(57)【要約】本発明は、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子スイッチ分子の制御下にある、少なくとも１つの免疫モジュレータをコードする少なくとも１つの核酸を含有する、ヒトまたは動物の非全能性細胞に関する。本発明はまた、移植のため、移植片拒絶を阻害するため、および移植片から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための、該細胞の製造および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の非全能性細胞であって、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも１つの免疫モジュレータをコードする少なくとも１つの核酸を含む、前記細胞。
【請求項２】
幹細胞、前駆細胞および／または不死化細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
細胞株の形態の、請求項１〜３の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項５】
調節できる遺伝子発現システムがプロゲステロン遺伝子発現システム、テトラサイクリン発現システムおよび／またはラパマイシン遺伝子発現システムであることを特徴とする、請求項１〜４の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項６】
免疫モジュレータが以下の機能的特性の少なくとも１つを有することを特徴とする、請求項１〜５の少なくとも１項に記載の細胞：
ａ．Ｔ細胞により仲介される抗原認識の阻害、
ｂ．Ｔ細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
ｃ．Ｔ細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
ｄ．Ｔ細胞の増殖の阻害、
ｅ．Ｔ細胞の生存を支援する分子の阻害、
ｆ．Ｔ細胞のエフェクター分子（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γなど）の阻害、
ｇ．Ｔ細胞の接着の阻害、
ｈ．Ｔ細胞同時刺激性相互作用の阻害（リンパ球の活性化は２つのシグナルを経て起こる：第１に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第２にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する；この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる）、
ｉ．例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および／またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
ｊ．例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
ｋ．補体系成分の阻害、
ｌ．外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および／または
ｍ．炎症反応の阻害。
【請求項７】
免疫モジュレータが抗体であることを特徴とする、請求項１〜６の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項８】
免疫モジュレータが、
ｄ．レセプター、
ｅ．可溶性分泌型レセプター、
ｆ．分泌されたタンパク質またはペプチド、
であることを特徴とする、請求項１〜６の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項９】
免疫モジュレータが、変異ＩＬ−１５およびＦｃフラグメントの融合タンパク質であり、該Ｆｃフラグメントは変異ＩＬ−１５分子のＣ末端へ、好ましくはヒンジ領域を経て融合されていることを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
抗体のＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、特に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくは類似の哺乳動物ＩｇＧまたはＩｇＭ、特に、ヒトＩｇＭ若しくは類似の哺乳動物ＩｇＭのＦｃフラグメントであることを特徴とする、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
核酸が追加として選択カセット、特に、適した遺伝子導入マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子をコードすることを特徴とする、請求項１〜１０の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項１２】
核酸が追加として、ＮＫ細胞および／またはキラー細胞を阻害する分子をコードすることを特徴とする、請求項１〜１１の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項１３】
核酸が追加として、
ａ．樹状細胞、
ｂ．単球および／またはマクロファージ、
ｃ．Ｂ細胞、
ｄ．多形核細胞、例えば好中性顆粒球
を阻害する分子をコードすることを特徴とする、請求項１〜１１の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項１４】
該阻害性分子が、ヒトＭＨＣクラスＩ分子、キメラＭＨＣクラスＩ分子またはウイルスＭＨＣクラスＩ相同体であることを特徴とする、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
少なくとも１つの免疫モジュレータ、および活性物質を加えることにより調節できる少なくとも１つの遺伝子発現システムをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の少なくとも１つの核酸を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞、および適した賦形剤および／または添加剤を含む、医薬。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞を含む、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞、および／または請求項１８に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物への移植のための使用。
【請求項２１】
同種移植、自家移植または異種移植であることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞、請求項１５に記載の核酸、請求項１８に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、適当な場合には少なくとも１つの免疫モジュレータの存在下での、ヒトまたは哺乳動物における移植片拒絶を阻害する医薬を製造するための使用。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞、請求項１５に記載の核酸、請求項１８に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植片から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療用の医薬を製造するための使用。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞を調製するための方法であって、以下の工程：
ｃ．請求項１５に記載の少なくとも１つの核酸および／または請求項１６に記載の少なくとも１つのベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
ｄ．遺伝子スイッチを調節するための少なくとも１つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること、
を含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ｅ．請求項１５に記載の少なくとも１つの核酸および／または請求項１６に記載の少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも１つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ導入すること、
ｆ．工程ａの細胞を分化させること、
ｇ．工程ｂの分化細胞を選択すること、および
ｈ．工程ｃの選択された細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
工程ａの後、前または同時に、少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカーを、少なくとも１つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ導入し、工程ａの後に、工程ａの遺伝子導入された細胞を優先的に選択することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１８に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程：
ｆ．請求項１５に記載の少なくとも１つの核酸および／または請求項１６に記載の少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも１つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および／または不死化細胞へ導入すること、
ｇ．工程ａの遺伝子導入細胞を選択すること、
ｈ．工程ｂに従って選択された細胞を、少なくとも１つのヒト以外の哺乳動物の胚盤胞へ導入すること、
ｉ．工程ｃの胚盤胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
ｊ．該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２９】
幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１９に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程：
ｄ．請求項１５に記載の少なくとも１つの核酸および／または請求項１６に記載の少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の２つの前核のいずれかに導入すること、
ｅ．工程ａの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
ｆ．該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項３１】
請求項２８または２９に記載の方法により作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３３】
請求項１９、３０および３１のいずれか１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、同種移植および／または異種移植用のヒト以外の細胞、ヒト以外の臓器特異的組織、および／またはヒト以外の哺乳動物臓器を得るための使用。
【請求項３４】
請求項１９、３０および３１のいずれか１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、請求項１８に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理学的に活性な成分を発見するため、および／または毒性物質を同定するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質の添加により調節可能な遺伝子スイッチ分子の制御下にある少なくとも１つの免疫モジュレータをコードする少なくとも１つの核酸を含有する、ヒトまたは動物の非全能性細胞に関する。本発明はまた、移植のための、移植片拒絶を阻害するための、ならびに移植片から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための、該細胞の調製および使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト疾患の多様性は、特定の細胞、組織または臓器の死または機能不全に基づいており、医薬では十分に処置することができないことが多い。慣用的な治療は従来、損傷を受けた組織または臓器を、健常ヒトドナーから得られた、例えば心臓、肺、腎臓、膵臓、または該臓器からの細胞または組織のごとき、健常細胞、組織または臓器を移植することにより置き換えることから成っている。しかしながら、現在のところ臓器ドナーが不足しているため、ドナー組織に対する要求を十分に満たすことができない。該不足は、特別に繁殖させたヒト以外のドナー動物からの組織または細胞を移植することによりなくすことができる。あるいは、交換細胞は細胞株から得ることもできる。これらの細胞は同様に、ヒト起源であっても、またはヒト以外の起源であってもよい。
【０００３】
しかしながら、ヒト生物体へのヒト以外の細胞、組織または臓器の移植（異種移植）も、ヒトレシピエントへの遺伝子的に同一でないヒトのドナー細胞、ドナー組織またはドナー臓器の移植（同種移植）も、免疫仲介移植片拒絶の問題を有している。該拒絶は外来性タンパク質であると認識されているドナー細胞上に存在する組織適合性抗原に基づいており、それにより移植片に対して向けられた免疫応答を起こしている。同種間および異種間の細胞、組織または臓器に対する免疫応答は、免疫系の異なった細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、抗原提示細胞）間の、多数の複雑な相互作用に基づいており、そして最終的には、移植された細胞、組織または臓器の拒絶を結果として生じることができる。したがって、該免疫応答を抑制するため、レシピエントは、免疫系を抑制し、または移植片に対して該レシピエントに耐性をもたらしてそのような拒絶を防止する、「免疫モジュレータ」として知られている医薬で処置しなければならない。
【０００４】
使用される免疫モジュレータの例は、ステロイド（プレドノソロンおよび誘導体）、カルシニューリン阻害剤（シクロスポリンＡ、タクロニムス）、ラパマイシン（シロリムス）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（イムラン）、リンパ球抗血清（ＡＬＧ−抗白血球グロブリン、ＡＴＧ−抗胸腺細胞グロブリン）またはモノクローナル抗体（抗ＣＤ２５：ゼナパックス、シムレクト）である。
【０００５】
抗体療法は、移植後の最初の数週および数ヶ月に支持療法として行われ（導入療法）、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、そしてしばしばＭＭＦおよびイムランは通常、移植時から、患者が移植片を伴っている全期間、即ち、時に全生涯にわたって投与される。しかしながら、現在使用されている免疫変調物質のタイプ、作用様式および組み合わせとは無関係に、医薬品は通常、静脈内または経口で投与され、それ故、患者の全身に分布する。従って、それらはその作用部位、即ち移植された臓器または組織、または移植された細胞が置かれた部位のみでなく、生物体の他の組織または臓器すべてにも到達する。このことは、移植片に限定されない、一般的な免疫防御の抑制を生じる。非標的組織および臓器においてそれらは免疫系の機能を害し、従って、多くの臓器の生理学的機能遂行を妨げ、多数の副作用を生じるであろう。
【０００６】
通常の免疫変調治療の最も重大な副作用は、これに関連する高血圧、腎臓および肝臓に対する損傷、日和見感染発生の増加、そして、例えばがんおよびリンパ球増殖性障害のごとき多様な悪性化の割合の増加である。従って、例えば、普通はわずかな症状のみを伴って進行するサイトメガロウイルス感染が、免疫抑制された患者においては肝炎、肺炎および髄膜炎を発症し得るため、それが移植片受容者の死亡率を増加させる主たる原因となっている（移植臨床管理、第５巻、２０００  Ｍｅｄｓｃａｐｅ社、Ｗｅｂ  ＭＤ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、ニューヨーク、ＵＳＡ）。他の研究では、免疫抑制された同種移植片レシピエントは、通常の処置後、がんの危険性が３倍〜４倍高く、特定の型のがんでは２０〜５００倍も増加し得ることを確認している（Ｐｅｎｎ  Ｉ．、Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌ．１４７−１５８、１９９８）。加えて、特に免疫抑制性の免疫モジュレータは、免疫系に対するそれらの作用とは無関係に、一般に毒性を有するかもしれない。従って、カルシニューリン阻害剤はしばしば腎不全、高血圧、高脂血症および糖尿病を発症している。医薬品による定期的な処置はさらに生活の質を非常に損なっており、従って、医学的に必要とされる程度まで患者が実行しないことが多い。
【０００７】
さらに不利なことは、全身循環による分布後に、移植部位で治療的に活性な濃度を依然として達成するためには、比較的高用量の該医薬品が投与される必要があるということである。このことはさらに、該副作用の発生を促進または増加させる。
【０００８】
こうした事実を打ち消すため、多数の新規免疫治療剤および付随する診断アプローチが近年開発されている。
免疫変調の副作用を減少させる臨床的に試験されたアプローチは、例えば、新規に開発された免疫応答性医薬品を低濃度で組み合わせ、標準療法剤（例えばステロイド、シクロスポリンＡ）をそれらと取り替えることから成る。このことは、例えば、ダクリズマブ、シロリムスおよび低用量タクロリムスの組み合わせを使用してグリココルチコイドの糖尿病誘発性作用が回避された、糖尿病処置のための同種間膵島細胞の移植で首尾よく実施された（Ｓｈａｐｉｒｏ  Ｊ．、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ  ３４３、Ｎ．４、２３０−２３８、２０００）。しかしながら、この処置でさえ、例えば白血球レベルの減少、口腔潰瘍および消化障害の発生のごとき、該組み合わせの中の個々の免疫モジュレータの副作用を避けることが不可能であった。
【０００９】
別の可能な治療的アプローチは、新規免疫変調物質を投与することにより、患者における外来組織への免疫学的許容性を達成させることである。これに関連して、許容性とは、継続的な免疫抑制を伴わない、移植片への免疫応答または拒絶の不在として特徴付けられる。この種の免疫変調物質は、当業者には公知の通常の方法に従って投与される（例えば、ＷＯ００／１２１３８；ＷＯ９７／４１２３２；ＷＯ９６／２６２７４；ＷＯ０１／８７３３０；Ｆｅｒｒａｒｉ−Ｌａｃｒａｚら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１、Ｖｏｌ１６７、ｐｐ．３４７８−３４８５；Ｋｉｍら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６０：５７４２−５７４８；Ｐｅｎｎ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ、１９９１、２３：１１０１；Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅら、Ｌａｎｃｅｔ、１９８４、１：７８８を参照されたい）。
【００１０】
慣用的治療アプローチの１つの不都合な点は、許容性誘導免疫モジュレータもまた通常全身投与される（例えば静脈内）ということである。別の不都合な点は、免疫モジュレータは、患者にその後外部から投与するため、天然資源から治療用生成物として単離するか、または組換え分子として生物工学的に調製しなければならないことである。しかしながら、調製による側面は、免疫モジュレータが、十分な量でまたは十分活性で、天然型または組換え分子として単離しまたは調製することができない結果を生じるかもしれない。加えて、免疫モジュレータのｅｘ  ｖｉｖｏ調製は、患者に対してさらなる健康危害をもたらし得る物質（例えば動物生物体から単離されたため、潜在的に動物由来感染症を移し得る物質）の添加を必要とするかもしれない。この結果として、全ての患者に対して適切な様式で免疫モジュレータにより処置することは不可能であり、または処置にはさらなる健康危害が付随するかもしれない。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明の範囲内の目的は、上記の不利益を回避しまたは軽減する免疫療法を開発することであり、それは特に、まさに免疫応答が活性化されまたは活性化し得る生物中で、即ち移植された細胞または臓器の場所で、その免疫変調作用、特に免疫抑制作用を示し、それと同時に、その時期と量が調節できる免疫変調作用を可能にする。
【００１２】
本発明によれば、調節可能な遺伝子発現システムの助けにより、細胞中での免疫モジュレータの発現を調節することが可能であった。
調節可能な遺伝子発現システムの助けにより、免疫モジュレータを局所的に（例えば、細胞移植片中で）および適用量で産生することが可能である。こうした免疫モジュレータの調節可能な産生はこれまで示されていない。従って、一過性細胞培養実験において免疫モジュレータＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節可能な産生を得たという発見は、ことさら驚くべきことであった（実施例１およびＫｉｍら、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８、１６０、５７４２−５７４８を参照されたい）。
【００１３】
調節可能な発現システムは、免疫モジュレータを、連続的かつ全身に、または低濃度でも、もはや投与する必要がないことを可能にする。
本発明の別の考慮すべき利点は、移植の場所でさえ、医学的観点から必要とされない場合は免疫応答の連続的抑制が生ずる必要はないが、必要な時にのみ抑制が活性化されることである。このことは、身体に対する、特に移植領域に対する副作用、そして負担を軽減する。それはまた、患者が免疫モジュレータ、特に免疫抑制剤の投与に継続的に頼る必要がないため、患者に対する肉体的および精神的的救済も意味する。本明細書における免疫抑制剤とは、生物中の移植片、特に細胞、組織および／または臓器により引き起こされる免疫応答を完全にもしくは部分的に阻害する物質を意味している。
【００１４】
加えて、本発明は、免疫モジュレータをもはや天然資源から単離する必要がなく、または組換え的に産生し精製する必要がないという利点を提供する。免疫モジュレータは、レシピエントの生体中でおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける作用部位で、治療的に活性な量および形で産生され、従って、その完全な天然の活性を保持している。
【００１５】
したがって、本発明の１つの側面は、活性物質を添加することにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも１つの免疫モジュレータをコードする少なくとも１つの核酸を含む移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞に関する。
【００１６】
本発明の核酸とは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡ、組換え的に産生されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または、例えばホスホラミデート化のレベルで合成された合成ＤＮＡを意味している。同様に含まれるのは、該核酸のヌクレオチドの組み合わせおよび／または修飾である。この用語はさらに、１本鎖および２本鎖の核酸も含む。
【００１７】
また、１以上の免疫モジュレータをコードする機能的に連結された成分、例えば１以上の遺伝子またはその活性部分、およびその活性化の状態が活性化物質を加えることにより調節される少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現システム、および例えばプロモーターおよび調節的ヌクレオチド配列のごとき調節可能な要素、およびポリアデニル化シグナル、例えばＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、を含む核酸も含まれる。該成分は、含有されている遺伝子配列が転写調節の影響下で転写されるような様式で接続されている場合は、機能的に連結されている。
【００１８】
本発明の用語、免疫モジュレータは、免疫変調作用、特に免疫抑制作用を有する任意の型の分子、例えばタンパク質、融合タンパク質および可溶性リガンドを本質的に含み、ここで、融合タンパク質は２以上の遺伝子または遺伝子断片の連結により産生された融合遺伝子の発現産物を意味している。
【００１９】
生物、細胞および／または組織の免疫応答が、例えば改変されたまたは抑制されたレセプター結合のため本質的に阻害される場合は、免疫変調作用が存在している。免疫変調作用は、移植された細胞、組織または臓器に対する免疫寛容が引き起こされる場合は、同様に存在している。
【００２０】
免疫モジュレータの作用は、例えば、以下の活性の１以上を含む：
・  Ｔ細胞により仲介される抗原認識の阻害、
・  Ｔ細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
・  Ｔ細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
・  Ｔ細胞の増殖の阻害、
・  Ｔ細胞の生存を支援する分子の阻害、
・  Ｔ細胞のエフェクター分子（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γなど）の阻害、
・  Ｔ細胞の接着の阻害、
・  Ｔ細胞同時刺激性相互作用の阻害（リンパ球の活性化は２つのシグナルを経て起こる：第１に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第２にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する；この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる）、
・  例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および／またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
・  例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
・  補体系成分の阻害、
・  外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および／または
・  炎症反応の阻害。
【００２１】
適した免疫モジュレータの例は抗体である。ＩＬ−１５、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンγ、ＴＮＦ−α、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６若しくはＣＤ１５４、またはこれらのレセプターに対する抗体が特に好ましい。
【００２２】
免疫モジュレータＦａｓＬ、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２が同様に好ましい。
さらに好ましい免疫モジュレータは、ＩＬ−１５、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２、インターフェロンγまたはＴＧＦ−βであり、特に融合タンパク質の形が好ましい。融合タンパク質は、特に好ましくは、第１に、野生型ＩＬ−１５、野生型ＩＬ−１０、野生型ＩＬ−４、野生型インターフェロンγまたは野生型ＴＧＦ−β、そして第２に、Ｆｃフラグメントを含む。さらに、第１に変異ＩＬ−１５、好ましくは１０１位および１０８位の「Ｑ」が「Ｄ」で置換されているもの、または変異ＩＬ−２、第２に、例えばヒンジ領域を経て変異ＩＬ−１５分子のＣ末端へ融合されたＦｃフラグメント（例えば、ＷＯ９７／４１２３２；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）、１６０（１２）：５７４２−５７４８；ＷＯ０１／８７３３０を参照されたい）を含む融合タンパク質が特に好ましい。
【００２３】
さらに好ましい免疫モジュレータは、第１にＴＮＦ−α  レセプター（タイプ１または２）、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＳＧＬ−１、ＩＣＡＭ−１またはＶＣＡＭ−１、第２に、例えばＥＰ４１７，５６３に開示されているＴＮＦレセプター融合タンパク質の場合のごときＦｃフラグメントの融合タンパク質である。
【００２４】
さらに好ましい免疫モジュレータは、例えば膜貫通ドメインおよび細胞質尾部のない変異体としての、好ましくはＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質としての、例えばＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８レセプターのごときサイトカインレセプターまたは増殖因子レセプターの分泌された変異体である。
【００２５】
融合タンパク質は好ましくはキメラ融合タンパク質である。適した融合タンパク質の例は、ＩＬ−１５または変異ＩＬ−１５、および異種Ｆｃフラグメントを含む、ＩＬ−１５誘導体である。
【００２６】
Ｆｃフラグメント（結晶可能フラグメント）とは、例えば、すべての定常ドメインまたは例えばヒンジ領域を含むもののような第１の定常（部分的または完全）ドメインを除いたすべての定常ドメイン、重鎖の第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の定常ドメインを含むフラグメントのような抗原に結合しない抗体のフラグメントを意味している。Ｆｃフラグメントは天然資源に由来しても、組換え的に調製しおよび／または合成してもよい。対応する方法は当業者には公知である。これに関連して、Ｆｃフラグメントは、例えば、融合タンパク質を構築するために適した切断部位を含むもののように、天然配列と比較して、１以上の突然変異を有することができる（Ｋｉｍら、上記文献を参照されたい）。
【００２７】
本発明のさらなる態様において、Ｆｃフラグメントは免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇの１つ、特に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４および／または類似の哺乳動物ＩｇＧ、および／またはＩｇＭ、特に、ヒトＩｇＭまたは類似の哺乳動物ＩｇＭ、および／またはマウスＩｇＧ２ａである。
【００２８】
免疫モジュレータは野生型配列を有していても他の変異配列を有していてもよい。免疫モジュレータは、機能的に活性な形態、例えば、機能的に活性な可溶型または機能的に活性なウイルス型ですでに存在していることが好ましい。可溶型とは、例えば可溶性レセプター分子のごとく、細胞膜に結合しない分子を意味している。ウイルス型とは、例えばウイルスＩＬ−１０のごとく、ウイルスゲノムにより内因的にコードされているタンパク質アイソフォームを意味している。
【００２９】
本発明の変異配列とは、例えば、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換により野生型配列からの逸脱を含むが、免疫変調作用を完全には失っていないヌクレオチドまたはアミノ酸配列を意味している。
【００３０】
したがって、本発明の変異した免疫モジュレータは、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、特に好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９９％の野生型配列との配列相同性を有している分子である。
【００３１】
本発明の配列相同性とは、２つの配列の類似度の程度（％陽性）を意味しており、それはポリヌクレオチドの場合においては、例えばフィルターセットを「オフ」にし、ＢＬＯＳＵＭ＝６２にしたＢＬＡＳＴＮ  ２．０．１４によって決定される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２）。配列相同性は、例えば、インターネット上、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ＳｅａｒｃｈＬａｕｎｃｈｅｒ／での共通の配列相同性プログラムを使用して確認することができる。
【００３２】
本発明の用語、調節可能な遺伝子発現システムとは、遺伝子スイッチ分子をコードする配列と遺伝子スイッチ結合配列との組み合わせを意味しており、該遺伝子スイッチ結合配列への該遺伝子スイッチ分子の結合は、活性物質の添加により調節され、それにより標的遺伝子の発現を制御しており、この場合、標的遺伝子は免疫モジュレータをコードしている（Ｂｕｒｃｉｎら、１９９８、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３：ｃｌ−７も参照されたい）。
【００３３】
一般に、遺伝子スイッチ分子は、適した遺伝子スイッチ結合配列へ結合させることにより、標的遺伝子の転写を活性化または阻害することが可能である。活性化は遺伝子スイッチ分子に基づくことができ、例えば、関与するＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写因子の接触部位を提供している。阻害は、転写複合体に必要とされるＤＮＡ結合部位を、ＤＮＡへのその結合によりブロッキングする遺伝子スイッチ分子により起こすことができ、それにより、該結合部位を、例えば、関与するＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写因子へ到達できないようにする。
【００３４】
活性物質の添加は、標的遺伝子の転写に正（活性化）にも負（阻害）にも影響することができる。例えば、標的遺伝子は活性物質の非存在下では発現されない。活性物質の添加後、後者は遺伝子スイッチ分子へ結合し、それにより活性化および遺伝子スイッチ結合配列への該遺伝子スイッチ分子の結合が起こり、続いて標的遺伝子の転写が開始される。別の例は、活性物質非存在下でＤＮＡへ結合し、そして転写を活性化する遺伝子スイッチ分子である。活性物質の添加および結合後、遺伝子スイッチ分子は不活性化され、標的遺伝子の転写が停止される。
【００３５】
用語、遺伝子スイッチ分子とは、活性物質のための結合部位および転写活性化ドメインを含有する分子、好ましくはタンパク質、特に融合タンパク質を意味しており、その分子は活性物質の結合後にその活性化の状態を変化させる。
【００３６】
本発明の用語、遺伝子スイッチ結合配列とは、好ましくは、免疫モジュレータをコードする遺伝子またはその活性部分の翻訳開始（＋１）の５’上流に位置している核酸配列を意味しており、その核酸配列は、標的遺伝子の転写、特に転写速度および／または組織特異性を制御するか、あるいは翻訳を制御する。プロモーター活性を有し、好ましくは同様にエンハンサー活性を有している調節核酸配列が、該遺伝子スイッチ結合配列に間接的にまたは直接的に結合されている。
【００３７】
本発明の調節可能遺伝子発現システムの機能は、例えば以下のように説明することができる：
遺伝子スイッチ結合配列に遺伝子スイッチ分子が結合しない場合は、共役標的遺伝子は発現されず、この場合、免疫モジュレータは産生されない。
【００３８】
活性物質が添加される場合、後者は、例えば、遺伝子スイッチ分子の２量体化ドメインへ結合する。この結合は２量体化ドメインにコンホメーション変化を生じ、２つの遺伝子スイッチ分子の２量体化、続いて遺伝子スイッチ結合配列への結合を起こす。この結合は、遺伝子スイッチ分子の活性化ドメインを最小ＴＡＴＡプロモーターの近傍へ近づけ、従って、免疫モジュレータをコードする共役標的遺伝子の転写を開始させる。活性物質が加えられてしまった後は、遺伝子スイッチ結合配列への遺伝子スイッチ分子の結合が解除され、従って標的遺伝子の発現が停止する。
【００３９】
従って、本発明の遺伝子スイッチ分子は、活性物質を加え、次に遺伝子スイッチ結合部位へ結合させることにより、調節し、例えば阻害または活性化し、好ましくは活性化することが可能である。
【００４０】
好ましい活性物質とは、例えば、ミフェプリストーン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンまたはラパマイシンのような遺伝子スイッチを経て、遺伝子または多数の遺伝子の直接的または間接的に調節された発現を起こす、薬理的適合性物質を意味している。
【００４１】
本発明の調節された遺伝子発現システムは、特にプロゲステロン遺伝子発現システムであり、それは、ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＤＢＤ）、切断型リガンド結合部位を有する変異プロゲステロンレセプター由来の２量体化ドメイン（ｈＰＲ−ＬＢＤ）、およびヒトＮＦ−κＢタンパク質のｐ６５サブユニットの活性化ドメイン（ｐ６５−ＡＤ）から成る、人工的に組み立てられた転写因子を意味する遺伝子スイッチを含む。遺伝子スイッチ結合配列は、例えば、対応する標的遺伝子が共役されている最小ＴＡＴＡプロモーターが後に続く１７ヌクレオチドＧＡＬ４結合配列から成るヌクレオチド配列である。言及した遺伝子スイッチ成分Ｇａｌ４−ＤＢＤ／ｈＰＲ−ＬＢＤ／ｐ６５−ＡＤを有するこの種の調節可能遺伝子発現システムは、例えば、Ｗａｎｇら、１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：８１８０−８１８４またはＷａｎｇら、１９９７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４３２−４４１に説明されている。このシステムに適した活性物質の例は、哺乳動物には存在せず、遺伝子スイッチ分子の２量体化ドメインへ特異的に結合し、それにより引き起こされる２量体化により該分子を活性化する人工ホルモン様分子、ミフェプリストーンである。
【００４２】
本発明のさらなる調節可能遺伝子発現システムは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）または誘導体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により誘導可能なシステムを意味するテトラサイクリン遺伝子発現システムであり、そのシステムにおいては、遺伝子スイッチ分子はＴｅｔトランス活性化因子タンパク質から成る。該トランス活性化因子（ｔＴＡ）は、ＶＰ１６活性化ドメインと大腸菌のＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）との融合タンパク質である。テトラサイクリン非存在下、ｔＴＡはその遺伝子スイッチ結合部位、Ｔｅｔ−応答性要素（ＴＲＥ）に対して高親和性を有しており、標的遺伝子の発現を活性化する。活性物質テトラサイクリンの添加はＤＮＡ結合、従って標的遺伝子活性化を阻害する。この調節可能な遺伝子発現システムは、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；Ｆｒｕｈ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：４１５−４１８；Ｃｈａｏら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（８）：４８８３−４８９８；Ｈａｌａｐｐｎａｖａｒら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５２）：３７０９７−３７１０４；またはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌａｇら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１）：６９７−７０４に記載されている。
【００４３】
この調節Ｔｅｔシステムの変形は逆トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）である。このシステムにおいては、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９：５５４７−５５５１；Ｌｉｎｓｔｅｄｔら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８：１０７３−１０８７；Ｍｅｈｌｅｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：８０１−８０４；またはＪｏｏｓｓｅら、２０００、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：３０７５−３０８２に記載されているように、野生型ＴｅｔＲは変異ＴｅｔＲ（ｒＴｅｔＲ）に置換されており、その結果、融合タンパク質は、ドキシサイクリン存在下でのみＤＮＡの遺伝子スイッチ結合部位を結合させ、従って共役標的遺伝子を誘導する。
【００４４】
本発明のさらなる調節可能遺伝子発現システムは、ラパマイシン遺伝子発現システムである。このシステムは、活性物質ラパマイシンにより仲介される、タンパク質ＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰの誘導可能２量体化を含む。これら２つのタンパク質の２量体化は、ＦＲＡＰに結合した活性化ドメインのＤＮＡ結合を起こし、従って共役標的遺伝子のスイッチを入れる。この種の調節可能遺伝子発現システムは、例えば、Ｒｉｖｅｒａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２：１０２８−１０３２に記載されている。
【００４５】
活性物質は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、眼窩内、嚢内、脊髄内、経皮、局所的、経口、または粘膜、例えば鼻腔または口腔を経て、当業者にはよく知られている方法により投与することができる。投与の方法のさらなる例は、全身的または局所的な注射、潅流、またはカテーテルに基づいた投与である。適した経口剤形の例は、錠剤またはカプセル剤である。経肺投与は、例えば、スプレーにより、および皮下に埋め込まれた配置物（dispository）を経て実施する。経皮吸収治療システム（ＴＴＳ）は、例えば、ＥＰ０  ９４４  ３９８−Ａ１、ＥＰ０  ９１６  ３３６−Ａ１、ＥＰ０  ８８９  ７２３−Ａ１またはＥＰ０  ８５２  ４９３−Ａ１に開示されている。
【００４６】
細胞は移植可能であることが好ましい。本発明の移植可能とは、生細胞が同一生体の異なった部位へ、または異なった（レシピエント）生体へ移植できることを意味しており、該細胞は非腫瘍原性細胞であることが好ましく、または細胞が腫瘍細胞に由来する場合は、該細胞はその増殖を阻害するために移植に先立って適切に処理される（例えば有糸分裂不活性化により）（例えば、ＷＯ００／６４４５９およびＵＳ５，１７５，１０３；Ｐｌｅａｓｕｒｅら（１９９２）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２（５）：１８０２−１８１５を参照されたい）。
【００４７】
本発明の移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞は、特にヒト細胞を含めた哺乳動物細胞であり、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコまたはサルから、好ましくはヒトから誘導される。
【００４８】
本発明の細胞の例は、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、心臓細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、神経細胞、骨髄細胞、骨細胞、軟骨細胞、血液細胞、結合組織細胞、および膵臓、腎臓、眼または肺の細胞である。
【００４９】
非全能細胞とは、完全な生体へ独立して発育することが不可能な細胞を意味している。
さらなる態様において、細胞は幹細胞、前駆細胞および／または不死化細胞である。好ましくは、多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。限定されるものではないが成人組織に由来する特に好ましい幹細胞は、神経幹細胞、骨髄幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、ならびに消化管、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤および膵管の幹細胞を含む。
【００５０】
本発明の細胞は、本発明の上記のものを含有し、ヒトまたは動物の生体の組織または臓器が同一のまたは異なったヒトまたは動物の生体内へ移植される前および／または後で、該組織または臓器内へ導入する細胞も含む。
【００５１】
好ましい態様は、細胞株の形態の本発明の細胞に関する。
本発明の細胞株は、例えば、当業者によく知られている方法、例えば遺伝子導入、形質転換または感染により、本発明の上記核酸で細胞株を形質転換するかまたは感染させることによって調製することができる。
【００５２】
本発明のさらなる態様において、核酸は追加として、選択カセット、特に適した遺伝子導入マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子をコードしている。
本発明の選択カセットは、特定の細胞、例えば遺伝子導入された細胞または分化した細胞の特異的選択を与える少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列である。
【００５３】
この種の選択のため、例えば、分化マーカー遺伝子、遺伝子導入マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子を使用することが可能である。このように使用される遺伝子は、主として、特定の毒性物質、例えば抗生物質への耐性を仲介する遺伝子である。これに関連して最も頻繁に使用される抗生物質は、ネオマイシン、ハイグロマイシン（ｈｐｈ）、ゼオシン（Ｓｈ  ｂｌｅ）およびピューロマイシン（ｐａｃＡ）である。特に幹細胞を選択するための、この種の遺伝子の他の例は、例えば、蛍光マーカー、例えばＧＦＰの発現を調節する遺伝子であり、その助けにより、選択すべき細胞を蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）で精製することができる。選択マーカーの他の例は、表面分子、例えば増殖因子レセプターであり、その助けにより、細胞を磁気免疫ビーズで濃縮することができる（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２７６、１７１９−１７２４、１９９７）。他の例は酵素活性（例えばチミジンキナーゼ）をコードする遺伝子であり、それは毒性物質の前駆体、「プロドラッグ」（例えばガンシクロビル）を毒性物質へ変換する。この場合ネガティブ選択が起こり、即ち、遺伝子の上流のプロモーターを発現しない細胞のみが生存する。
【００５４】
本発明の選択カセットのさらに可能な遺伝子は、ｌａｃＺ（β−ラクタマーゼをコードする）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシン  デアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、およびキサンチングアニン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）である。当業者は、必要に応じて、該遺伝子、例えば追加の核酸配列の機能を確実にするためまたは増加させるために使用することができる試薬に熟知している。
【００５５】
好ましい態様において、核酸はさらにＮＫ細胞および／またはキラー細胞、好ましくはヒトＭＨＣクラスＩ分子、キメラＭＨＣクラスＩ分子またはウイルスＭＨＣクラスＩ相同体を阻害する分子をコードしている。
【００５６】
キラー細胞は、自発性または後天の性細胞毒性の可能性を有する単核細胞の不均一な集団として当業者に公知である。ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）とは、天然に存在する、即ち、免疫応答の結果ではなく、従って抗原特異的に誘導されないキラー細胞を意味する。
【００５７】
本発明はさらに、本明細書においてすでに詳細に説明したように、少なくとも１つの免疫モジュレータ、および活性物質の添加により調節できる少なくとも１つの遺伝子発現システムをコードする核酸に関する。
【００５８】
核酸は同様に、遺伝子発現を調節する少なくとも１つの要素をコードしていることが好ましい。これらの要素とは、例えばプロモーターまたは調節核酸配列を意味している。これらおよび発現ベクター（以下により詳細に例示されている）は、核酸を発現するために適した条件を作り出すことができる。発現ベクターは一般に、特定の細胞に、または各々の場合に転写されるべき遺伝子に適したプロモーターを含む。
【００５９】
真核生物における構成的発現を可能にする調節可能な要素の例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより認識されるプロモーターである。全ての細胞および組織型における構成的発現のためのこの種のプロモーターは、例えばｐＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＴＫ（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１α（伸長因子１−α）プロモーター、ＳＶ４０（サルウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーターおよびｐＵＢ（ユビキチン）プロモーターである。
【００６０】
真核生物において細胞または組織特異的発現を可能にする調節可能な要素の例は、特定の細胞型においてのみ発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、またはプロモーターもしくはエンハンサーの活性化配列である。こうしたプロモーターの例は、膵β細胞のインスリンプロモーター、神経細胞のＳｏｘ−２プロモーター、筋肉細胞のミオシン重鎖プロモーター、内皮細胞のＶＥ−カドヘリンプロモーターおよび上皮細胞のケラチンプロモーターである。
【００６１】
真核生物における調節可能な発現を可能にする調節可能な要素のさらなる例は、対応するリプレッサーと組み合わされたテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓｅｎ  Ｍ．ら（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５、５１６−２０）。
【００６２】
発現は同様に、量に関しておよび／または時間の関数として発現に影響する調節ヌクレオチド配列を経て調節することができる。これらには、例えば、エンハンサー配列、リーダー配列、ポリアデニル化配列、ＩＲＥＳ配列、イントロン、インスレーター配列およびリプレッサー配列が含まれる。
【００６３】
本発明の核酸は、１以上の核酸分子上に位置することができる。しかしながら、多数の核酸分子の場合、これらは本発明に従って機能的に協力しなければならない。例えば、本発明に従って、（ｉ）遺伝子スイッチ分子の配列、（ｉｉ）遺伝子スイッチ結合部位の調節下にある免疫モジュレータの配列、および（ｉｉｉ）選択マーカーの配列は、３つの異なった核酸分子上に位置することが可能である。核内での遺伝子スイッチ分子の転写のため、翻訳後に細胞質中で産生される遺伝子スイッチタンパク質は、順に、核内で免疫モジュレータ配列の遺伝子スイッチ結合部位へ結合し、それらの発現を調節することができる。
【００６４】
したがって、本発明はさらに、少なくとも１つの本発明の核酸を含むベクターにも関する。
本発明の可能なベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現ベクターおよび遺伝子治療において活性なベクターである。
【００６５】
本発明の発現ベクターは、少なくとも１つの本発明の核酸、少なくとも１つの翻訳開始シグナル、１つの翻訳終結シグナルおよび／または真核生物における発現のための１つのポリアデニル化シグナルを含む。
【００６６】
特に哺乳動物細胞における発現のための、この種の発現ベクターは、なかでも市販されている例えばｐＩＲＥＳ（クローンテック、ハイデルベルグ、ドイツ）、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ、マンハイム、ドイツ）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、ＵＳＡ）およびｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ）であり、または個々の要素から個々に組み立てることができる。
【００６７】
遺伝子治療において活性な本発明のベクターの例は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスのレプリコンに基づいたベクターである（例えばＬｉｎｄｅｍａｎｎら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８；Ｋｈｒｏｍｙｋｈ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：５５５−６９を参照されたい）。
【００６８】
遺伝子治療において活性なベクターは、本発明の核酸フラグメントとリポソームを複合体形成させることによって得ることもできる。レポフェクションは、リポソーム懸濁液を超音波処理することによる、カチオン性脂質からの小さな単層小胞の調製を包含する。ＤＮＡは、リポソーム表面へイオン的に、そして総正電荷が保持され、１００％のプラスミドＤＮＡがリポソームと複合体形成するような比で結合されている。脂質混合物ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）に加え、多数の新規脂質製剤がその間に合成され、多様な細胞株において遺伝子導入効率が試験された（Ｂｅｈｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１８９、１９５−２０３；Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２５５０−２５６１）。該新規脂質製剤の例は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルサルフェート）およびＤＯＧＳ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。細胞内への核酸の輸送を増加させる賦形剤の可能な例は、核酸の核内への輸送を可能にする、ＤＮＡに結合したタンパク質もしくはペプチド、または合成ペプチドＤＮＡ分子である（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：２８２；Ｂｒａｎｄｅｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｓ．１７：７８４）。賦形剤は、核酸の細胞質内への放出を可能にする分子（Ｐｌａｎｃｋら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒら、１９９７、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８、２１３）、または、例えばリポソーム（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｉｍａｎｎ、１９９０、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０、５４４）も含む。本発明の細胞は、異種遺伝子を発現するために使用することもできる。
【００６９】
遺伝子治療ベクターは、遺伝子導入（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降）または感染により細胞内へ導入することができる。
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明の細胞、ならびに適した賦形剤および／または添加剤を含む、医薬品に関する。
【００７０】
本発明の医薬品は、例えば以下の疾患、
（ａ）リウマチ性障害、例えば関節リウマチ、シェ−グレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群またはベーチェット病、
（ｂ）Ｉ型糖尿病またはＬＡＤＡ、
（ｃ）甲状腺の自己免疫疾患、例えばグレーブス病、
（ｄ）中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、
（ｆ）皮膚疾患、例えば乾癬または神経皮膚炎、
（ｇ）炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎またはクローン病、
（ｈ）免疫障害、
（ｉ）血管疾患、および
（ｊ）移植により生ずる疾患、例えば移植片拒絶、
の予防および／または治療のために使用することができる。
【００７１】
例えば医薬品を安定化させおよび／または保存するために働く、適した賦形剤および添加剤は、一般的に当業者によく知られている。これらには、例えば、生理的食塩水、デキストロースリンゲル液、乳酸リンゲル液、ウィスコンシン大学液／ＶｉａＳｐａｎ（登録商標）（Ｂｅｌｚｅｒ  ＵＷ）、ユーロコリンズ液、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、フィコール、ペルフルオロカーボン、脱塩水、安定化剤、抗酸化剤、錯化剤、抗菌化合物、プロテイナーゼ阻害剤および／または不活性ガスが含まれる。
【００７２】
本発明の医薬品は、それらが投与されるべき特定の型の細胞、組織または臓器に適した方法に従って投与される。この種の方法は当業者によく知られている。それらによれば、本医薬品は、例えば以下のように投与することができる：
・  肝細胞に対しては静脈内、
・  心筋細胞に対しては筋肉内または他のカテーテルに基づいた投与、そして
・  β細胞に対しては皮下、静脈内、腹腔内、カプセル化もしくは筋肉内。
【００７３】
医薬品は、細胞を患者から取り出し、例えばＤＮＡ遺伝子導入により遺伝子組換えされ、そして患者へ再導入するｅｘ  ｖｉｖｏアプローチにより、あるいは遺伝子治療において活性な本発明のベクターを、裸のＤＮＡの形で、または本発明のウイルスもしくは非ウイルスベクターまたは本発明の細胞を使用することにより、患者の体内へ導入するｉｎ  ｖｉｖｏアプローチにより、生体内へ導入することができる。
【００７４】
医薬品の投与量は、例えば体重、一般的健康状態、体表面のサイズ、患者の年齢および他の医薬品との相互作用のような多数の因子に依存することが知られている。投与量は同様に、投与の型にも依存する。したがって、投与量は各々の患者に対し、当業者により個々のケースで決定されなければならない。医薬品は、１日当たり１回または数回、そして数日にわたって投与することができる；このこともまた当業者が決定することができる。
【００７５】
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明の細胞を含む、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／またはヒトもしくは哺乳動物の臓器に関する。
本発明の用語、臓器特異的組織および哺乳動物の臓器は、例えば哺乳動物の臓器である心臓、皮膚、膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、神経、眼、肺、骨髄、軟骨、骨、血管、結合組織、および該臓器の各々の組織を含む。
【００７６】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物にも関する。
トランスジェニック動物は通常、組織特異的に増加した核酸の発現を示し、従って、例えば免疫応答を分析するのに非常に適している。トランスジェニックマウスを使用することが好ましい。
【００７７】
本発明のヒト以外の哺乳動物の例は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコまたはサルである。
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物へ移植するための使用に関する。本発明の移植は、好ましくは自家移植、同種移植または異種移植である。
【００７８】
移植とは、例えば細胞、組織および臓器のような生体物質を、同一生体の異なった部位へ（自家移植）、または１つの生体（ドナー）から別の生体（レシピエント）へ移すことあるいは移植することとして当業者に理解されている。異なった生体への移植の場合、区別は以下のようになされている：
・  ドナーとレシピエントが同一種に属し、遺伝的に完全にまたは実質的に同一である同系移植（synotransplantation）、
・  ドナーとレシピエントが同一種に属するが、免疫学的に異なる同種移植、そして
・  ドナーとレシピエントが同一種に属さず、その結果として免疫学的に完全に異なる異種移植。
【００７９】
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、哺乳動物またはヒトにおける移植片拒絶を阻害するための使用に関する。
【００８０】
本発明の哺乳動物とは、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコまたはサルを意味している。
移植片拒絶とは、移植された材料、例えば細胞、組織または臓器がレシピエントの生体により拒絶されるプロセスとして当業者に理解されている。拒絶は細胞性免疫および体液性免疫により起こる。拒絶の原因は、移植された材料とレシピエントのあいだのタンパク質構造の相違である。移植された組織のタンパク質構造は、レシピエントの免疫系により免疫原性であると認識され、それにより免疫応答が誘発される。
【００８１】
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、移植から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための使用に関する。こうした疾患の例は、本発明の医薬品の応用分野に関連してすでに前に記述されている。
【００８２】
移植片拒絶を阻害するための、そして移植から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための、本発明の使用は、例えば本発明の細胞、組織および／または臓器をヒトまたは哺乳動物へ導入することにより行うことができる。本発明の免疫モジュレータの発現は、本発明の調節可能遺伝子発現システムを経て調節される。調節は、本発明の活性物質を投与することにより、または投与を中断することにより実施され、それにより遺伝子スイッチ分子を活性化または不活性化する。活性化の場合、遺伝子スイッチは、免疫モジュレータをコードする標的遺伝子の転写を活性化する。結果として発現された該免疫モジュレータは、移植された細胞、組織または臓器に対する免疫系の防御的応答を、特にヒトまたは哺乳動物の生体の移植領域において本質的に阻害する。
【００８３】
細胞の使用に基づいた処置は、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、非全能性胚性幹細胞または非全能性胚性生殖細胞または成人組織に由来する幹細胞の誘導体から本発明の細胞を選択することにより達成することができる。成人組織に由来する好ましい幹細胞は、ヒトまたは哺乳動物内へ導入された神経幹細胞、骨髄の幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、ならびに消化管、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤および膵管の幹細胞を含む。
【００８４】
本発明はまた、本発明の細胞を調製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む：
ａ．  少なくとも１つの本発明の核酸および／または少なくとも１つの本発明のベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
ｂ．  遺伝子スイッチ分子を調節するための少なくとも１つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること。
【００８５】
本発明の核酸、ベクター、分化マーカー遺伝子または遺伝子導入マーカー遺伝子、または細胞を細胞内へ導入するため、当業者によく知られている遺伝子導入、形質転換、電気穿孔または注入の標準法を使用する。
【００８６】
核酸の発現を引き起こすかまたは促進するのに適した条件は、本明細書において上にすでに説明されている。これらには、例えば発現ベクター、プロモーター、および調節可能核酸配列、例えばエンハンサー、ポリアデニル化配列が含まれる。
【００８７】
本発明はまた、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関するものであり、以下の工程を含む：
ａ．  少なくとも１つの本発明の核酸および／または少なくとも１つの本発明のベクター、ならびに少なくとも１つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも１つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ導入すること、
ｂ．  工程ａの細胞を分化させること、
ｃ．  工程ｂの分化細胞を選択すること、および
ｄ．  工程ｃの選択された細胞を、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織内および／またはヒトもしくは哺乳動物の臓器へ導入すること。
【００８８】
さらなる態様において、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法における工程ａの後、前または同時に、非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカーを導入することが好ましく、そして工程ａの後に、工程ａの遺伝子導入された細胞を選択することが好ましい。
【００８９】
本発明の核酸を含有する細胞の分化は、例えば胚様体形成により、好ましくは細胞を溶液中で培養することにより、細胞を高密度で培養することにより、細胞凝集により、分化阻害物質（例えばＬＩＦまたはフィーダー細胞により条件付けされた培地）を除去しながらフィーダー細胞上での培養を解除することにより、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ビタミン（例えばニコチンアミド）、レチノイン酸、酪酸ナトリウムまたはＤＭＳＯを培養細胞に加えることにより、または分化を開始させることが知られている他の物質を加えることにより、誘導することができる。
【００９０】
細胞を選択するための多数の方法が知られている。
分化した胚性幹細胞から細胞を選択するための方法は、例えば、Ｋｌｕｇら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６  Ｊｕｌ  １；９８（１）：２１６−２４）およびＳｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０００  Ｆｅｂ．；４９（２）：１５７−６２）に記載されている。
【００９１】
１つの好ましい選択の方法において、本発明の選択カセットは、抗生物質耐性遺伝子であるマーカー遺伝子を含む。細胞は、分化工程の間にまたは後に適した抗生物質を加えた後、分化細胞を濃縮することにより選択または単離される。マーカー遺伝子を発現する分化細胞のみが、抗生物質に対して耐性である。未分化細胞は死滅する。遺伝子導入細胞の選択も同一の方法により実施することができる。
【００９２】
本発明の抗生物質とは、本発明の選択カセットとして使用された抗生物質耐性遺伝子により耐性が生ずる抗生物質を意味している。培養幹細胞への抗生物質の添加後、本質的に、レポーター遺伝子発現ベクターを含有する幹細胞のみが生き残りそして分化する。
【００９３】
本発明の選択カセットの遺伝子がルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質および／または黄色蛍光タンパク質をコードする選択方法を適用することも可能である。選択されるべき細胞は、蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使って単離するか、またはアフィニティー精製により選択する。
【００９４】
さらに表面分子、例えば磁気免疫ビーズを使った増殖因子レセプターによって細胞を濃縮することも可能である（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２７６、１７１９−１７２４、１９９７）。
【００９５】
第２マーカー遺伝子を細胞へ導入できることが好ましく、それにより、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の工程ａに従った核酸および／またはベクターがうまく導入された細胞の選択を実施することを可能にする。この２重選択は、所望の細胞の約９０％、好ましくは約９５〜１００％純粋な集団を得ることを可能にする。
【００９６】
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む：
ａ．  少なくとも１つの本発明の核酸および／または少なくとも１つの本発明のベクター、ならびに少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも１つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および／または不死化細胞へ導入すること、
ｂ．  工程ａの遺伝子導入細胞を選択すること、
ｃ．  工程ｂに従って選択された細胞を、少なくとも１つのヒト以外の哺乳動物胚盤胞へ導入すること、
ｄ．  工程ｃの胚盤胞または工程ｄの胚をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
ｅ．  該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること。
【００９７】
好ましい態様において、幹細胞は多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む：
ａ．  少なくとも１つの本発明の核酸および／または少なくとも１つの本発明のベクター、ならびに少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の２つの前核のいずれかに導入すること、
ｂ．  工程ａの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
ｃ．  該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること。
【００９８】
精管切断したオスと交尾することにより偽妊娠させたヒト以外の哺乳動物養母が好ましい。
養母へ未分化胚芽細胞および／または卵母細胞を導入するための方法は、当業者に知られている。導入は、例えばファロピー管または子宮内への注入により実施することができる（例えばＨｏｇａｎ，Ｂ．、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．およびＬａｃｙ，Ｅ．、実験室マニュアル（１９９４）、コールドスプリングハーバー研究所出版、１７３−１８１頁を参照されたい）。
【００９９】
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、例えば、該ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物から、例えばマウスの尾からゲノムＤＮＡを抽出することにより同定することができる。続くＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）解析において、本発明の核酸に対する導入遺伝子を特異的に認識するプライマーを使用する。ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは、このようにして検出することができる。
【０１００】
また、サザンブロットにより同定を実施することも可能である。この場合、ゲノムＤＮＡを膜に転写し、ＤＮＡプローブ、例えば、探している導入遺伝子に特異的な放射性標識ＤＮＡプローブにより検出する。
【０１０１】
ヒト以外の幹細胞、卵母細胞、前駆細胞または不死化細胞を再生してヒト以外のトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを得ることによる、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法は、例えばＤＥ１９６  ２５  ０４９号およびＵＳ４，７３６，８６６号；ＵＳ５，６２５，１２２号；ＵＳ５，６９８，７６５号；ＵＳ５，５８３，２７８号およびＵＳ５，７５０，８２５号から当業者に公知であり、そして、例えば、本発明の発現ベクターを胚もしくは精母細胞へ直接注入することにより、または発現ベクターの胚性幹細胞への遺伝子導入を経ることにより作製できるトランスジェニック動物を含む（例えば、Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４：トランスジェニック動物技術：実験室ハンドブック、アカデミックプレス、ロンドン、ＵＫの中のＰｏｌｉｔｅｓおよびＰｉｎｋｅｒｔ：ＤＮＡマイクロインジェクション及びトランスジェニック動物の作製、１５−６８頁；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  １９９７、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム、オランダ；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記文献中のＤｏｅｔｓｃｈｍａｎ：胚性幹細胞への遺伝子移入、１１５−１４６頁；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記文献中のＷｏｏｄ：レトロウイルス介在遺伝子移入、１４７−１７６頁；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記文献中のＭｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ：遺伝子移入技術：代替技術及び応用、１７７−２２０頁を参照されたい）。
【０１０２】
トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを作製するための多数の方法は、なかでもＷＯ９８／３６０５２号、ＷＯ０１／３２８５５号、ＤＥ１９６  ２５  ０４９号、ＵＳ４，７３６，８６６号、ＵＳ５，６２５，１２２号、ＵＳ５，６９８，７６５号、ＵＳ５，５８３，２７８号およびＵＳ５，７５０，８２５号から、同様に当業者には公知であり、そして、例えば、本発明のベクターを胚もしくは精母細胞へ直接注入することにより、またはベクターもしくは核酸を胚性幹細胞へ遺伝子導入をすることにより作製できるトランスジェニック動物を含む（Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４：トランスジェニック動物技術：実験室ハンドブック、アカデミックプレス、ロンドン、ＵＫの中のＰｏｌｉｔｅｓおよびＰｉｎｋｅｒｔ、１５−６８頁：Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記文献中の１１５−１４６頁、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎも参照されたい）。
【０１０３】
さらなる態様において、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器を調製するための本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、および本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法で使用される幹細胞は、多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。
【０１０４】
本発明は同様に、本発明の前述の方法により作製されたヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、および該哺乳動物の子孫に関する。
本発明はさらに、同種移植および／または異種移植のためにヒトもしくは動物の細胞、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／またはヒトもしくは哺乳動物の臓器を得るための、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の使用に関する。
【０１０５】
細胞移植は、例えば、体内移植方法によって、または血管壁を通したカテーテル注入法によって実施することができる。
本発明に従って得ることとは、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の生体から、細胞、組織および／または臓器を取り出すことを意味する。こうした取り出し方法はよく知られている。
【０１０６】
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および／または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、薬理的に活性な成分を発見するため、および／または毒性物質を同定するための使用に関する。
【０１０７】
この種の方法は、例えば、本発明の細胞を、例えば９６ウェルマイクロタイタープレートにまき、続いて、研究されるべき薬理学的に活性なまたは毒性の物質を加え、次に、該物質が死細胞数を増加させたかどうかを細胞計数によって分析することから成るであろう。
【０１０８】
本発明の用語、薬理学的に活性な成分および毒性物質とは、適した条件下、哺乳動物またはヒトの個々の細胞、個々の組織、個々の臓器、または全生体に対して薬理学的または毒性の影響を発揮するすべての分子、化合物および／または組成物および物質混合物を意味している。
【０１０９】
可能な薬理学的に活性な成分および毒性物質は、単純な化学（有機または無機）分子または化合物、核酸または核酸類似体、核酸のアンチセンス配列、ペプチド、タンパク質または複合体および抗体であることができる。例は、物質ライブラリーに由来し、その薬理活性または毒性活性が研究されている有機分子である。
【０１１０】
薬理学的に活性な成分とは、例えば以下に影響する成分である：
・  細胞が分割および／または生き残るための能力、
・  タンパク質の分泌、例えば膵β細胞からのインスリン、神経細胞からのドーパミン、
・  筋肉細胞の収縮、
・  細胞の遊走行動、
・  細胞の代謝活性、
・  細胞の電気生理学的活性、
・  細胞生成物の酵素活性、
・  細胞分化、
・  組織または臓器への細胞の組織化。
【０１１１】
哺乳動物またはヒトの全生体へ適用されたとは、例えば以下に対する影響を意味している：
・  心臓血管系、
・  内分泌系、
・  胃腸系、
・  神経系、および
・  代謝活性。
【０１１２】
毒性物質の例は、以下のような活性成分である：
・  特定のシグナル、例えばストレスに続いて、アポトーシスを起こすように細胞を刺激する、
・  心臓血管系に影響する、
・  神経系に影響する、および／または
・  代謝活性に影響する。
【０１１３】
同定された薬理学的に活性な成分および毒性物質は、適切な場合、本明細書において前に例として述べたように、移植片から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療のための、診断薬または医薬を製造するのに適した添加剤および／または賦形剤と組み合わせまたは一緒に使用することができる。
【０１１４】
本発明はまた以下の項にも関する：
（ｉ）  ヒトまたは動物の非全能性細胞であって、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも１つの免疫モジュレータをコードする少なくとも１つの核酸を含む、前記細胞。
（ｉｉ）  幹細胞、前駆細胞および／または不死化細胞であることを特徴とする、（ｉ）に記載の細胞。
（ｉｉｉ）  多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、（ｉ）または（ｉｉ）に記載の細胞。
（ｉｖ）  細胞株の形態の、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｖ）  調節できる遺伝子発現システムがプロゲステロン遺伝子発現システム、テトラサイクリン発現システムおよび／またはラパマイシン遺伝子発現システムであることを特徴とする、（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｖｉ）  免疫モジュレータが以下の機能的特質の少なくとも１つを有することを特徴とする、（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１項に記載の細胞：
ａ．  Ｔ細胞により仲介される抗原認識の阻害、
ｂ．  Ｔ細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
ｃ．  Ｔ細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
ｄ．  Ｔ細胞の増殖の阻害、
ｅ．  Ｔ細胞の生存を支援する分子の阻害、
ｆ．  Ｔ細胞のエフェクター分子（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γなど）の阻害、
ｇ．  Ｔ細胞の接着の阻害、
ｈ．  Ｔ細胞同時刺激性相互作用の阻害（リンパ球の活性化は２つのシグナルを経て起こる：第１に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第２にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する；この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる）、
ｉ．  例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および／またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
ｊ．  例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中性顆粒球およびＮＫ細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
ｋ．  補体系成分の阻害、
ｌ．  外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および／または
ｍ．  炎症反応の阻害。
（ｖｉｉ）  免疫モジュレータが抗体であることを特徴とする、（ｉ）〜（ｖｉ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｖｉｉｉ）  免疫モジュレータが
ａ．  レセプター、
ｂ．  可溶性分泌型レセプター、
ｃ．  分泌されたタンパク質またはペプチド、
であることを特徴とする、（ｉ）〜（ｖｉ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｉｘ）  免疫モジュレータが、変異ＩＬ−１５およびＦｃフラグメントの融合タンパク質であり、該Ｆｃフラグメントは変異ＩＬ−１５分子のＣ末端へ、好ましくはヒンジ領域を経て融合されていることを特徴とする、（ｖｉｉｉ）に記載の細胞。
（ｘ）  抗体のＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、特に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくは類似の哺乳動物ＩｇＧまたはＩｇＭ、特に、ヒトＩｇＭ若しくは類似の哺乳動物ＩｇＭのＦｃフラグメントであることを特徴とする、（ｉｘ）に記載の細胞。
（ｘｉ）  核酸が追加として選択カセット、特に、適した遺伝子導入マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子をコードすることを特徴とする、（ｉ）〜（ｘ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｘｉｉ）  核酸が追加として、ＮＫ細胞および／またはキラー細胞を阻害する分子をコードすることを特徴とする、（ｉ）〜（ｘｉ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｘｉｉｉ）  核酸が追加として、
ａ．  樹状細胞、
ｂ．  単球および／またはマクロファージ、
ｃ．  Ｂ細胞、
ｄ．  多形核細胞、例えば好中性顆粒球、
を阻害する分子をコードする、（ｉ）〜（ｘｉ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｘｉｖ）  該阻害性分子が、ヒトＭＨＣクラスＩ分子、キメラＭＨＣクラスＩ分子またはウイルスＭＨＣクラスＩ相同体であること特徴とする、（ｘｉｉｉ）に記載の細胞。
（ｘｖ）  少なくとも１つの免疫モジュレータ、および活性物質を加えることにより調節できる少なくとも１つの遺伝子発現システムをコードする核酸。
（ｘｖｉ）  （ｘｖ）に記載の少なくとも１つの核酸を含むベクター。
（ｘｖｉｉ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞、および適した賦形剤および／または添加剤を含む医薬。
（ｘｖｉｉｉ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞を含む、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器。
（ｘｉｘ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
（ｘｘ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の細胞、および／または（ｘｖｉｉｉ）に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物への移植のための使用。
（ｘｘｉ）  同種移植、自家移植または異種移植であることを特徴とする、（ｘｘ）に記載の使用。
（ｘｘｉｉ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の細胞、（ｘｖ）に記載の核酸、（ｘｖｉｉｉ）に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、適当な場合には少なくとも１つの免疫モジュレータの存在下での、ヒトまたは哺乳動物における移植片拒絶を阻害する医薬を製造するための使用。
（ｘｘｉｉｉ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の細胞、（ｘｖ）に記載の核酸、（ｘｖｉｉｉ）に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植から生ずる疾患および／または自己免疫疾患の予防および／または治療用の医薬を製造するための使用。
（ｘｘｉｖ）  （ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の細胞を調製するための方法であって、以下の工程：
ｃ．  （ｘｖ）に記載の少なくとも１つの核酸および／または（ｘｖｉ）に記載の少なくとも１つのベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
ｄ．  遺伝子スイッチを調節するための少なくとも１つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること、
を含む、前記方法。
（ｘｘｖ）  （ｘｖｉｉｉ）に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ｅ．  （ｘｖ）に記載の少なくとも１つの核酸および／または（ｘｖｉ）に記載の少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも１つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ導入すること、
ｆ．  工程ａの細胞を分化させること、
ｇ．  工程ｂの分化細胞を選択すること、および
ｈ．  工程ｃの選択された細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む、前記方法。
（ｘｘｖｉ）  工程ａの後、前または同時に、少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカーを、少なくとも１つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ導入し、工程ａの後に、工程ａの遺伝子導入された細胞を優先的に選択することを特徴とする、（ｘｘｖ）に記載の方法。
（ｘｘｖｉｉ）  幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、（ｘｘｖ）または（ｘｘｖｉ）に記載の方法。
（ｘｘｖｉｉｉ）  （ｘｖｉｉｉ）に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程：
ｆ．  （ｘｖ）に記載の少なくとも１つの核酸および／または（ｘｖｉ）に記載の少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも１つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および／または不死化細胞へ導入すること、
ｇ．  工程ａの遺伝子導入細胞を選択すること、
ｈ．  工程ｂに従って選択された細胞を、少なくとも１つのヒト以外の哺乳動物の胚盤胞へ導入すること、
ｉ．  工程ｃの胚盤胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
ｊ．  該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
（ｘｘｉｘ）  幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、（ｘｘｖｉｉｉ）に記載の方法。
（ｘｘｘ）  （ｘｉｘ）に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程：
ｄ．  （ｘｖ）に記載の少なくとも１つの核酸および／または（ｘｖｉ）に記載の少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の２つの前核のいずれかに導入すること、
ｅ．  工程ａの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
ｆ．  該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
（ｘｘｘｉ）  （ｘｘｖｉｉｉ）または（ｘｘｉｘ）に記載の方法により作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
（ｘｘｘｉｉ）  （ｘｘｘ）に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
（ｘｘｘｉｉｉ）  （ｘｉｘ）、（ｘｘｘ）および（ｘｘｘｉ）のいずれか１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、同種移植および／または異種移植用のヒト以外の細胞、ヒト以外の臓器特異的組織、および／またはヒト以外の哺乳動物の臓器を得るための使用。
（ｘｘｘｉｖ）  （ｘｉｘ）、（ｘｘｘ）および（ｘｘｘｉ）のいずれか１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、（ｘｖｉｉｉ）に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理学的に活性な成分を発見するため、および／または毒性物質を同定するための使用。
【０１１５】
以下の図面および実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、本発明を限定するものではない。
本発明の遺伝子スイッチは、以下の３つの機能単位から成るキメラタンパク質である：
ｉ  ）遺伝子スイッチ結合ドメインＵＡＳを認識するＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ−ＤＢＤ）。本発明のＵＡＳ配列は、１７ヌクレオチドの配列モチーフの４つのコピーを含み、そのモチーフの各々は、２つのＧａｌ４−ＤＢＤ分子のための結合部位として働くことができる。
ｉｉ）  遺伝子スイッチへの活性物質ミフェプリストーンの結合を仲介し、そして遺伝子スイッチタンパク質の２量体化による活性コンホメーションへの変換を起こす、ヒトプロゲステロンレセプターの切断型リガンド結合ドメイン（ＰＲ−ＬＢＤ）。
ｉｉｉ）  遺伝子スイッチによって標的遺伝子の転写を活性化する、ｐ６５活性化ドメイン（Ｐ６５−ＡＤ）。
【０１１６】
ミフェプリストーン非存在下では、上流に偏在性の弱い基礎最小チミジンキナーゼプロモーター（ｐＴＫ）を経て、少量の遺伝子スイッチが転写される。しかしながら、これらの遺伝子スイッチ分子は、単量体として存在し、それ故、ＤＮＡ領域と結合できず、また転写を開始することができない。活性物質ミフェプリストーンの添加後、遺伝子スイッチシステムが活性化される。リガンド−結合遺伝子スイッチホモ２量体は、ＵＡＳ配列を含有するＤＮＡ領域（例えばＭｕｔＩＬ１５−ｍＦｃのためのＴＡＴＡプロモーター調節遺伝子の上流の調節領域など）へ結合し、従って、免疫変調タンパク質の転写を活性化する。加えて、ＵＡＳ配列を有するＤＮＡ領域は、遺伝子スイッチタンパク質遺伝子のＴＫプロモーターの上流に位置しているので、該遺伝子スイッチタンパク質それ自身の転写が、自己調節フィードバック機構で同時に活性化され、従って、活性遺伝子スイッチの量を増加させる。
【０１１７】
細胞株から調製された、本発明の移植可能細胞は、例えば、抗生物質ネオマイシン（Ｎｅｏ−Ｒ）およびハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏ−Ｒ）に耐性のマーカー遺伝子をさらに含むことができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｐＧＫ）のごとき、偏在性プロモーターにより調節されるマーカー遺伝子は、ＤＮＡ構築物の取り込みで細胞を選択するために役に立つ。例えば、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）のごとき、細胞型特異的プロモーターにより調節されるマーカー遺伝子は、特異的細胞型のトランスジェニック細胞を選択するために役に立つ。
【０１１８】
本発明のトランスジェニック動物を作製するため、細胞は少なくとも要素１および２を含んでいなければならない。細胞株からトランスジェニック細胞を調製するためには、細胞は追加として要素３も含むことができる。
実施例
免疫変調タンパク質ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節された発現の作用様式を研究し、示すため、２つの実験モデルを開発した。
ａ）移植のためのトランスジェニック細胞株
このモデルにおいて、幹細胞を、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ免疫モジュレータの調節可能発現のための要素に加えて、特定の細胞型（例えばインスリン産生細胞）の調製を可能にする選択カセット（ＵＳ５，７３３，７２７号参照）を含んでいるベクター構築物で遺伝子導入した。この方法において、未分化トランスジェニック幹細胞から、特定の細胞型の分化細胞を調製し、単離することが可能である。これらのトランスジェニック分化細胞は、適したレシピエントマウス（例えば糖尿病マウス）へ移植することができる。移植された動物がミフェプリストーンで処置された場合、移植細胞はそれら自身でＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生し、従って、それら自身の拒絶を防止する。
ｂ）トランスジェニックマウスモデル
ミフェプリストーンの添加を経たＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節された発現を起こす構築物をゲノムに含む、トランスジェニックマウスを作製した。ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ発現は、偏在性プロモーターにより調節されているので、マウスは、ミフェプリストーンの添加により刺激された場合にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生した。臓器（例えば心臓、腎臓）または細胞（島細胞、神経細胞）をトランスジェニック動物から取り出すことができ、別の、非トランスジェニックマウス内へ移植することができる。移植された動物がミフェプリストーンで処置された場合、移植臓器／細胞はそれ自身、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生し、従って、それ自身の拒絶を防止する。
【実施例１】
【０１１９】
トランスジェニックマウスモデルのためのベクタークローニング
１７×４／ｐＧＬ３  Ｂａｓｉｃベクター（ＴＡＴＡボックスおよび遺伝子スイッチ結合部位として１７オリゴマーの４コピーを有する、プロメガから入手した修飾ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃベクター）中のルシフェラーゼ遺伝子を、追加としてＣＤ５リーダー配列（Ｊｏｎｅｓ  Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３（６０８６）、３４６−３４９、１９８６）を含む、変異ＩＬ−１５タンパク質およびマウスＦｃ部分のための遺伝子（本明細書において以後、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃと称する：Ｋｉｍら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６０：５７４２−５７４８）で置換した。ＣＤ５−ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ遺伝子は、ＳＶ４０ポリＡ配列で終結している（ベクター名：１７×４／ＩＬ１５）。続いて、ＳｂｆＩおよびＰｍｅＩ切断部位を含有するオリゴヌクレオチドを１７オリゴマーの上流に導入した（ベクター名：１７×４／ＩＬ１５／オリゴ）。該切断部位は、ｐｓｗｉｔｃｈベクター（インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ）から単離された、上流調節領域（Ｇａｌ４ＵＡＳ−ＰＴＫ−ＩＶＳ８）を含んでいる、遺伝子スイッチ分子のための遺伝子（ＧＳ＝Ｇａｌ４−ＤＢＤ／ｈＰＲ−ＬＢＤ／ｐ６５−ＡＤ）を導入するために役に立つ（ベクター名：１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳ）。あるいは、および追加として、ＩＶＳ８イントロン（同様にｐｓｗｉｔｃｈから）がＴＡＴＡボックスおよびＣＤ５−ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ遺伝子の開始コドン間に挿入されたベクターを調製した（ベクター名：１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳ）。すべてのクローニング生成物のセグメント間の移行は配列決定により点検した。
【実施例２】
【０１２０】
インスリン産生細胞からのトランスジェニックｉｎ  ｖｉｔｒｏ移植片のためのベクタークローニング
これらのベクターは、トランスジェニックマウスモデルのためのベクターと類似して調製された。しかしながら、これらのプラスミドは追加として、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）により調節されているネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｐＧＫ）により調節されているハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇｒｏ）を含む、フラグメントも含んでいる。これらの要素はＣＤ５−ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ遺伝子の５’より下流に挿入され、あるいは２つの転写方向でクローン化される（ベクター名：１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｎｈ／ＧＳ）。あるいは、および追加として、ＩＶＳ８イントロン（同様にｐｓｗｉｔｃｈから）がＴＡＴＡボックスおよびＣＤ５−ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ遺伝子の開始コドン間に挿入されたベクターを調製した（ベクター名：１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＩＶＳ８／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｎｈ／ＩＶＳ８／ＧＳ）。すべてのクローニング生成物のセグメント間の移行は配列決定によりチェックした。
【実施例３】
【０１２１】
実施例１および２で述べたベクター中のＣＤ５−ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節された発現および分泌のチェック
ｃｏｓ−７細胞（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）およびＡ２９３細胞（Ｑｕａｎｔｕｍ、モントリオール、カナダ）の一時的遺伝子導入を実施した。この目的のため、遺伝子導入１日前に、５〜７．５×１０５細胞／ウェルを６ウェルプレートにまいた。１〜２μｇＤＮＡ／ウェルによる遺伝子導入を、各々の場合に１０ｎｇ／ｍｌの濃度での１０〜２０μｌのＤＮＡと、各々の場合に２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ培地（ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、ドイツ）を混合することにより実施した。平行した実験において、各々の場合に２μｌのリポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、＃１１６６８−０１９）／μｇのＤＮＡと、２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ培地（ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、＃３１９８５−０６２）を混合した。両方の混合物の等量を混合し、室温で２０分放置した。その間、５０〜７０％コンフルエントである細胞を含有する６ウェルプレートをＰＢＳで１回洗浄し、次に各々の場合に、１．５ｍｌの増殖培地／ウェル（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を加えた。各々の場合に、ウェル当たり５００μｌのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を該細胞に滴加した。追加としてミフェプリストーン刺激された細胞に、各々の場合に２μｌのミフェプリストーン（シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ；最終濃度１０−８Ｍ）の１０−５Ｍ  ８０％エタノール溶液（インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ）を与えた。次の日、培地を除去し、そして２ｍｌの新鮮培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を加えた。ミフェプリストーン刺激細胞は、再び追加として各々の場合に、２μｌのミフェプリストーンを受けた。遺伝子導入３日後、培地を細胞から除去し、細胞残渣を除くために遠心分離し、続いて保存のため−８０℃で凍結した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に掻き出し、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器へ移し、各々の場合に、５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１％ＩＧＥＰＡＬ／シグマ、ダイゼンホーフェン、Ｉ−３０２１、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０、１％ＳＤＳ、４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび完全ＥＤＴＡ−フリー  プロテアーゼインヒビターカクテル／ロシュ、マンハイム、ドイツ、＃１８７３５８０、を含んでいるＰＢＳ）を用い、４℃で３０〜６０分溶解させた。遠心分離した溶解物は、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０１２２】
ＣＤ５−ｍｕｔＩＬ１５−ｍＦｃ分泌は、融合タンパク質のマウスＦｃ部分を認識するＥＬＩＳＡにより分析した。この目的のため、９６ウェルプレート（ヌンク、ヴィースバーデン、ドイツ、＃４３９４５４）を各々の場合に、１００μｌの抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（クローンＲ１１−８９、ＢＤファーミンジェン、ハイデルベルグ、ドイツ、＃０２２５１Ｄ−５５３４４６）を用い、３７℃で１時間コーティングした。プレートは続いてＰＢＳで３回洗浄し、非特異的結合部位を飽和させるため、３７℃で１時間、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳとインキュベートした。各々の場合に、１００μｌの非希釈培地を、コーティングされたプレートへ加え、次に室温で１時間インキュベートし、続いて、各々の場合に、２００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回、および各々の場合に、２００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。マウスＦｃ部分を検出するため、酵素−結合ＨＲＰ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体、クローンＲ１９−１５（ＢＤファーミンジェン、ハイデルベルグ、＃０２０１７Ｅ−５５３３９１）を同様に室温で１時間プレートとインキュベートし、そしてプレートは次に上述のように再び洗浄した。結合された融合タンパク質の量は、ＯＰＤ含有基質溶液（２５ｍｌの０．１Ｍクエン酸、２５ｍｌの０．１Ｍリン酸水素２カリウム、Ｈ２Ｏで１００ｍｌとし、＋１錠のＯＰＤ（シグマ、ダイゼンホーフェン、＃Ｐ８４１２）＋４０μｌのＨ２Ｏ２、３０％）添加後の着色反応により可視化し、３Ｍ  ＨＣｌを加えることによって反応を停止させた後、４９０ｎｍにて、ＥＬＩＳＡリーダー（μＱｕａｎｔ、ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）中で測定した。
【０１２３】
さらに、非希釈培地上清は免疫ブロッティングにより分析した。この目的のためには、培地上清をレムリ（Ｌａｍｍｌｉ）試料緩衝液と混合し、９２℃に５分間加熱し、次に１２．５％強度ポリアクリルアミドゲルへ応用し、そして１５０Ｖで電気泳動的に分画した。タンパク質は続いてニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ｕ．Ｓｃｈｕｅｌｌ、ダーセル、ドイツ、ＣＤ０５６４−１）へ移した。非特異的結合部位を飽和させるため、膜を５％粉乳／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で処理した。それは次に、１：５００希釈のマウス抗ヒトＩＬ１５抗体（ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、＃５５４７１２）と、４℃で１６時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でよく洗浄し、次に、１：３０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体（アマシャム、フライブルグ、ドイツ  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ＆ｎｕｍ；ＮＡ９３１０）で、室温で１時間処理した。よく洗浄した後、膜を界面活性剤（ＮＥＮ；バッドホンブルグ、ドイツ、＃ＮＥ１０３Ｅ）を用い、室温で５分処理し、そして着色反応をＸ線フィルムを応用することにより検出した。
【０１２４】
ミフェプリストーンを添加してまたは添加せずに遺伝子導入された細胞の培地上清の分析は、以下の結果を明らかにした：
以下の遺伝子導入を実施した：
１．  ｍＣＤ５．６（ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ分泌に対する陽性対照、ベクターはＣＭＶプロモーター制御下のＣＤ５−ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを含んでいる）
２．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ±ミフェプリストーン（遺伝子スイッチを有しない陰性対照）
３．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ＋ｐｃＤＮＡ３スイッチ±ミフェプリストーン
４．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳ±ミフェプリストーン
５．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳ＋ｐｃＤＮＡ３スイッチ±ミフェプリストーン
６．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳ±ミフェプリストーン
７．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳ＋ｐｃＤＮＡ３スイッチ±ミフェプリストーン。
【０１２５】
遺伝子スイッチ分子を有しない対照ベクター（２．）で遺伝子導入された細胞、およびミフェプリストーンで刺激されなかった細胞においては、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの有意な発現は観察されなかった。単に自己調節遺伝子スイッチ分子（４．＋６．）を含む構築物での遺伝子導入後は、ミフェプリストーン刺激後にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ分泌のわずかな増加が、ＥＬＩＳＡの助けにより検出された。このことは多分、一過的遺伝子導入の過程での自己調節遺伝子活性化による、活性遺伝子スイッチ分子の不十分な形成によるものである。それ故、遺伝子スイッチの量を、一貫して高遺伝子スイッチ産生をもたらすｐｃＤＮＡ３スイッチ（ＣＭＶプロモーター制御下の遺伝子スイッチ）との同時遺伝子導入により外部的に増加させた。これらの同時遺伝子導入において、遺伝子スイッチ−フリー（３．）および遺伝子スイッチ含有（５．＋７．）構築物の両方で遺伝子導入した細胞の培地上清では、ミフェプリストーン処理後、ＥＬＩＳＡにより検出されたＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの量が増加していた。
【０１２６】
【表１】
2006502716.tif 000002
【０１２７】
遺伝子導入３．の培地上清の免疫ブロット分析（図１）から、同様に、非刺激細胞（レーン２）と比較して、ミフェプリストーン刺激後（レーン１）、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ（５０ｋＤａバンド）量の産生が増加したことを確認した。
【０１２８】
これらの結果は、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ融合タンパク質の転写および分泌が、上述のベクター（例えば、１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳ）で遺伝子導入された細胞においてミフェプリストーンの添加により誘導できることを立証している。このことは、調節されたＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ発現の機能性を立証している。
【実施例４】
【０１２９】
実施例１および２で述べたベクター中の遺伝子スイッチタンパク質（Ｇａｌ４ＵＡＳ−ＰＴＫ−ＩＶＳ８−Ｇａｌ４−ＤＢＤ／ｈＰＲ−ＬＢＤ／ｐ６５−ＡＤ）の調節された発現および機能性のチェック
前述のように、自己調節遺伝子スイッチのみを産生する、一過的に遺伝子導入された細胞（１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳでの遺伝子導入）中の、活性遺伝子スイッチ分子の数は少なかった。
【０１３０】
単一細胞レベルでのＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの発現を検出するためには、ＥＬＩＳＡの感度は十分ではないので、ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（インビトロジェン、カールスルーエ）との同時遺伝子導入を実施した。このベクターは、その転写が同様に遺伝子スイッチ結合部位により調節されるｌａｃＺ遺伝子を含んでおり、ミフェプリストーン刺激に基づき、活性遺伝子スイッチを同時に含む細胞でのみ、β−ガラクトシダーゼが産生されることを意味している。該遺伝子スイッチは第２のベクターにより提供した（この場合、自己調節遺伝子スイッチを有する構築物）。β−ガラクトシダーゼは、基質反応によって、個々の細胞内の青い沈殿として検出した。それにより、実質的により高い感度でベクター構築物の機能を検出することが可能である。
【０１３１】
実施例３に記載したように、Ａ２９３細胞を以下の構築物で遺伝子導入し、次に一部、ミフェプリストーンで刺激した：
１．  ｐＣＭＶβ（ｌａｃＺのための陽性対照、ＣＭＶプロモーター制御下のｌａｃＺ遺伝子を含んでいるベクター）、
２．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ＋ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ±ミフェプリストーン（遺伝子スイッチなしの陰性対照）、
３．  １７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳ＋ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ±ミフェプリストーン、
４．  １７×／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳ＋ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ±ミフェプリストーン
５．  ｐｃＤＮＡ３スイッチ＋ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ±ミフェプリストーン（構成的に高い遺伝子スイッチを有する陽性対照）
６．  ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺ±ミフェプリストーン（遺伝子スイッチを有しない陰性対照）。
【０１３２】
遺伝子導入３日後、−２０℃で１０分、細胞を氷冷メタノールで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、次に、ｌａｃＺ染色溶液（６０μｌの４００ｍＭフェリシカン化カリウム、６０μｌの４００ｍＭフェロシカン化カリウム、６０μｌの２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌ、５．５２ｍｌのＰＢＳ）を用い、３７℃で２．５時間処理した。
【０１３３】
遺伝子導入された細胞の光学顕微鏡による評価は、以下の結果を与えた（表２）：
【０１３４】
【表２】
2006502716.tif 000003
【０１３５】
細胞の有意な青色染色は、遺伝子スイッチなしでは観察されなかった（２．）。自己調節遺伝子スイッチで遺伝子導入細胞において（３．＋４．）、ミフェプリストーンによる刺激は、細胞の３〜５％で明瞭な青色染色を起こした。
【０１３６】
この低い数の細胞は非常に少量のＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃのみしか産生しないので、該量はＥＬＩＳＡの検出限界以下である。しかしながら、ｌａｃＺ染色では、個々の細胞でも遺伝子スイッチ活性を記録および検出することが可能である。
【０１３７】
これらの実験は、ミフェプリストーン刺激後に、１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳ構築物により提供される、ｌａｃＺの転写をもたらす、活性化された遺伝子スイッチの能力を立証している。これらのデータは従って、前述の構築物の、自己調節遺伝子スイッチの機能性を立証している。
【実施例５】
【０１３８】
トランスジェニックマウスの作製および特徴付け
構築物１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８／ＧＳの５０μｇのＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、そして各々、所望の４８００ｂｐおよび４９２４ｂｐフラグメントを精製した。該フラグメントは次に、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウスの前核内へ注入し、そして胚は続いて偽妊娠メス内へ移植した。得られたマウスからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ分析の助けを借りて、導入遺伝子の組み込みを試験した。該ＰＣＲにおいて、以下のプライマーを使用した：ＧＳ−ＩＬ１５ＦＷ．２（５’−ＴＡＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  Ｃ−３’）およびＧＳ−Ｌ１５ＲＶ．３（５’−Ｇ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＡＧ−３’）。従って、得られたＰＣＲ生成物は、各々、２１１ｂｐ（イントロンなし）および３３５ｂｐ（ＩＶＳ８イントロンあり）の長さである。
【０１３９】
１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＧＳ構築物の卵母細胞注入から得られた、４４匹のマウスの内、１６匹の動物（３６％）がトランスジェニックであった。
創立動物（Ｆ０世代）を野生型ＤＢＡ／２マウスと交尾させ、そして得られたｆ１子孫は再び、導入遺伝子のゲノムでの存在を試験した。トランスジェニックＦ１動物は続いて、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節された発現を試験した。約８〜１６週の年齢で、動物にゴマ油に溶解した２５０μｇ／ｋｇのミフェプリストーン（シグマ、ダイゼンホーフェン、Ｍ９０４６）を１日おきに、総計で３回、腹腔内へ注射した。最後の注射から１日後に動物を殺し、そしてＲＮＡおよびタンパク質を組織から抽出した。次に、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットの助けを借りて、組織中の遺伝子スイッチタンパク質および免疫モジュレータ発現を分析した。転写された遺伝子スイッチおよび免疫モジュレータの量を決定するため、定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＲＮＡの量を決定した。
【０１４０】
各々の場合、製造者の指示書に従い、１μｇのＲＮＡをＥｘｐａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ロシュ、マンハイム）の助けを借りて、ｃＤＮＡへ転写した。これに続いて、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｋｉｔｓ（ロシュ、マンハイム）の助けを借りて遺伝子スイッチおよび免疫モジュレータＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの発現を調べた。免疫モジュレータを検出するためのＰＣＲ条件は以下の通りである：
変性：９５℃、６００秒
サイクル：９５℃  １５秒、６０℃  ５秒、７２℃  １０秒
プライマーＣＤ５．６−ＦＷ：５’−ＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣ
プライマーＣＤ５．６−ＲＶ：５’−ＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＣ
ＭｇＣｌ２：３ｍＭ。
遺伝子スイッチを検出するためのＰＣＲ条件は以下の通りである：
変性：９５℃、６００秒
サイクル：９５℃  １５秒、５３℃  ５秒、７２℃  １０秒
プライマーＧＳ−ＦＷ：５’−ＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＣＴＣＣＡＡＡＧ
プライマーＧＳ−ＲＶ：５’−ＴＡＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＴ
ＭｇＣｌ２：３ｍＭ。
【０１４１】
さらに、ミフェプリストーン処理前および後に、一定間隔で動物から採血し、その中に含まれているＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの量を、ＥＬＩＳＡで決定した。
同一年齢の、および以前にミフェプリストーンで処理されていない同一トランスジェニック系統のマウスを比較のために使用した。
【０１４２】
もしくは、トランスジェニックマウスを２工程方法で作製した。第１に、遺伝子スイッチ分子のみ（系統「Ａ」）かまたは遺伝子スイッチ結合部位により調節された免疫モジュレータのみ（系統「Ｂ」）を発現する、トランスジェニックマウスの２つの異なった系統を発生させる。得られたＡ系統のトランスジェニックマウスの内、適した量の遺伝子スイッチ分子を発現する動物を選択し、第２の工程において、Ｂ系統のトランスジェニックマウスと交尾させた。得られた子孫は次に、２つの導入遺伝子の同時発現を試験する。この方法において、２重トランスジェニック系統「Ａ／Ｂ」が得られ、それは遺伝子スイッチ分子により調節される免疫モジュレータを発現する。
【０１４３】
構築物ｐｓｗｉｔｃｈ（系統「Ａ」に対して）または１７×４／ＩＬ１５／オリゴおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＩＶＳ８（系統「Ｂ」に対して）の５０μｇのＤＮＡを、適した制限酵素で切断し、そして所望のフラグメントを精製する。該フラグメントは次に、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウスの前核内へ注入し、そして胚は続いて偽妊娠メス内へ移植する。得られたマウスからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ分析の助けを借りて、導入遺伝子の組み込みを試験する。
【実施例６】
【０１４４】
トランスジェニックマウスのドナー臓器からの膵島の移植
膵島移植は、マウスの膵臓から単離された膵島を、糖尿病マウスの腎被嚢下に注入することを含んでいる（Ｆｅｒｒａｒｉ−Ｌａｃｒａｚら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１、Ｖｏｌ．１６７、ｐｐ．３４７８−３４８５）。ドナー膵島は、遺伝子スイッチの制御下でＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを発現するＤＢＡ／２Ｊ系統のトランスジェニックマウスから単離される。臓器除去の日に、検出可能にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生するように、ドナーマウスをミフェプリストーンで前処理（２５０μｇ／ｋｇ）する。膵島を調製するため、ドナー膵臓を原位置でタイプＩＶコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）で潅流する。３７℃で３０分の消化の後、膵島を不連続フィコール濃度勾配で精製し、続いて５．６ｍＭのグルコースを含んでいるＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ、カールスルーエ）で培養する。３００〜４００の膵島を、レシピエントの腎被嚢下で移植する。
【０１４５】
レシピエントは６〜１０週齢の、β細胞毒素ストレプトゾトシン（２２５ｍｇ／ｋｇ；シグマ、ダイゼンホーフェン）を腹腔内へ注射することにより糖尿病が誘導されている、非トランスジェニックＢ６ＡＦ１マウスである。同系膵島（即ち、Ｂ６ＡＦ１マウスの膵島）を対照として糖尿病マウスへ移植する。
【０１４６】
膵島は左腎被嚢下、無菌的に移植する。この目的のため、マウスを麻酔し、肋骨弓下で切断を実行する。左腎臓を腹腔から移動させ、腎被嚢の下極を短く切開する。鈍無菌カニューレを使用し、腎被嚢下にポケットを形成させる。次に、滅菌ピペットチップにより、膵島をこの空洞内へ注入する。続いて、腎臓を腹腔内へ戻し、そして腹部を閉じる。移植の日以後、連続的にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生するように、１日おきにミフェプリストーン（２５０μｇ／ｋｇ）でレシピエント動物を処理する。
【０１４７】
同種移植片機能は、定期的なグルコース測定によりモニターする（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  ＩＩＩ；ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、ドイツ）。糖尿病の誘導前および後、そして膵島移植後に、一定の間隔で動物の尾静脈または延髄後静脈叢から血液を採り、そして血糖レベルを決定する。追加の管理を、尿試験紙を使用して、血液採取の間に実施する。初期移植片機能は、移植３〜５日後に、１１．１ミリモル／ｌ（２００ｍｇ／ｄｌ）以下の血糖含量として定義される。初期移植片機能が観察された後、少なくとも２日連続して、もし、血糖レベルが５００ｍｇ／ｄｌより高くまで増加したら、移植片は拒絶されたとみなされる。
【０１４８】
対照として、ミフェプリストーンが投与されず、そして従って遺伝子スイッチ調節ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを発現しない動物で、またはＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの外的添加で処置された動物で、膵島移植を実施する。
【０１４９】
記述したような様式で処置された動物は、トランスジェニックドナーマウスから得られた膵島細胞の移植後、より良好に血糖レベルを調節することができ、そしてミフェプリストーン処置後、細胞移植片の拒絶が減少する。
【実施例７】
【０１５０】
異所性心臓移植
異所性心臓移植は、ドナー心臓とレシピエントの腹部中の大血管を連結することを含んでいる（Ｏｎｏら、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１９６９、Ｃｏｒｒｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９７３）。ドナー心臓を、遺伝子スイッチ制御下でＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを発現する、ＤＢＡ／２Ｊ系統のトランスジェニックマウスから単離する。ドナーマウスは、臓器除去の日に、検出可能にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生するように、ミフェプリストーンで前処理する（２５０μｇ／ｋｇ）。麻酔マウスの大静脈を分離し、そして全循環系に分布するようにヘパリン（４００Ｕ／ｋｇ）を注入する。動物は続いて腹部血管を切断することにより出血させ、そして胸骨正中切開の助けにより心臓を露出させる。大動脈および肺血管を分離しおよび切断し、そして肺血管および大静脈を４−１０Ｔｅｖｄｅｋ（Ｄｅｋｎａｔａｌ、クイーンズビレッジ）でひとまとめにして結索する。心臓は、その除去直後に、生理学的食塩水（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｓｏｌ、アボット・ラボラトリーズ、イリノイ、ＵＳＡ）中、４℃で保存する。レシピエント（６〜８週齢の非トランスジェニックＢ６ＡＦ１マウス）の下位大静脈および腹部大動脈を露出させ、そして血管にゆるく固定した血管クランプをつける。ドナー大動脈の末端を、８−０プロレン縫合糸によりレシピエント腹部大動脈の側面と結びつける。ドナーの肺動脈を、同一様式でレシピエントの大静脈へ融合させる。血管クランプを取り除き、そして、心臓収縮が再び自発的に開始するように、ドナー心臓を３７℃の乳酸リンゲル液で加熱する。移植の日以後、連続的にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生するように、１日おきにミフェプリストーン（２５０μｇ／ｋｇ）でレシピエント動物を処理する。腹部壁を通して拍動している心臓を触診することにより、１日おきに移植片生存をチェックし、そしてパルスの強度および速度に基づいて、１＋〜４＋のスケールで評価する。心筋収縮がもはや触診不能である場合、心臓が拒絶されたとみなされる。ドナー心臓が、非処置対照動物よりも長い期間にわたって拍動する場合は、拒絶が防止されている。対照として、ミフェプリストーンが投与されず、そして従って遺伝子スイッチ調節ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを発現しない動物で、またはＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの外的添加で処置された動物で、心臓移植を実施する。
【０１５１】
この実施例は、非処置動物と比較して、ミフェプリストーンで処置された動物においてはより長い時間、異所性心臓移植片が機能的に生き残っていることを示している。
【実施例８】
【０１５２】
トランスジェニックＥＳ細胞株の調製
構築物１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｎｈ／ＧＳ、１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＧＳ、１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＩＶＳ８／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｎｈ／ＩＶＳ８／ＧＳの１００μｇのＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、フラグメントを精製し、そして少なくとも１００μｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。構築物１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＧＳおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＩＶＳ８／ＧＳを次に、エレクトロポレーションにより、ＳＶＪ１２９またはＲ１系統のマウスＥＳ細胞内へ導入した。この目的のため、指数的に増殖しているマウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、分離しそして計数した。約３×１０７の細胞を、５〜１０ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして細胞ペレットは次に、ＤＮＡを含んだ最終容量が８００μｌになるように、冷ＰＢＳに集めた。続いて消化されたＤＮＡを細胞へ加え、溶液を混合し、そして氷上で少なくとも１０分間、インキュベートした。滅菌作業台上で、細胞／ＤＮＡ混合物を、０．４ｃｍ電極スリットを有する、前もって冷却したエレクトロポレーションキュベット（バイオラッド、ミュンヘン、ドイツ）に充填した。エレクトロポレーションはＧｅｎｅｐｕｌｓｅｒ２装置（バイオラッド、ミュンヘン）を使用して、０．８ｋＶおよび３μＦで実施した。細胞を次にＥＳ細胞培地（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５％熱不活性化ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｐｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１０３Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子を含んでいるＤＭＥＭ）と混合し、そして０．１％ゼラチンでコーティングした１０枚の１０ｃｍ細胞培養ディッシュに均等に分布させた。次の日、ＥＳ細胞培地に溶解した２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（シグマ、ダイゼンホーフェン、Ｈ３２７４）を加えることにより選択を開始した。細胞を、約５〜９日の構築物の取り込みで選択し、そして個々のトランスジェニッククローンを滅菌作業台上、手作業で単離し、そして９６ウェルプレートへ移した。細胞はコンフルエントに到達する前に継代し、そして連続的に、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、６ウェルプレートおよび１０ｃｍディッシュへ再プレートした。
【０１５３】
１０ｎＭミフェプリストーンの添加後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子スイッチおよびＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ、またはＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットアッセイの助けを借りたＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節可能な発現で細胞クローンを試験した（上記実施例３および４で説明したように）。
【０１５４】
あるいは、トランスジェニックＥＳ細胞を２工程方法で調製した。第１に、調節された様式で遺伝子スイッチ分子のみを発現するトランスジェニックＥＳ細胞を発生させる。得られたトランスジェニック細胞株のうち、適した量の遺伝子スイッチ分子を発現するクローンを選択する。第２の工程において、これらのクローンを、遺伝子スイッチ結合部位により調節される免疫モジュレータをコードしているＤＮＡ構築物でスーパー遺伝子導入する（supertransfect）。得られた２重トランスジェニック株は、実施例５に記載したように、２つの導入遺伝子の同時発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって試験する。この様式において、遺伝子スイッチ分子調節免疫モジュレータを発現する、２重トランスジェニックＥＳ細胞を得る。遺伝子スイッチ構築物の１００μｇのＤＮＡを適した制限酵素で切断し、所望のフラグメントを精製し、滅菌ＰＢＳに再懸濁し、そして前述のように、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞内へ導入する。構築物は抗生物質ゼオシンに対する耐性を伝えられているので、該抗生物質での処理により、遺伝子導入がうまくいった細胞を選択することができる。トランスジェニッククローンを、得られた細胞から単離し、ミフェプリストーン添加の関係する遺伝子スイッチ分子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調査する。適した量の遺伝子スイッチ分子を発現するクローンは、第２の工程において、構築物１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎおよび１７×４／ＩＬ１５／オリゴ／ＲＩＰｈｎ／ＩＶＳ８の精製Ｅｃｏ４７ＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントとエレクトロポレーションによりスーパー遺伝子導入し、そしてハイグロマイシン処理により第２の導入遺伝子の取り込みで選択する。両方の導入遺伝子の同時取り込みは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によりチェックする。
【０１５５】
得られた２重トランスジェニック細胞クローンは、上記実施例５ですでに説明したように、１０ｎＭミフェプリストーンの添加後、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子スイッチおよびＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ、またはＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットアッセイの助けを借りたＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの調節可能な発現を試験する。続いて、ミフェプリストーン添加後にのみ、十分量の免疫モジュレータＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生および分泌するクローンを、得られた細胞株から選択する。
【実施例９】
【０１５６】
トランスジェニックＥＳ細胞から調製されたインスリン産生細胞の移植
移植に先立って、遺伝子スイッチの制御下でＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを発現する、インスリン産生細胞を、未分化ハイグロマイシン耐性ＥＳ細胞クローンから調製する、Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０００  Ｆｅｂ．；４９（２）：１５７−６２。
【０１５７】
十分な量のＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生するように、インスリン産生細胞を移植前にミフェプリストーンで処理する。
続いて、百万のインスリン産生細胞を、腎被嚢下（実施例７で説明したように）かまたは脾臓内へ（Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０００  Ｆｅｂ．；４９（２）：１５７−６２）、ストレプトゾトシン処理のために糖尿病であるＣ５７ＢＬ／６マウス内へ注射する。移植の日以後、連続的にＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを産生するように、１日おきにミフェプリストーン（２５０μｇ／ｋｇ）でレシピエント動物を処理する。
【０１５８】
同種移植片機能は、定期的なグルコース測定によりモニターする（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  ＩＩＩ；ベーリンガー・マンハイム、マンハイム）。糖尿病の誘導前および後、そして膵島移植後に、一定の間隔で動物の尾静脈または延髄後静脈叢から血液を採り、そして血糖レベルを決定する。追加の管理を、尿試験紙を使用して、血液採取の間に実施する。初期移植片機能は、移植３〜５日後に、１１．１ミリモル／ｌ（２００ｍｇ／ｄｌ）以下の血糖含量として定義される。前記のように、初期移植片機能が観察された後、少なくとも２日連続して、もし、血糖レベルが５００ｍｇ／ｄｌより高くまで増加したら、移植片は拒絶されたとみなされる。
【０１５９】
対照として、同一の細胞クローンから調製されたが、しかしミフェプリストーンで前処理されていない、そして従って遺伝子スイッチ調節ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃを発現しない、インスリン産生細胞をレシピエント動物内へ移植する。あるいは、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃ構築物を含んでいるが、しかし遺伝子スイッチを含んでいないインスリン産生細胞を使用することも可能である。
【０１６０】
幹細胞から誘導されたインスリン産生細胞を受けとった後に、ＭｕｔＩＬ−１５／ｍＦｃの外部添加で処理された動物も、さらなる対照として働く。
幹細胞から調製され、インスリン産生細胞を受けとった動物の血糖レベルの研究は、ミフェプリストーンで処理された動物において、比較的長い時間、細胞移植片が機能的に活性であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、遺伝子導入１７×４／ＩＬ１５／オリゴ＋ｐｃＤＮＡ３スイッチ±ミフェプリストーンの培地上清の免疫ブロット解析を表す（実施例３）。
【図２】図２は、活性物質を添加することにより調節できる、本発明の遺伝子発現システムの作用機構の概略イメージを表す。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の非全能性細胞であって、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも１つの免疫モジュレータをコードする少なくとも１つの核酸を含む、前記細胞。
【請求項２】
調節できる遺伝子発現システムがプロゲステロン遺伝子発現システム、テトラサイクリン発現システムおよび／またはラパマイシン遺伝子発現システムであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
免疫モジュレータが、変異ＩＬ−１５およびＦｃフラグメントの融合タンパク質であり、該Ｆｃフラグメントは変異ＩＬ−１５分子のＣ末端へ、好ましくはヒンジ領域を経て融合されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
抗体のＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、特に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくは類似の哺乳動物ＩｇＧまたはＩｇＭ、特に、ヒトＩｇＭ若しくは類似の哺乳動物ＩｇＭのＦｃフラグメントであることを特徴とする、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
核酸が追加として選択カセット、特に、適した遺伝子導入マーカー遺伝子および／または分化マーカー遺伝子をコードすることを特徴とする、請求項１〜４の少なくとも１項に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも１つの免疫モジュレータ、および活性物質を加えることにより調節できる少なくとも１つの遺伝子発現システムをコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞、ならびに適した賦形剤および／または添加剤を含む、医薬。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞、および／または請求項６に記載の核酸の、適当な場合には少なくとも１つの免疫モジュレータの存在下での、ヒトまたは哺乳動物における移植片拒絶を阻害する医薬を製造するための使用。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ．請求項６に記載の少なくとも１つの核酸、および／または請求項６に記載の少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１つのベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
ｂ．遺伝子スイッチを調節するための少なくとも１つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ．請求項６に記載の少なくとも１つの核酸、および／または請求項６に記載の少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１つのベクター、ならびに少なくとも１つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも１つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および／または非全能性不死化細胞へ導入すること、
ｂ．工程ａの細胞を分化させること、
ｃ．工程ｂの分化細胞を選択すること、および
ｄ．工程ｃの選択された細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および／またはヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む、前記方法。
【国際調査報告】
2006502716.tif 000004
2006502716.tif 000005
2006502716.tif 000006
2006502716.tif 000007
2006502716.tif 000008
2006502716.tif 000009
2006502716.tif 000010
2006502716.tif 000011
2006502716.tif 000012
2006502716.tif 000013
2006502716.tif 000014
2006502716.tif 000015