(57)【要約】テトラゾールもしくは置換テトラゾールではない活性化物質の存在下で、ホスホラミダイトアプローチを用いて、オリゴヌクレオチドを膨張性固体担体上でアセンブルするオリゴヌクレオチドの合成プロセスが提供される。好ましい活性化物質は、ピリジニウム塩、イミダゾリニウム塩及びベンズイミダゾリニウム塩；ベンゾトリアゾール類及びこれらの誘導体；及びサッカリンもしくはサッカリン誘導体である。好ましい膨張性固体担体は、官能基化ポリスチレン、部分的に加水分解されたポリビニルアセテート又はポリ（アクリルアミド）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラゾール又は置換テトラゾールではない活性化物質の存在下で、ホスホラミダイトアプローチを用いてオリゴヌクレオチドを膨張性固体担体上にアセンブルするオリゴヌクレオチドの合成プロセス。
【請求項２】
前記活性化物質は、ピリジニウム塩、イミダゾリニウム塩及びベンズイミダゾリニウム塩；ベンゾトリアゾール及びこれらの誘導体；及びサッカリンもしくはサッカリン誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記活性化物質は、下記一般式：
【化１】
2006512411.tif 000005
（式中、pは0もしくは1〜4の整数であり；
各場合のRは置換基であるか、又は２個の隣接するR基が結合している炭素原子と一緒に６員の飽和環もしくは不飽和環を形成し；
XはOもしくはSである）
を有する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記活性化物質は、N-メチルイミダゾール、ピリジンもしくはサッカリンの3-メチルピリジン塩である、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記膨張性担体は、官能基化ポリスチレン、部分的に加水分解されたポリビニルアセテートもしくはポリ（アクリルアミド）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
ヌクレオシドホスホラミダイトを、遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドとカップリングさせることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
ヌクレオシドホスホラミダイトは、デオキシリボヌクレシド-3'-ホスホラミダイトもしくはリボヌクレシド-3'-ホスホラミダイトである、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドは遊離5'-ヒドロキシ基を含む、請求項６又は７に記載のプロセス。
【請求項９】
遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドは開裂可能なリンカーによって、固体担体に結合している、請求項６〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
固体担体を膨張させる溶媒を用いる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記溶媒は、アセトニトリル、ジメチルフォルムアミド、N-メチルピロリドン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン又はピリジンである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
アセンブルされたオリゴヌクレオチドは、固体担体から開裂される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴヌクレオチドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、発生期のオリゴヌクレオチドが固体担体に結合する固相合成により、慣用的に調製されている。慣用的に、テトラゾール又は置換テトラゾール活性化物質の存在下でのホスホラミダイト化学は、ヌクレオシドのシーケンシャルカップリング（連続的結合）に効果的に用いられている。合成用途の大半で用いられる固体担体は、剛性で非膨張性の担体であり、特にガラス多孔体（controlled pore glass）及び剛性ポリスチレンである。潜在的な装填量がもっと高いという点において利点を呈する膨張性担体を用いるようにするために、多くの試みがなされている。これらもまた慣用のテトラゾールベースの活性化物質を用いている。一般に、遅いカップリング反応を呈するか又は非常に多量の活性化物質を要するので、結果は失望するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
驚くべきことに、今や、特定の分類の活性化物質の選択がホスホラミダイト化学及び膨張性担体を用いるオリゴヌクレオチドの合成を驚異的に改良し得ることを知見した。
本発明によれば、テトラゾールでも置換テトラゾールでもない活性化物質の存在下で、ホスホラミダイトアプローチを用いてオリゴヌクレオチドを膨張性固体担体上にアセンブリするオリゴヌクレオチドの合成方法が提供される。
【０００４】
本発明の方法で用いることができる活性化物質は、複素環式芳香族環に４個未満の窒素原子を含む複素環式芳香族化合物の塩、特に、1又は2個の窒素原子を含む5員環又は6員環の複素環式芳香族化合物の塩を含む。例としては、国際公開パンフレットWO 99/62922（本願明細書に参照として組み込まれる）に開示されているようなピリジニウム塩、イミダゾリニウム塩及びベンズイミダゾリニウム塩、特に、ヘキサフルオロホスフェート、テトラフルオロボレート、トリフレート、ヒドロクロライド、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート、O-メシル、O-トシル、ブロマイド又はトリフルオロスルホニル塩；ベンゾトリアゾール及びその誘導体、特にヒドロキシベンゾトリアゾール；及び好ましくは有機塩基と一緒に形成された塩錯体として用いられるサッカリンもしくはサッカリン誘導体、特にサッカリンのN-メチルイミダゾール塩、ピリジン塩又は3-メチルピリジン塩を挙げることができる。
【０００５】
用いることができるサッカリン又はサッカリン誘導体は、好ましくは下記一般式を有する。
【０００６】
【化１】
2006512411.tif 000002
【０００７】
式1において、pは、0もしくは1から4の整数である。各場合のRは、置換基、好ましくはそれぞれ独立に、ハロ、置換もしくは未置換の脂肪族基、-NR1R2、-OR3、OC(O)R3、-C(O)OR3、シアノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のヘテロシクリル、-CHO、COR3、-NHCOR3、置換もしくは未置換のアラルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフルオロメチル及びトリクロロメチル）、又はSR3である。好ましくは、Rはハロ、置換もしくは未置換の脂肪族基、-NR1R2、OR3、OC(O)R3、-C(O)OR3又はシアノである。あるいは、２個の隣接するR基はそれらに結合している炭素原子と一緒に６員の飽和環もしくは不飽和環を形成する。好ましくは、形成された６員環は芳香族環である。R1及びR2はそれぞれ独立に、-H、置換もしくは未置換の脂肪族基、置換もしくは未置換のアリール基、置換もしくは未置換のアラルキル基であり；又はそれらに結合している窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成する。R3は置換もしくは未置換の脂肪族基、置換もしくは未置換のアリール基又は置換もしくは未置換のアラルキル基である。XはO又はSである。好ましくは、XはOである。XがOであり、pが0であることが特に好ましい。
【０００８】
存在し得る適切な置換基としては、アリール基、ハロゲン化アリール基、アルキル基、ハロゲン化アルキル基（例えば、トリフルオロメチル及びトリクロロメチル）、脂肪族エーテル類、芳香族エーテル類、ベンジル基、置換ベンジル基、ハロゲン類、特にクロロ基及びフルオロ基、シアノ基、ニトロ基、-S-基（脂肪族もしくは置換脂肪族基）及び-S-基（芳香族もしくは置換芳香族）を挙げることができる。
【０００９】
好ましくは、有機塩基との塩錯体としてサッカリンもしくはサッカリン誘導体が用いられる。
サッカリンもしくはサッカリン誘導体と一緒に塩錯体を形成することができる有機塩基は、pH7でプロトンを受容する傾向を有する有機化合物である。好ましい有機塩基は、二級アミン、三級アミン又はアザヘテロシクリル塩基であり、それぞれは１種以上の置換基で置換されていてもよく又は未置換でもよい。非プロトン性有機塩基は、プロトンを受容する前には化学構造中に水素結合プロトンを有していない有機塩基である。三級アミンなどの非プロトン性有機塩基及び非プロトン性アザヘテロシクリル化合物は、好ましくは本明細書に記載するように式1の化合物と併用される。
【００１０】
本明細書において用いられるアザヘテロシクリル塩基としては、芳香族環中に１種以上の窒素原子を有するヘテロアリール基及び非芳香族環系中に少なくとも１個の窒素原子を有するヘテロ脂環式基を挙げることができる。好ましくは、アザヘテロアリール塩基は、芳香族環中に１〜３個の窒素を有する５員環又は６員環芳香族環を有する。好ましくは、アザヘテロ脂環式化合物は、共に環内に１又は２個の窒素を含む５員環又は６員環である。アザヘテロシクリル塩基の例としては、ピリミジン類、1-アルキルピラゾール類、特に1-(C1-4アルキル）ピラゾール類、1-アリールピラゾール類、1-ベンジルピラゾール類、ピラジン類、N-アルキルプリン類、特にN-(C1-4アルキル）プリン類、N-アリールプリン類、N-ベンジルプリン類、N-アルキルピロール類、特にN-(C1-4アルキル）ピロール類、N-アリールピロール類、N-ベンジルピロール類、ピリジン類、N-アルキルイミダゾール類、特にN-(C1-4アルキル）イミダゾール類、N-アリールイミダゾール類、特にN-フェニルイミダゾール、N-ベンジルイミダゾール類、キノリン類、イソキノリン類、キノキサリン類、キナゾリン類、N-アルキルインドール類、特にN-(C1-4アルキル）インドール類、N-アリールインドール類、N-ベンジルインドール類、N-アルキルベンズイミダゾール類、特にN-(C1-4アルキル）ベンズイミダゾール類、N-アリールベンズイミダゾール類、N-ベンジルベンズイミダゾール類、トリアジン、チアゾール、1-アルキル-7-アザインドール類、特に1-(C1-4アルキル）-7-アザインドール類、1-アリール-7-アザインドール類、1-ベンジル-7-アザインドール類、ピロリジン類、モルフォリン類、ピペリジン類及びピペラジン類を挙げることができる。特に好ましいアザヘテロシクリル塩基は、ピリジン及び3-メチルピリジンなどのピリジン類、及びN-メチルイミダゾールなどのN-(C1-4アルキル）イミダゾール類である。
【００１１】
三級アミン類は、３個の炭素原子に結合している１個の窒素原子、しばしば３個のアリール、通常はフェニル及び／又はアルキル基、通常は３個のアルキル基に結合している１個の窒素原子を有する有機塩基であり、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類を挙げることができる。さらに、三級アミン類は、窒素原子が非プロトン性であるアザヘテロシクリル基であってもよい。アザヘテロシクリル基である三級アミン類が好ましい。アザヘテロシクリル三級アミン類の例は、N-アルキルピロリジン類、N-アリールピロリジン類、N-アルキルピロール類、N-アリールピロール類、N-アルキルモルフォリン類、N-アリールモルフォリン類、N-アルキルピペリジン類、N-アリールピペリジン類、N,N-ジアルキルピペラジン類、N,N-ジアリールピペラジン類、N-アルキル-N-アリール-ピペラジン類、キヌクリジン類、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノン-5-エン類及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン類である。三級アミン類は、アザヘテロアリール又はアザヘテロ脂環式化合物であってもよい。
【００１２】
二級アミン類は、単一の水素原子及び２個の炭素原子に結合している１個の窒素を含む有機塩基である。通常、窒素原子は、２個のアルキル基又はアリール基に結合しているか、あるいはアザヘテロシクリル基の部分を形成する。二級アミン化合物の例としては、ジエチルアミン及びジイソプロピルアミンを挙げることができる。
【００１３】
特に好ましい有機塩基としては、ピリジン、3-メチルピリジン及びN-メチルイミダゾールを挙げることができる。
【００１４】
本発明の方法において用いることができる膨張性固体担体は、適切な溶媒と接触する際に容積を増加させる担体である。膨張性の程度は、担体ごとに変動し、溶媒の性質に依存する。膨張性固体担体に対する好ましい膨張比は、5〜20の範囲にある。膨張比は下記のように規定される。
【００１５】
【数１】
2006512411.tif 000003
【００１６】
膨張性固体担体は、典型的には、架橋の量が膨張を可能とする程度に十分低い架橋ポリマーである。これらのポリマー中の架橋度は、パーセンテージで表すことができ、重合性二重結合の総モル数のパーセンテージとして、２個以上の重合性二重結合を含有するモノマーから誘導される重合性二重結合のモル数に対応する。架橋のパーセンテージは、しばしば、0.1%以上、通常は0.5%〜20%、例えば1%〜10%、好ましくは5%未満の範囲にある。20%以下の架橋を含むポリマーは一般に膨張性であり、一方、20%を超える架橋を含むポリマーは一般に非膨張性である。最も好ましくは1%〜5%、特に1%〜3%の架橋レベルが用いられる。
【００１７】
ポリマー担体は、１種以上のモノマーを含む組成物の重合から派生したものでよく、好ましくは２種以上のモノマーを含む組成物の重合から派生したものである。モノマーは１種以上の重合性二重結合を含み得る。好ましくは、ポリマー担体は、ただ１個の重合性二重結合を含む１種以上のモノマー及び２個以上の重合性二重結合を含む１種以上のモノマーを含有する組成物の重合から派生する。最も好ましくは、ポリマー担体は、ただ１個の重合性二重結合を含む１種又は２種のモノマーと２個又は３個の重合性二重結合を含む１種のモノマーとを含有する組成物の重合から派生する。
【００１８】
ただ１個の重合性二重結合を含むモノマーの例としては、α-メチルスチレン、メチルスチレン、t-ブチルスチレン、ブロモスチレン及びアセトキシスチレンなどのスチレン及び置換スチレン；ジ-n-ブチルマレート及びジ-n-ブチルフマレートなどのモノオレフィン性不飽和ジカルボン酸のアルキルエステル；ビニルアセテート、ビニルプロピオネート、ビニルラウレートなどのカルボン酸のビニルエステル、及びVeoVa 9及びVeoVa 10（VeoVaはShellの商標）などのバサチック（versatic）酸のビニルエステル；メチルアクリルアミド及びエチルアクリルアミドなどのアクリルアミド；メチルメタクリルアミド及びエチルメタクリルアミドなどのメタクリルアミド；アクリロニトリル及びメタクリロニトリルなどのニトリルモノマー；及びメチルアクリレート、エチルアクリレート、n-ブチルアクリレート、2-エチルヘキシルアクリレート、i-プロピルアクリレート及びn-プロピルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、n-ブチルメタクリレート、2-エチルヘキシルメタクリレート、i-プロピルメタクリレート、n-プロピルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、N,N-ジメチルアミノエチルアクリレート及びN,N-ジメチルアミノエチルメタクリレートなどのアクリル酸及びメタクリル酸のエステル、好ましくは場合によっては置換されているアクリル酸及びメタクリル酸のC1-20アルキル及びC1-20シクロアルキルエステルを挙げることができる。ただ１個の重合性二重結合を含む上述のモノマーの官能性誘導体もまた用いることができる。
【００１９】
２個以上の重合性二重結合を含むモノマーの例としては、ジビニルベンゼン（DVB）、トリビニルベンゼン及び多官能性アクリレート類及びメタクリレート類、例えばエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、エチレンビスアクリルアミド、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート及びN,N-ビス-アクリロイルエチレンジアミンなどを挙げることができる。好ましくは、架橋モノマー、特に、架橋ポリスチレンの調製用の架橋モノマーはDVBである。
【００２０】
膨張性担体の好ましい例としては、ポリスチレン、例えばポリスチレンポリ（エチレングリコール）コポリマー類、官能基化ポリスチレン類、特にポリエチレングリコール類で官能基化されたポリスチレン類、国際公開パンフレットWO00/02953（本願に参照として組み込まれる）に開示されているこれらのポリマーを含むポリスチレン、ポリエチレングリコールでグラフト共重合されたポリスチレン、例えばコアに対してグラフト化されたポリエチレングリコール（MWt 約4000）鎖を有するポリスチレンコアを含む商標"Tentagel"で入手可能なこれらのポリマー、ポリビニルアセテート等のポリマーを含むコポリマー類を挙げることができる。さらに好ましい担体としては、部分的に加水分解されたポリ（ビニルアセテート）を挙げることができる。さらに、所望であれば、ポリ（アクリルアミド）担体、特にペプチドの固相合成においてより一般的に用いられる微小多孔（microporous）担体又はソフトゲル担体を用いることもできる。好ましいポリ（アクリルアミド）担体は、アミン官能基化担体、特にアクリロイル-サルコシンメチルエステル、N,N-ジメチルアクリルアミド及びビス-アクリロイルエチレンジアミンの共重合により調製された担体から誘導されるアミン官能基化担体、例えばカタログ名「PL-DMA」で市販されている担体（Polymer Laboratories）などである。担体の調製手順は、Atherton, E.；Sheppard, R. C.らの"Solid Phase Synthesis: A Practical Approach”Publ., IRL Press at Oxford University Press （1984）（本願に参照として組み込まれる）に記載されている。このような担体上の官能基はメチルエステルであり、これはエチレンジアミンなどのアルキルジアミンとの反応により最初に一級アミン官能基に変換される。
【００２１】
膨張性固体担体は、オリゴヌクレオチド合成を行うことができる官能基を含む。このような官能基の例は、アミノ基及びヒドロキシ基である。
オリゴヌクレオチド合成は、固体担体の官能基への直接結合により行うことができる。しかし、多くの実施形態において、オリゴヌクレオチドを官能基を介して固体担体に取り付けるための開裂可能なリンカーを用いることが好ましい。このようなリンカーの例は当該分野で周知であり、特にスクシニル、オキサロイル及びトリチルリンカーを挙げることができる。
【００２２】
多くの実施形態において、担体は、担体上の官能基に容易にアクセスすることを可能とするために、所与溶媒中で膨張する。所与溶媒は、ポリマー組成物を考慮することにより予測可能であり、架橋剤の存在なしにであるが、類似の組成物から作ることができる理論上の直鎖ポリマーにとって「良溶媒」であることが多い。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは固体担体を膨張させるように選択される溶媒を用いる。溶媒の性質は、用いられる固体担体の性質に基づいて選択されることが認識されるであろう。ホスホラミダイト化学において用いるに適切な溶媒の例は当該分野で周知であり、特にアセトニトリル、ジメチルフォルムアミド、N-メチルピロリドン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン及びピリジンを挙げることができる。
【００２４】
本発明の方法で調製することができるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴデオキシリボヌクレオチド類、オリゴリボヌクレオシド、及びデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドの混合物を含むオリゴヌクレオチド類を挙げることができる。オリゴヌクレオチド類は、オリゴヌクレオチド化学の分野において公知の１種以上の修飾剤によって修飾されてもよい。例えば、リボヌクレオシド部位は、メトキシ又はメトキシエトキシ基などの2'-アルコキシ基の存在により、１種以上の2'-位で修飾されてもよい。デオキシリボヌクレオシド部位は、１個のハロ基、特に１個のフルオロ基などの置換基の存在により、あるいは１個のアリル基などの１個のアルケニル基により、2'-位で修飾されてもよい。脱塩基ヌクレオシド部位が存在していてもよい。１種以上の固定された（locked）ヌクレオシド類が存在していてもよい。多くの実施形態において、オリゴヌクレオチド類は、天然のD-異性体の形態であろう。しかし、オリゴヌクレオチドの数種又はすべてが、全体として又は部分的に、天然ではない異性体、例えばL-異性体もしくはB-アノマーを表すこともある。ヌクレオシド間結合は、天然のリン酸結合であってもよく、又は１種以上の修飾された結合、例えば、ホスホロチオエートもしくはホスホラミデート結合が存在していてもよい。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、１種以上の保護基を含み得る。このような保護基の例、及び保護基が保護するために用いられ得る位置の例は、当業者には周知であり、トリチル基、モノメトキシトリチル基及びジメトキシトリチル基、レブリノイル（levulinoyl）基、イソブチリル基、ベンゾイル基、アセチル基、及びBOC、特にFMOCなどのカーボネート基を挙げることができる。
【００２６】
オリゴヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7-デアザグアニン、7-デアザ-8-アザグアニン、5-プロピニルシトシン、5-プロピニルウラシル、7-デアザアデニン、7-デアザ-8-アザアデニン、7-デアザ-6-オキソプリン、6-オキソプリン、3-デアザアデノシン、2-オキソ-5-メチルピリミジン、2-オキソ-4-メチルチオ-5-メチルピリミジン、2-チオカルボニル-4-オキソ-5-メチルピリミジン、4-オキソ-5-メチルピリミジン、2-アミノ-プリン、5-フルオロウラシル、2,6-ジアミノプリン、8-アミノプリン、4-トリアゾーロ-5-メチルチミン、4-トリアゾーロ-5-メチルウラシル及びヒポキサンチンを含む天然及び／又は人工の核酸塩基を含むものでもよい。
【００２７】
オリゴヌクレオチドは、好ましくはヌクレオシドホスホラミダイトを遊離ヒドロキシ基を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドとカップリングすることにより、特に、デオキシリボヌクレシド-3'-ホスホラミダイトもしくはリボヌクレシド-3'-ホスホラミダイトを遊離5'-ヒドロキシ基を含む発生期のオリゴヌクレオチドとカップリングすることにより、調製される。本発明のプロセスは、遊離3'-ヒドロキシ基に対する5'-ホスホラミダイトのカップリングに対して同様に適用可能であることが認められるであろう。
【００２８】
好ましいホスホラミダイト類は、下記式の化合物である：
【００２９】
【化２】
2006512411.tif 000004
【００３０】
式中、R4は保護基、好ましくはトリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基であり：Bはヌクレオシド塩基であり、R5は-H、-F、-OR6、-NR7R8、-SR9又は置換もしくは未置換の脂肪族基、例えばメチルもしくはアリルを表す。PGは、リン保護基であり、一般にオリゴヌクレオチド合成に用いられる開裂可能なリン保護基であり、好ましくは置換もしくは未置換の脂肪族基又は式：-OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、-OR11、-SR11、-O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、-O-CH2CH2-C6H4-NO2、-S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3又は-S-CH2CH2-C6H4-NO2の基である。R6はH、置換もしくは未置換の脂肪族基（例えば、メチル、エチル、メトキシエチル又はアリル）、置換もしくは未置換のアリール基、置換もしくは未置換のアラルキル基、アルコール保護基、特に塩基に不安定な保護基もしくはシリル保護基、又は-(CH2)q-NR12R13を表す。R7及びR8はそれぞれ独立に、-H、置換もしくは未置換の脂肪族基又はアミン保護基を表す。あるいは、R7及びR8はこれらが結合している窒素と一緒にヘテロシクリル基となる。R9は、-H、置換もしくは未置換の脂肪族基又はチオール保護基を表す。R11は置換もしくは未置換の脂肪族基、置換もしくは未置換のアリール基又は置換もしくは未置換のアラルキル基を表す。R12及びR13はそれぞれ独立に、-H、置換もしくは未置換のアリール基、置換もしくは未置換のヘテロアリール基、置換もしくは未置換の脂肪族基、置換もしくは未置換のアラルキル基、置換もしくは未置換のヘテロアラルキル基又はアミン保護基を表す。あるいは、R12及びR13は、これらが結合している窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成する。ｑは、1〜約6の整数である。各R16は独立にC1-6アルキル基、好ましくはイソプロピル基である。用いられるホスホラミダイトは、通常、βシアノエチルオキシ-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトである。
【００３１】
本発明によるプロセスは、硫化ステージ、酸化ステージ及びキャッピングステージを含むホスホラミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドの固相合成のために慣用的に実施されるようなプロセス工程を用いてもよい。
【００３２】
硫化剤を用いる場合には、硫化剤は元素状硫黄を含んでいてもよい。好ましくは硫化剤は有機硫化剤である。
有機硫化剤の例としては、3H-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド（"Beaucage 試薬"ともよばれる）、ジベンゾイルテトラスルフィド、フェニルアセチルジスルフィド、N,N,N',N'-テトラエチルチウラムジスルフィド及び3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン（米国特許U.S. Patent No. 6,096,881参照、この教示全体は本願に参照として組み込まれる）を挙げることができる。
【００３３】
上述の剤を用いるオリゴヌクレオチドの硫化の典型的な反応条件は、Beaucageらの"Tetrahedron"（1993）, 49:6123（本願に参照として組み込まれる）に見いだすことができる。
【００３４】
好ましい硫化試薬は、3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン及びフェニルアセチルジスルフィドである。
オリゴヌクレオチドの硫化は、例えばピリジン／アセトニトリル（1：9）混合物又はピリジンなどの有機溶媒中約0.05M〜約0.2Mの濃度の3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン溶液の使用により実施することができる。
【００３５】
用いることができる酸化剤の例としては、ヨウ素及びt-ブチル過酸化水素などの過酸化物を挙げることができる。
望ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、通常は5'-保護である保護ヌクレオシドホスホラミダイトを遊離ヒドロキシ基とカップリングする工程と、カップリング工程で形成された保護ホスファイトトリエステルを酸化もしくは硫化してホスフェートもしくはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを形成する工程と、オリゴヌクレオチドから保護基を取り除く工程と、所望のシーケンスがアセンブルされるまでサイクル単位を繰り返す工程と、を含む一連の工程により実施することができる。オリゴヌクレオチドは、固体担体から開裂させることができ、任意の残留保護基、例えば核酸塩基及びリン保護基などは当該分野で公知の条件を用いて取り除くことができる。
【００３６】
本発明によるプロセスは、例えば、カラム、撹拌容器及び固定床反応器などの広範な適切な反応容器内で行うことができる
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
DMTrOABz-3'-サクシネートの合成
5'-DMTrOABz-3'-OH（75.0g、117mmol）をオーブンで乾燥させた500mlのフローレンティン（florentine）に仕込み、続いて無水コハク酸（15.6g、160mmol）及びN,N-ジメチルアミノピリジンを仕込んだ。フラスコを窒素ガスでフラッシュ洗浄し、首にゴム製隔膜を嵌め込んだ。無水ピリジン（250ml）をシリンジでフラスコに仕込んだ。得られた溶液を室温で82時間撹拌し、その後、ピリジンの塊を真空中で取り除いた。得られた粗油をストッパ付きのフラスコに50時間保存した。
【００３８】
粗油をジクロロメタン（DCM、250ml）中に溶解させ、この溶液を水（2×250ml）及びトリエチルアンモニウムホスフェート溶液（3M、pH7.5、250ml）で洗浄した。有機層を分離し、MgSO4で乾燥させて、溶媒を真空中で取り除いた。残留物をトルエン（200ml）中に溶解させ、溶媒を真空中で取り除いた。この操作をトルエン（200ml）で１回、DCM（200ml）で１回、繰り返した。こうして、オフホワイトの泡を得て、3時間の真空下乾燥後、流通自在の粉末（94.4g）に砕いた。
【００３９】
この生成物の強度を測定したところ（HPLC、面積%）97%であったが、これは91%の收率に対応する。
【００４０】
5'-HOABz-3'-サクシネート-ポリスチレン樹脂の調製
Novabiochemから得たアミノメチル化ポリスチレン樹脂（ジビニルベンゼンで1%架橋した）（cat. no. 01-64-0010）（5g、"5.65mmol"、1eq）を大型直線縁（straight-edged）焼結漏斗（sinter funnel）内に置いて、N-メチルピロリドン（NMP、およそ30ml）で予備膨張させ、枝口から窒素の正圧を付与して、高粘度のペーストをバブリングした。NMPをおよそ10分後に排出した。
【００４１】
5'-DMTrOABz-3'-サクシネート（19.4g、3.9eq）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（4.6g、6eq）をNMP（およそ35ml）中に溶解させ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、2.1g、2.9eq）をこの溶液に添加した。DICを添加した後およそ２分後に、この溶液にジイソプロピルエチルアミン（1.7g、3eq）を添加した。この全溶液を旋回させ、次いで焼結漏斗（sinter funnel）内の膨張した樹脂に素早く添加し、焼結漏斗（sinter funnel）の下から再び窒素の正圧を付与して高粘度の黄色ゲルを撹拌した。DICで汚染されたガラス製品及び等価物を苛性浴（caustic bath）内で解毒した。
【００４２】
焼結漏斗（sinter funnel）を覆って反応混合物の汚染を防止し（非気密性シール）、65時間にわたり、反応物を緩やかにバブリングしたままにした。
標準カイザーテスト（Kaiser tests）により反応の進行を確認したところ、この時間の後、否定的な結果（黄色）を与え、反応は完了したとみなされた。
【００４３】
N2フローを真空と交換して、溶液をフラスコ内に吸引することにより、試薬溶液を排出した。樹脂をNMP（3×40ml以下）で洗浄した。無水酢酸（4.2g、7.2eq）及びN,N-ジメチルアミノピリジン（0.07g、0.1eq）のNMP溶液（35ml以下）を添加して1時間保持することにより、任意の残留遊離アミノ基をキャップした。試薬を排出して、樹脂をジメチルフォルムアミド（DMF、5×40ml）、DCM（5×40ml）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×40ml）で崩壊させた。樹脂を窒素流で乾燥させ、室温において真空オーブンで一晩乾燥させた。使用済み試薬溶液をNaOH溶液で解毒処理した。
【００４４】
樹脂（1.028g）をジャケット付相反応器に仕込み、DCM（10ml以下）で洗浄した。反応器ジャケットを流体循環器で0℃まで冷却した。吸引しながら、DCM中3% v/vジクロロ酢酸溶液（84ml）を反応器に仕込んだ。速やかに深赤色が展開した。酸溶液のすべてを樹脂床（110s）に通過させてしまったら、樹脂をDMF（5×10ml以下）及びDCM（5×10ml以下）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×20ml以下）で崩壊させた。
【００４５】
5'-AcOG（isobu）TABzCBzABz-3'-ポリスチレン樹脂の調製
カップリング反応中のすべての「乾燥」工程のために（すなわち、予備カップリング洗浄から硫化まで）、用いたDMFは市販の無水DMF（Aldrich）であり、必要に応じておよそ100mlバッチ内でモレキュラーシーブ上で一晩乾燥させた。こうして、10〜50ppmの含水率のDMF（Karl-Fischer）を与えた。最初に供給された150ppm以下と比較せよ。溶液を排出することは、Rotafloタップを介して反応器の上部にN2ガスの正圧を付与することにより、これらの工程で達成された。この系列の反応器内で最初に用いた樹脂は、上記で調製したHOABz-ポリスチレン樹脂0.5mmolg-1であった。すべてのホスホラミダイト類は、保護デオキシリボ-3'-βシアノエチルオキシ-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト類であった。
【００４６】
HOABz-ポリスチレン樹脂（1.356g、0.69mmol）を、隔膜入口及びRotafloタップを取り付けたジャケット付固相反応器に仕込んだ。窒素入口及び出口の両方に、自己指示（self-indicating）P2O5で満たされたインライン乾燥管（in-line drying tubes）を嵌め込んだ。樹脂を乾燥DMF（3×5ml以下）及び乾燥DCM（2×5ml以下）で洗浄した。アミダイト（1.41g、2.5eq）をMeCN（2×10ml）で共沸的に乾燥させ、乾燥DCM（3ml以下）中に溶解させた。サッカリンのN-メチルイミダゾール塩（0.45g、2.5eq）を、オーブンで乾燥させた隔膜付バイアル瓶に仕込んで、乾燥DMF（0.75ml以下）及び乾燥DCM（1.5ml以下）中に溶解させた。次いで、アミダイト溶液及びサッカリン塩溶液をこの順序で、予め膨張させた樹脂に仕込んだ。
【００４７】
N2ガスで混合物を緩やかにバブリングしながら２時間保持した後、乾燥メタノール（2ml以下）を添加した。およそ5分後、溶液を反応器から排出し、樹脂を乾燥DMF（3×5ml以下）及び乾燥ピリジン（2×5ml以下）で洗浄した。使用済み試薬溶液をHPLCで分析して、反応の最後に残った活性アミダイトの量を概算した。
【００４８】
乾燥ピリジン中3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン（0.25g、2.5eq）溶液（4ml以下）を樹脂に仕込み、これを緩やかにN2でバブリングしながら、1時間保持し、その後、溶液を排出した。上部を反応器から取り除き、樹脂をベンチDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄し、次いでCap A 溶液（5：3：2 MeCN：ピリジン：N-メチルイミダゾール、2×5ml以下）で洗浄した。次いで、Cap A 溶液（2.5ml）及びCap B 溶液（4：1 MeCN：Ac2O、2.5ml）を反応器に仕込み、混合物を1時間保持した。
【００４９】
使用済みキャッピング溶液を排出し、次いで、樹脂をDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×5ml以下）で洗浄した。次いで、樹脂を脱トリチル化の前に、一晩放置した。
【００５０】
脱トリチル化の前に、反応器ジャケットを0℃まで冷却し、樹脂をDCMで洗浄／予備膨張させた。3%ジクロロ酢酸溶液（DCM中）を床に通過させながら樹脂を吸引下に保持し、深赤色を発色させた。用いた容積は、樹脂に結合すると予測されるDMT 1mmol あたり3%酸溶液の100mlに基づくものであった。すべての酸溶液を樹脂床に通過させたら、樹脂をDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄した。さらに1容積の酸溶液を樹脂に通過させたところ、淡橙色を呈した。樹脂を再び、DMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×5ml以下）で洗浄し、次のカップリング反応に備えた。
【００５１】
毎回同じ手順を用いて、HOABzPS樹脂サンプルをdC、dA、T及びdGアミダイト類とカップリングさせ、キャッピングさせた後、最後の脱トリチル化工程の後、5'-AcOG（isobu）TABzCBzABz-3'-ポリスチレン樹脂は2.653gの重さがあった。
【００５２】
［実施例2］
5'-AcOG（isobu）TABzCBzABz-3'-PDMA樹脂の調製
密閉した2L丸底フラスコ中で、アクリロイル-サルコシンメチルエステル、N,N-ジメチルアクリルアミド及びビス−アクリロイルエチレンジアミンの共重合により製造したポリ（アクリルアミド）樹脂（PL-DMA樹脂、例えばPolymer Labs、69g）をエチレンジアミン（700ml）で処理し、一晩、室温に放置した。次いで、スラリーを焼結漏斗（sinter funnel）に移し、DMF（12×700ml）で洗浄した。こうして、痕跡量のアミンも含まないDMF洗浄物を製造した。次いで、DCMを段階的に増量させ（2.5L；0〜100%DCM）、次いでDCM中エーテルを段階的に増量させて（900ml；0〜100%エーテル）、樹脂をDMFで洗浄した。次いで、樹脂を窒素流中で40℃にて一晩乾燥させた。製造された樹脂（"PDMA"）は、1グラムあたり973マイクロモルのアミノ官能基を有していた。
【００５３】
カップリング反応中のすべての「乾燥」工程のために（すなわち、予備カップリング洗浄から硫化まで）、用いたDMFは市販の無水DMF（Aldrich）であり、必要に応じて、およそ100mlバッチで、モレキュラーシーブ上で一晩乾燥させた。こうして、10〜50ppm（Karl-Fischer）の含水率を有するDMFを得た。最初に供給されたものは150ppm以下であったことと比較せよ。溶液を排出することは、これらの工程において反応器の頂部にRotafloタップを介して正圧のN2ガスを付与し、同時に真空下で吸引することにより達成された。この一連の反応器内で最初に用いた樹脂は、PDMAをポリスチレンの代わりに用いた点を除いて実施例1で5'-HOABz-3'-サクシネート-ポリスチレンについて用いた同じ手順に従って調製された5'-HOABz-3'-PDMA樹脂0.56mmolg-1であった。すべてのホスホラミダイト類は、5'-ジメトキシトリチル保護デオキシリボ-3'-βシアノエチルオキシ-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトであった。
【００５４】
5'-HOABz-3'-PDMA樹脂（1.00g、0.56mmol）を隔膜入口及びRotafloタップを取り付けたジャケット付固相反応器に仕込んだ。窒素入口及び出口の両者とも、自己指示（self-indicating）P2O5を充填したインライン乾燥管（in-line drying tubes）を具備していた。樹脂を乾燥DMF（4×5ml以下）及び乾燥DCM（1×5ml以下）で洗浄した。アミダイト（1.16g、2.5eq）をMeCN（2×10ml）で共沸的に乾燥させ、乾燥DCM（5ml以下）中に溶解させた。サッカリンのN-メチルイミダゾール塩（0.37g、2.5eq）をオーブンで乾燥させた隔膜付バイアル瓶に仕込み、乾燥DMF（1.5ml以下）及び乾燥DCM（2ml以下）中に溶解させた。アミダイト溶液及びサッカリン塩溶液を次いで、この順序で、予め膨張させた樹脂に仕込んだ。
【００５５】
混合物をN2ガスで緩やかにバブリングしながら1時間30分保持した後、乾燥メタノール（3ml以下）を添加した。およそ5分後、溶液を反応器から排出して、樹脂を乾燥DMF（3×5ml以下）で洗浄した。使用済み試薬溶液をHPLCで分析して、反応の最後に残った活性アミダイトの量を概算した。
【００５６】
乾燥ピリジン中3-アミノ-[1,2,4]-ジチアゾール-5-チオン（0.21g、2.5eq）溶液（7ml以下）を樹脂に仕込み、緩やかにN2でバブリングしながら、1時間保持し、その後、溶液を排出した。上部を反応器から取り出し、樹脂をベンチDMF（5×10ml以下）及びDCM（5×10ml以下）で洗浄し、次いでCap A溶液（5:3:2 DCM:ピリジン：N-メチルイミダゾール、3×10ml以下）で洗浄した。Cap A 溶液（5ml）及びCap B 溶液（4：1 DCM：Ac2O、5ml）を混合して、次いで反応器に仕込み、混合物を1時間保持した。
【００５７】
使用済みキャッピング溶液を排出し、次いで樹脂をDMF（5×10ml以下）及びDCM（5×10ml以下）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×15ml以下）で洗浄した。次いで、脱トリチル化の前に樹脂を一晩放置した。
【００５８】
脱トリチル化の前に、反応器ジャケットを0℃まで冷却し、樹脂をDCMで洗浄／膨張させた。DCM中5%ジクロロ酢酸溶液を調製した（樹脂に結合すると予測されるDMT 1 mmolに対して100ml、すなわち、ここでは60ml）。この溶液（15ml）を反応器に仕込み−深赤色が発色した−、排出する前に30秒間保持した。樹脂を吸引下に保持し、新鮮な酸溶液（30ml）を床に通過させた。酸溶液の最後のアリコート（15ml）を樹脂上に1分間保持し、この時点で使用済み溶液を排出した。次いで、樹脂をDMF（5×10ml以下）及びDCM（5×10ml以下）で洗浄した。DCMによる洗浄後の酸によるビーズのテストが赤色の発色を生じさせなくなるまで、サイクルを繰り返した。この時点で、樹脂をジエチルエーテル（3×15ml以下）で洗浄して、樹脂を崩壊させ、次のカップリング反応に備えた。
【００５９】
毎回同じ手順を用いて、5'-HOABz-3'-PDMA樹脂サンプルをdC、dA、T及びdGアミダイトでカップリングさせ、キャッピングさせた後、最後の脱トリチル化工程後、5'-AcOG（isobu）TABzCBzABz-3'-PDMA樹脂は1.80gの重さであった。
【００６０】
［実施例 3］
トリチル-テトラエチレングリコキシスチレンの10リットルスケールでの調製
ステージ 1
テトラエチレングリコール（4188g、21.5mol）を窒素雰囲気下で、機械的撹拌手段を具備する10L容器に添加して、60rpmで撹拌した。ピリジン（544g、6.9mol）をこの容器に添加して、混合物を50℃まで加熱した。トリフェニルメチルクロライド（1000g、3.6mol）をN2雰囲気下でトルエン（3000ml）中に溶解させ、温度を60℃以下に維持しながらグリコールにゆっくりと添加した。温度は、50℃に2時間保持し、次いで、室温まで冷却した。2Lのトルエンを添加して、混合物を6Lの脱イオン水で抽出し、水層を5Lのトルエンで抽出した。集めた有機抽出物を4Lの脱イオン水で2回洗浄し、500gの硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去して、淡黄色油を收率1230g（トリチルを基準として74%）、94.3%純度（NMR）で得た。
【００６１】
ステージ 2
モノ（トリチル）テトラエチレングリコール（1766.4g、3.8mol）を3Lのテトラヒドロフラン（THF）と一緒に10L容器に添加し、撹拌しながら-12℃まで冷却した。p-トルエンスルフォニルクロライド（945g、5mol）をグリコール／THF混合物に添加した。脱イオン水中KOH（880g、15.7mol）溶液（3L）を-5℃以下の温度に維持しながら1時間かけて、この溶液に添加した。添加の完了後、容器を25℃まで暖めて12時間保持した。層を分離して、下層の水層を2.5LのTHFで2回洗浄し、有機層を集めて、溶媒を減圧下で除去した。7.5Lのイソプロピルアセテート中の橙色／茶色油を10Lの水で抽出し、次いで2Lの水で5回抽出し、硫酸マグネシウム（500g）で乾燥させ、溶媒を除去して、粘性の橙色油1837g（78.0%）、純度95.3%（NMR）を得た。
【００６２】
ステージ 3
脱イオン水（1.5L）及びTHF（2.1L）を10L容器に添加して、100rpmで撹拌を始めた。容器を-12℃まで冷却して、水酸化カリウム（535g、9.5mol）をゆっくりと添加した。THF中アセトキシスチレン（575ml、3.7mol）（1L）を冷却しながら約30分かけて容器に添加した。容器を30℃まで加熱して、1時間保持し、次いで20℃まで冷却した。1050mlのTHF中のステージ2生成物（1800g、2.9mol）を反応容器に15分かけて添加して、次いで混合物を40時間にわたり60℃に加熱した。反応物を冷却し、層を分離して、有機層を2Lの8M水酸化カリウム水溶液で2回洗浄した。溶媒を減圧下で除去して、残留物をトルエン（5L）中に溶解させ、2Lの脱イオン水で3回洗浄し、次いで2Lの1M水酸化ナトリウム水溶液で2回洗浄し、最後に3Lの脱イオン水で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム（500g）で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、橙色油の生成物を收率1471g（75%）、純度79.7%（NMR）で得た。
【００６３】
テトラエチレングリコール-官能基化ポリマーの合成及び続いての脱保護
部分的に加水分解されたポリ（ビニルアルコール）（Airvol 540、34.9gの2.5wt%水溶液）及び塩化ナトリウム（31.2g）を、機械的撹拌手段を具備する脱イオン水（1181ml）含有の2Lの筒状バッフル付反応器に仕込んだ。ステージ3の生成物（79.7%、87.2g）、スチレン（59.1g）、ジビニルベンゼン（80%、1.4g）及び過酸化ラウロイルの混合物を反応器に仕込み、400rpmで撹拌した。20分後、撹拌速度を300rpmに減速し、反応物を水浴で80℃まで50分かけて加熱した。16時間後、反応混合物を冷却し、50μm濾布袋に移し、脱イオン水で洗浄した（5×1L）。次いで、ポリマービーズをTHF（4×1L）及びジクロロメタン（DCM、2×1L）で洗浄し、5Lフランジフラスコ／オーバーヘッド攪拌機内で室温にて窒素下で、ジクロロメタン（1800ml）、トリフルオロ酢酸（128g）及びトリエチルシラン（51.5g）の混合物と一緒に、4時間にわたり撹拌した。次いで、生成物をジクロロメタン（4×1L）及びヘキサン（5×1L）で洗浄してから、真空オーブン中で重さを一定にするために乾燥させて、0.97mmol/gのヒドロキシ負荷を有する白色ポリマービーズ78gを得た。
【００６４】
5'-DMTrOABz-3'-サクシネートのテトラエチレングリコール-官能基化ポリマーとの
カップリング
前述の工程により調製したテトラエチレングリコール-官能基化ポリマー（0.51g、0.357mmol）を、小さな磁石撹拌子（magnetic follower）を具備する50mL丸底フラスコに仕込んだ。5'-DMTrOABz-3'-サクシネート（1.28g、4eq）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、0.29g、6eq）をN-メチルピロリドン（NMP、およそ5ml）中に溶解させ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、0.19g、4.2eq）をこの溶液に添加した。DICを添加してからおよそ2分後、ジイソプロピルエチルアミン（0.19g、4.1eq）をこの溶液に添加した。この全溶液を旋回撹拌し、次いで、樹脂を含むフラスコに速やかに添加した。DICで汚染されたガラス製品及び等価物を2M水酸化ナトリウム浴内で解毒した。
【００６５】
フラスコに栓をして、混合物をおよそ70時間にわたり、ゆっくりと撹拌した。赤／茶色混合物を焼結漏斗（sinter funnel）に移して、吸引濾過して、樹脂をNMP（3×20ml以下）で洗浄した。NMP中無水酢酸（0.29g、8eq）及びジメチルアミノピリジン（DMAP、0.02g、0.5eq）溶液（30ml以下）を添加して、1時間保持し、樹脂床を上向きに窒素ガスをバブリングして撹拌することにより、任意の残留遊離ヒドロキシ基をキャッピングした。試薬を排出し、樹脂をDMF（5×10ml）、DCM（5×10ml）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×20ml）で崩壊させた。樹脂を窒素流で風乾させ、真空オーブン中で室温にて一晩乾燥させた。使用済み試薬溶液をNaOH 溶液で解毒処理した。
【００６６】
生成物の重さ：0.739g
【００６７】
5'-HOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマーの調製
前述の工程で調製した5'-DMTrOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマー（0.739g）を、窒素雰囲気下での運転に適するジャケット付焼結反応器を含む隔膜入口及びRotafloタップを嵌め込んだ固相反応器に仕込んだ。窒素入口及び出口の両者とも自己指示（self-indicating）P2O5を充填したインライン乾燥管（in-line drying tubes）を取り付けた。ポリマーをDCM（10ml以下）で洗浄した。反応器ジャケットを流体循環機で0℃まで冷却した。DCM中3% v/vジクロロ酢酸（DCA）（60ml）を吸引下で樹脂床に通過させた。赤色はビーズ上に展開したが、溶液中には速やかに拡散しなかった。ビーズは、溶液の上部にも浮かんでいた。酸溶液のすべてを反応器に通過させてしまったら、樹脂をDMF（5×5ml以下）で洗浄し、次いでDCM（5×5ml以下）で洗浄した。樹脂を洗浄することは、窒素ガスフローを樹脂床を通して上方に通過させ、溶媒を添加し、次いで窒素供給を真空で置換して樹脂を抜き出すことにより達成された。
【００６８】
窒素ガスを樹脂床を通して上方に流通させることにより、DCM中3% v/v DCA溶液（15ml）を反応器に仕込んだ。深赤色が速やかに展開した。1分後、窒素流を真空と交換して、酸溶液を排出させた。さらに30mlの3%酸溶液を吸引下で樹脂に通過させた。吸引排出する前に、窒素でバブリングしながら、第3の3%酸溶液のアリコート15mlを樹脂と一緒に1分間保持した。樹脂をDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄した。
【００６９】
さらに「保持−フラッシュ洗浄−保持」処理を前述のように行い、樹脂を洗浄した後、樹脂をジエチルエーテル（3×10ml以下）での洗浄により崩壊させた。
濾物のHPLC分析は、Aヌクレオシドの脱プリン反応が生じたとしたならば予想されるようにN-ベンゾイルアデニンの存在を示さなかった。
【００７０】
GTACAオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成
これは、下記のカップリング及び脱トリチル化条件を用い、ホスホラミダイト化学を用いて達成された。慣用の5'-ジメトキシトリチルデオキシリボヌクレオシド-3'-βシアノエチルオキシ-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトを用いた。
【００７１】
カップリング
カップリング反応中のすべての「乾燥」工程（すなわち、予備カップリング洗浄から硫化を含む工程まで）について、用いたDMFは、市販の無水DMF（Aldrich）であり、必要に応じて、およそ100mlバッチで4Åモレキュラーシーブ上で一晩乾燥させた。こうして、含水率が5〜50ppm（Karl-Fischer）のDMFを得た。最初に供給されたものは150ppm以下であったことと比較せよ。溶液の排出は、正圧のN2ガスを反応器の上部にRotafloタップを介して付与して、焼結漏斗（sinter funnel）の下方から吸引することにより、これらの工程において達成された。この一連の反応で最初に用いた担体は、上述の方法で調製した5'-HOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマーであった。
【００７２】
系列中の第1のカップリング及び脱トリチル化（dCbzアミダイト +  5'-HOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマー）の詳細は説明した。続くカップリング及び脱トリチル化は、対応するホスホラミダイト試薬（dAbz、dT及びdGibuアミダイト類）の同じ当量数を用いる同一の態様で実行した。
【００７３】
5'-HOABz-3'-サクシネート-テトラエチレングリコール-官能基化ポリマー（0.320mmol）を、隔膜入口及びRotafloタップを取付け、窒素雰囲気下での運転に適する固相反応器に仕込んだ。窒素入口及び出口の両者とも自己指示（self-indicating）P2O5を充填したインライン乾燥管（in-line drying tubes）を取り付けた。樹脂を乾燥DMF（3×5ml以下）及び乾燥DCM（2×5ml以下）で洗浄した。アミダイト（0.67 g、0.8mmol、2.5eq）をMeCN（2×10ml）で共沸的に乾燥させ、乾燥DCM（3ml以下）中に溶解させた。国際公開パンフレットWO03/004512の方法により調製したサッカリンメチルイミダゾール塩（SMI、0.21g、0.8mmol、2.5eq）を、オーブンで乾燥させた隔膜付のバイアル瓶に仕込み、乾燥DMF（0.5ml以下）及び乾燥DCM（2.5ml以下）中に溶解させた。次いで、アミダイト溶液及びSMI溶液を、この順序で、隔膜入口を介して予め膨張させた樹脂に仕込んだ。
【００７４】
混合物をN2ガスで緩やかにバブリングしながら2時間保持した後、乾燥メタノール（2ml以下）を添加した。およそ5分後、溶液を反応器から排出し、樹脂を乾燥DMF（3×5ml以下）及び乾燥ピリジン（2×5ml以下）で洗浄した。使用済み試薬溶液をHPLCで分析して、反応の最後に残った活性アミダイトの量を概算した。
【００７５】
乾燥ピリジン中キサンタンヒドライド（0.12g、0.8mmol、2.5eq）溶液（4ml以下）を樹脂に仕込み、緩やかにN2バブリングしながら、1時間保持し、その後、溶液を排出した。上部を反応器から取り出し、樹脂をベンチDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄し、次いで、Cap A溶液（5：3：2 MeCN：ピリジン：N-メチルイミダゾール、2×5ml以下）で洗浄した。次いで、Cap A溶液（2.5ml）及びCap B溶液（4：1 MeCN：Ac2O、2.5ml）を反応器に仕込み、混合物を1時間保持した。
【００７６】
使用済みキャッピング溶液を排出し、次いで、樹脂をDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×5ml以下）で洗浄した。次いで、脱トリチル化の前に、樹脂を一晩放置した。
【００７７】
脱トリチル化
脱トリチル化の前に、反応器ジャケットを0℃まで冷却して、樹脂をDCMで洗浄／膨張させた。DCM中3% (v/v) DCA（「酸溶液」）を用いて、樹脂を脱トリチル化した。各脱トリチル化サイクルについて、用いた酸溶液の容積は、樹脂に結合すると仮定したDMTの1mmolあたり167mlを基準とした。
【００７８】
焼結漏斗（sinter funnel）の下方から窒素ガスで撹拌しながら、酸溶液（12ml）を樹脂と一緒に1分間保持した。明赤色の溶液を吸引により排出し、さらに25mlの酸溶液を樹脂床に通過させた。排出する前に、第3の酸溶液アリコート12mlを樹脂と一緒に1分間保持した。樹脂をDMF（5×5ml以下）及びDCM（5×5ml以下）で洗浄した。
【００７９】
この酸処理／洗浄サイクルを1回以上繰り返した。最後のDCM洗浄の後、樹脂をジエチルエーテル（3×5ml以下）で洗浄することにより崩壊させた。
4カップリング工程を経た平均カップリング収率は、トリチル分析により97.5%と算出された。
【国際調査報告】
2006512411.tif 000006
2006512411.tif 000007
2006512411.tif 000008