(57)【要約】本発明は、配列番号３−４のアミノ酸配列を含む、新規ヒト分泌ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、心臓血管障害の血漿において減少したレベルで循環している。本発明はまたポリペプチド、それらをコードするポリヌクレオチドおよび、これらのポリペプチドに特異的な抗体を含む組成物を提供する。また提供されるのは、このような組成物の製造法、および本発明の組成物の心臓血管障害の診断、予後および処置における使用法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心臓血管障害をスクリーニングおよび／または診断する方法であり：
ｉ)該対象由来の生物学的サンプル中のポリペプチドのレベルを検出および／または定量し、ここでこのポリペプチドが：
ａ.  配列番号３−５から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ.  配列番号３−５のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性し、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する、変異体；および
ｃ.  最低１０アミノ酸長である、上記ｉ)またはii)で定義したポリペプチドのフラグメント
から選択されるものであり；そして
ii)該レベルを、コントロールサンプルのものと比較する、
段階を含み、ここで、コントロールと比較して減少した該レベルが、心臓血管障害の指標である、方法。
【請求項２】
対象における心臓血管障害を予測する方法であり：
(ａ)該対象由来の生物学的サンプル中のポリペプチドのレベルを検出および／または定量し、ここでこのポリペプチドが：
ａ.  配列番号３−５から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ.  配列番号３−５のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性し、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する、変異体；および
ｃ.  最低１０アミノ酸長である、上記ｉ)またはii)で定義したポリペプチドのフラグメント
から選択されるものであり；そして
(ｂ)該レベルを、コントロールサンプルのものと比較する、
段階を含み、ここで、コントロールと比較して減少した該レベルが、心臓血管障害を発症する危険性の指標である、方法。
【請求項３】
該心臓血管障害が冠動脈疾患(ＣＡＤ)である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該生物学的サンプルが血漿である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ポリペプチドを、質量分析法により検出および／または定量する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該ポリペプチドを、酵素免疫測定法より検出および／または定量する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
配列番号３−４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項８】
該ポリペプチドが異種ポリペプチド配列に融合している、請求項７記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３−４のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性し、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する、変異体を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項７または９のフラグメントであり、最低１０アミノ酸長である、単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項７、９または１０に記載のポリペプチドと、さらに担体または希釈剤を含む、組成物。
【請求項１２】
該ポリペプチドが有効量で存在する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号３−４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する、抗心臓血管障害血漿ポリペプチド(ＣＰＰ)抗体。
【請求項１４】
抗体を心臓血管障害血漿ポリペプチド(ＣＰＰ)に結合させる方法であり：
ｉ)請求項１３記載の抗体と生物学的サンプルを、抗体結合が可能な条件下で接触させ；そして
ii)汚染物を除去する
段階を含む、方法。
【請求項１５】
該抗体が標識グループに結合している、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該サンプルがヒト血漿である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
心臓血管障害血漿ポリペプチド(ＣＰＰ)モジュレーターを同定する方法であり：
ｉ)試験化合物と、配列番号１−５からなる群から選択されるポリペプチドを、少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性が可能なサンプル条件下で接触させて；
ii)該少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性を測定し；
iii)該レベルを、該試験化合物を欠くコントロールサンプルと比較し；そして
iv)心臓血管障害の予防的および／または治療的処置用ＣＰＰモジュレーターとしてさらに試験するために該レベルの変化をもたらす試験化合物を選択する
段階を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１１または１２記載の組成物を個体に投与する段階を含む、心臓血管障害の予防法。
【請求項１９】
請求項１１または１２記載の組成物を個体に投与する段階を含む、心臓血管障害の処置法。
【請求項２０】
該組成物を注射により投与する、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓血管障害の個体由来の血漿には存在しないが、本疾患を有しない個体の血漿には存在するポリペプチド種、該ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、その多形変異体、および、心臓血管障害診断、心臓血管障害処置および薬剤開発のための検出アッセイにおける、該核酸およびポリペプチドまたはその組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管疾患は、工業化世界の間で主要な健康上のリスクである。冠動脈疾患(ＣＡＤ)は、アテローム性動脈硬化症または動脈の硬化により特徴付けられる。アテローム性動脈硬化症は心臓血管疾患の中で一般的であり、心臓発作、卒中、および四肢壊死の主要な原因であり、したがって米国で死亡の主要原因である。アテローム性動脈硬化症は、多くの細胞型および分子因子が関与する複雑な疾患である(例えば、Ross, 1993, Nature 362: 801-809に記載)。通常の環境中で、動脈壁の内皮および平滑筋細胞(ＳＭＣ)の傷害に対する保護的反応は、炎症に先立つまたは炎症を伴う、線維脂肪および繊維性病巣またはプラークの形成を含む。アテローム性動脈硬化症の進行した病変は関係する動脈を閉塞し得、そして多くの異なる形の傷害に対する過剰の炎症性−線維増殖性反応に起因する。血管内皮の傷害または機能不全は、個体の心臓血管疾患の発症を加速させる、多くの状態の共通の性質である。
【０００３】
アテローム硬化性プラークは関与する血管を閉塞し、血流を制限し、虚血をもたらす。虚血は、不適切な潅流が原因の臓器中の組織における酸素供給の不足により特徴付けられる状態である。このような不適切な潅流は、アテローム硬化性または再狭窄病巣、貧血または卒中を含む、多くの自然的な原因を有することがある。心臓の虚血における最も一般的な原因は、心外膜冠動脈のアテローム硬化性疾患である。これらの血管の管腔の減少により、アテローム性動脈硬化症は、基底状態の心筋潅流の絶対的減少をもたらすか、または血流の増加が必要であるときの適切な潅流の増加を制限する。冠状動脈血流はまた動脈血栓、痙攣および、稀に、冠状動脈塞栓により、ならびに梅毒性大動脈炎による入口部狭窄により、制限されることがある。先天的異常、例えば、肺動脈からの左冠動脈前下行枝の異常起源は、幼児の心筋虚血および梗塞をもたらし得るが、この原因は成人では非常に稀である。
【０００４】
心筋虚血は、高血圧または大動脈弁狭窄が原因の重症の心室肥大におけるように、心筋酸素要求が異常に増加した場合にまた起こることがある。後者は、冠状動脈アテローム性動脈硬化症が原因のものと区別ができない、狭心症を伴って起こり得る。重症の貧血またはカルボキシ−ヘモグロビンの存在下におけるような、血液の酸素運搬能の減少は、心筋虚血原因としては稀である。しばしばではないが、左心室肥大および冠状動脈アテローム性動脈硬化症に二次的な酸素供給の減少による、酸素要求の増加のように、２種またはそれ以上の虚血の原因が存在することがある。
【０００５】
広範な臨床試験は、心臓血管障害の危険性を増加させる因子を同定している。これらの危険因子のいくつか、例えば、年齢、性別および家族歴は変えることができない。他の危険因子は下記のものを含む：喫煙、高い血圧、高脂肪および高コレステロール食、糖尿病、運動不足、肥満およびストレス。
【０００６】
幸運なことに、多くの関係因子はライフスタイルを変えることによりコントロールできる。喫煙者の心臓血管障害の危険性は、非喫煙者の２倍である。人が禁煙したとき、彼または彼女が過去にどの程度喫煙していたかに関わらず、疾患を発症する危険性は急速に減少する。血清コレステロールレベルは、心臓血管障害の有病率と直接関係し、高血圧症または高い血圧は重要な危険因子である。身体的活動は、種々の機構を介して心臓血管障害の発症の危険性を減少させると仮定されている：心筋酸素供給を増加させ、酸素要求を減少し、かつ心筋収縮およびその電気刺激安定性を改善する。減少した酸素要求および心筋作業量は休息時の心拍数と血圧の低下に反映される。身体的活動はまた冠動脈の直径および拡張能力を増加させ、副行動脈形成を増加し、冠状動脈アテローム性動脈硬化症の進行の速度を低下させる。肥満および血清脂肪酸は、活動により減少する。
【０００７】
休息時の心臓血管障害には目立つ症状がないことがあるが、胸部圧迫感のような症状が、活動やストレスの増加に伴い起こり得る。出現することがある他の最初の徴候は、胸焼け、悪心、嘔吐、麻痺、息切れ、ひどい冷や汗、説明できない疲労および不安な感じである。心臓血管障害のより重症な症状は、胸痛(狭心症)、リズムの乱れ(不整脈)、卒中または心臓発作(心筋梗塞)である。卒中および心臓発作は、各々脳および心臓組織における動脈の遮断に起因する。症状が多様であるため、選択される試験および処置は患者毎に非常に異なることがある。
【０００８】
心臓血管障害の範囲および重症度を測定するために有用な診断試験は以下のものを含む：心電図(ＥＫＧ)、ストレステスト、核医学検査、冠状動脈血管造影、休息時ＥＫＧ、ＥＫＧ多相情報診断指数(EKG Multiphase Information Diagnosis Indexes)、ホルター・モニター、遅延電位、ＥＫＧマッピング、超音波心臓検査図、タリウム・スキャン、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、血管造影図およびＩＶＵＳ。さらなる危険因子測定および有用な診断は、医学の分野の当業者には一般的であり、最もよく適用されている。多くの治療的アプローチが存在し、疾患の重症度に依存する。多くのヒトに関して、心臓血管障害はライフスタイルの変更と投薬により制御する。より重症な診断は、手術の必要性を指示することがある。
【０００９】
虚血性アテローム性動脈硬化症の手術的アプローチは、バイパス移植術、冠状動脈血管形成術、レーザー血管形成術、アテローム切除術、動脈内膜切除および経皮経管的血管形成術(ＰＣＴＡ)を含む。これらのアプローチ後の、閉塞が再発し、しばしばより悪くなる再狭窄が原因の失敗の割合は異常に高い(３０−５０％)。再狭窄のほとんどがさらなる炎症、平滑筋蓄積および血栓症が原因であるように見える。心臓血管疾患へのさらなる治療的アプローチは、虚血心臓および四肢疾患のような状態における血管形成および組織リモデリングの促進をする処置を含む。
【００１０】
ほとんどのＣＡＤおよび心臓血管障害症状の非特異的性質が、確定診断を困難にしている。より定量的な診断法は、個体間および一個体の読取り値間のバラツキに邪魔だてされている。故に、診断的測定は、十分に記録された、総合的な既往歴を以て、標準化され、個人に適用されなければならない。さらに、現在の診断法はしばしば与えられた規定の観察または記録の、根本原因を明らかにしない。したがって、特定の陽性結果に基づく治療戦略が、原因となる問題に近づいていないようであり、個体にとって危険でさえある可能性がある。
【００１１】
ヌクレオチド検出に依存した診断法は、遺伝的アプローチと発現プロファイリングを含む。例えば、心臓血管障害に関与することが既知の遺伝子を、配列決定、ハイブリダイゼーションに基づく技術、またはＰＣＲのような一般的遺伝子型決定法を使用して、変異に関してスクリーニングし得る。他の例において、既知の遺伝子からの発現を、ＲＴＰＣＲ、種々のハイブリダイゼーションに基づく技術および配列決定を含む、標準技術により追跡できる。これらの戦略では、しばしば実行者がｍＲＮＡプロセシングおよびスプライシング、翻訳率、ｍＲＮＡ安定性ならびに、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、グリコシル化およびアミド化のような翻訳後修飾の差を検出することができない。
【００１２】
心臓血管障害の分野の診断状態における現在の弱点に取り組むために、本発明は、心臓血管障害に関連するポリペプチドを提供する。本発明は、冠動脈疾患の個体由来の血漿では検出できないが、コントロール血漿に存在するポリペプチド種の同定を提供する。実際のポリペプチド種を提供することにより、ｍＲＮＡプロセシングおよびスプライシング、翻訳率、ｍＲＮＡ安定性ならびに、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、グリコシル化およびアミド化のような翻訳後修飾における差が示される。本発明のポリペプチドは、したがって、“心臓血管障害血漿ポリペプチド”またはＣＰＰと呼ぶ。これらのポリペプチド配列を配列番号３−４として記載し、そして、表１のトリプシン消化ペプチドから選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものである。
【００１３】
本発明は、冠動脈疾患(ＣＡＤ)の個体から得た血漿において減少している、“心臓血管障害血漿ポリペプチド”(ＣＰＰ)、フラグメント、ＣＰＰの翻訳後修飾種を記載する。好ましい本発明のフラグメントは、配列番号３−４に記載のものである。故に、本発明のＣＰＰは、ＣＡＤ、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患の危険性の測定に重要な診断ツールである。ＣＰＰは分泌性因子であり、それ自体、タンパク質に基づく(protein-based)治療の理想的な候補物である。臨床応用における投与量調節に関して、タンパク質治療は、精細に制御可能な発現を欠くことにより障害された遺伝子治療に好ましい。さらに、分泌性因子であるため、本発明のポリペプチド種は、例えば、小分子またはタンパク質モジュレーターの標的にしやすい。故に、本発明のポリペプチド種は、心臓血管疾患の予防および処置のための薬剤開発および治療戦略の設計に有用である。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、正常なヒト血清には存在するが、心臓血管障害の個体由来の血漿では検出されない、分泌され、活性なポリペプチド種に関する。これらのポリペプチド種は、本明細書で“心臓血管障害血漿ポリペプチド”またはＣＰＰと呼ぶ。特に、本発明の好ましいＣＰＰは、配列番号３−４として記載され、本発明でＣＰＰ６およびＣＰＰ７と名付けられているものである。組成物は、ＣＰＰ前駆体、モノクローナル抗体を含むＣＰＰに特異的な抗体および他のそれに由来する結合組成物を含む。さらに含まれるのは、これらの組成物の製造法および使用法である。本発明の前駆体は、非修飾前駆体、配列番号１−５のタンパク質分解的前駆体、および、配列番号１−５のアミノ酸配列における別のタンパク質分解部位に由来する中間体を含む。
【００１５】
本発明の好ましい態様は、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、アミド化またはＣ−、Ｎ−またはＯ−架橋炭水化物グループのような翻訳後修飾を有するＣＰＰを含む。さらに好ましいのは、より高次の構造をもたらす分子間または分子内相互作用、例えば、ジスルフィドおよび水素結合を有するＣＰＰである。また好ましいのは、異なるｍＲＮＡプロセシングまたはスプライシングに由来するＣＰＰである。好ましくは、本ＣＰＰは、心臓血管障害を有するまたは発症する危険性のある個体由来の血漿で特異的に減少している翻訳後修飾された種、構造変異体、またはスプライス変異体を示す。
【００１６】
他の局面において、本発明は、配列番号３−５と少なくとも９５％同一の配列から成る、ＣＰＰを含む。好ましくは、本発明は、配列番号３−５から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９７％、およびより好ましくは少なくとも９８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９％同一性のポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明は、配列番号３−５と少なくとも９９％同一の配列から成る、ポリペプチドを含む。
【００１７】
他の局面において、本発明は、選択した集団で少なくとも２％の頻度を有する、ＣＰＰの天然変異体を含む。より好ましくは、このような天然変異体は、選択した集団で少なくとも５％、およびさらにより好ましくは、少なくとも１０％の頻度を有する。最も好ましくは、このような天然変異体は、選択した集団で、少なくとも２０％の頻度を有する。この選択した集団は、集団遺伝学の分野における認識された研究用集団のいずれであってもよい。好ましくは、選択した集団は白人、ネグロイドまたはアジア人である。より好ましくは、選択した集団はフランス人、ドイツ人、イギリス人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、アイルランド人、韓国人、シンガポール人、アイスランド人、北米人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシャ人、イタリア人、ポーランド人、太平洋諸島の人、フィンランド人、ノルウェー人、スウェーデン人、エストニア人、オーストラリア人またはインド人である。より好ましくは、選択した集団は、アイスランド人、サーメ人、フィンランド人、白人系フランス人、スイス人、中国系シンガポール人、韓国人、日本人、ケベック人、北米ピマインディアン、ペンシルベニアのアマン派およびアマン派の信徒、ニューファンドランド人またはポリネシア人である。
【００１８】
本発明の好ましい局面は、単離ＣＰＰ、すなわち、ＣＰＰと著しく異なる等電点または有意に異なる見かけの分子量を有するタンパク質またはタンパク質イソ型がないＣＰＰを含む組成物を提供する。ＣＰＰの等電点および分子量は、親和性およびサイズに基づく分離クロマトグラフィー、２次元ゲル分析および質量分析法により示すことができる。
【００１９】
好ましい局面において、本発明は、配列番号３−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、特定のポリペプチド種を提供する。好ましくは、この特定のポリペプチド種は、さらに、配列番号１および２からなる群から選択される、適当な完全長配列由来の隣接アミノ酸配列を含む。好ましい種は、ｉ)配列番号３−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；ii)心臓血管障害を有しないコントロール個体由来の血漿で高レベルに発現される；そしてiii)配列番号１および２からなる群から選択される、完全長ポリペプチド配列のタンパク質分解的プロセシングに由来するポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドはＣＰＰ６(配列番号３)およびＣＰＰ７(配列番号４)である。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は修飾ＣＰＰを含む。このような修飾は、基の保護／遮断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合、および、タンパク質の検出および単離を可能にするための酵素、蛍光、放射または親和性標識のような検出可能標識を含む。化学修飾は、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元による特異的化学開裂、またはツニカマイシン存在下での代謝的合成を含むが、これらに限定されない既知の方法により行うことができる。
【００２１】
本発明によりまた提供されるのは、ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の増加、または、免疫原性の低下のような、付加的利点を提供できる、本発明のポリペプチドの化学修飾誘導体である(例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールのような水溶性ポリマー)。本ＣＰＰは、分子内の無作為の位置かまたは分子内の予め決めた位置で修飾され、１個、２個、３個またはそれ以上の結合した化学部分(chemical moiety)を含み得る。
【００２２】
他の態様において、本発明は、少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性のモジュレーターを同定する方法であり：ｉ)ＣＰＰ生物学的活性の試験モジュレーターと、配列番号１−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを接触させて；ii)該ＣＰＰ生物学的活性のレベルを測定し；そしてiii)該ＣＰＰ生物学的活性のレベルを、該試験モジュレーターを欠くコントロールサンプルのものと比較する段階を含む、方法を提供する。ＣＰＰタンパク質生物学的活性の差が減少であるとき、本試験モジュレーターは少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性の阻害剤である。ＣＰＰ生物学的活性のレベルの差が増加であるとき、本試験物質は少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性のアクティベーターである。
【００２３】
他の局面において、本発明は、本発明のＣＰＰをコードするポリヌクレオチド、配列番号１−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このような配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、診断的および分析的アッセイのためのＣＰＰ遺伝子配列と相補的なオリゴヌクレオチド(例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションを利用した技術)、およびＣＰＰを発現するためのベクターを含む。
【００２４】
他の局面において、本発明は、ＣＰＰをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を含む。また提供されるのは、ＣＰＰまたはＣＰＰ前駆体の製造法である。１つの好ましい方法は(ａ)上記のような発現ベクターを含む宿主細胞を提供して；(ｂ)本宿主細胞を、ＤＮＡセグメントが発現される条件下で培養して；そして(ｃ)本ＤＮＡセグメントによりコードされるタンパク質を回収する段階を含む。他の好ましい方法は：(ａ)ＣＰＰを発現できる宿主細胞を提供して；(ｂ)該宿主細胞を、該ＣＰＰの発現が可能な条件下で培養して；そして(ｃ)該ＣＰＰを回収する段階を含む。１つの態様中で、本発現ベクターはさらにＤＮＡセグメントに操作可能に結合した分泌シグナル配列をさらに含み、本細胞がそのタンパク質を培養培地に分泌し、そして本タンパク質を培地中から回収する。ＣＰＰを製造するためのとりわけ好ましい方法は、“ＣＰＰ組成物の化学的製造”なる表題の部分および実施例３に記載のような、標準ペプチド合成技術を使用した化学合成を含む。
【００２５】
他の局面において、本発明は、上記のポリペプチド、ペプチドフラグメントまたはペプチドのいずれかに特異的な単離抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。さらに好ましいのは、排他的にＣＰＰに結合する抗体、すなわち、他のポリペプチド、例えば、配列番号１−５からなる群から選択されるポリペプチドに由来しないポリペプチドを認識しない抗体である。抗ＣＰＰ抗体は、精製、診断および治療適用を有し、特に、ＣＰＰ−関連疾患の処置に適用を有する。精製および診断のための好ましい抗ＣＰＰ抗体は標識基に結合している。診断のための好ましいＣＰＰ−関連疾患は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患を含む。処置および診断法は、ＣＰＰ抗原に特異的な抗体または抗体−由来組成物を用いるものである。特異的組織サンプルおよび体液(好ましくは血漿)中のＣＰＰを検出するための、および、組織中のＣＰＰの発現を検出するための診断法もまた本発明の一部である。薬学的に許容される担体と一緒の、上記の１個またはそれ以上の抗体も本発明の範囲内である。
【００２６】
本発明は、さらに心臓血管障害の診断法であり、体液、好ましくは血漿のサンプルにおける、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＰＰまたはそれらのいずれかの組み合わせの存在またはレベルを検出することを含む、方法を提供する。これらの方法はまた臨床的スクリーニング、予後、治療成果のモニタリング、特定の治療的処置に最も応答しそうな患者の同定、薬剤スクリーニングおよび開発、および薬剤処置の新規標的の同定のためにまた適している。
【００２７】
本発明は、上記の方法に使用できる、および、単一のまたは複数の調製物、または、抗体を、必要であれば他の試薬、標識基、基質と共に含み、かつ、使用の指示書を含む、キットを提供する。キットは疾患の診断に使用でき、または、新規診断および／または治療薬の同定のためのアッセイであってよい。
【００２８】
１つの態様において、冠動脈疾患(ＣＡＤ)は、少なくとも１つの症状の出現により定義される。このような症状は、疾患が進行するにつれて、重篤になっていく。ＣＡＤは、しばしば、左心室機能または拍出量の低下を伴う。初期ＣＡＤ症状は、コレステロールおよび低密度リポタンパク質(とりわけ酸化型)の血漿レベルの上昇、ならびに多血小板血漿凝集を含む。炎症に対する血管内皮応答、すなわちプラークの形成、ならびに炎症性およびフィブリン生成性因子のレベルが上昇する。加えて、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症が、血管石灰化および動脈の硬化により特徴付けられる。結果的な血管の部分的閉塞は、高血圧および虚血性心臓疾患に至る。最終的な完全な血管閉塞は、心筋梗塞、卒中または壊疽に至る。
【００２９】
好ましい態様において、本発明の少なくとも１つのＣＰＰの低下した血漿レベルの検出は、個体がＣＡＤを発症する危険性が増加していることを示す。好ましくは、該検出は、個体がＣＡＤを発症する見込みが、少なくとも１.０５倍、１.１倍、１.１５倍、およびより好ましくは少なくとも１.２倍増加していることを示す。別法として、本発明の少なくとも１つのＣＰＰの血漿レベルの低下の検出は、個体がＣＡＤを有することを示す。個体の血漿サンプルにおいて観察されたコントロールサンプルと比較して減少したＣＰＰの量は、ＣＡＤの予測または診断の確実性と相関する。個体の血漿ＣＰＰレベルが家族歴および他の危険因子に依存して変化するため、各々の好ましくは個別に試験する。好ましい態様において、ＣＰＰを、本発明の方法によりヒト血漿サンプルで検出する。とりわけ好ましい技術は、質量分析法および免疫検出である。好ましくは、ＣＡＤの予測または診断は、実験したＣＰＰレベルが、コントロールと比較して少なくとも１.１倍、１.１５倍、１.２倍、１.２５倍、およびより好ましくは１.５倍減少していることに基づく。
【００３０】
本発明は、さらに、個体における配列番号３−４のＣＰＰの異常な発現またはプロセシングに関連する疾患を処置するためのＣＰＰ組成物の使用法を含む。好ましいＣＰＰ−関連疾患は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患を含む。さらに包含されるのは、ＣＰＰ遺伝子に相補的なプライマーおよび／またはメッセンジャーＲＮＡおよび抗ＣＰＰ抗体を含むＣＰＰ組成物の、組織および体液、好ましくは血漿におけるＣＰＰの量の検出および測定のための使用である。本発明は、さらに、ＣＰＰの発現を増加させる化合物のスクリーニング法、ならびに、ＣＰＰと相互作用するおよび／または活性を増加させる化合物のスクリーニング法を含む。本発明はさらにＣＰＰの発現を阻害する化合物のスクリーニング法、ならびに、ＣＰＰと相互作用するおよび／または活性を阻害化合物のスクリーニング法を含む。本発明はさらにこのようにして同定された化合物、ならびにそれらの組成物も包含する。
【００３１】
さらに別の局面において、本発明は、配列番号１−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および、薬学的に許容される担体化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。
【００３２】
本発明のさらなる局面は、また、明細書および特許請求の範囲に記載されている。
【００３３】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、完全長チトトリオシダーゼのアミノ酸配列を示す(SwissProt Q13231)。
配列番号２は、成熟チトトリオシダーゼポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３および４は、冠状動脈疾患を有する個体の血漿には存在しないか減少している血漿タンパク質のアミノ酸配列を示し、これらは本明細書で各々ＣＰＰ６およびＣＰＰ７と呼ぶ。
配列番号５は、冠状動脈疾患を有しない個体の血漿サンプルにおいて、ＭＳ−ＭＳおよび／またはＭＳ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により発見されたトリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００３４】
表の簡単な説明
表１は、冠動脈疾患(ＣＡＤ)を有しないコントロール個体の分画血漿で発見され、ＣＡＤの患者の血漿には存在しないトリプシン消化ペプチドを列記する。標題ＣＥＸの列は、１８カチオン交換フラクションのうちトリプシン消化ペプチドが溶出した数を示し、標題塩の列は、本明細書の実施例１のステップ３に記載のプロトコールによる、これらのフラクションの溶出のためのＮａＣｌ濃度を示す。ＲＰ１は、逆相フラクション(フラクション１−３０)、および％Ｂは、本明細書の実施例１のステップ４に記載のプロトコールによる、これらのフラクションのための溶出緩衝液のパーセンテージを示す。第２の逆相フラクション(フラクション１−２４)は、試験番号の最後の２つの数として示す。
【００３５】
【表１】
2006519771.tif 000002
【００３６】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトチトトリオシダーゼ・プレタンパク質(配列番号１)；成熟チトトリオシダーゼポリペプチド(配列番号２)；および心臓血管障害血漿ポリペプチド６−７(配列番号３−４)の配列を示す。タンデム質量分析法によりコントロール血漿サンプルで観察されるトリプシン消化ペプチドは太字であり、配列番号５として示す。シグナル配列は下線を引く。二塩基性タンパク質分解的開裂部位は、斜体でかつ下線を引いた文字である。得られた加工ペプチドであるＣＰＰ６−７(配列番号３−４)のアミノ酸配列を下に挙げる。本タンパク質の推定活性部位を太字かつ下線を引いて示す(Boot, R.G. et al., J. Biol. Chem., (1995), 270, p.26252-56)。
【００３７】
発明の詳細な説明
以下に詳述する本発明は、哺乳類個体の心臓血管障害のスクリーニング、診断および処置に；特定の治療的処置に最も応答しそうな患者の同定のために；心臓血管障害治療の結果をモニタリングするために；ＣＰＰモジュレーターをスクリーニングするために；および薬剤開発のために有用な方法、組成物およびキットを提供する。本発明を薬剤開発に、例えば、ＣＰＰモジュレーターまたは薬剤候補物が、抗心臓血管障害応答を誘発する能力を測定するために使用するとき、少なくとも１つのＣＰＰのレベルを分析するための体液は、好ましくは非ヒト哺乳類由来である。非ヒト哺乳類は、好ましくは、内因性および／または外因性動因による、抗心臓血管障害応答の誘導が、ヒトにおけるこのような応答の予測となるものである。齧歯類(マウス、ラットなど)および霊長類が、本発明のこの局面における使用に特に適している。本発明はまた心臓血管障害を処置または予防するための、哺乳類個体への治療的組成物の投与を包含する。哺乳類個体は非ヒト哺乳類であってよいが、好ましくはヒト、より好ましくは成人である。説明を明確にするために、そして、限定する目的ではなく、本発明を血漿サンプルの分析に関連して記載する。しかしながら、当業者には認識されるように、下記に示すアッセイおよび技術は、心臓血管障害を有する危険性を有するまたは発症する危険性のある個体由来の他の生体サンプル(例えば脳髄液、リンパ、胆汁、血清、唾液または尿)または組織サンプルに適用できる。本発明の方法および組成物は、生存個体のスクリーニング、診断および予後に有用であるが、同じ疾患の発症の危険性を有する家族の同定のための、個体の死後の診断にも使用できる。
【００３８】
定義
本明細書で使用する“核酸”および“核酸分子”は、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)およびＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)および、ヌクレオチドアナログを使用して産生した該ＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。本核酸分子は一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本明細書を通して、“ヌクレオチド配列”なる表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を差別せずに示すために用いることがある。より厳密に、“ヌクレオチド配列”なる表現は、核酸物質そのものを包含し、したがって、生化学的に特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴付けする配列情報(すなわち４種の塩基文字から選択した文字の連続)に限定されない。また、本明細書で、“核酸”、“オリゴヌクレオチド”および“ポリヌクレオチド”なる用語は交換可能に使用される。
【００３９】
“単離”核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、“単離”核酸は、核酸が由来する生物中のゲノムＤＮＡで本核酸に本来隣接して位置する配列(すなわち、核酸の５'および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の態様において、単離ＣＰＰ核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸分子と本来隣接しているヌクレオチド配列を、約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０.５kbまたは０.１kbより少なく含むことがある。さらに、ｃＤＮＡ分子のような“単離”核酸分子は、組み合わせ技術により製造したとき他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、化学的に合成したとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことがある。本発明の核酸分子は、標準分子生物学的技術および本明細書に提供された配列情報を使用して単離できる。核酸の全てまたは一部を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＣＰＰ核酸分子を標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離できる(例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 198９に記載のような)。
【００４０】
本明細書で使用する、“とハイブリダイズする”なる用語は、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション、好ましくは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、少なくとも互いに６０％相同のヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままであることが可能な条件を記載することを意図する。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％相同な配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたまま残るようなものである。ストリンジェント条件は当業者に既知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見ることができる。好ましい、非限定的例において、核酸相互作用のためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は下記の通りである：ハイブリダイゼーション段階は、６５℃で、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハルト溶液、０,５％ＳＤＳおよび１００μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡの存在下で再アニールと理解されている。ハイブリダイゼーションは４回の洗浄段階：
−５分、好ましくは６５℃で２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中の２回の洗浄；
−３０分、好ましくは６５℃で２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中の１回の洗浄、
−１０分、好ましくは６５℃で０.１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中の１回の洗浄
に続き、これらのハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸分子に適している。上記のハイブリダイぜージョン条件は、当業者に既知の方法にしたがって、望む核酸の長さにしたがって変化させるべきであり、例えばHames B.D. and Higgins S.J. (1985)Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach. Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford; およびCurrent Protocols in Molecular Biology(前掲)にしたがって変化させる。
【００４１】
“％相同性”は、本明細書では核酸配列およびアミノ酸配列の両方を指して使用する。本明細書で使用する、アミノ酸または核酸“同一性”は、アミノ酸または核酸“相同性”と同等である。２つのアミノ酸配列または２つの核酸の％相同性を測定するために、配列を最適比較目的で整列させる(例えば、ギャップを第一アミノ酸または核酸配列の配列に挿入し、第二アミノまたは核酸配列との最適配置をしてもよく、非相同性配列を比較目的で無視できる)。比較目的で配置した参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第一配列のある位置が、第二配列における対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されているとき、その分子はその位置で相同である。２つの配列の間の％相同性は、本配列が共有している同一位置の数の関数である(すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数１００)。
【００４２】
２つの配列間の配列の比較および％相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77のように改変された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68であり、その内容を出典明示により全体を本明細書に包含させる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)に包含されている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の配列と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、文字長＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のポリペプチド配列と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長＝３で実施できる。比較目的でギャップド・アラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997)Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402に記載のように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各ログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメーターを使用できる。その記載を出典明示により全体を本明細書に包含させるhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。配列の比較のために使用する数学的アルゴリズムの他の好ましい非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)であり、その記載を出典明示により全体を本明細書に包含させる。このようなアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に包含させ、それはＧＣＧ配列アラインメント・ソフトウエアパッケージの一部である。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較に使用するとき、ＰＡＭ１２０ウェイト・残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用できる。
【００４３】
“ポリペプチド”なる用語は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを意味する；故に、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語はまたポリペプチドの翻訳後修飾を明記または除外するものではなく、例えば、グリコシル、アセチル、リン酸、アミド、脂質、カルボキシル、アシルまたは炭水化物基の共有結合を含むポリペプチドは、明白にポリペプチドの用語に包含させる。またこの定義に包含されるのは、アミノ酸の１個またはそれ以上のアナログを含むポリペプチド(例えば、天然に存在しないアミノ酸、関連しない生物系においてのみ天然で存在するアミノ酸、哺乳類系由来の修飾アミノ酸などを含む)、置換された架橋を有するポリペプチドならびに、天然に存在するおよび天然に存在しない両方の当分野で既知の他の修飾を含む。
【００４４】
本明細書で使用する“タンパク質”なる用語は、“ポリペプチド”と同義に使用でき、または、それに加えて、ペプチド結合以外の結合で結合し得る、例えば、タンパク質を形成するこのようなポリペプチドがジスルフィド結合により架橋されていることがある、２個またはそれ以上のペプチドの複合体を意味し得る。“タンパク質”なる用語は、同一アミノ酸配列を有するが、特に、このようなタンパク質が真核宿主で発現されるときに付加されるような異なる翻訳後修飾を有するポリペプチドのファミリーも包含できる。
【００４５】
“単離”または“精製”タンパク質またはその生物学的活性部分は、本発明のタンパク質(すなわち、ＣＰＰまたはその生物学的活性フラグメント)が由来する細胞または組織供給源由来の細胞物質または汚染タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成したとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。“細胞物質を実質的に含まない”なる表現は、タンパク質を単離または組み換え的に製造した細胞の細胞性成分からそれを分離する、本発明のタンパク質の調製物を含む。１つの態様において、“細胞物質を実質的に含まない”なる表現は、本発明のタンパク質以外のタンパク質(また本明細書では“汚染タンパク質”と呼ぶ)を約３０％(乾燥重量で)より少なく、より好ましくは本発明のタンパク質以外のタンパク質を約２０％より少なく、さらにより好ましくは本発明のタンパク質以外のタンパク質を約１０％より少なく、および最も好ましくは本発明のタンパク質以外のタンパク質を約５％より少なく有する、本発明のタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的活性部分を組み換え的に製造したとき、それはまた好ましくは培養培地を実質的に含まない、すなわち、タンパク質調製物の容量の約２０％より少なく、より好ましくは約１０％より少なく、および最も好ましくは約５％存在する培養培地を意味する。
【００４６】
“化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない”なる表現は、本タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から、タンパク質を分離する、本発明のタンパク質の調製物を含む。１つの態様において、“化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない”なる用語は、化学的前駆体または非タンパク質化学物質が約３０％(乾燥重量で)より少ない、より好ましくは化学的前駆体または非タンパク質化学物質が約２０％より少ない、さらにより好ましくは化学的前駆体または非タンパク質化学物質が約１０％、最も好ましくは化学的前駆体または非タンパク質化学物質が約５％より少ない、本発明のタンパク質の調製物を含む。
【００４７】
“組み換えポリペプチド”なる用語は、本明細書で、人工的に設計され、最初の自然環境では連続しては見られない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むかポリペプチドを意味するか、組み換えポリヌクレオチドから発現されているポリペプチドを意味するために使用する。
【００４８】
“心臓血管障害血漿ポリペプチド”または“ＣＰＰ”なる用語は、配列番号３−５のいずれかに１つに記載の配列を含む、好ましくは、配列番号５のポリペプチド配列を含む、ポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドは、本明細書に記載のように翻訳後修飾されていてもよい。ＣＰＰはまた、複雑な二次元または三次元構造をもたらす、ジスルフィド結合、または水素もしくはアミド結合のようなアミノ酸側鎖相互作用のような他の構造的または化学的修飾も含み得る。ＣＰＰはまた、配列番号３−５からなる群から選択される配列の欠失、付加、交換のような変異ポリペプチド、または切断変異体、このようなポリペプチドを含む融合ポリペプチド、および、少なくとも３、しかし好ましくは８、１０、１２、１５または２１連続アミノ酸のポリペプチドフラグメントを含む。さらに包含されるのは、配列番号１−５からなる群から選択される配列のＣＰＰタンパク質分解前駆体および中間体である。本発明は、配列番号１−５のいずれか１つの配列からなる、本質的にこれらから成る、または、これらを含む単離ＣＰＰを含む、ＣＰＰ遺伝子またはＣＰＰ  ｍＲＮＡ種、好ましくはヒトＣＰＰ遺伝子およびｍＲＮＡ種によりコードされるポリペプチドを含む。好ましいＣＰＰは、配列番号３−５の配列を含む。好ましいＣＰＰは、配列番号３−４のＣＰＰの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【００４９】
本明細書で使用される“生物学的活性”なる用語は、ＣＰＰにより行われる全ての機能を意味する。これらは、下記のものを含むが、これらに限定されない：(１)心臓血管疾患からの防御；(２)血流を通した循環；(３)抗原性、または抗ＣＰＰ特異的抗体と結合する能力；(４)免疫原性、または抗ＣＰＰ特異的抗体を産生する能力；または(５)ＣＰＰ標的分子、好ましくはタンパク質との相互作用。
【００５０】
本明細書で使用する“ＣＰＰモジュレーター”または“ＣＰＰ６モジュレーター”または“ＣＰＰ７モジュレーター”なる用語は、本発明のＣＰＰの発現または生物学的活性のいずれかを調節(すなわち、増加または減少)できる分子(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子または抗体)である。ＣＰＰ発現または活性を促進するＣＰＰモジュレーターは、ＣＰＰアクティベーターまたはアゴニストと呼ぶ。逆に、ＣＰＰ発現または活性を抑制するＣＰＰモジュレーターは、ＣＰＰ阻害剤またはアンタゴニストと呼ぶ。好ましくは、ＣＰＰモジュレーターは、発現または活性を少なくとも５、１０または２０％増加／減少させる。ＣＰＰ阻害剤は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより特徴付けられる、抗ＣＰＰ抗体、そのフラグメント、アンチセンスポリヌクレオチドおよび分子を含む。ＣＰＰアゴニストは、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより特徴付けられるポリヌクレオチド発現ベクターおよ分子を含む。
【００５１】
“ＣＰＰ−関連障害(CPP-related disorder)”または“ＣＰＰ−関連病(CPP-related disease)”は、心臓血管障害を言う。好ましい疾患は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧、および他の心臓血管疾患を含む。好ましくは、個体がこのような疾患を発症する見込みまたはすでに有していることが、少なくとも１つのＣＰＰの血漿レベルの減少により示される。
【００５２】
本発明の他の局面は、抗ＣＰＰ抗体に関する。本明細書で使用する“抗体”なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＣＰＰのような抗原を特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合部位を含む分子、またはその生物学的活性フラグメントまたはその相同物を意味する。好ましい抗体は、配列番号３−４からなる群から選択されるＣＰＰと排他的に結合し、他のポリペプチド配列と高親和性で結合しない。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより産生できるＦ(ａｂ)およびＦ(ａｂ')２フラグメントを含む。本発明は、ＣＰＰと結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体または、その生物学的活性フラグメントまたは相同物を提供する。本発明で使用する“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”なる用語は、ＣＰＰの特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位のただ１つの種を含む、抗体分子の集団である。モノクローナル抗体組成物は、したがって、典型的にそれらが免疫反応する特定の親和性に対して単独の結合親和性を示す。好ましいＣＰＰ抗体は標識基に結合している。
【００５３】
本明細書で使用する“標識基”なる用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド(抗体を含む)と結合したとき、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出または精製を可能にする全ての化合物である。標識基は、該標識基に特異的な抗体を含む、二次化合物により直接的にまたは間接的に検出または精製できる。有用な標識基は、放射性同位体(例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ)、蛍光化合物(例えば、５−ブロモデスオキシウリジン、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシルクロライド、フィコエリスリンアセチルアミノフルオレン、ジコキシゲニン)、発光化合物(例えば、ルミノール、ＧＦＰ、ルシフェリン、エクオリン)、酵素または酵素補因子検出可能標識(例えば、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンステラーゼ)、または、ストレプトアビジン、ＧＳＴまたはビオチンのような二次因子により認識される化合物を含む。好ましくは、標識基は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物学的活性を妨害しないような方法で結合する。
【００５４】
放射性同位体は、例えば、電波放射、フィルム露光またはシンチレーション計数により検出できる。酵素標識は、適当な基質の、通常、蛍光反応を起こす生成物への変換の測定により検出できる。蛍光および発光化合物ならびに反応は、例えば、電波放射、蛍光顕微鏡、蛍光活性化細胞選別または照度計により検出できる。
【００５５】
抗体と関連して使用する場合、抗体が目的の標的を認識し、結合するが、目的の標的を含むサンプル、例えば、生物学的サンプル中の他の物質を実質的に認識および結合しないとき、抗体は、標的に“選択的に結合”するかまたは“特異的に結合”すると言う。
【００５６】
本明細書で使用する、“ベクター”なる用語は、それが結合している他の核酸核酸を輸送できる、核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは“プラスミド”であり、それは付加的ＤＮＡセグメントをその中にライゲートできる、環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの他のタイプは、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲートできるウイルスベクターである。あるベクターは、それらが挿入された宿主細胞内で自己複製することが可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター)は、宿主細胞への挿入により宿主細胞のゲノム内に統合され、それにより宿主ゲノムと一緒に複製する。さらに、あるベクターは、それらが操作可能に結合している遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターを本明細書で“発現ベクター”と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形であるため、交換可能に使用できる。しかしながら、本発明は、同等な機能を提供する、このような他の発現ベクターの形、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むことを意図する。
【００５７】
本明細書で使用する、“有効量”は、所望の効果を有するのに十分な薬剤、好ましくは本発明のＣＰＰまたはＣＰＰモジュレーターの量を言う。例えば、抗心臓血管障害有効量は、個体における心臓血管障害の症状を、少なくとも１、２、５、１０、１５または好ましくは２５％低下するのに必要な薬剤の量である。本用語はまた個体における心臓血管障害が原因の症状の軽減に必要な薬剤の量も言うことがある。心臓血管障害の一般的な症状は：胸部圧迫感、胸焼け、悪心、嘔吐、麻痺、息切れ、ひどい冷や汗、説明できない疲労および不安な感じを含む。心臓血管障害のより重症の症状は、胸痛(狭心症)、リズムの乱れ(不整脈)、卒中または心臓発作である。特定の患者に対する有効量は、測定した症状の診断法、処置する病気の状態、患者の全体的な健康状態、投与法、副作用の重さのような因子に依存して変化し得る。
【００５８】
本発明のＣＰＰ
本発明の心臓血管障害血漿ポリペプチド(ＣＰＰ)は、配列番号３−４として配列表に記載する。配列番号３−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＰＰは、血漿中に分泌され、かつ循環する。好ましくは、このようなＣＰＰはまた、配列番号１または２の完全長ヒトタンパク質由来の付加的アミノ酸を含む。このような付加的アミノ酸は、選択した配列とフレーム内で融合し、完全長ヒトタンパク質の隣接フラグメントを形成する。
【００５９】
興味深いことに、本発明のＣＰＰのレベルは、心臓血管障害を有する個体の血漿において減少し、検出できない。それ自体、本発明のＣＰＰは、ＣＰＰのレベルの減少が心臓血管障害の危険性の増加または存在を示すものである、有用な診断ツールを提供する。さらに、ＣＰＰは心臓血管障害の予防および処置のための医薬の設計および治療戦略に有用である。
【００６０】
配列番号１由来の配列は、キチナーゼのファミリー由来の、タンパク質チトトリオシダーゼのものである。キチナーゼは、キチンポリマーのベータ−１,４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン架橋の加水分解を触媒する。それらは広範囲の非脊椎動物種で発見されている。キチナーゼのヒト相同体であるチトトリオシダーゼが同定されている。チトトリオシダーゼは、グリコシルヒドロラーゼファミリー１８のメンバーであり、触媒反応に関係する保存的グルタメートにより特徴付けられる(Boot RG, et al., JBC, (1998); 273:25680-25685)。それは主に活性化マクロファージにより発現される。
【００６１】
チトトリオシダーゼは優勢に分泌されるが、一部、３９kDa形に加工され、それはリソゾームに蓄積する。５０kDaチトトリオシダーゼのＣ−末端伸長は、Ｏ−結合グリカンを含むシアル酸を含む。マクロファージにおいて、別のスプライシングが異なるチトトリオシダーゼｍＲＮＡ種を産生し、Ｃ−末端が切断された４０kDaチトトリオシダーゼをコードすることが観察された。この酵素はタンパク質分解プロセシングにより、５０kDa前駆体から形成される３９kDaチトトリオシダーゼとほとんど同一である。５０kDaチトトリオシダーゼに存在するが３９kDaイソ型に存在しないＣ−末端が、キチンへの緊密な結合を介在する。しかしながら、３９kDaチトトリオシダーゼはまだ可溶性基質に対しては活性である。血流中で分泌性５０kDaチトトリオシダーゼが優勢に存在するが、３９kDa形は組織中で豊富である。
【００６２】
ゴーシェ病患者の異常マクロファージから分泌されるチトトリオシダーゼは著しく増加する(Giraldo P, et al., Haematologica, Sep (2001); 86(9):977-984)。ゴーシェ病は、リソソームヒドロラーゼベータ−グルコセレブロシダーゼの常染色体劣性遺伝的欠損が原因であり、それが組織マクロファージのリソゾームにおける脂質の蓄積をもたらす。この酵素欠損は、肝臓、脾臓および骨髄における脂質グルコセレブロシドの蓄積に至る。別の脂質の蓄積が関与するある別の遺伝的リソゾーム貯蔵疾患において、とりわけニーマン−ピック病、ＧＭ１−ガングリオシド症およびクラッベ病のようなスフィンゴリピド症において、血漿チトトリオシダーゼのより少ない上昇が示されている。加えて、アテローム硬化性プラークに存在するマクロファージは、本酵素を高いレベルで発現する。これらの観察から、チトトリオシダーゼが組織リモデリングに関与しているとの推測に至っている。
【００６３】
我々は、ここで、正常ヒト血漿を循環する本発明の“心臓血管障害血漿ポリペプチド”を記載する。本発明のポリペプチド種は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患の危険性を測定するための、重要で正確な診断ツールを代表する。本発明のポリペプチドは、小、分泌性因子であり、それ自体、タンパク質を利用した治療の理想的な候補物である。臨床応用における投与量調節に関して、タンパク質治療は、精細に制御可能な発現を欠くことにより障害された遺伝子治療に好ましい。さらに、分泌性因子であるため、本発明のポリペプチド種、例えば、小分子またはタンパク質モジュレーターの標的にしやすい。故に、本発明のポリペプチド種は、心臓血管疾患の予防および処置のための薬剤開発および治療戦略の設計に有用である。
【００６４】
本発明のポリペプチド種は、チトトリオシダーゼの推定活性部位を含み、配列番号３−５として記載する。
【００６５】
“心臓血管障害血漿ポリペプチド”および“ＣＰＰ”なる用語は、本明細書で、任意のかつ全ての本発明のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含するために使用する。本発明の一部をまた形成するのは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。本発明は、配列番号３−５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、本質的にこれらから成る、または、これらを含む単離または精製ＣＰＰを含む、ヒト由来のＣＰＰを具体化する。さらに包含されるのは、配列番号１−２からなる群から選択される配列のＣＰＰタンパク質分解前駆体および中間体である。
【００６６】
本発明は、ＣＰＰ生物学的活性を有する、少なくとも３アミノ酸、好ましくは少なくとも８から１０アミノ酸から成る、単離、精製、および組み換えポリペプチドを具体化する。好ましい態様において、アミノ酸の連続的伸長は、ＣＰＰ配列におけるアミノ酸の欠失、付加、交換または切断を含む、変異の部位または機能変異体を含む。本発明はまた本発明のＣＰＰヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、または、その相補的配列またはそのフラグメントを含む。
【００６７】
本発明の１つの局面は、抗ＣＰＰ抗体を産生するための免疫原としての使用に適した単離ＣＰＰ、およびその生物学的活性部分、ならびにポリペプチドフラグメントに関する。１つの態様において、天然ＣＰＰペプチドは血漿、細胞または組織供給源から、標準タンパク質精製技術を使用すた適当な精製スキームにより単離できる。他の態様において、ＣＰＰは組み換えＤＮＡ技術により製造する。組み換え発現とは別に、ＣＰＰを、“ＣＰＰ組成物の化学的製造”なる表題の部分および実施例３に記載のようなペプチド合成技術を使用して背化学的に合成できる。
【００６８】
典型的に、生物学的活性部分は、ＣＰＰの少なくとも１つの活性のドメインまたはモチーフを含む。生物学的活性のＣＰＰは、例えば、配列番号３−５からなる群から選択される配列から変わった少なくとも１、２、３、または５アミノ酸を含むか、または、配列番号３−５からなる群から選択される配列からアミノ酸が少なくとも１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１５％変わっていてよい。
【００６９】
ＣＰＰの特徴付け
本発明のポリペプチドであるＣＰＰは、表１に挙げた配列番号５のトリプシン消化ペプチドにより定義される。このペプチドは、実施例１に記載のように、冠動脈疾患(ＣＡＤ)を有しないコントロール個体の血漿から単離された種の質量分析法での分析により同定され、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔ.ＴＭ法により特徴付けされた。この種は、ＣＡＤを有する患者由来の血漿では検出できなかった。
【００７０】
本発明のＣＰＰは、血漿サンプルを最初に分子量に基づいて分離して、分子量は全て約２０kDまたはそれ以下である。より高い分子量のポリペプチド種を異なる方法で分離および特徴付けする。実施例１に記載のように、本血漿サンプルを多数のクロマトグラフィー分離に付す。これらのクロマトグラフィー法の詳細は、実施例１に記載する。
【００７１】
最初の分離は、カチオン交換クロマトグラフィーカラムであり、これを塩濃度を増加させて溶出する。１８フラクションを回収する。表１のＣＥＸ列は、どのフラクションがトリプシン消化ペプチドを含むか、ならびにその溶出条件を挙げる。カチオン交換による分離は、ポリペプチド種の全体的陽性荷電の指標を提供する。カチオン交換の後に逆相ＨＰＬＣ分離を行う。表１のＲＰ１列は、３０フラクションの内どれにトリプシン消化ペプチドが溶出しているか、ならびにその溶出条件を挙げる。逆相による分離は、ポリペプチド種の全体的疎水性の指標を提供する。試験番号の列の最後の２つの数字は、２４の溶出フラクションうちどれが、２回目の逆相ＨＰＬＣ分離由来のトリプシン消化ペプチドを含むかを示す(実施例１参照)。
【００７２】
表１に提供した情報は、ＣＡＤを有しない個体の血漿に存在するポリペプチド種の数を確認する。例えば、同じトリプシン消化ペプチドが、ＲＰ１分離における１つ異常のフラクションで発見される。これらのＲＰ１フラクションは広く離れているため、これは、トリプシン消化ペプチドが異なる循環ポリペプチド種に由来することを示唆する。したがって、表１において、同じペプチド配列が、ＲＰ１分離のフラクション１６およびフラクション２０に出現することは、トリプシン消化ペプチドが由来した２つのポリペプチド種が存在し、それらが異なる全体的疎水性を有することを示唆する。
【００７３】
配列番号５の観察されたトリプシン消化ペプチドは、実施例１に記載のように、配列番号３−４のポリペプチドのトリプシン消化に由来する。配列番号１のプロペプチド上への、予測されたシグナル配列の除去によりおよび二塩基性部位での連続的タンパク質分解により、配列番号３−４のポリペプチドに到着する。検出した種の分子量にしたがった分離を考慮すると(実施例１のステップ２に記載)、ＣＰＰ６および７(各々配列番号３および４)は、配列番号５のトリプシン消化ペプチドをもたらし、かつＲＰ１フラクション１６および２０に観察される(表１)、有望な血漿ポリペプチドを示す。それ自体、ＣＰＰ６および７は、心臓血管障害に関する診断および治療的戦略のためにとりわけ有効である。
【００７４】
ＣＰＰ核酸
本発明の１つの局面は、本明細書にさらに詳述するようなＣＰＰまたは生物学的活性部分をコードする、精製または単離核酸分子、ならびにその核酸フラグメントに関する。該核酸は、例えば本明細書にさらに詳述するような治療および診断法および薬剤スクリーニングアッセイに使用できる。
【００７５】
本発明の目的は、ＣＰＰをコードする精製、単離、または組み換え核酸、その相補的配列およびそのフラグメントである。本発明はまたＣＰＰをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９５％ヌクレオチド同一性を有する、有利にはＣＰＰをコードするポリヌクレオチドと９９％ヌクレオチド同一性を、好ましくは９９.５％ヌクレオチド同一性を、および最も好ましくは９９.８％ヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含む、精製または単離核酸または、その相補的配列またはその生物学的活性フラグメントに関する。本発明の他の目的は、本明細書で定義したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組み換え核酸、またはその相補的配列またはその変異体またはその生物学的活性フラグメントに関する。
【００７６】
他の好ましい局面において、本発明は、ＣＰＰの一部または変異体をコードし、その一部または変異体が本発明のＣＰＰ生物学的活性を示すものである、精製または単離核酸分子に関する。好ましくは該一部または変異体は、天然に存在するＣＰＰまたはその前駆体の一部または変異体である。
【００７７】
本発明の他の目的は、配列番号３−５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＰＰをコードする、精製、単離、または組み換え核酸、またはそのフラグメントであり、ここで、単離核酸分子が、１個またはそれ以上のモチーフ(例えばＣＰＰ標的結合領域、分泌シグナルペプチドまたは二塩基性開裂部位)をコードするものである。
【００７８】
ＣＰＰ−コード遺伝子のクローニングから決定したヌクレオチド配列は、他のＣＰＰ(例えば新規機能的ドメインを共有する)の同定および／またはクローニングに使用するためのプローブおよびプライマーの産生を、ならびに他の種からのＣＰＰ相同物の産生を可能にする。
【００７９】
“ＣＰＰの生物学的活性部分”をコードする核酸フラグメントは、ＣＰＰ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするものであるＣＰＰをコードするヌクレオチド配列の部分を単離し、ＣＰＰのコード化部分を発現させ(例えば、インビトロまたはインビボでの組み換え発現により)、そして、ＣＰＰのコード化部分の活性を評価することにより製造できる。
【００８０】
本発明はさらに遺伝子コードの縮重により本発明のＣＰＰヌクレオチド配列と異なり、同じ本発明のＣＰＰをコードする核酸分子を包含する。
【００８１】
上記のＣＰＰヌクレオチド配列に加えて、当業者は、ＣＰＰのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団(例えば、ヒト集団)中に存在し得ることを認めるであろう。このような遺伝的多型は、集団中の個体で、自然の対立遺伝子変異により存在し得る。このような自然の対立遺伝子変異は、典型的にＣＰＰ−コード遺伝子のヌクレオチド配列または核酸配列に１−５％の不一致をもたらし得る。
【００８２】
本発明のＣＰＰ核酸の自然の対立遺伝子変異体および相同物に対応する核酸分子は、本明細書に記載のＣＰＰ核酸に対するそれらの相同性に基づいて、本明細書に記載のｃＤＮＡまたはその一部を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の標準的なハイブリダイゼーション技術にしたがって、単離できる。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかをコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことは、認識されよう。
【００８３】
ＣＰＰ核酸の使用
ＣＰＰをコードするポリヌクレオチド配列(またはその相補物)は、ハイブリダイゼーションプローブ、染色体および遺伝子マッピングならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの産生における使用を含む、種々の適用を有する。加えて、ＣＰＰ−コード核酸は、本明細書に記載のように、薬学的介入のための、例えばＤＮＡワクチンまたはアンチセンス組成物の開発のための標的として、および組み換え技術によるＣＰＰの製造のために、有用である。本明細書に記載の、その配列変異体を含むポリヌクレオチドは、診断アッセイに使用できる。したがって、体液または組織サンプルにおけるこのようなポリヌクレオチドの存在の検出に基づく診断法は、本発明の特徴である。本発明にしたがった、核酸を利用する診断アッセイの例は、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ−ベースのアッセイを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載のように、延長した長さのポリヌクレオチド、その配列変異体およびフラグメントを含むポリヌクレオチドを、このようなアッセイに使用するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーの産生に使用できる。このようなプローブおよびプライマーは、本明細書に記載のＣＰＰポリヌクレオチドと類似の、またはそれと相補的なゲノム配列を含む、ポリヌクレオチド配列の検出が可能であろう。
【００８４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのセグメントを増幅するためのＰＣＲを行うための、プライマー対を含む。その対の各プライマーは、
ｉ)本対の一方のプライマーが、本発明のポリヌクレオチドの１つの鎖と完全に適合した対を形成し、対の他方のプライマーが同じポリヌクレオチドの総補佐と完全に適合した二本鎖を形成し、そしてii)１０から２５００ヌクレオチドの間の距離で離れている、ポリヌクレオチド上の部位の、このような完全に適合した二本鎖由来の対になったプライマーのような、１５から３０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、対の各プライマーの、その各々の相補配列へのアニーリング温度は、実質的に同じである。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチド由来のハイブリダイゼーションプローブを、例えば、顕微鏡スライドまたは懸濁細胞上に調製した、固定または凍結組織切片のような、組織サンプル上のインサイチュハイブリダイゼーションを行うことにより、使用できる。簡単に言うと、標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、制御された条件下、調製した顕微鏡状の組織切片中のそのＤＮＡまたはＲＮＡ標的サンプルと結合させる。一般に、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡベクターにクローン化された目的のＤＮＡから成るｄｓＤＮＡプローブをこの目的に使用できるが、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡプローブもまた使用できる。プローブは、一般に約１５から４０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。あるいは、本プローブは、ＰＣＲランダム・プライミング・プライマー伸長により産生されたまたはプラスミドからのＲＮＡのインビトロ転写により産生された(リボプローブ)ポリヌクレオチドプローブであってよい。これらの後者のプローブは、典型的に数百塩基対長である。本プローブを多数の標識基のいずれかで標識でき、具体的な検出法はプローブに利用する標識のタイプに対応する(例えば、それぞれに見合った、オートラジオグラフィー、Ｘ線検出、蛍光または可視顕微鏡分析)。本反応は、蛍光標識されたプローブ上に存在するフルオレッセイン部分に対する抗体のような、使用したディテクター分子の標識に対する免疫組織化学的技術を使用して、さらにインサイチュで増幅できる。具体的標識およびインサイチュ検出法は、例えば、出典明示により本明細書に包含させるHoward, G. C., Ed., Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, Conn., (1993)に見ることができる。
【００８６】
ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーはまた天然に存在するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含む、本発明で同定した完全長タンパク質に対応するゲノム配列からも選択されてよい。ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列はまたそのＣＰＰをコードする遺伝子をマッピングのためのおよび個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するために使用できる。本発明のＣＰＰをコードする遺伝子の変異を担持する、または、変異がある個体は、ＤＮＡレベルで、種々の方法により検出できる。診断に使用するための核酸は、例えば、組織生検および剖検材料を含む、患者の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出に直接使用し得るか、分析前に、ＰＣＲ(Saiki, et al. Nature 324:163-166 (1986))を使用して酵素的に増幅し得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもこの同じ目的で使用できる。例として、本発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、本発明の遺伝子における変異を同定および分析するために使用できる。欠失および挿入は、増幅産物を正常遺伝子型と比較して、大きさの変化により検出できる。点変異は、増幅ＤＮＡを本発明の放射標識ＲＮＡとハイブリダイズするか、または、別法として、本発明の放射標識アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズすることにより同定できる。特異的位置で変化した配列はまたＲＮａｓｅおよびＳｌ保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学的開裂法(例えばCotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401 (1985))により、または融点の変化により確認できる。本発明の核酸に相補的なプローブ配列を含む、“分子ビーコン”(Kostrikis L. G. et al., Science 279:1228-1229 (1998))、ヘアピン形の、一本鎖合成オリゴヌクレオチドもまた点変異または他の配列変化の検出に、ならびに、ＣＰＰの発現レベルのモニターに使用できる。
【００８７】
オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス化合物
ＰＣＲプライマーおよびアンチセンス化合物を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、市販の自動ＤＮＡ合成装置、例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)モデル３８０Ｂ、３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置または同様の装置上の、慣用の手段により合成する。好ましくは、フォスフォアミダイト化学反応を、例えば下記の文献に記載のように用いる：Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311(1992); Molko et al, 米国特許４,９８０,４６０；Koster et al, 米国特許４,７２５,６７７；Caruthers et al, 米国特許４,４１５,７３２；４,４５８,０６６；および４,９７３,６７９；など。治療的使用のために、ヌクレアーゼ耐性バックボーンが好ましい。ヌクレアーゼ耐性に関与する修飾オリゴヌクレオチドの多くのタイプが利用可能であり、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、フォスフォアミダイトなど、多くの文献に、例えばホスホロチオエートは：Stec et al, 米国特許５,１５１,５１０；Hirschbein, 米国特許５,１６６,３８７；Bergot, 米国特許５,１８３,８８５；フォスフォアミダイトは：Froehler et al, 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３,１３８；およびさらなる適用可能な化学反応のレビューのために：Uhlmann and Peyman(上記)に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、特異的結合が所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ起こり、他の偶然の部位に起こらないことを確実にするのに十分長い。長さの上限は、約３０−４０ヌクレオチド以上の長さのオリゴマーの合成および精製における不便さおよび費用、短いオリゴヌクレオチドよりも長いオリゴヌクレオチドにおけるミスマッチに対する大きな耐性などを含む、数個の因子により決定する。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５から４０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。より好ましくは、本オリゴヌクレオチド部分は、約１８から２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００８８】
プライマーおよびプローブ
本発明のプライマーおよびプローブは、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限および、Narang SA et al(Methods Enzymol 1979; 68:90-98)のホスホジエステル法、Brown EL et al(Methods Enzymol 1979; 68:109-151)のホスホジエステル法、Beaucage et al(Tetrahedron Lett 1981, 22:1859-1862)のジエチルフォスフォアミダイト法、およびＥＰ０７０７５９２に記載の固相支持法のような方法による直接化学合成を含む、任意の適当な方法で製造でき、これらの文献の記載を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【００８９】
検出プローブは、一般に核酸配列または、例えば国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２に記載のペプチド核酸、米国特許５,１８５,４４４；５,０３４,５０６および５,１４２,０４７に記載のモルホリノアナログのような非荷電核酸アナログである。所望により、本プローブを、さらなるｄＮＴＰが本プローブに付加できない点で、“延長不可能”とできる。アナログは、それら自身および他との間で、通常延長不可能であり、核酸プローブは、ヒドロキシル基がもはや伸長に参加できないように、同プローブの３'末端を修飾することにより延長不可能にできる。例えば、本プローブの３'末端は、捕獲ラベルまたは検出ラベルで官能化でき、それでヒドロキシ基を消費するか別の方法で遮断する。
【００９０】
本発明のポリヌクレオチドの全てを、所望により、当分野で既知の全ての標識基を取り込むことにより標識でき、分光、光化学、生化学、免疫化学または化学手段により検出できるようにする。さらなる例は、Urdea et al. (Nucreic Acids Research. 11:4937-4957, 1988)またはSanchez-Pescador et al. (J. Clin. Microbiol. 26(10):1934-1938, 1988)に記載のような、核酸フラグメントの非放射活性標識である。加えて、本発明のプローブはまたシグナル増幅を可能にするような構造特性を有し得、このような構造は、例えば、Urdea et al(Nucreic Acids Symp. Ser. 24:197-200, 1991)または欧州特許ＥＰ０２２５８０７(Chiron)により記載のような、分子ＤＮＡプローブとして特徴付けられる。
【００９１】
標識はまた、プライマーまたは、増幅ＤＮＡのような、プライマー伸長産物の固体支持体への固定化を容易にするための、プライマーの捕獲に使用できる。捕獲標識はプライマーまたはプローブに結合し、固相試薬特異的結合メンバー(例えばビオチンおよびストレプトアビジン)と結合対を形成する、特異的結合メンバーであってよい。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブが担持する標識のタイプに依存して、それは、標的ＤＮＡの捕獲または検出に使用できる。さらに、本明細書に記載するポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それ自体、捕獲標識として働くことがある。例えば、固相試薬結合メンバーが核酸配列である場合、それはプライマーまたはプローブの相補部分と結合するように分泌され、それによりその固相にプライマーまたはプローブを固定化する。ポリヌクレオチドプローブそれ自体が結合メンバーとして働く場合、当業者は、プローブが標的と相補的ではない配列または“尾部”を含むことを認識するであろう。ポリヌクレオチドプライマーそれ自体が捕獲標識である場合、少なくともプライマーの一部は固相上の核酸と自由にハイブリダイズする。ＤＮＡ標識技術は、専門家には既知である。
【００９２】
本発明のプローブは、多くの目的のために有用である。それらはゲノムＤＮＡへのサザン・ハイブリダイゼーションにとりわけ使用できる。本プローブはまたＰＣＲ増幅産物の検出にも使用できる。それらはまた他の技術を使用した、ＣＰＰ−コード遺伝子またはｍＲＮＡにおけるミスマッチの検出に使用できる。
【００９３】
本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも、簡便には固体支持体上に固定できる。固体支持体は当業者には既知であり、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子のような微粒子、ヒツジ(または他の動物)赤血球細胞、耐久性細胞(duracyte)および他のものを含む。本固体支持体は重大ではなく、当業者により選択できる。故に、ラテックス粒子、微粒子、磁気または非磁気ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ(または他の適当な動物の)赤血球細胞および耐久性細胞は全て例として適当である。核酸を固相上に固定するための適当な方法はイオン、疎水性、共有結合的相互作用などである。本明細書で使用する固体支持体は、不溶性であるか、その後の反応により不溶性にできる、全ての物質を意味する。本固体支持体は、捕獲試薬を引き寄せ、固定化するその内在する能力について選択できる。あるいは、固相は、捕獲試薬を引き寄せ、固定化できる付加的受容体を保持してもよい。本付加的受容体は、捕獲試薬と逆に荷電しているか、捕獲試薬と結合した荷電物質と逆に荷電している、荷電物質を含み得る。さらに別法として、受容体分子は、固体支持体に結合した特異的結合メンバーのいずれかであってよく、特異的結合反応を介して捕獲試薬を固定化する能力を有する。本受容体分子は、アッセイを行う前、またはアッセイを行っている最中に、固体支持体物質への捕獲試薬の間接的な結合を可能にする。本固相は、故に、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ(または他の適当な動物の)赤血球細胞、耐久性細胞および当業者に既知の他の形状であってよい。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブは、固体支持体上に個々にまたは少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０もしくは２５の別々の本発明のポリヌクレオチドのグループで、１個の固体支持体に結合または固定化できる。加えて、本発明のもの以外のポリヌクレオチドを、１個またはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドと同じ固体支持体に結合できる。
【００９４】
本明細書に記載の全てのポリヌクレオチドを、固体支持体上の重なった領域にまたは無作為の位置に結合できる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを、各ポリヌクレオチドが、他の全てのポリヌクレオチドの結合部位と重複しない、秩序配置で、固体支持体の離れた領域に結合してもよい。好ましくは、このようなポリヌクレオチドの秩序配置は、明瞭な位置が記録された場所に“アドレス可能”であり、アッセイ工程の一部として接近できるように設計する。アドレス可能ポリヌクレオチドアレイは、典型的に、異なる公知の位置の基質の表面と結合できる、多くの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置の厳密な位置の知識により、これらの“アドレス可能”アレイは、特にハイブリダイゼーションアッセイに有用となる。当分野で既知の全てのアドレス可能アレイ技術を本発明のポリヌクレオチドと共に用いることができる。これらのポリヌクレオチドアレイの１つの特定の態様はＧｅｎｅｃｈｉｐｓとして既知であり、米国特許５,１４３,８５４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２に一般的に記載されており、これらの文献を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【００９５】
変異体核酸およびポリペプチドを得るための方法
集団中に存在し得るＣＰＰ配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列における変異により変化を挿入でき、それにより、ＣＰＰの機能的能力を変えるか、または変えずに、コードされたＣＰＰのアミノ酸配列に変化をもたらすことを認識するであろう。
【００９６】
変異体のいくつかのタイプが意図され、１)アミノ酸残基の１個またはそれ以上が、保存的または非保存的アミノ酸残基により置換されているもの(このような置換アミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであってもされないものであってもよい)、または２)アミノ酸残基の１個またはそれ以上が置換基を含むもの、または３)変異ＣＰＰが別の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を延長するような化合物(例えば、ポリエチレングリコール)と融合しているもの、または４)付加的アミノ酸、例えば、リーダー、シグナルまたはアンカー配列、ＣＰＰの精製に用いる配列、または前駆体タンパク質由来の配列がＣＰＰに融合しているものを含む。このような変異体は、当業者の範囲内であると考える。
【００９７】
例えば、アミノ酸置換に至るヌクレオチド置換は、タンパク質の生物学的活性を実質的に変えない配列に行うことができる。アミノ酸残基を、ＣＰＰをコードする野生型配列、その生物学的活性フラグメントまたは相同物から、生物学的活性を変化させずに、変えることができる。一般に、本発明のＣＰＰが共有しているアミノ酸残基は、置換にあまり影響を受けないと予測される。
【００９８】
他の局面において、本発明は、生物学的活性の増加をもたらすか、生物学的活性を修飾する、アミノ酸残基の変化を含む、ＣＰＰをコードする核酸分子に関する。他の局面において、本発明は、ＣＰＰ生物学的活性に必須であるアミノ酸残基に変化を含む、ＣＰＰをコードする核酸分子に関する。このようなＣＰＰは、配列番号３−４とアミノ酸配列が異なり、活性が低下しているか、または本質的に１個またはそれ以上のＣＰＰ生物学的活性を欠損している。
【００９９】
変異、置換、付加または欠失は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような、標準技術により、配列番号１−５に挿入できる。例えば、保存的アミノ酸置換を、１個またはそれ以上の予め決めた非必須アミノ酸残基に行い得る。“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族性側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。故に、ＣＰＰにおける予定された非必須アミノ酸残基、またはその生物学的活性フラグメントまたは相同物を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基と置換できる。あるいは、他の態様において、変異を、ＣＰＰコード配列の全てまたは一部に無作為に、例えば、飽和変異誘発(saturation mutagenesis)により挿入でき、得られた変異体をＣＰＰ生物学的活性に対してスクリーニングし、活性を保持する変異体を同定する。配列番号１−５の１つをコードするヌクレオチドの変異誘発に続き、タンパク質を組み換え的に発現でき、タンパク質の活性を、例えば、本明細書に記載のように、任意の適当なアッセイで測定できる。
【０１００】
本発明はまたＣＰＰキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用する、ＣＰＰ“キメラタンパク質”または“融合タンパク質”は、非ＣＰＰポリペプチド配列に操作可能に結合または融合した、本発明のＣＰＰまたはそのフラグメントを含む。好ましい態様において、ＣＰＰ融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＰＰの生物学的活性部分を含む。他の好ましい態様において、ＣＰＰ融合タンパク質は、少なくとも２つのＣＰＰの生物学的活性部分を含む。例えば、１つの態様において、本融合タンパク質は、ＣＰＰドメイン配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合した、ＧＳＴ−ＣＰＰ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組み換えＣＰＰの精製を容易にすることができる。他の態様において、本融合タンパク質は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含むＣＰＰであり、例えば、ある宿主細胞における所望の細胞局在化を可能にする。さらに別の態様において、本融合は、ＣＰＰ生物学的活性フラグメントと免疫グロブリン分子である。このような融合タンパク質は、例えば、ＣＰＰ結合部位の結合価を増加されるために有用である。例えば、２価ＣＰＰ結合部位を、生物学的活性ＣＰＰフラグメントを、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質に融合することにより形成できる。
【０１０１】
本発明のＣＰＰ融合タンパク質は医薬組成物に包含でき、インビボで対象に投与できる。さらに、本発明のＣＰＰ融合タンパク質は、対象における抗ＣＰＰ抗体を産生するための免疫原として、ＣＰＰまたはＣＰＰリガンドを精製するために、およびＣＰＰとＣＰＰ標的分子の相互作用を調節する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用できる。
【０１０２】
そのうえ、ＣＰＰの単離フラグメントをまた、このようなペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組み換え的に産生したペプチドのスクリーニングにより得ることができる。加えて、フラグメントを、慣用のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学反応のような当分野で既知の技術を使用して、化学的に合成できる。例えば、本発明のＣＰＰは、フラグメントの重複なしで所望の長さのフラグメントに適宜分割でき、または、好ましくは所望の長さの重複フラグメントに分割する。本フラグメントを製造し(組み換え的にまたは化学合成により)、試験して、ＣＰＰ生物学的活性を有するペプチジルフラグメントを、例えば、マイクロインジェクションアッセイまたはインビトロタンパク質結合アッセイにより、同定できる。説明のための態様において、ＣＰＰの異なるフラグメントを含むＣＰＰのペプチジル部分、例えばＣＰＰ標的結合領域を、チオレドキシン融合タンパク質として発現させることによりＣＰＰ活性を関して試験できる(例えば、米国特許５,２７０,１８１および５,２９２,６４６；およびＰＣＴ公開Ｗ０９４／０２５０２参照、これらの内容を、出典明示により本明細書に包含させる)。
【０１０３】
加えて、ＣＰＰコード配列のフラグメントのライブラリーを使用して、ＣＰＰの変異体のスクリーニングおよび続く選択のための、ＣＰＰフラグメントの多彩な集団を産生できる。１つの態様において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＣＰＰコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで、１分子あたり約１度ニッキングが起こる条件下処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して、異なるニックの入った産物由来のセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成させ、一本鎖部分を再形成した二本鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処置により除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲートすることにより産生できる。この方法により、種々のサイズのＣＰＰのＮ−末端、Ｃ−末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導できる。
【０１０４】
修飾ＣＰＰを、治療的または予防的効果を、または安定性(例えば、エキソビボ貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する耐性)の増強の目的で使用できる。このような修飾ペプチドは、本タンパク質の天然に存在する形の少なくとも１つ活性を維持するように設計したとき、本明細書でより詳細に記載しているＣＰＰの機能的均等物と見なす。このような修飾ペプチドを、例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加により産生できる。
【０１０５】
ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的ＣＰＰ相同物をもたらすか否かは、変異体ペプチドの少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性の評価により容易に決定できる。１個以上の置換が行われているペプチドは、同じ方法で容易に試験できる。
【０１０６】
本発明はさらに本明細書に記載のＣＰＰの組み合わせ変異体、ならびに切断および断片化変異体のセットを製造する方法を意図し、これは、特にＣＰＰ標的タンパク質への結合には機能的であるが野生型タンパク質と、例えば、効果、有効性および／または細胞内半減期が異なる、可能性のある変異体配列の同定に有用である。このような組み合わせライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、野生型タンパク質と比較したときに変化した生物学的活性を有する、または、新規活性を一緒に有する新規ＣＰＰ相同物を単離するためである。例えば、変異誘発は、対応する野生型タンパク質と劇的に異なる細胞内半減期を有するＣＰＰ相同物を発生できる。変更したタンパク質は、タンパク質分解、または、ＣＰＰの破壊または他の不活性化をもたらす細胞性過程に対して、より安定にできるか、または、安定性を低下できる。このようなＣＰＰ相同物、およびそれらをコードする遺伝子は、組み換えタンパク質の半減期を調節することにより、特定の組み換えＣＰＰの発現のエンベローブ(envelope)を変えるために利用できる。例えば、短い半減期は、特定の組み換えＣＰＰに関連する生物学的のより一過性の発現をさせ、誘導性発現系の一部であるとき、細胞内および循環血漿内の組み換えタンパク質レベルの厳しいコントロールを可能にする。上記のように、このようなタンパク質およびその組み換え核酸構築物を、遺伝子治療プロトコールに使用できる。
【０１０７】
この方法の説明のための態様において、ＣＰＰ相同物または他の関連タンパク質の集団のためのアミノ酸配列を整列させ、好ましくは可能性のある最高の相同性を高める。このような変異体の集団は、例えば、１個またはそれ以上の種由来のＣＰＰ相同物、または同じ種由来であるが、変異のために異なるＣＰＰ相同物を含むことができる。整列した配列の各位置に出現するアミノ酸を、組み合わせ配列の縮重セットを創成するために選択する。可能性のあるＣＰＰ相同物のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から産生できる、多くの方法がある。縮重遺伝子配列を自動ＤＮＡ合成装置で行い、次いで、合成遺伝子を、発現のための適当な遺伝子とライゲートできる。遺伝子の縮重セットの目的は、１つの混合物中で、可能性のあるＣＰＰ配列の所望のセットをコードする配列の全てを提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当分野で既知である(例えば、Narang, SA(1983)Tetrahedron 393; Itakura et al. (1981)Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam:Elsevier pp. 273-289; Itakura et al. (1984)Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984)Science 198:1056; Ike et al. (1983)Nucleic Acid Res. 11:477参照)。このような技術は、他のタンパク質の定方向発生(directed evolution)に用いられている(例えば、Scott et al. (1990)Science 249:386-390; Roberts et al. (1992)PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990)Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990)PNAS 87:6378-6382；ならびに米国特許５,２２３,４０９、５,１９８,３４６および５,０９６,８１５参照)。上記文献の記載は、出典明示により本明細書に包含させる。
【０１０８】
あるいは、変異誘発の別の形を使用して、特に、他の天然に存在する相同物がまだ配列決定されていないとき、組み合わせライブラリーを産生できる。例えば、ＣＰＰ相同物(アゴニストおよびアンタゴニスト形両方)を、例えば、アラニン・スキャンニング変異誘発などを使用した、スクリーニングにより(Ruf et al. (1994)Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994)J Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. (1993)Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993)Eur. J Biochem. 218:597-601; Nagashima et al. (1993)J Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al. (1991)Biochemistry 30:10832-10838; およびCunningham et al. (1989)Science 244:1081-1085)、リンカー・スキャンニング変異誘発により(Gustin et al. (1993)virology 193:653-660; Brown et al. (1992)Mol. Cell Biol. 12:2644 2652; McKnight et al. (1982)Science 232:316)；飽和変異誘発により(Meyers et al. (1986)Science 232:613)；ＰＣＲ変異誘発により(Leung et al. (1989)Method Cell Mol Biol 1:1-19)；または無作為変異誘発により(Miller et al. (1992)A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; and Greener et al. (1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34、これらの記載は出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)、ライブラリーを産生し、単離できる。
【０１０９】
別の方法は、本発明のタンパク質の配列をスクリーニングおよび最適化するためのタンパク質ライブラリーを産生するために、自動タンパク質設計を利用する。例えば、その内容を出典明示により本明細書に包含させる、米国特許６４０３３１２参照。簡単に言うと、一次ライブラリーを、ＣＰＰの配列および構造特性に基づくコンピューター使用プロセシングを使用して産生する。一般的に言うと、コンピューター使用プロセシングの目的は、全ての可能性のある配列の最低の構造エネルギーをもたらす、最適化タンパク質配列のセットを決定するためである。しかしながら、最小エネルギー(global minimum)ではない多くの配列が低いエネルギーを有し得、有用である。故に、一般に理論的量的安定性の観点の順番を含む、配列の一次ライブラリーを産生する。これらの配列を、延長した半減期またはＣＰＰ結合化合物およびタンパク質との安定した相互作用を示すペプチドを合成または発現するのに使用できる。
【０１１０】
点変異により産生した組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングならびにある特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための、広範囲の技術が、当分野で既知である。このような技術は、一般にＣＰＰの組み合わせ変異誘発により産生された遺伝子ライブラリーの急速スクリーニングに適用できる。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広範に使用される技術は、遺伝子ライブラリーを発現ベクターにクローニングして、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞をトランスフォーミングして、組み合わせ遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物を検出した遺伝子をコードするベクターの相対的に容易な単離を助けるような条件下で発現させることを含む。
【０１１１】
下記の説明のための各アッセイは、組み合わせ変異誘発技術により創成した、多数の縮重ＣＰＰ配列のスクリーニングに必要なハイスループット分析で分析できる。１つのスクリーニングアッセイにおいて、候補遺伝子産物を細胞またはウイルス粒子の表面に提示させ、特定の細胞またはウイルスが、この遺伝子産物を介してＣＰＰ標的分子(例えば修飾ペプチド基質)に結合できる能力を、“パニングアッセイ”で検出する。例えば、本遺伝子ライブラリーを、細菌細胞の表面膜タンパク質の遺伝子中にクローン化し、得られた融合タンパク質をパニングにより検出できる(Ladner et al., ＷＯ８８／０６６３０; Fuchs et al. (1991)BioTechnology 9:1370-1371およびGoward et al. (1992)TIBS 18:136 140)。同様の形態で、蛍光標識されたＣＰＰ標的を、可能性のある機能的ＣＰＰ相同物の採点に使用できる。細胞を目視検査し、蛍光顕微鏡下で分けるか、または、細胞の形態から可能であるとき、蛍光標示式細胞分取器で分ける。
【０１１２】
別の態様において、本遺伝子ライブラリーを、ウイルス粒子の表面上の融合タンパク質として発現させる。例えば、繊維状ファージシステムにおいて、外来ペプチド配列を感染ファージの表面上に発現させ、それにより２つの明らかな利点を与えることができる。第一に、これらのファージが非常に高濃度で親和性マトリックスに適用できるため、多くのファージを一度にスクリーニングできる。第二に、各感染ファージがその表面に組み合わせ遺伝子産物を提示するため、特定のファージを低収率で親和性マトリックスから回収した場合、ファージを感染の再実施により増幅できる。ほとんど同一の大腸菌(E. coli)繊維状ファージ  Ｍ１３、ｆｄおよびｆｌのグループは、ウイルス粒子の最終的なパッケージングを妨害することなく、ファージｇＩｌｌまたはｇＶIII被覆タンパク質のいずれかを融合タンパク質の産生に使用できるため、ファージ・ディスプレー・ライブラリーに最もしばしば使用されている(Ladner et al., ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２９０９；Garrard et al., ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０；Marks et al. (1992)J Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffiths et al. (1993)EMBO J 12:725-734; Clackson et al. (1991)Nature 352:624-628; およびBarbas et al. (1992)PNAS 89:4457 4461、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)。説明のための態様において、本組み換えファージ抗体システム(RPAS, Pharmacia Catalog number 27-9400-01)は、ＣＰＰ組み合わせライブラリーの発現における使用のために容易に修飾でき、ＣＰＰファージライブラリーを、固定化ＣＰＰ標的分子上にパン(panned)できる(グルタチオン固定化ＣＰＰ標的−ＧＳＴ融合タンパク質または固定化ＤＮＡ)。ファージ増幅およびパニングの連続的ラウンドは、ＣＰＰ相同物を非常に豊富にでき、それはＣＰＰ標的と結合する能力を保持し、さらに続いてアゴニストとアンタゴニストの間を区別するために自動アッセイにおいて生物学的活性に関してスクリーニングできる。
【０１１３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドとＣＰＰ標的分子の結合を妨害できる模倣物、例えばペプチドまたは非ペプチド剤を産生するために、ＣＰＰ機能的ドメインの機能的最小サイズを同定し、減少させるために提供される。故に、このような上記のような変異誘発技術も、例えば、ＣＰＰ標的タンパク質への結合に関与しているタンパク質−タンパク質相互作用に関係しているＣＰＰの決定基の地図作製に有用である。説明のために、ＣＰＰ標的の分子認識に関与するＣＰＰの重要な残基を決定し、ＣＰＰのＣＰＰ標的への結合を完全に阻害できる、ＣＰＰ標的−１３Ｐ−由来ペプチド模倣物の産生に使用できる。例えば、このような残基の非加水分解性ペプチドアナログを、レトロ−インバース(retro-inverse)ペプチド(例えば、米国特許５,１１６,９４７および５,２１９,０８９；およびPallai et al. (1983)Int J Pept Protein Res 21:84-92参照)、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger et al. in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988参照)、アゼピン(例えば、Huffman et al. in Peptides. Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988)、置換ガンマラクタム環(Garvey et al. in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988)、ケト−メチレン。シュードペプチド(Ewenson et al. (1986)J Med Chem 29:295; and Ewenson et al. in Peptides:Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、Ｐ−ターン・ジペプチドコア(Nagai et al. (1985)Tetrahedron Left 26:647; およびSato et al. (1986)J Chem Soc Perkin Trans 1:123 1)およびＰ−アミノアルコール(Gordon et al. (1985)Biochem Biophys Res Commun 126:419; and Dann et al. (1986)Biochem Biophys Res Commun 134:71、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)を使用して産生できる。
【０１１４】
ＣＰＰ組成物の化学的製造
本発明のペプチドを、標準技術により合成する(例えばStewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984)。好ましくは、市販のペプチド合成装置、例えばApplied Biosystems, Inc. (Foster City, CA)モデル４３０Ａを使用し、そして、集中的な合成アプローチ、例えばKent et al, 米国特許６,１８４,３４４およびDawson and Kent, Annu. Rev. Biochem., 69:923-960(2000)における複数の、別々の合成および精製した、ペプチドから本発明のポリペプチドを構築する。本発明のペプチドを、架橋ポリスチレン支持体上で、固相合成により、カルボキシル末端残基から開始し、完全なペプチドが形成されるまで、段階的形態でアミノ酸を添加することにより構築できる。下記の文献は、合成中に用いる化学反応のガイドである：Schnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180-193(1992); Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 85, pg. 2149(1963); Kent et al., pg 185, in Peptides 1984, Ragnarsson, Ed. (AlmquistおよびWeksell, Stockholm, 1984); Kent et al., pg. 217 in Peptide Chemistry 84, Izumiya, Ed. (Protein Research Foundation, B.H. Osaka, 1985); Merrifield, Science, Vol. 232, pgs. 341-347(1986); Kent, Ann. Rev. Biochem, Vol. 57, pgs. 957-989(1988)、および後者の２つの文献の文献。
【０１１５】
好ましくは、本発明のポリペプチドの化学合成は、Dawson et al, Science, 266:776-779(1994)およびKent el al, 米国特許６,１８４,３４４に記載のように、ペプチドフラグメントの天然化学ライゲーションによる構築により行う。簡単に言うと、本アプローチにおいて、第一ペプチドフラグメントに、非酸化スルフヒドリル側鎖を有するＮ−末端システインを提供し、そして第二ペプチドフラグメントにＣ−末端チオエステルを提供する。Ｎ−末端システインの非酸化スルフヒドリル側鎖をＣ−末端チオエステルと縮合し、中間体ペプチドフラグメントを提供し、これは第一および第二ペプチドフラグメントをβ−アミノチオエステル結合で連結する。中間体ペプチドフラグメントのこのβ−アミノチオエステル結合を、次いで分子内再配置に付し、第一および第二ペプチドフラグメントをアミド結合で連結するペプチドフラグメント産物を産生する。好ましくは、この内部フラグメントのＮ−末端システインは、下記のように、環状チアゾリジン保護基により、望ましくない環化および／または縮合反応から保護されている。好ましくは、このような環状チアゾリジン保護基はチオプロリニル基である。
【０１１６】
Ｃ−末端チオエステルを有するペプチドフラグメントを、出典明示により本明細書に包含させる下記の文献に記載の通りに製造できる：Kent et al, 米国特許６,１８４,３４４；Tam et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:12485-12489(1995); Blake, Int. J. Peptide Protein Res., 17:273(1981); Canne et al, Tetrahedron Letters, 36:1217-1220(1995); Hackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:7845-7850(1997); またはHackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 96:10068-10073(1999)。好ましくは、Hackeng et al(1999)に記載の方法を用いる。簡単に言うと、ペプチドフラグメントを固相支持体(下記)上で、典型的に０.２５mmolスケールで、出典明示により本明細書に包含させるSchnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180-193(1992)に記載の、Ｂｏｃ化学のインサイチュ中和／ＨＢＴＵ活性化法を使用して合成する。(ＨＢＴＵは２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸であり、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである)。各合成サイクルは、希釈していないＴＦＡでの１から２分の処理によるＮα−Ｂｏｃの除去、１分のＤＭＦでの流水洗浄、１０から２０分の、１.０mmolの予め活性化したＢｏｃ−アミノ酸とのＤＩＥＡ存在下での結合時間、および２回目のＤＭＦでの流水洗浄から成る。(ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＭＦはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、そしてＤＩＥＡはＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである)。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸(１.１mmol)を、３分、１.０mmolのＨＢＴＵ(ＤＭＦ中０.５Ｍ)で、過剰のＤＩＥＡ(３mmol)存在下予め活性化させる。各カップリング段階後、残った遊離アミンを、例えばSarin et al, Anal. Biochem., 117:147-157(1981)に記載のような慣用のニンヒドリンアッセイで測定することにより収率を測定する。Ｇｌｎ残基の結合後、ＤＣＭ流水洗浄を、ＴＦＡを用いた脱保護の前および後に使用し、可能性のある高温(ＴＦＡ／ＤＭＦ)−触媒ピロリドン形成を防止する。鎖構築が完了した後、本ペプチドフラグメントを脱保護し、無水ＨＦで１時間、０℃での処理により、４％ｐ−クレゾールをスカベンジャーとして使用して樹脂から開裂する。イミダゾール側鎖２,４−ジニトロフェニル(ｄｎｐ)保護基は、ｄｎｐ−除去法がＣ−末端チオエステル基と両立できないため、Ｈｉｓ残基上に残る。しかしながら、ｄｎｐをライゲーション反応中にチオールにより徐々に除去する。開裂後、ペプチドフラグメントを氷冷ジエチルエーテルで鎮連し、水性アセトニトリルに溶解し、凍結乾燥する。
【０１１７】
上記のチオエステルペプチドフラグメントは、好ましくはHackeng et al(1999)に記載のように、または同等なプロトコールで製造したトリチル−結合メルカプトプロピオン酸−ロイシン(ＴＡＭＰＡＬ)樹脂上で合成する。簡単に言うと、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ(４mmol)を３.６mmolのＨＢＴＵで、６mmolのＤＩＥＡの存在下活性化し、１６分、２mmolのｐ−メチルベンズヒドリルアミン(ＭＢＨＡ)樹脂またはその等価物と結合させる。次に、３mmolのＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を２.７mmolのＨＢＴＵで、６mmolのＤＩＥＡの存在下活性化し、１６分、Ｌｅｕ−ＭＢＨＡ樹脂と結合させる。得られたＴＡＭＰＡＬ樹脂を、２回、１分の３.５％トリイソプロピルシランおよび２.５％Ｈ２Ｏでトリチル保護基を除去した後、ＴＦＡポリペプチド−鎖構築のための出発樹脂として使用できる。チオエステル結合は、全ての所望のアミノ酸と、Schnolzer et al(上記)に記載のように、標準インサイチュウ−中和ペプチド結合プロトコールを１時間使用して形成できる。最終ペプチドフラグメントの無水ＨＦでの処置は、Ｃ−末端活性化メルカプトプロピオン酸−ロイシン(ＭＰＡＬ)チオエステルペプチドフラグメントを産生する。
【０１１８】
好ましくは、チアゾリジン−保護チオエステルペプチドフラグメント中間体を、Hackeng et al(1999)に記載の条件、または類似の条件下の天然化学ライゲーションに使用する。簡単に言うと、６Ｍグアニジン、４％(vol／vol)ベンジルメルカプタンおよび４％(vol／vol)チオフェノールを含む０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.５)を、ライゲートする乾燥ペプチドに添加し、約ｐＨ７で１−３mMの最終ペプチド濃度とし、凍結乾燥ペプチドからチオールおよびＴＦＡの添加により低下する。好ましくは、ライゲーション反応を、３７℃の加熱ブロック中、ボルテックス処理し、チオール添加物を平衡化する。本反応の完了の程度をＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化ＭＳで追跡できる。
【０１１９】
天然化学ライゲーション反応が完了したまたは停止させた後、本生成物のＮ−末端チアゾリジン環を、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン(０.５Ｍ)のようなシステイン脱保護剤で、ｐＨ３.５−４.５で２時間、３７℃で処理することにより開環し、その後１０倍過剰のＴｒｉｓ−(２−カルボキシエチル)−ホスフィンを反応混合物に添加して、全ての酸化反応成分を完全に還元し、その後慣用の分取ＨＰＬＣで本生成物を精製する。好ましくは、ライゲーション産物を含むフラクションを、エレクトロスプレーＭＳで同定し、プールし、凍結乾燥する。
【０１２０】
合成が完了し、最終産物を精製した後、本最終ポリペプチド産物を慣用法、例えばCreighton, Meth. Enzymol., 107:305-329(1984); White, Meth. Enzymol., 11:481-484(1967); Wetlaufer, Meth. Enzymol., 107:301-304(1984)；などにより再折りたたみできる。好ましくは、最終産物を下記に従い、またはそれに準じて空気酸化することにより再折りたたみする：還元した凍結乾燥産物を、１００mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  メチオニン含有１Ｍグアニジンヒドロクロライド(または類似のカオトロピック剤)中、ｐＨ８.６で溶解する(約０.１mg／mL)。穏やかに一晩撹拌後、この再折りたたみ産物を、慣用のプロトコールの逆相ＨＰＬＣにより単離する。
【０１２１】
組み換え発現ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を、適当な宿主細胞中の対応するポリペプチドの発現を指示する組み換えＤＮＡ分子に使用できる。遺伝子コードにおける縮重のため、他のＤＮＡ配列が同等のアミノ酸配列をコードしてもよく、ＣＰＰのクローンおよび発現に使用してもよい。特定の宿主細胞に好まれるコドンを選択して、天然に存在するヌクレオチド配列に置換して入れ、発現の割合および／または効率を増加し得る。所望のＣＰＰをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)を、複製可能なベクターにクローニング(ＤＮＡの増幅)または発現のために挿入できる。本ポリペプチドは、当分野で既知の方法にしたがい、多くの発現系のいずれにおいても組み換え的に発現できる(Ausubel, et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1990)。適当な宿主細胞は酵母、細菌、古細菌(archebacteria)、真菌ならびに昆虫および哺乳類細胞を含む動物細胞、例えば骨髄幹細胞を含むがこれに限定されない幹細胞を含む一次細胞を含む。より具体的に、これらは組み換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌および、酵母発現ベクターで形質転換した酵母を含むが、これらに限定されない。また包含されるのは、組み換え昆虫ウイルス(例えばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞、および哺乳類発現系である。発現すべき核酸配列を、種々の方法でベクターに挿入できる。一般に、ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に、当分野で既知の方法を使用して挿入する。ベクター構成要素は、一般に１個またはそれ以上のシグナル配列、複製の起点、１個またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写停止配列を含むが、これらに限定されない。これらの成分の１個またはそれ以上を含むベクターの構築は、当業者に既知の標準ライゲーション技術を用いる。
【０１２２】
本発明のＣＰＰは、ＣＰＰをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞の、本タンパク質の発現を誘発または起こすための適当な条件下で培養することにより産生する。ＣＰＰ発現に適当な条件は、当業者により確認されるように、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変化する。例えば、発現ベクターにおける構成型プロモーターの使用は、宿主細胞生長および増殖の慣用の最適化を必要とすることがあり、一方、誘導性プロモーターの使用は誘導のための適当な生長条件を必要とする。加えて、ある態様において、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現に使用するバキュロウイルス系は溶菌性ウイルスであり、したがって、回収時期の選択が産物の収率に重要であることがある。
【０１２３】
宿主細胞下部を、挿入配列の発現を調節する、または、発現タンパク質を所望の形態に加工する能力に関して選択できる。タンパク質のこのような修飾は、グリコシル、アセチル、リン酸、アミド、脂質、カルボキシル、アシルまたは炭水化物基を含むが、これらに限定されない。タンパク質の“プレプロ”形を開裂する翻訳後プロセシングはまた正しい挿入、折りたたみおよび／または機能に重要であり得る。例示の目的で、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８などの宿主細胞は、このような翻訳後活性に関する特異的細胞性機構および特徴的機構を有し、挿入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択できる。特に興味深いのはキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)細胞、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)および他の酵母、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ＳＦ９細胞、Ｃｌ２９細胞、２９３細胞、パンカビ属(Neurospora)、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、シュワン腫細胞系、不死化哺乳類骨髄およびリンパ系細胞系、ジャーカット細胞、ヒト細胞および他の初代細胞である。
【０１２４】
ＣＰＰをコードする核酸は、それを他の核酸配列との機能的関係に置くことにより“操作可能に結合”をしなければならない。例えば、シグナルペプチド(presequence)または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ＤＮＡに操作可能に結合する；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に操作可能に結合する；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために配置される場合、コード配列に操作可能に結合する。一般に、“操作可能に結合”したＤＮＡ配列は隣接し、そして、分泌リーダーまたは他のポリペプチド配列である場合、隣接し読み取り相の中にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、ライゲーションにより、簡便な制限部位で達成である。このような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、慣例にしたがって使用する。プロモーター配列は構成型または誘導性プロモーターのいずれかをコードする。本プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。１つ以上のプロモーターのエレメントを合わせたハイブリッドプロモーターが当分野で既知であり、本発明に有用である。発現ベクターは付加的なエレメントを含んでよく、例えば、発現ベクターは２つの複製系を有してよく、したがって２つの生物中、例えば哺乳類中または昆虫細胞中で、発現のために、および原核宿主中でクローニングおよび増幅のために維持できる。発現およびクローニングベクターの両方が、ベクターが１個またはそれ以上の選択した宿主細胞中での複製を可能にする核酸配列を含む。このような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスに関して既知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２：プラスミド複製起点が酵母に適しており、そして種々のウイルス複製起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)が、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。さらに、発現ベクターを統合するために、本発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つ配列、および好ましくは、２つの相同な配列を含み、これは発現構築物に隣接する。本統合ベクターは、宿主細胞の特異的座位に、ベクターに挿入されるための適当な相同配列を選択することにより向けることができる。統合ベクターの構築は、当分野で既知である。さらなる態様において、異種発現コントロールエレメントは、宿主細胞の内因性遺伝子と、相同組み換えにより操作可能に結合する(米国特許６４１０２６６および６３６１９７２に記載され、その内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)。この技術は、選択したコントロールエレメントで所望のレベルに発現を制御可能にし、一方、宿主細胞により内因性に発現されるＣＰＰのプロセシング修飾を確実にする。有用な異種発現コントロールエレメントは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えば、ラウス肉腫ウイルスウイルス(ＲＳＶ)および��タロチオネインプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
好ましくは、本発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当分野で既知であり、使用する宿主細胞で変わる。発現およびクローニングベクターは典型的に選択遺伝子を含み、また選択可能マーカーと呼ぶ。典型的な選択遺伝子は(ａ)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、(ｂ)補体栄養要求性欠損、または(ｃ)複合培地からは利用できない重要な栄養素、例えば、バチルス(Bacilli)のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給する、タンパク質をコードする。
【０１２６】
ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのコードしたタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養できる。組み換え細胞により産生された本タンパク質は、使用した配列および／またはベクターに依存して、分泌され、膜結合であり、または細胞内に包含されていてよい。当業者には理解されるように、ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核または真核細胞膜を介したＣＰＰの分泌を指示するシグナル配列を含むように設計できる。所望のＣＰＰは直接にだけではなく、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的開裂部位を有する、シグナル配列または他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドで組み換え的に製造できる。一般に、本シグナル配列はベクターの構成要素であってよいか、または、ベクターに挿入されているＣＰＰ−コードＤＮＡの一部であってよい。本シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定エンテロトキシンIIリーダーからなる群から選択される、原核シグナル配列であってよい。酵母分泌のために、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)およびクリュベロミセス(Kluyveromyces)ａ−因子リーダー、後者は米国特許５,０１０,１８２に記載されている)または酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２,１７９)、または、１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０１１３６４６に記載のシグナルであり得る。哺乳類細胞での発現において、同じまたは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列のような哺乳類シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダーをタンパク質の分泌の指示のために使用できる。選択した発現系にしたがって、本コード配列を適当なベクターに挿入し、それは次にある特徴的“コントロールエレメント”または“制御配列”の存在を必要とすることがある。適当な構築物は当分野で一般的に既知であり(Ausubel, et al., 1990)、そして、Invitrogen(San Diego, Calif.), Stratagene(La Jolla, Calif.), Gibco BRL(Rockville, Md.)またはClontech(Palo Alto, Calif.)のような商業的供給者から入手可能である。
【０１２７】
細菌系での発現
細菌細胞の形質転換は、誘導性プロモーター例えば、“ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”ファージミド(Stratagene)または“ｐＳＰＯＲＴ１”(Gibco BRL)のハイブリッド１ａｃＺプロモーターを使用して達成できる。加えて、“ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”(ａ−ガラクトシダーゼ；Stratagene)またはｐＧＥＸ(グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Promega, Madison, Wis.)を含むが、これらに限定されない、多くの発現ベクターを、容易に検出および／または精製できる開裂可能な融合タンパク質を製造するために、細菌細胞における使用のために選択できる。適当な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼの結合ができ、ＣＰＰ遺伝子のコード配列のｍＲＮＡへの下流(３')転写を開始できる、全ての核酸配列である。細菌プロモーターは、転写開始領域を有し、それは通常コード配列の５'末端に近位に配置する。この転写開始領域は典型的にＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列および、トリプトファンのような生合成酵素由来の配列を含む。バクテリオファージ由来のプロモーターも使用でき、当分野で既知である。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、ｔａｔプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。そのうえ、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合でき、転写を開始できる能力を有する、非転園細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。有効なリボソーム−結合部位もまた望ましい。本発現ベクターはまた細菌におけるＣＰＰの分泌のために提供されるシグナルペプチド配列も含む。本シグナル配列は典型的に、当分野で既知のように、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。本タンパク質は増殖培地に(グラム陽性細菌)または、細胞の内膜と外膜の間に位置する細胞膜周辺腔(グラム陰性細菌)のいずれかに分泌される。本細菌発現ベクターはまた選択可能マーカー遺伝子も含み、形質転換された細菌株の選択を可能にする。適当な選択遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンを含む。選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるような生合成遺伝子を含む。例えば、抗体の誘導のために、大量のＣＰＰが必要であるとき、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいことがある。このようなベクターは、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、ＣＰＰコード配列を、ベクターに、ベータ−ガラクトシダーゼのアミノ−末端Ｍｅｔおよび続く７残基の配列と共にフレーム内にライゲートできる、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ(Stratagene)のような多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター；ＰＩＮベクター(Van Heeke & Schuster JBiol Chem 264:5503-5509 1989))；ＰＥＴベクター(Novagen, Madison Wis.)；などである。細菌のための発現ベクターは上記に示す種々の構成要素を含み、当分野で既知である。例は、とり���け、枯草菌、大腸菌、クレモリス菌(Streptococcus cremoris)およびストレプトコッカス・リビダンス(Streptococcus lividans)のベクターを含む。細菌発現ベクターを、カルシウムクロライド介在トランスフェクション、エレクトロポレーションなどの当分野で既知の技術を使用して、細菌宿主細胞に形質転換する。
【０１２８】
酵母での発現
酵母発現系は当分野で既知であり、出芽酵母カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびカンジダ・マルトーサ(C. maltosa)、ハンヌセラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クリュベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)およびクリュベロミセス・ラクティス(K. lactis)、ピチア・ギレルモンディ(Pichia guillermondii)およびピチア・パストリス(P pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の発現ベクターを含む。酵母宿主における使用に適したプロモーターの例は、３−ホスフォグリセラートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073(1980))または、他の解糖酵素(Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg. 7:149(1968); Holland, Biochemistry 17:4900(1978))、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスフォグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、アルファ因子、ＡＤＨ２ＩＧＡＰＤＨプロモーター、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼおよびＰＧＨのプロモーターを含む。例えば、Ausubel, et al., 1990; Grant et al., Methods in Enzymology 153:516-544, (1987)参照。誘導性である他の酵母プロモーターは生長条件による転写制御のさらなる利点を有し、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関係する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域を含む。酵母発現のための適当なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３,６５７にさらに記載されている。酵母選択可能マーカーは、ツニカマイシンへの耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰｌおよびＡＬＧ７；Ｇ４１８への耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；および銅イオン存在下での酵母の増殖を可能にするＣＵＰ１遺伝子を含む。酵母発現ベクターは、目的のＣＰＰをコードするＤＮＡからのＣＰＰの細胞内産生または分泌のために構築できる。例えば、選択したシグナルペプチドおよび適当な構成型または誘導性プロモーターを、ＣＰＰの細胞内発現を指示するために選択したプラスミドの適当な制限部位に挿入できる。ＣＰＰの分泌のために、ＣＰＰをコードするＤＮＡを、ＣＰＰの発現のために、プロモーターをコードするＤＮＡ、酵母アルファ−因子分泌シグナル／リーダー配列、およびリンカー配列(必要に応じて)と一緒に、選択したプラスミドにクローン化できる。酵母細胞を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換でき、適当な発酵培地で培養する。このような形質転換酵母で産生したタンパク質を次いで１０％トリクロロ酢酸で沈殿し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびクーマシーブルー染色の後分析する。本組み換えＣＰＰを続いて発酵培地から、当業者に既知の技術により単離および精製できる。
【０１２９】
哺乳類系での発現
本ＣＰＰは哺乳類細胞で発現できる。哺乳類発現系は当分野で既知であり、レトロウイルスベクター介在発現系を含む。哺乳類宿主細胞を、コード領域が後期プロモーターおよび三者間リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートできる、アデノウイルスのような多くの異なるウイルスベースの発現系で形質転換できる。本ウイルスゲノムの非必須ＥｌまたはＥ３領域への挿入は、感染宿主細胞における目的のポリペプチドの発現が可能である。好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０１０４８に一般的に記載のようなレトロウイルスベクターである。適当な哺乳類発現ベクターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼと結合でき、ＣＰＰのコード配列の下流(３')のｍＲＮＡへの転写を開始できる、全てのＤＮＡ配列である、哺乳類プロモーターを含む。プロモーターは、通常コード配列の５'末端に近位である転写開始領域、および通常転写開始部位の２５−３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを含む。本ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼIIがＲＮＡ合成を正しい位置で開始するのを指示すると考えられている。哺乳類プロモーターはまた上流プロモーターエレメント(エンハンサーエレメント)を含み、これは、典型的にＴＡＴＡボックスの１００から２００塩基対上流に位置する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始する速度を決定し、いずれの配向でも働くことができる。哺乳類プロモーターとしての特定の使用は、ウイルス遺伝子がしばしば非常に発現され、広い宿主範囲を有するため、哺乳類ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２,２１１,５０４)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアン・ウイルス４０(ＳＶ４０)プロモーターのようなウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られるプロモーターを含む。ただし、このようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性である。高級真核生物によるＣＰＰをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列のベクターへの挿入により増加できる。エンハンサーは、プロモーター上でその転写を増加させるために働く、通常約１０から３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作動性エレメントである。多くのエンハンサー配列が現在哺乳類遺伝子から既知である(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトタンパク質およびインシュリン)。典型的に、しかしながら、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例は、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。本エンハンサーは、好ましくはプロモーターから５'の位置に位置する。一般に、哺乳類細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３'に位置する制御領域に位置し、したがって、プロモーターエレメントと一緒になって、コード配���に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。組み換えタンパク質の長期の高収率の産生は、適当な発現系において行うことができる。ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含む、発現ベクターをこの目的で使用できる。哺乳類細胞で使用するための選択可能マーカーを含む適当なベクターは市販品から容易に入手でき、当業者に既知である。このような選択可能マーカーの例は、各々ｔｋ−またはｈｐｒｔ−細胞で使用するための、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。外因性核酸を哺乳類宿主に、および他の宿主に挿入する方法は当分野で既知であり、使用する宿主細胞により変化する。方法は、デキストラン−介在トランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチド(複数もある)のリポソームへの封入および、核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【０１３０】
ＣＰＰは、ＣＰＰ−コード配列を担持する発現ベクターで一過性にトランスフェクトしたまたは安定に形質転換した哺乳類細胞の培養上清から精製できる。好ましくは、ＣＰＰは、ｐｃＤ発現ベクターにより一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞の培養上清から精製する。ＣＯＳ７細胞のｐｃＤでのトランスフェクションは下記のように行う：トランスフェクションの１日前、約１０６  ＣＯＳ７サル細胞を、１００mmプレート中、１０％ウシ胎児血清および２mM  グルタミン含有個々のダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥ)上に播く。トランスフェクションを行うために、本培地を核プレートから吸引し、５０mM  Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ  ｐＨ７.４、４００mg／ml  ＤＥＡＥ−デキストランおよび５０μｇのプラスミドＤＮＡを含む、４mlのＤＭＥで置換する。本プレートを４時間、３７℃でインキュベートし、次いでＤＮＡ−含有培地を除き、プレートを２回５mlの無血清ＤＭＥで洗浄する。ＤＭＥをプレートに戻し、それを再びさらに３時間、３７℃でインキュベートする。本プレートを１回ＤＭＥで洗浄し、その後、４％ウシ胎児血清、２mM  グルタミン、ペニシリン(１００Ｕ／Ｌ)およびストレプトマイシン(１００μｇ／Ｌ)を標準濃度で含むＤＭＥを添加する。本細胞を次いで７２時間、３７℃でインキュベートし、その後増殖培地をＣＰＰの精製のために回収する。トランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡを、Casadaban and Cohen, J. Mol. Biol., Vol. 138, pgs. 179-207(1980)に記載のような大腸菌ＭＣ１０６１、または類似の生物に挿入した、ＣＰＰ−コードｃＤＮＡを含む、ｐｃＤ(ＳＲα)または同様の発現ベクターの増殖により得る。本プラスミドＤＮＡを、標準技術、例えばSambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)またはAusubel et al(1990, 上記)により、培養物から単離する。
【０１３１】
昆虫細胞での発現
ＣＰＰはまた昆虫細胞で発現できる。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特にバキュロウイルス−ベースの発現ベクターは当分野で既知である。このような系の１つにおいて、ＣＰＰ−コードＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターのエピトープタグの上流に融合する。夜蛾(Autographa californica)核多角体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)を、ヨトウ蛾(Spodoptera frugiperda)Ｓｆ９細胞またはトリコプルシア・ラルバエ(Trichoplusia larvae)に外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。本ＣＰＰ−コード配列を、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子にクローン化し、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。ＣＰＰ−コード配列の十分な挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質の被覆を欠く組み換えウイルスを産生する。本組み換えウイルスを、次いでＣＰＰを発現するヨトウ蛾細胞またはトリコプルシア・ラルバエの感染に使用する(Smith et al., J. Wol. 46:584(1994); Engelhard E K et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227(1994))。ＣＰＰ−コードＤＮＡに融合させるための適当なエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグおよび免疫グロブリンタグ(ＩｇＧのＦｃ領域のような)である。ｐＶＬ１３９３(Novagen)のような市販のプラスミドを含む、種々のプラスミドを用いることができる。簡単に言うと、本ＣＰＰ−コードＤＮＡまたは本ＣＰＰ−コードＤＮＡの所望の領域を、５'および３'領域と相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５'プライマーは、制限部位に隣接して挿入できる。本ＰＣＲ産物を次いで選択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローン化する。組み換えバキュロウイルスを、上記プラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ(Pharmingen)の、ヨトウ蛾(“Ｓｆ９”)細胞(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１)への、リポフェクチン(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販)または当分野で既知の他の方法を使用した、同時形質移入により産生する。ウイルスを、Ｓｆ９細胞中、２８℃で培養４−５日までに産生し、さらなる増幅に使用する。方法は、O'Reilley et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL, Oxford University Press(1994)に詳述の通りに行う。抽出物を、Rupert et al., Nature 362:175-179(1993)に記載のように、組み換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製できる。別法として、発現したエピトープ−タグ付加ＣＰＰを、親和性クロマトグラフィーにより精製するか、または、例えば、ＩｇＧタグ付加(またはＦｃタグ付加)ＣＰＰの精製を、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー法を使用して行うことができる。
【０１３２】
遺伝子発現の評価
遺伝子発現を、サンプル中で直接、例えば、当業者に既知の標準法により、例えば、ｍＲＮＡの転写を決定するためのノーザン・ブロッティング、ドット・ブロッティング(ＤＮＡまたはＲＮＡ)、またはインサイチュハイブリダイゼーションにより、適当に標識したプローブを使用して、本明細書に提供された配列に基づいて評価できる。あるいは、抗体を、ポリペプチド、核酸、例えば、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖の検出のためのアッセイに使用できる。このような抗体は標識でき、本アッセイを、表面上への二本鎖の形成により、本二本鎖に結合する抗体の存在を検出できるように、二本鎖が表面に結合している場所で行うことができる。遺伝子発現は、別法として、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色および、細胞培養物または体液のアッセイにより測定でき、ＣＰＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を直接評価する。このような免疫学的アッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、天然配列ＣＰＰに対して産生できる。タンパク質レベルもまた質量分析法により検出できる。タンパク質検出のさらなる方法は、タンパク質チップを使用する。
【０１３３】
発現タンパク質の精製
発現したＣＰＰを、発現後に、当業者に既知の種々の方法のいずれかを使用して精製または単離できる。適当な技術は、サンプル中にどのような他の成分が存在するかに依存して変化する。単離または精製により除去すべき汚染成分は、典型的に本ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモンおよび他の溶質を含み得る。選択される精製段階(複数もある)は、例えば、使用する製造工程の性質および特に産生したＣＰＰの性質に依存するであろう。ＣＰＰが分泌されるならば、それらは培養培地から回収できる。あるいは、本ＣＰＰを宿主細胞融解物から回収できる。膜結合しているときは、それを適当な界面活性剤(例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００)を使用して、または酵素的開裂により膜から放出できる。別法として、ＣＰＰの発現に用いる細胞を、凍結−融解循環、超音波処理、機械的破壊のような種々の物理的または化学的手段により、または細胞融解剤の使用により破壊できる。精製手段の例は、イオン交換カラムクロマトグラフィー；シリカゲルまたは、ＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂を使用したクロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用したゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除去するためのタンパク質Ａセファロースカラム；ＣＰＰのエピトープ−標識付加形を結合するためのキレート化カラムを使用したクロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；および硫酸アンモニウム沈殿を含むが、これらに限定されない。通常、単離ＣＰＰは、少なくとも１つの精製段階により産生する。例えば、ＣＰＰを、標準抗ＣＰＰ抗体カラムを使用して精製できる。タンパク質濃縮と併せた限外濾過および透析技術も有用である(例えば、Scopes, R., PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, New York, N.Y., 1982参照)。必要な精製の程度は、ＣＰＰの使用に依存して変化するであろう。ある場合は精製が必要でない。必要に応じて発現および精製したら、本発明のＣＰＰおよび核酸は、本明細書に詳述のように、多くの適用において有用である。
【０１３４】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞を、非ヒトトランスジェニック動物の製造にも使用できる。例えば、１つの態様において、本発明の宿主細胞は、ＣＰＰ−コード配列がその中に挿入されている受精した卵母細胞または胚幹細胞である。このような宿主細胞を、外因性ＣＰＰ配列がそのゲノムに挿入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ＣＰＰ配列が変えられている相同組み換え動物の製造に使用できる。このような動物は、ＣＰＰまたはそのフラグメントの機能および／または活性の研究にならびにＣＰＰ生物学的活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書で使用する“トランスジェニック動物”なる用語は、１個またはそれ以上の動物の細胞が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスのような齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。本導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそこから発育し、成熟動物のゲノムを残している細胞のゲノムに統合されており、それによりトランスジェニック動物の１種またはそれ以上の細胞形または組織においてコードした遺伝子産物の発現を指示する、外因性ＤＮである。本明細書で使用する“相同組み換え動物”は、動物の発育前に、内因性遺伝子が内因性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞内に挿入された外因性ＤＮＡ分子の間の相同組み換えにより、変えられた、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスである。
【０１３５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＣＰＰ−コード核酸を、受精した卵母細胞の雄性前核に、例えば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染により挿入し、そして本卵母細胞を、偽妊娠雌性養育動物中で発育させる。本ＣＰＰ  ｃＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに挿入できる。別法として、マウスまたはラット由来のようなヒトＣＰＰ−コード遺伝子の非ヒト相同物を、導入遺伝子として使用できる。イントロンの配列およびポリアデニル化シグナルも導入遺伝子に包含でき、導入遺伝子の発現の効率を増加させる。組織−特異的制御配列(複数もある)は、ＣＰＰ導入遺伝子に操作可能に結合し、特定の細胞でのＣＰＰの発現を指示できる。トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を、胚操作およびマイクロインジェクションを介して産生する方法は当分野で一般的となっており、例えば、両方ともLeder et al.の米国特許４,７３６,８６６および４,８７０,００９、Wagner et al. の米国特許４,８７３,１９１ならびにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)に記載されている。同様の方法が、他のランスジェニック動物の製造に使用される。トランスジェニック創始動物を、そのゲノム内のＣＰＰ導入遺伝子の存在および／または本動物の組織または細胞におけるＣＰＰ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。トランスジェニック創始動物を次いで導入遺伝子を担持するさらなる動物を繁殖するために使用できる。さらに、ＣＰＰをコードする導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物に繁殖できる。
【０１３６】
所望の核酸が、相同組み換えを介してゲノムに挿入されている動物を製造するために、本ＣＰＰ−コード配列を変更する、例えば、機能的に妨害するために、欠失、付加または弛緩が挿入されたＣＰＰ−コード配列の少なくとも一部を含む、ベクターを製造する。本ＣＰＰ−コード配列はヒト遺伝子であり得るが、より好ましくは、ヒトＣＰＰ−コード配列の非ヒト相同物(例えば、ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列とのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離したｃＤＮＡ)である。例えば、マウスＣＰＰ−コード配列を使用して、マウスゲノムにおける内因性遺伝子を変えるのに適した相同組み換えベクターを構築する。好ましい態様において、本ベクターは、相同組み換えにより、内因性ＣＰＰ−コード配列が機能的に妨害されるように、設計する(すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；“ノックアウト”ベクターとも呼ぶ)。別法として、本ベクターを、相同組み換えにより、本内因性ＣＰＰ−コード配列が変異されているか、他の方法で変えられているが、まだ機能的なタンパク質をコードするように設計する(例えば、上流制御領域を変更し、それにより内因性ＣＰＰ−コード配列の発現を変えることができる)。本相同組み換えベクターにおいて、本ＣＰＰ−コード配列の変更された部分は、その５'および３'末端で、ＣＰＰ遺伝子の付加的核酸配列に隣接され、相同組み換えが、ベクターにより運ばれた外因性配列と、胚幹細胞中の内因性遺伝子の間で起こるようにする。さらなる隣接核酸配列は、内因性遺伝子との相同組み換えを成功させるのに十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ(５'および３’末端の両方)が、ベクターに包含されている(例えば、Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503参照、相同組み換えベクターの記載に関して、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)。本ベクターを、胚幹細胞系に(例えば、エレクトロポレーションにより)挿入し、挿入されたＣＰＰ−コード配列が内因性遺伝子と相同的に組み換えされている細胞を選択する(例えば、Li, E. et al. (1992) Cell 69:915参照、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)。選択した細胞を次いで動物(例えば、マウス)の胚盤胞に注入し、凝集キメラを形成させる(例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987)pp. 113-152参照、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)。キメラ胚を次いで適当な偽妊娠雌性養育動物に移植し、胚を出産させる。相同的に組み換えされているＤＮＡをその胚細胞に有する子孫を使用して、導入遺伝子の生殖細胞伝達によりその細胞全てに相同的に組み換えされているＤＮＡを含む動物を繁殖できる。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物を構築する方法は、Bradley, A. (1991)Current Opinion in Biotechnology 2:823-829およびＰＣＴ国際公開：Le Mouellec et al.のＷＯ９０／１１３５４；Smithies et al.のＷＯ９１／０１１４０；Zijlstra et al.のＷＯ９２／０９６８；およびBerns et al.のＷＯ９３／０４１６９にさらに記載され、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【０１３７】
他の態様において、導入遺伝子の制御された発現を可能にする選択した系を含む、トランスジェニック非ヒト動物を製造できる。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載に関しては、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる、例えば、Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236を参照のこと。リコンビナーゼ系の他の例は、出芽酵母のＦＬＰリコンビナーゼ系である(O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現の制御に使用するとき、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、“二重”トランスジェニック動物を、例えば、一匹は選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、もう一匹がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む、２匹のトランスジェニック動物の交配による構築を介して提供できる。
【０１３８】
ＣＰＰ活性の評価
本発明がさらに得られたＣＰＰおよびＣＰＰ配列の、またはフラグメントおよび変異体の活性を試験する方法を提供することは認められよう。このような方法は、変異体または修飾ＣＰＰ−コード核酸を提供して、このコードしたポリペプチドがＣＰＰ生物学的活性を発現するか否かを評価することを含む。包含されるのは：(ａ)ＣＰＰまたは、その生物学的活性フラグメントまたは相同物を提供して；そして(ｂ)該ＣＰＰまたはその生物学的活性フラグメントもしくは相同物のＣＰＰ生物学的活性に関して試験することを含む、ＣＰＰの機能を評価する方法である。無細胞、細胞ベースのおよびインビボ形態を含む、適当な形態全てを使用できる。例えば、該アッセイは、宿主細胞でＣＰＰ核酸を発現し、そして該細胞内または他の影響される細胞内でＣＰＰ活性を観察することを含んでよい。他の例において、ＣＰＰまたはその生物学的活性フラグメントもしくは相同物を、細胞で構築し、ＣＰＰ生物学的活性を観察する。
【０１３９】
ＣＰＰ生物学的活性は、(１)心臓血管疾患からの防御；(２)血流を通した循環；(３)抗原性、または抗ＣＰＰ特異的抗体と結合する能力；(４)免疫原性、または抗ＣＰＰ特異的抗体を産生する能力；または(５)ＣＰＰ標的分子、好ましくはタンパク質との相互作用のような、本明細書に記載の活性のいずれかであり得る。
【０１４０】
ＣＰＰ生物学的活性は、当分野で既知の任意の適当な方法でアッセイできる。抗原性および免疫原性は、例えば、本明細書で“抗ＣＰＰ抗体”および“ＣＰＰ抗体の使用”の少に記載する通りに検出できる。血漿中の循環は、“診断的および予後的使用”に記載のように検出できる。ＣＰＰ標的分子との相互作用は、本明細書に、例えば、“薬剤スクリーニングアッセイ”の章において記載の全ての方法にしたがい検出できる。
【０１４１】
心臓血管障害は、当業者が個体にとって適当であると決定した任意の方法により診断できる。さらに症状診断の例は、背景の章に見ることができ、患者の特定のプロフィールに基づいて当業者が適当に、最良に決定する。
【０１４２】
分子内相互作用は、配列ベースの構造的予測により決定できる。このような予測は、一般に、類似の配列のポリペプチドのＸ線結晶学またはＮＭＲ構造データに基づく。分子内相互作用の検出はまたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して達成できる。ジスルフィド結合の例に関して、あるタンパク質の異なる部分の間の架橋が、より圧縮されたタンパク質をもたらし、したがって見かけの分子量を減少させる。ジスルフィド結合は還元剤、例えば、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)により分裂できる。還元剤で処理しているタンパク質サンプルを、したがって、未処理コントロールとＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較し、見かけの分子量の変化を検出する。このような方法は、当分野で慣用である。
【０１４３】
アミド化を、サンプルペプチドの分子量と同じペプチドのアミド化形のものを比較することにより検出できる。このアミド化形は、例えば、米国特許４７０８９３４に記載のような慣用法により製造できる。分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルクロマトグラフィー、または質量分析法のような、当分野で慣用の方法のいずれかにより比較するのが容易である。タンパク質分解も、サンプルペプチドの分子量と、既知分子量のペプチドの比較により検出できる。好ましくは、試験ペプチドの分子量を、質量分析法により得、翻訳後修飾されたペプチドの分子量を含むデータベースと比較する。データベースの例は、Ｇｅｎｐｅｐｔ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＥＭＢＬ、およびタンパク質配列データベースを含む。このような技術は、本明細書でさらに詳述する。
【０１４４】
抗ＣＰＰ抗体
本発明は、ＣＰＰに特異的な抗体および結合組成物を提供する。このような抗体および結合組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのＦａｂおよび一本鎖Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート、ヒト化抗体などを含む。このような抗体および結合組成物は、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳類細胞培養における組み換え発現、トランスジェニック動物における組み換え発現などを含む、種々の方法で製造できる。特定の方法を選択するための豊富な手引きが文献に、例えばChadd and Chamow, Curr. Opin. Biotechnol., 12:188-194 (2001)に存在する。
【０１４５】
製造法の選択は、所望の抗体構造、抗体の炭水化物部分の重要性、培養および精製の容易さ、費用などを含む、数種の因子に依存する。完全長抗体、抗体フラグメント、例えばＦａｂおよびＦｖフラグメント、および、異なる種由来の成分を含むキメラ抗体を含む、多くの異なる抗体構造が、標準発現技術を使用して産生できる。エフェクター機能を有さず、限定された薬物動力学的活性を有する、ＦａｂおよびＦｖフラグメントのような小さいサイズの抗体フラグメントは、細菌発現系で産生できる。一本鎖Ｆｖフラグメントは、インビボ腫瘍に非常に選択的であり、良好な腫瘍浸透力および低免疫原性を示し、急速に血中から排泄される、例えばFreyre et al, J. Biotechnol., 76:157-163 (2000)。故に、このような分子は、放射免疫検出およびインサイチュ放射線療法に望ましい。増加した半減期の形の薬物動力学的活性が治療目的で必要である場合は、全て、完全長抗体が好ましい。例えば、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)分子は４つのサブクラス：γ１、γ２、γ３またはγ４の１つであり得る。エフェクター機能を有する完全長抗体が必要であるときは、ＩｇＧサブクラスγ１またはγ３が好ましく、ＩｇＧサブクラスγ１が最も好ましい。本γ１およびγ３サブクラスは、強力なエフェクター機能、補体活性化および抗体−依存的細胞介在細胞毒性を、特異的Ｆｃ受容体との相互作用を介して示す、例えばRaju et al, Glycobiology, 10:477-486 (2000); Lund et al, J. Immunol., 147:2657-2662 (1991)。
【０１４６】
ポリクローナル抗体
本発明の抗ＣＰＰ抗体はポリクローナル抗体であってよい。このようなポリクローナル抗体は、哺乳類で、例えば、免疫剤(immunizing agent)、および好ましくは、アジュバントの１回またはそれ以上の注射により製造できる。典型的に、本免疫剤および／またはアジュバントを、哺乳類に一連の皮下または腹腔内注射により注入する。本免疫剤は、ＣＰＰまたはその融合タンパク質を含み得る。抗原を、免役する哺乳類において免疫原性であることが既知のタンパク質と結合させることが有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、メチル化ウシ血清アルブミン(ｍＢＳＡ)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、Ｂ型肝炎表面抗原、血清アルブミン、ウシチログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤を含むが、これらに限定されない。アジュバントは、例えば、フロインド完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノ−ミコレート(trehalose dicoryno-mycolate))。免疫化プロトコールは、標準プロトコールに基づいて、または、日常的な実験により当業者が決定できる。
【０１４７】
あるいは、ＣＰＰまたはその一部が富んでいる粗タンパク質調製物を、抗体の産生に使用できる。このようなタンパク質、フラグメントまたは調製物を、適当なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に挿入する。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含むとき、本ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製する。
【０１４８】
有効なポリクローナル抗体の製造は、抗原および宿主種の両方が関係する多くの因子により影響される。また、宿主動物の応答は、接種の部位および容量により変化し、抗原の不適切なおよび過剰な用量の両方が低い抗血清力価をもたらす。少ない投与量(ngレベル)の抗原を複数の皮内部位に投与するのが最も確実であるようである。ポリクローナル抗血清を産生し、プロセシングする方法は当分野で既知であり、例えば、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させるMayer and Walker(1987)を参照のこと。ウサギのための有効な免疫プロトコールは、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる、Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971)に見ることができる。ブースター注射を一定間隔ででき、抗血清を、その抗体力価が、半定量的に、例えば、既知濃度の抗原に対する寒天中の二重免疫拡散で測定して、落ち始めた時に回収する。例えば、Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in:Handbook of Experimental Immunology D. Wier(ed) Blackwell (1973)参照。抗体のプラトー濃度は、通常、血清０.１から０.２mg／ml(約１２：Ｍ)である。抗血清の本抗原に対する親和性を、例えば、Fisher, D., Chap. 42 in:Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (RoseおよびFriedman, Eds.)Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D. C. (1980)に記載のように、競合的結合曲線を調製することにより測定する。
【０１４９】
モノクローナル抗体
あるいは、本抗ＣＰＰ抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体はハイブリドーマにより産生でき、ここで、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、産生する能力を有する、リンパ球を誘発するために、免疫剤で免疫する、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)。本免疫剤は、典型的にＣＰＰまたはその融合タンパク質と、所望により担体を含む。別法として、本リンパ球をインビトロで免疫する。一般に、非ヒト哺乳類供給源が望ましいとき、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するか、または、ヒト起源の細胞が望ましいとき、末梢血リンパ球(“ＰＢＬ”)を使用する。本リンパ球を、ポリエチレングリコールのような融合剤を使用して、不死化細胞系と融合し、ハイブリドーマ細胞を産生する、例えばGoding, MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press, pp. 59-103 (1986); Liddell and Cryer, A Practical Guide to Monoclonal Antibodies (John Wiley & Sons, New York, 1991); Malik and Lillenoj, Editors, Antibody Techniques (Academic Press, New York, 1994)。一般に、不死化細胞系は形質転換哺乳類細胞、例えば、ラット、マウス、ウシまたはヒト起源の骨髄腫細胞である。本ハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない、不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種またはそれ以上の物質を含む、適当な培養培地で培養する。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ)を欠くとき、ハイブリドーマのための培養培地は典型的にＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(ＨＡＴ)を含む。好ましい不死化細胞系は、有効に融合され、抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そして、ＨＡＴ培地のような培地に感受性であるものである。より好ましい不死化細胞系は、マウスまたはヒト骨髄腫系であり、これらは、例えば、American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, MDから得ることができる。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている、例えばKozbor, J. Immunol. 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)。
【０１５０】
ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地(上清)を、ＣＰＰに対するモノクローナル抗体の存在に関してアッセイできる。好ましくは、ハイブリドーマ上清に存在するモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)または酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)により測定できる。適当な技術およびアッセイは当分野で既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスキャッチャード分析により測定できる。所望の抗体産生ハイブリドーマ細胞が同定された後、本細胞を、限界希釈法によりクローン化し、標準法で増殖させる(Goding, 1986, 前掲)。この目的に適した培養培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。あるいは、本ハイブリドーマ細胞を、インビボで、哺乳類の腹水として増殖できる。選択したクローンにより分泌される本モノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシル−アパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーのような当業者が慣用的に使用している免疫グロブリン精製法により、培養培地または腹水液から単離または精製できる。
【０１５１】
本モノクローナル抗体はまた、米国特許４,８１６,５６７に記載のような組み換えＤＮＡ法により製造できる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、ＣＰＰ−特異的ハイブリドーマ細胞から、例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して、単離し、配列決定する。単離したら、本ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを、続いて、他の方法で免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトし、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成をさせることができる。本ＤＮＡはまた、例えば、マウス重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同なヒト配列で置換することにより(Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))、または、免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を共有結合させることにより修飾をされていてよい。本非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインで置換し、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変性ドメインで置換し、キメラ二価抗体を産生する。本抗体はまた一価抗体であってよい。一価抗体を製造する方法は、当分野で既知である。例えば、インビトロ法が、一価抗体の製造に適している。そのフラグメント特に、Ｆａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当分野で慣用の技術を使用して達成できる。
【０１５２】
本発明のハイブリドーマに特徴的な抗体および抗体フラグメントも、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、本抗体分子のセグメントをコードするクローンを選択することによる組み換え手段により、製造できる。下記は、抗体を製造するための組み換え技術を記載する文献の例である：Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, pgs. 3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, pgs. 3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12, pgs. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 2055-2065 (1980); Moore et al., 米国特許４,６４２,３３４；Skerra et al, Science, Vol. 240, pgs. 1038-1041 (1988)；Huse et al, Science, Vol. 246, pgs. 1275-1281 (1989)；および米国特許６,０５４,２９７；５,５３０,１０１；４,８１６,５６７；５,７５０,１０５；および５,６４８,２３７；これらの特許を出典明示により本明細書に包含させる。特に、このような技術を使用して、免疫原性を低下させるために、１つの種の結合領域が、他の種の抗体の非結合領域と合わさっている、種間モノクローナル抗体の製造に使用できる、例えばLiu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 84, pgs. 3439-3443 (1987), および特許６,０５４,２９７および５,５３０,１０１。好ましくは、組み換え的に製造したＦａｂおよびＦｖフラグメントを、細菌宿主系で発現させる。好ましくは、完全長抗体を、哺乳類細胞培養技術により製造する。より好ましくは、完全長抗体を、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞またはＮＳＯ細胞で発現させる。
【０１５３】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を、ＥＬＩＳＡでスクリーニングできる。他の固相免疫アッセイと同様、本試験は、巨大分子がプラスチックに非特異的に吸着する傾向に基づく。この反応の可逆性から、免疫学的活性の損失なしに、抗原−抗体複合体の形成と、非結合物質からのこのような複合体の簡単な分離を可能にする。抗ペプチド血清を力価測定するために、面系に使用したのと異なる担体と結合しているペプチドを、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに吸着させる。吸着した本抗原を次いでウェル中で、抗ペプチド血清の希釈と反応させる。非結合抗体を洗い流し、残った抗原−抗体複合体を、免疫動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。本二次抗体を、アルカリホスファターゼのような酵素と結合させる。酵素基質が添加された時に産生する可視的着色反応が、どのウェルが抗ペプチド抗体を含むかの指標である。分光光度計読み取りの使用が、ペプチド−特異的抗体結合の良好な定量を可能にする。抗力価抗血清は、１０−３および１０−５希釈の間で直線力価曲線を産生する。
【０１５４】
ＣＰＰペプチド担体
本発明はＣＰＰ由来の免疫原、および、担体と本発明のペプチドの間の結合体を含む免疫原を含む。本明細書で使用する免疫原なる用語は、免疫応答をもたらすことができる物質を意味する。本明細書で使用する担体なる用語は、それが本発明のペプチドと化学的に結合したとき、得られた結合体で免疫した宿主細胞が、本結合ペプチドに特異的な抗体を産生できる、全ての物質を意味する。担体は、赤血球細胞、バクテリオファージ、タンパク質または、アガロースビーズのような合成粒子を含む。好ましくは、担体はタンパク質、例えば、血清アルブミン、ガンマ−グロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン、チログロブリン、卵白アルブミン、フィブリノゲンなどである。
【０１５５】
合成ペプチドを担体と結合させる一般的技術は、数種の文献、例えばWalter and Doolittle, “Antibodies Against Synthetic Peptides”, in Setlow et al., eds., Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 61-91 (Plenum Press, N.Y., 1983); Green et al. Cell, Vol. 28, pgs. 477-487 (1982); Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78, pgs. 3403-3407 (1981); Shimizu et al., 米国特許４,４７４,７５４；およびGanfield et al.、米国特許４,３１１,６３９に記載されている。したがって、これらの文献を出典明示により本明細書に包含させる。また、ハプテンを担体と結合させるために用いる技術は、本質的に上記文献の技術と同じである、例えばchapter 20 in Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immuno Assay(Elsevier, New York, 1985)。ペプチドを担体に結合するための４つの最も一般的に使用されるスキームは(１)例えばKagan and Glick, in Jaffe and Behrman, eds. Methods of Hormone Radioimmunoassay, pgs. 328-329(Academic Press, N.Y., 1979)およびWalter et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 77, pgs. 5197-5200(1980)に記載のような、アミノ結合のためのグルタールアルデヒド；(２)例えばHoare et al., J. Biol. Chem., Vol. 242, pgs. 2447-2453(1967)により記載のような、カルボキシルのアミノへの結合のための水溶性カルボジイミド；(３)例えば、Bassiri et al., pgs. 46-47, in Jaffe and Behrman, eds. (上記)およびWalter et al. (上記)に記載のような、チロシンのチロシン側鎖への結合のためのビスジアゾベンジジン(ＢＤＢ)；および(４)例えばKitagawa et al., J. Biochem. (Tokyo), Vol. 79, pgs. 233-239(1976)およびLerner et al. (上記)により記載のような、アミノ基へのシステイン(または他のスルフヒドリル)の結合のためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)である。あるペプチドをタンパク質担体に結合するための適当な方法を選択する一般的な規則は下記のように述べることができる：結合に関与する基は、配列に１回だけ、好ましくは、セグメントの適当な末端に出現すべきである。例えば、ＢＤＢは、チロシン残基が、その可能性のある抗原性特性のために選択した配列に２回出現するとき、使用すべきではない。同様に、中心に位置するリシンは、グルタールアルデヒド法を除外し、そしてアスパラギン酸およびグルタミン酸の出現は、しばしばカルボジイミド法を除外する。他方、適当な残基を、それらが“天然”タンパク質配列に存在するかしないかに関わらず、選択した配列セグメントのいずれかの末端に、結合部位として配置できる。内部セグメントは、アミノおよびカルボキシ末端と異なり、ポリペプチド主鎖が続いている天然タンパク質において発見されるのと同じ配列と、“非結合末端”で有意に異なる。α−アミノ基をアセチル化し、続いてペプチドをそのカルボキシ末端の方向で結合することにより、問題がある程度解決できる。担体タンパク質への結合効率は、簡便には、放射活性アミノ酸を一段階合成のために使用して、または、完成したペプチドのチロシン残基のヨウ素化により標識して製造した、放射活性標識ペプチドを使用して、測定する。本ペプチドにおけるチロシンの存在がまた、望ましいとき、感受性放射免疫アッセイを可能にする。したがって、チロシンを、それが天然ポリペプチドにより定義されるペプチド配列の一部でないとき、末端残基として挿入できる。
【０１５６】
好ましい担体はタンパク質であり、好ましいタンパク質担体は、ウシ血清アルブミン、ミオグロビン、卵白アルブミン(ＯＶＡ)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)などを含む。ペプチドを、Liu et al., Biochemistry, Vol. 18, pgs. 690-697 (1979)に記載のように、ＭＢＳによりシステインを介してＫＬＨに結合できる。本ペプチドは、リン酸緩衝化食塩水(ｐＨ７.５)、０.１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ９.０)または１.０Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ４.０)に溶解する。本ペプチドを溶解するためのｐＨは、ペプチド溶解性を最適化するために選択する。可溶性ペプチドの遊離システイン含量は、Ellmanの方法により測定する、Ellman, Arch. Biochem. Biophys., Vol. 82, pg. 7077 (1959)。各ペプチドに関して、０.２５mlの１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.２)中の４mg  ＫＬＨを、０.７mg  ＭＢＳ(ジメチルホルムアミドに溶解)と反応させ、３０分、室温で撹拌する。ＫＬＨが＞３０％ホルムアミドで不溶性であるため、ＭＢＳを滴下して、ホルムアミドの局所濃度が高すぎないことを確認する。反応産物であるＫＬＨ−ＭＢＳを次いで５０mM  リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.０)で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５に通して、遊離ＭＢＳを除去し、本カラム溶出液のピークフラクションからのＫＬＨ回収(ＯＤ２８０でモニター)は、約８０％と概算される。ＫＬＨ−ＭＢＳを次いで１mlのこの選択した緩衝液に溶解した５mgペプチドと反応させる。ｐＨを７−７.５に調製し、反応物を３時間、室温で撹拌する。結合効率を、放射活性ペプチドで、本結合体のサンプルをリン酸−緩衝化食塩水に対して透析してモニターし、８％から６０％の範囲であってよい。本ペプチド−担体結合体が利用可能になったら、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、例えばCampbell, Monoclonal Antibody Technology(Elsevier, New York, 1984); Hurrell, ed. Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); Schreier et al. Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980)；米国特許４,５６２,００３；などに記載のような標準技術により製造する。特に、米国特許４,５６２,００３を出典明示により本明細書に包含させる。
【０１５７】
ヒト化抗体
本発明の抗ＣＰＰ抗体はさらにヒト化抗体またはヒト抗体を含んでよい。“ヒト化抗体”なる用語は、非ヒト抗体由来の配列のある部分を含む、キメラ抗体、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')、または抗体の他の抗原−結合部分配列)である、非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、所望の結合特異性、親和性およびキャパシティーを有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリンを含む。一般に、本ヒト化抗体は、少なくとも１個の、および一般に２個の可変性ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。本ヒト化抗体は、所望により免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を含み、それは典型的にヒト免疫グロブリンのものである(Jones et al., Nature 321:522-525(1986)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992))。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当分野で既知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト抗体により似せるために、非ヒトである供給源由来の１個またはそれ以上のアミノ酸をその中に挿入されているが、また抗体の本来の結合活性を維持している。抗体のヒト化の方法は、さらに、Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988); and Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988)に詳述されている。このような“ヒト化”抗体は、実質的にヒト可変領域全体より少ない部分が、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている、キメラ抗体である。
【０１５８】
ヘテロコンジュゲート抗体
２つの共有結合した抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、インビトロで、合成タンパク質化学における既知の方法を使用して製造でき、架橋剤が関与するものを含む。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合の形成により、製造できる。
【０１５９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二種の抗原に結合特異性を有する。このような抗体はモノクローナルであり、好ましくはヒトまたはヒト化されている。本発明の二重特異性抗体の結合特異性の一方はＣＰＰに対してであり、他方は好ましくは細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットに対してである。二重特異性抗体を製造する方法は当分野で既知であり、一般に、二重特異性抗体の組み換え製造は、ハイブリドーマ細胞における２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現であり、ここで、２つの重鎖は異なる特性を有する、例えばMilstein and Cuello, Nature 305:537-539(1983)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な分類が、ハイブリドーマによる１０種の異なる抗体分子の製造をもたらす可能性を考慮して、正しい分子の精製が通常、親和性精製、例えば親和性クロマトグラフィーを多少必要とする。
【０１６０】
ＣＰＰ抗体の使用
ＣＰＰ抗体を機能的アンタゴニストとして使用できる。好ましくは、このような抗体は、ＣＰＰに特異的である。より好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＣＰＰに特異的なフラグメントまたは結合組成物を含む。本明細書で使用する、“重鎖可変領域”なる用語は、(１)１１０から１２５アミノ酸長であり、そして、(２)そのアミノ酸配列が本発明の抗体の重鎖に対応し、重鎖Ｎ−末端アミノ酸から出発する、ポリペプチドを意味する。同様に、“軽鎖可変領域”は、(１)９５から１１５アミノ酸長であり、そして、(２)そのアミノ酸配列が本発明の抗体の軽鎖に対応し、軽鎖Ｎ−末端アミノ酸から出発する、ポリペプチドを意味する。本明細書で使用する“モノクローナル抗体”なる用語は、ＣＰＰに特異的に結合できる免疫グロブリンの同種集団を意味する。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＣＰＰに特異的なモノクローナル抗体に由来する。ＣＰＰを遮断するかまたは中和できるモノクローナル抗体を、ＣＰＰの生物学的活性を阻害するその能力により選択する。
【０１６１】
抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント：Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay(Elsevier, Amsterdam, 1985); およびFvフラグメント:Hochman et al. Biochemistry, Vol. 12, pgs. 1130-1135(1973), Sharon et al., Biochemistry, Vol. 15, pgs. 1591-1594(1976)およびEhrlich et al., 米国特許４,３５５,０２３；ならびに抗体半分子：Auditore-Hargreaves, 米国特許４,４７０,９２５の使用はまた既知である。
【０１６２】
好ましくは、モノクローナル抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、または本発明のモノクローナル抗体由来の他の結合組成物は、ＣＰＰに高親和性を有する。モノクローナル抗体および関連分子のＣＰＰに対する親和性は、プラスモン共鳴、ＥＬＩＳＡまたは平衡透析を含む、慣用の技術により測定できる。プラスモン共鳴技術による親和性測定は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を、製造者が推奨するプロトコールにしたがって使用して、行うことができる。好ましくは、親和性はＥＬＩＳＡで、例えば、米国特許６,２３５,８８３または同様の文献に記載のように測定する。好ましくは、ＣＰＰと本発明のモノクローナル抗体の解離定数は、１０−５モル濃度より小さい。より好ましくは、このような解離定数は１０−８モル濃度より小さい；さらにより好ましくは、このような解離定数は１０−９モル濃度より小さい；そして最も好ましくは、このような解離定数は１０−９から１０−１１モル濃度の範囲である。
【０１６３】
加えて、本発明の抗体はＣＰＰの検出に有用である。このような検出法は、有利には心臓血管障害、特に、冠状動脈疾患の診断に適用する。本発明の抗体は、抗原−抗体反応が関与するほとんどのアッセイで使用できる。アッセイは均一または不均一であってよい。均一アッセイ法において、サンプルは、血清、尿、全血、リンパ液、血漿、唾液、細胞、組織、および、インビトロで培養した細胞または組織により分泌された物質のような、生物学的サンプルまたは体液であり得る。本サンプルを、望ましくない物質を除去する必要があるとき、前処理してもよい。免疫学的反応は、通常、特異的抗体、標識分析物、および、抗原を含むことが疑われるサンプルを含む。本抗原を、本明細書に記載の標識基で直接標識できる。標識から発生したシグナルを、抗体の標識分析物への結合により、直接的または間接的に修飾する。免疫学的反応およびその程度の検出の両方とも、均質溶液中で行う。用いることができる免疫化学標識は、フリーラジカル、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、補酵素などである。
【０１６４】
不均一アッセイ法において、試薬は通常サンプル、特異的抗体、および検出可能なシグナルを産生させる手段を含む。標本を一般に支持体、例えばプレートまたはスライドに置き、液相中で抗体と接触させる。次いで、本支持体を本液相から分離し、支持体相または液相のいずれかを、検出可能なシグナルに関して、このようなシグナルを発生させる手段またはシグナル発生系を用いて、試験する。本シグナルは、サンプル中の抗原の存在と比例する。検出可能なシグナルを発生させる方法は、放射活性標識、蛍光化合物、酵素などの使用を含む。不均一免疫アッセイの例は、放射免疫アッセイ、蛍光抗体法、酵素結合免疫アッセイなどである。
【０１６５】
上記免疫アッセイ技術のさらなる詳細に関して、Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1980による“Enzyme-Immunoassay”を参照のこと。また、例えば、米国特許３,６９０,８３４；３,７９１,９３２；３,８１７,８３７；３,８５０,５７８；３,８５３,９８７；３,８６７,５１７；３,９０１,６５４；３,９３５,０７４；３,９８４,５３３；３,９６６,３４５；および４,０９８,８７６を参照のこと(このリストは、全てを網羅することを意図していない)。標識を抗体および抗体フラグメントに結合する方法は、当分野で既知である。このような方法は、米国特許４,２２０,４５０；４,２３５,８６９；３,９３５,９７４；および３,９６６,３４５に見ることができる。本発明の抗体を用いることができる他の技術の例は、免疫ペルオキシダーゼ標識である(Sternberger, Immunocytochemistry (1979) pp. 104-169)。別法として、本抗体を放射活性物質にまたは薬剤に結合し、各々放射性医薬品または医薬品を形成してもよい(Carrasquillo, et al., Cancer Treatment Reports (1984) 68:317-328)。
【０１６６】
本発明の抗体を用いるアッセイの１つの態様は、本発明のモノクローナル抗体が結合している表面の使用を含む。表面の基本構造は、異なる形を取ってよく、異なる組成を有し、組成物もしくは積層の混合物、またはそれらの組み合わせであり得る。本表面は、使用および測定の方法に依存して、種々の形状および形を取ることができ、種々の寸法を有し得る。表面の実例は、パッド、ビーズ、ディスクまたはストリップであり、平ら、凹状または凸状であってよい。厚さは厳密ではなく、一般に約０.１から２mmの厚さであり、任意の簡便な直径または他の寸法である。本表面は、典型的に棒、管、毛管、繊維、ストリップ、ディスク、プレート、キュベットで支えられ、典型的に、多孔性であり、抗体の共有結合を可能にし、検出可能なシグナルを発生させるための手段の一部を形成する他の化合物の結合を可能にするために、多機能性であるか、多機能性になることができる。天然および合成の両方の、広範囲の有機および無機ポリマーおよび、これらの組み合わせを、固体表面用物質として用いることができる。ポリマーの実例は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(４−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、レイヨン、ナイロン、ポリ(ビニルブチレート)、シリコン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロースおよびラテックスを含む。他の表面は、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド(metaloid)、半導体製品、セメント、ケイ酸塩などを含む。また包含されるのは、ゲル、ゼラチン、リポポリサッカライド、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドを形成する物質、またはデキストラン、ポリアルキレングリコール(２から３炭素原子のアルキレン)またはリン脂質のような界面活性剤のような、数個の水性相を形成するポリマーである。抗体の表面への結合は、文献から一般的に入手可能である、既知の技術により達成できる(例えば、“Immobilized Enzymes,” Ichiro Chibata, Press, New York (1978)およびCuatrecasas, J. Bio. Chem., 245:3059 (1970))。本発明のこの局面のアッセイの実施に際して、サンプルを水性媒体と混合し、本媒体を、それに結合した抗体を有する表面と接触させる。標識を、表面と結合した検出可能なシグナルを提供するために、水性媒体に、同時にまたは連続的に添加してよい。検出可能なシグナルを発生させる方法は、標識分析物の取り込みを含んでよく、または、それに標識結合体を有する二次モノクローナル抗体の使用を含んでよい。必要に応じて、分離および洗浄段階を行う。検出された本シグナルは、サンプル中のＣＰＰの存在と比例する。同じ支持体上の目盛り決めを含むのは、本発明の範囲内である。本発明のアッセイの特定の態様は、説明の目的で、限定の目的ではなく、スライドまたはペトリ皿のウェルのような支持体の使用を含む。本技術は、分析すべきサンプルを、適当な固定物質と共に支持体上に固定し、スライド上のサンプルをモノクローナル抗体とインキュベートすることを含む。例えば、リン酸緩衝化食塩水のような適当な緩衝液での洗浄後、支持体を、抗体の標識した特異的結合パートナーと接触させる。必要に応じてインキュベートした後、スライドを２回水性緩衝液で洗浄し、抗原���対する標識モノクローナル抗体の結合について測定を行う。標識が蛍光であるとき、スライドを、カバーガラス上の蛍光抗体マウンティング流体で覆い、次いで、蛍光顕微鏡で試験して、結合の程度を決定する。他方、標識が、モノクローナル抗体に結合した酵素であってよく、結合の程度を酵素活性の存在に関するスライドの試験により決定でき、これは、沈殿、色素などの形成により支持され得る。本発明の抗体を用いる特定の例は、二重決定要素ＥＬＩＳＡアッセイである。例えば、ガラスまたはビニールプレートのような支持体をＣＰＰに特異的な抗体で、慣用の技術によりコートする。本支持体を、ＣＰＰの含有が疑われるサンプルと、通常、水性培体中で接触させる。３０秒から１２時間のインキュベーション時間の後、本支持体を媒体から除去し、非結合ＣＰＰを除去するために、例えば、水または水性緩衝化媒体で洗浄し、ＣＰＰに特異的な抗体と、また通常水性媒体中で接触させる。本抗体を、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素で直接または間接的に標識する。インキュベーション後、本支持体を本媒体から除去し、上記のように洗浄する。本支持体または本水性媒体の酵素活性を測定する。この酵素活性は、サンプル中のＣＰＰの量と比例する。
【０１６７】
本発明はまた、上記の方法を行うための、キット、例えば、診断的アッセイキットを含む。１つの態様において、本キットは、(ａ)上記により具体的に定義したモノクローナル抗体および(ｂ)上記モノクローナル抗体の特異的結合パートナーと検出可能シグナルを発生できる標識の結合体の、包装された組み合わせから成る。本試薬は、補助的薬剤、例えば、緩衝液化剤およびタンパク質安定化剤、例えば、ポリサッカライドなどを含んでいてよい。本キットは、さらに、必要に応じて、標識がメンバーであるシグナル発生系の他のメンバー、試験におけるバックグラウンドを低下させるための薬剤、コントロール試薬、試験を行うための装置などを含んでいてよい。他の態様において、本診断的キットは、本発明のモノクローナル抗体と、検出可能なシグナルを発生できる標識の結合体を含む。上記のような補助剤も存在していてよい。
【０１６８】
さらに、抗ＣＰＰ抗体(例えば、モノクローナル抗体)を使用して、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準技術によりＣＰＰを単離できる。例えば、抗ＣＰＰ抗体は、細胞からの天然ＣＰＰの、および、宿主細胞で発現される組み換え的に製造したＣＰＰの精製を容易にすることができる。さらに、抗ＣＰＰ抗体を使用して、低濃度ＣＰＰ(例えば、血漿、細胞性融解物または細胞上清において)を検出するために、または、ＣＰＰの発生量および発現のパターンを評価するために、ＣＰＰを単離できる。抗ＣＰＰ抗体を、例えば、ある処置レジメンの効果を決定するための、臨床試験法の一部として、組織中のタンパク質レベルをモニターするために、診断的に使用できる。検出は、抗体の標識基への結合(すなわち、物理的架橋)により容易にすることができる。
【０１６９】
タンパク質アレイ
本発明のポリペプチドの検出、精製、およびスクリーニングは、その記載を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる米国特許６２２５０２７および米国特許出願２００１００１４４６１に記載のような、retentateクロマトグラフィー(好ましくは、タンパク質アレイまたはチップ)を使用して達成できる。簡単に言うと、retentateクロマトグラフィーは、ポリペプチド(および／または他のサンプル成分)を吸着剤(例えば、アレイまたはチップ)に保持し、続いて検出する方法を言う。このような方法は、(１)サンプル由来のポリペプチドを、多くの異なる吸着剤／溶離剤条件下で支持体に選択的に吸着させる(“選択性条件”)、そして(２)吸着したポリペプチドの保持を、脱着分光測定法(例えば、質量分析法)により検出することを含む。慣用のクロマトグラフィー法において、ポリペプチドを、検出前に吸着剤から溶出して離す。吸着クロマトグラフィーと、脱着分光測定法による検出の結合は、並はずれた感受性、種々の異なる選択性条件で保持した成分を急速に測定する能力、および、異なる溶出条件下のアレイ上の異なる部位(すなわち、“親和性部位”または“スポット”)に吸着した成分の平衡処理を提供する。
【０１７０】
これらの方法は：ＣＰＰの組み合わせ、生化学的分離および精製；特異な遺伝子発現の研究；タンパク質レベルにおける差異の検出(例えば、診断のため)；および、分子認識事象の検出(例えば、スクリーニングおよび薬剤開発のため)に有用である。故に、本発明は、平衡したおよび複数両方のポリペプチド処理能力を包含することを特徴とする、分子開発および診断装置を提供する。本発明のポリペプチドおよびＣＰＰ−結合物質は、好ましくは標識基に結合しており、したがって、直接に検出され、１つのユニットの操作中に、同じ“回路”(すなわち、アドレス可能“チップ”位置)からの２種またはそれ以上のシグナルの同時の伝達を可能にする。
【０１７１】
質量分析法によるＣＰＰの検出
本発明により、任意の装置、方法、工程などを利用して、サンプル中のタンパク質の同一性および発生量を検出できる。同一性を得るための好ましい方法は、サンプル中のタンパク質分子をイオン化し、次いで、得られたタンパク質イオンの質量および電荷を検出し、決定する、質量分析法によるものである。
【０１７２】
タンパク質の分析に質量分析法を使用するために、タンパク質をガス−イオン相に変位させるのが好ましい。タンパク質イオン化の種々の方法が有用であり、例えば、高速イオン照射(ＦＡＢ)、プラズマ脱離、レーザー脱離、熱脱離、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化(ＭＡＬＤＩ)を含む。多くの異なる質量分析器が、ペプチドおよびタンパク質分析に利用可能であり、飛行時間(ＴＯＦ)、イオントラップ(ＩＴＭＳ)、フーリエ変換イオンサイクロトロン(ＦＴＭＳ)、四重極イオントラップおよびセクター(電気的および／または磁気的)分光計を含む。例えば、イオントラップＭＳに関しては、米国特許５,５７２,０２５を参照。質量分析器を単独で、または、タンデム質量分光計において他の質量分析器と組み合わせて使用できる。後者の場合、第一の質量分析器を、タンパク質イオン(前駆体イオン)を互いに分離させ、サンプル中の種々のタンパク質成分の分子量を決定するために使用できる。第二の質量分析器を、各分離した成分の、例えば、前駆体イオンを、例えば不活性ガスを使用して生成物イオンに断片化することにより、分析するのに使用できる。質量分析器の全ての所望の組み合わせを使用でき、例えば、三連四重極、タンデム飛行時間、イオントラップ、および／またはこれらの組み合わせを含む。
【０１７３】
異なる種類の検出器を、タンパク質イオンの検出に使用できる。例えば、イオン電子増倍管または低温検出器のような破壊的検出器を使用できる(例えば、米国特許５,６４０,０１０)。さらに、四重極イオントラップ質量分析器またはＦＴＭＳイオントラップにおける、イオン電流ピックアップ装置として使用するイオントラップのような、非破壊的装置を使用できる。
【０１７４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに関して、乾燥した液滴(Karasand Hillenkamp, Anal. Chem., 60:2299-2301, 1988)、真空乾燥(Winberger et al., In Proceedings of the 41st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Francisco, May 31-June 4, 1993, pp. 775a-b)、結晶の破壊(Xiang et al., Rapid Comm. Mass Spectrom., 8:199-204,1994)、遅い結晶成長(Xiang et al., Org. Mass Spectrom, 28:1424-1429, 1993)；活性フィルム(Mock et al., Rapid Comm. Mass Spectrom.,6:233-238, 1992; Bai et al., Anal. Chem., 66:3423-3430, 1994)、空気スプレー(Kochling et al., Proceedings of the 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; Atlanta, GA, May 21-26, 1995, p1225)；エレクトロスプレー(Hensel et al., Proceedings of the 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; Atlanta, GA, May 21-26, 1995, p947)；高速溶媒蒸発(Vorm et al., Anal. Chem., 66:3281-3287, 1994)；サンドイッチ(Li et al., J. Am. Chem. Soc., 11 8:11662-11663,1996)；および二層法(Dal et al., Anal. Chem., 71:1087-1091, 1999)を含む、多くのサンプル調製法を利用できる。また、例えば、Liang et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 10:1219-1226, 1996; van Adrichemet al., Anal. Chem., 70:923-930, 1998を参照のこと。
【０１７５】
ＭＡＬＤＩ分析に関して、サンプルを固体状態共結晶としてまたは薄膜として、それらをエネルギー吸収化合物またはコロイド(マトリックス)と液相中で混合し、最終的に、不活性プローブの表面上で、溶液を固体状態に乾燥させることにより調製する。ある場合、エネルギー吸収分子(ＥＡＭ)は、表面を提示するサンプルの必須成分である。ＥＡＭ適用法に関わらず、本プローブ含量は、レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析計(ＬＤＩＭＳ)における挿入前に固体に乾燥させてよい。
【０１７６】
ＴＯＦ質量分析法におけるイオン検出は、典型的に電子放出性(electro-emissive)検出器、例えば、電子増倍管(ＥＭＰ)またはマイクロチャンネル・プレート(ＭＣＰ)の使用により達成できる。これらの装置の両方とも、一次投射荷電粒子を、二次的、三次的、四次的などの電子にのカスケードに変換することにより機能する。一個の投射荷電粒子の衝撃により産生される二次電気の可能性を、本荷電修理のイオン−対−電子変換効率と取ることができる(または、より単純に、変換効率)。入射荷電粒子の合計数と比較したときのカスケーディング事象に関する総電子収量を、典型的に検出器増幅率と記載する。一般にＭＣＰの全体的反応時間が、ＥＭＰより優れているため、ＭＣＰが、質量／荷電分解力の増強のために好ましい電子放出性検出器である。しかしながら、ＥＭＰは、速い反応時間と広い周波数バンド幅が必要ではない、消費動態エネルギーのイオン集団の検出に十分機能する。
【０１７７】
好ましい局面において、消化されたタンパク質の分析のために、液体−クロマトグラフィータンデム質量分析計(ＬＣ−ＴＭＳ)を使用する。本システムは、タンデム質量分析法後の液体クロマトグラフィーの使用により、サンプル分解の付加的段階を提供する。
【０１７８】
好ましい局面において、実施例１に記載のシステムにしたがってカラムから溶出させたタンパク質を、ＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析の両方を使用して分析する。例えば、ＲＰ２から溶出する無傷タンパク質の少量を、ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳを使用したオンライン検出に使用する。本タンパク質を、トリプシン消化をさせるかまたはさせない多くのプレート、ＭＡＬＤＩ−ＭＳならびにＥＳＩ−ＭＳのための調製、異なるマトリックスでのＭＡＬＤＩプレートの調製のために等分する。本方法はしたがって、無傷の質量の情報に加えて、ペプチド質量フィンガープリント法およびＭＳ−ＭＳ技術の両方により分析の実施を可能にする。
【０１７９】
本明細書に記載されているタンパク質の分離および断片化の方法は、別個のタンパク質の少量を含む個々のタンパク質または断片を提供する。これらのタンパク質は、それらの断片化により得られたタンパク質およびペプチドの分子の質量分析測定により同定できる。タンパク質配列データベースにおいて利用可能な情報の使用により、コンピューター内で産生したタンパク質分解によるペプチド質量パターンと、実験により観察されたペプチド質量の間の比較ができる。“ヒット−リスト”をコンパイルし、データベース中の候補タンパク質を、(他の基準の中でとりわけ)理論的および実験的タンパク質分解断片のマッチの数に基づいて順位付けする。ペプチドマッピングおよび配列データベース検索方法に基づいた、タンパク質同定のためのソフトウエアをオンラインで提供しているいくつかのウェブ・サイトにアクセス可能である(例えば、http://www.expasy.ch)。ＭＳを使用したペプチドマッピングおよび配列決定の方法は、ＷＯ９５／２５２８１９、米国特許５,５３８,８９７、米国特許５,８６９,２４０、米国特許５,５７２,２５９および米国特許５,６９６,３７６に記載されている。Yates, J. Mass Spec., 33:1 (1998)もまた参照のこと。
【０１８０】
質量分析計から集められたデータは、典型的に、各検出結果に関する強度および質量対荷電比を提供する。スペクトルデータは、例えば、グラフに、数字に、または、電子形態を含む適当な全ての形に、デジタルまたはアナログ形のいずれかで記録できる。スペクトルは、好ましくは、例えば、フロッピーディスク、テープまたはハードディスクのような磁気の；ＣＤ−ＲＯＭまたはレーザーディスクのような光学の；またはＲＯＭ−ＣＨＩＰＳを含む貯蔵媒体に記録する。
【０１８１】
あるサンプルのマススペクトルは、典型的にタンパク質強度、質量対荷電比、および分子量の情報を提供する。本発明の好ましい態様において、サンプル中のタンパク質の分子量を、データベースのクエリーのためのマッチング基準として使用する。本分子量は、簡便には、例えば、一価荷電プロトン化分子イオンに関してはイオン化部分の質量を引くことにより、多価荷電イオンに関しては測定した質量／荷電比に荷電の数を乗してイオン化プロトンの数を引くことにより計算する。
【０１８２】
種々のデータベースが本発明において有用である。有用なデータベースは、ゲノム配列、発現遺伝子配列、および／または発現タンパク質配列を含むデータベースを含む。好ましいデータベースは、既知の生物、臓器、組織または細胞型に存在するタンパク質のヌクレオチド配列由来分子量を含む。オープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)を同定し、かつ、タンパク質配列および分子量情報を多くのヌクレオチド配列に変換する多くの計算法が存在する。ＳｗｉｓｓＰＲＯＴ／ＴｒＥＭＢＬデータベース(http://www.expasy.ch)を含む、いくつかの公的にアクセスできるデータベースが利用可能である。
【０１８３】
典型的に、質量分析計は、一定閾値レベル以上のピークを同定し、質量、荷電および検出イオンの強度を計算する、市販のソフトウエアを備える。分子量とある拍出量ピークの相関は、直接スペクトルデータから、すなわち、イオン上の荷電が１つであり、したがって、分子量が分子値からイオン化プロトンの質量を引いたものと等しいときに、達成できる。しかしながら、タンパク質イオンは、種々のカウンターイオンおよび付加物、例えばＮ、ＣおよびＫ'により複雑になることがある。このような場合、あるタンパク質イオンが、三重のような複数ピークを示すことが予測され、同じタンパク質の異なるイオン状態(または種)を示す。故に、同じタンパク質から発生するピークのファミリーを決定するためにスペクトルデータを分析し、処理する必要があり得る。この分析は簡便には、例えば、Mann et al., anal. Chem., 61:1702-1708 (1989)に記載のように行うことができる。
【０１８４】
質量分析計から計算した分子質量と、ゲノムまたは発現遺伝子データベースのようなデータベースから予測される分子の一致において、翻訳後プロセシングが行われていてよい。タンパク質分解プロセシング、Ｎ−末端メチオニンの除去、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化などを含む、タンパク質構造を修飾する、種々のプロセシング事象が存在する。
【０１８５】
データベースで、未知の分子質量とマッチングするタンパク質の範囲に関してクエリーを実施できる。範囲枠は装置の精度、サンプルを調製した方法などに依存して決定できる。スペクトル中のヒットの数(ヒットがマッチであるとき)に基づいて、未知のタンパク質またはペプチドを同定または分類できる。
【０１８６】
１個またはそれ以上のＣＰＰを質量分析法により同定する方法は、心臓血管障害の診断および予後に有用である。好ましくは、このような方法は、ヒト血漿に存在する１個またはそれ以上のＣＰＰの検出のために使用する。技術の例は、米国特許出願０２／００６０２９０、０２／０１３７１０６、０２／０１３８２０８、０２／０１４２３４３、０２／０１５５５０９に記載され、それらの記載は出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【０１８７】
診断的および予後的使用
本明細書に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質相同物および抗体を、１個またはそれ以上の以下の方法に使用できる：本明細書にさらに詳述するような診断的アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリング、スクリーニングアッセイ、および薬理遺伝学。
【０１８８】
本発明は、さらに詳述するような、ＣＰＰ核酸およびタンパク質の検出のための、診断的および予後アッセイを提供する。また提供するのは、ＣＰＰとＣＰＰ標的分子、特に天然アゴニストおよびアンタゴニストの間の相互作用を検出するための診断的および予後アッセイである。
【０１８９】
本発明は、２種またはそれ以上のサンプルで異なって発現させるポリペプチドの同定法を提供する。“異なって発現”なる用語は、サンプル間のポリペプチドの量または質における差異を意味する。このような差異は、転写から翻訳後修飾までのタンパク質発現の全ての段階において起こることがある。例えば、タンパク質アレイ法を使用して、２つのサンプルを、吸着剤(例えば、チップ)の異なるセット上の親和性スポットに結合させ、認識マップを比較して、２セットの吸着剤により異なって保持されるポリペプチドを同定する。異なる保持は、ポリペプチドの保持量および質的差異を含む。例えば、タンパク質の翻訳後修飾の差異は、結合特性の差異として検出可能な認識マップにおける差異(例えば、グリコシル化タンパク質はレクチン吸着剤に異なって結合する)または質量における差異(例えば、翻訳後開裂産物)における差異をもたらすことができる。ある態様において、吸着剤は、疾患または症候群の診断的なマーカーの組み合わせに関して選択した親和性スポットのアレイを有してよい。
【０１９０】
サンプル間のポリペプチドレベルの差異(例えば、血漿サンプルにおいて異なって発現されるＣＰＰ)は、サンプルを、脱着分光測定法((例えば、質量分析法)による分析のための種々の条件下に暴露することにより同定できる。未知のタンパク質を物理化学的特性(例えば、分子質量)の検出により同定でき、この情報を類似の特性を有するタンパク質のためのデータベースの検索に使用できる。
【０１９１】
ＣＰＰの検出のための好ましい方法は、質量分析法技術を使用する。このような方法は、サンプル、例えば、診断または予後のために提供された生物学的サンプルに存在する特定のＣＰＰイソ型のサイズおよび特徴に関する情報を提供する。質量分析法技術は、“質量分析法によるＣＰＰの検出”なる標題の章に詳述する。実施例１は、生物学的サンプルを、質量分析法による特徴付け前にクロマトグラフィーで分離する、好ましい検出スキームを概説する。本発明は、生物学的サンプル(例えば、血漿、血清、リンパ、脳脊髄液、特定組織の細胞融解物)を、少なくとも１つのクロマトグラフ的段階により分画し；フラクションを質量分析法に付し；そして、質量分析法で観察されたポリペプチド種の特徴を、ＣＰＰポリペプチドの既知の特徴(例えば、図１に記載のようなＣＰＰ６−７)と比較する、段階を含む、生物学的サンプルにおけるＣＰＰの検出法を提供する。
【０１９２】
本発明の単離核酸分子は、例えば、下記に詳述するような、ＣＰＰ  ｍＲＮＡ(例えば、生物学的サンプル中)またはＣＰＰ−コード遺伝子における変化の検出に、および、ＣＰＰ活性の調節に使用できる。本ＣＰＰは、ＣＰＰの不十分な産生により、または、ＣＰＰ標的分子の過剰は産生により特徴付けられる疾患の処置に使用できる。加えて、本ＣＰＰは、天然に存在するＣＰＰ標的分子のスクリーニング、ＣＰＰ活性を調節する、好ましくは活性化する薬剤または化合物のスクリーニングに、ならびに、ＣＰＰの不十分な産生もしくは野生型ＣＰＰと比較して減少した異常な活性を有するＣＰＰ形の産生により特徴付けられる疾患の処置に使用できる。さらに、本発明の抗ＣＰＰ抗体はＣＰＰを検出および単離し、ＣＰＰのバイオアベイラビリティーを調節し、そしてＣＰＰ活性を調節するために使用できる。
【０１９３】
したがって、本発明の１つの態様は、本発明の分子(例えば、ＣＰＰ、ＣＰＰ核酸またはＣＰＰ阻害剤またはアクティベーター)を、上記のＣＰＰ活性のいずれかが関与する、疾患の診断、予後および／または処置に使用するものである、使用法(例えば、診断的アッセイ、予後アッセイまたは治療の予防的／治療的方法)に関する。他の態様において、本発明は、本発明の分子を、前記の活性のいずれかが病的に乱れている対象、好ましくはヒト対象の、例えば、診断、予後および／または処置に使用するものである、使用法(例えば、診断的アッセイ、予後アッセイまたは治療の予防的／治療的方法)に関する。好ましい態様において、使用法は、対象、好ましくはヒト対象に、本発明の分子を、診断、予後、および／または治療的処置のために投与する。他の態様において、使用法は、ヒト対象に本発明の分子を投与することに関する。
【０１９４】
例えば、本発明は、ＣＰＰが生物学的サンプル内で発現されているか否かを検出する方法であり：ａ)該生物学的サンプルと：ｉ)ストリンジェントな条件下でＣＰＰ核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチド；またはii)ＣＰＰに選択的に結合する検出可能ポリペプチド(例えば抗体)を接触させ；そしてｂ)該サンプル中のポリヌクレオチドとＲＮＡ種の間のハイブリダイゼーションの存在または不存在を検出するか、または、該検出可能ポリペプチドの該サンプル内のポリペプチドへの結合の存在または不存在を検出することを含む方法を包含する。該ハイブリダイゼーションまたは該結合の検出は、該ＣＰＰが該サンプル内で発現させることを示唆する。好ましくは、本ポリヌクレオチドはプライマーであり、該ハイブリダイゼーションを、該プライマー配列と比較した増幅産物の存在により検出するか、または検出可能ポリペプチドは抗体である。
【０１９５】
ある態様において、検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば、米国特許４,６８３,１９５および４,６８３,２０２を参照、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)、あるいは、ライゲーション連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080; およびNakazawa et al. (1994)PNAS 91:360-364参照、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)におけるプローブ／プライマーの使用に関し、後者は、ＣＰＰ−コード遺伝子における点変異の検出に特に有用であることがある(Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682参照、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)。
【０１９６】
また意図されるのは、哺乳類、好ましくはヒトが上昇したまたは減少したＣＰＰの発現レベルを有するか否かの決定法であり：ａ)該哺乳類から生物学的サンプルを提供し；そしてｂ)該生物学的サンプル中の、ＣＰＰの量またはＣＰＰをコードするＣＰＰ  ＲＮＡ種の量を、コントロールサンプルで発現されたまたは予測されるレベルと比較することを含む方法である。該コントロールサンプルにおいて検出されたまたは予測されるレベルと比較して、該生物学的サンプルで増加した該ＣＰＰまたは該ＣＰＰ  ＲＮＡ種の量は、該哺乳類のＣＰＰ発現のレベルが上昇していることを示唆し、該コントロールサンプルにおいて検出されたまたは予測されるレベルと比較して、該生物学的サンプルで低下した該ＣＰＰまたは該ＣＰＰ  ＲＮＡ種の量は、該哺乳類のＣＰＰ発現のレベルが減少していることを示唆する。
【０１９７】
本発明はまた診断的アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験のモニタリングが、それにより個体を予防的に処置するための予後目的で使用される、予測医学の分野にも関する。したがって、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル(例えば、血液、血漿、細胞、組織)との関連で、ＣＰＰおよび／または核酸発現ならびにＣＰＰ活性を決定し、それにより、個体が異常なＣＰＰ発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか、疾患を発症するリスクにあるか否かを決定する診断アッセイに関する。本発明はまた個体がＣＰＰ、核酸発現または活性と関連する疾患を発症するリスクにあるか否かを決定するための、予後(または予測的)アッセイを提供する。例えば、ＣＰＰ−コード遺伝子における変異を生物学的サンプルでアッセイできる。このようなアッセイは、予後または予測的目的で使用でき、それにより、ＣＰＰ発現または活性により特徴付けられるまたは関連する疾患の発症前に個体を予防的に処置する。
【０１９８】
“生物学的サンプル”なる用語は、個体から単離された組織、細胞および体液ならびに個体内に存在する組織、細胞および体液を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出法は、インビトロおよびインビボの生物学的サンプル中のＣＰＰ  ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡの検出に使用できる。好ましい生物学的サンプルは、体液、例えばリンパ、脳脊髄液、血液、およびとりわけ血漿である。例えば、ＣＰＰ  ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザン・ハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを含む。ＣＰＰの検出のためのインビトロ法は、質量分析法、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロット、免疫沈降および免疫蛍光検査法を含む。ＣＰＰ−コードゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザン・ハイブリダイゼーションを含む。そのうえ、ＣＰＰの検出のためのインビボ技術は、個体に標識抗ＣＰＰ抗体を導入することを含む。
【０１９９】
好ましい態様において、主題の方法は、個体(例えばヒト患者)の組織サンプルにおいて、(ｉ)主題のＣＰＰの１つをコードする遺伝子の変異、または(ii)ＣＰＰ−コード遺伝子の不適当な発現(mis-expression)の少なくとも１つにより特徴付けられる遺伝子病変の存在または不存在を検出することを含むことにより、一般に特徴付けられる。説明のために、このような遺伝子病変は、(ｉ)ＣＰＰ−コード遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、(ii)本遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加、(iii)本遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)本遺伝子の全体的染色体再配列または増幅、(ｖ)本遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物レベルの全体的変化、(vi)本遺伝子の異常な修飾、例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン、(vii)本遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、および(viii)ＣＰＰ−コード転写物の発現の制御エレメントにおける病変または限定性の減少を示唆する減少したレベルの少なくとも１つの存在の確認により検出できる。
【０２００】
さらに別の例示的態様において、ＣＰＰ核酸の異常なメチル化パターンは、患者サンプル由来のゲノムＤＮＡを、メチル化に感受性であり、その認識部位がＣＰＰ−コード遺伝子内(フランキング配列およびイントロンの配列内を含む)に存在する、１個またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化することにより検出できる。例えば、Buiting et al. (1994) Human Mol Genet 3:893-895参照。消化したＤＮＡをゲル電気泳動により分離し、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列由来のプローブとハイブリダイズする。本ＣＰＰ−コード遺伝子のメチル化状態は、サンプルＤＮＡで産生された制限パターンと既知のメチル化の標準を比較することにより決定できる。
【０２０１】
さらに別の態様において、ＣＰＰが細胞表面または細胞外タンパク質と結合する能力を検出する、診断的アッセイを提供する。例えば、それは、細胞中で検出可能なレベルで発現されている間はＣＰＰ標的タンパク質(標的に対して減少したまたは増加したいずれかの結合親和性を有する)の結合が欠失している、ＣＰＰ変異体の検出の望ましいであろう。このような変異体は、上記の診断的ＤＮＡ配列決定技術または免疫アッセイにより検出するために実際的でなくてもよい、例えば、変異、例えば、点変異体から産生できる。本発明は、したがって、サンプル組織由来の１個またはそれ以上のＣＰＰ−コード遺伝子をクローニングし、そして、クローン化遺伝子を組み換え遺伝子産物と標的タンパク質の間の相互作用の検出が可能な条件下で発現させることを一般的に含む、診断的スクリーニングアッセイを意図する。本明細書の、“薬剤スクリーニングアッセイ”の章の下に記載した種々のアッセイの記載から、他の分子に結合するＣＰＰの能力の決定に、広範囲の方法が使用できることは明らかであろう。これらの技術は、野生型ＣＰＰと比較してＣＰＰ標的タンパク質に対する高いまたは低い結合親和性を有するタンパク質の変異体を発生させる、ＣＰＰ−コード遺伝子の変異の検出に使用できる。逆に、ＣＰＰ標的タンパク質およびＣＰＰが“餌”であるものと、患者サンプル由来であるものを交換することにより、主題のアッセイはまたＣＰＰ標的タンパク質の野生型形と比較して、ＣＰＰに対して高いまたは低い結合親和性を有するＣＰＰ標的タンパク質変異体の検出に使用できる。
【０２０２】
態様の例において、標的タンパク質は、本明細書に記載のようなＧＳＴ融合タンパク質およびグルタチオン処理マイクロタイタープレートの使用によるような、固定化タンパク質(“標的”)として提供できる。
【０２０３】
他の態様において、本方法はさらにコントロール対象からコントロール生物学的サンプルを得て、本コントロールサンプルをＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出ができる化合物または薬剤と、ＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が生物学的サンプルで検出できるように接触させ、コントロールサンプルにおけるＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、試験サンプルにおけるＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を比較することを含む。本発明はまた生物学的サンプルにおけるＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、本キットは：生物学的サンプル中のＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる標識化合物または薬剤；本サンプル中のＣＰＰの量を検出するための手段；およびサンプル中のＣＰＰの量と標準を比較する手段を含んでいてよい。本化合物または薬剤を適当な容器中に包装できる。キットはさらにＣＰＰまたは核酸を検出するためのキットの使用指示書を含んでよい。
【０２０４】
薬剤スクリーニングアッセイ
本発明は、ＣＰＰに結合する、例えば、ＣＰＰ発現または好ましくはＣＰＰ生物学的活性に阻害または活性化効果を有する、または、例えば、ＣＰＰ標的分子の活性に阻害または活性化効果を有する、候補モジュレーター(例えば、小分子、ペプチド、抗体、ペプチド模倣物または他の薬剤)を同定するための方法(本明細書では“スクリーニングアッセイ”とも呼ぶ)を提供する。ある態様において小分子は、組み合わせ化学反応を使用して産生でき、または、天然産物ライブラリーから得ることができる。アッセイは細胞ベースのまたは非細胞ベースのアッセイであってよい。薬剤スクリーニングアッセイは結合アッセイであってよく、または、より好ましくは、さらに詳述するような機能アッセイであってよい。
【０２０５】
本発明を、例えば、ＣＰＰポリペプチドまたは候補モジュレーターが抗心臓血管障害応答を誘発する能力を決定するための、薬剤開発に使用するとき、少なくとも１つのＣＰＰのレベルを分析するための体液は、好ましくは非ヒト哺乳類由来である。本非ヒト哺乳類は、好ましくは、内因性および／または外因性動因による、抗心臓血管障害応答の誘導が、人におけるこのような応答の予測となるものである。齧歯類(マウス、ラットなど)および霊長類が、本発明のこの局面における使用に特に適している。
【０２０６】
本明細書にさらに詳述するようなスクリーニングアッセイを使用して、ＣＰＰ活性を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％まで調節することが判明した薬剤を、予防的および／または治療的抗心臓血管疾患剤としてさらなる試験に選択し得る。
【０２０７】
ＣＰＰ活性を上昇させることが判明した薬剤は、例えば、心臓血管障害の症状を減少させるために、単独で、または適当な薬剤または療法と組み合わせて使用できる。ＣＰＰ活性を阻害することが判明した薬剤は、例えば、心臓血管障害の処置レジメンの調節に使用できる。
【０２０８】
他の局面において、本明細書にさらに詳述するようなスクリーニングアッセイにおいて、ＣＰＰ発現を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％まで調節することが判明した薬剤は、予防的および／または治療的抗心臓血管疾患剤としてさらなる試験に選択し得る。
【０２０９】
タンパク質アレイ法は、スクリーニングおよび薬剤開発に有用である。例えば、受容体／リガンド対の１つのメンバーを吸着剤にドッキング(docked)させ、結合パートナーに結合するその能力を、試験物質の存在下で結合させる。吸着を試験できるその速さのために、試験物質の組み合わせライブラリーを、本相互作用を調節するそれらの能力に関して容易にスクリーニングできる。好ましいスクリーニング法において、ＣＰＰを吸着剤にドッキングさせる。結合パートナーを好ましくは標識し、故に相互作用の検出を可能にする。
【０２１０】
別法として、ある態様において、試験物質を吸着剤にドッキングさせる。本発明のポリペプチドを試験物質に暴露し、結合に関してスクリーニングする。好ましい試験物質は、疾患(好ましくは、心臓血管疾患)において特異に存在するタンパク質、脂質または内分泌因子のような疾患または障害と関連する物質を含む。
【０２１１】
他の態様において、アッセイは、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物がＣＰＰ活性を阻害する、活性化するまたは上昇させる能力を決定する、細胞ベースのアッセイである。試験化合物がＣＰＰ活性を阻害し、活性化し、または増加させる能力の決定は、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分の生物活性のモニタリングにより達成される。本細胞は、例えば、哺乳類起源、昆虫起源、細菌起源または酵母細胞であってよい。
【０２１２】
１つの態様において、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分の標的分子である、候補または試験化合物のスクリーニングのためのアッセイ法を提供する。他の態様において、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分に結合するかまたは活性を調節する、候補または試験化合物のスクリーニングのためのアッセイ法を提供する。本発明の試験化合物は：生物学的ライブラリー；空間的アドレス可能平衡固相または溶液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；‘１ビーズ１化合物(one-bead one-compound)’ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法を含む、当分野で既知の組み合わせライブラリー法における多数の研究のいずれかを使用して得ることができる。本生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーと共に使用するが、他の４種のアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用できる(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)。
【０２１３】
分子ライブラリーの合成法は文献に、例えば：DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 and 2061; およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見ることができ、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【０２１４】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、またはビーズ上(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner 米国特許５,２２３,４０９)、胞子(Ladner 米国特許'４０９)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)またはファージ上(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 前掲.)に存在できる。
【０２１５】
試験化合物がＣＰＰ活性を阻害しまたは増加する能力の決定は、例えば、標識基を有する本ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分のその同族標的分子への結合が、複合体中の標識ＣＰＰまたはその生物学的活性部分の検出により決定できるように、結合させることにより達成できる。例えば、複合体形成の程度を、複合体の免疫沈降によりまたはゲル電気泳動を行うことにより測定できる。
【０２１６】
相互作用する反応体の全てに標識することなく、化合物がその同族標的分子と相互作用する能力を決定することも本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)を使用して、本化合物または本標的分子のいずれも標識することなく、化合物と同族標的分子の相互作用を検出できる。McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる。サイトセンサーのようなマイクロフィジオメーターは、細胞がその環境を酸性化する割合を、光−アドレス可能電位差センサー(ＬＡＰＳ)を使用して測定する、分析装置である。この酸性化の割合の変化を、化合物と受容体の間の相互作用の指標として使用できる。
【０２１７】
好ましい態様において、本アッセイは：ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を発現する細胞と標的分子を接触させてアッセイ混合物を形成し、本アッセイ混合物と試験化合物を接触させ、試験化合物がＣＰＰまたはその生物学的活性部分の活性を阻害するまたは増加する能力を決定することを含む。本試験化合物がＣＰＰまたはその生物学的活性部分の活性を阻害するまたは増加する能力の決定は：試験化合物がＣＰＰ発現細胞の生物学的活性を阻害するまたは増加させる能力(例えば、上記のようなＣＰＰ標的分子との相互作用)の決定を含む。
【０２１８】
他の好ましい態様において、本アッセイは、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分に反応性の細胞と、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を接触させ、アッセイ混合物を形成し、本アッセイ混合物と試験化合物を接触させ、試験化合物がＣＰＰまたはその生物学的活性部分の活性を調節する能力を決定することを含む。試験化合物がＣＰＰまたはその生物学的活性部分の活性を調節する能力の決定は、試験化合物がＣＰＰ反応性細胞の生物学的活性を調節する能力の決定を含む。
【０２１９】
他の態様において、アッセイは、ＣＰＰ標的分子(すなわちそれとＣＰＰが相互作用する分子)を発現する細胞と、試験化合物を接触させ、試験化合物がＣＰＰ標的分子の活性を調節(例えば刺激または阻害)する能力を決定することを含む、細胞ベースのアッセイである。試験化合物がＣＰＰ標的分子の活性を調節する能力の決定は、例えば、標的分子の活性の評価により、またはＣＰＰがＣＰＰ標的分子に結合するまたはそれと相互作用する能力を評価することにより達成できる。
【０２２０】
ＣＰＰがＣＰＰ標的分子に結合するまたはそれと相互作用する能力は、例えば、結合を直接的または間接的に決定するための上記の方法の一つにより達成できる。好ましい態様において、本アッセイは、本ＣＰＰまたはその生物学的活性部分と、ＣＰＰと結合する既知化合物(例えば、ＣＰＰ抗体または標的分子)を接触させ、アッセイ混合物を形成し、本ＣＰＰと試験化合物を、該化合物の前にまたは後に接触させて、試験化合物がＣＰＰと相互作用する能力を決定することを含む。試験化合物がＣＰＰと相互作用する能力は、試験化合物が、既知化合物と比較して優勢にＣＰＰまたはその生物学的活性部分に結合する能力を決定することを含む。本ＣＰＰがＣＰＰ標的分子と結合する能力の決定はまたリアルタイム生体分子相互作用分析(ＢＩＡ)のような技術を使用して達成できる。Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。本明細書で使用する“ＢＩＡ”は、相互作用する反応対のいずれにも標識せずに、実時間で生物特異的相互作用を研究する技術である(例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ)。表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)の光学的現象の変化を、生物学的分子間の実時間反応の指標として使用できる。
【０２２１】
他の態様において、本アッセイは、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、本試験化合物が本ＣＰＰまたはその生物学的活性部分の活性を調節(例えば、刺激または阻害)する能力を決定する、無細胞アッセイである。好ましい態様において、本ＣＰＰがＣＰＰ標的分子と相互作用するまたは調節する能力の決定は、標的分子の活性の決定により達成することができる。例えば、本標的分子の活性を、本標的分子とＣＰＰまたはそのフラグメントと接触させ、標的の細胞性二次メッセンジャー(例えば、ｃＡＭＰ、ＳＴＡＴ３、Ａｋｔ、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など)の誘導を測定し、適当な基質に関する本標的の触媒的／酵素的活性を検出するか、レポーター遺伝子(検出可能マーカー、例えば、ルシフェラーゼに操作可能に結合した標的−反応性制御エレメントを含む)の誘導を検出するか、または標的−制御細胞性応答、例えば、シグナル伝達またはタンパク質：タンパク質相互作用を検出することにより決定できる。
【０２２２】
本発明の無細胞アッセイは、単離タンパク質(例えばＣＰＰまたはその生物学的活性部分または、ＣＰＰ標的が結合する分子)の可溶性形および／または膜結合形の両方の使用にしたがう。単離タンパク質の膜結合形を使用する無細胞アッセイの場合、単離タンパク質の膜結合形が溶液中に維持されるように、可溶化剤を使用することが望ましいことがある。このような可溶化剤の例は、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＭ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＭ  Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ  ＴＭ、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ,３−［(３−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、３−［(３−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)またはＮ−ドデシル＝Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アモニオ−１−プロパンスルホネートのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０２２３】
上記アッセイ法の１個以上の態様において、一方または両方のタンパク質の非結合形からの分離を容易にするため、およびアッセイの自動化に適用させるために、ＣＰＰまたはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましいことがある。候補化合物の存在下および非存在下での、試験化合物のＣＰＰへの結合、またはＣＰＰと標的分子の相互作用は、反応体を含有するのに適した全ての容器中で、かつ、本明細書に記載の全ての固定化プロトコールにより達成できる。あるいは、本複合体マトリックスから解離し、ＣＰＰ結合または活性のレベルを、標準技術を使用して決定できる。
【０２２４】
タンパク質をマトリックス上に固定化する他の技術はまた本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用できる。例えば、ＣＰＰまたはＣＰＰ標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して、固定化できる。ビオチン化ＣＰＰまたは標的分子を、ビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド)から当分野で既知の技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を使用して調製でき、ストレプトアビジン−被覆９６ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定化する。あるいは、ＣＰＰまたは標的分子と反応性であるが、ＣＰＰのその標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化でき、非結合標的またはＣＰＰが、抗体結合によりウェル内に捕獲される。このような複合体を検出する能力は、上記でＧＳＴ−固定化複合体に関して記載したものに加えて、ＣＰＰまたは標的分子と反応性の抗体を使用した複合体の免疫検出、ならびに、ＣＰＰまたは標的分子と関連する酵素的活性の検出に頼った酵素−結合アッセイを含む。
【０２２５】
他の態様において、ＣＰＰ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物接触させ、細胞中のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する、方法において同定する。候補化合物存在下のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、候補化合物非存在下のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較する。本候補化合物を次いでこの比較に基づいて、ＣＰＰ発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、候補化合物の存在下でＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその非存在下より大きい(統計的に有意に大きい)とき、本候補化合物はＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤として同定される。あるいは、候補化合物の存在下でＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその非存在下より小さい(統計的に有意に小さい)とき、本候補化合物は、ＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。細胞中のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、本明細書でＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して記載の方法により決定できる。
【０２２６】
本発明のさらに別の局面において、本ＣＰＰを２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて、“餌タンパク質”として使用でき(例えば、米国特許５,２８３,３１７；Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; およびBrent ＷＯ９４／１０３００参照、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)、ＣＰＰに結合するまたはそれと相誤作用し(“ＣＰＰ−結合タンパク質”または“ＣＰＰ−ｂｐ”)、ＣＰＰ活性に関与する他のタンパク質を同定する。このようなＣＰＰ−結合タンパク質はまた、例えば、ＣＰＰ−介在シグナル伝達経路の下流エレメントとして、ＣＰＰまたはＣＰＰ標的によるシグナルの伝達に関与しているようである。あるいは、このようなＣＰＰ−結合タンパク質はＣＰＰ阻害剤であるようである。
【０２２７】
本２−ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ−結合および活性化ドメインから成る、ほとんどの転写因子のモジュラー性質に基づく。簡単に言うと、本アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物において、ＣＰＰまたはそのフラグメントをコードする遺伝子を、既知転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。他方の構築物において、未確認タンパク質(“餌食”または“サンプル”)をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列を、本既知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。本“餌”および本“餌食”タンパク質が相互作用し、インビボで、ＣＰＰ−依存性構築物を形成するとき、本転写因子のＤＮＡ−結合および活性化ドメインを近づけ、接近させる。この接近が、本転写因子に応答する転写制御部位に操作可能に結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。本レポーター遺伝子の発現を検出でき、本機能的転写因子を含む細胞コロニーを、ＣＰＰと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために単離し、使用できる。
【０２２８】
本発明はさらに上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤、および、このような薬剤をこれらのアッセイの使用により産生する方法に関する。したがって、１つの態様において、本発明は上記のスクリーニングアッセイ(例えば、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイ)のいずれか一つの段階を含む方法により得ることができる、化合物または薬剤に関する。
【０２２９】
したがって、適当な動物モデルにおける、本明細書に記載のように同定された薬剤のさらなる使用も本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された薬剤(例えば、ＣＰＰ調節剤、またはＣＰＰ−結合パートナー)を動物モデルで使用し、このような薬剤での処置の効果、毒性、または副作用の決定に使用できる。あるいは、本明細書に記載のように同定された薬剤を動物モデルにおいて使用し、このような薬剤の作用機構を決定できる。そのうえ、本発明は、本明細書に記載のような処置のための、上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤の使用に関する。好ましくは、このような薬剤はＣＰＰ生物学的活性を活性化しまたは増強する。
【０２３０】
本発明はまた本明細書に記載のような診断、予後、予防および処置のための、上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤の使用に関する。したがって、このような薬剤を、本明細書に記載のような診断、予後または処置に使用するための薬剤または医薬組成物の設計、製剤、合成、製造および／または製品において使用することも本発明の範囲内である。例えば、１つの態様において、本発明は、上記スクリーニングアッセイの一つにより得ることができる化合物の構造および／または特性を参照した、薬剤または医薬組成物の合成または製造の方法を含む。例えば、薬剤または医薬組成物を、ＣＰＰ標的分子を発現する細胞と試験化合物を接触させ、本試験化合物が本ＣＰＰ標的分子と結合するまたは活性を調節する能力を決定する、方法により得られた化合物の構造および／または特性に基づいて合成できる。他の例示的態様において、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、本試験化合物がＣＰＰまたはその生物学的活性部分と結合する、または活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)能力を決定する方法により得られた化合物の構造および／または特性に基づいて合成する方法を含む。
【０２３１】
動物ベースの薬剤スクリーニング
薬剤スクリーニングアッセイをインビボで行うことがまた有利である。インビボスクリーニングアッセイを、心臓血管疾患において役割を演じ得る有効なＣＰＰモジュレーターを発見するために、非ヒト動物で行う。心臓血管疾患の動物−ベースのモデル系は、非組み換え動物およびトランスジェニック動物を含むが、これらに限定されない。
【０２３２】
心臓血管疾患のための非組み換え動物モデルは、例えば、遺伝モデルを含む。このような遺伝心臓血管疾患モデルは、ａｐｏＢまたはａｐｏＲ欠損ブタ(Rapacz, et al., 1986, Science 234:1573-1577)およびWatanabe遺伝性高脂血症(ＷＨＨＬ)ウサギ(Kita et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:5928-5931)である。アテローム性動脈硬化症の非組み換え、非遺伝動物モデルは、例えば、動物が、例えばＬＤＬの餌添加を介した化学的創傷に、または、バルーンカテーテル血管形成術を介した機械的創傷に曝されている、ブタ、ウサギ、またはラットモデルである。
【０２３３】
先行文献に示されるように(Ferns, G. A. A. et al. (1991)Science, 253:1129-1132)、再狭窄のラット頸動脈傷害モデルは、可能性のある治療作用の指標に有用であり得る。本方法の例は、米国特許６５００８５９に記載され、その記載を出典明示により本明細書に包含させる。簡単に言うと、国立加齢動物取扱および使用協議会(National Institute on Aging Animal Care and use Committee)により承認されたプロトコールを使用し、ＧＲＣコロニー由来の６ヶ月齢Wistarラットを、腹腔内２０mg／体重kgペントバルビタール、２mg／体重kgケタミンおよび４mg／体重kgキシラジン(xylazine)で麻酔する。左外頸動脈を２−Ｆｒｅｎｃｈ  Ｆｏｇａｒｔｙ塞栓摘出カテーテルでカニューレ挿入し、食塩水で膨張させ、総頸動脈を３回上下させて通し、拡張した脱内皮的傷害(deendothelializing injury)を作る。本動物を、適当な用量の試験物質またはビヒクル単独(例えば、一日あたりの体重に基づいて、１：２：２：１６５  ＤＭＳＯ：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：脱水エタノール：リン酸緩衝化食塩水のような適当な溶液)を、傷害２時間後に開始する腹腔内注射により処置した。試験物質またはビヒクル単独を、腹腔内注射として、１日１回、次の４日間投与した。１１日後、本動物(８匹処置および１０匹ビヒクル−処置)を上記のように麻酔し、頸動脈を単離り、１０％緩衝化ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。頸動脈の横断面を顕微鏡スライドにマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色する。本頸動脈の画像をデジタルボードに投影し、内膜と中膜の横断面領域を測定した。新生内膜領域(厚さ)の減少は、本試験物質が有効な抗再狭窄剤であることを示す。
【０２３４】
腸管の管腔からの胆汁酸の再循環の阻害が、因果関係のある血清コレステロールのレベルを減少することが判明した。このような減少が、アテローム性動脈硬化症の疾患状態の改善をもたらすことを示す疫学的データが蓄積されている(Stedronsky, Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255-287 (1994))。コレステリルエステル転移タンパク質(ＣＥＴＰ)が、血漿ＨＤＬ／ＬＤＬ比を有効に修飾することが示されており、ある心臓血管疾患の予後および／または発症をチェックすることが期待される。ＣＥＴＰの阻害が、血漿ＨＤＬコレステロールの上昇と血漿ＬＤＬコレステロールの低下をもたらし、それにより、治療的に有利な血漿脂質プロフィールを提供する(McCarthy, Medicinal Res. Revs., 13, 139-59 (1993))。ラット回腸の１４Ｃ−タウロコレートの胆汁への取り込みを阻害する化合物のインビボアッセイ(ＣＥＴＰ阻害)は、米国特許６４８９３６６およびUne, et al. Biochimica et Biophysica Acta, 833, 196-202 (1985)に記載されて、それらの記載を出典明示により本明細書に包含させる。
【０２３５】
簡単に言うと、雄Wistarラット(２００−３００ｇ)を、イナクチン(１００mg／kg)で麻酔する。胆管を１０インチ長のＰＥ１０管系でカニューレ挿入する。小腸を暴露し、ガーゼパッド上に広げる。カニューレ(１／８”luer lock, tapered female adapter)を、小腸と盲腸の分岐点から１２cmに挿入する。スリットを同分岐点から４cm離して切断する(回腸の８cm長を利用)。温ダルベッコリン酸緩衝化食塩水、ｐＨ６.５(ＰＢＳ)の２０mlを、この腸セグメントの洗い流しに使用する。本遠位開口部を２０cm長のシリコン管系でカニューレ挿入する(０.０２”Ｉ.Ｄ..×.０.０３７”Ｏ.Ｄ.)。本近位カニューレを蠕動ポンプに接続し、この腸を２０分、温ＰＢＳで０.２５ml／分で洗浄する。本腸セグメントの温度を連続的にモニターすべきである。実験の開始時に、２.０mlのコントロールサンプル(０.０５ｍＣｉ／mLの１４Ｃ−タウロコレートと５mM非放射標識タウロコレート)を本腸セグメントに３mlシリンジで充填し、胆汁サンプル回収を開始する。コントロールサンプルサンプルを０.２５ml／分の速度で２１分注入する。胆汁サンプルフラクションを３分毎に、工程の最初の２７分回収する。２１分のサンプル注入後、本回腸ループを、２０mlの温ＰＢＳ(３０mlシリンジを使用して)で洗い流し、次いで、本ループを２１分、温ＰＢＳで０.２５ml／分で洗い流す。２回目の潅流を上記のように、しかし、試験化合物をさらに添加して行い(２１分投与、その後の２１分洗い流し)、胆汁を最初の２７分、３分毎にサンプリングする。必要に応じて、３回目の潅流を上記のように行い、これは典型的にコントロールサンプルを含む。
【０２３６】
加えて、肝臓のコレステロール濃度の測定は、心臓血管障害に対する試験物質の有効性の決定に有用なアッセイである。このアッセイにおいて、肝臓組織を秤量し、クロロホルム：メタノール(２：１)中で均質化する。均質化および遠心後、上清分離し、窒素下で乾燥させる。本残渣をイソプロパノールに溶解し、コレステロール濃度を、Allain, C. A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974)(本明細書に出典明示により包含させる)に記載のようにコレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの組み合わせを使用して、酵素的に測定する。
【０２３７】
同様に、血清コレステロールを下記のように決定できる。総血清コレステロールを、Wako Fine Chemicals(Richmond, Va.)から市販のキット；Cholesterol C11, Catalog No. 276-64909を使用して酵素的に測定する。ＨＤＬコレステロールを、Sigma Chemical Co. HDL Cholesterol Reagent, Catalog No. 352-3(硫酸デキストラン法)でＶＬＤＬおよびＬＤＬを調製した後、同じキットを使用してアッセイできる。総血清トリグリセリド(blanked)(ＴＧＩ)もSigma Chemical Co. GPO-Trinder, Catalog No. 337-Bで酵素的にアッセイする。ＶＬＤＬおよびＬＤＬ(ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ)コレステロール濃度を、総コレステロールとＨＤＬコレステロールの差として計算する。コントロールと比較して、試験物質−処置サンプルで減少したＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールは、抗心臓血管障害剤の有効性の指標である。
【０２３８】
例えば、米国特許６４８９３６６に記載のような、脂質低下剤を評価するためのイヌモデルも利用できる。
【０２３９】
簡単に言うと、Marshall farmsのような小売店から購入した、６−１２kgの体重の雄ビーグル犬を、１日１回、２時間餌を与え、水は自由に与える。イヌを、無作為に各６から１２匹のイヌから成る：ビヒクル、ｉ.ｇ.；１mg／kg、ｉ.ｇ.；２mg／kg、ｉ.ｇ.；４mg／kg、ｉ.ｇ.；２mg／kg、ｐ.ｏ.(カプセル中の粉末)のような、投与グループに振り分ける。水性溶液(例えば、０.２％Ｔｗｅｅｎ  ８０溶液［ポリオキシエチレンモノオレエート、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.])に溶解した治療物質の胃内投与を、胃管栄養管を使用して投与できる。投与開始前に、血液サンプルを、血清コレステロール(総およびＨＤＬ)およびトリグリセリドを評価するために餌を与える前の朝に橈側皮静脈から採血してよい。その後数日間、動物に朝に餌の前に投与する。動物に２時間餌を食べさせ、その後残った餌を除去すべきである。糞を、試験の終わりの２日間にわたり回収し、胆汁酸または脂質含量を分析してよい。血液サンプルもまた、試験前血清脂質レベルとの比較のために、処置期間の最後に採る。統計的有意は、標準スチューデントのＴ検定を使用して、ｐ＜０.０５と決定する。
【０２４０】
血清脂質測定を同様に測定する。血液を、絶食させたイヌの橈側皮静脈から、血清分離管に採血する(Vacutainer SST, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, N.J.)。本血液を２０００rpmで２０分遠心し、血清を傾捨する。総コレステロールを、９６ウェル形で、Ｗａｋｏ酵素診断キット(Cholesterol CII)(Wako Chemicals, Richmond, Va.)を使用して、コレステロールオキシダーゼ反応を利用して、過酸化水素を産生させ、それを比色分析で測定することにより測定する。０.５から１０μｇコレステロールをプレートの最初の２カラムに調製する。本血清サンプル(２０−４０μｌ、予測される脂質濃度に依存する)または既知血清コントロールサンプルを、別のウェルにデュプリケートで添加する。水を添加して、各ウェルの容量を１００μｌとする。着色試薬の１００μｌアリコートを各ウェルに添加し、プレートを１５分、３７℃でインキュベートした後５００nmで読む。
【０２４１】
ＨＤＬコレステロールを、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に沈殿させるために硫酸デキストランおよびＭｇイオンを使用する、Sigma kit No. 352-3(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)を使用してアッセイし得る。１５０μｌの各血清サンプル、続いて１５μｌのＨＤＬコレステロール試薬(Sigma 352-3)を個々の微量遠心管に添加する。サンプルを混合し、５０００rpmで５分遠心する。本上清の５０μｌアリコートを、次いで、２００μｌの食塩水と混合し、総コレステロール測定と同じ方法を使用してアッセイする。
【０２４２】
トリグリセリドを、９６ウェルプレート形のSigma kit No. 337を使用して測定する。この方法は、グリセロールを、トリグリセリドとリポタンパク質リパーゼの反応によるその遊離後に測定する。１から２４μｇの範囲のグリセロール(Sigma 339-11)の標準溶液を、標準曲線の作成のために使用する。血清サンプル(２０−４０μｌ、予測される脂質濃度に依存する)をウェルにデュプリケートで添加する。水を添加して各ウェルの容量を１００μｌとし、１００μｌの着色試薬もまた各ウェルに添加する。混合し、１５分インキュベーションした後、プレートを５４０nmで読み、トリグリセリド値を標準曲線から計算する。複製プレートもまたブランク酵素試薬を使用して行い、血清サンプル中の全ての内因性グリセロールに関して補正する。
【０２４３】
試験化合物の血清グルコースおよび血清インシュリンにおける効果を、ｄｂ／ｄｂマウス(C578BL/KsJ-db/db Jcl)で、その記載を出典明示により本明細書に包含させるＵＳ６４６２０４６に記載のように、評価できる。本化合物をビヒクル(例えば、蒸留水中２％Ｔｗｅｅｎ  ８０から成る)に溶解し、経口で投与する。投与量は体重により決定する。本試験の動物の実験および処分を含む全ての局面は、一般に、医学生物学領域の動物実験に関する国際原則(International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals)(CIOMS Publication No. ISBN 92 90360194, 1985)にしたがって行う。グルコース−ＨＡアッセイキット(和光、日本)を血清グルコースの測定に使用し、ＥＬＩＳＡマウスインシュリンアッセイキット(SPI bio, France)をインシュリンの測定に使用する。適当な陽性コントロールは、トログリタゾン(Helios Pharmaceutical, Louisville, Ky.)である。
【０２４４】
動物を、各４匹の動物の２０グループに分ける。本動物は、体重５２±５ｇｍｓで、年齢８−１０週齢である。実験中、本動物に、自由に摂取できる実験動物用餌(Fwusow Industry Co., Taiwan)および水を与える。全ての処置の前に、血液サンプル(処置前血液)を各動物から採る。動物の４グループ、ビヒクルグループは、ビヒクルのみを投与される。本ビヒクルグループには、１００、３０、１０または１ml／体重kgのビヒクルを経口的に投与する。トリグリタゾン溶液(ｔｗｅｅｎ  ８０／水中１０ml／体重kg)を、４つの陽性コントロールグループに、各々１００、３０、１０および１ml／体重kgで投与する。本試験化合物を、同様に経口で溶液として４グループの動物に投与し、各グループは異なる用量の化合物を投与される。本ビヒクル、陽性コントロールおよび試験化合物溶液を、本グループに、処置前血液の採血直後、２４時間後および４８時間後に投与する。血液を、最後の投与１.５時間後に採血する(処置後血液)。血清グルコースを酵素的に測定し(Mutaratose-GOD)、インシュリンレベルをＥＬＩＳＡ(マウスインシュリンアッセイキット)により測定する。各グループの平均・標準誤差を計算し、血清グルコースおよびインシュリンの阻害％を処置前血液と処置後血液の比較により得る。処置前血液に対する処置後血液中の血清グルコースおよびインシュリンレベルの減少の割合を決定し、対応のないスチューデントｔ検定を、コントロールおよび試験溶液グループおよびビヒクルグループの比較のために適用する。有意差は、Ｐ＜０.０５と見なす。有効な抗心臓血管障害剤としてのトログリタゾンは、グルコースレベルを１０mg／体重kg(２５±２％)で減少させる。
【０２４５】
その記載を出典明示により本明細書に包含させる米国特許６１２１３１９は、高コレステロール血症ウサギにおけるアテローム性動脈硬化症の進行に関するアッセイを記載している。このウサギを殺し、大動脈を得る。本大動脈をスダン４で染色し、染色の程度を分析する。試験物質処置および非処置脂質給餌ウサギにおける病巣で覆われた大動脈表面の割合をグラフ化する。有効な抗アテローム硬化剤で処置したウサギの大動脈は染色が少なく、減少したアテローム性動脈硬化症を示す。加えて、大動脈の切片をＶＣＡＭ−１発現またはマクロファージ蓄積に関して、ＶＣＡＭ−１またはＲａｍ−１１抗原に対する抗体を使用して免疫染色する。コントロール処置サンプルと比較して減少したＶＣＡＭ−１発現およびマクロファージ蓄積は、有効な薬剤の指標である。
【０２４６】
ＬＤＬコレステロールの減少は、霊長類モデルでも測定できる。例えば、カニクイザルを、高脂コレステロール餌を与えることにより、試験化合物投与前に高コレステロール血症にする。次いで、本サルに試験化合物またはコントロールビヒクルを２週間経口投与する。この期間中のサルにおける血清ＬＤＬコレステロールの割合の減少が、有効な抗アテローム硬化剤の指標である。
【０２４７】
医薬組成物
本発明のポリペプチドが可溶性形で、例えば形質転換酵母または哺乳類細胞の分泌産物として発現されるとき、それらを硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、親和性クロマトグラフィーの段階を含む、当分野で標準の方法にしたがい精製でき、例えば、このような精製の手引きを提供する“Enzyme Purification and Related Techniques,” Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977)およびScopes, R., Protein Purification:Principles and Practice(Springer-Verlag, New York, 1982)にしたがう。同様に、本発明のポリペプチドが可溶性形で、例えば凝集体または封入体として発現されるとき、それらを、破壊された宿主細胞から封入体を遠心により分離し、封入体をカオトロピック剤および還元剤で可溶化し、可溶化した混合物を希釈し、そしてポリペプチドが生物学的活性形態を取るようにカオトロピック剤および還元剤の濃度を減少させることを含む、適当な技術により精製できる。後者の方法は、出典明示により本明細書に包含させる下記の文献に記載されている：Winkler et al, Biochemistry, 25:4041-4045 (1986); Winkler et al, Biotechnology, 3:992-998 (1985); Koths et al, 米国特許４,５６９,７９０；および欧州特許出願８６３０６９１７.５および８６３０６３５３.３。
【０２４８】
ＣＰＰ生物学的活性を調節および好ましくは増加できる化合物は、好ましくは小分子ペプチドであるが、ＣＰＰ核酸分子、ＣＰＰも含み、本発明の抗ＣＰＰ抗体は、投与に適した医薬組成物に包含できる。このような組成物は、典型的に薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する“薬学的に許容される担体”なる表現は、医薬投与と両立できる、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で既知である。既知の媒体または薬剤のいずれかが本活性化合物と両立できない場合を除き、本組成物におけるそれらの使用は意図される。付加的な活性化合物も本組成物中に包含できる。
【０２４９】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤する。投与経路の齢は、非経腸、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜的、および直腸投与を含む。非経腸、皮内または皮下投与に使用する溶液または懸濁液は下記のものを含んでいてよい：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張性を調節するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節できる。非経腸製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量バイアルに入れてよい。
【０２５０】
注射使用に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液(水溶性であるとき)または分散剤、および、滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈投与のために、適当な担体は、生理食塩水、静菌した水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ(登録商標)(BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。すべての例で、本組成物は滅菌すべきであり、容易なシリンジアビリティー(syringability)が存在する範囲で流体でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。本担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体でなければならない。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒子サイズの維持により、および、界面活性剤の使用により維持できる。微生物作用に対する保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合、等張性剤、例えば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを本組成物に含むことが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、本組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを包含させることによりもたらすことができる。
【０２５１】
活性化合物がタンパク質、例えば、抗ＣＰＰ抗体であるとき、滅菌注射用溶液は、必要量の本活性化合物を、必要に応じて上記の１種またはそれ以上の成分と組み合わせた適当な溶媒に包含させ、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般に、分散剤は、本活性化合物を、基本分散媒体および上記の他の必要な成分から成る、滅菌ビヒクルに包含させることにより調製する。滅菌注射用溶液調製用の滅菌粉末の場合、製造の好ましい方法は、予め滅菌濾過した溶液から、活性成分に加えてその由来の任意のさらなる所望の成分を含む粉末を産生する、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２５２】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに包含されるか、または錠剤に圧縮されていてよい。経口治療投与の目的で、本活性化合物は賦形剤と共に包含され、錠剤、トローチまたはカプセルの形で使用できる。吸入による投与のために、本化合物は、適当な推進剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で送達する。全身投与も、経粘膜的または経皮手段によりできる。経粘膜的または経皮のために、浸透すべきバリアに適当な浸透剤を、製剤中に使用する。このような浸透剤は一般に当分野で既知であり、例えば、経粘膜的投与に関して、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜的投与は、経鼻スプレーまたは坐薬の使用を介して達成できる。経皮投与のために、本活性化合物を軟膏、膏薬(salve)、ジェルまたはクリームに当分野で一般に既知のように製剤する。最も好ましくは、活性化合物を静脈注射により対象に送達する。
【０２５３】
１つの態様において、本活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達系(microencapsulated delivery system)を含む、制御放出製剤のような、体からの急速な排泄に対して化合物を保護する担体と製剤する。生物分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。このような製剤の製造法は当業者には明白であろう。本物質はまたAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から買うことができる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化したリポソームを含む)も、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは当業者に既知の方法で、例えば、その記載を出典明示により本明細書にその全体を包含させる米国特許４,５２２,８１１に記載のように製造できる。
【０２５４】
さらなる態様において、本活性化合物を、マイクロチップ・ドラッグ・デリバリー・デバイス上に被覆してよい。このようなデバイスは、タンパク質性組成物を、個体の血流、脳脊髄液、リンパまたは組織に、このような組成物が分解の対象とならずに、または、個体に注射せずに、制御された送達をするのに有用である。マイクロチップ・ドラッグ・デリバリー・デバイスの使用法は、それらの記載を出典明示により本明細書にその全体を包含させる米国特許６,１２３,８６１および５,７９７,８９８および米国特許出願２００２０１１９１７６Ａ１に記載されている。
【０２５５】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投与単位形態の経口または好ましくは非経腸組成物を製剤することが特に有利である。本明細書で使用する投与単位形態は、処置すべき対象への投与単位として適した物理的に分かれた単位を意味する；各単位は、所望の治療的効果を産生するために計算した活性化合物の予定された量を、必要な薬学的担体と共に含む。本発明の単位投与形に対する明細は、活性化合物の独特の特性および達成すべき具体的な治療効果、このような活性化合物を個体の処置用に配合するための本分野に固有の制限により決定され、これらに依存する。
【０２５６】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０(集団の５０％に致死の用量)およびＥＤ５０(集団の５０％に有効な用量)の決定のための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法決定できる。毒性および治療効果の間の用量比率が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として示すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、このような化合物が、非感染細胞を傷害する可能性を最小にし、それにより副作用を減少させるために、冒された組織の部位に標的化するために送達系の設計に注意しなければならない。
【０２５７】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトに使用するための投与範囲の公式化に使用できる。このような化合物の投与範囲は、好ましくは、わずかな毒性または毒性なしＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は用いる投与形および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用するすべての化合物に関して、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイから概算できる。投与量をヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定するために使用する、循環を達成するために、動物モデルにおいて処方してよい。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０２５８】
本医薬組成物は、容器、包装またはディスペンサー中に、投与の指示書と共に包含され得る。
【０２５９】
ＣＰＰの治療的使用
本発明のＣＰＰ、ＣＰＰモジュレーターおよび抗ＣＰＰ抗体を、ＣＰＰ−関連疾患の処置または予防において使用することができる。宿主において免疫反応の原因となるか、毒性が判明することがある製造した小分子治療剤と異なり、本発明のペプチドは通常分泌されており、それらを投与する対象に毒性ではないと考えられる。故に、１つの局面において、本発明はＣＰＰを活性成分として含み、好ましくは薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物に関する。本担体または希釈剤は好ましくは経口、静脈内、筋肉内または皮下投与に適合させる。ＣＰＰはまた吸入用の溶液として製剤できる。医薬組成物は、本明細書に記載のＣＰＰいずれかを含むか、これから成るか、本質的にこれから成るものであり得る。所望により、ＣＰＰはプロペプチドまたはプレプロペプチドとして投与できる。
【０２６０】
多くの薬剤が、心臓血管障害の処置および予防に有用である。このような薬剤は、遊離には、ＣＰＰと組み合わせて使用できる。
【０２６１】
例えば、細胞周期阻害剤および原腫瘍遺伝子(Simari and Nabel, Semin. Intervent. Cardiol. 1:77-83 (1996))；ＮＯ(一酸化窒素)ドナー薬剤；ｂｃｌ−ｘのようなアポトーシス誘発剤(Pollman et al., Nature Med. 2:222-227 (1998))；ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ｔｋ)遺伝子および全身性ガンシクロビル(Ohno et al., Science 265:781-784 (1994); Guzman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10732-10736 (1994); Chang et al., Mol. Med. 1:172-181 (1995); およびSimari et al., Circulation 92:1-501 (1995))が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄および新生内膜平滑筋増殖を処置するために開発されている。上記の文献の記載は、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【０２６２】
本発明のペプチドとの組み合わせに有用な抗血栓剤は、例えば、IIｂ／IIIａインテグリンの阻害剤；組織因子阻害剤；および抗トロンビン剤を含む。局所麻酔(クラスＩ剤)、交感神経アンタゴニスト(クラスII剤)、抗細動剤(クラスIII剤)、カルシウムチャネル剤(クラスIV剤)またはアニオンアンタゴニスト(クラスＶ剤)のような抗不整脈薬が、その内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させるVukmir, Am. J. Emer. Med. 13:459-470 (1995); Grant, PACE 20:432-444 (1997); Assmann I., Curr. Med. Res. Opin. 13:325-343 (1995); およびLipka et al., Am. Heart J. 130:632-640 (1995)に記載され、また使用できる。クラスＩ剤の例は：プロカインアミド；キニジンまたはジソピラミド；リドカイン；フェニトイン；トカイニドまたはメキシレチン；エンカイニド；フレカイニド；ロルカイニド；プロパフェノン(III)またはモリシジンを含む。交感神経アンタゴニストは：プロプラノロール、エスモロール、メトプロロール、アテネラールまたはアセブトロールを含む。抗細動剤の例は、ブレチリウム、アミオダロン、ソタロール(II)またはＮ−アセチルプロカインアミドである。クラスIV剤は、ベラパミル、ジルチアゼムおよびベプリジル、および、アリニジンのようなアニオンアンタゴニストを含む。
【０２６３】
鬱血性心不全治療剤は、ＴＮＦ阻害剤、例えばEmbrel.TM.(Immunex Corp.; Seattle, Wash.)、ＴＢＣ１１２５１、またはＡＣＥ(アンギオテンシン変換酵素)阻害剤、例えばＮａｔｒｅｃｏｒ(ネシリチド；Scios, Inc.)を含む。血管由来の薬剤(angiogenic agent)、例えば、Genentechが開発したｒｈＶＥＧＦのような組み換えＶＥＧＦイソ型；ＶＥＧＦの１２１アミノ酸イソ型をコードする核酸分子(BioByPass.TM.; GenVec/Parke Davis)；またはＶＥＧＦ−２をコードする核酸(Vascular Genetics, Inc.); Scios, Inc. (Mountain View, Calif.)およびWyeth Ayerst Laboratories(Radnor, Pa.)により開発されたＦＧＦ−２の組み換え形であるＦＩＢＬＡＳＴ.ＴＭ.、ＧＥＮＥＲＸ.ＴＭ.または、Collateral Therapeutics(San Diego, Calif.)およびSchering AG(Miller and Abrams, Gen. Engin. News 18:1 (1998)参照、その記載を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)により開発されたＦＧＦ−４をコードするアデノウイルス遺伝子治療ベクターも、本発明のＣＰＰ−関連組成物との組み合わせに有用である。最後に、カルシウムアンタゴニスト、例えばアムロジピン(Marche et al., Int. J. Cardiol. 62 (Suppl.):S17-S22 (1997); Schachter, Int. J. Cardiol. 62 (Suppl.):S85-S90 (1997))；ニカルジピン；ニフェジピン；プロパノロール；硝酸イソソルビド；ジルチアゼム；およびイスラジピン(Nayler(Ed.)Calcium Antagonists pages 157-260 London:Academic Press (1988); Schachter, Int. J. Cardiol. 62 (Suppl.):S9-S15 (1997))も、心臓血管障害のための有利な治療剤である。
【０２６４】
本発明を一般的に記載したが、説明の目的のために本明細書に提供し、他に明記しない限り限定する意図はないある具体的実施例を参照して、さらなる理解を得ることができる。
【実施例】
【０２６５】
実施例１：実験およびコントロール集団におけるＣＰＰレベルの特徴付け
心臓血管疾患に関してＤｕｋｅ  Ｄａｔａｂａｎｋに登録された対象を、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)に基づいて選択した。合計２４１名のＣＡＤ患者およびコントロール個体をさらに性別、年齢および民族に関して適合させ、血漿異常の個体は除外した。５３名のＣＡＤ患者の組と５３名のコントロール個体の組を確立した。６リットルの血漿を各組から集めた。血漿のアリコートを各個体から確保し、故に貯蔵サンプルにおける陽性結果が集団の各メンバーに関して確認できるようにした。このような確認は、心臓血管障害に関係しない特異的ポリペプチドの異常なレベルの個体による、可能性のある妨害作用を消すために有効である。各集団からの血漿２.５リットルを、下記のようなＭｉｃｒｏｐｒｏｔ.ＴＭプロセスにしたがった複数のクロマトグラフィー・ステップによる分離に付した：
【０２６６】
ステップ１：ＨＳＡ／ＩｇＧ枯渇
１２５ml凍結血漿を解凍し、０.４５μｍ滅菌フィルターで滅菌フード中濾過した。
濾液を、各々３００mlのＨＳＡリガンドセファロースファスト・フローカラム(Amersham, Upsala, Sweden)、ＩＤ  ５cm、長さ１５cm；および１００mlタンパク質Ｇセファロースファスト・フローカラム(Amersham, Upsala, Sweden)、ＩＤ  ５cm、長さ５cmである２つの直列カラムに注入した。
【０２６７】
カラムを、５０mM  ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.１、０.１５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化し、洗浄した。流速は５ml／分であった。
非保持フラクション(３５０ml)を第２ステップまで凍結した。２０回行った。
【０２６８】
ステップ２：ゲル濾過／逆相捕捉段階
ステップ１のサンプルを解凍し、０.４５μｍ滅菌フィルターで滅菌フード中濾過した。
濾液を２つの直列ゲル濾過カラム：２×９.５リットルＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５(Amersham, UK)カラム、ＩＤ  １４cm、長さ６２cmに注入した。カラムを５０mM  ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４、０.１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素で平衡化した。疎水性不純物は、逆相プレカラム：１５０ml  ＰＬＲＰＳ(Polymer Labs, UK)上に保持された。プレカラムをサンプル注入のために交換した。ゲル濾過を４０ml／分の流速で行った。
【０２６９】
低分子量タンパク質(＜２０kDa)は、直列逆相捕捉カラム：５０ml  ＰＬＲＰＳ  １００オングストローム(Polymer labs, UK)に適応させた。ＰＬＲＰＳカラム上の３方向バルブを、３３ｍＡＵ(２８０nm)のカットオフで切り替え、ゲル濾過溶出液を逆相捕捉カラムに送った。このカットオフ値は、最初にＯＤ値の概算範囲を提供するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用により、続く、３つのカットオフ値(ＯＤ範囲の高、中および低値)の評価により確率した。最終カットオフ値は、少なくとも８５％の低分子タンパク質比率で得られる低分子量タンパク質を最大となるように選択した。低分子量タンパク質およびペプチドを逆相捕捉ＰＬＲＰＳカラムから、０.１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮの水溶液の１カラム容量勾配により溶出した。
【０２７０】
溶出フラクション(５０ml)を次のステップまで凍結した。２０回行った。このステップの最後に、すべての逆相溶出液を解凍し、集め(１リットル)、７つのポリプロピレン容器に分けた(１４３ml)。容器を次ステップに使用するまで−２０℃で凍結した。
【０２７１】
ステップ３：カチオン交換
ステップ２からのサンプル(１４７ml)を解凍し、等量のカチオン交換緩衝液Ａ(Ｇｌｙ／ＨＣｌ緩衝液５０mM、ｐＨ２.７、尿素８Ｍ)と混合した。
サンプルを１００ml  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓカラム(Amersham, Upsala, Sweden)、ＩＤ  ３５mm、長さ１００mmに注入した。カラムを緩衝液Ａで平衡化し、洗浄した。流速は１０ml／分であった。
【０２７２】
タンパク質およびペプチドを１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ(１Ｍ  ＮａＣｌを含む、緩衝液Ａ)までの段階的勾配で溶出した：
３カラム容量７.５％Ｂ(７５mM  ＮａＣｌ)
３カラム容量１０％Ｂ(１００mM  ＮａＣｌ)
３カラム容量１７.５％Ｂ(１７５mM  ＮａＣｌ)
２カラム容量２２.５％Ｂ(２２５mM  ＮａＣｌ)
２カラム容量２７.５％Ｂ(２７５mM  ＮａＣｌ)
２カラム容量１００％Ｂ(１Ｍ  ＮａＣｌ)
４５から６０フラクションをピークに基づいて回収した。７回行った。７回目の達成後、フラクションを、１８フラクションを得るために、同一ラン内およびラン間で貯蔵した。フラクションを次ステップに使用するまで−２０℃で凍結した。
【０２７３】
ステップ４：還元／アルキル化および逆相ＨＰＬＣ分別１
濃Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨを８.５に調節した後、１８カチオン交換フラクションの各々をジチオエリスリトール(ＤＴＥ、３０mM、３時間、３７℃)で還元し、ヨードアセトアミド(１２０mM、暗所で１時間、２５℃)でアルキル化した。後者の反応を、ＤＴＥ(３０mM)の添加、続く酸化(ＴＦＡ、０.１％)により停止させた。本フラクションを次いでＵｐｔｉｓｐｈｅｒ  Ｃ８、５ミクロン(microm)、３００オングストロームカラム(Interchim, France)、ＩＤ  ２１mm、長さ１５０mmに注入した。注入を流速１０ml／分で行った。
【０２７４】
Ｃ８カラムを０.１％ＴＦＡの水溶液(溶液Ａ)で平衡化し、洗浄した。タンパク質およびペプチドを、１００％Ａから１００％Ｂ(０.１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮの水溶液)までの６０分の２相性勾配で溶出した。流速は２０ml／分であった。４０mlの３０フラクションを回収した。
【０２７５】
各フラクションの２８０nmでの光学密度(ＯＤ)の測定に基づき(そのフラクション中のタンパク質濃度を反映する)、類似のタンパク質含量のアリコートを各フラクションに関して作成した。
【０２７６】
すべてのアリコートを凍結し、フラクションあたり１個以外さらなる使用のために凍結し、その１個は過剰の乾燥を防止するために１０％グリセロールの水溶液５００μｌを添加後、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ(Savant, Fischer, Geneva)で乾燥した。乾燥フラクションを次ステップに使用するまで−２０℃で凍結した。
【０２７７】
ステップ５：逆相ＨＰＬＣ分別２
ステップ４のサンプルを１mlの溶液Ａ(０.０３％ＴＦＡの水溶液)に再懸濁し、Ｖｙｄａｃ  ＬＣＭＳ  Ｃ４カラム、５マイクロメートル、３００オングストローム(Vydac, USA)、ＩＤ  ４.６mm、長さ１５０mmに注入した。流速は０.８ml／分であった。
【０２７８】
Ｃ４カラムを溶液Ａで平衡化および洗浄し、タンパク質およびペプチドを、逆相ＨＰＬＣ分別１におけるサンプルの溶出一に適合させた２相性勾配で溶出した。完全な質量データを、エレクトロスプレー・イオン・トラップ質量分析を使用して獲得した。１６の異なる勾配を使用し、ＣＨ３ＣＮ濃度範囲が、溶媒濃度に対応するＲＰ１フラクションのＣＨ３ＣＮの５％マイナスおよびプラスの範囲であった。３０％ＣＨ３ＣＮ以上の溶媒濃度でＲＰ１中に溶出したタンパク質に関して、ＲＰ２勾配の出発溶出条件を、ＣＨ３ＣＮパーセントで、ＲＰ１溶出濃度マイナス３０％と設定した。２４の溶出フラクションを深いウェルプレートに回収し、最適ＳｐｅｅｄＶａｃ濃度およびさらなる自動装置処置のために設計した最適化した異なる収集構成を採用した。
【０２７９】
ステップ６：質量検出
約１３,０００フラクションを、逆相ＨＰＬＣ分別２に続き、９６−ウェル深ウェルプレート(ＤＷＰ)に回収した。この容量の少ない割合(２.５％)を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ(Bruker Esquire)を使用したオンライン分析に流用した。非消化タンパク質のアリコートをＭＡＬＤＩマトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩプレート上に、質量目盛り標準と感受性標準と共にスポットした。自動化スポット装置(Bruker MALDI sample prep. Robots)を使用した。２つの異なるＭＡＬＤＩマトリックスを用いた：シナピン酸(ＳＡ)(シナピニック・アシッドとしても既知)、ｔｒａｎｓ−３,５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸およびアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸(ＨＣＣＡ)。ＭＡＬＤＩプレートを、Bruker Reflex III MALDI MS装置を使用した質量検出に付した。本９６−ウェルプレートを＋４Ｃで貯蔵した。
【０２８０】
９６−ウェルプレート(ＤＷＰ)を回収し、２連続濃度段階に付した。容量を０.８mlから約５０μｌ／ウェルに、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥することにより濃縮し、次いで約２００μｌに再溶解し、約５０μｌ／ウェルに再濃縮し、＋４Ｃで貯蔵した。次いでタンパク質を再緩衝し、トリプシンを本ウェルに添加し、密封し、本プレートを３７Ｃで１２時間ｉｎ球部０とし、続いてクエンチ(ｐＨを２.０より低くするためのギ酸の添加)することにより消化させた。ウェルに添加すべきトリプシンの濃度は、各特定のフラクションに関して２８０nmで記録したＯＤに基づいて調節した。これはトリプシンの最適使用およびほとんどの濃縮フラクションの完全な消化を確実にする。自動スポット装置(Bruker MALDI sample prep. Robots)を使用して、ＭＡＬＤＩプレート上に、感受性および質量目盛り標準と共にＨＣＣＡマトリックスと予め混合した、各ウェルからの容量の付着に使用した。ＭＡＬＤＩプレートを、Bruker Reflex III MALDI MS装置を使用して分析した。９６ウェルプレートの各ウェルの内容物を、LC-ESI-MS-MS Bruker Esquire ESI Ion-Trap MS装置で分析した。
【０２８１】
ステップ７：ヒト血漿における低発生量ペプチドの検出および同定
分離したフラクションをさらに分離および検出のための質量分析法(両方ともマトリックス支援レーザー脱離／イオン化(ＭＡＬＤＩ)およびＭＳ−ＭＳ)に付す。
完全な質量データ、ペプチド・マス・フィンガープリントおよびペプチド配列データを、タンパク質同定および特徴付けのために統合する。タンパク質をＭａｓｃｏｔソフトウェア(Matrix Science Ltd., London, UK)を使用して同定し、ペプチド同定から得られた結果をスペクトルの手動での分析によりチェックした。
【０２８２】
この方法で同定されたタンパク質の内、Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ａ(Ｓ１００カルシウム−結合タンパク質Ａ８、SwissProt受託番号Ｐ０５１０９の)が、コントロールからの貯蔵サンプルにおいて、ＣＡＤ患者からの貯蔵サンプルよりも大きな程度で発現されていることが判明した(例えば、本タンパク質由来のペプチドは、疾患フラクションと比較してコントロールフラクションで２倍観察され、このタンパク質の質量スペクトルの同定中に得られた累積スコアは、コントロールサンプルが２.５倍高かった)。Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ａは、前炎症性(pro-inflammatory)タンパク質(Odink, et al., Nature 330(6143), 80-82 (1987)および多くのその後の文献)として特徴付けられている。これは、炎症応答中に管外遊出した骨髄細胞により発現され、そこでそれは上皮細胞上のグリコサミノグリカン構造と結合する(Robinson, et al., JBC 277:3658-65 (2002))。興味深いことに、ＰＣＴ公開ＷＯ００／６１７４２は、Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ａの、例えば動脈硬化による、心不全の処置への使用を記載している。さらに、ＰＣＴ公開ＷＯ００／１８９７０は、Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ａの、心筋梗塞および高血圧を予防するための血管膜増殖阻害剤としての使用を記載している。したがって、本明細書に記載のタンパク質分離および同定アプローチは、疾患サンプルよりもコントロールサンプルで高いレベルで検出されたとき、この試験している疾患の処置に有益な効果を有する、タンパク質を提供するのに有効であるようである。
【０２８３】
逆に、本実施例に記載のタンパク質の分離および同定法は、Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｌａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ(SwissProt受託番号Ｐ０８４９３の)を、コントロール由来の貯蔵サンプルと比較して、ＣＡＤ患者由来の貯蔵サンプルで過剰発現しているとして同定した(例えば、本タンパク質由来のペプチドは、コントロールフラクションと比較して多くの疾患フラクションでほとんど２倍観察され、このタンパク質の質量スペクトルの同定中に得られた累積スコアは、疾患サンプルでは２倍高かった)。ＭＧＰは、骨および軟骨の有機基質に関連する、ビタミンＫ依存性タンパク質である。Mori, et al. は、ＭＧＰが血管石灰化の阻害ができることを証明している(FEBS Letters 433:19-22 (1998))。ＭＧＰレベルはアテローム硬化性プラークで、血管石灰化のおそらくフィードバック反応として増加している。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０２８６３およびＷＯ０１／２５４２７は、ＭＧＰをアテローム性動脈硬化症および心臓血管障害の生物マーカーとして記載している。したがって、本明細書に記載のタンパク質分離および同定アプローチが、この試験している疾患の診断において認められた使用を有する、タンパク質を提供するのに有効であるようである。
【０２８４】
実施例２：ＣＰＰの精製および特徴付け
ヒト血漿を、実施例１に記載のように一連の複数のクロマトグラフィーカラムにより分画した。本フラクションを質量分析法により分析した。別個のトリプシンのフラグメントが、表１および配列番号５に記載のように判明した。
【０２８５】
表１(配列番号５)に挙げたトリプシン消化ペプチドは、冠動脈疾患なしのコントロール個体からの血漿におけるＭＳ−ＭＳにより観察された。ＣＡＤ患者の血漿に存在するＣＰＰペプチドは、配列番号３および４のＣＰＰ６および７を含む。本トリプシン消化ペプチドと相関する本完全長ポリペプチド配列は、配列番号１および２として記載する。この挙げたペプチドは、ＣＡＤサンプルでは見られなかった。本Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔ.ＴＭプロセスは、５０ｐＭ範囲の血漿濃度の、非常に低発生量タンパク質の検出が可能である。故に、ＣＡＤ血漿における列記したペプチドの不在は、ＣＰＰが、仮にあっても、ＣＡＤ患者で無視できるほど非常に低いレベルであることを示す。
【０２８６】
トリプシン消化ペプチドの存在は、２０kDより少ない分子量であり、アミノ酸配列ＦＴＴＬＶＱＤＬＡＮＡＦＱＱＥＡＱＴＳＧＫを含むのポリペプチドが、開始ヒト血漿サンプルに存在したことを示唆する。このようなポリペプチドは、配列番号３−４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものを含む。
【０２８７】
実施例３：ＣＰＰの化学合成
本実施例において、本発明のＣＰＰを合成する。ペプチドフラグメント中間体を最初に合成し、次いで、所望のポリペプチドに集合させる。
ＣＰＰを最初に、Ｃｙｓ残基を結合すべきフラグメントのＮ−末端に有するように選択した、例えば５フラグメントに調製できる。フラグメント１を最初にフラグメント２と結合させ、第１産物を産生し、次いで、分取ＨＰＬＣ精製後、本第１産物をフラグメント３と結合させて第２産物を得る。分取ＨＰＬＣ精製後、本第２産物をフラグメント４と結合させて第３産物を得る。最後に、分取ＨＰＬＣ精製後、第３産物をフラグメント５と結合させて所望のポリペプチドを得、それを精製および再折りたたみする。
【０２８８】
チオエステル形成
フラグメント２、３、４および５を、上記のようにチオエステル産生樹脂上で合成する。この目的のために、下記の樹脂を調製する：Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステルを、Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂に、本質的にHackeng et al (1999)により記載の条件下で結合させる。第一例の場合、得られた樹脂を、アセチル保護基を１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で３０分処置により除去した後、０.２mmolスケールでのペプチド鎖伸長用の出発樹脂として使用する。フラグメント２から５のＮ−末端Ｃｙｓ残基のＮαを、Ｂｏｃ−チオプロリン(Ｂｏｃ−ＳＰｒ、すなわちＢｏｃ−Ｌ−チオプロリン)を、慣用のＮαまたはＳβ保護を有するＣｙｓの変わりに、各鎖の末端に結合させることにより保護する、例えばBrik et al, J. Org. Chem., 65:3829-3835 (2000)。
【０２８９】
ペプチド合成
固相合成を、Applied Biosystemsのカスタム−修飾４３３Ａペプチド合成装置上で、Schnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180-193(1992)に記載のように、段階的Ｂｏｃ化学的鎖伸長のための、インサイチュ中和／２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−リン酸(ＨＢＴＵ)活性化プロトコールを使用して行う。各合成サイクルは、希釈していないＴＦＡでの１から２分の処置によるＮα−Ｂｏｃ−除去、１分のＤＭＦでの流水洗浄、２.０mmolの予め活性化したＢｏｃ−アミノ酸との、過剰のＤＩＥＡ存在下での１０分の結合時間、および、２回目のＤＭＦでの流水洗浄から成る。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸(２mmol)は、３分、１.８mmol  ＨＢＴＵ(ＤＭＦ中０.５Ｍ)で、過剰のＤＩＥＡ(６mmol)存在下予め活性化させる。Ｇｌｎ残基の結合後、ジクロロメタンでの流水洗浄を、ＴＦＡを使用した脱保護の前および後に使用し、可能性のある高温(ＴＦＡ／ＤＭＦ)−触媒ピロリドンカルボン酸形成を防止する。側鎖保護されたアミノ酸は、Ｂｏｃ−Ａｒｇ(ｐ−トルエンスルホニル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ(キサンチル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ(Ｏ−シクロヘキシル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ(４−メチルベンジル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｏ−シクロヘキシル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ(ジニトロフェニルベンジル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ(２−Ｃｌ−Ｚ)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(ベンジル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(ベンジル)−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ(シクロヘキシルカルボニル)−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｔｙｒ(２−Ｂｒ−Ｚ)−ＯＨ(Orpagen Pharma, Heidelberg, Germany)である。他のアミノ酸は、側鎖保護なしに使用する。Ｃ−末端フラグメント１をＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ−ＣＨ２−Ｐａｍ樹脂(０.７１mmol／ｇの充填された樹脂)上で合成し、一方フラグメント２から５に関する機械補助合成を、Ｂｏｃ−Ｘａａ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｐａｍ樹脂上で開始する。この樹脂を、Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステルのＬｅｕ−ＰＡＭ樹脂への、標準条件下での結合により得る。この得られた樹脂を、１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンのＤＭＦ溶液での３０分の処置でのアセチル保護基除去後、０.２mmolスケールのペプチド鎖伸長の出発樹脂として使用する。
【０２９０】
鎖集合が完成した後、本ペプチドフラグメントを脱保護し、無水フッ化水素で１時間、０℃で、スカベンジャーとしての５％ｐ−クレゾールと処置して、樹脂から開裂する。フラグメント１以外のすべての例で、イミダゾール側鎖２,４−ジニトロフェニル(ＤＮＰ)保護基は、ＤＮＰ−除去法がＣ−末端チオエステル基と両立できないため、Ｈｉｓ残基上に残る。しかしながらＤＮＰを、ライゲーション反応中にチオールにより徐々に除去し、非保護Ｈｉｓを産生する。開裂後、ペプチドフラグメントを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶解し、凍結乾燥する。本ペプチドフラグメントを、ＷａｔｅｒｓのＣ１８カラムのＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ(Ｈ２Ｏ／０.１％トリフルオロ酢酸)中の緩衝液Ｂ(アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸)の直線勾配および２１４nmでのＵＶ検出を使用して精製する。サンプルをエレクトロスプレー質量分析法(ＥＳＭＳ)で、Esquire instrument(Bruecker, Bremen, Germany)または類似の装置を使用して分析する。
【０２９１】
天然化学ライゲーション
下記により完全に記載するように、非保護フラグメントのライゲーションは下記のように行う：本乾燥ペプチドを、ほぼ７付近で１−８mMの最終ペプチド濃度を得るために、当モル量で６Ｍグアニジンヒドロクロライド(ＧｕＨＣｌ)、０.２Ｍリン酸、ｐＨ７.５に溶解し、１％ベンジルメルカプタン、１％チオフェノールを添加する。通常、本反応を一晩行い、ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析法で追跡する。本ライゲーション産物を続いてまだ存在する保護基を除去するために処置する。Ｎ−末端チアゾリジン環の開環は、ｐＨ３.５で最終濃度０.５Ｍのメトキサミンの添加および２時間、３７℃でのさらなるインキュベーションを必要とする。１０倍過剰のＴｒｉｓ(２−カルボキシエチル)ホスフィンを添加し、その後ＨＰＬＣ精製する。本ポリペプチド鎖を含むフラクションをＥＳＭＳにより同定し、集め、凍結乾燥する。
【０２９２】
フラグメント４および５のライゲーションは、ｐＨ７.０で６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中、行う。各反応物の濃度は８mMであり、１％ベンジルメルカプタンおよび１％チオフェノールを、還元環境を作るためおよびライゲーション反応を促進するために添加した。ほとんど定量的なライゲーション反応が、３７℃で一晩撹拌後に観察される。反応のこの時点で、ＣＨ３−Ｏ−ＮＨ２・ＨＣｌを本溶液に添加して０.５Ｍ最終濃度とし、Ｎ−末端チアゾリジン環を開環するためにｐＨを３.５に調節する。２時間、３７℃でインキュベーション後、ＥＳＭＳを使用して反応の完了を確認する。本反応混合物を続いて本ペプチドフラグメントの１０倍過剰のＴｒｉｓ(２−カルボキシエチルホスフィンで１５分処理し、本ライゲーション産物を分取ＨＰＬＣ(例えば、Ｃ４、２０−６０％ＣＨ３ＣＮ、０.５％／分)で精製し、凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵する。
同様の方法を、残りのライゲーションに関してわずかに改変して繰り返す。
【０２９３】
ポリペプチド折りたたみ
本完全長ペプチドを、還元した凍結乾燥タンパク質(約０.１mg／mL)を１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  メチオニン、ｐＨ８.６に溶解することによる、空気酸化により再折りたたみする。一晩穏やかに撹拌後、本タンパク質溶液を上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣで精製する。
【０２９４】
実施例４：ＣＰＰ抗体組成物の調製
実質的に純粋なＣＰＰまたはその一部を得る。最終調製物におけるタンパク質の濃度を、例えば、Ａｍｉｃｏｎフィルター装置上での濃縮により、数μｇ／mlのレベルに調節する。本タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、“モノクローナル抗体”および“ポリクローナル抗体”なる標題の章に記載のように製造する。
【０２９５】
簡単に言うと、抗ＣＰＰモノクローナル抗体を製造するために、マウスに数μｇのＣＰＰまたはその一部を、数週間の期間にわたり繰り返して接種する。本マウスを次いで殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。本脾臓細胞をポリエチレングリコールの手段によりマウス骨髄腫細胞と融合させ、過剰の非融合細胞をアミノプテリンを含む選択培地(ＨＡＴ培地)上の本システムの増殖により破壊する。十分に融合した細胞を希釈し、希釈物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェル中に入れ、そこで本培養物の増殖を続ける。抗体−産生クローンを、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させるEngvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980)により最初に記載されたような、ＥＬＩＳＡのような免疫アッセイ法により、ウェルの上清における抗体の検出により同定する。選択した陽性クローンを拡張でき、そのモノクローナル抗体産物を使用のために回収する。モノクローナル抗体製造のための詳細な方法は、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させるDavis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記載されている。
【０２９６】
免疫化によるポリクローナル抗体製造のために、ＣＰＰまたはその一部における異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を、マウスを、非修飾であるか免疫原性を増強するために修飾されていてよいＣＰＰまたはその一部で免疫することにより調製する。すべての適当な非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳類を選択でき、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマを含む。
【０２９７】
本モノクローナルまたは本ポリクローナルプロトコールのいずれかにしたがい調製した抗体調節物は、生物学的サンプルにおけるＣＰＰの濃度を決定する定量的免疫アッセイにおいて有用である；またはそれらはまた生物学的サンプルにおける抗体の存在の同定に、半定量的または定質的に使用する。本抗体は本タンパク質を発現する細胞を殺すための、または、体内のタンパク質のレベルを減少させるための治療用組成物としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
【図１】ヒトチトトリオシダーゼ・プレタンパク質(配列番号１)；成熟チトトリオシダーゼポリペプチド(配列番号２)；および心臓血管障害血漿ポリペプチド６−７(配列番号３−４)の配列を示す。タンデム質量分析法によりコントロール血漿サンプルで観察されるトリプシン消化ペプチドは太字であり、配列番号５として示す。シグナル配列は下線を引く。二塩基性タンパク質分解的開裂部位は、斜体でかつ下線を引いた文字である。得られた加工ペプチドであるＣＰＰ６−７(配列番号３−４)のアミノ酸配列を下に挙げる。本タンパク質の推定活性部位を太字かつ下線を引いて示す(Boot, R.G. et al., J. Biol. Chem., (1995), 270, p.26252-56)。
【配列表】
2006519771.tif 000003
2006519771.tif 000004
2006519771.tif 000005
2006519771.tif 000006
2006519771.tif 000007
2006519771.tif 000008
【図１】
2006519771.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月1日(2005.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006519771000001.app
【国際調査報告】
2006519771.tif 000010
2006519771.tif 000011
2006519771.tif 000012
2006519771.tif 000013
2006519771.tif 000014