(57)【要約】機能性遺伝子産物をコードする突然変異遺伝子を生産する方法であって、（ａ）１つ以上の突然変異を遺伝子に導入し突然変異遺伝子を形成する工程と、（ｂ）該突然変異遺伝子を宿主微生物に供給する工程と、（ｃ）該突然変異遺伝子産物の発現を可能にする条件下で該突然変異遺伝子を含有する宿主微生物を培養する工程と、（ｄ）該突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を生産可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性遺伝子産物をコードする突然変異遺伝子を生産するための方法であって、
（ａ）１つ以上の突然変異を遺伝子に導入し、突然変異遺伝子を形成する工程と、
（ｂ）前記突然変異遺伝子を宿主微生物に供給する工程と、
（ｃ）前記突然変異遺伝子産物の発現を可能にする条件下で、該突然変異遺伝子を含有する前記宿主微生物を培養する工程と、
（ｄ）前記突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を産生することが可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
（ａ）１つ以上の突然変異を遺伝子に導入し、複数の突然変異遺伝子を形成する工程と、
（ｂ）前記突然変異遺伝子を宿主微生物に供給する工程と、
（ｃ）前記突然変異遺伝子産物の発現を可能にする条件下で、前記突然変異遺伝子を含有する前記宿主微生物を培養する工程と、
（ｄ）前記突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を産生することが可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、さらに、
（ｅ）工程（ｄ）において前記微生物から機能性遺伝子産物をコードする突然変異遺伝子の混合プールを得て、工程（ａ）から（ｄ）を繰り返し、発現されうる突然変異遺伝子を複数含有し、機能性遺伝子産物を産生することが可能な微生物のライブラリを形成する工程、を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、さらに、
（ｆ）前記微生物ライブラリをスクリーニングし、突然変異遺伝子産物を発現することが可能な突然変異遺伝子を得る工程、を含む方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法であって、前記突然変異遺伝子産物が、天然遺伝子産物に比較して、改変された若しくは所望の活性、機能、または特性を有する、方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ａ）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または遺伝子シャッフリングを用いる、取り込みエラーによる突然変異誘発によって実行される、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｂ）が、前記突然変異遺伝子をベクターにライゲーションし、該ベクターを用いて細菌を形質転換することによって実行される、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記ベクターがプラスミドまたはウイルスであり、前記細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の方法であって、前記天然遺伝子が特定の宿主微生物において発現されることが期待される条件下で、前記宿主微生物が培養される、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、宿主微生物が液体培地で培養される、方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記培養条件の結果、検出可能な特性を有する機能性遺伝子を発現することが可能な何らかの宿主微生物が生じる、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記検出可能な特性が、色、大きさ、形状、蛍光、成長のために供給される代謝産物への依存性、供給される基質の酵素的変換などの酵素活性、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される選択可能な表現型である、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記遺伝子が、該遺伝子を発現する微生物において、蛍光または色素の表現型または特性を形成することが可能な酵素をコードする、方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子産物が酵素である、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記選択がフローサイトメトリーによる選別によって行われ、前記細菌が前記基質への前記酵素の作用によるスペクトル特性または蛍光特性の変化によって選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、前記酵素がＸ糖またはフルオレセイン結合の糖基質上で作用することが可能である、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記基質がインドキシル結合化合物である、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、インドキシル結合基質に作用する前記酵素が、グリコシル加水分解酵素、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、およびβ−キシロシダーゼからなる群から選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記酵素が、酵素的加水分解により色原体を形成する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシドに作用することが可能である、方法。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子産物の基質が、液体培養において前記細胞表面、または細胞内に保持される、方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法であって、機能性遺伝子産物を前記突然変異遺伝子から産生することが可能な前記宿主微生物が選択される、方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法によって産生される、突然変異遺伝子産物を産生可能な突然変異遺伝子。
【請求項２３】
機能性酵素をコードする突然変異遺伝子を生産する方法であって、
（ａ）１つ以上の突然変異を前記酵素をコードする遺伝子に導入し、複数の突然変異遺伝子を形成する工程と、
（ｂ）前記突然変異遺伝子をベクターに組み入れる工程と、
（ｃ）前記ベクターを用いて宿主微生物を形質転換する工程と、
（ｄ）前記微生物が前記突然変異遺伝子を発現するように、対応する天然遺伝子が発現して天然酵素を産生することを可能にする条件下で、前記突然変異遺伝子を含有する前記宿主微生物を培養する工程と、
（ｅ）前記酵素が作用することが可能な基質を供給し、機能性酵素を産生するいずれの宿主細菌においても、選択することが可能な表現型を生産する工程と、
（ｆ）前記選択することが可能な表現型を有する細菌を選別することで、前記突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を産生することが可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、さらに、
（ｇ）工程（ｆ）で前記微生物から突然変異遺伝子プールを得て、工程（ａ）から（ｆ）を繰り返すことで、発現されうる多重突然変異遺伝子を複数含有し、機能性酵素を産生することが可能な微生物のライブラリを形成する工程、を含む方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、さらに、
（ｈ）前記微生物ライブラリをスクリーニングし、改変された若しくは所望の活性、機能、または特性を有する酵素を発現することが可能な突然変異遺伝子を得る工程、を含む方法。
【請求項２６】
請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法であって、前記選択がフローサイトメトリーによる選別によって行われ、前記細菌が前記基質への前記機能性酵素作用によるスペクトル特性または蛍光特性の変化によって選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法によって産生される、突然変異遺伝子産物を生産することが可能な突然変異遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異遺伝子および突然変異遺伝子産物を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、獣医学、産業上の理由などで、突然変異遺伝子産物が求められる状況は数多い。微生物は、極めて多岐にわたるタンパク質、特に多くの場面で利用可能な酵素を生産することが可能である。しかしながら、これらのタンパク質の多くは、その後の使用にとって好ましくない特性を有することから、改変された活性または機能を有する突然変異体を得ることが望ましい。現在では、突然変異遺伝子およびこれに対応する突然変異遺伝子産物を生産できる多くの方法や技術が利用されている。
【０００３】
Ｓｔｅｍｍｅｒ（Stemmer, W.P.C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370,389-391, 1994.; Stemmer, W.P.C. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vitro recombination for molecular evolution. Proc.Natl.Acad.USA91，10747-10751,1994）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの配列空間を探索し、タンパク質の変異体の多様性を最大にするためのもっとも効果的な方法について論じている。最近に至るまで、コンビナトリアル・ライブラリを作製するもっとも一般的な方法は、点突然変異の付加によって配列を変化させようとする戦略の繰り返しである（Cadwell and Joyce. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR methods Appl.2:28-33,1992）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの変化のためには、組換えポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ（遺伝子シャッフリング）の導入が、単純な繰返し点突然変異誘発法に対して実際的かつ理論的に優位性を有する。点突然変異と野生型配列の組換えにより、タンパク質のいくつかの部位で速やかに突然変異荷重を微調整する。この方法（およびそのバリエーション手法）を利用することにより、酵素活性、基質特異性、安定性などが向上される。遺伝子シャッフリングは、通常、遺伝子が断片化された後にＰＣＲによってシャッフルされることで実施される。この方法は、ＰＣＲの再構築過程における相同組換えに基づくものである。たいていの方法において、シャッフルされるべき遺伝子間には、これらの領域に「交差点（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｐｏｉｎｔｓ）」が生じるように、比較的高レベルの配列類似性が必要とされる。
【０００４】
使用する遺伝子間の配列類似性が低い場合、主要な産物は再構築された親遺伝子であることが多く、組換え体を発見するためには更なる探索が行われる必要がある（Kikuchi, M., Ohnishi, K., & Harayama, S. Novel family shuffling methods for the in vitro evolution of enzymes. Gene 236, 159-167, 1999; Ostermeier, M. Shim, J.H. & Benkovic, S.J. A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology. Nat. Biotechnol. 17, 1205-1209, 1999.）。Kikuchiら（1999）は、親分子とそれに続く切断の配列における特異的制限酵素部位を利用する遺伝子シャッフリング法、ハイブリッド遺伝子を高頻度に形成可能にする工程について報告している。いくつかのＰＣＲ工程は、組換え遺伝子の増殖のために実行された。
【０００５】
２つの親配列におけるコード配列の連続的切断と、それに続く断片のライゲーションおよび酵素活性の選択、というOstermeierら（1999）によって提案された全く異なる方法のおかげで、コンビナトリアル・フュージョン・ライブラリの調製が可能になった。いずれかの親は、ハイブリッド遺伝子の５’配列を得るのに有用である。ハイブリッド酵素作製用反復切断（iterative truncation for the creation of hybrid enzymes, ITCHY）と称されるこの方法は、配列類似性が５０％程度であるものの遺伝子間の組換えにも適応可能で、標準的な遺伝子シャッフリング法と比較して、より幅広い交差範囲を提供することが見出された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人は、製紙用パルプの漂白能が向上された、好熱性β−キシラナーゼをコードする遺伝子を単離した。安定性が高められ、至適ｐＨを変化させた突然変異誘導体を得る可能性を探索することが望まれていた。error-prone ＰＣＲと取り込みエラーによる突然変異誘発と、それに続く遺伝子シャッフリングを用いる実験により、配列空間における変異についての限られたサンプルをコードする突然変異遺伝子の同定が可能になったものの、その同定にはさらなるスクリーニングが必要であった。関連遺伝子のＤＮａｓｅ１分解後の遺伝子シャッフリング（ファミリー・シャッフリング）では、主な産物として得られたのは野生型親配列がほとんどであった。バックグラウンドを低減するための方法を数回試みた後、配列類似性およびＧ：Ｃ含有量を広範に多様化し、野生型遺伝子の出現が劇的に低下した遺伝子のシャッフリングを可能にするある種の技法が考案された。さらに、プライマーの伸張条件を修正することで、親の入力遺伝子のいずれか１つ（または１つ以上）に対して、得られる生成物の子遺伝子にバイアスをかけられる可能性がある。本出願人は、この方法をDegenerate Oligonucleotide Gene Shuffling（ＤＯＧＳ）と名づけた。これは、国際公開第０２／１８６２９号パンフレットに記載されている。
【０００７】
突然変異体の生成に利用可能な選択肢は多いものの、これらの方法を用いた結果、必ずしも有用な産物が生じるとは限らず、時間がかかりすぎて成功しない可能性もある。本発明者は、多種多様な機能性突然変異体を生産する可能性を秘めた新たな手法を開発している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
第一の態様では、本発明は、機能性遺伝子産物をコードする突然変異遺伝子を生産するための方法であって、
（ａ）１つ以上の突然変異を遺伝子に導入し、突然変異遺伝子を形成する工程と、
（ｂ）前記突然変異遺伝子を宿主微生物に導入する工程と、
（ｃ）前記突然変異遺伝子産物の発現を可能にする条件下で、該突然変異遺伝子を含有する前期宿主微生物を培養する工程と、
（ｄ）前記突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を生産することが可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む方法を提供する。
【０００９】
好ましい形態では、本方法は、
（ａ）１つ以上の突然変異を遺伝子に導入し、突然変異遺伝子を形成する工程と、
（ｂ）前記突然変異遺伝子を宿主微生物に導入する工程と、
（ｃ）前記突然変異遺伝子産物の発現を可能にする条件下で、該突然変異遺伝子を含有する該宿主微生物を培養する工程と、
（ｄ）突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を生産することが可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む。
【００１０】
好ましい形態では、さらに本方法は、
（ｅ）工程（ｄ）において微生物から機能性遺伝子産物をコードする突然変異遺伝子の混合プールを得て、工程（ａ）から（ｄ）を繰り返すことで、発現して機能性遺伝子産物を生産可能な複数の突然変異遺伝子を含有する微生物ライブラリを形成する工程を含む。
【００１１】
別の好ましい形態では、さらに本方法は、
（ｆ）該微生物ライブラリをスクリーニングし、突然変異遺伝子産物を発現することが可能な突然変異遺伝子を得る工程を含む。
【００１２】
好ましくは、突然変異遺伝子産物は、天然遺伝子産物と比較して、改変されたまたは所望される活性、機能、または特性を有する。
【００１３】
好ましくは、工程（ａ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる取り込みエラーの突然変異誘発によって実施される。しかしながら、１つ以上の突然変異を遺伝子に導入する別の方法として、当業者に知られる別の方法もまた適していることが認識されるであろう。一例として遺伝子シャッフリングが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
好ましくは、工程（ｂ）は、突然変異遺伝子をベクターにライゲーションし、細菌を該ベクターで形質転換することによって実施される。遺伝子を微生物に導入する方法は、当業者によく知られており、本発明に適用可能であろう。たとえば、ベクターは、プラスミドであってもウイルスであってもよい。この工程に特に適する微生物は、大腸菌Escherichia coliである。また、他の宿主微生物もこの工程に利用可能であることは認識されるであろう。
【００１５】
好ましくは、宿主微生物は、天然遺伝子が特定の宿主微生物中で発現されることが期待される条件下で培養される。液体培地は、その後の使用または解析のために培養された微生物を回収することを容易にするので、この工程に特に適している。しかしながら、この工程では、Morris et al. Cloning of the xynB gene from Dictyoglomus thermophilum strain Rt46B.1 and action of the gene-product on kraft pulp. Appl. Environ. Microbiol. 64:1759-1765,1998；Gibbs et al. Cloning, sequencing and expression of a xylanase gene from the extreme thermophile Dictyoglomus Rt46B.1 and the activity of the enzyme on fibre-bound substrate. Appl. Environ. Microbiol. 61:4403-4408,1995（本願に引用して援用する）で見出された手段などの適切な培養手段のいずれもが利用可能である。
【００１６】
さらに好ましい形態では、該培養条件は、機能性遺伝子を発現可能なすべての宿主微生物に、検出可能な特性を持たせることができる。検出可能な特性の１つの好ましい形態は、選択可能な表現型である。例として、色、大きさ、形状、蛍光、成長のために供給される代謝産物への依存性、供給した基質を酵素的に変化することで色または蛍光に基づく選択が可能となるような酵素活性、が挙げられる。より好ましい形態では、該遺伝子は、好ましくは適切な条件下で、該遺伝子を発現する微生物中において、蛍光または色素の表現型または特性を形成できる酵素をコードする。
【００１７】
より好ましい形態では、該遺伝子は、液体培養条件下で、該遺伝子を発現する微生物中において、蛍光または色素の表現型または特性を形成できる酵素をコードする。
【００１８】
本発明は、セルソーターまたはサイトメーターなどの選別装置または選別装置を用いる高容量スクリーニングに特に適している。多種多様な酵素は、基質に作用して着色された産物を生産できる。基質が細胞内で該作用を受けると、細胞が色を変化させることがあり、その際には検出可能である。このように、適切な培養条件下では，機能性遺伝子産物を発現する微生物は着色され、それゆえに機能産物を生産しない他の微生物に対して選択可能になる。
【００１９】
本発明に係る方法と、突然変異遺伝子を得るための他の方法との相違は、その過程において、突然変異遺伝子産物による機能の維持を除けば、突然変異遺伝子産物の改変された活性に対するいかなる選択負荷も選択試験も施さないことである。
【００２０】
本発明に係る方法と、突然変異遺伝子を得るための他の方法とのさらなる相違は、中立突然変異体、または突然変異遺伝子産物の機能を低下させるが消去はしない突然変異体を除去するための選択をしない点が他の方法と異なる。
【００２１】
本発明による方法は、潜在的に機能性遺伝子産物をコードする多数の異なる突然変異遺伝子を生産するのに用いることができ、該機能性遺伝子産物は、その後、改変された特性、または所望の性質若しくは機能を検出することが可能な、多数の突然変異を有している。
【００２２】
好ましい形態では、遺伝子産物は酵素である。より好ましくは、酵素は、Ｉｍａｇｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（C12FDG、Molecular Proves，Eugene, 米国、オレゴン州）などのＸ糖または蛍光結合糖に作用することが可能である。好ましくは、酵素は、酵素による加水分解の際に色原体を形成するＸ−ｇａｌなどの基質上で作用可能である。Ｘ−ｇａｌは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシドとして定義される。
【００２３】
さらに好ましい形態では、遺伝子産物の基質は、液体培養の中で細胞表面または細胞内に保持されるべきである。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に記載の方法によって得られる突然変異遺伝子産物を生産することが可能な突然変異遺伝子を提供する。
【００２５】
第３の態様では、本発明は、機能性酵素をコードする突然変異遺伝子を生産する方法であって、
（ａ）１つ以上の突然変異を該酵素をコードする１つの遺伝子に導入し、複数の突然変異遺伝子を形成する工程と、
（ｂ）該突然変異遺伝子をベクターに組み入れる工程と、
（ｃ）該ベクターによって宿主微生物を形質転換する工程と、
（ｄ）前記微生物が突然変異遺伝子を発現させるように、対応する天然遺伝子が発現して天然酵素の産生を可能にする条件下で、突然変異遺伝子を含有する該宿主微生物を培養する工程と、
（ｅ）機能性酵素を生産するいずれの宿主細菌においても選択可能な表現型を生産するために該酵素が作用可能な基質を供給する工程と、
（ｆ）選択可能な表現型を有する細菌を選別することにより、突然変異遺伝子から機能性遺伝子産物を生産することが可能な宿主微生物を選択する工程と、を含む方法を提供する。
【００２６】
好ましい形態では、さらに該方法は、
（ｇ）工程（ｆ）において微生物から突然変異遺伝子のプールを得て、工程（ａ）から工程（ｆ）を繰り返すことで、発現されて機能性酵素を生産することが可能な複数の多重−突然変異遺伝子を含有する微生物ライブラリを形成する工程を含む。
【００２７】
別の好ましい形態では、さらに該方法は、
（ｈ）微生物ライブラリをスクリーニングし、改変された、または所望の活性、機能、あるいは特性を有する酵素を発現することが可能な突然変異遺伝子を得る工程を含む。
【００２８】
好ましくは、微生物は細菌である。他の適切な宿主細菌が利用可能であるとはいえ、適切な細菌は大腸菌Escherichia Coliである。
【００２９】
好ましくは、該選別は、フローサイトメトリーと、基質に対する機能性酵素の作用に基づくスペクトル特性または蛍光特性の変化によって選択された細菌とを用いて、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって行われる。
【００３０】
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載の方法によって生産される突然変異遺伝子産物を生産することが可能な突然変異遺伝子を提供する。
【００３１】
第５の態様では、本発明は、突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を得るための方法であって、
（ａ）から（ｆ）本発明の第１の態様に記載の各工程を実行して突然変異遺伝子を得る工程と、
（ｇ）該突然変異遺伝子を宿主微生物に導入する工程と、
（ｈ）さらなる突然変異誘発工程を実施し、突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を得る工程と、を含む方法を提供する。
【００３２】
工程（ｈ）における適切な突然変異誘発工程はいずれも適切であることは認識されるであろう。例として、遺伝子シャッフリング、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング、または突然変異誘発ポリメラーゼ連鎖反応（mutagenic PCR）が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００３３】
好ましい実施態様では、工程（ｈ）は、
（ｉ）共有されるコードされたアミノ酸配列の部位に基づいて該突然変異遺伝子の１つ以上の断片を割り当てる工程と、
（ｉｉ）増幅される遺伝子の鋳型または断片に基づいて非縮重コア（５’末端と３’末端の双方の側にあるコアは、必要な場合に縮重とする）を有するプライマーを用いる該遺伝子の１つ以上の割り当てられた断片を増幅する工程と、
（ｉｉｉ）１つ以上の増幅された断片の組換えによって突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成させる工程と、を含む。
【００３４】
第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様に記載の方法によって生産される突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を提供する。
【００３５】
第７の態様では、本発明は、酵素をコードする突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を得るための方法であって、
（ａ）から（ｈ）本発明の第３の態様に記載の工程を実行して酵素をコードする突然変異遺伝子を得る工程と、
（ｉ）該突然変異遺伝子を宿主微生物に導入する工程と、
（ｊ）さらなる突然変異誘発工程を実行して酵素をコードする突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を得る工程と、を含む方法を提供する。
【００３６】
工程（ｊ）においていかなる適切な突然変異誘発工程も適当であることは十分理解されるであろう。例として、遺伝子シャッフリング、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング、または突然変異誘発ＰＣＲ（Gibbs et al. Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS):A method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling. Gene271:13-20,2001）が挙げられるが、これに限られるものではない。その他の適切な定方向進化法（directed evolution methods）のレビューは、Farinas et al. Directed Enzyme Evolution. Current Opinion in Biotechnology 12:545-551（2001）（本願に引用して援用する）に見出されうる。
【００３７】
好ましい実施様態では、工程（ｊ）は、
（ｉ）共有されたコードされたアミノ酸配列の部位に基づいて該突然変異遺伝子の１つ以上の断片を割り当てる工程と、
（ｉｉ）増幅される遺伝子の断片または鋳型に基づく非縮重コア（５’末端と３’末端の双方の側にあるコアは、必要な場合に縮重とする）を有するプライマーを用い、該遺伝子の１つ以上の割り当てられた断片を増幅する工程と、
（ｉｉｉ）１つ以上の増幅された断片の組換えにより酵素をコードする突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成させる工程と、を含む。
【００３８】
第８の態様では、本発明は、本発明の第７の態様に記載の方法によって生産される酵素をコードする突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を提供する。
【００３９】
本発明に記載の方法は、蛍光発生特性を有する合成標的基質を加水分解することが可能な任意の遺伝子または酵素の定方向進化法に特に適用可能である。
【００４０】
該基質は、何らかのインドキシル結合化合物とすることができる。しかしながら、加水分解後に細胞内で保持され、フローサイトメトリーまたは他の手段によって検出可能な他のいかなる色原体基質または蛍光発生基質も適当であろう。
【００４１】
多くのインドキシル結合基質は、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼなどの多くのグリコシル加水分解酵素用基質として市販されている。エステラーゼおよび／またはリパーゼの基質もまた入手可能である。
【００４２】
本願明細書を通して、文脈的に例外を必要としない限り、「含む」（英語で“comprise”、または“comprises”あるいは“comprising”などの変化形）という語は、記載された要素、整数若しくは級数、または要素群、整数群若しくは級数群を含むが、それ以外の要素、整数若しくは級数、または要素群、整数群もしくは級数群を除外するものではないと理解されるであろう。
【００４３】
本願明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、論説などの説明はいずれも、本発明の論理展開を明確にすることのみを目的としたものである。これらの事項のすべてまたはいずれかが先行技術の基盤の一部を形成する、または本願の各優先日以前にオーストラリア国内に存在したことで本発明の関連分野において一般常識であったことを認めることは適当ではないと考えられる。
【００４４】
本発明をより明確に理解するために、以下に示す図面および実施例を参照して好ましい形態が示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
発明を実施するための形態
本発明者は、天然のものよりも新しい環境や応用により適するタンパク質、特に酵素の定方向進化を達成する新たな方法を開発した。この方法は、特にフローサイトメトリーおよび色原体基質または蛍光発生基質の利用に適している。この方法は、選択された突然変異体の間でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの突然変異および組換えのラウンドを繰り返し、続いて、改変された活性至適ｐＨで単離物のスクリーニングを行い、最も適合する組換え体を選択することを可能とする。ある特定の使用の結果、より優れた酵素特性を有する新規のグリコシル加水分解酵素が単離され、発現し、産業利用の可能性、すなわちｐＨの適合性が評価された。
【００４６】
本発明者は、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（ＤＯＧＳ）と呼ばれる、タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの進化のための新しい方法も開発した（国際公開ＷＯ０２／１８６２９号パンフレット，本願に引用して援用する）。ＤＯＧＳ法は、さまざまなファミリーに由来する遺伝子のシャッフリングを目的としたものであるが、いまや単一遺伝子のランダム突然変異に適用可能であること、それによって配列空間の範囲の探索が可能であることが見出されている。これは、標的遺伝子のコピーをＰＣＲで合成する間に起こる取り込みエラーの突然変異誘発によってなされる。低い突然変異頻度（１−２アミノ酸変化／タンパク質）の取り込みエラーによる突然変異誘発ライブラリを使用して、スクリーニングを繰り返し行うことで、適応可能な突然変異を段階的に蓄積することが可能になる。単一突然変異の段階的蓄積により、高度に突然変異した組換え体をスクリーニングする場合よりも、著しく多くの機能性配列空間のサンプリングが可能となる。その結果、中立突然変異（neutral mutation）または酵素適応を低下させる突然変異が放棄される一方で、取り込みエラーの突然変異誘発によって適応可能な突然変異が選択されることが多くなる。
【００４７】
熱安定性などの表現型は、単一突然変異を繰り返し取り込むことで容易に改良されうる。本発明者は、複数のアミノ酸の相互作用に由来する表現型（この場合、酵素の至適ｐＨ）が、中立突然変異（単離の際に中立）と適応可能な突然変異との蓄積および相互作用を必要とするかどうかを決定するための技法を開発してきた。本発明による方法の好ましい形態では、取り込みエラーによる突然変異誘発が、通常の方法で繰り返し利用される。しかしながら、適応可能な突然変異のスクリーニングをすることはなく、または必要でもない。その代わり、基質の加水分解を触媒する能力の維持（変化しないか、改善するか、または低下するか）のみを対象にスクリーニングが実施される。すべての陽性の組換え体は、必要とされる多くのラウンドで突然変異誘発などの追加ラウンドのための鋳型として混合され、利用されるであろう。この方法では、複数の適応可能な突然変異、中立突然変異および有害（しかし不活性ではない）突然変異の蓄積が起こることが推定される。このライブラリは、一度生成されると、たとえば至適ｐＨを改変された酵素のスクリーニングがされうる。その際、所望の表現型を有する組換え体は、ＤＯＧＳを用いて野生型親遺伝子と任意に戻し交配され、改変された表現型になんの寄与もしない突然変異を除去しうる。
【００４８】
方法
図１は、本発明によるランダムドリフト突然変異誘発法の一つの概略図である。工程１は、複数の突然変異遺伝子を形成するために、ある酵素をコードする遺伝子を多数複製する突然変異誘発ＰＣＲに関与する。つぎに、変異した遺伝子はプラスミドにライゲーションされ、大腸菌を形質転換する。続いて、該細菌は、細胞内である種の機能性酵素によって作用を受けたときに該細胞に検出可能な表現型をもたらす基質を含有する選択培地中で培養される。つぎに、この培養細胞は、フローサイトメータによって選別され、酵素によって誘発された表現型を有する細胞が選択される。選択されたすべての細胞は、機能性酵素をコードする遺伝子を含有する。プラスミドＤＮＡは、これらの細胞のいずれからも得られ、さらなる突然変異体を得るための方法を用いる場合に再び処理される。突然変異誘発および細胞選択のラウンドを多数行った後、各々の突然変異体は、所望される、または改変される特性を有する酵素の探索のためにスクリーニングされうる。この突然変異体は、さらに別の手段によって突然変異を受けるか、もしくは交差されうる。
【実施例】
【００４９】
実施例
本実験は、熱安定性のある酵素の遺伝子、および比較的安価な基質を用いた。また、本方法は、パルプ漂白領域の候補であるDictyoglomus XynB酵素（Morris et al. Cloning of the xynB gene from Dictyoglomus thermophilum strain Rt46B.1 and action of the gene-product on kraft pulp. Appl. Environ. Microbiol 64:1759-1765,1998）に対する遺伝子に適用された。（さらに、突然変異誘発実験においてはカスタム合成された基質を用いた。）
【００５０】
実験および技法
遺伝子：Caldicellulosiruptor saccharolyticus β−グルコシダーゼ、bglA（Love et al. 
Sequence structure and expression of a cloned β-glucosidase from an extreme thermophile. Mol Gen Genet 213:84-92,1988）；基質：β−Ｄ−クロロインドリル−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）またはβ−Ｄ−クロロインドリル−グルコース（Ｘ−ｇｌｕ）。本ケースでは、ＢｇｌＡなどの加水分解酵素によってこれらの商用の基質が切断される結果、不溶性インディゴが細胞内に沈殿する。すべての実験で、ｂｇｌＡ遺伝子は、ｉｎ−ｆｒａｍｅで発現ベクターｐＰｒｏＥＸＨＴｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）にライゲーションされ、大腸菌ＤＨ５−αを形質転換した。検出可能なレベルのＢｇｌＡ遺伝子産物は、基質Ｘ−ｇａｌと基質Ｃ12ＦＤＧを用いて生成された。ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ  ＴＡＣプロモーターからの構成的発現のレベルが低かったのでＩＰＴＧによる誘導は必要とされなかった。
【００５１】
工程：
（ｉ）ＰＣＲ突然変異誘発によるＢｇｌＡ遺伝子の組換え遺伝子あたり１〜２個のアミノ酸の変化（Cadwell and Joyce） Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR methods Appl 2:28-33,1992）。突然変異誘発ＰＣＲは、Amplitaq（Perkin Elmer社）、最終濃度1×AmplitaqのＰＣＲ緩衝液、7mM  MgCL2、0.2mM  dGTP、0.2mM  dATP、1mM  dCTP、1mM  dTTP、0.5mM  MnCl2、0.2μM  フォワードプライマー、0.2uM  リバースプライマー、  および50μlの最終体積における0.1ng  ｂｇｌＡ鋳型の５つのユニットを用いて実現された。
【００５２】
（ｉｉ）突然変異誘発ＰＣＲの産物をベクターにライゲーションし、Δｌａｃ宿主を形質転換する。制限部位であるＮｃｏｌとＢａｍＨＩは、各々フォワードおよびリバースプライマーに組み込まれ、ｂｇｌＡ  ＰＣＲ産物の制限的消化、および同じ制限酵素で予め消化されたｐＰｒｏＥＸＨＴｃへの方向性ライゲーションが可能になった。ライゲーション混合物は、高度な反応能を有する大腸菌ＤＨ５−α（5×108 cfu/μg ＤＮＡ、Invitrogen）を形質転換した。
【００５３】
（ｉｉｉ）ＬＢ＋Ｘ−ｇａｌ（0.2mg/ml）＋アンピシリン（60μg/ml）中で形質転換混合物を増殖させ、ＢｇｌＡの発現およびＸ−ｇａｌの加水分解を可能にする。515-565nmでの発光を検出することにより、細胞をＦＡＣＳフローサイトメトリーによってインディゴ（ＢｇｌＡ+）を含有する細胞と（ＢｇｌＡ-）を含有しない細胞とに選別する。
【００５４】
（ｉｖ）ＢｇｌＡ+細胞を取り、９５℃１５分間で細胞を加熱することにより、プラスミドＤＮＡを放出させる。
【００５５】
（ｖ）工程（ｉ）に進んで繰り返す。放出されたプラスミドＤＮＡを次のラウンドの突然変異誘発ＰＣＲのための鋳型として利用する。
【００５６】
（ｖｉ）各ラウンドの最後に、組換えの一部を取り分け、これらにまだ活性があることをチェックし（また選別手順を確認するために＋ｖｅ対−ｖｅ比をチェックする）、一部の組換えの配列を決定し突然変異体の蓄積レベルを決定する。
【００５７】
工程（ｉ）から（ｖｉ）は、通常１〜２日で実施可能である。この技術により、細胞選別の各ラウンドにおいて、潜在的に約１０6存在する突然変異体からの選択することができる。もし単一点突然変異体のわずか１０％が活性を維持するならば、各ラウンドで潜在的に１０5の突然変異体が選別・保持されうる。本方法は、短時間に複数の突然変異体を有する組換え体の選択を行い、冗長なスクリーニング手順を省くことができる。
【００５８】
本発明者は、蛍光性のβ−ガラクトシダーゼ／β−グルコシダーゼ基質であるＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（C12FDG、Molecular Probes社、米国）は、ＢｇｌＡ＋表現型を発現する大腸菌細胞のフローサイトメトリー検出にとって良好な基質であることを見出した。本発明による方法の実施例において、該基質はＸ−ｇａｌの直接の代替となりうる。
【００５９】
本発明者は、Ｘ−ｇａｌの加水分解産物は、ＢｇｌＡ＋表現型を発現する細胞内でのインディゴの蓄積に基づき細胞選別に利用可能であることを示した。図２は、機能性酵素の存在下で、細胞内での色原体基質の酵素的加水分解によって、細菌性細胞の色を変化させる化学反応を示す。
【００６０】
図３は、アルゴンイオン４８８ｎｍレーザを搭載するBecton Dickinson FACS Caliburフローサイトメトリー・システムを用い、ＦＬ１発光フィルタ（５１５〜５６５ｎｍ）を使用して、これらのインディコ標識された細胞が非標識細胞から容易に区別されることを示す。
【００６１】
図４は、ＢｇｌＡ＋細胞内でのＢｇｌＡ表現型の発現およびＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの蓄積に基づくＦＡＣＳフローサイトメトリー（励起４８８、発光ＦＬ１  ５１５−５６５ｎｍ）による細胞集団の選別を示す。この結果、ＢｇｌＡ＋表現型（円の部分）を発現する細胞集団に対するＢｇｌＡ−表現型（円で囲まれていない部分）を発現する細胞集団の挙動が、各細胞内でのＢｇｌＡによるＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの加水分解による細胞蛍光に基づき、明確に示されている。
【００６２】
さらに、本発明者は、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの存在下で蛍光標識したＢｇｌＡ＋細胞は、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎ基質の存在下で６５℃５分間加熱される際に有意に強調されることを見出した。この場合、ｐＰｒｏＥＸＨＴａ：ｂｇｌＡを用いて形質転換されるＤＨ５−α細胞は、ＬＢ＋アンピシリン（６０μｇ／ｍｌ）の中で約１０時間の間に増殖させた。細胞は、遠心分離によって回収した後、１０μＭのＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎを含有する水の中で再懸濁し、水槽内において６５℃で５分間加熱した。つぎに、細胞を遠心分離し、沈殿物を基質の存在しない水の中に再懸濁した。図５は、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎで標識されたＢｇｌＡ＋大腸菌細胞のエピ蛍光顕微鏡画像（Ａｘｉｏｓｋｏｐ２顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、励起４５０〜４９０ｎｍ）を示す。観察される蛍光は、細胞内に拡散されたＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの加水分解によるものである。細胞を加熱することによって、大腸菌の細胞壁の膜電位が低下して、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎが細胞内に速やかに拡散し、ＢｇｌＡによって加水分解されるものと考えられる。
【００６３】
結果
細胞内で蓄積可能で蛍光によって検出されうる基質はすべて選別に利用されうる。Ｘ−ｇａｌおよびＸ−ｇｌｕなどのすべてのＸ−基質は、インディゴとして細胞内に蓄積され、利用される。Dictyoglomus thermophilum由来のＸｙｎＢの性能をさらに改善するためのキシラナーゼ突然変異誘発において利用するために、Ｘ−キシロビオースを合成することも（Ｘ−セロビオースが市販されていることから技術的に実現可能である）可能であろう。ランダムドリフト突然変異誘発目的に利用されるＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの方法で、多くの糖を蛍光標識することも可能であろう。
【００６４】
現在、基質は、β−グルクロニダーゼ（FDGlcU、Molecular Probes社）、β−グルコシダーゼ（FDGlu、Molecular Probes社）およびグルコセレブロシダーゼ（BIODIPY  FLC12-glucocerebroside、Molecular Probes社）用に合成されている。高温かつ高アルカリ条件下で酵素が機能しなければならない木材パルプ漂白用途においては、Dictyoglomus thermophilum由来のＸｙｎＢの性能をさらに改善するためのキシラナーゼ突然変異誘発において利用するために、蛍光標識されたキシロビオースが合成されうる。（Morris et al. Cloning loning of the xynB gene from Dictyoglomus thermophilum strain Rt46B.1 and action of the gene-product on kraft pulp. Appl. Environ. Microbiol. 64:1759-1765,1998）。さらに、既に商用プロセスで用いられているマンナナーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼおよびアミラーゼなどの他の多くの糖分解酵素は、蛍光物質を結合させた基質を合成可能な場合には、ランダムドリフト突然変異誘発による改善のための適切な候補となる可能性がある。
【００６５】
本発明の技術思想または範囲を逸脱することなしに、幅広く記載されている具体的な実施態様に示される程度に、多くの変更、修正の両方もしくはいずれか一方が本発明に施される可能性があることは、当業者によって認識されるであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる観点で例証として考えられるべきであり、制限的にとらえるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ランダムドリフト突然変異誘発の基本概念を概説するランダムドリフトの流れ図である。
【図２】Ｘ糖について、Ｘ−ｇａｌなどの基質を結合させたインドキシルの大腸菌内への拡散と、それに続く酵素的切断による不溶性の色原体インディゴの細胞内沈殿の形成の詳細を示した図である。
【図３】プラスミドｐＰｒｏＥＸＨＴｃ：ｂｇｌＡを含有する大腸菌ＤＨ５−α細胞内におけるＢｇｌＡ表現型の発現および不溶性インディゴの蓄積に基づく、ＦＡＣＳフローサイトメトリー（励起４８８、emission ＦＬ１  ５１５−５６５ｎｍ）による細胞選別の流れ図である。Ａ．色原体基質Ｘ−ｇａｌの存在下または非存在下における、プラスミドｐＰｒｏＥＸＨＴｃ：ｂｇｌＡまたはプラスミドｐＰｒｏＥＸＨＴｃのいずれかを含有する大腸菌細胞集団の選別。キー：赤：Ｘ−ｇａｌ存在下でＢｇｌＡを発現する細胞青：Ｘ−ｇａｌ非存在下でＢｇｌＡを発現する細胞緑：Ｘ−ｇａｌ存在下でのコントロール細胞（ベクターのみ）マゼンタ：Ｘ−ｇａｌ非存在下でのコントロール細胞（ベクターのみ）Ｂ．パート１  ＢｇｌＡ＋表現型（赤）を発現する細胞集団とこれに対するＢｇｌＡ−表現型（緑）を発現する細胞集団との間の明確な区別を示す、図３Ａを重ねて示したデータセット。パート２および３。Ｘ−ｇａｌの有無が観察される効果に寄与しなかったことを示す、図３Ａを重ねて示したデータセット。このデータは、このインディゴ沈殿物がＦＡＣＳ法によって大腸菌内で検出されうることを示す。
【図４】ＢｇｌＡ＋細胞内のＢｇｌＡ表現型の発現およびＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの蓄積に基づいたＦＡＣＳフローサイトメトリー（励起４８８、emission ＦＬ１  ５１５−５６５ｎｍ）による細胞集団選別を示す。結果として、ＢｇｌＡ＋表現型（円の部分）を発現する細胞集団と、ＢｇｌＡ−表現型（円で囲まれていない部分）を発現する細胞集団とが、ＢｇｌＡによる各細胞内でのＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの加水分解に起因する細胞蛍光に基づいて、明確に区別される。
【図５】Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの存在下で５分間、６５℃の熱ショックを受けてからｐＰｒｏＥＸＨＴｃ：ｂｇｌＡ（ＢｇｌＡ＋）で形質転換されたＤＨ５−α細胞のエピ蛍光顕微鏡による観察結果を示す。細胞蛍光は、熱ショックの過程で細胞内に拡散されたＩｍａｇｅｎｅ  Ｇｒｅｅｎの加水分解に起因する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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