(57)【要約】本発明は、キメラカニューレポリペプチド及びそれらの作製法及び使用法を提供する。一例として、本発明は、タンパク又はリガンドの同定、選別又は合成のための組成物及び方法を提供する。一例として、本発明は、ナノチューブルの作製および使用のための組成物及び方法を提供する。一例として、本発明は、ラセミ混合物からキラル構成成分を選別及び精製するための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、カニューレポリペプチドを含む第一のドメイン、および異種ポリペプチド又はペプチドを含む第二のドメイン、を含むキメラポリペプチド。
【請求項２】
異種ポリペプチド又はペプチドがカニューレペプチドのアミノ末端、カルボキシル末端、またはカニューレペプチド内部に挿入されている、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
カニューレポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、又は配列番号:6に対し70％の配列同一性を有するタンパク質を含み、ポリマーへのアッセンブルが可能である又はキラル選別因子として作用可能である、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
カニューレポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、又は配列番号:6に対し80％の配列同一性を有するタンパク質を含み、ポリマーへのアッセンブルが可能である請求項３記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
カニューレポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、又は配列番号:6に対し90％の配列同一性を有するタンパク質を含み、ポリマーへのアッセンブルが可能である請求項４記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
カニューレポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、又は配列番号:6に対し95％の配列同一性を有するタンパク質を含み、ポリマーへのアッセンブルが可能である請求項５記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
カニューレポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、又は配列番号:6の配列を有するタンパク質を含み、ポリマーへのアッセンブルが可能である請求項６記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
カニューレポリペプチドがポリマーにアッセンブルすることが出来る、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
カニューレポリペプチドがナノチューブルへアッセンブルすることが出来る、請求項８記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
異種ポリペプチド又はペプチドがナノチューブルの内腔で発現される、請求項９記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
異種ポリペプチド又はペプチドがナノチューブルの外表面で発現される、請求項９記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
異種ポリペプチド又はペプチドがキラル選別モチーフを含む、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
異種ポリペプチド又はペプチドが受容体又はリガンドを含む、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
異種ポリペプチド又はペプチドが酵素を含む、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
異種ポリペプチド又はペプチドが酵素の活性部位を含む、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
異種ポリペプチド又はペプチドが抗原又は抗原結合部位を含む、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
異種ポリペプチド又はペプチドがグリーン蛍光タンパク質、α-ガラクトシターゼ又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
キメラポリペプチドが組換えタンパク質である、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
カニューレポリペプチドの少なくとも一つのサブ配列が除去されている、請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
カニューレポリペプチドのサブ配列が除去された箇所へ異種ポリペプチド又はペプチドが挿入されている、請求項１９記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
カニューレポリペプチドがCanAポリペプチドであり、そして除去されたサブ配列が配列番号:2(PDKTGYTNTSIWVP)の残基123から136から成る14残基モチーフ、又は配列番号:2 (PDKTGYTNTSIWVPGEP) の残基123から139から成る17の残基モチーフである、請求項１９記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
CanAポリペプチドの配列が除去された箇所へ異種ポリペプチド又はペプチドが挿入されている、請求項２１記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
異種ポリペプチド又はペプチドが、除去された14又は17残基モチーフを置き換えるためのCanAポリペプチドに挿入された、14又は17残基モチーフである、請求項２２記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１記載のキメラポリペプチドを含む固定化キメラポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１記載の複数のキメラポリペプチドを含むナノチューブル。
【請求項２６】
異種ポリペプチド又はペプチドが酵素を含む、請求項２５記載のナノチューブル。
【請求項２７】
複数の異なった酵素を含む、請求項２６記載のナノチューブル。
【請求項２８】
複数の酵素が生合成経路を含む、請求項２７記載のナノチューブル。
【請求項２９】
複数の酵素がナノチューブルに沿って生合成経路での作用順序と同じ順序で配置されている、請求項２８記載のナノチューブル。
【請求項３０】
異種ポリペプチド又はペプチドがキラル選別モチーフを含む、請求項２５記載のナノチューブル。
【請求項３１】
請求項１のキメラポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３２】
請求項３１の核酸を含む発現用カセット。
【請求項３３】
請求項３１の核酸を含む細胞。
【請求項３４】
細菌性細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞である、請求項３３記載の細胞。
【請求項３５】
請求項３１記載の核酸を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３６】
請求項３１記載の核酸を含む植物。
【請求項３７】
a)  請求項１２記載のキメラポリペプチドを提供する工程；
b)  組成物のラセミ混合物を提供する工程；および、
c)  前記組成物のただ一種のエナンチオマーのみが前記キメラポリペプチドと結合する条件の下、前記ラセミ混合物と前記キメラポリペプチドを接触させる工程を含み、
それによって、前記ラセミ混合物から単一のキラル種を選別する、組成物のキラル選別方法。
【請求項３８】
a)  請求項29記載のナノチューブルを提供する工程；
b)  ラセミ混合物組成を提供する工程；および、
c)  前記組成物のただ一種のエナンチオマーのみが前記ナノチューブルと結合する条件の下、前記ラセミ混合物と前記ナノチューブルを接触させる工程を含み、
それにより前記ラセミ混合物から単一のキラル種を選定する、組成物のキラル選別方法。
【請求項３９】
a)  請求項28記載の生合成経路を構成する複数の酵素を含むナノチューブルを提供する工程；
b)  少なくとも一つの前記酵素に対する基質を提供する工程；および、
c)  前記生合成経路の前記酵素が組成物の合成を触媒するような条件の下、前記ナノチューブルと前記基質とを接触させる工程、
を含む、組成物の酵素的生合成方法。
【請求項４０】
酵素がナノチューブルの内腔にて発現される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
酵素がナノチューブルの外表面にて発現される、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学及び薬の合成に関連する。一つの特徴において、本発明は、タンパク質又はリガンドの同定、分離又は合成のための組成物及び方法を提供する。一つの特徴において、本発明は、ナノチューブルの作製及び使用のための組成物及び方法を提供する。一つの特徴において、本発明は、ラセミ混合物からキラル成分を選別及び精製するための組成物及び方法を提供する。一つの特徴において、本発明は、キメラカニューレポリペプチド及びそれらの作製方法ならびに使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
エナンチオマーは、往々にして、劇的に異なる薬理学的性質を示す。結果として、単一のエナンチオマーから成る薬の使用は、薬効を改善したり、副作用を減少させる可能性がある。米国食品医薬品局は、各エナンチオマーの薬理学的性質を理解する重要性をも認識している。ラセミ医薬品が登録されるためには、各精製エナンチオマーの生物学的活性が特徴付けられることが必要である。カニューレA、あるいはCanA、は、ナノチューブルを形成することのできる耐熱性タンパク質である。CanAナノチューブルは、二価カチオンの存在下に外径約25nm、内径約20nmの中空ロッドに自己アッセンブル（自己集合）する21kDaの単量体サブユニットから構成され、真核生物の微小管と大差のない分子の大きさ及び全体的な形態を示す。E.coliで発現させたCanAモノマーは、熱に安定である。CanAは、細菌抽出物から、熱に不安定な宿主タンパク質の大部分を熱処理により除いた後、速やかに精製することができる。精製に引き続き、CanAは、上昇させた温度においてカルシウム及びマグネシウムの存在下、速やかにナノチューブルへと自己アッセンブルさせることができる。アッセンブルしたCanAナノチューブルの構造は、らせんピッチに配列され、ターン当たり28のCanAモノマーを含んでいる。CanAナノチューブルは、熱に安定であり（128℃まで）、SDS又は高濃度の尿素の存在下にもアッセンブルしたままである。Short等によるWO02/4436を参照。
【０００３】
カニューレナノチューブルは、高温環境下（＞100℃）で発見された高好熱性微生物であるピロディクティム・アビシィ（Pyrodictim abyssi）により特徴的に形成される。その天然環境及び細胞培養において、Pyrodictim abyssiは、細胞を連結及び包埋するそれらのナノチューブルによりお互いに連結している。これらファイバーのネットワークは、Pyrodictim属に固有の特徴であり、それらは、100℃以上での増殖に必要とされているように思われる。更に、細胞分裂時に、それらナノチューブルが増殖する細胞の両末端に結合するループを形成するような観察結果により示されるように、これらナノチューブル連結の維持と細胞の増殖との間に直接的な関連があるように見られる。細胞分裂後、ナノチューブルループは、娘細胞を連結するリンクとなる。天然におけるナノチューブルの真の機能が何であるかに関しては未だ推測的ではあるが、それらチューブルによる細胞の結合は、細胞が代謝物、遺伝情報、又はシグナル化合物の交換を可能にすることを示唆している。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、キメラポリペプチド本発明は、少なくとも、カニューレポリペプチドを含む第一のドメイン、及び、少なくとも、異種のポリペプチド又はペプチドを含む第二のドメイン、を含むキメラポリペプチドを提供する。その異種のポリペプチド又はペプチドは、カニューレポリペプチドの、又は、そのカニューレポリペプチドが一種以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含む場合、それらの混合物のアミノ末端、カルボキシ末端、あるいはその内部に挿入することができる。そのカニューレペプチドは、配列番号:2、配列番号:4、又は配列番号:6 と少なくとも55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 % 又は、それ以上の配列相同性を持つタンパク質を含むことができ、例えば、ナノチューブルのようなポリマーにアッセンブルすること、あるいはキラル選別因子として作用することができる。キメラカニューレタンパク質は、キラル選別因子、生合成経路、選別スキャッホールディング等として作用するナノチューブルポリマーへとアッセンブルすることができる。
【０００５】
一つの特徴において、カニューレポリペプチドはナノチューブルのようなポリマーにアッセンブルできる。一側面において、カニューレポリペプチドはポリマーへ自己アッセンブルできる。いくつかの例として、そのモノマーは、ポリマーアッセンブルのために、例えば、二価カチオン、あるいは他のカニューレモノマーであり得る「核形成因子」のような補欠因子を要求する。その二価カチオンとは、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Sr2+、Ni2+、Mn2+及び/又はFe2+であり得る。他の特徴において、ポリマーアッセンブル、例えば、ナノチューブルへのアッセンブルのためにCa2+及びMg2+の両方が必要とされる。一例において、二価カチオンは、ポリマーアッセンブルの間、mM濃度である。
【０００６】
一側面において、異種ポリペプチド又はペプチドは、ナノチューブルの内腔又はナノチューブルの外面で発現される。これらハイブリッドナノチューブルは、異種ポリペプチドあるいはペプチドをその外部表面又はチューブポリマーの内腔表面に配置することができ、そのモノマーが一種以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含む場合、それらは、チューブの外部及び内部の両表層上に「提示」されることができる。ナノチューブルのモノマー全てが、異種のポリペプチド又はペプチドを類似の様式で含む場合、異種のポリペプチド又はペプチドはナノチューブル上に規則的ヘリカルパターンで提示され得る。
一側面において、異種ポリペプチド又はペプチドは、キメラ選別モチーフ、受容体又はリガンド、酵素、酵素の活性部位、補欠因子、基質、抗原又は抗原結合部位、例えば、グリーン蛍光タンパク質（green fluorescent protein）のような検出可能残基、アルファー-ガラクトシダーゼ又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのような検出可能部分を含む。
【０００７】
一側面において、本キメラポリペプチドは、インビボ又はインビトロにおいて発現され得る組換えタンパク質、合成タンパク質、あるいはそれらの混合物である。
一側面において、本発明のキメラタンパク質のカニューレポリペプチドドメインの少なくとも一つのサブ配列が除去されている。異種ポリペプチド又はペプチドは、カニューレポリペプチドの除去されたサブ配列部位（又はその部位の一カ所）に挿入されることができる。一側面において、カニューレポリペプチドは、CanAポリペプチドであり、その削除された配列は、配列番号:2の123〜136残基（すなわち、“PDKTGYTNTSIWVP”）からなる14残基のモチーフ（ペプチド）、あるいは配列番号:2の123〜139残基（例えば、“PDKTGYTNTSIWVPGEP”）からなる17残基のモチーフである。異種ポリペプチド又はペプチドは、CanAポリペプチドの除去された14又は17残基のモチーフサブ配列部位の一カ所又は両部位に挿入されることができる。異種ポリペプチドは、14残基または17残基でもよく、CanAポリペプチドに挿入され、除去された14又は17残基のモチーフと置き換えることができる。
【０００８】
本発明は、本発明のキメラモノマー又はポリマーポリペプチドを含む固定化キメラポリペプチドを提供する。本発明は、複数の本発明のキメラポリペプチドを含む、例えば、ナノチューブルのようなポリマーを提供する。一側面において、そのポリマーは、例えば、発明のキメラタンパク質以外のモノマー、あるいは他のポリペプチド又は組成を含む、一種以上のカニューレポリペプチドがアッセンブルしたナノチューブルのようなヘテロポリマーである。異種ポリペプチド又はペプチドは酵素、例えば、活性部位、あるいは複数の異なる酵素を含む。複数の酵素には、生合成経路を含めることができる。その複数の酵素は、それらが生合成経路において作用する順番に、ナノチューブルに沿って並べることができる。その生合成経路を構成する種々の酵素は、異種ポリペプチド又はペプチドを欠いたカニューレモノマー（例えば、CanA、CanB、CanC、CanD、及びその類のような「野生型」カニューレモノマー）によって、チューブに沿ってお互いに分離させることができる。生合成経路を構成するポリマーは、基質、補欠因子、調節試薬等をも含めることができる。
【０００９】
本発明は、異種のポリペプチド又はペプチドが酵素又は酵素活性部位のような少なくとも一種のキメラ選別モチーフを含むポリマー、例えば、ナノチューブルのようなポリマーを提供する。
本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードしている配列を含んだ核酸を提供する。本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードしている発現カセット（例えば、ベクター、組換えウイルス、ファージ等）を提供する。本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする配列、あるいは本発明の発現カセットを含んだ細胞を提供する。その細胞は、例えば、細菌、植物細胞、酵母細胞、カビ細胞、昆虫細胞、あるいは高等動物細胞のような如何なる細胞でもよい。本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする配列、あるいは本発明の発現カセットを含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする配列、あるいは本発明の発現カセットを含む植物を提供する。
【００１０】
本発明は、組成物のキラル選別のための方法を提供する。その方法は、以下の工程を含む：本発明のキメラポリペプチドを提供する工程；組成物のラセミ混合物を提供する工程；および、前記ラセミ混合物を前記キメラポリペプチドとその組成物中のただ一つのエナンチオマーが前記ポリペプチドと結合する条件下で接触させる工程。それにより前記ラセミ混合物から単一のキラル種を選別する。本発明は、ある組成物のキラル選別のための方法を提供する。その方法は、以下の工程を含む：本発明のナノチューブルを提供する工程；組成物のラセミ混合物を提供する工程；および、前記ラセミ混合物を前記ナノチューブルとその組成物中のただ一つのエナンチオマーが前記ナノチューブルと結合する条件下で接触させる工程。それによりラセミ混合物から単一のキラル種を選別する。本法は、更に、異なるキラル種の分離を含む。
本発明は、ある組成物の酵素的生合成のための方法を提供する。その方法は、以下の工程を含む：生合成経路を構成する複数の酵素を含む本発明のナノチューブルを提供する工程；少なくとも一つの酵素に対する基質を与える工程；および、前記ナノチューブルと前記基質を生合成経路の酵素が組成物を合成する条件下で接触させる工程。一側面において、酵素は、ナノチューブルの内腔において発現されるか、あるいはナノチューブルの外腔上に発現される。ナノチューブルは、基質、補欠因子、調節因子及びその他をも含めることができる。
【００１１】
本発明の一つ以上の具体例の詳細は、添付図表及び以下の記述として示す。本発明の他の特徴、目的、あるいは便宜性は、その記述、図示、あるいはクレームから明らかとなるであろう。
ここに引用される全ての出版物、特許、特許出願、GenBank配列及びATCC受託物は、全ての目的のため、引用により明示的に本明細書に取り込まれる。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、キメラカニューレポリペプチド（即ち、融合体又はハイブリッドタンパク質） を用いた、タンパク質やリガンドの同定、分離又は合成のための組成物及び方法を提供する。本発明のキメラポリペプチドには、(配列番号:1 によりコードされる) 配列番号:2又はその配列の一部を含むCanA 融合タンパク質、（配列番号:3 によりコードされる) 配列番号:4又はその配列の一部を含むCanB 融合タンパク質、（配列番号:5 によりコードされる) 配列番号:6 又はその配列の一部を含むCanC 融合タンパク質、（配列番号:7 によりコードされる） 配列番号:8 又はその配列の一部を含むCanD 融合タンパク質を含んでいる。
一側面において、これらの組成物及び方法は、タンパク質及び他の成分のキラル分離に利用される。例えば、カニューレ（例えば、CanA、CanB、CanC、CanD）融合タンパク質は、キラル分離用素材として利用される。本発明のキメラポリペプチドは、単量体 (モノマー) 又は多量体 (例えば、ナノチューブル) の形で光学分割用素材として利用される。ナノチューブル形態で利用される場合、カニューレポリペプチド中の立体選択性を示すモチーフは、そのチューブの内腔側又は外表面、あるいはその両方に露出させることができる。
【００１３】
本発明は、更に異種ポリペプチド又はペプチドを含むカニューレポリペプチドを含む、カニューレ（例えば、CanA、CanB、CanC、CanD）融合タンパク質を提供する。異種ポリペプチド又はペプチドは、酵素、酵素活性部位、リガンド、受容体、抗原、エピトープ又は抗体であってよい。異種ポリペプチド又はペプチドは、タンパク質、あるいはその他の成分のキラル選択のための何れの配列でもよい。例えば、キラル選択用の異種ポリペプチド又はペプチドは、酵素、あるいは酵素活性部位である。
一側面において、カニューレ融合タンパク質は、モノマー又は二量体、三量体等の多量体 (ポリマー) であるか、あるいは図 1 に示すようなナノチューブル構造である。カニューレキメラポリマー (例えば、ナノチューブル) は、高密度調製素材として機能し、この場合、例えば、異種ポリペプチド又はペプチドは、キラル選択用モチーフを含んでいる。 
【００１４】
カニューレキメラポリマー (例えば、ナノチューブル) は、高密度選択素材としても機能し、この場合、例えば、異種ポリペプチド又はペプチドは、受容体、リガンド、エピトープ、抗体等を含んでいる。カニューレキメラポリマーがナノチューブルを形成する一例において、その異種ポリペプチド又はペプチドは、そのナノチューブルの外表面又は内腔表面、あるいはその両方に発現され得る。
カニューレキメラポリマー(例えば、ナノチューブル)は、また、生合成におけるスキャッフォールドとしても機能し、この場合、例えば、本発明のナノチューブルは、複数の異種ポリペプチド又はペプチドを生合成経路を構成する酵素、触媒性抗体又は酵素活性部位の形で含んでいる。一側面において、これらの酵素、触媒性抗体又は酵素活性部位の全ては、例えば、そのナノチューブルの外表面又は内腔表面等、ナノチューブル上の一表面に発現される。一側面において、これらの酵素、触媒性抗体又は酵素活性部位は、それらの生合成経路における順序と同様の順序に、そのチューブに沿って配置される。これらの酵素、触媒性抗体又は酵素活性部位は、一つのチューブ上に任意の数で固定化が可能である。どのような生合成経路も本発明のナノチューブル上に再アッセンブルさせることが可能である。
【００１５】
一側面において、複数の酵素、触媒性抗体及び/又は酵素活性部位を含むナノチューブルは、標準的分子生物学的クローニング技術により、カニューレポリペプチド (例えば、CanA、CanB) のリーディングフレームと目的の酵素配列のリーディングフレームを融合させることで、カニューレポリペプチド酵素融合タンパク質として構築することにより作製される。その融合配列は、例えば、原核生物又は真核生物用発現ベクター等の適切な発現カセットに導入され、組換えタンパク質として発現される。発現した融合タンパク質は、ポリマーを形成する前に、宿主タンパク質から精製することができる。例えば、キメラタンパク質 (例えば、モノマー) は、熱不安定性宿主タンパク質を変性させるような加熱処理 (例えば、80〜100 ℃、2〜20分) により分離することができる。可溶性の熱安定性融合タンパク質は、更に、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等のクロマトグラフィー技術、その他の標準的精製法によって共存タンパク質から精製することができる。
【００１６】
完全又は部分的精製又は未精製のキメラ (融合) タンパク質は、そのモノマー溶液を、ミリモル濃度の二価陽イオン (例えば、カルシウムやマグネシウム等) の存在下で加熱処理 (例えば、80 ℃まで) することにより、ナノチューブルの形成を誘導することができる。そのポリマーは、例えば、遠心分離 (例えば、30,000 X g で30分)、クロマトグラフィーなどにより回収することができる。
本発明は、ポリマー (例えば、ナノチューブル) に沿って生合成経路を構築させるための酵素、触媒性抗体及び/又は酵素活性部位、補欠因子、基質等、様々な成分を含むヘテロポリマー、例えば、ナノチューブル、を提供する。本発明のヘテロポリマー (例えば、ナノチューブル等) は、また、様々な抗体、抗原、受容体、リガンド、又は結合部位等を含むことができ、これらは空間的にそのチューブに沿って、何れの所望の順序にも配列させることができる。
【００１７】
ヘテロポリマー (例えば、一つの生合成経路を構築させるための複数の異なる酵素、触媒性抗体及び/又は酵素活性部位を含むナノチューブル) は、一例において図４に例示されるような手順により構築される。キメラモノマーをコードする核酸が構築され発現される。その異種タンパク質又はペプチドは、図４に示すように、カニューレポリペプチド (例えば、CanA) のアミノ末端、カルボキシ末端又はカニューレポリペプチド中に挿入さすることができる。発現したキメラモノマーの一つ又はそれ以上又はそれらの全てを精製することができる。そのヘテロポリマーの自己アッセンブルは、例えば、図 4に示すような融合モノマー 1のプール等のキメラポリペプチドのうちの一種を用いて開始させることができる。次に、この一側面において示された手順において、融合ポリマー 1は、成長過程のポリマーに加えられる大多数のサブユニットが融合モノマー 2 となるように、素早く融合モノマー 2 のプールで希釈される。又は、未会合の融合モノマー 1 は取り除かれ、そして融合モノマー 2 が加えられる。これにより生じたポリマーは、融合モノマー 1と融合モノマー 2 の配列を含んでいる。この工程は、一つの生合成経路を構築させるために必要な数の異なる酵素、触媒性抗体及び/又は酵素活性部位を含む目的のナノチューブルが産生されるまで反復することができる。これにより生じたナノチューブルは、指向性多酵素複合体の会合のためのスキャッフォールドとなり得る。
【００１８】
他の例として、本発明は、一種又はそれ以上の酵素 (又は、例えば、他の結合因子や補欠因子等) 活性をナノチューブルの外表面又は内腔上に示すナノチューブルポリマーを制御された装荷によりアッセンブルさせるための融合型、野生型及び非融合型モノマーを異なる比率で含むヘテロポリマーを提供する。
一側面において、本発明のポリマー鎖 (例えば、ナノチューブル)に固定化すべきいかなる数の成分も、ポリマーへの間接的な固定化により空間的にそのチューブ上に目的の順序で配列させることができる。その成分は、タンパク質でも非タンパク質性分でもよく、例えば、酵素、触媒性抗体、酵素活性部位、補欠因子 (例えば、NADH、FADH、ATP等) 、基質、抗体、抗原、受容体、リガンド又は結合部位などのタンパク質又は非タンパク質成分であってよい。この側面において、固定化剤(例えば、受容体、リガンド、抗体、エピトープ、基質等) は、望み通りにポリマー上に配列される。固定化される成分（例えば、キメラ組換えタンパク質）は、間接的固定化剤と結合する部位を含むか間接的固定化剤と結合する部位との複合体を形成するように構築される。間接的固定化剤は、成分を固定化させる結合剤であり得る。例えば、一本のナノチューブルは空間的にそのチューブ上に配列させた10種の異なる抗体を有するように構築される。このナノチューブルは、図 4に示される方法と類似の方法により構築され、例えば、酵素を含むキメラモノマーの代わりにこのキメラモノマーは異なった目的の酵素、基質、補欠因子等と特異的に結合する（例えば、抗原結合部位等を含む)抗体を含んでいる。
【００１９】
一側面において、本発明のキメラカニューレタンパク質は、自己アッセンブルによりらせん状のナノチューブルタンパク質ポリマー構造となる。これららせん状のナノチューブルタンパク質ポリマーは、キラル選別因子、生合成経路、選別スキャッフォールド等として機能し得る。これらのハイブリッドタンパク質ナノチューブルは、異種ポリペプチド又はペプチド (融合の相手) を、そのチューブ状ポリマーの外表面又は内腔表面に整列させることができる。ナノチューブルの全てのモノマーが同様の様式で異種ポリペプチド又はペプチドを含む場合、これらの異種ポリペプチド又はペプチドは、そのナノチューブル上に規則的ならせん状形式で提示され得る。
本発明のポリマー(例えば、ナノチューブル状タンパク質ポリマー)は、本発明のキメラモノマーを含むキラル選別因子、生合成経路、選別スキャッフォールド等として作用することに加え、非改変型カニューレモノマー、改変型非キメラカニューレモノマー又は他のポリペプチドを含むこともできる。例えば、一側面において、本発明のナノチューブルは、キメラモノマー A 、非改変型カニューレモノマー、キメラモノマー B 等を含んでいる。非改変型カニューレモノマーを含ませることにより、ナノチューブルの外表面又は内腔表面に(例えば、図 4に示されるように空間的に配列されて)発現された異種ポリペプチド又はペプチドの「クラスター」間に「間隔」が提供される。一側面において、本発明におけるポリマーは、異なる条件下において、異なる安定性を示すタンパク質の融合物を構成するように設計され、この例において、例えば、そのナノチューブルは、(例えば、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8に示されるようなキメラ又は野生型配列を含む)温度に対して安定なモノマーと不安定なモノマーを含む。一側面において、本発明のポリマーは、例えば、キメラ、野生型又は、例えば、温度非安定性となるように改変されたカニューレポリペプチドのような、種々のタンパク質の混合物を含むように設計される。
【００２０】
一側面において、カニューレタンパク質の部分配列は除去され、そして、異種ポリペプチド又はペプチドで置換されるか、あるいはその異種ポリペプチド又はペプチドは、カニューレモノマーに付加される。除去される部分配列は、カニューレタンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端又はそのカニューレタンパク質の内部の配列であり得る。一側面において、その取り除かれる部分配列は、カニューレナノチューブルの外表面又は内腔に発現されるモチーフである。よって、異種配列がその取り除かれる配列部位に発現される場合、その異種配列もまた、チューブの外表面又は内腔表面又はその両方に発現される。
【００２１】
一側面において、融合 (ハイブリッド) CanA タンパク質において、除去される配列部位は、配列番号:2の残基123から残基136よりなる14残基 (即ち、“PDKTGYTNTSIWVP”) であるか又は配列番号:2の残基123から残基139よりなる17残基 (即ち、“PDKTGYTNTSIWVPGEP”) である。一側面において、除去配列部位は、異種ポリペプチド又はペプチドで置換される。CanAモノマーがポリマー型ナノチューブル中に存在する場合、配列番号:2の残基123から残基136よりなる14残基 (即ち、“PDKTGYTNTSIWVP”)又は配列番号:2の残基123から残基139よりなる17残基 (即ち、“PDKTGYTNTSIWVPGEP”) は、ナノチューブルの外表面に発現される。この例において、そのCanAモノマータンパク質は、外表面においてキラル選別物質として作用する。ナノチューブルの全てのモノマーが、そのモチーフ部位の内部又は近隣に(そのCanAモチーフに付加的に、あるいはそのモチーフの全て又は一部を置換した形として)挿入された異種ポリペプチド又はペプチドを有する場合、その異種ポリペプチド又はペプチドは、CanAナノチューブルの外表面に規則的ならせん状構造として提示され得る。一側面において、14残基、又は17残基より成る異種ペプチドが、除去された配列番号:2 の残基123から残基136よりなる14残基又は配列番号:2の残基123から残基139よりなる17残基と置換される。
【００２２】
一側面において、本発明のキメラカニューレタンパク質は、そのモノマー又はポリマー (例えば、ナノチューブル)の何れの形態においても、様々な条件下 (例えば、温度、pH又はカオトロピック剤や界面活性剤等の存在)で安定である。一側面において、本発明のポリマー成分は、異なる条件下において、異なる安定性を示すモノマーを含むヘテロポリマーである。
一側面において、本発明のモノマー又はポリマーは、ラセミ混合物より目的成分を分離するためのキラル選別因子として利用される。キラル選別因子タンパク質の正味の電荷及び電気泳動における移動度は、分離操作に使用される緩衝液 (例えば、水溶性緩衝液) のpHに大きく影響される。一側面において、本発明の分離法 ｛例えば、カニューレ融合 (ハイブリッド) タンパク質をキメラ選別因子として利用する分離法｝ は、様々なpHにおいて行われる。その分離法において使用される緩衝液のpHは目的に応じて変えられ、至適pHは通常のスクリーニングにより決定される。一側面において、その方法は、pH約5.5から8.5、pH約3〜10又はpH約2.5〜11の範囲に渡り行われる。
【００２３】
一側面において、本発明の分離法 (例えば、キラル選別) は、SDS及び/又は尿素の存在下、様々なpHにおいて行われる。水溶液中でのキラル分離能は、SDS及び/又は尿素の添加により向上する；例えば、Bojarski (1997) Electrophoresis 18：965-969を参照。安定性を調べるためのスクリーニングは、以下のように行うことができる：精製された組換えカニューレモノマータンパク質を、中性pHにてin vitroアッセンブル手順によりポリマーへとアッセンブルさせる。アッセンブル反応の完了後、その試料は遠心分離され、カニューレポリマーを含む沈殿物が回収される。
カニューレ融合 (ハイブリッド) タンパク質を含むナノチューブルの安定性は、本発明の方法を実行する際に使用される緩衝液の環境に影響され得る。本発明の分離法 (例えば、キラル選別) は、様々な一般的に利用されている有機修飾剤を用いて行うことができる。一側面において、有機修飾剤は、エナンチオマーの光学的分離能を向上させるため、本発明の方法を実行する際に使用される緩衝液中に添加される。その分離法を行う際に使用される有機修飾剤の濃度は目的に応じて変えられ、至適濃度 は通常のスクリーニングにより決定することができる。
一側面において、本発明は、例えば、以下の表に示されたような一般的に利用されている有機修飾剤の存在下における本発明のポリマーの安定性を評価するための方法をも提供する: 
【００２４】
2006502695.tif 000002
【００２５】
これらの修飾剤は、タンパク質を用いるキメラ選別法開発において一般的に利用されている有機修飾剤である。本発明の方法には、これらの修飾剤、他の修飾剤、及び、例えば、Busch (1993) J. of Chromatography A. 635：119-126；De Lorenzi (1997) J. of Chromatography A. 790:47-64；Ahmed (1997) J. of Chromatography A. 766：237-244において述べられている手順も組み込まれている。水溶性緩衝液中におけるポリマーの安定性を評価するために使用される全ての分析学的手法においても、これらの有機修飾剤15% (v/v)まで含む緩衝液中で行うことができるであろう。有機修飾剤のスクリーニングに使用される緩衝液及びその緩衝液のpHの選択には、水溶性緩衝液中におけるポリマーの安定性試験の結果を考慮に入れることができる。一側面において、これらの修飾剤は、pH約6.5〜8.0、pH約5.5〜9.0又はpH約4.5〜10の緩衝液を用いても分析される。
一側面において、本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル選択性及び本発明のキラル選別法における収率は、キャピラリー電気泳動法により決定される。一側面において、そのキラル選択性方法は、キャピラリー電気泳動法、及び、例えば、ベーター遮断薬等の商業的に入手可能な成分のラセミ混合物を用いて評価される。これらの方法は、また、例えば、キメラ及び/又は野生型 CanA、CanB、CanC、CanD等、あるいはポリマーの混合種を含む規則的ならせん状ナノチューブル等、本発明の様々な実施例における効率 (例えば、キラル選択性) を評価するためにも利用される。安定性試験により得られたデータは、また、特定のキラル選択的分離法の好ましい結果に依存して、スクリーニングに至適なpH、使用可能な添加物及び有機修飾剤濃度を決定するために利用できる。
【００２６】
一側面において、本発明のポリマー (例えば、ナノチューブル状キメラカニューレ) 及びモノマーを使用して得られる分離能は、商業的に入手可能なキラル選別因子を用いて決定される。商業的に入手可能なキラル選別因子を用いたキャピラリー電気泳動などによるベーターブロッカー等のラセミ体成分のラセミ混合物からの分離方法は、非常に多く報告されている。これらの方法は、タンパク質及び非タンパク質性のキラル選別因子の何れをも利用できる。一側面において、商業的に入手可能な鏡像異性体分離用媒体を取り入れた試験により、本発明のナノチューブル状キメラカニューレポリマー及びモノマーのキラル選別因子としての比較された効率性に関するデータが与えられる。
一側面において、本発明のキラル選択性又は本発明のポリマー (例えば、ナノチューブル状キメラカニューレ) 及び/又はモノマーを使用して得られた分離能は、キャピラリー電気泳動により、以下に示されたような商業的に入手可能なベーター遮断薬のラセミ混合物を用いて評価される：
【００２７】
2006502695.tif 000003
【００２８】
一側面において、本発明のキラル選択法、若しくは本発明のポリマー、及びモノマーを使用して得られる分離能は、キャピラリー電気泳動と、プロプラノロールのラセミ混合物を用いて評価される。多くの文献にプロプラノロールのエナンチオマーの分離が報告されており、これは、例えば、キメラカニューレモノマー及び (ナノチューブルを含む) ポリマー等の本発明の成分を用いたキラル選別法の条件を最適化するスクリーニング法の検討における有用な判断基準となる。プロプラノロールのエナンチオマー分離は、ウズラの卵白リボフラビン結合タンパク質 (例えば、上述の De Lorenzi (1997) を参照)、ペプシン、セロビオヒドロラーゼ及びウシ血清アルブミン (例えば、Tanaka (2001) J. of Biochem. Biophysical Methods 48：103-116及び Henriksson (1996) FEBS Letters 390：339-344を参照) を用いて行われている。
【００２９】
一側面において、本発明のポリマー中のモノマーは、例えば、キャピラリーの表面に固定化される。一側面において、本発明の方法は、例えば、GIGAMATRIXTM (ギガマトリックスTM：Diversa Corporation、San Diego CA)等のキャピラリー管を用いて行われる。未処理及びポリアクリルアミドでコートされたキャピラリーの両方が、本発明の方法を実行する際に使用できる。未処理のキャピラリーは、その壁面にキラル選別因子又は分析される試料が吸着されてしまうため、キメラ選別法には不適であろう(例えば、上述のTanaka (2001) を参照)。
【００３０】
上述のように、何れの分離用流体又は有機修飾剤であっても、本発明の方法を実行する上で利用可能である。日常的なスクリーニングにおける最適条件の決定は、Allenmark S.G. Chromatographic Enantioseparation. Methods and applications. pg 90-141、1998、West Sussex England、Ellis Horwood Limitedに記述されている最適化の手順に基づくことができる。この例において、分離条件を決定する上での初期条件として、添加物又は修飾剤を含まない中性の緩衝液系が使用される。目的のエナンチオマーが分離されない場合、その緩衝液のpHは5.5又は8.5に調節される。あるpH条件において、本発明のキメラカニューレモノマー又はポリマーと試料間での過剰な複合体形成による試料の損失が生じる場合、低濃度の有機修飾剤が添加されるであろう。また、緩衝液のpHの変更、異なる有機修飾剤の選択及び有機修飾剤濃度の変更によっても分離能は改善されるであろう。
一側面において、日常的なスクリーニング法は、例えば、上述のTanaka (2001) や、Chankvetadze (2001) J. of Chromatography A. 906：309-363 に記述された部分充填法を用いて行われる。このような例示的技術において、そのキャピラリー (例えば、ギガマトリックスTM (Diversa Corporation、San Diego CA等) の一部のみにキラル選択用タンパク質 (本発明のキメラカニューレモノマー又はポリマー) が充填される。これにより、タンパク質の有する高いUVバックグラウンド吸収による検出器における感度の低下が最小化される。この方法により、エナンチオマー分離において、最大500μMまでのタンパク質が使用可能となる。
【００３１】
向流技術も利用できる。向流分離において、分析試料は検出器を通過するがキラル選別用タンパク質(本発明のキメラカニューレモノマー又はポリマー)は検出器より離れるような電気泳動的移動が生じる条件が利用される（例えば、上述のChankvetadze (2001) を参照）。
別の一側面において、モノマー、ポリマー又はそれらの混合物が、本発明の方法を実施する際に使用される。キメラカニューレモノマーは、ナノチューブルへと自己アッセンブルする特性を有することができる。一側面において、異なるポリマー (例えば、キメラ及び野生型カニューレタンパク質を含むヘテロポリマー) 及びモノマー、他のポリマー及びモノマーに対するキラル分離能力は、例えば、ここで述べられているような日常的なスクリーニングによって決定することができる。キメラカニューレタンパク質は、ナノチューブルへアッセンブルすることにより、内腔表面、空洞及び外表面等を含む特有の微小環境を有する巨大分子構造を示す。加えて、サブユニットの規則的なアッセンブルによるらせん状構造の形成により、そのポリマーに付加的な対掌性が導入される。対掌性の量を変化させることにより、組成物のエナンチオマー選択性を増加させることができるため、本発明のポリマーは、様々な量の対掌性を有している。本発明のモノマー及びポリマーは、様々な束縛された四次構造を持つように設計できる。一側面において、束縛された四次構造を変化させることにより、キラル選択性の程度の変化が生じる。
【００３２】
一側面において、キラル選別は冷却条件および充分な二価カチオンが存在しない（１mM未満）条件下で行われ、従ってカニューレモノマー（例えばCanAモノマー）はクロマトグラフィーの際に自己アッセンブルしないであろう。
一側面において、本発明のキラル選別用組成物の能力は、商業的に入手可能なキラル選別因子の能力と比較される。一側面において、セロビオハイドロラーゼ又はα1-酸性糖タンパク質 (ChromTech AB Cheshire, UK) を充填したキャピラリーを用い、例えば、供給業者により提供された分離用条件下でベーター遮断薬の分離が行われる。高度に硫酸化されたシクロデキストリン (Beckman Coulter、Fullerton CA) を用いて、供給業者の仕様書に示された方法に基づいた分離能の比較も適用できる。その他の特性、例えば、良好な安定性又は分析試料を用いた際の最低限の干渉性なども評価できる。CanAの表面に暴露される非本質的領域にペプチド領域を挿入することにより作成されたキメラCanAポリペプチドを含む本発明のキメラカニューレタンパク質（図 1）は、これらの日常的なスクリーニング法により評価することができる。図１は、E. coli （大腸菌）により発現された組換えCanAの会合したナノチューブルの透過電子顕微鏡像である。
【００３３】
ナノチューブル状カニューレポリマーの原核生物微小管に対する巨大分子類似性により、微小管に関する分野において確立されている何れの分析的手法をも本発明のキメラカニューレタンパク質の分析に利用できる；例えば、Frederiksen D.W. and Cunningham L.W. Structural and Contractile Proteins、Part B：The Contractile Apparatus and the Cytoskeleton. 1982. Methods in Enzymology 85 [Part B]を参照。本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル選択性及び本発明のキラル選別法における収率の評価において、光学及び電子顕微鏡(例えば、透過電子顕微鏡)、分画遠心法、サイズ排除クロマトグラフィー及び/又は濁度測定法が利用できる。これらの各々の方法は、会合したキメラカニューレポリマーの安定性及び特性に関して僅かに異なる情報を提供する。
【００３４】
本発明のポリマーは、アッセンブル及び脱アッセンブルの後、例えば、Purich D.L.他 (1982) Microtubule disassembly：a quantitative kinetic approach for defining endwise linear depolymerization. Methods in Enzymology 85 [Part B]、439-450に記述されているような方法により、その溶液の濁度変化を測定することができる。一側面において、速度論的濁度測定法が利用される。速度論的濁度測定法は、ポリマーの重量濃度における変化を示すために利用することができる。これらの測定法は、脱重合速度を決定するために利用することができる。一側面において、溶液の濁度は、長い光束路を有するキュベット中、350nmでの分光光度を測定することにより決定される。この長い光束路により、吸光度変化が増強され、そのアッセイ系の感度が改良され得る。一側面において、この方法には、pH3〜10の緩衝液を含む長い光束路を有しかつ温度調節が可能なキュベットが含まれる。ポリマーの安定性は、そのポリマーの濃縮液を温度平衡に達している緩衝液を含むキュベット中で希釈して測定することができる。
【００３５】
一側面において、本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル選択性及び本発明のキラル選別法における収率は、冷却機による冷却系を用いて決定される。ポリマーの安定性は、各々の緩衝液pHにおいて、例えば、４℃から80℃等、様々な温度範囲において評価することができる。一側面において、試験用緩衝液中でのポリマーの過剰な希釈等による迅速希釈法での正確な脱重合速度の測定が不可能な場合、再懸濁法を利用することができる。再懸濁法において、ポリマーのペレットを温度平衡に達している緩衝液中で再懸濁するために、広口のピペットを使用することができる。そして、再懸濁されたペレットは、分析用のキュベットへ移すことができる。この方法の利点は、更に高濃度のポリマー溶液を使用できることである。しかし難点は、懸濁操作中に起こり得るポリマーの剪断によるばらつきである。
一側面において、本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル選択性及び本発明のキラル選別法における収率は、分画遠心法を用いて決定される。分画遠心法は、溶液中でのモノマーとポリマーに取り込まれたモノマーの分布を評価するために利用することができる。分画遠心法によるアッセイは、長時間の安定性評価に有用である。これらのアッセイにおいて、中性pHにおける標準的な条件下でアッセンブルしたポリマーは、遠心分離により沈殿させることができ、緩衝液中（例えば、pH 3〜10までの様々なpH）に再懸濁され、そして、特定の温度 (例えば、4〜80 ℃等の様々な温度)において予備平衡化することができる。この試料は、その温度で2 時間から24時間インキュベートされ、無傷のポリマーをペレット化させるために、再度遠心分離を行うことができる。その上清及び沈殿画分は、SDS-PAGEにより分析することができる。この上清画分には(ポリマーの脱重合により分離された)一切の可溶性モノマーが、そして、沈殿画分には無傷のポリマーが含まれているであろう。
【００３６】
一側面において、本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル体選択性及び本発明のキラル選別法における収率は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて決定される。サイズ排除クロマトグラフィーは、全体的なポリマーの分子量分布を分析するために利用することができる。ポリマー試料は、緩衝液中(例えば、pH３からpH10までの様々なpH)に再懸濁することができ、４℃において24時間インキュベートすることができる。インキュベーション後、その試料は、例えば、Sephacryl S-1000 カラム (Amersham Pharmacia、Piscataway NJ) などにより分画することができる。このサイズ排除カラムにより、短いポリマー及びオリゴマーからミクロン単位の長さのポリマーが分離されるであろう。ポリマーは、中性pH及び４℃において非常に安定であるため、この緩衝液処理は対照として利用することができる。
一側面において、本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル選択性及び本発明のキラル選別法における収率は、例えば、位相差及びDIC (differential interference contract) 光束の両方を備えたビデオ増幅型光学顕微鏡を利用して決定される。光学顕微鏡は、例えば、pH3〜10の間の様々なpHにおける長時間のインキュベーション(例えば、24〜48時間)後のポリマーの巨視的な形態の観察に利用することができる。光学顕微鏡により、ナノチューブルポリマー会合の程度に関する有用な情報が得られる。
【００３７】
一側面において、本発明のキメラカニューレモノマー及び/又はポリマーのキラル選択性及び本発明のキラル選別法における収率は、例えば、標準的な逆染色透過電子顕微鏡等の電子顕微鏡(EM)を利用して決定される。電子顕微鏡は、ナノチューブルの微細構造を観察するために使用することができる。電子顕微鏡は、無傷のポリマーの周期性及びらせん構造を分析する上で有用である。更に、電子顕微鏡により、様々なpH又は有機修飾剤の存在下におけるインキュベーション中に形成される他のタンパク質会合の様子も検出できる。インキュベーションの条件に依存して、原核生物の微小管は、例えば、Hyams J.S. and Lloyd C.W. Microtubules. 1993. New York、Wiley-Liss に記述されたような、環状、シート状及びリボン状等を含む様々な巨大分子構造へとアッセンブルすることが示されている。本発明のポリマーは、このような別の構造へとアッセンブル又は脱アッセンブルするように改変することが可能である。
本発明のキメラカニューレタンパク質は、後述するように、組換えタンパク質として大量かつ経済的に発現させることが可能である。
【００３８】
カニューレポリペプチド及びペプチド
本発明は、少なくとも、カニューレポリペプチドを含む第一の領域、および、少なくとも、異種ポリペプチド又はペプチドを含む第二の領域を含むキメラポリペプチドを提供する。本発明のキメラ (融合) カニューレポリペプチドは、カニューレ融合(キメラ)タンパク質を産生させるために、カニューレモノマーの配列と他のタンパク質又はペプチドをコードする配列 (異種配列) を融合させた配列を含む核酸によりコードされる組換えタンパク質であり得る。しかし、本発明のキメラ (融合) カニューレポリペプチドは、リンカーを含むいかなる手段によっても異種ポリペプチド又はペプチドと連結することができる。本発明のキメラ (融合) カニューレポリペプチドは、その一部又は全部が合成ポリペプチドであり得る。一側面において、本発明のキメラモノマーは、二量体、三量体 (望みの長さのポリマー)を形成することが出来、及び/又は、例えば、自己アッセンブルなどにより、ナノチューブルなどの四次構造のような高度に整列した構造へとアッセンブルできる。異種配列をそのカニューレタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に付加することができ、あるいは内部に付加することができる。
【００３９】
一側面において、本発明のキメラ (融合) カニューレタンパク質の部分配列が除去される。一側面において、本発明のキメラ (融合) カニューレタンパク質の部分配列が除去され、異種ポリペプチド又はペプチドで置換される。あるいは、異種ポリペプチド又はペプチドを、そのモノマーの他の部位 (即ち、除去された部分配列の遠位)に付加することができる。除去される配列は、そのカニューレタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端でもよく、あるいは内部に存在してもよい。一側面において、融合（ハイブリッド）CanAタンパク質において、除去および置換される配列部位は、配列番号:2の残基123〜136よりなる14残基 (即ち、“PDKTGYTNTSIWVP”)であるか又は配列番号:2のアミノ酸残基123〜139よりなる17残基 (即ち、“PDKTGYTNTSIWVPGEP”) である。CanAモノマーがポリマーナノチューブル形態として存在する場合、配列番号:2の残基123〜136よりなる14残基（即ち、“PDKTGYTNTSIWVP”）又は配列番号:2の残基123〜139よりなる17残基（即ち、“PDKTGYTNTSIWVPGEP”）は、ナノチューブルの外表面に発現される。一側面において、このチューブルは高密度のキラル選別因子として作用する。表層に暴露されたCanAの14又は17残基は、ナノチューブルの自己アッセンブルには必須ではない。従って、これらの領域は、例えば、キラル選別特性、リガンド結合特性等を有するペプチドの挿入部位となり得る。
【００４０】
本発明のキメラカニューレタンパク質は、一度アッセンブルすると、例えば、ナノチューブルとしてアッセンブルした場合、異種配列（キメラ/融合された相手のタンパク質）を特定の方向性で規則正しく配列されたらせん構造上に提示する分子のスキャッフォールドとして働く。この機能的柔軟性により、ナノチューブルの表面に、広範な適用性を有するキラル選別因子となる様々な組換えタンパク質を提示することが可能となる。その異種配列は、キラル選別モチーフ、酵素、活性部位、エピトープ、リガンド、受容体、抗原、抗体、抗原結合部位又は核酸結合部位などであり得る。
一側面において、本キメラカニューレモノマーは、例えば、E. coliのような細菌等の宿主細胞中で過剰発現される。一側面において、過剰発現されるポリペプチドは、本報で記述されているような核酸の突然変異及び/又は指向性タンパク質進化法により改変される。
【００４１】
本発明のキメラポリペプチドのカニューレ領域は、(配列番号:1によりコードされる)配列番号:2に記載されたCanAポリペプチド、(配列番号:3によりコードされる) 配列番号:4に記載されたCanBポリペプチド、(配列番号:5によりコードされる) 配列番号:6に記載されたCanCポリペプチド、(配列番号:7によりコードされる) 配列番号:8に記載されたCanDポリペプチド、(配列番号:9によりコードされる) 配列番号:10に記載されたCanEポリペプチドを含むことができる。本発明のキメラポリペプチドのカニューレ領域は、また、
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10に記載されたポリペプチドと50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、又は98 %の配列同一性を示すポリペプチドを含むことができ、そのカニューレ領域ポリペプチドは、ナノチューブルを形成することができ、及び/又は（モノマー又はポリマー型で） キラル選別因子として機能することができる。本発明のキメラポリペプチドのカニューレ領域は、また、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9に記載された核酸と50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、又は98 % の配列相同性を示す核酸によりコードされるポリペプチドを含むことができ、そのカニューレ領域ポリペプチドは、ナノチューブルを形成することができ、及び/又は（モノマー又はポリマー型で）キラル選別因子として機能し得る。本発明のキメラポリペプチドのカニューレ領域は、CanA、CanB、CanC、CanD、及び/又はCanDの混合物を含むこれらのタンパク質のうちの二種又はそれ以上を含むことができる。
【００４２】
用語、タンパク質又はポリペプチド配列又はアミノ酸配列には、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列、あるいはこれらのいずれかの断片、部位又はサブユニット及び天然の分子又は合成分子に対する配列が含まれている。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」には、お互いがペプチド結合又は改変されたペプチド結合 (即ち、ペプチドイソスター) で連結されたアミノ酸を含んでおり、遺伝子によりコードされる20種のアミノ酸以外の改変されたアミノ酸も含まれ得る。用語「ポリペプチド」は、また、ペプチドやポリペプチドの断片やモチーフなどをも含んでいる。この用語は、また、グリコシル化されたポリペプチドも含んでいる。本発明のペプチド又はポリペプチドは、また、全ての「擬似体 (mimetic)」及び「ペプチド擬似体」も含んでいる。
【００４３】
本発明は、また、本発明のキメラポリヌクレオチド又はポリペプチドの「変種(variants)」及びそれらの作製法を提供する。これらの変種は、一種又はそれ以上の塩基対、コドン、イントロン、エクソン又はアミノ酸残基が（それぞれ）改変されており、本発明のキメラポリペプチドの活性が維持されているか、または改変された活性を有している。変種は、例えば、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド-特異的変異、アセンブリーPCR、セクシュアルPCR変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、再帰的アッセンブル変異導入、指数的アッセンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブル、遺伝子部位飽和変異（GSSM）、及びこれらの一切の組み合わせによる多くの方法により作製することができる。例えば、あるpHや温度において、鋳型キメラポリペプチドとは異なる活性を示すキメラポリペプチド変種を作製する技術はここに含まれる。用語「遺伝子部位飽和変異」又は「GSSM」には、以下にその詳細が記述されるように、ポリヌクレオチドに点突然変異を導入するための縮退オリゴヌクレオチドプライマーを利用する方法が含まれている。用語「至適化された指向性進化系」又は「至適化された指向性進化」には、例えば、関連した遺伝子等、関連した核酸配列の断片の再アッセンブルを行うための方法が含まれており、その詳細は以下に記述されている。用語「合成連結再アッセンブル」又は「SLR」には、オリゴヌクレオチドを非確率的な様式で連結させる方法が含まれており、その詳細は以下に記述されている。
【００４４】
一側面において、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸は、クローン化され、E. coli などの宿主細胞中で過剰発現される。精製された組換えキメラカニューレタンパク質は、ナノチューブルへと自己アッセンブルできる。条件およびナノチューブル重合物を含むポリペプチド混合物又はチューブル重合体を触媒又は促進するタンパク質の存在に依存して、二価の陽イオンの添加が必要となることがある。その二価陽イオンは、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Sr2+、Ni2+、Mn2+及び/又はFe2+であってよい。一側面において、一種の二価陽イオン、例えば、Ca2+又はMg2+が必要とされる。他の一側面において、キメラカニューレタンパク質のナノチューブルへの自己アッセンブルには、Ca2+及び Mg2+の両方の二価陽イオンが必要とされる。一側面において、二価陽イオンはミリモル濃度で存在する。
【００４５】
本発明のキメラポリペプチドは、カニューレポリペプチドCanA、CanB、CanC、CanD及び/又はCanE、その部分配列及びその混合配列を含むことができる。以下の配列において、CanA及びCanA_pep は、各々配列番号:1に示された核酸配列及びそれに対応するアミノ酸配列 配列番号:2；CanB及びCanB_pepは、各々配列番号:3に示された核酸配列及びそれに対応するアミノ酸配列 配列番号:4；CanC及びCanC_pepは、各々配列番号:5に示された核酸配列及びそれに対応するアミノ酸配列 配列番号:6；CanD_partialは、配列番号:7に示された核酸配列又はそれに対応するアミノ酸配列配列番号:8；及びCanE_partialは、配列番号:9に示された核酸配列又はそれに対応するアミノ酸配列 配列番号:10を表している。
【００４６】
配列番号:1、3、5、7、及び9の核酸配列は以下のとおりである:
1                                               50
CanA    (1) GTGAAGTACACAACCCTAGCTATAGCGGGTATTATTGCCTCGGCTGCCGC
CanB    (1) GTGAAGCCTACGGCTCTAGCCCTGGCTGGTATCATTGCCTCGGCTGCCGA
CanC    (1) ATGAGGTACACGACCCTAGCTCTGGCCGGCATAGTGGCCTCGGCTGCCGC
CanD_partial    (1) --------------------------------------------------
CanE_partial    (1) --------------------------------------------------
コンセンサス    (1)  TGA G   AC  C CTAGC  T GC GG AT  T GCCTCGGCTGCCG 
51                                             100
CanA   (51) CCTCGCCCTCCTAGCAGGCTTCGCCACCACCCAGAGCCCCCTCAACAGCT
CanB   (51) CCTCGCCCTGCTAGCAGGCTTCGCCACCACCCAGAGCCCGCTCAACAGCT
CanC   (51) CCTCGCCCTGCTAGCAGGCTTCGCCACGACCCAGAGCCCGCTAAGCAGCT
CanD_partial    (1) ----------------------------------------------AGCT
CanE_partial    (1) ----------------------------------------------AGCT
コンセンサス   (51) CCTCGCCCT CTAGCAGGCTTCGCCAC ACCCAGAGCCC CT A CAGCT
101                                            150
CanA  (101) TCTACGCCACCGGTACAGCACAGGCAGTAAGCGAGCCAATAGACGTAGAA
CanB  (101) TCTACGCCACCGGCACAGCAGCCGCAACAAGCGAGCCAATAGACGTAGAG
CanC  (101) TCTACGCCACCGGCACAGCACAAGCAGTAAGCGAGCCAATAGACGTAGAG
CanD_partial    (5) TCTACGCCACCGGCACAGCACAGGCAGTAAGCGAGCCAATAGACGTGGTA
CanE_partial    (5) TCTACGCCACCGGCACAGCAGAGGCAACAAGCGAGCCAATAGACGTTGTA
コンセンサス  (101) TCTACGCCACCGGCACAGCACAGGCAGTAAGCGAGCCAATAGACGTAGAA
151                                            200
CanA  (151) AGCCACCT---CGGCAGCATAACCCCCGCAGCCGGCGCACAGGGCAGTGA
CanB  (151) AGCCACCT---CAGCAGCATAGCCCCTGCTGCTGGCGCACAGGGCAGCCA
CanC  (151) AGCCACCTAGACAACACCATAGCCCCTGCTGCCGGTGCACAGGGCTACAA
CanD_partial   (55) AGCAGCCTCGGTACG---CTAAATACTGCCGCTGGTGCACAGGGTAAGCA
CanE_partial   (55) AGCAACCTTAACACGGCCATAGCCCCTGCTGCCGGCGCCCAGGGCAGCGT
コンセンサス  (151) AGCCACCT   CA CA CATAGCCCCTGCTGCCGGCGCACAGGGCAGC A
201                                            250
CanA  (198) CGACATAGGTTACGCAATAGTGTGGATAAAGGACCAGGTCAATGATGTAA
CanB  (198) GGACATAGGCTACTTCAACGTGACCGCCAAGGATCAAGTGAACGTGACAA
CanC  (201) GGACATGGGCTACATTAAGATAACTAACCAGTCAAAAGTTAATGTAATAA
CanD_partial  (102) GACGCTAGGAGACATAACAATATATGCGCACAATGACGTGAACATAACAA
CanE_partial  (105) GGGCATAGGCAGCATAACAATAGAGAACAAGACTGACGTGAACGTTGTGA
コンセンサス  (201) GGACATAGGCTACATAA AATA   A CAAG AT A GTGAACGT ATAA
251                                            300
CanA  (248) AGCTGAAGGTGACCCTGCGTAACGCTGAGCAGCTAAAGCCCTACTTCAAG
CanB  (248) AGATAAAGGTGACCCTGGCTAACGCTGAGCAGCTAAAGCCCTACTTCAAG
CanC  (251) AGCTGAAGGTGACTCTCGCTAACGCCGAGCAGCTAAAGCCCTACTTCGAC
CanD_partial  (152) AGCTAAAGGTCACGCTTGCTAACGCTGCACAGCTAAGACCATACTTCAAG
CanE_partial  (155) AGCTGAAGATAACCCTCGCCAACGCTGAGCAGCTAAAGCCCTACTTCGAC
コンセンサス  (251) AGCTGAAGGTGACCCT GCTAACGCTGAGCAGCTAAAGCCCTACTTCAAG
301                                            350
CanA  (298) TACCTACAGATACAGATAACAAGCGGCTATGAGACGAACAGCACAGCTCT
CanB  (298) TACCTACAGATAGTGCTAAAGAGCG-------------------------
CanC  (301) TACCTACAGCTAGTACTCACAAGCAAC------------------GCCAC
CanD_partial  (202) TACCTGATAATAAAGCTAGTAAGCCT--------------GGACAGC-AA
CanE_partial  (205) TACCTACAGATAGTGCTAAAGAGCGT--------------TGACAGC-AA
コンセンサス  (301) TACCTACAGATAGTGCTAA AAGCG                 ACAGC A 
351                                            400
CanA  (348) AGGCAACTTCAGCGAGACCAAGGCTGTGATAAGCCTCGACAACCCCAGCG
CanB  (323) AGGTAGCTGA--CGAGATCAAGGCCGTAATAAGCATAGACAAGCCTAGCG
CanC  (333) TGGCACCGACA---TGGTTAAGGCTGTGCTAAGCCTCGAGAAGCCTAGCG
CanD_partial  (237) CGGCAACGAGTCCGAGGAAAAGGGCATGATAACTCTATGGAAGCCTTACG
CanE_partial  (240) CGAGATCAAGGCTG------------TGCTAAGCCTCGAGAAGCCCAGCG
コンセンサス  (351)  GGCA C A   CGAG   AAGGC GTGATAAGCCTCGAGAAGCCTAGCG
401                                            450
CanA  (398) CCGTGATAGTACTAGACAAGGAGGATATAGCAGTGCTCTATCCGGACAAG
CanB  (371) CCGTCATAATACTAGACAGCCAGGA-------------------------
CanC  (380) CAGTCATAATACTAGACAACGATGA-------------------------
CanD_partial  (287) CCGTGATAATACTAGACCATGAAGA-------------------------
CanE_partial  (278) CAGTCATAATACTGGACAACGAGGA-------------------------
コンセンサス  (401) CCGTCATAATACTAGACAACGAGGA                         
451                                            500
CanA  (448) ACCGGTTACACAAACACTTCGATATGGGTACCCGGTGAACCTGACAAGAT
canB  (396) ----------------CTTCGACA--------------G-----------
CanC  (405) ----------------CTACGATA--------------G-----------
canD_partial  (312) ----------------TTTCAACAACGACA--------------------
canE_partial  (303) ----------------CTTCCAGGGCGGC---------------------
コンセンサス  (451)                 CTTCGA A  G                       
501                                            550
CanA  (498) AATTGTCTACAACGAGACAAAGCCAGTAGCTATACTGAACTTCAAGGCCT
canB  (405) ------CAACAACAGAGCAAAG--ATAAGCGCCACTG----------CCT
CanC  (414) ------CACTAACAAGATACAGCTA-AAGGTAGA---A-------G-CCT
canD_partial  (326) -----TCGACAATGACGGCAACAATGACGCCAAGATAAGGGTTGTAGCCT
canE_partial  (316) -------GACAACCAGTGCCAGATAGACGCCACC------------GCCT
コンセンサス  (501)       C ACAAC AG  AAAG  AGAAGC A A T A        GCCT
551                                            600
CanA  (548) TCTACGAGGCTAAGGAGGGTATGCTATTCGACAGCCTGCCAGTGATATTC
canB  (437) ACTACGAGGCTAAGGAGGGCATGCTATTCGACAGCCTACCGCTAATATTC
CanC  (446) ACTATGAGGCTAAGGAGGGCATGCTATTCGACAGCCTACCAGTAATACTG
canD_partial  (371) ACTATGAGGCTAAGGAGGGTATGCT-------------------------
canE_partial  (347) ACTACGAGGCTAAGGAGGGTATGCTA------------------------
コンセンサス  (551) ACTACGAGGCTAAGGAGGGTATGCTATTCGACAGCCT CC  T ATA T 
601                                    642
CanA  (598) AACTTCCAGGTGCTACAAGTAGGCTAA---------------
canB  (487) AACATACAGGTGCTAAGCGTCAGCTAA---------------
CanC  (496) AACTTCCAGGTACTGAGCGCCGCTTGCAGTCCCTTGTGGTGA
canD_partial  (396) ------------------------------------------
canE_partial  (373) ------------------------------------------
コンセンサス  (601) AAC T CAGGT CT    G     T                 
【００４７】
配列番号:2、4、6、8、及び10のアミノ酸配列は以下のとおりである:
1                                               50
CanA_pep    (1) VKYTTLAIAGIIASAAALALLAGFATTQSPLNSFYATGTAQAVSEPIDVE
CanB_pep    (1) VKPTALALAGIIASAADLALLAGFATTQSPLNSFYATGTAAATSEPIDVE
CanC_pep    (1) MRYTTLALAGIVASAAALALLAGFATTQSPLSSFYATGTAQAVSEPIDVE
CanD_partial    (1) --------------------------------SFYATGTAQAVSEPIDVV
CanE_partial    (1) --------------------------------SFYATGTAEATSEPIDVV
コンセンサス    (1) VK T LALAGIIASAA LALLAGFATTQSPL SFYATGTAQAVSEPIDVE
51                                             100
CanA_pep   (51) SHLG-SITPAAGAQGSDDIGYAIVWIKDQVNDVKLKVTLRNAEQLKPYFK
CanB_pep   (51) SHLS-SIAPAAGAQGSQDIGYFNVTAKDQVNVTKIKVTLANAEQLKPYFK
CanC_pep   (51) SHLDNTIAPAAGAQGYKDMGYIKITNQSKVNVIKLKVTLANAEQLKPYFD
CanD_partial   (19) SSLGTLNT-AAGAQGKQTLGDITIYAHNDVNITKLKVTLANAAQLRPYFK
CanE_partial   (19) SNLNTAIAPAAGAQGSVGIGSITIENKTDVNVVKLKITLANAEQLKPYFD
コンセンサス   (51) SHL  SIAPAAGAQGS DIGYI I  K  VNVVKLKVTLANAEQLKPYFK
101                                            150
CanA_pep  (100) YLQIQITSGYETNSTALGNFSETKAVISLDNPSAVIVLDKEDIAVLYPDK
CanB_pep  (100) YLQIVLKSEVAD---------EIKAVISIDKPSAVIILDSQDFDSNNR--
CanC_pep  (101) YLQLVLTSNATG-------TDMVKAVLSLEKPSAVIILDNDDYDSTN---
CanD_partial   (68) YLIIKLVSLDSNG-----NESEEKGMITLWKPYAVIILDHEDFNNDID--
CanE_partial   (69) YLQIVLKSVDSN---------EIKAVLSLEKPSAVIILDNEDFQG-----
コンセンサス  (101) YLQIVL S  S          EIKAVISLDKPSAVIILD EDF       
151                                            200
CanA_pep  (150) TGYTNTSIWVPGEPDKIIVYNETKPVAILNFKAFYEAKEGMLFDSLPVIF
CanB_pep  (139) --------------------------AKISATAYYEAKEGMLFDSLPLIF
CanC_pep  (141) ----------------KIQ---------LKVEAYYEAKEGMLFDSLPVIL
CanD_partial  (111) ------------------N--DGNNDAKIRVVAYYEAKEGM---------
CanE_partial  (105) ----------------------GDNQCQIDATAYYEAKEGML--------
コンセンサス  (151)                           A I   AYYEAKEGMLFDSLPVI 
201        214
CanA_pep  (200) NFQVLQVG------
CanB_pep  (163) NIQVLSVS------
CanC_pep  (166) NFQVLSAACSPLW-
CanD_partial  (132) --------------
CanE_partial  (125) --------------
コンセンサス  (201) N QVL         
【００４８】
これらのポリマーは、短いファイバー状の形態をとり得るため、「ポリマーファイバー」とも呼ばれる。このポリマーファイバーは、例えば、配列番号:2 の配列を有する182アミノ酸残基、分子量19,830ダルトンのCanA等のモノマータンパク質単位から形成される。このタンパク質の二次構造は、主にβ-シート状構造であろう。
このポリマー中のタンパク質サブユニットは、右巻き又は左巻きの二重らせん構造を取って整列している。時として、そのポリマーファイバーが三本鎖らせん状構造をとることもある。このポリマーの周期性（一つのらせん構造から次のらせん構造までの距離）は4.4 nmである。このポリマーは、特有の四次構造を有している。このポリマーファイバーは、懸濁液中での外径が25nmで、内径が21nmである。電子顕微鏡による観察では、乾燥ネガティブ染色したポリマーファイバーは、その崩壊のため25nmの外径を示す。殆どのポリマーファイバーの長さは３〜５μmの間である。いくつかのポリマーファイバーは10〜25μmの長さに達することもある。このポリマーファイバーは、全径100〜500nmの複数のファイバーの束を形成することもある。この束は、全径4,000nmに達することもある。このポリマーファイバーは、少なくとも 128℃までの温度において安定である。
【００４９】
CanAナノチューブルは顕著な温度安定性を示し、例えば、128℃までの温度及び２% SDSの存在下、100℃で少なくとも60分間安定であり得る。精製された組換えCanBタンパク質もまたナノチューブル構造を形成するが、これは、規則性が低く、CanAにより形成されたナノチューブルほどの温度安定性を示さない。精製された組換えCanCタンパク質は、ナノチューブルへ自己アッセンブルしない。また、CanA（配列番号:2）、CanB（配列番号:4）及びCanC（配列番号:6）は、非常に類似したタンパク質であるが、インビトロにおいて非常に異なるポリマー形成能を示す。
【００５０】
2006502695.tif 000004
表１: CanA、CanB及びCanCのアミノ酸配列の比較
【００５１】
CanAとCanBとの一つの違いは、CanA 配列中央部付近における14アミノ酸残基の挿入である（図 2）。免疫電子顕微鏡及びこの14残基配列に特異的な抗体を使用して、この配列が会合したナノチューブルの表面に提示されていることが確認された。CanBにおけるこれに対応する配列の欠如は、このペプチド領域がナノチューブルアッセンブルに必須でないことを示している。よって、この配列を取り除き、CanAの構造を変えるようなペプチド領域と置換させることが可能である。一側面において、この内在性14残基モチーフの異種ペプチドとの置換により、CanAの立体選択性が変更される。
本発明の組換えキメラタンパク質は、例えば、E. coli のような細菌等の宿主細胞中で発現させることができ、加熱処理による宿主 (例えば、E. coli)タンパク質の変性及び沈殿により宿主由来のタンパク質より分離することができる。可溶性の熱安定性タンパク質（例えば、CanA）は、遠心分離後の上清から回収することができる。このキメラタンパク質は、この段階でアッセンブル-受容(assembly-competent)タンパク質となり得る。一側面において、自己アッセンブル反応は、ミリモル濃度のCa2+及びMg2+の添加により開始される。一側面において、ナノチューブルのアッセンブル反応後、これらは陽イオンを含まない緩衝液中及び20mMまでのキレート剤（例えば、EDTAやEGTA等）を含む緩衝液中で安定である。
【００５２】
コロイド安定性：  本発明のナノチューブルは、様々な程度の対形成、束状化（bundling）、絡み合い（entangling、体積排除相互作用）及び静電気的架橋（二価陽イオンによる架橋）による相互作用が可能である。異なるタイプの凝集塊は、ロッド対から相互に連結した網状へと増加する大きさを有している。CanAナノチューブルの束状化は、マグネシウム依存的過程である。CanAは、マグネシウムの非存在下ではわずかな束状化しか示さない。しかし、ミリモル濃度のマグネシウムの添加により、CanAナノチューブルは、標準的な位相差光学顕微鏡で観察可能な束を形成する。
ナノチューブルの弾性(stiffness)：  CanAナノチューブルは、透過型及び原子間力電子顕微鏡により画像化されている。透過型電子顕微鏡による単一ファイバーの真空中での熱振動分析により、CanAの屈曲係数（bending modulus）は、約5±2 GPaであることが示された。この結果は、例えば、２GPaの屈曲係数を有する微小管などの同様の次元性を示す他の強固な生体ポリマーより幾分高く、ポリ（6-アミド）又はポリ（メチルメタクリル酸）や、PLEXIGLASTM等の最も強い屈曲係数を有する合成ポリマーファイバーの屈曲係数に匹敵する。
【００５３】
一側面において、本発明のキメラCanAタンパク質は、例えば、キャピラリー電気泳動法においてキラル選別因子として利用される。血清アルブミンは、エナンチオマーを効果的に分離するためのキメラ選択的固定相として利用された最初のタンパク質の一つである（Allenmark、1998 を参照）。多くのタンパク質が、キャピラリー電気泳動法によるキメラ選別を行うために利用されている。これらのタンパク質には、例えば、上述のTanada (2001)に記述されているようなα1-酸性糖タンパク質、アビジン、オボムコイド、トランスフェリン、チトクロームc、リソゾーム、ペプシン、セルラーゼ及びセロビオハイドロラーゼが含まれている。タンパク質は、例えば、Lloyd (1995) J. of Chromatography A. 694：285-296に記述されているように、様々なキラル選別法において頻用できるため、キラル選別因子としての利用に適している。更に、タンパク質は、水溶性緩衝液中でのキラル選別に利用できるため、例えば、上述Busch (1993)に記述されているような生物由来の試料の分析においても優れた選択肢の一つである。従って、その他の特徴として、本発明のキメラCanAポリペプチドは血清アルブミン、α1-酸性糖タンパク質、アビジン、オボムコイド、トランスフェリン、チトクロームc、リソゾーム、ペプシン、セルラーゼ及びセロビオハイドロラーゼに由来するキメラ選別モチーフを含んでいる。本発明のキメラCanAポリペプチドは、キラル選別能を有するペプチドモチーフの何れをも含むことができる。これらのモチーフは、CanA中に挿入すること、あるいはCan Aに付加することができる。一側面において、これらのモチーフは、例えば、配列番号:2 の残基123〜136よりなる14残基又は配列番号:2 の残基123〜139よりなる17残基等、CanAより取り除かれた部分配列と置換するために使用される。
【００５４】
本発明のキメラモノマー又はポリマーは、検出可能部分を含むことができる。一側面において、その異種モチーフは、例えば、グリーン蛍光タンパク質等の検出可能部分である。一側面において、本発明は、グリーン蛍光タンパク質モチーフを持つキメラモノマーを含むナノチューブルを提供している。これらのモノマー及びナノチューブルは、ナノチューブルの形成、解離及び機能の研究に利用することができる。例えば、図3は、CanAのリーディングフレーム（配列番号:1）とグリーン蛍光タンパク質ZSGREENTM（BD Biosciences Clontech、Palo Alto CA）のリーディングフレームとの連結により作製された融合タンパク質が会合したナノチューブルの免疫光学顕微鏡写真である。
本発明は、例えば、上述のBusch (1993)に記述されたように、緩衝液添加粒として溶液中で遊離タンパク質を使用したエナンチオマー分離法、及び、例えば、上述のTanada (2001)や、Ito (2001) J. of Chromatography A 925：41-47に記述されたような様々な方法により固定化されたタンパク質を使用したエナンチオマー分離法を提供している。これらの方法には利点と欠点の両方が存在する。溶液中でタンパク質を利用する方法では、そのタンパク質の天然の構造が保持されるため、そのキラル分離能に関与する部位は均一に提示される。しかし、キャピラリー電気泳動に基づく方法では、緩衝液溶液中に存在するタンパク質により非常に高いUVのバックグラウンド吸収が生じる。この問題は、部分充填及び向流技術により解決され、これらの方法により、比較的高い濃度のタンパク質溶液が検出器におけるバックグラウンド吸収の問題なく利用できる。例えば、上述のTanaka (2001)及びChankvetadze (2001)に記述されているような部分充填及び向流技術は、関連技術者には良く知られている。
【００５５】
一方、固定化技術の利用により、高濃度のキラル選別用タンパク質を備えたキャピラリーの作製が可能となる。これらの技術に潜在する欠点として、タンパク質の固定化に伴う不均一性が挙げられる。この不均一性は、例えば、前述のLloyd (1995)に記述されているように、タンパク質リガンド相互作用を分析する際に特に重要である。固定化法の結果として生ずるタンパク質の立体構造の変化は、タンパク質リガンド相互作用を著しく変化させ得るため、これらのタイプの分析にはより頻繁にタンパク質キラル選別因子を溶液中が遊離状態で使用される。
それらの立体特異的分子認識能力によれば（例えばLakshmi(1997)Nautre 388:758-760；Henriksson(1966)既出を参照せよ）、酵素およびアポ酵素は本発明の添え異物及び方法において使用するキラル選別因子の供給源である。従って、本発明はナノチューブルを含むキメラモノマーまたはポリマーを提供し、それらにはキラル選別因子酵素およびアポ酵素、および、酵素の活性部位モチーフのような酵素およびアポ酵素のキラル選別因子ペプチドモチーフが含まれる。ナノチューブルを含む本発明のキメラモノマーおよびポリマーは、酵素またはアポ酵素、またはいかなる酵素活性部位モチーフも含むことができる。例えば、ナノチューブルおよび活性部位モチーフを含む本発明のキメラモノマーおよびポリマーはグリコシルトランスフェラーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、アミダーゼ、リパーゼ、ポリメラーゼ、セルラーゼ、ヒドロラーゼ、デアミナーゼ、ニトロレダクターゼその他から誘導することができる。
【００５６】
本発明のキメラモノマー又はポリマーを作製及び/又は使用するためのポリペプチド及びペプチドは、天然資源より単離することができ、あるいは合成物又は組換えにより作製されたポリペプチドでもあり得る。ペプチド及びタンパク質は、インビトロ又はインビボにおいて組換え的に発現できる。本発明のポリペプチド及びペプチドは、関連技術内で知られている何れの方法によっても作製及び単離が可能である。本発明のキメラモノマー又はポリマーを作製及び/又は使用するためのポリペプチド及びペプチドは、例えば、以下に記述されているような関連技術内でよく知られている化学的方法により、その全体又は一部の合成が可能である：Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；Banga A.K.、Therapeutic Peptides and Proteins、Formulation、Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co.、Lancaster PA。例えば、ペプチド合成は、例えば、Roberge (1995) Science 269：202 やMerrifield (1997) Methods Enzymol. 289：3-13 に記述されているような固相技術を利用して行われ、それらの自動化された合成は、例えば、ABI 431A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer）を用いて製造業者により提供される説明書に従って行われる。
【００５７】
本発明のキメラモノマー又はポリマーを作製及び/又は利用するためのポリペプチド及びペプチドは、また、グリコシル化することができる。このグリコシル化は、タンパク質への翻訳後、化学的又は細胞内の生合成系を利用して行うことができ、後者ではその配列にとって天然のグリコシレーションモチーフが利用されるか、あるいはグリコシレーションモチーフとして知られるペプチド又はそれをコードする核酸配列の付加により行うことができる。このグリコシル化はO-結合型でもN-結合型でもよい。
本発明のキメラモノマー又はポリマーを作製及び/又は利用するためのポリペプチド及びペプチドは、上述に定義されたような全ての「擬似体」及び「ペプチド擬似体」を含んでいる。用語「擬似体」及び「ペプチド擬似体」は、本発明のポリペプチドと本質的に同様な構造及び/又は機能的特性を有している合成化合物を意味している。この擬似体は、アミノ酸の非天然類似体により完全に構成されたものでもよく、あるいは部分的に天然のペプチドアミノ酸で部分的に非天然のアミノ酸類似体であるキメラ分子であってよい。この擬似体は、また、その置換により擬似体の構造及び/又は活性が本質的に変化しない限り、如何なる天然アミノ酸による保存的置換をも含むことができる。保存的変種である本発明のポリペプチドに関して、擬似体が本発明の範囲内であるかどうか、即ち、その構造や機能が本質的に変更されていないかどうかは日常的な実験により決定できるであろう。よって、一側面において、その擬似体成分は、アミラーゼ活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。
【００５８】
ポリペプチド疑似体組成は、非天然構造構成成分を如何なる組み合わせでも含められる。別の側面として、本発明の疑似体組成物は、次の三種の構造基を一つあるいは全て含む：a)天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基結合グループ；b)天然に存在するアミノ酸残基に代わる非天然残基；あるいは、c)二次構造疑似体を誘導する残基、即ち、例えば、ベーター-ターン、ガンマ-ターン、ベーター‐シート、アルファー-へリックスのコンフォメーションその他の二次構造を誘導又は安定化するもの。例えば、本発明のポリペプチドは、その全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合されている場合、疑似体として特徴付けることができる。個々のペプチド疑似体残基は、ペプチド結合、他の化学結合、あるいはカップリング手段、例えば、グルタールアルデヒド、N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル、二官能性マレイミド、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）等によって結合されることができる。伝統的な天然のアミド結合（「ペプチド結合」）に代えることのできる結合グループは、例えば、ケトメチレン（例えば、-C(=O)-NH-に代わる-C(=O)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チアミド、あるいはエステル（例えば、Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins、7巻、pp 267-357、”Peptide Backbone Modifications” Marcell Dekker、NYを参照）である。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基に代えて非天然残基を全てに又はいくらか含ませることにより、疑似体として特徴付けることができる。非天然残基は、科学文献又は特許によく述べられている；天然アミノ酸残基の疑似体として有用である典型的な非天然組成及び指針を以下に述べる。芳香族アミノ酸の疑似体は、例えば、次の置換によって作製できる。それらは、D-あるいは L-ナフチルアラニン；D-あるいはL-フェニルグリシン; D-あるいはL-2チエネイルアラニン; D-あるいは L-1、-2、3-、又は4-ピレニルアラニン；D-あるいは L-3チエネイルアラニン；D-あるいはL-(2-ピリジル)-アラニン；D-あるいはL-(3-ピリジル)-アラニン；D-あるいはL-(2-ピラジニル)-アラニン；D-あるいはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；D-p-フルオロ-フェニルアラニン；D- あるいは L-p-ビフェニルアラニン；D-あるいは L-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン；D-あるいはL-2-インドール(アルキル)アラニン；及び D-あるいはL-アルキルアラニン等で、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、セクイソチル、イソペンチル、あるいは非アミノ酸で置換してもしなくてもよい。非天然アミノ酸の芳香環には、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、及びピリジル芳香環が含まれる。
【００６０】
酸性アミノ酸の疑似体は、負荷電を維持しつつ、非カルボキシアミノ酸（例えば、フォスホアラニン、硫酸化スレオニン）による置換によって作製できる。カルボキシ側鎖（例えば、アスパルチル又はグルタミル）は、1-シクロヘキシル-3(2-モルフォリニル-(4-エチル)カルボジイミド又は 1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメソルペンチル)カルボジイミドのようなカルボジイミド（R'-N-C-N-R’）を用いた反応によっても選択的に改変することができる。アスパルチル又はグルタミルは、アンモニウムイオンを用いた反応によってアスパラギニル又はグルタミニル残基に転換できる。塩基性アミノ酸の疑似体は、例えば、（リジン、アルギニンに加え）アミノ酸オルニチン、シトルリン、あるいは (グアニジノ)アルキル-酢酸による置換によって作製できる。ここでアルキルは、上に定義したものである。ニトリル誘導体（例えば、COOH に代わりCN-残基を含んでいる）は、アスパラギン又はグルタミンの代わりに置き換えることができる。アスパラギニル又はグルタミニル残基は、対応するアスパラギニル又はグルタミニル残基に脱アミノ化することができる。
【００６１】
アルギニン残基疑似体は、アルギニルと一種以上の簡便な試薬、例えば、フェニルグリオキザール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロ-ヘキサンジオン、あるいはニンヒドリン等を、好ましくはアルカリ条件下で、反応させることにより作製することができる。チロシン残基疑似体は、チロシルを、例えば、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることにより作製することができる。N-アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンは、それぞれ O-アセチルチロシル体及び3-ニトロ誘導体を形成するために使用することができる。システイン残基疑似体は、システイニル残基を、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミド及び対応するアミン（カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える）のようなアルファー-ハロアセテートと反応させることにより作製することができる。システイン残基疑似体は、システイニル残基を、例えば、ブロモ-トリフルオロアセトン、アルファー-ブロモ-ベーター-(5-イミドゾイル) プロピオン酸；クロロアセチルフォスフェート、N-アルリルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィッド；メチル 2-ピリジルジスルフィッド；p-クロロマーキュリーベンゾエイト；2-クロロマーキュリー-4 ニトロフェノール；あるいはクロロ-7-ニトロベンゾ-オギザ-1,3-ジアゾールと反応させることにより作製することができる。
【００６２】
リジン残基疑似体は、リジニル残基を、例えば、コハク酸又は他の無水カルボン酸と反応させることにより作製することができる（又アミノ末端残基は、変えられることができる）。リジン及び他のアルファー-アミノ含有残基疑似体は、メチルピコリンイミデート、ピリドキサルフォスフェート、ピリドキサル、クロロボロヒドリッド、トリニトロ-ベンゼンスルフォン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオン、及びグリオキシレイトとのトランスアミダーゼ-触媒反応等のようなイミドエステルとの反応により作製することもできる。メチオニン疑似体は、例えば、メチオニンスルホキシドを用いた反応により作製できる。プロリン疑似体は、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジン、カルボン酸、3-あるいは4- ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-あるいは4-メチルプロリン、あるいは3,3-ジメチルプロリン等を含む。ヒスチジン残基疑似体は、ヒスチジルと、例えば、ジエチルプロカーボネイト又はp-ブロモフェナシルブロミドを反応させることにより作製できる。他の疑似体は、例えば、プロリン及びリジンの水酸化；セリル又はスレオニル残基の水酸基のリン酸化；リジン、アルギニン及びヒスチジンのアルファー-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアシル化；主鎖アミド残基のメチル化又はN-メチルアミノ酸との置換；あるいはC-末端カルボキシル基のアミド化等が含まれる。
【００６３】
本発明のポリペプチドのある残基、例えば、アミノ酸、は、キラリティーが逆のアミノ酸（又はペプチド疑似体）により置き換えることもできる。従って、Ｌ-配座（それは、化学的実体の構造に依存してＲ又はＳとして言及することもできる）で天然に存在する如何なるアミノ酸も、同じ化学構造的タイプのアミノ酸又はペプチド疑似体で置換することができるが、Ｄ-アミノ酸と呼ばれる逆のキラリティーのものも、また、Ｒ-又はＳ-型として言及されることができる。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを転写後修飾（例えば、リン酸化、アシル化等）のような天然のプロセス、あるいは化学的修飾技術により改変する方法及びその結果として生じる改変されたポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ、あるいはカルボキシ末端を含むポリペプチドのどの部分でも起こり得る。同じタイプの改変が、与えられたポリペプチド中の数ヵ所で同じ、あるいは異なった度合で存在するかもしれないことが理解されるであろう。与えられたポリペプチドは、また、多様な改変タイプを含んでもよい。改変は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的な付加、ヘム基の共有結合的付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合的付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合的付加、フォスファチジルイノシトールの共有結合的付加、クロスリンク環状化、ジスルフィッド結合の形成、脱メチル化、共有結合クロスリンクの形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシレーション、GPIアンカーの形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペジル化（PEG化）、タンパク質分解的修飾、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びアルギニル化のようなトランスファーRNAにより媒介されるアミノ酸のタンパク質への付加等が含まれる。例えば、Creighton, T.E.、Proteins-Structure and Molecular Properties 第二版、W.H. Freeman and Company、New York (1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson、編集、Academic Press、New York、pp.1-12 (1983)を参照。
【００６４】
固相化学ポリペプチド合成法も、本発明のポリペプチド又は断片の合成に用いることができる。そのような方法は、よく知られた技術であり、（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85：2149-2154, (1963)；Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis、第二版、Pierce Chemical Co.、Rockford Ill.、pp.11-12を参照；又、商業的に入手可能な研究用のペプチドデザイン及びキット（Cambridge Research Biochemicals）に利用されている。そのような商業的に入手可能な研究用キットは、一般的に H. M. Geysen 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81：3998 (1984)の教示を利用し、一枚のプレートに全てが結合している複数の「ロッド」又は「ピン」のチップ上でのペプチド合成が提供される。そのようなシステムが使われる場合、ロッド及びピンのプレートが二番目のプレートの対応するウェルへ転回及び挿入され、それには、ピン又はロッドのチップに適当なアミノ酸を付着又はつなぐための溶液が含まれる。このプロセスを繰り返すことにより、即ち、そのロッド及びピンのチップを適当な溶液に転回又は挿入することを繰り返すことにより、適当なアミノ酸が望ましいペプチドに組み込まれる。更に、複数の入手可能なFMOCペプチド合成システムが利用できる。
【００６５】
核酸の作製と操作
本発明は、発現ベクターのような発現カセットを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。また、本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードしている核酸を、例えば、合成結合再アッセンブル、至適化指向進化システム及び/又は飽和変異導入により改変する方法を含んでいる。
本発明の核酸は、例えば、cDNAライブラリーのクローニングや発現、メッセージ又はゲノムDNAのPCRによる増幅その他により作製、単離及び/又は操作することができる。本発明は、科学文献及び特許によく述べられている如何なる方法又はプロトコール又は既に知られている装置との組み合わせにより実践することができる。
【００６６】
一般的な技術
本発明の実施に使われる核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス、又はそれらの雑種の類に関わらず、種々の供給源から単離することができ、遺伝学的に操作し、増幅及び/又は発現/組換え的に作製することができる。これら核酸より作製された組換えポリペプチドは、望まれる活性について個々に単離又はクローン化して調べることができる。細菌、高等動物、酵母、昆虫又は植物細胞の発現システムを含む如何なる組換え発現システムを使用することができる。
あるいは、これらの核酸は、例えば、以下に述べられるような、よく知られる化学合成技術によりインビトロで合成することができる。例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661；Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33：7886-7896；Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68：109；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859；米国特許番号4,458,066。
例えば、サブクローニング、プローブの標識(例えば、クレノーポリメラーゼを用いたランダム‐プライマー標識、ニックトランスレーション、増幅)、シークエンシング、ハイブリダイゼーションその他のような核酸を操作する技術は、例えば、以下の科学文献及び特許文献によく述べられている：Sambrook 編集、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (第二版)、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Ausubel 編集、 John Wiley & Sons, Inc.、New York (1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES、Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation、Tijssen 編集、Elsevier、N.Y. (1993)。
【００６７】
本発明の方法を実施するために使われる核酸を得たり操作したりするための他の有用な手段は、ゲノムサンプルからクローン化すること、所望であれば、例えば、ゲノムクローン又はcDNAクローンからスクリーン単離又は増幅したインサートを再クローン化することである。本発明の方法に使われる核酸の供給源には、高等動物の人工染色体(MAC)中に含まれたゲノム又はcDNAライブラリーが含まれる。例えば、米国特許番号 5,721,118；6,025,155；ヒト人工染色体、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15：333-335；酵母人工染色体 (YAC)；バクテリア人工染色体(BAC); P1 人工染色体、Woon (1998) Genomics 50：306-316；P1-由来 ベクター (PACs)、Kern (1997) Biotechniques 23：120-124；コスミド、組換えウイルス、ファージ又はプラスミド、を参照。
【００６８】
一側面において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はその断片の分泌を指令するリーダー配列と適切な位相でアッセンブルすることができる。
本発明は、融合タンパク質及びこれらをコードする核酸を提供する。キメラ選別モチーフ、酵素、受容体、リガンド、抗体、抗原、エピトープその他に加え、本発明中のポリペプチドは、N-末端同定ペプチドのような異種のペプチドやポリペプチドと融合させることができ、それらにより安定性の増加や精製の簡便化等の望ましい特性をそのポリペプチドに与えることができる。本発明中のペプチドやポリペプチドは、例えば、より免疫原性のペプチドの産生、組換え的に合成したペプチドのより容易な単離、抗体や抗体発現B細胞の同定ならびに単離等のために、一つ、あるいはそれ以上の付加的な領域と結合した融合タンパク質として合成又は発現させることができる。検出や精製を容易にするドメインとして、以下のものが含まれる; 固定化金属に関する精製を可能にするポリヒスチジン鎖及びヒスチジントリプトファン モジュールなどの金属キレートペプチド；固定化免疫グロブリンに関する精製を可能にするプロテインAドメイン；及びFLAGS伸張/親和性精製システム(Immunex Corp、Seattle WA)において利用されるドメイン；及び精製用ドメインと精製を容易にするモチーフ含有ペプチド又はポリペプチドとの間への第Xa因子例えば、発現ベクターは、チオレドキシンとエンテロキナーゼ切断部位を伴う六つのヒスチジン残基に結合したエピトープをコードする核酸配列を含むことができる(Williams (1995) Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12：404-414を参照)。ヒスチジン残基が検出や精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質の残りの部分からそのエピトープを精製する手段を提供する。
【００６９】
転写、及び翻訳を調節する配列
本発明は、RNA合成/発現を誘導又は調節するための、例えば、プロモーター又はエンハンサーのような発現(例えば、転写、あるいは翻訳の)調節配列と機能可能に結合した本発明の核酸配列(例えば、DNA)を提供する。その発現調節配列は、発現ベクター中に含めることができる。典型的な細菌のプロモーターには、lac I、lac Z、T3、T7、gpt、ラムダ PR、P、及びtrpが含まれる。典型的な真核生物のプロモーターには、前初期CMV、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期 SV40、レトロウイルス由来LTR, 及びマウス メタロチオネインIが含まれる。
細菌におけるポリペプチド発現に適したプロモーターには、E.coli のlac又はTrpプロモーター、lac Iプロモーター、lac Zプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダ PRプロモーター、PLプロモーター、3-フォスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)などの解糖系酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核生物のプロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期 SV40プロモーター、レトロウイルス由来LTRプロモーター、及びマウス メタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞、真核細胞、又はそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を調節することが知られている他のプロモーターもまた使用することができる。
【００７０】
本発明は、例えば、本発明のキメラポリペプチドを組織特異的に発現できるような、組織特異的に発現できる発現カセットを提供する。本発明は、本発明のキメラポリペプチドを組織特異的に発現する植物又は種子を提供する。その組織特異性は、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的その他であり得る。本発明の核酸は、化学試薬に曝すと誘導し得る植物プロモーターに動作可能に結合させることができる。
【００７１】
発現ベクター及びクローニングビヒクル
本発明は、例えば、本発明のキメラポリペプチドをコードする配列のような本発明の核酸を含む発現ベクター及びクローニングビヒクルを提供する。本発明における発現ベクター及びクローニングビヒクルには、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリア人工染色体、ウイルスDNA(例えば、ワクチニア、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及び SV40 型ウイルス)、P-1由来人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び関心対象の特定の宿主(bacillus、Aspergillus及び酵母)に対して特異的なその他のベクターが含まれる。本発明のベクターは、染色体由来、非-染色体由来、及び合成されたDNA配列を含むことができる。複数の有用なベクターが、関連技術内で知られており、これらは商業的な入手が可能である。代表的なベクターには、細菌用：pQE ベクター(Qiagen)、pBluescript プラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター(Stratagene)；ptrc99a, pKK223-3、pDR540、pRIT2T (Pharmacia)；真核細胞用：pXT1、pSG5 (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40 (Pharmacia)。しかし、宿主内での複製が可能である限り、その他のプラスミドやベクターも使用することが出来る。低コピー数、あるいは高コピー数のベクターが、本発明において使用することができる。
【００７２】
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位及び転写終結配列を含み得る。これらのベクターは、また、発現を増加させるための適切な配列も含んでよい。哺乳類発現ベクターは、複製起点、一切の必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、及び5’非転写配列を含むことができる。ある例では、SV40スプライス由来のDNA配列やポリアデニル化部位等が必要とされる非転写配列を与えるために利用されるかもしれない。一側面において、発現ベクターは、そのベクターを含んでいる宿主細胞の選別を可能にするための一種類以上の選択マーカー遺伝子を含んでいる。このような選択マーカーには、真核細胞用として、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、あるいはネオマイシン耐性遺伝子、E.coliにおけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、及びS. cerevisiae TRP1遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコール トランスフェラーゼ(CAT)ベクターやその他のベクターを用いて如何なる好ましい遺伝子からでも選択することができる。
【００７３】
真核細胞中でポリペプチド、あるいはその断片を発現させるためのベクターは、その発現レベルを増加させるためのエンハンサーも含むであろう。その例として、複製起点より約100〜270塩基対下流に存在するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製オリジン下流に存在するポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーがある。
核酸配列は、様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般的に、その配列は、挿入物及びベクターを適当な制限酵素で酵素消化した後に、ベクターの好ましい部位に結合される。別法として、挿入物及びベクターの平滑末端を結合させてもよい。例えば、Ausubel及びSambrookに述べられているように、様々なクローニング技術が知られている。そのような操作及び他の技術も当業者の能力の範囲内にあると考える。
【００７４】
ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、あるいはファージのいずれの形態でもよい。他のベクターには、染色体、非-染色体及び合成DNA配列、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクチニア、アデノウイルス、ポックスウイルス、及び仮性狂犬病ウイルスのようなウイルスDNAが含まれる。原核及び真核宿主を用いた様々なクローニング及び発現ベクターの使用は、例えば、Sambrookにより述べられている。宿主において複製及び増殖可能である限り、如何なるベクターを使用してもよい。
本発明の核酸は、発現カセット、ベクター又はウイルスで発現されることができ、植物細胞や種子において一過性又は安定に発現させることができる。一つの典型的な一過性発現システムは、例えば、スーパーコイルDNAを含むエピゾームのミニクロモゾームの転写により核中で産生されるカリフラワー モザイクウイルス(CaMV)のウイルスRNAのようなエピゾーム発現系を用いている。Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1633-1637を参照。別法として、コードしている配列、即ち、本発明の全配列又はサブ配列、を植物宿主細胞ゲノムに挿入することができ、宿主染色体DNAの完全な一部にすることができる。センス又はアンチセンス転写物は、この方法により発現できる。本発明の核酸に由来する配列(例えば、プロモーター又はコード領域)を含むベクターは、植物細胞又は種子において選別可能な表現型を与えるためにマーカー遺伝子を含めることができる。例えば、そのマーカーは、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性のような抗生物剤耐性、あるいはクロロスルフォン又はバスタに対する耐性のような特別な抗生物質耐性をコードすればよい。
【００７５】
植物において核酸やタンパク質を発現すことのできる発現ベクターは、よく知られた技術であり、例えば、以下に由来するベクターを含み得る。Agrobacterium spp.、ポテトウイルス X (例えば、Angell (1997) EMBO J. 16：3675-3684を参照)、タバコモザイクウイルス(例えば、Casper (1996) Gene 173：69-73を参照)、トマトブッシースタントウイルス(例えば、Hillman (1989) Virology 169：42-50を参照)、タバコエッチウイルス(例えば、Dolja (1997) Virology 234：243-252を参照)、インゲンゴールデンモザイクウイルス(例えば、Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37：471-476を参照)、カリフラワーモザイクウイルス(例えば、Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10：1094-1101を参照)、メイズAc/Ds 転位エレメント(例えば、Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17：6294-6302；Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204：161-194を参照)、及びメイズサプレッサー−ミューテーター(Spm) 転位エレメント(例えば、Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32：717-725を参照)；及びそれらの誘導体。
【００７６】
一側面において、発現ベクターは、二種の生物、例えば、発現のための高等動物又は昆虫の細胞及びクローニング又は増幅のための原核宿主、で維持されることができるように二種の複製システムを持つことができる。更に、組込みのために、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムと相同性のある少なくとも一つの配列を含むことができる。それは、発現コンストラクトに隣接する二種の相同配列を含めることができる。そのベクターは、ベクターに含める適当な相同配列を選択することにより、宿主の特定部位に指向させることができる。組込み型ベクターのための構築物は、よく知られた技術である。
本発明の発現ベクターは、また、例えば、細菌をアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン等の薬剤に対する抵抗性を与える遺伝子で形質変換した細菌株の選別を可能にする選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカーは、ヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン生合成のような生合成遺伝子を含んでもよい。
【００７７】
本明細書において用いる用語「ベクター」及び「発現カセット」とは、互換的に使用でき、例えば、本発明の変異核酸のような核酸の発現に影響を及ぼすことのできるヌクレオチド配列を言及する。発現カセットには、少なくとも、ポリペプチドをコードしている配列に動作可能に結合したプロモーターが含まれる；更に、オプションとして、転写終了シグナルのような他の配列も含まれる。例えば、エンハンサーのような発現に影響を及ぼす必須又は補助的な付加ファクターを使用してもよい。ここで用いる「動作可能に結合した」とは、プロモーターがDNA配列の転写を媒介するように、あるDNA配列の上流にあるプロモーターの結合を意味している。従って、発現カセットには、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、如何なる様態の組換え「裸のDNA」ウイルス、その他が含まれる。「ベクター」は、感染、トランスフェクト、一過性又は恒久的に細胞を形質転換できる核酸を含む。ベクターが、裸の核酸、あるいはタンパク質又はリピドとの核酸コンプレックスであり得ることが理解される。ベクターは、場合により、ウイルス又は細菌の核酸及び/又はタンパク質、及び/又は膜(例えば、細胞膜、ウイルス リピドエンベロープ等)を含む。ベクターには、それにDNA断片が付加され、複製されるレプリコン(例えば、RNAレプリコン、バクテリオファージ)が含まれるが、それらに限定されない。ベクターは、従って、RNA、独立した自己複製する環状又は直鎖DNA又はRNA(例えば、プラスミド、ウイルス、及びその類、米国特許番号5,217,879)を含み、発現及び非発現プラスミドの両方が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
宿主細胞及び形質転換細胞
本発明は、例えば、本発明のキメラポリペプチドをコードした配列のような本発明の核酸配列、又は本発明のベクターのような発現カセットを含む形質転換細胞を提供する。宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、あるいは植物細胞のような原核細胞又は真核細胞の何れの宿主細胞でもよい。代表的な細菌細胞には、E. coli、Streptomyces、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、及びPseudomonas、Streptomyces、あるいはStaphylococcus属に属する様々な種の細菌が含まれる。代表的な昆虫細胞には、Drosophila S2、及びSpodoptera Sf9が含まれる。また、代表的な動物細胞には、CHO、COS、あるいはBowesメラノーマやその他のマウスやヒト細胞株が含まれる。適切な宿主細胞の選択も、関連技術の範囲内である。広範に高等植物を形質変換させる技術はよく知られており、技術及び科学関連文献において述べられている。Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22：421-477、米国特許番号 5,750,870を参照。
【００７９】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、ウイルス感染、遺伝子銃、あるいはTi-媒介遺伝子導入を含む様々な技術により宿主細胞に導入することができる。特有の方法として、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーション法が含まれる(Davis L、Dibner M、Battey I、Basic Methods in Molecular Biology、(1986))。
一側面において、本発明の核酸又はベクターは、スクリーニングのために細胞に導入され、その核酸は、それにより、後の発現のために適した様態において細胞中に入る。導入の方法は、標的細胞のタイプに大きく影響される。典型的な方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム融合法、リポフェクション法（例えば、LIPOFECTINTM）、エレクトロポレーション法、ウイルス感染法等が含まれる。候補となる核酸は、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれても（例えば、レトロウイルスによる導入により）、あるいは細胞質中に一過性又は恒久的に存在してもよい（即ち、慣例的なプラスミドの使用、標準的な調節配列の使用、選択マーカー等による）。製薬的に重要な多くのスクリーニングは、ヒト又はモデル高等動物細胞の標的を必要とすることから、そのような標的に感染できるレトロウイルスが好まれる。
【００８０】
細胞は、遠心分離により集めることができ、物理的又は化学的手段により破砕することができ、得られた粗抽出物は、更なる精製のために保持される。タンパク質の発現に使用される細菌細胞は、凍結融解サイクル、超音波、機械的な破砕、又は溶解剤の使用を含む如何なる簡便的な方法によっても破砕することができる。そのような方法は、よく知られている技術である。発現されたポリペプチド又はそれらの断片は、組換え細胞の培養から、硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオンイオン交換クロマトグラフィー、フォスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー等の方法により回収及び精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再フォールディング工程をポリペプチドの構造を完全にするために利用することができる。もし望ましいならば、HPLCを最終精製工程に使用することができる。
【００８１】
様々な高等動物細胞培養システムが組換えタンパク質の発現に利用することができる。高等動物発現システムの例として、サル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株及びC127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞株のような互換性のあるベクターからタンパク質を発現できる細胞が含まれる。
宿主中の構築物は、通常の方法で組換え配列によりコードされた遺伝子産物を産生するために利用できる。組換え体産生工程において使用する宿主に依存して、ベクターを含んだ細胞により産生されるポリペプチドは、グリコシル化体であることも、あるいは非グリコシル化体であることもある。本発明ポリペプチドは、また、最初のメチオニン残基を含むことも含まなないこともある。
また、無細胞翻訳系も本発明のポリペプチドの作製に使用することができる。無細胞翻訳系は、ポリペプチド、あるいはその断片をコードする核酸と動作可能的に結合されたプロモーターを含むDNA構築物より転写されたmRNAを利用できる。いくつかの局面において、DNA構築物はインビトロ転写反応を受ける前に直線化されてもよい。次に、転写されたmRNAは、目的のポリペプチド又はその断片を生産するために、ウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳系抽出物とともにインキュベートされる。
発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選別するために、真核細胞用にジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子、E.coliにはカナマイシン、テトラサイクリン、あるいはアンピシリン耐性遺伝子等の特定の表現型特性を与えるために一種以上の選別用マーカー遺伝子を含むことができる。
【００８２】
核酸の増幅
本発明の実施において、本発明の核酸及びキメラポリペプチドをコードする核酸、あるいは本発明の改変した核酸は、増幅により再産生されることができる。増幅は、また、クローン化するため、あるいは本発明の核酸を改変するためにも利用できる。従って、本発明は、本発明の核酸を増幅する増幅配列プライマー対を提供する。
増幅反応は、サンプル中の核酸の量(細胞サンプルにおけるメッセージ量のような)を定量したり、核酸を標識したり(アレーやブロットに応用するため)、核酸を検出したり、サンプル中の特別な核酸を定量するため等に利用することができる。本発明の一側面において、細胞又はcDNAライブラリーから単離されたメッセージが増幅される。
【００８３】
当業者は、好ましいオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択したり設計することができる。増幅の方法は、既によく知られた技術であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR、を含む。PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS、編集、Innis, Academic Press, N.Y. (1990) 及び PCR STRATEGIES (1995)、編集、Innis、Academic Press, Inc.、N.Y.、ligase chain reaction (LCR) (例えば、Wu (1989) Genomics 4：560；Landegren (1988) Science 241：1077；Barringer (1990) Gene 89：117)；転写増幅(例えば、Kwoh (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173)；及び自己維持配列(例えば、Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1874)；Qベータ−レプリカ−ゼ増幅(例えば、Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35：1477-1491)、自動化Qベータ−レプリカ−ゼ増幅アッセイ(例えば、Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10：257-271)及び他のRNAポリメラーゼを利用した技術(例えば、NASBA、Cangene、Mississauga Ontario)；また、Berger (1987) Methods Enzymol. 152：307-316；Sambrook；Ausubel；米国特許番号4,683,195及び4,683,202；Sooknanan (1995) Biotechnology 13：563-564等を参照。
【００８４】
配列同一性の程度の決定
本カニューレポリペプチドは、配列番号:2、配列番号:4、あるいは配列番号:6と少なくとも55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 %、又はそれ以上の配列相同性を有するタンパク質を含むことが出来、ポリマーへとアッセンブルすること、例えば、ナノチューブルへとアッセンブルすること、あるいはキラル選別因子として作用することができる。キメラカニューレタンパク質は、キラル選別因子、生合成の経路、選別スキャッホールディングその他として機能するナノチューブル重合体へとアッセンブルすることができる。配列同一性（相同性）の程度は、デフォルトのパラメーターを用いてBLAST 2.2.2.又はFASTA バージョン3.0t78のような本明細書に述べられる如何なるコンピュータープログラム及び関連パラメーターを用いて決定されてもよい。
本明細書で特定される様々な配列比較プログラムは、本発明のこの側面において使用される。タンパク質及び/又は核酸の配列同一性(相同性)は、様々な配列比較アルゴリズム及び既に知られるプログラムのうちのどれを用いて評価されてもよい。そのようなアルゴリズム及びプログラムは、以下を含むがそれらに限定されない：TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、及び CLUSTALW (Pearson and Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8)：2444-2448、1988；Altschul他、J. Mol. Biol. 215(3)：403-410、1990；Thompson他、Nucleic Acids Res. 22(2)：4673-4680、1994；Higgins他, Methods Enzymol. 266：383-402、1996；Altschul他, J. Mol. Biol. 215(3)：403-410、1990；Altschul他、Nature Genetics 3：266-272、1993)。
【００８５】
相同性又は同一性は、配列分析ソフトウエアー(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison WI 53705)を用いて調べることができる。そのようなソフトウエアーは、様々な削除、置換及び他の改変に対する相同性の程度を帰属させることにより類似した配列をマッチングさせる。二種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して用いる用語「相同性」及び「同一性」とは、如何なる数の配列比較アルゴリズムの使用あるいは手動アラインメントおよび視覚的検索によって測定した場合、比較ウィンドウ上で最大の範囲又は指定した領域にわたって比較し最大一致についてアラインメントしたときに、同一の二種以上の配列又はサブ配列、あるいはある特定の割合で同じアミノ酸又はヌクレオチドを持つ配列又はサブ配列を意味する。配列比較のために、一つの配列が対照配列として機能することが出来る(本発明の配列と被験配列が比較される)。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験及び対照配列がコンピューターにインプットされ、必要ならば、サブ配列の座標が指定され、そして配列比較アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。デフォルトプログラムのパラメーターを使用することができ、別のパラメーターをデザインすることもできる。それにより、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメーターに基づいて、対照配列に対する被験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００８６】
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」とは、如何なる数の連続する残基のセグメントに対する参照をも含む。例えば、本発明の別の側面において、本発明の典型的なポリペプチド又は核酸配列の場所を問わず、二種の配列を最適整列させた後に、20〜完全長の範囲で対照配列中の同数の連続する配列部位と比較される。もしその対象配列が、本発明の典型的なポリペプチド又は核酸配列に対して必要とされる配列同一性を持つ場合、カニューレポリペプチドに対して50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、90 % 又は95 %、95 %、98 %、99 %又はそれ以上の配列同一性を持つならば、その配列は本発明の範囲に入る。別の具体例として、20〜600、50〜200、100〜150の範囲でサブ配列は、対照配列と最適整列させた後に、対照配列中の同数の連続する配列部位と比較される。比較のための配列アラインメントの方法は、既によく知られた技術である。比較のための至適な配列アラインメントの方法が、例えば、SmithとWatermanの局所相同性アルゴリズム；Adv. Appl. Math. 2：482, 1981、NeedlemanとWunschの相同性アラインメントアルゴリズム；J. Mol. Biol. 48：443、1970、Lipman らの類似性の検索； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444、1988、これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA：Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr. Madison WI)、あるいは手動のアラインメント及び視覚的な検索によって行うことができる。BLAST プログラム (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)に加え、相同性又は同等性を決定するための他のアルゴリズムには、例えば、ALIGN、AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences)、AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment)、ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、BANDS、BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node)、BLIMPS (BLocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman アルゴリズム、DARWIN、Las Vegas アルゴリズム、FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package)、GAP (Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC (Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN (Local Sequence Alignment)、LCP (Local Content Program)、MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench)、MAP (Multiple Alignment Program)、MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) 及び WHAT-IFが含まれる。そのようなアラインメント プログラムは、実質的に同じ配列を持つポリヌクレオチド配列ゲノムデーターベースをスクリーニングするために使用することができる。多くのゲノム データーベースが使用可能であり、例えば、かなりの部分のヒトゲノムがヒトゲノム シークエンシング プロジェクト（Gibbs、1995）として使用可能である。いくつかの機能情報を注釈されたゲノム情報を含むデーターベースが異なる組織において維持され、インターネットを通じてアクセス可能である。
【００８７】
BLAST、BLAST 2.0 及びBLAST 2.2.2アルゴリズムも本発明の実施に利用される。それらは、例えば、Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25：3389-3402；Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215：403-410に述べられている。BLAST分析を行うためのソフトウェアーは、National Center for Biotechnology Informationを通して公共的に入手が可能である。このアルゴリズムは、調べられる配列に関して、長さWのショートワードを同定することによる高いスコアーを持つ配列（HSP）を初めに同定することに関与し、それは、あるデーターベース配列を同じ長さのワードで整列させた場合、一致するか又は正の値の閾値スコアーを満たすものである。Tは、近傍ワードスコアー閾値(Altschul (1990)前述)を意味する。これら初期の近傍ワードのヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための初期検索の核として作用する。そのワードヒットは、累積アラインメント スコアーが上昇する限り各配列に沿ってその両方向に伸長される。ヌクレオチド配列に関する累積スコアーは、パラメーターM(一致している残基ペアーに対する報酬スコアー；常に０より大)を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリング マトリックスを用いて累積スコアーが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメント スコアがその最大到達値から量Xだけ低下する場合；1つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの累積のために累積スコアがゼロ又はそれ以下になる場合：又は、いずれかの配列が末端に到達した場合に停止される。
【００８８】
BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルト値としてワード長(word length、W)11、期待値(E)10、M = 5、N = -4、及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルト値としてワード長(W)3、期待値(E)10、及びBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff及びHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89：10915を参照)アラインメント50、期待値(E)10、M = 5、N = -4、及び両鎖の比較を用いる。BLASTアルゴリズムは、二種の配列間の類似性の統計的分析も実行する(例えば、Karlin及びAltshul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5787を参照)。BLASTアルゴリズムから提供される類似性の尺度の一つは、最小合計確率(P(N))であり、それは二種のヌクレオチド配列間又は二種のアミノ酸配列間のマッチングが偶然に発生する確率の指標を提供する。例えば、被験配列と参照配列との比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に、その核酸は参照配列と類似であると見なされる。
【００８９】
一側面において、タンパク質及び核酸の配列相同性は、Basic Local Alignment Search Tool （”BLAST”）により評価される。例えば、5種の特別なBLASTプログラムが以下の用件を実行するために使用することができる：(1) BLASTP及びBLAST3は、被験アミノ酸配列をタンパク質配列データーベースと比較する；(2) BLASTNは、被験ヌクレオチド配列をヌクレオチド配列データーベースと比較する；(3) BLASTXは、被験ヌクレオチド配列に由来する6種の仮想的翻訳産物（両鎖）をタンパク質配列データーベースと比較する；(4) TBLASTNは、被験タンパク質配列を６種全てのリーディングフレーム(両鎖)に翻訳されたポリヌクレオチド配列データーベースを比較する；そして、(5) TBLANTXは、被験ヌクレオチド配列の6種の翻訳をヌクレオチド配列データーベースの6種の翻訳と比較する。そのBLASTプログラムは、類似した部分を同定することにより相同的な配列を同定し、ここには、被験アミノ酸、あるいはヌクレオチド配列、好ましくは、タンパク質又はヌクレオチド配列データーベースから得られる試験配列間の「高スコアーセグメント ペアー」として言及される。高スコアーセグメント ペアーは、好ましくはスコアリング マトリックスにより同定(即ち、アラインメント)され、その大部分は既によく知られている。使用されるスコアリング マトリックスは、 好ましくは、BLOSUM62である(Gonnet他, Science 256：1443-1445、1992；Henikoff及びHenikoff、Proteins 17：49-61、1993)。好ましくはないが、PAM、あるいはPAM250を使用することもできる（例えば、Schwartz及びDayhoff、編集, 1978、Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington：National Biomedical Research Foundation を参照）。
【００９０】
本発明の一側面において、ある核酸が本発明の範囲に入るような必要とされている配列同等性を有するかを調べるために、NCBI BLAST 2.2.2プログラムが、blastpに対するデフォルトオプションで使用される。約38のオプション セッティングがNCBI BLAST 2.2.2プログラムに存在する。本発明のこの典型的な例として、全てのデフォルト値が、デフォルト フィルターリングセッティング（即ち、OFFにセットしてあるフィルターリングを除き、デフォルトへセットされた全てのパラメーター）を除き使用される；その場合、デフォルト フィルターリングセッティングでは、「-FF」セッティングが使用され、これはフィルターリングを不能にする。デフォルト フィルターリングの使用は、配列が短いためにKarlin-Altschulバイオレーションを引き起こす。
【００９１】
本発明のこの典型的な例において使用されるデフォルト値は以下を含む。
“低複雑度のためのフィルター  ：  ON
ワードサイズ  ：  3
マトリックス  ：  BLOSUM62
ギャップコスト  ：Existence: 11
拡  張：  1”
他のデフォルトセッティングは：低複雑度のためのフィルターがOFF、ワードサイズがタンパク質のために3、BLOSUM62マトリックス、ギャップExistence ペナルティーが‐11、拡張ペナルティーが‐1である。典型的なNCBI BLAST 2.2.2プログラムセッティングは、「W」オプションのデフォルトは0である。もしセットされない場合、これは、ワードサイズがタンパク質のためには3、核酸のためには11にデフォルト設定されることを意味している。
【００９２】
核酸の改変
本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする様々な核酸を作製する方法を提供する。これらの方法は、鋳型核酸によりコードされたキメラポリペプチドに比べて、改良又は異なった活性あるいは安定性を持ったキメラポリペプチドを作製するために様々な組み合わせで繰り返し又は使用することができる。これらの方法は、遺伝子/メッセージの発現、翻訳メッセージ又はメッセージの安定性に関する多様性を作製するために様々な組み合わせで繰り返し又は使用することができる。他の例として、例えば、細胞の遺伝的構成は、エックスビボでの相同遺伝子の改変とそれに続く細胞へのその再挿入によって変えられる。
本発明は、インビボ又はインビトロで酵素を特定の用途のために調整された特性を持つ変種へと進化させる方法を提供する。例えば、本発明の進化ストラテジーを利用することにより、触媒活性を失わせることなくして、酵素の活性部位が立体特異的認識能を維持するようなタンパク質へと改変することができる。一側面において、本発明のキメラモノマー及びポリマーがキメラ選別に関する応用のために、例えば、ここに述べる部位特異的飽和変異導入法（GSSMTM）及び遺伝子再アッセンブル法（GeneAssemblyTM）のような指向変異導入法及びインビボ進化ストラテジーにより進化させられる（例えば、米国特許番号6,171,820及び5,965,408を参照）。これらのテクノロジーは、好ましい表現型を持つ変種を選別するハイスループット(HT)アッセイでスクリーンされる変異配列変種の大きなライブラリーを作製するために利用される。
【００９３】
GSSMTMにより、全64コドン（ナンセンスコドンをも含む）の効果は、分析される遺伝子のオープンリーディングフレームの全長に沿って、各トリプレット部位で調べられることができる。例えば、200アミノ酸から成るタンパク質の場合、その遺伝子は、全64コドンが各アミノ酸の合成の際に存在するような200の異なる反応チューブにおいて同時に構築することができる。結果として、オープンリーディングフレームの各部位で可能な全てのコドンが現れる単一点変異変種ライブラリーが得られる。GSSMTM変種のライブラリーは、それから、進化した標的表現型を持つ変種を同定するために、HTアッセイによってスクリーニングされる。次いで、好ましい特性を持つ各GSSMTM変種は、更に、遺伝子再アッセンブル法を用いて進化させることができる。
遺伝子再アッセンブル法において、GSSMスクリーニングにおいて同定された単一点変異配列から得られるDNA断片を組換えることにより、変種の新規ライブラリーを作製することができる。従って、再アッセンブルライブラリーは、組換えの結果として蓄積した複数の点変異を持つオープンリーディングフレームを含むことができる。再アッセンブルされた変種は、標的活性に関する更なる改良を持った変種コンビネーションを同定するためにスクリーニングすることができる。必要がある場合、遺伝子再アッセンブル法は、好ましい標的特性を持った進化タンパク質が同定されるまで繰り返すことができる。これらのタンパク質進化ストラテジーは、タンパク質の構造に関する予備知識を必要とせず、そのために、スクリーニングのための偏りのないタンパク質変種プールを生成する。
【００９４】
一側面において、本発明は、キラル選別の方法のためのコンビナトリアルアプローチを提供する。例えば、本発明のハイスループットスクリーニング法は、固有のエナンチオマー認識特性を持つ配列を同定するためのペプチドライブラリーをスクリーンするために利用することができる；例えば、前記したChankvetadze(2000)を参照。従って、本発明は、ペプチドのライブラリーを含む、キメラモノマー及びポリマー（ナノチューブルを含む）を提供する。一側面において、これらペプチド配列は、キメラモノマーの配列に挿入され、ナノチューブル表面に均一に提示される。
一側面において、進化テクノロジーをキラル選別の開発に適用するために、本発明は、向上したエナンチオマー認識特性を持つタンパク質変種の同定に適したハイスループットスクリーンを提供する。例えば、上述したHenriksson(1996)は、Trichoderma reeseiのセロビオースハイドロラーゼ（CBH）活性がベーター-ブロッカーのプロパノロール及びアルプレノロールの(R)-及び(S)-エナンチオマーにより異なった阻害を示すことを報告している。T. reesei CBHがベーター-ブロッカーの効果的なキラル選別因子であることが実証されており、そのキラル選別性は、その阻害データーに一致している。これらの結果を基に、本発明の方法は、進化テクノロジーを利用して、CBHのエナンチオマー認識特性を進化させる。一側面において、ハイスループットスクリーンは、CBH活性のエナンチオマー認識特性的な阻害を測定するために利用される。
【００９５】
本発明の実施において、核酸（例えば、本発明のキメラペプチドをコードしている核酸）は、如何なる手段、例えば、無作為又は確率的な方法、非確率的又は「指向進化」等の方法によっても変化させることができる。例えば、米国特許番号6,361,974を参照。遺伝子の無作為的変異の方法は、既によく知られた技術であり、例えば、米国特許番号5,830,696を参照。遺伝子を無作為に変異させるために変異原を利用することができる。変異原には、再組換えにより修復され得るDNA解裂を誘導する、例えば、紫外線、ガンマ放射線又はマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレン等の化学変異原等の単独又は組み合わせによる使用が含まれる。他の化学変異原には、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又は蟻酸が含まれる。他の変異原には、ヌクレオチド前駆体類似物、例えば、ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、あるいはアクリジンが含まれる。これらの薬剤は、ヌクレオチド前駆体の代わりにPCR反応に加えることができ、それによってその配列を変異させる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン及びその類のインターカレート試薬もまた使用することができる。
【００９６】
例えば、ランダムPCR突然変異誘発；Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5467-5471を参照、多数のカセット突然変異誘発の組合わせ；Crameri (1995) Biotechniques 18：194-196を参照、等、分子生物学の如何なる技術をも使用することができる。あるいは、例えば、遺伝子のような核酸は、無作為又は「確率的」な断片化の後、再アッセンブルさせることができる。例えば、米国特許番号6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793を参照。別例として、改変、挿入又は削除は、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指向変異導入法、アセンブリーPCR、セクシュアルPCR 変異導入法、インビトロ変異導入法、カセット変異導入法、再帰的アンサンブル変異導入法、指数的アンサンブル変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子再アッセンブル、遺伝子飽和部位変異導入法（GSSM）、合成結合再アッセンブル（SLR）、リコンビネ−ション、再帰的な配列リコンビネ−ション、フォスホチオエイトDNA変異導入法、ウラシル含有テンプレート変異導入法、ギャップデュプレックス変異導入法、ポイントミスマッチリペアー変異導入法、リペアー欠損宿主変異導入法、化学変異導入法、放射線変異導入法、デリ−ション変異導入法、リストリクション/セレクション変異導入法、リストリクション/ピュ−リフィケ−ション変異導入法、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入法、キメラ遺伝子重合体の創製及び/又は他の方法との組み合わせ等の方法によって導入される。
【００９７】
次の出版物は、様々な再帰的リコンビネ−ションの操作及び/又は本発明の方法に組み込むことができる方法を記述している： Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties”  Tumor Targeting 4：1-4；Ness (1999) Nature Biotechnology 17：893-896；Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding” Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling” Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution” Nature 391：288-291；Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling” Nature Biotechnology 15：436-438；Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：4504-4509；Patten 他. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines” Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri 他. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling” Nature Medicine 2：100-103；Gates他 (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor `headpiece dimer`” Journal of Molecular Biology 255：373-386；Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR”：The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH 出版、New York. pp.447-457；Crameri and Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18：194-195；Stemmer 他 (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene 164：49-53；Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270：1510；Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553；Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370：389-391；及び Stemmer (1994) “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：10747-10751。
【００９８】
変種配列を生成する変異導入法は、例えば、部位特異的変異導入法 (Ling 他 (1997) “Approaches to DNA mutagenesis：an overview” Anal Biochem. 254(2)：157-178; Dale 他 (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374；Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19：423-462；Botstein & Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229：1193-1201；Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237：1-7；及び Kunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”：Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. 編集, Springer Verlag, Berlin))；鋳型を含むウラシルを用いた変異導入法 (Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：488-492；Kunkel他 (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382；及び Bass他 (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242：240-245)；oligonucleotide-directed mutagenesis (Methods in Enzymol. 100：468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154：329-350 (1987)；Zoller & Smith (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10：6487-6500；Zoller & Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500；及びZoller & Smith (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154：329-350)；フォスホチオエイト修飾DNA 変異導入法 (Taylor他 (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13：8749-8764；Taylor他 (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13：8765-8787 (1985)；Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14：9679-9698；Sayers他 (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16：791-802；and Sayers他 (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16：803-814)；ギャップデュプレックス DNAを用いた変異導入法 (Kramer 他 (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12：9441-9456；Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154：350-367；Kramer他 (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16：7207；及び Fritz他 (1988) “Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16：6987-6999、を含んでいる。
【００９９】
本法の実践において、変種配列を作製する付加的な方法には、以下の方法が含まれる：点ミスマッチ修復 (Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887)、修復不能宿主株を用いた変異導入法 (Carter 他 (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13：4431-4443；及び Carter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154：382-403), deletion mutagenesis (Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14：5115)、制限-選別及び制限-選別と制限-精製 (Wells 他 (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317：415-423)、全遺伝子合成による変異導入法 (Nambiar他 (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223：1299-1301；Sakamar and Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)” Nucl. Acids Res. 14：6361-6372；Wells他 (1985) “Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34：315-323；及びGrundstrom他 (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun` gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13：3305-3316)、二本鎖解裂修復 (Mandecki (1986)；Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4：450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83：7177-7181)。 上記方法の多数の付加的な細部は、Methods in Enzymology 154巻に見ることができ、それは、様々な変異誘発方法のトラブルシューティング問題のための有用な制御手段をも記述している。
【０１００】
本発明の方法の実践において、変種配列を作製するための付加的なプロトコールは、以下の文献において考察されたものを含む。米国特許番号5,605,793、Stemmer (1997年2月25日) “Methods for In Vitro Recombination”；米国特許番号5,811,238、Stemmer 他 (1998年9月22日) “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”；米国特許番号 5,830,721、Stemmer 他 (1998年11月3日) “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”；米国特許番号5,834,252、Stemmer 他 (1998年11月10日) “End-Complementary Polymerase Reaction”；米国特許番号 5,837,458, Minshull、他 (1998年11月17日) “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”；WO 95/22625、Stemmer及びCrameri、”Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”；WO 96/33207、Stemmer及びLipschutz “End Complementary Polymerase Chain Reaction”；WO 97/20078、Stemmer及びCrameri “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”；WO 97/35966、Minshull及びStemmer、”Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”；WO 99/41402、Punnonen他 “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”；WO 99/4138、Punnonen他 “Antigen Library ImLmunization”；WO 99/41369、Punnonen他 “Genetic Vaccine Vector Engineering”；WO 99/41368、Punnonen他 “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”；EP 752008, Stemmer及びCrameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”；EP 0932670, Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”；WO 99/23107, Stemmer他 “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”；WO 99/21979、Apt他 “Human Papillomavirus Vectors”；WO 98/31837、del Cardayre他 “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”；WO 98/27230、Patten 及び Stemmer、”Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”；WO 98/27230、Stemmer他 “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection”；WO 00/00632、 “Methods for Generating Highly Diverse Libraries”；WO 00/09679、”Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences”；WO 98/42832、Arnold他 “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”；WO99/29902、Arnold他 “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences”；WO 98/41653、Vind、”An in Vitro Method for Construction of a DNA Library”；WO 98/41622、Borchert他 “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling,” 及びWO 98/42727、Pati and Zarling、”Sequence Alterations using Homologous Recombination”を参照。
【０１０１】
本発明の方法の実施における変種配列を作製する付加的なプロトコールが以下に述べられている。例えば、米国特許出願番号09/407,800、”SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES”、Patten他、1999年9月28日出願；”EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”、 del Cardayre他、米国特許番号6,379,964；”OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”、Crameri他、米国特許番号6,319,714; 6,368,861；6,376,246；6,423,542；6,426,224及びPCT/US00/01203；”USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING”、Welch他、米国特許番号6,436,675；”METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”、Selifonov他、2000年1月18日出願、(PCT/US00/01202)及び、例えば、”METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”、Selifonov他、2000年7月18日出願(米国特許出願番号09/618,579)；”METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”、Selifonov及びStemmer、2000年1月18日出願、(PCT/US00/01138)；及び”SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION”、Affholter、2000年9月6日出願、(米国特許出願番号09/656,549)；及び米国特許番号6,177,263；6,153,410。
【０１０２】
非確率的、あるいは「指向進化」的な方法
本発明の実践における変種配列（例えば、本発明のキメラポリペプチドをコードしている改変された配列）の作製のための例示的なプロトコールは、例えば、飽和変異導入法(GSSM)、合成結合再構成(SLR)、あるいはそれらの組み合わせのような非確率的又は「指向進化」の方法を含む。これらの方法は、新しい又は変化された性質（例えば、高い又は低い酸性又はアルカリ性条件下、高い又は低い温度条件、高い又は低い塩濃度条件等におけるキラル選択活性；異なる基質親和性；対掌認識特性；改変された抗体結合活性等）を持つキメラポリペプチドを産生するための核酸を改変するために使用できる。改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、タンパク質分解活性又は他の活性を調べる前に、ある活性についてスクリーニングすることができる。如何なる試験形態又はプロトコール、例えば、キャピラリーアレーのプラットホーム、をも使用できる、例えば、米国特許番号 6,361,974；6,280,926；5,939,250を参照。
【０１０３】
飽和変異導入法、あるいは、GSSM
本発明の一側面において、非確率的な遺伝子の改変、「指向進化プロセス」が、新しい又は改変された性質を持つ本発明のキメラポリペプチドをコードする改変配列を作製するために使用される。この方法のバリエーションは、「遺伝子部位-飽和変異導入法」、「部位-飽和変異導入法」、「飽和変異導入法」又は簡単に「GSSM」と呼ばれている。 他の突然変異導入法との組み合わせでも使用することができる。例えば、米国特許番号 6,171,820; 6,238,884を参照。一側面において、GSSMは、鋳型ポリヌクレオチド及び複数のオリゴヌクレオチドを含み、その中の各オリゴヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに相同な配列を含み、それによって、鋳型ポリヌクレオチドの特異的な配列及び相同遺伝子の変種である配列を標的する；オリゴヌクレオチドを用いて鋳型ポリヌクレオチドを複製することによって非確率的な配列多様性を持つ親ポリヌクレオチドを作製する。それにより、相同性のある遺伝子配列の多様性を持つポリヌクレオチドを作製する。
本発明の一側面において、縮重N,N,G/T配列を含むコドンプライマーが、子孫ポリペプチドの集団を作製するためにポリヌクレオチドに点変異を導入するために使用され、その中には、単アミノ酸置換の全範囲が各アミノ酸の位置、例えば、改変される標的にされる酵素の活性部位又はリガンド結合部位のアミノ酸残基に表示されている。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第一の相同配列、縮重N,N,G/T配列、及び、任意に、第二の相同配列を含める。そのようなオリゴヌクレオチドの使用に由来する下流の子孫翻訳産物は、縮重N,N,G/T配列が20種全てのアミノ酸のためのコドンを含んでいることから、ポリペプチドに沿った各アミノ酸で全ての可能なアミノ酸変異を含んでいる。一側面において、一つのそのような縮重オリゴヌクレオチド（例えば、一種の縮重N,N,G/Tカセットを含む）が、親ポリヌクレオチド鋳型の各コドンを全範囲でコドン置換させるために使用される。他の例として、同じオリゴヌクレオチド又は異なる少なくとも二種の縮重カセットが、親ポリヌクレオチド鋳型の少なくとも二つコドンを全範囲でコドン置換させるために使用される。例えば、一種以上のN,N,G/T配列を、一ヶ所以上の部位でアミノ酸の変異を導入するための一つのオリゴヌクレオチドに含めることができる。この複数のN,N,G/T配列は、直接連続的であるか、又は一種以上の付加的なヌクレオチドによって分離することができる。他の例として、挿入及び削除を導入するために使われるオリゴヌクレオチドは、如何なる組換え、あるいはアミノ酸の挿入、削除、及び/又は置換を導入するために、単独で使用することも、N,N,G/T配列を含むコドンと組み合わせて使用することも可能である。
【０１０４】
一側面において、二ヶ所又はそれ以上の連続したアミノ酸部位の同時変異誘発が、連続的なN,N,G/Tトリプレットを含んだオリゴヌクレオチド、即ち、縮重N,N,G/T配列、を用いてなされる。他の例として、そのN,N,G/T配列よりもより少ない縮重を持つ縮重カセットが使われる。例えば、ある例では、一つのNだけを含む縮重トリプレット配列(例えば、オリゴヌクレオチド)を使用することが望ましいかもしれない。このNとは、トリプレットの第2又は第3番目の位置にある。如何なる組合せ及びここに含まれる変換を含む他のどのような塩基でもトリプレットの残った部位に使用することができる。代わりに、ある例では、縮重N,N,Nトリプレット配列(例えば、オリゴヌクレオチド)を使用することが好ましいかもしれない。
一側面において、縮重トリプレット(例えば、N,N,G/Tトリプレット)の使用は、系統的及び容易にポリペプチドのアミノ酸一残基ごとに天然アミノ酸を全体的に(合計で20アミノ酸)発現生成することを可能にする(別例として、その方法は、可能な全てのアミノ酸よりも少ないアミノ酸残基又はコドン部位当たりの置換の生成をも含む)。例えば、100アミノ酸ポリペプチドでは、2000の異なる変種(即ち、部位当たり20種の可能なアミノ酸 X 100アミノ酸部位)を作製することができる。オリゴヌクレオチド又は縮重N,N,G/Tトリプレットを含む一式のオリゴヌクレオチドを用いることによって、32の個々の配列を可能な20種全ての天然アミノ酸でコードさせることができる。従って、親ポリヌクレオチド配列が少なくとも一種類のそのようなオリゴヌクレオチドを用いた飽和変異導入法に供与されると、試験管内では、20種の異なるポリペプチドをコードしている32種の異なる子孫ポリヌクレオチドが存在する。対照的に、部位特異的変異誘発に非縮重オリゴヌクレオチドを使用することは、反応当たり一種の子孫ポリペプチド産物だけが得られる。非縮重オリゴヌクレオチドは、開示した縮重プライマーの組み合わせにより任意に使用することができる; 例えば、非縮重オリゴヌクレオチドは、対象ポリヌクレオチド中に特定の点変異を発生させるために使用することができる。これは、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸の変異を導く点変異、及び停止コドンやポリペプチド断片の発現を引き起こす点変異を作り出す一つの手段を提供する。
【０１０５】
一側面において、各飽和変異誘発反応容器には、親ポリヌクレオチド中の変異されるコドンに対応する１つの特定アミノ酸部位で20種の天然アミノ酸全てが現れるように（他の側面では、20種以下の天然アミノ酸の組合せを使用）、少なくとも20種の子孫ポリペプチド分子をコードしたポリヌクレオチドが含まれる。各飽和変異誘発反応から得られる32倍に縮重した子孫ポリペプチドは、クローンを増幅(例えば、発現ベクターを用いて、E.coliのような適した宿主にクローン化される)および発現スクリーニングにかけることができる。好ましい特性の変化(親ポリペプチドと比較して、アルカリ又は酸性条件の下で増強された蛋白質分解活性のような)を表示する個々の子孫ポリペプチドがスクリーニングによって同定された場合、その中に含まれた相当する好ましいアミノ酸置換を同定するための配列決定が行われる。
【０１０６】
一例において、この中に開示されるような飽和変異誘発法を使用して親ポリペプチドの各アミノ酸及び全アミノ酸部位を変異させた場合、好ましいアミノ酸変異が一ヶ所以上のアミノ酸部位で同定されるかもしれない。これらの好ましいアミノ酸置換を全体又は一部の組合せとして含む一種以上の新しい子孫分子を作製することができる。例えば、ポリペプチドのアミノ酸部位三ヶ所それぞれに二種の特別な好ましいアミノ酸変異が同定されれば、変異は、各部位及び三ヶ所の部位において三つの可能性(元のアミノ酸からの変異が無いか、それぞれ二種の好ましい変異)を含んでいる。従って、3 x 3 x 3又は27通りの可能性が存在し、それには前に調べられた7種が含まれている-6種の単一点変異(即ち、三ヶ所のそれぞれで二種)とどの部位にも変異の無いもの。
別例として、部位飽和変異誘発法は、配列を変化させるための他の確率的又は非確率的な手段、例えば、合成ライゲーション再アッセンブル（以下参照）、シャフリング、キメラ化、再組換え、及び他の変異プロセスや変異試薬等とともに使用することができる。この発明は、反復的な飽和変異誘発を含むあらゆる変異プロセスの使用を提供する。
【０１０７】
合成結合再構成 (SLR)(Synthetic Ligation Reassembly)
本発明は、本発明の変異配列を作製するための「合成結合再構成」又は単に「SLR」、「指向進化プロセス」と呼ばれる非確率的遺伝子改変システムを提供する。SLRは、オリゴヌクレオチド断片を非確率的にアッセンブル結合させる方法である。この方法は、核酸のビルディングブロックがランダムにシャッフル、結合又はキメラ化されるのではなく、むしろ非確率的に組み立てられる点において、確率論的なオリゴヌクレオチドシャフリングとは異なる。例えば、米国特許出願番号09/332,835 “Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution” 1999年６月14日出願(“米国特許出願番号09/332,835”)を参照。一例において、SLRは、次の工程を含む:(a) 鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程。この鋳型ポリヌクレオチドは、相同遺伝子をコードした配列を含む；(b) 複数のブロックのビルディングブロックポリヌクレオチドを提供する工程。このビルディングブロックポリヌクレオチドは、予め決定された配列部位で鋳型とクロスオーバー（交叉）するように設計され、あるビルディングブロックポリヌクレオチドは、相同遺伝子の変種であり、かつその変種配列に隣接した鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列を含む；(c) ビルディングブロックポリヌクレオチドを、そのビルディングブロックポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交叉再構成し、相同遺伝子配列の亜型ができるように鋳型ポリヌクレオチドと結合する工程。
【０１０８】
SLRは、再構成されるべきポリヌクレオチド間に高度の相同性が存在してもそれに左右されない。従って、この方法は、非確率的に10100以上のキメラから成る子孫分子のライブラリー（又は集団）を作製するために使用することができる。SLRは、101000以上のキメラから成る子孫の分子のライブラリーを作製するために使用することができる。従って、本発明の展望は、設計により選択される包括的なアセンブリー順序を刈り込む（shaving）1群の最終的なキメラ核酸分子を作製するための非確率的方法を含んでいる。この方法は、設計により相互に適用性のある結合可能末端を持つようにした複数の特定の核酸ビルディングブロックを作製する工程、および、これらの核酸ビルディングブロックを設計された包括的なアセンブリー順序が達成できるように組み立てる工程を含む。
組み立てられる核酸ビルディングブロックの相互に適用性のある結合可能末端は、もしそれらが予め決定された順序でそのビルディングブロック結合させ得るならば、このタイプの指示されたアセンブリーのために「利用可能」であると考えられる。従って、核酸ビルディングブロックが結合するその包括的なアセンブリー順序は、結合可能末端の設計によって特定される。一段階以上のアセンブリー工程が使用されるなら、核酸ビルディングブロックが結合するその包括的なアセンブリー順序は、アセンブリー工程の連続的な順序によっても特定される。一側面において、アニールしたビルディングブロック片は、それらを共有的に結合させるためにリガーゼのような酵素（例えば、T4 DNAリガーゼ）で処理される。
【０１０９】
一側面において、オリゴヌクレオチド ビルディングブロックの設計は、最終的なキメラポリヌクレオチドの子孫集団を産生するための元として働く一群の祖先核酸配列の鋳型を分析することによりなされる。これらの親オリゴヌクレオチドの鋳型は、変異、例えば、キメラ化又はシャッフル、される核酸ビルディングブロックのデザインを援助する配列情報源として働く。この方法の一側面において、複数の親核酸の鋳型の配列が、一ヶ所以上の境界点を選ぶためにアラインメントされる。境界点は、相同性のある区域に設定することができ、そして一種以上のヌクレオチドを含む。これらの境界点は、好ましくは少なくとも二種の祖先鋳型に共有される。それにより、境界点は、親ポリヌクレオチドを再配置することを目的に、作製されるオリゴヌクレオチド ビルディングブロックの境界を描写するために使用することができる。祖先分子内で同定及び選択された境界点は、最終的なキメラ子孫分子のアッセンブルにおける潜在的なキメラ化点として働く。境界点は、少なくとも二種の親鋳型により共有された（少なくとも1つの相同核酸塩基から成る）相同的領域であり得る。あるいは、境界点は、少なくとも半分の親鋳型により共有された相同的領域、又は少なくとも2/3の親鋳型により共有された相同的領域であり得る。更により好ましくは、利用可能な境界点は、少なくとも3/4の親鋳型により共有された相同的領域、更に一層より好ましくは、殆ど全ての親鋳型により共有された相同的領域である。一側面において、境界点は、全ての親鋳型により共有された相同的領域である。
【０１１０】
一側面において、徹底的な子孫キメラポリヌクレオチド ライブラリーを作製するために、結合再アッセンブル過程が網羅的に実施される。換言すると、核酸ビルディングブロックの全ての可能な順序の組み合わせが最終キメラ核酸分子の集団中に提示される。同時に、別の側面において、各組み合わせにおけるアッセンブル順序（即ち、各最終キメラ核酸の5'から3'配列における各ビルディングブロックのアッセンブル順序）は、上述されたような設計（又は非確率的な設計）による。本発明の非確率的性質のために、好ましくない副産物の可能性は大きく減少する。
【０１１１】
別例として、結合再構成法は、体系的に実施される。 例えば、本法は、子孫分子の区分されたライブラリーを作製するために、例えば、一つずつ、体系的にスクリーニングされうる区分を用いて実施される。換言すると、本発明は、連続段階的アッセンブル反応の選択的で適切な使用を組み合わせた特定の核酸ビルディングブロックの選択的で適切な使用と組み合わせることにより、あるデザインが子孫産物の特定の集団が各反応容器中で作製されることを達成させるようにする。これは、実施される実験及びスクリーニング操作を体系的にする。従って、非常に多数の潜在的な子孫分子をより少ない集団で体系的に調べることを可能にする。非常に柔軟で、更に、徹底的かつ体系的にキメラ化を実施する能力があることから、本発明は、特に、親分子間に低いレベルの相同性しかない場合、多数の子孫分子から成るライブラリー（又は、集団）の作製を提供する。本結合再構成の発明の非確率的な性質のために、作製される子孫分子は、好ましくは、設計により選ばれる包括的なアセンブリー順序を持つ最終的なキメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異誘発法及び指向進化法は、異なる子孫の分子種を作製するためにも使用することができる。本発明が、境界点の選択、核酸ビルディングブロックの大きさ及び数、ならびに結合の大きさ及び設計に関する選択と制御の自由を与えることは理解される。更に、分子間相同性の要求性が本発明の操作性に対して非常に緩和されることも理解される。実際、境界点は殆ど又は全く分子間相同性のない領域においても選択することができる。例えば、コドンのゆらぎ（wobble）、即ち、コドンの縮重、のために、対応する祖先鋳型に本来コードされたアミノ酸を変えることなく核酸ビルディングブロック中にヌクレオチド置換を導入することができる。あるいは、本来のアミノ酸のためのコードが変更されるようにコドンを変化させることができる。本発明は、分子間で相同的な境界点の頻度を増加させるため及びビルディングブロック間で達成される結合数を増加させるために、そのような置換の核酸ビルディングブロック中への導入を可能とし、その結果として、多数の子孫キメラ分子が作製されるようになる。
【０１１２】
別の側面において、ビルディングブロックが作製される工程における合成的性質は、後にインビトロ過程（例えば、変異誘発による）又はインビボ過程（例えば、宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用する）において、任意に除去されうるヌクレオチド（例えば、一種以上のヌクレオチド、コドンもしくはイントロン又は調節配列であってもよい）の設計及び導入を可能にする。多くの場合、利用可能な境界点を作製するという潜在的な利点に加えて、これらの核酸の導入は他の多くの理由によっても望ましいことが理解される。
一側面において、核酸ビルディングブロックは、イントロンを導入するために使用することができる。従って、機能的イントロンが、この中に述べられる方法により、本発明の人工遺伝子に導入される。人工的に導入したイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングに機能的であるように、宿主における遺伝子スプライシングにおいても機能的であり得る。
【０１１３】
至適化指向進化システム
本発明の方法の実施において、「至適化指向進化システム」と呼ばれる非確率的遺伝子改変システムを新規又は変化された性質を持つ本発明のキメラポリペプチドをコードしている改変された配列を作製するために利用することができる。至適化指向進化システムは、組換えを通して核酸の指向的分子進化を行わせる還元再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用を教示する。至適化指向的進化は、進化したキメラ配列の大集団の作製を可能にするもので、この中で作製された集団は、予め決定された数のクロスオーバー（交叉）イベントを有する配列のために非常に富化される。
交叉イベントは、一つの親変種から別の親変種に配列のシフトが起こるキメラ配列の点である。そのような点は、通常、二種の親からのオリゴヌクレオチドが互いに連結した単一の配列を形成する接続点である。この方法は、最終的な配列のキメラ集団が選択された回数の交叉イベントのために富化されるように、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度計算を可能にする。これは、予め決定された回数の交叉イベントを有するキメラ変種選択に対してより高い制御を提供する。
【０１１４】
更に、本方法は、他のシステムに比べ、莫大な量の可能なタンパク質変種の領域を調査する手段を与える。以前は、例えば、反応中に1013のキメラ分子が生成される場合、特定の活性をそのような多量のキメラ変種について調べることは非常に困難であった。また、子孫集団の大部分は、特定の活性レベルまで高められていないタンパク質を産生する非常に多くの数の交叉イベントを有しているであろう。これらの方法を使用することにより、キメラ分子の集団は、特定の数の交叉イベントを有する変種のために富化することができる。従って、なお反応中に1013のキメラ分子を作製することができるが、更なる分析を行うために選択したそれぞれの分子は、例えば、わずか三回の交叉イベントしか有していない可能性が高い。結果として生ずる子孫集団は、予め決定された数の交叉イベントを有するように変えられることから、キメラ分子間の機能的多様性の境界限度は減少される。これは、元の親ポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の特質に影響を与えているのかを判断する時に、取り扱い易い変異の数を与える。
【０１１５】
キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作製する一つの方法は、それぞれの親配列の断片又は部分に対応するオリゴヌクレオチドを作製することである。好ましくは、それぞれのオリゴヌクレオチドは、それによりオリゴヌクレオチドの混合によって正しい順序でそれぞれのオリゴヌクレオチド断片を有する新しい変種が得られるように特異的な重複区域を含んでいる。更なる情報は、例えば、米国特許出願番号09/332,835；米国特許番号6,361,974に記載されている。それぞれの親変種のために作製されたオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作製されるキメラ分子内に生ずる交叉の総数と関連がある。例えば、三種の親ヌクレオチド配列の変種が、例えば、高温下で高活性を示すキメラ変種を探すためのライゲーション反応を起こすために与えられるかもしれない。一側面において、それぞれの親変種のそれぞれの部分に対応して50種のオリゴヌクレオチド配列が作製される。従って、結合組換えプロセス中には、それぞれのキメラ配列の中に最高で50回の交叉イベントがあることになる。作製されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが交互に親変種からのオリゴヌクレオチドを含有している確率は極めて低い。それぞれのオリゴヌクレオチド断片が同一の分子数で結合反応中に存在している場合、いくつかの部位では同じ親ポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドが互いに結合し、そのために交叉イベントが起こらないということはありそうである。それぞれの親からの各オリゴヌクレオチドの濃度が、本例のどのライゲーションステップの間も一定に保たれる場合、同じ親変種に由来するオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で結合し、かつ、交叉を起こさない確率は（三種の親があると仮定した場合）1/3である。
【０１１６】
従って、それぞれの結合反応ステップ中に、決められた数の親変種、それぞれの変種に対応するいくらかのオリゴヌクレオチド及びそれぞれの変種の濃度において起こるであろう交叉イベントの起きる集団を予想するために、確率密度関数（PDF）を決定することができる。PDF決定の統計的及び数学的な背景を以下に説明する。これらの方法を利用して、そのような確率密度関数を推定することができ、その結果、特定の結合反応から生じる予め決められた回数の交叉イベントのためにキメラ子孫集団を富化することができる。更に、交叉イベントの目標回数を予め決定することができ、その後、システムは、結合反応中のそれぞれのステップにおいて各親オリゴヌクレオチドの開始時の量を計算するようにプログラムされ、それによって、予め決められた回数の交叉イベントを集中させる確率密度関数が得られる。これらの方法は、ポリペプチドをコードする核酸の指向的分子進化を組換えを通して行わせる還元再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用法を教示する。このシステムは、進化したキメラ配列の大集団の作製を可能にするもので、この中では、作製された集団は、予め決定された数の交叉イベントを有する配列のために非常に富化されている。交叉イベントは、親変種からその他の親変種に配列のシフトが起こるキメラ配列の点である。そのような点は、通常、二種の親由来のオリゴヌクレオチドが互いに連結して単一の配列を形成する連結点である。この方法は、最終的な配列のキメラ集団が選択された回数の交叉イベントのために富化されるように、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度計算を可能にする。これは、予め決定された回数の交叉イベントを有するキメラ変種選択の高い管理を提供する。
【０１１７】
更に、本方法は、他のシステムに比べ、莫大な量の可能なタンパク質変種スペースを調査する手段を与える。これらの方法を使用して、キメラ分子の集団は、特定の数の交叉イベントを有する変種のために富化されることができる。従って、反応中に1013のキメラ分子が作製されるが、更なる分析を行うために選択したそれぞれの分子は、例えば、わずか三回の交叉イベントしか有していない可能性が高い。結果として生ずる子孫集団は、予め決定された数の交叉イベントを有するように変えられるので、キメラ分子間の機能的多様性の境界限度は減少される。これは、初期親ポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の特質に影響を与えているのかを判断する時に、取り扱い易い変異性の数を与える。
一側面において、その方法は、それぞれの親配列の断片又は一部分に対応するオリゴヌクレオチドを作製することによって、キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作製する。好ましくは、各オリゴヌクレオチドは、それによりオリゴヌクレオチドの混合によって正しい順序でそれぞれのオリゴヌクレオチド断片を有する新しい変種が得られるように、特異的な重複領域を含む。米国特許出願番号09/332,835も参照。
【０１１８】
各親変種のために作製されたオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作製されるキメラ分子内に生ずる交叉の総数と関連がある。例えば、三種の親ヌクレオチド配列の変種が、例えば、高温下で高活性を示すキメラ変種を探すためにライゲーション反応を起こすものとする。一側面において、それぞれの親変種のそれぞれの部分に対応して50種のオリゴヌクレオチド配列が作製される。従って、結合組換えプロセス中には、それぞれのキメラ配列の中に最高で50回の交叉イベントがあることになる。作製されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが、交互に親変種からのオリゴヌクレオチドを含有している確率は極めて低い。それぞれのオリゴヌクレオチド断片が同一の分子数で結合反応中に存在している場合、いくつかの部位では同じ親ポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドが互いに結合し、そのために交叉イベントが起こらないということはありそうである。それぞれの親からの各オリゴヌクレオチドの濃度が、本例のどのライゲーションステップの間も一定に保たれる場合、同じ親変種に由来するオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で結合し、かつ、交叉を起こさない確率は（三種の親があると仮定した場合）1/3である。
【０１１９】
従って、それぞれの結合反応ステップ中に、決められた数の親変種、それぞれの変種に対応するいくらかのオリゴヌクレオチド及びそれぞれの変種の濃度において起こるであろう交叉イベントの起きる集団を予想するために、確率密度関数（PDF）を決定することができる。PDF決定の統計的及び数学的な背景を以下に説明する。そのような確率密度関数は、推定することができ、その結果、特定の結合反応から生じる予め決められた回数の交叉イベントのためにキメラ子孫集団を富化することができる。更に、交叉イベントの目標回数を予め決定することができ、その後、システムは、結合反応中のそれぞれのステップにおいて各親オリゴヌクレオチドの開始時の量を計算するようにプログラムされ、それによって、予め決められた回数の交叉イベントを集中させる確率密度関数が得られる。
【０１２０】
反復プロセス
本発明の実施において、これらのプロセスは、反復的に繰り返すことができる。例えば、本発明のキメラポリペプチドの変化された表現型を担う核酸（例えば、その核酸）は、本発明の方法を利用して、同定、再単離、再改変され、その活性が再び調べられる。このプロセスは、好ましい表現型が設計されるまで反復的に繰り返えすことができる。例えば、タンパク質分解活性を含む生化学的な異化又は同化の全経路を細胞中に設計することが可能である。
同様に、ある特定のオリゴヌクレオチドが望ましい特質に全く影響を与えないと確認された場合、その配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することにより、変数としてのその配列を除去することができる。より大きな配列内にその配列を組み入れることは、如何なる交叉イベントをも妨げることから、子孫ポリヌクレオチド内にこの配列の如何なる変異種ももはや存在しないことになる。どのオリゴヌクレオチドが最も望まれる特質に関連するか、またどれが関連していないかを決定するこの反復操作は、特定の特質又は活性を提供する可能なタンパク質変種の全てをより効果的に調査することを可能にする。
【０１２１】
配列変種の作製
本発明の実施において、核酸変種は、指向変異導入法、無作為的化学変異、エキソヌクレアーゼIII欠失法、及び標準的なクローニング技術のような遺伝的エンジニア技術を用いて作製することができる。あるいは、そのような変種、断片、類似物、あるいは誘導体は、化学的な合成又は改変によって作製してもよい。変種を作製するための他の方法も当業者にはよく知られている。これらは、天然から単離されたものに由来する核酸配列を企業又は研究応用における価値を向上させた特性を持ったポリペプチドをコードするように核酸に改変する方法を含む。そのようなプロセスにおいて、天然から単離されたものから得られた配列に関して、一種又はそれ以上のヌクレオチド変異を持つ非常に多くの変種配列が作製されて調べられる。これらのヌクレオチド変異は、天然から単離されたものから得られた核酸の配列にコードされたポリペプチドにアミノ酸変異を生じさせ得る。
【０１２２】
例えば、変種を変異性(error prone)PCRを利用して作製してもよい。変異性PCRにおいて、PCRは、点突然変異が高い割合でPCR産物の全長にわたり得られるように、DNAポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件で行われる。変異性PCRは、例えば、Leung, D.W.他、Technique、1：11-15、1989及び Caldwell, R. C. & Joyce G.F.、PCR Methods Applic.、2：28-33、1992に述べられている。簡単に言うと、そのような操作は、点突然変異が高い割合でPCR産物の全長にわたり得られるように、変異される核酸をPCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ及び適当量のdNTPとを混合する。例えば、その反応は、変異される核酸20 fM、30 pMのPCR プライマー、50 mM KCl、10 mM Tris HCl (pH 8.3) 及び0.01 %ゼラチンを含んだ反応緩衝液、7 mM MgCl2、0.5 mM MnCl2、5 ユニットの Taq ポリメラーゼ、0.2 mM dGTP、0.2 mM dATP、1mM dCTP、及び1 mM dTTPを用いて実行することができる。PCRは、94℃ 1分間、45℃ 1分間、72℃ 1分間のサイクルを30回繰り返すことによって行うことができる。しかしながら、これらのパラメーターは、適切に変えられることは理解されるであろう。変異された核酸は、適当なベクターにクローン化され、変異核酸によってコードされたポリペプチドの活性が評価される。
【０１２３】
変種は、関心対象のクローン化DNAに部位特異的な変異を発生させるために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発法を用いて作製してもよい。オリゴヌクレオチドの変異誘発は、例えば、Reidhaar-Olson (1988) Science 241：53-57に記述されている。簡潔に言うと、そのような操作において、クローン化したDNAに導入される一種以上の変異を持つ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異されるDNAに挿入される。変異DNAを含んでいるクローンは、回収され、それらがコードするポリペプチドの活性が評価される。
変種を作製する他の方法は、アセンブリーPCRである。アセンブリーPCRは、小さいDNA断片の混合物に由来するPCR産物のアセンブリを含む。複数の異なったPCR反応が、同じバイアル中で平行して起き、別の反応産物をプライムする他の反応産物が得られる。アセンブリーPCRは、例えば、米国特許番号5,965,408に記述されている。
【０１２４】
変種を作製する更に別の方法は、セクシュアルPCR変異導入である。セクシュアルPCR変異導入では、配列の相同性に基づいたそのDNA分子の無作為な断片化とそれに続くPCR反応におけるプライマー伸張による交叉の固定の結果として、インビトロにおいて異なるが非常に関連のあるDNA分子間で強制的な相同組換えが起こる。セクシュアルPCRは、例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：10747-10751に記述されている。簡潔に言うと、そのような操作において、複数の再組換えされる核酸は、平均サイズ50〜200のヌクレオチド断片を作製するためにDNaseによって消化される。好ましい平均サイズの断片は、精製され、PCR混合物中に再懸濁させる。PCRを核酸断片間の再組換えを容易にする条件下に行う。例えば、PCRは、精製した核酸断片を10〜30 ng/mlの濃度で以下の組成の溶液中に再懸濁させることによって行ってもよい：0.2 mM dNTP、2.2 mM MgCl2、50 mM KCl、10 mM Tris HCl（pH 9.0）及び0.1 % Triton X-100。Taqポリメラーゼを100 mlの反応溶液中に2.5ユニット加え、PCRは、以下の条件で行われる：94℃で60秒間、94℃ 30秒間、50〜55℃ 30秒間、72℃ 30秒間（30〜45サイクル）そして72℃ 5分間。しかしながら、これらのパラメーターは、適当に変えられることは理解されるであろう。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドがPCR反応中に含まれてもよい。他の例において、最初のPCR反応にDNAポリメラーゼIのクレノー断片を、引き続くPCR反応にはTaqポリメラーゼを使用してもよい。再組換え配列は、単離され、それらがコードするポリペプチドの活性が評価される。
【０１２５】
変種は、インビボ変異導入法によって作製してもよい。いくつかの例において、関心対象の配列におけるランダム変異は、E.coliのような細菌株においてその関心対象の配列を増やすことによって作製され、それは、一つ以上のDNA修復経路において変異を伝える。そのような「ミューテーター」株は、野生型の親よりも高いランダム変異率を持っている。これらの株の一つにおいてDNAを増やすことは、結果的に、そのDNA中にランダム変異を生じさせるであろう。インビボ変異導入法の使用に適したミューテーター株は、例えば、  WO 91/16427に記述されている。
変種は、また、カセット変異導入法を使って作製することができる。カセット変異導入法において、二本鎖DNＡ分子の小さな領域が元の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」と置き換えられる。そのオリゴヌクレオチドは、完全に及び/又は部分的にランダマイズされた元の配列をしばしば含む。
【０１２６】
再帰的アンサンブル変異導入法も変種を作製するために使用される。再帰的アンサンブル変異導入法は、アミノ酸配列が異なる表現型的に関連のある変異株の多様な集団を作製するために開発されたタンパク質 エンジニアリング（タンパク質変異）のアルゴニズムである。この方法は、組み合わせカセット変異導入法の連続したラウンドを制御するフィードバック機構を利用している。再帰的アンサンブル変異導入法は、例えば、Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7811-7815に記述されている。
いくつかの例において、変種は、指数的アンサンブル変異導入法によって作製される。指数的アンサンブル変異導入法は、高い割合で特徴的又は機能的な変異株を含む混合ライブラリーを作製するためのプロセスであり、その中では、残基の小さな集団が、それぞれ変異された部位で、並行してランダマイズされ、機能タンパク質へ導くアミノ酸が同定される。指数的アンサンブル変異導入法は、例えば、Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11：1548-1552に、ランダム及び部位特異的変異導入法は、例えば、Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4：450-455にそれぞれ記述されている。
いくつかの例において、変種はシャフリング操作を用いて作製され、その中では、異なるポリペプチドをコードした複数の核酸の一部がお互いに融合し、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸を作り出す。これは、例えば、米国特許番号5,965,408；5,939,250に記述されている。
【０１２７】
宿主において高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドン最適化
本発明の一側面において、核酸は、コドン頻度を改変するために変異される。一側面において、本発明の方法は、細菌、昆虫、高等動物、酵母又は植物細胞のような宿主における発現を増加又は減少させるために、本発明のキメラポリペプチドをコードしている核酸配列のコドンを改変することを含む。
その方法は、タンパク質をコードしている核酸中の「非優先」又は「低優先」コドンを同定したり、これら「非優先」又は「低優先」コドンの一つ以上を置換コドンとして同じアミノ酸をコードした「優先」コドン及び同じアミノ酸をコードする優先コドンにより置き換えられた核酸における少なくとも一つの非優先又は低優先コドンと置き換えることを含む。優先コドンは、宿主の遺伝子においてコードしている配列中に過剰出現するコドンであり、「非優先」又は「低優先」コドンは、宿主の遺伝子においてコードしている配列中に低出現するコドンである。
【０１２８】
方法論と装置
本発明の実践において、種々の装置及び方法論を、例えば、キラル選別のためのキメラモノマー及びポリマーを使用して、生合成経路として、選別スキャッフォールドとしてラセミ混合物からのキラル分離の効率を決定するため、変異キメラポリペプチドをスクリーンするため、ナノチューブル形成の度合いを決定するため、及びその類のために利用することができる。
【０１２９】
キャピラリーアレー
GigaMatrixTM（ギガマトリックスTM）、Diversa Corporation、San Diego, CA USA、のようなキャピラリーアレーを本発明の方法に使用することができる。本発明の核酸やポリペプチド（本発明のキメラモノマー及びポリマー）又は他の成分（本発明のナノチューブル生合成経路に利用される基質又は補欠因子、抗体又は本発明のキメラモノマーに結合する他の成分）は、キャピラリーアレ-を含むアレーに固定化されるか、又はそれらに添加される。アレーは、本発明のキラル選別法において利用することができる。キャピラリーアレーは、本発明のモノマー、本発明の方法により選別されたキメラ産物、基質ならびに本発明の生合成経路法に用いられる補欠因子や産物その他の保持及びスクリーニングのためのシステムを提供することができる。
サンプル装置は、隣接したキャピラリーアレーとして形成される複数のキャピラリーを含むことができ、各キャピラリーは、試料を保持する管腔を形成する少なくとも一つの壁を含む。この装置は、更に、アレー中の隣接したキャピラリーを整列させるための間質材を含んでおり、その間質材の間に一つ、あるいはそれ以上の参照指標を含む。試料をスクリーニングするためのキャピラリーは、キャピラリーアレーとして結合するために適合されており、試料を保持するための管腔を規定する第一の壁があり、更に、試料を励起させるために管腔に与えられる励起エネルギーを透過するためのフィルター材から形成される第二の壁がある。
【０１３０】
ポリペプチド又は他の成分は、キャピラリーアレー中における少なくとも一部のキャピラリーに第一の成分に導入することができる。キャピラリーアレーの各々のキャピラリーは、第一の成分を保持するための管腔を規定する少なくとも一つの壁を持つ。キャピラリー中には、第一の成分の後に空気泡を導入する。第二の成分がキャピラリーへ導入され、ここで第二の成分は、空気泡により第一の成分から分離される。関心対象試料は、検出可能な粒子で標識された第一液としてキャピラリーアレー中の一つのキャピラリーに導入され、キャピラリーアレーの各々のキャピラリーは、第一液と検出用粒子を保持するための管腔を規定する少なくとも一つの壁を含んでおり、前記少なくとも一つの壁が検出用粒子を結合させるための結合材料で被覆されている。本法は、更に、結合した検出用粒子が保持されているキャピラリーからの第一液を除去すること及びそのキャピラリーに第二液を導入することを含んでいる。
【０１３１】
キャピラリーアレーは管腔を隔てる少なくとも一つの外壁を持つ個々のキャピラリーにより形成されている。キャピラリーの外壁は、互いに融合した一つ以上の壁を持つことができる。同様に、壁は、それが液体や試料を保持する管腔を形成する限り、円筒形、四角、六角形やその他の幾何学的形態の管腔を規定することができる。キャピラリーアレー中のキャピラリーは、平面構造を形成するように近接して互いに支え合うことができる。キャピラリーは、融合(この例では、キャピラリーはガラス製)、接着剤、粘結剤、あるいは固定具などにより互いに結着させることができる。キャピラリーアレーは、如何なる数のキャピラリーからでも形成できる(例えば、100〜4,000,000のキャピラリー)。キャピラリーアレーは、約100,000又はそれ以上の互いに結着したキャピラリーを持つマイクロタイタープレートを形成できる。
【０１３２】
アレー、あるいは「バイオチップ」
本発明の実施において、本発明のポリペプチドは、アレーへ固定化されるか、又はそれらに適用することが出来る。アレーは、例えば、ラセミ混合物からエナンチオマーを選別するような本発明の方法を実施するために利用することができる。「ポリペプチドアレー」は、複数のタンパク質の定量又は選別を同時に行うために使用できる。本発明は、どのような既知「アレー」を用いても実行可能であり、これらのアレーには、「マイクロアレー」、又は「DNAアレー」、又は「核酸アレー」、又は「ポリペプチドアレー」、又は「抗体アレー」、又は「バイオチップ」、あるいはこれらを改変したものが含まれる。アレーは、一般的に、複数の「スポット」、あるいは試料分子との特異的結合を行わせるために基質表面の一定の領域に固定化された一定量の一種以上の生物分子を含む各標的成分である「標的要素」である。例えば、ジエチルアミノエチル-セルロース、多孔性ガラス、キチン又は細胞のような挿入サポートへの固定化のような如何なる固定化法も使用できる。本発明の方法を実施するにあたり、既知のアレイ及び/又はアレイの作製法、及びその使用法は、その全て、あるいは一部、又はその改変されたものが、例えば、以下に記述されている：米国特許番号6,277,628；6,277,489；6,261,776；6,258,606；6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440; 5,965,452；5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752；5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305；5,700,637；5,556,752；5,434,049；例えば、以下も参照、WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958；例えば、以下も参照、Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23：1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21：25-32 。又、米国特許出願番号20,010,018,642；20,010,019,827；20,010,016,322；20,010,014,449；20,010,014,448；20,010,012,537；20,010,008,765も参照。
【０１３３】
抗  体
本発明の組成及び方法は、抗体を用いて実施することができる。例えば、本発明のキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、例えば、本発明の生合成経路において使用するための触媒抗体、あるいは本発明の生合成経路に利用される酵素、補欠因子、基質及びその類に特異的に結合する抗体、あるいは本発明の方法に使用されるキラル選別タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体のような抗体であり得る。抗体は、例えば、キラル選別産物又は本発明の生合成経路の産物を精製するための免疫沈降、染色、イムノアフィニティーカラム、及びその類に使用されることができる。
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を用いて行うアッセイ法、例えば、ELISA、は、当業者によく知られている技術であり、科学文献及び特許文献に述べられている。例えば、以下を参照。Coligan、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、Wiley/Greene、NY (1991)；Stites (編集) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (第七版) Lange Medical Publications、Los Altos、CA (“Stites”)；Goding、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (第二版) Academic Press、New York、NY (1986)；Kohler (1975) Nature 256：495；Harlow (1988) ANTIBODIES、A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Publications、New York。抗体は、動物を用いた古典的なインビボ法に加え、例えば、ファージディスプレーライブラリーで組換え抗体結合部位を発現させるようなインビトロ法により作製することができる。例えば、Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15：62-70；Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26：27-45を参照。
【０１３４】
生物試料におけるタンパク質の抗体に結合する能力は、その技術に熟練した者が精通した多様な方法により測定してもよい。結合は、例えば、蛍光試薬、酵素標識、あるいは放射性同位体のような検出標識により抗体を標識することににより測定されてもよい。別法として、抗体の試料への結合は、その中にそのような検出可能標識を持つ二次抗体を用いて検出してもよい。具体的なアッセイには、ELISA法、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及びウエスタンブロット法が含まれる。
【０１３５】
キット
本発明は、ナノチューブル等のモノマー及びポリマーを含む本発明を実践するための材料から成るキットを提供する。キットは、また、手順を指導した資料、そしてここで述べられている本発明の用途を含む。
【０１３６】
実施例
実施例１：E.coliからの組換えタンパク質の単離
下記の例は、E.coliから組換え「カニューレ」又は「Can」タンパク質を単離するための例示的なアッセイを述べる。
本実施例における全ての例示なアッセイには、下記の緩衝液、試薬を用いた：
低塩緩衝液：80 mM NaCl、50 mM Tris/ HCl (pH 7.5)、9 % グリセロール    
高塩緩衝液：1.2 M NaCl、50 mM Tris/ HCl (pH 7.5)、9 % グリセロール
Bicinchonic Acid Test (BCA)：このテストは、製造業者のガイドに基づいて行った（Sigma、Deisenhofen）。タンパク質サンプル（CanA、B、C）の一部と既知のBSA希釈液を50倍量のBCA/CuSO4 (50:1)溶液と混合し、60℃にて30分間反応させ、常温に冷却後、分光計による562 nmの測定を行った。タンパク質濃度は、BSA検量線に基づき測定した。
【０１３７】
a)  CanAとCanB
CanA又はCanB等、特定の配列が発現された1ｇの組換えE.coliを、4 mlの低塩緩衝液に吸収させた(absorbed)。フレンチプレスによって細胞溶解を行なった(20,000 psi(138MPa)にて2回、American Instrument 社、Silver Spring、USA)。細胞断片を沈殿させた後（エッペンドルフ遠心分離機、13,000 rpm、5分間、常温）、タンパク質溶液は、80℃にて20分間インキュベートした。次に変性タンパク質を遠心によって（上述したように）除去した。上清は、1分間に1 mlの速度でQ Sepharoseカラムに通した(1 x 12 cm = 9.4 ml、Pharmacia、Freiburg)。CanA又はCanBを含んだ溶出液を集めた。集めた溶出液をロイペプチン処理し（１μg/μl）、排除限界5 kDaのMACROSEPTM遠心分離濃縮機(Pall Filtron、Dreieich)にて4〜8時間、3〜4倍（体積基準）に濃縮した。BCAによりタンパク質濃度を測定した後、精製タンパク質は、100-200 μlずつ小分けし、液体窒素によって凍結後、-80℃にて保存した。それぞれの過程でサンプルを採取し、SDSポリアクリルアミドゲルにて分析した。
【０１３８】
b)  CanC
CanCを単離する第一工程は、CanA及びCanBと同じである（例21.a参照）。しかし、第二工程中、CanCは、Qセファロースに保持した。低塩緩衝液にてカラムを洗浄した後、CanCは、塩密度勾配(80〜750mM、60mlの容量で)によって溶出分画して得られた（１mlごと）。SDSポリアクリルアミドゲルによる個々の分画分析の後、CanCを含む分画は、低塩緩衝液に対して４℃で一夜透析した。最後に、タンパク質溶液を、１ml RESOURCEQTMカラム(Pharmacia、Freiburg)にて１分間に１mlの速度で溶出した。次に、塩勾配にかけ(60mlに対し80〜750mM)、0.5mlの分画を集めた。SDSポリアクリルアミドゲル分析の後、CanCを含む分画を再度一緒にし、低塩緩衝液に対して一夜透析した。ロイペプチン(１μg/μl)添加の後、溶液は、排除限界５kDaのMACROSEPTM遠心分離濃縮機(Pall Filtron、Dreieich)にて6時間、7倍（体積基準）に濃縮した。
【０１３９】
実施例２：CanAポリマーの作製
下記の例は、本発明キメラポリペプチドを含むCanAポリマー作製の例示的な方法を述べる。
a)  組換えE.coliの300 Lファメンター培養
発現プラスミドpEX-CAN-A（実施例20に述べる方法を用い、同一の配列番号１と実質的に同一の配列をベクターpET17bに結合することにより作製）を含む組換えE.coli BL21(DE3)の300 L培養は、HTE-ファメンター（Bioengineering、Wald、Switzerland）でエアレーション（165 Lエアー/分）、攪拌（400rpm）、37℃にて行い、倍加時間約40分であった。OD（600nm）が0.80に達したとき、30ｇのIPTG添加によりCanAタンパク質の産生を誘導した。３時間の誘導後、細胞を４℃に冷却し、回収した。細胞収量：1,610ｇ（湿質量）
【０１４０】
b)  ポリマーの作製
i.  フレンチプレス：250ｇの組換えE.coli凍結細胞（-60℃にて保存）を600 mlの緩衝液（80 mM NaCl及び９% (v/v) グリ『セロール含有50 mM Tris-HCL、pH 7.5）に懸濁した：最終体積：900ml。細胞をフレンチプレス（Aminco；1 回 20,000 psi(138MPa)）にて破砕した。UltraturraxブレンダーによるDNAの剪断によって溶液の粘度を下げ、緩衝液を更に400ml添加した。
ii.  遠心分離：遠心分離（Sorvall SS34ローター；19,000 rpm、15分間）にて粒子を取り除き、透明な上清（「粗抽出物」と呼ぶ）を得た。
iii.  熱沈殿：熱感受性タンパク質を沈殿させる為、粗抽出物を100℃にて1分間加熱した。例えば、粗抽出物（1,200 ml）を100℃の水-グリセロール浴（水：グリセロール＝1：1）に浸した75 cmのプラスチックホース（内半径5 mm、4.75 ml/分）を通して送出した。ホース内の溶液を冷却する為、溶液を三角フラスコに採る前に、プラスチックホースの出口端を氷浴に通過させた。
iv.  遠心分離：熱処理された粗抽出物をSorvallローターGSAにより25分間9,000 rpmにて遠心分離した。透明な上清を集めた。
【０１４１】
v.  硫酸アンモニウム沈殿：透明な上清（840 ml）に100 ％飽和硫酸アンモニウム(452 ml)を４℃にて添加した（最終硫酸アンモニウム濃度：35％飽和）。４℃にて2時間沈殿させた後、遠心分離により沈殿物を得た（１時間；13,000 rpm；SowallローターGSA）。沈殿物は、緩衝液（最終量171 ml；12.35 mgタンパク質/ml；2,112 mg 全タンパク質）中にて可溶化し、タンパク質溶液を得た。最後に、タンパク質溶液は、Rapid Dialysisにより緩衝液に対して伝導性が緩衝液と同一になるまで透析した（3時間）。
【０１４２】
vi.  重合化：透析したタンパク質溶液を、最終タンパク質濃度が6.5 mg/ml（最終量325 ml）となるように希釈した。そして、100℃にて1 L三角フラスコの振盪下、希釈されたタンパク質溶液を迅速に80℃に加熱し、そして速やかに500mlスクリューキャップ保存ボトルに移した。保存ボトルには3.32mlの「ポリマープライマー」（「ポリマープライマー」は、前もって作製したポリマー懸濁液の4回にわたるフレンチプレス-剪断により調整しておいた）を入れた。そしてCaCl2とMgCl2（それぞれ最終濃度20mM）を添加し、密封したボトルを60℃水浴にて保存した。これらの塩の添加後、溶液は直ちに混濁し、急速なタンパク質ユニットの重合化が示された。10分間の重合化の後、ポリマーファイバーを、重合化を促進するポリマープライマーを作製するために20秒間Ultraturraxによる処理により剪断した。発泡を防ぐため、Ultraturrax処理の前にシリコン反発泡剤を添加してもよい。通常、80℃にて10分間のポリメリゼーションの後、電子顕微鏡にてポリマー又はポリマーファイバーが観察できる。１〜２時間の重合化の後、遠心分離(15分、20,000rpm、SorvallローターSS34)によってタンパク質ポリマーは溶液から完全に取り除くことができたが、これは完全な重合化を示している。ポリマー収量：250ｇ(湿質量)のE.coliから2.1ｇ（タンパク質）（約1ｇポリマー(乾燥質量)/119ｇE.coli）。
vii.  保存：湿潤：10mM アジ化ナトリウムを含む緩衝液中、4℃。乾燥：1/10希釈の緩衝液による洗浄、遠心分離の後、凍結乾燥。
【０１４３】
実施例３：脂質でコーティングされたドラッグデリバリー複合体の調製
以下の実施例は、本発明のキメラポリペプチドなどのCanAを含む、脂質でコーティングされたドラッグデリバリー複合体を調製するための例示的な工程を述べる。
３mg/mlの単量体タンパク質ユニット（例えば、配列番号. 2の配列を持つCan A：182 アミノ酸：MW = 19,830 Da）を含む溶液に、所望量の薬剤分子、十分量の電気的に中性な脂質、ミリモル量のカルシウム及びマグネシウムカチオンを添加する。この混合液を、リポソームが作られるまで十分な時間周囲条件にて保持する。次に、ゲルろ過クロマトグラフィーを行ない、混合液に含まれるリポソームを分画する。リポソームを含む目的の分画は、それぞれのリポソームの単量体ポリペプチドユニットの重合化を開始させる為、mM量のカルシウム及びマグネシウムカチオンと共に50℃に加熱する。重合化は、リポソームの極度の変形をもたらし、ドラッグ分子を含む密封された脂質チューブルを産生する。
【０１４４】
本発明の多くの実施態様を記載してきた。しかしながら、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく種々の改変を行うことができると理解される。従って、他の実施態様も請求の範囲内に入るものである。
種々の図における同じ参照符は、同じ要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１はE.coliにて発現された組換えCanAからアッセンブルされたナノチューブルの透過型電子顕微鏡写真を図示する。
【図２】図２は、CanAおよびCanB配列のリーディングフレームの概略図である。CanA配列がCanBには見られない14アミノ酸ドメインを含むことを示している。
【図３】図３は、CanAのリーディングフレーム(配列番号:1)とグリーン蛍光タンパク質ZSGREENTMの融合により作製された融合タンパクからアッセンブルしたナノチューブルの免疫蛍光顕微鏡イメージを示す。
【図４】図４は、下記に述べられるように、異なったキメラモノマーの自己集合により作製された本発明のヘテロポリマーを構築する典型的なプロセスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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