(57)【要約】【課題】  なし【解決手段】  嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、又は急性及び慢性気管支炎は、オキシアミドを含有する化合物によって治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウムイオンの輸送を阻害するのに効果的な量のオキシアミド結合を含有する化合物と気道上皮細胞を接触させることを含む、該気道上皮細胞におけるナトリウムイオン輸送を阻害する方法。
【請求項２】
前記化合物が下記一般式（I）で表されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１記載の方法：
【化１】
2006508986.tif 000008
式中、Aは、
C3〜14のシクロアルキル、3〜14員ヘテロシクロアルキル、C4〜14のシクロアルケニル、3〜8員ヘテロシクロアルケニル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選択される環状部分であり、該環状部分は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、又はアルキルスルホニルと任意に置換されているか；
又はAは、-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(O)-、-N(Ra)-SO2-、-SO2-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-N(Rb)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、又は-O-C(O)-O-で任意に中断されているC3〜12の分岐飽和炭化水素鎖、又はC3〜12の分岐不飽和炭素水素鎖であり、Ra及びRbは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル又はハロアルキルであり、飽和又は不飽和の分岐炭化水素鎖は、それぞれアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、又はアルキルスルホニルで任意に置換されており；
Y1及びY2は、それぞれ独立に、-CH2-、-O-、-S-、-N(Rc)-、-N(Rc)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Rc)-、-N(Rc)-C(O)-N(Rd)-、-O-C(O)-O-、又は結合であり、Rc及びRdは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルであり；
Lは、少なくとも1つの二重結合、少なくとも1つの三重結合、又は少なくとも1つの二重結合及び三重結合を任意に含むC2〜12の直鎖状炭化水素鎖であり；該炭化水素鎖は、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、C1〜4のアルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、Ｃ3〜5のシクロアルキル、3〜5員ヘテロシクロアルキル、単環式アリール、5〜6員ヘテロアリール、C1〜4のアルキルカルボニルオキシ、C1〜4のアルキルオキシカルボニル、C1〜4のアルキルカルボニル又はホルミルと任意に置換されており；さらに、-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Re)-、-N(Re)-C(O)-N(Rf)-、又は-O-C(O)-O-で更に任意に中断されており；Re及びRfは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル又はハロアルキルであり；
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、ハロアルキル又はアミノ保護基であり；かつ
R2は、水素、アルキル、ヒドロキシルアルキル、ハロアルキニル、又はヒドロキシル保護基である。
【請求項３】
R1が水素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
R2が水素である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
X1がOである、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
X2がOである、請求項２〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
Y1が、-CH2-、-O-、-N(Ra)-、又は結合であり、Y2が、-CH2-、-O-、又は-N(Rc)-である、請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Lが、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、C1〜4のアルコキシ、又はアミノで置換されており、かつ、さらに-O-又は-N(Rc)-で任意に中断されている、C4〜10の直鎖状飽和炭化水素鎖である、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Lが、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、又はC1〜4のアルコキシと任意に置換されており、かつ、さらに-O-又は-N(Rg)-で更に任意に中断されており、Rgが水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルである、2〜5個の二重結合を含有する、C4〜8の直鎖状不飽和炭化水素鎖である、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
Lが、-(CH=CH)m-であり、式中、mが2又は3であり、Lが、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、又はC1〜4のアルコキシで任意に置換されており、-O-又は-N(Rg)-で更に任意に中断されている、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
Aが、フェニル、フリル、チエニル、ピロリル、又はピリジルである、請求項２〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
Aが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、又はアミノで任意に置換されているフェニルである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該細胞を、インビボで、前記化合物と接触させる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
該細胞を、インビトロで、前記化合物と接触させる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が７−フェニル-2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がトリコスタチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物がSAHAである、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
有効量のオキシアミド結合を含む化合物を哺乳動物に投与することを含む、肺疾患の治療方法。
【請求項２０】
前記化合物が下記一般式（I）で表されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１８記載の方法：
【化２】
2006508986.tif 000009
式中、Aは、
C3〜14のシクロアルキル、3〜14員ヘテロシクロアルキル、C4〜14のシクロアルケニル、3〜8員ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールからなる群から選択される環状部分であり、該環状部分は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、又はアルキルスルホニルと任意に置換されているか；
又はAは、-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(O)-、-N(Ra)-SO2-、-SO2-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-N(Rb)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、又は-O-C(O)-O-で任意に中断されているC3〜12の分岐飽和炭化水素鎖、又はC3〜12の分岐不飽和炭素水素鎖であり、式中、Ra及びRbは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルであり、飽和又は不飽和の分岐炭化水素鎖は、それぞれアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル又はアルキルスルホニルで任意に置換されており；
Y1及びY2は、それぞれ独立に、-CH2-、-O-、-S-、-N(Rc)-、-N(Rc)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Rc)-、-N(Rc)-C(O)-N(Rd)-、-O-C(O)-O-、又は結合であり、Rc及びRdは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルであり；
Lは、少なくとも1つの二重結合、少なくとも1つの三重結合、又は少なくとも1つの二重結合及び三重結合を任意に含むC2〜12の直鎖状炭化水素鎖であり；該炭化水素鎖は、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、C1〜4のアルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、C3〜5のシクロアルキル、3〜5員ヘテロシクロアルキル、単環式アリール、5〜6員ヘテロアリール、C1〜4のアルキルカルボニルオキシ、C1〜4のアルキルオキシカルボニル、C1〜4のアルキルカルボニル又はホルミルと任意に置換されており；さらに、-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Re)-、-N(Re)-C(O)-N(Rf)-、又は-O-C(O)-O-で更に任意に中断されており；Re及びRfは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルであり；
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、ハロアルキル、又はアミノ保護基であり；かつ
R2は、水素、アルキル、ヒドロキシルアルキル、ハロアルキニル、又はヒドロキシル保護基である。
【請求項２１】
前記化合物が、5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸である、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸である、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がトリコスタチンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物がSAHAである、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
前記肺疾患が、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、又は急性及び慢性気管支炎である、請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
有効量の5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸又はその薬学的に許容される塩を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における嚢胞性線維症の治療方法。
【請求項２７】
有効量の7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸又はその薬学的に許容される塩を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における嚢胞性線維症の治療方法。
【請求項２８】
有効量の5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸又はその薬学的に許容される塩を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の治療方法。
【請求項２９】
有効量の7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸又はその薬学的に許容される塩を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の治療方法。
【請求項３０】
有効量の5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸又はその薬学的に許容される塩を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における喘息、急性気管支炎又は慢性気管支炎の治療方法。
【請求項３１】
有効量の7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸又はその薬学的に許容される塩を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における喘息、急性気管支炎又は慢性気管支炎の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤による肺細胞の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性気管支炎及び肺気腫を含む慢性閉塞性肺疾患（COPD）、又は慢性閉塞性肺疾患は、呼吸管の長期（慢性的）遮断又は閉塞を伴う。前記疾病と遭遇する問題の原因である、主要な物理的変化は、より大きい呼吸管（気管支）の細胞株による粘液の過剰産生である。この粘液は空気の動きを遮断することができ、感染の発達に寄与する。
【０００３】
嚢胞性線維症（CF）は、細胞膜を通過する、ナトリウムイオン及び塩素イオンの移動を制御するタンパク質を生産する遺伝子の突然変異によって引き起こされる。そのタンパク質は、肺、膵臓、大腸、尿生殖器官の通路に並んでいる細胞に存在する。このタンパク質が異常であると、肺及び他の細胞中の塩素イオン及び水の移動が遮断され、粘液の分泌が異常になる。
【０００４】
粘液線毛クリアランスは、呼吸により肺に入る、吸入された壊死組織片及び病原体の除去において重大な役割を果たす。障害性粘液線毛クリアランス及び粘液分泌過多は、嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、急性及び慢性気管支炎等の多くの肺疾患の２つの特徴である。肺疾患に苦しんでいるか肺疾患に苦しむ危険な状態にある患者中の粘液のクリアランスの改善は治療的な利益になり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（要約）
嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、又は急性及び慢性気管支炎等の肺疾患は、ヒドロキサム酸化合物、又はヒドロキサム酸化合物を含有する医薬組成物によって治療され得る。該治療方法は、細胞内のヒストンデアセチラーゼの阻害を含む。細胞内のヒストンデアセチラーゼの阻害は、通常、例えば米国特許第6,495,719号明細書に記載されている。
【０００６】
1つの態様において、気道上皮細胞におけるナトリウムイオン輸送を阻害する方法は、ナトリウムイオン輸送を阻害するのに効果的な量のオキシアミド結合を含む化合物と細胞とを接触させることを含む。前記化合物は、一般式（I）であり得る。
【０００７】
【化３】
2006508986.tif 000002
【０００８】
ある状況では、細胞は、一般式（I）で表わされる化合物とインビボで接触させることができる。他の状況では、細胞は、一般式（I）で表わされる化合物とインビトロで接触させる。
他の態様においては、哺乳動物における、肺疾患の治療方法は、一般式（I）で表わされる化合物等のオキシアミド結合を含む化合物の有効量を肺疾患に苦しんでいるか、又は苦しむ危険にさらされている哺乳動物に投与することを含む。肺疾患は、嚢胞性線維症、慢性閉塞性の呼吸系統の疾患、喘息、及び慢性又は急性気管支炎であり得る。
【０００９】
他の態様においては、哺乳動物における、嚢胞性線維症の治療方法は、5-フェニル-2,4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸、又は7-フェニル2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸、又はそれらの薬学的に許容される塩の有効量を、嚢胞性線維症に苦しんでいるか、又は苦しむ危険にさらされている哺乳動物に投与することを含む。
【００１０】
一般式（I）で表わされる化合物において、Aは、C3〜14のシクロアルキル、3〜14員ヘテロシクロアルキル、C4〜14のシクロアルケニル、3〜8員ヘテロシクロアルキルアルケニル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選択される環状部位であり得る。該環状部位はそれぞれアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、又はアルキルスルホニルで任意に置換されていてもよい。また、Aは、-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(O)-、-N(Ra)-SO2-、-SO2-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-N(Rb)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、又は-O-C(O)-O-で任意に中断されている、C3〜12の分岐飽和炭化水素鎖、又はC3〜12の分岐不飽和炭素水素鎖であり、前記Ra及びRbは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル又はハロアルキルである。飽和及び不飽和の分岐炭化水素鎖は、それぞれ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、又はアルキルスルホニルで任意に置換されていてもよい。
【００１１】
一般式（I）で表わされる化合物において、Y1及びY2は、それぞれ独立に、-CH2-、-O-、-S-、-N(Rc)-、-N(Rc)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Rc)-、-N(Rc)-C(O)-N(Rd)-、-O-C(O)-O-、又は結合である。Rc及びRdは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルである。
【００１２】
一般式（I）で表わされる化合物において、Lは、少なくとも1つの二重結合、少なくとも1つの三重結合、又は少なくとも1つの二重結合及び三重結合を任意に含む、C2〜12の直鎖状炭化水素鎖である。該炭化水素鎖は、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、C1〜4のアルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、C3〜5のシクロアルキル、3〜5員ヘテロシクロアルキル、単環式アリール、5〜6員ヘテロアリール、C1〜4のアルキルカルボニルオキシ、C1〜4のアルキルオキシカルボニル、C1〜4のアルキルカルボニル又はホルミルと任意に置換されている。該炭化水素鎖は、-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Re)-、-N(Re)-C(O)-N(Rf)-、又は-O-C(O)-O-で更に任意に中断され得る。Re及びRfは、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルであり得る。
【００１３】
一般式（I）で表わされる化合物において、R1は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、ハロアルキル、又はアミノ保護基であり、R2は、水素、アルキル、ヒドロキシルアルキル、ハロアルキニル、又はヒドロキシル保護基である。
ある状況では、R1は水素であり、R2は水素であり、X1は酸素であり、X2は酸素であり、Y1は-CH2-、-O-、-N(Ra)-、又は結合であり、Y2は-CH2-、-O-、-N(Rc)-であるか、Aはフェニル、フリル、チエニル、ピロリルであり、例えば、フェニルはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、又はアミノと任意に置換されている。
【００１４】
ある状況では、Lは、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル、C1〜4のアルコキシ又はアミノと置換されており、-O-、又は-N(Rc)-と更に任意に中断されている、C4〜10の直鎖状飽和炭化水素鎖であり、Lは、C1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル又はC1〜4のアルコキシと任意に置換されており、かつ、さらに、-O-、又は-N(Rｇ)-で任意に中断されている、2〜5個の二重結合を含有する、C4〜8の直鎖状不飽和炭化水素鎖であるか、Lは-(CH=CH)m-であり、式中、ｍは２又は３であり、LはC1〜4のアルキル、C2〜4のアルケニル、C2〜4のアルキニル又はC1〜4のアルコキシで任意に置換されており、かつ、さらに、-O-、又は-N(Rｇ)-と更に任意に中断されている。Rgは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル又はハロアルキルである。例えば、前記化合物は、5-フェニル-2,4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸、又は7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸であり得る。
一般式（I）で表わされる化合物の変形例として、該化合物は、スベロイルアニリドヒドラキサム酸（SAHA）、又はトリコスタチンがある。
【００１５】
前記化合物は、一般式（I）で表される化合物の薬学的に許容される塩であり得る。例えば、薬学的に許容される塩は、本発明のアミノ含有化合物と無機又は有機塩とが反応した時に形成され得る。このような酸の具体例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、p-ブロモフェニル硫酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、及び酢酸を含む。このようにして形成される薬学的に許容される塩の例は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩（monohydrogenphosphate）、リン酸二水素塩（dihydrogenphosphate）、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物塩（chloride）、臭化物塩（bromide）、ヨウ化物塩（iodide）、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、及びマレイン酸塩を含む。酸部分を有する本発明の化合物と、無機又は有機塩基とが反応した時に、本発明の化合物は、薬学的に許容される塩を形成することができる。このような塩は、無機又は有機塩基から由来するものを含み、例えば、ナトリウム、カリウム、又はリチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム又はマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；又はアンモニウム塩又はモルフォリン、ピペリジン、ピリジン、ジメチルアミン、又はジエチルアミン塩等の有機塩基の塩を含む。
【００１６】
一般式（I）で表わされる化合物は、キラルな炭素原子を含むことができると認識されている。すなわち、光学異性体又はジアステレオ異性体を有する。
アルキル基は、1〜10個（好ましくは、1〜6個、更に好ましくは1〜4個）の炭素原子を有する直鎖又は分岐炭化水素鎖である。アルキル基の具体例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert−ブチル、n-ペンチル、2-メチルヘキシル、及び3-エチルオクチルを含むが、これらに限定されない。
アルケニル及びアルキニルは、2〜10個の炭素原子、1又はそれ以上（好ましくは1〜4個、更に好ましくは1〜2個）の二重結合又は三重結合をそれぞれ含む直鎖状又は分岐炭化水素鎖である。アルケニル及びアルキニルのいくつかの具体例は、アリル、2-ブテニル、2-ペンテニル、2-ヘキセニル、2-ブチニル、2-ペンチニル、及び2-ヘキシニルを含む。
【００１７】
シクロアルキルは、3〜14個の炭素原子を有する、単環式、二環式又は三環式アルキル基である。シクロアルキルのいくつかの具体例は、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、及びノルボルニルを含む。ヘテロシクロアルキルは、窒素、酸素、又は硫黄等の少なくとも1個（例えば、1〜3個）のヘテロ原子を含むシクロアルキル基である。窒素又は硫黄は酸化されていてもよく、窒素は四級化されていてもよい。ヘテロシクロアルキルの具体例は、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフリル、及びモルフォリニルを含む。シクロアルケニルは、少なくとも1個（例えば、1〜3個）の二重結合を含むシクロアルキル基である。このような置換基の具体例は、シクロペンテニル、1,4-シクロヘキサ−ジ−エニル、シクロヘプテニル、及びシクロオクテニル基を含む。同様に、ヘテロシクロアルケニルは少なくとも1個の、酸素、窒素、又は硫黄の群から選択されるヘテロ原子を含むシクロアルケニル基である。
【００１８】
アリールは、5〜14個の環を含む芳香族基であり、飽和、不飽和、又は芳香族である融合した環を含んでいてもよい。アリールの具体例は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナントリル、及びアントラシルを含む。アリールが「単環式アリール」として定義された場合、1個の環のみを含む芳香族基として言及され、すなわち、融合環を含まない。
ヘテロアリールは、少なくとも1個（例えば、1〜3個）の窒素、酸素又は硫黄等のヘテロ原子を含有し、融合環を含んでいてもよいアリールである。ヘテロアリールのいくつかの具体例は、ピリジル、フラニル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、及びベンゾチアゾリルを含む。
環状部分は、先に記載された２つ以上から形成される融合した環であり得る。融合した環を有する環状部分の具体例は、フルオレニル、ジヒドロジベンゾアゼピン、ジベンゾシクロヘプテニル、７H-ピラジノ[2,3-c]カルバゾール、又は9,10-ジヒドロ-9,10-[2]ブテノ-アントラセンを含む。
【００１９】
アミノ保護基及びヒドロキシ保護基は、当業界において周知である。一般に、保護基の種類は重大でなく、化合物の他の位置における、いかなる次の反応の条件が安定していることを提供し、分子の残りの部分に逆に影響を及ぼすことなく除去される。更に、実質的な合成反応の後に、保護基は他方と置換される。アミノ保護基の具体例は、2,2,2,-トリクロロエチルカルバメート、又はtert-ブチルカルバメート等のカルバミン酸塩を含むが、これらに限定されない。ヒドロキシル保護基の具体例は、メチル、t-ブチル、ベンジル、p-メトキシベンジル、p-ニトロベンジル、アリル、トリチル、メトキシメチル、2-メトキシプロピル、メトキシエトキシメチル、エトキシエチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル等のエーテル；トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ジメチルアリールシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、及びｔ−ブチルジメチルシリルエーテル等のトリアルキルシリルエーテル；ベンゾイル、アセチル、フェニルアセチル、ホルミル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル等のモノ-、ジ-、及びトリハロアセチル等のエステル；メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、及びn-ペンチル等の1〜6個の炭素原子を有するアルキル炭酸塩；2,2,2-トリクロロエトキシメチル、及び2,2,2-トリクロロ-エチル等の1又はそれ以上のハロゲン原子で置換され、1〜6個の炭素原子を有する、アルキル炭酸塩；ビニル、及びアリル等の2〜6個の炭素原子を有するアルケニル炭酸塩；シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシル等の3〜6個の炭素原子を有するシクロアルキル炭酸塩；環上で1又はそれ以上のC1〜6のアルコキシ、又はニトロと任意に置換されている、フェニル、又はベンジル炭酸塩；を含むがこれらに限定されない。他の保護基及び反応条件は、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, (3rd, 1999, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)に開示されている。
【００２０】
アミノ基は、置換されていないか（すなわち、-NH2）、一置換（すなわち、-NHR）か、二置換（すなわち、-NR２）であることに注意すべきである。アミノ基は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキル等の置換基（R）と置換され得る。ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを意味する。
他の特徴又は利点は、以下に示す、いくつかの実施態様の詳細な説明、及び添付した請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
一般式（I）で表わされる化合物を含む医薬組成物は、嚢胞性線維症、COPD、喘息、及び急性又は慢性気管支炎等の肺細胞における疾患の治療に用いられる。嚢胞性線維症は、高ナトリウムイオン吸収及び障害性塩素イオン分泌によって特徴づけられる。変化したイオン移動は、上皮の上の層における液体、又は囲心腔液の量を崩壊し、粘液線毛クリアランスにおいて2〜4倍の減少を引き起こす。結果として、粘液及び壊死組織片は、粘液のさらなる分泌を刺激する気道に蓄積される。粘液のさらなる分泌は、気道の閉塞をもたらす。ENaCと呼ばれる、管腔膜（lumenal membrane）ナトリウムチャンネルは、気道内のナトリウムの吸収を仲介する。塩素イオンの分泌は、CFTRと呼ばれる、管腔膜塩素イオンチャンネルによって媒介される。CFTRをコードする遺伝子内の突然変異は嚢胞性線維症を引き起こす。COPD、喘息、及び急性及び慢性気管支炎は、最終的に障害性粘液線毛クリアランスをもたらす、粘液の過剰分泌によって特徴づけられる。
粘液線毛クリアランスは、薬理学的に調節され得る。薬理学的研究は、ENaCチャンネル遮断薬であるアミロライド、及びENaCを制御するプロテアーゼの阻害剤であるビクニンが、いずれもナトリウム輸送の阻害及び粘液線毛クリアランスの上昇を引き起こすことを示す。
【００２２】
上皮細胞においてナトリウム輸送を阻害する薬剤は、CF、COPD、喘息、及び急性及び慢性気管支炎を含む肺疾患の治療に用いることができる。例えば、CFは、一般式（I）で表わされる化合物を含む医薬組成物で治療することができる。CFの大部分のケースにおける初期欠陥は、小胞体（ER）を排出する変異体CFタンパク質（CFTR）の効率を減少させるので、一般式（I）で表わされる化合物は、ERからのCFタンパク質の輸送、及びゴルジ体によるその成熟を上昇させる効果が評価される。その生合成の間に、CFTRは最初に粗面小胞体内で、約120 kDa（バンドA）の分子量を有する初期ポリペプチド鎖として合成される。それは、ER内で、速やかにコアグリコシル化を受け、約140 kDa（バンドB）の分子量を与える。CFTRがERを出て、ゴルジ体（Golgi stacks）で成熟するにつれ、そのグリコシル化は末端の成熟したグリコシル化が達成するまで行われ、それに約170 kDa（バンドC）の分子量を与える。従って、CFTRがERを出て原形質膜に達するためにゴルジ体に渡る範囲は、バンドCタンパク質に対するバンドBタンパク質の割合において反映される。CFTRは、コントロール細胞、及び試験化合物にさらされた細胞から免疫沈降される。wtCFTR及びΔF508CFTR発現細胞の両方を試験した。細胞溶解に続いて、CFTRを種々のCFTR抗体を用いて免疫沈降させた。次いで、免疫沈降物を、放射性ATP及び外来性プロテインキナーゼＡを用いてインビトロリン酸化反応にかけた。次いで、試料を可溶化し、SDS-PAGEで解析した。次いで、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーにかけ、バイオラッド・パーソナルフィックスイメージステーションに決められたように、バンドB及びCの定量化について蛍光イメージ解析を行った。
【００２３】
一般式（I）で表される化合物は以下のように調製することができる。本発明のカルボン酸含有化合物は、当業界における公知の方法によって調製できる。例えば、Aと-C(=X1)との間に不飽和炭化水素鎖を有する本発明の化合物は、下記図式に示すように調製することができる。
【００２４】
【化４】
2006508986.tif 000003
【００２５】
前記式において、L'は、本発明の化合物において、A及び-CH=CH-の間にある、飽和又は不飽和炭化水素リンカーであり、A及びX1は前述したのと同じ意味である。Coutrotの論文（Syn. Comm. 133-134 (1978)）を参照。簡単に言えば、非常に低い温度（例えば、-65℃）でブチルリチウムを適当量の無水テトラヒドロフラン（THF）に加える。
同様に低い温度で、無水THF中のジエチルホスホン酢酸（diethylphosphonoacetic acid）を有する第２の溶液を、撹拌したブチルリチウム溶液に一滴ずつ加える。得られる溶液を同じ温度で更に30〜45分間撹拌し、無水THF中の芳香族アクリルアルデヒド溶液を1〜2時間以上かけて加える。次いで、反応混合物を室温にまで加温し、一晩撹拌する。次いで、酸性化（例えば、塩酸で）し、有機層を分離させる。次いで、有機層を乾燥し、精製し（例えば、再結晶により）、不飽和カルボン酸を得る。
【００２６】
また、カルボン酸含有化合物は、式A-L'-C(=O)-O- 低級アルキルの酸エステルとオキシ塩化リンとを、グリニャール試薬（例えば、メチルマグネシウムヨーダイド）と共に反応させ、対応するアルデヒドを得、更に酸化させて（例えば、硝酸銀と水酸化ナトリウム水溶液との反応）不飽和カルボン酸を形成する。
他のタイプのカルボン酸含有化合物（例えば、複数の二重結合又は三重結合を有するリンカーを含有する化合物）は、例えば、Parameswaraの論文（Synthesis, 815-818 (1980)）、及びDennyの論文（J. Org. Chem., 27, 3404 (1962)）に記載されたような公表されている方法に従って製造することができる。
次いで、下記図式に従い、カルボン酸含有化合物をヒドロキサム酸含有化合物に変換する。
【００２７】
【化５】
2006508986.tif 000004
【００２８】
カルボン酸を含有する、冷却した（例えば、0〜5℃）無水THF溶液に、トリエチルアミン（TEA）を添加する。次いで、カルボン酸を含有する溶液に、クロロギ酸イソブチル（isobutyl chloroformate）を加え、ヒドロキシルアミン塩酸塩及びTEAを加える。酸性化した後、該溶液をろ過し、所望のヒドロキサム酸を集める。
【００２９】
N-置換ヒドロキサム酸を、上述した方法と同様の方法で調製する。対応するカルボン酸 A-L'-C(=O)-OH を（塩化メチレン及びジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で）塩化オキサリルと反応させることにより、酸塩化物に変換し、次いで、低温（例えば、0〜5℃）でアルカリ媒体（例えば、40％水酸化ナトリウム水溶液）中で、N-置換ヒドロキサム酸塩酸塩（例えば、CH3NHOH・HCl）を酸塩化物と反応させることにより、所望のN-置換ヒドロキサム酸に変換する反応終了させた後、反応混合物を酸性化した後、所望のN-置換ヒドロキサム酸を集める（例えば、2〜3時間）。
【００３０】
X1がSである本発明の化合物としては、Sandler, S. R.及びKaro, W.の論文（Organic Functional Group Preparations, Volume III (Academic Press, 1972) 436-437頁）に記載された方法に従って調製することができる。X2が -N(Rc)OH- であり、X1がSである本発明の化合物の調製方法については、米国特許明細書第5,112,846号、第5,075,330号、及び第4,981,865号を参照のこと。
【００３１】
α-ケト酸部分を含有する本発明の化合物（例えば、X1が酸素であり、X2が-C(=O)OM、又は A-L'-C(=O)-C(=O)-OM であり、A及びL'は前述した通りであり、Mが水素、低級アルキル又はK+等の陽イオンである）は、Schummerの論文（Tetrahedron, 43, 9019 (1991)）に記載された方法で調製することができる。簡単に言えば、製造は関連するアルデヒド含有化合物（例えば、A-L'-C(=O)-H）で開始し、低温（例えば、0〜5℃）で、塩基性条件下（水酸化カリウム／メタノール）で、ピルビン酸と反応させる。反応混合物を室温にまで加温することにより、所望の生成物（カリウム塩の形態で）が形成される。
（チオ）ヒドロキサム酸又はα-キトサン対応物と同様、前述した化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害特性を有する。
【００３２】
本発明の化合物の製造中に、副生成物の製造を回避するために、適当な保護基が必要であるかもしれないことに注意する。例えば、リンカーL'はアミノ置換基を含み、ブチルリチウム等の試薬と処理する前に、トリフルオロアセチル又はtert-ブトキシカルボニル等の適当なアミノ保護基によって先ず保護される。他の適当な保護基については、例えば、上述した、T. W. Greeneの論文を参照。
上述した方法によって製造された化合物は、フラッシュカラムクロマトグラフィー、分離用高速液体クロマトグラフィー、又は結晶化によって精製される。
【００３３】
有効量は、治療される患者に治療効果を与えるのに必要な量として定義され、一般的には、年齢、表面積、体重、及び患者の状態によって決定される。動物及び人間の投与量（体表面の1 m2あたりのmgに基づく）の相互関係は、Freireichの論文（Cancer Chemother. Rep. 50, 219 (1966)）に記載されている。体表面積は、患者の身長及び体重からだいたい決定することができる。例えば、Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals（Ardsley, New York, 1970, 537）を参照。そこに記載された化合物の有効量は、約1 mg／kg〜約300 mg／kgの範囲である。当業界で認識されているように、有効投与量は、投与径路、賦形剤の使用に依存して変動する。
【００３４】
医薬組成物は、非経口的に、例えば、経口、局所的、皮下、腹腔、筋肉注射、静脈注射、又は吸入によって投与される。非経口的剤形の具体例は、等張食塩水、5％グルコース、又は周知の他の薬学的に許容される賦形剤中の活性薬剤の水溶液を含む。シクロデキストリン、又は当業界に周知の薬学的賦形剤が、治療化合物の配達用の薬学的賦形剤として使用することができる。本明細書に開示する化合物のいくつかは水溶性に限界があるので、化合物の溶解性を改善するために可溶化剤が組成物中に含有される。例えば、化合物はポリエトキシル化ひまし油（Cremophor EL（登録商標））中に溶解され、例えばエタノール等の他の溶媒を含有する。更に、本明細書に記載された化合物はリポソーム中に包括される。
【００３５】
本明細書に開示された化合物は、通常の方法を用いて他の投与径路の剤形に製剤化される。例えば、カプセル剤、ゲルシール、経口投与用錠剤に製剤化される。カプセル剤は、ゼラチン又、はセルロース等の標準的な薬学的に許容される材料を含有してもよい。錠剤は、固体キャリア及び滑沢剤と共に本明細書の化合物を圧縮することによって通常の方法に従って製剤化することができる。固体キャリアの具体例は、澱粉及びベントナイトを含む。本発明の化合物は、ハードシェル錠剤、又は、例えば、ラクトース、又はマンニトール、通常の賦形剤、及びタブレッティング剤（tabletting agent）等のバインダーを含むカプセルの形態で投与される。また、前記化合物はナノパーティクル、リポソーム、又は吸入用に適した他の製剤で投与される。
【００３６】
本明細書に開示された化合物の毒性は、一般式（I）で表わされる化合物を、試験マウスへの単一投与量の腹腔内投与によって評価することができる。試験マウス及び無処置コントロールの３つの群に、予め決められた投与量の化合物を投与し、死亡／病的状態のチェックを行った。体重及び全体の剖検所見を観察する。参考のために、Gad, S. C. (ed.), Safety Assessment for Pharmaceuticals (Van Nostrand Reinhold, New York, 1995)を参照。
さらなる推敲なしに、本明細書の記載に基づき、当業者は、その最も完全な範囲に対して本発明を利用することができると信じられる。従って、以下の、種々の化合物の合成、スクリーニング及び生物学的試験を描写する実施例は単に例示であり、開示の残余を少しも限定するものではない。本明細書に記載される刊行物は、それらの全てにおいて本明細書に引用されたものとする。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
（7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエン酸の合成）
冷却した（0〜55℃）927 mLの1 M濃度の臭化フェニルマグネシウムのテトラヒドロフラン溶液に、130 mLの無水エーテル中のクロトンアルデヒド（65.0 g）の溶液を、2時間45分かけて滴下した。更に45分撹拌して反応を行い、次いで室温にまで加温した。4時間以上撹拌した後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（750 mL）を加えた。混合物を750 mLのエーテルで2回抽出した。一緒にした抽出物を無水炭酸カリウムで乾燥してろ過した。溶媒を蒸発させ、所望の1-フェニル-2-ブテン-1-オールをオイル状として135.88 g（99.9％）得、さらなる精製なしで次のステップに用いた。
【００３８】
1-フェニル-2-ブテン-1-オール(135.88 g)を2300 mLのジオキサンに溶解し、室温で2750 mLの希塩酸（2.3 mLの濃塩酸を2750 mLの水に溶解）で処理した。混合物を一晩撹拌し、次いで4333 mLのエーテルに注ぎ、2265 mLの飽和炭酸水素ナトリウムにより中和した。水相を1970 mLのエーテルで抽出した。一緒にした抽出物を無水炭酸カリウムで乾燥した。30℃、30分のクゲロー(Kugelrohr)蒸留による溶媒の蒸留は、所望の4-フェニル-3-ブテン-2-オールをオイル状として131.73 g（96.8％）与え、さらなる精製なしで次のステップに用いた。
【００３９】
ジメチルホルムアミド（DMF、無水、14 mL）を0〜5℃に冷却し、オキソ塩化リン（8.2 mL）を40分以上かけて滴下して加えた。得られた溶液を、冷却した（0〜5℃）、4-フェニル-3-ブテン-2-オール（10 g）の無水DMF溶液（32 mL）に１時間以上かけて滴下して加えた。反応混合物を35分以上かけて室温にまで加温し、次いで、45分以上かけて徐々に80℃に加熱した。80℃で３時間撹拌して反応させ、次いで0〜5℃に冷却した。冷却した反応溶液に、酢酸ナトリウム（40 g）の脱イオン水溶液（100 mL）を１時間以上かけて滴下して加えた。混合物を再度80℃に加熱し、80℃で更に10分間撹拌し、室温にまで冷却し、エーテル（100 mL）で２回抽出した。一緒にした抽出液を食塩水（100 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して真空下で濃縮し、所望の5-フェニル-2,4-ペンタジエナールを液体状として8.78 g得、さらなる精製なしで次のステップに用いた。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz), δ(ppm) 7.51 (m, 2H), 7.37 (m, 3H), 7.26 (m, 1H), 7.01 (m, 2H), 6.26 (m, 1H)
【００４０】
ブチルリチウム（2.5 N溶液、12.8 mL）を65 mLの無水テトラヒドロフラン（THF）に-65℃で加えた。ジエチルホスホン酢酸（2.92 g）の無水THF溶液（25 mL）を-65℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を-65℃で更に30分間撹拌し、次いで、5-フェニル-2,4-ペンタジエナール（2.4 g）の無水THF溶液（15m L）を-65℃で反応溶液に加えた。反応溶液を１時間撹拌し、室温にまで加温し、次いで一晩撹拌した。反応溶液に30 mLの水を加え、5％塩酸（14 mL）で酸性化してpH 4.7とし、次いで更に20 mLの水を加えた。水層を10 mLのエーテルで2回、10 mLの酢酸エチルで1回抽出した。一緒にした有機層抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して真空下で濃縮した。粗精製した材料を50 mLの熱メタノールに溶解し、次いで一晩冷却した。形成された結晶をろ過し、真空下で乾燥して所望の7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエン酸を2.4 g得た。
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz), δ(ppm) 7.52 (m, 2H), 7.33 (m, 4H), 7.06 (m, 1H), 6.86 (m, 2H), 6.58 (m, 1H), 5.95 (d, 1H)
【００４１】
（実施例２）
（5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸の合成）
トリエチルアミン（TEA、29 mL）を、冷却した(0〜5℃)5-フェニル-2,4-ペンタジエン酸（29.0 g）の無水ジエチルフォルムアミド溶液（300 mL）に加えた。この溶液に、クロロギ酸イソブチル（27.0 mL）を滴下して加えた。反応混合液を１５分間撹拌し、ヒドロキシルアミン塩酸塩（28.92 g）を加え、58 mLのTEAを0〜5℃で一晩かけて滴下して加えた。反応溶液を室温にまで加温し、一晩撹拌した。反応溶液を、450 mLの1％（重量％）クエン酸溶液に加え、200 mLの塩化メチレンで２回、次いで、500 mLのエーテルで抽出した。溶媒を真空下、除去しオイルを得た。粗精製のオイルを200 mLの熱アセトニトリルで結晶化し、黄褐色の固体を得た。黄褐色固体を60 mLの熱アセトニトリルで再結晶し、所望の5-フェニル-2,4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸を12.5 g得た。
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz), δ(ppm) 7.56 (d, 2H), 7.31 (m, 4H), 7.03 (m, 2H), 6.05 (s, 1H)
【００４２】
（実施例３）
（7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸の合成）
トリエチルアミン（TEA、24.1 mL）を、冷却した（0〜5℃）7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエン酸（27.8 g）の無水ジエチルホルムアミド溶液（280 mL）に加えた。この溶液に、クロロギ酸イソブチル（22.5 mL）を75分以上かけて滴下して加えた。反応混合物を40分間撹拌し、ヒドロキシルアミン塩酸塩（24.2 g）を加え、0〜5℃で70分以上かけて40 mLのTEAを滴下して加えた。反応混合物を室温にまで加温し、一晩撹拌した。室温で撹拌した反応混合物に、280 mLの1％（重量％）クエン酸溶液、次いで1050 mLの水を加えた。反応混合物を30分間撹拌し、次いでろ過した。ろ過した固まりを水（200 mL）で洗浄し、真空下で乾燥し、所望の7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸を20.5 g得た。
1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz), δ(ppm) 7.48 (m, 2H), 7.32 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 7.01 (m, 1H), 6.75 (m, 2H), 6.51 (m, 1H), 5.93 (d, 1H)
【００４３】
（実施例４）
（嚢胞性線維症スクリーニングアッセイ）
前述したように、その生合成の間、CFTRは最初に粗面小胞体（ER）内で、約120 kDa（バンドA）の分子量を有する初期ポリペプチドとして合成される。ERで急速にコアグリコシル化を受け、約140 kDa（バンドB）の分子量となる。ERを出てゴルジ体で成熟するにつれ、そのグリコシル化は末端の成熟グリコシル化を達成し、約170 kDa（バンドC）の分子量を与える。CFTRがERを出て原形質膜に達するためにゴルジ体を横断する範囲は、バンドCタンパク質に対するバンドBの割合に反映される。CFTRは、コントロール細胞、及び試験化合物にさらされた細胞から免疫沈降される。wtCFTR及びΔF508CFTRの両方の発現細胞が試験された。溶解後、CFTRを、種々のCFTR抗体を用いて免疫沈降させた。次いで、免疫沈降物を、放射活性ATP及び外来性プロテインキナーゼＡを用いたインビトロリン酸化反応にかけた。次いで、試料を可溶化し、SDS-PAGEで解析した。次いで、ゲルを乾燥して、BioRadパーソナルフィックスイメージステーションにより測定されるように、バンドB及びＣの定量のために、オートラジオグラフィー、及び蛍光体画像解析にかけた。
【００４４】
（細胞培養）
wt及びΔF508CFTRを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を本アッセイに用いた。培養は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で、100 mmのプラスチック細胞皿（cel dish）上で行い、5％CO2／95％ O2で37℃に維持した。細胞を密集するまで培養し、3〜5日のポストプレイティングに用いた。一般式（I）で表わされる化合物を、解析の24時間前に細胞に加えた。
【００４５】
（免疫沈降）
細胞を、試験化合物、及びBradburyらの論文（Am. J. Physiol. 276, L659-668 (1999)）に記載されたように免疫沈降したCFTRと処理した。簡単に言えば、処理した細胞を、1％ TRITON X-100及び種々のプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで溶解した。Rドメイン及びC-末端に対するモノクローナル抗体を用いて可溶性物質を免疫沈降させた。次いで、免疫沈降したCFTRを、cAMP依存PKA触媒サブユニット及び[γ-32P]ATPを用いたインビトロリン酸化にかけ、次いでSDS-PAGEゲルで解析した。固定した後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィー及び蛍光体画像解析を行った。B及びCバンドの定量を、BioRadパーソナルフィックスイメージステーションにより測定した。
【００４６】
本発明の化合物（100μMで）は、処理していない細胞と比較して、処理した細胞内でバンドB及びCの濃度に有意な変化を示さないことがわかった。前記試験化合物を用いて得られた結果に基づき、野生型CFTRの発現について試験化合物の著しい効果はなかった。ΔF508CFTR CHO細胞のバンドCの解析は、野生型細胞と比較し、ΔF508細胞に非常に少ないバンドCが存在することを示した。前記細胞の37℃における100μM濃度の試験化合物への24時間の露出は、野生型及びΔF508CFTR発現細胞のいずれにおいてもバンドC CFTRの濃度に影響を及ぼさなかった。対照的に、ΔF508細胞におけるバンドB CFTRの解析は、100μMの試験化合物が、試験化合物にさらされていないΔF508細胞に比較してバンドBの濃度を有意に増加させる（約6〜7倍）ことを示した。データを表1に示す。
【００４７】
【表１】
2006508986.tif 000005
【００４８】
（実施例５）
（嚢胞性線維症スクリーニングアッセイ）
wt及びΔF508CFTRを発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を本アッセイに用いた。培養は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で、10 mmのプラスチック細胞皿（cel dish）上で行い、5％ CO2／95％ O2で37℃に維持した。細胞を密集するまで培養し、3〜5日のポストプレイティングに用いた。全ての試験化合物を、解析の24時間前に細胞に加えた。
ほとんどの研究のために、一般式（I）で表わされる化合物を細胞に７２時間接触させ、新鮮な培地及び薬物を24時間毎に接触させた。一般式（I）で表わされる化合物はDMSOに20 mM濃度で溶解して貯蔵した。
【００４９】
ΔF508CFTRを安定に形質導入されたCHO細胞は、わずかなバンドBを示し、バンドC CFTRは示さなかった。コントロールとして、ブチル化ナトリウム（5 mM）はバンドBの増加を示し、バンドCについては識別し得る増加を示さなかった。60μM濃度における7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、バンドBのわずかな増加を示し、バンドCは変化を示さなかった。100μM濃度では、バンドBの量は増加し、バンドCは変化がなかった。同様に、60μMの5-フェニル-2,4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸はバンドBを増加させたがバンドCは増加させず、100μMの5-フェニル-2,4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸はバンドBにおいては比例した増加を与えた。
【００５０】
CFTRの免疫ブロット解析は、全細胞CFTR含有量の変化を示すが、CFTRにおける、このような変化が細胞表面の発現における変化によって影響されるかどうかには影響しない。細胞表面の発現を評価するために、細胞表面のビオチン化プロトコールが用いられた。バンドB CFTRについてのわずかなバンドは野生型CFTRについての細胞表面において検出された。全細胞性CFTRにおける明瞭な変化にもかかわらず、低温又は酪酸塩に対するCHO細胞の露出は、細胞表面CFTRに取るに足らない影響を及ぼした。対照的に、5-フェニル-2,4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸及び7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、細胞表面でのCFTRの発現量について濃度依存的増加を示した。バンドB CFTRの増加のみが観察された。7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は全CFTR濃度の増加する効果を示した。5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸は、細胞表面CFTR発現における増加する効果を示した。5-フェニル-2，4-ペンタジエノイルヒドロキサム酸及び7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、細胞性CFTR、及び細胞表面におけるCFTRの発現を増加させる。
【００５１】
（実施例６）
（気管支上皮細胞電解質輸送）
5人の嚢胞性線維症（CF）患者及び5人のCFでない患者から得られた、ヒト気管支上皮（HBE）細胞を用いて研究を行った。プロトコールは、Devor, D. C.らの論文（“Pharmacological modulation of ion transport across wild-type and DeltaF508 CFTR-expressing human bronchial epithelia”, Am. J. Physiol. 279: C461-C479, (2000)）に記載されている。
細胞を単離し、短絡電流増幅率（Isc）研究のためにフィルター上で増殖させた。細胞を修飾ウッシングチャンバーに取り付け、Iscを観察した。アミロライド（10μM）に応じたIscの変化は、20分間の平衡の後に、ある程度のネット起電性のあるナトリウムの輸送としてとらえられた。フォルスコリン（2μM）、UTP（100μM）及びゲニステイン（30μM）を、陰イオン分泌を促進するために用いた。6〜12の同様な実験の結果が得られた。
【００５２】
7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸を培養液に加え、細胞を24、48及び72時間インキュベートした。24時間毎に細胞に、化合物を含む新鮮な培地を与えた。コントロール細胞は、当量の媒体（DMSO）を受けた。また、短絡電流の測定は、CFTRが仲介するメカニズムによって塩化物を分泌する、ヒト結腸上皮細胞であるT84細胞、及びENacが仲介するメカニズムによってナトリウムを吸収する、マウス腎臓細胞であるM1細胞上で行われた。
【００５３】
表2に、30μMの7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸で72時間処理したCF  HBE細胞のコントロール（未処理）細胞に対する結果をまとめた。起電性ナトリウム輸送は、アミロライド（5μM）に感受性のある短絡電流から評価された。患者１についてのCFTR遺伝子型は、異型接合性の、AAを欠くΔF508−CFTR／2183＞ＧCFTR（ΔF508-CFTR／2183deleteAA＞GCFTR）であり、患者2〜5についてのCFTR遺伝子型は、同型接合性の、ΔF508−CFTR／ΔF508−CFTRであった。いずれのケースにおいても、7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、ナトリウム輸送における実質的な阻害を引き起こした。例えば、7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、異型接合性の患者１のAAを欠くΔF508−CFTR／2183＞ＧCFTRから由来する細胞においてはナトリウム輸送において53％の阻害を引き起こし、同型接合性の患者2のΔF508−CFTRから由来する細胞においては100％の阻害を引き起こした。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸によるナトリウム輸送の阻害は、11.9μM±3.31μMの最大半減阻害濃度（n=各72時間処理される6個のフィルターを有する患者数3）において濃度依存的である。また、ナトリウム輸送の阻害は、24時間の処理で最大半減阻害を有し、時間依存的であり、48及び72時間で完全な阻害を示す。ウッシングチャンバーに直接加えられる時、7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、90分を超える阻害の間、ナトリウム輸送に影響を及ぼさなかった（T90 67±1.5μA／cm2に対して、T0 Isc 46±3.6μA／cm2 、n=3）。7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、経上皮電気抵抗を変化させなかった（処理は、544±23.1Ωcm2に対して、コントロールが537±17.8Ωcm2 、n =18である。）。
【００５６】
コントロール実験は、T84細胞及びＭ１細胞で行った。T84細胞は、CFTRが仲介するメカニズムを経て、cAMPに応じて塩化物を分泌する。7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、72時間の処理（処理が102±11μA／cm2に対して、コントロールが102±10μA／cm2、n=3）の後も、ウッシングチャンバー内における90分の露出の後も、塩化物の分泌に影響を及ぼさなかった。M1細胞は、ENaCが仲介するメカニズムによってナトリウムを吸収する。7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、M1細胞におけるナトリウム輸送に影響を及ぼさなかった。
【００５７】
３種類の参考化合物の影響についても評価を行った。強力なヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、トリコスタチン（低nMKi）は、3 nM、30 nM及び100 nMでナトリウム輸送に影響を及ぼさなかったが、72時間処理したHBE細胞においては、1μMにおいて有意な程度の阻害（84％）を引き起こした。100μMまでの濃度及び72時間の7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエン酸による処理は、CF HBE細胞においてナトリウム輸送又は陰イオン分泌に影響を及ぼさなかった。4-フェニルブチレート（1〜3 mM）は、24〜72時間でナトリウム輸送を3倍上昇させた。4-フェニルブチレートは、CF HBE細胞において陰イオン分泌を上昇させなかった。
【００５８】
表３に、COPD患者から由来する非−CF細胞を、30μMの7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸で72時間処理した結果をまとめた。起電性ナトリウム輸送は、アミロライド（5μM）に感受性のある短絡電流から評価された。陰イオン分泌は、アミロライドを添加した後に、フォルスコリン（2μM）で刺激された短絡電流から評価された。30μMの7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸による72時間の細胞の処理は、約80％のアミロライド感受性ナトリウム輸送の阻害を引き起こした。この効果は、13μM±3μMの最大半減阻害濃度、及び24時間における最大半減阻害を有する、濃度及び投与量に依存的であった。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
トリコスタチン（1μM）はナトリウム輸送を70％阻害した。7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエン酸は、非−CF HBE細胞において、ナトリウム輸送及び陰イオン分泌について影響を及ぼさなかった。4-フェニルブチレートは、ナトリウム輸送において3倍の上昇、陰イオン分泌において2倍の上昇を引き起こした。
【００６１】
前述の結果は、ナトリウムイオン輸送を阻害する有効量のオキシアミド結合を含む化合物が、肺性上皮細胞においてナトリウム輸送を減少するために用いることができ、嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、及び急性及び慢性気管支炎を含む気道の疾患を治療するために用いることができることを示す。予想外にも、7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸が、腎臓のナトリウム輸送における望ましくない効果を有することなく、インビトロにおいて気道におけるナトリウム輸送を阻害するために用いることができる。7-フェニル-2，4，6-ヘプタトリエノイルヒドロキサム酸は、全身的に送達されるか、例えば少なくとも10μMの血漿中濃度を少なくとも24時間持続するように気道疾患の治療のために吸入によって送達され、例えば、6時間毎に投与される。トリコスタチン（例えば、1μM）、SAHA、又は他のオキシアミド含有化合物も、肺性上皮細胞におけるナトリウム輸送を減少し、気道疾患を治療するために用いることができる。
【００６２】
（他の態様）
前記の説明から、当業者は容易に、そして、それの趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の基本的特徴が、本発明の種々の改変及び変更態様を様々な使用および状況に適応させるために実行可能なことを確認することができる。従って、他の実施例もまた、請求項の範囲内である
【国際調査報告】
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