(57)【要約】本発明は、インビトロまたはインビボで行われる細胞へのＤＮＡのトランスフェクションのためのＤＮＡ担持ナノ粒子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで行われる細胞へのＤＮＡのトランスフェクションのためのＤＮＡ担持ナノ粒子の使用。
【請求項２】
前記細胞が真核細胞であり、好ましくは培養真核細胞である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
インビボで行われる細胞へのＤＮＡのトランスフェクションのためのＤＮＡ担持ナノ粒子の使用。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡおよび腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記ＤＮＡが、誘導性プロモーターの制御下でトランスフェクションされる請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するプロセスであって、
それ自体は公知である合成手順によってナノ粒子を調製することと、
前記ナノ粒子にＤＮＡを担持させることと、
前記標的器官において有効なＤＮＡ濃度を得るのに十分な量の前記ＤＮＡ担持ナノ粒子を前記ヒトまたは動物の体に投与することとを含むプロセス。
【請求項７】
前記ＤＮＡ担持ナノ粒子の投与を、抗癌作用を有する医薬品、好ましくは細胞増殖の抑制に有効な作用物質を担持するナノ粒子の投与と組み合わせて行う請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、アクリレート、メタクリレート、アルキルシアノアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アルキレングリコールジアクリレートまたはジメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリルアミド、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−Ｌ−リジンジイルテレフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアクロレインおよびポリグルタルアルデヒドからなる群から選択される１種類または２種類以上のモノマーの重合によって調製される請求項６または請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記モノマーを重合させてナノ粒子とする過程において安定化剤を使用し、好ましくはジエチルアミノエチルデキストランを前記安定化剤として使用する請求項６〜８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ナノ粒子に対し、コーティング、好ましくは界面活性剤のコーティング、より好ましくはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０からなるコーティングを施す請求項６〜９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡおよび腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項６〜１０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ナノ粒子にＤＮＡを担持させる工程が、誘導性プロモーターを含むＤＮＡを前記ナノ粒子に担持させる工程であるか、この工程の前に行われる工程、この工程と同時に行われる工程、またはこの工程の後に行われる工程である請求項６〜１１のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
前記投与が、経口投与、腹膜内投与、静脈内投与のいずれか、またはこれらの併用である請求項６〜１２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
前記標的器官におけるＤＮＡ濃度が、癌の治療に有効な濃度であるか、または遺伝性疾患の治療に有効な濃度である請求項６〜１３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１５】
一投与単位当たりの前記ＤＮＡ担持ナノ粒子の量が、体重に対して５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項６〜１４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
前記投与が、一日当たり１〜４投与単位、好ましくは一日当たり１〜３投与単位の形態で行われる請求項６〜１５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１７】
異なる種類のＤＮＡを担持させた２種類のナノ粒子の投与を、好ましくは抗癌作用を有する医薬品または細胞増殖の抑制に有効な作用物質を担持させた少なくとも１種類のナノ粒子の投与と併用し、好ましくは前記少なくとも１種類のナノ粒子の投与を、前記２種類のナノ粒子の投与後に行う請求項６〜１６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１８】
ヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するための、ＤＮＡを担持するナノ粒子の使用。
【請求項１９】
ヒトまたは動物の体内の標的器官にプロモーターによって誘導されるＤＮＡを投与するための、誘導性プロモーターを含むＤＮＡを担持するナノ粒子の使用。
【請求項２０】
ヒトまたは動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のための、ＤＮＡを担持するナノ粒子の使用。
【請求項２１】
ヒトまたは動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のための、誘導性プロモーターを含むＤＮＡを担持するナノ粒子の使用。
【請求項２２】
前記ＤＮＡが、癌治療に関連するＤＮＡである請求項１８〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡおよび腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項１８〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
前記プロモーターが、ヒトパピローマウイルス上流調節領域（ＨＰＶ−ＵＲＲ）、？および？からなる群から選択される請求項１８〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記標的器官が、腫瘍ができている標的器官である請求項１８〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
前記標的器官が、脳、肝臓、腎臓、腸、胃、肺、および／または精巣であり、好ましくは前記標的器官が脳である請求項１８〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
前記腫瘍が、悪性神経膠腫、未分化神経膠星状細胞腫、神経グリア芽細胞腫および多形性グリア芽細胞腫からなる群から選択される請求項１８〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
ヒトまたは動物の体に対して癌の予防および／または治療のための標的重点的な治療（target-focussed treatment）を行う方法であって、癌に有効な１種類または２種類以上のＤＮＡを前記体に対して有効量投与することを含み、前記ＤＮＡはナノ粒子と組み合わせた形態で投与される方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子の形態で投与された前記ＤＮＡが、誘導性プロモーターを含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌が、悪性神経膠腫、未分化神経膠星状細胞腫、神経グリア芽細胞腫および多形性グリア芽細胞腫からなる群から選択される請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与が、経口投与、腹膜内投与、静脈内投与のいずれか、またはこれらの併用である請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡが前記ナノ粒子に吸着、吸収、または含有される請求項２８〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノ粒子が、アクリレート、メタクリレート、アルキルシアノアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アルキレングリコールジアクリレートまたはジメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリルアミド、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−Ｌ−リジンジイルテレフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアクロレインおよびポリグルタルアルデヒドからなる群から選択されるモノマーから形成されるナノ粒子である請求項２８〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノ粒子が、安定化剤およびコーティングからなる群から選択される物質を含む請求項２８〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子の凝集を防止できる安定化剤および前記ＤＮＡと前記ナノ粒子との結合を強化する安定化剤からなる群から、好ましくはポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、デキストラン１２．０００、デキストラン７０．０００、ジエチルアミノエチル−（ＤＥＡＥ−）デキストラン、グリセロールおよびソルビトールの脂肪酸エステル、ポロキサマー１８８、エトキシ化エーテル、エトキシ化エステル、エトキシ化フェノールおよびジフェノール、脂肪酸および脂肪族アルコール硫酸エステルの金属塩（好ましくはナトリウム塩）、および前記物質２種類以上の混合物からなる群から選択される安定化剤を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナノ粒子が、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、他のポリソルベート、ポロキサマーおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される物質でコーティングされている請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞へＤＮＡをトランスフェクションするためのナノ粒子の使用に関する。本発明はまた、ヒトまたは動物の体内の標的器官へのＤＮＡの投与に関する。本発明は、特に、ヒトまたは動物の体内における腫瘍ができている標的器官、例えば、脳腫瘍の場合には脳に対し、癌治療に関連するＤＮＡを投与するためのナノ粒子の使用に関する。本発明はまた、ヒトまたは動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のためのナノ粒子の使用に関する。本発明はまた、癌予防および／または癌治療に好適なＤＮＡを投与することにより、ヒトまたは動物の体に対して標的重点的な治療（target-focussed treatment）を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明で使用するナノ粒子は、合成または天然のポリマーで形成された粒子であり、その粒径は１〜１０００ｎｍの範囲である。ナノ粒子は、薬剤、医薬品、診断薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、プラスミド等の天然または合成の物質との結合（例えば、吸着、吸収、取り込み）、ならびにヒトまたは動物の体内における脳、肝臓、腎臓等の標的器官へのこのような物質の運搬に好適であることが、従来技術において明らかとなっている（特許文献１および特許文献２）。特に、癌治療用の医薬品を、脳を含む標的器官へと運搬するためにナノ粒子を使用できることが立証されている。換言すれば、適切なナノ粒子に結合させることにより、そうしなれば血液脳関門（ｂｂｂ）を通過することができない医薬品の血液脳関門の通過を可能にできるのである（特許文献３）。
【０００３】
特に、メタクリル酸メチル、アルキルシアノアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、エチレングリコールジメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリルアミド、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−Ｌ−リジンジイルテレフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、脱溶媒和高分子（desolvated macromolecules）または脱溶媒和炭水化物、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアクロレインおよびポリグルタルアルデヒドからなる群から選択されるモノマーを、血液脳関門の通過を可能にする安定化剤の存在下で重合させて得たナノ粒子であって、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（登録商標）８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート＝Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）等の物質で任意にコーティングを施したナノ粒子を使用し、ドキソルビシン等の癌治療薬を、他の器官にこの薬剤による影響を与えることなく、脳等の特定の標的器官に（血液脳関門を通過させて）運搬することができることが判明した。
【０００４】
遺伝子またはＤＮＡのそれぞれを、微粒子を用いてインビボで細胞にトランスフェクションすることが、特許文献４に記載されている。生体付着性（bioadhesive）のポリマー、すなわち、通常の生理学的条件下において粘膜上皮に結合できるものと定義されるポリマーからなる前記微粒子は、経口投与または吸入によって投与され、プロモーターの制御下にある遺伝子を含む。送られた遺伝子は、前記細胞内で効力を発揮する遺伝子療法に使用することができる。しかしながら、このアプローチは、特に前記微粒子によって輸送される遺伝子またはＤＮＡがそれぞれ血液脳関門のような生理学的関門（physiological barriers）を通過できないという事実により、あらゆる種類の細胞に遺伝子をトランスフェクションするための実用上有用な方法とはなり得ていない。このため、上述の米国特許は、上皮細胞、消化管関連リンパ細胞、脾臓細胞または肝細胞の治療のための、非特異的な遺伝子治療を教示しているに過ぎない。
【０００５】
世界的に見て、脳の腫瘍は若年層に広く観察される腫瘍に該当する。米国では、１８０，０００件もの異なる脳腫瘍の新たな症例、特に、未分化神経膠星状細胞腫、神経グリア芽細胞腫、および、特に、極めて悪性の多形性グリア芽細胞腫を含む悪性神経膠腫の混成群の症例が確認されている。再生腫瘍（recidives）の形成を薬理学的に抑制する製剤が未だ実用可能ではないことから、このような腫瘍にかかった若年層の死亡率は高い。したがって、治療の成功率を向上させるため、このような腫瘍の治療を成功させるための方法の発見が強く望まれている。
【０００６】
ヒトにおける悪性神経膠腫および神経グリア芽細胞腫は、ほとんどの場合、腫瘍組織を外科的に除去した後、化学療法および／または放射線治療を行うことによって治療される。しかしながら、前記治療工程で使用される細胞増殖抑制剤の効力が完全に発揮されるまでには克服しなければならない二つの障害、すなわち、血液脳関門と、血液脳関門と腫瘍とに頻発する内因的化学療法抵抗性とが存在するため、多くの場合、化学療法による治療は十分ではない。したがって、上述のような種類の脳腫瘍に対する薬理学的治療の過程においては、インビボで、血液脳関門を通過するように化学療法薬を輸送する方法の開発が不可欠である。公知の方法としては、血液脳関門を開くために脳を切開する方法（侵襲的治療）、薬理学的作用物質を改変し、該作用物質が血液脳関門を通過できるようにする方法、キメラペプチド（chimeric peptides）を使用し、薬理学的に有効な小分子を脳内の特定の部位へとターゲッティングする方法が挙げられる。
【０００７】
上述のＷＯ国際公開パンフレットにおいては、特に、ヒトまたは動物の体内における特定の器官、特に脳に対し、抗癌薬を含む薬剤のターゲッティングを可能にし、これにより、脳内の癌を治療するため、血液脳関門を通過しないことがわかっている薬剤の脳への輸送を可能にする薬剤輸送システム（drug delivery systems）が提案されている。特に、鎮痛薬（例えば、ヘキサペプチドエンケファリン（hexapeptide-encephaline）、ダラージン（dalargine））または抗癌薬（例えば、ドキソルビシン）を担持させたナノ粒子をＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（登録商標）８０でコーティングし、このような薬理学的ナノ粒子を含有する組成物を適当な賦形剤に含有させてヒトまたは動物の体へと投与した後に、脳内において、前記ナノ粒子薬剤輸送システムを使用せずに前記薬剤のみを投与した場合と比べて、前記薬剤の濃度の上昇を確認することができた。
【０００８】
遺伝子を細胞へと送るアプローチのほとんどが、遺伝子またはプラスミドを挿入したウイルスまたはウイルス性ベクター（viral vectors）を利用している。このため、体の細胞または組織は、前記遺伝子またはプラスミドを含むウイルスまたはウイルス性ベクターの作用を受ける。前記ウイルスは細胞に感染または侵入し、前記遺伝子またはプラスミドを細胞内部に放出する。ここで、前記遺伝子が前記細胞内で転写され、得られた転写生成物が生物学的に活性であることが理想的である。しかしながら、ウイルスまたはウイルス性ベクターを用いたアプローチには、数多くの問題が存在する。一例を挙げると、ウイルス性ベクターは有害な副作用を及ぼす可能性があるということである。しかも、ウイルス性ベクターは、望ましくない免疫反応を引き起こす。さらに、連続的に発現する遺伝子は、細胞応答によって「スイッチ・オフ」され、これにより、耐性のプロセスにおいて不活性となる可能性がある。さらに、ウイルス性ベクターは、体内において非特異的に分布するため、体内の特定の部位へと遺伝子／ＤＮＡをターゲッティングすることはできず、特に、血液脳関門のような自然障壁（natural barriers）によって保護された領域へのターゲッティングを行うことはできない。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９５／２２９６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／５６３６１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第００／７４６５８号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６,２４８,７２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、血液脳関門を通過するように癌治療薬およびＤＮＡを輸送するというアプローチを、癌、特に神経膠腫や神経グリア芽細胞腫の治療に有効な、さらに別の物質にも応用することであった。さらに本発明の目的は、癌治療に有効な新たな作用物質および薬剤をヒトまたは動物の体内における特定の領域へとターゲッティングするために、特に、このような薬剤および作用物質が血液脳関門を通過するようにするために、ナノ粒子を使用することであった。さらに本発明の目的は、インビトロで細胞へＤＮＡ分子をトランスフェクションするための、より有効でより安価な手段を提案することであった。さらに本発明の目的は、発現させようとする遺伝子に、前記遺伝子がトランスフェクションされる細胞内において前記遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターを組み込むことであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、上述の（およびその他多数の）薬剤は、適切なコーティングを施されたナノ粒子によって、血液脳関門を通過させて輸送できるということだけではなく、癌の活性を抑制する遺伝子のような高分子を適切なナノ粒子に結合させて（または取り込ませて）血液脳関門を通過するように容易に輸送し、同時に輸送される特定のプロモーターの制御により癌活性を効果的に抑制できるということが判明した。さらに、驚くべきことに、ナノ粒子は、ウイルスを使用することなく、インビトロでＤＮＡ分子を真核細胞にトランスフェクションする非常に有効かつ安価な手段であることが判明した。さらに驚くべきことに、遺伝子発現のタイミングを制御することが可能であり、これにより遺伝子発現によって誘発される有害な作用を低減することができると共に、細胞が遺伝子産物に対して耐性を持つようになる可能性をも低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
したがって、本発明は、インビトロおよびインビボで行われる細胞へ、好ましくは真核細胞へ、より好ましくは脳へ、最も好ましくは脳の癌を患う患者の脳へＤＮＡをトランスフェクションするのための遺伝子担持ナノ粒子の使用に関する。
【００１３】
さらに、上述のような遺伝子担持ナノ粒子の脳における使用は、腫瘍ができている哺乳類の体におけるその他の器官にも応用できる。数例を挙げると、このような他の器官は、肝臓、腎臓、腸、胃、肺および精巣であってもよい。
【００１４】
本発明はまた、ヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するプロセスであって、それ自体は公知である合成手順によってナノ粒子を調製することと、前記ナノ粒子にＤＮＡを担持させることと、前記標的器官において有効なＤＮＡ濃度を得るのに十分な量の前記ＤＮＡ担持ナノ粒子を前記ヒトまたは動物の体に投与することとを含むプロセスに関する。
【００１５】
本発明はまた、ヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するための、以下に詳述するプロセスによって得たナノ粒子の使用に関する。
【００１６】
本発明はまた、ヒトまたは動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のための、以下に詳述するプロセスによって得たナノ粒子の使用に関する。
【００１７】
最後に、本発明はまた、ヒトまたは動物の体に対して癌の予防および／または治療のための標的重点的な治療を行う方法であって、癌に有効な１種類または２種類以上のＤＮＡを前記体に対して有効量投与することを含み、前記ＤＮＡはナノ粒子と組み合わせた形態で投与される方法に関する。
【００１８】
ここで使用される「ナノ粒子」という用語は、生体適合性であり、かつ、使用環境による化学的および／または物理的な破壊に対して十分な耐性を有する担体構造物（carrier structure）を指す。故に、腹膜内投与、経口投与、または静脈内投与によってヒトまたは動物の体内に入った後も、十分な量のナノ粒子が実質的に無傷の状態で存在し、所望の標的器官、例えば、脳、肝臓、腎臓等へと到達できる。通常は、ナノ粒子は固体のコロイド粒子である。薬剤またはその他の関連材料（例えば、核医薬または放射線治療において診断目的で使用される材料、および／または、予防および／または治療目的で使用される材料）は、前記ナノ粒子に溶解、捕捉、封入および／または吸着もしくは付着させることができる。
【００１９】
前記ナノ粒子は、天然または合成ポリマー材料からなる合成粒子である。前記粒子の粒径は、１，０００ｎｍ未満、好ましくは約１〜１，０００ｎｍである。
【００２０】
本発明のプロセスおよび使用において、前記ナノ粒子は、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、好ましくはポリブチルシアノアクリレート、ポリアリールアミド、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、多糖類、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン、ポリグルタルアルデヒド、ならびにこれらの誘導体、共重合体、および混合物からなる群から選択されるポリマー材料を含んでいることが好ましい。連続的な水相での乳化重合によって生分解性ナノ粒子を製造するのに特に好適なモノマー材料としては、アクリレート、メタクリレート（好ましくは、メタクリル酸メチル）、アルキルシアノアクリレート（好ましくはブチルシアノアクリレート）、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アルキレングリコールジアクリレートまたはジメタクリレート（好ましくは、エチレングリコールジメタクリレート）、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリルアミドおよび２−ジメチルアミノエチルメタクリレートが挙げられる。また、その他のナノ粒子は、別の手法により、Ｎ，Ｎ−Ｌ−リジンジイルテレフタレート、アルキルシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、および脱溶媒和高分子または脱溶媒和炭水化物から調製される。さらに、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアクロレインおよびポリグルタルアルデヒド等の非生分解性材料を使用することもできる。材料および製造方法の概要が出版されている（J. Kreuter, (1991) Nanoparticles-preparation and applications. In: M. Donbrow (Ed.) Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy. CRC Press, Boca Ranton, Florida, pp. 125 to 141）。重合／ナノ粒子生成工程においてモノマー前駆物質および／またはオリゴマー前駆物質から形成されたポリマー材料自体は従来技術により公知であり、ナノ粒子製造業界の当業者が通常の技術に基づいて適切に選択することができる前記ポリマー材料の分子量および分子量分布もまた、従来技術により公知である。Kreuter et al.の文献、ならびに該文献中に引用されている文献に、これに関する記載がある。
【００２１】
本願の明細書および請求項で使用されている「ＤＮＡ」という用語は、基本的に、当該技術分野において考えられるあらゆるＤＮＡを指す。好ましい実施形態において、「ＤＮＡ」という用語は、２種類のＤＮＡ、すなわちプラスミドＤＮＡ、より好ましくは腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡ、さらに好ましくは腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲＢの情報を有するプラスミドＤＮＡと、アンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくはＢｃｌ２のような腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとを含むことを意図している。本発明においては、１種類のＤＮＡ（よって、１種類のＤＮＡ担持ナノ粒子）を使用してもよい。あるいは、２種類以上のＤＮＡを使用してもよく、この結果、異なる種類のＤＮＡを担持する、本発明に従って使用可能な複数の種類のナノ粒子が得られる。
【００２２】
驚くべきことに、ＤＮＡ、特に上述の２種類のＤＮＡは、ナノ粒子への組み込みまたは吸着が可能であり、これによって得られる２種類のＤＮＡ−ナノ粒子複合体を、生物、特に、癌（具体的には脳の癌であるが、これに限定されない）を患っている生物に接種することができた。接種後、腫瘍増殖の抑制を観察することができ、さらには腫瘍のネクローシスおよびアポトーシスを誘発することもできていた。
【００２３】
本発明の、不可欠ではないが好ましい実施形態においては、プロモーターを含むプラスミドＤＮＡ、より好ましくは誘導性プロモーターを含むプラスミドＤＮＡを、前記ナノ粒子に取り込ませることが可能である。前記ナノ粒子に担持させて前記細胞内で発現させるＤＮＡに、誘導性プロモーターを含有させるという新規な工程によって、関連する遺伝子の発現の外的な制御を実現でき、前記遺伝子を自在に「スイッチ」オンおよびオフすることができる。また、予期しなかった従来技術に対する利点として、遺伝子／ＤＮＡの発現のタイミングを制御できることが挙げられる。このような制御により、連続的な遺伝子発現による有害な副作用を低減すること、および／または、細胞が遺伝子産物に対して耐性を持つようになり、ネガティブセレクションが引き起こされる可能性を低減することができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態においては、前記誘導性プロモーターとしてヒトパピローマウイルスの上流調節領域（ＨＰＶ−ＵＲＲ）を使用した。腫瘍抑制因子（tumor suppressor）の発現が、デキサメタゾンまたはその他の誘発因子や化合物の投与後に誘発された。このようにして、腫瘍細胞のアポトーシスや腫瘍の退化（regression）を達成することができた。本発明で使用可能なプロモーターの他の例としては、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはシミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーターが挙げられる。
【００２５】
さらに、１種類または２種類以上のＤＮＡ含有ナノ粒子と、１種類または２種類以上の細胞増殖の抑制に有効な物質を含有するナノ粒子とを併せて投与することにより、腫瘍退化を含む極めて高い効果を得ることができた。好ましい実施形態においては、腫瘍抑制ＤＮＡを、さらに好ましくは、誘導性プロモーターの下流に存在する腫瘍抑制ＤＮＡを、細胞増殖の抑制に有効な化合物を含有するナノ粒子複合体の接種の前に注入してもよい。前記投与の併用のさらに好ましい実施形態においては、前記細胞増殖の抑制に有効な化合物がドキソルビシンである。
【００２６】
ＤＮＡを細胞へトランスフェクションするプロセス、ならびにヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するプロセスにおいて、第1の工程は、それ自体は公知である合成手順によってナノ粒子を調製することである。基本的に、ＤＮＡの投与に好適なナノ粒子の調製に適した合成手順であれば、いずれも使用できる。前記プロセスの好ましい実施形態においては、上述のポリマーを構成する化学的基本単位（chemical basis）となる前記モノマー材料のうちの１種類を用いて合成を開始する。このモノマー材料、もしくは任意に前記モノマー材料のうちの２種類以上を、好ましくは界面重合によって、生成されるナノ粒子の適切な非溶剤中で重合する。通常は、先に述べた先行技術文献にも詳しく記載されているように、前記重合は、適切な安定化剤の存在下で、例えば、上述の文献により当業者に公知の温度および濃度で行われる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態においては、前記ナノ粒子を調製するプロセスは、前記ナノ粒子に安定化剤を含有させる工程を含んでいてもよい。したがって、このような場合には、前記安定化剤は、前記ナノ粒子を調製するための組成において必須の成分でなければならない。安定化剤は、界面活性剤としての性質（surfactant properties）を有する化合物であることが好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態においては、安定化剤は１種類のみ使用される。この場合、ヒトまたは動物の体内または体表面の特定の標的へのＤＮＡの輸送を、理想的な形で達成することができる。例えば、ＤＮＡの運搬と血液脳関門（ｂｂｂ）の通過を極めて有効に行うことができ、よって、作用部位における有効物質の量が著しく増大され、これに応じてヒトまたは動物に投与する投与量を低減することができる。しかしながら、１種類より多くの安定化剤、例えば、２種類以上の安定化剤を使用することも可能である。
【００２９】
基本的には、本発明の目的を達成し得る安定化剤であれば、いずれも本発明の薬剤ターゲッティングシステムに組み込む上で好適である。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態においては、細胞へのＤＮＡのトランスフェクションまたは標的を設定して行うＤＮＡの投与に使用するナノ粒子に用いる安定化剤は、ナノ粒子の凝集を防止できる安定化剤からなる群から選択される。より具体的には、前記安定化剤は、ＤＮＡとナノ粒子との結合を強化する化合物から選択されてもよい。
【００３１】
前記ナノ粒子を調製するための特に有利なプロセスにおいては、前記安定化剤は、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート８０、ポリソルベート８５、ポリソルベート８１、デキストランとその誘導体、好ましくはデキストラン１２．０００、デキストラン７０．０００、ジエチルアミノエチル−（ＤＥＡＥ−）デキストラン、多官能アルコールのカルボン酸エステル、ポロキサマー、ポロキサミン、アルコキシ化エーテル、アルコキシ化エステル、アルコキシ化モノ−、ジ−およびトリグリセリド、アルコキシ化フェノールおよびジフェノール、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）およびＢａｕｋｉ（登録商標）系の物質、カルボン酸の金属塩、アルコール硫酸エステルの金属塩、およびスルホコハク酸の金属塩、ならびに前記物質２種類以上の混合物からなる群から選択される物質を含有する。例えば、前記安定化剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、ポリソルベート８１、デキストラン１２.０００、デキストラン７０.０００、ＤＥＡＥ−デキストラン、カルボン酸エステル、好ましくは、グリセロールおよびソルビトールの脂肪酸エステル、さらに好ましくは、グリセロールモノステアレート、ソルビタンモノステアレートおよびソルビタンモノオレエート、ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）、エトキシ化エーテル、エトキシ化エステル、エトキシ化トリグリセリド、エトキシ化フェノールおよびジフェノール、脂肪酸の金属塩および脂肪族アルコール硫酸エステルの金属塩、好ましくは、脂肪酸および脂肪族アルコール硫酸エステルのナトリウム塩、さらに好ましくは、ステアリン酸ナトリウムおよびラウリル硫酸ナトリウム、ならびに前記物質２種類以上の混合物からなる群から選択される物質を含有する。
【００３２】
本発明のプロセスにおいては、前記調製プロセスにおいて使用されるナノ粒子の安定化剤が、ＤＥＡＥ−デキストランおよびＤＥＡＥ−デキストランと上述の他の安定化剤との混合物から選択される物質を含有する場合に、前記ナノ粒子は特に良好な結果をもたらすことがわかっている。このようなナノ粒子を使用した場合には、生理学的に有効な物質をヒトまたは動物の体内または体表面の特定の部位にターゲッティングする工程を、極めて良好に達成することができた。特に、血液脳関門へとＤＮＡをターゲッティングし、前記物質を、前記粒子を凝集させることなく、前記ｂｂｂを通過させる工程において、脳内で腫瘍に作用するＤＮＡの有効量が比較的多いことがわかった。このように、前記ナノ粒子が安定化剤としてＤＥＡＥデキストランを、任意に他の安定化剤との混合物という形で含有している場合には、前記物質のｂｂｂ通過効率を向上させることができ、ナノ粒子の量を著しく低減させることができた。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態においては、ナノ粒子の調製プロセスは、ＤＮＡの標的器官への輸送および／または血液脳関門の通過が容易に行われるようにするため、前記ナノ粒子にコーティングを施す工程を含んでいてもよい。基本的に、従来技術においてナノ粒子および／またはその薬剤成分の血液脳関門の通過を可能にすると述べられているあらゆるコーティングが、本発明においても使用できる。前記コーティングとしては、１種類の物質を使用してもよいし、複数種類の物質（２種類、３種類等の物質）をコーティング材料として使用してもよい。好ましい実施形態においては、前記コーティングは、ポリソルベート８０（ＩＣＩよりＴｗｅｅｎ（登録商標）８０として市販されている）を含有していてもよいし、これのみで構成されていてもよい。ポリソルベート８０は、単独で使用してもよいし、例えば、ポロキサマー（ＢＡＳＦ  ＷｙａｎｄｏｔｔｅよりＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）として市販されている）のような他の適切なコーティング材料と組み合わせて使用してもよい。前記ナノ粒子の調製に使用するコーティング材料の量は、当業者であれば、従来技術において使用されているコーティングの量に基づいて容易に選択できる。特に好ましい実施形態においては、本発明のプロセスに従ってナノ粒子を調製する場合におけるコーティング材料の量は、コーティング溶液に対し、０．１〜１００ｍｇ/ｍｌの範囲、より好ましくは１〜５０ｍｇ/ｍｌの範囲、さらに好ましくは５〜２０ｍｇ/ｍｌの範囲であり、例えば１０ｍｇ/ｍｌである。
【００３４】
本発明のトランスフェクションプロセスにおける第３の工程は、ＤＮＡ担持ナノ粒子を、ＤＮＡをトランスフェクションする細胞の培養物（culture）に添加する工程を含む。本発明の好ましい実施形態においては、これは通常の培養培地において、より好ましくは前記ＤＮＡが前記細胞にトランスフェクションされるのに十分な時間行われる。前記時間は、（時間以外の反応条件と同様）何ら制限されることなく、当業者により自由に選択すればよく、特に、前記反応条件は、1種類または２種類の方向づけ試験（orienting test experiments）によって決定すればよい。より好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡ担持ナノ粒子を前記培養細胞でインキュベートする時間は、１時間〜７２時間の範囲内、さらに好ましくは６時間〜３６時間の範囲内、最も好ましくは１２時間〜３０時間の範囲内であり、例えば２４時間である。前記トランスフェクション工程における前記培養培地内でのＤＮＡ担持ナノ粒子の濃度は、好ましくは１μｇ〜２０μｇの範囲、さらに好ましくは１μｇ〜１０μｇの範囲内であり、例えば１μｇ〜６μｇである。温度は、通常の細胞培養温度であり、好ましくは２０℃〜４０℃の範囲内、より好ましくは３０℃〜３７℃の範囲であってもよい。本発明の特定の実施形態においては、培養培地は１種類のみ使用されていてもよい。しかしながら、当業者の経験と知識の範囲内において、トランスフェクション処理の過程において互いに異なる培養培地を使用してもよい。例えば、本発明の使用において、前記ナノ粒子ＤＮＡ複合体を、例えば、改変イーグル培地（ＭＥＭ）またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）のような標準的な培養培地に添加し、ＤＮＡを担持させた前記ナノ粒子を、前記培養細胞で、一定時間、例えば５時間インキュベートすることが好ましい。添加から５時間後、前記培養培地を、好ましくは新しい培地に、さらに好ましくは同種の新しい培地に取り替え、前記細胞の培養をさらに一定時間、例えばさらに２４時間、通常の条件、例えば（但し、限定されない）、ＣＯ2を５％含有する湿潤雰囲気において３７℃で培養する。細胞へのＤＮＡのトランスフェクションが成功したか否かは、常法によって確認できるが、好ましい確認方法は、化学反応または蛍光発光によって前記細胞を固定化した後にレポーター遺伝子の発現を可視化することである。さらに、他の遺伝子の転写は、例えば、ノーザンブロット法によって分析される。
【００３５】
本発明の投与プロセスにおける第３の工程は、これより前に行われた上述の２つの工程による調製および担持によって得られたＤＮＡ担持ナノ粒子を、標的器官において有効なＤＮＡ濃度を得るのに十分な量だけヒトまたは動物の体に投与する工程である。
【００３６】
前記投与は、好適ないずれの手順でおこなってもよい。例えば、前記ＤＮＡ担持ナノ粒子は、経口投与、皮下投与、静脈内投与、または腹膜内投与によって投与してもよく、なかでも静脈内または腹膜内投与が特に好ましい。また、本発明の特定の実施形態においては、上述の投与方法の２種類以上を組み合わせることが可能である。前記ＤＮＡは、前記ナノ粒子によって担持されて前記標的器官へと輸送され、これにより本発明の前記プロセスは、特に、その他の器官にＤＮＡを輸送することなく、前記ＤＮＡの特定の器官へのターゲッティングを達成する。これにより、ＤＮＡ担持ナノ粒子の投与量を低減することができ、また同時に、ヒトまたは動物の体のその他の部位における副作用を防止することができる。
【００３７】
いずれの場合においても、特定の標的器官におけるＤＮＡ濃度は、癌の治療に有効な濃度でなければならない。
【００３８】
特に好ましい実施形態においては、標的器官において上述のような濃度を得るためには、投与単位当たりのＤＮＡ担持ナノ粒子の量を、治療対象であるヒトまたは動物の体重１ｋｇに対し、５ｍｇ〜２０ｍｇの範囲とすべきであることがわかった。標的器官において所望の抗癌効果を得るためには、一日当たり、１〜４投与単位、好ましくは１〜３投与単位を投与すべきである。
【００３９】
本発明においては、好ましくはプラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるＤＮＡを担持させたナノ粒子は、特に標的器官が脳である場合に、有効な癌の治療に使用できる。その他の標的器官としては、肝臓、腎臓、腸、胃、肺および精巣が挙げられる。前記ＤＮＡ担持ナノ粒子の使用後、ナノ粒子に担持させていないＤＮＡを投与した場合と比べて、前記標的器官における有効ＤＮＡ濃度を著しく向上させることができた。特に、前記ＤＮＡ担持ナノ粒子の投与と、抗癌作用を有する医薬品／細胞増殖の抑制に有効な物質を担持させたナノ粒子の投与とを併用した場合には、腫瘍細胞のアポトーシスおよび実質的な腫瘍の退化を引き起こすことができた。
【００４０】
本発明はさらに、ヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するための、ＤＮＡを担持するナノ粒子の使用に関する。このような使用は、ＤＮＡ（１または複数のＤＮＡ）のみを担持するナノ粒子の使用であってもよいし、あるいは、誘導性プロモーターを含むＤＮＡ（１または複数のＤＮＡ）を担持するナノ粒子の使用であってもよい。後者の場合、誘導性プロモーターを含む前記ＤＮＡを、前記ナノ粒子によってヒトまたは動物の体へ投与してもよい。好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡは、１種類のＤＮＡであっても、２種類以上のＤＮＡであってもよく、例えば、１種類または２種類の異なるＤＮＡ担持ナノ粒子が得られるように、同一種類のナノ粒子または異なる種類のナノ粒子に担持された２種類のＤＮＡであってもよい。このような使用の好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡは、癌治療に関連するＤＮＡであり、より好ましくは、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から、好ましくは腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡおよび腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲＢの情報を有するプラスミドＤＮＡおよびＢｃｌ２またはＴｇｆβのような腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。
【００４１】
さらに本発明は、ヒトまたは動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のための、ＤＮＡを担持するナノ粒子の使用に関する。このような使用は、ＤＮＡ（１または複数のＤＮＡ）のみを担持するナノ粒子の使用であってもよいし、あるいは、該ＤＮＡの誘導性プロモーターを含むＤＮＡ（１または複数のＤＮＡ）を担持するナノ粒子の使用であってもよい。後者の場合、誘導性プロモーターを含む前記ＤＮＡを、医薬品の製造に使用してもよい。対象とする標的器官は、脳であることが好ましい。別の実施形態においては、前記標的器官は、脳、肝臓、腎臓、腸、胃、肺および精巣からなる群から選択される１以上の器官であってもよい。好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡは、１種類のＤＮＡであっても、２種類以上のＤＮＡであってもよく、例えば、１種類または２種類の異なるＤＮＡ担持ナノ粒子が得られるように、同一種類のナノ粒子または異なる種類のナノ粒子に担持された２種類のＤＮＡであってもよい。このような使用の好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡは、癌の治療に関連するＤＮＡであり、さらに好ましくは、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から、好ましくは腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡおよび腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲＢの情報を有するプラスミドＤＮＡおよびＢｃｌ２またはＴｇｆβのような腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。ナノ粒子を主成分とするこのような医薬品は、抗癌作用を有する通常の薬剤および化学物質と比べて極めて有利であると思われる。なぜなら、このような医薬品は容易に患者に投与でき、あるいは、今日に至るまで、癌に関して自己投薬の実現を妨げていたリスクを伴うことなく、患者自身が医薬品を摂取することができるからである。しかも、先に指摘したように、このような医薬品は、抗癌作用を有する医薬品、特に、細胞増殖の抑制に有効な作用物質を担持させたナノ粒子と組み合わせて使用することができる。このような組み合わせにより、これ以外の手段では治療し得なかった腫瘍に対し、より有効な治療を提供することができる。
【００４２】
特に、本発明の技術分野においてＤＮＡ担持ナノ粒子を使用することにより、癌の治療に関連するＤＮＡを、任意にその他の癌治療関連医薬品および作用物質と組み合わせて、ヒトまたは動物の体内における特定の器官、具体的には腫瘍ができている器官へとターゲッティングすることができる。特に好ましい実施形態においては、前記腫瘍ができている器官は脳であり、１種類または２種類以上のＤＮＡを、吸着、吸収、または含有によって担持するナノ粒子を投与することにより、前記ＤＮＡの血液脳関門の通過を可能にすることができる。特に、悪性神経膠腫、未分化神経膠星状細胞腫、神経グリア芽細胞腫および、特に、多形性グリア芽細胞腫のような悪性癌腫の標的治療が可能となる。
【００４３】
本発明で使用されるＤＮＡ担持ナノ粒子は、遺伝性疾患の遺伝子治療にも使用可能である。このような遺伝性疾患の例としては、副腎性器症候群（ＡＧＳ）、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ＡＰＣ抵抗型ライデン（APC resistence type leiden）、ハンチントン舞踏病、嚢胞性線維症、第Ｖ因子ライデン変異、ぜい弱Ｘ症候群、ゴーシェ症候群（gaucher syndrome）、ヘモクロマトーシス、ホモシスチン尿症、高コレステロール血症、III型高脂血症、ＩＬＳ（isolated lissencephalitis-sequence）、ネコ鳴き症候群、レッシュナイハン症候群、脳回欠損（lissencephalitis）、ミラー・ディッカー症候群、オスラー病（morbus osler）、ファブリ病（morbus fabry）、嚢胞性線維症（mucoviszidosis）、筋ジストロフィー（musculodystrophia）、フェニルケトン尿症、プロトロンビン変異（prothrombin mutation）、網膜芽細胞腫およびウォーカー・ワールブルグ症候群（walker-warburg syndrome）が挙げられる。
【００４４】
本発明の利点をまとめると、本発明に従って使用されるＤＮＡ担持ナノ粒子は、他の器官に影響を与えることなく、ヒトまたは動物の体内における標的器官へと特異的にターゲッティングされるというその特性により、特異的な癌治療に容易に利用することができる。これにより、細胞増殖の抑制に有効な作用物質の投与量を低減させることができる。これらの利点に加え、そうでなければ有害であり、副作用をもたらす細胞増殖抑止剤の投与量を、著しく低減することができる。
【００４５】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、あくまでも好ましい実施形態に関するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例）
【実施例１】
【００４６】
吸着によるナノ粒子へのＤＮＡの担持は、以下のようにして行うことができた。ブチルシアノアクリレートを通常のナノ粒子の製造方法によって重合させ、重量平均分子量が約１,５４７ｇ/ｍｏｌであり、かつ、安定化剤として、デキストラン７０，０００とジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）とを１.５：１のモル比で含有するポリマー（ポリブチルシアノアクリレート＝ＰＢＣＡ）とすることにより、１０ｍｇの凍結乾燥ＰＢＣＡ−（ＤＥＡＥ−デキストラン）ナノ粒子を調製した。平均粒径が約２００〜３００ｎｍである前記ナノ粒子を、攪拌により、ｐＨが４．５〜５．５であるリン酸緩衝液１ｍｌ中に再懸濁した。２０〜１５０μｇ/ｍｌのＤＮＡ（腫瘍抑制遺伝子p５３の情報を有するプラスミドＤＮＡ）を含むリン酸緩衝液（またはＨ2Ｏ）を前記懸濁液に添加し、攪拌を４〜１６時間継続した。得られた混合液を遠心分離した後、その上清を紫外分光法によって分析した。ＤＮＡ担持ナノ粒子のペレットを回収し、ミリポアフィルターで濾過した水１ｍｌ中に再懸濁した。前記ナノ粒子にコーティングを施すため、前記懸濁液にＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を１０ｍｇ添加した。前記懸濁液を３０分間攪拌した後、遠心分離を行い、非結合のコーティング成分を除去した。得られたペレットを、さらに０.９％ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に再懸濁した。このようにして得た懸濁液は、注射できる状態にあった。
【実施例２】
【００４７】
インビトロでの細胞へのＤＮＡのトランスフェクション用に、ＤＮＡナノ粒子複合体（腫瘍抑制遺伝子p５３の情報を有するプラスミドＤＮＡ）を、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養した細胞に添加した。前記ＤＮＡナノ粒子複合体の添加から５時間後、前記培地を（新たなＤ−ＭＥＭに）取り替え、３７℃で２４時間さらにインキュベートした。化学反応または蛍光発光によって前記細胞を固定化した後、レポーター遺伝子（レポーター＝異種プロモーター（heterologous promotor）の下流における、β−ガラクトシダーゼ、緑色光タンパク質）の発現を可視化した。他の遺伝子の転写については、ノーザンブロット法によって分析した。
【実施例３】
【００４８】
レポーター遺伝子（レポーター＝異種プロモーターの下流における、β−ガラクトシダーゼ、緑色光タンパク質）を担持させたナノ粒子の有効性を、ラットを用いたモデル実験によってさらに分析した。ＣＤフィッシャー系ラットの頭蓋内に、神経膠腫細胞系Ｃ６、Ｆ９８またはＲＧ２の細胞を接種した。これら細胞系のうち、後者の２種はより急速な腫瘍の成長を引き起こす。
【００４９】
複数匹の雄のフィッシャーＣＤラット（生後１５週、２５０ｇ）に、Ｋｅｔａｎｅｓｔ（８０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注入）、次いでＲｏｍｐｕｎ（１２．５ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注入）を用いて麻酔をかけた。次に、ラットの頭部を定位装置に固定し、高速ドリルにより切開した（ブレグマ付近の側頭部右側３〜４ｍｍ、開口部の径１ｍｍ）。ハミルトンの微量注射器（Hamilton micro-syringe）に接続された２６Ｇ針により、無血清培地（３μｌ）中に懸濁した１×１０3の腫瘍細胞を、ラットの脳内深さ４ｍｍに接種した。鉗子を用いて、縫合糸を縫い合わせた。
【００５０】
組織検査において、５ｍｇ/５００μｌのレポーター遺伝子担持ＤＮＡ−ナノ粒子複合体の懸濁液（注入体積５００μｌ）を、前記動物に対して全身的に投与することによって、前記ＤＮＡ担持ナノ粒子の分布を確認した。２４時間後と５日後とに潅流を行った。あらゆる器官の非染色凍結切片（unstained cryostat sliced cuts）を使用し、蛍光顕微鏡を用いて前記切片を観察することによって、蛍光粒子の局在（localization）を確認した。また、正確な局在を、メチレンブルーで染色した対応切片を用いて確認した。レポーター遺伝子の発現は、脳、肝臓、脾臓、腎臓および消化管において見られ、脳腫瘍組織において最も顕著であった。
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月10日(2005.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで行われる細胞へのＤＮＡのトランスフェクションのためのＤＮＡ担持ナノ粒子の使用。
【請求項２】
前記細胞が真核細胞、又は、培養真核細胞である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡ、及び、腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、誘導性プロモーターの制御下でトランスフェクションされる請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ヒトまたは動物の体内の標的器官にＤＮＡを投与するための、ＤＮＡ担持ナノ粒子を含む医薬品。
【請求項６】
抗癌作用を有する医薬品、及び、細胞増殖の抑制に有効な作用物質の少なくとも一方を担持するナノ粒子をさらに含む請求項５に記載の医薬品。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、アクリレート、メタクリレート、アルキルシアノアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アルキレングリコールジアクリレート、アルキレングリコールジメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリルアミド、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−Ｌ−リジンジイルテレフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアクロレイン及びポリグルタルアルデヒドからなる群から選択される１種類または２種類以上のモノマーの重合によって調製される請求項５又は６に記載の医薬品。
【請求項８】
前記モノマーを重合させてナノ粒子とする過程において、安定化剤、又は、ジエチルアミノエチルデキストランを含む安定化剤を使用する請求項５から７のいずれかに記載の医薬品。
【請求項９】
前記ナノ粒子に対し、コーティング、界面活性剤のコーティング、又は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０からなるコーティングを施す請求項５から８のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡ、及び、腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項５から９のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１１】
経口投与、腹膜内投与、静脈内投与のいずれか、又はこれらの併用によって投与することを意図した請求項５から１０のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１２】
前記標的器官におけるＤＮＡ濃度を、癌の治療に有効な濃度又は遺伝性疾患の治療に有効な濃度とする請求項５から１１のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１３】
一投与単位当たりの前記ＤＮＡ担持ナノ粒子の量が、体重に対して５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である請求項５から１２のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１４】
前記投与が、一日当たり１〜４投与単位、又は、一日当たり１〜３投与単位の形態で行われる請求項５から１３のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１５】
ヒト又は動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のための、ＤＮＡを担持するナノ粒子の使用。
【請求項１６】
ヒト又は動物の体内における標的器官の腫瘍に対する医薬品の製造のための、誘導性プロモーターを含むＤＮＡを担持するナノ粒子の使用。
【請求項１７】
前記ＤＮＡが、癌治療に関連するＤＮＡである請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、腫瘍抑制遺伝子の情報を有するプラスミドＤＮＡ、及び、腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される請求項１５から１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記プロモーターが、ヒトパピローマウイルス上流調節領域（ＨＰＶ−ＵＲＲ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、及び、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される請求項１５から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記標的器官が、腫瘍ができている標的器官である請求項１５から１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記標的器官が、脳、肝臓、腎臓、腸、胃、肺、及び/又は精巣である請求項１５から２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記腫瘍が、悪性神経膠腫、未分化神経膠星状細胞腫、神経グリア芽細胞腫及び多形性グリア芽細胞腫からなる群から選択される請求項１５から２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
それ自体は公知である合成手順によってナノ粒子を調製することと、
前記ナノ粒子に、標的器官において有効なＤＮＡ濃度を得るのに十分な量のＤＮＡを担持させることとを含む、ＤＮＡ担持ナノ粒子の調製プロセス。
【請求項２４】
前記ＤＮＡが、誘導性プロモーターを含む請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記ナノ粒子にＤＮＡを担持させる工程が、誘導性プロモーターを含むＤＮＡを前記ナノ粒子に担持させる工程であるか、この工程の前に行われる工程、この工程と同時に行われる工程、またはこの工程の後に行われる工程である請求項２３及び２４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２６】
前記ＤＮＡが、前記ナノ粒子に吸着、吸収、又は含有される請求項２３から２５のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２７】
前記ナノ粒子が、アクリレート、メタクリレート、アルキルシアノアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アルキレングリコールジアクリレート、アルキレングリコールジメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリルアミド、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−Ｌ−リジンジイルテレフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアクロレインおよびポリグルタルアルデヒドからなる群から選択されるモノマーから形成されるナノ粒子である請求項２３から２６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が、安定化剤およびコーティングからなる群から選択される物質を含む請求項２３から２７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子の凝集を防止できる安定化剤、前記ＤＮＡと前記ナノ粒子との結合を強化する安定化剤、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、デキストラン１２．０００、デキストラン７０．０００、ジエチルアミノエチル−（ＤＥＡＥ−）デキストラン、グリセロール及びソルビトールの脂肪酸エステル、ポロキサマー１８８、エトキシ化エーテル、エトキシ化エステル、エトキシ化フェノール及びジフェノール、脂肪酸及び脂肪族アルコール硫酸エステルの金属塩及びナトリウム塩、並びに、前記物質２種類以上の混合物からなる群から選択される安定化剤を含む請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、他のポリソルベート、ポロキサマー、及び、ポリエチレングリコールからなる群から選択される物質でコーティングされている請求項２８に記載のプロセス。
【国際調査報告】
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2006500015.tif 000003
2006500015.tif 000004
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