質抗原、OspAおよびOspBの使用を開示している。しかし、2002年2月25日現在、製造業者は、OspAを含むLYMErix(商標)ライム病ワクチンは市販しないことを発表した。
【０００６】
従って、ライム病を予防するのに効果的なワクチンを製造するために、防御免疫応答などの、B. ブルグドルフェリに対する免疫応答を形成するために使用することができる試薬の必要性がある。
【発明の開示】
【０００７】
概要
本明細書において、特有の化合物および治療的に許容されるそれらの塩などのそれらの類似体が開示されている。一局面により、以下の式Aの新規化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは錯体が本明細書において開示されている：
2006522808.tif 000003
式中、
R1は、アジド、アミノ、置換アミノ、ヒドラジノ(例えば、-NHNH2)、ヒドラジド(例えば、-C(O)NHNH2)、セミカルバジド(例えば、-NHC(O)NHNH2)、またはカルボヒドラジド(例えば、-NHNHC(O)NHNH2)から選択され；
R2は、1〜25個の炭素原子、特に5〜20個の炭素原子を含む飽和もしくは不飽和の炭素鎖、または1〜25個の炭素原子、特に5〜20個の炭素原子を含む飽和から不飽和の置換炭素鎖から選択され；および
LはO、N、S、Pまたはアルキレン基(例えば、メチレン(-CH2-))から選択される。
【０００８】
別の局面により、本明細書において、以下の式Bを有する精製化合物が開示されている：
2006522808.tif 000004
式中、「16」は、直鎖アルキル置換基の炭素原子数を示す。この特定の精製化合物は、簡便にするため本明細書においてだけ「BBGL-II」(すなわち、B. ブルグドルフェリ糖脂質-II(B. burgdorferi glycolipid-II))と呼ぶ。
【０００９】
さらに別の局面において、(i)担体および(ii)式AまたはBの化合物が担体に結合している、式AまたはBの化合物を含む複合物が本明細書において開示されている。
【００１０】
開示されている化合物および複合物(式AおよびBの両方)は、治療的に有効な量の化合物または複合物を被験体に投与することによって被験体においてB. ブルグドルフェリに対する免疫応答を誘導するために使用することができる。このような投与は、被験体のライム病を予防または治療するために特に有用である。本発明の化合物および治療的に許容されるその塩は、薬学的または免疫学的組成物に製剤化することができる。
【００１１】
上記および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して実施するいくつかの態様の以下の詳細な説明によりさらに明らかになると考えられる。
【００１２】
詳細な説明
I.  用語
特に記載しない限り、技術用語は従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Pressより出版, 1994（ISBN 0-19-854287-9）；Kendrew et al.編, 「The Encyclopedia of Molecular Biology」, Blackwell Science Ltd.より出版, 1994（ISBN 0-632-02182）;およびRobert A. Meyers編、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers Inc.より出版、1995（ISBN 1-56081-569-8）において見出すことができる。
【００１３】
本開示の種々の態様の概説を容易にするために、具体的な用語の以下の説明を提供する。
【００１４】
化合物「〜の投与」および化合物「〜を投与する」は、化合物、化合物のプロドラッグ、化合物の複合物、または本明細書に記載する化合物を含む薬学的組成物を提供することを意味すると理解されるべきである。
【００１５】
類似体：親化合物から化学構造が異なる分子、例えば、相同物(アルキル鎖の鎖長の差など、化学構造の増分が異なる)、分子断片、1つ以上の官能基またはイオン化の変化が異なる構造。構造的類似体は、Remington、「The Science and Practice of Pharmacology」、第19版(1995)、28章に開示されているものなどの技法を用いて、定量的構造活性相関(QSAR)を使用して見つけられることが多い。
【００１６】
抗原：動物に注射または吸収される組成物を含む、動物における抗体の産生またはT細胞応答の形成などの、免疫応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む、特定の液性または細胞性免疫産物と反応する。「抗原」という用語は、関連する全ての抗原エピトープを含む。
【００１７】
抗体：免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する(抗原と免疫反応する)抗原結合部位を含有する分子。
【００１８】
天然型抗体(例えば、IgG、IgM、IgD)は、ジスルフィド結合で相互接続されている4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む。しかし、抗体の抗原結合機能は、天然型抗体の断片によって実施されうることが示されている。従って、これらの抗原-結合断片も「抗体」という用語がつけられることが意図されている。抗体という用語に含まれる結合断片の限定するものではない具体的な例には、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片；(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；(iii)抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片；(iv)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989)；(v)単離された相補性決定領域(CDR)；および(vi)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合されている2つのFab断片を含む2価断片であるF(ab')2断片が挙げられる。
【００１９】
動物：例えば、ほ乳類および鳥類を含む分類である、生きている多細胞脊椎生物。ほ乳類という用語はヒトおよびヒト以外のほ乳類を含む。同様に、「被験体」という用語はヒト被験体および動物被験体を含む。
【００２０】
ボレリア(B.)ブルグドルフェリ(Borrelia (B.) burgdorferi)：Johnsonらによって1984年に最初に記載されたスピロヘータ。B. ブルグドルフェリは、BSK(Barbour-Stoenner-Kelly)と呼ばれる変法Kelly培地において節足動物ベクターまたは脊椎動物宿主から培養することができる。マダニならびにライム病患者の血液、皮膚および脳脊椎液からのボレリア(Borrelia)はBSKにおいて培養が成功している。1.3%アガロースで凝固したBSKは、単一生物からのコロニーの形成を可能にする。B. ブルグドルフェリは、ほとんどの細菌と比較して増殖が遅い。スピロヘータはどれも12〜24時間の伸張後に2つの細胞に分裂する。米国においてヒトに感染する種類のボレリア(Borrelia)はB. ブルグドルフェリセンスストリクト(B. burgdorferi sensu stricto)と命名されている。B. ブルグドルフェリセンスストリクトならびに2つの関連するボレリアであるB. ガリニ(B. garinii)およびB. アフゼリ(B. afzelii)もヨーロッパにおいてライム病を生じている。アジアでは、B. ガリニおよびB. アフゼリだけがヒトのライム病を生じている。
【００２１】
B. ブルグドルフェリを含むボレリアは、細胞膜が取り囲んでいる原形質円柱、7〜11本の細胞膜周辺の鞭毛、および下層組織にゆるく結合している外側膜を含む柔軟ならせん形の細胞である。B. ブルグドルフェリ種B31株のDNA配列は1997年に公開されており、950キロベースの鎖状の染色体、9個の鎖状のプラスミド、および12個の環状のプラスミドを含有する。B. ブルグドルフェリおよび他のボレリア(Borrelia)の外側膜は、タンパク質をコードする遺伝子が鎖状プラスミドに位置するという点において独自である；これらの染色体外遺伝子がこれらの生物の抗原性の正体を決定しており、おそらくこの細菌がマダニおよび異なるほ乳類宿主において適応し、生存する助けとなっている。
【００２２】
複合物：「複合物(コンジュゲート(conjugate))」は、薬学的に許容される担体に結合している本明細書に開示する免疫原性化合物を含む任意の構築物を含む。従って、「複合物」は、タンパク質担体に共有結合されている免疫原性化合物の複合物に限定されない(特定の種類の複合物は、当技術分野において「結合ワクチン」と呼ばれることが多い)。
【００２３】
誘導体：誘導体は、基本の分子構造から誘導された生物的に活性な分子である。
【００２４】
免疫応答：刺激に対するB細胞、T細胞または単球などの免疫系細胞の応答。一態様において、応答は特定の抗原に特異的である(「抗原特異的応答」)。一態様において、免疫応答は、CD4+応答またはCD8+応答などのT細胞応答である。別の態様において、応答はB細胞応答であり、特異的な抗体が産生される。「免疫原性組成物」は、免疫原性組成物が注射されるまたはそれ以外の方法で導入されると、ほ乳類宿主において免疫応答を誘発する任意の組成物である。免疫応答は液性、細胞性またはその両方であってもよい。「追加免疫」は、同じ免疫原性組成物にほ乳類宿主を接触させる結果生ずる免疫原性組成物に対する免疫応答の増加をいう。
【００２５】
単離された：「単離された」(脂質などの)生物成分は、成分が天然に存在する生物の細胞の他の生物成分、すなわち、他の染色体および染色体外DNAおよびRNA、タンパク質、脂質および細胞小器官から実質的に分離または精製されている。「単離」されている脂質は、標準的な精製方法によって精製された脂質を含む。この用語は、化学的に合成される脂質および他の化合物も含む。
【００２６】
標識：別の分子に直接または間接的に結合されて、その分子の検出を容易にする検出可能な化合物または組成物。限定するものではない標識の具体的な例には、蛍光標識、酵素結合および放射性同位体が挙げられる。
【００２７】
ライム病：ライム病は、細菌ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)の感染によって生ずる。これらの細菌は、感染している鹿ダニに咬まれることによってヒトに伝染し、毎年米国において16,000超の感染を生じている。
【００２８】
ライム病は、発熱、倦怠感、疲労、頭痛、筋肉の痛み(筋痛)および関節の痛み(関節痛)などの非特異的症状を伴う特徴的な「牛眼状」発赤、遊走性紅斑を呈することが多い。
【００２９】
感染から遊走性紅斑発症までの潜伏期間は、典型的には、7〜14日であるが、3日と短い場合も、30日と長い場合もある。感染患者の中には認識される疾患を生じない患者も(血清学的試験によって判定される無症候性感染)、または発熱、頭痛、疲労および筋肉痛などの非特異的な症状だけを発現する患者もいる。ライム病スピロヘータは、マダニが咬んだ部位から皮膚、リンパおよび血液媒介性経路によって広がる。初期播種性感染の徴候は、通常、孤立性遊走性紅斑病変の出現から数日〜数週間で生じる。多発性(二次性)遊走性紅斑病変以外に、初期播種性感染は神経系、筋骨格系または心臓の疾患として発現することがある。初期神経徴候には、リンパ球性髄膜炎、脳神経障害(特に、顔面神経麻痺)および神経根神経炎(radiculoneuritis)が挙げられる。筋骨格徴候には、関節腫脹の客観的徴候を伴うこともある遊走性の関節および筋肉痛を挙げることができる。心臓の徴候はまれであるが、種々の程度の心筋炎および一過的な房室ブロックを挙げることができる。未治療または治療が十分でない患者のB. ブルグドルフェリ感染は、感染から数週間または数ヶ月で後期播種性疾患に進行することがある。後期播種性ライム病の最も一般的な客観的徴候は、1つまたは数箇所の関節、通常体重を支える膝などの大きい関節の間欠的な腫脹および疼痛である。慢性の軸索多発性神経炎または脳症を発症する患者もおり、後者は、通常、認知障害、睡眠障害、疲労および人格変化として発現される。まれに、ライム病罹病は重症、慢性および廃疾的となることもある。ライム病の治療後に、あいまいなポスト-ライム病症候群が生じる患者もいる。
【００３０】
リンパ球：生体の免疫防御に関与する種類の白血球細胞。リンパ球は2つの主要な種類：B細胞およびT細胞がある。
【００３１】
薬学的に許容される担体：「担体」は、本明細書に開示する治療的または生物学的に活性な化合物が関連する生理学的に許容される物質である。担体は、治療的または生物学的に活性な化合物のある種の投与を促進することができ、および／または治療的または生物学的に活性な化合物によって誘導される免疫応答を増強することができる。一般に、担体の性質は、使用する特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩液、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等などの薬学的および生理学的に許容される流体を基剤として含む注射用流体を含む。固体組成物(例えば、粉末、ピル、錠剤またはカプセル剤形)では、従来の無毒性固体担体には、例えば、薬学用のマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体以外に、投与される薬学的組成物は、湿潤または乳化剤、保存剤およびpH緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの少量の無毒性補助物質を含有することがある。E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PAによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 第15版(1975年)は、本明細書に開示するBBGL-IIの薬学的送達に好適な組成物および製剤を記載している。
【００３２】
本明細書に開示する化合物の「薬学的に許容される塩」には、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛などの陽イオンから形成されるものならびにアンモニア、エチレンジアミン、N-メチル-グルタミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、N, N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、N-ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび水酸化テトラメチルアンモニウムなどの塩基から形成されるものが挙げられる。これらの塩は、例えば、遊離酸に好適な有機または無機塩基を反応させることによって標準的な手法によって製造することができる。または、本明細書に引用する任意の化合物を、薬学的に許容される塩として投与することができる。「薬学的に許容される塩」はまた、遊離酸、塩基および両性型も含む。好適な薬学的に許容される塩の説明は、「Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use」、Wiley VCH(2002)に見出すことができる。
【００３３】
本発明に開示するエストロゲン様物質の「薬学的に許容される錯体」には、金属イオンから形成される錯体または配位化合物が挙げられる。このような錯体には、エストロゲン様物質に結合するためのリガンドまたはキレート剤を挙げることができる。
【００３４】
ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にかかわらない任意の鎖のアミノ酸。
【００３５】
精製された：精製されたという用語は、絶対的な純粋さを必要としない；むしろ、それは相対的な用語として意図されている。従って、例えば、精製されたペプチド製剤は、ペプチドまたはタンパク質が細胞内の天然の環境にある場合よりも濃縮されているものである。一態様において、化合物製剤は、本明細書に開示する脂質が、化合物製剤の総脂質含量の少なくとも50%、さらに特に少なくとも約90%、最も特に少なくとも約98%に相当するように精製される。
【００３６】
「飽和または不飽和の炭素鎖」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカジエニルまたはシクロアルキル基を含む。
【００３７】
「置換アミノ」は、-NZ1Z2基(式中、Z1またはZ2の少なくとも1つが、独立に、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、およびそれらの組み合わせから選択される)をいう。
【００３８】
「置換炭素鎖」は、炭素鎖の1つ以上の水素原子が、ハロゲン、アリール、シクロアルキル、アミノ、およびそれらの組み合わせなどの別の基で置換されている炭素鎖をいう。
【００３９】
T細胞：免疫応答に重要な白血球細胞。T細胞には、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞が挙げられるが、これらに限定されない。CD4+ Tリンパ球は、「表面抗原分類4(cluster of differentiation 4)」(CD4)として既知のマーカーを表面に保有する免疫細胞である。ヘルパーT細胞としても既知のこれらの細胞は、抗体応答およびキラーT細胞応答を含む免疫応答を組織化する助けをする。CD8+ T細胞は「表面抗原分類8」(CD8)マーカーを保有する。一態様において、CD8 T細胞は細胞障害性Tリンパ球である。別の態様において、CD8細胞はサプレッサーT細胞である。
【００４０】
治療的に活性な物質：臨床応答によって測定するとき(例えば、免疫細胞集団の増加、特異的に結合する抗体の産生またはB. ブルグドルフェリの感染に対する測定可能な抵抗性)、免疫応答の誘導を生ずる物質。治療的に活性な物質には、BBGL-IIの作用を模倣する有機化合物または他の化合物を挙げることもできる。
【００４１】
上記の用語の説明は読者を助けるためだけに提供されており、当業者が理解しているよりも狭い範囲を有するまたは添付の特許請求の範囲の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。特にそうでないことを説明しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。同様に「または」という言葉は、内容が明らかにそうでないことを示さない限り、「および」を含むことが意図されている。化合物に与えられている全ての分子量(molecular weight)または分子量(molecular mass)値はおおよそであり、性状のために提供されていることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載するものと同様または等価な方法および材料を、本開示を実施または試験する際に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。「含む(comprise)」という用語は「含む(include)」を意味する。また、材料、方法および実施例は例示的にすぎず、限定する意図のものではない。本明細書に開示する全ての化合物は(+)および(-)立体異性体(ならびに(+)または(-)立体異性体)ならびにそれらの任意の互変異性体を含む。
【００４２】
上記のように、式Aの生物学的に活性な(例えば、免疫原性の)糖脂質が本明細書に開示されている。これらの糖脂質は、B. ブルグドルフェリからの抽出および精製と異なって、化学合成によって得られるという意味においてBBGL-IIの合成類似体である。一方、式Bの化合物は、B. ブルグドルフェリからの抽出によって得ることができる(言い換えると、天然のBBGL-II)。
【００４３】
天然BBGL-IIは、本明細書において「コレステリル6-O-パルミトイル-β-D-ガラクトピラノシド」と呼ばれる。抽出された天然のBBGL-IIは単離され、精製される。例えば、精製された天然BBGL-II単離物は、B. ブルグドルフェリ由来の他の脂質、化合物または分子断片を実質的に含まない。一例において、精製された天然BBGL-II単離物は、1重量パーセント未満の核酸および1重量パーセント未満のタンパク質しか含まない。
【００４４】
BBGL-IIの類似体も、本明細書に開示されているように治療的に有用である(式A参照)。例えば、このような類似体において、BBGL-II式に示されているアシル(例えば、パルミトイル)基は、飽和または不飽和の1〜25個の炭素原子を含む他の炭素含有基または鎖、特に有機脂肪酸から誘導される他のアシル基で置換されてもよい。コレステリルおよびガラクトピラノシド環構造は、任意の環位置に、アルキル基(特に、脂肪酸から誘導されるアシル基)、カルボキシル基、置換カルボキシル基(-COR(式中、Rはアルキルまたはカルボン酸またはエステルである))、アリール基、アルコキシ基、複素環基、ハロゲン基またはアミノ基などの置換基を含んでもよい。コレステリルとガラクトピラノシド環を架橋するヘテロ原子Oは、アルキル基(例えば、-CH2-)またはN、SもしくはPなどのヘテロ原子で置換されてもよい。
【００４５】
式Aの化合物において、R2は(-C(O)O-基と共に)、有機脂肪酸から誘導されるアシル基であってもよい。このようなアシル基には、パルミトイル、ラウロイル、ステアロイル、ミリストイル、オレイルおよびリノレイルが挙げられる。アシル基の誘導体化は、担体タンパク質との共有結合の部位(例えば、アシルアジド)を提供しうる。
【００４６】
ある形態において、R1基は、以下にさらに詳細に記載するように、担体タンパク質と共有結合を形成する(言い換えると、担体タンパク質に結合する)ことができる。担体タンパク質への結合は、コレステリル部分のアルキル基または鎖の少なくとも1つの誘導体化によっても実施することができる。このような誘導体化は以下に記載するように実施することができる。アジピン酸ジヒドラジドまたは1,6-ジアミノヘキサンなどの低分子を使用することができる。
【００４７】
BBGL-IIおよび／またはその類似体は、以下に記載するようにB. ブルグドルフェリ培養物から単離もしくは精製しても、またはそれらは化学的に合成してもよい。例えば、式Aの化合物は、ガラクトース環のヒドロキシ基に保護基が提供されているガラクトシルハライドを最初に得ることによって合成することができる。次いで、ガラクトシルハライドをコレステロールと反応させて、ガラクトシル-コレステロールを提供する。次いで、ガラクトース環の保護基を離脱させ、置換保護基と交換する。アジドアシル酸中間体を別に製造する。アジドアシル酸中間体をガラクトシル-コレステロールと縮合して、アジドアシル化コレステロールβ-D-ガラクトピラノシドを提供する。
【００４８】
本明細書に開示する一例において、精製された天然BBGL-II(式B)またはBBGL-IIの化学的に合成された類似体(式A)の治療的に有効な量は、被験体において免疫応答を形成するまたは被験体のB. ブルグドルフェリ感染症を治療もしくは予防するために使用される量である。治療は、B. ブルグドルフェリ感染症の徴候もしくは症状またはライム病の徴候もしくは症状を寛解させる治療的介入をいう。
【００４９】
免疫原性組成物およびそれらの使用
一態様において、B. ブルグドルフェリ感染症被験体を治療する、または感染もしくは臨床的ライム病の発症を予防もしくは阻止する方法を提供する。または、本発明の方法を使用して、既存の感染症の進行を阻止することができる。本発明の方法は、治療的に有効な量の精製された天然BBGL-IIまたは式Aの化合物を被験体に投与し、それによって感染症を治療もしくは予防する、または臨床的疾患を阻止もしくは回復させる段階を含む。被験体において免疫応答を形成するまたは被験体をワクチン化するための組成物を製造する際に、BBGL-IIまたは式Aの化合物を使用する。
【００５０】
本開示のこれらの免疫原性組成物は、ヒトおよび他の動物を含むほ乳類宿主においてB. ブルグドルフェリに対する免疫応答を誘発する。免疫応答は細胞依存性応答であっても、もしくは抗体依存性応答であっても、または両方であってもよく、さらに応答はほ乳類宿主において免疫学的記憶または追加免疫作用を提供することができる。T細胞からの支援によって抗体を誘発する抗原はT依存的抗原として既知である。抗体形成を誘発するためにT細胞の支援を必要としないが、B細胞を直接活性化することができる抗原はT非依存的抗原として既知である。これらの免疫原性組成物はワクチンとして有用であり、病原性微生物による感染症に対するほ乳類被験体または宿主による防御応答を提供することができる。
【００５１】
さらに特に、本明細書に記載するワクチンはT細胞非依存的ワクチンおよび／またはT細胞依存的ワクチンとして製造することができる。特定の形態によると、式AまたはBの活性化合物は、主に、T細胞非依存的であるが、担体(特に、タンパク質担体)との結合によりT細胞依存的応答ワクチンに変換される。
【００５２】
担体は、本明細書に開示する式AまたはBの化合物のために提供されうる。担体は、免疫原性化合物との混合物中に存在しても、または化学的相互作用もしくは結合を介して免疫原性化合物に結合されてもよい。例えば、免疫原性化合物は、高分子担体に結合されてもよい。担体は、免疫原性化合物が疎水性非共有相互作用によって結合される、プラスチック、例えば、ポリスチレンなどのポリマーであっても、または免疫原性化合物が共有結合される、多糖もしくはポリペプチド、例えば、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンもしくはキーホールリンペットヘモシアニンなどのポリマーであってもよい。担体は、好ましくは、無毒性で、非アレルギー性であるべきである。免疫原性化合物は、ワクチン製造の高い免疫原性を提供することができるので、高分子担体に多価結合されてもよい。
【００５３】
一態様において、担体はアミノ酸(例えば、ポリペプチドまたはタンパク質)または他の部分の鎖である。別の態様において、担体は、ダイマー、オリゴマーまたはB. ブルグドルフェリポリペプチドのアミノ酸配列の高分子量ポリマーである。有用な免疫原性担体の例には、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)；ウシ血清アルブミン(BSA)および卵白アルブミンなどのアルブミン、PPD(ツベルクリンの精製タンパク質誘導体)；赤血球細胞；破傷風トキソイド；コレラトキソイド；アガロースビーズ；活性炭；またはベントナイトが挙げられる。
【００５４】
本明細書に開示する脂質は、rARU、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒素Aの反復単位を含有する組換えタンパク質を含むが、これらに限定されない関心対象の任意のタンパク質に結合されてもよい。担体は、多糖の免疫原性を増加するようにおよび／または医学的に有用である担体に対して抗体を形成するように選択することができる。これらの基準を満たす担体は当技術分野において記載されている。ポリマー担体は、結合に利用可能な1つ以上の官能基、例えば、一級および／または二級アミノ基、アジド基、アルデヒド、ヒドラジド、エポキシド、チオールまたはカルボキシル基を含有する天然または合成物質であってもよい。担体は水溶性であってもまたは水不溶性であってもよい。
【００５５】
水溶性ポリペプチド担体が好ましく、ウシ血清アルブミンおよび細菌またはウイルスタンパク質または無毒性突然変異体またはそれらのポリペプチド断片、例えば、破傷風毒素またはトキソイド、ジフテリア毒素またはトキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素またはトキソイド、組換え緑膿菌エクソプロテイン(exoprotein)A、百日咳毒素またはトキソイド、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)およびクロストリジウム・ウェルシュ(Clostridium welchii)外毒素またはトキソイド、突然変異体無毒性志賀(Shiga)毒素ホロトキシン、志賀毒素1および2、志賀毒素1および2のBサブユニット、ならびにB型肝炎表面およびコア抗原などの天然または合成ポリペプチドまたはタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
別の担体は、元来、生理学的に許容可能で、免疫系にBBGL-II脂質を提示する機能を果たすいくつかの物質、動物、植物または鉱物である。従って、多種多様の担体が許容可能であり、不活性であるまたは生物学的活性を有するおよび／または免疫応答を促進する物質が挙げられる。例えば、タンパク質担体の例には、キーホールリンペットタンパク質およびヘモシアニンが挙げられるが、これらに限定されない。多糖も担体として使用することができ、デンプン、デキストラン、アガロース、フィコール、またはそのカルボキシルメチル誘導体およびカルボキシメチルセルロースなどの分子量10,000〜1,000,000のものが挙げられる。
【００５７】
ポリアミノ酸も担体としての使用が考慮されており、これらのポリアミノ酸には、特に、ポリリジン、ポリアラニルポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびポリ(C2〜C10)アミノ酸が挙げられる。
【００５８】
有機ポリマーを担体として使用することができ、これらのポリマーには、例えば、アミン、アミド、オレフィン、ビニル、エステル、アセタール、ポリアミド、炭酸塩およびエーテル等のポリマーおよびコポリマーが挙げられる。一般に、これらのポリマーの分子量は劇的に変わる。ポリマーは、2つの反復単位から最高数千、例えば、2000の反復単位を有することがある。反復単位の数は、宿主動物における免疫組成物の使用と一致している。一般に、このようなポリマーは、分子量が小さく、すなわち10,000〜100,000である(分子量は超遠心分離によって求められる)。
【００５９】
無機ポリマーも使用することができる。これらの無機ポリマーは、有機部分を含有する無機ポリマーであってもよい。特に、ケイ酸塩および水酸化アルミニウムを担体として使用することができる。担体は、免疫学的アジュバントであることが好ましい。このような場合には、アジュバントはムラミルジペプチドまたはその類似体であることが特に考慮される。
【００６０】
担体は、複数の合成ペプチドを含有する鎖に相互接続するために使用される架橋基の残基であってもよい。アルデヒド(グルタルアルデヒドなど)、カルボキシル、アミン、アミド、イミドまたはアジドフェニル基を官能基として有する架橋剤。特に、架橋剤としてのブチルアルデヒド、2価イミドエステルまたはカルボジイミドの使用も考慮されている。
【００６１】
本開示は、さらに、担体に本明細書に開示する脂質を結合することに関係する免疫原性組成物を製造する方法を含む。このような担体の例には、上記のものおよび担体もしくはアジュバントとして作用すると思われ、または脂質と併用して他の生物学的活性を有するポリペプチドまたは非ペプチド部分が挙げられる。式AまたはBの化合物は、化合物とタンパク質担体との間の共有結合形成を可能にする試薬の存在下において、化合物とタンパク質を混合することによってタンパク質担体に結合することができる。例示的なカップリング試薬には、グルタルアルデヒド、ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドが挙げられる。または、低化学分子を化合物またはタンパク質担体のいずれかに結合することができ、この分子は、その反応性のために、化合物とタンパク質担体の間のリンカー分子として作用する。例示的なリンカーには、アジピン酸ジヒドラジド、アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、D-グルクロノラクトンおよびp-ニトロフェニルアミンが挙げられる。
【００６２】
例えば、式AまたはBの化合物は、先ずスクシニル化によってポリペプチドを誘導体化し、次にポリペプチドと1,エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライドの化合物との反応により脂質成分をポリペプチドに結合することによる、などの数多くの手段の1つによってポリペプチドに結合することができる。さらに、脂質成分の活性化は、いくつかの試薬のいずれかであるが、好ましくは臭化シアノゲンを使用することによって実施することができる。
【００６３】
式AまたはBの化合物はまた、それらの安定性および／または免疫原性を増加するために、リポソーム送達システムによって被験体に投与することができる。リポソームは、治療される被験体の食細胞によって内部移行されうるので、リポソームによる化合物の送達は特に有利となりうる。このような細胞は、リポソームを摂取すると、リポソーム膜を消化し、その後強力な免疫応答を誘発するのに必要な他の分子と併用してポリペプチドを免疫系に提示すると思われる。リポソームシステムは、単層小胞、多重膜小胞または安定な多層(plurilamellar)小胞の任意の種類であってもよく、例えば、米国特許第5,169,637号、同第4,762,915号、同第5,000,958号または同第5,185,154号の開示内容により、当業者に既知の方法により製造し、投与することができる。
【００６４】
本開示は、式AまたはBの少なくとも1つの化合物を含有する治療的に有効な量の薬学的組成物を被験体に投与することに関係する。本発明の薬学的組成物の投与は当業者に既知の任意の手段によって実施することができる。被験体は、ヒトを含む任意のほ乳類を意味する。
【００６５】
薬学的組成物は、好ましくは、投与単位で製造され、投与される。固体の投与単位は錠剤、カプセルおよび坐剤である。被験体を治療するためには、化合物の活性、投与方法、疾患の性質および重症度、患者の年齢および体重に応じて、異なる1日量が必要である。しかし、高用量または低用量の1日量が適当である場合もある。1日量の投与は、個々の投与単位もしくは数個の少量の投与単位の単回投与および小分割した用量の特定の間隔での多数回投与によって実施することができる。投与はまた、例えば、1〜10週などの長期間にわたって持続投与により実施することもできる。
【００６６】
薬学的組成物は、一般に、経口または非経口投与される。非経口投与経路には、皮下注射(SQおよびデポSQ)、静脈内(IV)、筋肉内(IMおよびデポ-IM)、胸骨内または注入技法、鼻腔内(吸入)、くも膜下腔内、経皮、局所および点眼が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、植え込まれた容器またはポンプからも投与することができる。好適な固体または液体剤形は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、コート錠、(ミクロ)カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁剤、クリーム、エアゾール、アンプル形態の点滴薬または注射用溶液および製剤中に、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、矯味矯臭、甘味剤または可溶化剤などの賦形剤および添加剤および／または補助剤が通例上記のように使用されている、活性化合物が持続的に放出される製剤である。薬学的組成物は、種々の薬物送達システムに使用するのに好適である。薬物送達のための現在の方法の簡単な概説は、参照として本明細書に組み入れられる、Langer, Science 249: 1527-1533, 1990を参照されたい。接種剤は、典型的には、水、生理食塩液、リン酸-緩衝生理食塩液等などの生理学的に耐容される(許容される)希釈剤の溶液として調製されて、薬学的組成物水溶液を形成する。水酸化アルミニウムなどのアジュバントも組成物に含まれてもよい。
【００６７】
薬学的組成物は局所的または全身的に投与することができる。治療的用途に有効な量は、当然のことながら、疾患の重症度ならびに患者の体重および全身状態に依存する。典型的には、インビトロにおいて使用する用量は薬学的組成物のインサイチューにおける投与に有用な量の有用なガイダンスを提供し、動物モデルを使用して、特定の疾患を治療するために有効な用量を設定することができる。種々の考慮点は、例えば、おのおの参照として本明細書に組み入れられる、Gilmanら編、「Goodman and Gilman: The Pharmacological Bases of Therapeutics」、第8版、Pergamon Press、1990年；および「Remington's Pharmaceutical Science」、第17版、Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990年に記載されている。
【００６８】
本明細書に開示する化合物の有効用量は、治療対象の状態の性質および重症度、患者の年齢および状態ならびに他の臨床因子に応じて変わる。従って、適当な治療法の最終的な決定は担当医によって下される。開示されている化合物の用量範囲は、約0.1μg/体重1kg〜約100 mg/体重1kgである。他の好適な範囲には、約1μg/体重1kg〜10mg/体重1kgの用量が挙げられる。投与スケジュールは、脂質に対する被験体の感受性などの数多くの臨床因子に依存して、週1回から毎日と異なる。進行性疾患の場合には、静脈内またはくも膜下腔内を含む別の経路によって、上記の用量などの用量を投与することが好ましい場合がある。持続注入も適当であることがある。
【００６９】
動物への投与のためには、一般に、精製した治療的に活性な分子を薬学的に許容される担体と併用する。製剤は1種類だけの治療分子を含有しても、または数種の種類の治療分子の組み合わせを含んでもよい。一般に、担体の性質は、使用する特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩液、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等などの薬学的および生理学的に許容される流体を基剤として含む注射用流体を含む。固体組成物(例えば、粉末、ピル、錠剤またはカプセル剤形)については、従来の無毒性の固体担体として、例えば、薬学用のマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体以外に、投与される薬学的組成物は、湿潤または乳化剤、保存剤およびpH緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの少量の無毒性補助物質を含有することがある。
【００７０】
当技術分野において既知であるように、タンパク質-形の製剤は、摂取による送達は効率が悪いことがある。しかし、特に徐放性組成物に製剤化される場合には、ピル-系剤形の薬学的タンパク質を皮下投与することができる。徐放性製剤は、標的タンパク質にコレステロールなどの生体適合性マトリックスを合わせることによって製造することができる。タンパク質製剤を投与する考えられる別の方法は、小型浸透圧ポンプを使用することによる。上記のように、生体適合性担体も、この送達方法と併用使用してもよいと思われる。
【００７１】
薬学的組成物は、意図されている目的を達成する任意の手段によって投与することができる。治療分子を投与する量および療法は、ライム病およびB. ブルグドルフェリ感染に関連する任意の他の状態を治療する臨床分野の当業者によって容易に決定されうる。これらの状態を治療する際に使用するために、分子は、B. ブルグドルフェリの複製を阻止するのに有効な量が投与される。最初に投与される典型的な量は、インビトロにおいて望ましい作用を達成することが見出されている組織濃度を作用部位において達成するのに十分な量であると思われる。式AまたはBの化合物は、例えば、静脈内または腹腔内投与などの全身投与によってインビボにおいて宿主に投与することができる。また、式AまたはBの化合物は病巣内に投与することができる：すなわち、ペプチドまたはタンパク質を病巣内に直接注射する。免疫応答を増加するために、その後の投与すなわち追加免疫投与を、最初の注射の約4〜6週間後に投与することができる。その後の投与は本明細書に示すようにまたは担当医が望むように投与することができる。
【００７２】
本開示は以下の非限定的実施例によって例示される。
【００７３】
実施例
実施例1
材料および方法
生物および増殖条件：B. ブルグドルフェリB31株(ATCC 35210)、BL303株、およびN40株はBSK-H培地(Sigma)で培養した。培地に2%(容量)の凍結培地を接種し、37℃において72時間中期指数増殖期(pH 7.0)までインキュベーションした。12,000 gにおいて30分間遠心分離して細胞を回収し、冷却したPBSで3回洗浄し、使用時まで-20℃において保存した。
【００７４】
脂質抽出および分析：BlighおよびDyer(14)の方法によって洗浄した細胞から脂質を抽出した。回転式エバポレーターを使用し、次に窒素気流下でクロロホルム相を留去し、乾燥した脂質(0.1〜0.2mg/細胞タンパク質1ml)を1〜2mlのクロロホルムに溶解した。BBGLの定量的分離はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで実施した。総脂質抽出物(10 mg)の5 mlクロロホルム溶液をシリカゲルカラム(20×3 cm、Kieselgel 60、Merk、230〜400メッシュ)にロードし、10ベッドボリュームのクロロホルム(分画1)；2.5%メタノール：クロロホルム(容量：容量；分画2)；5%メタノール：クロロホルム(容量：容量；分画3)、10%メタノール：クロロホルム(容量：容量；分画4)、およびメタノール(分画5)で逐次的に溶出した。分画を回転式エバポレーターおよび窒素気流で蒸発乾固し、1 mlのクロロホルムに溶解し、-20℃において保存した。分画3はほとんど主にBBGL-IIを含有したが、分画4はBBGL-IIIを含有した。定量的脂質分析では、総脂質分画(200μgを含有する200μl)を、シリカゲルHR-コーティングしたアルミニウムプレート(Merck、Darmstadt、Germany)でクロマトグラフし、クロロホルム：メタノール(9：1容量)を使用して展開した。脂質スポットはヨウ素蒸気で検出し、糖脂質はアンスロンスプレー試薬で検出した。
【００７５】
放射性標識：B. ブルグドルフェリのコレステロール標識は、接種時に100 mlの培地に[4-14C]コレステロール(Amersham Pharmacia、GB、courtesy of W. Prinz、NIDDK、NIH)を添加することによって実施した。標識したコレステロール(比活性58.0 mCi/mmol)は、0.1μCi/mlをTween 80：エタノール(1：1容量)の混合物に最終容量50μlまで添加した。脂質の抽出は記載するように実施した。脂質スポットの放射能を測定するためには、総脂質をTLCプレートで分離し、次いで、このプレートを短時間ヨウ素蒸気に接触させ、1 mlのシンチレーション液を含有するシンチレーションチャンバーにスポットを削り取った。放射能は、Perkin Elmerシンチレーションカウンター(モデルI450マイクロベータ)で測定し、1分あたりの分解数(dpm)として表した。
【００７６】
アフィニティークロマトグラフィー：BBGL-IIはまた、Detoxy-Gel Endotoxin Removing Gel(Pierce、Rockford、IL)を使用したアフィニティークロマトグラフィーでも精製した。ボレリア(Borrelia)細胞はPBSで5回洗浄し、同緩衝液に再懸濁させ、100 Wにおいて50%デューティサイクルで作動するBranson ソニファイア(sonifier)で30秒間の超音波処理によって崩壊させた。37000 gにおいて30分間遠心分離することによって膜を可溶性分画から分離し、上清(1 mgの総タンパク質を含有する1 ml)をデトキシ(detoxi)-ゲル(アガロース固定ポリミキシンB)カラム(0.9×10 cm)にロードした。カラムを10ベッド-ボリュームのPBSで洗浄した。結合した物質の溶出は、製造業者の取扱説明書により、1%デオキシコール酸(w/v)を含有する10ベッドボリュームのPBSで洗浄することによって実施した。結合分画は蒸留水で透析し、凍結乾燥し、脂質を記載するように抽出した。
【００７７】
免疫および免疫染色：10匹の雌NIH Swissアルビノマウス(5〜6週齢、汎用)を、完全フロイントのアジュバント(1回目の投与)または不完全フロイントのアジュバント(2回目の投与)で乳化したBBGL-IIを2週間あけて2回腹腔内投与することにより免疫した。用量は0.1 mlあたり10μgのBBGL-IIを含有し、0.1 mlをIP投与した。別の方法として、0.1 mlのDMSO、スクアレンまたはPBSに乳化した10μgのBBGL-IIを用いて2週間あけて3回マウスを免疫した。2回目の投与の2週間後にマウスから採血し、このようにして得られた血清を使用時まで-20℃において保存した。ウサギ(雌、ニュージーランドホワイト、8週齢)は、各々75μgのBBGL-IIをフロイントのアジュバントを用いて20×0.05 mlをi.m.投与およびi.c.投与で2回投与して免疫した。
【００７８】
膜脂質の免疫染色は、以前に記載されているように(15)実施した。脂質スポットを含む展開後のクロマトグラムスポットにポリイソブチル-メタクリレート溶液(0.05%ヘキサン溶液)をコーティングして乾燥させた。次いで、1% BSAおよび0.05%tween 20を含有するPBSでプレートを15分間ブロックし、次いで抗PBS-BSA緩衝液で100倍希釈したBBGL-II抗血清と22℃において1時間インキュベーションした。プレートをPBS-BSA緩衝液で5回すすぎ、PBS-BSAで1：25,000希釈したアルカリ性ホスファターゼ結合ラット抗マウスIgG(KPL、MD)と22℃において1時間インキュベーションした。次いで、プレートを洗浄し、BCIP/NBT(KPL、MD)を使用して展開した。
【００７９】
分析方法：糖の分析は、Sawardekerら(16)により実施した。簡単に説明すると、0.5 mgのBBGL-IIまたはBBGL-IIIを1 M HCl中で100℃において4時間加水分解し、還元および過アセチル化後、HP-5型ガラスキャピラリーカラム(0.32mm×30分)および電子イオン化(106 eV)モードにおいて8℃/分で125〜250℃の温度プログラムを用いたHewlett-Packard装置(モデルHP 6890)を使用したGLC-MSによって分析した。脂肪酸は、乾燥した糖脂質を1 M HCl/MeOHで80℃において5時間メタノリシスした後に分析した。溶媒を窒素気流下で除去し、遊離脂肪酸のメチルエステルをクロロホルムで抽出した。分析は、上記の条件下においてGLC-MSを用いて実施した。
【００８０】
二重結合の局在化：不飽和脂肪酸の二重結合の位置は、4,4-ジメチルオキサゾリン誘導体化合物にGLC-MSによって実施した(17)。クロロホルム相を窒素気流下で乾燥し、次いで500μlの2-アミノ-2-メチルプロパノールと混合し、150℃において終夜加熱した。冷却後、反応混合物を3 mlのジクロロメタンに溶解し、2 mlの蒸留水で2回洗浄した。
【００８１】
メチル化分析：天然およびO-脱アシル化糖脂質は、(18)によりメチル化した。メチル化生成物を1 M HClで100℃において4時間加水分解し、アルジトール酢酸に変換し、GLC-MSで分析した。
【００８２】
O-脱アシル化：糖脂質(2 mg)は、37℃において0.25 M NaOCH3のメタノール溶液0.33 mlでO-脱アシル化した。反応はTLCでモニターした。2時間後、開始点のスポットが消失したら、未修飾の糖脂質が見られた。窒素気流下において溶媒を留去し、生成物をクロロホルム水(1：1容量による)で抽出した。有機相および無機相共に、GLC-MSによって糖および脂肪酸について分析した。
【００８３】
絶対配置の決定：BBGL-IIを1 M HClで100℃において4時間加水分解した。D-ガラクトースは、ガラクトースオキシダーゼを使用する酵素的方法によって中和して乾燥した試料から定量した(19)。グリセロールの絶対配置の決定は、以前の糖脂質の脱アシル化を用いて(1)により実施した。この方法では、糖脂質の鹸化によって放出されるグリセロールの一級ヒドロキシル基をTEMPOで酸化し、グリセリン酸残基に転移する。酸加水分解後、グリセリン酸を(R)-(-)-2-ブタノールでエステル化し、アセチル化し、GLC-MSで分析した。保持時間を、D-およびL-グリセリン酸から得られる標品と比較した。
【００８４】
FAB質量分析法：質量スペクトルは、マトリックスとしての3-ニトロベンジルアルコールまたはグリセロール由来の試料をイオン化するために6 keV原子を使用して記録した。試料のパーアセチル化はDell(21)によって記載されているように実施した。
【００８５】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化時間飛行型質量質量分析法(MALDI-TOF)：質量スペクトルは、PerSeptive BioSystem Voyager Elite DE-STR(PE-Biosystems、Framingham、MA) MALDI-TOF装置を使用して得た。質量スペクトルは、2600の減衰において100レーザーショットについて蓄積した。装置は、加速電圧20 kVおよびイオン抽出遅延時間150 nsecの線形モードで作動した。試料およびマトリックスは以前に記載するように調製した(22)。簡単に説明すると、BBGL-IIおよびBBGL-IIIは、クロロホルム：メタノール(1：1容量)に溶解して4μg/μLの濃度とし、0.5μＬの液滴として適用し、マルチプル試料プレートの中心の位置を分離した。等容量のマトリックス、2,5-ジヒドロ安息香酸、10 mg/水1 mLを各試料に適用し、質量分析計に挿入する前に乾燥した。
【００８６】
NMR分光分析：モノガラクトシルジグリセリド(MGFG、主に1,2-ジ-O-ステアロイル-3-O-β-D-ガラクトピラノシルグリセロール)は、Matreya、State College、PAから入手した。1,2-ジ-O-パルミトイルグリセロール(1,2-ジパルミチン)は、NuChek、New Elysian、MNから入手した。メチルα-D-ガラクトピラノシドは実験室で製造し、メチルβ-D-ガラクトピラノシドは、Aldrich、Milwaukee、WIから入手した。重水素化溶媒はCambridge Isotop Laboratories、Andover、MAから購入した。
【００８７】
NMRスペクトルは、5 mmのブロードバンド(BBO)プローブを備えたBruker DRX-500分光計を使用して、ノースピンで300 Kにおいて獲得した。5〜10 mgの化合物のCDCl3(0.5 mL、99.96原子%D)溶液または(CD3)2CO(99.9原子%D)もしくはCD3OD(99.8原子%D)との混合物を、1Hおよび13C NMRスペクトルの化学シフト基準としてのテトラメチルシランと共に脂質に使用した。アノマーメチルD-ガラクトピラノシド(11 mg)は、1Hおよび13C NMRスペクトルの内部標準としてのナトリウム4,4-ジメチル-4-シラペンタノエート-2,2,3,3-d4(TSP)を用いて、D2O(0.4 ml、99.96原子%D)溶液として調査した。データを獲得し、SGI O2またはOctane 2プロセッサーで作動するBruker XWINNMRプログラムバージョン3.0によって処理した。32,768ポイントのデータセットを1Dスペクトルに使用し、32,768または65,536ポイントまでゼロフィリングした例もあった。1D 1H NMRスペクトルは、スペクトル幅4.25 kHz、30°パルス(3.2μs)およびリサイクル時間6sで、500 MHzで記録した。コレステロールの狭い間隔の13C共鳴の高分解能検討では、65,536ポリントのデータセットを使用し、131,072ポイントまでゼロフィリングしたことを除いて、1D 13C NMRスペクトルは、スペクトル幅25.1 kHz、45°パルス(3μs)およびリサイクル時間1sを使用することによって126 MHzにおいて獲得した。1D 13C NMRスペクトルエディティングは、1H周波数において30°、90°および150°リードパルスで獲得されたスペクトルの組み合わせを使用して、DEPT方法によって実施した。他の場合には、135°1Hリードパルスを使用して、負に位相したCH2共鳴および正に位相したCHおよびCH3共鳴を有する13C NMRスペクトルを作製した。1Hカップル13C NMRスペクトルは、緩和遅延時間3.42s中に1H周波数においてゲート照射を使用することにより核オーバーハウザー効果を用いて獲得した。
【００８８】
2D NMRデータのほとんどは、z軸-磁場勾配による可干渉性選択(coherence selection)を含むパルス系列によって獲得した。
【００８９】
2D COSY 1H NMRスペクトルは、30°または45°リードパルスを使用して、2048×2048ポイントまでゼロフィリングした2048×512ポイントのデータセットにおいて収集した。シフトしていないサイン-ベルスクエアウィンドウ関数を両方の次元に適用してから、フーリエ変換し、その後周波数データをマグニチュードモードで表示した。2D TOCSY 1H NMRスペクトルは、磁場勾配-選択したフェーズセンシティブエコー/アンチ-エコープロトコールを使用することによって、16384×2048ポイントまでゼロフィルタリングした16384×256ポイントのデータセットを使用して獲得した。π/2 radシフトしたサイン-ベルウィンドウを両方の次元に適用した。個々の残基の1D 1H NMRサブスペクトルは、2D TOCSYスペクトルからF2スライスの抽出によって作製した。いくつかの1H NMRスペクトルについては、帰属はデジタルの選択的等核1Hデカップリングによっても確認した。
【００９０】
2D HSQCおよびHMBC 1H/13C NMRスペクトルは、HSQCには磁場勾配選択的で、感度増強されたフェーズ-センシティブなエコー/アンチ-エコーモードおよびHMBCには磁場勾配選択的で、ローパスフィルタリングされた、ロング-レンジのノン-デカップリングパルス系列を使用することによって、2048×2048ポイントまでゼロ-フィルタリングした2048×512ポイントのデータセットとして記録し、データはマグニチュードモードで表示した。2D HMBC NMRスペクトルは、83 msの進化遅延(evolution delay)で獲得した、すなわち2,3 JCH 6.0 Hzについて最適化した。両方の次元においてπ/2 radシフトしたサイン-ベルスクエアウィンドウ関数を使用することによってHSQCおよびHMBCスペクトルの最適感度が得られた。2Dスペクトルのt1次元の隆線は、Bruker AURELIAプログラム、バージョン2.8.12の平均行減法(mean row subtraction)によって適宜除去した。202 MHzにおける31P NMR測定は、調査した試料にリンが存在しないことを示した。
【００９１】
実施例2
BBGL-IIおよびBBGL-IIIの単離
B. ブルグドルフェリ(B31株)の糖脂質は、BlighおよびDyer抽出後に2.17 gの乾燥細胞から得た。それらはシリカゲルカラム(20×3 cm)によって精製して均一とし、極性を漸増させたクロロホルムとメタノールの混合物で段階的に溶出した。0.7 gの総脂質からのBBGL-IIの収率は163 mg(23.2%)であり、BBGL-IIIの収率は87 mg(12.4%)であり、従ってBBGL-IIおよびBBGL-IIIは、B. ブルグドルフェリの主要な脂質である。同様の収率は、脂質レパートリーがB31株のレパートリーに類似している臨床単離株BL303およびN40から得られた(図1)。B31株からのバイオマス収率はさらに高かったので、以降の全ての実験はこの株を用いて実施した。
【００９２】
実施例3
アフィニティークロマトグラフィー
BBGL-IIはDetoxi-Gel Endotoxin Removing Gel(Pierce)に結合した。この樹脂は、アガロースに固定したポリミキシンBからなり、LPSの脂質A部分に結合することによってエンドトキシンを除去するために使用される。超音波処理したB. ブルグドルフェリ細胞をこのカラムにロードすると、1%デオキシコール酸でカラムから溶出される結合物質中のBBGL-IIの存在は、TLCおよび免疫標識によって証明することができた(図1)。BBGL-IIIの存在は結合分画中で検出されなかった。
【００９３】
実施例4
BBGL-IIの放射性標識
14C-コレステロールの存在下で培養すると、総脂質抽出物中に見られる放射能の80%はBBGL-IIに帰属することができた(表1)。コレステロールまたはコレステロールエステルを含有しないBBGL-IIIに対応する脂質バンドにおいて放射能は検出されなかった。
【００９４】
（表１）B. ブルグドルフェリ糖脂質の化学組成
2006522808.tif 000005
aモル比はGLC-MSで求めた
b二重結合の局在化
c総脂質分画からの放射性標識の相対量(詳細は実施例1参照)
【００９５】
実施例5
組成分析
両方の糖脂質の糖分析は、唯一の単糖としてのガラクトースの存在を明らかにした。グリセロールはBBGL-IIIにおいてだけ検出された。メタノリシスは2つの主要なエステル-結合脂肪酸：C16：0およびC18：1ならびにいくつかの少量の脂肪酸：C14：0、C18：0 C18：2の存在を同定した(表1)。二重結合は、C18：1およびC18：2では、それぞれ、位置Δ9およびΔ9, 12に局在化され、これらの脂肪酸がオレイン酸およびリノレン酸であることを示唆している。
【００９６】
ガラクトースオキシダーゼを用いた酵素アッセイは、ガラクトース部分がD配置であることを証明した。位置C-3に糖残基ならびに位置C-1およびC-2に脂肪酸を有するBBGL-IIIのグリセロール部分の位置C-2の炭素の絶対配置は、Lであると判定した。これは、炭素が立体特異的に番号づけされるとき、sn-配置に一致する。
【００９７】
実施例6
メチル化分析
天然型BBGL-IIのメチル化分析は、1,5-ジ-o-アセチル-2,3,4,6-テトラ-O-メチル-ガラクチトール(galacitol)および1,5,6-トリ-O-アセチル2,3,4-テトラ-メチル-ガラクチトールが1.0〜0.9のモル比で存在することを明らかにしており、末端および6-置換ガラクトース残基を同定している。試料を事前に脱-O-アシル化すると6-置換ガラクトースが消失し、末端ガラクトースが唯一の検出成分であった。(23)により実施したメチル化中に完全に脱離されていない脂肪酸鎖がガラクトースの位置C6に位置することをこれは示唆している。BBGL-IIIのメチル化分析は、末端ガラクトースの存在を示す1,5-ジ-o-アセチル-2,3,4,6-テトラ-O-メチルガラクチトールを検出した。
【００９８】
実施例7
質量分析法
ポジティブイオンモードで記録したBBGL-IIのMALDI-TOFスペクトルは2つの分子サイズ810.1および836.1を検出した。分子量の差(Δm/z=26)は脂質成分の変化を示唆しており、パルミチンまたはオレイン脂肪酸で置換されたコレステリルガラクトースのナトリウム付加物を示した(図2)。これは、これらの脂肪酸を主要な部分として示したGLC-MSによって得られた結果と一致している。天然BBGL-IIのFAB-MS分析は809.7および835.7の分子量を検出したが、パーアセチル化BBGL-IIの分析は935.7および961.7の分子量を検出した。Δm/z=126の分子量の増加は、3つのアセチル基の導入を示しており、BBGL-IIに3つの遊離のヒドロキシル基が存在することを確認した。BBGL-IIIの組成を確認するために、高分解能FAB-MSを記録した。ヘキソース、コレステロールおよびオレイン酸を含む化合物のセシウム付加物 (C51H86O7Cs) の理論的なm/z値は943.5428であると算出された。観察されたm/z重量は943.5469であった。これは、理論的な組成C51H86O7Csを確認している(誤差[ppm/mmu]=+4.3/+4.1)。
【００９９】
BBGL-IIIのMALDI-TOFスペクトルは、それぞれ、2つの16：0脂肪酸または16：0および18：1脂肪酸を有するモノガラクトシルグリセロールのナトリウム付加物である780.1および806.1の分子量を有する2つのイオンを明らかにした(図2)。
【０１００】
実施例8
NMR分光分析
BBGL-IIおよびBBGL-IIIならびにそれらのパーアセチル誘導体の構造を、一次元(1D)および二次元(2D)NMR分光分析によって500 MHzにおいてさらに検討した。1H NMR帰属(表2)は2D相関分光法(COSY)、1H-1Hシフト相関二次元分光法(total correlation spectroscopy)(TOCSY)または選択的スピン-デカップリング実験によって確認したが、13C NMR帰属(表3)は、すでに決定されている1H NMR帰属に基づいて、2D異種核単量子相関(HSQC)によって示された。残基間接続および13C 帰属のさらなる証拠は、2D異種核多結合相関(heteronuclear multiple bond correlation)(HMBC)から得られた。
【０１０１】
（表２）糖脂質および関連化合物のガラクトースおよびグリセロール残基の1H化学シフト(ppm)
2006522808.tif 000006
【０１０２】
（表３）糖脂質および関連化合物の13C化学シフト(ppm)
2006522808.tif 000007
2006522808.tif 000008
【０１０３】
糖脂質の主要な同種-および異種核結合定数の値を表4に報告する。いくつかの基準化合物または糖脂質の構造成分のNMRデータも表2〜4に報告する。13C NMR共鳴の帰属は、結合している水素原子の数が異なる炭素核を識別する、分極移動による1D無ひずみ増強(1D distortionless enhancement by polarization transfer)(DEPT) NMRスペクトルエディティング実験によってさらにアシストした。
【０１０４】
（表４）糖脂質誘導体および関連する基準化合物のガラクトピラノースおよびグリセロール残基のカップリング定数(J, Hz)
2006522808.tif 000009
【０１０５】
実施例9
BBGL-II
BBGL-IIのクロロホルム-d溶液の1D 1H NMRスペクトルは500 MHzにおいて分散が不完全であり、糖残基のH-2'およびH-3'信号は〜3.62 ppmにおいてかなり重なっていた1。H-1'、H-6'aおよびH-6'b多重線2の重なりも観察され、2D TOCSYスペクトルにおいてこれらの信号から取った1Dスライスは、糖鎖プロトン信号(H-1'--H-6'b)の7つ全てを、おそらくH-1'--H-4'およびH-5'--H-6'bサブグループを含む2つのサブセットとして含むサブスペクトルを生じた。糖脂質の糖メチレンプロトンのメチルβ-D-ガラクトピラノシドに対して0.55 ppmの非遮蔽(表2)は、糖のO-6'がアシル化されていることを示唆している。このTOCSY実験は、特に、それはBBGL-IIのオレフィンプロトン信号から取った1D TOCSYスライスにおいても観察されたので、δ3.553の1:2:1三重線の1:2:1三重線は糖プロトンのスピンシステムの一部ではなく、この多重線はコレステロール部分のH-3に帰属されるも証明した。積分によって、コレステロール部分の1つのオレフィンプロトン(H-6)信号と単離された糖脂質におけるある割合の不飽和脂肪酸のオレフィンプロトン信号との一致により、後者の信号は1D 1H NMRスペクトルの〜2.5プロトンになった。この帰属を支持して、コレステロールおよび不飽和脂肪酸両方の脂肪族プロトンとの接続により、オレフィンプロトン信号のTOCSYスライスも脂肪族プロトン領域(δ2.8〜0.9)に大多数の多重線を含んだ。
1コレステロール、ガラクトース、パルミチン酸、オレイン酸およびグリセロール残基は、それぞれ、未標識(unprimed)ならびに一重、二重、三重および四重標識(primed)として標識する。
2aおよびbと標識したプロトンについては、a標識は、低磁場で共鳴するプロトンをいい、b標識は高磁場プロトンをいう。
【０１０６】
BBGL-IIの13C NMRスペクトルは、59の主要な分離された共鳴を示し、そのうちの5つは、四級13C核によるものであり、すなわち13C DEPT実験によって検出されなかった。低磁場から高磁場にかけて(表3)、5つの四級13C共鳴が、コレステロール部分の2つのエステルカルボニル共鳴ならびにC-5(オレフィン)、C-13およびC-10共鳴と帰属された。13C共鳴の総数のうち、15は、27のCH2および6つのCH3基(図3b)と共に、DEPTスペクトルエディティング(図3a)によってCHと同定することができた。CH3共鳴の5つはコレステロール残基に帰属され(表3)、δc 14.13の第6の弱いものは、典型的には、互いに分離することができない、脂肪酸エステル基のωメチル炭素の信号の組み合わせに帰属された。〜130 ppmの2つの主要なオレフィンCH共鳴は、主要な不飽和脂肪酸エステル基(オレイン酸、18：1)に帰属されたが、その領域の追加の弱い共鳴は、少量の割合の他の不飽和脂肪酸エステル基の存在を示した。122.12および79.46 ppmのCH共鳴は、それぞれ、コレステロール部分のC-6およびC-3に帰属された。残基の結合ポイント付近の核を除いて、BBGL-IIの13C化学シフトと脂質成分、コレステロール、パルミチン酸およびオレイン酸のそれらとの良好な帰属が得られた(表3)。コレステロールのクロロホルム-d溶液の13C帰属は、ピリジン-d5溶液について報告されているもの(24)に基づいているが、帰属がDEPT実験の結果と一致していたことを確実にしている。
【０１０７】
101.43〜68.32 ppm範囲の残りの5つのCH共鳴は、61.3 ppmにCH2信号も示した、ガラクトースのC-1'--C-5'に帰属された(表3)。ガラクトースのC-4'、C-5'およびC-6'信号のダブリングが観察され、ガラクトースのO-6'に異なる脂肪酸エステル基(パルミトイルおよびオレイル)を有する2つの糖脂質の存在に帰属することができた。観察されたコレステロールC-3信号のダブリングはこの方法で説明するのは困難である。その理由は、C-3は、C-4'、C-5'およびC-6'よりガラクトースのO-6'の置換基から離れているからである。このダブリングは、C-1'--O-1'結合の回転異性による可能性がある(25)。
【０１０８】
BBGL-IIのガラクトース(Gal)残基のO-1'のコレステリル基の位置は、2D HMBCスペクトルの3.556/101.49 ppmのH-3/C-1'/クロスピークの観察によって示された。同様に、ガラクトースのC-6'のアシルオキシ基の位置は、HMBCスペクトルのそれぞれ、4.351/173.86 ppmおよび4.297/173.86 ppmのH-6'a/C=OおよびH-6'b/C=Oクロスピークの観察から推論された。BBGL-IIの1H NMRスペクトルのコレステロールH-3多重線の分析は、カップリング定数J2eq, 3=J4eq, 3=4.7 HzおよびJ2ax, 3=J4ax, 3=11.4 Hzを得た。これらの値はH-3の配向をアクシャルと規定し、C-3に結合する酸素原子(O-1')はエカトリアルである。従って、C-3は、コレステロールに見られる通常の立体化学配置を有する。BBGL-IIのNMRデータは、2つの構造物、すなわち3-O-(6-O-パルミトイル-β-D-ガラクトピラノシル)コレステロールおよび3-O-(6-O-オレオイル-β-D-ガラクトピラノシル)コレステロールの混合物に一致する。糖環サイズの帰属は、BBGL-IIの糖環とメチルβ-D-ガラクトピラノシドのカップリング定数の類似性に基づいている(表4)。BBGL-IIのアノマー配置は以下に考察する。
【０１０９】
実施例10
糖脂質BBGL-II-Ac3
BBGL-IIにガラクトースが存在することのNMR証拠の確信は、トリアセチル誘導体を生じたパーアセチル化によって得られ、その1H NMRスペクトルは、BBGL-IIよりも分散および解像がすぐれていた。このスペクトルは、ガラクト配置に特徴的な狭いH-4'四重線(J3', 4'3.5 Hz、J4', 5' 1.0 Hz)と、H-2'およびH-3'に予想される広い四重線を示した。これらの信号の3つ全ては、非アセチル化BBGL-IIの位置に対してかなり非遮蔽されており(+1.41-1.57 ppm)(表2)、アセチル化がHO-2'、HO-3'およびHO-4'において生じたことを示している。3つのアセチル基の位置の確認は、H-2'、H-3'、H-4'と3つの異なる13C=O基との間の2D HMBCクロスピークの観察から得られた(図4)。このスペクトルはまた、GalのC-1'とコレステロールのH-3の間およびGalのH-6'a/H-6'bと脂肪酸エステルC=Oとの間のクロスピークを示し、それによってGalのO-1'のコレステリル基の位置とC-6'の脂肪酸アシルオキシ残基の位置を確認している。1H信号の帰属は2D COSYによって確認した(図5参照)。
【０１１０】
それぞれ、BBGL-IIおよびBBGL-II-Ac3について観察された大きな値J1', 2' 7.5 Hzおよび8.0 Hz(表4)は、H-1'およびH-2'はこれらの糖脂質においてトランス配向を有すること、従ってそれらはβアノマー配置を有することを示している。これは、メチルβ-D-ガラクトピラノシド(Me-β-D-Galp、表4)について観察された値1JC-1', H-1 160.6 Hzによって例示されるように、βアノマー配置(26)の適当な範囲に入る、それぞれ、BBGL-IIおよびBBGL-II-Ac3の値1JC-1', H-1' 158.7 Hzおよび157.4 Hzの測定によって確認された。
【０１１１】
BBGL-IIおよびBBGL-II-Ac3の糖環サイズの帰属は、糖環とメチルβ-D-ガラクトピラノシドのカップリング定数の類似性に基づいて行った(表4)。一方では、BBGL-IIとBBGL-II-Ac3のJ5', 6'aとJ5', 6'b値の差および他方ではメチルβ-D-ガラクトピラノシドとの差は、糖脂質のO-6'に大きな置換基が存在することによって生ずるC-5'-C-6'結合の異なる回転異性体の分布に帰することができる。BBGL-II-Ac3のNMRデータは、3-O-(2,3,4-トリ-O-アセチル-6-O-パルミトイル-β-D-ガラクトピラノシル)コレステロールおよび3-O-(2,3,4-トリ-O-アセチル-6-O-オレオイル-β-D-ガラクトピラノシル)コレステロールの混合物としての特徴に一致する。
【０１１２】
実施例11
BBGL-III
BBGL-IIIのクロロホルム-d溶液の1H NMRスペクトルは十分に分散されていた；特に、グリセロールプロトンは500 MHzにおいて十分に分散されており、2D COSYスペクトルおよび2D TOCSYスペクトル(図6)は、(低磁場から高磁場までの)グリセロールプロトンH-2''''、H-1''''a、H-1''''b、H-3''''aおよびH-3''''bを示す5-多重線を含有する。H-2''''はグリセロール炭素鎖の他のプロトンの全てにカップリングしたスピンであり、従ってTOCSYスペクトルのクロスピーク線に類似したCOSYスペクトルのクロスピーク線を形成するので、これらの2Dスペクトルは類似した性状を有する。後者のスペクトル(図5)はまた、ガラクト配置に特徴的であるH-1'-H-4'多重線を示し、H-4'〜H-5'、H-6'aおよびH-6'bからの磁化の伝達は通常わずかなJ4', 5'によって阻害される(表4参照)。結果として、Gal残基のH-4'多重線は特徴的に狭い(J3', 4' 3.2 Hz、J4', 5' 1.1 Hz)。2D TOCSYスペクトルの7-多重線は、不飽和脂肪酸(18：1)のオレフィンプロトン(δ 5.344)と脂肪族プロトンとの間の磁化の相互交換を示す。
【０１１３】
BBGL-IIIのDEPT-135 13C NMRスペクトルは、1つのグリセロール残基および1つのアルドース残基ならびに脂肪酸に帰属された脂肪族炭素領域の分離が不完全の25のCH2信号および1つのCH3共鳴に一致する、糖領域の6つのCH共鳴および3つのCH2信号を示した。δc 130.06および129.70の2つの強い共鳴は、1つの主要な不飽和脂肪酸残基の存在を示唆した。しかし、このオレフィン炭素領域の2つの弱い信号対の観察は、少量の割合の他の不飽和脂肪酸の存在を示した。C=O領域に3つの強い13C共鳴と(表3)、1つの弱い共鳴が観察された。親グリセロール(D2O中のδH, 3.653, H-1''''a；3.561, H-1''''b；3.783, H-2'''')の対応するプロトンに対するBBGL-IIIのグリセリル残基のH-1''''a、H-1''''bおよびH-2''''プロトンの実質的な非遮蔽(それぞれ、+0.724、+0.567および+1.470 ppm)は、グリセリル残基のO-1''''およびO-2''''のアシル化を指摘した(表2)。アシル基の位置の確認は、BBGL-IIIの2D HMBCスペクトルのH-1''''a/C=O、H-1''''b/C=OおよびH-2''''/C=Oクロスピークの観察によって提供された。このスペクトルはまた、グリセロール部分のO-3''''にガラクトシル残基を配置するH-3''''b/C-1'クロスピークを示した。
【０１１４】
実施例12
BBCL-III-Ac4
BBGL-IIIのパーアセチル化は、1Hおよび13C NMRスペクトルが4つの強力なアセチルメチルプロトン信号ならびに4つのアセチルメチル炭素およびカルボニル炭素信号をそれぞれ示した生成物を生じ、テトラ-O-アセチル誘導体の形成を示した。Gal H-2'、H-3'およびH-4'の実質的な非遮蔽(+1.266〜+1.547 ppm)ならびにH-6'aおよびH-6'bのさらに限定された非遮蔽(+0.180〜+0.255 ppm、表2)はGal残基のO-2'、O-3'、O-4'およびO-6'のアセチル化を指摘した。アセチルおよび脂肪酸エステル基のカルボニル炭素信号が、13Cの化学シフトのそれぞれ、170 ppmおよび173 ppm領域によって容易に識別される場合には、これは、BBGL-III-Ac4(図6)の2D HMBCスペクトルのH-2'/C=O、H-3'/C=O、H-4'/C=O、H-6'a/C=OおよびH-6'b/C=Oクロスピークの検出によって確認された。173 ppm領域では、BBGL-III-Ac4の2D HMBCスペクトルは、脂肪酸エステルカルボニル炭素のH-1''''a、H-1''''bおよびH-2''''のクロスピークならびにグリセロール単位のO-3''''のGal残基の帰属された位置を支持するH-3''''a/C-1'クロスピークを示した。
【０１１５】
BBGL-IIIおよびBBGL-III-Ac4のそれぞれ小さい値J1', 2' 3.8 Hzおよび3.7 Hzは(表4参照)は、これらの誘導体のH-1'およびH-2'のゴーシュ配向を示し、それらのGal残基はαアノマー配置を有することを意味する。これは、メチルα-D-ガラクトピラノシド(Me-α-D-Galp、表4)について観察されたように、αアノマー(26)について予想される範囲内に入るBBGL-IIIおよびBBGL-III-Ac4のそれぞれ大きい値JC-1', H-1' 170.5 Hzおよび172.4 Hz(表4)によって確認された。
【０１１６】
BBGL-IIIのNMRデータは、構造3-O-α-D-ガラクトピラノシル-1(2)-O-オレオイル-2(1)-O-パルミトイル-グリセロールに一致しており、BBGL-III-Ac4のデータは構造3-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシル)-1(2)-O-オレオイル-2(1)-O-パルミトイル-グリセロールを支持している。また、糖環サイズの帰属は、糖環のカップリング定数とメチルα-D-ガラクトピラノシドのカップリング定数の類似性に基づいていた(表4)。
【０１１７】
実施例13
モノガラクトシルジグリセリド
本発明者らは、市販のモノガラクトシルジグリセリド(MGDG)はBBGL-IIIの近接した構造類似体であることに気づき、従って、この生成物を、基準化合物としておよび本明細書に記載する分析技法を精緻化するために検討した。MGDGの1H NMRスペクトルは500 MHzにおいて極めて十分に分散し、ガラクト配置に特徴的な狭いH-4'四重線(J3', 4' 3.3 Hz、J4', 5' 1.1 Hz)を含む、Gal残基由来の7つのスピン多重線が容易に認識された。さらに、環プロトンカップリング定数(表4)は、ガラクトース残基は、先に考察した糖脂質と協力して、ピラノシル環として存在することを示す。オレフィンプロトン信号はMGDGでは観察されなかった。
【０１１８】
MGDGの2D COSYおよびTOCSY 1H NMRスペクトルは、H-1''''a、H-1''''bおよびH-2''''の低磁場シフトによって支持される置換パターンである、C-1''''およびC-2''''にアシルオキシ基を有するグリセロール残基に特徴的な分散性の高い同じ5-多重線を含有した(表2)。DEPT-135 13C NMRスペクトルは、糖領域(Gal+Gro)6つの主要なCH共鳴および3つの主要なCH2信号、通常の13C NMRスペクトルのδc 174.31および174.01の2つのC=O信号の検出によって確認されたように、2つの脂肪酸エステル残基を示す脂肪族領域の14の分離されたCH2信号および1つのCH3共鳴を示した。C-1''''およびC-2''''のアシルオキシ基の位置は、MGDGの2D HMBCスペクトルのH-1''''a/C-O、H-1''''b/C=OおよびH-2''''/C=Oクロスピークの観察によって立証される。このスペクトルはまた、Gal残基のC-1'とグリセロール部分のO-3''''への結合を確認するH-3''''a/C-1'およびH-3''''b/C-1'クロスピークを示した。グリセリル炭素の3つ全ての13C化学シフト間の良好な一致はMGDG、BBGL-IIIおよびBBGL-III-Ac4で得られたが(表3参照)、1,2-ジパルミチンでは、C-3''''シフトは、このジグリセリドのグリコシル置換基の非遮蔽が行われないことにより、他の化合物の対応するシフトの実質的に高磁場である。
【０１１９】
大きい値J1', 2' 7.3 Hzおよび小さい値JC-1', H-1' 160.2 Hz(表4)は、MGDGはβアノマー配置、すなわち糖脂質BBGL-IIIと反対の配置を有することを証明している。共に考慮すると、MGDGのNMRおよびGC-MSデータは、MGDGは、主に、1,2-ジ-O-ステアロイル-3-O-β-D-ガラクトピラノシルグリセロールからなることを示すが、NMRおよびGC-MSスペクトルの弱いピークは少量の割合の他の成分の存在を示した。MGDGとBBGL-IIIのジアステレオマー関係およびMGDGに不飽和脂肪酸残基がないことは、これら2つの糖脂質が異なる溶解度を有する十分の理由になる。検討した全ての他の脂質と異なり、MGDGのCDCl3への溶解は、約20%のCD3ODの添加を必要とした。
【０１２０】
このように、BBGL-IIおよびBBGL-IIIはB. ブルグドルフェリB31株、N40株およびBL303株から単離され(15)、シリカゲルクロマトグラフィーによってほぼ均一に精製された。種々の分析手法(GLC、MALDI-TOF、FABおよびNMR分光法)を使用して、B. ブルグドルフェリの主要な極性膜糖脂質の構造はコレステリル6-O-アシル-β-D-ガラクトピラノシド(BBGL-II、図8)および1,2-ジアシル-3-[O-α-D-ガラクトピラノシル]-sn-グリセロール(BBGL-III、図9)と同定された。
【０１２１】
BBGL-IIIは、以前に記載されているモノガラクトシルジアシルグリセロールであるBOLIP-7と構造的相同性が高い。しかし、得られた結果は、ガラクトースがグリセロールに結合しているBBGL-IIIと違い、BBGL-IIの末端ガラクトース部分はコレステロールに結合していることを明らかに実証している。
【０１２２】
BBGL-IIのコレステロール部分のさらに別の証拠は、細胞を14C-コレステロールと共に培養する結果、この糖脂質の代謝的な標識によって得られた。これらの実験では、総脂質分画の放射能の80%はBBGL-IIに帰属することができた。遊離のコレステロールはこれらの実験において検出されず、膜脂質プール由来の遊離のコレステロールはなく、BBGL-IIに速やかに取り込まれることを示唆している。遊離のコレステロールまたはコレステロールエステルは、マイコプラズマ(Mycoplasma)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ミクロコッカス・リソディクティカス(Micrococcus lysodeikticus)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)およびプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)を含む多数の種において細菌膜に取り込まれることが示された。しかし、コレステロールが増殖培地から取り込まれて、糖および／または脂質部分に結合される、デノボ合成されるコレステリル糖脂質は、これまではマイコプラズマ、ヘリコバクター・ピロリおよびB. ヘルムジ(B. hermsi)においてだけ証明されており、その全てについて、炭水化物はグルコースである。以前の検討は、コレステロールは免疫原性の高い分子であることを証明している。従って、B. ブルグドルフェリ膜の多量のコレステロール含有BBGL-IIIは、ライム病発症中に抗コレステロール抗体価が高くなりうる。
【０１２３】
ポリカチオン性の環状ペプチドであるポリミキシンBは、エンドトキシン、主にLPSおよびリピドAを除去するための親和性吸着体として使用されている。超音波処理したB. ブルグドルフェリ細胞を、固定したポリミキシンBを含有するカラムにロードすると、BBGL-IIの存在は、デオキシコール酸塩による溶出により結合物質中に証明することができた。BBGL-IIIは、同じ条件下でこのカラムに結合しなかったことに注目することは興味深い。エンドトキシンとポリミキシンBとの結合の駆動力は、これら2つの構造物の疎水性相互作用である。BBGL-IIのいくつかの構造的な要素が、リピドAの特徴と同様の特徴を提供すると推測することができる。
【０１２４】
BBGL-IIによるリピドAの分子的模倣性は、BBGL-IIを含有する種々のB. ブルグドルフェリ調製物で細胞クラスターを刺激する結果、インターロイキン-1、IL-6、TNF-αおよびPGE2などの前炎症媒介物質の分泌を誘発することによっても証明されている。理論に結びつけるわけではないが、従って、BBGL-IIはB. ブルグドルフェリにおいて「機能的なLPS」として作用する可能性がある。
【０１２５】
実施例14
免疫学的な結果
式B(BBGL-II)の化合物の種々の製剤を注射したマウスおよびウサギにおいて特異的な抗体が誘導された(図10および図11参照)。BBGL-IIIは、両方の糖脂質に反応する抗体、ほとんどIgMを誘導した(データは示していない)。PBS中のBBGL-II(おそらくミセルとして)は、DMSOまたはスクアレン中の溶質としてよりも免疫原性が強かった。最も高い抗体価はフロイントのアジュバントで得られた。
【０１２６】
驚くべきことに、小さいサイズにもかかわらず、BBGL-IIはマウスおよびウサギにおいて、ほとんどIgMアイソタイプの抗体を誘発した。これらの抗体は同種糖脂質に特異的であった。一方、BBGL-IIIは、両方の糖脂質に反応する抗体を誘発した。
【０１２７】
実施例15
BBGL-II類似体の合成(「アジドBBGL-II」)
標的化合物(「アジドBBGL-II」、化合物19、図15参照)は、プロトンの代わりにパルミトイル基の末端にアジド基を含有する点において天然の糖脂質BBGL-IIと異なる。19の合成は、主要な中間体ガラクトシルブロマイド4、コレステロール5およびω-アジドパルミチン酸16から実施した。
【０１２８】
化合物4(図12参照)は、塩化ピバロイルのピリジン溶液で処理したガラクトース1から製造した。予想されたペンタ-ピバロイル誘導体の代わりに、部分的にピバロイル化された化合物2が、クロマトグラフィーによる精製の必要なく、高収率および高純度で得られた。化合物2の遊離のヒドロキシル基をアセチル基によって保護した(→3)。次に、臭化水素の酢酸溶液で処理して、ガラクトシルブロマイド4を提供した。トリフルオロメタンスルホン酸銀のジクロロメタン溶液による促進下で、ブロマイド4をコレステロール5とカップリングさせて、望ましいβ-ガラクトシル-コレステロール6を立体選択的に提供した(図13参照)。β-アノマー配置は1-H NMR分光法によって証明した。その後、ナトリウムメトキシドの無水ジクロロメタンとメタノールの混合液溶液で処理することによって、O-保護基を離脱させて、コレステリルβ-D-ガラクトピラノシド7を非晶質の固体として提供した。
【０１２９】
数多くの保護基の組み合わせを試して、テトラオール7のHO-6位へのピバロイル部分の導入を可能にした。本発明者らの経験では、アセチル、レブリノイル、クロロアセチル基を含むアセチル-型保護基の使用は、ガラクトース部分内でのこれらの制御不能な移動のために、不成功であることが多いことがわかった。最終的に、この問題は、アリル、イソプロピリデンおよびシリル保護基の組み合わせを使用することによって克服した。従って、7位の一級ヒドロキシル基を、t-ブチル-ジフェニルシリル基で保護して、他のヒドロキシルに影響を与えないで化合物8を得た。次に、トリオール8を、カンファスルホン酸の存在下でジメトキシプロパンで処理して、HO-3およびHO-4にイソプロピリデン基を導入し、化合物9を得た。その後、中間体9を臭化アリル/NaHのジメチルホルムアミド溶液で処理して、十分に保護された誘導体10を得、分子の他の部分に影響を与えないで、シリル保護基を選択的に離脱させて、化合物11を提供した。この誘導体は、パルミトイル部分の結合点である遊離のHO-6ヒドロキシル基を特徴とする。
【０１３０】
16-アジドパルミチン酸中間体16の合成は図14に示す。このように、市販の16-ヒドロキシパルミチン酸12をジアゾメタンで処理して、定量的収率でメチルエステル13を得た。次に、アルコール13をp-トルエンスルホニルクロライドのピリジン溶液で処理して、スルホネート14を得、その後アジ化ナトリウムのジメチルホルムアミド溶液で処理して、アジド-エステル15を得た。次に、メチルエステルをジオキサンと水の混合液中で水酸化カリウムで切断して酸16を得た。
【０１３１】
コレステリルパルミトイル-ガラクトピラノシド19は、ジシクロヘキシルカルボジイミドの酢酸エチル溶液の存在下において、化合物11をアジドパルミチン酸16と縮合することによって定量的収率で製造した(→17)(図15参照)。その後、2段階で保護基を離脱させた。最初に、化合物17を酢酸/水で処理して、イソプロピリデン基を離脱させて、ジオール18を得た。次に、18をイリジウム錯体(MePh2)2(C8H12)IrPF6のテトラヒドロフラン溶液で処理し、得られたプロペニル基を、オスミウムテトロキシドとトリメチルアミンN-オキシドの組み合わせを使用して酸化的に離脱させて、アジド19を非晶質固体として得た。
【０１３２】
ELISAおよびTLCオーバーレイアッセイは、抗体は、精製された天然のBBGL-IIと同じ程度に合成化合物19に対して形成されたことを証明した。
【０１３３】
記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載されている本発明の精神から逸脱することなく、変更または改良することができることが明らかである。本発明者らは、特許請求の範囲の範囲および精神に含まれる全てのこのような改良および変更を主張する。
【０１３４】
参考文献
参考文献一覧
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
（図１）  B. ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)の脂質抽出物のTLC分析のデジタル画像である。B31株(レーンA)、N40株(レーンB)およびBL303株(レーンC)の総脂質抽出物にヨウ素蒸気を接触させ、アンスロン試薬を噴霧し(レーンD)、マウス抗BBGL-II抗血清で免疫染色した(レーンE)。または、超音波処理したB31細胞をDetoxi-Gelカラムにロードし、結合した物質をデオキシコール酸塩で溶出し、その脂質にヨウ素蒸気を接触させた(レーンF)。
（図２）BBGL-IIおよびBBGL-IIIのナトリウム付加物のMALDI-TOF質量-スペクトルの一部のデジタル画像である。m/z809.87および835.87の擬分子イオン[M+Na+]の2つの主要なピークは、BBGL-II(A)のパルミチン酸(MI)およびオレイン酸(MII)誘導体を有するコレステリルガラクトースを示し、m/z780.1および806.1の擬分子イオン[M+Na]+はジパルミトイル(MIII)およびパルミトイル-オレイル(MIV)誘導体(B)で置換したモノガラクトシルジアシルグリセロール(BBGL-III)を示す。
（図３）Ａ〜Ｂは、126 MHzにおいてCDCl3中で測定した糖脂質BBGL-IIのDEPT 13C NMRスペクトルエディティングのデジタル画像である。図3Aは、DEPT-90実験によって得られたCH信号だけのデジタル画像である。図3Bは、DEPT-150-fx DEPT-90からコンピュータで算出される正のCH3および負のCH2共鳴のデジタル画像であり、fは実験により調節される因子である。
（図４）500/126 MHzにおいてCDCl3中で測定した糖脂質BBGL-II-Ac3の部分的な2D 1H/13C HMBC NMRスペクトルを示し、Gal 1H/アセチルカルボニル13C、Gal 1H/脂肪酸エステルカルボニル13C、およびコレステロールH-3/Gal C-1'組み合わせの残基間1H/13C接続性を示す。2つの残基内接続も示す。
（図５）500 MHzにおいてCDCl3中で測定したBBGL-II-Ac3の2D 1H/1H COSY-30 NMRスペクトルを示し、近接およびジェミナルな1H/1H接続性を示す。
（図６）500 MHzにおいてCDCl3中で測定した糖脂質BBGL-IIIの2D 1H/1H TOCSY-30 NMRスペクトルを示す。固有のGal、Gro、および脂肪酸18:1サブスペクトルを同定する。
（図７）500/126 MHzにおいてCDCl3中で測定した糖脂質BBGL-III-Ac4の部分的な2D 1H/13C HMBC NMRスペクトルを示し、4つのGalプロトンとアセチルカルボニル13C核、3つのグリセリルプロトンと脂肪酸エステルカルボニル13C核および2つのグリセリルプロトンとGalのC-1'との残基間1H/13C接続性を示す。
（図８）天然の(native)BBGL-II、コレステリル6-O-パルミトイル-b-d-ガラクトピラノシドの主要部分の構造のダイアグラムである。
（図９）天然のBBGL-III、1-オレイル、2-パルミトイル、3-[O-α-D-ガラクトピラノシル]-sn-グリセロールの主要な部分の構造のダイアグラムである。
（図１０）式Bの糖脂質で免疫したウサギ由来の血清の抗体価を示すグラフである。抗体価は、以下に記載するようにELISAで測定し、1：100で希釈し、各々3回の別個のアッセイで試験した4つの異なるウサギ血清の平均を示す。白抜きのバー、IgG価；灰色のバー、IgM価；ブラケット、標準偏差。
（図１１）式Bの糖脂質で免疫したマウス由来の血清の抗体価を示すグラフである。マウス(1グループあたり10匹のマウス)を、以下に記載するように、フロイントのアジュバント (CFA)；PBS；DMSOまたはスクアレンを溶媒とした式Bの糖脂質で免疫した。抗体価は、1：100倍希釈した血清においてELISAで測定し、3回の別個のアッセイの平均として示す。ブラケット、標準偏差。
（図１２−図１５）本明細書に記載する合成脂質の一例を製造するための合成スキームを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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