(57)【要約】腫瘍壊死因子−結合タンパク質の新規精製方法を発表する。特に当該方法は、金属として銅を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を捕捉ステップとして使用することにより特徴付けられる。これは工程収率、最終産物の純度及び工業スケールへの適用可能性の観点からの利点をもたらす。
2006517187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属として銅を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）においてＴＮＦ−結合タンパク質の粗溶液を溶出することを含んで成る、純粋ＴＮＦ−結合タンパク質の単離方法。
【請求項２】
金属として銅を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを捕捉ステップとして含んで成る、組換えＴＮＦ−結合タンパク質の精製方法。
【請求項３】
前記ＩＭＡＣカラムからの溶出が、２．８から３．２の間のｐＨで実施される、請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＭＡＣカラムからの溶出が、１４から１６ｍSの間の塩分で実施される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
中間ステップとして、以下：酸性ｐＨ、好適には３から４の間、でのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、引き続き塩基性ｐＨ、好適には８から１０の間、でのイオン交換クロマトグラフィー、のステップを更に含んで成る、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
研磨ステップとして、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を更に含んで成る、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記それぞれのクロマトグラフィーステップに、限外ろ過ステップが続く、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＮＦ−結合タンパク質が、組換えｈ−ＴＢＰ−１である、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項の記載の方法により、タンパク質を単離又は精製することを含んで成る、ＴＮＦ−結合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド精製の分野に関する。更に詳細には、腫瘍壊死因子-結合タンパク質の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
強力なサイトカイン、腫瘍壊死因子-α(TNFA)は、細胞表面受容体へ結合することによって仲介される生物学的応答の幅広いスペクトルを誘発する。ヒトTNF-αの受容体はヒト細網肉腫細胞株から単離され得る(Stauber等.,J.Biol.Chem.,263,19098-104,1988参照)。
【０００３】
モノクローナル抗体を使用する他のグループでは、TNF-α及びTNF-βを特異的且つ高い親和性で結合する２つの別個の両TNF-結合タンパク質(Brockhaus等.,Proc.Nat.Acad.Sci.87：7380-7384,1990参照)のための証拠を獲得し、そして１つの受容体のためのcDNAを単離した。彼らはそれが171残基の細胞外ドメイン及び221残基の細胞質ドメインで分割される455アミノ酸のタンパク質をコードすることを見出した。
【０００４】
後に他のグループ（Aggarwal等.Nature318:665-667,1985参照)は、腫瘍壊死因子α及びβが通常の細胞表面受容体と結合することによって細胞機能へ影響を始めることを示した。TNFα及びTNFβ受容体は異なる大きさを有し、そして異なる細胞株において特異的に発現する(Engelmann等.,J.Biol.Chem.265:1531-1536,1990参照)。
【０００５】
TNFR55とも称されるTNFα受容体Iは２つの受容体の小さいほうである。両受容体のcDNAsは、クローン化され、そしてそれらの核酸配列が決定された（Loetscher等.,Cell 61:351-359,1990；Nophar等.,EMBO J.9:3269-3278,1990；Schall 等.,Cell 61：361-370,1990及びSmith等.,Science 248：1019-1023,1990）。
【０００６】
2つの受容体の細胞外ドメインは、構造において著しく類似するが、それらの細胞内ドメインは、関連がないと思われる。プローブとして2つの受容体のｃDNAを用いたヒドゲノムDNAのサザンブロッティングでは、いずれも一つの遺伝子によってコードされることを示した。
【０００７】
いくつかのアプローチでは、ポリペプチドを精製することが試みられた。その中の物質を精製するアフィニティークロマトグラフィーを含み、最も一般に使用される手段の一つであるクロマトグラフィーは、所定の物質を捕捉するため、その物質に親和性を有す試薬を上に固定した、適した支持体層又はカラムへ最初に吸着させ、そして原料混合物の残留成分を結合させず通過させる。吸着した物質は、その後、部分的に又は全体的に精製された分子を与えるｐＨ及び／又は塩濃度のような環境条件の変化によって溶出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アフィニティークロマトグラフィーの分野において、IMAC (固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)として公知の技術は、特に有効である一定のケースとして発表された(Arnold,Biotechnology,Vol.9,ページ151-156,Feb.1991による論文を参照)。IMACは、Glu、Tyr、Cys、His、Asp及びMetの側鎖とアミノ末端アミド窒素及び骨格のカルボニル酸素のような、金属結合に関与する官能基を有するポリペプチドの精製における強力な技術として発表されている。
【０００９】
当該技術は強力であるが、常に要求される特異性を有するわけではない。例えば、Cu2+を含むクロマトグラフィーのカラム上での吸着は、１又は好適には１以上のヒスチジンを含むポリペプチドにおいて優れていることを確認したが、吸着のために最も重要であると考えられている３つのアミノ酸、即ちヒスチジン、トリプトファン、及びシステインの不存在下でさえもタンパク質の吸着が起こり得るので、精製ステップの特異性が減弱していることも観察した。
【００１０】
吸着能力は、一般的に精製の目的には申し分のないものであるが、特に精製されたポリペプチドが糖タンパク質である場合は、おそらく最適ではない。この場合、非常に頻繁に炭化水素鎖が金属キレートへ結合するために活性なサイトを隠し、そして吸着ステップにおけるクロマトグラフィーカラムのための親和性を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の詳細な説明
TNF-結合タンパク質は金属として銅を用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC) ステップを含む工程手段により効果的に精製することができることをここに見出した。本ステップのためのｐＨの最適条件はｐＨ2.8から3.2、好適にはｐＨ３であり、及び塩分の最適条件は14から16mS、好適には15mSである。
【００１２】
本発明によれば、“TNF-結合タンパク質”とは、TNF-αもしくはTNF-β及び／又は細胞外に含まれるタンパク質, TNF受容体ファミリーに属するタンパク質の可溶性フラグメント、又はそれらのフラグメント、に親和性を有す任意のタンパク質を意味する。
【００１３】
TNF受容体ファミリーのメンバーのいくつかの例は、以下である:
・腫瘍壊死因子受容体1(TNFR1)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー1A(TNFRSF1A)、或いは腫瘍壊死因子-α受容体(TNFAR)又はTNFR 55-KD又はTNFR 60-KD とも呼ばれ(OMIM*191190 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIMでの発表を参照)、
・腫瘍壊死因子受容体2(TNFR2)は、腫瘍壊死因子受容体サブファミリー、メンバー1B (TNFRSF1B)又は腫瘍壊死因子-β受容体(TNFBR)、或いはTNFR 75-KD又はTNFR 80-KDとも呼ばれ(OMIM*191191での発表を参照)；
・0X40抗原(OX40)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー4(TNFRSF4)、或いは負荷(Tax)-転写的に活性化された糖タンパク質1受容体(TXGP1L)又はリンパ性活性化抗原ACT35(ACT35)又はCD134(OMIM*600315での発表を参照) とも呼ばれ；
・CD40L受容体(CD40)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー 5(TNFRSF5)或いはB-細胞表面抗原CD40、又はCDw40又はBp50 とも呼ばれ(Swiss-Prot Entry No.P25942での発表を参照)；
・FASL受容体(FAS)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー6 (TNFRSF6)、或いはアポトーシス仲介表面抗原FAS又はApo-1抗原又はCD95とも呼ばれ（Swiss-Prot Entry No.P25445での発表を参照）; 
・デコイ受容体3(DcR3)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー6B (TNFRSF6B)、或いはFASリガンド又はM68のデコイ受容体とも呼ばれ(Swiss-Prot Entry No.O95407での発表を参照)； 
・CD27抗原(CD27)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー7(TNFRSF7)或いはT-細胞活性化抗原S152(S152)とも呼ばれ(OMIM*602250での発表参照)；
・リンパ性活性化抗原CD30(CD30)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー8(TNFRSF8)とも呼ばれ(OMIM*153243での発表参照)、
・リンパ球活性化による誘導(ILA)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー9(TNFRSF9)又はCD137とも呼ばれ(OMIM*602250での発表を参照)；
・デスレセプター4(DR4)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー10A(TNFRSF10A)、或いはTNF-関連アポトーシス-誘導リガンド受容体1(TRAILR1)又はAP02とも呼ばれ(OMIM*603611での発表を参照)；
・デスレセプター5(DR5)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー10B(TNFRSF10B)、或いはTNFに関連したアポトーシス-誘導リガンド受容体2(TRAILR2)又はキラー/DR5又はTRICK2とも呼ばれ(OMIM*603612での発表を参照)；
・デコイ受容体1(DCR1)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー10C(TNFRSF10C)、或いはTNF-関連アポトーシス-誘導リガンド受容体3(TRAILR3)、又は 細胞内ドメイン(TRID)が存在しないTRAIL受容体とも呼ばれ(OMIM*603613での発表を参照)；
・デコイ受容体2(DCR2)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー10D(TNFRSF10D)或いはTNFに関連したアポトーシス-誘導リガンド受容体4(TRAILR4)又は円錐台(Truncated)デスドメイン(TRUNDD)を有するTRAIL受容体とも呼ばれ(OMIM*603014での発表参照)；
・NF-KAPPA-B (RANK)の受容体活性化因子は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー11A(TNFRSF11A)、或いは破骨細胞分化因子受容体(ODFR)又はPDB2又はTRANCERとも呼ばれ(OMIM*603499での発表を参照)；
・オステオプロテゲリン(OPG)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー11B(TNFRSF11B)又は破骨発生(Osteoclastogenesis)阻害因子(OCIF)とも呼ばれ(OMIM*602643での発表を参照)；
・デスレセプター3(DR3)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー12(TNFRSF12)、又はAP03又はリンパ球に関連した死の受容体(LARD)とも呼ばれ（OMIM*603366での発表を参照）；
・膜貫通活性化因子及びCaml相互作用因子(TACI)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー13B(TNFRSF13B)とも呼ばれ(OMIM*604907での発表を参照)；
・BAFF受容体(BAFFR)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー13C(TNFRSF13C)、又はB細胞活性化因子受容体とも呼ばれ(OMIM*606269での発表を参照)；
・ヘルペスウィルス侵入メディエーター(HVEM)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー14(TNFRSF14)、又はヘルペスウィルス侵入メディエーターA (HVEA)又はTR2とも呼ばれ(OMIM*602746での発表を参照)；
・神経成長因子受容体(NGFR)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、16(TNFRSF16)又はp75(NTR)とも呼ばれ(OMIM*162010での発表を参照)；
・B-細胞成熟因子(BCMA)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー17(TNFRSF17)又はBCMとも呼ばれ(OMIM*109545での発表を参照)；
・グルココルチコイドで誘導されるTNFR関連遺伝子(GITR)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー18(TNFRSF18)、或いは活性化を誘導し得るTNFRファミリーメンバー(AITR)とも呼ばれ(OMIM*603905での発表を参照);
・TRADEは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー19(TNFRSF19)、或いは毒性及びJNKインデューサー又はTROY又はTAJとも呼ばれ(Swiss-Prot Entry No.Q9NS68での発表を参照)；
・X連鎖Ectodyplasin-A2受容体(XEDAR)は、EDA-A2受容体とも呼ばれ(Swiss-Prot Entry No.Q9HAV5での発表を参照)、そして
・デスレセプター 6(DR6)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー21(TNFRSF21)とも呼ばれる(OMIM*605732での発表を参照)。
【００１４】
本発明の好適に態様によれば、TNF-結合タンパク質は、組換えh-TBP-1(Nophar等の20-180アミノ酸フラグメントに相当するアミノ酸配列を含む、ヒトTNF受容体-1の組換え細胞外可溶性フラグメント)及び組換えh-TBP-2(Smith等の23-257に相当するアミノ酸配列を含む、TNF受容体-2の組換え細胞外可溶性フラグメント)から選定される。最適には、組換えhTBP-1(r-hTBP-1)である。他の全てのタンパク質のために、可溶性細胞外ドメインは対応するSwiss-Prot entryに示されている。
【００１５】
本発明の他の好適な態様によれば、TNF-結合タンパク質の精製方法は、“捕捉ステップ”として“IMAC”ステップを含み、そして更に“中間ステップ”として以下の：酸性ｐH(好適には3から4の間)でのイオン交換クロマトグラフィー(IEC)、引き続き塩基性ｐH(好適には8から10の間)でのイオン交換クロマトグラフィーのステップ、を含んで成る。
【００１６】
本発明の更なる好適な態様によれば、TNF-結合タンパク質の精製方法は、更に“研磨ステップ”として疎水性相互作用クロマトグラフィー (HIC)を含んで成る。
【００１７】
更に好適には、上記それぞれのクロマトグラフィーのステップは、引き続き限外ろ過される。
【００１８】
本発明による“捕捉ステップ”とは、組換えTNF-結合タンパク質を含む組換え宿主細胞培養を粗採取した上澄液から組換えTNF-結合タンパク質を単離し、そして濃縮する間のステップを意味する。この開始ステップの最後での高い収率は、工程全体の実施及び収率において大きなインパクトを有する。本発明によれば、捕捉ステップはCu-キレートFFで実施され、好適には、pＨ3.0での溶出により、純度＞40％及び回収＞80％を有する生成物を産する。
【００１９】
“中間ステップ”とは、他のタンパク質及び核酸、内毒素及びウィルスのようなバルク不純物の多くが除去される間のステップである。
【００２０】
“研磨ステップ”とは、高い純度のタンパク質を得るために、任意の残留(remaining)微量不純物又は緊密に関連する物質を除去する間のステップである。
【００２１】
“イオン交換クロマトグラフィー”(IEC)は、非常に高い解像度の分離を与えることを課すために、ほんの軽度の差異を有する分子の分離を可能にする。フラクションは精製され、濃縮されたフォームで収集される。分離は、帯電した分子、及び対向して帯電したクロマトグラフィー媒体との間の可逆的相互作用に基づく。それらがカラム上に負荷された時に分子は結合する。条件がその後変化するので、結合した物質が差異的に溶出する。溶出は、通常塩濃度又はｐＨを変化させることにより実施する。変化は段階的、又は連続的な勾配とする。Qセファロース又はSPセファロースカラムが、一般的にイオン交換クロマトグラフィーに用いられる。“Qセファロース”は、第四アンモニウム強力アニオン交換体(帯電基：-N+(CH3)3)であるが、“SPセファロース”はスルホプロピル強カチオン交換体(帯電基:-SO3-) である。
【００２２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、それらの表面疎水性における差異に基づく生体分子の精製及び分離のための用途の広い方法である。タンパク質及びペプチドは、通常分子の表面から離れたドメインにおける疎水性アミノ酸を隔離する。しかしながら、親水性と考えられる多くの生体分子は、クロマトグラフィーマトリックスへ結合した疎水性リガンドの相互作用を許容するため露出された疎水性基を十分に有する。逆相クロマトグラフィーと比較して、マトリックス上のリガンドの密度はかなり低い。
【００２３】
この特徴はHICの高い選択性を促進させる一方、生物学的活性の保持に役立つ穏やかな溶出条件を許容する。“ブチルセファロース”カラムは、好適には疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)ステップにおいて本発明に従って用いられる。本カラム上においてn-ブチル基は疎水性リガンドとして使用される。
【００２４】
本発明によれば、TNF-結合タンパク質は真核細胞、好適には哺乳動物細胞において組換えDNA技術によって生産される。それらを生産するための組換え方法を完全にするため、以下に報告する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
当該方法の開始ステップでは、所望されるタンパク質をコードするDNA配列を適切なプラスミド中へ挿入し、そして結紮する。一度形成されると、発現ベクターは適切な宿主細胞へ導入され、その後、宿主細胞は所望されるタンパク質を生産するためにベクターを発現する。
【００２６】
本発明の任意の組換えタンパク質の発現は、本明細書で述べた通り、適切な発現ベクターを用いて真核細胞(例えば酵母、昆虫又は哺乳動物細胞)又は原核細胞においてもたらすことができる。当業界において任意の公知方法を使用することができる。 
【００２７】
例えば、任意の上記方法により得られたタンパク質をコードするDNA分子は、当業界における周知技術により(Sambrook等,1989参照)、適宜構築された発現ベクター中へ挿入される。２本鎖cDNAは、ホモ多量体尾部により、或いは合成DNAリンカー又は平滑末端化(blunt-ended)結紮技術の使用を包含する制限連結によりプラスミドベクターへ連結され：DNAリガーゼはDNA分子を結紮するために使用され、そして所望されない結合はアルカリホスファターゼによる処理により回避される。
【００２８】
所望されるタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターは、遺伝子発現及びタンパク質生産を許容するように、所望されるタンパク質をコードするDNAに連結した転写及び翻訳調節情報を含む特異的核酸配列も含むべきである。最初に遺伝子が転写されるため、ポリメラーゼが結合して転写過程を開始させるRNAポリメラーゼにより認識され得るプロモーターが先行していなくてはならない。使用されるかかるプロモーターは多種存在し、それらは様々な効力で作用する (強い、そして弱いプロモーター)。
【００２９】
真核細胞宿主のために、天然の宿主に依存する様々な転写及び翻訳調節配列を使用してよい。それらは、調節シグナルが高いレベルでの発現を有す特定の遺伝子と関連するアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、Simian ウィルス等のような、ウィルス起源由来でよい。例示すると、ヘルペスウィルスのTKプロモーター、SV40初期プロモーター、酵母gal4遺伝子プロモーター等 である。転写開始調節シグナルは、抑制及び活性化を許容するものから選定してよく、それ故に遺伝子の発現を調節することができる。
【００３０】
本発明のハイブリッドタンパク質をコードする核酸配列を含むDNA分子は、作用可能式に連結した転写及び翻訳調節シグナルを有するベクター中へ挿入される。これらのベクターは宿主細胞中へ所望される遺伝子配列を組み込むことを可能にする。導入されたDNAにより安定的に形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選定を可能にする1以上のマーカーを導入することによっても選定され得る。マーカーは、栄養素要求株宿主から光合成生物への変化、殺生物剤耐性、例えば抗生物質又は銅等の重金属に対する耐性を提供してもよい。選定され得るマーカー遺伝子は、発現されるDNA遺伝子配列へ直接連結させる、又は共感染により同一の細胞中へ導入させる、のいずれも可能である。本発明のタンパク質の最適な合成のために、追加の要素を要求してもよい。
【００３１】
特定のプラスミド又はウィルスベクターを選定する重要なファクターは：ベクターを含む受容細胞が、そのベクターを含まないそれらの受容細胞から、認識及び選定され易いこと；特定の宿主において所望されるベクターのコピーの数；そして様々な種の宿主細胞間でベクターを“往来する(shuttle)”ことが可能であることが所望されるか否か、を含む。
【００３２】
一度DNA構造物を発現するために調製された構造物を含むベクター又はDNA配列を、任意の様々な、適した手段、即ち：形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム-沈殿、直接的マイクロインジェクション等、により適宜宿主細胞へ導入してよい。
【００３３】
宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれでもよい。好適には真核細胞宿主、例えば、ヒト、サル、マウス、及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のような哺乳動物細胞であり、なぜならそれらは、正確なフォールディング又は正確な位置での糖化を含む、タンパク質分子への翻訳後修飾を提供するからである。また酵母細胞は糖化を含む翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。組換えDNA戦略の多くは、強力なプロモーター配列及び酵母中の所望されるタンパク質の生産のために利用することができるプラスミドの多くの数のコピーを利用するものである。酵母はクローン化された哺乳動物の遺伝子生産物上のリーダー配列を認識し、そしてリーダー配列を担持するペプチドを分泌する(即ちプレ-ペプチド)。
【００３４】
ベクターの導入後、宿主細胞は、ベクターを含む細胞の成長を選択する選択培地で成長させる。クローン化された遺伝子配列の発現は、所望されるタンパク質の生産物をもたらす。
【００３５】
そのようにして得られた組換えタンパク質の精製は、本発明の方法に従って実施される。
【００３６】
本発明の非常に詳細な態様を本明細書の以下の部分に示し、そして図１において図式化して要約する。
【００３７】
略語
TNF      腫瘍壊死因子
TBP      TNF結合タンパク質
IDA      イミノ二酢酸
Cu-キレートFF      銅-キレートFast  Flow
Q-SEPH. FF      Q-セファロースFast  Flow
SP-SEPH. FF      SP-セファロースFast  Flow
ブチル-SEPH FF      ブチル-セファロースFast  Flow
IEC      イオン交換クロマトグラフィー
ACN      アセトニトリル
CBB      クーマシーブリリアントブルー
DNA      デオキシリボ核酸
EtOH      エタノール
HIC      疎水性相互作用クロマトグラフィー
IEF      等電点電気泳動法
IEMA      免疫-酵素測定(EnzymoMetric)アッセイ
IFMA      免疫蛍光測定(Fluorimetric)アッセイ
IPC      プロセスコントロール
KD      キロダルトン
LOQ      定量限界
OD      最適密度
PI      等電点
RP-HPLC      逆相高速液体クロマトグラフィー
SDS-PAGE 又は SDS      ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法
SE-HPLC      サイズ排除高速液体クロマトグフラフィー
SMW      標準分子重量
SS      硫酸ナトリウム
トリス      トリス(ヒドロキメチル)アミノメタン
BV      層容積
【実施例】
【００３８】
原料
装置
クロマトグラフィーカラムXK26/20 (2.6x20cm)       ファルマシア
クロマトグラフィーカラムXK50/20(5x20cm)       ファルマシア
ぜん動ポンプMiniplus 2       Gilson 
ぜん動ポンプP-1       ファルマシア
チャートレコーダー2210       ファルマシア
UV検出器 Uvicord 2158       ファルマシア
オンラインpH-伝導率モニター       Biosepra 
低圧クロマトグラフィーシステム FPLC       ファルマシア
HPLC 分析システム       メルク
蛍光測定(Fluorimetric)検出器 mod. 9070       Varian 
冷凍ボックス MCF 1500       Angelantoni 
U.V 分光光度計 UV1204       島津
限外ろ過システム mod. Minitan       Millipore 
Minitan plates 4/K       Millipore 
Stirred cell mod. 8400       Amicon 
Stirred cell mod. 8050       Amicon 
限外ろ過膜 タイプYM10       Amicon 
限外ろ過膜 タイプYM10       Amicon 
【００３９】
樹脂及びカラム
SP セファロース FF       ファルマシア
Q セファロース FF       ファルマシア
ブチル セファロース FF       ファルマシア
キレート化 セファロース FF       ファルマシア
SP セファロース 大ビーズ       ファルマシア
フェニル セファロース 6 FF (high sub)       ファルマシア
CM セファロース FF       ファルマシア
DEAE セファロース FF       ファルマシア
DEAE-HyperD       Biosepra 
Supelcosil LC-308 0.46x5       Supelco 
Aquapore RP-300 Brownlee       Applied Biosystem 
TSK-G2000SWXL 0.78x30       TOSO-HAAS
Mono-Q HR 5/5       ファルマシア
【００４０】
化学物質
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン(トリス)       メルク
塩化ナトリウム       メルク
オルト-リン酸 85%       メルク
水酸化ナトリウム(ペレット)       メルク
リン酸水素ニナトリウム       メルク
リン酸二水素ナトリウム       メルク
無水エタノール       メルク
アセトニトリル(ACN)       メルク
トリフルオロ酢酸(TFA)       Baker 
50% 水酸化ナトリウム       Baker 
硫酸ナトリウム       メルク 
硫酸銅       メルク
塩化亜鉛       メルク
塩酸 37%       メルク
1-プロパノール cod. 1024       メルク
エチレンジアミノ４酢酸 (EDTA)       メルク
硫酸アンモニウム       メルク
【００４１】
生物学的物質 
r-hTBP-1 粗採取物      INTERPHARM LABORATORIES LTD.
TBP-1 クローン18に対するMcAb       INTERPHARM LABORATORIES LTD. 
アルブミン標準品 cod. 2321       Pierce 
r-hTBP-1(Onercept)の精製はここに詳細に発表されるであろう。
【００４２】
ステップ1−捕捉ステップ
緩衝剤及び溶液の説明
【００４３】
緩衝剤を添加した樹脂
32ｇの硫酸銅を900mLの精製水に溶解し、そして溶解後、容積を１リットルにする。
【００４４】
酸性化水
0.5mlの酢酸を１リットルの水に付加する。 
【００４５】
平衡緩衝剤
1.68±0.1mLの85％オルト-リン酸及び11.68±0.1ｇのNaClを900mLの精製水に溶解し、pＨを50％NaOH溶液で6.8±0.1に調整し、そして容積を１リットルにする。 
【００４６】
洗浄液
1リットルの精製水を洗浄液として用いる。
【００４７】
溶出緩衝剤（pH2.8から3.2の範囲で試験された) 
6.75±0.5mlの85％オルト-リン酸及び5.84±0.1ｇNaClを900mlの精製水に溶解し、pHを50％NaOH溶液で3±0.1に調整し、そして容積を１リットルにする。得られる伝導率は、15±1mSである。
【００４８】
再生緩衝剤
18.61±0.1ｇEDTA及び58.4±1ｇNaClを900mlの精製水に溶解し、そして容積を１リットルにする。
【００４９】
溶液の殺菌消毒
40ｇNaOHを900mlの精製水に溶解し、そして容積を１リットルにする。
【００５０】
溶液の保存
20％のエタノール又は0.01ＭのNaOHを保存溶液として使用する。
【００５１】
カラム調整
8±1mLのキレート化セファロースFast Flow(Amersham Biosciences)をイミノ二酢酸樹脂と結合させ、そして層高が4±0.5cmとなるようにクロマトグラフィーカラム中へ充填する。充填したカラムを10 BVの酸性化水で洗浄し、そしてその後2 BVの0.2M硫酸銅pH4-4.5を負荷する。製造業者の指示に従い、2-3mMの酢酸ナトリウムpH4-4.5溶液は硫酸銅の溶解を促進させるため、そして中性ｐＨでの沈殿を回避するために使用される。当該樹脂をその後10BVの酸性化水で洗浄する。
【００５２】
手順
４℃で保存するr-hTBP-1(組換えTNF-結合タンパク質-1)を含む粗採取物を室温にし、；pHを８５％オルト-リン酸を滴下付加することにより6.8に調整し、そして固形NaClを付加することにより伝導率を21±1 mSにする(銅とr-hTBP-1の相互作用へネガティブに影響し得る培地成分を除去するため、粗採取物を濃縮相の事前の限外ろ過の後、適用させることもできる)。
【００５３】
上記の通り調整したカラムを15-20 BVの 平衡緩衝剤と共にフラッシュすることにより最初の平衡が起こり、そしてその後r-hTBP-1の粗採取物を、室温(22±3℃)及び200mL/sqcm/時間の線形性流動率で操作することにより負荷する。
【００５４】
カラムをUVシグナルがベースラインに到達するまで最初の平衡緩衝剤で洗浄し、そしてその後12-15 BVの水で洗浄し、そしてカラム流出物を捨てる。
【００５５】
溶出は溶出緩衝剤により実施し、そして溶出物の収集はUVシグナルが検出された時に開始する。r-hTBP-1の溶出は、5-6 BVの溶出緩衝剤により達成される。半精製されたr-hTBP-1を含む溶出物を収集し、そして-20℃で保存する。
【００５６】
カラムは3 BVの再生産緩衝剤により再生産し、そしてカラム溶出物を捨てる。その後、当該カラムを5 BVの殺菌消毒した溶液で殺菌消毒する。
【００５７】
保存のため、カラムを5 BVの保存溶液で洗浄し、そしてその中で保存する。
【００５８】
本ステップ後の精製データを後述の表１に要約する。
【００５９】
捕捉ステップの遂行(Zn2+IMACとの比較)
捕捉ステップは元来Zn2+-キレートIMACカラム上で実施された。しかしながら粗r-hTBP-1のための捕捉ステップの負荷受容能は非常に低いことが考慮に入れられた(250-300 mcg r-hTBP-1又は粗採取物の40カラム容積／樹脂のｍL)。帯電金属として亜鉛を銅で置き換えることによって、負荷受容能の著しい増加が得られた。このCu2+MAC捕捉ステップ の間、r-hTBP-1は樹脂と結合し、混入タンパク質の多くが結合していないフラクションの中に溶出され、そして半精製されたr-hTBP-1が後のステップのために適した純度レベルで溶出物中において得られる。
【００６０】
選定された条件により、結合能において要求される改良がいくつかの他の利点と共に達成された。本発明に関連する最も意味のある結果を以下に要約する。
【００６１】
金属キレートクロマトグラフィーにより遂行されるr-hTBP-1の捕捉ステップは、 以下の特徴を見せる: 
1．濃度：粗採取物と比較してr-hTBP-1の25-30倍の濃度(表1参照)。
2．精製：当該ステップは表１に示す通り、混入物の減少に有効である。
3．スケール能：当該方法はスケールアップ及び製造スケールに適する。
4．生産能：当該ステップの回収は、表２において示される通り十分なものである。
【００６２】
更に当該ステップは非常に迅速であり、再生産でき、そして実施しやすい。当該樹脂は適宜殺菌消毒及び再添加の後に再利用できる。
【００６３】
更に、Zn2+を超えるCu2+の使用の主な利点は、以下に要約することができる：
・より高い負荷受容能：1mLのCu-樹脂が1-1.2 mgのr-hTBP-1と結合する（それに対しZn樹脂は0.25- 0.5 mg/ml）；
・表２に示す通り、Cu-樹脂の捕捉ステップ後の原料の純度レベルの改良は、Zn-樹脂の30-35％から、40-50％を得た(定量的RP-HPLC)。
・作動時間及び緩衝剤の消費の減少を伴う、Zn-樹脂の３ステップからCu-樹脂の１ステップへの洗浄ステップの数の減少。
【００６４】
【表１】
2006517187.tif 000003
【００６５】
ステップ２−SPセファロースFF上でのイオン交換クロマトグラフィー
緩衝剤及び溶液の説明
【００６６】
平衡緩衝剤
1.68mlの85％オルト-リン酸及び17.53ｇのNaClを撹拌しながら900ｍLの水に付加する。pHを50％NaOHで3.0±0.1に調整し、そして容積を１リットルに調整する。
【００６７】
洗浄緩衝剤
0.68mlの85％オルト-リン酸を撹拌しながら900 mlの水に付加する。pHを50％NaOHで4.0±0.1 に調整し、そして容積を１リットルに調整する。
【００６８】
溶出緩衝剤
3.37mlの85％オルト-リン酸及び17.53ｇのNaClを撹拌しながら900 mlの水に付加する。pHを50％NaOHで 4.0±0.1に調整し、そして容積を１リットルに調整する。
【００６９】
再生産緩衝剤
3.37 mLの85％オルト-リン酸及び116.8ｇのNaClを撹拌しながら900 mLの水に付加する。pHを50％NaOHで6.0±0.1に調整し、そして容積を１リットルに調整する。
【００７０】
殺菌消毒溶液
20ｇのNaOHを撹拌しながら900 mLの水に溶解し、そして容積を１リットルに調整する。
【００７１】
保存溶液
200 mlの無水エタノールを撹拌しながら800 mlの水に再付加する。
【００７２】
カラム調整
カラムは6-6.5cmの層高まで、製造業者の指示に従い、SP-セファロースFF樹脂を充填する。
【００７３】
当該カラムは3 BVのNaOH 0.5M をフラッシュすることにより、引き続き3BVの水をフラッシュすることにより殺菌消毒する。
【００７４】
当該カラムは4-5 BVの平衡緩衝剤をフラッシュすることにより平衡化される。カラム溶出物のpH及び伝導率をチェックし(pH3.0±0.1、伝導率29.5±0.5mS/cm)、そして当該カラムは、最終的に測定された数値が示された範囲内にない場合、更に平衡化される。
【００７５】
NB：或いは、平衡緩衝剤をNaClなしの25mMリン酸緩衝剤pH 2.8±0.1によって置き換えることができ；洗浄緩衝剤を除去することができ；再生産緩衝剤をNaCl 1.5Mに置き換えることができ；そして保存溶液を10mM NaOHによって置き換えることができる。
【００７６】
手順
全ての操作は2-8℃の温度、及び40-50 ml/cm/時間の流動率で実施する。
【００７７】
捕捉ステップでの溶出から得たr-hTBP-1の凍結物を室温又は６±２℃のいずれかで解凍する。８５％リン酸を付加することによりpHを3.7±0.2 から3±0.1に調整し、そして固形塩化ナトリウムを付加することにより伝導率を14±3mS/cmから22±3mS/cmに調整し、そして当該溶液をカラムへ負荷する。負荷完了後、カラムを3 BVの平衡緩衝剤によりフラッシュし、引き続き4 BVの洗浄緩衝剤でフラッシュする。或いは、洗浄緩衝剤による洗浄は、除去することができる(上記NBを参照)。
【００７８】
その後、溶出緩衝剤による溶出を開始する。180-220mlの後にr-hTBP-1の溶出を開始する。この最初の部分を捨て、そして引き続き収集した半精製r-hTBP-1が存在する3.5 BVを捨てる。溶出したフラクションをIPCのためにサンプル化 (5×0.5 ml)し、そして6±2℃で長くても３日保存する。
【００７９】
溶出完了後、カラムを約3BVの再生産緩衝剤でフラッシュする。フラクション(1×1 mL)をサンプル化し、それを捨てる。
【００８０】
保存のため、カラムを3BVのEtOH 20％(或いは10mM NaOH)でフラッシュし、そして 6±2℃で保存する。
【００８１】
本ステップの７つの実験結果は以下の表２である。
【表２】
2006517187.tif 000004
【００８２】
以下の表３は、IMACとSP-セファロースFFとの組み合わせステップの実行を示す。
【表３】
2006517187.tif 000005
【００８３】
ステップ３−SP 溶出液 限外ろ過
手順
全ての操作は室温(23±3℃)で実施する。
NaOH中で保存される限外ろ過フィルターをpH 7.0±0.5になるまで水で洗浄する。膜を集合させた限外ろ過フィルターにr-hTBP-1溶液を負荷する。当該溶液を50 mlまで濃縮する。保持するフラクションを200mlの水で希釈し、そして再び50mＬへ濃縮する。上記洗浄ステップを３回以上繰り返す。
【００８４】
浸透物の伝導率をチェックする：仮にそれが＜0.5 mS/cmならば、以下のステップを開始する。
【００８５】
仮に伝導率の数値が＞0.5 mS/cmならば、本洗浄ステップをもう一度繰り返す。 
【００８６】
200mlの50mMトリス(pH 9.0±0.1及び伝導率0.55±0.1 mS/cm)を保持するフラクションへ付加し、そして50 mlの溶液になるまで再び濃縮する。
【００８７】
上記操作を３回繰り返し、そしてもし必要ならば、浸透物フラクションのpＨ及び伝導率がそれぞれ9.0±0.2及び0.55±0.1mS/cmになるまで継続する。
【００８８】
保持するフラクションを収集し、そして限外ろ過フィルターを洗浄フラクションを付加した100mlの50 mMトリス(pH 9.0±0.1及び伝導率0.6±0.1 mS/cm)を３回に分割して洗浄する。
【００８９】
限外ろ過フィルターを長くても30分間再利用することによって0.1M NaOH(或いは、0.5M NaOH)により洗浄及び殺菌消毒する。限外ろ過フィルターに浸透するまでpH 7.0±0.5の水ですすぐ。限外ろ過フィルターをその後、0.01M又は0.05MのNaOH中で、23±3℃で保存する。
【００９０】
ステップ4−Q-セファロースFFにおけるイオン交換クロマトグラフィー
緩衝剤及び溶液
平衡緩衝剤：50mMトリスpH 9.0±0.1、伝導率0.55±0.1 mS/cm
溶出緩衝剤：250mMトリスpH 9.0±0.1、50 mM NaCl 伝導率7.2±0.5 mS/cm
再生産緩衝剤：250mM トリスpH 6.0±0.1、2M NaCl、或いは1.5M NaCl
殺菌消毒溶液：0.5M NaOH
保存溶液：20％ エタノール又は10mM NaOH。
【００９１】
手順
全ての操作は以下の条件下で実施する：
温度：2-8℃、又は室温；線形性流動率：80-90ml/cm2/時間
【００９２】
限外ろ過後のr-hTBP-1のpＨをチェックし、そして仮にpH が9.0±0.1と異なる場合、1Mトリス又は3M HClで調整する。伝導率もまたチェックする。
【００９３】
カラムにはQ-セファロース FF樹脂を、製造業者の指示に従って、13cm層高まで充填する。
【００９４】
Q-セファロースカラムを、その後3 BVのNaOH 0.5 Mでフラッシュし、引き続き6 BVの水でフラッシュすることにより殺菌消毒する。その後カラムを4 BVの溶出緩衝剤でフラッシュし、そして7-8 BVの平衡緩衝剤により平衡化させ、カラム溶出物のpH及び伝導率をチェックする(pH 9.0±0.2、伝導率 0.55±0.1 mS/cm)。カラムの平衡化は、測定された数値が提示された範囲内にないものであるならば、連続して実施する。
【００９５】
その後、上記の通り調製したr-hTBP-1 を限外ろ過しカラムに負荷する。 負荷完了後、当該カラムを3 BVの平衡緩衝剤によりフラッシュする。
【００９６】
溶出は、溶出緩衝剤により開始する。１BV後、純粋なh-hTBP-1が溶出し始め；r-hTBP-1の収集は、クロマトグラフィープロファイルに従って、最初のBVの後に開始し; その後の溶出は5-6 BV後に完了する。
【００９７】
カラムを3BVの再生産緩衝剤でフラッシュし、サンプル(1×1ml)をとった後捨てる。カラムを再び3BVの0.5M NaOHでフラッシュし、溶液のpHが７から8になるまで水ですすぐ。最終的に当該カラムを3 BVのEtOH 20％でフラッシュし、そして2-8℃で保存する。
【００９８】
ステップ５−DV50 PALLにおけるナノろ過
ステンレススチール支持体をディスクホルダーにインストールし、そしてDV50 フィルター(直径47 mm)を支持体上に置く。Pall Ultipor（登録商標）VF Grade DV50はフィルターカートリッジであり、ウィルス除去のために通常用いられる。数滴の水をディスク上に付加する。適したシールをインストールし、そしてディスクホルダーを密閉する。当該システムは50mlのQ溶出緩衝剤で満たされ、閉じられ、そして窒素源へ接続される。
【００９９】
窒素フラッシュの開始時は、0.5 barの開始圧で開放し、そしてその後、ディスクホルダー上に位置する通気孔バルブを、システムを消去するために開放する。
【０１００】
液体の最初のしずくがディスクホルダー上の通気孔バルブに現れるとすぐに、通気孔バルブを密閉し、そして窒素を好都合な圧力である3.0-3.5 barで開放する。
【０１０１】
その後、膜が湿式であること、そして空気が除去されていることを保障するため、膜を、全ての50 mlの緩衝剤でフラッシュし、仮に膜のシート間に残存しているならば、フィルター上の整合性検査を実施する。
【０１０２】
当該システムは前ステップからの原料で満たされ、そして以下の通り操作される：ろ過の開始時において窒素を0.5 barの開始圧で開放し、そしてその後、ディスクホルダー上に位置する通気孔バルブをシステムを消去するために開放する。溶液の最初のしずくが現れるとすぐにディスクホルダーの通気孔バルブを閉じ、そして窒素を1.5-2.5 barの圧力で開放する。
【０１０３】
窒素圧を1.5-2.5 barに保ち、そしてその後当該溶液をろ過する。
【０１０４】
ろ過された溶液を容器に収集し、そしてろ過終了時に、窒素源を閉鎖し、そして過剰な窒素ガスを除去するために通気性バルブを開放する。
【０１０５】
ろ過終了時において、当該システムを前ステップでの5-10 mLの溶出緩衝剤で、同一の操作圧である1.5-2.5 barで洗浄する。
【０１０６】
当該洗浄溶液をろ過した溶液と同一の容器に収集し、そしてIPCのためサンプルをとる。
【０１０７】
ステップ６−ブチルセファロースFFでの疎水性相互作用
緩衝剤及び溶液
平衡緩衝剤：200 mM トリス-HCl pH 7.5±0.1、1M Na2SO4 伝導率90±5mS/cm
溶出緩衝剤：200 mM トリス-HCl pH 7.5±0.1、0.7M Na2S04、伝導率75±5 mS/cm
再生産溶液：精製水
殺菌消毒溶液：1M NaOH 
保存溶液：20％ エタノール又は10 mM NaOH 
【０１０８】
手順
全ての操作は、23±3℃の温度、及び80-90 ml/cm/時間の線形性流動率で実施する。固形Na2SO4を撹拌しながら、1 Mまで、100 KD 限外ろ過後、Q-セファロース溶出物へ付加する。塩の溶解が終了した後、3M HClによりpHを7.5±0.1へ調整する。カラムをその後、3BVのNaOH 1Mでフラッシュし、引き続き4BVの精製水でフラッシュする。
【０１０９】
カラムを再び5-6 BVの平衡緩衝剤でフラッシュする。溶出物のpH及び伝導率(pH 7. 5±0.2、伝導率90±5 mS/cm)をチェックし、そして測定した数値が提示した範囲にない場合は、カラムの平衡を継続して実施する。
【０１１０】
上記の通り調製した溶液をカラム上へ負荷し、そして負荷終了後、カラムを3BVの平衡緩衝剤で洗浄する。平衡緩衝剤での洗浄を継続する。
【０１１１】
2-3 BVの洗浄後、タンパク質が溶出し始める。このフラクションはr-hTBP-1を細胞培養混入物により混入された、およその合計の10-12％含む。この洗浄はタンパク質溶出物がブロードピークを与えるプラトーに達するまで延長する(約2BV)。
【０１１２】
その後、溶出緩衝剤による溶出を開始する。最初の1-2 BVは、少量の混入物を含むから洗浄サンプルと共に保存し、そしてその後速やかにr-hTBP-1の収集を開始する。
【０１１３】
混入した原料及び溶出物を更に2.5-3 BVで溶出を続けた後、精製r-hTBP-1を速やかに溶出する。UV吸収が最大の0.5％に達する時、収集を停止する。r-hTBP-1の収集後、当該フラクション(5×O.5mL)をサンプル化し、そしてそれを2-8℃で長くても３日間保存する。
【０１１４】
カラムを3 BVの精製水でフラッシュして、そしてフラクションを収集する。
【０１１５】
カラムを3 BVの1M NaOHで殺菌消毒し、そしてpH7から8の間の流出物になるまで水ですすぐ。
【０１１６】
その後カラムを再び３カラム容積の20％エタノールでフラッシュし、そして長くても２週間室温で保存する。
【０１１７】
ステップ７−10KD 限外ろ過
膜により集められた、撹拌した細胞タイプ8400をブチル-セファロース溶出物と共に負荷する。当該溶液を、3 barsの窒素圧下で約25 mlに濃縮する。保持するフラクションを約100 mlの水で希釈し、そして25mlへ再び濃縮する。上記洗浄ステップを更に３回繰り返す。浸透物の伝導率をチェックし：それが＜0.3 mS/cmならば、その後以下のステップを開始することができる。伝導値が＞0.3mS/cmならば、洗浄ステップを繰り返すべきである。
【０１１８】
100 mlのバルク緩衝剤を保持するフラクションへ付加し、そして再び25mlの溶液になるまで濃縮する。この操作を３回繰り返し、そして必要ならば、浸透物のフラクションがそれぞれpH及び伝導率が7.1±0.2及び5.8±0.2 mS/cmになるまで繰り返す。
【０１１９】
保持するフラクションを捨て、そしてより小さい限外ろ過撹拌細胞タイプ8050を負荷し、膜で集める。保持物（The retentate）を最小容積に濃縮する(約3-5ml)。保持するフラクションを収集し、そしてバルクにより限外ろ過フィルターを濃縮したr-hTBP-1への洗浄フラクションを付加することにより洗浄する。最終的な容積をOD 280 nm(ε= 0.71)によって、約20-30 mg/mlの最終濃度を得るために調整する。 
【０１２０】
限外ろ過フィルターを、少なくとも３０分間再利用による0.2M NaOHで洗浄し、そして殺菌消毒する。限外ろ過フィルターを、その後、浸透物のpHが7.0±0.5になるまで水ですすぐ。当該限外ろ過フィルターをその後、0.01 M NaOH中、6±2℃で保存する。
【０１２１】
ステップ８−精密ろ過
使い捨てシリンジを0.22μのフィルターへ接続し、r-hTBP-1 濃縮溶液で満たし、ろ過し、そして1 mlバルク緩衝剤（ろ過したバルクによる洗浄物を貯蔵することによる）で２回洗浄する。得られた溶液を分析検査のためサンプル化し(15×0.2 mL)、そして-20℃で保存する。
【０１２２】
定量における結果は申し分のないものであり、そして純度の観点については、本工程（流出）の再現性を反映する十分の数の結果を、以下の表に示す(表4から6)。
【０１２３】
本発明の最も重要な工程は、Cu+2キレートカラム上の開始クロマトグラフィーステップである。更に、酸性ｐHでのSP セファロースクロマトグラフィーと次の塩基性ｐHでのQ セファロースとの組み合わせも重要である。それらの条件において、著しく良好な結果はr-hTBP-1(Onercept)のCHO産物からの粗採取物をかけることにより得られた。特に捕捉ステップでは、効果的に混入物を減少させるためにr-hTBP-1を25-30倍に濃縮することが可能であり、タンパク質の十分な回収率を有し、そして工業製品のスケールとすることができることを示した。
【０１２４】
更にいっそう驚くべきは、重要な精製データは、以下に示すように、開始原料が血清を含む細胞培養からの粗上清液である時、そしてそれが血清不存在培養から来る時、の両方で得られるという事実である。
【０１２５】
【表４】
2006517187.tif 000006
【０１２６】
【表５】
2006517187.tif 000007
【０１２７】
【表６】
2006517187.tif 000008
【０１２８】
分析プロトコール
1. 定量的RP-HPLC-作動手順
以下の方法は、全ての精製サンプルにおいてr-hTBP-1を定量するために使用した。それは、水性TFA及びn-プロパノールを有す C8カラムを使用し；r-hTBP-1と細胞培養混入物との間の良好な解像度が得られる。rhTBP-1は、カラムバッチに依存して１又は２のピークを解像することができる。当該手順はここより以下に記載する。
【０１２９】
1.1 装置及び原料及び方法
- 分析的HPLC システム(メルク又は同等物) 
- ダイナミック ミキサー(メルク又は同等物) 
- カラム：SUPELCOSIL LC-308φ0.46×5cm-cod 5-8851-Supelco 
- 溶離液 A：0.1 % 水性 TFA
- 溶離液 B：水/n-プロパノール 50：50中、0.1% TFA
- 溶離液 C：アセトニトリル
- 温度：23±3℃ 
- UV 検出：214 nm 
- 注入時間：62 分
- 注入容積：10-100μL
- 標準品：10及び20μLで注入されたOD 280 nm(ε= 0.71) によるBTC10、1.53mg/ml
- 変化率：
【０１３０】
【表７】
2006517187.tif 000009
【０１３１】
1.2  計算
それぞれの精製サンプルにおけるr-hTBP-1の量は、以下の通り得られた：
・  式に従う標準品(BTC10)のための応答因子(RF)の計算 ：
【数１】
2006517187.tif 000010
【０１３２】
サンプルの濃度を得る標準品のRFによるそれぞれのサンプルのr-hTBP-1ピークエリアの掛け算を、以下にmcg/mｌで示す：
TBP1 mcg/ml = TBP1 ピークエリア × RF 標準品
【０１３３】
以下に留意する:
・標準品として用いられるBTC 10は、利用性を基礎として選定され；
・r-hTBP-1ピークの保持時間をそれぞれの新しい緩衝剤調製に移行させることができ(1-3分)；
・濃縮したサンプルは溶離液A中で希釈する必要がある。
【０１３４】
2. 蛍光測定RP-HPLC-作動手順
精製試験を開始する時は、免疫化学的方法を利用することができないため、他の組換えタンパク質による以前の実験に基づき、蛍光検出によるRP-HPLC分析を、r-hTBP-1バルク中及び工程サンプル中の両方の残留細胞培養混入物の精製レベルを評価するために設定した。
【０１３５】
この方法は、最後の精製ステップ、即ちブチルセファロースクロマトグラフィーにおける細胞培養混入物の除去をモニターするために有用であることが見出され、並びに、それを工程サンプル中における分析に用いることができ、そして特別な材料及び／又は器具を必要としないことから、上記ステップの操作条件の選定において決定された。RP-HPLCは迅速であり(流出時間62分)、そしてこの検査を利用できるようにした時、イムノアッセイと比較した結果を提供する。混入物の標準品は未だ入手できていなかったことから、Pierce製のBSA溶液をサンプル中の混入物レベルを評価するために標準品として使用した。定量的RP-HPLCとして、本検査はr-hTBP-1 及びBSAエリア間での良好な解像を与える。
【０１３６】
2.1 装置、原料及び方法
- 分析 HPLC システム(メルク又は同等物) 
- ダイナミックミキサー
- 蛍光検出器(Varian又は同等物) 
- カラム：Aquapore RP-300、7μ、Brownlee、φ0.46×22 cm-cod 0711-0059、Applied Biosystem 
- 溶離液A：0.1％ 水性TFA 
- 溶離液B：アセトニトリル中0.1％ TFA
- 温度：23±3℃
- λ励起：220 nm
- λ発光：330 nm 
- 注入量：10-100μl 
- 注入時間：62 分
- 標準品：1:100に希釈したBSA (Pierce) 2 mg/mlを10及び20μl注入; 
- コントロール：OD 280 nm(ε=0.71)によるBTC10、1.53mg/ml。実際のところは200μl注入; 
- r-hTBP-1 標準品：OD 280 nm による1-5mg/ml (ε= 0.71)。
- 変化率：
【０１３７】
【表８】
2006517187.tif 000011
【０１３８】
2. 2 計算
それぞれのブチル精製サンプル中の混入物の量は、下記の通り得られる：
・下記の式に従って、標準品(BSA)のための応答因子（RF）を計算する： 
【数２】
2006517187.tif 000012
【０１３９】
それぞれのサンプルの混入物のピークエリアに標準品のＲＦ、及び１０００をかけると、ｎｇにおいて注入したサンプル中の混入物の量を得る。この数値を混入物を注入したr-hTBP-1の量で割ると、以下の式によって１００万当りの割合が得られる。
【数３】
2006517187.tif 000013
【０１４０】
以下に留意する:
・検査サンプルは溶離液A中で希釈する必要がある。
・190から240 ppm間の範囲でのコントロールサンプルの混入物。
【０１４１】
3. r-hTPB-1 Bulkの分析及び特徴化
ここより以下に記載する分析方法は、新規精製手順によって発明されたr-hTBP-1 バルクを特徴化するため、設定及び使用した。
【０１４２】
3.1 SE-HPLC
本法は、最終バルク中の二量体及び集合体の量を定量する目的で開発された。当該方法はr-hTBP-1の単量体並びにその二量体及び／又はその集合体を区別することができる。これはUV処置の後、いくつかのr-hTBP-1サンプルを、分子の集合体フォームを生成するための周知の方法で検査することにより証明した。簡潔には当該方法は、以下のように実施する：
【０１４３】
3.1.1  装置、原料及び方法
装置：分析HPLC システム
カラム：TSK G2000 SWXL cod. 08021 (TosoHaas)
移動層：0.1M リン酸ナトリウム pH 6.7、0.1M 硫酸ナトリウム
温度：23±3℃ 
UV 検出器：214 nm 
注入容積：20-30 mcg のr-hTBP-1(ODによる)に対応する10-100μl。
注入時間：30分間 
標準品：OD 280 nm(ε=0.71)10-20μlの注入によるBTC10、1.53mg/ml
r-hTBP-1 バルク：OD 280 nm(ε=0. 71)10-20μlの注入により1-2mg/mlへ希釈される 
サンプルの精製は、r-hTBP-1 ピーク/総エリア率の純度の％として表される。
【０１４４】
3.2  IE-HPLC
本方法は、上記目的のために一般的に使用されるクロマトフォーカシング技術と置き換える目的で、最終バルク中での異性体組成物を評価するために開発された。クロマトフォーカシングと対照的に、当該IEC分析は、上記よりも高速であり、必要とされる原材料がより少なく(1-2mgの代わりに150-200 mcg)、一般的な緩衝剤を使用し、そして検査サンプルの前処理を必要としないことから、より有利である。r-hTBP-1が糖タンパク質であるから、天然の物質として、それぞれ１つの異なる等電点（イオン交換分析で検査される時、異なる等電点では異なる挙動が測定される）を有する異なる異性体により特徴付けられる。糖タンパク質変異体のそれぞれ一つに相当する１２の異なるピークが得られる。当該方法による全てのr-hTBP-1の異性体は単離され、そして十分に特徴化された。簡潔には、当該方法を以下の通り実施する：
【０１４５】
3.2.1    装置、原料及び方法
分析の挿入HPLCシステム
カラム：      Mono Q HR 5/5 
緩衝剤A：      40mM トリス/HCl pH8.5 
緩衝剤B：      40mM トリス/HCl pH8.5、0.3M NaCl
変化率：
【表９】
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【０１４６】
流動率：      1 ml/分
温度：      23±3℃
UV検出：      220 nm 
注入量：      r-hTBP-1 (ODによる)の150-200 mcgに相当する 10-15 mcl 
注入時間：      70分
サンプル：      精製水により1：2に希釈されたr-hTBP-1バルク及び参照
【０１４７】
4.  ODによるr-hTBP-1の定量
本発明により生産されたr-hTBP-1バルクの濃度は、室内で計算されたモル吸光係数を用いてr-hTBP-1の精製の開始相中で生産されたr-hTBP-1バルク上で、280 nmでの最適密度により測定された。３つの代表的なr-hTBP1バルクは、既にε=0.776を得ている使用された新規精製方法により生産した。この新規の吸光係数は、スケールアップ及び生成物相に用いることができるだろう。バルクの濃度は20-30 mg/mlの範囲内であるから、バルク緩衝剤(40 mM PBS pH 7.1±0.2、10mM NaCl)により280 nmでの吸収を検査する前に、1mg/mlへ原材料を希釈することが必要である。 
【０１４８】
5. Bradfordによるタンパク質測定
Bradford方法は、r-hTBP-1 バルク中の総タンパク質を定量するために使用した (Bradford,MM.Analytical Biochemistry72：248-254,1976及びStoscheck,CM.. Methods in Enzymology 182 : 50-69,1990を参照)。本検査で使用される標準品は、BSAである。
【０１４９】
6. In vitroバイオアッセイ
r-hTBP-1のバイオアッセイは、そのTNFaへの結合能にある。この検査は工程サンプル及びバルクの両方をアッセイするために使用した。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】r-hTBP-1の精製のために用いられる方法のフローチャートを示す。捕捉ステップからr-hTBP-1バルク原料達成までの８ステップを実施し、その最重要は捕捉ステップである。それぞれのステップは実施例で十分に記載され、そして詳細に説明されている。
【図１】
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【国際調査報告】
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