(57)【要約】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を抑制する新規の種類の化合物、ならびにこれらの化合物を同定するためのアプローチの発見に関する。特に、酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミドおよび合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミドがヒト血清中のＨＩＶの複製を抑制する、ということが見出された。実施形態は、ＨＩＶを抑制する修飾グリシンアミド化合物の同定方法、修飾グリシンアミド化合物の単離および合成方法、ならびにこれらの化合物を含む治療用組成物を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製の抑制方法であって、以下の：
ＨＩＶの複製を抑制する作用物質を必要とする患者を特定すること、
ＨＩＶの複製を抑制するのに十分な量の修飾グリシンアミドを前記患者に提供すること
とを含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製の抑制方法。
【請求項２】
前記修飾グリシンアミドが陽イオン交換で分離されたグリシンアミドの高速ピーク中に存在する化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリシンアミドが分離前に血清、血漿または細胞抽出物とともにインキュベートされる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血清がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血漿がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＶの複製を抑制するのに十分な量の修飾グリシンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な担体を含む製剤。
【請求項７】
ＨＩＶの複製を抑制する分子の単離方法であって、以下の：
グリシンアミドを用意すること、
高速ピークを分離するのに十分な時間、陽イオン交換カラム上で前記グリシンアミドを分離すること、
前記高速ピークを得ること
とを含む方法であって、それらの工程により前記高速ピークがＨＩＶの複製を抑制する前記分子を含む、ＨＩＶの複製を抑制する分子の単離方法。
【請求項８】
前記グリシンアミドが分離前に血清または血漿とともにインキュベートされる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記血清がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血漿がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法により得られるＨＩＶの複製を抑制する分子を含む製剤。
【請求項１２】
ＨＩＶの複製を抑制する分子の同定方法であって、以下の：
グリシンアミドを用意すること、
高速ピークを分離するのに十分な時間、陽イオン交換クロマトグラフィーにより前記グリシンアミドを分離すること、
前記クロマトグラフィー後に前記高速ピークを得ること、
前記高速ピークに存在する分子のＨＩＶの複製を抑制する能力を測定すること
とを含む、ＨＩＶの複製を抑制する分子の同定方法。
【請求項１３】
前記グリシンアミドが分離前に血清または血漿とともにインキュベートされる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血清がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記血漿がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法により同定されるＨＩＶの複製を抑制する分子。
【請求項１７】
グリシンアミドを修飾グリシンアミドに転化する補因子の同定方法であって、以下の：
補因子の供給源を用意すること、
サイズ排除クロマトグラフィーにより前記補因子の供給源を分離すること、
分離された前記補因子の供給源の分画のグリシンアミドを修飾グリシンアミドに転化する能力を測定すること
とを含む、グリシンアミドを修飾グリシンアミドに転化する補因子の同定方法。
【請求項１８】
前記補因子の供給源が血清または血漿である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血清がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血漿がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法により同定される補因子。
【請求項２２】
分離された前記補因子の供給源のＨＩＶを抑制する能力を測定することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
分離された前記補因子の供給源のＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する能力を測定することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
グリシンアミドを修飾グリシンアミドに転化する補因子の単離方法であって、以下の：
補因子の供給源を用意すること、
サイズ排除クロマトグラフィーにより前記補因子の供給源を分離すること、
Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化し、または熱不活性化血清のＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する能力を回復し、またはＧ−ＮＨ2の熱不活性化血清中でＨＩＶの複製を抑制する能力を回復する、分離された前記補因子の供給源の分画を得ること
とを含む、グリシンアミドを修飾グリシンアミドに転化する補因子の単離方法。
【請求項２５】
前記補因子の供給源が血清または血漿である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血清がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血漿がウシ、イヌ、ネコ、ウマ、サルおよびブタから成る群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の方法により得られる補因子。
【請求項２９】
分離された前記補因子の供給源の分画がＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
分離された前記補因子の供給源の分画が熱不活性化血清のＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する能力を回復する請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
分離された前記補因子の供給源の分画が熱不活性化血清のＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する能力を回復する請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
分離された前記補因子の供給源の分画がＧ−ＮＨ2の熱不活性化血清中でのＨＩＶの複製を抑制する能力を回復する請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
活性成分として、他の活性成分とともにまたは伴わずに、式Ａ：
【化１】
2006518373.tif 000037
（式中、
ａ）Ｅは、酸素、硫黄およびＮＲ7から成る群から選択され、
ｂ）Ｔは、酸素、硫黄およびＮＲ8から成る群から選択され、
ｃ）Ｒ1〜Ｒ8は、各々独立して、水素；任意置換アルキル；任意置換アルケニル；任意置換アルキニル；任意置換シクロアルキル；任意置換へテロシクリル；任意置換シクロアルキルアルキル；任意置換へテロシクリルアルキル；任意置換アリール；任意置換へテロアリール；任意置換アルコキシアルキル；任意置換ペルハロアルキル；ならびにシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナート、チオシアナート、イソチオシアナート、ニトロ、シリル、トリハロメタンスルホニル、およびそれらの保護化誘導体で任意に置換されるアルキルカルボニルから成る群から選択される）
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルを含む製剤または薬剤であって、前記化合物がＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含まれる、製剤または薬剤。
【請求項３４】
Ｅが酸素である請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項３５】
Ｔが酸素である請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項３６】
前記ヘテロシクリルが、テトラヒドロチオピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、１，３−ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキシン、１，４−ジオキサン、ピペラジン、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダン
トイン、ジヒドロウラシル、モルホリン、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、ピロリドン、ピロリジオン、ピラゾリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、１，３−ジオキソール、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、イソキサゾリン、イソキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジンおよび１，３−オキサチオランから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項３７】
前記へテロアリールが、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、ピロール、ピリジン、インドール、オキサゾール、ベンズオキサゾール、イソキサゾール、ベンズイソキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、インダゾール、テトラゾール、キノリン、イソキノリン、ピリダジン、ピリミジン、プリン、ピラジン、フラザン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、プテリジン、フェノキサゾール、オキサジアゾール、ベンゾピラゾール、キノリジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリンおよびキノキサリンから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項３８】
前記アリールが、フェニル、ナフタレニル、フェナントレニル、アントラセニル、テトラリニル、フルオレニル、インデニルおよびインダニルから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項３９】
前記シクロアルキルが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロペンタジエン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプテンから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項４０】
Ｒ1が、水素；Ｃ1-6アルキル；Ｃ2-6アルケニル；Ｃ2-6アルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル；Ｃ3-8ヘテロシクリル；シクロアルキル（Ｃ1-6）アルキル；へテロシクリル（Ｃ1-6）アルキル；アリール；へテロアリール；（Ｃ1-6）アルキルカルボニル；（Ｃ1-6）アルコキシ（Ｃ1-6）アルキル；およびペルハロ（Ｃ1-6）アルキルから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項４１】
前記アルキルが、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルから成る群から選択される請求項４０に記載の製剤または薬剤。
【請求項４２】
Ｒ1が水素である請求項４０に記載の製剤または薬剤。
【請求項４３】
Ｒ2が、水素；Ｃ1-6アルキル；Ｃ2-6アルケニル；Ｃ2-6アルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル；Ｃ3-8ヘテロシクリル；シクロアルキル（Ｃ1-6）アルキル；へテロシクリル（Ｃ1-6）アルキル；アリール；へテロアリール；（Ｃ1-6）アルキルカルボニル；（Ｃ1-6）アルコキシ（Ｃ1-6）アルキル；およびペルハロ（Ｃ1-6）アルキルから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項４４】
前記アルキルが、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルから成る群から選択される請求項４３に記載の製剤または薬剤。
【請求項４５】
Ｒ2が水素である請求項４３に記載の製剤または薬剤。
【請求項４６】
Ｒ3−Ｒ6が、各々独立して、水素；Ｃ1-6アルキル；Ｃ2-6アルケニル；Ｃ2-6アルキニ
ル；Ｃ3-8シクロアルキル；Ｃ3-8ヘテロシクリル；シクロアルキル（Ｃ1-6）アルキル；へテロシクリル（Ｃ1-6）アルキル；アリール；へテロアリール；（Ｃ1-6）アルキルカルボニル；（Ｃ1-6）アルコキシ（Ｃ1-6）アルキル；およびペルハロ（Ｃ1-6）アルキルから成る群から選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項４７】
前記アルキルが、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルから成る群から選択される請求項４６に記載の製剤または薬剤。
【請求項４８】
Ｒ3−Ｒ6が水素である請求項４６に記載の製剤または薬剤。
【請求項４９】
Ｒ7およびＲ8が、各々独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択される請求項３３に記載の製剤または薬剤。
【請求項５０】
Ｒ7およびＲ8が水素である請求項４９に記載の製剤または薬剤。
【請求項５１】
活性成分として、他の活性成分とともにまたは伴わずに、式Ｂ：
【化２】
2006518373.tif 000038
（式中、Ｒ1は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、ベンジル基、あるいはアルキル基またはアルキル基と芳香族基で置換されるシリル基であり、そしてＲ2は水素原子またはアミノ保護基、またはその塩である）
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルを、ＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含む製剤または薬剤。
【請求項５２】
活性成分として、他の活性成分とともにまたは伴わずに、式Ｃ：
【化３】
2006518373.tif 000039
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルを、ＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含む製剤または薬剤。
【請求項５３】
活性成分として、他の活性成分とともにまたは伴わずに、式Ｆ：
【化４】
2006518373.tif 000040
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルを、ＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含む製剤または薬剤。
【請求項５４】
ＨＩＶの複製の抑制方法であって、請求項３３、５１、５２または５３に記載の製剤または薬剤を提供することを含む方法。
【請求項５５】
ＨＩＶの複製の抑制方法であって、以下の：
ＨＩＶの複製を抑制する作用物質を必要とする患者を特定すること、
前記患者に請求項３３、５１、５２または５３に記載の製剤または薬剤を提供すること
とを含む方法。
【請求項５６】
ＨＩＶに感染した患者におけるＨＩＶの複製の抑制方法であって、以下の：
このような治療を必要とする患者を特定すること、
前記患者に請求項３３、５１、５２または５３に記載の製剤または薬剤を投与すること
とを含む方法。
【請求項５７】
ＨＩＶに感染した患者におけるＨＩＶの複製の抑制方法であって、以下の：
前記患者に請求項３３、５１、５２または５３に記載の製剤または薬剤を投与すること、
ＨＩＶ複製の抑制を測定すること
とを含む方法。
【請求項５８】
α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体、ジグリシンアミドエーテル、α−メトキシグリシンアミドまたはα−エトキシグリシンアミドを含む製剤。
【請求項５９】
α−ヒドロキシグリシンアミドを含む請求項５８に記載の製剤。
【請求項６０】
α−ペルオキシグリシンアミド二量体を含む請求項５８に記載の製剤。
【請求項６１】
ジグリシンアミドエーテルを含む請求項５８に記載の製剤。
【請求項６２】
α−メトキシグリシンアミドを含む請求項５８に記載の製剤。
【請求項６３】
α−エトキシグリシンアミドを含む請求項５８に記載の製剤。
【請求項６４】
ＨＩＶ複製を抑制するためのα−ヒドロキシグリシンアミドの使用。
【請求項６５】
ＨＩＶの抑制の薬剤を調製するためのα−ヒドロキシグリシンアミドの使用。
【請求項６６】
ＨＩＶ複製を抑制するためのα−ペルオキシグリシンアミド二量体の使用。
【請求項６７】
ＨＩＶの抑制の薬剤を調製するためのα−ペルオキシグリシンアミド二量体の使用。
【請求項６８】
ＨＩＶ複製を抑制するためのジグリシンアミドエーテルの使用。
【請求項６９】
ＨＩＶの抑制の薬剤を調製するためのジグリシンアミドエーテルの使用。
【請求項７０】
ＨＩＶ複製を抑制するためのα−メトキシグリシンアミドの使用。
【請求項７１】
ＨＩＶの抑制の薬剤を調製するためのα−メトキシグリシンアミドの使用。
【請求項７２】
ＨＩＶ複製を抑制するためのα−エトキシグリシンアミドの使用。
【請求項７３】
ＨＩＶの抑制の薬剤を調製するためのα−エトキシグリシンアミドの使用。
【請求項７４】
活性成分として、他の活性成分とともにまたは伴わずに、式Ｅ：
【化５】
2006518373.tif 000041
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルを、ＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含む製剤または薬剤。
【請求項７５】
活性成分として、他の活性成分とともにまたは伴わずに、式Ｆ：
【化６】
2006518373.tif 000042
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミドまたはエステルを、ＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含む製剤または薬剤。
【請求項７６】
ＨＩＶの複製の抑制方法であって、請求項７４または７５の薬剤を提供することを含む方法。
【請求項７７】
ＨＩＶに感染した患者におけるＨＩＶの複製の抑制方法であって、以下の：
ＨＩＶの複製を抑制する作用物質を必要とする患者を特定すること、
請求項７４または７５に記載の薬剤を前記患者に投与すること
とを含む方法。
【請求項７８】
ＨＩＶに感染した患者におけるＨＩＶの複製の抑制方法であって、以下の：
このような治療を必要とする患者を特定すること、
請求項７４または７５に記載の薬剤を前記患者に投与すること
とを含む方法。
【請求項７９】
ＨＩＶに感染した患者におけるＨＩＶの複製の抑制方法であって、以下の：
請求項７４または７５に記載の薬剤を前記患者に投与すること、
ＨＩＶ複製の抑制を測定すること
とを含む方法。
【請求項８０】
塩酸α−ヒドロキシグリシンアミドの製造方法であって、以下の：
メタノール中でグリオキシル酸一水和物を反応させることによりメチルグリオキシレートヘミアセタールを調製すること、
前記メチルグリオキシレートヘミアセタールをｔｅｒｔ−ブチルカルバメートと反応させて、それによりメチルＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシネートを生成させること、
前記メチルＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシネートをアンモニアと反応させて、それによりＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシンアミドを生成させること、
塩酸とジオキサン中で前記Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシンアミドを反応させて、それにより塩酸α−ヒドロキシグリシンアミドを生成させること
とを含む、塩酸α−ヒドロキシグリシンアミドの製造方法。
【請求項８１】
α−メトキシグリシンアミドの製造方法であって、以下の：
グリオキシル酸一水和物と９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルカルバメートを反応させることによりメチルＮ−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−α−メトキシグリシネートを調製すること、
前記メチルＮ−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−α−メトキシグリシネートをアンモニアおよびモルホリンと反応させて、それによりα−メトキシグリシンアミドを生成させること
とを含む、α−メトキシグリシンアミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を抑制する新規の種類の薬剤が発見された。ＨＩＶの複製を抑制するグリシンアミドの代謝産物を同定するためのいくつかの方法が記載される。実施形態は、修飾グリシンアミド化合物を同定し、合成する方法、および修飾グリシンアミド化合物を含む組成物を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ヒトに感染し、そして後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレンチウイルスに与えられた名称である。ＨＩＶは、少なくとも９つの遺伝子を含有する複合レトロウイルスである。それぞれｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれるウイルス構造遺伝子は、それぞれ、ウイルスコアタンパク質、逆転写酵素およびウイルスエンベロープのウイルス糖タンパク質をコードする。残りのＨＩＶ遺伝子は、ウイルス複製に関与するアクセサリー遺伝子である。ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子はポリタンパク質をコードし、即ちこれらの遺伝子の各々から合成されるタンパク質は、翻訳後にいくつかのより小さいタンパク質に切断される。
【０００３】
ＨＩＶの全体的形状は球形であるが、しかしヌクレオキャプシドは、非対象的で、約１００ｎｍの長径、約４０〜６０ｎｍの幅広遊離端、および約２０ｎｍの幅狭端を有する。各成熟ウイルス粒子内のヌクレオキャプシドは、Ｇａｇ前駆体ポリペプチドからタンパク質分解的に処理されたタンパク質により封入されたウイルス一本鎖ＲＮＡゲノムの２分子から成る。ウイルスのコードされたプロテアーゼ（ＰＲ）によるｇａｇ遺伝子ポリタンパク質Ｐｒ５５gagの切断は、成熟キャプシドタンパク質を生じる。
【０００４】
ＡＩＤＳの病原性作用物質としてのＨＩＶ−１の発見以来、ウイルスが引き起こす疾患のメカニズムを理解するに際して有意の進歩がなされてきた。多数の診断試験が開発されたが、しかし、ウイルスの異種性および適切な動物モデルの欠如のため、ＨＩＶワクチン療法の進歩は非常に遅れた（例えばMartin, Nature, 345: 572-573 (1990)を参照）。
【０００５】
種々の薬学的作用物質は、ＡＩＤＳを治療するための試みに用いられている。ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）は、ウイルス複製におけるその重大な役割のため、１つの薬剤標的であるが、しかしながら酵素を抑制する薬剤の（全部でなければ）多くは、治療薬としてのそれらの有用性に限定される。これらは、連鎖停止を誘導するヌクレオシド／ヌクレオチド類似体ＲＴ阻害剤（ＮＲＴＩ：ｓ）ならびに非ヌクレオシド類似体ＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ：ｓ）と呼ばれる酵素を直接抑制する作用物質である。ヌクレオシド誘導体、例えばアジドチミジン（ＡＺＴ、ジドブジン（登録商標））およびその他のＲＴ阻害剤は、多数の患者が投与を耐容できないような重篤な副作用を引き起こす。
【０００６】
別の薬剤標的は、ウイルス成熟にきわめて重大なＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）である。ＰＲは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、合成化合物により抑制され得る（例えばRichards, FEBS Lett., 253: 214-216 (1989)を参照）。プロテアーゼ阻害剤はＨＩＶの複製を強力に抑制するが、長期療法は、代謝性疾患、例えばリポジストロフィー、高脂血症およびインスリン抵抗性に関連づけられてきた。
【０００７】
さらに、ＨＩＶはＮＲＴＩ：ｓ、ＮＮＲＴ：ｓおよびプロテアーゼ阻害剤に対する抵抗性を急速に発現する。抵抗性ウイルスは患者間にも広がり得る。例えば米国では、ＨＩＶに近年感染した個体の１０分の１〜１５分の１が、１つまたは複数の抗ウイルス薬に対する抵抗性を発現しているウイルスをすでに有するが、これはおそらくは抵抗性を発現して
いたウイルスを伝播時に保有したヒトに彼らが感染したためである、ということを研究は示している。
【０００８】
この１０年間に、いくつかのペプチドアミドはＨＩＶの複製を抑制する、ということが発見された（例えば、米国特許第５，６２７，０３５号；同第６，２５８，９３２号；同第６，４５５，６７０号、および米国特許出願第０９／８２７，８２２号；同第０９／９３８，８０６号；同第１０／０７２，７８３号；同第１０／２１７，９３３号および同第１０／２３５，１５８号を参照）。これらのペプチドアミドは、逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤とは異なるやり方でＨＩＶ複製を抑制し、もしあるとしても少しの副作用しか有さないと思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの尽力にもかかわらず、ＨＩＶ複製を抑制するさらなる選択的治療薬に対する必要性が存在することは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
酵素的に調製されたおよび合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミドは、ヒト血清中でのＨＩＶの複製を抑制する、ということが発見された。したがって本発明の態様は、修飾グリシンアミド化合物から成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む治療用組成物を包含する。修飾グリシンアミド化合物（例えばメタボライトＸ、α−ヒドロキシグリシンアミドまたはα−ＨＧＡ）のエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方は、ＨＩＶの複製および／または増殖を抑制する製剤および薬剤の活性成分として提供される。修飾グリシンアミド化合物、例えばα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ヒドロキシ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）およびα−メトキシグリシンアミド（α−ＭｅＯ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、あるいはその薬学的に許容可能な塩は、ＨＩＶの複製を抑制するために用いられ得る薬学的に許容可能な処方物中に組み入れるための好ましい活性成分である。
【００１１】
したがって、抗レトロウイルス製剤および薬剤は、修飾グリシンアミド化合物（例えば式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩにより規定される化合物）のエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方またはそれらの薬学的に許容可能な塩を用意することにより調製され得る。抗レトロウイルス製剤または薬剤中への処方のための好ましい化合物としては、例えばα−ヒドロキシグリシンアミド（式Ｃ）、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（式Ｅ）、ジグリシンアミドエーテル（式Ｆ）、およびα−メトキシグリシンアミドのエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方、またはそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。本明細書中に記載された抗レトロウイルス製剤および薬剤は、単位剤形（例えば錠剤、カプセル、ゲルキャップ、液体投薬形態、注射投薬形態、経皮または鼻内投与形態）で提供され、そして修飾グリシン化合物のほかに、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含有し得る。上記製剤および薬剤を含む容器（例えば滅菌バイアル、隔壁密封バイアル、瓶、壷、注射器、アトマイザー、綿棒）も、バルクであれ、個別投薬形態であれ、実施形態であり、そして好ましくは上記処方物は、認証された医薬品製造管理方法（ＧＭＰ）（good manufacturing processes)（例えばそれに適しているかまたは政府取締機関、例えば米国医薬品管理局（ＦＤＡ）により受諾される）に従って調製され、そして上記の容器は、上記の政府取締機関からの上記処方物の認可を示すラベルまたはその他の証印を含む。しかしながら、構造−機能証印とともにまたは伴わずに上記の化合物を含入する栄養価のある薬も実施形態である。
【００１２】
いくつかの実施形態は、１つまたは複数の上記の抗レトロウイルス化合物（例えばメタボライトＸ、α−ヒドロキシグリシンアミド（式Ｃ）、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（式Ｅ）、ジグリシンアミドエーテル（式Ｆ）およびα−メトキシグリシンアミドのエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方）に関する前駆体またはプロドラッグも包含する。このような前駆体またはプロドラッグとしては、例えばペプチドを含有するグリシンアミド、またはグリシンアミドそれ自体（例えばＧＰＧ−ＮＨ2またはＡＬＧＰＧ−ＮＨ2）が挙げられる。これらの前駆体またはプロドラッグは、前駆体またはプロドラッグをいずれかの修飾グリシンアミド化合物（例えば、式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩにより規定される化合物、例えばメタボライトＸ）のエナンチオマー（ＬまたはＤ）あるいは両方またはいずれかの異性体（ＲまたはＳ）あるいは両者に転化し得る物質（例えば単離、濃縮または未加工形態のウシ胎仔血清、ウシ血清、血漿または乳、ウマ血清、血漿または乳、ネコまたはイヌ血清のような物質を含有する補因子（単数または複数））とともに（例えば混合物中で同時投与、あるいはプロドラッグの送達の前または後）提供される。上記のように、上記プロドラッグ／補因子処方物は、認証された医薬品製造管理方法（ＧＭＰ）（例えばそれに適しているかまたは政府取締機関、例えば米国医薬品管理局（ＦＤＡ）により受諾される）に従って調製され得、そして上記の容器は、上記の政府取締機関からの上記処方物の認可を示すラベルまたはその他の証印を含む。構造−機能証印とともにまたは伴わずに上記の処方物を含有する栄養価のある薬も実施形態である。
【００１３】
アルファ−ヒドロキシグリシンアミド（α−ヒドロキシグリシンアミド）またはその薬学的に許容可能な塩（集合的に「α−ＨＧＡ」とも呼ばれる）は、ＨＩＶの複製を抑制するために用いられ得る製剤および／または薬剤中に組み入れるための好ましい活性成分である。Ｌ−α−ＨＧＡ（ＲまたはＳ異性体で）またはＤ−α−ＨＧＡ（ＲまたはＳ異性体で）あるいは両者（ＲまたはＳまたは両方の異性体で）から成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む製剤および薬剤は、実施形態である。これらの組成物（例えばアンプル、カプセル、ピル、錠剤、静脈内溶液、経皮、鼻内溶液、ならびにその他の薬学的に許容可能な処方物）は、好ましくは、ＨＩＶの複製および／または増殖を抑制する量の酵素的に調製された（メタボライトＸ）または合成的に調製された（α−ＨＧＡ）α−ヒドロキシグリシンアミドを含有し、提供し、または送達する。
【００１４】
実施形態は、例えば、式Ａ：
【００１５】
【化１】
2006518373.tif 000002
【００１６】
（式中、
ａ）Ｅは、酸素、硫黄およびＮＲ7から成る群から選択され、
ｂ）Ｔは、酸素、硫黄およびＮＲ8から成る群から選択され、および
ｃ）Ｒ1〜Ｒ8は、各々独立して、水素；任意置換アルキル；任意置換アルケニル；任意置換アルキニル；任意置換シクロアルキル；任意置換へテロシクリル；任意置換シクロ
アルキルアルキル；任意置換へテロシクリルアルキル；任意置換アリール；任意置換へテロアリール；任意置換アルキルカルボニル；任意置換アルコキシアルキル；および任意置換ペルハロアルキルから成る群から選択される）の修飾グリシンアミド化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミド、エステルまたはプロドラッグから成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む。
【００１７】
好ましい組成物は、式（Ｂ）：
【００１８】
【化２】
2006518373.tif 000003
【００１９】
（式中、Ｒ1は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、ベンジル基、あるいはアルキル基またはアルキル基と芳香族基で置換されるシリル基であり、そしてＲ2は水素原子またはアミノ保護基、またはその塩である）の修飾グリシンアミド化合物から成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む製剤および薬剤を包含する。
【００２０】
好ましい組成物は、式（Ｃ）：
【００２１】
【化３】
2006518373.tif 000004
【００２２】
の修飾グリシンアミド化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミド、エステルまたはプロドラッグから成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む製剤および薬剤を包含する。特に好ましい組成物は、式（Ｄ）の修飾グリシンアミド塩から成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む製剤および薬剤を包含する。
【００２３】
【化４】
2006518373.tif 000005
【００２４】
メタボライトＸまたはα−ＨＧＡとも呼ばれる式（Ｃ）の化合物α−ヒドロキシグリシンアミドは、酵素的方法により産生され、陽イオン交換ＨＰＬＣを用いて単離され、そして式（Ｄ）の化合物は合成的に製造されてきた。いくつかの文脈では、式（Ｃ）および（Ｄ）の化合物のエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方はともに、互換的に「メタボライトＸ」、「α−ＨＧＡ」または「修飾グリシンアミド」と呼ばれる。
【００２５】
好ましい組成物は、式（Ｅ）または式（Ｆ）の修飾グリシンアミド化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩から成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む製剤および薬剤も包含する。
【００２６】
【化５】
2006518373.tif 000006
【００２７】
【化６】
2006518373.tif 000007
【００２８】
好ましい組成物は、式（Ｇ）の修飾グリシンアミド化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩から成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む製剤および薬剤も包含する。
【００２９】
【化７】
2006518373.tif 000008
【００３０】
α−メトキシグリシンアミドも合成的に調製され、そしてこの化合物はα−ヒドロキシグリシンアミドより安定していることが判明した。
【００３１】
実施形態は、ＨＩＶの複製を抑制する修飾グリシンアミド化合物を同定し、単離するためのいくつかの方法、およびこれらの化合物を合成するための方法も包含する。いくつかの実施形態は、ＨＩＶの複製および／または増殖を抑制するための方法であって、ＨＩＶの複製を抑制する作用物質を必要とする患者が、ウイルスの増殖または複製を抑制するのに十分な量の酵素的に調製された（メタボライトＸ）または合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）を提供される方法に関する。これらの方法のいくつかにおいては、ＨＩＶ複製に及ぼす影響が（例えば、ウイルス源またはそのマーカーの低減を観察し、またはモニタリングすることにより）測定される。付加的実施形態は、ＨＩＶ感染を治療しおよび／または予防するためのアプローチであって、罹患者またはＨＩＶに罹患する危険のあるヒトがＨＩＶの複製を抑制するのに十分な量の修飾グリシンアミド（例えば、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体、ジグリシンアミドエーテルまたはα−メトキシグリシンアミド）を提供されるアプローチを包含する。上記のように、いくつかの実施形態では、化合物または化合物を含有する製剤は、ＨＩＶ複製を抑制する作用物質を必要とする患者に提供され、そして他の実施形態では、ＨＩＶに及ぼす影響が（例えば、ウイルス源またはそのマーカー、例えばｐ２４蓄積ま
たは逆転写酵素活性の低減を測定することにより）測定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
いくつかのトリペプチドアミドおよびグリシンアミドは、ＨＩＶの複製を抑制する化合物へ代謝されるプロドラッグである、ということが発見された。これらの抗ウイルス剤は、細胞培養中で高選択的阻害剤である（例えばＧＰＧ−ＮＨ2およびグリシンアミドまたは「Ｇ−ＮＨ2」は、ＣＥＭ細胞培養中でのＨＩＶ複製を同等程度（５０％有効濃度：〜３０μＭ）に抑制する）。この領域における研究の焦点は、Ｇ−ＮＨ2もＨＩＶの複製を抑制するため、グリシンアミド（Ｇ−ＮＨ2）へのトリペプチドアミドの転化に集中していた（米国特許出願第１０／２３５，１５８号を参照）。リンパ球表面糖タンパク質マーカーＣＤ２６はＧＰＧ−ＮＨ2をＧ−ＮＨ2に転化して、ジペプチドＧＰ−ＯＨを放出すること、およびこの切断はＧＰＧ−ＮＨ2がその抗レトロウイルス活性を発揮するために必要とされる、ということが目下既知である。
【００３３】
Ｇ−ＮＨ2はそれ自体、ＨＩＶの複製を抑制する１つまたは複数の化合物（例えば環状、荷電または非荷電形態のグリシンアミド）に代謝されるプロドラッグである、ということも発見された。Ｇ−ＮＨ2に由来するこれらの代謝産物は、「修飾グリシンアミド」、「グリシンアミド誘導体」または「メタボライトＸ」と呼ばれる。クロマトグラフィー分離後に単離される修飾グリシンアミドピーク分画の質量分光分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析は、それがα−ヒドロキシグリシンアミド（「α−ＨＧＡ」あるいは（Ｃ2Ｈ6Ｎ2Ｏ2）または（Ｃ2Ｈ7ＣｌＮ2Ｏ2））を含有する、ということを明示した。α−ヒドロキシグリシンアミドおよびα−メトキシグリシンアミドはともに、有機合成により調製された。酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸ）および合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）は、ヒト血清中のＨＩＶを効果的に抑制する、ということが判明した。これらの修飾グリシンアミドを含有する製剤および薬剤の処方は簡単であり、それを必要とする患者におけるＨＩＶの複製を抑制するためのこれらの化合物の使用が本明細書中に提供されている。以下の節は、ＣＤ２６がＧＰＧ−ＮＨ2をＧ−ＮＨ2に転化するという発見をより詳細に説明する。
【００３４】
［ＣＤ２６はＧＰＧ−ＮＨ2のＧ−ＮＨ2への転化を媒介する］
リンパ球表面糖タンパク質ＣＤ２６は、Ｔ細胞活性化／分化マーカーとして当初記載された（Fox et al., J. Immunol., 132: 1250-1256 (1984)を参照）。ＣＤ２６はＨＩＶの標的細胞上に豊富に発現され（即ちリンパ球ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ、Ｃ８１６６およびＭＴ−４および末梢血単核球）、そしてウシ、ネズミおよびヒト起源の血清中にも存在する。それは、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ、ＥＣ３．４．１４．５）と同一の膜関連ペプチダーゼであり、そしてＮ末端の末位から２番目のアミノ酸としてプロリンまたはアラニンを含有するペプチドに対する高い（しかし排他的でない）選択性を有する（Yaron anf Naider, Biochem. Mol. Biol., 28: 31-81 (1993); De Meester et al., Immunol. Today, 20: 367-375 (1999)およびMentlein, Regul. Pept., 85: 9-24 (1999)を参照）。それは種々の白血球サブセット上に発現されるだけでなく、いくつかの種類の上皮細胞、内皮細胞および繊維芽細胞上にも発現される（同文献を参照）。可溶性形態のＣＤ２６も存在する。それは膜貫通領域および細胞内尾を欠き、そして血漿および脳脊髄液中に低量で検出される（Yaron anf Naider, Biochem. Mol. Biol., 28: 31-81 (1993); De Meester et al., Immunol. Today, 20: 367-375 (1999)を参照）。
【００３５】
いくつかのサイトカイン、造血成長因子、ホルモンおよび神経ペプチドは、Ｘ−ＰｒｏまたはＸ−ＡｌａモチーフをそれらのＮ末端に含有する（De Meester et al., Immunol. Today, 20: 367-375 (1999)を参照）。Ｎ末端近くのプロリンの存在は、非特異的タンパク質分解性分解に対する構造的保護として役立つ（Vanhoof et al., FASEB J., 9: 736-744 (1995)を参照）。特に相対的に小さいペプチドは、天然基質として役立つ（例えばケ
モカインＲＡＮＴＥＳ（６８アミノ酸）およびＳＤＦ−１α（６８アミノ酸）およびグルカゴン／ＶＩＰ（血管作動性腸管タンパク質）ファミリーペプチド、例えばＧＩＰ（４２アミノ酸）およびＧＬＰ−２（３３アミノ酸））（De Meester et al., Immunol. Today,
20: 367-375 (1999)を参照）。時として、ペプチドは非常に短い（例えば神経ペプチドエンドモルフィン２（４アミノ酸）およびサブスタンスＰ（１１アミノ酸））。５アミノ酸のみから成るエンテロスタチンも、ＣＤ２６のための基質であることが判明している。
【００３６】
興味深いことに、ある場合には、ＣＤ２６は、分子のＮ末端部分からジペプチド部分を切り離した後、天然ペプチドの生物学的機能を変えることが示された（Oravecz et al., J. Exp. Med., 186: 1865-1872 (1997); Proost et al., J. Biol. Chem., 273 7222-7227 (1998)）。実際、切頭化ＲＡＮＴＥＳ（３〜６８）は、完全なＲＡＮＴＥＳと比較して、顕著に増大された抗ＨＩＶ−１活性を有することが見出された（Schols et al., Antiviral Res., 39: 175-187 (1998)を参照）が、一方、ＣＤ２６によるＮ末端処理ＳＤＦ−１αは、その抗ＨＩＶ−１効力を著しく減少した（Ohtsuki et al., FEBS Lett., 431: 236-240 (1998); Proost et al., FEBS Lett., 432: 73-76 (1998)を参照）。また、ＣＤ２６はヒト臍帯血ＣＤ３４+始原細胞のＳＤＦ−１α媒介性走化性を調節する、ということが近年示された（Christopherson et al., J. Immunol., 169: 7000-7008 (2002)を参照）。
【００３７】
トリペプチドグリシルプロリルグリシンアミド（ＧＰＧ−ＮＨ2）は、非毒性濃度でＨＩＶ複製を抑制することが判明している（例えば米国特許第５，６２７，０３５号を参照）が、しかしこの開示まで、それはＣＤ２６とは関連づけられていない。グリシルプロリルグリシンアミドは、２〜４０μＭの範囲内の広範な種々のＨＩＶ−１実験室株および臨床単離株を妨害する。ＨＩＶ  ｐ２４における２つのＧＰＧモチーフならびにウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループにおける１つのＧＰＧモチーフが存在するため、初期研究は、この新規のトリペプチド誘導体に対する潜在的標的としてのこれらのウイルスタンパク質に集中していた（Su, Ph.D. thesis at the Karolinska Institute (ISBN 91-628-4326-5), Stockholm, Sweden (2000) and Su et al., AIDS Res. Human Retrovir., 16: 37-48 (2000)を参照）。
【００３８】
ｇｐ１６０／１２０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度増大が高ＧＰＧ−ＮＨ2濃度で観察されたが、ＧＰＧ−ＮＨ2はＨＩＶの感染周期における早期事象に影響を及ぼさない、ということが判明した（Su et al., J. Hum. Virol., 4: 8-15 (2001)を参照）。さらにＧＰＧ−ＮＨ2とｐ２４タンパク質との結合が実証され、そしてウイルス粒子の非会合コア構造数増大がＧＰＧ−ＮＨ2処理ＨＩＶ−１感染細胞で観察された（Hoglund et al., Antimicrob. Agents Chemother., 46: 3597-3605 (2002)を参照）。また、ウイルスキャプシド（ｐ２４）形成は、薬剤の存在下で妨害されることが判明した（Hoglund et al., Antimicrob. Agents Chemother., 46: 3597-3605 (2002)を参照）。ＧＰＧ−ＮＨ2は新規のメカニズムによりＨＩＶの複製を抑制する、ということが明らかになった。
【００３９】
ＧＰＧ−ＮＨ2ペプチド分子の真ん中のプロリン残基（アミノ末端の末位から２番目のアミノ酸と等価）の存在を仮定すると、ＧＰＧ−ＮＨ2は、ＣＤ２６／ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する基質であり得、かつＣＤ２６酵素活性は化合物の抗レトロウイルス活性を変調し得る、と考えられた。したがって、ＣＤ２６／ジペプチジルペプチダーゼＩＶがＧＰＧ−ＮＨ2をＧ−ＮＨ2に転化するか否かを確定するための実験が実行され、実際、ＣＤ２６がプロリン残基の後ろでＧＰＧ−ＮＨ2を選択的に且つ効率的に切断して、ジペプチドＧＰ−ＯＨおよびＧ−ＮＨ2を放出する、ということが発見された。さらに、この切断はＧＰＧ−ＮＨ2がその抗レトロウイルス活性を発揮するために必要である、ということも実証された。以下の実施例は、これらの知見をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００４０】
初期実験において、いくつかのＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２株を、ＧＰＧ−ＮＨ2、Ｇ−ＮＨ2および関連化合物の抑制活性に対するそれらの感受性に関して評価した（表１および図１を参照）。グリシルプロリルグリシンアミド（ＧＰＧ−ＮＨ2）、グルタミニルプロリルグリシンアミド（Ｑ−ＰＧ−ＮＨ2）、サルコシニルプロリルグリシンアミド（Ｓａｒ−ＰＧ−ＮＨ2）およびグリシンアミド（Ｇ−ＮＨ2）は、TRIPEP AB (Huddinge, Sweden)により提供された。一方、ピログルタミニルプロリルグリシンアミド（ＰｙｒＱ−ＰＧ−ＮＨ2）はRega Instituteで合成された。ヒトＴリンパ球ＣＥＭ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Rockville, MD）から入手して、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Bio Wittaker Europe, Verviers, Belgium）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco）および０．０７５ＭのＮａＨＣＯ3（Gibco）を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco, Paisley, Scotland）中で培養された。ＨＩＶ−１（ＩＩＩB）は、R.C. Gallo博士およびM. Popovic博士（当時、National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD）から入手した。ＨＩＶ−１（ＮＬ４．３）は、National Institute of Allergy and Infectious Disease AIDS Reagent Program (Bethesda, MD)から入手した。ＨＩＶ−２単離株ＲＯＤおよびＥＨＯはL. Montagnier博士（Pasteur Institue, Pris, France）によって提供された。
【００４１】
ヒトＴリンパ球ＣＥＭ細胞（４．５×１０5細胞／ｍｌ）を新鮮な細胞培地中に懸濁し、１００  ＣＣＩＤ50（１  ＣＣＩＤ50は細胞培養の５０％に対して感染性をもつウイルス用量である）／細胞懸濁液１ｍｌで、ＨＩＶ−１（ＩＩＩBおよびＮＬ４．３）またはＨＩＶ−２（ＲＯＤまたはＥＨＯ）に感染させた。次に１００μｌの感染細胞懸濁液をマイクロプレートウェルに移して、試験化合物の適切な（新たに調製した）希釈液（即ち最終濃度２，０００、４００、８０、１６、３．２および０．６２μＭ）１００μｌと混合し、さらに３７℃でインキュベートした。４〜５日後、ＣＥＭ細胞培養中で巨細胞形成を顕微鏡を用いて記録した。５０％有効濃度（ＥＣ50）は、ウイルス感染ＣＥＭ細胞培養中のシンシチウム形成を５０％防止するために必要とされる化合物濃度に相当する。
【００４２】
【表１】
2006518373.tif 000009
【００４３】
興味深いことに、ＧＰＧ−ＮＨ2およびＧ−ＮＨ2はともに、抗ウイルス検定に用いられるウイルスの性質に関係なく、モルベースでのウイルス複製を抑制するのに等しく有効で
あった。それらのＥＣ50（５０％有効濃度）は、ＣＥＭ細胞培養中で３０〜５０μＭの等級であった。両化合物は、１，５００〜２，０００μＭという高い濃度では細胞傷害性を示さなかった。Ｓａｒ−ＰＧ−ＮＨ2およびＱ−ＰＧ−ＮＨ2もＨＩＶ複製に対して抑制性であったが、しかしＧＰＧ−ＮＨ2と同じく低い程度の抑制性であった。そのカルボキシ末端にＧ−ＮＨ2を、しかしそのアミノ末端に環状ピログルタミンを含有する新規のトリペプチド（ＰｙｒＱ−ＰＧ−ＮＨ2）誘導体を合成した。ＧＰＧ−ＮＨ2およびその他のトリペプチドアミド誘導体と対照して、ＰｙｒＱ−ＰＧ−ＮＨ2は、細胞培養中のＨＩＶ複製の抑制に効果がないことが判明した。
【００４４】
次に、ＣＤ２６ジペプチジルペプチダーゼ活性は精製ＣＤ２６、ならびにウシ、ネズミおよびヒト血清中で、ならびにヒトリンパ球または末梢血単核球懸濁液を用いて検出され得る、ということが確証された。合成基質グリシルプロリルｐ−ニトロアニリド（ＧＰ−ｐＮＡ）をグリシルプロリン（ＧＰ−ＯＨ）および黄色染料であるｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）に転化することによりＣＤ２６酵素活性を記録し、その生成を、４００ｎｍでの吸光度の増大によりモニタリングし得た。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の約２００マイクロリットルの精製ＣＤ２６（１ミリ単位／ｍｌ）、またはヒト、ネズミもしくはウシ血清（ＰＢＳ中５％）、またはＰＢＳ中の１０6ヒトリンパ球ＣＥＭ、Ｃ８１６６、Ｍｏｌｔ４／Ｃ８、ＭＴ−４、もしくは末梢血単核球懸濁液を２００μｌマイクロタイタープレートウェルに添加し、この後、最終濃度３ｍＭでＣＤ２６酵素活性を測定するための基質（グリシルプロリル−ｐａｒａ−ニトロアニリド）（ＧＰ−ｐＮＡ）を添加した。グリシルプロリル−ｐ−ニトロアニリド（ＧＰ−ｐＮＡ）およびグリシルフェニルアラニニル−ｐ−ニトロアニリド（ＧＦ−ｐＮＡ）をSigma Chemicals （St. Louis, MO）から入手した。ＧｌｙＰｒｏ−ｐＮＡから放出されるパラニトロアニリン（ｐＮＡ）（黄色着色）の量を測定することにより、時間の関数で、ｐ−ニトロ−アニリン（ｐＮＡ）の放出を３７℃でモニタリングした。Spectramaxマイクロプレート分光計（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で、吸光度［４００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）］の増大により、ｐＮＡ放出を記録した。実験条件下で、少なくとも６０分間、反応は直線的に進行した。ブランク反応混合物（ＣＤ２６酵素、血清または細胞を欠く）のＯＤ400値を得られたＯＤ400値から差し引き、酵素活性の測定値としてＯＤ400値の実増大を示すものとした。
【００４５】
細胞懸濁液へのＣＤ２６の特定阻害剤の添加が合成基質ＧＰ−ｐＮＡからのｐ−ニトロアニリンの放出をほとんど完全に妨害するため、ＧＰ−ｐＮＡは、ＣＤ２６によってのみ転化され、他のジペプチジル／ペプチダーゼの作用によっては転化されない、ということが判明した（下記）。全てのリンパ球懸濁液（ＣＥＭ、Ｃ８１６６、ＭＴ−４、Ｍｏｌｔ４／Ｃ８）そしてＰＢＭＣも、ＧＰ−ｐＮＡが投与されると、ＧＰ−ｐＮＡをｐ−ニトロアニリンに時間依存式に効率的に転化した（図２Ａを参照）。ＣＤ２６活性は、ＣＥＭ細胞懸濁液中で最高であり、そしてＭＴ−４細胞懸濁液中で最低であった。さらにまた、胎仔ウシおよびネズミ血清、そして特にヒト血清は、ＧＰ−ｐＮＡからｐ−ニトロアニリンを効率的に放出した（図２Ｂを参照）。したがってヒトＴリンパ球懸濁液および血清はともに、顕著なＣＤ２６／ジペプチジルペプチダーゼ酵素活性を示す。ＣＤ２６活性が効率的にモニタリングされ得る、ということが一旦確定されたので、ＣＤ２６がＧＰＧ−ＮＨ2をＧ−ＮＨ2に転化し得るか否かを確定するために実験を実行した。
【００４６】
一試料において、約１００μＭのＧＰＧ−ＮＨ2を２５単位／ｌの精製ＣＤ２６に曝露し、そして混合物を室温で４００分までインキュベートした。リンパ球表面糖タンパク質ＣＤ２６／ジペプチジルペプチダーゼＩＶを、上記と同様に精製した（De Meester, J. Immunol. Methods, 189: 99-105 (1996)を参照）。異なる時点で、反応混合物のアリコートを採取して、エレクトロスプレーイオントラップ質量分光計（Esquire, Bruker, Bremen, Germany）で分析した。ＧＰＧ−ＮＨ2分子のアミノ末端からの放出時のジペプチドＧＰ−ＯＨの出現、ならびに反応混合物からの完全なＧＰＧ−ＮＨ2の消失を確定し、かつ
エレクトロスプレーイオントラップ質量分光分析により様々な時点でのモニタリングを行った（図３を参照）。これらの実験条件下で、ＣＤ２６はＧＰＧ−ＮＨ2から時間依存的にＧＰ−ＯＨを放出し、そして反応の４〜６時間以内にほとんど完全にＧＰＧ−ＮＨ2をＧＰ−ＯＨおよびＧ−ＮＨ2に転化した。これに反して、ＣＤ２６はＰｙｒｒｏＱ−ＰＧ−ＮＨ2からＧ−ＮＨ2を放出できなかった。
【００４７】
次に、精製ＣＤ２６、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト血清（ＨＳ）およびＣＥＭ細胞懸濁液による［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2への放射標識化［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2の転化を分析した。放射標識化炭素がトリペプチドのカルボン酸末端のグリシンの主鎖炭素に位置する放射標識化［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2（放射線特異性：５８ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）ならびに炭素−２が放射標識される［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2（放射線特異性：５６ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）は、Amersham Pharmacia Biotech（Buckinghamshire, England）により合成された。種々の濃度の［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2を精製ＣＤ２６、ＦＢＳ、ＨＳおよびＣＥＭ細胞懸濁液に曝露し、そしてＧ−ＮＨ2への転化を分析した。
【００４８】
一組の実験において、例えば５ｍｌのＣＥＭ細胞培養（５×１０5細胞／ｍｌ）を２０μＭの［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2に２４時間曝露した。次に細胞を１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、洗浄して、細胞ペレットを６０％氷冷メタノールで１０分間処理した。メタノール細胞抽出物を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後、上清を陽イオン交換Partisphere−ＳＣＸカラム（Whatman）上に注入して、Ｇ−ＮＨ2からＧＰＧ−ＮＨ2を分離した。以下の勾配を用いた：０〜１５分：イソクラティック緩衝液Ａ（７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ３．５）；１５〜４０分：緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（２５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ３．５）への直線勾配；４０〜４５分：緩衝液Ｂから緩衝液Ａへの直線勾配；４５〜５５分：イソクラティック緩衝液Ａ。これらの溶離条件下での［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2および［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2の保持時間は、それぞれ２６〜２８分および１４〜１６分であった。
【００４９】
別の組の実験では、曝露１時間後、上記と同様に、陽イオン交換Partisphere−ＳＣＸカラムおよびリン酸ナトリウム緩衝液勾配をｐＨ３．５で用いて、ＨＰＬＣ分析により、完全な［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2の消失を確定した。ＧＰＧ−ＮＨ2は、Ｇ−ＮＨ2から良好に分離された（保持時間：それぞれ２５〜２７分および１５〜１７分）。Ｇ−ＮＨ2へのＧＰＧ−ＮＨ2のＣＤ２６触媒性転化のＫm値は、０．１８３ｍＭであると算定された。図４に示したＧＰＧ−ＮＨ2消失曲線から得られるように、ＨＳおよびＦＢＳに関連したジペプチジルペプチダーゼ活性に関するＧＰＧ−ＮＨ2の概算Ｋm値は、それぞれ０．４５および１．４ｍＭであった。ＣＥＭ細胞懸濁液によるＧＰＧ−ＮＨ2転化は、１．５ｍＭまで直線状に進行した。高ＧＰＧ−ＮＨ2濃度（例えば３および５．４ｍＭ）でのみ、ＣＥＭ細胞懸濁液に関する転化曲線はわずかにレベルオフを開始した。
【００５０】
次に、ＣＤ２６に及ぼすＬ−イソロイシンピロリジン（ＩｌｅＰｙｒ）の抑制作用を分析した。イソロイシンピロリジン（ＩｌｅＰｙｒ）は近年、精製ＣＤ２６関連ジペプチジルペプチダーゼ活性の相対的に強力な且つ選択的阻害剤である、と報告されている（De Meester, J. Immunol. Methods, 189: 99-105 (1996)を参照）。酵素活性検定は全て、９６ウェルマイクロタイタープレート（Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）で実施した。各ウェルに、ＰＢＳ中の５μｌの精製ＣＤ２６（最終濃度０．２ミリ単位／２００μｌ−ウェル）、１０μｌのウシ胎仔血清（ＢＳ）（最終濃度：ＰＢＳ中５％；５６℃で３０分間予熱）、またはＰＢＳ中１００万個のＣＥＭ細胞、ＰＢＳ中の５μｌの適切な濃度のＩｌｅＰｙｒ阻害剤溶液（５００および２００μＭ）、そして全容積を１５０μｌにする量のＰＢＳを添加した。４ｍｇ／ｍｌ（２００μｌ反応混合物中の最終濃度：１ｍｇ／ｍｌまたは３ｍＭ）での５０μｌの基質ＧＰ−ｐＮＡの添加により反応を開始し、３７℃で実行した。ＣＤ２６、ＢＳおよびＣＥＭ細胞懸濁液に付随したジペプチジルペ
プチダーゼ活性に対するＩｌｅＰｙｒの５０％抑制濃度は、ＧＰ−ｐＮＡのｐＮＡおよびＧＰ−ＯＨへの酵素触媒性加水分解を５０％抑制するのに必要とされる化合物濃度として定義された。
【００５１】
初期実験では、基質としてＧＰ−ｐＮＡを用いてＩｌｅＰｙｒに付されたＣＥＭ細胞懸濁液（ウシ胎仔血清中）におけるＣＤ２６抑制を分析した。陽性対照として精製ＣＤ２６を含めた（図５を参照）。阻害剤ＩｌｅＰｙｒは、それぞれ１１０および９９μＭの５０％抑制濃度（ＩＣ50）で、ＣＥＭ細胞懸濁液に、ならびにウシ胎仔血清に曝露されたＧＰ−ＮＡからのｐ−ニトロアニリンの放出を、用量依存的に防止した。精製ＣＤ２６は、２２μＭのＩＣ50値で抑制された。したがって血清およびＣＥＭ細胞懸濁液に曝露された阻害剤ＩｌｅＰｙｒの５０％抑制濃度（ＩＣ50）は、精製ＣＤ２６を５０％抑制するのに必要とされる阻害剤濃度の〜５倍より高かった。
【００５２】
次にＧＰＧ−ＮＨ2を用いて観察される抗レトロウイルス活性がトリペプチド誘導体からのＧ−ＮＨ2のＣＤ２６触媒性放出に関連するか否かを確定するために、実験を実行した。ＨＩＶ−１感染ＣＥＭ細胞培養を、非毒性濃度のＩｌｅＰｙｒ（５００μＭおよび２００μＭ）の存在下で異なる濃度のＧＰＧ−ＮＨ2に曝露した。Ｇ−ＮＨ2とＩｌｅＰｙｒの同様の組合せがこの試験に包含された。これらの実験では、ＣＤ２６特異的阻害剤Ｌ−イソロイシンピロリジン（ＩｌｅＰｙｒ）を各細胞培養マイクロプレートに添加した後、試験化合物およびウイルス感染細胞を添加した。
【００５３】
２００および５００μＭのＩｌｅＰｙｒ（ＥＣ50：３５〜４３μＭ）の存在下でＣＥＭ細胞培養中のその抗ＨＩＶ活性を完全に保存したＧ−ＮＨ2と対照して、ＧＰＧ−ＮＨ2は、特異的ＣＤ２６阻害剤の存在下で、ウイルス誘導性細胞壊死性に対するその抑制活性を顕著に損失した（図６を参照）。最高阻害剤濃度（５００μＭ）は、トリペプチドＧＰＧ−ＮＨ2の抗ＨＩＶ−１活性を取り消すのに際して、より低い（２００μＭ）阻害剤濃度よりわずかに効率的であった。細胞培養中で抗レトロウイルス活性を同様に付与される別のトリペプチドアミド誘導体であるＳａｒ−ＧＰ−ＮＨ2に関して、同様の結果が観察された。
【００５４】
本実施例で示された結果は、細胞培養中でその抗ＨＩＶ活性を発揮し得る前にＧＰＧ−ＮＨ2はグリシンアミドを放出する加水分解を要する、ということを実証する。データは、ＧＰＧ−ＮＨ2からのＧ−ＮＨ2の放出は、リンパ球表面糖タンパク質活性化／分化マーカーＣＤ２６の酵素活性により誘導される、という証拠も提供する。ＧＰＧ−ＮＨ2からのＧ−ＮＨ2の生成を、精製ＣＤ２６、ヒトＴリンパ球懸濁液、ならびにヒトおよびウシ血清を用いて実行した。さらにＱ−ＰＧ−ＮＨ2の顕著な抗ウイルス活性、ＰｙｒＱ−ＰＧ−ＮＨ2（ＣＤ２６による酵素攻撃に抵抗性である）の抗ウイルス活性の完全欠如、ならびにＣＤ２６の特異的阻害剤の存在下でのＧＰＧ−ＮＨ2およびＳａｒ−ＧＰ−ＮＨ2の抗ウイルス効力の損失は、ＧＰＧ−ＮＨ2がＧ−ＮＨ2の効率的プロドラッグとして作用し、そしてＣＤ２６がＧ−ＮＨ2へのＧＰＧ−ＮＨ2の転化を触媒するという強力な証拠を提供する。
【００５５】
したがって、膜関連ジペプチジルペプチダーゼであるリンパ球表面糖タンパク質ＣＤ２６は、例えばＧＰＧ−ＮＨ2、ＱＰＧ−ＮＨ2およびサルコシルプロリルグリシンアミド（ＳＡＲ−ＰＧ−ＮＨ2）をＧ−ＮＨ2に代謝するのに関与する酵素である、ということが発見された。選択的ＣＤ２６阻害剤Ｌ−イソロイシンピロリジン（ＩｌｅＰｙｒ）を用いた実験から、ＧＰＧ−ＮＨ2およびＳＡＲ−ＰＧ−ＮＨ2の抗ＨＩＶ活性のかなりの低減が観察され、ペプチドアミドを代謝し、ＨＩＶの複製を抑制する形態にするのにＣＤ２６が関与するというさらなる証拠が得られた。しかしながらＩｌｅＰｙｒ阻害剤は、ＨＩＶの複製を抑制するＧ−ＮＨ2の能力に及ぼす作用を有さなかった。したがってＸ−Ｐｒｏ−グ
リシンアミド含有ペプチドアミドは、リンパ球表面糖タンパク質ＣＤ２６によりＧ−ＮＨ2に代謝される抗レトロウイルスプロドラッグまたは前駆体である。次節は、グリシンアミドがＨＩＶの複製を抑制する、という発見をさらに詳細に記載する。
【００５６】
［グリシンアミドはＨＩＶの複製を抑制する］
最初に、Ｇ−ＮＨ2はＨＩＶの複製を効率的に抑制するが、しかし構造が類似する化合物はそうでない、ということを確定した。ＨＩＶ−１（ＩＩＩB）感染ＣＥＭ細胞培養を、種々の濃度のＧ−ＮＨ2またはＧ−ＮＨ2と類似の構造を有する種々の濃度の化合物とともにインキュベートし、そして標準手法を用いてＨＩＶ複製の抑制を評価した。これらの実験を次の実施例で説明する。
【実施例２】
【００５７】
ヒトＴリンパ球ＣＥＭ細胞（約４．５×１０5細胞／ｍｌ）を新鮮な培地中に懸濁し、約１００  ＣＣＩＤ50／細胞懸濁液１ｍｌでＨＩＶ−１（ＩＩＩB）に感染させた（１  ＣＣＩＤ50は細胞培養の５０％に対して感染性をもつウイルス用量である）。次に１００μｌの感染細胞懸濁液をマイクロタイタープレートの個々のウェルに移し（１００μｌ／ウェル）、１００μｌの新たに希釈した試験化合物（２，０００、４００、８０、１６、３．２または０．６２μＭ）と混合した。その後、混合物を３７℃でインキュベートした。インキュベーションの４〜５日後に、巨細胞形成をＣＥＭ培養中で顕微鏡を用いて記録した。５０％有効濃度（ＥＣ50）は、ウイルス感染ＣＥＭ細胞培養中のシンシチウム形成を５０％防止するために必要とされる化合物の濃度に対応した。
【００５８】
これらの実験結果を表２に示す。グリシンアミドは、細胞培養中でのＨＩＶ複製を感知可能的に抑制する唯一の化合物であることが判明した。Ｇ−ＮＨ2に関するＥＣ50は、約２１．３μＭであり、一方、試験した他の化合物はＨＩＶの抑制を示さなかった。これらの結果は、Ｇ−ＮＨ2がＨＩＶ複製を抑制する特定の構造を有する、ということを確証した。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
その後の分析は、Ｇ−ＮＨ2がＨＩＶの特異的阻害剤である、ということを明示した。種々の型のウイルスで感染させた細胞培養において、種々の濃度のＧ−ＮＨ2およびＧＰＧ−ＮＨ2の細胞傷害性および抗ウイルス活性を評価した。各々の異なる型の細胞およびウイルスに関する慣用的宿主細胞培養、ウイルス感染、および感染性分析に従った。分析した特定の型のウイルスの複製を抑制することが既知である化合物を、対照として用いた。
【００６１】
表３〜５は、これらの実験の結果を示す。データは、Ｇ−ＮＨ2およびＧＰＧ−ＮＨ2が
、単純ヘルペスウイルス−１（ＫＯＳ）、単純ヘルペスウイルス−２（Ｇ）、単純ヘルペスウイルス−１ＴＫ-ＫＯＳ  ＡＣＶr、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、コクサッキーウイルスＢ４、呼吸器合胞体ウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、１型レオウイルス、シンドビスウイルスおよびプンタトロウイルスの複製を抑制するのに効果的ではない、ということを示す。これらの結果は、Ｇ−ＮＨ2およびＧＰＧ−ＮＨ2がＨＩＶの選択的阻害剤である、ということを確証した。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
【表４】
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【００６４】
【表５】
2006518373.tif 000013
【００６５】
Ｇ−ＮＨ2はそれ自体、数種類の動物の血漿および血清中に存在する酵素または補因子（単数または複数）により、ＨＩＶの複製を抑制する１つまたは複数の化合物（例えば環状、荷電または非荷電形態のグリシンアミド）に代謝されるプロドラッグまたは前駆体である、ということが発見された。以下の節は、この発見をさらに詳細に説明する。
【００６６】
［数種類の動物の血漿および血清中に存在する補因子（単数または複数）はＧ−ＮＨ2をＨＩＶを抑制する代謝産物に転化する］
数種類の動物の血清および血漿中に存在する少なくとも１つの補因子はＧ−ＮＨ2を活性形態（「修飾グリシンアミド」またはメタボライトＸ）に代謝し、これは細胞中に輸送されてＨＩＶの複製を抑制する、という根拠が、本明細書中に提供されている。したがってＧ−ＮＨ2は抗レトロウイルス化合物に関する前駆体またはプロドラッグであり、そしてＧ−ＮＨ2は上記補因子または上記補因子を含有する物質と共に投与するために処方され得る。クロマトグラフィー法を用いて、この補因子を単離した。本明細書中に記載したアプローチ、ならびに分子生物学における慣用的技法を用いて、この補因子を精製し、クローン化し、そしてシーケンシングする。したがっていくつかの実施形態は、Ｇ−ＮＨ2またはＧ−ＮＨ2に代謝される化合物（例えばＧＰＧ−ＮＨ2）との混合物中に含有するか、Ｇ−ＮＨ2をメタボライトＸに転化する物質（例えば精製、濃縮または単離形態のブタ血清、血漿または乳、ウマ血清、血漿または乳、ウシ血清、血漿または乳）と一緒に（Ｇ−ＮＨ2の投与の前または後）投与される製剤または栄養価のある薬調製物を包含する。
【００６７】
活性形態のＧ−ＮＨ2（修飾グリシンアミドまたはメタボライトＸ）は、ある種の血清または血漿中でのＧ−ＮＨ2のインキュベーションにより容易に産生され、修飾グリシンアミドは下記のクロマトグラフィー法により容易に単離される。本開示全体を通して、グリシンアミド代謝産物（抗レトロウイルス活性形態のグリシンアミド）は、集合的に「修飾グリシンアミド」、「修飾Ｇ−ＮＨ2」または「高速ピークグリシンアミド」と呼ばれる。修飾Ｇ−ＮＨ2の例としては、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミド、ならびにこれらの化合物の塩および／または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー分離後に単離された修飾グリシンアミドピーク分画の質量分光分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析は、それがα−ヒドロキシグリシンアミドを含有する、ということを明示した。化合物α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）は、α−ヒドロキシグリシンアミドより安定であり、かつα−ヒドロキシグリシンアミドおよびα−メトキシグリシンアミドはともに、有機合成により調製されてきた。本明細書中に記載された手法ならびにその他の利用可能な合成アプローチを用いて、当業者はその他の修飾グリシンアミド化合物を容易に調製し得る（例えばＪＰ  ５０９７７８９Ａ２（特開平０５−０９７７８９号）（表題：Hayakawa et al.,"Alpha-hydroxyglycinamide Derivative and its Preparation"１９９１年１０月３日出願）を参照）。合成的または酵素的産生α−ＨＧＡ（α−ヒドロキシグリシンアミド）の存在下で実行されたＨＩＶ感染試験は、化合物がヒト血清中のＨＩＶ複製を効率的に抑制する、ということを明示した。
【００６８】
製剤および薬剤中への修飾Ｇ−ＮＨ2の処方は、修飾Ｇ−ＮＨ2が合成的に産生されようが、血清中でのＧ−ＮＨ2のインキュベーションにより酵素的に産生されようが、簡単である。したがって抗レトロウイルス製剤および薬剤は、修飾グリシンアミド化合物（例えば式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩにより規定される化合物）のエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方またはそれらの薬学的に許容可能な塩を用意することにより調製され得る。抗レトロウイルス製剤または薬剤中への処方のための好ましい化合物としては、例えばα−ヒドロキシグリシンアミド（式Ｃ）、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（式Ｅ）、ジグリ
シンアミドエーテル（式Ｆ）、およびα−メトキシグリシンアミドのエナンチオマーのいずれか（ＬまたはＤ）または両方、あるいは異性体のいずれか（ＲまたはＳ）または両方、またはそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。本明細書中に記載された抗レトロウイルス製剤および薬剤は、単位剤形（例えば錠剤、カプセル、ゲルキャップ、液体投薬形態、注射投薬形態、経皮または鼻内投与形態）で提供され、そして修飾グリシン化合物のほかに、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含有し得る。上記製剤および薬剤を含む容器（例えば滅菌バイアル、隔壁密封バイアル、瓶、壷、注射器、アトマイザー、綿棒）も、バルクであれ、個別投薬形態であれ、実施形態であり、そして好ましくは上記処方物は、認証医薬品製造管理方法（ＧＭＰ）（good manufacturing processes)（例えばそれに適しているかまたは政府取締機関、例えば米国医薬品管理局（ＦＤＡ）により受諾される）に従って調製され、そして上記の容器は、上記の政府取締機関からの上記処方物の認可を示すラベルまたはその他の証印を含む。しかしながら、構造−機能証印とともにまたは伴わずに上記の化合物を含入する栄養価のある薬も実施形態である。
【００６９】
いくつかの実施形態は、修飾グリシンアミド化合物から成るかまたはそれが濃縮されたＨＩＶの抑制のための調製物である（例えばウイルスの複製を抑制する量で、単離、精製または合成形態の修飾グリシンアミド化合物から成るか、本質的にそれらから成るかまたはそれらを含むＨＩＶの抑制のための製剤および薬剤）。好ましい実施形態としては、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミド、あるいはこれらの化合物の誘導体から成るか、本質的にそれらから成るか、またはそれらを含む製剤または薬剤が挙げられる。
【００７０】
本明細書中で用いる場合、「濃縮」とは、物質の濃度が（例えば）その天然濃度の１０００倍までのもの、有益には０．０１重量％、好ましくは少なくとも約０．１重量％であることを意味する。約０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％および２０重量％〜の濃縮調製物も意図される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えばそれが天然に生じる場合には、天然環境）から切り離されることを要する。「精製された」という用語は、絶対純度を要しない、むしろ、それは相対的定義として意図される。単離タンパク質は、クロマトグラフィーおよび／またはゲル電気泳動により慣用的に精製され得る。少なくとも１オーダー分の、好ましくは２または３オーダーの、さらに好ましくは４または５オーダー分への出発物質または天然物質の精製が、特に意図される。
【００７１】
以下の実施例は、市販のグリシンアミドを精製するために用いられたアプローチを記載する。下記のように、このアプローチの態様を用いて、種々の動物血清中でのインキュベーション後に産生されるグリシンアミドの代謝産物を精製した。
【実施例３】
【００７２】
［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2の非精製調製物が陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離される場合、Ｇ−ＮＨ2の２つの集団が分離される、ということが観察された（表６を参照）。陽イオン交換カラム（例えばPartisphere SCX-Whattman）を用いてＨＰＬＣにより、放射標識化Ｇ−ＮＨ2および放射標識化ＧＰＧ−ＮＨ2の粗製調製物を分離した。以下の勾配を用いた。０〜１５分（５ｍＭのリン酸アンモニウムから成るイソクラティック緩衝液Ａ、ｐＨ３．５）、１５〜４０分：緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（２５０ｍＭのリン酸アンモニウム、ｐＨ３．５）への直線勾配、４０〜４５分：緩衝液Ｂ、４５〜５５分：緩衝液Ａへの直線勾配、および５５〜６０分：次の実行のためにカラムを平衡させるためのイソクラティック緩衝液Ａ。
【００７３】
この分離アプローチにより、大多数の粗製［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2は典型的には、２６
〜２８分で溶離した（分画２６〜２８）。しかしながら微量の放射標識化化合物が、２０〜２２分（分画２０〜２２）、１５〜１７分（分画１５〜１７）および２〜３分（分画２〜３）で溶離した。粗製［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2の約８９％は典型的には、１５〜１７分で溶離した（分画１５〜１７）が、しかし粗製［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2の約１１％は２〜３分で溶離した（分画２〜３）。微量の粗製［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2は、分画２０〜２２および分画５〜６でも検出された。
【００７４】
緩衝液および勾配におけるわずかな変化は、化合物の溶離時間においてわずかな移行をもたらすが、しかし全ての調製物において、グリシンアミドの２つの主な集団、即ちカラムから迅速に溶離した第一集団（高速ピーク、分画２〜３または分画３〜４、あるいは放射標識化Ｇ−ＮＨ2中の不純物、または修飾Ｇ−ＮＨ2と呼ばれる）と、カラムに強力に結合される第二集団（低速ピーク、分画１３〜１４または分画１５〜１７またはＧ−ＮＨ2と呼ばれる）が検出された。例えば修飾Ｇ−ＮＨ2を単離するための別のプロトコールも、緩衝液Ａ（５ｍＭのリン酸アンモニウム、ｐＨ３．５）および緩衝液Ｂ（２５０ｍＭのリン酸アンモニウム、ｐＨ３．５）を用いた。これらの緩衝液とともに用いた勾配を以下に示す。１０分間、緩衝液Ａ；緩衝液Ｂへの直線勾配、６分間；緩衝液Ｂで２分間；次に緩衝液Ａへの直線勾配、６分間；ならびに緩衝液Ａ中で６分間平衡化。このアプローチにより、同様にＧ−ＮＨ2および放射標識化Ｇ−ＮＨ2中の不純物は、それぞれ１０〜１１分および２〜３分で溶離した。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
この実施例では、市販Ｇ−ＮＨ2を精製するためのアプローチが提供される。このアプローチの変法を用いて、下記のように修飾グリシンアミドを精製した。多数の異なる陽イ
オン交換カラムがこれらの手法のために利用可能であり、かつ多数の異なる緩衝液および勾配が用いられ得る、と理解されるべきである。本明細書中の開示を考えれば、当業者は特定の型の陽イオン交換カラム、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣ、緩衝液または勾配を迅速に適用して、修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）を単離し得る。即ち上記の手法の変法は当該技術分野の範囲内であり、かつ本明細書中に記載した方法と等価である。
【００７７】
以下の節で考察されるように、種々の血清または血漿中で非修飾Ｇ−ＮＨ2をインキュベートすることにより、修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）は非修飾Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）から作製され得る、ということが発見された。このようにして作製される（酵素的に調製される）修飾Ｇ−ＮＨ2はしたがって、上記のアプローチのうちの１つを用いて単離され得る。構造分析における慣用的技法を用いて、上記のクロマトグラフィー手法により単離された修飾Ｇ−ＮＨ2はα−ヒドロキシグリシンアミドを含む、ということが確定された。
【００７８】
最初に、ウシ胎仔血清を含有する細胞培地を９５℃で３０分間加熱する場合、ＨＩＶの複製を抑制するＧ−ＮＨ2の能力は損失される、ということが観察された。いくつかの実施形態では、ヒトＴリンパ球ＣＥＭ細胞（約４．５×１０5細胞／ｍｌ）を新鮮な培地中に懸濁し、約１００  ＣＣＩＤ50／細胞懸濁液１ｍｌでＨＩＶ−１（ＩＩＩB）に感染させた。その後、感染細胞に、ＲＰＭＩ−１６４０培地を含む血清（ＰＢＳ中の１０％ウシ胎仔血清）に溶解された種々の濃度のＧ−ＮＨ2またはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む熱不活性化血清（９５℃に３０分間加熱されていたＰＢＳ中の１０％ウシ胎仔血清）に溶解されたＧ−ＮＨ2を与えた。次に細胞再懸濁液を３７℃でインキュベートし、４〜５日後に、ＨＩＶ複製を評価した。熱不活性化血清含有培地中でインキュベートされていたＧ−ＮＨ2は、ＨＩＶの複製を抑制するその能力を損失していた、ということが発見された。これらの結果は、血清中に存在する熱不安定性タンパク質がＧ−ＮＨ2をＨＩＶの複製を抑制する修飾Ｇ−ＮＨ2形態に代謝する、という強力な証拠を提供した。
【００７９】
ウシ胎仔血清中に存在する熱不安定性補因子（単数または複数）がＧ−ＮＨ2を抗レトロウイルス活性形態のグリシンアミドに転化するという発見の後、この補因子（単数または複数）がヒト血清および他の動物からの血清中に存在するか否かを確定するために実験を実行した。以下の実施例は、これらの実験をさらに詳細に説明する。
【実施例４】
【００８０】
数ロットのヒト血清およびウシ胎仔血清を、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化するそれらの能力に関して分析した。放射標識化陽イオン交換ＨＰＬＣ精製Ｇ−ＮＨ2（実施例３を参照）を、３７℃で１５分間および１、６、２４または７２時間、ＰＢＳ中１０％最終濃度で種々の血清とともにインキュベートした。その後、上記の陽イオン交換ＨＰＬＣアプローチを用いて、放射標識化修飾Ｇ−ＮＨ2の量を評価した。結果を図７に示す。１０の異なるヒト血清試料の各々は、２４時間のインキュベーション後、修飾Ｇ−ＮＨ2へのＧ−ＮＨ2の１０％未満の転化を示した。試験したウシ胎仔血清は全て、６時間（６〜１０％）および２４時間（１８〜３２％）のインキュベーション後に、修飾Ｇ−ＮＨ2へのＧ−ＮＨ2の十分な転化を示した。結果は、ウシ胎仔血清は、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に十分に代謝する補因子（単数または複数）を含有するが、しかしヒト血清はそうではない、ということを確証した。
【００８１】
次に、他の動物から得られた血清の評価を、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化するそれらの能力に関して分析した。ブタ（ＰＳ）、マウス（ＭＳ）、イヌ（ＣＳ）、ネコ（ＦＳ）、ウマ（ＥＳ）およびサル（ＳＳ）から得られた血清を、ＨＰＬＣ精製Ｇ−ＮＨ2とともに、１５分間、１時間、６時間および／または２４時間インキュベートし、混合物のアリコートを取り出して、上記のように陽イオン交換ＨＰＬＣにより分析した。ＰＢＳ中の
約１０％希釈血清を用いた。図８に示したように、ブタ、イヌ、ネコ、ウマおよびサルから得られた血清はＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に迅速に転化したが、一方、マウス血清はＧ−ＮＨ2を十分に代謝しなかった。数種類の動物はＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に代謝し得るが、しかしＧ−ＮＨ2を代謝する補因子（単数または複数）の能力はヒトおよびマウスにおいては進化的に保存されていない、ということをデータは示した。
【００８２】
ブタ血漿中に見出される補因子（単数または複数）をより良好に特性化するためのいくつかの実験も実施した。１組の実験では、ブタ血漿を透析し（ＭＷカットオフ１０，０００）、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する能力に関して透析物を評価した。種々の濃度のＧ−ＮＨ2を９０％ブタ血漿または９０％透析ブタ血漿と混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、混合物のアリコートを上記のように陽イオン交換ＨＰＬＣにより分離し、Ｇ−ＮＨ2の修飾Ｇ−ＮＨ2への転化を評価した。表７は、これらの実験の結果を示す。データより、Ｇ−ＮＨ2の修飾Ｇ−ＮＨ2への転化は、ブタ血漿および透析ブタ血漿試料の両方においてほとんど同じであった。ブタ血漿（ＰＢＳ中９０％）中の補因子（単数または複数）の酵素活性の飽和は、１，０００μＭ〜１０，０００μＭのＧ−ＮＨ2間で起きた。これらの結果は、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に代謝する補因子（単数または複数）は血漿または血清中に見出されるタンパク質である、というより多くの証拠を提示した。
【００８３】
【表７】
2006518373.tif 000015
【００８４】
別の組の実験では、透析ブタ血漿中に見出される補因子（単数または複数）の飽和点をより細かく精査した。透析ブタ血漿（ＰＢＳ中９０％）を、２，０００μＭ〜１０，０００μＭの濃度のＧ−ＮＨ2と混合した。その後、混合物を３７℃で６時間インキュベートし、上記と同様に陽イオン交換ＨＰＬＣによりアリコートを分離した。表８に示した結果は、ブタ血漿中の補因子（単数または複数）の飽和点がほぼ２，０００μＭ  Ｇ−ＮＨ2である、ということを確証した。
【００８５】
【表８】
2006518373.tif 000016
【００８６】
ブタ血清中に存在する補因子（単数または複数）がＧ−ＮＨ2に特異的であるか否かを確定するために、アミノ酸競合試験も用いた。これらの実験では、１８μＭのＧ−ＮＨ2および競合物（１０μＭ、４０μＭ、１００μＭ、４００μＭ、１，０００μＭ、４，０００μＭまたは１０，０００μＭグリシン、１０，０００μＭ  Ｌ−セリン−ＮＨ2、１０，０００μＭ  Ｌ−アラニン−ＮＨ2、１，０００μＭ、４，０００μＭまたは１０，０００μＭ  ＧＰＧ−ＮＨ2）の存在下で、ＰＢＳ中の約１０％のブタ血清を、３７℃で６時間インキュベートした。競合物を伴わない対照も評価した。その後、Ｇ−ＮＨ2の修飾Ｇ−ＮＨ2への転化を、上記と同様に陽イオン交換ＨＰＬＣにより分析した。図９に示した結果は、ブタ血清中に存在する補因子（単数または複数）はＧ−ＮＨ2に特異的である、という証拠を提供したが、ＧＰＧ−ＮＨ2もＧ−ＮＨ2転化に及ぼす抑制作用を有すると考えられる。
【００８７】
ある種の血清がＧ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化し得る補因子（単数または複数）を含有する、ということを一旦確証したので、補因子（単数または複数）を単離するための実験を実行した。以下の実施例は、これらの実験をさらに詳細に説明する。
【実施例５】
【００８８】
Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する補因子（単数または複数）を単離するよう意図された第１組の実験では、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200）を用いて、ウシ胎仔血清中に存在する構成成分を分離した。分離は、ミリＱ水中で６０分間で行い、そして３０分画（０．５ｍｌ／分）を収集した。ＨＰＬＣ精製Ｇ−ＮＨ2とともに単離分画のアリコートをインキュベートし、その後、陽イオン交換ＨＰＬＣにより確定される修飾Ｇ−ＮＨ2の存在または非存在を分析することにより、種々の分画中の補因子（単数または複数）の存在を確認した。図１０に示したように、補因子の大多数は、サイズ排除カラムから分画１０〜１２において溶離した。上記のようなＨＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィーにより修飾Ｇ−ＮＨ2の蓄積をモニタリングすることにより確定されるように、分画１０〜１２は、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に効率的に転化することが判明した。分画１０〜１２は、加熱血清中のＧ−ＮＨ2の抗ＨＩＶ活性を回復することも判明した。より後の分画中に検出される活性は、部分分解補因子または用いた樹脂と非特異的に相互作用した補因子の結果であり得る。このデータより、Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2に転化する補因子が単離された、ということを確証した。タンパク質精製および分子生物学における慣用的技法を用いて、補因子は精製され、シーケンシングされ、クローン化され得る。
【００８９】
血清とともにＧ−ＮＨ2をインキュベート後、クロマトグラフィーにより、陽イオン交換ＨＰＬＣを用いて修飾Ｇ−ＮＨ2をＧ−ＮＨ2から単離し（例えば実施例３を参照）、かつ精製修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）および精製Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）の抗ＨＩＶ活性を、慣用的ＨＩＶ感染検定で比較し得る。ＨＩＶ複製に及ぼす修飾グリシンアミド化合物（例えばα−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミド、および／またはその誘導体）の作用も、このようにして分析し得る。
【００９０】
例えば、上記のＨＩＶ感染検定を用いて、精製修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）、精製Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミドおよびα−エトキシグリシンアミドまたはその誘導体に関するＥＣ50を確定する。要するに、ヒトＴリンパ球ＣＥＭ細胞（約４．５×１０5細胞／ｍｌ）を新鮮な培地中に懸濁し、約１００  ＣＣＩＤ50／細胞懸濁液１ｍｌでＨＩＶ−１（ＩＩＩB）に感染させた。次に１００μｌの感染
細胞懸濁液をマイクロタイタープレートの個々のウェルに移し（１００μｌ／ウェル）、１００μｌの新たに希釈した修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）、Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミドまたはその誘導体（２，０００、４００、８０、１６、３．２または０．６２μＭ）と混合した。その後、混合物を３７℃でインキュベートする。４〜５日後に、巨細胞形成をＣＥＭ培養中で顕微鏡を用いて記録した。次に５０％有効濃度（ＥＣ50）を確定する。
【００９１】
この組の実験からの結果は、修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミドまたはその誘導体が、Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）に匹敵するかまたはそれより低いＥＣ50を有する、ということを示す。例えば修飾Ｇ−ＮＨ2、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミドおよび誘導体は約２５μＭ以下のＥＣ50を有するが、一方、Ｇ−ＮＨ2は約３０μＭのＥＣ50を有する。これらの実験は、Ｇ−ＮＨ2が、活性形態の抗ウイルス剤である修飾Ｇ−ＮＨ2に代謝される、という証拠を提供する。
【００９２】
別の例として、熱不活性化血清（９５℃で３０分）またはヒト血清含有培地中のＨＩＶの複製を抑制する修飾Ｇ−ＮＨ2の能力を比較する。ヒトＴリンパ球ＣＥＭ細胞（例えば約４．５×１０5細胞／ｍｌのＣＥＭ細胞）をウシ胎仔血清を含有する新鮮な培地中に懸濁し、約１００  ＣＣＩＤ50／細胞懸濁液１ｍｌでＨＩＶ−１（ＩＩＩB）に感染させる。次に感染細胞をＰＢＳ中で洗浄し、９５℃で３０分間加熱された１０％ウシ胎仔血清を、またはヒト血清を含有する培地中に再懸濁する。次に１００μｌの感染細胞懸濁液をマイクロタイタープレートの個々のウェルに移し（１００μｌ／ウェル）、１００μｌの新たに希釈した精製修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミドまたはその誘導体、あるいは精製Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）（例えば２，０００、４００、８０、１６、３．２または０．６２μＭ）と混合する。その後、混合物を３７℃でインキュベートする。インキュベーションの４〜５日後に、巨細胞形成を培養中で顕微鏡を用いて記録する。次に５０％有効濃度（ＥＣ50）を確定する。この組の実験からの結果は、精製修飾Ｇ−ＮＨ2（分画２〜３）、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、ジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミドまたはその誘導体が煮沸ウシ胎仔血清またはヒト血清試料中のＨＩＶの複製を効率的に抑制するが、一方、精製Ｇ−ＮＨ2（分画１５〜１７）はそうではない、ということを示す。以下の実施例は、酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸ）がＨＩＶの複製を有効に抑制することを実証した実験を記載する。
【実施例６】
【００９３】
修飾グリシンアミドを酵素的に生成し、単離し、そしてＨＩＶの複製を抑制するその能力に関して分析した。透析チューブ（３，５００ｋＤ分子量カットオフ）をＰＥＳＴ緩衝液（ストレプトマイシンおよびペニシリンを含有するＲＰＭＩ）と蒸留水中で、室温で３０分間振盪した後、２％重炭酸ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡ中で、６０℃で３０分間振盪した。透析チューブをＰＥＳＴと蒸留水中で２回すすいだ。その後、透析チューブ
をＰＥＳＴと蒸留水中で５分間煮沸した。煮沸後、ＰＢＳ＋ＰＥＳＴを充填したビーカーに透析チューブを移し、使用するまで＋４℃で保存した。
【００９４】
煮沸後２０日目に透析チューブを用いた。滅菌ベンチ内で、透析チューブを滅菌および脱イオン水で洗浄した。約１０ｍｌのブタ血清（Promeda corp.）を透析チューブに添加した。透析チューブを、２００ｍｌのＰＢＳ−Ａ／ＰＥＳＴ（１ｍｌのＰＥＳＴ＋１ＬのＰＢＳ−Ａ）を充填したガラスビーカー中に入れた。ビーカーを滅菌ベンチから取り出して、オービタルシェーカー上に載せた。１時間後、ＰＢＳ−Ａ／ＰＥＳＴを２００ｍｌの新鮮なＰＢＳ−Ａと置き換えた＝「予洗」。透析チューブを上記と同様に５部のＰＢＳ−Ａで５回予洗した。予洗後、血清を含有する透析チューブを、１００ｍｌの滅菌濾過１ｍＭグリシンアミド（Bachem）および磁気撹拌棒を入れた滅菌ガラス瓶に移した。グリシンアミドおよび血清を含有する瓶を、磁気撹拌プレート上で３７℃でインキュベートした。約４８時間後、透析を停止し、透析溶液を３部分に分け（１０ｍｌ＋３８ｍｌ＋５０ｍｌ）、ラベルを貼ったガラス瓶に移して、これを密封し、−８５℃で凍結させた。次に凍結透析溶液の一部を凍結乾燥した。
【００９５】
凍結乾燥系（真空油（Heto 88900100）、Milli-Q水、水精製設備、凍結乾燥機および−８５℃冷凍機）を準備した。凍結透析溶液（１−１からの３８ｍｌ部分）を−８５℃冷凍機から凍結乾燥小室に移した。蓋を小室の上に載せて、真空をオンにした。約７２時間後に、凍結乾燥工程を停止した。真空をオフにして、ガラス瓶を凍結乾燥小室から取り出した。
【００９６】
次にＨＰＬＣにより凍結乾燥物質を精製した。ＫＨ2ＰＯ4  ２７．２２ｇを計量し、２Ｌの水中にそれを溶解する（ｐＨ〜４．０６）ことにより、約２Ｌの０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4（Merck１４８７３−２５０／ロット番号：Ａ３９７３７３２５１）を調製した。カラム（Hypersil SCXイオン交換カラム５μｍ／２５０×１０ｍｍ（ThermoQuest ３−３４０８７／バッチ番号：５／１００／５５８０）およびＨＰＬＣ系−ソフトウェアＤ−７０００ＨＳＭを含む）を移動相（９０％  ０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4／１０％アセトニトリル（Scharlau  ＡＣ０３２９／バッチ番号：５７０４８））で、５ｍｌ／分で６０分間、平衡化した。ＵＶ検出器波長を２０６ｎｍに設定した。乾燥透析「試料」を水２ｍｌ中に溶解し（１９ｍＭのグリシン−アミドが透析開始時に存在した）、注入し、５ｍｌ／分で移動相のイソクラティック実行（上記を参照）で分析した（実行−１）。実行１に関する注入容積は約１００μｌであった。
【００９７】
検量後、２００μｌの試料を９回以上注入し（実行２→１０）、そして２．５〜３．１分で溶離する分画を、０．１分／分画の時間モード収集設定を用いて、各実行に関して収集した。実行−８および９の間、ＫＨ2ＰＯ4  １３．６１ｇを計量し、１Ｌの水中にそれを溶解することにより、１Ｌの０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4を調製した。実行２→１０で収集された対応する分画をプールし、カラム全体に注入した（実行１１→１６）。実行１１→１６において、各注入量は約１００μｌであった。分画を２．６〜２．８分の間に収集し、プールした。元のグリシンアミドの量および収集ピークの面積から確定した場合、約１．２５ｍｇの修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）を得た。７．５ｍｌの移動相（９０％
０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4／１０％アセトニトリル）のプールされた２．６〜２．８分分画を、ラベルを付したガラス瓶に移し、これを密封して、−８５℃で凍結させた。さらに７．５ｍｌの移動相を、塩対照として、−８５℃で凍結させた。ＨＰＬＣ分析は、全ての検出可能なグリシンアミド（保持時間〜５．９分）が修飾グリシンアミドに転化されていた（〜２．７分）、ということを明示した。分析／精製後、カラムを４０％アセトニトリル／水で、５ｍｌ／分で３１分間洗浄し、そして上記のアプローチを用いて、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（「メタボライトＸ」）を凍結乾燥した。
【００９８】
次に、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（ＭｅｔＸ）を用いて、ＨＩＶ感染検定を実施した。凍結乾燥ＭｅｔＸ（１．２５ｍｇ）を７．５ｍｌの滅菌蒸留水中に溶解した（２．２４ｍＭ  ＭｅｔＸ）。約３．７ｍｌの２．２４ｍＭ  ＭｅｔＸを４．８ｍｌの各正常および煮沸ＲＰＭＩ＋＋（１０％ＦＣＳおよび０．１％ＰＥＳＴを有するＲＰＭＩ培地）と混合した。即ち、２組の１ｍＭ  ＭｅｔＸ８．５ｍｌを調製した。次に約３ｍｌの１ｍＭ  ＭｅｔＸを正常および煮沸ＲＰＭＩ＋＋（即ち、２×６ｍｌの５００μＭ  ＭｅｔＸ）と混合した。次に約１ｍｌの５００μＭ  ＭｅｔＸを正常および煮沸ＲＰＭＩ＋＋の各々４ｍｌと混合して、２×５ｍｌの１００μＭ  ＭｅｔＸを産生した。上記のＭｅｔＸと全く同じに凍結乾燥塩対照を溶解し、希釈した。非修飾グリシンアミドの１ｍＭストック溶液も、同様にＭｅｔＸに関して記載したように、正常および煮沸ＲＰＭＩ＋＋（対照）中に１００μＭグリシンアミドを調製するために用いた。
【００９９】
３つのＡ平方のBurkeチャンバー（１．２×１０6細胞／ｍｌ、これは３．３ｍｌ中に４×１０6細胞）中で、Ｈ９細胞を計数した。約４×１０6細胞（３．３ｍｌ）を２つの５０ｍｌチューブに添加した。次に約１４．７ｍｌの正常ＲＰＭＩ＋＋を第一チューブに添加し、そして約１４．７ｍｌの煮沸ＲＰＭＩ＋＋を第二チューブに添加した（即ち、１８ｍｌのＨ９細胞プラス正常／煮沸ＲＰＭＩ＋＋）。次に約２ｍｌのウイルスストック（ＳＦ２＋Ｈ９、９日目：２２／３−０２  ２）を、細胞および培地を約２０ｍｌ含有する各５０ｍｌチューブに添加し、そして溶液を混合した。２つのウイルス／細胞混合物を２つの新しい５０ｍｌチューブに分割した（即ち、１０ｍｌの細胞／ウイルスを有する４つのチューブ（正常ＲＰＭＩ＋プラスを有する２つのチューブおよび煮沸ＲＰＭＩ＋プラスを有する２つのチューブ））。細胞／ウイルスチューブを、３７℃で９０分間インキュベートし、５０分後から攪拌した。細胞を収集する（１，２００ｒｐｍで５分）ことにより、感染を停止させた。次に細胞を再懸濁し、１２本の１０ｍｌ透析チューブに移した（０．５×１０6細胞／透析チューブ）。即ち、正常ＲＰＭＩ＋＋中に懸濁された細胞の６本の透析チューブおよび煮沸ＲＰＭＩ＋＋中に懸濁された細胞の６本の透析チューブ。細胞をＲＰＭＩ（添加剤なし）で洗浄し、収集した（１，５００ｒｐｍで５分）。上清を廃棄し、以下の各々４．５ｍｌ中に細胞を再懸濁した：
・正常ＲＰＭＩ＋＋
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋
・正常ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭグリシンアミド
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭグリシンアミド
・正常ＲＰＭＩ＋＋中５００μＭＭｅｔＸ
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中５００μＭＭｅｔＸ
・正常ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭＭｅｔＸ
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭＭｅｔＸ
・正常ＲＰＭＩ＋＋中５００μＭ塩
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中５００μＭ塩
・正常ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭ塩
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭ塩
【０１００】
約０．９ｍｌ／ウェルの各細胞懸濁液（各４反覆）を４８ウェルプレートに以下のように添加した。
プレート１
・正常ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭグリシンアミド  ４ウェル
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭグリシンアミド  ４ウェル
・正常ＲＰＭＩ＋＋中５００μＭＭｅｔＸ  ４ウェル
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中５００μＭＭｅｔＸ  ４ウェル
・正常ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭＭｅｔＸ  ４ウェル
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中１００μＭＭｅｔＸ  ４ウェル
プレート２
・非処理正常ＲＰＭＩ＋＋  ４ウェル
・非処理煮沸ＲＰＭＩ＋＋  ４ウェル
・正常ＲＰＭＩ＋＋中「１００μＭ」塩  ４ウェル
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中「１００μＭ」塩  ４ウェル
・正常ＲＰＭＩ＋＋中「５００μＭ」塩  ４ウェル
・煮沸ＲＰＭＩ＋＋中「５００μＭ」塩  ４ウェル
【０１０１】
残りのウェルを、滅菌蒸留水で充填した。細胞培養プレートを、３７℃で５％ＣＯ2でインキュベートした。４日後、培地を取り替え、８日後に培地を取替え、そして細胞を収集した。１１日後、感染を停止させて、倍率１０倍の顕微鏡で細胞を見て、６５０μｌの各細胞上清を収集し、さらなる分析のために−８０℃で凍結した。５日以上後に、上清を解凍し、慣用的逆転写酵素（ＲＴ）活性検定（例えばRoche AMPLICOR MONITOR（登録商標））またはｐ２４定量検定（例えばAbbott Laboratories, Chicago）に用いた（米国特許第６，２５８，９３２号および米国特許出願１０／２３５，１５８号を参照）。結果を図１１および表９に示す。
【０１０２】
【表９】
2006518373.tif 000017
【０１０３】
視覚的検査により、修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）は煮沸ウシ胎仔血清中のＨＩＶの複製および／または増殖を有効に抑制したが、しかしグリシンアミドはそうではなかった（表９）。逆転写酵素（ＲＴ）活性データ（図１１）は、Ｇ−ＮＨ2がこれらの条件下でＨＩＶの複製を抑制できない場合でも、修飾グリシンアミド（Ｍｅｔ−ＸまたはメタボライトＸ）が煮沸ウシ胎仔血清試料中のＨＩＶの複製を有効に抑制する、ということを確証した。即ち、修飾グリシンアミド（ＭｅｔＸ）の抗ウイルス活性は、ウシ胎仔血清中に存在する補因子（単数または複数）を必要としないが、しかしグリシンアミドは必要とする。このデータは、ウシ胎仔血清の加熱が、グリシンアミドを修飾グリシンアミドに転化する酵素（補因子（単数または複数））を変性した、ということも示す。
【０１０４】
別の組の関連実験では、５回透析されていたメタボライトＸの抗レトロウイルス活性を、上記のアプローチにより調製されたメタボライトＸと比較した。要するに、５回透析メ
タボライトＸおよび上記のアプローチにより調製されたメタボライトＸを用いて、上記のようにウシ胎仔血清中のＧ−ＮＨ2を用いて、ＨＩＶ感染検定を実施した。これらの実験の結果を、図１２に示す。酵素的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸ）の標準調製物と比較した場合の５回透析α−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸ）の活性における有意の変化は、観察されなかった。
【０１０５】
上記の酵素的アプローチに従って得られた修飾グリシンアミドは、質量分光分析およびＮＭＲにより分析されており、そして構造分析は、α−ヒドロキシグリシンアミド（「α−ＨＧＡ」）を明示した。したがってこの実施例における実験は、修飾グリシンアミド（α−ヒドロキシグリシンアミドまたはメタボライトＸ）が、Ｇ−ＮＨ2の抗レトロウイルス活性に必要とされるウシ胎仔血清中に存在する補因子（単数または複数）の非存在下で、ＨＩＶの複製を有効に抑制する、ということを示している。α−ヒドロキシグリシンアミド（「α−ＨＧＡ」）は、合成的にも調製されており、そして下記のように、補因子（単数または複数）の非存在下でＨＩＶ複製を抑制することも判明した。
【０１０６】
さらに多くの実験において、ウシ胎仔血清を含有する細胞培養中で、メタボライトＸの５０％抑制濃度（ＩＣ50）を分析した。以下の実施例は、これらの実験をさらに詳細に説明する。
【実施例７】
【０１０７】
約０．１×１０6個のＨ９細胞を５０  ＴＣＩＤ50  ＨＩＶ（ＳＦ２ウイルス）に感染させて、感染細胞を種々の濃度の酵素的に調製されたメタボライトＸで処理した（実施例６を参照）。ウシ胎仔血清を検定に包含した。細胞を１０日間培養し（７日目に新鮮な培地を培養に添加した）、その後、上清を収集し、慣用的逆転写酵素（ＲＴ）定量検定により分析した。データを図１３に示す。結果は、ＨＩＶ複製の有効な抑制が低濃度のメタボライトＸ（例えば３．９μＭ〜１５．６μＭ）で起こり、そして濃度が１５．６μＭまたはそれ以上に達すると、ＨＩＶ複製の抑制が事実上完了する、ということを示す。
【０１０８】
さらに多くの実験において、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）をＨＩＶ感染Ｈ９細胞（ＳＦ２ウイルス）とともにインキュベートし、電子顕微鏡により処理ウイルスの形態を分析に付した。陽性対照として、ＧＰＧ−ＮＨ2を用いた（これらの種類の電子顕微鏡実験を実施するためのアプローチに関しては、米国特許第６，２５８，９３２号を参照）。以下の実施例は、これらの実験をさらに詳細に説明する。
【実施例８】
【０１０９】
一アプローチにより、ブタ血清に対する精製Ｇ−ＮＨ2の透析により（実施例６を参照）修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）を酵素的に調製した；次に修飾グリシンアミドを用いて、ＨＩＶ（ＳＦ２ウイルス）感染Ｈ９細胞を処理し、電子顕微鏡により感染細胞を分析に付した。要するに、透析チューブ（３５００ＭＷカットオフ−スペクトル）にブタ血清（Biomedia）を投入して、ブタ血清をＲＰＭＩ  １６４０緩衝液に対して４回、各１時間予備透析して、３５００ダルトン未満である分子を除去した。次に予洗血清をＲＰＭＩ  １６４０中の１ｍＭの精製Ｇ−ＮＨ2に対して３７℃で４８時間透析した。実施例６に記載したように、修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）を含有する透析緩衝液を次に滅菌濾過し、分注して、凍結した。
【０１１０】
次に、ＲＰＭＩ（ウシ胎仔血清を含有）１０ｍｌ中の約０．５×１０6個のＨ９細胞を含有する（各々）４つの瓶中に、１００μｍのメタボライトＸまたは１００μＭのＧＰＧ−ＮＨ2濃度を確立した。試料中の細胞を計数し、次に遠心分離した。次に細胞をＲＰＭＩ  １６４０（ウシ胎仔血清を含有）１０ｍｌならびに１００μｍのメタボライトＸまたは１００μＭのＧＰＧ−ＮＨ2中に再懸濁した。非感染対照および非処理対照試料も実験
に含まれた。次に試料を３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
【０１１１】
次に、慣用的ｐ２４検出検定を用いて、試料中のｐ２４の量を分析した（米国特許第６，２５８，９３２号を参照）。図１４に示したように、１００μＭ修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）または１００μＭ  ＧＰＧ−ＮＨ2はウシ胎仔血清の存在下でＨＩＶ複製を有効に抑制した。一方、非処理対照試料は、容易に感知可能なＨＩＶ複製を示した。慣用的逆転写酵素（ＲＴ）活性検定により、これらの結果を確証したが、これは、非処理対照試料における容易に感知可能量の逆転写酵素活性を示したが、しかし１００μＭ修飾グリシンアミドまたは１００μＭ  ＧＰＧ−ＮＨ2で処理した試料中の逆転写酵素活性は示さなかった。１００μＭ修飾グリシンアミドまたは１００μＭ  ＧＰＧ−ＮＨ2で処理した試料が抑制されたウイルスを含有することが立証されたので、試料を電子顕微鏡による分析に付した。
【０１１２】
一アプローチにより、ＳＦ２ウイルスに感染したＨ９細胞を、慣用的手段により２．５％グルタルアルデヒド中に固定した。次に固定細胞を１％ＯｓＯ4中で後固定し、脱水して、エポキシ樹脂に包埋し、ブロックを重合させた。ヌクレオキャプシドの幅に合わせて、ウイルス感染細胞のエポン切片を約６０〜８０ｎｍ薄片に作製した。切片をグリッドに載せて、１．０％酢酸ウラニルで染色し、加速電圧８０ｋＶで、ツァイスＣＥＭ９０２顕微鏡で分析した。顕微鏡は画質を改良するための分光計を装備し、そしてビーム損傷を低減するために液体窒素冷却トラップを用いる。対照ＧＰＧ−ＮＨ2インキュベート細胞およびメタボライトＸインキュベート細胞の切片を有するグリッドを、いくつかの盲検で検査する。
【０１１３】
非処理ＨＩＶ粒子の電子顕微鏡知見は、特徴的円錐形ヌクレオキャプシド、ならびにヌクレオキャプシドの長さに伸びる包入均一染色ＲＮＡを示す。一方、ＧＰＧ−ＮＨ2またはメタボライトＸで処理されるＨＩＶ−１粒子を有する細胞は、相対的に完全であるように見える円錐形キャプシド構造を有するＨＩＶ粒子を示すが、しかしＲＮＡがキャプシドの外側またはキャプシドの上部（幅広端）に球様形状で集積された。ＧＰＧ−ＮＨ2またはメタボライトＸ処理試料からのいくつかのキャプシドは、正常ヌクレオキャプシドと似た形態をほとんどまたは全く有さない奇形構造を有することが観察され、ＲＮＡは構造物の外側に、または構造物の内側の一端に存在し得る。
【０１１４】
さらなる実験では、Ｇ−ＮＨ2、ＧＰＧ−ＮＨ2、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）および合成的に調製された修飾グリシンアミド（α−ＨＧＡ）の抗レトロウイルス活性を比較した。以下の実施例は、これらの実験をさらに詳細に説明する。
【実施例９】
【０１１５】
上記実施例に記載したように（実施例６〜８を参照）、ウシ胎仔血清の存在下でＨＩＶ感染検定を実施したが、しかしながら種々の濃度のＧ−ＮＨ2、ＧＰＧ−ＮＨ2および酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）、ならびに１００μＭの合成的生成修飾グリシンアミド（α−ＨＧＡ）を用いた（表１０を参照）。非感染試料および非処理試料の３回反覆試験物試料（「レプリカ試験物」）も、対照として実験に含めた。慣用的検出キットを用いて、ｐ２４のレベルを定量することにより、ＨＩＶ複製の抑制をモニタリングした。
【０１１６】
【表１０】
2006518373.tif 000018
【０１１７】
図１５は、これらの実験の結果のいくつかを示す。示したように、実験１１日目に、合成的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）は、ウシ胎仔血清含有倍地中のＧＰＧ−ＮＨ2と同様に有効にＨＩＶを抑制した。同様の結果は、７日目にも観察された。このデータは、合成的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）がＨＩＶ複製を有効に抑制する、ということを実証する。
【０１１８】
さらなる実験では、酵素的に調製されたおよび合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミドの抗レトロウイルス活性を、ヒトまたはウシ胎仔血清の存在下で、比較した。以下の実施例は、これらの実験をさらに詳細に説明する。
【実施例１０】
【０１１９】
上記実施例に記載したように（実施例６〜８を参照）、ヒト血清またはウシ胎仔血清の存在下でＨＩＶ感染検定を実施したが、しかしながら種々の濃度のＧ−ＮＨ2、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）、ならびに１００μＭの合成的生成修飾グリシンアミド（α−ＨＧＡ）を用いた（表１１および１２を参照）。非感染試料および非処理試料の３回反覆試験物も、対照として実験に含めた。
【０１２０】
【表１１】
2006518373.tif 000019
【０１２１】
【表１２】
2006518373.tif 000020
【０１２２】
これらの実験の結果を、表１３および１４に、ならびに図１６Ａおよび１６Ｂに提示する。１２日目に、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）ならびに合成的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）はウシ胎仔血清含有培地中のＧ−ＮＨ2と同様に有効にＨＩＶ複製を抑制したが、しかしながら酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）および合成的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）のみがヒト血清中でのＨＩＶ複製を抑制し得た、ということをデータは示す。即ちＧ−ＮＨ2はヒト血清中でのＨＩＶ複製を抑制できなかったが、しかし酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）および合成的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）はともに、ヒト血清中でのＨＩＶ複製の有効な阻害剤であった。同様の結果は、７日目に観察された。このデータは、酵素的に調製された修飾グリシンアミド（メタボライトＸ）および合成的生成α−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）がと
もに、感染ヒトにおけるＨＩＶ複製の強力な阻害剤である、という強力な証拠を提供する。
【０１２３】
【表１３】
2006518373.tif 000021
【０１２４】
【表１４】
2006518373.tif 000022
【０１２５】
別のシリーズの実験では、３７℃での長期加熱に対する合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）の安定性を分析した。合成α−ＨＧＡ（Ｃ2Ｈ7ＣｌＮ2Ｏ2）の希釈試料を３７℃で一定期間インキュベートし、次にインキュベートされた化合物の抗レトロウイルス活性を新たに希釈したα−ＨＧＡの活性と比較した。これらの実験を、以下の実施例でさらに詳細に説明する。
【実施例１１】
【０１２６】
上記実施例に記載したように（実施例６〜８を参照）、ウシ胎仔血清の存在下でＨＩＶ感染検定を実施したが、しかしながら種々の濃度のＧ−ＮＨ2、合成的生成修飾グリシンアミド（α−ＨＧＡ）、ならびに３７℃で３日間インキュベートされていた合成的生成修飾グリシンアミド（α−ＨＧＡ  ３７）を用いた（表１５を参照）。非感染試料および非処理試料の３回反覆試験物も、対照として実験に含めた。
【０１２７】
【表１５】
2006518373.tif 000023
【０１２８】
これらの実験の結果を、図１７および表１６に示す。図１７は、７日目に検出されたＲＴ活性のプロットを示す。同様の結果は、ＲＴ活性が１１日目に分析された場合に観察された。データは、合成的に調製されたα−ＨＧＡが３７℃で少なくとも３日間のインキュ
ベーションに対して安定である、ということを示す。新たに希釈されたα−ＨＧＡとインキュベート化合物の抗レトロウイルス活性における非常に小さな差異が観察された。さらにこれらのデータは、ＨＩＶ複製の容易に感知可能な抑制が８μＭより高い濃度で合成α−ＨＧＡ（熱処理してもしなくても）を用いて起こり、より良好な抗レトロウイルス活性が１６μＭより高い濃度で観察され、そしてＨＩＶ複製に対する非常に効率的な抑制が３０μＭより高い濃度で認められた。興味深いことに、検定におけるウシ胎仔血清によるＧ−ＮＨ2の転化から生成されるメタボライトＸ（Ｇ−ＮＨ2試料に関するデータを参照）は、合成的精製α−ＨＧＡより活性であったが、このことは、α−ＨＧＡの一エナンチオマーおよび／または異性体が他のものより強い抗レトロウイルス活性を有する、という証拠を提供する。
【０１２９】
【表１６−１】
2006518373.tif 000024
【０１３０】
【表１６−２】
2006518373.tif 000025
【０１３１】
以下の節は、修飾グリシンアミドを含有する製剤の調製、ならびにＨＩＶの複製を治療し、予防しおよび／または抑制するためのこれらの組成物の使用を記載する。
【０１３２】
［ＨＩＶを抑制する化合物］
上記のように、Ｇ−ＮＨ2および修飾Ｇ−ＮＨ2のほかに、Ｇ−ＮＨ2のある種の誘導体および代謝産物はＨＩＶ複製を抑制し、そしてこれらの化合物は薬剤または製剤に処方され、これがＨＩＶ複製を抑制し、そしてＨＩＶ感染を治療および／または予防するために用いられ得る。いくつかの製剤または薬剤は、式Ａ：
【０１３３】
【化８】
2006518373.tif 000026
【０１３４】
（式中、
ａ）Ｅは、酸素、硫黄およびＮＲ7から成る群から選択され、
ｂ）Ｔは、酸素、硫黄およびＮＲ8から成る群から選択され、
ｃ）Ｒ1〜Ｒ8は、各々独立して、水素；任意置換アルキル；任意置換アルケニル；任意置換アルキニル；任意置換シクロアルキル；任意置換へテロシクリル；任意置換シクロアルキルアルキル；任意置換へテロシクリルアルキル；任意置換アリール；任意置換へテロアリール；任意置換アルキルカルボニル；任意置換アルコキシアルキル；および任意置換ペルハロアルキルから成る群から選択される）の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミド、エステルまたはプロドラッグから成るか、本質的にそれから成るか、またはそれを含む。
【０１３５】
したがって「修飾Ｇ−ＮＨ2または修飾グリシンアミド化合物」という用語は、細胞から濃縮されまたは単離されようが、あるいは合成的に調製されようが、グリシンアミドの誘導体および代謝産物、例えば本明細書中に記載したような式Ａのもの（例えばα−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）、α−メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミドおよび／またはその誘導体）を包含する。
【０１３６】
これらの化合物のいくつかは、上記のようにグリシンアミドを血清中でインキュベートしたのちにＨＰＬＣカラムから抽出され、そして質量分光分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析により同定された。これらの化合物および誘導体または関連化合物は、下記のように利用可能な出発物質から合成され得る。
【０１３７】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、それが投与される生物体に対する有意の刺激を引き起こさない、そして化合物の生物学的活性および特性を阻害しない化合物の処方物を指す。薬学的塩は、本発明の化合物を無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等と反応させることにより得られる。薬学的塩は、本発明の化合物を、塩基と反応させて、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム塩、有機塩基、例えばジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンの塩、ならびにアミノ酸、例えばアルギニン、リシン等との塩といったような塩を生成することによっても得られる。
【０１３８】
「エステル」という用語は、式−（Ｒ）n−ＣＯＯＲ’（式中、ＲおよびＲ’は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環により結合される）、および複素脂環式（炭素環により結合される）からなる群から選択され、そしてｎは０または１である）を有する化学的部分を指す。
【０１３９】
「アミド」とは、式−（Ｒ）n−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’または−（Ｒ）n−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’（式中、ＲおよびＲ’は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環により結合される）、および複素脂環式（炭素環により結合される）からなる群から選択され、そしてｎは０または１である）を有する化学的部分である。アミドは、本発明の分子に結合され、それによりプロドラッグを生成するアミノ酸またはペプチド分子であり得る。
【０１４０】
本発明の化合物上の任意のアミン、ヒドロキシまたはカルボキシル側鎖は、エステル化またはアミド化され得る。この目的を達成するために用いられる手法および特定の基は当業者に既知であり、そしてGreene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,
3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999といったような参考文献資料中に容易に見出され得る。
【０１４１】
「プロドラッグ」とは、in vivoで母体薬剤に転化される作用物質を指す。プロドラッ
グは、いくつかの場合に、それらは母体薬剤より投与するのが容易であり得るため、しばしば有用である。例えばそれらは経口投与により生物利用可能性があり得るが、一方、母体薬剤はそうではない。プロドラッグは、母体薬剤を上回る薬学的組成物中の溶解性または安定性の改善も示し得る。プロドラッグの一例は、水溶性が移動にとっては有害である細胞膜を横切る透過を促進するためにエステル（「プロドラッグ」）として投与され、次に水溶性が有益である細胞内部に一旦入ると活性実体であるカルボン酸に代謝的に加水分解される本発明の化合物であるが、これに限定されない。プロドラッグのさらなる例は、ペプチドが代謝されて活性部分を示す酸基に結合される短いペプチド（ポリアミノ酸）であり得る。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための慣用的手法は、例えばDesign of Prodrugs, (ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985)に記載されている。
【０１４２】
「芳香族」という用語は、共役ｐｉ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を指し、そして炭素環式アリール（例えばフェニル）および複素環式アリール基（例えばピリジン）の両方を包含する。本用語は、一環式または縮合環多環式（即ち、炭素原子の隣接対を共有する環）基を包含する。「炭素環式」という用語は、１つまたは複数の共有的閉環構造を含有し、そして環の主鎖を形成する原子が全て炭素原子である化合物を指す。したがって本用語は、環主鎖が炭素とは異なる少なくとも１つの原子を含有する複素環式から、炭素環式を区別する。「複素芳香族」という用語は、少なくとも１つの複素環式環を含有する芳香族基を指す。
【０１４３】
本明細書中で用いる場合、「アルキル」という用語は、脂肪族炭化水素基を指す。アルキル部分は、「飽和アルキル」基であり、これは、それが任意のアルケンまたはアルキン部分を含有しないことを意味する。アルキル部分は、「不飽和アルキル」部分でもあり、これは、それが少なくとも１つのアルケンまたはアルキン部分を含有することを意味する。「アルケン」部分は少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合から成る基を指し、そして「アルキン」部分は、少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合から成る基を指す。アルキル部分は、飽和であれ、不飽和であれ、分枝鎖、直鎖または環状であり得る。
【０１４４】
アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し得る（それが本明細書中に出てくるときはいつでも、「１〜２０」といったような数範囲は、各々所定範囲の整数を指す；例えば「１〜２０個の炭素原子」とは、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子・・・２０個までの炭素原子から成る、ということを意味するが、しかし本発明の定義は、数値範囲が明示されない「アルキル」という用語の出現も網羅する）。アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を有する中間サイズのアルキルでもあり得る。アルキル基は、１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルでもあり得る。本発明の化合物のアルキル基は、「Ｃ1-6アルキル」と呼ばれるかまたは同様の呼称であり得る。実例（例示のみ）として、「Ｃ1-6アルキル」は、アルキル鎖中に１〜６個の炭素原子が存在することを示し、即ちアルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル（直鎖または分枝鎖）およびヘキシル（直鎖または分枝鎖）から成る群から選択される。
【０１４５】
アルキル基は、置換または非置換であり得る。置換される場合、置換基（単数または複数）は、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、トリハロメタンスルホニル、ならびにアミノ、例えば一および二置換アミノ基、ならびにそれらの保護化誘導体から個別にそして独立して選択される１つまたは複
数の基である。典型的アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。置換基が「任意に置換される」と記載される場合はいつでも、その置換基は上記の置換基のうちの１つで置換され得る。
【０１４６】
それ自体そして数値を伴わずに出現する置換基「Ｒ」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環により結合される）および複素脂環式（炭素環により結合される）から成る群から選択される置換基を指す。
【０１４７】
「Ｏ−カルボキシ」基は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｏ−基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１４８】
「Ｃ−カルボキシ」基は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１４９】
「アセチル」基は、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3基を指す。
【０１５０】
「トリハロメタンスルホニル」基は、Ｘ3ＣＳ（＝Ｏ）2−基（式中、Ｘはハロゲンである）を指す。
【０１５１】
「シアノ」基は、−ＣＮ基を指す。
【０１５２】
「イソシアナト」基は、−ＮＣＯ基を指す。
【０１５３】
「チオシアナト」基は、−ＣＮＳ基を指す。
【０１５４】
「イソチオシアナト」基は、−ＮＣＳ基を指す。
【０１５５】
「スルフィニル」基は、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１５６】
「Ｓ−スルホンアミド」基は、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１５７】
「Ｎ−スルホンアミド」基は、ＲＳ（＝Ｏ）2ＮＨ−基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１５８】
「トリハロメタンスルホンアミド」基は、Ｘ3ＣＳ（＝Ｏ）2ＮＲ−基（式中、ＸおよびＲは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１５９】
「Ｏ−カルバミル」基は、−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１６０】
「Ｎ−カルバミル」基は、ＲＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１６１】
「Ｏ−チオカルバミル」基は、−ＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１６２】
「Ｎ−チオカルバミル」基は、ＲＯＣ（＝Ｓ）ＮＨ−基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１６３】
「Ｃ−アミド」基は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ2基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１６４】
「Ｎ−アミド」基は、ＲＣ（＝Ｏ）ＮＨ−基（式中、Ｒは本明細書中で定義されたものと同じである）を指す。
【０１６５】
「ペルハロアルキル」という用語は、水素原子が全てハロゲン原子により置換されるアルキル基を指す。
【０１６６】
本明細書の文脈では、「アリール」という用語は、炭素環式芳香族環または環系を意味するよう意図される。さらに「アリール」という用語は、少なくとも２つのアリール環、あるいは少なくとも１つのアリールおよび少なくとも１つのＣ3-8−シクロアルキルが少なくとも１つの化学結合を共有する縮合環系を包含する。「アリール」環のいくつかの例としては、任意置換フェニル、ナフタレニル、フェナントレニル、アントラセニル、テトラリニル、フルオレニル、インデニルおよびインダニルが挙げられる。「アリール」という用語は、環形成炭素原子のうちの１つを介して連結され、そして任意にヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、アルキルアミド、アシル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、Ｃ1-6アミノアルキル、Ｃ1-6アルキルアミノ、アルキルスルフェニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイルまたはトリフルオロメチルから選択される１つまたは複数の置換基を保有する芳香族、好ましくはベンゼノイド基に関する。アリール基は、パラおよび／またはメタ位置で置換され得る。アリール基の代表例としては、フェニル、３−ハロフェニル、４−ハロフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、３−アミノフェニル、４−アミノフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、４−トリフルオロメトキシフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、ジメチルフェニル、ナフチル、ヒドロキシナフチル、ヒドロキシメチルフェニル、トリフルオロメチルフェニル、アルコキシフェニル、４−モルホリン−４−イルフェニル、４−ピロリジン−１−イルフェニル、４−ピラゾリルフェニル、４−トリアゾリルフェニルおよび４−（２−オキソピロリジン−１−イル）フェニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本明細書の文脈では、「へテロアリール」という用語は、芳香族環中の１つまたは複数の炭素原子が、窒素、硫黄、リンおよび酸素から成る群から選択される１つまたは複数の異種原子で置換された複素環式芳香族基を意味するよう意図される。
【０１６８】
さらに本明細書の文脈では、「へテロアリール」という用語は、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環、少なくとも２つのヘテロアリール環、少なくとも１つのヘテロアリール環および少なくとも１つのヘテロシクリル環、あるいは少なくとも１つのヘテロアリール環および少なくとも１つのＣ3-8−シクロアルキル環が少なくとも１つの化学結合を共有する縮合環系を含む。
【０１６９】
「ヘテロアリール」という用語は、１個の酸素または硫黄原子または４個までの窒素原子、あるいは１個の酸素または硫黄原子と２個までの窒素原子の組合せ、そしてそれらの置換化、ならびに好ましくは環形成炭素原子のうちの１つにより連結されるベンゾ−およびピリド−縮合化誘導体をさらに含有する芳香族Ｃ3-8環式基に関すると理解される。ヘテロアリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、アルキルアミド、アシル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、Ｃ1-6アミノアルキル
、Ｃ1-6アルキルアミノ、アルキルスルフェニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイルまたはトリフルオロメチルから選択される１つまたは複数の置換基を保有し得る。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、上記のものから選択される同一であるかまたは互いに異なる０、１または２個の置換基を保有する５および６員芳香族複素環式系であり得る。ヘテロアリール基の代表例としては、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、ピロール、ピリジン、インドール、オキサゾール、ベンズオキサゾール、イソキサゾール、ベンズイソキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、インダゾール、テトラゾール、キノリン、イソキノリン、ピリダジン、ピリミジン、プリンおよびピラジン（これらは全て好ましい）、ならびにフラザン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、プテリジン、フェノキサゾール、オキサジアゾール、ベンゾピラゾール、キノリジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリンおよびキノキサリンの非置換および一または二置換誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、置換基はハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、Ｃ1-6−アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1-6−アルキル、アミノ−Ｃ1-6−アルキルである。
【０１７０】
本明細書の文脈では、「アルキル」および「Ｃ1-6−アルキル」という用語は、最長鎖が１〜６個の炭素原子を有する線状または分枝鎖飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびヘキシルを意味するよう意図される。アルキル鎖は、任意に置換され得る。
【０１７１】
「ヘテロシクリル」という用語は、炭素原子が１〜３個の異種原子と一緒に上記環を構成する３−、４−、５−、６−、７−および８員環を意味するよう意図される。ヘテロシクリルは、芳香族π−電子系が生じないように１つまたは複数の不飽和結合を任意に含有し得る。異種原子は、独立して、酸素、硫黄および窒素から選択される。
【０１７２】
ヘテロシクリルはさらに、オキソ系およびチオ系、例えばラクタム、ラクトン、環状イミド、環状チオイミド、環状カルバメート等を含むように定義をなすよう１つまたは複数のカルボニルまたはチオカルボニル官能基を含有する。
【０１７３】
定義が二環式構造を含むよう、ヘテロシクリル環はさらにまたアリール環と任意に縮合され得る。好ましいこのような縮合へテロシクリル基は、任意置換ベンゼン環と１つの結合を共有する。ベンゾ縮合へテロシクリル基の例としては、ベンズイミダゾリジノン、テトラヒドロキノリンおよびメチレンジオキシベンゼン環構造が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
「ヘテロシクリル」のいくつかの例としては、テトラヒドロチオピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、１，３−ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキシン、１，４−ジオキサン、ピペラジン、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、モルホリン、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、ピロリドン、ピロリジオン、ピラゾリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、１，３−ジオキソール、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、イソキサゾリン、イソキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジンおよび１，３−オキサチオランが挙げられるが、これらに限定されない。複素環との結合は、異種原子の位置であり得るか、
あるいは複素環の炭素原子を介して、あるいはベンゾ縮合誘導体に関してはベンゼノイド環の炭素を介してであり得る。
【０１７５】
「（ヘテロシクリル）Ｃ1-6−アルキル」という用語は、各々本明細書中に定義されたような、アルキルを介して、置換基として、ヘテロシクリル基が連結されたものと理解される。（ヘテロシクリル）Ｃ1-6−アルキル基のヘテロシクリル基は、置換されてもまたは置換されなくてもよい。「（ヘテロシクリル）Ｃ1-6−アルキル」という用語は、典型的にはアルキル鎖の末端位置で、ヘテロシクリル基で少なくとも１回置換されたアルキル鎖を意味するよう意図される。
【０１７６】
本明細書の文脈では、「Ｃ2-8アルケニル」という用語は、２〜８個の炭素原子を有し、そして１つまたは複数の二重結合を含有する線状または分枝鎖炭化水素基を意味するよう意図される。Ｃ2-8アルケニル基のいくつかの例としては、アリル、ホモ−アリル、ビニル、クロチル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニルおよびオクテニルが挙げられる。１つより多い二重結合を有するＣ2-8アルケニルのいくつかの例としては、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、ヘプタジエニル、ヘプタトリエニルおよびオクタトリエニル基、ならびにこれらの分枝鎖形態が挙げられる。不飽和（二重結合）の位置は、炭素鎖に沿った任意の位置であり得る。
【０１７７】
本明細書の文脈では、「Ｃ2-8アルキニル」という用語は、２〜８個の炭素原子を含有し、そして１つまたは複数の三重結合を含有する線状または分枝鎖炭化水素基を意味するよう意図される。Ｃ2-8アルキニル基のいくつかの例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニルおよびオクチニル基、ならびにこれらの分枝鎖形態が挙げられる。不飽和（三重結合）の位置は、炭素鎖に沿った任意の位置であり得る。「Ｃ2-8アルキニル」が当業者に既知であるようにジ−インまたはエネジ−インであるよう、１つより多い結合は不飽和であり得る。
【０１７８】
本明細書の文脈では、「Ｃ3-8シクロアルキル」という用語は、炭素原子のみを含む３−、４−、５−、６−、７−および８員環を網羅するよう意図される。Ｃ3-8シクロアルキルは、芳香族π−電子系が生じないように１つまたは複数の不飽和結合を任意に含有し得る。
【０１７９】
好ましい「Ｃ3-8シクロアルキル」のいくつかの例は、炭素環、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロペンタジエン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプテンである。
【０１８０】
「（アリール）Ｃ1-6アルキル」という用語は、各々本明細書中に定義されたような、Ｃ1-6アルキルを介して、置換基として、アリール基が連結されたものを意味するよう意図される。（アリール）Ｃ1-6−アルキルのアリール基は、置換されてもまたは置換されなくてもよい。例としては、ベンジル、置換ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピルおよびナフチルアルキルが挙げられる。
【０１８１】
「（シクロアルキル）Ｃ1-6アルキル」という用語は、各々本明細書中に定義されたような、アルキルを介して、置換基として、シクロアルキル基が連結されたものを意味するよう意図される。
【０１８２】
本明細書中で用いる場合、「Ｏ−Ｃ1-6−アルキル」という用語は、Ｃ1-6−アルキルオキシまたはアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ
、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシおよびヘキシルオキシを意味するよう意図される。
【０１８３】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。
【０１８４】
本明細書の文脈では、即ち「Ｃ1-6−アルキル」、「アリール」、「へテロアリール」、「へテロシクリル」、「Ｃ3-8−シクロアルキル」、「へテロシクリル（Ｃ1-6−アルキル）」、「（シクロアルキル）アルキル」、「Ｏ−Ｃ1-6−アルキル」、「Ｃ2-8−アルケニル」および「Ｃ2-8−アルキニル」という用語に関して、「任意に置換される」という用語は、当該基が１回または数回、例えば１〜５回、または１〜３回、あるいは１〜２回、Ｃ1-6−アルキル、Ｃ1-6−アルコキシ、オキソ（互変異性エノール形態で表される）、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシ（エノール系中に存在する場合、互変異性ケト形態で表され得る）、ニトロ、アルキルスルホニル、アルキルスルフェニル、アルキルスルフィニル、Ｃ1-6−アルコキシカルボニル、Ｃ1-6−アルキルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノ；カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ1-6−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノ−Ｃ1-6−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ1-6−アルキルカルボニルアミノ、Ｃ1-6−アルキルヒドロキシイミノ、シアノ、グアニジノ、カルバミド、Ｃ1-6−アルカノイルオキシ、Ｃ1-6−アルキルスルホニルオキシ、二ハロゲン−Ｃ1-6−アルキル、三ハロゲン−Ｃ1-6−アルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールおよびハロから選択される１つまたは複数の基で置換されてもよい、ということを意味するよう意図される。概して、上記の置換基はさらなる任意の置換を受けることができてもよい。
【０１８５】
別記しない限り、置換基が「任意に置換される」とみなされる場合、置換基が、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、トリハロメタンスルホニルおよびアミノ、例えば一および二置換アミノ基、ならびにその保護化誘導体から個々にそして独立して選択される１つまたは複数の基（単数または複数）で置換されてもよい基である、ということを意味する。上記の置換基の保護誘導体を形成し得る保護基は当業者に既知であり、そして上記のGreene and Wutsのような参考文献中に見出され得る。
【０１８６】
ある種の実施形態では、式Ａの化合物において、Ｅは酸素である。いくつかの実施形態では、Ｔも酸素である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、「へテロシクリル」という用語は、テトラヒドロチオピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、１，３−ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキシン、１，４−ジオキサン、ピペラジン、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、モルホリン、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、ピロリドン、ピロリジオン、ピラゾリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、１，３−ジオキソール、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、イソキサゾリン、イソキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジンおよび１，３−オキサチオランから成る群から選択される置換基を指す。
【０１８８】
ある種の実施形態では、「へテロアリール」という用語は、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、ピロール、ピリジン、インドール、オキサゾール、ベンズオキサゾール、イソキサゾール、ベンズイソキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、インダゾール、テトラゾール、キノリン、イソキノリン、ピリダジン、ピリミジン、プリン、ピラジン、フラザン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、プテリジン、フェノキサゾール、オキサジアゾール、ベンゾピラゾール、キノリジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリンおよびキノキサリンから成る群から選択される置換基を指す。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、「アリール」という用語は、フェニル、ナフタレニル、フェナントレニル、アントラセニル、テトラリニル、フルオレニル、インデニルおよびインダニルから成る群から選択される置換基を指す。
【０１９０】
その他の実施形態では、「シクロアルキル」という用語は、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロペンタジエン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプテンから成る群から選択される置換基を指す。
【０１９１】
式Ａの化合物のいくつかの実施形態は、Ｒ1が、水素；Ｃ1-6アルキル；Ｃ2-6アルケニル；Ｃ2-6アルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル；Ｃ3-8ヘテロシクリル；シクロアルキル（Ｃ1-6）アルキル；へテロシクリル（Ｃ1-6）アルキル；アリール；へテロアリール；（Ｃ1-6）アルキルカルボニル；（Ｃ1-6）アルコキシ（Ｃ1-6）アルキル；およびペルハロ（Ｃ1-6）アルキルから成る群から選択されるものを包含する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、上記の種々の置換基のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルから成る群から選択される。
【０１９２】
しかしながらある種の実施形態では、Ｒ1は水素である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、Ｒ2は、水素；Ｃ1-6アルキル；Ｃ2-6アルケニル；Ｃ2-6アルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル；Ｃ3-8ヘテロシクリル；シクロアルキル（Ｃ1-6）アルキル；へテロシクリル（Ｃ1-6）アルキル；アリール；へテロアリール；（Ｃ1-6）アルキルカルボニル；（Ｃ1-6）アルコキシ（Ｃ1-6）アルキル；およびペルハロ（Ｃ1-6）アルキルから成る群から選択される。これらの実施形態のうちのいくつかでは、上記の種々の置換基のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルから成る群から選択される。
【０１９４】
しかしながらある種の実施形態では、Ｒ2は水素である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、Ｒ3〜Ｒ6は、各々独立して、水素；Ｃ1-6アルキル；Ｃ2-6アルケニル；Ｃ2-6アルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル；Ｃ3-8ヘテロシクリル；シクロアルキル（Ｃ1-6）アルキル；へテロシクリル（Ｃ1-6）アルキル；アリール；へテロアリール；（Ｃ1-6）アルキルカルボニル；（Ｃ1-6）アルコキシ（Ｃ1-6）アルキル；およびペルハロ（Ｃ1-6）アルキルから成る群から選択される。これらの実施形態のうちのいくつかでは、上記の種々の置換基のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルから成る群から選択される。
【０１９６】
しかしながらある種の実施形態では、Ｒ3〜Ｒ6は水素である。
【０１９７】
更なる実施形態では、Ｒ7およびＲ8は、各々独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択される。これらの実施形態のうちのいくつかでは、Ｒ7およびＲ8は水素である。
【０１９８】
好ましい製剤または薬剤は、式Ｃ：
【０１９９】
【化９】
2006518373.tif 000027
【０２００】
の化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、アミド、エステルまたはプロドラッグから成るか、本質的にそれらから成るか、あるいはそれらを含む。本明細書中に記載したように（実施例６を参照）、補因子含有血清中で非修飾Ｇ−ＮＨ2をインキュベートした後、陽イオン交換ＨＰＬＣを用いて、この化合物を単離した。上記のクロマトグラフィー単離の後にそのＮＭＲスペクトルを用いて、式Ｃの化合物を修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）として同定した。
【０２０１】
分析は、二重標識、即ち13Ｃ／15Ｎ、試料に基づいた。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、７．６５および７．１５ｐｐｍに位置する２つの広域ＮＨ−アミドシグナル、ならびに５．２１ｐｐｍで中心に位置するＣＨ−陽子二重項（Ｊ＝１６３  Ｈｚ）で構成された。３つのシグナル全ての強度比は、１：１：１に近かった。水溶媒シグナルの前飽和を伴わずに採取されたスペクトルでは、〜７．４ｐｐｍで極大ＮＨ3+基シグナルを観察し得た。これは、グリシンメチレン基中の一陽子が電気陰性置換基により置換されて、元のグリシンアミドと比較して、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおける有意のダウンフィールド移動を引き起こす、ということを示した。
【０２０２】
13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、等強度の２つのシグナルを示した：１７７．６ｐｐｍでの13Ｃ＝Ｏ（Ｊ＝６２Ｈｚ）に対する二重項、ならびに３つの異なる結合定数（Ｊ＝７．１；６２および１６３Ｈｚ）を有する８９．０ｐｐｍでの脂肪族炭素シグナルに対する８本の線。Ｊ＝１６３Ｈｚは一結合13Ｃ−1Ｈカップリングであり、Ｊ＝６２Ｈｚは一結合13Ｃ−13Ｃカップリングであり、一方、第三のカップリング７．１Ｈｚは一結合15Ｎ−13Ｃカップリングと一致した。考え得る２つの結合カップリングは全て、理論的考察から予測されるように、ゼロに近かった。1Ｈ−13Ｃおよび13Ｃ−13Ｃカップリングはともに、相対的に大きく、グリシン脂肪族炭素での強電気陰性置換基の導入と一致した。同一の結論が、化学的シフト予測に関する既存の付加的スキームを用いて、脂肪族炭素の13Ｃ化学シフトの分析から得られた。
【０２０３】
15Ｎ−1Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルは、〜２０ｐｐｍに位置する15Ｎ標識アミンからの強シグナル、ならびに〜１０５ｐｐｍでの非標識アミド窒素からの弱シグナルで構成された。これらは、ＮＨ3+およびＣＯＮＨ2窒素共鳴に対して予測された典型値である。二重標識試料に関する全測定時間は、〜１０時間であった。
【０２０４】
したがって、式Ｃの化合物の構造に関して、1Ｈおよび13Ｃスペクトル間の最良の一致が得られた。したがって好ましい実施形態は、式Ｃの化合物およびその誘導体、特にヒド
ロキシル基がメトキシ、エトキシまたはアルコキシにより置換された誘導体から成るか、本質的にそれらから成るか（例えば式Ｃの化合物のエナンチオマー（ＤまたはＬ）および／または異性体（ＲまたはＳ）を含有する濃縮または単離調製物）、またはそれらを含む製剤および薬剤を包含する。
【０２０５】
付加的な好ましい実施形態は、式Ｅで記述される構造を有するα−ペルオキシグリシンアミド二量体（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）あるいは式Ｆで記述される構造を有するジグリシンアミドエーテル（ＮＨ2−ｇｌｙ−Ｏ−ｇｌｙ−ＮＨ2）から成るか、本質的にそれらから成るか、またはそれらを含む、製剤および薬剤を包含する：
【０２０６】
【化１０】
2006518373.tif 000028
【０２０７】
【化１１】
2006518373.tif 000029
【０２０８】
好ましい組成物は、式（Ｇ）で記述される構造を有するα−メトキシジグリシンアミド（α−ＭｅＯ−ｇｌｙ−ＮＨ2）から成るか、本質的にそれらから成るか、またはそれらを含む、製剤および薬剤を包含する：
【０２０９】
【化１２】
2006518373.tif 000030
【０２１０】
修飾グリシンアミドを合成するための種々のアプローチは、当該技術分野で既知である（例えばＪＰ  ５０９７７８９Ａ２（表題：Hayakawa et al.,"Alpha-hydroxyglycinamide Derivative and its Preparation"１９９１年１０月３日出願）を参照）。一アプローチにより、次式（Ｂ）により表されるα−ヒドロキシグリシンアミド誘導体およびその塩が調製される：
【０２１１】
【化１３】
2006518373.tif 000031
【０２１２】
（式中、Ｒ1は水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、ベンジル基、あるいはアルキル基またはアルキル基と芳香族基で置換されるシリル基であり、そしてＲ2は水素原子またはアミノ保護基である）。
【０２１３】
別のアプローチにより、次式（Ｈ）により表されるα−ヒドロキシグリシンアミド誘導体またはその塩：
【０２１４】
【化１４】
2006518373.tif 000032
【０２１５】
（式中、Ｒ1およびＲ2は式（Ｂ）で定義され；Ｒ3は水素原子またはカルボキシル保護基である）が、溶媒中のアンモニアで処理され、所望によりアミノ保護基が除去され、そして得られた化合物はさらに、所望によりその塩に転化される。
【０２１６】
本明細書中に記載された好ましい実施形態のいくつかと一致して、参照記号Ｒ1により表される低級アルキル基は、６個以下、好ましくは４個以下の炭素原子を含有するアルキル基である。このような基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、分枝鎖であり得るペンチル基、および分枝鎖であり得るヘキシル基が挙げられる。
【０２１７】
参照記号Ｒ1により表される低級アルケニル基は、６個以下、好ましくは４個以下の炭素原子を含有するアルケニル基である。このような基の例としては、任意の位置に二重結合を有するエテニル基、アリル基およびブテニル基が挙げられる。参照記号Ｒ1により表される低級アルキニル基は、６個以下、好ましくは４個以下の炭素原子を含有するアルキニル基である。このような基の例としては、エチニル基等が挙げられる。
【０２１８】
参照記号Ｒ1により表される低級アルキル基で置換されるシリル基は、１〜３個の低級アルキル基で置換されるシリル基である。この場合に用いられる低級アルキル置換基は、Ｒ1に関連して本明細書中で上記された低級アルキル基のいずれかまたはそれらの組合せである。低級アルキル基で置換されたシリル基は、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。アルキルおよび芳香族基で置換されたシリル基は、上記のアルキル基およびフェニル基で置換されたシリル基、例えばｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。
【０２１９】
アミノ酸またはペプチド化学の分野に用いられてきた保護基は、Ｒ2により表されるアミノ保護基として用いられ得る。このような基の例としては、オキシカルボニル型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ−）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）−］、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ−）、または２−ビフェニルイソプロポキシカルボニル（Ｂｐｏｃ−）等；アシル保護基、例えばＨＣＯ−、フタレート基（Ｐｈｔ−）またはｏ−ニトロフェニルチオ基（Ｎｐｓ−）等；およびアルキル保護基、例えばトリフェニルメチル基（Ｔｒｔ−）等が挙げられる。
【０２２０】
本明細書中に記載された実施形態のいくつかによるα−ヒドロキシグリシンアミド誘導体の塩は、酸付加塩、例えばハロゲン化水素酸塩のような無機塩、例えば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはリン酸塩、あるいは有機酸塩、例えばフマル酸塩、酢酸塩等である。
【０２２１】
式（Ｃ）により表される化合物は、次式（Ｈ）により表されるα−ヒドロキシグリシン誘導体を：
【０２２２】
【化１５】
2006518373.tif 000033
【０２２３】
（式中、Ｒ1およびＲ2は式（Ｂ）で定義され；Ｒ3は水素原子またはカルボキシル保護基である）溶媒中のアンモニアで処理し、そして任意にアミノ保護基を除去することにより調製され得る。
【０２２４】
カルボニル保護基Ｒ3は、アンモニアを用いた処理によりアミノ基で置換され得る通常のカルボキシ保護基である。このような基の例としては、低級アルキルオキシ基、例えばメトキシ基（−ＯＭｅ）、エトキシ基（−ＯＥｔ）、ベンジルオキシ基（−ＯＢｚｌ）またはｔｅｒｔ−ブトキシ基（−ＯｔＢｕ）、あるいはアリールオキシ基、例えばｐ−ニトロフェノキシ基（−ＯＮｐ）等が挙げられる。
【０２２５】
低級アルコールのような通常の有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、エーテル、例えばメチルエチルエーテル、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル等は、反応のための溶媒として用いられ得る。反応は、上記の溶媒中に式（Ｈ）により表される化合物を溶解し、そして減圧、常圧または加圧下で、例えば−７８℃〜４０℃、好ましくは０℃〜２５℃の温度で、例えば室温で、アンモニアを吹き付けることにより実行され得る。
【０２２６】
この反応は、化合物（Ｂ）（式中、Ｒ2はアミノ保護基である）を得ることを可能にする。この化合物からアミノ保護基Ｒ2を除去し、そして化合物（Ｂ）（式中、Ｒ2は水素である）を生成するために、アミノ保護基Ｒ2の種類によって、通常の脱保護化処理を実行し得る。例えば保護基Ｒ2がベンジルオキシカルボニル、Ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル等である場合、脱保護化は、水素化触媒、例えばパラジウム／炭素等の存在下で、水素ガスによる処理を行なうことにより実行され得る。さらに、保護基Ｒ2がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである場合、脱保護化は、塩酸−ジオキサンを用いて実行され得る。化合物（Ｂ）の塩は、例えば塩酸のような酸の存在下で上記の脱保護化処理を実行することにより生成され得る。
【０２２７】
式（Ｈ）（式中、Ｒ1は水素原子でない）の化合物は、例えば以下の２つの方法により生成され得る。第一の方法を用いて、それは、水素以外のＲ1を、式（Ｈ）（式中、Ｒ1は水素原子である）により表される化合物の中の化合物中に導入することにより生成され得る。水素以外の基Ｒ1の導入は、その基のそれぞれの機能性誘導体、例えばハロゲン誘導体を用いて実行され得る。例えば低級アルキル置換シリル基を導入するために、シリル基のハロゲン化物が用いられ、例えば塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルがｔｅｒｔ−ブトキシジメチルシリル基を導入するために用いられ得る。この反応は、ジメチルホルムアミドのような溶媒中で、０℃〜３０℃の温度で実行され得る。
【０２２８】
さらに、低級アルケニルまたは低級アルキニル基を導入するために、それぞれアルケン
またはアルキルのハロゲン誘導体が用いられ得る。例えばアリル基は、酸化銀のような触媒の存在下で、ハロゲン化アリル、例えばヨウ化アリルを用いることにより導入され得る。この反応は、ジメチルホルムアミドのような溶媒中で、−１０〜５０℃、好ましくは０℃〜２５℃の温度で実行され得る。
【０２２９】
式（Ｈ）（式中、Ｒ1は水素原子でない）の化合物を生成するためのその他の方法を用いて、式（Ｈ）（式中、Ｒ1およびＲ2は水素原子である）により表される化合物を低級アルコール、例えばメタノールまたはエタノール、を溶媒として用いて塩化チオニルで処理する。この場合、式（Ｈ）（式中、Ｒ1およびＲ2は低級アルコール溶媒に対応する同じ低級アルキル基である）により表される化合物が得られ得る。反応は、−１０〜４０℃、好ましくは０℃〜２５℃の温度で実行され得る。
【０２３０】
式（Ｈ）（式中、Ｒ1は水素原子である）により表される化合物は、例えば以下の２つの方法により生成され得る。第一の方法を用いて、それは、グリセルアルデヒドＣＨＯ−ＣＯＯＨを、アミノ保護基Ｒ2で保護されたアミンＲ2ＮＨ2と反応させることにより得られ得る。この反応は、例えば米国特許第３，６６８，１２１号（Philip X. Masciantonio等に発行）およびStanlen D. Young et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 1933 (1989)に記載された方法により、アセトン、エーテル等のような溶媒中で、２０℃〜７５℃の温度で実行され得る。この場合、式（Ｈ）（式中、Ｒ1およびＲ3は水素原子である）により表される化合物が得られ得る。
【０２３１】
式（Ｈ）（式中、Ｒ1は水素原子である）により表される化合物の調製のためのその他の方法を用いて、次式（Ｉ）により表される化合物：
【０２３２】
【化１６】
2006518373.tif 000034
【０２３３】
（式中、Ｒ3は式（Ｈ）に関して記載したように定義され、そしてＲ4は低級アルキル基である）を、アミノ保護基Ｒ2で保護されたアミンＲ2ＮＨ2と反応させる。この反応は、テトラヒドロフランのような溶媒中で、２０℃〜８０℃の温度で、例えば用いられる溶媒の還流温度で実行され得る。低級アルキル基Ｒ4は、低級アルキル基Ｒ1と同様に定義される。以下の実施例は、これらの合成アプローチをさらに詳細に説明する。
【実施例１２】
【０２３４】
［１２−１］
α−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステル（４．１１ｇ、２０ｍｍｏｌ）およびイミダゾールを室温でＤＭＦ中に溶解し、０℃に冷却する。次に塩素化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルをこの温度で溶液に添加し、構成成分を１０分間撹拌する。溶液を室温に戻し、撹拌を１時間継続する。次に飽和かん水を添加し、酢酸エチルを用いて抽出を実行する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸留除去する。
【０２３５】
次に、得られた油状物質をエタノール（５０ｍＬ）中に溶解し、過剰量のアンモニアを０℃の温度で溶液に吹き込む。次に、過剰量のアンモニアを減圧下で除去し、エタノールを蒸留除去する。このようにして得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、α−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンアミド（６．１０ｇ、定量）を得る。予測プロファイル：1ＨＮＭＲ
δ（ＣＤＣｌ3）０．１６（ｓ、３Ｈ）、０．２１（ｓ、３Ｈ）、０．９２（ｓ、９Ｈ）、５．４６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、５．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、６．２２−６．８２（ｂｒ、２Ｈ）。
【０２３６】
［１２−２］
上記１２−１における出発物質であるα−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステルを、以下のような方法で調製する：ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート（２．８３ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（２．０２ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）をアセトン（５０ｍＬ）中に溶解し、一晩還流する。次に、溶液を０℃の温度に冷却し、この温度で過剰量のジアゾメタン−エーテル溶液で処理する。次に溶媒を蒸留除去する。
【０２３７】
次に飽和かん水を添加し、クロロホルムを用いて抽出を実行し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸留除去する。このようにして得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、α−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステル（２．５６ｇ、５８％）を得る。予測プロファイル：1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．４６（ｓ、９Ｈ）、１．６５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、５．２７−５．５２（ｂｒ、１Ｈ）、５．５９−５．９０（ｂｒ、１Ｈ）。ＩＲ（ＮａＣｌ）１７５５（ｓ）、１６９０（ｓ）、１５２８（ｓ）ｃｍ-1。
【０２３８】
［１２−３］
上記１２−１における出発物質であるα−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステルは、１２−２以外の方法により調製され得る。したがって、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート（１１．３５ｇ、９５．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシ−１−メトキシ酢酸メチルエステル（１４．３５ｇ、１１９．５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、一晩還流する。次に温度を室温に戻し、次に１−ヒドロキシ−１−メトキシ酢酸メチルエステル（１．１５ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を添加し、構成成分をさらに８時間還流する。温度が室温に戻るまで、反応液を放置し、次に溶媒を蒸留除去する。このようにして得られた粗製物をクロロホルム−ヘキサン溶液から再結晶化し、純粋なα−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステル（１６．４２ｇ、８４％）を得る。
【実施例１３】
【０２３９】
上記の１２−２または１２−３で得られたα−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステル（１．２１ｇ、５．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、次に酸化銀（１．０４ｇ、４．５ｍｍｏｌ）およびヨウ化ベンゼン（１．９９ｇ、９．１ｍｍｏｌ）を室温で添加する。構成成分を室温で一晩撹拌し、沈殿物を濾過して、水を母液に添加し、酢酸エチルを用いて抽出を実行する。抽出溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次に溶媒を蒸留除去して、粗精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて実行する。
【０２４０】
このようにして得られた油状物質をエタノール（５０ｍＬ）中に溶解し、過剰量のアンモニアを０℃の温度で溶液に吹き込む。次に過剰量のアンモニアを減圧下で除去し、溶媒を蒸留除去する。このようにして得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、α−ベンジルオキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンアミ
ド（０．３９７ｇ、２２％）を得る。予測プロファイル：融点１１５〜１２０℃、1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．４４（ｓ、９Ｈ）、４．６１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１．３Ｈｚ）、４．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１１．３Ｈｚ）、５．４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、５．７５（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、６．００（ｂｒ、１Ｈ）、６．５２（ｂｒ、１Ｈ）、７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＩＲ（ＮａＣｌ）１６９８（ｓ）、１６６４（ｓ）、１５０２（ｓ）、７３２（ｍ）、６９５（ｍ）ｃｍ-1。元素に関する分析値（Ｃ14Ｈ20Ｏ4Ｎ2）：計算値Ｃ：５９．９９、Ｈ：７．１９、Ｎ：９．９９、観察値Ｃ：５９．９４、Ｈ：７．３３、Ｎ：１０．２８が予測される。
【実施例１４】
【０２４１】
上記の１２−２または１２−３により調製されたα−ヒドロキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンメチルエステル（２．０７ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、酸化銀（１．３９ｇ、６．０ｍｍｏｌ）およびヨウ化アリル（１．２ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ）を室温で添加する。室温で一晩撹拌後、沈殿物を濾し取って、水を母液に添加し、酢酸エチルを用いて抽出を実行する。抽出溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次に溶媒を蒸留除去して、チオ硫酸ナトリウムの水溶液を添加し、その後、酢酸エチルで抽出し、反応副産物としてのヨウ素を除去する。
【０２４２】
このようにして得られた油状物質をエタノール中に溶解し、過剰量のアンモニアを０℃の温度で溶液に吹き込み、その後、過剰量のアンモニアを減圧下で除去し、溶媒を蒸留除去する。得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、α−アリルオキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンアミド（０．６２５ｇ、２７％）を得る。予測プロファイル：1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．４５（ｓ、９Ｈ）、４．１４（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．２、１．８Ｈｚ）、５．１１−５．５６（ｍ、３Ｈ）、５．７０−６．２０（ｍ、２Ｈ）、６．３３−７．０１（ｍ、２Ｈ）。ＩＲ（ＣＤＣｌ3）２９７５（ｗ）、１７０５（ｓ、ｂｒ）、１４９８（ｍ）、９９０（ｓｈ．ｗ）ｃｍ-1。
【実施例１５】
【０２４３】
［１５−１］
α−ヒドロキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシン（４．４４ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）中に溶解する。塩化チオニル（２．９ｍＬ、４０．０ｍｍｏｌ）を０℃の温度で溶液に滴下し、この温度で３０分間、次に室温で２時間、撹拌を実行する。次に溶媒を蒸留除去して、得られた粗製物をメタノール（５０ｍＬ）中に溶解する。溶液を０℃に冷却して、過剰量のアンモニアをその中に吹き込む。
【０２４４】
反応完了時に、過剰量のアンモニアを減圧下で除去し、溶媒を蒸留除去して、得られた白色結晶を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、α−メトキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンアミド（３．４２ｇ、７３％）を得る。予測プロファイル：融点１１０〜１１２℃、1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）３．４４（ｓ、３Ｈ）、５．１６（ｓ、２Ｈ）、５．３１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、５．４５−５．９８（ｂｒ、２Ｈ）、６．２８−６．６８（ｂｒ、１Ｈ）、７．３６（ｓ、５Ｈ）。ＩＲ（ＮａＣｌ）１６８０（ｓ．ｂｒ）、１５４０（ｓ）、１５２０（ｓ）、８６０（ｍ）、７００（ｍ）ｃｍ-1。元素に関する分析値（Ｃ11Ｈ14Ｏ4Ｎ2）：計算値Ｃ：５５．４６、Ｈ：５．９２、Ｎ：１１．７６、観察値Ｃ：５５．７０、Ｈ：５．９４、Ｎ：１１．５８が予測される。
【０２４５】
［１５−２］
上記１２−４における出発物質であるα−ヒドロキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンを以下のような方法で調製する。ベンジルカルバメート（３０．２４ｇ、０．２ｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（２０．２６ｇ、０．２２ｍｏｌ）をジエチルエ
ーテル（２００ｍＬ）中に溶解し、溶液を室温で一晩撹拌する。生成された結晶を濾過し、次にエーテルで洗浄して、純粋なα−ヒドロキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシン（３３．７８ｇ、７５％）を得る。予測プロファイル：融点２００〜２０５℃、1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤ3ＯＤ）５．１２（ｓ、２Ｈ）、５．４０（ｓ、１Ｈ）、７．３４（ｓ、５Ｈ）．
【実施例１６】
【０２４６】
上記の１５−２により生成されたα−ヒドロキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシン（２．２６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）中に溶解する。塩化チオニル（２ｍＬ、２７．４ｍｍｏｌ）を−１０℃の温度で溶液に滴下し、撹拌を室温で一晩実行する。次に溶媒を蒸留除去し、このようにして得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、α−エトキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンエチルエステル（２．８１ｇ、定量）を得る。予測プロファイル：融点６６〜６８℃、1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．２２（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．３０（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、３．７０（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、４．２４（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．１５（ｓ、２Ｈ）、５．３３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７Ｈｚ）、５．９３（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７Ｈｚ）、７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＩＲ（ＮａＣｌ）１７４０（ｓ）、１７００（ｓ）、１５４０（ｓ）、７６０（ｍ）、７００（ｍ）ｃｍ-1。元素に関する分析値（Ｃ14Ｈ19Ｏ5Ｎ）：計算値Ｃ：５９．７８、Ｈ：６．８１、Ｎ：４．９８、観察値Ｃ：６０．０３、Ｈ：６．８８、Ｎ：４．８９が予測される。
【実施例１７】
【０２４７】
上記の１５−２により生成されたα−ヒドロキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシン（２．２６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール（２０ｍＬ）中に溶解する。塩化チオニル（２ｍＬ、２７．４ｍｍｏｌ）を−１０℃の温度で溶液に滴下し、撹拌を室温で一晩実行する。次に溶媒を蒸留除去し、このようにして得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、α−イソプロポキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンイソプロピルエステル（３．１０ｇ、定量）を得る。予測プロファイル：1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．１６−１．３７（ｍ、１２Ｈ）、３．８７−４．２２（ｍ、１Ｈ）、４．５７−５．２０（ｍ、１Ｈ）、５．１４（ｓ、２Ｈ）、５．３３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７Ｈｚ）、５．９３（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．７Ｈｚ）、７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＩＲ（Ｎｅａｔ）１７２８（ｓ、ｂｒ）、１５０８（ｍ）、７４０（ｍ）ｃｍ-1。
【実施例１８】
【０２４８】
実施例１６により生成されたα−エトキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンエチルエステル（２．２９ｇ、８．１ｍｍｏｌ）をエタノール（８０ｍＬ）中に溶解し、０℃に冷却する。この温度で過剰量のアンモニアを溶液中に吹き込む。反応完了時に、過剰量のアンモニアを減圧下で除去し、溶媒を蒸留除去し、このようにして得られた白色結晶をヘキサン−酢酸エチル混合溶液で洗浄して、純粋なα−エトキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンアミド（１．５１ｇ、７７％）を得る。予測プロファイル：融点１１９〜１２１℃、1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．２３（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、３．５０−３．９０（ｍ、２Ｈ）、５．１４（ｓ、２Ｈ）、５．３７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、５．６５−５．９６（ｂｒ、２Ｈ）、６．４１−６．７１（ｂｒ、１Ｈ）、７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＩＲ（ＮａＣｌ）１６８０（ｓ）、１６６４（ｓ）、１５４２（ｍ）、１５２４（ｍ）、７６０（ｗ）、７４０（ｗ）、７００（ｍ）ｃｍ-1。元素に関する分析値（Ｃ12Ｈ16Ｏ4Ｎ2）：計算値Ｃ：５７．１３、Ｈ：６．３９、Ｎ：１１．１０、観察値Ｃ：５７．０９、Ｈ：６．３４、Ｎ：１１．３７が予測される。
【実施例１９】
【０２４９】
実施例１６により生成されたα−イソプロポキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンイソプロピルエステル（２．４８ｇ、８．０ｍｍｏｌ）をエタノール（４０ｍＬ）中に溶解し、０℃に冷却する。次に、この温度で過剰量のアンモニアを溶液中に５時間吹き込み、アンモニア飽和した状態でさらに攪拌を２日間実行する。反応完了時に、過剰量のアンモニアを減圧下で除去し、溶媒を蒸留除去し、このようにして得られた白色結晶をヘキサン−酢酸エチル混合溶液で洗浄して、純粋なα−イソプロポキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンアミド（１．６４ｇ、７７％）を得る。予測プロファイル：融点１１１〜１１３℃、1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3）１．１８（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝４．４Ｈｚ）、１．２５（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝４．４Ｈｚ）、３．８１−４．２０（ｍ、１Ｈ）、５．１５（ｓ、２Ｈ）、５．４４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、５．５３−５．８６（ｂｒ、２Ｈ）、６．３７−６．７３（ｂｒ、１Ｈ）、７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＩＲ（ＮａＣｌ）１６６８（ｓ）、１６６０（ｓ）、１５３８（ｍ）、１５３０（ｍ）、７６０（ｗ）、７４０（ｗ）、７００（ｍ）ｃｍ-1。元素に関する分析値（Ｃ13Ｈ18Ｏ4Ｎ2）：計算値Ｃ：５８．６３、Ｈ：６．８１、Ｎ：１０．５２、観察値Ｃ：５８．６０、Ｈ：６．８２、Ｎ：１０．５４が予測される。
【実施例２０】
【０２５０】
実施例１２の（１２−１）により生成されたα−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンアミド（５．０８ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）をジオキサン（１０ｍＬ）中に溶解し、０℃に冷却する。次に、４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液（１７ｍＬ）を添加し、この温度で１時間、撹拌を実行する。
【０２５１】
反応を完了するために、４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液をさらに添加し、温度を室温に上げて、撹拌を１時間実行する。次にジエチルエーテルを溶液に添加し、できるだけ多量の物質を沈殿させ、濾過して、エーテルで洗浄する。次に沈殿物を減圧下で乾燥して、純粋な塩酸α−ヒドロキシグリシンアミド（１．８６ｇ、８８％）を得る。予測プロファイル：1ＨＮＭＲ  δ（ＤＭＳＯ−ｄ6）４．９９（ｂｒ  ｓｄ、１Ｈ）、７．６２−８．０３（ｂｒ、２Ｈ）、８．３２−８．８５（ｂｒ、３Ｈ）。ＩＲ（ＫＢｒ）１６８６（ｓ）、１５８１（ｍ）、１５４６（ｍ）、１４７７（ｓ）、８４３（ｍ）ｃｍ-1。
【実施例２１】
【０２５２】
実施例１５（１５−１）により調製されたα−メトキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシンアミド（０．２４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）をメタノール中に溶解し、１２Ｎ塩酸（０．１ｍＬ）およびパラジウム−炭素（５０ｍｇ）を室温で溶液に添加し、水素雰囲気下で３０分間撹拌を実行する。次にパラジウム−炭素を濾し取り、母液の溶媒を蒸留除去して、塩酸α−メトキシグリシンアミド（０．１４ｇ、定量）を得る。予測プロファイル：1ＨＮＭＲ  δ（ＣＤ3ＯＤ）３．３５（ｓ、３Ｈ）、５．０１（ｓ、１Ｈ）。13ＣＮＭＲ  δ（ＣＤ3ＯＤ）４２．１、８４．３（ｄ、Ｊ＝１５９．８Ｈｚ）、１７０．３。次の実施例は、製剤または薬剤中に処方するための塩酸α−ヒドロキシ−グリシンアミドを合成するために用いられたアプローチを説明する。
【実施例２２】
【０２５３】
［塩酸α−ヒドロキシ−グリシンアミドの調製］
【０２５４】
【化１７】
2006518373.tif 000035
【０２５５】
［２２．１  メチルグリオキシレートヘミアセタール］
メタノール（３５ｍＬ）中のグリオキシル酸一水和物（７．０ｇ、７６ｍｍｏｌ）の溶液を一晩還流した。次に飽和ＮａＨＣＯ3で溶液を中和し、蒸発させた。残渣をＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。蒸発により３．２３ｇ（４０．０％）の粗製油を得て、これをさらに精製せずにその後の反応に用いた。
【０２５６】
［２２．２  メチルＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシネート］
トルエン（４５ｍＬ）中のメチルグリオキシレートヘミアセタール（２．０ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルカルバメート（２．０ｇ、１７．１８ｍｍｏｌ）の溶液を一晩還流した。蒸発により油を得た。この粗製油を、溶離液としてＥｔＯＡｃ／ヘプタン  １／９〜２／８を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。精製分画は０．６ｇの油状物質を生じ、次にこれをジエチルエーテル／ヘプタンを用いて結晶化した。収量０．３９ｇ（１０．１％）。観察されたＮＭＲスペクトル：
1ＨＮＭＲ  （３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ５．７４（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、５．４４（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、１．４６（ｓ、９Ｈ）。
13ＣＮＭＲ  （３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１７０．３、１５４．７、７８．６、７２．８、５１．９、２８．１。
【０２５７】
［２２．３  Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシンアミド］
メチルＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシネート（０．３４ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）中の７Ｎ  ＮＨ3に溶解した。溶液を室温で一晩撹拌し、蒸発させて、次にアセトニトリルを用いて２回、共蒸発させた。生成物を、溶離液としてＥｔＯＡｃ／ヘプタン  ３／７〜５／５を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。収量０．１ｇ（３１．７％）。観察されたＮＭＲスペクトル：
1ＨＮＭＲ  （３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ７．２８（ｂｒ  ｄ、２Ｈ）、６．２０（ｄ、１Ｈ）、５．０９（ｔ、１Ｈ）、１．３９（ｓ、９Ｈ）。
13ＣＮＭＲ  （３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１７１．７、１５５．０、７８．３、７３．４、２８．２。
【０２５８】
［２２．４  塩酸α−ヒドロキシグリシンアミド］
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ヒドロキシグリシネート（４０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をジオキサン（１．５ｍＬ）中に溶解した。ジオキサン（０．５ｍＬ）中の４Ｎ  ＨＣｌを、０℃で溶液に添加した。冷却浴を除去し、溶液を室温で４０分間撹拌した。ジエチルエーテルを添加し、溶液を撹拌した。エーテルをデカントし、残渣を蒸発させた。収量は約〜４０ｍｇであった。観察されたＮＭＲスペクトル：
1ＨＮＭＲ  （５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ８．５−７．１（ｍ、５Ｈ）、４．８５（ｓ、１Ｈ）。
13ＣＮＭＲ  （５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１７３．１、８７．４。
【０２５９】
以下の実施例は、α−メトキシ−グリシンアミドを調製するために用いられたアプローチを説明する。
【実施例２３】
【０２６０】
［α−メトキシ−グリシンアミドの調製］
【０２６１】
【化１８】
2006518373.tif 000036
【０２６２】
［２３−１  メチルＮ−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−α−メトキシグリシネート］
グリオキシル酸一水和物（２７６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）および９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルカルバメート（３２０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をドライジエチルエーテル（１０ｍＬ）中に溶解した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させて、残渣をメタノール（２０ｍＬ）中に溶解し、１滴の硫酸を添加した。反応混合物を室温で３日間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ3（１００ｍＬ）を混合物に添加し、それを酢酸で抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラム上で精製して、２５０ｍｇ（５５％）の表題化合物を得た。観察されたＮＭＲスペクトル：
1ＨＮＭＲ  （３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ７．７６（ｄ、２Ｈ）、７．５９（ｄ、２Ｈ）、７．４０（ｔ、２Ｈ）、７．３１（ｔ、２Ｈ）、５．９０（ｂｒ  ｄ、１Ｈ）、５．３５（ｄ、１Ｈ）、４．４６（ｍ、２Ｈ）、４．２４（ｔ、１Ｈ）、３．８２（ｓ、３Ｈ）、３．４３（ｓ、３Ｈ）。
13ＣＮＭＲ  （３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ  １４３．６、１４３．５、１４１．２、１２７．７、１２７．１、１２４．９、１２０．０、８０．５、６７．２、５６．２、５２．９。
【０２６３】
［２３−２  α−メトキシグリシンアミド］
メチルＮ−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−α−メトキシグリシネート（２４０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）中の３Ｎ  ＮＨ3を用いて、室温で一晩処理した。メタノールを蒸発により除去した。固体をＴＨＦ（３０ｍＬ）中に溶解し、モルホリン（３０５ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で５時間撹拌した。溶媒を蒸発させて、生成物をシリカゲルカラム上で精製して、５ｍｇ（６％）の表題化合物を得た。観察されたＮＭＲスペクトル：
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ４．４０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、３．３５（ｓ、３Ｈ）。
【０２６４】
本明細書中に記載された修飾グリシンアミド化合物は、化合物とＨＩＶとの相互作用を試験するためのバイオテクノロジー・ツールとして、そしてＨＩＶにすでに感染している患者の治療のための製剤または薬剤としても、あるいはＨＩＶ感染を回避するための予防的調製物として用いるのに適している。本明細書中に記載された方法により得られる補因子（単数または複数）（単独で、あるいはＧ−ＮＨ2またはＧ−ＮＨ2含有ペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ2、と一緒にまたは組合せて）も、バイオテクノロジー・ツールとして、そしてＨＩＶ複製の治療または予防のための薬剤として用いるのに適している。例えば一アプローチにより、Ｇ−ＮＨ2またはＧ−ＮＨ2含有ペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ2が、それを必要とする患者に提供され、そして補因子が同時投与により提供されるプロドラッグ療法が意図される。あるいは、Ｇ−ＮＨ2またはＧ−ＮＨ2含有ペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ2、ならびに補因子は、製剤中に併合され得る（例えば、Ｇ−ＮＨ2またはＧ−ＮＨ2含有ペプチド、例えばＧＰＧ−ＮＨ2、ならびに補因子を含む製剤組成物）。この手法では、補因子および／またはＧ−ＮＨ2および／またはＧＰＧ−ＮＨ2、および／またはその他のグリシンアミド含有ペプチドは、例えば持続放出または長期治療が望ましい場合、プロドラッグとして投与され得る。
【０２６５】
予防薬としてこれらの抗ＨＩＶ組成物を用いて誰でも治療され得るが、しかし最適患者は、ウイルス感染の危険のある人々である。このような患者としては、高齢者、慢性疾患患者、ホモセクシャル、売春婦、静脈内薬剤使用者、血友病患者、小児、ならびに患者または生物学的試料との接触を有する医療従事者が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６６】
修飾Ｇ−ＮＨ2（例えばメタボライトＸまたはα−ＨＧＡ）を含む薬剤の製造および使用方法も、本発明の実施形態である。本明細書中に記載された方法により得られる修飾Ｇ−ＮＨ2は、患者、例えばヒトを含む哺乳類、への投与のための医薬剤を生成するための製剤学の慣用的方法に従って処理され得る。修飾Ｇ−ＮＨ2は、変法を用いてまたは用いずに、薬学的製品中に組み入れられ得る。さらに、いくつかの経路により修飾Ｇ−ＮＨ2を送達する製剤または治療薬の製造は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６７】
本明細書中に記載された修飾Ｇ−ＮＨ2は、慣用的賦形剤、即ちペプチド剤と有害に反応しない非経口、経腸（例えば経口）または局所的適用に適した薬学的に許容可能な有機または無機担体物質と混合して、用いられ得る。適切な薬学的許容可能担体としては、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シアル酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的調製物は滅菌され得、そして所望により、助剤、例えば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味剤および／または芳香性物質等（修飾Ｇ−ＮＨ2と有害に反応しない）と混合され得る。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、修飾Ｇ−ＮＨ2を含む薬剤は、ウイルス感染、例えばＨＩＶ感染を抑制するその他の作用物質とともに処方されるか、あるいはそれらと一緒に投与されて、より良好なウイルス応答を達成する。目下、ヒトにおけるＨＩＶ−１の抗ウイルス治療において、４つの異なる種類の薬剤が臨床使用中である。これらは、（ｉ）ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ）、例えばジドブジン、ラミブジン、スタブジン、ジダノシン、アバカビルおよびザルシタビン；（ｉｉ）ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、例えばテノフォビル；（ｉｉｉ）非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）、例えばエファビレンツ、ネビラピンおよびデラビルジン；ならびに（ｉｖ）プロテアーゼ阻害剤、例えばインジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビルおよびアムプレナビルである。ＨＩＶは、異なる種類の薬剤および修飾Ｇ−ＮＨ2を克服する多
突然変異が同一ウイルス粒子中に出現するということはあまり起こる可能性は少ないため、２、３または４つの異なる種類の薬剤を、修飾Ｇ−ＮＨ2の投与と同時に使用することにより、ほとんど耐性を発現しないと思われる。
【０２６９】
したがって、修飾Ｇ−ＮＨ2を含む薬剤は、そして当業者に既知の用量および方法により、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤とともに処方されるかまたはそれらと組合せて投与される、というのが好ましい。修飾Ｇ−ＮＨ2ならびにヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を含む薬剤は、修飾Ｇ−ＮＨ2の送達、保持または安定性に役立つ他の成分を含有するよう処方され得る。
【０２７０】
特定の修飾Ｇ−ＮＨ2処方物の有効用量および投与方法は、個々の患者および疾病の段階、ならびに当業者に既知のその他の因子に基づいて変わり得る。このような化合物の治療効能および毒性は、細胞培養または実験動物における標準薬学的手法により、例えばＥＤ50およびＬＤ50（集団の５０％に対して致死性である用量）により確定され得る。毒性対治療効果の用量比が治療指数であり、それは比ＬＤ50／ＥＤ50として表され得る。大きい治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養検定および動物試験から得られるデータは、ヒト使用のための一連の投薬量を処方するのに用いられる。このような化合物の投薬量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ50を含む一連の循環濃度内である。投薬量は、用いられる剤形、患者の感受性および投与経路によって、この範囲内で変わる。
【０２７１】
的確な投薬量は、治療される患者を考慮して、個々の医者により選択される。投薬量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するよう、あるいは所望の作用を保持するよう調整される。考慮され得る付加的因子としては、患者の疾患状態の重症度、年齢、体重および性別；食餌、投与の時間および回数、薬剤の組合せ（単数または複数）、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答が挙げられる。短期作用性薬学的組成物は毎日投与されるが、一方、長期作用性薬学的組成物は、２、３〜４日毎、週毎、あるいは２週間に１回投与される。特定の処方物の半減期およびクリアランス速度によって、本発明の薬学的組成物は、１日に１回、２回、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上投与される。
【０２７２】
通常投薬量は、投与経路によって、約１〜１００，０００μｇで、総用量約２０ｇまでで変化してよい。望ましい投薬量としては、２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１１ｇ、１２ｇ、１３ｇ、１４ｇ、１５ｇ、１６ｇ、１７ｇ、１８ｇ、１９ｇおよび２０ｇが挙げられる。さらに、修飾Ｇ−ＮＨ2の濃度は、局所形態で作用物質を投与する実施形態では、非常に高いことがある。ペプチド剤のモル濃度は、いくつかの実施形態に関して用いられ得る。局所投与のためのおよび／または医療器具をコーティングするための望ましい濃度は、１００：Ｍ〜８００ｍＭの範囲である。これらの実施形態のための好ましい濃度は、５００：Ｍ〜５００ｍＭの範囲である。例えば局所適用に用いるためのおよび／または医療器具をコーティングするための好ましい濃度としては、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ、８００μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ
、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭおよび５００ｍＭが挙げられる。特定の投薬量および送達方法に関する指針は、参考文献中にならびに下記に提示される（例えば米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号または同第５，２２５，２１２号を参照）。
【０２７３】
特に、修飾Ｇ−ＮＨ2の投薬量は、適正なウイルス放出の抑制および／またはＨＩＶ複製の抑制を含めた望ましい作用を達成するのに十分な修飾Ｇ−ＮＨ2を提供するものである。したがって、修飾Ｇ−ＮＨ2の用量は、好ましくは約０．１ｎＭ〜５００ｍＭの組織または血中濃度あるいはその両方を生じる。望ましい用量は、約０．１ｎＭ〜８００μＭの組織または血中濃度あるいはその両方を生じる。好ましい用量は、約１０ｎＭ〜約３００：Ｍより大きい組織または血中濃度を生じる。好ましい用量は、例えば１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭおよび３００μＭの組織または血中濃度あるいはその両方を達成するのに要する修飾Ｇ−ＮＨ2の量である。８００μＭより高い組織濃度を生じる用量は好ましくないが、しかしそれらはいくつかの実施形態に関して用いられ得る。血中レベルにより測定した場合の組織中の安定濃度を保持するために、修飾Ｇ−ＮＨ2の一定注入も提供され得る。
【０２７４】
修飾Ｇ−ＮＨ2の投与経路としては、局所、経皮、非経口、胃腸、経気管支および経肺胞が挙げられるが、これらに限定されない。局所投与は、修飾Ｇ−ＮＨ2を含有する局所的適用クリーム、ゲル、リンス等により成し遂げられる。経皮投与は、皮膚に修飾Ｇ−ＮＨ2を浸透させて血流に入らせ得る、クリーム、リンス、ゲル等の適用により成し遂げられる。非経口的投与経路としては、電気的または直接注入、例えば中心静脈ラインへの直接注入、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下注射が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸投与経路としては、摂取および直腸が挙げられるが、これらに限定されない。経気管支および経肺胞投与経路としては、口または鼻内からの吸入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
局所適用に適した修飾Ｇ−ＮＨ2含有化合物の組成物としては、生理学的許容可能な移植片、軟膏、クリーム、リンスおよびゲルが挙げられるが、これらに限定されない。化合物が少なくとも最小度に可溶性である任意の液体、ゲルまたは固体の薬学的に許容可能な基剤は、本発明における局所的使用に適している。局所適用のための組成物は、ＨＩＶの伝播を防止するために、性交中に特に有用である。このような使用のための適切な組成物としては、膣または肛門用座薬、クリーム、ゼリー、滑剤、油および灌注剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７６】
経皮投与に適した修飾Ｇ−ＮＨ2の組成物としては、皮膚に直接適用されるかまたは保護担体、例えば経皮デバイス（「経皮パッチ」）中に組み入れられる薬学的に許容可能な懸濁液、油、クリームおよび軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。適切なクリーム、軟膏等の例は、例えば医師用卓上参考書に見出され得るし、当該技術分野で既知である。適切な経皮デバイスの例は、例えば米国特許第４，８１８，５４０号（Chinen等、１９８９年４月４日発行）に記載されている。
【０２７７】
非経口投与に適した修飾Ｇ−ＮＨ2の組成物としては、薬学的に許容可能な滅菌等張溶液が挙げられるが、これらに限定されない。このような溶液としては、修飾Ｇ−ＮＨ2の中心静脈ラインへの注入、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下注射のための生理食塩水お
よびリン酸緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７８】
経気管支および経肺胞投与に適した修飾Ｇ−ＮＨ2の組成物としては、吸入用の種々の種類のエーロゾルが挙げられるが、これらに限定されない。例えばペンタミジンは、ニューモシスティス・カリニにより引き起こされる肺炎を予防するためにＡＩＤＳ患者にエーロゾルを介して鼻内に投与される。修飾Ｇ−ＮＨ2の経気管支および経肺胞投与に適したデバイスとしては、噴霧器および気化器が挙げられ（これらに限定されない）、これらも本発明の範囲内に含まれる。一般に利用可能な噴霧器および気化器の多数の形態が、修飾Ｇ−ＮＨ2を送達するために容易に適合され得る。
【０２７９】
胃腸投与に適した修飾Ｇ−ＮＨ2の組成物としては、摂取のための粉末、ピル、サッシェまたは液体、ならびに直腸投与のための座薬が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＩＶ感染の最も一般的な経路および使用の容易さのために、胃腸投与、特に経口投与が好ましい。胃腸投与のための製剤は、例えばカプセル、ピルまたは錠剤形態で処方され、この場合、活性成分である修飾Ｇ−ＮＨ2（例えばα−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体、ジグリシンアミドエーテルまたはα−メトキシグリシンアミド）は、ＨＩＶ複製を抑制するのに有効な量で含まれる。
【０２８０】
修飾Ｇ−ＮＨ2は、ＨＩＶ感染の防止が重要である状況における使用にも適している。例えば医療従事者は、ＨＩＶ陽性であり得る、そしてその分泌物および体液がＨＩＶウイルスを含有する患者に絶えず曝露される。さらに修飾Ｇ−ＮＨ2は、ＨＩＶの伝播を防止するために、性交中に用いるための抗ウイルス組成物中に処方され得る。このような処方物は当該技術分野で既知であり、ＰＣＴ公告ＷＯ９０／０４３９０（Modak等、１９９０年５月３日公開）下で公開された国際出願にも記載されている。
【０２８１】
本発明の実施形態は、医療器具、例えばウイルス伝染に対して防護する手袋、シート、作業表面のためのコーティングも包含する。あるいは修飾Ｇ−ＮＨ2は、高分子医療用具中に含浸され得る。特に好ましいのは、医療用手袋およびコンドームのためのコーティングである。医療用具に用いるのに適したコーティングは、ペプチドを含有する粉末により、あるいはペプチド剤が懸濁される高分子コーティングにより提供され得る。コーティングまたは用具のための適切な高分子材料は、生理学的に許容可能であるものそして治療的有効量の修飾Ｇ−ＮＨ2がそれにより拡散され得るものである。適切なポリマーとしては、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、酢酸セルロース、シリコーンエラストマー、コラーゲン、シルク等が挙げられるが、これらに限定されない。このようなコーティングは、例えば米国特許第４，６１２，３３７号（Fox等、１９８６年９月１６日発行）に記載されている。したがってＨＩＶ複製を抑制する薬剤の製造方法は、修飾Ｇ−ＮＨ2を用意し、そして上記のように患者、例えばヒトに送達するために上記薬剤を処方することを包含する。
【０２８２】
ＨＩＶ複製を抑制する化合物の同定方法も提供される。一方法により、例えば修飾Ｇ−ＮＨ2を代謝するのに十分な時間中、血清、血漿または細胞抽出物とともにＧ−ＮＨ2をインキュベートし、そして陽イオン交換ＨＰＬＣにより修飾Ｇ−ＮＨ2を単離することにより、抗ＨＩＶ製剤中に組み入れるための化合物が同定される。好ましくはヒト血清、ブタ血清、ウシ血清、ネコ血清、イヌ血清、ウマ血清、サル血清またはブタ血漿が用いられる。このアプローチにより、修飾Ｇ−ＮＨ2はカラムから迅速に溶離し、一方、非反応Ｇ−ＮＨ2はかなり長時間、カラム上に保持される。修飾Ｇ−ＮＨ2の単離は、上記のように単離化合物の存在下でＨＩＶ感染試験を実行することにより、さらに確証され得る。同様に、α−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体、ジグリシンアミドエーテル、メトキシグリシンアミド、α−エトキシグリシンアミド、およびこれらの
化合物の誘導体に関連する合成化合物は、本明細書中に提示されたＨＩＶ感染試験を用いてスクリーニングされ得る。単離された修飾Ｇ−ＮＨ2の純度、あるいは合成的修飾グリシンアミドの構造によって、化合物のＥＤ50は、１μＭ未満〜３０μＭ未満である。即ち、精製修飾Ｇ−ＮＨ2のＥＤ50は、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭまたは３０μＭ未満である。したがって、いくつかの実施形態では、上記の方法により同定された修飾Ｇ−ＮＨ2が製剤中に組み入れられる。さらに上記の方法は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される抗ウイルス化合物を製剤中に供給することにより補足され得る。さらに上記の方法は、製剤中に担体を組み入れることにより補足され得る。
【０２８３】
修飾Ｇ−ＮＨ2はＨＩＶの抑制を分析するための研究ツールとして用いられ得るが、しかし望ましくは修飾Ｇ−ＮＨ2を用いて、患者におけるＨＩＶ複製および感染を抑制する。例えば一方法により、ＨＩＶに感染するようになる危険がある、あるいはすでにＨＩＶに感染している患者が特定され、そして上記患者は修飾Ｇ−ＮＨ2を提供される。付加的方法により、患者は修飾Ｇ−ＮＨ2を提供され、そしてＨＩＶ複製または感染に及ぼす作用が確定される（例えば生物学的試料中のｐ２４または逆転写酵素活性の量を分析することにより）。
【０２８４】
慣用的ヌクレオシド類似体およびプロテアーゼ阻害剤（米国特許第６２５８９３２号；米国特許第６４５５６７０号；米国特許第６５３７９６７号を参照）とは異なるメカニズムにより、修飾グリシンアミドはＨＩＶの複製を抑制する、と考えられる。したがって、修飾グリシンアミドを含有する製剤を摂取する好ましい患者は、ヌクレオシド類似体およびプロテアーゼ阻害剤に対する耐性を発現しているＨＩＶ感染個体である。
【０２８５】
一アプローチにより、９名のＨＩＶ感染患者に異なる量の修飾グリシンアミド（例えばα−ヒドロキシグリシンアミド、α−ペルオキシグリシンアミド二量体、ジグリシンアミドエーテルまたはα−メトキシグリシンアミド）を提供し、そしてＨＩＶ複製の抑制を分析する。群Ｉ（３個体を含入）には、カプセル形態で１日３回、１．０ｇの修飾グリシンアミドを投与する；一方、群ＩＩ（３個体を含入）には、カプセル形態で１日３回、１．５ｇの修飾グリシンアミドを投与する；そして群ＩＩＩ（３個体を含入）には、１日を通して、カプセル形態で、２．０ｇの修飾グリシンアミドを投与する。ＨＩＶ  ＲＮＡの量を検出する慣用的技法（例えばRoche AMPLICOR MONITOR（登録商標））により、ウイルス源の低減を毎日モニタリングする。検出されたＨＩＶ  ＲＮＡの量の低減により示されるように、ウイルス源の低減が観察される。
【０２８６】
上記の方法は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される抗ウイルス治療の投与により補足され得る。さらにこれらの方法に用いられる修飾Ｇ−ＮＨ2は、支持体に連結され得るし、あるいは薬学的に許容可能な担体を含む製剤中で投与され得る。
【０２８７】
明快さと理解のために多少詳細に本発明を説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細における種々の変更がなされ得る、と当業者は理解する。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】グリシルプロリルグリシンアミド（ＧＰＧ−ＮＨ2）、サルコシルピロリルグリシンアミド（ＳＡＲ−ＰＧ−ＮＨ2）、環状ピログルタミニルプロリルグリシンアミド（ＰｙｒＱＰＧ−ＮＨ2）、グルタミニルプロリルグリシンアミド（ＱＰＧ−ＮＨ2）およびグリシンアミド（Ｇ−ＮＨ2）の構造を示す。
【図２Ａ】時間の一関数としての、ヒトＴリンパ球（ＣＥＭ、Ｃ８１６６、Ｍｏｌｔ４／Ｃ８、ＭＴ−４）およびＰＢＭＣ懸濁液中（パネルＡ）のＣＤ２６活性を示す。基質はグリシルプロリル−ｐ−ニトロアニリド（ＧＰ−ｐＮＡ）であった。４００ｎｍでの吸光度により酵素活性を測定した。
【図２Ｂ】時間の一関数としての、いくつかの異なる血清（ヒト（ＨＳ）、ネズミ（ＭＳ）、ウシ（ＢＳ）（パネルＢ））中のＣＤ２６活性を示す。基質はグリシルプロリル−ｐ−ニトロアニリド（ＧＰ−ｐＮＡ）であった。４００ｎｍでの吸光度により酵素活性を測定した。
【図３】ＧＰ−ＯＨおよびＧ−ＮＨ2への、非標識ＧＰＧ−ＮＨ2の精製ＣＤ２６媒介性転化を示す。質量分光分析により検出を実施した。
【図４】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５％ウシ血清（ＢＳ）、ＰＢＳ中５％ヒト血清（ＨＳ）およびＣＥＭ細胞懸濁液（１０6細胞）による、［14Ｃ］Ｇ−ＮＨ2への放射標識化［14Ｃ］ＧＰＧ−ＮＨ2の転化を示す。
【図５】基質としてＧＰ−ｐＮＡを用いたＰＢＳ中の５％ウシ血清（ＢＳ）ならびにＰＢＳ中の１０6ＣＥＭ細胞懸濁液におけるＣＤ２６のジペプチジルペプチダーゼ活性に及ぼす、ＣＤ２６特異的阻害剤ＩｌｅＰｙｒの抑制作用を示す。
【図６】ＣＥＭ細胞培養中の、ＧＰＧ−ＮＨ2およびＧ−ＮＨ2の抗ＨＩＶ−１活性に及ぼすＣＤ２６阻害剤ＩｌｅＰｙｒの作用を示す。
【図７】Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）に転化する能力に関する、ヒト血清およびウシ胎仔血清の数ロットの分析結果を示す。
【図８】Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）に転化する能力に関する、異なる動物血清の分析結果を示す。
【図９】競合検定の結果を示す。この場合、修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）へのＧ−ＮＨ2の転化を抑制する異なる濃度のグリシン、Ｌ−セリン−ＮＨ2、Ｌ−アラニン−ＮＨ2またはＧＰＧ−ＮＨ2の能力を評価した。
【図１０】Ｇ−ＮＨ2を修飾Ｇ−ＮＨ2（メタボライトＸ）に転化する、サイズ排除クロマトグラフィーにより得られたウシ胎仔血清の異なる分画の分析結果を示す。
【図１１】逆転写酵素（ＲＴ）活性検定の結果を示す。この場合、酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸまたはＭｅｔ−Ｘ）は、煮沸ウシ胎仔血清を含有する培養中のＨＩＶの複製を抑制したが、Ｇ−ＮＨ2は抑制しなかった。
【図１２】逆転写酵素（ＲＴ）検定の結果を示す。この場合、５回透析されていた酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸまたはＭｅｔ−Ｘ）は、煮沸ウシ胎仔血清を含有する培養中のＨＩＶの複製を抑制した。
【図１３】逆転写酵素（ＲＴ）検定の結果を示す。この場合、種々の濃度の酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸまたはＭｅｔ−Ｘ）の抗レトロウイルス活性（ＩＣ50）を分析した。
【図１４】ｐ２４の蓄積をモニタリングしたＨＩＶ感染検定（ウシ胎仔血清中）の結果を示し、この場合、酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸまたはＭｅｔ−Ｘ）は、ＧＰＧ−ＮＨ2と同様に有効にＨＩＶを抑制した。
【図１５】ｐ２４の蓄積をモニタリングしたＨＩＶ感染検定（ウシ胎仔血清中）の結果を示し、この場合、合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）は、ＧＰＧ−ＮＨ2と同様に有効にＨＩＶを抑制することが観察された。
【図１６Ａ】ｐ２４の蓄積をモニタリングしたＨＩＶ感染検定（ウシ胎仔血清中（パネルＡ））の結果を示し、この場合、酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸまたはＭｅｔ−Ｘ）および合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）は、ウシ胎仔血清においてＧ−ＮＨ2と同様に有効にＨＩＶを抑制した（パネルＡ）。
【図１６Ｂ】ｐ２４の蓄積をモニタリングしたＨＩＶ感染検定（ヒト血清中（パネルＢ））の結果を示し、この場合、ヒト血清中では、酵素的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（メタボライトＸまたはＭｅｔ−Ｘ）および合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）が、ＨＩＶ複製を抑制し得ただけであった（パネルＢ）。
【図１７】逆転写酵素（ＲＴ）検定（ウシ胎仔血清中）の結果を示し、この場合、Ｇ−ＮＨ2、新たに希釈された合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（α−ＨＧＡ）および合成的に調製されたα−ヒドロキシグリシンアミド（３７℃で３日間インキュベートされていた）（α−ＨＧＡ３７）の、抗レトロウイルス活性を比較した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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