(57)【要約】本発明は、該サイトカインの過剰発現を伴う疾患の治療において能動免疫のために使用されるＩＬ−１５からなるワクチン組成物に関するものである。本発明の技術的目的は、免疫された個体においてＩＬ−１５中和抗体を発生させる治療用ワクチンの開発によりＩＬ−１５の活性を阻害することである。発明のワクチン組成物中にＩＬ−１５は単独で又はＰ６４ｋのような担体タンパク質及び水酸化アルミニウムのようなアジュバントと結合して存在する。本発明は慢性関節リュウマチ及びＩＬ−１５の過剰発現を伴う他の疾患又は白血病の場合のように該サイトカインが増殖因子として作用する疾患の治療に該ワクチンを使用することにも関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１５が抗原であるワクチン組成物。
【請求項２】
ＩＬ−１５が組換え体である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ＩＬ−１５が担体タンパク質に融合している請求項１及び請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
担体タンパク質がｐ６４ｋである請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
その方法が請求項１〜５に記載のワクチン組成物の有効治療量投与からなるＩＬ−１５発現関連疾患を治療する方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のワクチン組成物を有効治療量投与することを含むＲＡ，クローン病及び乾癬のような自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項７】
請求項１〜５に記載のワクチン組成物を有効治療量投与することを含む増殖因子としてのＩＬ−１５に関連する白血病を治療する方法。
【請求項８】
ワクチン組成物が抗炎症薬又は他のサイトカイン拮抗物質と併用される請求項６〜８に記載の方法。
【請求項９】
自家インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）に対する中和抗体応答を発生させるための請求項１〜５に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１０】
ＲＡ、クローン病及び乾癬のような自己免疫疾患を治療するための請求項１０に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１１】
増殖因子としてのＩＬ−１５に関連する白血病を治療するための請求項１０に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１２】
ＩＬ−１５発現関連疾患を治療するためのＤＮＡワクチンのようなヒトＩＬ−１５をコードするＤＮＡ配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫分野、特にＩＬ−１５の過剰発現に関連する疾患を治療するための能動免疫におけるＩＬ−１５の新規使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１５として知られるこのサイトカインは、１４〜１５ＫＤａの糖タンパク質であり、同時に二つのグループによりＴ−細胞活性化増殖因子として記述されている（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６４，９６５；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４，９１，４９３５）。ＩＬ−１５ｍＲＮＡは細胞及び組織内に広く存在しているが、翻訳レベルにおけるその発現の強力な転写後調節及び細胞内輸送のため、細胞内又は細胞上清中にそのタンパク質を発見することは困難である（Ｂａｍｆｏｒｄ  ＲＮ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８，１６０．４４１８−４４２６），（Ｋｕｒｙｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００，２７５．３０６５３−３０６５９）。
【０００３】
ＩＬ−１５の生物学的効果は、それが３種のサブユニットα、β及びγからなる細胞膜受容体へ結合することにより仲介される。ＩＬ−１５Ｒαは、このサイトカインに非常に高い親和性のＫｄ  １０−１１で結合する特異的なサブユニットであり、βサブユニットはＩＬ−２と共有されており、そしてγサブユニットはいくつかのサイトカイン、ＩＬ−２；ＩＬ−４；ＩＬ−７；ＩＬ−９；ＩＬ−１５；ＩＬ−２１の共通の受容体である（Ｂａｍｆｏｒｄ  ＲＮ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４，９１，４９３５），（Ｇｉｒｉ  ＪＧ．，ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５，１４．３６５４−３６６３）。
【０００４】
ＩＬ−１５は、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞の増殖及び機能活性を増強する免疫刺激サイトカインであり（Ｇｉｒｉ，Ｊ．Ｇ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４，１３，２８２２−２８３０）、好中球を活性化しそしてモノカイン分泌を修飾する（Ｇｉｒａｒｄ  Ｄ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８，３１７６；Ａｌｌｅｖａ  Ｄ．Ｇ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，２９４１）。このサイトカインは免疫応答のいくつかの段階に対して種々の影響を及ぼし、ＣＤ５６  ＮＫ細胞増殖を誘発し、そしてＩＬ−１２と一緒に作用して、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを誘発する（Ｒｏｓｓ  ＭＥ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ８９，９１０−９１８；Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ＴＡ，１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ，３１，１４７６−１４７８）。
【０００５】
Ｔ細胞受容体へのこのリガンドの結合は、ＩＬ−１５Ｒαの発現並びにＣＤ６９、ＣＤ２５及びＴＮＦＲＩＩのようないくつかの活性化抗原の発現を誘導する。またＩＬ−１５は、ヒト血液Ｔリンパ球の化学誘引物質である（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  １９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１，１２５５−１２５９）。これ等のデータは全て、抗原提示細胞によるＩＬ−１５の発現は炎症部位における初期Ｔ細胞活性化の際に重要であることを示している。
【０００６】
ＩＬ−１５は、クローン病（Ｋｉｒｍａｎ  Ｉ．，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９１，１７８９）、乾癬
2006507260.tif 000002
白血病（Ｙａｍａｄａ  Ｙ．１９９９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｉｍｐｈｏｍａ，３５（１−２）：３７−４５）及び慢性関節リュウマチ（ＲＡ）（ＭｃＩｎｎｅｓ  Ｉ．Ｂ．１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１９，７５−７９）を含むいくつかの疾患の経過のなかで検出されている。
【０００７】
Ｆｅｌｄｍａｎｎ等（１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４．３９７−４４０）は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ並びに慢性関節リュウマチ（ＲＡ）の発症及び進行に密接に関係するＭｉｐ  １α、Ｍｉｐ  １β及びＩＬ−８のようないくつかの炎症性サイトカインを含むサイトカインカスケードにおける主要サイトカインとしてＴＮＦαを提案した。ＭｃＩｎｎｅｓ等は、この疾患におけるＩＬ−１５発現異常、滑液中の高いＩＬ−１５濃度及び滑液膜細胞におけるその発現を発見した。彼らは、サイトカインカスケードにおいてＩＬ−１５がＴＮＦαより重要であることを示唆し、ＩＬ−１５活性化Ｔ細胞がマクロファージによるＴＮＦα合成を誘発する細胞接触による機序を提案した。さらに、Ｔ細胞の滑液への遊走に関してＩＬ−１５が重要な因子として作用することを提案した（ＭｃＩｎｎｅｓ，１９９７，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，３．１８９−１９５  ）。
【０００８】
Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋａ等は、ＩＬ−１５がＲＡ患者の関節においてＩＬ−１７の発現を誘発することを報告したが、滑液膜細胞によるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ及びプロスタグランジンＥ２のようないくつかの炎症性メディエーターの放出をこのサイトカインが刺激することは知られていたので、ＲＡ発病におけるＩＬ−１５の重要な役割を示した（Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋａ  ｙ  ｃｏｌ  ２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６４．２８３２−２８３８）。
【０００９】
Ｔ細胞動員及び活性化は、ＩＬ−１５の局所合成の結果として起こり得る、そのような非特異的活性化は継続的炎症の結果として生じ得る。これ等は全て、ＩＬ−１５の阻害によりこの病気を治療できる可能性があることを示している。
【００１０】
ＩＬ−１５拮抗分子の使用は、動物モデルにおいて有効であることが示された。Ｒｕｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．は、マウス受容体のαサブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）の可溶性フラグメントを作製し、それをＤＢＡ／１マウスに投与した場合に、このフラグメントがコラーゲン誘発関節炎を抑制することを実証した（Ｒｕｃｈａｔｚ  Ｈ．１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０．５６５４−５６６０）。
【００１１】
その他のＩＬ−１５拮抗分子は、１以上のアミノ酸残基において突然変異しているＩＬ−１５及び成熟ＩＬ−１５に結合することができそしてその受容体を介するシグナル伝達を阻害することができるモノクロナール抗体を含めて特許になっている（米国特許、６００１９７３，６１７７０７９，６１６８７８３，及び６０１３４８０）。その使用は上記特許に記述されているが、その有効性を裏付ける科学誌に公開された結果は極めて少ない。２００２年５月にＧｅｎｍａｂ社はＩｍｍｕｎｅｘによる特許のＩＬ−１５に対する抗体を使用したＩ／ＩＩ相臨床試験を明らかにしたが、これは上述した米国特許６１７７０７９に相当するはずであるが、この結果はまだ公表されていない。
【００１２】
他の試験がＩＬ−１５受容体を持つ細胞に結合するキメラタンパク質ＭｕｔＩＬ１５−Ｆｃを使用して行われた。これにより活性化された免疫細胞の数は限界レベル以下に減少し、免疫寛容が誘導される。例えば、移植片拒絶において重要な役割をする自己反応性活性化Ｔ細胞はＩＬ−１５に応答し、ＩＬ−１５拮抗物質として作用するＭｕｔＩＬ１５−Ｆｃタンパク質を使用することによりそれらを抑制できることが実証された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ワクチンの文献に自家分子に対する抗体を作製した例がいくつか存在し、例えば、ＥＧＦ依存性腫瘍を治療するためのＥＧＦに対するワクチン（米国特許５８９４０１８）がある。その有効性はＥＧＦ活性を阻害する抗体を使用することにより臨床試験において示されている。自分自身を免疫寛容とする自然の機構のために自家タンパク質に対する中和抗体の作製は非常に複雑である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明において、ＩＬ−１５に対する中和自己抗体を作製するための適当な製剤中のＩＬ−１５による能動免疫は、自己免疫疾患及び白血病の患者に認められるこのサイトカインの異常な量の中和を可能にする。
【００１５】
本発明においては、能動免疫を行ってＩＬ−１５中和自己抗体の作製を可能とし、ＩＬ−１５のレベルを免疫系により調節する。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の本質及び新しさは、ＩＬ−１５過剰発現に関連する疾患を治療するための能動免疫用にＩＬ−１５を使用するワクチン組成物にある。
【００１７】
このワクチン組成物は、自家ＩＬ−１５に対する中和抗体応答を引き出すためにヒトに使用されるであろう。
【００１８】
この発明は、担体タンパク質に融合したＩＬ−１５並びにそれを含む他の製剤も含む。
【００１９】
本発明はまた、このワクチンの単独又は抗炎症薬又は他のサイトカイン拮抗物質との併用による使用も意図している。
【００２０】
本発明のある態様に従うと、哺乳動物発現ベクターは、能動免疫用の適当な製剤中にＩＬ−１５をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
【００２１】
本発明のある態様に従うと、ＩＬ−１５はＥ．ｃｏｌｉにおいて得られる組換えタンパク質であり、したがって、そのグリコシル化パターンは自家ＩＬ−１５とは異なる。本発明の一部の態様において、ＩＬ−１５はＣＴＬＬ−２検定により２〜５×１０６  Ｕ／ｍｇの比活性を持つ活性タンパク質である。
【００２２】
本発明のＩＬ−１５遺伝子はＬＰＳ活性化単球から単離され、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター中にクローニングされそしてこの材料から精製された。タンパク質の生物学的活性はＣＴＬＬ２検定においてＴ細胞増殖の誘導により測定された。
【００２３】
本発明のある態様に従うと、融合タンパク質ｐ６４ｋＩＬ−１５は、ＩＬ−１５遺伝子がＰＣＲにより増幅されるようにオリゴヌクレオチドを設計し、そしてｐ６４ｋタンパク質をコードする遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター中にこの遺伝子を挿入することにより得られる。ＩＬ−１５タンパク質はｐ６４ｋ担体タンパク質のＣ−末端領域に融合されそしてこの原料から精製される。このタンパク質の生物学的活性はＣＴＬＬ２検定においてＴ細胞増殖の誘導により測定される。
【００２４】
この発明に示された発想の立証は、そのＩＬ−１５がヒトＩＬ−１５に９６．４％の相同性をもつカニクイサルをモデルとして使用して行われた。
【００２５】
本発明にしたがって、ＩＬ−１５又は融合タンパク質ｐ６４ｋＩＬ−１５による能動免疫を行ったところ、免疫動物血清にＩＬ−１５に特異的に応答する抗体及び中和抗体を生じたことを示す結果が得られた。
【００２６】
この発明の目的は、本発明によるヒトＩＬ−１５をコードするＤＮＡを含有するベクターを含むＤＮＡワクチン及びＩＬ−１５発現に関連する疾患の遺伝子治療における代替としてのその使用にも拡張される。
【００２７】
記述したワクチンは、ＲＡの治療に使用される抗炎症薬又は免疫抑制薬又はその他のサイトカイン拮抗物質と併用することができる。
【００２８】
以下の実施例は本発明の態様を説明するために提供される。
【実施例１】
【００２９】
組換えＩＬ−１５の調製
ヒトＩＬ−１５をコードするＤＮＡは、ＬＰＳ−活性化単球からＲＴ−ＰＣＲにより単離され、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター中にクローニングされた。
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現させた組換えＩＬ−１５を細胞ペレットから８Ｍ尿素で抽出し、水／アセトニトリル、ＴＦＡ緩衝系で、ＴＳＫ  Ｇ４０００ＳＷ（Ｍｅｒｃｋ）を使用するクロマトグラフィー次いでＲＰ−Ｃ４（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を使用するクロマトグラフィーにより精製された。生物学的活性はＣＴＬＬ−２細胞系の増殖を刺激することにより測定し、ＭＴＴミトコンドリア染色を使用した（Ｃｏｓｍａｎ  ｙ  ｃｏｌ  １９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２．７６８−７７１）。ＩＬ−１５の比活性は２×１０６  Ｕ／ｍｇであった（図１）。
【００３１】
組換えｐ６４ｋ−ＩＬ１５融合タンパク質の調製
ｐ６４ｋ−ＩＬ１５融合タンパク質は、ＰＣＲによりＩＬ−１５遺伝子を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、それをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター中のｐ６４ｋのＣ−末端へ挿入することにより得られた（図２）。
【００３２】
タンパク質はフレンチプレスによる細胞破壊により可溶化された。硫酸ストレプトマイシンを破壊上清に加えて０．８％とし、それを１時間４℃に保ち、１５分間１００００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。硫酸アンモニウムによる沈殿を２回行い、そしてペレットをＴｒｉｓ  ２０ｍＭ，ＥＤＴＡ  ６ｍＭ，尿素  ２Ｍ，ｐｅｆａｂｌｏｃ  ０．５ｍｇ／ｍＬに懸濁し、そしてＴＳＫ  ＤＥＡＥ  ＰＷのイオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００のゲル濾過により精製した。
【実施例２】
【００３３】
カニクイサルにおける評価モデル
ＩＬ−１５、融合タンパク質及びプラセボで免疫された３群においてサルの免疫機構が評価された。タンパク質は接種当り１００μｇの量でフロイントアジュバントとともに注射した。最初の免疫はフロイントの完全アジュバントで行い、不完全フロイントアジュバントを使用した２回目の免疫は１ヵ月後に、そして不完全フロイントアジュバントを使用した３回目の免疫は２ヵ月後に行った。２回目及び３回目の免疫の１週間後に血液を採取し、サル血清中の抗−ＩＬ１５抗体のレベルを評価した。データは図３に示されている。
【実施例３】
【００３４】
サル血清中の中和抗体の測定
サイトカイン依存性細胞系のＣＴＬＬ−２は、ＩＬ−１５の存在下に増殖する。ＩＬ−１５結合分子は受容体依存性のシグナル伝達を阻害して、この細胞系の増殖を阻害する。
【００３５】
サル血清中に存在する抗体の中和能力を調べるために、その連続希釈を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）中１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）の５０μＬ容量で行った。ＩＬ−１５の最適量以下（３０ｐｇ）を各ウエルに加えそして予め洗ったＣＴＬＬ−２細胞を５×１０３細胞／ウエル加えた。プレートを４８時間５％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。増殖の測定にはＭＴＴミトコンドリア染色を使用した（Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２．７６８−７７１）。図３に示す結果にはＩＬ−１５誘導増殖の抗体仲介阻害が認められる。
【００３６】
発明の利点：
−受動免疫により得られる抗体よりも発生する抗体のレベルは経時的により安定している
−受動免疫に比較して患者に投与する頻度が少ない
−投与当り及び投与全体のタンパク質の必要量はＩＬ−１５拮抗分子による治療に必要な量より極めて少ない；これは製造コストが少ないことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＩＬ−１５の純度
【図２】融合タンパク質の純度
【図３】サルにおける抗−ＩＬ−１５抗体のレベルを示すＥＬＩＳＡ試験の結果
【図４】サル血清中のＩＬ−１５中和抗体の測定
【図１】
2006507260.tif 000003
【図２】
2006507260.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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