(57)【要約】本発明は、細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明は、細胞表面膜において、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）などのタンパク質の挿入または保持を調節する方法に関する。本発明はまた、嚢胞性線維症など、細胞表面膜タンパク質の異常な挿入または活性によって生じる疾患の診断および治療または予防方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの活性または細胞での位置を決定するステップを含み、前記化合物の不在下と比較したときの、前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの活性または細胞での位置の変化が、前記化合物が細胞表面タンパク質の活性を調節することを示す、前記方法。
【請求項２】
前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの細胞での位置の変化が、前記化合物が細胞表面タンパク質の活性を増大させることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの発現レベルを決定するステップを含み、前記化合物の不在下と比較したときの、前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現の変化が、前記化合物が細胞表面タンパク質の活性を調節することを示す、前記方法。
【請求項４】
前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現低下が、前記化合物が細胞表面タンパク質の活性を増大させることを示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でのトロポミオシンのその結合相手の１つとの結合を測定するステップを含み、前記化合物の不在下と比較したときの、前記化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの変化が、前記化合物が細胞表面タンパク質の活性を調節することを示す、前記方法。
【請求項６】
前記化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの低下が、前記化合物が細胞表面タンパク質の活性を増大させることを示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トロポミオシンの結合相手が、カルポニン、ＣＥＡＣＡＭ１、エンドスタチン、エニグマ、ゲルソリン（好ましくは、サブドメイン２）、Ｓ１００Ａ２およびアクチンからなる群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記トロポミオシンの結合相手がアクチンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞表面タンパク質が、輸送タンパク質、チャネル、受容体、増殖因子、抗原、シグナル伝達タンパク質および細胞接着タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が輸送タンパク質またはチャネルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
嚢胞性線維症の治療のための治療用化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの活性または細胞での位置を決定するステップを含み、前記化合物の不在下と比較したときの、前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの活性または細胞での位置の変化が、前記化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、前記方法。
【請求項１２】
前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの細胞での位置の変化が、前記化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
嚢胞性線維症の治療のための治療用化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの発現レベルを決定するステップを含み、前記化合物の不在下と比較したときの、前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現の変化が、前記化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、前記方法。
【請求項１４】
前記化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現低下が、前記化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
嚢胞性線維症の治療のための治療用化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンのその結合相手の１つとの結合を測定するステップを含み、前記化合物の不在下と比較したときの、前記化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの変化が、前記化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、前記方法。
【請求項１６】
前記化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの低下が、前記化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記トロポミオシンの結合相手が、カルポニン、ＣＥＡＣＡＭ１、エンドスタチン、エニグマ、ゲルソリン（好ましくは、サブドメイン２）、Ｓ１００Ａ２およびアクチンからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トロポミオシンの結合相手がアクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
同定した化合物をヒトまたは非ヒト動物への投与用に製剤するステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞表面膜におけるタンパク質の挿入または保持を調節する方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記細胞表面膜における前記タンパク質の挿入または保持が、前記細胞にトロポミオシンアンタゴニストを投与することによって増加する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、輸送タンパク質、チャネル、受容体、増殖因子、抗原、シグナル伝達タンパク質および細胞接着タンパク質からなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記輸送タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞内外への分子の輸送を調節する方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記細胞内外への分子の輸送が、前記細胞にトロポミオシンアンタゴニストを投与することによって増加する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記分子が、電解質、水、単糖類およびイオンからなる群から選択される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を被験体に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記細胞が非筋肉細胞である、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞がニューロン細胞または上皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記上皮細胞が消化管上皮細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞表面膜タンパク質の異常な挿入または活性によって生じる前記疾患が、嚢胞性線維症、多発性硬化症、多発性嚢胞腎疾患、ウイルス感染、細菌感染、再灌流損傷、メンケス病、ウィルソン病、糖尿病、筋緊張性ジストロフィー、てんかん、および、うつ病、双極性障害または気分変調性障害などの気分障害からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
被験体における嚢胞性線維症を治療または予防する方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を前記被験体に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記トロポミオシンが、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＰＭ３およびＴＰＭ４からなる群から選択される遺伝子によってコードされるアイソフォームである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記トロポミオシンアイソフォームが、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ５ａ、ＴＭ５ｂ、ＴＭ６、Ｔｍ５ＮＭ−１、Ｔｍ５ＮＭ−２、Ｔｍ５ＮＭ−３、Ｔｍ５ＮＭ−４、Ｔｍ５ＮＭ−５、Ｔｍ５ＮＭ−６、Ｔｍ５ＮＭ−７、Ｔｍ５ＮＭ−８、Ｔｍ５ＮＭ−９、Ｔｍ５ＮＭ−１０、およびＴｍ５ＮＭ−１１からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記トロポミオシンアイソフォームが、ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１１）、またはＴＰＭ３遺伝子のエキソン１ｂによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記トロポミオシンアイソフォームが、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記作用因子が、ペプチド、トロポミオシンに対する抗体、有機小分子、トロポミオシンをコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス化合物、リボザイムやＤＮＡザイムなどの抗トロポミオシン触媒分子、およびトロポミオシン発現を標的とするｄｓＲＮＡまたは短鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子からなる群から選択されるトロポミオシンアンタゴニストである、請求項２０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記トロポミオシンアンタゴニストが、トロポミオシンをコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス化合物、触媒分子またはＲＮＡｉ分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記トロポミオシンアンタゴニストが、ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂ（配列番号７）またはＴＰＭ３遺伝子のエキソン１ｂ（配列番号８）を特異的に標的とするアンチセンス化合物、触媒分子またはＲＮＡｉ分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記トロポミオシンアンタゴニストが、配列ＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧ（配列番号１３）を標的とするアンチセンス化合物、触媒分子またはＲＮＡｉ分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記トロポミオシンアンタゴニストが、配列ＣＡＣＣＧＣＣＵＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴ（配列番号１４）を含むアンチセンス化合物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる疾患に対する個人の素因を評価する方法であって、前記個人のトロポミオシン遺伝子における突然変異の存在を判定するステップを含む、前記方法。
【請求項４３】
細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる疾患に対する個人の素因を評価する方法であって、前記個人の細胞におけるトロポミオシンの局在分布を分析するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞表面膜においてタンパク質の挿入または保持を調節する方法に関する。本発明はまた、嚢胞性線維症などの、細胞表面膜タンパク質の異常な挿入または活性によって生じる疾患の診断および治療または予防のための方法にも関する。本発明はさらに、細胞内外への分子の輸送を調節する化合物、および細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞極性の確立および維持は、上皮細胞の機能に固有のものである。この独特の機能ドメインの形成は、障壁をもたらし、イオンおよび溶質の輸送を調節する際の役割に関係する。この機能的な極性化の発生を導く事象には、Ｅカドヘリンが媒介する細胞と細胞の接触、およびインテグリンが媒介する細胞と細胞外マトリックスの接着がある。この空間的な手がかりは、細胞骨格およびシグナル伝達複合体の局在化された構築を介して、細胞の内部成分とコミュニケーションする。これは次に細胞表面および分泌系の再組織化を誘導する。インテグリンを含む複合体とカドヘリンを含む複合体の両方との直接の相互作用に基づくアクチン骨格は、上皮細胞極性の確立に中心的な役割を果たす。同様に、アクチン繊維系は、出芽酵母における標的分泌に関与する。したがって、アクチン骨格は、様々な生物門で極性の確立に役割を果たすと思われる。
【０００３】
アクチン骨格の局在化した機能は、インテグリンおよびカドヘリンを含む複合体とのアクチン繊維の特異的な相互作用以上のことを行うことができる。アクチン繊維自体のアイソフォーム組成が、細胞の異なる部位で異なる可能性を示す証拠が増加している。胃壁細胞では、βおよびγアクチンアイソフォームは細胞中で示差的に分布しており、βアクチンは、主としてより代謝的に活性な頂端表面に位置する。βおよびγアクチンの同様の局在化が、成人ニューロン中で観察される。局在化はまた、ｍＲＮＡの位置まで拡張され、γではなくβアクチンｍＲＮＡが、層状仮足や成長円錐など運動性と関係する細胞内の末梢部位に特異的に位置する。
【０００４】
上皮細胞極性の変化またはタンパク質標的送達のプロセスの欠陥が重要な特徴である多数の疾患状態がある。常染色体性の多発性嚢胞腎では、例えば、頂端膜上の側底タンパク質の異常な発現の結果、体液で満たされた嚢胞が生成する。側底膜組織化に必要な３種の細胞骨格結合タンパク質であるＥカドヘリン、ｓｅｃ６およびｓｅｃ８が、この疾患細胞内で異常な位置を占めることが最近報告されている。この結果、側底膜へのタンパク質および脂質の送達が障害される（Charronら、2000, Journal of Cell Biology 149, 111-124）。
【０００５】
嚢胞性線維症とは、一般にΔＦ５０８突然変異に起因する常染色体劣性の病態である。この突然変異の結果、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）塩素イオンチャネルの異常が生じる。ΔＦ５０８突然変異による嚢胞性線維症では、このＣＦＴＲが異常に折り畳まれ、その状態で保持され、ＲＥＲによって分解される（Quら、1997, Journal of Bioenergetics & Biomembranes 29, 483-490; BrownおよびBreton、2000, Kidney International 57, 816-824）。さらに、ΔＦ５０８突然変異を伴うＣＦＴＲは、頂端膜での半減期がより短い（Hedaら、2001, American Journal of Physiology-Cell Physiology 280, C166-C174）。
【０００６】
嚢胞性線維症の患者では、肺上皮細胞表面でＣＦＴＲタンパク質の量が低下している。デルタＦ５０８と呼ばれる共通の変異型ＣＦＴＲが細胞内部に捕捉され、ごく少ないコピー数のＣＦＴＲしか、それが属する細胞の表面に出現しなくなることが過去に示されている。ＣＦＴＲタンパク質が捕捉されるのは、単にそれが十分迅速に折り畳まれず、それらの誤って折り畳まれたタンパク質が、目的地（すなわち細胞表面）に達する機会を得る前に分解されることによるものであるという１つの理論がある。ＣＦＴＲが細胞内に捕捉されるのは、それが細胞内部の他のタンパク質、例えばＢＡＰ３１と結合するからである可能性もある。したがって、ＣＦＴＲの細胞表面への供給を促進することができるどんな作用因子も、嚢胞性線維症の治療についての潜在的な治療薬となる。
【０００７】
細胞骨格タンパク質の分布の変化は、虚血に反応した腎近位尿細管細胞でも観察されている（Brownら、1997, American Journal of Physiology 273, F1003-F1012）。ラット腎では、１時間の虚血および再灌流を行うと、刷子縁タンパク質であるビリン（ｖｉｌｌｉｎ）およびアクチンが側底極に再配置された（Brownら、1997, American Journal of Physiology 273, F1003-F1012）。再灌流から２４時間後に部分的な回復が認められ、５日以内に完全に回復した。その著者らは、皮質アクチン骨格の分解により、細胞外形が変化し、それにより生存細胞が細胞消失した領域をカバーできる可能性があることを主張した。他の研究では、腎近位尿細管細胞の虚血により、Ｆアクチンからトロポミオシンが解離し、トロポミオシンが微絨毛の遠位側に移動したことが認められた。この著者らは、トロポミオシンの移動により、競合するアクチン結合タンパク質、アクチン脱重合因子（ＡＤＦ）が、頂端微小繊維、したがって頂端微絨毛を破壊することが可能になることを示唆している。
【０００８】
上皮細胞極性の変化またはタンパク質標的送達のプロセスの欠陥によって生じる疾患状態（嚢胞性線維症など）の診断および治療のための方法が、非常に望まれている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要旨
本発明者らは、消化管上皮細胞でのアクチン微小繊維の組成、および嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）を頂端膜に送達する際のその役割について研究した。この研究から、細胞単層中に局在化した、トロポミオシンアイソフォームを含む特有の微小繊維集団が明らかとなった。この微小繊維集団の局在化は、細胞と細胞の接触および細胞と基層の接触に反応して非常に迅速に行われ、無傷の微小繊維の移動を伴う。トロポミオシンアイソフォームおよびＣＦＴＲの共局在が長期培養物中に観察された。トロポミオシンアイソフォームの発現が低下すると、ＣＦＴＲの表面での発現と、ｃＡＭＰ刺激に反応する塩素イオン流出がどちらも増大した。この結果は、トロポミオシンアイソフォームが、原形質膜へのタンパク質の挿入および／または保持を調節することができる、頂端にある微小繊維集団の位置を示すことを示すものである。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの活性または細胞での位置を決定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの活性または細胞での位置の変化が、その化合物がその細胞表面タンパク質の活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００１１】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの細胞での位置の変化、好ましくは局在分布の消失が、その化合物が細胞表面タンパク質の活性を増大させることを示す。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、細胞内外への分子の輸送を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの活性または細胞での位置を決定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの活性または細胞での位置の変化が、その化合物が細胞内外への分子の輸送を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００１３】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの細胞での位置の変化、好ましくは局在分布の消失が、その化合物が細胞内外への分子の輸送を増加させることを示す。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、嚢胞性線維症の治療のための治療用化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの活性または細胞での位置を決定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの活性または細胞での位置の変化が、その化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、前記方法を提供する。
【００１５】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの細胞での位置の変化、好ましくは局在分布の消失が、その化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す。
【００１６】
この態様の特定の一実施形態では、トロポミオシンの細胞での位置は、その化合物の、細胞内外への分子の輸送、または細胞表面タンパク質の活性を調節する能力の指標として評価される。トロポミオシンの局在分布を通常示す細胞（例えば、消化管上皮細胞、線維芽細胞またはニューロン）は、好ましくはこのスクリーニングの方法で選択する。選択した細胞に候補化合物をさらした後、トロポミオシンの位置または分布を評価し、候補化合物にさらさなかった細胞でのトロポミオシンの位置または分布と比較する。好ましい実施形態では、候補化合物にさらした細胞でのトロポミオシンの局在分布の消失が、その候補化合物が細胞表面タンパク質の活性を増大させることができること、またはその候補化合物が細胞内外への分子の輸送を増加させることができること、またはその化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることが示唆される。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの発現レベルを決定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現の変化が、その化合物がその細胞表面タンパク質の活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００１８】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現低下が、その化合物が、細胞表面タンパク質の活性を増大させることを示す。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、細胞内外への分子の輸送を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの発現レベルを決定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現の変化が、その化合物が細胞内外への分子の輸送を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００２０】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現低下が、その化合物が細胞内外への分子の輸送を増加させることを示す。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、嚢胞性線維症の治療のための治療用化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンの発現レベルを決定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現の変化が、その化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、前記方法を提供する。
【００２２】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンの発現低下が、その化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す。
【００２３】
好ましい実施形態では、トロポミオシンの発現レベルを決定することは、トロポミオシンのタンパク質および／またはｍＲＮＡの量を測定するステップを含む。好ましい一実施形態では、トロポミオシンタンパク質の量は、抗トロポミオシン抗体を用いて測定する。他の実施形態では、トロポミオシン関連転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の量は、トロポミオシン転写物と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと試料を接触させることによって測定する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンのその結合相手の１つとの結合を測定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの変化が、その化合物が細胞表面タンパク質の活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００２５】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの低下が、その化合物が細胞表面タンパク質の活性を増大させることを示す。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、細胞内外への分子の輸送を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンのその結合相手の１つとの結合を測定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの変化が、その化合物が細胞内外への分子の輸送を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００２７】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの低下が、その化合物が細胞内外への分子の輸送を増加させることを示す。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、嚢胞性線維症の治療のための治療用化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下でトロポミオシンのその結合相手の１つとの結合を測定するステップを含み、その化合物の不在下と比較したときの、その化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの変化が、その化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す、前記方法を提供する。
【００２９】
この態様の好ましい実施形態では、その化合物の存在下におけるトロポミオシンのその結合相手との結合レベルの低下が、その化合物が嚢胞性線維症の治療に有用であることを示す。
【００３０】
本発明のこれらの態様のさらに好ましい実施形態では、トロポミオシンの結合相手は、カルポニン、ＣＥＡＣＡＭ１、エンドスタチン、エニグマ（Ｅｎｉｇｍａ）、ゲルソリン（好ましくは、サブドメイン２）、Ｓ１００Ａ２およびアクチンからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、トロポミオシンの結合相手はアクチンである。
【００３１】
当業者なら容易に理解されるように、本発明の方法は、トロポミオシンと相互作用し、その活性をモジュレートする化合物を設計し選択する合理的な方法を提供する。大部分の場合、これらの化合物は、活性を高めるためにさらなる開発を必要とする。特定の実施形態では、本発明の方法は、そのようなさらなる開発ステップを含むものとする。例えば、本発明の実施形態は、医薬品製造において、医薬組成物中にその化合物を組み入れるような製造ステップをさらに含むものとする。
【００３２】
したがって、さらなる態様では、この方法は、本明細書に記載のようにしてその同定した化合物をヒトまたは非ヒト動物への投与用に製剤化するステップをさらに含む。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面膜においてタンパク質の挿入または保持を調節する方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を細胞に投与するステップを含む前記方法を提供する。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面膜においてタンパク質の挿入または保持を増加させる方法であって、トロポミオシンアンタゴニストを細胞に投与するステップを含む方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、細胞内外への分子の輸送を調節する方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を細胞に投与するステップを含む前記方法を提供する。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、細胞内外への分子の輸送を増加させる方法であって、トロポミオシンアンタゴニストを細胞に投与するステップを含む前記方法を提供する。
【００３７】
本発明の一実施形態では、輸送される分子は、電解質、水、単糖類およびイオンからなる群から選択される。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子を被験体に投与するステップを含む前記方法を提供する。好ましくは、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子は、トロポミオシンアンタゴニストである。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、その細胞表面膜タンパク質は、輸送タンパク質、チャネル、受容体、増殖因子、抗原、シグナル伝達タンパク質および細胞接着タンパク質からなる群から選択される。その輸送タンパク質は、好ましくは嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）である。
【００４０】
本発明のさらに好ましい実施形態では、その細胞は非筋肉細胞である。好ましい一実施形態では、その細胞はニューロン細胞または上皮細胞である。好ましくは、その上皮細胞は消化管上皮細胞である。
【００４１】
細胞表面膜タンパク質の異常な挿入または活性によって生じる疾患は、例えば、嚢胞性線維症、多発性硬化症、多発性嚢胞腎疾患、ウイルス感染、細菌感染、再灌流損傷、メンケス病、ウィルソン病、糖尿病、緊張性筋ジストロフィー、てんかん、またはうつ病、双極性障害、もしくは気分変調性障害などの気分障害である可能性がある。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、被験体の嚢胞性線維症を治療または予防するための方法であって、トロポミオシンの発現、位置または活性を調節する作用因子を被験体に投与するステップを含む前記方法を提供する。好ましくは、トロポミオシンの発現、位置または活性をモジュレートする作用因子は、トロポミオシンアンタゴニストである。
【００４３】
本発明の状況では、トロポミオシンが、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＰＭ３およびＴＰＭ４からなる非限定的な群から選択されるヒト遺伝子によってコードされるアイソフォームであることが好ましい。例えば、そのアイソフォームは、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ５ａ、ＴＭ５ｂ、ＴＭ６、Ｔｍ５ＮＭ−１、Ｔｍ５ＮＭ−２、Ｔｍ５ＮＭ−３、Ｔｍ５ＮＭ−４、Ｔｍ５ＮＭ−５、Ｔｍ５ＮＭ−６、Ｔｍ５ＮＭ−７、Ｔｍ５ＮＭ−８、Ｔｍ５ＮＭ−９、Ｔｍ５ＮＭ−１０、およびＴｍ５ＮＭ−１１からなる群から選択してもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、そのトロポミオシンアイソフォームは、ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１１）、またはＴＰＭ３遺伝子のエキソン１ｂによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を含む。
【００４５】
さらに好ましい実施形態では、そのトロポミオシンアイソフォームは、ＴＭ５ａ（好ましくは配列番号９で示す配列を有する）またはＴＭ５ｂ（好ましくは配列番号１０で示す配列を有する）である。
【００４６】
本発明で使用するトロポミオシンアンタゴニストは、ペプチド、トロポミオシンに対する抗体、有機小分子、トロポミオシンをコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス化合物、リボザイムやＤＮＡザイムなどの抗トロポミオシン触媒分子、およびトロポミオシン発現を標的とするｄｓＲＮＡまたは短鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子からなる群から選択できる。
【００４７】
好ましい一実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、トロポミオシンをコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス化合物、触媒分子またはＲＮＡｉ分子である。さらに好ましい実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂ（配列番号７）またはＴＰＭ３遺伝子のエキソン１ｂ（配列番号８）を特異的に標的とするアンチセンス化合物、触媒分子またはＲＮＡｉ分子である。
【００４８】
さらに好ましい実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、配列ＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧ（配列番号１３）を標的とするアンチセンス化合物、触媒分子またはＲＮＡｉ分子である。
【００４９】
特に好ましい一実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、配列ＣＡＣＣＧＣＣＵＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴ（配列番号１４）を含むアンチセンス化合物である。
【００５０】
好ましい実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂの細胞での位置を特異的に変化させる。「ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂの細胞での位置を特異的に変化させる」とは、その化合物が、他のトロポミオシンアイソフォームの細胞での位置を著しく変化させることなく、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂの細胞での位置を著しく変化させることを意味する。
【００５１】
他の好ましい実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂの発現を特異的に低下させまたは抑制する。「ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂの発現を特異的に低下させまたは抑制する」とは、その化合物が、他のトロポミオシンアイソフォームの発現を著しく低下させまたは抑制することなく、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂの発現を著しく低下させまたは抑制することを意味する。
【００５２】
他の好ましい実施形態では、トロポミオシンアンタゴニストは、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂのその結合相手の１つとの結合を特異的に変化させる。「ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂのその結合相手の１つとの結合を特異的に変化させる」とは、その化合物が、他のトロポミオシンアイソフォームのその結合相手との結合を著しく変化させることなく、ＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂのその結合相手との結合を著しく変化させることを意味する。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる疾患に対する個人の素因を評価する方法であって、その個人のトロポミオシン遺伝子における突然変異の存在を判定するステップを含む前記方法を提供する。
【００５４】
トロポミオシン遺伝子の突然変異は、点突然変異（すなわち、一塩基多型（ＳＮＰ））、欠失および／または挿入でもよい。そのような突然変異は、トロポミオシン遺伝子由来のＤＮＡ断片を単離しその配列を決定することによって検出することもでき、あるいはそうでなければ個人からｍＲＮＡを単離し、それから配列決定用に（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）ＤＮＡを合成することによって検出することもできる。突然変異はまた、識別用のオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって検出することもでき、あるいは、識別用のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅法によって検出することもできる。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる疾患に対する個人の素因を評価する方法であって、その個人の細胞におけるトロポミオシンの局在分布を分析するステップを含む前記方法を提供する。
【００５６】
試験される個人に由来する細胞での特定のトロポミオシンアイソフォームの分布が、正常被験体の細胞で観察されるものと異なる場合、これは、試験される個人が、細胞表面膜タンパク質の異常な挿入、保持または活性によって生じる疾患に対する素因を有することを示唆している。
【００５７】
本発明はまた、ポリヌクレオチドプローブおよび／またはモノクローナル抗体を含み、さらに場合によっては定量用標準物質を含む、本発明の方法を実施するためのキットをも提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載の疾患の治療についての臨床試験に関して、薬剤の効力を評価し、患者の経過をモニターする方法を提供する。
【００５８】
明らかであろうが、本発明の一態様の好ましい特徴および性質は、本発明の他の態様にも当てはまる。
【００５９】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語尾変化は、述べられた要素、整数もしくはステップ、または一群の要素、整数もしくはステップを包含するが、他のいかなる要素、整数もしくはステップ、または一群の要素、整数もしくはステップをも除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
【００６０】
配列表の要点
配列番号１：トロポミオシン１（α）（ＴＰＭ１）遺伝子配列によってコードされるアイソフォームのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ配列；
配列番号２：トロポミオシン２（β）（ＴＰＭ２）遺伝子配列によってコードされるアイソフォームのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ配列；
配列番号３：トロポミオシン３（ＴＰＭ３）遺伝子配列によってコードされるアイソフォームのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ配列；
配列番号４：トロポミオシン４（ＴＰＭ４）遺伝子配列によってコードされるアイソフォームのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ配列；
配列番号５：アイソフォームＴＭ５ａのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ配列；
配列番号６：アイソフォームＴＭ５ｂのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ配列；
配列番号７：ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＤＮＡ配列；
配列番号８：ＴＰＭ３遺伝子のエキソン１ｂのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＤＮＡ配列；
配列番号９：アイソフォームＴＭ５ａのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）タンパク質配列；
配列番号１０：アイソフォームＴＭ５ｂのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）タンパク質配列；
配列番号１１：ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）タンパク質配列；
配列番号１２：ＴＰＭ３遺伝子のエキソン１ｂのヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）タンパク質配列；
配列番号１３：好ましいアンチセンス構築物用の、ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂ内のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）標的配列；
配列番号１４：ＴＰＭ１遺伝子のエキソン１ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列；
配列番号１５：ナンセンスオリゴヌクレオチド配列（対照配列）；
配列番号１６および１７：ヒトＴＭ５ａまたはＴＭ５ｂ産生を下方制御するｓｉＲＮＡ分子生成用のポリヌクレオチド；
配列番号１８〜２０：ＴＭＰ１遺伝子のエキソン１ｂによってコードされるアミノ酸配列内の抗原エピトープ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
好ましい態様の詳細な説明
特に示さない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。分子遺伝学的生化学的方法（一般に、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ならびにAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第４版; John Wiley & Sons, Inc.および表題がCurrent Protocols in Molecular Biologyである完全版を参照、これらを参照により本明細書に組み込む）および化学的方法について、標準的な技術を使用する。
【００６２】
トロポミオシン
本発明は、細胞の表面膜におけるタンパク質の挿入、保持または維持がトロポミオシンによって調節されるという知見に基づくものである。この知見から、細胞表面タンパク質の異常な挿入または機能によって生じる疾患に関する診断法および治療法の基礎がもたらされる。
【００６３】
トロポミオシン（ＴＭ）は、すべての真核細胞で認められる多様なタンパク質群であり、異なるアイソフォームが筋肉（骨格筋、心筋および平滑筋）、脳および種々の非筋肉細胞で認められる。これは細長いタンパク質であり、その長さ全体に沿って単純な二量体αへリックスコイルドコイル構造を有する。このコイルドコイル構造は、第１および第４の位置に疎水性残基を有する７アミノ酸の反復パターンに基づくものであり、顕著な７残基の周期性（５モチーフ）とともに、酵母からヒトまでの真核生物で認められるすべてのＴＭアイソフォームにおいて高度に保存されている。異なるアイソフォームは、示差的スプライシングによって生じる。例えば、αトロポミオシンのアイソフォームは、横紋筋と平滑筋で異なる。
【００６４】
ＴＭは、筋細胞の筋節中の細い繊維および非筋肉細胞の微小繊維と結合している。ＴＭは、頭部−尾部の形で互いに結合し、Ｆアクチンの溝に位置し、各分子は６つまたは７つのアクチン単量体と相互作用する。
【００６５】
骨格筋および心筋におけるＴＭの機能は、トロポニン複合体（トロポニンＴ、ＣおよびＩ）と共同で、アクチンおよびミオシンのカルシウム感受性相互作用を調節することである。静止期の細胞内のカルシウムイオン濃度下で、トロポニン−トロポミオシン複合体は、アクトミオシンＡＴＰアーゼ活性を抑制する。筋細胞内で刺激によってカルシウムイオン放出が誘導されるとき、トロポニンＣは、さらなるカルシウムイオンと結合し、コンホメーションの変化は、トロポニン−トロポミオシン複合体によって伝達され、それによってアクトミオシンＡＴＰアーゼ活性の抑制が解除され、収縮が生じる。
【００６６】
骨格筋および心筋と異なり、平滑筋および非筋肉ＴＭの生物学的機能はほとんど分かっていない。平滑筋および非筋肉細胞は、トロポニン複合体を欠いており、ミオシン軽鎖のリン酸化は、アクチンおよびミオシンの相互作用を制御する主要なカルシウム感受性調節機構であると思われる。様々な細胞型の収縮装置の調節におけるこれらの違いは、構造的にも機能的にも異なる型のＴＭを必要とするものと思われる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「トロポミオシン」という用語は、そのタンパク質のアイソフォームをすべて包含するものとする。例えば、この用語は、哺乳動物遺伝子ＴＰＭ１（α−ＴＭ遺伝子としても知られる）（MacLeodおよび Gooding、1988, Mol. Cell. Biol. 8, 433-440）、ＴＰＭ２（β−ＴＭ遺伝子としても知られる）（MacLeodら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7835-7839）、ＴＰＭ３（γ−ＴＭ遺伝子としても知られる）（Claytonら、1988, J. Mol. Biol. 201, 507-515）、およびＴＰＭ４（δ−ＴＭ遺伝子としても知られる）（MacLeodら、1987, J. Mol. Biol. 194, 1-10）によってコードされるアイソフォームをすべて包含する。
【００６８】
選択的スプライシングによりこれら４種の遺伝子から生じるトロポミオシンアイソフォームが少なくとも４０種存在する（図１）。例えば、Lees-MillerおよびHelfman、1991, Bioessays 13 (9): 429-437を参照されたい。トロポミオシンアイソフォームは高度な類似性を有するが、アクチン結合ドメインおよび頭部−尾部結合ドメインにおいていくらかの違いが存在する。種々のトロポミオシンアイソフォームはアクチンに対して異なる結合親和性を有し、この結果、アクチン微小繊維の安定性に対する影響の違いが生じると考えられる。さらに、アクチン微小繊維上のトロポミオシンの位置により、細胞の運動性、および細胞骨格の再構築におけるアクチンの役割をモジュレートすることができる。一旦挿入されると、トロポミオシンは、アクチンと他のアクチン結合タンパク質との相互作用に影響を及ぼす。例えば、高分子量のトロポミオシンは、アクチン結合タンパク質であるゲルソリンの切断活性に対して保護的である。
【００６９】
ヒトＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＰＭ３およびＴＰＭ４遺伝子によってコードされるアイソフォームのｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１〜４に示す。これらの配列は代表例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の方法は、他のヒトまたは非ヒトトロポミオシン配列を標的としてもよい。
【００７０】
診断分析
一態様では、本発明は、細胞表面タンパク質の異常な挿入、保持または機能によって生じる疾患に対する素因を個人が有する可能性を予測し、または疾患などの診断に役立てる方法に関する。
【００７１】
一実施形態では、その診断法は、評価される個人からポリヌクレオチド試料を得るステップと、トロポミオシン遺伝子を分析するステップとを含む。
【００７２】
評価すべき遺伝物質は、その個人に由来する任意の有核細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡのアッセイでは、実際上（純粋な赤血球以外）いかなる生物学的試料でも適切である。例えば、都合のよい組織試料には、全血、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、皮膚、精巣、胎盤、腎および毛髪が含まれる。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのアッセイでは、組織試料は、その標的核酸が発現している臓器から得ることが好ましい。例えば、上皮細胞は、トロポミオシン遺伝子のｃＤＮＡを得るのに適した供給源である。
【００７３】
トロポミオシン遺伝子の分析は、標的試料からのＤＮＡ増幅を必要とする可能性がある。これは、例えばＰＣＲによって達成することができる。一般には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification（H. A. Erlich編、reeman Press, New York, N.Y., 1992）; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innisら編、Academic Press, San Diego, Calif., 1990）; Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckertら、PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR（McPhersonら編、IRL Press, Oxford）；および米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい。
【００７４】
他の適切な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（WuおよびWallace, Genomics 4, 560 (1989)、Landegrenら、Science 241, 1077 (1988)を参照）、転写増幅（Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)）、および自己維持型配列複製（Guatelliら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)）および核酸を基礎とする配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。後者の２つの増幅法では、等温転写に基づく等温反応を用い、これにより、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）と二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を、増幅産物として、それぞれの方法で約３０対１、１００対１の比で生じる。
【００７５】
対象とする多型部位を占めるヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのサザン分析；制限酵素消化による直接の突然変異分析；ＲＮＡのノーザン分析；変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）；遺伝子の単離および配列決定；増幅遺伝子産物を用いた、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション；エキソントラッピング、一塩基伸長（ＳＢＥ）；トロポミオシンタンパク質の分析など様々な方法によって同定することができる。
【００７６】
他の実施形態では、診断法には、個人の細胞におけるトロポミオシンの局在分布の分析が含まれる。例えば、試験する個人に由来する細胞（好ましくは上皮細胞）内での特定のトロポミオシンアイソフォームの抗体染色によって、この分析を行うことができる。
【００７７】
トロポミオシンアンタゴニスト／アゴニスト
一態様では、本発明は、細胞内でのトロポミオシンの活性または位置を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００７８】
特定の実施形態では、トロポミオシンと結合する能力、または活性をモジュレートする能力について潜在的な変調因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする。従来法では、ある望ましい特性または活性を有する化合物、例えば活性を抑制する化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、そのリード化合物の変種を作製し、その変種化合物の特性および活性を評価することにより、有用な特性を有する新しい化学物質が得られる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法は、このような分析にしばしば使用される。
【００７９】
好ましい一実施形態では、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的治療用化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することを含む。次いで、このような「コンビナトリアル化学物質ライブラリー」を１つまたは複数のアッセイでスクリーニングして、所望の特徴的な活性を示すそのライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このように同定した化合物を、従来の「リード化合物」として使用することもでき、あるいは、それ自体を潜在的なまたは実際の治療薬として使用することもできる。
【００８０】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーとは、試薬など多数の化学的な「ビルディングブロック」を組み合わせることによる化学的合成または生物学的合成によって得られる多様な化合物の集合物である。例えば、ポリペプチド（例えば突然変異タンパク質）ライブラリーなどの直鎖状コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる一組の化学的ビルディングブロックを、所与の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）で可能なあらゆる仕方で組み合わせることによって形成される。化学的ビルディグブロックのこのような組合せ混合によって、数百万の化合物を合成することができる（Gallopら、1994,J. Med. Chem. 37 (9): 1233-1251）。
【００８１】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学物質ライブラリーには、それだけに限らないが、ペプチドライブラリー、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）、コードされたペプチド、ランダム生体オリゴマー、非ペプチド性ペプチド模倣物、小化合物ライブラリーの類似有機合成物、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー、抗体ライブラリー、糖鎖ライブラリーおよび有機小分子ライブラリーがある。
【００８２】
トロポミオシン結合性化合物は、当業者に周知の方法によって容易に同定し単離することができる。トロポミオシン結合性化合物の同定に使用することができる方法の例は、酵母２ハイブリッドスクリーニング、ファージディスプレイ、アフィニティークロマトグラフィー、発現クローニングおよびＢｉａｃｏｒｅシステムである。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、このシステムが、標識せずに、またしばしば付随する物質を精製せずに、生体分子の結合事象をリアルタイムに直接検出しモニターすることができることから、トロポミオシンタンパク質の化学的模倣物の同定に使用される。（Biacore, Rapsagatan 7, SE 754 50 Uppsala）。
【００８３】
具体的には、酵母２ハイブリッドスクリーニングの手法では、転写活性化を利用してタンパク質とタンパク質の相互作用を検出する。転写因子の多くは、２つのドメインに分離することができ、その２つのドメインであるＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインは分離されると不活性である。その２つのドメインを「近接」させたとき、その機能的な転写活性化活性が再生される。本発明では、トロポミオシンタンパク質を転写因子のＤＮＡ結合ドメインと融合させ、ｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡを転写活性化ドメインをコードする配列と融合させる。転写因子のＤＮＡ結合ドメインと融合させた目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡで形質転換した酵母株を、転写活性化ドメイン／ｃＤＮＡ融合ライブラリーで形質転換する。目的のタンパク質と結合するタンパク質をコードするいかなるｃＤＮＡも、機能的なハイブリッド転写活性化因子を形成することが可能となり（ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインが今や「近接」しているため）、それによってリポーター遺伝子の発現がもたらされ、その結果、細胞が生存する。次いで、結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、それをコードするタンパク質を同定する。
【００８４】
変調因子を同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適合することが好ましい。したがって、好ましいアッセイは、トロポミオシン遺伝子転写の促進または抑制、ポリペプチド発現の抑制または促進、およびポリペプチド活性の抑制または増強を検出するものである。
【００８５】
特定の核酸またはタンパク質産物の存在、不在、量、または他の特性についてのハイスループットアッセイは、当業者に周知である。同じく、結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイも同様に周知である。したがって、例えば米国特許第５，５５９，４１０号は、タンパク質のハイスループットスクリーニング法について開示し、米国特許第５，５８５，６３９号は、核酸結合（すなわち、アレイ中での）に対するハイスループットスクリーニング法について開示しており、一方、米国特許第５，５７６，２２０号および第５，５４１，０６１号はリガンド／抗体結合に対するハイスループットスクリーニング法について開示している。
【００８６】
さらに、ハイスループットスクリーニングシステムは市販されている（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MAなどを参照）。これらのシステムは通常、アッセイに適した、すべての試料および試薬のピペット操作、液体の分注、定時間インキュベーション、および検出器でのマイクロプレートの最終的な読み取りを含めた手順全体を自動化する。これらの設定可能なシステムは、高い処理能力および迅速な開始、ならびに高度な柔軟性およびカスタマイズをもたらす。このようなシステムの製造業者は、種々のハイスループットシステムの詳細なプロトコルを提供している。したがって、例えばＺｙｍａｒｋ社は、遺伝子転写、リガンド結合などのモジュレーションを検出するためのスクリーニングシステムについて記載した技術報告書を提供している。
【００８７】
タンパク質またはペプチド阻害因子
一実施形態では、変調因子は、タンパク質であり、しばしば、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の断片である。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、あるいはタンパク性細胞抽出物のランダム消化物または特異的消化物を使用することができる。このようにして、本発明の方法におけるスクリーニング用にタンパク質のライブラリーを作製することができる。細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳動物タンパク質のライブラリーがこの実施形態で特に好ましく、後者が好ましいが、ヒトタンパク質がとりわけ好ましい。特に有用な試験化合物は、その標的が属するクラスのタンパク質、例えば酵素の基質、またはリガンドおよび受容体を対象とする。
【００８８】
好ましい実施形態では、変調因子は、約５〜約３０アミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５が特に好ましい。このペプチドは、上記で概説したように天然に存在するタンパク質の消化物でもよく、ランダムペプチドでもよく、あるいは「偏りのある」ランダムペプチドでもよい。「ランダム化された」またはそれと文法的に同等な語は、本明細書において各核酸およびペプチドが、それぞれ本質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般にこれらのランダムなペプチド（または下記で論じる核酸）は化学的に合成されるため、これは、任意の位置に任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込むこともできる。その合成プロセスは、ランダム化されたタンパク質または核酸を生成し、その配列の長さにわたってすべてのまたは大部分の考えられる組合せの形成が可能となるように設計することができ、それによってランダム化された候補生理活性タンパク性作用因子のライブラリーが形成される。
【００８９】
一実施形態では、トロポミオシン配列に由来するオリゴペプチド（長さ約１０〜２５アミノ酸）として、ペプチジルトロポミオシン阻害因子を化学的にまたは組換えにより合成する。あるいは、例えば、タンパク質分解酵素、例えばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、またはペプシンを用いることにより、天然のまたは組換えにより生成させたトロポミオシンを消化することによって、トロポミオシン断片を生成する。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｏｍｅｇａ，ＰＣＧｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を用いて）を使用して、タンパク質分解切断部位を同定する。タンパク質分解断片または合成断片は、トロポミオシンの機能を部分的にまたは完全に抑制するのに必要なものと同じ数のアミノ酸残基を含むことができる。好ましい断片は、少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のアミノ酸長を含む。
【００９０】
タンパク質またはペプチド阻害因子はまた、トロポミオシンのドミナントネガティブ変異体でもよい。「ドミナントネガティブ変異体」という用語は、その天然の状態から突然変異しており、かつトロポミオシンが通常は相互作用するタンパク質と相互作用する（これによって内因性の天然トロポミオシンがその相互作用を形成することを阻止する）トロポミオシンポリペプチドを、指す。
【００９１】
抗トロポミオシン抗体
本発明において使用する「抗体」という用語には、完全な分子、ならびにＦａｂ、Ｆ(
ａｂ')２やＦｖなどのトロポミオシンのエピトープ決定基と結合することができるその断片が含まれる。これらの抗体断片は、その抗原と選択的に結合する能力をある程度保持し、下記のように定義される：
（１）抗体分子の一価の抗原結合性断片を含む断片Ｆａｂは、酵素パパインで抗体全体を消化して、完全な軽鎖および１本の重鎖の一部を生じさせることによって生成することができる；
（２）抗体分子の断片Ｆａｂ’は、抗体全体をペプシンで処理し、その後還元して、完全な軽鎖および重鎖の一部を得ることによって得られる；抗体１分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる；
（３）抗体の断片(Ｆａｂ')２は、その後還元せずに抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって得られる；Ｆ(ａｂ)２は、２つのジスルフィド結合で１つに結合されている２つのＦａｂ’断片の二量体である；
（４）Ｆｖは、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子工学的に作製された断片として定義される；
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝的に融合させた一本鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子操作で作製された分子として定義される。
【００９２】
これらの断片の作製法は、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込む、HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照）。
【００９３】
本発明の抗体は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）トロポミオシンまたはその断片を免疫化用抗原として使用して調製することができる。動物を免疫するのに使用するペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学合成から得られるものでもよく、必要であれば精製し担体タンパク質と結合させる。ペプチドと化学結合されるこのような通常用いられる担体としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風トキソイドが挙げられる。次いで、この結合したペプチドを用いて、動物（例えば、マウスまたはウサギ）を免疫することができる。
【００９４】
必要であれば、例えば、それに対する抗体を産生させたペプチドを結合したマトリックスに、ポリクローナル抗体を結合させ、そしてそこから溶出させることにより、そのポリクローナル抗体をさらに精製することができる。当業者であれば、免疫学の分野で一般的であるポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための様々な技術を知っているであろう（例えば、参照により組み込む、Coliganら、Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991を参照）。
【００９５】
例えば、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術やＥＢＶハイブリドーマ技術など、連続的な細胞系統培養によって抗体分子の産生をもたらすどんな技術を用いてもモノクローナル抗体を調製することができる（Kohlerら、Nature 256, 495-497, 1975; Kozborら、J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Coteら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030, 1983; Coleら、Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984）。
【００９６】
当技術分野で公知の方法により、トロポミオシンとの結合を示す抗体を抗体発現ライブラリーから同定し単離することが可能である。例えば、トロポミオシンとの結合を示す抗体結合ドメインを同定し単離する方法は、バクテリオファージλベクター系である。このベクター系は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）でのマウス抗体レパートリー（Huseら、Science, 246: 1275-1281, 1989）およびヒト抗体レパートリー（Mullinaxら、Proc. Nat. Acad. Sci., 87: 8095-8099, 1990）に由来するＦａｂ断片のコンビナトリアルライブラリーを発現させるのに使用されてきた。予め選択したリガンドと結合するモノクローナル抗体を発現しているハイブリドーマ細胞系統に、この方法を適用することもできる。当業者によく理解されている技術を用いて、所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを様々な方法で作製することができるが、ここでは繰り返さない。この技術の詳細は、参照により組み込まれるMonoclonal Antibodies-Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Roger H. Kennettら編、Plenum Press, 1980や米国特許第４，１７２，１２４号などの参照文献に記載されている。
【００９７】
さらに、「ヒト化」抗体を様々に組み合わせたキメラ抗体分子を生成する方法は、当技術分野で知られており、ネズミ可変領域をヒト定常領域と組み合わせること（Cabilyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3273, 1984）を含むか、あるいはヒトフレームワーク上にネズミ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植すること（Riechmannら、Nature 332: 323, 1988）によるものである。
【００９８】
一実施形態では、抗体は、限定されないが、配列番号１８〜２０からなる群から選択されるヒトトロポミオシンの領域の少なくとも一部と結合する。
【００９９】
アンチセンス化合物
「アンチセンス化合物」という用語は、トロポミオシンｍＲＮＡ分子（IzantおよびWeintraub, Cell 36: 1007-15, 1984; IzantおよびWeintraub, Science 229 (4711): 345-52, 1985）の少なくとも一部と相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳などの転写後の事象に干渉することができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を、包含する。合成が容易であり、標的トロポミオシン産生細胞中に導入した場合により大きな分子よりも問題を生じる可能性が低いことから、トロポミオシンをコードするｍＲＮＡの連続した少なくとも約１５ヌクレオチドに対する相補的なアンチセンスオリゴマーが好ましい。アンチセンスの方法の使用については、当技術分野で周知である（Marcus-Sakura, Anal. Biochem. 172: 289, 1988）。好ましいアンチセンス核酸は、配列番号７または配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする配列の少なくとも連続した１５ヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
触媒核酸
触媒核酸という用語は、独特の基質を特異的に認識し、この基質の化学修飾を触媒するＤＮＡ分子またはＤＮＡ含有分子（「ＤＮＡザイム」としても当技術分野で知られている）、あるいはＲＮＡまたはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」としても知られている）を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ、ならびにそれらの誘導体でもよい。これらの塩基の誘導体は、当技術分野で周知である。
【０１０１】
通常、触媒核酸は、標的核酸を特異的に認識するためのアンチセンス配列、および核酸切断性酵素活性部分（本明細書において「触媒ドメイン」とも呼ばれる）を含む。特異性を実現するために、好ましいリボザイムおよびＤＮＡザイムは、トロポミオシンアイソフォームをコードする配列の連続した少なくとも約１２〜１５ヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
本発明で特に有用なリボザイムのタイプは、ハンマーヘッド型リボザイム（HaseloffおよびGerlach 1988, Perrimanら、1992）およびヘアピン型リボザイム（Shippyら1999）である。
【０１０３】
本発明のリボザイムおよびリボザイムをコードするＤＮＡは、当技術分野で周知の方法を用いて化学合成することができる。リボザイムはまた、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと作動的に連結したＤＮＡ分子（転写後にＲＮＡ分子を生成する）から調製することもできる。したがって、本発明のリボザイムをコードする核酸分子、すなわちＤＮＡまたはｃＤＮＡも、本発明によって提供される。ベクターがＤＮＡ分子と作動的に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターも含む場合、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドとともにインキュベーションする際にｉｎ  ｖｉｔｒｏでリボザイムを生成させることができる。別個の実施形態では、発現カセットまたは転写カセット中にＤＮＡを挿入することができる。合成後、リボザイムを安定化させ、それをＲＮａｓｅ抵抗性にする能力を有するＤＮＡ分子に連結することにより、そのＲＮＡ分子は改変されうる。あるいは、リボザイムを、リポソーム送達系で使用するためにホスホチオ類似体に改変することもできる。この改変も、リボザイムをエンドヌクレアーゼ活性に対して抵抗性にする。
【０１０４】
ＲＮＡ阻害因子
ｄｓＲＮＡは、特定のタンパク質の産生を特異的に抑制するのに特に有用である。特定の理論に拘泥するものではないが、DoughertyおよびParks（Curr. Opin. Cell Biol. 7: 399 (1995)）は、ｄｓＲＮＡを使用してタンパク質産生を低下させることができる機構についてのモデルを提供した。このモデルは、Waterhouseらによって最近修正され拡張されている（Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 13959 (1998)）。この技術は、対象とする遺伝子のｍＲＮＡ、この場合ではトロポミオシンタンパク質をコードするｍＲＮＡと本質的に同一の配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に依存する。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは、組換えベクターまたは宿主細胞中、単一のオープンリーディングフレームで生成することができ、そこではセンスおよびアンチセンス配列が無関係な配列と隣接しており、その無関係な配列は、そのセンスおよびアンチセンス配列をハイブリダイズさせて、その無関係な配列がループ構造を形成したｄｓＲＮＡ分子が形成されるようにすることができる。トロポミオシンを標的とする適切なｄｓＲＮＡ分子の設計および生成は、特にDoughertyおよびParks（1995，上記）、Waterhouseら（1998，上記）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９ならびにＷＯ０１／３４８１５を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０５】
本明細書において、「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）、および「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子産物を特異的に標的とし、それによってヌル表現型またはハイポモルフ表現型をもたらす、相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を指す。具体的には、ｄｓＲＮＡは、ＰＡＣ−１をコードする標的ＲＮＡから得られ、かつアニーリングできるような自己相補性を示す２つの短いヌクレオチド配列を含んでおり、そしてそれは、おそらく転写後レベルで、標的遺伝子の発現に干渉する。ＲＮＡｉ分子については、Fireら、Nature 391, 806-811, 1998に記載されており、Sharp, Genes & Development, 13, 139-141, 1999に総説がある。
【０１０６】
好ましいｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの連続した約１９〜２１ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、その標的配列は、ＴＰＭ１またはＴＭＰ３遺伝子のエキソン１ｂである。
【０１０７】
本明細書で例示するように、トロポミオシンコード領域に対する好ましいｓｉＲＮＡは、配列番号１６または配列番号１７に示す２１ヌクレオチドの配列を含む。配列番号１６および１７に示す例示ｓｉＲＮＡに由来するステムループ構造を含むｓｉＲＮＡを生成するために、介在ループ配列と隣接するようにセンス鎖およびアンチセンス鎖を配置する。好ましいループ配列は、当業者には公知である。
【０１０８】
小分子阻害因子
免疫系をモジュレートする能力について多数の有機分子をアッセイすることができる。例えば、本発明の一実施形態では、化学物質を個々にアッセイする化学物質ライブラリーから、または複数の化合物を一度にアッセイするコンビナトリアル化学物質ライブラリーから、適当な有機分子を選択し、次いで解析して最も活性の高い化合物群を決定し単離することができる。
【０１０９】
このようなコンビナトリアル化学物質ライブラリーの代表的な例としては、以下で報告されたものが挙げられる：Agrafiotisら、"System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties" 米国特許第5,463,564号; Armstrong, R. W.、"Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses"、WO95/02566; Baldwin, J. J.ら、"Sulfonamide derivatives and their use" WO95/24186; Baldwin, J. J.ら、"Combinatorial dihydrobenzopyran library" WO95/30642; Brenner, S.、"New kit for preparing combinatorial libraries." WO95/16918; Chenera, B.ら、"Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds" WO95/16712; Ellman, J. A.、"Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support" 米国特許第5,288,514号; Felder, E.ら、"Novel combinatorial compound libraries" WO95/16209; Lerner. R.ら、"Encoded combinatorial chemical libraries" WO93/20242; Pavia, M. R.ら、"A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library," WO95/04277; Summerton, J. E.およびD. D. Weller、"Morpholino-subunit combinatorial library and method" 米国特許第5,506,337号; Holmes, C.、"Methods for the Solid Phase Synthesis of Thiazolidinones, Metathiazanones, and Derivatives thereof" WO96/00148; Phillips, G. B.およびG. P. Wei、"Solid-phase Synthesis of Benzimidazoles," Tet. Letters 37: 4887-90, 1996; Ruhland, B.ら、"Solid-supported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse beta-Lactams," J. Amer. Chem. Soc. 111: 253-4, 1996; Look, G. C.ら、"The Identification of Cyclooxygenase-1 Inhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries," Bioorg and Med. Chem. Letters 6: 707-12, 1996。
【０１１０】
候補化合物は、有機分子、好ましくは、分子量が１００ダルトンより大きく約２，５００ダルトンより小さい小有機化合物であってよい。好ましい小分子は、２，０００ダルトン未満、または１，５００ダルトン未満、または１，０００ダルトン未満、または５００ダルトン未満である。候補作用因子は、タンパク質との構造的な相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含み、通常少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、好ましくはその官能化学基を少なくとも２つ含む。候補作用因子は、１つまたは複数の上記の官能基で置換された、炭素環またはヘテロ環構造、および／あるいは芳香族または多環芳香族構造をしばしば含む。候補作用因子は、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの組合せを含めた生体分子にも認められる。
【０１１１】
一実施形態では、本発明は、親のおよび分画された天然物抽出物のライブラリー内で表された小分子の化学的多様性をスクリーニングして、潜在的な候補としてさらに特徴付けるために生物活性化合物を検出する。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、その候補化合物は、遺伝子ライブラリーの発現産物、低分子量化合物ライブラリー（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの低分子量化合物ライブラリーなど）、細胞抽出物、微生物の培養上清、細菌細胞成分などから得られる。特定の一実施形態では、その候補化合物は、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）株の抽出物から得られる。
【０１１３】
トロポミオシンアゴニスト／アンタゴニストについてスクリーニングする方法
トロポミオシンの局在分布に基づくスクリーニングプロトコル
候補化合物がトロポミオシンの機能を抑制する能力についてのスクリーニング方法の例では、細胞内でのトロポミオシンの局在分布に対するその化合物の効果を分析することを含む。
【０１１４】
例えば、対象とする標識トロポミオシンアイソフォームを発現する細胞を候補化合物にさらし、そのトロポミオシンアイソフォームの局在分布の消失をモニターすればよい。この標識トロポミオシンアイソフォームは、例えば、細胞内で蛍光化合物（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）と連結したトロポミオシンを含む融合構築物を発現させることによって得ることができる。当業者であれば、他の検出可能な標識をこのスクリーニングアッセイで使用できることを理解するはずである。
【０１１５】
あるいは、細胞試料を候補化合物にさらし、対象とするトロポミオシンアイソフォームの分布を抗体染色によって決定することができる。
【０１１６】
トロポミオシンの発現に基づくスクリーニングプロトコル
候補化合物がトロポミオシンの発現を抑制する能力についてスクリーニングする方法の例は、下記のステップを含みうる：
（ｉ）トロポミオシンを発現することができる細胞と候補化合物を接触させるステップと、
（ｉｉ）候補化合物と接触させた細胞におけるトロポミオシンの発現量を測定し、この発現量を、試験物質と接触させなかった、対応する対照細胞におけるトロポミオシンの発現量（発現対照量）と比較するステップと、
（ｉｉｉ）上記ステップ（ｉｉ）の結果に基づいて、対照発現量と比べてトロポミオシンの発現量低下を示す候補化合物を選択するステップ。
【０１１７】
このスクリーニング法で使用する細胞は、天然遺伝子と組換え遺伝子の間の差異にかかわらず、トロポミオシンを発現することができるいかなる細胞でもよい。さらに、トロポミオシンの由来は特に限定されない。細胞は、ヒト由来でもよく、あるいはマウスなどのヒト以外の哺乳動物に由来してもよく、あるいは他の生物由来でもよい。適切なヒト細胞の例は、肥満細胞を含めた造血細胞である。さらに、トロポミオシンをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む形質転換細胞を使用することもできる。
【０１１８】
トロポミオシンを発現することができる細胞と候補化合物を接触させることができる条件は限定されないが、適用する細胞を殺さず、トロポミオシン遺伝子が発現されうる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）の中から選択することが好ましい。
【０１１９】
「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」という用語は、発現対照量との比較を指すだけでなく、トロポミオシンが全く発現されない場合をも包含する。具体的には、これにはトロポミオシンの発現量が実質的にゼロである状況が含まれる。
【０１２０】
トロポミオシン遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量の測定により、または産生したトロポミオシンタンパク質の量を測定することにより、トロポミオシンの発現量を評価することができる。さらに、トロポミオシンの量を測定する方法は、遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量または産生したタンパク質の量を直接測定する方法である必要はなく、それらを反映する任意の方法であってよい。
【０１２１】
具体的には、トロポミオシンの発現量を測定するために（検出およびアッセイ）、ＤＮＡアレイ、またはノーザンブロット法などの周知の方法、ならびに適用するトロポミオシンｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを利用するＲＴ−ＰＣＲ法を利用して、トロポミオシンｍＲＮＡの発現量を測定することができる。さらに、抗トロポミオシン抗体を利用するウェスタンブロット法など周知の方法を実施することにより、トロポミオシンタンパク質の量を測定することができる。
【０１２２】
トロポミオシン遺伝子と連結したレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子およびエクオリン遺伝子）などのマーカー遺伝子を含む融合遺伝子を導入した細胞系統を使用して、マーカー遺伝子に由来するタンパク質の活性を測定することにより、トロポミオシンの発現量の測定（検出およびアッセイ）を実施することができる。あるいは、その遺伝子から発現されたトロポミオシン産物がリポーターで標識されるように、レポーター配列が相同組換えによりトロポミオシン遺伝子中に導入されている遺伝子操作で作製された細胞中でトロポミオシンの発現を測定することもできる。
【０１２３】
トロポミオシンの、１つまたはそれ以上のその結合相手との結合に基づく、スクリーニングプロトコル
一実施形態では、トロポミオシンの、トロポミオシンの結合相手との結合に干渉する候補化合物についてスクリーニングすることにより、トロポミオシンアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。トロポミオシンの適切な結合相手の例はアクチンである。
【０１２４】
標準的な固相ＥＬＩＳＡアッセイ形式は、タンパク質とタンパク質の相互作用のアンタゴニストを同定するのに特に有用である。この実施形態によれば、例えばポリマー・ピンの整列やガラス支持体などの固体マトリックス上に、結合相手の１つ、例えばアクチン繊維を固定化する。固定化された結合相手は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；例えば、ＣＡＰ−アクチン融合物）を含む融合ポリペプチドであると好都合であり、その場合、ＧＳＴ部分が固相支持体へのタンパク質の固定化を促進する。溶液中の第２の結合相手（例えば、トロポミオシン）は、固定化されたタンパク質と物理的な関係を形成してタンパク質複合体を形成するようになり、その複合体は、第２の結合相手に対する抗体を用いて検出される。その抗体は一般に、蛍光分子で標識されるか、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされることによって標識され、あるいは、第１の抗体と結合する第２の標識抗体を使用することもできる。第２の結合相手は、ＦＬＡＧまたはオリゴヒスチジンペプチドタグが付いた融合ポリペプチドあるいはその他の適切な免疫原性ペプチドとして発現させることが好都合であり、その場合、そのペプチドタグに対する抗体を使用してその結合相手を検出する。あるいは、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）との結合によってオリゴ−ＨＩＳタグ付加タンパク質複合体を検出することもでき、あるいは、ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティーゲル（Ｋｏｄａｋ）への結合によってＦＬＡＧ標識タンパク質複合体を検出することもできる。本明細書に記載のアッセイ形式が、例えば、結合ペプチドまたは融合タンパク質のマイクロアレイの使用など、試料のハイスループットスクリーニングに適合することは、当業者には明らかであろう。
【０１２５】
米国特許第６，３１６，２２３号に記載の２ハイブリッドアッセイを使用して、トロポミオシンの、その結合相手の１つとの結合を妨げる化合物を同定することもできる。この系の基本的な機構は、酵母２ハイブリッド系と同様である。この２ハイブリッド系では、２つの異なる融合タンパク質として、哺乳動物宿主細胞中で結合相手を発現させる。標準的な２ハイブリッドスクリーニングを本目的に適合させる際、第１の融合タンパク質は、一方の結合相手と融合したＤＮＡ結合ドメインからなり、第２の融合タンパク質は、他方の結合相手と融合した転写活性化ドメインからなる。そのＤＮＡ結合ドメインは、１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子の発現を調節するオペレーター配列と結合する。転写活性化ドメインは、結合相手同士の機能的な相互作用を経てプロモーターへと動員される。その後、転写活性化ドメインは、細胞の基本転写装置と相互作用し、それによってレポーター遺伝子の発現を活性化させ、その発現を判定することができる。宿主細胞とともにインキュベートする場合にレポーター遺伝子の転写をモジュレートする能力により、結合相手同士のタンパク質とタンパク質の相互作用をモジュレートする候補生物活性因子を同定する。アンタゴニストは、レポーター遺伝子発現を阻害しまたは低下させるが、アゴニストは、レポーター遺伝子発現を促進するであろう。小分子の変調因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の場合、これを細胞培地に直接添加し、レポーター遺伝子発現を判定する。その一方で、宿主細胞内にトランスフェクトした核酸からはペプチド変調因子が発現可能であり、レポーター遺伝子発現が判定される。実際、ペプチドライブラリー全体を、トランスフェクト細胞中でスクリーニングすることができる。
【０１２６】
あるいは、例えば、Vidalら、Proc. Natl Acad. Sci USA 93, 10315-10320, 1996に記載のような逆２ハイブリッドスクリーニングを使用して、アンタゴニスト分子を同定することもできる。逆２ハイブリッドスクリーニングは、それが、例えばＣＹＨ２やＬＹＳ２など、タンパク質とタンパク質の相互作用に対して選択する対抗選択レポーター遺伝子を使用する点で、上記の順方向スクリーニングと異なる。細胞の生存または増殖は、対抗選択レポーター遺伝子産物の非毒性基質の存在下で低下しまたは阻害されるが、その基質が、前記遺伝子産物によって毒性化合物に変換されるものである。したがって、前記相互作用のアンタゴニストの存在下などで、本発明のタンパク質とタンパク質の相互作用が起こらない細胞は、基質が毒性産物に転換されないのでその基質の存在下で生存する。例えば、アクチンと結合するトロポミオシンの一部／断片を、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとの融合物などの、ＤＮＡ結合ドメイン融合物として発現させ、トロポミオシンと結合するアクチンの一部を、適当な転写活性化ドメイン融合ポリペプチド（例えば、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインを有するもの）として発現させる。その発現にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの間の物理的関係を必要とするＵＲＡ３のＵＲＡ３対抗選択レポーター遺伝子と作動的に結合させた融合ポリペプチドを、酵母中で発現させる。例えば、レポーター遺伝子発現を、ＧＡＬ４が結合するヌクレオチド配列を含むプロモーターの制御下に置くことによって、この物理的関係が実現する。このレポーター遺伝子を発現させる細胞は、ウラシルおよび５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下では、５−ＦＯＡが毒性化合物に転換されるので増殖しない。そのような細胞のライブラリー中で候補ペプチド阻害因子を発現させ、ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下で増殖するその細胞を、例えば、候補ペプチド阻害因子をコードする核酸の分析などのさらなる分析のために保持する。小分子の存在下で細胞をインキュベートし、ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下で増殖または生存する細胞を選択することにより、この相互作用に拮抗する小分子を決定する。
【０１２７】
あるいは、Ｋａｒｉｎらの米国特許第５，７７６，６８９号に記載のものなどのタンパク質動員系を使用することもできる。標準的なタンパク質動員系では、特定の細胞区画に転写因子でないエフェクタータンパク質を動員することにより、細胞中でのタンパク質とタンパク質の相互作用を検出する。エフェクタータンパク質が細胞区画に転位すると、エフェクタータンパク質は、その区画に存在するレポーター分子を活性化するが、そのレポーター分子の活性化は、例えば、タンパク質とタンパク質の相互作用が存在することを示す細胞生存率によって検出可能である。
【０１２８】
より具体的には、タンパク質動員系の成分は、エフェクタータンパク質および一方の結合相手（例えば、アクチンまたはその一部）を含む第１の融合タンパク質をコードする第１の発現可能な核酸、ならびに細胞区画局在ドメインおよび他方の結合相手（例えば、トロポミオシンまたはその一部）を含む第２の融合タンパク質をコードする第２の発現可能な核酸分子を含む。タンパク質とタンパク質の相互作用の不在下ではレポーター分子が発現しないように、内因性エフェクタータンパク質の活性が欠損しているかまたは不在である細胞系統または細胞株（例えば、酵母細胞または他の非哺乳動物細胞）も必要である。
【０１２９】
結合相手同士の相互作用の結果、融合ポリペプチド間で複合体が形成され、それによって、細胞区画局在ドメイン（例えば、原形質膜局在ドメイン、核局在ドメイン、ミトコンドリア膜局在ドメインなど）が媒介する、適当な細胞区画へのその複合体の転位が誘導され、次いでそこでエフェクタータンパク質がレポーター分子を活性化する。そのようなタンパク質動員系は、例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞および細菌細胞を含む基本的に任意の細胞型において、様々なエフェクタータンパク質／レポーター分子系を用いて、実施することができる。
【０１３０】
例えば、酵母細胞ベースのアッセイを実施し、そのアッセイでは、トロポミオシンと１つまたは複数のその結合相手との相互作用の結果、原形質膜にグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦまたはＣ３Ｇ）が動員され、ＧＥＦまたはＣ３ＧがＲａｓなどのレポーター分子を活性化し、それによって、そうでない場合特定の培養条件下で生存しないはずの細胞が生存する。この目的に適した細胞には、例えば、機能的なＧＥＦが発現するときだけ３６℃で増殖する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｃｄｃ２５−２細胞がある（Petitjeanら、Genetics 124, 797-806, 1990）。原形質膜へのＧＥＦの転位は、原形質膜局在ドメインによって促進される。例えば、市販のアッセイキットおよび／または試薬を使用して、細胞中の環状ＡＭＰレベルを測定することによって、Ｒａｓの活性化を検出する。本発明のタンパク質とタンパク質の相互作用のアンタゴニストを検出するために、試験化合物の存在下で、あるいは細胞中での候補アンタゴニストペプチドの発現の存在下または不在下で、二重反復のインキュベーションを実施する。候補化合物または候補ペプチドの存在下での細胞の生存または増殖の低下は、そのペプチドまたは化合物が、トロポミオシンと１つまたは複数のその結合相手との相互作用のアンタゴニストであることを示唆するものである。
【０１３１】
「逆の」タンパク質動員系も予想され、その場合、細胞の生存または増殖の変更は、候補化合物または候補ペプチドによるタンパク質とタンパク質の相互作用の崩壊を条件とする。例えば、ＧＥＦの存在下で活性化Ｒａｓを構成的に発現するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を使用することができ、この場合、細胞が形質転換されないと、候補化合物またはペプチドによってタンパク質複合体が崩壊することが示唆される。それと異なり、ＧＥＦの存在下で活性化Ｒａｓを構成的に発現するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、形質転換された表現型を有する（Aronheimら、Cell. 78, 949-961, 1994）。
【０１３２】
さらに他の実施形態では、参照により本明細書に組み込むVidalおよびEndoh、TIBS 17, 374-381, 1999に記載のプレート寒天拡散アッセイを適合させることにより、トロポミオシンのその結合相手の１つとの結合を妨げる能力について小分子を試験する。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態では、トロポミオシンの結合相手は、カルポニン（Childsら、BBA 1121: 41-46, 1992）、癌胎児性抗原細胞接着因子１（ＣＥＡＣＡＭ１）（Schumannら、J. Biol. Chem. 276 (50): 47421-33, 2001）、エンドスタチン（MacDonaldら、J. Biol. Chem. 276, 25190-25196, 2001）、エニグマ（Guyら、FEBS letters 10: 1973-1984,1999）、ゲルソリン（好ましくは、サブドメイン２）（KoepfおよびBurtnick FEBS 309 (1): 56-58, 1992）、Ｓ１００Ａ２（Gimonaら、J. Cell Sci. 110: 611-621, 1997）およびアクチンからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、トロポミオシンの結合相手はアクチンである。
【０１３４】
ミオシンＡＴＰアーゼ活性に基づくスクリーニング法
トロポミオシンの、１つまたは複数のその結合相手との結合に基づくスクリーニングプロトコルの適合化において、その方法は、ミオシンの反応混合物への添加と、ミオシンＡＴＰアーゼ活性の検出を伴う。
【０１３５】
例えば、トロポミオシンアイソフォームをアクチン繊維および特定のミオシンとともにインキュベートすることができる。次いで、候補化合物の存在下でミオシンＡＴＰアーゼ活性を測定する。通常の条件下で、トロポミオシンは、ミオシンＡＴＰアーゼ活性を抑制する。したがって、トロポミオシンと相互作用し、この抑制活性を阻害する化合物によって、ミオシンＡＴＰアーゼ活性が増大する。さらなるスクリーニングおよび／または特徴付けのために、そのような化合物を選択することができる。トロポミオシンを含まない状態、または抗ミオシン効果を除去するのに不適当なトロポミオシンアイソフォームを含む状態で、適切な陽性対照反応を行うことができる。
【０１３６】
本発明での使用に適合させることができる、ミオシンＡＴＰアーゼ活性を測定する方法は、当業者には公知である。そのようなアッセイの例は、Zhaoら、Biochem. Biophys. Res Commun. 267 (1): 77-79, 2000; Westraら、Archives of Physiology and Biochemistry 109: 316-322, 2001;およびDrottら、Biochem J. 264: 191-8, 1989に記載されている。
【０１３７】
治療法
本発明の方法によって同定されたトロポミオシンアゴニストまたはアンタゴニストを、細胞表面タンパク質の異常な挿入、保持または機能によって生じる疾患に対し治療用に使用することができる。「治療用」という用語、または本発明のトロポミオシンアゴニストまたはアンタゴニストと併せて本明細書で用いるものは、予防上の投与ならびに治療上の投与をどちらも意味する。したがって、疾患の可能性および／または重症度を小さくするために高リスク患者にトロポミオシンアゴニスト／アンタゴニストを投与することもでき、あるいは、すでに活発な疾患の徴候を示している患者にそれを投与することもできる。
【０１３８】
トロポミオシン機能のアゴニストまたはアンタゴニストで治療することができるヒトまたは他の生物種の疾患または病的状態としては、限定しないが、嚢胞性線維症、多発性硬化症、多発性嚢胞腎疾患、ウイルス感染、細菌感染、再灌流損傷、メンケス病、ウィルソン病、糖尿病、筋緊張性ジストロフィー、てんかん、または、うつ病、双極性障害もしくは気分変調性障害などの気分障害が挙げられる。
【０１３９】
投与形態
候補化合物が低分子量化合物、ペプチドまたは抗体などのタンパク質の形態である場合は、その物質を、そのような形態のものについて一般的に使用される通常の医薬組成物（医薬品）に製剤化することができ、そのような組成物は、経口的にまたは非経口的に投与することができる。一般的に述べると、下記の剤形および投与法を使用することができる。
【０１４０】
剤形としては、固体製剤、例えば錠剤、丸剤、粉剤、微粉剤、顆粒剤、およびカプセル剤、ならびに液体製剤、例えば液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、およびエリキシル剤のような代表的な剤形が挙げられる。これらの剤形は、投与経路により、前記の経口剤形、または様々な非経口剤形、例えば経鼻製剤、経皮製剤、直腸製剤（坐剤）、舌下剤、経膣製剤、注射剤（静脈内、動脈内、筋内、皮下、皮内）や点滴注入剤などに分類することができる。例えば経口製剤は、例えば錠剤、丸剤、粉剤、微粉剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などでもよく、特に、直腸製剤および経膣製剤には、錠剤、丸剤およびカプセル剤がある。経皮製剤は、ローションなどの液体製剤だけでなく、クリーム、軟膏などの半固体製剤でもよい。
【０１４１】
注射剤は、液剤、懸濁剤および乳剤などの形で使用可能にすることができ、ビヒクルとしては、滅菌水、水−プロピレングリコール、緩衝液、および濃度０．４重量％の食塩水を例として挙げることができる。これらの注射剤は、このような液体の形で、凍結または凍結乾燥することができる。凍結乾燥により得られる後者の産物は、注射用蒸留水などで即時に再構成し、投与する。医薬組成物（医薬品）の上記の形態は、当技術分野で確立されている方法で、トロポミオシン抑制作用を有する化合物と、製薬上許容される担体とを配合することによって調製することができる。製薬上許容される担体には、とりわけ、様々な賦形剤、希釈剤、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、潤滑剤、および分散剤がある。当技術分野で通常使用される他の添加剤を配合することもできる。生産する医薬組成物の形態に応じて、とりわけ、様々な安定化剤、殺真菌剤、緩衝剤、増粘剤、ｐＨ調節剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、香料、着色料、張性調節剤または等張化剤、キレート剤および界面活性剤の中から、このような添加剤を慎重に選択することができる。
【０１４２】
このような形態のうちいかなる形態の医薬組成物も、目的の疾患、標的臓器、および他のファクターに適した経路で投与することができる。例えば、静脈内に、動脈内に、皮下に、皮内に、筋内に、または気道を通してそれを投与することができる。それを罹患組織へと局所に直接投与することもでき、あるいは経口でまたは直腸から投与することもできる。
【０１４３】
このような製剤の投与量および投与スケジュールは、他にもファクターはあるが、剤形、疾患またはその症状、患者の年齢および体重で変わり、一般的には述べることができない。通常の投与量は、ヒト成人に対する有効成分の１日量について約０．０００１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲でありうるが、１日１回、または１日数回に分けて毎日この量を投与することができる。
【０１４４】
トロポミオシン抑制活性を有する物質がアンチセンス化合物などのポリヌクレオチドの形態であるとき、遺伝子治療用薬または予防薬の形でその組成物を提供することができる。近年、様々な遺伝子の使用に対する多数の報告があり、遺伝子治療は、現在では確立された技術である。
【０１４５】
目的のポリヌクレオチドをベクター中に導入し、またはそのベクターで適当な細胞をトランスフェクトすることにより、遺伝子治療用薬を調製することができる。患者への投与の様式は、おおよそ２つの形態に分けられる。すなわち、（１）非ウイルスベクターを使用する場合に適した形態、および（２）ウイルスベクターを使用する場合に適した形態である。ウイルスベクターを前記ベクターとして使用する場合、および非ウイルスベクターを使用する場合それぞれに関して、遺伝子治療用薬剤を調製する方法も投与する方法も、実験プロトコルに関するいくつかの書籍に詳細に論じられている［例えば、「別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術（Supplement to Experimental Medicine, Fundamental Techniques of Gene Therapy）」、Yodosha, 1996；別冊実験医学：遺伝子導入＆発現解析実験法（Supplement to Experimental Medicine: Experimental Protocols for Gene Transfer & Expression Analysis）、Yodosha, 1997; Japanese Society for Gene Therapy（編）：遺伝子治療開発研究ハンドブック（Research Handbook for Development of Gene Therapies）、NTS, 1999など］。
【０１４６】
非ウイルスベクターを使用するとき、抗トロポミオシン核酸を発現することができるいかなる発現ベクターをも使用することができる。適切な例には、ｐＣＡＧＧＳ［Gene 108, 193-200 (1991)］、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＺｅｏＳＶ（Invitrogen, Stratagene)がある。
患者へのポリヌクレオチドの導入は、目的のポリヌクレオチドをそのような非ウイルスベクター（発現ベクター）中に通常の方法で挿入し、得られた組換え発現ベクターを投与することによって実現することができる。そうすることにより、目的のポリヌクレオチドを患者の細胞または組織中に導入することができる。
【０１４７】
より具体的には、ポリヌクレオチドを細胞中に導入する方法としては、とりわけ、リン酸カルシウムトランスフェクション（共沈）技術、およびガラス微小管を用いたＤＮＡ（ポリヌクレオチド）直接注入法が挙げられる。
【０１４８】
ポリヌクレオチドを組織中に導入する方法としては、とりわけ、内部型リポソームまたは静電型リポソームを用いたポリヌクレオチド導入技術、ＨＶＪ−リポソーム技術、改変型ＨＶＪ−リポソーム（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム）技術、受容体媒介性ポリヌクレオチド導入技術、パーティクルガンを用いて運搬体（金属粒子）と共にポリヌクレオチドを細胞中に導入することを含む技術、むき出しのＤＮＡを直接導入する技術、および正荷電ポリマーを用いた導入技術が挙げられる。
【０１４９】
適切なウイルスベクターには、組換えアデノウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクターがある。例としては、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビズ（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスに由来するベクターがある。特に、アデノウイルスベクターは、他のウイルスベクターより感染効率が非常に高いことで知られ、この観点から、アデノウイルスベクターを使用することが好ましい。
【０１５０】
患者へのポリヌクレオチドの導入は、目的のポリヌクレオチドをそのようなウイルスベクター中に導入し、所望の細胞を得られた組換えウイルスに感染させることによって実現することができる。この方法では、目的のポリヌクレオチドを細胞中に導入することができる。
【０１５１】
このように調製した遺伝子治療用薬を患者に投与する方としては、遺伝子治療用薬を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ技術、特定の細胞を人体から取り出すステップと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に遺伝子治療用薬を導入するステップと、その細胞を人体に戻すステップとを含むｅｘ  ｖｉｖｏの技術が挙げられる［Nikkei Science, April, 1994 issue, 20-45; Pharmaceuticals Monthly, 36 (1), 23-48, 1994; Supplement to Experimental Medicine, 12 (15), 1994; Japanese Society for Gene Therapy（編）：Research Handbook for Development of Gene Therapies, NTS, 19991］。本発明が扱う炎症性疾患の予防または治療での使用では、ｉｎ  ｖｉｖｏの技術によって薬を体内に導入することが好ましい。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｖｏの方法を使用するとき、目的の疾患、標的臓器などに適した経路で薬を投与することができる。例えば、静脈内に、動脈内に、皮下にまたは筋内にそれを投与することもでき、例えば、あるいはそれを罹患組織へと局所に直接投与することもできる。
【０１５３】
前記の投与経路に従う様々な製剤形態で遺伝子治療用薬を供給することができる。注射可能な形の場合では、例えば、それ自体確立された手順によって、例えば有効成分のポリヌクレオチドを、緩衝液、例えばＰＢＳ、生理食塩水や滅菌水などの溶媒中で溶解し、その後必要な場合はフィルターに通して滅菌し、その溶液を滅菌容器に入れることによって注射剤を調製することができ、必要な場合は、この注射剤に通常の担体などを補充することができる。ＨＶＪ−リポソームなどのリポソームの場合では、懸濁剤、凍結製剤や遠心濃縮凍結製剤などの形での様々なリポソーム取り込み型製剤で薬剤を供給することができる。
【０１５４】
さらに、遺伝子が罹患部位の近傍に容易に局在化できるために、徐放性製剤（例えば、ミニペレット）を調製し罹患部位の近くに移植することもでき、あるいは、浸透圧ポンプなどによって薬剤を連続的かつ段階的に罹患部位に投与することもできる。
【０１５５】
遺伝子治療用薬剤のポリヌクレオチドの含有量は、治療する疾患、患者の年齢および体重、および他のファクターに従って慎重に調整することができるが、通常の投与量は、各ポリヌクレオチドについて約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇであり、好ましくは約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇである。好ましくは、この量を数日または数ヶ月の間隔で投与する。
【０１５６】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語尾変化は、述べられた要素、整数またはステップ、あるいは一群の要素、整数またはステップを包含するが、他のどんな要素、整数またはステップ、あるいは一群の要素、整数またはステップをも除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
【０１５７】
本明細書に含まれている、文献、行為、材料、機器、物品などについてのどんな考察も、本発明の状況を与える目的のものに過ぎない。これらの事柄のいずれかまたはすべてが、本願の各請求項の優先日の前からオーストラリアで存在していたように、従来技術の土台の一部を形成し、または本発明に関係する分野における通常の一般的な知識であったことを認めるものとみなすべきでない。
【０１５８】
本発明を下記の実施例によって次に説明するが、その実施例は、いかなる形でも限定的に意図されるものではない。
【実施例】
【０１５９】
実験の詳細
材料および方法
試薬および抗体
サイトカラシンＤ、フォルスコリン、６−メトキシキノリニウム１−酢酸エチルエステル（ＭＱＡＥ）、ノコダゾール、３’３’５’５’テトラメチルベンジジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２．］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、ポリ−Ｄ−リシンおよび１％コラーゲンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）から購入した。リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）試薬およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｕｌｇｒａｖｅ，Ｖｉｃ，オーストラリア）から購入した。ジャスプラキノリド（Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）は、Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｙｍｅａ，Ｎ．Ｓ．Ｗ．，オーストラリア）から購入した。塩化ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＮＢＴおよびＢＣＩＰ）、組織培養液および試薬は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｕｌｇｒａｖｅ，Ｖｉｃ，オーストラリア）から購入した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキットは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ，米国）から購入した。サーマノックス（Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ）カバーガラスおよびガラスチャンバースライドは、Ｍｅｄｏｓ（Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ，Ｖｉｃ，オーストラリア）から購入した。組織培養用プラスチック容器は、Ｉｎｔｅｒｐａｔｈ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，米国）から購入した。ウェスタンライトニング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）（商標）化学発光試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，米国）から購入した。
【０１６０】
ローダミンレッドＸコンジュゲートおよびローダミン付加ヤギ抗ヒツジＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，米国）から入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）付加抗マウスおよび抗ウサギＩｇＧは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）から入手した。マウスモノクローナルＴｍ抗体３１１、および２次抗体フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−ロバ抗マウスは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）から入手した。Ｔｍ抗体ＣＧ３は、Ｊ．Ｃ．Ｌｉｎ（アイオワ大学、アイオワ、米国）から贈与されたものである。ＣＦＴＲ抗体（ＭＡ１−９３５）は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ，米国）から入手した。マウスモノクローナル抗ヒトＣ末端特異的ＣＦＴＲ抗体は、Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｙｍｅａ，Ｎ．Ｓ．Ｗ．，オーストラリア）から入手した。
【０１６１】
細胞培養
ヒトＴ８４結腸癌細胞を、ポリ−Ｄ−リシンおよび１％コラーゲンで被覆した、２枚のチャンバーガラススライド、２４または９６穴プレートあるいはカバーガラスに播いた。Ｔ８４細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得し（継代数６０）、またＫｉｍ  Ｂａｒｒｅｔｔ（サンディエゴ、米国）（継代数２０）から厚意により贈与を受けた。研究の経過において、これらを、それぞれ継代数８０および３０まで継代培養した。Ｌｉらの方法を用いて、Ｔ８４細胞を培養した（Liら、1999, Infection & Immunity 67, 5938-5945）。
【０１６２】
トリパンブルー排除アッセイを用いて、各処理後のＴ８４細胞の生存率を評価した。処理後、Ｔ８４細胞単層を穏やかにＰＢＳで洗浄し、１％トリパンブルーで１０分間染色した。位相差顕微鏡法によって細胞を直ちに調べた。ランダムな顕微鏡視野で、トリパンブルーを取り込んだ細胞数をカウントすることにより、処理した単層および対照の単層を比較した。
【０１６３】
免疫蛍光分析
２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで固定した。１００％メタノールでこれを透過処理し、−８０℃で２０分間冷却した。１次抗体および２次抗体とともに細胞を室温で１時間インキュベートし、各インキュベーション後に２％ＦＢＳ含有ＰＢＳでの１０分間の洗浄を３回行った。カバーガラスを、抗退色試薬ＤＡＢＣＯとともにスライド上に載せた。
【０１６４】
蛍光顕微鏡法
共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌｅｒ，ドイツ）で、６３×油浸対物レンズを用いて、蛍光を調べた。ＦＩＴＣについては４８８ｎｍで、ローダミンについては５６８ｎｍで走査し、ノイズを除去するために８回ライン平均（ｌｉｎｅ  ａｖｅｒａｇｅ）を用いることによってフルオロフォアの分布を測定した。垂直（ｘｚ）面および水平（ｘｙ）面で画像を取得した。水平面での画像は、細胞の頂端領域から基底領域まで１μｍ刻みで得た画像断面を重ねることによって構築した。
【０１６５】
共焦点顕微鏡法によって得た画像上でのＴｍ抗体染色の画素強度を測定した。単層の頂端領域を横断して、またその中央領域を横断して、測定を行い、それらを平均して個々の単層についての平均画素強度を得た。個々の単層内の抗体染色の分布は、頂端領域での平均画素強度の、その単層の中央領域での平均画素強度に対する比として記載される。αｆ９ｄ抗体染色と３１１抗体染色の相対的な分布を決定するために、αｆ９ｄと３１１についての頂端：中央の平均画素強度比を、対をなす試料についてのスチューデントｔ−検定を用いて共染色した単層において比較した。
【０１６６】
組織検体の抗体染色
ラット十二指腸の組織検体を４％パラホルムアルデヒド生理食塩水中で固定し、パラフィン中に包埋するまでそれを４℃で７０％エタノール中に保存した。切片をキシロール中で脱蝋し、段階的なエタノール（１００％、１００％、７０％、水）中で段階的に再水和した。１×クエン酸緩衝液（１０×クエン酸緩衝液：５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、２．５ｇ／ｌトリス塩基、３．２ｇ／ｌクエン酸三ナトリウム；ｐＨ８．０）中で検体を加熱し、１２分間高マイクロ波処理し、次いで冷ますことによって抗原回復を行った。検体をＰＢＳで２回洗浄し、１０％血清含有ＰＢＳで１０分間ブロッキングを行った。次いで、室温で一晩１次抗体を反応させた。２次抗体を反応させる前に、検体をＰＢＳ中で５分間にわたり２回洗浄した。２次抗体を１時間反応させ、その後検体をＰＢＳで５分間１回、アルカリリン酸緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）１０ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ  ５ｍｌおよび５Ｍ  ＮａＣｌ  ２ｍｌ）で５分間１回洗浄した。次いで、ＮＢＴおよびＢＣＩＰを含む基質を４０〜６０分間反応させ、その後検体をＰＢＳで５分間１回洗浄した。次いで、検体をＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄで１分間対比染色し、その後蒸留水で２回すすぎ、漸増勾配のエタノール（７０％、１００％、１００％、１００％）で脱水し、キシロールで洗浄し、カバーガラスをかけた。
【０１６７】
単層形成の際のジャスプラキノリド、サイトカラシンおよびノコダゾールによる細胞処理
トリプシン／ＥＤＴＡを用いて上皮細胞の単層をトリプシン処理し、遠心して細胞ペレットを形成させた。次いで、細胞を１μＭジャスプラキノリド、２０μＭサイトカラシンＤまたは３３μＭノコダゾールを含む培地中に再懸濁し、ポリ−ｄ−リシンおよびコラーゲンで被覆されたガラスチャンバースライド中に播いた。次いで、発達中の単層を、播いてから１０分後に固定し染色した。βチューブリンに対する抗体で染色し、非処理細胞と比較することにより、微小管に対するノコダゾールの効果を確認した。成熟したＴ８４細胞単層を２０μＭサイトカラシンＤを含む培地で３時間処理し、次いで固定し染色した。次いで免疫蛍光分析を上記に記載のようにして行った。
【０１６８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対するアンチセンスおよびナンセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列は、それぞれ５’−ＣＡＣＣＧＣＣＵＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴ（配列番号１４）および５’−ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＴ（配列番号１５）であった。これらは、ヒトαＴＭｆａｓｔ遺伝子（Novyら、1993, Cell Motility & the Cytoskelton 25, 267-281）のエキソン１ｂ配列から設計した。ガラスチャンバースライドまたは２４穴プレート中のカバーガラス上で、Ｔ８４細胞単層を集密状態まで増殖させた。製造業者の説明書に従って、オリゴヌクレオチドを濃度２μＭで、リポフェクチン試薬を１０μｇ／ｍｌで加えた。次いで、Ｔ８４細胞単層をオリゴヌクレオチドとともに３７℃、５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートし、その時間の後、これを、オリゴヌクレオチド前処理を必要とする実験に使用した。
【０１６９】
トロポミオシンアイソフォームのイムノブロット分析
ＷｅｓｓｅｌおよびＦｌｕｇｇｅ（WesselおよびFlugge, 1984）の方法を用いて、Ｔ８４細胞からタンパク質を抽出した。記載の通りに（Percivalら、2000, Cell Motility & the Cytoskeleton 47, 189-208）ウェスタンブロットを行った。簡潔に述べると、１５％低ビスアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分画し、それをポリ二フッ化ビニリデン膜に転写し、Ｔｍ抗体を用いてプローブした。ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、結合した抗体を検出した。ウェスタンライトニング（商標）化学発光試薬を用いてバンドを検出し、それをＸ線フィルムに露光した。
【０１７０】
コンピュータプログラムＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５，Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，米国）を使用し、ウェスタンブロットのオートラジオグラフ上のタンパクバンドの濃さとして、タンパク質発現を測定した。タンパクバンドの濃さは、個々の実験内で、対照群のタンパクバンドの濃さに対して標準化したタンパクバンドの濃さとして報告される。処理の効果を判定するために、片側スチューデントｔ検定により、帰無仮説値１に対して、標準化したタンパクバンドの濃さを比較した。
【０１７１】
ＭＱＡＥ塩素イオン流出アッセイ
２４穴または９６穴プレート上で培養したＴ８４細胞単層を、１０ｍＭ  ＭＱＡＥを含む培地中で１６時間インキュベートした。次いで単層を塩素イオン緩衝液（２．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．４ｍＭ  ＫＣｌ、１２４．６ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で３回洗浄した。１０μＭフォルスコリンを含む塩素イオン緩衝液とともに１０分間インキュベートすることによって、フォルスコリンでＴ８４細胞単層を刺激し、その後塩素イオン緩衝液を除去し、１０μＭフォルスコリンを含む塩素イオン不含緩衝液（２．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．４ｍＭ  ＫＮＯ３、１ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、１２４．６ｍＭ  ＮａＮＯ３、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で置換した。蛍光プレート読み取り器（励起、λ−３６０ｎｍ；発光、λ−４６０ｎｍ）を用いて、直ちに反復的蛍光分析を開始した。測定は、３０〜６０秒毎に１５分間行った。
【０１７２】
基線から特定の時点までの間における蛍光のパーセンテージ増加として、塩素イオン流出を測定した。蛍光のパーセンテージ増加は、各実験において、その実験の対照群における蛍光の平均パーセンテージ増加に対して標準化した。処理の効果を判定するために、蛍光の標準化パーセンテージ増加を群間で比較した。スチューデントｔ検定を用いて、２群の比較を行った。
【０１７３】
酵素結合表面ＣＦＴＲアッセイ
コラーゲン被覆カバーガラス上で培養したＴ８４細胞単層を、１０μＭフォルスコリンを含む塩素イオン緩衝液、または塩素イオン緩衝液単独の中で、３７℃、５％ＣＯ２中で３０分間インキュベートし、次いで４％パラホルムアルデヒドで４℃で２０分間固定した。最初に、１：５００に希釈したＣＦＴＲ（ＭＡ１−９３５）抗体（Walkerら、1995）、その後、１：１０００に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇＧとともに、Ｔ８４細胞単層を１時間インキュベートした。各インキュベーションの前に、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で１０分間にわたりＴ８４細胞単層をブロッキング処理し、各インキュベーション後にＰＢＳ中で４回洗浄した。次いで、クリーンな２４穴プレート中にそのカバーガラスを入れ、３’３’５’５’テトラメチルベンジジン５００μｌとともに３０分間インキュベートした。各ウェルからの上清をキュベットに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６５０分光光度計で、６５５ｎｍでの吸光度を測定した。１次抗体陰性の対照について６５５ｎｍでの吸光度も測定し、そして１次抗体陽性の単層での吸光度からその値を差し引いて、そのアッセイの結果を決定した。
【０１７４】
ＣＦＴＲ表面発現は、個々の実験内で、対照群の平均吸光度に対して標準化した、６５５ｎｍで測定した吸光度として報告される。処理の効果を判定するために、６５５ｎｍでの標準化吸光度を群間で比較した。スチューデントｔ検定を用いて、２群の比較を行った。
【０１７５】
実施例１：  Ｔ８４細胞におけるトロポミオシン遺伝子発現および抗体特異性
Ｔｍタンパクは、４つの異なる遺伝子によってコードされている。この研究で使用する抗体は、３つのＴｍ遺伝子から生成される特定のアイソフォームを検出することができた。これらの遺伝子のエキソン／イントロン構造を図１に示す。αｆ９ｄ抗体は、Ｔｍ１、２、３、５ａ、５ｂおよび６を検出する（Schevzovら、1997, Molecular & Cellular Neurosciences 8, 439-454）。３１１抗体は、αｆ９ｄ抗体によって検出されるＴｍサブセット、すなわちＴｍ１、２、３、および６を検出する。ＣＧ３抗体は、Ｔｍ５ＮＭ１−１１を検出する（Novyら、1993, Cell Motility & the Cytoskeleton 25, 267-281; Dufourら、1998, Journal of Biological Chemistry 273, 18547-18555）。
【０１７６】
ヒト線維芽細胞では、３１１抗体によって３本のバンドが検出された。バンドは、４０、３６および３４ｋＤａで認められ、それぞれＴｍ６、２および３に対応した（図２Ａ）。Ｔ８４細胞では、３１１抗体によりＴｍ６および３に対応する４０ｋＤａおよび３４ｋＤａのバンドだけが検出された（図２Ａ）。αｆ９ｄ抗体により、Ｔ８４細胞で４本のバンドが検出され、４０ｋＤａおよび３４ｋＤａに認められるバンドはＴｍ６およびＴｍ３に対応し、３０ｋＤａでの二重のバンドはＴｍの５ａおよび５ｂに対応した（図２Ｂ）。ＣＧ３抗体により、３０ｋＤａで単一バンドが検出され、これは同時移動するＴｍ５ＮＭアイソフォーム群に対応した（図２Ｃ）。
【０１７７】
実施例２：  Ｔ８４細胞単層は、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの局在分布を示す
Ｔ８４細胞における別々の微小繊維集団の分布を決定するために、各抗体で染色した８つの単層を、共焦点顕微鏡法により垂直面と水平面の両方について調べた。代表的な画像を図３に示す。Ｔｍ３、５ａ、５ｂおよび６を検出するαｆ９ｄ抗体で、細胞の頂極が主に染色されることが判明した（図３Ａ）。しかし、Ｔｍ３および６を認識する３１１抗体は、同じ細胞の頂極から基底極まで、より均一な分布を示すことが判明した（図３Ｃ）。この染色パターンの違いは、αｆ９ｄによって検出されるが３１１によって検出されない２つのアイソフォーム（すなわち、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂ）が高度に局在分布することによってのみ説明されうる。したがって、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂは頂端表面において高度に富化されていると結論付けられる。Ｔｍ５ＮＭ１−１１を染色する抗体ＣＧ３は、細胞全体に分布していた（図３Ｅ）。
【０１７８】
水平面で得られた、上皮細胞単層の断面では、αｆ９ｄ（図３Ｂ）および３１１（図３Ｄ）の分布は、側方細胞膜と関連していることが判明し、細胞質中では染色が少し認められた。ＣＧ３は、細胞核の周囲の細胞質中に位置付けられることが判明した（図３Ｆ）。
【０１７９】
図３Ｇに示すαｆ９ｄおよび３１１抗体染色の相対的分布の定量分析から、上記で述べた質的差異が確認された。αｆ９ｄ抗体についての頂端と中央の画素強度の平均比は、３１１抗体のものよりかなり高かった（３．８８±０．６０  対  １．６４±０．２３；ｐ＜０．００１）。
【０１８０】
実施例３：  特有の微小繊維集団の局在分布は、ラット十二指腸での上皮細胞の分化に伴って変化する
Ｔ８４細胞で観察されるＴｍアイソフォームの分布が、陰窩と絨毛の両方の消化管上皮細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで認められるものと異なるかどうかを判定するために、６つのラット十二指腸組織検体をＴｍアイソフォームについて染色し、明視野顕微鏡法で調べた。代表的な切片を図４に示す。αｆ９ｄ抗体で染色すると、陰窩上皮中で散在した染色像を示した（図４Ｃ矢印）。より分化した絨毛上皮での染色は、頂端領域で高度に富化されていたが、細胞質全体にも認められた（図４Ｄ矢印）。３１１抗体での染色（Ｔｍ３および６）は、陰窩上皮中ではまばらであった（図４Ｅ）。絨毛上皮では、その青い染色が、核の上に位置する環状の領域で認められた（図４Ｆ）。ＣＧ３抗体での染色（Ｔｍ５ＮＭ１−１１）は、αｆ９ｄ抗体で認められるものと同様の分布を示した。陰窩上皮細胞では、その染色は、細胞全体にわたって散在した（図４Ｇ）が、絨毛上皮細胞では、頂端領域で強く濃縮された染色が認められた（図４Ｈ）。陰窩で主にみられる杯細胞では、その染色は、特徴的な粘液胞の外側に散在していた（図４Ｇ）。
【０１８１】
これらの結果から、Ｔｍアイソフォームが、より分化した絨毛上皮細胞では局在するが、あまり分化していない陰窩上皮細胞では局在しないことが実証される。重要なことに、十二指腸の絨毛上皮細胞におけるαｆ９ｄ抗体と３１１抗体染色の相対分布からは、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂが、Ｔ８４細胞モデルでの局在と同様にｉｎ  ｖｉｖｏ局在することが示唆される。
【０１８２】
実施例４：  特有の微小繊維集団の局在分布は、単層形成の初期段階で起こる
αｆ９ｄ染色の局在分布が起こる時間系列を、Ｔ８４細胞を播いてから１０分後、１時間後、２時間後および２４時間後に調べた。各時点について３回実験を行った。播いてから１時間後、２時間後、４時間後、２４時間後および７日後に収集したＴ８４細胞から抽出したタンパク質に対してウェスタンブロットを行うことにより、Ｔｍアイソフォームの発現を調べた。各時点で３回実験を行った。
【０１８３】
代表的な共焦点顕微鏡画像を図５に示す。懸濁液中でみられるＴ８４細胞では、αｆ９ｄ、３１１およびＣＧ３抗体（図６Ａ、６Ｂおよび５Ｉ矢印、またデータを示さず）の染色は、周縁性である。播いてから１０分後（５Ａ〜Ｃ）、Ｔ８４細胞が、細胞と細胞の接触および細胞とスライドの接触を形成することが広く観察された。染色はαｆ９ｄよりＣＧ３および３１１で明らかであったが、すべての抗体で、この最初の時点で細胞とスライドの接触部位での染色の低下が認められた。さらに、αｆ９ｄ抗体染色は、自由表面に限られているように見えたが、３１１抗体染色は、細胞と細胞の接触部位でより顕著であった。それと異なり、ＣＧ３抗体染色は、自由表面と、細胞と細胞の接触部位の両方にわたってより均一に分布していた。経時的には、αｆ９ｄ染色の分布は基本的には変化せず（５Ｅ、ＨおよびＫ）、自由表面において濃縮された染色を示し（これはＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂを表す）、３１１と似た低レベルの散在性染色を示す（これはＴｍ６およびＴｍ３を表す）。それと異なり、３１１抗体染色（５Ｄ、ＧおよびＪ）とＣＧ３抗体染色（５Ｆ、ＩおよびＬ）の分布はどちらも、すべての表面および細胞質を含むように細胞全体にわたってより均一に分布するようになった。
【０１８４】
ウェスタンブロット分析から、播いてから２時間後および４時間後に収集したＴ８４細胞では、Ｔｍ６および５ａの発現が、播いてから２４時間後および７日後に収集した細胞と比べてわずかに増加することが明らかとなった（図５Ｎ）。これらのアイソフォームのレベルの変化では、αｆ９ｄおよび３１１抗体の染色の変化を説明することはできない。したがって、これらのアイソフォームの分布の変化は、これらのタンパク質の標的化の変化から生じている可能性が最も高い。
【０１８５】
実施例５：  Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの初期の局在分布は繊維の代謝回転を伴わず、微小管に依存しない
微小繊維の局在化の生起について考えられる機構を、細胞を播く際の細胞骨格の薬剤操作によって検討した。アクチン繊維を安定化するのにジャスプラキノリドを使用し、アクチン繊維を断片化するのにサイトカラシンＤを使用し、微小管を崩壊させるのにノコダゾールを使用した。Ｔ８４細胞が懸濁液中に存在する間にこれらの薬剤をＴ８４細胞に加え、１０分後にプレートに播いた。プレートに播いてから１０分後に細胞を調べた。
【０１８６】
Ｔ８４細胞をジャスプラキノリドで前処理した後に細胞を播くと、細胞の形態が変化した。Ｔ８４細胞は、非処理細胞（図５Ａ）と比べて扁平な外観（図６Ａ）となった。ジャスプラキノリドで前処理したＴ８４細胞では、細胞を播いてから１０分後のαｆ９ｄ（図６Ｂ）と３１１（図６Ａ）抗体染色のどちらの分布も、対照のＴ８４細胞（５Ａおよび５Ｂ）と同様であった。αｆ９ｄ抗体の分布は頂端のままであったが、３１１抗体の分布は、細胞と細胞の接触部位でより顕著であるように見えた。Ｔ８４細胞をサイトカラシンＤで前処理した後に細胞を播くと、細胞とスライドの接着が妨げられ、画像が得られなかった。しかし、構築された単層をサイトカラシンＤで処理すると、αｆ９ｄ染色の局在分布が消失したことから、その維持に無傷のアクチン骨格が必要であることが示唆される（図６Ｆ）。
【０１８７】
Ｔ８４細胞をノコダゾールで前処理した後に細胞を播くと、細胞の形態が変化した。Ｔ８４細胞は、湾曲した表面をもつもの（図５Ａ）から不規則な外観をもつもの（図６Ｃ）へと変化した。細胞を播いた後の１０分間ノコダゾールで処理したＴ８４細胞でのαｆ９ｄ抗体染色の分布（図６Ｄ）は、非処理Ｔ８４細胞と同様であった。３１１抗体での染色は、αｆ９ｄ抗体と同様であるように見え、頂端表面での濃縮と、細胞とスライドとの接触部位での少量の染色とが認められた（図６Ｃ）。βチューブリンの染色から、ノコダゾールが正常な微小管構造を崩壊させたことが確認された（データは示さず）。
【０１８８】
これらの結果から、アクチン安定化剤であるジャスプラキノリドが局在化の初期の生起に影響を及ぼさなかったので、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの初期の局在化が繊維の代謝回転を伴わないことが示唆される。さらに、ノコダゾールで微小管を崩壊させたにも関わらずＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂの局在化が生じたように、無傷の微小管は必要でない。しかし、微小管は、細胞と細胞の接触部位へのＴｍ３およびＴｍ６の再配置またはその部位でのそれらによる安定化に関与する可能性がある。
【０１８９】
実施例６：  Ｔｍ５ａとＴｍ５ｂは、膜に挿入されたＣＦＴＲと共局在するが、頂端の下の小胞中に含まれるＣＦＴＲとは共局在しない
ＣＦＴＲ抗体でＴ８４細胞を染色することにより（図７Ｂ）、ＣＦＴＲの様々な発現が示された。ＣＦＴＲは、２つの形態で認められた。いくつかの細胞は頂端の顕著な染色を示し、ＣＦＴＲは頂端膜で突き出しているように見えた。ＣＦＴＲはまた、細胞質中に位置する小さな斑点としても認められ（図７Ｂ、矢印）、これは小胞様の構造内に位置するように見えた。αｆ９ｄ抗体と同時染色すると、頂端表面の周囲から上方に突出した非常に強い頂端染色部位に加えて、頂端に濃縮された典型的な局在化が見られることが明らかとなった。このαｆ９ｄ染色の高度に濃縮された部位は、ＣＦＴＲの膜取り込み部位と一致した（図７Ｃ）。したがって、Ｔｍは、ＣＦＴＲと関連した構造中に取り込まれるように思われた。ＣＦＴＲの膜染色部位はすべて、この強いαｆ９ｄ染色部位と関連していた。しかし、強いαｆ９ｄ染色部位のすべてが著しいＣＦＴＲ染色を示すわけではなかったことから、αｆ９ｄ抗体染色は、ＣＦＴＲが挿入できる部位に関連することが示唆される。αｆ９ｄ抗体は、細胞質の小胞様構造内に含まれるＣＦＴＲと共局在しなかった。
【０１９０】
実施例７：  Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ８４細胞単層におけるαｆ９ｄの頂端染色の強度を変化させる
以前の研究で、サイトカラシンＤがアクチン繊維の崩壊を誘導しＣＦＴＲを通る塩素イオン流を増大させることが示されており（Pratら、1995, American Journal of Physiology 268, C1552-C1561）、また本発明者らはサイトカラシンＤがαｆ９ｄ染色の局在分布をも崩壊させることを観察している（図６Ｆ）。そこで本発明者らは、ＣＦＴＲと共局在する、αｆ９ｄによって標識されたアクチン繊維が、ＣＦＴＲによる塩素イオン分泌を抑制する可能性を推論した。このことについて調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはランダムな（scrambled）ナンセンス対照でＴ８４細胞単層を処理した。ウェスタンブロット分析から、オリゴヌクレオチドにさらしてから２４時間後にＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂのレベルが実質的に低下することが示された（図８Ｄ）。ナンセンス処理と比較して、アンチセンスではＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂのレベルで５４±１３％（ｐ＝０．０２）の平均低下を示した。
【０１９１】
Ｔ８４培養物をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理すると、αｆ９ｄ染色の局在分布が消失し、細胞全体にわたって広く一様となった（図８Ｂ）。それと異なり、ナンセンスオリゴヌクレオチドは、αｆ９ｄ染色の分布に対して基本的に影響を及ぼさなかった（図８Ａ）。アンチセンスオリゴヌクレオチドによって誘導される染色の再分布は、頂端表面でのαｆ９ｄ染色の画素強度の低下に対応していた。これらのオリゴヌクレオチドと並行して処理したＴ８４細胞単層では、ナンセンス培養物と比べてアンチセンス培養物の頂端での画素強度が低下した（図８Ｅ）。これは、αｆ９ｄ抗体によって検出された、局在化Ｔｍ群のレベルの減少と一致している。
【０１９２】
結論として、αｆａｓｔ遺伝子のエキソン１ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理すると、αｆ９ｄ抗体での頂端染色が著しく低下した。これらの結果から、非処理のＴ８４細胞単層における頂端での顕著なαｆ９ｄ抗体染色が、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの局在分布に起因するものであることも確認される。
【０１９３】
実施例８：  Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＦＴＲ表面発現および塩素イオン流出を増大させる
アンチセンスによるＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂレベルの低下ならびにαｆ９ｄ染色の局在分布の消失によって、これらの分子のＣＦＴＲ表面発現における役割を評価する機会が与えられた。これは、ナンセンス対照と比べてアンチセンスで５０％の増加を示した（１．４９±０．７８  対  １±０．４２；ｐ＜０．００１）。このことから、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの存在が、頂端膜中へのＣＦＴＲ挿入に対する障害として、または膜中でＣＦＴＲを保持するものとして作用することが示唆される。
【０１９４】
ＣＦＴＲ表面発現の増大は、アンチセンス処理細胞からの塩素イオン流出の増大と対応していた。合計で、２１個のＴ８４細胞単層を２μＭのアンチセンスで２４時間処理し、２μＭのナンセンスで２４時間処理した２１個のＴ８４細胞単層と比較した。アンチセンスおよびナンセンス処理の後、ＭＱＡＥ塩素イオン流出アッセイを行った。その結果を図９Ｂに示す。アンチセンスで処理したＴ８４細胞単層は、１０μＭのフォルスコリンで１５分間刺激した後にナンセンスで処理したＴ８４細胞単層より著しく高い相対蛍光測定値を示した（１，４７±０．４１  対  １±０．３６；ｐ＜０．００１）。
【０１９５】
実施例９：  微小管の崩壊は、Ｔ８４細胞単層におけるＣＦＴＲ表面発現に影響を及ぼさない
Ｔｍのアンチセンス処理によるＣＦＴＲ表面レベルおよび塩素イオン流出に対する効果は、微小管の崩壊と対応していなかった。Ｔ８４細胞をノコダゾールとともにインキュベートしても、ＣＦＴＲ表面発現（図１０Ａ）にも塩素イオン流出（図１０Ｂ）にも著しい変化は誘導されなかった。本発明者らは、これらのパラメーターは、短期間の条件下でアッセイを行った場合、微小管系ではなく微小繊維系の崩壊を受けやすいと結論付ける。このことは、小胞体カーゴの頂端膜への挿入またはその保持を調節する際に、微小管ではなくアクチン繊維がより重要な役割を果たすこととよく相関する。
【０１９６】
実施例１０：  アクチン骨格に対する腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）感染の影響
腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）は、オーストラリア原住民社会の小児における胃腸炎の最大１７％の原因である。それが下痢を引き起こす機構は不明であるが、動物モデルでは塩素イオン分泌の増大が関係していた。本発明者らは、細胞培養モデルで、ＥＰＥＣ感染がＣＦＴＲ塩素イオンチャネルによる上皮細胞の塩素イオン分泌低下を引き起こし、上皮細胞の細胞骨格内でトロポミオシン５ａおよび５ｂアイソフォームの再分布を誘導することを以前示した。これらのトロポミオシンの機能は知られていないが、本発明者らは、頂端膜でそれらがＣＦＴＲ塩素イオンチャネルと共局在することを示した。
【０１９７】
この実験の目的は、ＥＰＥＣ感染が、ＣＦＴＲ塩素イオンチャネルを通る塩素イオン分泌を変化させる機構について調べることであった。
【０１９８】
コラーゲン被覆した２４穴プレート中でまたはプラスチック製カバースリップ上で増殖させた培養Ｔ８４結腸癌細胞単層を、消化管上皮モデルとして使用した。ＥＰＥＣ（１穴に付き１０４生物）を接種した単層を６〜９時間インキュベートしたものをＥＰＥＣ感染モデルに使用し、非病原性対照であるＨＢ１０１と比較した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、トロポミオシン５ａおよび５ｂの発現を低下させた。免疫比色アッセイを使用してＣＦＴＲ表面発現を評価し、細胞内でのＭＱＡＥの蛍光を使用して塩素イオン流出を評価した。
【０１９９】
その結果、ＨＢ１０１と比べてＥＰＥＣ感染によってＣＦＴＲ発現が増加した（平均増加率：１５３％；９５％ＣＩ：１００％、２０５％；ｐ＜０．００１）が、塩素イオン分泌は低下した（平均低下率：３７％；９５％ＣＩ：８％、６６％；ｐ＝０．０１４）ことが示された。
【０２００】
トロポミオシン５ａおよび５ｂの再分布は、ＥＰＥＣ感染で認められた、頂端膜でのＣＦＴＲ挿入の増大と、原因として関係する可能性がある。トロポミオシン５ａおよび５ｂを含む繊維は、消化管上皮細胞の頂端膜でのＣＦＴＲの挿入または保持に対する障害となる可能性がある。増加した膜ＣＦＴＲの存在下で塩素イオン分泌が低下したことから、ＥＰＥＣがＣＦＴＲ塩素イオンチャネル機能をも抑制できることが示唆される。ＥＰＥＣ感染では、高い表面発現の存在下でＣＦＴＲ機能が回復した後の反動現象として、下痢が起こる可能性がある。
【０２０１】
これらの結果から、ＥＰＥＣが、ＴＭ５ａおよびＴＭ５ｂの局在または機能を阻害することができる化合物を含むことが示唆される。したがって、ＥＰＥＣは、本明細書に記載のスクリーニングアッセイで使用する物質の有用な供給源である可能性がある。
【０２０２】
考察
上皮細胞の極性の確立におけるトロポミオシンアイソフォームの選別
特殊化した機能ドメインの生成を伴う局在化の生起は、正常な上皮細胞機能を必要とする。上皮細胞の局在化プロセスの中心は、ドメインにその機能を与えるタンパク質を選別し、膜へ輸送し挿入することである（Yeamanら、1999, Physiological Reviews 79, 73-98）。このプロセスにおけるその細胞の細胞骨格、特にアクチン微小繊維系の役割は明らかでない。アクチン骨格ドメインが急速に生成することから、細胞骨格の局在化が、機能的な極性の生起、特に特定の膜ドメインに対するタンパク質の選別および移動を必要とする可能性がある。
【０２０３】
本研究での知見は、上皮細胞の極性の生起、および膜タンパク質の局在送達における微小繊維の役割をさらに裏付けるものである。本発明者らは、特定のＴｍアイソフォームが、単層発達の際に急速に局在化することを見出した。同じアイソフォームが、頂端膜におけるＣＦＴＲの挿入および／またはその保持を調節することも明らかとなった。
【０２０４】
アイソフォーム選別の機構
細胞骨格と相互作用する薬剤は、細胞のプロセスを調べるのに広く使用されている。この技術を使用することにより、上皮細胞が微小繊維を急速に選別することができる機構を調べることができた。発達途中の単層では、アクチン繊維の分解および代謝回転を阻害する薬剤ジャスプラキノリドは、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの初期の局在化に影響を及ぼさなかった。成熟した単層では、アクチン繊維を崩壊させるサイトカラシンＤは、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの局在分布を崩壊させた。したがって、無傷の微小繊維が、Ｔｍアイソフォームの局在化（polarisation）の生起にもその極性の維持にも必要であると結論付けることができる。さらに、Ｔｍアイソフォームは、孤立した分子として存在するのではなくアクチン繊維を含む高次構造の一部を形成する。
【０２０５】
本研究でみられたＴｍアイソフォームの選別は、非常に急速に起こった。１０分以内に、特定のＴｍアイソフォームはその分布が局在化された。他の研究者らも、細胞構造の生起においてＴｍおよびアクチンの構造および組成の変化が早期に起こることを明らかにしている。Ｔｅｍｍ−Ｇｒｏｖｅらによる研究では、上皮細胞中へと微小注入を行った後、特定のＴｍアイソフォームの局在化が早くも１５分で起こった（Temm-Groveら、1998, Cell Motility & the Cytoskeleton 40 ,393-407）。Ｔｍ５が隣接する細胞間の接着ベルトに急速に局在したことが明らかとなった。他の研究では、経時的な発現レベルについて調べている。線維芽細胞では、Ｔｍ５ＮＭアイソフォームの発現レベルが細胞周期において５時間で２倍に増加した（Percivalら、2000, Cell Motility & the Cytoskeleton 47, 189-208）。培養肝細胞では、細胞外マトリックスと細胞接着してから３０分以内にＦアクチン塊が２０倍に増大した（Mooneyら、1995, Journal of Cell Science 108, 2311-2320）。発生途中のニューロンでは、Ｔｍ５  ｍＲＮＡが軸索小丘に局在し、それによってニューロンの極性の初期マーカーが形成されることが明らかとなった（Hannanら、1995, Molecular & Cellular Neurosciences 6, 397-412）。したがって、様々な種類の細胞が、細胞骨格タンパク質発現を増加させるか、または無傷のタンパク質を細胞内で移動させることにより、細胞骨格の構造を急速に変化させる能力があることが結論付けられる。これらの知見から、細胞接着の初期プロセスおよび極性化の生起にＴｍが関係することが示唆される。
【０２０６】
ＣＦＴＲ機能の調節に対するＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂの役割
特定の理論に拘泥するものではないが、どのようにＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂがｃＡＭＰ刺激に反応して頂端膜へのＣＦＴＲ挿入を制限するかについて説明することができる、少なくとも３つの考えられる機構がある。第１に、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂは、上皮細胞の頂端表面に向けての小胞の移動に対する物理的な障害として働く可能性がある。除去したとき、小胞の移動は、より自由に行われるはずであり、その後の膜挿入ＣＦＴＲの増加は必至であるはずである。第２に、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂは、小胞の移動に対する機能的な障害として働くのではなく、アクチン繊維に沿った小胞の移動についての抑制的調節機構である可能性がある。アクチン繊維に沿った小胞の移動は、アクチンとミオシンの相互作用を必要とする能動的なプロセスである。Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂは、この相互作用を阻害する可能性がある。これがその場合であるならば、頂端領域中にＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂが存在すると、頂端膜へのＣＦＴＲ小胞の送達が阻害されることが予想されるはずである。その反対に、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂが脱局在されると、頂端膜へのＣＦＴＲの送達が増大することが予想されるはずである。最後に、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂが結合した微小繊維は、表面タンパク質のエンドサイトーシス循環プロセスに関与する可能性がある。Ｇｏｔｔｌｉｅｂらによる研究で、微小繊維が上皮細胞の頂端膜でタンパク質のエンドサイトーシスにおいて役割を果たすことが明らかとなった（Gottliebら、1993， Journal of Cell Biology 120, 695-710）。その観察結果から、アクチン微小繊維が機械化学的モーターの一部を形成し、そのモーターが、絨毛内空間へ向けての微絨毛膜成分の移動またはエンドサイトーシス小胞中へ膜の窪みを変換させるのに関与するとの仮説が立てられた。これらのプロセスに関与する微小繊維がＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂを含む場合、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂを除去すると、頂端膜からＣＦＴＲなどのタンパク質をエンドサイトーシスできなくなるはずである。
【０２０７】
Ｔｍ５ａおよび／またはＴｍ５ｂが頂端膜へのＣＦＴＲの挿入またはその保持を調節するという本発明者らの知見は、Ｔｍアイソフォームが様々な機能を有することを示す、増えつつある多数の証拠にさらに寄与するものである。４０を超えるＴｍアイソフォームが存在することが知られている（Lees-MillerおよびHelfman、1991, Bioessays 13, 429-437; Pittengerら、1994, Current Opinion in Cell Biology 6, 96-104）（Dufourら、1998, Journal of Biological Chemistry 273, 18547-18555）。様々な機能が存在することの裏付けとして、様々なＴｍが、アクチン微小繊維に対して異なる機械化学的特性を与えることが知られている。例えば、アクチンに対するＴｍアイソフォームの結合親和性が異なることにより、アクチン微小繊維の安定性に対する影響の違いが生じる（Pittengerら、1994, Current Opinion in Cell Biology 6, 96-104）。さらなる証拠は、Ｔｍ５ＮＭがアクチン微小繊維に対してより高いサイトカラシンＤ抵抗性を与えることを発見したPercivalらによる研究に由来するものである（Percivalら、2000, Cell Motility & the Cytoskeleton 47, 189-208）。他の研究者らは、特定のＴｍアイソフォームがアクチン繊維の剛性を増大させることを発見した（Kojimaら、1994, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 12962-12966）。アクチン微小繊維中に挿入された後、Ｔｍは、アクチンと他のアクチン結合タンパク質の相互作用に影響を及ぼす。例えば、高分子量のＴｍは、アクチン結合タンパク質であるゲルソリンの切断活性に対して保護的である（Ishikawaら、1989, Journal of Biological Chemistry 264, 7490-7497）。
【０２０８】
本発明者らの知見は、特定の細胞機能におけるＴｍの役割を裏づける、増え続ける多数の証拠に寄与するものである。Ｔｍアイソフォームが消化管上皮細胞中で区分され、重要な細胞機能を調節する能力を有することが結論付けられる。
【０２０９】
上記で言及したすべての文献は、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。
【０２１０】
広範に記載した本発明の趣旨または範囲を逸脱せずに、特定の実施形態で示した本発明に多数の変更および／または改変を加えることができることは当業者に理解されるであろう。したがって、本願の実施形態は、すべての点で例示的であるとみなすべきであり、限定的であるとみなすべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】４種のトロポミオシン（Ｔｍ）遺伝子およびその産物のマップである。エキソンを影付きのボックスで示し、３’の非翻訳配列を影無しのボックスで示し、イントロンを線で示す。（Ａ）は、ｆａｓｔ遺伝子（α−Ｔｍｆ）である。エキソン１ｂがＴｍ５ａおよびＴｍ５ｂに独特であることに留意されたい。（Ｂ）は、Ｔｍ５ＮＭ遺伝子である。（Ｃ）は、β−ＴＭ遺伝子である。（Ｄ）は、ＴＭ−４遺伝子である（Temm-Grove CJら、1998およびPercivalら、2000から引用）。
【図２】トロポミオシン抗体の特異性を示す図である。Ｔ８４細胞およびヒト線維芽細胞におけるトロポミオシン抗体の特異性をウェスタンブロットで示す。Ｔ８４細胞（左）および線維芽細胞（右）における３１１の特異性をＡに示し、αｆ９ｄおよびＣＧ３抗体の特異性を、それぞれＢおよびＣに示す。３１１抗体は、ヒト線維芽細胞でＴｍ６（４０ｋＤａ）、Ｔｍ２（３６ｋＤａ）およびＴｍ３（３４ｋＤａ）を検出する。Ｔｍ２はＴ８４細胞に存在しない。Ｔｍ１（３６ｋＤａ）は、Ｔ８４細胞にもヒト線維芽細胞にも存在しなかった。αｆ９ｄは、Ｔｍ６（４０ｋＤａ）、Ｔｍ３（３４ｋＤａ）、Ｔｍ５ａ（３０ｋＤａ）およびＴｍ５ｂ（３０ｋＤａ）を検出する。ＣＧ３抗体は、３０ｋＤａに同時移動する、１１種の考えられるアイソフォームを検出する。
【図３】Ｔ８４細胞単層は、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂの局在分布を示すことを示す図である。（Ａ〜Ｆ）成熟したＴ８４細胞単層をαｆ９ｄ（ＡおよびＢ）、３１１（ＣおよびＤ）およびＣＧ３抗体で標識した。抗体の分布を共焦点レーザー走査顕微鏡法によって分析した。垂直面（ｘｚ）での画像を左側に示し、水平面（ｘｙ）での画像を右側に示す。αｆ９ｄと３１１の染色パターンの違いは、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに相当する。バーの長さは、１０μｍである。（Ｇ）個々の単層の頂端領域および中央領域を横切って、頂端および中央での平均画素強度を測定した。αｆ９ｄと３１１についての頂端：中央の平均画素強度比を、同時染色した単層において比較し、それを各群の平均±標準偏差として表す。結果は、８つの同時染色した単層の平均を表す。
【図４】ラット十二指腸の陰窩および絨毛におけるトロポミオシンアイソフォームの局在を示す図である。ラット十二指腸組織切片を固定し、αｆ９ｄ（ＣおよびＤ）、３１１（ＥおよびＦ）およびＣＧ３（ＧおよびＨ）抗体で染色した。陰窩の断面は左側であり、絨毛の断面は右側である。ＡおよびＢは、抗体陰性対照を表す。矢印は、消化管上皮細胞を示す。免疫反応は青い染色で示され、スライドをＮｕｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄで対比染色した。バーの長さは、１０μｍである。
【図５】トロポミオシンアイソフォームの局在化の生起を示す図である。（Ａ〜Ｌ）細胞を播いた後の様々な時点でトロポミオシンアイソフォームを染色したＴ８４細胞の、免疫蛍光共焦点顕微鏡法による画像である。画像はすべて垂直面（ｘｚ）のものである。各時点で、左側および中央の画像は、同時染色した同じ細胞のものである。左側に、３１１抗体（Ｔｍ３、６）染色を示す。中央に、αｆ９ｄ抗体（Ｔｍ３、５ａ、５ｂ、６）染色を示す。右側の細胞は、ＣＧ３抗体（ＴｍＮＭ１−１１）で染色したものである。（Ａ、ＢおよびＣ）１０分後；（Ｄ、ＥおよびＦ）１時間後；（Ｇ、ＨおよびＩ）２時間後；（Ｊ、ＫおよびＬ）２４時間後。矢印は、周縁性の染色を示す、懸濁液のＴ８４細胞を示す。バーの長さは、１０μｍである。（ＭおよびＮ）Ｔ８４細胞単層の発達中の総タンパク質および特定のトロポミオシンアイソフォームの発現を示す図である。タンパク質は、播いてから１時間後、２時間後、４時間後、２４時間後および７日後のＴ８４細胞から抽出した。（Ｍ）総タンパク質を示す、クーマシーブルーで染色したゲルである。（Ｎ）αｆ９ｄ抗体（Ｔｍ３、５ａ、５ｂ、６）でイムノブロットしたウェスタンブロットである。
【図６】ジャスプラキノリドまたはノコダゾールで処理した後のＴ８４細胞におけるトロポミオシンアイソフォームの局在を示す図である。トロポミオシンアイソフォームについて染色した、細胞を播いてから１０分後のＴ８４細胞（Ａ〜Ｄ）および成熟したＴ８４細胞単層（ＥおよびＦ）の、免疫蛍光共焦点顕微鏡法による画像を示す。画像はすべて垂直面（ｘｚ）のものである。左側の細胞は、３１１抗体（Ｔｍ３、６）で染色したものであり、右側の細胞は、αｆ９ｄ抗体（Ｔｍ３、５ａ、５ｂ、６）で染色したものである。（ＡおよびＢ）１μＭのジャスプラキノリドで処理した細胞である。（ＣおよびＤ）３３μＭのノコダゾールで処理した細胞である。（ＥおよびＦ）２０μＭのサイトカラシンＤで３時間処理したＴ８４細胞単層である。矢印は、周縁性の染色を示す、懸濁液のＴ８４細胞を示す。バーの長さは、１０μｍである。
【図７】トロポミオシンアイソフォームおよびＣＦＴＲについて同時染色したＴ８４細胞単層を示す図である。トロポミオシンアイソフォームおよびＣＦＴＲについて同時染色したＴ８４細胞単層の、免疫蛍光共焦点顕微鏡法による画像である。画像はすべて垂直面のものである。（Ａ）αｆ９ｄ抗体（Ｔｍ３、５ａ、５ｂ、６）。矢印は、ＣＦＴＲと結合しない頂端膜における濃縮されたαｆ９ｄ染色の領域を示す；（Ｂ）ＣＦＴＲ抗体。矢印は、細胞質中に位置するＣＦＴＲを示す；（Ｃ）画像Ａと画像Ｂの重ね合わせ像。棒の長さは、１０μｍである。
【図８】Ｔ８４細胞単層におけるαｆ９ｄ抗体染色の分布に対する、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対するアンチセンスおよびナンセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。Ｔ８４細胞単層の、免疫蛍光共焦点顕微鏡法による画像である。どちらの画像も垂直面のものである。どちらの単層も、αｆ９ｄ（Ｔｍ３、５ａ、５ｂ、６）で染色している。（Ａ）２μＭのナンセンスオリゴヌクレオチドで２４時間；（Ｂ）２μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで２４時間。バーの長さは、１０μｍである。（ＣおよびＤ）Ｔ８４細胞に対する、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対するアンチセンスおよびナンセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すウェスタンブロットである。Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対する、２μＭのアンチセンスおよびナンセンスオリゴヌクレオチドで２４時間処理した後、Ｔ８４細胞単層からタンパク質を抽出した。（Ｃ）総タンパク質を示す、クーマシーブルーで染色したゲルである。（Ｄ）αｆ９ｄ抗体（Ｔｍ３、５ａ、５ｂ、６）でイムノブロットしたウェスタンブロットである。（Ｅ）Ｔ８４細胞単層におけるαｆ９ｄ抗体による頂端での染色の強度に対する、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対するアンチセンスおよびナンセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。共焦点顕微鏡により、２μＭのアンチセンスまたはナンセンスオリゴヌクレオチドで２４時間処理したＴ８４細胞単層における、頂端でのαｆ９ｄ抗体染色の画素強度を決定した。各群について平均±１ＳＤを示す。（ナンセンス１５０．８６±４８．２８、アンチセンス５３．６２±３１．６２；ｐ＜０．００１）
【図９】Ｔ８４細胞単層におけるＣＦＴＲの細胞表面発現および塩素イオン流出に対する、Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対するアンチセンスおよびナンセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。（Ａ）２μＭのアンチセンスまたはナンセンスオリゴヌクレオチドで２４時間処理したＴ８４細胞単層に対して、酵素結合ＣＦＴＲ表面発現アッセイを行った。ＣＦＴＲ発現は、個々の実験内で、ナンセンス処理群の平均吸光度に対して標準化した、６５５ｎｍでの吸光度で表す。各群について平均±１ＳＤを示す。（ナンセンス１±０．４２、アンチセンス１．４９±０．７８；ｐ＜０．００１）。（Ｂ）Ｔｍ５ａおよびＴｍ５ｂに対する２μＭのアンチセンスまたはナンセンスオリゴヌクレオチドで処理した対照Ｔ８４細胞単層に対して、ＭＱＡＥ塩素イオン流出アッセイを行った。１５分での累積塩素イオン流出は、個々の実験内でナンセンス群の平均パーセンテージ増加に対して標準化した、基線からの蛍光の平均パーセンテージ増加で表す。各群について平均±１ＳＤを示す。（ナンセンス１±０．３６、アンチセンス１．４７±０．４１；ｐ＜０．００１）
【図１０】Ｔ８４細胞単層におけるＣＦＴＲの細胞表面発現および塩素イオン流出に対するノコダゾール処理の効果を示す図である。３３μＭのノコダゾールで３時間処理したもの、および処理しないものである、フォルスコリン刺激Ｔ８４細胞単層に対して、酵素結合ＣＦＴＲ表面発現アッセイを行った。ＣＦＴＲ発現は、個々の実験内で、対照群の平均吸光度に対して標準化した、６５５ｎｍでの吸光度で表す。各群について平均±ＳＤを示す。（対照１．００±０．２９、ノコダゾール０．９２±０．２５；ｐ＝０．６４）。（Ｂ）対照Ｔ８４細胞単層および３３μＭのノコダゾールで３時間処理したＴ８４細胞単層に対して、ＭＱＡＥ塩素イオン流出アッセイを行った。１５分での累積塩素イオン流出は、個々の実験内で、対照群の平均パーセンテージ増加に対して標準化した、基線からの蛍光の平均パーセンテージ増加で表す。各群について平均±ＳＤを示す。（対照１．００±０．２２、ノコダゾール１．０１±０．４３；ｐ＝０．９３）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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