(57)【要約】この開示は、他のものの内で、患者の新生物疾患を分類するための分子マーカー、それらの分子マーカーの診断試験における利用方法、これらの分子マーカーに関連する核酸及びアミノ酸配列、分子マーカーの検出のための試薬、及び高度に並行的な遺伝子発現データにおいて候補の分子マーカーを同定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が結腸新生物形成を有することがありそうなことかどうかを検出する方法であって、該方法は、下記：
ａ）生物学的試料を該被験者から得；
ｂ）少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの内から選択する少なくとも一のポリペプチドを検出する
ことを含み、該少なくとも一のポリペプチドの存在が結腸新生物形成を示す、上記の方法。
【請求項２】
ＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９８〜９９％同一である核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号４によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号５の核酸配列と少なくとも９８〜９９％同一である核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号５によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号４の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号５の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２及び配列番号１３の何れか一つに示したアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸によりコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号３及び配列番号１４の何れか一つに示したアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸によりコードされる、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記の生物学的試料を、全血液又はその画分よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の生物学的試料を、尿又は大便試料よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の生物学的試料が、血液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の血液試料を分画して、血液血清及び／又は血液血漿を得る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の生物学的試料を、ＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２について富化させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドを、アッセイにより検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記のアッセイが、抗体を用いる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記のアッセイを、免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)よりなる群から選択する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記のアッセイが、生物学的試料を、ＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドと相互作用する抗体と接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、配列番号１上のエピトープ及び配列番号２上のエピトープの内から選択するエピトープと相互作用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体が、配列番号３上のエピトープ及び配列番号１４上のエピトープの内から選択するエピトープと相互作用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
抗体を、検出可能に標識する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
標識を、酵素、蛍光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯化剤よりなる群から選択する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１上のエピトープ及び配列番号２上のエピトープの内から選択するエピトープと相互作用する精製された抗体。
【請求項２６】
配列番号３上のエピトープ及び配列番号１４上のエピトープの内から選択するエピトープと相互作用する精製された抗体。
【請求項２７】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項２７に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項３０】
請求項２７に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項３１】
生物学的試料中の少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
生物学的試料中の少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、予め決めた標準と比較する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
生物学的試料中の少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、予め決めた標準と比較する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
生物学的試料中の少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、被験者の過去の基準線と比較する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、被験者が、結腸新生物形成を発生することがありそうであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、被験者が、結腸腺腫又は結腸癌を有することがありそうであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、結腸新生物形成を有する患者に施すべき治療プロトコールの決定を助成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
被験者が、以前に、結腸癌と診断されたことのない、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験者が、以前に結腸癌の治療を受けたことがあり又は現在受けており、少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、その被験者が、再発した又は持続性の又は進行性の結腸癌を有することを示す、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
結腸新生物形成が、結腸腺腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
結腸新生物形成を、結腸癌及び転移性結腸癌の内から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
生物学的試料中の少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
生物学的試料中の結腸新生物形成を検出するためのキットであって、下記を含む当該キット：
ａ）ＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２のエピトープと相互作用する抗体；及び
ｂ）使用指示書。
【請求項４４】
生物学的試料中の結腸新生物形成を検出するためのキットであって、下記を含む当該キット：
ａ）配列番号１〜３の何れか一つに示したアミノ酸配列を有するポリペプチドと相互作用する抗体；及び
ｂ）容器。
【請求項４５】
前記の抗体を、検出可能に標識してある、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記の標識を、酵素、蛍光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯化剤よりなる群から選択する、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列、又はその相補鎖を含む組換え核酸。
【請求項４８】
配列番号５の核酸配列と少なくとも９９．５％同一である核酸配列、又はその相補鎖を含む、請求項４７に記載の組換え核酸。
【請求項４９】
配列番号５の核酸配列と同一である核酸配列、又はその相補鎖を含む、請求項４７に記載の組換え核酸。
【請求項５０】
配列番号３及び１４よりなる群から選択するポリペプチドと少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列、又はその相補鎖を含む組換え核酸。
【請求項５１】
配列番号３及び１４よりなる群から選択するポリペプチドと少なくとも９９．５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列、又はその相補鎖を含む、請求項５０に記載の組換え核酸。
【請求項５２】
配列番号３及び１４よりなる群から選択するポリペプチドと同一であるポリペプチドをコードする核酸配列、又はその相補鎖を含む、請求項５０に記載の組換え核酸。
【請求項５３】
請求項５０に記載の組換え核酸を含む発現用構築物。
【請求項５４】
請求項５３に記載の発現用構築物を含むベクター。
【請求項５５】
請求項５３に記載の発現用構築物を含む細胞。
【請求項５６】
細胞を、細菌細胞及び真核細胞よりなる群から選択する、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを製造する方法であって、下記を含む当該方法、
(ａ)請求項５５に記載の細胞を得；
(ｂ)その細胞を、組換え核酸によりコードされたポリペプチドの産生を促進する条件下で培養し；
(ｃ)組換え核酸によりコードされたポリペプチドを含む細胞画分を得る。
【請求項５８】
(ｃ)の細胞画分を精製して実質的に純粋なＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを得ることを更に含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【請求項６０】
配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６２】
組換えポリペプチドが、更に、組換えポリペプチドの抗体による検出を容易にするエピトープタグを含む、請求項５９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項６６】
第一のポリペプチドドメイン及び第二のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第一のポリペプチドドメインが、配列番号３及び１４よりなる群から選択する配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列よりなる、当該融合タンパク質。
【請求項６７】
第二のポリペプチドドメインが、検出用ドメイン、精製用ドメイン及び抗原性ドメインよりなる群から選択するドメインである、請求項６６に記載の融合タンパク質。
【請求項６８】
請求項６３に記載のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項６９】
抗体が、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドと、１０-6Ｍ未満の解離定数で結合する、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７０】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７１】
抗体が、血液試料中のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドへの特異的結合に有効である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７２】
抗体が、結腸新生物形成に由来する細胞を含む試料中のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドへの特異的結合に有効である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７３】
請求項６３に記載のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)マウスに、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な量のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与し；
(ｂ)抗体産生細胞をそのマウスから得て、それらの抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて、抗体産生ハイブリドーマを得；
(ｃ)それらの抗体産生ハイブリドーマを試験して、好適ハイブリドーマを同定し、この好適ハイブリドーマは、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生し；
(ｄ)このＣｏに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する好適ハイブリドーマの細胞培養を培養し；そして
(ｅ)この細胞培養から、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を得る。
【請求項７４】
抗体産生ハイブリドーマを試験することが、抗体産生ハイブリドーマが、酵素結合免疫吸着アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅアッセイ及び免疫沈降アッセイよりなる群から選択するアッセイにおいて、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに結合する抗体を産生するかどうかを試験することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
被験者が結腸新生物形成を有することがありそうなことかどうかを検出する方法であって、該方法は、下記：
ａ）該被験者から生物学的試料を得；
ｂ）少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの内から選択する少なくとも一のポリペプチドを検出する
ことを含み、該少なくとも一のポリペプチドの存在が結腸新生物形成を示す、当該方法。
【請求項７６】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを、下記より選択する、請求項７５に記載の方法：
ａ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；
ｂ）配列番号５の天然の変異体である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；
ｃ）配列番号５の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；
ｄ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチド；及び
ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチド。
【請求項７７】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号５の配列を有する核酸の発現により生成される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号５の核酸配列と少なくとも９８〜９９％同一である核酸配列の発現により生成される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドが、配列番号３及び配列番号２１の内から選択するアミノ酸配列と少なくとも９８〜９９％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８０】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドを、下記より選択する、請求項７５に記載の方法：
ａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；
ｂ）配列番号４の天然の変異体である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；
ｃ）配列番号４の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；
ｄ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチド；及び
ｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチド。
【請求項８１】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号４の配列を有する核酸の発現により生成される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９８〜９９％同一である核酸配列の発現により生成される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドが、配列番号１及び配列番号２の内から選択するアミノ酸配列と少なくとも９８〜９９％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８４】
生物学的試料が、血液試料又は血液に由来する画分である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８５】
生物学的試料を、全血液、血液血漿、及び血液血清の内から選択する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
生物学的試料を、腸管の内壁及び／又は内腔から導く、請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
生物学的試料が、大便試料である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
生物学的試料が、尿試料である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８９】
ポリペプチドを、抗体を用いるアッセイにより検出する、請求項７５に記載の方法。
【請求項９０】
アッセイを、免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)の内から選択する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
アッセイが、生物学的試料を、分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド又は分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドと相互作用する抗体と接触させることを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
抗体が、配列番号１及び排列番号２の内から選択するアミノ酸配列のエピトープと相互作用する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
抗体が、配列番号３のアミノ酸配列のエピトープと相互作用する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列のエピトープと相互作用する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
抗体を、検出可能に標識する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
標識を、酵素、蛍光物質、化学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯化剤よりなる群から選択する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
生物学的試料中の少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一のＣｏｌｏＵｐ２の量を検出することを更に含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項９８】
生物学的試料中の少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、予め決めた標準と比較する、請求項７５に記載の方法。
【請求項９９】
生物学的試料中の少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、被験者の過去の基準線と比較する、請求項７５に記載の方法。
【請求項１００】
少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、被験者が結腸腺腫又は結腸癌を有することがありそうであることを示す、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０１】
少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、結腸新生物形成を有する患者に施すべき治療プロトコールの決定を助成する、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０２】
被験者が、以前に、結腸癌と診断されたことのない、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０３】
被験者が、以前に結腸癌の治療を受けたことがあり又は現在受けており、少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在が、被験者が、再発した又は持続性の又は進行性の結腸癌を有することを示す、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０４】
結腸新生物形成が、結腸腺腫である、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０５】
結腸新生物形成が、結腸癌である、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０６】
結腸新生物形成が、転移性結腸癌である、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０７】
生物学的試料中で、少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び少なくとも一の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを検出することを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０８】
生物学的試料中の結腸新生物形成の少なくとも一の分子マーカーを検出するためのキットであって、下記を含む当該キット：
ａ）分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド又は分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドのエピトープと相互作用する抗体；及び
ｂ）使用指示書。
【請求項１０９】
抗体が、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド及び配列番号２１のポリペプチドの内から選択するポリペプチドのエピトープと相互作用する、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
抗体を、検出可能に標識する、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１１】
本質的に、配列番号２１の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列よりなる精製されたポリペプチド。
【請求項１１２】
本質的に、配列番号２１の配列と少なくとも９８〜９９％同一であるアミノ酸配列よりなる、請求項１１１に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１１３】
本質的に、配列番号２１のアミノ酸配列からなる、請求項１１１に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１１４】
第一のポリペプチドドメイン及び第二のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第一のポリペプチドドメインが、本質的に配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列よりなる当該融合タンパク質。
【請求項１１５】
第二のポリペプチドドメインが、検出用ドメイン、精製用ドメイン及び抗原性ドメインよりなる群から選択するドメインである、請求項１１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１１６】
本質的に、配列番号２１のアミノ酸配列よりなるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１１７】
ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに、１０-6Ｍ未満の解離定数で結合する、請求項１１６に記載の抗体。
【請求項１１８】
モノクローナル抗体である、請求項１１６に記載の抗体。
【請求項１１９】
血液試料中のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出に有効である、請求項１１６に記載の抗体。
【請求項１２０】
結腸新生物形成に由来する細胞を含む試料中のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出に有効である、請求項１１６に記載の抗体。
【請求項１２１】
請求項１１８に記載のモノクローナル抗体を生成する方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な量のＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与し；
(ｂ)抗体産生細胞をそのマウスから得て、その抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得；
(ｃ)それらの抗体産生ハイブリドーマを試験して好適なハイブリドーマを同定し、その好適ハイブリドーマは、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり；
(ｄ)ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する好適ハイブリドーマ細胞培養物を培養し；そして
(ｅ)その培養物から、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を得る。
【請求項１２２】
抗体産生ハイブリドーマを試験することが、抗体産生ハイブリドーマが、酵素結合免疫吸着アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅアッセイ及び免疫沈降アッセイよりなる群から選択するアッセイにおいて、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに結合する抗体を産生するかどうかを試験することを含む、請求項１２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
結腸直腸癌(ここでは、結腸癌とも呼ぶ)は、米国の成人の癌による第二位の死亡原因である。毎年、１３５，０００人と見積もられる新たな結腸癌患者が出現している。多くの結腸癌の人々が亡くなっているが、初期ステージの結腸癌は、しばしば、患部組織の外科的除去(切除術)によって治療することができる。外科的治療は、化学療法剤と組み合わせて、ある種の結腸癌において一層高い生存率を達成することができる。しかしながら、転移性(末期)結腸癌の患者における５年生存率は、５％以下に落ちる。
【０００２】
適当な治療的介入と結合させた患者の有効なスクリーニング及び早期の同定は、結腸癌死亡数を減少させることが判明している。７４，０００，０００人の年配の米国人が、結腸癌及び前癌性結腸腺腫(腺腫と結腸癌を合わせて、結腸新生物と呼ぶ)についての定期的スクリーニングの恩恵に浴するであろうということが見積もられている。しかしながら、結腸新生物のスクリーニングのための現在のシステムは、不十分なものである。例えば、便潜血試験は、患者の大便試料を血液の存在について試験することを含む。この試験は、比較的簡単であり且つ安価であるが、しばしば、結腸新生物を検出し損ない(低い感度)、しばしば、血液が大便中で検出された場合でも、結腸新生物が存在しない(低い特異性)。可撓性のＳ状結腸鏡による検査は、結腸の下三分の一を視覚的に調べるために短い結腸鏡の直腸内への挿入を含む。Ｓ状結腸鏡は比較的短いので、それは、比較的単純な診断方法でもある。しかしながら、全結腸新生物の殆ど半分は、結腸の上側部分で生じ、それは、Ｓ状結腸鏡では見ることはできない。結腸鏡検査(結腸鏡が、結腸の全長を通る)は、患者の結腸新生物の検出のための非常に信頼性のある方法であるが、費用がかかり、時間を浪費して、患者の鎮静を必要とする。
【０００３】
現代分子生物学は、ある種の生理的状態と特異的に関連するタンパク質及び核酸を同定することを可能にした。これらの分子マーカーは、妊娠からウイルス(例えば、ＨＩＶ)感染に及ぶ様々な健康状態の診断に大変革を起こした。
【０００４】
研究者は一般に、健康状態に関する分子マーカーを、ある健康状態と他の健康状態(例えば、妊婦と妊娠してない女性)とで異なるレベルで発現される遺伝子及びタンパク質を探すことにより同定する。この研究を遂行するための伝統的な方法例えばノーザンブロット及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応は、研究者が、一握りの潜在的分子マーカーだけを一度に研究することを可能にする。マイクロアレイ(数百又は数千の遺伝子転写物の検出のための数百又は数千のプローブの規則正しいアレイよりなる)は、研究者が、多くの潜在的分子マーカーについて、単一実験で、データを集めることを可能にする。現在、研究者は、大量のマイクロアレイにより生成された遺伝子発現データによって、種々の健康状態を区別する分子マーカーとしての本当の利用でありうる遺伝子を同定するように変えることの挑戦に直面している。
【０００５】
大量の遺伝子発現データにおいて高品質の候補の分子マーカーを同定するための改良されたシステムは、かかるツールの力の錠を開けて、結腸新生物などの重要な病気の分子マーカーを同定する見込みを増大させることを助成することができる。結腸新生物の有効な分子マーカーは、潜在的に、結腸新生物の診断、治療及び全体的な健康への影響に大変革を起こしうるものである。
【０００６】
発明の概要
この出願は、少なくとも部分的に、結腸新生物の有用な分子マーカーの選択に基づいている。結腸新生物は、正常な健康な組織から、前癌性結腸腺腫の発生へ、結腸癌の一層浸潤性の段階例えばデュークスＡ及びデュークスＢ段階へ、及び最終的な結腸癌の転移段階例えばデュークスＣ及びデュークスＤ段階への進行を含む多段階過程である。
【０００７】
一面において、この出願は、結腸新生物の検出又は診断において有用な分子マーカーを提供する。ある具体例において、この出願に記載した分子マーカーは、正常な被験者を結腸新生物が発生していることがありそうな者又は結腸腺腫を有することがありそうな者から区別するのに有用である。他の面において、この発明は、正常又は前癌性の被験者を、結腸癌を有する者から区別するのに有用でありうる分子マーカーを提供する。他の具体例において、この出願は、患者における結腸癌の段階を決めるのを助成するマーカーを提供する。更に別の具体例において、この出願は、結腸新生物の検出、診断及び段階決定ための少なくとも一種のここに記載の分子マーカーの利用を企図する。
【０００８】
一面において、この出願は、結腸新生物を指示する少なくとも一種の分子マーカー例えばＣｏｌｏＵｐ１−ＣｏｌｏＵｐ８及びオステオポンチンの増大したレベルと関係する病気について、患者をスクリーニングする方法を提供する。好適具体例において、この出願は、患者を、分泌されるマーカー例えばＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２と関連する病気について、生物学的試料中で、ＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２の量を検出して、該患者において見出されるＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２の量を次の少なくとも一つと比較することによってスクリーニングする方法を提供する：予め決めた基準、該患者に由来する正常試料中で検出されるＣｏｌｏＵｐ１若しくはＣｏｌｏＵｐ２の量、患者の、ＣｏｌｏＵｐ１若しくはＣｏｌｏＵｐ２の過去の基準線レベル、又は異なる正常な患者(対照用の患者)において検出されるＣｏｌｏＵｐ１若しくはＣｏｌｏＵｐ２のレベル。予め決めた基準より高い患者におけるＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２のレベル又は患者の過去の基準線より増大したの検出又はＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２のレベルの検出は、結腸新生物などの病気を指示する。ある面において、ＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２の量の、患者の過去の基準線と比較しての増大は、新たな新生物を示すか、又は既存の新生物の進行を示す。同様に、ＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２の量の、患者の過去の基準線と比較しての減少は、既存の新生物の退行を示す。
【０００９】
一面において、ここに記載したこれらの分子マーカーは、配列番号４〜１２の核酸配列と、一層好ましくは配列番号４〜５に示した配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％又は９９．７％同一の核酸配列によってコードされる。他の面において、この出願は、配列番号４〜１２の核酸配列と一層好ましくは配列番号４〜５に示した核酸配列と高緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるマーカーを提供する。
【００１０】
他の面において、この出願は、結腸新生物の診断となる分子マーカーを提供し、該マーカーは、配列番号１〜３又は１３〜２０に示したアミノ酸配列と、一層好ましくは配列番号３及び１４に示したアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％又は９９．７％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００１１】
一面において、この出願は、生物学的試料中のＣｏｌｏＵｐ１−ＣｏｌｏＵｐ８ポリペプチドの選択したポリペプチド型又はオステオポンチンを検出する方法を提供する。他の面において、この出願は、ここに記載のマーカーＣｏｌｏＵｐ１〜ＣｏｌｏＵｐ８の何れか一つへの抗体のターゲティングによる結腸新生物のイメージング方法を提供し、好適具体例において、これらの抗体は、ＣｏｌｏＵｐ３を標的とする。ある面において、この出願は、ターゲティング部分と活性部分とを含むイメージング剤を投与する方法を提供する。このターゲティング部分は、抗体、Ｆab、Ｆ(ab)2、一本鎖抗体又は他の結合剤(配列番号１〜３及び１３〜２０に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド配列により特定されるエピトープと相互作用するもの)であってよい。活性部分は、放射性テクネチウム、放射性インジウム、又は放射性ヨウ素などの放射性剤であってよい。このイメージング剤は、ヒトなどの哺乳動物における診断用途に有効な量で投与され、次いで、該イメージング剤の局在化及び蓄積が検出される。このイメージング剤の局在化及び蓄積は、放射性シンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法又は陽電子放射断層撮影法によって検出することができる。
【００１２】
好適具体例において、この出願は、配列番号１〜３の一つに示したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法を提供する。当業者には明らかであろうが、これらのここに記載の分子マーカーは、多くの方法で例えば様々なアッセイ(抗体ベースのアッセイを含む)によって検出することができる。抗体ベースのアッセイの例には、免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)が含まれる。ここに記載の分子マーカーは、抗体を用いないアッセイにより、例えば、二次元ゲル電気泳動法を用いる方法、質量分析を用いる方法、適当な酵素活性のアッセイを用いる方法などによって検出されうる。好適具体例において、この出願は、血液、血液画分(例えば、血清又は血漿)、尿又は大便試料中の選択したマーカー例えばＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを検出する方法を提供する。これらのマーカーの増大したレベルは、多くの病気例えば結腸新生物(結腸腺腫、結腸癌、及び転移性結腸癌を含む)と関連しうる。ある面において、この出願は、結腸新生物を示す少なくとも一種のマーカーの検出を含む方法例えばＣｏｌｏＵｐ１とＣｏｌｏＵｐ２の両方を検出する方法を提供する。更に別の面において、ＣｏｌｏＵｐマーカーの組合せ、例えば、生物学的試料を選択したマーカー例えばＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２について試験することを、膜貫通マーカー例えばＣｏｌｏＵｐ３をイメージング剤の標的として試験することと組み合せて含む試験の組合せは、有用でありうる。
【００１３】
更に別の面において、この出願は、患者が、結腸癌を発生することがありそうか又は前癌性結腸腺腫を有することが一層ありそうかどうかを、配列番号１〜３に示した分子マーカーの存否を検出することにより決定する方法を提供する。これらのマーカーの組合せの検出も又、結腸新生物の段階決定において有用である。
【００１４】
更に別の面において、この出願は、正常及び前癌性患者を結腸癌を有する患者から区別するのに有用なマーカーを提供する。ある具体例において、この出願は、ここに与えたＣｏｌｏＵｐ１〜ＣｏｌｏＵｐ８及びオステオポンチンなどのマーカーのレベルを測定することを企図する。一面において、ＣｏｌｏＵｐ６及びオステオポンチンなどのマーカーは、正常であり又は前癌性結腸腺腫を有する患者の範疇と結腸癌を有する患者の範疇とを区別するのに役立つ。他の面において、この出願は、結腸新生物の段階の決定において、少なくとも一つの該マーカーの検出を与える。
【００１５】
ある面において、この発明は、配列番号１〜３及び１３〜２０に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの何れか一つの、一層好ましくは、配列番号１〜３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの何れか一つの、生物学的試料中における存在を測定するための免疫アッセイを提供する。この方法は、生物学的試料を得ること、及び該試料を、配列番号１〜３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的な抗体と接触させること、及びその抗体の結合を検出することを含む。
【００１６】
幾つかの面において、この出願は、生物学的試料例えば血液(血清又は血漿などの血液画分を含む)における分子マーカーの検出方法を提供する。例えば、患者から得られた血液試料を、更に、血清を得るための分画などによって処理することができ、その後、該血清をあるポリペプチドについて富化させることができる。そのように富化させた血清を、次いで、所望のマーカーポリペプチドのエピトープと反応性の抗体と接触させる。
【００１７】
更に別の具体例において、この出願は、患者のための適当な治療用プロトコールを決定する方法を提供する。例えば、結腸新生物の検出は、治療する内科医に、大規模な又は侵襲的なプロトコール例えば結腸鏡検査、外科手術又は化学療法が効果的な診断又は治療に必要かどうかの決定において価値ある情報を提供する。かかる検出は、以前に結腸新生物と診断されてない患者についてのみならず、患者が以前に結腸癌の治療を受け又は現在受けている場合にも、ここに示したこれらの分子マーカーの存否又はレベルの変化は、その患者が、再発した若しくは進行した又は持続的な結腸癌を有することことを示しうる。
【００１８】
ある面において、この出願は、結腸新生物の分子マーカー例えばＣｏｌｏＵｐ１〜ＣｏｌｏＵｐ８を提供する。ある例においては、これらのマーカーは、分泌されるタンパク質例えばＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２及びオステオポンチンであり、結腸新生物の検出及び診断に有用である。他の面において、これらのマーカーは、膜貫通タンパク質例えばＣｏｌｏＵｐ３であってよく、イメージング剤の標的(例えば、新生物細胞を標識するための標的)として有用でありうる。
【００１９】
一面において、この出願は、配列番号１〜３に示したアミノ酸配列又は配列番号１３〜２０に示したアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％又は９８〜９９％同一のアミノ酸配列を有する単離され、精製され又は組み換えられたポリペプチドを提供する。一層好適な具体例において、この出願は、配列番号３又は１４に示したアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８〜９９％、９９．３％、９９．５％又は９９．７％同一であるアミノ酸配列を提供する。この出願は又、ここに記載したＣｏｌｏＵｐタンパク質を異質タンパク質と融合させて含む融合タンパク質をも提供する。ある具体例において、かかるポリペプチドは、例えば、抗体の生成に有用であり、又は候補の治療剤を同定するスクリーニングアッセイでの利用に有用である。
【００２０】
他の面において、この出願は、配列番号１〜３及び１３〜２０に示したポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。一面において、この出願は、配列番号４〜１２に、一層好ましくは４〜５に示した核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８〜９９％、９９．３％、９９．５％又は９９．７％同一である核酸配列を含む核酸を提供する。ここでは、配列番号４〜１２に、一層好ましくは配列番号４〜５に示した核酸配列を含むベクター、及び該核酸配列を発現する宿主細胞も又、企図される。
【００２１】
他の面において、この出願は、配列番号１〜３及び１３〜２０又はこれらの部分により一層好ましくは配列番号１〜３又はこれらの部分により特定されるエピトープと相互作用する抗体を提供する。好適具体例において、この抗体は、結腸腺腫の検出に有用であり、配列番号１〜３の一つにより特定されるエピトープと相互作用する。ある面において、この出願は、かかる抗体の生成を与え、モノクローナル及びポリクローナル抗体を生成する方法並びに他の型の抗体を生成する方法を包含する。他の面において、この出願は、配列番号１〜３及び１３〜２０により、一層好ましくは配列番号１〜３、又はこれらの部分により特定されるエピトープと相互作用する抗体を産生することのできるハイブリドーマ細胞系統をも提供する。更に別の具体例において、この抗体は、一本鎖抗体であってよい。
【００２２】
更に別の具体例において、この出願は、生物学的試料において結腸新生物を検出するためのキットを提供する。かかるキットには、配列番号１〜３及び１３〜２０の一つにより特定されるエピトープと、一層好ましくは配列番号１〜３の一つにより特定されるエピトープと相互作用することのできる少なくとも一種の抗体が含まれる。一層好適な具体例において、これらの抗体は、例えば、酵素、蛍光物質、化学ルミネセント物質、発色団、放射性同位元素又は錯化剤によって、検出可能に標識されうる。
【００２３】
ある具体例において、この出願は、イン・ビボで血清中に分泌され且つ培養腸細胞において頂端細胞表面及び基底外側細胞表面を横切って分泌されるＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの正体を与える。従って、ある具体例においては、この出願は、患者が結腸新生物を有することがありそうかどうかを検出する方法であって、ａ）該患者から生物学的試料を得；及びｂ）少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの内から選択する少なくとも一首のポリペプチドを検出することを含み、該少なくとも一種のポリペプチドの存在が結腸新生物を示す当該方法を提供する。
【００２４】
ある具体例において、分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドは、ａ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；ｂ）配列番号５の天然の変異体である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；ｃ）配列番号５の核酸配列と緊縮条件下でハイブリダイズする核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；ｄ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチド；及びｅ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチドの内から選択する。適宜、この分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドは、配列番号５の配列を有する核酸の発現により生成され、好ましくは、この分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドは、配列番号５の核酸配列と少なくとも９８％、９９％又は１００％同一である核酸配列の発現により生成された。ある具体例において、この分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドは、配列番号３及び配列番号２１の内から選択するアミノ酸配列と少なくとも９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。ある具体例において、この分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドは、ａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；ｂ）配列番号４の天然の変異体である核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；ｃ）配列番号４の核酸配列と緊縮条件下でハイブリダイズする核酸の発現により生成された分泌されるポリペプチド；ｄ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチド；及びｅ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有する分泌されるポリペプチドの内から選択する。適宜、この分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有する核酸の発現により生成される。好ましくは、この分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチドは、配列番号１及び配列番号２の内から選択するアミノ酸配列と少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。適宜、基底外側から分泌されるＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出につき、この生物学的試料は、血液試料又は血液に由来する画分(例えば、血清、血漿)、細胞、又は頂端から分泌されるＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドにつき富化させた画分である。適宜、基底外側から分泌されるＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出につき、この生物学的試料は、尿試料又は尿に由来する画分である。適宜、頂端から分泌されるＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出につき、この生物学的試料は、腸管の内壁及び／又は内腔に由来する(例えば、腸管の粘液又は他の液体、結腸内から取り出した排泄される大便)。ある具体例において、このポリペプチドは、抗体を用いるアッセイ例えば免疫沈降アッセイ、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)により検出される。適宜、アッセイは、生物学的試料を、分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド又は分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドと相互作用する抗体と接触させることを含む。抗体は、例えば、配列番号１及び配列番号２の内から選択するアミノ酸配列のエピトープと相互作用することができる。抗体は、例えば、配列番号３及び配列番号２１の内から選択するアミノ酸配列のエピトープと相互作用することができる。適宜、この抗体は、例えば、酵素、蛍光物質、化学ルミネセント物質、発色団、放射性同位元素又は錯化剤を用いて、検出可能に標識される。適宜、生物学的試料中の少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、予め決めてある標準(例えば、既知量の精製したＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチド)と比較する。適宜、生物学的試料中の少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの量を、患者の過去の基準線と比較する。ある具体例において、少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在は、その患者が結腸腺腫又は結腸癌を有することがありそうなことであることを示す。ある具体例において、少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在は、結腸新生物を有する患者に施与すべき治療プロトコールの決定に利用することができ、該患者は、以前に結腸癌と診断されていなくてよいし又は以前に結腸癌の治療を受けたことがあってもよいし若しくは現在受けていてもよく、少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び／又は少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの存在は、その患者が再発した又は持続的な若しくは進行した結腸癌を有することがありそうであることを示す。該分泌されるポリペプチドの検出は、患者における様々な新生物例えば結腸腺腫、結腸癌及び転移性結腸癌の存在を示す。適宜、方法は、少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド及び少なくとも一種の分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの両方を生物学的試料において検出することを含む。
【００２５】
ある具体例において、この出願は、生物学的試料において、少なくとも一種の結腸新生物の分子マーカーを検出するためのキットを提供する。キットは、ａ）分泌されるＣｏｌｏＵｐ１ポリペプチド又は分泌されるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドのエピトープと相互作用する抗体；及びｂ）使用指示書を含むことができる。適宜、この抗体は、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド及び配列番号２１のポリペプチドの内から選択するポリペプチドのエピトープと相互作用する。適宜、この抗体は、検出可能に標識される。
【００２６】
ある具体例において、この出願は、血清中で見出されるＣｏｌｏＵｐ２の部分である新規な精製されたポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは、本質的に、配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列よりなるものであってよい。「本質的に、・・・よりなる」とは、示されたアミノ酸配列以外に、様々な改変物(例えば、リン酸化、グリコシル化、ジスルフィド結合、異常な又は改変されたアミノ酸など)がありうるということを意味する。
【００２７】
ある具体例において、この出願は、第一のポリペプチドドメインと第二のポリペプチドドメインを含み、該第一のポリペプチドドメインが、本質的に、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列よりなる新規な融合タンパク質を提供する。該第二のポリペプチドドメインは、検出用ドメイン、精製用ドメイン及び抗原性ドメインよりなる群から選択するドメインであってよい。
【００２８】
ある具体例において、この出願は、本質的に配列番号２１のアミノ酸配列よりなるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ又は１０-9Ｍ未満の解離定数で結合することができる。この抗体は、本質的に、ポリクローナル、モノクローナル及び一本鎖抗体又は他の断片を含む任意の型の抗体であってよい。診断用途については、ヒト化抗体を有することには殆ど利益はないが、治療用途に関しては、ヒト化抗体は、大いに望ましい。好ましくは、診断用抗体は、血液、大便若しくは尿試料又はこれらの画分などの生物学的試料におけるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出について有効である。適宜、この抗体は、結腸新生物に由来する細胞を含む試料におけるＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドの検出に有効である。この出願は、更に、様々な方法で、かかる抗体を製造する方法を提供する。例えば、モノクローナル抗体は、(ａ)検出可能な免疫応答を刺激するのに有効なＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを含むある量の免疫原性組成物をマウスに投与すること；(ｂ)抗体産生細胞をそのマウスから得て、該抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること；(ｃ)該抗体産生ハイブリドーマを試験して好適なハイブリドーマを同定すること(該好適ハイブリドーマは、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである)；(ｄ)ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する好適ハイブリドーマ細胞培養物を培養すること；及び(ｅ)該細胞培養物から、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることを含む方法で製造することができる。適宜、これらの抗体産生ハイブリドーマは、これらの抗体産生ハイブリドーマが、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに結合する抗体を産生するかどうかを、酵素結合免疫吸着アッセイ、ビアコアアッセイ及び免疫沈降アッセイよりなる群から選択するアッセイにおいて試験することを含む。
【００２９】
本発明のこれらの具体例及び実施、他の具体例、及びそれらの特徴及び特性は、下記の説明、図面及び請求の範囲から明らかとなるであろう(該請求の範囲のすべては、この要約に組み込まれる)。
【００３０】
図面の簡単な説明
図１は、分泌されるＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１及び２)を示している。Ａ. Ｎ末端シグナルペプチドは、完全長ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸３０〜３１の間で開裂される。Ｂ. Ｎ末端シグナルペプチドは、完全長ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸３３〜３４の間で開裂される。
図２は、分泌されるＣｏｌｏＵｐ２タンパク質のアミノ酸配列(配列番号３)を示している。
図３は、ＣｏｌｏＵｐ１の核酸配列(配列番号４)を示している。
図４は、ＣｏｌｏＵｐ２の核酸配列(配列番号５)を示している。
図５は、オステオポンチンの核酸配列(配列番号６)を示している。
図６は、ＣｏｌｏＵｐ３の核酸配列(配列番号７)を示している。
図７は、ＣｏｌｏＵｐ４の核酸配列(配列番号８)を示している。
図８は、ＣｏｌｏＵｐ５の核酸配列(配列番号９)を示している。
図９は、ＣｏｌｏＵｐ６の核酸配列(配列番号１０)を示している。
図１０は、ＣｏｌｏＵｐ７の核酸配列(配列番号１１)を示している。
図１１は、ＣｏｌｏＵｐ８の核酸配列(配列番号１２)を示している。
図１２は、完全長ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１３)を示している。
図１３は、完全長ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１４)を示している。
図１４は、完全長オステオポンチンタンパク質のアミノ酸配列(配列番号１５)を示している。
図１５は、完全長ＣｏｌｏＵｐ３タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１６)を示している。
図１６は、完全長ＣｏｌｏＵｐ４タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１７)を示している。
図１７は、完全長ＣｏｌｏＵｐ５タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１８)を示している。
図１８は、完全長ＣｏｌｏＵｐ６タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１９)を示している。
図１９は、完全長ＣｏｌｏＵｐ８タンパク質のアミノ酸配列(配列番号２０)を示している。
図２０は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ１発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ１発現レベルのグラフ表示である。
図２１は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ２発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ２発現レベルのグラフ表示である。
図２２は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したオステオポンチン発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したオステオポンチン発現レベルのグラフ表示である。
図２３は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ３発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ３発現レベルのグラフ表示である。
図２４は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ４発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ４発現レベルのグラフ表示である。
図２５は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ５発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ５発現レベルのグラフ表示である。
図２６は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ６発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ６発現レベルのグラフ表示である。
図２７は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ７発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ７発現レベルのグラフ表示である。
図２８は、異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ８発現レベルのグラフ表示である。Ａ．正常な結腸上皮片、正常な肝臓及び結腸筋肉；Ｂ．前癌状態の結腸腺腫並びにデュークスステージＢ、デュークスステージＣ及びデュークスステージＤの結腸癌；Ｃ．結腸癌の肝臓転移物；Ｄ．結腸癌細胞株、無胸腺マウスにおいて成長した結腸癌異種移植片、ＭＳＩ細胞株及びＴＧＦβで処理したＶ３３０細胞株におけるマイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ８発現レベルのグラフ表示である。
図２９は、正常な結腸組織と結腸癌細胞株又は組織におけるＣｏｌｏＵｐ１ｍＲＮＡのレベルのノーザンブロット分析を示している。Ａ．正常な結腸組織試料及び一群の結腸癌細胞株；Ｂ．及びＣ．正常な結腸組織及び結腸癌を有する１５の個体及び結腸腺腫を有する１個体からの結腸新生物におけるＣｏｌｏＵｐ１ｍＲＮＡのレベルのノーザンブロット分析を示している。
図３０は、トランスフェクトされたＦＥＴ細胞及びＶａｃｏ４００細胞におけるＴ７エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質レベルの検出を示している。Ａ．Ｖ４００細胞成長培地におけるエピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の分泌のノーザンブロットによる検出(「Ｔ」は、エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１発現ベクターでトランスフェクトしたものであり、「Ｃ」は、空の対照用ベクターでトランスフェクトしたものである)；Ｂ．トランスフェクトされたＦＥＴ細胞及びＶ４００細胞におけるＴ７エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の発現のウエスタンブロットによる検出(左パネル)、及び成長培地におけるエピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の分泌の連続する免疫沈降及びウエスタンブロットによる検出(右パネル)（細胞抽出物の積載量：
ＦＥＴ＝７５ｍｇ／ウェル；Ｖ４００＝３１．１ｍｇ／ウェル；免疫沈降に用いた培地の容積＝２０ｍｌの内の１ｍｌ）。
図３１は、正常な結腸組織試料及び結腸癌細胞株の群におけるＣｏｌｏＵｐ２ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示している(上側パネル)。下側パネルは、該ブロットに対応するエチジウムブロミド染色したゲルを示している。
図３２は、トランスフェクトされたＳＷ４８０細胞及びＶａｃｏ４００細胞におけるＶ５エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質レベルの検出を示している(トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後)。トランスフェクトされた細胞におけるエピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の発現のウエスタンブロットによる検出(右パネル)、及び成長培地におけるエピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の分泌の連続する免疫沈降及びウエスタンブロットによる検出(左パネル)。
図３３は、正常な結腸組織及び結腸癌細胞株の群におけるＣｏｌｏＵｐ５ｍＲＮＡレベルの２つのノーザンブロット分析を示している(上側パネル)。下側パネルは、該ブロットに対応するエチジウムブロミド染色したゲルを示している。
図３４は、ヒト、マウス及びラットのＣｏｌｏＵｐ５(ＦｏｘＱ１)アミノ酸配列のアラインメントを示している。
図３５は、ヒト、マウス及びラットのＣｏｌｏＵｐ５(ＦｏｘＱ１)アミノ酸配列のアラインメントを示している。
図３６は、抗Ｖ５抗体により検出されたＶ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質のウエスタンブロットを示している。レーン１：空の発現ベクターでトランスフェクトしたＳＷ４８０結腸癌細胞からの培地上清。レーン２：ＣｏｌｏＵｐ２−Ｖ５を発現する細胞からの培地上清。レーン３：サイズマーカー。レーン４は、レーン１に対応する対照用ＳＷ４８０細胞を異種移植されたマウス由来の血清のアッセイを示している。レーン５及び６は、レーン２に示したＣｏｌｏＵｐ２−Ｖ５を発現するＳＷ４８０結腸細胞に由来するヒト結腸癌異種移植片を有する二匹のマウスの血液中を循環するＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の検出を示している。ＣｏｌｏＵｐ２は、８５ＫＤの大きさのタンパク質とそれに伴う５５ＫＤの大きさのタンパク質として分泌される。
図３７は、Ｖ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の、抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロットを示している。レーン１：空の発現ベクターでトランスフェクトしたＳＷ４８０結腸癌細胞からの培地上清。レーン２：ＣｏｌｏＵｐ１−Ｖ５を発現するＳＷ４８０細胞からの培地上清。レーン３は、レーン１に対応する対照用ＳＷ４８０細胞を異種移植されたマウスの血清のアッセイを示している。レーン４は、レーン２に示したＣｏｌｏＵｐ１−Ｖ５を発現するＳＷ４８０細胞に由来する腫瘍異種移植片を有するマウスの血液中の循環するＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の検出を示している。レーン５：サイズマーカー。
図３８は、上段パネルにおいて、ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の精製を示している。示されているのは、２５０ｎｇ(レーン２ａ)及び５００ｎｇ(レーン３ａ)のクーマシーブルー染色した精製ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質調製物である。サイズマーカーは、レーン１ａである。下段パネルにおいては、示されているのは、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上のＨｉｓタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の精製を示すクーマシーブルー染色したゲルである。レーン１：マーカー、レーン２擬似トランスフェクトした細胞からの培地、レーン３ＣｏｌｏＵｐ１トランスフェクト細胞からの培地の精製。明らかに示されているのは、１８０ｋｄＣｏｌｏＵｐタンパク質の均質への精製である。
図３９は、上段パネルにおいて、Ｖ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の抗Ｖ５ウエスタンにおける検出を示している。レーン１：擬似トランスフェクトＣａｃｏ２細胞からの培地。レーン２：標準的培養皿で成長した一時的トランスフェクトＣａｃｏ２細胞からの選択したＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の検出。見られるのは、典型的な８５ＫＤと５５ＫＤの分泌されたバンドである(このレーンは、非常に過剰積載されており、少量の分解産物も可視化されている)。レーン３：分子量マーカー。レーン４〜７：トランスウェルフィルター上に単層として生育された一時的にトランスフェクトされたＣａｃｏ２の基底外側区画に分泌されたＣｏｌｏＵｐ２の検出。レーン９〜１２は、対応する頂端区画におけるＣｏｌｏＵｐ２の、４８時間の時点を除く一般的不在を示している。この表は、各時点で測定した電気抵抗及びトランスフェクション効率(ｇｆｐ発現)を示している。４８時間の時点における電気抵抗の下降は、その時点における単層の幾らかの漏れを示唆している。
図４０：上段パネルは、Ｖ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の抗Ｖ５ウエスタンにおける検出を示している。対照用レーンは、精製された組換えＣｏｌｏＵｐ１の検出を示している。頂端及び基底外側区画の両方から１〜４日目に収穫された培地(レーンＤ１〜Ｄ４)において同じバンドが示されている。この表は、各時点で測定した電気抵抗及びトランスフェクション効率(ｇｆｐ発現)を示している。
図４１は、ＣｏｌｏＵｐ２の顕著な分泌及び血清型であるＣｏｌｏＵｐ２の約５５ｋＤａのＣ末端断片のアミノ酸配列を示している。
【００３１】
詳細な説明
１．定義：
便宜のために、この明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いるある種の用語をここに集めた。別途定義しない限り、ここで用いるすべての技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００３２】
本願では、単数形で記載したものでも、一つ又は一つより多く(即ち、少なくとも一つ)を指す。例えば、「エレメント」は、一つのエレメント又は一つより多くのエレメントを意味する。
【００３３】
用語「腺腫」、「結腸腺腫」及び「ポリープ」は、ここでは、結腸の任意の前癌性新生物を記載するために用いる。
【００３４】
用語「抗体」は、ここで用いる場合、例えば何れかのイソ型(ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど)の全抗体を包含することを意図しており、且つその断片(これらも、脊椎動物例えば哺乳動物のタンパク質と特異的に反応性)を含む。抗体は、慣用の技術を利用して断片化することができ、且つそれらの断片は、関心ある用途及び／又は特定のエピトープとの相互作用についてスクリーニングすることができる。従って、この用語は、ある種のタンパク質と選択的に反応することのできる抗体分子のタンパク質分解により開裂させたセグメント又は組換えにより調製した部分を包含する。かかるタンパク質分解及び／又は組換え断片の非制限的例には、Ｆab、Ｆ(ab')２、Ｆab'、Ｆｖ及びペプチドリンカーで結合されたＶ[Ｌ]及び／又はＶ[Ｈ]ドメインを含む一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)が含まれる。このｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するように共有結合又は非共有結合によって結合することができる。この用語抗体は又、ポリクローナル、モノクローナル又は他の抗体の精製した調製物及び組換え抗体をも包含する。
【００３５】
用語「結腸」は、ここで用いる場合、右側結腸(盲腸を含む)、横行結腸、左側結腸及び直腸を包含することを意図している。
【００３６】
用語「結腸直腸癌」及び「結腸癌」は、ここでは交換可能に、結腸(上で定義したように、直腸を含む)の任意の癌性新生物を指すために用いる。
【００３７】
用語「ＣｏｌｏＵｐＸ」(例えば、ＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２・・ＣｏｌｏＵｐ８)は、ＣｏｌｏＵｐタンパク質をコードする核酸又はＣｏｌｏＵｐタンパク質自体を指すために、並びにかかる核酸及びタンパク質の区別できる断片、区別できる断片又は完全長の核酸若しくはポリペプチドを含む一層長い核酸及びポリペプチド、及びこれらの変異体を指すために用いる。変異体は、この出願で言及している関連するヒトＣｏｌｏＵｐ配列番号と少なくとも９０％同一であるポリペプチド、及びかかる変異体ポリペプチドをコードする核酸を包含する。加えて、変異体は、異なる翻訳後修飾例えばグリコシル化、メチル化などを包含する。特に好適な変異体は、任意の天然の変異体例えばアレルの異なるもの、新生物に生じる突然変異及び分泌され又はプロセッシングを受けた型を包含する。用語「変異体」及び「断片」は、重複している。
【００３８】
ここで用いる場合、語句「遺伝子発現」又は「タンパク質発現」は、試料中に存在する遺伝子転写物又はタンパク質の量に関する任意の情報並びに遺伝子若しくはタンパク質が作られ又は蓄積し又は分解される速度に関する情報を包含する(例えば、レポーター遺伝子のデータ、核流出実験からのデータ、パルスチェースデータなど)。ある種のデータは、遺伝子及びタンパク質発現の両方に関係すると見ることができる。例えば、細胞内のタンパク質レベルは、タンパク質のレベル並びに転写のレベルを反映しており、かかるデータは、語句「遺伝子又はタンパク質発現情報」に包含されるものである。かかる情報は、細胞当たりの量、対照用遺伝子又はタンパク質に対する量(ユニットレス測定)などの形態で与えられうる(用語「情報」は、如何なる代表的な特定の意味にも限られず、関連情報を与える任意の表示を意味するものである)。用語「発現レベル」は、遺伝子又はタンパク質発現データに反映された又は該データから導き出せる量を指す(該データが、遺伝子転写物の蓄積又はタンパク質の蓄積又はタンパク質合成速度などに向けられていても)。
【００３９】
用語「検出」は、ここでは、生物学的試料中のマーカーを観察する任意の過程を指すために用いる(マーカーが実際に検出されるか否かによらない)。換言すれば、マーカーについて、試料をプローブで検査する作用が、たとえそのマーカーが存在しないと測定され又は感度レベル未満と測定されても、「検出」である。検出は、定量的、半定量的又は非定量的観察であってよい。
【００４０】
用語「健康な」、「正常な」及び「非新生物性」は、ここでは、ＣｏｌｏＵｐ遺伝子の増大した発現と関係する病気例えば新生物のまったくない(少なくとも検出の限界内においてまったくない)被験者又は特定の細胞若しくは組織を指すために交換可能に用いる。これらの用語は、ここでは、しばしば、結腸の組織及び細胞に関して用いる。従って、この出願の目的に関して、重い心臓病を有するがＣｏｌｏＵｐ関連疾患を有しない患者は、「健康な」患者と呼ばれる。
【００４１】
用語「含む」は、ここで用いる場合、語句「含むが、それらに限られない」という意味で用い、該語句と交換可能に用いる。
【００４２】
ここで用いる場合、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド例えばデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及び適宜リボ核酸(ＲＮＡ)を指す。この用語は又、ヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡ又はＤＮＡの類似体、及び、記載した具体例に適用可能であれば、一本鎖(例えば、センス又はアンチセンス)及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むとも理解されるべきである。
【００４３】
用語「又は」は、ここでは、文脈上明確にに別の指示がない限り、用語「及び／又は」を意味するように用いられ、該用語と交換可能に用いられる。
【００４４】
用語「パーセント同一」は、２つのアミノ酸配列の間の又は２つのヌクレオチド配列の間の配列同一性を指す。同一性は、比較目的のために整列させることのできる各配列中の位置を比較することによって各々決定することができる。比較する配列中の同等の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められるならば、それらの分子は、その位置で同一であり；同等の部位が同じ又は類似のアミノ酸残基(例えば、立体的及び／又は電気的性質が類似)で占められるならば、それらの分子は、その位置で相同(類似)であるということができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較される配列に共有される位置の同一又は類似アミノ酸の数の関数と呼ばれる。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含む様々なアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムが、用いられうる。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析用パッケージ(ウィスコンシン大学、ウィスコンシン、Madison在)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルトセッティングを利用して使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (米国立衛生研究所、メリーランド、Bethesda在)を介して利用可能である。一具体例において、２つの配列の同一性パーセントは、１のギャップウェイトを利用してＧＣＧプログラムにより決定することができる(例えば、各アミノ酸ギャップを、２つの配列間で単一のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチがあるかのように計る)。
【００４５】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ここでは、交換可能に用いる。
【００４６】
用語「精製タンパク質」は、好ましくは、細胞又は細胞溶解物中で通常結合している他のタンパク質から単離された(或は、実質的にそれらを含まない)タンパク質の調製物を指す。用語「実質的に他の細胞性タンパク質を含まない」(「実質的に他の夾雑タンパク質を含まない」ともいう)は、２０％(乾量)未満の、好ましくは５％未満の夾雑タンパク質を含む各成分タンパク質の個別の調製物を包含するとして定義される。各成分タンパク質の機能型は、精製調製物として、添付の実施例において、クローン化遺伝子を利用して調製することができる。「精製した」とは、再構成タンパク質混合物を生成するのに用いる成分タンパク質調製物に言及する場合に、同一の分子が、他の生物学的巨大分子例えば他のタンパク質(特に、他の、これらの成分タンパク質の性質を、精製調製物として又は主題の再構成混合物におけるそれらの機能において、実質的にマスクし、減じ、混乱させ又は変化させうるタンパク質)の非存在下に存在することを意味する。用語「精製した」は、ここで用いる場合、好ましくは、少なくとも８０重量％(乾量)、一層好ましくは８５重量％の範囲、一層好ましくは９５〜９９重量％、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％の存在する同じ種類の生物学的巨大分子を意味する(但し、水、緩衝液、及び他の小分子特に分子量５０００未満の分子は存在してよい)。用語「純粋な」は、ここで用いる場合、好ましくは、すぐ上の「精製した」と同じ数値限界を有する。
【００４７】
「組換え核酸」は、組換えＤＮＡ技術によって、他の核酸と隣接して置かれた任意の核酸である。「組換え核酸」は又、実験室の遺伝学的技術例えばトランスフォーメーション及び組込み、トランスポゾンホッピング又はウイルス感染によって、第二の核酸と隣接して置かれた任意の核酸をも包含する。一般に、組換え核酸は、自然には、第二の核酸の隣に配置されない。
【００４８】
用語「組換えタンパク質」は、組換え核酸からの発現によって生成されたタンパク質を指す。
【００４９】
「試料」は、分子マーカーの検出のために得られ又は調製される任意の物質、又は分子マーカーの検出目的のために検出試薬若しくは検出装置と接触される任意の物質を包含する。
【００５０】
「被験者」は、関心ある任意の任意の生物、一般には、哺乳動物被験者、例えばマウス及び好ましくはヒトの被験者である。
【００５１】
２．概観
ある面において、この発明は、被験者が、結腸新生物を有することがありそうかどうかを決定する方法に関係する。他の面において、この発明は、患者が結腸癌を有することがありそうかどうかを決定する方法に関係する。更なる面において、この発明は、被験者の結腸新生物をモニターする方法に関係する。更なる面において、この発明は、被験者の結腸新生物の段階を決定する方法に関係する。結腸新生物は、結腸に位置する(又は由来する)任意の癌性又は前癌性の成長物である。結腸は、約３フィート長の、小腸の末端から直腸まで伸びている腸管の一部である。横断面で見ると、結腸は、消化された物質が通過する内腔と呼ばれる内部空間を囲む同心環状に配置された４つの区別できる層からなっている。内腔から外側へ向かって順に、これらの層は、粘膜、粘膜下組織、粘膜固有筋層及び漿膜下層と呼ばれる。この粘膜は、上皮層(内腔に隣接する細胞)、基底膜、粘膜固有層及び粘膜筋板を含んでいる。一般に、結腸の「壁」は、粘膜下組織及び粘膜下組織の外側の層を指すことを意図している。
【００５２】
前癌性の結腸新生物は、腺腫又は腺腫性ポリープとして言及される。腺腫は、典型的には、結腸の内面上の小さいマシュルーム様又はいぼ様の成長物であり、結腸壁内へ侵入しない。腺腫は、結腸内視鏡又は可撓性Ｓ状結腸鏡などのデバイスによって可視化することができる。幾つかの研究は、腺腫のスクリーニング及びその除去を受ける患者が減少した結腸癌による死亡率を有することを示した。これ及び他の理由により、腺腫は多くの結腸癌の真の前駆体であるということが一般に受け入れられている。
【００５３】
結腸新生物が結腸の基底膜に侵入する場合、それは、結腸癌であると考えられ、用語「結腸癌」を用いる。結腸癌の記載において、この明細書は、一般にいわゆる「デュークス」結腸癌ステージシステムに従う。他のステージシステムが考案されており、選択した特定のシステムは、この開示の目的に関して、重要ではない。癌を記載する特徴は、認識可能なステージを記載するのに用いられる特定の用語より一層重要である。最も広く用いられているステージシステムは、一般に、次の特徴の少なくとも一つを利用する：腫瘍の結腸壁への侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；結腸壁及び隣接する他の組織への腫瘍の侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；局所リンパ節への腫瘍の侵入の程度(一層大きい侵入は、一般に、一層危険な腫瘍と相関する)；及び一層遠方の組織(例えば、肝臓)への転移浸潤の程度(一層大きい転移浸潤は、一般に、一層危険な病状と相関する)。
【００５４】
「デュークスＡ」及び「デュークスＢ」結腸癌は、結腸壁に侵入したけれど、他の組織にまで拡大していない新生物形成である。デュークスＡ結腸癌は、粘膜下組織を超えて侵入してない癌である。デュークスＢ結腸癌は、２つの群「デュークスＢ１」及び「デュークスＢ２」に細分される。「デュークスＢ１」結腸癌は、粘膜固有筋層まで侵入しているがそれを通過していない新生物形成である。デュークスＢ２結腸癌は、粘膜固有筋層を完全に突破した癌である。５年間にわたって、外科治療(即ち、患部組織の除去)を受けたデュークスＡの癌患者は、９０％を超える生存率を有する。同じ期間にわたって、外科治療を受けたデュークスＢ１及びュークスＢ２の癌患者は、それぞれ、８５％及び７５％の生存率を有する。デュークスＡ、Ｂ１及びＢ２の癌は又、それぞれ、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３−Ｔ４癌とも呼ばれる。
【００５５】
「デュークスＣ」結腸癌は、局所リンパ節(例えば、消化管のリンパ節)にまで拡大した癌である。外科治療を受けたデュークスＣの癌患者は、３５％の５年生存率を有するが、この生存率は、化学療法を受けた患者では、６０％に増大する。
【００５６】
「デュークスＤ」結腸癌は、他の器官に転移した癌である。肝臓が、転移した結腸癌が見出される最も一般的な臓器である。デュークスＤ結腸癌の患者は、治療養生法によらずに、５％未満の５年生存率を有する。
【００５７】
上に記載のように、適当な介入と結合させた、結腸新生物形成の初期の検出は、患者の生存率を増大させるために重要である。結腸新生物形成のスクリーニングのための現在のシステムは、特異性若しくは感度の欠如(例えば、便潜血試験、可撓性Ｓ状結腸鏡検査)又は医療資源(例えば、結腸鏡)の高いコストと集中的使用を含む様々な理由のために不十分である。結腸新生物形成の検出のための別のシステムは、広範囲の他の臨床状況にも有用であろう。例えば、結腸癌の外科的治療又は薬物治療を受ける患者は、再発を経験しうる。かかる患者が結腸新生物形成の再発を有するかどうかを測定する別のシステムを有することは有利であろう。更なる例として、別の診断システムは、結腸新生物形成を有することが知られた患者における結腸新生物の増大、減少又は残留をモニターすることを容易にするであろう。化学療法を受けている患者をモニターして、その療法の効力を評価することができる。
【００５８】
従って、ある具体例において、この発明は、結腸新生物形成の部分でない細胞(ここでは「健康な細胞」と呼ぶ)と結腸新生物形成(例えば、腺腫又は結腸癌)の部分である細胞(ここでは、「結腸新生物細胞」と呼ぶ)を区別する分子マーカーを提供する。ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２を含むこの発明のある種の分子マーカーは、腺腫、デュークスＡ、デュークスＢ１、デュークスＢ２及び肝臓の転移性結腸癌(肝臓転移)において、健康な結腸組織、健康な肝臓組織又は健康な結腸筋肉より有意に高いレベルで発現される。ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２を含むある種の分子マーカーは、結腸癌に由来する細胞株又は結腸癌細胞の性状を真似るように処理された細胞株において、有意に高いレベルで発現される。この発明の特に好適な分子マーカーは、健康な細胞と腺腫の細胞を区別するマーカーである。理論に拘束されることは望まないが、腺腫は、結腸癌の９０％より多くの真の前駆体であるので、健康な細胞と腺腫の細胞を区別するマーカーは、見かけ上健康な患者をスクリーニングしてその患者が結腸癌を発生する(かかり易い)増大した危険にあるかどうかを決定するために特に価値があるということは企図される。その上、特に好適な分子マーカーは、結腸新生物形成を有する動物の血清中に現実に存在するものであり、一般に、分泌されるタンパク質は、血管と接触している細胞又は血管と拡散性接触している区画から分泌される場合にのみ血清中に存在する。例えば、大きい又は進行した結腸癌から分泌されるタンパク質は、一般に、血流中に見出されるが、結腸腺腫から分泌されるタンパク質は、その細胞の基底外側面から分泌されない限り、血液中には存在しえない。尿中に出現する分子マーカーは、一般に、血液中に存在するポリペプチドに由来する。適宜、分子マーカーは、結腸の内腔内に存在するものであり(例えば、腸粘膜又は大便試料中に見出されうる)、かかるマーカーは、一般に、細胞の頂端面から分泌されるものである。
【００５９】
ある具体例において、この発明は、患者が、少なくとも一種のＣｏｌｏＵｐ核酸又はここに記載のタンパク質の増大した発現を特徴とする病気を有するか有しないかを決定するためのＣｏｌｏＵｐ分子マーカーを利用する方法を提供する。ある具体例において、この発明は、患者が結腸新生物形成を有することがありそうかどうかを決定する方法を提供する。更なる具体例において、この発明は、患者が再発を有するかどうか又は、患者の結腸新生物形成が治療に応答するかどうかを決定する方法を提供する。
【００６０】
３．結腸新生物形成の候補の分子マーカーを同定する方法
ある面において、この発明は、遺伝子発現データを、注意深く選択した基準を利用して分析した場合に、結腸新生物形成の強力な候補の分子マーカーを同定する見込みが極めて高いという観察に関係する。従って、ある具体例において、この発明は、遺伝子発現データを分析して、結腸新生物形成の候補の分子マーカーを同定するための方法及び基準を提供する。この発明の方法及び基準は、本質的に、任意の関連遺伝子発現データに適用することができるが、この発明の方法及び基準を利用する利益は、高度に並行的な遺伝子発現測定システム例えばマイクロアレイシステムにより生成された豊富なデータに適用した場合に、容易に明らかである。ヒトのゲノムは、約２０，０００〜１００，０００の異なる遺伝子転写物を生成することができると見積もられており、その内の数千は、発現レベルの、健康な細胞と結腸新生物形成細胞での変化を示すことができる。多量の遺伝子発現データを得ること及びこのデータを利用して数千の候補の分子マーカーを同定することは、比較的費用有効的である。しかしながら、候補の分子マーカーの同定から、関心ある健康状態についての有効な診断試験への進展には、有意の量の集中的実験が一般に必要とされる。事実、この出願の出願日現在、遺伝子発現データにより同定された単一の候補の分子マーカーから診断試験を生成するのに必要な資源は、商業的に価値があって臨床的に有用な診断薬を特定の状況で発現レベルの変化する数百又は数千の遺伝子のリストから抽出するのが本質的に不可能なほど大きい。従って、更なる研究のために少数(例えば、１０以下)の高品質の分子マーカーを選択できることの中にかなりの実際的値がある。
【００６１】
ある具体例において、結腸新生物形成の候補の分子マーカーは、肝臓転移結腸癌試料(「肝臓mets」)、正常(非新生物)結腸試料及び正常肝臓試料における遺伝子発現を比較することにより選択することができる。この具体例において、候補の分子マーカーは、正常結腸試料における発現レベル(試料セットを横切る中央発現レベルとして評価)の少なくとも４倍の肝臓metsにおける発現レベル(試料セットを横切る中央発現レベルとして評価)を有する遺伝子(及びそれらの遺伝子産物)である。その上、この具体例において、肝臓metsにおける発現の中間レベルは、正常肝臓試料における発現の中間レベルより大きくあるべきである。この具体例で用いた基準は、殆どの低い品質のマーカーを排除し且つ更に夾雑物を肝臓組織から排除する高い閾値を与える。
【００６２】
ある具体例において、結腸新生物形成の候補の分子マーカーは、正常結腸における遺伝子発現を、転移性結腸癌試料から培養された複数の異なる細胞株における遺伝子発現と比較することにより選択することができる。例えば、中間転移性結腸癌細胞株遺伝子発現は、Ｖａｃｏ結腸癌細胞株シリーズ(Markowitz, S.等、Science 268:1336-1338, 1995)例えば次の肝臓転移物由来の細胞株：Ｖ３９４、Ｖ５７６、Ｖ２４１、Ｖ９Ｍ、Ｖ４００、Ｖ１０Ｍ、Ｖ５０３、Ｖ７８６の８つの結腸癌細胞株の中間値として計算することができる。この基準を用いる具体例において、候補の分子マーカーは、試験した細胞株を横切る発現の、正常結腸組織より少なくとも３倍高い中間レベルを有する遺伝子(及びそれらの遺伝子産物)である。
【００６３】
ある具体例において、結腸新生物形成の候補の分子マーカーは、正常結腸における遺伝子発現を、無胸腺マウスで成長させた複数の結腸癌異種移植片(「異種移植片」)における遺伝子発現と比較することにより選択することができる。この基準を用いる具体例において、候補の分子マーカーは、正常結腸組織より少なくとも４倍高い、試験した異種移植片を横切る発現の中間レベルを有する遺伝子(及びそれらの遺伝子産物)である。
【００６４】
ある具体例において、結腸新生物形成の候補の分子マーカーは、正常結腸における最大の遺伝子発現を、肝臓metsにおける最小の遺伝子発現と比較することにより選択することができる。これらの具体例において、候補の分子マーカーは、少なくとも正常結腸における最大の遺伝子発現と等しい、肝臓metsにおける最小の遺伝子発現を有する遺伝子(及びそれらの遺伝子産物)である。その上、この具体例においては、肝臓metsにおける発現の中間レベルは、正常肝臓試料における発現の中間レベルより大きくあるべきである。
【００６５】
好適具体例において、結腸新生物形成の候補の遺伝子マーカーのリストは、先ず、正常結腸及び正常肝臓より４倍大きい、肝臓metsにおける中間発現を有する遺伝子のサブセットを同定することによって選択される。次いで、このサブセットを、更に、正常結腸より３倍大きい、結腸癌細胞株を横切る中間発現を有する遺伝子を同定することにより、最終リストまで狭める。適宜、特に好適なリストは、正常結腸における最大遺伝子発現以上の肝臓metsにおける最小遺伝子発現を有する遺伝子を更に選択することによって生成することができる。これらの好適具体例で生成された遺伝子の短いリストの遺伝子産物(例えば、タンパク質及び核酸)は、結腸癌の高品質な候補の分子マーカーのリストを構成する。
【００６６】
他の好適具体例において、結腸新生物形成の候補の分子マーカーのリストは、先ず、正常結腸及び正常肝臓より４倍大きい、肝臓metsにおける中間発現を有する遺伝子のサブセットを同定することにより選択することができる。次いで、このサブセットを、更に、正常結腸より９倍大きい、肝臓metsにおける中間発現を有する遺伝子を同定することによって狭める。次いで、このサブセットを、更に、正常結腸より４倍大きい、結腸癌細胞株を横切る中間発現を有する遺伝子を同定することによって、最終リストまで狭める。これらの好適具体例で生成された遺伝子の短いリストの遺伝子産物(例えば、タンパク質及び核酸)は、結腸癌の高品質な候補の分子マーカーのリストを構成する。
【００６７】
分子マーカーについて意図する用途の性質に依存して、前記の具体例の何れかについて更なる基準を加えることが望ましいであろう。ある具体例において、この発明は、患者を結腸新生物形成(腺腫及び結腸癌を含む)を有することがありそうかありそうでないかで類別するための候補の分子マーカーに関係し、これらの具体例においては、高品質の候補の分子マーカーが、腺腫及び肝臓metsの両方において(好ましくは、デュークスＡ、デュークスＢ１、デュークスＢ２及びデュークスＣを含む、他の結腸癌ステージにおいて)正常結腸と比較して増大した発現を有する遺伝子から発現される。ある具体例において、この発明は、患者を結腸癌(転移性及び非転移性の型を含む)を有することがありそうかありそうでないかで類別するための候補の分子マーカーに関係し、これらの具体例においては、高品質の候補の分子マーカーが、肝臓metsにおいて腺腫及び正常結腸と比較して増大した発現を有する遺伝子から発現される(好ましくは、デュークスＡ、デュークスＢ１、デュークスＢ２及びデュークスＣを含む他の結腸癌ステージにおいて増大した発現がある)。ある具体例において、この発明は、患者を転移性結腸癌を有することがありそうかありそうでないかで類別するための候補の分子マーカーと関係し、かかる具体例においては、非転移状態における発現は、候補の分子マーカーが転移性結腸癌を非転移性状態から区別することについて高品質でないことを示しうるということは注意されるが、他の結腸新生物形成における遺伝子発現(例えば、腺腫、デュークスＡ、デュークスＢ１、デュークスＢ２、デュークスＣ)との比較は、潜在的に有用であるが、必要ない。
【００６８】
その上、体液例えば血液における検出のために利用する分子マーカーに関係する具体例において、高品質の分子マーカーは、好ましくは、分泌されるタンパク質である。新生物形成の同定又はターゲティングに関係する具体例において、高品質の分子マーカーは、好ましくは、粘着性の部分を有し且つ新生物の細胞外面に露出しているタンパク質例えば有意の細胞外部分を有する膜貫通タンパク質である。
【００６９】
遺伝子発現データは、多くの公知の適当な技術の一つ以上を利用して集めることができ、それは、この明細書を考慮して、当業者に選択されうる。ある好適具体例において、遺伝子発現データは、高度に並行的なシステム(１００以上の遺伝子転写物の発現データの同時又はほぼ同時の収集を可能にするシステムを意味する)により集められる。典型的な高度に並行的なシステムには、しばしばマイクロアレイとマクロアレイに分けられるプローブアレイ(「アレイ」)が含まれ、マイクロアレイは、遥かに高密度の領域当たりの個々のプローブ種を有する。アレイは、一般に、遺伝子産物に配列において対応するプローブ(例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド)を既知の位置に結合させた面よりなる。これらのプローブは、例えば、合成オリゴマー、完全長ｃＤＮＡ、完全長より短いｃＤＮＡ、又は遺伝子断片であってよい。通常、マイクロアレイは、少なくとも１００の、一層好ましくは、５００、１０００、４０００又は一層多くの遺伝子産物に対応するプローブを有する。プローブは、小さいオリゴマー又は一層大きいポリマーであってよく、各転写物について、複数の重複する又はしないプローブがありうる。
【００７０】
マイクロアレイに接触させるべき核酸は、様々な方法で製造することができる。全ＲＮＡ及びポリ(Ａ)＋ＲＮＡを調製する方法は、周知であり、Sambrook等(前出)に一般的に記載されている。標識されたｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから、オリゴｄＴプライムされた又はランダムプライムされた逆転写によって調製することができ、これら両者は、当分野で周知である(例えば、Klug及びBerger, 1987, Methods Enzymol.152:316-325を参照されたい)。ｃＤＮＡは、標識ヌクレオチドの組込み又は合成後の標識によって標識することができる。好ましい標識は、蛍光標識である。
【００７１】
核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、標識された核酸の集団が、マトリクスに添付した適当な、相補的プローブと特異的にハイブリダイズするように選択する。最適のハイブリダイゼーション条件は、標識された核酸及び固定化されたポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの長さ(例えば、オリゴマー対２００塩基より大きいポリマー)及び型(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ)に依存する。特異的(即ち、緊縮)ハイブリダイゼーション条件のための一般的パラメーターは、Sambrook等(前出)及びAusubel等、1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interschience, New Yorkに記載されている(すべての目的のために、そっくりそのまま、援用する)。標識核酸のアレイへの非特異的結合は、アレイを多量の非特異的ＤＮＡで処理すること(いわゆる「ブロッキング」ステップ)により減らすことができる。
【００７２】
アレイ上の各位置についての蛍光放射などのシグナルが、一般に、記録され、定量されて、様々なコンピューターソフトウェアを利用して分析される。任意の一つの遺伝子産物についてのシグナルは、様々な異なる方法によって規格化することができる。アレイは、好ましくは、対照及び参照用プローブを含む。対照用プローブは、ハイブリダイゼーションが有効であったことを示すのに役立つ核酸である。参照用プローブは、一つの実験の結果を他のものに対して規格化して、多数の実験を定量的レベルで比較することを可能にする。参照用プローブは、典型的には、異なる細胞型を横切って及び／又は異なる培養条件を横切って、比較的一定レベルで発現される遺伝子に対応するように選択される。典型的な参照用核酸には、既知の発現レベルのハウスキーピング遺伝子例えばＧＡＰＤＨ、ヘキソキナーゼ及びアクチンが含まれる。
【００７３】
データ収集操作後に、そのデータを、典型的には、データ分析システムに伝える。データの分析を容易にするために、この装置からリーダーにより得られたデータを、典型的には、デジタルコンピューターを利用して分析する。典型的には、このコンピューターは、装置からのデータの受入れ及び蓄積のために並びに収集されたデータの分析及び報告のために適当にプログラムされる(例えば、バックグラウンドの減算、マルチカラーイメージのデコンボルーション、アーティファクトの弱化又は除去、制御が適当に行なわれたことの確認、シグナルの規格化、ハイブリダイズした標的の量を決定するための蛍光データの解釈、バックグラウンド及び単一塩基ミスマッチハイブリダイゼーションの標準化など)。かかるデータ分析システムに(又は、分離したコンピューターにより)採用することのできる様々な分析方法を記載した。
【００７４】
アレイを構築し又は利用するための多くの方法は、下記の参考文献に記載されている。Schena等、1995, Science 270:467-470；DeRisi等、1996, Nature Genetics 14:457-460；Shalon等、1996, Genome Res. 6:639-645；Schena等、1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10539-11286；Fodor等、1991, Science 251:767-773；Pease等、1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5022-5026；Lockhart等、1996, Nature Biotech 14:1675；米国特許第６，０５１，３８０号；６，０８３，６９７号；５，５７８，８３２号；５，５９９，６９５号；５，５９３，８３９号；５，６３１，７３４号；５，５５６，７５２号；５，５１０，２７０号；欧州特許第０ ７９９ ８９７号；ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９７／２９２１２；ＰＣＲ Ｎｏ．ＷＯ９７／２７３１７；欧州特許第０ ７８５ ２８０号；ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９７／０２３５７；欧州特許第０ ７２８ ５２０号；欧州特許第０ ７２１ ０１６号；ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９５／２２０５８。
【００７５】
様々な会社が、マイクロアレイ及びマイクロアレイのデータからある種の情報を抽出するためのソフトウェアを提供している。かかる会社には、Affymetrix (カリフォルニア、Santa Clara在)、GeneLogic (メリーランド、Gaithersburg在)及びEos Biotechnology Inc. (カリフォルニア、South San Francisco在)が含まれる。
【００７６】
上の議論は遺伝子発現データの収集のためのアレイの利用に集中しているが、かかるデータは又、この出願の故に当業者に公知の他の様々な方法によっても得ることができる。かかる方法には、Velculescu等、(1995) Science 270, 484-487に最初に記載された遺伝子発現のシリアル分析(ＳＡＧＥ)技術が含まれる。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)を利用することができ、特に、Ｔａｑｍａｎ(商標)蛍光プローブシステムなどの蛍光プローブシステムと組み合わせて利用することができる。多くのＲＴ−ＰＣＲ試料を、並行的ＰＣＲ増幅を行なうことによって(例えば、多重ＰＣＲにより)、同時に分析することができる。更なる技術は、ドットブロット分析及び関連する方法を包含する(例えば、G.A. Beltz等、Methods in Enzymology, 第100巻、Ｂ部、R. Wu, L. Grossman, K. Moldave編、Academic Press, ニューヨーク、第19章、第266-308頁、1985 参照)、ノーザンブロット及びイン・シトゥーハイブリダイゼーション(組織試料を直接プローブ検出する)。
【００７７】
遺伝子発現データの品質及び生物学的適切さは、遺伝子発現を得るのに用いる生物学的材料の品質によって有意に影響を受ける。好適具体例において、結腸新生物形成の候補の分子マーカーを同定するためのここに記載した方法は、同意の上でヒト患者から得て急速冷凍した組織試料を用いる。遺伝子発現分析の前に、その組織試料を、好ましくは、できるだけ多くの異質組織を、利用可能な道具を用いて、注意深く切り取ることにより調製する。換言すれば、結腸癌試料について、粘着性の非癌性組織は、可能な限り切り取るべきである。好適具体例において、健康な組織は、結腸新生物形成を有する被験者から得るが、該組織は、新生物形成に直接からんでいない組織である。
【００７８】
下記の実施例１は、高品質の分子マーカーを選択する方法の実施を説明し、ここに開示した基準を利用して、マイクロアレイ発現データから次のマーカーを選択した：ＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２、ＣｏｌｏＵｐ３、ＣｏｌｏＵｐ４、ＣｏｌｏＵｐ５、ＣｏｌｏＵｐ６、ＣｏｌｏＵｐ７及びＣｏｌｏＵｐ８。加えて、これらの選択基準を利用して同定したものに非常に類似した発現特性を有するとして、オステオポンチンを同定した。更なる実験(実施例参照)は、これらの分子マーカーが、４つの範疇：「分泌される」(ＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２及びオステオポンチン)、「膜貫通」(ＣｏｌｏＵｐ３)、「転写因子」(ＣｏｌｏＵｐ４、ＣｏｌｏＵｐ５)及び「その他」(ＣｏｌｏＵｐ６、ＣｏｌｏＵｐ７、ＣｏｌｏＵｐ８)に入るということを示した。更なる実験は又、ＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２、ＣｏｌｏＵｐ３、ＣｏｌｏＵｐ５及びＣｏｌｏＵｐ７が、概して、様々な結腸新生物形成(腺腫、デュークスＢ腫瘍、デュークスＣ腫瘍及び肝臓mets)において、健康な細胞よりも高レベルで発現されることを示した。加えて、更なる実験は、オステオポンチンが、結腸癌(デュークスＢ、デュークスＣ及び肝臓mets)において、腺腫及び正常結腸と比較して過剰発現されることを示した。
【００７９】
ある具体例において、血液若しくは尿試料などの体液試料又は排泄された試料例えば大便を用いる診断試験で使用するための好適な分子マーカーは、分泌されるタンパク質例えばＣｏｌｏＵｐ１タンパク質、ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質又はオステオポンチンタンパク質の分泌される部分である。
【００８０】
ある具体例において、結腸新生物形成のターゲティング又はマーキングを含む方法のための好適な分子マーカーは、ＣｏｌｏＵｐ３などの膜貫通タンパク質(特に、ＣｏｌｏＵｐ３の細胞外部分)である。膜貫通タンパク質は、新生物細胞に繋留されて且つ細胞外面に露出されるので、かかる方法には望ましい。
【００８１】
ある具体例において、結腸新生物形成を有することがありそうな被験者を、結腸新生物形成を有することがありそうでないものから区別するための診断試験において使用するのに好適な分子マーカーは、ＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２、ＣｏｌｏＵｐ３、ＣｏｌｏＵｐ４又はＣｏｌｏＵｐ５遺伝子の遺伝子産物である。適当な遺伝子産物の例には、分泌されるタンパク質及び分泌されないタンパク質及び転写物の両者が含まれる。分泌されないタンパク質(ＣｏｌｏＵｐ３、ＣｏｌｏＵｐ４及びＣｏｌｏＵｐ５など)を用いる具体例において、この診断試験の好適具体例は、結腸又は結腸新生物形成(転移性の場合には、必ずしも結腸に位置決めされない)から試料物質(例えば、大便)中に散らばった細胞におけるタンパク質又は転写物の存在についての試験である。分泌されるタンパク質例えばＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２を用いる具体例においては、診断試験の好適具体例は、尿若しくは血液などの体液又は大便などの排泄された物質中のタンパク質の存在についての試験である。しかしながら、細胞内タンパク質は、有意の細胞溶解又は幾つかの他の過程によって体液中に存在しうるということに注意すべきである。同様に、分泌されたタンパク質は、比較的低レベルであっても、それらが生成された細胞に対して粘着性であることはありそうなことである。
【００８２】
ある具体例において、結腸癌を有する被験者を、腺腫又は正常な結腸を有するものから区別するための好適な分子マーカーは、ＣｏｌｏＵｐ６及びオステオポンチン遺伝子の遺伝子産物である。分泌されるマーカータンパク質を好適に用いる具体例(体液試料を利用する試験など)において、好適マーカーは、分泌されるオステオポンチンタンパク質である。
【００８３】
ＣｏｌｏＵｐ１：
ヒトのＣｏｌｏＵｐ１核酸配列は、１３６１アミノ酸の完全長タンパク質をコードしている。シグナルＰ Ｖ１．１は、ヒトＣｏｌｏＵｐ１タンパク質が、Ｎ末端シグナルペプチドを有し、それは、アミノ酸３０〜３１(ＡＴＳ−ＴＶ)又はアミノ酸３３〜３４(ＴＶＡ−ＡＧ)間で開裂されるということを予言する。４つの潜在的なグリコシル化部位が、ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質において同定される。更に、ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質は、プロテインキナーゼＣ、ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼ、カゼインキナーゼＩＩ、及びチロシンキナーゼなどのキナーゼのための多数のセリン、スレオニン、及びチロシンリン酸化部位を有することが予想される。このＣｏｌｏＵｐ１タンパク質は、ヒトの膜貫通タンパク質２と相同な限界配列を共有する(Scott等、2000 Gene 246:265-74参照)。マウスのＣｏｌｏＵｐ１類似体は、既存のＧｅｎＢａｎｋデータベース中で同定され且つ中胚葉の発生とリンクされる(Wines等、2001 Genomics. 88-89；ヒトのＣｏｌｏＵｐ１と３６３／３９０(９３％)同一の１１７９ｂｐ核酸配列見出し項目についてのGenBank見出し項目ＡＡＧ４１０６２、ＡＹ００７８１５参照)。
【００８４】
ここに示したように、ＣｏｌｏＵｐ１は、腸管細胞の基底外側及び頂端面から分泌される。
【００８５】
ＣｏｌｏＵｐ２：
ＣｏｌｏＵｐ２核酸配列は、７５５アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。この出願は又、例えば、ヌクレオチド１１３ＧＣＣ→ＡＣＣ(Ａｌａ−Ｔｈｒ)；ｎｔ４８０ＧＡＡ→ＧＧＡ(Ｇｌｕ−Ｇｌｙ)；及びｎｔ２２２０ＣＡＧ→ＣＧＧ(Ｇｌｎ−Ａｒｇ)で認められたある種の多型をも開示する。ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の配列は、ＶＩ型コラーゲンアルファ３、イソ型２前駆体の配列と類似している。加えて、少数のドメイン、例えばフォン・ウィルブランド因子Ａ型ドメイン(ｖＷＦ)及びＥＧＦ様ドメインが、ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質中で同定されている。このｖＷＦドメインは、様々な血漿タンパク質例えば幾つかの補体因子、インテグリン、ある種のコラーゲン及び他の細胞外タンパク質中で見出される。ｖＷＦドメインを有するタンパク質は、リガンドの大きなアレイとの相互作用を含む多くの生物学的事象例えば細胞接着、移動、ホーミング、パターン形成、及びシグナル変換に関係する。約３０〜４０アミノ酸残基よりなるＥＧＦ様ドメインは、多くのタンパク質中で見出されている。ＥＧＦドメインの機能的重要性は、未だ明らかでない。しかしながら、一般的特徴は、これらのＥＧＦ様リピートは、膜結合タンパク質又は分泌されることの知られているタンパク質の細胞外ドメインにおいて見出されることである。
【００８６】
ここに示したように、ＣｏｌｏＵｐ２は、腸管細胞の頂端及び基底外側面の両方から分泌され、且つ血液中で、完全長の分泌された型とＣ末端断片(約５５ｋＤａ)２つの異なる型で見出されうる。
【００８７】
オステオポンチン：
オステオポンチン核酸配列は、３００アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。オステオポンチンは、酸性糖タンパク質であり、主として破骨細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、腎臓及び血管平滑筋細胞により生成される。サイトカインとして、オステオポンチンは、様々な癌による転移形成にかなり寄与することが知られている。加えて、それは、マクロファージのホーミング及び細胞性免疫に寄与し、新血管新生を媒介し、アポトーシスを阻害し、そして遊離のカルシウムのホメオスタシスを維持する(総説Weber GF. 2001 Biochim Biophys Acta.1552:61-85参照)。
【００８８】
ＣｏｌｏＵｐ３：
ＣｏｌｏＵｐ３核酸配列は、８２９アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。ＣｏｌｏＵｐ３は、文献中では、Ｐ−カドヘリン(又は、カドヘリン３、１型)と呼ばれている。Ｐ−カドヘリンは、Ｅ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンを含むカドヘリンファミリーに属する。Ｐ−カドヘリンは、胎盤及び重層扁平上皮で発現されている(Shimoyama等、1989 J Cell Biol.109:1787-94参照)が、正常結腸では発現されない。Ｐ−カドヘリンヌルマウスは、乳腺過形成、異形成、及び異常なリンパ浸潤を発生し(Radice等、1997 J Cell Biol.139:1025-32参照)、これは、正常なＰ−カドヘリン発現の喪失が、細胞及び腺の異常を引き起こすことを示している。Ｐ−カドヘリンは、炎症性及び異形成の結腸粘膜で異常発現され、付随性のＥ−カドヘリンのダウンレギュレーションを伴うということが示されている。最近、異所的Ｐ−カドヘリン発現が、結腸における過形成及び異形成トランスフォーメーションにおいて、初期事象として見出される(Hardy等、2002 Gut.50:513-514 参照)。
【００８９】
ＣｏｌｏＵｐ４：
ＣｏｌｏＵｐ４核酸配列は、６９４アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。ＣｏｌｏＵｐ４は、文献中では、ＮＦ−Ｅ２関連因子３(ＮＲＦ３)と呼ばれている。ＮＲＦ３は、他のＣＮＣタンパク質例えばＮＲＦ１及びＮＲＦ２と高度に相同性の塩基性領域−ロイシンジッパードメインを有する新規なＣａｐ’ｎ’カラー(ＣＮＣ)因子として同定されて特性決定された。これらのＣＮＣ因子は、小型のＭａｆタンパク質とのヘテロ二量体形成により、Ｍａｆ認識エレメント(ＭＡＲＥ)に結合する。イン・ビトロ及びイン・ビボ分析は、ＮＲＦ３がＭａｆＫとヘテロ二量体形成することができること及びこの複合体がニワトリのβグロビンエンハンサーにおいてＭＡＲＥと結合して転写を活性化することができることを示した。ＮＲＦ３ｍＲＮＡは、ヒト胎盤及びＢ細胞及び単球系統において高度に発現される(Kobayashi等、1999 J Biol Chem.274:6443-52参照)。
【００９０】
ＣｏｌｏＵｐ５：
ＣｏｌｏＵｐ５核酸配列は、４０２アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。ＣｏｌｏＵｐ５は、文献中では、ＦｏｘＱ１(Forkhead box, サブクラスｑ、メンバー１、以前は、ＨＦＨ−１として知られていた)と呼ばれている。ＦｏｘＱ１は、進化的に保存されたウイングドへリックス／フォークヘッド転写因子遺伝子ファミリーのメンバーである。このファミリーの特徴は、約１１０アミノ酸の保存されたＤＮＡ結合領域(ＦＯＸドメイン)である。ＦＯＸ遺伝子ファミリーのメンバーは、酵母からヒトに至る広範囲の生物体において見出される。ヒトのＦｏｘＱ１遺伝子は、胃、気管、膀胱、及び唾液腺などの種々の組織において発現される。ＦｏｘＱ１遺伝子は、組織特異的な遺伝子調節及び発生例えば胚発生、細胞周期調節、細胞シグナリング及び腫瘍形成において重要な役割を演じる。このＦｏｘＱ１遺伝子は、第６ｐ２３−２５染色体上に位置している。配列分析は、ヒトのＦｏｘＱ１が、マウスのＦｏｘｑ１遺伝子(以前のＨｆｈ−１Ｌ)及びラットのＦｏｘＱ１遺伝子(以前のＨｆｈ−１)の修正された配列と８２％の相同性を示すということを示している。マウスのＦｏｘＱ１は、サテンマウスにおける毛の分化を調節することが示された。このＤＮＡ結合性モチーフ(即ち、ＦＯＸドメイン)は、よく保存されており、ヒト、マウス及びラットにおいて１００％同一性を示す。ヒトのＦｏｘＱ１タンパク質の配列は、２つの推定の転写活性化ドメインを含み、それらは、対応するマウス及びラットのドメインと高いアミノ酸同一性を共有している(Bieller等、2001 DNA Cell Biol.20:555-61参照)。
【００９１】
ＣｏｌｏＵｐ６：
ＣｏｌｏＵｐ６核酸配列は、２０９アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。このＣｏｌｏＵｐ６タンパク質は、ケラチン２３のＣ末端部分(又はサイトケラチン２３、又はＩ型中間フィラメントサイトケラチン)と９９％の同一であり、従って、用語ＣｏｌｏＵｐ６は、２０９アミノ酸のタンパク質(及び関連する核酸、断片、変異体など)とGenBank見出し項目ＢＡＡ９２０５４．１のサイトケラチン２３のアミノ酸配列(及び関連する核酸、断片、変異体など)の両方を包含する。ケラチン２３ｍＲＮＡは、種々の膵臓癌細胞株において、酪酸ナトリウムに応答して高度に誘導されることが見出された。このケラチン２３タンパク質は、４２２アミノ酸を有し、中間体フィラメントの特徴的配列及びＩ型ケラチンに対する広範な相同性を有する。ケラチン２３は、ヒストンの過剰アセチル化を含む機構によって分化を受ける膵臓癌細胞において誘導される酸性ケラチンファミリーの新規なメンバーであるということが示唆される(Zhang等、2001 Genes Chromosomes Cnacer.30:123-35参照)。
【００９２】
ＣｏｌｏＵｐ７：
ＣｏｌｏＵｐ７核酸配列は、ＥＳＴ配列である。ＣｏｌｏＵｐ７遺伝子の機能に関する情報は、同定されていない。
【００９３】
ＣｏｌｏＵｐ８：
ＣｏｌｏＵｐ８核酸配列は、２７８アミノ酸の完全長タンパク質をコードする。ＣｏｌｏＵｐ８遺伝子に関しては、何の機能も示唆されていない。
【００９４】
従って、ある具体例において、この出願は、単離され、精製され又は組み換えられたＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２、ＣｏｌｏＵｐ３、ＣｏｌｏＵｐ４、ＣｏｌｏＵｐ５、ＣｏｌｏＵｐ６、ＣｏｌｏＵｐ７、ＣｏｌｏＵｐ８及びオステオポンチン核酸を提供する。ある具体例において、かかる核酸は、完全な又は部分的なＣｏｌｏＵｐポリペプチドをコードすることができ、又はかかる核酸は又、ＣｏｌｏＵｐ核酸を検出若しくは増幅する方法のために有用なプローブ若しくはプライマーであってよい。ある具体例において、ＣｏｌｏＵｐ核酸は、一本鎖又は二本鎖であり、天然の核酸、核酸類似体又はこれらの混合物よりなる。ある具体例において、この出願は、配列番号３〜１２の何れかの核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列(又は、その相補鎖)、及び適宜、配列番号３〜１２の何れかの核酸と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％又は１００％同一である核酸配列(又は、その相補鎖)を含む、単離され、精製され又は組み換えられた核酸を提供する。ある好適具体例において、この出願は、配列番号３〜１２の何れかの核酸と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％又は１００％同一である核酸配列(又は、その相補鎖)を含む、単離され、精製され又は組み換えられた核酸を提供する。ある具体例において、この出願は、単離され、精製され又は組み換えられた、配列番号１〜３又は１３〜２１の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列(又は、その相補鎖)、及び適宜、配列番号１〜３又は１３〜２１の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％又は１００％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列(又は、その相補鎖)を含む核酸を提供する。ある好適具体例において、この出願は、配列番号３、１４又は２１の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列(又は、その相補鎖)、及び適宜、配列番号３、１４又は２１の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％又は１００％同一であるポリペプチドをコードする核酸(又は、その相補鎖)を含む、単離され、精製され又は組み換えられた核酸を提供する。
【００９５】
更なる具体例において、この出願は、ＣｏｌｏＵｐ核酸を含む発現用構築物、ベクター及び細胞を提供する。発現用構築物は、発現可能な核酸(例えば、ＣｏｌｏＵｐ核酸)の適当な細胞型又はイン・ビトロ発現系における発現を可能にするようにデザインされた核酸構築物である。様々な発現用構築物システムが、この明細書を考慮して、当分野で周知であり、かかるシステムは、一般に、発現可能な核酸に操作可能に結合されたプロモーターを含む。このプロモーターは、多くのウイルス性プロモーターの場合のような構成的プロモーターであってもよいし、原核生物のｌａｃＩ抑制可能な、ＩＰＴＧ誘導可能なプロモーター及び真核生物のテトラサイクリン誘導可能なプロモーターのような条件付きプロモーターであってもよい。ベクターは、それが結合された他の核酸を、種々の細胞又はウイルス間で輸送することのできる任意の核酸を指す。一つの型のベクターは、エピソームである(即ち、プラスミドなどの染色体外で複製できる核酸)。エピソーム型のベクターは、典型的には、ベクターの宿主細胞中での複製を指示する複製起点を有する。他の型のベクターは、宿主細胞の遺伝物質と組換えを起こすようにデザインされた組込み型ベクターである。ベクターは、自律的に複製し及び組み込まれるものであってよく、ベクターの特性は、細胞状況に依って変化しうる(即ち、ベクターは、一の宿主細胞型においては自律的に複製し、他の宿主細胞型においては純粋に組込み型であってよい)。機能的に結合された遺伝子の発現を指示することのできるベクターは、ここでは、「発現ベクター」と呼ばれる。発現用構築物を有するベクターは、一般に、発現ベクターである。ベクターは、様々な細胞型用にデザインされてきた。例えば、細菌の大腸菌において一般的に用いられるベクターには、ｐＵＣプラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミド、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ及びＭ１３プラスミドが含まれる。昆虫細胞(例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１及びＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞)において一般的に用いられるベクターには、ＢａｃＰａｋ６(Clontech)及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ(Pharmingen)が含まれる(Clontech及びPharmingenは、共に、ニュージャージー、Franklin Lakes在、Becton,Dickinson and Co.の部門である)。哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、Ｖａｃｏ細胞及びヒトの胎児腎臓(ＨＥＫ)細胞)において一般的に用いられるベクターには、ｐＣＭＶベクター(Stratagene, Inc., カリフォルニア、La Jolla在)及びｐＲＫベクターが含まれる。ある具体例において、この出願は、ＣｏｌｏＵｐ核酸、特に組換えＣｏｌｏＵｐ核酸例えばＣｏｌｏＵｐ核酸を含む発現用構築物又はベクターを含む細胞を提供する。細胞は、予想される用途に応じて、真核又は原核細胞であってよい。原核細胞、特に大腸菌は、核酸、特にプラスミド又はウイルスベクター上で運ばれる核酸を貯蔵して複製するのに特に有用である。細菌細胞は又、核酸を発現させて多量の組換えタンパク質を生成させるのに特に有用であるが、細菌細胞は、通常、グリコシル化又は脂質修飾などの真核生物の翻訳後修飾を模倣せず、それ故、翻訳後修飾状態が重要であるタンパク質の製造に関しては、一層適合性が低い傾向がある。真核細胞、特に、バキュロウイルスベースの���ンパク質発現系により作動する昆虫細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞などの細胞型は、有意の翻訳後修飾を有する真核生物タンパク質の発現のための優れた系である。真核細胞は又、真核生物のタンパク質の機能の様々な面の研究のためにも有用である。例えば、結腸癌細胞株は、結腸癌におけるＣｏｌｏＵｐ遺伝子及びタンパク質の役割を研究するための優れたモデル系である。
【００９６】
ある面において、この出願は、更に、ＣｏｌｏＵｐポリペプチドの製造方法を提供する。一般に、かかる方法は、ＣｏｌｏＵｐポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を得ること、及びその細胞をＣｏｌｏＵｐポリペプチドの産生を引き起こす条件下で培養することを含む。この方法において産生されたポリペプチドは、適当な細胞又は培養画分から得ることができる。例えば、分泌されるタンパク質は、培養上清から最も容易に得ることができ、可溶性の細胞内タンパク質は、細胞溶解物の可溶性画分から最も容易に得られ、そして膜タンパク質は、膜画分から最も容易に得られる。しかしながら、各型のタンパク質は、一般に、３つすべての種類の細胞又は培養画分において見出されうる。粗細胞又は培養画分は、更なる精製手順にかけて、かなり精製されたＣｏｌｏＵｐポリペプチドを得ることができる。一般的な精製手順には、アフィニティー精製(例えば、ヘキサヒスチジンタグ付きポリペプチド)、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどが含まれる。
【００９７】
ある面において、この出願は、組換えの、単離された、実質的に精製された又は精製されたＣｏｌｏＵｐ１、ＣｏｌｏＵｐ２、ＣｏｌｏＵｐ３、ＣｏｌｏＵｐ４、ＣｏｌｏＵｐ５、ＣｏｌｏＵｐ６、ＣｏｌｏＵｐ７、ＣｏｌｏＵｐ８及びオステオポンチンポリペプチドを提供する。ある具体例において、かかるポリペプチドは、完全な又は部分的なＣｏｌｏＵｐポリペプチドをコードしうる。ある具体例において、ＣｏｌｏＵｐポリペプチドは、天然のアミノ酸、アミノ酸類似体、又はこれらの混合物よりなる。ＣｏｌｏＵｐポリペプチドは又、少なくとも一つの翻訳後修飾例えばグリコシル化、リン酸化、脂質化異変、アセチル化などをも含むことができる。ある具体例において、この出願は、配列番号１〜３又は３〜２１の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、適宜、配列番号１〜３又は３〜２１の何れかの核酸配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％又は９９．７％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された、実質的に精製された、精製された又は組換えのポリペプチドを提供する。ある好適具体例において、この出願は、配列番号３、１４又は２１の何れかの核酸と、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％又は９９．７％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された、実質的に精製された、精製された又は組換えのポリペプチドを提供する。ある好適具体例において、この出願は、配列番号３、１４又は２１とは４アミノ酸以下の置換、付加又は欠失により異なるアミノ酸配列を含む、単離された、実質的に精製された、精製された又は組換えのポリペプチドを提供する。適宜、この発明のポリペプチドは、追加の部分例えば追加のポリペプチド配列又は特定の機能を有する他の追加の化合物例えば組換えポリペプチドの抗体による検出を容易にするエピトープタグ、精製を容易にする精製用部分(例えば、アフィニティー精製による)、イン・ビボ若しくはイン・ビトロでのポリペプチドの検出を容易にする検出用部分、抗体産生を容易にするようにポリペプチドの抗原性を増大させる抗原性部分を含む。しばしば、単一部分が、多数の機能性を提供する。例えば、エピトープタグは、そのエピトープを認識する抗体は、アフィニティー精製手順でも利用できるので、一般に、精製をも助成する。一般に用いられるエピトープタグの例は、ＨＡタグ、ヘキサヒスチジンタグ、Ｖ５タグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＦＬＡＧタグ、エンテロキナーゼ開裂部位タグ及びＴ７タグである。一般に用いられる精製用部分には、ヘキサヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメイン、セルロース結合ドメイン及びビオチンタグが含まれる。一般に用いられる検出用部分には、蛍光タンパク質()、ビオチンタグ、及び色素産生／蛍光原酵素(例えば、β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼ)が含まれる。一般に用いられる抗原性部分には、カサガイヘモシアニン及び血清アルブミンが含まれる。これらの部分は、ポリペプチドである必要はないし、ポリペプチドと伝統的なペプチド結合により結合されている必要もないということに注意されたい。
【００９８】
４．抗体及びその利用
この発明の他の面は、ＣｏｌｏＵｐポリペプチドと特異的に反応する抗体、特に、ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドなどのＣｏｌｏＵｐポリペプチドと特異的に反応する抗体に関係する。例えば、ＣｏｌｏＵｐポリペプチドに由来する免疫原を利用することにより(例えば、ｃＤＮＡ配列に基づいて)、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を、標準的プロトコールによって作成することができる(例えば、Harlow及びLane編、A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: 1988)参照)。マウス、ハムスター又はウサギなどの哺乳動物は、免疫原形態のペプチド(例えば、抗体応答を誘出することのできるＣｏｌｏＵｐポリペプチド又は抗原性断片、又は融合タンパク質)を用いて免疫化することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与える技術には、キャリアーへの結合又は他の当分野で周知の技術が含まれる。ＣｏｌｏＵｐポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によりモニターすることができる。免疫原を抗原として用いる標準的ＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイを利用して、抗体のレベルを評価することができる。好適具体例において、主題の抗体は、哺乳動物のＣｏｌｏＵｐポリペプチドの抗原決定基(例えば、配列番号１〜３及び１３〜２１に、一層好ましくは配列番号１〜３又は２１に示したタンパク質の抗原決定基)について免疫特異的である。
【００９９】
一具体例において、抗体は、配列番号４〜５に示した核酸配列によりコードされる分泌されるタンパク質について特異的である。他の具体例において、これらの抗体は、配列番号１〜３及び１３〜２１(好ましくは、配列番号１〜３又は２１)に示したアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも一つのタンパク質と免疫反応性である。他の具体例において、抗体は、配列番号１〜３及び１３〜２１に示したアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも一つのタンパク質と免疫反応性である。一層好ましくは、この抗体は、配列番号１〜３又は２１に示したアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも一つのタンパク質と免疫反応性である。ある好適な具体例において、この発明は、配列番号３、１４又は２１のポリペプチドのＣ末端部分を含むエピトープに結合する抗体を提供する。ある好適具体例において、この発明は、結腸新生物形成を有する動物の血中で優勢なＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチド(配列番号３又は２１)のエピトープに結合する抗体を提供する。
【０１００】
動物をＣｏｌｏＵｐポリペプチドの抗原性調製物で免疫化した後に、抗ＣｏｌｏＵｐ抗血清を得ることができ、所望であれば、ポリクローナル抗ＣｏｌｏＵｐ抗体をその抗血清から単離することができる。モノクローナル抗体を製造するには、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫化した動物から収穫して、標準的な体細胞融合手順によって、不滅化細胞例えばミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成することができる。かかる技術は、当分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(最初、Kohler及びMilstein (1975) Nature, 256:495-497により開発された)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar等、(1983) Immunology Today, 4:72)、及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole等、(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. 77-96頁)が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、本発明の哺乳動物ＣｏｌｏＵｐポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養物からモノクローナル抗体を単離することができる。一具体例において、抗ヒトＣｏｌｏＵｐ抗体は、配列番号４〜１２を有する核酸によりコードされるタンパク質と特異的に反応し；一層好ましくは、これらの抗体は、配列番号４又は５を有する核酸によりコードされるタンパク質と、好ましくは、配列番号４又は５の配列を有する核酸の発現により生成される分泌されるタンパク質と特異的に反応する。
【０１０１】
用語抗体は、ここでは、主題のＣｏｌｏＵｐポリペプチドの一つとやはり特異的に反応するその断片を包含することを意図している。抗体は、慣用の技術を利用して断片化することができ、そしてそれらの断片を、全抗体について上記したのと同様にして有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab)2断片は、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。その結果生成したＦ(ab)2断片をジスルフィド橋を還元するように処理して、Ｆab断片を生成することができる。本発明の抗体は、更に、抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域により与えられるＣｏｌｏＵｐポリペプチドに対する親和性を有する、二官能性の、一本鎖の、及びキメラのヒト化された分子を包含することを意図している。好適具体例において、こ(れら)の抗体は、更に、それ(ら)に結合されて検出されうる標識(例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素補因子であってよい)を含む。
【０１０２】
ある好適具体例において、この発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、ある具体例においては、この発明は、新規な抗体を生成するための利用可能な方法を作成する。例えば、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドなどのＣｏｌｏＵｐポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、マウスに、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効なＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドを含むある量の免疫原性組成物を投与すること、そのマウスから抗体産生細胞(例えば、脾臓由来の細胞)を得て、それらの抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること、及びそれらの抗体産生ハイブリドーマを試験して、ＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定することを含みうる。一度得られれば、ハイブリドーマを、細胞培養で増殖させることができ、適宜、ハイブリドーマ由来の細胞がＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成することのできる培養条件で増殖させることができる。このモノクローナル抗体を、この細胞培養から精製することができる。
【０１０３】
抗ＣｏｌｏＵｐ抗体を利用して、前記の患者が結腸癌を発生することがありそうか又は結腸腺腫を有することが一層ありそうかどうかを測定し又は結腸新生物形成、結腸癌、転移性結腸癌及び結腸腺腫に苦しんでいる個体に対する所定の治療養生法の効力の測定を可能にするために、例えば、生物学的試料中のＣｏｌｏＵｐポリペプチドを検出し及び／又は個体中のＣｏｌｏＵｐポリペプチドレベルをモニターすることができる。ＣｏｌｏＵｐポリペプチドのレベルは、様々な種類の試料例えば細胞、大便及び／又は体液例えば全血液試料、血清、血漿及び尿において測定することができる。形容詞「特異的に反応性の」は、抗体に関して用いる場合、当分野で一般的に理解されているように、抗体が、関心ある抗原(例えば、ＣｏｌｏＵｐポリペプチド)と他の関心のない抗原との間で、十分に選択的であること、抗体が、少なくとも、特定の種類の生物学的試料中の関心ある抗原の存在の検出に有用であることを意味することを意図している。この抗体を用いるある方法においては、一層高度の結合特異性が望ましい。例えば、少なくとも一種の非常に多量の関心のないタンパク質の存在下で、少量の関心あるタンパク質の検出に用いる抗体は、関心ある抗原と他の交差反応性抗原との間で一層高度の選択性有するならば一層良好に機能しうる。モノクローナル抗体は、一般に(ポリクローナル抗体と比較して)、所望の抗原と交差反応性ポリペプチドとを効果的に識別する一層強い傾向を有する。加えて、一つの種類の生物学的試料(例えば、大便試料)中の関心ある抗原の選択的同定において有効である抗体は、他の種類の生物学的試料(例えば、血液試料)中の同じ抗原の選択的同定に対して同様に有効ではありえない。同様に、他の生物学的夾雑物が全くない精製されたタンパク質調製物中の関心ある抗原の同定に有効である抗体は、粗生物学的試料(血液又は尿試料など)中の関心ある抗原の同定において同様に有効ではありえない。従って、好適具体例において、この出願は、抗体の利用のために特に選択した試料型でありそうな試料中の関心ある抗原(特に、制限はしないが、ＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチド)に対する特異性を示した抗体を提供する。特に好適な具体例において、この出願は、結腸新生物形成を有する患者に由来する血液(適宜、血清又は血漿)からのタンパク質調製物中のＣｏｌｏＵｐ１又はＣｏｌｏＵｐ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体又は粗血液試料(適宜、粗血清又は血漿試料)中で特異的に結合する抗体を提供する。
【０１０４】
抗体：抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす一つの特性は、抗体の抗原に対する親和性である。所望の特異性が、種々の親和性の範囲で達成されえても、一般に好適な抗体は、約１０-6、１０-7、１０-8、１０-9以下の親和性(解離定数)を有する。
【０１０５】
加えて、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするのに用いる技術は、得られる抗体の特性に影響を及ぼしうる。例えば、ある種の治療目的のために用いられる抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的とすることができる。従って、この型の抗体を得るためには、関心ある抗原を発現する細胞に結合する抗体をスクリーニングすることが望ましいであろう(例えば、蛍光活性化セルソーティングにより)。同様に、抗体を、溶液中の抗原に結合させるために用いるならば、溶液結合を試験することが望ましいであろう。抗体：抗原相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、異なる様々な技術が利用可能である。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacore結合アッセイ、Bia-core AB、スウェーデン、Uppsala在)、サンドイッチアッセイ(例えば、IGEN International, Inc., メリーランド、Gaithersburg在の、常磁性ビーズシステム)、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ及び免疫組織化学が含まれる。
【０１０６】
本発明の抗ＣｏｌｏＵｐ抗体の他の応用は、ｇｔ１１、ｇｔ１８−２３、ＺＡＰ及びＯＲＦ８などの発現ベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングにある。正しい読み枠と向きで挿入されたコード配列を有するこの型のメッセンジャーライブラリーは、融合タンパク質を生成することができる。例えば、ｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列よりなり、カルボキシ末端が外来ポリペプチドよりなる融合タンパク質を生成するであろう。次いで、ＣｏｌｏＵｐポリペプチド(例えば、他の特定のタンパク質のオルトログ又は同じ種に由来する他のパラログ)の抗原性エピトープを、抗体を利用して検出することができる(例えば、感染プレートからリフトしたニトロセルロースフィルターを適当な抗ＣｏｌｏＵｐ抗体と反応させる)。このアッセイにより検出された陽性ファージを、次いで、感染プレートから単離することができる。こうして、ＣｏｌｏＵｐ同族体の存在を検出することができ、他の動物からクローン化することができる(ヒト由来のイソ型(スプライス変異体を含む)と交替できる)。
【０１０７】
５．患者における分子マーカーの検出方法
ある具体例において、この発明は、ここに記載のＣｏｌｏＵｐマーカーのタンパク質又は核酸転写物などの分子マーカーを検出する方法を提供する。ある具体例において、この発明の方法は、生物学的試料を用意すること及びその生物学的試料をＣｏｌｏＵｐマーカーの存在についてプローブ検査することを含む。次いで、ＣｏｌｏＵｐマーカーの存否及び適宜ＣｏｌｏＵｐマーカーの定量的レベルに関する情報を利用して、その生物学的試料の性質について推断することができ、もしその生物学的試料が被験者から得られたものであるならば、その被験者の健康状態を推断することができる。
【０１０８】
ここに記載の方法で用いるための試料は、本質的に、任意の関心ある生物学的試料であってよい。例えば、試料は、被験者からの組織試料、被験者からの液体試料、被験者からの固形若しくは半固形試料、被験者に由来する材料の一次細胞培養若しくは組織培養物、細胞株からの細胞、又は細胞若しくは組織培養物からの培地若しくは他の細胞外物質、又は異種移植片(第一の被験者例えばヒトに由来して、第二の被験者例えば免疫無防備マウスで培養された結腸癌の試料を意味する)であってよい。用語「試料」は、ここで用いる場合、被験者から直接得られた生物学的材料(一次試料と記載する)並びに一次試料の操作した形態又は部分の両方を包含することを意図している。例えば、ある具体例において、好適な液体試料は、血液試料である。この場合には、用語試料は、被験者から直接得られる血液のみならず、血液の画分例えば血漿、血清、細胞画分(例えば、血小板、赤血球、リンパ球)、タンパク質調製物、核酸調製物などをも包含することを意図している。試料は又、生物学的材料を外因性液体と接触させて、接触した生物学的物質のある部分を含む洗浄液を生成することにより得ることもできる。その上、用語「試料」は、少なくとも一種の添加物例えば防腐剤、キレート化剤、抗凝固因子などと混合した後の一次試料を包含することを意図している。ある具体例において、液体試料は、尿試料である。ある具体例において、好適な固形又は半固形試料は、大便試料である。ある具体例において、好適な組織試料は、結腸新生物形成を有するか又は有すると疑われた組織の生検材料である。ある具体例において、好適な細胞培養試料は、結腸癌細胞株(例えば、転移性結腸癌腫瘍から培養された細胞株、又は機能的ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βレセプター若しくはＴＧＦ−βシグナリング経路を欠く結腸由来の細胞株)の培養細胞を含む試料である。被験者は、好ましくは、ヒトの被験者であるが、ここに開示した分子マーカー及び特にそれらの同族体は、他の動物において同様に有用であることは予想される。ある具体例においては、マーカーを、生物学的材料の分離した部分を得ることなく、生物体内において直接検出することが可能でありうる。かかる事例においては、用語試料は、検出過程に含まれる試薬又は装置と接触される生物学的材料の部分を包含することを意図している。
【０１０９】
ある具体例において、この発明の方法は、試料中のＣｏｌｏＵｐタンパク質の存在を検出することを含む。適宜、この方法は、試料中のＣｏｌｏＵｐタンパク質の定量的尺度を得ることを含む。この明細書を考慮して、当業者は、タンパク質の存在を検出し、適宜、定量するために用いることのできる広範囲の技術を認識するであろう。好適具体例において、ＣｏｌｏＵｐタンパク質は、抗体を用いて検出される。適当な抗体は、以下の別の節に記載してある。多くの具体例において、抗体ベースの検出アッセイは、試料と抗体を接触させ、それで、抗体が、対応するエピトープを有するタンパク質と結合する機会を得るようにすることを含む。多くの具体例において、抗体ベースの検出アッセイは又、典型的には、抗体−エピトープ複合体の存在を検出し、それにより対応するエピトープを有するタンパク質の存在の検出を達成するためのシステムを含む。抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、免疫沈降、ウエスタンブロットを含む様々な検出技術において利用することができる。タンパク質を同定するための抗体に依存しない技術も又、用いることができる。例えば、質量分析法(特に、液体クロマトグラフィーと結合したもの)は、試料中の多数のタンパク質の検出及び定量を可能にする。二次元ゲル電気泳動法も又、タンパク質を同定するために利用することができ、質量分析法又は他の検出技術(Ｎ末端タンパク質配列決定法)と結合させることができる。関心あるタンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーも又、生成させて、検出試薬として利用することができる。
【０１１０】
ある好適具体例において、この発明の方法は、ＣｏｌｏＵｐタンパク質又はオステオポンチンの分泌される型の検出を含む(特に、ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質又はＣｏｌｏＵｐ２タンパク質)。
【０１１１】
試料は、一般に、用いる検出システムと一致する仕方で調製すべきである。例えば、タンパク質検出システムで用いる試料は、一般に、プロテアーゼの非存在下で調製すべきである。同様に、核酸検出システムで用いる試料は、一般に、ヌクレアーゼの非存在下で調製すべきである。多くの事例において、抗体ベースの検出システムにおいて用いるための試料は、実質的な準備ステップにかけられないであろう。例えば、尿は、唾液及び血液と同様に、直接、使用することができるが、血液は、ある好適具体例においては、血漿及び血清などの画分に分離される。
【０１１２】
ある具体例において、この発明の方法は、試料中のＣｏｌｏＵｐ発現された核酸例えばｍＲＮＡの存在を検出することを含む。適宜、この方法は、試料中でＣｏｌｏＵｐ発現された核酸の定量的尺度を得ることを含む。この明細書を考慮して、当業者は、核酸の存在を検出し、適宜、定量するために用いることのできる広範囲の技術を認識するであろう。核酸検出システムは、一般に、試料の精製された核酸画分を調製すること、及びその試料を直接的検出アッセイにかけ又は増幅工程とその後の検出アッセイにかけることを含む。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写酵素(ＲＴ)及び結合したＲＴ−ＰＣＲによって達成することができる。核酸の検出は、一般に、精製された核酸画分を、関心ある核酸にハイブリダイズするプローブを用いてプローブ検査することによって達成され、多くの事例において、検出は、増幅をも含む。ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲは、すべて、試料中の核酸を検出するための周知の方法である。
【０１１３】
ある具体例において、この発明は、ＣｏｌｏＵｐ核酸に特異的に結合する核酸プローブを提供する。かかるプローブは、例えば、蛍光性成分、放射性核種、酵素又はアフィニティータグ例えばビオチン成分により標識することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ(登録商標)システムは、核酸プローブを用いるが、該プローブは、溶液中に遊離している場合には蛍光シグナルが消え、一層大きい核酸に組み込まれるときに輝くという仕方で標識される。
【０１１４】
ある具体例において、この出願は、ここに記載したマーカーＣｏｌｏＵｐ１〜ＣｏｌｏＵｐ８又はオステオポンチンの何れか一つへの抗体(一層好ましくは、ＣｏｌｏＵｐ３を標的とする抗体)のターゲティングにより結腸新生物のイメージを得るための方法を提供する。ここに記載したマーカーは、モノクローナル抗体を利用して、その標的とすることができ、該モノクローナル抗体は、腫瘍の臨床イメージングのために放射性同位体により標識し又はそれらを破壊するための毒性剤によって標識することができる。
【０１１５】
他の具体例において、この出願は、ターゲティング成分と活性成分を含むイメージング剤を投与する方法を提供する。このターゲティング成分は、配列番号１〜３及び１３〜２１に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド配列により特定されるエピトープ(好ましくは、配列番号１６により特定されるエピトープ)と相互作用する抗体、Ｆab、Ｆ(Ab)２、一本鎖抗体又は他の結合剤であってよい。活性部分は、放射性剤例えば放射性重金属例えば鉄キレート化合物、ガドリニウム又はマンガンの放射性キレート化合物、酸素、窒素、鉄、炭素又はガリウムの陽電子エミッター、43Ｋ、52Ｆｅ、57Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、132Ｉ、又は99Ｔｃであってよい。このイメージング剤を、哺乳動物例えばヒトにおける診断用途に有効な量で投与し、次いで、そのイメージング剤の局在性と蓄積を検出する。このイメージング剤の局在性と蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法又は陽電子放射断層撮影法によって検出することができる。
【０１１６】
ＣｏｌｏＵｐマーカーに向けられたモノクローナル抗体を利用するイムノシンチグラフィーを利用して、結腸新生物形成を検出及び／又は診断することができる。例えば、99テクネチウム、111インジウム、125ヨウ素で標識したＣｏｌｏＵｐ３などのＣｏｌｏＵｐマーカーに対するモノクローナル抗体は、かかるイメージングに有効に利用することができる。当業者には明らかとなろうが、投与すべき放射性同位体の量は、放射性同位体に依存する。当業者は、投与すべき量のイメージング剤を、活性成分として用いる所定の放射性核種の比放射能及びエネルギーに基づいて、容易に配合することができる。典型的には、イメージング剤の投与量当たり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは、１〜１０ミリキュリー、最も多くは、２〜５ミリキュリーが投与される。従って、ターゲティング成分を放射性成分と結合して含む、イメージング剤として有用な本発明の組成物は、０．１〜１００ミリキュリーを含み、幾つかの具体例では、好ましくは１〜１０ミリキュリーを含み、幾つかの具体例では、好ましくは２〜５ミリキュリーを含み、幾つかの具体例では、一層好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【０１１７】
典型的具体例
この発明を今から一般的に記載するが、それは、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう(これらの実施例は、単に、本発明のある面及び具体例を説明することを目的とするものであり、この発明を制限することを意図したものではない)。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：結腸新生物形成の８つの分子マーカーの選択
発現マイクロアレイプロファイリングを利用して、正常結腸と転移性結腸癌とで発現が異なる遺伝子を見つけた。正常結腸及び転移性結腸癌の試料を、遺伝子発現について、約５０，０００の遺伝子、ＥＳＴ及び予想されるエキソンの発現パターンをプロファイルするＤＮＡ発現マイクロアレイ技術を利用して分析した。データの分析は、表２に示したように、８つの結腸新生物形成の分子マーカーを同定した。
【０１１９】
【表１】
2006512565.tif 000002
【０１２０】
オステオポンチンも又、類似の特性を有する分子マーカーとして同定した(例の配列、配列番号６、１５)。様々な種類の結腸新生物形成において、これらの分子マーカーの各々を、更なる分析にかけた。ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２の場合には、このマイクロアレイ発現は、ノーザンブロットにより確認され、タンパク質の分泌が確立された。
【０１２１】
実施例２：様々な細胞型におけるＣｏｌｏＵｐ１の発現パターン
図２０に、種々の組織試料について測定したＣｏｌｏＵｐ１の発現レベルのグラフ表示を示した。ＣｏｌｏＵｐ１転写物は、本質的に、正常結腸上皮片(結腸上皮と標示)、正常肝臓及び結腸筋肉(結腸筋肉と標示)において、検出不能(ＡＩ発現レベルが０未満)であった。対照的に、ＣｏｌｏＵｐ１発現は、前癌性腺腫並びにデュークスＢ(初期結節陰性結腸癌)、デュークスＣ(結節陽性結腸癌)、デュークスＤ(転移拡張を有する一次結腸癌)の９０％及び結腸癌肝臓転移物(肝臓転移と標示)において明確に検出された。ＣｏｌｏＵｐ１の発現は又、結腸癌細胞株(結腸細胞株と標示)において及び、無胸腺マウスにおいて成長させた結腸癌異種移植片(異種移植片と標示)においても示された。これらの細胞株及び異種移植片における発現は、結腸新生物細胞が腫瘍におけるＣｏｌｏＵｐ１発現の起源であることを確認した。
【０１２２】
ＣｏｌｏＵｐ１のプローブは、遺伝子ＫＩＡＡ１１９９、ＧｅｎｅＢａｎｋ見出し項目ＡＢ０３３０２５、Ｕｎｉｇｅｎｅ見出し項目Ｈｓ．５００８１に対応する転写物を認識するようにデザインした。この遺伝子に対応する転写物は、結腸癌細胞株Ｖａｃｏ−３９４からＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。この転写物の配列を、図３に示した。
【０１２３】
実施例３：ＣｏｌｏＵｐ１の確認された遺伝子発現パターン
図２９は、クローン化ＣｏｌｏＵｐ１ｃＤＮＡを利用するノーザン分析を示しているが、それは、リボソーム大型サブユニット(プローブが交叉ハイブリダイズする)の上方に泳動された転写物を同定しており、それは、正常結腸組織試料では発現されず、一群の結腸癌細胞株においては、遍在的に発現されている。
【０１２４】
図２９Ｂ及び２９Ｃは、正常結腸組織及び結腸癌を有する１５個体及び結腸腺腫を有する１個体に由来する結腸新生物におけるＣｏｌｏＵｐ１のノーザン分析の結果を示している。正常結腸試料は、ＣｏｌｏＵｐ１を発現していない。しかしながら、１５の結腸癌の内の１３において及び１つの結腸腺腫において、発現が見られる。発現は、右及び左の結腸の両方に発生した癌、及びデュークスステージＢ２、Ｃ及びＤの癌において見られる。
【０１２５】
実施例４：ＣｏｌｏＵｐ１は、分泌されるタンパク質である
クローン化したＣｏｌｏＵｐ１結腸転写物を、Ｃ末端Ｔ７エピトープタグと共に、ｃＤＮＡ発現ベクターに挿入した。図３０Ａは、このベクターのＶａｃｏ４００細胞へのトランスフェクションにより発現されたタグ付きタンパク質の振舞いの概要を示している。抗Ｔ７ウエスタンブロットは、トランスフェクトされた細胞のペレットの溶解物中で検出されたトランスフェクトされたタグ付きタンパク質の発現を示しており(細胞ペレットのレーンＴ)、これは、対照の空の発現ベクターをトランスフェクトされた細胞には存在しない(細胞ペレットのレーンＣ)。その上、Ｖ４００細胞が成長した培地(免疫沈降前に遠心分離により清澄化)からのＴ７タグ付きタンパク質の連続する免疫沈降及びウエスタンブロッティングも又、明らかに、ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の成長培地中への分泌を示している。
【０１２６】
図３０Ｂは、ウエスタン分析により示されたＶ４００細胞におけるタグ付き４０９０４１タンパク質の発現を示す完全なゲルを左に示しており、連続する免疫沈降及びウエスタン分析により検出された成長培地中の分泌された４０９０４１タンパク質を右に示している。(ＦＥＴ細胞を成長させた高レベルの血清からの抗体は、ＦＥＴ細胞からの成長培地中の４０９０４１に結合した抗Ｔ７を沈降させるｓｔａｐｈＡ結合ビーズの能力をブロックした)。
【０１２７】
実施例５：ＣｏｌｏＵｐ２の様々な細胞型における発現パターン
図２１には、分析した種々の試料について測定したＣｏｌｏＵｐ２の発現レベルのグラフ表示を示してある。ＣｏｌｏＵｐ２転写物は、本質的に、正常結腸上皮片(結腸上皮と標示)、正常肝臓及び結腸筋肉(結腸筋肉と標示)において、検出不能(ＡＩ発現レベルが０未満)であった。対照的に、ＣｏｌｏＵｐ２発現は、前癌性結腸腺腫並びにデュークスステージＢ(初期結節陰性結腸癌)、デュークスステージＣ(結節陽性結腸癌)、デュークスステージＤ(転移拡張を有する一次結腸癌)の９０％及び結腸癌肝臓転移物(肝臓転移と標示)において、明確に検出された。ＣｏｌｏＵｐ２の発現は又、結腸癌細胞株(結腸細胞株と標示)において及び、無胸腺マウスにおいて成長させた結腸癌異種移植片(異種移植片と標示)においても示された。これらの細胞株及び異種移植片における発現は、結腸新生物細胞が腫瘍におけるＣｏｌｏＵｐ２発現の起源であることを確認した。
【０１２８】
ＣｏｌｏＵｐ２のプローブは、非コードＥＳＴ、ＧｅｎｅＢａｎｋ見出し項目ＡＩ３５７４１２、Ｕｎｉｇｅｎｅ見出し項目Ｈｓ．１５７６０１に対応する転写物を認識するようにデザインした。５’ＲＡＣＥ、データベースアセンブリー、及び最終的にはＲＴ−ＰＣＲによって、我々は、結腸癌細胞株から、新規なタンパク質をコードするＲＮＡ転写物をクローン化した(その非コード３’ＵＴＲは、ＣｏｌｏＵｐ２特定化ＥＳＴに対応することが示された)。この完全長コード配列を、結腸癌細胞株Ｖａｃｏ５０３からＲＴ−ＰＣＲ増幅により決定し、配列を図４に与えた。
【０１２９】
ＣｏｌｏＵｐ２は、「クラス識別子」であり(即ち、それは、すべての結腸癌試料において、すべての正常結腸試料より高い)、それは、正常な身体組織では発現されず且つそれは、そのタンパク質産物が分泌されることを予言するシグナル配列(並びに、上皮成長因子タンパク質由来の及びフォン・ウィルブランドタンパク質由来のドメインを含む幾つかの他の認識可能なタンパク質モチーフ)を含んでいる。
【０１３０】
実施例６：ＣｏｌｏＵｐ２の確認された遺伝子発現パターン
図３１は、クローン化ＣｏｌｏＵｐ２ｃＤＮＡを利用するノーザン分析を示しているが、それは、リボソーム大型サブユニット(プローブが交叉ハイブリダイズする)の上方に泳動された転写物を同定しており、それは、正常結腸組織試料では発現されず、結腸癌細胞株の群の殆どにおいて、発現されている。図のパネルＡは、ノーザンハイブリダイゼーションを示している。赤い矢印は、ＣｏｌｏＵｐ２転写物を示している。各レーンの上には、試料名と記録されたＣｏｌｏＵｐ２発現のレベル(括弧内)を記してある。黒い矢印は、交叉ハイブリダイゼーションするリボソーム大型サブユニットを示している。パネルＢは、このブロットに対応するエチジウムブロミド染色したゲルを示しており、黒い矢印は、大型及び小型のリボソームサブユニットを示している。
【０１３１】
実施例７：ＣｏｌｏＵｐ２は、分泌されるタンパク質である
クローン化したＣｏｌｏＵｐ２結腸転写物を、Ｃ末端Ｖ５エピトープタグと共に、ｃＤＮＡ発現ベクターに挿入した。図３２は、このベクターのＳＷ４８０及びＶａｃｏ４００細胞へのトランスフェクションにより発現されたタグ付きタンパク質の振舞いの概要を示している。抗Ｖ５ウエスタンブロットは、トランスフェクトされた細胞のペレットの溶解物中で検出されたトランスフェクトされたタグ付きタンパク質(赤い矢印)の発現を示しており(溶解物ウエスタンパネル、ＣｏｌｏＵｐ２／Ｖ５と標示されたレーン)、これは、対照の空の発現ベクターをトランスフェクトされた細胞には存在しない(ｐｃＤＮＡ３．１と標示したレーン)。その上、Ｖ４００及びＳＷ４８０細胞が成長した培地(免疫沈降前に遠心分離により清澄化)からのＶ５タグ付きタンパク質の連続する免疫沈降及びウエスタンブロッティングも又、明らかに、ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の成長培地中への分泌を示している(培地ＩＰ−ウエスタンと標示したパネル)。免疫沈降に由来する抗体バンドも又、ＩＰ−ウエスタンブロット上に存在する。分泌されたＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の検出は、トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後の両方においてアッセイした細胞において示された。
【０１３２】
実施例８：ＣｏｌｏＵｐ３−ＣｏｌｏＵｐ８及びオステオポンチンの様々な細胞型における発現パターン
図２２〜２８には、ＣｏｌｏＵｐ３〜ＣｏｌｏＵｐ８及びオステオポンチンの、分析した種々の試料について測定した発現レベルのグラフ表示を示してある。
【０１３３】
実施例９：ＣｏｌｏＵｐ５の確認された遺伝子発現パターン
図３３は、ＣｏｌｏＵｐ５が結腸癌細胞株で発現されるが、非新生物材料においては発現されないことを示すノーザンブロットである。図３３は、正常結腸組織と一群の結腸癌細胞株におけるＣｏｌｏＵｐ５ｍＲＮＡレベルの２つのノーザンブロット分析を示している(上側パネル)。下側パネルは、このブロットに対応するエチジウムブロミド染色したゲルを示している。ＣｏｌｏＵｐ５の同族体は、マウス及びラットを含む他の哺乳動物において見出されており、配列アラインメントを図３４及び３５に示した。
【０１３４】
実施例１０：マウスの血中を循環する異種移植片由来のＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の検出
ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２タンパク質が、結腸新生物形成の有効な血清学的マーカーであることを測定するために、我々は、Ｖ５−エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２タンパク質を安定に発現して分泌するトランスフェクトされた細胞株を誘導した。これらの細胞株を、次いで、無胸腺マウスに注射して、腫瘍異種移植片として成長させた。マウスを犠牲にして、血清を得た。Ｖ５タグ付きタンパク質を、次いで、その血清から、抗Ｖ５抗体と結合したビーズを利用して沈降させた。沈降させた血清タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動して、ＨＲＰ結合した抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロッティングにより可視化した(それにより、如何なる夾雑マウス免疫グロブリンも排除される)。図３６は、マウス血清中の循環ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の検出を示している。ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質は、８５ＫＤ及び５５ＫＤの大きさの２つのバンドとして分泌され、その内の５５ＫＤのバンドが血清中で優勢である。この５５ＫＤのバンドは、おそらく、８５ＫＤのバンドのプロセッシングを受けた型であろう。この観察は、このマウスモデルにおいて、ＣｏｌｏＵｐ２が、実際、結腸癌及び腺腫の分泌されるマーカーであること及びＣｏｌｏＵｐ２が患者の血清に到達できて安定に循環することができるということを示している。この観察は、ＣｏｌｏＵｐ２のプロセッシングを受けた断片は、そのタンパク質の優勢な血清型であり、それ故、この部分を標的とする検出試薬は診断試験に特に適しているという驚くべき結果を与える。
【０１３５】
タイムコース実験は、ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質が、マウスの血液において、アッセイの最初、ＣｏｌｏＵｐ２を分泌する結腸癌細胞の注射の１週間後(異種移植片腫瘍の容積は、１００ｍｍ3だけである)に検出可能であることを示した。
同様の観察が、図３７に示したように、ＣｏｌｏＵｐ１についても為された。
【０１３６】
実施例１１：ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の精製
ネイティブなＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を開発するために、我々は、これらのタンパク質を発現するように加工されたＳＷ４８０細胞の培地上清からの組換えＨｉｓタグ付きＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース(QIAGEN)ニッケルビーズ上での精製のためのプロトコールを工夫した。現在、我々は、ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２の両方を、抗体生成のために十分な純度にまで精製した。図３８に示したように、精製したＣｏｌｏＵｐ２のクーマシーブルー染色したゲルは、８５ＫＤ及び５５ＫＤの大きさのバンドのみを示し、これは、ウエスタンブロット上で可視化されたタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質に対応する。同様に、精製したＣｏｌｏＵｐ１のクーマシーブルー染色したゲルは、その調製物が高度に精製されており、エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のウエスタンブロッティング上で示された大きさのバンドに完全に対応する単一の１８０ＫＤのバンドよりなることを示している。こうして、我々は、ＣｏｌｏＵｐ２及びＣｏｌｏＵｐ１を十分な均質性及び収量まで精製した。これらのタンパク質の、５０リットルの培地調製物からのスケールアップした精製は、２．５ｍｇのタンパク質を産出し、これは、ネイティブなＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２に特異的なモノクローナル抗体の開発のためにマウスを免疫化して融合上清をスクリーニングするのに十分なものを超えるであろう。
【０１３７】
実施例１２：ＣｏｌｏＵｐ１及びＣｏｌｏＵｐ２の頂端及び基底外側分泌の測定
我々は、ＣｏｌｏＵｐ２は、結腸癌のみならずやはりＣｏｌｏＵｐ２を発現する大きい結腸の腺腫の検出の血清学的マーカーとして役立つであろうということを予想した。腺腫は、結腸癌と異なり、非侵襲的である。従って、腺腫のＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の循環への移動のためには、それらは、このタンパク質を、結腸内腔に面した頂端細胞表面からではなく、毛細血管及びリンパ管と面している基底外側細胞表面から分泌する必要がある。ＣｏｌｏＵｐ２分泌の極性を決定するために、我々は、極性化Ｃａｃｏ２結腸癌細胞の単層を、Ｖ５エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の発現ベクターを用いて一時的にトランスフェクトした。この細胞を、上部トランスウェルチャンバー(単層の頂端面にさらされる培地に相当)が下部トランスウェルチャンバー(単層の基底外側面にさらされる培地に相当)から分離しているトランスウェルディッシュ中で成長させた。単層のシーリングの完全性は、フィルターを横切る電気抵抗の測定によりアッセイし、一時的トランスフェクトの効率は、ｇｆｐマーカーの発現によりモニターした。上下チャンバーの培地をトランスフェクション後２４、４８、７２及び９６時間で採集して、分泌されたタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質を、Ｖ５エピトープタグに向けられたウエスタン分析により検出した。図３９に示したように、特徴的な８５ＫＤ及び５５ＫＤの分泌型のＣｏｌｏＵｐ２が、アッセイした全時点において基底外側単層区画の培地中で検出された。４８時間の単一時点において、ＣｏｌｏＵｐ２は、頂端分泌面に相当する培地中で追加的に検出されたが、フィルターを横切る電気抵抗の４８時間での下降は、この時点での単層を横切る幾らかの漏出の可能性を示唆している。確かに、このデータは、ＣｏｌｏＵｐ２の基底外側単層区画への分泌を明確に示しており、それ故、ＣｏｌｏＵｐ２を、結腸腺腫の候補の血清学的マーカーについて必須の生物学を示すものとして確立している。
【０１３８】
ＣｏｌｏＵｐ２について行なったように、ＣｏｌｏＵｐ１の発現ベクターを利用して、トランスウェルフィルター上で成長させたＣａｃｏ２細胞単層を一時的にトランスフェクトした。次いで、ＣｏｌｏＵｐ１の分泌を、上側及び下側のチャンバーからそれぞれ集めた培地にてアッセイした。ウエスタンブロットアッセイは、ＣｏｌｏＵｐ１の、頂端及び基底外側の両単層表面からの等しい分泌を示した。ＣｏｌｏＵｐ１の研究はＣｏｌｏＵｐ２の研究と並行して行ない、ＣｏｌｏＵｐ１単層の電気抵抗は、ＣｏｌｏＵｐ２単層のそれを超えており、これは、ＣｏｌｏＵｐ１をトランスフェクトした単層が十分シールされていたことを支持している。加えて、分泌されたＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のレベルは、分泌されたＣｏｌｏＵｐ２のものと類似しており、これは、頂端及び基底外側区画の両者によるＣｏｌｏＵｐ１分泌が単に過剰発現によるものではないことを示唆している。従って、我々は、ネイティブなＣｏｌｏＵｐ１タンパク質が、少なくとも部分的に基底外側上皮面から分泌されることはありそうなことであり、それ故、大きい結腸の腺腫の血清学的マーカーとして検出可能であろうということを予想する。
【０１３９】
実施例１３：５５ｋＤａのＣｏｌｏＵｐ２断片の配列決定
ヒト細胞株から分泌され、血液中で優勢な断片(４８８ａａ)として検出されたＣｏｌｏＵｐ２のＣ末端断片のタンパク質配列を決定した。上記のように、我々は、ウエスタンブロットにおいて及びトランスフェクトされたヒト結腸癌細胞により分泌されたＣ末端エピトープタグ付き(Ｖ５−Ｈｉｓエピトープ)ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の精製した調製物において、約９０ｋＤａの完全な大きさのバンドと、一層小さい約５５ｋＤａのＣ末端断片(Ｃ末端エピトープタグの保持により実証)の両者を見出した。その上、これらの細胞を無胸腺マウスに注射した場合、５５ｋＤａのＣ末端タグ付きタンパク質は、そのマウスの血液中を循環して検出される優勢な種であった(マウス血清を、Ｖ５タグに対する連続する免疫沈降及びウエスタンブロット分析により分析した場合)。このＣ末端断片を説明する開裂部位の正確な位置は、精製されたＣ末端断片を含むアクリルアミドゲルバンドを切り出して、そのタンパク質からのトリプシン消化断片の質量分析を行なうことにより確立した。配列ＡＶＬＡＡＨＣＰＦＹＳＷＫのペプチドが、５５ＫＤ断片の消化物中にだけ存在し、完全長タンパク質の消化物には存在しなかったが、これは、このペプチドが５５ＫＤ断片のユニークなアミノ末端に対応することを示している。５５ＫＤのＣ末端断片の完全な配列は、図４１に示してある。
【０１４０】
参考文献の援用
ここで言及したすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、特に及び個別的に、参考として援用されることが指示されているかのように、そっくりそのまま参考として本明細書中に援用する。矛盾がある場合には、本願は、本明細書中の如何なる定義をも含めて調整する。
【０１４１】
同等物
主題の発明の特定の具体例が議論されていても、上記の明細書は、説明であって、制限ではない。この発明の多くの変形物は、この明細書及び後記の請求の範囲を考慮すれば当業者には明らかとなろう。この発明の全範囲は、請求の範囲を同等物の全範囲と共に参照し、明細書をかかる変形物と共に参照して決められるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１Ａ】分泌されるＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１及び２)を示している。
【図１Ｂ】分泌されるＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１及び２)を示している。
【図２】分泌されるＣｏｌｏＵｐ２タンパク質のアミノ酸配列(配列番号３)を示している。
【図３】ＣｏｌｏＵｐ１の核酸配列(配列番号４)を示している。
【図４】ＣｏｌｏＵｐ２の核酸配列(配列番号５)を示している。
【図５】オステオポンチンの核酸配列(配列番号６)を示している。
【図６】ＣｏｌｏＵｐ３の核酸配列(配列番号７)を示している。
【図７】ＣｏｌｏＵｐ４の核酸配列(配列番号８)を示している。
【図８】ＣｏｌｏＵｐ５の核酸配列(配列番号９)を示している。
【図９】ＣｏｌｏＵｐ６の核酸配列(配列番号１０)を示している。
【図１０】ＣｏｌｏＵｐ７の核酸配列(配列番号１１)を示している。
【図１１】ＣｏｌｏＵｐ８の核酸配列(配列番号１２)を示している。
【図１２】完全長ＣｏｌｏＵｐ１タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１３)を示している。
【図１３】完全長ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１４)を示している。
【図１４】完全長オステオポンチンタンパク質のアミノ酸配列(配列番号１５)を示している。
【図１５】完全長ＣｏｌｏＵｐ３タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１６)を示している。
【図１６】完全長ＣｏｌｏＵｐ４タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１７)を示している。
【図１７】完全長ＣｏｌｏＵｐ５タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１８)を示している。
【図１８】完全長ＣｏｌｏＵｐ６タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１９)を示している。
【図１９】完全長ＣｏｌｏＵｐ８タンパク質のアミノ酸配列(配列番号２０)を示している。
【図２０】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ１発現レベルのグラフ表示である。
【図２１】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ２発現レベルのグラフ表示である。
【図２２】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したオステオポンチン発現レベルのグラフ表示である。
【図２３】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ３発現レベルのグラフ表示である。
【図２４】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ４発現レベルのグラフ表示である。
【図２５】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ５発現レベルのグラフ表示である。
【図２６】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ６発現レベルのグラフ表示である。
【図２７】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ７発現レベルのグラフ表示である。
【図２８】異なる試料において、マイクロアレイプロファイリングにより測定したＣｏｌｏＵｐ８発現レベルのグラフ表示である。
【図２９Ａ】正常な結腸組織と結腸癌細胞株又は組織におけるＣｏｌｏＵｐ１ｍＲＮＡのレベルのノーザンブロット分析を示している。
【図２９Ｂ】正常な結腸組織と結腸癌細胞株又は組織におけるＣｏｌｏＵｐ１ｍＲＮＡのレベルのノーザンブロット分析を示している。
【図２９Ｃ】正常な結腸組織と結腸癌細胞株又は組織におけるＣｏｌｏＵｐ１ｍＲＮＡのレベルのノーザンブロット分析を示している。
【図３０Ａ】トランスフェクトされたＦＥＴ細胞及びＶａｃｏ４００細胞におけるＴ７エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質レベルの検出を示している。
【図３０Ｂ】トランスフェクトされたＦＥＴ細胞及びＶａｃｏ４００細胞におけるＴ７エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質レベルの検出を示している。
【図３１】正常な結腸組織試料及び結腸癌細胞株の群におけるＣｏｌｏＵｐ２ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示しており(上側パネル)、下側パネルは、該ブロットに対応するエチジウムブロミド染色したゲルを示している。
【図３２】トランスフェクトされたＳＷ４８０細胞及びＶａｃｏ４００細胞におけるＶ５エピトープタグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質レベルの検出を示している(トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後)。
【図３３】正常な結腸組織及び結腸癌細胞株の群におけるＣｏｌｏＵｐ５ｍＲＮＡレベルの２つのノーザンブロット分析を示しており(上側パネル)、下側パネルは、該ブロットに対応するエチジウムブロミド染色したゲルを示している。
【図３４】ヒト、マウス及びラットのＣｏｌｏＵｐ５(ＦｏｘＱ１)アミノ酸配列のアラインメントを示している。
【図３５】ヒト、マウス及びラットのＣｏｌｏＵｐ５(ＦｏｘＱ１)アミノ酸配列のアラインメントを示している。
【図３６】抗Ｖ５抗体により検出されたＶ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質のウエスタンブロットを示している。
【図３７】Ｖ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の、抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロットを示している。
【図３８】上段パネルにおいて、ＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の精製を示している。
【図３９】上段パネルにおいて、Ｖ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ２タンパク質の抗Ｖ５ウエスタンにおける検出を示している。
【図４０】上段パネルは、Ｖ５タグ付きＣｏｌｏＵｐ１タンパク質の抗Ｖ５ウエスタンにおける検出を示している。
【図４１】ＣｏｌｏＵｐ２の顕著な分泌及び血清型であるＣｏｌｏＵｐ２の約５５ｋＤａのＣ末端断片のアミノ酸配列を示している。
【図１Ａ】
2006512565.tif 000003
【図１Ｂ】
2006512565.tif 000004
【図２】
2006512565.tif 000005
【図３】
2006512565.tif 000006
【図４】
2006512565.tif 000007
【図５】
2006512565.tif 000008
【図６】
2006512565.tif 000009
【図７】
2006512565.tif 000010
【図８】
2006512565.tif 000011
【図９】
2006512565.tif 000012
【図１０】
2006512565.tif 000013
【図１１】
2006512565.tif 000014
【図１２】
2006512565.tif 000015
【図１３】
2006512565.tif 000016
【図１４】
2006512565.tif 000017
【図１５】
2006512565.tif 000018
【図１６】
2006512565.tif 000019
【図１７】
2006512565.tif 000020
【図１８】
2006512565.tif 000021
【図１９】
2006512565.tif 000022
【図２０】
2006512565.tif 000023
【図２１】
2006512565.tif 000024
【図２２】
2006512565.tif 000025
【図２３】
2006512565.tif 000026
【図２４】
2006512565.tif 000027
【図２５】
2006512565.tif 000028
【図２６】
2006512565.tif 000029
【図２７】
2006512565.tif 000030
【図２８】
2006512565.tif 000031
【図２９Ａ】
2006512565.tif 000032
【図２９Ｂ】
2006512565.tif 000033
【図２９Ｃ】
2006512565.tif 000034
【図３０Ａ】
2006512565.tif 000035
【図３０Ｂ】
2006512565.tif 000036
【図３１】
2006512565.tif 000037
【図３２】
2006512565.tif 000038
【図３３】
2006512565.tif 000039
【図３４】
2006512565.tif 000040
【図３５】
2006512565.tif 000041
【図３６】
2006512565.tif 000042
【図３７】
2006512565.tif 000043
【図３８】
2006512565.tif 000044
【図３９】
2006512565.tif 000045
【図４０】
2006512565.tif 000046
【図４１】
2006512565.tif 000047
【国際調査報告】
2006512565.tif 000048
2006512565.tif 000049