(57)【要約】  （ａ）検体を所定の周波数で光を吸収する光吸収標識体で標識して、標識検体を形成する工程と、（ｂ）標識検体を、光を吸収する少なくとも１つの化合物から形成されるマトリックスに包埋して、包埋標識検体を形成する工程と、（ｃ）包埋標識検体を所定の周波数を有する光を照射することで脱離して、脱離検体を形成する工程と、（ｄ）脱離検体を質量分析法により検出し、検体の特徴を分析する工程とを含み、光吸収標識体は蛍光体部分を含み、検体は質量分析計による検出の前に蛍光体部分に基づいて検出のために選択されることを特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する方法であって、
（ａ）  検体を所定の周波数で光を吸収する光吸収標識体で標識して、標識検体を形成する工程と、
（ｂ）  前記標識検体を、光を吸収する少なくとも１つの化合物から形成されるマトリックスに包埋して、包埋標識検体を形成する工程と、
（ｃ）  前記包埋標識検体を所定の周波数を有する光で照射することで脱離して、脱離検体を形成する工程と、
（ｄ）  前記脱離検体を質量分析法により検出し、前記検体の特徴を分析する工程と
を含み、前記光吸収標識体は蛍光体部分を含み、前記検体は質量分析法による検出の前に前記蛍光体部分に基づいて検出のために選択されることを特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する方法。
【請求項２】
前記検体は、前記蛍光体部分の種類及び／又は量に基づいて検出のために選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光体部分は、キサンテン色素部分、又はシアニン色素部分を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光体部分は、プロピル−Ｃｙ３−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチル−Ｃｙ５−ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はＣｙ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記脱離検体は、質量分析法により直接検出される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記検体は前記検体に関係づけられる質量標識体で更に標識され、該質量標識体が前記脱離検体から切断されて質量分析法により検出されて検体の特徴を分析するように、前記脱離検体は質量分析法により間接的に検出される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記包埋標識検体を照射する光は、レーザー光である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックスを形成する化合物は、前記光吸収標識体と同一周波数で光を吸収する請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記マトリックス及び前記光吸収標識体は、同一化合物から形成される請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記マトリックスは、固体マトリックス、又は液体マトリックスである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記マトリックスは、ニトロベンジルアルコールを含む液体マトリックスである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリックスは、酸性マトリックス、又は塩基性マトリックスを含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記マトリックスは、３−ヒドロキシピコリン酸、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸から選択される化合物を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記光吸収標識体は、色素から形成される請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記色素は、非蛍光色素である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記色素は、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド（ダブシル（ＤＡＢＳＹＬ）クロライド）、３−ヒドロキシピコリン酸、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び／又は４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸を含む請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検体は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片及びアミノ酸から選択される１つ以上の化合物を含む請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
（ａ）  任意にポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元して、遊離チオールを形成し、該遊離チオールをキャップする工程と、
（ｂ）  前記ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成する工程と、
（ｃ）  任意に前記開裂試薬を不活性化する工程と、
（ｄ）  存在する１つ以上のε−アミノ基をリジン反応剤でキャップする工程と、
（ｅ）  前記ペプチド断片を請求項１から１７のいずれかに定義する方法により分析して、前記ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程と、
（ｆ）  前記マスフィンガープリントから前記ポリペプチドを同定する工程と
を含むことを特徴とするポリペプチドの特徴を分析する方法。
【請求項１９】
複数のポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
（ａ）  任意に１つ以上のポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元して、遊離チオールを形成し、該遊離チオールをキャップする工程と、
（ｂ）  複数のポリペプチドから１つ以上の前記ポリペプチドを分離する工程と、
（ｃ）  １つ以上の前記ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成する工程と、
（ｄ）  任意に前記開裂試薬を不活性化する工程と、
（ｅ）  存在する１つ以上のε−アミノ基をリジン反応剤でキャップする工程と、
（ｆ）  前記ペプチド断片を請求項１から１７のいずれかに定義する方法により分析して、１つ以上の前記ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程と、
（ｇ）  前記マスフィンガープリントから１つ以上の前記ポリペプチドを同定する工程と
を含むことを特徴とする複数のポリペプチドの特徴を分析する方法。
【請求項２０】
各試料が１つ以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する方法であって、
（ａ）  任意に試料からの１つ以上のポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元し、かつ遊離チオールをキャップする工程と、
（ｂ）  各試料から１つ以上の前記ポリペプチドを分離する工程と、
（ｃ）  前記ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成する工程と、
（ｄ）  任意に前記開裂試薬を不活性化する工程と、
（ｅ）  存在する１つ以上のε−アミノ基をリジン反応剤でキャップする工程と、
（ｆ）  前記ペプチド断片を請求項１から１７のいずれかに定義する方法により分析して、前記試料から１つ以上の前記ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程と、
（ｇ）  １つ以上の前記マスフィンガープリントから前記試料中の１つ以上の前記ポリペプチドを同定する工程と
を含むことを特徴とする各試料が１つ以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する方法。
【請求項２１】
前記リジン反応剤は標識したリジン反応剤である請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
各試料が１つ以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する方法であって、
（ａ）  任意に試料からの１つ以上のポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元し、かつ遊離チオールをキャップする工程と、
（ｂ）  各試料中に存在する１つ以上のε−アミノ基を標識したリジン反応剤でキャップする工程と、
（ｃ）  前記試料をプールする工程と、
（ｄ）  プールした前記試料から１つ以上の前記ポリペプチドを分離する工程と、
（ｅ）  前記ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂してペプチド断片を形成する工程と、
（ｆ）  任意に前記開裂試薬を不活性化する工程と、
（ｇ）  前記ペプチド断片を請求項１から１７のいずれかに定義する方法により分析して前記試料から１つ以上の前記ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程と、
（ｈ）  １つ以上の前記マスフィンガープリントから前記試料中の１つ以上の前記ポリペプチドを同定する工程と
を含み、同一の標識体を同一の試料からのポリペプチド又はペプチドに使用し、また異なる標識体を異なる試料からのポリペプチド又はペプチドに使用して、ポリペプチド又はペプチドが由来する前記試料が前記標識体から決定可能となるようにする請求項２０に記載の各試料が１つ以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する方法。
【請求項２３】
前記配列特異的開裂試薬は、リジン残基のＣ−末端側で１つ以上の前記ポリペプチドを開裂する請求項１８から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記特異的開裂試薬は、Ｌｙｓ−Ｃ又はトリプシンを含む請求項１８から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ε−アミノ基がキャップされた前記ペプチド断片は親和性捕捉により除去され、前記リジン反応剤はビオチンを含む請求項１８から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記リジン反応剤は、立体障害のあるミカエル試薬を含む請求項１８から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記立体障害のあるミカエル試薬は以下の構造を有する化合物を含み、
【化１】
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Ｘは、陰電荷を安定化可能な電子吸引基であり、Ｒ基は、Ｒ基の少なくとも１つが立体障害基を含むという条件で水素、ハロゲン、アルキル、アリール、又は芳香族基を独立して含み、Ｒ２基は、水素、ハロゲン、炭化水素基、電子吸引基及び／又は親和性捕捉官能基又は固相担体へ付加可能なリンカーを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
質量分析法により前記脱離検体を検出する工程は、存在する前記検体量の検出工程の前に行われるか、存在する前記検体量の検出工程を含むか、あるいは、存在する前記検体量の検出工程の後に行われる請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
存在する前記検体量は前記検体に付加した蛍光体群の蛍光を測定して決定する請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する方法であって、
（ａ）  検体を所定の周波数で光を吸収する光吸収標識体で標識して、標識検体を形成する工程と、
（ｂ）  前記標識検体を、光を吸収する少なくとも１つの化合物から形成されるマトリックスに包埋して、包埋標識検体を形成する工程と、
（ｃ）  前記包埋標識検体を所定の周波数を有する光を照射することで脱離して、脱離検体を形成する工程と、
（ｄ）  前記脱離検体を質量分析法により検出し、前記検体の特徴を分析する工程と
を含み、質量分析法により前記脱離検体を検出する工程は、存在する前記検体量の検出工程の前に行われるか、存在する前記検体量の検出工程を含むか、あるいは、存在する前記検体量の検出工程の後に行われることを特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する方法。
【請求項３１】
存在する前記検体量は、質量スペクトル分析により決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
標識検体化合物は、以下の構造のどちらかを含み、
Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ａ
Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ａ
Ｆは蛍光体を含み、Ｄは光吸収標識体を含み、Ｌはリンカーを含み、及びＡは検体を含むことを特徴とする標識検体化合物。
【請求項３３】
検体を標識するための化合物は、以下の構造のどちらかを含み、
Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｒ
Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｒ
Ｆは蛍光体を含み、Ｄは光吸収標識体を含み、Ｌはリンカーを含み、及びＲは検体に化合物が付加するための反応性官能基を含むことを特徴とする検体を標識するための化合物。
【請求項３４】
前記Ｄは非蛍光色素を含む請求項３２又は３３に記載の化合物。
【請求項３５】
前記Ｄは桂皮酸誘導体、ニコチン酸誘導体、ピコリン酸誘導体、ヒドロキシ安息香酸誘導体、メトキシ安息香酸誘導体、又はシナピン酸誘導体を含む請求項に３２記載の化合物。
【請求項３６】
前記非蛍光色素は、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド（ダブシル（ＤＡＢＳＹＬ）クロライド）、３−ヒドロキシピコリン酸、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸から選択される化合物を含む請求項３４又は３５に記載の化合物。
【請求項３７】
前記化合物は、更なるリンカーを介して付加する質量マーカーＭを更に含み、Ｍはアリールエーテルから形成される化合物、及び２つ以上のアリールエーテルユニットから形成されるオリゴマーから選択される請求項３２から３６のいずれかに記載の化合物。
【請求項３８】
前記リンカー及び／又は更なるリンカーは、ＣＲ２−ＣＨ２−ＳＯ２−、−Ｎ（ＣＲ２−ＣＨ２−ＳＯ２−）２、−ＮＨ−ＣＲ２−ＣＨ２−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＳＯ２−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及び−ＯＰ(＝Ｏ)(Ｏ)Ｏ−から選択される基を含む請求項３２から３７のいずれかに記載の化合物。
【請求項３９】
前記Ａは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片及びアミノ酸から選択される請求項３２から３８のいずれかに記載の化合物。
【請求項４０】
前記Ｆはキサンテン色素部分、又はシアニン色素部分を含む請求項３２から３９のいずれかに記載の化合物。
【請求項４１】
前記蛍光体部分は、プロピル−Ｃｙ３−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチル−Ｃｙ５−ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はＣｙ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
前記Ｒは、前記化合物をタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片又はアミノ酸に付加するためにある請求項３２から４１のいずれかに記載の化合物。
【請求項４３】
前記Ｒは、エステル基、酸無水物基、酸塩化物等の酸ハロゲン化物基、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基、アルケニルスルホン基、又はヨードアセトアミド基を含む請求項３３から４２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４４】
親和性リガンドを更に含む請求項３２から４３のいずれかに記載の化合物。
【請求項４５】
前記親和性リガンドは、ビオチンを含む請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
イオン性部分を更に含む請求項３２から４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項４７】
前記イオン性部分は、３級アミノ基、グアニジノ基、及びスルホン酸基から選択される請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
前記化合物は、桂皮酸官能基を含む請求項３２から４７のいずれかに記載の化合物。
【請求項４９】
アレイ中の化合物は、請求項３３から４８のいずれかに定義される化合物であり、前記アレイ中の各化合物は蛍光体及び／又はその質量に基づいて前記アレイ中の他の全ての化合物から識別可能である検体を標識するための２つ以上の化合物のアレイ。
【請求項５０】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析するためのキットであって、
（ａ）  検体に標識体を付加するための反応性官能基を有する請求項３３から４８のいずれかに定義する１つ以上の光吸収標識体と、
（ｂ）  前記光吸収標識体と同じ周波数で光を吸収する、マトリックスを形成するための化合物と
を含むマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析するためのキット。
【請求項５１】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析するためのキットであって、
（ａ）  請求項３３から４９のいずれかに定義する化合物、又は化合物のアレイと、
（ｂ）  イオン交換樹脂と
を含むマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析するためのキット。
【請求項５２】
前記化合物又は前記化合物のアレイは、正電荷を形成するイオン性部分を含み、前記イオン交換樹脂は陽イオン交換樹脂を含む請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記化合物又は前記化合物のアレイは、陰電荷を形成するイオン性部分を含み、前記イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂を含む請求項５１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非質量系分析法及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法による関連検体の生体分子検出感度を向上する多モードマーカーで検体分子、特には不揮発性の生体分子を標識する方法に関する。詳細には、本発明は、蛍光検出能力を特定の色素の能力と組み合わせて、これらの色素で標識した検体のＭＡＬＤＩ質量分析法による検出感度を向上するマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中のタンパク質の発現を決定する従来の技術は、タンパク質の同定に左右される。タンパク質発現プロファイルは、試料中のできる限り多くのタンパク質を同定し、好ましくは、試料中のタンパク質量を決定することを目標とする。典型的なタンパク質のプロファイリング法は、二次元電気泳動法(２−ＤＥ)によるものである（非特許文献１）。この方法では、生体試料から抽出したタンパク質試料が２つの独立した電気泳動法によって分離される。通常、第１の分離はタンパク質の等電点に基づく分離であり、ｐＨ勾配のあるゲル充填毛細管又はゲルストリップを使用する。タンパク質はｐＨ勾配に沿って電気泳動的に移動し、最終的にはタンパク質に正味の荷電が存在しなくなるｐＨ、（これを等電点と呼ぶ）、に達するとそれ以上タンパク質は移動できなくなる。試料中の全タンパク質が等電点に達した後、第２の電気泳動法を使って、タンパク質を更に分離する。第２の方法を実施するために、次に、等電点電気泳動ゲルストリップ全体を、長方形のゲルの１つの角に合わせて置く。その後、ストリップ中の分離されたタンパク質を、そのサイズに基づいて、第２ゲルで電気泳動によって分離する。タンパク質は、長方形のアクリルアミド板中の二次元スポット列で解像される。しかし、試料中のタンパク質を相互に分離した後には、タンパク質の検出とその後の同定の問題が残る。現時点でタンパク質を同定する好ましい方法は、ゲル上の特定スポットにあるタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を使用してペプチドマスフィンガープリンティング法により分析することである（非特許文献２）が、処理量が限られている。従って、２−ＤＥ技術は、ゲルスポット中のタンパク質同定に使用されるペプチドマスフィンガープリンティング法の検出能に制限される。現在の２−Ｄゲル技術を用いて行われる分析から有効なタンパク質同定の数量を増加する１つの方法は、病気の試料のゲルと参照試料のゲルと比較して違いを同定し、発現差異に対応するスポットに存在するタンパク質を同定するだけである。２つ以上の試料を異なる蛍光体で共有結合標識して同一ゲル上で分離する、改良２−ＤＥゲル技術が開発されている（非特許文献３）。この技術はＤＩＧＥと称され、試料対を同じ分析で定量的に比較可能にし、これは異なるゲル上で試料が比較されるという厄介な再現性の問題を避けるために非常に有利である。蛍光標識タンパク質は、ゲル上のタンパク質の視覚化に特に必要とされる追加的な染色工程を経ずに検出可能である。染色が多いとその後に続く質量分析法による解析を妨げるので、染色を避けることは有利である。しかしながら、ＤＩＧＥ法は、ペプチドマスフィンガープリンティング法に対して通常使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析の感度を高めない。
【０００３】
代表的なペプチドマスフィンガープリンティング法のプロトコルでは、未同定タンパク質の質量を決定し、次にトリプシン等の酵素で（ゲル状又は溶解した）タンパク質を消化する。トリプシンは、ポリペプチドをアルギニン及びリジン残基で選択的に開裂し、生じたペプチドのＣ−末端にアルギニンかリジンを残す。ポリペプチド配列中のリジン及びアルギニンの位置によって、どこでポリペプチドが開裂されて特徴的な一連のペプチドが生じるかが決定する。ペプチドパターンはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により容易に検出できる。この質量分析技術は、質量範囲が広く、大きな生体分子を容易にイオン化可能であり、優先的に１価のイオンを生じるので、この技術ではイオン化の競合が深刻ではない。ただし、競合は問題となる可能性がある。以上のことは、一般的に質量スペクトルではペプチド毎に１つのピークがあり、各ピークの質量電荷比の値はプロトンが加わってイオン化したペプチドの質量と実質的に同じであり、従って、未同定タンパク質のトリプシン消化ペプチドは大部分（時には全て）同時に分析可能であるということを意味する。実際、質量スペクトルは「バーコード」であり、そのスペクトル線によってタンパク質の特徴的な開裂によって生じたペプチドの質量が表現されている。任意のタンパク質のあるペプチドが他のタンパク質由来のペプチドと質量が同じであることはあり得るが、２種類のタンパク質が同一質量な同一のペプチド群を生じる可能性は低い。これは、トリプシンタンパク質消化物の質量パターンがそのタンパク質のかなり特異的な識別子であることを意味し、それゆえにペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）と呼ばれる。ＰＭＦが相対的に特異であるということは、既知タンパク質配列、ゲノムＤＮＡから予測した配列、又は発現配列タグ（ＥＳＴ）から決めた予測（仮定の）ＰＭＦのデータベースを使用すれば、生物学試料中のタンパク質を同定することができることを意味する（非特許文献４〜６）。未同定タンパク質のＰＭＦをデータベース中の全てのＰＭＦと比較して、最良の一致を見出さすことで、そのタンパク質を同定することができる。この種の検索には、消化前にタンパク質質量を決めなければならないという制約を受ける。しかし、このようにして未同定ポリペプチドの質量パターンは、その配列に関連付けることができ、これにより、特定試料中のタンパク質の役割を決定するのに役立てることができる。
【０００４】
しかし、タンパク質に対するＰＭＦ決定には、多くの技術的難題が含まれる。典型的なタンパク質は、トリプシンによる開裂後、２０〜３０個のペプチドを生じるが、これらのペプチドの全部が質量スペクトルに現れるわけではない。これに関する正確な理由は、十分に理解されていない。不完全なスペクトルを引き起こすと考えられる一つの要因としては、イオン化の過程でプロトン化と競合し、アルギニン含有ペプチドが優先的にイオン化してしまうことが挙げられる（非特許文献７）。更に、ＭＡＬＤＩ標的の調製過程に起因する表面効果がある。標的は、ペプチド消化物をマトリックス材料の溶液に溶解して調製する。ペプチド／マトリックス溶液の小滴を金属標的上に滴下し、乾燥する。ペプチドの溶解度に差があるために、あるペプチドはマトリックス上面近くで優先的に結晶化し、その場所で一層容易に脱離することになる。
【０００５】
ＰＭＦからタンパク質を同定するための従来のプロトコルでは感度もまた問題である。そのプロトコルが有効なツールであるためには、できるだけ小さなタンパク質試料のＰＭＦを決定することができ、タンパク質試料の分析の感度を向上させなければならない。
【０００６】
ペプチドの化学的誘導体化によりアルギニンを含まないペプチドのイオン化を増大するための様々な試みが行われている。リジンのホモアルギニンへの変換は、ある程度成功した取り組みである（非特許文献８〜１０）。リジンをホモアルギニンに変換すると、トリプシン消化に由来するＣ−末端ペプチドを除く全てのペプチドにグアニジノ官能基が導入され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルにおけるリジン含有ペプチドの出現が増大する。
【０００７】
グアニジノ基を導入するためのペプチドの誘導体化は、誘導体化ペプチドのプロトン親和性を改善する方法である。感度を向上するためのこの取り組みは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びＭＡＬＤＩ分析等のイオン化を達成するためにプロトン付加に依存する技術での検出感度向上に適度に成功した。これらの技術は、検体がプロトン親和性の高い官能基、例えば、オリゴ糖などをまだ有していなければ最も効果的である（非特許文献１１）。しかしながら、トリプシン消化ペプチド等の容易にプロトン化される官能基を既に含む検体は、これらの種類の検体の感度を改善するために必要とされるような試薬及び他の方法から大きく恩恵を受けない。
【０００８】
ペプチドを誘導体化するための様々な他の試薬もまた開発されている。４級アンモニウム基及び４級ホスホニウム基を導入する試薬が、陽イオン質量分析法用に開発されている。ハロゲン化合物、特に、ハロゲン化芳香族化合物は良く知られた電荷運搬体で、即ち、熱電子を非常に簡単に捕捉することは公知である。フッ素化芳香族化合物に基づく様々な誘導体化試薬（非特許文献１２）が、陰イオン質量分析法に使用可能な非常に高感度なイオン化及び検出方法である電子捕獲検出法のために開発されている（非特許文献１３）。フッ素化芳香族基は、感度向上基としてもまた使用可能である。芳香族スルホン酸もまた、陰イオン質量分析法における感度を改善するために使用されている。
【０００９】
先行技術で開示されている各種類の誘導体化試薬は、使用するイオン化方法、及び使用する質量分析方法によって異なる利点及び制限がある（概説については、非特許文献１４）。感度向上メカニズムもまた、各々の基の種類により異なる。誘導体化方法のいくつかは塩基性を増加させることによりプロトン化と電荷の局在を促進させ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び高速原子衝撃法（ＦＡＢ）の様な表面脱離技術における感度を改善する。これまでは、電荷を有する官能基又は高プロトン化親和性の官能基を導入する試薬がＭＡＬＤＩ質量分析法に対して開発されてきたが、光吸収能、及び対マトリックス混合能を改善することで検体の脱離を向上する試薬は報告されていない。
【００１０】
陰イオン質量分析法は、時に、バックグランドノイズがより少ないために感度がより高くなる。陰イオンモード検出及び陽イオンモード検出の両方を向上させることができるタグは、重要な利点を有している。全ての関連する検体の感度を一様に改善するタグは、全ての質量分析技術に対してはまだ見つけられておらず、万能試薬が見つかる見込みはない。しかしながら、特定の質量分析技術に対して特定の技術の特徴を活用して検出感度を促進する試薬の設計は可能なはずである。
本発明では、誘導体化試薬及びその使用方法がゲル上でのタンパク質の標識及び検出の両方を可能にするために開発され、その上、ＭＡＬＤＩ質量分析法による検出感度が向上された。
【００１１】
特許文献１には、共有結合した核酸プローブの配列を同定する、質量分析法で検出できる開裂可能な標識体のアレイが開示される。これらの質量標識体は、他の核酸分析方法と比べて多くの利点がある。目下、ＤＮＡの蛍光標識に基づくシステムが商業的に好まれる。蛍光標識方式は、比較的少ない分子を同時に標識可能であり、一般的に４標識体を同時に使用可能であり、最大８標識体まで可能である。しかしながら、検出装置の費用、及び得られた信号分析の困難性により蛍光検出方式で同時に使用可能である標識体の数が限定される。質量標識体を使用する利点は、多数の標識体を形成する可能性であり、該標識体は、質量スペクトル中で個々のピークを有するので、同様の数の別個の分子種を同時に標識可能にする。蛍光色素は、合成費用が高いが、質量標識体は低価で多数の標識体の組み合わせの合成を可能にする比較的単純なポリマーを含むことができる。この用途は、生体分子の標識用に質量を変えたＭＡＬＤＩマトリックス分子の使用が使用されることを示している。光解離性リンカーを介して生体分子に付着可能な桂皮酸、及びシナピン酸等のＭＡＬＤＩマトリックス剤を含むタグが、追加的にマトリックスを必要とせずにレーザー脱離イオン化質量分析計内でタグの切断及び脱離を可能とする。
【００１２】
特許文献２は、核酸及びオリゴヌクレオチドを標識するためのトリチル基を含む質量タグを開示する。これらのタグは、脱離前にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計において光分解により関連するオリゴヌクレオチドから切断可能である。帯電される切断産物は、タグの検出感度を向上するので有利である。この方法もまた追加のマトリックスを必要としない。
【００１３】
従って、先行技術は、ＭＡＬＤＩ質量分析法で使用する追加のマトリックス無しで脱離し得る切断可能なタグのための方法及び試薬を開示する。本発明は、タグが検体から切断されず、及びタグが自由なマトリックス材料の存在下で使用される事実により特徴付けられる。
【００１４】
【非特許文献１】Ｒ．Ａ．Ｖａｎ  Ｂｏｇｅｌｅｎ．，  Ｅ．Ｒ．  Ｏｌｓｏｎ，  “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”,  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ，  １：６９−１０３，１９９５
【非特許文献２】Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  Ｐ，  Ｔｈｉｅｄｅ  Ｂ．  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ２−ＤＥ  ｇｅｌｓ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．”  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ.  １６：１４５−１６２，１９９７
【非特許文献３】Ｕｎｌｕ，  Ｍ．；  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｍ．Ｅ．;  Ｍｉｎｄｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９７，  １８，  ２０７１−２０７７
【非特許文献４】Ｐａｐｐｉｎ  ＤＪＣ，  Ｈｏｅｊｒｕｐ  Ｐ  ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ  ＡＪ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：  ３２７−３３２，  “Ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．”１９９３
【非特許文献５】Ｍａｎｎ  Ｍ，  Ｈｏｊｒｕｐ  Ｐ，  Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ  Ｐ，  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２２  （６）：  ３３８−３４５，  “Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ.”１９９３
【非特許文献６】Ｙａｔｅｓ  ＪＲ  ３ｒｄ，  Ｓｐｅｉｃｈｅｒ  Ｓ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＰＲ，  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  Ｔ，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１４（２）：３９７−４０８，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｍａｐｓ：  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ.”１９９３
【非特許文献７】Ｋｒａｕｓｅ  Ｅ．  ＆  Ｗｅｎｓｃｈｕｈ  Ｈ．  ＆  Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  Ｐ．Ｒ．，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ７１（１９）：  ４１６０−４１６５，  “Ｔｈｅ  ｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ＭＡＬＤＩ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”１９９９
【非特許文献８】Ｖ．Ｂｏｎｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６  (５)：  ３７１−３７４，  “Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ”,１９９７
【非特許文献９】Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｌ.  Ｂｒａｎｃｉａ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｇ．  Ｏｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ  Ｊ．  Ｇａｓｋｅｌｌ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．，  １４，  ２０７０−２０７３，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”２０００
【非特許文献１０】Ｂｒａｎｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２：  ５５２−５５９，  “Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｔｏｏｌｓ  ｏｐｔｉｍｉｓｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”，２００１
【非特許文献１１】Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ６９（１５）：  ２９１９−２９２６，  “Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅｃａｙ  ｏｆ  ２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．”１９９７
【非特許文献１２】Ｂｉａｎ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １１(１６)：  １７８１−１７８４，  “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ａｌｂｕｍｉｎ．”１９９７
【非特許文献１３】Ａｂｄｅｌ−Ｂａｋｙ  Ｓ．  ＆  Ｇｉｅｓｅ  Ｒ.  Ｗ．，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ６３(２４)：  ２９８６−２９８９，  “Ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｚｅｐｔｏｍｏｌｅ  ｌｅｖｅｌ．”１９９１
【非特許文献１４】Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７：  ２５５−２７４，  “Ｃｈａｒｇｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”,１９９８
【特許文献１】国際公開第９８／３１８３０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／６０００７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、上記先行技術に関する問題を解決することである。特に、本発明の目的は、改善されたペプチドマスフィンガープリントの作製に使用することができる方法及び標識体を提供し、それにより他の標識不揮発性高分子、特にタンパク質及び核酸等の他の生体分子の検出感度を向上させることである。この方法は感度を向上し、及び従来のＭＡＬＤＩ実験では検出不可能であったタンパク質から検出するペプチド（例えば、小さいペプチド）の数を増加可能である。更に、適切なタグの使用により、本発明は多数の試料を同時に分析可能であり、また異なる試料における対応するペプチド比、及び１つ以上の試料における個別のペプチド量もまた決定可能である。適切な標識方法を用いることで、質量分析法で検出するためのポリペプチド試料の調整もまた容易になる。
【００１６】
本発明の更なる目的は、質量標識体として所望の特徴を有する化合物、及び関連する検体の改善された質量スペクトルを提供するそれらの化合物の使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する下記工程（ａ）から（ｄ）を含む方法を提供する。
（ａ）  検体を所定の周波数で光を吸収する光吸収標識体で標識して、標識検体を形成する工程。
（ｂ）  標識検体を、光を吸収する少なくとも１つの化合物から形成されるマトリックスに包埋して、包埋標識検体を形成する工程。
（ｃ）  包埋標識検体を所定の周波数を有する光で照射することで脱離して、脱離検体を形成する工程。
（ｄ）  脱離検体を質量分析法により検出し、検体の特徴を分析する工程。
上記工程において、光吸収標識体は蛍光体部分を含み、検体は質量分析法による検出の前に蛍光体部分に基づいて検出のために選択される。
【００１８】
上記に示す選択の１例は、事前にゲル又はＨＰＬＣで同定した多くのタンパク質種について蛍光体を分析する工程と、それらのタンパク質に付着した特定の蛍光体に基づいて該ゲル又はＨＰＬＣから特定の１つ又は複数のタンパク質を質量分析法で検査するために選択する工程とを含むことがある。
【００１９】
従って、本発明は、同じ実験において異なる試料から検体（例えば、タンパク質)の発現差異の定量（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能にする増感質量タグ（ＳＭＴ）を使用してＭＡＬＤＩ感度を向上する方法を提供する。定量は、多くの方法で達成し得る。例えば、ゲル上又はＨＰＬＣにおける蛍光体の蛍光強度の比較、ＭＡＬＤＩスペクトル中のピーク高さ／領域の比較、及び検体の標識上への質量レポーター基を封入し、タンデム質量分析計による解析において同定されたレポーター基に基づく量の測定が挙げられる。
【００２０】
本発明においては、該方法を二次元電気泳動法（２−ＤＥ）よりもむしろ液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と組み合わせる場合に、ＳＭＴを使用すると更に有利である。これは、高塩基性及び／又は小さな（例えば、１０Ｄａ以下）検体に対して特に利点である。本発明の方法により、ユーザが非常に高価なエレクトロスプレー質量分析計を必要とせずに比較的単純なＭＳ及びＬＣ機器を用いて、信頼できる定量を得ることが可能となる。
【００２１】
本発明の文脈において、ＭＡＬＤＩとは、脱離イオン化技術型、又はＭＡＬＤＩの単に最も一般的な型であるレーザー脱離イオン化技術型を包含することを意図する。従って、ＭＡＬＤＩという用語そのものは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、及びＳＥＬＤＩ（下記に示す）を含む。
【００２２】
特に好適な実施形態において、上記方法は、質量分析法による検出の前に、蛍光体部分の種類及び／又は量に基づいて検出するために検体を選択する工程を含む。よって、例えば、単一試料を分析したい場合は、試料中のタンパク質は、上記のように標識され、及び初めにゲル上（例えば大きさ及び／又は等電点に基づいて）で分離されうる。通常、ゲル上で露呈したタンパク質毎に同定しようとするのは好ましくなく、選択的に同定するのが好ましい。例えば、高発現タンパク質だけが重要であり得る。この場合、蛍光体が、ゲルから抽出するタンパク質の選択、消化による同定、その次の質量分析に使用され得る。また、一緒に分析される試料がいくつかあれば、タンパク質を様々な試料から識別するために蛍光体が使用され、これに基づき選択がなされる。もちろん、必要であれば、量及び種類も選択の基準となり得る。
【００２３】
好ましくは、蛍光体部分は色素部分を含む。色素部分は、キサンテン色素部分（フルオレセイン部分、又はローダミン部分等）及びシアニン色素部分から選択され得る。より好ましくは、蛍光体部分は、プロピル−Ｃｙ３−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチル−Ｃｙ５−ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はＣｙ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。
【００２４】
概して、脱離検体は質量分析法により直接検出される。或いは、脱離検体は質量分析法により間接的にも検出される。この実施形態において検体は、当該検体に関係づけられる質量標識体で更に標識されて、当該質量標識体は脱離検体から切断され、当該脱離検体が質量分析法により検出されて検体が特徴分析される。
【００２５】
一般的に、包埋標識検体を照射する光はレーザー光である。マトリックスを形成する化合物は光吸収標識体と同一周波数で光を吸収するのが好ましい。ある実施形態において、マトリックス及び光吸収標識体は、同一化合物から形成される。
【００２６】
概して、マトリックスは、固体マトリックス又は液体マトリックスである。好ましくは、マトリックスが液体マトリックスである場合に、ニトロベンジルアルコールを含む。他の実施形態において、好ましくは、マトリックスは、３−ヒドロキシピコリン酸、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸から選択される化合物を含む。
【００２７】
マトリックスのｐＨは、特に限定されず、マトリックスは、酸性マトリックス、又は塩基性マトリックスを含む。
【００２８】
一般的に、光吸収標識体は、色素から形成される。好ましくは、色素は非蛍光色素である。色素は、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド（ダブシル（ＤＡＢＳＹＬ）クロライド）、３−ヒドロキシピコリン酸、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸を含む適切な化合物から選択され得る。
【００２９】
検体の本質は、特に限定されない。好ましくは、検体はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片及びアミノ酸から選択される１つ以上の化合物を含む。
【００３０】
また、本発明は、ポリペプチドの特徴を分析する下記工程（ａ）から（ｆ）を含む方法を提供する。
（ａ）  任意にポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元し、遊離チオールを形成し、遊離チオールをキャップする工程。
（ｂ）  ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成する工程。
（ｃ）  任意に開裂試薬を不活性化する工程。
（ｄ）  存在する１つ以上のε−アミノ基をリジン反応剤でキャップする工程。
（ｅ）  ペプチド断片を上記で定義する方法により分析して、ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程。
（ｆ）  マスフィンガープリントからポリペプチドを同定する工程。
【００３１】
更に本発明は、複数のポリペプチドの特徴を分析する下記工程（ａ）から（ｇ）を含む方法も提供する。
（ａ）  任意に１つ以上のポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元して、遊離チオールを形成し、遊離チオールをキャップする工程。
（ｂ）  複数のポリペプチドから１つ以上のポリペプチドを分離する工程。
（ｃ）  １つ以上のポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成する工程。
（ｄ）  任意に開裂試薬を不活性化する工程。
（ｅ）  存在する１つ以上のε−アミノ基をリジン反応剤でキャップする工程。
（ｆ）  ペプチド断片を上記で定義する方法により分析して、１つ以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程。
（ｇ）  マスフィンガープリントから１つ以上のポリペプチドを同定する工程。
【００３２】
本発明は、また各試料が１つ以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する下記工程（ａ）から（ｇ）を含む方法も提供する。
（ａ）  任意に試料からの１つ以上のポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元し、かつ遊離チオールをキャップする工程。
（ｂ）  各試料から１つ以上のポリペプチドを分離する工程。
（ｃ）  ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成する工程。
（ｄ）  任意に開裂試薬を不活性化する工程。
（ｅ）  存在する１つ以上のε−アミノ基をリジン反応剤でキャップする工程。
（ｆ）  ペプチド断片を上記で定義する方法により分析して、試料から１つ以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程。
（ｇ）  １つ以上のマスフィンガープリントから試料中の１つ以上のポリペプチドを同定する工程。
上記方法において、リジン反応剤は標識したリジン反応剤であるのが好ましい。
【００３３】
必要であれば、上記方法は複数の試料に適応され得る。各試料が１つ以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する本発明の方法は、下記工程（ａ）から（ｈ）を含む。
（ａ）  任意に試料からの１つ以上のポリペプチド中でシステインジスルフィド架橋を還元し、及び遊離チオールをキャップする工程。
（ｂ）  各試料中に存在する１つ以上のε−アミノ基を標識したリジン反応剤でキャップする工程。
（ｃ）  試料をプールする工程。
（ｄ）  プールした試料から１つ以上のポリペプチドを分離する工程。
（ｅ）  ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂してペプチド断片を形成する工程。
（ｆ）  任意に開裂試薬を不活性化する工程。
（ｇ）  ペプチド断片を上記で定義する方法により分析して試料から１つ以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程。
（ｈ）  １つ以上のマスフィンガープリントから試料中の１つ以上のポリペプチドを同定する工程。
上記方法において、同一の標識体を同一の試料からのポリペプチド又はペプチドに使用し、及び異なる標識体を異なる試料からのポリペプチド又はペプチドに使用して、ポリペプチド又はペプチドが由来する試料がその標識体から決定可能となるようにする。
【００３４】
好ましくは、配列特異的開裂試薬は、リジン残基のＣ−末端側で１つ以上のポリペプチドを開裂する。特異的開裂試薬は、一般的にＬｙｓ−Ｃ又はトリプシンを含む。概して、ε−アミノ基がキャップされたペプチド断片は親和性捕捉により除去される。この実施形態において、リジン反応剤はビオチンを含む。
【００３５】
ある好適な実施形態において、リジン反応剤は、立体障害のあるミカエル試薬を含むのが好ましい。一般的に、立体障害のあるミカエル試薬は以下の構造を有する化合物を含む。
【化２】
2006528344.tif 000002
Ｘは、陰電荷を安定化可能な電子吸引基である。Ｒ基はＲ基の少なくとも１つが立体障害基を含むという条件で水素、ハロゲン、アルキル、アリール、又は芳香族基を独立して含む。Ｒ２基は、水素、ハロゲン、炭化水素基、電子吸引基及び／又は親和性捕捉官能基又は固相担体へ付加可能なリンカーを含む。
【００３６】
更に本発明は標識検体化合物を提供し、化合物は以下の構造のどちらかを含む。
Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ａ
Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ａ
Ｆは蛍光体を含み、Ｄは光吸収標識体を含み、Ｌはリンカーを含み、また、Ａは検体を含む。一般的に、蛍光体Ｆは更なるリンカーを介してＤに付加する。必要であれば、特に、標識体そのものが質量分析法により解析されるならば、質量マーカーＭは、Ｄ又はＦとＬとの間に（Ｆ−Ｄ−Ｍ−Ｌ−Ａ又はＤ−Ｆ−Ｍ−Ｌ−Ａ）配置してよい。
【００３７】
また、本発明は、検体を標識するための化合物を提供し、化合物は以下の構造のどちらかを含む。
Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｒ
Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｒ
Ｆは蛍光体を含み、Ｄは光吸収標識体を含み、Ｌはリンカーを含み、及びＲは検体に化合物が付加するための反応性官能基を含む。一般的に、蛍光体Ｆは更なるリンカーを介してＤに付加する。必要であれば、特に、標識体そのものが質量分析法により解析されるならば、質量マーカーＭは、Ｄ又はＦとＬとの間に（Ｆ−Ｄ−Ｍ−Ｌ−Ｒ又はＤ−Ｆ−Ｍ−Ｌ−Ｒ）配置してよい。
【００３８】
上記タイプの全ての化合物の場合、一般的にＭが存在するならば、各標識体は同じＭ、または少なくとも同じ質量を有するＭを有することが好ましく、その結果、スペクトルはＭの複数の質量に由来する複数のピークで複雑にはならない。
【００３９】
既に上記に示したように、概してＤは非蛍光色素を含む。よって、Ｄは、例えば、桂皮酸誘導体、ニコチン酸誘導体、ピコリン酸誘導体、ヒドロキシ安息香酸誘導体、メトキシ安息香酸誘導体又はシナピン酸誘導体を含み得る。好ましくは、非蛍光色素は、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド（ダブシル（ＤＡＢＳＹＬ）クロライド）、３−ヒドロキシピコリン酸、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸から選択される化合物を含む。
【００４０】
Ｍの種類は、特に限定されない。好ましくは、Ｍはアリールエーテルから形成される化合物、及び２つ以上のアリールエーテルユニットから形成されるオリゴマーから選択される。
【００４１】
リンカーもまた特に限定されない。好ましくは、リンカー及び／又は更なるリンカーは、ＣＲ２−ＣＨ２−ＳＯ２−、−Ｎ（ＣＲ２−ＣＨ２−ＳＯ２−）２、−ＮＨ−ＣＲ２−ＣＨ２−ＳＯ２−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＳＯ２−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及び−ＯＰ(＝Ｏ)(Ｏ)Ｏ−から選択される基を含む。
【００４２】
一般的に、検体、Ａは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片及びアミノ酸から選択される。
蛍光体は、既に上記に定義した成分が好ましい。
【００４３】
一般的に、Ｒはエステル基、酸無水物基、酸塩化物等の酸ハロゲン化物基、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基、アルケニルスルホン基、又はヨードアセトアミド基を含む。
【００４４】
更に、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析するための下記（ａ）及び（ｂ）を含むキットを提供する。
（ａ）  検体に標識体を付加するための反応性官能基を有する１つ以上の光吸収標識体。
（ｂ）  光吸収標識体と同じ周波数で光を吸収する、マトリックスを形成するための化合物。
【００４５】
これから、本発明を、ほんの一例としてより詳細な実施形態を参照して更に詳細を示す。本発明の１つの態様において、蛍光体に結合するＭＡＬＤＩ色素を含む標識化合物を提供し、蛍光体及びＭＡＬＤＩ色素はどちらも反応性官能基に結合する。
【００４６】
本発明のこの態様の一実施形態において、標識分子は次の構造の１つを有する。
ＭＡＬＤＩ色素−リンカー−蛍光体−リンカー−反応性官能基
蛍光体−リンカー−ＭＡＬＤＩ色素−リンカー−反応性官能基
ＭＡＬＤＩ色素は、好ましくは非蛍光であり、また、好ましくは吸収した放射エネルギーを熱で消散する。
【００４７】
本発明のこの態様の更なる実施形態において、２つ以上の標識化合物からなるアレイが提供され、異なる標識化合物は、それぞれ他の標識化合物とは異なる発光周波数を有する蛍光体で識別される。好適な実施形態において、標識化合物のアレイは同じ質量のタグを含む。
【００４８】
本発明の更なる態様において、１つ以上の試料の検体分子を分析する下記工程１から８を含む方法を提供する。
１．  各試料の検体分子をＭＡＬＤＩ色素及び蛍光体を含む本発明の第１の態様の異なる標識化合物で標識し、異なる標識化合物は、それぞれ他の標識化合物とは異なる発光周波数を有する蛍光体で識別される工程。
２．  標識検体を分離する工程。
３．  標識検体を蛍光測定により検出する工程。
４．  標識検体を単離する工程。
５．  任意に標識検体分子を開裂する工程。
６．  標識検体分子を脱離工程で使用するレーザーの周波数で光を吸収する色素を含むマトリックスに包埋する工程。
７．  マトリックスの蒸発によりまた標識検体も蒸発するように、標識検体を所定の周波数のレーザー光で照射することで脱離する工程。
８．  質量分析法による脱離工程の間に形成されるイオンを検出する工程。
【００４９】
本発明の更なる態様において、下記１及び２を含むキットを提供する。
１．  本発明の第１の態様による質量標識分子。
２．  適合性ＭＡＬＤＩマトリックス試薬。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下、更に本発明の詳細を示す。
ＭＡＬＤＩマトリックス色素
様々な化合物が大きな生体分子のＭＡＬＤＩ分析のためのマトリックスとして見出された。これらの化合物は、概して多くの特性により特徴付けられる。化合物は、概して、脱離に使用されるレーザーの周波数で強力な吸光係数を有する。化合物は、また、固溶体中の検体分子を分離可能であり、ＭＡＬＤＩ質量分析計によってレーザーショットが照射された場合、化合物は十分に蒸発し易いため急速に昇華する。昇華色素は、包埋検体分子を同伴する噴流中で急速に蒸発するはずであり、ほとんどの目的に対して検体を切断せずに蒸発するはずである（検体について構造的情報を求めるならば切断が望ましいこともあるが）。しかし、時々実験が数時間かかる場合もあり、この間は検体／マトリックス共結晶は、イオン源において真空下で安定でなければならないので、マトリックスは過度に揮発性であるべきではない。レーザー照射下での揮発性及び真空下での安定性の特性はある程度矛盾する。レーザー照射に対する揮発度は、マトリックスが形成する検体イオンの初期速度を決定することでおおよそ測定可能である。より速い初期速度が「よりソフトな」イオン化、即ち還元切断に関連して観察されている（Ｋａｒａｓ  Ｍ．  ＆  Ｇｌｕｅｃｋｍａｎｎ  Ｍ.,  Ｊ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ３４：４６７−４７７，  “Ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｍａｔｒｉｘ，  ａｎａｌｙｔｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ”，１９９９）が、初期イオン速度の速いマトリックスもまた真空下の急速な昇華に相関する。
【００５１】
マトリックスによって、包埋検体の脱離を支援する能力、及びその後の検体を検出する感度に関する特性は様々である。ある種のマトリックスは、他のマトリックスよりも特定の検体の分析により適していることが経験的に分かっている。例えば、３−ヒドロキシピコリン酸は、オリゴヌクレオチドの分析に最も効果的であることが分かっており（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ７：１４２−１４６，  “Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ａｎ  ｕｌｔｒａ−ｖｉｏｌｅｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ”，１９９３）、２,５−ジヒドロキシ安息香酸、及び４−ヒドロキシ−α−シアノ−桂皮酸（ＨＣＣＡ）はペプチド及びタンパク質の分析に最も効果的である（Ｓｔｒｕｐａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．  １１１：８９−１０２，  “２，５−ｄｉｈｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ：  ａ  ｎｅｗ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，１９９１；  Ｂｅａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２７：  １５６−１５８，“α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ａ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，１９９２)。様々な桂皮酸誘導体がタンパク質の分析に効果的であることが分かっており（Ｂｅａｖｉｓ  Ｒ．Ｃ．  ＆  Ｃｈａｉｔ  Ｂ．Ｔ.,  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ３（１２）：  ４３２−４３５,  “Ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ.”１９８９）、及びマトリックスの選択は検体の特性次第であり、例えば、ＨＣＣＡは、概してより小さなペプチドに対して好まれるが、大きなペプチド及びポリペプチドに対しては、ＨＣＣＡよりシナピン酸が好まれることがある。２,５−ジヒドロキシ安息香酸は、場合によっては桂皮酸誘導体よりもより少ない切断を生じるようである。所定の検体に対してマトリックスを選択するには、最良の結果を得るために、数回の実験を要することが多い。
【００５２】
上記で考察された殆どのマトリックスは、酸性マトリックスである。塩基性マトリックスもまた開発されており、酸に鋭敏な化合物の分析に最適である（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ６５（２２）：  ３２０４−３２１１，  “Ｂａｓｉｃ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓs  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”１９９３)。
【００５３】
赤外光ＭＡＬＤＩ（ＩＲ−ＭＡＬＤＩ）は、検体が、脱離機器においてレーザーの周波数で強力な吸光係数を有するのが好ましいマトリックスに包埋されなければならない点で、主に紫外光ＭＡＬＤＩ（ＵＶ−ＭＡＬＤＩ）と似ている。適切なマトリックスは、ＵＶ−ＭＡＬＤＩで使用する化合物とは異なる化合物を使用する傾向があり液体マトリックスがしばしば使用される。グリセリン、ウレア、氷、及びコハク酸は全て、ＩＲ−ＭＡＬＤＩに対して効果的なマトリックスであることが示されている（Ｔａｌｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １３（２１）：  ２１９１−２１９８，  “Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ／ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｃｅｓ，  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．”１９９９）。しかし、桂皮酸誘導体等のいくつかのＵＶ−ＭＡＬＤＩマトリックスもまたＩＲマトリックスとして作用するようである（Ｎｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ９：１−７，  “Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，１９９８)。
【００５４】
ＵＶ−ＭＡＬＤＩに対する液体マトリックスの探索も行われている（Ｒｉｎｇ  Ｓ．  ＆  Ｒｕｄｉｃｈ  Ｙ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １４（６）：  ５１５−５１９，  “Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｌｉｑｕｉｄ  ａｎｄ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．”２０００；  Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ９（２）：  １６６−１７４，  “Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．”  １９９８；  Ｋａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ  １０：  ３３５，１９９１）。液体マトリックスの最も簡単な例は、固体として使用するマトリックス溶体を含む。実際の液体マトリックスとしては、ニトロベンゾイルアルコール等も知られている。どちらのタイプのマトリックスも試料稠度、真空下での安定性、及び取扱易さの点でいくつか利点を有するが、固体マトリックスは更により注意を払うべきである。本発明の文脈において、感度の改善には、液体マトリックスの使用が正当であると証明する。これは、液体取扱ロボットが広範囲で可能であり、また、固体マトリックスの共結晶化により分注装置を容易に詰まらせるマトリックス溶体の使用を避けることができるので、試料調製の自動化上有利である。
【００５５】
色素を含む反応タグ及びＭＡＬＤＩマトリックス色素
本発明の第１の態様において、反応性色素分子が提供される。ＭＡＬＤＩ質量分析法で従来使用されていない様々な色素が本発明では使用され得る。反応性官能基と共にＵＶ周波数で強力に吸収する色素がいくつか市販されており、例えば、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニルクロライド（ダブシル（ＤＡＢＳＹＬ）クロライド  シグマアルドリッチ（株）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）プール、ドーセット州、イギリス）がある。発明者らは、この試薬及び管腔の励起を熱で消散する同様のＵＶ吸収色素は、本発明に適用するはずであると見込んでいる。
【００５６】
市販の中間体から反応性色素を調製することも可能である。ＭＡＬＤＩ質量分析法に広く使用される桂皮酸、ニコチン酸、及びヒドロキシ安息香酸誘導体等の多くの酸性マトリックスが市販されている。これらの殆どの試薬中の酸性官能基は、カルボン酸基である。この官能基は、従来の化学方法で活性エステル又は酸塩化物に容易に変換し得る(例えば、Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，  “Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”第５版  Ｗｉｌｅｙ社参照)。好適な活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル及びペンタフルオロフェニルエステルを含む。発明者らは様々な色素が本発明の方法において機能すると見込んでいるが、好適な化合物は質量分析計におけるレーザー脱離に対して使用する周波数で強力に吸収することが期待される。
【００５７】
桂皮酸誘導体はＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで広く使用される好適な色素である（Ｂｅａｖｉｓ  ＲＣ，  Ｃｈａｉｔ  ＢＴ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ３(１２)：  ４３２−４３５，“Ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”１９８９)。桂皮酸の反応性誘導体は、下記の実施例で考察する。この試薬はＵＶ−及びＩＲ−ＭＡＬＤＩの両方に適用可能であると見込まれる。
【００５８】
反応性官能基
タンパク質は、自身に反応性を示す試薬を使用して標識可能とする様々な求核性官能基を含む。タンパク質は、一般的に、チオール、アミノ、ヒドロキシル、及びイミダゾール基を含む。これらは、必要に応じて、全て適切な試薬で標識し得る。本発明の好適な実施形態において、アミノ基が標識される。アミノ基は、様々な標識体で標識されるが、酸塩化物及び活性エステルが通常最も選択される反応性官能基である。他の様々な反応性官能基は本発明の反応性色素の調製に適している。下記表１に色素分子に組み込まれ得る反応性官能基をいくつか列挙する。これらの反応性官能基は、生体分子、特に、ペプチド及びポリペプチド中に見られる求核性官能基と反応し得る。求核性官能基と反応する反応性官能基は、２つの物質間に共有結合を形成する。共有結合は表の第３列に示す。合成オリゴヌクレオチドへの応用においては、標識を可能にするために、合成の際に分子の末端に１級アミン、又はチオールが導入されることが多い。下記のいずれの官能基も、本発明の化合物に導入し、質量マーカーを目的分子に付加させるために用いることができる。必要に応じて、反応性官能基を他の反応性官能基を持つ他のリンカー基の導入にも使用可能である。表１は、完全網羅することを意図しておらず、本発明は列挙した官能基のみの使用に限定されない。
【００５９】
【表１】
2006528344.tif 000003
【００６０】
尚、本発明の質量マーカーによるオリゴヌクレオチドの標識を使用する用途においては、上記の反応性官能基の一部又はそれらから得られる結合基は、オリゴヌクレオチド合成機に導入する前に保護しなければならない。好ましくは、非保護エステル、チオエーテルおよびチオエステル、アミンおよびアミド結合は、通常、オリゴヌクレオチド合成機中で安定しないので避けるべきである。多様な保護基が当分野公知であり、それらを使用して望ましくない副反応から結合を保護することができる。或いは、アミン官能基を有するオリゴヌクレオチドは公知の標準方法を使用して調製可能であり、これらはＮＨＳ−エステル等のアミン反応性試薬で標識可能である。
【００６１】
蛍光体
本発明の第１の態様では、標識化合物は蛍光体を含むと規定される。多数の蛍光体が当分野公知であり、殆どが本発明に適用可能である。しかしながら、好適な色素はキサンテン色素（フルオレセイン及びローダミン色素等)及びシアニン色素（例えば、米国特許第５，２８６，４８６号明細書、参照することにより本発明に援用する)を含む。
【００６２】
本発明の好適な実施形態において、２つ以上の試料、例えばタンパク質試料が本発明の第１の態様に定義される様々な標識試薬で標識され、標識した試薬は、例えば二次元ゲル電気泳動法等で分析的に分離される。分離した検体は局在化され、及びそれらの相対量は、タグ由来の蛍光を測定して決定される。これらの実施形態において、様々な蛍光タグは、好ましくは特定の判定基準を満たす。
【００６３】
試薬は、好ましくは、分析分離中における標識検体の共移動に適合する大きさ及び電荷を有する。蛍光体が高い量子収率及び高い吸光係数を有するならば、有利である。蛍光体は、好ましくはｐＨに対して無感受、すなわち、第一次元（ＩＥＦ）分離間に使用される広いｐＨ範囲上において信号の変化を示すべきでない。蛍光体の発光周波数は、好ましくは、個別の信号が各蛍光体から得られるようにするために重複すべきでない。更に、蛍光体は、標識、分析分離、及び検出間の信号の損失を最小にするために有利に光安定性である。
【００６４】
本発明に使用する好適な色素（図１参照）は、米国特許第６，１２７，１３４号明細書及びＭｕｊｕｍｄａｒ他に記載されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ４（２）：  １０５−１１  “Ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ：  ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ．”，１９９３)。これらの文献は、明確な発光周波数、高い吸光係数、及び高い量子収率を有するインドール含有色素を開示する。色素はまた大きさ及び電荷も適合する。これらの文献は、タンパク質中のアミノ基、特にリジン−ε−アミノ基を標識するためのこれらの色素の活性エステルを開示する。タンパク質中のリジンアミノ酸は、中性又は酸性ｐＨで１価の正電荷を元々持つ。米国特許第６，１２７，１３４号明細書に開示される蛍光体もまた１価の正電荷を持ち、リジンに結合する場合、リジンの１価の正電荷を蛍光体の１価の正電荷と置き換えて、標識タンパク質の等電点（ｐＩ）が同じ非標識タンパク質に比べて大きく変わらないことを確実にする。本発明で開示される活性エステル色素は、これらの蛍光体を本発明の標識化合物に組み込むことができ、リンカーに容易に結合可能である（図２〜５参照）。
【００６５】
親和性捕捉リガンド
本発明の特定の実施形態において、質量マーカーは、更に親和性捕捉リガンドを含み得る。親和性捕捉リガンドは、極めて特異的な結合パートナーを有するリガンドである。これらの結合パートナーは、リガンドで標識した分子を結合パートナーで選択的に捕捉可能にする。好ましくは、親和性リガンド標識分子が固相担体上に選択的に捕捉可能となるように固相担体は結合パートナーで誘導体化される。親和性捕捉リガンドの使用は、多くの利点をもたらす。すなわち、分析前に標識種が選択的に捕捉可能であるから、標識、非標識物質の分離を可能にし、一方ではまた質量分析法のための検体の調整を可能にする。試料の調整は、イオン化を抑制、或いは、質量分析を妨げる可能性がある界面活性剤、及び他の不純物の除去も含む。調整は、また、質量スペクトル中で質量シフトを生じる検体に付加化合物を形成しうる塩の除去も含む。更に、ｐＨはイオン化を最適化するように調整される。捕捉された材料が所望のｐＨ次第で炭酸アンモニウム又はトリフルオロ酢酸等の揮発性塩を含む適切なバッファーで容易に洗浄可能であるため、固相担体上に捕捉された標識検体の調整は些細なことである。この洗浄工程は、不純物を除去可能であり、ｐＨを適切に調整するために使用可能である。
【００６６】
親和性リガンドを含むことの更なる利点は、タグが特定の検体に親和性リガンドを結合する反応性官能基を更に含む場合、ある種の検体種を選択的に隔離する能力である。例えば、Ｇｙｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：  ９９４−９９９，１９９９）は、タンパク質発現分析を可能にするタンパク質からペプチドを捕捉するための「同位体コードアフィニティータグ」（ＩＣＡＴ）の使用を開示している。著者らは、イースト中のタンパク質の大部分（＞９０％）は、少なくとも１つのシステイン残基を有することを報告している（平均では１つのタンパク質に約５つのシステイン残基を有する）。タンパク質試料中のジスルフィド結合を還元し、また、ヨードアセトアミドイルビオチンによって遊離チオールをキャップすることにより、全てのシステイン残基が標識される。そして、標識タンパク質は、トリプシン等で消化され、システイン標識ペプチドはアビジン化ビーズを使用して単離し得る。次いで、これらの捕捉ペプチドを液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で解析してタンパク質試料の発現プロフィールが決定可能である。２つのタンパク質試料は、異なる同位体修飾ビオチンタグでシステイン残基を標識することで比較可能である。本発明の有用な実施形態において、同位体識別された親和性リガンドを含む本発明のシステイン反応タグは、ＩＣＡＴ解析方法の感度を改善するために用いることができる。同様に、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（国際公開第９８／３２８７６号パンフレット）は、質量分析法によるタンパク質発現プロファイリング解析のためにＣ−又はＮ−末端ペプチドを捕捉するためのビオチン試薬の使用を開示している。このプロセスの感度もまた親和性リガンドを含む本発明のタグにより向上する。
【００６７】
好適な親和性捕捉リガンドは、ビオチンであり、当分野公知の標準方法により本発明のタグに導入可能である。特に、リジン残基をアミノ酸２の後に取り込むと、このアミノ酸を介してアミン反応性ビオチンをペプチド質量タグに結合することができる（例えば、Ｇｅａｈｌｅｎ  Ｒ．  Ｌ.  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０２（１)：  ６８−６７，  “Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ．”１９９２;  Ｓａｗｕｔｚ  Ｄ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １２(５)：  １０１９−１０１２，  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  [Ｌｙｓ]ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ．”１９９１；  Ｎａｔａｒａｊａｎ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４０（６）：  ５６７−５６７，  “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ＰＴＨ−ａｎａｌｏｇ.”,１９９２)。イミノビオチン及びデスチオビオチンもまた適用可能である。ビオチンに対して多様なアビジンカウンターリガンドが利用でき、これには、単量体及び四量体アビジン及びストレプトアビジンがあり、全て多数の固相担体上で利用できる。
【００６８】
他の親和性捕捉リガンドとしては、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ニトロフェニル部分、及びｃ−ｍｙｃエピトープ等の多数のペプチドエピトープが挙げられ、これらに対する選択的なモノクローナル抗体はカウンターリガンドとして存在する。Ｎｉ２＋イオンと容易に結合する金属イオン結合リガンド、例えばヘキサヒスチジンも利用できる。例えば、イミノ二酢酸キレート化Ｎ２＋イオンを放出するクロマトグラフ用樹脂が市販されている。これらの固定化ニッケルカラムは、オリゴマーヒスチジンを含む標識ペプチドの捕捉に使用できる。他の方法として、親和性捕捉官能基を適切に誘導体化された固相担体と選択的に反応させることができる。例えばボロン酸は、隣接するシス−ジオール及びサリチルヒドロキサム酸等化学的に類似するリガンドと選択的に反応することが知られている。ボロン酸を含む試薬は、サリチルヒドロキサム酸を誘導体化した固相担体上でのタンパク質捕捉用に開発されている（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ  Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ.,  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ.  １２(２)：  ２２９−２３９，  “Ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  １.  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｏｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．”２００１；  Ｗｉｌｅｙ  Ｊ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １２(２)：  ２４０−２５０，  “Ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  ２．  Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．”２００１，  Ｐｒｏｌｉｘ，  Ｉｎｃ，  ワシントン州、米国）。本発明のタグにフェニルボロン酸官能基を結合し、選択的化学反応で捕捉できる捕捉試薬を生成するのは、比較的簡単であろうと予想される。この種の化学の使用は、隣接するシス−ジオール含有糖を有する生体分子と直接両立しないと思われる。しかし、ボロン酸誘導体化標識試薬との反応の前にこの種の糖はフェニルボロン酸又は関連試薬で封鎖できる。
【００６９】
ペプチドの電荷誘導
本発明の第１の態様の実施形態において、タグは、容易にイオン化可能な基を含み、質量分析計でのタグ及び標識検体の可溶化、及び標識検体のイオン化の両方を支援可能である。多様な官能基をイオン性基として使用可能である。３級アミノ基及びグアニジノ基は、可溶化及びイオン化のどちらにも有用な官能基である（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｌ．  Ｂｒａｎｃａ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｇ．  Ｏｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ  Ｊ．  Ｇａｓｋｅｌｌ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．，  １４，  ２０７０−２０７３，”  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”２０００）。
【００７０】
様々な他のペプチド誘導体化方法もまた開発されている。これらには、陽イオン質量分析法のための、４級アンモニウム誘導体、４級ホスホニウム誘導体及びピリジル誘導体の使用がある。各種類のイオン性官能基は使用するイオン化方法、及び使用する質量分析法によって、様々な利点を有する。塩基性を増加することで陽イオン質量分析法のためのプロトン付加及び／又は電荷局在を促進する誘導体化試薬もあれば、急速にプロトンを失って陰イオン質量分析法に適するようになる誘導体化試薬もある。陰イオン質量分析法はバックグラウンドノイズがより少ないため、大抵、陽イオン質量分析法よりもより感度が高い。衝突誘起解離を使用する際に、電荷を誘導して誘導体化ペプチドの切断産物を変化可能である。特に、ペプチドを衝突誘起解離などの技術によって分析することになっている場合には、切断パターンを簡素化する非常に有利な誘導技術がいくつかある。用いるイオン性官能基は、使用予定の質量分析技術によって決定する（概説については、Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７：２５５−２７４，  “Ｃｈａｒｇｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，１９９８参照）。本発明の目的として、陽又は陰イオンの形成を促進するイオン性官能基は同等に使用可能である。
【００７１】
３級アミノ基、グアニジノ基及びスルホン酸基等の荷電基は更に利点をもたらす。これらの基はイオン交換により標識検体を精製可能にする親和性リガンドとして作用可能である。グアニジノ基機能及び３級アミノ基機能を含むタグ（例えば、図３及び図５参照）は、質量分析法による解析の前に調整可能にする強力な陽イオン交換樹脂上に捕捉可能である。同様に、スルホン酸機能を含むタグは、質量分析法による解析の前に調整可能にするアミノ交換樹脂上に捕捉可能である。更に、未反応タグと陰イオン交換樹脂又は陽イオン交換樹脂との間の相互作用は、標識検体の相互作用よりも弱いので未反応タグを容易に洗い流すことができる。標識検体は、樹脂に応じて適切な濃度の揮発性の酸、塩基、又は塩を含む適当なバッファーで溶出させることができる。従って、陽イオン交換樹脂又は陰イオン交換樹脂を充填したピペットチップ、スピンカラム及びカートリッジは、標識試料の有効な調製用器具であり、分析の前に標識ペプチドを容易に浄化可能にすると予想される。
【００７２】
更に、スルホン酸基は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に有利である。ペプチドのα−アミノ官能基のスルホン酸誘導体は、ＭＡＬＤＩ−イオントラップ型ペプチド分析で切断効率を向上し、それによりアスパラギン酸及びグルタミン酸を含むペプチド類等のイオントラップにおいて一般的に不良なＭＳ／ＭＳスペクトルを与えるある種のペプチドについて、スペクトルの改善が認められる（Ｋｅｏｕｇｈ，  Ｔ．，  Ｌａｃｅｙ  Ｍ．  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １５（２３）：  ２２２７−２２３９，  “Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”，２００１）。強力な酸性官能基は、ＭＡＬＤＩにおいて１価のペプチド類のアミド主鎖のプロトン付加を促進するために、切断効率の増加をもたらす。
本発明の特定の実施形態において、グアニジノ基及びスルホン酸基を含むタグが合成される（図及び実施例部分参照）。概して、好適な荷電基としては、グアニジノ基、３級アミノ基、及びスルホン酸基が挙げられる。
【００７３】
表面増強レーザー脱離イオン化
表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、ＭＡＬＤＩの通常の金属標的が誘導体化されるＭＡＬＤＩの変形である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  Ｓ．  Ｒ．，  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔ．  Ｓ．，  Ｐａｗｌａｋ  Ｍ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １（４）：  ３９５−４１６  “Ｒｅｃｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｃｈｉｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”，２０００)。これらの表面修飾としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体、疎水性表面、又は親水性表面での誘導体化が挙げられる。タンパク質、又はペプチド試料をこれらの表面に適用する場合、試料は該表面に吸収され、適切な洗浄工程によって試料を選択的に分画することで、標的の特定の成分が残り、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって更に解析する。これは、分析的目的のため、及び未反応タグ、特に陽イオン交換樹脂、又は陰イオン交換樹脂で被覆された表面から標識検体を分離するために、本発明の標識体に用いるための有効な技術であると予想される。
【００７４】
タンパク質発現プロファイリング法及びペプチドマスフィンガープリンティング法
本発明の第２の態様は、検体の１つ以上の試料の発現レベルを比較する方法を提供する。好適な実施形態において、試料はポリペプチドを含み、各種試料中のポリペプチドは、二次元ゲル電気泳動法で分離され、分離されたポリペプチドは、ペプチドマスフィンガープリンティング法により同定される。２つの試料の発現プロファイルを比較するには、２つの試料中の各成分ポリペプチドの種類及び相対量を決定する必要がある。本発明の第３の態様は、２つ以上の異なる試料中の成分ポリペプチドのそれぞれの種類及び相対量の両方を決定する方法を提供する。これを達成するには、各試料中のポリペプチドを蛍光発光で解像できる標識体で標識する。次に、標識されたポリペプチドをプールする。プールした試料の成分は、電気泳動又はクロマトグラフィーで分離することによって、互いに解像する。その後、分離されたタンパク質は、ペプチドマスフィンガープリンティング法で同定できる。本発明で記載する成分及び標識操作を使用すると、各成分ポリペプチドの相対レベルを標識ポリペプチドの質量分析による同定前に、蛍光測定で決定することも可能である。更に、本発明のタグは、質量分析同定工程の感度を向上する。
【００７５】
本発明の第２の態様の好適な実施形態においては、２つ以上のポリペプチド含有試料を分析する方法が提供され、各試料は１つよりも多いポリペプチドを含み、該方法は下記１から５を含む。
１．  本発明の第１の態様で提供する形態のタグで各試料のポリペプチドを共有結合反応させる工程。
２．  標識試料をプールする工程。
３．  プールした試料をゲル電気泳動、等電点電気泳動、液体クロマトグラフィー又は他の適当な手段で分離し、個別の分画を生成する工程。これらの分画は、ゲル上のバンド若しくはスポット、又はクロマトグラフィー分離による液体分画である。１度の分離による分画は、第２分離技術を使って更に分離することができる。同様に、その後の分析工程用にタンパク質が十分な解像度を持つまで、再度分画を進めることができる。
４．  配列特異的開裂試薬で、各分画のポリペプチドを消化する工程。
５．  消化物を質量分析法で解析し、ペプチドマスフィンガープリントでポリペプチドを同定する工程。
【００７６】
本発明の第２の態様の上記の好適な実施形態において、タンパク質の分画工程は、第一次元の等電点電気泳動と第二次元のＳＤＳ  ＰＡＧＥを使った二次元ゲル電気泳動を実施することで達成されるのが好ましい。一般的には、該ゲルを可視化し、タンパク質がゲル上のどこに移動したかを突き止める。ゲルの可視化は、一般的にゲルを染色し、タンパク質スポットを明らかにすることによって実施される。しかしながら、本発明のタグは、蛍光体を含むため通常の染色工程を省くことができる。よって、各スポットのタンパク質は標識化合物の蛍光によって同定される。従って、ゲルは色素を励起するレーザーでスキャンされ、異なる色素は、異なる励起波長、又は異なる発光波長のどちらか（又は両方）を有するはずであり、様々な色素が個別に撮像可能になる。図１に示すＣｙ３化合物の最適励起波長は５５３ｎｍ、及び最大発光波長は５６９ｎｍであり、一方、Ｃｙ５化合物の最適励起波長は６４５ｎｍ、及び最大発光波長は６６４ｎｍであるため、これらの２色素は一緒に使用可能となる。これらの化合物を用いて、ゲルは異なる色素を励起するレーザーを使用して２度撮像されるため、各試料に対応するゲルの２つの異なる蛍光像が形成される。これらの色素は、共に移動するために最適化されているので、２つの蛍光像は容易に表れるため各試料中の対応するタンパク質の発光強度が比較可能になるはずである。よって、この情報は同定対象の２つの試料中で発現差異を示すタンパク質の同定に使用可能である。これは、ペプチドマスフィンガープリンティング法によるその後の同定の調節を指示するタンパク質だけを選択可能とするため、その後の質量分析法によるタンパク質同定がより効率的となる。同定工程には、２つの方法がある。第1の方法では、タンパク質をゲルから抽出する。ロボット装置を使用して、ゲルからタンパク質含有スポットを切り取ることができる。次に、切り取ったゲルスポットからタンパク質を抽出する。その後、これらの抽出タンパク質を消化し、ポリペプチドからの消化ペプチドを質量分析法で解析しペプチドマスフィンガープリントを決定する。通常は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で決定するが、電子スプレー質量分析法もかなり広く使用されている。タンパク質は、ポリビニリデンジフロライド膜上のエレクトロブロッティングでも抽出でき、その後、タンパク質の酵素消化を該膜上で行うことができる（Ｖｅｓｔｌｉｎｇ  ＭＭ，  Ｆｅｎｓｅｌａｕ  Ｃ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ２２（２）：  ５４７−５５１，  “Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  （ＰＶＤＦ）：  ａｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，１９９４）。第２の方法では、消化ペプチドをゲルから、又は、切り取ったゲルスポットから抽出した後、ポリペプチドをゲル中で消化し、質量分析法によってペプチドマスフィンガープリントを決定する（Ｌａｍｅｒ  Ｓ，  Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  ＰＲ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．  ７５２（２）：  ３１１−３２２，  “Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ:  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｆｔｅｒ  ｏｎ−ｂｌｏｔ  ｏｒ  ｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．”２００１）。
【００７７】
標識ポリペプチドのペプチドマスフィンガープリンティング法
本発明の第２の態様において、１つ以上の試料の検体分子を分析する方法が提供される。この方法において、検体分子は、本発明の第１の態様の標識化合物で共有結合標識される。標識検体は分離され、そして任意に切断される。そして、切断ペプチドが検体分子に結合する標識化合物を更に含むＭＡＬＤＩ色素から同じ、又は異なる色素分子を含むＭＡＬＤＩマトリックスに包埋される。そして、標識及び包埋生体分子は、ＭＡＬＤＩ質量分析計で解析される。検体分子の標識に使用するＭＡＬＤＩ色素、及び自由なマトリックスとして選択される色素は、どちらもＭＡＬＤＩプロセスに使用される周波数で強力に光を吸収するために選択される。一般的に、紫外レーザー（ＵＶ）周波数２６６ｎｍ（Ｎｄ：ＹＡＧレーザー）又は３３７ｎｍ（窒素レーザー）が使用される。
【００７８】
ペプチド及びタンパク質は、本発明の方法の恩恵をうける好適な生体分子である。ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチド混合物、又はペプチド混合物は電気泳動、クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の方法のいずれかで単離可能である。質量分析の目的のため、ポリペプチド、又はタンパク質が塩又は界面活性剤、特に金属塩で汚染されていないのが好ましい。ポリペプチド、又はペプチド混合物を脱塩する様々な技術が当分野公知であり、例えば、ゲル濾過、透析、又は疎水性樹脂の使用等がある。特に便利で簡単なペプチドの脱塩方法は、Ｃ１８充填材料を装填するピペットチップでペプチド、又はポリペプチド混合物溶液の少量吸引によるものである。Ｃ１８樹脂は、一般的に、より極性のある塩汚染物よりもペプチドに対してより高い親和性を有するので、塩、及び界面活性剤がまず初めに溶出可能である。この浄化工程はペプチド分析の検出感度を実質的に向上する。適切な樹脂が事前に充填されたピペットチップ、及びその使用説明書はミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から「Ｚｉｐ  Ｔｉｐ(R)」（ベッドフォード、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）として市販されている。
【００７９】
本発明で使用する好適なＵＶ吸収色素には、桂皮酸の活性エステル及びその誘導体、ニコチン酸の活性エステル、又はヒドロキシ安息香酸誘導体の活性エステルが挙げられる。従って、本発明の第２の態様の一実施形態において、混合物中の単離ペプチドは、４−ヒドロキシ−α−シアノ−桂皮酸誘導体の活性エステルを含むタグで標識される。ペプチドは、Ｚｉｐ  Ｔｉｐ(R)を使用して脱塩され、非修飾４−ヒドロキシ−α−シアノ−桂皮酸のマトリックスに包埋される。一般的に、マトリックス溶体は、少量のトリフルオロ酢酸（０．１から０．５容量％で十分）を含むアセトニトリル等の揮発性溶剤で調製される。次いで、この溶液をピペットで金属標的上に滴下し、小さな溶滴を形成する。少量の脱塩標識ペプチド溶液をマトリックス溶液の溶滴に滴らせる。溶液は、ペプチドがマトリックスと共結晶化できるようにそのまま乾燥する。他の技術では、マトリックス溶液は、ペプチド溶液を加える前に、乾燥して結晶可能である（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｙｉｐ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ.  ７:  ５７６−５８０,１９９３）。この手法もまた、検体とマトリックスの共結晶層を形成するために繰り返される。これらの共結晶技術とその変形は、ペプチド又はポリペプチドの分析を改善するために使用され得る。上記の液体マトリックスもまた使用され得る。概して、これらの手法の成功、又は失敗はペプチド混合物の組成次第であり、特別な試料に対する優れたスペクトルを得るために異なる手法を試みる必要があろう。そして、マトリックス／ペプチド共結晶は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計でレーザー脱離により分析される。
【００８０】
定量
本発明の方法及び化合物は、タンパク質、及びペプチドの定量に特に良く適している。これは、多くの様々な方法で達成され、より好適な方法を以下に記載する。
【００８１】
本願において先行技術との決定的な違いは、同じ実験において異なる試料からタンパク質の発現差異の定量（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能にするＳＭＴを使用して下記（ａ）から（ｃ）のいずれかによりＭＡＬＤＩ感度を向上する方法を提供することである。（ａ）検出及び相対的に定量可能な異なる蛍光色素をゲルに組み込む、（ｂ）同じ配列を有するポリペプチドがＭＡＬＤＩにおいて互いにＰＭＦオフセットを形成するが、この相対イオン強度が親タンパク質の相対存在度と適合するように、異なる質量のレポーターを標識体に組み込む、又は（ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析器のタンデムＭＳモード、又はＭＡＬＤＩソースを装備したタンデムＭＳ機で定量するように、異なる質量のレポーターを標識体に組み込む。
【００８２】
従って、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により検体の特徴を分析する下記（ａ）から（ｄ）を含む更なる方法を提供する。
（ａ）  検体を所定の周波数で光を吸収する光吸収標識体で標識して、標識検体を形成する工程。
（ｂ）  標識検体を、光を吸収する少なくとも１つの化合物から形成されるマトリックスに包埋して、包埋標識検体を形成する工程。
（ｃ）  包埋標識検体を所定の周波数を有する光を照射することで脱離して、脱離検体を形成する工程。
（ｄ）  脱離検体を質量分析法により検出し、検体の特徴を分析する工程。
質量分析法により前記脱離検体を検出する工程は、存在する前記検体量の検出工程の前に行われるか、存在する前記検体量の検出工程を含むか、あるいは、存在する前記検体量の検出工程の後に行われる。
【００８３】
上記の工程（ａ）において、光吸収標識体が蛍光体部分を含み、質量分析法による検出前に検体は蛍光体部分に基づいて検出のために選択される。この実施形態において定量は、ゲル上又は液体クロマトグラフィーの実施のいずれかで蛍光体部分の蛍光を測定して行われる。この方法では、同じ検体が異なる試料から一緒に溶出するために、標識体は同じ質量であるのが好ましい。
【００８４】
上記の工程（ｂ）において、検体は異なる質量のレポーターで標識される。これらは、異なるＳＭＴ標識体（下記実施例１参照）又は同位体標識したＰＳＴ標識体等の異なる標識体（下記実施例２参照）がよい。定量は、試料を組み合わせて、組み合わせた試料混合物を質量分析法により解析することにより行われる。特徴的なピーク対（２つを超える試料があれば２つ以上のピーク）のピーク高／領域が測定されて各種に相対存在度を与える。蛍光体群は、この実施形態に必須ではない。質量分析法による解析が定量的に確実になるように正確な感度を提供するためには光吸収標識体の存在だけが必要である。
【００８５】
上記の工程（ｃ）において、検体は異なる質量のレポーターで再度標識される。これらは、好ましくは、上記により詳細を示したＴＭＴ標識体である。定量は、レポーター群を検出するためにＭＡＬＤＩと組み合わせたタンデム質量分析方法を用いて及びレポーター群の数量を決定することで行われる（下記実施例３参照）。蛍光体群は、この実施形態には必須ではない。質量分析法による解析が定量的に確実になるように正確な感度を提供するためには光吸収標識体の存在だけが必要である。
【００８６】
上記の工程（ｂ）において、本発明の光吸収標識体は、質量に基づく質量スペクトル中で個別に区別できる。よって、２つの試料１と２にタンパク質Ａが存在すれば、タンパク質は異なる質量を有する標識体に付加されるため、同じ断片から得られるが異なる試料由来のスペクトル中のイオンを試料のＭＡＬＤＩスペクトルから分離する。これらの異なる質量は、標識体の同位体置換、又は小さな化学変換により達成され得る。前者の例として、それぞれ２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１８Ｏを有する１Ｈ、１２Ｃ、１４Ｎ及び１６Ｏで置換される。後者の例として、分子中のＣＨ２基等の不活性基の含有が挙げられる（例えば、図６中のＳＭＴ＃１３及びＳＭＴ＃１４と比較)。
【００８７】
上記のとおり、他の方法として、本発明の増感標識体に加えて、更に質量に基づいて個別に区別可能な標識体に断片を付加することが挙げられる。そのような標識体の例は、国際公開第９８／３２８７６号パンフレット及び国際公開第００／２０８７０号パンフレットに開示される。これらの標識体は、概してタンパク質配列タグ（ＰＳＴ)と称され、定量に適合する際にはｑＰＳＴと称される。本発明のこの実施形態において、２つの試料１と２にタンパク質Ａが存在すれば、タンパク質は異なる質量を有するｑＳＭＴ標識体に付加されるため、同じ断片から得られるが異なる試料由来のスペクトル中のイオンを試料のＭＡＬＤＩスペクトルから分離する。本発明の標識体は、感度の改善により更に定量を正確にする。
【００８８】
工程（ｃ）としては、本発明の増感標識体に加えて質量に基づいて個別に区別可能な更なる標識体に断片を付加することが挙げられる。そのような標識体の例は、国際公開第０１／６８６６４号パンフレット及び国際公開第０３／０２５５７６号パンフレットに開示される。これらの標識体は、概してタンデム質量タグ（ＴＭＴ）であり、定量に適合する際にはｑＴＭＴと称される。これらの標識体は２つの部分に形成され、１つは質量マーカーであり、１つは質量を標準化するためであるので１セット内の全てのＴＭＴ標識体が同じ質量を有するという利点がある。これは、ＨＰＬＣ、又は他のクロマトグラフィー間に、異なる標識体を有していても同じ質量を有する標識断片は同じ方法で溶出するという利点がある。本発明のこの実施形態において、２つの試料１と２にタンパク質Ａが存在すれば、タンパク質は異なる質量を有するｑＴＭＴ標識体に付加されるため、同じ断片から得られるが異なる試料由来のスペクトル中のイオンを試料のＭＡＬＤＩスペクトルから分離する。本発明の標識体は、感度の改善により更に定量を正確にする。実際に、本発明の標識体は、適切な設計では、ＴＭＴ標識体の代わりに使用され得ることもある。
【００８９】
質量分析計
質量分析計の必須の特徴は次の通りである：
導入系→イオン源→質量分析器→イオン検出器→データ捕捉系
大きな生体分子を分析するために使用可能な導入系、イオン源及び質量分析器が様々あるが、しかし、本発明の文脈において、イオン源は、導入系の数だけが限られているマトリックス支援レーザー脱離イオン化源である。同様に、商業的に生産されていない質量分析器構造があるが、様々な質量分析器、イオン検出器、及びデータ捕捉系がＭＡＬＤＩと共に使用される。飛行時間型質量分析器は、一般的にＭＡＬＤＩと共に使用され、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析器及び四重極／飛行時間型質量分析器も同様である。主に、イオントラップ、及びセクター方式装置もまた、ＭＡＬＤＩと共に使用可能であるが、これらは概して商業的に生産されていない。
【００９０】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）
ＭＡＬＤＩでは、生体分子の溶液を大過剰モルの光励起「マトリックス」に包埋する必要がある。適切な振動数のレーザー光を当てると、マトリックスが励起し、次に閉じ込めた生物分子と一緒にマトリックスが迅速に気化する。酸性マトリックスから生物分子にプロトンが移動して生物分子のプロトン化形が生じ、これは陽イオン質量分析法、特に飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析法により検出することができる。陰イオン質量分析法もＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより可能である。この技術は、イオンにかなりの量の遷移エネルギーを付与するが、これにもかかわらず、過剰な分離を誘導しない傾向がある。イオン源からイオンを加速するために使用するレーザーエネルギー及び電位差の印加時期は、この技術を用いる開裂を調整するために使用できる。この技術は、質量範囲が大きいこと、１価イオンが多いこと、及び複数ペプチドを同時に分析する能力があること等から、ペプチドマスフィンガープリントの決定に非常に好まれる。
【００９１】
光励起性マトリックスは「色素」、即ち、特別な周波数の光を強力に吸収する化合物を含み、好ましくは、蛍光、又は、りん光によりそのエネルギーを放射せず、むしろ熱でエネルギーを消散する、即ち振動モードによりエネルギーを消散する。レーザー励起により生じるマトリックスの振動が、色素の急速な昇華を招き、同時に包埋検体を気相中に取り込む。
【００９２】
質量分析器
飛行時間型質量分析器
名前が暗示する通り、飛行時間型質量分析器は、イオンが所定の電位差の影響下で所定の距離を移動する時間を測定する。飛行時間型測定により、検出器にぶつかるイオンの質量電荷比の算出が可能となる。これらの機器は、試料内のほぼ全てのイオンの出現を測定するので、結果として非常に高感度であるが、この技術で選択性を達成するのはより難しい。この技術は、また、イオントラップ、又は四重極質量分析計で一般的に測定できるイオンより高い質量電荷比のイオンを検出可能である。ＴＯＦ質量分析器は、現在はＭＡＬＤＩと共に広く使用される。
【００９３】
イオントラップ
イオントラップ質量分析計は、四重極質量分析計に関連するものである。一般にイオントラップは３個の電極からなる構造をしており、すなわち各端に「キャップ」電極があり、それらによって空洞が形成されている円筒状電極である。円筒状電極には正弦波高周波数電位を印加し、キャップ電極にはＤＣ又はＡＣ電位でバイアスをかける。空洞に注入されたイオンは円筒状電極の振動電界によりトラップ内の安定な円形軌道に拘束される。しかし、所定の振幅の振動電位に対して特定のイオンは不安定な軌道をとり、トラップから放出される。振動高周波電位を変化することによって、トラップに注入したイオン試料をそれらの質量電荷比に応じてトラップから連続的に放出させることができる。次に放出されたイオンを検出することによって質量スペクトルが生成される。
【００９４】
一般にイオントラップは、イオントラップの空洞に存在する少量の「浴ガス」、例えばヘリウムで操作される。これにより装置の解像度と感度の両方が向上する。その理由は、トラップに入ったイオンは本質的には浴ガスとの衝突を経て浴ガスの環境温度にまで冷却されるからである。衝突すると、試料をトラップに導入した時のイオン化が増加し、それと共にイオン軌道の振幅と速度は減衰し、イオン軌道はトラップの中央近傍に保持される。これは、振動電位を変更することにより軌道が不安定になったイオンは減衰している循環イオンに比べると急速にエネルギーを獲得し、緊密な束となってトラップから飛び出し、その結果、ピークが狭く大きくなることを意味する。
【００９５】
イオントラップは、タンデム質量分析計の構造を模倣することができ、実際に多重質量分析計の構造を模倣することにより、トラップイオンの複雑な分析が可能になっている。試料から単一質量種をトラップに保持できる、すなわちその他の種は全てトラップから放出させることができ、保持した種は、注意しながら第１振動周波の上に第２振動周波を重ね合わせることにより励起することができる。次に励起されたイオンは浴ガスと衝突し、十分に励起されると開裂する。次にその開裂を更に分析することができる。更なる分析のために他のイオンをトラップから排出することによって開裂イオンを保持し、その開裂イオンを励起して開裂させることができる。十分な試料が存在する限りこのプロセスを反復することにより、更なる分析が可能になる。留意すべきこととして、これらの機器は一般に誘導開裂後の開裂イオンを高い存在割合で保持する。これらの機器及びＦＴＩＣＲ質量分析計（下記記載）は、線形質量分析計に存在する空間的に解決されたタンデム質量分析計というよりもむしろ時間的に解決されたタンデム質量分析計の形態を代表するものである。
【００９６】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＩＣＲ  ＭＳ）
ＦＴＩＣＲ質量分析計には、イオン試料が空洞内に保持されるという点でイオントラップと類似の特徴があるが、ＦＴＩＣＲ  ＭＳではイオンは交差電磁界により高真空チャンバに捕捉される。箱の２つの側面を形成する一対の平板電極が電界を形成する。この箱は電界を形成しかつ捕捉平板と呼ばれる２枚の平板に連結しており、捕捉平板の間にあってかつ印加磁界に直交する円形軌道に注入イオンを拘束する超伝導磁石の磁界に含まれる。箱の他の対向側面を形成する２枚の「送信板」に高周波パルスを印加するとイオンはより大きな軌道の中に励起される。イオンの円形運動によりそれに対応する電界が、「受信板」を含む箱の残りの２つの対向側面に発生する。励起パルスによりイオンはより大きな軌道に励起されるが、衝突を経てイオンの凝集運動が失われるに従いこの軌道は崩壊する。受信板が検出した対応シグナルはフーリエ変換（ＦＴ）解析により質量スペクトルに変換される。
【００９７】
誘起開裂実験のために、これらの機器は、イオントラップと類似の方法、すなわち目的の単一種を除く全てのイオンがトラップから排出可能な方法で行うことができる。衝突ガスをトラップに導入して開裂を誘起することができる。その後に開裂イオンを分析することができる。
【実施例】
【００９８】
１．本発明のタグを使用する定量（ｑＳＭＴ）
この実験では、本発明の標識体（増感質量タグ、ＳＭＴ）を異なるリンカー鎖長を使用する定量に適応した。図６に示す２つの標識体（ＳＭＴ＃１３及びＳＭＴ＃１４）を用いた。
ＢＳＡ消化を本発明の方法により行った。２つの試料を用いて、各試料中のリジン側鎖及びＮ−末端をタグ（各試料に対して異なるタグ）の１つで修飾した。
各試料のＭＡＬＤＩスペクトルを図７に示し、拡大したスペクトルを図８に示す。これらのスペクトルから同じピークプロファイルが形成され、２つのタグの質量が異なるため、一方が他方に対して質量において若干移動するのが分かる。これは図９に示す１：１混合スペクトル、及び図１０に示す対応する拡大スペクトルでより容易に分かる。図１１に示す分離した試料スペクトルと１：１混合スペクトルも同様である。
存在する種の数はこれらのスペクトルに正確に反映され、上述の図において同様のピーク高（及び領域から）分かる。存在する２つの試料の量を変化させてこれを実証した。図１２は図１１に対応する１セットのスペクトルを示し、図１２では３つの混合比、１：２、１：１、及び２：１と量が変化する。図１４は、同位体除去後の同じスペクトルを示す。量の変化は極めて明白であり、絶対量の計算、又は２つの試料間の相対量の比較に用いることができる。
【００９９】
上記記載の３つの量の比率、１：２、１：１、及び２：１のスペクトル中のピーク下で領域の測定により、ピーク強度が得られ、下記結果が得られる。
比率１：１
2006528344.tif 000004
比率１：２
2006528344.tif 000005
比率２：１
2006528344.tif 000006
内比は以下のように算出される。
内比＝ＩＳ／ＩＬ
ＩＬ＝軽い種のイオン強度
ＩＳ＝重い種のイオン強度
以下の式も記載する。
ＮＬ＝軽い種の総量 
ＮＳ＝重い種の総量
Ｄｅｌｔａ＝ＩＳＮＬ／ＩＬＮＳ
これらの小規模実験、及び上記比率から、２つの種の相対量の正当な推定値が決定されると理解できる。
【０１００】
２．ｑＰＳＴと共に本発明のタグを使用する定量（ＳＭＴ−ｑＰＳＴ)
この実験では、本発明の標識体（増感質量タグ、ＳＭＴ）は、ｑＰＳＴタグと共に使用する定量に適用した（これらのタグのより詳細については上記に記載）。ｑＰＳＴ標識体対を同位体標識した（それぞれ質量が＋８５及び＋９５Ｄａ）。ｑＰＳＴタグはトリプシン消化を行う前に、試料の分離に用いた。これにより、トリプシンに切断されないリジン残基が修飾される。
消化後、増感標識体を加え、新規のＮ−末端ペプチドと反応させた。各混合物中に、各ペプチドは１つのＳＭＴの最大数を有する。
ＨＰＬＣ分離を、試料に対するＭＡＬＤＩ質量分析法の実施前に各試料に対して実施した。組み合わせた試料のスペクトルを図１５に示すが、予想ピーク対が明らかに際立っている。
この増感標識体を用いた実験と、この増感標識体を用いない実験とを繰り返して、存在するＳＭＴ標識体の有用性を実証した。比較スペクトルを図１６に示す。図１６では、上側スペクトルは増感標識体を含むが、下側は含まない。例えば、下側スペクトル中の増感体（＋３４１Ｄａ)で修飾された９０２／９０７対が、上側スペクトルでは１２４３／１２４８対として現れる。上側スペクトルにおけるピークは、存在するＳＭＴ標識体によりかなり向上した。
完全のため、ＨＰＬＣ後の比較スペクトルを図１７に示す。図１８は、ＨＰＬＣ終了時点での塗布標本を示す。２０６６／２０７１対が長く溶離するが、確実な定量を提供するための方法の能力には影響しない。
【０１０１】
３．タンデム質量分析法と共に本発明のタグを使用する定量
この実験では、本発明の標識体（増感質量タグ、ＳＭＴ）は、ＭＳ／ＭＳモード質量分析計と共に使用した。ペプチドＶＡＴＶＳＬＰＲを本発明の方法においてＳＭＴ＃２で標識した。ＳＭＴ＃２は以下の構造を有する。
【化３】
2006528344.tif 000007
得られた断片のタンデム質量スペクトルを図１９に示す。スペクトルは７０、７２、８６、１１２、及び１１４でイミニウムイオンを示す。イオンは、１７２で増感タグを切断して生成される（ＳＭＴ＃２におけるアミド結合の切断）。ピークは以下のように同定された。
Ｙ２−ＮＨ３              ２５５．１
Ｙ２                      ２７２．２
Ｂ１                      ３８４．２
Ｙ３                      ３８５．２
Ｂ２                      ４５５．３
Ｂ３−１８（Ｔｙｒ）      ５３８．３
Ｂ３                      ５５６．３
Ｂ４                      ６５５．３
ここで使用する命名法は１９８４年にＲｏｅｐｐｓｔｏｒｆとＦｏｈｌｍａｎｎに考案された正式な命名法である。ＭＳ／ＭＳ測定によるペプチド切断に使用され、ＹはＣ−末端断片、及びＢはＮ−末端断片を言及する（例えば、Ｂ１はスペクトル中の第１Ｎ−末端断片）。
この実施例は、更なる特徴分析方法において本発明のＳＭＴ標識体の有用性を実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
本発明のより詳細な記載をほんの１例として図面を参照して以下に示す。
【図１】図１は、市販されている３つの反応性蛍光体である、プロピル−Ｃｙ３−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチル−Ｃｙ５−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＣｙ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを示す。これらの蛍光体は、タンパク質中のアミノ基と反応し、これらの色素で標識される異なる試料中の対応するタンパク質は共に移動する。
【図２】図２は、桂皮酸誘導体及びアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基に結合したプロピル−Ｃｙ３蛍光体を含むバイモーダルなタグを示す。
【図３】図３は、桂皮酸誘導体、可溶化のためのアルギニン、及びアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基に結合したプロピル−Ｃｙ３蛍光体を含むバイモーダルなタグを示す。
【図４】図４は、桂皮酸誘導体及びアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基に結合したメチル−Ｃｙ５蛍光体を含むバイモーダルなタグを示す。
【図５】図５は、桂皮酸誘導体、可溶化のためのアルギニン、及びアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基に結合したメチル−Ｃｙ５蛍光体を含むバイモーダルなタグを示す。
【図６】図６は、存在するペプチド量を決定可能な本発明の実施形態において用いられる本発明の２つのタグ（ＳＭＴ＃１３及びＳＭＴ＃１４）を示し、ＳＭＴタグ＃１３及びＳＭＴタグ＃１４は芳香族系と反応性基の間のリンカー長が異なるため、結果として質量差が１４．０１５６Ｄａとなる。
【図７】図７は、ＢＳＡ消化物の２つの質量スペクトルを比較するために示し、上方がＳＭＴ＃１４、下方がＳＭＴ＃１３を用いた質量スペクトルである。
【図８】図８は、図７のスペクトルの拡大図を示す。
【図９】図９は、ＳＭＴ＃１３標識ＢＳＡ消化物及びＳＭＴ＃１４標識消化物を１対１で混合した単一質量スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、図９のスペクトルの拡大図を示す。
【図１１】図１１は、異なるＳＭＴで標識したＢＳＡの３つのスペクトルを示し、上側はＳＭＴ＃１３、下側はＳＭＴ＃１４、及び中央は両者の１：１混合を用いたスペクトルである。
【図１２】図１２は、両方のＳＭＴを異なる比率で標識したＢＳＡの３つのスペクトルを示し、ＳＭＴ＃１３：ＳＭＴ＃１４が、上側は１：２、中央は１：１、及び下側は２：１である。
【図１３】図１３は、同位体除去後の図１２の３つのスペクトルを示す。
【図１４】図１４は、図１３のスペクトルの拡大図を示す。
【図１５】図１５は、定量的タンパク質配列タグ（ｑＰＳＴ）及び本発明のタグ（ＳＭＴ）の両方で標識したＢＳＡ消化物の結果のスペクトルを示す。ｑＰＳＴ標識体は、識別的に同位体標識され、結果として１つの試料からより高い質量対、及びもう１つの試料からより低い質量対のピーク対を得る。
【図１６】図１６は、本発明の増感タグが有る場合と無い場合での図１５と同じ消化物の比較を示す。
【図１７】図１７は、プロセスにＨＰＬＣ分離工程を含んだ後で選択されたイオン対を示す。
【図１８】図１８は、スペクトル中の弱いピーク対でさえも本発明の増感体を使用して有効な定量データを生じ得ることを示す。
【図１９】図１９は、増感質量タグ（ＳＭＴ）で標識したペプチドＶＡＴＶＳＬＰＲのタンデム質量スペクトルを示す。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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