(57)【要約】本発明は、アルキル置換PCDFを投与することによって前立腺新生物を調節する方法に関する。
2006514692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物：
【化１】
2006514692.tif 000006
（式中、R１、R３、R６およびR８、または、R２、R４、R６およびR８は個々に、かつ独立して水素であり、あるいは、塩素、フッ素および臭素、ならびに炭素数１〜４の直鎖アルキル基または分枝状アルキル基からなる群から選択される置換基である）、前記化合物は少なくとも1つのアルキル置換基および少なくとも2つのハロゲン置換基を有する、を有効量で対象に投与することを含む前立腺新生物を調節する方法。
【請求項２】
ハロゲン置換基が、塩素、臭素およびフッ素からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アルキル置換基が、メチル基、エチル基およびプロピル基からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
化合物が6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフランである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
化合物が8−メチル−1，3，6−トリクロロジベンゾフランである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
化合物が6−プロピル−1，3，8−トリクロロジベンゾフランである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
化合物が、6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン、8−メチル−1，3，6−トリクロロジベンゾフラン、6−エチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン、6−プロピル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン、6−メチル−2，3，8−トリクロロジベンゾフラン、6−メチル−2，3，4，8−テトラクロロジベンゾフラン、8−メチル−1，3，7−トリクロロジベンゾフラン、8−メチル−1，2，4，7−テトラクロロジベンゾフラン、8−メチル−2，3，7−トリクロロジベンゾフランおよび8−メチル−2，3，4，7−テトラクロロジベンゾフランからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
新生物がアンドロゲン応答性である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
新生物がアンドロゲン非応答性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
新生物が良性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
新生物が悪性である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
アンドロゲン依存性腫瘍を処置する方法であって、そのような処置を必要としている対象に6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフランを有効量で投与することを含む方法。
【請求項１３】
アンドロゲン非依存性腫瘍を処置する方法であって、そのような処置を必要としている対象に6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフランを有効量で投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第60／382，693号（2002年5月22日出願；これは引用により本明細書中に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から受けたNIH補助金番号ES09106、および国防総省陸軍医学研究・資材司令部から受けたDAMD17−02−0147のもとでの政府援助によりなされた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は腫瘍の治療および防止に関する。より詳細には、本発明は、前立腺新生物を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
前立腺ガンは、北米男性における最も一般的に診断されるガンであり、300，000人以上の新たな患者が、毎年、診断されることが推定されている（Landis他、1998；Shibata他、1998）。前立腺ガンの発病率および死亡率が増大し続けており、これは、部分的には、ますます高齢化する人口のためであり、また、この疾患の発生率が高齢男性ではより大きいためである（Gao他、1997；Chiarodo、1991）。良性前立腺肥大（BPH）および前立腺ガンはともに、去勢男性では少ないか、または検出されず、従って、年齢の進行だけでなく、精巣の存在およびアンドロゲン機能にも関係づけられている（Gao他、1997；Chiarodo、1991；SaktiおよびCrawford、1993）。
【０００５】
初期の前立腺ガンは、アンドロゲン依存性の傾向があり、機能的なアンドロゲン受容体（AR）の発現を要求し、これに対して、後期段階の腫瘍は、場合によりAR機能の喪失と相関させられるアンドロゲン非依存性に進行する（Cheng他、1993）。興味深いことに、男性における前立腺ガンでのホルモン依存的な初期段階から後期段階のホルモン非依存性への進行が、エストロゲン応答性が初期段階または後期段階の疾患の女性において類似するパターンで変遷する、女性における乳ガンについても認められる（HoppおよびFuqua、1999；Fuqua他、1995）。
【０００６】
前立腺ガンの治療は腫瘍の病期段階およびAR発現に依存している。初期段階のアンドロゲン応答性前立腺ガンは、去勢によって、または、ステロイド系抗アンドロゲン剤（シプロテロン）、LHRHアナログ、非ステロイド系抗アンドロゲン剤（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）および強力なエストロゲン性薬物ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）などの様々な抗アンドロゲン剤、または、アンドロゲンにより誘導される応答を阻止する薬物を用いて処置することができる（Sadar他、1999；Klotz他、2000；Morris他、2000；Boccardo、2000に総説される）。さらに、前立腺ガンおよび他の腫瘍タイプを処置するための可能性のある新規な方法がいくつかあり、これらには、腫瘍細胞の増殖および転移に関与する重要な遺伝子を標的化すること（例えば、血管新生阻害剤、アンチセンス治療）が含まれる（Boasberg他、1997；Knox他、1998；1998；Yamaoka他、1993；Folkman、1995；Folkman、1971）。核受容体（NR）に対するリガンドもまた、レチノイド酸／X受容体と結合するリガンドまたは薬物（レチノイド類）、ビタミンD受容体と結合するリガンドまたは薬物（カルシトロール）、およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γと結合するリガンドまたは薬物（トロギラタゾン）などの様々なリガンドまたは薬物を伴う、阻害的なNR−ARクロストークを介する前立腺ガンの処置のために開発中である（Dorai他、1997；Pienta他、1993；Pollard他、1991；Kelly他、1996；Miller他、1992；Miller他、1995；Peehl他、1994；Gross他、1998；Kubota他、1998；Tontonoz他、1997；Tontonoz他、1994；Smith他、1999）。
【０００７】
本発明は、アルキル置換されたポリ塩化ジベンゾフラン（PCDF）を前立腺ガンの処置のための新しい化学治療剤として利用する最初のものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は腫瘍の治療および防止に関する。より詳細には、本発明は、前立腺新生物を調節するための方法に関する。本発明は、アンドロゲン応答性新生物またはアンドロゲン非応答性新生物に罹患している対象を処置するために使用され得ることが想定される。さらに、本発明において使用される化合物はアリール炭化水素受容体（AhR）に対するリガンドであることが考えられる。本発明において使用されるAhRアゴニストは、前立腺新生物の調節をもたらすホルモン受容体との阻害的なAhRクロストークを受けることが予想される。従って、AhRアゴニストは選択的なAhR調節剤（SAhRM）である。
【０００９】
本発明は、下記の式の化合物の有効量を対象に投与することを含む、前立腺新生物を調節する方法を提供する：
【００１０】
【化２】
2006514692.tif 000003
上記式において、R１、R３、R６およびR８、または、R２、R４、R６およびR８は個々に、かつ独立して水素であり、あるいは、塩素、フッ素および臭素、ならびに炭素数1〜4の直鎖アルキル基または分枝状アルキル基からなる群から選択される置換基である。好ましくは、化合物は少なくとも1つのアルキル置換基および少なくとも2つのハロゲン置換基を含有する。より好ましくは、ハロゲン置換基は、塩素、臭素およびフッ素からなる群から選択され、アルキル置換基は、メチル基、エチル基およびプロピル基からなる群から選択される。
【００１１】
具体的な実施形態において、化合物は、6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン、8−メチル−1，3，6−トリクロロジベンゾフラン、6−エチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン、6−プロピル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン、6−メチル−2，3，8−トリクロロジベンゾフラン、6−メチル−2，3，4，8−テトラクロロジベンゾフラン、8−メチル−1，3，7−トリクロロジベンゾフラン、8−メチル−1，2，4，7−テトラクロロジベンゾフラン、8−メチル−2，3，7−トリクロロジベンゾフランまたは8−メチル−2，3，4，7−テトラクロロジベンゾフランから選択することができる。
【００１２】
別の実施形態は、アンドロゲン依存性腫瘍またはアンドロゲン非依存性腫瘍を処置する方法であって、そのような処置を必要としている対象に6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフランの有効量を投与することを含む方法である。
【００１３】
前記には、下記の本発明の詳細な記載がより良好に理解され得るために、本発明の特徴および技術的利点がかなり大まかに概略されている。本発明のさらなる特徴および利点が本明細書中下記に記載され、これらは本発明の請求項の主題を形成している。開示される概念および具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を行うために他の様々な構成を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者によって理解されるはずである。また、様々なそのような等価な構成が、添付された請求項に示されるような本発明の精神および範囲から逸脱しないことも当業者によって理解されるはずである。さらなる目的および利点とともに、その構成および操作方法の両方に関して、本発明に特徴的であると考えられる新規な特徴が、添付されている図面と一緒に検討されたとき、下記の記載からより良好に理解される。しかしながら、明らかなことではあるが、図のそれぞれは、例示および説明のために提供されるだけであり、本発明の限定の定義として意図されないことを理解しなければならない。
【００１４】
本発明をより完全に理解するために、次に、添付されている図面とともに理解される下記の記載が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
様々な実施形態および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示される発明に対してなされ得ることが当業者には容易に明らかである。
【００１６】
A．定義
本明細書中で使用される場合、語「a」または語「an」の使用は、請求項および／または明細書において用語「含む」と一緒に使用されるとき、「one（1つ）」を意味する場合があり、しかし、それらはまた、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは2つ以上」の意味と一致する。
【００１７】
本明細書中で使用される用語「アンドロゲン」は、例えば、男性性器の活性を刺激し、男性性徴の発達等を促す典型的にはホルモンである薬剤（例えば、アンドロステロン、テストステロン）を示す。本発明において使用されるアンドロゲンは、自然もしくは天然のアンドロゲン、合成アンドロゲン、または各種アンドロゲンの誘導体であり得る。
【００１８】
用語「アンドロゲン応答性（的）」は、発達、増殖および／または転移するためにアンドロゲンまたはその誘導体を利用する新生物を示す。その上さらに、本明細書中で使用されるとき、用語「アンドロゲン応答性（的）」および用語「アンドロゲン依存的」は交換可能である。
【００１９】
本明細書中で使用される用語「有効量」は、新生物の増殖を低下、減少、阻害、もしくはそうでない場合には阻止するか、またはアポトーシスを誘導するか、または新生物の血管新生を阻害するか、または転移を阻害するか、または新生物における細胞毒性を誘導する薬剤の量として定義される。従って、有効量は、疾患またはその症状の程度を検出可能かつ反復的に改善、軽減、最小化または制限するために十分な量である。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「調節する」は、機能の抑制、増強または誘導を示す。より詳細には、「調節する」または「調整する」はまた、タンパク質、酵素、阻害剤、シグナル伝達物質、受容体、転写活性化因子、補因子などの生物学的活性を増大または低下させる方法、状態または薬剤を示す。そのような増強または阻害は、特定の事象（例えば、シグナル伝達経路の活性化など）が生じたときに伴うことがあり、および／または、ある種の細胞型においてだけ現れることがある。具体的な実施形態において、「調節する」は、例えば、過増殖性細胞または新生物細胞などを増殖させる細胞の能力を増大または低下させることを示す。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「前立腺」は、男性または女性の尿道の上部の部分を取り囲む構造部を示す。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「新生物」は、組織の異常な形成物（例えば、腫瘍）を示す。当業者は、新生物には、良性腫瘍および／または悪性腫瘍が包含されることを認識している。さらに、本明細書中で使用されるとき、用語「新生物」および用語「腫瘍」は交換可能である。
【００２３】
用語「アンドロゲン非応答性（的）」は、発達、増殖および／または転移するためにアンドロゲンまたはその誘導体を利用しない新生物を示す。その上さらに、本明細書中で使用されるとき、用語「アンドロゲン非応答性（的）」および用語「アンドロゲン非依存的」は交換可能である。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「対象」は、本発明の組成物が、本明細書中に記載される方法に従って投与される任意の哺乳動物対象を意味することが理解される。具体的な実施形態において、本発明の方法は、ヒト対象を処置するために用いられる。別の実施形態では、前立腺新生物に罹患しているヒト対象を処置することが含まれる。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「治療有効量」は、疾患または状態の症状の改善または矯正をもたらす量を示す。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「処置する」および用語「処置」は、対象が疾患における改善を有するように、アルキル置換PCDFの治療有効量を対象に投与することを示す。改善は症状の任意の改善または矯正である。改善は、観察可能または測定可能な改善である。従って、当業者は、処置により、疾患状態が改善され得ること、しかし、処置は疾患に対する完全な治療でないことを認識している。
【００２７】
B．前立腺新生物の処置
特定の実施形態において、前立腺新生物に罹患している対象が、アルキル置換されたポリ塩化ジベンゾフラン（PCDF）の治療有効量を対象に投与することによって処置され得る。対象は好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００２８】
本発明において使用されるアルキル置換PCDFは、アリール炭化水素受容体（AhR）に対するリガンドである。本発明において使用されるこれらのアルキル置換PCDFは、前立腺新生物の調節をもたらすホルモン受容体との阻害的なAhRクロストークを受けることが想定される。従って、本発明のアルキル置換PCDFは選択的なAhR調節因子（SAhMR）である。
【００２９】
さらに、転移する新生物が本発明において処置され得ることが考えられる。転移は、二次的な腫瘍成長の確立を生じさせる、通常的には血流またはリンパ系を介した原発性腫瘍部位から非連続部位への細胞の拡大であることが当業者によって理解される。
【００３０】
1．処置のために使用される化合物
本発明において利用される化合物は、1，3，6，8−置換または2，4，6，8−置換されたアルキルPCDFである。可能な置換基には、臭素、塩素、フッ素などのハロゲン、および／または、炭素数約1〜5のアルキル基などの直鎖置換基もしくは分枝状置換基が含まれる。2位、4位、6位または8位、および、1位、3位、6位または8位はまた、個々に、かつ独立して、置換基の代わりに水素により占有され得る。好適なアルキル置換基には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル（i−プロピル）基、n−ブチル基、sec−ブチル基またはtert−ブチル基が含まれるが、これらに限定されない。本発明におけるPCDFは少なくとも1つのアルキル置換基を含有することが想定されるが、PCDFが2つ以上のアルキル置換基を含有し得ることは十分に本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明において使用されるPCDFは、例えば、米国特許第5，516，790号（Stephen Safe、1996年5月14日発行；これはその全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。PCDFには、下記式を有するPCDFが含まれ得るが、それらに限定されない：
【００３２】
【化３】
2006514692.tif 000004
R１、R３、R６およびR８、または、R２、R４、R６およびR８は個々に、かつ独立して水素であり、あるいは、塩素、フッ素および臭素、ならびに炭素数1〜4の直鎖アルキル基または分枝状アルキル基からなる群から選択される置換基である。ここで、化合物は少なくとも1つのアルキル置換基および少なくとも2つのハロゲン置換基を有する。さらに、ハロゲンは塩素である場合があり、アルキル置換基は、メチル基、エチル基およびプロピル基からなる群から選択される場合がある；R６はアルキル置換基である場合があり、R１、R３およびR８は、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される場合がある；さらになおかつ、R８はアルキル置換基である場合があり、R１、R３およびR６は、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される場合があり、アルキル置換基はメチルである場合がある；さらに、R６はアルキルである場合があり、R２、R４およびR８は、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される場合がある；例えば、R８はアルキル置換基である場合があり、R２、R４およびR6は、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される場合がある。
【００３３】
例示的な化合物には、6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン（6−MCDF）、8−メチル−1，3，6−トリクロロジベンゾフラン（8−MCDF）、6−エチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン（6−エチル−1，3，8−トリCDF）、6−n−プロピル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン（6−n−プロピル−1，3，8−トリCDF）、6−i−プロピル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン（6−i−プロピル−1，3，8−トリCDF）、6−メチル−2，3，8−トリクロロジベンゾフラン（6−メチル−2，3，8−トリCDF）、6−メチル−2，3，4，8−テトラクロロジベンゾフラン（6−メチル−2，3，4，8−テトラCDF）、8−メチル−1，3，7−トリクロロジベンゾフラン（8−メチル−1，3，7−トリCDF）、8−メチル−1，2，4，7−テトラクロロジベンゾフラン（8−メチル−1，2，4，7−テトラCDF）、8−メチル−2，3，7−トリクロロジベンゾフラン（8−メチル−2，3，7−トリCDF）、8−メチル−2，3，4，7−テトラクロロジベンゾフラン（8−メチル−2，3，4，7−テトラCDF）、ならびに、8−メチル−2，3，7−トリクロロジベンゾ−p−ジオキシンおよび8−メチル−2，3，7−トリブロモジベンゾ−p−ジオキシンが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
2．処置計画
処置計画もまた変化することがあり、多くの場合、腫瘍タイプ、腫瘍位置、疾患の進行、ならびに患者の健康状態および年齢に依存し得る。自明なことではあるが、ある種のタイプの腫瘍はより積極的な処置を必要とし、その一方で、同時に、特定の患者は、より負担の大きいプロトコルに耐えることができない。臨床医は、治療製剤の知られている効力および（存在する場合には）毒性に基づいてそのような決定をするのに最も適している。
【００３５】
好ましくは、処置される患者は、十分な骨髄機能（これは、2，000／mm３を超える末梢の絶対的顆粒球数および100，000／mm3の血小板数として定義される）、十分な肝機能（1．5mg／dl未満のビリルビン）および十分な腎機能（1．5mg／dl未満のクレアチニン）を有する。
【００３６】
本発明の方法および組成物を使用して、新生物細胞を殺すために、また、新生物細胞の増殖を阻害するために、または、転移を阻害するために、また、新生物またはは組織のサイズを減少させるために、または、そうでない場合には、新生物細胞の悪性表現型を逆転または軽減させるために、新生物を、一般には、本発明のアルキル置換PCDFの有効量と接触させられる。投与経路は、当然のことではあるが、病変部の位置および性質に関して変化し、投与経路には、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、腫瘍内、潅流、潅注、直接的な注射、ならびに経口投与および経口製剤が含まれる。
【００３７】
本発明において使用されるアルキル置換PCDFの有効量は、新生物の増殖を低下、減少、阻害、もしくはそうでない場合には阻止する量、またはアポトーシスを誘導する量、または新生物の血管新生を阻害する量、または転移を阻害する量、または新生物において細胞毒性を誘導する量である。従って、有効量は、疾患またはその症状の程度を検出可能かつ反復的に改善、軽減、最小化または制限するために十分な量である。
【００３８】
外科的介入の場合、本発明は、手術不可能な腫瘍を切除できるようにするために手術前に使用することができる。あるいは、本発明は、残存する疾患または転移した疾患を処置するために、手術時および／またはその後で使用することができる。例えば、腫瘍が切除された腫瘍床に、アルキル置換PCDFを含む製剤を注入または潅流することができる。潅流は、例えば、手術部位にカテーテル埋め込んだままにすることによって切除後に続けることができる。定期的な術後処置もまた考えられる。
【００３９】
連続投与もまた、適する場合には、例えば、腫瘍が切除され、腫瘍床が、残留する微視的な疾患を除くために処置される場合、適用することができる。シリンジまたはカテーテル設置による送達が好ましい。そのような連続潅流は、処置開始後、約1時間〜2時間から、約2時間〜6時間まで、約6時間〜12時間まで、約12時間〜24時間まで、約1日〜2日まで、約1週間〜2週間またはそれ以上までの期間にわたって行うことができる。一般には、連続潅流を介するアルキル置換PCDF組成物の用量は、単回注射または複数回注射によって与えられる用量と等しく、潅流が行われる期間にわたって調節される。
【００４０】
特定の実施形態において、処置されている腫瘍は、少なくとも最初は切除可能でない場合がある。アルキル置換PCDFによる処置は、縁が収縮するために、または特定の特に浸襲性の部分を除くことによって腫瘍の切除可能性を増大させることができる。処置後、切除が可能になり得る。切除後のさらなる処置は、腫瘍部位における微視的な残存疾患を除くために役立つ。
【００４１】
典型的な処置経過では、原発性腫瘍または切除後の腫瘍床の場合、多数回の投薬を伴う。典型的な原発性腫瘍処置では、2週間の期間にわたって6回の投薬適用を伴う。この2週間の治療計画を、1回、2回、3回、4回、5回、6回またはそれ以上繰り返すことができる。処置経過期間中、予定されている投薬を完了させる必要性が再評価され得る。
【００４２】
処置は様々な「単位用量物」を含む場合がある。単位用量物は、アルキル置換PCDFの有効量の事前に決定された量を含有するとして定義される。投与される量、ならびに特定の経路および剤形は臨床分野の当業者の範囲内である。単位用量物は、単回注射物として投与する必要はないが、設定された期間にわたる連続注入を含む場合がある。
【００４３】
C．併用処置
アルキル置換PCDFの有効性を増大させるために、アルキル置換PCDFを、前立腺腫瘍の処置において効果的な他の薬剤（例えば、抗ガン剤など）と、または手術と併用することが望ましい場合がある。アルキル置換PCDFをさらなる抗ガン剤との組合せで投与することも考えられる。「抗ガン」剤は、例えば、ガン細胞を殺すことによって、または、ガン細胞においてアポトーシスを誘導することによって、または、ガン細胞の増殖速度を低下させることによって、または、転移の発生もしくは数を減少させることによって、または、腫瘍サイズを低下させることによって、または、腫瘍成長を阻害することによって、または、腫瘍細胞もしくはガン細胞への血液供給を低下させることによって、または、ガン細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進させることによって、または、ガンの進行を防止もしくは阻害することによって、または、ガンを有する対象の寿命を増大させることによって、対象におけるガンに負の影響を及ぼすことができる。抗ガン剤には、生物学的薬剤（生物療法）、化学療法剤および放射線療法剤が含まれる。より一般的には、これらの他の組成物は、腫瘍細胞の増殖または腫瘍の成長を中止させるか、または阻害するために効果的な併用用量で与えられる。このプロセスでは、細胞をアルキル置換PCDFおよび抗ガン剤または多数の因子と同時に接触させることが伴い得る。これは、細胞を、アルキル置換PCDFおよび抗ガン剤の両方を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と接触させることによって、または、細胞を2つの別個の組成物もしくは製剤（この場合、一方の組成物がアルキル置換PCDFを含み、もう一方が第2の薬剤もしくは抗ガン剤を含む）と同時に接触させることによって達成され得る。
【００４４】
あるいは、本発明のアルキル置換PCDFの前または後に、数分から数週間の間隔による他の抗ガン剤処置を行うことができる。他の抗ガン剤およびアルキル置換PCDFが細胞に対して別々に適用される実施形態では、抗ガン剤およびアルキル置換PCDFが細胞に対する好都合な組合せ効果を依然として発揮することができるように、意味のある期間がそれぞれの送達時間との間で失効しなかったことを一般には確保する。そのような例では、細胞を、互いに約12時間〜24時間以内に、より好ましくは互いに約6時間〜12時間以内に、両方の治療と接触させることが考えられる。しかしながら、場合により、数日（2日、3日、4日、5日、6日または7日）から数週間（1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間または8週間）がそれぞれの投与の間に経過する場合、処置に対する期間を著しく延ばすことが望ましい場合がある。
【００４５】
様々な組合せを用いることができ、アルキル置換PCDFを「A」とし、第二の薬剤（例えば、抗ガン剤または抗ガン治療など）を「B」とすると、例えば、
A／B／A、B／A／B、B／B／A、A／A／B、A／B／B、B／A／A、A／B／B／B、B／A／B／B、B／B／B／A、B／B／A／B、A／A／B／B、A／B／A／B、A／B／B／A、B／B／A／A、B／A／B／A、B／A／A／B、A／A／A／B、B／A／A／A、A／B／A／A、A／A／B／A
を用いることができる。
【００４６】
1．化学療法
ガン治療にはまた、化学物質に基づく様々な処置が含まれる。化学療法剤のいくつかの例には、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、マイトマイシン（これはまたムタマイシンおよび／またはマイトマイシン−Cとして知られている）、アクチノマイシンD（ダクチノマシン）、ブレオマシン、プリコマイシンなどの抗生物質化学療法剤、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド、シスプラチン（CDDP）、エトポシド（VP16）、腫瘍壊死因子およびカルムスチン、メルファラン（これはまた、アルケラン、L−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、L−PAMまたはL−サルコリシンとして知られており、これはナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である）、シクロホスファミド、クロラムブチル、ブスルファン（これはまたミレランとして知られている）、ロムスチンなどのアルキル化剤など種々の薬剤が含まれる。
【００４７】
他の薬剤のいくつかの例には、エストラムスチン、タキソール、パクリタキセル、ドキタキセル、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5−フルオロウラシル、過酸化水素、およびメトトレキサート、テマゾロミド（DTICの水性形態）、ドラスタチン−10、ブリオスタチン、または前記の任意のアナログもしくは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
2．放射線療法剤
放射線療法剤および放射線療法因子には、DNA損傷を誘導する放射線および波動（例えば、γ線、X線、UV線、マイクロ波、電子線、放射性同位体など）が含まれる。治療は、位置決定された腫瘍部位に上記形態の放射線を照射することによって達成することができる。おそらくは、これら因子のすべてが、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対して広範囲の損傷DNAを生じさせるようである。
【００４９】
X線に対する線量範囲は、長期間（3週間〜4週間）については50レントゲン〜200レントゲンの1日線量から、2000レントゲン〜6000レントゲンの単回線量までに及ぶ。放射性同位体に対する線量範囲は非常に広範囲に変化し、同位体の半減期、放射される放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００５０】
3．外科手術
ガン患者の約60％が、予防的手術、診断的手術または病期分類手術、治療的手術および緩和的手術を含む何らかの種類の手術を受ける。治療的手術は、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替治療などの他の治療と一緒に使用され得るガン処置である。
【００５１】
治療的手術には、ガン性組織のすべてまたは一部が物理的に除去、摘出および／または破壊される切除が含まれる。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを示す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置には、レーザー外科手術、冷凍外科手術、電気外科手術、および顕微鏡制御外科手術（モーズ手術）が含まれる。本発明は、表層ガン、前ガン、または偶発的な量の正常組織の除去と一緒に使用され得ることがさらに考えられる。
【００５２】
ガン性の細胞、組織または腫瘍の一部またはすべてが摘出されたとき、空洞が体内に形成される場合がある。処置は、さらなる抗ガン治療を用いたそのような領域への潅流、直接的な注射または局所的な適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎もしくは7日毎に、または、1週間毎、2週間毎、3週間毎、4週間毎および5週間毎に、または、1ヶ月毎、2ヶ月毎、3ヶ月毎、4ヶ月毎、5ヶ月毎、6ヶ月毎、7ヶ月毎、8ヶ月毎、9ヶ月毎、10ヶ月毎、11ヶ月毎もしくは12ヶ月毎に繰り返すことができる。これらの処置も同様に、様々な投薬量で行われ得る。
【００５３】
4．遺伝子治療
さらに別の実施形態において、本明細書中に記載されるアルキル置換PCDFを使用する併用治療と組み合わせた遺伝子治療が考えられる。本発明との組合せでの何らかの形態の遺伝子治療のために標的化され得る様々な遺伝子には、細胞周期遺伝子、すなわち、サイクリンE、サイクリンA、cdk4、cdk2、cdk6、cdk7、サイクリンH、cdc25A、p21、p27、および網膜芽細胞腫（Rb）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
5．生物学的薬剤
他の様々な薬剤が、処置の治療的効力を改善するために本発明との組合せて使用され得ることが考えられる。化学療法と一緒に使用される1つの治療形態には、患者の組織が（106ｏFまでの）高い温度にさらされる手法である温熱療法が含まれる。体外加熱装置または体内加熱装置が、局所的温熱療法、限局的温熱療法または全身温熱療法の適用には伴い得る。局所的温熱療法では、腫瘍などの小さい領域に熱を加えることを含む。熱は、体外の装置から腫瘍を標的化する高周波を用いて体外から生じさせることができる。体内加熱は、薄い加熱されたワイヤもしくは温水で満たされた中空チューブ、埋め込まれたマイクロ波アンテナ、または無線周波数電極を含む無菌プローブを含む。
【００５５】
患者の器官または四肢が限局的温熱療法のために加熱されるが、これは、高エネルギーをもたらす装置（例えば、磁石など）を使用して達成される。あるいは、患者血液の一部が取り出され、加熱され、その後、内部から加熱される領域の中に潅流させることができる。全身加熱もまた、ガンが全身に広がっている場合には実施することができる。温水毛布、熱ろう、誘導コイルおよび加熱室をこの目的のために使用することができる。
【００５６】
アジュバント治療もまた、本発明と一緒に使用することができる。アジュバントまたは免疫調節剤の使用には、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ；IL−2および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカインアナログ；または、MIP−1、MIP−1β、MCP−1、RANTESおよび他のケモカインが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
6．免疫療法
免疫療法剤は、一般に、ガン細胞を標的化および破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に依拠する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面に存在する何らかのマーカーに対して特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療のエフェクターとして役立つことができ、または、細胞殺傷を実際に行うために他の細胞を呼び寄せることができる。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合することができ、標的化剤として単に役立たせることができる。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【００５８】
ガンを処置するために使用される様々なワクチンが、処置の治療的効力を改善するために本発明と組合せて使用されることが考えられる。そのようなワクチンには、ペプチドワクチンまたは樹状細胞ワクチンが含まれる。ペプチドワクチンは、細胞溶解性Tリンパ球によって認識される任意の腫瘍特異的抗原を含むことができる。さらに、当業者は、樹状細胞ワクチン接種が、ペプチドまたは抗原でパルス処理される樹状細胞を含み、かつ、パルス処理された樹状細胞が患者に投与されることを認識している。
【００５９】
7．ホルモン療法
ホルモン療法もまた、本発明と組み合わせて使用することができる。抗アンドロゲン剤であるか、または、アンドロゲンにより誘導される応答を阻止することが知られている化合物を本発明のアルキル置換PCDFと組合せて使用することができる。例えば、抗アンドロゲン剤には、ステロイド系抗アンドロゲン剤（すなわち、シプロテロン、黄体形成ホルモン放出ホルモンアナログ）および非ステロイド系抗アンドロゲン剤（すなわち、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）が含まれる。他のホルモン処置でもまた、エストロゲン性薬物（例えば、ジエチルスチルベストロール）を含むことができる。
【００６０】
D．医薬用製剤および送達
本明細書中に開示されるアルキル置換PCDFは、米国特許第5，543，158号、米国特許第5，641，515号および米国特許第5，399，363号（これらはそれぞれがその全体において引用により本明細書中に特に組み込まれる）に記載されるように、非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、経皮的に、腫瘍内に、または腹腔内にも投与することができる。
【００６１】
遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としてのアルキル置換PCDFの溶液を、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなど）と好適に混合された水中で調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、また、オイル中で調製することができる。貯蔵および使用の一般的な条件のもとで、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。注射使用のために好適な医薬用形態は、無菌の注射用溶液または注射用分散物を必要に応じて調製するための無菌の水溶液または水性分散液および無菌の粉末を含む（米国特許第5，466，468号はその全体が引用により本明細書中に特に組み込まれる）。すべての場合において、形態物は無菌でなければならず、また、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性でなければならない。形態物は、製造および貯蔵の条件のもとで安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物および／または植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性が、例えば、コーティング剤（例えば、レシチンなど）に使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズを維持することによって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の働きを防止することが、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物の長期にわたる吸収が、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に使用することによってもたらされ得る。
【００６２】
例えば、水溶液での非経口投与の場合、溶液は、必要により、好適に緩衝化されなければならず、液体希釈剤が、最初に、十分な生理的食塩水またはグルコースで等張性にされなければならない。これら特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与および腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、用いられ得る様々な滅菌した水性媒体が、本開示に照らして当業者には知られている。例えば、1個の投薬物を1mlの等張性NaCl溶液に溶解することができ、これを1000mlの皮下注入液に加えることができ、または、予定された注入部位に注射することができる（例えば、“Remington's  Pharmaceutical  Sciences”、第15版、1035頁〜1038頁および1570頁〜1580頁を参照のこと）。投薬量における何らかの変化が、処置されている対象の状態に依存して生じることは避けられない。投与責任者は、いかなる場合でも、個々の対象について適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与の場合、調製物は、FDA生物製剤局によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性および純度の各基準を満たさなければならない。
【００６３】
無菌の注射用溶液は、必要量のアルキル置換PCDFを、必要な場合には上記に列挙された様々なそれ以外の成分とともに適切な溶媒に配合し、その後、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒体と、上記に列挙された成分からの要求される他の成分とを含有する無菌のビヒクルに様々な滅菌された有効成分を配合することによって調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法としては、真空乾燥技術および凍結乾燥技術があり、これにより滅菌した溶液から有効成分および任意のさらなる所望される成分の粉末が得られる。
【実施例】
【００６４】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために包含される。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために本発明者らによって発見された技術を表しており、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変化が、開示されている具体的な実施形態においてなされ得ること、また、多くの変化により、同様な結果または類似する結果が依然として得られ得ることを、本開示に照らして理解しなければならない。
【００６５】
＜実施例１＞
一過性トランスフェクションアッセイ
ZR−75ヒト乳ガン細胞およびLNCaPヒト前立腺ガン細胞がAmerican  Type  Culture  Collection（Manassas、VA）から得た。これを、10％のFBS、1％の抗生物質／抗カビ剤溶液、1．5g／Lの重炭酸ナトリウムおよび10mMのHEPES（7．4の最終pH）を添加したRPMI1640培地で維持した。細胞を、2．5％の活性炭処理されたウシ胎児血清（FBS）を添加したフェノールレッド非含有DME−F12において22mmのウエルあたり2．75×105細胞で播種した。24時間後に、細胞を、製造者の説明書に従ってLipofectaminおよびPlus試薬（Invitrogen）を使用してトランスフェクトした。LNCaP細胞およびZR−75細胞を、500ng／ウエルのどちらかのレポータープラスミドおよび内部コントロールとしての250ng／ウエルのpcDNA3．1−β−gal（Invitrogen）でトランスフェクトした。さらに、ZR−75細胞を500ngのhARでトランスフェクトした。処理後24時間で、細胞を200μL／ウエルのレポーター溶解緩衝液を用いてはぎ取ることによって集めた。溶解液を40，000gで遠心分離し、ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を、Lumicountルミノメーター（PerkinElmer、Boston、MA）を使用して、サンプルあたり30μLの上清抽出物を用いてアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、それぞれのトランスフェクトしたウエルについてβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。
【００６６】
＜実施例２＞
細胞増殖アッセイ
トリプシン処理および低速遠心分離の後、LNCaP細胞を再懸濁し、Coulter細胞カウンター（Beckman  Coulter、Fullerton、CA）を使用して計数した。細胞を、2．5％の活性炭処理されたウシ胎児血清（FBS）を添加したフェノールレッド非含有DME−F12を使用して5×104個／35mmウエルの密度で播種した。播種後24時間で、最初の処理を加え、その後、続いて、トリプシン処理によって集められるまで、2日毎に新しい培地を再び加えた。細胞を集めた後、細胞を、Coulterカウンターを使用して計数した。
【００６７】
＜実施例３＞
蛍光標示式細胞分取分析（FACS）
細胞を、CellQuest（Becton  Dickinson）（画像）取り込みソフトウエアを使用して、15mW空冷アルゴンレーザーを備えるFACS  Calibur（Becton  Dickinson、San  Jose、CA）フローサイトメーターで分析した。ヨウ化プロピジウム（PI）の蛍光を585／42nmの帯域通過フィルターによって集め、リストモードデータを、PI幅対PI面積のドットプロットにより規定される少なくとも12,000個の単一細胞について取得した。データ分析を、細胞凝集物を除くためにPI幅対PI面積を使用するModFit  LT（Verity  Software  House、Topsham、ME）で行った。
【００６８】
＜実施例４＞
ウエスタン免疫ブロット分析
細胞を、200μL／22mmウエルの氷冷された溶解緩衝液（50mMのHEPES（pH7．5）、500mMのNaCl、10％（v／v）のグリセロール、1％（v／v）のトリトンX−100、1．5mMのMgCl2、1mMのEGTA）（McDougal他、2001）を使用して処理後6時間に集めた。溶解物を40,000gで遠心分離して、上清を抽出物として集めた。全細胞抽出物（50μg／サンプル）を7.5％（上部）／12．5％（底部）の勾配SDS−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、PVDFメンブラン（Bio−Rad、Richmond、CA）に転写した。メンブランを、5％ミルク（m／v）を含むトリス緩衝生理的食塩水−0．05％Tween（TBST）でブロッキングした。メンブランを、5％ミルク／TBSTにおいて1：1000で3時間、ARに対する一次抗体（sc−7305）、サイクリンD1に対する一次抗体（sc−718）、またはp27に対する一次抗体（sc−528）（これらはそれぞれがSanta  Cruz  Biotechnology（Santa  Cruz、CA）から入手）とともにインキュベーションした。メンブランをTBSTで2回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体を5％ミルク／TBSTにおいて1：5000で1時間加えた。2回のTBST洗浄の後、PVDFに結合している抗体を、化学発光キット（Western  Lightning、PerkinElmer）、ImageTek−Hフィルム（American  X−Ray  and  Medical  Supply、Rancho  Cordova、CA）および自動処理装置（Hope  Macro−Med、Warminster、PA）を使用して検出した。ウエスタンブロットの定量を、Sharp  JX−330スキャナー（Sharp、Mahwah、NJ）およびZero−Dソフトウエア（Scanalytics、Billerica、MA）を使用して行った。
【００６９】
＜実施例５＞
AhRの発現および機能の特徴づけ
アンドロゲン応答性の前立腺ガン細胞株22Rv1およびアンドロゲン非応答性の前立腺ガン細胞株PC3をTCDDで処理し、エトキシレゾルフィンO−デエチラーゼ（EROD）活性を測定した。
【００７０】
図1は、TCDDにより、EROD活性が24時間の処理期間にわたり22Rv1細胞において誘導されたことを示している（図1A）。PC3細胞を1nMのTCDDで24時間〜96時間にわたって処理したとき、活性は誘導されず、これに対して、10nMのTCDDでは、経時的に増大するようであり、96時間後に最大の応答が誘導された（図1B）。従って、22Rv1細胞およびPC3細胞はともにAh応答性であった。
【００７１】
＜実施例６＞
TCDDおよび6−MCDFの増殖阻害効果
22Rv1細胞を様々な濃度のTCDDで処理した。図2Aには、1nMのTCDDは単独でこれらの細胞の構成的かつテストステロン誘導性の増殖を阻害したことが示される。
【００７２】
別の研究では、22Rv1細胞が10％血清中で維持され、様々な濃度の6−MCDFが細胞に加えられた。図2Bは、6−MCDFにより、細胞増殖の濃度依存的な減少が誘導されたことを示している。
【００７３】
従って、これらのデータは、選択的なAhR調節因子（SAhRM）が前立腺ガン細胞増殖の効果的な阻害剤であったことを示している。
【００７４】
＜実施例７＞
LNCaP細胞のAhR活性化および増殖に対するTCDDおよび6−MCDFの作用
LNCaP細胞を、上記実施例に記載されるように、pDRE3でトランスフェクトし、様々な化合物で処理して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７５】
図3Aに例示される結果は、10nMのTCDDによるLNCaP細胞の処理では、pDRE3でトランスフェクトした細胞における溶媒コントロール（DMSO）と比較して、9倍を超えるルシフェラーゼ活性が誘導されたことを示している。対照的に、10nMのDHT（ジヒドロテストステロン）、10nMのE2（17β−エストラジオール）、およびE2＋DHTは活性を有意に誘導せず、そして、DHTまたはE2はいずれも、TCCDとの組合せでは、誘導された活性に影響を及ぼさなかった。6−MCDF（2μM）（すなわち、原型SAhRM）はまた、（7倍を超える）ルシフェラーゼ活性を誘導した。E2およびDHTはともに、6−MCDFとの組合せでは、6−MCDFにより誘導される活性を有意に阻害し、これに対して、E2またはDHTとの組合せでTCDDで処理された細胞では、阻害的な相互作用が観察されなかった。
【００７６】
次に、LNCaP細胞を10nMのDHTの非存在下または存在下で増殖させた。上記の実施例に記載されるように、細胞を6日間培養し、10nMのDHTの非存在下または存在下で種々の濃度のTCDDまたは6−MCDFで処理して、細胞数を測定した。結果は、TCDD（1nM〜100nM）はLNCaP細胞の増殖を有意に阻害し、また、増殖阻害が6−MCDFについても観察されたことを示していた（図3B）。両方の化合物は1つ以上の濃度で50％以上の細胞増殖を阻害した。ホルモンにより誘導される細胞増殖は観察されなかった。しかしながら、6−MCDFおよびTCDDはともに、DHTの存在下でLNCaP細胞の増殖を阻害した（図3C）。これらの結果から、LNCaP細胞がAh応答性であり、TCDDおよび6−MCDFはともにLNCaP細胞増殖を阻害することが確認された。
【００７７】
細胞周期進行におけるTCDDの効果もまた、1．0nM、10nMおよび100nMのTCDDで48時間処理し、その後、FACS分析されたLNCaP細胞において明らかにされた（表1）。結果が示すように、TCDDは、G0／G1期における細胞百分率（％）において、小さいが有意な増大を誘導し、S期における細胞の減少を誘導した。これに対して、溶媒（DMSO）およびDHT（10nM）は最小限の差異を示した。
【００７８】
【表１】
2006514692.tif 000005
【００７９】
＜実施例８＞
アンドロゲン応答性コンストラクトでトランスフェクトしたLNCaP細胞における阻害的なAhR−ARクロストーク
LNCaP細胞を、アンドロゲン応答性プロバシン遺伝子プロモーターの−286から＋28までの領域を含有するpPBでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、その後、上記の実施例に記載されるように、ホルモンまたはAhRアゴニストの単独または組合せで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８０】
図4Aが示すように、10nMのDHTで処理し、pPBでトランスフェクトしたLNCaP細胞におけるルシフェラーゼ活性は13倍を越えて増大し、誘導された応答は、DHT＋TCDDによる同時処理の後、有意に阻害された。類似する阻害応答が、2μMのMCDFの使用でも観察された（図4A）。これに対して、TCDDおよびMCDFは単独では活性を有意に誘導しなかった。驚くべきことに、10nMのE2は単独で、pPBでトランスフェクトしたLNCaP細胞においてルシフェラーゼ活性を誘導し、ホルモンにより誘導される応答が、E2＋TCDDまたはE2＋6−MCDFで同時処理された細胞において有意に減少した（図4A）。
【００８１】
次いで、LVCaP細胞を、3コピーのプロバシンアンドロゲン応答エレメントを直列で含有するpARR3コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、上記の実施例に記載されるように、ホルモンまたはAhRアゴニストの単独または組合せで処理して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８２】
図4Bが示すように、10nMのDHTは、pARR3でトランスフェクトしたLNCaP細胞におけるルシフェラーゼの27倍を超える増大を誘導した。しかしながら、このコンストラクトの場合、DHT＋MCDFまたはTCDDによる同時処理ではDHT誘導活性を減少させなかった。E2（10nM）はまた、pARR3でトランスフェクトした細胞において、（24倍を超える）ルシフェラーゼ活性を誘導し、また、E2＋TCDDまたはMCDFで同時処理された細胞では、E2単独で観察される活性と比較した場合、有意な活性の減少はなかった。これらの結果から、DHTおよびE2はともに、pPBまたはpARR3でトランスフェクトした細胞における遺伝子発現を活性化するが、阻害的なAhR−ARクロストークはpPBコンストラクトについてだけ観測されたことが確認された。
【００８３】
DHTおよびE2のARアゴニスト活性を、pPBでトランスフェクトし、ホルモンおよび抗アンドロゲン剤または抗エストロゲン剤で処理したLNCaP細胞でさらに調べた。pPBでトランスフェクトしたLNCaP細胞における10nMのDHTおよびE2によるルシフェラーゼ活性の誘導は、ホルモン＋10μMのHPTE（ARアンタゴニスト）で同時処理された細胞では阻害された（図5A）。しかしながら、平行した実験において、「純粋な」抗エストロゲン剤ICI182780もまた、E2により誘導される活性を有意に阻害した。これに対して、最小限の阻害のみが、DHT＋ICI182780で処理したLNCaP細胞で観察された。pARR3でトランスフェクトしたLNCaP細胞における平行した実験では、HPTEおよびICI182780はともに、DHTおよびE2により誘導されるルシフェラーゼ活性を阻害し（図5B）、これに対して、1μMのフルタミド（ARアンタゴニスト）は、ホルモンで誘導される活性の最小限の減少を生じさせただけであった（図5C）。
【００８４】
HPTEはERαアゴニストかつERβアンタゴニストでもあり（Gaido他、2000）、HPTEおよびICI182780の両方について得られた結果は、pPBおよびpARR3の媒介活性化におけるERβの関与が考えられることを示唆していた。図6Aおよび図6Bにおける結果が示すように、DHT、E2、TCDDおよびMCDFは、pPB単独でトランスフェクトしたZR−75細胞におけるレポーター遺伝子活性を活性化しないが、DHTおよびE2はともに、pPBおよびhARの発現プラスミドで同時トランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ活性を誘導した。E2による誘導は有意ではあったが、ZR−75細胞におけるDHTについて観察されるよりも低く、TCDDは、ホルモン＋TCDDで同時処理した細胞における、DHTではなく、E2により誘導される活性を阻害した。従って、これらのデータから、pPBのE2依存的なトランス活性化がアンドロゲン応答性であったことが確認された。
【００８５】
＜実施例９＞
LNCaP細胞におけるAR、サイクリンD1およびp27のタンパク質レベルに対する様々な処理の影響
ARタンパク質発現のレベルはアンドロゲン応答性および阻害的なAhR−ARクロストークに影響を及ぼし得る。
【００８６】
LNCaP細胞を、DHT、E2、TCDD、6−MCDFおよびそれらの組合せで6時間処理し、全細胞溶解物中のARタンパク質レベルをウエスタンブロット分析によって測定した。p27は、これらの処置群のすべてにおいて本質的に変化せず、この実験に対する負荷コントロールとして役立った。
【００８７】
図7Aが示すように、10nMのDHT、10nMのE2、またはDHT＋E2による処理はARレベルの著しい増大を生じさせた。対照的に、10nMのTCDDおよび2μMの6−MCDFは、単独ではARタンパク質のレベルに有意な影響を及ぼさなかったが、DHTとの組合せでは、DHT単独で処理した細胞と比較した場合、ARレベルが有意に減少した。E2と組み合わせたTCDDもまた、E2単独で処理した細胞で観察されたARレベルと比較して、ARレベルを減少させた。対照的に、免疫反応性p27タンパク質のレベルは、いずれの処理によっても有意には変化せず、負荷コントロールとして役立った。
【００８８】
別の研究では、ARレベルに対する抗アンドロゲン剤HPTEおよび抗エストロゲン剤ICI182780の単独での作用ならびにE2またはDHTとの組合せでの作用もまた測定された（図7B）。10μMのHPTE単独ではLNCaP細胞においてARレベルに影響を及ぼさなかった。これに対して、ICI182780処理は、DMSO（溶媒）処理と比較した場合、ARレベルを増大させた。ホルモン（E2またはDHT）により誘導されるARタンパク質のアップレギュレーションは、HPTEまたはICI182780で同時処理したとき、減少しなかった。サイクリンD1タンパク質は、この実験では著しく変化せず、負荷コントロールとして役立った。これらのデータは、様々な処理により、LNCaP細胞においてARタンパク質レベルが異なった形で調節されることを明らかにした。
【００８９】
＜実施例１０＞
阻害的なAhR−ARクロストークに対するインビボモデル−無胸腺ヌードマウス
前立腺ガン細胞株の異種移植片を有する無胸腺ヌード雄BALB／cマウスが使用される。異種移植のための細胞（LNCaP、PC3、22Rv1またはPCa2b）はAmerican  Type  Culture  Collection（ATCC；Manassas、VA）から得られ、ATCCにより提供される推奨プロトコルに従って増殖させる。細胞を増殖させた後、細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、マトリゲル（Matrigel）基底膜と1：1で混合する。それぞれのマウスには、1．0×106個の細胞を2回の皮下注射で、脇腹領域の背側に移植した。
【００９０】
腫瘍形成のために14日間放置した後、触診可能な腫瘍（200mm3）を有する動物を処置群に無作為に分け、7週間〜10週間にわたって胃管法によって毎日投薬した。腫瘍サイズを、［長さ／2］×［幅／2］×［高さ／2］Xπの式を使用し、測径器で測定することによって評価した（週に2回）。投薬は経口胃管法によって行われる。1mg／kg／日〜100mg／kg／日の濃度で一連のSAhRM（6−MCDF）を、相対的なSAhRM有効性を測定するために使用した。抗アンドロゲン剤フィナステリドを、アンドロゲン応答性ガン細胞異種移植片およびアンドロゲン非応答性ガン細胞異種移植片を有する動物における腫瘍増殖の陽性コントロール阻害剤として使用した。
【００９１】
これらの研究により、インビボにおける阻害的なAhR−ARクロストークに対する直接的な証拠がもたらされ、また、アンドロゲン応答性の前立腺ガンを処置するための間接的な抗アンドロゲン剤としてのSAhRMの有効性が明らかにされる。
【００９２】
引用文献
本明細書中で言及された特許および刊行物はすべて、本発明が関連する技術分野における当業者のレベルを示している。すべての特許および刊行物は、それぞれの個々の刊行物が、引用により組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのようにそれと同じ程度に引用により本明細書中に組み込まれる。
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【００９３】
本発明およびその様々な利点が詳しく記載されているが、様々な変化、置換および代替が、添付された説明によって規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明においてなされ得ることを理解しなければならない。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者は、本明細書中に記載されている対応する実施形態が本発明に従って利用され得るので、実質的に同じ機能を行うか、または、実質的に同じ結果を達成する、現在存在しているか、後に開発されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程を本発明の開示から容易に理解する。従って、添付された説明は、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程をその範囲内に含むことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ．１Ｂ】前立腺ガン細胞株におけるEROD活性の誘導を示す。図1Aは、24時間、48時間、72時間および96時間にわたって2，3，7，8−テトラクロロ−p−ジオキシン（TCDD）で処理されたPC3細胞を示す。図1Bは、24時間にわたってTCDDで処理された22Rv1細胞を示す。
【図２Ａ．２Ｂ】前立腺ガン細胞に対するTCDDおよび6−メチル−1，3，8−トリクロロジベンゾフラン（6−MCDF）の増殖阻害作用を示す。図2AはTCDDによる22Rv1細胞の増殖阻害を示す。図2Bは6−MCDFによる22Rv1細胞の増殖阻害を示す。
【図３Ａ．３Ｂ．３Ｃ】LNCaP細胞における増殖阻害を示す。図3AはLNCaP細胞におけるリガンド依存的なAhR活性化および増殖阻害を示す。図3Bは10nMのDHTの非存在下におけるLNCaP細胞の増殖を示し、図3Cは10nMのDHTのLNCaP細胞の増殖を示す。
【図４Ａ．４Ｂ】TCDDおよび6−MCDFによるAR依存的トランス活性化の阻害を示す。LNCaP細胞をpPB（図4A）またはpARR3（図4B）でトランスフェクトし、ホルモンまたはAhRアゴニストの単独または組合せで処理した。
【図５Ａ．５Ｂ．５Ｃ】LNCaP細胞における抗アンドロゲン剤および抗エストロゲン剤によるAR依存的トランス活性化の阻害を示す。細胞を、pPB（図5A）、pARR3（図5B）またはpPB（図5C）でトランスフェクトし、様々な化合物で処理した。
【図６Ａ．６Ｂ】pPBでトランスフェクトしたZR−75乳ガン細胞におけるホルモン誘導トランス活性化の阻害を示す。図6AはpPB単独でのトランスフェクションを示し、図6BはpPBおよびhARによるトランンスフェクションを示す。
【図７Ａ．７Ｂ】ホルモン、AhRアゴニスト、抗アンドロゲン剤および抗エストロゲン剤で処理したLNCaP細胞におけるARタンパク質発現を示す。図7Aでは、LNCaP細胞を、DHT、E2、TCDD、6−MCDFおよびそれらの組合せで6時間処理し、全細胞溶解物におけるARタンパク質レベルをウエスタンブロット分析によって測定した。p27タンパク質を測定した。図7Bでは、ARタンパク質レベルを図7Aで示したように測定し、ブロットを細長く切断して、サイクリンD1抗体で再プローブした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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