(57)【要約】本発明は、シュードモナス（Pseudomonas）属又はグルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微生物によって、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法、特にＬ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトン又はＬ−グロン酸を産生する方法及びＬ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン又はＬ−ガラクトン酸を産生する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応混合物からＬ−アルドノラクトンを場合により単離する、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できる微生物によるＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法。
【請求項２】
Ｌ−アルドノラクトンがＬ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、及びＬ−ガラクトン酸からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｌ−アルドヘキソースがＬ−グロース又はＬ−ガラクトースから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物がシュードモナス（Pseudomonas）又はグルコノバクター（Gluconobacter）から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
微生物がシュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）又はグルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微生物がシュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）ATCC21812又はグルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）IFO3293である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
微生物を成長培養又は静止細胞反応において使用する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１〜１２０時間、約１〜約９までの範囲のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃までの範囲の温度で実施する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１〜１２０時間、約２〜約８までの範囲のｐＨにて、約１８℃〜約４２℃までの範囲の温度で実施する請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス（Pseudomonas）属又はグルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微生物によってＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法を目的とする。
Ｌ−アルドノラクトンのＬ−グロノ−１、４−ラクトン及びＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンは、それぞれ、動植物によるＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の生合成の中間体である。動物におけるビタミンＣ合成のために提案された経路は、Ｄ‐グルコースから始まって、中間体のＤ−グルコース−６−ホスフェート、Ｄ−グルコース−１−ホスフェート、ＵＤＰ−Ｄ−グルコース、ＵＤＰ−Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−グロン酸、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、及び２−ケト−Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンを介して進行して、最終産物のビタミンＣに至る。植物のビタミンＣ合成のために提案された経路は、Ｄ−グルコースから始まって、中間体のＤ−グルコース−６−ホスフェート、Ｄ−フルクトース−６−ホスフェート、Ｄ−マンノース−６−ホスフェート、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース、ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース−Ｉ−ホスフェート、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、及び２−ケト−Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを介して進行して、最終産物のビタミンＣに至る。
【０００２】
ビタミンＣの生物工学的合成の実現可能化に関する研究が、「ライヒシュタイン法」が１９３４年に確立されて以来、長い間が行われてきた。微生物のGluconobacter oxydans DSM4025、Candida albicans、及びSaccharomyces cerevisiaeは、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンをビタミンＣに酸化する。Saccharomyces cerevisiae及びCandida albicansは、Ｄ−アラビノース及びＬ−ガラクトースからのそれぞれＤ−アラビノノ−１，４−ラクトン及びＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンの産生を触媒するＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼを有する。しかしながら、ビタミンＣの立体配置に対応する立体配置を有する（Ｃ４位及びＣ５位で）、中間体としての他のＬ−ヘキソース、すなわちＬ−イドース、Ｌ−グロース、及びＬ−タロースから、生物学的にビタミンＣを産生できる可能性を述べた報告はなかった。
【０００３】
本発明は、場合により反応混合物からＬ−アルドノラクトンを単離する、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できる微生物によるＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法を提供する。
【０００４】
本発明の方法により産生されるＬ−アルドノラクトンは、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、及びＬ−ガラクトン酸からなる群より選択される。
【０００５】
本願で使用される「Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン（及びその酸性型のＬ−グロン酸）」又は「Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（及びその酸性型のＬ−ガラクトン酸）」は、物理化学的平衡の結果として酸性型に加えてラクトンの形態も共存する混合物を意味する。
【０００６】
Ｌ−アルドノラクトンを産生するための本発明の方法において使用されるＬ−アルドヘキソースは、Ｌ−グロース又はＬ−ガラクトースから選択される。
【０００７】
かくして、本発明においてＬ−グロノ−１，４−ラクトン及びその酸性型のＬ−グロン酸をＬ−グロースから産生し、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン及びその酸性型のＬ−ガラクトン酸をＬ−ガラクトースから産生する。
【０００８】
Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、及びＬ−タロースのようなＬ−アルドヘキソースは希少な糖であり、基本的に化学的方法により製造され、商業的にはコストの高い化合物である。しかし、Ｌ−グロース及びＬ−ガラクトースの生物学的調製が近年報告されている。G.oxydans DSM4025の酵素ＡによるＤ−ソルビトールからのＬ−グロースの産生が、EP0832974A2に報告された。Ｌ−リボースイソメラーゼによるＬ−ソルボースからのＬ−グロースの産生は、米国特許第6,037,153号に開示された。Ｌ−ソルボースからのＬ−ガラクトースの産生は、Izumoriら（日本生物工学会の２００１年会）により報告されている。
【０００９】
本発明のＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できる微生物は、Pseudomonas又はGluconobacterから選択されてもよい。好適な微生物はPseudomonas putida又はGluconobacter oxydansである。P. putida ATCC21812又はG. oxydans IFO3293がより好適である。微生物はまた、P. putida ATCC21812又はG. oxydans IFO3293の同定特徴を有する微生物の生物学的及び／又は分類学的に均一な培養物であってもよい。
【００１０】
P. putida ATCC21812株は、アメリカ基準株培養収集局（American Type Culture Collection）（米国、メリーランド州、２０８５２、ロックビル、パークローンドライブ、１２３０１）から入手可能である。G. oxydans IFO3293株は、大阪の発酵研究所研究所（日本国大阪府淀川区十三本町２丁目１７−８５）から入手可能である、
【００１１】
本願で使用される用語「生物学的及び／又は分類学的に均一な培養物」は、P. putida ATCC21812又はG. oxydans IFO3293以外に、異なる種／属の微生物であるがP. putida ATCC21812又はG. oxydans IFO3293の同定特徴を有するものも包含する。微生物がこのような均一な培養物に属するかどうかの決定は１６ＳｒＲＮＡシーケンスの比較に基づく。
【００１２】
微生物「Pseudomonas putida」又は「Gluconobacter oxydans」はまた、国際原核生物命名法に定義されたような、同じ生理化学的性質を有するこのような種のシノニム又はバソニムも包含する。
【００１３】
本発明は、従って、反応混合物からＬ−アルドノラクトンを場合により単離する、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できるPseudomonas属又はGluconobacter属に属する微生物による、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法、特にＬ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトン若しくはＬ−グロン酸を又はＬ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン若しくはＬ−ガラクトン酸を産生する方法を提供する。この方法を成長培養又は静止細胞反応において行う。
【００１４】
かくして、本発明の実施態様は、上記のＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法であって、上記のＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できる微生物を成長培養又は静止細胞反応において使用する方法を提供することである。
【００１５】
本発明において上述した菌株の変異体もまた使用できる。本願で使用される用語「変異」は、微生物のゲノム配列の改変を意味し、これを任意の便利な手段により誘発してもよい。例えば、化学的突然変異誘発及び紫外線突然変異誘発の後に所望の表現型をスクリーニング又は選択すること、組換え技術によるインビトロでの機能障害性遺伝子の作製を使用して微生物のゲノムにおいて遺伝子の正常対応物を単一及び二重の交差組換えにより置換すること、並びに他の周知の技術などである。Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、並びにHarwood及びCutting, Molecular Biology Methods For Bacillus, John Wiley and Sons(1990),pp. 27-74を参照のこと。適切な変異原として、紫外線、Ｘ線、ガンマー線、及び亜硝酸などが挙げられるが、これらに限定されない。さらにまた、変異株を、その自然的突然変異によって生じるクローンから、それ自体その目的のために当業者に周知の任意の方法で単離することによって得ることができる。
【００１６】
微生物は、好気的条件下で適切な栄養分を補充した水性培地中で培養してもよい。培養は、約１．０〜９．０、好ましくは約２．０〜８．０のｐＨで実施してもよい。培養期間は、ｐＨ、温度、及び使用する栄養培地に応じて変化するが、通常１〜１２０時間が良好な結果をもたらす。培養を実施するに適切な温度範囲は、約１３℃〜４５℃、より好ましくは約１８℃〜４２℃である。
【００１７】
かくして、本発明の目的は、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できる微生物によるＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法であって、１〜１２０時間、約１〜約９までの範囲のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃までの範囲の温度で実施する方法を提供することである。好ましい実施態様では、上記の方法を約２〜約８までの範囲のｐＨにて、約１８℃〜約４２℃までの範囲の温度で実施する。
【００１８】
反応混合物中のＬ−アルドヘキソースの濃度は、他の反応条件に応じて変更することができるが、一般に１ｇ／ｌから３００ｇ／ｌ、好ましくは１０ｇ／ｌから２００ｇ／ｌであってもよい。
【００１９】
培養培地は、同化可能な炭素源、消化可能な窒素源、及び無機物質、ビタミン、微量元素、並びに他の増殖促進因子などの栄養分を含むことが通常必要である。同化可能な炭素源の例には、グリセロール、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−ソルビトール、及びＬ−ソルボースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
酵母抽出液、肉抽出液、ペプトン、カゼイン、コーンスティープリカー（corn steep liquor）、尿素、アミノ酸、硝酸塩、及びアンモニウム塩などの種々の有機又は無機物質もまた窒素源として使用してもよい。無機物質として、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一鉄及び塩化第二鉄、炭酸カルシウムなどを使用してもよい。
【００２１】
ビオチン、シアノコバラミン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、パントテン酸カルシウム、葉酸、イノシトール、ナイアシン、ｐ−アミノ安息香酸、及びリボフラビンなどのビタミンが、本発明に有用である。
【００２２】
本発明に使用される適切な微量元素は、希少金属、例えば、無機塩の形態のＭｏ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｏ、及びＺｎ、例としてＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ビタミン、アミノ酸、プリン、及びピリミジンから選択される。他の増殖促進因子として、アミノ酸（例えば、トリプトファン又はヒスチジン）、プリン（例えば、アデニン又はグアニン）、及びピリミジン（例えば、シトシン及びチミン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
反応後、Ｌ−アルドノラクトンを、反応混合物から、例えば、薄層クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィーの組合せにより回収してもよい。反応生成物は、本発明の反応混合物中に存在するので、精製せずにさらなる反応の基質として使用することもできる。
【００２４】
以下の実施例を、本発明の方法をさらに説明するために提供する。これらの実施例は単なる実例であり、いずれにしても本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
実施例１：P. putida又はG. oxydansによるＬ−グロースからのＬ−グロノ−１，４−ラクトンの産生
P. putida ATCC21812及びG. oxydans IFO3293を、２．５％マンニトール、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、及び０．３％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ）を含むＭＢ寒天培地上で４８時間３０℃で成長させた。得られた細胞を、静止細胞反応に使用した。２％Ｌ−グロース、０．３％ＮａＣｌ、１％ＣａＣＯ３、及び１ｍＭフェナジンメタンスルフェートを含む反応混合物（１ｍｌ）を、１７時間室温でインキュベートした。表ｌに概略したとおり、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン及びＬ−グロン酸の生成量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりアッセイした。ＴＬＣアッセイを、シリカゲル（キーゼル・ゲル６０Ｆ２５４、０．２５ｍｍ、メルク）、ｎ−プロパノール−Ｈ２Ｏ−１％Ｈ３ＰＯ４−ＨＣＯＯＨ（４００：１００：１０：１）の溶媒系を用いて実施した。ＨＰＬＣアッセイを、YMC-Pack ポリアミンIIカラム（１５０×４．６ｍｍＩ.Ｄ.；ＹＭＣ株式会社、京都、日本国）及びアセトニトリル−５０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（６７：３３）を用いて、２１０ｎｍにて実施した。ＴＬＣプレートを、０．５％ＫＩＯ４溶液で噴霧し、次に四塩基−飽和２Ｎ  ＣＨ３ＣＯＯＨ及び１５％ＭｎＳＯ４溶液の等容量の混合物を噴霧した。産生物のＬ−グロノ−１，４−ラクトン及びＬ−グロン酸は白色のスポットとして検出された。
【００２６】
【表１】
2006500048.tif 000002
【００２７】
基質としてＬ−グロースを用いる反応を、２％−グロース、０．３％ＮａＣｌ、１％ＣａＣＯ３を含む１００μｌの反応混合物を用いる小静止細胞反応においても行った。ルーリア・ベルターニ（ＬＢ）寒天上で、１日３７℃で成長させたEscherichia coli HB101もまた、この反応において使用した。産生したＬ−グロノ−１，４−ラクトン及びＬ−グロン酸の量を表２に示す。
【００２８】
【表２】
2006500048.tif 000003
【００２９】
実施例２：Ｌ−ガラクトースからのＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンの産生
P. putida ATCC21812及びG. oxydans IFO3293をＭＢ寒天プレート上で４８時間３０℃で成長させた。Saccharomyces cerevisiae ATCC9763を、２％Ｄ‐グルコース及び１．８％寒天を含むＹＮ培地（Ｄｉｆｃｏ）上で４８時間３０℃で成長させた。ルーリア・ベルターニ（ＬＢ）寒天上で１日３７℃で成長させたE. coli HB101もまた、この反応において使用した。得られた細胞を静止細胞反応に使用した。２％Ｌ−ガラクトース、０．３％ＮａＣｌ、１％ＣａＣＯ３、及び細胞（ＯＤ６００＝約２０）を含む反応混合物（１００μｌ）を２３時間室温でインキュベートした。表３に概略したとおり、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン及びＬ−ガラクトン酸の産生量をＴＬＣ及びＨＰＬＣによりアッセイした。P. putida ATCC21812及びG.oxydans IFO3293は、S. cerevisiae ATCC9763及びE. coli HB101（両方とも、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン及びＬ−ガラクトン酸を検知できない量で産生した）より、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンをＬ−ガラクトン酸とともにより多く産生した。
【００３０】
【表３】
2006500048.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月17日(2004.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応混合物からＬ−アルドノラクトンを場合により単離する、Ｌ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生できるシュードモナス（Pseudomonas）又はグルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微生物によるＬ−アルドヘキソースからＬ−アルドノラクトンを産生する方法であって、Ｌ−アルドノラクトンがＬ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、及びＬ−ガラクトン酸からなる群より選択され、Ｌ−アルドヘキソースがＬ−グロース又はＬ−ガラクトースから選択される、方法。
【請求項２】
微生物がシュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）又はグルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物がシュードモナス プチダ（P. putida）ATCC21812又はグルコノバクター オキシダンス（G. oxydans）IFO3293である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物を成長培養又は静止細胞反応において使用する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１〜１２０時間、約１〜約９までの範囲のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃までの範囲の温度で実施する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１〜１２０時間、約２〜約８までの範囲のｐＨにて、約１８℃〜約４２℃までの範囲の温度で実施する請求項５に記載の方法。
【国際調査報告】
2006500048.tif 000005
2006500048.tif 000006
2006500048.tif 000007
2006500048.tif 000008
2006500048.tif 000009