(57)【要約】本発明は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）を結合し、非機能的複合体を形成し得る融合ポリペプチドを提供する。この融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこの融合ポリペプチドを作製および使用する方法もまた提供される。上記核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群から選択される配列を含む単離された核酸分子であって、ＩＬ−１を結合して非機能的複合体を形成し得るマチルマーを形成する融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群から選択される配列を含む単離された核酸分子であって、インターロイキン−１（ＩＬ−１）を結合して非機能的複合体を形成し得るマチルマーを形成する融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２４からなる群から選択される配列をそれぞれコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記配列が、配列番号７である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が、配列番号８の配列を含む融合ポリペプチドをコードする、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６】
発現制御配列に作動可能に連結された請求項１〜４のいずれか１つに記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項７】
適切な宿主細胞中に請求項６に記載の発現ベクターを含む、融合ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系。
【請求項８】
前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項７に記載の宿主−ベクター系。
【請求項９】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の宿主−ベクター系。
【請求項１０】
融合ポリペプチドを産生する方法であって、
請求項８に記載の宿主−ベクター系の細胞を該融合ポリペプチドの産生を許容する条件下で増殖させる工程、およびこのように産生された該融合ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
配列番号１、３、または５の前記核酸が、以下：
（ａ）ヌクレオチド１９７９がＡからＣに改変されている；および
（ｂ）ヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡが、ヌクレオチド９９６と９７７との間に挿入されている；の１つ以上の改変を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号７、９、または１１の前記核酸が、以下：
（ａ）配列番号７、９、または１１のヌクレオチド１０４３がＡからＣに改変されている；および
（ｂ）ヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡが、ヌクレオチド１０７７と１０７８との間に挿入されている；の１つ以上の改変を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１３、１５、または１７の前記核酸が、以下：
（ａ）ヌクレオチド２０２７がＡからＣに改変されている；および
（ｂ）ヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡが、ヌクレオチド１０４４と１０４５との間に挿入されている；の１つ以上の改変を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１９、２１、または２３の前記核酸が、以下：
（ａ）ヌクレオチド１０４３がＡからＣに改変されている；および
（ｂ）ヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡが、ヌクレオチド１０７４と１０７５との間に挿入されている；の１つ以上の改変を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１または１１〜１４のいずれか１つに記載の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、または２４のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１７】
ＩＬ−１を結合して請求項１６に記載の融合ポリペプチドを含む非機能的複合体を形成し得る、マルチマー。
【請求項１８】
ダイマーである、請求項１７に記載のマルチマー。
【請求項１９】
各融合ポリペプチドが、配列番号８の配列を有する、請求項１８に記載のマルチマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、今や放棄された１９９８年９月２５日に出願された米国仮出願第６０／１０１，８５８号の優先権を主張し、特許されている１９９９年５月１９日に出願された米国出願第０９／３１３，９４２号に対する優先権を主張する、１９９９年９月２２日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２０４５号の米国国内段階出願である２００１年３月２２日に出願された米国出願第Ｎｏ．０９／７８７，８３５号の一部継続出願である。本出願を通じで種々の刊行物が参照される。これら刊行物の開示は、それらの全体が本出願中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
ＣＮＴＦファミリーサイトカインは、アンタゴニストおよびアゴニストの両方の潜在的な治療適用を提供する広範な種類の生理学的プロセスで重要な役割を演じている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明の目的は、サイトカイン関連疾患または障害の処置で有用であるサイトカインアンタゴニストの産生である。
【０００４】
本発明の別の目的は、サイトカイン関連疾患または障害の処置のための開示されたサイトカインアンタゴニストの使用である。
【０００５】
本発明の別の目的は、各々は異なる配列を有するが、すべてがＩＬ−１のそのレセプターの結合をブロックし得、それ故、ＩＬ−１アンタゴニストとして作用する、ＩＬ−１  Ｔｒａｐと称されるいくつかの特異的なＩＬ−１サイトカインアンタゴニストの構築である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、サイトカインを結合して以下を含む非機能的な複合体を形成し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する：（ａ）サイトカインのレセプターの特異性決定成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合性部分のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）サイトカインのレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインのサイトカイン結合性部分のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）マルチマー成分のアミノ酸配列を含む、第３の融合ポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列。
【０００７】
「サイトカイン結合性部分」によって意味されるのは、サイトカインを結合するために必要な細胞外ドメインの最小部分である。当業者によって、サイトカインレセプターを規定する特徴は、規準システインを含む２つのフィブロネクチン様ドメインおよびＷＳＸＷＳボックス（配列番号２６）（Ｂａｚａｎ（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：６９３４〜６９３８）の存在であることが受容されている。サイトカインのレセプターの結合性成分の細胞外ドメイン、およびサイトカインのレセプターのシグナル伝達成分の細胞外ドメインをコードする配列また、本発明の融合ポリペプチドを生成するために用いられ得る。同様に、サイトカインのレセプターの成分のより大きな部分をコードするより長い配列が用いられ得る。しかし、この細胞外ドメインのより小さなフラグメントが、サイトカインを結合するよう機能し、そしてそれ故、本発明は、サイトカイン結合性部分としてサイトカインを結合するために必要な細胞外ドメインの最小部分を含む融合ポペプチドを企図する。
【０００８】
本発明は、サイトカインのレセプターの「特異性決定成分」およびサイトカインのレセプターの「シグナル伝達部分」を含む。サイトカインレセプターの特定の成分またはサブユニットを指すために用いられる命名法にかかわらず、当業者は、レセプターのどの成分またはサブユニットがサイトカインの細胞標的を決定する原因であるかを認識し得、そしてそれ故、どの成分が「特異性決定成分」を構成するのかを知り得る。同様に、用いられる命名法にかかわらず、当業者は、レセプターのどの成分またはサブユニットが、「シグナル伝達成分」を構成し得るのかを知り得る。本明細書で用いられるとき、この「シグナル伝達成分」は、特異性決定成分ではなく、そしてこの特異性決定成分の不在下でサイトカインを結合しないか、または弱く結合する、特異性決定成分ではないネイティブなレセプターである。ネイティブなレセプターでは、この「シグナル伝達成分」は、シグナル伝達に参加し得る。
【０００９】
本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を調製することにおいて、この融合ポリペプチドの第１、第２、および第３の成分は、一本鎖のヌクレオチド中にコードされ、これは、宿主ベクター系によって発現されるとき、この融合ポリペプチドのモノマー種を産生する。このように発現されたモノマーは、次いで、マルチマー（となる）成分（第３の融合ポリペプチド成分）間の相互作用に起因してマルチマーとなる。この様式で融合ポリペプチドを産生することは、第１および第２の成分が別個の分子として産生され、そして次にマルチマーとされる場合に生じ得るヘテロダイマー混合物の生成の必要性を避ける。例えば、１９９５年１１月２８日に発行された米国特許第５，４７０，９５２号は、ＣＮＴＦまたはＩＬ−６アンタゴニストとして機能するヘテロダイマータンパク質の産生を記載している。これらヘテロダイマーは、適切なα（ａ）およびβ（ｂ）成分で同時トランスフェクトされた細胞株から生成される。次いで、ヘテロダイマーを、調製用非変性ポリアクリルアミドゲルからの受動的溶出のような方法を用いるか、または高速カチオン交換クロマトグラフィーを用いることにより、ホモダイマーから分離される。この精製ステップの必要性は、本発明の方法により避けられる。
【００１０】
さらに、ダイマーＩＬ−４インヒビターと題する１９９６年４月１８日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ  ９６／１１２１３は、出願人が、２つのＩＬ−４レセプターがポリマー性スペーサーによって結合されるホモダイマーを調製し、そしてＩＬ−４レセプターがポリマースペーサーによってＩＬ−２レセプターγ鎖に連結されているヘテロダイマーを調製したことを記述している。記載されるポリマー性スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。２つのレセプター成分、ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−２Ｒγは、別個に発現かつ精製される。ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ホモダイマーおよびヘテロダイマーが、次に、これら成分を、２官能性ＰＥＧ試薬を用いて一緒に連結することにより産生される。このような時間を消費し、かつコストのかかる精製およびペグ化工程を避けることが本はつめいの利点である。
【００１１】
本発明の１つの実施形態では、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の上流にある。本発明の別の実施形態では、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の下流にある。本発明のさらなる実施形態は、第１、第２および第３の融合ポリペプチド成分の順序が再配列されて調製され得る。例えば、第１の成分をコードするヌクレオチド配列が１で指定され、第２の成分をコードするヌクレオチド配列が２で指定され、そして第３の成分のヌクレオチド配列が３で指定されるとき、本発明の単離された核酸中の成分の順序は、５’〜３’まで読まれるとき、以下の６つの組み合わせのいずれかであり得る：１、２、３；１、３、２；２、１、３；２、３、１；３、１、２；または３、２、１。
【００１２】
本発明の特定の実施形態では、融合ポリペプチドによって結合されるサイトカインは、インターロイキン−１（ＩＬ−１）である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、上記マルチマー成分は、免疫グロブリン由来ドメインを含む。より特定すれば、この免疫グロブリン由来ドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群から選択され得る。なおより特定すれば、免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメイン、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖、およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４の軽鎖からなる群から選択され得る。別の実施形態では、このマルチマー成分は、最初の５つのアミノ酸（システインを含む）が除去されてＦｃ（ＤＣ１）と称されるマルチマー成分を生成するＦｃドメインであり得る。あるいは、このマルチマー成分は、この最初の５つのアミノ酸内のシステインが、例えば、セリンまたはアラニンのような別のアミノ酸によって置換されたＦｃドメインであり得る。
【００１４】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子によってコードされた融合ポリペプチドを提供する。好ましくは、この融合ポリペプチドは、マルチマー成分である第３の成分の機能に起因して、マルチマー形態にある。好ましい実施形態では、このマルチマーはダイマーである。適切なマルチマー成分は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：６７１〜６７９）；免疫グロブリン遺伝子配列、およびその部分をコードする配列である。本発明の好ましい実施形態では、免疫グロブリン遺伝子配列、特にＦｃドメインをコードする遺伝子配列が、マルチマー成分をコードするために用いられる。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に記載のような本発明の核酸分子を含むベクターを企図する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号２に提示される配列を有する融合ポリペプチドをコードする配列番号１に提示される配列を有する単離された核酸（ここで、この融合ポリペプチドは、サイトカインを結合して非機能的複合体を形成し得るマルチマーを形成する）；配列番号４に提示される配列を有する融合ポリペプチドをコードする配列番号３に提示される配列を有する単離された核酸分子（ここで、この融合ポリペプチドは、サイトカインを結合し、非機能的な複合体を形成する）；および配列番号６に提示される配列を有する融合ポリペプチドをコードする配列番号５で提示される配列を有する単離された核酸分子（ここで、この融合ポリペプチドは、サイトカインを結合し、非機能的な複合体を形成する）；および上記に記載の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドである。
【００１７】
本発明のその他の好ましい実施形態は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２にそれぞれ提示される配列を有する融合ポリペプチドをコードする配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３に提示される配列を有する単離された核酸分子であり、ここで、各融合ポリペプチドは、ＩＬ−１を結合して非機能的複合体を形成し得る。
【００１８】
本明細書に記載のような本発明の核酸分子を含む発現ベクターもまた提供され、ここで、この核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターを含む融合ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系もまた提供され、この発現ベクターは、上記融合ポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞中に導入されている。適切な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、またはＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、ＢＨＫまたはＮＳ０細胞のような哺乳動物細胞である。
【００１９】
本発明はまた、本明細書に記載の宿主−ベクター系の細胞を、上記融合ペプチドの産生を許容する条件下で増殖する工程、およびこのように産生された融合ポリペプチドを回収する工程により、本発明の融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００２０】
本発明によって調製されたｓＲα：β１ヘテロダイマーは、それらのリガンドのための有効なＴｒａｐを提供し、これらリガンドを、機能的中間体を生成することなくピコモル範囲にある親和性をもって結合する。本明細書に記載される技術は、特異性を与えるα−成分、およびα−特異性成分に結合されるときいずれの成分単独よりサイトカインに対してより高い親和性を有するβ成分を利用する任意のサイトカインのためのサイトカインＴｒａｐを開発するために適用され得る。従って、本発明によるアンタゴニストは、インターロイキン１（ＩＬ−１）のアンタゴニストを含む。
【００２１】
αおよびβレセプター細胞外ドメインは、当業者に公知の方法を用いて調製され得る。本発明を実施するために有用なレセプター分子は、原核生物また真核生物発現系でクローニングおよび発現することにより調製され得る。レセプター遺伝子は、任意の数の方法を利用して発現および精製され得る。この因子をコードする遺伝子は、例えば、制限されることなくｐＣＰ１１０のような細菌発現ベクター中にサブクローンされ得る。
【００２２】
この組換え因子は、安定な生物学的に活性なタンパク質の次の形成を可能にする任意の技法によって精製され得る。例えば、制限されることなく、これら因子は、可溶性タンパク質として、または封入体として回収され得、そこから、これらは、８Ｍ塩酸グアニジウムおよび透析によって定量的に抽出され得る。これら因子をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が用いられ得る。
【００２３】
ｓＲα：βヘテロダイマーレセプターは、βレセプターヘテロダイマーの産生を記載する公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に記載のような公知の融合領域を用いて処理され得るか、またはそれらは、化学的手段による細胞外ドメインの架橋によって調製され得る。利用されるこれらドメインは、αおよびβ成分の全細胞外ドメインからなり得るか、またはそれらは、そのリガンドおよびｓＲα：β複合体中のその他の成分と複合体を形成する能力を維持するその改変体またはフラグメントからなり得る。
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、上記細胞外ドメインは、ロイシンジッパーを用いて処理される。ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、１：１化学量論で、安定なヘテロダイマーを形成することが示されている（Ｂｕｓｃｈら（１９９０）Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：３６−４０；Ｇｅｎｔｚら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６９５−１６９９）。ｊｕｎ−ｊｕｎホモダイマーもまた形成されることが示されているが、それらは、ｊｕｎ−ｆｏｓヘテロダイマーより約１０００倍安定性がより少ない。ｆｏｓ−ｆｏｓホモダイマーは検出されていない。
【００２５】
ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓいずれかのロイシンジッパードメインは、遺伝子的に処理されたキメラ遺伝子により、上記のレセプター成分の可溶性または細胞外ドメインのＣ末端でフレームを合わせて（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）融合される。これら融合は直接的であり得るか、またはそれらは、ヒトＩｇＧのヒンジ領域のような柔軟リンカードメイン、または種々の長さおよび組み合わせの、グリシン、セリン、スレオニンまたはアラニンのような小数アミノ酸からなるポリペプチドリンカーを採用し得る。従って、上記キメラタンパク質は、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ６）（配列番号２５）によってタグ化され得、金属−キレートクロマトグラフィーにより、そして／または抗体が利用可能であるエピトープにより迅速な精製が可能であり、ウェスタンブロット、免疫沈降、またはバイオアッセイにおける活性枯渇／ブロックを可能にする。
【００２６】
別の実施形態では、上記ｓＲα：βヘテロダイマーは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ−ドメイン（Ａｒｕｆｆｏら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：３５−４４）を用いて精製される。後者とは対照的に、ヘテロダイマーの形成は、生化学的に達成されなければならない。なぜなら、Ｆｃ−ドメインを保持するキメラ分子は、ジスルフィド連結ホモダイマーとして発現されるからである。従って、ホモダイマーは、鎖内ジスルフィドを行わず、鎖間ジスルフィドの破壊を好む条件下で減少され得る。次いで、異なる細胞外部分をもつモノマーが、等モル量で混合され、そして酸化されてホモ−およびヘテロダイマーの混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフィー技法により分離される。あるいは、このタイプのヘテロダイマーの形成は、遺伝子的に処理すること、およびセレプター成分の可溶性部分または細胞外部分、それに続くｈＩｇＧのＦｃ−ドメイン、それに続く上記のｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓロイシンジッパーのいずれか（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３）からなる分子を発現することにより偏らされ得る。こられのロイシンジッパーは、ヘテロダイマーを優勢に形成するので、それらは、所望される場合ヘテロダイマーの形成を駆動するために用いられ得る。ロイシンジッパーを用いる記載のキメラタンパク質については、これらもまた、金属キレートまたはエピトープでタグ化され得る。このタグ化ドメインは、金属−キレートクロマトグラフィーによるか、そして／または抗体による迅速な精製のために用いられ得、ウェスタンブロット、免疫沈降、またはバイオアッセイにおける活性枯渇／ブロックを可能にする。
【００２７】
さらなる実施形態では、ヘテロダイマーは、ダイマーの形成を駆動するその他の免疫グロブリン由来ドメインを用いて調製され得る。このようなドメインは、例えば、ＩｇＧの重鎖（Ｃｇ１およびＣｇ４）、およびヒト免疫グロブリンのκ（ｋ）およびλ（ｌ）軽鎖の定常領域を含む。Ｃｇの軽鎖とのヘテロダイマー化は、ＣｇのＣＨ１ドメインと軽鎖の定常領域（ＣＬ）との間で起こり、そして単一のジスルフィド架橋による２つのドメインの共有結合により安定化される。従って、構築物は、これら免疫グロブリンドメインを用いて調製され得る。あるいは、これら免疫グロブリンドメインは、ダイマー化を駆動するＴ細胞レセプター成分に由来し得るドメインを含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ｓＲａ：ｂ１ヘテロダイマーが、柔軟なリンカーループを利用するキメラ分子としての発現により調製される。このキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、それが、柔軟なループによってタンデム（頭から頭に）に共に融合された２つの可溶性または細胞外ドメインを発現するように設計されている。このループは、完全に人工的であり得るか（例えば、特定の間隔でセリンまたはスレオニンにより中断されたポリグリシン反復）または天然に存在するタンパク質（例えば、ｈＩｇＧのヒンジ領域）から「借用している」。分子は処理されて、融合された可溶性または細胞外ドメインの順序がスイッチされて（例えば、ｓＩＬ６Ｒａ／ループ／ｓｇｐ１３０またはｓｇｐ１３０／ループ／ｓＩＬ−６Ｒａ）および／またはループの長さおよび組成が変化され、所望の特徴をもつ分子の選択を可能にする。
【００２９】
あるいは、本発明に従って作製されたヘテロダイマーは、適切なαおよびβ成分で同時トランスフェクトされた細胞株から精製され得る。ヘテロダイマーは、当業者に利用可能な方法を用いてホモダイマーから分離され得る。例えば、制限された量のヘテロダイマーが、調製用の非変性ポリアクリルアミドゲルからの受動的溶出により回収され得る。あるいは、ヘテロダイマーは、高圧カチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され得る。優れた精製は、Ｍｏｎｏ  Ｓカチオン交換カラムを用いて得られた。
【００３０】
ＩＬ−１関連疾患または障害を処置するために有用な効率的な用量は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら（１９７５）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１−４６頁を参照のこと）。本発明による使用のための薬学的組成物は、インビボでの投与の前の、薬学的に受容可能な液体、固体または半固体キャリヤ中、キャリヤまたは標的分子（例えば、抗体、ホルモン、成長因子など）に連結されて、および／またはリポソーム、マイクロカプセル、および制御放出調製物（アンタゴニスト発現細胞を含む）中に取り込まれる上記のアンタゴニストを含む。例えば、この薬学的組成物は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液またはデキストロース溶液のような水溶液中の１つ以上のアンタゴニストを含み得る。あるいは、活性薬剤は、このような処置の必要な患者中に移植され得る固体（例えば、ワックス）または半固体（例えば、ゼラチン状）処方物中に構成され得る。投与経路は、当該分野で公知の投与の任意の様式であり得、制限されずに、静脈内、くも膜下腔内、皮下、関連する組織中への注射による、動脈内、鼻内、経口、または移植デバイスによる、を含む。
【００３１】
投与は、身体全体または局所領域中の本発明の活性薬剤の分布を生じ得る。例えば、神経系の遠隔領域を含むいくつかの症状では、薬剤の静脈内またはくも膜下腔内投与が所望され得る。いくつかの状況では、活性薬剤を含むインプラントが、障害領域中またはその近傍に配置され得る。適切なインプラントは、制限されずに、発泡ゲル、ワックス、微粒子ベースのインプラントを含む。
【実施例】
【００３２】
（実施例１、融合ポリペプチド成分のクローニング）
ヒトサイトカインレセプターの細胞外ドメインを、組織ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いる標準的ＰＣＲ技法により得、発現ベクターｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）中にクローン化し、そしてＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｌｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いる標準的な技法により配列決定した。ＩＬ−１ＲＡｃＰについては、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ＡＢ００６３５７からのヌクレオチド１〜１０７４（アミノ酸１〜３５８に対応する）がクローン化された。ＩＬ−１ＲＩについては、Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｘ１６８９６らのヌクレオチド５５〜９９９（アミノ酸１９〜３３３に対応）がクローン化された。
【００３３】
（実施例２、融合ポリペプチド（サイトカインＴｒａｐｓ）の産生）
サイトカインＴｒａｐをコードするヌクレオチド配列は、標準的なクローニングおよびＰＣＲ技法により個々のクローン化ＤＮＡ（上に記載）から構築された。各場合において、配列は、第１の融合ポリペプチド成分をコードする配列が、マルチマー成分としてＦｃドメイン（ヒンジ、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域）が続く第２の融合ポリペプチド成分をコードする配列に融合されるようにフレームを合わせて構築された。いくつかの場合には、余分のヌクレオチドが、第１および第２の融合ポリペプチド成分をコードする配列の間にフレームを合わせて挿入され、これら２つの成分の間にリンカー領域を付加した。
【００３４】
（実施例３、ＩＬ−１  ＴｒａｐのためのＭＲＣ５バイオアッセイ）
ＭＲＣ５ヒト肺線維芽細胞はＩＬ−６を分泌することによりＩＬ−１に応答し、そしてそれ故、ＩＬ−６のＩＬ−１依存性産生をブロックするＩＬ−１  Ｔｒａｐの能力をアッセイするために利用された。ＩＬ１  Ｔｒａｐ  １ＳＣ５６９は、Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−１  Ｔｙｐｅ  Ｉレセプターの細胞外ドメインであるＩＬ−１−ＲＩ．Ｆｃに対して試験された。
【００３５】
ＭＲＣ５細胞を、培地中に１×１０５細胞／ｍｌで懸濁し、そして細胞の０．１ｍｌを９６ウェル組織培養プレートのウェル中に入れる（ウェルあたり１０，０００細胞）。プレートを、湿潤化５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートする。
【００３６】
種々の用量のＩＬ−１  Ｔｒａｐおよび組換えヒトＩＬ−１を、９６ウェル組織培養ディシュ中で予備インキュベートし、そして３７℃で２時間インキュベートする。次いで、この混合物の０．１ｍｌを、ＭＲＣ５細胞を含む９６ウェルプレートに、ＩＬ−１  Ｔｒａｐの最終濃度が１０ｎＭであり、そしてＩＬ−１の最終濃度が２．４ｐＭ〜５ｎＭの範囲であるように添加する。コントロールウェルは、Ｔｒａｐ単独を、または何も含まない。
【００３７】
次いで、プレートを、湿潤化５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートする。上清液を回収し、そしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｑｕａｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔを製造業者の指示に従って用い、ＩＬ−６のレベルをアッセイする。
【００３８】
（実施例４、ＩＬ−１  Ｔｒａｐによるインビボの注入されたＩＬ−１のブロック）
ＩＬ−１は、前炎症性サイトカインである。ＩＬ−１の全身投与は、一過性高血糖、低インスリン血症、発熱、食欲不振症、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の増加した血清レベルを含む、動物における急性応答を惹起することが示されている（Ｒｅｉｍｅｒｓ、１９９８）。マウスは、マウスおよびヒトＩＬ−１の両方に応答性であるので、ヒトＩＬ−１が用いられ得、そしてヒト特異的ＩＬ−１アンタゴニストのインビボ結合効果が評価され得る。この急性マウスモデルを用いて、ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐの外から投与されたヒトＩＬ−１のインビボ効果を拮抗する能力を決定した。これは、ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐのインビボの効き目の迅速な適応症を提供し、そして分子選択を補助するためのアッセイとして用いられ得る。
【００３９】
実験デザイン：雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、組換えヒトＩＬ−１βの皮下注射を与えた（ｒｈＩＬ−１β；０．３ｍｇ／ｋｇ）。ｒｈＩＬ−１β投与の２４時間前、動物を、ビヒクルであるヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５６９（５０または１５０倍モル過剰；それぞれ０．１８または０．５４ｍｇ／ｋｇ）、または組換えマウスＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｒｍＩＬ−１ｒａ；１５０または７５０倍モル過剰；それぞれ、４５．８または２２９μｇ／ｋｇ）。血液サンプルを、ｒｈＩＬ−１βの投与２時間後採取し、そして血清を、マウスＩＬ−６  ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−６レベルについてアッセイした。ｒｈＩＬ−１βの外因性投与は、血清ＩＬ−６レベルを有意に増加した。５０または１５０倍いずれかのモル過剰のｈＩＬ−１  Ｔｒａｐでの前処理は、ＩＬ−６のｒｈＩＬ−１β−誘導をブロックした。対照的に、１５０または７５０倍いずれかのモル過剰におけるｒｍＩＬ−１ｒａの注射は、ＩＬ−６誘導をブロックしなかった。
【００４０】
結果．ヒトＩＬ−１の外因性投与は、血清ＩＬ−６レベルの劇的な誘導を生じた。１５０倍モル過剰では、ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐは、ＩＬ−６増加を完全にブロックした（図１）。さらに、ヒトＩＬ−１の効果は、少なくともさらに２４時間持続し、ＩＬ−１が再投与されたときでさえ、ＩＬ−６増加を防いだ（図１）。このような長く続く効き目は、ＩＬ−１  Ｔｒａｐの毎日の注射が、長期間適用のために必ずしも必要でないかも知れないことを示唆している。
【００４１】
別の実験では、１５０倍または７５０倍モル過剰において、ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ６誘導を有意にブロックしなかった。従って、この実例では、ＩＬ−１  Ｔｒａｐは、ＩＬ−１活性のより良好なブロッカーであるようである。
【００４２】
（実施例５、さらなる一本鎖ＩＬ−１  Ｔｒａｐの構築）
本明細書に記載されたＤＮＡベクターを構築するために用いた技法は、当業者に周知の標準的な分子生物学技法である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１、２、および３巻、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）。すべてのＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｌｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いる標準的な技法により行う。
【００４３】
（ａ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ８２３配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ８２３配列は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号７のヌクレオチド１−１０７７に対応する）にヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン（配列番号７のヌクレオチド１０７８−２０１３に対応する）が続き、システインをグリシンに変えるヌクレオチド２０１７−２０１９における変異（ＴＧＴ−＞ＧＧＡ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一部（配列番号７のヌクレオチド２０１４−２７０３）が続く。この核酸配列は、配列番号８に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００４４】
（ｂ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ８２３−１１９８−Ｂ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ８２３−１１９８−Ｂ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号９のヌクレオチド１−１０７７に対応）にヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン（配列番号９のヌクレオチド１０７８−２０１３に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（配列番号９のヌクレオチド２０１４−２０１９に対応）が続き、ヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９のヌクレオチド２０２０−２７０９に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号１０に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００４５】
（ｃ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ８２３−１２６７−Ｃ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ８２３−１２６７−Ｃ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号１１のヌクレオチド１−１０７７に対応）にヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン（配列番号１１のヌクレオチド１０７８−２０１３に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（配列番号１１のヌクレオチド２０１４−２０１９に対応）が続き、セリンをプロリンに変えるヌクレオチド２０４７における変異（Ｔ＞Ｃ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１のヌクレオチド２０２０−２７０９に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号１２に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００４６】
（ｄ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５７０−ＦＥ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５７０−ＦＥ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン（配列番号１のヌクレオチド１−９９６に対応）にヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号１のヌクレオチド９９７−２０１３に対応）が続き、システインをグリシンに変えるヌクレオチド２０１７−２０１９における変異（ＴＧＴ−＞ＧＧＡ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１のヌクレオチド２０１４−２７０３に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号２に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００４７】
（ｅ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５７０−ＦＥ−Ｂ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５７０−ＦＥ−Ｂ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン（配列番号３のヌクレオチド１−９９６に対応）にヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号３のヌクレオチド９９７−２０１３に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（配列番号３のヌクレオチド２０１４−２０１９に対応）が続き、ヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号３のヌクレオチド２０２０−２７０９に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号４に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００４８】
（ｆ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５７０−ＦＥ−Ｃ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５７０−ＦＥ−Ｃ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン（配列番号５のヌクレオチド１−９９６に対応）にヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号５のヌクレオチド９９７−２０１３に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（配列番号５のヌクレオチド２０１４−２０１９に対応）が続き、セリンをプロリンに変えるヌクレオチド２０４７における変異（Ｔ＞Ｃ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号５のヌクレオチド２０２０−２７０９に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号６に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００４９】
（ｇ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４７−ＣｔＦ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４７−ＣｔＦ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＩＩの細胞外ドメイン（配列番号１３のヌクレオチド１−１０４４に対応）にヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号１３のヌクレオチド１０４５−２０５８に対応）が続き、システインをグリシンに変えるヌクレオチド２０６２−２０６４における変異（ＴＧＴ−＞ＧＧＡ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一部（配列番号１３のヌクレオチド２０５９−２７４８に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号１４に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００５０】
（ｈ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４７−ＣｔＦ−Ｂ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４７−ＣｔＦ−Ｂ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＩＩの細胞外ドメイン（配列番号１５のヌクレオチド１−１０４４に対応）にヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号１５のヌクレオチド１０４５−２０５８に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（配列番号１５のヌクレオチド２０５９−２０６４に対応）が続き、ヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１５のヌクレオチド２０６５−２７５４に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号１６に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００５１】
（ｉ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４７−ＣｔＦ−Ｃ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４７−ＣｔＦ−Ｃ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＩＩの細胞外ドメイン（配列番号１７のヌクレオチド１−１０４４に対応）にヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号１７のヌクレオチド１０４５−２０５８に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（配列番号１７のヌクレオチド２０５９−２０６４に対応）が続き、セリンをプロリンに変えるヌクレオチド２０９２における変異（Ｔ＞Ｃ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１７のヌクレオチド２０６５−２７５４に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号１７に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００５２】
（ｊ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９配列は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号１９のヌクレオチド１−１０７４に対応）にヒトＩＬ−１ＲＩＩの細胞外ドメイン（配列番号１９のヌクレオチド１０７５−２０５８に対応）が続き、システインをグリシンに変えるヌクレオチド２０６２−２０６４における変異（ＴＧＴ−＞ＧＧＡ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一部（配列番号１９のヌクレオチド２０５９−２７４８に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号２０に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００５３】
（ｋ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９−Ｂ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９−Ｂ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号２１のヌクレオチド１−１０７４に対応）にヒトＩＬ−１ＲＩＩの細胞外ドメイン（配列番号２１のヌクレオチド１０７５−２０５８に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（ヌクレオチド２０５９−２０６４に対応）が続き、ヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号２１のヌクレオチド２０６５−２７５４に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号２２に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００５４】
（ｌ）ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９−Ｃ配列−このＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９−Ｃ配列は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン（配列番号２３のヌクレオチド１−１０７４に対応）にヒトＩＬ−１ＲＩＩの細胞外ドメイン（配列番号２３のヌクレオチド１０７５−２０５８に対応）が続き、アミノ酸のストレッチ（ヌクレオチド２０５９−２０６４に対応）が続き、セリンをプロリンに変えるヌクレオチド２０９２における変異（Ｔ＞Ｃ）を含むヒンジ領域であるヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号２３のヌクレオチド２０６５−２７５４に対応）が続く。この核酸配列は、配列番号２４に提示されるような融合ポリペプチド配列をコードする。
【００５５】
前述に記載される配列に加え、これら配列に対する以下の改変もまた主題の発明によって企図される。
１．ＩＬ１  Ｔｒａｐである８２３、８２３−１１９８．Ｂ、および８２３−１２６７．Ｃについて：ＡｃＰ代替物：アミノ酸をＬｙｓからＴｈｒに変えるＡからＣへのヌクレオチド１０４３における変化。ＳＧ挿入物：ヌクレオチド１０７７と１０７８との間のヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡの挿入は、このＴｒａｐの２つのレセプタードメイン間にアミノ酸のＳｅｒ  Ｇｌｙストレッチを付加し得る。
２．ＩＬ１  Ｔｒａｐである５７０−ＦＥ、５７０−ＦＥ．Ｂ、および５７０−ＦＥ．Ｃについて：ＡｃＰ代替物：アミノ酸をＬｙｓからＴｈｒに変えるＡからＣへのヌクレオチド１９７９における変化。ＳＧ挿入物：ヌクレオチド９９６と９９７との間のヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡの挿入は、このＴｒａｐの２つのレセプタードメイン間にアミノ酸のＳｅｒ  Ｇｌｙストレッチを付加し得る。
３．ＩＬ１  Ｔｒａｐである１６４７−ＣｔＦ、１６４７−ＣｔＦ．Ｂ、および１６４７−ＣｔＦ．Ｃ：ＡｃＰ代替物：アミノ酸をＬｙｓからＴｈｒに変えるＡからＣへのヌクレオチド２０２７における変化。ＳＧ挿入物：ヌクレオチド１０４４と１０４５との間のヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡの挿入は、このＴｒａｐの２つのレセプタードメイン間にアミノ酸のＳｅｒ  Ｇｌｙストレッチを付加し得る。
４．ＩＬ１  Ｔｒａｐである１６４９、１６４９−Ｂ、および１６４９−Ｃ：ＡｃＰ代替物：アミノ酸をＬｙｓからＴｈｒに変えるＡからＣへのヌクレオチド１０４３における変化。ＳＧ挿入物：ヌクレオチド１０７４と１０７５との間のヌクレオチドＴＣＣ  ＧＧＡの挿入は、このＴｒａｐの２つのレセプタードメイン間にアミノ酸のＳｅｒ  Ｇｌｙストレッチを付加し得る。
【００５６】
さらに、当業者は、Ｆｃドメインが異なるアロタイプをもつ免疫グロブリンに由来するＩＬ１  Ｔｒａｐを構築することが所望され得ることを認識する。上述に記載の改変のいずれもＩＬ１を結合するＴｒａｐの能力を改変しない。
【００５７】
（実施例６、ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐは、炎症関節におけるＩＬ−１の効果をブロックする）
背景：ザイモサンは、膝に注射されるとき、関節における急性炎症およびＩＬ−１βの上方制御を引き起こす酵母細胞壁抽出物である（Ｊｏｏｓｔｅｎら（１９９４）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９７：２０４−２１１）。軟骨細胞は、関節中の軟骨の漸進的破壊に寄与するヒト関節炎の特徴であるプロテオグリカン合成を下方制御することによりこの炎症およびＩＬ−１βに応答する。ＩＬ−１βに対するアンタゴニストは、ＩＬ−１βにおけるザイモサン誘導上昇の効果をブロックするそれらの能力を上昇するために用いられ得る。
【００５８】
材料および方法：麻酔された雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、膝蓋靭帯を通じて右膝関節中にザイモサンＡ（Ｓｉｇｍａ；１０μｌ中３００μｇ）の関節内（ｉ．ａ．）注射を与えた。滅菌ＰＢＳを、膝蓋靭帯を通じて左膝関節中にｉ．ａ．注射した（１０μｌ）。ｉ．ａ．注射の２４時間前、動物を、ビヒクルまたはｈＩＬ−１  Ｔｒａｐ  ５６９のいずれかで処理した（１９ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）。膝蓋を、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９８２）上述に記載されるようにプロテオグリカン合成を測定するためにザイモサンの注射の２４時間後に取り除いた。簡単に述べれば、各々の膝蓋およびともなう靭帯を、１０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−硫酸塩（ＮＥＮ  ＤｕＰｏｎｔ）を含む培地（ＨＥＰＥＳ、ＨＣＯ３、グルタミン＆ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ）中、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。インキュベーション後、組織を洗浄し、そして１０％ホルマリン（ＶＷＲ）中で一晩固定した。この組織を、次に、周辺組織からの膝蓋を解剖の前に４時間Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）中に置いた。次に、各膝蓋を、５０℃でＳｏｌｖａｂｌｅ（Ｐａｃｋａｒｄ）中で一晩インキュベートした。Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ液体シンチレーション流体（Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、そしてこれらサンプルを、液体シンチレーションカウンター中でカウントした。値を、各動物について、ザイモサン膝蓋のｃｐｍ／ビヒクル膝蓋のｃｐｍの比として記録した。
【００５９】
結果：ザイモサンの関節内注射は、ビヒクル注射に対し約５０％プロテオグリカン合成を減少する（図３）。ザイモサン注射前のｈＩＬ−１  Ｔｒａｐの投与は、ＩＬ−１βの局所作用をブロックし、そしてプロテオグリカン合成は、コントロールの約９０％まで戻った。これらのデータは、ｈＩＬ−１  Ｔｒａｐ５６９が皮下注射後関節を貫通し得、これら関節内のＩＬ−１の生物学的効果を効率的に中和することを示す。
【００６０】
（実施例７、マウスＩＬ−１  Ｔｒａｐは、サイモサン加速コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける関節炎症状の重篤度を減少する）
背景．ＩＬ−１は、慢性関節リウマチにおける炎症および軟骨破壊の発症に関係している（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７（６）：２０９５−２１４７；Ｗｏｏｌｅｙら（１９９３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ３６（９）：１３０５−１３１４）。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、慢性関節リウマチに類似性を有する炎症性の多発性関節炎の広く研究された動物モデルであり；共通の組織病理学的特徴は、関節炎症および腐食、滑膜仮形成および炎症細胞浸潤を含む（Ｊｏｅら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ５：３６７−３６９）。従前の研究は、種々の抗−ＩＬ−１処置が、ＣＩＡ動物における関節炎症状を減少することに関しボジティブな影響を有することを示し（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９４）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９５：２３７−２４３；Ｊｏｏｓｔｅｎら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｏｌ  １６３：５０４９−５０５５；ｖａｎ  ｄｅ  Ｌｏｏら（１９９２）Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９：３４８−３５６）、本出願人らは、この動物モデルにおける関節炎症状の進行に対する上記ＩＬ−１  Ｔｒａｐのマウスバージョン（ｍＩＬ−１  Ｔｒａｐ）の影響を調べた．ＩＬ−１  Ｔｒａｐのヒトバージョンは、げっ歯類ＩＬ−１とは乏しい交差反応性である。このｍＩＬ−１  Ｔｒａｐは、マウスＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外ドメイン、それに続くマウスＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン、それに続くヒンジであるマウスＩｇＧ２ａのＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる。
【００６１】
材料および方法．雄のＤＢＡ−１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、尾の基部の皮内に、完全および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（２：１：１比；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）で乳化した１００μｇ／５０μｌのウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）で免疫化し、そして２１日目に、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントで乳化したＣＩＩ（１００μｇ／５０μｌ）で皮内にブーストした。ＤＢＡ−１マウスにおけるＣＩＡは、低発生率で長期間に亘り漸進的に生じるので（Ｊｏｏｓｔｅｎら（１９９４）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９７：２０４−２１１）、本出願人は、３０日目に３ｍｇザイモサン（Ｓｉｇｍａ）を動物に腹腔内に注射することにより関節炎症状の発症を同期した。ザイモサン注射の２時間前に、マウスを処置群にランダムに分配し、そしてビヒクルまたはｍＩＬ−１  Ｔｒａｐ（３１または１０ｍｇ／ｋｇ、３×／週、８注射、ｓ．ｃ．）のいずれかで注射した。足における関節炎症状（Ｗｏｏｌｅｙら（１９９３）Ａｒｒｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ３６（９）：１３０５−１３１４によって記載されるようなＡＳＩスコア）を、処置群を理解できない個人によって、３×／週評価した。動物を８回目の注射の２４時間後屠殺し、その時点でＡＳＩスコアとともに足の幅を測定した。
【００６２】
結果．ザイモサンのｉ．ｐ．注射後５日以内に、ビヒクルで処理された動物は、ｍＩＬ−１  Ｔｒａｐを受けている動物と比較してＡＳＩスコアにおける有意な増加を有し、症状は、ザイモサン注射の１０〜１４日後最大に到達した。マウスＩＬ−１  Ｔｒａｐは、１０ｍｇ／Ｋｇ  Ｔｒａｐを受けている動物が、３１ｍｇ／ｋｇを受けている動物より多い関節炎症状（より大きなＡＳＩスコア）を有したように、用量依存様式で作用した。しかし、両方のｍＩＬ−１  Ｔｒａｐ処置群は、ビヒクルより有意により低い程度の関節炎症状を有していた。ＡＳＩスコアにおけるこの差異はまた、屠殺の時点における足の幅に反映されている（図５）。ｍＩＬ−１  Ｔｒａｐを受ける動物は、ネイティブの非コラーゲン免疫化動物のそれと同様であった。これらのデータは、ｍＩＬ−１  Ｔｒａｐが、ＩＬ−１を効率的に中和し得、そして関節炎関節の発症をブロックすることを示す。
【００６３】
（実施例８、ＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９は、ＩＬ−１βの活性をブロックし得る）
種々の濃度のＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９を、５ｐＭのヒトＩＬ−１ｂの存在下、室温で一晩インキュベートした。これら混合物を、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で５時間の間、２９３−ＮＦｋＢ細胞の２連のウェル（２０，０００細胞／ウェル）に添加した。２９３−ＮＦｋＢ細胞は、５ＮＦｋＢ部位を含むプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を所有する安定に組み込まれたレポータープラスミドを含む。ＩＬ−１ｂの添加は、増加したルシフェラーゼ遺伝子発現を生じる。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、室温で１５分間細胞に添加し、そしてルシフェラーゼ遺伝子発現を、照度測定により相対光単位（ＲＬＵ）として定量した。ＩＬ−１  Ｔｒａｐ１６４９は、約３０ｐＭのＫｄを示す３２ｐＭのＩＣ５０を示す（図６）。これらのデータは、ＩＬ−１  Ｔｒａｐ１６４９がＩＬ−１をブロックする能力を有することを示す。
【００６４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって制限されることはない。実際、本明細書に記載のこれらに加えて本発明の種々の改変が、先行する記載および添付の図面から当業者に明らかになる。このような改変は、添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐは、外因的に投与されたｈｕＩＬ−１のインビボの効果をブロックする。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、時間０にｈｕＩＬ−１（０．３μｇ／Ｋｇ）の皮下注射を受けた。ｈｕＩＬ−１注射の２４時間前に、動物は、ビヒクルまたは１５０倍モル過剰のｈｕＩＬ−１  Ｔｒａｐのいずれかで予備処理された。屠殺の２時間前（２６時間）、マウスは、ｈｕＩＬ−１の第２の注射（０．３μｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）により再抗原投与された。種々の時間点で血液サンプルを収集し、そして血清をＩＬ−１レベルについてアッセイした（平均＋／−ＳＥＭとして表した；１群あたりｎ＝５）。
【図２】ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐは、外因的に投与されたヒトＩＬ−１のインビボの効果をブロックする。
【図３】ヒトＩＬ−１  Ｔｒａｐは、腫れ上がった関節の影響をブロックする。
【図４】マウスＩＬ−１  Ｔｒａｐは、ザイモサン増強コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける関節炎症状の重篤度を減少する。
【図５】マウスＩＬ−１  Ｔｒａｐは、ザイモサン増強コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける関節炎症状の重篤度を減少する。
【図６】種々の濃度のＩＬ−１  Ｔｒａｐ  １６４９を、５ｐＭのヒトＩＬ−１ｂの存在下、室温で一晩インキュベートした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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