(57)【要約】ＲＮＡｉ発現のためのアデノウイルスのＶＡ１  ＰｏｌＩＩＩ発現系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスのＶＡ１プロモーター及び干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子をコードする構築物を含有する発現カセット。
【請求項２】
ＲＮＡｉをコードする構築物がプロモーターの非必須ステム領域内に含有される、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
非必須ステム領域がＢｓｔＥＩＩ部位を含有する、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
ＲＮＡｉをコードする構築物がヘアピンｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする構築物である、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項５】
ＲＮＡｉをコードする構築物が約４ないし約９塩基を含有するループを含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項６】
ループが約８塩基を含有する、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
哺乳動物細胞において干渉ＲＮＡ分子を発現する方法であって、アデノウイルスのＶＡ１プロモーター配列に操作的に連結した干渉ＲＮＡ分子をコードする構築物を前記哺乳動物細胞に導入することを含み、前記配列が該細胞において該構築物の発現を指向する、前記方法。
【請求項８】
干渉ＲＮＡ分子をコードする構築物が、ヘアピンｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする構築物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡｉをコードする構築物が約４ないし約９塩基を含有するループを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ループが約８塩基を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アデノウイルスのＶＡ１プロモーターに操作的に連結した干渉ＲＮＡ分子をコードする構築物が導入されている哺乳動物細胞。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が初代細胞である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［0001］本出願は、同時係属中の米国仮出願シリアル番号第６０／３９９，３９７号、２００２年７月３１日に出願の優先権を主張する。
政府の権利の言及
［0002］本発明は、米国政府保険社会福祉省の国立衛生研究所からシティー・オブ・コープへの助成金番号Ａ１２９３２９のもとで、連邦政府の援助を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
［0003］本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関し、より具体的には、哺乳動物における小干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）及びｓｉＲＮＡ前駆体を含む干渉ＲＮＡ分子を生産するための発現システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
［0004］遺伝子治療は、免疫療法、プロテアーゼ阻害剤、及びワクチンのようね既存の抗ウイルス剤の制限された効果のため、ＡＩＤＳの有望な治療として残されている。いくつかのタイプのＲＮＡ遺伝子治療が開発され、哺乳動物の培養においてＨＩＶ−１複製を阻害することを示している；これらはアンチセンスＲＮＡ、触媒ＲＮＡ（リボザイム）、及び高アフィニティーＲＮＡリガンド（アパマー（ａｐａｍｅｒ）又はデコイ（ｄｅｃｏｙ））を含む。しかし、それらの効率は非常に変化しやすく、多くの場合、効果的でないようである。
【０００４】
［0005］ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、動物や植物において、配列においてサイレンス遺伝子に相同的である二重鎖ＲＮＡによって開始される配列特異的な転写後の遺伝子のサイレンシングのプロセスである（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，２００１）。この強力な遺伝子工学的技術は、最近、哺乳動物において有用であることが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１；  Ｎｏｖｉｎａ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｌｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。二重鎖ＲＮＡの一形体は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるが、ＨＩＶ−１遺伝子の発現を標的とし、阻害することが示されている（Ｌｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００５】
［0006］３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡは、誘導性ｄｓＲＮＡに本質的に配列非特異的である、哺乳動物におけるインターフェロン応答を引き起こし得ることが知られている（Ｅｌａｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。突き出している３’末端を有する２１ヌクレオチドの二重鎖は、培養の哺乳動物細胞において配列特異的な方法でＲＮＡｉを仲介することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００６】
［0007］哺乳動物の系において、配列特異的なＲＮＡｉの効果は、ｓｉＲＮＡを標的細胞にトランスフェクションによって直接的に導入すること（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＮｏｖｉｎａ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、又はｓｉＲＮＡ若しくは短いヘアピンｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の内因性の発現によって間接的に導入すること（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；及びＬｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）によって観察することができる。ｓｈＲＮＡのステム−ループ部分は、小さな一時的（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）又はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を生じるためのダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって処理される自然発生のステムループ構造に匹敵する。したがって、ＨＩＶ−１配列に対応するｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの前駆体の発現は、ヒトのダイサーによって作用され、ＨＩＶ−特異的ｓｉＲＮＡを生じ得た。最近、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ鋳型から異なるステム−ループ構造を有するいくつかのｓｈＲＮＡの発現が、いくつかの標的を合成のｓｉＲＮＡと同様に効果的にサイレントした。
【０００７】
［0008］合成のｓｉＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡから発現したｓｉＲＮＡを用いるＨＩＶ−１複製の阻害は、ｓｉＲＮＡ技術が宿主細胞におけるＨＩＶ−１複製及び感染を阻害するための治療的戦略として有用であり得る（Ｎｏｖｉｎａ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；及びＪａｃｑｕｅ，Ｊ．−Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これらのデータは、抗ＨＩＶ−１剤としてｓｉＲＮＡの治療用途を調査するための根拠を提供する。本目的としては、ＨＩＶ−１感染に対する免疫性を与え、ウイスル複製を妨げるために、ｓｉＲＮＡを細胞に発現させる。
【０００８】
［0009］細胞にｓｉＲＮＡを発現させるための１つのアプローチは、ｓｉＲＮＡ遺伝子をウイルスベクターに挿入し、初代細胞に形質導入することを含む。ウイルス性遺伝子及び／又は細胞の遺伝子の組み合わせを標的とするベクターを基礎とした戦略は、ＲＮＡを基礎とした抗ウイルス治療に対する改良を提供する。ＣＣＲ５、ＨＩＶ−１コレセプターは、魅力的な標的候補を提供するが、ＣＣＲ５におけるホモ接合体欠損が、ヒトの免疫機能におけるいかなる重い有害な効果なしにＨＩＶ−１からの保護を与える。ヒト細胞におけるＨＩＶ−１  ｒｅｖをサイレントするためのベクターを基礎とする戦略は、Ｕ６プロモータ系を用いて示されている（Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００９】
［00010］ＶＡ１ベクターの基本的な設計は、Ｃａｇｎｏｎ及びＲｏｓｓｉ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０：２５１−２６１，２０００に記載され、本明細書に参照として援用される。リボザイム発現のためのアデノウイルスnのＶＡ１プロモータの使用は、米国特許第６，１００，０８７（Ｒｏｓｓｉら）に記載され、本明細書に参照として援用される。
【００１０】
［00011］初代細胞におけるベクターを基礎とするｓｉＲＮＡ指向性遺伝子サイレンシングは、細胞株において見られるものよりも低く、これは、恐らくは初代細胞においてｓｉＲＮＡの発現が低いか、又はサイレンシングの仕組みの効率がより低いためである。
【００１１】
［00012］初代細胞におけるサイレンシングＲＮＡの発現及び効率を改良する戦略が必要とされる。戦略には、初代細胞において干渉ＲＮＡ分子、及び部分的なｓｉＲＮＡを発現するための代替的プロモータシステムが含まれる。本発明は、この必要性を追求する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の概要
［00014］一側面において、本発明は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡ分子及びｓｉＲＮＡ前駆体分子を含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子を発現するためのＶＡ１  ＰｏｌＩＩＩプロモータシステム、及び好ましくはアデノウイルスのＶＡ１プロモータシステムを提供する。このプロモータシステムの１つの利点は、ＶＡ１転写物が、ＲＮＡｉ関連酵素のダイサーが局在する細胞質に輸送されるものである。
【００１３】
［00015］好ましい態様において、ＲＮＡｉ分子をコードする構築物は、ＶＡ１プロモータ遺伝子の非必須のステム領域に埋め込まれる。ＲＮＡｉ分子は、二本鎖ＲＮＡとして発現し、酵素ダイサーの基質として供給し得るｓｈＲＮＡ又は他のｓｉＲＮＡ前駆体を含むことができ、該酵素ダイサーは、ｓｉＲＮＡとして機能することができる約２１−２３のヌクレオチド二重鎖に該ＲＮＡを消化する。
【００１４】
［00016］別の好ましい態様において、ＶＡ１遺伝子は、初代細胞においてより高い発現レベル又は効率を提供することができる前駆体ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする構築物を含む。ｍｉＲＮＡ前駆体は、同様に、酵素ダイサーによって約２１−２４のヌクレオチドのｓｉＲＮＡに処理される。より好ましい態様において、ヒトのｍｉｒ−３０及びｌｅｔ−７ａ−３ｍｉＲＮＡは、ヒト細胞におけるそれらのＲＮＡｉ効果のために利用することができる。
【００１５】
［00017］別の側面では、本発明は、上述のアデノウイルスのＶＡ１  ＰｏｌＩＩＩプロモータシステムを用いて哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉ分子を発現するための方法を提供する。この方法は、遺伝子発現及び／又は複製を阻害するために有用である。
【００１６】
［00018］さらなる側面では、本発明は、干渉ＲＮＡ分子をコードする構築物を含有するＶＡ１プロモータシステムを導入している哺乳動物細胞、好ましくは初代細胞を提供する。該構築物及びＶＡ１プロモータ遺伝子は、好ましくは、操作的に連結される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の詳細な説明
［00027］本発明において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）を基礎としたアデノウイルスのＶＡ１プロモータ遺伝子（例えば、図１Ａ）は、哺乳動物細胞及び好ましくは初代細胞においてｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ前駆体を含む干渉ＲＮＡの発現を調節するために使用される。
【００１８】
［00028］ＶＡ１  ＰｏｌＩＩＩプロモータは、２つのプロモータ調節要素を分離する配列における可変性を寛容することができる。サイレンシングＲＮＡをコードする配列は、ＶＡ１遺伝子のコード領域、好ましくはステム−ループＩＶ内に挿入され、サイレンシングＲＮＡを効率的に転写し、天然のＲＮＡの二次構造及び三次構造によって安定化させることができる。ＶＡ１転写物はまたサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）やダイサーのような本質的なｓｉＲＮＡ機構成分が局在する細胞質に主に局在する。ＶＡ１  ＲＮＡとｓｉＲＮＡ機構成分の細胞質の同時局在は、ｓｉＲＮＡを介したＲＮＡｉの効率を改善するものかもしれない。
【００１９】
［00029］好ましい態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、ＶＡ１  ＲＮＡにクローニングするための適切なサイレンシングＲＮＡであり、これは、該ＲＮＡが同様に約２１−２４のヌクレオチドｓｉＲＮＡにダイサーによって処理されるためである（図２Ｂ）。多くのヒトのｍｉＲＮＡのうち、自然の及び設計されたｍｉｒ−３０  ｍｉＲＮＡがヒト細胞において標的ｍＲＮＡの発現を阻害することができる（Ｚｅｎｇ，Ｙ.ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ヒトのｍｉｒ−３０及びｌｅｔ−７ａ−３ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−３０に類似の構造を有する）は、ヒト細胞におけるそれらのＲＮＡｉ効果のために、本目的に有用である。ｍｉＲＮＡ前駆体をコードする構築物は、ｒｅｖ又はＣＣＲ５  ｍＲＮＡの二重鎖配列を含み、ＤＮＡフォワード及びリバースオリゴマーを用いるＰＣＲによって設計され生産することができる。
【００２０】
［00030］ＶＡ１ベクターにクローニングする前に、設計したｍｉｒ−３０若しくはｌｅｔ７のｒｅｖ若しくはＣＣＲ５  ｍｉＲＮＡ前駆体構築物は、ダイサーに対する感受性を試験するために、ＤＮＡオリゴマーの鋳型及びＴ７メガショートスクリプトキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写することができる。５’末端でＴ７プロモーター配列を含む転写の鋳型を設計する。その後、Ｔ７転写したｍｉＲＮＡは、ヒトのダイサーとともにインキュベートし、生産物をＰＡＧＥゲルで視覚化する。
【００２１】
［00031］ダイサーがｉｖ  ｖｉｖｏにおいてＲＮＡｉに関わるを決定するために、ダイサーの活性は、ダイサーｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞から消耗させることができる。
【００２２】
［00032］好ましい態様において、ｒｅｖ及び／又はＣＣＲ５  ｍＲＮＡに対して標的とされるｓｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡは、ＢｓｔＥＩＩ部位を用いてＶＡ１ベクターにクローニングされる（図２Ａ）。構築物並びに対照の構築物は、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰ又はｐＩＮＤ−ＣＣＲ−ＥＧＦＰ標的構築物を用いて２９３／ＥｃＲ細胞に同時にトランスフェクトされる。阻害効率は、ＦＡＣＳ及び蛍光顕微鏡イメージングを含むアッセイを用いてモニターされる。
【００２３】
［00033］ｍｉＲＮＡ−ＶＡ１構築物の細胞内局在は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて調べることができる（Ｌｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＶＡ１カセット中の挿入物に相補的な修飾したＣｙ３標識ＤＮＡプローブ、及び標的に相補的なＦＩＴＣ標識ＤＮＡプローブをこの目的のために使用することができる。細胞内配列に相補的な適切な対照（核小体に対するＵ３、核に対するＵ６、及び細胞質に対するｔＲＮＡ  ｌｙｓ）はまた、細胞内コンパートメントを確かめるために第三の蛍光色素と共に使用することができる。効果的なｓｈＲＮＡ構築物の予備的な同定に続いて、該構築物は、ヒトＣＤ３４＋細胞及びＨＩＶ−１でチャレンジしたＴ細胞に発現する。
【００２４】
［00034］ｓｉＲＮＡに対する耐性は、ＨＩＶ−１感染個体において起こり得るし、そして起こるであろう。この問題を回避するためには、ウイルスの異なる部位を標的とした複数のｓｉＲＮＡを、好ましくは細胞のコレセプターＣＣＲ５に対して標的とされるｓｉＲＮＡとともに、同時に発現するベクターを生産することが可能である。
【００２５】
［00035］遺伝子治療前に、抗ＨＩＶ−１候補構築物を効率的に初代細胞又は休止期の幹細胞に形質導入する。候補構築物は、同時係属中の米国出願シリアル番号第１０／３６５，６４３、２００３年２月１３日出願に記載される具体例のベクターにサブクローニングすることができ、本明細書に参考として援用される。候補構築物は、好ましくはレンチウイルスベクター、より好ましくはＨＩＶ７レンチウイルスベクターにサブクローニングされる。ＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、集積を増大させるためのＨＩＶ−１のポリプリントラクト、及びＲＮＡの安定性を増大するためのウッドチャックの肝炎の翻訳後の制御因子（ＷＣＲＥ）を含む。５’ＬＴＲは、ウイルスＲＮＡのリバース転写にその後に除去されるＣＭＶプロモーターでベクターを置換される。最終の構築物において、ＰｏｌＩＩＩカセットは、ポリプリントラクトとＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）の下流であり、ｐＨＩＶ−７のＣＭＶの上流に挿入される。ＥＧＦＰ遺伝子はまた選択マーカーを提供するためにベクターに挿入することが可能である。
【００２６】
［00036］好ましい態様において、ＶＡ１  ｍｉＲＮＡを宿すベクターは、それらを、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現するｐＣＭＶ−Ｇ、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質を発現するｐＣＨＧＰ−２、及びｐＣＭＶ−Ｒｅｖと一緒に同時にトランスフェクトすることによってパッケージ化される。ＣＥＭ細胞は、初代細胞における構築物の発現前にそれらの発現レベルをプレスクリーニングするために使用される。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの上清を用いて、ＣＥＭ細胞をトランスフェクトし、ＶＡ１  ｍｉＲＮＡを宿すレンチウイルスベクターの発現レベルをノーザンゲル解析を用いて解析する。
【００２７】
［00037］その後、形質導入物は、Ｍ−トロピックＪＲＦＬ及びＢａＬ、及びＴ−トロピックＩＩＩＢ及びＮＬ４−３のようなＨＩＶ−１のｌａｂ菌株で感染させる。ウイルスの複製物の懸濁液は、ＲＴ及びｐ２４レベル、シンシチウム（ｓｙｎｃｙｔｉａ）形成、及び生存率をモニターすることによって測定することができる。一度、構築物を適当に機能することを決定すれば、その後、例えば、Ｂａｕｅｒら（Ｂａｕｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７）のプロコルを用いて、初代ＣＤ３４＋細胞及びＴリンパ球にそれらを形質導入される。形質導入した細胞は、その後、ｓｉＲＮＡ発現及び抗ＨＩＶ１活性について評価される。
【００２８】
［00038］本発明は、さらに、下記の実施例を詳述し、例証の方法によって添付され、いかなる手法においても発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００２９】
実施例１
［00039］ＶＡ１−ｍｉＲＮＡ及びＶＡ１−ｓｉＲＮＡは、１）２１−ｎｔセンス、２）ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−３０又はｌｅｔ−７ａ−３）に対する４、８、又は９塩基ループ、３）ＨＩＶ−１  ｒｅｖ標的（全体で約５０−ｎｔ）に相補的な２１−ｎｔのアンチセンス鎖を含有することができる。不活性化の突然変異のｍｉ−又はｓｉ−ＲＮＡ改変体を作製するために、ステム配列の中間の４−ｎｔを標的に対して非相補的になるように変異させた。ｍｉ−又はｓｉ−ＲＮＡ配列を含むＢｓｔＥＩＩ制限断片を合成オリゴヌクレオチドから調製し、それらの３’末端の相補配列の１２塩基を共有する。これらをアニールし、Ｔａｑポリメラーゼ及びＰＣＲの数ラウンドを用いてプライマー末端を伸長した。ｗｔ及びｍｔ  ｍｉ−又はｓｉ−ＲＮＡ配列をｐＶＡ１のＢｓｔＥＩＩにクローニングした（図１Ａ）。ループの配列は、４塩基ループ：ＴＴＡＡ［配列番号４］、８塩基ループ：ＧＡＡＧＣＴＴＧ［配列番号５］（下線：ＨｉｎｄＩＩＩ部位）、及び９塩基ループ：ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号６）である。
【００３０】
実施例２
［00040］ｒｅｖ部位ＩＩを標的とするＶＡ１−ｓｉＲＮＡ発現構築物は、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合構築物で同時にトランスフェクトした（図３）。様々なＶＡ１  ｓｈＲＮＡキメラ構築物又はＵ６プロモータｓｉＲＮＡ発現構築物は、カチオン脂質を用いてヒト２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡを細胞から単離し、６％の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ＲＮＡをナイロン膜に電気ブロットし、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのアンチセンス配列に相補的な３２Ｐ標識した合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドでハイブリダイズした。
【００３１】
実施例３
［00041］センス及びアンチセンス鎖のいくつか異なるループサイズ及び相対的な配向をヒト２９３細胞内にＶＡ１−ｓｉＲＮＡ構築物とｐＮＬ４−３とを同時にトランスフェクトすることによって試験した。多様な構築物をコードするプラスミドをヒト２９３細胞にＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡで同時にトランスフェクトし、ＨＩＶ−１  ｐ２４アッセイを指定した時間に採取したサンプルについて実行した。結果（図４）は、８塩基のループが中でも、機能性ｓｉＲＮＡを生じることにおいて最も効果的であり、センス及びアンチセンス（＃１及び＃２）の相対的な配向がｓｉＲＮＡの効率に影響を与えないようであることを示す。
【００３２】
［00042］本発明の背景を明らかにし、本発明の実施に関する追加の詳細を提供するための本明細書で使用される刊行物やその他の材料は、各々が参照により本明細書により個別に援用されるかのように、本明細書に参照により援用される。
【００３３】
［00043］本発明が、その好ましい態様の詳細に言及することによって本特許出願に開示されてはいるが、本発明の意図及び添付の請求の範囲内において、変更が当業者に容易に生じるであろうことを予期されるため、その開示は限定的な意味というよりはむしろ例証される意味に意図されると理解されるべきである。
【００３４】
参考文献リスト
【００３５】
【化１】
2006500017.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】［0019］図１Ａは、本発明に従ってＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩを基礎としたアデノウイルスＶＡ１発現構築物の概略図である。図は、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ前駆体の構築物に対するＶＡ１遺伝子と挿入部位を図示する。
【図１Ｂ】［00020］図１Ｂ［配列番号１］は、ＶＡ１遺伝子のＢｓｔＥＩＩ部位で挿入可能なＨＩＶ  ｒｅｖ部位ＩＩに標的とされるｓｉＲＮＡヘアピン前駆体（ｓｈＲＮＡ）を図示する。
【図２】［0021］図２Ａ−Ｃは、ＶＡ１発現カセット、前駆体ｓｉＲＮＡ構築物、及びＶＡ１プロモータ−ｓｉＲＮＡ前駆体発現産物の概略図である。［00022］図２Ａは、配列をコードするｍｉＲＮＡをＶＡ１遺伝子のＢｓｔＥＩＩ部位で挿入することを示す。ｐｏｌＩＩＩプロモータはＡ及びＢボックスで示される。［00023］図２Ｂは、２つの好ましいヒトｍｉＲＮＡ構築物（ｇｕｇａａｇｃｃａｃａｇａｕｇ［配列番号２］、ｕｇｇｇｇｃｕｃｕｇｃｃｃｕｇｃｕａｕｇ  ｇｇａｕ［配列番号３］を示す。［00024］図２Ｃは、ｍｉＲＮＡを含む発現したＶＡ１  ＲＮＡ（Ｍｆｏｌｄバージョン３．０）を示す。
【図３】［0025］図３は、本発明に従って、ＶＡ１−ｓｉＲＮＡの発現のノーザンゲル解析の結果を示す写真である。レーンは、左から右について、Ｕ６  ｓｉＩＩ、Ｕ６  ｓｉ無関係、８塩基ループを有するＶＡｓｈ−部位ＩＩ、８塩基ループを有する後ろ向きのＶＡｓｈ−部位ＩＩ（アンチセンス−ループ−センス）、９塩基ループを有する後ろ向きのＶＡｓｈＩＩ、４塩基ループを有する後ろ向きのＶＡｓｈＩＩ、ＤＮＡオリゴサイズマーカーである。Ｕ６プロモーターｓｉＲＮＡ  ＩＩからの２３ヌクレオチド転写産物を示す。全長、中間の処置された産物及びｓｉＲＮＡ産物もまた図示する。
【図４】［0021］図４は、キメラＶＡ１  ｓｈＲＮＡ構築物とＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３プロウイルスＤＮＡをヒト２９３細胞に同時トランスフェクトした結果を示すグラフである。様々なＶＡ１−ｓｈＲＮＡキメラ構築物が、正の対照であるＵ６  ｓｉＲＮＡ発現構築物とともに示される。文字ＦとＲは、転写開始部位に関してＶＡ１ベクターにおけるｓｈＲＮＡ配列の配向を意味する。Ｆ＝フォワード  センス−ループ−アンチセンス、及びＲ＝リバース  アンチセンス−ループ−センス。ループサイズはまた示される。
【図１Ａ】
2006500017.tif 000003
【図１Ｂ】
2006500017.tif 000004
【図２】
2006500017.tif 000005
【図３】
2006500017.tif 000006
【図４】
2006500017.tif 000007
【配列表】
2006500017000001.app
【国際調査報告】
2006500017.tif 000008