(57)【要約】本発明は、サンプル中のヒト・パピローマウイルスＨＰＶを定量的且つ定性的に測定するための方法及びキットに関する。より詳細には、子宮頚癌を生ずるＨＰＶ感染の危険性を予測するために、発癌性ＨＰＶを定量的且つ定性的に測定するためのものである。本方法及びキットは、数種の発癌性ＨＰＶタイプの同時測定を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）を定量的且つ定性的に測定するための方法であって、以下の工程：
ｉ）  ＨＰＶ感染が疑われる患者のサンプルを準備し、場合によりサンプルの核酸を抽出すること；
ｉｉ）  サンプル又はサンプル由来の核酸を２以上のサブサンプルに分けること；
ｉｉｉ）  サブサンプルの１つにおいて、そのプライマーが増幅反応中に競合しないように設計されている、各ウイルス又はウイルス群を増幅するための特異的プライマー、及びそのプローブが増幅反応及び検出段階で競合しないように設計されている、各ウイルス又はウイルス群に対する特異的プローブを用いて、２以上のウイルスの存在及び量を同時に測定すること;
ｉｖ）  別の増幅反応において、所定量の他のサブサンプル中の核遺伝子の解析によりサンプル量を測定すること; そして、
ｖ）  工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）の結果から、サンプル量当たりの各ウイルス又はウイルス群の量を計算すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）の増幅がＰＣＲ増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＲに基づく蛍光５’エキソヌクレアーゼアッセイである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｉｉｉ）のウイルスが、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５２及び５８から選択される、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＶ１６、３１、１８、４５が１つのサブサンプル中で検出及び定量され、場合によりＨＰＶ３３、３５、３９、５２及び５８が他のサブサンプル中で検出及び定量される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｉｖ）で、ヒト単一コピー遺伝子の量を検出及び定量する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子が、ＨＵＭＰＢＧＤＡ、ホモサピエンス・ヒドロキシメチルビラン合成酵素遺伝子、ａｃｃｎｒ  Ｍ９５６２３．１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
子宮頚癌を検出及び診断するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ヒト・パピローマウイルスを検出及び定量するためのキットであって、
ａ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ１６、３１、１８、４５に対する７つの増幅プライマー及び３つのプローブ；並びに、場合により、
ｂ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ３３、３５、３９、５２及び５８に対する８つの増幅プライマー及び３つのプローブ、
を含む、前記キット。
【請求項１０】
ｃ）  明細書の表１及び表２に記載の、ヒト単一コピー遺伝子の量を検出及び定量するための２つの増幅プライマー及び１つのプローブを更に含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
遺伝子がＨＵＭＰＢＧＤＡ、ホモサピエンス・ヒドロキシメチルビラン合成酵素遺伝子、ａｃｃｎｒ  Ｍ９５６２３．１である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ｄ）少なくとも２つの異なる蛍光体を更に含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
ａ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ１６、３１、１８、４５に対する７つの増幅プライマー及び３つのプローブ；
ｂ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ３３、３５、３９、５２及び５８に対する８つの増幅プライマー及び３つのプローブ；
ｃ）  明細書の表１及び表２に記載の、ヒト単一コピー遺伝子の量を検出及び定量するための２つの増幅プライマー及び１つのプローブ；並びに、
ｄ）  ３つの異なる蛍光体、
を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
子宮頚癌を検出及び診断するための、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のヒト・パピローマウイルス、ＨＰＶを定量的且つ定性的に測定するための方法及びキットに関する。より正確には、子宮頚癌を生ずるＨＰＶ感染の危険性を予測するために、発癌性ＨＰＶを定量的且つ定性的に測定するためのものである。
【背景技術】
【０００２】
子宮頚癌は、世界中の女性に３番目に一般的ながんであると考えられている。１９９４年に、米国で推定５５，０００人の女性が上皮内頚部癌であると診断され、更に１５，０００人の症例が浸潤癌であった。系統的な又は任意のスクリーニングが多くの国において利用可能であり、一連の診療行為も存在するが、この疾患を診断された約４，６００人の女性は生存していない。スウェーデンでは系統的なスクリーニングが過去２０年間実施されているが、依然として約５００人の浸潤癌の症例が毎年診断されている。米国及びヨーロッパでは子宮頚癌の管理に重要な進展があるが、発展途上国では未だに罹患率及び死亡率の重大な原因である。
【０００３】
あるタイプのヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頚癌の進行に最も重要なたった１つの危険因子である。９５％を越える子宮頚癌生検サンプルは、危険性の高いＨＰＶタイプ、最も一般的にはＨＰＶ１６、続いてＨＰＶ１８、４５、３１及び３３のＤＮＡを含有することがわかっている。子宮頚癌の病因論におけるＨＰＶ感染の重要性を前提として、ウイルスを検出するため又はウイルス形質転換に起因する細胞変化を同定するための非常に多くの方法が開発されている。血清学的検出法がＨＰＶの存在又は最近の感染を検出するために用いられているが、全ての感染した個人が抗体を発現させるわけではない点に限界がある。インサイチューハイブリダイゼーション、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及びサザンブロット解析、ハイブリッドキャプチャー（モノクローナル抗体によってＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖が認識される）及び種々のＰＣＲに基づくアッセイのような多くのＤＮＡ技術がウイルス核酸の検出に採用されている。ＨＰＶ検出のために開発されたＰＣＲシステムの多くは増幅工程を包含し、個々のＨＰＶタイプを同定するために別個の工程を伴う。ホルマリン固定生検サンプルや保管パパニコロー（Ｐａｐ）子宮頚管スミアのような限られたＤＮＡを有するサンプルを解析する場合のアッセイの技術的感度を上昇させるために、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲが頻繁に用いられている。
【０００４】
以前に、危険性の高いＨＰＶ  ＤＮＡを検出し且つ定量するためのリアルタイムＰＣＲに基づくアッセイが記載された（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、１９９９）。リアルタイムＰＣＲに用いられる５’エキソヌクレアーゼアッセイは、ＰＣＲの伸長段階に、２重標識された非伸展性のハイブリダイゼーションプローブを切断する、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の能力に基づいている。
【０００５】
この以前に記載された方法を用いて、ケースコントロール研究において、子宮頚管スミア中のＨＰＶ１６価により上皮内子宮頚癌（頚部間質新生物、ステージＩＩＩ；ＣＩＮ  ＩＩＩ）が進行する危険性を予測できることが証明された（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０００；Ｙｌｉｔａｌｏら、２０００）。これらの結果は、ＨＰＶ価が、感染が子宮頚癌へ進行するか消滅するかを決定する強力な手段を意味するかもしれないことを示している。この発明は米国特許第６，４２０，１０６号に記載されており、ヒト被検者においてウイルスに関連するがんへ進行する危険性を予測する方法に関するものである。 
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ヒト・パピローマウイルスを定量的且つ定性的に測定するための方法及びキットに関する。本発明の方法は、ＨＰＶ感染の予測される結果の基準として、定量的且つ定性的測定を提供する。本発明の方法及びキットは、複雑で時間を要するようなことがなく、発癌性ＨＰＶタイプを広く対象範囲とする。本発明は、リアルタイムＰＣＲで提供される定量的能力及びダイナミック・レンジを用いて数種のＨＰＶタイプを同時に測定するためのアッセイ及びキットに関する。本発明は、頚部腫瘍で最も一般的に検出されるＨＰＶタイプの検出及び定量に利点があり、一方、各サンプルについて同時に実施される反応数を最小限にし、頚管スワブサンプルの日常的スクリーニングでの使用に好適なシステムにする。本発明の１つの態様によれば、最適化された試験システムは、２回の試験、及び標準化のための別の１回の試験でサンプル測定を可能にする。
【０００７】
したがって、第１の側面において、本発明は、サンプル中のヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）を定量的且つ定性的に測定するための方法に関し、以下の工程：
ｉ）  ＨＰＶ感染が疑われる患者のサンプルを準備し、場合によりサンプルの核酸を抽出すること；
ｉｉ）  サンプル又はサンプル由来の核酸を２以上のサブサンプル又は等量のアリコートに分けること；
ｉｉｉ）  サブサンプルの１つにおいて、そのプライマーが増幅反応中に競合しないように設計されている、各ウイルス又はウイルス群を増幅するための特異的プライマー、及びそのプローブが増幅反応及び検出段階で競合しないように設計されている、各ウイルス又はウイルス群に対する特異的プローブを用いて、２以上のウイルスの存在及び量を同時に測定すること;
ｉｖ）  別の増幅反応において、所定量の他のサブサンプル中の核遺伝子の解析によりサンプル量を測定すること;
ｖ）  工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）の結果から、サンプル量当たりの各ウイルス又はウイルス群の量を計算すること、
を含む。
【０００８】
好ましくは、工程ｉｉｉ）及び工程ｉｖ）の増幅はＰＣＲ増幅であり、より好ましくは、その方法はＰＣＲに基づく蛍光５’エキソヌクレアーゼアッセイである。
工程ｉｉｉ）のウイルスは、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６７及び６８から選択される。
【０００９】
好ましい態様によれば、ＨＰＶ１６、１８、３１、１８、４５が１つのサブサンプル中で検出及び定量され、場合によりＨＰＶ３３、３５、３９、５２、５８及び６７が他のサブサンプル中で検出及び定量される。初期の実験シリーズではＨＰＶ６７が検出及び測定されたが、本発明の現在の好ましい態様によれば、ＨＰＶ６７はキット及びそのキットを用いる方法に含まれない。
【００１０】
好ましくは、工程ｉｖ）で、ヒト単一コピー遺伝子の量を検出及び定量する。
この遺伝子は、ＨＵＭＰＢＧＤＡ、ホモサピエンス・ヒドロキシメチルビラン合成酵素遺伝子、ａｃｃｎｒ  Ｍ９５６２３．１であり得る。
【００１１】
本発明の方法は、好ましくは子宮頚癌の検出及び診断に用いられる。
第２の側面において、本発明は、ヒト・パピローマウイルスを検出及び定量するためのキットに関するものであり、
ａ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ１６、３１、１８、４５に対する７つの増幅プライマー及び３つのプローブ；並びに、場合により、
ｂ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ３３、３５、３９、５２及び５８に対する８つの増幅プライマー及び３つのプローブ、
を含む。
【００１２】
好ましくは、キットは、明細書の表１及び表２に記載の、ヒト単一コピー遺伝子、例えばＨＵＭＰＢＧＤＡ、ホモサピエンス・ヒドロキシメチルビラン合成酵素遺伝子、ａｃｃｎｒ  Ｍ９５６２３．１の量を検出及び定量するための２つの増幅プライマー及び１つのプローブを更に含む。
【００１３】
好ましい態様において、キットは、少なくとも２つの異なる蛍光体を更に含む。
１つの態様において、キットは、
ａ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ１６、３１、１８、４５に対する７つの増幅プライマー及び３つのプローブ；
ｂ）  明細書の表１及び表２に記載のＨＰＶ３３、３５、３９、５２及び５８に対する８つの増幅プライマー及び３つのプローブ；
ｃ）  明細書の表１及び表２に記載の、ヒト単一コピー遺伝子の量を検出及び定量するための２つの増幅プライマー及び１つのプローブ；並びに、
ｄ）  ３つの異なる蛍光体、
を含む。
【００１４】
本発明のキットは、好ましくは子宮頚癌の検出及び診断に用いられる。この目的のために、キットは場合により頚管スワブを含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
材料及び方法
ＤＮＡ抽出：
ＨＰＶ１６、ｌ８、３１、３３、３５、３９、４５、５２、５８及び６７を含有するプラスミドを陽性対照として用いてアッセイの感受性を評価した。ＨＰＶが組み込まれたプラスミドをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ細胞（ＩＮＶαＦ’、インビトロジェンＴＡクローニングキット、フローニンゲン、オランダ）に形質転換し、陽性形質転換体を単離して、１００ｍｌのＬＢ中、３７℃で一晩培養し、キアゲンＭａｘｉｐｒｅｐキット（キアゲン、ＷＷＲ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。分光光度計によるＯＤの測定で、それぞれのプラスミド調製物のコピー数を評価した。
【００１６】
ヒト核遺伝子アッセイの開発に用いられた血液サンプルのＤＮＡは、プロテイナーゼＫ処理、続いてフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿に基づいた標準プロトコールを用いて抽出された。ホルマリン固定した生検組織のＤＮＡを公表されているプロトコールを用いて抽出した。ＤＮＡの純度及び濃度は、光学密度測定（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ、Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ケンブリッジ、イングランド）により決定した。
【００１７】
保管スミアのＤＮＡの研究のために、以前に記載されたプロトコールを改変した。簡潔には、このプロトコールには、カバースリップを取り除くためのキシレン中でのインキュベーション、脱染、プロテイナーゼＫ処理（６０℃で最低１時間）、続いて滅菌エッペンドルフチューブへの細胞の移し替えが含まれる。次に飽和酢酸アンモニウムを添加してタンパク質を沈殿させる。ＤＮＡ上清をエタノールで回収し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させて、２００μｌのＴＥ−ｌｏｗ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させる。
【００１８】
頚管スワブからのサンプル調製：
抽出プロトコールの研究のため、頚管スワブサンプルを用いて５つの異なる抽出プロトコール（Ａ〜Ｅ）を比較した。
【００１９】
プロトコールＡはサンプルの凍結と煮沸に基づいている。簡潔には、頚管スワブ(又はブラシ)を１ｍｌのＰＢＳに浸し、ぐるぐるかき混ぜて細胞を放出させる。２５０μｌのこの懸濁液を以下のプロトコールに用いる。卓上遠心機で、この溶液を３，０００ｇで１０分間遠心する。上清を回収し、２５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加する。次にサンプルを注意深くボルテックスにかけ、細胞を均一に分散させる。１００μｌの溶液を新しいエッペンドルフチューブに移し、この１００μｌアリコートと残量を（バックアップとして用いる）−２０℃で凍結する。次にこの１００μｌアリコートを解凍し、ヒーティングブロック中１００℃で１０分間煮沸する。チューブを短時間遠心して凝縮した水を下に落とし、２μｌの懸濁液をＴａｑｍａｎ反応に用いる。
【００２０】
プロトコールＢでは、タンパク質の沈殿に基づく市販のＤＮＡ抽出キットを用いる（Ｗｉｚａｒｄ、プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）。簡潔には、頚管スワブ（又はブラシ）を１ｍｌのＰＢＳに浸し、ぐるぐるかき混ぜて細胞を放出させる。２５０μｌのこの懸濁液を以下のプロトコールに用いる。エッペンドルフ遠心機で、この溶液を最大速度で５分間遠心する。上清を廃棄し、３００μｌの核溶解溶液（Ｗｉｚａｒｄキット）を添加する。この溶液をピペットで混合し、３７℃で１時間インキュベーションする。このサンプルを室温まで冷却し、１００μｌのタンパク質沈殿溶液（Ｗｉｚａｒｄキット）を添加する。次にこの溶液をボルテックスに１０〜２０秒間かけ、１３，０００〜１６，０００ｇで３分間遠心する。上清を、３００μｌのイソプロパノールとともに新しいエッペンドルフチューブに移し（室温）、この溶液を混合して１３，０００〜１６，０００ｇで１分間遠心する。上清を除去し、７０％エタノールで沈殿を洗浄し、１３，０００〜１６，０００ｇで１分間、再度遠心する。最後に、エタノールを除去し、沈殿を空気乾燥させる。沈殿を１００μｌの再水和溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解し、６５℃で１時間インキュベーションし、２μｌをそれぞれのＴａｑｍａｎ反応に用いる。
【００２１】
プロトコールＣはサンプルのプロテイナーゼＫ消化に基づいている。簡潔には、頚管スワブ（又はブラシ）を１ｍｌのＰＢＳに浸し、ぐるぐるかき混ぜて細胞を放出させる。２５０μｌのこの懸濁液を以下のプロトコールに用いる。エッペンドルフ遠心機で、この溶液を最大速度で５分間遠心する。上清を除去し、プロテイナーゼＫ溶液（１４８μｌの消化バッファー（Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ  ５０ｍＭ、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び１．９５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加する。サンプルを５６℃で２時間インキュベーションし、９５℃で５分間、プロテイナーゼＫを失活させる。最後にサンプルを５分間遠心し、２μｌの上相をそれぞれのＴａｑｍａｎ反応に用いる。
【００２２】
プロトコールＤはサンプルの有機抽出(フェノール／クロロホルム)を含む。最初に、核溶解溶液（Ｗｉｚａｒｄキット）の添加と３７℃１時間のインキュベーションを含めた上記プロトコールＢを用いる。次に３００μｌの平衡化フェノールをサンプルに添加する。この溶液を混合し、遠心し、水相をフェノールで再度抽出し、その後クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、沈殿を洗浄し、乾燥し、１００μｌのＴＥ−ｌｏｗに溶解する。２μｌの溶解ＤＮＡ調製物をそれぞれのＴａｑｍａｎ反応に用いる。
【００２３】
最後に、プロトコールＥでは、核酸のガラスビーズへの結合に基づく市販のＤＮＡ抽出キット（ニュークリセンス、Ｎａｓｂａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｃａ、ボクステル、オランダ）を用いる。溶解バッファー及び洗浄バッファーを３７℃まで３０分間加熱する（１０分毎にボルテックスする）。続いて洗浄バッファーと溶解バッファーを室温まで冷却する。次にサンプル（１０〜２００μｌの頚管スワブ溶液）を９００μｌの溶解バッファーに添加し、混合物をボルテックスし、チューブを１０，０００ｇで３０秒間遠心する。シリカ溶液を不透明になるまでボルテックスし、５０μｌを各サンプルに添加し、混合物をボルテックスする。チューブを室温で１０分間インキュベーションし、２分毎にボルテックスする。シリカビーズを１０，０００ｇで３０秒間遠心して落とし、上清を除去し、１ｍｌの洗浄バッファーを添加する。沈殿が溶解するまでボルテックスし、最初に１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し（２回）、次に１ｍｌのアセトンで洗浄する（１回）。残留するアセトンを（１００μｌのピペットで）注意深く除去し、沈殿を５６℃で１０分間乾燥させる。シリカ沈殿物が乾燥したら、５０μｌの溶出バッファーを添加し、沈殿が溶解するまでチューブをボルテックスにかける。チューブを、シリカの沈降を回避するために断続的にボルテックスしながら、５６℃で１０分間インキュベーションする。サンプルを１０，０００ｇで２分間遠心し、上清（３０〜３５μｌ）を新しいチューブに移す。２〜５μｌの上清をそれぞれのＴａｑｍａｎ反応に用いる。
【００２４】
プライマー：
プログラムＯｌｉｇｏ  ｖｓ  ６．６（Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、オスロ）及びＰｒｉｍｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡＢＩ、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）を用いて、１５〜２４ｂｐのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
【００２５】
プローブ：
プライマーよりも確実にＴｍを高くするために、プローブの長さは２２〜３０ｂｐにした。プローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、チェシア、英国及びＣｙｂｅｒｇｅｎｅ（Ｈｕｄｄｉｎｇｅ、スウェーデン）で合成して、最も５’端はグアノシンを避けるようにし、使用前にＨＰＬＣで精製した。
【００２６】
リアルタイムＰＣＲ：
ＰＣＲ増幅は、１×バッファーＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ２００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び４００ｎＭ  ｄＵＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）、０．６２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）、３．１μｇのＢＳＡ（シグマ）並びにそれぞれ２００ｎＭのプライマー及びプローブ、並びにＤＮＡ（抽出プロトコールによる）を含有する２５μｌ量で実施した。
【００２７】
増幅及び検出は７７００シークエンス・ディテクション・システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。増幅ランプには、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を解放するために９５℃で１０分間の初期保持プログラムを含めた。保持工程には、９５℃で１５秒間及び５７℃で１分間から成る２工程サイクルが続いた。アッセイの開発には５０サイクルのＰＣＲを用い、臨床サンプルの解析には、ＰＣＲ効率が高いため、わずか４０サイクルを用いた。ＰＣＲ成分を全て含むが鋳型ＤＮＡ（ＮＴＣ反応という）を含まないチューブを用いて試薬混合物に汚染のないことを確実にした。
【００２８】
計算：
シークエンス・ディテクション・システム・ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）を用いて生データを有するファイルを作成した。閾値サイクル数の計算及びＨＰＶコピー数／細胞への転換に専用のソフトウェアを用いた。
【００２９】
統計：
統計及びグラフはマイクロソフト・エクセル、ＳｔａｔＶｉｅｗ及びＳＡＳを用いて作成した。
【００３０】
結果
本発明の結果を、添付の図面に関連づけて以下に記載する。
本発明の方法及びキットの論理的根拠及び設計：
本発明の方法及びキットは、種々のグレードの頚部間質新生物（ＣＩＮ  Ｉ〜ＩＩＩ）及び頚部腫瘍で最も頻繁に見出されるＨＰＶタイプの範囲についてウイルス量の評価を可能にするように設計された。ＨＰＶタイプのセットは研究によって異なるが、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５２、５８及び６７に焦点を合わせた。本発明の鋳型には更にＨＰＶ５１、５６、５９及び６８を含む。これらのＨＰＶタイプは、上皮内子宮頚癌及び浸潤性子宮頚癌に罹患する症例の約８０〜９０％で見出される。したがって、本試験は発癌性ＨＰＶ感染のある女性の８０〜９０％を検出する可能性を有する。
【００３１】
アッセイで検出されるＨＰＶタイプはヌクレオチドレベルで実質的に異なり、一連のＰＣＲプライマーの使用を余儀なくされ、一連のＨＰＶタイプを検出可能な分類システムの開発を複雑にする。選択されたリアルタイムＰＣＲ法は非常に広いダイナミック・レンジと定量に優れた特徴を有するが、各反応において単一標的がアッセイされ、定量される場合のみ市販のソフトウェアを用いて最適に作動する。我々のアッセイは大規模スクリーニング目的と臨床分類を意図するため、各ＨＰＶタイプについて１回のＰＣＲアッセイを実施することは次善のものである。こうした制限を前提として、設計したアッセイは３本の反応チューブで実施される。アッセイは各患者サンプルに由来する３つの平行したリアルタイムＰＣＲに基づいている：ａ）反応１は、３種の異なる蛍光体を用いて、ＨＰＶタイプ１６、３１、１８及び４５を検出し、定量する（ＨＰＶ１８及び４５はともに検出され、定量される）、ｂ）反応２は、同じく３種の異なる蛍光体を用いて、ＨＰＶタイプ３３、３５、３９、５２、５８及び６７を検出し、定量する（ＨＰＶ３３、５２、５８及び６７はともに検出され、定量される）、並びにｃ）反応３はヒト単一コピー遺伝子（ＨＵＭＰＢＧＤＡ、ホモサピエンス・ヒドロキシメチルビラン合成酵素遺伝子、ａｃｃｎｒ  Ｍ９５６２３．１）の量を検出し、定量する。反応１は全部で７つのＰＣＲプライマーと３つのプローブを含み、反応２は全部で７つのＰＣＲプライマーと３つのプローブを含み、反応３は２つのＰＣＲプライマーと１つのプローブを含む（表１及び表２）。
【００３２】
混合サンプル中の異なるＨＰＶタイプをバランスよく同時増幅するための能力を最適にするようにプライマー及びプローブを設計した。同時増幅に最も好適なプライミング部位を見い出し、有効なＰＣＲに対する障害、例えば強い２次構造を有する領域を避けるために、アンプリコンを異なるＨＰＶリーディング・フレームに位置付けた。結果として、反応１において、ＨＰＶ１６のアンプリコンはＥ７に位置し、ＨＰＶ１８／４５のアンプリコンはＥ１に位置し、ＨＰＶ３１のアンプリコンはＥ６に位置する。反応２で検出されるアンプリコンはＬ１（ＨＰＶ３３、５２、５８、６７）、Ｅ７（ＨＰＶ３９）及びＥ４（ＨＰＶ３５）に位置する。ヒト遺伝子に対するＰＣＲプライマーはイントロン−エクソン・ジャンクションにわたる（ヌクレオチド：４７５０〜４８６８）。
【００３３】
技術的感度及び特異性：
ＨＰＶアッセイの感度及び特異性を、調べる種々のＨＰＶタイプの全ゲノムを含有するプラスミドと、ゲノムＤＮＡ（子宮頚管スミア・サンプルなど）からの１回の増幅において存在する複雑な核酸環境を模倣するための３３×１０−６ｇのヒトゲノムＤＮＡとを用いて測定した。プラスミドコピー数をＯＤ測定値から計算し、ＨＰＶ１０２〜１０７コピーの希釈シリーズを作製し、高分子ヒトゲノムＤＮＡ（組み込まれたＨＰＶは欠失している）を加えた。各ＨＰＶコピー数についての１２回の独立した測定に基づき、各ＨＰＶタイプ又はＨＰＶタイプ群について、サンプルあたり１０２〜１０７コピーの範囲の標準曲線を構築した（図１〜３）。試験した全てのＨＰＶタイプについて、ＨＰＶコピー数と、シグナルが所定のベースラインを越えるＰＣＲサイクル数を意味する閾値サイクル（Ｃｔ）とのあいだに、非常に有意な直線回帰が見られる。分類アッセイにおいて、ＨＰＶ１８及び４５は同一プローブを使用し、したがって一緒に検出されるため、これら２つのＨＰＶタイプについての標準曲線が非常に類似していることが致命的である。実際、ＨＰＶ１８及び４５の標準曲線は、同じ傾きを有するだけでなく、同じ切片を有する。同様に、１つのプローブを用いてＨＰＶタイプ３３、５２、５８及び６７が一緒に検出される。これらの標準曲線は同じ傾きを有するが、切片に関しては若干異なっている。このことは、このグループ内のウイルスタイプを一緒に定量する場合、精度を低くするかもしれない。ＨＰＶ５２及び６７と比べてＨＰＶ３３と５８とのあいだに見られる切片に見られる変動にもかかわらず、アッセイは十分な精度で定量することが可能である。最後に、ヒト単一コピー遺伝子のコピー数と閾値サイクルとのあいだに有意な直線回帰が見られた（図４）。ＨＰＶ及びヒトＤＮＡの定量システムに見られるＣｔとして表現される変動を表３及び表４に示す。ＨＰＶアッセイに関するＣｔ値の平均標準偏差（ＳＤ）は０．８９であり、より低いコピー数についてより高い値が見られる（表３）。ヒト遺伝子システムに関するＣｔ値の平均標準偏差（ＳＤ）は０．８５であることがわかった（表４）。
【００３４】
反応１及び反応２におけるプライマーとプローブの組合わせの能力を測定することにより、異なるＨＰＶタイプを有するプラスミドを区別するためのＨＰＶシステムの特異性を試験した。反応２で検出されるＨＰＶタイプ（即ちＨＰＶ３３、３５、３９、５２、５８及び６７）を有するシグナルを解析することにより、反応１における試薬の特異性を試験した。開始ウイルス１０４コピーではこれらＨＰＶタイプのいずれを用いてもシグナルは観察されなかった（データは示していない）。同様に、反応１で検出されるＨＰＶタイプ（即ちＨＰＶ１６、１８、３１、４５）を用いてシグナルを解析することにより、反応２における試薬の特異性を試験した。開始ウイルス１０４コピーの濃度ではＨＰＶ１６、１８、３１、又は４５を用いてもシグナルは観察されなかった（データは示していない）。本システムは、他のＨＰＶタイプについての特異性を試験していない。しかしながら、それぞれ、反応１及び反応２の試薬は（非常に多くのＨＰＶタイプに由来するシークエンス・アラインメントを用いて）個々のＨＰＶタイプに特異的であるように設計し、反応３は核遺伝子のためのものである（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ及びＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈｅｓを用いた）。また、有効なリアルタイムＰＣＲアッセイは、オリゴヌクレオチド・プローブの標的に対する相同性に基づいている。前記のように、子宮頚癌と診断された女性の約８０〜９０％は、本アッセイで検出されるタイプの１種又は複数のＨＰＶに感染している。１０〜２０％の、本アッセイのいずれのタイプにも感染していない残りの腫瘍生検サンプルは、それぞれ非常に低頻度で起こる非常に多くの他のＨＰＶタイプのいずれかを含有する。本アッセイはこうした更なるＨＰＶタイプを検出するようには設計されていないため、重篤な頚部間質新生物又は浸潤癌と診断された女性の偽陰性率は１０〜２０％であると推定される。
【００３５】
混合感染の解析：
スウェーデン人患者由来の子宮頚癌生検サンプルについての先の研究において、約５％のサンプルが数種のＨＰＶタイプに感染していた（Ｙｌｉｔａｌｏら、１９９５）。したがって、本発明の重要な側面は、ＨＰＶ１６と、子宮頚癌に関連することが見出されたより頻度の高い他のタイプ、例えばＨＰＶ１８、３１及び４５などとの混合感染を検出する能力である。ＨＰＶプラスミドを用いて既知のＨＰＶコピー数の合成混合物を作製することにより、我々の蛍光５’エキソヌクレアーゼ・アッセイが、複合感染サンプル中のＨＰＶ力価を正確に検出し、定量する能力を、反応あたり１ｎｇの高分子ゲノムＤＮＡのバックグラウンドで試験した。最初に、ＨＰＶ１６のバックグラウンドでＨＰＶ１８の検出について試験した。ＨＰＶ１６が１０２〜１０５コピーの範囲で、同一コピー数範囲についてＨＰＶ１８量を正確に定量する能力を試験した。例えば１０５コピーのＨＰＶ１６に対し、１０２〜１０５コピーのＨＰＶ１８の定量を試験した。ＨＰＶ１８コピー数のｌｏｇをＣｔに関係づけた結果をグラフに示す。バックグラウンドＨＰＶ１６の各コピー数に対して別の線が示されている。正確な定量に対するバックグラウンドＨＰＶタイプの効果は、ＨＰＶコピー数のｌｏｇと閾値サイクルとのあいだに予想される直線関係からの偏差としてみられる。ＨＰＶ１６のバックグラウンドでＨＰＶ１８を定量する場合、１０２〜１０５コピーのＨＰＶ１６のバックグラウンド（混合感染）で、アッセイはＨＰＶ１８コピー数を１０４〜１０５コピーの範囲で正確に評価することが可能である（図５ａ）。１０３コピーのＨＰＶ１８では、１０４〜１０５コピーのＨＰＶ１６のバックグラウンド・レベルで直線関係からわずかに偏差があるが、依然としてコピー数を評価できる。１０２コピーのＨＰＶ１８では、１０５コピーのＨＰＶ１６のバックグラウンドを除いた全範囲にわたりコピー数を正確に評価できる。これらの結果は、アッセイは、ＨＰＶ１８がＨＰＶ１６のコピー数の少なくとも１〜１０％で生ずる限り、ＨＰＶ１６のバックグラウンドでＨＰＶ１８量を定量可能であることを示している。同様に、逆の実験では（ＨＰＶ１８のバックグラウンドでＨＰＶ１６を検出）、ＨＰＶ１６がＨＰＶ１８のコピー数の少なくとも１〜１０％で生ずる限り、ＨＰＶ１８のバックグラウンドでＨＰＶ１６感染を検出できることを証明している（データは示していない）。
【００３６】
起こり得る混合感染は、ＨＰＶ１６と、ＨＰＶ３１又はＨＰＶ４５である。ＨＰＶ４５は、１０２〜１０５コピーのＨＰＶ１６のバックグラウンドで、１０３〜１０５のコピー数で正確に定量できる（図５ｂ）。唯一の例外は、１０３コピーのＨＰＶ４５及び１０５コピーのＨＰＶ１６であり、このときＨＰＶ４５を正確に定量する能力が低下する。同様に、逆の実験では（ＨＰＶ４５のバックグラウンドでＨＰＶ１６を検出）、ＨＰＶ１６がＨＰＶ４５のコピー数の少なくとも１〜１０％で生ずる限り、ＨＰＶ４５のバックグラウンドで、ＨＰＶ１６感染を検出できることを証明している（データは示していない）。ＨＰＶ３１は、１０２〜１０４コピーの範囲のＨＰＶ１６のバックグラウンドで、１０２〜１０５コピーの範囲で定量できる（図５ｃ）。ＨＰＶ１６が１０５コピーに対してＨＰＶ３１が１０２コピーの比率の場合のみ、ＨＰＶ３１からのシグナルがない。逆の実験、即ちＨＰＶ３１のバックグラウンドでＨＰＶ１６を定量する場合、ＨＰＶ３１コピー数が１０２〜１０３コピーの範囲であれば、１０２〜１０５の範囲にわたりＨＰＶ１６コピー数を定量可能であることを示す（データは示していない）。より多いＨＰＶ３１コピー数では、ＨＰＶ１６の定量能は低下する。最も一般的タイプの混合感染を模倣する、試験したＨＰＶタイプの組あわせに基づき、主要ＨＰＶタイプのコピー数の少なくとも１〜１０％を示す限り、アッセイは１つのＨＰＶタイプの量を正確に定量できる。
【００３７】
再現性：
一連の臨床サンプル中のＨＰＶコピー数及びヒトＤＮＡを反復測定することにより、試験の再現性を調べた。
【００３８】
実験室内の再現性
３人の異なる技術者（操作者）により、同一実験室内で、同一ロットの試薬を用いて、１セットの臨床サンプルを解析した。サンプルＤＮＡはプロトコールＤ（材料及び方法の項を参照されたい）にしたがい抽出した。ＨＰＶ陽性度（±）に関する操作者間の一致は９８．６％（１３９／１４１）であり、操作者間のＣｔ値の平均標準偏差は０．６２単位（表６）である。１セットの臨床サンプルの反復解析間のＣｔの一致を図６に図示する。この実験では、反応１及び反応３を用いて１セットの頚管スワブサンプルを解析した。２回の独立した実験の結果のあいだに統計的に有意な直線回帰が見られる（ｒ２＝０．９９、ｐ＞０．０００１）（図６）。
【００３９】
ロット間の再現性
３つの異なる試薬ロットを用い、１人の技術者によって１セットの臨床サンプルを解析した。サンプルＤＮＡはプロトコールＤ（材料と方法の項を参照）にしたがい抽出した。ＨＰＶ陽性度に関する異なるロット間の一致は１００％（１４１／１４１）であり、異なる試薬ロット間のＣｔ値の平均標準偏差は０．７５Ｃｔ単位である（表７）。
【００４０】
長期間の再現性
同じ技術者によって、同一ロットの試薬を用いて、４週間にわたり毎週１回臨床サンプルセットを解析した。サンプルＤＮＡはプロトコールＤ（材料と方法の項を参照されたい）にしたがい抽出した。ＨＰＶ陽性度に関する異なる期間間の一致は９８．９％（１８６／１８８）であり、異なる時点間のＣｔ値の平均標準偏差は０．１９Ｃｔ単位である（表８）。
【００４１】
試験の測定値の一般変動
ＨＰＶ量又はヒトＤＮＡ量に関するＣｔ評価値の分散をＳＡＳ（登録商標）システムのＧＬＭ法を用いて計算した。実験室内分散（Ｖａｒ（誤差））は１．５７Ｃｔ単位、ロット間分散は１．４５Ｃｔ単位、長期間分散は０．７６Ｃｔ単位であった。測定値の全体的平均標準偏差は１．１Ｃｔ単位であった。システムの測定範囲はおおよそ２０Ｃｔ単位（Ｃｔ１５〜３５）であるため、システムの平均変動（１．１Ｃｔ）はその範囲の約５％を示す。
【００４２】
安定性
一連の臨床サンプル中のＨＰＶ量及びヒトＤＮＡ量を調べることにより、アッセイ試薬の安定性を試験した。サンプルＤＮＡはプロトコールＤ（材料及び方法の項を参照されたい）にしたがい抽出した。同一ロットの試薬を用い、試験した３つの異なる保存温度は−２０℃、＋４℃(冷蔵庫)、及び＋３０℃（加速室温安定性試験）であった。−２０℃試験については、ＨＰＶ陽性の３３サンプル及びヒトＤＮＡを有する１４サンプルを、同一試薬バッチを用いて毎週１回試験した（試験期間２８日）。試験期間中、試験したアッセイの性能に有意な変化は見られなかった（図７ａ）。時点間平均ＳＤは、ＨＰＶタイプについてはＳＤ＝０．８１Ｃｔであり（ＨＰＶ１６はＳＤ＝０．６０；ＨＰＶ３１はＳＤ＝０．７１；ＨＰＶ１８／４５はＳＤ＝０．５８；ＨＰＶ３３群はＳＤ＝１．１；ＨＰＶ３９はＳＤ＝０．９１）、ヒトＤＮＡはＳＤ＝０．８６Ｃｔであった。＋４℃試験については、ＨＰＶ陽性の５サンプル及びヒトＤＮＡを有する３サンプルを、同一試薬バッチを用いて３０日間にわたって７回試験した（第３日、６日、１０日、１３日、１７日、２０日、３０日）。ＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６及び５２）又はヒトＤＮＡを３０日の試験期間にわたり定量する上でアッセイの性能に有意な変化は見られなかった（図７ｂ）。時点間平均ＳＤは、ＨＰＶタイプはＳＤ＝０．７９Ｃｔであり（ＨＰＶ１６はＳＤ＝０．８８；ＨＰＶ５２はＳＤ＝０．６９）、ヒトＤＮＡはＳＤ＝１．４Ｃｔであった。＋３０℃試験については、ＨＰＶ陽性の６サンプル及びヒトＤＮＡを有する３サンプルを、同一試薬バッチを用いて１３日間にわたって６回試験した（第１日、２日、１３日、１６日、１０日、１３日）。ＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６及び５２）及びヒトＤＮＡに関し、６日間にわたり（最初の４サンプル）性能に有意な変化はない（図７ｃ）。最初の４時点間の平均ＳＤは、ＨＰＶタイプはＳＤ＝０．７１Ｃｔであり（ＨＰＶ１６はＳＤ＝０．８４；ＨＰＶ５２はＳＤ＝０．８３）、ヒトＤＮＡはＳＤ＝０．７７であった。６日後、試薬はＨＰＶ分類アッセイ及びヒトＤＮＡアッセイに対して同時に機能しなかった。
【００４３】
要約すると、−２０℃及び＋４℃における試験は、同一技術者により、同一ロットの試薬を用いて実施した場合、試験した期間にわたる変動は約１Ｃｔ単位であることを示す。これはロット間の比較又は操作者間の比較で見られる変動の程度に類似する。したがって、表示の期間にわたるこうした温度での保存は、試験試薬に対し測定可能な作用を及ぼさない。＋３０℃では、６日後、試薬は試験結果を作製できなかった。ＨＰＶ及びヒトＤＮＡのための試薬は同一時点で機能しなかった。
【００４４】
サンプル調製
異なる純度のサンプルについてアッセイの性能を調べるため、２つの異なる実験計画を用いて５つの異なる抽出プロトコールを比較した。第１の実験では、１セットの新鮮な凍結頚管スワブサンプルをそれぞれ４つの等量のアリコートに分け、以下の抽出プロトコールに供した；材料及び方法に詳細に説明するように、Ａ．凍結／煮沸、Ｂ．Ｗｉｚａｒｄキット、Ｃ．消化、Ｄ．Ｗｉｚａｒｄ消化後有機抽出。最初の３つのプロトコールを用いたＴａｑｍａｎアッセイの結果を、４番目のプロトコール（判断標準として用いる）の結果と比較した。ＨＰＶアッセイのデータを調べる上で、プロトコールＤを用いてＨＰＶ陽性と記録されたサンプルに基づく直線回帰解析は、プロトコールＢが、Ｄで得られるＣｔに対し、最も高い相関を生ずることを示す（ｒ２＝０．８６６、ｐ＜０．０００１）（図８ａ）。プロトコールＡ（ｒ２＝０．９７４、ｐ＜０．０００１）及びプロトコールＣ（ｒ２＝０．６２７、ｐ＜０．００２）は、Ｄのデータに対し、より小さい回帰係数を示す（図８ｂ、ｃ）。ヒト遺伝子のデータを比較すると、抽出プロトコール間の相違はより顕著である。やはり、プロトコールＢの結果は方法Ｄに対して最も高い相関を示している（ｒ２＝０．７７１、ｐ＜０．０００１）（図８ｅ）。プロトコールＡ（ｒ２＝０．６４９、ｐ＜０．０６８、非有意）及びプロトコールＣ（ｒ２＝０．２０４、ｐ＜０．１２７、非有意）は、いずれもＤに対して有意な相関を示さないデータを生ずる（図８ｄ、ｆ）。とりわけ、プロトコールＡ及びＣは、ヒトＤＮＡについて陰性と記録する多くのサンプルを生じ、ＨＰＶ量の標準化を妨げる。したがって、結果は、通常臨床用途には好適でないと考えられている有機抽出プロトコールと比べて、Ｗｉｚａｒｄキット又はプロテイナーゼＫ消化を伴う迅速プロトコールは非常に簡便な凍結/煮沸法よりも好ましいことを示す。
【００４５】
抽出プロトコールＡ〜Ｄ間の比較結果と、凍結/煮沸法の広範囲に及ぶ普及を前提として、日常の産婦人科健康管理において採取された頚管スワブサンプルセットを用いて第２の実験を行い、診断ウイルス学実験室において頻繁に使用されている更に他の市販のサンプル調製法;ニュークリセンスキットを適用した。サンプルをまず凍結／煮沸法（プロトコールＡ）で抽出し、Ｔａｑｍａｎアッセイを実施した（表８）。多くのサンプルは、ＨＰＶ分類が成功することを証明したが、ヒトＤＮＡの存在を示さなかった。ニュークリセンスキットを適用後、これらのサンプルについてＴａｑｍａｎアッセイを再度実施したところ、非常に高頻度のサンプルが測定可能量のヒトＤＮＡを示した（表８）。したがって、ニュークリセンス・プロトコールの適用は、おそらく阻害剤を除去し、より信頼できるＴａｑｍａｎアッセイをもたらす。用いたサンプルは、ＨＰＶ陽性度を記録するための別のＰＣＲに基づくアッセイを用いて以前に分類されている（ＧＰ５／６プライマーを用いた）。ＨＰＶ陽性度に関するＴａｑｍａｎアッセイの結果は、以前の方法による結果と適合した（表８）。
【００４６】
臨床サンプルの解析：
アッセイの性能を調べるために、日常の健康管理で採取された保管子宮頚管スミアから抽出された４７２３に及ぶＤＮＡサンプルのセットについてアッセイを試験した（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０００）。これらのサンプルは大規模なケースコントロール研究の一部として収集されたものであり、症例は上皮内子宮頚癌と診断されている。４７２３サンプルのうち、４２６８（９０．６％）はヒト単一コピー遺伝子座のシグナルを示した。ヒト遺伝子陽性サンプルの中で、最も優勢なＨＰＶタイプは予想されるようにＨＰＶ１６であり、ほぼ２２％の頻度である（図９）。他のＨＰＶタイプは、それぞれサンプルの１０％未満で見出される。このサンプルセットのうち、１８５サンプルは少なくとも２つのＨＰＶタイプに感染し（１６／３１はｎ＝３９；１６／１８−４５はｎ＝７５；１６／３３群はｎ＝４０；１８−４５／３１はｎ＝２３；１６／３９はｎ＝６；１６／３５はｎ＝２）、９サンプルは少なくとも３つのＨＰＶタイプに感染していた（１６／１８−４５／３１はｎ＝６；１６／３１／３３群はｎ＝１；１６／１８−４５／３３群はｎ＝２）。ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８／４５の混合感染では、高くは、細胞あたりＨＰＶ１８が３コピー中、細胞あたりＨＰＶ１６が４５０コピーから、逆の場合、細胞あたりＨＰＶ１８が２０８３コピー中、細胞あたりＨＰＶ１６が１３コピーまで比が変化した。ＨＰＶ１６と３１の混合感染では、細胞あたりＨＰＶ３１が５５コピー中、細胞あたりＨＰＶ１６が１９６４コピーから、逆の場合、細胞あたりＨＰＶ３１が６９７コピー中、細胞あたりＨＰＶ１６が９コピーまで比が変化した。これらの結果は、臨床サンプルの混合感染を解析する際の本アッセイの能力を証明している。
【００４７】
考察
本発明者らは、臨床用途に好適な一連のＨＰＶタイプの定量アッセイを開発した。臨床サンプル中のＨＰＶの検出に多くの方法が利用可能である。２分するＨＰＶ分類（ウイルスの存在の有無を検出すること）は、ウイルスの高罹患率と、多くは診療しなくとも感染が明らかであるという事実により、臨床での実用性を制限する。ＨＰＶ１６  ＤＮＡの高力価は上皮内子宮頚癌が進行する有意な危険性と関連しているという観察に照らせば（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０００；Ｙｌｉｔａｌｏら、２０００）、ウイルス価の解析は診断用途を有するかもしれない。このような力価試験に好適な方法は、幅広いダイナミック・レンジを有し、容易に使用でき、そして子宮頸部形成異常の進行に関連する一連の非常に相違したＨＰＶタイプのアッセイを可能にする必要がある。本アッセイは他のＰＣＲに基づく方法よりも多くの利点を有するため、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲに焦点を合わせている：（ｉ）データ収集を増幅中に行うため、増幅後に更なる実験室工程を必要としない、（ｉｉ）同一反応中で複合検出プローブの使用を可能にする、（ｉｉｉ）幅広いダイナミック・レンジを有する、（ｉｖ）ＰＣＲ産物が汚染する可能性を制限する閉鎖性チューブシステムを有する均一なアッセイである。本発明者らは、各反応チューブ内で３つの異なる蛍光体を定量することにより、本方法の有用性を拡張し、実施する必要がある平行反応数を制限した。ＨＰＶを定量するためのいくつかの他のシステムは、内部対照（即ちヒト遺伝子の同時増幅）の使用、及びＰＣＲの終点測定によるＨＰＶのＰＣＲ産物とヒト遺伝子ＰＣＲ産物との量の比較に基づいている。本発明者らは、ＨＰＶとヒト遺伝子のアンプリコン間の競合は細胞あたりのコピー数を誤って評価するかもしれないので、そのような競合を避けるため、外部対照を用いるシステムを設計することを選択する。内部対照とＨＰＶのＰＣＲ産物との競合は、低ウイルス量サンプルのＨＰＶコピー数について過小評価を、高ウイルス量のサンプルのＨＰＶコピー数について過大評価をもたらすかもしれない。したがって、内部対照を有するシステムは、サンプル間のＨＰＶコピー数の範囲が減少する傾向にあるかもしれない。我々のサンプル中の細胞あたりのＨＰＶコピー数は、非常に広範囲に及ぶ。このように広範なコピー数に対して内部対照を有するシステムを用いると、おそらくデータの解像度を実質的に制限するであろう。
【００４８】
単一コピー核遺伝子に関し、市販のアッセイを用いるのではなく、別のアッセイを開発した。我々のヒト単一コピー遺伝子アッセイを用いると、ＨＰＶコピー数はゲノムＤＮＡ量（含まれる細胞数と等価）に対して標準化することができる。サンプル間のＨＰＶコピー量及びサンプル間のゲノムＤＮＡ量における変動を考えると、細胞数によるこうした標準化は比較可能で重要なＨＰＶ価の評価を得る必要があるようである。そのような測定値は、感染細胞数、又は細胞間のＨＰＶゲノムの相対分布を表示しない。しかしながら、細胞あたりのＨＰＶ平均コピー数は、がんが進行する危険性の増加に関連するため、そのような測定値はＨＰＶ分子の細胞内及び細胞間分布に依存しない有用な診断指針を意味する（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０００；Ｙｌｉｔａｌｏら、２０００）。診断技術の重要な側面は偽陰性サンプルを同定する能力であり、開始ＤＮＡ量不足、又はＰＣＲに対するインヒビターの存在に起因する。ヒト遺伝子アッセイのシグナルの欠如は、アッセイにおけるインヒビターの存在又はＤＮＡ量不足を表す。実際、サンプル抽出プロトコールの比較において、より速いプロトコールの１つを使用する際、多くのサンプルはヒト単一コピー遺伝子のシグナルを示さなかったことがわかった。これらサンプルの多くは、サンプルを更に精製した場合、核遺伝子アッセイで陽性の結果を示した。
【００４９】
記載のアッセイは、プラスミド希釈シリーズから作成された標準曲線に基づいている。そのような曲線の臨床サンプルへの適用は、サンプル中にインヒビターが存在していないことに依拠している。核遺伝子アッセイを通して、通常重大な阻害を検出することができ、ＢＳＡのような薬剤を反応混合物へ添加することにより多くの阻害作用が軽減される。それにもかかわらず、いくつかのサンプルタイプは新しい標準曲線を作成する必要があるかもしれない。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを解析する上で、ＨＰＶ価が正確に評価される前に、例えばヒト対照アッセイを用いて、阻害の程度を定量する必要がある。保管パパニコロー染色スミアを解析する場合、同様の問題が起こるかもしれない（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、１９９９）。高ＤＮＡ濃度では、パパニコロー染色スミアはＰＣＲの阻害を示す（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、１９９９）。ＢＳＡが阻害作用を除去していない場合、組織サンプル由来のウイルスコピー数を定量するには、用いる標準曲線は生体サンプルと同一の方法で処理されたＤＮＡサンプルに由来する必要がある。
【００５０】
本アッセイの重要な側面は、混合感染において個々のＨＰＶタイプを定量する能力である。感染した頚部細胞におけるコピー数は、形成異常の異なるステージ間だけでなく（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０００；Ｙｌｉｔａｌｏら、２０００；Ｓｗａｎら、１９９９）、ＨＰＶタイプ間においても（Ｓｗａｎら、１９９９）異なっているとの指摘がある。したがって、混合感染では、診断アッセイは個々のＨＰＶタイプを同定し且つ定量する能力を有する必要がある。我々の合成混合物における多くのＨＰＶタイプの組合わせでは、本アッセイは、主要ＨＰＶタイプの量の少なくとも１〜１０％を示す限り、１種のＨＰＶタイプを検出し且つ定量する能力を示した。ＨＰＶタイプ間の比が１／１００未満である場合、感度の減少は異なるＨＰＶタイプのＰＣＲ産物間の競合によるものであると思われる。数種のＨＰＶタイプに感染した臨床サンプルでは、比は非常に幅広く、広範な比にわたって信頼できる定量を提供できるアッセイの必要性を強調している。
【００５１】
要約すると、本発明の方法及びキットは、記載の蛍光５’エキソヌクレアーゼ・アッセイで例示されるように、ＨＰＶウイルス価の定量に好適な多くの特徴を有する。広範なウイルスタイプを対象とする他のアッセイが存在するが、複雑なＰＣＲ後解析を必要とし、ＰＣＲに基づく蛍光５’エキソヌクレアーゼ・アッセイの迅速性、簡便性及び柔軟性との競合は不可能である。
【００５２】
参考文献
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，Ａ．Ｊ．、Ｐ．Ｋ．Ｅ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｎ．Ｙｌｉｔａｌｏ、Ｐ．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、Ｐ．Ｑｗａｒｆｏｒｔｈ−Ｔｕｂｂｉｎ、Ｐ．Ｋ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｍ．Ｍｅｌｂｙｅ、Ｈ．Ｏ．Ａｄａｍｉ及びＵ．Ｂ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ２０００  上皮内がんの進行の決定因子としてのＨＰＶウイルス量。Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：２１８９−９３。
【００５３】
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，Ａ．、Ｋ．Ｌｉｖａｋ及びＵ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  １９９９  蛍光  ５−エキソヌクレアーゼ・アッセイ（ＴＡＱＭＡＮ）を用いたヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出及びリアルタイム定量。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３７、４９０−４９６。
【００５４】
Ｓｗａｎ  Ｄ．Ｃ．、Ｒ．Ａ．Ｔｕｃｋｅｒ、Ｇ．Ｔｏｒｔｏｌｅｒｏ−Ｌｕｎａ、Ｍ．Ｆ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｌ．Ｗｉｄｅｒｏｆｆ、Ｅ．Ｒ．Ｕｎｇｅｒ、Ｒ．Ａ．Ｎｉｓｅｎｂａｕｍ、Ｗ．Ｃ．Ｒｅｅｖｅｓ、Ｊ．Ｐ．Ｉｃｅｎｏｇｌｅ  １９９９  ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡコピー数は子宮頚疾患のグレード及びＨＰＶタイプに依存する。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：１０３０−４。
【００５５】
Ｙｌｉｔａｌｏ，Ｎ．、Ａ．Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ、Ｐ．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、Ｐ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｐ．Ｋ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｊ．Ｐｏｎｔｅｎ、Ｈ．Ｏ．Ａｄａｍｉ、Ｕ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ及びＭ．Ｍｅｌｂｙｅ  ２０００  ヒト・パピローマウイルス  タイプ１６の高ウイルス量と上皮内子宮頚癌の危険性の一致。Ｌａｎｃｅｔ３５５：２１９４−８。
【００５６】
Ｙｌｉｔａｌｏ，Ｎ．、Ｔ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ及びＵ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  １９９５  単一チューブｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ及びタイプ特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションによる陰部ヒト・パピローマウイルスの検出。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（７）：１８２２−８。
【００５７】
【表１】
2006500952.tif 000002
【００５８】
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【００６１】
【表５】
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【００６２】
【表６】
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【００６３】
【表７】
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【００６４】
【表８】
2006500952.tif 000009
【００６５】
【表９】
2006500952.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ａ）ＨＰＶ１６アッセイ、及びｂ）ＨＰＶ３１アッセイに関する標準曲線。ＨＰＶのｌｏｇコピー数に対して閾値サイクル（Ｃｔ）数がプロットされている。点は１２回の独立した測定値の平均を表す。
【図２】ａ）ＨＰＶ１８アッセイ（直線）及びＨＰＶ４５アッセイ（点線）、並びにｂ）ＨＰＶ３３群（３３、５２、５８）アッセイに関する標準曲線。ＨＰＶのｌｏｇコピー数に対して閾値サイクル（Ｃｔ）数がプロットされている。点は１２回の独立した測定値の平均を表す。
【図３】ａ）ＨＰＶ３５アッセイ、及びｂ）ＨＰＶ３９アッセイに関する標準曲線。ＨＰＶのｌｏｇコピー数に対して閾値サイクル（Ｃｔ）数がプロットされている。点は１２回の独立した測定値の平均を表す。
【図４】ヒト遺伝子（ＨＵＭＰＢＧＤＡ）アッセイに関する標準曲線。ＨＰＶのｌｏｇコピー数に対して閾値サイクル（Ｃｔ）数がプロットされている。点は１２回の独立した測定値の平均を表す。
【図５】混合感染を模倣するために作製された合成混合物における個々のＨＰＶタイプの解析：ａ）ＨＰＶ１６をバックグラウンドにしたＨＰＶ１８の検出、ｂ）ＨＰＶ１６をバックグラウンドにしたＨＰＶ４５の検出、ｃ）ＨＰＶ１６をバックグラウンドにしたＨＰＶ３１の検出。
【図６】同一セットの子宮頚管スミアサンプルに関する２回の独立した測定における閾値サイクル（Ｃｔ）値の比較。
【図７ａ】３つの異なる保存温度におけるアッセイ試薬の安定性：ａ）−２０℃（４時点）、ｂ）−４℃（７時点）、及びｃ）＋３０℃（６時点）。棒は、個々のサンプルに関し、さまざまな時点におけるサンプルのＣｔ値を表す。
【図７ｂ】３つの異なる保存温度におけるアッセイ試薬の安定性：ａ）−２０℃（４時点）、ｂ）−４℃（７時点）、及びｃ）＋３０℃（６時点）。棒は、個々のサンプルに関し、さまざまな時点におけるサンプルのＣｔ値を表す。
【図７ｃ】３つの異なる保存温度におけるアッセイ試薬の安定性：ａ）−２０℃（４時点）、ｂ）−４℃（７時点）、及びｃ）＋３０℃（６時点）。棒は、個々のサンプルに関し、さまざまな時点におけるサンプルのＣｔ値を表す。
【図８ａ】異なる抽出プロトコールを用いたアッセイ結果の比較：ａ）ＨＰＶアッセイ、プロトコールＡ対Ｄ。
【図８ｂ】異なる抽出プロトコールを用いたアッセイ結果の比較：ｂ）ＨＰＶアッセイ、プロトコールＢ対Ｄ。
【図８ｃ】異なる抽出プロトコールを用いたアッセイ結果の比較：ｃ）ＨＰＶアッセイ、プロトコールＣ対Ｄ。
【図８ｄ】異なる抽出プロトコールを用いたアッセイ結果の比較：ｄ）核遺伝子アッセイ、プロトコールＡ対Ｂ。
【図８ｅ】異なる抽出プロトコールを用いたアッセイ結果の比較：ｅ）核遺伝子アッセイ、プロトコールＢ対Ｄ。
【図８ｆ】異なる抽出プロトコールを用いたアッセイ結果の比較：ｆ）核遺伝子アッセイ、プロトコールＣ対Ｄ。
【図９】ケースコントロール材料の子宮頚管スミアサンプルにおけるＨＰＶタイプの度数分布。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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