(57)【要約】  キャリア粒子（１０）はペイロード分子（４）を標的生物環境へ封入および運搬するべくアレンジされ、ペイロード分子（４）がその中に含有される内部キャビティ（８）を含む。キャビティ（８）は透過選択性のヒドロゲル層（６）によって囲まれており、ペイロード分子（４）は粒子（１０）が標的生物環境に少なくとも隣接した場合に活性であることが可能である。
2006528234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物環境（target  biological  environment）に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子であって、前記粒子は、前記ペイロード分子がその中に含有される内部キャビティを有し、前記キャビティは、透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれており、前記粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能なキャリア粒子。
【請求項２】
前記標的生物環境が、血液もしくはリンパのような実質的に全身に広がった循環をもつ体液、または、腹腔液もしくは滑液といった限定された循環をもつ体液、または、細胞もしくは細胞の集合体である、請求項１記載のキャリア粒子。
【請求項３】
前記ヒドロゲル層が、リビング重合機構反応（living  polymerization  mechanism  reaction）の結果として得られるポリマー鎖を含む、請求項１または２記載のキャリア粒子。
【請求項４】
前記ヒドロゲル層が、以下の式Ｉ：
【化１】
2006528234.tif 000007
［式中、Ｒ’はＨ，ＣＮ，ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＯＯＲを示し、ＸはＯＨ，Ｏ−Ｙ＋，ＯＲ，ＮＨ２，ＮＨＲ，ＮＲ２を示す（ここでＲは炭素原子で終わる任意の有機残基であり、Ｙは少なくとも一つの一価の正電荷を帯びた任意の有機または無機残基を示す）］
によって定義されるポリマー構造を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項５】
前記ヒドロゲル層が１０〜５００ｎｍの範囲の厚さを有している、前記いずれかの請求項に記載のキャリア粒子。
【請求項６】
前記ヒドロゲル層中の前記ポリマー鎖が、スペーサーセグメント（spacer  segment）により、実質的に永久的かつ物理的に架橋されている、請求項３〜５のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項７】
前記スペーサーセグメントが、オリゴ−、またはポリ（エーテル）、（エステル）、（アミド）といったオリゴマーまたはポリマー構造を含む、請求項６に記載のキャリア粒子。
【請求項８】
前記スペーサーセグメントが、少なくとも二つのポリマー鎖を結合する直鎖か、または少なくとも三つのポリマー鎖を結合する分枝鎖である、請求項６または７に記載のキャリア粒子。
【請求項９】
前記ヒドロゲル層の平均メッシュサイズが、約０．１ｎｍ〜５０ｎｍである、前記いずれかの請求項に記載のキャリア粒子。
【請求項１０】
前記ヒドロゲル層のポリマーが、前記層のｐＨ感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基を含む、請求項４〜９のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項１１】
前記ヒドロゲル層のポリマーが、前記層のイオン強度および組成物に対する感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基を含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項１２】
前記ヒドロゲル層のポリマーが、前記層の温度に対する感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基を含む、請求項４〜１１のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項１３】
前記ヒドロゲル層のポリマーが、前記層の酸化還元電位に対する感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基を含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項１４】
前記ヒドロゲル層のポリマーが、前記層のタンパク質吸着に対する抵抗性を決定する少なくとも一つの基を含む、請求項４〜１３のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項１５】
前記ヒドロゲル層のポリマーが、活発なターゲティングまたはイメージング作用のための生物学的認識リガンド（biological  recognition  ligand）、および／または検出のための蛍光標識（fluorescent  label  for  detection）を提供するべく適用された、少なくとも一つの基を含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載のキャリア粒子。
【請求項１６】
前記ペイロード分子が、染料、電気化学的媒介物、ペプチド、タンパク質、抗体、または酵素である、前記いずれかの請求項に記載のキャリア粒子。
【請求項１７】
前記ペイロード分子が、前記キャリア粒子内に封入されている間、活性状態のままでいる、前記いずれかの請求項に記載のキャリア粒子。
【請求項１８】
前記ペイロード分子がその中に含まれる内部キャビティが、実質的に水性である、前記いずれかの請求項に記載のキャリア粒子。
【請求項１９】
前記キャリア粒子が約５０〜１０００ｎｍである、前記いずれかの請求項に記載のキャリア粒子。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のキャリア粒子を産生する方法であって、
（ｉ）支持マトリックスを前記ペイロード分子と接触させる工程；
（ｉｉ）前記マトリックスを封入するヒドロゲル層を産生する工程；および
（ｉｉｉ）前記マトリックスを溶解し、それによりキャリア粒子を産生する工程、
を含む方法。
【請求項２１】
前記ペイロード分子が実質的に前記マトリックス内に埋込まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マトリックスが、最終的にキャリア粒子の形態およびサイズを確定するために使用され、次いで溶解される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記マトリックスが、有機前駆体の加水分解に基づくゾル−ゲル法によって調製される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記有機前駆体が、アルコキシシラン、テトラアルコキシシラン、テトラメトキシ−、テトラエトキシ−、またはテトラプロポキシシラン、または、テトラキスヒドロキシアルコキシシラン、または、テトラキス（２−ヒドロキシプロポキシ）シランを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
逆エマルジョン（油中水型）が、前記ペイロード化合物を疎水性液体中に含有する水相を、適当な乳化剤とともに混合することにより生成される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
無機マトリックスの調製のため、アルキルシランが混合物中へ投入され、前記水相によって加水分解され、ケイ酸を、さらに最終的にはＳｉ−Ｏ−Ｓｉ共有結合のネットワークを産生し、それにより前記ペイロード分子をその中へ埋込む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒドロゲル層が、表面原子移動ラジカル重合によって産生される、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記支持マトリックスが犠牲鋳型である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記支持マトリックスがシリカ犠牲鋳型である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記シリカ犠牲鋳型がフッ化物処理によって溶解される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記フッ化物処理が、アンモニアまたはアンモニウムイオンを含有する、フッ化物含有溶液の使用を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のキャリア粒子のための前駆体であって、ペイロード分子を含有するマトリックスを含み、前記マトリックスの表面がヒドロゲル層によって封入される、前駆体。
【請求項３３】
標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子であって、前記ペイロード分子が含有される内部キャビティを含み、前記キャビティは透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれており、前記粒子が前記標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能な、薬物としての使用のためのキャリア粒子。
【請求項３４】
標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子の用途であって、前記粒子は、前記ペイロード分子が含有される内部キャビティを含み、前記キャビティは透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれており、前記粒子が前記標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能であるキャリア粒子の、漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病の治療用薬物の製造のための用途。
【請求項３５】
漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病が、腫瘍、および損傷治癒に関連した血管系である、請求項３４に記載の用途。
【請求項３６】
漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病を患っている個体を治療する方法であって、かかる治療を必要とする個体へ治療上有効な量の、標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子を投与する工程を含み、前記粒子はペイロード分子が含有される内部キャビティを含み、前記キャビティが透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれており、前記粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能なキャリア粒子を、投与することを含む方法。
【請求項３７】
漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病が、腫瘍、および損傷治癒に関連した血管系である、請求項３６に記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャリア粒子および特に、しかし排他的にではなく、感受性の生体分子の封入およびデリバリーに使用されてよいキャリア粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
感受性の生体分子または「ペイロード」分子を封入し、標的部位に対して運搬（carry）、およびデリバリー（deliver）するべく使用される数多の小胞性キャリアが存在する。実例は、リポソーム、ニオソーム、ポリマー小胞などを含む。かかる粒子は、ペイロード生体分子がその中に含有されている水キャビティ含有構造を提供する。ペイロード分子は、一般に両親媒性化合物、たとえば、リン脂質からなる、液体様の膜に囲まれている。キャリアは体液中を自由に循環することができ、ペイロード生体分子を特定の標的細胞または組織へデリバーするべく使用されてよい。
【０００３】
小胞性キャリアとしては多様な組成物が存在しており、それらは両親媒性化合物、たとえば、リン脂質、非イオン性低分子両親媒性物質、およびブロック共重合体とは性質を異にする。さらに、それらの疎水性ドメインの組成物もまた異なり、すなわち、コレステロールのような安定化剤の存在によって異なっている。さらに、キャリアの表面化学が異なることが可能であり、たとえば、小胞性キャリアの表面は、タンパク質吸着の極小化およびインビボにおけるキャリアの寿命の延長のための、特定のポリマーを表示（display）することが可能である。
【０００４】
かかるキャリアの実例は、その表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を表示しているリポソーム、すなわち、図１１に示されている、ＰＥＧｙｌａｔｅｄまたはＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームである。リポソームは内部の水キャビティ内に薬物を封入しており、その膜はリン脂質の二重層からなり、それらはＰＥＧ鎖により一部機能化されている。このようなＰＥＧポリマー鎖は、タンパク質吸着に対する抵抗性を提供することによってキャリアを異物として認識することを低減するという点において必須であり、最終的に循環時間の延長にもつながる。
【０００５】
しかしながら、かかる小胞性キャリアにおいては、いかなる封入された物質も、キャリアの完全性が保持されている限り外部環境と接触することはない。したがって、ペイロード分子は、キャリアがその最終標的に到達したか、あるいは物理的または機械的作用によってそれが破壊され、それが放出されるまで、不活性な状態に維持される。この標的部位において、放出されたペイロード化合物は活性になる。しかしながら、封入されたペイロードの放出の後、キャリア膜はもはや、活性化合物またはペイロードに対し、何ら保護作用を実行することはできない。このことは、多くの適用において、活性化合物が、キャリアによって保護されている時においてもその機能を実行することがしばしば望ましいことから、問題となる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、先行技術のキャリア粒子自体の問題、および特にリポソームキャリアに関連した問題に対処すること、および特にペイロード生体分子用の改良された運搬特性を示すキャリア粒子を提供することである。
【課題を解決する手段】
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、ペイロード分子を封入し、標的生物環境に対し運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子であって、該粒子は、ペイロード分子がその中に含有される内部キャビティ（internal  cavity）を含み、該キャビティは、透過選択性（perm-selective）のヒドロゲル層によって囲まれており、粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合にペイロード分子が活性であることが可能な粒子が提供される。
【０００８】
本発明者らは、本発明の第一の態様によるキャリア粒子が、特定の標的生物環境、たとえば体液または特定の組織への、ペイロード分子のターゲティング(targeting)に有用であることを見出した。それゆえ、標的生物環境は、血液またはリンパのような実質的に全身に広がった循環をもつ体液か、または、腹腔液または滑液といった限定された循環をもつ体液であってよい。
【０００９】
特定の組織においては、標的生物環境は細胞か、または細胞群であってよい。標的生物環境は、細胞の外側、すなわち、細胞外マトリックス内か、または細胞の表面であることが好ましい。したがって、「標的生物環境に少なくとも隣接した」という表現は、ペイロード分子は、標的生物環境、たとえば細胞または細胞群、および好ましくは細胞または複数の細胞の外側に充分接近した場合に生化学的に活性であることが可能であるという意味であることが理解できよう。
【００１０】
細胞の群は、組織または、たとえば、癌本体を構成してもよい。キャリア粒子は、生化学的変換、またはインビボにおける薬理活性成分の産生のためか、またはイメージング薬剤(imaging  agent)用に使用されてよい。たとえば、キャリア粒子は、化学療法等において、不活性のプロドラッグの、対応する活性成分への化学的変換を局所的に行なうべく使用されてよい。加えて、キャリア粒子は癌性腫瘤に向けた活性成分の標的デリバリーにおいて使用されてよい。
【００１１】
したがって、キャリア粒子は三つの主要な成分を含んでおり、すなわち：（ｉ）透過選択性のヒドロゲル層であり、それは（ｉｉ）ペイロード分子、を封入しており、ペイロード分子は（ｉｉｉ）内部キャビティ、の中に含有されている。ヒドロゲル層の透過選択性は、キャリア粒子が生物環境に少なくとも隣接している場合に活性および機能的であることを可能にしており、すなわち、ペイロード分子はインタクト（intact）なヒドロゲル層によって封入されている場合、活性である。
【００１２】
ヒドロゲル層は有機および／または無機ポリマーを含んでよい。しかしながら、ヒドロゲル層は実質的に有機ポリマーを含むことが好ましい。好ましくは、ヒドロゲル層は実質的に親水性である。
【００１３】
ヒドロゲル層は、架橋によって相互に連結された複数のポリマーを含んでよい。架橋が存在しない場合、好ましくは実質的に親水性であるポリマー鎖は、水中に拡散する傾向があり、キャリア粒子は完全に可溶化されることとなる。したがってポリマー鎖は、物理的および／または共有結合性の架橋により連結されてよい。しかしながら、好ましい態様においては、ポリマー鎖は共有結合性架橋によって相互に連結される。
【００１４】
架橋の存在は、ヒドロゲル層の機械的特性および透過性特性の双方に影響を及ぼす。高い架橋濃度は層の弾性率を増大し、層の透過性を低減する。加えて、架橋はヒドロゲル層中のポリマーのネットワークの形成を決定し、その平均メッシュサイズは、層の透過性に分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）効果を生ずることが可能である。ここで「平均メッシュサイズ」とは、ポリマーネットワークヒドロゲル層中の平均ポアサイズを意味する。
【００１５】
層の平均メッシュサイズよりも大きいサイズの分子は、層を通って拡散することはできないが、より小さいサイズの分子には透過が可能である。したがって、好ましくは、粒子のヒドロゲル層は、小さい〜中間の分子サイズの分子に対して実質的に透過性であるが、より大きい分子に対しては実質的に非透過性である。有利なことに、本発明によるキャリア粒子はペイロード分子を封入し、それゆえ有害な相互作用または反応から防御するが、好適なものが起こることは可能にする。
【００１６】
小さい〜中間の分子サイズとは、５ｎｍより小さい、好ましくは３ｎｍより小さい、最も好ましくは２ｎｍより小さい分子サイズをもつ分子を意味する。より大きい分子とは、５ｎｍより大きい、好ましくは１０ｎｍより大きい分子サイズをもつ分子を意味する。上記の測定値は、分子の最大直径として与えられる。
【００１７】
ある分子（小さい〜中間サイズ）に対しては実質的に透過性であるが、他の（より大きいサイズ）分子に対しては実質的に不透過性であるヒドロゲル層の作用は、本文においてサイズ透過選択性（size  perm-selectivity）と呼ばれる。したがって、「透過選択的」とは、ヒドロゲル層がサイズ選択的透過性を有することを意味する。ヒドロゲル層は、直径５ｎｍより小さい分子を通過させ、かつ直径５ｎｍより大きい分子の通過を防止または阻止するべく形成されることが最も好ましい。
【００１８】
さらに、ヒドロゲル層はある化学組成、または電荷をもつ基質に対して透過性であり、かつ、他に対しては非透過性であってもよい。たとえば、ヒドロゲル層は、同じ符号の正味電荷をもつ分子の接近および透過に不利な正味電荷を呈してよい。たとえば、ヒドロゲル層の正味の電荷は正であってよく、そのことは正味の正の電荷をもつ分子をはね返すこととなる。この作用は、本文において組成物透過選択性（composition  perm-selectivity）と呼ばれる。したがって、「透過選択的」とは、ヒドロゲル層が組成物選択的透過性をもつことも意味する。
【００１９】
粒子がサイズ選択的透過性および組成物選択的透過性の双方を有することは特に好ましい。かかる二重の透過性により、キャリア粒子は封入されたペイロード分子を保護し、かつヒドロゲル層を通過する分子のサイズ、重量、および化学組成を調節し、それにより、封入されたペイロード分子に対して制御可能な保護を与えることができる。
【００２０】
好ましくは、ヒドロゲル層は一以上のモノマーの、好ましくは二以上のモノマーの、および最も好ましくは、その一つが物理的架橋または化学的架橋を提供する二以上のモノマーの重合反応から結果として生じるポリマー鎖を含む。好ましくは、ヒドロゲル層はリビング重合機構反応からの結果として生じるポリマー鎖を含む。リビング重合とは、停止反応がないこと、または存在が無視できるほど小さいことを指す。停止反応は、ポリマーの分子量、この場合にはヒドロゲル層の厚さ、を厳密に調節することを可能にする事象である。好ましくは、モノマーは水溶性または水分散性のモノマーである。
【００２１】
ヒドロゲル層の透過選択性は、重合化反応用に好適なモノマーを慎重に選ぶことによって調節されてよい。この理由は、層の透過選択性がそこに広がっているポアサイズ（すなわちメッシュサイズ）によって決まり、また層中のポアサイズが、ａ）（物理的または化学的）架橋を産生することが可能なモノマーのモル分率により、ｂ）これらのモノマーの各々が生じることが可能な架橋の数により、ｂ）モノマー構造中の架橋間の距離によって決まるからである。したがって、ポリマーは、所望のサイズ透過選択性を提供するために定義された調節可能なメッシュサイズで架橋され、かつそれは所望の組成物透過選択性を提供するために組成が変えられることが可能であることが好ましい。
【００２２】
ヒドロゲル層を生成するために使用され得る好適なモノマーは、当業者には周知であろう。好適なモノマーは、以下の式Ｉによって定義されるポリマー構造を提供してよい：
【００２３】
【化２】
2006528234.tif 000003
［式中、Ｒ’はＨ，ＣＮ，ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＯＯＲを示し、ＸはＯＨ，Ｏ−Ｙ＋，ＯＲ，ＮＨ２，ＮＨＲ，ＮＲ２を示す（ここでＲは炭素原子で終わる任意の有機残基であり、Ｙは少なくとも一つの一価の正電荷を帯びた任意の有機または無機残基を示す）］
【００２４】
たとえば、好適なモノマーは、アクリル、メタクリル、またはビニルモノマーを含んでよい。ポリマー鎖はポリアクリル、またはポリメタクリル誘導体により提供されてよい。ポリマー鎖は、ポリオレフィン（ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−、または４−ビニルピリジン）およびこれらの単位すべてのコポリマーのような）、ポリオキサゾリン、ポリエーテル、ポリスルフィド、ポリスルホキシド、ポリスルホン、ポリアミン、ポリアンモニウム、およびポリアミドによって提供されてよい。
【００２５】
ポリマー鎖の長さはそれらの重合化の程度に関係し、ヒドロゲル層の厚さを決定し、今度はそれが層の機械的および輸送的特性に影響を及ぼす。より厚いヒドロゲル層は、剪断に対してより高い抵抗性を有しており、分子または化合物がそれを通過するのにより長い時間を必要とする。理想的なコイル構造のポリマー鎖を想定すること、およびフローリー（Flory）の統計理論を用いることにより、層厚はヒドロゲル層中の重合度の平方根に対してほぼ直線的に増加する。
【００２６】
好ましい態様においては、重合度は１０２〜１０６以上の範囲内であり、それは１０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜３００ｎｍ、および最も好ましくは１００〜２００ｎｍの範囲内の層厚に相当することが可能である。重合度は、ポリマー鎖を構成しているモノマーの数である。このような層のサイズは、活性ペイロード分子に対して保護策を講じながら、さらに、層の透過選択性を維持することが可能となるので好ましい。好ましくは、ヒドロゲル層ポリマーを形成する重合反応は、層の構造安定性および透過選択的作用を厳密に調節することができるようにする。したがって、キャリア粒子は調節可能なヒドロゲル層の厚さを有する。
【００２７】
上記のこの特性は、鋳型分子またはマトリックス上への、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）のような、リビング重合の適用によって得られてよく、このことは本発明の第二の態様（下文参照）および実施例に関し、さらに詳細に記述されている。このプロセスは、ペイロード分子の不可逆的変性を避けるため、水環境中で起こることが好ましい。
【００２８】
たとえば、使用されたモノマーが、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（一官能基性モノマー）およびエチレングリコールジメタクリレート（二官能基性モノマー、それゆえ化学的架橋の形成が可能である）が３：１の割合であれば、ポリマー鎖は４番目のモノマー単位ごとに架橋をもち（８原子ごとに１架橋）、ポリマー鎖間のスペーサーは６原子の鎖によって構成される。それゆえこのことは、結果として、ポアサイズが溶媒の組成およびイオン強度に依存して約０．５〜０．７ｎｍであるヒドロゲル層を生じることとなり、それは好ましくは水混合物である。
【００２９】
ヒドロゲル層のポリマー鎖中のモノマーの反復単位は、少なくとも一つの側鎖を含んでよく、それは構造上および／または機能上の役割を有してもよい。しかしながら、すべての反復単位が側鎖を呈する必要はない。
【００３０】
たとえば、構造性側鎖は、充分に定義された親水性の基を含んでよく、それがヒドロゲル層の膨潤度に寄与してもよい。構造性側鎖はまた、ヒドロゲル層に正味の電荷を提供してよく、そのことは反対に帯電した化学化合物の吸着および透過には有利である一方、同じ電荷をもつ化学化合物の吸着および透過には不都合であってよい。
【００３１】
本発明の好ましい態様においては、ポリマーの構造性側鎖は、共有結合または物理的相互作用に基づく永久架橋のための部位を含んでよい。双方のタイプの架橋の密度は、ヒドロゲル層の機械的および透過選択的特性を決定する。たとえば、高い架橋密度は、ヒドロゲル層の高い弾性率、すなわち、剪断、圧縮、および伸び応力に対するより高い抵抗性、ならびに低い透過性を決定する。
【００３２】
ヒドロゲル層中のポリマー鎖は、スペーサーセグメント(spacer  segment)により、実質的に永久的および共有結合的に架橋されてよい。当業者は、適当なスペーサーセグメントとポリマー鎖との間の連結の化学組成については認識しているであろう。たとえば、アクリルまたメタクリルポリマー鎖が使用される場合、スペーサーセグメントとポリマー鎖との間の結合において、エステルまたはアミド基が存在するであろう。
【００３３】
ヒドロゲル層におけるポリマー鎖は、スペーサーセグメントにより、実質的に永久的および物理的に架橋されてよい。スペーサーセグメントは２以上のポリマー鎖と相互作用することが可能であり、これらの相互作用は架橋効果を提供する。たとえば、永久静電荷を帯びているスペーサーセグメントは、反対の永久静電荷を帯びているポリマー鎖と相互作用する永久架橋を提供することが可能である。複数の非対称な水素結合を形成することが可能なスペーサーセグメントは、ポリマー鎖内の相補的な基との水素結合に基づき、永久架橋を提供することが可能である。
【００３４】
スペーサーセグメントは、オリゴ−、またはポリ（エーテル）、（エステル）、（アミド）といったオリゴマーまたはポリマー構造か、または当業者には明らかであろう、他の構造を含んでよい。しかしながら、オリゴマーまたはポリマー構造のないスペーサーセグメントもまた使用されてよい。
【００３５】
スペーサーセグメントは、少なくとも二つのポリマーを結合する直鎖か、または少なくとも三つのポリマーを結合する分枝鎖であってよい。好適なスペーサーセグメントの実例は、図１９に例示されている。かかるスペーサーセグメントは、単なる例としてリストされており、当業者には多数の変型（ポリマー鎖の種類において、機能性において、架橋のサイズおよび化学組成において）が明らかであろう。同等の密度のスペーサーセグメントでは、分枝した架橋は、より高い架橋密度およびより小さいメッシュサイズを、それゆえより高い率およびより小さい透過性（またはより小さいＭＷＣＯ）のヒドロゲル層を提供する。
【００３６】
同程度の分枝をもつ二つのスペーサーセグメントの比較では、ポリマー鎖間のより短い距離の故に、より高い架橋密度はより短いセグメントによって与えられる。セグメントの長さはオリゴマー化の度合いが増すにつれて増加し、ネットワークのメッシュサイズもまた増大する。
【００３７】
ヒドロゲル層中のポリマー鎖は、構造性側鎖間の直接的な相互作用によって、実質的に永久的および物理的に架橋されてよい。たとえば、反対の永久電荷を帯びている側鎖は、静電引力に基づく永久架橋を提供してよい。多数の相補的な水素結合を形成することが可能な側鎖は、水素結合に基づく永久架橋を提供してよい。高度に疎水性の側鎖は、疎水性の凝集に基づく架橋を提供してよく、これらの架橋は疎水性の基のための溶媒の不在下において安定している。それゆえポリマーネットワークのメッシュサイズは、ポリマー鎖あたりの架橋性側鎖の数、これらの架橋単位の分枝、およびそれらの長さを変えることによって調整されることが可能である。
【００３８】
好ましくは、ヒドロゲル層の平均メッシュサイズは、約０．１ｎｍ〜５０ｎｍ、さらに好ましくは約０．５ｎｍ〜２０ｎｍ、最も好ましくは約１ｎｍ〜１０ｎｍである。約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、または４ｎｍの平均メッシュサイズが好ましい。しかしながら、一つの好ましい態様においては、メッシュサイズは約５ｎｍである。
【００３９】
機能性側鎖は、ヒドロゲル層のポリマー中に、環境条件に対して感受性があり、かつ可逆性架橋に関与してもよい基を与えてよい。たとえば、これらの基は、ｐＨ、イオン強度、あるいは組成、温度、または酸化還元電位に応じて、その親水性および／またはその会合挙動が変化し、それゆえヒドロゲル層の含水量および／またはメッシュサイズが変化し得る。ヒドロゲル層の含水量および／またはメッシュサイズにおける変化は、層の膨潤または収縮を引き起こすことが可能であり、その機械的および輸送特性に影響を及ぼす場合もある。より高い水濃度においては、ヒドロゲル層の弾性率は減少し、透過性は増大する。さらに詳細には、含水量および／またはメッシュサイズを増大することにより、所与の分子サイズをもつ分子が層を貫いて移動するため要する時間を短縮化することが可能である。もしヒドロゲル層の架橋が機能性側鎖の会合挙動にのみ依存するなら、その親水性および／または会合挙動の修飾により、ヒドロゲル層を可溶化、すなわち全てのキャリア粒子を可溶化することができる。
【００４０】
ヒドロゲル層のポリマー、およびさらに好ましくはその機能性側鎖は、層のｐＨ感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基を含んでよい。ｐＨ感受性は、プロトン化／脱プロトン化の平衡を受ける基によって与えられてよく、帯電した種は中性のものよりもさらに親水性である。かかる平衡に対して適用可能な構造物のリストは、図２０に示されている。しかしながら、数多くの他の基が使用されてよく、当業者には周知であろう。
【００４１】
ヒドロゲル層のポリマー、およびさらに好ましくはその機能性側鎖はまた、イオン強度および組成に対する層の感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基も含んでよい。たとえば、イオン強度および組成に対する感受性は、鎖間の会合−解離現象（すなわち、可逆的架橋の形成）を受ける基によって、周囲のイオンの数および性質に依存した方式で与えられてよい。たとえば、多価イオン、たとえば、カルシウムイオンのような第ＩＩ族アルカリ土類金属イオンは、二つのポリマー鎖の間の「架橋（bridge）」位を占めているイオンを用いて、一以上のカルボキシル基と相互作用してよい。多価イオン濃度の増大は、鎖間の相互作用を促進することが可能であり、そのことは親水性の減少およびヒドロゲル層の収縮を引き起こす。しかしながら、数多くの他の基が使用されてよく、当業者には周知であろう。
【００４２】
ヒドロゲル層のポリマー、およびさらに好ましくはその機能性側鎖はまた、温度に対する層の感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基も含んでよい。たとえば、温度に対する感受性は、鎖間温度依存性の、鎖間会合−解離現象（すなわち、可逆的架橋の形成）を受ける基によって与えられてよい。たとえば、これらの側鎖は、ポリ（エチレングリコール）ホモポリマーまたはブロックコポリマー、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）、ポリ（メチルビニルエーテル）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）といった、水中で下部完溶温度を与えるオリゴマーまたはポリマーによって構成される。しかしながら、このリストはいくつかの実例のみを提供するものであって、網羅的であるとは考えられないであろう。
【００４３】
ヒドロゲル層のポリマー、およびさらに好ましくはその機能性側鎖はまた、酸化還元電位に対する層の感受性に影響を及ぼす少なくとも一つの基も含んでよい。たとえば、酸化還元電位に対する感受性は、酸化還元依存性の鎖間会合−解離現象（すなわち、可逆的架橋の形成）を受ける基によって与えられてよい。たとえば、ヒドロゲル層は、異なるポリマー鎖において側鎖を架橋するジスルフィドの存在に、部分的にまたは完全に起因して架橋されてよい。たとえば、還元剤の存在は、それらをチオールへ、または非対称ジスルフィドへ変換してよく、架橋密度の低減およびヒドロゲルメッシュサイズの増大を決定する。もしすべてのヒドロゲル架橋がジスルフィドに基づくものであれば、それらの開裂はヒドロゲル全体の可溶化、すなわちキャリア粒子の可溶化という結果に終わってよい。
【００４４】
ヒドロゲル層のポリマーはまた、タンパク質吸着に対する抵抗性を決定する、少なくとも一つの基も含んでよい。タンパク質吸着に対する抵抗性および特定の結合基の不在により、キャリア粒子に細胞接着に対する抵抗性を与えることができるようにする。たとえば、ヒドロゲル層ポリマーは、少なくとも一つのタンパク質を寄せつけないモノマー、たとえば、少なくとも一つのＰＥＧ鎖を含有するモノマーを含んでもよい。最終的なヒドロゲルにおいては、ＰＥＧ鎖は側鎖として、または架橋におけるスペーサーセグメントとして存在してよい。Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドまたはＮ−ビニルピロリドンのような、第三級アミド、または２−メトキシエチルまたはＮ−モルホリンアクリレートまたはメタクリレートといった他の基を含有するモノマーもまた使用されてよい。上記のモノマー単位のオリゴマーまたはポリマー鎖を含有するモノマーもまた使用されてよい。
【００４５】
ヒドロゲル層のポリマー、およびさらに好ましくはその官能性側鎖は、必要とされるキャリア粒子の最終的な組成物の透過選択性によって、上記の特性、すなわち、ｐＨ感受性；イオン強度；温度感受性；酸化還元電位感受性；および／またはタンパク質吸着、の任意の組合せまたはすべてを含んでよく、このことはキャリア粒子の意図された用途によって決定される。
【００４６】
好ましくは、本発明のキャリア粒子は以下の工程：
（ｉ）ペイロード分子をマトリックス中に保持、または包埋すること；
（ｉｉ）マトリックスを封入するポリマーヒドロゲル層を産生すること；
（ｉｉｉ）マトリックスを溶解し、それによりキャリア粒子を産生すること、
によって産生される。
【００４７】
マトリックスは、その表面にヒドロゲル層が産生された後に溶解されることから、犠牲鋳型として知られている。マトリックスのサイズにより、キャリア粒子の内部キャビティの最終的なサイズを決定する。
【００４８】
耐タンパク質性の基をもつモノマーが、他のモノマーとともに重合される場合、耐タンパク質基の優先的な局在性を、たとえば、その機能をより良く発現することができる外表面上にもつヒドロゲル層を得ることが可能である。リビング重合機構により、犠牲鋳型との境界から始まり、水溶液との境界で終わる「ブロッキー」（“blocky”）な構造物を得ることが可能である。好ましい態様においては、「ブロッキー」なポリマーはその後期ブロック（区画）中に耐タンパク質基を含んでおり、それはキャリア粒子内では、外部の水環境との境界に近接して優先的に局在する。
【００４９】
たとえば、犠牲鋳型上では、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（単官能モノマー）単独か、またはモル比１０：１の混合物エチレングリコールジメタクリレート（２官能モノマーおよび共有結合性架橋剤）が最初に重合される。次いで、この第一のモノマー混合物の完全な変換の時点で、ＰＥＧＧ２０００（分子量２０００のポリ（エチレングリコール））モノアクリレート単独か、またはモル比３：１のＰＥＧ５７０ジアクリレートとの混合物からなる第二の混合物が添加され、ヒドロゲルの外表面上に優先的に重合する。
【００５０】
ヒドロゲル層のポリマーはまた、活発なターゲティングまたはイメージング作用のための生物学的認識リガンド、および／または検出のための蛍光標識を提供するべく適用された、少なくとも一つの基を含有してもよい。蛍光標識は、環境感受性の蛍光を示してよく、選ばれたイオンまたは基質の存在、または環境のＲＥＤＯＸ電位といった外部刺激に反応して発生、増加、減少、または除去される。
【００５１】
生物学的認識リガンドまたは蛍光標識の導入は、二つの方法で行なわれてよい。第一の方法は、一以上の反応基をもつ一つのモノマーから、または少なくとも一つが一以上の反応基をもつモノマー混合物からの、ヒドロゲル層の調製を含む。次いで反応基は、生物学的認識リガンドまたは蛍光標識に対する共有結合のために連続的に使用される。第二の方法は、一以上の反応基から、または少なくとも一つが一以上の生物学的認識リガンドまたは蛍光標識をもつモノマーの混合物からの、ヒドロゲル層の調製を含む。
【００５２】
第一の方法においては、反応基はモノマーの化学構造中に既に存在してよい。それゆえ、反応基は重合の間に未変化のまま残らねばならない。別法として、反応基は、脱保護またはポスト機能化反応によってポリマー上に生成されてよい。典型的な好ましい反応基は、カルボン酸、アミン反応性エステル（たとえば、p−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）、第一級および第二級アミン、ビシナルジオール、チオール、チオール反応性基（たとえば、２−ブロモエステル、２−ヨードエステル、マレイミド、およびアクリル、メタクリル、またはイタコン酸エステルまたはアミド）でよい。典型的には、これらの基は次に、アミド、エステル、アセタール、およびケタール、および当業者には明らかな種々の化学的機能性をもつチオエーテルを形成するべく反応されてよい。
【００５３】
反応基をもつモノマーが他のモノマーとともに重合される場合、反応基が優先的に、たとえば外表面上または内表面上に、局在するヒドロゲル層を得ることが可能であってよい。リビング重合機構は、犠牲鋳型との境界から始まり、水溶液とのそれ（境界）で終わる「ブロッキー」な構造物を得ることを可能にする。好ましい態様においては、「ブロッキー」なポリマーはその後期ブロック中に反応基を含んでおり、それはキャリア粒子内では、外部の水環境との境界に近接して優先的に局在する。この状況は、外部空間に導入されかつ反応基に到達するべくヒドロゲル層を通って拡散することのない、蛍光体という高分子リガンドによるその機能化を促進する。
【００５４】
この状況は、生物学的認識リガンドおよび蛍光標識が、ヒドロゲル層を容易には拡散することができない系と相互作用し、かつそれに感受性を示すことになっている場合に好ましい。たとえば、重合はまず犠牲鋳型上で、モル比１０：１の２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよびエチレングリコールジメタクリレートにより構成されるモノマー混合物を用いることによって行なわれてよい。これらのモノマーの８０％の変換が達成されたとき、反応基を含有する一量のモノマーが添加される。この量は、キャリア粒子の機能性を決定するものであり、標識基の適用および検出法に依存する。
【００５５】
好ましい態様においては、各キャリア粒子は約１０２〜１０５の反応基を含み、したがって同等な量の標識をその最終的な状態の中に含んでいる。たとえば、直径５００ｎｍのキャリア粒子の１体積％の分散系は、１リットルあたりほぼ１０１４のキャリア粒子を含んでいる。もし各々の粒子が１０３の標識基を含むとすれば、最終的な蛍光標識の濃度はほぼ０．１μＭである。
【００５６】
もう一つの好ましい態様においては、「ブロッキー」なポリマーはその最初のブロックに反応基を含んでおり、それはキャリア粒子においては、外部の水環境との境界に近接して優先的に局在する。この状況は、封入されたペイロード分子またはその活性の産物との、その相互作用を促進する。たとえば、もしペイロード化合物の活性が標識された（たとえば蛍光性の）分子を産生し、それがヒドロゲル層を通して拡散するなら、それらの何分の一かは反応基と相互作用することが可能であり、共有結合によってヒドロゲル内に取込まれるようになる。反応基がない場合、標識はキャリア粒子の外へ拡散し、消失する。この方法は、活性のあるペイロードをもつキャリア粒子のみが標識される（たとえば、蛍光性である）ことから、キャリア粒子をその活性に関してイメージングするために有用である。
【００５７】
キャリア粒子内に封入されているペイロード分子は、標的生物環境、たとえば、標的細胞タイプとの、または標的細胞タイプに対する、好適な活性をもつ任意の分子でよい。たとえば、ペイロード分子は触媒活性を有してもよい。化合物が生物活性を有すること、すなわち化合物が、標的環境への到達時に生物学的効果を有すると同時に、キャリア粒子内に保持されることが好ましい。化合物生物活性の実例は、保護基を加水分解し、かつプロドラッグを活性薬物へ変換する酵素反応である。
【００５８】
ペイロード分子は、活性状態のままでいると同時に、キャリア粒子内に封入されていることが好ましい。それゆえ、分子は比較的大きい分子であってよく、ヒドロゲル層を透過できないようにする。したがって、使用される封入された分子のサイズは、ヒドロゲル層の構造、および組成、およびメッシュサイズに依存しており、そこに保持されるようにすることが理解されよう。好ましくは、封入された分子は直径３ｎｍより大きく、さらに好ましくは５ｎｍより大きく、なおさらに好ましくは直径７ｎｍより大きい分子サイズを有する。特に好ましい態様においては、ペイロード分子は１０ｎｍより大きい分子サイズを有する。
【００５９】
たとえば、ペイロード分子は染料、電気化学的媒介物、ペプチド、タンパク質、抗体、または酵素であってよい。ペイロード分子はオリゴマー種またはポリマー種で被覆されてもよい。先に記述された実例において、キャリア粒子がヒドロゲル層への透過を避けるために必要なサイズに達していない場合に、該被膜は必要となり得る。
【００６０】
キャリア粒子内に封入され得る適当な酵素の実例は、５−フルオロシトシンの、化学療法用５−フルオロウラシルヘの変換を触媒することの可能な、細菌（およびしたがって免疫原性の）酵素、大腸菌シトシンデアミナーゼ、；５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドのようなアジリジン含有プロドラッグの、細胞毒性化合物への還元を触媒することが可能な、細菌（およびしたがって免疫原性の）酵素、大腸菌ニトロレダクターゼ；および、ドキソルビシングルクロニドの、化学療法用ドキソルビシンへの変換を触媒することが可能な、細菌（およびしたがって免疫原性の）酵素、β−グルクロニダーゼを含む。他の可能な酵素は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、およびデオキシシチジンキナーゼである。
【００６１】
したがって、たとえば、キャリア粒子は潜在的な免疫原性酵素を封入してよく、透過選択性の膜が、免疫系応答のメディエイター（免疫グロブリン、補体）またはタンパク質分解酵素といった、危険な高分子化合物から酵素を保護するが、同時に、粒子のキャビティ内への基質分子の透過を可能にし、それによって酵素がその生化学反応を遂行できるようにする。さらには、膜の透過選択性は、酵素触媒の産生物がヒドロゲル層を透過し、かつ粒子の外へ透過できるようになっている。したがって、封入されたペイロード分子は、延長された期間にわたり、活性状態を保つことが可能である。さらに、単なる例として、キャリア粒子は、外側のプロテアーゼから遮蔽されているが、たとえば、蛍光発光の発生により、粒子の内部へ拡散することが可能な特定の低分子の存在を知らせることができる、設計されたタンパク質を封入してもよい。
【００６２】
本発明によるキャリア粒子のヒドロゲル層の透過選択的特性は、透過選択性の層をもたないリポソームキャリアまたはポリマー中空ナノ粒子といった、既存のキャリアに比べて大きな利点をもつ。したがって、リポソームの、またはポリマー中空ナノ粒子の外膜は透過選択的ではないことから、小〜中間のサイズの分子（たとえば、基質分子）が、リポソームの中心部へ透過し、かつ酵素のようなペイロード分子と相互作用することは可能ではない。さらに、産物分子がペイロード分子、たとえば酵素から離れ、膜を通って外部へ透過することも可能ではない。リポソームキャリアは酵素を封入しており、それが標的環境へ向かって移動するとき、キャリアの外側に存在するプロテアーゼのような有害化合物からそれを保護する。しかしながら、リポソームの膜は透過選択的でないため、リポソームがその標的環境に到達するまで、封入された酵素は不活性な状態に維持される。標的環境への到達に際して、リポソームは破壊されるかまたは破裂し、それにより酵素を放出するが、酵素は、今や基質分子が入ってきてそれと接触することができるためにそれによって活性化される。
【００６３】
したがって、リポソームがそのペイロード分子を不活性な状態で運ぶこと、およびそれらがその標的に到達したときにのみ治療上有用であって、破壊に続きその負荷をデリバーすることができることが理解されよう。ひとたびリポソームが破裂してペイロードを放出すれば、プロテアーゼのような有害分子がそれと反応することが可能になり、それによりペイロードは素早く不活性化される。それゆえ、ペイロードは短時間活性であるにすぎない。対照的に、本発明によるキャリア粒子は、ヒドロゲル層の透過選択性のためそのペイロードを不活性な状態で運びかつデリバーしており、したがって、分子とそれらとのアクセスをサイズおよび／または化学組成に基づいて調節する。さらに、活性ペイロードヒドロゲル層はペイロードを保護しており、それにより活性ペイロード分子の半減期は増大され、したがってその活性の長さも増大する。
【００６４】
好ましくは、ペイロード分子が含有される内部キャビティは、実質的に水性であり、好ましくは水を含有する。水性キャビティは、分子（たとえば、基質または産物化合物）を、ヒドロゲル層（これもまた実質的に水性である）を通して、ペイロード分子へ、および、ペイロード分子から、の両方向へ容易に通過できるようにし、ペイロードが活性状態に維持されてよいようにする。
【００６５】
好ましくは、キャリア粒子は充分に小さく、体液、たとえば、血流中に懸濁されてよい。それゆえ、粒子は、個々の身体の血管系、すなわち、静脈、動脈、および／または毛細血管を通って進むことができるよう、充分に小さいことが好ましい。
【００６６】
キャリア粒子の好適なサイズは、約５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１００〜７５０ｎｍ、最も好ましくは２００〜５００ｎｍである。好ましくは、キャリア粒子は実質的に形が球形である。したがって、前文に示した直径は、キャリア粒子の平均直径である。しかしながら、球形のジオメトリをもつ元のキャリアは、環境条件に依存して、楕円形、または両凹レンズ形に変更されてよい。たとえば、最初の球形のジオメトリは、剪断力の作用によって楕円形に、またはより高い外部浸透圧によって両凹形になることが可能である。
【００６７】
したがって、キャリア粒子は実質的に形が球形であり、中空の内部キャビティを囲むヒドロゲル層からなる。それゆえ、その物理的および構造的組成により、キャリア粒子はまた本文において、中空ヒドロゲルナノスフェア（ＨＨＮ）と呼ばれる。ＨＨＮのヒドロゲル層は、１０〜５００ｎｍの範囲の調節可能な厚さを有する。さらにそれは、水溶液で満たされた直径２０〜５００ｎｍの範囲の内部キャビティを囲む。さらにＨＨＮは、本文において架橋されたヒドロゲル層と呼ばれる、架橋された、水膨潤性のポリマーによって構成される。好ましい態様においては、ヒドロゲルの含水量は９９％もの高さであることが可能である。ヒドロゲルは概して弾性があり、容易に変形しうる物質であって、高い機械的応力に対するその応答は、ＨＨＮのジオメトリにおける有意な変化を決定することが可能である。
【００６８】
本発明の第二の態様によれば、第一の態様によるキャリア粒子を産生する方法であって、
（ｉ）支持マトリックスをペイロード分子と接触させること；
（ｉｉ）マトリックスを封入するヒドロゲル層を産生すること；および
（ｉｉｉ）マトリックスを溶解し、それによりキャリア粒子を産生すること、
の段階を含む方法が提供される。
【００６９】
好ましくは、支持マトリックスは実質的に球形構造であり、次にくる相のための鋳型または前駆体として作用する。マトリックスのサイズは、結果として得られる産生されたキャリア粒子の、内部キャビティの最終的なサイズを決定する。好ましくは、マトリックスは約２０〜５００ｎｍの範囲の平均サイズを有する。したがって、キャビティの直径は約２０〜５００ｎｍである。
【００７０】
好ましくは、ペイロード分子は実質的にマトリックス内に埋込まれる。ペイロード分子は生物活性化合物、たとえば、水溶性のペプチドまたはタンパク質、酵素、多糖、または合成ポリマー物質を含んでよい。
【００７１】
マトリックスは、最終的なキャリア粒子に形態およびサイズを提供するために使用されてよく、次には溶解される。したがって、マトリックスは上述のように鋳型分子であってよい。マトリックスは酸化物を含んでよく、それは無機酸化物でよく、有機前駆体の加水分解に基づくゾル−ゲル法によって調製されてよい。
【００７２】
好ましくは、マトリックスは逆エマルジョン（油中水型エマルジョン）におけるゾル−ゲル法によって調製される。ゾル−ゲルプロセスは、有機前駆体のケイ酸への変換と、それに続く濃縮および凝集に基づいており、図１３において図示されたように、ＳｉＯｘＯＨ（４−２ｘ）のネットワークを形成する。このプロセスは、混合物のｐＨおよび組成に依存した速度で、インシトゥにおいて完全に行なわれてよい。
【００７３】
たとえば、有機前駆体はアルコキシシランを、さらに好ましくは、テトラメトキシ−、テトラエトキシ−、またはテトラプロポキシシランといったテトラアルコキシシランか、またはテトラキス（２−ヒドロキシプロポキシ）シランのようなテトラキスヒドロキシアルコキシシランを含んでよい。
【００７４】
もう一つの態様においては、マトリックスは水溶液中でゾル−ゲルプロセスを受ける有機ポリマーを含んでよい。ゾル−ゲルプロセスは、ゲル化剤の存在により活性化されてよい。好ましくは、ゾル−ゲルプロセスは、生体分子には無害な（ポリ）エレクトロライトの、錯形成反応に基づく。たとえば、アルギン酸ナトリウム溶液は、カルシウム−、またはバリウム−含有溶液と混合されてよく、アルギン酸カルシウムまたはバリウムのゲルを産生する。このプロセスのカイネティクスは、二価イオンの錯化剤を使用することにより調整されてよい。他のポリマーを主成分とするゲル化組成物は、当業者には明らかであろう。
【００７５】
逆エマルジョン（水中油型）は、ペイロード化合物を疎水性液体中に含有する水相を、好ましくは適当な乳化剤とともに混合することにより産生されてよい。この方法は、直径＜１００ｎｍのシリカ鋳型（実施例１参照）を産生するために有用である。しかしながら、テトラアルコキシシランの加水分解は、ｐＨの調節された水溶液中で、別個に行なわれてもよい。この溶液は次に、生理学的に許容されるｐＨにおいて緩衝化され、ペイロード分子へ添加され、逆エマルジョン中に分散されてよい。
【００７６】
水相は、純水か、または水を主成分とする緩衝液か、または活性ペイロード分子の作用を損なわないｐＨ、イオン強度、および組成における、極性溶媒（メタノール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような）との水の混合物を含んでよい。
【００７７】
疎水性液体は、脂肪族化合物、たとえば、アルカンまたはアルケンを含んでよい。疎水性液体は、直鎖または分枝鎖をもつアルカンか、または直鎖または分枝鎖をもつアルカンの混合物か、またはかかるアルカンの、アルキル−芳香族化合物との混合物を含んでよい。たとえば、疎水性液体はヘキサンか、またはヘキサンおよびオクタン、あるいはヘキサンおよびイソオクタンを含んでもよい。
【００７８】
乳化剤は、任意の両親媒性物質か、または、疎水性液体と名づけられた液体および水相によって構成される、逆エマルジョンの安定化のための、適当な親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）によって特徴づけられる、物質の混合物を含んでよい。たとえば、乳化剤はベロール（Berol）シリーズの化合物のようなノニルフェノールエトキシレート、または他のオリゴエトキシル化非イオン界面活性剤、またはソルビタンモノ−、ジ−、およびトリ−オレエートまたは−ステアレートを含んでもよい。他の非イオン性、陰イオン性、または陽イオン性乳化剤もまた単独で、または混合物において、必要であれば、それらが逆エマルジョン、たとえば、ＡＯＴ（２−エチル−ヘキシル）スルホスクシネート、およびその非イオン界面活性剤との混合物を安定化することができるという条件で使用されてよい。
【００７９】
無機マトリックスの調製用には、好ましくはアルキルシランが混合物中へ投入され、水相によって加水分解され、ケイ酸を、さらに最終的にはＳｉ−Ｏ−Ｓｉ共有結合のネットワークを産生し、それによりペイロード分子をその中へ埋込むようにする。このプロセスは、元の含水小滴をシリカナノ粒子に変形する。
【００８０】
別法として、アルコキシシランはまず、水環境中で、迅速な反応を得るために必要な適当なｐＨ、たとえば、ｐＨ＞８、またはｐＨ＜６を用いて、部分的または完全にケイ酸へ加水分解される。ケイ酸はペプチド、たとえば、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬのような、高リジンペプチド、高アルギニンペプチド、または他のシラフィン−１の誘導体、あるいはシラフィン−２のいくつかの誘導体のようなリン酸タンパク質の影響下に凝集してよい。
【００８１】
有機マトリックスの調製用には、好ましくはポリマー溶液およびゲル化剤が混合され、直ちに乳化剤および疎水相が添加されて、逆エマルジョンが産生されてよく、それは硬化してゲルナノ粒子を産生する。たとえば、アルギン酸ナトリウム溶液は、カルシウムまたはバリウム含有溶液と前混合され、次に乳化される。別法として、ポリマーはまず乳化され、次いでゲル化剤溶液が添加されてもよい。たとえば、０．７ｍｌの１質量％の高M（高マンヌロン酸）アルギン酸ナトリウム溶液、高分子ペイロード（たとえば、酵素）中の０．１ｍＭは、まず４０ｍｌのヘキサン中に、乳化剤の混合物（２gのベロール２６および２gのベロール２６７）の助けにより分散され、次に０．３ｍｌの、クエン酸緩衝液中の塩化カルシウム０．１Ｍ溶液が添加されてもよい。
【００８２】
ひとたびペイロード化合物がマトリックス中に埋込まれれば、ヒドロゲル層が次いでその周囲に産生されてよい。好ましくは、モノマーサブユニット間の重合反応が、ヒドロゲル層を産生する。好ましくは、ヒドロゲル層は実質的に犠牲鋳型の外表面上に形成される。段階１によって産生されたマトリックスまたは犠牲鋳型の表面の周囲に、ヒドロゲルポリマー層を形成するべく、表面原子移動ラジカル重合（Surface Atom Transfer Radical Polymerization）が使用されることが好ましい。
【００８３】
マトリックス前駆体の調製の後、その表面は、重合、好ましくはリビング重合を開始することが可能な基を用いて、機能化されてよい。適当な官能基は、当業者には周知であり、たとえば、立体的に妨げられた２−ハロエステル、およびアミド、および、表面原子移動ラジカル重合を開始することが可能な他のハロゲン化物、好ましくは臭化物である。別の態様においては、開環機構によるリビング重合の開始用に、チオールおよびアミンといった他の基が使用されてよい。かかる官能基は、ポリエレクトロライト表面沈着またはシラン処理反応によって導入されてよい。ポリエレクトロライト表面沈着においては、犠牲鋳型は、ペイロード分子にとって許容されるｐＨ（６〜８）において水中または水混合物中に分散された場合、正味の静電荷、たとえば、純粋なシリカ、またはアルギン酸カルシウムまたはバリウムでは負の電荷を、アミノ機能化シリカでは正の電荷を帯びる。
【００８４】
反対の正味の電荷を帯びているポリマー種またはオリゴマー種は、静電引力のみによって永久に吸着され、それゆえ表面機能化のための便利な方法を提供する。好ましくは、ポリマー種またはオリゴマー種は、５反復単位当たり少なくとも１荷電基の正味荷電をもつ陽イオン系であり、分子量は２０，０００g／ｍｏｌを超えない。荷電ポリマーは、表面吸着が起こった後に鋳型を飾る官能基を運んでよい。好ましい態様においては、官能基は犠牲鋳型を取囲む媒体中に存在するモノマーの、表面原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）の開始剤であってよい。この媒体は、水または含水溶液でよい。
【００８５】
適当なモノマーが重合反応に使用されてよく、好ましくは、上記の式Ｉによって定義され、かつ図１６に例示されたポリマー構造を産生する。実例は、水溶性または水分散性のアクリル、メタクリル、またはビニルモノマーを含み、それは化学的および／または物理的に架橋された親水性のポリマー層、すなわちヒドロゲル層、を鋳型の表面上に形成する。好ましい反応においては、化学的に架橋されたヒドロゲル層を得るために、多官能性モノマーが使用される。
【００８６】
モノマー混合物は、少なくとも一つの、タンパク質を寄せつけないモノマー、たとえば、少なくとも一つのポリ（エチレングリコール）鎖を含有するモノマーを含んでよい。モノマー混合物はまた、特別の活性、たとえば、生物学的認識に必要なリガンドを表示することか、またはヒドロゲル層中の特定の分子の拡散を促進するかまたは妨害すること、すなわち組成物透過選択性、のための基を表示することを特徴とする少なくとも一つのモノマーを含んでよい。ポリマー鎖は、スペーサーセグメントにより、永久的および物理的に架橋されてよい。
【００８７】
マトリックスの表面への官能基の付加に続き、マトリックスの表面は次に、表面ＡＴＲＰのための開始基を含有するシラン処理剤で処理される。ひとたびモノマーおよび触媒を含有する溶液に対して暴露されれば、重合は表面から進行し、マトリックス表面にヒドロゲルの表面薄膜を生成する。
【００８８】
第３の態様によれば、第一の態様によるキャリア粒子のための前駆体であって、ペイロード分子を含有するマトリックスを含んでおり、マトリックスの表面がヒドロゲル層によって封入されている前駆体が提供される。
【００８９】
マトリックスは、適当な手段により、本発明のキャリア粒子を産生するべく溶解されるが、その手段は当業者には認識されるであろうし、また主として犠牲鋳型または支持マトリックスの組成によって決定されるであろう。したがって前駆体は、その中にペイロード分子が、たとえば輸送のために、含有されるかまたは埋込まれてもよい好ましいビヒクルを提供する。キャリア粒子の使用に先立ち、マトリックスは粒子を「活性化」するべく溶解されてもよい。
【００９０】
好ましくは、マトリックスはシリカ鋳型用のフッ化物処理によって溶解される。さらに好ましくは、フッ化物含有溶液はまた、プロセスを促進するアンモニアまたはアンモニウムイオンも含有する。最も好ましくは、溶液は、シリカの溶解の間のｐＨの上昇を避けるため、生理学的に許容されるｐＨ（５．５〜８）において緩衝化される。
【００９１】
他の好ましい態様においては、マトリックスはアルギネート鋳型用の錯化剤によって溶解されてもよい。たとえば、ナノ粒子は、カルシウムイオンを抽出しかつコアを液化するＥＤＴＡ−またはシトレート−含有溶液中で透析されてよい。カルシウム抽出の後、アルギネート高分子は、ヒドロゲル層の分子量カットオフ効果のため、水キャビティ内に残留してよい。それらは、ＨＨＮにさらなる安定性を提供する目的で、水キャビティの粘性および浸透圧の調節に使用されてよい。
【００９２】
結果として得られる中空の容器は、ペイロード分子を含有する水キャビティを特色とする。それによりポリマーヒドロゲル層は、その中にペイロード分子が封入され、かつ透過選択的である、球形の膜を形成する。
【００９３】
本発明の第４の態様によれば、標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子であって、該粒子は、ペイロード分子が含有される内部キャビティを含んでおり、該キャビティは透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれ、該粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合にペイロード分子が活性であることが可能な、薬物としての使用のためのキャリア粒子が提供される。
【００９４】
本発明の第５の態様によれば、標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子の用途であって、該粒子は、ペイロード分子が含有される内部キャビティを含んでおり、該キャビティは透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれ、該粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合にペイロード分子が活性であることが可能であるキャリア粒子の、漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病の治療用薬物の製造のための用途が提供される。
【００９５】
本発明の第６の態様によれば、漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病を患っている個体を治療する方法であって、かかる治療を必要とする個体へ治療上有効な量の、標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリア粒子であって、ペイロード分子が含有される内部キャビティを含んでおり、該キャビティは透過選択性のヒドロゲル層によって囲まれ、該粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合にペイロード分子が活性であることが可能なキャリア粒子を、投与することを含む方法が提供される。
【００９６】
ペイロード分子は、粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合に、活性でありかつ保護されていることが好ましい。保護は、ペイロード分子の周囲を封入しているヒドロゲル層によって与えられる。
【００９７】
キャリア粒子は、治療されるべき個体が、漏出性または不完全に形成された毛細血管をもつ組織を有している症状の治療のために特に有用である。漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する病理学的状況の実例は、ほとんどの固形腫瘍および損傷治癒を含み、中でも瘢痕形成のプロセス（血管形成部位：ここでは新たな血管および毛管が迅速に作られる）におけるものである。したがってキャリア粒子は、かかる症状の治療における使用のための、新規な生物医学的適用を提供する。
【００９８】
一つの適用においては、キャリア粒子は血流中に投与されてよく、血管形成部位、たとえば、損傷および腫瘍において選択的に蓄積する。このことは、コロイド物質に特有の、ＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention）効果によるものであってよい。
【００９９】
もう一つの適用においては、リンパによる取込みが限定されるかまたは無視できるほど小さい領域において、経皮的に投与されてよく、そこに残留してその活性を発現する。別法として、それらはリンパによる取込みが充分な領域において経皮的に注射されることが可能であり、血流中に放出される前の２〜３週間までの期間にわたり、リンパ系内でその活性を発現する。
【０１００】
ペイロード分子は、治療されるべき個体にとり免疫原性であってもよい。それゆえペイロード分子は、封入されていない場合には個体の免疫系によって破壊される。したがって、このことはキャリア粒子およびペイロード分子のターゲティングにポジティブな選択を提供する。たとえば、ペイロード分子は細菌酵素（もし治療される個体が非細菌、たとえば、ヒトのような哺乳類であれば）でよく、その酵素がプロドラッグを薬物に変換し、その薬物が癌細胞を殺すこととなる。もし粒子が癌細胞に到達する前にヒドロゲル層が破壊されれば、細菌酵素は哺乳類の免疫系によって破壊されることとなる。
【０１０１】
好ましい態様においては、キャリア粒子は約５００ｎｍの平均外径、および約１００ｎｍの平均内径を含む。ヒドロゲル層内表面は、実質的にポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）または、１０：１のモル比のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート−ｃｏ−エチレングリコールジメタクリレート）を含む。ヒドロゲル層外表面は、実質的にポリ（ＰＥＧ２０００アクリレート）または、３：１のモル比のポリ（ＰＥＧ２０００アクリレート−ｃｏ−ＰＥＧ５７０ジアクリレート）を含む。この組成は、充分な機械的安定性、好適なメッシュサイズ（約２〜３ｎｍの範囲内）、およびタンパク質吸着に対する抵抗性を保証する。
【０１０２】
キャリア粒子は、好ましくは、β−グルクロニダーゼの０．１ｍＭ溶液によって占められた約１０６ｎｍ３の体積を封入し、したがってナノ粒子あたりほぼ１０個の酵素分子を封入する。キャリア粒子の１体積パーセント（％ｖ／ｖ）の分散物は、約１ｎｍｏｌ／ｌの酵素濃度を提供する。
【０１０３】
この分散物は、何ら有意な漏出性血管をもたない健康な個体において、静脈内に注射されてよく、血液循環において４〜７日の半減期を有し、肺、肝臓、腎臓、および脾臓といった臓器における蓄積が次第に増加する。固形腫瘍塊、たとえば、皮下移植された結腸癌、肺癌、結腸癌を呈している個体における注射は、結果として分散物の選択的な蓄積を生じ、約２日後には、投与量の２０〜５０％が腫瘍内に蓄積するようになる。２日目から後、ドキソルビシングルクロニドの毎日の静脈内注射（５〜２０日の期間にわたる）は、酵素作用のための基質を提供し、それは選択的蓄積のため、ほとんどが腫瘍塊内に局在化される。この方法では、酵素産物（化学療法用ドキソルビシン）の高い濃度勾配が得られ、最大濃度は腫瘍部位において得られる。
【０１０４】
本発明のキャリア粒子が、単剤療法（すなわち、漏出性または不完全に形成された毛細血管をもつ疾病を予防および／または治療するための、本発明のキャリア粒子のみの使用）において使用されてよいことが認識されるであろう。別法として、本発明のキャリア粒子は、既知の治療法との補助または併用として使用されてよい。
【０１０５】
本発明のキャリア粒子は、一つの組成物に製剤されてよい。組成物は、特に、組成物が使用されるべき方法に依存して、多くの異なる形状を有してよい。したがって、たとえば、組成物はカプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮パッチの形状か、または、ヒトまたは動物へ、水和したかまたは湿った形状で投与されてもよい、任意の他の適当な形状でよい。組成物のビヒクルが、それが与えられる患者によって充分に耐えられるものであり、かつ好ましくはキャリア粒子の標的組織へのデリバリーを可能にするべきであることが認識されよう。
【０１０６】
本発明のキャリア粒子を含む組成物は、多くの方法において使用されてよい。たとえば、キャリア粒子が、たとえばカプセルまたは液体の形状で経口摂取されてもよい組成物内に含有されてよい症例では、全身投与が必要とされてよい。好ましくは、組成物は血流内への注射によって投与されてよい。注射は、静脈内（塊状注入または点滴）または皮下（塊状注入または点滴）でよい。組成物はまた、吸入により投与されてもよい（たとえば、鼻腔内）。
【０１０７】
キャリア粒子はまた、徐放型または遅延型の放出装置内に取込まれてもよい。かかる装置は、たとえば、皮膚の上または下に挿入され、組成物は数週間または数ヶ月間にもわたって放出されてよい。かかる装置は、本発明のキャリア粒子による長期間の治療が必要であり、かつ普通には頻繁な投与（たとえば、少なくとも毎日の注射）が必要となる場合に特に有利であってよい。
【０１０８】
必要とされるキャリア粒子の量または数は、その中に封入されたペイロード分子の必要量、およびその生物活性およびバイオアベイラビリティによって影響され、それは次に投与の方式、使用されるキャリア粒子の物理化学的性質、および、キャリア粒子が単剤療法として使用されるのか、あるいは併用療法においてか、に依存することが認識されよう。投与の頻度もまた、上記の因子、および特に、封入されたペイロードおよびキャリア粒子の、治療される患者内での半減期によって影響されるであろう。
【０１０９】
投与されるべき最適投与量は、当業者によって決定されてよく、使用するペイロード分子およびキャリア粒子、製剤の濃度、投与方式、および病気の症状によって変わるであろう。治療される特定の患者に依存した付加的な因子は、患者の年齢、体重、性別、食餌、および投与時間を含めて、投与量を調整する必要を生じる結果となる。
【０１１０】
製薬産業によって慣例的に用いられるもののような既知の方法（たとえば、インビボの実験法、臨床試験など）が、本発明のキャリア粒子の特定の製剤、および厳密な治療レジメ（キャリア粒子の日用量および投与の頻度のような）を確立するべく使用されてよい。
【０１１１】
キャリア粒子の用量が、運ばれる特定のペイロード分子、および標的細胞、および治療される疾病に、高度に依存することが認識されよう。しかしながら、一般的には、本発明のキャリア粒子の０．０１μg／ｋｇ体重と０．５g／ｋｇ体重の間の日用量が、どの特定のキャリア粒子およびペイロード分子が使用されるかに依存して、漏出性または不完全に形成された毛細血管をもつ疾病の予防および／または治療に使用されてよい。さらに好ましくは、日用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と２００ｍｇ／ｋｇ体重の間、および最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇの間である。
【０１１２】
日用量は、単回投与（たとえば、毎日１回の注射）として与えられてよい。別法として、使用されるキャリア粒子は、一日の間に２回以上の投与を必要としてもよい。実例として、本発明のキャリア粒子は、２回（または症状の激しさに依存してさらに多く）の、５ｍｇと７０００ｍｇの間の日用量（すなわち、体重７０ｋｇと仮定して）として投与されてよい。治療を受けている患者は、覚醒時に最初の用量を、次に２回目の用量を夕方に（２回用量のレジメの場合）、または、その後３または４時間ごとの間隔で受けてもよい。別法として、反復用量を投与する必要なしに最適な用量を患者に提供するべく、徐放装置が使用されてもよい。
【０１１３】
本発明は、治療上有効な量の本発明のキャリア粒子、および任意に製薬上許容されるビヒクルを含む、製剤組成物を提供する。一つの態様においては、キャリア粒子の量は、約０．０１ｍｇから約８００ｍｇの量である。もう一つの態様においては、キャリア粒子の量は、約０．０１ｍｇから約５００ｍｇの量である。もう一つの態様においては、キャリア粒子の量は、約０．０１ｍｇから約２５０ｍｇの量である。もう一つの態様においては、キャリア粒子の量は、約０．１ｍｇから約６０ｍｇの量である。もう一つの態様においては、キャリア粒子の量は、約０．１ｍｇから約２０ｍｇの量である。
【０１１４】
本発明は、治療上有効な量の本発明のキャリア粒子と、製薬上許容されるビヒクルとを組合せることを含む、製剤組成物を作成するプロセスを提供する。「治療上有効な量」は、患者に投与された場合、漏出性または不完全に形成された毛細血管をもつ疾病の予防および／または治療を与える、本発明のキャリア粒子の任意の量である。しかしながら、キャリア粒子中のペイロード分子のタイプおよび量が、該粒子の治療効果に寄与するであろうことが認識されよう。「患者」は、脊椎動物、哺乳類、家畜、またはヒトである。
【０１１５】
本文において言及された「製薬上許容されるビヒクル」は、製剤組成物の製剤において有用な、当業者には周知の、任意の生理学的ビヒクルである。
【０１１６】
好ましい態様においては、製剤用ビヒクルは液体であり、製剤組成物は溶液の形状である。さらなる態様においては、製剤ビヒクルはゲルであり、組成物はクリームなどの形状である。
【０１１７】
液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、および加圧組成物の調製において使用される。キャリア粒子は、水、有機溶媒、双方の混合物、または製薬上許容される油または脂肪中に溶解または懸濁されることが可能である。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、着香料、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤といった、他の適当な医薬品添加物を含有することが可能である。経口および非経口投与用の液体ビヒクルの適当な実例は、水（一部は上記のような添加物、たとえば、セルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液、を含む）、アルコール（一価アルコール、および多価アルコール、たとえば、グリコール）およびその誘導体、および油（たとえば、分別されたヤシ油およびラッカセイ油）を含む。非経口投与用には、ビヒクルはまたオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような、油性エステルであることも可能である。無菌の液体ビヒクルは、非経口投与用の無菌液の形状の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素か、または他の製薬上許容される噴射剤であることが可能である。
【０１１８】
無菌の溶液または懸濁液である液体製剤組成物は、たとえば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、皮下、および特に静脈内注射によって利用されることが可能である。キャリア粒子は、無菌の固形組成物として調製されてもよく、投与時に無菌の水、食塩水、または他の適当な無菌の注射可能な媒体を用いて溶解または懸濁されてよい。ビヒクルは、必要かつ不活性の結合剤、懸濁化剤、潤滑剤、着香料、甘味料、保存料、染料、およびコーティングを含むことが意図される。
【０１１９】
本発明のキャリア粒子は、他の溶質または懸濁化剤（たとえば、等張液を製するべく充分な、食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノオレート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよび、エチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含有する無菌の溶液または懸濁液の形状で、経口投与されることが可能である。
【０１２０】
本発明のキャリア粒子はまた、液体のまたは個体の組成物の形状で、経口投与されることが可能である。経口投与に適した組成物は、ピル、カプセル、顆粒、錠剤、および粉末といった個体の形状および、溶液、シロップ、エリキシル、および懸濁液といった液体の形状を含む。非経口投与に有用な形状は、無菌の溶液、エマルジョン、および懸濁液を含む。
【０１２１】
本文において記述された全ての特徴（任意の添付のクレイム、要約、および図面を含めて）、および／またはそのように開示された任意の方法またはプロセスの全ての段階は、かかる特徴および／または段階の少なくともいくつかが互いに排反する組合せを除いて、
任意の組合せにおいて、上記の任意の態様と組合わされてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２２】
本発明のよりよい理解のため、および本発明の態様がどのように実施されてよいかを示すため、単なる例として、添付の説明図面が参照されよう。
【０１２３】
図１を参照すれば、本発明の態様によるキャリア粒子１０の産生を例示した概略図が示される。かかるキャリア粒子１０はまた、中空ヒドロゲルナノ粒子またはナノスフェア（ＨＨＮ）１０として知られる。かかるＨＨＮ１０のさらに詳細な産生は、図９に例示されている。
【０１２４】
本発明によるキャリア粒子（ＨＨＮ）１０の製造のための特別の実例は、次に本文において記述されよう。
【０１２５】
図１を参照すれば、中空ヒドロゲルナノスフェア１０が三つの段階；（ｉ）ペイロード分子を含有するシリカナノ粒子の調製；（ｉｉ）これらのシリカナノ粒子の、その周囲のポリマー膜の産生のための鋳型としての使用；および（ｉｉｉ）シリカナノ粒子を溶解して、結果として生じるＨＨＮ１０を産生すること、において調製される。これら三つの段階の各々は、次に詳細に記述される。
【０１２６】
（段階１）
第一の段階においては、球形構造２が調製され、それは次にくる相（段階２）のための鋳型または前駆体として作用する。この元の球形構造２は、約２０〜５００ｎｍの範囲の平均サイズを有しており、犠牲鋳型２と呼ばれる。犠牲鋳型２は、第二の構造に対し、形態およびサイズを提供するべく使用され、次いで溶解される。
【０１２７】
確立された文献の方法（以後記述される）を用いて、シリカナノ粒子１は広範囲のミクロン以下の直径で調製されることが可能であり、生物活性物質４を封入する。適当な生物物質の例は、図１に示したように酵素である。これらの生物活性化合物４は、その元の活性を、少なくとも部分的に、最終的なＨＨＮ１０中に保持している。
【０１２８】
一般に、段階Ｉの、または鋳型２を産生するプロセスは、シリコンアルコキシドの加水分解および濃縮に基づく。このプロセスを実行するために用いられた方法論は、鋳型２のディメンションを、および最終的には結果として生じるＨＨＮ１０のそれを決定することが可能である。犠牲鋳型２は無機酸化物からなり、有機前駆体の加水分解に基づくゾル−ゲル法を通して調製される。たとえば、一つの態様においては、有機前駆体はテトラアルコキシシランである。
【０１２９】
ゾル−ゲルプロセスは、有機前駆体のケイ酸への変換、およびそれに続く濃縮および凝集に基づいており、図１３に例示されたような、ＳｉＯｘＯＨ（４−２ｘ）ネットワークを形成する。このプロセスは、混合物のｐＨおよび組成に依存した速度で、インシトゥにおいて完全に行なわれることが可能である。別法として、テトラアルコキシシランは、水環境中で、迅速な反応を得るための好適なｐＨ、たとえばｐＨ＞８または＜６を用いて、まず部分的または完全に、ケイ酸へ加水分解されることが可能である。
【０１３０】
得られた溶液は次に、凝集および鋳型２の調製のための環境内へ投入される。たとえば、ケイ酸は適当に設計されたペプチドの影響下に凝集されることが可能である。別法として、テトラアルコキシシランは水環境中で、迅速な反応を得るための好適なｐＨ、たとえばｐＨ＞８、または＜６を用いて、まず部分的または完全に、ケイ酸へ加水分解されてよい。ケイ酸はペプチド、たとえば、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬのような、高リジンペプチド、高アルギニンペプチド、または他のシラフィン−１誘導体、またはシラフィン−２のいくつかの誘導体のようなリンタンパク質の影響下に凝集されることが可能である。このプロセスを行なうために使用される方法論は、鋳型２の、および最終的にはＨＨＮ１０のディメンションを決定することが可能である。
【０１３１】
さらに詳細には、犠牲鋳型２は、逆エマルジョン（油中水型エマルジョン）におけるゾル−ゲル法によって調製されており、それは図１３に詳細に例示されたように、テトラアルコキシシランのインシトゥの加水分解に基づいている。逆エマルジョン（油中水型）は、疎水性液体１６中に生物活性成分４を含有する水相を、適当な乳化剤とともに混合することによって生成される。この方法は、直径＜１００ｎｍのシリカ鋳型を産生するために有用である（実施例１参照）。もう一つの態様においては、テトラアルコキシシランの加水分解は、ｐＨの調節された水溶液中で別個に行なわれる。この溶液は、次いで生理学的に許容されるｐＨにおいて緩衝化され、感受性の生物活性物質４へ添加され、逆エマルジョン中に分散される。
【０１３２】
水相は、純水か、または水を主成分とする緩衝液か、または、活性ペイロード分子成分４の作用を損なわないｐＨ、イオン強度、および組成における、非常に極性のある溶媒（メタノール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような）との水の混合物からなる。活性ペイロード分子４は、単なる例として、水溶性のペプチド、タンパク質、酵素、多糖、抗体、または合成ポリマー物質を含む。疎水性液体は、直鎖または分枝鎖をもつアルカンか、または直鎖または分枝鎖をもつアルカンの混合物か、またはかかるアルカンの、アルキル−芳香族化合物との混合物である。
【０１３３】
乳化剤は、任意の両親媒性物質か、または、疎水性液体と名づけられた液体および水相によって構成される、逆エマルジョンの安定化のための、適当なＨＬＢ値によって特徴づけられる物質の混合物である。たとえば、乳化剤はベロールシリーズの化合物のような、ノニルフェノールエトキシレートである。他の非イオン性、陰イオン性、または陽イオン性乳化剤もまた、必要であれば、単独で、または混合物において使用されることが可能である。
【０１３４】
図１３に示されたように、テトラアルコキシシランは次に混合物中へ投入され、水相によって加水分解され、ケイ酸を、および最終的にはＳｉ−Ｏ−Ｓｉ共有結合のネットワークを産生し、それによりペイロード分子４をその中へ埋込む。このプロセスは、元の含水小滴をシリカナノ粒子へ変形する。
【０１３５】
（段階２）
第二の段階においては、表面原子移動ラジカル重合が使用されて、図１に示されたような、段階一によって産生された犠牲鋳型２の表面の周囲に、ヒドロゲルポリマー層６を形成する。鋳型前駆体２の調製の後、犠牲鋳型２の表面はまず、リビング重合を開始することの可能な基を用いて機能化される。図７を参照すれば、これらの官能基は、ポリエレクトロライト表面沈着またはシラン処理反応によって導入される。官能基は、犠牲鋳型２の周囲の媒体中に存在するモノマーの、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）の開始剤である。この媒体は、水または含水溶液である。
【０１３６】
ＡＴＲＰに使用されることが可能なモノマーは、水溶性または水分散性のアクリル、メタクリル、またはビニルモノマーであり、化学的に架橋された疎水性のポリマー層６、すなわちヒドロゲル層を、鋳型２の表面上に形成する。ＡＴＲＰに使用される好ましいモノマーの式は、図１６に例示されている。好ましい反応においては、化学的に架橋されたヒドロゲル層６を得るため、多官能性モノマーが使用される。
【０１３７】
たとえば、一つの態様においては、ポリマーヒドロゲル層はそのｐＨ感受性に影響を及ぼす基を含むことが可能である。好適な構造のリストは、図２０に示されている。もう一つの態様においては、ポリマーヒドロゲル層はまた、層の酸化還元電位に対する感受性に影響を及ぼす基も含むことが可能である。たとえば、ヒドロゲル層は、異なるポリマー鎖における側鎖を架橋するジスルフィドの存在に、部分的に、またはもっぱら起因して、架橋されてよい。たとえば、還元剤の存在は、図２１に例示されたように、それらをチオールへ、または非対称ジスルフィドへ変換してよく、架橋密度の低減およびヒドロゲルメッシュサイズの増大を決定する。
【０１３８】
もう一つの態様においては、モノマー混合物は、少なくとも一つの、タンパク質を寄せつけないモノマー、たとえば、少なくとも一つのポリ（エチレングリコール）鎖を含有するモノマーを含んでよい。もう一つの態様においては、モノマー混合物はまた、特別の活性、たとえば、生物学的認識に必要なリガンドを表示することか、またはヒドロゲル層６の中の特定の分子の拡散を促進するかまたは妨害すること、すなわち組成物透過選択性、のための基を表示することを特徴とする少なくとも一つのモノマーを含んでよい。もう一つの態様においては、ポリマー鎖は、スペーサーセグメントにより、永久的および物理的に架橋される。同程度の側鎖をもつ二つのスペーサーセグメントの比較では、図１９に例示されるように、ポリマー鎖間のより短い距離の故に、より高い架橋密度はより短いセグメントによって与えられる。セグメントの長さはオリゴマー化の度合いが増すにつれて増加し、ネットワークのメッシュサイズもまた増大する。
【０１３９】
本文においてＡＴＲＰと呼ばれる、原子移動ラジカル重合においては、ポリマー分子量の値は、停止反応の抑制のため、可用性のモノマーの量に直接的に関連する。ＡＴＲＰは、以前は表面のコーティングに適用されていた（ボンテンポ（Bontempo,  D.）ら著、Macromol.  Rapid Commun.  ２００２年、第２３巻、ｐ．４１７−４２２、フォン・ネツマー（Von  Natzmer）ら著、Chem.  Commun.  ２００３年、ｐ．１６００−１６０１）が、それにおいては、薄膜の厚さは、モノマーの量によって調製されることが可能である。ＡＴＲＰのこの特別の態様は、鋳型２の表面に連結された基から進行し、かつ溶液中のモノマーおよび触媒を用いており、本文において「表面ＡＴＲＰ」と呼ばれる。
【０１４０】
鋳型２の表面への官能基の付加に続き、犠牲鋳型２の表面は次に、表面ＡＴＲＰのための開始基を含有するシラン処理剤で処理される。ひとたびモノマーおよび触媒を含有する溶液に対して暴露されれば、重合は表面から進行し、ヒドロゲルの表面薄膜６を生成する。
【０１４１】
図４〜７を参照すれば、本発明の態様によって使用されるＡＴＲＰの特別の機構の詳細が示される。図４は、ラジカル重合と関係している段階、すなわち開始段階、次に続く増殖（propagation）段階、次の停止段階を例示している。図５は、調節されたリビングラジカル重合に関係する段階を例示している。図６は、ＡＴＲＰに関係する段階を例示している。図７は、支持されたＡＴＲＰに関係する段階を例示している。表面ＡＴＲＰは、ポリマー層６の厚さについて微調整することを可能にする。
【０１４２】
モノマー構造中の重合可能な基の数および間の距離は、ＨＨＮ１０の最終的なヒドロゲル層６のメッシュサイズを、それゆえその分子量カットオフ、すなわちヒドロゲル層６における目的物のサイズ依存性の拡散特性、すなわちサイズ透過選択性を決定するであろう。ポリマー鎖の長さは、その重合度に関連づけられ、ヒドロゲル層の厚さを決定し、そのことが膜の機械的および輸送特性に影響を及ぼす。より厚い膜は、剪断に対してより高い抵抗性をもち、目的物がそこを透過するためにより長い時間を必要とする。好ましい態様においては、ポリマー鎖は１０２〜１０６以上の範囲内の重合度を有し、それは図１７に例示されたような、１０〜５００ｎｍの範囲内の厚さに相当することが可能である。
【０１４３】
したがって、表面ＡＴＲＰは（ａ）無機または有機表面によって開始されることが可能であり；（ｂ）水環境中で進行することが可能であり；さらに（ｃ）モノマーが使い尽くされたときにのみ停止する（寄生反応なし）。ヒドロゲル層６の厚さは、重合時間、および添加されたモノマーの量によって調節されることが可能である。犠牲鋳型２およびヒドロゲル層６からなる目的物、すなわちコアーシェル型ナノ粒子のサイズは、約５０〜１，０００ｎｍである。
【０１４４】
（段階３）
ＡＴＲＰによるヒドロゲル層６の調製の後、犠牲鋳型２は、図１、９、および１０に例示されたように、たとえばシリカ鋳型用のフッ化物処理によって溶解される。それによりポリマーヒドロゲル膜６は球形の膜１０を形成し、その中に生物活性ペイロード化合物４（酵素）が封入される。図１４は、ＨＨＮ１０の別の態様を示している。最初の球形のジオメトリは、環境条件に依存して、楕円形、または両凹レンズ形に変更されてよい。たとえば、最初の球形のジオメトリ（図１４の下部）は、剪断力の作用によって楕円形（左上）に、またはより高い外部浸透圧によって両凹形（右上）になることが可能である。
【０１４５】
結果として生じる中空の容器１０は、ペイロード分子４を含有する水キャビティ８を特色としており、ペイロード分子はその大きいサイズの故にヒドロゲル層６の外側に拡散することはできないが、周囲の水媒体中に存在し、かつヒドロゲル層６を透過することの可能な、低分子量化合物１４によって到達されることは可能である。これは、図１５において詳細に例示されている。
【０１４６】
高分子量の活性ペイロード生体分子４は、犠牲鋳型２内に取込まれることが可能である。もし鋳型２の可溶化の後に、ポリマー膜６が適当な分子カットオフを有していれば、これらの化合物４はキャビティ８内に閉じ込められ、その生物活性を保持する。
【０１４７】
図２および１２を参照すれば、ＨＨＮ１０の構造が詳細に、特にヒドロゲルポリマー膜６の透過選択的性質が示される。使用された調製法、すなわち、この調製法が、球形のヒドロゲル膜６の合成に表面ＡＴＲＰを適用していることの故に、ＨＨＮ１０は新規である。ＨＨＮ１０の製造におけるＡＴＲＰの使用は、膜６の厚さ、機能性、および輸送特性を厳密に調節できるようにする。ヒドロゲル層のメッシュサイズよりも大きいサイズの分子は、層を通って拡散することができないが、図１５に示されたように、より小さいサイズの分子には透過が可能である。
【０１４８】
ポリマー層６は架橋され、かつ分子量カットオフをもつ、すなわち透過選択性をもつ膜として作用する。したがって、図２を参照すれば、ヒドロゲル中空球１０の水キャビティ８内に封入された、酵素４が示される。ナノスフェア１０の膜６の特性は、酵素活性の基質および産物といった、低分子化合物１４の自由拡散または透過を可能にするが、しかし酵素４自体のキャリア１０の外への、潜在的に有害な高分子化合物１２（タンパク質分解酵素または、酵素のような免疫系媒介物）のキャビティ８内への透過を可能にしないよう、設計されている。
【０１４９】
図３および１０を参照すれば、ＨＨＮ１０に酵素４を埋込む方法論が示される。封入された酵素４は、透過選択性によって示されるようなその活性を保持することが可能であるが、外部の過酷な環境に対し保護されている。酵素４は体液内で使用されるが、そこでは中空の構造１０が外来の身体反応からそれらを保護し、その半減期を増大する。
【０１５０】
（中空ヒドロゲルナノスフェアの適用）
結果として生じるＨＨＮ１０は、機能性および免疫防御された酵素の、腫瘍塊に対する標的デリバリーにおいて使用されてよい。それらはまた、不活性のプロドラッグを化学療法薬へ局所的に変換するべく使用されてもよい。好ましい態様においては、ヒドロゲル中空球１０は血中へ投与され、コロイド物質に特有のＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention）効果により、血管形成部位（損傷、または腫瘍）において選択的に蓄積される。キャリア１０は、有効成分４が閉じ込められるであろう、内部の水キャビティを囲む、ポリマーの親水性の球形の膜６を特徴としてもよい。
【０１５１】
蓄積の部位において、それらはプロドラッグの、対応する活性成分への化学的変換を実行することが可能である。図３および１０を参照すれば、ヒドロゲル中空球１０は、５−フルオロシトシンの、化学療法用５−フルオロウラシルへの変換のための、シトシンデアミナーゼのような、酵素４を含有する。
【０１５２】
（インビボの生化学的変換のためのＨＨＮの用途）
ＨＨＮ１０は、生化学的変換を行うことが可能な活性化合物４の化合物または混合物を封入するべく使用される。これらの化合物４は、天然または設計された酵素か、または酵素模倣性の活性を有する化合物か、または生理学的条件下に触媒活性を有する任意の化合物であることが可能である。活性化合物４は、その合成の間に犠牲鋳型中に封入され、鋳型の溶解の後、ＨＨＮの水キャビティ内に閉じ込められたまま残る。
【０１５３】
ヒドロゲル膜６のメッシュサイズは、活性化合物４の外部環境における拡散を避けるが、化合物の基質または、補酵素のような、可能性のある共活性化合物の拡散を可能にする値を提供するべく設計されている。
【０１５４】
たとえば、大腸菌ニトロレダクターゼのような、２８，０００g／ｍｏｌといわれる分子質量をもつ酵素には、ヒドロゲル膜の平均メッシュサイズは、ＨＨＮヒドロゲル層の調製における適当なコモノマー混合物の使用（たとえば、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、ＭＷ（分子量＝７５０）、およびエチレングリコールジメタクリレート）により、平均値５ｎｍに設定される。このメッシュサイズ値は、基質および産物（アジリジン含有性の芳香族化合物、ＭＷ＜１，０００、サイズ≦２ｎｍ）の拡散を可能にするが、免疫グロブリン（ＭＷ≧１００，０００、サイズ≧１０ｎｍ）の拡散は可能にしない。
【０１５５】
活性化合物含有性のＨＨＮ１０は、封入された物質に対して長期間の活性を与えるため、インビボにおいて使用されることが可能である。たとえば、タンパク質を避け、かつ非接着性のヒドロゲル膜をもつＨＨＮ１０は、毛細リンパ管におけるその取込みに有利にするため、血流中に直接に、または経皮的に、生きた動物に投与されることが可能である。ヒドロゲル膜６のメッシュサイズは、ａ）活性化合物の液体中の拡散を避け、ｂ）化合物の活性（蛋白質分解性の活性酵素、抗体）を潜在的に妨害することが可能な物質の、水キャビティ内への拡散を避け；ｃ）化合物の基質または共活性化合物の透過を可能にする値を提供するべく設計される。
【０１５６】
かかる系は、体液中での薬物の調節された産生のために使用されることが可能である。標的動物には有意な量で存在しない、適当な酵素の使用は、ＨＨＮの存在下でのみ変換を行うことを可能にする。
【０１５７】
（バイオイメージングのためのＨＨＮ１０の用途）
ＨＨＮ１０は、その分光特性が生化学的事象に対して変化する、生物活性物質の封入のために使用されることが可能である。たとえば、ＨＨＮは、その蛍光が結合事象に対して変化する、設計されたグリーン蛍光タンパク質突然変異体のために使用されることが可能である。体液中に存在する低分子リガンドに対する、設計されたＧＦＰ突然変異体の結合を検出することは、ＧＦＰの蛍光における変化を検出することによって可能である。同時に、高分子量のタンパク質または核酸の、ＧＦＰまたはＧＦＰの任意の酵素的分解物に対する結合からのいかなる影響も回避される。好ましい態様においては、突然変異体ＧＦＰを封入しているＨＨＮは、体液のサンプルに対して暴露され、標的リガンドの濃度は、ＧＦＰの蛍光における変化、たとえば、クエンチングによるその減少を測定することによって測定される。
【０１５８】
（実施例）
以下の詳細な実施例を用いて、本発明者らは、どのようにして：
ａ）調節可能な直径をもつ犠牲鋳型ナノ粒子を得ることが可能であり（実施例１）；
ｂ）本方法が、感受性の生物学的物質、すなわちペイロード分子を含有する鋳型ナノ粒子の調製に拡大されることが可能であり（実施例２）；
ｃ）鋳型ナノ粒子が、穏やかな条件下で可溶化されることが可能であり（実施例３）；
ｄ）鋳型ナノ粒子の表面を、それらが、重合を開始することが可能な基で装飾される方法で修飾することが可能であり（実施例４）；
ｅ）開始基によって表面上に修飾された鋳型ナノ粒子は、表面開始重合により、ポリマー薄膜で装飾される（実施例５．Ａ．１）。薄膜の厚さは、重合のリビング特性により、調節可能である（実施例５．Ａ．２）。薄膜は、直鎖または架橋されたポリマーからなることが可能である（実施例５Ｂ）。この方法は、コアーシェル型ナノ粒子を提供する。
ｆ）コア−シェル型ナノ粒子のコアは、シェルを破壊することなく可溶化され、中空のナノスフェアを提供することが可能であり（実施例６）
ｇ）鋳型ナノ粒子（ポイントｂ）におけるような）内に閉じ込められた感受性の生物学的物質（ペイロード分子）は、コア−シェル型構造内に、また中空ナノスフェア内に封入されたまま残る（実施例２）のであるかを示す。
【実施例１】
【０１５９】
シリカナノ粒子の調製
Ａ  逆エマルジョンにおける調節された直径をもつシリカナノ粒子の一段階合成
４gの陰イオン界面活性剤混合物（２gのベロール２６および２gのベロール２６７）は、４０ｍｌのｎ−ヘキサン中に溶解された。溶液は１．０ｍｌの塩基性水溶液（０．０５Ｍ  ＮＨ３、０．１gのＮＨ３３５％を純水４０ｍｌ中に希釈することによってあらかじめ調製された）が添加された。混合物は、撹拌下に維持され、安定かつ透明なマイクロエマルジョン（わずかに青みを帯びた不透明体）を形成した。０．６ｍｌのテトラエトキシシラン（２．７ｍｍｏｌ；d＝０．９３４g／ｍｌ）が次に添加され、４００ｒｐｍでの撹拌下に７２時間置かれた。次いで６０ｍｌのトルエンがマイクロエマルジョンに添加され、フロキュレーションおよび沈殿が測定され、それは１５分以内に完了された。
【０１６０】
沈殿は、デカンテーションにより有機相から分離され、４０ｍｌのｎ−ヘキサン中に再懸濁された。２０分後、白色沈殿は透明になり、次いで分離され、再度４０ｍｌのｎ−ヘキサンを用いて洗浄された。ゲル様の透明な沈殿は、１０ｍｌの１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液中に、ｐＨ７．４において分散され、白色のエマルジョンを生じた（ＰＢＳ組成：０．２g
ＫＣｌ、０．２６gＮａＨ２ＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ、２．８６gＮａ２ＨＰＯ４＊１２Ｈ２Ｏ、１ｌのＨ２Ｏ中に溶解された８gＮａＣｌ）。分散物中になお含有されているｎ−ヘキサンは、ロータリーエバポレータ（圧力は４００から２０ｍｂａｒまで減少、周囲温度）において蒸発された。有機溶媒が完全に除去されたとき、懸濁液は透明に変化した。懸濁液は最終的にＰＢＳ（ｐＨ７．２、ＭＷＣＯ  １０ｋＤａの透析膜使用）において３日間透析され、界面活性剤および可能な有機溶媒の痕跡を除去した。
【０１６１】
１μｍのフィルターを通した濾過の後、動的光散乱分析は二つのｐＨを明らかにしたが、一つは界面活性剤ミセル（平均直径〜１０ｎｍ）によって構成され、透析の間に除去されることが可能であり、他方はナノ粒子によって構成される（d〜５０÷６０ｎｍ）。
【０１６２】
【表１】
2006528234.tif 000004
【０１６３】
ベロール２６およびベロール２６７は、同等の疎水性部分（ノニルフェニル）と、ベロール２６では４単位の、ベロール２６７では８単位のエチレングリコールからなる、サイズの異なる親水性部分を有する（ベロール２６ではＨＬＢ＝８．９、ベロール２６７では１２．３）。ベロール２６７の量を増すことにより、平均ＨＬＢおよび水ドメインのサイズも増大する。２６／２６７の比が０．８未満では、エマルジョンは不安定である。
【０１６４】
Ｂ  逆エマルジョンにおける調節された直径をもつシリカナノ粒子の二段階合成（ｐＨ＝７−緩衝化合成の例）
１ｍｌのテトラエトキシシランは、１ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌ水溶液へ添加され、激しく撹拌された。テトラエトキシシランの完全な可能化は、２時間後に達せられ、それはその完全な加水分解のための最少時間として解釈された。ｐＨ＝８の、１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝食塩水が添加され、結果として得られた溶液のｐＨを７．０まで上昇させた。４gの陰イオン界面活性剤混合物（２gのベロール２６および２gのベロール２６７）は、４０ｍｌのｎ−ヘキサン中に溶解された；あらかじめ加水分解され、かつ緩衝化された１．０ｍｌのテトラエトキシシラン溶液が添加され、結果として得られたマイクロエマルジョンは、実施例１Ａで記述されたように処理された。
【実施例２】
【０１６５】
フッ化物含有溶液によるシリカナノ粒子の可溶化
フッ化物含有溶液は、１００ｍｌのＨ２０に１gのフッ化アンモニウム、１gのフッ化ナトリウム、１．５gの氷酢酸、および２gの酢酸アンモニウムを溶解して調製された。最終的な溶液は、２７０ｍＭ  ＮＨ４Ｆ、２４０ｍＭ  ＮａＦ、２５０ｍＭ酢酸、および２６０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、最終的なｐＨは５．７である。１００μｌの市販のルドックス（Ludox）シリカ溶液（３４質量％、アルドリッチ（Aldrich））は、１０ｍｌのＨ２Ｏ中に希釈され、結果として得られた溶液は、ナノ粒子の封じ込めのための適当な分子量カットオフをもつが、低分子の、可用性産物（ＭＷＣＯ＝１５，０００）の自由な流通のある透析バッグへ充填された。
【０１６６】
透析バッグは、１００ｍｌのフッ化物溶液に対し１８時間暴露された。プロセスの終わりに、ｐＨはなお５．７であった。次いで透析バッグは移され、シリケートおよびフッ化物の除去のため、純水に対し、周囲の溶液を１時間ごとに純水で交換して、６時間にわたり暴露された。透析バッグの内容物は次に、動的光散乱において分析され、未処理のルドックス懸濁液と同じ濃度において比較された。二つのプロットは、ピーク強度を平均散乱強度（未処理サンプルでは５００ｋ  ｃｐｓ、処理サンプルでは１３k  ｃｐｓ）で割ることによってノーマライズ（normalized）され、図２２に例示されたような、ナノ粒子のほぼ完全な溶解を示した。
【実施例３】
【０１６７】
シリカモノマーにおけるタンパク質性物質の取込み
実施例１Ｂにおいて用いられた手法は、タンパク質性物質の安定性を確保するべく修正された。１００μｌの４．１ｍｇ／ｍｌのグリーン蛍光タンパク質の溶液は、ｐＨ８．０の１．０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝食塩水中に希釈され、次いで加水分解されたテトラエトキシシラン溶液へ添加された。実験は次に、実施例１Ｂにおいて記述されたように行なわれ、タンパク質の取込みは、透析（ＭＷＣＯ＝２００，０００）の後、ナノ粒子分散物の蛍光を測定することによって検査された。
【実施例４】
【０１６８】
ナノ粒子表面からリビング重合を開始することの可能な基をもつシリカナノ粒子の機能化
Ａ  原子移動ラジカル重合を開始することが可能な基を含有する陽イオンポリマー（ｐＣＡＴ）の吸着による機能化
Ａ．１  ポリマー合成
段階１−ポリマー主鎖の合成
９ｍｌの２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡ）（５３ｍｍｏｌ）
および２ｍｌの２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）（１３ｍｍｏｌ）は、１０ｍｌのメタノール中に溶解され、溶液は窒素により４５分間にわたり激しく脱気された。０．２１５ｍｌのエチル−２−ブロモイソブチレート（１．４７ｍｍｏｌ）が、２０℃の温度において窒素気流下に添加され；０．４６gの２，２′−ビピリジル（ｂｐｙ、２．９４ｍｍｏｌ）および０．２２gのＣｕ１Ｂｒ（１．４７ｍｍｏｌ）の添加が、重合反応を開始した。１５分後、反応溶液中のゲル化をさけるため、４０ｍｌの新たに脱気されたメタノールが添加された。
【０１６９】
１８時間後、溶液は空気に暴露され（色は暗褐色からグリーンへ変化する）、シリカクロマトグラフィーカラムを通して銅を除去し、最終的に蒸発された。固体は次に、２５ｍｌのＴＨＦ中に溶解され、第二のシリカカラムを通して濾過され、ヘキサン中で沈殿された。二回目の沈殿の後、ポリマーは真空下に乾燥され、３５％ＨＥＭＡによって構成される（ＮＭＲ分析から）、８gの白色粉末を生じた（収率８０％）。
【０１７０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝４．０（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方），３．７５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＨＥＭＡのみ），２．５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＤＭＡのみ），２．２５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＤＭＡのみ），１．７−１．９（−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方），０．７−１．０（−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方）ｐｐｍ
【０１７１】
【数１】
2006528234.tif 000005
【０１７２】
段階２−ポリマー主鎖への開始基の挿入
４gの、段階１で合成されたポリマー（約６．７５ｍｍｏｌ  −ＯＨ）は、窒素下に、１００ｍｌのＴＨＦ中に溶解された。溶液は、２．５gの４−ジメチルアミノピリジン（２０．２５ｍｍｏｌ）および６．６ｍｌのトリエチルアミン（４７．２５ｍｍｏｌ）が添加された。４．２ｍｌの２−ブロモ−イソブチルブロミド（３３．７５ｍｍｏｌ）は、１０ｍｌのＴＨＦ中に溶解され、氷浴により０℃の温度に維持した溶液中へ窒素下に滴下された。白色の塩（トリエチルアンモニウムブロミド）が瞬時に形成された。添加の終わりに、懸濁液は室温に温められ、この条件において一晩保持された。
【０１７３】
懸濁された塩は濾過され、ＴＨＦ溶液はロータリーエバポレータにおいて蒸発された。油性の物質は５０ｍｌのジクロロメタン中に溶解され、１０倍過剰のトリエチルアミンが添加され、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄された。溶液は次に硫酸ナトリウム上で乾燥され、次いでヘキサン中に沈殿され、定量的な程度のＯＨ基の置換をもつ（ＮＭＲ分析から）、５gの薄黄色の個体（ほぼ定量的な収量）を生じた。
【０１７４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝４．３（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＯＯＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ、反応したＨＥＭＡ），４．１５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＯＯＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ、反応したＨＥＭＡ），４．０（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＝、ＤＭＡ），２．５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＤＭＡ），２．２５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、ＤＭＡのみ），１．９（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＯＯＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ、反応したＨＥＭＡ），１．７−１．９（−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方），０．７−１．０（−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方）ｐｐｍ
【０１７５】
段階３−ポリマー主鎖上への陽イオン基の挿入（ｐＣＡＴの合成）
３００ｍｇの、段階２で合成されたポリマー（第三級アミンの約０．９７ｍｍｏｌ）は、１０ｍｌの蒸留水中へ溶解された。１ｍｌのヨウ化メチル（１６２ｍｍｏｌ）が撹拌下に添加されると、溶液は乳状の懸濁液となり（水中でのヨウ化メチルの非常に低い溶解性）、その不透明度は時間とともに減少した。２４時間後、１００ｍｌのアセトニトリルが添加され、ポリマーの沈殿を生じた。アセトニトリルの添加は、ロータリーエバポレータでの共沸蒸留（割合は共沸点を超え、水中で１６％に達する）による水の除去を促進する。約５０ｍｌの液体が残されたとき、さらなる５０ｍｌのアセトニトリルが添加され、懸濁液は最終的に乾燥するまで蒸発された。４００gの固形の黄色がかった物質が回収された。
【０１７６】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：４．２−４．５（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方；−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＯＯＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ、ＨＥＭＡ），３．７−３．９（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＤＭＡのみ），３．２−３．３（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＤＭＡのみ），１．７−１．９（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２ＯＯＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ、ＨＥＭＡ  および−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方），０．８−１．１（−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）−、ＨＥＭＡおよびＤＭＡ双方）ｐｐｍ
【０１７７】
Ａ．２  ポリマー（ｐＣＡＴ）が溶液中のＡＴＲＰの開始に活性があることの証明
２０ｍｇのｐＣＡＴ（０．００３５ｍｍｏｌのＢｒ基）は、２．５ｍｌの水中へ溶解され、窒素バブリングにより２０分間脱気された。同時に、ＡＴＲＰ触媒の溶液が、２１ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒ（０．１５ｍｍｏｌ）および４６ｍｇのビピリジル（０．３０ｍｍｏｌ）を２．５ｍｌのメタノール中に溶解することおよび２０分間脱気することにより、別個に調製された。１ｍｌの新たに蒸留されたＨＥＭＡが、窒素下に水溶液へ添加された。二つの溶液は窒素雰囲気下に混合された。各０．５ｍｌの三つのサンプルが、異なる時間（１５分、３０分、１２０分）に重合溶液から採られ、１０ｍｌのアセトニトリルが添加された。溶媒混合物は次に、ロータリーエバポレータにおいて除去された。
【０１７８】
固体は、５ｍｌのメタノール中に再溶解され、結果として得られた溶液は、銅を除去するため、ロータリーエバポレータにおいて再度蒸発される前にシリカゲルカラムを通された。最後に、固体は１ｍｌのエタノール中に溶解され、１０ｍｌのヘキサン中で沈殿された。真空下に乾燥された後、回収されたポリマーの量が測定された：時間とともに増加していくポリマーの量（各々３９ｍｇ、５４ｍｇ、および１４０ｍｇ）は、調べられた時間間隔における重合のリビング性を保証した。
【０１７９】
Ａ．３  シリカナノ粒子の表面上でのｐＣＡＴの吸着
一般的な実験においては、ナノ粒子の懸濁液は、大過剰のｐＣＡＴを含有する溶液へ徐々に添加された。最適な濃度条件は、ナノ粒子の凝集、凝塊形成、およびあるいは沈殿を避けるべく見出されるべきである。本発明らは、少なくとも５ｍｇ／ｍｌのｐＣＡＴ濃度が良好なコーティングを提供することを見出した。
【０１８０】
【表２】
2006528234.tif 000006
【実施例５】
【０１８１】
シリカナノ粒子上に吸着されたｐＣＡＴからの重合
Ａ  多官能性モノマーの重合
Ａ．１重合性の原理の証明
５体積％の濃度において平均直径＝８０ｎｍ（コーティング前は６０ｎｍ）をもち、濃度３．４＊１０−３ｍｍｏｌのブロミド基を表示している、０．５ｍｌのｐＣＡＴコートされたナノ粒子の水分散物は、水で２．５ｍｌの最終体積に希釈され、窒素をバブリングすることにより２０分間脱気された。２１ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒ（０．１５ｍｍｏｌ）および４６ｍｇのビピリジル（２x０．１５ｍｍｏｌ）は、窒素下にバイアルへ導入され、あらかじめ脱気された２．５ｍｌのメタノール中に溶解された。次に、ナノ粒子の水溶液が、窒素雰囲気下にバイアルへ導入された。２ｍｌの水／メタノール溶液は、第二のバイアルへ移され、２５ｍｇの純粋な２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）が添加された。３時間の重合の後、サンプルは動的光散乱において分析され、８０から４００ｎｍまでの平均直径の増加を示した。
【０１８２】
Ａ．２ポリマー層の厚さが重合時間によって調節され得ることの証明
実施例５．Ａ１において記述されたように調製された、ナノ粒子および開始剤を含有している、３ｍｌの水／メタノール溶液は、バイアルへ移され、０．５ｍｌ（非常に大過剰）の純粋なＨＥＭＡが添加された。サンプルは動的光散乱において、時間の関数として分析され、８０ｎｍ（t＝０）から１７０ｎｍ（１５分）、２００ｎｍ（３０分）までの平均直径の増加を与えた。サンプルのフロキュレーション（ナノ粒子は合体するには大きすぎる）は、t＝２時間において記録された。
【０１８３】
Ｂ  多官能性モノマーを含有するモノマー混合物の重合と、架橋ヒドロゲル層の調製
５体積％の濃度においてφ＝８０ｎｍ（コーティング前は６０ｎｍ）をもち、濃度３．４＊１０−３ｍｍｏｌのブロミド基を表示している、０．５ｍｌのｐＣＡＴコートされたナノ粒子の水分散物は、水で２．５ｍｌの最終体積に希釈され、０．２gのポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ、ＭＷ＝８７０）が添加され、窒素をバブリングすることにより２０分間脱気された。２１ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒ（０．１５ｍｍｏｌ）および４６ｍｇのジピリジル（２x０．１５ｍｍｏｌ）は、窒素下にバイアルへ導入され、あらかじめ脱気された２．５ｍｌのメタノール中に溶解された。０．２ｍｌのＨＥＭＡが最後に添加された。
【０１８４】
次に、ナノ粒子の水溶液が、窒素雰囲気下にこのバイアルへ導入された。１５分間の重合の後、サンプルは動的光散乱において分析され、８０から１６０ｎｍまでの平均直径の増加を示した。
【実施例６】
【０１８５】
犠牲鋳型の可溶化による中空ナノスフェアの調製
実施例５．Ａ２（３０分）および５Ｂの重合化溶液を各々含有する、２ｍｌの二つのサンプルが透析バッグへ導入され、１００ｍｌのフッ化物含有溶液に対して１８時間暴露され、実施例２で記述されたシリカ溶解の同じ方法がそれに続けられた。次いで透析バッグは移され、シリケートおよびフッ化物の除去のため、純水に対し、周囲の溶液を１時間ごとに純水で交換し、４時間にわたり暴露された。
【０１８６】
コア−シェル型シリカヒドロゲルナノ粒子は、純粋なＨＥＭＡの重合（実施例５．Ａ２）およびＨＥＭＡ／ＰＥＧＤＭＡの重合（実施例５．Ｂ）では、当初は各々２００および１６０ｎｍの直径を示した。フッ化物処理および透析精製の後、動的光散乱分析は、各々４５０ｎｍおよび３００ｎｍの直径を与え、シリカコアの可溶化の後の、コロイド構造の永続性を示している。
【０１８７】
要約
要約すれば、本発明は、他の状態では中空ヒドロゲルナノスフェア（ＨＨＮ）として知られる、透過選択性のキャリア粒子に関する。これらの中空構造は、本質的に三つの重要な段階：（ａ）その中にペイロード分子が埋込まれるシリカナノ粒子の調製；（ｂ）これらを、ＡＴＲＰによるポリマー膜の産生のための鋳型として使用すること；（ｃ）シリカナノ粒子の溶解、によって産生される。
【０１８８】
したがって、ＡＴＲＰは感受性および生物活性のある（ペイロード）化合物を封入するための系を提供するべく使用されており、それらは（Ａ）興味の化合物４を含有する内部水区画８；および（Ｂ）サイズ透過選択的方法、または組成物透過選択的方法で、内部水区画８を外部環境から分離するヒドロゲル膜６において構造化される。本発明は、蛍光測定法（標識化合物を研究するべく使用された）、動的光散乱（コロイド凝集物のサイズの特徴づけのため）、およびレオロジー（コロイド懸濁液の凝塊形成の研究のため）のような分析技術といった、これらの系の製造および特徴づけのために使用される技術の理解に基づいている。
【０１８９】
二つの主要な方法がシリカナノ粒子の産生のために考案されてきたが、双方ともに二酸化ケイ素およびテトラオキシシランの有機前駆体から出発する。本発明者らは、実施例において議論されたようなナノ粒子のディメンションおよび安定性に対する、逆エマルジョンの特徴（乳化剤のタイプおよび濃度、水対油比）およびシリカ前駆体の前または後−加水分解といった、調製の変動要素の影響を研究してきた。
【０１９０】
表面開始重合に関しては、原子移動ラジカル重合が、水環境における表面からのポリマー鎖の成長に好適な機構であることが見出された。ほとんどのラジカル重合技術とは対照的に、ＡＴＲＰは、溶液への無視できるほど小さい重合の転移、およびリビング性を示す。この方法では、ポリマー層６の厚さは用いたモノマーの量に直接的に依存し、非常に高い値を容易に得ることが可能である。
【０１９１】
本発明者らは、シリカナノ粒子の表面の機能性化と、親水性ポリマー層６をもつナノ粒子１０の装飾のためのＡＴＲＰの適用を研究した。膜の化学組成に対する、その輸送特性および安定性の依存性を研究することを目指して、いくつかのモノマーが適用された。研究は溶解の段階に焦点をあて、シリカコアの可溶化におけるフッ化物イオンの使用条件を最適化した；反応の間のｐＨのずれを避け、かつ生理学的に許容される酸性度を維持する方法の確立に、特別な注意が向けられた。
【０１９２】
ペイロード分子４、たとえば酵素は、アルコキシシラン濃縮プロセスの間に、シリカナノ粒子２の中に封入された。遊離の形状におけるそれらの安定性および活性が調べられ、シリカコア２の可溶化の後のものと比較された。中空のヒドロゲルナノ粒子１０の利点は、ヒドロゲル層６の透過選択性にある。表面ＡＴＲＰにおける多官能性の水溶性モノマーの重合は、調節された厚さおよびメッシュサイズをもつヒドロゲル層６を産生する。これら二つの量が、層６を通した分子の拡散特性を決定する。したがって、本発明のキャリア分子１０は、身体における標的部位への生物活性化合物のデリバリーにおいて、たとえば癌療法における使用のための有用性をもつ。
【０１９３】
有利なことに、キャリア粒子１０はペイロード分子４を危険な相互作用から封入および防御するが、都合のよいものは起きることができるようにする。キャリア粒子１０は、潜在的に免疫原性の酵素を封入するべく使用されてよく、それらを免疫系の反応から防御するが、同時に、それらが生化学的変換を行なうことを可能にする。キャリア粒子１０は、設計されたタンパク質を封入するべく用いられてよく、それらはプロテアーゼによってシールドされているが、シグナルを送ることは可能である（たとえば、ＧＦＰの発生により）。
【０１９４】
キャリアのヒドロゲル層６は、小〜中程度の分子サイズの基質（リガンド）を透過することができるが、より大きい分子（プロテアーゼ、抗体）は透過できず、すなわちサイズ透過選択的である。別法として、ヒドロゲル層はある化学組成または電荷をもつ物質に対して透過性であるが、他のものには透過性がない、すなわち組成物透過選択性である。
【０１９５】
最近の刊行物の文献は、上記の特性を集約するべく原理的には適用可能かまたは修正可能な、壁（または膜）をもつ中空コロイド構造物の調製のための方法を報告している。最も一般的には、これらの構造はコアとして、プロセスの終わりには可溶化されるもの、すなわち犠牲鋳型を用いる方法論によって提供されることが可能である。しかしながら、他の中空構造物（リポソーム）もまた前駆体として使用されることが可能であり、あるいは壁は鋳型としてエマルジョンを用いて、界面によって産生されることも可能である。
【０１９６】
多くの方法論において、水キャビティは、最初は水を含有しない鋳型から産生される。対照的に、本発明の態様における機能性の活性成分の封入を確実にするため、最初の段階の活性成分（ペイロード分子４）は、水を多く含む鋳型内に封入される。
【０１９７】
文献に提示された構造物の中で、犠牲鋳型上でのポリエレクトロライトのコアセルベーションまたは伝導性ポリマーの重合によるか、他の中空鋳型によるか、または水素結合によって得られたものは、非常に限定された壁厚(数ｎｍ)を提供する。反対に、機械的安定性および透過選択的作用についての良好な対照として、本発明の第一の態様によるＨＨＮ１０は、より高度の、調節可能な壁厚を有する。
【０１９８】
この最後の特性は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）のようなリビング重合を、鋳型上に適用することによって得られた。この方法論は、通常には疎水性壁を調製するべく適用されてきた。対照的に、本発明の第一の態様により、水溶性分子の透過に有利にするため、ＡＴＲＰが使用されて親水性壁を提供する。さらに、ＡＴＲＰプロセスは、活性成分の不可逆的な変性を避けるため、水環境中で行なわれる。
【０１９９】
さらに、親水性壁は、サイズ透過選択性を提供するため、規定された調節可能なメッシュサイズで架橋されており、組成物透過選択性を提供するため、組成が変えられることが可能である。
【０２００】
さらに、疎水性壁６の組成物は、クリアランス率を低減し、かつ体液中の循環時間を延長する目的のため、タンパク質吸着および／または細胞接着を低減する。疎水性壁６の組成物は、活発なターゲティングを可能にする目的で、タンパク質吸着を低減し、同時に生物学的認識リガンドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】球形構造物の形状に調製され、最終的には活性物質を封入する犠牲鋳型を例示している略図である。表面原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）は、鋳型の周囲にポリマー層を形成する。鋳型の可溶化の後、活性物質はポリマー層を通って拡散することが難しいため、内部キャビティに綴じ込められる。
【図２】本発明のキャリア粒子または中空ヒドロゲルナノスフェア（ＨＨＮ）の態様における、封入された酵素を例示している略図である。
【図３】酵素を含有しているキャリア粒子のさらなる態様を例示している略図である。
【図４】ラジカル重合の機構を例示している略図である。
【図５】調節されたリビングラジカル重合の機構を例示している略図である。
【図６】原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を例示している略図である。
【図７】支持されたＡＴＲＰを例示している略図である。
【図８】先の研究を例示している略図である。
【図９】本発明のキャリア粒子または中空ナノスフェア（ＨＨＮ）のさらなる態様を例示している略図である。
【図１０】本発明のナノスフェアのさらなる態様における、封入された酵素を例示している略図である。
【図１１】その内部キャビティに薬物を封入する、ＰＥＧｙｌａｔｅｄリポソームの略図である。
【図１２】酵素を封入し、かつそれに対するアクセスを、壁の特性調節する、中空ヒドロゲルナノ粒子（ＨＨＮ）のさらなる態様の略図である。
【図１３】逆エマルジョンにおける鋳型ナノ粒子の生成の略図である。
【図１４】ＨＨＮの構造およびジオメトリの略図である。
【図１５】ＨＨＮのポリマーネットワークを通した分子の拡散を示している略図である。
【図１６】ＨＨＮ膜組成物のための、アクリルまたはメタクリルポリマー鎖の化学構造である。
【図１７】ＨＨＮ膜の架橋されたポリマー鎖の長さの略図である。
【図１８】ポリアクリレート側鎖を架橋している、二官能性（左）および三官能性（右）の架橋剤の実例の化学構造である。
【図１９】オリゴマー化の程度１、２、および３をもつオリゴ（エチレングリコ−ル）に由来する、スペーサーセグメントの実例の化学構造である。
【図２０】側鎖として取込まれることが可能な、ｐＨ感受性基の実例および、それらのプロトン付加／脱プロトン化から生じる影響の、化学構造である。
【図２１】基として取込まれることが可能な、ＲＥＤＰＸ電位感受性基の実例の化学構造である。
【図２２】左に、未処理のルドックスナノ粒子を、右に、フッ化物処理の後の同じ濃度におけるルドックスナノ粒子を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年10月10日(2006.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物環境（target  biological  environment）に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリアナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、ペイロード分子がその中に含有される内部キャビティを有し、前記キャビティは、リビング重合反応からの結果として生じるポリマー鎖を含む、実質的に親水性のヒドロゲル層によって囲まれ、前記ヒドロゲル層がサイズ選択的透過性および/または組成物選択的透過性を有し、前記ナノ粒子が前記標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能なキャリアナノ粒子。
【請求項２】
前記キャリアナノ粒子が、直径約５０ｎｍ〜７５０ｎｍである、請求項１に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項３】
前記標的生物環境が、血液もしくはリンパのような実質的に全身に広がった循環をもつ体液か、または、腹腔液もしくは滑液といった限定された循環をもつ体液、または、細胞もしくは細胞群である、請求項１または２に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項４】
前記ヒドロゲル層が、以下の式Ｉ：
【化１】
2006528234.tif 000030
［式中、Ｒ’はＨ，ＣＮ，ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＯＯＲを示し、ＸはＯＨ，Ｏ−Ｙ＋，ＯＲ，ＮＨ２，ＮＨＲ，ＮＲ２を示す（ここでＲは炭素原子で終わる任意の有機残基であり、Ｙは少なくとも一つの一価の正電荷を帯びた任意の有機または無機残基を示す）］
によって定義されるポリマー構造を含む、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項５】
前記ヒドロゲル層が１０〜５００ｎｍの範囲の厚さを有している、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項６】
前記ヒドロゲル層中の前記ポリマー鎖が、スペーサーセグメント（spacer  segment）により、実質的に永久的かつ物理的に架橋されている、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項７】
前記スペーサーセグメントが、オリゴ−、またはポリ（エーテル）、（エステル）、（アミド）といったオリゴマーまたはポリマー構造を含む、請求項６に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項８】
前記スペーサーセグメントが、少なくとも二つのポリマー鎖を結合する直鎖か、または少なくとも三つのポリマー鎖を結合する分枝鎖である、請求項６または７に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項９】
前記ヒドロゲル層の平均メッシュサイズが、約０．１ｎｍ〜５ｎｍである、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項１０】
前記ペイロード分子が、染料、電気化学的媒介物、ペプチド、タンパク質、抗体、または酵素である、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項１１】
前記ペイロード分子がその中に含まれる内部キャビティが、実質的に水性である、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項１２】
前記キャリアナノ粒子の直径が約１００〜５００ｎｍである、前記いずれかの請求項に記載のキャリアナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキャリアナノ粒子を産生する方法であって、
（ｉ）支持マトリックスを前記ペイロード分子と接触させる工程；
（ｉｉ）前記マトリックスを封入するヒドロゲル層を産生する工程；および
（ｉｉｉ）前記マトリックスを溶解し、それによりキャリアナノ粒子を産生する工程、
を含む方法。
【請求項１４】
前記ペイロード分子が実質的に前記マトリックス内に埋込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒドロゲル層が、表面原子移動ラジカル重合によって産生される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記支持マトリックスがシリカ犠牲鋳型である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シリカ犠牲鋳型がフッ化物処理によって溶解される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フッ化物処理が、アンモニアまたはアンモニウムイオンを含有する、フッ化物含有溶液の使用を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリアナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、ペイロード分子がその中に含有される内部キャビティを有し、前記キャビティは、リビング重合反応からの結果として生じるポリマー鎖を含む、実質的に親水性のヒドロゲル層によって囲まれ、前記ヒドロゲル層がサイズ選択的透過性および/または組成物選択的透過性を有し、前記ナノ粒子が前記標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能である、薬物としての使用のためのキャリアナノ粒子。
【請求項２０】
標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリアナノ粒子の用途であって、前記ナノ粒子は、ペイロード分子がその中に含有される内部キャビティを有し、前記キャビティは、リビング重合反応からの結果として生じるポリマー鎖を含む、実質的に親水性のヒドロゲル層によって囲まれ、前記ヒドロゲル層がサイズ選択的透過性および/または組成物選択的透過性を有し、前記ナノ粒子が前記標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能なキャリアナノ粒子の、漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病の治療用薬物の製造のための用途。
【請求項２１】
漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病を患っている個体を治療する方法であって、かかる治療を必要とする個体へ治療上有効な量の、標的生物環境に対しペイロード分子を封入および運搬するための使用においてアレンジされたキャリアナノ粒子を投与する工程を含み、前記粒子はペイロード分子が含有される内部キャビティを有し、前記キャビティは、リビング重合反応からの結果として生じるポリマー鎖を含む、実質的に親水性のヒドロゲル層によって囲まれ、前記ヒドロゲル層がサイズ選択的透過性および/または組成物選択的透過性を有し、前記粒子が標的生物環境に少なくとも隣接した場合に前記ペイロード分子が活性であることが可能なキャリア粒子を、投与することを含む方法。
【請求項２２】
漏出性または不完全に形成された毛細血管を有する疾病が、腫瘍、および損傷治癒に関連した血管系である、請求項２１に記載の治療法。
【国際調査報告】
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