(57)【要約】ここに記述されるのは、タンパク質凝集に関与した細胞因子を識別するための組成物およびその方法である。１つのこのような因子は、核酸成分である。別の因子は、細胞の巨大分子共有結合成分である。所定のＮＡおよび共有結合因子の存在は、所定のタンパク質の凝集を促進する。ここで記述される組成物および方法は、タンパク質凝集プロセスに関与するこの因子を識別するために使用される。さらに、プリオンタンパク質を保護する上で医薬剤の効力を評価する方法も、ここに記述される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階：
（ａ）該１種またはそれ以上の核酸が、ヌクレオチド抗体ライブラリーから得られるものである１種またはそれ以上の核酸との該サンプルマトリックスの混合物を形成し；
（ｂ）少なくとも１種の凝集複合体を形成するのに適した条件下で、該段階（ａ）の混合物をインキュベートし、該凝集複合体が、以下の式：
［ＡｘＢｙＣｚ］
（式中、Ａは、タンパク質を表し、そしてｘは、１から無限大までの値を示す整数であり、Ｂは、細胞結合係数であり、該結合係数は、複合体の形成に関与し、そしてｙは、１から無限大までの値を示す整数であり、そしてＣは、核酸抗体の該ライブラリーから選択される核酸であり、そしてｚは、１から無限大までの値を示す整数であり、ＡおよびＢより構成される群の少なくとも１つは、該サンプルマトリックス中に存在し、そして角型括弧内に表される複合体は、Ａ、ＢまたはＣでいずれの次数も意味せず、そしてＡ、ＢおよびＣは、非共有結合を通して凝集複合体を形成する）
によって表され；
（ｃ）該凝集複合体を検出；
することを包含する、個体から得られるサンプルマトリックスからの凝集複合体の存在または不在を識別する方法。
【請求項２】
前記凝集複合体は、該サンプルマトリックスが、プリオンに基づいた疾患に影響を及ぼされた個体から得られる溶解性が減少したことを示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集複合体は、タンパク質分解酵素の存在下で安定性が増大したことを示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質分解酵素が、プロテアーゼＫである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記凝集複合体が、前記サンプルマトリックスから単離されて、単離産物を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記凝集複合体が、成分Ａ、ＢおよびＣに分離される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記成分Ａ、ＢおよびＣを、識別し、そしてプリオンに基づいた疾患によって影響を及ぼされない第二の個体から得られる第二のサンプルマトリックスから誘導される成分と比較する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、天然に生じるＮＡから誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、非天然に生じるＮＡから誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、ＲＱ１１＋１２、ＭＤＶ、ＭＮＶ、ＭＮＶ−ＡＰ１、ＭＮＶＵＰ、ＭＮＶＬＯ  ＲＮＡ、およびそれらの組合わせを包含する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、プリオンに基づいた疾患の症状を示す個体から誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、少なくとも２種の機能性立体配座、第一の活性立体配座、および第二の不活性立体配座を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞結合因子が、リポタンパク質のファミリーから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞結合因子が、フィブロネクチンである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、ヒト組換えプリオンタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記凝集複合体が、以下の式：
［ＡｘＢｙＣｚ］
（式中、Ａは、タンパク質を表し、そしてｘは、１から無限大までの値を示す整数であり、Ｂは、細胞結合係数であり、該結合係数は、巨大分子との非共有相互作用を通して複合体の形成に関与し、そしてｙは、１から無限大までの値を示す整数であり、そしてＣは、核酸抗体のライブラリーから選択される核酸であり、そしてｚは、１から無限大までの値を示す整数であり、ＡおよびＢより構成される群の少なくとも１つは、該サンプルマトリックス中に存在し、そして角型括弧内に表される複合体は、Ａ、ＢまたはＣでいずれの次数も意味せず、そしてＡ、ＢおよびＣは、非共有結合およびハイブリダイゼーションを通して凝集複合体を形成する）
によって表され、凝集複合体に関連した組成物。
【請求項１７】
ＡおよびＢより構成される群の内の少なくとも１つが、凝集複合体が関連する疾患の症状を示す個体のサンプルマトリックスに存在する請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記凝集複合体は、前記サンプルマトリックスが、プリオンに基づいた疾患に影響を及ぼされた個体から得られる溶解性が減少したことを示す請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
Ａが、プリオン−タンパク質である請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、ＲＱ１１＋１２、ＭＤＶ、ＭＮＶ、ＭＮＶ−ＡＰ１、ＭＮＶＵＰ、ＭＮＶＬＯ  ＲＮＡ、およびそれらの組合わせを包含する請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
以下の段階：
（ａ）以下を有する下で、混合物を形成し；
（ｉ）１種またはそれ以上の細胞結合因子；
（ｉｉ）該１種またはそれ以上の核酸抗体が、ヌクレオチド抗体ライブラリーから得られるものである１種またはそれ以上の核酸抗体；
（ｉｉｉ）１種またはそれ以上のプリオンタンパク質；および
（ｉｖ）該医薬剤
（ｂ）該プリオンタンパク質のプロテアーゼ消化に適した条件下で、段階（ａ）の該混合物に、プロテアーゼＫを添加し；
（ｃ）段階（ａ）の該プリオンタンパク質の存在を検出し、それにより該プリオンタンパク質の存在は、プロテアーゼＫによるプロテアーゼ消化に対して該プリオンタンパク質を保護する上で有効である医薬剤を示すことを包含する、プロテアーゼＫ消化に対するプリオンタンパク質を保護する医薬剤の効力を試験する方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、天然に生じるＮＡから誘導される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、非天然に生じるＮＡから誘導される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヌクレオチド抗体ライブラリーは、ＲＱ１１＋１２、ＭＤＶ、ＭＮＶ、ＭＮＶ−ＡＰ１、ＭＮＶＵＰ、ＭＮＶＬＯ  ＲＮＡ、およびそれらの組合わせを包含する請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞結合因子が、リポタンパク質のファミリーから選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞結合因子が、フィブロネクチンである請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記プリオンタンパク質が、ヒト組換えプリオンタンパク質である請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬剤が、クロロプロマジンである請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）ＮＡ抗体；
（ｂ）ＣＢＦ；および
（ｃ）タンパク質
を包含する、試験剤がタンパク質凝集を示す可能性があるかどうかを測定するキット。
【請求項３０】
前記ＮＡ抗体が、配列番号：１−６より構成される群から選択されるヌクレオチド配列である請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
該ＣＢＦが、フィブロネクチンである請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
該タンパク質が、プリオンタンパク質である請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
さらに、プロテアーゼＫを包含する請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質と相互作用するために使用される組成物および方法に関する。特に、本発明は、タンパク質の誤った折り畳みに関与した細胞因子を識別するために使用される組成物および方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
基本的に、生物に見られる２つの型の核酸がある。一方は、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）であり、そして他方は、リボ核酸（「ＲＮＡ」）である。正常な生理学的条件下では、これらの核酸分子の両方が、タンパク質と関連し、そして核タンパク複合体を形成する。これらのタンパク質は、スカフォールドタンパク質、酵素、リガーゼ、テロメラーゼなどを含みうる。これらの核酸結合タンパク質は、正常な代謝および細胞／組織生存性のために必要な機能を発揮する。
【０００３】
ＲＮＡ結合タンパク質（「ＲＮＰ」）の重要な一部は、遺伝子発現の後転写制御を達成させる。異種核ＲＮＡ（「ｈｎＲＮＡ」）は、タンパク質コード化遺伝子の主要転写物である。これらの転写物（ｈｎＲＮＡ）は、真核細胞の核中でプロセシングにかけられ、そしてこのようなｈｎＲＮＡの少なくとも一部は、伝令ＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）になる。その時点から、ｈｎＲＮＡは、転写複合体から発生し、そしてそれらが核中にある時点を通して、ｈｎＲＮＡタンパク質と名づけられたタンパク質と関連する。このファミリーのタンパク質のメンバーは、前ｍＲＮＡプロセシングおよびｍＲＮＡ局在化、翻訳および安定性を含めたｍＲＮＡ代謝の間、多段階について要求される。ＲＮＡに関連したタンパク質の大半は、ｈｎＲＮＰおよびｍＲＮＡ複合体中のｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡと関連するように見える。
【０００４】
ある種の疾患プロセスは、タンパク質の誤った折り畳みから起こるように見える。この誤った折り畳みは、しばしば、核酸（ＮＡ）および細胞因子に関連する。これらの誤って折り畳まれたタンパク質は、病理学的凝集を形成し続ける可能性がある。これらの凝集は、ヒトにおけるアルツハイマー病およびパーキンソン氏病、動物におけるスクレイピー、狂牛病および慢性消耗のような神経細胞死および脳消耗性疾患に関連することが示された。しばしば、所定の神経細胞死および脳消耗性症候群に関与する海綿状脳障害は、切開により明白になったタンパク質プラークまたは凝集を特徴的に示す。海綿状脳障害で、プリオンタンパク質は、病因因子であると考えられる。プリオン基本疾患は、感染性異型に誤って折り畳ままれた細胞良性プリオンタンパク質である「感染性タンパク質」から生じる。この感染性異型は、病因学的タンパク質凝集に関与する。誤って折り畳まれたタンパク質は、肺、心臓、腎臓、膵臓および他の臓器で細胞に損傷を与えるようにも見える。
【０００５】
凝集を引起す疾患を生じるこれらの誤って折り畳まれたタンパク質は、所定のＲＮＡ分子および他の細胞因子に関連すると思われる。最近、タンパク質の誤った折り畳みに関与したこれらの細胞因子を識別できる組成物および方法についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質凝集を生理学的に促進する細胞因子を識別する組成物および方法に関する。１つのそのような因子は、様々な種のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する核酸（以降「ＮＡ」）成分である。別の因子は、巨大分子の細胞結合因子（以降、ＣＢＦ）である。所定のＮＡおよびＣＢＦの存在は、タンパク質の凝集を促進し、上に明記されるとおり、この凝集プロセスは、病理学的生理学に関連した。本発明は、このプロセスに関与したこのようなＣＢＦを識別する組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、タンパク質凝集に影響を及ぼすそれらの能力における医薬剤の効力を試験する方法に向けられる。さらに、本発明は、タンパク質凝集に推定的に影響を及ぼす医薬剤を試験するために使用されうるキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施態様では、サンプルマトリックス中の１種またはそれより多くのＣＢＦの存在または不在を識別する方法が開示される。この方法は、サンプルマトリックスから適量を取出し、そしてこのサンプルマトリックスに、予定されたＮＡおよび予定された生来のタンパク質を添加することを包含する。その混合物を、添加タンパク質の凝集に対処するのに適した条件下でインキュベートする。好ましくは、凝集複合体は、式［ＡｘＢｙＣｚ］（式中、ｘ、ｙおよびｚは、整数であり、そして各整数は、独立に、１（１）から無限大（∞）までの値を示す）によって示されうるタンパク質成分（「Ａ」）、ＣＢＦ成分（「Ｂ」）、およびＮＡ成分（「Ｃ」）を包含する。その後、タンパク質凝集は、例えば、核−タンパク質複合体の不溶性特性を使用して、または電子顕微鏡法により、あるいは習熟者に周知の他の方法により検出されうる。これらの検出方法から得られた正の結果は、当初のサンプルマトリックス中の１種またはそれより多くのＣＢＦの存在を示す。
【０００８】
別の検出方法は、プロテアーゼＫの存在と上で関連づけられた方法を増大し、そして消化に対するタンパク質耐性を試験することを包含する。ＣＢＦの不在下で、プリオンタンパク質のような所定のタンパク質は、遊離でそして溶解性であり、結果として、タンパク質は、プロテイナーゼＫによって十分に消化される。サンプルマトリックス、ＮＡおよびタンパク質のインキュベーションに続いて、プロテアーゼＫを、混合物に添加する。適切なインキュベーション期間に対処した後、反応産物を、プロテアーゼＫ処理にかける。プロテアーゼＫ処理に続くプリオンタンパク質フラグメントの存在を、例えば、ウエスタンブロット分析と一緒にゲル電気泳動により試験する。プリオンタンパク質が、凝集複合体に結合される場合、それによりプロテアーゼＫによる消化に感受性がなく、したがって、試験により、プリオンタンパク質フラグメントの負の所見があり、それにより当初のサンプルマトリックス中の１種またはそれより多くのＣＢＦの存在を示すにちがいない。
【０００９】
本発明の別の実施態様では、タンパク質凝集を阻害するその能力に関して医薬剤の効力を試験する方法が開示される。プリオンタンパク質によるタンパク質消化に対する感受性は、タンパク質凝集での関与に向かうその傾向を示すために使用されうる。例えば、プロテアーゼＫを使用するタンパク質消化に向かう感受性の欠如は、プリオンタンパク質の立体配座が、タンパク質凝集を促進するようなこのような手段で変化を示すことを示唆する。凝集複合体でのプリオンタンパク質は、タンパク質消化に無反応性である。逆に、プリンタンパク質が、タンパク質消化に影響され易い場合、それにより、それは、遊離であり、そして可溶性でなければならず、したがって、凝集複合体中に関与してはいけない。この理解は、タンパク質凝集を阻害する上で推定の医薬剤の効力を評価するために使用されうるアッセイ系の基礎を提供する。簡潔には、試験剤（並びにＮＡおよびＣＢＦ）の存在下で、プリオンタンパク質は、タンパク質消化に影響され易いことがわかり、それにより、これは、試験剤が、タンパク質凝集のために必要なプリオンタンパク質により、要求される立体配座上の変化を阻害したことを示唆する。
【００１０】
この方法は、１種またはそれ以上のＣＢＦ、１種またはそれより多くのＮＡ抗体、１種またはそれ以上のプリオンタンパク質、および試験の医薬剤の混合物を形成することを包含する。タンパク質消化に適した条件下で、プロテアーゼＫのようなプロテアーゼ酵素を、この混合物に添加する。適切な期間の後、混合反応容器から適量を回収し、そしてすなわち、生来のプリオンタンパク質の状態を試験する。試験により、生来のプリオンタンパク質の消化産物が検出される場合、それにより、これは、医薬上の試験剤が、プリオンタンパク質が凝集複合体を形成するのを防止する上で有効であることを示す有望な結果である。他方では、凝集複合体が形成する場合、それにより、その薬剤は、プリオンタンパク質の濃度でのこのような複合体形成を阻止する上で明らかに有効でない。
【００１１】
本発明は、アッセイキットに関する。このキットは、タンパク質凝集を防止する試験剤の能力を評価するために使用されうる。そのキットは、１種またはそれ以上のＮＡ抗体、１種またはそれ以上のＣＢＦ、および１種またはそれ以上のプリオンタンパク質を包含する。キットは、さらに、プロテアーゼＫを包含する。好ましくは、このキットは、上述の方法に関連して使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、タンパク質凝集に関与する細胞因子を識別する組成物および方法に関する。１つのこのような因子は、核酸（ＮＡ）成分である。別の因子は、細胞結合因子（ＣＢＦ）成分である。プリオンタンパク質のようなタンパク質を含有する混合物中の所定のＮＡおよびＣＢＦの存在は、これらのタンパク質の凝集を促進する。先の研究は、このプロセスに関与する能力のあるＮＡ成分を解明した。本発明は、この凝集プロセスに関与するＣＢＦを識別するために有用な組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、タンパク質凝集形成を防止する上で推定医薬品の効力を評価する方法にも関する。さらに、試験剤、およびタンパク質凝集形成を防止するそれらの能力を試験するのに技能者によって使用されうるキットが、ここに記述される。
【００１３】
ここに記述される本発明は、部分的には、機能性リガンド、および標的分子と相互作用するそれらの能力に関与する。ここに使用される場合、機能性リガンドは、標的分子と結合されるか、または相互作用するときに、標的分子を化学的におよび／または生物学的に修飾する分子である。例えば、標的分子との機能性リガンドの相互作用は、ほかの点ではプロテアーゼ消化に影響され易いその遊離形態と対照的に、結合した標的分子によりタンパク質消化耐性を付与しうる。他の化学的および生物学的特性は、このような相互作用によるのと同様に、修飾されうる。多くのこれらの修飾は、当業界で現存する技術を使用する当業者に周知の方法によって検出されうる。このような機能性リガンドの例は、それに限定されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、およびその組み合わせが挙げられる。
【００１４】
タンパク質モノクローナル、ポリクローナル抗体および核酸分子は、最近、サンプルマトリックス中の標的分子の存在を検出するための選択の機能性リガンドである。
【００１５】
実験室動物で開発された抗体は、免疫原性であり、そしてそれは、それらが、ヒトでの免疫応答を引起すことを意味する。したがって、抗体は、別の非常に洗練され、そして非常に高価な修飾プロセスである「ヒト化」なしに治療剤として使用することができない。望ましくない免疫反応を誘発する能力は、抗体の治療用途を劇的に減じる。したがって、今までのところ開発された数百の内のわずか数個の抗体が、治療目的のために許容されてきた。したがって、抗体技術は、労働集約的で、時間がかかり、そして高価である欠点を有し、そして治療用途について免疫原性応答を克服する必要がある。抗体の別の望ましくない限定は、それらの感受性（サンプル中の少数の分子を識別する能力）そして変動性特異性（良性および病理学的分子の間を区別する能力）に乏しい。多くの制限にもかかわらず、新たな抗体は、一般に、新たな標的分子について開発されようとしている。
【００１６】
核酸プローブは、抗体に多くの点で類似であるが、しかし、それらの用途はまったく異なる。核酸プローブは、ＮＡ標的分子を識別、結合および不活化するように設計される。核酸プローブは、モノクローナル抗体で観察される多くの制限を欠く。ＮＡプローブの主要な制限は、それらが、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の検出のために特異的に設計され、そしてタンパク質および他の非ＮＡ細胞標的を検出するために特別の修飾を必要とすることである。ＮＡのこの限定は、ほとんどのタンパク質が、ＤＮＡまたはＲＮＡ産物より数千倍優勢であるので、非常に重要である。非常に頻繁にタンパク質標的は、ＮＡ分子より利用するのが容易であり、例えば、タンパク質検出は、困難なサンプル作製を必要としない。サンプル作製の間のタンパク質の比較的高い安定性、およびＤＮＡまたはＲＮＡに比べてそれらの潜在的に高い生理学的妥当性は、それらを、検出アッセイの開発で選択の標的にさせた。リボソームまたはミトコンドリアＲＮＡのような、ある種のＮＡは、複数コピーに存在する。しかし、最も重要なクラスの病原体の内の１つであるウイルスは、リボソームまたはミトコンドリアＲＮＡを有しない。さらに、全ての疾患が、病原体生物またはそのＮＡ、例えばトキシン、代謝異常、または毒性気体を必要とするわけではない。ＮＡ標的の不活化についての遺伝子療法手段としてのＮＡの使用は、なお非常に問題があり、さらに、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）によって承認された現在断定された遺伝子療法は１つもない。
【００１７】
本発明は、機能性リガンドとしてＮＡを使用する。特に、これらのＮＡは、それらが、標的分子、通常にはタンパク質と特異的に相互作用するので、抗体様（以降「ＮＡ抗体」）として特徴づけられうる。（ここで記述されるＮＡ抗体は、ニューヨーク州ニューヨークのＱ−ＲＮＡから入手可能である。）ＮＡ抗体は、特定の標的分子と相互作用するために要求されるヌクレオチド配列を包含するＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかでありうる。標的分子は、タンパク質またはタンパク質フラグメントを含みうる。これらのＮＡ抗体は、あらゆる数の標的で指示されうる。例えば、これらは、海綿状脳障害のような神経疾患に関与するプリオンタンパク質に指示されうる。（２００２年５月３０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／１６９２２号を参照、その全体の技術は、参照してここに組み込まれる。）核酸抗体は、習熟した技能者が、当業界で周知の方法により挿入でき、それにより特定の標的について特異的に設計されるキメラＮＡ分子を形成する人工的な合成ヌクレオチド配列を包含しうる。
【００１８】
対応標的の認識でＮＡ抗体によって達成される分子区別の程度は適合し、そしてある種の場合には、伝統的なモノクローナル抗体のものを超える。それらのタンパク質競合相手、例えばモノクローナル抗体を越えるＮＡ抗体の重要な利点は、ＮＡ抗体の組成および構造が、その性能を増強するために非常に容易に修飾されうることである。現時点で、ＮＡ抗体が、医療上の診断、バイオテクノロジーおよび治療学で将来性の広い用途で、新規でそして強力な分子生物学上の道具を表すことが、広く受け入れられている。
【００１９】
新規医薬品の知見、診断用デバイスおよび治療剤の設計に、並びに基礎および応用バイオテクノロジー研究におけるＮＡ抗体の役割は、膨大である。それらの特異的で、そして強固な結合活性を示すＮＡ抗体の特徴的な特性は、種々の実施目的に、並びに生物学上のプロセスのさらなる我々の理解に使用することができる極度に強力な分子生物学的道具を構築する新たな機会を作り出す。
【００２０】
本発明の１つの態様では、ＮＡ抗体は、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡは、普遍な巨大分子での特徴的分子である。それらは、ＤＮＡおよびタンパク質の両方によって保持される特性を合わせる。ＤＮＡのようにＲＮＡは、ＮＡであるが、しかしタンパク質のようにＲＮＡは、「鍵と鍵穴」形態で、他の分子から得られる相補的構造と相互作用し、そして複合体を形成できる多様で安定な二次構造に折り重なりうる。あらゆる既知例外なしに、非ＮＡ標的とのＲＮＡの特異的相互作用が、それらのヌクレオチド組成により、そしてＲＮＡおよび標的分子の両方の結合領域の形状により決定されることが示された。高い親和性ＲＮＡ（０．１−１．０ｎＭの範囲に入るＫｄを示す）は、ウイルスのような、小型有機分子から非常に複雑な多重構造までの化学的組成およびサイズの範囲に入る多数の標的について首尾よく識別された。
【００２１】
核酸は、タンパク質分子に結合する。この結合は、しばしば、ＮＡによって仮定される二次構造によって促進される。例えば、ヌクレオチドのループおよび膨らみは、しばしば、タンパク質結合に関与する。タンパク質凝集は、しばしば、このようなＮＡ相互作用によって促進される。ＲＮＡと相互作用するタンパク質（以降、「ＲＮＰ」と称される）は、一般に、適切なＲＮＡ二次構造を受けるＲＮＡ結合モチーフを有する。適切な条件下では、ＲＮＰは、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列に関することなく、タンパク質によって識別される概略の特性を示すＲＮＡに非特異的に結合できる。核酸の高次構造が、タンパク質に結合識別を提供するものであることが一般に考えられる。例えば、ＲＮＡは、順に、ＲＮＰとの結合のために使用される構造モチーフとして役割を果たしうる二次構造様ループを保有することでよく知られている。（この概念は、特定のタンパク質に結合するＲＮＡ分子の一次ヌクレオチド配列を取り、そしてその構造をノックアウトさせ、そして突然変異ＲＮＡとタンパク質との間の結合親和性を測定するために、ループのような特定の二次構造のヌクレオチド配列を変化させることによって簡潔に分析に従う。）
緊縮インビトロアッセイは、異種の核ＲＮＡ結合タンパク質（ｈｎＲＮＰ）が、特異的ＲＮＡ配列について様々の優位を示すことを照明した。１つの研究は、２Ｍ  ＮａＣｌ条件下で、種々のＲＮＡへの種々のｈｎＲＮＡの結合を試験し、そしてそれらの好ましいＲＮＡについてのｈｎＲＮＰの親和性に至る成果を生じた。これらの研究は、様々のｈｎＲＮＰ、および外見上他のＲＮＰは、様々のＲＮＡの中および間で区別することを示す。区別のこの特性は、種々の群のＲＮＰの単離、精製および分類に利用されうる。
【００２２】
ＲＮＰの分子構築を、ｈｎＲＮＰを使用して詳細に研究した。しかし、ｈｎＲＮＰ系を研究することを通して得られる全般的原理は、他のＲＮＰにも利用可能である。ほとんどのＲＮＰは、１種またはそれより多くのＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、および別のタンパク質との相互作用を指向する特別のドメインを有する基本単位の構造を示す。ＲＮＰ中のＲＢＤの特質は、およそ３０個のアミノ酸の伸縮物により互いから分離された固有の共通配列である。ＲＮＡを結合する上で関与するアミノ酸のほとんどは、∃ひだ付きシートに配置される。ＲＢＤのこれらの特定の構造要素は、ＲＮＡ分子が結合できるプラットフォームとして役割を果たしうる露出表面を供するように見える。結合される場合、ＲＮＡは、露出したままであり（タンパク質のポケット内に埋設されるのとは対照的に）、したがって、他のタンパク質に利用しやすい。多くのＲＮＰは、１種以上のＲＢＤを含み、したがって、複数のＲＮＡ配列に結合するか、または同時に複数のＲＮＡ分子と相互作用できる。
【００２３】
本発明の核酸抗体は、タンパク質凝集に関与する少なくとも１種のタンパク質について親和性を示す１種またはそれ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を包含する。ＮＡ成分は、２０個またはそれ以上のヌクレオチド塩基を有する天然に、または非天然に生じる分子である。１つの実施態様では、このＲＮＡ分子の少なくとも１種のヌクレオチド配列部分は、凝集ＲＮＡ結合タンパク質に存在する少なくとも１種の共通配列に親和性を示す。本発明の「共通配列」は、ヘヤピンループ、膨らみループ、内部ループ、または一本鎖領域のような一本鎖ＲＮＡ二次構造要素を識別するタンパク質中に存在するＲＮＡ結合モチーフと称される。本発明の１つの実施態様では、凝集タンパク質について親和性を示すＲＮＡポリヌクレオチドの一部は、ＲＮＡウイルス、ＲＮＡファージ、伝令ＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）、リボソームＲＮＡ（「ｒＲＮＡ」）、トランスファーＲＮＡ（「ｔＲＮＡ」）、１つまたはそれ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるテンプレートとして受取られる配列、またはその組合わせのいずれかから誘導される配列である。
【００２４】
用語「ウイルス」および「ファージ」は、この開示を通して相互交換可能に、「ウイルスおよびファージ」を意味するために使用される。本発明の１つの態様では、ＲＮＡウイルスは、レトロウイルスである。ＲＮＡウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、水痘ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびその組合わせより構成される群から選択されうる。
【００２５】
本発明のＲＮＡテンプレートは、Ｑ−ベータレプリカーゼ、Ｑ−Ａｍｐ、およびＤＮＡまたはＲＮＡについての核酸レプリカーゼによって与えられ、そして増幅されうるＲＮＡである。（ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６９２２号を参照。）当業者は、本発明のＮＡ抗体を増幅するあらゆるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「ＲＮＡｐｏｌ」）が、本発明の範囲内にあるということを認識する。本発明の１つの実施態様では、ＲＮＡテンプレートは、ＲＱ１１＋１２であり、そしてその配列は、（配列番号：１）である：
【００２６】
【化１】
2006502709.tif 000003
本発明の他のＲＮＡ分子は、それに限定されないが、しかし、ミディ−変異株ＲＮＡ（ＭＤＶ  ＲＮＡ）、ミニ−変異株ＲＮＡ（ＭＮＶ  ＲＮＡ）、ＭＮＶ−ＡＰ１  ＲＮＡ、ＭＮＶＵＰ  ＲＮＡ、ＭＮＶＬＯ  ＲＮＡ、ＲＱ  ＲＮＡ、およびその組合わせが挙げられる。
それらの個別の配列は、
ＭＤＶ  ＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列（配列番号：２）は、
【００２７】
【化２】
2006502709.tif 000004
であり、
ＭＮＶ  ＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列（配列番号：３）は、
【００２８】
【化３】
2006502709.tif 000005
であり、
ＭＮＶ−ＡＰ１  ＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列（配列番号：４）は、
【００２９】
【化４】
2006502709.tif 000006
であり、
ＭＮＶＵＰ  ＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列（配列番号：５）は、
【００３０】
【化５】
2006502709.tif 000007
であり、
ＭＮＶＬＯ  ＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列（配列番号：６）は、
【００３１】
【化６】
2006502709.tif 000008
であるものである。
【００３２】
ＲＮＡ配列は、ＲＮＡ配列をコード化するＤＮＡを使用して得られうる。当業者に周知な方法を使用して、ＤＮＡを、適切なベクター内に挿入し、続いてそのベクターで適切な宿主をトランスフェクトさせうる。その後、転写物を、当業界で一般に知られる方法によって単離しうる。
【００３３】
核酸抗体は、普遍の検査器分子と見なされうる。モノクローナル抗体も、核酸プローブのいずれも、それらの用途で普遍でない。抗体は、通常には、タンパク質を標的にするのに対して、核酸プローブは、核酸標的の検出のために使用される。核酸は、シグナル検出について容易に修飾されるのに対して、モノクローナル抗体は、シグナルを生成するために別の酵素基本の成分を要求する。ＮＡ抗体の普遍の特性は、両方の非核酸分子の検出、並びに核酸標的とのハイブリダイゼーションに対処する。普遍の非ＮＡ標的としては、抗体が、発生するのが実質的に不可能であるタンパク質、毒素、および小型の生物制御因子を含む。
【００３４】
伝統的モノクローナル抗体と対照的に、ＮＡ抗体を、容易に修飾して、標的に対するそれらの結合性を増大し、そしてそれらの特異性を増強できる。現存する免疫診断性または核酸アッセイハードウエアを使用するフォーマットで、指定された標的の検出のために、核酸抗体を使用できる。重要には、それらを、伝統的な抗体と一緒に使用して、現存の免疫診断アッセイの総親和性を劇的に増大させうる。
【００３５】
機能性リガンド様ＮＡ抗体は、非常に特異的な分子治療薬としての能力を示す。溶解性のプロテイナーゼＫ消化可能形態のプリオンタンパク質との、構築されたプリオン特異的ＮＡ抗体の相互作用が、このタンパク質を、非溶解性およびプロテイナーゼＫ耐性にすることが示された。機能性リガンドのこの相互作用は、プリオン疾患に関連した将来の治療目的についての特別の目的を有する機能性リガンドの別の群を表す可能性がある別の代謝産物および細胞成分を識別するために利用されうる。特に、本発明者らは、この機能性相互作用が、少なくとも１種の他の機能性リガンド、主に細胞結合因子（ＣＢＦ）に依存することを示した。（本発明は、１種またはそれ以上のＣＢＦを包含するが、しかし、都合および簡便さに合わせて、特に明記されない限り、単独形態のＣＢＦが、終始使用される。）別の機能性リガンド、特にプリオンタンパク質特異的ＮＡ抗体の助けで識別される機能性リガンドＣＢＦは、治療用途のための有望な標的であることは明らかである。核酸抗体は、治療薬についての新たな標的を識別する上でのみならず、治療薬それら自身としても重要な役割を果たしうる。修飾されたＮＡ抗体を使用したＣＢＦの不活化は、プリオンタンパク質が凝集するのを阻止し、したがって全体のプリオンに基づいた疾患プロセスでの重要な部分を遮断する。
【００３６】
この先に知られていない細胞要素ＣＢＦが、プリオンに基づいた疾患病因論、発生および進行で関与することは明らかである。データは、１つの特定のＣＢＦが、高分子量成分、例えばフィブロネクチンまたはリポタンパク質のファミリーのメンバーであることを示す。図１を参照のこと（配列番号：７、受託番号ＮＰ００２０１７号、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ，Ａ．Ｒ．ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ  １９８３年、８０（１１）巻：３２１８−２２頁も参照のこと）。２つの機能性リガンド、すなわち、ＣＢＦおよびＮＡプリオン特異的抗体とプリオンタンパク質との間の相互作用の知見は、この成功の例を必然的に伴う破壊的な疾患をうまく処理する新たな方向を開く。
【００３７】
ＣＢＦの知見は、ずっと先の到達する成果を有する。ＣＢＦまたは修飾ＣＢＦなしの動物の繁殖は、狂牛病を潜在的に決して発生する可能性のないウシの血統を生じる。他方では、特別に設計された治療薬によるＣＢＦの不活化も、動物およびヒトがプリオンに基づいた疾患を発生する可能性を減じるにちがいない。
【００３８】
本発明の１つの実施態様は、サンプルマトリックス中の１種またはそれ以上のＣＢＦの存在または不在を識別する方法を記述する。この方法は、適量のサンプルを取り、そしてサンプルに、ＲＱ１１＋１２ＲＮＡのような所定のＮＡ抗体、またはその機能性フラグメントを添加することを包含する。（機能性フラグメントは、生来の親のＮＡとして標的タンパク質を機能する、例えばそれに結合し、そしてそれと相互作用するＮＡフラグメントに該当するが、しかしその結合または相互作用特性に影響を及ぼさない切断または修飾ヌクレオチド配列を有する。）この混合物に、所定のタンパク質を添加する。このタンパク質は、適切な条件下で凝集複合体を形成する既知タンパク質であり、そして少なくとも２つの形態を示しうる。タンパク質の第一の立体配座は、活性タンパク質のものである。好ましくは、遊離形態のタンパク質は、その第一の立体配座または活性形態にある。第二の形態は、不活性形態にあるタンパク質により推定される立体配座である。好ましくは、凝集複合体では、この第二の不活性立体配座は、第一の立体配座より優先する。このようなタンパク質の例は、プリオンタンパク質である。その後、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６９２２号で概説される条件のもののような、タンパク質の凝集に対処するのに適切な条件下で、混合物をインキュベートする。
【００３９】
本発明の１つの態様では、凝集複合体は、その複合体が、式：［ＡｘＢｙＣｚ］（式中、ｘ、ｙおよびｚは、整数であり、各々独立に、１（１）から無限大（∞）までの値を示す）によって表されるタンパク質成分（「Ａ」）、細胞結合因子（「Ｂ」）、およびＮＡ抗体（「Ｃ」）を包含する。式中の構成要素の次数は、実際の複合体でのあらゆる特定の次数を表さない。ＮＡ抗体（「Ｃ」）は、それに限定されないが、配列番号：１−６を含めたＮＡ抗体を包含するヌクレオチドライブラリーから得られるＮＡである。１つの態様では、無傷で複合体を保持する結合力は、非共有結合の集合であり、そしてそれに限定されないが、疎水性、イオン性、ファンデルワールス、水素結合、およびそれらの組合わせが挙げられる。
【００４０】
凝集複合体を形成するためのプロトコルの例は、以下のとおりである：約０．８３ピコモルのヒト組換えプリオンタンパク質（「ｈｒＰｒＰ」、プリオンタンパク質）を、約０．２ピコモル（または１．２ピコモルと）のＲＱ１１＋１２のようなＮＡ抗体とインキュベートする。ＲＮＡ−タンパク質結合は、およそ５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ  ｔＲＮＡ、８０−１００μｇ／μｌ  ＢＣＳ、０．０５％ＤＯＸ、および０．０５％ＮＰ−４０より構成される２０μｌの反応混合液中で行われる。反応混合液を、約２０分間、室温付近でインキュベートする。
【００４１】
使用されるプリオンタンパク質は、ｈｒＰｒＰ、ＰｒＰC、並びに他のプリオンタンパク質でありうる。タンパク質は、適切な条件下で、１種またはそれ以上の凝集を形成する。その後、これらの凝集は、例えば、電子顕微鏡法を使用して検出されうる。凝集複合体の形成は、反応混合液中のＣＢＦの存在を示す。
【００４２】
上で表現された方法は、プリオンタンパク質のプロテアーゼＫ耐性を試験することによって補われうる。ＮＡ抗体および／またはＣＢＦの不在下で、プリオンタンパク質は、溶解性であり、そしてプロテアーゼＫにより十分に消化される。したがって、様々の検出機構を、上に表される方法のために使用しうる。ＮＡ抗体およびプリオンタンパク質（ＰｒＰ）とのサンプルマトリックスのインキュベーションに続いて、プロテイナーゼＫを、その混合物に添加する。複合体形成は、上に概説されるとおり行われる。タンパク質消化に対するＰｒＰの耐性は、ＲＮＡ−ＰｒＰ−ＣＢＦ複合体を、プロテアーゼＫで処理することによって分析される。例えば、混合物に、およそ２μｇのプロテアーゼＫ（市販の源から入手可能）を、反応混合液に添加し、そして約６０分間、３７℃付近でインキュベートする。１０ｍＭのホスホメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有するおよそ２０μＬの２×サンプル緩衝液（ノベックス（ＮＯＶＥＸ）から入手可能）を使用して、その反応を終結させうる。その後、適量の反応液を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ／分析により分析しうる。サンプルを、７Ｍ尿素と伴う６％ポリアクリルアミドゲルにかける。１×ＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭトリス−ボレート（ｐＨ８．３）、０．５％ＤＯＸ、０．５％ＮＰ−４０および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して、約６０−９０分間、室温付近で、電気泳動を行う。続いて、ゲルを乾燥させ、そして、ｘ線フィルムに露出させるか、またはホスホイメイジャー（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＢＩＬ−２０）によって分析させる。当業界で習熟した技能者らは、ゲル電気泳動および同様の分析に精通している。ウエスタンブロットを作製する場合、それにより耐性株ＰｒＰは、例えば、ハムスターＰｒＰのアミノ酸１０９−１１２エピトープに特異的であるモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）３Ｆ−４、およびマウスＰｒＰのアミノ酸１００−１４５エピトープに特異的な７Ａ−１２ＭｏＡｂを用いた免疫ブロット技術を使用して可視化されうる。
【００４３】
適切なＮＡ抗体およびＣＢＦの存在下で、プリオンタンパク質は、非溶解性であり、そしてプロテイナーゼＫに対して耐性である。混合物中に存在するこれらのプリオンタンパク質は、凝集するに違いなく、そして検出されうる。したがって、プリオンタンパク質のタンパク質消化産物は、存在する場合にしても最小である。図２および３は、このような実験の典型的な結果を描く。（この型のアッセイの例は、下の実施例で記述される。）
ＣＢＦそれ自身は、凝集複合体から単離されうる。ここに記述される型のタンパク質複合体は、１種またはそれ以上のＮＡ抗体、タンパク質標的（プリオンタンパク質のような）および１種またはそれ以上のＣＢＦをおそらく包含する。例えば、カオトロピック剤を使用して、複合体を崩壊させうる。実験設定では、ＮＡ抗体および標的タンパク質は、知られ、したがって第三の主要要素は、ＣＢＦである。その後、カオトロピック混合液を、ＮＡおよび標的タンパク質についての既知水準を使用するクロマトグラフィーおよび／またはゲル電気泳動にかけうる。その後、未知起点のクロマトグラフィーのピークおよび／または電気泳動のバンドを、単離し、そしてさらに試験しうる。実地では、１種またはそれ以上のクロマトグラフィー手段は、ＣＢＦを単離および精製するために要求されうる。その後、単離物、すなわち、推定ＣＢＦを、例えば標的タンパク質によるプロテイナーゼＫ耐性を付与するその能力について分析しうる。したがって、その識別をＣＢＦとして確認する。
【００４４】
以下の手段は、ＣＢＦを豊富にしたヒト血清のフラクションを構築するために発明者らによって使用されてきた。適量、例えば、５ｍＬのヒト血漿（溶血なし）を、１ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合した。混合液を、およそ１５分間、室温で、静置させた。その後、混合液を、約１５分間、およそ３５００×ｇで遠心分離した。その後、上清を別容器に移した。ペレットを、およそ２ｍＬの生理食塩水を使用して穏やかに洗浄した。ペレットを、穏やかな音波を使用しておよそ５ｍＬの生理食塩水−ＥＤＴＡ中で再懸濁させた。懸濁液を、およそ２ｍＬ生理食塩水で穏やかに洗浄し、そして２分間静置させ、その後、上清を除去した。残りのペレットを、音波を使用して約１ｍＬの生理食塩水で再懸濁させた。ＰＥＧを除去するために、懸濁液を、透析し、そして４℃で保存した。
【００４５】
次に、沈殿複合体を、およそ１０分間、９５℃付近で、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、２０％グリセロールの溶液中でインキュベートした。その後、適切なタンパク質フラクションの結果としての抽出と共に電気泳動を行うか、またはサンプルを、分取カラムにかけ、そして１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、および２０％グリセロールでサンプルを溶出させた。
【００４６】
本発明の１つの実施態様では、タンパク質凝集を阻害するその能力に関連した医薬剤の効力を試験する方法が記述される。理論に捕われることを望まずに、プリオンタンパク質によるタンパク質消化に対する感受性が、タンパク質凝集に関与することへのその傾向を示す。タンパク質の３次元立体配座が、複合体形成の場合、タンパク質消化に対するタンパク質の影響されやすさ、並びにその関与に影響を及ぼしうるということが当業界で十分に認識される。この場合には、プロテアーゼＫによる消化に対するプリオンタンパク質の感受性が、プリオンタンパク質凝集に関連する相互関係が、経験的に確立された。タンパク質が凝集複合体を形成するために、それは、その不溶性立体配座にあるべきである。この立体配座では、それは、プロテアーゼＫ消化に感受性がない。対照的に、タンパク質が、その溶解性の遊離形態にある場合、それは、例えばプロテアーゼＫによるタンパク質消化に影響を受けやすい。したがって、薬剤は、プリオンタンパク質がそれらの非溶解性立体配座に変換することを防止することができる場合、それにより論理の拡大により、この薬剤は、凝集複合体の形成を阻止しうる。
【００４７】
本方法は、ＮＡ抗体、プリオンタンパク質、および試験医薬剤と一緒に、ＣＢＦを有する混合物を形成することを包含する。タンパク質消化のために適した条件下で、プロテアーゼＫのようなプロテアーゼを、この混合物に添加する。実施例Ｃを参照のこと。適切な期間の後、適量を混合反応容器から回収し、そしてすなわち、生来のプリオンタンパク質の状態を試験する。試験により、タンパク質消化産物を検出する場合、それによりこれは、医薬試験剤が、溶解性プリオンタンパク質がその非溶解性の凝集立体配座に変換することを妨げる上で有効であることを示す。したがって、試験剤は、凝集複合体の形成を阻止する上で有効である。しかし、試験によるあらゆる消化産物がほどんどないにちがいない場合、それにより、薬剤は、凝集複合体の形態を阻止する上で有効でないことが推定されうる。さらに、凝集複合体は、例えば、電子顕微鏡を使用して、さらなる分析により明らかであるにちがいない。
【００４８】
そのような分析の例として、プリオンタンパク質（例えば、ｈｒＰｒＰ）を得て、そして例えば、蛍光染料Ｃｙ５（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から購入された）を使用して標識する。（典型的には、標識プロトコールは、供給業者から提供される）。およそ１．６ピコモルのＲＱ１１＋１２のようなＮＡ抗体を、周囲温度付近で、約１時間、医薬上の試験剤の存在下で、約１０μＬの結合緩衝液中の仔ウシ血清（約８０μｇタンパク質）と一緒に約０．３ナノモルのプリオンタンパク質を有する結合緩衝液（およそ５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；５０ｍＭ  ＬｉＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１ｍＭ  ＤＴＴ；０．０５％ＮＰ−４０；０．０５％ＤＯＸ；５％グリセロール；１μｇＢＳＡ；１μｇ  ｔＲＮＡ）中でインキュベートする。その後、約０．５μｇプロテアーゼＫを添加し、そして混合液を、約３７℃で、約３０分間、インキュベートした。約５ｍＭ  ＰＭＳＦおよび約１２μＬの２×ＳＤＳタンパク質サンプル緩衝液の添加により、消化反応を停止させうる。その後、反応サンプルを、９５℃付近で、約１０分間沸騰させる。その後、サンプルを、ＰＡＡＧ（４−２０％、ノベックスから入手可能）で電気泳動にかけうる。
【００４９】
本発明は、アッセイキットに関与する。このキットは、タンパク質凝集を防止する試験剤の能力を評価するために使用されうる。キットは、ＮＡ抗体、ＣＢＦ、およびタンパク質を包含する。キットは、さらに、プロテアーゼＫを包含しうる。ＮＡ抗体は、配列番号：１−６より構成される群から選択されうる。このキットで使用されるＣＢＦは、フィブロネクチン（例えば、配列番号：７）またはリポタンパク質ファミリーのメンバーでありうる。特定の態様では、キットのタンパク質は、プリオンタンパク質である。好ましくは、このキットは、ここに記述される方法と組合わせて使用される。（実施例Ｃも参照のこと。）
本発明の特性および他の詳細は、ここで、さらに特に記述され、そして実施例で指摘される。本発明の特定の実施態様が、本発明の例示の手段により、そして限定としてでなく示されることが理解される。本発明の原則特性は、本発明の概念および範囲から逸脱することなく、種々の実施態様で使用されうる。
【実施例】
【００５０】
Ａ．プロテアーゼＫ保護
図２は、ＣＢＦおよびＮＡ抗体の存在下で、プロテアーゼＫに対するプリオンタンパク質の耐性を示すゲルである。７ピコモルのｈｒＰｒＰを、室温で、１７時間、１０μＬ結合緩衝液中の１２３フェムトモルのＲＱ１１＋１２ＲＮＡ（「ＲＱ  ＲＮＡ」）とインキュベートした。次に、プロテアーゼＫ（５０ｎｇ／μＬ）を添加し、そしてサンプルを、３７℃で３０分間、インキュベートした。ＰＭＳＦ（５ｍＭ）および１０μＬの２×ＳＤＳサンプル緩衝液の添加により、タンパク質分解を終結させた。その後、サンプルを、９５℃で７分間インキュベートさせ、そしてＰＡＧＥにより分析し、そして３Ｆ−４抗ＰｒＰ抗体（Ｑ−ＲＮＡから入手可能）を使用して免疫ブロッティングをした。
【００５１】
抗−ＰｒＰモノクローナル抗体（３Ｆ−４）を使用したウエスタン免疫ブロッティング・データは、ＣＢＦが、複合体形成の間にＲＱ  ＲＮＡ−ＰｒＰ混合物中に存在する場合、ｈｒＰｒＰが、プロテアーゼＫ消化から保護されうることを示す。ＣＢＦは、実際に、仔ウシ血清（「ＢＣＳ」）に存在した。
Ｂ．ヒト血清中のＣＢＦの存在
図３は、ヒト血清中のＣＢＦの存在を示す２つのゲルを描く。ＲＱ  ＲＮＡを、室温で、１時間、ヒトまたは仔ウシ血清（８０μｇタンパク質）の存在下、２５０ｎｇのｈｒＰｒＰを伴う１０μＬの結合緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；５０ｍＭ  ＬｉＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１ｍＭ  ＤＴＴ；０．０５％ＮＰ−４０；０．０５％ＤＯＸ；５％グリセロール；１μｇＢＳＡ；および１μｇｔＲＮＡ）中でインキュベートした。その後、０．５μｇプロテアーゼＫを添加し、そして３７℃で、３０分間インキュベートした。ＰＭＳＦ（５ｍＭ）および１２μＬの２×ＳＤＳタンパク質サンプル緩衝液の添加により、消化を止めた。その後、サンプルを、９５℃で、１０分間、加熱した。その後、サンプルを、ＰＡＡＧ（４−２０％、ノベックス）にかけ、そしてｈｒＰｒＰに対する３Ｆ−４モノクローナル抗体を使用して免疫ブロッティングをした。抗−ＰｒＰモノクローナル抗体（３Ｆ−４）を用いたウエスタン免疫ブロッティングのデータは、様々の作製のヒト血清が、プロテアーゼＫ消化に対するｈｒＰｒＰの耐性を生じる特徴的能力を示し、そしてこれらのサンプル中のＣＢＦの存在を示すこをと示した。
Ｃ．ＰｒＰ保護アッセイ
グアニジン−ＨＣｌ−ＳＤＳ溶液から再折り畳みされたヒト組換えプリオン（ｈｒＰｒＰ）を、蛍光染料Ｃｙ５（アマシャムから購入された）で標識するために使用した。（標識プロトコールは、供給業者から提供される。）およそ１．６ピコモルのＲＱ１１＋１２ＲＮＡを、周囲温度で、１時間、クロロプロマジンの存在下、１０μＬの結合緩衝液中の仔ウシ血清（８０μｇタンパク質）と一緒に、０．３ナノモルのｈｒＰｒＰを伴う結合緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；５０ｍＭ  ＬｉＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１ｍＭ  ＤＴＴ；０．０５％ＮＰ−４０；０．０５％ＤＯＸ；５％グリセロール；１μｇＢＳＡ；１μｇｔＲＮＡ）中でインキュベートした。その後、０．５μｇプロテアーゼＫを添加し、そして混合液を、３７℃で、３０分間インキュベートした。５ｍＭのＰＭＳＦおよび１２μＬの２×ＳＤＳタンパク質サンプル緩衝液の添加により、消化反応を止めた。その後、反応サンプルを、９５℃で１０分間沸騰させた。その後、サンプルを、ＰＡＡＧ（４−２０％、ノベックス）中で電気泳動にかけた。
【００５２】
図４は、用量依存性手段で、血清またはリポタンパク質によりＰｒＰ保護を遮断する上でのクロロプロマジンの効率を描く。特に、レーン１，６および１０は、プロテアーゼ処理がなかった反応を表す；レーン２、３、４、５、７、８、９、１１、１２、１３および１４は、プロテアーゼＫ処理サンプルを表す；レーン３、７、１２は、２０ｍＭのクロロプロマジンの添加を示すサンプルを表す；レーン４、８、１３は、４０ｍＭのクロロプロマジンの添加を示すサンプルを表す；レーン５、９および１４は、８０ｍＭクロロプロマジンが添加された反応を表す。最後に、レーン：１−５は、血清のＨＳフラクションを表す；６−９は、血清のＬＰ１フラクションを表す；１０−１４は、血清のＬＰ２フラクションを表す。クロロプロマジンの存在下で、プロテアーゼＫ消化に対するプリオンタンパク質の感受性が保存されることが観察されうる。
【００５３】
ここに明示される試薬の全ては、市販の源から、またはニューヨーク州ニューヨークのＱ−ＲＮＡを通して得ることができる。
【００５４】
本発明は、その実施態様に関連して特に示され、そして記述された場合、形態および詳細での種々の変化は、ここに付随の請求項により定義されるとおり、本発明の概念および範囲から逸脱することなくここで行われうることは、当業者に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】フィブロネクチンについてのアミノ酸配列である。
【図２】ＣＢＦおよびＮＡ抗体の存在下でのプロテイナーゼＫに対するプリオンタンパク質の耐性を示すゲルである。
【図３】ヒト血清中のＣＢＦの存在を示す２つのゲルを描く。
【図４】クロロプロマジンの存在下でのタンパク質消化からのプリオンタンパク質の保護を示すゲル電気泳動を描く。
【図１】
2006502709.tif 000009
【図２】
2006502709.tif 000010
【図３】
2006502709.tif 000011
【図４】
2006502709.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月29日(2005.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006502709000001.app
【国際調査報告】
2006502709.tif 000013