(57)【要約】ウイルスゲノム核酸を含んでなる核酸構築物が与えられるが、ここでこのウイルスゲノム核酸は少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、これらのユニットはそれぞれ１つの内在性プロモーターを含んでなるが、この場合、これらのユニットの内在性プロモーターは、ウイルスゲノムの起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期に活性となる。内在性遺伝子発現制御ユニットを用いて、特定の選択された異種コード配列を発現させるが、特に異種抗原を発現させる。この構築物をワクチンに使用して、異種抗原に対する免疫応答を生じることができるが、特にDNAワクチンに使用することができる。構築物を作製する方法およびそれらを投与する手段も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノム核酸を含んでなる核酸構築物であって、前記ウイルスゲノム核酸は少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはそれぞれ１つの内在性プロモーターを含んでなり、ここでユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期に活性を示すが、ここにおいて：
(a)  同時期に活性となるプロモーターを含んでなる少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノム核酸に挿入される別々の異種コード配列にそれぞれが機能しうるように連結される；さらに
(b)  ウイルスゲノム核酸の長さは、その中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである、
前記核酸構築物。
【請求項２】
少なくとも２つの内在性プロモーターがゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期にスイッチオンとなる、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットがいずれも最初期ウイルス遺伝子に由来する、またはいずれも初期ウイルス遺伝子に由来する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットが異なっている、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
ウイルスゲノム遺伝子の起源となるウイルスがDNAウイルスおよびRNAウイルスからなる一群から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
DNAウイルスが、ヘルペスウイルスおよびアデノ関連ウイルス（AAV）から選択される二本鎖DNAウイルスである、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）およびエプスタイン-バールウイルス（EBV）からなる一群から選択される、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
HSVがHSV-1およびHSV-2からなる一群から選択される、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
ウイルスゲノム核酸が単純ヘルペスウイルスに由来し、少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットがそれぞれ、ICP0, ICP4, ICP22およびICP27遺伝子プロモーターからなる一群から選択される内在性プロモーターを含んでなる、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
ウイルスゲノム核酸が単純ヘルペスウイルスに由来し、少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットの２つの内在性プロモーターがHSV外被タンパク質遺伝子プロモーターである、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
ウイルスゲノム核酸がヒトサイトメガロウイルスに由来し、少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットの内在性プロモーターが：
−UL36、UL37およびUL38遺伝子プロモーターからなる一群から選択される少なくとも２つのプロモーターである；
−UL82およびUL83遺伝子プロモーターである；または
−UL122およびUL123遺伝子プロモーターである、
請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
内在性遺伝子発現制御ユニットによって発現される異種コード配列のすべてが同じ生物に由来する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
２以上の異種コード配列が抗原をコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記抗原が病原体に由来する抗原である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを除いて、構築物中のウイルスゲノム核酸の5’末端と3’末端の間に相当するウイルスゲノムの領域に存在するウイルス配列の一部またはすべてが構築物から欠失した、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記欠失領域が、異種コード配列に結合した隣接する２つの内在性遺伝子発現制御ユニット間の介在配列の一部またはすべてを含んでなる、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記欠失領域が、異種コード配列を発現するために使用される少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットの領域以外のウイルスゲノム領域内に存在する、１または複数の遺伝子に相当する、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
ウイルスゲノム核酸がHSV-2に由来し、ウイルス配列が下記の技法：
(a)  BstXI酵素による部分消化後、再連結してICP27とICP0間の配列を除去する；
(b)  BspHI酵素による完全消化後、BsiWI酵素で部分消化し、さらに再連結してICP22に隣接する配列を除去する；
(c)  SrfI酵素による消化後、再連結してICP4とICP0間の配列を除去する；および
(d)  BstXI酵素による完全消化後、再連結してICP27とICP0間の配列を除去する、
のうち1以上の技法によって構築物から除去された、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
ウイルスゲノム核酸がHSV-1に由来し、ウイルス配列が構築物から除去されてICP0, ICP4, ICP22およびICP27コード配列と無関係なHSV-1配列のほぼすべてを取り除いた、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
内在性遺伝子発現制御ユニットが自然状態で機能しうるように結合しているコード配列を異種コード配列で置き換えた以外は、ウイルスゲノム核酸がその起源であるウイルスゲノムの隣接する領域に相当する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
異種コード配列に機能しうるように連結された内在性遺伝子発現制御ユニットが内在性プロモーターである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
被験体において免疫応答を誘導することができる、被験体に直接投与するための核酸構築物を作製する方法であって、
(a)  ベクターの骨格構造にウイルスゲノム核酸を挿入すること、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはさらにそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでなり、ここでユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期に活性となる；および、
(b)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入する前、挿入する時、もしくは挿入後のいずれかの時に、ウイルスゲノム核酸中の少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットの内在性プロモーターをそれぞれ、機能しうるように異種コード配列に連結すること、
を含んでなり、
ここにおいて、ウイルスゲノム核酸の長さは、その中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである、
前記方法。
【請求項２３】
少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを除いて、構築物中のウイルスゲノム核酸の5’末端と3’末端の間に相当するウイルスゲノムの領域に存在するウイルス配列の一部またはすべてを構築物から欠失させることを、前記方法がさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記欠失領域が、異種コード配列が機能しうるように連結されている隣接する内在性遺伝子発現制御ユニット間の非コード介在配列の一部またはすべてである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ゲノム核酸が単一の断片としてベクターの骨格構造に挿入される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
粒子を介したデリバリー装置からの送達に適した、コーティングされた粒子であって、その粒子は核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなるが、ここでこの構築物はウイルスゲノム核酸を含んでなり、前記ウイルスゲノム核酸は少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはそれぞれ１つの内在性プロモーターを含んでなるが、この場合、ユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性を示し、ここにおいて：
−  プロモーターを含んでなる遺伝子発現制御ユニットを含む少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノム核酸に挿入される異種コード配列にそれぞれ機能しうるように連結される；さらに
−  ウイルスゲノム核酸の長さは、その中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである、
前記コーティングされた粒子。
【請求項２７】
担体粒子が金またはタングステンである、請求項２６に記載のコーティングされた粒子。
【請求項２８】
請求項２６に記載のコーティングされた粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリー装置用の投与容器。
【請求項２９】
請求項２６に記載のコーティングされた粒子を充填した、粒子を介したデリバリー装置。
【請求項３０】
ニードルレスシリンジである、請求項２９に記載の粒子を介したデリバリー装置。
【請求項３１】
哺乳類細胞において当該ポリペプチドの発現を得る方法であって、その方法は、ウイルスゲノム核酸を含んでなる核酸構築物を前記細胞内に移行させることを含んでなり、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなるが、そのユニットはそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでなり、その場合、ユニットの内在性プロモーターは、ウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期に活性となるが、ここで：
- プロモーターを含んでなる少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットはそれぞれ、ウイルスゲノム核酸内に挿入される異種コード配列に、機能しうるように連結される；さらに 
- ウイルスゲノム核酸の長さは、それに挿入される異種配列を除いて1から50 kbまでである、
前記方法。
【請求項３２】
構築物が直接、被験体に送達される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
構築物が、注射、経皮的粒子デリバリー、吸入によって、局所的に、経口で、鼻内に、または粘膜を通して送達される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
構築物がニードルレス注入によって送達される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
核酸構築物が担体粒子をコーティングする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
被験体に有効量のコーティングされた粒子を投与することを含んでなる、核酸免疫化の方法であって、この粒子は、粒子を介したデリバリー装置からの送達に適しており、その粒子は核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなり、ここでこの構築物はウイルスゲノム核酸を含んでなり、前記ウイルスゲノム核酸は少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、その各ユニットは1つの内在性プロモーターを含んでなるが、この場合、これらのユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性となり、ここにおいて：
- プロモーターを含んでなる少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットはそれぞれ、ウイルスゲノム核酸に挿入される異種コード配列に、機能しうるように連結される；さらに 
- ウイルスゲノム核酸は、それに挿入される異種配列を除いて、長さが1から50kbまでである、
前記方法。
【請求項３７】
被験体において免疫応答を誘導することができる、被験体に直接投与するための核酸構築物を作製する方法であって、
(a)  ベクターの骨格構造にウイルスゲノム核酸を挿入すること、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはさらにそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでなり、ここでユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性となる；および、
(b)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入する前、挿入する時、もしくは挿入後のいずれかの時に、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットは別として、構築物のウイルスゲノム核酸の5’から3’末端までの間に相当するウイルスゲノムの領域に存在するウイルス配列の一部または全部を、ウイルスゲノム核酸から欠失させること、
を含んでなり、
ここにおいて、ウイルスゲノム核酸の長さは、ベクター骨格構造中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである、
前記方法。
【請求項３８】
欠失した核酸配列が、２つの内在性プロモーターの間の非コード介在配列の一部またはすべてである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
粒子を介したデリバリー装置からの送達に適した、コーティングされた粒子であって、その粒子は請求項３６に記載の方法によって作成された核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなる、前記のコーティングされた粒子。
【請求項４０】
請求項３９に記載のコーティングされた粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリー装置のための投与容器。
【請求項４１】
請求項４０に記載のコーティングされた粒子を充填した、粒子を介したデリバリー装置。
【請求項４２】
哺乳類細胞において当該ポリペプチドの発現を得る方法であって、その方法は、請求項３７に記載の方法によって作製された核酸構築物を前記細胞内に移行させることを含んでなる、前記方法。
【請求項４３】
被験体に有効量のコーティングされた粒子を投与することを含んでなる、核酸免疫化の方法であって、この粒子は、粒子を介したデリバリー装置からの送達に適しており、その粒子は請求項３７に記載の方法によって作製された核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学および免疫学の分野に関わるものであるが、概して遺伝子発現の方法に関する。より詳細には、本発明はポリペプチドを発現するための核酸構築物に関するものであり、さらに、免疫化により、特に核酸免疫化により、被験体において免疫応答を誘導するための前記構築物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のワクチン接種法は、一般に、“生”ワクチンまたは“死菌”ワクチンのいずれかの投与を含む（Ertl et al., (1996) J Immunol. 156:3579-3582）。いわゆる生ワクチンは、弱毒化した微生物、および生きたベクターを基にした組換え分子を包含する。死菌ワクチンは、死滅した病原体の全体およびサブユニットワクチン、たとえば可溶性病原体サブユニットもしくはタンパク質サブユニット、を基にしたワクチンを包含する。
【０００３】
生ワクチンは一般に、免疫化した被験体において効果的な免疫応答を提供することには成功する；しかしながら、こうしたワクチンは、免疫無防備状態または妊娠中の被験体には危険なものとなることがあり、病原体に戻る可能性、または他の病原体が混入する可能性がある（Hassett et al., (1996) Trend in Mictobiol. 8:307-312）。サブユニットワクチンのような死菌ワクチンは、生ワクチンに付随する安全性の問題を回避する。サブユニットワクチンは病原体の全体を含んでいるわけではないので、こうしたワクチンも、弱毒化ウイルスワクチンから発現してワクチン接種の有効性を減じる可能性のある免疫調節性ウイルスタンパク質の問題を回避することができる。しかしながら、死菌ワクチン、特にサブユニットワクチンは、免疫化した被験体において、しばしば、適切および／または有効な免疫応答を提供することができないことがある。
【０００４】
サブユニットワクチンの有効性を高めるために考えられる１つの方法は、ワクチンが複数のサブユニットを包含することである。複数の抗原による免疫化が望ましいのは、そのことが一般的に、単一抗原による免疫化よりもすぐれた感染防御を与えることができる、より広範な免疫応答を誘導するためである。複数サブユニットワクチンはまた、感染防御応答を与える能力を有する、特定の単一抗原を同定する必要性を減少させることにも役立つ可能性がある。このことは、非近交系集団における細胞性免疫の誘導にとって特に重要であると考えられるが、すなわち非近交系集団において個体は単一遺伝子産物に対する応答の点で大きく異なる可能性があり、したがってその集団において全体として感染防御免疫応答を生じることができる単一の抗原は存在しない。
【０００５】
多くの経路によって、免疫化すべき被験体にワクチンを導入することができる。ごく最近、注射針と注射器を用いた筋肉注射（Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468）もしくは皮内注射（Raz et al. (1994) PNAS USA 91:9519-9523）によるプラスミドDNAの直接注入が報告された。このようにして、抗原それ自体ではなく、抗原をコードする構築物が被験体に導入された。抗原をコードする核酸構築物を含んでなるこのようなワクチンは、DNAワクチンと呼ばれる。
【０００６】
DNAワクチンを送達する別の方法は、衝撃による、または粒子を介した、DNAデリバリーと呼ばれ、針のない粒子デリバリー装置を用いてDNAコーティングした微細な金粒子を表皮細胞内に直接投与する（Yang et al. (1990) PNAS USA 87:9568-9572）。このように、多くのデリバリー技術を用いて免疫化のために核酸を送達することができるが、こうした技術は、核酸をコーティングした微粒子を標的組織に送達する、粒子を介した技法を包含する（たとえば共同所有の米国特許第5,865,796号、1999年2月2日発行、を参照されたい）。
【０００７】
DNAワクチンによって達成される有効な感染防御レベルは、従来のタンパク質サブユニットワクチン、および死菌もしくは弱毒化ウイルスワクチンによって誘導されるレベルと同様である；ただし、自然感染から回復した後の回復期の動物で認められるレベルよりはもともと低い（Manicken et al. (1997) Critical Review Immunol. 17:139-154）。粒子を介した核酸免疫化法は、ナノグラム程度の量のDNAを表皮に送達した後、体液性および細胞傷害性Tリンパ球免疫応答の両者を誘導することが示されている（Permer et al. (1995) Vaccine 13:1427-1430）。このような粒子を介したデリバリー技法は、他のタイプの核酸接種法と比較して、著しく優れていることが見出された。Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83、Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482、およびRaz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ウイルスゲノムの遺伝子群が、遺伝子発現の干渉は最小限とする一方、遺伝子含有領域の安定性は最大となるように共進化してきたという事実に基づくものである。ウイルス遺伝子のこのような調和した進化を、異種コード配列を同時に発現するための発現構築物の作製に利用することができる。このように、２以上のウイルス遺伝子を含んでなるゲノム核酸領域を取り出し、ウイルス遺伝子の本来のコード配列を、発現させるべき異種コード配列で置き換える。したがって構築物は、用いられるウイルスプロモーターおよび他の制御エレメントの適合による恩恵を受けるであろうし、それによって安定性の増加および最小の干渉を示すと考えられる。さらに、そこでゲノム核酸に改変を導入して、構築物を最適化することができる。
【０００９】
したがって、本発明は複数の異種コード配列を発現することができる構築物を提供する。単一の構築物を用いていくつかの異種ポリペプチドを発現することは、別々の構築物からそれぞれを発現するよりも、製造および品質管理の複雑さを低減する。それはまた、規制当局の許可を得る困難を減らす可能性も高い。構築物の安定性の増加および干渉の減少は、ウイルスゲノム核酸構築物の内在性遺伝子発現制御ユニットを使用することに起因するが、構築物は複数の遺伝子を、それらに固有のプロモーター、または高レベルの発現を達成するために通常使用される他のプロモーターとともにベクター内に挿入することによって構築されるので、そういった構築物はプロモーター間の不安定性および干渉を露呈することが多い。
【００１０】
したがって、本発明は、ウイルスゲノム核酸を含んでなる核酸構築物を与えるが、前記ウイルスゲノム核酸は少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはそれぞれ１つの内在性プロモーターを含んでなり、この場合、ユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性を示す。ここで：
(a)  同時期に活性となるプロモーターを含んでなる少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノム核酸に挿入される別々の異種コード配列にそれぞれが機能しうるように連結される；さらに
(b)  ウイルスゲノム核酸の長さは、その中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである。
【００１１】
本発明はまた、被験体において免疫応答を誘導することができる、被験体に直接投与するための核酸構築物を作製する方法を与えるが、その方法は下記を含んでなる：
(a)  ベクターの骨格構造にウイルスゲノム核酸を挿入すること、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはさらにそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでおり、ここでユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性となる；および、
(b)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入する前、挿入時、もしくは挿入後のいずれかの時に、ウイルスゲノム核酸中の少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットの内在性プロモーターを、機能しうるように異種コード配列に連結すること、
ここにおいて、ウイルスゲノム核酸の長さは、その中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである。
【００１２】
本発明はさらに、粒子を介したデリバリー装置からの送達に適した、コーティングされた粒子を与えるが、この粒子は核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなり、ここでこの構築物はウイルスゲノム核酸を含んでなる。前記ウイルスゲノム核酸は少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはそれぞれ１つの内在性プロモーターを含んでなるが、この場合、ユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性を示す。ここで：
(a)  プロモーターを含んでなる少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノム核酸に挿入される別々の異種コード配列にそれぞれが機能しうるように連結される；および
(b)  ウイルスゲノム核酸の長さは、その中に挿入される異種配列を除いて、1から50 kbである。
【００１３】
本発明はさらに下記を与える：
- 本発明のコーティングされた粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリー装置のための投与容器；および
- 本発明のコーティングされた粒子を充填した、粒子を介したデリバリー装置。
【００１４】
本発明はまた、別の実施形態において、哺乳類細胞において当該ポリペプチドの発現を得る方法を与えるが、その方法は、ウイルスゲノム核酸を含んでなる核酸構築物を前記細胞内に移行させることを含んでなり、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなるが、そのユニットはそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでなり、その場合、ユニットの内在性プロモーターは、ウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期に活性となる、ここで：
- プロモーターを含んでなる少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットはそれぞれ、ウイルスゲノム核酸内に挿入される異種コード配列に、機能しうるように連結される；および
- ウイルスゲノム核酸の長さは、それに挿入される異種配列を除いて1から50 kbまでである。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、被験体に有効量のコーティングされた粒子を投与することを含んでなる、核酸免疫化の方法を与えるが、この粒子は、粒子を介したデリバリー装置からの送達に適しており、その粒子は核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなる。ここでこの構築物はウイルスゲノム核酸を含んでなり、前記ウイルスゲノム核酸は少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなるが、その各ユニットは1つの内在性プロモーターを含んでなる。この場合、複数のユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性となるが、そこで：
- プロモーターを含んでなる少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットはそれぞれ、ウイルスゲノム核酸内に挿入される異種コード配列に、機能しうるように連結される；および
- ウイルスゲノム核酸は、それに挿入される異種配列を除いて、長さが1から50kbである。
【００１６】
本発明はまた、被験体において免疫応答を誘導することができる、被験体に直接投与するための核酸構築物を作製する方法を与えるが、その方法は下記を含んでなる：
(a)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入すること、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでおり、ここでユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性となる；および、
(b)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入する前、挿入時、もしくは挿入後のいずれかの時に、ウイルスゲノム核酸から、少なくとも２つの内在性遺伝子発現制御ユニット以外のウイルス配列の一部または全部を欠失させること、ここでこれらの配列は、構築物のウイルスゲノム核酸の5’および3’末端の間に相当するウイルスゲノムの領域に存在するが、
ここにおいて、ベクターの骨格構造に挿入されるウイルスゲノム核酸の長さは、1から50 kbである。
【００１７】
本発明はまた、哺乳類細胞において当該ポリペプチドの発現を得る方法を与えるが、その方法は本発明の方法によって作製された核酸構築物を前記細胞内に移行させることを含んでなる。
【００１８】
本発明はまた、被験体に有効量のコーティングされた粒子を投与することを含んでなる、核酸免疫化の方法を与えるが、この粒子は、粒子を介したデリバリー装置からの送達に適しており、その粒子は本発明の方法によって作製された核酸構築物でコーティングされた担体粒子を含んでなる。
【００１９】
上記の、および他の、本発明の目的、態様、実施形態および利点が、本明細書の開示に照らして、容易に当業者に想起されるであろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明について詳細に説明する前に、特に例示された分子またはプロセスパラメータは当然変化しうるので本発明がそうした分子またはプロセスパラメータに限定されないことはあらかじめ理解されるべきである。したがって、たとえば、本発明は特定の抗原に、または抗原をコードするヌクレオチド配列に限定されない。
【００２１】
当然のことながら、本明細書で使用される専門用語は、本発明の個別の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を目的としない。加えて、本発明の実施は、他に指示のない限り、いずれも当技術分野の通常の技術に含まれる、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技法および免疫学の従来の方法を使用する。こうした技法は文献においてすべて説明されている。たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版、1989); DNA Cloning: A Practical Approach，第I巻および第II巻 (D. Glover編); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait編1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); およびFundamental Virology, 第2版、第I巻および第II巻 (B. N. FieldsおよびD. M. Knipe編)を参照されたい。また、当然のことながら、開示された方法のさまざまな応用を当技術分野の具体的なニーズに合わせて調整することができる。
【００２２】
本明細書に記載のあらゆる刊行物、特許および特許出願は、上記、下記にかかわらず、その全体を参考として本明細書に含めるものとする。
【００２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形”a”, “an”および”the”は、その内容が明らかにそうではないと指示しない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。
【００２４】
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。次の用語は、下記の通り定義されることを主旨とする。本明細書に記載のものと同様の、または等価な多くの方法および材料を、本発明の実施に際して使用することができるが、好ましい材料および方法は、本明細書に記載したとおりである。
【００２５】
「ワクチン組成物」という用語は、抗原を含有するあらゆる医薬組成物（たとえば抗原をコードするポリヌクレオチド）を意味するが、この組成物を使用して、被験体の病気または容態を予防または治療することができる。したがってこの用語は、サブユニットワクチン、すなわち自然状態で抗原が結合している完全な生物体から分離した抗原を含有するワクチン組成物、ならびに死滅、弱毒化もしくは不活化した細菌、ウイルス、寄生虫、または他の微生物の生物体全体を含有する組成物をいずれも包含する。
【００２６】
「核酸免疫化」という用語は本明細書では、単一または複数の抗原をin vivoで発現させるために、1つまたは複数の選択された抗原をコードする核酸分子を、宿主細胞に導入することを示すために使用される。核酸分子を直接、レシピエント被験体に、たとえば標準的な筋肉注射もしくは皮内注射；経皮的粒子デリバリー；吸入によって、局所的に、または経口、鼻内または粘膜投与法によって導入することができる。あるいはまた、その分子をex vivoで、被験体から採取された細胞内に導入することができる。後者の場合、当該の核酸分子を含有する細胞は被験体に再び戻し入れられ、その結果、その核酸分子によってコードされる抗原に対して免疫応答を起こすことができる。こうした免疫化に使用される核酸分子は、一般に、本明細書では「核酸構築物」と呼ばれる。
【００２７】
「経皮的」デリバリーという用語は、皮内（たとえば、真皮もしくは表皮内への）、経皮的（たとえば「皮膚を通して」）および経粘膜投与、すなわち、皮膚もしくは粘膜組織の内部へ、またはそうした組織を通って作用物質が通過することによるデリバリーを意味する（たとえば、Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, HadgraftおよびGuy（編）、Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, RobinsonおよびLee（編）、Marcel Dekker Inc., (1987); ならびにTransdermal Delivery of Drugs, 第1-3巻、KydonieusおよびBerner（編）、CRC Press, (1987)を参照されたい）。したがって、この用語は、米国特許第5,630,796号に記載の粒子デリバリー装置（たとえばニードルレス シリンジ）からのデリバリー、ならびに米国特許第5,865,796号に記載の、粒子を介したデリバリーを包含する。
【００２８】
「コア担体」は、粒子を介したデリバリー技法、たとえば米国特許第5,100,792号に記載の技法によって核酸を送達することができるように、規定された粒径、ならびに細胞膜を透過するために必要な運動量を達成するのに十分な高密度を与えるための、核酸（たとえば、DNA）をコーティングする担体粒子を意味する。コア担体は典型的には、タングステン、金、白金、フェライト、ポリスチレンおよびラテックスといった材料を包含する。たとえば、Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N.編、Oxford University Press, New York, NY,10-11ページを参照されたい。
【００２９】
「ニードルレス シリンジ」は、皮膚を刺し貫く従来の針を使わずに、経皮的に粒子状組成物を送達する器具を意味する。本発明に使用するニードルレス シリンジは、本明細書において検討される。
【００３０】
「抗原」は、個体において免疫応答を誘導することができる、いかなる作用物質も指示するが、一般的には高分子である。個々の高分子、または抗原性高分子の均一な、もしくは不均一な集団を指示するためにこの用語を使用することができる。本明細書で使用される場合、「抗原」は一般に、1または複数のエピトープを含有するタンパク質分子もしくはその一部を指すために用いられる。本発明のために、あらゆる適当な起源から抗原を得る、または導き出すことができる。さらに、本発明の上で、「抗原」は、そのタンパク質が十分な免疫原性を維持する限り、天然の配列に対する欠失、付加および置換（自然状態では一般に保存的）といった修飾を有するタンパク質を包含する。これらの修飾は、たとえば部位特異的変異誘導によって計画的に行うこともできるが、抗原を産生する宿主の突然変異のように偶然である場合もある。抗原によって誘導される免疫応答は、細胞性抗原特異的免疫応答、または体液性抗体応答、またはその両方と考えられる。抗原は、たとえば、いかなる既知のウイルス、細菌、寄生虫、植物、原生動物または真菌からも得ることができる。「抗原」という用語は、腫瘍抗原も包含する。この用語はまた、自己抗原、およびアレルゲン由来の抗原も包含する。同様に、DNA免疫化を適用する場合のように、抗原を発現するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドも、抗原の定義に含めるものとする。合成抗原、たとえば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換え体、もしくは合成によって生成された抗原も含まれる。(Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998).
所定の抗原に対する「免疫応答」は、その抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の個体における推移である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は抗体分子が介在する免疫応答を示し、一方「細胞性免疫応答」はT-リンパ球および／または他の白血球が介在する免疫応答である。
【００３１】
「ポリペプチド」という用語は、その用語としてもっとも広い意味で使用され、2以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチドミメティクスからなる化合物を指す。サブユニットはペプチド結合または他の結合、たとえばエステル、エーテル結合などによって結合することができる。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、およびDもしくはL型光学異性体の両方を含めた、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸、およびアミノ酸アナログおよびペプチドミメティクスを指示する。3以上のアミノ酸からなるペプチドを通常、そのペプチド鎖が短いならばオリゴペプチドと呼ぶ。ペプチド鎖が長い場合は、そのペプチドは通常、ポリペプチドもしくはタンパク質と称される。
【００３２】
「病原体」という用語は、幅広い意味で使用され、免疫応答を引き起こすあらゆる分子の起源となるものを指す。したがって、病原体は、毒性のある、または弱毒化されたウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、癌細胞などを包含するがそれらに限定されない。典型的には、免疫応答はこれらの病原体が作り出す、単一または複数のペプチドによって誘導される。下記に詳細に記載するように、上記の、または他の病原体に由来する抗原ペプチドをコードする核酸を用いて、自然感染に対する応答によく似た免疫応答が生じる。本明細書における教示を考慮すると、その方法が２以上の病原体からの抗原をコードする核酸の使用を包含することも、明らかであろう。
【００３３】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能な同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログ）の重合体を表す。ポリヌクレオチドは、いかなる3次構造をとることも可能であり、既知または未知のいかなる機能をも果たすことができる。限定的ではないポリヌクレオチドの例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、オープンリーディングフレーム、メッセンジャーRNA (mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、 リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、枝分かれしたポリヌクレオチド、プラスミド、コスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマーがある。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、一般に、4つのヌクレオチド塩基：アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；およびチミン(T)（ポリヌクレオチドがRNAである場合にはチミン(T)の代わりにウラシル(U)）からなる特有の配列で構成される。このように、ポリヌクレオチド配列という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示を、中央演算処理装置を有するコンピューターのデータベースにインプットして、機能ゲノム科学および相同性探索といったバイオインフォマティクスへの応用のために使用することができる。
【００３５】
「構築物」は、核酸配列を標的細胞に移入する能力を有するあらゆる部分（たとえば、非ウイルスベクター、粒子担体、リポソームおよびウイルスベクター）である。「プラスミド」構築物は、宿主細胞内で自己複製する能力を有する染色体外遺伝子要素である。「コスミド」は、ラムダ（λ）ファージのcos配列を利用する特殊な型のプラスミド構築物である。「cos末端」または「cos部位」という用語は、λDNAの一本鎖12塩基対の相補的延長部分を表す。コスミドは、たとえば約50kbまでの大きな挿入断片を保有することができるが、これに対して典型的なプラスミドは約10kb未満の大きさの挿入断片を保有することができる。大きな断片を保有することができるため、コスミドは、ゲノムライブラリを構築するために有用であり、大きな断片が必要とされる状況のためにも有用である。一般に、「ベクター」、「構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、当該遺伝子の発現を指示する能力を有し、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる、あらゆる核酸構築物を意味する。したがって、この用語はクローニングおよび発現媒体、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００３６】
「ゲノムライブラリ」は、全体として、ある生物の完全な、もしくはほぼ完全なゲノムに相当する、組換え核酸分子を集めたものである。ライブラリが、ゲノムの、完全ではないがほとんどすべてを有する場合、それは、たとえば、ゲノム中の配列の95%, 98%, 99%または実に99.9%より多くを含んでなる。
【００３７】
「コード配列」、または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適当な制御配列（または「調節配列」）の制御下におかれたときに、転写され（DNAの場合）、in vivoでポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、5’（アミノ）末端側の開始コドン、および3’（カルボキシ）末端側の翻訳終始コドンによって決定される。コード配列は、ウイルス、原核生物もしくは真核生物のmRNAに由来するcDNA、ウイルスもしくは原核生物DNAに由来するゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列まで包含することができるがそれらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の3’側にあると考えられる。コード配列の転写および翻訳は一般に「調節配列」によって制御され、これは、転写プロモーター、転写促進因子、Shine-Dalgarno配列、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終始コドンの3’側にある）、翻訳開始を最適化する配列（コード配列の5’側にある）、および翻訳終結配列を包含するがそれらに限定されない。「遺伝子発現制御ユニット」は、最小限のものとしてプロモーターを含んでなるヌクレオチド配列を指す。このユニットは、機能しうるようにプロモーターに連結されたコード配列を発現するために必要とされる、またはその発現に影響を及ぼす、他の配列を追加して含んでなることができる。ユニットの成分は隣接している必要はなく、介在配列によって隔てられていてもよい。ユニットの成分は、転写、RNAの安定性、RNAプロセシングおよび／または翻訳のレベルでコード配列の発現に影響を与えることができる。一般的にユニットは、コード配列に、機能しうるように連結されているが、そのコード配列を含まない。一部の例では、遺伝子発現制御ユニットは、遺伝子のコード配列以外の、天然に存在する遺伝子を含んでなる、または基本的にそれらから成ると考えられる。
【００３８】
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を指示するヌクレオチド配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター（この場合、機能しうるようにプロモーターに連結されたポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、コファクター、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制可能なプロモーター（この場合、機能しうるようにプロモーターに連結されたポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、コファクター、調節タンパク質などによって抑制される）、および構成的プロモーターを包含することができる。「プロモーター」または「調節配列」という用語は、全長プロモーター領域および前記領域の機能性（たとえば転写または翻訳を制御する）セグメントを包含する。
【００３９】
「内在性遺伝子発現制御ユニット」は、それが含まれる核酸配列の一部またはすべてと同じ生物に由来する遺伝子発現制御ユニットである。したがって、内在性遺伝子発現制御ユニットは、典型的には、その上流または下流、またはその両方に、遺伝子発現制御ユニットそれ自体と同一の生物に由来する配列であって、好ましくはその生物のゲノムにおいて遺伝子発現制御ユニットに隣接する配列の一部またはすべてに相当する配列を有すると思われる。一般に、遺伝子発現制御ユニットとして同一の生物から得られた隣接配列の一部、またはすべては、遺伝子発現制御ユニットに対して、隣接配列がその生物のゲノム内で占めているのと同じ位置を占めることができ、遺伝子発現制御ユニットのすぐ上流および／または下流とすることができる。このように、本発明の核酸構築物の場合、内在性遺伝子発現制御ユニットは、典型的には構築物中に存在するウイルスゲノム核酸配列に由来し、その一部であると考えられる。
【００４０】
「異種コード配列」は、自然状態では結びつかない遺伝子発現制御ユニット、特にプロモーターに、機能しうるように連結されたコード配列である。一般に、これら２つの配列は組換えDNA技法によって機能しうるように連結されている。異種コード配列は、機能しうるよう連結された内在性遺伝子発現制御ユニットと同じ生物を起源とすることができるが、あるいはまた、それが連結された遺伝子発現制御ユニットとは異なる生物に由来していてもよい。異種コード配列はたとえば、本明細書に記載のコード配列のいずれであってもよく、特に異種抗原をコードすることができる。
【００４１】
「単離されたポリヌクレオチド」分子は、自然状態でその分子が見出される生物体から分離した核酸分子；または自然状態でそれと通常結合している配列の全体または一部を欠いた核酸分子；または自然状態で存在するが結合した異種配列（下記に定義するような）を有する配列である。ある配列が、起源となる分子のある領域、そのcDNA、それらの相補物と同一または実質的に同一の塩基配列を有するならば、または下記のような配列同一性を示すならば、配列は分子「に由来し」または「から得られる」。
【００４２】
「機能しうるように連結される」は、記載された構成要素が通常の機能を果たすように配列される、要素の配置を示す。したがって、機能しうるようにコード配列（たとえば関心のある抗原をコードする）に連結された、所定の遺伝子発現制御ユニット、特にプロモーターは、適正な酵素が存在するとき、そのコード配列の発現を達成する能力を有する。プロモーターもしくは他の調節配列は、それらが機能してコード配列の発現を指示する限り、そのコード配列と隣接する必要はない。たとえば、翻訳も転写もされない介在配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することが可能であって、それでもやはりプロモーター配列はコード配列に機能しうるように連結されていると見なすことができる。
【００４３】
核酸分子を説明するために本明細書で使用される「組換え体」は、ゲノム、cDNA、半合成物もしくは合成物を起源とするポリヌクレオチドであって、その起源または操作によって、(1)自然状態で結合しているポリヌクレオチドの全部または一部と結合していない；および／または(2)自然状態で結合している以外のポリヌクレオチドと連結されている、前記ポリヌクレオチドを意味する。組換え体は、この定義に含まれるDNAおよびRNA分子をいずれも包含する。タンパク質もしくはポリペプチドに関して用いられる「組換え体」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成するポリペプチドを意味する。
【００４４】
本明細書においてポリヌクレオチドの相同体に言及している。典型的には、別のポリヌクレオチドに相同なヌクレオチドは、少なくとも70%、そのポリヌクレオチドに対して相同であるが、好ましくは少なくとも80もしくは90%、さらに好ましくは少なくとも95%、97%、もしくは99%相同である。相同性を計る方法は当技術分野でよく知られており、本明細書の文脈において当業者には当然のことながら、相同性は核酸の同一性に基づいて算出される。こうした相同性は、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、たとえば少なくとも40、60、または100以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって存在することがある。
【００４５】
ポリヌクレオチドの相同性もしくは同一性、ならびにポリペプチドの相同性もしくは同一性を計る方法は当技術分野において周知である。たとえば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために使用（たとえば、デフォルト設定で使用）することができるBESTFITプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。
【００４６】
PILEUPおよびBLASTアルゴリズムも、たとえば、Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のように、相同性を計算し、または配列を並べるために（一般的にはデフォルトの設定で）使用することができる。
【００４７】
BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公開され入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときに、一定のプラスの閾値スコアTに見合う、またはそれを満たす、問い合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコアの配列ペア（HSP）を同定することを包含する。Tは隣接ワードスコア閾値を表す（Altschul et al、上記）。これらの当初の隣接ワードヒットは、それらを含むHSPを見出す探索を開始するためのシードとなる。累積アラインメントスコアが増加する限り、ワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に伸ばす。ワードヒットの各方向への伸長を止めるのは次の場合である：1以上のマイナススコアを持つ残余のアラインメントが積み重なったために、累積アラインメントスコアがゼロ以下となる；または、いずれかの配列の末端に達する。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワードの長さ(W) 11、BLOSUM62スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）アラインメント(B) 50、期待値(E) 10、M=5、N=4、および二本鎖の比較を使用する。
【００４８】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性について統計的な解析を行う；たとえば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの指標は、最小和の確率(P(N))であるが、これは２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列の間の適合が偶然生じる確率の指標となる。たとえば、ある配列を別の配列と比較した最小和の確率が約１より小、好ましくは約0.1より小、さらに好ましくは約0.01より小、さらにもっとも好ましくは約0.001より小であるならば、第１の配列は第２の配列に類似しているとみなされる。
【００４９】
相同物は一般に、バックグラウンドより有意に高いレベルで、関連性のあるポリヌクレオチドとハイブリダイズする。ポリヌクレオチドと相同物との相互作用によって生じるシグナルレベルは、一般に「バックグラウンドハイブリダイゼーション」の少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍強い。相互作用の強さは、たとえば、32Pなどを用いてプローブを放射標識することによって、測定することができる。一般に、中程度から高いストリンジェンシー条件を用いて選択的なハイブリダイゼーションが達成される（たとえば、約50℃から約60℃の温度にて0.03M塩化ナトリウムおよび0.003Mクエン酸ナトリウム）。
【００５０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5x Denhardt’s Solution、5x SSC、0.1% SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNAを包含し、洗浄条件は、37℃にて2x SSC、0.1% SDSに続いて68℃にて1x SSC、0.1% SDSを包含することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当技術分野の技術の範囲に含まれる。Sambrookら、上記、を参照されたい。
【００５１】
相同物は、3未満、5、10、15、20以上の変異（変異はそれぞれ、置換、欠失または挿入とすることができる）によって関連性のあるポリヌクレオチドの配列と異なっていてもよい。相同物の、少なくとも30，たとえば少なくとも40、60または100以上の連続したヌクレオチドの領域にわたってこれらの変異を測定することができる。あるポリヌクレオチドがあるポリペプチドをコードする場合、置換はコードされるアミノ酸において「保存的」変化を生じることが好ましい。これは下記の表によって定義される。第2列の同じブロックのアミノ酸、および好ましくは第3列の同じ行のアミノ酸は、保存的変化において、相互に置き換えることができる。
【表１】
2006500062.tif 000002
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「アジュバント」という用語は、薬物、抗原、ポリヌクレオチド、ベクターなどの作用を強めるどのような物質も指示するものである。必ずしも明記されているとは限らないが、野生型または精製されたペプチドアジュバントに類似した生物学的活性を有する分子（たとえば、組換えで製造された、あるいはそのムテイン）、およびこれらの分子をコードする核酸は、本発明の精神および範囲において使用することを主旨とする。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「処置」という用語は、下記をいずれも包含する；感染もしくは再感染の予防；症状の軽減もしくは消失；病原体の減少もしくは完全な除去；および疾病もしくは障害の軽減、予防、改善もしくは消失。予防的に（たとえば、感染より前に）または治療的に（たとえば、感染後に）処置を実施することができる。
【００５４】
「個体」および「被験体」という用語は、本明細書では置き換え可能であって、脊椎動物亜門を構成するあらゆる動物を表し、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーならびに他の大型および小型のサルといったヒト以外の霊長類を含める）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマといった家畜；イヌおよびネコといったペットの哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットといった齧歯動物を含めた実験動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ科のトリ、カモ、ガチョウなどといった、家禽、野禽および猟鳥を含めたトリを包含するが限定しない。この用語は特定の齢を示さない。したがって、成体および新生個体をいずれも包含するものである。上記哺乳動物のすべての免疫系は同じように機能するため、本明細書に記載の方法は、上記の哺乳動物種のいずれにおける使用も意図する。
【００５５】
発明の概要
本発明について詳細に説明する前に、当然理解されるべきは、本発明が特定の製剤またはプロセスパラメータに（これらは当然変化しうるので）限定されないことである。やはり当然のことながら、本明細書で使用される用語は本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを目的としない。
【００５６】
本発明は、同一構築物から複数の抗原の発現を可能にする核酸構築物、およびこれらの構築物を核酸による免疫化のために使用することに関する。本発明はまた、そうした構築物を構築する方法を与える。構築物はウイルスゲノム核酸を含んでなり、ウイルスゲノム核酸中に存在する２以上の内在性遺伝子発現制御ユニットを、望ましい異種ポリペプチドを発現させるために利用する。発現されるべき異種コード配列は構築物に挿入されて、選択された内在性遺伝子発現制御ユニットに、さらにとりわけ前記ユニットの内在性プロモーターに、機能しうるように連結される。構築物は、宿主細胞において、異種コード配列、特に抗原をコードする遺伝子の効果的な発現を可能にする。
【００５７】
本発明の核酸構築物は典型的には、ウイルスゲノム核酸を含んでなり、ある実施形態においては基本的にウイルスゲノム核酸から構成される。前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、これらのユニットはそれぞれ１つの内在性プロモーターを含んでなるが、ここでこれらのユニットの内在性プロモーターは、そのウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスライフサイクルにおいて同時期に活性を示す。ここにおいて、
(a)同時期に活性となるプロモーターを含んでなる少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノム核酸に挿入された別の異種コード配列にそれぞれ機能しうるように連結される；さらに
(b)ウイルスゲノム核酸は、それに挿入される異種配列を除いて1から50 kbまでの長さである。
【００５８】
本発明の利点には下記が挙げられるがそれに限定されない：(i)構築物の安定性が高く、遺伝子間の干渉が少ないこと；(ii)構築物が自然感染の抗原にいっそう近づくように、単一抗原ではなく一連の複数抗原（エピトープ）を与えること；(iii)複数抗原の調和のとれた発現を達成するために同一細胞内への複数抗原の同時デリバリーを達成すること；(iv)複数の抗原の発現によって、自然感染によって引き起こされるのと類似した免疫応答を誘導すること；(v)たとえば、選択された抗原が、全ウイルスワクチンにおいて存在する可能性のある、免疫応答を抑制する主要抗原もしくはポリペプチドを含まないため、自然感染によって誘導されるよりも感染防御性の高い免疫応答を誘導すること、および(vi)通常、細胞内の感染の排除に関与する、抗原プロセシングおよび抗原提示経路を引き起こすこと。
【００５９】
内在性遺伝子発現制御ユニット
本発明の構築物中のウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなる。それぞれの内在性遺伝子発現制御ユニットは、内在性プロモーターを含んでなると思われる。しかしながら、一般的に、ユニットは他のヌクレオチド配列を含んでなると考えられる。詳細にはユニットは、コード配列の転写および／または翻訳に必要な、またはそれに影響を及ぼすヌクレオチド配列を含んでなるが、そのコード配列には、内在性遺伝子発現制御ユニットが機能しうるように連結されている。多くの実施形態において、1または複数のユニットは内在性遺伝子を含んでなる、または基本的に内在性遺伝子からなると考えられるが、その内在性遺伝子において、その遺伝子と本来結合しているコード配列は異種コード配列で置き換えられている。
【００６０】
それぞれの内在性遺伝子発現制御ユニットは、そのユニットに機能しうるように結合したコード配列からの転写に必須の要素、またはそうした転写に影響を与える要素を含んでなることができる。これらの要素は、エンハンサー配列、または機能しうるように連結されたコード配列の発現を調節する他の配列を包含すると考えられる。コード配列の高次構造および／または接近可能性を調節する配列、および／または他の配列が、ユニット内に存在する可能性がある。好ましい実施形態において、内在性転写終結配列も存在すると考えられる。
【００６１】
最小限のものとして、内在性遺伝子発現制御ユニットは、内在性プロモーターを含んでなる。典型的には、これは完全な内在性プロモーターであって、すなわち内在性プロモーターが自然状態で機能しうるように結合しているコード配列の正常な発現を達成し、および／または本発明の構築物においてユニットが機能しうるように結合している異種コード配列について同じ特異性および同レベルの発現を達成するために必要な、内在性配列であると考えられる。ある実施形態において、プロモーターはそれに対するいくつかの配列変異を有していたかもしれない。たとえば、0、2、5、10または11個以上の塩基置換、挿入および／または欠失といった、塩基の置換、挿入もしくは欠失が導入されていたかもしれない。他の実施形態において、もっと大きな変異が導入されていたかもしれない。たとえば、2から5、5から10、10から20、または21個以上の塩基の欠失が導入されていたかもしれない。ある場合には、一般的に本発明の場合には当てはまらないだろうが、プロモーターは、それが機能しうるように結合しているコード配列の発現を達成するために必要な最小の配列にトランケートされていたかもしれない。ある実施形態において、プロモーターと転写開始点の間の内在性配列は保持される。
【００６２】
内在性遺伝子発現制御ユニットはまた、翻訳に関わる、または翻訳に影響を及ぼす配列を含んでなることができる。ユニットの起源である内在性遺伝子と連結された、転写される非翻訳配列がユニット中に存在することがある。たとえば、ユニットの翻訳される5’および／または3’領域の一部またはすべてが保持される可能性がある。転写物に影響を及ぼす特定の領域において、プロセシングおよび／または安定性は保持される。Shine Dalgarno配列、開始コドンおよび／または終始コドンも保持されると考えられる。転写物の高次構造に影響を及ぼす配列は、ユニットにおいて保持されることがあるが、特にその場合そうした配列は、ユニットに機能しうるように結合されたコード配列の発現レベルに影響を与える。
【００６３】
内在性遺伝子発現制御ユニットは、ユニットの起源である内在性遺伝子に由来する非コード配列をすべて含んでなることがあるかもしれないが、必ずしもそうである必要はない。ユニットは内在性プロモーターおよび選択肢として、コード配列以外の内在性遺伝子に由来するなんらかの他の領域を含んでなることができる。ユニットは、本明細書に記載の１または複数の内在性遺伝子エレメントと組み合わせて内在性プロモーターを含んでなることができる。内在性遺伝子発現制御ユニットは内在性遺伝子において場所的に離れている配列を含んでなることができる。
【００６４】
内在性遺伝子の非コード領域における配列の一部は、ユニットから欠けていてもよいが、それはたとえば転写および／または翻訳に役立たない、または影響を及ぼさない配列である。ある場合には、遺伝子発現制御ユニットの起源である内在性遺伝子に由来する制御エレメントではなくて、自然状態で異種コード配列と結びついている制御エレメントを使用することができる。たとえば、転写物の5’もしくは3’非翻訳領域は、自然状態で異種コード配列に結び付けられる領域であってもよい。イントロンは異種コード配列と同じ起源に由来していてもよい。場合によっては、異種コード配列の起源とは異なる異種起源に由来する制御領域を使用することができる。
【００６５】
内在性遺伝子発現制御ユニットは何らかの適当なウイルス遺伝子、特に本明細書に記載のいずれのウイルス遺伝子も起源とすることができる。
【００６６】
本発明の構築物におけるウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなるが、たとえば、2、3、4、5または6個以上の内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなることができる。内在性遺伝子発現制御ユニットの少なくとも2つは、ウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時に発現される内在性プロモーターを含んでなるが、好ましくは3、4、5もしくは6個以上の内在性遺伝子発現制御ユニットが、ウイルスライフサイクルにおいて同時に発現されるそうしたプロモーターを含んでなる。ある実施形態において、ユニットの内在性プロモーターのすべてを、同時期に発現させることができる。ウイルスライフサイクルにおいて同時期に発現される内在性プロモーターの少なくとも2つは、個々に機能しうるように異種コード配列に連結され、好ましくは3、4、5または6個以上のプロモーターが異種コード配列に個々に機能しうるように連結されていてもよい。ある実施形態において、ユニットの内在性プロモーターのすべてを異種コード配列に別々に結合することができる。
【００６７】
内在性遺伝子発現制御ユニットは、典型的には同一の起源を有し、それらが含まれるウイルスゲノム核酸の一部である。したがって、好ましくは、ウイルスゲノム核酸は単一の断片としてウイルスゲノムから得られ、その後改変されて異種コード配列を導入し、必要とされるいかなるその他の改変も行われるであろう。これが本発明の構築物を生成するための好ましいルートであるが、ウイルスゲノム核酸をいくつかの断片として得ること、および同時にまたは後に適当なベクター中に挿入された追加の配列を用いてそれらを段階的に構築すること、といった、同じ最終結果に達する他のルートも、本発明の範囲に含まれる。
【００６８】
多くの実施形態において、内在性遺伝子発現制御ユニット、および特にユニットの内在性プロモーターは、その上流および／または下流に、ウイルスゲノムにおいて有していたのと同じ配列を有していると考えられる。詳細には、内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノム内にあったのと同じ上流配列の一部または全部を、構築物のウイルスゲノム核酸の範囲内に有することができる。ある実施形態において、ユニット、特に内在性プロモーターが機能しうるように連結される異種コード配列の下流の配列の一部または全部は、ユニット、特に内在性プロモーターが自然状態で連結されているコード配列の下流配列と同等とすることができる。ユニット中に存在する内在性下流エレメントは、内在性プロモーターからの転写物に含まれるエレメント、たとえば、転写物の安定性を決定することに関連するエレメントを包含することができる。存在する内在性下流配列は、転写終結因子および／またはポリアデニル化シグナルを含んでなることができる。異種コード配列の上流および／または下流の配列、またはコード配列内部のイントロン配列中の配列は、内在性エンハンサーエレメントを包含することができる。存在する上流配列は、内在性Shine Dalgarno配列を包含することができる。ある実施形態において、内在性遺伝子の全体は（内在性遺伝子発現制御ユニットはそれに由来する）、コード配列を除いて、構築物において保持される。さらに、エンハンサーのような、ユニットの内在性プロモーターからの発現に影響を及ぼす配列はいずれも、やはり保持されると考えられる。
【００６９】
ある実施形態において、ユニットの、特にプロモーターの上流側の100塩基対を越える、好ましくは500bpより大きい、さらに好ましくは1kbより大きい、さらにいっそう好ましくは2kbより大きい配列、および／または異種コード配列の下流の配列は、ユニット、特にウイルスゲノム中の内在性プロモーターおよびそのコード配列の上流および／または下流の配列と相同または同一であってよい。ウイルスゲノム中の配列と上流および／または下流の配列が同一である領域は、異種コード配列と機能しうるように連結された次の内在性遺伝子発現制御ユニット、および／または次の異種コード配列にまで達していてもよい。ある実施形態において、構築物中のウイルスゲノム核酸において、内在性遺伝子発現制御ユニットおよび異種コード配列の上流および／または下流に欠失が存在してもよいが、そのことは、ウイルスゲノムにおいて上流及び／または下流に認められた配列の一部と等しい上流および／または下流の配列を、事実上、構築物において内在性遺伝子発現制御ユニットにより近づけることができることを意味する。
【００７０】
内在性プロモーターには異種コード配列が機能しうるように連結されているが、それらの内在性プロモーターは、ウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのライフサイクルにおいて同時期に、典型的には同様の時点で、または同時に発現されることが好ましい。ウイルスライフサイクルは、典型的には期に分けられ、それぞれの期は、遺伝子の特定のサブセットの発現を伴うが、こうした遺伝子は、どの期にその遺伝子が発現されるかで分類される。たとえば、ウイルスライフサイクルは、最初期、初期および後期遺伝子発現、または潜伏期間の遺伝子発現を包含することができる。したがって、多くの実施形態において、遺伝子発現制御ユニットの内在性プロモーターは、ウイルスライフサイクルにおける同時期または近接した時期、好ましくは同時期、に由来するウイルス遺伝子のプロモーターである。したがって、それらはすべて、最初期、初期、後期もしくは潜伏期関連プロモーターであるといえる。
【００７１】
典型的には、ウイルスライフサイクルのある段階で、2つ以上の内在性プロモーターがすべて発現され、それはすなわち、オーバーラップ、すなわちそれらのプロモーターが転写を生じる時期が存在すると考えられる。異種コード配列に結合した内在性プロモーターから転写が始まる時期および／または終結する時期は、同じような、または同一の時点であることが好ましい。
【００７２】
場合によっては、選択されたプロモーターがいずれも、ウイルス遺伝子発現の同じ時期、たとえば最初期に発現されるかもしれないが、プロモーターが発現される実際のオーバーラップは存在せず、それどころかすべてのプロモーターが同時期の中で順次発現されることがある。
【００７３】
本発明のある実施形態において、異種コード配列を発現するために最初期プロモーターを選択することができる。これは、特に、ウイルスライフサイクルの後期からは、プロモーターからの発現のためにウイルスタンパク質が必要とされる場合であると考えられる。したがって、選択されるプロモーターは発現のためにウイルスタンパク質を必要としないことが好ましい。
【００７４】
他の実施形態において、プロモーターはウイルスライフサイクルの特定の段階を再現するように選択することができる。したがって、最初期プロモーターを使用することによって、たとえばHSVのようなウイルスが潜伏期から出現する状況を模倣することができる。
【００７５】
好ましい内在性プロモーターの組み合わせとしては、たとえば下記が挙げられる：
(i) HSVのICP 0、4、22および27遺伝子のうち少なくとも2つ、特にICP 0および4；ICP 4および22；ICP 22および27；ICP 0、4および22；ICP 4、22および27；またはICP 0、4、22および27。
【００７６】
(ii) HSV外被プロモーターのうち少なくとも2つ、特にUL 48、49および50のうち2つ、たとえば、UL 48およびUL 49；UL 49および50；UL 48、49および50。
【００７７】
(iii) サイトメガロウイルスのUL 83およびUL 84；UL 122およびUL 123；またはUL 36、37および38のうち少なくとも2つ、特にヒトサイトメガロウイルス、たとえばUL 36および37；またはUL 37および38。
【００７８】
多くの場合、ウイルスライフサイクルの同様の段階で発現されるウイルス遺伝子は、間に遺伝子の介在無しに、相互に隣接している。多くの実施形態において、選択される内在性遺伝子発現制御ユニットは、したがって、それらの起源であるウイルスゲノム中の隣接した、または密接に関連した遺伝子に由来するユニットとなる。このように、異種コード配列の発現を推進するために選択される内在性遺伝子発現制御ユニットは、ウイルスゲノムの2、3、4以上の連続した遺伝子に由来するものとすることができるが、ただし、ある場合には、たとえば1、2、または3以上の介在配列が選択された内在性遺伝子発現制御ユニットのうち2つのユニットの間に存在することもある。
【００７９】
一部のウイルスは、ゲノム中に反復配列を含有する。たとえば、HSVは2組のそうした反復配列を有する。本発明の多くの実施形態において、構築物中に存在するウイルスゲノム核酸は、反復配列を含有せず、また特に、同一遺伝子、ユニットもしくはプロモーターの複数コピーは含まない。好ましくは、構築物はウイルスゲノム核酸中に逆位反復配列を含まず、特に、遺伝子、プロモーターおよび／またはユニットの逆位反復配列、または２つの相同なプロモーター、遺伝子、もしくはユニットの逆位反復配列を含まない。
【００８０】
内在性プロモーターに機能しうるように連結された異種コード配列は、その配列が自然状態で機能しうるように結合しているプロモーターエレメントを何も保持しないことが好ましい。したがって、それらの発現を引き起こすプロモーターは、内在性遺伝子発現制御ユニットの内在性ウイルスプロモーターであって、たとえば異種コード配列とともに挿入されたものではない。しかしながら、ある実施形態において、自然状態で異種コード配列に結合しているプロモーターの一部またはすべてを、内在性プロモーターの上流、またはその下流、ただし転写開始点の上流に、導入することができる。このような実施形態において典型的には、異種プロモーターは内在性プロモーターの下流にある。
【００８１】
典型的には、異種コード配列は、プロモーターが自然状態で結合しているコード配列の代わりに挿入される。したがって、自然状態で内在性プロモーターに結合しているコード配列を、典型的には欠失させて、異種コード配列で置き換えることになる。ある実施形態において、天然型のコード配列の最初のいくつかのコドンが残存していてもよく、異種コード配列と融合させることができる。異種配列によってコードされるポリペプチドの発現をもたらす何らかのアレンジを行うことができる。ある実施形態において、プロモーターが自然状態で結合しているコード配列が残存し、異種コード配列はその下流で内部リボソーム進入配列（IRES）によって翻訳を確実にする。
【００８２】
ある実施形態において、構築物は2セット以上の、異種コード配列に機能しうるように連結された内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなることができる。機能しうる遺伝子発現制御ユニットの各セットは、構築物のウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのライフサイクルにおいて同時期に発現される少なくとも2つのプロモーターを含んでなる。ユニットの別のセットが、異なる時期に発現を生じさせることがある。このことは特定の抗原を異なる時期に発現させることを可能にする。
【００８３】
抗原
本発明の構築物中に存在する異種コード配列は、典型的には抗原をコードする。本明細書に記載の方法および構築物は、多種多様な細胞、組織およびヒトもしくは動物病原体に対して免疫応答を誘導するために有用である。これらの病原体は、1または複数の抗原を含んでなる。本発明の構築物によって発現される異種ポリペプチドは、上記の1または複数の抗原のいずれであってもよい。本発明の構築物によって発現される抗原の起源に関する、限定的でない例としては、ウイルス、細菌細胞、真菌細胞、寄生虫および他の病原生物がある。多くの実施形態において、抗原は病気を引き起こす感染性病原体に由来する。
【００８４】
本発明の構築物中の異種コード配列によってコードされる抗原は、構築物のウイルスゲノム核酸と同じ生物、または異なる生物を起源とすることができる。それらの抗原は、すべて同じ生物を起源としてもいいが、それらのうち2つ以上またはすべてが、異なる生物を起源とすることもできる。抗原は、いくつかの密接に関連した生物に由来してもよい。したがって、たとえば、それらの抗原は同一病原体のいくつかの菌株を起源としてもよく、その目的は、抗原の起源であるそれぞれの菌株に対して感染防御応答を生じることができるように、被験体を免疫化することである。それらは、各菌株からの対応する抗原をコードすることができる。
【００８５】
典型的には、複数の異種コード配列は異なる抗原をコードするが、ただしある実施形態においては、それらの異種コード配列のうち2つ以上または実にすべてが、高レベルの抗原の発現を得ることを目的として、同一抗原をコードしていてもよい。
【００８６】
構築物によって発現される複数の抗原は、病原体において同じような位置に発現し、および／または同様の機能を有すると考えられる。たとえば、そうした抗原はすべて病原体の表面に発現されることがあり、あるいはまた、細胞内抗原のように病原体表面に露出されない抗原であってもよい。抗原がいずれも、ウイルス外被タンパク質、糖タンパク質、またはウイルス表面に発現される他のタンパク質であってもよい。ある実施形態において、構築物は、表面抗原と非-表面抗原の2つをともに発現することができる。
【００８７】
ある実施形態において、抗原は、内在性プロモーターから発現される融合タンパク質の一部となっている。したがって、抗原配列は、遺伝子発現制御ユニットの内在性プロモーターによって通常発現される配列に融合されていてもよい。あるいはまた、内在性プロモーターは、いくつかの異なる抗原またはエピトープを含んでなる、またはある実施形態においては基本的にそれらからなる、融合タンパク質の発現を駆動することができる。融合タンパク質は、本明細書に記載の2つ以上の抗原をいかようにも組み合わせて含んでなることができる。抗原をコードする配列に加えて、挿入される異種コード配列は、抗原を適当な部位に向けてターゲッティングする配列も包含することができる。そうした配列はまた、特異的なプロテアーゼが融合物から特異性抗原または配列を遊離することを可能にする切断部位を包含することができる。
【００８８】
本願発明のある実施形態において、抗原は主に、またはすべてが、細胞性もしくは体液性応答を最初に生じると考えられる抗原であって、結果として応答は主として、またはほとんどすべてが細胞性または体液性である。したがって、体液性ではなく主として細胞が介在する応答を生じさせるために、抗原は病原体表面に存在しないものであってもよく、たとえば、糖タンパク質でなくてもよい。ある実施形態において、逆もまた真であるかもしれない。ある実施形態において、抗原は、細胞性および体液性応答をいずれも特異的に誘導するように選択することができる。
【００８９】
適当なウイルス抗原は、A型（HAV）、B型（HBV）、C型（HCV）、デルタ型（HDV）、E型(HEV)およびG型（HGV）肝炎ウイルスを含めた肝炎ウイルス群から得られる、またはそれを起源とする抗原を包含するがそれらに限定されない。たとえば、国際公開WO 89/04669；WO 90/11089；およびWO 90/14436を参照されたい。HCVゲノムは、E1およびE2を含めて、いくつかのウイルスタンパク質をコードしている。たとえば、Houghton et al. (1991) Hepatology 14:381-388を参照されたい。同様に、HDVに由来するδ-抗原に対するコード配列が判明している（米国特許第5,378,814号を参照されたい）。
【００９０】
同じように、ヘルペスウイルス群に由来するさまざまなタンパク質を本発明において抗原として使用することができるが、前記タンパク質は、単純ヘルペスウイルス(HSV)１型および２型に由来するタンパク質、たとえばHSV-1およびHSV-2糖タンパク質gB、gDおよびgH；水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、エプスタイン-バールウイルス（EBV）およびサイトメガロウイルス（CMV）に由来する抗原（これにはCMV gBおよびgHを含める）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス、たとえばHHV6およびHHV7に由来する抗原を包含する。（たとえばChee et al. (1990) Cytomegaloviruses  (J.K. McDougall編、Springer-Verlag, pp. 125-169; McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; 米国特許第5,171,568号; Baer et al. (1984) Nature 310:207-211; およびDavison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816を参照されたい。）
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原は、たとえば、HIVのさまざまな遺伝的サブタイプを含めた多数のHIV-1およびHIV-2分離株に関して、gp 120分子が、判明し報告されているが（たとえば、Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); and Modrow et al. (1987) J. Virol.  61:570-578を参照されたい）、これらのいかなる分離株に由来する、またはいかなる分離株から得られる、抗原をコードする配列も、本発明において用途を見いだすことができる。さらに、さまざまなHIV分離株のいずれに由来する、もしくはいずれから得られる他の免疫原性タンパク質も、本発明の構築物によって発現される抗原となりうるのであって、１または複数の、さまざまなエンベロープタンパク質またはその断片、たとえばgp160およびgp41、gag抗原、たとえばp24gagおよびp55gag、ならびにHIVのpol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpuおよびLTR領域に由来するタンパク質を含めるものとする。
【００９１】
他のウイルスに由来する、もしくは他のウイルスから得られる抗原、たとえば、限定はしないが、ピコルナウイルス科（たとえば、ポリオウイルス、ライノウイルスなど）；カリシウイルス科；トガウイルス科（たとえば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科（たとえばロタウイルスなど）；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（たとえば、狂犬病ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（たとえば、インフルエンザウイルスA型、B型、およびC型など）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（たとえば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルスなど）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（たとえば、HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, などとしても知られている)に属するウイルスに由来する抗原も、本明細書において用途が見いだされ、これは分離株HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN；HIV-1CM235, HIV-1US4；なかでもHIV-2；サル免疫不全ウイルス（SIV）；パピローマウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスなどに由来する抗原を包含するが、それらに限定されない。
【００９２】
ある状況において、選択された抗原は、典型的には粘膜表面から体内に入り、ヒトの疾病の原因となることが判明している、またはヒトの疾病と関連するウイルス病原体、たとえば、限定するものではないが、HIV(AIDS)、インフルエンザウイルス（インフルエンザ）、単純ヘルペスウイルス（性器感染症、口唇ヘルペス、STD）、ロタウイルス（下痢）、パラインフルエンザウイルス（呼吸器系感染症）、ポリオウイルス（灰白髄炎）、RSウイルス（呼吸器感染症）、麻疹およびムンプスウイルス（麻疹、耳下腺炎）、風疹ウイルス（風疹）およびライノウイルス（感冒）から得られる、またはそれに由来するウイルス抗原であることが好ましいと考えられる。
【００９３】
本発明の構築物の異種コード配列がコードすることができる細菌および寄生虫の抗原は、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌性もしくは真菌性肺炎、中耳炎、淋病、コレラ、チフス、髄膜炎、単核球症、ペスト、細菌性赤痢もしくはサルモネラ症、在郷軍人病、ライム病、ハンセン病、マラリア、鉤虫症、回旋糸状虫症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア症、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア症および旋毛虫症を包含するがそれらに限定されない疾病の、原因となる既知の病原体から得られる、またはそれらに由来する抗原を含めるものとする。
【００９４】
クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、スクレイピー、伝播性ミンク脳症および慢性消耗病の原因となる病原体を含めた、プリオンのような、従来にない濾過性病原体から、または狂牛病に関わるプリオンから、さらに別の抗原が得られ、または導き出される可能性がある。抗原は致死性家族性不眠症の原因となるプリオンであり、またはそのプリオンから得ることもできる。プリオン病において、正常な高次構造型のみならず、病気に関与する特別な高次構造型のプリオンタンパク質が存在する場合、構築物によって発現される抗原は、病気に関連した高次構造型のプリオンタンパク質に対してのみ応答が生じ、正常型のタンパク質には生じないようにすることが好ましい。
【００９５】
抗原の起源とすることができる具体的な病原体としては、結核菌（M. tuberculosis）、 クラミジア（Chlamydia）、淋菌（N. gonorrhoeae）、赤痢菌（Shigella）、サルモネラ菌（Salmonella）、コレラ菌（Vibrio Cholera）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidua）、シュードモナス（Pseudomonas）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ（Brucella）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ワイル病レプトスピラ（Leptospira interrogans）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、ペスト菌（Yersinia pestis）、連鎖球菌（Streptococcus）(AおよびB型)、肺炎球菌（Pneumococcus）、髄膜炎菌（Meningococcus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）(b型)、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondic）、カンピロバクター症（Campylobacteriosis）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、鼠径肉芽腫症（ドノバン症) （Donovanosis）、および放線菌症（Actinomycosis）；カンジダ症およびアスペルギルス症を含む真菌性病原体；条虫（Taenia）、吸虫（Fluke）、回虫（Roundworm）、アメーバ症（Amebiasis）、ランブル鞭毛虫症（Giardiasis）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、住血吸虫（Schistosoma）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、トリコモナス症（Trichomoniasis）および旋毛虫症（Trichinosis）を含む寄生虫病原体が挙げられる。したがって、本発明を使用して、たとえば、口蹄疫（Foot and Mouth disease）、コロナウイルス（Coronavirus）、パルツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ヘリコバクター（Helicobacter）、普通円虫（Strongylus vulgaris）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae)、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus (BVDV)）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌（E. coli）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis ）および気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）といった多数の動物病に対しても適当な免疫応答を与えることができる。
【００９６】
ある実施形態において、本発明の構築物によって発現される抗原のうち1以上、さらに好ましくはすべてが腫瘍抗原である。好ましくは、前記抗原は腫瘍に特異的であって、他の細胞型、もしくは少なくとも被験体の他の細胞型によっては発現されないものとする。このような抗原は、悪性腫瘍、特に転移性腫瘍を起源とすることができる。ある場合には、抗原を、処置すべき被験体から特異的に分離し、または被験体の腫瘍が発現する特異的腫瘍抗原に適合させることができる。
【００９７】
他の実施形態において、抗原は自己抗原であってもよいが、特に自己免疫疾患または障害に関わる、もしくはその原因となる自己抗原とすることができる。あるいはまた、抗原はアレルゲンであり、またはアレルゲンを起源とすることができる。
【００９８】
アジュバント
ある実施形態において、本発明は、任意の適当なアジュバントもしくはアジュバントの組み合わせとともに、効果的に使用することができる。たとえば、適当なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）から形成されるアジュバント、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；水中油および油中水型エマルション製剤、たとえばフロイント完全アジュバント（CFA）およびフロイント不完全アジュバント（IFA）；細菌細胞壁成分から形成されるアジュバント、たとえばリポ多糖（たとえばリピドAもしくはモノホスホリルリピドA（MPL）、Imoto et al, (1985) Tet. Lett. 26: 1545-1548）、トレハロース・ジミコラート（TDM）、および細胞壁骨格（CWS）を含むアジュバント；熱ショックタンパク質もしくはその誘導体；ジフテリア毒素（DT）、百日咳毒素（PT）、コレラ毒素（CT）、大腸菌易熱性毒素（LT1およびLT2）、シュードモナス内毒素A、シュードモナス外毒素S、セレウス菌（B. cereus）外酵素、ボツリヌス菌（B. sphaericus）C2およびC3毒素、C. limosum外酵素、同じくウェルシュ菌（C. perfringens）、C. spiriforma およびディフィシレ菌（C. difficile）からの毒素、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）EDINおよびCRM197、無毒性ジフテリア毒素変異体のような ADPリボシル化細菌毒素変異体に由来するアジュバント；Quil A（米国特許第5,057,540号）のようなサポニンアジュバント、またはISCOM（免疫賦活性複合体）のようなサポニンから生じる粒子；ケモカインおよびサイトカイン、たとえばインターロイキン（IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, など）、インターフェロン（たとえばγインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（MCSF）、腫瘍壊死因子（TNF）、ディフェンシン1または2、RANTES、MIP1-αおよびMIP-2、など；ムラミルペプチド、たとえばN-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン (thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン (ノル-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2- (1' -2' -ジパルミトイル-sn-グリセロ-3ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン (MTP-PE)など；CpG分子群、CpGジヌクレオチド、およびCpGモチーフを含んでなる合成オリゴヌクレオチド（Krieg et al.  Nature (1995) 374:546, Medzhitov et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9, および Davis et al. J. Immunol.  (1998) 160:870-876を参照されたい）、たとえばTCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (配列番号1) および ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC (配列番号2)に由来するアジュバント；ならびに合成アジュバント、たとえばPCPP（ポリ[ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン]）（Payne et al. Vaccines (1998) 16:92-98）があるが、限定するものではない。このようなアジュバントは、Accurate Chemicals   c ; Ribi Immunechemicals（Hamilton, MT）; GIBCO; Sigma（St. Louis, MO）のような多くの業者から市販されている。
【００９９】
本発明で用いる好ましいアジュバントはイミキモド（imiquimod）である。イミキモドは1-(2-メチル-プロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c] キノリン-4-アミンである。これは、分子式C14H16N4および分子量240.3を有する。イミキモドは下記の構造を有する：
【化１】
2006500062.tif 000003
【０１００】
もう一つの好ましいアジュバントはレシキモド（resiquimod）である：
【化２】
2006500062.tif 000004
【０１０１】
レシキモドは4-アミノ-2-エトキシメチル-α, α-ジメチル-1H-イミダゾ [4,5-c] キノリン-1-エタノールである。（R-848; S-28463）。イミキモドおよびレシキモドの適当な誘導体も使用することができる。
【０１０２】
アジュバントを個別に、または2つ以上のアジュバントを組み合わせて、送達することができる。この点に関して、アジュバントの併用は免疫応答を促進することに関して相加的または相乗的効果があると考えられる。相乗効果とは、2以上のアジュバントを併用することによって達成される結果が、個別に投与されたときに個々のアジュバントによって達成される結果を単に足し合わせることによって予想されるよりも大きい状態である。
【０１０３】
被験体に投与される核酸構築物からアジュバントを発現させることができる。アジュバントは、本発明の構築物によってコードされ、または別の構築物によってコードされていてもよい。したがって、本発明の構築物はアジュバントをコードする領域を、被験体においてアジュバントの発現を可能にする制御エレメントに機能しうるように連結して、包含することができる。
【０１０４】
アジュバントが核酸によってコードされる実施形態において、任意の遺伝子発現制御ユニットを使用してアジュバントを発現することができる。アジュバントの高レベルの構成的発現を生じるプロモーターを使用することができる。あるいはまた、抗原の発現に使用されるのと類似の、または同一の遺伝子発現制御ユニットを使用してもよい。
【０１０５】
アジュバントが本発明の核酸構築物とは別の構築物にコードされる実施形態において、アジュバントをコードする構築物は、本発明の構築物とともに、同時に、または順次、投与されることが好ましい。典型的には、２つの構築物は単一の組成物として投与される。たとえば、２つの構築物で同じ粒子をコーティングすることができるが、あるいはまた別々の粒子をコーティングしてから混合してもよい。このような粒子、または粒子の混合物を含んでなる組成物が本発明によって提供される。
【０１０６】
アジュバントが、被験体に投与されるべき核酸によってコードされる実施形態において、好ましいアジュバントの例は、本明細書に記載されるいかなるポリペプチドアジュバントも包含するが、特にPT、CT、LTおよびDTを含めるものとする。
【０１０７】
ウイルスゲノム核酸の調製
概して、本発明に用いるウイルスゲノム核酸は、選択された特定のウイルスのゲノムライブラリから得られる。ウイルスゲノムの選択された領域をいくつかの断片として、または単一の断片としてPCR増幅すること、またはその領域を、ウイルスゲノムの小領域の既存のクローンから得ること、といった他の方法も用いることができる。
【０１０８】
ウイルスゲノムライブラリは、当技術分野で公知のいかなる方法によっても作成することができる。本発明の多くの実施形態において、本発明の構築物におけるウイルスゲノム核酸は、ゲノムライブラリに属する断片とすることができるが、またはそうした断片から導き出すことができる。ゲノムDNAのためにさまざまな起源を用いることができる。ゲノムDNAは、たとえばAdvanced Biotechnologies Inc (ABI) および Clonetech, Incといった供給元から市販され入手可能である。ほかの標準的な起源は、選択されたウイルスから直接分離されたゲノムDNAである。
【０１０９】
本発明の構築物において使用されるウイルスゲノム核酸、およびその構築物自体も、二本鎖または一本鎖の核酸であって、RNAまたはDNAとすることができる。RNAウイルスが使用される本発明の実施形態において、RNAはまず始めにDNAに変換された後、その形で操作され、次にそのDNAからRNA構築物が生成する。
【０１１０】
選択された起源からゲノムDNAを、標準的な手順によって分離することができるが、その手順は一般的に、連続してフェノールおよびフェノール／クロロホルム抽出を行った後エタノール沈澱することを包含する。沈澱後、当該ウイルスから得られたDNAを制限酵素で処理することができる。制限酵素による消化は、より長い断片を得るために、意図的に不完全にすることができる。あるいはまた、ゲノムDNAを完全に消化してもよい。使用する制限酵素は、DNAを切断する平均頻度に基づいて選択され、その結果、得られた消化物中の断片の大部分が一定の望ましいサイズ範囲に含まれることになる。選択された大きさのDNA断片を、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはパルスフィールドゲル電気泳動（Carle et al. (1984) Nuc. Acid Res. 12:5647-5664; Chu et al. (1986) Science 234:1582; Smith et al. (1987) Methods in Enzymology 151:461）を含む多くの技法によって分離して、クローニングのために適切な大きさの出発材料が与えられる。
【０１１１】
ゲノム断片は平滑末端とし、同様に平滑末端を有するベクターにクローニングすることができるが、または、制限酵素切断に起因する特定の一本鎖オーバーハングを有し、したがって、適合するオーバーハングを与えるように調製されたベクター内にクローニングすることができる。必要であれば、標準的な技法を用いて4種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）の存在下で大腸菌DNAポリメラーゼIの大きな断片（Klenow）で処理することによって、制限酵素切断された断片を平滑末端とすることができる。Klenow断片は、5’一本鎖オーバーハングに相補鎖を補うが、突出した3’一本鎖は、たとえ4種のdNTPが存在していても消化切断する。必要ならば、1つだけ、またはいくつかの選択されたdNTPを供給することによって、オーバーハングの性質によって規定される限度内で、選択的修復を行うことができる。Klenow処理後、混合物をたとえばフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱を行うことができる。適当な条件下でS1ヌクレアーゼまたはBAL-31で処理した結果、制限酵素断片のあらゆる一本鎖部分に加水分解が起こり、やはり平滑末端の断片を生じる。
【０１１２】
ひとたび適当なゲノム断片が調製されたならば、それらを任意の適当なベクター構築物またはレプリコンにクローニングすることができる。適当なベクターの例は、当業者によく知られている。ベクターは、たとえば、プラスミドであってもよいが、本発明のある実施形態ではコスミドとすることができる。コスミドクローニングベクターを使用する場合、そのベクターにクローニングされるゲノム核酸断片は、概して大きく、サイズは好ましくは約20,000 bp（20 Kb）から50,000塩基対（50 Kb）の間（もしくはその間のあらゆる整数）であるが、好ましくは約25 kbから50 kbの間、より好ましくは約30-35 kbから50 kbの間であって、約35 kbから約50 kbまでがなおいっそう好ましい。適当なコスミドベクターは、たとえば、SuperCos 1 コスミドベクターキット(Stratagene, La Jolla, California)として市販されている。コスミドへのDNAの連結は、メーカーの使用説明書に従って実施されるが、本明細書の教示に照らして、当技術分野で公知の方法によって、経験的に決定することができる。
【０１１３】
別の好ましい実施形態において、ウイルスゲノム断片は、プラスミドにクローニングされて、プラスミドライブラリを生じる。プラスミドクローニングベクターを使用する場合、断片は、一般的に約5,000 bp (5 kb)から25,000塩基対（25 kb）の間の大きさ（もしくはその間にある、あらゆる整数）であるが、好ましくは約10 kbから25 kbの間、さらに好ましくは約10-15 kbから25 kbの間であって、約15 kbから20 kbまでがなおいっそう好ましい。適当なプラスミドベクターが市販されている。プラスミドへのDNAの連結は、本明細書の教示に照らして、当技術分野でよく知られた方法を用いて行われる。
【０１１４】
構築物のウイルスゲノム核酸から一部の配列を除去することが求められる本発明の実施形態において、構築物中に存在するウイルスゲノム核酸の量は、挿入された異種コード配列を除いて、より小さくなると考えられる。たとえば、ベクター中のウイルスゲノム核酸の全体の大きさは、導入された異種コード配列の長さを除いて、1から20kb、好ましくは1から15kb、より好ましくは3から12kb、なおいっそう好ましくは5から10kbまでの長さとすることができる。
【０１１５】
本発明の多くの実施形態において、選択された内在性遺伝子発現制御ユニットに自然状態で結合している内在性コード配列は欠失していると考えられる。これは適切ないかなる手段によっても行うことができるが、多くの実施形態ではPCRによって行われると考えられる。
【０１１６】
２段階PCR法を用いてコード配列を欠失させることができる。特定の遺伝子についてユニークな制限酵素切断部位を選択する；１つは内在性コード配列の内部、１つはその遺伝子の外側で上流、5’領域、そして第３の部位はその遺伝子の下流、3’領域にある。次に、5’側のユニークな制限酵素切断部位からコード配列のすぐ上流までを増幅するプライマーを用いてPCR反応を実施する。下流のプライマーは、コード配列中のユニークな制限酵素切断部位を包含する。これによって、内在性プロモーターおよびなんらかの他の必要とされる制御エレメントを包含するがコード配列を欠いた、当該遺伝子の5’領域を含んでなるPCR産物が与えられるが、これは5’側の制限酵素切断部位およびコード配列内部の同部位を包含する。次に、野生型ウイルスゲノム核酸を含有するベクターを、5’側および内部のユニークな部位に特異的な制限酵素で消化して、この遺伝子の5’領域を切り取り、次にこれをPCR産物と置き換える。この遺伝子の3’末端についても同じステップのセットを繰り返して、その結果、当該遺伝子のもとの5’および3’末端を有するが、その中のコード配列は除去された構築物が与えられる。
【０１１７】
前に内在性コード配列が存在していたところにユニークな制限酵素切断部位を有する構築物を作製することによって、そのことは、選択された任意の異種コード配列を次にそのベクターに挿入することができることを意味する。ある実施形態において、選択された異種コード配列は、求める部位に容易にクローニングすることを可能にする、ユニークな制限酵素切断部位を含むプライマーを用いてPCRによって増幅される。ある実施形態において、複数のユニークな部位を、選択されたプロモーターの下流に遺伝子操作によって作製し、クローニング法に最大の自由度を与えることができる。
【０１１８】
本発明の構築物は、ゲノムウイルス核酸の単一断片から出発して、次にそれを改変することによって作製されることが好ましいが、同じ最終結果を他の方法によって達成することもできる。たとえば、ゲノム核酸の領域を、一部分ずつ構築することができる。これによって、必要な異種コード配列の導入をいっそう容易にすることができる。ある実施形態において、これによって、ウイルスゲノム核酸から不要な配列を除去するといった、欠失をゲノム核酸に効果的に導入することが可能となる。
【０１１９】
ある実施形態において、PCRを使用して、後に改変するための、または構築物のゲノム核酸の特定の小領域を増幅するための、単一のゲノム核酸断片を得ることができる。また、PCRを使用して、たとえば変異および／または特定の制限酵素切断部位の導入といった、望ましい配列の改変を導入することができる。
【０１２０】
本発明の構築物は一般的に、完全なウイルスゲノムを含んでなることはなく、むしろ構築物は、ウイルスゲノムの1以上の小領域を含んでなると考えられる。したがって、典型的には本発明の構築物は、それ自体、感染性ウイルス粒子を生じる能力を欠くものである。構築物はウイルスの複製開始点、および／または構築物のウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスの複製に必要な１以上の遺伝子を欠いていてもよい。構築物のウイルスゲノム核酸配列は、パッケージングシグナルを欠いていてもよい。その配列は、野生型ウイルスのウイルス粒子中に含まれるタンパク質、またはウイルスの複製に関わるタンパク質をコードする特定の遺伝子を欠いていてもよく、構築物はそうした遺伝子を含有しない可能性がある。ある実施形態においては、構築物中のウイルス核酸配列から発現される唯一の配列が、内在性遺伝子発現制御ユニットに機能しうるように連結された異種コード配列である。
【０１２１】
本発明のある実施形態において、構築物中に存在するウイルスゲノム核酸配列は、選ばれた内在性遺伝子発現制御ユニットの間の不要な配列の一部を除去することによって、短くなっていることがある。このように、異種コード配列に結合した転写終結エレメントの末端から、次の、異種コード配列に機能しうるように結合した遺伝子発現制御ユニットまでの介在配列の一部または全部を欠失させることができる。それに加えて、またはその代わりに、それ自体ユニットに含まれない遺伝子発現制御ユニットの5’と3’末端の間の内在配列の一部または全部を欠失させることができる。これによって、構築物の操作および増殖を容易にすることができる。また、野生型ウイルスと本発明の構築物の間の組換えの可能性を減らすことも意味する。
【０１２２】
欠失した、不必要な配列の量に関しては、総計で、構築物中のウイルスゲノム核酸の5’と3’末端間に相当するウイルスゲノム中の領域のサイズと比較して、10%より多くが除去されるが、好ましくは20%より多く、より好ましくは30%より多く、さらにいっそう好ましくは50%より多くの配列を除去することができる。ある実施形態において、ウイルスゲノム核酸配列の最大75%まで、好ましくは85%まで、さらにいっそう好ましくは95%までを欠失させることができる。一部の例では、１つの異種コード配列に機能しうるように連結された１以上の内在性遺伝子発現制御ユニットの上流の内在性配列の長さは、5kb未満とすることができるが、好ましくは2.5kb未満、より好ましくは1kb未満、さらにいっそう好ましくは500bp未満とすることができる。前記は内在性プロモーターの上流の内在性配列の総量とすることができる。内在性遺伝子発現制御ユニットのすぐ下流の、特に異種コード配列の下流の内在性配列の量は、同様の大きさとすることができる。
【０１２３】
すべての内在性遺伝子発現制御ユニットの間から、またはそれらのうち一部の間からのみ、配列を取り除くことができる。一部の例では、異種コード配列の発現に関わる配列を除く、内在性配列のすべてを欠失させることができる。欠失の大きさは、たとえば、少なくとも250bpからであるが、好ましくは少なくとも1kb、より好ましくは少なくとも2.5 kb、さらにいっそう好ましくは少なくとも5 kbである。導入される欠失は、隣接する2つずつの内在性遺伝子発現制御ユニット間の単一の欠失に相当するが、複数の欠失を導入することもできる。欠失を非コード配列に限定することができる。一般的には、弱毒化を目的とするよりむしろ、構築物のサイズを小さくするために欠失が導入される。
【０１２４】
本発明のある実施形態において、内在性遺伝子発現制御ユニットは内在性プロモーターからなる。このような実施形態において、異種コード配列に機能しうるように連結された内在性プロモーターの間の介在配列の一部または全部を欠失させることができる。欠失させる領域は、典型的には、本明細書に記載のいかなる大きさであってもよい。内在性遺伝子の他の成分、たとえば転写された非コード配列および／またはエンハンサーエレメントを切り取って、異種配列と置き換えることができる。
【０１２５】
任意の適切な方法によって欠失を導入することができる。たとえば、欠失させるべき領域の両側で消化切断する制限酵素によって、構築物を切断することができる。その結果得られたベクターを、不要な断片を取り除いて精製し、再連結して求める欠失を含んでなるベクターを与えることができる。PCRのような他の技法を使用して、選択された欠失を導入することができる。配列決定および制限酵素消化物を用いて、意図した欠失が導入されたことを確認することができる。クローニングの際に求める欠失を有する構築物を選択するために、形質転換の前に、欠失させたはずの領域内部を切断する制限酵素で、連結された核酸を消化することができる。
【０１２６】
ベクターのサイズを小さくするために本質に無関係な配列の一部または全部を除去することは、本明細書で検討されたその他のものと同様に、ウイルスゲノム核酸を含有する構築物に等しく適用できるが、これらは同時期に発現される内在性プロモーターが、異種コード配列ではなく、自然状態で結合しているコード配列に機能しうるように連結されているという点でのみ異なる。たとえば、ウイルスゲノム核酸はHSVを起源とすることができるが、構築物は、ICP 0, 4, 22および27といった、正常な内在性プロモーターの制御下でウイルスゲノム核酸から発現される前初期タンパク質に対する免疫応答を生じるために用いられることを目的とする。発現されるべき抗原をコードする配列およびそうした配列が機能しうるように結合している内在性遺伝子発現ユニットから本質に無関係な配列を除去することは、こういった種類のゲノム核酸構築物にとっても等しく有益である。この場合にも、遺伝子発現制御ユニットの両末端の間の本質に無関係な配列を除去して、構築物の大きさをさらに小さくすることができる。
【０１２７】
したがって、本発明はまた、被験体への直接投与がその被験体において免疫応答を引き起こす、核酸構築物を作製する方法を提供するが、その方法は下記を含んでなる：
(a)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入すること、前記ウイルスゲノム核酸は、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットを含んでなり、このユニットはさらにそれぞれ1つの内在性プロモーターを含んでおり、ここでユニットの内在性プロモーターはウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスのウイルスサイクルにおいて同時期に活性となる；および、
(b)  ウイルスゲノム核酸をベクターの骨格構造に挿入する前、挿入時、もしくは挿入後のいずれかの時に、少なくとも2つの内在性遺伝子発現制御ユニットは別として、構築物のウイルスゲノム核酸の5’から3’末端までの間に相当するウイルスゲノムの領域に存在するウイルス配列の一部または全部を、ウイルスゲノム核酸から欠失させること、
ここで、ベクターの骨格構造に挿入されるウイルスゲノム核酸の長さは１から50 kbまでである。
【０１２８】
導入される欠失は、本明細書で検討されるいずれの欠失にも類似した性質を有し、作製される構築物は、内在性遺伝子発現制御ユニットが、異種コード配列ではなく、その本来のコード配列に結合しているという事実は別として、本発明の他の構築物のいずれにも類似した特徴および有用性を有すると考えられる。したがって、そうした構築物を用いて、コーティングされた粒子、投与容器、粒子を介したデリバリー装置などを作製することが可能であり、構築物を本明細書の他の箇所での記載のように、免疫化の方法および遺伝子発現を達成する方法に用いることができる。
【０１２９】
構築物の投与
本明細書に記載の核酸構築物および補助的物質を何らかの適当な方法によって投与することができる。下記の好ましい実施形態において、適当な構築物でコア担体粒子をコーティングした後、コーティングされた粒子を被験体または細胞に投与することによって、構築物は投与される。しかしながら、他の非ウイルス性のシステム、たとえば裸の核酸のデリバリーによって、ゲノム断片を送達することもできる。
【０１３０】
構築物を、ウイルスを用いて送達することができるが、ウイルスを用いないことが好ましい。したがって、構築物は典型的には、非ウイルス性の手段によって被験体に直接送達されることとなる。このように、構築物は、ウイルスパッケージングシグナル配列および／またはウイルスの複製開始点を欠失してさしつかえない。典型的には、構築物は、ウイルスゲノム核酸の起源であるウイルスに本来備わっているウイルスパッケージング配列および／またはウイルス複製開始点を欠いている。構築物は、複製するためにin transで与えられるヘルパーウイルスおよび／またはウイルスタンパク質を必要としないことが好ましく、特に、複製のために、ゲノム核酸の起源であるウイルスに由来するヘルパーウイルスもしくはタンパク質を使用することはない。しかしながら、コスミドを基にした構築物の場合、λタンパク質をin transで提供してもよく、ウイルスは複製に必要なコスミド配列を有することができる。
【０１３１】
アジュバントを発現するために別の核酸構築物が使用される実施形態において、その構築物は本発明の構築物とともに製剤することができるが、別々に製剤してもよい。別々に製剤する場合には、製剤方法は本発明の構築物の製剤で用いられたのと同じとすることができる、および／または製剤は、含まれる構築物以外は相互に同一とすることができる。２つの構築物を、どのような適当な割合で投与することもできるが、たとえば、等モル量で、または1:2、好ましくは1:5、さらに好ましくは1:10のモル比でどちらか一方の構築物が過剰となる。本発明はまた、本発明の構築物およびアジュバントをコードする構築物を含んでなるワクチンを提供する。
【０１３２】
従来型の医薬品
アジュバント組成物の添加の有無にかかわらず、本発明の構築物を含んでなる標品の製剤は、いずれも当業者に容易に利用可能な標準的な医薬品製剤化学および方法論によって実施することができる。たとえば、１つまたは複数の構築物を含有する組成物を、1つ以上の製薬上許容される添加剤または賦形剤と混合して、液体製剤を与えることができる。
【０１３３】
補助的な物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝物質などが添加剤または賦形剤中に存在してもよい。これらの添加剤、賦形剤および補助的物質は一般に、組成物を受容する個体において免疫応答を誘導しない医薬品であって、不適当な毒性なしに投与することができる。製薬上許容される添加剤には、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールといった液体があるがそれらに限定されない。また、製薬上許容される塩としては、たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などといった鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などといった有機酸の塩を挙げることができる。
【０１３４】
必要ではないが、ワクチン組成物中に含まれるならば、製剤は、特にペプチド、タンパク質または他の同様の分子に対して安定化剤として機能する、製薬上許容される添加剤を含有することも好ましい。ペプチドに対して安定化剤としても作用する適当な担体の例は、医薬品等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどを包含するがそれらに限定されない。他の適当な担体は、やはり限定するものではないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）、およびそれらの組み合わせを包含する。製薬上許容される添加剤、賦形剤および補助的物質に関する詳細な考察は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991) に見出すことができるが、参考として本明細書に含めるものとする。
【０１３５】
核酸の取り込みおよび／または発現を促進する特定の物質（「トランスフェクション促進物質」）も組成物中に含めることができるが、これはたとえば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースといった促進剤、ならびに核酸分子のデリバリーに通常使用されるリポソームもしくは脂質標品といったトランスフェクション促進媒体である。陰イオン性および中性リポソームは広範に利用可能であって、核酸分子を送達することでよく知られている（Liposomes: A Practical Approach, (1990) RPC New Ed., IRL Pressを参照されたい）。陽イオン性脂質標品も、核酸分子のデリバリーに用いる公知の媒体である。適当な脂質標品には、DOTMA（N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロリド）、商標名リポフェクチン（Lipofectin(登録商標)）として入手可、およびDOTAP（1,2-ビス(オレイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン）があるが、たとえば、Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081; 米国特許第5,283,185号および第5,527,928号、ならびに国際公開WO 90/11092, WO 91/15501 および WO 95/26356を参照されたい。これらの陽イオン性脂質は中性脂質、たとえばDOPE（ジオレイル ホスファチジルエタノールアミン）と共に使用されることが好ましい。上記の脂質もしくはリポソーム標品に添加することができる、さらに上記以外のトランスフェクション促進組成物としては、スペルミン誘導体（たとえば、国際公開WO 93/18759を参照されたい）ならびに膜透過性を高める化合物、たとえばGALA、グラミシジンSおよび陽イオン性胆汁酸塩がある（たとえば、国際公開WO 93/19768を参照されたい）。
【０１３６】
あるいはまた、本発明の核酸分子を粒子性担体にカプセル化する、吸着する、もしくは結合することができる。適当な粒子性担体は、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導される担体、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド-コ-グリコリド）から誘導されるPLG微粒子を包含する。たとえば、Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照されたい。他の粒子系およびポリマー、たとえば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンならびにこれらの分子の複合体といったポリマーも使用することができる。
【０１３７】
調剤されたワクチン組成物は本発明の構築物を包含するものとする。適当な有効量は当業者であれば容易に決定することができる。こうした有効量は、日常的な実験で決定することができる比較的広範な範囲となるであろう。たとえば、1μgのような少量のDNAを用いて免疫応答が得られたが、それに対して他の投与では、最大2 mgまでのDNAが使用された。概して、構築物の有効投与量は、構築物約10μgから1000μgまでの範囲にあると予想されるが、しかしながら、この範囲より上および下の用量も有効であると認められる可能性がある。したがって、組成物は約0.1%から約99.9%までの構築物を含有することができる。
【０１３８】
従来型医薬品の投与
上記医薬品の投与は、治療経過の全体をとおして、単回投与で、継続的に、または断続的に実施することができる。デリバリーは、もっとも一般的には液体組成物および粒子性組成物を含有する液体懸濁液に対して従来の注射器と針を用いて行われる。さらに、さまざまな液体ジェット式注入が当技術分野で知られており、それを用いて本発明の組成物を投与することができる。もっとも効果的な投与方法および投与量を決定する方法は当業者によく知られており、デリバリー媒体、治療組成物、標的細胞および処置されるべき被験体によって変動すると思われる。主治医によって選択された投与量レベルおよび投与パターンにしたがって、単回および複数回の投与を行うことができる。
【０１３９】
さらに、本発明の方法によって送達される構築物を他の適当な組成物および治療と併用することも目的とする。たとえば、被験体において免疫応答を増大させるために、本明細書に記載の組成物および方法は、さらに、薬剤、サイトカインなどといった補助的な物質（たとえば、アジュバント）を包含することができる。補助的物質は、本明細書に記載のDNAワクチン（たとえばコスミドもしくはプラスミド）の投与と同時に、投与前に、もしくは投与後に、たとえばタンパク質または他の高分子のように投与することができる。また、当業者に公知の方法によって、組成物を直接、被験体に投与すること、あるいはまたex vivoで被験体に由来する細胞に送達することもできる。
【０１４０】
コーティングされた粒子
ある実施形態において、本発明の構築物、およびアジュバントのような他の補助的成分は担体粒子を用いて送達される。こうした核酸標品を投与する、粒子を介したデリバリー法は当技術分野で公知である。したがって、上記構築物が調製され、適切に精製されたならば、当技術分野で既知のさまざまな技法を用いて、担体粒子（たとえばコア担体）表面をこの構築物でコーティングすることができる。担体粒子は、一般に適当な粒子デリバリー装置からの細胞内デリバリーのために使用される粒子サイズの範囲で適当な密度を有する材料から選択される。最適な担体粒子サイズは、当然、標的細胞の直径によって決まる。
【０１４１】
本発明の目的のために、使用可能なコア粒子は、タングステン、金、プラチナ、およびイリジウムのコア担体粒子を包含する。タングステンおよび金粒子が好ましい。タングステン粒子は、平均粒径0.5から2.0μmのサイズで簡単に入手できる。こうした粒子は粒子デリバリー法で使用する最適密度を有し、非常に効率的な核酸によるコーティングを可能にするが、タングステンは特定の細胞タイプに対して潜在的毒性を有する可能性がある。したがって、金粒子もしくは微結晶性の金（たとえば、金粉末A1570、Engelhard Corp., East Newark, NJより入手可能）も本発明で用いられる。金粒子は、大きさとしては均一であり（Alpha Chemicalsより市販、粒子サイズ1-3μm、またはDegussa, South Plainfield, NJより市販、0.95μmを含む粒子サイズ範囲）、毒性は低い。
【０１４２】
DNAもしくはRNAを金もしくはタングステン粒子上にコーティングする、または沈着させる多数の方法が知られており、記載されている。そのような方法の大半は、一般に、予め決められた量の金またはタングステンをプラスミドDNA、CaCl2およびスペルミジンと混合する。その結果得られた溶液をコーティングが進行する間、頻繁にボルテックスで撹拌して、反応混合物の均一性を確実なものとする。核酸の沈着後、コーティングされた粒子を適当な膜に移し、使用前に乾燥させてサンプルモジュールまたはカセットの表面にコーティングし、または適当な粒子デリバリー装置で使用するためにデリバリーカセット内に充填することができる。
【０１４３】
ペプチドアジュバント（たとえば、サイトカインおよび細菌毒素）も、同一または類似のコア担体粒子上にコーティングすることができる。たとえば、２つの成分を経験的に決められた比率で単純に混合することによって、硫酸アンモニウム沈澱もしくは他の当業者によく知られた溶媒沈澱法によって、またはペプチドを担体粒子に化学的に結合させることによって、ペプチドを担体粒子に付着させることができる。L-システイン残基の金に対する結合は、すでに記載されている（Brown et al., Chemical Society Reviews 9:271-311 (1980)）。他の方法には、たとえば、ペプチドアジュバントを無水エタノール、水またはアルコール／水混合物に溶解すること、その溶液を一定量の担体粒子に加えること、そしてその混合物を次にボルテックス撹拌しながら（空気）気流下もしくは窒素ガス気流下で乾燥することを包含する。あるいはまた、アジュバントを担体粒子表面上で真空遠心によって乾燥することができる。乾燥したら、コーティングされた粒子を適当な溶媒（たとえば、酢酸エチルまたはアセトン）に再懸濁し、細かく分散させて均一化し（たとえば超音波処理によって）、実質的に均一な懸濁液を与えることができる。アジュバントでコーティングされたコア担体粒子を次に、本発明の核酸構築物を保有する担体粒子と混合して１回の粒子注入ステップで投与する、または核酸構築物組成物とは別々に投与することができる。
【０１４４】
ある実施形態において、アジュバントをコードする構築物を本発明の構築物と同じ粒子上にコーティングすることができる、または別の粒子にコーティングした後本発明の構築物でコーティングされた粒子と混合することができる。
【０１４５】
コーティングされた粒子の投与
コーティング粒子の作製後、本発明の構築物でコーティングされたコア担体粒子は単独で、またはたとえばアジュバント標品と組み合わせて、粒子を介したデリバリー技法を用いて被験体に送達される。
【０１４６】
粒子を介したデリバリー技法に適したさまざまな粒子デリバリー装置が当業界で知られているが、いずれも本発明の実施で使用するために適している。現行の装置の設計は、爆発性の発射、電気的発射、またはガスによる発射を利用して、コーティングされたコア担体粒子を標的細胞に向けて推進する。コーティングされた粒子自体は、放出可能なように移動可能なキャリアシートに付着し、または気流が通過する表面に移動可能なように付着しており、その表面から粒子を捲き挙げて、標的に向かってそれらを加速する。ガス発射装置の例が米国特許第5,204,253号に記載されている。爆発型装置は、米国特許第4,945,050号に記載されている。電気的発射型粒子加速装置の例は、米国特許第5,120,657号に記載されている。本発明で使用するのに適した他の電気的発射装置は米国特許第5,149,655号に記載されている。これらすべての特許の装置の開示はその全体を参考として本明細書に含めるのもとする。
【０１４７】
コーティングされた粒子は、投与剤形と適合する方法で、しかも望ましい免疫応答を引き起こすのに有効な量で、処置を受けるべき被験体に投与される。送達すべき組成物の量は、核酸の場合には一般に0.001から100.0μgの範囲内、より典型的には0.01から10.0μg、好ましくは用量当たり0.1から5μgの核酸分子であり、ペプチドもしくはタンパク質の場合には1μgから5mgまで、より典型的には1から50μg、好ましくは5から25μgのペプチドであるが、これは処置を受けるべき被験体によって決まる。
【０１４８】
抗原をコードする構築物が投与されるべき実施形態において、同様の量のそうした構築物を投与することができる。あるいはまた、本発明の構築物とアジュバントをコードする構築物の総量は、上記範囲に含めることができる。
【０１４９】
必要な構築物の正確な量は、他の因子はもちろんであるが、免疫化すべき個体の年齢および全身状態、および選択された特定のヌクレオチド配列もしくはペプチドに応じて変化するであろう。本明細書を読めば、当業者は適切な有効量を、容易に決定することができる。
【０１５０】
このように、本明細書に記載の構築物の有効量は、免疫化される被験体において適当な免疫応答を引き起こすのに十分であって、比較的広い範囲内にあると思われるが、日常的な試験によって決定することができる。好ましくは、コーティングされたコア粒子は、処置された被験体において免疫応答（たとえば、T細胞活性化）を引き起こすために、適当なレシピエント細胞に送達される。
【０１５１】
粒子性組成物
あるいはまた、本発明の構築物、ならびに1または複数の選択されたアジュバントは、粒子性組成物として製剤されることもある。より詳細には、標準的な製薬製剤化学および方法論によって当該の構築物を含んでなる粒子の製剤を行うことができるが、それらはいずれも当業者に容易に使用可能である。たとえば、１以上の構築物および／またはアジュバントを、１以上の製薬上許容される添加剤もしくは賦形剤と混合して１つのワクチン組成物を与えることができる。ある実施形態において、アジュバント自体ではなく、アジュバントをコードする核酸を組成物に含めるものとする。補助的物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝物質などが添加剤もしくは賦形剤中に含まれていてもよい。これらの添加剤、賦形剤および補助的物質は一般に、その組成物を受容する個体においてそれ自体免疫応答を引き起こすことのない薬剤であって、しかも不適当な毒性なしに投与することができる。製薬上許容される添加剤には、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールといった液体があるがそれらに限定されない。製薬上許容される塩としては、たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などといった鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などといった有機酸の塩を挙げることができる。
【０１５２】
必要ではないが、核酸組成物は、特にペプチド、タンパク質または他の同じようなアジュバントもしくは補助的物質に対して安定化剤として機能する、製薬上許容される担体を含有することも好ましい。ペプチドに対して安定化剤としても作用する適当な担体の例は、医薬品等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどを包含するが限定されない。他の適当な担体は、やはり限定するものではないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）、およびそれらの組み合わせを包含する。製薬上許容される添加剤、担体、安定化剤および他の補助的物質に関する詳細な考察は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991) に見出すことができるが、これは参考として本明細書に含めるものとする。
【０１５３】
製剤された組成物は、上記のように、免疫応答を引き起こすに足る量として送達される。適切な有効量は、当業者であれば容易に決定することができる。こうした量は、比較的広い範囲に含まれるが、概して当該核酸構築物の約0.1μgから25 mg以上に至る範囲内であって、具体的な適量は日常的な実験によって決定することができる。
【０１５４】
組成物は、核酸分子を約0.1%から約99.9%まで、好ましくは1から80%まで、より好ましくは10から50%まで、さらにいっそう好ましくは20から40%まで、含有することができる。アジュバントが組成物中に含まれるならば、または粒子性アジュバント組成物を与えるような方法が用いられるならば、アジュバントは上記の適当な量の中に含まれることになる。次に、組成物は、標準的な技法、たとえば、単純な蒸発（風乾）、真空乾燥、噴霧乾燥、フリーズドライ（凍結乾燥）、噴霧凍結乾燥、吹き付けコーティング、沈着、超臨界液体粒子形成などによって粒子として調製される。必要ならば、得られた粒子を、共有する国際公開WO 97/48485（参考として本明細書に含める）に記載の技法によって高密度化することができる。
【０１５５】
使用に先立って、単回投与または複数回投与容器内に粒子を収めることができるが、こうした容器は、適当な核酸構築物および／または選択されたアジュバントを含んでなる（たとえばワクチン組成物を与える）、適量の粒子を封入した密閉容器を含んでなると考えられる。粒子性組成物を無菌製剤として容器に収めることができるが、したがって密閉容器は、本発明の方法で使用するまで、製剤の無菌性を維持するようにデザインされる。必要ならば、容器を、粒子デリバリー装置における直接的な使用に適合させることができる。このような容器はカプセル、ホイルパウチ、小袋、カセットなどの形をとることができる。適当な粒子デリバリー装置（たとえば、ニードルレスシリンジ）が本明細書に記載されているが、これもデリバリー用の粒子と共に包装されていてもよい。
【０１５６】
粒子を収めた容器は、さらに組成物が識別できるようにラベルを付けて、適切な投与情報を与えることができる。加えて、容器には、たとえば食品医薬品局のような政府機関によって規定された形式による告示のラベルを付けてもよく、この場合この告示は、ヒトへの投与用の容器に含まれる抗原、アジュバント（またはワクチン組成物）の製造、使用または販売に関する、連邦法に基づいた当局による認可を示す。
【０１５７】
粒子性組成物（1または複数の当該構築物だけを含んでなる、または選択されたアジュバントと組み合わせて含んでなる）を次に、経皮的デリバリー技法によって投与することができる。好ましくは、粒子性組成物は粉末注入法によって送達されるが、これは、たとえば、共有する国際公開WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513、およびWO 96/20022に記載のようなニードルレス シリンジ システムから送達されるものであって、前記はいずれも参考として本発明に含めるものとする。このようなニードルレス シリンジ システムからの粒子のデリバリーは、典型的には、その大きさが概算でおおむね0.1から250μmまでの範囲にある粒子で実施されるが、約10-70μmの範囲が好ましい。約250μmより大きな粒子も装置から送達することができるが、その上限は、粒子の大きさが皮膚細胞に対する不都合な損傷を引き起こすであろう限界点である。送達された粒子が標的表面を貫通する実際の距離は、粒子サイズ（たとえば、おおまかに粒子が球形であると想定した公称粒径）、粒子密度、粒子が表面に衝突する初速度、ならびに標的皮膚組織の密度および動粘性率によって決まる。この点について、ニードルレス注入に使用するために最適な粒子密度は、概して約0.1から25 g/cm3の範囲であるが、好ましくは約0.9から1.5 g/cm3まで、さらに好ましくは約1.2から1.4 g/cm3の範囲であって、注入速度は、概して、約100から3,000 m/sec以上である。適当なガス圧で、10-70 μmの平均粒径を有する粒子を、ノズルを通して超音速の駆動ガスフローに近い速度に加速することができる。
【０１５８】
必要ならば、これらのニードルレス シリンジ システムを、構築物および／または選択されたアジュバントを含んでなる、適当な投与量の粒子を含有する、あらかじめ充填された状態で提供することができる。充填されたシリンジは密封容器に包装することができるが、その容器にはさらに上記のようなラベルを付けることができる。
【０１５９】
このように、この方法を用いて、約10から約250μmの範囲の大きさを有する核酸粒子を得ることができるが、好ましくは約10から約150μm、もっとも好ましくは約20から約60μmまでの範囲である；さらに、粒子密度は約0.1から約25 g/cm3までの範囲であるが、かさ密度は約0.5から約3.0 g/cm3まで、またはそれ以上である。
【０１６０】
同様に、選択されたアジュバント粒子であって、大きさは約0.1から約250μmまでの範囲、好ましくは約0.1から約150μm、もっとも好ましくは約20から約60μmまでの範囲であり；さらに、粒子密度は約0.1から25 g/cm3までの範囲であるが、かさ密度は、好ましくは約0.5から約3.0 g/cm3まで、もっとも好ましくは約0.8から約1.5 g/cm3までの範囲である前記粒子を得ることができる。
【０１６１】
粒子性組成物の投与
組成物を作製後、粒子性組成物（たとえば粉末）を、適当な経皮的デリバリー法を用いて、脊椎動物被験体の組織に経皮的に送達することができる。当該物質を投与するのに適した、さまざまな粒子デリバリー装置が当技術分野で知られているが、それらを本発明の実施に利用することができる。特に好ましい経皮的粒子デリバリーシステムはニードルレスシリンジを用いて、傷のない皮膚および組織の中に貫通して、制御された投与量の固形微粒子を発射するものである。たとえば、ニードルレスシリンジ（「PowderJect（登録商標）粒子デリバリー装置」としても知られている）を記載するBellhouseらの米国特許第5,630,796号を参照されたい。他のニードルレスシリンジ構造も当技術分野において知られており、本明細書に記載される。
【０１６２】
本明細書に記載の粉末にした分子を治療上有効な量含有する組成物を、上記粒子デリバリー装置によって、適合するどのような標的組織にも送達することができる。たとえば、組成物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織に送達することができる。核酸構築物に関しては、デリバリーは最終分化細胞を到達点とし、そこで分子が発現することが好ましいが、血液幹細胞および皮膚線維芽細胞といった未分化もしくは部分分化した細胞に分子を送達することもできる。
【０１６３】
粉末状にした組成物を被験体に投与し、剤形に適合した方法で、しかも予防上および／または治療上有効と思われる量で処置する。送達されるべき組成物の量は、一般に単位用量当たり核酸構築物0.5μg/kgから100μg/kgの範囲内であるが、処置されるべき被験体によって決まる。生理活性ペプチドおよびタンパク質といった他の医薬品の投与量は、一般に約0.1μgから約20 mgまでの範囲であるが、10μgから約3 mgまでが好ましい。正確な必要量は、処置されるべき個体の年齢および全身状態、処置される状態の重症度、送達される個別製剤、投与部位、ならびに他の要因によって変動すると考えられる。当業者は容易に適切な有効量を決定することができる。
【０１６４】
したがって、本発明の粒子状組成物の「治療上有効な量」は、病気または症状の治療もしくは予防を達成するのに十分な量であって、日常的な実験によって決定可能な比較的広い範囲に含まれると考えられる。
【０１６５】
下記は、本発明の実施に関する具体的な実施形態の例である。実施例は説明する目的でのみ提示され、決して本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【０１６６】
実施例
使用する数字（たとえば量、温度など）については正確さを確保するよう努力したが、ある程度の実験誤差および偏りは当然考慮されるべきである。
【０１６７】
実施例１：OP23-6構築物の構築
4個すべての前初期遺伝子を含んでなるが、本質に無関係なウイルスゲノム配列を欠失したHSV-2構築物を構築した。このベクターを構築する出発点は、公表された配列（HG52株）に基づくHSV-2ゲノム遺伝子のヌクレオチド110,931から147,530に及ぶ、HSV-2 MS株に由来する3個のEcoRI断片を包含するコスミドとした。遺伝子の順序も公表された配列に示されるとおりである。
【０１６８】
このコスミドを部分的にEcoRIで消化して再連結し、28,000断片（110,931 - 139,697）のみを有する構築物を選択した。この分子をOP-23と称することとした。この分子から6個の変異体が作製され、ウイルスゲノム核酸から不要な配列の大部分を除去した。改変は下記のように行った：
1. コスミドをBst1107IおよびScaIで消化し、再連結して（アンピシリン耐性遺伝子を除去し）OP23-1を作製する。
【０１６９】
2. NsiIで消化し、再連結してSV40複製開始点を除去し、OP23-2を作製する。
【０１７０】
3. BstXIで部分消化して再連結し、ICP27からICP0の間の領域を除去してOP23-3が与えられる。
【０１７１】
4. BspHIで完全消化した後、BsiWIで部分消化してから再連結し、ICP22遺伝子に続く配列および一部の骨格構造配列を除去する。これによってOP23-4が与えられる。
【０１７２】
5. SrfIで消化し再連結してOP23-5を作製する（ICP4とICP0の間の配列を除去する）。
【０１７３】
6. BstXIで完全消化し再連結してOP23-6を作製する（ICP27とICP0の間から小断片を除去する）。
【０１７４】
OP23-6構築物の配列決定を行って、ベクターの構造およびその配列を確認した。
【０１７５】
構築物OP23およびOP23-6の構造を図1に示す。
【０１７６】
実施例２：不必要な配列を欠失した複数抗原HSV1ワクチンの作製
HSV1について、実施例1でHSV-2について記載したのと同タイプのワクチンを開発することができる。
【０１７７】
EcoRIによる部分消化をHSV-1に対して行ってゲノム断片を生成したのち、Stratagene製のsuperCosキットを用いて、その断片を含んでなるコスミドを作製した。次に、HSV-1ゲノムの110,095から146,694の配列を含有するコスミドを選択する。数回の消化および再連結を行って、HSV-1由来の4個の前初期遺伝子を発現するが不必要な介在配列の大部分を欠失した最終的な小型ベクターを作製することができる。
【０１７８】
下記のステップを実行し、求める構築物を作製する：
1. コスミドHSV1（43392 bp）をSca IおよびNdeIで消化し、再連結してOPhsv1-1が与えられる。
【０１７９】
2. OPhsv1-1（39694 bp）をAflIIおよびClaIで消化し、再連結してOPhsv1-2が与えられる。
【０１８０】
3. OPhsv1-2（31365 bp）をEcoRVおよびSwaIで消化し、再連結してOPhsv1-3が与えられる。
【０１８１】
4. OPhsv1-3（30727 bp）をBbvCIで消化し、再連結してOPhsv1-4が与えられる。
【０１８２】
5. OPhsv1-4（27688 bp）をBpu11021およびBbvC1で消化し、再連結してOPhsv1-5が与えられる。
【０１８３】
6. OPhsv1-5（26121 bp）をkpnで消化し、Psp14061で部分消化し、存在する4個すべての前初期遺伝子を有するが他の不必要な配列の大部分を除去した最終構築物OPhsv1-6が与えられる。
【０１８４】
実施例３：異種コード配列の挿入
(i)一般戦略
実施例１で作製された構築物OP23-6を用いて、ICP0、4、22および27コード配列を異種コード配列で置き換えた構築物を作製する。使用する基本戦略は、まず本来のコード配列を除去してから、その場所に異種コード配列を挿入することである。それぞれのコード配列を置き換えるための考え方は、3個のユニークな制限酵素切断部位を見出すことである；１つは遺伝子内部；1つは遺伝子の外側で上流の5’領域；および1つは下流3’領域にある。次に２段階でコード配列を置き換える。
【０１８５】
PCRプライマーを選択し、5’上流のユニークな制限酵素切断部位を含めてそこからコード配列開始のすぐ上流までを増幅する。3’プライマーはコード配列内のユニークな制限酵素切断部位配列を包含する。PCRは、遺伝子の5’領域を有するがコード配列はなく、コード配列内に認められるユニークな制限酵素切断部位を末端に有するDNA断片を生成する。次に本来のベクターを5’制限酵素切断部位、およびコード配列に内在する制限酵素切断部位に特異的なユニークな酵素で消化し、遺伝子の5’側の半分を切り取る。次にこれを同じ酵素で消化したPCR産物で置き換える。コード配列の3’末端についても同じステップのセットを繰り返して、結果的に、遺伝子のもとの5’および3’末端を有するがコード配列は除去された構築物が与えられる。その構築物のうち残存するのは、その内部のユニークな制限酵素切断部位がすべてである。その後、新たな遺伝子をその部位に挿入することになる。そこで、OP23-6に存在するICP遺伝子の数について必要な回数だけ、このプロセスを繰り返すことができる。
【０１８６】
(ii)分子生物学
DNA配列を操作するために使用される標準的な分子生物学の方法論は、OP23-6を、異種抗原を発現する望ましい複遺伝子性構築物に変換するために利用される。本来のOP23-6の部分に置き換える、適当なDNA断片を作製するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、その断片をpTARGETベクター（Promega）にクローニングする。陽性クローンを次に制限消化によって同定し、陽性クローンの細菌培養物から精製したDNAを使用して、望ましい断片の精製標品を単離する。あらかじめ適当な制限酵素で切断しアガロースゲルで精製したOP23-6ベクター中に、アガロースゲルで精製した断片を連結する。次に、陽性のものを制限消化によって選別する。
【０１８７】
ベクター中に挿入されるべき異種遺伝子はPCR反応によって得られるが、この反応において、適当な制限酵素切断部位がPCR断片の5’および3’末端に遺伝子工学によって作られる。望ましい挿入物を含有する陽性物を制限消化によって選別し、さらに正しい方向性を確認する。DNA配列決定を行って、得られたクローンが求める配列を含有することを確認する。
【０１８８】
(iii) DNAワクチンの調製
DNAの金粒子への沈着は、DNAワクチンのカルシウム／スペルミジン製剤のための標準的な方法によって達成される。50mMスペルミジン300 mlを含有する小型遠心チューブ内でDNAを2ミクロン金粒子と混合する。添加するDNA量は金粒子1 mgあたり2μgであるが、典型的には金26 mg（DNA 52μg）のバッチを行う。DNAは、ロータリーミキサーでのチューブの連続撹拌中に1/10容量の10% CaCl2を添加することによって、金に沈着する。DNA金複合体を無水エタノールで3回洗浄した後、テフゼルチューブに充填して乾燥し、XR-1装置で使用するための0.5インチセグメントに切断する。
【０１８９】
免疫化のために、DNAワクチンをXR-1装置によってBalb/Cマウスの腹部に送達する。各回の免疫化のために1回の発射が行われ、動物は4週間で初回および追加免疫を与えられる。最終免疫化の2週間後に動物からサンプルを採取する。
【０１９０】
(iv)抗体ELISA
血清サンプルについて、ELISAアッセイを用いて、ベクターによって発現される異種抗原に対する抗体をアッセイする。Falcon Pro BindマイクロタイタープレートをPBS（リン酸緩衝食塩水、Bio Whittaker）中の抗原で4℃にて一晩コーティングする。プレートを5%粉乳/PBSで室温にて1時間ブロックした後、洗浄バッファー（10 mM Tris緩衝食塩水、0.1% Brij-35）で3回洗浄する。希釈バッファー（2%粉乳/PBS/0.05% Tween 20）で希釈した血清サンプルをプレートに加えた後、室温にて2時間インキュベートする。プレートを3回洗浄し、希釈バッファーで1:8000に希釈したビオチン化ヤギ抗マウス抗体（Southern Biotechnology）をプレートに加え、室温にて1時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを3回洗浄し、次にPBSで1:8000に希釈したストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（Southern Biotechnology）を加え、プレートを室温にてさらに1時間インキュベートする。プレートを3回洗浄後、基質溶液を加え（BioRad）、1N H2SO4で反応を止める。光学密度を450 nmで読み取る。
【０１９１】
(v)細胞培養
マウスの脾臓から単一細胞浮遊液を得る。脾臓を網に押し込んで漉し、単一細胞浮遊液を作ったのち、細胞を沈降させてACKバッファー（Bio Whittaker, Walkersville MD）で処理し、赤血球を溶解する。次に細胞を、HEPES、1%グルタミン（Bio Whittaker）および5%の熱失活させたウシ胎仔血清（FCS, Harlan, Indianapolis IN）を添加したRPMI 1640培地で2回洗浄する。細胞を計数し、適当な濃度で“Total”培地中に再懸濁するが、この培地は、5% 熱失活FCS、50 mMメルカプトエタノール（Gibco-BRL, Long Island NY）、ゲンタマイシン（Gibco-BRL）、1 mM MEMピルビン酸ナトリウム（Gibco-BRL）およびMEM非必須アミノ酸（Sigma, St. Louis MO）を加えた、HEPESおよび1%グルタミンを含むRPMI 1640からなる。細胞懸濁液を次にさまざまなイムノアッセイに使用する。CD8特異的アッセイのために、既知のCD8エピトープに相当するペプチドの存在下で細胞をin vitroで培養する。ペプチドはDMSO中（10 mg/ml）として調製され、培地で10μg/mlに希釈される。
【０１９２】
(vi)ELISPOT
IFN-g ELISPOTアッセイのために、Millipore Multiscreen膜濾過プレートを、滅菌0.1M炭酸バッファーpH 9.6中の15μg/ml抗IFN-g抗血清（Pharmingen）50μlで4℃にて一晩コーティングする。プレートを滅菌PBSで6回洗浄した後、10%ウシ胎仔血清（FBS）を含有する組織培養培地で室温にて1-2時間ブロックする。培地を除去し、脾細胞を、ウェル当たり1 x 106細胞個となるようにウェル内に分注する。免疫化した動物由来の細胞が1 x 106細胞個に満たないウェルについては、未処置動物由来の細胞を用いて全体として1 x 106細胞個となるようにする。上記ペプチドの存在下で組織培養インキュベーター内にて一晩細胞をインキュベートする。プレートをPBSで2回、蒸留水で1回、洗浄する。これに続いてPBSで3回洗浄する。ビオチン化抗IFN-gモノクローナル抗体（Pharmingen）をプレートに加え（PBS中1μg/ml溶液を50μl）、室温で2時間インキュベートする。プレートをPBSで6回洗浄した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体（1:1000 in PBS, Pharmingen）50μlを加え、室温で2時間インキュベートする。プレートをPBSで6回洗浄し、発色基質（BioRad）を加えて濃い色のスポットが現れるまで反応を進行させる。水で3回洗浄することによって反応を止める。プレートを風乾して顕微鏡下でスポットを計数する。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１ａ】図１ａはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｂ】図１ｂはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｃ】図１ｃはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｄ】図１ｄはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｅ】図１ｅはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｆ】図１ｆはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｇ】図１ｇはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ｈ】図１ｈはコスミド23および構築物OP23-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図２ａ】図２ａは構築物OPhsv1-1およびOPhsv1-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図２ｂ】図２ｂは構築物OPhsv1-1およびOPhsv1-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図２ｃ】図２ｃは構築物OPhsv1-1およびOPhsv1-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図２ｄ】図２ｄは構築物OPhsv1-1およびOPhsv1-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図２ｅ】図２ｅは構築物OPhsv1-1およびOPhsv1-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図２ｆ】図２ｆは構築物OPhsv1-1およびOPhsv1-6、ならびにそれら２つの間のさまざまな中間構築物のプラスミド地図を与える。
【図１ａ】
2006500062.tif 000005
【図１ｂ】
2006500062.tif 000006
【図１ｃ】
2006500062.tif 000007
【図１ｄ】
2006500062.tif 000008
【図１ｅ】
2006500062.tif 000009
【図１ｆ】
2006500062.tif 000010
【図１ｇ】
2006500062.tif 000011
【図１ｈ】
2006500062.tif 000012
【図２ａ】
2006500062.tif 000013
【図２ｂ】
2006500062.tif 000014
【図２ｃ】
2006500062.tif 000015
【図２ｄ】
2006500062.tif 000016
【図２ｅ】
2006500062.tif 000017
【図２ｆ】
2006500062.tif 000018
【国際調査報告】
2006500062.tif 000019
2006500062.tif 000020
2006500062.tif 000021
2006500062.tif 000022