(57)【要約】本発明は、除草剤の新規標的としての、存在しない場合には成長低減やクロロティックリーフとなる、配列番号２の核酸配列又は該核酸配列の機能的等価物によりコードされる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼに関する。この目的のため、配列番号２を含む新規核酸配列及び配列番号２の機能的等価物を提供する。さらに、本発明は、除草活性又は成長調節活性を有する化合物の同定方法における、上記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びその機能的等価物の使用、並びに上記方法により同定された化合物の除草剤又は成長調節剤としての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草剤の同定方法におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用。
【請求項２】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む核酸配列によりコードされる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む核酸配列によりコードされるグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼである、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも７９％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｅ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも８７％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含むグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする植物核酸配列。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子によりコードされる、除草剤の標的としてのグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２の機能的類似体を検出する方法であって、
ａ）プローブを調製し、続いて対象の種のゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること、あるいは
ｂ）電子的データベースにおける類似配列についてコンピュータ検索を行うこと、
を含む、上記方法。
【請求項７】
ａ）請求項４記載の核酸配列と機能的に連結された遺伝子制御配列；又は
ｂ）さらなる機能的配列；又は
ｃ）上記ａ）及びｂ）の組み合わせ、
を含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項７記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項９】
請求項４記載のグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、請求項７記載の発現カセット、又は請求項８記載のベクターを含み、細菌、酵母、真菌、動物細胞又は植物細胞から選択される、トランスジェニック生物。
【請求項１０】
除草活性を有する物質の同定方法であって、以下のステップ：
ｉ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、１以上の試験化合物と、該試験化合物が核酸分子又は該グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼと結合するような条件下で接触させるステップ；並びに
ｉｉ）試験化合物が、ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼと結合するか否かを検出するステップ；あるいは
ｉｉｉ）試験化合物が、ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素活性又は生物学的活性を低減又は阻止するか否かを検出するステップ；あるいは
ｉｖ）試験化合物が、ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの転写、翻訳又は発現を低減又は阻止するか否かを検出するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１１】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
ａ）請求項４記載の核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼであり、
ａ）請求項４記載の核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性又は生物学的活性を低減又は阻止する試験化合物を選択する、請求項１０、１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）トランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを発現させる、又は天然にリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む生物を成長させるステップ；
ｉｉ）ステップｉ）の、トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物における、部分的に精製された形態又は均質に精製された形態のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを試験化合物と接触させるステップ；並びに
ｉｉｉ）ステップａ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低減又は阻止する化合物を選択するステップ
を行う、請求項１０、１１、１２又は１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップ：
ｉ）請求項７記載のトランスジェニック生物、又は遺伝暗号の縮重に基づいて配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列の逆翻訳により誘導されうる核酸配列を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含有するトランスジェニック生物を作出し、該トランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させるステップ；
ｉｉ）試験物質を、ステップｉ）のトランスジェニック植物及び同じ遺伝子型の非トランスジェニック植物に適用するステップ；
ｉｉｉ）試験物質の適用後にトランスジェニック植物及び非トランスジェニック植物の成長又は生存を判定するステップ；
ｉｖ）トランスジェニック植物の成長と比較して非トランスジェニック植物の成長の低減をもたらす試験物質を選択するステップ、
を含む、請求項１０、１１、１２、１３又は１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
植物生物、シアノバクテリア又はプロテオバクテリアにおいて行う、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
成長調節活性を有する物質を同定する方法であって、以下のステップ：
ｉ）ａ）請求項４記載の核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列
を含むグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物を作出し、該トランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させるステップ；
ｉｉ）試験物質を、ステップｉ）のトランスジェニック植物及び同種の非トランスジェニック植物に適用するステップ；
ｉｉｉ）試験物質の適用後にトランスジェニック植物及び非トランスジェニック植物の成長又は生存を判定するステップ；並びに
ｉｖ）トランスジェニック植物の成長と比較して非トランスジェニック植物の成長の低減をもたらす試験物質を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項１８】
物質がハイスループットスクリーニング法において同定される、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項４記載の１以上の核酸分子、請求項７記載の１以上の発現カセット、請求項８記載の１以上のベクター、請求項９記載の１以上の生物、又は請求項５記載の１以上の（ポリ）ペプチドを含む支持体。
【請求項２０】
物質が請求項１９記載の支持体を用いたハイスループットスクリーニングにおいて同定される、請求項１０〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１０〜１６、１８及び２０のいずれかに記載の方法の１つにより同定される、除草活性を有する化合物。
【請求項２２】
請求項１７、１８又は２０のいずれかに記載の方法により同定される、成長調節活性を有する化合物。
【請求項２３】
農芸化学組成物の製造方法であって、
ａ）請求項１０〜１６、１８及び２０のいずれかに記載の方法の１つにより除草活性を有する化合物を、又は請求項１７、１８若しくは２０のいずれかに記載の方法により成長調節活性を有する化合物を同定するステップ；並びに
ｂ）上記化合物を好適な補助剤と共に製剤化し、除草活性又は成長調節活性を有する作物防除製品を得るステップ
を含む方法。
【請求項２４】
望ましくない植生の防除のため及び／又は植物の成長を調節するための方法であって、請求項２１若しくは２２記載の少なくとも１つのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、又は請求項２１若しくは２２記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む農芸化学組成物を、植物、その環境及び／又は種子に作用させることを含む方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法における、請求項２１若しくは２２記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、又は請求項２１若しくは２２記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む農芸化学組成物の使用。
【請求項２６】
請求項２１記載の物質により阻害されないリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の作製方法であって、該核酸配列は、遺伝暗号の縮重により配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列の逆翻訳により誘導されうる核酸配列を含み、以下のステップ：
ａ）異種系又は無細胞系においてｉ）に記載の核酸配列によりコードされるタンパク質を発現させるステップ；
ｂ）核酸の改変によりタンパク質のランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を行うステップ；
ｃ）改変型遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定するステップ；
ｄ）相互作用をあまり示さないタンパク質の誘導体を同定するステップ；
ｅ）除草剤の適用後にタンパク質の生物学的活性をアッセイするステップ；並びに
ｆ）除草剤に対する生物学的活性が改変された核酸配列を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項２７】
請求項２６のステップｆ）に従って選択された配列を生物に導入する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２１記載の物質に対する耐性を有するトランスジェニック植物の作出方法であって、
ａ）請求項４記載の核酸配列；又は
ｂ）配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の核酸配列の機能的等価物
を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を上記植物において過剰発現させることを含む方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤の新規標的としての、存在しない場合には成長低減やクロロティックリーフとなる、配列番号２の核酸配列又は該核酸配列の機能的等価物によりコードされる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼに関する。この目的のため、配列番号２を含む新規核酸配列及び配列番号２の機能的等価物を提供する。さらに、本発明は、除草活性又は成長調節活性を有する化合物の同定方法における、上記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びその機能的等価物の使用、並びに上記方法により同定された化合物の除草剤又は成長調節剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の標的を阻害することにより除草剤を同定する基本的な原理は公知である（例えば米国特許第５，１８７，０７１号、ＷＯ９８／３３９２５号、ＷＯ００／７７１８５号）。一般に、除草剤の新規標的となる可能性のある酵素を検出することが非常に望まれている。その理由は、既知の標的に対して作用する除草剤の有効成分は耐性の確立という問題があるためであり、活性範囲ができる限り広く、環境保護に寄与し、また毒性学的に適合性があり、及び／又は適用率が低いことにより区別される新規な除草剤有効成分を同定するための努力が常になされている。
【０００３】
実際には、新規な標的の検出は常に非常に困難である。なぜなら、代謝経路の一部である酵素の阻害は、植物の成長に対してさらなる影響を及ぼすことはない。その理由は、植物が、その存在が知られていない他の代謝経路に転換するか、あるいは阻害される酵素が代謝経路を律速するものではない可能性があるためである。さらに、植物ゲノムは高度に機能的な冗長性により区別される。シロイヌナズナゲノムにおいては、昆虫又は哺乳動物の場合と比較して機能的に等価な酵素が多くの遺伝子ファミリーに見出される（Nature, 2000, 408(6814):796-815）。この仮説は、今までのところ、シロイヌナズナにＴ−ＤＮＡ又はトランスポゾンを挿入することによる大きな遺伝子のノックアウト手法が、予想されたよりも低い表現型の発現をもたらしたという事実により実験的に確認されている（Curr. Op. Plant Biol. 4, 2001, pp.111-117）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、植物の成長に必須の新規標的、又はその阻害によって植物成長が低減する新規標的を同定すること、並びに、除草活性を有する及び／又は成長調節性の化合物の同定に好適な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記目的が、除草剤の同定方法におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用により達成されることを見出した。
【０００６】
さらに、本明細書で使用される用語は以下に定義する。
【０００７】
「アフィニティタグ」：
これは、そのコード核酸配列を、通常のクローニング手法を用いて、直接又はリンカーにより本発明に係る核酸配列と融合させうるペプチド又はポリペプチドを指す。アフィニティタグは、全細胞抽出物からのアフィニティクロマトグラフィーによる組換え標的タンパク質の単離、濃縮及び／又は選択的精製に役立つ。上記リンカーは、プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン又は第Ｘａ因子の切断部位）を含むことが有利であり、それによりアフィニティタグは必要な場合に標的タンパク質から切り出すことができる。一般的なアフィニティタグの例は、例えばquiagen及びHilden製の「Ｈｉｓタグ」、「Ｓｔｒｅｐタグ」、「Ｍｙｃタグ」（Invitrogen, Carlsberg）、キチン結合ドメイン及びインテインからなるNew England Biolabs製のタグ、New England Biolabs製のマルトース結合タンパク質（ｐＭａｌ）、及びNovagen製のＣＢＤタグとして知られるタグがある。アフィニティタグは、標的タンパク質をコードする配列と共に、コード核酸配列の５’末端又は３’末端に結合させうる。
【０００８】
「グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性」：
本発明の目的のため、上記用語は、成長能及び生存能を付与することが可能なグリオキシオソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの存在を意味する。グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するタンパク質の活性が阻害されると、植物の成長が低減したり、成長が停止したり又は死に至る。
【０００９】
「グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性」：
酵素活性という用語は、酵素が基質をある産物に変換する能力をいう。酵素活性は、産物の増大、基質（若しくは出発物質）の低減、又は特定の補因子の低減、あるいは上記パラメータの少なくとも２つの組み合わせを、時間経過の関数として調べる活性アッセイとして知られている方法において測定することができる。
【００１０】
「グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性」：
この用語は、本明細書中、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼにより同様に触媒される反応を触媒する酵素の能力を説明する。
【００１１】
「発現カセット」：
発現カセットは、少なくとも１つの遺伝子制御配列（プロモーターなど）と機能的に連結した本発明に係る核酸配列、及び有利にはさらなる制御配列（ターミネーターなど）を含むものである。発現カセットの核酸配列は、例えばゲノムＤＮＡ配列若しくは相補的ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ配列とすることができ、半合成又は完全合成類似体であってもよい。これらの配列は、直鎖状又は環状で、染色体とは別に又はゲノム中に組み込まれて存在することができる。対象の核酸配列は、合成してもよいし若しくは天然に得てもよく、又は合成ＤＮＡ成分と天然ＤＮＡ成分との混合物であってもよい。あるいは、種々の生物に由来する種々の異種遺伝子断片から構成されるものであってもよい。
【００１２】
本発明においては、人工核酸配列もまた、それらが細胞又は生物において、本発明に係る核酸配列によりコードされるポリペプチドである、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性（好ましくは、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性）を有するポリペプチドを発現可能である限り好適である。例えば、合成ヌクレオチド配列は、形質転換しようとする生物のコドン用法に関して最適化されるように作製することができる。
【００１３】
上記ヌクレオチド配列は全て、公知の方法において化学合成により、例えば二重らせんの個々の重複する相補的ヌクレオチド単位の断片縮合などにより、ヌクレオチド単位から作製することができる。オリゴヌクレオチドは、化学的に、例えばホスホアミダイト法（Voet, Voet, 2nd Edition, Wiley Press New York, pp. 896-897）を用いる公知の方法により合成することができる。発現カセットを調製する場合には、種々のＤＮＡ断片を、リーディングが正確な配向でありかつ正確なリーディングフレームを有するヌクレオチド配列が得られるように操作することができる。核酸断片は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)；T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)；及びAusubel, F.M. et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994)に記載されているような一般的なクローニング手法により互いに連結することができる。
【００１４】
「機能的連結」：
機能的（operable又はfunctional）連結は、調節配列の各々又は遺伝子制御配列の各々が、コード配列を発現させる場合に目的の機能を果たすような、調節配列又は遺伝子制御配列の配列の順序を意味するものと理解される。
【００１５】
「機能的等価物」：
これは、本明細書においては、配列番号２の核酸配列又は配列番号２の一部と標準的な条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞又は生物において、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性、好ましくはリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドを発現可能な核酸配列を意味する。
【００１６】
ハイブリダイゼーションを実施するためには、例えば、保存領域又はその他の領域の短いオリゴヌクレオチド、約１０〜５０ｂｐ長、好ましくは１５〜４０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドを用いるのが有利である。このようなオリゴヌクレオチドは、他の関連遺伝子との比較により、当業者に公知の方法で決定することができる。しかし、本発明に係る核酸のこれより長い１００〜５００ｂｐの断片、又は完全配列をハイブリダイゼーションに用いてもよい。用いた核酸／オリゴヌクレオチドのより長い断片又は完全配列に応じて、あるいは、ハイブリダイゼーションにどのタイプの核酸（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いるかに応じて、これらの標準的条件は変わってくる。こうして、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０℃低くなる。
【００１７】
標準的ハイブリダイゼーション条件とは、核酸に応じて、例えば、濃度０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）のバッファー水溶液中での４２〜５８℃の温度、さらに、５０％ホルムアミドの存在下では、例えば、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中での４２℃の温度、を意味するものと理解すべきである。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣ及び約２０〜６５℃、好ましくは約３０〜４５℃の温度が有利である。また、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合には、ハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣ及び約３０〜６５℃、好ましくは約４５〜５５℃の温度が有利である。ここに記載したこれらのハイブリダイゼーション温度は、例示のため、長さが約１００ヌクレオチドで、Ｇ＋Ｃ含量が５０％で、ホルムアミドが存在しない核酸について計算した融解温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、例えば、Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989のような遺伝学の専門書に記載されており、当業者が熟知している式を用いて、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、又はＧ＋Ｃ含量の関数として、計算することができる。当業者は、以下の文献からハイブリダイゼーションについてのさらに詳しい情報を得ることができる：Ausubel et al.（編）、1985, "Current Protocols in Molecular Biology"、John Wiley & Sons, New York；Hames and Higgins（編）、1985、"Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown（編）、1991、Essential Molecular Biology：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００１８】
さらにまた配列番号２の機能的等価物は、配列番号２に対して特定の程度の相同性又は同一性を有する核酸配列、また特に、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性、好ましくは生物学的活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸配列の天然又は人工の変異体を意味すると理解される。
【００１９】
従って、本発明はまた、例えば上記核酸配列の改変によって得られるヌクレオチド配列を含む。例えば、そのような改変は、当業者に周知の技術、例えば「部位特異的突然変異誘発」「エラープローンＰＣＲ」「ＤＮＡシャフリング」（Nature 370, 1994, pp.389-391）又は「付着伸張法（Staggered Extension Process）」（Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261）などにより行いうる。かかる改変の目的は、例えば、制限酵素の切断部位のさらなる挿入、配列を末端切断するためのＤＮＡの除去、コドン最適化のための塩基の置換、又は別の配列の付加でありうる。改変型核酸配列によりコードされるタンパク質は、核酸配列の変更にもかかわらず、所望の機能を保持する必要がある。
【００２０】
用語「機能的等価物」はまた、目的の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列にも関する。この場合、用語「機能的等価物」は、そのアミノ酸配列が配列番号３に対し所定の％の同一性又は相同性を有するタンパク質を意味する。
【００２１】
従って、機能的等価物は、本明細書に記載する配列の天然に存在する変異体、及び例えば化学合成により得られるコドン用法を最適化した人工の核酸配列、並びにそれらから誘導されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
「遺伝子制御配列」：
用語「遺伝子制御配列」は、真核生物又は原核生物における、本発明に係る核酸の転写、及び適当であれば翻訳に影響を及ぼす配列である。その例としては、プロモーター、ターミネーター、又は「エンハンサー」配列として知られる配列である。これらの制御配列に加えて、又はこれらの配列の代わりに、これらの配列の天然の調節は、実際の構造遺伝子の前に依然として存在していてもよく、適当な場合には、天然の調節をなくして、標的遺伝子の発現が改変（すなわち増大又は低減）されるように遺伝的に改変してもよい。制御配列の選択は、宿主生物又は出発生物に応じて異なる。遺伝子制御配列は、さらに遺伝子の５’非翻訳領域、イントロン又は非コード３’領域を含みうる。制御配列は、さらに、相同組換え又は宿主生物ゲノムへの挿入を可能とする配列、あるいはゲノムからの除去を可能とする配列を意味するものと理解される。遺伝子制御配列は、さらにプロモーター、プロモーター配列又は最小プロモーター配列、発現に関する性質を改変することが可能な、クロマチン構造に影響を及ぼす配列（例えばマトリックス付着領域（ＭＡＲ））を含みうる。従って、遺伝子制御配列は、組織特異的発現がさらに特定のストレス要因に依存するという事実にも影響を受ける。このような配列は、例えば、水ストレス、アブシジン酸（Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135）、高温及び低温ストレス（Plant Cell 1994, (6): 251-264）、並びに熱ストレス（Molecular & General Genetics, 1989, 217(2-3): 246-53）について記載されている。
【００２３】
「相同性」：
２つの核酸配列又はポリペプチド配列間の「相同性」は、各々のケースで、配列全長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって規定され、この同一性は、プログラムアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（Wisconsin Package Version 10.0、ウィスコンシン大学、遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ）、Madison, USA）を用いたアラインメントによって、ポリペプチドについては下記のパラメーター：
ギャップ重み：８                      長さ重み：２
平均マッチ：２，９１２                平均ミスマッチ：−２，００３
核酸については下記のパラメーター：
ギャップ重み：５０                    長さ重み：３
平均マッチ：１０．０００              平均ミスマッチ：−９．０００
を設定して、計算する。
【００２４】
以下本明細書において、用語「同一性」は、「相同」又は「相同性」という用語と共に同義に使用される。
【００２５】
「変異」：
核酸配列又はアミノ酸配列の「変異」は、１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆転又は挿入を含み、これはまた１以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失により標的タンパク質の対応するアミノ酸配列の変化をもたらし、かつ標的タンパク質の機能的特性は、全体として本質的に保持されているものである。
【００２６】
「天然の遺伝的環境」：
これは、起源の生物における天然の染色体の遺伝子座を意味する。ゲノムライブラリーの場合には、核酸配列の天然の遺伝的環境は、少なくとも一部が保持されることが好ましい。この環境は、核酸配列の少なくとも５’又は３’側に隣接し、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、特に好ましくは少なくとも５００ｂｐ、非常に特に好ましくは少なくとも１０００ｂｐ、最も好ましくは少なくとも５０００ｂｐの配列の長さである。
【００２７】
「植物」：
本発明の目的において、「植物」は、植物細胞、植物組織、植物器官、又は植物個体、例えば種子、塊茎、花、花粉、果実、苗木、根、葉、茎、又は他の植物部分である。さらに、用語「植物」は、増殖部位、例えば種子、果実、苗木、挿木、塊茎、切枝又は根塊を意味するものと理解される。
【００２８】
「反応時間」：
これは、酵素活性に関する有意な知見が得られるまで酵素活性を測定するためのアッセイを行うのに必要な時間を意味し、アッセイで使用するタンパク質の比活性、及び採用する方法、及び使用する機器の感度に応じて異なる。当業者であれば、反応時間の決定を容易に理解できる。測光法に基づいて除草活性を有する化合物を同定する方法の場合には、反応時間は一般的には例えば０〜１２０分である。
【００２９】
「組換えＤＮＡ」：
これは、組換えＤＮＡ技術により作製されうるＤＮＡ配列の組み合わせを意味する。
【００３０】
「組換えＤＮＡ技術」：
これは、一般的に、ＤＮＡ配列を融合するための既知の技術をいう（例えばSambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている）。
【００３１】
「複製起点」：
これは、微生物及び酵母における、本発明に係る発現カセット又はベクターの複製（倍化）を保証するものであり、例えば、大腸菌のｐＢＲ３２２ ｏｒｉ又はＰ１５Ａ ｏｒｉ（Sambrook et al.: “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）、及び酵母のＡＲＳ１ ｏｒｉ（Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068）がある。
【００３２】
「リポーター遺伝子」：
これは、容易に定量可能なタンパク質をコードする。形質転換効率又は発現の部位若しくは時期の評価は、これらの遺伝子を用いて、増殖アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ又は耐性アッセイにより、あるいは、光度測定（固有色）又は酵素活性によって、実施することができる。これに関しては、以下に挙げるようなリポータータンパク質が特に好ましい（Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999；13(1)：29-44）。「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）（Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996；389(1)：44-47；Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6：325-330；Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5)：912-8, 1997）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ（Giacomin, Plant Sci 1996, 116：59-72；Scikantha, J Bact 1996, 178：121；Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10：324-414）、及びルシフェラーゼ遺伝子、一般的にはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子若しくはβグルコルニダーゼ遺伝子（Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907）、又はＵｒａ３遺伝子など。
【００３３】
「選択マーカー」：
これは抗生物質に対する耐性を付与する。これに関する例として、下記のものを挙げることができる：アミノグリコシド系の抗生物質であるネオマイシン（Ｇ４１８）、カナマイシン、及びパロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Deshayes A et al., EMBO J. 4（1985）2731-2737）；変異型ジヒドロプテロエート合成酵素をコードするｓｕｌ遺伝子（Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990；15(1)：127-136）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０１１９３）及びブレオマイシン抗生物質（ゼオシンなど）に対する耐性を付与する、ｓｈｂｌｅ耐性遺伝子。選択マーカー遺伝子のさらに別の例として、２−デオキシグルコース−６−リン酸（ＷＯ９８／４５４５６号）又はホスフィノトリシンなどに対する耐性を付与する遺伝子、あるいは、代謝拮抗物質に対する耐性を付与するもの、例えば、ｄｈｆｒ遺伝子（Reiss, Plant Physiol.（Life Sci. Adv.）13（1994）142-149）が挙げられる。その他の好適な遺伝子として、ｔｒｐＢ又はｈｉｓＤ（Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85（1988）8047-8051）のような遺伝子がある。これら以外の好適な遺伝子としては、下記のものが挙げられる：マンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＷＯ９４／２０６２７号）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）遺伝子（McConlogue, 1987：Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory編）又はアスペルギルス・テレウスデアミナーゼ（Tamura K. et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59（1995）2336-2338）。
【００３４】
「形質転換」：
これは、異種ＤＮＡを原核細胞又は真核細胞に導入する方法を意味する。形質転換細胞という用語は、形質転換方法自体の産物のみならず、形質転換により作製されたトランスジェニック生物のトランスジェニック子孫の全てを意味する。
【００３５】
「標的／標的タンパク質」：
これは、本発明に係る核酸配列によりコードされるポリペプチドであって、典型的には酵素の形態、又は、例えば、構造タンパク質、発生過程に関連するタンパク質、調節タンパク質（例：転写因子）、キナーゼ、ホスファターゼ、受容体、チャネルサブユニット、輸送タンパク質、酵素複合体に対して基質若しくは活性調節を付与する調節サブユニットなどの形態でありうる。標的又は作用部位の全ては、それらの機能的な存在が生存又は正常な発生及び成長に必須であるという特徴を有する。
【００３６】
「トランスジェニック」：
これは、本発明に係る核酸配列、核酸配列を含む発現カセット若しくはベクター、又は上記核酸配列、発現カセット若しくはベクターで形質転換された生物を指し、トランスジェニックという用語は、標的タンパク質の核酸配列若しくは標的タンパク質の核酸配列と機能的に連結された遺伝的制御配列、又はこれらの可能な組み合わせのいずれかが天然の遺伝的環境にはないか又は組換え手法により改変されている、遺伝子操作方法により作製された構築物のすべてを意味する。これに関し、改変は、例えば、対象の核酸配列の１以上のヌクレオチド残基を変異することにより達成しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、オキサル酢酸及びリンゴ酸のピリジン塩基依存的変換を可逆的に触媒する。一次代謝のこれらの重要な代謝産物の変換のために、リンゴ酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応は種々の過程において大きな影響がある（Faske et al. 1997, Plant Physiology 115, 705-715の概説）。ＮＡＤ＋依存的リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、ミトコンドリア、微小体（ペルオキシソーム又はグリオキシソームなど）、サイトゾル、根瘤において見出されており、色素体は、その調節が光依存的であるＮＡＤＰ＋依存的リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有する。シロイヌナズナにおいて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは遺伝子ファミリーによりコードされる。個々のアイソフォームは、色素体、ミトコンドリア及び微小体に輸送されるための特定のＮ末端移行配列を含有する。さらに移行ペプチドの欠損のために、サイトゾルに残留すると推測されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの配列もある。リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする配列は種々のＣ３及びＣ４植物から単離されている（Miller et al. 1998 Plant Journal 15, 173-184参照）。グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列及びタンパク質配列は、スイカ（Ｐ１９４４６、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ；配列番号２との同一性７７．５％；配列番号３との同一性８５．４％）、キュウリ、シロイヌナズナ、ダイズ及びイネに存在することが知られている。
【００３８】
ジャガイモにおけるサイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの残留活性が４０％にまで低減するアンチセンス阻害は、顕著な成長の表現型を生じるものではなく、また塊茎の収率低減をもたらすものでもない（Jenner et al. 2001, Plant Physiology 126, 1139-1149）。Faskeら（1997, Plant Physiology 115, 705-715）によると、アンチセンス及び共抑制によるタバコ色素体リンゴ酸デヒドロゲナーゼの発現の低減は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの発現が大きく低減された場合（２０％未満の残渣活性）であっても、トランスジェニック植物の生存能には影響を及ぼさない。成長パラメータ（生重量、乾重量）に関してほんのわずかな変化が観察された。またＣ４植物であるフラベリア（Flaveria）においてソルガム色素体リンゴ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させる試みによって、植物の生存能には有意な影響を及ぼすことなく、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が５〜５０％の残渣活性にまで劇的に阻害された（Trevanion et al. 1997, Plant Physiology 113, 1153-1165）。
【００３９】
驚くべきことに、本発明の範囲内において、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼが選択的に低減された植物は、除草剤の適用により生じる表現型に匹敵しうる表現型を有することが見出された。顕著な成長の遅延や白化及び壊死などの損傷が観察された。
【００４０】
サイトゾル及び色素体リンゴ酸デヒドロゲナーゼは植物にとって必須ではないが、これらの酵素は、基本的に、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を決定するために用いることができる。なぜなら、サイトゾル及び色素体リンゴ酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応は、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応と同じだからである。
【００４１】
本発明は、除草剤の同定方法におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは植物リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、特に好ましくは、以下：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む核酸配列によりコードされる植物リンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用に関する。ここで、上記ｃ）及びｄ）の機能的等価物は、同じ機能性、すなわちグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を有する、ということにより区別される。
【００４２】
「含んでいる（comprising）」又は「含む（comprise）」という用語は、核酸配列を参照する場合、本発明に係る核酸配列が、３’末端又は５’末端に付加的な核酸配列を含む可能性があることを意味すると理解される。ここで、付加的な核酸配列の長さは、本発明に係る核酸配列の５’末端において５００ｂｐを超えずかつ３’末端において５００ｂｐを超えず、好ましくは５’末端において２５０ｂｐで３’末端で２５０ｂｐであり、特に好ましくは５’末端において１００ｂｐで３’末端で１００ｂｐである。
【００４３】
上記ｄ）の機能的等価物の例としては、
キュウリ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３１９００）
シロイヌナズナ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ００５６７１）
ダイズ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０１６２８）及び
イネ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ８５７６３）
に由来するリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする植物核酸配列、並びにスイカに由来するリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列によりコードされる核酸配列（アクセッション番号Ｐ１９４４６、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）がある。
【００４４】
上記配列はすべて同様に本発明に含まれる。
【００４５】
ｄ）に記載される配列番号３の本発明に係る機能的等価物は、配列番号３に対して少なくとも６３％、６４％、６５％、６６％、好ましくは少なくとも６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、好ましくは少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。
【００４６】
特に好ましくは、除草剤の同定方法における、以下：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む核酸配列によりコードされるグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用である。
【００４７】
上記ｄ）に記載の機能的等価物は、同じ機能性、すなわちグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的機能を有する、ということにより区別される。
【００４８】
上記核酸配列は、好ましくは植物に由来するものである。
【００４９】
ｄ）に記載される配列番号３の本発明に係る機能的等価物は、配列番号３に対して少なくとも６６％、６７％、６８％、好ましくは少なくとも６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、好ましくは少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。
【００５０】
さらに、本発明の範囲内には、以下：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）配列番号２に対して少なくとも７９％の同一性を有する配列番号２の核酸配列の機能的等価物；又は
ｅ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも８７％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む植物グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列が含まれる。
【００５１】
上記核酸配列によりコードされるポリペプチドも同様に本発明に含まれる。ｃ）及びｄ）に記載の機能的等価物は、同じ機能性、すなわちグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性、好ましくは生物学的活性を有する、ということにより区別される。
【００５２】
配列番号２の機能的等価物は、配列番号３に対して少なくとも７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、好ましくは少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、特に好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する。
【００５３】
配列番号３の本発明に係る機能的等価物は、配列番号３に対して少なくとも８７％、８８％、８９％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、好ましくは９４％、９５％、９６％、特に好ましくは少なくとも９７％、９８％、９９％の同一性を有する。
【００５４】
本明細書中以下使用する「本発明に係る核酸配列」という用語は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列、好ましくは植物リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列、特に好ましくは以下：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む植物リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列、特にさらに好ましくは、以下：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む植物グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を意味する。
【００５５】
グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性、好ましくは生物学的活性を有する、本発明に係る核酸配列によりコードされるポリペプチドは、本明細書中以下、単に「ＭＤＨ」と称する。用語「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ」は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を有する任意のタンパク質／酵素を意味する。
【００５６】
グリオキシソームＭＤＨの量の低減は、成長の遅延、並びに植物における葉の壊死及び白化（クロロティックリーフ）を引き起こす
本発明に係る核酸の遺伝子産物は、除草剤の新規な標的となり、これにより望ましくない植物を防除するための新規な除草剤を提供するものである。さらに、本発明に係る核酸の遺伝子産物は、成長調節剤の新規な標的となり、これにより植物の成長を調節するための新規な成長調節剤を提供することが可能となる。
【００５７】
望ましくない植物は、広い意味で、望ましくない位置に成長する植物すべてを意味するものと理解され、例えば以下のものである：
下記属に属する双子葉の雑草：
カラシ（Sinapis）、マメグンバイナズナ（Lepidium）、ヤエムグラ（Galium）、ハコベ（Stellaria）、マトリカリア（Matricaria）、アンセミス（Anthemis）、ハキダメギク（Galinsoga）、アカザ（Chenopodium）、イラクサ（Urtica）、セネシオ（Senecio）、ヒユ（Amaranthus）、スベリヒユ（Portulaca）、オナモミ（Xanthium）、サンシキヒルガオ（Convolvulus）、サツマイモ（Ipomoea）、タデ（Polygonum）、セスバニア（Sesbania）、ブタクサ（Ambrosia）、キルシウム（Cirsium）、ヒレアザミ（Carduus）、ノゲシ（Sonchus）、ナス（Solanum）、イヌガラシ（Rorippa）、ロタラ（Rotala）、アゼトウガラシ（Lindernia）、オドリコソウ（Lamium）、クワガタソウ（Veronica）、イチビ（Abutilon）、イメックス（Emex）、チョウセンアサガオ（Datura）、スミレ（Viola）、チシマオドリコソウ（Galeopsis）、ケシ（Papaver）、ヤグルマギク（Centaurea）、シャジクソウ（Trifolium）、キンポウゲ（Ranunculus）、タンポポ（Taraxacum)
下記属に属する単子葉の雑草：
ヒエ（Echinochloa）、エノコログサ（Setaria）、キビ（Panicum）、ヒメシバ（Digitaria）、アワガエリ（Phleum）、イチゴツナギ（Poa）、ウシノケグサ（Festuca）、オヒシバ（Eleusine）、ビロードキビ（Brachiaria）、ライグラス（Lolium）、イヌムギ（Bromus）、カラスムギ（Avena）、カヤツリグサ（Cyperus）、モロコシ（Sorghum）、カモジグサ（Agropyron）、ギョウギシバ（Cynodon）、ミズアオイ（Monochoria）、テンツキ（Fimbristyslis）、オモダカ（Sagittaria）、ハリイ（Eleocharis）、フトイ（Scirpus）、スズメノヒエ（Paspalum）、カモノハシ（Ischaemum）、ナガボノウルシ（Sphenoclea）、タツノツメガヤ（Dactyloctenium）、コヌカグサ（Agrostis）、スズメノテッポウ（Alopecurus）、セイヨウヌカボ（Apera）。
【００５８】
配列番号２又は配列番号２の一部は、ハイブリダイゼーションプローブの調製に用いることができる。これらのプローブの調製及び実験手順は公知である。例えば、ＰＣＲにより放射性又は非放射性のプローブを選択的に作製し、好適に標識されたオリゴヌクレオチドを使用し、続いてハイブリダイゼーション実験を行うことにより実施することができる 。この目的に必要な技術は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に詳細に記載されている。対象のプローブは、標準的な技法により修飾することができ（Ｌｉｔ．ＳＤＭ又はランダム突然変異誘発法）、さらに別の目的で、例えば他の生物における対応する配列を分析するために、ｍＲＮＡ及び対応するコード配列と特異的にハイブリダイズするプローブとして用いることができる。
【００５９】
上記プローブは、配列同一性に基づいて、配列番号２の他の植物種に由来する機能的等価物の検出及び単離にも使用することができる。本明細書においては、対象の配列番号２の配列の一部又は全部を、対象の植物種のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、あるいは電子的データベースの機能的等価物の配列のコンピュータ検索において使用することができる。
【００６０】
好ましい植物種は、上述した望ましくない植物である。
【００６１】
本発明はさらに、以下：
ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかを含む本発明に係る核酸配列と機能的に連結させた遺伝子制御配列：
（ｉ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸、若しくは
（ｉｉ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；若しくは
（ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも７９％の同一性を有する配列番号２の核酸配列の機能的等価物；若しくは
（ｉｖ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも９２％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｂ）さらなる機能的配列；又は
ｃ）上記ａ）及びｂ）の組み合わせ、
を含む発現カセット、並びに、以下：
ａ）本発明に係る核酸配列と機能的に連結させた遺伝子制御配列；
ｂ）さらなる機能的配列；又は
ｃ）上記ａ）及びｂ）の組み合わせ、
を含む発現カセットの、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を発現させるための使用に関し、これはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系において使用しうる。上記発現カセットのいずれの実施形態も、本発明に係る発現カセットとして以下本明細書中に記載する。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明に係る発現カセットは、コード配列の５’末端にプロモーターを、３’末端に転写終止シグナルを含み、必要であれば、さらに本発明に係る挿入核酸配列と機能的に連結した別の遺伝子制御配列を含む。
【００６３】
本発明に係る発現カセットはまた、例えば１つのポリヌクレオチド上の個々の核酸配列の組み合わせ（複数の構築物）又は細胞内における複数のポリヌクレオチド上の個々の核酸配列の組み合わせ（共形質転換）によって、あるいは連続的な形質転換によって提供することも可能である。
【００６４】
本発明に係る発現カセット又は本発明に係る発現カセットを含むベクターのための上記構成要素ａ）の有利な遺伝子制御配列の例は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ、若しくはλ−ＰＬプロモーターなどであり、これらはすべて、グラム陰性細菌株においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を発現させるのに用いることができる。
【００６５】
さらに有利な遺伝子制御配列の例は、例えば、プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２（これらはいずれもグラム陽性菌株においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＭＤＨを発現させるために用いることができる）、並びに酵母若しくは真菌由来プロモーターＡＵＧ１、ＧＰＤ−１、ＰＸ６、ＴＥＦ、ＣＵＰ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ１、ＴＰＩ、ＰＨＯ５、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１、ＣＹＣ１、ＯｌｉＣ、ＡＤＨ、ＴＤＨ、Ｋｅｘ２、ＭＦＡ若しくはＮＭＴ、又は上記プロモーターの組み合わせ（Degryse et al., Yeast 1995 June 15; 11(7):629-40；Romanos et al. Yeast 1992 June;8(6):423-88；Benito et al. Eur. J. Plant Pathol. 104, 207-220 (1998)；Cregg et al. Biotechnology (N Y) 1993 Aug;11(8):905-10；Luo X., Gene 1995 Sep 22;163(1):127-31；Nacken et al., Gene 1996 Oct 10;175(1-2): 253-60；Turgeon et al., Mol Cell Biol 1987 Sep;7(9):3297-305）、又は転写ターミネーターＮＭＴ、Ｇｃｙ１、ＴｒｐＣ、ＡＯＸ１、ｎｏｓ、ＰＧＫ若しくはＣＹＣ１（Degryse et al., Yeast 1995 June 15; 11(7):629-40；Brunelli et al. Yeast 1993 (Dec9(12): 1309-18；Frisch et al., Plant Mol. Biol. 27(2), 405-409 (1995)；Scorer et al., Biotechnology (N.Y. 12 (2), 181-184 (1994), Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ４６２３２；Zhao et al. アクセッション番号ＡＦ０４９０６４；Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117-124）（これらはすべて酵母菌株においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＭＤＨを発現させるために用いることができる）がある。
【００６６】
昆虫細胞における発現に好適な遺伝子制御配列の例は、多角体プロモーター及びｐ１０プロモーターである（Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55）。
【００６７】
細胞培養物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を発現するための有利な遺伝子制御配列は、ポリアデニル化配列に加えて、例えばウイルス起源のシミアンウイルス４０真核性プロモーターに由来するもの、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス又はシミアンウイルス４０のプロモーターなどがある。
【００６８】
植物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を発現するための別の有利な遺伝子制御配列は、植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ［Franck et al., Cell 21(1980) 285-294］、ＰＲＰ１［Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)］、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ＬＥＢ４、ＵＳＰ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ＮＯＳ；ＦＢＰａｓｅＰ（ＷＯ９８／１８９４０号）、又はユビキチン若しくはファセオリンプロモーターであり、特に、植物プロモーター若しくは植物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーターなどのウイルス起源のプロモータが特に好ましい（Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294；Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812）。構成的プロモーター、例えばアグロバクテリウムのノパリンシンターゼプロモーター、ＴＲ二重プロモーター、アグロバクテリウムのＯＣＳ（オクトピンシンターゼ）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649）、液胞ＡＴＰａｓｅサブユニットのプロモーター、又はコムギプロリンリッチタンパク質のプロモーター（ＷＯ９１／１３９９１号）がさらに好ましい。
【００６９】
発現カセットは、遺伝子制御配列として化学的に誘導可能なプロモーターを含んでいてもよく、かかるプロモーターを用いると、植物において外因性遺伝子の発現を特定の時点に制御することができる。このようなプロモーター、例えば、ＰＲＰ１プロモーター（Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361-366（1993））、サリチル酸誘導プロモーター（ＷＯ９５／１９４４３号）、ベンゼンスルホンアミド誘導プロモーター（ＥＰ−Ａ−０３８８１８６号）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Gatz et al., Plant J. 2, 397-404（1992））、アブシジン酸誘導プロモーター（ＥＰ−Ａ−０３３５５２８号）、又はエタノール若しくはシクロヘキサノン誘導プロモーター（ＷＯ９３／２１３３４号）を用いることができる。
【００７０】
さらに、好適なプロモーターは、組織特異的又は器官特異的発現を付与するものであり、例えば、葯、卵巣、花序及び花器、葉、気孔、トリコーム、茎、維管束組織、根及び種子における発現を付与するプロモーターである。上記構成的プロモーターの他の好適なプロモーターとしては、特に葉特異的発現を指令するプロモーターである。特に例示すべきプロモーターは、ジャガイモ細胞質ＦＢＰａｓｅプロモーター（ＷＯ９７／０５９００号）、ルビスコ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ）ＳＳＵ（小サブユニット）プロモーター又はジャガイモ由来のＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245）である。さらに好ましいプロモーターは、種子及び植物胚における発現を制御するものである。種子特異的プロモーターの例は、ファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号；Bustos MM et al., Plant Cell. 1989;1(9):839-53）、２Ｓアルブミン遺伝子のプロモーター（Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262:12196-12201）、レグミンプロモーター（Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2):326-331）、ＵＳＰ（未知の種子タンパク質）プロモーター（Baumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3):459-67）、ナピン遺伝子プロモーター（Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199:515-519）、スクロース結合タンパク質プロモーター（ＷＯ００／２６３８８号）又はＬｅＢ４プロモーター（Baumlein H et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128；Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090）である。
【００７１】
遺伝子制御配列として好適な別のプロモーターは、例えば、塊茎、貯蔵根又は根に特異的なプロモーター、例えばクラスＩパタチンプロモーター（Ｂ３３）、ジャガイモカテプシンＤインヒビタープロモーター、スターチシンターゼ（ＧＢＳＳ１）プロモーター、又はスポラミンプロモーターなど、果実特異的プロモーター、例えばトマト由来の果実特異的プロモーター（ＥＰ−Ａ４０９６２５号）など、果実成熟特異的プロモーター、例えばトマト由来の果実成熟特異的プロモーター（ＷＯ９４／２１７９４号）など、花序特異的プロモーター、例えばフィトエンシンターゼプロモーター（ＷＯ９２／１６６３５号）又はＰ−ｒｒ遺伝子のプロモーター（ＷＯ９８／２２５９３号）、又は色素体若しくは有色体特異的プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＷＯ９７／０６２５０号）、又はダイズホスホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８７９９９も参照のこと）、あるいは別の結節特異的プロモーター（ＥＰ−Ａ２４９６７６号に記載）が挙げられる。
【００７２】
さらなる機能的配列ｂ）は、限定するものではないが、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）と直接又は場合によりプロテアーゼ切断部位を含んでもよいリンカーを介して融合させた、リポーター遺伝子、複製起点、選択マーカー及びアフィニティタグとして知られるもの、を意味するものと理解される。別の好適なさらなる機能的配列は、産物がアポプラスト、色素体、液胞、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、小胞体（ＥＲ）に標的化されるようにする配列、あるいは、そのような機能配列がないために産物が形成された細胞小器官（例えば細胞質）に維持されるようにする配列である（Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423）。
【００７３】
本発明においては、本発明に係る核酸配列及び／又は本発明に係る発現カセットを少なくとも１コピー含むベクターである。
【００７４】
プラスミド以外にも、ベクターは、当業者が熟知しているその他のあらゆるベクターを包含すると理解すべきであり、例えば、ファージや、ＳＶ４０、ＣＭＢ、バキュロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、又は線状若しくは環状ＤＮＡを挙げることができる。これらのベクターは、宿主生物における自律複製又は染色体複製が可能であり、染色体複製が好ましい。
【００７５】
ベクターの別の実施形態では、本発明に係る核酸構築物は線状ＤＮＡの形態で生物に導入し、非相同又は相同的組換えにより宿主生物のゲノムに組み込むこともできる。この線状ＤＮＡは、線状化されたプラスミド、又はベクターとしての核酸構築物のみ、あるいは用いた核酸配列からなるものであってもよい。
【００７６】
さらに、原核生物又は真核生物発現系については、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual.” 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第１６節及び第１７節に記載されている。別の有利なベクターはHellensら（Trends in plant science, 5, 2000）に記載されている。
【００７７】
さらに、本発明に係る発現カセット及びそれから誘導されるベクターを用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を組換えにより産生する目的で、細菌、シアノバクテリア（例えば、シネコシスティス属、アナバエナ属、カロスリックス属、シトネマ属（Scytonema）、オスシラトリア属、プレクトネマ属（Plectonema）及びノストック属）、プロテオバクテリア（例えば、マグネトコッカス・エスピーMC1）、酵母、糸状菌及び藻類、並びに非ヒト真核細胞（例えば昆虫細胞）を形質転換することができ、好適な発現カセットの作製はそれを発現させようとする生物により異なる。
【００７８】
以下：
ａ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸、又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、又は
ｃ）配列番号２に対して少なくとも７９％の同一性を有する配列番号２の核酸配列の機能的等価物、又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも８７％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含むベクターもまた本発明を構成する。
【００７９】
さらに有利な実施形態では、本発明に係る方法で用いる核酸配列を単独で生物に導入することも可能である。
【００８０】
核酸配列のほかに、別の遺伝子を生物に導入する場合には、単一のベクターでそれらすべてを一緒に生物に導入するか、あるいは、個々の遺伝子をそれぞれ１つのベクターで生物に導入することができ、各種ベクターは同時に導入しても、順次導入してもよい。
【００８１】
本発明において、本発明に係る核酸、発現カセット若しくはベクターの対象生物への導入（形質転換）は、基本的に、当業者に公知のあらゆる方法により行うことができる。
【００８２】
微生物の場合、当業者であれば、Sambrook, J. et al., (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press、von F.M. Ausubel et al., (1994) "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons；D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)；Kaiser et al., (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press；又はGuthrie et al., "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic Pressの教科書に好適な方法を見出すことができる。糸状菌の形質転換においては、最初にプロトプラストを作製しＰＥＧを用いて形質転換を行う方法（Wiebe et al. (1997) Mycol. Res. 101 (7): 971-877；Proctor et al. (1997) Microbiol. 143, 2538-2591）を最初に選択し、次にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて形質転換を行う方法（de Groot et al. (1998) Nat. Biotech. 16, 839-842）を選択する。
【００８３】
双子葉植物の場合には、植物の形質転換と植物組織又は植物細胞からの植物の再生について記載されている方法を一過性又は安定な形質転換に用いることができる。好適な方法は、バイオリスティック法（微粒子銃）又はプロトプラストの形質転換（例えば、Willmitzer, L., 1993 Transgenic Plants. : Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise（H.J. Rehm, G. Reed, A. Puehler, P.Stadler編）, Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge参照）、エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション、及びアグロバクテリウム媒介遺伝子導入がある。上記の方法は、例えばB. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. Kung and R. Wu編, Academic Press (1993) 128-143；及びPotrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Biol. 42 (1991) 205-225）に記載されている。
【００８４】
アグロバクテリウムを用いる形質転換及び形質転換に使用するベクターは当業者に公知であり、文献に多く記載されている（Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711）。媒介ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列に対して相同な配列を有するために相同組換えによりアグロバクテリウムのＴｉ又はＲｉプラスミドに組み込むことができる。このプラスミドはさらに、Ｔ−ＤＮＡを導入するために必要なｖｉｒ領域を含む。媒介ベクターはアグロバクテリウムにおいて複製することができない。媒介ベクターは、ヘルパープラスミドを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入することができる（共役）。バイナリーベクターは大腸菌及びアグロバクテリウムの両方において複製することができる。これらは、マーカー遺伝子の選択、並びにＴ−ＤＮＡの右側及び左側境界領域と隣接するリンカー又はポリリンカーを含む。これらは、直接アグロバクテリウムに形質転換することができる（Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187）；ＥＰＡ０１２０５１６号；Hoekema, : The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V；Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46；及びAn et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287）。
【００８５】
アグロバクテリウムに基づくベクターを用いた単子葉植物の形質転換もまた記載されている（Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506；Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271-282；Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34；Wilmink et al, Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80；May et al; Biotechnology 13 (1995) 486-492；Conner and Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992) 550-555；Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265）。単子葉植物の形質転換のための別の系は、バイオリスティック手法（微粒子銃）を用いた形質転換（Wan and Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48；Vasil et al; Biotechnology 11 (1992), 667-674；Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325；Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性とした細胞のエレクトロポレーション、及びガラスファイバーを用いたＤＮＡの導入である。特に、トウモロコシの形質転換については反復的に文献に記載されている（例えば、ＷＯ９５／０６１２８号；ＥＰ０５１３８４９Ａ１号；ＥＰ０４６５８７５Ａ１号；ＥＰ０２９２４３５Ａ１号；Fromm et al, Biotechnology 8 (1990), 833-844；Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618；Koziel et al, Biotechnology 11(1993) 194-200；Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726参照）。
【００８６】
他の穀類種、例えばオオムギ（Wan and Lemaux、上記参照；Ritala et al、上記参照）及びコムギ（Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297）の形質転換もまたその成功例が記載されている。
【００８７】
本発明に係るベクターで形質転換したアグロバクテリウムは、植物、特に、シロイヌナズナなどの実験植物、又は、穀類、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ニンジン、トウガラシ、ナタネ、タピオカ、キャッサバ、クズ、マンジュギク、アルファルファ、レタス及び各種樹木、堅果及びブドウなどの作物植物を形質転換する公知の方法、例えば、表皮処理した葉又は葉切片をアグロバクテリウム溶液に浸けた後、適当な培地中で培養する方法に用いることができる。
【００８８】
遺伝子改変した植物細胞は、当業者に公知のあらゆる方法により再生させることができる。かかる方法は、S.D. Kung and R. Wu、Potrykus、又はHofgen and Willmitzerによる上記で引用した刊行物に見ることができる。
【００８９】
本発明に係る核酸配列を含む発現カセット又は上記発現カセットを含むベクターの上記実施形態の１つを用いた形質転換により作出したトランスジェニック生物、及び発現によりトランスジェニック生物から得ることができる組換えリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）もまた本発明の範囲内である。本発明に係る発現カセットを含むトランスジェニック生物の、例えば組換えタンパク質を得るための使用、及び／又は当該生物のｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系における使用は、同様に本発明の範囲内である。
【００９０】
組換え発現のために好ましい生物は、細菌、酵母、コケ、藻類及び真菌のみならず、真核細胞系も含まれる。
【００９１】
好ましいコケは、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）、及びKryptogamen [Cryptogamia], Vol.2, Moose, Farne [Mosses, Ferns], 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515)に記載される他のコケである。
【００９２】
好ましい細菌は、例えば、エッシュリヒア属、アーウィニア属、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属に由来する細菌、又はシアノバクテリア、例えばシネコシスティス属、アナベナ属、カロスリックス属、シトネマ属、オスシラトリア属、プレトネマ属及びノストック属、特に好ましくはシネコシスティス属又はアナベナ属に由来する細菌である。
【００９３】
好ましい酵母は、カンジダ、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンセヌラ又はピヒアである。
【００９４】
好ましい真菌は、アスペルジルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、アシュビア（Ashbya）、ノイロスポラ（Neurospora）、フサリウム（Fusarium）、ボーベリア（Beauveria）、モルティエレラ（Mortierella）、サポロレグニア（Saprolegnia）、ピチウム（Pythium）、又はIndian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995)に記載される他の真菌である。
【００９５】
好ましい植物は、特に単子葉作物植物、例えば、穀類種（コムギ、オオムギ、ソルガム若しくはアワ、ライムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ又はオートムギ、及びサトウキビ）から選択される。本発明に係るトランスジェニック植物はさらに、特に、双子葉作物植物、例えば、アブラナ科（Brassicaceae）（アブラナ、クレソン、アラビドプシス、キャベツ若しくはキャノーラなど）、マメ科（Leguminosae）（ダイズ、アルファルファ、エンドウ、ビーン若しくはラッカセイなど）、ナス科（Solanaceae）（ジャガイモ、タバコ、トマト、ナスビ若しくはトウガラシなど）、キク科（Asteraceae）（ヒマワリ、マンジュギク、レタス若しくはキンセンカなど）、ウリ科（Cucurbitaceae）（メロン、カボチャ／スカッシュ、ズッキーニなど）、又はアマニ、綿、麻、アマ、アカトウガラシ、ニンジン、ニンジン、サトウダイコン、あるいは種々の樹木、果実及びブドウのつる種から選択される。
【００９６】
原則として、トランスジェニック動物、例えば線虫（C. elegans）もまた好適な宿主生物である。
【００９７】
また、公に入手可能な又は市販の発現系及びベクターを使用することも好ましい。
【００９８】
大腸菌細菌において使用するために記載すべきベクターは、典型的に、市販の融合及び発現ベクターｐＧＥＸ［Pharmacia Biotech Inc；Smith, D.B.及びJohnson, K.S.（1988）Gene 67：31-40］、ｐＭＡＬ（New England Biolabs、マサチューセッツ州ベヴァリー）、並びに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、又はプロテインＡを含むｐＲＩＴ５（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＴｒｃベクター（Amann et al.（1988）Gene 69：301-315）、CLONTECH社（カリフォルニア州パロアルト）製の「ｐＫＫ２３３−２」、並びに、Storatagene社（La Jolla）製の「ｐＥＴ」及び「ｐＢＡＤ」ベクター系である。
【００９９】
酵母に使用するためのベクターは、下記のものがある：ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al.（1987）Embo J. 6：229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan及びHerskowitz,（1982）Cell 30：933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al.（1987）Gene 54：113-123）、並びに、ｐＹＥＳ誘導体、ｐＧＡＰＺ誘導体、ｐＰＩＣＺ誘導体、並びに、「ピキア発現キット」のベクター（Invitrogen Corporation（カリフォルニア州サンジエゴ）製）。糸状菌に使用するためのベクターは、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J.(1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F.Pberdy et al.編, p.1-28, Cambridge University Press: Cambridgeに記載されている。
【０１００】
あるいは、昆虫細胞発現ベクターも有利に用いることができ、例えば、組換えバキュロウイルスにより感染されるＳｆ９、Ｓｆ２１又はＨｉ５細胞において発現させることができる。これらの例としては、ｐＡｃ系のベクター（Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）及びｐＶＬ系のベクター（Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39）がある。使用可能な他のものとして、バキュロウイルス発現系「MaxBac 2.0 Kit」及び「Insect Select System」（Invitrogen製、Carlsbad）又は「BacPAK Baculovirus Expression System」（CLONTECH製、Palo Alto, CA）がある。昆虫細胞は、真核性タンパク質を過剰発現させるために特に好適である。なぜなら、昆虫細胞は細菌や酵母においては不可能なタンパク質の翻訳後修飾を行うことができるためである。当業者であれば、昆虫細胞の培養操作、及びタンパク質発現のための感染方法を、公知の方法と同様に実施しうることを理解しうる（Luckow and Summers, Bio/Tech. 6, 1988, pp.47-55；Glover and Hames (編) DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244）。
【０１０１】
植物細胞又は藻類細胞は、遺伝子を有利に発現させるために用いることができる別の細胞である。植物発現ベクターの例は、Becker, D. et al.（1992） "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20：1195-1197、又はBevan, M.W.（1984） "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12：8711-8721に報告されている。
【０１０２】
さらに、本発明に係る核酸配列は哺乳動物細胞において発現させることができる。好適な発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣであり、これについては、Seed, B.（1987）Nature 329：840又はKaufman et al.（1987）EMBO J. 6：187-195に記載されている。本発明において好ましく用いられるプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス又はシミアンウイルス４０のプロモーターなどのウイルス由来のものである。これ以外にも、原核又は真核生物発現系について、Sambrook et al., Molecular Cloning：A laboratory Manual. 2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の第１６節及び１７節に記載されている。また、別の有利なベクターが、Hellensら（Trends in plant science, 5, 2000）に記載されている。
【０１０３】
核酸配列を含むトランスジェニック生物は本発明の範囲内に記載されている。
【０１０４】
トランスジェニック生物の上記実施形態は全て、用語「本発明に係るトランスジェニック生物」となる。
【０１０５】
本発明はさらに、除草活性を有する試験化合物の同定方法における、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＭＤＨの使用に関する。
【０１０６】
本発明に係る、除草活性を有する化合物の同定方法は、好ましくは以下のステップを含む：
ｉ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を、１以上の試験化合物と、該試験化合物がリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）と結合するような条件下で接触させるステップ；
ｉｉ）上記試験化合物が、上記ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）と結合するか否かを検出するステップ；又は
ｉｉｉ）上記試験化合物が、上記ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の酵素活性又は生物学的活性を低減又は阻止するか否かを検出するステップ；又は
ｉｖ）上記試験化合物が、上記ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の転写、翻訳又は発現を低減又は阻止するか否かを検出するステップ。
【０１０７】
上記方法のステップ（ｉｉ）において行う検出は、タンパク質とリガンドとの相互作用を同定する技法を用いて実施することができる。これに関して、試験化合物又は酵素のいずれかは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、放射性同位体、化学発光標識又は酵素標識などを含みうる。酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼが挙げられる。その後行う検出は、標識により異なり、当業者に周知である。
【０１０８】
この点に関し、本発明に関連してハイスループット法（ＨＴＳ）に適した５つの好ましい実施形態を記載する。
【０１０９】
１．質量の関数としての蛍光分子の平均拡散速度を、蛍光相関分光学（ＦＣＳ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1994）11753-11575）により少量のサンプルで測定することができる。ＦＳＣを用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）と結合したとき必然的に起こる試験化合物の質量変化、若しくは変化した拡散速度を測定することにより、タンパク質／リガンド相互作用を測定することができる。本発明に係る方法は、蛍光分子で標識した試験化合物の結合を測定するために直接設計することができる。あるいは、本発明に係る方法は、蛍光分子により標識された化学参考化合物が別の試験化合物と置き換わるように設計することもできる（置換アッセイ）。
【０１１０】
２．蛍光偏光は、偏光を発するように偏光で励起された静止蛍光団の特徴を利用する。しかしながら、蛍光団は励起状態の間に回転する場合に、放射された蛍光の偏光が事実上消失する。同一条件下（例えば、温度、粘度、溶媒）において、回転は分子サイズの関数であり、それにより蛍光団が結合した残基のサイズに関する知見を読み取り値から得ることができる（Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300）。本発明に係る方法は、蛍光分子で標識した試験化合物のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）への結合を測定することにより直接設計することができる。あるいは、本発明に係る方法はまた、１に記載したように「置換アッセイ」の形態とすることもできる。
【０１１１】
３．蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、好適な条件下における空間上で隣接する２つの蛍光分子の間の非放射線エネルギー移動に基づくものである。その条件は、供与分子の発光スペクトルが受容分子の励起スペクトルと重複することである。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）及び結合する試験化合物の蛍光標識について、その結合をＦＲＥＴにより測定することができる（Cytometry 34, 1998, pp. 159-179）。あるいは、本発明に係る方法はまた、１に記載したように「置換アッセイ」の形態とすることもできる。ＦＲＥＴ技術の特に好適な実施形態は「均一系時間分解蛍光」（ＨＴＲＦ）であり、Packard BioScienceにより入手することができる。
【０１１２】
４．飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）と組み合わせた表面活性化レーザー脱着／イオン化（Surface-enhanced laser desorption/ionization：ＳＥＬＤＩ）により、支持体上の分子の高速分析が可能であり、これを用いて、タンパク質−リガンド相互作用を分析することができる（Worral et al.(1998) Anal. Biochem. 70：750-756）。好ましい実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を好適な支持体に固定化し、次いでこれを試験化合物と一緒にインキュベートする。１回以上の好適な洗浄ステップの後、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）とさらに結合した試験化合物の分子を前記方法により検出することができ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）に結合した試験化合物を選択する。
【０１１３】
５．表面プラズモン共鳴の測定は、試験化合物が、表面に固定化したタンパク質と結合する際の、該表面での屈折率の変化に基づくものである。表面での質量濃度の規定変化については、屈折率の変化が、すべてのタンパク質及びポリペプチドについてほぼ同じであるため、この方法は、原則として、あらゆるタンパク質に適用することができる（Lindberg et al., Sensor Actuators 4（1983）299-304；Malmquist Nature 361（1993）186-187）。この測定は、例えば現在１日当たり最大３８４サンプルを処理するBiacore（Freiburg）より入手可能な表面プラズモン共鳴に基づく自動分析装置で行うことができる。本発明に係る方法は、試験化合物のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）への結合を直接測定するために設計することもできるし、あるいは本発明に係る方法はまた、１に記載したように「置換アッセイ」の形態とすることもできる。
【０１１４】
上記方法１〜５により同定される化合物は阻害剤として好適でありうる。上記方法により同定される物質はすべて、その後、本発明に係る方法の別の実施形態において、その除草活性について試験することができる。
【０１１５】
さらに、Ｘ線構造解析によるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の三次元構造の解明を通じた分子モデリング法によって、除草活性成分についてのさらなる候補物質を検出することも可能である。Ｘ線構造解析に必要なタンパク質結晶の調製、並びに、関連する測定値と、それに続くこれら測定値の評価、タンパク質中の結合部位の検出、そして推定阻害剤構造の予測は、当業者には公知である。原則として、前記方法により同定された化合物の最適化は、分子モデリング法によっても可能である。
【０１１６】
本発明に係る方法の好ましい実施形態であって、ステップｉ）及びｉｉ）に基づくものは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の酵素活性を低減又は阻止する試験化合物を選択することからなる。
【０１１７】
本発明に係る方法の特に好ましい実施形態であって、ステップｉ）及びｉｉ）に基づくものは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の酵素活性を低減又は阻止する試験化合物を選択することからなり、試験化合物とインキュベートしたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の活性を、試験化合物とインキュベートしていないリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の活性を比較する。
【０１１８】
ステップｉ）及びｉｉ）に基づいて行う本発明に係る方法の好ましい実施形態は、以下からなる：
ｉ）本発明に係るトランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を発現させる、又は天然にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を含む生物を成長させるステップ；
ｉｉ）ステップｉ）の、トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物における、部分的に精製された形態又は均質に精製された形態のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を試験化合物と接触させるステップ；並びに
ｉｉｉ）試験化合物とインキュベートした場合に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）活性を低減又は阻止する化合物を選択するステップ。
【０１１９】
ステップｉ）及びｉｉ）に基づいて行う本発明に係る方法の好ましい実施形態は、以下からなる：
ｉ）本発明に係るトランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を発現させる、又は天然にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を含む生物を成長させるステップ；
ｉｉ）ステップｉ）の、トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物における、部分的に精製された形態又は均質に精製された形態のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を試験化合物と接触させるステップ；並びに
ｉｉｉ）試験化合物とインキュベートしていない場合のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）活性と比較して、試験化合物とインキュベートした場合に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）活性を低減又は阻止する化合物を選択するステップ。
【０１２０】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＭＤＨを含む溶液は、元の生物又は本発明にかかる発現カセットで形質転換させたトランスジェニック生物の溶解物から構成されてもよい。必要であれば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＭＤＨは、慣用法により部分的に精製してもよいし、又は完全に精製してもよい。現在のタンパク質精製技術に関する一般的な概要は、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6に記載されている。組換え調製の場合には、アフィニティタグと融合させたタンパク質を、当業者に公知のようにアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１２１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法に必要なリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）は、このようにして、本発明に係るトランスジェニック生物から異種発現により、又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性（好ましくは生物学的活性）を有する酵素を含む生物から、例えば望ましくない植物から単離することができる。用語「望ましくない植物」は、上述した種を意味するものと理解される。
【０１２２】
除草性化合物を同定するために、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を試験化合物と共にインキュベートする。反応時間後、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の酵素活性を、試験化合物とインキュベートしていないリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の酵素活性と比較して測定する。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）が阻害される場合には、本発明に係る非阻害ポリペプチドの活性と比較して活性の有意な低減が観察される。その低減の結果は、少なくとも１０％、有利には少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、特に好ましくは少なくとも５０％、最大１００％の低減（阻止）である。マイクロモル範囲の酵素濃度に基づいて、試験化合物濃度が１０−４Ｍ、好ましくは１０−５Ｍ、特に好ましくは１０−６Ｍにおいて少なくとも５０％の阻害が好ましい。
【０１２３】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の酵素活性は、例えば活性アッセイにより、すなわち産物の増大、基質（若しくは出発物質）の低減、又は補因子の低減若しくは増大を測定するか、あるいは上記パラメータの少なくとも２つの組み合わせにより、所定の時間の関数として、測定することができる。
【０１２４】
好適な基質の例は、例えば、リンゴ酸塩、（−）−酒石酸塩（Ｓ，Ｓ）、（Ｓ）−リンゴ酸塩、２−ヒドロキシ酪酸塩、２−ヒドロキシグルタル酸塩、２−ヒドロキシマロン酸塩、２−オキソ酪酸塩、２−オキソグルタル酸塩、ケトマロン酸塩、Ｌ−リンゴ酸塩、メゾ−酒石酸塩（Ｓ，Ｒ）、オキサル酢酸塩であり、好適な補因子の例は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＡＰＡＤ、ＡＰＡＤＨである。使用するリンゴ酸デヒドロゲナーゼに応じて、ＮＡＤＰＨはまた補基質として用い得る。適当であれば、例えば蛍光標識、放射性標識又は化学発光標識などの検出可能な標識を含む上記化合物の誘導体もまた用いられる。
【０１２５】
活性試験において使用すべき基質の量は０．５〜１００ｍＭの範囲であり、補因子の量は、１〜１００αｇ／ｍｌの酵素に基づいて０．１〜５ｍＭである。
【０１２６】
活性は、例えばGietl et al.（1996, BBA 1274, 48-58）により記載されている方法と同様に決定することができる。
【０１２７】
さらに、上記方法のステップｉｉｉ）における活性は、
ａ）ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への変換により光学的に、
ｂ）ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの変換により光学的に、
ｃ）ＡＰＡＤのＡＰＡＤＨへの変換により光学的に、
測定することができる。
【０１２８】
ステップｉ）及びｉｉｉ）に基づく本発明に係る方法の好ましい実施形態は、以下のステップからなる：
ｉ）以下のａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、若しくは
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列、若しくは
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、若しくは
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％、好ましくは８１％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含むグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸を含むトランスジェニック生物を作出するステップ；
ｉｉ）試験化合物をｉ）のトランスジェニック生物及び同遺伝子型の非トランスジェニック生物に適用するステップ；
ｉｉｉ）該試験物質の適用後にトランスジェニック生物及び非トランスジェニック生物の成長又は生存を判定するステップ；
ｉｖ）トランスジェニック生物の成長と比較して非トランスジェニック生物の成長の低減又は生存の低減をもたらす試験化合物を選択するステップ。
【０１２９】
上記方法において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはトランスジェニック生物において過剰発現される。
【０１３０】
本実施形態において、除草活性を有する阻害剤の選択のためのステップｉｖ）における成長の差異は、少なくとも１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、特に好ましくは４０％、非常に特に好ましくは５０％である。
【０１３１】
本実施形態におけるトランスジェニック生物は、本発明に係るポリペプチドをコードする配列を形質転換により組み込んだ、好ましくは植物、藻類、シアノバクテリア（例えば、シネコシスティス属）、又はプロテオバクテリア（例えば、マグネトコッカス・エスピーMC1）、好ましくは慣用技術により形質転換可能な植物、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、タバコ（Nicotiana tabacum）、又は容易に形質転換可能なシアノバクテリア（シネコシスティス属など）である。従って、これらのトランスジェニック生物は、本発明に係るポリペプチドを阻害する化合物に対する耐性が増大している。この生物の天然に存在する類似のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の遺伝子が選択的にスイッチオフされている「ノックアウト」変異体もまた用いることができる。
【０１３２】
しかしながら、本発明に係る上記方法の実施形態はまた、成長調節活性を有する物質の同定にも用いることができる。本実施形態において、使用するトランスジェニック生物は植物である。従って、成長調節活性を有する物質を同定する方法は以下のステップを含む：
ｉ）以下：
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列、若しくは
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列、若しくは
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、若しくは
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％、好ましくは８１％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含むグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物を作出するステップ、
ｉｉ）試験物質をｉ）のトランスジェニック植物及び同種の非トランスジェニック植物に適用するステップ、
ｉｉｉ）上記試験化合物の適用後、上記トランスジェニック植物及び非トランスジェニック植物の成長又は生存を判定するステップ、並びに
ｉｖ）上記トランスジェニック植物の成長と比較して非トランスジェニック植物の成長の低減をもたらす試験物質を選択するステップ、
を含む。
【０１３３】
上記方法において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼはトランスジェニック生物において過剰発現される。
【０１３４】
ここで、ステップｉｖ）は、トランスジェニック生物の成長と比較して非トランスジェニック生物の成長の変化をもたらす試験化合物の選択を含む。成長の変化とは、本実施形態においては、特に長期的な成長の低減を発現しうる、植物の栄養生長の阻害を意味するものと理解される。従って、処理植物は成長不良を示し、さらにこれらの葉は暗色となる。また、成長の変化は、経時的な成熟過程の変化、植物の側分枝成長の阻害又は促進、発生段階の短縮又は延長、立ち安定性の増大、多量の芽、花、葉、果実、種子、根及び塊茎の成長、植物（例えばテンサイ、サトウキビ及び柑橘果実など）中の糖含量の増大、植物（例えば穀類又はダイズなど）中のタンパク質含量の増大、あるいはゴムの木におけるゴム流量の刺激を意味するものと理解される。
【０１３５】
また、本発明に係る方法においては、本発明に係る方法において多数の試験化合物を用いることも可能である。試験化合物の群が標的に影響を及ぼす場合には、その後、個々の試験化合物を直接単離することもできるし、又は試験化合物を種々の下位群に分類することもできる。例えば、試験化合物が複数の異なる成分から構成される場合には、本発明に係る方法において異なる試験化合物の数を低減するために分類を行うことができる。続いて、本発明に係る方法を個々の試験化合物又は試験化合物の関連する下位群を用いて反復実施する。サンプルの複雑度に応じて、上述したステップを反復して、好ましくは本発明に係る方法に従って同定した下位群が少数の試験化合物又は１つの試験化合物を含むようになるまで反復して行うことができる。
【０１３６】
除草活性又は成長調節活性を有する阻害剤を同定するための上記方法は全て、本明細書中以下「本発明に係る方法」という。
【０１３７】
その後、本発明に係る方法により同定された化合物はいずれも、除草活性及び成長調節活性についてｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。除草活性について化合物を試験する方法の１つは、マイクロタイタープレートにおいてウキクサ、コウキクサ（Lemna minor）を使用することである。測定しうるパラメータは、クロロフィル含量及び光合成速度の変化である。また、化合物を直接望ましくない植物に適用することも可能であり、例えば成長の制限により、除草活性を同定することも可能である。
【０１３８】
本発明に係る方法はまたハイスループット法又はハイスループットスクリーニング法（ＨＴＳとして知られる）において実施することが有利でありうる。
【０１３９】
本発明に係る１以上の核酸分子、本発明に係る核酸配列を含む１以上のベクター、本発明に係る核酸配列の少なくとも１つを含む１以上のトランスジェニック生物、又は本発明に係る核酸配列によりコードされる１以上の（ポリ）ペプチドを含む支持体の使用により、実際にＨＴＳを実施することができる。使用する支持体は、固体又は液体とすることができ，好ましくは固体、特に好ましくはマイクロタイタープレートである。上記支持体はまた、本発明の一部を形成する。最も広く用いられている技術に従って、一般に２００μｌの容量を含むことができる９６ウエル、３８４ウエル及び１５３６ウエルのマイクロタイタープレートを用いる。マイクロタイタープレートに加えて、対応するマイクロタイタープレートと適合するＨＴＳシステムの別の構成要素、例えば多数の装置、材料、自動ピペット装置、ロボット、自動プレートリーダー及びプレートウォッシャーなどは市販されている。
【０１４０】
マイクロタイタープレートに基づくＨＴＳシステムの他、「フリーフォーマットアッセイ」として知られるもの、又はサンプル間に物理的障壁のないアッセイ系、例えばJayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 19 (1994) 161418；Chelsky, “Strategies for Screening Combinatorial Libraries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995)；Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763；及び米国特許第５，９７６，８１３号に記載のアッセイを使用することも可能である。
【０１４１】
本発明はさらに、本発明に係る方法により同定される除草活性を有する化合物に関する。これらの化合物は、以下、「選択化合物」という。該化合物は、１０００ｇ／ｍｏｌ未満、有利には５００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは４００ｇ／ｍｏｌ未満、特に好ましくは３００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。除草活性を有する化合物は、１ｍＭ未満、好ましくは１μＭ未満、特に好ましくは０．１μＭ、非常に特に好ましくは０．０１μＭ未満のＫｉ値を有する。
【０１４２】
本発明はさらに、本発明に係る方法により同定される成長調節活性を有する化合物に関する。これらの化合物もまた本明細書中以下「選択化合物」という。
【０１４３】
通常、本発明に係る方法により同定される選択化合物はまた、その農業上有用な塩の形態で存在してもよい。好適な農業上有用な塩は、主に、これらの陽イオンの塩、又はこれらの酸の酸付加塩であり、その陽イオン又は陰イオンは、本発明に係る方法により同定される、除草活性を有する化合物の除草活性に有害な影響を及ぼすものではない。
【０１４４】
選択化合物が非対称置換α炭素原子を含む場合、これらはさらに、ラセミ体、エナンチオマー混合物、純粋なエナンチオマーの形態で存在してもよく、あるいは、これらのキラル置換体である場合には、ジアステレオマー混合物の形態であってもよい。
【０１４５】
選択化合物は、化学的に合成された物質であってもよいし又は微生物により産生される物質であってもよく、例えば、細胞抽出物、又は例えば植物、動物又は微生物に見出すことができる。反応混合物は、細胞不含抽出物であってもよいし、細胞又は細胞培養物を含んでもよい。好適な方法は当業者に公知であり、一般的には、例えばAlberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994)の例えば第１７章に記載されている。選択化合物はまた、包括的物質ライブラリを起源とするものであってもよい。
【０１４６】
候補試験化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、有機小物質、ホルモン、ＰＮＡなどであってもよい（Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198及び該文献に引用される参照文献）。
【０１４７】
選択化合物は、望ましくない植物の防除に及び／又は成長調節剤として用いることができる。選択化合物を含む除草性組成物は、非作物領域に対して植物の良好な防除を行う。コムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ及び綿などの作物においては、これらは、作物植物に対して何ら有意な損傷を与えることなく、広葉雑草及びイネ科雑草に対して作用する。この作用は、特に低い適用量においても観察される。選択化合物は、上述した有害植物の防除に用いることができる。
【０１４８】
有利なことには、適用方法に応じて、選択化合物、若しくはそれらを含む組成物をさらに多種の作物植物に用いて、望ましくない植物を除去することもできる。好適な作物としては、例えば、下記のものが挙げられる：
タマネギ（Allium cepa)、パイナップル（Ananas comosus)、落花生（Arachis hypogaea)、アスパラガス（Asparagus officinalis)、サトウダイコンアルチッシマ種（Beta vulgaris spec. altissima)、サトウダイコンラパ種（Beta vulgaris spec. rapa)、セイヨウアブラナ変種ナパス（Brassica napus var. napus)、セイヨウアブラナ変種ナポブラシカ（Brassica napus var. napobrassica)、アブラナ変種シルベストリス（Brassica rapa var. silvestris)、チャ（Camellia sinensis)、ベニバナ（Carthamus tinctorius)、ヒッコリーイリノイネンシス（Carya illinoinensis)、レモン（Citrus limon)、オレンジ（Citrus sinensis)、アラビカコーヒー（Coffea arabica)（ロブスタコーヒー（Coffea canephora)、リベリカコーヒー（Coffea liberica))、キュウリ（Cucumis sativus)、ギョウギシバ（Cynodon dactylon)、ニンジン（Daucus carota)、アブラヤシ（Elaeis guineensis)、エゾヘビイチゴ（Fragaria vesca)、ダイズ（Glycine max)、リクチワタ（Gossypium hirsutum)、（キワタ（Gossypium arboreum)、アジアワタ（Gossypium herbaceum)、ワタビチホリウム（Gossypium vitifolium))、ヒマワリ（Helianthus annuus)、パラゴムノキ（Hevea brasiliensis)、オオムギ（Hordeum vulgare)、ホップ（Humulus lupulus)、サツマイモ（Ipomoea batatas)、カシグルミ（Juglans regia)、レンズマメ（Lens culinaris)、アマ（Linum usitatissimum)、トマト（Lycopersicon lycopersicum)、リンゴ種（Malus spec.)、キャッサバ（Manihot esculenta)、アルファルファ（Medicago sativa)、バショウ種（Musa spec.)、タバコ（Nicotiana tabacum （N. rustica))、オリーブ（Olea europaea)、イネ（Oryza sativa)、ライマメ（Phaseolus lunatus)、サヤインゲン（Phaseolus vulgaris)、ヨーロッパトウヒ（Picea abies)、マツ種（Pinus spec.)、エンドウ（Pisum sativum)、セイヨウミザクラ（Prunus avium)、モモ（Prunus persica)、セイヨウナシ（Pyrus communis)、スグリ（Ribes sylvestre)、トウゴマ（Ricinus communis)、サトウキビ（Saccharum officinarum)、ライムギ（Secale cereale)、ジャガイモ（Solanum tuberosum)、モロコシ（Sorghum bicolor （s. vulgare))、カカオ（Theobroma cacao)、アカツメクサ（Trifolium pratense)、コムギ属アエスチバム（Triticum aestivum)、マカロニコムギ（Triticum durum)、ソラマメ（Vicia faba)、ブドウ（Vitis vinifera)、トウモロコシ（Zea mays）。
【０１４９】
さらに、選択化合物はまた、育種（組換え法など）のために除草剤の作用に耐性を有する作物において用いることもできる。かかる作物の作出は本明細書において後述する。
【０１５０】
本発明はさらに、既に上述した除草性組成物又は成長調節性組成物の製造方法に関し、該方法は、選択化合物を好適な補助剤と共に製剤化し、作物防除剤を得ることを含むものである。
【０１５１】
この場合、選択化合物は、例えば、直接スプレー可能な水溶液、粉末、懸濁液、また非常に高度に濃縮された水性、油性若しくはその他の懸濁液若しくはサスポエマルジョン、若しくは分散液、乳濁可能な濃縮物、乳液、油性分散液、ペースト、倍散剤、散布用材料、又は顆粒の形態で、あるいは、噴霧、霧化、散粉、散布又は給水といった手段により製剤化することができる。この使用形態は、意図する用途及び選択化合物の性質に依存するが、どんな場合でも、選択化合物の最も微細な分布を確実にしなければならない。除草剤組成物は、除草剤として有効な量の少なくとも１つの選択化合物、及び除草剤組成物の製剤化において一般に使用される補助剤を含む。
【０１５２】
乳剤、ペースト又は水性若しくは油性製剤及び分散可能な濃縮物（ＤＣ）の調製については、選択化合物を、油又は溶媒中に溶解又は分散させることができる。さらに、均質にする目的で別の製剤用補助剤を添加することも可能である。しかしながら、選択化合物から液体又は固形濃縮物を調製することも可能であり、必要であれば、溶媒又は油と、場合によっては液体又は固形濃縮物を含むさらなる補助剤、及びこれらの濃縮物を、水で希釈することが適切である。以下においては、水に溶解可能又は分散可能な（湿潤可能な）固形製剤について、乳化可能な濃縮物（ＥＣ、ＥＷ）、懸濁液（ＳＣ）、溶解可能な濃縮物（ＳＬ）、分散可能な濃縮物（ＤＣ）、ペースト、ピル、湿潤可能な粉末又は顆粒を記載する。さらに、好適な粉剤若しくは顆粒剤又は錠剤は、有効成分の磨耗又は早期放出を防止する固形被膜を行ってもよい。
【０１５３】
原則として、用語「補助剤」は、以下のクラスの化合物を意味するものと理解される：消泡剤、増粘剤、湿潤剤、濃縮剤、分散剤、乳化剤、殺菌剤及び／又はチキソトロープ剤。当業者であれば、上記薬剤の意味を理解することができる。
【０１５４】
ＳＬ、ＥＷ及びＥＣは、対象の構成成分を単に混合することで調製することができる。粉剤は、特定種のミル（例えばハンマーミル）において混合又は粉砕することで調製することができる。ＤＣ、ＳＣ及びＳＥは、通常、湿潤混合により調製することができ、さらに補助剤又は選択化合物を含み得る有機相を添加することによりＳＣからＳＥを調製することも可能である。この調製物は公知である。展着及び粉末のための材料である粉剤は、有効成分と固形担体とを一緒に混合するか又は同時に粉砕することにより調製することが有利でありうる。顆粒は、例えば被覆顆粒、含浸顆粒及び均質顆粒があり、これらは選択化合物と固形担体とを結合することにより調製することができる。当業者であれば、例えば以下の文献に記載されている、これらの調製についてさらなる詳細を理解することができる：米国特許第３，０６０，０８４号、ＥＰ−Ａ７０７４４５号（液体濃縮物に関して）；Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48；Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57及びこれ以下参照；ＷＯ９１／１３５４６号、米国特許第４，１７２，７１４号、米国特許第４，１４４，０５０号、米国特許第３，９２０，４４２号、米国特許第５，１８０，５８７号、米国特許第５，２３２，７０１号、米国特許第５，２０８，０３０号、ＧＢ２，０９５，５５８号、米国特許第３，２９９，５６６；Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961；Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989；並びにMollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim（Federal Republic of Germany）, 2001）。
【０１５５】
本発明に係る製剤に好適な不活性液体及び／又は固体担体は、当業者に周知であり、以下に挙げるような液体添加剤である：中〜高沸点の鉱油留分、例えば灯油又はディーゼル油、さらには、コールタール油、並びに、植物又は動物油、脂肪族、環状及び芳香族炭化水素、例えば、パラフィン、テトラヒドロフタレン、アルキル化ナフタレン若しくはそれらの誘導体、アルキル化ベンゼン若しくはそれらの誘導体、アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びシクロヘキサノール、シクロヘキサノンのようなケトン、又は強い極性溶媒、例えば、N-メチルピロリドンのようなアミン又は水。
【０１５６】
固形担体の例としては、土類鉱物、例えばシリカ、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、石灰岩、石灰、白亜、木幹（bole）、黄土、粘土、白雲石、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、土類合成物質、肥料、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、並びに植物由来の産物、例えばシリアルミール、樹皮ミール、樹木ミール及び堅果ミール、セルロース粉末又は他の担体が挙げられる。
【０１５７】
当業者であれば、本発明に係る製剤に好適な界面活性物質（サーファクタント）の多様性を理解でき、例えば、芳香族スルホン酸（例：リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸）の、脂肪酸の、アルキル−及びアルキルアリールスルホネートの、アルキルスルホネートの、ラウリルエーテルスルフェートの、及び脂肪アルコールスルフェートのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩；並びに、硫酸化ヘキサ−、ヘプタ−及びオクタデカノールの、脂肪アルコールグリコールエーテルの塩；スルホン化ナフタレン及びその誘導体とホルムアルデヒドとの縮合体、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドとの縮合体、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチル−、オクチル−又はノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、脂肪アルコール／酸化エチレン縮合体、エトキシル化ひまし油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、リグニン亜硫酸パルプ廃液又はメチルセルロースが挙げられる。
【０１５８】
除草性組成物、又は選択化合物は、出芽前又は出芽後に適用しうる。特定の作物植物が選択化合物を十分には許容しない場合には、選択化合物と植物とがほとんど接触しないように、もし接触する場合には感受性の作物植物の葉に接触し、選択化合物が土壌表面の表面下に又は表面にむきだしで成長する好ましくない植物の葉に到達するように、散布装置を用いて選択化合物を散布する適用手法を用いてもよい（適用後、一時停止）。
【０１５９】
意図する防除程度の目的、季節、標的植物及び成長期に応じて、選択化合物の適用率は０．００１〜３．０、好ましくは０．０１〜１．０ｋｇ／ｈａである。
【０１６０】
除草剤の標的がさらにリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）の同定方法を可能にするものと仮定する。これは、作用部位としてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を有する除草剤、例えば除草活性を有する選択化合物、により阻害されない又は限定的な程度にしか阻害されないものである。本明細書の以下において、このようにリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）と異なるタンパク質をＭＤＨ変異体という。これは、以下：
ｉ）上記方法により同定される、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）を阻害する除草活性を有する物質によって阻害されないリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
ｉｉ）配列番号３に対し少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の核酸配列の機能的等価物によりコードされる核酸配列、
によりコードされる。
【０１６１】
好ましい実施形態では、核酸配列のＭＤＨ変異体をコードする核酸配列を作製する方法は、以下のステップ：
ａ）異種系又は無細胞系において上記核酸によりコードされるタンパク質を発現させるステップ；
ｂ）核酸の改変によるタンパク質のランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を行うステップ；
ｃ）改変型遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定するステップ；
ｄ）相互作用をあまり示さないタンパク質の誘導体を同定するステップ；
ｅ）除草剤を適用した後のタンパク質の生物学的活性をアッセイするステップ；
ｆ）除草剤に対する生物学的活性が改変された核酸配列を選択するステップ
を含む。
【０１６２】
ｉｉ）に記載の配列番号３の機能的等価物は、配列番号３に対して少なくとも６３％、６４％、６５％、６６％、好ましくは少なくとも６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、好ましくは少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。
【０１６３】
上記方法により選択される配列は、生物に有利に導入することができる。このため、本発明はさらに、上記方法によって作製される生物に関する。当該生物は、植物であることが好ましく、特に上記作物植物が好ましい。
【０１６４】
次に、植物個体を再生させ、選択化合物に対する耐性を植物個体で確認する。
【０１６５】
植物において、選択化合物に対する耐性を付与することができる改変タンパク質及び／又は核酸は、部位特異的突然変異誘発として知られる方法によって、上記核酸配列から作製することができる。例えば標的タンパク質の安定性及び／若しくは酵素活性、又は本発明の前記阻害剤の結合などの特性は、このような突然変異誘発を用いて、高度の標的様式で、改善又は改変することができる。
【０１６６】
例えば、植物において、有利に用いることができる部位特異的突然変異誘発方法は、Zhuらにより記載されている（Nature Biotech., 第18巻、2000, 5月：555-558）。
【０１６７】
加えて、改変は、ランダム突然変異誘発にｄＩＴＰを用いるSpeeら（Nucleic Acids Research, 第21巻、第3号、1993：777-78）により記載されたＰＣＲ法、あるいは、Rellosら（Protein Expr. Purif., 5, 1994：270-277）によるさらに改善された方法によって、行うことができる。
【０１６８】
また、これらの改変型タンパク質及び／又は核酸の作製は、Stemmerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第91巻、1994：10747-10751）により記載された分子進化のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え法、あるいは、Mooreら（Nature Biotechnology 第14巻, 1996：458-467）により記載されたＰＣＲと組換え法の組合せによっても、実施可能である。
【０１６９】
タンパク質の突然変異誘発のための別の手法がGreenerらによりMethods in Molecular Biology（第57巻、1996：375-385）に記載されている。ＥＰ−Ａ−０９０９８２１号には、微生物大腸菌ＸＬ−１ Ｒｅｄを用いて、タンパク質を改変する方法が記載されている。この微生物は、複製の間に、導入された核酸に突然変異を発生させ、これによって、遺伝情報の改変を引き起こす。有利な核酸及びこれらによりコードされるタンパク質は、改変型核酸又は改変型タンパク質を単離し、耐性試験を実施することにより、容易に同定することができる。これらの核酸又はタンパク質を植物に導入すると、これらは、そこで耐性を発揮することができ、従って、除草剤に対する耐性をもたらす。
【０１７０】
別の突然変異誘発及び選択方法は、例えば、種子又は花粉をｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発し、本発明の阻害剤の存在下で耐性対立遺伝子を選択した後、改変された耐性対立遺伝子の遺伝的及び分子同定を行なうことからなるもの；さらには、濃度が連続的に増加する本発明の阻害剤の存在下で、培養物を培養することにより、組織培養物中の耐性の突然変異誘発及び選択を実施することからなるものなどの方法がある。この方法で、化学／物理的突然変異誘発処理による自発的突然変異率の増大を利用してもよい。前述したように、微生物を用いて、改変型遺伝子を単離することもでき、その場合、該微生物は、本発明の方法で用いられる核酸によりコードされるタンパク質の外因性又は組換え活性を呈示し、かつ、本発明に従い同定された阻害剤に対する感受性を有する。本発明の阻害剤の濃度を増加しながら、培地で微生物を増殖させると、本発明の標的の耐性変異体の選択及び進化が可能になる。同様に、突然変異頻度は、突然変異誘発処理によって高めることができる。
【０１７１】
さらに、核酸の特異的改変方法も利用可能である（Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第96巻、8768-8773及びBeethem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第96巻、8774-8778）。これらの方法により、タンパク質において、阻害剤との結合に重要なアミノ酸を、機能的に同等であるが、阻害剤の結合を阻止するアミノ酸によって置換することが可能となる。
【０１７２】
本発明はさらに、生物学的活性が改変された遺伝子産物をコードする核酸配列を作製する方法に関するが、その際、生物学的活性は、それが増大するように改変される。「活性の増大」とは、元の生物又は元の遺伝子産物と比較して、少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも３０％高い、特に好ましくは少なくとも５０％高い、非常に特に好ましくは少なくとも１００％高い活性を意味するものとして理解される。さらに、本発明の物質及び／又は組成物が、核酸配列及び／又はそれらによってコードされた遺伝子産物と、もはや結合しない、あるいは、もはや正しく結合しないように、生物学的活性を改変することもできる。本発明が意図する「もはや〜しない」、又は「もはや正しく〜しない」とは、上記物質が、元の遺伝子産物又は元の核酸と比較して、改変型核酸及び／又は遺伝子産物と、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７０％未満、非常に特に好ましくは少なくとも８０％未満で少なく結合する、あるいは、まったく結合しないことを意味するものとして理解される。
【０１７３】
従って本発明のさらに別の態様は、生物学的活性が改変された遺伝子産物をコードする核酸配列、又はＭＤＨ変異体をコードする核酸配列で形質転換されたトランスジェニック植物に関する。形質転換方法は当業者に公知であり、例示により詳細を上述している。
【０１７４】
本発明に係る方法により見出される物質及び／又はこれら物質を含む組成物に対して耐性の遺伝的に改変されたトランスジェニック植物は、本発明に係る核酸配列を形質転換し、過剰発現させることにより作出してもよい。本発明は従って、本発明の方法によって見出される物質に耐性のトランスジェニック植物を作出する方法に関し、該方法は、これら植物における、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）をコードする核酸を過剰発現するステップを含む。同様の方法は、例えばLermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75-83に記載されている。
【０１７５】
耐性植物を作出するための本発明に係る前記方法により、非選択的除草剤に対して耐性を有する有用植物の開発と組み合わせて、活性が可能な限り完全で、かつ、植物種とは独立した新規除草剤（いわゆる非選択的除草剤）の開発が可能になる。非選択的除草剤に対して耐性の有用植物については、すでに何度か説明してきた。本明細書においては、耐性を生み出す原理を次のように区別しうる：
ａ）除草剤の標的として作用するタンパク質を顕著に過剰産生することにより、また、除草剤の標的として作用するタンパク質の過剰量のために、該細胞においてこのタンパク質が果たす機能が除草剤の適用後さえも維持されることによる、突然変異方法又は組換え方法を用いた、植物における耐性の発生
ｂ）除草剤の標的として作用するタンパク質の改変型を導入し、新しく導入した改変型タンパク質の機能が、除草剤の悪影響を受けないような、植物の改変
ｃ）新規なタンパク質／新規なＲＮＡを導入するが、その際、低分子量物質の除草作用に応答する、該タンパク質又は核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡなど）の化学的構造を改変し、これにより、改変された構造が除草作用の発生を阻止する、すなわち、除草剤が標的ともはや相互作用できないようにする、植物の改変
ｄ）植物に導入される新規な遺伝子で、標的の機能を置換し、これによって、代替経路として知られるものを形成する
ｅ）標的の機能を、植物に存在する別の遺伝子、若しくはその遺伝子産物によって引き継がせる。
【０１７６】
当業者は、相同的核酸を同定する別の方法について熟知しており、これは、例えば、別の植物において、例えば、トランスポゾンの使用など、類似配列を用いて行なう。従って、本発明はまた、別の植物における、配列番号３の核酸配列、遺伝暗号に基づいてこれら配列から誘導される配列、及び／又はかかる配列の誘導体への外来核酸の挿入のための、別の挿入突然変異誘発方法の使用に関する。
【０１７７】
トランスジェニック植物は、これについても前述した通常の形質転換方法により、本発明に係る発現カセットの前記実施形態の１つを用いて作製される。
【０１７８】
組換えにより発現させたＭＤＨ変異体の発現効率は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、シュート分裂組織増殖又は発芽試験により測定することができる。
【０１７９】
さらに、性質及びレベルに関して改変されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）遺伝子の発現、並びに、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（好ましくはＭＤＨ）阻害剤に対する耐性に及ぼす影響については、試験植物を用いて、温室実験で試験することができる。
【０１８０】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これは限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１８１】
植物形質転換ベクターのｃＤＮＡライブラリーの作製
植物の形質転換に直接使用することができるベクターにおいてｃＤＮＡライブラリー（以下、「バイナリ−ｃＤＮＡライブラリー」と称する）を作製するため、種々の植物組織からｍＲＮＡを単離し、cDNA Synthese Kit（Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg）を用いて二本鎖ｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、Ｔ１２−１８オリゴヌクレオチドを製造業者の説明書に従って用いて行った。サイズ分画を行った後、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを製造業者の説明書に従って連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）で突出部分を平滑末端化し、ｃＤＮＡ集団を平均化した。この目的のため、Kohci et al., 1995, Plant Journal 8, 771-776の方法に従って、表１に示す条件下でオリゴヌクレオチドＮ１を用いたＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。
【０１８２】
2006512069.tif 000002
【０１８３】
得られたＰＣＲ産物をPCR purification kit（Qiagen, Hilden）のカラムマトリクスに結合させ、３００ｍＭ ＮａＰバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％ＳＤＳで溶出した。ＤＮＡを沸騰水浴中で５分かけて変性し、続いて６０℃にて２４時間かけて再生させた。５０μｌのＤＮＡをヒドロキシアパタイトカラムにアプライし、カラムを１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＰバッファー、ｐＨ６．８で３回洗浄した。結合した一本鎖ＤＮＡは１３０ｍＭ ＮａＰバッファー、ｐＨ６．８で溶出させ、エタノールで沈殿させ、４０μｌの水に溶解させた。その２０μｌを上記のさらなるＰＣＲ増幅に使用した。さらなるｓｓＤＮＡ濃縮の後、上記の通り３回目のＰＣＲ増幅を行った。
【０１８４】
上記の通り作製したｃＤＮＡ集団を導入するための植物形質転換ベクターは、ベクターｐＵＣ１８をＳｂｆＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限酵素切断し、ベクター断片を精製した後、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて突出部分を平滑末端化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Stratagene）で再度連結することにより作製した。得られた構築物を以下ｐＵＣ１８ＳｂｆＩ−と称する。
【０１８５】
最初に、ベクターｐＢｉｎＡＲをＮｏｔＩで切断し、その末端を平滑末端化して、ベクターを再度連結し、ＳｂｆＩで切断し、平滑末端化し、ベクターを再度連結した後、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた断片を、アグロバクテリウムによる植物の形質転換が可能であり、トランスジェニック植物にカナマイシン耐性を付与する植物形質転換用バイナリーベクターｐＰＺＰ（Hajdukiewicz,P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994）の誘導体に連結した。このように作製した構築物は以下ｐＳｕｎ１２／３５Ｓと称する。
【０１８６】
オリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２（表２参照）、並びにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ｐＵＣ１８ＳｂｆＩ−を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。得られた断片をＳｍａＩで切断したｐＳｕｎ１２／３５Ｓに連結し、ｐＳｕｎｂｌｕｅｓ２を得た。ＮｏｔＩで切断後、エビアルカリホスファターゼ（Roche Diagnostics, Mannheim）で脱リン酸化し、ベクター断片を精製した後、ｐＳｕｎｂｌｕｅｓ２を同様に正規化したＮｏｔＩ切断ｃＤＮＡ集団と連結した。大腸菌Ｘｌ−１ｂｌｕｅ（Stratagene）に形質転換した後、得られたクローンをマイクロタイタープレートに播いた。バイナリーｃＤＮＡライブラリーは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下にて「センス」及び「アンチセンス」配向でｃＤＮＡを含むため、タバコ植物への形質転換後にはこれらのｃＤＮＡは「共抑制」及び「アンチセンス」効果を発揮し得る。
【０１８７】
2006512069.tif 000003
【実施例２】
【０１８８】
タバコ植物の形質転換及び分析
バイナリーｃＤＮＡライブラリーの選択クローンをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８Ｃ１：ｐＧＶ２２６０（Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777-4788）に形質転換し、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン選択においてインキュベートした。クローンｎｔ００２０３５０４１ｒでのタバコ植物（Nicotiana tabacum cv. Samsun NN）の形質転換に用いた材料は、ＹＥＢ培地でＯＤ６００が０．８〜１．６となるよう希釈した陽性形質転換アグロバクテリウムコロニーの一晩培養物とした。滅菌植物のリーフディスク（それぞれ約１ｃｍ２）をペトリ皿においてアグロバクテリウム希釈液と共に５〜１０分間インキュベートした。この後、２％スクロース（２ＭＳ培地）及び０．８％バクトアガーを添加したムラシゲ−スクージ培地（Physiol. Plant. 15(1962), 473）において２５℃にて２日間暗室でインキュベートした。この培養を、１６時間明反応／８時間暗反応の光周期で２日後まで継続し、５００ｍｇ／ｌクラホラン（セフォタキシムナトリウム）、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、１ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ｍｇ／ｌナフチル酢酸及び１．６ｇ／ｌグルコースを添加したＭＳ培地で週周期において継続した。成長したシュートを、２％ショ糖、２５０ｍｇ／ｌクラホラン及び０．８％バクトアガーを添加したＭＳ培地に移した。再生させたシュートをカナマイシン及びクラホランを添加した２ＭＳ培地に移した。トランスジェニック植物系統Ｅ＿００００００５８６９をこのようにして作出した。
【０１８９】
クローンｃＤＮＡのトランスジェニック系統のゲノムへの組み込みは、オリゴヌクレオチドＧ１及びＧ２（表２参照）及び対象のトランスジェニック系統から調製したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより検出した。この目的のため、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを製造業者（MoBiTec, Gottingen）の説明書に従って好ましく使用した。各場合に形質転換に使用したクローンであるバイナリーｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンは、陽性対照としてＰＣＲ反応の鋳型として使用した。同一サイズ又は適切であれば種々の制限酵素による切断後に得られる同一の制限パターンを有するＰＣＲ産物は、対応するｃＤＮＡが組み込まれていることの裏付けとなった。このようにして、クローンｎｔ００２０３５０４１ｒの挿入物が上記表現型を有するトランスジェニック植物において検出された。
【０１９０】
シュートを土壌に移した後、温室において、２〜２０週間にわたり表現型の発現について植物を観察した。ｎｔ００２０３５０４１ｒ挿入物が検出されたトランスジェニック植物系統Ｅ＿００００００５８６９は表現型が類似していた。これらの植物は、顕著な成長の遅延を示し、クロロティックリーフも生じ、場合によっては壊死が観察された。
【実施例３】
【０１９１】
クローンの配列分析
Ｓｍａｒｔ−ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造業者の指示に従って用いて、ｎｔ００２０３５０４１ｒの全長ｃＤＮＡ配列（配列番号２）を単離した。１５１３ｂｐの配列番号２は、９６０塩基長のオープンリーディングフレーム（１４８〜１２２１番の塩基）上に３２０アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０１９２】
従って、グリオキシソームＭＤＨをコードする配列の天然の発現は植物にとって必須であり、その発現の低下は実施例２に示す表現型に見られるように損傷をもたらすことが、驚くべきことに初めて示された。従って、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＭＤＨは除草剤の標的として好適であると結論付けられた。
【０１９３】
ヌクレオチドレベルにおいて、スイカ由来のグリオキシソームＭＤＨ（Ｐ１９４４６、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）と７７．５％の同一性（タンパク質レベルでは、９０．７％類似性、又は８５．４％同一性）を示し、またキュウリ、シロイヌナズナ、ダイズ及びイネとも最も高い相同性を有した。Ｎ末端の３８アミノ酸はグリオキシソーム移行配列であると推定される。
【実施例４】
【０１９４】
大腸菌における発現
植物ＭＤＨ活性を有する活性Ｎｔ−ＭＤＨタンパク質を作製するために、シロイヌナズナ由来のコード領域Ｎｔ−ＭＤＨ及びＭＤＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ａｔ２ｇ２２７８０）を大腸菌において過剰発現させた。この目的のため、ＮｔＭＤＨ断片を、特異的オリゴヌクレオチド及びＰｆｕ−Ｕｌｔｒａポリメラーゼ（Stratagene）を用いてＰＣＲにより増幅し、発現ベクターｐＣＲ Ｔ７／ＣＴ ＴＯＰＯ（Invitrogen）に連結した（構築物Ｎｔ１及びＡｔ１、表７）。このようにして、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグとのコード化融合タンパク質を作製した。クローニングステップにおける特定のオリゴヌクレオチドの使用によって、機能的発現に影響を及ぼす可能性のあるグリオキシソーム移行配列を排除するためのＭＤＨのＮ末端切断型が得られた。開始点は、スイカグリオキシソームＭＤＨ（Giet, et al. 1996, BBA 1274, 48-58）の移行配列とした。以下の標準的な条件（例えばSambrook, J. et al.(1989) “Molecular cloning: A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載）、すなわちアニーリング温度４５〜５５℃、及び重合時間それぞれ１０００ｂｐ当たり６０秒を３６サイクル行って、ＰＣＲを実施した。鋳型及びその鋳型のために使用したプライマーは、アニーリング温度と共に表７に示す。
【０１９５】
2006512069.tif 000004
【０１９６】
ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ Ｔ７／ＣＴ ＴＯＰＯに連結し、大腸菌に形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ（Invitrogen）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）又はＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（Stratagene）などの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において、ＩＰＴＧで誘導して発現を実施した。標準的なプロトコール（Invitrogen）に従った。
【０１９７】
Ｎｔ−ｇＭＤＨ−Ｅ１及びＡｔ−ｇＭＤＨ−Ｅ１の発現産物をＮｉ−アガロースにおけるアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。これは製造業者の説明書に従って行った（Qiagen）。
【実施例５】
【０１９８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系
ｇＭＤＨの酵素活性を、Huangら（1974, Plant Physiol 54, 364-368）の方法により植物微小体の調製物中で測定しうる。しかしながら、サイトゾル及びミトコンドリアＭＤＨのバックグラウンド活性を最小限にするために、上述のように大腸菌で発現させ、精製したタンパク質を用いることも有利な方法である。
【０１９９】
実施例３のｇＭＤＨの酵素活性を、Gietlら（1996, BBA 1274, 48-58）の方法を用いてＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの変換により３４０ｎｍにて光学的に測定した。このアッセイはマイクロタイタープレートのスケールで行うことができる。
【配列表】
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2006512069.tif 000009
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月5日(2005.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草剤の同定方法におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用であって、該リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含む核酸配列によりコードされるグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼである、上記使用。
【請求項２】
ａ）配列番号１に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｂ）配列番号２に示される核酸配列を有する核酸配列；又は
ｃ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に示されるアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｄ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも７９％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列；又は
ｅ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも８７％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列、
を含むグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする植物核酸配列。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子によりコードされる、除草剤の標的としてのグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２の機能的類似体を検出する方法であって、
ａ）プローブを調製し、続いて対象の種のゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること、あるいは
ｂ）電子的データベースにおける類似配列についてコンピュータ検索を行うこと、
を含む、上記方法。
【請求項５】
ａ）請求項２記載の核酸配列と機能的に連結された遺伝子制御配列；又は
ｂ）さらなる機能的配列；又は
ｃ）上記ａ）及びｂ）の組み合わせ、
を含む、発現カセット。
【請求項６】
請求項５記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項７】
請求項２記載のグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、請求項５記載の発現カセット、又は請求項６記載のベクターを含み、細菌、酵母、真菌、動物細胞又は植物細胞から選択される、トランスジェニック生物。
【請求項８】
除草活性を有する物質の同定方法であって、以下のステップ：
ｉ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、１以上の試験化合物と、該試験化合物が核酸分子又は該グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼと結合するような条件下で接触させるステップ；並びに
ｉｉ）試験化合物が、ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼと結合するか否かを検出するステップ；あるいは
ｉｉｉ）試験化合物が、ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素活性又は生物学的活性を低減又は阻止するか否かを検出するステップ；あるいは
ｉｖ）試験化合物が、ｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの転写、翻訳又は発現を低減又は阻止するか否かを検出するステップ、
を含み、上記リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
ａ）請求項２記載の核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる、上記方法。
【請求項９】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼであり、
ａ）請求項２記載の核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６６％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列
を含む核酸配列によりコードされる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
グリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性又は生物学的活性を低減又は阻止する試験化合物を選択する、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
ｉ）トランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを発現させる、又は天然にリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む生物を成長させるステップ；
ｉｉ）ステップｉ）の、トランスジェニック生物又は非トランスジェニック生物の細胞消化物における、部分的に精製された形態又は均質に精製された形態のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを試験化合物と接触させるステップ；並びに
ｉｉｉ）ステップｉ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低減又は阻止する化合物を選択するステップ
を行う、請求項８、９又は１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
以下のステップ：
ｉ）請求項７記載のトランスジェニック生物、又は遺伝暗号の縮重に基づいて配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列の逆翻訳により誘導されうる核酸配列を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含有するトランスジェニック生物を作出し、該トランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させるステップ；
ｉｉ）試験物質を、ステップｉ）のトランスジェニック植物及び同じ遺伝子型の非トランスジェニック植物に適用するステップ；
ｉｉｉ）試験物質の適用後にトランスジェニック植物及び非トランスジェニック植物の成長又は生存を判定するステップ；
ｉｖ）トランスジェニック植物の成長と比較して非トランスジェニック植物の成長の低減をもたらす試験物質を選択するステップ、
を含む、請求項８、９又は１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
植物生物、シアノバクテリア又はプロテオバクテリアにおいて行う、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
成長調節活性を有する物質を同定する方法であって、以下のステップ：
ｉ）ａ）請求項２記載の核酸配列；又は
ｂ）遺伝暗号の縮重に基づいて、配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列から逆翻訳により誘導されうる核酸配列
を含むグリオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物を作出し、該トランスジェニック生物においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させるステップ；
ｉｉ）試験物質を、ステップｉ）のトランスジェニック植物及び同種の非トランスジェニック植物に適用するステップ；
ｉｉｉ）試験物質の適用後にトランスジェニック植物及び非トランスジェニック植物の成長又は生存を判定するステップ；並びに
ｉｖ）トランスジェニック植物の成長と比較して非トランスジェニック植物の成長の低減をもたらす試験物質を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項１５】
物質がハイスループットスクリーニング法において同定される、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項２記載の１以上の核酸分子、請求項５記載の１以上の発現カセット、請求項６記載の１以上のベクター、請求項７記載の１以上の生物、又は請求項３記載の１以上の（ポリ）ペプチドを含む支持体。
【請求項１７】
物質が請求項１６記載の支持体を用いたハイスループットスクリーニングにおいて同定される、請求項８〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項８〜１３、１５及び１７のいずれかに記載の方法の１つにより同定される、除草活性を有する化合物。
【請求項１９】
請求項１４、１５又は１７のいずれかに記載の方法により同定される、成長調節活性を有する化合物。
【請求項２０】
農芸化学組成物の製造方法であって、
ａ）請求項８〜１３、１５及び１７のいずれかに記載の方法の１つにより除草活性を有する化合物を、又は請求項１４、１５若しくは１７のいずれかに記載の方法により成長調節活性を有する化合物を同定するステップ；並びに
ｂ）上記化合物を好適な補助剤と共に製剤化し、除草活性又は成長調節活性を有する作物防除製品を得るステップ
を含む方法。
【請求項２１】
望ましくない植生の防除のため及び／又は植物の成長を調節するための方法であって、請求項１８若しくは１９記載の少なくとも１つのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、又は請求項１８若しくは１９記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む農芸化学組成物を、植物、その環境及び／又は種子に作用させることを含む方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法における、請求項１８若しくは１９記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、又は請求項１８若しくは１９記載のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む農芸化学組成物の使用。
【請求項２３】
請求項１８記載の物質により阻害されないリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の作製方法であって、該核酸配列は、遺伝暗号の縮重により配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の機能的等価物のアミノ酸配列の逆翻訳により誘導されうる核酸配列を含み、以下のステップ：
ａ）異種系又は無細胞系において上記核酸配列によりコードされるタンパク質を発現させるステップ；
ｂ）核酸の改変によりタンパク質のランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を行うステップ；
ｃ）改変型遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定するステップ；
ｄ）相互作用をあまり示さないタンパク質の誘導体を同定するステップ；
ｅ）除草剤の適用後にタンパク質の生物学的活性をアッセイするステップ；並びに
ｆ）除草剤に対する生物学的活性が改変された核酸配列を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項２４】
請求項２３のステップｆ）に従って選択された配列を生物に導入する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１８記載の物質に対する耐性を有するトランスジェニック植物の作出方法であって、
ａ）請求項２記載の核酸配列；又は
ｂ）配列番号３に対して少なくとも６３％の同一性を有する配列番号３の核酸配列の機能的等価物
を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を上記植物において過剰発現させることを含む方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物。
【国際調査報告】
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