(57)【要約】グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合性が低下しているＣＣケモカイン変異体は、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患に有効である。特に好ましくは、ＧＡＧ結合性が低下しているＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ変異体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性及び／又は自己免疫性線維化肝疾患の治療のための、ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体の使用であって、前記ＣＣケモカインが、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである使用。
【請求項２】
前記ＣＣケモカインがＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳであり、前記変異体が三重４０’ｓ  ＲＡＮＴＥＳ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＣＣケモカインがＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αであり、前記変異体が三重ＭＩＰ−１α変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ＣＣケモカインがＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βであり、前記変異体が三重ＭＩＰ−１β変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ＣＣケモカイン変異体が、保存的な形で１個又は複数個のアミノ酸を付加した、欠失させた、又は置き換えた、前記ＣＣケモカイン変異体の活性型異型である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＣＣケモカイン変異体が、前記対応するＣＣケモカイン以外のタンパクの配列に属するアミノ酸配列をさらに含むポリペプチド中に含まれる、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＣＣケモカイン変異体が、活性型前駆体、塩、誘導体、結合体又は複合体の形で存在する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患用薬剤組成物の調製における、ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体の使用であって、前記ＣＣケモカインが、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである使用。
【請求項９】
前記肝疾患が、アルコール性肝疾患、ウイルス性肝炎、又は自己免疫性肝炎である、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患を治療又は予防する方法であって、ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体を有効量投与するステップを含み、前記ＣＣケモカインが、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体の新しい治療適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインとは、分泌性後炎症性の小さなタンパク（７０〜１３０アミノ酸）であり、主に細胞の指向性遊走及び活性化、特に、血液から、白血球の動員を必要とする組織へと局在するまでの白血球の血管外遊走に関与している（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、１９９７；Ｒｏｓｓｉ  Ｄ及びＺｌｏｔｎｉｋ  Ａ、２０００；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＥＪ及びＬｏｌｉｓ  Ｅ、２００２）。通常、ケモカインは、損傷部位、炎症部位又は他の組織変化部位で、パラクライン型又はオートクライン型で産生され、細胞型特異的な遊走及び活性化を引き起こす。
【０００３】
配列中に保存されているシステインの数及び位置に応じて、ケモカインは、Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ及びＣＸ３Ｃケモカインに分類されている。これらの各ファミリー内で、ケモカインは、配列全体の、又は特定のセグメントの相同性によってさらにグループ分けすることができる。
【０００４】
一連の７回膜貫通型（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）のＧタンパク共役型膜受容体は、ケモカインが標的細胞に対してその生物学的活性を発揮することを可能にする結合相手であり、この標的細胞は、その状態及び／又は型に従って、特異的な組合せの受容体を提示している。当初は発見した科学者によって非常にばらばらに名付けられていた、ケモカインリガンド及び受容体に関して、ＣＣケモカインにはＣＣＬ１、ＣＣＬ２など、ＣＣケモカイン受容体にはＣＣＲ１、ＣＣＲ２など、各分子を連続番号を含む体系的な名称と関連付ける統一された用語が提案されている。
【０００５】
ケモカインの生理的作用は、同時発生する相互作用の複雑な集積システムから生じる。単一の受容体が様々なケモカインと結合することができ、また単一のケモカインが様々な受容体と結合することができるように、受容体には重複したリガンド特異性があることが多い。特に、ケモカインのＮ末端ドメインは受容体結合に関与しており、Ｎ末端のプロセシングにより、ケモカインを活性化することもでき、ケモカインを完全に不活性にすることもできる。
【０００６】
今までに特徴付けられてきたすべてのケモカインの中で、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても知られている、Ａｐｐａｙ  Ｖ及びＲｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ  ＳＬ、２００１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１αとしても知られている、米国特許第６３５５４７６号）などのＣＣケモカインが、治療に有用な分子を同定するために集中的に研究されている。Ｎ末端側の最大９アミノ酸が欠失したＣＣケモカイン異型に、天然に存在する型の阻害剤又はアンタゴニストとしての活性があるかどうかが調べられている。この分子は、単球に対して不活性であり、受容体アンタゴニストとして有用である（Ｇｏｎｇ  ＪＨら、１９９６；ＷＯ  ９９／１６８７７）。或いは、成熟型ＣＣケモカインのＮ末端側にメチオニンを１個付けると、ほとんど完全にこの分子が不活性化され、これも本物に対するアンタゴニストとして作用する（ＷＯ  ９６／１７９３５）。
【０００７】
さらに、ＣＣケモカインの構造と機能について分析するために、内部の様々な位置での置き換え又は化学修飾を含む異型、並びにＣＣケモカインから誘導されるペプチドが、受容体又は他の分子と相互作用するかどうかが調べられている。結合特性が意味のあるように変化したこの異型がいくつか開示され、時にはそれが、ＣＣケモカインアンタゴニストとして活性があり、ＨＩＶ感染及びある種の炎症性又はアレルギー性疾患の治療において、治療に適用できる潜在的可能性を有している（ＷＯ９９／３３９８９；Ｎａｒｄｅｓｅ  Ｖら、２００１）。特に、特異的な位置にある塩基性残基を用いて、結合決定基及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とケモカインの相互作用の生理的重要性が集中的に研究されている（ＷＯ  ０２／２８４１９；Ｖｉｖｅｓ  Ｒら、２００２；ＭｃＣｏｒｎａｃｋ  ＭＡら、２００３；Ｓｔｒｉｎｇｅｒ  ＳＥら、２００２；Ｆｕｋｕｉ  Ｓら、２００２；Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ＪＳら、２００１；Ｍａｒｔｉｎ  Ｌら、２００１；Ｋｏｏｐｍａｎｎ  Ｗ及びＫｒａｎｇｅｌ  ＭＳ、１９９７）。
【０００８】
ケモカインを治療用作用因子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）として使用する際に、たとえ潜在的欠点（凝集する傾向、無差別な結合）が存在しても、炎症性及び自己免疫性疾患、癌、並びに細菌又はウイルス感染に関係する様々な適応症に関して、細胞の、特に白血球の過度の動員及び活性化を妨げる目的で、特異的なケモカイン及びその受容体を特に阻害する／アンタゴナイズすることにより、この分子は、このようなプロセスに関係する病的状態における治療処置の可能性を提供する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＧＰら、２００１、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍ、２００１；Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ  Ｎ及びＫｕｎｋｅｌ  ＳＬ、２００１）。
【０００９】
最近総説されているように（Ａｊｕｅｂｏｒ  ＭＮら、２００２；Ｍａｒｒａ  Ｆ、２００２、Ｃｏｌｌｅｔｔｉ  ＬＭ、１９９９）、肝疾患に対するケモカイン関連化合物の可能な治療適用が集中的に研究されている。具体的には、肝特異的炎症は、活性化ＣＤ４（＋）Ｔ細胞によって媒介され、肝でのＩＦＮγ発現の亢進によってさらに進行するが、Ｔ細胞が媒介する肝疾患の際に肝へのＴ細胞の動員を促進する内因性の媒介物の特徴付けが不十分であるために、Ｔ細胞が媒介する肝炎の際に血液から組織へのＴ細胞の遊走を支配する機構についての理解は不十分なままである。
【００１０】
（アセトアミノフェン誘発、コンカナバリンＡ誘発、アデノウイルス誘発、又はＢ型肝炎ウイルス特異的）肝炎関連動物モデルで、いくつかのケモカインが高度に発現し、肝浸潤リンパ球の動員に重要であることが実証され、肝炎の発症にこれらの分子が特定の役割を果たすことが示唆されている（Ｂａｕｔｉｓｔａ  ＡＰ、２００２；Ｌａｌｏｒ  ＰＦら、２００２；Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭら、２０００；Ｋｕｓａｎｏ  Ｆら、２０００）。
【００１１】
肝疾患に関して、いくつかの広域ＣＣケモカインアンタゴニストが開示された（ＷＯ  ００／７３３２７；ＷＯ  ０１／５８９１６；米国特許第６４９５５１５号）。ＣＸＣケモカインは、損傷後の急速な肝細胞増殖及び肝再生を誘導することができる（ＷＯ  ０１／１０８９９）。ＣＣＲ１又はＭＩＰ−１αのアンタゴニストは、移植関連又は虚血／再灌流関連の肝機能障害を抑制するのに使用することができる（ＷＯ  ００／４４３６５；Ｍｕｒａｉ  Ｍら、１９９９）。
【００１２】
しかし、従来技術では、内部残基の置き換えによって生成される特定の単離ＣＣケモカイン変異体の、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患に対するどんな治療効果についての記載も存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
驚くべきことに、特定の内部残基の置き換えから得られた、ＧＡＧ結合性が低下しているＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ変異体が、関係する動物モデルにおいて肝の線維性損傷に拮抗することが発見された。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この事実は、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患の治療に、この変異体、及びＧＡＧ結合活性が同様に低下している（ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βなど）ＣＣケモカインの他の変異体が使用できる可能性があることを実証するものである。特に好ましいＣＣＬ５変異体は、ＣＣＬ５のＧＡＧ結合ドメインに適当に変異を誘発することによって生成される、ＧＡＧ結合性欠損ＣＣＬ５変異体である。
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の主目的は、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患の治療に、ＧＡＧ結合性が低下しているＣＣケモカイン変異体を使用することである。具体的には、このような変異体は、ＣＣケモカインＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳに関して、従来技術ですでに開示されているものである（ＷＯ  ０２／２８４１９；Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ＪＳら、２００１；Ｋｏｏｐｍａｎｎ  Ｗ及びＫｒａｎｇｅｌ  ＭＳ、１９９７）。
【００１７】
具体的には、ＣＣケモカイン変異体は、三重（ｔｒｉｐｌｅ）４０’ｓ  ＲＡＮＴＥＳ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、三重ＭＩＰ−１α変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、及び三重４０’ｓ  ＭＩＰ−１β変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）という名称で、従来技術で開示されている変異体の配列を有する。しかし、従来技術で開示されたものと同じ残基の、しかし異なるアミノ酸での置き換えから得られる（すなわち、塩基性残基がＡｌａ以外の非極性アミノ酸又は酸性残基で置き換えられる）、又は他の（複数の）位置での置き換えから得られる、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの対応する他のどんなＧＡＧ結合性低下変異体も、本発明によって使用することができることは明らかである。
【００１８】
化学合成、部位特異的変異誘発技術、又は他の適切な既知の技術によってこのポリペプチドを調製することができ、これらの技術によって、有限な数の組の十分に対応する変異ペプチド、短縮ペプチド又はポリペプチドが提供され、これらのペプチドは通常、当業者なら従来技術及び本特許出願の実施例で提示されている教示を用いて得ることができ試験することができる。ＧＡＧ存在下又は不在下で、同様の化合物もコードＤＮＡの変異誘発の従来技術、（ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイ／選択など）コードＤＮＡ配列レベルでの組合せ技術、又はケモカインの三次元構造及び他の機能アッセイに基づく、コンピュータ支援の設計研究から得ることができる（Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋ、２００２；Ｖｉｖｅｓ  Ｒら、２００２；ＭｃＣｏｒｎａｃｋ  ＭＡら、２００３；Ｓｔｒｉｎｇｅｒ  ＳＥら、２００３；Ｆｕｋｕｉ  Ｓら、２００２；Ｍａｒｔｉｎ  Ｌら、２００１）。
【００１９】
ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体における上記で引用した従来技術では、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患が、この分子が有益な効果をもたらすことができる治療適応症であると認識されていない。現在、アルコール性肝疾患、ウイルス性又は自己免疫性肝炎などの疾患の治療には部分的に有効である及び／又は許容される療法しか存在しないので、開示されたＣＣケモカイン変異体は、おそらく現在の療法より許容されかつ効率のよい、代替の治療用化合物となる。
【００２０】
「ＧＡＧ結合活性低下」又は「ＧＡＧ結合性欠損」という表現は、ＣＣケモカイン変異体のＧＡＧとの結合能が低い、すなわち、このような変異体を開示している上記で引用した従来技術におけるアッセイで測定したとき、対応する野生型分子に対して各変異体が（硫酸ヘパリンのような）ＧＡＧと結合する割合が低いことを意味する。
【００２１】
ＧＡＧに対する親和性低下が生じる特定の位置での変異に加えて、ＣＣケモカイン変異体には、保存的な形で１個又は複数個のアミノ酸を付加した、欠失させた、又は置き換えた、前記ＣＣケモカイン変異体の活性型異型をもたらす野生型分子に対する他の改変も含まれ得る。この追加の改変は、特定の変異体の特性を維持し、又はさらに向上させ、或いは、当技術分野で知られている他の任意の該当する手段により、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患の治療にも同様に有用なものにするものである。この活性型異型における他の好ましい追加の変化は、「保存的」又は「安全な」置き換えとして通常知られるものであり、これは、ＣＣケモカイン変異体の構造及び生物学的機能を維持するために、化学的特性が十分に類似しているアミノ酸で置き換えることである。特に挿入又は欠失に少数のアミノ酸、例えば１０個より少ない、好ましくは３個より少ないアミノ酸しか関係せず、タンパク又はペプチドの機能的構造にとって決定的に重要なアミノ酸が除去されない又は置き換えられない場合、上記で定義した配列中でその機能を変えずにアミノ酸の挿入及び欠失を行うことができることは明らかである。
【００２２】
天然タンパクの配列及び／又は構造についての統計的及び物理化学的研究に基づいて、保存的なアミノ酸の置き換えを選択することができる多数のモデルが文献で提供されている（Ｒｏｇｏｖ  ＳＩ及びＮｅｋｒａｓｏｖ  ＡＮ、２００１）。タンパク設計の実験から、特定のアミノ酸サブセットの使用により、タンパク構造中により容易に収まることができ、機能及び構造上のホモログ及びパラログを検出するのに使用することができ、アミノ酸の「同義的な」置き換えを分類する助けとなる、折り畳み可能な活性型タンパクを生成することができることが判明している（Ｍｕｒｐｈｙ  ＬＲら、２０００）。同義的なアミノ酸グループ及びより好ましい同義的グループは、表１中で定義したものである。
【００２３】
或いは、活性型ＣＣケモカイン変異体は、天然のアミノ酸と「同義的」である１つ又は複数の非天然アミノ酸誘導体を含むこともでき、これは表２中に定義されている。「アミノ酸誘導体」は、遺伝子にコードされている天然に存在する２０種のアミノ酸以外のアミノ酸又はアミノ酸様化学物質とする。具体的には、アミノ酸誘導体は、直鎖状、分枝状、又は環状の置換又は非置換アルキル部分を含んでもよく、１つ又は複数のヘテロ原子を含んでもよい。アミノ酸誘導体は、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）に作成することもでき、商業的供給源から得ることもできる（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＡＧ、スイス；Ｂａｃｈｅｍ、米国）。タンパクの構造及び機能を調べるかつ／又は向上させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの翻訳システムをどちらも使用する、非天然アミノ酸誘導体をタンパクに組み込むための様々な方法が文献中に開示されている（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ＤＡ、２０００）。
【００２４】
「活性型」という用語は、このような代替化合物が、本発明に記載の、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患に対するＣＣケモカイン変異体の治療上の特性を維持しているはずであり、その上薬剤として許容されかつ有用であるはずであることを意味する。
【００２５】
他の実施形態では、ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体及び対応するＣＣケモカイン以外のタンパクの配列に属するアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用して、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患を治療することもできる。この非相同配列は、治療上の活性をほとんど損なわずに、さらなる特徴をもたらすものとする。このようなさらなる特徴の例には、精製手順がより容易となること、体液中での半減期がより長くなること、結合部分が追加されること、内部タンパク分解（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）消化によって成熟すること、又は細胞外に局在することがある。この最後の特徴によって、ＣＣケモカイン変異体が、このポリペプチドの単離及び精製が容易である場所であるだけでなくＣＣケモカインが受容体又は他の分子と本来相互作用する場所でもある空間中に局在することが可能となるため、この特徴は、上記の定義中に含まれる特定グループの融合タンパク又はキメラタンパクを定義するのに特に重要である。融合タンパクの部分、リガンド、及びリンカーの設計、並びにその構築、精製、検出及び使用の方法は、文献中で広範に論じられている（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊら、１９９７；「キメラ遺伝子及びハイブリッドタンパクの適用」（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６−３２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；ＷＯ  ０１／７７１３７）。
【００２６】
追加のタンパクの配列は、膜結合タンパクの細胞外ドメイン、イムノグロブリン定常領域、多量体化ドメイン、細胞外タンパク、シグナルペプチド含有タンパク、細胞外輸送シグナル含有タンパクの中から選択することができる。ＣＣケモカイン変異体と融合すべきこれらの配列を１つ又は複数選択するのが、所望の使用、送達及び／又は調製法にとって効果的である。
【００２７】
ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体は、炎症性及び／又は自己免疫性の線維化肝疾患の治療に、その対応する活性型の前駆体、塩、誘導体、結合体又は複合体の形で提供することもできる。この代替形態は、所望の送達及び／又は生成方法に従って選択することができる。
【００２８】
「前駆体」とは、細胞に又は生物に投与する前後に、代謝及び酵素によるプロセシングによって他の化合物に転換することができる化合物である。
【００２９】
本明細書において「塩」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はそのアナログのカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当技術分野で既知の手段によって形成することができ、これには、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄又は亜鉛の塩などの無機塩、例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成されるような、有機塩基を含む塩がある。例えば、酸付加塩には、例えば塩酸や硫酸などの鉱酸を含む塩、例えば酢酸やシュウ酸などの有機酸を含む塩がある。このような塩はいずれも、元のポリペプチドと相当類似した活性を有しているべきである。
【００３０】
本明細書において「画分」という用語は、アミノ酸部分の側鎖上に、或いはＮ末端基又はＣ末端基上に提示されている官能基から、既知の方法によって調製することができる誘導体を指す。このような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド、並びに遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又は遊離水酸基のＯ−アシル誘導体があり、これは、例えばアルカノイル基やアロイル基のようなアシル基を用いて形成される。或いは、この誘導体は、アミノ酸部分の側鎖上に提示されている官能基に連結された糖又はリン酸基を含むこともできる。このような分子は、最初の配列を通常変えないｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法、例えばペプチドの化学的誘導体化（アセチル化又はカルボキシル化）、リン酸化（リン酸化チロシン、リン酸化セリン、又はリン酸化スレオニン残基の導入）、又は糖鎖付加（糖鎖付加に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物の糖鎖付加酵素や糖鎖除去酵素にペプチドをさらすことによる）から得ることができる。
【００３１】
本発明において「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖上に、或いはＮ末端基又はＣ末端基上に提示されている官能基から、既知の方法によって調製することができる誘導体を指す。このような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド、並びに遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又は遊離水酸基のＯ−アシル誘導体があり、これは、例えばアルカノイル基やアロイル基のようなアシル基を用いて形成される。
【００３２】
或いは、ポリエチレングリコール、他の天然又は合成ポリマーなどの、他のタンパクとの相互作用の検出能（放射性同位体又は蛍光色素による標識、ビオチン）、治療上の効率（細胞障害性作用因子、放射性同位体）、又は薬剤送達の効率を高めるための、本技術分野で既知の分子及び方法を使用することにより、ＣＣケモカイン変異体の有用な結合体又は複合体を生成することもできる（Ｐｉｌｌａｉ  Ｏ及びＰａｎｃｈａｇｎｕｌａ  Ｒ、２００１）。後者の場合、天然の配列中に存在する、又は天然の配列に変異を誘発することで導入される適当な残基の部位特異的改変を、内部又は末端の位置に導入することができる。同様の改変は、ケモカインに関してすでに開示されている（ＷＯ  ０２／０４４９９；ＷＯ  ０２／０４０１５；Ｖｉｔａ  Ｃら、２００２）。
【００３３】
残基が、ポリマーが付着可能な側鎖（すなわち官能基を含むアミノ酸側鎖、例えばリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンなど）を有するという条件で、どんな残基も付着に使用することができる。或いは、ポリマーが付着可能な側鎖を有する異なったアミノ酸で、これらの部位の残基を置き換えることもできる。この目的に適するポリマーは、生体適合性がある、すなわち生物系に毒性がないものであり、このようなポリマーは多数知られている。このようなポリマーは、事実上疎水性でも親水性でもよく、生分解性、非生分解性、或いはその組合せでもよい。このポリマーには、天然ポリマー（コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸など）、並びに合成ポリマー（ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物など）がある。疎水性非分解性ポリマーの例としては、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、及びポリメチルメタアクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｅｒｙｌａｔｅｓ）がある。親水性非分解性ポリマーの例としては、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、及びそのコポリマーがある。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、連続した反復単位としてエチレンオキシドを含むものである。
【００３４】
好ましい付着方法は、ペプチド合成と化学的連結の組合せを使用する。有利には、特にタンパクのＮ末端側の領域で、生分解性リンカーによって水溶性ポリマーを付着させる。このような修飾は、リンカーの分解後、ポリマー修飾のないタンパクが放出される「プロドラッグ」の形でタンパクを提供するように働く。
【００３５】
ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体は、真核細胞（例えば酵母、昆虫又は哺乳動物細胞）又は原核細胞中での発現を使用する組換えＤＮＡ関連技術など、当技術分野における任意の適当な手順で調製することができる。ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体を生成する詳細な方法は、それを初めに開示した従来技術（ＷＯ  ０２／２８４１９；Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ＪＳら、２００１；Ｋｏｏｐｍａｎｎ  Ｗ及びＫｒａｎｇｅｌ  ＭＳ、１９９７）中、並びにケモカイン生成のプロトコルを掲載している他の文献（Ｅｄｇｅｒｔｏｎ  ＭＤら、２０００）、又はＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓから刊行されている「実践的手法（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」シリーズ中の何冊か（「ＤＮＡクローニング２：発現システム（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、１９９５；「ＤＮＡクローニング４：哺乳動物のシステム（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４：  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、１９９６；「タンパク発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、１９９９；「タンパク精製技術（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、２００１）など、宿主の原核細胞又は真核細胞中での組換えタンパク産生のための一般の分子生物学技術中に認めることができる。
【００３６】
或いは、ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体は、当技術分野で周知の他のどんな手順で調製することもでき、特に、長さが短いこの分子に効率よく適用することができる、十分に確立されている化学合成手順で調製することもできる。追加の化学基を含む完全合成ケモカインは、文献中に開示されている（Ｂｒｏｗｎ  Ａら、１９９６；Ｖｉｔａ  Ｃら、２００２）。
【００３７】
化学合成技術の例は、固相合成及び液相合成である。固相合成のように、例えば、合成すべきペプチドのＮ末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒に不溶性の支持体に結合させ、アミノ基を含むアミノ酸、及び適当な保護基で保護されている側鎖官能基をＣ末端からＮ末端へと１つづつ縮合する反応と、樹脂又はペプチドのアミノ基の保護基と結合したアミノ酸を解放する反応を交互に反復することによって、ペプチド鎖をこのように伸長させる。固相合成法は、使用する保護基のタイプに応じて、主としてｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に分類されている。一般に使用される保護基には、アミノ基用としては、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）及びＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基用としては、ＮＯ２（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；水酸基用としては、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）がある。合成後、所望のペプチドに脱保護反応を施し、固相支持体から切り出す。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを用いて実施することができる。最後に、未加工の完全長ペプチドを精製し、化学的に又は酵素を用いて（システインとシステインの間のジスルフィド架橋形成を含めて）折り畳んで、対応するＣＣケモカイン変異体とする。
【００３８】
天然、合成又は組換えタンパクの精製は、この目的で知られているどんな方法の１つによっても、すなわち、抽出、沈降、クロマトグラフィー、電気泳動などを使用する従来のどんな手順によっても実施することができる。好みでタンパクの精製に使用することができる追加の精製手順は、標的タンパクと高い効率で結合することができ、カラム内に含まれるゲルマトリックス上に固定化することができるモノクローナル抗体、ヘパリン、又は他の任意の適切なリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーである。タンパクを含む不純な調製物を、カラム中を通過させる。タンパクはこのリガンドによってカラムと結合するが、不純物は通過する。洗浄後、ｐＨ又はイオン強度の変化によって、ゲルからタンパクを溶出させる。或いは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用することもできる。
【００３９】
本発明の他の目的は、特に製剤上許容される担体、賦形剤、安定化剤、アジュバント、又は希釈剤と組み合わせて配合するとき、炎症性及び／又は線維化肝疾患用薬剤組成物の調製に、ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体を使用することであり、ここでＣＣケモカインは、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである。
【００４０】
ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体を使用することができる、肝障害に関係する疾患を非限定的に列挙すると、アルコール性肝疾患（肝硬変、脂肪肝）、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、又は他の任意の線維化変性肝疾患がある。
【００４１】
本発明の他の目的は、ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体を有効量投与するステップを含む、炎症性及び／又は線維化肝疾患を治療する又は予防する方法であり、ここでＣＣケモカインは、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、又はＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである。
【００４２】
ＣＣケモカイン変異体は、単独で使用することもでき、炎症性及び／又は線維化肝疾患の治療において、この変異体と相乗的に又は協調して／連続的に作用する他の治療用組成物とともに使用することもできる。例えば、ＣＣケモカイン変異体の同様な相乗性がシクロスポリンとの組合せで実証されている（ＷＯ  ００／１６７９６）。
【００４３】
特許請求の範囲の使用及び治療方法に鑑みて、ＧＡＧ結合性欠損ＣＣケモカイン変異体の標的送達を可能にするどんな薬剤送達法も好ましい。同様の方法は、従来から知られており、ＣＣケモカイン変異体のガラクトシル化又はマンノシル化アルブミンとの結合（Ｃｈｕａｎｇ  ＶＴら、２００２）、又はラクトビオン酸、ジアミン終結型ポリエチレングリコール及びコール酸からなる糖含有結合体からのポリマーナノ粒子の合成（Ｋｉｍ  ＩＳ及びＫｉｍ  ＳＨ、２００２）を使用することができる。
【００４４】
「有効量」とは、疾患の経過及び重症度に影響を与えて、肝病変の軽減又は寛解をもたらすのに十分な有効成分の量を指す。有効量は、投与経路及び患者の状態によって変わる。
【００４５】
肝疾患を治療するための投与形態の必要に応える、どんな許容される方法によって、薬剤組成物を配合することもできる。例えば、薬剤送達用の生体材料及び他のポリマーの使用、同様に特定の投与形態の妥当性を立証する様々な技術及びモデルが、文献中に開示されている（Ｌｕｏ  Ｂ及びＰｒｅｓｔｗｉｃｈ  ＧＤ、２００１；Ｃｌｅｌａｎｄ  ＪＬら、２００１）。
【００４６】
「製剤上許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げず、投与された宿主に毒性を示さないどんな担体をも含むことを意味する。担体は、デンプン、セルロース、滑石、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉（ｃｈａｌｋ）、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、ドライスキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、並びに石油、動物、野菜又は合成物由来のもの（ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油）を含めた種々の油から選択することもできる。例えば、非経口投与では、上記の有効成分を、生理食塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミン、リンガー液などの賦形剤中で注射単位剤形に配合することができる。
【００４７】
製剤上許容される担体に加えて、本発明の組成物はまた、安定化剤、賦形剤、緩衝液、保存剤など、有効成分を処理して薬剤として使用することができる調製物とするのを容易にすることができる少量の添加剤を含むこともできる。さらに、この組成物は、ＣＣケモカイン変異体と相乗的に又は協調して作用することができる他の有効成分を含むことができる。
【００４８】
このような有効成分の投与は、静脈内経路によるものでもよく、筋肉内、或いは皮下経路によるものでもよい。肝においてそれぞれの成分の所望の効果を確立することができる他の投与経路は、本発明に含まれる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、頬部（ｂｕｃｃａｌ）経路など、様々な非経口経路によるものでよい。本発明の薬剤組成物はまた、蓄積注射、浸透圧ポンプなどを含めた、所定のレートでのポリペプチド投与の持続のための持続放出又は制御放出型剤形で、好ましくは正確な投与量での単回投与に適した単位剤形で投与することもできる。
【００４９】
非経口投与は、ボーラス注射によって行うこともでき、長期にわたる漸増的灌流によって行うこともできる。非経口投与用調製物には、水性又は非水性の滅菌液剤、懸濁剤、及び乳剤があり、これらは、当技術分野で周知の補助的な作用因子又は賦形剤を含むことができ、通常の方法に従って調製することができる。さらに、適当な油性注射懸濁剤として有効成分の懸濁液を投与することができる。適切な親油性溶媒又は賦形剤には、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又は中性脂肪がある。懸濁液の粘性を増大させる物質を含む水性注射懸濁剤には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランがある。場合によっては、懸濁剤は安定化剤も含む。薬剤組成物は、注射による投与に適した溶液を含み、賦形剤と一緒に、０．０１〜９９．９９％の、好ましくは２０〜７５％の活性型化合物を含む。
【００５０】
有効成分の最適投与量は、投与経路、患者の状態及び特徴（性、年齢、体重、健康、サイズ）、症状の程度、併用療法、治療の頻度、並びに所望の効果に従って、適当に選択することができる。確立された投与量の範囲の調整及び操作は、当業者の能力の範囲内で十分に行うことができる。
【００５１】
通常、有効成分の１日投与量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜１００ｍｇとすることができる。通常、分割投与で又は持続放出型剤形で投与量１日当たり体重１ｋｇ当たり１〜４０ｍｇが、所望の結果を得るのに有効である。２回目又は次回の投与は、個体に投与した最初の又は前回の投与量と同量、それより少ない量又はそれより多い量で行うことができる。
【００５２】
特定の実施形態に関して本発明を説明してきたが、その説明の内容は、特許請求の範囲の趣旨及び目的から逸脱せずに当業者がもたらすことができるすべての変更及び置き換えを含む。
【００５３】
次に以下の実施例を用いて本発明を説明するが、この実施例はどのように本発明を限定するものとも解釈されるべきでない。下記の実施例では、本明細書で説明した図面を参照する。
【実施例１】
【００５４】
肝炎モデルでの、ＧＡＧ結合活性が低下している様々なＣＣＬ５変異体の効力
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発肝損傷は、マクロファージによるＣＤ４（＋）Ｔ細胞の動員の活性化に依存する。一般に、Ｔ細胞は、免疫媒介性の肝疾患の根底にある推進力であり、このことにより、ＣｏｎＡモデルは自己免疫性肝炎、急性肝炎などの疾患の病態生理研究に極めて重要なものとなっている（Ｔａｋｅｄａ  Ｋら、２０００；Ｔｉｅｇｓ  Ｇら、１９９２）。
【００５５】
このアッセイでは、肝細胞に含まれ、この細胞が損傷を受けたとき血清中に放出される肝臓酵素である血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定する。ＡＬＴは、（肝炎の場合と同様に）肝細胞の損傷及び破壊を立証するのにヒト及び動物で最も広く使用されているマーカーであり、一般に、ＡＬＴ濃度は、組織変化と関係がある。
【００５６】
ＧＡＧ結合活性が低下しているＣＣケモカイン変異体の例として、三重４０’ｓ  ＲＡＮＴＥＳ変異体と称されるＣＣＬ５変異体を選択し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、以前に記載した通りに（ＷＯ  ０２／２８４１９）精製した。
【００５７】
特定病原体無感染の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（体重２１〜２３ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆａｒｍｓ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、賦形剤対照、０．１ｍｌ）、又は上記に記載のＣＣＬ５変異体の１つ（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌ中３０μｇ）で処置した。マウス（１群当たり５〜１０匹）に皮下注射してから１時間後、ＣｏｎＡ（新たに調製したＣｏｎＡ  Ｖ型、マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌ中０．２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を静脈内注射した。ＣｏｎＡを投与してから８時間後、ハロタン麻酔下で血液を採集して、ＡＬＴ判定用の市販のキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて血漿ＡＬＴを測定した。
【００５８】
肝損傷の程度を定量化するこの生化学的手法から、三重４０’ｓ  ＲＡＮＴＥＳ変異体が、前処置した動物の血清中のＡＬＴ濃度を統計的に有意に低下させることができることが判明した（図１）。
【実施例２】
【００５９】
コンカナバリンＡマウスモデル中でのＭＩＰ−１α発現の重要性
対照雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αノックアウトＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｏｏｋ  ＤＮら、１９９５）で、ＡＬＴレベルと、肝臓のＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αタンパク濃度の間に何か関係があるかどうかを確認するために、正常マウスに対して時間経過実験を行った。
【００６０】
マウス（体重２１〜２３ｇ、５〜６週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆａｒｍｓから市販されている）に、新たに調製したコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、体重１ｋｇ当たり１３．５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液０．１ｍｌ又はＰＢＳ０．１のみ（賦形剤対照）を静脈内注射した。
【００６１】
血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを市販のキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。ＣｏｎＡを投与してから３０分後、９０分後、８時間後及び２４時間後に、ハロタン麻酔下でマウスから血液を採集した。
【００６２】
別の１組の実験で、ＣｏｎＡを又はＰＢＳのみを注射した対照及びＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αノックアウトマウス中の肝臓ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α又はＩＦＮγレベルを決定した。ＣｏｎＡ又はＰＢＳを注射した後の指示された時点でマウスを屠殺し、血液成分を除去するために氷冷滅菌ＰＢＳで肝臓を灌流した。肝臓を摘出後直ちに、プロテアーゼカクテルインヒビター（Ｓｉｇｍａ）含有氷冷ＰＢＳ緩衝液中で、個々の灌流した肝臓をホモジナイズし、組織ホモジネートを２回遠心分離し、その上清を０．４５ｍｍフィルターでろ過し、タンパク決定に使用するまで−８０℃で貯蔵した。公表されているプロトコル（Ｂｏｎｅ−Ｌａｒｓｏｎ  ＣＬら、２００１）に準拠した特定のネズミＥＬＩＳＡにより、市販の抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて肝臓ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α及びＩＦＮγレベルを測定した。市販のタンパク比色法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ホモジネート中の総タンパク濃度を算出した。
【００６３】
このデータから、ＣｏｎＡの静脈内単回投与（体重１ｋｇ当たり１３．５ｍｇ）の８時間後に、ＡＬＴ濃度を使用することによって評価される最大肝損傷も、肝臓ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αレベルのピークも認められることが示された。この化合物により、対照ＰＢＳ注射の１００倍を超えるＡＬＴレベルの増大（図２Ａ）と、それと並行して５倍を超える肝臓ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αタンパク発現の増大（図２Ｂ）が引き起こされた。
【００６４】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α欠損によりＣｏｎＡ誘発肝損傷の発生が妨げられるかどうかを確認するために、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α遺伝子が欠如しているトランスジェニックマウスでのＣｏｎＡ投与の効果を調べた。実際、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αノックアウトマウスでは、ＣｏｎＡを注射してから８時間後の肝損傷が対照マウスと比べて有意に少ないことが示され、このことは、ＡＬＴレベルが有意に低い（約５倍）によって生化学的に実証された（図３Ａ）。さらに、肝に動員されるＣＤ４（＋）Ｔ細胞によって産生される（Ｍｉｚｕｈａｒａ  Ｈら、１９９６）ため、ＣｏｎＡ誘発性肝炎の病態生理に関係するサイトカインの１つであるＩＦＮγの肝臓での濃度は、ＣｏｎＡを投与してから８時間後のＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αノックアウトマウスでは対照マウスと比べたとき有意に低かった（図３Ｂ）。
【００６５】
データはすべて、平均値±標準偏差で示す。２つの実験群（マウスは１群当たりｎ＝４〜１０）間での平均値の比較に、対応なしのスチューデントｔ検定を使用し、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｓｔａｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．００）  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。
【００６６】
ＣＣＬ５変異体に置き換えてＭＩＰ−αノックアウトマウスで得られたデータの分析から、従来技術で特定の結合プロフィルが特徴付けられている単一のＣＣケモカイン変異体（ＷＯ  ０２／２８４１９；Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ＪＳら、２００１；Ｋｏｏｐｍａｎｎ  Ｗ及びＫｒａｎｇｅｌ  ＭＳ、１９９７）を使用すると、どのようにして驚くべき治療上重要な効果が得られるかが実証され、炎症反応及び／又は自己免疫反応に関係する線維化肝疾患の治療での類似分子の使用が示唆される。このような疾患の他の動物モデル（アセトアミノフェン誘発又はアデノウイルス誘発肝炎）を用いて得られる結果との比較から、この特定のＣＣケモカイン変異体の治療適用可能性についてさらなる確認がもたらされる可能性がある。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
【表２】
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【００６９】
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【００７０】
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【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）投与及び血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）測定に基づいた、肝疾患動物モデルでのＧＡＧ結合性欠損ＣＣＬ５変異体（三重（ｔｒｉｐｌｅ）４０’ｓ  ＲＡＮＴＥＳ変異体）による処置の効果を示す図である。星印は、ＰＢＳ処置対照と比較したとき、測定差が統計上有意である（Ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図２】マウスの血清ＡＬＴ（Ａ）及び肝臓ＭＩＰ−１α（Ｂ）レベルに対するＣｏｎＡ（ＣｏｎＡ）投与効果の時間経過分析を示す図である。
【図３】マウスの血清ＡＬＴ（Ａ）又は肝臓ＩＦＮ−γ（Ｂ）レベルに対しての、対照（ＭＩＰ−１αＷＴ）及びＭＩＰ−１αノックアウト（ＭＩＰ−１αＫＯ）マウスに対するＣｏｎＡ又はＰＢＳによる処置の効果を示す図である。ＰＢＳ又はＣｏｎＡを投与してから８時間後にそのレベルを測定した。星印は、ＰＢＳ処置対照と比較したとき、測定差が統計上有意である（Ｐ＜０．０５）ことを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2006514699.tif 000014
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