(57)【要約】ＤＮＡメチル化度を決定する新しい技術は、ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、メチル化されていないメチル化部位を切断することにより、試験サンプルのＤＮＡ断片を生成するステップを含む。この手法によって、Ｃｐｇ島内又はその範囲外にある１個のメチル化シトシンの差に対してさえも高い感度が得られ、またこの手法を使用して、ＣｐＧ島を含むＤＮＡ領域、１個又は複数のＣｐＧ含有島を含むＤＮＡ領域、さらには多種類のＤＮＡ領域のメチル化状態を確認することができる。
2006500901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度が対照と異なっているかどうか検出する方法であって、
ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、ＤＮＡ中のメチル化されていないメチル化部位を切断することにより、少なくとも１種の試験ＤＮＡサンプルからＤＮＡ断片を生成するステップ、
前記ＤＮＡ断片の両端にオリゴヌクレオチドリンカーを連結するステップ、
リンカープライマーにより前記オリゴヌクレオチドリンカーのところでＤＮＡ増幅を開始して、前記ＤＮＡ断片を増幅するステップ、
前記増幅されたＤＮＡを、試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域と相補的な、固体担体上に固定化された１種又は複数のポリヌクレオチドにハイブリダイズするステップ、及び
固定化されたポリヌクレオチドにハイブリダイズされる、試験サンプル由来の増幅されたＤＮＡの量を対照のものと比較し、それによって、前記１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度が試験サンプルと対照とで異なっているかどうか検出するステップ、
を含む上記方法。
【請求項２】
前記対照が、前記１種又は複数の試験ＤＮＡサンプルと同様に処理した１種又は複数の対照ＤＮＡサンプルである請求項１記載の方法。
【請求項３】
メチル化感受性作用物質による切断によって前記ＤＮＡ断片を生成する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記メチル化感受性作用物質がメチル化感受性制限酵素である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記制限酵素が、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＣ、ＡＣＧＴ、ＣＧＧＣＣＧ、ＧＣＣＧＧＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＧＣＧ、ＡＴＣＧＴＡ、ＴＴＣＧＡＡ、ＧＴＣＧＡＧ、及びＣＴＣＧＡＧからなる群から選択された認識配列を切断する請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化感受性制限酵素が、ＣＧＧＣＣＧ、ＧＣＣＧＧＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＣ、及びＡＣＧＴからなる群から選択された認識配列を切断する請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドリンカーがリン酸化されている請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドリンカーがリン酸化されていない請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記リン酸化されていないオリゴヌクレオチドリンカーが２本鎖であり、前記リンカーの一方の鎖のみが前記断片に連結される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
連結された断片のポリメラーゼ連鎖伸長を増幅ステップの前に行い、前記オリゴヌクレオチドリンカーの一方の鎖がリンカープライマーである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種のメチル化非感受性作用物質によってＤＮＡを切断するステップをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記メチル化非感受性作用物質がメチル化非感受性制限酵素である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記メチル化非感受性制限酵素が、ＥｃｏＲＩ、ＡｐｏＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＭｓｅＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＮｌａＩＩＩ、ＤｐｎＩＩ、及びＣｖｉＪＩからなる群から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記メチル化感受性作用物質及び前記メチル化非感受性作用物質による前記切断を同じ混合物中で同時に行う請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１種のメチル化非感受性作用物質によって生成された各ＤＮＡ断片の末端にリン酸化されていないオリゴヌクレオチドリンカーを連結するステップをさらに含む請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
メチル化非感受性作用物質によって切断された部位に連結される前記オリゴヌクレオチドリンカーが、メチル化感受性作用物質によって切断された部位に連結されるオリゴヌクレオチドリンカーと異なる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドリンカーが、共通（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）オリゴヌクレオチドリンカーである請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ハイブリダイズされる増幅されたＤＮＡの量を比較する前記ステップを、前記増幅されたＤＮＡに結合された検出可能部分を測定することによって行う請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記検出可能部分がシアニン色素である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記検出可能部分が標識されたデンドリマーである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記検出可能部分を増幅プライマーに結合させた後、これが増幅産物中に組み込まれる請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
増幅を行った後、前記検出可能部分を増幅されたＤＮＡに結合させる請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能部分が増幅の際に合成ＤＮＡに組み込まれる請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記固定化されたポリヌクレオチドが１種又は複数のＣｐＧ島と相補的な配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記固定化されたポリヌクレオチドが、１種又は複数の遺伝子調節配列、又は一遺伝子コード配列と相補的な配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記固定化されたポリヌクレオチドが、アレイとして固定化された少なくとも２種のポリヌクレオチドを含む請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記アレイがマイクロアレイである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡを増幅する前記ステップをポリメラーゼ連鎖反応によって行う請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記試験サンプル及び前記対照サンプル由来の前記ＤＮＡ断片が、混ぜ合わせたときに互いに識別可能な異なる検出可能部分で標識される請求項２記載の方法。
【請求項３０】
前記の異なる検出可能部分がシアニン３色素及びシアニン５色素からなる請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ハイブリダイゼーションステップの前に前記試験サンプル及び対照サンプルを混ぜ合わせる請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度が対照と異なっているかどうか検出する方法であって、
ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、ＤＮＡ中のメチル化されていないメチル化部位を切断することにより、少なくとも１種の試験ＤＮＡサンプルからＤＮＡ断片を生成するステップ、
前記ＤＮＡ断片の両端にオリゴヌクレオチドリンカーを連結するステップ、
特定のサイズ範囲のＤＮＡ断片を選択するステップ、
前記ＤＮＡ断片を検出可能部分で標識するステップ、
試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域と相補的な、固体担体上に固定化された１種又は複数のポリヌクレオチドに前記ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせるステップ、及び
前記の固定化されたポリヌクレオチドに結合した前記検出可能部分の量を試験サンプルと対照とで比較し、それによって、１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度が試験サンプルと対照とで異なっているかどうか検出するステップ、
を含む上記方法。
【請求項３３】
前記対照が、１種又は複数の試験ＤＮＡサンプルと同様に処理した１種又は複数の対照ＤＮＡサンプルである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
メチル化感受性作用物質による切断によって前記ＤＮＡ断片を生成する請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記メチル化感受性作用物質がメチル化感受性制限酵素である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記制限酵素が、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＣ、ＡＣＧＴ、ＣＧＧＣＣＧ、ＧＣＣＧＧＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＧＣＧ、ＡＴＣＧＴＡ、ＴＴＣＧＡＡ、ＧＴＣＧＡＧ、及びＣＴＣＧＡＧからなる群から選択された認識配列を切断する請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記メチル化感受性制限酵素が、ＣＧＧＣＣＧ、ＧＣＣＧＧＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＣ、及びＡＣＧＴからなる群から選択された認識配列を切断する請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記検出可能部分が標識されたデンドリマーである請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
前記１種又は複数の固定化されたポリヌクレオチドが１種又は複数のＣｐＧ島と相補的な配列を含む請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
前記１種又は複数の固定化されたポリヌクレオチドが、１種又は複数の遺伝子調節配列、又は一遺伝子コード配列と相補的な配列を含む請求項３２記載の方法。
【請求項４１】
前記１種又は複数の固定化されたポリヌクレオチドが、アレイとして固定化された少なくとも２種のポリヌクレオチドを含む請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
前記アレイがマイクロアレイである請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記試験サンプル及び前記対照サンプル由来の前記ＤＮＡ断片が、混ぜ合わせたときに互いに識別可能な異なる検出可能部分で標識される請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
前記の異なる検出可能部分がシアニン３色素及びシアニン５色素からなる請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ハイブリダイゼーションステップの前に前記試験及び対照サンプルを混ぜ合わせる請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチドリンカーを標識することにより前記ＤＮＡを標識する請求項３２記載の方法。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチドリンカーが、検出可能な標識を結合させるのに使用する捕捉配列を含む請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
特定のサイズ範囲の前記ＤＮＡ断片を選択する前記ステップを、リンカーに連結するステップの後に実施する請求項３２記載の方法。
【請求項４９】
特定のサイズ範囲の前記ＤＮＡ断片ステップを選択する前記ステップによって、長さ約１，５００塩基対以下の断片が分離される請求項３２記載の方法。
【請求項５０】
個体が、その個体の１箇所又は複数のＤＮＡ領域の異常な程度のメチル化に関連した疾患状態に罹っているかどうか検出する方法であって、
前記個体の組織から得た試験ＤＮＡサンプルを準備するステップ、
請求項１の方法に従って、前記個人からの前記サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度を決定するステップ、及び
前記試験サンプル中の前記１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度を健常対照のものと関連付けることにより、異常なメチル化であるかどうか判定し、それによって前記個体が疾患状態に罹っているかどうか示すステップ、
を含む上記方法。
【請求項５１】
個体が、その個体の１箇所又は複数のＤＮＡ領域の異常な程度のメチル化に関連した疾患状態に罹っているかどうか検出する方法であって、
前記個体の組織から得た試験ＤＮＡサンプルを準備するステップ、
請求項３２の方法に従って、前記個体からの前記サンプルＤＮＡ中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度を決定するステップ、及び
前記試験サンプル中の前記１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度を健常対照のものと関連付けることにより、異常なメチル化であるかどうか判定し、それによって前記個体が疾患状態に罹っているかどうか示すステップ、
を含む上記方法。
【請求項５２】
個体のＤＮＡ領域中のメチル化度が疾患状態と相関関係にあるかどうか確定する方法であって、
請求項１の方法に従って、疾患状態にある様々な個体と疾患状態にない様々な個体のＤＮＡ中前記領域のメチル化度を決定し、次いで前記領域のメチル化度が前記疾患状態と相関関係にあるかどうか判定するステップ、
を含む上記方法。
【請求項５３】
個体のＤＮＡ領域中のメチル化度が疾患状態と相関関係にあるかどうか確定する方法であって、
請求項３２の方法に従って、疾患状態にある様々な個体と疾患状態にない様々な個体のＤＮＡ中前記領域のメチル化度を決定し、次いで前記領域のメチル化度が前記疾患状態と相関関係にあるかどうか判定するステップ、
を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾されたヌクレオチド配列の検出、より詳細には、ヌクレオチド配列の核酸塩基のメチル化を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのメチル化は、真核生物における遺伝子発現の調節に重要な影響をもち、示差的な遺伝子発現、細胞分化、クロマチンの不活性化、ゲノム刷り込み、発癌など、様々な細胞活動に後成的作用及び変異原性作用を及ぼすと考えられている。Ｇｏｎｚａｌｇｏ及びＪｏｎｅｓ、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．第３８６巻：１０７〜１１８ページ（１９９７年）。ＤＮＡのメチル化は、細胞が発達する間の遺伝子発現の調節においてもある役割を担うことが知られている。Ｈｕａｎｇら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第８巻：４５９〜４７０ページ（１９９９年）。哺乳動物では、ＤＮＡのメチル化は、通常、グアニンの５’側に位置するシトシンで起こり、ＣｐＧジヌクレオチドとして知られている。多くのＣｐＧは、遺伝子の調節領域の所／付近でクラスターを形成しており、ＣｐＧ島と呼ばれる。ＣｐＧ島内でのＤＮＡのメチル化又は過剰メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、遺伝子の発現の調節において特に重要であると考えられる。かなりの種類の遺伝子がＣｐＧ島と関連しており、ＣｐＧ島の過剰メチル化は、９０種を超える遺伝子プロモーター中で観察されている。ＣｐＧ島の過剰メチル化は、癌では、腫瘍抑制遺伝子又は成長調節遺伝子の後成的な不活性化と関連している。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化は、しばしば疾患の状態を反映するので、メチル化パターンの変化を検出する正確で感度及び効率のよい方法があれば、大いに望ましい。メチル化パターンの変化を検出する既存の方法には、サブストラクティブハイブリダイゼーションやサザンブロットを使用する分析など、面倒な段階を要することが多い。メチル化されていないシトシンを亜硫酸水素ナトリウムのような化学試薬と反応させることを利用する既存の方法は、鋳型に損傷を与え、塩基組成を変更するので、後続のＰＣＲ増幅で問題を生じかねない。既存の方法は、ゲノム全体についてのメチル化の変化を高感度で検出できないなど、他の欠点ももつ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ＤＮＡのメチル化を検出するための、より高処理量（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）で精度の高まった改良された方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度が対照と異なっているかどうか検出する方法を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明は、ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、メチル化されていないメチル化部位を切断することにより、少なくとも１種のＤＮＡ試験サンプルからＤＮＡ断片を生成するステップ、オリゴヌクレオチドリンカーをＤＮＡ断片の両端に連結するステップ、そのリンカーから増幅を開始してＤＮＡを増幅するステップ、増幅されたＤＮＡを、固体担体上に固定化された１種又は複数のポリヌクレオチド、すなわち試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域と相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするステップ、及び固定化されたポリヌクレオチドにハイブリダイズされる、試験サンプル由来の増幅されたＤＮＡを対照のものと比較するステップを含む。典型的な実施形態では、検出可能部分を用いてＤＮＡ断片を標識することができる。
【０００７】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、メチル化されていないメチル化部位を切断することにより、少なくとも１種の試験ＤＮＡサンプルからＤＮＡ断片を生成するステップ、適切な大きさの断片を分離するステップ、検出可能部分を用いて標識したオリゴヌクレオチドリンカーをそのＤＮＡ断片の末端に連結するステップ、増幅されたＤＮＡを、固体担体上に固定化された１種又は複数のポリヌクレオチド、すなわち試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域と相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするステップ、及びポリヌクレオチドと結合した検出可能部分の量を試験サンプルと対照とで比較するステップを含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、上述の方法を使用して、個体が、その個体の１箇所又は複数のＤＮＡ領域の異常な程度のメチル化に関連した疾患状態に罹っているかを判定する。本発明の上記の諸態様には、以下で詳細に扱う多くの異なる実施形態がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
先に述べたように、哺乳動物では、ＤＮＡのメチル化は、ＣｐＧ部位のシトシンを含めてシトシンの所で、シトシンのピリミジン環へのメチル基の付加によって起こる。１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化変化の程度を決定すべく本発明で開発した新しい手法が提供される。本発明の方法を使用すると、あるサンプル中のＤＮＡ領域のメチル化度が対照と異なっているかどうか判定することができる。
【００１０】
一態様では、本発明の手法によって、ＣｐＧ島内又はその範囲外にある１個のメチル化シトシンの差に対しても敏感なほど感度が高まり、またこの手法を使用して、１個又は複数のＣｐＧ島を含むＤＮＡ領域、１個又は複数のＣｐＧ含有島を含む１箇所又は複数のＤＮＡ領域、さらには多種類のＤＮＡ領域のメチル化状態を突き止めることができる。後者は、単一個体ゲノムのＤＮＡセグメント約１０，０００〜５０，０００以上のメチル化状態を決定することを意味し得る。たとえば、この方法を使用すれば、既知のすべてのＣｐＧ高含有部位（現在約４５，０００箇所が知られている）に存在するメチル化の程度を照会することができる。別の側面では、標準の分子生物学実験室やマイクロアレイ施設で数百以上のサンプルを毎日分析することができる。したがって、本発明により、ゲノム全体のメチル化状態が多くの個体について迅速かつ比較的安価に照会できるようになる。
【００１１】
一態様では、本発明は、ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、ＤＮＡ中のメチル化されていないメチル化部位を切断することにより、ＤＮＡサンプルからＤＮＡ断片を生成するステップを含む。そのＤＮＡ断片の末端にオリゴヌクレオチドリンカーを連結する。ある実施形態では、検出可能部分を用いてこのリンカーを標識する。他の実施形態では、そのオリゴヌクレオチドリンカーから増幅を開始してＤＮＡを増幅する。そのＤＮＡ断片を、固体担体上に固定化された１種又は複数のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることにより分析する。最後に、試験サンプルＤＮＡ用の固体担体と結合したＤＮＡの量を対照と比較して、評価しようとするＤＮＡ領域のメチル化度が、試験サンプルと対照とで異なっているかどうか判定する。ある実施形態では、実際の対照ＤＮＡサンプルを使用し、固定化されたポリヌクレオチドにハイブリダイズする前に、試験ＤＮＡ断片を混ぜ合わせてもよい。こうした方法の種々のステップ、並びにその手順に対する変更及び／又は追加に基づく追加の実施形態については以下で論じる。
【００１２】
ＤＮＡの断片化
ＤＮＡ断片は、細胞、組織、又は体液から精製されたＤＮＡから生成することができる。このような供給源からＤＮＡを単離する技術は、当分野の技術者によく知られている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験室必携（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）」第１巻〜３巻（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）を参照されたい。純度の高いＤＮＡが調製しやすく好ましいが、後続のステップで必要とされるようにＤＮＡを切断加工することができるのなら、低めの純度を使用してもよい。
【００１３】
ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ中のメチル化されているメチル化部位を残しながら、メチル化されていないメチル化部位で切断することにより生成する。この記述では、表現「メチル化部位」とは、細胞内でメチル化され得る可能性のあるＤＮＡ中の部位を指す。そのような部位は、ＣｐＧ状況下で（もっぱらではないが）しばしば見られるシトシンを含有している。ＤＮＡ中のメチル化されている部位を残しながら、メチル化されていないメチル化部位でＤＮＡ断片を切断する好ましい方法は、１種又は複数のメチル化感受性作用物質を用いてＤＮＡを切断するものである。「メチル化感受性」作用物質とは、普通は、メチル化部位がメチル化されていないときにその部位でＤＮＡを切断するが、メチル化部位がメチル化されているときにはその部位を切断しない、又は低い効率で切断する作用物質である。メチル化感受性作用物質は、ＤＮＡ中のメチル化部位がメチル化されていないときに、それだけを認識し、そこだけを切断することが好ましい。細菌ＤＮＡ中のアデニンもしくはシトシンヌクレオチド、又は植物もしくは哺乳動物ＤＮＡ中のＣｐＧ、ＣｐＮｐＧ、及びＣＣＷＧＧ部位のシトシンヌクレオチドのメチル化に関与するメチル化部位を認識するメチル化感受性作用物質を使用することができる。
【００１４】
好ましいメチル化感受性作用物質は、メチル化感受性制限酵素である。そうした酵素及びその使用例の詳細は、たとえば、特にＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＰｒｏＭｅｇａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販品を入手することができる。他のメチル化感受性制限酵素を同定する技術は、当分野の技術者に知られている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前掲書（１９８９年）は、制限酵素及び他の酵素を使用する方法の全般的な説明を提示している。
【００１５】
ＣｐＧ部位でのメチル化の変化を分析するための、本発明での使用に適するメチル化感受性制限酵素の例には、ＨｐａＩＩ（Ｃ‘ＣＧＧ）、ＡｃｉＩ（Ｃ‘ＣＧＣ）、ＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ‘ＣＧＣ）、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ（Ａ‘ＣＧＴ）、ＥａｇＩ（Ｃ‘ＧＧＣＣＧ）、ＮｇｏＭＩＶ（Ｇ‘ＣＣＧＧＣ）、ＫａｓＩ（Ｇ‘ＧＣＧＣＣ）、ＳｍａＩ（ＣＣＣ‘ＧＧＧ）、ＢｓｔＵＩ（ＣＧ‘ＣＧ）、ＢｓｐＤＩ（ＡＴ‘ＣＧＴＡ）、ＢｓｔＢＩ（ＴＴ‘ＣＧＡＡ）、ＳａｌＩ（Ｇ‘ＴＣＧＡＧ）、及びＸｈｏＩ（Ｃ‘ＴＣＧＡＧ）が含まれる。本発明によれば、切断は、１種以上の作用物質を別々に使用しても、又は併用しても実現することができる。ＥａｇＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＫａｓＩ、ＳｍａＩなどの酵素は、特に有用である。これらの酵素は、主にＣｐＧ島中に位置し、ゲノムの他の区域では比較的まれであり、また生成されるアンプリコンがそれほど複雑にならず、したがって、制限部位の出現頻度が高い酵素を使用する場合よりもハイブリダイゼーションシグナルが強く、かつ特異的になるからである。ＨｐａＩＩ（Ｃ‘ＣＧＧ）、ＡｃｉＩ（Ｃ‘ＣＧＣ）、ＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ‘ＣＧＣ）、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ（Ａ‘ＣＧＴ）などの酵素は、同じ「粘着」末端を生じ、ＤＮＡ断片の切断末端が１種類のオリゴヌクレオチドリンカー（すなわち、共通（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）リンカー）にその後結合できるようになるので、特に好都合であるといえる。方法の特定の段階で生成されたすべての切断末端に連結できる共通リンカーが好ましい。
【００１６】
メチル化されていないメチル化部位で、制限酵素以外の化学作用物質を使用することにより、ＤＮＡ断片を生成してもよい。たとえば、メチル化されているＤＮＡ部位が切断されないように特異的に保護する作用物質（たとえば、メチル化結合タンパク質）でＤＮＡを処理することができ、次いで、メチル化されていないメチル化部位を切断する作用物質によって、処理済みのＤＮＡを切断する。そのような作用物質は、メチル化非感受性制限酵素でもよいし、又はエンドヌクレアーゼと融合もしくは結合することができ、次いでそのエンドヌクレアーゼによってメチル化されたＣｐＧ部位を特異的に切断することのできるメチル−ＤＮＡ結合タンパク質でもよい。
【００１７】
ここでは、「メチル化非感受性作用物質」とは、その部位がメチル化されているか否かにかかわらず、ＤＮＡを切断部位で切断する作用物質である。好ましい実施形態では、使用するメチル化非感受性作用物質は、メチル化非感受性制限酵素である。本発明で使用するメチル化非感受性酵素の例は、ＥｃｏＲＩ（Ｇ‘ＡＡＴＴＣ）、ＡｐｏＩ（Ｒ‘ＡＡＴＴＹ）、Ｔｓｐ５０９Ｉ（ＡＡＴＴ）、ＭｓｅＩ（ＴＴＡＡ）、ＢｆａＩ（Ｃ’ＴＡＧ）、Ｃｓｐ６Ｉ（Ｇ’ＴＡＣ）、ＮＩａＩＩＩ（ＣＡＴＧ’）、ＤｐｎＩＩ（’ＧＡＴＣ）、ＣｖｉＪＩ（ＲＧ’ＣＹ）、Ｓａｕ３Ａ（‘ＧＡＴＣ）、ＲｓａＩ（ＧＴ’ＡＣ）、Ｔｓｐ５０９Ｉ（‘ＡＡＴＴ）、ＭａｅＩ（Ｃ’ＴＡＧ）、ＮｌａＩＩＩ（ＣＡＴＧ’）、及びＤｐｎＩ（ＧＡ’ＴＣ）である。他のメチル化非感受性作用物質は、ギ酸、塩酸、及び過ギ酸などの化学薬品でもよい。たとえば、メチル化に特異的なＤＮＡ結合タンパク質とエンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質など、操作を加えた作用物質を使用して、メチル化されているメチル化部位及びメチル化されていないメチル化部位でＤＮＡを切断することができる。
【００１８】
オリゴヌクレオチドリンカーへの連結及び増幅
ＤＮＡ中の非メチル化部位を切断してＤＮＡ断片を生成した後、その断片の末端をオリゴヌクレオチドリンカーに連結する。オリゴヌクレオチド−リンカーは、２本鎖でも１本鎖でもよく、一般に、約１２から約２４ヌクレオチド長であるが、それよりも短い又は長いオリゴヌクレオチドリンカーを使用してもよい。２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーが好ましい。２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーは、平滑末端でも、粘着末端をもっていてもよい。平滑末端オリゴヌクレオチドリンカーは、平滑末端をもつＤＮＡ断片に連結することができる。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドリンカーは、連結が所望されるＤＮＡ断片の粘着末端と相補的な粘着末端を有する。オリゴヌクレオチドリンカーは、合成して調製してもよく、２本鎖ならば、長さの異なる上部ＤＮＡ鎖及び下部ＤＮＡ鎖を合成することにより、粘着末端を備えて設計してもよい。別の手法では、平滑末端を有するリンカーを合成して調製し、次いで適切な粘着末端を生じさせる作用物質で処理する。たとえば、平滑末端をもつオリゴヌクレオチドリンカーを、試験もしくは対照ＤＮＡの切断に使用するのと同じメチル化感受性制限酵素で処理してもよい。この場合では、ＤＮＡ断片とその断片に連結するオリゴヌクレオチドリンカーの両方に相補的な粘着末端が生じることになる。
【００１９】
以下に示す配列番号１と配列番号２を組み合わせることにより、ＨｐａＩＩ消化されたＤＮＡ断片に連結するための例示的な２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを形成することができる（このリンカーを図２の上方に示す）。このオリゴヌクレオチドリンカーは、部分的に２本鎖であり、リン酸化されていない。以下に示す配列番号１と配列番号５を組み合わせることにより、別のオリゴヌクレオチドリンカーを作製することもできる（このリンカーを図４の上方に示す）。このオリゴヌクレオチドリンカーは、ＨａｐＩＩ部位をもたらす２塩基のセグメントを除き、完全に２本鎖である。またこの２番目のオリゴヌクレオチドリンカーは、図に示すとおり（配列番号５の５’末端）に下部鎖の５’末端がリン酸化されている。
５’−ＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴ−３’  （配列番号１、上部鎖）
５’−ＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡ−３’  （配列番号２、下部鎖）
５’−ｐＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＧＣＡＧ−３’  （配列番号５、下部鎖）
配列番号１と５の組合せなど、リン酸化された２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーでは、リンカーの両方の鎖が切断ＤＮＡに連結される（図４、パネルＥ１を参照のこと）。配列番号１と２の組合せなど、リン酸化されていない２本鎖オリゴヌクレオチドでは、リンカーの一方の鎖のみが切断ＤＮＡに連結される（たとえば、図２、パネルＣに見られる下部鎖）。他方の鎖は、ワトソン−クリック塩基対合によってしかるべき場所に保持され、変性条件によって除去することができる。
【００２０】
このオリゴヌクレオチドリンカーの特性は、個々の実施形態に応じて異なる。たとえば、その方法の後のステップでＤＮＡ断片を検出できるようにオリゴヌクレオチドリンカーを検出可能部分で標識することができる。たとえば、リンカー又は断片中のヌクレオチドに検出可能部分を直接に結合させることにより、あるいはリンカーが標識用の特殊な部位をもつよう設計することにより、あるいは増幅後にランダムに標識することにより、標識を行うことができる。リンカー中の特殊な部位は、化学リンカー又はヌクレオチド捕捉配列でよい。本発明では、ヌクレオチド「捕捉配列」とは、標的オリゴヌクレオチド配列と塩基対合によってアニールされるように設計された配列である。たとえば、捕捉配列は、デンドリマーなど、別の核酸上の相補配列と強く塩基対合する非生物的でＧＣに富んだ配列を有するオリゴヌクレオチドとすることができる。「非生物的な」配列とは、試験ＤＮＡのゲノムに存在しない配列である。デンドリマーは、数ダースの色素分子が結合することのできる枝分かれ分枝である（Ｓｔｅａｒｓら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ第３巻：９３〜９９ページ、２０００年）。オリゴヌクレオチドリンカー中に捕捉配列を設計して、標識されたデンドリマーなど、検出可能部分による標識を支持することができるが、これについては以下で詳述する。増幅後のランダム標識は、当技術分野でよく知られているように、標準の蛍光性デオキシヌクレオチド、ランダムプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを使用して実施することができる。
【００２１】
オリゴヌクレオチドリンカーは、ＤＮＡ増幅の際にＤＮＡの合成を開始するためのターゲットとなるように設計することもできる。したがって、リンカーに連結した後、ＤＮＡ断片の末端は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ増幅のために選択されたプライマーに対する特殊な認識部位となるのに十分な長さの特殊配列を備えることができる。このオリゴヌクレオチドリンカーは、増幅プライマーによるターゲッティングに十分な特殊配列を含んでいることが好ましい。特殊配列は、リンカーの一部分を含んでいても、又はリンカーすべてを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドリンカーは、このようにリンカープライマーとして機能することができる。増幅プライマーは、隣接するＤＮＡ断片の配列の一部を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明で使用する増幅プライマーの長さは、そのヌクレオチド配列、及びそのような核酸がハイブリダイズされ、又は核酸増幅の間に使用されるときの温度を含むいくつかの要因によって変わる。増幅プライマーに好ましい長さを決定するのに必要な考慮すべき点は、当分野の技術者によく知られている。たとえば、短い核酸もしくはオリゴヌクレオチドの長さがそのハイブリダイゼーション特異性もしくは選択性に関係することがあり得る。消化されたＤＮＡ断片は、核酸の複合混合物を含んでいることがあるので、約１２ヌクレオチド未満のプライマーは、リンカー以外のものにハイブリダイズされるかもしれず、したがって、メチル化感受性作用物質で切断されたＤＮＡ断片だけを増幅するのに十分なハイブリダイゼーション選択性をもたないことになる。しかし、１２〜１５ヌクレオチドの配列は、一般に、哺乳動物ゲノムでは１度しか生じない。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）の前掲書、１１．７〜１１．８ページ。したがって、オリゴヌクレオチドリンカーに連結されていないＤＮＡ断片の増幅を除外するために、一般に少なくとも約１４又は１５ヌクレオチド長の増幅プライマーを選択する。プライマーは、少なくとも約１６〜１７ヌクレオチド長であることが好ましく、２０〜２５ヌクレオチド長以上でもよい。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１１．７〜１１．８ページ）。ＨａｐＩＩオリゴヌクレオチドリンカー用の増幅プライマーの例は、以下のとおりである。
５’−ＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＣ−３’  （配列番号６、リンカープライマー）
このプライマーは、上で示したオリゴヌクレオチドリンカー（たとえば、配列番号１及び５を使用して形成した２本鎖リンカー）のところでハイブリダイズし、プライマーとなるのに適する。
【００２３】
オリゴヌクレオチドリンカーのＤＮＡへの連結は、当分野でよく知られている方法を使用して行う。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の前掲書、１．５３を参照されたい。これは、通常、５０℃から２５℃へと徐々に冷却した後、４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で連結することにより、オリゴヌクレオチドリンカーをＤＮＡ断片に連結するものである。徐々に冷却するステップは、平滑末端の連結を企図する場合は省くことができる。
【００２４】
メチル化感受性作用物質での切断によって生成したオリゴヌクレオチドリンカーをＤＮＡ断片の両端に連結することにより、連結されたＤＮＡ断片は、両端が増幅プライマーのターゲットになるときにはその両端から複製され、たとえばＰＣＲによる効率のよい増幅がもたらされる（図１）。ある実験条件下では、比較的短い断片（たとえば１０００塩基対未満のもの）しか増幅することができないので、増幅された断片は、メチル化されていない領域を表す。逆に言えば、ＤＮＡ領域がメチル化されているか、又はＣｐＧジヌクレオチドをもたないときには、メチル化感受性作用物質によって切断されず、オリゴヌクレオチドリンカーが連結されず、その結果増幅は起こらない（たとえば図１）。したがって、試験サンプル及び対照サンプルの特別な領域に由来する増幅された断片の相対的量は、そのメチル化レベルの相対的な差を反映する。
【００２５】
ポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡを増幅するための好ましい方法である。ＤＮＡ断片のＰＣＲ合成は、ＤＮＡ断片の熱変性（すなわち、少なくとも約９５℃に加熱する）、メチル化感受性切断されたＤＮＡ断片のプライマーアダプター末端の全部又は一部に増幅プライマーがハイブリダイズする温度でのインキュベート、及びプライマーの伸長からなるサイクルを繰り返すことによって行う。このようなサイクルは、手動式に、又は好ましくは自動的に実施することができる。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（登録商標）サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ボストン）などのサーマルサイクラーは、ＰＣＲプロセスを自動化するために特別に設計されたものであり、好ましい。１回の合成あたりのサイクル数は、一般に２回から５０回以上で様々であり、最適な数は、核酸鋳型の供給源及び量、所望の収率、ＤＮＡの検出に使用する手順を考慮して容易に決定される。ｐｗｏ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼなど、熱に安定な増幅酵素が市販されており、これにより各変性サイクルごとに加える必要がなくなる。基本的なＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉ他の米国特許に記載されており、１９８８年のＳｃｉｅｎｃｅ第２３９巻：４８７ページ、及び米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号によるもの、及び当分野でよく知られている他のＰＣＲ変形形態も参照されたい。
【００２６】
増幅及びハイブリッド形成の両反応が競合的である場合、すなわち試験サンプルと対照サンプルからのＤＮＡを合わせて、同時に増幅させ、したがって、ポリメラーゼ及びヌクレオチド三リン酸のような増幅資源を得ようと同等に競合する場合に、具体的なＰＣＲ及びハイブリダイゼーション条件が本発明の効果に及ぼす影響は、他のＰＣＲに基づくアッセイの場合よりもはるかに小さくなる。したがって、本発明と共により正確なアッセイが実現でき、アッセイを実施する際の変動又は誤差が、結果に不利な影響を与えることなく、より多く許容される。とはいえ、温度、塩及びカチオン濃度、ｐＨ、及び関連条件を含む、一般にＰＣＲに影響する変動要素を各状況に合わせて最適化することができる。
【００２７】
ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅に適する様々な酵素が当技術分野でよく知られており、それらには、たとえば、Ｐｗｏ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、又はＱβレプリカーゼなどが含まれる。酵素の混合物を使用することもできる（たとえばＰｗｏとＴａｑ）。好ましい増幅酵素は、再現性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）及び処理能力が高いＰｗｏ及びＴａｑポリメラーゼである。既知及び未発見の他のＤＮＡ増幅酵素を本発明に利用してもよい。
【００２８】
ＧＣ含有量の異なるＤＮＡ断片を同程度に増幅できるような増幅条件を使用することが望ましい。ＰＣＲ反応にベタイン（１．２Ｍ）を加えることを利用して、ＧＣに富んだ領域の増幅を助けることができる。このような条件下では、４２％ＧＣ領域と７３％ＧＣ領域をほぼ等しく良好に増幅することができる。ＧＣに富んだ領域とＧＣに乏しい領域のバランスの取れた増幅を実現する他の手法は、当技術分野で知られている。
【００２９】
分析しようとする部位がメチル化感受性作用物質によって（増幅に適する）断片として切断できる状況では、オリゴヌクレオチドリンカーは、リン酸化されていても、リン酸化されていなくてもよい。リン酸化されたオリゴヌクレオチドリンカーを使用するスキームは、図１に示す。粘着末端を有するリン酸化されたオリゴヌクレオチドリンカーを使用するときには、オリゴヌクレオチドリンカーが二量体を形成し得る可能性が生じ、連結ステップの際にその二量体が連結されかねない。リンカー二量体は、増幅プライマーとハイブリダイズし、増幅されることが可能であり、したがって、増幅反応の資源を枯渇させ、それによって連結されたＤＮＡ断片の増幅量を減少させる恐れがある。この問題を最小に抑える別の戦略が利用可能であり、それらにはたとえば、以下のものが含まれる。すなわち、（１）シリカゲル膜型スピンカラムを備えたものなど、カラムクロマトグラフィーを利用して、リンカー二量体から連結ＤＮＡ断片を精製する戦略。この手法では、そのカラムを正規の洗浄ステップの前に３０％塩酸グアニジンで洗浄することにより、リンカー二量体をさらに除去することもできる。（２）リンカー二量体とハイブリダイズされるときには３’側が符合しないが、リンカーに連結されたゲノム断片とハイブリダイズされるときには３’側が符合するヌクレオチドからなるリンカープライマーを使用する戦略。２番目の手法の例を図４に示す。
【００３０】
リン酸化されていないオリゴヌクレオチドリンカーを使用する増幅のためのスキームは、図２に示す。この実施形態では、リンカーは、図のようにリン酸化されていない短い下部鎖を備えて設計される。したがって、連結ステップの後、リンカーの下部鎖と断片の間にはニック又は空間が存在する。リンカー連結された（ｌｉｎｋｅｄ）断片にポリメラーゼ及びＮＴＰを加え、混合物を数分間インキュベート（たとえば７２℃）する短鎖伸長反応ステップによる連結に従って、プライマーによる増幅を実現することができる。重合ステップの間、連結されていない下部鎖を変性させ、除去して、下部鎖がポリメラーゼによって上部鎖の末端と同一面にまで合成されるようにする。温度循環を利用することにより指数関数的な増幅を実現することができる。この場合では、オリゴヌクレオチドリンカー由来の過剰な上部鎖が連結ステップで残り、ＰＣＲプライマーとして働き得るので、リンカープライマーを加える必要がない。
【００３１】
照会しようとする特定のメチル化部位が、次の最も近いメチル化部位からあまりに離れた位置にあり、そのような長さの断片の増幅、したがって検出が難しくなる場合では、ＤＮＡをメチル化感受性作用物質とメチル化非感受性作用物質の両方で切断して、増幅可能な断片を生成することができる。メチル化感受性作用物質とメチル化非感受性作用物質は、別々に使用しても、又は適合性があれば同時に使用してもよい。メチル化感受性作用物質によって切断される部位により近い第２の切断部位をもたらし、増幅により適した断片サイズを与える、特定のメチル化非感受性作用物質（メチル化非感受性制限酵素が好ましい）を選択することができる。一般に、５０〜１０００塩基対の断片長さが増幅に適するであろう。
【００３２】
好ましいメチル化非感受性作用物質は、メチル化非感受性制限酵素である。メチル化感受性作用物質によって生じる末端と異なる粘着末端をＤＮＡ上にもたらすメチル化非感受性制限酵素を選択することが好ましい。この場合、互いに異なり、生じた粘着末端の一方の型にしか連結されないオリゴヌクレオチドリンカーを使用すべきである。
【００３３】
メチル化非感受性作用物質による切断だけによって生じた断片の増幅を避けるために、メチル化感受性部位への連結にはリン酸化されたオリゴヌクレオチドリンカーを使用し、メチル化非感受性部位への連結にはリン酸化されていないオリゴヌクレオチドリンカーを使用することができる。この手法については、図３にさらに示す。図からわかるように、メチル化非感受性部位への連結後、リンカーの一方の鎖と断片の間に切れ目又は「ニック」が残る。この切れ目は、その鎖にハイブリダイズされるように選択されたリンカープライマーによる鎖の増幅の妨げとなる。このような状況では、両端がメチル化感受性作用物質によって切断されて生じたＤＮＡ断片と、一方がメチル化感受性作用物質、他方がメチル化非感受性作用物質によって切断されて生じたＤＮＡ断片では指数関数的な増幅が起こる。両端がメチル化非感受性酵素によって切断されて生じたＤＮＡ断片は増幅されない。
【００３４】
メチル化感受性作用物質とメチル化非感受性作用物質の両方を使用してＤＮＡを切断するときには、使用するオリゴヌクレオチドリンカーが、どちらか一方の作用物質によって生じた末端だけに選択的に連結することが好ましい。ＤＮＡ切断作用物質のそれぞれを別々の反応で使用し、ＤＮＡを第２の切断作用物質に曝す前に最初の反応用のオリゴヌクレオチドリンカーを加える場合には、選択的な連結が必要とならないこともある。
【００３５】
代替実施形態では、ＤＮＡ増幅のステップが完全に不要になることもある。この場合、メチル化感受性作用物質による切断によって生じたＤＮＡ断片の末端をオリゴヌクレオチドリンカーに連結し、ＤＮＡ断片をサイズ選別にかけて特定のサイズ範囲を単離し、その断片を検出可能部分で標識し、次いでさらに先で述べるとおりにハイブリダイズさせ、分析する。ＤＮＡ断片をサイズ選別にかけて、長さ約２，５００塩基対以下、より好ましくは長さ約１，５００塩基対以下、さらに好ましくは長さ約１，０００塩基対以下の範囲にする。オリゴヌクレオチドリンカーに連結する前又はその後にＤＮＡ断片をサイズ分けすることができる。サイズ分けは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、密度勾配遠心分離もしくは超遠心分離（たとえばＳｔｅｅｎｓｅｌら（２００１年）のＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第２７巻：３０４〜３０８ページを参照のこと）、一定孔径の膜を通す濾過などを含む、当技術分野で知られている任意の方法によって行うことができる。一定孔径の膜を通す濾過は、外圧をかけ、又は遠心分離によって実現することができる。
【００３６】
増幅なしの実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカーに検出可能部分を結合させることが好ましく、検出可能部分は、比活性が適度に高いものであることが好ましい。標識されたデンドリマーや蛍光共鳴エネルギー転移色素が、比活性の高い検出可能部分の例である。オリゴヌクレオチドリンカーは、標識されたデンドリマーなど、検出可能部分に結合するように設計された捕捉配列を備えることができる。オリゴヌクレオチドリンカーは、それをＤＮＡ断片に連結する前、又はその後に標識することができる。
【００３７】
消化されるＤＮＡの量を増やして、増幅を用いない実施形態での検出感度を高めることもできる。当分野の技術者ならば、ＤＮＡ増幅ステップの省略を可能にするのに十分なＤＮＡの量は、アッセイの他の特徴に応じて決まり、大掛かりな実験に頼らずとも容易に決定できることがわかるであろうが、０．５〜１．５ｍｇの範囲のＤＮＡがこの目的に適しているといえる。
【００３８】
さらに別の実施形態では、十分多量のＤＮＡを使用し、消化された断片をサイズ分別にかけ、任意選択でランダムプライミングによって断片を（たとえば、Ｃｙ３及びＣｙ５色素で標識したｄＣＴＰで）標識し、これらをマイクロアレイなどの固体担体とハイブリダイズさせることにより、ＤＮＡ増幅ステップ及びＤＮＡ断片をオリゴヌクレオチドリンカーに連結するステップを省くこともできる。たとえば、ＳｔｅｅｎｓｅｌらＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  第２７巻：３０４ページ（２００１年）を参照されたい。
【００３９】
ＤＮＡの標識
ＤＮＡを検出可能部分で標識して、後のステップでの検出を向上させることができる。標識は、この方法の様々なステップのいずれで行ってもよい。たとえば、検出可能部分をオリゴヌクレオチドリンカーに結合させ、次いでそれをＤＮＡ断片に連結することができる。別の手法では、検出可能部分を増幅プライマーに結合させ、これを増幅されたＤＮＡに組み込ませることができる。さらに別の手法では、ＤＮＡ断片を検出可能部分で直接に標識してもよい。状況によっては、検出可能部分による標識を複数のステップで行うことが好ましいこともある（たとえば、標識されたオリゴヌクレオチドリンカーと直接標識を使用する）。これは、感度の向上が望まれるときに有用であるかもしれない。検出可能部分を様々に組み合わせて使用して同じ分子を標識し、その比活性を高めてもよい。
【００４０】
語句「検出可能部分」は、本明細書では、検出可能部分を検出することにより間接的に分子を検出できるように分子と結合させ、あるいは別な方法で関連付けることのできる任意の分子（又は分子の組合せ）を示すのに用いる。検出可能部分は、放射性同位体（たとえば、ヨウ素、インジウム、硫黄、水素など）、色素もしくは蛍光体（たとえば、シアニン、フルオレセイン、ローダミン）、タンパク質（たとえば、アビジン、抗体）、酵素（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなど）、又は直接もしくは間接的に検出できる他の作用物質とすることができる。酵素は、間接的な手段によって検出される検出可能部分の例である。この場合、酵素を標的核酸に結合させ、酵素による作用を受けたときに、色が変化し又はもとの基質と異なる色を呈する切断産物を放出する適切な基質を加えることにより、酵素の存在を検出する。
【００４１】
蛍光検出可能部分は、検出装置によって捕捉される発光を伴うレーザーによって刺激することができる。検出装置は、その強度を記録する電荷結合素子（ＣＣＤ）又は共焦点顕微鏡とすることができる。アレイの場合では、アレイイメージによって得られた強度を、スポットの平均又は積分強度を測定することにより数量化することができる。Ｄａｐｐｌｅなどの特別なソフトウェアを使用して、マイクロアレイ実験からのデータの解釈の助けとすることができる。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｓ／ｊｂｕｈｌｅｒ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄａｐｐｌｅ／）を参照されたい。
【００４２】
好ましい検出可能部分は、Ｃｙ−５やＣｙ−３などのシアニン色素である。たとえば、試験ＤＮＡ断片をＣｙ−５で標識し、対照ＤＮＡ断片をＣｙ−３で標識する（又はその逆）ことができる。このようにして、２種のＤＮＡ断片調製物を混合し、次いで一緒に固体担体にハイブリダイズさせ、上記の装置を用いて各色素ごとに対応する波長で走査することができるが、測定された濃度から、２種のサンプルからのハイブリダイズされた各ＤＮＡ断片の相対的な量を識別することができる。
【００４３】
検出可能部分は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）におけるように、１種を超える化学的実体を含んでいてもよい。ＦＲＥＴに基づくアッセイでは、慎重に選択した蛍光色素の対の一方を問題の各分子に結合させることにより、生体分子間の相互作用を間接的に測定する。アクセプターの吸収スペクトルは、ドナーの蛍光発光スペクトルに重なり合わなければならず、ドナーとアクセプターの遷移双極子の配向は、ほぼ平行でなければならない。ＦＲＥＴでは、生体分子が結合しているためにこれらの蛍光色素が極めて接近した状態（通常は１０〜１００Å）にあるとき、特殊な蛍光シグナルが発生し、それによって、この近接関係が、したがって結合反応がはっきりと確認される。共鳴転移は、発光強度の全体的な増強をもたらす。たとえば、Ｊｕら（１９９５年）のＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）第９２巻：４３４７ページを参照されたい。共鳴エネルギー転移が実現されるには、第１の蛍光分子（「ドナー」蛍光）が光を吸収し、その光を励起電子の共鳴を通じて第２の蛍光分子（「アクセプター」蛍光）に転移させる。
【００４４】
大部分の場合、ドナー色素とアクセプター色素とが異なるとき、増感されたアクセプター蛍光の出現又はドナー蛍光の消光によってＦＲＥＴを検出することができる。ドナーとアクセプターが同じときには、生じる蛍光によってＦＲＥＴを検出することができる。使用できるドナー／アクセプター色素対には、たとえば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、及びフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。たとえば、Ｌｅｅ他の米国特許第５，９４５，５２６号を参照されたい。これら色素の多くは、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）から市販されている。
【００４５】
別の実施形態では、標識されたデンドリマーを検出可能部分として使用して、シグナル増幅を実現することもできる。デンドリマーは、標識されると比活性が非常に高くなり、シグナル増幅をもたらすことのできる嵩高な３次元分子である（たとえば、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ第３巻：９３〜９９ページ、２０００年を参照のこと）。蛍光標識されたデンドリマーは、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（米国ニュージャージー州Ｍｏｎｔｖａｌｅ）から入手できる。こうしたデンドリマーは、当技術分野で知られている方法によってＤＮＡ断片に化学的に結合させることができる。デンドリマー中の相補配列のターゲットになることのできる、増幅プライマー中の捕捉配列（たとえば、非生物的な長いＧＣに富んだヌクレオチド配列）を設計することにより、標識されたデンドリマーを増幅されたＤＮＡに結合させることもできる。プライマー中の捕捉配列が増幅の際に問題を引き起こす場合では、捕捉配列の３’側（捕捉配列とプライマー配列の間）に重合「停止シグナル」を加えて、プライマー中の捕捉配列が増幅されないようにすることができる。以下のＣ１８スペーサーは、有用な「停止シグナル」の例である。
【化１】
2006500901.tif 000003
当分野の技術者ならば、これは単に一例に過ぎず、他の多くの停止シグナルが利用可能であり、当技術分野で知られていることがわかるであろう。たとえば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）及び他の製造元からいくつかを得ることができる。
【００４６】
固定化されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
ポリヌクレオチドを固定化させた固体担体は、上述のように調製したＤＮＡ断片を捕捉して、任意のゲノム領域のメチル化状態を判定するのに有用である。すでに論じたように、ＤＮＡ断片を検出可能部分で標識して、固定化したポリヌクレオチドにハイブリダイズされるＤＮＡ量を検出する助けとすることが好ましい。
【００４７】
固定化したヌクレオチドは、そのメチル化度の判定が所望されるＤＮＡ領域と特異的にハイブリダイズされるように設計する。したがって、ゲノム中の単一部位でのメチル化度を判定しようとする場合、固体担体は、その部位がメチル化されていない場合にこの方法で生じるはずの断片と相補的な１種類のポリヌクレオチドを備えることができる。固体担体は、多種類の異なる固定化ポリヌクレオチドを備えてもよく、そのそれぞれが、断片の一方の末端にあるメチル化部位がメチル化されているかどうかに応じて、アッセイで生じ得る異なるＤＮＡ断片にアニールするように設計される。さらに先で述べるように、多種類のポリヌクレオチドは、単一の担体にアレイの形で固定化させてもよい。固相は、アレイサイズ及び固定化に使用する技術に応じて、アレイとして固定化されたポリヌクレオチドを数百から数万備えることもできる。
【００４８】
試験サンプル及び対照サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度は、１種類のオリゴヌクレオチドリンカー対（又は単一酵素による消化の場合は１種類のオリゴヌクレオチドリンカー）を用いたＤＮＡ断片の競合的増幅、及び／又は固体担体への競合的ハイブリダイゼーションによって定量化する。このことは、試験及び対照からのゲノムＤＮＡを少なくとも１種のメチル化感受性酵素で消化する以下の例からわかるであろう。オリゴヌクレオチドリンカーを使用して１００，０００個の断片が増幅され、その断片のうち１００個で２種のサンプル同士のメチル化に差がある場合、９９，９００個の断片は、反応が飽和状態になった後、両方のサンプル中で非常に近い程度に増幅され、１００個の断片は、増幅に差が出ることになる。（それぞれを別の色素で標識した）２種の増幅産物を混合し、担体上に固定化させたポリヌクレオチド（たとえばマイクロアレイ）とハイブリダイズさせ、指定の波長で走査した後、担体上の９９，９００個のウェル又はスポットは中間色を示し（すなわち、２種のＤＮＡ供給源に対するハイブリダイゼーションシグナルのレベルが同程度）、１００個のウェルもしくはスポットは、赤色（Ｃｙ−５）又は緑色（Ｃｙ−３）を示し（すなわち、２種のＤＮＡ供給源に対するハイブリダイゼーションシグナルレベルに差がある）、後者ではそれによってその部位（たとえばＣｐＧ部位）でのメチル化レベルの差が示される。
【００４９】
Ｃｙ３標識試験サンプルとＣｙ５標識対照サンプルの組合せを使用して、ハイブリッド形成後のアレイ上で得られるハイブリダイゼーションシグナル強度を次のように解釈することができる。
赤：試験サンプルと対照サンプルのメチル化に差があることを意味する。対照サンプルが優位を占めているので、対照サンプルは試験サンプルよりもメチル化されていない。
緑：試験サンプルと対照サンプルのメチル化に差があることを意味する。試験サンプルが優位を占めているので、試験サンプルは対照サンプルよりもメチル化されていない。
黄：試験サンプルと対照サンプルのメチル化がほぼ等しいことを意味する。
無色：試験サンプルと対照サンプルの両方のメチル化が甚だしいか、又は固定化されたポリヌクレオチド配列が試験もしくは対照のゲノムＤＮＡ中に存在しないことを意味する。
彩度：色よりも予測に役立たないが、彩度が高いことは、試験及び対照両サンプル中の領域の全体的なメチル化度が低いことを示し、彩度が低いことは、試験及び対照両サンプル中の領域の全体的なメチル化度が高いことを示す。
【００５０】
Ａ．固定化されたポリヌクレオチド
担体に固定化させるポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノムプロジェクトから少しずつ収集したものを含め、公的に利用できる配列データベース中の容易に入手可能なＤＮＡ配列を頼りにして決定することができる。本発明では、ポリヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖の核酸でよく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチドを含み、合成によって調製しても、又は自然の核酸を切断して調製してもよい。用語ポリヌクレオチドは、用語オリゴヌクレオチドをも含み、２から約１００ヌクレオチド長の短めのポリヌクレオチドを指す。
【００５１】
ポリヌクレオチド配列は、メチル化の疑いのあるほぼどのゲノム領域にもハイブリダイズされるように設計することができる。問題のメチル化感受性作用物質に対する認識配列、及び固定化された決定済みのポリヌクレオチドに対する配列の識別を利用して、ヒトゲノムＤＮＡ配列について仮想（すなわち「コンピューターに基づく」）制限消化を実施してもよい。固定化させるポリヌクレオチドは、遺伝子の上流調節領域、その遺伝子のタンパク質コード部分、その遺伝子に結合している下流配列など、遺伝子中の特定の配列を照会するものを選択することができる。そのような場合、固定化されるポリヌクレオチドは、その遺伝子中又はその遺伝子付近の配列にハイブリダイズするように設計することができる。
【００５２】
固定化させるポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドなどの短いＤＮＡセグメントでもよく、あるいは固定化させるポリヌクレオチドをｃＤＮＡもしくはその部分、ゲノムＤＮＡ断片など、より長い範囲のＤＮＡとすることもできる。本明細書ではプロモーターの上流の配列及びポリＡ部位の下流の配列を指す遺伝子間領域を照会するポリヌクレオチドを選択することもできる。どちらの場合でも、固定化されたポリヌクレオチド配列は、問題の領域にハイブリダイズし、他の領域にはハイブリダイズしないものを選択することが好ましい。これは、ＢＬＡＳＴなどのコンピューター配列プログラムを使用して決定することができる。
【００５３】
固定化させるポリヌクレオチドは、選択された方法の特定の実施形態によって生成され得る他の断片とハイブリダイズしないように設計すべきである。増幅を利用する場合、固定化されたポリヌクレオチドは、メチル化感受性作用物質に対する潜在的な切断部位を有するＤＮＡセグメントと相補的な配列を備えていることが好ましい。これらの部位は、メチル化されておらず、したがって切断されているならば、指定のＰＣＲ条件下で断片を増幅できるのに十分なほど互いの間隔が狭いはずである。固定化させるポリヌクレオチドは、好ましくは約４０〜７０ヌクレオチド長、より好ましくは約５０〜６０ヌクレオチド長のハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドであることが好ましい。すでに論じたように、固定化されたポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長より長くすることができ、さらにはｃＤＮＡ又はそのゲノムＤＮＡ断片を構成するものでもよい。
【００５４】
Ｂ．固体担体
固体担体に固定化させたポリヌクレオチドは、増幅され検出可能に標識されたターゲット核酸とのハイブリッド形成の検出に使用する。こうしたポリヌクレオチドは、有機であれ無機であれ、又はそのいずれかの組合せであれ、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、細管、球、容器、毛細管、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライドなどの形のどんな固体担体に固定化することもできる。典型的な担体は、ガラス、プラスチック、又はナイロン製である。
【００５５】
本発明の実施に関して、ポリヌクレオチドを固定化する固体担体は、平坦であることが好ましいが、それに代わる表面形状をもつものでもよい。たとえば、固体担体は、ポリヌクレオチドの合成がそこで行われ、又はポリヌクレオチドがそこに付着する隆起した領域又はくぼんだ領域を含んでいてもよい。ある実施形態では、適切な吸光特性をもたらす固体担体を選択する。したがって、担体は、重合ラングミュア・ブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改質シリコン；又は（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフロライド、ポリスチレン、ポリカートネート、これらの組合せなど、様々なゲルもしくはポリマーのどれでもよい。固体担体は、ガラス製の顕微鏡スライドでもよい。
【００５６】
固体担体の表面は、反応性の基を含むことができ、この反応性基は、固定化されるポリヌクレオチドに付随する反応性の基に結合するのに適したカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどとすることができよう。ポリヌクレオチドは、イオン結合、共有結合、又は当技術分野でよく知られている他の力など、化学的もしくは物理的手段によって固体担体に付着させることができる。本質的にＬｏｃｋｈａｒｔ他の米国特許第５，５５６，７５２号に記載されているように、ポリヌクレオチドを、スペーサー分子によって固体担体に付着させることもできる。スペーサー分子は、通常、それより長いものも短いものも可能であるが、長さが６〜５０個分の原子を含み、固体担体に付着する表面付着部分を含む。
【００５７】
担体への結合は、たとえば（ポリ）トリフルオロクロロエチレンの表面を備えた担体を用い、炭素−炭素結合によって、あるいは好ましくは、たとえばガラスもしくは一酸化シリコンを固体担体として用い、シロキサン結合によって実現することができる。担体をスペーサーのトリクロロシリル基もしくはトリアルコキシシリル基と反応させることにより、シロキサン結合を形成することができる。アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−ヒドロキシエチルアミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、又はヒドロキシプロピルトリエトキシシランが、有用な表面付着基である。さらに、ポリヌクレオチド合成に使用できるように、スペーサーは、（固体担体とは反対側の）スペーサーの遠位末端もしくは終末末端上の官能基（すなわち、ヒドロキシル、アミノ、又はカルボン酸）に結合させた保護基をもつこともできる。遠位末端は、脱保護及び結合後、オリゴマーに共有結合させることができる。
【００５８】
別の固体担体は、たとえば、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ他の米国特許第６，０５１，３８０号、Ｓｈｅｌｄｏｎ，ＩＩＩ他の同第６，１２９，８２８号、及びＨｅｌｌｅｒ他の同第６，０１７，６９６号に記載されているようなマイクロ電子チップである。この種のチップは、非常に低塩濃度の条件下で行われる電子加速型のハイブリダイゼーションを利用するものであり、これによって他のハイブリダイゼーション法に伴うＤＮＡの高次構造及び２次構造に関する問題が回避される。固定化したポリヌクレオチドを電的にマイクロチップ上の特異な部位に移動させ、次いでハイブリッド形成を判定することができる。この電子工学を媒介とする手法では、電子を媒介とする能動ハイブリッド形成プロセスを使用して、ターゲットＤＮＡ分子を移動、集中させることにより、ハイブリッド形成を検出する時間が（従来の受動的方法でのような）数時間から数分に短縮される。
【００５９】
ポリヌクレオチドは、「ＤＮＡチップ」、「ＤＮＡマイクロアレイ」、「遺伝子アレイ」、「遺伝子チップ」、及び「ゲノムチップ」としても知られているマイクロアレイの形、又はマクロアレイの形で、従来の技術によって固体担体に付着させることができる。ここでは、アレイとは、サンプルを規則的に並べたものであり、それによって、塩基対合則に基づく既知及び未知のＤＮＡサンプルのマッチング、及び未知のものを同定する自動操作が可能になる。
【００６０】
「マイクロアレイ」及び「マクロアレイ」は相対的な用語であり、関係するサンプルスポットの直径の点で互いに区別される。たとえば、マイクロアレイのサンプルスポットは、通常は直径約２００ミクロン以下であり、単一チップ上に数千のサンプルスポットを配列することが可能になっている。このようなアレイは、手作業で調製することもできるが、専用のロボット技術を利用して作製し、特に下端の範囲にある直径のスポットを備えた専用の画像処理装置によって読み取ることが好ましい。それとは対照的に、マクロアレイのサンプルスポットは、通常直径２００ミクロンを越えており、ゲル及びブロット走査装置による画像処理に適するようになっている。マクロアレイは、標準のマイクロプレート又は標準のブロッティング膜を使用して、手作業で調製することができる。
【００６１】
固定化されたポリヌクレオチドを含有するマイクロアレイは、周知のいくつかの手法によって調製することができ、その手法にはたとえば、ＶＬＳＩＰＳ（商標）（米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと）などの光リソグラフィー（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）法、ＰＣＴ国際公開９２／１０１８３号又は米国特許第５，３８４，２６１号に記載のものなど、機械による方法、たとえば国際出願ＰＣＴ  ＵＳ／９３／０４１４５号に記載のビーズ法、及び米国特許第５，２８８，５１４号に詳述されているようなピン法が含まれ、特にＬｏｃｋｈａｒｔの米国特許第５，５５６，７５２号は、ＶＬＳＩＰＳ（商標）を使用する、マイクロアレイとしての異なる２本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの調製を記載しており、この手法もマイクロアレイ状ポリヌクレオチドライブラリーの調製に適する。米国特許第５，６７７，１９５号及び同第５，３８４，２６１号に記載されているような流路技術を利用して、種々の異なる固定化されたポリヌクレオチドを備えたマイクロアレイチップを調製することもできる。この場合では、ポリヌクレオチドが流路を通して担体に送達されるときに、基板の、ある活性化領域が他の領域から機械的に分離される。先に述べたように、Ｌｏｃｋｈａｒｔの‘７５２特許は、指定の流路を通って液体を定方向に流すことを改善するための保護コーティングウェッティング促進装置の使用を含む、流路法を幾分詳細に記載している。
【００６２】
スポット法を使用して、固定化された様々なポリヌクレオチドを備えたマイクロアレイバイオチップを調製することもできる。この場合、担体の選択された領域に比較的少量を直接に注入することにより反応物を送達する。いくつかの段階で、当然、担体表面全体に特定の溶液を噴霧し、又はその他の方法でコーティングすることができる。特定の形式では、分注装置が、各ステップで必要なだけのポリヌクレオチド又は他の試薬のみを注入しながら、領域から領域へと移動する。典型的な分注装置は、ポリヌクレオチド含有溶液もしくは他の流体を担体に送達するためのマイクロピペット、ナノピペット、インクジェット型カートリッジ、又はピン、並びにこれらの送達デバイスの担体からの位置を制御するための任意選択のロボットシステムを含む。他の形式では、分注装置は、様々な試薬を反応領域に同時に送達できるように、一連の管もしくは複数のウェルトレー、多岐管、及び送達デバイスのアレイを含む。
【００６３】
スポット法はよく知られており、これにはたとえば、米国特許第５，２８８，５１４号、同第５，３１２，２３３、及び同第６，０２４，１３８号に記載のものが含まれる。場合によっては、担体の予め定められた領域上で流路と「スポッティング」を併用して、固定化されたポリヌクレオチドを備えたマイクロアレイバイオチップを調製することもできる。
【００６４】
マイクロアレイ作成についての情報及び例は、ＣｈｅｕｎｇらのＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２１巻（補遺）、１５〜１９ページ（１９９９年）；ＬｉｐｓｈｕｔｚらのＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２１巻（補遺）、２０〜２４ページ（１９９９年）；Ｂｒｏｗｎ＆ＢｏｔｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２１巻（補遺）、３３〜３７ページ（１９９９年）；ＳｈｏｅｍａｋｅｒらのＮａｔｕｒｅ、第４０９巻、９２２〜２７ページ（２００１年）；ＳｃｈｅｎａらのＳｃｉｅｎｃｅ（１９９５年）４６７〜４７０ページ；ＳｃｈｅｎａらのＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９６年）第９３巻：１０６１４〜１０６１６ページ；ＰｉｅｔｕらのＧｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６年６月）第６巻：４９２〜５０３ページ；ＺｈａｏらのＧｅｎｅ（１９９５年４月２４日）第１５６巻：２０７〜２１３ページ；ＳｏａｒｅｓのＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７年１０月）第８巻：５４２〜５４６ページ；ＲａｖａｌのＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４年１１月）第３２巻：１２５〜１２７ページ；ＣｈａｌｉｆｏｕｒらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９４年２月１日）第２１６巻：２９９〜３０４ページ；Ｓｔｏｌｚ＆ＴｕａｎのＭｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６年１２月）第６巻：２２５〜２３０ページ；ＨｏｎｇらのＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８２年）第２巻：９０７ページ；ＭｃＧｒａｗのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４年）第１４３巻：２９８ページなど、当技術分野で容易に入手できる。マイクロアレイの開発に関連する特許は非常に多数あり、米国特許第５，０８２，８３０号、同第６，１１０，４２６号、同第６，００４，７５５号、同第５，４４５，９３４号、同第５，５３２，１２８号、同第５，５５６，７５２号、同第５，２４２，９７４号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４７２，６７２号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５２９，７５６号、同第５，５４５，５３１号、同第５，５５４，５０１号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６５８，７３４号、同第５，７００，６３７号、及びＰＣＴ出願ＷＯ９７／２７３１７が含まれる。
【００６５】
Ｃ．ハイブリダイゼーション及び分析
ＤＮＡ断片を固体担体の固定化された相補ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、望ましくないクロスハイブリッド形成が回避されるハイブリダイゼーション条件（洗浄なしの初回ハイブリダイゼーション又は初回ハイブリダイゼーションと洗浄の組合せ）を選択することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）の９．４７〜９．６２章を参照されたい。一般に、ＤＮＡのアニールは、アニール速度を最大にするために高イオン強度で、かつＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）より低い約２０〜２５℃の温度で実施する。非特異的結合を低減するために様々な作用物質を使用することもできる（たとえば、デンハート液、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、及び変性サケ精液ＤＮＡ）。洗浄条件は、できる限り厳密に、一般に十分な塩濃度、及びＴｍより低い１２〜２０℃の温度にすべきである。洗浄条件は、予備実験の際に実験的に決定することができる。他の手法を利用してもよく、当分野の技術者ならば容易に決定できよう。
【００６６】
固体担体にハイブリダイズされる増幅ＤＮＡの量を対照と比較して、試験サンプル中の１箇所又は複数のＤＮＡ領域のメチル化度が対照サンプルと異なっているかどうか判定する。一実施形態では、対照は、試験サンプルと並行して処理した健常組織からのゲノムＤＮＡなど、実際のＤＮＡサンプルとすることができる。このような対照サンプルは、試験サンプルを得たものと同じ種類の細胞、組織、又は臓器から得ることができる。あるいは、対照サンプルは、完全にメチル化されるか、完全にメチル化されないか、又は部分的にメチル化されるように必要に応じて調製された１種又は複数の選択されたＤＮＡ断片を含んでいてもよい。対照は、前の実験から得た過去の値を表す理論的な対照とすることもできる。
【００６７】
好ましい実施形態では、試験及び対照ＤＮＡ断片を、Ｃｙ−３又はＣｙ−５色素で別々に標識する。次いで標識された試験断片と対照断片を混ぜ合わせ、固体担体にハイブリダイズさせる。洗浄した後、アレイ走査装置を用いて６３５ｎｍ（Ｃｙ５）及び５３２ｎｍ（Ｃｙ３）の励起波長でスライドを連続的又は同時に走査する。各波長についての像を記録し、各像に仮の色（Ｃｙ５には赤、Ｃｙ３には緑）をつけ、像を重ねると、相対的な濃度の差がわかる。各スポットごとに両方の波長での濃度も定量し、分析する。次いで、試験サンプル中のＤＮＡの、対照サンプルと比較した相対的メチル化度（「メチル化状態」）を、各スポットの色によって視覚的に、又は走査した各溝ごとの測定濃度によって判定する。
【００６８】
この方法は競合的な増幅及びハイブリダイゼーションによって実現され定性的な性質のものであるため、非常に高い感度を得ることができ、各領域のメチル化レベルの微細な変化の検出が可能になる。組織サンプルはしばしば、混合細胞集団を含有しているので、このことは非常に望ましい。
【００６９】
この方法の応用例
本発明は、ゲノム全体にわたる特定の領域でのメチル化的変化を検出する高処理量の方法を提供する。ロボット制御、自動化された液体操作、自動スポッティング、プレート及びスライドローダー、ピンアレイ（９６、３８４、１５３６など）などに関係する周知のシステムを使用して、高処理量を実現することができる（たとえば、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の自動化アレイシステムを参照のこと）。これにより、ＣｐＧ島領域でも島でない領域でも、数万の領域を同時に試験することが可能になり、ゲノム中のどんなメチル化変化も検出できるようになる。また、異なる個体からの数百以上のサンプルを分析することができ、特定の疾患と関連付けられるメチル化の変化を、疾患があるかどうか診断するふるいとして後に活用することができる。本発明の他の応用例を以下に詳述する。
【００７０】
診断：本発明の方法を使用して集めた情報は、特定の疾患を特徴付ける遺伝子サイレンシングパターンを全部又は一部反映する診断情報及び予後診断情報を知らせる。すなわち、本発明によって判定されるメチル化は、選択性、特異性、及び感度が格別に優れた病態指標となる。さらに、腫瘍中に高頻度で出現する異常なＣｐＧ島過剰メチル化も、診断情報となり得る。本発明によって患者ゲノムのメチル化を判定することにより、費用効率の高いやり方で先例のない初期警告診断への道が開ける。ＣｐＧ島中の不適切なメチル化変化は、多くの癌が発達する際に最も初期にわかる標識の１つであり、ここで開示する方法を使用して、分子のこのような逸脱を直接に検出することは、先例のない癌の初期段階分子診断を行う絶好の機会を提供する。さらに、後成的変化は、他の重要ないくつかの疾患とも関連付けられている。それらには、いくつかの例を挙げれば、アテローム性動脈硬化症（Ｐｏｓｔら、１９９９年）、アンゲルマン症候群（Ｌａｌａｎｄｅら、１９９９年）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｙｏｓｈｉｏｋａら、１９９８年）、及びＩＣＦ症候群（Ｋｏｎｄｏら、２０００年）が含まれる。
【００７１】
改良された臨床治験を可能にする技術：ここで開示する方法を使用して、どの個体がメチル化依存的な癌に罹患しているかを判定することができる。これによって、癌におけるメチル化の差の根拠をターゲットとする薬物の臨床治験における効力の研究はますます成功を収めることができる。メチル化状態に影響を及ぼす薬物候補は、細胞傷害性でない次世代癌治療の代表格である。さらに、遺伝子のメチル化状態は、その発現と相関があるので、試験対象のメチル化プロフィールを、癌の薬を含む他の薬物の臨床治験で患者を選抜する際に使用することもできる。
【００７２】
個別化医薬：癌治療の費用は高く、癌の種類は多様であるので、どの患者がどの治療に応答するのかを判定する試験を開発することは重要である。新世代のメチル化依存的な癌治療が進歩するにつれて、本発明のアッセイは、どの癌患者がメチル化の欠陥をもっているかを判定するのに重要となろう。そのようなデータは、患者がメチル化に基づく薬物投与計画に適合するかどうか判定する、腫瘍遺伝子学者の治療決定プロセスの助けとなり得る。
【００７３】
発見：ＣｐＧ島中の不適切なメチル化の検出は、どの遺伝子が癌の発生に関与しているかの指標として働く。さらに、その癌における役割に関しては、ＣｐＧ島すべてのうちの小さな画分（＜３％）しか調査されていない。ここで述べた方法を使用して、癌における新しい遺伝子サイレンシング事象が発見されれば、新薬発見及び最適化戦略を創始するための決定的な情報がもたらされよう。
【００７４】
毒物学：薬物候補を毒性の問題のために失敗に終わってしまう臨床治験にかける費用は莫大である。したがって、メチル化検出法によって、初期（臨床前）段階で毒性の問題を伴う薬物を「取り除く」ことが大いに求められている。本発明の方法を高処理量のスクリーニング形式で適用すると、特定の薬物が細胞又は組織のメチル化状態に影響を与えるかどうか判定する際に有用となるであろう。そのようなスクリーニングによって、変異原性もしくは後成的毒性を有する候補薬物が不適当にも臨床治験にまで進められる可能性が低くなるはずである。
【実施例１】
【００７５】
マウス導入遺伝子での示差的メチル化部位（“ＤＭＳ２）直接マイクロアレイスクリーニング
この実施例では、マウスＤＮＡ中の導入遺伝子のメチル化度の検出を目的とした本発明の実施形態の使用について説明する。この方法は、ＤＮＡ増幅ステップを含むものであり、ＤＭＳ２（示差的メチル化部位の直接マイクロアレイ式スクリーニング）と称する。
【００７６】
５０〜６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが合成され、マウス遺伝子中の選択されたＣｐＧ島にハイブリダイズされ、またＨＲＤとして知られているマウス導入遺伝子にもハイブリダイズされている（Ｅｎｇｌｅｒら、（１９９１年）Ｃｅｌｌ第６５巻（６）：９３９〜４７ページ）。ＨＲＤは、一方のマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、略してＢ）では高度にメチル化され、他方の系統（ＤＢＡ／２Ｊ、略してＤ）ではメチル化されておらず、またマウスゲノム中に他のマウス遺伝子に匹敵する量が組み込まれているので、このアッセイにおいて有用な対照ＤＮＡとなる。図５Ａは、この導入遺伝子が系統Ｂではメチル化されているが、系統Ｄではメチル化されていないことを示すサザンブロットである。
【００７７】
各ＨＲＤトランスジェニックマウス系統からのＤＮＡ（１μｇ）を３７℃で６時間、５０μｌ中５単位のＨｐａＩＩで別々に消化した。消化混合物を６５℃で１５分間熱失活させ、エタノールで沈殿させ、再懸濁して体積２０．５μｌとした。連結するために、サンプルに１００μＭのオリゴヌクレオチドリンカー２μｌ、１０倍のライゲーション用結緩衝液２．３μｌ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ０．２μｌ（共に製造元はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）を加え、混合物を室温で６〜１６時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドリンカーは、図４Ａに示す。
【００７８】
シリカゲル膜スピンカラムを主体としたＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用して、連結されたＤＮＡ断片を精製した。正規の洗浄の前に３０％の塩酸グアニジンによる洗浄ステップを加えたことを除き、製造者の指示に従ってサンプルを処理した。産物を、キット中で提供される溶離緩衝液２５μｌ（１５μｌ＋１０μｌ）で溶離した。
【００７９】
ＰＣＲについては、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）を用い、Ｇｏｌｄ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、１００μＭのｄＮＴＰ、１．２Ｍのベタイン、１μＭのシアニン色素標識増幅プライマー（メチル化マウス系統ＤＮＡではＣｙ−３、非メチル化マウス系統ＤＮＡではＣｙ−５）、及び１単位のＤＮＡポリメラーゼを含む５０μｌの反応液中で溶離されたＤＮＡ２．５μｌを増幅した。プライマー配列は以下のとおりである。
Ｄｙｅ−５’−ＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＣＧＧ−３’  （配列番号６）
サイクル条件は、９５℃で６．５分間の後、９４℃で３０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル繰り返した。増幅産物（すなわちアンプリコン）をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、１０μｌの溶離緩衝液で溶離した。
【００８０】
導入遺伝子プライマーを使用した２回目のＰＣＲ反応の後にアガロースゲル電気泳動を実施して、そのアンプリコンがアッセイデザインによって予測された予想断片を含んでいるかどうか判定した。図５Ｂの結果では、非メチル化導入遺伝子マウス系統の処理済みＤＮＡに由来する導入遺伝子ＤＮＡ断片（レーンＤ）が予想通りの強い増幅を示し（矢印を参照）、メチル化導入遺伝子マウス系統の処理済みＤＮＡに由来する導入遺伝子ＤＮＡ断片（レーンＢ）の増幅は見られなかった。ＤＮＡアンプリコン上のＣｙ−３もしくはＣｙ−５標識の存在は、結果に影響しなかった。
【００８１】
機械式アレイ作製装置（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）を使用し、ガラス製スライド上にポリヌクレオチドを３通りスポットしてマイクロアレイを調製した。Ｃｙ−３とＣｙ−５で標識したＤＮＡアンプリコンを混ぜ合わせ、６×ＳＳＣ中、５５℃で数時間かけてアレイにハイブリダイズさせた。洗浄条件は、すべて室温で２×ＳＳＣ及び０．０３％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣとした。アレイをＣｙ−５について６３５ｎｍで走査し、Ｃｙ−３について５３２ｎｍで走査した。
【００８２】
図５Ｃに示すように、導入遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブでは、３通りで一貫して（系統Ｄからの）Ｃｙ５ハイブリダイゼーションシグナルが（系統Ｂからの）Ｃｙ３シグナルよりも高く検出され、導入遺伝子のメチル化の差が首尾よく検出されたことが示された。対照プローブでは、予想されたように、２系統の対照遺伝子にメチル化がないことに対応して、Ｃｙ５及びＣｙ３の両方のチャネルで同様のレベルのハイブリダイゼーションシグナルが検出された。
【実施例２】
【００８３】
ｃＤＮＡマイクロアレイを使用する、示差的メチル化部位のスクリーニング
この実施例では、マウス遺伝子のメチル化度の検出を目的とした、高密度ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる本発明の実施形態の使用について説明する。Ｃｙ−３とＣｙ−５で標識したＤＮＡアンプリコンの混合物を実施例１に記載のとおりに調製し、顕微鏡用スライド上にスポットした約９０００の配列確認済みｃＤＮＡクローンを含むＭ９ＫマウスｃＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたアレイを実施例１に記載のように５３２ｎｍ及び６３５ｎｍで走査した。
【００８４】
擬似色付け（Ｃｙ−３には緑、Ｃｙ−５には赤）によって、２枚の走査画像を重ね合わせた。４件のハイブリダイゼーションを独立に実施したが、結果は再現性が高いことを示した。大部分のスポットは、彩度の低い黄色を示し、各クローンに対するゲノム領域のメチル化に差がなく（各クローンのメチル化レベルが同様である）、どちらのサンプルにもメチル化がなさそうなことを示している。赤又は緑のスポットは、Ｃｙ５／Ｃｙ３比が３より大きい、又は０．３より小さい約５０のクローンで観察され、これらのスポットが表すゲノム領域中のメチル化レベルが異なっていることを示している。多くのスポットは、非常に弱いシグナルを示すか、又はシグナルを示さず、固定化したｃＤＮＡによって検出された領域が、両方のサンプル中で高度にメチル化されているか、又はアンプリコン中にないことを示している（後者は、ｃＤＮＡマイクロアレイが、ＣｐＧジヌクレオチドをもたない３’部分の遺伝子に由来するクローンを多く含んでいるためであるかもしれない）。
【実施例３】
【００８５】
特徴７６２のＣｐＧ島断片マイクロアレイを使用する、ヒト乳癌中示差的メチル化部位のスクリーニング
この実施例では、３種のヒト乳房腫瘍細胞系Ｔ４７Ｄ、ＭＢ４３５、及びＳＫＢＲ３に由来する２μｇのゲノムＤＮＡを３７℃で終夜ＨｐａＩＩ消化した。３０μｌの反応液中で、消化したＤＮＡの４分の１を図２に示すリン酸化されていない１００μＭのリンカー１０μｌに１６℃で５〜１６時間かけて連結させた。０．２ｍｌ容のＰＣＲ管は、１０μｌの連結産物、１０μｌの１０倍反応緩衝液、２ｍＭのｄＮＴＰ  １０μｌ、５Ｍのベタイン２０μｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）、５μｌのＤＭＳＯ、４４．５μｌのＨ２Ｏ、及び０．５μｌ（２．５単位）のＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を含んでいた。ＰＣＲ条件は、７２℃で５分間、次いで９４℃で３分間の後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３分間を２５サイクル繰り返した。増幅されたサンプルを４℃で保管した。増幅産物（アンプリコン）をＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を用いて精製した。２μｇの各アンプリコンをＣｙ３（Ｔ４７Ｄ用）又はＣｙ５（ＭＢ４３５及びＳＫＢＲ３用）ｄＣＴＰで標識して、標識されたプローブを以下のように生成した。すなわち、（Ｈ２Ｏで希釈して２１μｌとした）アンプリコン２μｇと、２．５倍ランダムプライマー／反応緩衝液（１２５ｍＭのトリスｐＨ６．８、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭの２−メルカプトエタノール、７５０μｇ／ｍｌのランダム八量体）２０μｌとを０．５ｍｌ容のエッペンドルフ管中で合わせ、沸騰湯中で５分間インキュベートし、氷上に５分間置いた。サンプルを簡単に遠心分離にかけ、液体画分を氷上に置き、５μｌの１０倍ｄＮＴＰミックス（それぞれ１．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、０．６ｍＭのｄＣＴＰ、１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）；３μｌのＣｙ５もしくはＣｙ３ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、１ｍＭ）、及び１μｌのクレノウ断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた。この混合物を３７℃で１．５時間インキュベートした。標識されたプローブをＭｉｃｒｏｃｏｎ３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製した。
【００８６】
精製されたプローブを混合して、２種の混合物、すなわちＴ４７Ｄ／Ｃｙ３とＭＢ４３５／Ｃｙ５、Ｔ４７Ｄ／Ｃｙ３とＳＫＢＲ３／Ｃｙ５を生成した。７６２ＣｐＧ島断片から構成されたマイクロアレイを実施例１に記載のとおりに製造した。６５℃の水浴中で、これら色素標識された混合物を１６時間かけてマイクロアレイとハイブリダイズさせ、記載（実施例１）のとおりに洗浄、走査した。
【００８７】
結果は、ハイブリダイゼーションシグナルに有意な差の出た（Ｃｙ５／Ｃｙ３比が３より大きい、又は０．３より小さい）２５個のＣｐＧ島断片を示し、細胞系間でメチル化に差があることが示唆された。亜硫酸水素塩に基づく定量的なメチル化アッセイであるＣＯＢＲＡ（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７年６月１５日、第２５巻（１２）：２５３２〜２５３４ページ）を利用して、検出されたサンプル間のメチル化の差を検証した。ＣＯＢＲＡアッセイによって、試験したＣｐＧ島断片９例のうち６例でメチル化に差のあることが確認された。
【００８８】
以上、本発明を広く開示し、上述の代表的な実施形態に即して説明してきた。当分野の技術者ならば、その意図及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々に修正を加えられることがわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の方法の一実施形態を示す概略図である。領域Ａ及びＢは、試験サンプル及び対照サンプルから得られたＤＮＡ中に存在するゲノムＤＮＡセグメントを表す。縦線は、そのＤＮＡ中のメチル化部位の位置を示す。両端に「Ｍ」のついた縦線は、そのメチル化部位がメチル化されていることを示す。したがって、図に示されるとおり、対照サンプルではＤＮＡ領域が両方ともメチル化されていないが、試験サンプルでは領域Ｂがメチル化されている。メチル化されていないメチル化部位を両端とする領域の選択的な増幅は、ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で断片に消化し、その断片をオリゴヌクレオチドリンカーと連結し、リンカーと連結した断片を、リンカープライマーを用いて増幅することによって実現される。試験サンプル及び対照サンプルから得られた増幅産物を、図に示するように、Ｃｙ３及びＣｙ５シアニン色素で区別して標識する。２種のサンプルからの標識されたアンプリコンを合わせ、領域Ａ及びＢのための固定プローブを有するアレイにハイブリダイズさせる。マイクロアレイを、５３２ｎｍ及び６３５ｎｍの励起波長で走査する。プローブＡに対する二重シグナルは、試験サンプル中の領域Ａがメチル化されていないことを示し、プローブＢに対する単一シグナルは、試験サンプル中の領域Ｂがメチル化されていることを示す。
【図２】メチル化感受性制限酵素で切断して生成した断片を増幅するスキームにおけるリン酸化されていないリンカーの使用を示す図である。縦の棒線は、符合する塩基対を表す。パネルＡは、上部鎖（配列番号１）及び５’側にリン酸をもたない短い下部鎖（配列番号２）を備えた２本鎖ＨｐａＩＩ（Ｃ‘ＣＧＧ）リンカーを示す。パネルＢは、ＨｐａＩＩ制限消化後のＤＮＡ断片を示す。パネルＣは、リン酸化されていないリンカーがＨｐａＩＩ断片に連結された後に生成したＤＮＡを示す。図からわかるとおり、５’側リン酸を欠いているリンカー（配列番号２）の短い下部鎖は、連結されずにニックが残り、上部鎖は、断片の５’側リン酸に連結される（配列番号３となる）。連結された断片に増幅反応物（ポリメラーゼ及びｄＮＴＰ）を加えた後、７２℃で短時間インキュベートすると、リンカーの連結されていない下部鎖が新たに合成された領域（太字）で置き換えられる（配列番号４）。その後の温度サイクルで、未使用のリン酸化されていないリンカー上部鎖をプライマーとして増幅が行われる。
【図３】メチル化感受性（「ＭＳ」）とメチル化非感受性（「ＭＩＳ」）の両方の制限酵素で切断することにより、希少なメチル化部位を照会するためのアンプリコン調製の原理を示す図である。増幅としては、ＭＳ制限消化（ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＩＳ）に関与する断片のためだけに求められる。パネルＡは、２種類のリンカー、すなわちＭＳ切断部位用のリン酸化されたリンカーとＭＩＳ切断部位用のリン酸化されていないリンカーが使用されることを示す。パネルＢは、ＭＳ及びＭＩＳ酵素での制限消化後、ＭＩＳリンカーの下部鎖は、５’側リン酸がないために連結できないことを示す。したがって、リンカーの短い下部鎖と断片の間にニックが存在する。この共有結合していないリンカーＤＮＡ下部鎖は、不安定であり、プライマーによって指示される増幅を支持することができない。したがって、断片の両端に共有結合していないリンカーＤＮＡを有するＭＩＳ／ＭＩＳ断片は、増幅不可能であるが、ＭＳのみ（ＭＳ／ＭＳ）によって、又は一方の末端のＭＳと他方の末端のＭＩＳ（ＭＳ／ＭＩＳ）によって生成された断片は、増幅することができる。
【図４】リンカープライマーをどのように設計するとリンカー二量体の増幅を妨げられるかを示す図である。縦の棒線は、符合する塩基対を表す。パネルＡは、５’側リン酸を有する二本鎖（配列番号１及び５）のＨｐａＩＩ（Ｃ‘ＣＧＧ）リンカーを示す。パネルＢは、ＨｐａＩＩ酵素で制限消化した後のＤＮＡ断片を示す。パネルＣは、リンカー二量体の増幅を回避するためのリンカープライマー（配列番号６）を示す。パネルＤ１は、パネルＡのリンカーから生成したリンカー二量体（配列番号７）を示す。パネルＤ２は、リンカー二量体の下部鎖（配列番号７）にハイブリダイズさせたとき、リンカープライマー（配列番号６）の３’末端にある符合しない塩基（グアニン）を示す。符合しない３’末端ヌクレオチドの存在が、プライマーによる増幅の指示を妨げる。パネルＥ１は、ＨｐａＩＩ断片に連結したリンカー二量体（配列番号８及び９となる）を示す。パネルＥ２は、連結した断片の下部鎖（配列番号９）とハイブリダイズさせたとき、リンカープライマー（配列番号６）の３’末端に符合しない塩基がないことを示す。リンカープライマー中に符合しない３’側塩基が存在しないので、プライマーによって増幅が指示されることになる。したがって、プライマーとプライマー二量体の間に３’側塩基の不適合が得られるまでリンカープライマーの３’末端を伸長させ、３’末端のリンカープライマーとＤＮＡ断片の間の適合性は維持することにより、リンカー二量体の増幅が妨げられる（この例では、１個の塩基しか伸長させる必要がない）。
【図５】本発明のメチル化検出法で、導入遺伝子の系統特異的なメチル化を検出できることを示す図である。パネルＡは、その導入遺伝子に対する標識されたプローブとハイブリダイズさせた、トランスジェニック系統Ｄ及びＢに由来するマウスＤＮＡのサザンブロットである。このブロットは、系統Ｂでは導入遺伝子がメチル化されているが、系統Ｄではメチル化されていないことを示す（メチル化感受性制限酵素を使用してサザンブロットを調製した結果、メチル化（「ｍｅｔｈ」）導入遺伝子の分子量が非メチル化（「ｕｍ」）導入遺伝子よりも増大している）。パネルＢは、実施例１に記載したように、アンプリコンを系統Ｄ及びＢから調製するとき、系統Ｄ（導入遺伝子をメチル化しない系統）からしか増幅された導入遺伝子が検出できないことを示す。パネルＢに示すゲルは、導入遺伝子に特異的なＰＣＲのアンプリコンを電気泳動にかけて調製した。矢印は、増幅された導入遺伝子の位置を指す。パネルＣは、パネルＢに記載のように系統Ｄ及びＢから調製したアンプリコン中に存在する導入遺伝子及び非メチル化対照遺伝子の量を示す。系統Ｄに由来するアンプリコンはＣｙ５で標識し、系統Ｂに由来するアンプリコンはＣｙ３で標識した。２種のアンプリコンを合わせ、導入遺伝子用と非メチル化対照遺伝子用のオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイとハイブリダイズさせた（共に３通り）。この表は、導入遺伝子のオリゴヌクレオチド及び対照遺伝子のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたＣｙ３及びＣｙ５色素の量を示す。Ｃｙ３シグナルの相対的な減少が認められることは、（Ｃｙ３で標識された）系統Ｂの導入遺伝子が系統Ｄものもよりもメチル化されていることを示唆している。それとは対照的に、対照遺伝子に対するＣｙ３及びＣｙ５シグナルが相対的に類似していることは、この遺伝子が、この２系統のマウスで同程度にメチル化されていることを示している。
【図１】
2006500901.tif 000004
【図２】
2006500901.tif 000005
【図３】
2006500901.tif 000006
【図４】
2006500901.tif 000007
【図５】
2006500901.tif 000008
【国際調査報告】
2006500901.tif 000009
2006500901.tif 000010
2006500901.tif 000011