(57)【要約】本開示は、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子における突然変異の検出を目的とするＰＣＲに基づく方法であって、突然変異塩基（複数も可）と相補的であるプライマーを用い、ＤＮＡの増幅が行われたか否かを測定することにより突然変異を検出することを含む方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ−ＲＡＦ遺伝子における特異的突然変異の検出方法であって、
（ａ）突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたないＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの３'末端は、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の第一ＤＮＡ鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であって、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能増幅産物が製造されるように選択されるものとし、そして
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法。
【請求項２】
検出プライマーが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または４２を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
配列番号５７、５９、６０、６１または６２を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
請求項１記載の方法にしたがって検出プライマーとして使用される、請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
請求項１記載の方法にしたがって検出プライマーとして使用される、請求項５記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
請求項１記載の方法にしたがって検出プライマーとして使用される、請求項６記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の要旨
本発明は、核酸、特にゲノムＤＮＡにおける特異的突然変異の検出を目的とする好都合なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
一部の癌および他の増殖性疾患は、増殖を促進するかまたは細胞分化または正常な細胞死を妨げる形で正常細胞を形質転換する突然変異により誘発されると仮定されている。上記突然変異は、たとえば、細胞生長を促し、細胞分化またはアポトーシス経路を妨げ、活性が高められたかまたは低下した酵素または他の因子を生産するなどの遺伝子を活性化し得る。特定突然変異の存在または不存在は、疾患の適切な処置に関する決定にとっての基礎であり得る。すなわち、上記突然変異を検出できることは、上記疾患の適切な処置にとって非常に重要であり得る。
【０００３】
本発明は、特異的突然変異が核酸の特定セグメントに存在するか否かを測定する診断方法についての基礎としてＰＣＲに信頼を置くものである。ＰＣＲは、既知配列の２領域間に存する核酸セグメントのインビトロ増幅についてのよく知られた技術である。一般的に、鋳型核酸をたとえば加熱により変性させ、次いで２つのオリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングさせる。プライマーは、鋳型核酸の反対鎖の配列と相補的であり、増幅される核酸セグメントの両端に位置する。当業者に公知の条件下、適切な核酸ポリメラーゼ、たとえばＤＮＡポリメラーゼに曝露すると、所望の核酸セグメントの新たな２コピーが製造される。このサイクルを数回反復すると、所望の核酸セグメントのコピー数は、理論的には２ｎ倍（ｎはサイクル数である）で増加する。明らかな通り、幾つかのサイクル後、所望の核酸セグメントの多くの新たなコピーが製造される。
【０００４】
本発明によると、プライマーの一方（以後「検出プライマー」）の３'末端は、鋳型核酸の第一鎖で推測されている突然変異と相補的であり、第二プライマーは、ＰＣＲにより製造された場合に増幅産物が検出可能となるように充分に突然変異の上流または下流にある鋳型核酸の反対鎖のセグメントと相補的である。ＰＣＲ実施条件は、検出プライマーの３'末端が鋳型核酸の第一鎖と相補的であるときのみＰＣＲが進行するように選択される。すなわち、検出プライマーの３'末端が突然変異塩基と相補的である場合、ＰＣＲによる核酸セグメントの増幅は、突然変異が鋳型核酸に存在することを示す。
【０００５】
発明の詳細な記載
第一局面において、本発明は、核酸における突然変異の検出方法であって、
（ａ）検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でエキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼを用いるＰＣＲにより突然変異を含む核酸セグメントの増幅を試み、ただし、検出プライマーの３'末端は、核酸の第一鎖における突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、核酸の反対鎖のセグメントと相補的であって、ＰＣＲが行なわれている場合に検出可能増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）核酸セグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法である。
【０００６】
好ましくは、核酸はＤＮＡ、たとえばゲノムＤＮＡである。すなわち、本発明のこの局面は、さらに特定すれば既知配列のＤＮＡにおける特異的突然変異の検出方法であって、
（ａ）突然変異を含むＤＮＡのセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたないＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの３'末端は、ＤＮＡセグメントの第一鎖における突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であって、突然変異塩基を含む核酸セグメントの検出可能な増幅が行われ得るように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法に関するものである。
【０００７】
プライマーは、鋳型核酸の反対鎖の配列に相補的であり、増幅される核酸セグメントの両端に位置するオリゴヌクレオチドである。プライマーは、少なくとも約１４ヌクレオチド長、好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド長、たとえば２０〜２４ヌクレオチド長であるべきである。本発明のこの局面の基礎は、突然変異を含むと考えられている核酸セグメント、たとえばＤＮＡセグメントにおける突然変異塩基と相補的であることが知られている３'末端を有する検出プライマーの使用である。ＰＣＲは、３'末端の塩基が鋳型核酸鎖における突然変異点に存在する塩基と相補的でなければ、検出プライマーの３'末端で伸長が行なわれない条件下で実施される。すなわち、検出プライマーの３'末端が鋳型核酸における突然変異点に存在する塩基と相補的でなければ、大した量の核酸セグメント増幅は起こらない。したがって、検出プライマーの３'末端が突然変異と相補的である場合、核酸セグメントの増幅は、突然変異が存在することを示す。
【０００８】
ＰＣＲは２本のプライマーが両端に位置する鋳型核酸セグメントを増幅するため、本発明にしたがって増幅される核酸セグメントは２本のプライマーにより画定される。したがって、第二プライマーは、核酸の反対鎖と相補的であり、増幅産物が容易に検出され得るように突然変異の充分に上流または下流に位置するように選択される。一般に、増幅される核酸セグメントは、少なくとも約７０塩基対を含むべきである。核酸セグメントは、少なくとも７０塩基対長、ただし６０００塩基対長を越えない、たとえば約１００〜１０００または１５０〜５００塩基対長であるように増幅されるのが好ましい。それぞれの場合において、核酸セグメントは検出される突然変異を含む。
【０００９】
本発明方法によると、ＰＣＲは、検出プライマーの３'末端にある塩基が鋳型核酸における対応塩基と相補的でなければ、増幅があまり行われない条件下で実施される。上記条件は、一般的に標準であるが、使用されている条件下で３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼの使用を必要とする。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたない上記核酸ポリメラーゼは、当業者には公知であり、市販されている。それらの例としては、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ（エキソ−）［ニューイングランド・バイオラボズ］、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（エキソ−）［ニューイングランド・バイオラボズ］、９°Ｎポリメラーゼ［ニューイングランド・バイオラボズ］およびＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ（登録商標）［エピセントレ］ポリメラーゼがあり、これらは全て市販されている。核酸はＤＮＡであり、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、ＶＥＮＴ（エキソ−）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ（エキソ−）、９°ＮおよびＭＡＳＴＥＲＡＭＰ ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼ、特にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであるのが好ましい。
【００１０】
一般的に、本発明方法によると、約２０〜４０サイクルのＰＣＲを実施する。好ましくは、約２５〜３５サイクル、特に３５サイクルのＰＣＲを実施する。
【００１１】
核酸セグメントの増幅が行なわれているか否かは、当業者に公知の方法により検出される。上記検出方法には、特にゲル電気泳動があり、ＤＮＡ染色はたとえば臭化エチジウム方法により行なわれる。
【００１２】
本発明方法によると、検出プライマーの３'末端にある塩基が鋳型核酸における対応塩基と相補的である場合のみ増幅が行われる。すなわち、検出プライマーの３'末端が突然変異と相補的である場合、増幅産物の存在は、突然変異が鋳型核酸鎖に存在することを示しており、増幅産物の不存在は、鋳型核酸が突然変異を含まないことを示している。
【００１３】
すなわち、本発明は、核酸における特異的突然変異の検出方法であって、
（ａ）検出プライマーおよび第二プライマーの存在下で３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼを用いるＰＣＲにより突然変異を含む核酸セグメントの増幅を試み、ただし、検出プライマーの３'末端は、核酸の第一鎖における突然変異点にある突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、核酸の反対鎖のセグメントと相補的であって、ＰＣＲが行なわれている場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）核酸セグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）核酸セグメントが増幅されている場合には突然変異が存在することを示すものとする
方法を包含する。
【００１４】
当業者であれば、ＰＣＲに適切な第二プライマーの選択に使用される基準については理解できるはずである。一般に、第二プライマーは、反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に増幅産物が突然変異を含み、容易に検出され得るほどの充分なヌクレオチドを含むように充分に突然変異の上流または下流に位置する。好ましくは、第二プライマーは、それが少なくとも約１４ヌクレオチド長、および好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド長、たとえば２０〜２４ヌクレオチド長であるように選択され、増幅産物は、少なくとも約７０塩基対、たとえば７０〜６０００塩基対、好ましくは１００〜１０００塩基対、たとえば１５０〜５００塩基対を含み、好ましくは検出プライマーの場合と類似した融解点を有する。
【００１５】
本発明の別の局面は、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子における突然変異の検出に関するものである。Ｂ−ＲＡＦは、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫキナーゼ経路で機能するセリン／トレオニンキナーゼである。ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子のヌクレオチド配列は既知である。Ｂ−ＲＡＦは、通例、試験された黒色腫セルラインの５９％を含む、ヒト癌において幾つかの体細胞点突然変異の一つにより活性化されることが最近報告されている。Davies et al.、Nature、第４１７巻、９４９〜９５４頁（２００２）参照。癌患者のＢ−ＲＡＦ遺伝子からこれらの突然変異が検出できることから、たとえば、Ｂ−ＲＡＦキナーゼを阻害するかまたは突然変異キナーゼの発現を制限する化合物による処置を含む合理的な処置の選択肢がもたらされる。
【００１６】
本発明のこの局面によると、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子における突然変異は、上記のＰＣＲに基いた方法より検出される。すなわち、本発明は、さらにＢ−ＲＡＦにおける特異的突然変異の検出方法であって、
（ａ）突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたないＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの３'末端は、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の第一ＤＮＡ鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であって、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、そして
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法に関するものである。
【００１７】
好ましくは、検出プライマーの３'末端は突然変異塩基と相補的であり、突然変異が存在するときのみ顕著な増幅が行われる。すなわち、本発明は、さらにＢ−ＲＡＦ遺伝子における特異的突然変異の検出方法であって、
（ａ）突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でエキソヌクレアーゼ活性をもたないＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの３'末端は、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の第一ＤＮＡ鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であって、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）増幅産物の存在または不存在を検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００１８】
表１は、特定されたＢ−ＲＡＦ突然変異を検出するための本発明方法による検出プライマーの３'末端として有用であるオリゴヌクレオチドセグメントを示す。
【表１】
2006500057.tif 000002
【００１９】
上記で示されているところによると、プライマーは、少なくとも約１４ヌクレオチドを含むべきであり、好ましくは１６〜２４ヌクレオチドを含む。すなわち、プライマーは、その３'末端に表１に具体的に示された１４程度のヌクレオチドを含むべきである。しかしながら、有用なプライマーは、５'末端に追加的ヌクレオチドを含むことが多い。オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能するのに充分なヌクレオチドを含むこと、および３'末端にあるヌクレオチドは突然変異と相補的であることが既知であることが専ら重要である。
【００２０】
すなわち、本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１３８８Ａ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１３８８Ａ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号１を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２１】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１３８８Ｔ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１３８８Ｔ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号２を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２２】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１３９４Ｃ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１３９４Ｃ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号３を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２３】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１３９４Ａ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１３９４Ａ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号４を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２４】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１３９４Ｔ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１３９４Ｔ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号５を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２５】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１４０３Ｃ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１４０３Ｃ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号６を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２６】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１４０３Ａ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１４０３Ａ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号７を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２７】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１７５３Ａ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１７５３Ａ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号８を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２８】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴ１７８２Ｇ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｔ１７８２Ｇ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号９を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００２９】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＧ１７８３Ｃ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｇ１７８３Ｃ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号１０を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００３０】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴ１７８７Ｇ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｔ１７８７Ｇ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号１２を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００３１】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴ１７９６Ａ突然変異の検出方法であって、
（ａ）Ｔ１７９６Ａ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号１３を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００３２】
さらに本発明は、ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴＧ１７９６−９７ＡＴ突然変異の検出方法であって、
（ａ）ＴＧ１７９６−９７ＡＴ突然変異を含むＢ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントを、配列番号１４を有する３'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でＰＣＲによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
（ｂ）ＤＮＡセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
（ｃ）Ｂ−ＲＡＦ遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
【００３３】
好ましい実施態様において、検出プライマーは、表２に示されている配列番号１５〜２８の一つを有する３'末端を含む。
【表２】
2006500057.tif 000003
【００３４】
特に好ましい実施態様では、表３に示した検出プライマーを、対応する突然変異の検出に使用する。
【表３】
2006500057.tif 000004
【００３５】
本発明のこの局面によると、第二プライマーは、それが反対側ＤＮＡ鎖のセグメントと相補的であり、ＰＣＲが行なわれる場合に増幅産物が容易に検出され得るほどの充分なヌクレオチドを含むように充分に突然変異の上流または下流に位置するように選択される。好ましくは、第二プライマーは、それが少なくとも約１４ヌクレオチド長、および好ましくは約１６〜２４ヌクレオチド長、たとえば２０〜２４ヌクレオチド長であるように選択され、増幅産物は、少なくとも約７０塩基対、たとえば７０〜６０００塩基対、好ましくは１００〜１０００塩基対、たとえば１５０〜５００塩基対を含み、好ましくは検出プライマーの場合と類似した融解点を有する。
【００３６】
すなわち、表４に示したオリゴヌクレオチドは、示されたＢ−ＲＡＦ突然変異について上記で述べた検出プライマーと連係させて示されたＢ−ＲＡＦ突然変異を検出するための第二プライマーとして有用である。
【表４】
2006500057.tif 000005
【００３７】
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様において、表３に示した検出プライマーは、対応する突然変異について表４に示した第二プライマーと連係的に使用される。
【００３８】
表１、２、３および５に列挙した各検出プライマーは、表に報告されている対応するＢ−ＲＡＦ突然変異を検出する目的で本発明にしたがって使用され得る。本発明はまた、表１、２、３および５に列挙した対応する突然変異を検出するための検出プライマーを用いる本明細書記載のＰＣＲ方法に関するものである。
【表５】
2006500057.tif 000006
【００３９】
プライマーは、少なくとも１４ヌクレオチドおよび好ましくは１６〜２４ヌクレオチド、たとえば２３、２２、２１、２０、１９ヌクレオチドを含むべきである。本発明によると、配列番号５７から誘導された有用なプライマーは、５'末端にそれより少ないヌクレオチドを含み得、その３'末端には表５で特定された１４ヌクレオチドを当然含む。ヌクレオチドが、プライマーとして機能するのに充分なヌクレオチドを含むこと、および３'末端にあるヌクレオチドが突然変異と相補的であることが既知であることは重要である。
【００４０】
本発明の他の一実施態様では、検出プライマー配列番号５７が、突然変異Ｔ１７９６−９７Ａ（Ｖ５９９Ｅ）を検出するため第二プライマー配列番号５８と共に使用される。
【００４１】
本発明のさらなる実施態様では、検出プライマー配列番号４１が、突然変異Ｔ１７９６−９７Ａ（Ｖ５９９Ｅ）を検出するため第二プライマー配列番号５５と共に使用される。
【００４２】
別の局面において、本発明は、突然変異ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子のＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチドプライマーに関するものである。すなわち、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
【００４３】
本発明のこの局面の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含む。
【００４４】
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２により構成される。
【００４５】
さらなる局面において、本発明は、配列番号５７、５９、６０、６１および６２を有するオリゴヌクレオチドプライマーに関するものである。
【００４６】
以下の実施例は、本発明をさらに制限するのではなく、さらに説明することを意図したものである。
【００４７】
実施例１：ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴ１７９６Ａ突然変異の検出
検出プライマー：配列番号４１、第二プライマー：配列番号５５
ゲノムＤＮＡを、ＧＥＮＥＬＵＴＥ哺乳類ゲノムＤＮＡキット（シグマカタログ番号Ｇ１Ｎ３５０）を用いて黒色腫セルラインからのヒト細胞から単離する。ロシュによるＰＣＲコアキット（カタログ番号１５７８ ５５３）を用いることにより５０マイクロリットルの総容量でＰＣＲ機（ＭＪリサーチ、モデルＰＴＣ１００）においてＰＣＲ反応を実施する。ＰＣＲ反応混合物は、５マイクロリットルの１０×反応緩衝液、１マイクロリットルの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１００〜１０００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０.５マイクロリットルのＴａｑポリメラーゼ（２.５〜５Ｕ）、１マイクロリットルの各プライマーの３１μＭストックを含む。
【００４８】
ＰＣＲ条件は以下の通りである：３分間９５℃、３５サイクルの［１分間９４℃、３０秒間５０℃、１分間７２℃］、１０分間７２℃、次いで４℃で浸漬。
【００４９】
増幅後、８マイクロリットルのＰＣＲ反応混合物を、２マイクロリットルの核酸試料ローディング緩衝液［バイオラッド、カタログ番号１６１−０７６７］と混合する。１０マイクロリットルの試料を、０.３μｇ／ｍＬの臭化エチジウム［ピアスカタログ番号１７８９８］を含む１.５％アガロース［ギブコ−ＢＲＬカタログ番号１５５１０−０２７］ゲルにローディングする。分子量標準［１００ｂｐのＤＮＡラダー、インビトロゲン、カタログ番号１０３８０−０１２］を、隣接レーンでローディングする。ＤＮＡを、ＴＡＥ緩衝液（０.０４Ｍのトリス−酢酸、０.０１ＭのＥＤＴＡ、０.０２Ｍの氷酢酸ｐＨ８.４）［ロシュカタログ番号１６６６６９０］中での電気泳動により分離する。電気泳動条件は、３０〜４０分間１２０Ｖである。分離後、ゲルをＵＶ光線に曝露し、アルファイメージャー２０００ドキュメンテーションシステムで写真を撮影する。
【００５０】
一般的に、ゲルから２つのバンドが検出される。速く移動するバンドは１００ｂｐマーカーに先行し、プライマーを表す。Ｔ１７９６Ａ突然変異体特異的ＰＣＲ増幅から生じるＤＮＡは、１５２ｂｐの予測サイズを有し、予測通り１００ｂｐ標準および２００ｂｐ標準間で移動する。ＰＣＲ増幅産物は、配列決定により確認される。ＰＣＲ増幅産物の存在は、Ｔ１７９６Ａ突然変異が鋳型ＤＮＡに存在することを立証する。
【００５１】
実施例２：ヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴ１７９６Ａ突然変異の検出
検出プライマー配列番号５７および第二プライマー配列番号５８を用いて、黒色腫セルラインからのヒト細胞から単離したゲノムＤＮＡで実施例１の方法を実施した。
【００５２】
Ｔ１７９６Ａ突然変異体特異的ＰＣＲ増幅から生じるＤＮＡは、１４２ｂｐの予測サイズを有し、予測通り１００ｂｐ標準および２００ｂｐ標準間で移動する。ＰＣＲ増幅産物は、配列決定により確認される。ＰＣＲ増幅産物の存在は、Ｔ１７９６Ａ突然変異が鋳型ＤＮＡに存在することを立証する。
【００５３】
実施例３：黒色腫および結腸癌患者からのＤＮＡサンプルからのヒトＢ−ＲＡＦ遺伝子におけるＴ１７９６Ａ突然変異の検出
１００名の黒色腫患者および１００名の結腸癌患者からのゲノムＤＮＡを、実施例１および実施例２記載の方法にしたがって分析した。プライマー配列番号４１および配列番号５５による実施例１の方法は、プライマー配列番号５７および配列番号５８による実施例２における方法と同じ結果をもたらす。
【００５４】
黒色腫患者の６２.９％および結腸癌患者の８.２％は、Ｖ５９９Ｅ突然変異を有する。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月15日(2005.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006500057000001.app
【国際調査報告】
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