(57)【要約】本発明は新規の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を予測または設計し、検出し、および／または証明する方法、および前記ＣＰＰの使用法および／または細胞エフェクタの細胞内取り込みを改善するための前記ＣＰＰと公知ＣＰＰとの新規の組み合わせ使用にも関係する。さらに、本発明は細胞エフェクタ活性を模する、および／または細胞エフェクタ活性を阻害する新規の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を予測または設計し、検出し、および／または証明するための方法にも関係する。本発明はさらに、前記ＣＰＰを使用して医学的障害を治療および／または予防し、または前記ＣＰＰを使用する医学的障害を治療する医薬組成物の製造にも関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞侵入ペプチドまたは蛋白質および／またはペプチドまたは蛋白質の細胞侵入フラグメントを確認する方法であって、
ａ）前記蛋白質またはペプチドのアミノ酸配列を得、
ｂ）少なくとも１つの候補フラグメントのアミノ酸配列を選択し、
ｄ）前記配列のバルク特性値ＺΣを評価し、ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、
前記ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は前記アミノ酸配列における残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算され
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｒｘｅｓ２・・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表１Ａに記載される記述子値スケールにおけるＺ１；Ｚ２；Ｚ３；Ｚ４およびＺ５記述子値に対応し、
ｅ）前記少なくとも１つの候補フラグメント（類）から、そのＺΣバルク特性値に基づいて細胞侵入フラグメントを確認し、
細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２であり、
ｆ）任意にインビトロおよび／またはインビボ法によって前記確認されたペプチドまたは蛋白質および／または前記フラグメントの細胞侵入能力を証明する諸工程を含む方法。
【請求項２】
ペプチドの細胞侵入特性をチェックする方法であって、
ａ）ペプチドのアミノ酸配列を得、
ｄ）前記配列のバルク特性値ＺΣを評価し、ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、
ここでＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は下記の式で計算される、前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表１Ａに記載される記述子値スケールにおけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応し、
ｅ）前記ペプチドの細胞侵入特性を、そのＺΣバルク特性値に基づいてチェックし、細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２であり、
ｆ）前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、
ｇ）任意に、合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボ法によって証明する
諸工程を含む方法。
【請求項３】
細胞侵入ペプチドおよび機能的蛋白質模擬ペプチドの製法であって、
ａ）対象とする機能的蛋白質を選択し、
ｂ）前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を得、
ｃ）前記蛋白質の細胞内部分に対応する少なくとも１つの候補フラグメントのアミノ酸配列を選択し、
ｄ）前記配列のバルク特性値ＺΣを評価し、ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、
ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は下記の式で計算される前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり、
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表１Ａに記載される記述子値スケールにおけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応し、
ｅ）前記少なくとも１つの候補フラグメント（類）からそのＺΣバルク特性値に基づいて細胞侵入フラグメントを確認し、
細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、その際ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２であり、
ｆ）前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、
ｇ）任意に、前記合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボ法によって証明する
諸工程を含む方法。
【請求項４】
人工的細胞侵入ペプチドおよび／または人工的細胞侵入性および機能的蛋白質模擬ペプチドを新たに設計し、生産する方法であって、
ａ）少なくとも１つの人工的ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントを設計し、    ｄ）前記人工的ペプチドまたはペプチドフラグメントのアミノ酸配列のバルク特性値ＺΣを評価し、ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、
ここでＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は下記の式で計算される前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表１Ａに記載される記述子値スケールにおけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応し、
ｅ）前記人工的ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの細胞侵入特性をそのＺΣバルク特性値に基づいてチェックし、
細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、その際ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２であり、
ｆ）細胞侵入性であることが確認されたアミノ酸配列を含む前記ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントを合成し、および
ｇ）任意に、合成ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボ法によって証明する
諸工程を含む方法。
【請求項５】
工程ｅ）後の前記アミノ酸配列が追加的に
ｈ）実質的に個々の平均区間値、すなわちＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．１およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜８．１３およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜３．５２およびＺΣ２＞−３．９およびＺΣ２＜３．１およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−３．５１およびＺΣｈｄｂ＞−０．１１５およびＺΣｈｄｂ＜５．１およびｈｄｂ＞０およびｈｄｂ＜８４からなる特性値を有することに関して評価され、選択される
請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｅ）後の前記アミノ酸配列が追加的に
ｈ）実質的に個々の平均区間値、すなわちＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜５．９およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜１．９２およびＺΣ２＞−１．２２およびＺΣ２＜１．２９およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−１．９４およびＺΣｈｄｂ＞０．２８およびＺΣｈｄｂ＜２およびｈｄｂ＞５およびｈｄｂ＜３０からなる特性値を有することに関して評価および選択される請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｅ）後の前記アミノ酸配列が追加的に
ｈ）実質的に個々の平均区間値、すなわちＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜４．８およびＺΣ１＞−１．１およびＺΣ１＜１．９２およびＺΣ２＞−１．１およびＺΣ２＜０およびＺΣ３＜−０．５５およびＺΣ３＞−１．９４およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜１．５７およびｈｄｂ＞７およびｈｄｂ＜２５からなる特性値を有することに関して評価および選択される
請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）およびｅ）に代わって、
ｈ）実質的に個々の平均区間値、すなわちＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．１およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜８．１３およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜３．５２およびＺΣ２＞−３．９およびＺΣ２＜３．１およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−３．５１およびＺΣｈｄｂ＞−０．１１５およびＺΣｈｄｂ＜５．１およびｈｄｂ＞０およびｈｄｂ＜８４からなる特性値を有することに関してアミノ酸配列を評価し、選択する
工程を含む請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｄ）およびｅ）に代わって
ｈ）実質的に、個々の平均区間値、すなわちＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜５．９およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜１．９２およびＺΣ２＞−１．２２およびＺΣ２＜１．２９およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−１．９４およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜２およびｈｄｂ＞５およびｈｄｂ＜３０からなる特性値を有することに関してアミノ酸配列を評価および選択する工程を含む
請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）およびｅ）に代わって、
ｈ）実質的に、個々の平均区間値、すなわちＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜４．８およびＺΣ１＞−１．１およびＺΣ１＜１．９２およびＺΣ２＞−１．１およびＺΣ２＜０およびＺΣ３＜−０．５５およびＺΣ３＞−１．９４およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜１．５７およびｈｄｂ＞７およびｈｄｂ＜２５からなる特性値を有することに関してアミノ酸配列を評価および選択する工程を含む
請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛋白質が膜貫通蛋白質である請求項１ないし請求項１０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛋白質がヒトＰｒｐＣ、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）およびプレセニリン−１（ＰＳ−１）からなる群から選択される蛋白質である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記蛋白質が哺乳動物受容体、例えばチロシンキナーゼ受容体のスーパーファミリに属する受容体、７ＴＭ受容体および／またはＧ−蛋白質結合受容体などである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記蛋白質がＧＬＰ−１受容体、ＡＴ１Ａ受容体、およびドーパミン−２受容体からなる群から選択される蛋白質である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの細胞侵入能力を、前記ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントに曝露した後の前記細胞への検出可能色素の取り込み率をモニターすることによって証明する先行請求項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記色素がフルオレセインである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
先行請求項のいずれかの項に記載の方法によって得られる細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項１８】
実質的に、先行請求項のいずれかの項に記載の方法によって得られるペプチドからなる細胞侵入ペプチド。
【請求項１９】
細胞侵入能力を有する８ないし５０アミノ酸残基長のペプチドまたはそのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２０】
ペプチドが１４ないし３０アミノ酸残基長である請求項１９記載の細胞侵入ペプチド。
【請求項２１】
ペプチドが１６ないし２０アミノ酸残基長である請求項１９記載の細胞侵入ペプチド。
【請求項２２】
配列番号：６２３４−７４２０に列挙されるアミノ酸配列の一つに対応する８アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２３】
配列番号：１−１５０に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する１２ないし５０アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２４】
配列番号：１５１−２６８４に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する１２アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２５】
配列番号：７４２１−１１６４９に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する１２アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２６】
配列番号：２６８５−６２３３に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する１６アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２７】
配列番号：１１６５０−１８３９８に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する１６アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項２８】
転写因子から誘導され、または転写因子または転写因子の少なくとも機能的部分に酷似するように設計された細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項２９】
配列番号：１８３９９−３１８３９に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する８−１６アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項３０】
セクレターゼから誘導され、またはセクレターゼまたは少なくともセクレターゼの機能的部分に酷似するように設計された細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項３１】
配列番号：３１８４０−３１８６４に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項３２】
ＧＬＰ−１受容体から誘導されるかまたはＧＬＰ−１受容体または少なくともＧＬＰ−１受容体の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項３３】
配列番号：３１８６５−３１８８６に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項３４】
ＣＧＲＰ受容体から誘導されるか、またはＣＧＲＰ受容体または少なくともＣＧＲＰ受容体の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項３５】
配列番号：３１８９５に示されるアミノ酸配列に対応するペプチドまたはペプチドフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項３６】
ＡＴ２型受容体から誘導されるかまたはＡＴ２型受容体または少なくともＡＴ２型受容体の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項３７】
配列番号：３１８８７−３１８９４に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項３８】
ＰｒｐＣから誘導されるか、またはＰｒｐＣまたは少なくともＰｒｐＣの機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項３９】
配列番号：３１８９６−３１８９９に示されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項４０】
アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはプレセニリン−１（ＰＳ−１）から誘導されるか、またはアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはプレセニリン−１（ＰＳ−１）または少なくともアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはプレセニリン−１（ＰＳ−１）の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
【請求項４１】
配列番号：３１９００−３１９０６に列挙されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
【請求項４２】
請求項１９ないし請求項４１のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドの機能的類似体。
【請求項４３】
請求項１９ないし請求項４１のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／または非ペプチド類似体に少なくとも７５％は一致する細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項４４】
請求項１９ないし請求項４１のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／または非ペプチド類似体を含む細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項４５】
アミノ酸配列ＩＶＩＡＫＬＫＡおよび／またはその細胞膜侵入性機能的類似体を含むペプチド類からなる群から選択される、請求項１９ないし請求項４４のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項４６】
アミノ酸配列ＩＶＩＡＫＬＫＡＮＬＭＣＫＴＣＲＬＡＫを含む、請求項４５記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項４７】
ペプチドがカーゴに結合する、請求項１９ないし請求項４６のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項４８】
ペプチドがＳ−Ｓ架橋によってカーゴに結合する、請求項４７に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項４９】
前記カーゴが細胞エフェクタである請求項４７または請求項４８に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項５０】
前記カーゴが薬物学的活性成分である請求項４７ないし請求項４９のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項５１】
前記カーゴが小分子、ペプチド、蛋白質、砂糖、一本鎖および／または二本鎖オリゴヌクレオチド、プラスミド、抗生物質、細胞傷害性および／または抗ウィルス物質からなる群から選択される請求項４７ないし請求項５０のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項５２】
前記カーゴがマーカー分子である請求項４７ないし請求項５１のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項５３】
配列番号：３１９０７−３１９２２に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される、請求項４７ないし請求項５１のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体。
【請求項５４】
ａ）標的細胞中に特異的に過剰発現しおよび／または標的細胞によって特異的に分泌されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンンサス部位を含む細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および
ｂ）細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性物質
を含む細胞増殖抑制および／または細胞傷害性物質の細胞選択的送達系であって、
前記細胞選択的送達系がその他に前記細胞侵入ペプチドの活性を抑制する不活性化配列を含み、それは前記細胞選択的送達系が前記標的細胞の近くに導入されると前記プロテアーゼによって切断される
前記細胞選択的送達系。
【請求項５５】
細胞にトランスフェクトするベクターであって、そのベクターは
ａ）核酸成分、
ｂ）ポリカチオン結合体、および
ｃ）細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体
を含み、同一条件における細胞あたりの平均トランスフェクション率が、成分ａ）およびｂ）だけ、または成分ａ）およびｃ）だけを含むベクターに比較して少なくともファクタ２だけ増加する
前記ベクター。
【請求項５６】
前記ベクターが細胞の一過性トランスフェクションおよび／または安定的トランスフェクションに使用される請求項５５記載のベクター。
【請求項５７】
前記ベクターが細胞のインビボおよび／またはインビトロトランスフェクションに使用される請求項５６記載のベクター。
【請求項５８】
前記ベクターが細胞の非ウィルス性トランスフェクションのために使用される請求項５７記載のベクター。
【請求項５９】
前記ポリカチオン結合体がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である請求項５５ないし請求項５８のいずれかの項に記載のベクター。
【請求項６０】
配列番号：３１９１３に記載されるアミノ酸配列に対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される請求項５５ないし請求項５９のいずれかの項に記載のベクター。
【請求項６１】
前記細胞侵入ペプチドが請求項２２ないし請求項２７、請求項２９、請求項３１、請求項３３、請求項３５、請求項３７、請求項３９、請求項４１、請求項４５、請求項４６、請求項５２、および請求項６０のいずれかの項に記載のペプチドまたはペプチドのフラグメントである請求項５５ないし請求項５９のいずれかの項に記載のベクター。
【請求項６２】
さらに細胞および／または細胞型および／または組織に特異的であるという特徴を有する請求項２２ないし請求項２７、請求項２９、請求項３１、請求項３３、請求項３５、請求項３７、請求項３９、請求項４１、請求項４５、請求項４６、請求項５２、請求項５９および請求項５５ないし請求項６０のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６３】
前記細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクターが選択的に細胞表面蛋白質と相互作用し、前記細胞および／または細胞型および／または組織に特異的な細胞侵入を媒介する請求項６２記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６４】
前記細胞表面蛋白質が前記特異的な細胞および／または細胞型および／または組織に過剰発現する、請求項６３記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６５】
前記細胞表面蛋白質が受容体チロシンキナーゼ型受容体類、グリコスフィンゴリピド類、ＣＤ４４、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、および神経ペプチド受容体類からなる群から選択される請求項６３または請求項６４記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６６】
前記ペプチドおよび／またはベクターが、過剰発現した細胞内および／または細胞外蛋白質と選択的に相互作用し、それによって細胞および／または細胞型および／または組織に特異的な細胞侵入を媒介する、請求項６２記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６７】
前記過剰発現する蛋白質が細胞および／または細胞型および／または組織特異的受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニストからなる群から選択される、請求項６２記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６８】
前記過剰発現する蛋白質がプロテアーゼ類、プロテアーゼインヒビタ類およびプロテアーゼアクチベータ類からなる群から選択される請求項６２または請求項６３記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター。
【請求項６９】
医薬組成物の製造のために請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター、および／または請求項５４記載の細胞選択的送達系の使用。
【請求項７０】
請求項６９によって製造される医薬組成物。
【請求項７１】
遺伝子治療のために請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクターおよび／または細胞選択的送達系および／または医薬組成物の使用。
【請求項７２】
遺伝子治療のための医薬組成物を製造するために、請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクターおよび／または細胞選択的送達系の使用。
【請求項７３】
腸／頬系の上皮、口、肺、直腸または鼻の粘膜、または哺乳動物の血液脳障壁を介するなど、上皮膜を介する膜貫通輸送のための薬剤送達系を作るために請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクターおよび／または細胞選択的送達系の使用。
【請求項７４】
感染性疾患、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌からなる群から選択される医学的障害を治療および／または予防するための医薬組成物の製造のために請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクターおよび／または医薬組成物および／またはドラッグ・デリバリー・システムの使用。
【請求項７５】
医学的障害にかかった患者の治療法であって、請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター、医薬組成物および／またはドラッグ・デリバリー・システムを、それらを必要とする患者に適用することを含む方法。
【請求項７６】
Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、心臓血管病、感染性疾患、シグナル形質導入の混乱に起因する諸疾患、または癌からなる群から選択される医学的障害にかかった患者を治療する方法であって、請求項１７ないし請求項６８のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体および／またはベクター、医薬組成物および／または薬剤送達系を、それらを必要とする患者に適用することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を予測または設計し、検出し、および／または証明する方法、および前記ＣＰＰの使用法および／または細胞エフェクタの細胞内取り込みを改善するために前記ＣＰＰと公知のＣＰＰとの新規の組み合わせ使用にも関係する。さらに、本発明は細胞エフェクタ活性を模する、および／または細胞エフェクタ活性を阻害する新規の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を予測または設計し、検出し、および／または証明するための方法にも関係する。本発明はさらに、前記ＣＰＰを使用して医学的障害を治療および／または予防し、または前記ＣＰＰを使用して医学的障害を治療する医薬組成物を製造することにも関係する。
【背景技術】
【０００２】
種々の細胞エフェクタを細胞内に送達する多数の技術が開発されている。これらの技術の大部分はエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのように侵襲的である。リポソーム被包化や受容体依存性エンドサイトーシス（細胞内取り込み）が比較的おだやかな方法であるが、それらは残念ながら重大な欠点、特に低い送達収率を示す。
【０００３】
細胞生物学における確立された視点から、親水性生体高分子の細胞インターナリゼーションは典型的エンドサイトーシス経路によってのみ実現し得ることが示されている。しかし過去１０年間に数種のペプチドが見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を通過して移動することが証明された。これらのペプチドは細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）と定義され、それらの分子量の数倍大きい分子量を有する生体高分子の細胞内送達のために上首尾に使用されている。（リンドグレン（Ｍ．Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、２０００、細胞侵入ペプチド（Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；ＴＩＰＳ、２１巻、ｐ．９９−１０３）
【０００４】
これらの細胞侵入ペプチドを使用する細胞送達は従来の方法にまさる幾つかの利点を有する。それは非侵襲的、エネルギー非依存性であり、広範囲の細胞型において有効であり、全ての細胞に適用できる。さらに、幾つかの種類のＣＰＰｓでは細胞インターナリゼーションが３７℃でも４℃でも同様に起こり、飽和することがないことが判明した。また大部分の場合に、そのインターナリゼーションはキラル受容体蛋白質を必要としないようにみえる。なぜならば光学異性的差別が認められないからである。
【０００５】
最近まで、細胞膜を破壊せずに親水性生体高分子を生体細胞の細胞質−および核コンパートメントに運搬することは遥かに遠くの目標であるように見えた。ポリペプチド類およびオリゴペプチド類は、生体膜透過性が低く、比較的速やかに分解するために、治療的価値は制限されると一般的に考えられていた。これは生医学的研究並びに製薬工業の両方において一つの障害である。
【０００６】
非常に重要な仕事であるとはいえ、さらにより困難なことは、親水性生体高分子を血液脳障壁を通過して送達することである。この関門を越えるために幾つかの方法が推奨された。にもかかわらずそれら全てに、その効果がある分子サブセットに限定されるとか、それらの収率が低すぎるなどの制限がある。しかし最近の報告は、ＣＰＰｓが生体高分子を血液−脳障壁を通って運搬し得ることを示唆している。
【０００７】
エフェクタ類の所望の送達のためのもう一つの重要な領域は、核内輸入である。その際シグナル配列がある正電荷を担った（塩基性）残基を含まなければならないことは一般に知られている（モロイアヌ（Ｍｏｒｏｉａｎｕ  Ｊ．）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９９）。このような帯電アミノ酸は細胞膜転位のためにも必要であるようにみえる。
【０００８】
今日では、細胞侵入ペプチド、ＣＰＰｓの送達は知られている。数種のペプチドが見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を経て転位することが証明された。こうして細胞侵入ペプチドは、ペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子など薬物学的に興味深い物質類の送達ベクターとして、並びに研究ツールとして使用できるかも知れない。
【０００９】
ＣＰＰｓの中で特に興味深いのは、低い溶解（ｌｙｔｉｃ）活性を有するペプチド類である。トロジャン・ペプチドとしても知られているこれら転位ペプチド（デロッシ（Ｄ．Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８（１９９８）ｐ．８４−８７）は、インビボおよびインビトロの両方において、親水性生体分子および薬剤を細胞の細胞質−および核コンパートメントに送達するためのベクターとして利用された（リンドグレン（Ｍ．Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．２１巻（２０００）ｐ．９９−１０３）。それ自体の分子量の何倍も大きい分子量を有するポリペプチドおよびオリゴペプチドなどのカーゴと共有結合した場合でもこれらペプチドは転位することができる。
【００１０】
有用な運搬ペプチドの例は、ある種の転写因子のホメオドメインから誘導される配列、並びにシグナル配列をベースとしたいわゆるＴａｔ−誘導ペプチド類である。ホメオドメインから誘導された転位ペプチドの最初のものはｐＡｎｔｐと記載されるペネトラチンであった。これはドロソフィラのアンテナペディナ・ホメオドメイン蛋白質からの第三α−ヘリックス（残基４３−５８）の１６残基に対応する配列を有する（デロッシら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻（１９９４）ｐ．１０４４４−１０４５０；プロキアンツ（Ａ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ）、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８６巻（１９９９）ｐ．１７２−１７９を参照されたい）。ｐＡｎｔｐペプチドはその膜転位特性を保有し、そのため普遍的細胞内送達ベクターであると提唱されてきた（デロッシら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８巻（１９９８）ｐ．８４−８７）。
【００１１】
純粋に合成されたペプチド、またはキメラ−ペプチドも文献に参照されるように（デロッシら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８巻（１９９８）ｐ．８４−８７；リンドグレンら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１巻（２０００）ｐ．９９−１０３）設計された。
【００１２】
非天然ペプチドなどのトランスポータンは、それ自体は３ｋＤペプチドに過ぎないのに、約１５０ｋＤａの分子量を有する抗体分子を細胞膜を経て送達することができる。トランスポータンおよびペネトラチンは非天然ＤＮＡ類似体、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を培養細胞の細胞質および核内に送達することが証明された（プーガ（Ｐｏｏｇａ）ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。
【００１３】
驚いたことに、疎水性部分に結合した際に細胞膜を通過して運搬できることが証明されたまた別の群のペプチドは、ペプドゥシンと呼ばれる修飾受容体、特にＧ蛋白質結合受容体である（ＷＯ０１８１４０８、クリオプロス（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ）ら、を参照されたい）。７ＴＭ受容体の第三細胞内ループから誘導されるペプチドに疎水性部分を結合させると、前記キメラペプチド類の細胞内転位および受容体Ｇ−蛋白質シグナリングの完全アゴニストおよび／またはアンタゴニストの細胞内転位が起きることが発見された。これらペプドゥシンは膜侵入性、膜結合性キメラペプチドであり、活性をあらわすためにはそれらの同種受容体の存在を必要とし、受容体型に対して非常に選択的である。
【００１４】
驚くほどの運搬能力のために、ＣＰＰｓは近年、科学的関心の的になったとはいえ、種々のＣＰＰｓの転位の最も基礎的なメカニズムはいまだに知られていない。例えば、転位を許す（エネルギー的に）ためには何らかの特別の二次構造、例えば同時に起きる一過性の膜不安定化などが誘導されなければならないのか否かはこの分野ではいまだに知られていない。しかしペプチド−膜相互作用の分子レベルでの詳細が転位プロセスのための基礎的重要事項であることは明らかである。
【００１５】
インターナリゼーションのメカニズムよび必要事項が両親媒性α−ヘリカルペプチドと脂質（二）層との相互作用に関して研究された。これらの研究結果のなかには、トリプトファンがペプチドのインターナリゼーションを起こすことを示唆するものが多い。しかし芳香族アミノ酸がＣＰＰ配列に優勢であるとはいえ、それらは細胞侵入に絶対に必要というわけではない。
【００１６】
細胞侵入能力とは別に、ＣＰＰｓ間に構造または挙動の相関関係はほとんど認められていない。したがって現在までＣＰＰｓは合理的方法では設計されず、偶然に発見されていた。しかしこれまでに公表されたＣＰＰｓの配列は唯一の共通的特徴として正の正味電荷を有し、これが所定のペプチド配列におけるＣＰＰ機能性を予測するための出発点となった。しかし正の正味電荷を有する配列が全て細胞侵入性ではあり得ないことは明らかであり、確実にＣＰＰｓを選択するためにはさらなる制限が必要であることが示唆される。
【００１７】
本発明は始めて、一揃いの新規の予測／選択クリテリアの適用によって特徴づけられる細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体を予測し、設計し、検出し、および／または証明するための新規の一般的原理を、任意に前記の発見されたＣＰＰのインビトロおよび／またはインビボ細胞侵入能力の試験法と組み合わせて提供する。
【００１８】
本発明は、これまで疑いもなく非常に大きい困難を伴って、トライアルおよび誤差を繰り返しながら見いだされてきたＣＰＰ活性天然発生性ペプチドフラグメント類の、非常に効果的かつ正確な選択を容易にするだけでなく、そのような所望のＣＰＰを新たに設計することを始めて全面的に可能にするものでもある。そのこと以上に、本発明は正しく予測された天然発生性ＣＰＰを、その細胞侵入効果を改善するようにまたはその細胞侵入能力を失うことなく第二の特殊な要求に合うように修飾することを始めて可能にするものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は新規の予測／選択クリテリアの適用によって特徴づけられる細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）および／またはその非ペプチド類似体を予測し、設計し、検出し、および／または証明するための方法に関係し、前記方法は任意に、前記発見されたＣＰＰのインビトロおよび／またはインビボ細胞侵入能力の試験法と組み合わせられる。
【００２０】
したがって本発明の統一的局面は、細胞侵入アミノ酸フラグメントの確認法であって、前記配列のバルク特性値ＺΣを評価することを含んでなる前記確認法に関係する。ＺΣは少なくとも５個の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５は前記アミノ酸配列の残基のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算される
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子値であり、その際各残基の記述子値は記述子値スケールのＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応し、細胞侵入フラグメントは、実質的に個々の平均区間値、すなわちＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられる。
【００２１】
本発明の現在好ましい実施形態において、上記の選択クリテリアはさらに記述子区間を連続的に狭化するための３段階のシステムによって補強され、その際次の２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（例えばＣ、Ｎ、ＳおよびＯ）の数であり、ｈｄｂはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数をあらわす。
【００２２】
本発明はさらに、前記新規ＣＰＰの使用法および／または前記ＣＰＰに結合する細胞エフェクタの細胞内取り込みを改善するための公知のＣＰＰの新規および改善された使用にも関係し、細胞エフェクタ活性自体を有する新規の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を予測、検出、設計および／または証明するための方法にも関係する。さらに本発明は医学的障害を治療および／または予防するために、および／または医学的障害を治療する医薬組成物を製造するために前記ＣＰＰおよび／または改善された公知のＣＰＰを使用することにも関係する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は始めて、新規の予測／選択クリテリアの使用によって特徴づけられる細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体を予測し、設計し、検出し、および／または証明するための新規の一般的原理を、任意に、新たなランダム配列または天然発生性蛋白質またはその非ペプチド類似体から誘導される前記発見されたＣＰＰの細胞侵入能力をインビボおよび／またはインビトロで試験する方法と組み合わせて開示する。
【００２４】
細胞侵入ペプチド類の機能に対して有効なプレディクタの評価
大部分のペプチドの定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）の研究においては、一組の無次元値を用いてアミノ酸の物理的特徴の合成物をあらわす。典型的文献において、３数値、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３がこの目的のために用いられる。最近、Ｗｏｒｌｄ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓはこの記述子セットに次の２つをさらに加えた：Ｚ４およびＺ５；そして８７の天然および非天然アミノ酸を網羅する記述子スケールを作成した（サンドバーグ（Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．）、エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｌ．）、ジョンソン，Ｊ（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｊ．）ショーストロム（Ｓｊ  ｓｔｒ  ｍ，Ｍ．）、およびワールド（Ｗｏｒｌｄ，Ｓ．）；生物学的活性ペプチドの設計のために有効な新しい化学的記述子。８７アミノ酸の多変数特徴づけ（Ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ８７  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１巻、２４８１（１９９８））。
【００２５】
本出願に記載される新規の方法は前記拡大ＱＳＡＲ記述子スケールを使用して任意の与えられた天然発生性ペプチドのＣＰＰ機能性を評価し、またはＣＰＰを新たに設計することを含む。このように前記の新しい方法は、天然並びに非天然構造ブロックからなるＣＰＰｓの生成に速やかかつ確実な道をつけるものである。さらに、ここに開示される種々の物理的試験によるＣＰＰ取り込みの精密な定量は組織特異性のためのＱＳＡＲモデルも可能にする。
【００２６】
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表１Ａに列挙した拡大記述子スケールを使用して、発明者らは４種類の公知の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）：トランスポータン、ペネトラチン、ｐＶＥＣおよびＭＡＰについて、その配列のアミノ酸の総数を平均化した５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を組み立てた。
【００２７】
トレーニングセットから得られる下記の式で計算された、
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を表１Ｂに列挙する。
【００２８】
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結果として、発明者らは、ＺΣバルク特性値に基づく細胞侵入アミノ酸フラグメントが、実質的に個々の平均区間数値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられることを確認できた。この際ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である。
【００２９】
したがって本発明は潜在的細胞侵入ペプチドを予測、検知および／または証明する最初の方法であって、蛋白質またはペプチドのアミノ酸配列を知り、少なくとも１つの候補フラグメントのアミノ酸配列を選択し、前記配列のバルク特性値ＺΣを評価し、その際ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、その際ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は、式
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
で計算される、前記アミノ酸配列における残基類のそれぞれの記述子の数値の平均値であり、Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子の数値であり、各残基の記述子の数値は表１Ａに列挙したような記述子値スケールにおける記述子値Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５に対応し、ＺΣバルク特性値に基づいて前記少なくとも１つの候補フラグメント（類）から細胞侵入フラグメントを確認することを含む前記方法を開示する。細胞侵入フラグメントは本発明においては実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、その際ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である。任意に前記確認されたペプチドまたは蛋白質および／または前記フラグメントの前記細胞侵入能力はインビトロおよび／またはインビボ法によってさらに証明される。
【００３０】
その上、細胞侵入活性をあらわすために所定のペプチドの必要な性質を始めて確認することによって、本発明は結果的に多数のＣＰＰｓを新たに設計することを可能にする；それらは必ずしも天然発生対応物をモデルにする必要はなく、その他の任意の所望パラメータを考慮して、例えばあるサイズ、所定のｐＨ環境、体内における分解性、または所定の標的細胞／組織または器官に与える生物学的効果にしたがって設計できる。
【００３１】
本発明のまた別の現在好ましい実施形態において、上記の選択クリテリアはさらに、記述子区間を逐次的に狭くする三段階システムによって補強され、２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（Ｃ、Ｎ、ＳおよびＯ）であり、ｈｄｂはアミノ酸側鎖のための受け入れる水素結合の数をあらわす。
【００３２】
2006514602.tif 000010
【００３３】
補充された選択クリテリアはＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣＢｕｌｋｈａおよび正味水素結合授与（ｈｄｂ）および平均ｈｄｂ  ＺΣｈｄｂを使用する。
Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の原子数として計算されるが、水素は数えない。例えばＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（セリン）ではＢｕｌｋｈａ＝２＊Ｃ＋１＊Ｏ＝３である。前記アミノ酸配列中の残基類において、ＺΣＢｕｌｋｈａはアミノ酸側鎖の、水素以外の原子数の平均値であり、式
ＺΣＢｕｌｋｈａ＝（ＺＢｕｌｋｈａｒｅｓ１＋ＺＢｕｌｋｈａｒｅｓ２・・・＋ＺＢｕｌｋｈａｒｅｓｎ）／ｎ
で計算される。ＺＢｕｌｋｈａｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれのＢｕｌｋｈａ値である。
【００３４】
ｈｄｂは側鎖の授与水素結合−受容水素結合として計算される。例えばＮ−−−Ｈは与え、Ｃ＝Ｏは受容する。同じ組（セット）において水素結合の使用法は２つあり、総合（ｈｄｂ）と平均（ＺΣｈｄｂ）である。ＺΣｈｄｂは、前記アミノ酸配列中の残基類において、側鎖の授与水素結合−受容水素結合の数の平均値であり、下記の式によって計算される
ＺΣｈｄｂ＝（Ｚｈｄｂ ｒｅｓ１＋Ｚｈｄｂ ｒｅｓ２・・・＋Ｚｈｄｂ ｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｈｄｂ ｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれのｈｄｂ値である。
【００３５】
前記三段階は記述子区間の逐次狭化を示す。これら段階のパフォーマンスは表１１からわかる。つまり、段階が高ければ高いほど、予測されたＣＰＰが“偽（ｆａｌｓｅ）"陽性である機会は低くなる。したがって段階３（２＞）に入るアミノ酸配列は、その後ｉｎ  ｖｉｔｏまたはインビトロで試験した際、実質的に比較的高度な細胞侵入能力を表わすと期待される。
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【００３６】
陽性とはＣＰＰトレーニングセットに対応し、陰性とは非機能的ＣＰＰ類似体トレーニングセットに対応し、無関係（ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）とはホルモントレーニングセットに対応する。表１２の“トレーニングセット"２を参照されたい。
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選択クリテリアの第一組について既述したように、ペプチドの数値は平均値である（ペプチド中のアミノ酸残基の数で割ったもの）。ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣＢｕｌｋｈａ、ＺΣｈｄｂ
【００３７】
異なる段階の区間は：
３：好ましい：ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．１およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜８．１３、ＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜３．５２、ＺΣ２＞−３．９およびＺΣ２＜３．１、ＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−３．５１、ＺΣｈｄｂ＞−０．１１５およびＺΣｈｄｂ＜５．１、およびｈｄｂ＞０およびｈｄｂ＜８４。
２：より好ましい：ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜５．９、ＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜１．９２、ＺΣ２＞−１．２２およびＺΣ２＜１．２９、ＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−１．９４、ＺΣｈｄｂ＞０．２８およびＺΣｈｄｂ＜２、およびｈｄｂ＞５およびｈｄｂ＜３０。
１：最も好ましい：ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜４．８、ＺΣ１＞−１．１およびＺΣ１＜１．９２、ＺΣ２＞−１．１およびＺΣ２＜０、ＺΣ３＜−０．５５およびＺΣ３＞−１．９４、およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜１．５７、およびｈｄｂ＞７およびｈｄｂ＜２５。
【００３８】
思いがけなく発見された数種のＣＰＰｓ、例えばトランスポータン、ペネトラチンおよびｔａｔなどで証明されたように、元の配列を短縮しても活性ＣＰＰは与えられる。これは、以前に発見されたＣＰＰｓが運搬体“モータ"として作用する、より短い配列を含むことを示唆する。これを考慮すると、本発明の第二の局面は、あるペプチドまたはペプチドのより短いフラグメント、例えば公知ＣＰＰからのフラグメントなどの細胞侵入特性をチェックする方法であって、そのペプチドのアミノ酸配列を得る段階、前記配列のバルク特性値ＺΣを評価する段階であって、その際ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は前記アミノ酸配列の残基のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算され
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子値であり、その際各残基の記述子値は表１Ａに列挙される記述子値スケールのＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応する前記段階、および前記ペプチドの細胞侵入特性をそのＺΣバルク特性値に基づいてチェックする段階であって、その際細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値によって特徴づけられ、ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である段階、前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離する段階、および任意に、合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボ法によって証明する段階を含んでなる方法に向けられる。ここで再び任意に、上記の選択クリテリアを記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムによって補強することができ、その際上記のように２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（Ｃ、Ｎ、Ｓ、およびＯ）の数であり、ｈｄｂはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数を示す。
【００３９】
本発明には、細胞侵入ペプチドおよび機能的蛋白質模擬ペプチドを生産する次の諸段階を含んでなる方法も含まれる：実質的に、対象とする機能的蛋白質を選択し、前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定し、前記蛋白質の細胞内部分に対応する少なくとも１つの候補フラグメントのアミノ酸配列を選択し、前記配列のバルク特性値ＺΣを測定し、その際ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は前記アミノ酸配列の残基のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算され
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子の値であり、その際各残基の記述子の値は表１Ａに列挙される記述子値スケールのＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応し、および前記少なくとも１つの候補フラグメント（類）からの細胞侵入フラグメントをそのＺΣバルク特性値に基づいて確認し、その際細胞侵入フラグメントは、実質的に、ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられる。最後に、前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、任意に、前記合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボの方法によって証明する。また任意に、記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムによって上記の選択クリテリアを補強することができ、上記のように次の２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（Ｃ、Ｎ、Ｓ、およびＯ）の数であり、ｈｄｂはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数を示す。
【００４０】
また別の好ましい実施形態において、本発明はＣＰＰペプチドまたはフラグメントを新たに設計および生産することを含み、その際前記フラグメントが天然に発生するＣＰＰに類似していてもよいし、および／または天然に発生する細胞エフェクタペプチドを模するように設計してもよく、または、主として所定の長さのランダムアミノ酸配列の予測細胞侵入能力を考慮して前記フラグメントを実質的にランダムに設計してもよく、その方法は前記配列のアミノ酸配列を設計し、前記配列のバルク特性値ＺΣを評価する工程を含み、その際ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は前記アミノ酸配列の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算され
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子の値であり、各残基の前記記述子値は表１Ａに列挙される記述子値スケールのＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応するものであり、前記ペプチドの細胞侵入特性をそのＺΣバルク特性値に基づいてチェックし、その際細胞侵入フラグメントは実質的に、ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、さらに前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、および任意に、合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボの方法によって証明する諸工程を含む。また、任意に、記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムによって上記の選択クリテリアを補強することができ、その際上記のように次の２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（Ｃ、Ｎ、Ｓ、およびＯ）の数であり、ｈｄｂはアミノ酸の側鎖のための受容水素結合の数を示す。
【００４１】
本発明のまた別の同様に好ましい実施形態は、人工的細胞侵入ペプチドおよび／または人工的細胞侵入ペプチドおよび機能的蛋白質模擬ペプチドの製法であって、少なくとも１種類の人工的ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントを設計し、前記人工的ペプチドまたはペプチドフラグメントのアミノ酸配列のバルク特性値ＺΣを評価し、その際ＺΣは少なくとも５つの個々の平均区間値ＺΣ１；ＺΣ２；ＺΣ３；ＺΣ４およびＺΣ５を含み、ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣ４およびＺΣ５は前記アミノ酸配列の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算され
ＺΣＸ＝（Ｚｘｒｅｓ１＋Ｚｘｒｅｓ２・・・＋Ｚｘｒｅｓｎ）／ｎ
Ｚｘｒｅｓｙは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基ｙのそれぞれの記述子の値であり、各残基の前記記述子の値は表１Ａに列挙される記述子値スケールのＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５記述子値に対応するものであり、前記人工的ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの細胞侵入特性をそのＺΣバルク特性値に基づいてチェックし、その際細胞侵入フラグメントは、実質的に、ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値によって特徴づけられる諸工程を含む製法に関係する。この製法はさらに、細胞侵入性であることが確認されたアミノ酸配列を含む前記ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントを合成し、任意に、その合成されたペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの蛋白質模擬機能性および／または細胞侵入能力をインビトロおよび／またはインビボの方法によって証明することも含む。また任意に、記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムで上記の選択クリテリアを補強することができ、その際上記のように次の２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（Ｃ、Ｎ、Ｓ、およびＯ）の数であり、ｈｄｂはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数を示す。
【００４２】
本発明の範囲において、細胞侵入フラグメントは、最も好ましくはＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である実質的に個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値を有することによって特徴づけられる。本発明のまた別の実施形態において、前記個々の平均値は、ＺΣ１＜０．３、例えばＺΣ１＜０．２１、ＺΣ１＜０．２２、ＺΣ１＜０．２３、ＺΣ１＜０．２４、ＺΣ１＜０．２５、ＺΣ１＜０．２６、ＺΣ１＜０．２７、ＺΣ１＜０．２８、またはＺΣ１＜０．２９；
ＺΣ２＜１．２、例えばＺΣ２＜１．１１、ＺΣ２＜１．１２、ＺΣ２＜１．１３、ＺΣ２＜１．１４、ＺΣ２＜１．１５、ＺΣ２＜１．１６、ＺΣ２＜１．１７、ＺΣ２＜１．１８、またはＺΣ２＜１．１９；
ＺΣ３＜−０．３９、例えばＺΣ３＜−０．４、ＺΣ３＜−０．４１、ＺΣ３＜−０．４２、ＺΣ３＜−０．４３、ＺΣ３＜−０．４５、ＺΣ３＜−０．４６、ＺΣ３＜−０．４７、ＺΣ３＜−０．４８；
ＺΣ４＜０．４３、例えばＺΣ４＜０．３４、ＺΣ４＜０．３５、ＺΣ４＜０．３６、ＺΣ４＜０．３７、ＺΣ４＜０．３８、ＺΣ４＜０．３９、ＺΣ４＜０．４、ＺΣ４＜０．４１、またはＺΣ４＜０．４２；
ＺΣ５＜１．０５およびＺΣ５＞０．２２、例えばＺΣ５＜１．０４およびＺΣ５＞０．２１、ＺΣ５＜１．０３およびＺΣ５＞０．２０、ＺΣ５＜１．０２およびＺΣ５＞０．１９、ＺΣ５＜１．０１およびＺΣ５＞０．１８、ＺΣ５＜１．００およびＺΣ５＞０．１７、ＺΣ５＜０．９９およびＺΣ５＞０．１６、ＺΣ５＜０．９８およびＺΣ５＞０．１５、ＺΣ５＜０．９７およびＺΣ５＞０．１４、またはＺΣ５＜０．９６およびＺΣ５＞０．１３；
を含むことができる。
【００４３】
現在好ましい実施形態において、前記細胞侵入フラグメントはその他にまたはその代わりに、実質的に下記に示す個々の平均区間値からなる上記のような記述子値によって特徴づけられる：最も好ましくはＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．１およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜８．１３、およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜３．５２、ＺΣ２＞−３．９およびＺΣ２＜３．１、ＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−３．５１、およびＺΣｈｄｂ＞−０．１１５およびＺΣｈｄｂ＜５．１、およびｈｄｂ＞０およびｈｄｂ＜８４であり；またはＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜５．９、およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜１．９２、およびＺΣ２＞−１．２２およびＺΣ２＜１．２９、およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−１．９４、およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜２、およびｈｄｂ＞５およびｈｄｂ＜３０であり、
最も好ましくは；ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜４．８、およびＺΣ１＞−１．１およびＺΣ１＜１．９２、およびＺΣ２＞−１．２２およびＺΣ２＜０、およびＺΣ３＜−０．５５およびＺΣ３＞−１．９４、およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜１．５７、およびｈｄｂ＞７およびｈｄｂ＜２５である。
【００４４】
さらに、本発明の方法によって見いだされ、設計されおよび／または証明されたＣＰＰの配列の任意の保存的変異体および本発明の方法によって見いだされ、設計されおよび／または証明されたＣＰＰの任意の細胞膜侵入類似体は前記ＣＰＰとの機能的関連性によって、本発明の範囲内であると考えられる。
【００４５】
本発明の範囲において、ある配列の保存的変異体とは、異なる種の間で同じアミノ酸配列の変異体を比較した際に少なくとも７０％、例えば７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％保存されているアミノ酸配列と定義される。ある変異体の保存程度は当業者には公知のように、そのＰＡＭ誘導によって計算でき（デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）およびオルカット（Ｏｒｃｕｔｔ）（１９７８）、Ａｔｌａｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑ．Ｓｔｒｕｃ．５巻：ｐ．３４５−３５２）、またはヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（１９９２）のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９巻（２２号）：ｐ．１０９１５−９に記載されるようにブロック（Ｂｌｏｃｋｓ）データベースから誘導される配列ブロックの比較に基づいて計算できる。  
【００４６】
保存的置換は例えば下の表１７によって行われる。第二欄の同じブロック中、およびより好ましくは第三欄の同じラインのアミノ酸が互いに置換される：
2006514602.tif 000015
【００４７】
このような置換は非天然アミノ酸によっても行われ；アルファ＊およびアルファ−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハリド誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊など、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−ａ−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ｇ−アミノ酪酸、Ｌ−ａ−イソ酪酸、Ｌ−ｅ−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルフォン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊など、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−メチル−イソプロピル）＊Ｌ−Ｔｉｃ（１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊。記号＊はここでは誘導体の疎水性を示し、＃は誘導体の親水性を示す。＃＊は両親媒性を示す。
【００４８】
変異体アミノ酸配列は配列の任意の２アミノ酸残基の間に挿入できる適切なスペーサ基を含むことができる。それらにはグリシンまたはｂ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサに加えて、メチル、エチルまたはプロピル基などのアルキル基が含まれる。その他の変異型には、当業者には公知のように、ペプトイド型の１個以上のアミノ酸残基の存在が含まれる。念のために、“ペプトイド型"とは、ａ−炭素置換基がα−炭素ではなく、むしろその残基の窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を指す用語である。ペプトイド型のペプチドの製法は当業者には公知である。例えばシモン（Ｓｉｍｏｎ  ＲＪ）ら、ＰＮＡＳ（１９９２）８９巻（２０号）、９３６７−９３７１ページおよびホーウエル（Ｈｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３巻（４号）、ｐ．１３２−１３４を参照されたい。
【００４９】
本発明のペプチド類は実質的に分離された型である。ペプチドは、そのペプチドの意図する目的を妨害しない担体または希釈剤と混合することができ、それでも実質的に分離されていると見なされることは当然である。本発明のペプチドは実質的に精製した形でもよい；その場合、製剤中の蛋白質の９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％が本発明のペプチドであるように、そのペプチドまたはそのペプチドのフラグメントが製剤中に含まれるのが普通である。
【００５０】
さらに、実質的に個々の平均区間値（ＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜０．３３；およびＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２）からなるＺΣバルク特性値を有することによって、または段階１、２、または３に適合することによって特徴づけられ、本発明の方法によって上記のように評価され、検出され、設計されおよび／または証明されたＣＰＰのアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％一致する任意のアミノ酸配列も本発明の範囲内であると考えられる。
【００５１】
基準アミノ酸配列に例えば少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、基準アミノ酸配列の１００アミノ酸につき５までの点突然変異を含むことを除けば、基準配列に一致することを意味する。言い換えれば、基準アミノ酸配列に少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、基準アミノ酸配列の５％までのアミノ酸が欠失したり、その他のアミノ酸で置換されてもよく、または基準配列中の総アミノ酸の５％までの数のアミノ酸が基準配列に挿入されてもよい。基準配列のこれらの突然変異は基準アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置間の任意の位置に起こり、基準配列中のアミノ酸内に個々に、または基準配列内の連続基の１つ以上に点在することができる。
【００５２】
本発明において、同一性を確認するには局所アルゴリズムプログラムが最も適している。（スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ））のような局所アルゴリズムプログラムはある配列における結果を第二配列における結果とを比較し、全体的最大類似スコアを与える結果の組み合わせおよびこれら結果の整合性を見いだす。内部ギャップは、もしあるならばペナルティを課す。局所アルゴリズム作業は、単一ドメインを有するか、または共通の１つの結合部位を有する２つのマルチドメイン蛋白質を比較するために適する。
【００５３】
同一性および類似性を決定する方法は一般に使用できるプログラムにコード（体系化）されている。２つの配列の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラムの方法には、非制限的に、ＧＣＧプログラム・パッケージ（デヴェロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２巻（１号）：３８７ページ（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：ｐ．４０３−４１０（１９９０））などがある。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから一般的に提供される（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド、２０８９４；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻；ｐ．４０３−４１０（１９９０））。各配列分析プログラムは既定のスコアリングマトリックスおよび既定のギャップ・ペナルティを有する。概して、分子生物学者は使用するソフトウエア・プログラムによって確立された既定値設定を使用すると予想される。
【００５４】
本発明に関連して、アミノ酸はアミノ（−ＮＨ２）およびカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を含む任意の有機化合物である。アミノ酸はＬ−型でもＤ−型でもよい。現在、ｍＲＮＡのリボソーム翻訳中に蛋白質を合成する公知のコーデドα−アミノ酸が２２種類ある。それに加えて、非常に多数の非コーデドアミノ酸が定常的にあらわれており、そのうちの５６例が表１Ａに示される。コーデドおよび非コーデドアミノ酸は、本発明に含まれるアミノ酸配列、ペプチドフラグメント類、ペプチド類、蛋白質類および／またはポリペプチド類の一部であることは当然である。
【００５５】
本発明に関連して、アミノ酸配列とはペプチドフラグメント、ペプチド、蛋白質またはポリペプチド中に精確に決められた順序で線状に配列するアミノ酸（コーデドおよび／または非コーデドアミノ酸を両方含む）である。
【００５６】
用語“非ペプチド類似体"は、本発明に関連して、少なくとも１つの非コーデドアミノ酸を含み、および／または主鎖修飾を有し、その結果ペプチド結合（すなわち１つのアミノ酸のカルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基との間に形成されるＣＯ−ＮＨ結合）のないアミノ酸配列を生成する、任意のアミノ酸配列である。
【００５７】
さらに、本発明のアミノ酸配列はアミド化されていてもよく、遊離酸として生成してもよい。
【００５８】
異なる特性のリポータ基、例えばビオチンおよび種々のフルオロフォア類、例えばフルオレセイン、アミノ安息香酸およびローダミン類など、を予測ＣＰＰに結合させて、その細胞転位および効率を推定することができる。
【００５９】
本発明は新規のＣＣＰおよび／または公知ではあるが改善されたＣＣＰの細胞侵入能力を効率的に速く、確実に証明するための、および広範囲の種々のＣＣＰｓの細胞内取り込みをインビトロおよびインビボでスクリーニングするための方法を開示する。本発明は一実施形態において、細胞をペプチドおよび／またはペプチドフラグメントに曝露した後に前記ペプチドの前記細胞内への取り込み率をモニターすることによって、前記ペプチドおよび／またはペプチドフラグメントの細胞侵入能力を証明する方法に関係する。特に適切な実施形態において、本発明は、ＣＣＰそれ自体を蛍光検出マーカーなどの追跡可能マーカーに結合させ、細胞内取り込みが起きた後に標的細胞を免疫組織学的に染色することによって前記マーカーが検出できるという方法に関係する。
【００６０】
これらの方法の例証的例は実施例１０および実施例１６に記載される。
【００６１】
したがって本発明の一つの局面は、広範囲の種々のＣＣＰｓの細胞内取り込みをインビトロでスクリーニングする方法であって、細胞をガラスカバースリップ上で、適切な、例えば５０％密度にまで増殖させ、その後培地を変えて無血清にし、ビオチニル化ペプチド溶液を加えるという方法を含む。細胞をその後インキュベートし、洗い、固定し、そのペプチドを例えばアビジン−ＦＩＴＣ、またはストレプトアビジン−ＴＲＩＴＣで染色して可視化し、細胞の核を例えばヘキストで対染色する。蛍光顕微鏡で画像を生成し、評価するのが好ましい。
【００６２】
用語、ペプチドの“細胞侵入能力"とは、以後、細胞膜を経て真核細胞および／または原核細胞の細胞質および／または核コンパートメント、例えば細胞形質、核、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび／または葉緑素、などに見かけ上エネルギー非依存的に転位する能力、と同意義に用いられる。追加的に、用語、ペプチドの“細胞侵入能力"は本発明のある局面においては、細胞貫通または膜貫通輸送と同意義にも用いられ、したがって、腸／頬系の上皮などの上皮膜、口腔、肺、直腸または鼻の粘膜、または哺乳動物の血液−脳障壁を通過する転位能力も表す。
【００６３】
本発明により細胞侵入能力をあらわす検出された、または新たに設計され、証明されたペプチドは、本発明に関連して“細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）"と定義され、例えば、それ自体の分子量より数倍大きい分子量をもつポリペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチドなどの生体高分子を細胞内に送達するために使用できる。
【００６４】
概して細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体を使用する細胞内送達は非侵襲的、エネルギー非依存的であり、広範囲の細胞型および／または非常に種々様々のカーゴにとって効率的であり、全ての細胞に適用でき、飽和せず、受容体非依存性である。  
【００６５】
本出願に開示される方法によって見いだされるかまたは新たに設計され、および／または証明されたＣＰＰｓは親水性生体高分子を生体細胞および／または微生物の細胞質および核コンパートメントに、細胞膜を恒久的に破壊することなく輸送するのに有用であり、血液−脳障壁を介して親水性生体高分子を送達し、共役オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドおよび薬剤類の細胞内輸送を可能にするために有用である。
【００６６】
こうして本発明に関連して、細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が任意の薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、低分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または任意の人工的または部分的人工的核酸、例えばＰＮＡ、の送達ベクターとして、並びに、タグやマーカーなど送達のための研究ツールとしておよび／または膜ポテンシャルおよび／または特性を変化させるための研究ツールとして使用できる。
【００６７】
したがって本発明によって見いだされまたは設計および／または生産されるＣＰＰは親水性生体分子および／または薬剤を細胞および／または組織の細胞質および核コンパートメントに送達するためのベクターとしてインビボおよびインビトロの両方に用いられる。
【００６８】
ＣＰＰ自体の分子量より何倍も大きい分子量を有する任意のペプチド、ポリペプチド、蛋白質、低分子物質、薬剤、ポリペプチドおよびオリゴペプチドを含むカーゴ（ｃａｒｇｏ）と共有結合した場合でも、ＣＰＰは転位することができる。
【００６９】
その上、ＣＰＰはそれ自体細胞内および／または細胞外エフェクタ活性を示し、細胞侵入機能的蛋白質模擬ペプチドとして働くことができ、または新たに設計され、新しい予想もできない機能をあらわすことがある。
【００７０】
天然に発生する細胞エフェクタから生成し、標的細胞に転位した後その本来のカウンターパートの生物学的活性を実質的に保持することが判明している多くの種々の分子類が技術的分野に存在する（クリオパルス（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ）ら、ＷＯ０１８１４０８；またはコヴィク（Ｃｏｖｉｃ）ら、２００２、ＰＮＡＳ  ９９巻などを参照されたい）。それにもかかわらず、これらの中でＣＰＰでもあり同時に生物学的エフェクタでもあるものは一つもない。一般的に、短縮ペプチドが公知のＣＰＰに、または疎水性部分に結合し、したがって種々の中間的合成工程および費用のかかる複雑な製法が必要である。
【００７１】
本発明に関連する細胞侵入性機能的蛋白質類似ペプチドはその本質的ＣＰＰ能力のために、ホスト細胞に取り込まれ、ひとたびホスト細胞内に入ると、そのペプチドを発生した本来の蛋白質またはペプチドの活性を模する活性をあらわし、或いはそのペプチドの設計の目標となったすぐれた蛋白質またはペプチドの活性を模する活性をあらわす。そのため細胞侵入性機能的蛋白質様ペプチドは、それが由来する活性化機能的蛋白質と類似して、“それ自体がエフェクタ活性を有し、内部および／または外部シグナリング経路および／またはカスケードを活性化または不活性化するＣＰＰ"と定義される。したがってそれは細胞侵入能力も、エフェクタおよび／または機能的蛋白質模擬活性も有すると特徴づけられる。
【００７２】
細胞エフェクタは本明細書では細胞内および／または細胞外エフェクタであり、本発明に関連して、収縮、分泌、電気インパルス、または細胞内および／または細胞外シグナリング・カスケードの活性化または不活性化などの細胞効果を生み出す構造、または前記エフェクタによる刺激に応えてｍＲＮＡおよび／または蛋白質の細胞レベルのアップレギュレーションを誘発する構造と定義される。典型的エフェクタは本発明に関連して、代謝産物、アンタゴニスト、アゴニスト、受容体・リガンド、受容体結合蛋白質、活性化受容体、酵素インヒビタ、アクチベータ／インアクチベータおよび／またはスティミュレータ、キナーゼ、ホスファターゼ、エンハンサ、またはサイレンサ、転写因子、トランスポータおよび／またはトランスミッタ、ホルモン、チャンネル、イオン、プリオン、およびウィルス蛋白質からなる群から選択される。
【００７３】
本発明の方法によって見いだされ、証明される典型的ＣＰＰは非常に種々様々の蛋白質および／またはペプチドから誘導することもできるし、これらに似るように設計してもよい。一実施形態において、前記蛋白質および／またはペプチドは膜貫通蛋白質であり、また別の実施形態においてはそれは膜非結合性蛋白質でもよい。
【００７４】
したがって本発明の一つの局面は、転写因子から誘導された、本発明による方法によって見いだされ、証明された細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド、または転写因子、または少なくとも転写因子の機能的フラグメントに酷似するように設計された細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチドに関係する。
【００７５】
このため、本発明の好ましい実施形態は本発明による方法によって、そして上記のように見いだされ、証明される、配列番号１８３９９−３１８３９に含まれる任意のＣＰＰに関係し、その際各ＣＰＰは天然に発生する転写因子から誘導される。
【００７６】
しかし現在のところ、本発明の方法によって見いだされ、証明されるＣＰＰが膜関連性受容体または受容体アゴニストおよび／またはアンタゴニストのような、膜貫通蛋白質から誘導され、または前記膜貫通蛋白質に似るように設計されることが最も好ましい。細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチドはこの実施形態ではマクロファージ関連性受容体から誘導されるか、膜関連性受容体、または少なくとも膜関連性受容体のフラグメントに酷似するように設計されるのがより好ましい。
【００７７】
多くのＧ−蛋白質結合受容体で見いだされるように、それらの細胞内ループから誘導される幾つかの合成ペプチドは膜標本における受容体−Ｇ−蛋白質相互作用に影響を与える。例えば本発明の非常に好ましい実施形態において、前記細胞侵入機能的蛋白質模擬ペプチドは蛋白質ファミリに属するような哺乳動物受容体から誘導され、またはこれら哺乳動物受容体に似るように設計される。これら受容体はそれらの膜構造および機能に基づいて分類され、チャンネル受容体、チロシンキナーゼ受容体、グアニレートシクラーゼ受容体、セリン／スレオニンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体、およびグアノシン三燐酸（ＧＴＰ）結合蛋白質（Ｇ−蛋白質結合受容体類：ＧＰＣＲｓ）を含む。
【００７８】
ＧＰＣＲｓは本発明に関連して、７個の膜貫通ドメイン、３個の細胞外ループ（ｅ１、ｅ２、ｅ３）および４個の細胞内ループ（ｉ１、ｉ２、ｉ３、ｉ４）を有すると定義づけられる。細胞侵入性機能的蛋白質様ペプチドはこうして前記受容体の細胞内または細胞外ループのどちらかのループのフラグメントから誘導され、またはそれに似るのが好ましい。  
【００７９】
さらにより好ましい実施形態において、前記細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチドはＧＬＰ−１受容体、ＡＴ１Ａ受容体、ＣＧＲＰ受容体、およびドーパミンー２受容体からなる群から誘導されるか、この群に似るように設計される。
【００８０】
それにもかかわらず、細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチドはその他の任意の細胞エフェクタ、例えば酵素、チャンネル、ホルモン、転写因子、受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、トランスポータ、またはリガンドなどから同様に誘導され、例えば類似の血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ＣＧＲＰ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）から誘導されることができ、またはこれらに似ていてもよい。
【００８１】
上記の一般的例は実施例１３に記載されている。そこでは２４のペプチドがＡβ−産生に関係すると考えられる種々のセクレターゼから誘導されるペプチド・フラグメントに似るように合成される。本発明に特に含まれるペプチド配列は配列番号３１８４０−３１８６４として列挙され、セクレターゼ／ＡＰＰのコンセンサス配列に結合する能力を含むペプチドであって天然発生性セクレターゼ結合と競合し、同時に細胞侵入性でもあるペプチドを産生する目的で、種々のセクレターゼから誘導される。
【００８２】
上記のように、ＣＰＰは受容体活性化リガンド、または受容体の内部ループまたは膜貫通ループから生成してもよいし、またはそれに似るように設計することができ、したがって内部活性化／抑制特性を有するが、単にカーゴを膜を経て運搬するだけでもよい。したがって本発明に関連して、ＣＰＰｓは２つの群に分けられる：
ａ．機能的蛋白質模擬ＣＰＰｓ
ｂ．カーゴ運搬ＣＰＰｓ
【００８３】
勿論、ａ）に属するＣＰＰは大部分の場合カーゴ運搬も可能で、有用であることは当然である。
【００８４】
上記の新規の輸送ペプチドまたは、誘導されまたは類似のその他の任意の受容体は、普遍的運搬ペプチド、機能的蛋白質模擬ＣＰＰｓ、並びにカーゴ運搬ＣＰＰｓであり、種々の細胞エフェクタ、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのような、細胞内および／または細胞外代謝的およびシグナリングメカニズムの一般的修飾体を細胞内に送達するために、および／または抗生物質および／または抗ウィルス剤を細胞および微生物内に送達するために使用できる。
【００８５】
下記は本発明による方法で検出または設計され、証明された種々のＣＰＰｓを説明する。本出願に開示された種々の方法で始めて検出または設計され得る潜在的ＣＰＰｓの規模の大きさを考えれば、本出願に示される特異的かつ新規のＣＰＰｓの選択および公知のＣＰＰｓの改良使用は例示的に過ぎず、決して完全に網羅するものでないことは当然である。
【００８６】
本出願による方法によって検出され、証明されたＣＰＰｓに関する実施例が実験の部に挙げられているが、これらも例証的であるに過ぎず、決して網羅するものではない。
【００８７】
本出願に記載される参考文献は組み込まれているものと考えられる。
【００８８】
受容体誘導ＣＰＰｓ：
本発明の好ましい一実施形態は、グルカゴン様ペプチド１受容体、ＧＬＰ−１受容体、から誘導される新規の合成ペプチド：ＧＯＰを含む（実施例５に詳細に記載される）。新規のＣＰＰはＧＬＰ−１受容体の作用の強力な模擬体として作用する、すなわちそれはラットおよびヒト膵島と共にインキュベートした際にインスリン放出を高める。さらに、このペプチドおよびその細胞膜侵入類似体は、細胞と共にインキュベートした際細胞内に局在し、ＧＬＰ−１受容体蛋白質作用のアゴニストの模擬体として作用することができる。したがってそれらは非インスリン依存性真性糖尿病、ＮＩＤＤＭの治療、および概してＩ型およびＩＩ型糖尿病の両方の治療に有効な強力な潜在的候補となる。
【００８９】
したがって本発明の一つの特殊な局面は、アミノ酸配列ＩＶＩＡＫＬＫＡ（ＧＯＰ）、この配列の保存的変異体およびその細胞侵入類似体を含む、または実質的にこれらからなるペプチド類からなる群から選択されるペプチドに向けられる。
【００９０】
ラットＧＬＰ−１受容体または前記受容体に似るように新たに設計された、ＧＯＰ−６（これは完全に新しく設計された配列であり、全アミノ酸がＤ−型である）のようなまたはＧＯＰ−８（これは全アミノ酸がＮ−メチル化されている）のような、実施例５に記載されるペプチドＧＯＰの細胞侵入類似体は表８に配列番号３１８６５−３１８８６として示され、例えばその他の哺乳動物種または同じ種の個々の変異体からの対応するペプチドでもよく、したがってそれらが細胞侵入特性／能力を有する限り、ペプチドＧＯＰのアミノ酸配列に関してアミノ酸伸長、欠失または置換を有することができる。本発明の範囲内であるこの種類の細胞侵入ペプチドの代表的例はＩＶＩＡＫＬＫＡＮＬＭＣＫＴＣＲＬＡＫ−アミド（Ｍ５６９）である。ＧＯＰの前記類似体の細胞侵入特性は当業者に公知の、または実施例２または１６に説明されるような種々の標準的方法によって容易に試験することができる。
【００９１】
上記の新規の運搬ペプチド、またはその他の任意の誘導されたまたは類似させたＣＰＰは、普遍的運搬ペプチド、機能的蛋白質模擬ＣＰＰｓ、並びにカーゴ運搬ＣＰＰｓであり、種々の細胞エフェクタ、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのような、細胞内および／または細胞外代謝的およびシグナリングメカニズムの一般的修飾体を細胞内に送達するために、および／または抗生物質および／または抗ウィルス剤を細胞および微生物内に送達するために使用できる。
【００９２】
本発明のその他の局面は薬剤、特に非インスリン依存性真性糖尿病におけるインスリン不全を治療するための薬剤として使用するための上に開示された本発明のＣＰＰに向けられる。したがって、その他の任意の受容体誘導性ＣＰＰは前記ＣＰＰが由来する受容体に関係する任意の疾患または異常状態を治療する薬剤として使用できることはもちろんである。一般的にはこのような疾患はＩ型およびＩＩ型糖尿病などの代謝疾患、神経性疾患例えばアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、うつ病、不安など、発癌性疾患、潰瘍、薬物嗜癖および乱用症状、感染症、炎症、痛み、免疫学的疾患または免疫学的異常、例えば喘息およびアレルギー、免疫学的抑制、免疫学的過機能、または自己免疫病からなる群から選択される。
【００９３】
前記ＣＰＰがＧ蛋白質−結合受容体から誘導されまたはＧ蛋白質−結合受容体を模するように設計される現在好ましい実施形態において、前記ＣＰＰは、中毒性甲状腺過形成（突然変異甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体）、色素性網膜炎（突然変異ロドプシン）、性早熟症（突然変異黄体ホルモン（ＬＨ）受容体）、低カルシウム血症（突然変異Ｃａ２＋受容体）およびヤンセン骨幹端軟骨異形成症（突然変異副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐ）受容体）などを含む発癌性を有する疾患を治療するための医薬組成物の製造にも使用される。さらに、前記組成物はＧＰＣＲｓの不活性化と関連する病変、例えば伴性腎性尿崩症（バソプレッシンＶ２受容体）、家族性グルココルチコイド欠乏症（副腎皮質ホルモン（ＡＣＴＨ）受容体）、出血性疾患（トロンボキサンＡ２受容体）、男性仮性半陰陽（ＬＨ受容体）、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、新生児副甲状腺機能亢進症（Ｃａ２＋受容体）またはヒルシュスプルング病（エンドテリンＢ受容体）などの、ＧＰＣＲｓ不活性化に関係する病変の治療にも使用できる。
【００９４】
本発明のさらにまた別の局面は非インスリン依存型新生糖尿病の患者のインスリン欠乏を治療する方法であって、前記患者にインスリン放出を高める量の本発明によるペプチド、または本発明による医薬組成物を投与する段階を含む前記方法に向けられる。インスリン放出を高める量はメーカーからの指針および患者の反応を見て、主治医が決める。
【００９５】
本発明のさらに別の局面は、活性成分として本発明によるペプチドを薬物学的に容認されるビヒクルと共に含む医薬組成物、および患者のインスリン欠乏を治療および／または予防するための医薬組成物の製造における本発明によるペプチドの使用に向けられる。ビヒクルは所望投与経路に基づいて、製造者によって選択される。適切なビヒクルの例は、米国または英国薬局方に見い出される。
【００９６】
また別の非常に好ましい実施形態において、本発明は新規の血管収縮剤、より正確に言えばアンジオテンシン１Ａ受容体の細胞内Ｃ−末端から誘導される合成ペプチドに関係する。そのペプチドは機能的模擬ＣＰＰであり、異なる起源の心臓冠状血管の収縮を促進する。
【００９７】
本発明に関係するＣＰＰはＡＴ１Ａ受容体から誘導され、その受容体の第三および／または第二細胞内ループに含まれるＣ−末端尾部の少なくとも１つのフラグメントに対応するペプチドを含む。
【００９８】
アゴニスト活性化ＡＴ１Ａを模する開示されたペプチドは、例えば慢性低血圧または片頭痛において血管収縮が要求される状態に有効な強力な薬剤として特に興味深い。
【００９９】
本発明は一実施形態において、ラットＡＴ１Ａ受容体のＣ−末端細胞内部分から誘導される合成ペプチドＭ５１１を含む。Ｍ５１１はヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｗｅｓに転位することができる。Ｍ５１１およびビオチニル化Ｍ５１１の効果をブタ冠状動脈および静脈で試験し、ヒト臍血管でも試験した（実施例８に示す）。全ての場合に、ペプチド類は血管の収縮の引き金をひいた。Ｍ５１１ペプチドが対応する配列はＡＴ１受容体・サブファミリ内に保存されるがＡＴ２受容体との類似性は小さい（表２参照）。
2006514602.tif 000016
【０１００】
発明者らはＡＴ１依存性シグナル形質導入に対するその選択性を証明しなかったとはいえ、彼らはそのペプチドがアゴニスト活性化ＡＴ１Ａ受容体と同じ種類のＧ−蛋白質を特異的に活性化することを示している。スクランブルドＭ５１１（表３に見られる）を調製し、対照として試験したが、血管収縮には効果はなかった。
2006514602.tif 000017
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【０１０１】
上に列挙したＭ５１１類似体の生物学的効果を確認するために、ブタ冠状動脈および静脈、並びにヒト臍血管で容易に試験できる（実施例８に例証される）。
【０１０２】
新規のペプチドＭ５１１の特殊な性質は、例えばそれが非エンドサイトーシス・メカニズムによって細胞膜に侵入するのでなく、それが血管の持続的収縮を誘起し、この収縮がペプチド配列特異的であるということである。さらに、それはＧ−蛋白質と相互作用し、アゴニスト活性化ＡＴ１Ａ受容体を模する。
【０１０３】
こうして本発明の一つの局面は、アミノ酸配列ＦＬＧＫＫＦＫＫＹＦＬＱＬＬＫ（＝Ｍ５１１）を有するペプチド類からなる群から選択されるペプチドおよびそれらの細胞膜侵入類似体並びに非ペプチド膜侵入類似体に向けられる。
【０１０４】
ペプチドＭ５１１の細胞侵入類似体（ラットＡＴ１Ａ受容体から誘導）は、その他の哺乳動物種または同じ種の個々の変異体、または非ペプチド類似体からの対応ペプチドでもよく、したがってペプチドＭ５１１のアミノ酸配列に関して、それらが細胞侵入特性を有する限り、アミノ酸伸長、欠失または置換を有することができる。
【０１０５】
１Ａ受容体から誘導される上記の合成ペプチドに類似の、もう一つの血管収縮剤が本発明の範囲に含まれ、発明者らによって設計および生産された。それはＣＧＲＰ受容体ループｉＣ４から誘導され、配列３９１−４０５（ＶＱＡＩＬＲＲＮＷＮＱＹＫＩＱ）を有し、Ｍ６３０と命名された。配列番号３１８９５を参照されたい。実施例１７に示されるように、それは非エンドサイトーシス・メカニズムによって細胞膜に侵入し、ペプチド配列特異的様態で持続的血管収縮を引き起こす。
【０１０６】
こうして本発明のもう一つの局面は本質的にアミノ酸配列ＶＱＡＩＬＲＲＮＷＮＱＹＫＩＱ（＝Ｍ６３０）を含むペプチド類からなる群から選択されたペプチド、およびその細胞膜侵入類似体に向けられる。それらはここに開示される選択クリテリアを使用して見いだすことができる。
【０１０７】
ペプチドＭ６３０の細胞侵入類似体はその他の哺乳動物種または同じ種の個々の変異体、または非ペプチド類似体からの対応ペプチド類でよく、細胞侵入特性を示す限り、ペプチドＭ６３０のアミノ酸配列に関してアミノ酸伸長、欠失または置換を有することができる。
【０１０８】
本発明の追加的実施形態において、上記のＣＰＰはカーゴに結合する。カーゴはビオチンのようなマーカー分子でよい。
【０１０９】
本発明のもう一つの局面は血管収縮剤として使用するための本発明のペプチド、および血管収縮を治療および／または予防するための医薬組成物の製造におけるその使用に関係する。
【０１１０】
本発明のもう一つの局面は、活性成分としての本発明によるペプチドを、薬物学的に容認されるビヒクルと共に含む医薬組成物に向けられる。前記ビヒクルは製造者が所望投与経路によって選択する。適切なビヒクルの例は米国または欧州薬局方に見いだすことができる。
【０１１１】
本発明のさらにもう一つの局面は個体の血管の収縮を誘起する方法であって、前記個体に本発明によるペプチドまたは本発明による医薬組成物の血管収縮量を投与する諸段階を含む方法に向けられる。
【０１１２】
膜貫通蛋白質誘導ＣＰＰ類：
別の、同様に好ましい実施形態において、本発明に関連するＣＰＰはその他の任意の膜貫通ペプチドに由来することができ、受容体からの誘導に限られるものではない。例えば実施例６に開示されるように、本発明の一実施形態はマウスＰｒｐＣ（１−２８）：ＭＡＮＬＧ  ＹＷＬＬＡ  ＬＦＶＴＭ  ＷＴＤＶＧ  Ｌｃｋｋｒ  ＰＫＰ、ヒトＰｒｐＣ（１−２８：ＭＡＮＬＧ  ＣＷＭＬＶ  ＬＦＶＡＴ  ＷＳＤＬＧ  ＬＣＫＫＲ  ＰＫＰ）、またはウシＰｒｐＣ（１−３０）：ＭＶＫＳＫ  ＩＧＳＷＩ  ＬＶＬＦＶ  ＡＭＷＳＤ  ＶＧＬＣＫ  ＫＲＰＫＰから誘導されるＣＰＰに関係する。配列番号：３１８９６−３１８９９を参照されたい。
【０１１３】
実施例７に開示されるように、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）およびプレゼニリン−１（ＰＳ−１）は細胞侵入配列を有し、したがって本発明に記載される方法によると、アミノ酸配列から誘導されるＣＰＰのソースとして含まれる。配列番号：３１９００−３１９０６を参照されたい。
【０１１４】
検出された潜在的ＣＰＰ類
本発明に関連して、細胞侵入ペプチド類はランダムペプチド配列および天然発生蛋白質の両方から誘導されるか、または新たに設計される。新たに設計されたＣＰＰの典型的例は下の表１８に与えられ、配列番号：３１９２３−３１９４０として示される。
2006514602.tif 000020
2006514602.tif 000021
【０１１５】
さらに、天然発生性配列を修飾し、細胞侵入性にすることができ、またはその細胞侵入能力を最適化することができるのは当然である。
【０１１６】
本発明の方法によって検出される細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体は８ないし５０アミノ酸残基長のペプチド、例えば８ないし３０アミノ酸残基長のペプチド、または１４−３０アミノ酸残基長のペプチド、または１６ないし２０アミノ酸残基長のペプチドから選択されるのが好ましい。
【０１１７】
だが特殊な環境においては、本発明による方法によって検出される前記細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体は少なくとも２、３、４、５、６、または７アミノ酸からなる。
【０１１８】
本発明の典型的実施形態において、細胞侵入ペプチドは１２ないし５０アミノ酸残基長のペプチドまたは配列番号：１−１５０として記載される添付の配列に列挙されるアミノ酸配列の一つのペプチド・フラグメントから選択される。
【０１１９】
本発明のまた別の同様に好ましい実施形態において、細胞侵入ペプチドは配列番号：６２３４−７４２０として記載されている添付の配列に列挙されるアミノ酸配列の８アミノ酸残基長のペプチドまたはそのアミノ酸配列の一つのペプチド・フラグメントから選択される。
【０１２０】
本発明のまた別の実施形態において、細胞侵入ペプチドは配列番号１５１−２６８４として、および配列番号７４２１−１１６４９として記載されている添付の配列に列挙されるアミノ酸の１２アミノ酸残基長のペプチド、またはそのアミノ酸配列の一つのペプチド・フラグメントから選択される。
【０１２１】
さらに、本発明のその他の実施形態において、細胞侵入ペプチドは配列番号２６８５−６２３３、および配列番号：１１６５０−１８３９８として記載される添付の配列に列挙されるアミノ酸配列の１６アミノ酸残基長のペプチドまたはそのアミノ酸配列の一つの、ペプチド・フラグメントから選択される。
【０１２２】
カーゴ
既述のように、ＣＰＰはカーゴに結合し、前記カーゴを細胞、種々の細胞コンパートメント、組織または器官へ運ぶ担体として機能する。カーゴは薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、小分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または任意の人工的または一部人工的核酸、例えばＰＮＡ、低分子量分子、糖類、プラスミド、抗生物質、細胞傷害剤および／または抗ウィルス剤などからなる群から選択される。さらに、カーゴの運搬は例えばタグ類およびマーカー類を送達するための研究ツール並びに膜電位および／膜特性を変えるための研究ツールとして有用であり、カーゴは例えばビオチンのようなマーカー分子でもよい。
【０１２３】
カーゴを意図的に血液脳障壁を通過して運搬することに関連して、細胞内および細胞外物質類は同様に好ましいカーゴである。
【０１２４】
任意のおよびそれぞれのカーゴを運搬するために全てのＣＰＰが同様に適するとは限らないのは当然である。例えばＴａｔおよびペネトラチンではＤＮＡのような高度に負に帯電したカーゴを運搬するには適さないことが示された。例えば、あるカーゴを運搬するためのすぐれた最も適切なＣＰＰの選択は、当業者によって予測され、証明されなければならない、そして特殊なカーゴおよび標的細胞／組織の性質に大きく依存する。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態において、細胞侵入ペプチドは前記カーゴにＳ−Ｓ架橋によって結合する。当然、カーゴをＣＰＰに結合するための非常に種々様々の結合法があり、ＣＰＰ、カーゴおよび目的とする用途の性質に応じて個々に選択される。結合モードは共有および非共有結合（ビオチン−アビジン結合など）、エステル結合、およびアミド結合、抗体結合などからなる群から選択できる。
【０１２６】
ある実施形態においては、不安定な結合が好ましく、ある実施形態においては安定な結合が重要である；例えば本発明によるＣＰＰを医学的物質の運搬のために使用する際には、使用前に前記医薬組成物を保存しておく必要があるため、安定な結合が重要である。
【０１２７】
上記の実施形態のための例証的例は実施例４、６、１４および１５に記載される。
【０１２８】
実施例１４において、メトトレキセート（ＭＴＸ）とＣＰＰ担体との結合体が記載されている。ＭＴＸは細胞傷害性薬剤であり、それは悪性腫瘍の治療のために開発されたが、いまは乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。ＭＴＸは負に帯電した分子として体液中に存在するのが普通である。そのためそれが細胞膜を通過するには困難を伴う。  
【０１２９】
本発明によるカーゴの運搬のためにＣＰＰを使用する一つの例証的例は、実質的に配列番号３１９０７−３１９１１に含まれるようなＭＴＸ−ＣＰＰ結合体を含む。それらは例えば実施例１４に記載されるような固相ペプチド合成法を用いて合成される。その特殊な例は下の表１６に示される：
2006514602.tif 000022
【０１３０】
ＣＰＰと共に細胞膜を通過して運ばれる分子のその他の例は実施例１５に記載されており、そこではｓｉＲＮＡの取り込みが実質的に改善される。
【０１３１】
近年、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するそれらの高い感受性能力のために、注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化によって相補的ｍＲＮＡの特異的切断を引き起こす二本鎖ＲＮＡの短鎖（約２１〜２３ｂｐ）である。ＲＮＡ誘導性サイレンシングが内因性メカニズムであるとはいえ、合成的に合成されたｓｉＲＮＡ類はインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが証明された。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡを使用する際の公知の問題は、細胞内取り込みの低収率である。細胞侵入ペプチド類（ＣＰＰ）を合成的に合成したｓｉＲＮＡに結合することによって、細胞内取り込みは有意に改善する。
【０１３３】
本発明に含まれるカーゴ運搬のためにＣＰＰを使用するもう一つの特殊な実施形態はトランスポータン１０（Ｔｐ１０）のようなＣＰＰにジスルフィド・リンカーによって結合した、ＧＡＬＲ−１  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに関するものである。例えば、図３６に示され、配列番号：３１９１２に記載されている。
【０１３４】
公知の細胞侵入法の改善
追加的に、本発明による方法によって発見されたＣＰＰは公知の細胞侵入法、例えばトランスフェクション、マイクロインジェクション、形質導入またはエレクトロポレーションを含むインビボ遺伝子送達を改善するためにも使用できる。
【０１３５】
過去４０年間に、ＤＮＡ送達、特に非ウィルス性経路によるＤＮＡ送達（すなわちトランスフェクション）は遺伝子の機能および調節を解明する強力な研究ツールとなった。非ウィルス性遺伝子送達系は概して、特に臨床試験により一般的に使用されるウィルス類に比較して、すぐれた安全性を示す。しかしそれらの比較的低い導入遺伝子効率が主な障害である（マ（Ｍａ，Ｈ．）＆ダイアモンド（Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｓ．Ｌ．）、非ウィルス性遺伝子治療およびその送達系（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ  ２巻、ｐ．１−１７（２００１））。ＤＮＡ送達効率は次の数工程に左右される：トランスフェクション複合体の細胞表面への吸着、細胞による取り込み、エンドソーム放出、核内転位および遺伝子の発現。
【０１３６】
非ウィルス性トランスフェクション法
今日使用できる非ウィルス性トランスフェクション試薬は主として次の３つの仕方で作用する：細胞膜を介するプラスミドの取り込みを増加する；エンドソーム膜を不安定にする；そして核内取り込みを高める。主なトランスフェクション・プロトコルおよび試薬類には：１）燐酸カルシウム沈殿；２）ＤＥＡＥデキストラン、ポリリシンおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）としてのカチオン性ポリマー（ガーネット（Ｇａｒｎｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．）、カチオン性ポリマーを使用する遺伝子送達システム（Ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １６巻、ｐ．１４７−２０７（１９９９））；３）マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション、ＤＮＡガンなどの物理的方法（ソミアリ（Ｓｏｍｉａｒｉ，Ｓ．）ら、エレクトロポレーションによる遺伝子送達の理論およびインビボ適用（Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）。Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２巻、ｐ．１７８−８７（２０００））；および４）カチオンおよびアニオン性リポソームのようなリポソームベクター類（リー（Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．）＆フアング（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）遺伝子伝達のための脂質ベクター系（Ｌｉｐｉｄｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）。Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １４巻、ｐ．１７３−２０６（１９９７））がある。これらの方法およびトランスフェクション試薬の多くはインビトロおよびエキソビボトランスフェクションではうまく使用されるが、インビボ遺伝子伝達には十分には適さない（マ（Ｍａ，Ｈ．）＆ダイアモンド（Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｓ．Ｌ．）、非ウィルス性遺伝子治療およびその送達系（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２巻、ｐ．１−１７（２００１）。概して高い送達効率を有する方法は細胞にとって有毒でもある。一つの例外はマイクロインジェクションである。これは有効に送達し、無毒性でもあるが、残念ながらまとめて使用することはできない（ルオ（Ｌｕｏ，Ｄ．）＆ザルツマン（Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．）、細胞表面におけるＤＮＡの物理的濃度によるトランスフェクションの増加（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）。Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８巻、ｐ．８９３−５）。ＤＥＡＥ−デキストランおよび燐酸カルシウム沈殿のような古い化学的試薬および方法は簡単で、有効であり、いまだに広く使用されているが、細胞傷害性があり、インビボ適用は難しい。リポフェクションは細胞特異的ターゲティングが不十分であり、ＤＥＡＥ−脂質複合体の構造はよく理解されていない。
【０１３７】
細胞内へのＤＮＡの導入のために好ましい方法は種々の化合物との複合体化である。このアプローチは形質転換剤の製造が容易であり、したがってＤＮＡ構成物および形質転換条件を速やかに改変することができる。複合体化剤の主な役割はＤＮＡ主鎖の燐酸基の負電荷の中和、および大きいＤＮＡ分子の濃縮である。異種ＤＮＡの送達のために使用される平均ＤＮＡ分子は、製造中に細菌細胞にひろがるためには少なくも３０００塩基対長でなければならない。哺乳動物細胞発現のための近代的プラスミドの多くは４５００ないし５０００ｂｐであり、すなわち３，０００，０００以上の分子量を有する。負電荷を中和し、緻密な粒子に包まれた後、ＤＮＡ分子はエンドサイトーシス経路を経て細胞内に取り込まれる。伝統的トランスフェクション法／作用物質類は、エンドサイトーシスに反応した分解経路活性化を阻止または中和することを試み、多くのやり方で改変されてきた。
【０１３８】
燐酸カルシウム・トランスフェクション法はいまだに最も人気があり、広く使用されている。この人気の主な理由は費用が非常に安いことである。しかしこの方法は細胞型に極めて特異的であり、神経的一次細胞類を含む多くの細胞型に対して有毒である。ＤＮＡをリポソーム様構造に挿入するために多くの試みがなされた。その他の方法はＤＮＡと、ＤＮＡに結合するポリマー分子との複合体化にかかっている。これら全てのアプローチに関係する主な問題は細胞毒性である。
【０１３９】
ポリプレックス法
近年非常に目立つもう一つのアプローチは、ポリカチオンを有するＤＮＡを濃縮するという原理に基づくトランスフェクション系の使用である。新しい命名法によると、この技術はポリプレックスと呼ばれる（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．）ら、合成遺伝子送達系のための命名法（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８巻、ｐ．５１１−２。（１９９７））。ポリプレックスは脂質ベースのベクター類より効果的で、大部分の場合毒性がより小さい（ゲブハルト（Ｇｅｂｈａｒｔ，Ｃ．Ｌ．）＆カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．）遺伝子伝達物質としてのポリプレックスの評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ  ａｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｇｅｎｔｓ）。Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ７３巻、ｐ．４０１−１６（２００１））。最も安価で非常に有効で、最も広く使われるポリカチオンの一つはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である（ブッシフ（Ｂｏｕｓｓｉｆ，Ｏ．）ら、遺伝子およびオリゴヌクレオチドの培養細胞およびインビボ細胞への伝達のための有用なベクター：ポリエチレンイミン（Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２巻、ｐ．７２９７−３０１（１９９５）。アブダラ（Ａｂｄａｌｌａｈ，Ｂ．）ら、成哺乳動物脳へのインビボ遺伝子伝達のための強力な非ウィルス性ベクター：ポリエチレンイミン（Ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）。Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７巻、ｐ．１９４７−５４（１９９６）、シャツレイン（Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ，Ａ．Ｇ．）癌遺伝子治療における非ウィルス性ベクター：原理および進歩。Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １２巻、ｐ．２７５−３０４（２００１））。それは高い正味の正電荷を有するためｄｓＤＮＡの負電荷を中和し、ＤＮＡを濃縮する。緻密なＰＥＩ／ＤＮＡ小粒体は大抵はエンドサイトーシスによって細胞内に陥入する（レミ−クリステンセン（Ｒｅｍｙ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．）クランメ（Ｃｌａｍｍｅ，Ｊ．Ｐ．）、ブロイミア（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ，Ｃ．）、クーリ（Ｋｕｈｒｙ，Ｊ．Ｇ．）＆メリー（Ｍｅｌｙ，Ｙ．）ポリエチレンイミン／ＤＮＡ複合体によるＬ９２９線維芽細胞のトランスフェクションにおけるエンドサイトーシスの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｉｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ９２９  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｎｅ／ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５１４巻、ｐ．２１−３２（２００１））。これらの複合体はリソソーマル酵素によるＤＮＡ分解の阻止およびエンドサイト小胞からのＤＮＡ放出の増加によってもトラン���フェクションを促進する（ゲブハルトおよカバノフ、２００１）。しかし残念ながら、インビトロで上首尾に使用できる濃度では、これらのポリカチオンはまが毒性が強く、全身的インビボ使用することはできない。
【０１４０】
本出願に記載されるアプローチは大きいＤＮＡ分子を細胞膜を通して運搬する原理的に新しい方法を開示する。細胞活性依存性エンドサイトーシスに依存する代わりに、カーゴ類を細胞内に運ぶ細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）の能力を使用する、プラスミドの活性輸送を提案する。ＣＰＰｓは運搬作用を行う一方、第二の成分が燐酸基を中和し、大きいＤＮＡ分子を濃縮する（パックする）。さらに燐酸化合物を遮蔽するパック剤は常にプロトン緩衝剤としての付加的機能を有する。プロトンの結合はリソソームを中和し、多くの分解経路の酵素を阻害する。また細胞上の活性輸送によって分解経路を回避すると、必要な燐酸中和／パッキング剤の量は劇的に減少し、そのためその毒性作用は低下する。
【０１４１】
実施例９に記載されるように、本発明はこのように改善されたポリプレックス依存性遺伝子送達法にも関係する。この際細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド性類似体はリポータ遺伝子、またはポリエチレンアミンのようなトランスフェクション試薬のどちらかに結合する。いずれの場合もリポータ蛋白質、ＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現の増加が認められる。
【０１４２】
本研究において、発明者らは新しい遺伝子送達系を開発した。ＰＥＩおよびＴＰ１０またはＹＴＡ−２の効果を組み合わせることによって、ＰＥＩだけの場合より実質的に高いトランスフェクション率が得られた。このアプローチはＴＰ１０またはＹＴＡ−２をトランスフェクション試薬に架橋することであった。その後一般的トランスフェクションプロトコルのＰＥＩをＣＰＰ修飾ＰＥＩに代えた。最適条件のもとでは、この結果はその他の系に比較して遺伝子送達を有意に改善することを予想させた。
【０１４３】
2006514602.tif 000023
【０１４４】
したがって、本発明は特に、ａ）核酸成分、ｂ）ポリカチオン結合体、およびｃ）細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド性類似体、例えばＹＴＡ−２（配列番号：３１９１３）など、を含む（非ウィルス性）細胞トランスフェクション用ベクターに関係し、そのベクターは同一トランスフェクション条件において成分ａ）およびｂ）だけ、またはａ）およびｃ）だけを含むベクターに比較して、１細胞あたりの平均トランスフェクション率を少なくもファクター２、例えば少なくもファクター５、１０または１５だけ高めることができる。
【０１４５】
インビボおよび／またはインビトロ細胞の一過性トランスフェクションおよび／または安定トランスフェクションにも、ヒト、齧歯類、ブタ、ウシからなる群から選択される細胞のような哺乳動物細胞のトランスフェクションにも、上記のベクターは使用できると想定される。
【０１４６】
上記のベクターは一般的にはオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドのようなＤＮＡを含み、前記ポリカチオン結合体はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリオルニチン、ポリリシン、ポリアミン類、デンドリマー類、スペルミジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、パトリシン、トランスフェリン−ＰＥＩ、ポリエチレングリコシル化ＰＥＩ、またはオリゴマー類である。
【０１４７】
したがって、本発明はホスト組織の細胞に核酸をインビボトランスフェクトするための方法であって、ホスト組織の細胞および／または分離された細胞に核酸をトランスフェクトするために本発明によるベクターを、例えば実施例９に示すように導入することを含む方法にも関係する。
【０１４８】
細胞選択ＣＰＰｓ
本発明のさらに別の実施形態において、ある細胞型／組織／器官に選択的に侵入し、またはある細胞型、組織型または器官型においてのみ活性化されるカーゴを運搬する細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が提供される。
【０１４９】
発明者は、種々の異なるＣＰＰｓが特異的細胞系、例えばヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｗｓなどによって、有意に異なる効率、および有意に異なる取り込み速度、時には２倍も異なる速度でインターナライズされることを示す。これは、異なる効率で異なる細胞系および組織にインターナライズされるＣＰＰｓを定義する予備的条件である。そこで本発明の重要な実施形態は、選択的輸送が要求される細胞系、細胞類、組織類および／または器官類における細胞内取り込みのための天然のまたは新たに設計される全てのＣＰＰｓを試験することによって特徴づけられる選択性ＣＰＰｓ（ｓｅｌＣＰＰｓ）の開発法である。他方では、ある標的細胞または標的細胞集団のために選択されたＣＰＰｓの細胞選択性を人工的に高める幾つかの特殊な方法が使用される。これは以下に詳細に記載される。
【０１５０】
一例として、癌細胞は多くの細胞表面抗原および／または蛋白質を露出し、並びにある蛋白質類を分泌する。通常、腫瘍細胞は特異的な細胞表面マーカーを発現せず、むしろ一般的受容体／マーカーを過剰発現する。これらの過剰に発現されるマーカー類および／または細胞内および／または細胞外シグナルの過剰増幅によるシグナリングは細胞周期を通じた細胞機構の制御を喪失するメカニズムの一つであると考えられる。こうして本発明の特殊な実施形態において、過剰発現する細胞表面蛋白質および／または分泌蛋白質は、ＣＰＰアドレッシングのための標的として使用される。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、細胞選択ＣＰＰ（ｓｅｌＣＰＰ）は、チャンネル受容体類、チロシンキナーゼ受容体類（例えばＥＧＥ、ＩＧＦ）、グアニレートシクラーゼ受容体類、セリン／スレオニン・キナーゼ・受容体類、サイトカイン受容体類、グアノシン三燐酸（ＧＴＰ）−結合蛋白質に結合した受容体（Ｇ−蛋白質結合受容体：ＧＰＣＲｓ）、スフィンゴ糖脂質類、ＣＤ４４、神経ペプチド受容体、例えばニューロテンシン受容体類、ガラニン、およびサブスタンスＰ受容体類からなる群から選択される細胞マーカーに対して生成した抗原／蛋白を含むことが予測される。
【０１５２】
概して、細胞選択ＣＰＰ（ｓｅｌＣＰＰ）は任意の種類の薬剤または医薬物質の、種々の特異的真核および／または原核細胞標的への標的化輸送に極めて重要であることは当然である。このようなカーゴの細胞選択輸送は、例えばウィルス、細菌または寄生虫感染症によって起きる疾患のような感染症の治療または予防のための使用が想定される。
【０１５３】
標的細胞をインビボで見いだす前にＣＰＰｓの非特異的イターナリゼーションを避けるために、別の局面において本発明は酵素−プロドラッグ戦略の新しい変形体に関係する。その際ｓｅｌＣＰＰ結合物は、ＣＰＰ類の細胞侵入−活性構造が、前記ｓｅｌＣＰＰのペプチド部分の細胞／組織または器官特異的受容体／マーカーへの結合事象または標的細胞／組織または器官によって分泌されるプロテアーゼによる前記ｓｅｌＣＰＰ結合体の切断によって構造識別体からＣＰＰを放出するまでは破壊されないように、設計される。
【０１５４】
用語"酵素−プロドラッグ戦略／療法"は、アミノ酸または核酸プロドラッグ（それらは送達前または後に多かれ少なかれ組織、器官および／または細胞選択酵素類による活性化を要求する）の開発に焦点をおいたプロドラッグ送達の特異的アプローチを定義するために使用される。選択性の大きい差が先行技術に見いだされる。幾つかのプロドラッグでは標的組織／器官／細胞からの放出薬剤の速やかな除去が低選択性を説明し、またあるプロドラッグでは、非標的組織における切断、および細胞を経由する酵素部位への不十分な輸送が（低選択性の）主な原因であると考えられる。
【０１５５】
特に、多くの抗癌剤は非常に有毒であり、そのためより効果的およびより毒性の少ないプロドラッグおよび／またはソフトドラッグが必要である。そのため典型的プロドラッグ／ソフトドラッグは活性化酵素のための効率的および選択的基質でなければならないし、好ましくは細胞周期の全段階において細胞を殺す強力な細胞傷害物質および／または細胞増殖抑制物質に代謝されなければならない。初期の抗代謝産物ベースのプロドラッグの多くは、細胞膜を経由する拡散能力が限られ、客観的効果を得るには細胞間の細隙結合に依存しなければならない極性の高い活性化型を提供した。しかし本発明に記載されるプロドラッグ類は良好な分布特性を有し、それらの活性種は翻訳細胞侵入性であり、それによって得られる客観的効果はその療法の効果を最大にすることができる。
【０１５６】
本発明に関連して、用語“酵素−プロドラッグ戦略／療法"とは、その他に薬剤を送達する上記の方法であって、前記薬剤それ自体またはその運搬体ＣＣＰを非細胞侵入性にして、インビボ標的細胞を見つける前にＣＰＰｓの非特異的インターナリゼーションが起こるのを回避するようにし、その際前記ｓｅｌＣＰＰのペプチド部分の細胞／組織または器官特異的受容体／マーカーへの結合事象、または前記ｓｅｌＣＰＰ−結合体の、標的細胞／組織又は器官によって分泌されるプロテアーゼによる前記ｓｅｌＣＰＰ結合体の切断によってのみ、構造的識別体からＣＰＰが放出され、それが標的細胞に侵入できるという方法を説明するための用語である。
【０１５７】
細胞型標的化ＣＰＰｓはさらに受容体標的配列の部分との非結合分子間相互作用によって改変され得る。受容体に結合した後、そのＣＰＰは受容体に置換され、ＣＰＰは陥入（インターナライズ）する。図１および図２を参照されたい。受容体インターナリゼーションはＣＰＰ転位に比べて比較的遅い。
【０１５８】
本発明のまた別の同様に好ましい局面において、ｓｅｌＣＰＰは細胞侵入性でないように特に選択されまたは設計された上記のものとは対照的である。厳密に言えば、このようなｓｅｌＣＰＰは“ｓｅｌ−ｎｏｎ−ＣＰＰ"と呼ぶべきである。その意図は、ｎｏｎ−ＣＰＰは標的細胞内に放出されず、特異的細胞に結合した後に周囲の細胞外空間に放出される。本出願に記載される選択クリテリアは勿論、細胞侵入性でないペプチドの予測、証明、設計、および／または生産のためにも使用できる。前記ｎｏｎ−ＣＰＰは本質的に下記に示す個々の平均区間値からなるＺΣバルク特性値をもたないことによって特徴づけられなければならない；すなわち最も好ましいＺΣ１＜０．２；ＺΣ２＜１．１；ＺΣ３＜−０．４９；ＺΣ４＜：ＺΣ５＜１．１およびＺΣ５＞０．１２である。本発明の別の実施形態において、それは、ＺΣ１＜０．３、例えばＺΣ１＜０．２１、ＺΣ１＜０．２２、ＺΣ１＜０．２３、ＺΣ１＜０．２４、ＺΣ１＜０．２５、ＺΣ１＜０．２６、ＺΣ１＜０．２７、ＺΣ１＜０．２８、またはＺΣ１＜０．２９；
ＺΣ２＜１．２、例えばＺΣ２＜１．１１、ＺΣ２＜１．１２、ＺΣ２＜１．１３、ＺΣ２＜１．１４、ＺΣ２＜１．１５、ＺΣ２＜１．１６、ＺΣ２＜１．１７、ＺΣ２＜１．１８、またはＺΣ２＜１．１９；
ＺΣ３＜−０．３９、例えばＺΣ３＜−０．４、ＺΣ３＜−０．４２、ＺΣ３＜−０．４３、ＺΣ３＜−０．４５、またはＺΣ３＜−０．４６、ＺΣ３＜−０．４７、またはＺΣ３＜−０．４８；
ＺΣ４＜０．４３、例えばＺΣ４＜０．３４、ＺΣ４＜０．３５、ＺΣ４＜０．３６、ＺΣ４＜０．３７、ＺΣ４＜０．３８、ＺΣ４＜０．３９、ＺΣ４＜０．４、ＺΣ４＜０．４１、またはＺΣ４＜０．４２；
ＺΣ５＜１．０５およびＺΣ５＞０．２２、例えばＺΣ５＜１．０４およびＺΣ５＞０．２１、ＺΣ５＜１．０３およびＺΣ５＞０．２０、ＺΣ５＜１．０２およびＺΣ５＞０．１９、ＺΣ５＜１．０１およびＺΣ５＞０．１８、ＺΣ５＜１．００およびＺΣ５＞０．１７、ＺΣ５＜０．９９およびＺΣ５＞０．１６、ＺΣ５＜０．９８およびＺΣ５＞０．１５、ＺΣ５＜０．９７およびＺΣ５＞０．１４、またはＺΣ５＜０．９６およびＺΣ５＞０．１３；
を含む個々の平均値を有することはできない。
【０１５９】
したがって本発明の特に好ましい実施形態は、ａ）標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位、ｂ）細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体、およびｃ）細胞増殖抑制物質および／または細胞傷害物質を含む、細胞増殖抑制物質および／または細胞傷害物質の細胞選択的送達系に関するものであり、前記細胞選択的送達系はその他に前記細胞侵入ペプチドの細胞侵入能力を抑制する不活性配列も含み、その配列は前記細胞選択的送達系によって前記標的細胞の近くに導入されると、前記標的細胞に特異的に過剰発現される前記プロテアーゼによって切断される。実施例１２などを参照されたい。
【０１６０】
上記の概念の典型的例は基質金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）であり、それらはＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである。このファミリは結合したメンバーも分泌されたメンバーも両方共含み、それらは両方共細胞膜上または細胞外基質（ＥＣＭ）に存在する蛋白質の分解を触媒する（スターンリヒト（Ｍ．Ｄ．Ｓｔｅｒｎｌｉｃｈｔ）およびワーブ（Ｚ．Ｗｅｒｂ）「基質金属プロテアーゼが細胞挙動を調節する仕方（Ｈｏｗ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）」Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻：ｐ．４６３−５１６、２００１）。ＭＭＰｓは多種多様の悪性腫瘍の侵襲性および転移性挙動に関連があり、これら酵素は一般的に種々の腫瘍に過剰発現される（スターンリヒトおよびワーブ「基質金属プロテアーゼが細胞挙動を調節する仕方」Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻：ｐ．４６３−５１６；ロザノフ（Ｄ．Ｖ．Ｒｏｚａｎｏｖ）ら、“膜１型金属プロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ、別名ＭＭＰ−１４）"Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＪＢＣ）２７６巻：ｐ．２５７０５−１４、２００１年７月１３日）。ＭＭＰ−ＭＴ１のような膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）は発癌に強く関係している。これらの酵素は侵襲性先端に局在する。可溶性ＭＭＰｓ１−３および９も腫瘍発生のアゴニストとして関係している（スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．，パークス（Ｐａｒｋｓ，Ｋ．Ｋ．），ハセガワ（Ｋ．Ｋ．Ｈａｓｅｇａｗａ，），イーストモンド（Ｅａｓｔｍｏｎｄ  Ｄ．Ａ．）＆グロソヴスキ（Ｇｒｏｓｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｊ．）パラセントメトリック・ヘテロクロマチンの標的化破壊は染色体を不安定にする（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｒｅａｋａｇｅ  ｏｆ  ｐａｒａｃｅｎｔｍｅｔｒｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｈｒｏｍａｓｏｍａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）；Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  １３巻、ｐ．４３５−４３（１９９８））。
【０１６１】
これに付随して、そして実施例４および１２に明確に証明されたように、本発明は次の３つの基礎的機能に基づいてｓｅｌＣＰＰを設計する方法に関係する：１）ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−ＭＴ１による選択的切断（およびそれによる活性化）、２）ペプチド（ＣＰＰｓ）による細胞侵入、および３）それによって腫瘍細胞または腫瘍の血管新生に関係する内皮を既知の細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤によって死滅させること（図３、４、２５および２６を参照されたい）。
【０１６２】
本発明はこうして表５または表６に含まれるアミノ酸配列から選択されるｓｅｌＣＰＰ、および、表５または表６に列挙されるアミノ酸配列および細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤を含む、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の複合的細胞選択的送達系に関係する。配列番号：３１９１３−３１９２２を参照されたい。
2006514602.tif 000024
2006514602.tif 000025
【０１６３】
したがって、本発明はａ）標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位を含む細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体およびｃ）細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤を含む、細胞増殖抑制および／または細胞傷害性薬剤の細胞選択的送達系にも関係し、前記細胞選択的送達系はその他に前記細胞侵入ペプチドの活性を抑制する不活性化配列を含み、この配列は前記細胞選択的送達系が前記標的細胞近くに導入されると標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼによって切断される。
【０１６４】
上記のような前記細胞選択的送達系の好ましい実施形態において、前記細胞選択的送達系に含まれる前記細胞侵入ペプチドは前記細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の細胞内取り込みの平均速度を、ａおよびｃ）の成分のみを含む細胞選択的送達系または前記細胞の成分ｃ）だけの平均細胞内取り込み率に比較して、１細胞あたり少なくとも１．５のファクターだけ高める。
【０１６５】
前記細胞選択的送達系の、また別の同様に好ましい実施形態において、前記細胞選択的送達系に含まれる前記細胞侵入ペプチドは、前記細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の前記選択的細胞の１細胞あたりの平均取り込み率を、ａ）およびｃ）の線分だけを含む細胞選択的送達系の前記細胞への平均取り込み率、または前記細胞のｃ）成分だけの平均取り込み率に比較して少なくともファクター１．５、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００または１００００だけ高める。
【０１６６】
上記のような細胞選択的送達系のまた別の同様に好ましい実施形態において、前記過剰発現するプロテアーゼは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−ＭＴ１からなる群から選択されるＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである。
【０１６７】
もう一つの実施形態において、前記過剰発現するプロテアーゼは細菌表面プロテアーゼおよびウィルス酵素からなる群から選択される。
【０１６８】
さらに、本発明の範囲には、ＣＰＰｓを特殊の細胞および組織に標的化する方法、すなわちｓｅｌＣＰＰを設計および適用する方法も含まれる。適切なＣＰＰはここでは、指示された細胞型または組織型に特異的な、特殊な表面マーカーで設計される。上記の方法は、予測／選択クリテリアによって設計されるかまたはその他の任意の方法によって見いだされた任意の適切なＣＰＰ配列から１つのＣＰＰを選択し、適切な細胞表面受容体からのエピトープ（これに対して特異的モノクローナル抗体が作られ、このモノクローナル抗体はこの特定のエピトープを識別し、高い親和性を有する）としてペプチドＸ、またはアドレスを選択し、ポリペプチド類（Ｇｌｙｎ、Ｐｒｏｎ、ＧＡＢＡｎ、Ａｈａｎ、など）または適切な有機物質のなかから、ペプチドＸ／抗体間およびＣＰＰ／細胞膜間の必要な相互作用が得られるようにリンカーを選ぶことによって特徴づけられる。
【０１６９】
本出願には、特殊な細胞集団の細胞増殖を停止させるためのインビボおよびインビトロ法、および特殊な細胞集団の細胞増殖のインビボおよびインビトロ停止のためにここに記載の細胞選択的送達系の使用も含む。
【０１７０】
ここに記載される細胞選択的送達系は哺乳動物における特殊な細胞集団の細胞増殖を停止させ、細胞増殖をコントロールできないという特徴を有する医学的障害、例えば腫瘍性異常または腫瘍疾患、または免疫学的および／または代謝機能亢進などに罹患した患者を治療するための医薬組成物の製造にも使用できることは勿論である。
【０１７１】
本発明の全般的局面は、遺伝子治療のための医薬組成物の製造のために本発明に関連する細胞選択的送達系またはＣＰＰの使用、および前記細胞選択的送達系またはＣＰＰを含む医薬組成物の使用も含む。
【０１７２】
本発明のその他の局面は、本発明による細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体、または細胞選択的送達系を含み、または本発明の任意の方法を実施することによって作られる組成物、および細胞内代謝的またはシグナリング・メカニズムを阻害するかまたは活性化する全般的調整物質であるペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質から選択される化合物に関係する。
【０１７３】
本発明のさらにまた別の局面は、本発明による、または本発明の任意の方法を実行することによって作られる、細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体、または細胞選択的送達系を使用して薬剤を製造することに関係する。
【０１７４】
本発明のもう一つの局面は薬剤の製造のために本発明による組成物を使用することに関する。
【０１７５】
本発明の種々の局面および実施形態を以下の実施例によって説明する。本発明は特別に記載された詳細によって制限されるものではない。
【０１７６】
略語
Ａβ          ベータ−アミロイド
ＡＤ          アルツハイマー病
ＡＰＰ        アミロイド前駆体蛋白質
ＡＴ１        アンジオテンシン・受容体ＡＴ１型
ＡＴ１Ａ      アンジオテンシン・受容体・サブタイプＡＴ１Ａ
ＡＴ１Ｂ      アンジオテンシン・受容体・サブタイプＡＴ１Ｂ
ＡＴ２        アンジオテンシン・受容体ＡＴ２型
ＢＡＣＥ      β−部位ＡＰＰ−切断酵素
Ｂｉｏ        ビオチン、ビオチニル化
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
ＣＰＰ        細胞侵入ペプチド
ＣＴＦ        Ｃ−末端フラグメント
ＤＣＣ        Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ        ジクロロメタン
ＤＩＥＡ      ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ        ジメチルホルムアミド
ＤＮＰ        ジニトロフェニル
ＥＯＦＡＤ    早発性アルツハイマー病
ＦＩＴＣ      ５−フルオレセイン・イソチオシアネート
Ｆｍｏｃ      ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＯＰ        ＩＶＩＡＫＬＫＡ−アミド
ＧＰＣＲ      Ｇ−蛋白質結合受容体
ＧＴＰ        グアノシン  ５’−三燐酸
ＧＴＰａｓｅ  グアノシントリホスファターゼ
ＧＴＰγＳ    グアノシンγ−Ｓ−５’−三燐酸
ＨＫＲ        ヘペス−クレプス−リンゲル
ＨＯＢｔ      Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ      高性能液体クロマトグラフィー
ＩＤＥ        インスリン分解酵素
ＬＯＡＤ      遅発性アルツハイマー病
ＭＢＨＡ      ４−メチルベンズヒドリルアミン
ＮＦＴ        神経原線維糸球
ＮＩＣＤ      ノッチ細胞内ドメイン
ＮＭＰ        Ｎ−メチルピロリドン
ＮＴＦ        Ｎ−末端フラグメント
ＰＡＦ        パラホルムアルデヒド
ＰＢＳ        燐酸緩衝食塩液
ＰＮＡ        ペプチド核酸
ＰＳ          プレセニリン
ＲＮＡ        リボ核酸
ＳＡＰＰ      分泌ＡＰＰ
ＴＡＣＥ      腫瘍壊死因子アルファ変換酵素
ｔ−Ｂｏｃ    ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＴＢＴＵ      ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾールー１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロ硼酸
ＴＦＡ        三フッ化酢酸
ＴＦＡ        三フッ化酢酸
ＴＦＭＳＡ    トリフルオロメタンスルホン酸
【実施例１】
【０１７７】
ペプチドの細胞侵入特性の予測
序文
大部分のペプチドの定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）の研究において、一組の無次元値を使用してアミノ酸の物理的特徴の組み合わせを説明する。典型的文献において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３の３数値がこの目的のために使用される。最近の研究はこの記述子セットをさらに、Ｚ４およびＺ５の２つ広げ、８７の天然および非天然アミノ酸を網羅する記述子スケールを生成した。
【０１７８】
方法
拡大された記述子スケール、バルク特性値ＺΣ、を使用する。これは４種類の細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）：トランスポータン、ペネトラチン、ｐＶＥＣおよびＭＡＰで組み立てられ（トレーニングセット）、配列中のアミノ酸の総数で平均化したものである。ここでＺ３値は主として極性をあらわし、最高の予測力を有する。多数の蛋白質およびランダム配列から、トレーニングセットから得られるバルク特性値ＺΣ区間内に入る配列を探す。
【０１７９】
使用した記述子区間は：ＺΣ１＜０．２およびＺΣ２＜１．１およびＺΣ３＜−０．４９およびＺΣ４＜０．３３およびＺΣ５＜０．９５およびＺΣ５＞０．１２である。
【０１８０】
結果
ランダム−または天然蛋白質配列を検索すると、ＣＰＰｓに相当する配列が集まってブロックとなってあらわれる。この挙動は“運搬モータ"、すなわちＣＰＰ特性を有する比較的短い配列が検索ウィンドウ内に存在することによる。ＧＬＰ−１およびアンジオテンシン受容体類では、ＣＰＰに対応する配列は上に概略記載した方法によって正しく予測された。１０，０００アミノ酸長のランダム配列を検索すると、１８アミノ酸のスライディングウィンドウの長さで平均３２ブロックがヒットする。しかしヒット数はウィンドウの長さに依存する。その他のＣＰＰｓが対照として用いられる。上に概略記したクリテリアはＣＰＰのＴａｔ／ｐｏｌｙ  Ａｒｇファミリを除いて、それら全てで真実であると考えられる。
2006514602.tif 000026
2006514602.tif 000027
【実施例２】
【０１８１】
ペプチド合成（特に他の記載がなければ、以下の諸実験の既定の方法が記載される）
ペプチドは固相ペプチド合成のｔ−Ｂｏｃ戦略を使用してペプチド合成器（アプライド・ビオシステムス４３１Ａ型、ＵＳＡ）で０．１ｍｍｏｌスケールで段階的方法によって合成される。ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニルアミノ酸（バチェム、ブデンドルフ、スイス）をヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）エステルとしてｐ−メチルベンジルヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（バチェム、ブデンドルフ、スイス）に結合させ、Ｃ−末端アミデート化ペプチドを得た。ビオチンを手動でＮ−末端に結合した；そのためには３倍過剰のＨｏＢｔおよびｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロ硼酸（ＴＢＴＵ）活性化ビオチン（ケミコン、ストックホルム、スイス）をＤＭＦ中でペプチジル樹脂に加えた。上記ペプチドを、最後にｐ−クレゾールの存在下でＯ℃、３０分間、液体ＨＦで樹脂から切り離した。このペプチドの純度は、分析ヌクレオシル１２０−３  Ｃ−１８  ＰＲ−ＨＰＬＣカラム（０．４×１０ｃｍ）上のＨＰＬＣによって測定したところ、＞９８％であることが証明され、正確な分子量はプラズマ脱着質量分析（ビオイン２０、アプライド・ビオシステムス、ＵＳＡ）またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｖａａｇｅｒ  ＳＴＲ−Ｅ、アプライド・ビオシステムス、ＵＳＡ）を使用して、記載されるようにして得た（ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．，）、ランド（Ｌａｍｄ，Ｔ．）＆バルトファイ（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．）、ガラニン受容体およびサブスタンスＰ受容体に対するキメラペプチドリガンドの設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３９巻、ｐ．５１６−２２（１９９２））。
【０１８２】
細胞培養（特に他の記載がなければ、下の実験の既定の方法を述べる）
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞およびＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍペトリ皿中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃で５％ＣＯ２気流中で増殖させた。細胞を播種し、５日目ごとに再培養した。播種した際ＣＯＳ−７および１０Ｔ１／２細胞をトリプシン化し、その一方、Ｎ２Ａ細胞は培地をその細胞に加えて、機械的力で懸濁した。実験開始前に細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で２倍に希釈し、その後２４ウェルプレートに加えた（約６００００細胞／ウェル）。
【０１８３】
カーゴ送達効率の高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）
ＣＰＰ−Ｓ−Ｓ−カーゴ構成物（カーゴは２−アミノ安息香酸フルオロフォアで標識化され、ＣＰＰは２−ニトロトリプシン消光剤で標識化されている）を使用することによって、還元性細胞内メジウムに起因するジスルフィド結合の細胞内分解、および目に見える蛍光の増加による前記構成物の細胞内取り込みを実時間でモニターすることができる。
【０１８４】
懸濁細胞または付着細胞内のペプチド取り込みおよび流出の研究
細胞をトリプシン（インビトロゲン、スイス）で分離し、培養培地に溶解し、遠心分離した（１０００×ｇ、室温で１０分間）。細胞を再懸濁し、計数し、その一部を３０００００細胞／チューブの割合で氷上のＨＫＲ中に取った。Ａｂｚ−標識化ペプチドを懸濁細胞と共に、３７℃の水浴中で振とうしながら１５および３０分間インキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を３分間加えた。細胞を４℃で、１００×ｇ、１０分間回転した。ペレットをＨＫＲ中に再懸濁して蛍光を検出し、または流出サンプルでは再び無ペプチドＨＫＲと共にインキュベートした。蛍光をスペクトラマックス・ジェミニＸＳ（モレキュラーデバイセス、カリフォルニア）上で３２０／４２０ｎｍで読んだ。細胞内濃度をＡｂｚ標識化ペプチドの標準曲線から計算した。Ｃａｃｏ−２細胞の平均細胞量を、クールター２５６チャンネライザー（クールター・エレクトロニックス社、カリフォルニア）を使用して測定した。その他に、同じアッセイの変法を使用した：細胞を２４ウェルプレートに１０００００細胞／ウェルの密度で前日に播種した。細胞を５μＭペプチド濃度で３７℃で３０分間インキュベートした。トリプシン処理し、洗浄し、塩酸中で溶解した。蛍光を懸濁アッセイについて記載したように測定した。
【０１８５】
材料および方法
細胞
ヒトメラノーマ細胞Ｂｏｗｅｓを標準細胞培養法を使用してＭＥＭに培養し、実験を行う前の日に２４ウェルプレートに１０００００細胞／ウェルの密度で播種した。
【０１８６】
結果および検討
2006514602.tif 000028
表２０はペプチドが実際に細胞侵入ペプチドであることを証明するための好ましい方法から得たデータを示す：懸濁細胞または付着細胞におけるペプチド取り込みおよび流出研究（以下を参照されたい）。これまでに約５０のペプチドをスクリーニングした。陰性対照では膜非侵入性糖ポリマーであるフルオレセイニル・デキストランを同じやり方で細胞に加える。デキストランの細胞溶解物に認められたパーセンテージは常に０．５％未満である。ＹＴＡ−２ｐｓ、ＬＲＳＷ−１およびＬＲＳＷ−３は新たに設計された人工ペプチドの例である。
【実施例３】
【０１８７】
配列の予測
１００００アミノ酸長のランダムに作られた数種の配列を検索した。ヒット量はウィンドウの長さによって変動したが、総配列の約３％を保った。受容体配列に結合した約５００のＧ蛋白質を検索し、可能性のある配列の約０．０１５％がＣＰＰクリテリアに合うことが判明した。これはＣＰＰｓが自然に逆らって選択されることを示唆すると考えられる。  概略示したクリテリアは公表されたＣＰＰ配列の約９５％を上首尾に予測した。
【実施例４】
【０１８８】
細胞選択的ＣＰＰ
ＣＰＰｓの組織特異性：
ＣＰＰｓの細胞内取り込みは標的細胞の膜特性および膜電位に依存すると考えられるので、細胞特異的ＣＰＰｓを得ることができる。上に概略示したクリテリアを使用して、ペプチドの、片寄りのあるライブラリーが作られる。このライブラリーについてその後、例えば上記の方法を用いて取り込み／カーゴ送達効率を試験した。つまり、ＣＰＰ−Ｓ−Ｓ−カーゴ構成物（カーゴは２−アミノ安息香酸フルオロフォアで標識化され、ＣＰＰは３−ニトロチロシン消光剤で標識化されている）を使用することによって、ジスルフィド結合の細胞内分解を（実時間で）モニターできる。したがって構成物の細胞内取り込みおよびＣＰＰのカーゴ送達効率を目に見える蛍光の増加によって測定することができる（図２７）。この方法により陥入したペプチドと膜の外側に結合したペプチドとを識別する実験的に難しい工程を回避することができる。
【０１８９】
基質金属プロテイナーゼー２（ＭＭＰ−２）のＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断の測定法；
上に、そして図２７に示したように、発明者らは選択的ＣＰＰ（ＹＴＡ−２）のＣＰＰ部分が３７℃でも４℃でも細胞に効率よく入ることができることを示した（データは示されず）。それに加えて“インアクチベータ"は細胞膜を介する転位に関してペプチドをより不活性にした。この方法の開発における次の工程は活性ＭＭＰ−２によるＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断をチェックすることである。それは蛍光／消光剤アッセイによって行われる。ここではＭＭＰ−２基質ＹＴＡ−２ｐｓは切断で蛍光強度を高める。正しい切断は質量分析によってさらにチェックされる。
【実施例５】
【０１９０】
非インスリン依存性真性糖尿病におけるインスリン欠乏治療のための新しいエフェクタ模擬ＣＰＰによって例示される、機能的蛋白質模擬ＣＰＰの設計：
背景
ＧＰＣＲ−リガンド相互作用および諸疾患におけるそれらの模擬
７ＴＭスパン・受容体とそれらそれぞれのＧ−蛋白質との相互作用は十分明らかにされており、特異的である。実際、これらの相互作用は特異的な十分明らかにされた蛋白質間のＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用に類似するものである。７ＴＭ受容体はＧ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）であり、例えばそれらは、Ｇ−蛋白質結合を起こすと考えられている両親媒性α−ヘリカル・モチーフを露出する。ＧＰＣＲの第三の細胞内ループ部分（ただし場合によっては他のループの部分も）がシグナリングに関係している。添付の略図である図７に、このような７ＴＭ受容体−Ｇ−蛋白質複合体が示される。ＧＰＣＲの細胞内部分からの合成ペプチドはＧＰＣＲとＧ−蛋白質との相互作用を模することができる。すなわち細胞フラグメント系において証明されたように活性受容体シグナルを運搬する。
【０１９１】
この実施例において、発明者らは、ＧＰＣＲの前記細胞内部分の一つから誘導される新規のＣＰＰは細胞侵入ペプチドとして作用すると共に、同時に細胞内の活性化受容体の機能を模する、例えば標的細胞内のＧＰＣＲとＧ−蛋白質との相互作用を模することができることを証明した。
【０１９２】
非インスリン依存性真性糖尿病、ＮＩＤＤＭ、およびグルカゴン様ペプチド１受容体、ＧＬＰ−１Ｒ
非インスリン依存性真性糖尿病、ＮＩＤＤＭ、は２型真性糖尿病、Ｔ２ＤＭとしても知られ、複雑なホルモン異常およびインスリン抵抗が特徴である。ＮＩＤＤＭの治療はその疾患の複雑さ並びにその背後にあるメカニズムの理解不足のために難しい。ＮＩＤＤＭの幾つかの重要な細胞性および分子レベルのメカニズムはまだ明らかになっていないと考えられる。ＮＩＤＤＭのメカニズムの包括的知識の不足にもかかわらず、糖尿病研究の最近の成果は研究および治療のための幾つかの有望な標的を明らかにした。
【０１９３】
現在、非インスリン依存性真性糖尿病、ＮＩＤＤＭはインスリンによるホルモン置換、インスリン放出剤、またはインスリン増感剤によって治療されている。しかしこれら治療のいずれも十分満足するようには血糖値をコントロールしない。糖依存性インスリン放出は、一部はＧ−蛋白質結合受容体グルカゴン様ペプチド１受容体、ＧＬＰ−１Ｒの活性化によってコントロールされ、これは新しいＮＩＤＤＭ治療薬の有望な標的となる。ＧＬＰ−１Ｒ、グルカゴン様ペプチド１のための理想的内因性アゴニストの存在がほぼ１５年前から知られている。しかしこれまで、その薬物学的活用は、静脈内投与した際のそのペプチドの短い半減期のために、そして大部分の合成類似体のアゴニスト効率が喪失するために失敗であった。
【０１９４】
発明者らはここに、ＧＬＰ−１Ｒ受容体の細胞内ループ３（ｉＣ３）ペプチド類をベースにしたＧＬＰ−１Ｒアゴニスト模擬物質が、インスリン放出を開始するシグナリングにおけるアゴニスト占有受容体の活性状態を模することができることを証明した。
【０１９５】
ラット膵島におけるインスリン放出を誘発する、ＧＬＰ−１ＲｉＣ３から誘導されるペプチドの設計および合成が明らかにされている。これらのアプローチはＧＬＰ−１によるインスリン放出の活性化の基礎にあるメカニズムの研究を著しく容易にし、インスリン放出を刺激する物質類の物理的ライブラリーを提供し、それによってＮＩＤＤＭ治療薬を開発するための強力な手掛かりとなる。
【０１９６】
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト模擬物質としてのＧＬＰ−１Ｒフラグメント
ＧＬＰ−１受容体の第三細胞内ループ、ｉＣ３、から誘導される合成ペプチドはＧＴＰａｓｅおよびアデニレートシクラーゼ（ＡＣ）をＥＣ５０＝１００ｎＭで活性化する。ｉＣ３ペプチドは強力な酵素活性剤で、ＡＣ活性を６−ないし１３倍に高めることがよくある。それに加えて、これらのペプチドはＧ−蛋白質へのシグナル変換におけるＧＬＰ−１受容体の複雑さを研究するためのツールとして役立つかも知れない。
【０１９７】
短い１２〜２０アミノ酸長のｉＣ３ペプチドはインビトロにおいてアゴニスト占有７ＴＭ受容体蛋白質類の相互作用を模する。これらペプチドはさらにトランスポータンのような細胞運搬体に結合することができ、インビボ研究でこれらの相互作用があらわれる細胞内部により効率的に侵入する。
【０１９８】
結果の概要
発明者らは、配列ＩＶＩＡＫＬＫＡ−アミド（ＧＯＰ）を有するグルカゴン様ペプチド−１受容体、ＧＬＰ−１Ｒから誘導される新規のオクタペプチドを設計し、合成し、インスリン放出を試験した。このペプチドは親蛋白質であるＧＬＰ−１Ｒの作用を模する。ＧＬＰ−１Ｒは膵島においてインスリン放出を開始し、その後ＧＬＰ−１ペプチドホルモンを認識することが知られている７回膜貫通蛋白質である。このペプチドの類似体が、被験細胞の細胞膜を転位させ得る新規の細胞侵入ペプチド、ＣＰＰｓである。これらのデータは所望蛋白質のアゴニスト類（それら自体が細胞侵入性である）を設計する新しい可能性を示すものである。
【０１９９】
方法
ビオチン標識ペプチドの細胞侵入
血清を含む培地を無血清培地に交換し、ペプチド水溶液を直接その培地に加えて１０μＭの濃度にした。陰性対照を常に使用した。なぜならば生きている細胞は常に若干のビオチンを内部に有するからである。対照細胞にはペプチド溶液の代わりに純粋な水を加え、その他は他の全てと同様に処理した。細胞を５％ＣＯ２を加えた空気中で３７℃または４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗い、固定し、メタノールで−２０℃で１０分間浸透性にし、再びＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）無脂肪ミルク溶液中で１時間インキュベートして非特異的結合を減らした。ペプチド類を同じ溶液中で室温で１時間、０．１μＭストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色することによって可視化した。細胞核をヘキスト３３２５８（０．５μｇ／ｍｌ）で５分間ＤＮＡ染色することによって可視化し、その後カバースリップをＰＢＳで３回洗い、ＰＢＳ中２０％グリセロールに載せた。画像をツァイス・アクシオプラン（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ）２顕微鏡（カール・ツァイス社、ドイツ）によって得た。
【０２００】
インスリン放出
インスリン分泌に与えるペプチド類の影響を体重２００〜２５０ｇの雄ウィスターラットの膵島で評価した。島をコラゲナーゼ消化によって無菌的に分離し、その後一晩３７℃で、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培養培地で培養した。培養後、３つの島を１回分として、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび２ｍｇ／ｍｏｌウシ血清アルブミンを含むクレプス−リンゲル重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）各３００μｌ中で、３７℃で１時間インキュベートすることによってインスリン分泌を測定した。インキュベーションメジウムはペプチドを含むかまたは含まず、３．３または１６．７ｍＭグルコースを含んでいた。一実験シリーズにおいて、５×１０５Ｒｉｎ  ｍ５Ｆ細胞のバッチを、メジウムからグルコースを除いたこと以外は同様な条件下でインキュベートした。インキュベーションメジウムの部分をとり、インスリンのラジオイムノアッセイを行った。インスリン分泌はμＵインスリン／島／ｈおよびμＵインスリン／５×１０５細胞／ｈでそれぞれあらわされる。統計的有意性をスチュデントｔ−検定で評価し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２０１】
結果および結論
ＧＬＰ−１Ｒ配列から誘導される短いペプチドは、分離ラット膵島からのインスリン分泌を用量依存的、グルコース依存的に増加させ得る。さらにこのペプチドはラットに静脈注射した際、インスリン分泌を高め、血糖値を低下させる。
【０２０２】
ＧＬＰ−１Ｒループ誘導ペプチドの細胞侵入
図８において、ＧＯＰ類似体Ｍ５６９の細胞侵入が説明される。発明者らは上記のＧＬＰ−１Ｒ誘導ペプチド類をその他に開発することができた。配列ＩＶＩＡＫＬＫＡを含むこれら新世代のペプチドは、ラット膵島と共にインキュベートした際細胞侵入特性を有し、Ｇ−蛋白質を活性化し、インスリン放出を高めるという特徴を有する。ＧＬＰ−１Ｒ誘導ペプチドＭ５６９は温度には無関係にヒトＢｏｗｅｓメラノーマ細胞に侵入し、そのペプチドの同じ細胞内局在が４℃でも同様に記録される（図示されていない）。
【０２０３】
インスリン放出
ペプチドＧＯＰが存在しない場合、１６．７ｍＭグルコースは、３．３ｍＭグルコースにおける基礎的放出に比較してインスリン放出をほぼ３倍刺激した（図１および図１１）。ＧＯＰ（１０μＭ）は３．３ｍＭグルコースにおけるインスリン放出を５倍（ｐ＜０．００１）刺激し、１６．７ｍＭグルコースでは１および１０μＭＧＯＰによる刺激は４倍である。
【０２０４】
インスリン放出および血糖値に与えるＧＯＰ（Ｍ５２８）のインビボ効果
体重約２５０ｇの健康な雄ウィスターラットを一晩空腹状態にした。最初の血液サンプルを遠位尾静脈の切開によって得た後（０ｍｉｎ）、ＧＯＰ（Ｍ５２８、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ；ｎ＝４）を腹腔内に注射し、その後さらにグルコース（１ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。対照ラット（ｎ＝４）には食塩液およびグルコースを注射した。１０および３０分後に尾静脈から別の血液サンプルを採取した。血糖値をグルコースオキシダーゼ法によって測定し、血漿インスリン値はラジオイムノアッセイによって測定した。
【０２０５】
図１０および図１１からわかるように、血中インスリンおよび血糖濃度は注射前の全てのラットにおいて同様であった。１０分後、血糖値インスリンはＧＯＰ−注射ラットでは対照ラット（ｐ＜０．０５）および０分の同じ群のラット（ｐ＜０．０１）に比較して有意に増加した（１０図）。同時に、１０分後、血糖値はＧＯＰ注射ラットでは対照ラットに比較して有意に低かった（ｐ＜０．０２）（図１１）。３０分後、両方のラット群の間にインスリンおよび糖濃度に関して差はなかった。このデータはインスリンインビボ放出に対してこのペプチドが顕著だが一過性の効果を有することを示す。結論として、ＧＯＰファミリのＧＬＰ−１Ｒ誘導ペプチドは細胞膜に侵入し、それぞれのＧ−蛋白質と特異的に相互作用し、ラット膵島からのインスリン放出を増加させる。
【０２０６】
2006514602.tif 000029
2006514602.tif 000030
【０２０７】
ＧＯＰ類似体シリーズは下記から選択される：
ＩＶＶ−Ｘ−ＫＬＫＡ、ＩＶＩ−Ｘ−ＫＬＫＡ、ＩＶ−Ｘ１−Ｘ−ＫＬＫＡ
上記においてＸ１はアミノ酸であり、Ｘはリンカーである。
【実施例６】
【０２０８】
プリオン蛋白質（ＰｒｐＣ）のＮ−末端配列に対応する新しいエフェクタ模擬ＣＰＰによって例示される非受容体機能的蛋白質模擬ＣＰＰの設計
背景
プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）のＮ−末端配列は細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）として機能することが判明している、構成されたシグナルペプチド−ＮＬＳキメラに非常に似ている（ヴィダル（Ｖｉｄａｌ，Ｐ）ら、主要両親媒性ベクターペプチド類と膜との相互作用。コンフォメーション的因果関係および細胞局所化に与える影響（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．）。Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ  １６２巻、ｐ．２５９−６４（１９９８））。これら配列類似性に基づいて、発明者らは、非切断シグナル配列を有するマウスからのＰｒＰＣ誘導配列もＣＰＰとして活性であるという仮説を試験した。発明者らは、マウスＰｒＰＣ（１−２８）が実際にＣＰＰであり、カーゴ−アビジンを細胞内に運ぶ能力を有することを標準蛍光アッセイ法を用いて見いだした。蒸留水中で、ＰｒＰＣ（１−２８）ペプチドは１ｍＭより高い濃度で強く凝集し、特徴的β構造を有する。これらの知見は、完全Ｎ末端を有するプリオン蛋白質が細胞に侵入する仕方およびその蛋白質のスクレイピー型への変換と関係するβ構造への二次的構造変換を理解するために重要な意味を有する。
【０２０９】
下記のペプチド配列を比較した：
キメラＣＰＰ、すなわちＨＩＶ（１−１７）のｇｐ４１からの疎水性配列＋ＳＶ４０大抗原Ｔ（１８−２４）からのＮＬＳ：ＭＧＬＧＬ  ＨＬＬＶＬ  ＡＡＡＬＱ  ＧＡＫＫＫ  ＲＫＶＣ（１）
マウスＰｒｐＣ（１−２８）：ＭＡＮＬＧ  ＹＷＬＬＡ  ＬＦＶＴＭ  ＷＴＤＶＧ  ＬＣＫＫＲ  ＰＫＰ（２）
ヒトＰｒｐＣ（１−２８）：ＭＡＮＬＧ  ＣＷＭＬＶ  ＬＦＶＡＴ  ＷＳＤＬＧ  ＬＣＫＫＲ  ＰＫＰ（３）
ウシＰｒＰＣ（１−３０）：ＭＶＫＳＫ  ＩＧＳＷＩ  ＬＶＬＦＶ  ＡＭＷＳＤ  ＶＧＬＣＫ  ＫＲＰＫＰ（４）
【０２１０】
両方の配列型の一般的特徴は１６−２３残基の主として疎水性シグナルペプチド部分を有し、その後に高い正電荷をもつ約７残基のＮＬＳ部分が続くことである。
【０２１１】
Ｎ末端にビオチンを付けたマウスＰｒｐＣ（１−２８）を合成し、その細胞侵入特性を研究した。このペプチドのインターナリゼーションを、実施例７に既述し、培養Ｎ２Ａ細胞で行ったように、結合フルオレセインによってモニターした。細胞侵入特性を、そのペプチド自体で、およびアビジン蛋白質（６５ｋＤ）の大きいカーゴを担うペプチドで研究した。行われたプロトコルはこれまでの実験に用いたものと同じであり（キルク（Ｋｉｌｋ，Ｋ．）ら、Ｉｓｌｅｔ−１ホメオドメインの第三ヘリックスから誘導される新規ペプチドと複合体を形成したカーゴの細胞内インターナリゼーション。ペネトラチンペプチドとの比較（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｇｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔ−１  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ．）。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １２巻、ｐ．９１１−６（２００１）、マグゾーブ（Ｍａｇｚｏｕｂ，Ｍ．，）、キルク、エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．）ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ、Ｕ．）＆グラスランド（Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ａ）。リン脂質小胞の存在下における細胞侵入ペプチドの相互作用および構造誘導（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５１２巻、ｐ．７７−８９（２００１））、ラット転写因子Ｉｓｌｅｔ−１のホメオドメインから誘導されるｐＩｓｌペプチド配列のＣＰＰ特性を明らかに示すものである（イノウエ，Ａ．、タカハシ，Ｍ．、ハッタ，Ｋ．、ハッタ，Ｙ．＆オカモト，Ｈ．；ゼプラダニオ胚の神経分化中におけるｉｓｌｅｔ−１の発達調節（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ−１  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）。Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  １９９巻、ｐ．１−１１。（１９９４））。図１２は、アビジンカーゴのない標本およびアビジンカーゴを有する標本の両方の、ＰｒｐＣ（１−２８）のＣＰＰ効果および核周囲局在を明らかに示す蛍光顕微鏡画像を示す。
【０２１２】
ペプチドの二次構造を、今度はビオチンの結合なしに、水溶液中および種々の膜模擬溶媒中で、ＣＤおよびＮＭＲ分光法によってさらに研究した。図２０Ｂは蒸留水中１ｍＭペプチドのＣＤスペクトルを示す。これは明らかなβ構造が関与している典型的特徴を有する。塩を付加するとβ構造の関与は高まる（データは示されず）。平行して行われた１Ｈ  ＮＭＲ実験はスペクトル分解の証拠を与えず、拡散を研究する試みは、ＮＭＲ法によって測定できる大きさ以上の大きさのペプチド凝集体がサンプル中に形成されたことを示した。負に帯電したリン脂質小胞の存在下において、ペプチドのβ構造の関与はかなり高まった（図１３）。図２０ＣはＳＤＳミセル中のペプチドの部分的ＮＭＲ  ＴＯＣＳＹスペクトルを示す。ＳＤＳミセルはペプチド凝集体を溶解し、よく分解された１Ｈ  ＮＭＲが得られ、共鳴の原因が得られるようにする。ペプチド鎖に沿ったＨαｓの二次的化学的シフトはα−ヘリカル構造が誘導された明らかな証拠を与える。種々の溶媒中のペプチドのこのカメレオン様挙動はその他のＣＰＰｓ、例えばペネトラチン（デロッシ（Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．）、ジョリオット（Ｊｏｌｉｏｔ，Ａ．Ｈ．）、チャセイング（Ｃｈａｓｓａｉｎｇ，Ｇ）＆プロキアンツ（Ｐｒｏｃｈｉａｎｚ，Ａ．）、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ホメオドメインの第三ヘリックスは生物学的膜を通って転位する（Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、ｐ．１０４４４−１０４５０（１９９４））およびｐＩｓｌ（キルクら、ｉｓｌｅｔ−１  ホメオドメインの第三ヘリックスから誘導される新規のペプチドとカーゴとの複合体の細胞内インターナリゼーション。ペネトリン  ペプチドとの比較（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｇｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔ−１  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １２巻、ｐ．９１１−６（２００１））などからの観察を実質的に反映する。ただし水溶液中の凝集体およびβ構造の関与は、ペネトラチンおよびｐＩｓｌに比べて、マウスＰｒｐＣ（１−２８）ではより顕著で、イオン強度により強く依存する。
【実施例７】
【０２１３】
アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）およびプレセニリン−１（ＰＳ−１）に対応する新しいエフェクタ−模擬−ＣＰＰｓによって例示される機能的蛋白質模擬ＣＰＰの設計
背景
アルツハイマー病は老人の痴呆の最も一般的な型であり、この病気がほとんど一世紀も前に発見されたにもかかわらず、治療法も正確な作用メカニズムも発見されていない。この病気の最も典型的な特徴はいわゆる老人斑と呼ばれる蛋白質凝集体である。これらの老人斑は主としてβ−アミロイドと呼ばれる、アミロイド前駆体蛋白質から誘導されるペプチドからなる。このβ−アミロイドペプチドはアミロイド前駆体蛋白質のプロセッシング中に作り出され、これにはプレセニリン−１およびプレセニリン−２と呼ばれる２種類の蛋白質が関係していると思われる。
【０２１４】
概要
実施例はアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）およびプレセニリン−１（ＰＳ−１）が細胞侵入配列と呼ばれる特殊なペプチド配列を有し、その配列が細胞膜を介して転位し、生体細胞によるインターナリゼーションを助けることを証明する。これは分泌されるＡＰＰまたはその他の任意の神経保護ペプチドが細胞に陥入し、それによってその神経保護特性をあらわすメカニズムとして使用できる。
【０２１５】
材料および方法
細胞アッセイ
細胞培養：
マウス神経芽細胞腫細胞、Ｎ２Ａ、をグルタマックス−Ｉを含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコ最小必須培地に培養した。
【０２１６】
細胞インターナリゼーション・アッセイ：
インターナリゼーションのために用いる細胞を２４ウェルプレートの丸いカバースリップ上に植え付けた。播種後１日目に細胞は半融合した。培地を無血清培地に取り替えた。フルオレセイン標識化ペプチドを最終濃度１０μＭになるまで加えた。３７℃で６０分間インキュベーション後、細胞をヘペス−クレプス−リンゲル−（ＨＫＲ）緩衝液１ｍｌで３回洗い、燐酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中で３％パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定した。細胞をその後ＨＫＲ緩衝液１ｍｌで３回洗い、カバースリップを載せ、顕微鏡検査のために密封した。
【０２１７】
ペプチドの合成および精製
下記のペプチド類を合成し、フルオレセインに結合し、ＨＰＬＣ上で精製し、質量分析で分析した（ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．）、ランド（Ｌａｎｄ，Ｔ．）＆バルトファイ（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．）ガラニン受容体およびサブスタンスＰ受容体へのキメラペプチド・リガンド類の設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ）３９巻、ｐ．５１６−２２（１９９２）に記載されている）。
2006514602.tif 000031
【０２１８】
細胞インターナリゼーション・アッセイ
フルオレセイン標識ペプチドに関するインターナリゼーション・アッセイに使用する細胞型はＮ２Ａマウス神経芽細胞腫細胞であった。この細胞系はアルツハイマー病の研究に関連して一般に用いられ、これらのインターナリゼーション・アッセイ（ここではアルツハイマー病に関係する蛋白質から誘導されるペプチドが研究された）のための良いモデル細胞系として役立つ。これらのインターナリゼーション・アッセイは３７℃で行われた。したがってエンドサイトーシスによるインターナリゼーションは排除できる。
【０２１９】
図２１は１０μＭ濃度におけるＮ２Ａ細胞中のペプチドの細胞内局所化を示す。Ａ）およびＢ）フルオレセイン標識化ＡＰＰ５２１−５３６で処理した細胞。Ｃ）フルオレセイン標識化ＡＰＰ７２５−７４０で処理した細胞。Ｄ）フルオレセインに結合したＰＳ−１９７−１０９欠失類似体で処理した細胞。Ｅ）フルオレセイン標識化した公知のＣＰＰペネトラチンで処理した細胞。Ｆ）未処理細胞。
【０２２０】
インターナリゼーション実験は、蛋白質の細胞外部分から誘導されるＡＰＰ（５２１−５３６）が細胞侵入能力を有し（図１４ＡおよびＢ）、核および膜の両方に局所化することを示す。これは分泌アミロイド前駆体蛋白質（ｓＡＰＰ）が陥入する推定的経路である。この事実は興味深い、なぜならばこのフラグメントはニューロンを低血糖性損傷およびグルタメート神経毒性から保護し、神経保護物質として作用することを示したからである。膜スパニング−および第一細胞外ループ部分から誘導されるプレセニリン−１（９７−１０９）欠失類似体も細胞侵入能力を示した。しかしこのペプチドはほとんど細胞質に局所化されるが、細胞膜および核にも検出できる（図１４Ｄ）。ＡＰＰ（７２５−７４０）はバックグラウンドに比較して増加した蛍光を示し、それは大部分が細胞質に存在するように見える。しかしこれは最初に記載したペプチドのようにはっきりとは見えず、最近の実験によりそれは４℃では陥入しないことが判明した。これは、認められた蛍光の軽度の増加はエンドサイトーシスによるものであることを示唆する。プレセニリン−１の第一細胞内ループから誘導されるペプチドであるプレセニリン−１（１５１−１６２）でも同一の蛍光増加が認められた（示されず）。ＡＰＰ（７１２−７２６）ＷＴおよびＡＰＰ（７１２−７２６）Ｖ７１７Ｆ突然変異体に関するインターナリゼーション実験では、取り込みは全く示されなかった。この背後にある理由として、これらのペプチドは２４ウェルプレートに加えられると直ぐに凝集体を形成することが考えられる。この凝集傾向は初期、特にＨＰＬＣ精製のために粗生成物を溶解した際にも認められた。
【実施例８】
【０２２１】
アンジオテンシン１Ａ受容体の細胞内Ｃ−末端から誘導される合成ペプチドに対応する新しいエフェクタ−模擬−ＣＰＰによって例示される機能的蛋白質模擬ＣＰＰの設計
実施例８は新規の血管収縮剤、より精確に述べれば、アンジオテンシン−１Ａ受容体の細胞内Ｃ−末端から誘導される合成ペプチドを開示する。このペプチドは細胞侵入ペプチドであり、心臓冠状血管の収縮を促進する。
【０２２２】
背景
アンジオテンシン受容体類は７回膜貫通Ｇ−蛋白質結合受容体ファミリのメンバーであり、哺乳動物における血圧および電解質バランス維持システムの重要な構成成分である。それらには２型が存在する：ＡＴ１（ＡＴ１ＡおよびＡＴ１Ｂサブタイプからなる）およびＡＴ２。それらのなかでＡＴ１がアンジオテンシンＩＩの公知のほとんど全ての全身作用の媒介を引き受けているようにみえる。ＡＴ１受容体は種々の組織、例えば血管、子宮、膀胱、および幾つかの内分泌腺などの平滑筋の収縮に関係し、腎臓、肝臓および中枢神経系に広く分布している。ＡＴ１受容体のアンタゴニストは潜在的抗高血圧剤であり、幾つかの非ペプチド性アンタゴニスト、例えばロルサタンは臨床的使用に導入され、成功している。しかしＡＴ１受容体の選択的アゴニストは現在は入手できない。アゴニスト類は、血管収縮を必要とする例えば慢性低血圧または片頭痛などの症状に有用な潜在的薬剤として興味深い。
【０２２３】
方法および材料
細胞培養
Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞（アメリカ培養コレクション  ＣＲＬ−９６０７）を１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、１％非必須アミノ酸および１％ピルビン酸ナトリウムを補充したグルタマックス含有最小必須培地（ＭＥＭ、ライフ・テクノロジーズ、ストックホルム、スエーデン）に培養した。
【０２２４】
細胞インターナリゼーション・アッセイ
インターナリゼーション実験のために使用する細胞を１００００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの丸いガラスカバースリップ上に播種した。１日後、それらが約５０％の融合に達したとき、培地を無血清培地に取り替え、ビオチニル化ペプチドをその培地に直接加えた。３７℃または４℃で６０分間インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗い、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液で１５分間固定した。ビオチン標識ペプチドを間接的に検出するために、固定した細胞をＰＢＳ中０．５％トリトンＸ−１００で浸透性にし、非特異的結合部位をＰＢＳ中５％ＢＳＡでブロックした。処理細胞をストレプトアビジン−ＴＲＩＴＣ（モレキュラー・プローブス、オランダ、１：２００）と共に室温で１時間インキュベートすることによってビオチン部分を可視化した。細胞核をヘキスト３３２５８（０．５μｇ／ｍｌ、モレキュラー・プローブス、オランダ）で染色した。蛍光を、ＣＣＤ（Ｃ４８８０、浜松フォトニックス、日本）を備え付けたツァイス・アキシオプラン（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ）２顕微鏡を使用して検査した。
【０２２５】
組織の調製
切り取ったブタ心臓（２６０〜３９０ｇ）を氷冷クレプス−ヘンスレット溶液（１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．６３ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１６．５ｍＭグルコース）に入れて、地方の屠殺場から実験室に運んだ。左前下行冠状動脈および大心臓静脈を分離した。分離後直ちに各血管部分を収縮アッセイに使用し、その一方でその一部を膜調製のために液体窒素に冷凍保存した。幾つかの実験において、内皮を機械的に除去した血管を使用した。同じ方法をヒト臍血管の調製にも用いた；臍帯はオブステトリック・クリニク・オブ・リュブリャナ・クリニカル・センタ（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  Ｌｊｕｂｌｉｊａｎａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）、スロベニヤ、から入手した。
【０２２６】
血管収縮測定
既述のように測定を行った（２０）。血管の環（５ｍｍ巾）を切り取り、クレプス−ヘンスレット溶液（３７℃；ｐＨ＝７．４）を満たした１０ｍｌ組織チェンバに取り付けた。上記溶液は９５％Ｏ２および５％ＣＯ２の混合物で酸素化された。最初に５０ｍＮの伸長を加え、平衡化した後３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて安定なアイソメトリック収縮を得た。内皮の存在はサブスタンスＰで証明した。ＫＣｌおよびサブスタンスＰを洗い流した後、そしてシステムの平衡を回復した後、試験ペプチドを組織チェンバに加え、血管収縮を記録した。
【０２２７】
Ｓｆ９細胞におけるＧ−蛋白質の過剰発現
Ｇｓα、Ｇｉα１およびβ１γ２の遺伝子を宿すバキュロウィルス転移ベクターはハガ・タツヤ教授（東京大学、東京、日本）から寄贈された。ｐＶＬ１３９２中のウシＧｓα（２１）、ｐＶＬ１３９２中のウシＧｉα１（２２）およびｐＶＬ１３９３中のウシβ１γ２（２３）のためのｃＤＮＡを、線状バキュロウィルスＤＮＡ（ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡ）と共にトランスフェクトし、生成したウィルスストックを１ラウンドのプラーク精製にかけ、高力価ウィルスストックを生成した。発現操作において、懸濁培養液中の２００万細胞／ｍｌ密度のＳｆ９細胞に２：１比のα対βγを感染させた。感染後４８時間目に細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗い、膜を調製するまで−７０℃で保存した。
【０２２８】
膜の調製
血管の冷凍片を機械によって粉末化した。その後、多少の改良を加えたマッケンジーのプロトコル（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｆ．Ｒ．、シグナル形質導入（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｅ．、編集）、オックスフォード大学出版、オックスフォード、ニューヨーク、東京（１９９２））によって膜を得た。それらは使用するまで、ロウリー法（ロウリー（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．）、ローゼンブロー（Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ，ｎ．Ｙ．）、ファール（Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．）＆ランダル（Ｒａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３巻、ｐ．２６５−２７５（１９５１））によって測定して１〜２ｍｇ／蛋白質／ｍｌ濃度で冷凍保存した。異なる型のＧ−蛋白質を過剰発現するＳｆ９細胞から膜を調製する際にも同じ方法（組織の粉末化を除いて）を使用した；これらの膜標本の蛋白質濃度は０．２ないし０．４ｍｇ／ｍｌであった。
【０２２９】
ＧＴＰγＳ結合率
血管膜からのＧ−蛋白質への結合をマッケンジーが記載したように行った（マッケンジー；シグナル形質導入（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｅ．編集）、オックスフォード大学出版、オックスフォード、ニューヨーク、東京（１９９２））。つまり、膜（アッセイ混合物中の最終的蛋白質濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌであった）を異なる濃度のペプチドの不在および存在下で、０．５ｎＭ[３５Ｓ]ＧＴＰγＳと共にＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５中で、１３℃で３分間インキュベートした。未結合[３５Ｓ]ＧＴＰγＳは、反応混合物を真空下でミリポア社のＧＦ／Ｃガラス線維フィルタによって急速濾過することによって除去された。フィルタに含まれる残った放射能をＬＫＢ１２１４ラックベータ（Ｒａｃｋｂｅｔａ）液体シンチレーション・カウンタで測定した。膜標本を緩衝液に置き換えることによってブランク値を測定した。
【０２３０】
ＧＴＰａｓｅ活性の測定
この測定はカッセルおよびセリンガーの方法による放射能測定によって行われた（Ｃａｓｓｅｌ，Ｄ．＆Ｓｅｌｉｎｇｅｒ，Ｚ．（１９７６）４５２巻（２号）、ｐ．５３８−５１（１９７６、マッケンジーによる改良を伴う）（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｆ．Ｒ．シグナル形質導入（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｅ．編集）オックスフォード大学出版、オックスフォード、ニューヨーク、東京（１９９２））。異なる型のＧ−蛋白質を過剰発現するＳｆ９細胞から得られる希釈膜（アッセイ混合物中の最終的蛋白質濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ）に、ＡＴＰ（１ｍＭ）、５’−アデニリルイミド二燐酸（１ｍＭ）、ウアバイン（１ｍＭ）、ホスホクレアチン（１０ｍＭ）、クレアチンホスホ−キナーゼ（２．５単位／ｍｌ）、ジチオスレイトール（４ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、および反応混合物の部分に５００００〜１０００００ｃｐｍを与えるための痕跡量の[γ−３２Ｐ]ＧＴＰ（ＧＴＰの必要な総濃度０．５μＭを得るための冷ＧＴＰの添加と共に）を含む氷冷反応混合物を加えた。インキュベーション・メジウムは標準ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．５、であった。[γ−３２Ｐ]ＧＴＰのバックグラウンド低親和性加水分解を１００μＭ  ＧＴＰの存在下で平行チューブ類をインキュベートすることによって測定した。膜溶液をアッセイ緩衝液に代えることによってブランク値を測定した。ＧＴＰａｓｅ反応は反応混合物を３０℃水浴に２０分間移すことによって開始した。未反応ＧＴＰは２０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４中活性炭５％懸濁液によって除去した。得られた放射性燐酸化合物の放射能をパッカード３２５５液体シンチレーション・カウンタで測定した。
【０２３１】
曲線フィッティングおよびその他の計算値並びに結果のグラフ提示がプリズム・コンピュータープログラムを用いて行われた（グラフパッド・ソフトウエア社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）、ＵＳＡ）。
【０２３２】
結果
ペプチドの細胞インターナリゼーション
ビオチニル化Ｍ５１１は間接的免疫蛍光によって判断して、４℃でも３７℃でも生体細胞内に陥入した。このペプチドは温度とは無関係にＢｏｗｅｓメラノーマ細胞に移動するから、取り込みの主なメカニズムはエンドサイトーシスではあり得ない。このペプチドは核に優先的に局所化されるが（図１５Ａ）、細胞質にも局在する。Ｍ５１１のスクランブルド類似体（やはりビオチニル化されている）はＢｏｗｅｓ細胞に陥入し、Ｍ５１１と同様な細胞内局所化および温度依存性を与えることが判明したが（図１５Ｂ）、効率は若干低かった。よく研究されている細胞侵入ペプチドであるペネトラチン（１２−１４）を陽性対照として用いた（図１５Ｄ）。
【０２３３】
血管収縮
Ｍ５１１およびビオチニル化Ｍ５１１が血管の強力な収縮剤として作用することが認められた。図１６の上方のパネルに見られるように、Ｍ５１１は１６μＭ濃度でブタ左前下行冠状動脈の強い持続的収縮を促進する。収縮の強さはカリウムイオンの最大効果の約５０％である、３０ｍＭ  Ｋ＋の効果に匹敵する。より高濃度では、最大効果は、一般に到達し得る最大収縮効果と考えられる９０ｍＭ  ＫＣｌの効果に近い。カリウムの収縮効果に対して、Ｍ５１１の効果はアッセイ溶液から収縮剤を洗っても停止させることはできなかった。さらに、Ｍ５１１の添加後、収縮が起きる前に、濃度に依って５ないし１５分の時間的遅れがあった。結果から（図１６真ん中のパネル）、Ｍ５１１の効果のためには血管内皮は必要でないことも判明した。図１６でＭ５１１について示される定性的には同じだが、定量的にはより顕著な血管収縮が、ビオチン結合Ｍ５１１でも認められた（図には示されず）。Ｍ５１１およびビオチン標識Ｍ５１１によってあらわされるブタ左前下行冠状動脈の最大収縮力の濃度依存性が図１７に示される。スクランブルドＭ５１１はＭ５１１と同じ環境下で収縮を全く起こさなかった（図１６、下方のパネル）。
【０２３４】
ＧＴＰγＳ結合
図１７に示されるように、ブタ左前下行冠状動脈から得られた膜へのＧＴＰγＳの結合率はＭ５１１の存在下では用量依存的に増加し、それはビオチニル化Ｍ５１１の存在下ではさらにより顕著であった。５００μＭより高濃度のペプチド類の存在下で実験をすることができなかったため、効果の上方プラトーは得られなかった。この効果はＭ５１１に（ビオチニル化Ｍ５１１でも）配列特異的である、なぜならばスクランブルドペプチドは不活性であったからである。ブタ大冠状静脈およびヒト臍動脈から調製した膜でも原則として同じ結果が得られた（図は示されず）。
【０２３５】
Ｇ−蛋白質の選択性
Ｍ５１１によって影響されるＧ−蛋白質の種類に焦点を当てるために、発明者らは異なる型のＧ−蛋白質を過剰発現するＳｆ９細胞からの膜を使用し、これらの膜のＧＴＰａｓｅ活性をＭ５１１（１００μＭ）の不在下および存在下で測定した。図１７にまとめた結果はＧ１およびＧ０の小さいが有意な活性化を示し、興味深いことにＧ１１の軽度の阻害も示す；Ｇ−蛋白質のＧＳ型は影響を受けないようにみえる。これらの研究結果は、ＡＴ１Ａ受容体がアデニルシクラーゼの抑制（Ｇ１／Ｇ０の活性化）を介して、およびホスホイノシチド代謝の調節を介して、十中八、九、百日咳毒素不感受性Ｇ−蛋白質（ＧｑおよびＧ１１）によって機能するという提唱に一致する。だが実際には、Ｇ１１のＭ５１１による調節はこの種類のＧ−蛋白質の活性化によってではなく、むしろ抑制によって行われることが証明された。
【０２３６】
Ｓａｒ１−Ｔｈｒ８−アンジオテンシンＩＩの効果
これに加えて、発明者らは、アンジオテンシンＩＩアンタゴニストＳａｒ１−Ｔｈｒ８−アンジオテンシンＩＩがブタ左前下行冠状動脈に与えるアンジオテンシンＩＩの収縮効果を逆転させることができるが、Ｍ５１１によって誘発した血管収縮に影響することはできないことも証明した。これは、アンジオテンシンＩＩおよびＭ５１１が同じ収縮メカニズムによって作用するものではないことを強く示唆するものであり、Ｍ５１１がアンジオテンシン受容体を活性化せず、直接Ｇ−蛋白質に結合し、ホスホリパーゼＣの活性化を誘起すると考えられるという知見を確認するものである。
【０２３７】
さらに、血管収縮において十中、八、九、Ｍ５１１はアンジオテンシンＩＩより効果的である。なぜならばそれは３０ｍＭ  ＫＣｌによって誘起されるものと比較して、約４０％高い収縮力を引き起こし、他方アンジオテンシンの効果は３０ｍＭ  ＫＣｌの効果とほぼ同じであったからである。１μＭアンジオテンシンおよび１００μＭ  Ｍ５１１を用いて、図２０に示すように両リガンドの最大効果を得た。
【０２３８】
結論
Ｍ５１１はラットＡＴ１Ａ受容体の位置３０４−３２７に対応するペプチドである（表７）。図１５が示すように、ビオチニル化Ｍ５１１は、十分研究された細胞侵入ペプチド、ペネトラチンと同様に、ヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｗｅｓに侵入する。その上、ブタ動脈および静脈血管収縮によって得られた結果は、Ｍ５１１のインターナリゼーションを確認し、陥入したペプチドが天然受容体と競合し、そのシグナリング経路に影響を与えることを示唆する。興味深いことに、スクランブルド・ビオチニル化Ｍ５１１もＢｏｗｅｓ細胞に陥入するが、動脈または静脈血管の収縮を起こさない。筋肉収縮研究で認められた遅れ時間は、ペプチドの十分な量が細胞に侵入するために必要な時間として理解され、ペプチド濃度の増加により遅れ時間が短縮すること、並びにＭ５１１をアッセイ溶液から洗い流すことによって収縮を停止できないことは、その作用が細胞内作用であるためと考えられる。ブタ動脈および大心臓静脈およびヒト臍動脈においてＭ５１１が実質的に同じ効果をあらわすことは、この効果が静脈に限定されず、種々の組織の血管に対する一般的な性質であることを説明するものである。
【０２３９】
ＡＴ１Ａが７−膜貫通受容体のメンバーとして、Ｇαサブユニットと受容体の細胞内部分との相互作用によってＧ−蛋白質に結合することはよく知られている。ＧＴＰγＳ結合率の上昇（図１８）は、Ｍ５１１によって誘発される血管収縮プロセスにＧ−蛋白質が関与していることを証明し、Ｍ５１１がＡＴ１Ａ受容体からのＧ−蛋白質には結合しないことを確認する。示されたこれらの結果は血管収縮に与えるこれらペプチドの効果とよく一致する（図１６および１７を参照されたい）。
【０２４０】
いずれのＧ−蛋白質がＭ５１１の作用に関係しているかを解明するために、種々の型のＧ−蛋白質を過剰発現する膜におけるＧＴＰａｓｅ活性を測定した。Ｇ１／Ｇ０の軽度の活性化、およびＧｓに対する影響がないことが、これまでの研究とよく一致した。
【０２４１】
発明者らはさらに、ホスホリパーゼＣインヒビタＵ７３１２２の使用によってＭ５１１作用のメカニズムを研究した。図２６Ａにみられるように、３０μＭ濃度のＵ７３１２２はブタ左前下行冠状動脈（真ん中のパネル）のトーヌスに影響を与えなかった。そして１６μＭ濃度のＭ５１１を後（冠状動脈）に投与した後誘発される血管収縮も変化させなかった（上方のパネル）。しかしホスホリパーゼＣインヒビタをＭ５１１投与の３０分前に与えたときは、Ｍ５１１の効果を実質的に減少させた（５０％以上）（下方のパネル）。これは、期待したように、Ｍ５１１による血管収縮がホスホイノシトール燐酸メカニズムによって媒介されることを示唆する。
【０２４２】
もう一つの興味深い発見は、血管収縮に与えるペプチドの効果がビオチニル化によって増幅することである。それはＧＴＰγＳ結合率に対するほとんど同じ効果によって証明できる（図１８）。ＧＴＰγＳ結合率からは、Ｍ５１１上のＮ−末端ビオチンが、収縮に導く平行シグナリングカスケードを誘発せず、むしろＧ−蛋白質とペプチドとの相互作用を増幅することが明らかになる。
【０２４３】
結論として、Ｍ５１１（より顕著なのはビオチニル化Ｍ５１１）は、Ｇ１およびＧ０蛋白質からＡＴ１Ａ受容体を分離することによって、そして多分Ｇα蛋白質を阻害することによって、細胞内にうまく侵入する強力な血管収縮物質であるようにみえる。そのため、それは慢性低血圧および片頭痛にも効果のある興味深い候補薬剤である。血管収縮のためには比較的高濃度が必要であるということがその潜在的欠点であるが、自発的に細胞に陥入し、その作用が長期間持続することはその利点である。その他に、それはアンジオテンシン研究のために新しい可能性を与えた。
【０２４４】
結果の概要
発明者らはアンジオテンシンおよびその受容体を介するシグナル形質導入を研究した。細胞侵入ペプチドの研究によって、彼らは細胞マクロファージに侵入し、アンジオテンシン受容体のＡＴ１Ａ型に類似のエキソビボ細胞内シグナリング・カスケードを誘発するペプチドを設計することに成功した。ラットＡＴ１Ａ受容体のフラグメント３０４−３２７に対応するペプチドＭ５１１は温度には無関係にＢｏｗｅｓ細胞内に陥入することが見いだされた。この観察は異なる起源の血管の収縮によって確認された。濃度依存性遅れ時間後の、ブタ冠状動脈血管およびその他の数種の起源からの血管の長期持続的収縮はこのペプチドの溶液に起因するとされた。この作用の原理を発見するために、そのペプチドの、ＧＴＰγＳ結合率およびＧα−サブタイプ選択性に与える影響を測定した。その結果、Ｍ５１１ペプチドはアゴニスト活性化ＡＴ１Ａ受容体と同じ選択性でＧ−蛋白質サブタイプと相互作用し、それらを活性化／抑制することが判明した。血管収縮のＵ７３１２２によるダウンレギュレーションは、その他の経路がホスホイノシトール燐酸系を含み、ビオチン結合Ｍ５１１でも認められたようにＭ５１１によってホスホリパーゼＣを刺激することを示唆する（図は示されず）。Ｍ５１１およびビオチン標識Ｍ５１１によってあらわれるブタ左前下行冠状動脈の最大収縮力の濃度依存性が図１７に示される。Ｍ５１１と同じ環境下においてスクランブルドＭ５１１は収縮を全く起こさなかった（図１６、下のパネル）。
【実施例９】
【０２４５】
ＰＥＩおよびＴＰ１０および／またはＹＴＡ−２の効果の組み合わせ
本研究において、発明者らは既に存在するＰＥＩプロトコルに基づく新しい遺伝子送達系を開発した。ＰＥＩおよびＴＰ１０またはＹＴＡ−２の効果を組み合わせることによって、ＰＥＩだけで行うよりも実質的により高いトランスフェクション率が得られた。そのアプローチはＴＰ１０をトランスフェクション試薬に架橋させることであった。その後一般的トランスフェクション・プロトコルのＰＥＩをＣＰＰ修飾ＰＥＩに代え、それ以上はプロトコルを変更しなかった。最適条件のもとで、結果はその他の系に比較して遺伝子送達の著しい改善を予測させる。
【０２４６】
材料および方法
ＴＰ１０およびＹＴＡ−２の合成および精製
上記ペプチド類をパーキン・エルマー／アプライド・ビオシステム社、４３１Ａ型ペプチド合成器で、既述のプロトコルによるｔ−Ｂｏｃ戦略を用いて段階的に合成した（ランゲル、ランドら、１９９２）。システインまたはグルタミン酸を手動で結合させた。ＴＰ１０配列は与えられている（プーガ（Ｐｏｏｇａ）、１９９８、ＦＡＳＥＢ．Ｊ）。システインまたはグルタミン酸を手動で結合した。ＴＰ１０配列はプーガ、１９９８、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．に与えられている。ＹＴＡ−２配列は表５に与えられ、配列番号：３１９１３として記載されている。あらかじめペプチド類をＰＥＩに結合させ、それらを逆相ＨＰＬＣ（ギンコテク（Ｇｙｎｋｏｔｅｋ））Ｃ１８カラム上で、ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ勾配で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（アプライド・ビオシステム社、ＶｏｙａｇｅｒＳＴＲ型）を用いて分析した。得られた質量値は計算値と一致した。
【０２４７】
ＰＥＩ修飾
ＴＰ１０またはＹＴＡ−２のＰＥＩとの結合は２つの方法で行われた。第一の場合にはシステインをＴＰ１０のＬｙｓ７側鎖、またはＹＴＡ−２のＮ−末端に結合した。ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ、ＭＷ：６０ｋＤａ、アルドリッヒ）を、種々のＴＰ１０／ＰＥＩモル比の際に必要な濃度の二官能価架橋剤スクシンイミジル  トランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で処理した。第二の場合には、グルタミン酸をＴＰ１０のＮ−末端に結合し、さらにＢＯＰ生成Ｈｅｂｔエステルを使用してＰＥＩ（ＭＷ：６０：２５ｋＤａ、シグマ）に共有結合させた。形成された複合体の理論的分子量はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析によって確認された。
【０２４８】
細胞培養
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞およびＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍペトリ皿中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に増殖させた。細胞を播種し、５日目ごとに培養しなおした。播種したときにＣＯＳ−７および１０Ｔ１／２細胞をトリプシン化し、その一方でＮ２Ａ細胞を、それら細胞に培地を加えることによって機械的に懸濁した。実験開始前に、細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で２倍に薄め、その後２４ウェルプレートに加えた（約６００００細胞／ウェル）。
【０２４９】
プラスミドの増殖
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（両方共クロンテク社）、ｐＧＬ３−プロモータベクター（プロメガ社）およびｐＲＬ−ＣＭＶベクター（プロメガ社）プラスミド類をメーカーの指示するプロトコルにしたがって複製コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に増殖させた。増殖したプラスミドをキアゲン・ミディプレプ（ｍｉｄｉｐｒｅｐ）（キアゲン社）を使用して精製し、アガロースゲル上に置き、プラスミドの純度および濃度を推定した。最後に濃度を各プラスミドでＯＤ−分光器によって測定した
【０２５０】
トランスフェクション
ＣＯＳ−７およびＮ２Ａ細胞およびネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２のトランスフェクション。ＰＥＩ溶液を透析膜（ＭＷ−カットオフ１５ｋＤａ）によって透析し、細胞に対して毒性のあるより小さいＰＥＩフラグメントを除去した。その後ＴＰ１０を上記のようにＰＥＩに架橋させた。ＰＥＩおよび／またはＣＰＰ−ＰＥＩストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を希釈し、各Ｎ／Ｐ比の実験のために同容量の溶液が使えるようにした。１０μｌのプラスミド（０．０５μｇ／μｌ）および１０μｌのトランスフェクション試薬を、各実験時点に個別に９６ウェルプレート中で混合した。混合物を室温で１５分間インキュベートした。その間、前以て２４時間培養した細胞の培地を新鮮培地に取り替えた（２４ウェルプレート中、２５０μｌ／ウェル）。プラスミドおよびＰＥＩのインキュベーションが終了した後、結合物の２０μｌを細胞に加えた。トランスフェクションは３７℃で３時間行われ、その後培地を交換した。トランスフェクション効率をトランスフェクション後２４時間または７２時間に測定した。
【０２５１】
蛍光顕微鏡検査
トランスフェクション後１〜３日目にＧＦＰ発現レベルを倒立蛍光顕微鏡（蛍光顕微鏡検査のために装備したツアイス・アキシオバート（Ｚｅｉｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００、またはＲＦＬ−１蛍光装置を備えたオリンパスＩＭＴ２倒立顕微鏡）によって検査した。
【０２５２】
ＧＦＰ定量
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２中のＧＦＰを定量するために、細胞を溶解し、溶解物を４８５ｎｍで励起し、ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）のフルオロスキャン・アセント（Ａｓｃｅｎｔ）ＣＦインスツルメント（ラブシステムズ、ＦＩ）を用いてＵＶ放射を５２７ｎｍで測定した。
【０２５３】
ルシフェラーゼ・アッセイ
ウミシイタケまたはホタルのルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後３６時間目に、受動性溶解緩衝液（プロメガ）を使用して溶解した。サンプル類を一度、凍結−融解し、ルシフェラーゼ活性を同じ日または翌日に測定した。メーカーが推薦する二重ルシフェラーゼ・キットのプロトコルをビクター（ワラク、フィンランド）ルミノメータ上で行った。得られたルシフェラーゼ活性を総蛋白質濃度１ｍｇあたりの活性に変換した。総蛋白質濃度の測定はブラドフォード法によって行われた。
【０２５４】
ヒナドリ胚のインビボトランスフェクション
発生中のヒナドリ胚（３日）を有する卵を開け、ＳＭＶ−ｌａｃＺリポータ遺伝子を胚の神経管近くに注入した。４８時間後に胚を取り出し、２％パラホルムアルデヒド、０．２５％グルタールアルデヒド中で１〜２時間固定し、ＰＢＳＴで洗い、染色溶液（９ｍｌのスペルミジン、ＤＭＦ中２％Ｘｇａｌ  １ｍｌ、０．５ｍｌの１６５ｍｇ／ｍｌ  Ｋ−フェリシアナイド、０．４５ｍｌの２１０ｍｇ／ｍｌ  Ｋ−フェロシアナイド）で、青色が発現するまで（２時間）染色した。
【０２５５】
結果
ＣＰＰ−ＰＥＩおよびＧＦＰ
ＴＰ１０−ＰＥＩ並びにＹＴＡ−２−ＰＥＩ構成物は非修飾ＰＥＩプロトコルに比較して、全ての被験濃度でかなり高レベルのＧＦＰトランスフェクションを媒介した。最も有意な増加は、ウェルあたり１μｇ未満の濃度のＴＰ１０−ＰＥＩで得られた。より高濃度では修飾ＰＥＩおよび非修飾ＰＥＩ間の差は有意であったとはいえ、さほど著しくはなかった。図２１Ａａ、ｂおよびｃは、それぞれウェルあたり０．２５、０．５および１．０μｇ濃度の非修飾ＰＥＩの効果を示す。同じ図のｄ、ｅおよびｆは同じ濃度のＴＰ１０修飾ＰＥＩに対応する。平行研究において、ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２をＮ２Ａ細胞の代わりに用いた。ＧＦＰ発現は所定実験条件下ではＰＥＩ単独の実験に比べて１４倍以上まで測定された（ＰＥＩ−ＴＰ０．４μｇ  対  ＤＮＡ１．２μｇの比）。蛍光顕微鏡検査ではｅＧＦＰ発現細胞の数はＰＥＩ−ＴＰをトランスフェクトしたサンプルにおいて有意に高かった。
【０２５６】
ＴＰ１０−ＰＥＩおよびルシフェラーゼ
最適条件下で、完全増殖培地において、ＴＰ１０修飾ＰＥＩ（ＴＰ１０／ＰＥＩモル比５）はルシフェラーゼ・トランスフェクション効率の約１００％の増加を媒介した（図２１参照）。非最適条件下では有意な陽性効果は認められなかった。
【０２５７】
図２２は、非修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または化学的架橋ＰＥＩおよびシステイニルＹＴＡ２またはＴＰ１０ペプチドによるマウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞のトランスフェクションを示す。次の２種類の濃度のＰＥＩまたはペプチジル−ＰＥＩを試験した：培地１ｍｌあたり１または０．５μｇ。トランスフェクションを無血清増殖培地（ＤＭＥＭ）中で３時間行い、トランスフェクション後４８時間目に写真をとった。ＹＴＡ２およびＴＰ１０ペプチドの両方の適用においてトランスフェクションの改善が記録された。ＹＴＡ２−ＰＥＩおよびＰＥＩ−ＴＰ１０は、非修飾ＰＥＩに比べて２倍以上細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞における発現レベルもより高かった。
【０２５８】
ＴＰ１０／ＰＥＩモル比
ポリカチオン分子１個あたりＴＰ１０分子１ないし１００の範囲で４種類のＴＰ１０／ＰＥＩ比について試験した。結果は、送達収率がこの比に依存することを示した。ＰＥＩ１分子あたり５分子のＴＰ１０が最良の比であることがわかった。これに比２０が続く。最適比は５ないし２０であると考えられる。比１および１００は最低効果を示した。
【０２５９】
ヒナドリ胚のインビボトランスフェクション
ＳＭＶ−ｌａｃＺ単独、またはＰＥＩと組み合わせたＳＭＶ−ｌａｃＺを胚に適用した際、リポータ遺伝子の発現は認められなかった。ＳＭＶ−ｌａｃＺをＰＥＩ−ＴＰ１０と複合体化すると、神経管領域にリポータ遺伝子が発現するのが特殊染色によって検出された。Ｂ−ガラクトシダーゼ染色は強く、神経管領域全域にわたって同じ強度で分布していた。
【実施例１０】
【０２６０】
ヒト７ＴＭ受容体内のＣＰＰの位置の走査
ヒト７ＴＭ受容体配列をｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ｒｒｍｂｌデータベースからダウンロードした。それら配列の指示された長さ（８、１２および１７ａａ長さ）のＣＰＰｓを検索した。この蛋白質におけるＣＰＰの開始位置をその蛋白質の全長で割り、発生頻度に対してプロットした（ＣＰＰｓの部分）。ここで１７ａａの大きさの検索ウィンドウが最大のヒットをもたらした。４つのピークが明らかに７ＴＭ受容体の４つの細胞内部分に対応し、最大のピークは第三の内部ループ（ＩＣ３）に対応する。ＣＰＰの機能は、７ＴＭ受容体の形態並びに提示されたＧ蛋白質活性部位の両方と十分相関するようにみえる。図２３を参照されたい。
【実施例１１】
【０２６１】
新しい選択クリテリア
三段階（ｔｈｒｅｅ  ｇｒａｄｅｄ）システム
三段階は記述子区間の逐次的狭化をあらわす。これら段階のパフォーマンスは表１０から明らかになる。第一に、段階が高ければ高いほど、それだけ予測ＣＰＰが“偽"の陽性である機会が低くなる。しかしＣＰＰを見失う機会も高くなる。
【０２６２】
新しい“記述子"
２つの追加的記述子が導入される：Ｂｕｌｋｈａはアミノ酸の側鎖の非水素原子（Ｃ，Ｎ，ＳおよびＯ）であり、ｈｄｂはそのアミノ酸の側鎖の受容（ａｃｃｅｐｔｉｎｇ）水素結合の数である。
2006514602.tif 000032
【０２６３】
補充された選択クリテリアはＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣＢｕｌｋｈａおよび正味水素結合授与（ｄｏｎａｔｉｏｎ）および平均ｈｄｂを使用する。Ｂｕｌｋｈａは水素以外の、アミノ酸の側鎖中の原子数として計算される。例えばＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（セリン）ではＢｕｌｋｈａ＝２＊Ｃ＋１＊Ｏ＝３である。ｈａｂは側鎖の授与水素結合−受容水素結合として計算される。例えばＮ−−−Ｈは与え、Ｃ＝Ｏは受け入れる。
【０２６４】
三段階は記述子区間の逐次的狭化をあらわす。それら段階のパフォーマンスが表１１にみられる。
【０２６５】
2006514602.tif 000033
ｐｏｓｉｔｉｖｅ（陽性）はＣＰＰトレーニングセットに対応し、ｎｅｇａｔｉｖｅ（陰性）は非機能性ＣＰＰ類似体トレーニングセットに対応し、ｕｎｒｅｌａｔｅｄ（関連のない）はホルモントレーニングセットに対応する。
【０２６６】
2006514602.tif 000034
2006514602.tif 000035
2006514602.tif 000036
【０２６７】
第一セットの選択クリテリアで既述したように、ペプチドに関する数値を平均する（ペプチド中のアミノ酸残基数によって割る）。ＺΣ１、ＺΣ２、ＺΣ３、ＺΣＢｕｌｋｈａ、ＺΣｈａｂ
【０２６８】
異なる段階の区間は：
３：好ましい：ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．１およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜８．１３およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜３．５２およびＺΣ２＞−３．９およびＺΣ２＜３．１およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−３．５１およびＺΣｈｄｂ＞−０．１１５およびＺΣｈｄｂ＜５．１およびｈｄｂ＞０およびｈｄｂ＜８４
【０２６９】
２：より好ましい：ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜５．９およびＺΣ１＞−１．２５およびＺΣ１＜１．９２およびＺΣ２＞−１．２２およびＺΣ２＜１．２９およびＺΣ３＜−０．５およびＺΣ３＞−１．９４およびＺΣｈｄｂ＞０．２８５およびＺΣｈｄｂ＜２およびｈｄｂ＞５およびｈｄｂ＜３０
【０２７０】
１：最も好ましい：ＺΣＢｕｌｋｈａ＞３．２およびＺΣＢｕｌｋｈａ＜４．８およびＺΣ１＞−１．１およびＺΣ１＜１．９２およびＺΣ２＞−１．１およびＺΣ２＞０およびＺΣ３＜−０．５５およびＺΣ３＞−１．９４およびＺΣｈｄｂ＞−０．２８およびＺΣｈｄｂ＜１．５７およびｈｄｂ＞７およびｈｄｂ＜２５
【実施例１２】
【０２７１】
ｓｅｌＣＰＰ
序文
基質金属プロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）はＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼ類である。このファミリは膜結合メンバーおよび分泌メンバーの両方を含む。その両方共細胞質膜上または細胞外基質（ＥＣＭ）内のどちらかに局在する蛋白質類の分解を触媒する（スターンリヒト−０１）。
【０２７２】
ＭＭＰｓはＥＣＭを分解できるので、ＭＭＰｓは細胞の移動、再形成および炎症性反応に影響を与える。しかしこれらの酵素は侵襲性および炎症性疾患、例えば癌、リウマチ性関節炎、多発性硬化症および細菌性髄膜炎などの基礎的原因にも関係する（レッパート−０１）。
【０２７３】
転移や血管新生などの侵襲性プロセスの一つの特徴は、通常は細胞移動に対する物理的障壁であるＥＣＭおよび基底膜の分解である。ＭＭＰｓは種々様々の悪性腫瘍の侵襲性および転移性挙動に関連しており、これらの酵素は種々の腫瘍に過剰発現するのが普通である（スターンリヒト−０１、ロザノフ−０１）。異なるＭＭＰｓの数が腫瘍の進行につれて増加し（ヘキストラ−０１）、ある種の腫瘍の侵襲力と相関関係にある（ホーンベック−０１）ことが見いだされている。さらに、ＭＭＰｓの発現はトランスジェニックマウスの転移腫瘍数と相関関係にある（ストレンリヒト−０１）。
【０２７４】
ＭＭＰ−ＭＴ１のような膜型ＭＭＰｓ（ＭＴ−ＭＭＰ）は発癌に密接に関係している。これらの酵素は侵襲先端に局在する。可溶性ＭＭＰｓ１−３および９も腫瘍発生のアゴニストとして関係している（ロザノフー０１およびナベシマ−０２）。ＭＭＰ−ＭＴ１は血管形成中の内皮細胞の誘導および移動中にもアップレギュレートする（ガルヴェズ−０１）。その上、ＭＭＰ−ＭＴ１（またはＭＭＰ１４とも呼ばれる）はその“シェダーゼ（ｓｈｅｄａｓｅ）"活性によるｐｒｏＭＭＰ−２の活性化に関係し、それによって侵襲先端にＭＭＰ−２を放出する（ソンニ−０２）。ＭＭＰ−２は腫瘍血管新生に重要な役割を有するようにみえる（チェン−０１）。
【０２７５】
ｓｅｌＣＰＰｓ
選択的ＣＰＰｓの概念はＭＭＰｓ酵素活性の組織特異性に基づく。
一アプローチはＣＰＰをガラニンのような任意の受容体リガンドに結合することによって、エンドサイトーシス取り込みを用いてそのＣＰＰの特異性および活性化を調べることである。
【０２７６】
2006514602.tif 000037
2006514602.tif 000038
【０２７７】
ＭＭＰ活性化ｓｅｌＣＰＰ
典型的ｓｅｌＣＰＰ（図２５）は３つの部分、すなわちトランスポータ（ＣＰＰ）、特異的プロテアーゼ部位およびインアクチベータから作られる。インアクチベータはＣＰＰを不活性化するために付加され、インアクチベータが切り離される前にはそれが細胞に入ることができないようにする。ＣＰＰはトキシン、例えば公知の非侵入性細胞増殖停止物質および／または細胞傷害物質を担う。諸配列の好ましい実施形態およびペプチド類の標識化については表１３を参照されたい。
【０２７８】
上記の概念は次の３つの基礎的機能に基づく：ａ）ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−ＭＴ１による選択的切断（およびそれによる活性化）、ｂ）トキシンを担うペプチド（ＣＰＰ）による細胞侵入およびそれによるｃ）近くの、好ましくは腫瘍細胞または、腫瘍血管新生に含まれる内皮の死滅（略図が図２５に示される）。
【０２７９】
上記の概念を証明する例証的例として、発明者らは選択的ＣＰＰ（ＹＴＡ−２）のＣＰＰ部分が３７℃（図２７及び２８）および４℃（データは示されず）の両方において細胞に効率的に侵入できることを証明することに成功した。その上“インアクチベータ"（図２６参照）は細胞膜を転位する際のペプチドをより不活性にする。ＭＭＰ２によるＹＴＡ−２の正しい切断も質量分析によって確認されている（データは示されず）。細胞増殖停止物質および／または細胞傷害物質（ＭＴＸ）のＣＰＰ−部分への付着および効率は実施例１４を参照されたい。
【０２８０】
ＭＭＰ１４（またはＭＭＰ−ＭＴ１）の切断のための新しい配列が４種類ある：ＬＲＳＷ１−３およびｐｅｎＭＭＰ１４。後者はＭＭＰ１４を発現する細胞（ＢｏｗｅｓおよびＣａｃｏ−２）に取り込まれることが証明されている。図２４を参照されたい。
【０２８１】
それに加えて、６７ｋＤａ蛋白質蛍光標識化ストレプトアビジンは、ビオチニル化ＹＴＡ−２に結合したとき、陥入した（図３９および４０を参照）。これは、ＹＴＡ−２が大きいカーゴ分子を細胞内に運搬できることを示す。
【０２８２】
2006514602.tif 000039
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これまでに取り込みを試験した全てのｓｅｌＣＰＰを質量分析で確認する。さらに細胞培養培地および細胞溶解物中の安定性を測定する。さらに、これらのペプチドの選択性をインビトロ細胞アッセイで、例えばＣＰＰ部分の活性化のためのプロテアーゼを発現しない細胞と混合した選択的にプロテアーゼを発現する細胞で試験する（表１４）。
【実施例１３】
【０２８３】
分泌活性の調節によるＡβ産生の変化
アミロイド前駆体蛋白質をセクレターゼと呼ばれるプロテアーゼによって少なくとも３カ所処理する。Ａβ−フラグメントを生成する、アルツハイマー病における毒性の主因であると考えられるセクレターゼは、β−およびγ−セクレターゼである。これらのセクレターゼの調節は現在、アルツハイマー病の症状を軽減する目的の薬剤の開発のために最も興味深いアプローチである。
【０２８４】
このアプローチはＡＤ症状を直接抑制するようにみえるとはいえ、若干の注意が必要である。それは主として、セクレターゼ・プロセッシングにおいて作り出される他のフラグメント類、ｓＡＰＰ（分泌性ＡＰＰ）およびＡＩＣＤ（ＡＰＰ細胞内ドメイン）が、細胞の正しい機能のために必要なある種の活性を有するかどうかについてまだ若干の疑問があるからである。克服しなければならないもう一つの問題は、ＡＰＰへの影響をノッチから分離できることである。ノッチはＡＰＰと同様な様態でプロセッシングされるようにみえる。本発明の一実施形態において、この問題へのアプローチは、種々のセクレターゼから誘導されるペプチドフラグメントを合成し、セクレターゼ／ＡＰＰにおけるコンセンサス配列に結合できる能力を含むペプチドを見いだし、同時に細胞侵入能力を有するセクレターゼ結合と競合させることを含む。前記アプローチは同じ配列にトランスポータおよびデアクチベータを導入し、それによってアルツハイマー病に対して効果の可能性のある薬剤を得ることである。
【０２８５】
前記配列は、γ−セクレターゼ複合体における重要な構成成分である、プレゼニリン−１、ニカストリン、ＡＰＨ−１およびＰＥＮ−２から開始点（ｏｒｉｇｉｎ）を合成した。β−セクレターゼであると考えられる、ＢＡＣＥからの配列も合成される。
【０２８６】
2006514602.tif 000041
【０２８７】
方法
γ−セクレターゼ切断はルシフェラーゼ・リポータ・アッセイによってモニターされる（カールシュトレム（Ｋａｒｌｓｔｒ  ｍ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２年５月１日；２７７巻（９号）ｐ．６７６３−６）。ペプチドを曝露する時点は、これらのペプチドに関するこれまでのデータを調べることができなかったため、任意に選んだ。ペプチドを２回加え、その間に４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗い、溶解した。溶解後、ルシフェラーゼ活性および蛋白質濃度を測定した。結果は、ペプチドを加えなかった対照の％として示された。
【０２８８】
いずれかのペプチドの存在によりあらわれるルミネセンスを図３０に示す。ゼロより大きい結果は、対照に比較してＡＰＰの切断が増加したことを示し、ゼロより小さいデータは反対のことを示す。２種類のペプチド投与法の間にも細胞系反応の間にも差が認められる。Ｎ２９３は時点に関係なく種々の程度に影響を受け、他方、Ｃ２９３細胞系は主としてより長い暴露時間によって影響を受ける。２種類のペプチドは互いに切断パターンを辿るように見えるが、結果は異なる。
【実施例１４】
【０２８９】
細胞内薬剤送達の実施例：
メトトレキセートおよび細胞侵入ペプチド（ＭＴＸ−ＣＰＰ）の結合物
序文
メトトレキセート（ＭＴＸ）は細胞傷害性薬剤であり、悪性腫瘍の治療のために開発されたものであるが、現在は乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。ＭＴＸは葉酸拮抗物質（式１）であり、葉酸トランスポータによって細胞に入る。ＭＴＸの標的は葉酸要求酵素である。
乾癬治療におけるＭＴＸの使用は、全身投与時のその副作用によって抑制される。最も重大な副作用は肝毒性である。そこで、ＭＴＸの局所的投与組成物が非常に好ましい。
【０２９０】
式１．ＭＴＸの構造
2006514602.tif 000042
【０２９１】
生物学的液において、ＭＴＸは負電荷を有する分子として存在する。そのため、それは、葉酸トランスポータによってのみ細胞膜を通過することができる。本発明は先ず第一に、  １）容易に、かつ受容体／担体−非依存的に細胞内および皮膚内に侵入する
２）乾癬の顕著な特徴であるケラチノサイト過剰増殖を抑制する
３）不都合な副作用（ヒスタミン放出など）がない
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合体を生成する手段を明らかにする。
【０２９２】
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合体は全て、固相ペプチド合成戦略を用いて合成される。これには次の２つの理由が考えられる：
１）ＭＴＸ（ＣＡＳ番号５９−０５−２）は２つの構造単位：４−デオキシ−４−アミノ−Ｎ１０−メチルプテロイン酸（Ａｐａ、ＣＡＳ番号１９７４１−１４−１）およびγ−グルタメートに分けることができる
２）ＭＴＸはそのγ−カルボキシル基上の置換に対して比較的非感受性である。
【０２９３】
2006514602.tif 000043
表１６に示すように、数種のＭＴＸ−ＣＰＰ結合体が設計される。上記結合体のＣＰＰ部分は細胞内で分解すると予想される。
【０２９４】
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合物の固相合成
ＭＴＸはＢｏｃ化学作用の標準的切断条件のもとでは不安定であるため、Ｆｍｏｓ−化学作用を使用した（フッ化水素、０℃、３０分）。Ｆｍｏｓ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕとＡｐａとの結合は標準カップリング法（ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵ）を使用して行われた。結合物を試薬Ｋ（８２．５％ＴＦＡ：５％フェノール：５％チオアニソール：２．５％１，２−エタンジチオール）を用いて樹脂から切り離した。
【０２９５】
細胞培養物
全ての細胞は３７℃で５％ＣＯ２中で培養された。プラスチック実験器具はコーニング社（アクトン、ＭＡ）から入手した。ヒト新生児表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）、全ての増殖培地の成分および、その増殖のために必要なトリプシン化試薬はカスケード・バイオロジックス（商標）（ポートランド、オレゴン）から入手した。ＨＥＫｎ細胞を、ヒトケラチノサイト増殖補充キット（ＨＫＧＳ）およびペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシンＢを補充したエピライフ（Ｅｐｉｌｉｆｅ）（商標）培地に培養した。ＨＥＫｎ細胞を１週間に一度分割し、Ｔ７５あたり３０００００細胞を播種した。増殖培地を１〜２日ごとに交換した。
【０２９６】
Ｂｏｗｅｓヒトメラノーマ細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ＶＡ）から得た。Ｂｏｗｅｓ細胞を、グルタマックス−Ｉ、非必須アミノ酸、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン（図には“ＭＥＭ"として示される）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したイーグル最小必須培地に培養した。Ｂｏｗｅｓ細胞のための全ての培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）からのものであった。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）からのものであった。細胞を１週間に１回継代培養し、Ｔ７５あたり２０００００細胞を播種した。生育性のアッセイでは、実験前日に、２４ウェルプレートに１ウェルにつき５００００細胞（３００μｌ中）を播種した。
【０２９７】
Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ＶＡ）から入手した。Ｋ５６２細胞をグルタマックス−Ｉ、ペニシリン、ストレプトマイシン（図３２〜図３５には“ＲＰＭＩ"として示される）およびウシ胎児血清（７．５％）を補充したＰＲＭＩ−１６４０培地に培養した。Ｋ５６２のための全ての培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）から入手した。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）からのものであった。細胞を２日目または３日目（そのとき細胞密度は１００００００細胞／ｍｌに達した）ごとに継代培養し、１０００００細胞／ｍｌを播種した。生育性を試験するためには２４ウェル−プレートに１ウェルにつき３００００細胞／３００μｌを播種した。
【０２９８】
細胞の生育性の測定
結合物のストック溶液（１ｍＭ）を滅菌水で調製し、ＭＴＸのストック溶液を１０％ＤＭＳＯ水溶液で調製した。曝露のために、薬剤を曝露培地（無血清ＯＰＴＩＭＥＭまたはＭＥＭ中１％ＦＢＳまたはＭＥＭ中１０％ＦＢＳまたはＲＰＭＩ中７．５％ＦＢＳ）で希釈し、所望濃度（Ｂｏｗｅｓ細胞の場合）または１０×最終濃度（Ｋ５６２細胞の場合）にした。１ウェルにつき、それぞれの曝露混合物３００μｌ（Ｂｏｗｅｓの場合）または３０μｌ（Ｋ５６２の場合）を使用した。Ｂｏｗｅｓ細胞を使用するいくつかの実験で、曝露混合物を２時間後に除去し、あらかじめ温めた薬剤不含有曝露培地に代えた。１〜２日後、細胞の生育性をセルタイタ−グロ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）（商標）ルミネセント細胞生育性アッセイ（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）を使用して試験した。プレートを室温で平衡化した（約３０分間）。セルタイタ−グロ（商標）試薬３００μｌを各ウェルに付加し、１０分間インキュベートした。３００μｌを白色ポリスチレン製フルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ）（商標）プレート（ヌンクＡ／Ｓ、ロスカイルド、デンマーク）に移し、ルミネセンスを二重走査ミクロプレート・スペクトロフルオロメータ（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標）ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ、モレキュラー・デバイセス、サニーベイル、カリホルニア）で記録した。
【０２９９】
結果
これまでに得られた結果は、ＣＰＰへのＭＴＸの結合はＣＰＰの細胞侵入性を破壊しないことを明らかに示した（図３１にはＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５がヒト上皮ケラチノサイトに侵入することが示される）。また発明者らは、ＣＰＰへのＭＴＸの結合がＭＴＸの毒性作用を破壊しないことも見いだした。ＭＴＸのγ−カルボキシル基はＭＴＸのα−カルボキシル基よりもＣＰＰへの結合に適していることに注目されたい（図３２に見られるように、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ｐＶＥＣはＡｐａ−Ｇｌｕ−ＧｌｙｐＶＥＣより毒性が大きいことが証明されている）。さらに言えることは、これまでに試験された全ての結合物によって例示されるように、種々の異なるＣＰＰｓがＭＴＸ−ＣＰＰ結合物において有用であることである：図３２のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ｐＶＥＣ、図３４のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５および図３４および図３５のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２。
【実施例１５】
【０３００】
ＣＰＰを使用するｓｉＲＮＡ取り込みの改善
近年、小さい干渉ＲＲＮＡが、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する高い選択能力のために多くの注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化によってそれらの相補的ｍＲＮＡの特異的切断を誘起する二本鎖ＲＮＡの短い鎖（約２０ｂｐ）である。ＲＮＡ誘導性サイレンシングは内性メカニズムであるが、合成によって合成されたｓｉＲＮＡはインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが示された。
【０３０１】
残念ながらｓｉＲＮＡを使用する際の典型的問題は、細胞への取り込み収率が低いことである。本発明による細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を合成的に合成したｓｉＲＮＡに結合することによって、発明者らはインビトロおよびインビボの両方で細胞内取り込みを改善することができた。
【０３０２】
ＣＰＰトランスポータン１０（Ｔｐ１０）がジスルフィド−リンカーを介して結合しているガラニン受容体−１（ＧＡＬＲ−１）ｍＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡが設計された。そのＣＰＰの特性は、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを高め、それによってｓｉＲＮＡを薬物学的使用により適したものにすることが判明した。図３９に、その作用メカニズムの略図が与えられる。
【０３０３】
材料および方法：
Ｂｏｗｅｓｅ細胞を２４ウェルプレートで一晩増殖させた（１０００００細胞／ウェル）。それら細胞を２００μｌの１μＭ蛍光標識ペプチド（ｐＶＥＣ）、または蛍光標識したｓｉＲＮＡ−ペプチド（図３７による）で３７℃で３０分間処理した。細胞を３倍希釈の標準トリプシン／ＥＤＴＡにさらし、外側細胞膜にくっついた全てのペプチドを除去した。細胞をその後０．１％トリトン−Ｘで溶解し、スペクトロマックス・ゲメニＸＳ（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ  Ｇｅｍｅｎｉ  ＸＳ）蛍光リーダを使用してペプチド／ｓｉＲＮＡの取り込みを測定した。
【０３０４】
結果：
図３７からわかるように、結合していないｓｉＲＮＡに比較して、ＣＰＰ−結合ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の取り込みには明らかな差が認められた。取り込みは細胞侵入ペプチドによる膜の破壊によるものではなかった。さらに、非結合のｐＶＥＣおよびｓｉＲＮＡの混合物は細胞内に陥入しなかった。
当業者には公知のように、ｓｉＲＮＡは細胞内で低濃度（ｐＭレベル以下）でも良い効率を有したから、この取り込みは標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性分解を十分活性化する可能性があると考えられる。
【実施例１６】
【０３０５】
生体活性細胞侵入ペプチドを特徴づける一般的方法
トランスウェル（商標）実験
ヒト結腸癌細胞系Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ｖｉａ  ＬＧＣ、スエーデン）を１０％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、非必須アミノ酸１×１００、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した、グルタマックス（インビトロゲン、スエーデン）を含むダルベッコ改良必須培地に、５％ＣＯ２を富化した空気中で３７℃で増殖させた。
【０３０６】
トランスウェル（商標）透明カップ（０．４μｍ孔、コーニング・コスタ、オランダ）にウシ血漿フィブロネクチン０．５μｇ／ｍｌ（インビトロゲン、スエーデン）を塗布した。１０００００  Ｃａｃｏ−２細胞を１２ウェル  トランスウェル（商標）（１．１３ｃｍ２フィルタ面積）の各カップに播種し、少なくとも１０日間培養した。下方（１．５ｍｌ）および上方（０．５ｍｌ）チェンバ両方の培地を２〜３日ごとに交換した。細胞融合を位相差顕微鏡で検査し、ミリセル−ＥＲＳ（ミリポア、スエーデン）で、交流を使用してＴＥＥＲを測定した。細胞層侵入性の対照として、ＦＩＴＣ標識デキストラン４，４ｋＤａ（シグマーアルドリッヒ、スエーデン）の通過を、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ処理を行って、または行わずに測定した。ペプチド類の添加前、下方ウェルの培地をＨＥＰＥＳ干渉クレプス−リンゲル溶液（ＨＫＲ）に取り替えた。実験を開始する前に抵抗は６００Ω／ｃｍ２に達したので、５００Ωを超える数値は高抵抗と考えられる。
【０３０７】
燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に溶解した１０μＭ濃度のホルオロフォア標識ペプチドを上方トランスウェル（商標）チェンバに加えた。各時点に、１５０μｌサンプルを下方チェンバから集め、蛍光をスペクトロマックス・ゲミニＸＳ（モレキュラーデバイス、カリホルニア）を用いて３２０／４２０ｎｍ（Ａｂｚ）および４９２／５２０ｎｍ（フルオレセイン）で測定した。
【０３０８】
細胞侵入研究および蛍光顕微鏡
細胞を２４−ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ（１２ｍｍ、ＧＴＦ、スエーデン）上に約５０％融合するまで増殖させた。培地を無血清培地に代え、ビオチニル化ペプチド溶液を加えた。細胞を３７℃または４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い、４％パラホルムアルデヒド溶液で室温で（暗所）１５分間固定し、その後０．５％ｗ／ｖトリトンＸ−１００を含む３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中で氷上で３分間、浸透性にした。非特異的結合部位を３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で４℃で一晩ブロックした。ペプチド類をアビジン−ＦＩＴＣまたはストレプトアビジン−ＴＲＩＴＣ（モレキュラー・プローブス、オランダ）で染めることによって可視化した。細胞核をヘキスト３３２５８（０．５μｇ／ｍｌ）で５分間染色し、その後カバースリップをＰＢＳで３回洗い、ＰＢＳ中２５％グリセロール中に固定する。画像をライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭ  ＩＲＥ２蛍光顕微鏡（ライカ・マイクロシステム、スエーデン）でとり、フォトショップ（ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ）６．０ソフトウエア（アドーブシステムズ社（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｎｓ）、カリホルニア）で処理した（図３８〜図４０などを参照されたい）。
【０３０９】
懸濁細胞におけるペプチドの取り込みおよび流出の研究
細胞をトリプシン（インビトロゲン、スエーデン）で脱着し、培養培地に溶解し、遠心分離した（１０００×ｇ、１０分間、室温）。細胞を再懸濁し、数え、氷上のＨＫＲ中に３０００００細胞／チューブづつ取り分けた。Ａｂｚ標識化ペプチドを懸濁液中の細胞と一緒に３７℃で１５分間および３０分間振とうしながらインキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を３分間加えた。細胞を１０００×ｇで４℃で１０分間スピンダウンした。蛍光検出のためにペレットをＨＫＲに再懸濁し、または流出サンプルで、無ペプチドＨＫＲと共に再びインキュベートした。蛍光をスペクトロマックス・ゲミニＸＳ（モレキュラーデバイス、カリホルニア）で３２０／４２０ｎｍで読んだ。細胞内濃度をＡｂｚ−標識ペプチドの標準曲線から計算した。Ｃａｃｏ−２細胞の平均細胞容量をクールター２５６チャネライザー（クールタ・エレクトロニックス社、カリホルニア）を使用して測定した。
【０３１０】
質量分析により検出されるペプチドの分解／細胞内取り込み
３５ｍｍ細胞培養皿における８％融合細胞を、種々の時点において、無血清培地に溶解した１０μＭペプチドで処理した。細胞をＰＢＳで３回洗い、細胞を氷上で０．１％ＨＣｌで１５分間処理することによって細胞溶解物を調製した。溶解物を１３０００ｇで５分間遠心分離し、凍結した。充填する前に、それらのサンプルをＣ１８  Ｚｉｐ  Ｔｉｐカラム（ミリポア、スエーデン）を用いて精製し、その後Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＲ  ＳＴＲ装置で分析した（アプライド・ビオシステムズ、フラミンガム）。
【０３１１】
膜侵害アッセイ
２−デオキシグルコース・アッセイ
細胞を１２−ウェルプレートに播種し、播種の５日後に実験に使用した。先ず最初に、２−デオキシ−Ｄ−[１−３Ｈ]−グルコースの０．５μＣｉを無糖緩衝液中で各ウェル（アマーシャム・ファルマシア・ビオテク、英国）に加えた。３７℃で２０分間インキュベーション後、ペプチドを無血清培地に加え、最終濃度５、１０および２０μＭにした。陽性対照として、細胞をＰＢＳ中１％トリトンＸ−１００で処理した（漏出の上限を確認するため）。１、５、１５および３０分に、１５０μｌ培地サンプルを集め、エマルジファイアセーフ・シンチレーション・カクテル（パッカード、オランダ）を加え、放射能をパッカード３２５５液体シンチレーションカウンタで測定した。各ウェルからの相対的放射性流出を未処理細胞のパーセンテージとして計算した。
【０３１２】
ラクテート・デヒドロゲナーゼ・アッセイ
ラクテート・デヒドロゲナーゼ漏出を、プロメガ社（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）のＣｙｃｌｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）ホメオゲナス・メンブラン・インテグリティ・（Ｈｏｍｅｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）アッセイを用いて試験し、メーカーの説明書によってラクテート・デヒドロゲナーゼ活性を計算した。
【０３１３】
ヒスタミン放出アッセイ
細胞培養
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ヴァージニア）から入手した。細胞を、グルタマックス−Ｉ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび加熱不活性化ウシ胎児血清（１０％）を補充したイーグル最小必須培地に培養した。全培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）から得た。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）から得た。細胞を１週間に２回分割し、Ｔ７５あたり約１．２百万個の細胞を播種した。ヒスタミン放出アッセイでは、実験の前日に、２４ウェル−プレートに１ウェルごとに１２５０００〜２５００００個の細胞（１ｍｌ中）を播種した。
【０３１４】
次の溶液を使用した：アッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  １ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．５ｍＭ  グルコース、ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＴ）−メタノール溶液、３Ｍ  ＨＣｌおよび０．１％トリトンＸ−１００。全ての化学物質はシグマ−アルドリッヒ（セントルイス、マサチューセッツ）からのものである。１ｍＭペプチド保存溶液を水で調製し、アッセイ緩衝液を使用してさらに希釈した。細胞をアッセイ緩衝液で２回洗い、その後ペプチドをアッセイ緩衝液３００μｌに所望濃度で加えた。総細胞ヒスタミンを測定するために、幾つかのウェルを０．１％トリトンＸ−１００にさらした。３７℃で２０分間インキュベートした後、曝露培地を１．５ｍｌポリプロピレンチューブに移し、短時間遠心分分離した（２分間、３０００ｒｐｍ）。
【０３１５】
ＯＰＴを使用するヒスタミン測定
ＯＰＴはシグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ミズーリ州、から入手した。上澄液２００μｌを黒色未処理マイクロウエル−プレート（ＮＵＮＣ）に移し、４０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨおよび１０μｌのＯＰＴ溶液を加え、４分間振とうすることによってヒスタミンを測定した。反応を停止するために、２０μｌの３Ｍ  ＨＣｌを加えた。３０秒後、蛍光強度を３５５ｎｍ励起フィルタおよび４５５ｎｍ発光フィルタを使用して測定した（ＳＰＥＫＴＲＡＭＡＸ（商標）ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ、モレキュラデバイス、サニーベイル、カリホルニア）。放出されたヒスタミンを総細胞ヒスタミンのパーセンテージとしてあらわした。
【０３１６】
ＥＬＩＳＡを使用するヒスタミン測定
ヒスタミン用のＥＬＩＳＡキットはＩＢＬ社（ハンブルグ、ドイツ）から入手した。アッセイはメーカーの説明書にしたがって実施した。吸光度測定はＡＳＹＳ  Ｈｉｔｈ社（ユーゲンドルフ、オーストリア）からのディジスキャン（Ｄｉｇｉｓｃａｎ）・マイクロプレート・リーダーを使用して行った。
【０３１７】
[３５Ｓ]−ＧＴＰγＳ結合アッセイ
[３５Ｓ]−ＧＴＰγＳ結合の初速度に与えるペプチドの影響を若干改良を加えたマッケンジーによるプロトコルにしたがって測定した。つまり、膜を５００００〜７００００ｃｐｍの[３５Ｓ]−ＧＴＰγＳ（アマーシャム・ビオサイエンシス）と共にアッセイ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭ  ＧＤＰ、ｐＨ７．５）中でインキュベートした。アッセイ混合物中における最終的蛋白質濃度、インキュベーション時間および温度を調節し、結合曲線の直線部分にウィンドウを与えるようにした。一般的には、それぞれの数値は１−２．５ｍｇ／ｍｌ、２〜５分、１５または２５℃であった。未結合[３５Ｓ]−ＧＴＰγＳを除去するために、０．９ｍｌの氷冷ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスーＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を加え、反応混合物を、少なくとも１時間ＴＥ緩衝液に予備浸漬した、結合樹脂のないガラス繊維フィルタ（ミリポア、ＡＰＦＡ０２５００）を通して急速濾過した。それらのフィルタを３×５ｍｌの氷冷ＴＥ−緩衝液で洗い、カウンティング・バイアルに移した。１０ｍｌのシンチレーション・カクテル（エマルジファイアーセイフパッカード）を各バイアルに加え、翌日放射能を計数した。
【実施例１７】
【０３１８】
ブタ冠状動脈に与えるＣＧＲＰＲループ（Ｍ６３０）の細胞内ループの影響：
ＣＧＲＰ受容体ループｉＣ４、配列３９１−４０５（ＶＱＡＩＬＲＲＮＷＮＱＹＫＩＱ）を合成し、Ａｔ１ＡＲループについて既述したように、血管で試験した。
【０３１９】
ブタ冠状動脈をＫＣｌを用いて収縮させた。その動脈を洗浄によって弛緩した後、５０μＭ  Ｍ６３０を加えた。約１０分後に収縮が始まり、添加後１５〜２０分以内に最大値に達した。洗浄は収縮を逆転させなかった。その効果は再現性があり、常に非常にはっきりと認められた。典型的実験の記録を図４１に示す。１０分間の遅れ時間は、Ｍ６３０が細胞に侵入するために必要な時間であった。Ｍ６３０は収縮した動脈には効果を示さなかった。
【０３２０】
この実験のための方法
１．細胞培養
Ｒｉｎ  ｍ５Ｆ細胞を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に単層培養として３７℃で５％ＣＯ２空気中で増殖させた。
Ｓｆ９細胞は、１０％加熱活性化ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したグレース（Ｇｒａｃｅ）のインセクト培地に単層培養として２８℃で５％ＣＯ２空気中で維持した。
【０３２１】
２．Ｓｆ９細胞におけるＧ−蛋白質の過剰発現
Ｓｆ９細胞に、ヘテロトリマーＧ−蛋白質（Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｏ、Ｇα１１）の種々のαサブユニットを担う組換えバキュロウィルス・ベクターをβ１γ２と共に、若干改良したネスマン（Ｎａｅｓｓｍａｎ）らの方法によって同時トランスフェクトした。つまり、約６×１０６細胞／７５ｃｍ２フラスコ  に高力価組換えバキュロウィルス・ストック溶液を感染させた。２８℃で６０分間インキュベーションした後、ウィルスストックを除去し、新鮮培地を加え、細胞を２８℃で３日間増殖させた。Ｇ−蛋白質の発現を１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。それは対照の非トランスフェクト細胞とは異なり、Ｇ−蛋白質のβ−サブユニットおよびαサブユニットにそれぞれ対応する分子量３６および４０〜４５ｋＤａの強い蛋白質バンドを示した。過剰発現したＧ−蛋白質の各型（Ｇｓ、Ｇｉ１、Ｇｏ、Ｇ１１）を、それぞれのモノクローナル抗体を使用してさらにチェックした。過剰発現の収率は、トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞から得られた膜に対する[３５Ｓ]−ＧＴＰγＳ結合率の比較によって評価した。
【０３２２】
３．細胞膜の調製
細胞膜を既述のように若干改良を加えたマッケンジーたらのプロトコル、１９９２、によって得た。単層細胞培養物を洗浄し、その後ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁した。脳膜の場合はウィスターラットを殺し、全脳を摘出し、スライスした。脳皮質を分離し、液体窒素中で速やかに凍結した。膜調製の直前に、組織を細かく切り刻んだ。材料（組織または細胞）をポリトロン型ホモジナイザー（ブラウン社（Ｂｒａｕｎ  ＡＧ）、ドイツ）でホモジナイズした。ホモジネートを５００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄液をベックマン−Ｌ８  ７０Ｍ超遠心機（ベックマン・インスツルメント、ＵＳＡ）で４００００×ｇで３０分間遠心分離することによって膜を集めた。全操作は４℃未満の温度で行われた。膜調製物中の蛋白質濃度はローリーらの方法（１９５２）によって測定して１ないし２．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０３２３】
Ｍ６３０の細胞内取り込みを前記のように試験し、その結果を図４２に示す。
【０３２４】
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【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】単一膜貫通（Ａ）または７回膜貫通（Ｂ）受容体との相互作用の適用によってｓｅｌＣＰＰを特定位置に入れる図式である。
【図２】細胞内に拘束されているｓｅｌＣＰＰが、特異的受容体による認識事象によってその拘束をゆるめられ、インターナリゼーションが起きる。
【図３】キメラｓｅｌＣＰＰの略図である。
【図４】非共有結合ｓｅｌＣＰＰ−ＡＢ複合体と、エピトープ配列を露出する選択された細胞とのインキュベーション。ペプチドＸはＡＢと細胞表面蛋白質のペプチドＸ配列との競合的相互作用に導く。
【図５】不活性化されたｓｅｌＣＰＰの例。ＬｏＶｏ細胞におけるＹＴＡ−２（Ａ）とＹＴＡ−２ｐｓ（Ｂ）とのインターナリゼーションの比較。両方とも３７℃でＴＲＩＴＣアビジンによって検出されるビオチニル化ペプチドである。
【図６】プロテアーゼ活性化ｓｅｌＣＰＰ、フルオロフォア／クェンチャー（消滅）システムによる検出の例。基質金属プロテイナーゼ−２のＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断の確認法（ＭＭＰ−２）。
【図７】受容体およびトリマーＧ−蛋白質に結合した７ＴＭ架橋（ｓｐａｎｎｕｎｇ）Ｇ−蛋白質の図式的構造。
【図８】３７℃におけるＢｏｗｓｅ細胞におけるＧＯＰ（Ｍ５６９）の細胞内取り込み。細胞質および細胞膜の両方に局在しているのがわかる。
【図９】細胞侵入ペプチドＧＯＰによるラット膵島におけるインキュベート放出の促進
【図１０】ＧＯＰ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびグルコース（１ｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射後の健康ラットにおける血糖濃度
【図１１】ＧＯＰ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびグルコース（１ｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射後の健康ラットにおける血漿インスリン濃度
【図１２】Ｐｒｐｃ−アビジン−ＦＩＴＣのインターナリゼーション。２．５μＭと共にアビジン−ＦＩＴＣの１００倍希釈物をＢｏｗｓｅメラノーマ細胞と共に３時間インキュベートした。細胞膜および核膜が明らかに輪郭づけられる。
【図１３】ＬｏＶｏ細胞（ヒト結腸癌）、３７℃、における１０μＭペプチドの転位
【図１４】１０μＭ濃度のＮ２Ａ細胞の細胞内インターナリゼーションＡおよびＢ）蛍光に結合したＡＰＰ５２１−５３６で処理した細胞。Ｃ）フルオレセインに結合したＡＰＰ７２５−７４０で処理した細胞。Ｄ）蛍光に結合したＰＳ−１  ９７−１０９欠失類似体で処理した細胞。Ｅ）蛍光に結合した公知のＣＰＰペネトラチンで処理した細胞。
【図１５】Ｂｏｗｓｅメラノーマ細胞中のビオチニル−Ｍ５１１（Ａ）、ビオチニル−グクランブルＭ５１１（Ｂ）、天然バックグラウンド（Ｃ）およびペネトラチン（Ｄ）の局在。ペプチド濃度１０μＭ、インキュベーション時間１時間（４℃）。染色には１５０ｎＭストレプトアビジン−ＦＩＴＣを使用した。
【図１６】ブタ左前下行冠状動脈の収縮に与えるＭ５１１（上および中のパネル）およびスクランブルドＭ５１１（下のパネル）の影響。上皮のないブタ左前下行冠状動脈の場合（上パネル）および完全な上皮のある場合（中および下パネル）。矢印の意味：１−３０ｍＭ  ＫＣｌ投与；２−サブスタンスＰの投与；３−洗浄；４−１６μＭ  Ｍ５１１またはスクランブルドＭ５１１の投与。
【図１７】Ｍ５１１（■）およびビオチン結合Ｍ５１１（□）の濃度と、ブタ冠状動脈の最大に認められる相対的収縮との関係。９０ｍＭ  ＫＣｌによて得られた収縮を１００％とした。曲線はプリズムコンピューター・パッケージ（グラフパド・ソフトウエア社、ＵＳＡ）を使用する非線型回帰法により、変数勾配（Ｈｉｌｌ係数）を有するが底部（０％）と頂部（１００％）は固定値である用量反応等式によって作成した。
【図１８】ブタ左前下行冠状動脈から作成した膜へのＧＴＰγＳ結合率に与えるＭ５１１（□−膜とペプチドとの予備的インキュベーションなし；−●  膜とペプチドとの２５分間の予備的インキュベーション）、ビオチニル化Ｍ５１１（○−膜とペプチドとの予備的インキュベーションなし）、およびスクランブルドＭ５１１（×−膜とペプチドとの予備的インキュベーションなし）の影響。
【図１９】Ｍ５１１によって誘発されたブタ左前下行冠状動脈の収縮に与えるホスホリパーゼＣインヒビタＵ７３１２２の影響。収縮力は任意の単位で与えられる。矢印の意味：１−３０ｍＭ  ＫＣｌの投与；２−サブスタンスＰの投与；３−洗浄；４−１６μＭ  Ｍ５１１の投与；５−３０μＭ  Ｕ７３１２２の投与。
【図２０】Ｍ５１１（上のグラフ）およびアンジオテンシンＩＩ（下のグラフ）によって誘発されるブタ左前下行冠状動脈の収縮に与えるＳａｒ１−Ｔｈｒ８−アンジオテンシンＩＩの影響。矢印の意味：１−−３０ｍＭ  ＫＣｌの投与；２−−洗浄；３−−１００μＭ  Ｍ５１１の投与；４−−１μＭ  アンジオテンシンＩＩの投与；５−−４５μＭ  Ｓａｒ１−Ｔｈｒ８−アンジオテンシンＩＩの投与。
【図２１Ａ】未修飾６０ｋＤａ  ＰＥＩ（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはＴＰ１０修飾ＰＥＩ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）をトランスフェクトした３日後のＮ２Ａ細胞におけるＧＦＰ発現。プラスミド濃度は各時点に０．５μｇ／ウェルで、Ｍ／Ｐ比は４（ＡおよびＤ）、８（ＢおよびＥ）または１６（ＣおよびＦ）である。
【図２１Ｂ】ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２で測定したＧＦＰ活性。各場合のプラスミド濃度１．２μｇ／ウェル。トランスフェクションの２４時間後に発現を測定した。Ｂ）バックグラウンドを対照として示されたルシフェラーゼ活性。プラスミド濃度０．５μｇ／ウェル。蛋白質発現はトランスフェクションの７２時間後に測定した。
【図２２】マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞の、未修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、または化学的に架橋したＰＥＩおよびシステイニルＹＴＡ２またはＴＰ１０ペプチドによるトランスフェクション。２種類の濃度のＰＥＩまたはペプチジル−ＰＥＩを試験した：１または０．５μｇ／１ｍｌ培地。トランスフェクションは無血清増殖培地（ＤＭＥＭ）中で３時間行われ、トランスフェクションの４８時間後に写真をとった。ＹＴＡ２およびＴＰ１０ペプチド類の使用でトランスフェクションが改善することが記録された。ＹＴＡ２−ＰＥＩおよびＰＥＩ−ＴＰ１０は未修飾ＰＥＩより２倍も多くの細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞における発現レベルもより高い。
【図２３】ヒト７Ｔｍ受容体内のＣＰＰの位置の走査。ヒト７Ｔｍ受容体配列をｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ｔｒｍｂｌデータベースからダウンロードした。その配列について指示された長さ（８、１２および１７ａａ長さ）のＣＰＰを検索した。蛋白質中のＣＰＰの開始位置をその蛋白質の全長で割り、発生頻度に対してプロットする（ＣＰＰｓフラクション）。ここで検索ウィンドウ１７ａａが最大のヒットを生じた。４つのピークは明らかに７Ｔｍの細胞内４部分に対応し、最大のピークはＩＣ３に対応する。ＣＰＰの機能性が７Ｔｍのトポロジー並びに提案されたＧ−蛋白質の活性化部位の両方とよく相関するようにみえることは注目される。
【図２４】不活性化されたｓｅｌＣＰＰの別の例。Ｂｏｗｅｓ（Ａ）および（Ｂ）およびＣａｃｏ−２（Ｃ）および（Ｄ）におけるＰｅｎＭＭＰ１４の取り込み。左側はフルオレセイン標識化ペプチド（Ａ）および（Ｃ）の取り込みで、左はクマリン標識（Ｂ）および（Ｄ）である。
【図２５】組織−（腫瘍）選択的取り込み（ｂ）に導く、任意の組織／器官／細胞特異的プロテアーゼを代表する基質金属プロテアーゼ（ａ）によるｓｅｌＣＰＰ活性化の図式。
【図２６】組織−（腫瘍）選択的取り込み（ｂ）に導く、基質金属プロテアーゼ（ａ）によるｓｅｌＣＰＰ活性化の図式。
【図２７】ヒト結腸腺癌、ＬｏＶｏ細胞におけるビオチニル化ＹＴＡ−２のインターナリゼーション．Ａ）ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで検出  Ｂ）ヘキストによる核染色を比較。
【図２８】ＬｏＶｏ細胞におけるＹＴＡ−２ｐｓ（Ｂ）と比較したＹＴＡ−２（Ａ）のインターナリゼーション。両方とも３７℃でＴＲＩＴＣ−アビジンによって検出された。Ｃ）およびＤ）はストレプトアビジンＴＲＩＴＣおよび核染色で検出されるＣａｃｏ−２細胞中のＹＴＡ−２。
【図２９】蛍光標識化ペプチド（Ｆ）の取り込み。図は加えたペプチドの取り込み％で示される。
【図３０】ペプチド誘導性ルミネセンス。Ａ、Ｃ：指示された濃度のＰＳ−１（７）およびＰＳ−１（１１）の４×８時間の曝露を受けたＮ２９３およびＣ２８３細胞系。Ｂ、Ｄ：４時間ペプチド曝露後のＮ２９３およびＣ２８３細胞系。
【図３１】培養ヒト上皮ケラチノサイトへのＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５の侵入。免疫蛍光的検出。
【図３２】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与える種々のＭＴＸ−ｐＶＥＣ結合体の影響。１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ中で２４時間曝露。
【図３３】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与えるＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５の影響（アッセイにはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）を使用）。
【図３４】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与えるＭＴＸ、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２およびＹＴＡ２の影響（アッセイにはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）を使用）。
【図３５】Ｋ５６２細胞生育性に与えるＭＴＸ、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２およびＹＴＡ２の影響。７．５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩに２日間曝露。
【図３６】ジスルフィド結合でＴｐ１０−ＰＮＡに結合したｓｉＲＮＡ。構成物および細胞内の理論的作用メカニズムの略図。
【図３７】Ｂｏｗｅｓ細胞への１μＭペプチド−ＤＮＡ構成物の取り込み、３７℃、３０分間、２４ウェルプレート。
【図３８】十分に研究されたＣＰＰによる細胞侵入の例。生きているＣａｃｏ−２細胞内への１μＭフルオ−ペプチドのペプチドインターナリゼーション。
【図３９】３７℃およびＴ／Ｅにおけるフルオ−ストレプトアビジンのＹＴＡ−２による蛋白質インターナリゼーション。ｓｅｌＣＰＰの送達特性を示す。
【図４０】４℃およびＴ／Ｅによるフルオ−ストレプトアビジンのＹＴＡ−２による蛋白質インターナリゼーション。ｓｅｌＣＰＰの送達特性および温度依存性を示す。
【図４１】ブタ冠状動脈に与えるＭ６３０（５０μＭ）の影響。矢印は下記の操作を示す：１−ＫＣｌの適用；２−洗浄；３−５０μＭ  Ｍ６３０の適用。
【図４２】共焦点性顕微鏡によって可視化された、フルオレセインに結合したＭ６３０のＮ２ａ細胞への細胞インターナリゼーション。細胞は最終的ペプチド濃度５μＭで３７℃１時間インキュベートされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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