(57)【要約】本発明は、３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列及びそのようなリポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードするそのような核酸配列の部分、そのような核酸配列又はそのような部分を含む、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞に関する。本発明はまた、そのような配列によってコードされる３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性部分に関する。さらに、本発明は、そのような核酸配列及びその部分、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞を含有するワクチンに関する。そのような核酸配列及びその部分、リポタンパク質又はその免疫原性部分、及びそのようなリポタンパク質又はその免疫原性部分に対する抗体を含有する細胞に関する。また、本発明は、ワクチンにおける及びワクチンの製造のための上記リポタンパク質の使用に関する。さらに、本発明は、診断又はワクチン接種のための上記核酸配列、リポタンパク質又は抗体の使用に関する。最後に、本発明は、そのような核酸、リポタンパク質又はそのようなリポタンパク質に対する抗体を含む診断キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すパラロガスブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質遺伝子の１つの核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、３０ｋＤのブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質をコードする核酸又は上記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする上記核酸配列の部分。
【請求項２】
その配列が、配列番号１に示すパラロガスブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質遺伝子の１つの核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列又はその部分。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸配列を含むＤＮＡフラグメント。
【請求項４】
機能的に連結されたプロモーターの制御下にある、請求項１又は２に記載の核酸配列又は請求項３に記載のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１もしくは２に記載の核酸配列、又は、請求項３に記載のＤＮＡフラグメントもしくは請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体。
【請求項６】
請求項１もしくは２に記載の核酸配列、又は、請求項３に記載のＤＮＡフラグメント、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子もしくは請求項５に記載の生組換え担体を含む宿主細胞。
【請求項７】
配列番号２、３、４又は５に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有する、３０ｋＤのブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質又は上記リポタンパク質の免疫原性フラグメント。
【請求項８】
配列番号２、３、４又は５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同性を有する、請求項７に記載の３０ｋＤのブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質又は上記リポタンパク質の免疫原性フラグメント。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の核酸配列によってコードされることを特徴とする、３０ｋＤのブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項１０】
ワクチンにおける使用のための、請求項７から９に記載の３０ｋＤのブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質又はその免疫原性フラグメント。
【請求項１１】
ブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）感染に対抗するためのワクチンを製造するための、請求項１又は２に記載の核酸配列、請求項３に記載のＤＮＡフラグメント、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６に記載の宿主細胞又は請求項７から９に記載のリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントの使用。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の核酸配列、請求項３に記載のＤＮＡフラグメント、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６に記載の宿主細胞又は請求項７から９に記載のリポタンパク質又はその免疫原性フラグメント、及び医薬適合性の担体を含有することを特徴とする、ブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）感染に対抗するためのワクチン。
【請求項１３】
請求項７から９に記載のリポタンパク質又は上記リポタンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体、及び医薬適合性の担体を含有することを特徴とする、ブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）感染に対抗するためのワクチン。
【請求項１４】
アジュバントを含有することを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１５】
ブタに対して病原性のウイルス又は微生物から誘導される付加的な抗原、そのような抗原に対する抗体又は上記抗原をコードする遺伝情報を含有することを特徴とする、請求項１２から１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
ブタに対して病原性の上記ウイルス又は微生物が、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｅｒａｓｕｉｓ）、グレーサー病（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ病（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、ブタマイコプラズマ肺炎（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びブタ胸膜肺炎（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
請求項１又は２に記載の核酸配列、請求項３に記載のＤＮＡフラグメント、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６に記載の宿主細胞、請求項７から９に記載のリポタンパク質又は請求項７から９に記載のリポタンパク質に対する抗体と、医薬適合性の担体を混合することを含む、請求項１２から１６に記載のワクチンの製造のための方法。
【請求項１８】
適切な検出手段、及び、請求項１もしくは２に記載の核酸配列又はそのプライマー、または請求項７から９に記載のリポタンパク質もしくはその免疫原性フラグメント、または請求項７から９に記載のリポタンパク質と反応性である抗体を含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ赤痢（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）リポタンパク質をコードする核酸配列及びそのようなリポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードするそのような核酸配列の部分、並びにそのような核酸配列又は部分を含む、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞に関する。本発明はまた、そのような配列によってコードされるＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性部分に関する。さらに、本発明は、そのような核酸配列及びその部分、そのような核酸配列又はその部分を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体及び宿主細胞、リポタンパク質又はその免疫原性部分、及びそのようなリポタンパク質又はその免疫原性部分に対する抗体を含有するワクチンに関する。また、本発明は、ワクチンにおける及びワクチンの製造のための上記リポタンパク質の使用に関する。さらに、本発明は、診断又はワクチン接種のための上記核酸配列、リポタンパク質又は抗体の使用に関する。最後に、本発明は、そのような核酸、リポタンパク質又はそのようなリポタンパク質に対する抗体を含む診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅは、強力なβ溶血性の嫌気性、酸素耐性、グラム陰性スピロヘータである。過去には、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅはＴｅｒｐｏｎｅｍａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ及びＳｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅとしても知られた。離乳後のブタの粘血性下痢疾患である、ブタの赤痢の病因菌である。かかる菌によるブタの感染は抗菌剤で抑制されうる。しかし、近年は動物飼料における抗生物質の使用が制限されていることから、抗菌薬の使用の代替策として候補ワクチン抗原の特定が急がれている。
【０００３】
ブタ赤痢（ＳＤ）は離乳後のブタの粘血性下痢疾患である。ブタ赤痢は世界的に重大な経済的影響を及ぼす。症状の重症度は、個体間及び群間で様々である。感染の最初の徴候は、黄色から灰色の軟便、食欲不振及び一部の動物では直腸温度の上昇を含む。これに続いて、便は血液の斑点及び粘液栓を含み始める。疾患が進行すると共に、水様便となり、長期的な下痢は脱水による死亡に至ることもある。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含む便は、罹病性のブタによって経口摂取され、その後該生物は胃の酸性条件を生き延びて通過し、大腸に達する。実験での証拠は、該生物が粘液に対する走化性応答を有しており、そのことが該生物を結腸粘膜へと進行させることを可能にし、そこで結腸陰窩を浸潤する。大腸は、ブタにおいては水及び電解質吸収のための重要な部位である。大腸への損傷は、それ故、結腸吸収不全及び脱水を生じさせる。
【０００４】
ブタ赤痢の診断は、臨床徴候、群れの履歴及び選択培地でのＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの単離に基づく。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅは、その緩慢な増殖と嫌気性必要条件のために、しばしば単離が困難である。そして、問題なのは、劣悪な保存と試料の輸送によって悪化することである。単離が可能なときでも、単離物の生化学試験は、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅと非病原性腸内スピロヘータＢ．ｉｎｎｏｃｅｎｓを識別することができない。ブタ又は適切な動物モデル（マウス、モルモット及びニワトリなど）における腸内病原体試験のコストと時間がかかる性質は、定期的診断のためのかかるアプローチをあらかじめ排除してしまう。
【０００５】
Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのいくつかの病原性因子が特定されており、ブタの下痢の病因におけるそれらの役割が検討されてきた。例えば、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによる結腸の初期コロニー形成は粘液に対するその走化性応答によって促進される。（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ．Ｋ．Ｒｏｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｇ．Ｕｌｒｉｃｈ及びＲ．Ｊ．Ｙａｎｃｅｙ．１９８８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：１５６５−１５７６）。（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．とＲ．Ｊ．Ｙａｎｃｅｙ．１９９６，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：２１−３０）。
【０００６】
走化性の重要性は、マウスモデルにおいて二重鞭毛突然変異体が著しく弱毒化されることを示した、Ｒｏｓｅｙ（Ｒｏｓｅｙ，Ｅ．Ｌ．，Ｍ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＲ．Ｊ．Ｙａｎｃｅｙ，Ｊｒ．１９９６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４１５４−４１６２）によって明らかにされた。ひとたびブタ盲腸のコロニー形成が確立されると、ＮＡＤＨオキシダーゼが酸素毒性からＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａを保護すると思われる。（Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．とＮ．Ｓ．Ｊｅｎｓｅｎ．１９９３，Ｊ．Ｂａｃｅｔｒｉｏｌ．１７５：２９８０−２９８７）。（Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．とＲ．Ｓｅｌｌｗｏｏｄ．１９９９，Ａｎａｅｒｏｂｅ  ５：５３９−５４６）。この仮説は、ＮＡＤＨオキシダーゼ突然変異体がブタ盲腸のコロニー形成低下を示すという所見によって裏付けられる。慢性感染ブタの病理学的検査で明らかな盲腸病変は、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの溶血素含有抽出物の投与によって誘発することができる。最初に、３つの異なる推定上の溶血素遺伝子、ｔｌｙＡ、ｔｌｙＢ及びｔｌｙＣがクローン化され、配列決定された。（Ｍｕｉｒ，Ｓ．，Ｍ．Ｂ．Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｌｉｂｂｙ，Ｌ．Ａ．Ｊｏｅｎｓ，Ｆ．Ｈｅｆｆｒｏｎ及びＪ．Ｇ．Ｋｕｓｔｅｒｓ．１９９２、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：５２９−５３５）。（ｔｅｒ  Ｈｕｕｒｎｅ，Ａ．Ａ．，Ｓ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．ｖａｎ  Ｈｏｕｔｅｎ，Ｂ．Ａ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｉｊｓｔ，Ｗ．Ｇａａｓｔｒａ及びＪ．Ｇ．Ｋｕｓｔｅｒｓ．１９９４，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１６：２６９−２８２）。Ｈｓｕらによる最近の報告は、ｔｌｙ遺伝子が実際に溶血素をコードするのかどうかに関して疑いを投げかけ、もう１つ別の遺伝子ｈｌｙＡを溶血素産生に関係付けた。（Ｈｓｕ，Ｔ．，Ｄ．Ｌ．Ｈｕｔｔｏ，Ｆ．Ｃ．Ｍｉｎｉｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｚｕｅｒｎｅｒ及びＭ．Ｊ．Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ．２００１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７０６−７１１）。
【０００７】
防御免疫応答を惹起する抗原の検索において、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの外膜に局在するいくつかのタンパク質が特定された。プロテイナーゼＫ感受性１６ｋＤａ抗原は外膜に局在した。その後、この抗原をコードする遺伝子、ｓｍｐＡがクローン化され、インビボでは発現されないことが認められた（Ｔｈｏｍａｓ，Ｗ．，Ｒ．Ｓｅｌｌｗｏｏｄ及びＲ．Ｊ．Ｌｙｓｏｎｓ．１９９２，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３１１１−３１１６）。（Ｓｅｌｌｗｏｏｄ，Ｒ．，Ｆ．Ｗａｌｔｏｎ，Ｗ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｒ．Ｂｕｒｒｏｗｓ及びＪ．Ｃｈｅｓｈａｍ．１９９５．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２５−３５）。細胞質外の３９ｋＤａ抗原、Ｖｓｐ３９は、表面ヨウ素化によってＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの主要表面成分として特定された（Ｇａｂｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｒ．Ｅ．Ｃｈａｎｇ，Ｒ．Ｊ．Ｓｌｏｍｉａｎｙ，Ｗ．Ｈ．Ａｎｄｒｅｗｓ及びＭ．Ｔ．Ｍｃｃａｍａｎ．１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１４２−１４８）。Ｖｓｐ３９をコードする遺伝子はクローン化されていないが、８３から９０％の同一性を有する３９ｋＤａタンパク質をコードする一連の関連縦列パラロガス遺伝子が特定された（Ｇａｂｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｅ．Ｄｒａｇｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｃｈａｎｇ及びＭ．Ｔ．ＭｃＣａｍａｎ．１９９８、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｏｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｂ２０４）ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ３９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４４４−４４８）．（ＭｃＣａｍａｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｋ．Ａｕｅｒ，Ｗ．Ｆｏｌｅｙ及びＪ．Ｄ．Ｇａｂｅ．１９９９，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：２７３−２８３）。推定上の３０ｋＤａリポタンパク質、ＢｍｐＢは、回復期ブタ血清と反応することが認められた。しかしながら、このタンパク質についてのさらなるデータは公表されていない（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｔ．Ｌａ，Ａ．Ｓ．Ｍｉｋｏｓｚａ及びＤ．Ｊ．Ｈａｍｐｓｏｎ．２０００、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６：２４５−２５７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それ故、新しい有効なワクチン、特に広範な防御を提供するワクチンが求められていることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対抗するための新規ワクチンを提供することが本発明の１つの目的である。
【００１０】
驚くべきことに、新規表面発現細菌リポタンパク質をコードすると思われる、４個の遺伝子を含む新しい遺伝子座が発見された。これらのリポタンパク質は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対抗するためのワクチン中の適切なワクチン成分であることが判明している。今や、その遺伝子座全体がクローン化され、配列決定されており、その配列を配列番号１に示す。４個のパラロガス遺伝子、ｂｌｐＧ、Ｆ、Ｅ及びＡをコードするという事実に鑑みて、該遺伝子座をｂｌｐＧＦＥＡ−遺伝子座と命名した。該遺伝子座の構造を図１に示す。最初のＯＲＦ、ｂｌｐＧは、３０．３ｋＤの分子量を有する２６５アミノ酸のリポタンパク質をコードする。２番目のＯＲＦ、ｂｌｐＦは、３０．８ｋＤの分子量を有する２６２アミノ酸のリポタンパク質をコードする。ＯＲＦ、ｂｌｐＥも、２６２アミノ酸の、但し３０．４ｋＤの分子量を有するリポタンパク質をコードする。最後に、ＯＲＦ、ｂｌｐＡは、２９．９ｋＤの分子量を有する２７２アミノ酸のリポタンパク質をコードする。遺伝子間領域は、それぞれ３１、２０及び７８ｂｐである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
遺伝子が重複事象後に分岐した場合、それらの遺伝子はパラロガスであると称される。その最初の引用はＷａｌｔｅｒ  Ｆｉｔｃｈ（１９７０、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  １９：９９−１１３）：「相同性が、生物の歴史において両方のコピーがそろって子孫へと伝えられるような遺伝子重複の結果である場合（例えばαヘモグロビンとβヘモグロビン）、それらの遺伝子はパラロガス（パラ＝平行）と呼ばれるべきである。相同性が、遺伝子の歴史が種の歴史を反映するような種分化の結果である場合（例えばヒトとマウスにおけるαヘモグロビン）、それらの遺伝子はオーソロガス（オーソ＝正確）と呼ばれるべきである。」これは、Ｌｉ  ＆  Ｇｒａｕｒ  １９９１、Ｅｄ．Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡによる「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」の本においても詳しく説明されている。
【００１２】
多くの異なる核酸配列が全く同一のタンパク質をコードしうることは当技術分野において周知である。この現象は一般に、１個のアミノ酸をコードする各々のトリプレットの２番目と３番目の塩基、特に３番目の塩基におけるゆらぎとして知られる。この現象は、まだ同じタンパク質をコードする２個の核酸配列に関して約３０％の非相同性をもたらしうる。それ故、約７０％の配列相同性を有する２個の核酸配列は、まだ全く同一のタンパク質をコードすることがありうる。
【００１３】
そこで、１つの実施態様は、配列番号１に示すパラロガスＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の１つの核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸又は上記リポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする上記核酸配列の部分に関する。
【００１４】
３０ｋＤの分子量は、ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動において決定される。当技術分野においてしばしば遭遇する分子量測定のわずかな変動性のために、該分子量は２５−３５ｋＤの間で変動しうる。それ故、本発明のリポタンパク質の分子量は３０ｋＤ＋／−５ｋＤと解釈されるべきである。
【００１５】
好ましくは、この３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸又はそのリポタンパク質の免疫原性フラグメントをコードするその核酸配列の部分は、配列番号１に示すパラロガスＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子の１つの核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００１６】
９８％、９９％又はさらに１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。配列番号１に示す配列に相補的なヌクレオチド配列又は本発明の配列の縦列を含むヌクレオチド配列も本発明の範囲内である。
【００１７】
ヌクレオチド相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．に認められるサブプログラム：「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによりコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」で決定することができる。
【００１８】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するパラメータは、次のデフォルトパラメータである：
対合についてのリウォード：＋１。不適正対合についてのペナルティー：−２。オープンギャップ：５。伸長ギャップ：２。ギャップ×＿ドロップオフ：５０。
【００１９】
また、本発明のこの実施態様の１つの形態は、配列番号２、３、４又は５に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９８％又はさらに１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はそのタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする核酸配列に関する。
【００２０】
本発明は新規３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質をコードする核酸配列を開示するので、今回初めて該タンパク質を十分な量で入手することが可能となる。これは、例えば、該タンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードするパラロガス遺伝子の全体又は部分を発現する発現系を使用することによって実施できる。
【００２１】
それ故、この実施態様のより好ましい形態では、本発明は、本発明の核酸配列を含むＤＮＡフラグメントに関する。ＤＮＡフラグメントとは、本発明の核酸配列のための担体として機能する所与の長さのヌクレオチドである。そのようなＤＮＡフラグメントは、例えば、本発明の核酸配列をその中にクローン化することができるプラスミドでありうる。そのようなＤＮＡフラグメントは、例えば、下記に述べるようにプライマーとして使用するため及び本発明の核酸配列の発現のためにＤＮＡの量を増加させるのに有用である。
【００２２】
核酸配列の発現のために不可欠な必要条件は、その核酸配列に機能的に連結された適切なプロモーターであり、該核酸配列は該プロモーターの制御下にある。プロモーターの選択が、タンパク質発現のために宿主細胞として使用する細胞において遺伝子転写を指令することができる真核生物、原核生物又はウイルスプロモーターに及ぶことは、当業者には明白である。
【００２３】
それ故、この実施態様のさらに一層好ましい形態は、本発明のＤＮＡフラグメント及び／又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関し、その場合、本発明の核酸配列は機能的に連結されたプロモーターの制御下に置かれる。これは、例えば標準分子生物学手法によって入手できる。（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）。
【００２４】
機能的に連結されたプロモーターとは、それらが連結されている核酸配列の転写を制御することができるプロモーターである。そのようなプロモーターは、そのプロモーターが発現のために使用する細胞において機能性であることを条件として、該新規遺伝子の天然プロモーター又はＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａのもう１つ別のプロモーターでありうる。そのようなプロモーターはまた、異種プロモーターでありうる。宿主細胞が細菌であるとき、使用しうる有用な発現制御配列は、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｃｕｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．とＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１、７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら、Ｎｃｕｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））プロモーター及びオペレーター、終結配列、及び選択宿主細胞と適合性の他の発現促進及び制御配列を含む。
【００２５】
宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現制御配列は、例えば、α接合因子を含む。昆虫細胞については、ポリヘドリン又はバキュロウイルスのｐ１０プロモーターが使用できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が脊椎動物由来であるとき、例示的な有用発現制御配列は、（ヒト）サイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら、ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ，Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ら、ＰＮＡＳ  ７９，６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎら、前出；Ｕｌｍｅｒら、前出）、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５０，７２５−７３２，１９８４）、ＳＶ４０最初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３、１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーター及びβアクチンプロモーター（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）を含む。調節配列はまた、ターミネーター及びポリアデニル化配列を含みうる。使用できる配列の中で特に周知であるのは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーター及びポリアデニル化配列である。
【００２６】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び脊椎動物細胞発現系は非常に頻繁に使用される系である。そのような系は当技術分野において周知であり、一般的に入手可能であって、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡが市販している。これらの発現系に次いで、寄生生物に基づく発現系は魅力的な発現系である。そのような系は、例えばフランス特許出願公開番号第２  ７１４  ０７４号及び米国ＮＴＩＳ公開番号第ＵＳ０８／０４３１０９号（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．とＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）に述べられている。
【００２７】
本発明のこの実施態様のさらに一層好ましい形態は、本発明の３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、本発明のＤＮＡフラグメント又は本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体（Ｌｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ（ＬＲＣ））に関する。これらのＬＲＣは、付加的な遺伝情報、この場合は本発明の３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列がその中にクローン化されている微生物又はウイルスである。そのようなＬＲＣに感染したブタは、該担体の免疫原に対してだけでなく、その遺伝暗号が該ＬＲＣに付加的にクローン化されているタンパク質の免疫原性部分、例えば本発明の３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質遺伝子に対しても免疫応答を生じる。
【００２８】
細菌ＬＲＣの一例として、当技術分野において既知の弱毒化サルモネラ菌株は非常に魅力的に使用できる。
【００２９】
また、生組換え担体寄生生物は、とりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））によって記述されている。
【００３０】
さらに、ＬＲＣウイルスは、核酸配列を標的細胞に輸送する方法として使用しうる。生組換え担体ウイルスはベクターウイルスとも呼ばれる。しばしばベクターとして使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２）、ヘルペスウイルス（欧州特許出願第０４７３２１０Ａ２号）及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら、Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．及びＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．編集、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ−１９８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐ．９２−９９（１９８９））である。
【００３１】
当技術分野において周知のインビボでの相同的組換えの手法は、宿主動物において本発明の挿入核酸配列の発現を誘導することができる、選択した細菌、寄生生物又はウイルスのゲノム内に組換え核酸配列を導入するために使用できる。
【００３２】
最後に本発明のこの実施態様のもう１つの形態は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むＤＮＡフラグメント又は機能的に連結されたプロモーターの制御下にあるそのような核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態はまた、本発明の３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸分子を含む生組換え担体を含む宿主細胞に関する。
【００３３】
宿主細胞は、細菌由来、例えば、ｐＢＲ３２２などの細菌ベースのプラスミド又はｐＧＥＸなどの細菌発現ベクター又はバクテリオファージと組み合わせた、大腸菌、枯草菌及び乳酸杆菌属種由来の細胞でありうる。宿主細胞はまた、真核生物由来、例えば、酵母特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、又はベクター又は組換えバキュロウイルスと組み合わせた昆虫細胞のような高等真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））、例えば、Ｔｉ−プラスミドに基づくベクター又は植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））、同様に適切なベクター又は組換えウイルスを伴う、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣｒａｎｄｅｌｌネコ腎細胞のような哺乳類細胞由来でありうる。
【００３４】
本発明のもう１つの実施態様は、本発明の新規３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。
【００３５】
免疫原性フラグメントの概念は下記で定義する。
【００３６】
この実施態様の１つの形態は、とりわけ、配列番号２、３、４又は５に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同であるアミノ酸配列を有する、３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。
【００３７】
１つの好ましい形態では、該実施態様は、配列番号２、３、４又は５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、そのようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａリポタンパク質及びその免疫原性フラグメントに関する。
【００３８】
９８％、９９％又はさらに１００％の相同性レベルはさらに一層好ましい。
【００３９】
この実施態様のもう１つの形態は、本発明の核酸配列によってコードされる３０ｋＤのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質及び上記タンパク質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４０】
タンパク質相同性のレベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．に認められるサブプログラム：「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによりコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」で決定することができる。
【００４１】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６２」。使用するパラメータは、次のデフォルトパラメータである：
オープンギャップ：１１。伸長ギャップ：１。ギャップ×＿ドロップオフ：５０。
【００４２】
ここに包含される特定タンパク質に関して、個々のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ菌株の間で変異が存在しうることは明白である。これらの変異は、全体配列におけるアミノ酸の相違によって又は上記配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によって明らかにされうる。基本的に生物学的及び免疫学的活性を変化させないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」より、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）によって記述されている。関連アミノ酸の間でのアミノ酸置換又は進化においてしばしば起こった置換は、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８、第５巻、補遺３参照）。他のアミノ酸置換は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕを含む。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは迅速で感受性のあるタンパク質比較のための方法を開発し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）、相同なタンパク質の間の機能的類似性を判定した。本発明の例示的実施態様のそのようなアミノ酸置換ならびに欠失及び／又は挿入を有する変異は、生じるタンパク質がそれらの免疫反応性を保持している限り、本発明の範囲内である。これは、なぜ本発明のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａリポタンパク質が、種々のフィールド（ｆｉｅｌｄ）単離物から単離したとき、まだ同じ免疫学的性質を有する同じタンパク質でありながら、約７０％の相同性レベルを有しうるかを説明する。
【００４３】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによる感染に対して又は少なくとも該感染の臨床症状に対して免疫応答を誘導することができるタンパク質をいまだ提供する、本発明のある種のタンパク質のアミノ酸配列における変異は、「基本的に免疫原性に影響を及ぼさない」とされる。
【００４４】
タンパク質を、例えばワクチン接種のため又は抗体を惹起するために使用するとき、必ずしも全タンパク質を使用する必要はない。それ自体で又は例えばＫＬＨなどの担体に結合して、そのタンパク質に対する免疫応答を誘導することができるそのタンパク質のフラグメント、いわゆる免疫原性フラグメントを使用することも可能である。「免疫原性フラグメント」は、脊椎動物宿主において免疫応答を誘導する能力を依然として保持する完全長タンパク質のフラグメントであって、例えば、Ｂ又はＴ細胞エピトープを含むものと理解される。簡単に述べると、免疫原性フラグメントは、本発明の３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質に対する抗原応答を誘導することができるフラグメントである。この時点で、抗原性フラグメント（抗原決定基）をコードするＤＮＡフラグメントを容易に特定するために様々な手法が使用できる。Ｇｅｙｓｅｎら（国際公開広報第ＷＯ８４／０３５６４号、国際公開広報第ＷＯ８６／０６４８７号、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７）によって述べられた方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、タンパク質の免疫学的に重要な領域である、エピトープの検出のための実施しやすく、迅速で、十分に確立された方法である。該方法は世界中で使用されており、それ自体当業者には周知である。この（経験的）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適する。また、タンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられれば、コンピュータアルゴリズムは、現在既知であるエピトープとそれらの配列及び／又は構造的一致に基づき、特定タンパク質フラグメントを免疫学的に重要なエピトープとして指定することができる。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））に従った親水性判定基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５４，１０１号）に従った二次構造局面の組合せに基づく。Ｔ細胞エピトープは、同様に、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性判定基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許出願ＮＴＩＳ第ＵＳ０７／００５，８８５号）を用いてコンピュータによって配列から予測することができる。簡潔な概要は：共通原理に関してはＳｈａｎ  Ｌｕ；Ｔｉｂｔｅｃｈ  ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄら；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、総説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：３−７（１９９２）、ＨＩＶエピトープについてはＢｅｒｚｏｆｓｋｙ；Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：２４１２−２４１８（１９９１）に認められる。免疫原性フラグメントは通常、最小長８アミノ酸、好ましくは９、１０、１２、１５又はさらに２０アミノ酸などの、８アミノ酸以上を有する。そのようなフラグメントをコードする核酸配列は、それ故、少なくとも２４核酸であるが、好ましくは２７、３０、���６、４５又はさらに６０核酸の長さを有する。
【００４５】
それ故、本発明のさらにもう１つの実施態様の１つの形態は、医薬適合性の担体と共に、上述したような本発明の３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はその免疫原性フラグメントを含有する、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対抗するためのワクチンに関する。
【００４６】
本発明のさらにもう１つの実施態様は、ワクチンにおいて使用するための本発明の３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はその免疫原性フラグメントに関する。
【００４７】
本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対抗するためのワクチンの製造のための、本発明の核酸配列、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体、宿主細胞、あるいはリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントの使用に関する。
【００４８】
本発明のワクチンを製造する１つの方法は、該細菌を増殖させること、及び次に該細菌から、３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントを生化学的に精製することによる。これは、しかしながら、非常に時間のかかるワクチン製造方法である。
【００４９】
それ故、ワクチンにおいて３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードするパラロガス遺伝子の１つの発現産物を使用することははるかに簡便である。本発明において３０ｋＤリポタンパク質をコードするパラロガス遺伝子の核酸配列が提供されるので、今回初めてこれが可能となる。
【００５０】
これらの遺伝子の発現産物に基づくワクチンは、本発明のタンパク質又は本発明のその免疫原性フラグメントを、下記に述べるような医薬適合性の担体と混合することによって容易に作製できる。
【００５１】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメントを発現することができる、上述したような生組換え担体を含有しうる。例えばサルモネラ菌担体又はウイルス担体、例えば、ヘルペスウイルスベクターに基づくそのようなワクチンは、サブユニットワクチンに比べてＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの自然の感染方法をより良好に模倣するという利点を有する。さらに、免疫のためにはごく定量の組換え担体しか必要としないので、それらの自己増殖は好都合である。
【００５２】
ワクチンはまた、本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメントを含む、上述したような宿主細胞に基づきうる。
【００５３】
上述したすべてのワクチンが能動ワクチン接種に寄与する、すなわち宿主の防御システムの引き金となる。
【００５４】
あるいは、例えば、ウサギにおいて抗体を惹起することができ、又は下記に述べるような抗体産生細胞系統から抗体を得ることができる。その後そのような抗体をブタに投与することができる。このワクチン接種法、受動ワクチン接種は、動物が既に感染していて、自然免疫応答を始動させる時間がないときの選択ワクチン接種法である。また、突然の高い感染圧に罹患しやすい動物にワクチン接種するための好ましい方法でもある。投与された本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメントに対する抗体は、これらの場合、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに直接結合することができる。これは、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの増殖を低下させる又は停止させるという利点を有する。
【００５５】
それ故、本発明の他の１つの実施態様は、本発明のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はそのタンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体、及び医薬適合性の担体を含有する、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対抗するためのワクチンに関する。
【００５６】
本発明のさらにもう１つの実施態様は、本発明のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質又はそのタンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体に関する。
【００５７】
本発明の抗体の大量生産のための方法も当技術分野において既知である。そのような方法は、ファージディスプレイのための糸状ファージにおける、本発明のタンパク質をコードする遺伝情報（のフラグメント）のクローニングに基づく。そのような手法は、とりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．の「糸状ファージディスプレイ」の下に「抗体構築ページ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ）」において、及びＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５、及びＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５による総説論文において述べられている。該ファージはその後、ｃａｍｅｌｉｄ重鎖抗体を発現するｃａｍｅｌｉｄ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用される。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．とＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）及びＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望抗体を発現するライブラリーからの細胞を増幅させ、その後、抗体の大量発現のために使用することができる。
【００５８】
さらにもう１つの実施態様は、本発明の抗体と医薬適合性の担体を混合することを含む、本発明のワクチンの製造のための方法に関する。
【００５９】
ワクチンの効率的な代替方法は、適切な抗原をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種である。タンパク質をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種は、多くの異なるタンパク質に関して成功を収めてきた。（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３））の中で総説されている）。このワクチン接種方法はまた、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染に対してブタをワクチン接種するために魅力的である。それ故、本発明の実施態様のさらなる他の形態は、本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むＤＮＡフラグメント、又は本発明の組換えＤＮＡ分子、及び医薬適合性の担体を含有するワクチンに関する。
【００６０】
本発明のＤＮＡワクチンにおける使用に適するＤＮＡプラスミドの例は、細菌、真核生物及び酵母宿主細胞のための従来のクローニング又は発現プラスミドであり、上記プラスミドの多くは市販されている。そのようなプラスミドの周知の例は、ｐＢＲ３２２及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本発明のＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は、ヌクレオチド配列のタンパク質発現を誘導することができなければ成らない。該ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は、本発明の１又はそれ以上のヌクレオチド配列を含みうる。加えて、該ＤＮＡフラグメント又は組換えＤＮＡ分子は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどの他のヌクレオチド配列、又は他の抗原性タンパク質又はアジュバント性サイトカインをコードするヌクレオチド配列を含みうる。
【００６１】
本発明のワクチンにおいて使用される、好ましくは転写調節配列に作動可能に連結された、本発明のヌクレオチド配列又は本発明のヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドは、裸であるか又は送達システム内にパッケージングされうる。適切な送達システムは、すべて当技術分野において周知の、脂質小胞、ｉｓｃｏｍ、デンドロマー、ニオソーム、多糖類基質等（さらなる詳細は下記参照）である。また、上述したような、サルモネラ菌種などの弱毒化生菌及びヘルペスウイルスベクターなどの弱毒化生ウイルスも、送達系として非常に適する。
【００６２】
実施態様のさらなる他の形態は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するワクチンに関する。
【００６３】
ＤＮＡワクチンは、例えば針なし注射器を用いることなどによる皮内適用を通して容易に投与することができる。この投与方法は、ワクチン接種する動物の細胞内に直接ＤＮＡを送達する。１０ｐｇから１０００μｇの範囲内のＤＮＡの量は、良好な成績を提供する。好ましくは、１μｇから１００μｇのマイクログラム範囲内の量を使用する。
【００６４】
さらなる実施態様では、本発明のワクチンは、ブタ病原体及びウイルスから誘導される１又はそれ以上の抗原、それらの抗原に対する抗体又はそのような抗原をコードする遺伝情報を付加的に含有する。
【００６５】
言うまでもなく、そのような抗原は、例えば他のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ抗原でありうる。また、もう１つ別のブタ病原性生物又はウイルスから選択される抗原でありうる。そのような生物及びウイルスは、好ましくは仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｅｒａｓｕｉｓ）、グレーサー病（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ症（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、ブタマイコプラズマ肺炎（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びブタ胸膜肺炎（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の群から選択される。
【００６６】
３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質に基づくワクチンはまた、マーカーワクチンとしても非常に適する。マーカーワクチンは、例えば、野生型感染によって誘導される抗体パネルとは異なる、特徴的な抗体パネルワクチンに基づいて、接種したブタとフィールド感染ブタを識別することを可能にするワクチンである。例えば、野生型細菌上に存在する免疫原性タンパク質がワクチン中に存在しないときは、異なる抗体パネルが誘導される：そのため、宿主はワクチン接種後そのタンパク質に対する抗体を産生しない。それ故、本発明の３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質に基づくワクチンは、３０ｋＤリポタンパク質に対する抗体だけを誘導し、一方生野生型、生弱毒化又は不活化全Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに基づくワクチンは、細菌タンパク質の全部又は大部分に対する抗体を誘導する。
【００６７】
例えば精製組換え核タンパク質を含むウエル及び精製３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質だけを含むウエルを有する簡単なＥＬＩＳＡ試験は、ブタからの血清を試験し、そのブタが３０ｋＤリポタンパク質ワクチンを接種されているのか又はＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａのフィールド感染に罹患しているのかを明らかにするのに十分である。
【００６８】
本発明のすべてのワクチンは、医薬適合性の担体を含有する。医薬適合性の担体は、例えば滅菌水又は滅菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態では、該担体は、例えば緩衝液でありうる。
【００６９】
ワクチンを製造するための方法は、本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメント、及び／又はそのタンパク質又はその免疫原性フラグメントに対する抗体、及び／又は本発明の核酸配列及び／又はＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体又は宿主細胞と、医薬適合性の担体を混合することを含む。
【００７０】
本発明のワクチンはまた、好ましい形態では、免疫刺激性物質、いわゆるアジュバントを含有しうる。一般にアジュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を促進させる物質を含む。いくつもの異なるアジュバントが当技術分野において既知である。ブタワクチンにおいて頻繁に使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖類、いくつかのグルカン及びグリカン、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）である。
【００７１】
該ワクチンはまた、いわゆる「賦形剤」も含有しうる。賦形剤はタンパク質が、共有結合することなく接着している化合物である。そのような賦形剤は、とりわけ、すべて当技術分野において周知の、バイオマイクロカプセル、マイクロアルギネート、リポソーム及びマクロソル（ｍａｃｒｏｓｏｌ）である。
【００７２】
抗原が部分的に賦形剤中に包埋されている、そのような賦形剤の特殊な形態がいわゆるＩＳＣＯＭである（欧州特許第１０９．９４２号、欧州特許第１８０．５６４号、欧州特許第２４２．３８０号）。
【００７３】
加えて、該ワクチンは、１又はそれ以上の適切な表面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを含有しうる。
【００７４】
該ワクチンは、例えば、分解しやすいタンパク質を分解から保護するため、ワクチンの貯蔵寿命を高めるため、又は凍結乾燥効率を改善するために、しばしば安定剤と混合される。有用な安定剤は、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン又はカゼイン又はそれらの分解産物などのタンパク質、及びアルカリ金属リン酸塩などの緩衝剤である。加えて、該ワクチンは、生理的に許容される希釈剤に懸濁しうる。
【００７５】
免疫増強、賦形剤化合物又は希釈剤の添加、タンパク質の乳化又は安定化の他の方法も、本発明において具体化されることは言うまでもない。
【００７６】
本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメントに基づく本発明のワクチンは、動物当りタンパク質１μｇから１００μｇの範囲の量で非常に適切に投与されるが、より低用量も原則的に使用できる。１００μｇを越える用量は、免疫学的には非常に適切であるが、商業的理由からあまり魅力的ではない。
【００７７】
上述したＬＲＣウイルス及び細菌などの生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、感染の間に自ら増殖するので、はるかに低い用量で投与することができる。それ故、非常に適切な量は、細菌及びウイルスについてそれぞれ１０３及び１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの範囲である。
【００７８】
本発明のワクチンは、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内で、又は経口又は経鼻などの粘膜表面で投与することができる。
【００７９】
疾患に対する効率的な防御のためには、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ感染の迅速で正確な診断が重要である。
【００８０】
それ故、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ感染の検出に適した診断ツールを提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００８１】
本発明の核酸配列、タンパク質及び抗体はまた、診断における使用にも適する。
【００８２】
それ故、本発明のもう１つの実施態様は、診断における使用のための本発明の核酸配列、タンパク質及び抗体に関する。
【００８３】
本発明の核酸配列又はそのフラグメントは、ブタにおいてＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａの存在を検出するために使用できる。Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａに感染したブタから採取した試料は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む、上記細菌由来の核酸物質を含有する。これらの核酸配列は本発明の核酸配列とハイブリダイズする。本発明の核酸配列と反応性である核酸配列を検出するための適切な方法は、ＰＣＲ手法及びＮＡＳＢＡ手法を含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーション手法を包含する。そこで、本発明の核酸配列、特に配列番号１に示す配列は、ＰＣＲ及び／又はＮＡＳＢＡ手法における使用のためのプローブ及びプライマーを作製するために使用できる。
【００８４】
Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの検出のための診断キットは、例えば、試験するブタから単離した細菌核酸とこれらのツールとの反応を可能にするツールを含みうる。そのようなツールは、例えば、本発明の核酸配列に基づく、プライマーフラグメントとも称される、特異的プローブ又は（ＰＣＲ）プライマーである。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの遺伝物質が動物中に存在する場合、これは、例えば特異的ＰＣＲプライマーに特異的に結合し、例えば、ｃＤＮＡ合成後に、ＰＣＲ反応において増幅される。ＰＣＲ反応産物は、その後、ＤＮＡゲル電気泳動において容易に検出することができる。
【００８５】
標準的なＰＣＲ教本は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＤＮＡに関する選択的ＰＣＲ反応のためのプライマーの長さを決定する方法を教示している。少なくとも１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプライマーフラグメントがしばしば使用されるが、１５以上、より好ましくは１８ヌクレオチドのプライマーは幾分より選択的である。特に少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有するプライマーは非常に一般的に適用しうる。ＰＣＲ手法は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５（１９９５）において広汎に述べられている。
【００８６】
核酸配列又はその部分が、配列番号１に示す核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する、本発明の核酸配列又は少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８、さらに一層好ましくは２０、２２、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド（この順序でより一層好ましい）の長さを有するそれらの核酸配列のプライマーも、それ故、本発明の一部である。プライマーは、少なくとも１２ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１に示す核酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はさらに１００％（この順序でより一層好ましい）の相同性を有すると理解される。そのような核酸配列は、それらがコードするＤＮＡの量を高めるためにＰＣＲ反応において又はハイブリダイゼーション反応において、プライマーフラグメントとして使用することができる。これは、例えば、上記に示すようなＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの検出のための診断ツールとして使用するための特定ヌクレオチド配列の迅速な増幅又はブロットでの検出を可能にする。
【００８７】
遺伝物質に関するもう１つの試験は、例えば、綿棒から得た細菌材料の増殖、それに続く古典的ＤＮＡ精製、次いで放射性又は色標識プライマーフラグメントとの古典的ハイブリダイゼーションに基づく。色標識及び放射性標識フラグメントは一般に検出手段と呼ばれる。ＰＣＲ反応及びハイブリダイゼーション反応の両方が当技術分野において周知であり、とりわけ、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）に述べられている。
【００８８】
そこで、本発明の１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ核酸配列の検出のための診断試験キットに関する。そのような試験は、本発明の核酸配列又はそのプライマーフラグメントを含む。
【００８９】
特異的Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ３０ｋＤリポタンパク質の抗原物質の検出に基づく、それ故Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染の検出に適する診断試験キットは、とりわけ、標準ＥＬＩＳＡ試験を含みうる。そのような試験の一例では、ＥＬＩＳＡプレートのウエルの壁が該３０ｋＤリポタンパク質に対する抗体で被覆されている。試験する物質と共にインキュベートした後、標識抗Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ抗体をそれらの穴に加える。その後、呈色反応がＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからの抗原物質の存在を明らかにする。
【００９０】
それ故、本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの抗原物質の検出のための診断試験キットに関する。そのような試験キットは、本発明の３０ｋＤリポタンパク質又はそのフラグメントに対する抗体を含む。
【００９１】
血清中の、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの３０ｋＤリポタンパク質に対する抗体の検出に基づく、それ故Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染の検出に適する診断試験キットは、とりわけ、標準ＥＬＩＳＡ試験を含みうる。そのような試験においては、ＥＬＩＳＡプレートのウエルの壁を、例えば該３０ｋＤリポタンパク質で被覆することができる。試験する物質と共にインキュベートした後、標識抗３０ｋＤ抗体をそれらの穴に加える。その後、呈色反応がないことが、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに対する抗体の存在を明らかにする。
【００９２】
それ故、本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに対する抗体の検出のための診断試験キットに関する。そのような試験キットは、本発明の３０ｋＤ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅリポタンパク質又はそのフラグメントを含む。
【００９３】
免疫測定法の設計は多様でありうる。例えば、免疫測定法は競合又は直接反応に基づきうる。さらに、プロトコールは固体保持体を使用しうるか又は細胞物質を使用しうる。抗体−抗原複合体の検出は標識抗体の使用を含みうる；標識は、例えば、酵素、蛍光性、化学発光性、放射性又は染料分子でありうる。
【００９４】
試料中の、本発明のタンパク質と反応性の抗体の検出のための適切な方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光検査法（ＩＦＴ）及びウエスタンブロット分析を含む。
【００９５】
例えば上述したように発現される、本発明のタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、抗体を生産するために使用することができ、抗体はポリクローナル、単一特異性又はモノクローナル（又はその誘導体）でありうる。ポリクローナル抗体を所望する場合、ポリクローナル血清を生産し、プロセシングするための手法は当技術分野において周知である（例えばＭａｙｅｒとＷａｌｔｅｒ編集、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。
【００９６】
本発明のタンパク質又は本発明のその免疫原性フラグメントに対して反応性のモノクローナル抗体は、やはり当技術分野において既知の手法により、近交系マウスを免疫することによって作製できる（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）。
（実施例）
【実施例１】
【００９７】
細菌株及び培地。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｂ２０４Ｔ及びＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｉｎｎｏｃｅｎｓ  Ｂ２５６＋を本試験において使用した。Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａを、０．１％酵母抽出物を添加した５％ウマ脱繊維素血液を含むトリプチケースソイ寒天上で、３７℃で４８時間嫌気的に増殖させた。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのブロス培養を、Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒら（Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｒ．Ｄ．Ｈｕｂｂａｒｄ及びＪ．Ｍ．Ｇｒｅｅｒ．１９８８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：３０３２−３０３９）が述べたように調製した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を組換えヘキサヒスチジン融合タンパク質の生産のために使用した。大腸菌ＤＨ５αを遺伝子ライブラリーのクローニングと構築のために使用した。大腸菌ＫＳＳ３３０ｒ−［Ｆ−Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＥ  ｇａｌＫ  ΔｌａｃＸ７４  ｒｐｓＬ（Ｓｔｒｒ）ｄｅｇＰ４：：Ｔｎ５  Ｉｐｐ５５０８］（Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｋ．Ｌ．とＪ．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ．１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１５７６−１５８０）を使用して、プラスミド挿入物をブルーハロ（ｂｌｕｅ  ｈａｌｏ）表現型に関して調べた。大腸菌株は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中又は１．５％ＬＢ寒天上で、３７℃で一晩培養した。
【００９８】
オリゴヌクレオチド。本試験において使用したオリゴヌクレオチドを表１に列挙する。
【００９９】
【表１】
2006500914.tif 000002
2006500914.tif 000003
【０１００】
ＤＮＡ操作。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからの染色体ＤＮＡは、臭化セチルトリメチルアンモニウム沈殿法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ａ．，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ及びＫ．Ｓｔｒｕｈｌ．１９９１、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて作製し、一方プラスミドＤＮＡは、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．とＪ．Ｄｏｌｙ．１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）が記載したように単離した。
【０１０１】
分子生物学における標準方法は、基本的にＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されているように実施した。ヌクレオチド配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシーケンシングキット（Ｔｈｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＮ）及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．３７３Ａ自動シーケンサーを用いて実施した。
【０１０２】
ライブラリーの構築及びコロニー免疫ブロット法。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからの染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。コンピテント大腸菌ＤＨ５αを連結混合物で形質転換し、合計４，０００コロニーを得た。コロニーをニトロセルロースフィルターにのせ、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ感染が確認された培養物を含むブタからの血清と共にインキュベートした。アルカリホスファターゼ複合ウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、回復期ブタ抗体の結合を検出した。回復期血清と反応するコロニーからのプラスミド挿入物を配列決定した。
【０１０３】
ブルーハロ（ｂｌｕｅ  ｈａｌｏ）アッセイ。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのゲノムライブラリーを、シグナルペプチド欠損アルカリホスファターゼベクターｐＭＧを用いて構築し、前述のように分析した（Ｂｌａｎｃｏ，Ｄ．Ｒ．，Ｍ．Ｇｉｌａｄｉ，Ｃ．Ｉ．Ｃｈａｍｐｉｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｈａａｋｅ，Ｇ．Ｋ．Ｃｈｉｋａｍｉ，Ｊ．Ｎ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ａ．Ｌｏｖｅｔｔ．１９９１，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２４０５−２４１５）。
【０１０４】
ＤＮＡ塩基配列決定及びｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座の分析。ブルーハロベクター挿入物に隣接するゲノムＤＮＡ配列を、Ｓｈｙａｍａｌａ  ＆  Ａｍｅｓ  ３４（Ｓｈｙａｍａｌａ，Ｖ．とＧ．Ａｍｅｓ．１９８９，Ｇｅｎｅ  ８４：１−８）によって記載された方法を用いてＳＳＰ−ＰＣＲ産物派生物を塩基配列決定することによって特定した。その後、ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座全体を、Ｅｘｐａｎｄ高正確性ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた高正確性ＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡ塩基配列決定のために増幅した。配列データをＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．１（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）で分析し、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇ．Ｗａｒｒｅｎ，Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｍｙｅｒｓ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ．１９９０，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＢＬＡＳＴプログラムを使用することによってＤＮＡ及びタンパク質データベース比較を行った。ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ［Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ］Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて多重配列アラインメントを実施した。
【０１０５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−６８５）の緩衝系を用いて、１２．５％ポリアクリルアミド分離用ゲル及び４％ポリアクリルアミド濃縮用ゲルを使用するＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩゲル電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でタンパク質を分離した。タンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ電気泳動輸送セル（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。膜を１／２０００希釈のウサギ抗血清と共にインキュベートした。ウサギ抗体の結合を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヒツジ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｌｅｎｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて検出した。
【０１０６】
組換えタンパク質発現。最終産物中に独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を構築するために設計したプライマーを使用し、ＰＣＲを用いて、予測された成熟長タンパク質をコードする遺伝子を増幅した（表１）。そのＰＣＲ産物のアリコートをＢａｍＨＩ及び／又はＮｄｅＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を、消化してアルカリホスファターゼ処理したｐＥＴ１５−Ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターに連結した。所望融合タンパク質をコードするクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、発現菌株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。発現菌株の培養物を６００ｎｍで０．６の吸光度に増殖させ、５ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ；Ｓｉｇｍａ）と共に４時間インキュベートした。フレンチプレス細胞破砕機（Ａｍｉｎｃｏ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて細胞を溶解し、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、製造者の指示に従って組換えタンパク質を精製した。カラム溶出液をＰＢＳ  ｐＨ７．２に一晩透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）濃縮器を用いて濃縮した。抗体の交差反応試験のために、組換えタンパク質１００μｇ当り０．４Ｕのトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してヘキサヒスチジンタグを開裂し、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に再びインキュベートすることによって除去した。
【０１０７】
ポリクローナル抗血清の生産。フロイント不完全アジュバントを各々の組換えタンパク質１００μｇで等容量中に乳化し、２匹のニュージーランド白色ウサギに各々の精製組換えタンパク質５０μｇを皮下注射した。５週間後、麻酔したウサギから心臓穿刺によって血清を採集した。
【０１０８】
ノーザンブロット法。ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の存在下にＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからＲＮＡを単離した。ｂｌｐＡ、ｂｌｐＥ、ｂｌｐＦ又はｂｌｐＧの部分に相補的なリボプローブの合成のために、Ｔ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドを設計して約４００ｂｐの鋳型を増幅した（表１）。リボプローブ合成のための鋳型を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）を用いて精製した。インビトロ転写キット（Ｒｏｃｈｅ）中のＴ７／ＳＰ６  ＤＩＧを使用してリボプローブを合成し、定量した。２％ホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲル上で変性ＲＮＡを分画した。一晩キャピラリーブロッティングによってＲＮＡを正に荷電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）に移した。ＲＮＡ試料の転移後、膜をメチレンブルーで染色して、該ＲＮＡが単離又は電気泳動の間に分解しなかったことを確認した。該膜を、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２％ブロッティング試薬（Ｒｏｃｈｅ）、０．５％ＳＤＳ、０．１％Ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ及び２００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液中、６５℃で一晩プレハイブリダイズした。上記プローブを含む新鮮プレハイブリダイゼーション緩衝液により６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って使用し、化学発光によってハイブリダイゼーションを検出した。
【０１０９】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４抽出。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ外膜物質を、Ｈａａｋｅら（Ｈａａｋｅ，Ｄ．Ａ．，Ｇ．Ｃｈａｏ，Ｒ．Ｌ．Ｚｕｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｍ．Ｍａｚｅｌ，Ｊ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｐ．Ｎ．Ｌｅｖｅｔｔ及びＣ．Ａ．Ｂｏｌｉｎ．２０００，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：２２７６−２２８５）が記載した方法を用いて０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（ＴＸ−１１４）中で抽出した。
【０１１０】
二次元ゲル電気泳動（２−ＤＧＥ）。４×１０８ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａからアセトン沈殿させた外膜物質を、ボルテックスすることによって膜特異的試料溶液［７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１％テトラデカノイルアミド−プロピル−ジメチルアミノ−プロパン−スルホレート（ＡＳＢ−１４）、２ｍＭトリブチルホスフィン及び１％両性担体］４６０μｌに再懸濁した（Ｎｏｕｗｅｎｓ，Ａ．Ｓ．，Ｓ．Ｊ．Ｃｏｒｄｗｅｌｌ，Ｍ．Ｒ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｐ．Ｍｏｌｌｏｙ，Ｍ．Ｇｉｌｌｉｎｇｓ，Ｍ．Ｄ．Ｗｉｌｌｃｏｘ及びＢ．Ｊ．Ｗａｌｓｈ．２０００，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３７９７−３８０９）。１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。４６０μｌ試料を使用して、ｐＨ４−７の固定化ｐＨ勾配ドライストリップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を受動的に再水和した。最終合計７５ｋＶｈに等しい、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で３，５００Ｖの最終電圧による段階的プロトコールを用いて等電点電気泳動を実施した。Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、８％から１８％Ｔ勾配ゲルを使用する二次元電気泳動を実施した（Ｗａｌｓｈ，Ｂ．Ｊ．とＢ．Ｒ．Ｈｅｒｂｅｒｔ．１９９８，Ｃａｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｌａｂ−ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ２Ｄ−ＰＡＧＥ，ｐ．２４５−２５３．Ａ．Ｊ．Ｌｉｎｋ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ：２−Ｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１１２巻より、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。ゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｆｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でゲル画像を得た。
【０１１１】
質量分析のための試料の調製。タンパク質スポットをゲルから切り出し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／１００％アセトニトリル（６０：４０ｖ／ｖ）で洗った。ゲルの断片を乾燥し、配列決定グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む溶液中、４℃で１時間再水和した。過剰のトリプシン溶液を除去し、再水和したゲル断片を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムに液浸して、３７℃で一晩インキュベートした。溶出したペプチドを濃縮し、μ−Ｃ１８Ｚｉｐ−Ｔｉｐ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて脱塩して、５％ギ酸１０μｌで洗った。基質溶液（７０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍｌα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸［Ｓｉｇｍａ］）中のＺｉｐ−Ｔｉｐ（商標）から、結合ペプチドを直接ＭＡＬＤＩ標的プレート上に溶出させた。
【０１１２】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析。３３７ｎｍ窒素レーザーを備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＴｏｆＳｐｅｃ２Ｅを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを得た。すべてのスペクトルは、リフレクトロン／遅延抽出モードにおいて、各試料当り平均２５６レーザーショットで得た。スペクトルの２ポイント内部検定を、内部ブタトリプシン自己分解ペプチドに基づいて実施した（８４２．５及び２２１１．１０［Ｍ＋Ｈ］＋イオン）。翻訳ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子から成る、モノアイソトピックピークのリストを手動で作製し、オンライン及び局在タンパク質データベースの両方を検索するために使用した。
【０１１３】
放射性免疫沈降法及び蛍光光度法。３［Ｈ］パルミチン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００μＣｉを、１０６細胞／ｍｌの細胞密度のＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅブロス培養物２５ｍｌに添加した。１０９細胞／ｍｌの細胞密度が得られたとき、遠心分離によって細胞を収集した。１．２５×１０１０細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸、１０％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ  ｐＨ８．０）に再懸濁し、音波破砕によって溶解した。次に不溶性物質を１２，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。天然ＢｌｐＡを、抗ＢｌｐＡ血清０．２ｍｌ及びプロテインＡスラリー０．２ｍｌの添加、４℃で３０分間のインキュベーション及び１２，０００×ｇでの遠心分離によってこの混合物から免疫沈降させた。次にペレットをＲＩＰＡ緩衝液中で３回洗った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料緩衝液に再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試料を分離し、ゲルをＡｍｐｌｉｆｙ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理した。フィルムカッセット内の乾燥ゲルをプレフラッシュしたＨｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に−７０℃で１週間インキュベートすることによって画像を得た。
【０１１４】
結果
ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座の特定と遺伝分析。回復期ブタ血清によるＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅゲノムライブラリーのコロニー免疫ブロット法は、２９．７ｋＤａタンパク質をコードする、ｂｌｐＡと命名した８１３ｂｐのオープンリーディングフレームを有するプラスミド挿入物を担う大腸菌クローンを特定した。独立して、ｂｌｐＥと命名した、７８６ｂｐのオープンリーディングフレームの部分を含むブルーハロクローンを特定した。ＳＳＰ−ＰＣＲを用いた染色体歩行は、これら２個の遺伝子が、ｂｌｐＧＦＥＡと命名した、パラロガスタンパク質をコードし、３，５４５ｂｐにわたる４個の遺伝子座の一部であることを示した（図１）。ｂｌｐＧＦＥＡに隣接する配列の分析は、付加的なパラロガス遺伝子を示さなかった。ｂｌｐＡの下流７８６ｂｐではオープンリーディングフレームは特定されなかった。ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座によってコードされるタンパク質は６１％から８０％の同一性を共有した（表２）。
【０１１５】
【表２】
2006500914.tif 000004
【０１１６】
ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座は２４．６％のＧ＋Ｃ含量を有する；この低いＧ＋Ｃ含量は、推定上のプロモーター配列の予測をあらかじめ排除した。しかし、いくつかの推定上のｒｈｏ非依存性転写ターミネーターが特定された（図１）。ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの７つの血清型において遺伝子座の存在を調べた。Ｂ２０４Ｔから増幅されたものと同じ大きさのＰＣＲ産物がすべての血清型において認められた。
【０１１７】
ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座の転写分析。ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座内の各々の遺伝子のリボプローブを合成し、ノーザンブロット法によって個々の遺伝子の転写を検出するために使用した（図２）。ｂｌｐＡについては９０１ｂｐの転写産物が検出されたが、ｂｌｐＥ、ｂｌｐＦ又はｂｌｐＧについては転写産物は検出されなかった。検出された転写産物の大きさは、推定上の転写開始点からｒｈｏ非依存性転写ターミネーターの開始部までの配列を含む、ｂｌｐＡ転写産物の予測サイズに対応した。
【０１１８】
ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子産物の免疫学的分析。組換えＢｌｐＡ、ＢｌｐＥ、ＢｌｐＦ及びＢｌｐＧ融合タンパク質を精製し、ヘキサヒスチジンタグを除去した（図３ａ）。組換えＢｌｐＦ及びＢｌｐＧに対する抗血清は特異的であり、その他の組換えタンパク質と交差反応しなかった（図３ｂ）。組換えＢｌｐＡに対する抗血清はＢｌｐＧと交差反応し、ＢｌｐＥとはごくわずかに交差反応したが、ＢｌｐＥに対する抗血清はＢｌｐＦ及びＢｌｐＧと交差反応した。組換えＢｌｐＡ及びＢｌｐＧに対して惹起した抗血清だけがＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの全細胞溶解産物からのタンパク質を認識した。ＢｌｐＡに対する抗血清に関するウエスタンブロット分析は、ＢｌｐＡがＢ．ｉｎｎｏｃｅｎｓにおいても発現されることを確認した（図３ｃ）。
【０１１９】
ＢｌｐＡの脂質化。ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の分析は、各々のタンパク質が推定上のシグナルペプチダーゼＩＩ認識配列を含むことを明らかにした。スピロヘータのリポタンパク質におけるシグナルペプチダーゼＩＩ認識配列は、大腸菌及び他のグラム陰性菌について確立されているコンセンサスとは異なることに留意すべきである（Ｈａａｋｅ，Ｄ．Ａ．２０００、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１４９１−１５０４）。特に、大部分のタンパク質におけるリーダー配列が同様の特徴を有する；これらの特徴は、シグナルペプチドのｎ領域を構成する正に荷電した２個のリシン残基の存在及びシグナルペプチダーゼＩＩ認識配列へと伸長するｈ領域を形成する一連の疎水性アミノ酸を含む。ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座によってコードされる４個のタンパク質の各々のＮ末端の特徴を図４に示す。トリチウム化パルミチン酸を含むＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ培養物からのＢｌｐＡの放射性免疫沈降法は、天然ＢｌｐＡがパルミチン酸の添加によって脂質化されることを明らかにした（図５）。
【０１２０】
表面局在化試験。ＴＸ−１１４によるスピロヘータ外膜の単離及びその後の界面活性剤相におけるタンパク質の検出は、外膜の位置を強く指示する（Ｈａａｋｅ，Ｄ．Ａ．２０００、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１４９１−１５０４）。組換えＢｌｐＡに対する抗血清に関するウエスタンブロット法は、天然ＢｌｐＡが原形質円柱ペレットには存在せず、もっぱらＴＸ−１１４界面活性剤相に分配されていることを明らかにした（図６）。Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのＴＸ−１１４界面活性剤相からのタンパク質を、膜タンパク質の溶解度を高めるように設計した非イオン性界面活性剤溶液に溶解し、ｐＨ４−７固定化ｐＨ勾配を用いた２−ＤＧＥによって分離した。我々は３６個のユニークスポットを分離することができ、そのうち３４個は４．０−５．５のｐＨ範囲に集中した（図７）。分離したタンパク質の各々をトリプシン消化に供し、トリプシンペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析によって分析した。その配列が入手可能である、これまでに特性付けられたわずかに２個のＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ外膜タンパク質（ＯＭＰ）の１つである、ＳｍｐＡに対してペプチド質量の一致を得た（図７）。Ｖｓｐ３９を検出できなかったのは、おそらく、尿素を含む試料緩衝液に不溶であるというそのまれな特性によるものであった。ペプチド質量マップのいずれも、ＢｌｐＥ、ＢｌｐＦ及びＢｌｐＧに関して予測されたトリプシンペプチド質量と一致しなかった。しかし、予測上の翻訳ＢｌｐＡ配列に対応する１個のゲル精製タンパク質が特定された（図７）。これらのデータは免疫学的及び転写所見と一致し、ＢｌｐＡだけが現在検討されている条件下で発現されることを示唆した。
【０１２１】
ｂｌｐＡ（該遺伝子座の４番目の遺伝子）だけが転写されるという観察された転写のパターンは、免疫ブロット法実験と一致し、ＢｌｐＡだけが感染の間に発現されることを示唆した。種内及び種間の両方での該遺伝子座の保存は、該パラログが必要とされ、一定の条件下で発現されることを強く示唆しており、さもなければそれらは分岐進化の間に失われていたはずである。該パラログの可能性のある１つの役割は、表面発現抗原の変異による免疫回避においてである。発現されないｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座からの遺伝子は、潜在的に抗原変異のための遺伝子貯蔵所として働くと考えられる。また、その他のパラログは、特定環境条件下で特定の目的のために、おそらく一過性に、発現されると考えられる。例えば、鉄制限はしばしば病因及び感染に関与する遺伝子の誘導因子である。フコースなどの他の環境的誘導物質は、（同じく）、腸内病原体に関して（さらに一層）適切でありうる。これは、２個以上のｂｌｐを含むワクチンが１個のｂｌｐだけを含むワクチンよりも好ましいことを示唆する。
【実施例２】
【０１２２】
経口ワクチン生産のためのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＢｌｐＡの発現。発現ベクターｐＤＵＭＰは、Ｃｕｌｌｅｎ，Ｐ．Ａ．らにより、Ｐｌａｓｍｉｄ  ４９：１８−２９（２００３）の中で記述されている。この発現ベクターは、脂質化表面暴露タンパク質の生産のために設計された。ＢｌｐＡの成熟部分をコードするオープンリーディングフレームの区域をｐＤＵＭＰにクローン化した。生じた構築物を発現のために弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに形質転換した。ウエスタンブロット分析は、ＢｌｐＡがこの菌株において高レベルで発現されることを示す。このＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株を生経口ワクチンとしての使用のために設計する。
【０１２３】
ｐＤＵＭＰにおけるｂｌｐＡのクローニング／発現の結果：
図８に示すウエスタンブロットからわかるように、ｂｌｐＡを挿入物として有するｐＤＵＭＰを含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株は、ウサギ抗ＢｌｐＡ一次抗体によって認識される、有意の量のＢｌｐＡを生産する。
【実施例３】
【０１２４】
生弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株によって送達されるＢｌｐＡに対する抗体応答の測定。マウスを脂質化ＢｌｐＡで免疫した。これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの生弱毒化ａｒｏＡ突然変異菌株を使用して実施された。粘膜免疫応答を刺激するために動物を経口的にワクチン接種した。体液性及び粘膜免疫応答の両方の程度を測定するためにワクチン接種後にアッセイを実施した。間接ＥＬＩＳＡアッセイはＩｇＡ（粘膜）及びＩｇＭ（体液）の存在を検出するために使用する：
免疫：
各々７匹のマウスから成る下記の群を使用した：
・未処置対照マウス−ＰＢＳで免疫
・ｐＤＵＭＰ（挿入物なし）を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで免疫
・ｐＤＵＭＰ（ｂｌｐＡ）を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで免疫。
【０１２５】
マウスをワクチン接種の前に食餌なしで一晩及び水なしで４時間飢餓させた。ワクチン接種の直後から食餌と水を自由に摂取させた。
１．増殖ブロスを一晩接種した。
２．培養物を希釈し、対数増殖期中期まで増殖させた。
３．細胞密度を〜５×１０９ｃｆｕ／ｍｌに調整した。
４．ワクチン接種後試料との比較のために血液約１５０μｌを採集した。
５．３％重炭酸ナトリウム１００μｌを経口投与した。
６．Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  １００μｌによるワクチン接種を経口的に実施した。
【０１２６】
血液及びＩｇＡを含む粘膜表面試料（ＭＳＳ）の採集
血液及びＭＳＳの採集を次のように実施する：
１．事前にマウスから血液試料を採集する。
２．マウスから小腸を切除する。
３．０．１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害因子を添加した５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５  ２ｍｌを通過させることによって内容物を収集する。
４．０．１５Ｍ  ＮａＣｌで容量を５ｍｌに調整する。
５．混合物を強くボルテックスし、３，０００ｇで１０分間遠心分離する。
６．１００ｍＭ  ＰＭＳＦ  ５０μｌを加え、４℃で２０分間、２０，０００ｇで遠心する。
７．１００ｍＭ  ＰＭＳＦ  ５０μｌ及び２％ＮａＮ３  ５０μｌを加える。
８．氷上で１５分間インキュベートし、７％ＢＳＡ  ２５０μｌを加える。
９．必要なときまで−２０℃で凍結する。
【０１２７】
ＩｇＡの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイは次のように実施することができる：
１．５０μｇ／ｍｌの抗原溶液を調製する。
２．抗原溶液５０μｌを穴に充填し、４℃で一晩ＥＬＩＳＡプレートに吸着させる。
３．ＰＢＳ中の０．２５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０により室温で３０分間遮断する。
４．蒸留水で３回洗う。
５．連続希釈の血清又はＭＳＳ  ５０μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートする。
６．蒸留水で３回洗う。
７．ヤギ抗マウスＩｇＡ  ＨＲＰ複合物を加え、３７℃で２時間インキュベートする。
８．蒸留水で３回洗う。
９．０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．２中ＡＢＴＳで展開する。
１０．自動プレートリーダーにおいてＡ４９２で反応を読み取る。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座の構造。各々の遺伝子の位置と方向を一方向矢印で示している。遺伝子座の５’末端の名称のない矢印は、乳酸デヒドロゲナーゼと配列類似性を共有する部分的オープンリーディングフレームを示す。推定上のｒｈｏ非依存性転写ターミネーターの位置はｒｈｏ記号（ρ）で示している。二方向矢印は、遺伝子間領域及び非コード領域の大きさを示すために使用している。
【図２】インビトロ条件下で増殖させ、ｂｌｐＡ（レーン１）、ｂｌｐＥ（レーン２）、ｂｌｐＦ（レーン３）又はｂｌｐＧ（レーン４）に特異的なリボプローブとハイブリダイズさせたＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからの全ＲＮＡのノーザンブロット。標準ＲＮＡサイズマーカーの位置（ｋｂ）を左側に示している。
【図３】（ａ）ヘキサヒスチジンタグを除去してクマシーブルー染色した組換えタンパク質：ＢｌｐＡ（レーン１）、ＢｌｐＥ（レーン２）、ＢｌｐＦ（レーン３）及びＢｌｐＧ（レーン４）。（ｂ）ＢｌｐＡ（左上）、ＢｌｐＥ（右上）、ＢｌｐＦ（左下）及びＢｌｐＧ（右下）に対するウサギ抗血清でプローブした免疫ブロット。レーンは図３（ａ）の通りである。（ｃ）ウサギＢｌｐＡ抗血清でプローブしたＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（レーン１）又はＢ．ｉｎｎｏｃｅｎｓ（レーン２）の全細胞溶解産物の免疫ブロット。分子量標準の位置（ｋＤ）を左側に示している。
【図４】ｂｌｐＧＦＥＡ遺伝子座によってコードされるタンパク質及びＳｍｐＡのシグナルペプチド領域。非定型シグナルペプチダーゼＩＩ認識部位を破線の箱で示している。シグナルペプチドｎ領域を構成する正に荷電したリシン残基の存在を実線の箱で示している。良好に機能するｈ領域に認められた疎水性アミノ酸に明灰色の陰影をつけ、あまり良好に機能していないものには暗灰色の陰影をつけている。
【図５】３［Ｈ］パルミチン酸の存在下で増殖させたＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（レーン１）及び免疫沈降させたＢｌｐＡ（レーン２）の全細胞溶解産物のオートラジオグラフ。クマシーブリリアントブルーで染色した免疫沈降ＢｌｐＡ（レーン３）。分子量標準の位置（ｋＤ）を左側に示している。
【図６】ＢｌｐＡ抗血清でプローブしたＢ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ分画のウエスタンブロット。レーン１、全細胞溶解産物；レーン２、原形質円柱；レーン３、ＴＸ−１１４抽出物の水相；レーン４、ＴＸ−１１４の界面活性剤相。分子量標準の位置（ｋＤ）を左側に示している。
【図７】Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅからのＴＸ−１１４界面活性剤相の二次元ゲル電気泳動。すべてのタンパク質スポットをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析によって分析し、ｂｌｐＧＦＥＡによってコードされるタンパク質のうちＢｌｐＡだけが特定された（配列の３０．１％をカバーする適合ペプチド）。１６ｋＤａのＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ外膜タンパク質ＳｍｐＡも特定された（配列の４７．１％をカバーする適合ペプチド）。分子量標準の位置（ｋＤ）を左側に示している。
【図８】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＢｌｐＡの発現。ウサギ抗ＢｌｐＡ一次抗体でプローブしたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ全細胞溶解産物のウエスタンブロット。レーン１：低分子量マーカー。レーン２：挿入物なしのｐＤＵＭＰを含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ。レーン３：ｂｌｐＡを挿入物として有するｐＤＵＭＰを含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ。
【配列表】
2006500914.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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