(57)【要約】金属カルボニルが、例えば血管拡張や血小板凝集の阻害等の生理活性を有するＣＯの放出のために、少なくとも一つのグアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤との組合せで使用される。その二つの成分は、同時又は連続して投与することが出来る。特に記述された組合せは、トリカルボニルクロロ（グリシネート）ルテニウム（ＩＩ）と薬剤ＹＣ−１のものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属カルボニル化合物又はその薬学的に許容し得る塩と、グアニル酸シクラーゼ刺激剤又は安定剤と、少なくとも一つの薬学的に許容し得るキャリヤとを含んでいることを特徴とする薬剤調合物。
【請求項２】
前記金属カルボニルが、生理学的対象に一酸化炭素を放出するために、生理学的効果に適したＣＯを利用可能とする請求項１に記載の薬剤調合物。
【請求項３】
前記金属カルボニル化合物が、以下の何れかの方法のうち少なくとも一つにより、ＣＯを利用可能とする請求項２に記載の薬剤調合物：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒又は配位子との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【請求項４】
前記金属カルボニル化合物と前記グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤とが、単一の組成物として合同されている請求項、請求項２又は請求項３に記載の薬剤調合物。
【請求項５】
前記金属カルボニル化合物と前記グアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤と  が、同時に又は連続して投与される別個の組成物中に存在している請求項１、請求項２又は請求項３に記載の薬剤調合物。
【請求項６】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ［但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａはイオン結合、共有結合又はＣＯ以外の配位結合によってＭに結合した原子又は基であり、１＜ｙの時、各Ａは同じ又は異なるものである］にて表されるか、又はそのような化合物の薬学的に許容し得る塩である先行の請求項の何れか一つに記載の薬剤調合物。
【請求項７】
前記Ｍが、遷移金属である請求項６に記載の薬剤調合物。
【請求項８】
前記Ａが、ハロゲン化物のような、中性若しくはアニオン性の配位子、又はルイス塩基からの誘導体で、配位原子として、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ又はＣを有するものの中から選択される請求項６又は請求項７に記載の薬剤調合物。
【請求項９】
前記金属カルボニル化合物が、式 Ｍ：（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、Ｍは、Ｆｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり、且つ、Ｍに対する単座配位子又は多座配位子であり、且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、［Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-、及び［ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-の中から選択されるものであり、またＢは、任意、且つ、ＣＯ以外の配位子である］にて表される請求項１乃至請求項５の何れか一つに記載の薬剤調合物。
【請求項１０】
前記グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤が、ＹＣ−１である先行の請求項の何れか一つに記載の薬剤調合物。
【請求項１１】
口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬を経由して放出するのに適合せしめられた先行の請求項の何れか一つに記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
先行する請求項の何れか一つに記載の薬剤調合物を投与する工程を含む、哺乳類への治療薬の導入方法。
【請求項１３】
ａ）金属カルボニルを投与すること；及び
ｂ）グアニル酸シクラーゼ刺激剤又は安定剤を投与すること、
を含む哺乳類への治療薬の導入方法。
【請求項１４】
生理学的対象にＣＯを放出するべく、前記金属カルボニルが、生理学的効果のためにＣＯを利用可能にする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属カルボニル化合物が、以下の何れかの方法のうち少なくとも一つにより、ＣＯを利用可能とする請求項１４に記載の方法：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒又は配位子との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【請求項１６】
前記金属カルボニルと前記グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤の投与の工程が、同時である請求項１３乃至請求項１５の何れか一つに記載の方法。
【請求項１７】
前記金属カルボニルとグアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤の投与の工程が、連続している請求項１３乃至請求項１５の何れか一つに記載の方法。
【請求項１８】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ［但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａはイオン結合、共有結合又はＣＯ以外の配位結合によってＭに結合した原子又は基であり、１＜ｙの時、各Ａは同じ又は異なるものである］にて表されるか、又はそのような化合物の薬学的に許容し得る塩である請求項１３乃至請求項１７の何れか一つに記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｍが、遷移金属である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ａが、ハロゲン化物のような中性又はアニオン性の配位子、若しくはルイス塩基からの誘導体で、配位原子として、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ又はＣを有するものの中から選択された請求項１８又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、Ｍは、Ｆｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり、且つ、Ｍに対する単座配位子又は多座配位子であり、且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、［Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-、及び［ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-の中から選択されるものであり、またＢは、任意、且つ、ＣＯ以外の配位子である］にて表される請求項１３乃至請求項１７の何れか一つに記載の方法。
【請求項２２】
グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤が、ＹＣ−１である請求項１３乃至請求項２１に記載の何れか一つに記載の方法。
【請求項２３】
金属カルボニル化合物及び／又はグアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤が、口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬を経由して投与される請求項１５乃至請求項２２の何れか一つに記載の方法。
【請求項２４】
前記金属カルボニルとグアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤が、体外に置かれた体の器官に対して投与される請求項１２乃至請求項２３の何れか一つに記載の方法。
【請求項２５】
前記投与が、血管拡張の刺激を目的とするものであり、又は、急性の、肺の又は慢性の高血圧の如き高血圧症、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、喘息や慢性関節リウマチのような炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の疾病、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起性機能不全、成人の呼吸窮迫症候群、及び血小板凝集阻害のうちの何れかの処理を目的とするものである請求項１２乃至請求項２４の何れか一つに記載の方法。
【請求項２６】
ａ）金属カルボニル化合物；及びｂ）グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤を含むキット。
【請求項２７】
前記金属カルボニルが、生理学的効果に適したＣＯを利用可能とする能力を有している請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記金属カルボニル化合物が、以下の何れかの方法のうち少なくとも一つにより、ＣＯを利用可能とする請求項２７に記載のキット：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒又は配位子との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【請求項２９】
前記金属カルボニルとグアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤とが、同時に又は連続して投与される別個の組成物中に存在している請求項２６又は請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ［但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａはイオン結合、共有結合又は配位結合によってＭに結合したＣＯ以外の原子又は基であり、１＜ｙの時、各Ａは同じ又は異なるものである］にて表されるか、又はそのような化合物の薬学的に許容し得る塩である請求項２６乃至請求項２９の何れか一つに記載のキット。
【請求項３１】
前記Ｍが、遷移金属である請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記Ａが、ハロゲン化物のような中性若しくはアニオン性の配位子、又はルイス塩基からの誘導体で、配位原子として、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ又はＣを有するものの中から選択される請求項３０又は請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、Ｍは、Ｆｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり、且つ、Ｍに対する単座配位子又は多座配位子であり、且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、［Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-、及び［ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-の中から選択されるものであり、またＢは、任意、且つ、ＣＯ以外の配位子である］にて表される請求項２６乃至請求項２９の何れか一つに記載のキット。
【請求項３４】
前記グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤が、ＹＣ−１である請求項２６乃至請求項３３の何れか一つに記載のキット。
【請求項３５】
前記金属カルボニル化合物及び／又はグアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤が、口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬を経由して放出するのに適合せしめられている請求項２６乃至請求項３４の何れか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤調合物、特に人及び他の哺乳類に対する一酸化炭素の治療的放出のための調合物、治療薬の放出の方法、及びこの目的のためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（ＮＯ）及び一酸化炭素（ＣＯ）ガスの血管拡張の効果は、かなりの間、知られてきている（非特許文献３）。Ｌ−アルギニン／ＮＯシンターゼ経路（synthase pathway）は、血管内皮に存在し、哺乳類における血管の弛緩と動脈血圧の制御において基本的な役割を演じてきた（非特許文献４）。増大した一酸化炭素（ＣＯ）の発生は、血管組織内でヘムオキシゲナーゼ−１酵素の活性化に続いて起こり、さらに生体内（in vivo）での急激な高血圧の抑制（非特許文献６）及び生体外（ex vivo）での血管の収縮の予防をもたらすこととなる（非特許文献７）。
【０００３】
ごく最近になって、一連の遷移金属カルボニルが、血管緊張低下を引き出したり、血圧の上昇を引き止めるために、生物学的システムにおいて、ＣＯ放出分子（ＣＯ−ＲＭｓ）として利用可能であることが、報告された（非特許文献５）。
【０００４】
ＮＯ及びＣＯによる血管の弛緩には、可溶性ヘム依存性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）（非特許文献３；非特許文献６；非特許文献７）の活性化を通じて、細胞内の環状３’，５’−グアノシン一リン酸塩（ｃＧＭＰ）レベルの増加が伴うように思われる。しかしながら、試験管内（in vitro）の研究において、ＣＯは、ＮＯと比較すると、ｓＧＣの促進剤として劣ることが知られている；精製したグアニル酸シクラーゼの酵素活性は、ＮＯ及びＣＯとの相互作用により、それぞれ、１３０倍と４．４倍とに増加した（非特許文献８）。
【０００５】
興味深いことに、文献からのデータは、ｓＧＣの触媒率が、実質的には、ベンジル−インダゾール誘導体の３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジル−インダゾール（ＹＣ−１）により改善され得ることを、明らかにしている。ＹＣ−１の作用の基礎となるメカニズムは、その活性コンフォメーションにおけるグアニル酸シクラーゼの安定化であり得るのである。そして、そこでは、また、ＹＣ−１がグアニル酸シクラーゼの製造を促進することがあることも、示唆されている。
【０００６】
２００２年１１月２１日に公開された、本発明者等の研究に基づく、ＷＯ０２／０９２０７５（特許文献１）は、体の細胞や組織への一酸化炭素の放出に利用可能である様々な金属カルボニル化合物について、開示している。そこに開示されている金属カルボニル化合物の一部は、一般的に、ＣＯ以外の配位子が含まれており、そしてそれは、本発明において利用可能である。そこでは、ＹＣ−１は、配位子として利用可能であることが、述べられている。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ  ０２／０９２０７５
【非特許文献１】Friebe A, Mullershausen F, Smolenski A, Walter U, Schultz G and Koesling D. YC-1 potentiates nitric oxide- and carbon monoxide-induced cyclic GMP effects in human platelets. Mol Pharmacol 54: 962-967, 1998.
【非特許文献２】Friebe A, Schultz G and Koesling D. Sensitizing solubleguanylyl cyclase to become a highly CO-sensitive enzyme. Embo J 15: 6863-6868, 1996.
【非特許文献３】Furchgott RF and Jothianandan D. Endothelium-dependent and -independent vasodilation involving cGMP: relaxation induced by nitric oxide,carbon monoxide and light. Blood Vessels 28: 52-61, 1991.
【非特許文献４】Moncada S, Palmer RMJ and Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 43: 109-142, 1991.
【非特許文献５】Motterlini R, Clark JE, Foresti R, Sarathchandra P, Mann BEand Green CJ. Carbon monoxide-releasing molecules: characterization ofbiochemical and vascular activities. Circ Res 90: E17-E24, 2002.
【非特許文献６】Motterlini R, Gonzales A, Foresti R, Clark JE, Green CJ andWinslow RM. Heme oxygenase-1-derived carbon monoxide contributes to thesuppression of acute hypertensive responses in vivo. Circ Res 83: 568-577, 1998.
【非特許文献７】Sammut IA, Foresti R, Clark JE, Exon DJ, Vesely MJJ,Sarathchandra P, Green CJ and Motterlini R. Carbon monoxide is a majorcontributor to the regulation of vascular tone in aortas expressing high levels of haeme oxygenase-1. Br J Pharmacol 125: 1437-1444, 1998.
【非特許文献８】Stone JR and Marletta MA. Soluble guanylate cyclase frombovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectralcharacterization of the ferrous states. Biochemistry 33: 5636-5640, 1994.
【非特許文献９】Becker EM et al. NO-independent regulatory site of direct sGC stimulators like YC-1 and BAY 41-2272. BMC Pharmacology 1: 13, 2001.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、人又は他の哺乳類の体への一酸化炭素の放出によって、改善された治療的効果を達成する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以下に詳記する実験データによって例証されているように、本発明者らは、金属カルボニル化合物が、グアニル酸シクラーゼ刺激剤又は安定剤（guanylate cyclase stimulant or stabilizer）との組合せにより、生理学的効果の改善を与えるものとして利用可能であることを見出した。
【００１０】
従って、第一の態様によれば、本発明は、金属カルボニル化合物又はそれの薬学的に許容し得る塩と、グアニル酸シクラーゼ刺激剤又は安定剤と、少なくとも一つの薬学的に許容し得るキャリヤとを含む薬剤調合物を、提供する。一般に、かかる金属カルボニルは、生理学的対象に一酸化炭素を放出するために、生理学的効果に適したＣＯを利用可能とするものである。
【００１１】
前記調合物は、金属カルボニルとグアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤を一つの組成物中に含めることが出来、又は、これら二つの成分は、同時に若しくは連続して投与するように、別個に処方することも出来る。
【００１２】
第二の態様によれば、本発明は最初の態様による薬剤調合物を投与する工程を含む、哺乳類への治療薬の方法を提供する。
【００１３】
第三の態様によれば、本発明は、
ａ）金属カルボニルを投与すること；及び
ｂ）グアニル酸シクラーゼ刺激剤又は安定剤を投与すること、
を含む哺乳類への治療薬の導入方法を提供する。
【００１４】
前記金属カルボニルと前記グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤は、単一の組成物として、又は二つの別々の組成物として、どちらも同時に投与することが可能である。該金属カルボニルと該グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤は、連続して投与されてもよい。好適には、初めに該安定剤／刺激剤が、続いて該金属カルボニルが投与されるが、この順序は逆であってもよい。
【００１５】
第四の態様によれば、本発明は、ａ）金属カルボニル化合物と、ｂ）グアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤とを含むキットを提供する。
【００１６】
二つの成分は、同時に又は連続して投与することが可能である。
【００１７】
本発明は、ここで、最初に、金属カルボニルが生理学的効果のために利用可能なＣＯを作り出す、生理学的対象への一酸化炭素の放出を含むものとして議論したが、一方、金属カルボニルがＣＯを放出しないで直接作用するような、異なる機構が含まれているものを、除外しない。
【００１８】
本発明の様々な態様が、生きた哺乳類における様々な体の細胞を処理するために利用可能である。加えて、隔離された器官、例えば体外の器官、又は、血液供給源から隔離された原位置の（in situ）器官が、処理可能である。該器官は、例えば、循環器官、呼吸器官、泌尿器官、消化器官、生殖器官、神経器官、筋肉若しくは皮膚切片又は成長細胞を含む人工器官であってもよい。特に、該器官は、心臓、肺、腎臓又は肝臓であってもよい。しかしながら、処理可能な体の組織は限定されたものではなく、体外又は動物の体における原位置のどちらでも、如何なる人又は哺乳類の組織であってもよい。
【００１９】
本発明の様々な態様が、生理学的効果を提供するため、例えば、神経刺激伝達若しくは血管拡張の刺激、又は急性の、肺の、慢性の高血圧の如き様々な高血圧症、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、喘息や慢性関節リウマチのような炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の疾病、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起性機能不全、成人の呼吸窮迫症候群、及び血小板凝集阻害等を処理するために使用される。
【００２０】
様々な態様は、また、例えば移植手術用の器官の保存及び／又は輸送の間等の、哺乳類の生きた体外の器官の潅流培養（perfusion）、又は、例えば外科手術の間等の、体内にはあるが、血流からは一時的に隔離された器官の処理のために、利用可能である。この目的のために、該金属カルボニルは溶解した形態、特に水溶液であることが好ましい。
【００２１】
本発明の様々な態様において、好ましくは、前記金属カルボニルは、以下の何れかの方法のうち少なくとも一つによりＣＯを利用可能とする：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒又は配位子との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【００２２】
最も好ましい金属カルボニルは、水溶性の金属カルボニルである。
【００２３】
ある種の金属カルボニル化合物は、適した溶媒との接触によって、ＣＯの放出が可能である。金属カルボニル成分が、液体形態にて投与されるとき、この溶媒は、成分の一部分を形成する。従って、薬剤調合物は、溶解形態にて、金属カルボニルから放出されたＣＯを含んでいる。金属カルボニル成分の調合の間に、カルボニル化合物が溶媒へ溶解される状態下では、そのようなＣＯの放出は、溶液中において保持されるように制御されてもよい。解離した成分と解離していないカルボニルとの間に平衡が存在する場合には、これが促進されてもよい。
【００２４】
元の金属カルボニルから解離した成分は、それ自身が、さらにＣＯを放出し得る金属カルボニル錯体であってもよい。例えば、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2がＤＭＳＯに溶解しているとき、ＣＯは溶液中に遊離され、そして、トリ−カルボニル及びジ−カルボニル錯体の混合物が形成され、これら自身がさらにＣＯを放出することが可能である。
【００２５】
或いは、前記金属カルボニル成分は、それ自身に溶解したＣＯを含まなくても、適切な溶媒又は媒体との接触によってＣＯを放出するように調製されてもよい。例えば、前記組成物は、例えば血液又はリンパ液等の水溶性の生理学的液体との接触のような、水との接触によって、ＣＯを放出し得る金属カルボニル化合物を含むようにしてもよい。該金属カルボニル化合物は、また、パーフルオロカーボン型の血液代用液との接触、又は、心筋保護液との接触によって、ＣＯを放出するようにしてもよい。
【００２６】
或いはまた、前記薬剤組成物は、投与の前に水に溶解させるようにしてもよい。そのような金属カルボニル成分は、溶液にて、又はタブレット形態のような、固体形態にて、調製されてもよい。もし、それらが溶液形態の場合には、適切な物質との接触によってのみＣＯの放出が行われるように、一般的には、金属カルボニル化合物の解離を支持しない溶媒中にて調製される。
【００２７】
或いは、又はそれに加えて、カルボニルからのＣＯの放出は、例えば、かかる錯体の配位子の一つの置換により該錯体からのＣＯの損失に至るというような、溶液中の配位子との反応によって刺激されてもよい。配位子は、硫黄又は窒素を含むものであってもよい。金属カルボニルには、グルタチオン又はヒスチジンのような生物学的な配位子との接触によってＣＯを放出するものもある。
【００２８】
他に代わるものとして、金属カルボニル成分は、組織、器官、又は細胞との接触によってＣＯを放出する金属カルボニル化合物を含んでもよい。ある種の金属カルボニル化合物は、溶液に対してはＣＯを放出しないが、それにも拘わらず、生理学的な細胞物質又は血管内皮のような組織に対しては、ＣＯを放出し得ることが知られている。例えば、［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−ビピリジン）（ＣＯ）2］は、溶液中でミオグロビンに対してＣＯを放出しないが、それにも拘わらず、予め収縮させた大動脈環の拡張を促進することが出来る。何れの特定の理論によっても限定されることは、望まないところであるが、恐らく、ＣＯは、シトクロムのような細胞の成分により媒介された、酸化還元反応の結果として、そのような化合物から放出されると、考えられる。
【００２９】
しかしながら、本発明は、ＣＯの放出についての機構として、酸化還元反応に限定されたものではない。それは、錯体からの少なくとも最初のＣＯ分子の損失は、酸化還元でなくても、起き得るからである。
【００３０】
また更に、他に代わるものとして、前記金属カルボニル成分は、照射によってＣＯを放出する金属カルボニル化合物を含んでいてもよい。該化合物は、例えばＣＯを溶解させた溶液を生成するように、投与の前に照射されても、又は投与後に、原位置で照射されてもよい。そのような組成物は、ＣＯの放出を制御し、局部的に制限するように使用されることも、意図されている。例えば、このタイプの薬剤組成物は、外科手術中に投与されてもよく、また、例えば、レーザー又は紫外線等の、その他の放射エネルギー源による特定の場所への照射により血管拡張を引き起こすように、それを必要とする箇所に特定して、ＣＯを放出してもよい。
【００３１】
本発明の金属カルボニル成分は、一般的に、溶解した形態において、治療の対象に利用し得るように、ＣＯを放出する。しかしながら、ある環境では、ＣＯは、非溶媒アクセプター分子に対して、直接、金属カルボニルから放出され得るものである。
【００３２】
かかる金属カルボニル化合物は、一般に、遷移金属の錯体を含み、好ましくは、第６族から第１０族の遷移金属（本明細書では、周期表の族は、１から１８までのＩＵＰＡＣ命名法に従い、番号が付けられている。）である。少なくとも一つのカルボニル配位子が存在すれば、カルボニル配位子の数は限定されない。好適な金属は、低分子量の遷移金属であり、特に、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ及びＲｈである。他に使用可能な金属は、ＰｄとＰｔの二つである。本発明で使用される金属カルボニル錯体において、該金属は、一般的に、低い酸化状態、すなわち０、Ｉ、又はＩＩのものである。好適な金属は、一般的に、酸化状態が、ＦｅII、ＲｕII、ＭｎI、ＣｏIIよりも高くなく、好ましくは、ＣｏI、ＲｈIII、さらに好ましくはＲｈI、ＮｉII、ＭｏIIである。そのような金属は、放射性核種でないものが、好ましい。Ｆｅは、哺乳類に多量に存在するため、特に適した金属の一つである。
【００３３】
金属中心に配位したＣＯ基を含んでいるため、前記金属カルボニル化合物は、錯体とみなしてもよい。しかしながら、該金属は、配位結合以外の結合により、例えばイオン結合や共有結合により、その他の基に結合していてもよい。従って、金属カルボニル化合物の一部分を形成するＣＯ以外の基は、孤立電子対を介して金属中心に配位するという意味では、厳密に「配位子」である必要はないが、ここでは参照し易くするために、「配位子」と呼ぶことにする。
【００３４】
従って、金属への配位子は、例えば［Ｍｎ2（ＣＯ）10］におけるように、全てが、カルボニル配位子であってもよい。あるいは、カルボニル化合物は、少なくとも一つの調節的な配位子（modulatory ligand）を含めてもよい。これは、ＣＯではないが、錯体の特定の特性、例えば、ＣＯを放出する傾向や、溶解性、疎水性、安定性、電気化学的ポテンシャル等を調節する配位子であることを意味する。従って、配位子の適切な選択は、化合物の挙動を調節するために行われ得る。例えば、それは、有機及び／又は水系溶媒における化合物の溶解性を調節し、細胞膜を通過する能力、特定の溶媒若しくは細胞種との接触、又は照射によるＣＯの放出率などを調節することが望ましいであろう。
【００３５】
そのような配位子は、概して、ハロゲン化物のような中性若しくはアニオン性の配位子又はルイス塩基の誘導体で、配位原子としてＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓ又はＣを有するものである。好適な配位原子は、Ｎ、Ｏ又はＳである。例としては、ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド、例えば、グリシン、システイン及びプロリン等の天然及び合成アミノ酸とそれらの塩、ＮＥｔ3及びＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2のようなアミン、例えば、ビ−２，２’−ピリジル、インドール、ピリミジン及びシチジン等の芳香族塩基及びそれらの類似化合物、ビリベルジン及びビリルビンのようなピロール、ＥｔＳＨ、ＰｈＳＨのようなチオール及びチオレート、塩化物、臭化物及びヨウ化物、ホルメート、アセテート、オキサレートのようなカルボキシレート、Ｅｔ2Ｏ及びテトラヒドロフランのようなエーテル、ＥｔＯＨのようなアルコール及びＭｅＣＮのようなニトリルが含まれるが、これらに限定されるものではない。特に好適なものは、アミノ酸のような配位結合による配位子であり、それは、水溶液中で安定なカルボニル錯体を与える。その他の可能な配位子は、ジエンのような共役炭素基である。本発明において有用な金属カルボニル化合物を与え得る配位子の一種は、シクロペンタジエニル（Ｃ2Ｈ5）及び置換シクロペンタジエニルである。置換シクロペンタジエニルにおける置換基は、例えば、アルカノール、エーテル及びエステルであり、例えば、−（ＣＨ2）ｎＯＨ［但し、ｎは１乃至４である］、特に、−ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）ｎＯＲ［但し、ｎは１乃至４であり、Ｒは炭化水素、好適には、１乃至４の炭素原子を有するアルキルである］及び−（ＣＨ2）ｎＯＯＣＲ［但し、ｎは１乃至４であり、Ｒは炭化水素、好適には、１乃至４の炭素原子を有するアルキルである］である。そのようなシクロペンタジエニル又は置換シクロペンタジエニルのカルボニル錯体において、好適な金属は、Ｆｅである。シクロペンタジエニルカルボニル錯体は、カチオン性で、塩化物のようなアニオンと会合するために、好ましい。
【００３６】
それ故に、本発明の薬剤組成物の特性は、金属カルボニル化合物における、金属中心及び会合した配位子の数と種類を適切に選択することにより、必要に応じて調製することが出来るのである。
【００３７】
前記金属カルボニル化合物は、適切な箇所へのＣＯの放出を促進するために、さらに標的部分（targeting moiety）を含んでもよい。該標的部分は、概して、必要な箇所へのＣＯの放出を促進するために、特定の標的となる細胞表面上において、レセプターと結合することが出来る。該標的部分は、標的となる細胞の表面上で発見されたレセプターと結合し得る調節的な配位子の一部分であっても、又は適切なリンカーによって該錯体に繋がっている、特定のレセプターに対して割り当てられている抗体のような、その他の分子から誘導してもよい。
【００３８】
本発明は、また、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ［但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａは、イオン結合、共有結合又はＣＯ以外の配位結合によってＭに結合した原子又は基であり、１＜ｙの時、各Ａは、同じものか、又は異なるものである］にて表されるか、又はそのような化合物の薬学的に許容し得る塩を、金属カルボニル成分として含む。概して、Ｍは、遷移金属、特に６族から１０族までのものであり、Ａは、ハロゲン化物のような中性若しくはアニオン性の配位子、又はルイス塩基からの誘導体で、配位原子として、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ又はＣを有するもの中から選択され得る。単座、二座又は多座配位子が使用され得る。好適な金属及び配位子についての更なる詳細については、上に記載のとおりである。該化合物の分子量は、好ましくは１０００未満、例えば８２２以下である。いくつかのＣＯ放出カルボニル（CO-releasing carbonyls）と、それらの放出特性を、図３Ａから図３Ｆに示した。
【００３９】
前記カルボニル錯体は、薬学的に許容し得る、特に、無毒又は予想される投薬量レベルにおいて許容し得る毒性であるべきである。
【００４０】
前記金属カルボニル成分は、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、Ｍは、Ｆｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり、且つ、Ｍに対する単座配位子又は多座配位子であり、且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、［Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-、及び［ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2］2-の中から選択されるものであり、またＢは、任意、且つ、ＣＯ以外の配位子である］にて表される化合物であってもよい。
【００４１】
ｘは、好ましくは３であり、ｙは、好ましくは１であり、ｚは、好ましくは１である。
【００４２】
ここで使用するアミノ酸という用語には、グリシナト（glycinato）のような、酸性水素を失うことにより得られる種も、含まれる。
【００４３】
Ｂｚは、一つ又はそれ以上の任意のその他の配位子を表す。Ｂは、特に限定されたものではなく、例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物、及びアセテート等のカルボキシレートのような配位子を使用することが出来る。
【００４４】
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ及びＣｏから選択される。これらの金属は、上述したように、低い酸化状態のものが、好ましい。
【００４５】
公知の鉄化合物［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−ビピリジン）（ＣＯ）2］及び［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）（ＣＯ）2］の使用もまた、本発明において考慮に入れられている。
【００４６】
前記グアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤化合物は、グアニル酸シクラーゼの製造を刺激するか、又は、特に、グアニル酸シクラーゼの活性形態において、グアニル酸シクラーゼを安定化する、如何なる化合物であってもよい。単一の化合物が用いられ得、又は、化合物の組合せが、同時的な又は連続した投与の何れにでも使用され得る。即ち、様々な形態が、少なくとも一つのグアニル酸シクラーゼ刺激剤／安定剤化合物を含み、又は使用する。
【００４７】
例としては、３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジル−インダゾール（ＹＣ−１）、４ピリミジナミン−５−シクロプロピル−２−［１−［（２−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−ｙｌ］（ＢＡＹ４１−２２７２）、ＢＡＹ  ５０−６０３８（ｏｒｔｈｏ−ＰＡＬ）、ＢＡＹ  ５１−９４９１（ｍｅｔａ  ＰＡＬ）及びＢＡＹ  ５０−８３６４（ｐａｒａ  ＰＡＬ）が、含まれる。オルト−、メタ−及びパラ−ＰＡＬの構造は、図２に示されている。これらの化合物は、グアニル酸シクラーゼ上の活性サイトと結合することが分かっており（非特許文献９）、そして、同様にサイトに結合する、その他の如何なる化合物も、グアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤として、有用である。また、ＮＯドナー並びに１−ベンジル−３−（３1−エトキシカルボニル）−フェニル−インダゾール、１−ベンジル−３−（３1−ヒドロキシメチル）−フェニル−インダゾール、１−ベンジル−３−（５1−ジエチルアミノメチル）−フリル−インダゾール、１−ベンジル−３−（５1−メトキシメチル）−フリル−インダゾール、１−ベンジル−３−（５1−ヒドロキシメチル）−フリル−６−メチル−インダゾール、１−ベンジル−３−（５1−ヒドロキシメチル）−フリル−インダゾル−ベンジル−３−（５1−ヒドロキシメチル）−フリル−インダゾール、１−ベンジル−３−（５1−ヒドロキシメチル）−フリル−６−フルオロ−インダゾール、１−ベンジル−３−（５1−ヒドロキシメチル）−フリル−６−メトキシ−インダゾール、及び１−ベンジル−３−（５1−ヒドロキシメチル）−フリル−５，６−メチレンジオキソインダゾール、又はそれらの薬学的に許容し得る塩が、有用である。
【００４８】
前記金属カルボニル成分及び／又はグアニル酸シクラーゼ安定剤／刺激剤成分は、一般的に、薬学的に許容し得る、賦形剤、キャリヤ、緩衝剤、安定剤、又はその他の当業者によく知られた物質を含む。そのような物質は、無毒であるべきであり、且つ、活性成分の効果を過度に阻害しないものであるべきである。キャリヤ又はその他の物質の正確な性質は、例えば、口、静脈、皮下、鼻、筋肉内、腹腔内又は座薬等の投与の経路に依存するであろう。
【００４９】
経口投与のための成分／調合物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体の形態にすることが出来る。錠剤は、ゼラチン若しくは補助薬（adjuvant）、又は遅放出性のポリマー（slow-release polymer）のような固体キャリヤを含んでいてもよい。液体組成物／調合物は、一般に、水、石油、動物性又は植物性の油、鉱油又は合成油の如き液体キャリヤを含む。生理食塩水、ブドウ糖若しくはその他の糖の溶液、又は、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールが、含まれてもよい。特に、組成物中に含まれる特定の金属カルボニル化合物の溶解に必要な、薬学的に許容し得る量の、その他の溶媒も、また、含まれてもよい。かかる組成物は、さらに、沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素添加食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非含水媒質（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール又は分留植物油）；防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）；及びエネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物、パルミチン酸エステルのような脂肪又はアミノ酸）のような、薬学的に許容し得る添加物を含んでいてもよい。
【００５０】
静脈、皮膚若しくは皮下注射、又は病気の部位への注射のために、前記活性成分は、一般的に、発熱物質を含まず、適切なｐＨであり、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容し得る溶液の形態にある。それらに関連の当業者であれば、例えば、生食注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射のような等張性媒質を使用して適当な溶液を上手に調製することが出来る。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又はその他の添加剤を、必要に応じて、含んでもよい。針を用いない注射のための放出システムも、また、知られており、そのようなシステムと共に使用するための組成物が、それに応じて調合されてもよい。
【００５１】
投与は、好適には、予防に効果的な量又は治療に効果的な量（但し、場合により、予防も治療と考えられることがある）であり、これは、各個人に対する利益を明らかにする充分なものとする。投与される実際の量並びに投与の割合及び時間的経過は、何が治療されるかによって、その性質及び厳格さに依存するであろう。例えば、投与量の決定等のような処置乃至は治療の処方は、一般開業医及びその他の医師の責任の範囲内であり、一般的に、治療される疾病、個々の患者の健康状態、放出の部位、投与の方法、及び、医師が知るその他の要因が考慮される。上で述べた技術やプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980 で調べることが出来る。
【００５２】
本発明に従う組成物／調合剤を調合する（formulating）際には、活性成分、刺激剤／安定剤及び／又は溶媒の毒性が、よく考慮されなければならない。医学的利益と毒性とのバランスを考慮に入れるべきである。投薬及び調合は、一般的に、構成物質の毒性によるあらゆるリスクにも勝る医学的利益が与えられるように、決定されるだろう。例としては、St.Thomas 病院液、Euro-Collins 液、Wisconsin 大学液、Celsior 液、リンゲル乳酸液、Bretschneider 液、及びパーフルオロカーボン等が含まれる。
【００５３】
前記金属カルボニル化合物及び前記刺激剤／安定剤は、単一の組成物として調合することが出来、それは、あらゆる物理的形態が可能である。この場合、成分は、同時に投与されるだろう。あるいは、該成分は、同時に又は連続して投与し得る二つの組成物として調合することも可能である。
【００５４】
本願を通して、医学的な処置（treatment）のための言及は、人の処置及び獣医学的な処置の両方を含むものであり、従って、薬剤組成物についての言及は、人の処置及び獣医学的な処置に使用するための組成物を包含するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
ＣＯＲＭ−３（１００ｍＭ）の貯蔵液が、実験を始める前に、蒸留水に該化合物を溶解することにより調製された。トリカルボニルジクロロルテニウム（ＩＩ）二量体（［Ｒｕ（ＣＯ3）Ｃｌ2］2）、３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジル−インダゾール（ＹＣ−１）及びその他の全ての試薬は、Sigma-Aldrich 社 (Poole, Dorset)から購入された。
【００５６】
全てのデータは、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．で示してある。分析を行ったグループ間の違いについては、両側検定のｔ−テスト（Student's two-tailed t-test）により評価し、二つ以上の処置を比較する場合には、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。結果は、Ｐ＜０．０５であり、統計的に有意であると考えられるものであった。
【００５７】
以下の実施例では、「ｍＭ」及び「μＭ」は、濃度（それぞれ millimolar 及び micromolar)を意味する。
【００５８】
合成
図３Ａから図３Ｆの金属カルボニル化合物を得るための合成方法は、ＷＯ０２／０９２０７５に記述されており、その内容の全体が、参考として、ここに組み入れられる。これらの化合物は、本発明において有用なものの実施例である。図３Ａから図３ＦにおけるＣＯ放出のデータは、ＷＯ０２／０９２０７５に説明されている。
【００５９】
Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯ2）［ＭR ２９４．５］の調製
グリシン錯体。参照番号：ＣＯＲＭ−３
［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びグリシン（０．０３９ｇ、０.５０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、丸底フラスコ中に入れた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、そして１８時間攪拌して、反応させた。その後、圧力下で溶媒を取り除き、そして黄色の残渣をＴＨＦに再溶解させて、ろ過し、過剰の４０−６０軽質石油を加えた。その黄色溶液を濃縮して、黄白色の固体（０．１４２ｇ、９６％）を得た。ＣＯＲＭ−３は、密閉式の小瓶に詰めて４Ｃで保存し、実験の日に新たに使用した。
【００６０】
代替としての、Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（ＮＨ2ＣＯ2ＣＯ2）［ＭR２９４．６］の好適な調製
グリシン錯体。参照番号：ＣＯＲＭ−３
［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０.２５ｍｍｏｌ）及びグリシン（０．０３９ｇ、０.５０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、丸底フラスコ中に入れた。メタノール（４０ｃｍ3）及びナトリウムメトキシド（０．５Ｍメタノール溶液、１．００ｃｍ3、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、そして１８時間攪拌して、反応させた。ＨＣｌ（２．０Ｍジエチルエーテル溶液）を、溶液ＩＲ分光法において、１９８７ｃｍ-1におけるＩＲのバンドが検出されなくなるまで、少しずつ分割して加えた。その後、溶媒を減圧下で取り除き、黄色の残渣をＴＨＦに再溶解させて、ろ過し、そして過剰の４０−６０軽質石油を加えた。得られた沈殿物を、母液をピペットで除くことによって分離し、高真空下で乾燥した。同じ作業を、一度、濃縮した母液に対して繰り返し行った。生成物の色は、白色から黄白色の間で変化し、０．１３３ｇ（９０％）の平均収量にて生成した。
【００６１】
実施例１
隔離したラットの大動脈環の調製及び実験のプロトコル
隔離した大動脈環（isolated aortic rings）の調製の方法は、以前に記述されたものである（非特許文献５；非特許文献７）。Sprague-Dawley ラット（３５０−４５０ｇ）から隔離した胸部の大動脈を、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２２ｍＭのＮａＨＣＯ3、１１ｍＭのグルコース、０．０３ｍＭのＫ+ＥＤＴＡ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2を含む、冷やした Krebs-Henseleit 緩衝液（４℃、ｐＨ７．４）で洗い、１０μＭのインドメタシンを追加した。各大動脈は、外膜組織が切り分けられ、そして環状部分（〜３ｍｍ長）が、動脈の環節の中心部分から形成された。かかる環は、その後、３７℃に保たれ、連続的に９５％Ｏ2−５％ＣＯ2のガスを供給した、Krebs-Henseleit 緩衝液を含む９−ｍＬの器官浴（organ bath）中にて、二つのステンレススチールのフックの間に取り付けられた。一つのフックはＧｒａｓｓＦＴ０３等張力変換器（isometric force transducer）に取り付け、もう片方を、大動脈環を張った状態にして、ハンマーで打ち付けて固定した。該環は、まず最初に、予め決定した最適条件である、２ｇの張力を３０分間かけて平衡にさせた。張力の連続的な記録は、Grass 7D polygraph (Grass Instruments 社, Quincy, MA)を、AcqKnowledgeTM software (Linton Instruments 社, Norfolk, UK)を使用した Biopac MP100 システムとの組合せにより、行った。各プロトコルを実行する前に、内部基準（internal reference）を供給し、そして組織間の収縮性の感度における変異性を制御するために、該環を、標準投与量のＫＣｌ（１００ｍＭ）にて収縮させた。ＹＣ−１（最終濃度５μＭ、３０分間のプレインキュベーション）の有無によるＣＯＲＭ−３（２５μＭ）の弛緩応答は、フェニレフリン（１μｍｏｌ／Ｌ）にてあらかじめ収縮させた動脈環において評価した。
【００６２】
結果
図１Ａは、フェニレフリンに対する血管の反応性の典型プロット及び、この実施例におけるＣＯＲＭ−３のみ、又はＹＣ−１との組合せにおける血管拡張の効果を示している。ＹＣ−１の不在下において、予め収縮させた環へのＣＯＲＭ−３（各２５μＭ）の三回の連続した添加は、血管緊張低下（vasorelaxation）を引き起こした（一番上のプロット参照）。その弛緩を、フェニレフリンを介した収縮の極大のパーセンテージとして表すと、ＣＯＲＭ−３は、初めの添加後に１０．３％の弛緩、二回目の添加後に２４．１％の弛緩、そして三回目の添加後に３８％の弛緩を引き起こした（図１Ｂ）。器官浴中におけるＹＣ−１の存在は、ＣＯＲＭ−３により媒介される観測された血管拡張の効果を増幅し（図1Ａ、一番下のプロット参照）、ＣＯキャリヤの最初の添加後に３３％の弛緩、二回目の添加後に６６．６％の弛緩、三回目の添加後に８０．９％の弛緩を引き起こした（図１Ｂ）。これらのデータは、ＣＯＲＭ−３により放出されたＣＯは、血管拡張の効果を媒介し、その効果は、ｓＧＣ活性化剤ＹＣ−１の添加によって更に高めることが出来ることを示している。ＣＯの存在下において、ＹＣ−１により増加したｃＧＭＰレベルは、血小板凝集の完全な阻害に導く（非特許文献１）という事実から考えて、ここにある結果は、血小板凝集の増加によって特徴付けられる病理生理学的な状態における、ＹＣ−１との組合せによるＣＯＲＭ−３の潜在的な治療目的での使用の可能性を示している。
【００６３】
実施例２及び実施例３は、ＣＯの放出及び血管緊張低下におけるＣＯＲＭ−３の効果を例証するために、ここでバックグラウンドとして示されている。
【００６４】
実施例２
ＣＯガス及びＣＯＲＭ−３によるミオグロビン（Ｍｂ）の一酸化炭素−ミオグロビン（ＭｂＣＯ）への転換
還元状態でのミオグロビン（Ｍｂ）は、５５５ｎｍに最大吸収ピークを有する特性スペクトルを示す（図４Ａ、点線を参照）。Ｍｂ（５０μＭ）の溶液中に、１分間、ＣＯガス（１％）を吹き込むと、一酸化炭素−ミオグロビン（ＭｂＣＯ）への急速な転換が観察される。図４Ａ（実線）に示すように、ＭｂＣＯは、それぞれ、５４０ｎｍと５７６ｎｍに二つの最大吸収ピークを有する特徴的なスペクトルを示す。この方法は、ＣＯ−ＲＭｓから放出されたＣＯの量をモニターし、決定するために、以前より発展してきたものである（非特許文献７）。確かに、ＣＯＲＭ−３［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（グリシナト）］を初めに水に溶解し、そこにＭｂ溶液を加えると、ＭｂＣＯの形成が確認された（図４Ｂ、実線）。形成されたＭｂＣＯ量は、瞬時のものであり、そしてそれは、ＣＯＲＭ−３の１モル当たりＣＯの１モルが速やかに放出されたことを示している（非特許文献７）。興味深いことに、ＣＯＲＭ−３を、ｐＨ＝７．４のリン酸バッファ中において３７℃で一晩中インキュベートしたままにすると、ＣＯは急速に失われる。この工程は、不活性な化合物（ｉＣＯＲＭ−３）を発生させ、それは、ＭｂをＭｂＣＯへ転換せず（図４Ｂ、点線を参照）、薬理学的活性のためのテストのときに、ＣＯＲＭ−３の負のコントロールとして使用される。
【００６５】
実施例３
血管緊張低下を引き起こす能力におけるＣＯＲＭ−３とｉＣＯＲＭ−３との比較
フェニレフリン（Ｐｈｅ）で予め収縮させた、隔離された大動脈環へのＣＯＲＭ−３（１００μＭ）の添加は、添加から数分以内に、約５４％の弛緩を促進した（図５、実線を参照）。対照的に、１００μＭのｉＣＯＲＭ−３（これはＣＯを放出することは出来ない）は、血管の緊張力において如何なる重要な変化も起こさなかった（図５、点線を参照）。これらの結果は、ＣＯＲＭ−３から遊離したＣＯが、観測された薬理学的な効果に直接的に責任があることを示している。
【００６６】
実施例４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ
隔離されたラットの大動脈環の調製及び実験プロトコル
隔離された大動脈環の調製及び張力の記録は、実施例１と同様である。各プロトコルを実行する前に、内部基準を供給し、そして組織間の収縮性の感度における変異性を制御するために、該環を、標準投与量のＫＣｌ（１００ｍＭ）で収縮させた。ＹＣ−１（最終濃度１μＭ、３０分間のプレインキュベーション）の有無によるＣＯＲＭ−３（２５、５０及び１００μＭ）の弛緩応答は、フェニレフリン（１μｍ）によりあらかじめ収縮させた動脈環において評価した。ＣＯＲＭ−３は、三回の累積した添加物として、１０分間隔で大動脈環に添加し、そして各添加後に、生じた弛緩のパーセンテージを記録した。もう片方の実験セットにおいて、グアニル酸シクラーゼ阻害剤（ここではＯＤＱと呼ぶ、Ｈ−（１，２，４）オキサジアゾロ（４，３−ａ）キノキサリン−１−オン、１０μＭ）及びＡＴＰ依存カリウムチャンネルの阻害剤（グリベンクラミド、１０μＭ）を、ＣＯＲＭ−３依存血管緊張低下を調節する能力について試験した。ＯＤＱ及びグリベンクラミドは、ＣＯＲＭ−３の添加より前に、大動脈環調製物に添加した（それぞれ１５分と３０分）。一酸化窒素（ＮＯ）のシンターゼ経路が、ＣＯＲＭ−３により介在された血管緊張低下の効果に係わっているという可能性を試験するために、ＮＯシンターゼ阻害剤（Ｌ−ニトロアルギニンメチルエステル又はＬ−ＮＡＭＥ、１０μＭ）を、ＣＯＲＭ−３の添加の３０分前に、大動脈環に添加した。追加の実験セットは、ＣＯＲＭ−３の添加前に大動脈組織から移動させた血管内皮にて行った。ＣＯＲＭ−３による直接的なグアニル酸シクラーゼの活性化の指標として、環状グアノシン一リン酸塩（ｃＧＭＰ）のレベルも、また、以前に記載された（非特許文献７）市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した、凍結して固めた（freeze-clamped）大動脈組織抽出物において、測定した。大動脈組織におけるｃＧＭＰのレベルは、ＣＯＲＭ−３（１００μＭ）の三回の累積的な添加のそれぞれ８分後に測定し、ｃＧＭＰの基礎レベル（比較対照、何も処置しない）と比較した。
【００６７】
結果−実施例４Ａ
ＣＯＲＭ−３により介在された血管緊張低下に関するグアニル酸シクラーゼ及びカリウムチャンネル阻害剤の効果
図６、７及び８でグラフが示している構成において、「添加０」における１００％の値は、ＣＯＲＭ−３の添加前の血管収縮性の値である。
【００６８】
予め収縮させた大動脈環を、上記したように、ＣＯＲＭ−３（２５、５０及び１００μＭ）の濃度を増加させていきながら処置した。三回の累積的なＣＯＲＭ−３の添加が行われ、各添加の最後に、血管緊張低下のパーセンテージを算出した。図６Ａにおいて示されているように、ＣＯＲＭ−３は、濃度依存の挙動において、かなりの弛緩を引き起こしている（グラフ中で、収縮の減少として示されている）。そのグラフから、１００μＭのＣＯＲＭ−３での処理後、三回の累積的な添加により引き起こされた弛緩のパーセンテージは、それぞれ３７．５±５．３％、４８．２±４．４％、及び５３．９±４．３％であるということが分かる。ＣＯを放出しないｉＣＯＲＭ−３（１００μＭ）の添加は、血管の収縮性に、如何なる検出可能な変化も生じなかった。そのデータは、各グループについて６つの独立した実施例（*ｐ＜０．０５  ｖｓ．ｉＣＯＲＭ−３）の ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。図６Ｂは、ＣＯＲＭ−３を介した血管緊張低下における、ＯＤＱ（グアニル酸シクラーゼ阻害剤）及びグリベンクラミド（Ｇｌｉ、ＡＴＰ依存カリウムチャンネルの阻害剤）の効果を示すものである。両方の阻害剤は、共に、ＣＯＲＭ−３により引き起こされる弛緩を弱めることにおいて非常に有効である。例えば、最初の添加の後で、ＣＯＲＭ−３により引き出された３７．５±５．３％の弛緩は、ＯＤＱ及びグリベンクラミドの存在下では、それぞれ、１．０±０．８％と１３．２±４．１％とに減少した。ＣＯＲＭ−３の初めの二回の添加の間、弛緩の阻害は、ＯＤＱを用いることによって顕著であると言明される。データは、各グループについて６つの独立した実験例（*ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣＯＲＭ−３）の ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。
【００６９】
結果−実施例４Ｂ
ＣＯＲＭ−３を介した血管緊張低下に関するＹＣ−１の効果
ＹＣ−１は、Ｆｒｉｅｂｅなど（非特許文献１；非特許文献２）によって以前に報告されているように、ＣＯガスの効果に対して、グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）を敏感にする。ＣＯＲＭ−３の存在下において、同様の効果が観測されるか、どうかを試験するために、ＣＯＲＭ−３の添加３０分前に、ＹＣ−１を、大動脈環調製物に添加した。図７Ａに示されているように、ＹＣ−１の存在は、ＣＯＲＭ−３（注：ＹＣ−１のみの前処理は、血管の収縮性に対して如何なる重大な変化も引き起こしていない）により引き起こされた弛緩の効果を増加させた。特に、ＹＣ−１は、使用された全ての濃度において、ＣＯＲＭ−３により介在された収縮性の減少を著しく増幅した。例えば、三回目の添加後、２５μＭのＣＯＲＭ−３のみは、約３１％の弛緩を引き起こしたが、一方、ＹＣ−１による血管の前処理は、弛緩の範囲を７７％まで増加させた（図７Ｂ）。ＹＣ−１による弛緩の増強を示す同様のパターンが、５０μＭ（図７Ｃ）及び１００μＭ（図７Ｄ）のＣＯＲＭ−３を使用した実験においても得られた。これらの結果は、ＣＯＲＭ−３により放出されたＣＯが、血管拡張の効果を媒介し、それは、ｓＧＣ活性化剤ＹＣ−１の添加によりさらに強化することができるということを示している。データは、各グループについて６つの独立した実験例（*ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣＯＲＭ−３）の ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。
【００７０】
結果−実施例４Ｃ
ＣＯＲＭ−３を介した血管緊張低下に関するＬ−ＮＡＭＥ及び内皮の除去の効果
ＮＯシンターゼ阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥは、ＣＯＲＭ−３が、ＮＯの内生的な発生を含む機構を通して、その効果を媒介するのか、どうかを確かめるために、使用されている。図８Ａに示されているように、Ｌ−ＮＡＭＥ（１００μＭ）は、ＣＯＲＭ−３の各添加により引き起こされた弛緩効果を著しく弱めた。例えば、最初の添加の後で、ＣＯＲＭ−３は約３７％の弛緩を引き起こしたが、器官浴中におけるＬ−ＮＡＭＥの存在は、弛緩の程度を５％に減少させた。興味深いことに、Ｌ−ＮＡＭＥの効果は、ＣＯＲＭ−３の濃度（２００及び４００μＭ）の増加により逆になる。同様な効果が、前記血管から内皮を除去することによって得られた。図８Ｂに示されているように、内皮を失った大動脈血管（−Ｅとしてグラフに示されている）は、ＣＯＲＭ−３の濃度が４００μＭまでの間における無傷の環（＋Ｅ）と同様に、ＣＯＲＭ−３に応答しない。これらの結果は、ＮＯ及び内皮により形成されるその他の要因が、血管緊張低下を促進するＣＯＲＭ−３の血管弛緩の能力を促進する事を示している。データは、各グループについて６つの独立した実験例（*ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣＯＲＭ−３）の ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。
【００７１】
実施例５
平均動脈血圧におけるＣＯＲＭ−３及びＹＣ−１の効果
Lewis ラット（２８０−３５０ｇ）は、１ｍＬ／ｋｇのＨｙｐｎｏｒｍの筋肉内注射により麻酔された（anaesthetised）。大腿部の動脈及び静脈のために特別に設計されたカテーテルを、以前に記述されているように（非特許文献５；非特許文献６）、外科手術によって挿入し、ポリグラフ（多元記録器）を使用して、血圧を連続的にモニターした。ラットにＣＯＲＭ−３（３０μモル／ｋｇ）の丸薬（bolus）を一つ投与し、２０分後、次の丸薬を投与した。ＣＯＲＭ−３は、静脈に注射され、各注射の後、平均動脈血圧ＭＡＰの変化を２０分間記録した。ＹＣ−１を使用した実験において、ｓＧＣ活性化剤（１．２μモル／ｋｇ）は、ＣＯＲＭ−３の最初の注射の５分前に静脈に投与された。生体内における平均動脈血圧（mean arterial pressure: ＭＡＰ）における、ＣＯＲＭ−３のみの、又は、ＹＣ−１との組み合わせの効果は、図７に総括した。ＣＯＲＭ−３の二つの丸薬（３０μモル／ｋｇ）は、互いに２０分の間隔を空けて静脈に注射し、ＭＡＰの変化を記録した。ＹＣ−１を使用した実験において、ｓＧＣ活性化剤（１．２μモル／ｋｇ）は、ＣＯＲＭ−３の最初の注射の５分前に静脈に投与された。示されているように、ＣＯＲＭ−３のみが、ＭＡＰの急速な、かなりの減少を引き起こした；特に、ＣＯＲＭ−３の最初の注射が、９．４±２．８ ｍｍＨｇのＭＡＰの減少を引き起こし、その一方、二番目のＣＯＲＭ−３の丸薬は、１３．３±４．９ ｍｍＨｇの低下をもたらした。ＹＣ−１の注射は、ＣＯＲＭ−３により介在される、血圧を下げる効果を増強させた。ＹＣ−１の投与は、５分後にＭＡＰの減少（７．０±１．６ ｍｍＨｇ）を導いた；次のＣＯＲＭ−３の注射は、この効果を増幅し、最初及び次の注射の後、それぞれ３７．０±２．４と２２．０±２．３ ｍｍＨｇのＭＡＰの減少という結果をもたらした。これらの結果は、ＣＯＲＭ−３により放出されたＣＯが生体内で血圧を下げる効果を媒介し、それはｓＧＣ活性化剤ＹＣ−１との組合せによってさらに強化されることを、示している。
【００７２】
本発明を、以上で記述した好適な具体例に関連して記述してきたが、数多くの同様な修正及び変形が、この開示を得た時に、当業者にとって明らかであろう。従って、上記にある本発明の好適な具体例は、あくまでも例示的なものであり、本発明を限定するものではないものと見なされる。記載された具体例の様々な変更は、本発明の精神や範囲を逸脱することなしに、行うことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】実施例１で得られた、ＣＯＲＭ−３のみ、及びＹＣ−１との組合せにおける血管拡張の効果を示す図である。
【図１Ｂ】実施例１で得られた弛緩率を示す図である。
【図２】オルト−、メタ−及びパラ−ＰＡＬの構造を示す図である。
【図３Ａ】一酸化炭素放出分子を示す図である。
【図３Ｂ】一酸化炭素放出分子を示す図である。
【図３Ｃ】一酸化炭素放出分子を示す図である。
【図３Ｄ】一酸化炭素放出分子を示す図である。
【図３Ｅ】一酸化炭素放出分子を示す図である。
【図３Ｆ】一酸化炭素放出分子を示す図である。
【図４Ａ】実施例２で得られた吸光度のデータを示す図である。
【図４Ｂ】実施例２で得られた吸光度のデータを示す図である。
【図５】実施例３の弛緩データを示す図である。
【図６Ａ】実施例４Ａのデータを示す図である。
【図６Ｂ】実施例４Ａのデータを示す図である。
【図７Ａ】実施例４Ｂのデータを示す図である。
【図７Ｂ】実施例４Ｂのデータを示す図である。
【図７Ｃ】実施例４Ｂのデータを示す図である。
【図７Ｄ】実施例４Ｂのデータを示す図である。
【図８Ａ】実施例４Ｃのデータを示す図である。
【図８Ｂ】実施例４Ｃのデータを示す図である。
【図９】実施例５のデータを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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