(57)【要約】【課題】  なし  【解決手段】  ”PG”、”GP”、”PI”、及び”IG”からなる群から選択されたアミノ酸モチーフを含み、かつ該アミノ酸モチーフの上流域、及び／又は下流域に、10個までのアミノ酸を有し、ここで、該モチーフの”P”は、プロリン、又はヒドロキシプロリンであり、かつ骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する、新規ペプチドを記述する。本発明は、さらに、これらのペプチドの医薬組成物、並びにこのようなペプチドの治療上、及び予防上の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
”PG”、”GP”、”PI”、及び”IG”からなる群から選択されたアミノ酸モチーフを含み、かつ前記アミノ酸モチーフの上流域、及び／又は下流域に、10個までのアミノ酸を有するペプチドであって、前記モチーフの”P”が、プロリン、又はヒドロキシプロリンであり、かつ骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する、前記ペプチド。
【請求項２】
骨細胞、骨細胞前駆体、及び系統共有細胞の活性を刺激する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
軟骨細胞、軟骨細胞前駆体、及び系統共有細胞の活性を刺激する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
骨形成を刺激する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
軟骨形成を刺激する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
インビトロ、エキソビボ、及び／又はインビボにおける応答を刺激する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
長さが、少なくとも３アミノ酸である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
長さが、少なくとも４アミノ酸である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
さらに、一以上のリンカー基を含む、請求項６、７、又は８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記リンカー基が、カルボジイミド、アルデヒド、マレイミド、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、及びNHSエステル、修飾システイン、リン酸化アミノ酸、アミノ酸、二酢酸、塩化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシ、ビスホスホネート、ピロホスフェート、ホスフェート、ジスルフィド、フェニルアジド、ハロゲン化アルキル、及びヒドラジドアシルクロライドからなる群から選択される、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
キメラペプチドとして提供される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記キメラペプチドが、オステオポンチン、象牙質マトリックスリンタンパク質、ホスビチン、ホスホホリン、ベータ−カゼイン、ストラセリン、マトリックスglaタンパク質、リボフラビン結合性タンパク質、及びアルファS1カゼインからなる群から選択された、タンパク質のカルシウム結合性配列を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記結合配列が、S*S*、S*S*GS*EE、S*S*S*EE、S*S*S*S*S*S*、DS*S*DS*S*、S*LS*S*S*S*、DS*S*EE、DS*S*ES*、S*MS*S*S*EE、及びS*IS*S*S*EEからなる群、及びこれらの組合せから選択された、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記刺激を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞増殖、細胞内カルシウムチャンネリングアッセイ、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイからなる群から選択される、一以上の基準の分析により評価することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
医薬として許容し得るキャリアを含む組成物として提供される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記組成物が、さらに、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、カルシトニン、エストロゲン、エストラジオール、プロスタグランジンＡ１、ビスホスホン酸、イプリフラボン類、フッ化ナトリウム、ビタミンＫ、骨形態形成タンパク質、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子１及び２、エンドセリン、副甲状腺ホルモン、上皮増殖因子、白血病抑制因子、オステオゲニン、及びこれらの混合物からなる群から選択された薬剤を含む、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記組成物を、局所的、及び／又は全身的に投与することができる、請求項１５、又は１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
全身投与が、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻内投与、経肺投与、局所的投与、経皮投与、及びこれらの組合せから選択される、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
局所投与が、注射、又は移植片の使用により提供される、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記移植片のマトリックスに、被覆するか、充填するか、又は分散するかにより提供される、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
顆粒状、又は粉末状のバイオマテリアル化合物とともに提供される、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
生体適合性、及び／又は生分解性ポリマーとともに提供される、請求項１、１５、又は２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドが、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；PIGP（配列番号：20）、及びこれらの混合物からなる群から選択された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のペプチドの機能類似体。
【請求項２５】
請求項２３に記載のペプチドの模造類似体。
【請求項２６】
（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式を有するペプチドであって；式中Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；式中Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；かつ式中Ｚはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート−アラニンからなる群から選択された、前記ペプチド。
【請求項２７】
骨細胞、骨細胞前駆体、及び系統共有細胞の活性を刺激する、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
軟骨細胞、軟骨細胞前駆体、及び系統共有細胞の活性を刺激する、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２９】
骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項３０】
インビトロ、エキソビボ、及び／又はインビボにおける応答を刺激する、請求項２６〜２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
長さが、少なくとも３アミノ酸である、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
長さが、少なくとも４アミノ酸である、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３３】
さらに、一以上のリンカー基を含む、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３４】
前記リンカー基が、カルボジイミド、アルデヒド、マレイミド、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、及びNHSエステル、修飾システイン、リン酸化アミノ酸、アミノ酸、二酢酸、塩化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシ、ビスホスホネート、ピロホスフェート、ホスフェート、ジスルフィド、フェニルアジド、ハロゲン化アルキル、及びヒドラジドアシルクロライドからなる群から選択された、請求項３３に記載のペプチド。
【請求項３５】
キメラペプチドとして提供される、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記キメラペプチドが、オステオポンチン、象牙質マトリックスリンタンパク質、ホスビチン、ホスホホリン、ベータ−カゼイン、ストラテリン、マトリックスglaタンパク質、リボフラビン結合性タンパク質、及びアルファS1カゼインからなる群から選択された、タンパク質のカルシウム結合性配列を含む、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３７】
前記結合性配列が、S*S*、S*S*GS*EE、S*S*S*EE、S*S*S*S*S*S*、DS*S*DS*S*、S*LS*S*S*S*、DS*S*EE、DS*S*ES*、S*MS*S*S*EE、及び S*IS*S*S*EEからなる群、及びこれらの組合せから選択される、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記刺激を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞増殖、細胞内カルシウムチャンネリングアッセイ、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイから選択される、一以上の基準の分析により評価することができる、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドが、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項４０】
配列NGLPGPIGP*（配列番号：1）を有する、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４１】
配列PGPIG（配列番号：7）を有する、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４２】
配列GPIG（配列番号：11）を有する、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４３】
配列PGPIGP*（配列番号：15）を有する、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４４】
請求項３０に記載のペプチドの機能類似体。
【請求項４５】
請求項３０に記載のペプチドの模造類似体。
【請求項４６】
骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する組成物であって、該組成物は、（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式を有するペプチド、及び医薬として許容し得るキャリアを含み；該式中Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは、独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；式中Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；式中Ｚはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート−アラニンからなる群から選択される、前記組成物。
【請求項４７】
前記組成物が、さらに、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、フィブリン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、カルシトニン、エストロゲン、エストラジオール、プロスタグランジンＡ１、ビスホスホン酸、イプリフラボン、フッ化ナトリウム、ビタミンＫ、骨形態形成タンパク質、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子１及び２、エンドセリン、副甲状腺ホルモン、上皮増殖因子、白血病抑制因子、オステオゲニン、及びこれらの混合物からなる群から選択された薬剤を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ペプチドが、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；PIGP（配列番号：20）、及びこれらの混合物からなる群から選択された、請求項４５、又は４６に記載の組成物。
【請求項４９】
局所、及び／又は全身投与に用いる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
全身投与が、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻内投与、経肺投与、局所的投与、経皮投与、及びこれらの組合せから選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
局所投与が、注射、又は移植片の使用により提供される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記移植片のマトリックスに、被覆するか、充填するか、又は分散するかにより提供される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
顆粒状、又は粉末状のバイオマテリアル化合物とともに提供される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
生体適合性、及び／又は生分解性ポリマーとともに提供される、請求項４８、５２、又は５３に記載の組成物。
【請求項５５】
哺乳動物の骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する方法であって、”PG”、”GP”、”PI”、及び”IG”からなる群から選択されたアミノ酸モチーフを含み、かつ前記アミノ酸モチーフの上流域、及び／又は下流域に、10個までのアミノ酸を有するペプチドの有効量を、投与することを含み、ここで、前記モチーフの”P”は、プロリン、又はヒドロキシプロリンである、前記方法。
【請求項５６】
前記ペプチドは、長さが、少なくとも３アミノ酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドは、長さが、少なくとも４アミノ酸である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドが、（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式で表され；式中Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは、独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；式中Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；かつ式中Ｚはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート−アラニンからなる群から選択された、請求項５５、５６、又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチドが、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；PIGP（配列番号：20）、及びこれらの混合物からなる群から選択された、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
哺乳動物の骨成長を刺激する方法であって、配列番号：1、配列番号：4、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：15、及び配列番号：18からなる群、並びにこれらの機能類似体、及び模造類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項６１】
哺乳動物の軟骨成長を刺激する方法であって、配列番号：1、配列番号：4、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11からなる群、並びにこれらの機能類似体、及び模造類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項６２】
骨、及び／又は軟骨形成、及び付随する結合組織を刺激するペプチドのスクリーニング方法であって、前記方法は：
（ａ）骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第一生物学的試料と、試験ペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第二生物学的試料と、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、生物学的に有効な量のペプチドとを、別々に接触させ、それによってコントロールを提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）、及び工程（ｂ）から得られる骨、及び／又は軟骨形成の水準を評価する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で評価された骨、及び／又は軟骨形成の水準を比較し、
それによって、工程（ｂ）のコントロールと比較した場合、骨、及び／又は軟骨形成を刺激できるペプチドを、骨、及び／又は軟骨形成の水準を変える能力により同定する、前記方法。
【請求項６３】
骨、及び／又は軟骨形成、及び付随する結合組織を刺激するモジュレータのスクリーニング方法であって、前記方法は：
（ａ）骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第一生物学的試料と、試験化合物、及びNGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、生物学的に有効な量のペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）第二生物学的試料と、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、生物学的に有効な量のペプチドとを、別々に接触させ、それによってコントロールを提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）、及び工程（ｂ）から得られた骨、及び／又は軟骨形成の水準を評価する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で評価した骨、及び／又は軟骨の水準を比較し、
それによって、工程（ｂ）のコントロールと比較した場合、骨、及び／又は軟骨形成、及び付随する結合組織のモジュレータを、骨、及び／又は軟骨形成の水準を変えるその能力により同定する、前記方法。
【請求項６４】
工程（ｃ）を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞増殖、細胞内カルシウムチャンネリングアッセイ、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイから選択される、一以上の基準の分析により評価することができる、請求項６２、又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激するペプチドの同定方法であって、前記ペプチドが、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、一以上のペプチドに匹敵する活性を有するかどうか測定することを含み、ここで、前記活性を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞の増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞の増殖、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイからなる群から選択された、一以上の基準の分析により評価する、前記方法。
【請求項６６】
一以上の”GP”、及び／又は”PG”モチーフを含み、かつ合計約20個までのアミノ酸を含むペプチドであって、前記モチーフの”P”は、プロリン、又はヒドロキシプロリンであり、かつ骨、及び軟骨組織を、成長、維持、及び／又は修復するように、骨、及び軟骨細胞の活性を誘導する、前記ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、結合組織の成長、維持、及び修復に関するものである。さらに具体的には、本発明は、骨、軟骨、及び付随する結合組織を含む骨格組織の形成、及び修復に影響を与え得る新規ペプチドの同定に関するものである。さらに、本発明は、これらのペプチドの医薬組成物、並びにこのようなペプチドの治療的な、及び予防的な使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
本出願を通して、様々な文献をカッコ書きで引用し、本発明が関連する技術の状況を、さらに十分に記述している。これらの文献の明細書は、本明細書中で、引用により取り込んでいる。
骨の、及び／又は軟骨の形成、及び組織修復の刺激に使用するため、様々な薬剤が、同定され、かつ特徴づけされている。このような薬剤の例には、例えば、カルシウム製剤（例えば、炭酸カルシウム）、カルシトニン製剤、性ホルモン（例えば、エストロゲン、エストラジオール）、プロスタグランジンＡ１、ビスホスホン酸、イプリフラボン類、フッ素化合物（例えば、フッ化ナトリウム）、ビタミンＫ、骨形態形成タンパク質（BMPs）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF-β）、インシュリン様増殖因子１及び２（IGF-1、IGF-2）、副甲状腺ホルモン（PTH）、上皮増殖因子（EGF）、白血病抑制因子（LIF）、オステオゲニン、及びエストロゲン、カルシトニン、及びビホスホネートのような、骨吸収抑制体がある。
【０００３】
米国特許第5,169,837号、及び第5,403,825号は、骨形成因子、及び哺乳動物骨の粗抽出物からの抽出方法を開示している。該骨形成因子は、骨成長を誘発することが可能であり、ラットの骨成長アッセイを用いて測定された。米国特許第5,599,792号は、骨刺激活性、及び血管作用の減少を示す、副甲状腺ホルモン（PTH）変異体を開示している。
様々な特許が、骨形態形成タンパク質（BMPs）、及びそのようなタンパク質の単離方法を開示している。BMPsは、骨の、及び軟骨の欠損治療にとって有用である。米国特許第4,761,471号は、鉱質除去した骨組織からのBMP組成混合物を精製する方法を開示しており；米国特許第5,013,649号は、骨形態形成タンパク質−３（BMP-3）を開示しており；米国特許第5,106,748号は、骨形態形成タンパク質−５（BMP-5）を開示していおり；米国特許第6,187,076号は、骨形態形成タンパク質−６（BMP-6）を開示しており；米国特許第5,141,905号は、骨形態形成タンパク質−７（BMP-7）を開示しており；ＰＣＴ公開第WO 91／18098は、骨形態形成タンパク質−８（BMP-8）を開示しており；米国特許第6,287,816号は、骨形態形成タンパク質−９（BMP-9）を開示しており；かつＰＣＴ公開第WO 94／26893は、骨形態形成タンパク質−１０（BMP-10）を開示している。
【０００４】
米国特許第6,352,973号は、骨疾患の治療に使用する骨刺激因子ポリペプチドを開示している。米国特許第6,344,439号は、骨形成を促進する薬剤を開示していおり、該薬剤は、RGD結合配列を含む。米国特許第5,958,428号は、コラーゲンが細胞と結合することを促進する合成化合物を開示している。
上述の薬剤は、骨修復の態様において、一般的使用性を有するが、これらは、様々な欠点も有している。例えば、該薬剤のいくつかは、比較的、非特異的で、かつ従って骨組織修復促進において、非常に効果的というわけではない。抽出因子のような、ある種の薬剤は、免疫原性、感染、及び／又は疾病伝播の危険を伴う。また、組換え法を介した、組織、又は製剤の粗抽出物からの抽出は、高価であり、従って、商業的可能性を疑問視することになる。さらに、いくつかの薬剤は、第二の望ましくない全身的、又は局所的効果を有する。最も注目すべきは、公知の薬剤のいくつかが、異所的な骨形成を起こしうる事実である。そのような異常骨形成は、全く望ましくなく、かつ深刻な内科的合併症を生じさせ得る。
それゆえ、有効に、結合組織の成長、維持、修復に有効な影響を与える、インビトロ、インビボ、又はエキソビボでの使用において、特異性を有する新規ペプチドを提供する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、骨格生態に影響を及ぼす多くの新規ペプチド、及びその類似体を提供する。該ペプチドは、インビトロ、インビボ、エキソビボにおいて、及び組織工学の応用にとって、骨、軟骨、及び付随する結合組織の正常な形成を刺激するのに役立つ。これらの新規ペプチドの機能類似体は、開示したペプチド配列に、一以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含む。
一般的に、本明細書中で記述した新規ペプチドを、BCSP（“bone and cartilage stimulating peptides”（“骨、及び軟骨刺激ペプチド”））と呼ぶ。
また、本発明は、単離された結合組織促進性ペプチド、及びその類似体をコードする核酸、該核酸分子を含む発現ベクター、該核酸分子を含む宿主細胞、このようなペプチドの、及びそれをコードしている核酸の組成物、及びこれらのペプチドに対する抗体に関するものである。
【０００６】
該新規ペプチド、及びそれをコードしている核酸を、様々なキャリアを用いて投与される組成物において、及び骨、及び軟骨のような様々な結合組織の形成、及び機能を促進する方法に使用することができる。そのようなものとして、該ペプチド、及びその類似体を用いて、様々な骨格異常の治療を行うことができる。該骨格異常とは、制限はないが、外傷、及び／又は疾患による、骨、及び軟骨の欠陥を含む。
該ペプチド、及びその機能類似体を、様々なインビボ、インビトロ、又はエキソビボの応用、及び方法に使用することができる。さらにまた、該ペプチド、及びその機能類似体は、様々な組織工学の応用において用途を有する。
一つの実施態様において、本発明は、異常な骨の、及び／又は軟骨の形成、及び軟骨変性に伴う疾患、関節炎、及び変形性関節症から生じる、関連した異常な骨格成長に伴う障害を治療する治療用組成物、及び方法を提供する。また、該治療用組成物、及び方法を、骨格、又は軟骨損傷を誘発する外傷の治療に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、“PG”、“GP”、“PI”、及び“IG”からなる群から選択されたアミノ酸モチーフを含み、かつ前記アミノ酸モチーフの上流域、及び／又は下流域に、10個までのアミノ酸を有するペプチドであり、ここで、該モチーフの”P”は、プロリン、又はヒドロキシプロリンであり、該ペプチドは、骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する。
本発明の他の態様は、一以上の“GP”、及び／又は“PG”モチーフを含み、かつ合計約20個までのアミノ酸を含むペプチドであって、ここで、該モチーフの”P”は、プロリン、又はヒドロキシプロリンであり、かつ本発明のペプチドは、軟骨細胞、軟骨細胞前駆体、及びそこで系統を共有する細胞の活性を刺激する。それ自体で、これらのペプチドは、インビトロ、エキソビボ、及び／又はインビボで使用され、骨、及び軟骨形成の刺激に用途を有する。
本発明のペプチドは、長さにおいて、わずか３アミノ酸とすることができ、かつ、さらに好ましくは、長さにおいて、少なくとも４アミノ酸とすることができる。該ペプチドは、さらに、一以上のリンカー、カルシウム結合モチーフ、及び薬剤を含むことができ、かつ局所、又は全身投与で使用し得る。
【０００８】
本発明の他の態様によれば、（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式を有するペプチドを提供する。該式中Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは、独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；式中Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；かつ式中Ｚはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニンからなる群から選択される。
【０００９】
結果的に、本発明の一態様において、次のアミノ酸配列を有し、かつ次のように命名されているペプチドを提供する。すなわち、アミノ酸配列NGLPGPIGP*（配列番号：1）を有するBCSP1；アミノ酸配列NGLPGPIG（配列番号：2）を有するBCSP2；アミノ酸配列NGLP*GPIG（配列番号：3）を有するBCSP3；アミノ酸配列NGLP*GPIGP*（配列番号：4）を有するBCSP4；アミノ酸配列NGLPGP（配列番号：5）を有するBCSP5；アミノ酸配列LPGP（配列番号：6）を有するBCSP6；アミノ酸配列PGPIG（配列番号：7）を有するBCSP7；アミノ酸配列NGLPGPIGP（配列番号：8）を有するBCSP8；アミノ酸配列PGPIGP （配列番号：9）を有するBCSP9；アミノ酸配列PGPIGPPGPR（配列番号：10）を有するBCSP10；アミノ酸配列GPIG（配列番号：11）を有するBCSP11；アミノ酸配列PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）を有するBCSP12；アミノ酸配列GPRGRTGDA（配列番号：13）を有するBCSP13；アミノ酸配列PGPIGPP（配列番号：14）を有するBCSP14；アミノ酸配列PGPIGP*（配列番号：15）を有するBCSP15；アミノ酸配列PGPI（配列番号：16）を有するBCSP16；アミノ酸配列GLPGPIG（配列番号：17）を有するBCSP17；アミノ酸配列GPIGP*（配列番号：18）を有するBCSP18；アミノ酸配列GPIGP（配列番号：19）を有するBCSP19；及びアミノ酸配列PIGP（配列番号：20）である。ここで使用したP*は、ヒドロキシプロリンを特定するために使用した。これらのペプチドの各々を用いて、インビトロ、インビボ、及びエキソビボにおける結合組織促進応答を誘発することができる。
【００１０】
他の態様において、本発明は、インビトロ、インビボ、及びエキソビボで結合組織促進応答を誘発する、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20の機能類似体を提供する。
他の局面において、本発明は、インビトロ、インビボ、及びエキソビボで結合組織促進応答を誘発する、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20の模造類似体を提供する。
さらに、本発明の態様において、哺乳動物（例えば、人）の結合組織応答を刺激する組成物を提供し、前記組成物は、医薬として許容し得る希釈剤、又はキャリアとともに、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、並びにその機能類似体、及び／又はその機能模造体から選択された、一以上の有効量のペプチドを含む。このような組成物を、付加アジュバント、共刺激分子、及び／又は安定剤を含むように作ってもよい。
【００１１】
本発明の他の実施態様に従い、骨、軟骨、及び関連する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する組成物であって、該組成物は、（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式を有するペプチド、及び医薬として許容し得るキャリアを含む。該式中Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは、独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；式中Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；式中Ｚはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニンからなる群から選択される。
【００１２】
本発明の他の態様に従い、哺乳動物の骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する方法であって、該方法は、”PG”、”GP”、”PI”、及び”IG”からなる群から選択されたアミノ酸モチーフを含み、かつ前記アミノ酸モチーフの上流域、及び／又は下流域に、10個までのアミノ酸を有するペプチドの有効量を投与することを含み、ここで、該モチーフの”P”は、プロリン、又はヒドロキシプロリンである。
さらに、本発明の実施態様は、哺乳動物の結合組織形成を促進する治療方法であって、該方法は、（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式を有するペプチド、機能類似体、又は（Ｉ）、（II）、及び／又は（III）の類似体を、哺乳動物に投与することを含み；該式中Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは、独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；該式中Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；かつ該式中Ｚはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニンからなる群から選択される。
【００１３】
さらに、本発明の実施態様は、患者の結合組織形成を促進する治療方法であって、前記方法は、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、並びにその機能類似体から選択された、一以上のペプチドを、前記患者に投与することを含む。
さらに、実施態様に従い、本発明は、患者の損傷を受けた骨、軟骨、及び関連する組織を治療する方法を提供し、該方法は、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びその機能類似体、及び／又はその模造類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドを、該患者に投与することを含み、ここで、該ペプチドは、結合組織を刺激し、修復、及び形成する。
【００１４】
さらに、実施態様に従い、本発明は、患者における、整形外科による骨の組み込み、又は歯の移植を向上させる方法を提供し、該方法は、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びその機能類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドを該患者に投与することを含む。
さらに、本発明の実施態様によれば、インビトロで、軟骨欠陥部位に軟骨を産生する方法を提供し、該方法は、該欠陥部位に、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びその機能類似体から選択された、一以上のペプチドの存在下、インビトロで培養した軟骨形成細胞の集団を移植することを含む。
【００１５】
本発明は、インビボで、軟骨欠陥部位の軟骨修復を促進する方法を含み、ここで、新規軟骨は、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びその機能類似体から選択された、一以上のペプチドの存在下、組織工学的手法により調製され、該欠陥部位に移植される。
本発明の他の実施態様によれば、軟骨変性により特徴付けされる、変形性関節症を治療する方法を提供し、該方法は：BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びその機能類似体から選択された、一以上の治療的有効量のペプチドを、疾患部位に運搬することを含む。
【００１６】
さらに、実施態様に従い、本発明は、哺乳動物の骨関連疾患を治療する方法を提供し、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、前軟骨細胞、骨、骨髄、又は血液から誘導された骨格始原細胞、及びこれらの混合物からなる群から選択された、哺乳動物細胞に投与することを含み、これらの細胞は、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びこれらの機能類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドで処理されたものである。
【００１７】
本発明の方法は、本発明の選択されたペプチド、又は機能類似体を、全身、及び／又は局所投与することを伴っていてもよい。
本発明の他の態様によれば、脊椎動物の骨部位に移植する、形態形成装置が提供され、該装置は：移植可能な生体適合性キャリア；及び前記キャリアの中に、又は上に、提供されるか、又は分散された、BCSP1、BCSP2、BCSP3、BCSP4、BCSP5、BCSP6、BCSP7、BCSP8、BCSP9、BCSP10、BCSP11、BCSP12、BCSP13、BCSP14、BCSP15、BCSP16、BCSP17、BCSP18、BCSP19、及びBCSP20からなる群、及びその機能類似体から選択された、一以上のペプチドを含む。
本発明の他の態様により、哺乳動物の骨成育を刺激する方法であって、前記方法は、配列番号：1、配列番号：4、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：15、及び配列番号：18からなる群、並びにその機能類似体、及びその模造類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドを投与することを含む。
【００１８】
さらに、本発明の他の態様により、哺乳動物の軟骨成育を刺激する方法であって、前記方法は、配列番号：1、配列番号：4、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11からなる群、並びにその機能類似体、及びその模造類似体から選択された、一以上の有効量のペプチドを投与することを含む。
さらに、本発明の他の態様によれば、骨の、及び／又は軟骨の形成、及び付随する結合組織を刺激するペプチドのスクリーニング方法であって、前記方法は下記工程を含む：
（ａ）骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第一生物学的試料と、試験ペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第二生物学的試料と、NGLPGPIGP* （配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、生物学的有効量のペプチドとを、別々に接触させ、それによってコントロールを提供する工程；
【００１９】
（ｃ）工程（ａ）、及び工程（ｂ）で得られる骨、及び／又は軟骨形成の水準を評価する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で評価した骨、及び／又は軟骨形成の水準を比較し、
それによって、工程（ｂ）のコントロールと比較した場合、骨、及び／又は軟骨形成を刺激することができるペプチドを、骨、及び／又は軟骨形成の水準を変えるその能力により同定する。
さらに、本発明の他の態様によれば、骨、及び／又は軟骨形成、及び付随する結合組織を刺激するモジュレータをスクリーニングする方法であって、前記方法は下記工程を含む：
（ａ）骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第一生物学的試料と、試験化合物、及びNGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、生物学的有効量のペプチドとを接触させる工程；
【００２０】
（ｂ）第二生物学的試料と、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、生物学的有効量のペプチドとを、別々に接触させ、それによってコントロールを提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）、及び工程（ｂ）で得られる骨、及び／又は軟骨形成の水準を評価する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で評価した骨、及び／又は軟骨形成の水準を比較し、
それによって、工程（ｂ）のコントロールと比較した場合、骨、及び／又は軟骨形成のモジュレータを、骨、及び／又は軟骨形成の水準を変えるその能力により同定する工程である。
【００２１】
さらに、本発明の他の態様によれば、骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激するペプチドの同定方法であって、前記方法は：
前記ペプチドが、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）；及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択された、一以上のペプチドに匹敵する活性を有するかどうか測定することを含み、ここで、該活性を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞増殖、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイからなる群から選択された、一以上の基準の分析により評価する。
【００２２】
本発明の他の特徴、及び利点は、次の詳細な説明で明らかになるであろう。しかし、本発明の思想、及び範囲内である様々な変形、及び修飾は、詳細な説明から、当業者にとって明らかになるものであるから、本発明の実施態様を示しているが、詳細な説明、及び具体的実施例は、本発明の詳細な説明を提供するだけであると理解されるべきである。
本発明は、図を参考に用いて、下記記述から、さらに理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、インビトロ、及び哺乳動物におけるインビボ、両方において、及びエキソビボの組織工学において、結合組織の成長、維持、及び修復に影響を与える、多くの新規ペプチド、及びその機能類似体を提供する。このようなペプチドは、結合組織の修復、及び再生において、多くの用途がある。
本明細書中で使用する用語“結合組織”は、骨、軟骨、及びそのような系統共有細胞により形成される、関連結合組織を含む。そのような細胞は、例えば、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、前軟骨細胞、骨、骨髄、又は血液から誘導される骨格始原細胞を含み得る。それ自体で、該ペプチドは、骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復に有用である。
本明細書中で使用する“骨”は、当業者にとって、多くの脊椎動物の骨格の主要部分を形成する、稠密な、半硬質な、多孔質の、石灰化した結合組織として、定義される。それは、稠密な有機マトリックス化、無機ミネラル成分、及びそこに含まれる細胞から成る。
【００２４】
本明細書中で使用する“軟骨”は、当業者にとって、体の種々の部分（例えば、関節、外耳、及び喉頭）に見られる、強い、弾力性のある、繊維質の結合組織である。軟骨は、骨のように石灰化しされていないが、骨形成骨芽細胞の系統を共有する軟骨細胞により産生される。
本明細書中で使用する“関連する結合組織”は、骨髄、及びそこに含まれている細胞、腱、及び靭帯のような骨、及び軟骨に関連する組織と定義される。
一つの実施態様において、本発明のペプチドは、“骨刺激応答”を提供し、該応答は、軟骨内の骨形成を増進させ、骨のミネラル化を増進させ、骨密度を増加させ、骨無機質含量を増加させ、かつ骨修復を増進させる。通常、これは、制限するものでないが、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、及び前軟骨細胞を含む骨形成細胞のプラス効果に関連しており、新しい骨組織の基礎であるミネラル化マトリックスの増加した量の産生、及び分泌を誘導する。該応答は、該ペプチドの局所運搬が、異所性化骨を導かないように、特異的である。
【００２５】
本明細書中で使用する句“BCSP”は、新規“骨、及び軟骨刺激ぺプチド”（“bone and cartilage stimulating peptides”）を意味する。本発明のBCSPペプチドは、可変長であってもよく、最低３つ隣接するアミノ酸、及びさらに好ましくは、少なくとも４つ隣接するアミノ酸であると、当業者は評価するであろう。本発明の特定の実施態様において、本発明のBCSPペプチドは、最低３個のアミノ酸から、10、又は20、又はそれ以上のアミノ酸を含む。本明細書中に記述する該ペプチド配列は、当業者にとって明らかである、アミノ酸の標準的な一文字表記を利用する（Short Protocols In Molecular Biology, Second Edition, John WILEY & Sons, 1992）。
本発明のBCSPペプチドは、”PG”、”GP”、”PI”、及び”IG”からなる群から選択されたアミノ酸モチーフを含み、かつ該アミノ酸モチーフの上流域、及び／又は下流域に、10個までのアミノ酸を有するペプチドである。該ペプチドは、骨、軟骨、及び付随する結合組織の成長、維持、及び修復を刺激する。該モチーフの”P”は、プロリン、及びヒドロキシプロリンから選択することができる。
【００２６】
他の実施態様において、本発明のBCSPペプチドは、一以上の”GP”、及び／又は”PG”モチーフを含み、かつ合計約20個までのアミノ酸を含み、ここで、該ペプチドは、骨、及び軟骨組織を、成長、維持、及び／又は修復するように、骨、及び軟骨細胞の活性を誘発する。該モチーフの”P”は、プロリン、及びヒドロキシプロリンから選択することができる。
通常、本発明のペプチドは、該選択したモチーフの上流域、及び／又は下流域、どちらかに、次のアミノ酸の組合せを伴う：ロイシン、グリシン、アスパラギン、イソロイシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アルギニン、トレオニン、アスパルテート（アスパラギン酸塩またはエステル）、及びアデニンである。このような、該選択したモチーフとともに用いるのに適切なアミノ酸配列は、制限はないが：プロリン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、ロイシン−プロリン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン、プロリン−アルギニン、グリシン−ロイシン、グリシン−ロイシン−プロリン、グリシン−ロイシン−プロリン−グリシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン−プロリン、プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニン、プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）、プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン、プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン、プロリン−グリシン−プロリン、アスパラギン−グリシン−ロイシン−プロリン−グリシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン−プロリン−グリシン−プロリン、アスパラギン−グリシン−ロイシン−プロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン、プロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン、プロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリン、プロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、及びこれらの組合せを含むことができる。
【００２７】
本発明のペプチドは、（Ｉ）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ、（II）（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚ、及び（III）Ｘ−（Ｐ１）ｍＧｌｙ（Ｐ２）ｎ−Ｚからなる群から選択された式で表すことができ；式中、Ｐ１、及びＰ２は、プロリン、及びヒドロキシプロリンからなる群から選択され、ここでｍ、及びｎは、独立して選択され、ｍ＝０、又は１、ｎ＝０、又は１であり；Ｘは、ロイシン、グリシン−ロイシン、プロリン−イソロイシン、グリシン−プロリン−イソロイシン、アスパラギン−グリシン−ロイシン、及びプロリン−グリシン−プロリン−イソロイシン−グリシン−プロリンからなる群から選択され；かつＺはイソロイシン、アルギニン、イソロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−ヒドロキシプロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン、イソロイシン−グリシン−プロリン−プロリン−グリシン−プロリン−アルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニン、及びアルギニン−グリシン−アルギニン−トレオニン−グリシン−アスパルテート（アスパラギン酸塩又はエステル）−アラニンからなる群から選択される。本発明の特定の実施態様において、該ペプチドは、NGLPGPIGP*（配列番号：1）；NGLPGPIG（配列番号：2）；NGLP*GPIG（配列番号：3）；NGLP*GPIGP*（配列番号：4）；NGLPGP（配列番号：5）；LPGP（配列番号：6）；PGPIG（配列番号：7）；NGLPGPIGP（配列番号：8）；PGPIGP（配列番号：9）；PGPIGPPGPR（配列番号：10）；GPIG（配列番号：11）；PGPIGPPGPRGRTGDA（配列番号：12）；GPRGRTGDA（配列番号：13）；PGPIGPP（配列番号：14）；PGPIGP*（配列番号：15）；PGPI（配列番号：16）；GLPGPIG（配列番号：17）；GPIGP*（配列番号：18）；GPIGP（配列番号：19）、及びPIGP（配列番号：20）からなる群から選択される。
【００２８】
また、本発明は、前記、及びここに記述した該ペプチドの機能的に同等な変異体に関するものである。“機能的に同等な変異体”、又は“機能類似体”とは、部分的配列相同性を有するペプチド、一以上の特異的な保存的、及び／又は非保存的なアミノ酸の変化を有するペプチド、ペプチド接合体、キメラタンパク質、融合タンパク質、及びペプチドコード化核酸を含む。該機能的に同等な変異体は、未変異タンパク質の生物活性を維持している。該生物活性（すなわち、骨、又は軟骨細胞の刺激）を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞増殖、細胞内カルシウムチャンネリングアッセイ、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイから選択される、一以上の基準の分析により評価することができる。これらの方法は、周知のものであり、かつ従って、当業者の知識の範囲内にある（例えば、米国特許第6,333,312号、第5,972,623号、第5,965,136号、第6,030,792号、及び第6,060,255号。）。
【００２９】
“機能類似体”の用語において、該概念は当業者により十分に理解されているように、生物学的機能性ペプチド類似体の定義において固有であり、該分子の規定した部分中で生じ、かつさらに同様な生物活性を許容し得る水準で伴う分子を与えることができる変化の数に制限があることである。この場合、結合組織形成の変化を誘導する能力を有するであろう。異なる置換基を有する、複数の異なるペプチド／タンパク質の多くを、容易に作ることができ、かつ本発明に従って使用することができる。また、特定の残基は、レセプター認識部位の残基のように、タンパク質、又はペプチドの生物学的特性、又は構造特性にとって、特に重要であり、そのような残基は、通常変化させない。
【００３０】
機能類似体を、保存的な、又は非保存的なアミノ酸の置換により、生成することができる。通常、アミノ酸の置換は、例えば、これらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどのような、該アミノ酸側鎖の置換の相対的な類似性を基礎とする。従って、本発明の範囲内において、保存的なアミノ酸変化は、本来あるような、同種類の特定部位でのアミノ酸変化を意味する；すなわち、疎水性アミノ酸を、疎水性アミノ酸に交換する、塩基性アミノ酸を、塩基性アミノ酸に交換するなどである。保存的な置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンの代わりのような、一極性（疎水性）残基の置換、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間のような、代わりの一極性（親水性）残基の置換、リジン、アルギニン、又はヒスチジンの代わりのような、一塩基性残基の置換、又はアスパラギン酸、又はグルタミン酸の代わりのような、酸性残基の置換、イソロイシン、ロイシン、又はバリンの代わりのような、分岐鎖アミノ酸の置換、フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンの代わりのような、一芳香族性アミノ酸の置換がある。このようなアミノ酸変化により、該ペプチドの全体の電荷、及び／又は立体配置を大きく変えることのない、機能類似体を得る。このような保存的な変化の例は、当業者にとって、周知のものであり、かつ本発明の範囲内である。また、保存的な置換は、提供した非誘導化残基の代わりに、化学的に誘導体化した残基の使用も含み、得られるペプチドは、本明細書中で記述したペプチド、及び配列番号：1から配列番号：20のいずれか一つのペプチドと生物学的機能が同等である。
【００３１】
本発明のペプチドを、他のタンパク質の配列を含むキメラタンパク質として提供することができる。一態様において、本発明のペプチドに、他のタンパク質の変性カルシウム結合性ドメインを与えることを所望してもよい。本発明のキメラペプチドは、オステオポンチン、象牙質マトリックスリンタンパク質（dentine matrix phosphoprotein）、ホスビチン、ホスホホリン、ベータ−カゼイン、ストラセリン、マトリックスglaタンパク質（matrix gla protein）、リボフラビン結合性タンパク質、及びアルファS1カゼインからなる群から選択されたタンパク質のカルシウム結合性配列を含み得る。一つの実施態様において、該カルシウム結合性配列を、S*S*、S*S*GS*EE、S*S*S*EE、S*S*S*S*S*S*、DS*S*DS*S*、S*LS*S*S*S*、DS*S*EE、DS*S*ES*、S*MS*S*S*EE、及びS*IS*S*S*EEからなる群、及びこれらの組合せから選択してもよく、ここで、S*は、リン酸化セリンのアミノ酸残基を示している。従って、このようなキメラペプチドの機能類似体、及び模造体も、本発明の範囲内である。
【００３２】
また、本発明のペプチドに結合する一以上のリンカー分子を有することも、本発明の範囲内である。態様において、該リンカー分子を、選択したペプチドのどちらか、又は両側（すなわち、末端部分）に結合させることができる。このようなリンカー分子を、カルボジイミド、アルデヒド、マレイミド、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、及びNHSエステル、修飾システイン、リン酸化アミノ酸、アミノ酸、二酢酸、塩化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシ、ビスホスホネート、ピロホスフェート（ピロリン酸塩又はエステル）、ホスフェート（リン酸塩又はエステル）、ジスルフィド、フェニルアジド、ハロゲン化アルキル、及びヒドラジドアシルクロライドからなる群から選択してもよい。
【００３３】
また、本発明は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、及び配列番号：20のペプチドを誘導体化したペプチドを含むが、一以上の部分で、非保存的なアミノ酸変化、単に、このようなペプチドが、インビトロ、インビボ、及び／又はエキソビボにおける応答を生じることができるような範囲を含む。
本発明のペプチドを、自動化機器を用いて、化学合成により、又は代わりに、当業者に周知である組換えDNA技術を用いて、該ペプチドの直接合成が可能である核酸配列からの発現により、得ることができる。本発明のペプチドを、固相合成（マリーフィールド（Merrifield）の論文、J. Am. Chem. Assoc. 85：2149-2154（1964））、又は均一溶液中での合成（ホーベンウェイル（Houbenweyl）の論文、Methods of Organic Chemistry（1987）,（Ed. E. Wansch）Vol.15, pts. I and 11, Thieme, Stuttgart））のようなタンパク質の化学において周知である技術を用いて、化学合成により調製してもよい。組換え体の発現によるタンパク質生成技術は、当業者にとって、周知であり、かつ例えばサムブルーク（Sambrook）らの著書（1989）、又はその最新版に記述されている。
【００３４】
また、本発明は、本発明のペプチドの非ペプチド類似体を意図することができる（例えば、安定な構造、又は小さい生分解性を有するような、ペプチド模造体。）。ペプチド模造類似体を、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、又は配列番号：20から選択された配列を有する、選択したBCSPペプチドを基礎として、一以上の残基を非ペプチド部分に置換することにより、調製することができる。好ましくは、該非ペプチド部分は、該ペプチドが、その自然構造を保持し、又は好ましくは、例えば生理活性の確認を安定化するようにする。このようなペプチドを、構造、及び／又は活性において、置換基効果を評価するように、分子、又は細胞ベースの結合実験で、試験することができる。本発明のペプチドからの非ペプチド模造類似体の調製を、例えば、ナッハマン（Nachman）らの論文、Regul. Pept. 57：359-370（1995）を参照して行うことができる。
【００３５】
また、本発明は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、又は配列番号：20、並びにこれらの変異体から選択された、一以上のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。
また、本発明に包含される核酸配列は、配列コード化、及びその同等な配列の変異体に対し、相補的、及び抗相補的である。当業者は、このような相補的な、又は抗相補的な核酸配列を、容易に決定することができるであろう。また、本発明の一部分として、核酸配列は、厳しい条件下で、上述の核酸分子の一つにハイブリダイズする。ここで用いた“厳しい条件”は、公知技術のパラメーターを参照し、かつ、このようなパラメーターは、例えばMolecular Cloningの最新版：A Laboratory Manual、ジェー・サムブルーク（J. Sambrook）ら、eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, or Current Protocols in Molecular Biology、エフ・ダブリュー・オーベル（F. M. Ausubel）ら、eds.,（ジョンウィリーアンドサンズ社（John WILEY & Sons INC.）, New Yorkで論じられている。当業者は、本発明のBCSPペプチドをコードしている核酸の相同性を同定することができる。細胞、及びライブラリーを、そのような分子の発現、次いで普通の単離のため、スクリーニングし、次いで適切な核酸分子を単離し、そして配列決定する。
【００３６】
また、本明細書中に記述した核酸分子は、縮重した核酸を含むことを記述する。遺伝コードの縮重のため、該DNA配列の変異体は、同一のペプチドを翻訳するであろう。従って、本発明のペプチド、又はその機能類似体の直接生成を可能にする配列となるような、多くのヌクレオチドの選択を行うことができることは明らかである。結果として、縮重したヌクレオチドの置換は、本発明の範囲内である。
当業者とって明らかであるように、本発明の核酸分子は、一本鎖、又は二本鎖の形態、プラスミド、ウイルス核酸、プラスミドバクテリアDNA、裸／遊離DNA、及びRNAを含んでもよい。本発明の少なくとも一のペプチドをコードしている核酸配列を含むウイルス核酸を、ウイルスベクターと呼んでもよい。
【００３７】
また、本発明は、発現ベクター中に、配列番号：1〜20、及びその機能類似体のペプチドを一以上コードしている、本発明の核酸配列を構成している発現ベクターを含む。原核生物の、又は真核生物の宿主細胞中に、本発明のペプチド、及びその機能類似体をコードしている核酸配列を保有し、かつ発現することができる発現ベクターを使用することができ、ポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、及びレンチウイルスのような、組換えウイルスが含まれる。
また、本発明は、このようなベクターを、形質転換した、形質移入した、又は感染させた宿主細胞を含み、本発明のペプチド、又は機能類似体を発現する。そういうものとして、宿主細胞は、本発明の核酸を、導入し、かつ／又は形質移入することができる、すべての可能な細胞が含まれる。
【００３８】
組成物
本発明の一以上のペプチドは、インビトロ、インビボ、又はエキソビボにおいて、直接、結合組織形成に影響を与え、かつ特に、組織修復、及び組織工学に影響を及ぼす骨形成促進活性、又は軟骨形成促進活性を有し得る証拠があるので、直ぐに、医薬組成物を開発し、かつ骨格外傷、骨格成長異常（非代謝性骨疾患、及び代謝性骨疾患）、関節炎、及び変形性関節症の治療に使用することができる。
骨外傷、又は骨成長異常に対する本発明のペプチドの代表的な用途には、例えば、皮下、開放、及び非結合骨折、骨／脊髄変形、骨肉腫、骨髄腫、骨異形成症、及び脊柱側弯症の発生；皮下、及び開放骨折整復に関する予防的使用；整形外科における、骨治癒の促進；非接合人工関節、及び人工歯根の骨内殖の刺激；閉経前の女性の最大骨質量の上昇；歯周病、及び欠損の治療、及び他の歯修復処置；骨延長の間の骨形成の増大；及び年齢関連性の骨粗鬆症、閉経後の骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発骨粗鬆症、又は廃用性骨粗鬆症のような他の骨障害、及び関節炎、骨軟化症、線維性骨炎、腎の骨ジストロフィー、及び骨ページェット病の治療のような骨欠損、及び欠損の修復、又は骨形成の刺激から利益を得るすべての状態を含む。
【００３９】
また、本発明のペプチドを、新しい軟骨形成の刺激において、治療的応用に使用することができる。軟骨外傷、又は軟骨異常に対する、本発明のペプチドの代表的な用途には、被裂軟骨のような、軟骨のスポーツ損傷；軟骨損傷、及び骨軟骨性欠陥のような、軟骨欠陥；及び骨関節炎のような、変性軟骨疾患がある。
当業者は、本明細書中で記述した該ペプチド組成物を使用し、上述の外傷、及び疾患を治療し、かつ緩和し、かつ制限はないが、骨細胞（すなわち、骨芽細胞、前骨芽細胞、及びそこで系統を共有している細胞）、軟骨細胞（すなわち、軟骨細胞、前軟骨細胞、及びそこで系統を共有している細胞）、及び骨、骨髄、又は血液から誘導される骨格始原細胞を含む様々な細胞種において、プラスの生理学的効果に関する妥当な成功可能性を有することができるであろう。さらに、骨形態形成因子、再吸収抑制薬剤、骨形成因子、軟骨形成因子、成長ホルモン、及び分化因子のような、あらゆる薬剤を、結合組織の成長、維持、及び修復の促進を手助けするために、本発明のペプチド組成物とともに使用することができる。
【００４０】
本発明の組成物を、結合組織の先天的な、外傷誘発的な、又は外科的な切除（例えば、癌治療により）の修復、及び美容整形に役立たせることができる。このような組織欠損、又は欠陥を、脊椎動物の対象に、構造的、及び機能的特性を示す本発明のペプチドを投与することにより、治療することができる。
本発明のペプチドを、脊椎動物に移植する軟骨、及び／又は骨組織のエキソビボ組織工学技術を含む、骨格再構築に使用してもよい。細胞、及び／又は発生組織を、組織工学プロセスの間に、選択したペプチド、又はその機能類似体を用い、インビトロで処理することができ、細胞増殖、細胞分化、及び／又は組織構築形成の何工程か、又はすべての工程を促進する。該組織工学プロセスの細胞源は、自己の、同種間の、又は異種間のものであってよい。該エキソビボプロセスを、細胞増殖、細胞分化、又は組織構築形成後に終了し、かつこのようにして生じた、該細胞、及び／又は組織を、該患者に導入することができる。組織工学技術の使用により、新しい組織の形成が可能になり、自己移植、同種移植、又は異種移植組織を得る必要が減るか、又はなくなる。これらの組織源の各々は、付添い人の合併症を有するので、このような実施は、非常に所望されている。一般に、自己移植手順は、結果として供与部の罹病を生じ、一方、同種移植の使用は、感染の危険があり、かつ異種移植は、免疫学的合併症を誘発する可能性がある。本発明の組成物を、全身的、又は局所的に投与してもよい。全身的な使用において、本明細書中の化合物を、従来の方法に従い、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、経腸、非経口、鼻内、経肺、局所的、又は経皮の投与から選択される、投与法で処方することができる。例えば、該組成物を、関節内注射、又は移植片の使用による、局所投与用に調製してもよい。
【００４１】
経口投与において、該組成物を、液状形態で得た場合、経口製剤を得るように、液状製剤の形態にしてもよく、又はソフトカプセル等に満たしてもよい。本発明の組成物が、固体分散体である場合、経口製剤を得るように、カプセルに充填するか、又はペレット状、細顆粒状、顆粒状、錠剤に形成することができる。固体分散体として、該組成物を、当業者とって明らかである、欠くことのできない付加的な添加物の存在下、球状、棒状、針状、ペレット状、及びフィルム状のような固体形態に、形成することができる。
静脈内投与を、一連の注射により、又は長期間にわたる連続的な注入により、行うことができる。不連続な間隔の、注射による投与、又は他経路による投与を、毎週一回から、一日三回の間隔の範囲で行うことができる。あるいは、本明細書中に開示したペプチドを、周期的な方法で（開示したペプチドの投与；続いて、未投与；続いて、開示したペプチドの投与などのように）投与してもよい。所望の成果が達成されるまで、治療を続けることができる。
【００４２】
該ペプチド組成物を、本発明に従い、治療に有効な量を投与する。治療上の濃度を、組織形成、又は局所組織修復の所望される水準；又はある状況の、又はこのような状況の拡大速度の低下をもたらす濃度にするであろう。有用な治療上、又は予防上の濃度は、状態により変えられるであろうし、かつ特定の事例において、重症な状態の治療、及び治療患者の感受性により、変えてもよい。従って、単一濃度が、均等に有用でなくともよいが、治療される慢性、又は急性状態の特殊性に依存する変更を要するであろう。このような濃度は、当業者にとって公知の日常の実験法を通して、到達し得る。
通常、医薬配合物は、生理食塩水、緩衝食塩水、５％デキストロース水、エタノール、微量金属等を含む硼酸塩緩衝食塩水等、及びこれらの混合物のような、医薬として許容し得るビヒクルを組み合わせた、本発明のペプチドを含むであろう。配合物は、さらに、一以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を防ぐアルブミン、潤滑剤、充填剤、及び安定剤等を含むことができる。配合方法は、技術的に周知であり、かつ例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton Pa., 1990（本明細書中に、引用により取り込んでいる。）に開示されている。
【００４３】
本発明の組成物を、他の骨疾患治療用薬剤と同時に使用することができる。同時に使用する薬剤の例には、例えば、カルシウム製剤（例えば、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム）、カルシトニン製剤、性ホルモン（例えば、エストロゲン、エストラジオール）、プロスタグランジンＡ１、ビスホスホン酸、イプリフラボン類、フッ素化合物（例えば、フッ化ナトリウム）、ビタミンＫ、フィブリン、プロテオグリカン、骨形態形成タンパク質（BMPs）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF-β）、インシュリン様増殖因子１及び２（IGF-1、-2）、エンドセリン、副甲状腺ホルモン（PTH）、上皮増殖因子（EGF）、白血病抑制因子（LIF）、オステオゲニン、及びエストロゲン、カルシトニン、及びビスホスホネートのような骨吸収抑制体がある。また、このような薬剤の混合物を、本発明の組成物に配合し、かつ使用するか、又は本発明の組成物とともに使用することができると考えられる。
【００４４】
本発明で使用する医薬組成物を、無菌、非発熱性溶液、又は懸濁液、被覆カプセル、クリーム、ローション、乾燥パウダーの形態、又は技術的に公知である他の形態にすることができる。本発明のペプチドを、局所投与のため、又は所望のキャリアに適用するため、ヒドロゲル中に配合してもよい。局所投与を、損傷の、又は欠陥の部位に注射、又は該部位に、固体キャリアの挿入、又は付着により行うことができる。局所投与にとって、運搬ビヒクルは、マトリックス、又は骨、又は軟骨の内殖用足場を提供することができ、かつ逆効果にならないように、対象に吸収させることができるビヒクルとすることができる。
【００４５】
一つの好ましい実施態様において、本発明のペプチドを、合成バイオマテリアル化合物（Skelite（登録商標）、米国特許第6,323,146号に記述されており、かつ本命臍書中に、引用により取り込んでいる。）とともに使用してもよい。この単離した生体吸収性バイオマテリアル化合物は、カルシウム、酸素、及びリンを含み、ここで、前記成分の少なくとも一部は、約0.1〜0.6オングストロームのイオン半径を有する成分で置換される。この実施態様において、該合成バイオマテリアル化合物を、所望の三次元移植片に形作ることができ、かつ該ペプチド組成物は、その上の被膜として、又はその中に分散されたマトリックスとして提供される。あるいは、該ペプチド組成物を、局所投与用に、Skelite（登録商標）の顆粒状、又は粉末状形態で、均質に配合してもよい。
【００４６】
様々なポリマーを、所望のインビボ部位に、本発明のペプチド組成物を運搬する目的のため、移植片形成に使用することができる。適切なポリマーには、制限はないが、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリレート類（ポリアクリル酸塩又はエステル）、ポリオルトエステル類、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（polyhema）、及びポリ酸無水物類（polyanhydrides）がある。特定のポリマーを、生分解性、及び生体適合性の両方の特性に基づき選択することができる。ラクチド、グリコリド、及び−カプロラクトンモノマーから誘導される脂肪族ポリエステルは、非常に幅広い範囲の分解性を有するので特に好ましい。本発明のペプチド組成物を、コラーゲン、フィブリン、デンプン、アルギネート（アルギン酸塩又はエステル）、及びヒアルロン酸とともに使用することができる。
【００４７】
上述したポリマー、及びキャリアに加えて、該ペプチド組成物を組込んだ生分解性フィルム、及びマトリックスは、上で論じた、他の活性、又は不活性成分、及びこれらの混合物を含んでいてもよい。増殖因子のような、組織増殖、又は浸透を促進する薬剤は、特に興味深い。この目的の典型的な増殖因子には、上皮増殖因子（EGF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGFs）、副甲状腺ホルモン（PTH）、白血病抑制因子（LIF）、及びインシュリン様増殖因子（IGFs）等がある。また、例えば、骨形態形成タンパク質（米国特許第4,761,471）、オステオゲニン（サンパス（Sampath）らの論文、Proc. Natl. Acad Sci USA （1987） 84： 7109-13）、及びNaF（テンサー（Tencer）らの論文、J. Biomed. Mat. Res. （1989） 23： 571-89）のような、骨成長を促進する薬剤も好ましい。生分解性フィルム、又はマトリックスは、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ酸無水物類、骨、又は皮膚コラーゲン、純粋なタンパク質、細胞外マトリックス成分等、及びこれらの組合せを含む。このような生分解性物質を、所望の生物学的、機械的、表面的、又はマトリックス界面特性を提供するように、非生分解性物質（例えば、ポリマー移植片、チタン移植片）とともに使用してもよい。
【００４８】
一つの態様において、本明細書中に記述した、所望部位への該ペプチド運搬を、WIPO公開第WO 93／20859号（本明細書中で、その全体を引用により取り込んでいる。）に記述されているような、徐放性組成物の使用により、向上させることができる。この種のフィルムは、再吸収性、及び非再吸収性の人工器官、及び外科的移植片の両方の被覆にとって特に有用である。該フィルムは、例えば、外科的なスクリュー、ロッド、ピン、及びプレート等の外部表面周りを包むことができる。通常、この種の移植用装置を、整形外科手術に使用する。また、該フィルムを、ヒドロキシアパタイトブロック、脱ミネラル化骨マトリックスプラグ、及びコラーゲンマトリックス等のような、骨充填材の被覆に使用することができる。通常、本明細書中に記述したフィルム、又は装置を、骨折部位で骨に適用することができる。通常、標準的な外科手術を用いて、該骨に移植するか、又は表面に固定するかにより、適用する。
【００４９】
本発明の配合物を運ぶ、代わりの方法に含まれるのは、ALZET osmotic minipumps（ALZA社（ALZA Corp.）、Palo Alto, Calif.）；ワング（Wang）らが、ＰＣＴ公開第WO 90／11366号で開示しているような、持続性の徐放マトリックス物質（sustained release matrix materials）；バオ（Bao）らが、ＰＣＴ公開番号第WO 90／11366号で開示しているような、電気的に荷電したデキストランビーズ（electrically charged dextran beads）；例えば、サンダー（Ksander）らが、論文Ann. Surg.（1990）211（3）：288-94で開示しているような、コラーゲン−ベース運搬システム（collagen-based delivery systems）；ベック（Beck）らが、論文J. Bone Min. Res.（1991）6（11）：1257-65で開示しているような、メチルセルロースゲルシステム（methylcellulose gel systems）；及びエデルマン（Edelman）らが、論文Biomaterials（1991）12：619-26で開示しているような、アルギネート（アルギン酸塩又はエステル）−ベースシステム（alginate-based systems）等である。骨に持続的に局所運搬する、技術的周知の他の方法には、含浸することができる多孔性被覆金属の人工器官、及び本発明の治療用組成物を含む固体プラスチックロッドがある。
【００５０】
一つの実施態様において、該ペプチド組成物は、配列番号：1〜20から選択された、少なくとも一のペプチドを含み、リポソームと呼ばれるリン脂質小胞中に含まれた溶液、又はエマルジョンとして提供することができる。該リポソームを、一枚膜、又は多重膜とすることができ、かつホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、及びこれらの組合せから選択される成分で形成することができる。該多重膜リポソームは、単ラメラ小胞と同じ組成物の多重ラメラ小胞を含むが、溶液、又はエマルジョンにおいて、選択されたペプチドを包括する、複数の区画を得るように調製される。加えて、他の補助剤、及び改質剤を、ポリエチレングリコール、又は他の物質のような、リポソーム配合物中に含んでもよい。
あらゆるリポソーム二層組成物を、本発明の組成物中に使用することができることは、当業者にとって明らかである。リポソームを、米国特許第4,235,871号、及びRRC, Liposomes：（A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1990, 33-101ページ）で開示しているような、様々な公知の方法により、調製することができる。
【００５１】
本発明のペプチドを含むリポソームは、ハプテン、酵素、抗体、又は抗体フラグメントのような、該リポソームの外部に結合する非重合分子、サイトカイン、及びホルモンを有するような改質剤、及び該リポソームに、所望の酵素、又は表面認識特性を与える、他の小さいタンパク質、ポリペプチド、又は非タンパク質分子を有してもよい。特定の器官、又は細胞種に対して、優先的に該リポソームを標的とする表面分子には、例えば、細胞支持特定抗原に対して、該リポソームを標的にする抗体がある。このような分子を結合する技術は、当業者にとって周知のものである（例えば、米国特許第4,762,915号）。代わりに、又は組合せにおいて、当業者は、正、又は負の実効電荷を支持している、あらゆる脂質を、該リポソーム膜の表面電荷、又は表面電荷密度を変えるように使用することができると理解するであろう。
【００５２】
また、該リポソームは、脂質小胞膜の制御した分解を提供するように、該脂質二層の成分として、熱感受性、又はpH感受性脂質を組込むことができる。
静脈内運搬による全身的適用に対し、血液中において長期循環時間を示すような立体的に安定化したリポソーム中に、本発明のペプチドを封入することにより、有益にすることができる。該立体的に安定化したリポソームは、これらの表面の必須成分として、ポリエチレングリコールを含むことが提供され、かつこのようなリポソームを作る方法は、当業者にとって公知である。
該リポソームのサイズを、意図した標的、及び投与経路に基づき選択することができる。約10 nmから300 nmのリポソームが、適切であり得る。さらに、本発明の組成物は、さらに、異なるサイズのリポソームを含むことができる。
【００５３】
本発明の組成物を、投与用に、リポソームに封入することができるが、他種の封入剤を、本発明のBCSPを封入するために使用することもできることは、当業者にとって明らかである。制限はないが、イオン交換樹脂、結晶性セラミックス、生体用ガラス、ラテックス、及び分散粒子からなる微小球（マイクロスフェア）は、本発明の使用に適している。同様に、微小球（ナノスフェア）、及び他の脂質、ポリマー、又はタンパク質の物質もまた使用することができる。
また、単独で、又は組成物中で提供される本発明のペプチドを、骨細胞、及び／又は軟骨細胞の活性を刺激するようにインビトロで使用することができ、次いで、このような細胞を、骨、又は軟骨の障害／欠陥を治療するため、哺乳動物に投与することができる。
【００５４】
また、本発明は、さらに、該ペプチドの機能類似体のスクリーニング、及び同定方法を提供し、このように同定したペプチドは、本明細書中で記述したペプチドの本質的な活性を有する。このようなスクリーニング法は、骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる生物学的試料と、試験ペプチド、又は化合物とを接触させ、かつ次いで、また、骨、及び／又は軟骨形成を起こすことができる第二生物学的試料と、配列番号：1から配列番号：20の一以上のペプチドの量を、別々に接触させる。次いで、骨、及び／又は軟骨形成の水準を、骨密度、骨無機質含量、アルカリホスファターゼ活性、骨芽細胞増殖、骨の小結節形成、骨の小結節ミネラル化、軟骨細胞増殖、細胞内カルシウムチャンネリングアッセイ、コラーゲンアッセイ、及びプロテオグリカンアッセイから選択された、一以上の基準の分析により評価する。次いで、骨、及び軟骨形成の水準を、該試験ペプチド、又は化合物が、本発明のペプチドの本質的な活性を有するかどうか同定するため、各生物学的試料において比較する。同様のアプローチを用いて、骨、及び／又は軟骨形成のモジュレータも評価することができる。
要約すると、本発明のペプチドは、骨だけでなく、軟骨、及び関連する結合組織をも含む、結合組織の成長、維持、及び修復に影響を及ぼす。
【００５５】
前記開示は、一般的に、本発明を記述している。さらに完全な理解を、次の特定の実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単に説明の目的のため記述されており、かつ本発明の範囲を制限するものではない。状況は、手段を提案する、又は与えることができるので、形態変化、及び均等な置換が企画される。特定の用語を、本明細書中で使用しているが、このような用語は、記述的意味を意図しており、かつ制限を意図するものではない。
【実施例】
【００５６】
（実施例）
実施例は、説明を目的として記述され、かつ本発明の範囲を制限するものではない。
合成化学、タンパク、及びペプチド生化学、分子生物学、組織学、及び免疫学の方法を参照するが、科学文献で報告され、かつ当業者にとって周知である開示、及び例の明確な記述はない。
（実施例１）
移植片に適用する、BCSP1、及びSkelite（登録商標）キャリア
骨修復に適用するBCSPの性能を、骨格の熟成したNew Zealand White（NZW）ラビットの尺骨に作った、臨界サイズの欠陥を用いて、インビボで評価した（ボランダー（Bolander）らの論文、J. Bone and Joint Surg., 68-A（8）, Oct. 1986に記述されている。）。腸骨稜から収集した自己移植片は、対側性のコントロールとして供給した。調査グループ、及びコントロールグループのラビットを、12週で終結させた。
【００５７】
水0.15 ml中に、9.0 mgのBCSP1を溶解し、かつ該移植片の表面上に、凍結乾燥することにより、BCSP1をSkelite（登録商標）移植片に結合させ、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片を作った。動物を、フェンタニル（Fentanyl）（0.3 mg／kg）、及びミダゾラム（Midazolam）（2.0mg／kg）の筋肉内注射を用いて麻酔した。２cmの長さで測定する、全区画の尺骨の臨界サイズ欠陥を、ホールミクロサジタルソー（hall micros saggital saw）（Model 100, Blade No. 5023-160）を用いて作った。隣接する橈骨の‘記録’、又は切断は、応力集中部として、損傷を起こし、かつ該橈骨の骨折を起こすことのないことを確実にするように注意した。
【００５８】
１８標準針を用いて、大腿骨の大転子から経皮的に収集した骨髄を、多孔Skelite（登録商標）／BCSP1移植片（6×4×20 mm）の各々の表面に投与した。これは、骨髄穿刺液のプールを含む無菌ペトリ皿に、該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片を置き、かつ尺骨欠陥を作る間に、該移植片を４分間、１分毎に回転させることにより達成した。該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片を、右前肢の受取ベッド、及び先の傷の閉鎖の中に移植した後、付加的な骨髄穿刺液0.5 mlを、注射器を用いて該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片の表面に適用した。標準的な整形外科技術を用いて、腸骨稜から収集した自己移植骨を、適切な寸法に切り取り、かつ右前肢欠損中に移植した。標準的な臨床試験の後で、該自己移植片を、骨髄穿刺液に追加しなかった
【００５９】
動物を、2 mlのユータニル（Euthanyl）を用い、静脈内に過剰摂取させ、12週で安楽死させた。該前肢を、切取り、かつ周りの筋肉を取り除いた。外観検査の後、該切取った骨（橈骨、及び尺骨の両方）を、70％エタノール、又は100％ホルマリンで固定し、かつ組織学的な、及び骨密度測定技術を用いて分析した。
すべての動物において、皮質様構造、又はカルスを、該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片近くで記録した。皮質シェルは、該移植片を囲んでいる尺骨の両端を架橋していた。この新皮質構造は、偏光下、ラメラパターンを有していた。脂肪質の骨髄様組織を、新皮質と該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片との間で記録した。同様に、骨髄様組織を、該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片と該橈骨との間で記録した。
【００６０】
すべてのSkelite（登録商標）／BCSP1移植片は、欠陥を治療し、優れたオステオインテグレーション、及び該欠損の両端で、ホスト骨と移植片との間の組込みとともに、すべてのSkelite（登録商標）／BCSP1移植片の多孔性構造にわたって、実質的な骨形成を示した。該対側性のコントロールと異なり、すべての欠陥は、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で治療され、術後９週目で結合に達した（図１）。加えて、顕微鏡組織学的観測により、Skelite（登録商標）物質の広範囲破骨細胞性吸収、及び該Skelite（登録商標）‘壁体（strut）’の三角空間中に組織形成を確認した。
Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で治療される欠陥にとって、12週での組織病理学的観察は、一貫して、著しい、広範囲のオステオインテグレーション、線維性骨のわずかな形成、層状骨の適度な形成、延髄様空洞の形成、擬似皮質の形成、及び結合を示した（図２）。対照的に、自己移植で処置した欠損の顕微鏡観察結果は、擬似関節、腐骨、骨髄の壊死／線維症、及び骨間結合の証拠を示した。
【００６１】
Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した、臨界サイズ欠陥は、自己骨で処置した欠陥と比較した場合、促進的速度の治癒を示した。この促進的速度の治癒は、放射線透過写真において、早くも術後３週目で明白であり、かつ実質的なカルス形成を、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した、すべての欠陥で観測した。Skelite（登録商標）／BCSP1で処理した欠陥は、典型的に、術後６週目で、放射線透過写真で結合の証拠を示した。欠損を処置した該Skelite（登録商標）／BCSP1移植片の進行中の治癒は、連続的カルス形成、該カルスの再構築、及び全移植片を含む皮質シェルの成長をもたらした。９週目まで、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した欠陥のすべては、効果的な構造的結合、及びカルス再構築を示した。Skelite（登録商標）／BCSP1移植片と該ホスト骨との間の優れたインテグレーション、及び強い結合は、終結で明らかである。これらの放射線透過写真の結果を、切除した骨の骨密度走査により実証した。
【００６２】
組織学的評価は、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した欠陥すべてに対し、オステオインテグレーションを示した。擬似関節、腐骨、及び骨髄の壊死／線維症とともに、該欠陥の部分的治癒のみ得られる自己骨とは異なり、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した欠陥は、堅固な骨癒合、高水準のオステオインテグレーション、及び皮質シェル、及び骨髄様空洞の両方の形成を示した。熟成した、層状骨は、Skelite（登録商標）／BCSP1物質と直接的な接触で観測され（線維組識膜界面の欠如において）、かつ高水準の骨破壊活性を記録した。スカラップ状吸収窩、及び‘切削錐（cutting cones）’を、すべてのSkelite（登録商標）／BCSP1移植片の外部、及び内部の表面上に、頻繁に観測した。
【００６３】
Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した欠陥に対し、該移植部位で増加した組織形成のさらなる数量化可能パラメーターを提供するため、カルス形成も分析した。区域性欠損ラビットモデルのカルス形成の増加を、リーンマス（lean mass）のDEXA分析を使用して測定した。リーンマスの定量的変化は、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片の走査範囲において、カルス、又は軟部組織形成の変化を示した（図３）。
これらの結果は、ラビットにおいて、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片を用いた、臨界骨欠損の治療は、コントロールの自己移植片と比べて、有意な骨修復を生じることを示している。
【００６４】
（実施例２）
BMC、及びBMDへのBCSP1、BCSP7、BCSP9、及びBCSP10の効果
BCSP1ペプチド、及びBCSP4ペプチドを、４つの投与量レベル、0.05、0.5、1.0、及び5.0 mg／ラット、又はビヒクル、１投与量につきｎ＝６で試験した。重量90〜110グラムである、60のオスのウィスターラットを、２つのグループにランダム化し、耳タグを付け、かつ該手順の前に一週間静かにしておいた。食物、及び水を、任意に与えた。注射時、動物の重量は、150〜190グラムであった。グループ１には、環境順化の８日目に、BCSP4ペプチドを注射した。グループ２には、環境順化の９日目に、BCSP1ペプチドを注射した。解剖を、各日の注射後７日目に行った。
【００６５】
該ペプチドを、滅菌水で、100マイクロリットル容量ごとに0.05〜5 mgを溶解し、乾燥Skelite（登録商標）粉末0.5 gを加え、かつ該キャリア上へ凍結乾燥した。試料を、注射用に、無菌生理食塩水100マイクロリットル中に再懸濁した。該試験化合物の運搬を、酸素とともに、一般麻酔薬のイソフルラン下で行った。28 G 1／2”針に合う0.5 ccインシュリン注射器を用いて、該ペプチドを、脛骨前筋群の下の膝に近接した右内側脛骨表面の骨膜面上に注入した。コントロール動物には、生理食塩水ビヒクル、及びSkelite（登録商標）キャリアを注射した。
【００６６】
動物を、注射後７日目に、二酸化炭素を用いて安楽死させ、かつ解剖して、処置する右脛骨、及び対側コントロール肢を取り除いた。筋肉、及び軟結合組織を、70％エタノールで固定する前に、切り離した。
各固定脛骨を、骨密度（BMD）、及び骨無機質含量（BMC）のペアとして、小対象モードにおいて、Norland Eclipse DEXAスキャナーで走査した。DEXA分析範囲を、図４に示す。未処置対側肢に対する、局所BMDの百分率増加（図５）を計算した。BCSP1で見られる骨サイズの増加のため、BMCの増加量（図６）も、BMDとは別に、骨形成活性の尺度として測定した。物理的サイズにおける、この増加は、BMDの全体の百分率増加を下げる（BMD＝BMC／cm2）。各脛骨を、３近接範囲、近位、中央、及び遠位、並びに全脛骨寸法で分析した。投与量対ビヒクルの比較、及び統計学的評価を、標準スチューデントｔ−試験（student t-test）を使用して、骨形成活性を、各ペプチドに対して行った。
また、全範囲における、処置した全脛骨中、BCSP7、BCSP9、及びBCSP10が、BMD、及びBMCにおいて、有意の変化を示した（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ）。
【００６７】
（実施例３）
軟骨細胞へのBCSP1の効果
BCSP1を、［3H］チミジン取り込み法を使用して、牛の、及び人の主要軟骨培養への効果を測定するため、インビトロで試験した。細胞を、牛軟骨に対し、250,000／ウェルで；人軟骨（96ウェルプレート）に対し、500,000／ウェルで供給し，かつ48時間固定させた（10％胎児牛血清（FBS）を含む培養液）。次いで、前密集的細胞を、４つのBCSP1（０、10、20、及び40 ng／ml）で48時間、及び［3H］チミジン（１Ci／ml）で少なくとも24時間処置した（２％FBSを含む培養液）。該培養液は、200ユニット／mlのペニシリン、200 ug／mlのスプレプトマイシン、及び成長用の10％FBSと投与用の２％FBSとを含む、ドウルベッコ改良イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（DMEM）（Gibco, Cat. #23800）を使用した。
結果は、インビトロにおいて、BCSP1で処置した場合、投与依存が、人の、又は牛の軟骨細胞の増殖を増加させることを示している。効果は、ナノグラム範囲で、投与の３倍まである（図９、及び１０）。
【００６８】
（実施例４）
BCSPペプチドを用いたインビトロアッセイ
BCSP1を、該ペプチドにより、骨刺激機構を明らかにするため、３つのアッセイで試験した。マイクログラム範囲において、用量反応曲線を生じるような投与範囲を使用した。すべてのアッセイは、骨髄、又は頭蓋冠から、主要ラット骨芽細胞培養を用いた。
骨芽細胞増殖を、ブロモデオキシウリジン（BrdU）取り込みを測定する、DNAベースアッセイを使用して評価した。骨芽細胞の分化を、中央の後期骨マーカーアルカリホスファターゼを用いて測定した。後期分化、及びミネラル化を、骨の小結節形成アッセイを用いて決定した（頭蓋冠のみ）。
ラット骨髄から誘導した骨芽細胞培養は、BCSP1の存在に反応し、増殖を示した。細胞を、該ペプチドに、24時間曝す前に、４日間培養した（図１１）。骨芽細胞増殖において、投与反応増加を、100μg／mlに観測した。これは、BCSP1の添加が、DNA合成を75％まで増加させることを示している。
【００６９】
また、ラット頭蓋冠から誘導した骨芽細胞培養も、BCSP1の存在に反応し、増殖を示した。細胞を、ペプチド100μg／mlから1.3 ng／mlの投与範囲で、該ペプチドに、24時間曝す前に、４日間培養した（図１２）。高投与で、逆転した投与反応を観測した。実質的に有意な増加を、ペプチド1.3〜6.4 ng/mlの投与範囲で観測した。
【００７０】
細胞は、骨芽細胞から誘導したラット骨髄、及び骨芽細胞から誘導したラット頭蓋冠の培養細胞可溶化物から、アルカリホスファターゼを結合した。BCSP1を、100μg／mlから１μg／mLの投与範囲で与えた。細胞を、該ペプチドに、48時間曝す前に、３日間培養した。投与依存反応は、ラット骨髄培養（RBM）のコントロール（ビヒクル）に対し、１μg／mlから100μg／mlで（図１３）、及びラット頭蓋冠培養（RC）では、10μg／mlから100μg／mlで見られた（図１４）。
【００７１】
ラット頭蓋冠培養を、BCSP1の存在下、各液体変化を供給した投与とともに、１ ng／mlから100μg／mlの投与範囲で、10日間持続した。ミネラル化骨小結節を、アゼラインレッドで染色して決定した。小結節領域を数え、かつ定量するため、画像解析をAlpha Imager 2000（登録商標）で行った。その結果は、１ng／mlから10 ng／mlの範囲で、わずかな増加とともに、形成した骨小結節の数において、ミネラルの変化を示した（図１５）。全ミネラル化骨小結節領域（小結節のサイズ）は、投与依存法において、BCSP1の存在下、有意に増加し（図１６）、これは、該アルカリホスファターゼのデータと一致した。増加したアルカリホスファターゼは、全ミネラル化領域の増加へと導くであろう。
【００７２】
インビトロにおける全結果は、BCSP1ペプチドが、細胞増殖を増加し、アルカリホスファターゼ水準の増加へと導くことを示している。さらに、実験は、アルカリホスファターゼの特定の活性において、増加を示しており（図示せず）、該ペプチドのため、さらに分化効果を示している。また、これは、形成した骨小結節の数、及びミネラル化領域の全量に見られた、骨形成細胞の増加により確認した（図１６）。
本発明の好ましい実施態様を、本明細書中に詳細に記述したが、変法を、本発明の精神から外れることなしに、それに対して行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
（図の説明）
【図１】図１は、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片で処置した、骨欠損の組織学的断面を示す。
【図２】図２は、術後９週目の自己移植に対して、Skelite（登録商標）／BCSP1移植片の性能を示す放射線透過写真を示す。
【図３】図３は、自己移植に対して、移植片のリーンマス（lean mass）（カルス形成）に対するBCSP1の治療効果を示す。
【図４】図４は、BCSP1ペプチドを注射した脛骨のDEXA分析域を示す。全骨分析は、該脛骨の３つの領域すべてを含む。BCSP1ペプチド注射は、領域２に行った。
【図５】図５は、該脛骨領域２のBCSP1の局所効果に対して、該脛骨全体の骨密度（BMD）のBCSP1の効果を示す。
【図６】図６は、該脛骨領域２のBCSP1の局所効果に対して、該脛骨全体の骨無機質含量（BMC）のBCSP1の効果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、BCSP1、BCSP7、BCSP9、BCSP10、及びコントロールの脛骨全体に対する骨密度の平均増加量を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、BCSP1、BCSP7、BCSP9、BCSP10、及びコントロールの脛骨領域２（図４）に対する骨密度の平均増加量を示す。
【００７４】
【図８Ａ】図８Ａは、BCSP1、BCSP7、BCSP9、BCSP10、及びコントロールの脛骨全体に対する骨無機質含量の平均増加量を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、BCSP1、BCSP7、BCSP9、BCSP10、及びコントロールの脛骨領域２（図４）に対する骨無機質含量の平均増加量を示す。
【図９】図９は、牛の軟骨細胞増殖に対するBCSP1の効果を示す。
【図１０】図１０は、人の軟骨細胞増殖に対するBCSP1の効果を示す。
【図１１】図１１は、骨芽細胞培養で得たラットの骨髄における、DNA合成に対するBCSP1の効果を示す。
【図１２】図１２は、骨芽細胞培養で得た頭蓋冠の増殖に対するBCSP1の効果を示す。
【図１３】図１３は、骨芽細胞に由来する骨髄における、アルカリホスファターゼ活性に対するBCSP1の効果を示す。
【図１４】図１４は、骨芽細胞に由来する頭蓋冠において、アルカリホスファターゼ活性に対するBCSP1の効果を示す。
【図１５】図１５は、頭蓋冠培養において、骨の小結節形成に対するBCSP1の効果を示す。
【図１６】図１６は、頭蓋冠培養における、骨の小結節形成のミネラル化に対するBCSP1の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2006502971.tif 000009
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月19日(2005.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006502971000001.app
【国際調査報告】
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