(57)【要約】細胞外領域に６個のロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）と１個の免疫グロブリンドメインを含む、膜貫通型タンパク質であるＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３（Amphoterin induced gene and orphan receptor、即ち、「アンフォテリン誘導性遺伝子とオーファン受容体」）。これらのタンパク質を用いた、神経系細胞の成長、遊走、軸索伸長、ミエリン形成、束形成または増殖を制御する方法、ならびに癌、腫瘍増殖および転移腫瘍の処置方法。２つのＡＭＩＧＯ化合物間の相互作用、またはＡＭＩＧＯと上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）との相互作用を制御する物質のスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する、単離精製したＡＭＩＧＯ核酸。
【請求項２】
配列番号１、３または５に記載のヌクレオチド配列を包含する、単離精製したＡＭＩＧＯ核酸。
【請求項３】
配列番号１、３または５に記載のヌクレオチド配列、その相同体、またはそれらの断片を含む組換えヌクレオチド配列を包含する、単離精製した核酸。
【請求項４】
発現制御配列に発現可能な状態に連結した請求項２の核酸を包含し、ＡＭＩＧＯポリペプチドまたはその変異体をコードしうる発現構築物。
【請求項５】
請求項４の発現構築物で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項６】
ポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドはヒト ヌクレオチド配列を含んだヌクレオチド鎖を含み、該ヒト ヌクレオチド配列は、配列番号１、３または５に記載の配列に相補的な非コード鎖を含むＤＮＡと以下のハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズすることを特徴とする、宿主細胞。
（ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で２０時間の条件下でフィルターのハイブリダイゼーションを行い、そして
（ｂ）該フィルターの洗浄を、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む洗浄液を用い、室温で３０分間を２回、そして６５℃で３０分間を２回行う。
【請求項７】
配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列を包含する、単離精製したＡＭＩＧＯポリペプチド。
【請求項８】
請求項５の宿主細胞であって、発現可能となるようにプロモーター配列と共にＡＭＩＧＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有し、該ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する宿主細胞を培養し、そして
該宿主細胞または該宿主細胞を培養した培地から該ポリペプチドを単離する
ことを包含する、請求項７のＡＭＩＧＯポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項７の単離精製したＡＭＩＧＯポリペプチドまたはその抗原性断片で哺乳類を免疫することを包含する、抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項７の単離精製したＡＭＩＧＯポリペプチドまたはその抗原性断片を用いた抗原。
【請求項１１】
請求項９の方法で製造した抗体。
【請求項１２】
検出可能な標識で標識した、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
− 容器、および
− 該容器に入っている、ＡＭＩＧＯまたはその対立遺伝子変異体を検出しうる化合物、好ましくは標識されている化合物
を包含することを特徴とする、生物学的試料中のＡＭＩＧＯまたはその対立遺伝子変異体の存在を検出するための、複数の試薬からなるキット。
【請求項１４】
該化合物がプライマーまたはプローブであることを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
該化合物が請求項１１の抗体であることを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
ＡＭＩＧＯの変異または機能不全が影響する病態に関する個体の疾病素質を評価するための、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１７】
該キットを用いるための説明書をさらに包含する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ヒトまたはマウスのＡＭＩＧＯ遺伝子をトランスジーンとして有する、トランスジェニックなヒト以外の動物。
【請求項１９】
ＡＭＩＧＯ遺伝子またはその相同体の発現を妨害するトランスジーンまたは挿入物を有する、トランスジェニックなヒト以外の動物。
【請求項２０】
ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯペプチド断片、ＡＭＩＧＯ融合タンパク質、ＡＭＩＧＯ作用物質、ＡＭＩＧＯ拮抗物質または抗ＡＭＩＧＯ抗体を包含する医療用化合物。
【請求項２１】
薬学的に有効な量の請求項２０の医療用化合物を、治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、ＡＭＩＧＯに依存する病態の治療方法。
【請求項２２】
以下の工程を包含する、ＡＭＩＧＯに結合するリガンドを親和性精製する方法。
（ａ）ＡＭＩＧＯに対する精製すべき受容体が支持体に固定化したＡＭＩＧＯ上に選択的に吸着される条件下で、該受容体の原料を固定化したＡＭＩＧＯに接触させ、
（ｂ）固定化したＡＭＩＧＯとその支持体を、吸着されていない物質を取り除くために洗浄し、そして
（ｃ）固定化したＡＭＩＧＯに吸着している受容体分子を溶離緩衝液で溶離して、ＡＭＩＧＯに結合するリガンドを得る。
【請求項２３】
以下の工程を包含する、ＡＭＩＧＯ受容体と他のＡＭＩＧＯ受容体との結合に対する制御物質を同定する方法。
（ａ）制御物質と推定される化合物の存在下および不在下で、ＡＭＩＧＯ受容体を含有するＡＭＩＧＯ受容体組成物を、該ＡＭＩＧＯ受容体のリガンドとなる他のＡＭＩＧＯ受容体を含有するＡＭＩＧＯ組成物に接触させ、
（ｂ）制御物質と推定される化合物の存在下および不在下で、ＡＭＩＧＯ受容体と他のＡＭＩＧＯ受容体との結合を検出し、そして
（ｃ）制御物質と推定される化合物の不在下における結合との比較によって確認することのできる、制御物質と推定される化合物の存在下におけるＡＭＩＧＯ受容体と他のＡＭＩＧＯ受容体との結合の増減を指標として、制御物質を同定する。
【請求項２４】
次の工程（ｄ）をさらに包含する請求項２３に記載の方法。
（ｄ）工程（ｃ）において同定した制御物質を、薬学的に許容される担体と組み合わせて制御組成物を作製する。
【請求項２５】
次の工程（ｅ）をさらに包含する請求項２４に記載の方法。
（ｅ）ＡＭＩＧＯ受容体を発現する細胞を有する動物に該制御組成物を投与し、動物における制御組成物の生理学的影響を判定する。
【請求項２６】
該ＡＭＩＧＯ受容体組成物が、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選ばれる１種を含有することを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
（ａ）ＡＭＩＧＯ受容体の、ＡＭＩＧＯに結合する細胞外ドメイン断片を包含する、精製したポリペプチド、
（ｂ）ＡＭＩＧＯ受容体ポリペプチドを包むリン脂質膜、および
（ｃ）細胞表面のＡＭＩＧＯ受容体の発現量が増加するように組換え技術によって修飾した細胞。
【請求項２７】
該ＡＭＩＧＯ受容体組成物が、固体支持体に固定されているＡＭＩＧＯ受容体細胞外ドメイン断片を含有することを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
該ＡＭＩＧＯ受容体組成物が、免疫グロブリンのＦｃ断片と融合したＡＭＩＧＯ受容体細胞外ドメイン断片を含有することを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
該ＡＭＩＧＯ受容体が、哺乳類のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
該ＡＭＩＧＯ受容体がヒト由来であることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
該ＡＭＩＧＯ組成物が、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選ばれる１種を含有することを特徴とする、請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法。
（ａ）該ＡＭＩＧＯ受容体に結合するＡＭＩＧＯ断片を包含する、精製したポリペプチド、
（ｂ）ＡＭＩＧＯポリペプチドを包むリン脂質膜、および
（ｃ）細胞表面のＡＭＩＧＯの発現量が増加するように組換え技術によって修飾した細胞。
【請求項３２】
該ＡＭＩＧＯ組成物が、固体支持体に固定されているＡＭＩＧＯ細胞外ドメイン断片を含有することを特徴とする、請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
該ＡＭＩＧＯ組成物が、免疫グロブリンのＦｃ断片と融合したＡＭＩＧＯ細胞外ドメイン断片を含有することを特徴とする、請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
該ＡＭＩＧＯがヒト由来であることを特徴とする、請求項２３〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
該ＡＭＩＧＯ受容体組成物が細胞表面のＡＭＩＧＯ受容体の発現量が増加するように組換え技術によって修飾した細胞を含有し、工程（ｂ）はＡＭＩＧＯの結合が誘導する細胞の生理学的変化の測定を含むことを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
該ＡＭＩＧＯ組成物が細胞表面のＡＭＩＧＯの発現量が増加するように組換え技術によって修飾した細胞を含有し、工程（ｂ）はＡＭＩＧＯの結合が誘導する細胞の生理学的変化の測定を含むことを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
以下の工程を包含する、ＡＭＩＧＯとＥＧＦＲとの結合に対する選択性を示す制御物質をスクリーニングするための方法。
（ａ）ＡＭＩＧＯ受容体とＥＧＦＲ受容体との結合を制御する化合物の存在下および不在下で、ＡＭＩＧＯ受容体を含有するＡＭＩＧＯ受容体組成物を、ＥＧＦＲ受容体を含有するＥＧＦＲ受容体組成物に接触させ、
（ｂ）制御化合物の存在下および不在下で、ＡＭＩＧＯ受容体組成物とＥＧＦＲ受容体組成物との結合を検出し、そして
（ｃ）制御化合物の不在下における結合との比較によって確認することのできる、制御化合物の存在下におけるＡＭＩＧＯ受容体とＥＧＦＲ受容体との結合の増減を指標として、選択性を示す制御化合物を同定するが、ＡＭＩＧＯ−ＥＧＦＲ結合に対する該制御化合物の選択性の増加は、ＡＭＩＧＯ−ＥＧＦＲ結合の他の結合との差異の減少と関連する。
【請求項３８】
以下の工程を包含する、哺乳類の生体における細胞の成長、遊走、軸索伸長、ミエリン形成、束形成または増殖を制御する方法。
（ａ）ＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲからなる群より選ばれる少なくとも１種を発現する細胞を有する哺乳類の生体を同定し、そして
（ｂ）該哺乳類の生体においてＡＭＩＧＯを発現する細胞の成長、遊走または増殖の制御に効果的な量の、以下の物質(i)〜(vi)からなる群より選ばれる１種を含有する組成物を該哺乳類の生体に投与する。
(i) ＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲからなる群より選ばれる少なくとも１種に結合するＡＭＩＧＯ受容体を包含するポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、
(ii) ＡＭＩＧＯの断片を包含するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドおよび該断片は共にＡＭＩＧＯの有するＡＭＩＧＯ結合特性を保持する、
(iii) 上記(i)または(ii)のポリペプチドに特異的に結合し、該ポリペプチドがＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲからなる群より選ばれる少なくとも１種に結合するのを阻害する抗体、あるいは該抗体の、上記(i)または(ii)のポリペプチドに特異的に結合する断片、
(iv) 抗原結合性である上記(iii)の抗体断片を包含するポリペプチドであって、上記(i)または(ii)のポリペプチドがＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲ受容体からなる群より選ばれる少なくとも１種に結合するのを阻害するポリペプチド、
(v) ＡＭＩＧＯが該ＥＧＦＲ受容体に結合するのを阻害することなく、ＡＭＩＧＯが該ＡＭＩＧＯ受容体に結合するのを選択的に阻害する分子、および
(vi) ＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲ受容体に選択的に結合する分子。
【請求項３９】
該哺乳類の生体がヒトであることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該細胞が神経系細胞を含むことを特徴とする、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
神経系細胞または神経突起の成長、遊走または増殖の異常を特徴とする疾病に該生体が罹患していることを特徴とする、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
該生体が神経系細胞に外傷を有することを特徴とする、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
さらに以下の工程を包含することを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
神経系細胞の成長、遊走、再生または増殖を制御するために第２の薬剤を生体に投与する工程であって、該薬剤は、上記物質(i)〜(vi)のいずれかのポリペプチドに特異的に結合する抗体、上記物質(i)〜(vi)のいずれかのポリペプチドに対する受容体に特異的に結合する抗体、および該抗体の抗原結合性断片を包含するポリペプチドからなる群より選ばれる１種である。
【請求項４４】
投与する組成物中のＡＭＩＧＯが、ＡＭＩＧＯの細胞外断片がＦｃドメインに結合したＡＭＩＧＯ−Ｆｃタンパク質であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
該ＡＭＩＧＯ−Ｆｃタンパク質が、ラットＡＭＩＧＯ−Ｆｃ融合タンパク質配列をヒトＡＭＩＧＯ配列およびヒトＦｃ配列で実質的に置換したものであることを特徴とする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３８〜４５のいずれかで定義したポリペプチドであって、ＡＭＩＧＯ受容体を発現する細胞の成長、遊走、再生または増殖の異常を特徴とする疾病の治療剤の製造に用いるポリペプチド。
【請求項４７】
該細胞が、海馬細胞、大脳細胞、小脳細胞、外傷を受けた神経系細胞、グリア性瘢痕細胞、脊髄細胞、視神経細胞、網膜細胞、腎臓細胞、ならびに束形成、軸索誘導、軸索伸長またはミエリン形成の際に機能する細胞からなる群より選ばれる神経系細胞であることを特徴とする、請求項３８〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
以下の工程を包含する、哺乳類の生体における癌、腫瘍の増殖または癌転移を制御する方法。
（ａ）ＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲからなる群より選ばれる少なくとも１種を発現する細胞を有する哺乳類の生体を同定し、そして
（ｂ）該哺乳類の生体において、癌の進行またはＡＭＩＧＯを発現する細胞の転移を制御するのに効果的な量の、以下の物質(i)〜(vi)からなる群より選ばれる１種を含有する組成物を該哺乳類の生体に投与する。
(i) ＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲからなる群より選ばれる少なくとも１種に結合するＡＭＩＧＯ受容体を包含するポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、
(ii) ＡＭＩＧＯの断片を包含するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドおよび該断片は共にＡＭＩＧＯの有するＡＭＩＧＯ結合特性を保持する、
(iii) 上記(i)または(ii)のポリペプチドに特異的に結合し、該ポリペプチドがＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲからなる群より選ばれる少なくとも１種に結合するのを阻害する抗体、あるいは該抗体の、上記(i)または(ii)のポリペプチドに特異的に結合する断片、
(iv) 抗原結合性である上記(iii)の抗体断片を包含するポリペプチドであって、上記(i)または(ii)のポリペプチドがＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲ受容体からなる群より選ばれる少なくとも１種に結合するのを阻害するポリペプチド、
(v) ＡＭＩＧＯが該ＥＧＦＲ受容体に結合するのを阻害することなく、ＡＭＩＧＯが該ＡＭＩＧＯ受容体に結合するのを選択的に阻害する分子、および
(vi) ＡＭＩＧＯ受容体およびＥＧＦＲ受容体に選択的に結合する分子。
【請求項４９】
該哺乳類の生体がヒトであることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
該細胞が、グリオーマ、グリオブラストーマ、アストロサイトーマ、異型性アストロサイトーマ、脳室上衣腫、乏突起膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、松果体芽細胞腫、松果体細胞腫、胚細胞腫細胞、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、扁平上皮細胞癌または腎臓癌の細胞を含むことを特徴とする、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
癌または癌転移と診断される疾病に該生体が罹患していることを特徴とする、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
該疾病が脳腫瘍を含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
さらに以下の工程を包含することを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
癌の進行または癌転移の進行を制御するために第２の薬剤を生体に投与する工程であって、該薬剤は、上記物質(i)〜(vi)のいずれかのポリペプチドに特異的に結合する抗体、上記物質(i)〜(vi)のいずれかのポリペプチドに対する受容体に特異的に結合する抗体、および該抗体の抗原結合性断片を包含するポリペプチドからなる群より選ばれる１種である。
【請求項５４】
投与する組成物中のＡＭＩＧＯが、ＡＭＩＧＯの細胞外断片がＦｃドメインに結合したＡＭＩＧＯ−Ｆｃタンパク質であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
該ＡＭＩＧＯ−Ｆｃタンパク質が、ラットＡＭＩＧＯ−Ｆｃ融合タンパク質配列をヒトＡＭＩＧＯ配列およびヒトＦｃ配列で実質的に置換したものであることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
グリオーマ、グリオブラストーマ、アストロサイトーマ、異型性アストロサイトーマ、脳室上衣腫、乏突起膠腫、神経髄芽細胞腫、髄膜腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍である胚細胞腫、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、扁平上皮細胞癌および腎臓癌からなる群より選ばれる癌または癌細胞転移の進行を処置するための方法であって、治療を必要とする対象に請求項２０の化合物を投与する工程を包含する方法。
【請求項５７】
海馬細胞、大脳細胞、小脳細胞、外傷を受けた神経系細胞、グリア性瘢痕細胞、脊髄細胞、視神経細胞、網膜細胞、腎臓細胞、ならびに束形成、軸索誘導、軸索伸長およびミエリン形成の際に機能する細胞からなる群より選ばれる神経系細胞を処置するための方法であって、治療を必要とする対象に請求項２０の化合物を投与する工程を包含する方法。
【請求項５８】
ＡＭＩＧＯ受容体を発現する細胞の成長、遊走、再生または増殖の異常を特徴とする疾病用の治療剤を製造するための、ＡＭＩＧＯ受容体に結合するＡＭＩＧＯの断片を包含するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５９】
細胞または組織をＡＭＩＧＯ化合物と接触させることを包含する、細胞または組織のヒト上皮成長因子受容体のリン酸化を制御する方法。
【請求項６０】
該ＡＭＩＧＯ化合物が、配列番号１、３および５からなる群より選ばれるヌクレオチド配列によってコードされるＡＭＩＧＯペプチドを包含することを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該ＡＭＩＧＯ化合物が、抗ＡＭＩＧＯ抗体を包含することを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して遺伝子工学の分野に関し、より詳細には、軸索路（axon tract）の発生に関与する膜貫通型タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
数十億の連結部を有する神経系の発生は、自然界において最も複雑かつ興味深い現象の一つである。このような事象の鍵となる特徴の１つは、適切な標的への神経成長円錐の誘導である。種々の可溶性マトリクスおよび細胞表面分子が、軸索成長および成熟した繊維路を形成するための軸索の会合に関与していることが見出された（文献としてはTessier-Lavigne and Goodman, 1996 および Drescher et al., 1997を参照）。
【０００３】
末梢神経系（ＰＮＳ）においては、損傷した神経繊維は長い距離に渡って再生し、優れた機能回復を達成することができる。過去１５年の間に神経科学者は、これは末梢神経系の神経細胞と中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞との間に存在する固有の差異がもたらすものではないことを認識し始めた。驚くべきことに、ＣＮＳのニューロンは、ＰＮＳ（例えば、坐骨神経）の移植部位を介して成長する機会を与えた時には、長距離に渡って軸索を伸長する。したがって、ＣＮＳのニューロンは、細胞外環境から正しいシグナルを与えられれば成長する能力を保持している。ＣＮＳとＰＮＳの異なる成長能に寄与する要因には次のものが含まれる：  部分的にしか特徴付けられていない成長阻害分子であって、ＣＮＳで神経繊維を取り巻く乏突起膠細胞の表面に存在するが、ＰＮＳにおける対応細胞集団（シュワン細胞）では存在量の少ない分子；基底層および他の表面の分子であって、ＰＮＳでは成長を促進するがＣＮＳには存在しないもの（例えばラミニン）；および細胞の生存および分化をもたらす遺伝子発現のプログラムを活性化する栄養因子や可溶性ペプチド。このような栄養因子は神経細胞の生存能および分化能の維持に必須であるとみなされているが、ＣＮＳの軸索再生の誘導などを担う特定の物質は不明である。その結果、今日までＣＮＳ損傷の有効な治療法は開発されていない。
【０００４】
免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は、神経突起の伸長、軸索の誘導およびシナプスの可塑性の接触依存型制御に関与することが示されている分子からなる最も多様かつ研究されているクラスを形成している（文献としてはSchachner, 1997、Walsh and Doherty, 1997、Stoeckli and Landmesser, 1998 および Van Vactor, 1998を参照）。ロイシン−リッチリピート（ロイシンに富んだ反復配列、ＬＲＲ）を含む細胞外タンパク質も、軸索誘導に関与することが明らかになっている。例えば、ＬＲＲドメインを有するSlitタンパク質は、Robo（Roundabout）受容体を介した交連軸索に対する正中線忌避物質として作用し（Battye et al., 1999 および Brose et al., 1999）、近年、Battyeら（2001）は、SlitとそのRobo受容体との相互作用はSlitに存在するＬＲＲに基づくことを明らかにした。さらに、Puschら（2000）は、Ｘ連鎖先天性定常的夜盲症（X-linked congenital stationary night blindness、ＸＬＣＳＮＢ）と呼ばれる疾病は、網膜のニクタロピンというＬＲＲ含有タンパク質しかコードしない遺伝子にマッピングされることを明らかにした。近年、軸索再生阻害物質であるNogoに対する受容体（Chen et al., 2000）は、ＧＰＩ−結合細胞表面タンパク質であり、その唯一の確認可能なモチーフがＬＲＲドメインであることが見出された（Fournier et al., 2001）。
【０００５】
アンフォテリン（“ＨＭＧＢ１”とも呼ぶ）は、神経突起伸長促進因子として周生期ラットの脳から単離されたヘパリン結合性タンパク質であり（Rauvala and Pihlaskari, 1987）、神経系細胞の成長円錐に豊富に存在する因子である。アンフォテリンは、細胞表面の受容体（ＲＡＧＥおよび硫酸化グリカンエピトープ）への結合、ならびにアンフォテリンに対するプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンアクチベーターの結合を介したＥＣＭのタンパク質分解の活性化という機能故に、侵襲細胞や成長円錐の遊走に対するオートクリン因子であると提案されている（文献としてはRauvala et al., 2000 および Muller et al., 2001を参照）。
【０００６】
細胞の運動性、特に神経突起の伸長におけるアンフォテリンの役割を調べるために、アンフォテリンマトリクス上に誘導された遺伝子をｍＲＮＡ ディファレンシャル ディスプレイ法を用いて検索した。本発明においては、ＡＭＩＧＯ（AMphoterin Induced Gene and Orphan receptor、即ち、「アンフォテリン誘導性遺伝子とオーファン受容体」）と命名した新規なタンパク質のクローニングおよび機能的特徴付けを開示する。ＡＭＩＧＯのクローニングは、２種の他の関連性のあるタンパク質（ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３）のクローニングを可能とする配列データを提供した。これら３種のタンパク質が統合的に膜貫通型タンパク質の新規なファミリーを構成する。これらＡＭＩＧＯの予想されるアミノ酸配列は、ＡＭＩＧＯが分泌のためのシグナル配列と膜貫通型ドメインを有するＩ型の膜貫通型タンパク質であることを示唆する。興味深いことには、これらＡＭＩＧＯの細胞外領域には、６個のロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）、それに隣接するシステイン−リッチＬＲＲ Ｎ末端ドメインとシステイン−リッチＬＲＲ Ｃ末端ドメイン、および膜貫通領域の近傍に位置する１つの免疫グロブリンドメインが含まれている。このような２つのモチーフを有する構造は、これらＡＭＩＧＯを免疫グロブリンスーパーファミリーおよびロイシン−リッチリピートスーパーファミリーの両方のメンバーとして定義することができる。
【０００７】
アンフォテリン 
アンフォテリンは、その神経突起伸長促進能に基づいて、周生期ラットの脳から単離されたタンパク質である（Rauvala and Pihlaskari, 1997）。アンフォテリンは、正に帯電した領域および負に帯電した領域をいずれも有する極性分子である。このような二極性の性質により、アンフォテリンは非常に接着性の強い分子であり、例えばヘパリンや他の硫酸化グリカンに結合する。
【０００８】
アンフォテリンは細胞核に局在し、ＤＮＡに結合することも分かっており、このような役割においてアンフォテリンはＨＭＧ１と呼ばれている（Bianchi et al., 1989）。後の研究によって、アンフォテリンは細胞内に拡散状態で局在するが、細胞が突起の伸長を始めるとアンフォテリンは突起の先端に局在する（Merenmies et al., 1991 および Parkkinen et al., 1993）。アンフォテリンは分泌のためのシグナル配列を欠いているが、細胞外マトリクス（extracellular matrix、ＥＣＭ）にも存在することが明らかになっている。In vitroにおいてアンフォテリンは、ニューロンの表面に局在していることが明らかになっており（Rauvala and Pihlaskari, 1997 および Rauvala et al., 1988）、またアンフォテリンは細胞表面受容体であるＲＡＧＥに対するリガンドであることも明らかになっている（Hori et al., 1995）。エンドトキシン ショックの際には大量のアンフォテリンがヒトの血漿に蓄積することが明らかになっている（Wang et al., 1999）。この期間に赤血球が成熟過程にあると、ＥＣＭにアンフォテリンが分泌されて、そこで分化因子として作用すると考えられている（Passalacqua et al., 1997）。また、グリア細胞から分泌されるアンフォテリンは、グリア細胞とニューロンとの相互作用に関連する因子として作用することも示唆されている（Passalacqua et al., 1998 および Daston and Ratner, 1994）。
【０００９】
アンフォテリンは、発生途中の神経系のニューロンおよびグリア細胞で高度に発現しており、未成熟細胞でも概ね発現している。アンフォテリンは単球およびマクロファージならびにしばしば形質転換細胞でも高度に発現している。アンフォテリンは細胞の侵襲性遊走に関与すると考えられている。アンフォテリンはプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンアクチベーターを結合し、この結合がプラスミンの形成およびアンフォテリンの分解も活性化することが明らかになっている（Parkkinen and Rauvala, 1991 および Parkkinen et al., 1993）。細胞表面レベルでは、アンフォテリンは膜貫通型タンパク質であるＲＡＧＥ、いくつかのプロテオグリカン（例えばシンデカン−１）および硫酸糖脂質に結合する。マルチリガンドタンパク質であるＲＡＧＥ（Receptor of advanced glycation end products、即ち、ＡＧＥ受容体）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。アンフォテリンは、ＲＡＧＥ依存シグナル伝達を介して神経突起の伸長を刺激するが、アンフォテリンとＲＡＧＥはいずれも発生途中の神経系の同じ部分に局在している（Hori et al., 1995）。アンフォテリンは、侵襲的遊走においてオートクリン因子および／またはパラクリン因子として作用することが示唆されており、具体的には、アンフォテリンはその受容体に結合し、ＥＣＭのタンパク質分解と細胞骨格の再構築の両方を活性化する（Rauvala et al., 2000 および Rauvala et al., 1988）。アンフォテリンとＲＡＧＥとの間の相互作用を阻害することにより、腫瘍の増殖および侵襲性を低減することができる。
【００１０】
免疫グロブリンドメイン 
ＩｇＧドメインは最も一般的な細胞外タンパク質モチーフの１つである。これは抗体分子から初めに発見された。抗体分子に加えて多くの細胞接着分子、細胞表面受容体およびいくつかの細胞内筋タンパク質がＩｇＧドメインを含有する。ＩｇＧドメインは全長約７０〜１１０アミノ酸であり、通常、５５〜７７個のアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含有している。また、ＩｇＧドメインは７〜１０枚のβシートを形成し、疎水性残基を内側に、親水性残基を外側に向けてしっかりとまとめられた球状構造をとっている。多くの場合この構造は、保存されたシステイン間のジスルフィド結合によって安定化されている（Walsh and Doherty 1997 および Williams and Barclay, 1988）。
【００１１】
配列レベルでは、ＩｇＧドメイン類は大きく異なる。同じタンパク質内の異なるＩｇＧドメイン間の相同性についても、共有する類似アミノ酸はたった１０〜３０％である。全てのＩｇＧグロブリンが同じコア構造、即ち、重ねられた２枚のβシートを共有しているが、他の特徴はかなり異なっている。ＩｇＧドメインは多様であるが、それらをいくつかのカテゴリーに分類することができる。ＩｇＧドメインはもともとＣ１、Ｃ２およびＶに分類され、その後、グループＩが加えられた（Williams and Barclay, 1988）。ＩｇＧドメインの安定性は、ＩｇＧドメインが共通して細胞外空間に存在する理由を説明する、即ち、ＩｇＧドメインはタンパク質分解性および酸化的な環境に耐性があるからである。細胞外ＩｇＧドメインを有する分子は、細胞接着ならびに分子の認識および結合に機能し得る。ＩｇＧドメインはそのドメイン表面のいかなる部分とも相互作用すると考えられる（Williams and Barclay, 1988）。
【００１２】
ＩｇＧドメイン含有タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーと呼ばれるタンパク質のファミリーを形成し、これは細胞表面タンパク質の最も一般的なファミリーである。配列分析によると、７６５個のヒトタンパク質がこのファミリーに属することが分かっており、ハエ（flyes）では１４０個そして蠕虫（worms）では６４個のタンパク質がこのファミリーに属する（Venter et al., 2001）。ＩｇＧファミリーのメンバーは、細胞の認識および接着に関与するタンパク質、例えば、抗体分子、Ｔ細胞受容体、成長因子受容体、多くの接着分子および神経突起伸長促進受容体をコードする。ＩｇＧドメイン接着分子は、多くの場合、いくつかの連続したＩｇＧドメインおよびIII型フィブロネクチン様ドメインからなる（Crossin and Krushel, 2000）。
【００１３】
免疫グロブリンスーパーファミリーの神経系由来のメンバーは、受容体分子および接着分子として作用し、特に軸索の成長および誘導に関連する多くの重要な機能についてその役割が明らかになっている。接着分子は、多くの相互作用を緻密に組み合わせることが必要な神経系の発生において重要な役割を担い、例えば、ＮＣＡＭおよびＬ１は軸索の成長および誘導の際に機能する（Walsh and Doherty, 1997）。他のメンバーには、ＦＧＦに対する受容体（ＦＧＦＲ）、神経栄養因子受容体からなるＴｒｋファミリー、Ｅｐｈ受容体、Slitの機能を仲介するRobo（Roundabout）およびネトリンと相互作用するＤＣＣ（Deleted in colorectal carcinoma）が含まれる（Tessier-Lavigne and Goodman, 1996 および Brose and Tessier-Lavigne, 2000）。
【００１４】
軸索のＩｇＧ細胞接着分子は、ホモフィリックまたはヘテロフィリックに他のＩｇＧファミリーのメンバーと相互作用し得る。このような結合パートナーは、同じ細胞膜内、隣接する細胞膜または細胞外空間に局在し得る。多くのＩｇＧタンパク質は細胞相互作用の非常に複雑なネットワークを形成し、部分的に重複した機能さえ持ち得る。複数のＩｇＧタンパク質が、他のリガンドに対する結合親和性を調節することによって同じリガンドを競合することもある（Brummendorf and Lemmon, 2001）。
【００１５】
ミエリン形成に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、ＭＡＧ（myelin-associated glycoprotein、即ち、ミエリン関連糖タンパク質）およびＰ０であるが、これらの正確な機能は不明である。ＭＡＧの機能はＣＮＳニューロンの再生阻害と関連するか、あるいはある種のニューロンの神経突起の伸長を活性化または阻害できることが知られている。ミエリンに含まれる全タンパク質の約半分は、ミエリン鞘の細胞膜の相互結合に関与していると考えられるホモフィリックな細胞接着分子であるＰ０タンパク質からなる（Brummendorf and Rathjen, 1994）。
【００１６】
ＬＲＲドメイン 
ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）は全長２０〜２９アミノ酸からなる配列モチーフであり、一定の距離を隔てて存在する疎水性残基、特にロイシン、の反復によって特徴付けられる。この配列の反復はタンパク質中に数回現れ、反復配列からなるこのような領域を「ＬＲＲドメイン」と呼ぶ。ＬＲＲは、全長１１アミノ酸のコンセンサス配列であるLxxLxLxxzxL（配列中、ｘはいかなるアミノ酸でもよく、ｚはＮまたはシステインであり、そしてＬはロイシン、バリン、イソロイシンまたはフェニルアラニンである）を含有する。ＬＲＲタンパク質は、通常、複数のＬＲＲドメインを含んでおり、最大３０個含んでいるもの（カオプチン（chaoptin））もある。ＬＲＲドメインはコンセンサス配列と常に同一なわけではなく、したがって、ギャップを含んだり、その長さやアミノ酸の組成が異なっていてもよい（Kobe and Deisenhofer, 1994）。
【００１７】
ＬＲＲドメインの唯一の疎水性コアが溶媒と直接相互作用するのを防ぐために、ＬＲＲドメインはそのＮ末端側および／またはＣ末端側にいくつかのシステイン残基が隣接している（ＬＲＲ ＮＴドメインおよびＬＲＲ ＣＴドメイン）。配列の分析により、４種のＣ末端システインリッチドメインと１種のＮ末端システインリッチドメインの存在が明らかになった（Kobe and Kajava, 2001 および Kajava, 1998）。これらのシステインドメインは細胞外タンパク質にのみ見出されており、システインは分子間ジスルフィド結合を形成する（Kresse et al., 1993 および Hashimoto et al., 1991）。
【００１８】
ＬＲＲドメインタンパク質は細胞の様々な場所に存在し、種々の機能を有する。真核生物のＬＲＲタンパク質は細胞外空間に加えて、細胞核、細胞質や細胞膜に存在し、ホルモンの受容体、酵素のサブユニットおよび細胞接着分子として機能し、細胞認識の際にも作用する（Kobe and Kajava, 2001）。さらに、このようなＬＲＲタンパク質は、例えばシグナル伝達や細胞内輸送といった種々の細胞機能およびＤＮＡの修復、組換えや転写を仲介する（Buchanan and Gay, 1996）。
【００１９】
ＬＲＲタンパク質は、ＬＲＲの長さおよびコンセンサス配列の組成によって少なくとも７種のサブクラスに分類することができる。７種のサブクラスは、ＲＩ様ＬＲＲ、ＳＤＳ２２様ＬＲＲ、システイン含有ＬＲＲ、細菌性ＬＲＲ、典型的ＬＲＲ、植物特異的ＬＲＲおよびＴｐＬＲＲである（Kobe and Kajava, 2001）。前者の３つが細胞内に存在するのに対し、後者の４つは細胞膜または細胞外空間に存在する。
【００２０】
ＬＲＲドメインはタンパク質−タンパク質相互作用における役割を担っていると考えられている。例えば、カオプチンはＬＲＲドメインからなる細胞表面タンパク質であり、脂質アンカーを介して細胞膜に繋がれており、ホモフィリックな細胞接着を仲介することが明らかになっている（Reinke et al., 1988 および Krantz and Zipursky, 1990）。
【００２１】
細胞外マトリクスは、相同性を有するいくつかの小さなプロテオグリカンを含有し、その配列の７０〜８０％がＬＲＲドメインで構成されている。このような小さなプロテオグリカンはＮ−末端グリコサミノグリカン、ならびに可変量のＬＲＲとそこに隣接するＬＲＲ ＮＴドメインとＬＲＲ ＣＴドメインで構成されている。バイグリカンなどのプロテオグリカンはラミニンおよびフィブロネクチンに結合するのに対し、デコリンおよびフィブロモジュリンはＩ型コラーゲンおよびII型コラーゲンに結合する（Svensson et al., 1995）。軸索伸長調節分子であるSlitはＬＲＲドメイン、ＥＧＦ反復配列、ラミニン様ＧドメインおよびＬＲＲ ＮＴドメインとＬＲＲ ＣＴドメインを含む。SlitのＬＲＲドメインのみが、in vivoにおける反発的なシグナル伝達の仲介のみならず、in vitroにおけるRoboへの結合に必要である（Battye et al., 2001）。
【００２２】
神経系で発現する複数のＬＲＲタンパク質が知られているが、その機能や結合パートナーが明かなものはほんのわずかである。最もよく特徴付けられた神経系のＬＲＲタンパク質はショウジョウバエのコネクチン、カプリシャスおよびカオプチンである。コネクチンは、筋神経連結の発生における役割を担うＧＰＩ（glycosyl phosphatidyl inositol、即ち、グリコシルフォスファチジルイノシトール）結合細胞接着タンパク質である。コネクチンは、１０個のＬＲＲドメインと、そこに隣接したＬＲＲ ＣＴドメインを含む。筋神経連結の形成の際にコネクチンはある種の筋肉細胞の表面で発現し、同時にそれらを支配する運動ニューロンの、特に成長円錐で発現する。シナプス形成の際にはコネクチンは連結領域に局在するが、シナプスの成熟の際にはコネクチンの発現は下向きに調節される。In vitroの実験によって、コネクチンをトランスフェクトしたＳ２細胞間でホモフィリックな細胞接着が上昇することが明らかになった（Nose et al., 1992 および Meadows et al., 1994）。さらに、in vivoの研究は、神経系に対する興味深い成長調節タンパク質としてのコネクチンの役割を支持している。コネクチンが全ての筋肉細胞において誤って発現されると、異常な筋神経連結形成が生じる（Yu et al., 2000）。
【００２３】
カプリシャスは、筋神経連結形成におけるコネクチンの機能と類似した機能を有する細胞膜タンパク質である。カプリシャスは、１２個のＬＲＲドメインと、そこに隣接したＬＲＲ ＣＴドメインとＬＲＲ ＮＴドメインを有する。In vitroの研究はホモフィリックな接着を支持しなかったので、筋神経連結形成の際の細胞間シグナル伝達過程を仲介すると考えられる（Shishido et al., 1998）。
【００２４】
カオプチンは、光受容細胞に特異的な、３０〜４０個のＬＲＲドメインを有する接着分子であり、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に結合している。カオプチンはホモフィリックな細胞接着を仲介し、光受容細胞の適切な形成に必要である（Krantz and Zipursky, 1990）。
【００２５】
Slitタンパク質は保存性が高く、細胞外空間に分泌されて、軸索の伸長および分岐におけるガイダンスを提供する。Slitタンパク質はいくつかのＬＲＲドメイン、ＥＧＦ様反復配列、ラミニン様Ｇ−ドメインおよびＬＲＲ ＮＴドメインからなる（Brose and Tessier-Lavigne, 2000）。Slitは軸索伸長を抑制するものとしてショウジョウバエから発見された（Rothberg et al., 1990 および Kidd et al., 1999）。Slitは正中線のグリア細胞で産生され、正中線を横切る軸索路の形成と水平側生路（horizontal lateral tracts）の配置に必要である。Slitの生物学的機能は、細胞膜受容体であるRoboによって仲介されている。SlitのＬＲＲドメインはin vitroでRoboに結合するので、ＬＲＲドメインはSlitによる反発的なシグナル伝達に必要である（Battye et al., 2001）。３種の哺乳類由来SlitおよびRoboがクローニングされている。また、Slitはラミニン−１、ネトリン−１およびグリピカン−１に結合する（Brose et al., 1999 および Liang et al., 1999）。
【００２６】
Nogo受容体（NogoR）はミエリンに見出されたＣＮＳ受容体タンパク質であり、軸索再生を阻害する原因因子である。NogoRは、８個のＬＲＲドメインとそこに隣接するＬＲＲ ＣＴドメインからなり、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に繋がっている。NogoRは、Nogo-66に結合し、軸索伸長を阻害する（Grandpre and Strittmatter, 2001 および Fournier et al., 2001）。
【００２７】
ＯＭｇｐは、ＣＮＳミエリンおよび乏突起膠細胞の細胞膜に見られる乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（oligodendrocyte-myelin glycoprotein）である。ＯＭｇｐは、少なくとも６個のＬＲＲドメインと１個のＬＲＲ ＮＴドメインを含む１１０ｋＤａのＧＰＩ−結合細胞膜タンパク質である（Mikol et al., 1988 および 1990）。Nogoと同様に、ＯＭｇｐは哺乳類のＣＮＳで軸索の再生を阻害する。最近になって、ＯＭｇｐはNogoRに結合し、軸索再生を阻害することが明らかになった（Wang et al., 2002）。
【００２８】
ＬＲＲドメインとＩｇドメインを含有するタンパク質 
神経系のいくつかの膜貫通型タンパク質はＬＲＲドメインとＩｇドメインを共に含有する。このようなタンパク質について以下で説明する。
【００２９】
KekkonおよびＩＳＬＲ 
ショウジョウバエは、ＬＲＲドメインとＩｇドメインの両方を有する膜貫通型タンパク質をコードするkekkonと呼ばれる遺伝子ファミリーを有する。Kekkon1（kek1）およびKekkon2（kek2）の細胞外領域は、６個のＬＲＲとそこに隣接するＬＲＲ ＮＴドメインおよびＬＲＲ ＣＴドメインを含む。これらは、膜貫通領域の近傍に位置する１個のＣ２型 Ｉｇドメインと大きな細胞内テール構造を有する。いずれの遺伝子も発生途中の中枢神経系（ＣＮＳ）で発現し、kekkon1はさらに発生途中の卵巣にも存在する（Musacchio and Perrimon, 1996）。Kek1は卵形成における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の機能を阻害することが知られている（Ghiglione, 1999）。興味深いことに、ＥＧＦＲの阻害に必要なのは、kek1タンパク質の細胞外領域と膜貫通ドメインのみである。
【００３０】
膜貫通型タンパク質であるＩＳＬＲは、kekkonタンパク質と同様のドメイン構造を有する。ＩＳＬＲの細胞外領域は、６個のＬＲＲとそれに隣接するＬＲＲ ＮＴドメインおよびＬＲＲ ＣＴドメインを含有する。ＩＳＬＲはさらに膜貫通領域の近傍に１個のＣ２型Ｉｇドメインを含有するが、細胞内領域は含有しない。ＩＳＬＲはヒトおよびマウスからクローニングされている。ＩＳＬＲは網膜、心臓、胸腺および脊髄などの種々の組織で発現する（Nagasawa et al., 1999 および Nagasawa et al., 1997）。
【００３１】
Ｔｒｋ−受容体 
ニュートロフィン受容体であるＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣはチロシンキナーゼ型受容体であり、細胞外領域は３個のＬＲＲ領域を有し、各領域がＬＲＲ ＮＴドメインおよびＬＲＲ ＣＴドメインと隣接している。細胞外領域は２個のＩｇドメインも有している。Ｔｒｋ受容体の細胞内領域はチロシンキナーゼドメインを有している。Ｔｒｋ受容体のリガンドはニュートロフィンであり、これは中枢神経系および末梢神経系の発生および維持に重要な因子である。ニュートロフィンのＴｒｋ受容体への結合によってＴｒｋ受容体が二量体化し、次いでチロシンキナーゼドメインが自己リン酸化し、このリン酸化によっていくつかのシグナル伝達カスケードが活性化される（Kaplan and Miller, 1997）。もともと、Ｔｒｋ受容体のＬＲＲ領域がリガンド結合ドメインであることを示す研究がいくつか存在した（Windisch et al., 1995 および Windish et al., 1995）。近年では、ＴｒｋＡ受容体の細胞表面に最も近いＩｇドメインが、神経成長因子（nerve growth factor、ＮＧＦ）を結合するものであることが明らかになった（Holden et al., 1997、Perez et al., 1995、Robertson et al., 2001、Urfer et al., 1995 および Wiesmann et al., 1999）。
【００３２】
ＮＬＲＲ、ＰａｌおよびＬＩＧ−１ 
神経系のロイシン−リッチリピートタンパク質（ＮＬＲＲ）は神経組織で発現される膜貫通型タンパク質である。ＮＬＲＲの細胞外領域は、１２個のＬＲＲとそこに隣接するＬＲＲ ＮＴドメインおよびＬＲＲ ＣＴドメイン、１個のＩｇドメインおよびIII型フィブロネクチン様ドメインを含有する。類似したＮＬＲＲタンパク質がマウス、ラット、ゼブラフィッシュ、カエルおよびヒトから見出されている（Hayata et al., 1998、Taniguchi et al., 1996、Taguchi et al., 1996、Bormann et al., 1999 および Fukamachi et al., 1998）。ゼブラフィッシュにおいては、ＮＬＲＲファミリーのメンバーの１つが損傷後の軸索再生の際に特異的に発現される（Hayata et al., 1998）。成熟した哺乳類のＣＮＳとは異なり、ゼブラフィッシュのニューロンは損傷領域に新たなニューロンを伸ばすことができた。マウスでは、皮質損傷後にＮＬＲＲ−３遺伝子が誘導されることが明らかになっている（Ishii et al., 1996）。
【００３３】
Ｐａｌは網膜で特異的に発現される膜貫通型タンパク質である。Ｐａｌの細胞外領域は５個のＬＲＲとそこに隣接したＬＲＲ ＮＴドメインおよびＬＲＲ ＣＴドメイン、１個のＣ２型ＩｇドメインおよびIII型フィブロネクチン様ドメインを含有する。成熟した網膜では、Ｐａｌは光受容体細胞によって発現されており、タンパク質は視神経円板（disks）に局在すると考えられている。Ｐａｌの機能はまだ不明であるが、ホモダイマーを形成することが明らかになっている（Gomi et al., 2000）。
【００３４】
ＬＩＧ−１も、ＬＲＲドメインと免疫グロブリンドメインを含む膜貫通型タンパク質である。ＬＩＧ−１の細胞外領域は１５個のＬＲＲおよび３個のＣ２型Ｉｇドメインを含有する。ＬＩＧ−１の細胞内領域は全長２７０アミノ酸であり、既知のドメインを１つも有していない。ＬＩＧ−１はマウスおよびヒトの脳で高度に発現する。マウスでは、ＬＩＧ−１の発現は、神経系支持細胞の特定の集団に局在し、小脳では、ＬＩＧ−１はバーグマングリア細胞に局在する（Nilsson et al., 2001 および Suzuki et al., 1996）。
【００３５】
本発明においては、神経系で高度に発現するタンパク質ファミリーのメンバーであるＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３の特徴付けを行った。本発明は、これらＡＭＩＧＯが神経系における繊維路の発生に際してホモフィリックな機構およびへテロフィリックな機構を介して細胞間相互作用を仲介することを開示する。
【００３６】
上皮成長因子受容体 
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、内因性のチロシンキナーゼ活性を有する１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である（Cohen et al., 1982）。ＥＧＦＲは、細胞の生存、分裂促進性の応答、分化および細胞運動を含む非常に多様な生物学的機能を発揮する（Khazaie et al., 1993）。ＥＧＦＲに対する多くのリガンドが同定されており、リガンドとしては上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレギュリン（ＥＲ）、バタセルリン（Batacellulin）（ＢＴＣ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）およびシュワノーマ由来増殖因子（ＳＤＧＦ）が挙げられる。ＥＧＦファミリーのペプチドは乳腺の発生、形態形成および乳汁分泌の制御に著しく関与し、ヒト乳癌の病因にも影響を与える（Normanno and Ciardiello, 1997）。
【００３７】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（配列番号２１〜２４）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）（配列番号２５〜２８）およびトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）（配列番号２９〜３２）に対する特異的な受容体である。これらの分裂促進性のポリペプチドがＥＧＦＲに結合すると、受容体のチロシンキナーゼ活性が誘導され、その結果として細胞の成長を調節する一連の事象が開始する。多くの悪性腫瘍および非悪性腫瘍に関連した病態が今ではＥＧＦＲ、特にＥＧＦＲの異常発現と関連すると考えられている。異常発現には、正常なＥＧＦＲの発現量の上昇および変異ＥＧＦＲの発現の両方が含まれる。ＥＧＦＲの過剰発現は、大部分のグリオブラストーマ、ならびに乳癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、扁平上皮細胞癌および腎臓癌を含む多くのヒト腫瘍で見られる。上昇したＥＧＦＲレベルは、ヒト腫瘍における予後不良と相関する。ヒトＥＧＦＲをコードするｍＲＮＡの配列は公知である（Ullrich et al., Nature, 1984, 309, 418; GenBank Accession Number NM_005228）。ＥＧＦＲをコードする遺伝子はc-erb-B1として知られている。典型的な例においては、ノーザンブロット上に２種のＥＧＦＲ転写物が検出され、１つの測定値は１０ｋｂであり、他方の測定値はは５．６ｋｂである。
【００３８】
ＥＧＦ受容体系の１つの役割は、オートクリン刺激による成長を介した、細胞の腫瘍形成性の成長であると考えられる。細胞がＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−αを分泌する場合には、このような細胞はその細胞自身の成長を促進することができる。ヒト乳癌の細胞系および腫瘍のいくつかはＥＧＦＲを発現し（Osborne, et al., J. Clin. Endo. Metab., 55:86-93 (1982)、Fitzpatrick, et al., Cancer Res., 44:3442-3447 (1984)、Filmus, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 128:898-905 (1985)、Davidson, et al., Mol. Endocrinol., 1:216-223 (1987)、Sainsbury, et al., Lancet, i: 1398-1402 (1987) および Perez, et al., Cancer Res. Treat., 4:189-193 (1984))、ＴＧＦ−αを分泌するので（Bates, et al., Cancer Res., 46:1707-1713 (1986) および Bates, et al., Mol. Endocrinol., 2:543-555 (1988)）、オートクリンによる成長刺激経路が乳癌に存在することが提案されている（Lippman, et al., Breast Cancer Res. Treat., 7:59-70 (1986)）。
【００３９】
ＥＧＦＲに対する多くの阻害剤がヒト腫瘍細胞の成長阻害に効果的であることが明らかになっている。ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体およびＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する薬物は、ヌードマウスのヒト癌細胞異種移植片の成長を阻害することができる（Normanno et al., Clin. Cancer Res., 1996, 2, 601 および Grunwald et al, J Nat Cancer Inst, 2003, 95:851）。ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する薬物であるPD153035はヌードマウスのＡ４３１細胞の成長を阻害することができ、他のチロシンキナーゼと同様にＥＧＦＲの活性を阻害するチロホスチンはヌードマウスの扁平癌の増殖を阻害することが示されいる（Kunkel et al., Invest. New Drugs, 1996, 13, 295 および Yoneda et al., Cancer Res., 1991, 51, 4430）。また、さらなる低分子チロシンキナーゼ阻害剤には、ZD1839、OSI-774、CI-1033、PKI-166、GW2016、EKB-569、PD168393、AG-1478 および CGP-59326Aが含まれる（Grunwald et al., J Nat Cancer Inst, 2003, 95:851の記載は全て本明細書に組み込まれているものとする）。
【００４０】
さらに、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞によるＥＧＦＲの発現は、ＥＧＦＲに対するリガンド（即ち、ＴＧＦ−αやＥＧＦを含む他の分子）の産生をしばしば伴い、このことはオートクリンループがこのような腫瘍細胞の進行に関与することを示唆している（Baselga, et al., (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154 および Modjtahedi, et al., (1994) Int. J. Oncology. 4:277-296）。したがって、上記ＥＧＦＲリガンドとＥＧＦＲとの相互作用の遮断は、腫瘍の増殖および生存を阻害することができる（Baselga, et al., (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154）。
【００４１】
多様なアプローチをＥＧＦＲのターゲティングに用いることができ、そのような方法として、例えば、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対する活性リガンドの結合とモノクローナル抗体を競合させる方法、ＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼドメインに対する低分子の阻害剤を用いる方法、イムノトキシン結合体を用いてＥＧＦＲをターゲティングする毒素を腫瘍細胞に送達する方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＥＧＦＲのレベルを低減する方法、そしてＥＧＦＲシグナル伝達ネットワークの下流に存在するエフェクターを阻害する方法が挙げられる。前述の方法にも関わらず、ＥＧＦＲの発現に関連した疾患の治療および／または予防に有効な、ＥＧＦＲに対する新規な化合物が求められている。
【００４２】
発明の概要 
本発明は、脊椎動物のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３（集合的に脊椎動物ＡＭＩＧＯポリペプチドと称する）、関連核酸、脊椎動物ＡＭＩＧＯに特異的な構造と活性を有するそのポリペプチドドメイン、ならびに脊椎動物ＡＭＩＧＯの機能を制御する物質に関連した方法と組成物を提供する。脊椎動物ＡＭＩＧＯポリペプチドは、細胞、特に神経細胞の機能および形態を調節することができる。このようなポリペプチドは、本発明の脊椎動物ＡＭＩＧＯポリペプチドをコードする核酸で形質転換した宿主細胞から組換え技術によって製造するか、または哺乳類細胞から精製することができる。本発明は、天然の脊椎動物ＡＭＩＧＯ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることが可能な、脊椎動物ＡＭＩＧＯの単離したハイブリダイゼーション用のプローブとプライマー、および特異的抗体などの脊椎動物ＡＭＩＧＯ特異的結合性物質を提供し、さらに本発明の組成物の製造方法とそれを用いた診断方法（例えば、脊椎動物ＡＭＩＧＯ転写産物を検出するための、遺伝的ハイブリダイゼーション スクリーニング法）や治療方法（例えば、神経細胞の成長を制御する方法）、および上記組成物を用いた生命医薬産業製品（例えば、免疫原、脊椎動物ＡＭＩＧＯの遺伝子やポリペプチドを単離するための試薬、ならびに薬理学的先導物質（lead pharmacological agents）を得るための化合物ライブラリー スクリーニング用試薬）を提供する。
【００４３】
１つの態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドを神経突起伸長の促進に用いた条件下で神経系細胞を培養する、in vitroの方法およびそれに用いるキットを包含し、上記方法およびキットは、このような培養神経系細胞の神経突起伸長を刺激する物質の存在およびその量を検出する方法を含んでもよい。本願で開示するＡＭＩＧＯタンパク質およびＡＭＩＧＯポリペプチドは、本願で開示する方法の範囲内で有用であり、本願で開示するキットに含まれていてもよい。
【００４４】
神経突起伸長アッセイへの使用に適した細胞を調製する。例えば、海馬ニューロンの調製が本願実施例に記載されている。アッセイを開始する前に、調製した細胞を再懸濁し、基質で被覆したディッシュに添加し、次いで予め選択した時間、所定のアッセイ条件下に放置してもよい。細胞の接着と増殖のための時間が経過したら、上記のディッシュから接着していない細胞を取り除くためにすすぎ、次いで接着細胞を固定し、例えば位相差顕微鏡法などによって、観察する。
【００４５】
好ましくは、複数の細胞を基質ごとに分析する。それから細胞を所定の基準に基づき、「判定」する。例えば、ある細胞の直径よりも突起が長い場合、細胞は神経突起を有しているとみなすことができる。神経突起を発出している細胞のパーセンテージを、平均神経突起長と共に求めることが好ましい。特に好ましい神経突起伸長アッセイ方法を本願実施例に記載する。
【００４６】
したがって、本発明のタンパク質およびポリペプチドは、細胞培養および組織培養に関連した様々な用途において有用である。
【００４７】
例えば、１つの態様は、細胞培養系で神経系細胞の神経突起の伸長を阻害するための、以下の工程（１）と（２）を包含する方法に関する。（１）培地を含む組織培養条件下に神経系細胞を導入する工程、および（２）上記培養条件下で神経突起伸長の阻害に効果的な量の本発明のＡＭＩＧＯポリペプチドを培地に導入する工程。
【００４８】
他の１つの態様は、細胞培養系で神経系細胞の神経突起の伸長を促進するための、以下の工程（１）と（２）を包含する方法に関する。（１）神経突起伸長促進活性を有する本発明のポリペプチドを基材上に固定する工程、および（２）組織培養条件下で神経系細胞を上記基材に接触させる工程。
【００４９】
他の１つの態様は、細胞培養系で神経系細胞の神経突起の伸長を促進するための、以下の工程（１）〜（３）を包含する方法に関する。（１）神経突起伸長促進活性を有する本発明のペプチドをコードするＡＭＩＧＯ核酸を、神経系細胞に導入する工程、（２）神経突起伸長促進活性を有する本発明のポリペプチドを基材に固定する工程、および（３）組織培養条件下で上記神経系細胞を培養する工程。
【００５０】
本発明はまた、神経突起伸長促進性を示す、実質的に純粋なポリペプチドを含有する組成物を開示する。各種の態様において、上記ポリペプチドはＡＭＩＧＯタンパク質の部分に由来する。
【００５１】
他の１つの態様においては、本発明の組成物は、実質的に純粋な本発明のポリペプチドを含有し、上記組成物は固体支持体または基材に固定する。固体支持体としては、表面が神経系細胞などに接触するように設計した人工器官、インプラントまたは縫合用器具が挙げられ、さらに、固体支持体は、免疫系による拒絶反応の恐れを低減するように設計されたもの、具体的には、上記器具の表面を本発明のポリペプチドまたは拒絶反応を改善するように設計した他の物質で被覆したものでもよい。
【００５２】
本願で開示するＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯポリペプチドおよびＡＭＩＧＯ核酸は、本願に記載する様々な治療用途においても有用である。
【００５３】
本発明の治療方法は、自然にまたは外科的に生じた外傷、梗塞、毒物暴露、変性疾患、および末梢ニューロンまたは中枢ニューロンに影響する悪性疾患と関連する末梢神経損傷の治療に有用であり、また、脳、脊髄または後根神経節由来の新鮮な神経系細胞を移植し、移植片からの神経突起伸長を刺激して受容組織への神経分布を達成することが必要とされる外科的方法または移植法においても有用である。上記の疾病には、さらに中枢神経系障害、グリオーシス、パーキンソン病、アルツハイマー病、神経変性などが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の方法は、グリオーシス様の反応や炎症を引き起こすいかなる疾患の治療にも有用である。
【００５４】
神経損傷の治療においては、損傷後すぐに本発明の治療用組成物を損傷した神経に接触させることが回復の速さと程度を向上させる上で特に重要である。
【００５５】
したがって、本発明は、対象生物または選択したその組織において神経突起の伸長を促進する方法に関し、この方法は、治療に効果的な量の本発明の神経突起伸長促進ＡＭＩＧＯ化合物を含有する、生理的に許容される組成物を対象生物または組織に投与することを包含する。
【００５６】
好ましい方法においては、対象生物はヒトの患者であり、投与するポリペプチドはヒトＡＭＩＧＯの細胞外ドメインを含んでいる。他の１つの好ましい方法においては、対象生物はヒトの患者であり、投与する核酸はヒトＡＭＩＧＯのＡＭＩＧＯ細胞外ドメインをコードしている。
【００５７】
１つの態様においては、切断または損傷した神経は、神経を挿管用器具（entubalation device）の中に外科的に挿管して、効果的な量の本発明の神経突起伸長促進ポリペプチドを投与することで修復または再生することができる。
【００５８】
関連した態様においては、移植可能な送達器具（セルロースブリッジ（cellulose bridge）、縫合糸、スリング用人工補装具（sling prosthesis）やこれらと関連する送達機具など）に本発明のポリペプチドを含浸させることができる。このような器具は、所望により、神経膠で被覆することができ、被覆方法については Silver, et al., Science 220:1067-1069, (1983)に記載されており、この記載によってこの被覆方法は本明細書に組み込まれているものとする。
【００５９】
本発明の治療用組成物は、生理的に許容される担体と共に、本明細書に記載した本発明の神経突起伸長促進ポリペプチドを少なくとも１種含んでおり、ポリペプチドは有効成分として担体中に分散している。好ましい態様においては、治療用組成物はヒトの患者に治療目的で投与した場合に免疫原性を示さないものである。
【００６０】
便宜上、本明細書で説明する治療用組成物の有効成分を、「神経突起伸長促進ポリペプチド」と称する。この用語は、融合タンパク質、合成ポリペプチドおよび天然タンパク質の断片のみならず、それらの誘導体をも含む、本明細書で説明する種々のＡＭＩＧＯポリペプチドを包含するものと理解されるべきである。この用語はまた、融合タンパク質、合成ポリペプチドおよび天然タンパク質の断片のみならず、それらの誘導体をも含む、本明細書で説明するＡＭＩＧＯポリペプチドをコードする核酸も包含する。
【００６１】
上述した方法においては、所望により、ニューロンの生存、成長、分化または再生を促進し得るその他の物質と神経系細胞または神経を接触させる工程と組み合わせて実施することもできる。
【００６２】
本願で開示するＡＭＩＧＯタンパク質が神経突起の伸長を促進し得るという発見によって、神経再生の向上と神経生存の促進、末梢神経損傷と脊髄損傷の治療、および内因性や移植した（implanted or transplanted）ＣＮＳ組織の成長刺激に用いる物質が提供される。
【００６３】
従って本発明は、損傷または切断した神経や神経組織の再生を促進する方法や、神経系細胞の伸長を必要とする様々な神経学的条件下において、神経系細胞の神経突起の伸長を促進する方法も提供する。このような方法は、神経突起を伸長することのできる神経系細胞、あるいは損傷または切断した神経を、神経突起の伸長促進に効果的な量の本発明の神経突起伸長促進ポリペプチドを含む基質を包含する細胞培養系に接触させることを包含する。この方法はin vitroやin vivoで行うことができる。
【００６４】
本発明の方法に用いるポリペプチドおよび核酸は、本明細書に記載したいかなる神経突起伸長促進ポリペプチドでもよい。
【００６５】
本発明の方法によって細胞培養系で種々の哺乳類神経系細胞を処置することができ、細胞には脳、ＣＮＳ、末梢神経などの細胞が含まれる。さらに、このような細胞は、ヒト、マウス、ニワトリ、ならびに農業用家畜および飼養化されていないいかなる他の哺乳類種を含む様々な哺乳類種に由来するものであってもよい。
【００６６】
本発明の方法に用いる特定のポリペプチドの選択においては、本明細書に記載したいかなるポリペプチドも神経突起の伸長促進に用いることができ、神経系細胞の由来する種および本発明のポリペプチドを誘導したＡＭＩＧＯタンパク質の由来する種には関係ない。しかし、ヒト神経系細胞の神経突起の伸長を誘導するにはヒトＡＭＩＧＯタンパク質を用いることが好ましく、その他も同種のものを選択するのが好ましい。このように、好ましい態様においては、例えば、ラット神経系細胞とラットＡＭＩＧＯタンパク質由来のポリペプチドを使用し、ヒト神経系細胞とヒトＡＭＩＧＯタンパク質由来のポリペプチドを使用し、マウス神経系細胞とマウスＡＭＩＧＯタンパク質由来のポリペプチドを使用する。
【００６７】
神経突起伸長促進組成物は、基材に固定したり、液相またはコラーゲンを含むゲル相において接触させたりすることができる。使用するアッセイ系により、ＡＭＩＧＯタンパク質は、固体表面に固定した場合には神経系における伸長を促進するが、液相として提供した際には神経系における伸長を阻害することもある。組成物は、本明細書に記載したような融合タンパク質の形態で本発明のポリペプチドを含有してもよい。本発明の方法は、本明細書に記載したいかなる形態（apparati format）の本発明ポリペプチドを用いても実施することができる。
【００６８】
本発明はまた、ＡＭＩＧＯの、ＡＭＩＧＯ、上皮成長因子受容体またはＡＭＩＧＯリガンド（ＡＭＩＧＯリガンドは、結合パートナー、内因性タンパク質、外因性タンパク質およびＡＭＩＧＯに結合し得る物質からなる群より選ばれたもの）との相互作用を制御する物質を同定するための方法および組成物、ならびに上記相互作用を制御するための方法および組成物を提供する。ＡＭＩＧＯ制御物質の同定方法は、商業的な薬物のスクリーニングにおいて特に有用である。このような方法は概して以下の工程を包含する。（１）ＡＭＩＧＯポリペプチドと、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはリガンドポリペプチドとを、候補物質と共に混合する工程であって、該混合を、候補物質の不在下では、ＡＭＩＧＯと、ＡＭＩＧＯ／ＥＧＦＲ／ＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドとが一次相互作用を示す条件下で行い、そして（２）候補物質の存在下における、ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ／ＥＧＦＲ／ＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドとの二次相互作用を測定する工程であって、一次相互作用と二次相互作用との間に差が見られる場合には、候補物質がＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ／ＥＧＦＲ／ＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドとの相互作用を制御することを意味する。
【００６９】
ＡＭＩＧＯの相互作用を制御する本発明の方法においては、ＡＭＩＧＯと、ＡＭＩＧＯ／ＥＧＦＲ／ＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドとを、制御物質と共に混合する。ＡＭＩＧＯと、ＡＭＩＧＯ／ＥＧＦＲ／ＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドとは制御物質の不在下では一次相互作用を示すが、上記条件下では、ＡＭＩＧＯと、ＡＭＩＧＯ／ＥＧＦＲ／ＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドとは一次相互作用とは異なる二次相互作用を示す。特定の態様においては、制御物質はＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドのドミナントネガティブ型である。
【００７０】
１つの態様においては、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合するＡＭＩＧＯ化合物、およびそのような化合物を１種または組み合わせて包含する組成物を提供する。ＡＭＩＧＯ化合物は、好ましくはＥＧＦやＴＧＦ−αなどのＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲへの結合を阻害（例えば遮断）し、さらに好ましくはＥＧＦＲのリン酸化を阻害する。例えば、ＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲへの結合および／またはＥＧＦＲのリン酸化は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害することができ、ＥＧＦＲ仲介細胞シグナル伝達を阻止することが好ましい。
【００７１】
本願で例示する１つの態様においては、本発明のＡＭＩＧＯ化合物は、ベクターにクローニングしたＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡを有するＡＭＩＧＯ ＤＮＡ構築物である。他のＡＭＩＧＯ化合物も本願の範囲内であり、具体的には、ＡＭＩＧＯペプチド、変異体、生物学的に活性な断片、ＡＭＩＧＯの抗原性断片、抗ＡＭＩＧＯ抗体またはその結合性部位、およびＡＭＩＧＯポリペプチドの有する結合特性および／またはＥＧＦＲリン酸化阻害特性を保持するポリペプチドをコードする核酸も包含する。上記抗体は抗体分子全体であってもよいし、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）2断片、Ｆｖ断片および鎖状Ｆｖ断片（chain Fv fragments）を含む、抗体の抗原結合性断片であってもよい。
【００７２】
発明の詳細な説明 
アンフォテリンとラミニンは共に神経突起伸長促進因子である。アンフォテリンまたはラミニンのマトリクス上に培養した海馬ニューロンを用いたオーダード ディファレンシャル ディスプレイ（ordered differential display）法（Matz et al., 1997）によって、アンフォテリンマトリクス上に誘導した遺伝子を検出した。アンフォテリン上に誘導した遺伝子には新規な遺伝子が観察された。この発現量の異なる遺伝子の全長コード配列のクローニングを行い、ＡＭＩＧＯ（AMphoterin Induced Gene and Orphan receptor、即ち、「アンフォテリン誘導性遺伝子とオーファン受容体」）と命名した。ＡＭＩＧＯの予想されるアミノ酸配列は、分泌のためのシグナル配列と膜貫通ドメインを有するＩ型の膜貫通型タンパク質をコードしている。演繹したＡＭＩＧＯの細胞外領域には、６個のロイシン−リッチリピート（ロイシンに富んだ反復配列、ＬＲＲ）、それに隣接するシステイン−リッチＬＲＲ Ｎ末端ドメインとシステイン−リッチＬＲＲ Ｃ末端ドメイン、および膜貫通領域の近傍に位置する１個の免疫グロブリンドメインが含まれている。このタンパク質の演繹した１００個のアミノ酸からなる細胞質内領域には、公知のドメインは含まれていない。我々は、さらにＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３からなる膜貫通型タンパク質の新規なファミリーを同定した。これら３種のタンパク質は互いに明確な相同性を示し、種々のドメインの長さや位置は高い同一性を示した（図２Ｂ）。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲ実験、in situ ハイブリダイゼーションおよび免疫組織染色に基づき、ＡＭＩＧＯは実質的に神経系に特異的なタンパク質であることが判明した。軸索結合の増加における細胞機構の１つが束形成、即ち、パイオニア軸索を後続軸索の成長円錐の基底として軸索が互いに沿って伸長することである。興味深いことに、培地に含まれるＡＭＩＧＯの細胞外ドメインのドミナントネガティブ変異体を用いたアプローチは、ＡＭＩＧＯの束形成における役割をはっきりと示唆した。さらに、ＡＭＩＧＯは、その束形成における役割を説明するホモフィリックな結合機構を示す。また、ＡＭＩＧＯのＬＲＲ配列が、軸索の伸長、再生および誘導に関与すると報告されているslitタンパク質やNogo受容体と相同性を示す点も注目すべきである（図１１）。ＡＭＩＧＯの２回目の発現上昇は、ミエリン形成における役割を示唆している。ＡＭＩＧＯが発生のこの段階の細胞間相互作用も仲介すると考えることは妥当である。さらにＡＭＩＧＯの発現は成人期まで高いまま維持される。これは、繊維路発生機構の一般的な反復機構である、成人繊維路の再生と可塑性においてＡＭＩＧＯが役割を担うことを示唆している。
【００７４】
したがって、本発明は、ＡＭＩＧＯと命名した新規なヒト遺伝子／タンパク質、およびＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３と命名したＡＭＩＧＯに対応する相同体の発見と特徴付けに基づく。これら３種のタンパク質が膜貫通型タンパク質の新規なファミリーを構成する（単純化するために、３種のタンパク質を全て「ＡＭＩＧＯ」または「ＡＭＩＧＯｓ」と称する）。
【００７５】
１つの態様においては、本発明は、ＡＭＩＧＯポリペプチドまたはその生物学的活性か抗原性を有する断片を包含する精製タンパク質、あるいは上記ポリペプチドまたは断片からなる精製タンパク質を提供する。
【００７６】
他の１つの態様においては、本発明は、ＡＭＩＧＯタンパク質との相同性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるか、相同性が１００％であるアミノ酸配列を包含するタンパク質、あるいは上記アミノ酸配列からなるタンパク質に関する。
【００７７】
遺伝子コードの縮重に基づいて、配列番号１、３または５のヌクレオチド配列あるいはそれらの断片に含まれるｃＤＮＡの核酸配列との相同性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるか、相同性が１００％であるヌクレオチド配列を有する多数の核酸分子が、「機能的な活性を有する」ポリペプチドをコードすることを当業者は直ちに認識する。実際に、いずれのヌクレオチド配列の縮重変異体もすべて同じポリペプチドをコードするので、多くの場合、多数の核酸分子が「機能的な活性を有する」ポリペプチドをコードすることは当業者には明かである。さらに当業界においては、上述の核酸分子が縮重変異体ではない場合でも、かなりの数の核酸分子が機能的な活性を有するポリペプチドをコードすると認められる。その理由は、タンパク質の機能に著しい影響を与える可能性が低いかまたは与えないと考えられるアミノ酸置換（例えば、第１の脂肪族アミノ酸の第２の脂肪族アミノ酸による置換）について、当業者はよく知っているからである。これについては下記で詳細に説明する。
【００７８】
例えば、表現形質に影響することのないアミノ酸置換を行うための指針がBowie et al.,“Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions (タンパク質配列のメッセージを解読する：アミノ酸置換の許容度)” Science 247:1306-1310 (1990) に開示されており、この論文の著者は、変更するアミノ酸配列の許容度を検討するための２つの主要な方法を示している。
【００７９】
第１の方法は、進化の過程における自然淘汰によるアミノ酸置換の許容度を活用する。色々な生物種の有するアミノ酸配列を比較することで、保存されているアミノ酸を同定することができる。このような保存されているアミノ酸はタンパク質の機能に重要であると考えられる。一方、自然淘汰によってある位置のアミノ酸置換が許容されたということは、この位置のアミノ酸はタンパク質の機能にとって決定的ではないことを意味する。したがって、アミノ酸置換を許容する位置のアミノ酸は、タンパク質の生物学的活性を維持しながら修飾することができる。
【００８０】
ＡＭＩＧＯの天然の対立遺伝子変異体の他にも、ＡＭＩＧＯヌクレオチド配列のコードするＡＭＩＧＯポリペプチドのアミノ酸配列に置換が生じるように、突然変異によってＡＭＩＧＯヌクレオチド配列に変更を導入することもできる。ヌクレオチドの置換によって、ＡＭＩＧＯポリペプチドの配列中の「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変更することなくＡＭＩＧＯの野生型配列において変更することのできる残基であり、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要なアミノ酸残基である。例えば、本発明のＡＭＩＧＯ分子間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更の影響を受けにくい部分であると予測される。同類置換が可能なアミノ酸は当業者にはよく知られている。有用な同類置換を表Ｂの「好ましい置換」の欄に示した。あるクラスのアミノ酸を、同じクラスの他のアミノ酸で置換した同類置換体も、化合物の生物学的活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。
【００８１】
第２の方法では、遺伝子工学を用いてクローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化をもたらす変異を導入し、タンパク質の機能に重要な領域を同定する。例えば、部位特異的変異法やアラニンスキャニング変異法（分子内の全ての残基に対して単一アラニン変異を導入する方法）を用いることができる。Cunningham et al., Science 244:1081-1085 (1989) を参照。その結果として得られた変異分子について、次にその生物学的活性を試験する。同類アミノ酸置換（下記の表Ｂ参照）の他に、本発明の変異体には次の(i)〜(iv)が含まれる：（i）１つまたはそれ以上の非同類アミノ酸残基による置換体であって、置換したアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされているかコードされていないもの、（ii）１つまたはそれ以上の、置換基を有するアミノ酸残基による置換体、（iii）成熟ポリペプチドと、ポリペプチドの安定性および／または溶解性を向上する化合物（例えば、８９６Ｉポリエチレングリコール）などの他の化合物との融合物、または（iv）ポリペプチドと、ＩｇＧ Ｆｃ融合ペプチド、血清アルブミン（好ましくはヒト血清アルブミン）またはその断片や変異体、リーダー配列または分泌性配列、精製を容易にする配列などの付加的なアミノ酸配列との融合物。このような変異ポリペプチドは、本願の開示に基づいて当業者が作製可能である。
【００８２】
【表１】
2006525784.tif 000002
【００８３】
本発明のさらなる態様は、アミノ酸置換を導入したアミノ酸配列を包含するポリペプチドに関し、該アミノ酸配列は、本願で開示するポリペプチド配列に１〜５０個のアミノ酸置換を導入したアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列である。上記アミノ酸置換は４０個以下が好ましく、３０個以下がより好ましく、２０個以下がさらに好ましい。非常に好ましいポリペプチドは、そのアミノ酸配列が配列番号２、４または６のＡＭＩＧＯポリペプチド、その一部またはその補体のアミノ酸配列を包含し、１個以上であって、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個以下、あるいは１個のアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換の数は少ないほど好ましい。
【００８４】
好ましい態様においては、アミノ酸置換は同類置換である。
【００８５】
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号２、４または６に示した参照用アミノ酸配列の断片または変異体を包含するか、または断片または変異体からなるポリペプチドであって、上記断片または変異体は、参照用アミノ酸配列と比較して、１〜５個、５〜１０個、５〜２５個、５〜５０個、１０〜５０個または５０〜１５０個のアミノ酸残基の付加、置換および／または欠失を有する。
【００８６】
１つの態様においては、ＡＭＩＧＯポリペプチドの製造に適した技術は当業界で広く知られており、そこにはポリペプチドの内因性原料からＡＭＩＧＯを単離する技術、（ペプチド合成機を用いた）ペプチド合成法および組み換え技術（またはこれら技術の組み合わせ）が含まれる。
【００８７】
１つの態様においては、単離した核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含し、このタンパク質は、ＡＭＩＧＯのアミノ酸配列と少なくとも約４５％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、８０％または９０％、最も好ましくは約９５％の相同性を有するアミノ酸配列を包含する。
【００８８】
他の態様においては、ＡＭＩＧＯポリペプチド変異体は、以下の（１）〜（３）の少なくとも１つを有する：（１）配列番号２、４または６に示した全長前駆体ＡＭＩＧＯポリペプチド配列と約８０％の相同性を示すアミノ酸配列、（２）シグナルペプチドを欠いたＡＭＩＧＯポリペプチド配列、または（３）全長ＡＭＩＧＯポリペプチド配列の他の断片。例えば、ＡＭＩＧＯポリペプチド変異体には、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を全長前駆体アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付加したか、Ｎ末端またはＣ末端から欠失したＡＭＩＧＯポリペプチドが含まれる。ＡＭＩＧＯポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、全長前駆体ＡＭＩＧＯポリペプチド配列と少なくとも約８０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも約８１％の相同性、より好ましくは、少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の相同性を示し、少なくとも約９９％の相同性を示すことが最も好ましい。ＡＭＩＧＯポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、全長ＡＭＩＧＯポリペプチド配列のシグナルペプチドや他の断片を欠失していてもよい。通常、ＡＭＩＧＯ変異体ポリペプチドの長さは、少なくとも約１０アミノ酸であり、一般的には少なくとも約２０アミノ酸であり、より一般的には少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０アミノ酸、またはより長いものである。
【００８９】
本発明の１つの態様においては、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する単離した核酸分子、あるいは上記ポリヌクレオチドからなる単離した核酸分子を提供する。（ａ）配列番号１、３または５のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１、３または５に含まれるヌクレオチド配列であって、成熟ＡＭＩＧＯポリペプチドをコードする部分、（ｃ）ＡＭＩＧＯポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）ＡＭＩＧＯポリペプチドの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【００９０】
さらに本発明は、遺伝コードの縮重ゆえに本発明のヌクレオチド配列とは異なる核酸分子であって、配列番号２、４または６のアミノ酸配列で表されるＡＭＩＧＯタンパク質と同じものをコードする核酸分子も包含する。
【００９１】
さらに、核酸分子の集団の中には、ＡＭＩＧＯのアミノ酸配列を変化させる配列多型が存在してもよい。例えば、個体間の対立遺伝子変異はＡＭＩＧＯの遺伝的多型を示す。「遺伝子」と「組換え遺伝子」という用語は、ＡＭＩＧＯ、好ましくは脊椎動物のＡＭＩＧＯをコードする読み枠（ＯＲＦ）を包含する核酸分子を意味する。このような天然の対立遺伝子変異は、典型的には１〜５％の変異をＡＭＩＧＯにもたらす。このようなヌクレオチド変異およびその結果であるアミノ酸配列の多型は天然の対立遺伝子変異の産物であり、ＡＭＩＧＯの機能的活性を変化させないものである。このような変異および多型のそれぞれとそのすべてが本発明の範囲に含まれる。
【００９２】
さらに、ヒトのＡＭＩＧＯ配列とは異なるヌクレオチド配列からなる他の種のＡＭＩＧＯも予想することができる。天然の対立遺伝子変異体や本発明のＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡの相同体に対応する核酸分子は、ＡＭＩＧＯとの相同性に基づいて、ｃＤＮＡから誘導したプローブをストリンジェントな条件下で相同ＡＭＩＧＯ配列にハイブリダイズさせることで単離することが可能である。
【００９３】
「ＡＭＩＧＯ変異ポリヌクレオチド」または「ＡＭＩＧＯ変異核酸配列」とは、以下の（１）〜（３）のいずれかを有する活性ＡＭＩＧＯをコードする核酸分子を意味する：（１）全長前駆体ＡＭＩＧＯをコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の相同性を示すもの、（２）全長前駆体ＡＭＩＧＯがシグナルペプチドを欠いたもの、または（３）全長ＡＭＩＧＯの他の断片。通常、ＡＭＩＧＯ変異体ポリヌクレオチドは、全長前駆体ＡＭＩＧＯをコードする核酸配列と少なくとも約８０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の相同性を示し、少なくとも約９９％の相同性を示すことがより好ましい。ＡＭＩＧＯ変異ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを欠失した全長前駆体ＡＭＩＧＯをコードするが、シグナル配列を有するか有していないもの、または全長ＡＭＩＧＯの他の断片をコードするものでもよい。変異体には、前駆体ヌクレオチド配列は含まれない。
【００９４】
通常、ＡＭＩＧＯ変異体ポリヌクレオチドの長さは少なくとも約３０ヌクレオチドであり、一般的には少なくとも約６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００または４００ヌクレオチドであり、より一般的には少なくとも約５００ヌクレオチド、またはより長いものである。
【００９５】
本願で開示するヒトおよびマウスの配列をコードする哺乳類ＡＭＩＧＯのｃＤＮＡ配列の構造とヌクレオチド配列は、他の哺乳類からＡＭＩＧＯをコードしている遺伝子配列をクローニングすることを可能にした。本発明において特に興味深い点は、本願に開示した配列を用いてヒトＡＭＩＧＯ分子のクローニングが可能な点である。ＡＭＩＧＯをコードするＤＮＡは、本願実施例で行ったように、ＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡを有すると考えられ、検出可能なレベルで発現する組織から調製したいかなるｃＤＮＡライブラリーからも得ることができる。したがって、ＡＭＩＧＯ ＤＮＡは、例えば哺乳類胎児の肝臓、脳、筋肉、腸および末梢神経から調製したｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。ＡＭＩＧＯをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリーまたはオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【００９６】
目的遺伝子またはそれにコードされているタンパク質を同定するように設計したプローブ（ＡＭＩＧＯに対する抗体または約２０〜８０塩基からなるオリゴヌクレオチドなど）でライブラリーのスクリーニングを行う。選択したプローブでｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを行う際には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子クローニング：実験マニュアル) (ニューヨーク州: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) の１０〜１２章に記載の標準的な方法で行うか、または上記Sambrook et al.のセクション１４に記載のＰＣＲ法で行うことができる。
【００９７】
ＡＭＩＧＯのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変異をＡＭＩＧＯ ＤＮＡに導入するか、または目的ＡＭＩＧＯポリペプチドを合成することで調製することができる。このような変異体は、配列番号２、４または６に示したアミノ酸配列からなる天然ＡＭＩＧＯのアミノ酸配列の内部または末端の一方か両方に挿入、置換および／または特定の欠失を有する。好ましくは、このような変異体は、成熟配列の内部または末端の一方か両方に挿入および／または置換を有するか、ＡＭＩＧＯのシグナル配列の内部または末端の一方か両方に挿入、置換および／または特定の欠失を有する。成熟配列とシグナル配列の両方に変異を有していてもよい。本願で定義したような目的の生物学的活性を有する最終的な構築物が得られるように、挿入、置換および／または特定の欠失を色々な組み合わせで用いる。
【００９８】
上述したような前駆体配列に見られる変異は、米国特許第5,364,934号に記載の同類および非同類変異に関する技術とガイドラインを元に作製することができる。このような方法には、オリゴヌクレオチドを介した（部位特異的）変異法、アラニンスキャニング変異法およびＰＣＲ変異法が含まれる。
【００９９】
ＡＭＩＧＯをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）や発現のために複製可能なベクターに挿入する。種々のベクターが入手可能である。一般的にベクター構成成分には、１つまたは複数の以下の成分が含まれるが、これらに限定されるものではない：シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーターおよび転写停止配列。
【０１００】
本発明のＡＭＩＧＯ類は、直接的に組換えによって製造する以外にも、異種ポリペプチド（好ましくはシグナル配列や特定の開裂部位を成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に有する他のポリペプチド）との融合ポリペプチドとして製造することもできる。融合タンパク質は組換え法によって容易に調製することができる。ＡＭＩＧＯをコードする核酸を読み枠内でＡＭＩＧＯをコードしない核酸と融合することができるが、ＡＭＩＧＯをコードしない核酸はＡＭＩＧＯのＮ末端、ＣＯＯＨ末端または内部に融合させる。融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置などの公知の方法で合成することもできる。ＡＭＩＧＯ融合タンパク質は全長ＡＭＩＧＯのいかなる部分を含有していてもよく、生物学的活性部位をいくつも含有していてもよい。融合ポリペプチドは発現の研究、細胞の局在化、バイオアッセイおよびＡＭＩＧＯの精製に有用である。
【０１０１】
また、ＡＭＩＧＯ融合タンパク質は、ＰＣＲ増幅法とアンカープライマーを用いて容易に製造することもできる。この方法では２つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを調製し、次いで増幅産物のアニーリングを行い、それを再増幅することでキメラ遺伝子配列を製造する（Ausubel et al., supra）。
【０１０２】
シグナル配列はベクターの構成要素でもよいし、ベクターに挿入するＡＭＩＧＯ ＤＮＡの一部でもよい。選択した異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（例えば、シグナルぺプチダーゼによって開裂される）ものが好ましい。本来のＡＭＩＧＯシグナル配列を認識および処理することのない原核生物を宿主細胞とする場合には、ＡＭＩＧＯシグナル配列を原核性シグナル配列（例えば、アルカリフォスファターゼのリーダー配列、ペニシリナーゼのリーダー配列および熱安定性II型エンテロトキシンのリーダー配列からなる群より選ばれるもの）で置換する。酵母による分泌のためには、本来のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼのリーダー配列、α因子のリーダー配列（Saccharomyces属およびKluyveromyces属のα因子リーダー配列を含み、後者は1991年4月23日に発行された米国特許第5,010,182号に記載されている）、酸フォスファターゼのリーダー配列やCandida albicansグルコアミラーゼのリーダー配列（1990年4月4日に発行されたEP 362,179を参照）で置換することができる。哺乳類細胞による発現においては、本来のシグナル配列（例えば、通常、ヒト細胞においてin vivoでＡＭＩＧＯの分泌を指示するＡＭＩＧＯプレ配列）で十分であるが、他の哺乳類シグナル配列が適当な場合もある。他の哺乳類シグナル配列としては、他の動物のＡＭＩＧＯのシグナル配列や、同一または関連する種の分泌ポリペプチド用のシグナル配列が挙げられ、他にはウイルス分泌用のリーダー配列、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＤシグナルも挙げられる。
【０１０３】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識されるプロモーターを含有し、発現可能な状態でＡＭＩＧＯ核酸と連結している。ベクターの選択は、使用する生物または細胞と目的とするベクターの性質によって支配されている。ベクターは標的細胞中で一回複製するものでも、「自殺」ベクターでもよい。一般的に、ベクターはシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーターおよび転写停止配列を包含する。各因子の選択については、ベクターを使用する生物に依存し、容易に決定することができる。上記因子のいくつかは特定条件下でのみ機能するものであり、例えば、適切な条件下でのみ機能する誘導性または条件付プロモーターが挙げられる。
【０１０４】
ベクターは２種に大別することができる。１つはクローニングベクターであって、適切な宿主細胞における増殖に必要のない領域も有する複製プラスミドまたはファージであり、外来ＤＮＡを挿入することができる。外来ＤＮＡはベクターの一成分であるかのように複製し、増幅する。もう一方の発現ベクター（プラスミド、酵母または動物ウイルスゲノム）は、外来遺伝物質を宿主細胞または組織に導入し、外来ＤＮＡの転写と翻訳を行うためのものである。発現ベクターに導入したＤＮＡは、宿主細胞に挿入遺伝子を転写するための指示を伝達するプロモーターなどの因子に発現可能な状態で連結している。いくつかのプロモーター、例えば、特定の因子に応答して遺伝子の転写を制御する誘導性プロモーター、は特に有用である。誘導性プロモーターに発現可能な状態で連結したＡＭＩＧＯまたはそのアンチセンス構築物は、ＡＭＩＧＯまたはその断片、あるいはアンチセンス構築物の発現を制御することができる。典型的な誘導性プロモーターの具体例には、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、グルココルチコイドなどのステロイド類（Kaufman RJ,“Vectors Used for Expression in Mammalian Cells (哺乳類細胞における発現に用いるベクター)”“Methods in Enzymology, Gene Expression Technology (酵素学の方法、遺伝子発現技術)”, David V. Goeddel ed., 1990, 185:487-511）やテトラサイクリンに応答するプロモーターが挙げられる。他の好ましい誘導性プロモーターには、構築物を導入する細胞にとって内因性ではないが、誘導性物質を細胞の外部から与えた時に応答するものが挙げられる。
【０１０５】
プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’側）に位置する非翻訳配列（通常、約１００〜１,０００ｂｐ）であり、そこに発現可能な状態で連結した特定の核酸配列（例えばＡＭＩＧＯ核酸配列）の転写と翻訳を制御するものである。このようなプロモーターは典型的には２つのクラス、誘導性と構成性、に大別することができる。誘導性のプロモーターは、培養条件の変化（例えば、栄養素の存在または不在、または温度変化）に応じて、その制御下のＤＮＡの転写レベルの増加を制御するプロモーターである。今では、種々の宿主細胞候補によって認識されるプロモーターが多数知られている。このようなプロモーターを発現可能な状態でＡＭＩＧＯをコードするＤＮＡに連結する時には、ＤＮＡの原料から制限酵素消化によってプロモーターを切り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入する。本来のＡＭＩＧＯプロモーター配列と種々の異種プロモーターは共に、ＡＭＩＧＯ ＤＮＡの直接的な増幅および／または発現に使用することができる。しかし、異種プロモーターは、通常、本来のＡＭＩＧＯプロモーターよりも高い転写率とＡＭＩＧＯの高収率を可能とするため、異種プロモーターが好ましい。原核細胞、真核細胞、酵母および哺乳類の宿主細胞に用いるための種々のプロモーターが存在し、当業者に知られている。
【０１０６】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物から得た有核細胞）に用いる発現ベクターも、転写停止とｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの通常５’側、時には３’側の非翻訳領域に存在する。このような領域は、ＡＭＩＧＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳領域中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１０７】
上で列挙した成分を１つまたは複数含有する適切なベクターの構築には、標準的な連結技術を用いる。必要なプラスミドとなるような形に単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、仕立て直し、再連結する。
【０１０８】
本発明を実施する際に特に有用なのは、哺乳類細胞中でＡＭＩＧＯをコードするＤＮＡの一過性発現を可能とする発現ベクターである。一般的に、一過性発現には宿主細胞内で効果的に複製することのできる発現ベクターを用い、宿主細胞が発現ベクターの複数のコピーを蓄積し、その代わりに発現ベクターによってコードされている目的ポリペプチドを高レベルで合成する（上述のSambrook et al., pp. 16.17 - 16.22を参照）。適切な発現ベクターと宿主細胞を包含する一過性発現系は、クローニングしたＤＮＡにコードされているポリペプチドの存在の同定を簡単に行うだけでなく、このようなポリペプチドを対象として目的とする生物学的特徴または生理的特徴についての迅速なスクリーニングを可能とする。したがって、一過性発現系は、ＡＭＩＧＯの生物学的に活性な類似体や変異体を同定するために、本発明において特に有用である。
【０１０９】
培地における脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は、日常的な操作である（例えば、“Tissue Culture (組織培養)”, Academic Press, Kruse and Patterson ed. (1973）を参照）。有用な哺乳類宿主細胞系としては、サル腎臓細胞系ＣＶ１をSV40で形質転換したもの（COS-7、ATCC CRL 1651）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4216 (1980)）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）およびイヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）が挙げられる。
【０１１０】
上述のＡＭＩＧＯ製造用の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または目的配列をコードする遺伝子の増幅に適当なように修飾した市販の栄養培地で培養する。
【０１１１】
トランスフェクションとは、コード配列が実際発現されるかどうかに関係のない、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。通常の知識を有する当業者にトランスフェクションのための方法が多数知られており、例えば、エレクトロポレーション法が挙げられる。トランスフェクションの成功は、通常、宿主細胞においてこのベクターが機能したことを示す何らかの指標が生じたことによって確認する。
【０１１２】
形質転換とは、核外因子または染色体導入物として複製可能なようにＤＮＡを生体に導入することを意味する。使用する宿主細胞によるが、形質転換は各細胞に適した標準的な方法で行う。上述のSambrook et al.、セクション１．８２に記載の塩化カルシウムを用いたカルシウム処理またはエレクトロポレーション法が、実質的に細胞壁のバリアを有する原核細胞や他の細胞に一般的に用いられている。
【０１１３】
哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な特徴は、1983年8月16日発行の米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) および Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979) の方法に準じて実施する。しかし、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば、核のマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、細菌のプロトプラストを無傷の細胞と融合する方法、またはポリカチオン法（例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどを用いる方法）を実施することもできる。哺乳類細胞を形質転換する種々の方法については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) および Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988) を参照されたい。
【０１１４】
本発明のＡＭＩＧＯポリペプチドの製造に用いる原核細胞は、上述のSambrook et al.などに一般的に記載されている適切な培地で培養する。一般的に、哺乳類培養細胞の生産性を最大にするための原理、方法、実践的技術については、“Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (哺乳類細胞生物工学：実践的手法)”, M. Butler ed. (IRL Press, 1991) に記載されている。 
【０１１５】
遺伝子の増幅および／または発現は試料から直接測定することができ、例えば、本願で開示する配列に基づいた適切な標識プローブを用いた、公知のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を測定するためのノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ解析）または in situ ハイブリダイゼーション法によって測定することができる。種々の標識、最も一般的にはラジオアイソトープ、特に32Ｐを使用する。しかし、その他の技術、例えば、特定の二本鎖分子（二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む）を認識するポリヌクレオチドまたは抗体に標識を導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドも使用可能である。
【０１１６】
遺伝子の発現は、組織切片の免疫組織的染色、培養細胞や体液のイムノアッセイといった免疫学的手法によって、遺伝子産物の発現を直接定量することもできる。免疫組織的染色技術においては、細胞試料を（典型的な方法では脱水と固定によって）調製し、細胞にカップリングされている遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させる。この場合の標識は、通常目視で検出可能な酵素ラベル、蛍光ラベル、発光ラベルなどである。本発明での使用に適した特に感度の高い染色方法が、Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980) に記載されている。
【０１１７】
組換え体の作製 
ヒト由来ではない組換え細胞によってＡＭＩＧＯを製造した場合、得られたＡＭＩＧＯはヒト由来のタンパク質やポリペプチドを全く含まない。しかし、ＡＭＩＧＯとして実質的に均質な調製物を得るためには、製造したＡＭＩＧＯを組換え細胞のタンパク質やポリペプチドから精製する必要がある。精製を行うには、まず、培地または細胞溶解物を遠心分離することで、そこから粒状の細胞片を取り除くことができる。次いで、適切な精製方法の例として以下に挙げる方法で、異物である可溶性のタンパク質やポリペプチドからＡＭＩＧＯを精製することができる。このような方法としては、イオン交換カラムによる分取、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ充填カラムを用いたクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング（chromatofocusing）、イムノアフィニティ法、エピトープタグ結合樹脂を用いる方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、Sephadex G-75などを用いたゲル濾過、およびＩｇＧなどの異物を取り除くためのプロテインＡセファロースカラムを用いる方法が挙げられる。
【０１１８】
アミノ酸残基が欠失、挿入または置換されたＡＭＩＧＯ変異体は、変異によって生じた物性の実質的な変化にも注意しながら、前駆体ＡＭＩＧＯ配列と同様の方法で回収する。モノクローナル抗ＡＭＩＧＯ抗体結合樹脂（monoclonal anti-AMIGO resin）などのイムノアフィニティ樹脂をＡＭＩＧＯ変異体中に残っている少なくとも１つのエピトープに結合させることにより、ＡＭＩＧＯ変異体を樹脂に吸収させることができる。
【０１１９】
変異体のアッセイは以下のようにして行うことができる。ＡＭＩＧＯ分子の免疫特性の変化、例えば一定の抗体に対する親和性などは、競合的なイムノアッセイによって測定できる。タンパク質やポリペプチドの物性の他の考えうる変化、例えば酸化還元性、熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、担体との凝集傾向や多量体形成傾向などは、当業界で公知の方法でアッセイを行う。
【０１２０】
本発明は、異種ポリペプチドに融合したＡＭＩＧＯを含むキメラポリペプチドも包含する。キメラＡＭＩＧＯは、本発明で定義するＡＭＩＧＯ変異体の１種である。１つの好ましい態様においては、キメラポリペプチドは、ＡＭＩＧＯと、抗タグ抗体または抗タグ分子が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合物を包含する。このようなエピトープタグは、一般的にＡＭＩＧＯのアミノ末端またはカルボキシル末端に設けられる。エピトープタグを付したこのような形態のＡＭＩＧＯは、タグポリペプチドに対する標識抗体を用いてその存在を検出することが可能なので好ましい。また、エピトープタグを付与することで、抗タグ抗体を用いた親和性精製でＡＭＩＧＯを容易に精製することが可能になる。抗体を用いた親和性精製の方法および診断のためのアッセイに関しては後述する。
【０１２１】
タグポリペプチドとその抗体については、当業界においてよく知られている。例えば、インフルエンザＨＡタグポリペプチドとその抗体である１２ＣＡ５（Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)）、ｃ−ｍｙｃタグとその抗体である８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）、ならびに単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグとその抗体（Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)）などである。その他のタグポリペプチドも開示されており、例えば、Ｆｌａｇ ペプチド（Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）、ＫＴ３エピトープペプチド（Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)）、α−チューブリンエピトープペプチド（Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）、およびＴ７遺伝子誘導タンパク質に由来するペプチドタグ（Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が挙げられる。
【０１２２】
タグポリペプチドを選択すれば、それに対する抗体を、本願で説明する方法によって作製することができる。Ｃ末端ポリヒスチジン配列タグが好ましい。ポリヒスチジン配列は、Lindsay et al., Neuron 17:571-574 (1996) に記載のＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってタグを付したタンパク質の単離を可能にする。
【０１２３】
エピトープタグを付したＡＭＩＧＯの構築と製造に適した一般的な方法は、上記した様々な方法と同様のものである。
【０１２４】
エピトープタグを付したＡＭＩＧＯは、抗タグ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより簡便に精製することができる。アフィニティ抗体を結合させるマトリクスとしては大抵の場合アガロースが用いられるが、他のマトリクス（例えば、多孔性ガラスビーズ（controlled pore glass）やポリスチレンジビニルベンゼン）も使用可能である。エピトープタグを付したＡＭＩＧＯは、例えば緩衝液のｐＨやイオン強度を変化させたり、カオトロピックな物質を加えたりすることにより、アフィニティカラムから溶出させることができる。
【０１２５】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に結合したＡＭＩＧＯ配列より構築されるキメラ（イムノアドヘシン（immunoadhesins））は当業界でよく知られている。文献に発表されたイムノアドヘシンとしては、以下のタンパク質との融合物が挙げられる。Ｔ細胞受容体（Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2936-2940 (1987)）、ＣＤ４*（Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989)、Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1989)、Zettmeissl et al., DNA Cell Biol USA, 9: 347-353 (1990) および Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1990)）、ＴＮＦ受容体（Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539 (1991)、Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 27: 2883-2886 (1991) および Peppel et al., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)）、およびＩｇＥレセプターα*（Ridgway et al., J. Cell. Biol., 1 15:abstr. 1448 (1991)）。文中のアスタリスク（*）は、受容体が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【０１２６】
最も単純で簡単なイムノアドヘシン設計においては、「アドヘシン」タンパク質の結合領域を、免疫グロブリンのＨ鎖のヒンジ部とＦｃ領域と組み合わせる。通常、本発明のＡＭＩＧＯ−免疫グロブリンキメラを調製する場合は、ＡＭＩＧＯをコードする核酸を、ＡＭＩＧＯのＣ末端側に免疫グロブリンが結合するように、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端側に免疫グロブリンが結合するように核酸を融合することも可能である。
【０１２７】
このような融合物では、概してコードされたキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン Ｈ鎖の定常領域のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを、機能的な活性を有する形態で保有する。定常ドメインのＦｃ部位のＣ末端から融合することもできるし、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端の直前やＬ鎖の対応領域から融合することもできる。
【０１２８】
融合させる正確な位置は重要ではなく、融合に適した特定の位置もよく知られている。融合位置は、ＡＭＩＧＯ−免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌特性または結合特性の最適化を目的として選択することができる。
【０１２９】
ＡＭＩＧＯイムノアドヘシンを発現させる宿主細胞系の選択は、主に発現ベクターに依存する。他に考慮する点は、必要なタンパク質の量である。例えば、リン酸カルシウム法またはＤＥＡＥ−デキストラン法（Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990) および Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)）を用いた一過性トランスフェクションでは、しばしばミリグラム単位のタンパク質を製造できる。より多量のタンパク質が望まれる場合には、宿主細胞系を安定トランスフェクションに付した後でイムノアドヘシンを発現させればよく、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするさらなるプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）に発現ベクターを導入する。
【０１３０】
抗体 
ＡＭＩＧＯ核酸は、本発明で例示する組換え技術によるＡＭＩＧＯポリペプチドの調製に有用であり、このようにして得られるＡＭＩＧＯポリペプチドは、後述する多様な用途を有する抗ＡＭＩＧＯ抗体の製造に用いることができる。
【０１３１】
免疫組織染色および／または体液試料のアッセイに有用な抗体は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【０１３２】
本発明はさらに、ＡＭＩＧＯに特異的に結合する抗体、またはその断片を包含する。本発明の１つの好ましい態様には、ＡＭＩＧＯの生物学的活性を阻害する抗体も含まれる。上記の抗体は、診断アッセイにおけるＡＭＩＧＯの同定に有用であり、このような診断アッセイによって、ＡＭＩＧＯの存在量が関与する疾患に罹患した哺乳類におけるＡＭＩＧＯ存在量を測定することができる。さらに、ＡＭＩＧＯに特異的に結合する抗体は、ＡＭＩＧＯとその受容体との相互作用を遮断するのにも有用であるため、後述するように、ＡＭＩＧＯ関連疾患を治療するための治療環境においても有用である。
【０１３３】
ＡＭＩＧＯタンパク質またはペプチドの全長配列またはペプチド断片に対するモノクローナル抗体は、公知のいかなるモノクローナル抗体調製法、例えば Harlow et al., （1988, “Antibodies, A Laboratory Manual（抗体、実験マニュアル）”、ニューヨーク州：Cold Spring Harbor）に記載の手法、を用いて調製してもよい。なお、抗ＡＭＩＧＯモノクローナル抗体は、少なくとも次の４つの工程を含んでなるハイブリドーマ法を用いて調製することができる。（１）宿主または宿主のリンパ球を免疫する工程、（２）モノクローナル抗体を分泌する（または分泌能を有する）リンパ球を回収する工程、（３）不死化した細胞へと該リンパ球を融合する工程、そして（４）所望の（抗ＡＭＩＧＯ）モノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する工程。モノクローナル抗体は、従来のＩｇ精製法、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫酸アンモニウム沈殿またはアフィニティクロマトグラフィーなどを用いて、培地や腹水液から単離または精製することができる（Harlow et al., supra）。
【０１３４】
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはその他の適当な宿主を免疫して、免疫原に特異的に結合する抗体を製造するか、または製造能を有するリンパ球を誘導する。また、リンパ球は in vitro で免疫してもよい。
【０１３５】
ヒトの細胞が望ましい場合は、一般に、末梢血リンパ球を用いる。しかし、ヒト以外の哺乳類由来の脾臓細胞または脾臓リンパ球が好ましい。
【０１３６】
免疫原には一般にＡＭＩＧＯまたはＡＭＩＧＯ融合タンパク質が含まれる。
【０１３７】
本発明はさらに、ヒト化抗ＡＭＩＧＯ抗体およびヒト抗ＡＭＩＧＯ抗体も包含する。
【０１３８】
ヒト化した非ヒト動物抗体とは、非ヒト動物Ｉｇから誘導した最小配列を含有するキメラＩｇ、そのＩｇ鎖または断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）またはその他の抗原結合性配列）である。
【０１３９】
一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト動物原料から導入した１つ以上のアミノ酸残基を有する。このような非ヒト動物種由来アミノ酸残基をしばしば「外来（import）」残基と称し、その残基は一般に「外来」可変ドメインから得たものである。ヒト化は、げっ歯類の相補性決定部位（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することで達成する（Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988) および Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, (1988)）。このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第 4,816,567 号, 1989）、それは完全なヒト可変ドメインに実質的には満たない部分が、非ヒト動物種の対応配列で置換されたものである。実際には、ヒト化抗体は、一般的にヒト抗体のＣＤＲ内の残基の一部、さらに可能であればＦＲ内の残基の一部が、げっ歯類抗体の相同部位の残基によって置換されたものである。ヒト化抗体には、レシピエント抗体の相補性決定部位（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および適応力を有する非ヒト動物種抗体（ドナー抗体）（例えばマウス、ラット、ウサギなどの抗体）のＣＤＲの残基によって置換された、ヒトＩｇ（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒトＩｇ Ｆｖ断片のフレームワーク配列中の残基を、非ヒト動物種の対応する残基で置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、あるいは外来ＣＤＲ配列やフレームワーク配列中にも存在しない残基を包含してもよい。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含有し、この可変ドメインのＣＤＲ領域の全てでなくとも大部分は非ヒト動物ＩｇのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全てでなくとも大部分はヒトＩｇのコンセンサス配列である。最適なヒト化抗体は、典型的にはヒトＩｇのＩｇ定常領域の少なくとも一部も含有する（Jones et al., supra および Presta LG, Curr Opin Biotechnol 3:394-398 (1992)）。
【０１４０】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー法（Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res 19:4133-4137 (1991) および Marks et al., Biotechnology (NY) 10:779-83 (1991)）やヒトモノクローナル抗体の調製法（Boerner et al., J. Immunol 147(1):86-95 (1991) および Reisfeld and Sell,“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（モノクローナル抗体と抗癌治療）”ニューヨーク州：Alan R. Liss, Inc., 1985）などの様々な方法によっても製造することができる。同様に、内因性Ｉｇ遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物にヒトＩｇ遺伝子を導入する方法も、ヒト抗体の合成に活用することができる。この方法を実践してみると、ヒト抗体の製造が観察され、例えば遺伝子の再配列、アセンブリおよび抗体のレパートリーなどの事象が、ヒトに見られるものと全ての点において酷似していた（米国特許第 5,545,807 号, 1996、米国特許第 5,545,806 号, 1996、米国特許第 5,569,825 号, 1996、米国特許第 5,633,425 号, 1997、米国特許第 5,661,016 号, 1997、米国特許第 5,625,126 号, 1997、Fishwild et al., Nat Biotechnol 14:845-51 (1996)、Lonberg and Huszar, Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)、Lonberg et al., Nature 368:856-9 (1994) および Marks et al., Biotechnology (NY) 10:779-783 (1992)）。
【０１４１】
１つの好ましい態様において、本発明は、モノクローナルな二重特異性抗体、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体を包含する。二重特異性抗体は少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。例えば、一方がＡＭＩＧＯに対する結合特異性で、他の一方は任意の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質、受容体または受容体サブユニット、に対する結合特異性である。
【０１４２】
従来の方法では、二重特異性抗体の組換えによる製造は、２組のＩｇのＨ鎖とＬ鎖の共発現に基づいているが、その場合、２本のＨ鎖は異なる特異性を有している（Milstein and Cuello, Nature 305:537-540 (1983)）。ＩｇのＨ鎖とＬ鎖を任意に組合せることによって得られるハイブリドーマ（クワドローマ（quadroma））は、異なる１０種の抗体分子の混合物を産生する可能性があるが、そのうち所望の二重特異性構造を有するのは１種だけである。得られた所望の抗体はアフィニティクロマトグラフィーやその他の方法（WO 93/08829, (1993) および Traunecker et al., Trends Biotechnol 9:109-113 (1991)）によって精製することができる。
【０１４３】
二重特異性抗体を製造する（Suresh et al., Methods Enzymol. 121:210-228 (1986)）には、所望の抗原抗体結合部位を有する可変ドメインをＩｇ定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、ヒンジ部、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含有するＩｇのＨ鎖定常ドメインに融合させる。Ｌ鎖との結合に必要な部位を含む第１Ｈ鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つに含まれていることが好ましい。Ｉｇ Ｈ鎖融合物と、所望によりＩｇ Ｌ鎖もコードするＤＮＡを、それぞれ別の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトする。
【０１４４】
Ｆａｂ断片は大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成する。例えば、完全にヒト化した二重特異性Ｆ（ａｂ’）抗体を作製することができる（Shalaby et al., J Exp Med. 175: 217-225 (1992)）。各Ｆａｂ断片を大腸菌に別々に分泌させ、in vitro で化学的に直接カップリングして、二重特異性抗体を形成する。
【０１４５】
また、二重特異性抗体の断片を培養組換え細胞から直接調製したり単離したりするための様々な方法も報告されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを活用することができる（Kostelny et al., Immunol. 148:1547-1553 (1992)）。Fosタンパク質とJunタンパク質から得たペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ部位に結合する。抗体のホモダイマーをヒンジ部で還元してモノマーに分離し、該モノマーを再び酸化して抗体のヘテロダイマーを形成する。この方法で抗体のホモダイマーを製造することもできる。
【０１４６】
「二重特異性抗体（diabody）」技術（Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90:6444-6448 (1993)）は、二重特異性抗体断片を製造するための別の方法を提供する。この断片は、同一鎖上で２つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを介して結合した、Ｈ鎖の可変ドメイン（ＶＨ）とＬ鎖の可変ドメイン（ＶＬ）を含有する。１つの断片のＶＨドメインとＶＬドメインを、他の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインに対合させ、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体断片を製造するための別の方法は、１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを用いる（Gruber et al., Immunol. 152:5368-5374 (1994)）。また、三重特異性抗体など、２価を超える力価の抗体も想像することができる（Tutt et al., J lmmunol. 147:60-69 (1991)）。
【０１４７】
ポリクローナル抗体は、例えば、１種以上の免疫原を、所望によりアジュバントと共に注射することで、哺乳類を宿主として製造することができる。概して、免疫原および／またはアジュバントを哺乳類に対して皮下注射または腹腔内注射を数回行うことによって投与する。免疫原としては、ＡＭＩＧＯまたはＡＭＩＧＯ融合タンパク質が挙げられる。
【０１４８】
アジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバントおよびモノホスホリル脂質Ａ合成トレハロースジコリノミコレート（monophosphoryl Lipid A synthetic-trehalose dicorynomycolate、ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。免疫応答を高めるには、ＡＭＩＧＯ宿主中で免疫原性を有するタンパク質、例えばスカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシ チログロブリンおよび大豆トリプシン阻害因子、に免疫原を結合させてもよい。抗体の製造手順は、上記したHarlow et al.に記載されている。その他にも、ポリクローナル抗体は、ＩｇＹ分子を産生するニワトリで製造することもできる（Schade et al.,“The production of avian (egg yolg) antibodies: IgY. The report and recommendations of ECVAM workshop（トリ（卵黄）抗体であるＩｇＹの製造 ECVAMワークショップによる報告と推奨方法）”、Alternatives to Laboratory Animals NAILA. 24:925-934 (1996)）。
【０１４９】
治療 
ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯ遺伝子およびＡＭＩＧＯ核酸は、ＡＭＩＧＯの活性に関連するかＡＭＩＧＯの反応性に益を得る疾患や障害の治療において哺乳類、特にヒトに投与することを目的とした、ex vivo または in vivo における治療用途を有すると考えられる。特にＡＭＩＧＯが適した疾患は、神経障害、好ましくは中枢神経系障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、神経損傷または脳腫瘍である。
【０１５０】
患者に対し、効果的な量の本発明のＡＭＩＧＯタンパク質、生物学的活性を有するペプチド断片、変異体またはそのペプチドをコードする核酸を投与する。ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ作用物質、ＡＭＩＧＯ拮抗物質または抗ＡＭＩＧＯ抗体の投与を包含する治療方法は本願の範囲内である。本発明はまた、適切な薬理学的担体に担持させた、ＡＭＩＧＯのタンパク質、ペプチド断片または誘導体を含有する医薬組成物を提供する。ＡＭＩＧＯのタンパク質、ペプチド断片または変異体の投与は、全身に行ってもよいし、局所的に行ってもよい。
【０１５１】
疾患や医学的障害において、神経細胞および／または神経細胞の軸索突起の生存や機能に欠陥が生じた場合、それは神経障害とみなされる。そのような神経障害は、以下に挙げる病態の結果として起こるものである。（ａ）傷害部位近傍の軸索突起および／または神経細胞本体の変性を引き起こす身体的傷害、（ｂ）発作などの虚血症、（ｃ）癌の化学療法薬剤（例えば、シスプラチン）およびエイズの化学療法薬剤（例えば、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ））などの神経毒素への曝露、（ｄ）糖尿病や腎臓機能障害などの慢性代謝障害、および（ｅ）パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの、特定の神経群の変性を伴う神経変性疾患。即ち、神経障害を起こす病態の中には、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、発作、糖尿病性多発神経炎、中毒性神経炎、グリア性瘢痕、および神経系への物理的損傷が含まれる。物理的損傷には、脳や脊髄の物理的傷害や、上肢、手や身体の他の部位における圧挫傷や切り傷などがあり、例えば、発作によって生じた、神経系の一部における血流の一時的または永続的な停止も含まれる。
【０１５２】
本発明は、発作や外傷性傷害など、中枢神経系に傷害を負った哺乳類の治療方法を開示する。この方法は、負傷後少なくとも６時間、例えば１２、２４、４８時間またはそれ以上の長時間が経過した哺乳類に対し、本発明のＡＭＩＧＯタンパク質、ペプチド断片、または変異体を投与する工程を含む。なお本発明の治療方法を実践することのできる対象治療範囲には、未だ限界が定まっていない。本発明は、様々な病態が原因となって起こる中枢神経系傷害に伴う、１つまたは複数の悪性症状を治療するために用いることができる。血栓、塞栓および全身の低血圧は発作の原因として最も一般的なものである。他の傷害の原因としては、高血圧症、高血圧性大脳血管疾患、動脈瘤破裂、血管腫、血液疾患、心不全、心拍停止、心臓性ショック、腎不全、敗血症性ショック、頭部外傷、脊髄外傷、癲癇発作、腫瘍からの出血やその他の血液量または血圧の低下などが考えられる。これらの傷害は、生理機能の破壊、それに続くニューロンの死滅、そして負傷部位の壊死（梗塞）へとつながる。本願明細書で「発作」とは、上述の様々な傷害に関連して生ずる突然かつ劇的な神経的欠損を意味する。
【０１５３】
本願明細書で「虚血症」または「虚血症の発症」とは、組織への血液供給の欠乏につながるようないかなる状況をも意味する。したがって、中枢神経系における虚血症の発症は、脳のあらゆる部位に対する血液供給の欠乏または中断の結果であり、そのような脳の部位とは、例えば大脳、小脳または脳幹の一部などであるが、これらに限定されるものではない。脊髄もまた中枢神経系の一部であり、脳と同様に、血流の減少による虚血症の影響を受けやすい。虚血症の発症は、血栓や塞栓の場合に起こるような血管の狭窄または閉塞に起因する。その他にも、虚血症の発症の原因として、例えば上に挙げた心拍停止など、あらゆる心臓機能欠陥が考えられる。欠陥が非常に深刻かつ長期に渡る場合、生理機能の破壊、それに続くニューロンの死滅、そして負傷部位の壊死（梗塞）が起きる。傷害による神経系の異常の程度と種類は、梗塞や虚血病巣の位置と大きさによる。虚血が発作と関係する場合、その程度は全身的な場合もあれば、局所的な場合もある。
【０１５４】
本発明はまた、頭部の強打などの、機械的な力によって起きる中枢神経系への外的損傷の治療においても有用であることが期待できる。外傷には、哺乳類の頭部、頸部や脊柱のあらゆる部位やそこに付属する部位に対する外部からの物体の接触による外傷に起因する、擦過傷、切り傷、挫傷、刺し傷、圧迫傷（compression）などからなる群より選ばれる組織の損傷が含まれる。他の種類の外的損傷は、体液の不適当な蓄積（正常な脳脊髄液や硝子液の産生、代謝や容量調節の遮断または不全、あるいは硬膜下血腫、硬膜下水腫、頭蓋内血腫や頭蓋内水腫など）による、哺乳類のＣＮＳ組織の狭窄または圧迫に起因する。同様に、外傷性の狭窄または圧迫は、転移腫瘍や一次腫瘍（primary tumor）などの異常組織塊の存在によって引き起こされることもある。
【０１５５】
本発明はまた、腫瘍や転移腫瘍細胞、特に脳腫瘍の治療において有用であることが期待できる。最も一般的な脳腫瘍はグリオーマであり、これはグリア組織で始まる。また、アストロサイトーマは、「星状細胞」と呼ばれる小さな星型の細胞から発生し、成人の場合、大脳で発生することがほとんどである。第III度のアストロサイトーマは「異型性アストロサイトーマ」と称されることがある。第IV度のアストロサイトーマは通常、「多形性膠芽腫」と称される。また、脳幹膠腫は脳の最下方、幹状部分で発生する。脳幹は様々な生体機能を司る。大部分の脳幹膠腫は重度のアストロサイトーマである。脳室上衣細胞腫は、通常、脳室の内側に発生するが、脊髄に発生することもある。乏突起膠腫は、ミエリン（神経を保護している脂質の被覆）を産生する細胞で発生する。この腫瘍は通常大脳内で発生する。これらはゆっくりと増殖し、普通は脳周辺の組織に広がることはない。髄芽細胞腫は、通常は生後の体内に残存することのない原始神経細胞から発生する。そのため、髄芽細胞腫はしばしば原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）と称される。髄芽細胞腫はたいてい小脳で発生するが、他の部位に発生することもある。また、髄膜腫は髄膜から発生し、一般に良性である。この腫瘍は非常にゆっくりと増殖するため、その間に脳が腫瘍の存在に順応することもありうる。したがって、髄膜腫は症状が表れるまでにかなり大きく成長することが多い。髄膜腫は３０代から５０代の女性に最も多く発病する。シュワン細胞腫はシュワン細胞から発生する良性の腫瘍であり、シュワン細胞は聴神経を保護するミエリンを産生する。なお聴神経腫はシュワン細胞腫の一種である。頭蓋咽頭腫は視床下部付近の下垂体領域に発生する。通常、頭蓋咽頭腫は良性だが、視床下部を圧迫したり損傷を与えたりして生理機能に影響を与えることがあるので、悪性とみなされることもある。胚細胞腫瘍は原始性細胞（発生中の性細胞）または胚細胞より発生する。脳の胚細胞腫瘍で最もよく見られるのは胚細胞腫である。松果体領域の腫瘍は松果体の内部または周囲で発生し、増殖の遅い松果体細胞腫または増殖の早い松果体芽細胞腫になる。松果体領域は非常に治療の行いにくい場所にあり、腫瘍を除去できないことがしばしばである。脳腫瘍の治療法は、様々な要素に依存する。要素とは、腫瘍の種類、位置および大きさ、ならびに患者の年齢と健康状態などである。一般に、脳腫瘍は外科手術、放射線療法および化学療法で治療する。ＡＭＩＧＯ療法によって治癒可能な腫瘍としては、ＥＧＦＲを発現し、ＡＭＩＧＯを介したＥＧＦＲのリン酸化阻害に反応するものが好ましい。
【０１５６】
本発明は霊長類、好ましくはヒトなどの高等霊長類の治療に適している。しかし本発明はさらに、飼養化した哺乳類、例えば人間にとってのコンパニオンアニマル（イヌ、ネコ、ウマなど）、高い商業的価値のあるもの（ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、競技用動物や役畜など）、高い科学的価値のあるもの（捕獲後のまたは野生の絶滅危惧種、あるいは交配または生命工学によって調製した動物系統）、または上記以外の価値のあるもの、の治療にも用いることができる。医学や獣医学分野の当業者は、ある哺乳類が中枢神経系に虚血性損傷または外部損傷を受けているかどうか判別できるよう教育を受けている。例えば、慣行的な試験および／または臨床的診断評価や獣医学的診断評価によって、哺乳類が中枢神経系の（例えば神経学的な）機能の欠陥や損失を被っているかどうかが分かる。熟練した当業者には、本発明に開示した治療法やその他の治療法に関連のある、臨床的および非臨床的な指標ならびに経験の蓄積から、ある個体が中枢神経系に虚血性損傷または外部損傷を受けているかどうか、あるいは、本発明の方法を含む特定の治療法が対象生物にとって最適であるかどうか、について決定するための情報が自ずと与えられるものである。
【０１５７】
遺伝子治療用途においては、例えば欠損遺伝子の代わりに、治療に有効な遺伝子産物の in vivo 合成を行うために遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子治療」には、単一の治療によって永続効果が得られる従来の遺伝子治療と、治療に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡを一回または繰返して投与することを含む遺伝子治療剤の投与との両方がある。アンチセンスＲＮＡとＤＮＡは in vivo において特定の遺伝子の発現を阻害するための治療物質として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みが限定されるためその細胞内濃度が低いにも関らず、細胞内に導入されて阻害剤として働くことが明かになっている（Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:41434146 (1986)）。オリゴヌクレオチドは、例えば、負の電位を帯びたリン酸ジエステル基を電位を帯びていない基で置換するといった修飾によって、取り込み量を高めることができる。
【０１５８】
遺伝子の発現を阻害する他の方法には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の誘導にＲＮＡを用いる方法が含まれ、この方法では二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列を用いるか（Fire et al., Nature 391: 806-811. 1998）、または短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を用いる（Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA. 99:6047-52. 2002）。「ＲＮＡｉ」とは、ｄｓＲＮＡが相補的ｍＲＮＡの相同性依存的分解を誘導する過程である。１つの態様においては、合成アンチセンス核酸分子を、相補的塩基対の形成に基づいて「センス」リボ核酸とハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡであるアンチセンスおよびセンス核酸分子を提供するが、この核酸分子は、ＡＭＩＧＯコード鎖の少なくとも約２０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドあるいはＡＭＩＧＯコード鎖全体に対応するか、あるいはその部分にのみ対応する配列である。別の態様においては、ｓｉＲＮＡの長さは３０ヌクレオチド以下、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであって、特徴的な２〜３ヌクレオチドの３’オーバーハング末端（overhanging ends）を有するものである。このようなｓｉＲＮＡはより長いｄｓＲＮＡをリボヌクレアーゼIIIで開裂することで生成する（例えば、Tuschl T. Nat Biotechnol. 20:446-48. 2002を参照）。
【０１５９】
短鎖ＲＮＡ分子の細胞内転写は、一般に、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６またはヒトＲＮＡｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１をコードしているＲＮＡポリメラーゼIII（Pol III）転写ユニット内に、鋳型ｓｉＲＮＡをクローニングすることで達成される。ｓｉＲＮＡを発現させるには２種類のアプローチを用いることができる。即ち、１つの態様においては、ｓｉＲＮＡ二本鎖を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を、それぞれ別個のプロモーターを有する構築物を用いて転写する（Lee, et al., Nat. Biotechnol. 20, 500-505. 2002）。別の態様においては、細胞内プロセシングの後でｓｉＲＮＡを生じるステムループタイプのヘアピンＲＮＡ構造としてｓｉＲＮＡを発現させる（Brummelkamp et al., Science 296:550-553. 2002）（その記載によって本明細書中に組み込まれているものとする）。
【０１６０】
ｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡは、生物に送達する前に、in vitro でＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングしてから投与する方法が最も一般的である。別の態様では、本発明のセンス核酸およびアンチセンス核酸を、投与前にアニーリングせず、同じ溶液中に入れて投与することでＲＮＡｉを起こすことができるが、上記２つの核酸を別々のベヒクルに入れて、ほとんど間隔を空けずに投与してもＲＮＡｉを起こすことができる。さらに、ＡＭＩＧＯの断片や変異体をコードする核酸分子、またはＡＭＩＧＯ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸も提供される。
【０１６１】
生細胞に核酸を導入する際に利用可能な方法はいろいろある。用いる方法は、核酸を in vitro の培養細胞に導入するか、ex vivo で導入するか、または目的宿主内の細胞に in vivo で導入するかによって異なる。In vitro での哺乳類細胞への核酸導入に適した方法としては、リポソームを利用する方法（Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982)、Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979)、Felgner, Sci. Am., 276(6):102-6 (1997) および Felgner, Hum. Gene Ther., 7(15):1791-3, (1996)）、エレクトロポレーション法（Tur-Kaspa, et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, (1986) および Potter, et al.,  Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, (1984)）、直接マイクロインジェクション法（Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099 (1985)）、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)）、リン酸カルシウム沈殿法（Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467 (1973)、Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, (1987) および Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695 (1990)）、細胞の超音波処理法（Fechheimer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467 (1987)）、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子ボンバードメント法（gene bombardment using high velocity microprojectiles）（Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9568-9572 (1990)）などが挙げられる。現在、in vivo 遺伝子導入法として好ましい方法としては、ウイルス（概してレトロウイルス）ベクターによるトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質−リポソームを介したトランスフェクション（Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)）などが挙げられる。状況によっては、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、あるいは標的細胞に提示された受容体に対するリガンドなどの、標的細胞をターゲティングする物質を核酸材料と共に用いることが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、ターゲティングおよび／または取り込みの促進に用いてもよく、そのようなタンパク質としては、特定の細胞種に対する屈性を示すキャプシッドタンパク質やその断片、サイクリングの際に内在化するタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化をターゲットとして細胞内半減期を延ばすタンパク質などが挙げられる。なお、受容体を介したエンドサイトーシスに関する技術については、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987) および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990)に開示されている。現在までに公知の遺伝子標識および遺伝子治療のプロトコールに関する文献としては、Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)を参照されたい。
【０１６２】
目的の外来性遺伝子を動物内に導入するときは、適切であればいかなるベクターを用いてもよい。公知文献に開示されたベクターの例としては、例えばレンチウイルスベクター（ただしこれに限定されない）などの非増殖性レトロウイルスベクター（[Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46.]、アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第5,824,544号、米国特許第5,707,618号、米国特許第5,792,453号、米国特許第5,693,509号、米国特許第5,670,488号、米国特許第5,585,362号、Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992)、Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992) およびRosenfeld et al., Cell, 68: 143-155 (1992)を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第5,888,502号、米国特許第5,830,725号、米国特許第5,770,414号、米国特許第5,686,278号、米国特許第4,861,719号を参照）、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、米国特許第5,474,935号、米国特許第5,139,941号、米国特許第5,622,856号、米国特許第5,658,776号、米国特許第5,773,289号、米国特許第5,789,390号、米国特許第5,834,441号、米国特許第5,863,541号、米国特許第5,851,521号、米国特許第5,252,479号 および Gnatenko et al., J. Investig. Med., 45: 87-98 (1997)を参照）、アデノウイルスとアデノ随伴ウイルスとのハイブリッドベクター（例えば、米国特許第5,856,152号を参照）またはワクシニアウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,879,934号、米国特許第5,849,571号、米国特許第5,830,727号、米国特許第5,661,033号 および 米国特許第5,328,688号を参照）、リポフェクチン仲介の遺伝子導入ベクター（ＢＲＬ製）、リポソームベクター（例えば、米国特許第5,631,237号 “Liposomes comprising Sendai virus proteins（センダイウイルスタンパク質を包含するリポソーム）”）、およびこれらの組み合わせである。なお上記文献の記載は全て本明細書に組み込まれているものとする。また、好ましい態様においては、非増殖性アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびレンチウイルスを用いる。
【０１６３】
ウイルスベクターを用いる態様において好ましいポリヌクレオチドは、目的の標的組織における発現を促進する適切なプロモーターとポリアデニル化配列を含んでいる。本発明の多様な用途において哺乳類細胞による発現に適したプロモーター／エンハンサーとしては、例えば、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー（Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29:2494-2502 (1991) および Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)）；ラウス肉腫ウイルスのプロモーター（Davis et al., Hum. Gene Ther., 4:151 (1993)）；シミアンウイルス４０のプロモーター、レトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ケラチン１４のプロモーターおよびα ミオシンＨ鎖プロモーターが挙げられる。
【０１６４】
本発明の具体的な態様においては、発現構築物（または上記のペプチド）は、リポソームに封入されていてもよい。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞状の構造体である。多重層リポソームは、水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。このようなリポソームは、リン脂質を過剰量の水溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造を形成する前の自己再配列を経て、脂質二重層間に水とそれに溶解している溶質を封入する（Ghosh and Bachhawat,“In Liver Diseases, Targeted Diagnosis And Therapy Using Specific Receptors And Ligands（肝臓病における、特異的な受容体とリガンドを用いる標的診断および治療法）”, Wu, G., Wu, C., ed.,ニューヨーク州：Marcel Dekker、pp. 87-104 (1991)）。陽イオンリポソームにＤＮＡを添加すると、位相変化（topological transition）が生じて、リポソームは光学的に複屈折性を示す液晶性凝縮小球となる（Radler, et al., Science, 275(5301):810-4, (1997)）。このようなＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療や遺伝子デリバリーに用いる非ウイルスベクターとなる可能性がある。
【０１６５】
また本発明は、「リポフェクション」法を含む様々な市販のアプローチにも関する。本発明のある態様においては、リポソームは赤血球凝集性のウイルス（ＨＶＪ、即ち、センダイウイルス）と複合体を形成していてもよい。これにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソームに封入されたＤＮＡが細胞へ入り込むのを促進することが報告されている（Kaneda, et al.,  Science, 243: 375-378 (1989)）。他の態様においては、リポソームは、細胞核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）との複合体として、またはＨＭＧ−１と共に使用してもよい（Kato, et al., J. Biol. Chem., 266:3361-3364 (1991)）。さらに他の態様においては、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方との複合体を形成するか、または３種を共に使用してもよい。In vitro および in vivo において核酸の導入と発現に有効に用いることができる発現構築物は、本発明に適用可能である。
【０１６６】
治療用遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するのに用いることができる他のベクター送達システムとしては、受容体仲介送達ベヒクルが挙げられる。このようなシステムは、ほぼ全ての真核細胞に見られる受容体仲介エンドサイトーシスにより巨大分子の選択的な取り込みを利用する。種々の受容体は細胞種特異的に分布するため、このようなシステムを用いた送達は高い特異性を示す（Wu and Wu (1993), supra）。
【０１６７】
本発明の他の１つの態様においては、発現構築物は、単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなるものでもよい。構築物の導入は、物理的または化学的に細胞膜を透過させる上記のいずれの方法によって行ってもよい。これは in vitro での導入に特に適するが、in vivo での使用に適用してもよい。Dubensky, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533 (1984)には、ポリオーマウイルスのＤＮＡをリン酸カルシウム沈殿物の形態で成体マウスおよび新生マウスの肝臓と脾臓に注射して、能動的なウイルス複製および急性感染に成功したことが報告されている。Benvenisty and Neshif, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555 (1986)にも、リン酸カルシウム沈殿したプラスミドの腹腔内直接投与がトランスフェクトした遺伝子の発現をもたらすことが報告されている。
【０１６８】
裸のＤＮＡ発現構造物を細胞に導入するための、本発明の他の１つの態様としては、粒子衝突法が挙げられる。この方法は、ＤＮＡで被覆したマイクロプロジェクタイルを高速に加速して細胞膜を貫通させ、細胞を殺すことなく遺伝子を導入することが可能である（Klein, et al., Nature, 327:70-73 (1987)）。小さい粒子を加速するための装置がいくつか開発されている。そのような装置の１つは、高圧放電を用いて電流を発生させ、その結果として原動力を提供する（Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572 (1990)）。使用するマイクロプロジェクタイルは、タングステンや金のビーズのような、生物学的に不活性な物質からなる。
【０１６９】
当業者は、in vivo と ex vivo の状況下で、どのように遺伝子送達を適用するかを認識している。ウイルスベクターに関しては、通常、ウイルスベクターの原液を調製する。ウイルスの種類と達成可能な力価により、１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11または１×１０12の感染粒子を患者に送達する。リポソームまたはその他の非ウイルス性の処方物（formulation）についても、相対的な取り込み効率を比較することにより、同様の数値が外挿できる。薬学的に許容される組成物となる処方物については以下に述べる。
【０１７０】
様々な細胞種に対する様々な投与方法が考えられる。実用的には、いかなる細胞、組織または器官の種類に関しても、全身送達（systemic delivery）が考えられる。他の態様においては、多様な、即ち、直接的、局所的そして部分的なアプローチを用いることができる。例えば、細胞、組織または器官に発現ベクターまたはタンパク質を直接注射することができる。
【０１７１】
また、別の態様は、ex vivo の遺伝子治療に関する。Ex vivo の態様においては、細胞を患者から取り出し、少なくともある程度の期間体外で保持する。この期間中に、取り出した細胞に治療を施し、その後、細胞を患者の体内に再導入する。
【０１７２】
本発明はまた、ＡＭＩＧＯの活性化に対する拮抗物質（例えば、ＡＭＩＧＯアンチセンス核酸、ＲＮＡｉおよび中和抗体など）を提供する。内因性のＡＭＩＧＯ活性化レベルが増加しているか、または過剰である哺乳類にＡＭＩＧＯ拮抗物質を投与することが考えられ、そのようなＡＭＩＧＯレベルの増加が病理学的な障害を引き起こす状況で投与することが好ましい。
【０１７３】
医薬用および治療用の組成物と処方物 
本発明のＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯポリペプチド、ＡＭＩＧＯ作用物質、ＡＭＩＧＯ拮抗物質および抗ＡＭＩＧＯ抗体（活性化合物）ならびにそれらの誘導体、断片、類似体および相同体は、医薬組成物に組み込むことができる。
【０１７４】
そのようなＡＭＩＧＯ組成物は、保存を目的として、望ましい純度を有するＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体を、生理的に許容される所望の担体、賦形剤または安定剤（“Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの薬理科学）”, 第１６版, Osol, A.編集, (1980)）と混合し、凍結乾燥した固体または水溶液の形態に調製する。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用する用量および濃度においてレシピエントに非毒性であり、その例としては、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよびリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースおよびデキストリンなどの単糖、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールおよびソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン（salt-forming counter-ions)；ならびにＴｗｅｅｎ、プルロニックおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１７５】
ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯ作用物質、ＡＭＩＧＯ拮抗物質またはＡＭＩＧＯ抗体は、例えば、コアセルベーション法で調製したマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース マイクロカプセル）や界面重合法により調製したマイクロカプセル（例えば、ゼラチン マイクロカプセルとポリメチルメタクリレートマイクロカプセル）、コロイダルドラッグデリバリーシステム（colloidal drug delivery systems）に用いる送達用物質（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに封入してもよい。このような手法は前出の「レミントンの薬理科学」に記載されている。
【０１７６】
ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体の投与は、公知の方法に従って行えばよく、例えば、個々の態様に関して上記した方法や静脈、腹腔内、脳内、筋内、眼内、鞘内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、動脈内または病巣内への注射や点滴などの一般的な方法、あるいは以下に述べる徐放システムなどの公知の方法で行うことができる。ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体は、点滴により継続的に投与するか、または大量瞬時投与する。一般的には、疾患が許せば、ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体を部位特異的送達用に処方して投与すべきである。投与は継続的または断続的に行うことができる。また、投与は、流量が一定のまたは流量をプログラムできる埋め込み型のポンプ、あるいは断続的な注射により行うことができる。本発明の核酸分子は、ベクターに挿入し、遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば静脈注射や局所投与により対象生物に送達することができ（Nabel and Nabel, 米国特許第5,328,470号, 1994）、定位注射（stereotactic injection）（Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 (1994)）により対象生物に送達することもできる。遺伝子治療用ベクターの医薬用製剤は、許容される希釈剤を含んでいてもよいし、または遺伝子送達ベヒクルを包埋した徐放性マトリクスを包含していてもよい。
【０１７７】
他の方法として、完全な遺伝子送達ベクターを無傷の状態で組換え細胞から製造することができる場合、例えばレトロウイルスベクターを用いる場合には、上記の医薬用製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を包含していてもよい。
【０１７８】
適当な徐放性製剤の例としては、ＡＭＩＧＯタンパク質を含有する、固体の疎水性ポリマーからなる半透性マトリクスが挙げられ、このようなマトリクスは成形品（フィルムやマイクロカプセルなど）の形態をとっている。徐放性マトリクスの具体例としては、ポリエステル、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) および Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載のあるヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号およびEP 58,481）または非分解性エチレン酢酸ビニル（Langer et al., supra）が挙げられる。
【０１７９】
徐放性ＡＭＩＧＯ組成物には、リポソームに封入されたＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯ作用物質、ＡＭＩＧＯ拮抗物質またはＡＭＩＧＯ抗体も含まれる。ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体を含有するリポソームは、それ自体公知である次の方法によって調製する：Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:40304034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、米国特許第4,485,045号および第4,544,545号；ならびにEP 102,324。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストロームの）単膜型のものであり、脂質含量はコレステロールとして約３０ｍｏｌ％を超え、その組成は、ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体を用いた治療の効果が最適となるように調整したものである。
【０１８０】
エチレン酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日に渡って分子を放出することを可能にする一方、特定のヒドロゲルはタンパク質をより短期間で放出する。封入されたタンパク質が体内に長期間残存すると、３７℃で湿気にさらされることによって変性したり凝集したりすることがあり、結果として生物活性が失われたり、免疫原性に変化が生じることがある。関連するメカニズムに基づいて、タンパク質を安定化させる合理的な方法を考案することが可能である。例えば、凝集のメカニズムがチオール−ジスルフィド相互交換（thio-disulfide interchange）による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると分かったら、タンパク質のスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用および特定のポリマーマトリクス組成物の開発により、安定化を達成することもできる。
【０１８１】
半透性の、移植可能な膜状装置は、特定の環境において薬物を送達するのに有用な手段である。例えば、可溶性ＡＭＩＧＯを分泌する細胞、ＡＭＩＧＯを細胞表面に発現する細胞、あるいはキメラまたは抗体を発現する細胞を上記の装置に封入し、患者、例えば、パーキンソン病、神経系の外傷またはグリア性瘢痕を患う患者の脳に移植することができる。米国特許第4,892,538号（Aebischer et al.）、米国特許第5,011,472号（Aebischer et al.）、米国特許第5,106,627号（Aebischer et al.）、ＰＣＴ出願 WO 91／10425、ＰＣＴ出願 WO 91／10470、Winn et al., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991)、Aebischer et al., Exper Neurology, 111:269-275 (1991)、および Tresco et al., ASAIO, 38:17-23 (1992)を参照されたい。
【０１８２】
したがって、本発明は、神経の損傷またはその他のＡＭＩＧＯ反応性細胞の損傷を予防または治療する方法であって、ＡＭＩＧＯ、あるいは特定の病態に対して必要とされるＡＭＩＧＯ作用物質またはＡＭＩＧＯ拮抗物質を分泌または細胞表面に発現する細胞の、治療を必要とする患者の体内への移植を包含する方法に関する。また、本発明は、神経の損傷または本願に記載する他の細胞の損傷を予防または治療するための、半透膜とそこに封入されたＡＭＩＧＯ（あるいは特定の病態に対して必要とされる作用物質または拮抗物質）を分泌する細胞とを包含する装置であって、該半透膜はＡＭＩＧＯ（あるいはＡＭＩＧＯ作用物質またはＡＭＩＧＯ拮抗物質）に対して透過性であるが、細胞にとって有害な患者由来の因子に対しては不透性である装置に関する。ＡＭＩＧＯを製造するようにex vivoで形質転換した患者自身の細胞は、所望により、上記のようなカプセル封入を行うことなく、患者に直接移植することができる。生細胞の膜封入の方法は当業者にはよく知られたものであり、封入細胞の調製と封入細胞の患者への移植は過剰な（under）実験を行わずとも実施可能である。
【０１８３】
したがって、本発明は、神経の損傷を予防または治療する方法であって、ＡＭＩＧＯまたはＡＭＩＧＯ抗体を産生する能力を天然に有する細胞、または生物工学的に分泌するようにした細胞を、治療を必要とする患者の体内に移植することを包含する方法を含む。患者がヒトの場合、発現または分泌されたＡＭＩＧＯまたはＡＭＩＧＯ抗体は、可溶性のヒト成熟ＡＭＩＧＯであることが好ましい。移植物は、非免疫原性であるか、免疫原性の移植細胞が免疫系により認識されるのを防ぐものであるか、またはこの両方であることが好ましい。ＣＮＳに送達するのに好ましい移植部位は、脊髄の脳脊髄液である。
【０１８４】
治療に用いるＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯ作用物質、ＡＭＩＧＯ拮抗物質またはＡＭＩＧＯ抗体の効果的な量は、例えば、治療目的、投与方法および患者の状態に依存する。したがって、治療を行う専門家は投薬を滴定し、最適な治療効果が達成されるように投与方法を調整することが必要となる。典型的には、臨床医は、所望の効果を得られる投与量に達するまでＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体を投与する。全身療法における典型的な１日の投与量は、上記の要因により異なるが、約１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ以上である。もう１つの一般的な投与法としては、ＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯタンパク質またはＡＭＩＧＯ抗体を処方し、組織中で効果的であるが過剰に毒性にならないＡＭＩＧＯレベルを達成する投与量を、標的部位または標的組織に送達する。可能であれば、連続的な点滴、徐放的な放出、局所的な投与、ＡＭＩＧＯ発現細胞の移植または経験的に定めた頻度の注射によってこの組織内濃度を維持するべきである。この治療の経過は、公知のアッセイによって簡単にモニターすることができる。
【０１８５】
当業者であれば認識することであろうが、処方する組成物は治療に効果的な量の本発明のＡＭＩＧＯタンパク質、そのペプチド断片または変異体あるいはＡＭＩＧＯレセプターの制御物質を包含する。つまり、そのような組成物は、病変した神経系組織に上記の物質を適切な濃度で提供し、該提供は、中枢神経系機能の検出可能な修復を刺激するために十分な時間、例えば完全にその修復がなされるまで継続する。当業者であれば認識することであろうが、これらの濃度は種々の要因、例えば、選択した物質の生物学的効力、その化学的性質（例えば、疎水性）、組成（例えば、１種またはそれ以上の賦形剤との混合物における組成）、投与方法および想定する治療法（例えば、有効成分を直接組織部位に投与するか、全身投与するか）などによって変動する。好ましい一回当たりの投与量も、罹患または損傷している組織の状態や、個々の哺乳類の総合的な健康状態といった変動する要因に左右されやすい。一般的に、本発明のＡＭＩＧＯタンパク質、そのペプチド断片または変異体あるいはＡＭＩＧＯ受容体の作用物質は、０．００００１〜１，０００ｍｇを単一投与か、毎日、週２回または週１回投与すれば十分であり、好ましい投与量は０．０００１〜１００ｍｇであり、さらに好ましくは０．００１〜１０ｍｇである。あるいは、体重ｋｇ当たり０．０１〜１,０００μｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを単一投与か、毎日、週２回または週１回投与する方法も有効である。本発明で用いる効果的な投与量は、所望により、または個々の状況に応じて適切に、１回または複数回（２回またはそれ以上）に分割して投与してもよい。大量瞬時投与または拡散可能な注入処方物による投与を用いることができる。繰り返してまたは頻繁に行われる点滴を容易に行いたい場合、半永久的ステントの（例えば、静脈内、腹腔内、槽内または嚢内への）移植が望ましいと考えられる。下記の実施例において、ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の脊髄内投与は、中枢神経系機能の損失または障害の、検出可能なレベルの修復に明確に寄与した。
【０１８６】
ＡＭＩＧＯ化合物の用途 
本発明は、ＡＭＩＧＯ化合物をＥＧＦＲの機能阻害に用い、最終的にはＥＧＦＲのリン酸化を制御し、ＥＧＦＲから開始するシグナル伝達カスケードを制御する。これは、ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦＲのリン酸化を制御するＡＭＩＧＯ化合物を提供することによってなされる。そのようなＡＭＩＧＯ化合物はＥＧＦＲの機能の正常な役割に干渉し、その細胞シグナル伝達を制御する。干渉されるＥＧＦＲリン酸化の機能には、リガンド−受容体相互作用、細胞膜におけるＥＧＦＲの二量体化、ＥＧＦＲのリン酸化、ＥＧＦＲが関与すると考えられるＥＧＦＲ開始シグナル伝達カスケードの制御などの重要な機能が全て含まれる。このようなＡＭＩＧＯ化合物の干渉によって生じる総合的な影響は、ＥＧＦＲのリン酸化の制御である。本発明においては、「制御」とは、ＥＧＦＲのリン酸化の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれも意味する。本発明においては、阻害はＥＧＦＲリン酸化の制御の好ましい形態である。
【０１８７】
本発明のＡＭＩＧＯ化合物のいくつかは、不適切なＥＧＦＲ活性を特徴とする細胞増殖異常の処置に用いることができる。「不適切なＥＧＦＲ」活性とは、次の（１）〜（５）のそれぞれを意味する。（１）通常はＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）を発現しない細胞によるＥＧＦＲの発現；（２）通常はＥＧＦ／ＴＧＦ−αを発現しない細胞によるＥＧＦの発現；（３）望まない細胞増殖を引き起こす、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）発現の増加；（４）望まない細胞増殖を引き起こす、ＥＧＦ／ＴＧＦ−αの発現の増加；および／または（５）ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の構成的な活性化を引き起こす変異。ＥＧＦ／ＴＧＦ−αやＥＧＦＲの存在量や活性が不適切であるか異常であることは、当業界で公知の手順により決定する。
【０１８８】
ＥＧＦ／ＴＧＦ−αの活性または発現の増加は、ＥＧＦリガンドの結合の際に生じる１種またはそれ以上の次のような活性の増加を特徴とする。（１）ＥＧＦＲの二量体化；（２）ＥＧＦＲの自己リン酸化；（３）ＥＧＦＲ基質（例えば、ＰＬＣγ）のリン酸化；（４）アダプター分子の活性化；および（５）細胞分裂の増加。これらの活性は、次に述べる手法および当業界で公知の手法を用いて測定することができる。例えば、ＥＧＦＲの自己リン酸化は抗リン酸チロシン抗体を用いて測定することができ、細胞分裂の増加は、ＤＮＡの3Ｈ−チミジンの取り込み量の測定によって確認することができる。ＥＧＦＲ活性の増加は、リン酸化したＥＧＦＲおよび／またはＤＮＡ合成量の増加を特徴とすることが好ましい。
【０１８９】
望まない細胞増殖は、癌細胞、癌細胞の周辺の細胞や内皮細胞を含む様々な種類の細胞において生じる不適切なＥＧＦＲ活性により起こり得る。不適切なＥＧＦ活性を特徴とする疾患の例としては、グリオーマ、頭部癌、頸部癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌および前立腺癌などの癌が挙げられる。
【０１９０】
ＡＭＩＧＯ化合物：「ＡＭＩＧＯ化合物」という用語は、ＡＭＩＧＯペプチド、ＡＭＩＧＯ変異体、ＡＭＩＧＯの生物学的に活性である断片、ＡＭＩＧＯ抗原性断片、抗ＡＭＩＧＯ抗体またはその結合部位を意味するか、あるいはＥＧＦＲまたは上皮成長因子受容体リガンドと結合、あるいはなんらかの方法で相互作用できる上記のペプチドをコードする核酸を意味する。本発明のＡＭＩＧＯ化合物と、対応するリガンドとの結合または相互作用は、リガンドと対応する受容体との間の相互作用の制御、好ましくは防止または阻害をもたらす。リガンド−受容体相互作用はＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の増殖に関与するため、「ＡＭＩＧＯ化合物」という用語は、上皮成長因子受容体と対応するリガンドとの間の相互作用を制御し、さらに好ましくは上皮成長因子受容体と対応するリガンドとの間の相互作用を減少させるように作用して、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害をもたらす全ての化合物を包含する。
【０１９１】
本願においては、「リン酸化を阻害する」という用語（例えば、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害／遮断に言及する際に用いる用語）は、部分的阻害と完全阻害の両方を包含する。ＥＧＦＲリン酸化の阻害は、ＥＧＦＲリガンドが阻害または遮断されることなくＥＧＦＲに結合した際に生じる細胞シグナル伝達の正常のレベルや種類を、減少あるいは変化させることが好ましい。阻害はまた、ＥＧＦＲリガンドがＡＭＩＧＯ化合物と接触していない場合との比較から明かな、ＡＭＧＩＯ化合物に接触しているＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲに対する結合親和性の、いかなる測定可能な減少も包含する。例えば、ＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲに対する結合の遮断は少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％である。
【０１９２】
本発明のＡＭＩＧＯ化合物には多数の治療用および診断用の用途がある。例えば、治療用途としては、癌または他の関連した疾病に罹患している疑いのある患者に対する癌の治療が含まれる。具体的には、本発明のＡＭＩＧＯ化合物は、ＥＧＦＲリガンドの産生および／またはＥＧＦＲタンパク質の過剰発現を行う腫瘍細胞を有する患者の治療に用いることができる。
【０１９３】
治療の１つの種類は、治療物質に結合させたＡＭＩＧＯ化合物の使用を含んでもよい。効果的な量の治療物質と結合したＡＭＩＧＯ化合物を患者に投与することにより、患者に存在する、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の成長を阻害するか、または腫瘍細胞を殺すことで、癌を治療することができる。
【０１９４】
本発明の癌の治療方法によると、このような治療物質を結合したＡＭＩＧＯ化合物は、腫瘍細胞とＥＧＦＲとの関連性に基づいて、腫瘍細胞を認識し結合することができる。これに限定されることはないが、癌細胞に対する結合機構には、ＥＧＦＲ、即ち細胞表面に存在するリガンドあるいは発現および／または分泌されたリガンドの認識が含まれる。
【０１９５】
治療物質を結合したＡＭＩＧＯ化合物がＥＧＦＲとの相互作用によって腫瘍細胞と結合または密接に会合すると、治療物質はその細胞を阻害または殺すことができる。このように、本発明の治療方法は、例えばＥＧＦＲと関連性のある癌細胞などの特定の標的に対して選択的である。
【０１９６】
正常な細胞およびＥＧＦＲと関連性のないその他の細胞（即ち、ＥＧＦＲを発現しない細胞）は、ＡＭＩＧＯ化合物による治療法によって影響を受ける恐れはほとんどないと考えられる。
【０１９７】
また、本発明のＡＭＩＧＯ化合物は、腫瘍細胞の増殖誘発の防止または阻害に用いることができる。例えば、ＥＧＦＲを有する癌細胞は、低濃度のＥＧＦＲリガンドの存在下で増殖が誘発される。ＥＧＦＲリガンドがその受容体と相互作用するのを防止することにより、癌患者を治療する方法を提供することが可能である。
【０１９８】
細胞の増殖を阻害または防止する本発明の方法によると、ＡＭＩＧＯ化合物はＥＧＦＲに結合することができる。In vivo でのＥＧＦＲとの結合により、ＥＧＦＲ−ＡＭＩＧＯ化合物複合体が形成され、立体的に（sterically）、またはその他の方法で、リガンド−受容体相互作用を防止または阻害することができる。このことから、本発明は、腫瘍細胞を有する患者に効果的な量のＡＭＩＧＯ化合物を投与することにより、患者における腫瘍細胞の増殖を防止または阻害する治療を提供する。
【０１９９】
本発明のＡＭＩＧＯ化合物の上記以外の治療用用途も多数考案可能であることを認識いただきたい。そのような治療は、本発明のＡＭＩＧＯ化合物を他の公知の治療法と組み合わせて用いることを包含していてもよい。本発明は、本願で説明した治療用処置に限定されるわけではなく、これらは単なる例示として記載したものである。
【０２００】
さらに、腫瘍細胞を阻害または殺すのに十分な本発明のＡＭＩＧＯ化合物の投与量は、悪性細胞の種類、患者の体重、用いる治療物質の種類などの多数の要因によって変化する。当業者にとっては、in vitro または in vivo において特定の悪性細胞を阻害または殺すのに必要な化合物の量は、慣行的な実験を最小限行うことにより容易に定めることができることは明かである。効果的な量のＡＭＩＧＯ化合物を腸管外、皮下、静脈内、筋内、腹腔内または経口的に投与することができる。さらに、適切な賦形剤、補助剤（auxiliaries）または医薬物質として本発明のＡＭＩＧＯ化合物の作用や安定性を促す化合物を含有する医薬製剤を調製することができる。
【０２０１】
本発明のＡＭＩＧＯ化合物の（ＥＧＦＲのリン酸化の制御に基づく）診断的用途としては、例えば、患者から得たサンプル中のＥＧＦＲの検出が挙げられる。そのようなサンプルとしては、体組織、体液（例えば、血液、尿、涙、唾液、血清および脳脊髄液）、便、細胞抽出物などが挙げられる。
【０２０２】
したがって、本発明で開示したＥＧＦＲのリン酸化反応を患者から得たサンプルから検出することは、癌の診断方法を提供する。つまり、患者から得たサンプル中のＥＧＦＲの検出は、患者にＥＧＦＲを発現する細胞が存在することを示す。さらに、ＡＭＩＧＯ化合物はＥＧＦＲに対して特異的であるため、リン酸化のアッセイは、患者の腫瘍の生物学的特徴に関する情報を提供することができる。例えば、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞を有する癌患者は、ＥＧＦＲの過剰発現を示さない癌患者よりも全体的な生存率が低いことが知られている。したがって、ＥＧＦＲのリン酸化の検出は予後検査として役立ち、臨床医が患者を治療するためのより効果的な治療法を選択することを可能にする。
【０２０３】
本発明のＡＭＩＧＯ化合物の組成物は、in vitro での治療用途または診断用途に関連する結合活性を最初に試験することができる。例えば、本発明の組成物は、下記の実施例に記載するＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによるアッセイを用いて試験することができる。さらに、少なくとも１種のエフェクターが仲介するエフェクター細胞活性、例えば、ＥＧＦＲ発現細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化、を引き起こす際のこれらの分子の活性をアッセイすることができる。
【０２０４】
本発明の組成物は、ＥＧＦＲ関連疾病の治療と診断においても有用性を有する。例えば、ＡＭＩＧＯ ＤＮＡは、in vivo または in vitro で１つ以上の次の生物学的活性の誘発に用いることができる。ＥＧＦＲ発現細胞におけるＥＧＦまたはＴＧＦ−α誘導性の自己リン酸化の阻害；オートクリンＥＧＦまたはＴＧＦ−α誘導性の、ＥＧＦＲ発現細胞の活性化の阻害；および、ＥＧＦＲを（例えば少量）発現している細胞の成長阻害。
【０２０５】
具体的な態様においては、ＡＭＩＧＯ化合物およびその誘導体／変異体は、様々なＥＧＦＲに関連する疾病の治療、予防または診断にin vivo で用いられる。ＥＧＦＲ関連疾病の例としては、種々の癌、例えばグリオーマ、グリオブラストーマ、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸部癌、結腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、扁平上皮細胞癌、肺癌（非小細胞肺癌）、食道癌、頭部癌および頸部癌が挙げられる。
【０２０６】
本発明の組成物の投与方法は当業界で公知である。使用する分子の適した投与量は対象生物の年齢と体重や用いる特定の薬物による。ＡＭＩＧＯ化合物は、Goldenberg, D. M. et al., (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360およびEP 0,365,997に記載の方法によって、131Ｉ、90Ｙ、105Ｒｈ、インジウム−１１１などの放射性核種と結合することができる。他の１つの態様においては、本発明は、放射性同位体、細胞毒性物質（例えば、カリチェアミシン（calicheamicin）やデュオカルマイシン（duocarmycin））、細胞増殖抑制性物質または化学療法薬に結合した、本発明のＡＭＩＧＯ抗体またはその結合部位、あるいはＡＭＩＧＯペプチドまたはその断片を包含する免疫複合体（immunoconjugate）に関する。本発明の組成物は抗感染物質に結合することもできる。
【０２０７】
他の１つの態様においては、ＡＭＩＧＯ化合物は、化学療法薬や免疫抑制剤などの治療物質と同時に投与してもよいし、ＡＭＩＧＯ化合物の投与を、他の公知の治療法、例えば理学療法（放射線治療、発熱療法や移植（例えば、骨髄移植など））と組み合わせてもよい。上記の治療物質には、他の薬物と共に、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドおよびヒドロキシウレアなどの、それ自身では患者に毒性または準毒性となるレベルでのみ有効な抗癌薬も含まれる。シスプラチンは１００ｍｇ／ｍ2を４週間毎に静脈内投与し、アドリアマイシンは６０〜７５ｍｇ／ｍ2を、２１日毎に静脈内投与する。
【０２０８】
本発明の医薬組成物は、次の化学療法薬からなる群より選ばれる１種以上を包含することができる：ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミドやイホスファミド）、アジリジン（例えば、チオテパ)、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン)、ニトロソウレア（例えば、カルムスチンやストレプトゾシン)、白金錯体（例えば、カルボプラチンやシスプラチン）、非古典的アルキル化剤（non-classical alkylating agents）（例えば、ダカルバジンやテモゾロマイド）、葉酸誘導体（analogs）（例えば、メトトレキサート）、プリン誘導体（例えば、フルダラビンやメルカプトプリン、アデノシン誘導体（例えば、クラドリビンやペントスタチン）、ピリミジン誘導体（例えば、フルオロウラシル（単独でまたはロイコボリンと組み合わせて用いるもの）やゲムシタビン）、尿素置換体（例えば、ヒドロキシ尿素）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドやテニポシド）、微小管作用物質（microtubule agents）（例えば、ドセタキセルやパクリタキセル）、カンプトテシン誘導体（camptothecin analogs）（例えば、イリノテカンやトポテカン）、酵素（例えば、アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２やインターフェロン−α）、モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブやベバシツマブ）、組換え毒素や免疫毒素（例えば、組換えコレラ毒素−ＢやＴＰ−３８）、癌遺伝子療法薬、理学療法薬（例えば、発熱療法、放射線療法や外科治療に用いる薬剤）ならびに癌ワクチン（例えば、テロメラーゼに対するワクチン）。
【０２０９】
本発明のＡＭＩＧＯ化合物と化学療法薬とを同時に投与することにより、異なるメカニズムを通じて作用する２種の抗癌物質が提供され、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果がもたらされる。このような同時投与は、薬物への耐性の発現や、抗体に対して不活性となる腫瘍細胞の抗原性の変化によって生じる問題を解決することができる。
【０２１０】
他の１つの態様においては、対象生物は、リンフォカイン製剤でさらに処置することができる。リンフォカイン製剤を用いることにより、ＥＧＦＲを高度には発現しない癌細胞にＥＧＦＲの高度発現を誘導することができる。リンフォカイン製剤は、腫瘍細胞のＥＧＦＲのより相同的な発現を引き起こすことができ、それはより効果的な治療につながる。投与に適したリンフォカイン製剤としては、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子およびそれらを組合せたものが挙げられる。このようなリンフォカイン製剤は、静脈内投与することができる。リンフォカインの適した投与量は１０，０００〜１，０００，０００単位／患者である。
【０２１１】
１つの態様においては、本発明は、サンプルにおけるＥＧＦＲリン酸化反応の存在を検出するか、またはＥＧＦＲリン酸化反応を定量する方法を提供し、該方法は、ＡＭＩＧＯ化合物とＥＧＦＲとの間で複合体を形成することができる条件下で、サンプルと対照サンプルをそれぞれＥＧＦＲに特異的に結合するＡＭＩＧＯ化合物に接触させる工程を包含する。そして、複合体の形成、即ち、リン酸化の制御、好ましくはリン酸化の阻害を検出するが、サンプルと対照サンプルとの間のＥＧＦＲリン酸化反応の差は、サンプル中のＥＧＦＲの存在を示す。
【０２１２】
スクリーニング 
本発明はまた、ＡＭＩＧＯの発現または活性を制御する物質にも関する。そのような物質は、例えば、低分子であってもよい。このような低分子物質の例としては、ペプチド、ペプチド模倣物（例えばペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約１０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物）、分子量が約５，０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機または無機化合物、分子量が約１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機または無機化合物および分子量が約５００ｇ／ｍｏｌ未満の有機または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステルおよび薬学的に許容される他の形態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。低分子物質の適切な投与量は、通常の技量を有する医師、獣医師、研究者の考えのおよぶ範囲の多数の要因に依存すると理解されている。低分子物質の投与量は、例えば、処置する対象生物またはサンプルの特性、大きさおよび状態によって変わり、さらに、該当する場合は、このような化合物の投与経路によっても変わり、本発明の核酸またはポリペプチドに対する、従事者が望む低分子物質の効果によっても変わる。典型的な投与量としては、対象生物またはサンプルの１ｋｇ当たりミリグラム量またはマイクログラム量（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）の低分子物質を使用する。さらに、低分子物質の適切な投与量は、低分子物質の制御する発現または活性に対する効能にも依存すると理解されている。そのような適切な投与量は、本願明細書に記載するアッセイを用いて求めることができる。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現や活性を制御するために１つ以上の低分子物質を動物（例えば、ヒト）に投与する場合、医師、獣医師または研究者は、例えば、初めは比較的低投与量で処方し、その後適当な反応が得られるまで投与量を増加させてもよい。さらに、特定の対象動物のための特定の投与レベルは、例えば、使用する特定化合物の活性、対象動物の年齢、体重、健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、他の薬物との組み合わせならびに制御する発現または活性の程度、などの種々の要因に依存すると理解されている。
【０２１３】
本発明の方法には、ホモフィリックまたはヘテロフィリックなＡＭＩＧＯ相互作用を制御する物質をスクリーニングするための方法、およびこれらの相互作用を制御する方法が含まれる。ＡＭＩＧＯの活性化は、細胞間相互作用、細胞の遊走、神経突起の成長および束形成などの広い範囲の細胞機能を制御することが分かっている。ＡＭＩＧＯポリペプチドは、ＥＧＦＲポリペプチドの機能の特異的な制御物質として開示される。したがって、本発明は標的となる細胞機能を制御する方法であって、ＡＭＩＧＯ：ＡＭＩＧＯ相互作用またはＡＭＩＧＯ：ＡＭＩＧＯリガンド相互作用に対する制御物質と細胞を接触させることによって、ＡＭＩＧＯの活性化を制御する工程を包含する方法を提供する。本発明はまた、標的となる細胞機能を制御する方法であって、ＡＭＩＧＯ：ＥＧＦＲ相互作用を制御する物質と細胞を接触させることによって、ＥＧＦＲの活性化を制御する工程を包含する方法を提供する。
【０２１４】
別の態様においては、本発明は、ＡＭＩＧＯ：ＡＭＩＧＯ相互作用、ＡＭＩＧＯ：ＥＧＦＲ相互作用またはＡＭＩＧＯ：ＡＭＩＧＯリガンド相互作用を制御する物質をスクリーニングするための方法を提供する。これらの方法は、一般に、ＡＭＩＧＯ発現細胞と、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドポリペプチドと候補物質との混合物を形成し、そして候補物質が細胞のＡＭＩＧＯ発現量に与える効果を求める。この方法は、先導化合物を得るための、自動化した、費用効果の高い、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適応可能である。同定した試薬は、動物およびヒトの治験に用いるといった医薬産業における用途を見出している。例えば、試薬は誘導化し、そして in vitro および in vivo でのアッセイで再スクリーニングし、医薬開発のために活性の最適化と毒性の最小化を行うことができる。具体的には、神経系細胞に基づく神経系伸長アッセイ、束形成および凝集アッセイについて後述の実施例において詳しく説明する。
【０２１５】
本発明はさらに、制御物質の同定方法（本願明細書では「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供し、制御物質は、ＡＭＩＧＯタンパク質に結合するか、（例えばＡＭＩＧＯの発現や活性を）刺激または阻害する効果を有するか、または（例えばＡＭＩＧＯ基質の発現や活性を）刺激または阻害する効果を有する物質の候補あるいはテスト用の化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、低分子の薬物または他の薬物）である。この方法によって同定された化合物は、治療プロトコールでＡＭＩＧＯの活性を制御したり、ＡＭＩＧＯの生物学的機能を明らかにしたり、正常なＡＭＩＧＯ相互作用を妨害する化合物を同定するために用いることができる。この態様において好ましいＡＭＩＧＯは、本発明のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３である。
【０２１６】
１つの態様において、本発明は、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯポリペプチドまたはその生物学的に活性な部位に対する基質の候補物質またはテスト用化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の態様においては、本発明は、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯポリペプチドまたはその生物学的に活性な部位に結合するかまたはその活性を制御する候補物質またはテスト用化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０２１７】
本発明のテスト化合物は、当業界で公知のコンビナトリアル ライブラリー法における多数のアプローチのいずれを用いることによっても得られる。コンビナトリアル ライブラリー法の例としては、生物学的ライブラリー法（biological libraries）、ペプトイドライブラリー法［ペプチドの機能性を有するが新規な非ペプチド主鎖を有する分子であり、酵素分解に耐性であるが、生物活性を保持する分子のライブラリー］（例えば、Zuckermann, R. N. et al., J. Med. Chem. 1994, 37: 2678-85を参照）、立体構造によって特定可能な、並行合成した固相または溶液相ライブラリーを用いる方法（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、“１ビーズ−１化合物”（one-bead one-compound）ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィーによる選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリー法とペプトイドライブラリー法はペプチドライブラリーにのみ適応可能なアプローチであるが、他の４つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子からなる化合物ライブラリーに適用可能なアプローチである（Lam, K. S., (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０２１８】
１つの態様においては、アッセイは、ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位を発現する細胞をテスト化合物と接触させ、テスト化合物がＡＭＩＧＯ活性を制御する能力を測定する細胞ベースのアッセイである。テスト化合物がＡＭＩＧＯ活性を制御する能力は、例えば、細胞の結合や付着、細胞成長、神経突起の伸長、束形成および細胞の化学走化性をモニターすることによって測定できる。細胞は、例えば、哺乳類由来の細胞、例えば神経細胞でもよい。好ましい態様においては、ＡＭＩＧＯは神経系細胞で発現したものであり、ＡＭＩＧＯ活性を制御するテスト化合物の能力は神経突起の伸長をモニターするか、または軸索の束形成をモニターすることによって行われる。別の好ましい態様においては、ＡＭＩＧＯとＥＧＦＲが、例えば神経系または非神経系由来の腫瘍細胞によって同時に発現されており、ＥＧＦＲリン酸化反応の量をモニターする。
【０２１９】
ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な断片が、ＡＭＩＧＯ標的分子（例えば、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドを含有する分子）に結合するか、または相互作用する能力の測定は、直接結合を測定するための上記の方法のうちの１つによって行うことができる。好ましい態様においては、ＡＭＩＧＯタンパク質がＡＭＩＧＯ標的分子に結合するか、または相互作用する能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって行うことができる。例えば、標的分子の活性は、標的分子による細胞内第二メッセンジャー（即ち、細胞内カルシウムやＩＰ３）の誘導の検出、適当な基質に対する標的分子の触媒活性／酵素活性の検出、（検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼ、をコードする核酸に発現可能な状態に結合した標的応答性制御エレメントを含有する）レポーター遺伝子の誘導の検出、または標的分子が制御する細胞応答（即ち、細胞の結合、付着、成長または遊走）を検出することによって測定する。
【０２２０】
さらに別の態様においては、本発明のアッセイは細胞を用いないアッセイであって、該アッセイでは、ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位をテスト化合物と接触させ、テスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位に結合する能力を測定する。本発明のアッセイで用いるＡＭＩＧＯタンパク質の生物学的に活性な部位の好ましい例としては、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドタンパク質との相互作用に関与する断片が挙げられる。これらの断片はＡＭＩＧＯタンパク質またはＥＧＦＲタンパク質の細胞外領域を含有することが好ましい。
【０２２１】
細胞を用いない本発明のアッセイは、単離ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位が可溶性の形態および／または膜に結合した形態のいずれにも適応可能である。膜に結合した形態のＡＭＩＧＯタンパク質を用いる、細胞を用いないアッセイの場合には、単離ＡＭＩＧＯタンパク質の膜結合形態が溶液中において維持されるような可溶化剤を用いることが望ましい。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデシル、ポリ（エチレングリコールエーテル）n（Isotridecypoly(ethylene glycol ether)n）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-1-propane sulfonate、ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-2-hydroxy-1-propane sulfonate、ＣＨＡＰＳＯ）およびＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが挙げられる。
【０２２２】
ＡＭＩＧＯタンパク質に結合する化合物を同定するために用いるアッセイの原理には、ＡＭＩＧＯタンパク質とテスト化合物とを、これら２つの成分が相互作用し結合する条件下で結合に十分な時間反応させて反応混合物を調製し、その結果として反応混合物から除去および／または検出され得る複合体を形成することが含まれる。このアッセイは多様な方法で行うことができる。例えば、このようなアッセイを行うための一つの方法としては、ＡＭＩＧＯタンパク質またはテスト化合物を固相上に固定し、固相上に固定したＡＭＩＧＯタンパク質／テスト化合物複合体を反応の終了時に検出する方法が挙げられる。このような方法の一つの態様としては、ＡＭＩＧＯタンパク質を固体表面に固定し、（固定されていない）テスト化合物を、本願明細書に記載した、当業者にはよく知られている検出可能な標識で直接的に、または間接的に標識することができる。
【０２２３】
本発明の上記のアッセイ方法の多数の態様においては、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドのいずれかを固定化することによって、複合体を形成していない一方または両方のタンパク質からのタンパク質複合体の分離を容易にすると共に、アッセイの自動化に適応させることが望ましい。テスト化合物のＡＭＩＧＯタンパク質への結合や、候補化合物の存在下および不在下におけるＡＭＩＧＯタンパク質とＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドとの相互作用は、このような反応物質を入れるのに適当ないかなる容器を用いても行うことができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心管が挙げられる。１つの態様においては、一方または両方のタンパク質をマトリクスに結合させるドメインを加えた融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＡＭＩＧＯ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemical製）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着させることができる。次いでこれらのビーズまたはプレートをテスト化合物と接触させるか、またはテスト化合物と吸着されていないＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドタンパク質のいずれかと接触させ、得られた混合物を複合体が形成される条件下（例えば、塩濃度およびｐＨが生理的に適合した条件下）でインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄してマトリクスに結合していない成分を除去するが、ビーズを用いた場合にはマトリクスを固定しておく。複合体の存在量は、例えば上述のようにして直接的または間接的に測定する。また、複合体はマトリクスから分離できるので、ＡＭＩＧＯの結合または活性のレベルは標準的方法を用いて測定する。
【０２２４】
アッセイを行うために、固定化されていない成分を、固定された成分を含有するコーティングを施した表面に添加する。反応が完全に終了した後、形成されたいかなる複合体も固体表面に固定化されたままであるような条件下で、未反応成分を（例えば洗浄によって）除去する。固体表面に固定された複合体の検出は、多くの方法によって行うことができる。固定化前に成分が予め標識されている場合には、固体表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。固定化前に成分が予め標識されていない場合には、固体表面に固定された複合体を検出するために間接的な標識、例えば、固定化した成分に特異的な標識抗体を用いることができる（その後、この抗体は、例えば標識抗Ｉｇ抗体によって、直接的または間接的に標識することができる）。
【０２２５】
１つの態様では、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドとは反応するがＡＭＩＧＯタンパク質のＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドへの結合に干渉しない抗体を用いてアッセイを行う。そのような抗体をプレートのウェルに誘導化し、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドを抗体との結合によってウェルに捕える。このような複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体を検出するための上記の方法以外に、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドと反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、および、ＡＭＩＧＯタンパク質、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドに関連した酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２２６】
また、別の態様において、このアッセイは液相において行うことができる。そのようなアッセイにおいては、反応生成物は、未反応成分から、多くの標準的方法のいずれを用いることによっても分離される。標準的方法の例としては、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈降法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。分画遠心法においては、一連の遠心工程を通して分子の複合体を、複合化していない分子から分離するが、この分離は、サイズおよび密度の違いに基づく複合体の沈降平衡の差によるものである（例えば、Rivas, G., および Minton, A. P., Trends Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7を参照）。標準的なクロマトグラフィーもまた、複合化していない分子から複合化した分子を分離するために用いることができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは分子をそのサイズに基づいて分離するが、カラムに充填した適当なゲル濾過樹脂を利用することによって、例えば、相対的に大きな複合体を相対的に小さな複合化していない成分から分離することができる。同様に、複合化していない分子とは比較的異なる複合体の電荷特性を、例えばイオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、残存する個々の反応物質から複合体を分画分離するために利用することができる。このような樹脂とクロマトグラフィーを用いた手法は、当業者にはよく知られている（例えば、Heegaard, N. H., J Mol Recognit 1998 Winter; 11(1-6):141-8 および Hage, D. S., Tweed, S. A., J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525を参照）。ゲル電気泳動もまた、複合化分子を未結合分子種から分離するために用いることができる（例えば、Ausubel, F. et al. 編“Current Protocols in Molecular Biology （分子生物学最新プロトコール）”1999, J. Wiley: ニューヨーク州を参照）。この技術においては、タンパク質または核酸の複合体を、例えばサイズまたは電荷に基づいて分離する。電気泳動を行っている間も結合相互作用を維持するためには、還元剤の不在下で非変性ゲルを用いることが典型的には好ましいが、特定の相互作用物質に適する条件は当業者によく知られている。免疫沈降は、溶液からタンパク質−タンパク質複合体を単離するために用いられるもう１つの一般的な技術である（例えば、Ausubel, F. et al.編“Current Protocols in Molecular Biology （分子生物学最新プロトコール）”1999, J. Wiley: ニューヨーク州を参照）。この技術においては、遠心分離によって容易に回収することができるポリマービーズに、結合分子の１つに特異的な抗体を結合し、この抗体に結合するすべてのタンパク質を溶液中から沈殿させる。結合したタンパク質は、（複合体のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害しない、特定のタンパク質分解反応または周知の技術により）ビーズから外し、第２の免疫沈降工程を実施する。このときには別の相互作用タンパク質に特異的な抗体を利用する。この方法では、複合体のみがビーズに付着したまま残るはずである。捕捉した複合体は、ゲル電気泳動を用いて視覚化することができる。（これらの手法のどれを用いても同定され得る）分子複合体の存在は、特異的な結合が生じたこと、および導入した化合物が標的タンパク質に特異的に結合することを示す。さらに、蛍光エネルギー転移もまた、ここに述べるように、複合体を溶液から、さらに���製せずに結合を検出するのに便利に用いることができる。
【０２２７】
好ましい態様においてアッセイは、ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位を、ＡＭＩＧＯと結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成し、形成したアッセイ混合物をテスト化合物と接触させ、そしてテスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質と相互作用する能力を測定することを包含する。テスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質と相互作用する能力の測定は、公知の化合物に比べて、テスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位に優先的に結合する能力を測定することによって行う。さらに好ましい態様においては、ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位をＡＭＩＧＯタンパク質と接触させ、テスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質と相互作用する能力を既知のＡＭＩＧＯ：ＡＭＩＧＯ相互作用と比較する。さらに好ましい態様においては、ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位をＥＧＦＲタンパク質と接触させ、テスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質と相互作用する能力を既知のＡＭＩＧＯ：ＥＧＦＲ相互作用と比較する。
【０２２８】
さらに別の態様において細胞を用いないアッセイは、ＡＭＩＧＯタンパク質またはその生物学的に活性な部位をＡＭＩＧＯタンパク質と結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、形成したアッセイ混合物をテスト化合物と接触させ、そしてテスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質と相互作用する能力を測定することを包含する。テスト化合物がＡＭＩＧＯタンパク質と相互作用する能力の測定は、ＡＭＩＧＯタンパク質がＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドに優先的に結合するか、または活性を制御する能力を測定することによって行う。
【０２２９】
本発明のＡＭＩＧＯタンパク質は、in vivoで、１つまたはそれより多くの細胞内または細胞外高分子（例えばタンパク質）と相互作用することができる。この点について説明する際には、そのような細胞内および細胞外高分子をここでは「結合パートナー」と称する。このような相互作用を妨害する化合物はＡＭＩＧＯの活性を制御するのに有用である。このような化合物の例としては、抗体、ペプチドおよび低分子が挙げられるが、これらの分子に限定されない。この態様に用いる好ましいタンパク質は、本発明で同定したＡＭＩＧＯタンパク質である。In vivoにおける相互作用を妨害する物質の探索という目的のために、別の態様においては、本発明は、テスト化合物がＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドの下流に位置するエフェクターの活性を制御することで、ＡＭＩＧＯタンパク質の活性を制御する能力を測定するための方法を提供する。例えば、既に述べたように、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドに対するエフェクター分子の活性を測定したり、ＡＭＩＧＯ、ＥＧＦＲまたはＡＭＩＧＯリガンドに対するエフェクター分子の結合を測定したりすることができる。
【０２３０】
ＡＭＩＧＯとその細胞内または細胞外の少なくとも１つの結合パートナーとの相互作用に干渉する化合物を同定するために用いるアッセイシステムの基本原理には、ＡＭＩＧＯと結合パートナーが相互作用して結合し、そして複合体を形成するような条件下で十分な時間反応させて、ＡＭＩＧＯとその結合パートナーを含む反応混合物を得ることが含まれている。物質の阻害活性を試験するために、上記反応混合物を、テスト化合物の存在下および不在下で調製する。テスト化合物は初めから反応混合物に含まれていてもよいし、ＡＭＩＧＯおよびその細胞内または細胞外の結合パートナーの添加に続いて添加してもよい。対照の反応混合物は、テスト化合物の添加なしに、またはプラシーボを添加してインキュベートする。その後、ＡＭＩＧＯとその細胞内または細胞外の結合パートナーとの複合体の形成を検出する。複合体の形成がテスト化合物を含む反応混合物には見られないが、対照の反応混合物で見られるということは、テスト化合物がＡＭＩＧＯとそれと相互作用する結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。なお、テスト化合物とＡＭＩＧＯとを含む反応混合物における複合体の形成は、テスト化合物と変異ＡＭＩＧＯとを含む反応混合物における複合体の形成とも比較することができる。この比較は、変異ＡＭＩＧＯの相互作用を妨害するが、正常なＡＭＩＧＯの相互作用は妨害しない化合物の同定が望ましい場合には重要となり得る。
【０２３１】
ＡＭＩＧＯと結合パートナーとの相互作用に干渉する化合物のためのアッセイは、異質性のまたは同質性の形態で行うことができる。異質性のアッセイにおいては、ＡＭＩＧＯまたは結合パートナーのいずれかを固相に固定し、固相に固定された複合体を反応終了時に検出する。同質性のアッセイにおいては、反応全体を液相で行う。どちらのアプローチにおいても、試験する化合物に関する異なる情報を得るために、反応物質を添加する順序を替えることができる。例えば、ＡＭＩＧＯと結合パートナーとの相互作用に（例えば、競合によって）干渉するテスト化合物は、テスト物質の存在下で反応を行うことによって同定することができる、即ち、ＡＭＩＧＯおよび相互作用する細胞内または細胞外の結合パートナーの添加の前または同時に、テスト物質を反応混合物に添加することによって、テスト化合物を同定することができる。また、すでに形成されている複合体を壊すテスト化合物（例えば、複合体の成分の１つを置換するほど高い結合定数を有する化合物）を、複合体の形成後に反応混合物に添加することによって、テスト化合物を試験することができる。以下、このような各種形態について簡単に説明する。
【０２３２】
異質性のアッセイシステムにおいては、ＡＭＩＧＯまたは相互作用する細胞内結合パートナーか細胞外結合パートナーを固体表面に固定し、固定しない分子種を直接的または間接的に標識する。実際には、マイクロタイタープレートを用いるのが簡便である。固定する分子種は、非共有結合または共有結合により固定化することができる。非共有結合は、単に、固体表面にＡＭＩＧＯまたは結合パートナーの溶液を塗布して乾燥させることによって達成することができる。また、ある分子種を固体表面に固定するために、固定する分子種に特異的な抗体を固定化することもできる。このような表面は、予め調製し保存しておくことができる。
【０２３３】
アッセイを行うために、固定化した分子種に対する結合パートナーを、テスト化合物を含有するコーティングまたは含有しないコーティングを施した固体表面に曝す。反応が完全に終了した後、未反応成分を（例えば洗浄によって）除去するが、形成されたいかなる複合体も固体表面に固定化されたまま残る。固体表面に固定された複合体の検出は、多くの方法で行うことができる。固定化しなかった分子種が予め標識されている場合には、固体表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。固定化しなかった分子種が予め標識されていない場合には、表面に固定された複合体を検出するために間接的な標識、例えば、初めに固定化しなかった分子種に特異的な標識抗体を用いることができる（その後、この抗体は、例えば、標識抗Ｉｇ抗体によって、直接的または間接的に標識することができる）。反応成分を添加する順序により、複合体形成を阻害するか、または形成された複合体を壊すテスト化合物を検出することができる。
【０２３４】
また、反応を液相においてテスト化合物の存在下または不在下で行い、得られた反応生成物を未反応成分から分離し、そして複合体を検出することができる。検出には、例えば、溶液中で形成されたいかなる複合体も固定するための、結合成分の１つに特異的な固定化抗体や、固定化複合体を検出するための他の結合パートナーに特異的な標識抗体を用いることができる。また、反応物質を液相に添加する順序により、複合体を阻害するか、または形成された複合体を壊すテスト化合物を同定することができる。
【０２３５】
本発明の別の態様においては、同質性のアッセイを用いることができる。このアプローチにおいては、ＡＭＩＧＯとそれと相互作用する細胞内または細胞外の結合パートナー産物との複合体を予め形成しておく。この複合体を調製する際には、ＡＭＩＧＯまたは結合パートナーのいずれか一方を標識するが、標識の発生するシグナルが複合体の形成によって消失するようにする（例えば、このアプローチを免疫アッセイに用いる米国特許第4,109,496号を参照）。予め形成しておいた複合体の分子種の１つと競合して該分子種を置換するテスト物質の添加は、バックグラウンド値を超えるシグナルの発生をもたらす。このようにして、ＡＭＩＧＯと細胞内または細胞外の結合パートナーとの相互作用を壊すテスト物質を同定することができる。
【０２３６】
テスト化合物がＡＭＩＧＯの発現を制御する能力を検出するためのアッセイ 
別の態様においては、ＡＭＩＧＯ発現の制御物質は、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現を定量するという方法によって同定する。候補化合物の存在下におけるＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現レベルを、候補化合物の不在下におけるＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現レベルと比較する。その後、この比較に基づいて、候補化合物をＡＭＩＧＯ発現の制御物質として同定することができる。例えば、ＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現が、候補化合物の不在下よりも候補化合物の存在下の方が高い（即ち、統計学的に有意に高い）場合は、候補化合物はＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現の促進物質と同定する。一方、ＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現が、候補化合物の不在下よりも候補化合物の存在下の方が低い（即ち、統計学的に有意に低い）場合は、候補化合物はＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現の阻害物質と同定する。細胞におけるＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質の発現レベルは、ＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯタンパク質を検出するために、本願明細書に記載した方法によって定量することができる。
【０２３７】
アッセイの組み合わせ 
別の態様においては、本発明は、本願明細書に記載した２つ以上のアッセイの組み合わせに関する。例えば、制御物質は細胞を用いたアッセイまたは細胞を用いないアッセイで同定することができ、制御物質がＡＭＩＧＯタンパク質の活性を制御する能力は、in vivoで、例えば、ＣＮＳ疾患、あるいは細胞形質転換および／または神経系再生の動物モデルなどの動物で確認することができる。
【０２３８】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規な物質にも関する。したがって、本願で説明するように同定した物質を適切な動物モデルに用いることは本発明の範囲内である。例えば、本願で説明するように同定した物質（ＡＭＩＧＯ制御物質、アンチセンスＡＭＩＧＯ核酸分子、ＡＭＩＧＯ特異的抗体やＡＭＩＧＯに対する結合パートナーなど）を動物モデルに用い、このような物質による治療の効果、毒性または副作用を決定することができる。また、本願明細書で説明するように同定した物質を動物モデルに用い、このような物質の作用メカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規な物質を用いた、本願明細書に記載の治療剤にも関する。
【０２３９】
アッセイの形態の選択は、主として、アッセイを行う感受性／耐性のタンパク質の性質および種類に基づく。当業者は、本発明で用いるタンパク質活性アッセイを本発明において同定する遺伝子に容易に適合させることができる。
【０２４０】
診断 
本発明はまた、生物学的試料中のＡＭＩＧＯまたはその対立遺伝子変異体を検出するために用いる診断用のまたは予後予測用のキットに関する。このキットは、上述したＡＭＩＧＯ依存性の病態を診断するための手段、あるいはＡＭＩＧＯの変異または機能不全が影響する病態に関する個体の疾病素質を評価するための手段を提供する。このキットは、生物学的試料中のＡＭＩＧＯポリペプチドまたはＡＭＩＧＯ核酸（例えばＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡ）を検出することができる標識化合物を含んでいてもよい。このキットはまた、ＡＭＩＧＯ遺伝子またはその対立遺伝子変異体の少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プライマーまたはプローブを含んでいてもよい。このキットは適当な容器に入れることができ、該キットを用いるための説明書を含むことが好ましい。
【０２４１】
ＡＭＩＧＯ結合分子の精製 
本発明のさらに別の態様においては、ＡＭＩＧＯやＡＭＩＧＯ類似体は、ＡＭＩＧＯに結合する分子（受容体）の親和性精製に用いることができる。ＡＭＩＧＯは、精製のための好ましいリガンドである。簡単に言えば、この技術は、（ａ）ＡＭＩＧＯに対する精製すべき受容体が支持体に固定化したＡＭＩＧＯ上に選択的に吸着される条件下で、該受容体の原料を固定化したＡＭＩＧＯに接触させ、（ｂ）固定化したＡＭＩＧＯとその支持体を、吸着されていない物質を取り除くために洗浄し、そして（ｃ）固定化したＡＭＩＧＯに吸着している受容体分子を溶離緩衝液で溶離して、ＡＭＩＧＯに結合するリガンドを得ることを包含する。親和性精製の特に好ましい態様においては、ＡＭＩＧＯは不活性で多孔性のマトリクスまたは樹脂（例えば、臭化シアンと反応させたアガロース）に共有結合している。ここで、特に好ましいのは、プロテインＡカラムに固定化したＡＭＩＧＯイムノアドヘシンである。次に、ＡＭＩＧＯ受容体を含む溶液を、クロマトグラフィー材料に流す。ＡＭＩＧＯ受容体はカラムに吸着し、溶離条件（例えば、ｐＨまたはイオン強度）を変えることによってＡＭＩＧＯ受容体を溶離させる。
【０２４２】
ＡＭＩＧＯに結合する分子を同定するための好ましい手法は、固相（例えば、アッセイプレートのウェル）に結合するキメラＡＭＩＧＯ（例えば、エピトープタグを付したＡＭＩＧＯまたはＡＭＩＧＯイムノアドヘシン）を用いる。所望により標識した（例えば、放射線標識した）候補分子の固定化したＡＭＩＧＯへの結合を測定することができる。
【０２４３】
トランスジェニック動物の作製 
ＡＭＩＧＯをコードする核酸、好ましくはヒト以外の種（例えばマウスやラット）のＡＭＩＧＯタンパク質をコードする核酸は、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物の作製に用いることができ、作製した動物は、治療に有用な試薬の開発やスクリーニングに役立てることができる。トランスジェニック動物（マウスなど）とは、トランスジーンを含有する細胞を有する動物であり、そのトランスジーンは、出生前段階、例えば胚の段階で該動物またはその祖先に導入されたものである。トランスジーンは、トランスジェニック動物の発生の出発点となる細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。１つの態様においては、確立された技術を用いてＡＭＩＧＯをコードするヒトおよび／またはマウスのｃＤＮＡ、あるいはその適当な配列を、ＡＭＩＧＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに用い、得られたゲノム配列を、ＡＭＩＧＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物の作製に用いることができる。トランスジェニック動物、特にマウスなどのトランスジェニック動物の作製法は当業界ではすでに一般的なものとなっており、例えば米国特許第4,736,866号および米国特許第4,870,009号に開示されている。典型的には、組織特異的エンハンサーを用いたＡＭＩＧＯトランスジーンの導入のために特定の細胞を標的とすることにより、所望の治療結果が得られることがある。胚発生期に動物の生殖細胞系に導入した、ＡＭＩＧＯをコードするトランスジーンの複製物を含むトランスジェニック動物は、ＡＭＩＧＯをコードするＤＮＡの発現増加効果を調べるのに用いることができる。このような動物は、例えばＡＭＩＧＯが関与する疾患からの保護を与えると考えられる試薬のための実験動物として使うことができる。本発明のこのような態様に基づいて、上記試薬で動物を処置すると、トランスジーンを有する未処置の動物と比較してＡＭＩＧＯ関連疾患の発病率が低下するため、その疾患の治療に有効となる介入である可能性が示される。
【０２４４】
トランスジーンが５’側にイントロンを含有し、かつそのイントロンが天然のイントロンであった場合、トランスジーンがより効率的に発現されることが現在よく知られている（Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988) および Yokode et al., Science 250:1273-1275 (1990)）。
【０２４５】
生まれてきたトランスジェニックな動物（transgenic offspring）は、マイクロインジェクトしたトランスジーンの動物ゲノムへの組み込みを立証することで同定できるが、トランスジーンの組み込みは、テール部の短い部分からＤＮＡを調製し、トランスジーンの存在をサザンブロット法（即ち、「テールブロット（Tail Blots）法」）で分析することが好ましい。プローブとして好ましいのは、マウスゲノムには存在せず、トランスジーン特有の配列として存在するトランスジーン融合構築物（transgene fusion construct）の断片である。また、トランスジーン内のコドンの天然配列を、同じペプチドをコードする異なる配列で置換することにより、ＤＮＡおよびＲＮＡの解析の際に同定可能な特有の領域が得られる。この方法で同定されたトランスジェニック「ファウンダー」マウスを正常なマウスと交配してヘテロ個体を得、得られたヘテロ個体を戻し交配することでトランスジェニックマウスの系統を創生する。そして、系統が確立されホモ個体が現れるまで、各世代のマウスのテールブロットを行う。産生に成功したファウンダーマウスおよびその系統は、系統間でマウスゲノムに挿入されたトランスジーンの位置やコピー数が異なるため、トランスジーンの発現レベルには幅広い多様性が見られる。確立された各系統から選択した動物を生後２ヶ月の時点で殺し、トランスジーンの発現を、肝臓、筋肉、脂肪、腎臓、脳、肺、心臓、脾臓、生殖腺、副腎および腸由来のＲＮＡのノーザンブロット法により分析する。
【０２４６】
ノックアウト動物の作製 
また、ヒト以外の動物種由来ＡＭＩＧＯ相同体を、ＡＭＩＧＯ「ノックアウト」動物（即ち、内因性ＡＭＩＧＯ遺伝子と、動物の胚細胞に導入した改変ゲノムＡＭＩＧＯ ＤＮＡとの相同組換えの結果として、ＡＭＩＧＯをコードする遺伝子が欠陥を有するかまたは改変されている動物）の作製に用いることもできる。例えば、マウスのＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡを用い、確立された手法でゲノムＡＭＩＧＯ ＤＮＡをクローニングすることが可能である。つまり、ゲノムＡＭＩＧＯ ＤＮＡを欠損させたり、他の遺伝子（例えば組込みをモニターしたりするのに使うことのできる選択的マーカーをコードする遺伝子）などで置換することが可能である。典型的には、ベクターには数キロベースの非改変隣接ＤＮＡ配列が（５’末端と３’末端の両方に）含まれている（相同組換えベクターに関する記載については、Thomas and Capecchi, Cell 51:503 (1987)等を参照のこと）。ベクターを胚性幹細胞系に（エレクトロポレーション法などで）導入し、導入したＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えした細胞を選択する（例えば、Li et al., Cell 69:915 (1992)を参照）。続いて、選択した細胞を（マウスなどの）動物の胚盤胞に注入し、凝集キメラ（aggregation chimera）を形成する（Bradley, “Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach（奇形癌と胚性幹細胞：実践的アプローチ）”, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152等を参照）。その後、適切な偽妊娠した代理母動物にキメラ胚を移植し、「ノックアウト」動物が生まれるようにキメラ胚を出産日まで育てる。性細胞に相同組換えＤＮＡを有する、子供の「ノックアウト」動物は標準的な手法で同定することができ、また、全細胞が相同組換えＤＮＡを有する動物を交配するために用いることができる。ノックアウト動物は、ヒトの神経学的な障害や欠陥を模倣するその能力によって特徴付けられる。
【０２４７】
同等物 
本明細書中ではある特定の態様を詳細に開示しているが、これはあくまで説明を目的とした実例として開示したにすぎず、添付の請求項に定義する本発明の請求の範囲を限定するものではない。特に、本発明者らは、請求の範囲に定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の多様な置き換え、変更および改良をなし得ることを意図している。出発物質としての核酸、目的のクローン、ライブラリーの種類などの選択は、本明細書に開示する態様についての知識を有する当業者には慣例的な事項であると考える。本発明の他の態様、効果および改良に関しては、添付の請求項の範囲内にあるとみなす。
【実施例】
【０２４８】
材料と方法 
オーダード ディファレンシャル ディスプレイ法 
Matz et al. (1997)の記載に従ってオーダード ディファレンシャル ディスプレイを行い、アンフォテリンマトリクス上に誘導した遺伝子とラミニンマトリクス上に誘導した遺伝子を対比した。１８日齢のラット胚から海馬を切り取り、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するｐＨ７．４のハンクス平衡塩類溶液（ＣａとＭｇを含有しないＨＢＳＳ、GIBCO BRL製）中で、パスツールピペットを用いて磨砕した。磨砕した海馬をＨＢＳＳで洗浄後、神経細胞培養用基礎培地（Neurobasal medium、GIBCO BRL製）に２％のＢ２７サプリメント（GIBCO BRL製）、２５μＭのＬ−グルタミン酸（Sigma-Aldrich製）および１％のＬ−グルタミン（GIBCO BRL製）を添加したものに得られたニューロンを懸濁し、ニューロンをラミニン（１０μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich製）または組換えアンフォテリン（１０μｇ／ｍｌ）を塗布した３５ｍｍのプラスチック板（Greiner製）あたり１０6細胞の密度で植え付けた。植え付けから２４時間後にRNeasy mini kit（Qiagen製）を用いてＲＮＡを単離し、得られたＲＮＡをオーダード ディファレンシャル ディスプレイに使用した。
【０２４９】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のｃＤＮＡのクローニング 
ラットＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡの５’末端を、鋳型乗り換え効果（template-switching effect）とステップアウトＰＣＲに基づいてMatz et al. (1999)の方法で増幅した。また、全長ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いたＲＴ反応により生後１４日齢のラットの大脳からクローニングした：５’プライマーは ACTGCTTCTCGCCTGGCCCGT であり、３’プライマーは GAACCTCCCCATCAGCCTATACTG であった。ヒトＡＭＩＧＯおよびマウスＡＭＩＧＯをクローニングするための配列を得るために、ラットＡＭＩＧＯ配列を用いてヒトＥＳＴおよびマウスＥＳＴを探索した。ヒトＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いたＲＴ反応によりＴＨＰ−１細胞系（ATCC #TIB-202）からクローニングした：５’プライマーは CAGAACATGCCCGGGTGAC であり、３’プライマーは GGACCAATTCCCTTGAGGTCAG であった。マウスＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いたＲＴ反応により、マウス成体の大脳からクローニングした：５’プライマーは ACTGCTTCTCGCCTGGCCCGT であり、３’プライマーは AACCTCCCCATCAGCCTACGCTG であった。関連性があると考えられる別の配列を発見するために、ＡＭＩＧＯ配列を用いたＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行った。上記と同様に、ヒトＡＭＩＧＯ２ ｃＤＮＡをＨＴ１０８０細胞系（ATCC #CCL-121）からクローニングした。このときの５’プライマーは CTCAGAGGCGACCATAATGTC であり、３’プライマーは TGTTTATTTTGCAGACCACACAC であった。マウスＡＭＩＧＯ２ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いてマウス成体の大脳からクローニングした：５’プライマーは CTCAGAGGCGACCATAATGTC であり、３’プライマーは GCGATGCTGAAGGCTAAGATG であった。ヒトＡＭＩＧＯ３ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いてＨＥＫ２９３細胞系（ATCC #CRL-1573）からクローニングした：５’プライマーは CAACCTGCACAGAGCTGCTCTGTAC であり、３’プライマーは GCACAGTGCTTCCCACCAGTATCTG であった。マウスＡＭＩＧＯ３ ｃＤＮＡは、次のプライマーを用いてマウス成体の小脳からクローニングした：５’プライマーは AGAAGTAGGTGAGTCTTGGAGCT であり、３’プライマーは TGTTGTGCAGGTAGAGCCTG であった。
【０２５０】
ＲＴ−ＰＣＲおよび in situ ハイブリダイゼーション 
総ＲＮＡの逆転写を、１μｇのＲＮＡ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｇのランダムノナマー、２０Ｕの組換えＲｎａｓｉｎ（Promega製）および２００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ（Promega製）と添付の１×ＭＭＬＶ反応緩衝液を含む反応混合物中で行った。得られた逆転写反応混合物を２μｌ用い、遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を行った。マウスＡＭＩＧＯに対するプライマーは、５’プライマーが AGCAACATCCTCAGCTGCTCであり、３’プライマーが CTTCAGCTTGTTGGAGGACAG であった。マウスＡＭＩＧＯ２に対するプライマーは、５’プライマーが GGCACTTTAGCTCCGTGATGであり、３’プライマーが GTCTCGTTTAACAGCCGCTG であった。マウスＡＭＩＧＯ３に対するプライマーは、５’プライマーが AGGTGTCAGAGTCCCGAGTGであり、３’プライマーが GTAGAGCAACACCAGCACCA であった。対照のＧＡＰＤＨに対するプライマーは、５’プライマーが CAACGACCCCTTCATTGACCであり、３’プライマーが AGTGATGGCATGGACTGTGG であった。
次に、ＰＣＲ反応を行った。反応は、５’プライマーと３’プライマーを０．２μＭずつと１単位のＤＹＮＡｚｙｍｅ II ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes製）を含有するＰＣＲ ｍｉｘ（２．５μＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）、１５０ｍＭの塩化カリウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で行った。増幅産物は１．５％ アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。
【０２５１】
放射線標識したプローブを用いた in situ ハイブリダイゼーション用に、マウスＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡの１．２ｋｂ断片を、次のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した：５’プライマーは CCGCTCGAGCCGGCCGATCTGTGGTTAG であり、３’プライマーは CGGAATTCTCACACCACAATGGGTCTATCAGA であった。得られた増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターに連結した。In situ ハイブリダイゼーションは、公知の方法（Reponen et al., 1994）に従い、マウス胎児とマウス成体のパラフィン包埋組織切片に対して一本鎖ＲＮＡプローブを用いて行った。
【０２５２】
ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質の製造 
マウスＡＭＩＧＯの全細胞外コード領域を含む１１８０ｂｐのＢａｍＨＩ断片を、次のプライマーを用いたＰＣＲで増幅した：５’プライマーは CGGGATCCTAGGGTGACTCTCTCCCAGATCC であり、３’プライマーは CGGGATCCGTTGAGGGTGTCATGGTGTCC である。得られた増幅産物をｐＲＭＨＡ３−３ｃ−ＦＣ−ｃＤＮＡに連結した。Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（ROCHE製）を用いて、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質プラスミドとハイグロマイシン耐性プラスミドであるｐ−ＣＯＰ−ｈｙｇをショウジョウバエのＳ２細胞にコトランスフェクトした。３週間後、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Calbiochem製）による選択に付し、安定なＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合Ｓ２細胞のプールを振とうフラスコで培養し、５００μＭのＣｕＳＯ４でタンパク質の発現を誘導した。６日間の培養後、プロテインＡアガロース（Upstate製）を製造者の説明書に従って使用し、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質を培養上清から単離した。
【０２５３】
抗体、ウェスタンブロット法および免疫組織染色 
ウサギ抗ＡＭＩＧＯペプチド抗体を、合成ペプチドであるＹＡＭＧＥＴＦＮＥＴ（マウスＡＭＩＧＯの３４１〜３５０番目のアミノ酸およびラットＡＭＩＧＯとヒトＡＭＩＧＯの３４２〜３５１番目のアミノ酸に相当）に対し製造した。ＡＭＩＧＯへの抗体の結合を、組換えＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質と脳粗抽出物を用いたウェスタンブロット法で検証した（下記参照）。抗体は、ラット以外の種に由来するＡＭＩＧＯよりもラットＡＭＩＧＯの方により強く特異的に結合したため（これは、免疫に用いたペプチド配列の近傍に位置するグリコシル化部位の種間における相違が原因だと考えられるが）、免疫組織染色による検出においては主としてラット試料を使用した。
【０２５４】
最終濃度が８３．３ｍｇ組織／ｍｌのＳＤＳ抽出緩衝液（６２．５ｍＭのトリス、１．８％のＳＤＳ、７．７５％のグリセロールおよび４．４％の２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）となるように、ラット胚、新生ラットおよびラット成体の脳を抽出に付した。上記ＳＤＳ抽出緩衝液を脳に加えた後に、抽出物を針に通して数回つぶした。抽出物を５分間の煮沸に２回付し、その後１０，０００×ｇで１０分間遠心分離に付し、不溶性の物質を取り除いた。同じ湿重量の組織に相当する試料をウェスタンブロット法で分析した。ブロット後の膜をポンソー染色したところ、タンパク質の量は均一であることが確認された。
【０２５５】
４〜１５％のプレキャストゲル（Bio-Rad製）を、ウェスタンブロット法で行うＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。タンパク質は、セミドライブロット法でＨｙｂｏｎｄ（商標）ニトロセルロース膜（Amersham Pharmacia Bitech製）に転写した。ウサギ抗ＡＭＩＧＯペプチド抗体（１／１，０００に希釈）とモノクローナル抗ＣＮＰａｓｅ、クローン１１−５Ｂ（Sigma製、１／１，５００に希釈）を一次抗体として用いた。ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Bio-Rad製）とＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（AP Biotech製）を二次抗体として用いた。これらの抗体複合体は、ＥＣＬ（商標）試薬（AP Biotech製）で検出した。
【０２５６】
ＡＭＩＧＯの免疫組織染色はパラフィン切片を用いて行った。つまり、ラット成体をＣＯ2処理してから頚椎脱臼で殺し、４％パラホルムアルデヒドを含む氷冷したＰＢＳで組織を固定し、得られた組織試料をパラフィンに包埋した。水和したパラフィン切片（厚さ４〜１０μｍ）を１％過酸化水素のメタノール溶液で２０分間インキュベートし、再びＰＢＳで洗浄した。得られた切片を５％スキムミルク粉末のＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。次いでこれら切片を、ブロッキング緩衝液で２００分の１に希釈したウサギＡＭＩＧＯペプチド抗血清と共に４℃で一晩インキュベートした。このような処理を施した切片をＰＢＳで洗浄後、５００分の１に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Biorad製）と共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、発色基質であるアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ、Sigma製）と共にインキュベートした。In vitro で培養した海馬ニューロンの免疫蛍光染色は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Jackson lab製）を用いて行った。
【０２５７】
神経突起伸長アッセイ 
１８日齢のラット胚から海馬を切り取り、ＣａとＭｇを含有しない磨砕用培地（１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ、ｐＨ７．４）に入れた。細胞を、ガラス製のパスツールピペットで２５回ピペッティングすることにより分離し、ＣａおよびＭｇ含有緩衝液（１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ＋Ｃａ＋Ｍｇ、ｐＨ７．４）で一回洗浄した。洗浄した細胞は、テストタンパク質で被覆し、２％のＢ２７サプリメント（GIBCO BRL製）、１％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＬ−グルタミン、２５μＭのＬ−グルタミン酸および１×ペニシリン−ストレプトマイシンを含む神経細胞培養用基礎培地（Neurobasal medium、GIBCO BRL製）を入れた９６穴ポリスチレンディッシュのウェルに、密度が７０，０００細胞／ｃｍ2となるように植えた。細胞を加える前に、ディッシュをテストタンパク質のＰＢＳ溶液（３．１２５〜１００μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩被覆し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液によるブロッキングを室温で１時間行った。神経突起伸長を計測する前に、細胞を２４時間培養した。神経突起伸長を計測する際は、ランダムに選択した顕微鏡視野から生細胞の画像を撮り、生細胞の細胞体の２倍の長さの突起を神経突起とみなして計測した。神経突起伸長を定量するために、合計７５０個の細胞を示す１５枚の画像（２７５μｍ × ２２５μｍ）を、被覆に用いたテストタンパク質（ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合物質またはＦｃ対照基質）の全ての濃度について評価した。３つの独立した実験によるデータを収集した。
【０２５８】
可溶性ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質の効果を試験するために、ディッシュをＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（ＰＢＳ中の濃度は１２．５μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩被覆し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液によるブロッキングを室温で１時間行った。細胞を、７０，０００細胞／ｃｍ2の密度で植え付け、神経突起伸長を計測する前に２４時間培養した。３つの独立した実験において、上記のようにして計測を行った。合計７５０個の細胞を、溶液中のテストタンパク質（ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質またはＦｃ対照タンパク質）の全ての濃度について評価した。
【０２５９】
In vitro における束形成のアッセイ 
神経突起の束形成を、上述のように調製した海馬ニューロンを用いて研究した。９６穴プレートをポリ−Ｌ−リシンで４℃にて一晩被覆し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で室温において１時間ブロッキングした。細胞は、無血清培地に密度が７０，０００細胞／ｃｍ2となるように植え付け（「神経突起伸長アッセイ」の項を参照）、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質溶液またはＦｃ対照タンパク質溶液を加えた。ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質とＦｃ対照タンパク質は３．２５〜２５μｇ／ｍｌで試験した。実験は独立に３回行い、培養開始から４日後に生細胞の写真を撮影した。神経突起の伸長を定量するために、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質溶液およびＦｃ対照タンパク質溶液の各濃度について、１２枚のランダムに取り出した画像（４５μｍ×３５μｍ）を撮影した。束形成の阻害を評価するために、試験した各タンパク質濃度について撮影した１２枚の画像より、（１〜３本の神経突起だけで形成される）直径２μｍ未満の細胞突起の長さの合計を計測した。
【０２６０】
神経突起の伸長および束形成の実験においては、写真はオリンパス製ＤＰ１０デジタルカメラを用いて撮影し、計測はＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ画像解析ソフトを用いて行った。
【０２６１】
結合アッセイ 
共免疫沈降実験は一過性トランスフェクションに付したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて行った。構築物は、ＦＵＧＥＮＥ６（ROCHE製）を用いて製造者の説明書に従って細胞にトランスフェクトした。全長ＡＭＩＧＯは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech製）およびｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓベクター（Invitrogen製）を用い、読み枠に合わせてクローニングした。全長ＲＡＧＥはｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓベクターを用いて読み枠に合わせてクローニングした。トランスフェクション後、細胞を４８時間培養し、１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦと６０μｇ／ｍｌのアプロチニン（SIGMA製）を含むＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。共免疫沈降実験は、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（ｓｃ−８３３４、Santa Cruz製）とマウス抗Ｖ５抗体（４６−０７０５、Invitrogen製）を１μｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。
【０２６２】
凝集アッセイは、プロテインＡフルオレスブライトカルボキシル基導入ビーズ（サイズ：１μｍ、Polysciences製）を用いて行った。ビーズ（１００μｇ）を最初に２％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液を用いて３回洗浄し、洗浄したビーズを上記緩衝液５０μｌと混合し、水浴中で超音波処理した。ビーズを２つに分け、試験タンパク質および対照タンパク質（各１０μｇ）をそれぞれ２％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液２５μｌとしてビーズに加えた（最終体積はそれぞれ５０μｌ）。タンパク質の添加後の様々な時間において、サンプル２μｌを、２％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液１００μｌの入った９６穴プレートのウェルに加えた。プレートを室温でインキュベートし、蛍光顕微鏡を用いて凝集を評価した。ビーズ凝集の動態は、３つの独立した実験により得た、それぞれ１，５００個のビーズを含む１２個の顕微鏡視野より計算した。ビーズ凝集の程度は、Ｎt／Ｎ0を指標として表す。ここで、ＮtおよびＮ0はそれぞれ、インキュベーション時間ｔおよび０における粒子の総数を表す（Agarwala et al., 2001）。
【０２６３】
ＡＭＩＧＯおよびＡＭＩＧＯ２のＥＧＦＲとの共免疫沈降 
共免疫沈降実験は、安定なＥＧＦＲ発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて行った。構築物は、ＦＵＧＥＮＥ６（ROCHE製）を用いて製造者の説明書に従って細胞にトランスフェクトした。ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３のそれぞれの全長と細胞外領域（ＥＣ領域）を、ｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓベクター（Invitrogen製）を用いて読み枠に合わせてクローニングした。トランスフェクション後、細胞を４８時間培養し、１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、６０μｇ／ｍｌのアプロチニン（SIGMA製）と１ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＩＰＡ緩衝液中で細胞を溶解した。共免疫沈降実験は、ウサギ抗ＥＧＦＲ抗体（Santa Cruz製）とマウス抗Ｖ５抗体（４６−０７０５、Invitrogen製）を１μｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。
【０２６４】
ＥＧＦＲリン酸化実験 
ＥＧＦＲリン酸化実験は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて行った。構築物は、ＦＵＧＥＮＥ６（ROCHE製）を用いて製造者の説明書に従って細胞にトランスフェクトした。全長ＡＭＩＧＯ、全長ＡＭＩＧＯ２および全長ＡＭＩＧＯ３を、ｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓベクター（Invitrogen製）を用いて読み枠に合わせてクローニングした。全長ヒトＥＧＦＲは、Ｃ末端Ｆｌａｇタグと共にｐｃＤＮＡ６ベクター（Invitrogen製）にクローニングした。０．３μｇのＥＧＦＲプラスミドを、１．７μｇのＡＭＩＧＯプラスミド、ＡＭＩＧＯ２プラスミド、ＡＭＩＧＯ３プラスミドまたは対照のプラスミド（ｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓ、Invitrogen製）と共に６ｃｍプレートで５０％コンフルエントに達した細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞に血清欠乏処理を４時間施した。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを３７℃で５分間与えることにより、ＥＧＦＲの自己リン酸化を誘導した。細胞を溶解し、抗リン酸化チロシン抗体（クローンＰＹ２０）で免疫沈降を行った。抗Ｆｌａｇタグ抗体（クローンＭ２）を用いた細胞の免疫沈降も行った。抗リン酸化チロシン免疫沈降物のサンプルを、抗Ｆｌａｇタグ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出し、サンプル間のＥＧＦＲリン酸化の違いを調べた。また、抗Ｆｌａｇタグ免疫沈降物のサンプルを、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロット法により検出し、サンプル間のＥＧＦＲリン酸化の違いを調べた。
【０２６５】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のホモフィリックな結合およびヘテロフィリックな結合 
共免疫沈降実験は一過性トランスフェクションに付したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて行った。構築物は、ＦＵＧＥＮＥ６（ROCHE製）を用いて製造者の説明書に従って細胞にトランスフェクトした。ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３のそれぞれの全長と細胞外領域（ＥＣ領域）を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Clontech製）またはｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓベクター（Invitrogen製）を用いて読み枠に合わせてクローニングした。全長ＲＡＧＥはｐｃＤＮＡ６−Ｖ５−Ｈｉｓベクターを用いて読み枠に合わせてクローニングした。トランスフェクション後、細胞を４８時間培養し、１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦと６０μｇ／ｍｌのアプロチニン（SIGMA製）を含むＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。共免疫沈降実験は、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（ｓｃ−８３３４、Santa Cruz製）とマウス抗Ｖ５抗体（４６−０７０５、Invitrogen製）を１μｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。
【０２６６】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のノックアウト構築物 
ＡＭＩＧＯ遺伝子ターゲティングのために、マウスファージライブラリー（１２９ＳＶ株）から得たゲノムＤＮＡ断片を用いて置換ベクターを構築した。次の仕立てた（tailored）ＰＣＲプライマーを用いて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をＡＭＩＧＯ遺伝子プロモーターの下流に挿入し、ＡＭＩＧＯ遺伝子の全コード領域を置換した：５’プライマーは GCGGCCGCTCAGGGCCCACGGTTTCTGCAG（ＮｏｔＩサイトを有する）であり、３’プライマーは GGCGCGCCACTGGGAAGAGVGAGGAAGGCCAC（ＡｓｃＩサイトを有する）であった。陽性の選択のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の後ろにネオマイシン耐性遺伝子をクローニングした。３’末端相同アームをＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ断片（ＮｃｏＩ末端は平滑）としてベクターに挿入した。相同組換えアームの長さについては、５’アームが９．９ｋｂであり、３’アームが２．０ｋｂであった。
【０２６７】
ＡＭＩＧＯ２遺伝子ターゲティングのために、マウスファージライブラリー（１２９ＳＶ株）から得たゲノムＤＮＡ断片を用いて置換ベクターを構築した。次の仕立てたＰＣＲプライマーを用いて、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子をＡＭＩＧＯ２遺伝子プロモーターの下流に挿入し、ＡＭＩＧＯ２遺伝子の全コード領域を置換した：５’プライマーは TAAACTAGCGGCCGCTCATGGAGGCTCACCCATGGAC（ＮｏｔＩサイト有する）であり、３’プライマーは AGATATGGCGCGCCGGTCGCCTCTGAGTCTCTTGCCAG（ＡｓｃＩサイトを有する）であった。陽性の選択のために、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子の後ろにネオマイシン耐性遺伝子をクローニングした。３’末端相同アームをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ末端は平滑）としてベクターに挿入した。相同組換えアームの長さについては、５’アームが３．０ｋｂであり、３’アームが３．０ｋｂであった。
【０２６８】
ＡＭＩＧＯ３遺伝子ターゲティングのために、マウスファージライブラリー（１２９ＳＶ株）から得たゲノムＤＮＡ断片を用いて置換ベクターを構築した。次の仕立てたＰＣＲプライマーを用いて、ＥＧＦＰ遺伝子をＡＭＩＧＯ３遺伝子プロモーターの下流に挿入し、ＡＭＩＧＯ３遺伝子の全コード領域を置換した：５’プライマーは ACCTTAATTAACCAGATGGCTTCTTCTTTC（ＰａｃＩサイトを有する）であり、３’プライマーは AGATATGGCGCGCCAGTGACTACCAGGGAAGAT（ＡｓｃＩサイトを有する）であった。陽性の選択のために、ＥＧＦＰ遺伝子の後ろにネオマイシン耐性遺伝子をクローニングした。３’末端相同アームをＢａｍＨＩ断片としてベクターに挿入した。相同組換えアームの長さについては、５’アームが３．５ｋｂであり、３’アームが２．６ｋｂであった。
【０２６９】
標準的な方法で、ＰＢＳ中に懸濁したＲ１マウス胚性幹細胞に、線状化した（ＡＭＩＧＯはＮｏｔＩで、ＡＭＩＧＯ２はＮｏｔＩで、ＡＭＩＧＯ３はＰａｃＩでそれぞれ線状化した）ターゲティングベクター２０μｇをGene Pulser（２４０Ｖおよび５００μＦ）（BioRad製）を用いてエレクトロポレーションにより導入した。３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Gibco製）を用いてトランスフェクトされた細胞を選択した。エレクトロポレーションから９〜１１日後に１００〜４００個のクローンを選び、ネオマイシン耐性遺伝子と標的遺伝子座の外側の配列に対するプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、相同組換えを有する耐性クローンを同定した。ＰＣＲの結果は、標的遺伝子座の外側の配列に対するプローブを用いたサザンブロット法により確認した。
【０２７０】
標準的な方法により、選択した胚性幹細胞を凝集させてＩＣＲマウス桑実胚とし、凝集物を偽妊娠代理母に移した。キメラである確率の高いオスをメスのＩＣＲマウスと交配してヘテロ個体の子を得、ヘテロ個体の子同士を交配してホモ個体の変異マウスを得た。遺伝子タイピングのために、プロテインＫ消化とイソプロパノール沈降によりゲノムＤＮＡを尾の生検材料から分離した。慣例的な遺伝子タイピングの方法として、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅においては、１回目の反応系には、無傷のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の遺伝子座からのみの（即ち、その遺伝子の内側から）生成物を増幅するオリゴ核酸が含まれている。２回目のＰＣＲ反応系には、標的遺伝子座からのみ生成物を増幅するオリゴ核酸が含まれている（一方のオリゴ核酸はネオマイシン遺伝子から、他方のオリゴ核酸はターゲティングに用いた３’相同アームから増幅する）。
【０２７１】
これらのＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３の一重ノックアウトマウス株を用い、二重ノックアウトマウス株（ΔＡＭＩＧＯ／ΔＡＭＩＧＯ２；ΔＡＭＩＧＯ／ΔＡＭＩＧＯ３；ΔＡＭＩＧＯ２／ΔＡＭＩＧＯ３）と三重ノックアウトマウス株（ΔＡＭＩＧＯ／ΔＡＭＩＧＯ２／ΔＡＭＩＧＯ３）を標準的な交配方法により得た。変異マウスの遺伝子型は、一重ノックアウト株と同じＰＣＲ反応により確認した。
【０２７２】
ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合トランスジェニック動物 
マウスＡＭＩＧＯ細胞外領域をコードするＤＮＡ領域を、ＢａｍＨＩ含有上流プライマーである CGGGATCCTAGGGTGACTCTCTCCCAGATCC とＢａｍＨＩ含有下流プライマーである CGGGATCCGTTGAGGGTGTCATGGTGTCC を用い、マウスＡＭＩＧＯ ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。発現ベクターであるｐＲＭＨＡ３−３ｃ−ＦＣに、ヒトＩｇＧ ＦＣ部位と共にＰＣＲ断片を読み枠に合わせてクローニングした。ＩｇＧ ＦＣ部位と融合したマウスＡＭＩＧＯ細胞外領域をコードするＤＮＡ領域を、ＮｏｔＩ含有上流プライマーである ATAAGAATGCGGCCGCCAATGTGCATCAGTTGTGGTCAG とＸｂａＩ含有下流プライマーである GCTCTAGACGTGCCAAGCATCCTCGTGCGAC を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ断片はベクターであるｐｓｉｓＧＩにクローニングした。得られたプラスミドにおいては、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合物の読み枠はＰＤＧＦβプロモーターの制御下に位置し、このフレームにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル配列を加えた。構築物は、Ｃ５７ＢＬ／６株の排卵過度にしたメスから得た卵母細胞の受精前核に注入した。トランスジーンの組込み（transgene integration）は、サザンブロット法およびテールＤＮＡのＰＣＲ解析により決定した。トランスジェニック系統を確立するために、ファウンダーをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。
【０２７３】
ＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯ２タンパク質またはＡＭＩＧＯ３タンパク質による再生実験 
脊髄損傷およびＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の送達は以下のように行なうことができる。メスのＢＡＬＢ−ｃマウス（ｎ＝７０）に、０．４ｍｌ／ｋｇのハイプノームと５ｍｇ／ｋｇのジアゼパムで麻酔をかける。鋭い骨鉗子で骨を除去し、胸髄部分を露出させ、Ｔ７レベルで背側部過片側切除（dorsal over-hemisection）した。鋭利な鋏を用いて脊髄の背側を切り、損傷が脊髄の中心管を越えて及ぶように２回目は鋭利なナイフで切る。薬物送達システムＳＡＢＥＲ（DURECT Corporation製）を製造者の説明書に従って用い、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質、ＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ融合タンパク質またはＡＭＩＧＯ３−Ｉｇ融合タンパク質をＳＡＢＥＲ溶液に１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で添加する。対照として、第２群の動物にＰＢＳ緩衝液を含むＳＡＢＥＲ溶液を投与し、第３群には何も処理を施さない。再切断は、脊髄損傷から３週間後、上記で説明したように脊髄のＴ６位を切り、ＢＢＢ運動機能評価スケール（Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating scale）を用いて２回目の手術から１日後、２日後および６日後に動物を試験する。また、後述するように、Ｉｇ融合タンパク質をＡＭＩＧＯ細胞外ドメインに置き換えて実験する。
【０２７４】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の可溶性細胞外ドメインを用いた軸索再生実験 
脊髄背側部片側切除術（spinal cord dorsal hemisection）および皮質脊髄繊維の追跡（corticospinal fiber tracing）には、GrandPre et al. (2002)の記載を採用した。Nogo-66受容体の拮抗物質であるペプチドは軸索再生を促進する（Nature 417: 547−551）。メスの成体マウス Ｃ５７ＢＬ／６（８〜１０週齢）に、筋内にケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）と腹腔内にキシラジン（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与し深く麻酔をかける。完全な椎弓切除を行い、脊髄の背側部をＴ６レベルおよびＴ７レベルで完全に露出させる。皮質脊髄路の背側部を切断するために、脊髄の背側半分をマイクロシザー（microscissors）で切り、１１番の刃（number 11 blade）の鋭利な部分を脊髄の背側半分に渡らせて損傷の深さ（およそ１．０ｍｍ）を確かなものにする。背側脊髄を片側切除した後、浸透圧ミニポンプ（Alzet model 2002、カリフォルニア州、マウンテンビュー、Alza製）を移植し、皮下腔に試薬を送達するために配置する。ミニポンプの出口に接続したカテーテルを、髄膜の小さい穴を通して、Ｔ７レベルの脊髄の髄腔内に挿入する。ミニポンプを、ベヒクル（９７．５％ ＰＢＳ＋２．５％ ＤＭＳＯ）、あるいは可溶性のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２および／またはＡＭＩＧＯ３の細胞外ドメインを含有する上記のベヒクルの溶液で満たす。ベヒクル、あるいは可溶性のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２および／またはＡＭＩＧＯ３を、約０．６μｌ／時間の流速で１４日間連続的に送達する。この時、可溶性のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２および／またはＡＭＩＧＯ３の細胞外ドメインの投与量は、２．０ｍｇ／ｋｇ／日、７．５ｍｇ／ｋｇ／日および１５．０ｍｇ／ｋｇ／日である。脊髄を損傷させずに可溶性のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２および／またはＡＭＩＧＯ３の細胞外ドメインを投与するマウスにも、椎弓切除およびミニポンプの設置を同様のやり方で行う。損傷から２週間後、下肢の感覚運動皮質を覆う頭蓋骨の各側に穿頭孔（burr hole）を作る。順行性神経トレーサー（anterograde neuronal tracer）であるビオチン デキストラン アミン（ＢＤＡ、ＰＢＳに１０％含有）を頭蓋骨の各側の皮質表面から０．５〜０．８ｍｍの深さに、４箇所の注入部位から注入する。ＢＤＡ注入から２週間後、マウスをＰＢＳ、次いで４％パラホルムアルデヒドの灌流によって殺す。損傷部位から吻側６ｍｍの地点から尾側６ｍｍの地点にわたる脊髄を振動刃ミクロトーム（vibrating microtome）を用いて傍矢状に（５０μｍ）切断する。横断面は損傷部位から吻側８〜１２ｍｍの地点と損傷部位から尾側８〜１２ｍｍの地点にわたる脊髄から採取する。得られた断面を、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートし、再生した軸索を追跡するためのＢＤＡトレーサーを、ニッケルで増強したジアミノベンジジン ＨＲＰ反応により視覚化する。行動（bevioral）分析のために、ベヒクルで処置したマウスと可溶性のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の細胞外ドメインで処置したマウスとを、Basso et al.(1995) “A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats（ラットのオープンフィールド試験のための高感度で正確な運動機能評価スケール）”. Neurotrauma 12, 1-21.に記載の、ＢＢＢ運動機能評価スケールを用いて比較する。
【０２７５】
可溶性のＡＭＩＧＯタンパク質、ＡＭＩＧＯ２タンパク質およびＡＭＩＧＯ３タンパク質による、ＣＮＳにおけるグリア性瘢痕形成の阻害 
大脳皮質の定位的破壊（stereotactic lesioning）および脳質内カニューレ挿管はLogan et al., 1994に従って行うことができる。２００ｇ〜２５０ｇのメスの成体ウィスター系ラットを、各５匹からなる２つの処置群に分け、（i）群には３０μｇ／１０μｌ／日のＦｃ対照タンパク質の生理食塩水溶液を投与し、（ii）群には３０μｇ／１０μｌ／日のＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質、ＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ融合タンパク質および／またはＡＭＩＧＯ３−Ｉｇ融合タンパク質の生理食塩水溶液を投与する。実験０日目には、定位的に決めた片側切開性破壊（unilateral incisional lesion）を大脳皮質から側脳室へ行い、同時に、同側の脳室内へのカニューレの永久的な設置を行う。試薬（１０μｌ）を、ハロタン麻酔下で上記のカニューレを介した脳室内注入により破壊部位へ１４日間毎日灌流する。破壊の１４日後、ラットを殺し、破壊部位の免疫組織染色による分析のためにその脳を処理する。別の方法としては、Ｆｃドメインに対する免疫応答を避けるために、Ｆｃ−融合タンパク質をＡＭＩＧＯ細胞外ドメインで置き換える。したがって、各５匹からなる処置群は、次の（i）または（ii）の投与を受ける：（i）１０μｌ／日のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）投与、そして（ii）３０μｇ／１０μｌ／日の、ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の可溶性細胞外ドメインを含有するリン酸緩衝生理食塩水の投与。
【０２７６】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の可溶性細胞外ドメインの使用による腫瘍転移の制御 
腫瘍転移制御のアッセイは、以下のように行うことができる。マウス ルイス肺癌細胞を６〜８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（メイン州、バーハーバー、Jackson Laboratoriesより購入）の背側中線に注射する。腫瘍体積が１，５００ｍｍ3となった時点（１４日目）で一次腫瘍を外科的に切除する。一次腫瘍の切除前の３日間は、マウスにＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質、ＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ融合タンパク質またはＡＭＩＧＯ３−Ｉｇ融合タンパク質、あるいは対照Ｆｃ−部分タンパク質を１日１回投与する。切除後２１日目には、肺の重量を量り、肺表面の転移の数を、インディアインク（１５％）を気管内注射した後にオリンパス顕微鏡を用いて４倍の倍率で観察して求める。別の方法として、Liao et al. (2000)に記載の動物実験が挙げられる。肺転移モデルを作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（メイン州、バーハーバー、Jackson Laboratoriesより購入）に、１×１０5細胞のマウス ルイス肺癌細胞を肉球内注射する。肉球の腫瘍が直径５ｍｍに達した時点で、腫瘍を有する脚を外科的に結紮する。それからマウスを２群に分け、ベヒクル（リン酸緩衝生理食塩水）、あるいはベヒクルとＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の可溶性細胞外ドメインのいずれかを、３週間にわたり３日毎に約２０〜３０ｍｇ／ｋｇ／１回の用量で注射する。肺の重量を量り、肺表面の転移の数を、インディアインク（１５％）を気管内注射した後にオリンパス顕微鏡を用いて４倍の倍率で観察して求める。
【０２７７】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の可溶性細胞外ドメインによる局所腫瘍増殖の阻害 
ラットＣ６グリオーマ細胞を、４〜６週齢のメスのＮＣＲ免疫無防備状態マウス（ニューヨーク州、ジャーマンタウン、Taconic Farmsより購入）の背側中線に注射する。別の方法として、ラットＣ６グリオーマ細胞を、メスの重症複合免疫不全のマウス（severe combined immunodeficiency、ＳＣＩＤ；Taconic Farmsより購入）の背側中線に注射する。ラットＣ６グリオーマ細胞の注射後、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質、ＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ融合タンパク質またはＡＭＩＧＯ３−Ｉｇ融合タンパク質、あるいは対照Ｆｃ−部分タンパク質を免疫無防備状態の（無胸腺症ヌード）マウスに、１日１回投与する。２１日目に腫瘍をカリパスで測定し、体積を次の式から計算する：Ｖ＝π×ｈ（ｈ2＋３ａ2）／６（式中、ｈは腫瘍部分の高さであり、ａは（腫瘍の長さ＋腫瘍の幅）／４であり、そしてＶは腫瘍の体積である）。腫瘍組織を回収し、ホルマリン（１０％）中で固定し、パラフィン包埋切片を調製する。別の方法として、ヒトＡ４３１扁平上皮細胞癌異種移植片は、０．５〜２×１０6細胞のヒトＡ４３１扁平上皮癌細胞を６〜８週齢の無胸腺ヌードｎｕ／ｎｕマウスの背側脇腹に皮下移植することで調製した。ヒトＡ４３１扁平上皮癌細胞の移植後、免疫無防備状態の（無胸腺症ヌード）マウスに、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質、ＡＭＩＧＯ２−Ｉｇ融合タンパク質またはＡＭＩＧＯ３−Ｉｇ融合タンパク質、あるいは対照Ｆｃ−部分タンパク質を（１回あたり約１０〜４０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回投与する。２１日目に腫瘍をカリパスで測定し、体積を次の式から計算する：Ｖ＝π×ｈ（ｈ2＋３ａ2）／６（式中、ｈは腫瘍部分の高さであり、ａは（腫瘍の長さ＋腫瘍の幅）／４であり、そしてＶは腫瘍の体積である）。腫瘍組織を回収し、ホルマリン（１０％）中で固定し、パラフィン包埋切片を調製する。
【０２７８】
可溶性のあるいは全長のＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３による、レンチウイルス仲介遺伝子送達による腫瘍形成の抑制 
動物実験には、Reed et al. (2002) “Suppression of tumorigenicity by adenovirus-mediated gene transfer of decorin（デコリンのアデノウイルス仲介遺伝子送達による腫瘍形成の抑制）”. Oncogene 21:3688-95 の記載を採用した。ヒトWiDr結腸細胞癌異種移植片およびヒトＡ４３１扁平上皮細胞癌異種移植片は、６〜８週齢の無胸腺ヌードｎｕ／ｎｕマウスに０．５〜２×１０6細胞の癌細胞を背側脇腹に皮下移植することで調製した。２〜３日毎にマウスを注意深く検査し、いかなる腫瘍もマイクロカリパスを用いて測定し、その増殖を次の式によって求める：Ｖ＝ａ（ｂ２／２）（式中、ａは腫瘍の長径を表し、ｂは短径を表す）。腫瘍の長径が２〜３ｍｍに達した時点で、マウスの腫瘍に直接注射液を注射し、さらに計３回の注射を１回目の注射から２、４および６日後に行う。注射液は複製能力のないレンチウイルス（４×１０7の毒素単位を含有する約５０μｌ）を含み、このレンチウイルスは、空のウイルスか、ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２またはＡＭＩＧＯ３の全長遺伝子または可溶性細胞外ドメイン遺伝子を有するウイルスである。スチューデントの両側ｔ−検定（Student's two-sided t-test）を、処置したサンプルから得られた数値と対照サンプルから得られた数値との比較に用いる。Ｐ＜０．０５の数値を有意と見なす。
【０２７９】
動物は、実験の最後に（処置方法や移植片の大きさにより、１９日目〜５８日目の間に）殺し、それぞれの腫瘍を注意深く解剖する。腫瘍は１０％の緩衝化ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋し、慣行的な組織学的分析のために処理する。腫瘍異種移植片の増殖の指標を定めるために、Ki-67マーカーに陽性の腫瘍細胞核のパーセンテージを動物１匹あたり１０個の高倍率（４００倍）の顕微鏡視野から概算する。
【０２８０】
結果
ロイシン−リッチリピートと免疫グロブリンドメインからなる縦列配列を包含する、膜貫通型タンパク質の新規なファミリー（ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３）の同定およびクローニング 
オーダード ディファレンシャル ディスプレイ（ＯＤＤ；Matz et al., 1997）を、ニューロン中のアンフォテリン誘導性遺伝子の探索に用いた。アンフォテリンとラミリンで被覆したプレート上で生育した１８日齢ラット胚の海馬ニューロンのＯＤＤによる比較により、アンフォテリン上でより強く発現されている転写産物の存在が明らかになった（図１、パネルＡ）。このような発現の相違は、ＲＴ−ＰＣＲでも確認した（図１、パネルＢ）。
【０２８１】
この部分転写物の配列は、これまでクローニングされたいかなる遺伝子とも相同性を示さなかった。５’ＲＡＣＥ法（Matz et al., 1999）を用いて、全長コード配列をコードするｃＤＮＡをクローニングした（図２、パネルＡ）。この発現量の異なる遺伝子をＡＭＩＧＯ（AMphoterin Induced Gene and Orphan receptor、即ち、「アンフォテリン誘導性遺伝子とオーファン受容体」）と命名した。疎水性プロファイル解析（Nielsen et al., 1997; ソフトウェア SignalIP V2.0.b2）によって、ＡＭＩＧＯのタンパク質配列にはシグナル配列および膜貫通領域と推定されるものが含まれることが明らかになった。演繹したＡＭＩＧＯタンパク質の細胞外領域には、６個のロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）および１個の免疫グロブリンドメインが含まれている。このタンパク質の演繹した細胞質内領域には、公知のドメインは含まれていない。
【０２８２】
ラットＡＭＩＧＯ配列およびＥＳＴ配列のデータを用いた５’ＲＡＣＥ法により、ヒトとマウスのＡＭＩＧＯ相当物もクローニングした。ラットＡＭＩＧＯとマウスＡＭＩＧＯとのアミノ酸レベルの同一性は９５％であり、マウスＡＭＩＧＯ配列は、ヒトＡＭＩＧＯと８９％同一である。細胞外領域では、マウスＡＭＩＧＯとヒトＡＭＩＧＯとの間で最も保存性の高いモチーフは、Ｎ末端のシステイン−リッチドメインとＬＲＲ １〜３である。興味深いことに、膜貫通ドメイン全体および細胞質内テールはマウスＡＭＩＧＯとヒトＡＭＩＧＯとで１００％同一である。
【０２８３】
ホモロジー検索を用いて、ＡＭＩＧＯに対して相同性を示すが同一ではないＥＳＴを検出した。このＥＳＴ配列を用いて、２種の他の新規なタンパク質をクローニングし、便宜上、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３と命名した。演繹したアミノ酸配列から、ＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３がＡＭＩＧＯと同じドメイン構成を有すること、即ち、分泌のためのシグナル配列と推定されるもの、ならびにシステイン−リッチＬＲＲ ＮＴドメインとシステイン−リッチＬＲＲ ＣＴドメインがＮ末端側とＣ末端側に隣接している６個のＬＲＲを含有することが明らかになった。ＡＭＩＧＯと同様に、演繹したＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３の細胞外領域は膜貫通ドメイン近傍に免疫グロブリンドメインを含有する（ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３の概略図は図２のパネルＢを参照）。
【０２８４】
アミノ酸レベルでは、ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ２との類似性は４８％であり、ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ３との類似性は５０％であり、ＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３との類似性は４８％である。ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のアライメントから、これらの３種のタンパク質間で最も保存性の高い領域はＬＲＲ、膜貫通領域、および細胞質内テールのいくつかの部分であることが分かる（図２、パネルＡ）。３種のＡＭＩＧＯで見出されたＬＲＲは LX2LXLX2NX(L/I)X2aX4(F/L/I)（「a」は脂肪族残基であり、「X」はいかなるアミノ酸でもよい）というモチーフで表すことができる。このモチーフは、動物性タンパク質の細胞外領域にしばしば見られる典型的なＬＲＲ配列に類似している（Kajava, 1998）。
【０２８５】
遺伝子ファミリーメンバーの成体組織における発現 
成体マウス組織のＲＴ−ＰＣＲ分析（図３）により、ＡＭＩＧＯは、主として神経系組織（小脳、大脳および網膜）で発現しているが、肝臓、腎臓、小腸、脾臓、肺および心臓にも低い発現がいくらか見られることが明らかになった。ＡＭＩＧＯ２の発現は小脳、網膜、肝臓および肺で最も顕著である。大脳、腎臓、小腸、脾臓および精巣にも、ＡＭＩＧＯ２ ｍＲＮＡの低い発現が見られる。ＡＭＩＧＯ３ ｍＲＮＡの発現は、分析した全ての組織で検出することができたが、ＡＭＩＧＯやＡＭＩＧＯ２と比較して、固有の発現パターンは示さなかった。したがって、ＡＭＩＧＯが、神経系に実質的に特異的なタンパク質ファミリーのメンバーであると考えられることから、本発明者らは、ＡＭＩＧＯに焦点を当てて詳細に研究した。
【０２８６】
大脳 
成体ラットの大脳では、多くの神経繊維の束や神経路でＡＭＩＧＯ染色が見られた（図７および図９のパネルａ）。抗ＣＮＰａｓｅ染色と比較して、ＡＭＩＧＯ染色は、大脳のほぼ全ての有髄領域と共に局在する。この分析において、白質領域でＡＭＩＧＯ染色が見られなかったのは、外側嗅索だけであった。
【０２８７】
しかし、ＡＭＩＧＯの発現は有髄繊維路のみに限定されない。例えば、海馬では、透明層のＣＡ３領域の無髄繊維路は、抗ＣＮＰａｓｅ抗体とミエリン塩基性タンパク質（ミエリン塩基性タンパク質のデータは示さない）に陰性であったが、抗ＡＭＩＧＯ抗体では、明確に染色された（図９、パネルａおよびｃ）。冠状断面の染色は、ＣＡ３領域の透明層に限定され、錐体細胞の先端樹状突起の基底部により厳密に局在していた（図８）。抗ＡＭＩＧＯ抗体は、樹状突起を染色したのではなく、先端樹状突起の基底部の周辺領域を染色したようである。矢状断面では、ＡＭＩＧＯ染色はわずかに繊維状に見えた（図９、パネルｃおよびｄ）。海馬におけるＡＭＩＧＯ染色の局在性および構造は、苔状線維に見られるものを連想させる。苔状線維は顆粒細胞の軸索であり、歯状回からＣＡ３領域の透明層まで達して、そこで錐体細胞の先端樹状突起とシナプスを形成する。苔状線維は抗ニューロフィラメント抗体で非常に強く染色されることが報告されている（Huber et al., 1985）。本発明者らが行った海馬の抗ＮＦ−Ｍ染色の結果は、抗ＡＭＩＧＯ染色の結果と非常に類似しており、このことは、ＡＭＩＧＯが苔状線維またはそれと密接に関連する構造に局在するという解釈を裏付ける。一方、そのような構造は、ＣＡ３領域の介在ニューロンの軸索であってもよく、ＣＡ３領域の介在ニューロンの軸索は、透明層の苔状線維に沿って伸長することが報告されている（Vida and Frotscher, 2000）。
【０２８８】
大脳皮質では、ＡＭＩＧＯ免疫染色は、抗ＣＮＰａｓｅ抗体および抗ＮＦ−Ｍ抗体にも免疫反応性である特定の領域のみで見られた（図７）。用いた全３種の抗体（ＡＭＩＧＯ、ＣＮＰａｓｅおよびＮＦ−Ｍ）に対する皮質の染色は、いずれも拡散していて不明瞭であり、この染色結果は有髄軸索に関連する。同時に、ＡＭＩＧＯの染色が皮質錐体細胞の先端樹状突起の基底部に見られるが、興味深いことに、全ての先端樹状突起がＡＭＩＧＯ免疫反応性であるわけではない。抗ＮＦ−Ｍ染色も、先端樹状突起に見られたが、抗ＮＦ−Ｍ染色は、錐体細胞の細胞体および樹状突起の基底部にも見られた（図１０）。
【０２８９】
小脳 
小脳でも、抗ＡＭＩＧＯ染色は抗ＮＦ−Ｍ染色と共に局在した。小脳では、抗ニューロフィラメント抗体は、有髄軸索およびバスケット細胞軸索を非常に強く染色することが報告されている（Matus et al., 1979）。
【０２９０】
白質および顆粒細胞層の有髄軸索において、抗ＮＦ−Ｍ抗体に対して見られたのと同様の強いＡＭＩＧＯ染色が見られた。白質で最も強い染色が見られたのは小脳の中心部であり、数珠を模した構造が染色された（図１１、パネルａおよびｂ）。
【０２９１】
小脳の皮質領域では、プルキンエ細胞層の両側にＡＭＩＧＯ染色が見られた。プルキンエ細胞体の周辺のバスケット状構造はＡＭＩＧＯに対して免疫反応性であり、この構造はバスケット細胞軸索により形成される（図１１、パネルａおよびｂ）。
【０２９２】
小脳の分子層では、ＡＭＩＧＯ染色は、プルキンエ細胞層に沿って走る繊維に見られる（図１１）。この繊維の少なくともいくつかはバスケット細胞軸索であるが、他の軸索のいくつかにも、抗ＮＦ−Ｍ染色と比較して強いＡＭＩＧＯ免疫染色が見られたため、ＡＭＩＧＯ陽性である（データは示さない）。
【０２９３】
また、小脳の中心部分の細胞核はＡＭＩＧＯ免疫反応性であった。細胞核においては、ＡＭＩＧＯ染色とＮＦ−Ｍ染色は互いに異なる結果を示した。つまり、ＡＭＩＧＯ染色は神経突起でのみ見られたが、ＮＦ−Ｍ染色は神経突起と細胞体でも見られた。
【０２９４】
橋および延髄 
橋および延髄では、ＡＭＩＧＯ染色は白質に見られた。
【０２９５】
脊髄 
脊髄の横断面では、抗ＡＭＩＧＯ染色は白質に点状構造として見られた。パラフィン切片では、ミエリン鞘は溶け出してしまい、ミエリンが位置した場所に円形の穴を残していた。これらの切片では、ＡＭＩＧＯ染色は穴の中心の点に見られる（図１２、パネルａ）。抗ＮＦ−Ｍ抗体もこの点を染色した（図１２、パネルｃ）が、一方、抗ＣＮＰａｓｅはこの構造を染色しなかった（図１２、パネルｂ）。凍結切片では、ＡＭＩＧＯ染色は有髄軸索の中心に局在し、多層ミエリン鞘内には局在しないことが観察された（データは示さない）。全てのＡＭＩＧＯ陽性軸索が有髄であるのか、またはそうでないかは、光学顕微鏡観察の限界のために明らかではない。
【０２９６】
脊髄の灰白質では、抗ＡＭＩＧＯ抗体はいくつかの神経繊維を染色した。灰白質の繊維のうち、白質に交差しているものだけがＡＭＩＧＯ陽性であった。この結果は、ＡＭＩＧＯはこのような交差している軸索の集団のみに発現していることを示唆する（データは示さない）。
【０２９７】
腎臓、視神経および大腿神経 
腎臓におけるＡＭＩＧＯ染色は、抗ＮＦ−Ｍ染色と共に局在することが分かった。このような染色構造は、自律神経繊維であることが確認された（図１３）。視神経は抗ＡＭＩＧＯ抗体により強く染色されたが、大腿神経は染色されなかった（データは示さない）。
【０２９８】
胚 
Ｅ１８期のラット胚の頭部では、染色は、内包（図１４、パネルｃ）、視索（図１４、パネルａ）、中小脳脚、視床髄条、反屈束および縦束橋（longitudinal fasciculus pons）の神経繊維および神経繊維路で観察された。ＡＭＩＧＯ陽性染色が抗ＮＦ−Ｍ染色と共に局在したが、Ｅ１８期の胚では、ＣＮＰａｓｅは化学組織染色的手法では検出されなかった（データは示さない）。
【０２９９】
Ｅ１６期胚体の切片においては、抗ＡＭＩＧＯ免疫染色は、発生途中の脳領域のいくつかの部位、視神経、および腸と肋骨の近傍の領域でのみ見られた（データは示さない）。
【０３００】
発生段階におけるＡＭＩＧＯの発現 
In situ ハイブリダイゼーションでより詳細にＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡの発現を研究した。ＡＭＩＧＯ アンチセンス プローブは、発生途中の神経組織および成体の神経組織において明確なシグナルを示したが、センス プローブは明確なシグナルを示さなかった（センス プローブについてのデータは示さない）。明確なＡＭＩＧＯ発現は、Ｅ１３期のげっ歯類胚で既に検出されており、この期での最も高いＡＭＩＧＯの発現レベルは、後根神経節および三叉神経節で見られ、中枢神経系でもいくらかの発現が見られた（図４、パネルＡおよびＢ）。発生の後期および成体では、ＡＭＩＧＯは脳でも顕著に発現し、海馬で最も強いシグナルが検出された（図４、パネルＣ）。
【０３０１】
タンパク質レベルでＡＭＩＧＯの発現を調べるために、ＡＭＩＧＯに存在するが、ＡＭＩＧＯ２とＡＭＩＧＯ３には存在しない、細胞外領域の１０個のアミノ酸からなるペプチド配列に対するポリクローナル抗血清を製造した。このような抗ペプチド抗体は、ショウジョウバエのＳ２細胞で産生された７５ｋＤ ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質を認識した（図５、レーン１と３）。脳粗抽出物を用いたウェスタンブロットにより、６５ｋＤ ポリペプチドに対する特異的な結合が明らかになった（図５、レーン２と４）。認識されたポリペプチドの分子量は、計算したＡＭＩＧＯの分子量（５６ｋＤ）に近似している。抗体の、融合タンパク質への結合と脳の６５ｋＤ ポリペプチドへの結合は、いずれも免疫原として用いた合成ペプチドによって遮断された（図５、レーン３〜６）。
【０３０２】
様々な発生段階の脳粗抽出物を用いたＡＭＩＧＯのウェスタンブロットの結果は、in situ ハイブリダイゼーションのデータと一致した。脳におけるＡＭＩＧＯの発現は、末梢神経系における発現よりもいくらか遅く始まり、Ｅ１３期とＥ１４期の間にはっきりと増加する（図６）。周生期発生段階ではＡＭＩＧＯの発現は高く維持されるが、出生後のＰ６期〜Ｐ１０期の間は下向きに調節される。この後、ＡＭＩＧＯの発現は再度上向きに調節され、成体の脳では高い発現が維持される（図６）。出生後にＡＭＩＧＯの発現が上向きに調節される期間が、ミエリン形成の開始と一致すると考えられるため、ＡＭＩＧＯの発現をミエリン特異的マーカーであるα−ＣＮＰａｓｅの発現と比較した。実際に、ＡＭＩＧＯの発現とＣＮＰａｓｅの発現は、出生後発生において平行に増加する（図６）。したがって、ＡＭＩＧＯの発現は脳の発生において次の２つの特徴を示す。１回目のＡＭＩＧＯの発現のピークは後期胚発生および周生期発生に生じ、２回目のＡＭＩＧＯの発現の増加はミエリン形成を伴う。
【０３０３】
抗ペプチド抗体を用いた免疫組織染色により、神経系のみで見られる特異的な染色が明らかになった。一般的に、免疫染色の強度は、ウェスタンブロットの結果から推測される発現データ（図６）と一致した。さらに、免疫染色の特異性は、免疫原として用いたペプチドによって組織切片への抗体の結合が阻害されたことにより示唆された（図５、パネルＢ）。一般的に、ＡＭＩＧＯは発生途中および成熟した繊維路で高い染色強度を示した。脊髄神経節が豊富にＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡを発現する胚発生の途中では（図４参照）、神経節と脊髄に接続する繊維路で免疫染色が観察されたが、神経節自体では観察されなかった（図７、パネルＡ）。これは、ＡＭＩＧＯタンパク質が軸索突起に運ばれることを示唆している。小脳では、最も強い染色はプルキンエ細胞層の両側の繊維で観察された。プルキンエ細胞体の周辺のバスケット細胞軸索によって形成される独特の構造は、ＡＭＩＧＯ免疫染色により明確に識別された（図７、パネルＢ）。ウェスタンブロットで得たデータと一致して、ＡＭＩＧＯ免疫染色は、成体の有髄軸索路のほとんどを標識した。一例を図７（パネルＣおよびＤ）に示したが、この図は海馬周辺のＡＭＩＧＯ免疫染色結果およびα−ＣＮＰａｓｅ免疫染色結果の類似性を示す。しかし、ＡＭＩＧＯの発現は有髄繊維路に限定されない。例えば、海馬では、α−ＣＮＰａｓｅに対して陰性（図７、パネルＤ）で、ミエリン塩基性タンパク質に対しても陰性（データは示さない）であった透明層のＣＡ３領域の無髄繊維路がＡＭＩＧＯに対する染色で明確に染色された（図７、パネルＣ）。一般的に、（発生途中および成体動物の両方において）１４５ｋＤのニューロフィラメントに対する抗体によっても染色された、直径の大きい神経突起（軸索）においてＡＭＩＧＯ染色は検出された（データは示さない）。前脳と同様に、小脳、橋、髄質および脊髄の有髄軸索路もＡＭＩＧＯに対する染色を示した。
【０３０４】
ＡＭＩＧＯは、培養海馬ニューロンの細胞体、ならびに束形成している突起および束形成していない突起においても明確に免疫染色された（図７、パネルＦ）。組織切片の免疫染色結果から予想されたように、二重免疫染色により、ＡＭＩＧＯは１４５ｋＤのニューロフィラメントおよびβ−チューブリン（ＴｕＪ１）と共に局在するが、ＭＡＰ２とは局在しないことが明らかとなった（結果は示さない）。したがって、ＡＭＩＧＯは樹状突起よりも軸索突起に選択的に発現する。
【０３０５】
ＡＭＩＧＯは海馬ニューロンの神経突起伸長を促進する 
アンフォテリン上で神経突起を伸長している海馬ニューロンからＡＭＩＧＯを同定したこと、in vivoで繊維路が生じること、およびＬＲＲドメインとＩｇドメインを含むドメイン構造を有することは、ＡＭＩＧＯが神経突起伸長における役割を担うことを示唆する。ＡＭＩＧＯの機能を理解するために、ＡＭＩＧＯが海馬ニューロンの神経突起伸長を促進することができるかどうかを試験した。ＡＭＩＧＯの細胞外領域をヒトＩｇＧ Ｆｃ部位と融合し、この融合タンパク質をマイクロタイターウェルに固定し、海馬ニューロンの基材として用いた。これらの実験は、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質が海馬ニューロンの接着と神経突起伸長を促進する（図８、パネルＡおよびＣ）が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ対照タンパク質上では、神経突起伸長は非常に低いか、検出不能な値である（図８、パネルＢおよびＣ）ことを示した。固定したＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質の誘導する神経突起伸長は、培地中の可溶性ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質によって阻害された（図８、パネルＤ）。
【０３０６】
可溶性ＡＭＩＧＯはin vitroで束形成軸索路の発生を妨げる 
ＡＭＩＧＯ免疫染色が、in vitro の海馬の束形成軸索、およびin vivo の軸索路で検出されたことから、ＡＭＩＧＯは神経突起の束形成に関与すると考えた。ＡＭＩＧＯの細胞外ドメインを培地に含まれるＩｇ融合タンパク質として使用し、ドミナントネガティブ変異体を用いたアプローチによりこの問題に取り組んだ。海馬ニューロンをポリ−Ｌ−リシンで被覆したウェルに植え付けて、神経突起伸長と束形成を促進した。培養物の顕微鏡観察の結果は、可溶性ＡＭＩＧＯの存在下で神経突起の伸長パターンが劇的に変化したことを示した。対照培養では、神経突起は４日間の培養で束形成したが、可溶性ＡＭＩＧＯの存在下では、少なくとも培養の５日目までは、突起はほとんど束形成しなかった（図９、パネルＡ〜Ｃ）。
【０３０７】
ＡＭＩＧＯはホモフィリックな結合機構を示す 
軸索の束形成は、ホモフィリックな相互作用と関与することが知られており、これは可溶性ＡＭＩＧＯが束形成を妨げる理由であると考えられる。したがって、ＡＭＩＧＯがＡＭＩＧＯ自身に結合することができるかどうかを、共免疫沈降アッセイによって試験した。ＡＭＩＧＯ−ＡＭＩＧＯ会合を調べるために、ＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯ（図１０、パネルＡ、レーン１〜４）を、Ｖ５タグを付した全長ＡＭＩＧＯ（図１０、パネルＡ、レーン１）またはＶ５タグを付した可溶性ＡＭＩＧＯ細胞外ドメイン（図１０、パネルＡ、レーン２）と共に２９３細胞にコトランスフェクトした。細胞溶解物中に存在する２つの形態のＡＭＩＧＯ−Ｖ５は、ＡＭＩＧＯ−ＧＦＰを沈降し（図１０、パネルＡ、レーン１および２）、同様に、全長ＡＭＩＧＯ−Ｖ５および可溶性ＡＭＩＧＯ−Ｖ５は抗ＧＦＰ抗体で沈降した（図１０、パネルＡ、レーン１および２）。Ｖ５タグを付したＡＭＩＧＯを細胞にトランスフェクトしなかった場合には、共免疫沈降は観察されなかった（図１０、パネルＡ、レーン３）。対照タンパク質であるＶ５タグを付したヒトＲＡＧＥは、ＡＭＩＧＯ−ＧＦＰでは共免疫沈降せず、反対の場合も同様であった（図１０、パネルＡ、レーン３）。
【０３０８】
ＡＭＩＧＯのホモフィリックな結合を研究するための別のアプローチとして、プロテインＡで被覆したビーズにＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質を添加して、ＡＭＩＧＯタンパク質が細胞表面に存在するように配向させた。ＡＭＩＧＯはこのようなビーズを急速に凝集させたが（図１０、パネルＢおよびＣ）、対照タンパク質であるＩｇＧ Ｆｃ部位のビーズへの添加は凝集を全く誘導しなかった（図１０、パネルＢおよびＤ）。
【０３０９】
ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ２のＥＧＦＲとの共免疫沈降 
この実験の結果、ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ２は両方ともＥＧＦＲに結合し、ＥＣ領域のみが結合には十分なことが判明した（ＡＭＩＧＯについてのみデータを示した、図２７）。
【０３１０】
ＡＭＩＧＯはＥＧＦＲのリン酸化を阻害する 
ＡＭＩＧＯとＦｌａｇタグを付したヒトＥＧＦＲが一緒に発現している場合、ＡＭＩＧＯは、ＡＭＩＧＯ２、ＡＭＩＧＯ３および対照ベクターと比較して、ＥＧＦの結合によって誘導されるＥＧＦＲの自己リン酸化を明確に阻害することができた（図２９）。
【０３１１】
ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のホモフィリックな結合およびヘテロフィリックな結合 
共免疫沈降の結果により、各ＡＭＩＧＯはヘテロフィリックに互いに結合し、さらにホモフィリックな結合特性も有することが明らかになった（図２８）。
【０３１２】
考察
６個のＬＲＲおよび１個のＩｇ様ドメインを有する膜貫通型タンパク質の新規なファミリー 
本研究において、本発明者らはＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３と呼ばれる膜貫通型タンパク質の新規なファミリーを同定した。これら３種のタンパク質は互いに明確な相同性を示し、種々のドメインの長さや位置は高い同一性を示した（図２、パネルＢ）。このようなドメインの関係性は、３種のＡＭＩＧＯの進化上の起源が同じであることを示唆する。
【０３１３】
ゲノム配列データによると、これらの３種のタンパク質はおそらくフグ（Fugu rubripes）に存在する（データは示さない）。興味深いことに、ショウジョウバエにはkekkonと呼ばれるタンパク質ファミリーが存在し、この膜貫通型タンパク質の３種のメンバーであるkek1、kek2（Musacchio and Perrimon, 1996）およびkek3（Ashburner et al., 1999）は細胞外領域においてＡＭＩＧＯと相同性を示す。ＡＭＩＧＯとkekタンパク質の細胞外領域はいずれも６個のＬＲＲドメイン、それに隣接するシステイン−リッチＬＲＲ ＮＴドメインとシステイン−リッチＬＲＲ ＣＴドメインおよび貫通領域近傍に１個の免疫グロブリンドメインを含有する。しかし、ＡＭＩＧＯタンパク質とkekタンパク質の細胞質領域は互いに相同性を示さない。kek1 および kek2（Musacchio and Perrimon, 1996）の遺伝子発現データは、ＡＭＩＧＯおよびＡＭＩＧＯ２の遺伝子発現データを連想させ、これらは全て成体生物の中枢神経系に発現している。このようなドメインおよび発現の類似性は、ＡＭＩＧＯタンパク質とkekタンパク質が共通の先祖遺伝子から誘導された可能性を示唆する。
【０３１４】
細胞外領域では、ＡＭＩＧＯ間で最も相同性の高いモチーフはＬＲＲ３〜５である。ＢＬＡＳＴサーチで最も適合度の高かったものは、細胞外軸索誘導タンパク質のSlitファミリーであり（Whitford et al., 2002）、Nogo-66受容体との明確な相同性も見られたが、認識可能なモチーフはＬＲＲドメインのみである（Fournier et al., 2001）（図１１）。ＡＭＩＧＯ、Slit1およびNogo-66受容体のＬＲＲに見られる類似性は、これらのタンパク質が進化上の起源が同じ祖先から誘導されたものであることを示唆する。ＡＭＩＧＯ間でＬＲＲに見られる明確な保存性は、この領域が細胞外リガンドとの相互作用に重要であること、そして同じ結合パートナーを共有し得ることを示唆する。
【０３１５】
文献には、ＬＲＲドメインとＩｇドメインを細胞外領域に含んでいる他の膜貫通型タンパク質に関する報告がある。そのようなタンパク質は、５個のＬＲＲと１個のＩｇドメインを有するISLR（Nagasawa et al., 1997）、５個のＬＲＲと１個のＩｇドメインを有するPal（Gomi et al., 2000）、１５個のＬＲＲと３個のＩｇドメインを有するLIG-1（Suzuki et al., 1996）、および１２個のＬＲＲと１個のＩｇドメインを有するGAC1（Almeida et al., 1998）である。これらのタンパク質全てと３種のＡＭＩＧＯに共通なのは、ＬＲＲが常にＩｇドメインより膜貫通領域に対して遠位に位置するという、ＬＲＲドメインとＩｇドメインの配列の順序である。興味深いことに、ＡＭＩＧＯから得たＩｇドメイン配列を用いたＢＬＡＳＴサーチは、Ｉｇスーパーファミリータンパク質の他のＩｇドメインとは明確な相同性を示さないが、最も近いものはＩｇドメインとＬＲＲドメインの両方を含有するタンパク質に見られるものである（データは示さない）。 
【０３１６】
ＡＭＩＧＯの細胞質内部分はこれまでに特徴付けられた膜貫通型タンパク質と明確な相同性を示さないが、３種のＡＭＩＧＯのアライメント（図２、パネルＡ）は保存された２個のセリン−リッチ領域を示す。一方は膜貫通ドメインの近傍に存在し、もう一方はＣ末端に存在する。ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ２のＣ末端 セリン−リッチ領域は、脳で偏在的に発現するセリン／スレオニン キナーゼであるカゼイン キナーゼ II（ＣＫ２）のコンセンサス配列（Allende et al., 1995）を有するが、脳で発現していないＡＭＩＧＯ３はこの配列を有していない。近年、Watts et al. (1999)は、膜貫通型のＴＮＦ−αがカゼインキナーゼ I（ＣＫ１）依存性リン酸化反応の基質であるコンセンサス配列 SXXS を有することを報告した。興味深いことに、３種のＡＭＩＧＯの全てが、保存された２個のセリン−リッチ領域に、ＣＫ１リン酸化部位となり得る４つの部位を有している。これらの保存されたセリン残基が、ＡＭＩＧＯのシグナル伝達事象に重要な役割を有するかどうかは今後の研究によって明らかにされるであろう。
【０３１７】
ＬＲＲドメインとＩｇドメインの両方を有する、哺乳類の膜貫通型タンパク質に関する報告が文献およびデータバンクに増えているが、残念ながら、現在のところそのようなデータのほとんどはこれらのタンパク質のクローニングと組織発現に関するものだけである。本願のデータは、これらのＬＲＲスーパーファミリーとＩｇスーパーファミリーの両方に属する、２つのモチーフを有する膜貫通型タンパク質の機能に関する洞察を、ＡＭＩＧＯのより詳細な特徴付けという形で示す。
【０３１８】
ＡＭＩＧＯ：神経突起に存在する、ホモフィリックな結合機構を有する新規な膜貫通型タンパク質 
ＲＴ−ＰＣＲ実験、in situ ハイブリダイゼーションおよび免疫組織染色に基づき、ＡＭＩＧＯは実質的に神経系特異的なタンパク質であることが判明した。興味深いことに、ＡＭＩＧＯの発現は脳の発生過程におけるはっきりと認識することのできる２つの段階において上向きに調節される。１回目の発現のピークは周生期に見られ、２回目の発現上昇は、乏突起膠腫細胞特異的マーカーであるα−ＣＮＰａｓｅが上向きに調節されている間、またはそれより若干前に生じる。
【０３１９】
ＡＭＩＧＯの１回目の発現ピークは、軸索結合の増加における役割と一致する。このＡＭＩＧＯの役割は、in vivo と in vitro の両方における発生途中の軸索路におけるＡＭＩＧＯの発現および本発明者らが行った神経突起伸長実験が裏付けとなる。軸索結合の増加における細胞機構の１つが束形成、即ち、パイオニア軸索を後続軸索の成長円錐の基底として軸索が互いに沿って伸長することである。興味深いことに、培地に含まれるＡＭＩＧＯの細胞外ドメインのドミナントネガティブ変異体を用いたアプローチは、ＡＭＩＧＯの束形成における役割をはっきりと示唆した。さらに、ＡＭＩＧＯは、その束形成における役割を説明するホモフィリックな結合機構を示す。Ｉｇスーパーファミリーおよびカドへリンファミリーの両方に属するホモフィリックな付着分子が、神経系の発生過程において、神経突起伸長および束形成を仲介することが報告されている（Kamiguchi and Lemmon, 1997 および Martinek and Gaul, 1997を参照されたい）。また、ＡＭＩＧＯのＬＲＲ配列が、軸索の伸長、再生および誘導に関与すると報告されているSlitタンパク質やNogo受容体と相同性を示す点も注目すべきである（図１１）。
【０３２０】
ＡＭＩＧＯの２回目の発現上昇は、ミエリン形成における役割を示唆している。ＡＭＩＧＯが発生のこの段階の細胞間相互作用も仲介すると考えることは妥当である。しかし、ミエリン形成している軸索路（例えば、乏突起膠腫細胞やシュワン細胞と相互作用している軸索）におけるＡＭＩＧＯの役割がさらなる研究によって立証されることは明確である。さらにＡＭＩＧＯの発現は成人期まで高いまま維持される。これは、繊維路発生機構の一般的な反復機構である、成人繊維路の再生と可塑性においてＡＭＩＧＯが役割を担うことを示唆している。
【０３２１】
発生段階および成人期におけるＡＭＩＧＯの機能的役割への理解をさらに深めるために、本発明者らは、近年、ＥＳ細胞における遺伝子を標的とし、現在、ＡＭＩＧＯを持たないマウス（ＡＭＩＧＯ null mice）（Kuja-Panula and Rauvala、未出版）を作製している。遺伝子ターゲティングを用いたin vivo でのアプローチに加えて、どの分子ドメインがホモフィリックな結合を仲介するのか、そしてＡＭＩＧＯの細胞内ドメインがシグナル伝達特性を有するのかどうかを理解することが重要になるであろう。さらに、本願で軸索路におけるＡＭＩＧＯについて特徴付けたように、今後の研究により、ＡＭＩＧＯファミリーのメンバーが非神経系組織における類似の細胞間相互作用を仲介するのかどうかが明らかになるであろう。
【０３２２】
本発明の方法は種々の態様に組み込むことができ、本願に開示されているのはその一部に過ぎないと認められる。他の態様が存在し、それは本発明の精神から外れるものではないことは当業者には明らかである。したがって、本発明の諸態様は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０３２３】
発明の背景を明らかにするため、特に、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本願で使用した出版物とその他の資料は、この記載によって本明細書に組み込まれているものとする。
【０３２４】
実施例に記載した参考文献のリスト 
Agarwala, K.L., S. Ganesh, Y. Tsutsumi, T. Suzuki, K. Amano, and K. Yamakawa. 2001. Cloning and functional characterization of DSCAML1, a novel DSCAM-like cell adhesion molecule that mediates homophilic intercellular adhesion. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285:760-772.
Allende, J.E. and C.C. Allende. 1995. Protein kinases. 4. Protein kinase CK2: an enzyme with multiple substrates and a puzzling regulation. FASEB. J. 9:313-323.
Almeida, A., X.X. Zhu, N. Vogt, R. Tyagi, M. Muleris, A.M. Dutrillaux, B. Dutrillaux, D. Ross, B. Malfoy, and S. Hanash. 1998. GAC1, a new member of the leucine-rich repeat superfamily on chromosome band 1q32.1, is amplified and overexpressed in malignant gliomas. Oncogene. 16:2997-3002.
Ashburner, M., S. Misra, J. Roote, S.E. Lewis, R. Blazej, T. Davis, C. Doyle, R. Galle, R. George, N. Harris, G. Hartzell, D. Harvey, L. Hong, K. Houston, R. Hoskins, G. Johnson, C. Martin, A. Moshrefi, M. Palazzolo, M.G. Reese, A. Spradling, G. Tsang, K. Wan, K. Whitelaw, and S. Celniker. 1999. An exploration of the sequence of a 2.9-Mb region of the genome of Drosophila melanogaster: the Adh region. Genetics. 153:179-219.
Battye, R., A. Stevens, and J.R. Jacobs. 1999. Axon repulsion from the midline of the Drosophila CNS requires slit function. Development. 126:2475-2481.
Battye, R., A. Stevens, R.L. Perry, and J.R. Jacobs. 2001. Repellent signaling by Slit requires the leucine-rich repeats. J. Neurosci. 21:4290-4298.
Brose, K., K.S. Bland, K.H. Wang, D. Arnott, W. Henzel, C.S. Goodman, M. Tessier-Lavigne, and T. Kidd. 1999. Slit proteins bind Robo receptors and have an evolutionarily conserved role in repulsive axon guidance. Cell. 96:795-806.
Chen, M.S., A.B. Huber, M.E. van der Haar, M. Frank, L. Schnell, A.A. Spillmann, F. Christ, and M.E. Schwab. 2000.  Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature. 403: 434-439.
Drescher, U., A. Faissner, R. Klein, F.G. Rathjen, and C. Sturmer. 1997. Axonal growth and pathfinding: from phenomena to molecules. Cell Tissue Res. 290:187-188.
Fournier, A.E., T. GrandPre, and S.M. Strittmatter. 2001. Identification of a receptor mediating Nogo-66 inhibition of axonal regeneration. Nature. 409:341-346.
Gomi, F., K. Imaizumi, T. Yoneda, M. Taniguchi, Y. Mori, K. Miyoshi, J. Hitomi, T. Fujikado, Y. Tano, and M. Tohyama. 2000. Molecular cloning of a novel membrane glycoprotein, pal, specifically expressed in photoreceptor cells of the retina and containing leucine-rich repeat. J. Neurosci. 20:3206-3213.
Kajava, A.V. 1998. Structural diversity of leucine-rich repeat proteins. J. Mol. Biol. 277:519-527.
Kamiguchi, H. and V. Lemmon. 1997. Neural cell adhesion molecule L1: signaling pathways and growth cone motility. J. Neurosci. Res. 49:1-8.
Logan, A., M. Berry, A. M. Gonzalez, S. A. Frautschy, M. B. Sporn, and A. Baird. 1994. Effects of transforming growth factor b1 on scar production in the injured central nervous system. Eur. J. Neurosci. 6: 355_363.
Martinek, S. and U. Gaul. 1997. Neural development: how cadherins zipper up neural circuits. Curr. Biol. 7:R712-R715.
Matz, M., N. Usman, D. Shagin, E. Bogdanova, and S. Lukyanov. 1997. Ordered differential display: a simple method for systematic comparison of gene expression profiles. Nucleic Acids Res. 25:2541-2542.
Muller, S., P. Scaffidi, B. Degryse, T. Bonaldi, L. Ronfani, A. Agresti, M. Beltrame, and M.E. Bianchi. 2001. New EMBO members' review: the double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signal. EMBO. J. 20:4337-4340.
Musacchio, M. and N. Perrimon. 1996. The Drosophila kekkon genes: novel members of both the leucine-rich repeat and immunoglobulin superfamilies expressed in the CNS. Dev. Biol. 178:63-76.
Nagasawa, A., R. Kubota, Y. Imamura, K. Nagamine, Y. Wang, S. Asakawa, J. Kudoh, S. Minoshima, Y. Mashima, Y. Oguchi, and N. Shimizu. 1997. Cloning of the cDNA for a new member of the immunoglobulin superfamily (ISLR) containing leucine-rich repeat (LRR). Genomics. 44:273-279.
Nielsen, H., J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng. 10:1-6.
Pusch, C.M., C. Zeitz, O. Brandau, K. Pesch, H. Achatz, S. Feil, C. Scharfe, J. Maurer, F.K. Jacobi, A. Pinckers, S. Andreasson, A. Hardcastle, B. Wissinger, W. Berger, and A. Meindl. 2000. The complete form of X-linked congenital stationary night blindness is caused by mutations in a gene encoding a leucine-rich repeat protein. Nat. Genet. 26:324-327.
Rauvala, H. and R. Pihlaskari. 1987. Isolation and some characteristics of an adhesive factor of brain that enhances neurite outgrowth in central neurons. J. Biol. Chem. 262:16625-16635.
Rauvala, H., H.J. Huttunen, C. Fages, M. Kaksonen, T. Kinnunen, S. Imai, E. Raulo, and I. Kilpelainen. 2000. Heparin-binding proteins HB-GAM (pleiotrophin) and amphoterin in the regulation of cell motility. Matrix Biol. 19:377-387.
Reponen, P., C. Sahlberg, C. Munaut, I. Thesleff, and K. Tryggvason. 1994. High expression of 92-kD type IV collagenase (gelatinase B) in the osteoclast lineage during mouse development. J. Cell Biol. 124:1091-1102.
Schachner, M. 1997. Neural recognition molecules and synaptic plasticity. Curr. Opin. Cell Biol. 9:627-34.
Stoeckli, E.T. and L.T. Landmesser. 1998. Axon guidance at choice points. Curr. Opin. Neurobiol. 8:73-79.
Suzuki, Y., N. Sato, M. Tohyama, A. Wanaka, and T. Takagi. 1996. cDNA cloning of a novel membrane glycoprotein that is expressed specifically in glial cells in the mouse brain. LIG-1, a protein with leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains. J. Biol. Chem. 271:22522-22527.
Tessier-Lavigne, M. and C.S. Goodman. 1996. The molecular biology of axon guidance. Science. 274:1123-1133.
Van Vactor, D. 1998. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr. Opin. Neurobiol. 8:80-86.
Walsh, F.S. and P. Doherty. 1997. Neural cell adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily: role in axon growth and guidance. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13:425-456.
Watts, A.D., N.H. Hunt, Y. Wanigasekara, G. Bloomfield, D. Wallach, B.D. Roufogalis, and G. Chaudhri. 1999. A casein kinase I motif present in the cytoplasmic domain of members of the tumour necrosis factor ligand family is implicated in 'reverse signalling'. EMBO. J. 18:2119-2126.
Whitford, K.L., V. Marillat, E. Stein, C.S. Goodman, M. Tessier-Lavigne, A. Chedotal, and A. Ghosh. 2002. Regulation of cortical dendrite development by Slit-Robo interactions. Neuron. 33:47-61.
【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】海馬ニューロンのアンフォテリン誘導性遺伝子としての、ＡＭＩＧＯのクローニング。パネルＡ：ゲル電気泳動を用いたオーダード ディファレンシャル ディスプレイ法による分析。ＡＭＩＧＯに対応するバンド（矢印で示したもの）は配列決定のために切り出した。レーン１はアンフォテリン マトリクスから得たサンプル、レーン２はラミニン マトリクスから得たサンプルである。パネルＢ：ＡＭＩＧＯの誘導をＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した結果。レーン１はアンフォテリン上の海馬ニューロンから得たＲＴ−ＰＣＲ反応産物であり、レーン２はラミニン上の海馬ニューロンから得たＲＴ−ＰＣＲ反応産物である。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を対照として分析した。
【図２】ヒトのＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３の一次構造。パネルＡ：上記３種のＡＭＩＧＯのアライメントであり、全てのＡＭＩＧＯ間で同一なアミノ酸は赤地に白い文字で示し、類似しているアミノ酸は赤地に黒い文字で示す。ＡＭＩＧＯに見出だされた種々のドメインは、そのドメインを構成する配列の上に色つきの枠で示す。パネルＢ：３種のＡＭＩＧＯを示す概略図である。
【図３】種々の成体マウス組織における、ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のＲＴ−ＰＣＲ ｍＲＮＡ分析。ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の略である。
【図４】ＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡのin situ ハイブリダイゼーション法による分析。パネルＡとＢ：Ｅ１３期のマウス胚では、ＡＭＩＧＯ ｍＲＮＡの発現は後根神経節（パネルＡおよびＢの「ＤＲＧ」）および三叉神経節（パネルＡの「ＴＧ」）が最も高い。パネルＣ：成体マウス大脳では、最も強いシグナルを示す歯状回（ＤＧ）を有する海馬体においてＡＭＩＧＯの発現は最も高い。錐体細胞層（ＣＡ１とＣＡ３）もＡＭＩＧＯを発現している。
【図５】組換えＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質および抗ＡＭＩＧＯ抗体の特徴付け。パネルＡ：組換えＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（レーン１、３および５）および成体ラット脳由来タンパク質溶解物（レーン２、４および６）を銀染色法（レーン１と２）またはウサギ抗ＡＭＩＧＯ抗体を用いたイムノブロット法（レーン３〜６）により分析した結果。抗ＡＭＩＧＯ抗体は、ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（レーン３）とラット脳溶解物の６５ｋＤのバンド（レーン４）の両方を認識する。ＡＭＩＧＯに対応するバンドへの抗体の結合は、免疫に使用したペプチドにより阻害される（パネルＡのレーン５と６）。組織切片もまた、上記ペプチドにより用量依存的に阻害される（パネルＢに、成体の小脳の免疫組織染色による分析結果として示した）。
【図６】脳の発生の際のＡＭＩＧＯの発現には２つの特徴がある。様々な発生段階の脳の粗抽出物を用いたウェスタンブロット法によるＡＭＩＧＯの分析によって、後期胚発生（Ｅ）と出生後発生における明確なＡＭＩＧＯ発現が明らかとなり、発現はＥ１４期から始まる。ＡＭＩＧＯの発現は出生後（Ｐ）のＰ６期〜Ｐ１０期の間は下向きに調節される。ＡＭＩＧＯの発現はＰ１０期とＰ１２期に再度上向きに調節され、成体の脳では高い発現が維持される。ＣＮＰａｓｅ発現との比較から分かるように、上向きの調節はミエリン形成の開始と一致する。ＡＭＩＧＯの発現とＣＮＰａｓｅの発現は、出生後発生において平行に増加する。Ｗは出生後の週齢を表す。
【図７】組織および培養細胞では、ＡＭＩＧＯは軸索繊維路に局在する。ラット組織の免疫組織染色により、ＡＭＩＧＯが神経系で特異的に発現していることが明らかになった。Ｅ１５胚（パネルＡ）では、発生中の繊維路および神経、例えば、脊髄（ＳＣ）の辺縁層（ｍｌ）の腹側部および後根神経節（ＤＲＧ）や脊髄に接続する神経、に免疫染色が観察される。成体（パネルＢ、Ｃ、ＤとＥ）では、ＡＭＩＧＯは神経繊維でも検出された。小脳（パネルＢ）では、バスケット細胞軸索によってプルキンエ細胞体（ｐ）の周囲に形成された独特なかご状構造（矢印で示す）に見られるように、顆粒細胞層（Ｇ）の両側の繊維に最も強い染色が検出された。小脳白質（Ｗ）の繊維も染色されている。矢状断面における海馬周辺のＡＭＩＧＯに対する染色（パネルＣ）およびＣＮＰａｓｅに対する染色（パネルＤ）が示した同様の結果から明かなように、一般的に有髄繊維路は、動物成体においてはっきりと染色される。小脳のバスケット細胞軸索に加えて、海馬の無髄繊維も染色されている（パネルＣ、拡大図はパネルＥ）。このような海馬のＣＮＰａｓｅ陰性繊維は、ＣＡ３錐体細胞体の近傍に存在する。培養海馬ニューロン（パネルＦ）では、免疫蛍光染色によって神経突起でもＡＭＩＧＯが検出される。Ｇは小脳皮質の顆粒細胞層であり、Ｍは小脳皮質の分子層であり、ＣＡ１はＣＡ１領域であり、ＣＡ３はＣＡ３領域であり、そしてｈは門である。パネルＡ、Ｂ、ＥおよびＦ中のスケールバーは５０μｍであり、パネルＣおよびＤ中のスケールバーは５００μｍである。
【図８】ＡＭＩＧＯは海馬ニューロンの神経突起の伸長を促進する。パネルＡ：２５μｇ／ｍｌのＡＭＩＧＯで被覆した基材は、Ｅ１８期の海馬ニューロンの神経突起伸長を促進する。パネルＢ：２５μｇ／ｍｌの、ＡＭＩＧＯ細胞外ドメインを含まないＦｃタンパク質で被覆した対照基材上の細胞を比較のために示す。パネルＣ：２４時間培養後の、ＡＭＩＧＯ誘導性海馬神経突起伸長。基材に被覆したＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（グレーの棒）およびＦｃ対照タンパク質（黒い棒）の量は以下の通りである：０μｇ／ｍｌ（１）、３．１２５μｇ／ｍｌ（２）、６．２５μｇ／ｍｌ（３）、１２．５μｇ／ｍｌ（４）、２５μｇ／ｍｌ（５）、５０μｇ／ｍｌ（６）および１００μｇ／ｍｌ（７）。パネルＤ：ＡＭＩＧＯ誘導性神経突起伸長（２５μｇ／ｍｌのＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質で被覆した基材を使用）が、アッセイ培地中のＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質によって遮断される。培地に添加したＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（グレーの棒）およびＦｃ対照タンパク質（黒い棒）の量は以下の通りである：０μｇ／ｍｌ（１）、３．１２５μｇ／ｍｌ（２）、６．２５μｇ／ｍｌ（３）、１２．５μｇ／ｍｌ（４）、２５μｇ／ｍｌ（５）、５０μｇ／ｍｌ（６）および１００μｇ／ｍｌ（７）。エラーバーは、３つの独立した実験で観察した１５個の顕微鏡視野から計算した標準偏差を示す。パネルＡおよびＢ中のスケールバーは５０μｍである。
【図９】可溶性ＡＭＩＧＯは海馬ニューロンの束形成を阻害する。パネルＡ：２５μｇ／ｍｌのＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質を含む培地における、ポリ−Ｌ−リシン基材上のＥ１８海馬ニューロン。パネルＢ：比較のための、２５μｇ／ｍｌのＦｃ対照タンパク質の存在下における、ポリ−Ｌ−リシン基材上のＥ１８海馬ニューロン。パネルＣ：ポリ−Ｌ−リシン基材上の、（１〜３本の神経突起で形成される）直径２μｍ未満の突起の長さの合計。培地に添加したＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（グレーの棒）およびＦｃ対照タンパク質（黒い棒）の量は以下の通りである：０μｇ／ｍｌ（白い棒）（１）、３．１２５μｇ／ｍｌ（２）、６．２５μｇ／ｍｌ（３）、１２．５μｇ／ｍｌ（４）および２５μｇ／ｍｌ（５）。パネルＣ中のエラーバーは３つの独立した実験で観察した１２個の顕微鏡視野から計算した標準偏差を示す。パネルＡおよびＢ中のスケールバーは５０μｍである。
【図１０】ＡＭＩＧＯのホモフィリックな相互作用。パネルＡ：共免疫沈降実験。レーン１はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯおよびＶ５タグを付した全長ＡＭＩＧＯでトランスフェクトした細胞であり、レーン２はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯおよびＶ５タグを付した可溶性ＡＭＩＧＯでトランスフェクトした細胞であり、レーン３はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯのみでトランスフェクトした細胞であり、レーン４はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯおよびＶ５タグを付した全長ヒトＲＡＧＥでトランスフェクトした細胞である。ＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯは、Ｖ５タグを付した全長ＡＭＩＧＯで共免疫沈降し（レーン１）、細胞外ドメインのみを含有する、Ｖ５タグを付した可溶性ＡＭＩＧＯでも共免疫沈降した（レーン２）。ＧＦＰ抗体を用いた沈降によっても共免疫沈降は生じた。パネルＢ：ビーズ凝集の動態。ＮtおよびＮ0はそれぞれ、インキュベーション時間ｔおよび０における粒子の総数を表す。ビーズ凝集の程度は、Ｎt／Ｎ0を指標として表す。グレーの棒はＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質で被覆されたビーズを示し、黒い棒はＦｃタンパク質で被覆されたビーズを示す。パネルＣとＤ：プロテインＡビーズの６０分後のビーズ凝集状態であり、パネルＣはＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質で被覆したビーズ、パネルＤはＦｃ対照タンパク質で被覆したビーズを表す。エラーバーは３つの独立した実験で観察した１２個の顕微鏡視野から計算した標準偏差を示す。
【図１１】Slit1、Nogo受容体およびＡＭＩＧＯの有するロイシンリッチ−リピート領域の多重アライメント。Slit1とNogo受容体のアミノ酸配列のうち、ＡＭＩＧＯと同一のアミノ酸は黒で示し、類似のアミノ酸はグレーで示す。ＡＭＩＧＯの６個のＬＲＲモチーフのコンセンサス配列はアミノ酸配列の上に記す。
【図１２】免疫グロブリンドメインの三次元構造の概略図。Ｉｇ−ドメインは、２つの逆平行βシートに挟まれている（Principles of Biochemistry (生化学の原理), Horton et al., 2002）。
【図１３】リボヌクレアーゼ阻害剤の構造。パネル（ａ）：MOLSCRIPTというプログラムで作成した、ブタＲＩの構造を示すリボン図。パネル（ｂ）：ブタＲＩのＬＲＲのコンセンサス配列と二次構造。ＲＩの配列のアライメントは、２種の反復配列（ＡとＢ）が配列中で交互になるように行った。アミノ酸の一文字表記を用いた。「ｘ」はいかなるアミノ酸でもよく、「ａ」は脂肪族アミノ酸である。全てのＬＲＲタンパク質中で強固に保存されている反復配列の部分を下線で示し、保存されている残基は太字で示す。配列の下に実線を引いた部分はＩｇ−シートとヘリックスのコア領域であり、種々の反復配列に見られるヘリックスの拡張部分を点線で示す（Kobe and Deisenhofer, 1995）。
【図１４】ＲＮａｓｅ Ａ−ＲＩ複合体の構造。リボン図では、ＲＮａｓｅ Ａは暗色、ＲＩは淡色で示す（Kobe and Deisenhofer, 1995）。
【図１５】いくつかのＬＲＲ含有タンパク質の構造の概略図。タータン（tartan）はショウジョウバエの発生に関与するタンパク質である（Chang et al., 1993 および Milan et al., 2001）。Slitタンパク質は、この図には示さないドメインを更に含有する。Ｓｉｇはシグナルペプチドであり、ＡＦＲはアミノ末端隣接領域であり、ＬＲＲはロイシン−リッチリピートであり、ＣＦＲはカルボキシル末端隣接領域であり、そしてＰＩはホスファチジルイノシトールである（Hayata et al., 1998）。
【図１６】ＡＭＩＧＯの予想される構造の概略図。
【図１７】組織におけるＡＭＩＧＯ染色の特異性。α−ＡＭＩ（抗ＡＭＩＧＯ抗体）を、ＡＭＩＰ２ペプチドまたはＡＭＩＰ１ペプチドの濃度が上昇していく系列でインキュベートした。ラット小脳の組織切片を、ペプチドとインキュベートした抗体で染色した。ＡＭＩＰ２ペプチドの濃度の上昇により組織染色は減少し、最終的には組織染色を完全に遮断した。明らかに、α−ＡＭＩの組織切片への結合はＡＭＩＰ２ペプチドによって阻害されている。対照ペプチドであるＡＭＩＰ１は、高濃度であってもα−ＡＭＩ結合に影響しなかった。
【図１８】α−ＡＭＩで染色したラット大脳の冠状断面。有髄繊維路がはっきりと染色されている。大脳皮質のいくつかの部分が染色されており、そのうち一ヶ所を矢じりで示す（乏突起膠細胞マーカーであるα−ＣＮＰａｓｅおよびα−ＮＦ−Ｍでも同じ部分が染色された）。無髄構造は海馬のＣＡ３領域で染色された（矢印で示す）。
【図１９】海馬のＣＡ３領域の冠状断面（図７の矢印で示した部分の拡大図）。パネルＡ：α−ＡＭＩによる染色。パネルＢ：α−ＮＦ−Ｍによる染色。いずれの染色部も錐体細胞の先端の樹状突起に近接した部分に位置する。このような層は透明層と呼ばれる。染色強度が低い円形構造は、ヘマトキシリンで染色された細胞核である。スケールバーは２５μｍである。
【図２０】ラット海馬の矢状断面。パネルａ：α−ＡＭＩによる染色、そしてパネルｂ：α−ＣＮＰａｓｅによる染色。いずれの抗体も、海馬の内部および周辺の有髄神経繊維を染色する。さらにα−ＡＭＩは、海馬のＣＡ３領域および歯状回（ＤＧ）の門（ｈ）に存在する無髄構造も強く染色した。パネルｃとｄ：α−ＡＭＩで染色したものの高倍率写真。ＣＡ３領域および歯状回においては繊維状構造が染色された（矢印で示す）。スケールバーは５０μｍである。
【図２１】大脳皮質の高倍率写真。パネルａ：α−ＡＭＩによる染色、そしてパネルｂ：α-ＮＦ−Ｍによる染色。大脳皮質の同じ部分がα−ＡＭＩとα−ＮＦ−Ｍの両方で染色された。より高い倍率で観察したところ、錐体細胞のいくつかの太い先端樹状突起（矢印で示す）およびいくつかの細い繊維（矢じりで示す）は両方の抗体で染色されている。錐体細胞の細胞体および基底樹状突起もα−ＮＦ−Ｍで染色された。スケールバーは５０μｍである。
【図２２】α−ＡＭＩで染色した小脳切片。パネルａ：小脳の冠状断面。小脳皮質は次の３層からなる：最外分子層（Ｍ）、プルキンエ細胞層（Ｐ）および顆粒細胞層（Ｇ）。白質（Ｗ）は小脳皮質の下に位置する。α−ＡＭＩは、この図では白質および顆粒細胞層の有髄繊維を染色した。プルキンエ細胞体（ｐ）の周辺にバスケット細胞軸索が形成したバスケット状構造（矢印で示す）および分子層内の繊維も染色された。分子層においては、染色は分子層の内部に限られ、染色された繊維は主にプルキンエ細胞層に平行して走っている。パネルｂ：小脳の矢状断面。小脳の内側部では、白質（Ｗ）の染色に見られる構造は、数珠を模した構造である。スケールバーは２５μｍである。
【図２３】脊髄白質の横断面図。パネルａ：α−ＡＭＩによる染色、パネルｂ：α−ＣＮＰａｓｅによる染色、そしてパネルｃ：α−ＮＦ−Ｍによる染色。断面図のはっきりとした丸い部分はミエリン鞘である。小さい点（矢印で示す）は、α−ＡＭＩおよびα−ＮＦ−Ｍではっきりと染色されたミエリン鞘の内部である。これらの点は、軸索の断面であると考えられる。これらの点はα−ＣＮＰａｓｅでは染色されない。断面に平行に走る軸索路はα−ＮＦ−Ｍで染色されるが、α−ＡＭＩでは染色されない。スケールバーは５０μｍである。
【図２４】腎臓の免疫組織染色。α−ＡＭＩによる染色（パネルａ）およびα−ＮＦ−Ｍによる染色（パネルｂ）の両方によって、同じ小さい構造（矢印で示す）が腎臓で検出された。したがって、α−ＡＭＩによって染色されたのは腎臓の神経である。スケールバーは１００μｍである。
【図２５】１８日齢の胚の頭部の免疫組織染色。α−ＡＭＩ染色によって、視神経（パネルａ）や内包（パネルｃ）などの、発生途中の繊維路および脳神経が検出された。網膜においては、染色部（パネルａ中に矢印で示す）は神経繊維層に存在する。神経繊維層は視神経を形成するガングリオン細胞軸索からなる。対照切片（パネルｂおよびｄ）は、ＡＭＩＰ２で遮断したα−ＡＭＩで染色したものである。スケールバーは１００μｍである。
【図２６】種々の発生段階のラットから得た粗脳抽出物を用いた、ＡＭＩＧＯのウェスタンブロット。同じ総重量の組織を各サンプルについて用いた。１６日齢および１８日齢の胚（Ｅ１６およびＥ１８）の脳、１、２、４、６、８、１０および１４日齢のラット（Ｐ１〜Ｐ１４）の脳、そしてラット成体の脳を用いた。ＡＭＩＧＯ−Ｉｇ融合タンパク質（ＡＭＩＩｇ）を対照サンプルとして用いた。パネルａにおいては、ウェスタンブロットをα−ＡＭＩおよびα−ＣＮＰａｓｅで検出した。α−ＡＭＩは約６５ｋＤａのタンパク質のバンドと、それよりも弱いタンパク質のバンド（約１３０ｋＤａ）を検出する。α−ＣＮＰａｓｅは約４８ｋＤａのタンパク質のバンドを検出する。脳の発生の際のＡＭＩＧＯの発現には２つの特徴がある。免疫ブロット法により、後期胚発生（Ｅ）と周生期発生における明確なＡＭＩＧＯの発現が明らかとなった。ＡＭＩＧＯの発現は出生後（Ｐ）のＰ４期〜Ｐ１０期の間は下向きに調節される。ＡＭＩＧＯの発現はＰ１０期とＰ１４期の間で再度上向きに調節され、成体の脳では高い発現が維持される。ＣＮＰａｓｅ発現との比較から分かるように、上向きの調節はミエリン形成の開始と一致する。ＡＭＩＧＯの発現とＣＮＰａｓｅの発現は、出生後発生において平行に増加する。パネルｂは、各サンプルに含まれるタンパク質の総量を比較するために、ウエスタンブロットをポンソー染色した結果である。
【図２７】ＡＭＩＧＯとＥＧＦＲの共免疫沈降。ＥＧＦＲを安定に発現する２９３細胞を、Ｖ５タグを付した以下のＡＭＩＧＯでトランスフェクトした：全長ＡＭＩＧＯ（レーン１）、ＡＭＩＧＯのＥＣ領域を含む部分（レーン２）、全長ＡＭＩＧＯ２（レーン３）および全長ＡＭＩＧＯ３（レーン４）。共免疫沈降は抗ＥＧＦＲ抗体を用いて行い、検出は抗Ｖ５抗体を用いて行った。その結果、ＡＭＩＧＯとＡＭＩＧＯ２は両方ともＥＧＦＲに結合し、ＥＣ領域のみが結合には十分なことが判明した（ＡＭＩＧＯについてのみ示した）。
【図２８】ＡＭＩＧＯ、ＡＭＩＧＯ２およびＡＭＩＧＯ３のホモフィリックな結合およびヘテロフィリックな結合。共免疫沈降は、抗Ｖ５タグ抗体を用いて行い、検出は抗ＧＦＰタグ抗体を用いて行った。レーン１〜５はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯであり、レーン６〜９はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯ２であり、レーン１０〜１２はＧＦＰタグを付した全長ＡＭＩＧＯ３である。この実験では、Ｖ５タグを付した以下のタンパク質を使用した：レーン１は全長ＡＭＩＧＯであり、レーン２はＡＭＩＧＯのＥＣ領域であり、レーン３と６は全長ＡＭＩＧＯ２であり、レーン７はＡＭＩＧＯ２のＥＣ領域であり、レーン４、８と１０は全長ＡＭＩＧＯ３であり、レーン１１はＡＭＩＧＯ３のＥＣ領域であり、レーン５、９と１２は全長ＲＡＧＥである。図は、全長ＡＭＩＧＯ−ＧＦＰは、全長ＡＭＩＧＯ、全長ＡＭＩＧＯ２と全長ＡＭＩＧＯ３で共免疫沈降することができるが、全長ＲＡＧＥでは共免疫沈降できないことを示す。全長ＡＭＩＧＯ−ＧＦＰは、ＡＭＩＧＯのＥＣ領域を含む部分のみで共免疫沈降することもできた。全長ＡＭＩＧＯ２−ＧＦＰは、全長ＡＭＩＧＯ２と全長ＡＭＩＧＯ３のみならず、ＡＭＩＧＯ２のＥＣ領域を含む部分のみで共免疫沈降することもできた。全長ＡＭＩＧＯ３−ＧＦＰは、全長ＡＭＩＧＯ３とＡＭＩＧＯ３のＥＣ領域を含む部分で共免疫沈降することができた。共免疫沈降の結果により、各ＡＭＩＧＯはヘテロフィリックに互いに結合し、さらにホモフィリックな結合特性も有することが明らかになった。
【図２９】ＡＭＩＧＯはＥＧＦＲのリン酸化を阻害する。ＡＭＩＧＯおよびＦｌａｇタグを付したヒトＥＧＦＲを共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させると、ＡＭＩＧＯ２、ＡＭＩＧＯ３および対照ベクターと比較して、ＡＭＩＧＯは、ＥＧＦの結合によって誘導されるＥＧＦＲの自己リン酸化を明らかに阻害する。
【配列表フリーテキスト】
【０３２６】
配列番号７〜１２：
人工的な配列の説明： Ｉｇ−融合タンパク質
【図１】
2006525784.tif 000003
【図２】
2006525784.tif 000004
【図３】
2006525784.tif 000005
【図４】
2006525784.tif 000006
【図５】
2006525784.tif 000007
【図６】
2006525784.tif 000008
【図７】
2006525784.tif 000009
【図８】
2006525784.tif 000010
【図９】
2006525784.tif 000011
【図１０】
2006525784.tif 000012
【図１１】
2006525784.tif 000013
【図１２】
2006525784.tif 000014
【図１３】
2006525784.tif 000015
【図１４】
2006525784.tif 000016
【図１５】
2006525784.tif 000017
【図１６】
2006525784.tif 000018
【図１７】
2006525784.tif 000019
【図１８】
2006525784.tif 000020
【図１９】
2006525784.tif 000021
【図２０】
2006525784.tif 000022
【図２１】
2006525784.tif 000023
【図２２】
2006525784.tif 000024
【図２３】
2006525784.tif 000025
【図２４】
2006525784.tif 000026
【図２５】
2006525784.tif 000027
【図２６】
2006525784.tif 000028
【図２７】
2006525784.tif 000029
【図２８】
2006525784.tif 000030
【図２９】
2006525784.tif 000031
【配列表】
2006525784000001.app
【国際調査報告】
2006525784.tif 000032
2006525784.tif 000033
2006525784.tif 000034
2006525784.tif 000035
2006525784.tif 000036
2006525784.tif 000037
2006525784.tif 000038
2006525784.tif 000039