(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病患者の特異的な脳領域におけるＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の差次的発現を開示する。この発見に基づいて、本発明は、被験者における神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断する、またはその予後を判定する、または被験者が前記疾患を発症するリスクが高いかどうかを決定する方法を提供する。さらに、本発明は、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子および相当するその遺伝子産物を使用して、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患を治療または予防するための治療的かつ予防的方法を提供する。神経変性疾患の調節剤をスクリーニングする方法も開示されている。
2006518199.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における神経変性疾患を診断する、またはその予後を判定する、または被験者が前記疾患を発症するリスクが高いかどうかを決定する方法であって：
前記被験者からの試料における、
（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写産物または翻訳産物の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体
のレベルおよび／または活性を決定する段階と、前記レベルおよび／または前記活性を既知の疾患または健康状態を表す基準値と比較し、それによって前記被験者における前記神経変性疾患を診断する、またはその予後を判定する、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症するリスクが高いかどうかを決定する段階と、を含む方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者における神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断するための、またはその予後を判定するための、またはかかる疾患を発症する、被験者の傾向または素因を決定するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬、および（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬からなる群から選択される、少なくとも１種類の試薬と、
（ｂ）（ｉ）前記被験者からの試料において、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を決定すること；（ｉｉ）神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断する、またはその予後を判定すること、またはかかる疾患を発症する被験者の傾向または素因を決定すること；により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断する、またはその予後を判定するための、またはかかる疾患を発症する被験者の傾向または素因を決定するための説明書と、を備え、既知の健康状態を表す基準値と比較される前記転写産物および／または前記翻訳産物の異なるレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方；あるいは既知の健康状態を表す基準値と同様な、または等しい前記転写産物および／または前記翻訳産物のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方によって、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の診断または予後、あるいはかかる疾患を発症する高い傾向または素因が示される、キット。
【請求項４】
（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
からなる群から選択される、少なくとも１種類の物質の活性および／またはレベルの修飾因子。
【請求項５】
ＳＣＮ２Ｂをコードする非天然遺伝子配列、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体を含む、組換え非ヒト動物であって、前記組換え非ヒト動物が：
（ｉ）前記遺伝子配列および選択マーカー配列を含有する遺伝子ターゲティング構築物を提供する段階と、
（ｉｉ）非ヒト動物の幹細胞に前記ターゲティング構築物を導入する段階と、
（ｉｉｉ）非ヒト胚に前記非ヒト動物幹細胞を導入する段階と、
（ｉｖ）偽妊娠非ヒト動物に前記胚を移植する段階と、
（ｖ）前記胚を臨月まで発達させる段階と、
（ｖｉ）そのゲノムが両方の対立遺伝子において前記遺伝子配列の修飾を含む、遺伝子改変非ヒト動物を同定する段階と、
（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を繁殖させて、そのゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を得る段階と、によって得ることが可能であり、前記破壊（disruption）によって、神経変性疾患または関連する疾患もしくは障害の症状を発症する素因を示す前記非ヒト動物が生じる、組換え非ヒト動物。
【請求項６】
（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される１種または複数種の物質の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患もしくは障害の修飾因子をスクリーニングするアッセイであって、
（ａ）細胞を試験化合物と接触させる段階と、
（ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種または複数種の物質の活性および／またはレベルを測定する段階と、
（ｃ）前記試験化合物と接触させていない対照細胞における（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種または複数種の物質の活性および／またはレベルを測定する段階と、
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞における物質のレベルおよび／または活性を比較する段階と、を含み、接触させた細胞における物質の前記活性および／または前記レベルの変化によって、試験化合物が前記疾患および障害の修飾因子であることが示される、アッセイ。
【請求項７】
（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される１種または複数種の物質の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患もしくは障害の修飾因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の物質に関して、神経変性疾患または関連する疾患もしくは障害を発症する素因が与えられた、または既に発症している非ヒト試験動物に試験化合物を投与する段階と、
（ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種または複数種の物質の活性および／またはレベルを測定する段階と、
（ｃ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の物質に関して、神経変性疾患または関連する疾患もしくは障害を発症する素因が与えられた、または既に発症している対応する（matched）非ヒト対照動物であり、かかる試験化合物がそれに投与されていない非ヒト動物における、（ｉ）または（ｉｖ）に記載の１種または複数種の物質の活性および／またはレベルを測定する段階と、
（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の非ヒト動物おける物質の活性および／またはレベルを比較する段階と、を含み、非ヒト試験動物における物質の活性および／またはレベルの変化によって、試験化合物が前記疾患もしくは障害の修飾因子であることが示される、方法。
【請求項８】
前記非ヒト試験動物および／または前記非ヒト対照動物が、天然ＳＣＮ２Ｂ遺伝子転写制御因子ではない転写制御因子の制御下にて、ＳＣＮ２Ｂ、またはその断片、もしくはその誘導体、もしくは変異体を発現する、組換え非ヒト動物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物を試験するためのアッセイ、好ましくは複数の化合物をスクリーニングして、ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体への、前記化合物の結合の程度を決定するアッセイであって：
（ｉ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその断片もしくは誘導体、もしくは変異体の液体懸濁液を複数の容器に添加する段階と、
（ｉｉ）前記結合に関してスクリーニングすべき、検出可能な、特に１種類の蛍光標識化合物または複数種の蛍光標識化合物を前記複数の容器に添加する段階と、
（ｉｉｉ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその前記断片、もしくは誘導体、もしくは変異体と、前記の検出可能な、特に蛍光標識化合物（１種または複数種）とをインキュベートする段階と、
（ｉｖ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物と、またはその前記断片、もしくは誘導体、もしくは変異体と結合した、好ましくは蛍光の量を測定する段階と、
（ｖ）前記化合物のうちの１種または複数種による、前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその前記断片、もしくは誘導体、もしくは変異体への結合の程度を決定する段階と、を含むアッセイ。
【請求項１０】
前記タンパク質分子が、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的として使用される、ＳＣＮ２Ｂ、配列番号１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体である、タンパク質分子。
【請求項１１】
前記タンパク質分子が、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防または治療または改善する試薬または化合物のためのスクリーニング標的として使用される、ＳＣＮ２Ｂ、配列番号１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体である、タンパク質分子。
【請求項１２】
被験者からの試料における細胞の病的状態を検出するための、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体の使用であって、前記免疫原が、ＳＣＮ２Ｂ、配列番号１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体である使用であり、前記細胞を前記抗体で免疫細胞化学的に染色することを含み、既知の健康状態を表す細胞と比較して前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化から、前記細胞の病的状態が示される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における神経変性疾患の進行を診断し、その予後を判定し、モニターする方法に関する。さらに、治療コントロールの方法および神経変性疾患の調節剤（modulating agent）をスクリーニングする方法が提供される。本発明は、医薬組成物、キット、および組換え非ヒト動物モデルもまた開示する。
【０００２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、強く衰弱させる影響を患者の生活に及ぼす。さらに、これらの疾患は、非常に大きな健康的、社会的、および経済的負担となる。ＡＤは、すべての痴呆の症例の約７０％を占める、最も一般的な神経変性疾患であり、年齢６５歳を超える人口の約１０％、８５歳を超える人口の４５％までが冒されている、おそらく最も破壊的な加齢性神経変性症状である（最近の評論として、Vickersら, Progress in Neurobiology 2000, 60: 139-165を参照のこと）。現在、米国、ヨーロッパ、および日本において、推定１２００万症例に達する。先進国において高齢者の数が人口学的に増加する（「ベビーブーマー」の高齢化）に従って、この状況は必然的に悪くなるだろう。ＡＤに罹患している個人の脳に生じる神経病理学的な顕著な特徴は、アミロイド−βタンパク質で構成される老人斑、異常な糸状構造の出現と同時に起こる細胞骨格の変化および神経原線維変化の形成である。
【０００３】
アミロイド−β（Ａβ）ペプチドは、様々な種類のプロテアーゼによってアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の切断によって産生される。セクレターゼβ／γによる切断によって、異なる長さのＡβペプチドが形成され、一般に、４０アミノ酸からなる、短く、より可溶性であり、ゆっくりと凝集するペプチド、および細胞外で急速に凝集し、特有のアミロイドプラークを形成する、長い４２アミノ酸ペプチドが形成される（Selkoe, Physiological Rev 2001, 81: 741-66; Greenfieldら, Frontiers Bioscience 2000, 5: D72-83）。２種類の、びまん性斑（diffuse plaque）および老人斑（neuritic plaque）をＡＤ患者の脳において検出することができ、後者は古典的であり、最も一般的な種類である。それらは主に、大脳皮質および海馬において見られる。老人斑は、直径５０μｍ〜２００μｍを有し、小膠細胞および星状膠細胞の死んだ神経細胞の不溶性の原線維アミロイド、断片、および他の成分、例えば神経伝達物質、アポリポタンパク質Ｅ、グリコサミノグリカン、α１−抗キモトリプシンなどで構成される。脳における毒性Ａβ沈着物の形成は、ＡＤの経過の非常に初期に始まり、ＡＤ症状につながるその後の破壊的プロセスに主要な役割を果たすと論じられている。ＡＤの他の病理学的な顕著な特徴は、神経網の糸（neuropil thread）として記載されている神経原線維変化（ＮＦＴ）および異常神経突起である（Braak and Braak, Acta Neuropathol 1991, 82: 239-259）。ＮＦＴは、神経細胞の内部で出現し、互いの周りでより合わされた対らせん状のフィラメントを形成する、化学的に変化したタウタンパク質からなる。ＮＦＴが形成するにつれて、神経細胞の減少が認められる。前記神経細胞の減少は、微小管関連輸送系が原因であり得ると論じられている（Johnson and Jenkins, J Alzheimers Dis 1996, 1: 38-58; Johnson and Hartigan, J Alzheimers Dis 1999, 1: 329-351）。神経原線維変化の出現およびそれらの数の増加は、ＡＤの臨床的重要度とかなり相関している（Schmittら, Neurology 2000, 55: 370-376）。
【０００４】
ＡＤは、記憶形成における初期の欠損と関連する進行性疾患であり、最終的には、より高い認知機能が完全に侵される。認知障害としては、とりわけ、記憶障害、失語症、失認および実行機能（executive functioning）の低下が挙げられる。ＡＤの病因の特有の特徴は、変性プロセスに対する、特定の脳の領域および神経細胞の分集団の選択的な脆弱性である。具体的には、疾患の進行中、側頭葉領域および海馬は初期に、かつより重度に影響を受ける。一方、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は大部分が損傷を受けていない状態のままであり、神経変性から保護されている（Terryら, Annals of Neurology 1981, 10: 184-92）。ＡＤ発症の年齢は、５０年の範囲内で様々であり、早期発症型ＡＤは、年齢６５歳未満のヒトに起こり、晩期発症型ＡＤは６５歳を超えるヒトに起こる。すべてのＡＤ症例のうち約１０％が、早期発症型ＡＤに罹患しており、わずか１〜２％が家族性、遺伝性症例である。現在、ＡＤの治療法はなく、ＡＤの進行を止めるのに有効な治療、または高い確率で生前にＡＤを診断する方法さえもない。ＡＤを発症する素因を個体に与えるいくつかの危険因子、主に最も顕著には、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の３つの異なる既存の対立遺伝子（イプシロン２、３、および４）のイプシロン４対立遺伝子が同定されている（Strittmatterら, Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 1977-81; Roses, Ann NY Acad Sci 1998, 855: 738-43）。多型の血漿タンパクＡｐｏＥは、低密度リポタンパク質受容体に結合することによって、細胞間のコレステロールおよびリン脂質の輸送において役割を果たし、神経突起成長および再生において役割を果たすと思われる。更なる感受性遺伝子および疾患関連多型を検出する努力によって、ヒトの第１０および第１２染色体上の特定の領域および遺伝子が晩期発症型ＡＤと関連するという仮説が導かれている（Myersら, Science 2000, 290: 2304-5; Bertramら, Science 2000, 290: 2303; Scottら, Am J Hum Genet 2000, 66: 922-32）。
【０００５】
第２１染色体上のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）、第１４染色体上のプレセニリン−１、および第１染色体上のプレセニリン−２の遺伝子における遺伝的欠陥に起因している早期発症型ＡＤの稀な例はあるが、晩期発症型散発性ＡＤの優勢な形態は、今までに不明の病因に由来している。神経変性疾患の晩期発症および複合病因は、治療薬および診断剤の開発に難題を投げかけている。潜在的な薬物標的および診断マーカーのプールを拡大することが重要である。したがって、本発明の目的は、神経疾患の病因への洞察を提供し、かつこれらの疾患の診断および治療法の開発に特に適している方法、材料、薬剤、組成物、および非ヒト動物モデルを提供することである。この目的は、独立した請求項の特徴によって解決されている。サブクレームは、本発明の好ましい実施形態を定義する。
【０００６】
本発明は、アルツハイマー病のヒト脳試料における電位作動性ナトリウムチャネルＩＩ型βサブユニット（ベータ−２サブユニット、β２−サブユニット、β２またはＳＣＮ２Ｂ）をコードする遺伝子の差次的発現に基づく。したがって、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子および相当するその転写産物および／または翻訳産物は、ＡＤで一般に認められる局所の選択的神経細胞変性において原因となる役割を有し得る。これらの開示内容に基づいて、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの診断的評価および予後、ならびにその素因の同定に対して有用性を有する。さらに、本発明は、かかる疾患の治療を受ける患者を診断的にモニターする方法を提供する。
【０００７】
電位作動性イオンチャネルは、伝導（conducted）活動電位を発生させることによって重要な役割を果たす。カチオン（ナトリウム、カルシウム、カリウムイオン）およびアニオン（塩素イオン）のイオン伝導性膜チャネルが記述されている（Lehmann-Hornら, Physiological Reviews 1999, 79: 1317-1358）。細胞膜を介したイオンの輸送によって、細胞網状構造全体にわたって電気インパルスが高速で伝達される。それによって、チャネルは、機能上異なる３つの状態：静止状態、活性状態、および不活性状態の間で切り換わる。静止状態と不活性状態のどちらも非伝導性であり、チャネルは閉じている。膜電位が−６０ｍＶ未満から増大するに従って、チャネルはその孔を開き始める（つまり、活性化）。イオン（例えば、ナトリウム）の流入によって、活動電位が発生するまで、膜電位がさらに増大する。１ミリ秒以内に（つまり、急速な不活性化）または数秒から数分以内（つまり、緩慢な不活性化）に孔を閉じることによって、チャネルは不活性化状態に迅速に戻る。イオンコンダクタンスは非常に選択的かつ効率的であり、そのため、記憶、運動および認知などのプロセスを微調整することができる（Lehmann-Hornら,Physiological Reviews 1999, 79: 1317-1358）。電位作動性イオンチャネルの分子クローニングから、サブタイプの多様性が明らかになっており、特にナトリウムチャネルの根底にある構造および機能についての理解が高められた（Nodaら, Nature 1986, 322: 826-828; Schallerら, Journal of Neuroscience 1995, 15: 3231-3242; Isomら, Neuron 1994, 12: 1183-1194; Isomら,  Cell 1995, 83: 443-445）。
【０００８】
電位作動性ナトリウムチャネルは、約２６０ｋＤａの孔形成α−サブユニット、およびヘテロメリック（heteromeric）複合体を形成する、２つの小さな補助的β−サブユニット、約３６ｋＤａのβ１および約３３ｋＤａのβ２で構成される。α−サブユニットおよび両方のβ−サブユニットは、高度にグリコシル化される（α、β１およびβ２それぞれに対して、約２２０ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２１ｋＤａを有する脱グリコシル化サブユニット）。現在まで、β−サブユニットをコードする３つの異なる遺伝子が同定されている。β１−サブユニットはα−サブユニットと非共有結合するのに対して、β２−サブユニットはジスルフィド架橋によりα−サブユニットに共有結合する。β１−サブユニットと同様な第３のβ−サブユニットアイソフォーム（β３）が最近発見された（Morganら, Proceedings National Academy of Science USA  2000, 97: 2308-2313）。α−サブユニットは、ナトリウムチャネル機能性に必要十分であると思われる。β−サブユニットは、不活性化の速度を加速することによって、Ｎａ＋振幅ピーク電流を増加することによって、活性化速度を増加することによって、電位依存性を変えることによって、ナトリウムチャネル機能を調節する（Pattonら, Journal Biological Chemistry 1994, 269: 17649-17655）。β２−サブユニットはβ１−サブユニットほど有効ではないと思われる。このように、どちらも、α−サブユニットの機能の調節に協力し得る。
【０００９】
ヒトβ２−サブユニットは、タンパク質の成熟中に切断される、２９アミノ酸のシグナルペプチド配列を有する糖タンパク質である。さらに、このタンパク質は、短い細胞内Ｃ末端セグメントと、１回膜貫通領域と、α−サブユニットとのジスルフィド結合を形成することができる保存されたシステイン残基を含む、アミノ末端の大きな細胞外ドメインと、で構成される。β−サブユニットは、細胞接着分子（ＣＡＭ）、例えばコンタクチンとの構造類似性を有する、免疫グロブリン様モチーフ、つまり免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインを示す。したがって、β２−サブユニットは、テネイシンＣおよびテネイシンＲなどの細胞外マトリックスと相互作用し得る（Isomら, Cell  1995, 83: 443-445）。神経細胞ＣＡＭ（ＮＣＡＭ）およびミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）などの細胞接着分子は、β２−サブユニットと同じ種類の免疫グロブリンの折りたたみを有する。β２−サブユニットは、それらがＣＡＭモチーフを特徴とする点から、および細胞表面膜を局所的に拡大する能力において、他のβ−サブユニットと異なる。このように、ナトリウムチャネルの修飾因子であることに加えて、それらは、ナトリウムチャネルの発現に対して制御因子として細胞間接着相互作用において機能し、かつ原形質膜の特定の領域においてナトリウムチャネルの局在化および固定化を調節し得る。ヒトβ２は、ミエリンタンパク質ゼロ（ｐ０）、膜貫通型糖タンパク質および末梢神経ミエリンの主要な構造成分との類似性を有する（Eubanksら, Neuroreport 1997, 8: 2775-2779）。
【００１０】
ＳＣＮ２Ｂ遺伝子のゲノム構造が１９９８年に報告された（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４９４９６；ＡＦ０４９４９７；Bolinoら, European Journal of Human Genetics 1998, 6: 629-634；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４９４９８；完全なコード配列および相当するタンパク質配列）。マッピング研究によって、ＳＣＮ２Ｂが染色体１１ｑ２３に位置付けられた（Eubanksら, Neuroreport 1997, 8: 2775-2779）。ＳＣＮ２Ｂは、１８６アミノ酸の成熟ＳＣＮ２Ｂタンパク質、および２９アミノ酸の推定シグナルペプチドを含む２１５アミノ酸のＳＣＮ２Ｂタンパク質をコードする、４個のエクソンおよび３個のイントロンを有する、約１４ｋｂのゲノムＤＮＡにわたる（タンパク質配列および推定ドメイン：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ６０９３９）。ヒトおよびラットＳＣＮ２Ｂタンパク質は、等しい長さであり、高度に保存されている（相同性８９％および類似性９３％）。
【００１１】
脳の４つのナトリウムチャネル、つまりＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、およびＳＣＮ８Ａは、中枢神経系において主な発現を示す。β１およびβ２−サブユニット（それぞれ約２ｋｂおよび約４ｋｂの転写物）のｍＲＮＡは、広いが、特異な局所的発現パターンを有する。ＳＣＮ１Ｂ遺伝子をコードするβ１−サブユニットとは異なり、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子は中枢神経系のみに発現する。海馬傍回、皮質、顆粒層、および小脳のプルキンエ細胞において優勢な発現レベルが認められた。ラットの脳において、β２の発現は、神経発生と並行して、胎児齢９日で始まり、軸索伸長およびシナプス形成に伴って急速に増加する（Isomら, Cell  1995, 83: 443-445）。
【００１２】
神経細胞ナトリウムチャネルのサブユニット遺伝子、ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂに関して、熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）を伴う全身性てんかんを引き起こす、疾患の原因となる突然変異が同定されている。したがって、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子における変異によって、特発性全身性てんかんの共通のサブタイプがもたらされる結果にもなり得ることが推測される。ハウク（Haug）および共同研究者は、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子において新規な単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）およびミスセンス突然変異（Ａｓｎ２０９Ｐｒｏ）を同定したが、かんしゃくにおける主要な感受性遺伝子としてＳＣＮ２Ｂ遺伝子を除外した（Haugら, Neuroreport 2000, 11: 2687-2689）。国際公開番号ＷＯ０２／１９９６６、ＷＯ０２／０８７４１９、およびＷＯ０２／０９０５３２では、ナトリウムチャネルβ−サブタイプを心血管疾患、炎症性疾患および筋疾患、癌およびかんしゃくと関連付けている。タンパク質の相同性および染色体上の位置決定に基づいて、ＳＣＮ２Ｂはまた、シャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ４Ｂ）と呼ばれる、脱髄性の常染色体劣性運動および感覚神経障害に適した候補遺伝子であるとみなされている。しかしながら、この見解は、ボリノ（Bolino）および共同研究者によって意義が唱えられた（Bolinoら, European Journal of Human Genetics 1998, 6: 629-634）。それにもかかわらず、国際公開番号ＷＯ０１／７９５４７では、脱髄疾患と関連する可能性があるＳＣＮ２Ｂ遺伝子における単一ヌクレオチド多型が述べられている。現在のところ、電位作動性イオンチャネルＩＩ型のβ２−サブユニットとアルツハイマー病などの神経変性疾患との関連性について報告はない。
【００１３】
ナトリウムチャネルは、神経障害の痛み、かんしゃく、および脳卒中を治療するための、局所麻酔薬、抗痙攣薬、抗不整脈薬としての様々な薬物の有用な標的である。多くの毒素、薬物、および無機カチオンが、中枢神経系関連の疾患においてナトリウムチャネルのα−サブユニットの遮断薬として医薬業界で使用されている。電位作動性イオンチャネルの阻害剤は、効力が弱く、比較的非特異的であり、それらの治療学的可能性が完全に開拓されていないにもかかわらず、既に市販されている。注目すべきことには、ナトリウムチャネルのβ−サブユニットと相互作用する薬物は現在知られていない。したがって、β２−サブユニットなどの電位作動性ナトリウムチャネルの選択的サブユニットに特異的な薬物を見出すことが望まれている。
【００１４】
本発明は、アルツハイマー病患者からの脳試料における電位作動性ナトリウムチャネルβ−２サブユニット（β２−サブユニット、ＳＣＮ２Ｂ）遺伝子発現の調節不全（dysregulation）を開示する。かかる調節不全は、年齢が一致する、健康な対照から得られた試料では認められない。現在まで、β２−サブユニット遺伝子発現の調節不全と、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患との関連性を実証する実験は記述されていない。同様に、β２−サブユニット遺伝子における突然変異が、前記疾患と関連することは記述されていない。本発明で開示されているように、β２−サブユニット遺伝子をアルツハイマー病と関連付けることによって、特に前記疾患を診断および治療する新規な方法が提供される。
【００１５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される単数形の「１つの（a）」、「１個の（an）」、および「その（the）」は、指定がない限り、複数を含む。例えば、「（１つの）細胞」とは、複数の細胞なども含む。本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という用語は、この用語の前および後のフレーズが、代替として、または組み合わせて考えられるべきことを意味する。例えば、「レベルおよび／または活性の決定」という言い回しは、レベルのみ、または活性のみ、またはレベルと活性の両方が決定されることを示す。本明細書で使用される「レベル」という用語は、転写産物、例えばｍＲＮＡ、または翻訳産物、例えばタンパク質またはポリペプチドのゲージ（gage）、尺度（measure）、量、または濃度を含むことを意味する。本明細書で使用される「活性」という用語は、転写産物または翻訳産物が生物学的効果をもたらす能力の尺度または生物活性分子のレベルの尺度として理解されるべきである。「活性」という用語は、酵素活性も意味する。本明細書で使用される「レベル」および／または「活性」という用語は、遺伝子発現レベルまたは遺伝子活性をさらに意味する。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生を引き起こす転写および翻訳による、遺伝子中に含まれる情報の利用として定義することができる。「調節不全」とは、遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味するべきである。遺伝子産物は、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかを含み、遺伝子の発現の結果である。遺伝子産物の量は、遺伝子がどれほど活性であるかを測定するために使用することができる。本明細書および特許請求の範囲で使用される「遺伝子」という用語は、コード領域（エクソン）および非コード領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー、イントロン、リーダーおよびトレーラー配列）のどちらも含む。「ＯＲＦ」という用語は「オープンリーディングフレーム」の頭字語であり、少なくとも１つの読み枠に終止コドンを保有せず、したがって潜在的にアミノ酸の配列に翻訳することができる、核酸配列を意味する。「調節因子」は、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および遺伝子発現を操作および調節する他の要素を含む。本明細書で使用される「断片」という用語は、例えば、選択的スプライシングされた、または切り詰められた、または切断された転写産物または翻訳産物を含むことを意味する。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、突然変異、ＲＮＡ編集、または化学修飾、または別の方法で改変された転写産物、あるいは突然変異、または化学修飾、または別の方法で改変された翻訳産物を意味する。例えば、「誘導体」は、改変されたリン酸化、またはグリコシル化、またはアセチル化、脂質化などのプロセスによって、あるいは改変されたシグナルペプチド切断または他の種類の成熟切断によって生成される。これらのプロセスは、転写後に起こる。本発明および特許請求の範囲で使用される「修飾因子」という用語は、遺伝子、または遺伝子の転写産物、または遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性を変化または改変することができる分子を意味する。「修飾因子」は、遺伝子の転写産物または翻訳産物���生物活性を変化または改変することができることが好ましい。例えば、前記変調（modulation）は、酵素活性の増加または減少、結合特性の変化、または遺伝子の前記翻訳産物の生物学的、機能的、または免疫学的特性の他の変化または改変であり得る。「作用物質（agent）」、「試薬」または「化合物」という用語は、細胞、組織、体液に対して、または生体系の状況、または調べられたアッセイ系内で正または負の生物学的効果を有する、物質、化学物質、組成物または抽出物を意味する。それらは、標的のアゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニストまたは逆アゴニストであり得る。かかる作用物質、試薬、または化合物は、核酸、天然もしくは合成ペプチドまたはタンパク質複合体、または融合タンパク質であり得る。それらは、抗体、有機もしくは無機分子または組成物、小分子、薬物および前記作用物質のいずれかの組み合わせであってもよい。それらは、診断または治療の目的で試験するために使用することができる。「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」という用語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって所定の標的ポリヌクレオチドにアニールすることができ、ポリメラーゼによって伸長することができる、短い核酸配列を意味する。それらは、特定の配列に特異的であるように選択されてもよいし、またはそれらはランダムに選択されてもよい。例えば、それらは、混合物中のすべての可能な配列をプライミングするだろう。本明細書で使用されるプライマーの長さは、１０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチドと様々である。「プローブ」は、本明細書に記載かつ開示されている核酸配列の短い核酸配列、またはそれと相補的な配列である。それらは、所定の配列の完全長配列、または断片、誘導体、アイソフォーム、または変異体（variant）を含み得る。「プローブ」とアッセイされる試料とのハイブリダイゼーション複合体を同定することによって、その試料内の他の類似配列の存在を検出することが可能となる。本明細書で使用される「ホモログまたは相同性」とは、ヌクレオチドまたはペプチド配列と他のヌクレオチドまたはペプチド配列との関連性を説明するために当技術分野で使用されている用語であり、比較される前記配列間の同一性および／または類似性の程度によって決定される。当技術分野において、「同一性」および「類似性」という用語は、問い合わせ配列と、好ましくは同一種類の他の配列（核酸またはタンパク質配列）とを互いにマッチングすることによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」を計算かつ決定するための、好ましいコンピュータープログラム法としては、限定されないが、ＧＣＧ  ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Altschulら, J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410; Altschulら, Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402； Devereuxら, Nucleic Acids Res. 1984, 12: 387)、ＢＬＡＳＴＮ２．０（Gish W., http://blast.wustl.edu, 1996-2002)、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 2444-2448）、および最長のオーバーラップを有する１組のコンティグを決定かつアラインするＧＣＧ  ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Wilbur and Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44: 557-567; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453）が挙げられる。本明細書で使用される「変異体（variant）」という用語は、本発明に開示されているポリペプチドおよびタンパク質に関して、それにおいて１つまたは複数のアミノ酸が、Ｎ末端および／またはＣ末端で、および／または本発明の天然ポリペプチドまたはタンパク質の天然アミノ酸配列内で付加および／または置換および／または欠失および／または挿入されているが、その本質的な特性を残している、いずれかのポリペプチドまたはタンパク質を意味する。さらに、「変異体」という用語は、より短いまたはより長いタイプのポリペプチドまたはタンパク質を含む。「変異体」は、電位作動性ナトリウムチャネルβサブユニットタンパク質、特にＳＣＮ２Ｂ、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列も含む。配列番号１に示されるタンパク質分子の「変異体」は、例えば、非常に保存的な領域において保存的アミノ酸置換を有するタンパク質を含む。本発明の「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ＳＣＮ２Ｂ、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、断片および化学的誘導体を含む。それらは、天然から単離することができる、または組換え手段および／または合成手段によって産生することができるタンパク質およびポリペプチドを含むことができる。天然に存在するタンパク質またはポリペプチドとは、天然に存在する切断型または分泌型、天然に存在する変異型（例えば、スプライスバリアント）および天然に存在する対立遺伝子変異体（allelic variant）を意味する。「単離」という用語は、変化した、かつ／またはそれらの自然環境から取り除かれた、つまりそれらが通常存在する細胞または生体から単離された、あるいはそれらが自然界でそれと関連すると見出されている共存する構成要素から分離されるか、または本質的に精製された、分子または物質を意味するとみなされる。この概念はさらに、かかる分子をコードする配列が、それらがその天然状態では結合しない、ポリヌクレオチドに人の手によって結合することができることと、かかる分子を組換えおよび／または合成手段によって産生することができることを意味する。前記目的のために、これらの配列が当業者に公知の方法によって生体または非生体に導入されたとしても、これらの配列が前記生物にまだ存在するとしても、それでもなお、単離されていると見なされる。本発明において、「リスク」、「感受性」、および「素因」という用語は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して使用される。「ＡＤ」という用語はアルツハイマー病を示す。本明細書で使用される「ＡＤ型神経病理学」とは、本明細書に記載され、かつ現況技術文献から一般的に知られているように、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的および臨床的に顕著な特徴を意味する（以下参照： Iqbal, Swaab, Winblad and Wisniewski, Alzheimer's Disease and Related Disorders (Etiology, Pathogenesis, and Therapeutics), Wiley & Sons, New York, Weinheim, Toronto, 1999; Scinto and Daffner, Early Diagnosis of Alzheimer's Disease, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2000; Mayeux and Christen, Epidemiology of Alzheimer's Disease: From gene to Prevention, Springer Press, Berlin, Heidelberg, New York, 1999; Younkin, Tanzi and Christen, Presenilins and Alzheimer's Disease, Springer Press, Berlin, Heidelberg, New York, 1998）。本発明による神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆、多系統萎縮症、嗜銀顆粒性痴呆および他のタウオパシー、および軽い認知障害を含む。神経変性プロセスを伴う他の疾患は、例えば、虚血性脳卒中、加齢性黄斑変性症、ナルコレプシー、運動ニューロン疾患、プリオン病、外傷性神経損傷および修復、および多発性硬化症である。
【００１６】
一態様において、本発明は、被験者における神経変性疾患を診断する、またはその予後を判定する、または被験者が前記疾患を発症するリスクが高いかどうかを決定する方法を特徴とする。この方法は：前記被験者からの試料における（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｉｉ）前記転写産物または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を決定する段階と、前記レベルおよび／または前記活性を既知の疾患または健康状態を表す基準値と比較し、それによって前記被験者における前記神経変性疾患を診断するか、またはその予後を判定するか、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症するリスクが高いかどうかを決定する段階と、を含む。
【００１７】
本発明は、本発明に開示される、核酸配列、またはその断片もしくは変異体に固有である、プライマーおよびプローブの作製および使用にも関する。オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、蛍光、生物発光、磁気、または放射性物質で特異的に標識することができる。本発明はさらに、適切な組み合わせで前記の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、前記核酸配列、またはその断片もしくは変異体の検出および作製に関する。当業者によく知られている方法であるＰＣＲ分析を前記プライマーの組み合わせを用いて行い、核酸を含有する試料から前記の遺伝子特異的核酸配列を増幅することができる。かかる試料は、健康な被験者または疾患のある被験者から採取される。増幅した結果、特異的核酸産物が得られるかどうか、および異なる長さの断片が得られるかどうかは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の指標となり得る。このように、本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連する、検討すべき核酸配列を含有する所定の試料における遺伝子突然変異および単一ヌクレオチド多型の検出に有用な、全コード配列および遺伝子配列までの長さで少なくとも１０塩基の核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する。この特徴は、迅速なＤＮＡベースの診断試験の開発に、好ましくはキットのフォーマットにおいても有用性を有する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、被験者における神経変性疾患の進行をモニターする方法を特徴とする。前記被験者からの試料における（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｉｉ）前記転写産物または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が決定される。前記レベルおよび／または前記活性は、既知の疾患または健康状態を表す基準値と比較される。それによって前記被験者における前記神経変性疾患の進行がモニターされる。
【００１９】
さらに他の態様において、本発明は、神経変性疾患の治療を評価する方法であって、前記疾患の治療を受けた前記被験者から採取した試料における（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｉｉ）前記転写産物または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を決定する段階を含む方法を特徴とする。前記レベル、または前記活性、または前記レベルおよび前記活性のどちらも、既知の疾患または健康状態を表す基準値と比較され、それによって前記神経変性疾患の治療が評価される。
【００２０】
本明細書において特許請求される方法、キット、組換え非ヒト動物、分子、アッセイ、本発明の使用の好ましい実施形態では、ヒト電位作動性ナトリウムチャネルβサブユニットタンパク質をコードする前記遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４９４９８、ＡＦ０４９４９６、ＡＦ０４９４９７、ＡＦ１０７０２８、ＡＸ３７６０００、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースからのＥＳＴのｃＤＮＡ配列に相当するｍＲＮＡ（配列番号２）から推論されたＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｏ６０９３９（タンパク質ＩＤ）、配列番号１によって表されるβ−２サブユニットタンパク質またはβ２−タンパク質とも呼ばれるヒト電位作動性ナトリウムチャネルＩＩ型βサブユニット（ＳＣＮ２Ｂ）をコードする遺伝子である。本発明において、ＳＣＮ２Ｂは、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｏ６０９３９）のタンパク質をコードする配列番号２の核酸配列も意味する。本発明において、その用語が本明細書で使用されているように、前記配列が「単離」される。さらに、本発明において、前記ＳＣＮ２Ｂタンパク質をコードする遺伝子は一般に、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子、または単にＳＣＮ２Ｂとも呼ばれ、ＳＣＮ２Ｂのタンパク質は一般に、ＳＣＮ２Ｂタンパク質、または単にＳＣＮ２Ｂとも呼ばれる。
【００２１】
本明細書において特許請求される方法、キット、組換え非ヒト動物、分子、アッセイ、本発明の使用の他の好ましい実施形態において、前記神経変性疾患または障害はアルツハイマー病であり、前記被験者はアルツハイマー病に罹患している。
【００２２】
本発明は、ＡＤ患者の特定の脳領域においてＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の検出および差次的発現および調節を開示する。結果的に、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子およびその相当する転写産物および／または翻訳産物は、ＡＤに通常認められる局所選択的神経細胞変性において原因となる役割を有する。その代わりとして、ＳＣＮ２Ｂは、残存している神経細胞に神経保護機能を与える。これらの開示内容に基づいて、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの診断的評価および予後、ならびにその素因の同定に有用性を有する。さらに、本発明は、かかる疾患の治療を受ける患者を診断的にモニターする方法を提供する。
【００２３】
分析かつ測定すべき試料は、脳組織または他の組織、または体細胞を含む群から選択されることが好ましい。試料は、脳脊髄液または他の体液、例えば唾液、尿、血液、血清血漿、または粘液を含むことができる。本発明に従って、神経変性疾患の診断、予後判定、その疾患の進行のモニタリングまたはその疾患の治療の評価の方法は生体外（ex corpore）で行うことができることが好ましく、かかる方法は好ましくは、被験者または患者から除去、採取、または単離された試料、例えば体液または細胞に関する。
【００２４】
他の好ましい実施形態において、前記基準値は、前記神経変性疾患に罹患していない被験者からの試料における（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｉｉ）前記転写産物または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の値である。
【００２５】
好ましい実施形態において、前記被験者から採取された試料細胞、または組織、または体液における、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／またはＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／またはその断片、またはその誘導体もしくは変異体のレベルまたは活性における、既知の健康状態を表す基準値に対する変化から、神経変性疾患、特にＡＤの診断、または予後、またはそれに罹患する高いリスクが示される。
【００２６】
好ましい実施形態において、被験者の試料から抽出されたＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡからの前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせを使用した定量的ＰＣＲ分析を用いて、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子の転写産物レベルの測定が被験者からの試料で行われる。
【００２７】
前記遺伝子に特異的なプローブを用いたノーザンブロット法も適用することができる。チップベースのマイクロアレイ技術によって、転写産物を測定することがさらに好ましい。これらの技術は当業者には公知である（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001; Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, Natick, MA, 2000参照）。イムノアッセイの一例としては、国際公開番号ＷＯ０２／１４５４３に開示かつ記載されている酸素活性の検出および測定が挙げられる。
【００２８】
さらに、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または前記翻訳産物の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体のレベルおよび／または活性、および／または前記翻訳産物および／またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体の活性のレベルを、イムノアッセイ、活性アッセイおよび／または結合アッセイを用いて検出することができる。これらのアッセイでは、抗タンパク質抗体または抗タンパク質抗体に結合する二次抗体のいずれかに結合する、酵素、クロモ力学的（chromodynamic）、放射性、磁気、または発光標識の使用によって、前記タンパク質分子と抗タンパク質抗体との結合の量を測定することができる。さらに他の高親和性リガンドを使用してもよい。使用することができるイムノアッセイとしては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および当業者に公知の他の技術が挙げられる（Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999 and Edwards R, Immunodiagnostics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford; England, 1999参照）。これらすべての検出技術は、マイクロアレイ、タンパク質−アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップまたはタンパク質−チップベース技術のフォーマットに用いることもできる（Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, Natick, MA, 2000参照）。
【００２９】
好ましい実施形態において、前記被験者から採取した一連の試料における、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｉｉ）前記転写産物または翻訳産物の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体のレベルまたは活性、または前記レベルと前記活性の両方を、前記疾患の進行をモニターするために長期間にわたって比較する。他の好ましい実施形態において、前記被験者は、前記試料採取の１つまたは複数の前に治療を受ける。さらに他の好ましい実施形態において、前記レベルおよび／または活性は、前記被験者の前記治療前および後に決定される。
【００３０】
他の態様において、本発明は、被験者における神経変性疾患、特にＡＤを診断するか、またはその予後を判定するための、または神経変性疾患、特にＡＤを発症する、被験者の傾向または素因を決定するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬、および（ｉｉ））ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬からなる群から選択される、少なくとも１種類の試薬と、
（ｂ）−前記被験者からの試料において、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を決定すること；
−神経変性疾患、特にＡＤを診断する、またはその予後を判定すること、またはかかる疾患を発症する被験者の傾向または素因を決定すること；により、神経変性疾患、特にＡＤを診断する、またはその予後を判定するための、またはかかる疾患を発症する被験者の傾向または素因を決定するための説明書と、を備え、既知の健康状態を表す基準値と比較される前記転写産物および／または前記翻訳産物の異なるレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方；あるいは既知の健康状態を表す基準値と同様な、または等しい前記転写産物および／または前記翻訳産物のレベルまたは活性、または前記レベルおよび前記活性の両方によって、神経変性疾患、特にＡＤの診断または予後、あるいはかかる疾患を発症する傾向または素因の増加が示される、キットを特徴とする。本発明によるキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクのある個体を同定するのに特に有用である。結果として、本発明によるキットは、疾患発症前に、その疾患の間に不可逆的損傷を受ける前に、早期の予防策または治療的介入のために、同定された個体を標的とする手段として役立つ。さらに、好ましい実施形態において、本発明において特徴とされるキットは、被験者における神経変性疾患、特にＡＤの進行をモニターするのに、かつ前記被験者のかかる疾患の治療的処置の成功または失敗をモニターするのに有用である。
【００３１】
他の態様において、本発明は、被験者において神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防する方法であって、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体のレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方に直接的または間接的に影響を及ぼす、治療有効量または予防有効量の作用物質（１種または複数種）を前記被験者に投与することを含む方法を特徴とする。前記作用物質は小分子を含むか、あるいはそれは、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドも含み得る。前記ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドは、ＳＣＮ２Ｂタンパク質、をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体のアミノ酸配列を含み得る。本発明に従って、神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防するための作用物質は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドからもなり得る。前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかに、ＳＣＮ２Ｂタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、この方法は、前記作用物質（１種または複数種）を投与するための、遺伝子治療および／またはアンチセンス核酸技術のそれ自体既知の方法の適用を含む。一般に、遺伝子治療はいくつかのアプローチ：突然変異した遺伝子の分子置換、治療用タンパク質の合成で得られた新たな遺伝子の付加、および組換え発現法による、または薬物による内因性細胞遺伝子発現の調節を含む。遺伝子導入技術は詳細に記述されており（例えば、Behr, Acc Chem Res 1993, 26: 274-278 and Mulligan, Science 1993, 260: 926-931参照）、直接的遺伝子導入技術、例えば細胞内へのＤＮＡの機械的微量注入ならびに生物学的ベクター（組換えウイルス、特にレトロウイルスのような）またはモデルリポソームを用いた間接的技術、またはポリカチオンでのＤＮＡ共沈、化学的手段（溶媒、洗剤、ポリマー、酵素）または物理的手段（機械的、浸透性、熱性、電気ショック）による細胞膜摂動（cell membrane pertubation）を用いたトランスフェクションに基づく技術が挙げられる。中枢神経系への出生後遺伝子導入が詳細に記述されている（例えば、Wolff, Curr Opin Neurobiol 1993, 3: 743-748参照）。
【００３３】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療により神経変性疾患を治療または予防する方法、つまりアンチセンス核酸またはその誘導体を特定の重要な細胞に導入することにより、不適切に発現した、または欠陥のある遺伝子をダウンレギュレートする方法を特徴とする（例えば、Gillespie, DN&P 1992, 5: 389-395; Agrawal and Akhtar, Trends Biotechnol 1995, 13: 197-199; Crooke, Biotechnology 1992, 10: 882-6参照）。ハイブリダイゼーション法を除いて、リボザイム、つまり疾患のメッセージを運ぶＲＮＡを破壊する、酵素として作用するＲＮＡ分子の適用も記述されている（例えば、Barinaga, Science 1993, 262: 1512-1514参照）。好ましい実施形態において、治療されるべき被験者はヒトであり、治療用のアンチセンス核酸またはその誘導体は、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写物に対して作られる。中枢神経系、好ましくは被験者の脳の細胞をこのようにして治療することが好ましい。細胞侵入（Cell penetration）は、アンチセンス核酸およびその誘導体の担体粒子への結合、または上述の技術など公知の方法によって行うことができる。治療用標的オリゴデオキシヌクレオチドを投与する方法は当業者にはよく知られている（例えば、Wickstrom, Trends Biotechnol 1992, 10: 281-287参照）。場合によっては、単なる局所適用によって送達を行うことができる。その他のアプローチは、局所適用の細胞内発現に向けられている。この方法では、標的核酸の領域に相補的なＲＮＡの合成を指示する組換え遺伝子で細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで形質転換される。細胞内に発現したアンチセンスＲＮＡの治療的使用は手順上、遺伝子治療と同様である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として様々に知られている二本鎖ＲＮＡの使用によって遺伝子の細胞内発現を調節する、最近開発された方法は、核酸治療のもう１つの有効なアプローチであり得る（Hannon, Nature 2002, 418: 244-251）。
【００３４】
他の好ましい実施形態において、適切な細胞、例えばＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞、または他の神経細胞経において電位作動性ナトリウムチャネルＳＣＮ２Ａまたは他の電位作動性ナトリウムチャネルタンパク質と共発現するＳＣＮ２Ｂへの化合物および／または作用物質の作用を調査する方法が提供される。それによって、ＳＣＮ２Ａと、または他の電位作動性ナトリウムチャネルタンパク質と共発現したＳＣＮ２Ｂによって仲介される、ナトリウム電流への化合物および／または作用物質の電気生理学的効果が調べられる。前記試験を行うために、ヒト遺伝子産物ＳＣＮ２ＢをコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングする。ＳＣＮ２ＡをコードするｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３２７２２４〜ＡＦ３２７２４６）または他の電位作動性ナトリウムチャネルをコードするｃＤＮＡを他の適切な発現ベクターにクローニングする。好ましくは試薬のようなＤＭＲＩＥ−Ｃ（陽イオン性脂質１，２−ジミリステルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド−コレステロールのリポソーム形成）を使用して、上記のような適切な細胞系に前記プラスミドをトランスフェクトする。パッチクランプ実験を電圧固定モードで行うことができ（Hamillら, Pflugers Arch. 1981, 391: 85-100）、全細胞電流が記録され、得られたシグナルは、適切なソフトウェア、例えばＰｕｌｓｅ／Ｐｕｌｓｅｆｉｔ（HEKA, Lambrecht,ドイツ）を使用して、増幅され、デジタル化され、保存かつ解析される。電流の「低下（run-dow）」または「上昇（run-u）」（Varnumら, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 11528-11532）が依然として化合物および／または作用物質効果の評価には強すぎる場合には、前記電位作動性ナトリウムチャネルの仲介電流についての研究は、非特異的な電流振幅変化を防ぐために、穿孔パッチクランプ法で行うことができる（Dartら, J. Physiol. 1995, 483: 29-39; Dinesh & Hablitz, Brain Res. 1990, 535: 318-322）。ＳＣＮ２Ａまたは他のナトリウムチャネルタンパク質と共発現するＳＣＮ２Ｂに対する試験化合物の効果および可逆性を研究するための刺激プロトコルの一例が以下に示される。ＳＣＮ２ＢをＳＣＮ２Ａまたは他のナトリウムチャネルと共に共発現する細胞は、例えば−８０ｍＶの保持電位で固定されるだろう。パルスサイクル速度は１０秒である。化合物および／または作用物質の試験では、安定にトランスフェクトされた細胞を、例えば１００ミリ秒間、例えば−８０ｍＶの保持電位から、例えば−１００ｍＶまたは−１２０ｍＶに過分極させ、続いて、例えば−６０ｍＶ〜＋６０ｍＶの試験電位に１秒間脱分極させることができる。試験パルスのピーク電流振幅が解析に使用されるだろう。この方法は、ＳＣＮ２Ａまたは他の電位作動性ナトリウムチャネルと共発現されるＳＣＮ２Ｂの生物物理学的特性を開く、閉じる、活性化する、不活性化する、または修飾することができる化合物および／または作用物質を同定かつ試験するのにも適している。このように同定かつ試験された電位作動性ナトリウムチャネルの修飾因子は学習および記憶機能に影響する可能性があり、例えば神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療的アプローチに使用することができる。
【００３５】
他の好ましい実施形態において、この方法は、前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳に、ドナー細胞、または移植片拒絶を最小限に抑えるため、または低減するために処理されることが好ましいドナー細胞を移植することを含む方法であって、前記ドナー細胞が、前記作用物質（１種または複数種）をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を挿入することによって遺伝子改変される、方法を含む。前記導入遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって運ばれる。導入遺伝子は、導入遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス性の物理的トランスフェクション、特に微量注入によってドナー細胞に挿入することができる。導入遺伝子の挿入は、電気穿孔法、化学的に仲介されるトランスフェクション、特にリン酸カルシウムトランスフェクション、またはリポソーム仲介トランスフェクションによって行うこともできる（Mc Celland and Pardee, Expression Genetics: Accelerated and High-Throughput Methods, Eaton Publishing, Natick, MA, 1999）。
【００３６】
好ましい実施形態において、神経変性疾患、特にＡＤを治療および予防するための前記作用物質は、前記被験者に被験者細胞を導入することを含むプロセスであって、前記被験者細胞が、前記治療用タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理され、前記被験者細胞が前記被験者において治療有効量の前記治療用タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現するプロセスによって、前記被験者、好ましくはヒトに投与することができる治療用タンパク質である。前記ＤＮＡセグメントは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記細胞に挿入することができる。
【００３７】
本発明による治療法は、既に記載の細胞および遺伝子治療法のいずれかと組み合わせられる、治療的クローニング、移植、および胚幹細胞または胚生殖細胞および成体神経幹細胞を使用した幹細胞治療の適用を含む。幹細胞は、全能性または多能性である。それらは臓器特異的でもあり得る。疾患および／または損傷のある脳細胞または組織を修復する方法は、（ｉ）成体組織からドナー細胞を採取することを含む。これらの細胞の核は、遺伝物質がそれから除去されている、未受精卵細胞に移植される。胚幹細胞が、体細胞核導入を受けた細胞の胚盤胞段階から単離される。次いで、分化因子を使用することによって、幹細胞の、特殊（specialized）細胞型、好ましくは神経細胞への定方向の発達が生じるか（Lanzaら, Nature Medicine 1999, 9: 975-977）、または（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖のために、中枢神経系または骨髄（間葉幹細胞）から単離された成体幹細胞を精製し、続いてグラフトおよび移植するか、または（ｉｉｉ）内因性神経幹細胞を直接誘導して、増殖させ、移行し、機能性神経細胞に分化させる（Peterson DA, Curr. Opin. Pharmacol. 2002, 2: 34-42）。成体の脳の胚中心には神経損傷または機能不全がないことから、成体神経幹細胞は、損傷または疾患のある脳組織の修復に大きな可能性を秘めている（Colman A, Drug Discovery World 2001, 7: 66-71）。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明による治療または予防を受ける被験者は、ヒト、実験動物、例えばマウスまたはラット、家畜、または非ヒトの霊長類である。実験動物は、神経変性疾患のための非ヒト動物モデル、例えば、ＡＤ型神経病理学を有する遺伝子導入マウスおよび／またはノックアウトマウスである。
【００３９】
他の態様において、本発明は、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される少なくとも１種類の物質の活性またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の修飾因子を特徴とする。
【００４０】
その他の態様では、本発明は、前記修飾因子と、好ましくは薬剤担体とを含む医薬組成物を特徴とする。前記担体は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味し、それと共に修飾因子が投与される。
【００４１】
他の態様では、本発明は、医薬組成物において使用される、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される少なくとも１種類の物質の活性またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の修飾因子を特徴とする。
【００４２】
他の態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防する薬物を製造するための、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される少なくとも１種類の物質の活性またはレベル、または前記活性および前記レベルの両方の修飾因子の使用を提供する。
【００４３】
一態様において、本発明は、治療有効量または予防有効量の前記医薬組成物で満たされた１つまたは複数の容器を備えたキットも提供する。
【００４４】
他の態様において、本発明は、ＳＣＮ２Ｂをコードする非天然遺伝子配列、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体を含む、組換え非ヒト動物を特徴とする。前記組換え非ヒト動物の作製は、（ｉ）前記遺伝子配列および選択マーカー配列を含有する遺伝子ターゲティング構築物を提供する段階と、（ｉｉ）非ヒト動物の幹細胞に前記ターゲティング構築物を導入する段階と、非ヒト胚に前記非ヒト動物幹細胞を導入する段階と、（ｉｖ）偽妊娠非ヒト動物に前記胚を移植する段階と、（ｖ）前記胚を臨月まで発達させる段階と、（ｖｉ）そのゲノムが両方の対立遺伝子において前記遺伝子配列の修飾を含む、遺伝子改変非ヒト動物を同定する段階と、（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を繁殖させて、そのゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を得る段階と、を含み、前記遺伝子が、誤発現されるか、または過小発現されるか、または過剰発現され、かつ前記破壊または改変によって、神経変性疾患、特にＡＤと同様な神経病理学の症状を発症する素因を示す前記非ヒト動物が得られる。かかる動物を作製かつ構築する方法および技術は当業者には公知である（例えば、Capecchi, Science 1989, 244: 1288-1292; Hoganら, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1994 and Jackson and Abbott, Mouse Genetics and Transgenetics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, England, 1999参照）。神経変性疾患、特にＡＤを研究するための動物モデルとして、かかる組換え非ヒト動物を利用することが好ましい。かかる動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断学および治療学の開発において、化合物、作用物質および修飾因子をスクリーニングし、試験し、かつバリデートするのに有用である。好ましい実施形態において、前記組換え非ヒト動物は、ＳＣＮ２Ｂタンパク質をコードする非天然遺伝子配列、またはその断片、もしくは誘導体、またはその変異体を含む。
【００４５】
他の態様において、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または関連する疾患および障害の修飾因子であって、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される１種または複数種の物質の修飾因子をスクリーニングするアッセイを特徴とする。このスクリーニング法は、（ａ）細胞を試験化合物と接触させる段階と、（ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種または複数種の物質の活性またはレベル、またはその活性およびレベルの両方を測定する段階と、（ｃ）前記試験化合物と接触させていない対照細胞における前記物質の活性またはレベル、またはその活性およびレベルの両方を測定する段階と、（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の細胞における物質のレベルを比較する段階と、を含み、接触させた細胞における前記物質の活性および／またはレベルの変化によって、試験化合物が前記疾患および障害の修飾因子であることが示される。
【００４６】
その他の一態様において、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、または関連する疾患および障害の修飾因子であって、（ｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、および／または（ｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の断片、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される１種または複数種の物質の修飾因子のスクリーニングアッセイであって、（ａ）神経変性疾患または関連する疾患もしくは障害を発症する素因が与えられた、または既に発症している非ヒト試験動物に試験化合物を投与する段階と、（ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種または複数種の物質の活性および／またはレベルを測定する段階と、（ｃ）前記症状を発症する素因が等しく与えられた、または前記症状を既に発症している対応する（matched）非ヒト対照動物であり、かかる試験化合物がそれに投与されていない非ヒト動物における前記物質の活性および／またはレベルを測定する段階と、（ｄ）段階（ｂ）および（ｃ）の動物おける物質の活性および／またはレベルを比較する段階と、を含み、非ヒト試験動物における物質の活性および／またはレベルの変化によって、試験化合物が前記疾患および障害の修飾因子であることが示される、スクリーニングアッセイを特徴とする。
【００４７】
好ましい実施形態において、前記非ヒト試験動物および／または前記非ヒト対照動物は、天然ＳＣＮ２Ｂ遺伝子転写制御因子ではない転写制御因子の制御下にて、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子、またはその断片、またはその誘導体、または変異体を発現する、組換え非ヒト動物である。
【００４８】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）上述のスクリーニングアッセイの方法によって神経変性疾患の修飾因子を同定する段階と、（ｉｉ）修飾因子と薬剤担体とを混合する段階と、を含む、薬物を製造する方法を提供する。しかしながら、前記修飾因子は、他の種類のスクリーニングアッセイによっても同定可能である。
【００４９】
他の態様において、本発明は、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体と、リガンドとの結合を阻害するための、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。前記スクリーニングアッセイは、（ｉ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその断片もしくは誘導体の液体懸濁液を複数の容器に添加する段階と、（ｉｉ）前記阻害のために、スクリーニングすべき化合物（１種または複数種）を前記複数の容器に添加する段階と、（ｉｉｉ）検出可能なリガンド、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に添加する段階と、（ｉｖ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその前記断片、もしくは誘導体、もしくは変異体と、前記化合物（１種または複数種）と、前記検出可能なリガンド、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする段階と、（ｖ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物と、またはその前記断片、もしくは誘導体、もしくは変異体と結合する、好ましくは蛍光の量を測定する段階と、（ｖｉ）前記化合物のうちの１種または複数種による、前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその前記断片、もしくは誘導体、もしくは変異体への前記リガンドの結合の阻害の程度を決定する段階と、を含む。前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体を人工リポソームに再構成して、相当するプロテオリポソームを産生し、リガンドと前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物との結合の阻害を決定することが好ましい。洗浄剤からＳＣＮ２Ｂ翻訳産物をリポソームに再構成する方法が詳述されている（Schwarzら, Biochemistry 1999, 38: 9456-9464; Krivosheev and Usanov, Biochemistry-Moscow 1997, 62: 1064-1073）。蛍光標識リガンドを利用する代わりに、一部の態様では、当業者に公知の他の検出可能な標識、例えば放射性標識を使用し、しかるべくそれを検出することが好ましい。前記方法は、新規な化合物を同定するのに、ならびにＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の遺伝子産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体へのリガンドの結合を阻害するそれらの能力において改善された、または最適化された化合物を評価するのに、有用であり得る。担体粒子の使用に基づくこの場合における、蛍光結合アッセイの一例が、国際公開番号ＷＯ００／５２４５１に開示かつ記述されている。他の例は、国際公開番号ＷＯ０２／０１２２６に記載の競合アッセイ法である。本発明のスクリーニングアッセイに好ましいシグナル検出法が、以下の国際公開番号ＷＯ９６／１３７４４、ＷＯ９８／１６８１４、ＷＯ９８／２３９４２、ＷＯ９９／１７０８６、ＷＯ９９／３４１９５、ＷＯ００／６６９８５、ＷＯ０１／５９４３６、ＷＯ０１／５９４１６に記載されている。
【００５０】
他の一実施形態では、本発明は、（ｉ）上述の阻害的結合アッセイによって、リガンドと、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の遺伝子産物との結合の阻害剤として化合物を同定する段階と、（ｉｉ）その化合物を薬剤担体と混合する段階と、を含む、薬物を製造する方法を提供する。しかしながら、前記化合物は、他の種類のスクリーニングアッセイによっても同定可能である。
【００５１】
他の態様において、本発明は、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体に前記化合物が結合する程度を決定するために、化合物を試験する、好ましくは、複数の化合物をスクリーニングするアッセイを特徴とする。前記スクリーニングアッセイは、（ｉ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体の液体懸濁液を複数の容器に添加する段階と、（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングされるべき、１種類の検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、または複数種の検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物を前記複数の容器に添加する段階と、（ｉｉｉ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、または前記のその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体、および前記の検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物（１種または複数種）をインキュベートする段階と、（ｉｖ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、または前記のその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体と結合した、好ましくは蛍光の量を測定する段階と、（ｖ）前記ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、または前記のその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体への前記化合物の１種または複数種による結合の程度を決定する段階と、を含む。この種類のアッセイでは、蛍光標識を使用することが好ましい。しかしながら、他の種類の検出可能な標識も使用することができる。この種類のアッセイにおいても、本発明に記載の人工リポソームに、ＳＣＮ２Ｂ翻訳産物またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体を再構成することが好ましい。前記アッセイは、新規な化合物の同定、ならびにＳＣＮ２Ｂ翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体に結合するそれらの能力において改善された、または最適化された化合物の評価に有用である。
【００５２】
他の一実施形態では、本発明は、（ｉ）上述の結合アッセイによって、ＳＣＮ２Ｂの遺伝子産物に対する結合剤（binder）としての化合物を同定する段階と、その化合物を薬剤担体と混合する段階と、を含む、薬物を製造する方法を提供する。しかしながら、前記化合物は、他の種類のスクリーニングアッセイによっても同定可能である。
【００５３】
他の実施形態において、本発明は、本明細書に特許請求されるスクリーニングアッセイによる方法のいずれかによって得られる薬物を提供する。他の一実施形態では、本発明は、本明細書に特許請求されるスクリーニングアッセイによる方法のいずれかによって得られる薬物を提供する。
【００５４】
本発明は、配列番号１で示されるタンパク質分子を特徴とし、前記タンパク質分子は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的として使用される、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体である。
【００５５】
本発明はさらに、配列番号１に示されるタンパク質分子を特徴とし、前記タンパク質分子は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防、または治療、または改善する試薬または化合物のスクリーニング標的として使用される、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体である。
【００５６】
本発明は、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体を特徴とし、前記免疫原は、ＳＣＮ２Ｂ、配列番号１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体である。その免疫原は、前記遺伝子の翻訳産物の免疫原性もしくは抗原エピトープまたは部分を含み、翻訳産物の前記免疫原性または抗原性部分はポリペプチドであり、かつ前記ポリペプチドは動物における抗体応答を誘発し、かつ前記ポリペプチドは前記抗体によって免疫特異的に結合される。抗体を作製する方法は当技術分野でよく知られている（Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988参照）。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナ抗体ル、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体、ならびにその断片など、当技術分野で公知のすべての形態の抗体を包含する（Dubel and Breitling, Recombinant Antibodies, Wiley-Liss, New York, NY, 1999）。本発明の抗体は、例えば、酵素イムノアッセイ（例えば、酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降および抗体マイクロアレイなどの現況技術に基づく様々な診断および治療法において有用である（Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999 and Edwards R., Immunodiagnostics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, England, 1999参照）。これらの方法は、ＳＣＮ２Ｂ遺伝子の翻訳産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体の検出を含む。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体は、被験者からの試料中の細胞の病的状態を検出するのに使用することができ、前記細胞を前記抗体で免疫細胞化学的に染色することを含み、既知の健康状態を表す細胞と比較して前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化から、前記細胞の病的状態が示される。好ましくは、病的状態は、神経変性疾患、特にＡＤに関する。細胞の免疫細胞化学染色は、当技術分野でよく知られている多くの様々な実験法によって行うことができる。しかしながら、抗体結合の検出に自動化された方法を適用することが好ましく、その方法では、細胞の染色程度の決定、または細胞の細胞（cellular）染色または細胞内（subcellular）染色の決定、または細胞表面上での、または細胞器官および細胞の中の他の細胞内構造の間での抗原の位相分布の決定が、米国特許第６１５０１７３号に記載の方法に従って行われる。
【００５８】
本発明の他の特徴および利点は、図面および実施例の以下の説明から明らかであり、それらは単なる実例であり、その開示内容の残り部分を決して制限するものではない。
【００５９】
図１は、ＡＤにおける神経細胞減少および変性に対する選択的な脆弱性を有する脳領域を図示する。主に、下側頭葉、嗅内皮質、海馬、および扁桃体内の神経細胞は、ＡＤにおける変性プロセスを受けやすい（Terryら, Annals of Neurology 1981, 10: 184-192）。これらの脳領域は大部分は、学習および記憶機能の処理に関与する。それと対照的に、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は、大部分が損傷を受けていない状態のままであり、ＡＤにおける神経変性プロセスから守られている。ＡＤ患者および健康な、年齢が一致する対照個体の前頭皮質（Ｆ）、側頭皮質（Ｔ）および海馬（Ｈ）からの脳組織を本明細書に開示される実施例に使用した。実例としての目的のために、正常な健康な脳の画像をＳｔｒａｎｇｅによる出版物から選び取った（Brain Biochemistry and Brain Disorders, Oxford University Press, Oxford, 1992, p.4）。
【００６０】
図２は、蛍光ディファレンシャルディスプレイスクリーンにおけるＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の差次的発現の最初の同定を開示する。この図は、大きな調製用蛍光ディファレンシャルディスプレイゲルのクリッピングを示す。健康な対照被験者２名およびＡＤ患者６名の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）からのＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲル上に２通りで添加した（左から右）。相当する一塩基アンカー（one-base-anchor）オリゴヌクレオチドおよび特異的なＣｙ３標識ランダムプライマーを用いて、個々のｃＤＮＡを増幅することによって、ＰＣＲ産物を得た。矢印は、移動位置を示し、そこにＡＤ患者の側頭皮質から誘導されるシグナルと比較される、前頭皮質から誘導されるＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の転写産物のシグナルの強度の有意な差が存在する。その差次的発現は、ＡＤ患者の前頭皮質と比較される、側頭皮質におけるＳＣＮ２Ｂ遺伝子転写のダウンレギュレーションを反映する。健康な非ＡＤ対照被験者の側頭皮質および前頭皮質から得られるシグナルを互いに比較した場合には、シグナル強度の差、つまり発現レベルの変化は検出できない。
【００６１】
図３および図４は、２つの異なるセットのプライマー対、プライマーセットＡ（図３）とプライマーセットＢ（図４）を使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＡＤ脳組織におけるヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子の差次的発現の検証を示す。ＡＤ患者（図３ａ；４ａ）および年齢が一致する健康な対照個体（図３ｂ；４ｂ）の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から収集したＲＮＡ試料からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化を、ライトサイクラー迅速熱サイクル技術（LightCycler rapid thermal cycling technique）によって行った。それらの遺伝子発現レベルの有意な差を示さない、１セットの標準遺伝子の合わせた平均値にデータを規準化した。前記セットの標準遺伝子は、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィリンＢおよびβ−アクチンに対する遺伝子からなった。図は、その蛍光によって測定される増幅物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の速度論を図示する。反応の対数期中、正常な対照個体の前頭皮質および側頭皮質の両方からのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡの増幅速度論は近接しており（図３ｂ；４ｂ：矢印）、それに対してＡＤにおいては（図３ａ；４ａ：矢印）、分析された２つの脳領域におけるＳＣＮ２Ｂの差次的発現を示す、相当する曲線の有意な分離があることに留意されたい。
【００６２】
図５は、プライマーセットＡを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析による、ＡＤ脳組織におけるヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子の差次的発現を示す。ＡＤ患者（図５ａ）の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）から採取されたＲＮＡ試料からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化を、ライトサイクラー迅速熱サイクル技術によって行った。同様に、年齢が一致する健康な対照個体の試料を比較した（図５ｂ）。それらの遺伝子発現レベルの有意な差を示さない１セットの標準遺伝子の合わせた平均値にデータを正規化した。前記セットの標準遺伝子は、サイクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびβ−アクチンに対する遺伝子からなった。図は、その蛍光によって測定される増幅物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の速度論を図示する。反応の対数期中、正常な対照個体の前頭皮質および海馬の両方からのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡの増幅速度論は近接しており（図５ｂ：矢印）、それに対してアルツハイマー病においては（図５ａ、矢印）、相当する曲線の有意な分離があり、分析されたそれぞれの脳領域におけるＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の差次的発現、好ましくは海馬に対する前頭皮質におけるヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子の転写産物、またはその断片、もしくは誘導体、もしくは変異体の調節不全が示されていることに留意されたい。
【００６３】
図６は、配列番号１；ＳＣＮ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列を開示する。完全長ヒトＳＣＮ２Ｂタンパク質は２１５アミノ酸を含む。
【００６４】
図７は、配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースにおいて見出される重複ヒトヌクレオチド配列断片の重複する大きなセットのアセンブリから得られるコンセンサス配列によって表される４９０３ヌクレオチドを含む、ヒトＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（図１０参照）。
【００６５】
図８は、配列番号３、ディファレンシャルディスプレイにより同定され、得られた、９９ｂｐのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を図示する（５’から３’方向の配列）。
【００６６】
図９は、ヒトＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、配列番号２への配列番号３の配列アラインメントを示す。
【００６７】
図１０は概略的に、ＳＣＮ２ＢコンセンサスｃＤＮＡ配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４９４９８、ＡＦ１０７０２８、ＡＸ３７６０００、ＨＳＵ８７５５５に基づく、およびそれから誘導される延長および補正されたコンセンサス配列、および示される他のＥＳＴ配列断片、およびＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子に対するプライマーを用いたＰＣＲ増幅から得られる配列（ｅｎｓ−ＰＣＲ１、ｅｎｓ−ＰＣＲ２）を構成する、ゲノムデータベース配列断片からの配列番号２のアセンブリを図示する。プライマーセットＤ（ｅｎｓ−ＰＣＲ１、配列番号２のヌクレオチド３２０４〜４１８２位の配列）：５’−ＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧ−３’および５’−ＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＴＣ−３’；プライマーセットＣ（ｅｎｓ−ＰＣＲ２、配列番号２のヌクレオチド２１３８〜３２３０位の配列）：５’−ＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＡＣ−３’および５’−ＣＡＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＴＣＧＣＴＣ−３’。
【００６８】
図１１は、配列番号３のＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡとの模式的アラインメントを示す。開いた長方形は、ＳＣＮ２Ｂオープンリーディングフレームを表し、細い棒は５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を表す。
【００６９】
図１２は、ＳＣＮ２Ｂのアミノ酸１７９〜２１５位に相当するペプチドに対して産生される、親和性の精製ウサギポリクローナル抗ＳＣＮ２Ｂ抗血清（緑色のシグナル）で標識されたヒト中心前回からの切片を図示する。ＳＣＮ２Ｂの免疫活性が大脳皮質（ＣＴ）および白質（ＷＭ）のどちらにも認められた（図１２ａ、低倍率）。神経プロセスを飾るＳＣＮ２Ｂ免疫活性の点状パターン（樹状突起棘様）および神経細胞体のより弱く、かつ拡散した免疫活性が認められた（図１２ｂ、高倍率）。図１２ｃは、グリア細胞体および神経繊維の点状免疫活性を示す。青色のシグナルは、ＤＡＰＩで染色された核を示す。
【００７０】
図１３の表は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９、Ｐ０２６、Ｐ０３１、Ｐ０３８、Ｐ０４０、Ｐ０４１、Ｐ０４２、Ｐ０４６、Ｐ０４７により本明細書で同定されたＡＤ患者１５名（０．２９〜０．９８倍）、および内部参照番号Ｃ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４、Ｃ０２０、Ｃ０２２、Ｃ０２４、Ｃ０２５、Ｃ０２６、Ｃ０２７、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３１、Ｃ０３２、Ｃ０３３、Ｃ０３４、Ｃ０３５により本明細書で同定された、年齢が一致する健康な対照個体１９名（０．５９〜２．１５倍）における前頭皮質に対する側頭皮質でのＳＣＮ２Ｂ遺伝子発現レベルを示す。プライマー対セットＡを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。示される値は本明細書に記載の式によって計算される（以下参照）。散布図によって、対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角形）それぞれにおける、側頭と前頭皮質とのレギュレーション比の個々の対数値、ｌｏｇ（比ＩＴ／ＩＦ）が視覚化されている
【００７１】
図１４における表は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９により本明細書で同定されたＡＤ患者７名（０．２０〜０．９１倍）、および内部参照番号Ｃ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４により本明細書で同定された、年齢が一致する健康な対照個体５名（０．４８〜１．４８倍）における前頭皮質に対する側頭皮質でのＳＣＮ２Ｂ遺伝子発現レベルを示す。プライマー対セットＢを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。示される値は本明細書に記載の式によって計算される（以下参照）。散布図によって、対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角形）それぞれにおける、側頭と前頭皮質とのレギュレーション比の個々の対数値、ｌｏｇ（比ＩＴ／ＩＦ）が視覚化されている。
【００７２】
図１５における表は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１９により本明細書で同定されたアルツハイマー秒患者６名（０．４８〜１０．８７倍）、および内部参照番号Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８により本明細書で同定された、年齢が一致する健康な対照個体３名（０．７７〜１．２６倍）におけるＳＣＮ２Ｂ遺伝子についての前頭皮質に対する海馬での遺伝子発現レベルを示す。プライマー対セットＡを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。示される値は本明細書に記載の式によって計算される（以下参照）。散布図によって、対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角形）それぞれにおける、海馬と前頭皮質とのレギュレーション比の個々の対数値、ｌｏｇ（比ＨＣ／ＩＦ）が視覚化されている。
【実施例】
【００７３】
実施例Ｉ：
（ｉ）ＡＤの患者からの脳組織の解剖
ＡＤ患者および年齢が一致する対照被験者からの脳組織を死後６時間以内に採取し、直ぐにドライアイスで凍結した。診断を病理組織学的に確認するために、各組織からの試料切片をパラホルムアルデヒドで固定した。差次的発現分析のための脳領域を同定し（図１参照）、ＲＮＡ抽出が行われるまで−８０℃で保存した。
【００７４】
（ｉｉ）全ｍＲＮＡの単離：
製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、全ＲＮＡを死後脳組織から抽出した。正確なＲＮＡ濃度およびＲＮＡ品質をＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してＤＮＡ  ＬａｂＣｈｉｐシステムで決定した。作製されたＲＮＡをさらに品質試験するために、つまり部分的な分解を排除し、ＤＮＡ混入について試験するために、特異的に設計されたイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドおよびゲノムＤＮＡを基準対照として使用して、製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ社）に記載のライトサイクラー技術を用いて融解曲線を作成した。
【００７５】
（ｉｉｉ）蛍光ディファレンシャルディスプレイ（ＦＤＤ）による差次的に発現された遺伝子のｃＤＮＡ合成および同定：
異なる組織における遺伝子発現の変化を同定するために、改変かつ改善されたディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）スクリーニング法を用いた。本来のＤＤスクリーニング法は当業者には公知である（Liang and Pardee, Science 1995, 267:1186-7）。この技術では、ＲＮＡの２つのＲＮＡの集団を比較し、１つの集団では発現するが、他の集団では発現しない遺伝子のクローンを得る。いくつかの試料を同時に分析し、アップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子のどちらも同じ実験において同定することができる。ＤＤ法におけるいくつかの段階を調整かつ洗練し、かつ技術的パラメーターを改良することによって、例えば重複性を高めること、全ＲＮＡの逆転写のための最適化された試薬および条件を評価すること、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその産物の分離を最適化することによって、高い再現性かつ高感度な結果を得ることができる技術が開発された。適用かつ改善された技術はｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｋａｍｍｅｒらによって詳細に記述されている（Nucleic Acids Research 1999, 27: 2211-2218）。特異的に設計された６４個のプライマー１セットを開発し（標準セット）、すべての可能性のあるＲＮＡ種の統計学的に包括的な分析を達成した。さらに、その方法を改良して、蛍光標識プライマーの使用に基づく、調製用ＤＤスラブゲル技術を生み出した。本発明において、アルツハイマー病患者および年齢が一致する対照被験者の、注意深く選択された死後脳組織（前頭および側頭皮質）からのＲＮＡ集団を比較した。ＤＤ分析の出発原料として、上述の（ｉｉ）のように抽出された全ＲＮＡを使用した。各０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素１μｌおよび１×ＲＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ社）、１０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｑｉａｇｅｎ社）、および１μＭの１塩基アンカーオリゴヌクレオチドＨＴ11Ａ、ＨＴ11ＧまたはＨＴ11Ｃのいずれかを含有する反応２０μｌ中で、等量のＲＮＡ０．０５μｇをそれぞれ、ｃＤＮＡへと転写した（Liangら, Nucleic Acids Research 1994, 22: 5763-5764; Zhaoら, Biotechniques 1995, 18:842-850）。逆転写を３７℃で６０分間行い、最後の変性段階は９３℃で５分間行った。最終容積２０μｌで、Ｃｙ３標識ランダムＤＤプライマーのうちのいずれか１つ（１μＭ）、１×ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、２μＭ ｄＮＴＰ−ミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）、１Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に、相当する１塩基アンカーオリゴヌクレオチド（１μＭ）を使用して、得られたｃＤＮＡ２μｌをそれぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけた。ＰＣＲ条件を以下のように設定した：１ラウンドは、変性のために９４℃で３０秒間行い、１℃／秒で４０℃に冷却し、低いストリンジェンシーでプライマーをアニーリングするために４０℃で４分間行い、１℃／秒で７２℃まで加熱し、伸長のために７２℃で１分間行った。このラウンドに続いて、３９回の高ストリンジェンシー���サイクルを行った：９４℃で３０秒行い、続いて１℃／秒で６０℃に冷却し、６０℃で２分間行い、１℃／秒で７２℃まで加熱し、７２℃で１分間行った。７２℃で５分間の最終段階を最後のサイクルに加えた（ＰＣＲサイクラー：Ｍｕｌｔｉ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ  ２００，ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）。ＤＮＡローディングバッファー８μｌをＰＣＲ産物プレパラート（preparation）２０μｌに添加し、５分間変性させ、ゲル上に添加するまで、氷上に維持した。３．５μｌそれぞれをスラブゲルシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）において、厚さ０．４ｍｍの６％ポリアクリルアミド（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ）／７Ｍ尿素シーケンシングゲル上で２０００Ｖ、６０Ｗ、３０ｍＡにて１時間４０分の間分離した。電気泳動が完了した後、適切なＦＭＢＩＯ ＩＩ分析８．０ソフトウェアを使用して、ＦＭＢＩＯ ＩＩ蛍光スキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）でゲルをスキャンした。実物大の写真を印刷し、差次的に発現したバンドをマークし、ゲルから除去し、１．５ｍｌ容器に移し、滅菌水２００μｌでオーバーレイし、抽出されるまで−２０℃で維持した。
【００７６】
ディファレンシャルディスプレイ産物の溶出および再増幅：Ｈ2Ｏ２００μｌ中で１０分間沸騰させ、氷上で冷却し、−２０℃でエタノール（Ｍｅｒｃｋ社）およびグリコーゲン／酢酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ社）を使用して、上清液から一晩沈殿させ、続いて１３．０００ｒｐｍにて４℃で２５分間遠心分離することによって、差次的な（differential）バンドをゲルから抽出した。ペレットを氷冷のエタノール（８０％）で２回洗浄し、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）（Ｍｅｒｃｋ社）に再懸濁し、０．０２５μｍのＶＳＷＰ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）上にて１０％グリセロール（Ｍｅｒｃｋ社）に対して室温で１時間透析した。最初のラウンドが９４℃で５分行われ、続いて９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、１℃／秒で４５分間７０℃に上昇させる１５サイクル、および７２℃で５分間の最終段階を除いては、同一の条件下にてディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（上記参照）に使用される相当するプライマー対を含有するＰＣＲ混合物２５μｌ中で１５回の高ストリンジェンシーのサイクルによって再増幅するために、得られたプレパラート（preparation）を鋳型として使用した。
【００７７】
ディファレンシャルディスプレイ産物のクローニングおよびシーケンシング：再増幅されたｃＤＮＡをＤＮＡ  ＬａｂＣｈｉｐシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて分析し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにライゲートし、製造元の説明書（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従ってＴｏｐ１０Ｆ'大腸菌細胞に形質転換した。クローン化ｃＤＮＡ断片を市販のシーケンシング設備によってシーケンスした。ヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子についてのかかる蛍光ディファレンシャルディスプレイ実験の結果を図２に示す。
【００７８】
（ｉｖ）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる差次的発現の確認：
ライトサイクラー技術（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の差次的発現の決定的な裏付けを行った。この技術は、ポリメラーゼ連鎖反応に対する迅速な熱サイクル、ならびに増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を特徴とし、したがって、終点読取りではなく速度論的（kinetic）読取りを用いることによって、ＲＴ−ＰＣＲ産物を非常に正確に定量化することができる。側頭皮質からのＳＣＮ２Ｂｃ ＤＮＡと前頭皮質からのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡとの比、および海馬からのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡと前頭皮質からのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡとの比がそれぞれ決定された（相対的定量化）。
【００７９】
最初に、標準曲線を作製し、ＣＮ２Ｂをコードする遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲの効率を決定した。
プライマーセットＡ：
５’−ＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＴＴ−３’
５’−ＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＴＡＧＡＣＣＣＡＡＡＣ−３’。
プライマーセットＢ：
５’−ＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＡＧＧ−３’
５’−ＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣ−３’。
【００８０】
ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩミックス（LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I mix）（ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰとのｄＮＴＰ混合物、ＳＹＢＲグリーンＩ染料、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；Ｒｏｃｈｅ社を含有する）、０．５μＭプライマー、ｃＤＮＡ希釈液シリーズ２μｌ（ヒト全脳のｃＤＮＡ最終濃度４０、２０、１０、５、１および０．５ｎｇ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を含有し、かつ使用するプライマーに応じて、さらに３ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する容積２０μｌ中にて、ＰＣＲ増幅（９５℃で１秒、５６℃で５秒、７２℃で５秒）を行った。融解曲線の分析から、約８６．５℃で単一ピークが示され、可視のプライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物の質およびサイズをＤＮＡ  ＬａｂＣｈｉｐシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で決定した。プライマーセットＡでは期待サイズ（expected size）８２ｂｐでの、プライマーセットＢでは期待サイズ８４ｂｐでの単一ピークが試料の電気泳動図において認められた。類似の手法において、ＰＣＲプロトコルを適用し、定量化のための参照標準として選択された１セットの参照遺伝子のＰＣＲ効率を決定した。本発明において、かかる参照遺伝子５つの平均値を決定した：（１）サイクロフィリンＢ；ＭｇＣｌ2を除いては（３ｍＭではなく、さらに１ｍＭ ＭｇＣｌ2を添加した）、特異的なプライマー５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’および５’−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３’を使用した。融解曲線分析から、約８７℃で単一ピークが示され、可視のプライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析から、期待サイズ（６２ｂｐ）の単一バンドが示された。（２）リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）；特異的なプライマー５’−ＧＧＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡ−３’および５’−ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣ−３’を使用した（３ｍＭではなく、さらに１ｍＭ ＭｇＣｌ2を添加した）。融解曲線分析から、約８５℃で単一ピークが示され、可視のプライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析から、期待サイズ（６２ｂｐ）の単一バンドが示された。（３）β−アクチン；特異的なプライマー５’−ＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ−３’および５’−ＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’を使用した。融解曲線分析から、約８７℃で単一ピークが示され、可視のプライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析から、期待サイズ（１４２ｂｐ）の単一バンドが示された。（４）ＧＡＰＤＨ；特異的なプライマー５’−ＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧ−３’および５’−ＧＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’を使用した。融解曲線分析から、約８３℃で単一ピークが示され、可視のプライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析から、期待サイズ（８１ｂｐ）の単一バンドが示された。（５）トランスフェリン受容体ＴＲＲ；特異的なプライマー５’−ＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＴＴ−３’および５’−ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣ−３’を使用した。融解曲線分析から、約８３℃で単一ピークが示され、可視のプライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析から、期待サイズ（８０ｂｐ）の単一バンドが示された。
【００８１】
値を計算するために、最初にＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子および５つの参照標準遺伝子についての閾値サイクル値Ｃｔに対して、ｃＤＮＡ濃度の対数をプロットした。標準曲線（つまり、線形回帰）の傾きおよび切片をすべての遺伝子について計算した。第２段階では、前頭皮質および側頭皮質からのｃＤＮＡ、および前頭皮質および海馬からのｃＤＮＡをそれぞれ、並行して分析し、サイクロフィリンＢに正規化した。Ｃｔ値を測定し、相当する標準曲線を用いて全脳ｃＤＮＡ（ｎｇ）に変換した：
１０＾（（Ｃｔ値−切片）／傾き）［全脳ｃＤＮＡ（ｎｇ）］
【００８２】
前頭皮質および側頭皮質のＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡの値、および前頭皮質および海馬のＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡの値をそれぞれ、サイクロフィリンＢに正規化し、その比を次式に従って計算した：
【数１】
2006518199.tif 000003
【数２】
2006518199.tif 000004
【００８３】
第３の段階において、参照標準遺伝子のセットを並行して分析し、個々の脳試料それぞれの参照標準遺伝子の発現レベルの、側頭皮質と前頭皮質との比の平均値、および海馬と前頭皮質との比の平均値を決定した。サイクロフィリンを段階２および段階３において分析し、一方の遺伝子と他方の遺伝子との比が異なる実施において一定のままであったことから、単一の遺伝子のみに正規化するのではなく、参照標準遺伝子のセットの平均値にＳＣＮ２Ｂの値を正規化することが可能であった。すべてのハウスキーピング遺伝子の平均値からのサイクロフィリンＢの偏差によって、上記で示されるそれぞれの比を割ることによって計算を行った。ＳＣＮ２Ｂ遺伝子についてのかかる定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図３、４、および５に示す。
【００８４】
（ｖ）免疫組織化学：
ヒト脳におけるＳＣＮ２Ｂの免疫蛍光染色では、ドナーの死後の中心前回から凍結切片をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて作製し、アセトン中で室温にて１０分間固定した。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片をブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）と共に３０分間プレインキュベートし、次いで親和性の精製ウサギ抗ＳＣＮ２Ｂ抗血清（ブロッキングバッファー中で１：２０〜１：４０に希釈；Ｓ−６８１１，Ｓｉｇｍａ社）と共に４℃で一晩インキュベートした。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ中で３回すすいだ後、切片をＦＩＴＣ−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：１５０に希釈）と共に室温で２時間インキュベートし、次いで再度、ＰＢＳ中で洗浄した。ＰＢＳ中の５μＭ ＤＡＰＩと共に切片を３分間インキュベートすることによって、核の染色を行った（青色のシグナル）。ヒト脳におけるリポフスチンの自己蛍光をブロックするために、７０％エタノール中の１％ズダンブラックＢで室温にて２〜１０分間処理し、続いて７０％エタノール、蒸留水およびＰＢＳ中に浸漬した。「Ｖｅｃｔｒａｓｈｉｅｌｄ」封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、切片をカバーガラスで覆い、倒立顕微鏡（ＩＸ８１，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ社）で観察した。適切なソフトウェア（ＡｎａｌｙＳｉＳ，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ社）でデジタル画像を取り込んだ。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、ＡＤにおける神経細胞減少および変性に対する選択的な脆弱性を有する脳領域を図示する。
【図２】図２は、蛍光ディファレンシャルディスプレイスクリーンにおけるＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子の差次的発現の最初の同定を開示する。
【図３】図３は、２つの異なるセットのプライマー対、プライマーセットＡを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＡＤ脳組織におけるヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子の差次的発現の検証を示す。
【図４】図４は、２つの異なるセットのプライマー対、プライマーセットＢを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＡＤ脳組織におけるヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子の差次的発現の検証を示す。
【図５】図５は、プライマーセットＡを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析による、ＡＤ脳組織におけるヒトＳＣＮ２Ｂ遺伝子の差次的発現を示す。
【図６】図６は、配列番号１；ＳＣＮ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列を開示する。完全長ヒトＳＣＮ２Ｂタンパク質は２１５アミノ酸を含む。
【図７−１】図７は、配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースにおいて見出される重複ヒトヌクレオチド配列断片の重複する大きなセットのアセンブリから得られるコンセンサス配列によって表される４９０３ヌクレオチドを含む、ヒトＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図７−２】図７は、配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースにおいて見出される重複ヒトヌクレオチド配列断片の重複する大きなセットのアセンブリから得られるコンセンサス配列によって表される４９０３ヌクレオチドを含む、ヒトＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は、配列番号３、ディファレンシャルディスプレイにより同定され、得られた、９９ｂｐのＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を図示する（５’から３’方向の配列）。
【図９】図９は、ヒトＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、配列番号２への配列番号３の配列アラインメントを示す。
【図１０】図１０は概略的に、ＳＣＮ２ＢコンセンサスｃＤＮＡ配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４９４９８、ＡＦ１０７０２８、ＡＸ３７６０００、ＨＳＵ８７５５５に基づく、およびそれから誘導される延長および補正されたコンセンサス配列、および示される他のＥＳＴ配列断片、およびＳＣＮ２Ｂをコードする遺伝子に対するプライマーを用いたＰＣＲ増幅から得られる配列（ｅｎｓ−ＰＣＲ１、ｅｎｓ−ＰＣＲ２）を構成する、ゲノムデータベース配列断片からの配列番号２のアセンブリを図示する。
【図１１】図１１は、配列番号３のＳＣＮ２Ｂ ｃＤＮＡとの模式的アラインメントを示す。開いた長方形は、ＳＣＮ２Ｂオープンリーディングフレームを表し、細い棒は５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を表す。
【図１２】図１２は、ＳＣＮ２Ｂのアミノ酸１７９〜２１５位に相当するペプチドに対して産生される、親和性の精製ウサギポリクローナル抗ＳＣＮ２Ｂ抗血清（緑色のシグナル）で標識されたヒト中心前回からの切片を図示する。
【図１３】図１３は、年齢が一致する健康な対照個体１９名（０．５９〜２．１５倍）における前頭皮質に対する側頭皮質でのＳＣＮ２Ｂ遺伝子発現レベルを示す。
【図１４】図１４は、年齢が一致する健康な対照個体５名（０．４８〜１．４８倍）における前頭皮質に対する側頭皮質でのＳＣＮ２Ｂ遺伝子発現レベルを示す。
【図１５】図１５は、アルツハイマー秒患者６名（０．４８〜１０．８７倍）、および年齢が一致する健康な対照個体３名（０．７７〜１．２６倍）におけるＳＣＮ２Ｂ遺伝子についての前頭皮質に対する海馬での遺伝子発現レベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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