(57)【要約】正常細胞の表面上のＨＳＣ７０タンパク質の発現レベルと比較した多剤耐性新生物細胞または損傷細胞の表面上の熱ショック同族体（ＨＳＣ７０）タンパク質７０の細胞表面発現の増加の検出による、新生物細胞または損傷細胞の検出方法および新生物細胞または損傷細胞中の多剤耐性の検出方法を開示する。
2006512579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）所与の起源または細胞型の試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、
ｂ）前記試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルと同一の起源または細胞型の非耐性新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルとを比較する工程と、
前記試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルが前記同一の所与の起源または細胞型の非耐性新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルよりも高い場合、前記試験新生物細胞が多剤耐性であるか多剤耐性の可能性があることとを含む、試験新生物細胞における多剤耐性または多剤耐性の可能性の検出方法。
【請求項２】
前記試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する工程が、細胞から細胞質膜画分を単離し、前記細胞質膜画分中のＨＳＣ７０レベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する工程が、前記細胞を抗ＨＳＣ７０抗体と接触させて細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルの測定が免疫蛍光放射によるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルの測定が放射性標識によるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記試験新生物細胞が、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、および卵巣細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非耐性新生物細胞が、ＨＬ６０、ＮＢ４、ＣＥＭ、ＨＳＢ２、Ｍｏｌｔ４、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ、ＳＫＯＶ−３、および２００８からなる群から選択される薬物感受性細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試験新生物細胞が、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽腫細胞、肝癌細胞、骨髄腫細胞、神経膠腫細胞、中皮腫細胞、および癌腫細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試験新生物細胞が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）検出可能な標識に作動可能に連結されたＨＳＣ７０結合剤を患者に投与する工程と、
（ｂ）前記ＨＳＣ７０結合剤に作動可能に連結した標識を検出する工程と、
前記ＨＳＣ７０結合剤が前記患者中の多剤耐性細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０に特異的に結合することとを含む、患者の多剤耐性細胞の検出方法。
【請求項１１】
前記ＨＳＣ７０結合剤が抗体またはそのフラグメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＳＣ７０結合剤が、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン（ａｕｘｉｌｉｎ）、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）（ＤＳＧ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＣ７０結合剤が、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、および抗体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、化学染料、放射性化合物、化学発光化合物、磁性化合物、常磁性化合物、プロ磁性（ｐｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ）化合物、有色生成物を生成する酵素、化学発光生成物を生成する酵素、および磁性生成物を生成する酵素からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記多剤耐性細胞が新生物細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記新生物細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、骨髄腫癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、および癌腫癌細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記新生物細胞が、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、および卵巣細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）ＨＳＣ７０検出のための第１のプローブと、
ｂ）ヌクレオホスミンおよびＨＳＣ７０からなる群から選択される多剤耐性マーカー検出のための第２のプローブとを含む、試験新生物細胞における多剤耐性の診断または検出用キット。
【請求項２１】
ａ）ＨＳＣ７０検出のための第１のプローブと、
ｂ）ＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＭＲＰ１、ＭＲＰ５、およびＬＲＰからなる群から選択されるマーカー検出のための第２のプローブとを含む、試験新生物細胞における多剤耐性の診断または検出用キット。
【請求項２２】
前記ＨＳＣ７０検出のためのプローブが抗ＨＳＣ７０抗体である、請求項２０または請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＨＳＣ７０検出のためのプローブが、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）からなる群から選択されるＨＳＣ７０リガンドである、請求項２０または請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記第２のプローブが、ヌクレオホスミン抗体およびビメンチン抗体からなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
前記第２のプローブが、ヌクレオホスミンリガンドおよびビメンチンリガンドからなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
前記第１のプローブが、前記試験新生物細胞の表面上に存在するＨＳＣ７０を検出する、請求項２０または請求項２１に記載のキット。
【請求項２７】
前記第２のプローブが、前記試験新生物細胞の表面上に存在するマーカーを検出する、請求項２０または請求項２１に記載のキット。
【請求項２８】
前記第２のプローブが、ＭＤＲ１抗体、ＭＤＲ３抗体、ＭＲＰ１抗体、ＭＲＰ３抗体、およびＬＲＰ抗体からなる群から選択される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２９】
ｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのＨＳＣ７０結合成分および検出可能な標識を含む、患者の細胞表面ＨＳＣ７０の検出のための細胞表面ＨＳＣ７０ｉｎ ｓｉｔｕ検出プローブ。
【請求項３０】
前記ＨＳＣ７０結合成分が抗体である、請求項２９に記載の細胞表面ＨＳＣ７０ｉｎ ｓｉｔｕ検出プローブ。
【請求項３１】
前記検出可能な標識がテクネチウムである、請求項２９に記載の細胞表面ＨＳＣ７０ｉｎ ｓｉｔｕ検出プローブ。
【請求項３２】
ＨＳＣ７０結合成分および治療成分を含み、前記ＨＳＣ７０結合成分が治療成分を多剤耐性新生物にターゲティングし、それにより前記多剤耐性新生物を治療する、多剤耐性新生物の治療または防止のための細胞表面ＨＳＣ７０標的薬。
【請求項３３】
前記ＨＳＣ７０結合成分が抗ＨＳＣ７０抗体である、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３４】
前記ＨＳＣ７０結合成分が、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３５】
前記ＨＳＣ７０結合成分が、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、およびそのＨＳＣ７０結合フラグメントからなる群から選択される、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３６】
前記治療成分が、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エポエチン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タキソール、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンからなる群から選択される、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３７】
前記治療成分がリポソーム処方物中に存在する、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３８】
前記治療成分が放射性同位体である、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３９】
前記放射性同位体が、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、211Ａｔ、および213Ｂｉからなる群から選択される、請求項３８に記載の薬剤。
【請求項４０】
前記治療成分が、前記標的化多剤耐性新生物細胞を死滅することができるかその死滅を誘導することができる毒素である、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項４１】
前記毒素が、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、植物リシン毒素、植物アブリン毒素、植物サポリン毒素、植物ゲロニン毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質からなる群から選択される、請求項４０に記載の薬剤。
【請求項４２】
前記ＨＳＣ７０結合成分が前記標的細胞の表面に結合し、前記治療エレメントが内在化されて前記細胞の成長を停止させ、前記細胞の生存度に悪影響を与えるか、前記細胞を死滅させる、請求項３２〜請求項４１のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項４３】
ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはそのＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能なワクチン成分を含む、多剤耐性新生物の治療または防止のためのワクチン。
【請求項４４】
前記ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはポリペプチドサブシーケンスが、配列番号１のヒトＨＳＣ７０ポリペプチド配列である、請求項４３に記載のワクチン。
【請求項４５】
前記ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスが少なくとも８アミノ酸長である、請求項４３に記載のワクチン。
【請求項４６】
前記ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスがハプテンを含む、請求項４５に記載のワクチン。
【請求項４７】
前記薬学的に許容可能なワクチン成分がアジュバントである、請求項４３に記載のワクチン。
【請求項４８】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、オイルエマルジョン、細菌産物、全不活化細菌、内毒素、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系化合物、植物油、モノホスホリル脂質Ａ、サポニン、およびスクアレンからなる群から選択される、請求項４７に記載のワクチン。
【請求項４９】
請求項３２〜請求項４１のいずれか１項に記載の細胞表面ＨＳＣ７０標的化治療薬を投与する工程を含む、被験体の多剤耐性新生物を治療または防止する方法。
【請求項５０】
前記新生物が、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽腫、肝癌、神経膠腫、中皮腫、および癌腫からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体がヒト患者である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヒト患者が多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記新生物細胞が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４３〜請求項４８のいずれか１項に記載のＨＳＣ７０ワクチンを投与する工程を含む、被験体の多剤耐性新生物を治療または防止する方法。
【請求項５５】
前記新生物が、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫癌、黒色腫癌、肉腫、白血病癌、網膜芽腫癌、肝臓癌、神経膠腫癌、中皮腫癌、および癌腫癌からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記被験体がヒト患者である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒト患者が多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記新生物が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
ａ）所与の起源または細胞型の試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、
ｂ）前記試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルと同一の起源または細胞型の非新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルとを比較する工程と、
前記試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルが前記同一の起源または細胞型の非新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルよりも高い場合、前記試験細胞が新生物であることとを含む、試験細胞が新生物であるかどうかを検出する方法。
【請求項６０】
前記試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する工程が、細胞から細胞質膜画分を単離し、前記細胞質膜画分中のＨＳＣ７０レベルを測定することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する工程が、前記細胞を抗ＨＳＣ７０抗体と接触させて細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルを測定することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルの測定が免疫蛍光放射によるものである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルの測定が放射性標識によるものである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記試験細胞が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記非新生物細胞が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
患者の新生物細胞の検出方法において、
（ａ）検出可能な標識に作動可能に連結されたＨＳＣ７０結合剤を患者に投与する工程と、
（ｂ）前記ＨＳＣ７０結合剤に作動可能に連結した標識を検出する工程と、
前記ＨＳＣ７０結合剤が前記患者中の新生物細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０に特異的に結合することとを含む、方法。
【請求項６７】
前記ＨＳＣ７０結合剤が抗体またはそのフラグメントである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＨＳＣ７０結合剤が、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＨＳＣ７０結合剤が、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、およびそのフラグメントからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、化学染料、放射性化合物、化学発光化合物、磁性化合物、常磁性化合物、プロ磁性化合物、有色生成物を生成する酵素、化学発光生成物を生成する酵素、および磁性生成物を生成する酵素からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記新生物細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、骨髄腫細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、および癌腫癌細胞からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記新生物細胞が、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、および卵巣細胞からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記患者がヒトである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記患者が新生物細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
新生物細胞を診断または検出するためのキットにおいて、
ａ）ＨＳＣ７０検出のための第１のプローブと、
ｂ）ヌクレオホスミンおよびＨＳＣ７０からなる群から選択される新生物マーカー検出のための第２のプローブとを含む、キット。
【請求項７６】
前記ＨＳＣ７０検出のためのプローブが抗ＨＳＣ７０抗体またはその結合フラグメントである、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
前記ＨＳＣ７０検出のためのプローブが、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）からなる群から選択されるＨＳＣ７０リガンドである、請求項２０または請求項７５に記載のキット。
【請求項７８】
前記第２のプローブが、ヌクレオホスミン抗体およびＨＳＣ７０抗体からなる群から選択される、請求項７５に記載のキット。
【請求項７９】
前記第２のプローブが、ヌクレオホスミンリガンドおよびビメンチンリガンドからなる群から選択される、請求項７５に記載のキット。
【請求項８０】
前記第１のプローブが、前記試験細胞が新生物である場合に前記試験細胞の表面上に存在するＨＳＣ７０を検出する、請求項７５に記載のキット。
【請求項８１】
前記第１のプローブが、前記試験細胞が新生物である場合に前記試験細胞の表面上に存在するマーカーを検出する、請求項７５に記載のキット。
【請求項８２】
ＨＳＣ７０結合成分および治療成分を含み、前記ＨＳＣ７０結合成分が治療成分を新生物細胞成長にターゲティングし、それにより前記新生物を治療する、癌性新生物細胞成長の治療のための細胞表面ＨＳＣ７０標的薬。
【請求項８３】
前記ＨＳＣ７０結合成分が抗ＨＳＣ７０抗体である、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項８４】
前記ＨＳＣ７０結合成分が、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）からなる群から選択される、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項８５】
前記ＨＳＣ７０結合成分が、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、およびそのＨＳＣ７０結合フラグメントからなる群から選択される・・、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項８６】
前記治療成分が、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エポエチン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タキソール、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項８７】
前記治療成分がリポソーム処方物中に存在する、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項８８】
前記治療成分が放射性同位体である、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項８９】
前記放射性同位体が、90Ｙ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、211Ａｔ、および213Ｂｉからなる群から選択される、請求項８８に記載の薬剤。
【請求項９０】
前記治療成分が、前記標的化新生物細胞を死滅することができるかその死滅を誘導することができる毒素である、請求項８２に記載の薬剤。
【請求項９１】
前記毒素が、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、植物リシン毒素、植物アブリン毒素、植物サポリン毒素、植物ゲロニン毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質からなる群から選択される、請求項９０に記載の薬剤。
【請求項９２】
前記ＨＳＣ７０結合成分が前記標的細胞の表面に結合し、前記治療エレメントが内在化されて前記細胞の成長を停止させ、前記細胞の生存度に悪影響を与えるか、前記細胞を死滅させる、請求項８２〜請求項９１のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項９３】
ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはそのＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能なワクチン成分を含む、新生物の治療または防止のためのワクチン。
【請求項９４】
前記ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはポリペプチドサブシーケンスが、配列番号１のヒトＨＳＣ７０ポリペプチド配列である、請求項９３に記載のワクチン。
【請求項９５】
前記ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスが少なくとも８アミノ酸長である、請求項９３に記載のワクチン。
【請求項９６】
前記ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスがハプテンを含む、請求項９５に記載のワクチン。
【請求項９７】
前記薬学的に許容可能なワクチン成分がアジュバントである、請求項９３に記載のワクチン。
【請求項９８】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、オイルエマルジョン、細菌産物、全不活化細菌、内毒素、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系化合物、植物油、モノホスホリル脂質Ａ、サポニン、およびスクアレンからなる群から選択される、請求項９７に記載のワクチン。
【請求項９９】
請求項８２〜請求項９１のいずれか１項に記載の細胞表面ＨＳＣ７０標的化治療薬を投与する工程を含む、被験体の新生物を治療または防止する方法。
【請求項１００】
前記新生物が、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽腫、肝癌、神経膠腫、中皮腫、および癌腫からなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記被験体がヒト患者である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ヒト患者が多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記新生物が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項９３〜請求項９８のいずれか１項に記載のＨＳＣ７０ワクチンを投与する工程を含む、被験体の新生物を治療または防止する方法。
【請求項１０５】
前記新生物が、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫癌、黒色腫癌、肉腫、白血病癌、網膜芽腫癌、肝臓癌、神経膠腫癌、中皮腫癌、および癌腫癌からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記被験体がヒト患者である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ヒト患者が新生物細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記新生物が、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する、請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）本発明は、診断および治療分野に関する。特に、本発明は、新生物および／または損傷細胞の検出および治療、さらに、多剤耐性細胞および／または損傷細胞の検出および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌または病原体感染に起因する疾患などのために一般的に使用されている治療は、薬物（例えば、化学療法薬および抗生物質）の投与である。罹患細胞を死滅させるために、薬物が細胞に侵入して不可欠な生化学経路を妨害するのに有効な用量に達しなければならない。しかし、いくつかの細胞は、薬物耐性の発生によって薬物による死滅を回避する（「薬物耐性」と呼ばれる）。さらに、いくつかの場合、癌細胞（腫瘍細胞または新生物細胞とも呼ばれる）および損傷細胞（例えば、病原体感染細胞）また病原体自体が広範な薬剤（治療のために最初に使用されない薬物が含まれる）に対する耐性を生じる。この現象を、「多剤耐性」（ＭＤＲ）という。例えば、腫瘍中のいくつかの癌細胞は、広範な化学療法薬（治療のために最初に使用されない薬物が含まれる）に対する多剤耐性の発生によって化学療法薬による死滅を回避する。
【０００３】
構造的および機能的に異なった異なる抗菌薬および抗癌薬に対する患者の交差耐性は、癌患者および罹患癌非癌患者の両方に問題を生じ得る。したがって、ＭＤＲは、癌細胞および損傷非癌細胞（例えば、病原体（ウイルスおよび細菌が含まれる）に感染した細胞）を含み得る。ＭＤＲ表現型の出現は、感染症治療の主な失敗原因である（非特許文献１、非特許文献２を参照のこと）。同様に、多剤耐性癌細胞の発生は、癌患者の治療の主な失敗理由である（非特許文献３を参照のこと）。
【０００４】
多剤耐性は多因子性である。古典的ＭＤＲ機構は、細胞または微生物から薬物を能動的に輸送（ポンピング）する進化的に高度に保存された原形質膜タンパク質（Ｐ−糖タンパク質またはＭＤＲ１）の遺伝子増幅による遺伝子の変化を含む（非特許文献４、非特許文献５）。ヒト癌細胞および感染性細菌病原体は共に、Ｐ−糖タンパク質をコードする遺伝子の増幅によるＰ−糖タンパク質（伝令ＲＮＡおよびタンパク質の両方）の過剰発現を含む機構によって古典的ＭＤＲを生成することができる。ＭＤＲ癌細胞または病原体感染細胞中でのＰ−糖タンパク質ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現は、ＭＤＲの生物マーカーである。ＭＤＲ癌および病原体感染の診断および治療のためのＰ−糖タンパク質マーカーの過剰発現を使用する診断試験および治療方法が開発されている（非特許文献６）。しかし、種々の正常な組織が異なる量のＰ−糖タンパク質を発現するので、ＭＤＲ癌細胞の細胞表面上のＰ−糖タンパク質をターゲティングする任意の治療法は、Ｐ−糖タンパク質発現レベルもまた比較的高い正常組織（肝臓、腎臓、幹細胞、および血液脳関門上皮など）に影響を与えるという副作用に関する重要な問題が存在する。
【０００５】
「非定型ＭＤＲ」は、多剤耐性機構が未知であるか、新規であるか、Ｐ−糖タンパク質を含む古典的機構と異なるＭＤＲ癌細胞または病原体を説明するために使用する用語である。例えば、ヒト肺腫瘍は多剤耐性であるが、Ｐ−糖タンパク質は変化しない（非特許文献７を参照のこと）。むしろ、これらは別の薬物輸送体（多剤耐性関連タンパク質またはＭＲＰ１）を発現する。この非定型ＭＤＲ型のマーカーである肺耐性関連タンパク質を含む新規ＭＤＲ機構が最近説明されている（特許文献１）。ＭＤＲのいくつかの他の非定型マーカーには、ヌクレオシドアナログ薬のための新規の哺乳動物流出ポンプであるＭＲＰ５（特許文献２を参照のこと）および一定のスフィンゴ糖脂質（特許文献３を参照のこと）が含まれる。
【０００６】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、分子シャペロンまたはシャペロニンとも呼ばれる）は、通常細胞内に存在する進化的に高度に保存されたタンパク質ファミリーである（非特許文献８に概説）。熱ショック応答は、適切なタンパク質のアセンブリ、折りたたみ、および輸送で重要な役割を果たす種々の起源由来の外的ストレス要因に対する固有の細胞防御機構と考えられる。環境ストレス（すなわち、高温（熱ショック）、炎症、重金属、一定の薬物、アミノ酸アナログ、環境有毒汚染物質、感染）に対する熱ショックタンパク質合成の上方制御により、細胞がその環境の段階的変化に適応するか、致死的条件で生存することが可能である。細胞ストレス事象および細胞死事象は関連し、ストレスに応答して誘導された熱ショックタンパク質は、アポトーシス（プログラム細胞死）調節における重要な調節点で機能するようである。
【０００７】
ＨＳＰには、種々の細胞タンパク質と相互作用する抗アポトーシスタンパク質が含まれる。その発現レベルは、死刺激に応答した細胞の運命を決定することができ、アポトーシス阻害ＨＳＰ（特に、ＨＳＰ２７およびＨＳＰ７０）は発癌に関与し得る（非特許文献９に概説）。例えば、ＨＳＰ７０は、細胞ｐ６３腫瘍抑制タンパク質と相互作用し、乳癌細胞は時折いくつかのＨＳＰを高レベルで発現する。ＨＳＰ７０の増加はリンパ節陰性乳癌における不吉な予後徴候である一方で、ＨＳＰ２７は乳癌細胞株の特異的ドキソルビシン耐性を増加させる（非特許文献１０）。
【０００８】
ＨＳＰ７０は、通常、細胞内タンパク質であり、非癌細胞の細胞表面上に見出されない（非特許文献１１）。いくつかのヒト腫瘍型は、その細胞表面上にＨＳＰ７０を発現する。例えば、ＨＳＰ７０は、肺、結腸直腸、ニューロン、および膵臓の癌の原発性腫瘍生検材料ならびに肝臓転移および急性骨髄性白血病患者の白血病芽細胞の細胞表面上に見出すことができる。しかし、ＳＰ７０は、乳癌の新鮮な生検材料由来の細胞表面に見出されない（非特許文献１２）。
【０００９】
ＨＳＰ７０遺伝子は、類似のタンパク質（イソ型）をコードする複数の異なる類似の遺伝子を有する巨大な進化的に保存されたスーパーファミリーを形成する。古典的な細菌および哺乳動物のＨＳＰ７０型タンパク質がストレス（例えば、高温、化学物質、病原体感染）によって誘導される一方で、１つのイソ型（熱ショック同族体ＨＳＣ７０）は構成性に発現される（非特許文献１３）。ＨＳＣ７０の細菌ホモログはＤｎａＫである。ＨＳＰ７０と同様に、ＨＳＣ７０およびＤｎａＫは分子シャペロンとして機能し、正確なタンパク質折りたたみの媒介、未熟なタンパク質の折りたたみまたは凝集の防止、ならびに細胞膜を介したタンパク質の転位置および分泌の促進に関与する（非特許文献１４に概説）。
【００１０】
したがって、ヒトおよび動物の両方において、どのようにしてＭＤＲが惹起するか（例えば、天然に存在するかまたは薬物によって誘導されるか）に無関係に癌細胞および損傷非癌細胞における古典的および非定型ＭＤＲ表現型の発生の治療、検出、防止、および／または逆転が必要である。さらに、ＭＤＲを同定する試薬の同定および使用能力は、多剤耐性癌および多剤耐性損傷細胞の治療、モニタリング、診断、および医学的画像診断の改良に臨床的見込みがある。
【特許文献１】Ｒｏｍｅ  Ｌ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９６２５４７号
【特許文献２】Ｆｒｉｄｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｔｚ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ００５８４７１号
【特許文献３】米国特許第６，０９０，５６５号
【非特許文献１】Ｄａｖｉｅｓ  Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：３７５−３８２，１９９４
【非特許文献２】Ｐｏｏｌｅ，Ｋ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：５００−５００８，２００１
【非特許文献３】Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：６１５−６２７，２０００
【非特許文献４】Ｖｏｌｍ  Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ７１：３９８１−３９８７，１９９３
【非特許文献５】Ｂｒａｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１３：２２３−２３３，１９９４
【非特許文献６】Ｓｚａｋａｃｓ  Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．４：２５１−２５７，１９９８
【非特許文献７】Ｃｏｌｅ  Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１６５０−１６５４，１９９２
【非特許文献８】Ｋｕｓｍｉｅｒｃｚｙｋ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０５：３４３−７，２００１
【非特許文献９】Ｇａｒｒｉｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８６：４３３−４２，２００１
【非特許文献１０】Ｆｕｇｕａ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３２：６７−７１，１９９４
【非特許文献１１】Ｋｉａｎｇ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８０：１８３−２０１，１９９８
【非特許文献１２】Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ，５：４３８−４２，２０００
【非特許文献１３】Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７５３７−４１，１９９１
【非特許文献１４】Ｆｅｌｄｍａｎ，ＤＥ，Ｆｒｙｄｍａｎ  Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：１３−５，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、全長ＨＳＣ７０（通常は細胞内タンパク質）が新生物細胞および損傷細胞の細胞表面上で全長で発現し、多剤耐性（ＭＤＲ）新生物細胞およびＭＤＲ損傷細胞の細胞表面上でより豊富に発現するという発見に一部基づく。薬物感受性新生物細胞の細胞表面上でのＨＳＣ７０発現レベルは低いが、他の細胞表面ＭＤＲマーカー（Ｐ−糖タンパク質など）と対照的に、ＨＳＣ７０は体内の正常な細胞の細胞表面で無視できるほどの量しか発現されない。「無視できるほどの量」は、細胞表面上での１００分子未満のＨＳＣ７０を意味する。したがって、本発明により、死滅した非ＨＳＣ７０細胞が薬物感受性新生物細胞または損傷細胞のみであり、正常な細胞は無傷のままであるので、副作用がなくＨＳＣ７０に特異的に結合する毒素または他の治療薬もしくは診断薬に結合する結合剤が使用可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様では、本発明は、所与の起源または細胞型の試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルの測定および同一の起源または細胞型の非耐性新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルとの比較による、試験新生物細胞における多剤耐性または多剤耐性の可能性の検出方法を提供する。試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルが同一の所与の起源または細胞型の非耐性新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルよりも高い場合、試験新生物細胞は多剤耐性であるか多剤耐性の可能性がある。一定の実施形態では、細胞からの細胞質膜画分の単離および細胞質膜画分中のＨＳＣ７０レベルの測定によって、試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。他の実施形態では、細胞と抗ＨＳＣ７０抗体との接触および細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルの測定によって、試験新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。例えば、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する抗体レベルを、免疫蛍光放射または放射性標識によって測定することができる。
【００１３】
本発明のこの態様の一定の実施形態では、試験新生物細胞は、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、または卵巣細胞である。他の実施形態では、試験新生物細胞は、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽腫細胞、肝癌細胞、骨髄腫細胞、神経膠腫細胞、中皮腫細胞、または癌腫細胞である。本発明のさらに他の実施形態では、試験新生物細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。さらなる実施形態では、非耐性新生物（コントロール）細胞は、ＨＬ６０、ＮＢ４、ＣＥＭ、ＨＳＢ２、Ｍｏｌｔ４、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ、ＳＫＯＶ−３、または２００８などの薬物感受性新生物細胞株である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、検出可能な標識に作動可能に連結されたＨＳＣ７０結合剤を患者に投与することによる、患者の多剤耐性細胞の検出方法を提供する。標識は、患者の多剤耐性細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０に特異的に結合するＨＳＣ７０結合剤に作動可能に連結され、その後検出され、それにより患者の多剤耐性細胞の存在（存在する場合）を位置づける。一定の実施形態では、使用したＨＳＣ７０結合剤は抗体またはそのフラグメントである。他の実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン（ａｕｘｉｌｉｎ）、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドである。
【００１５】
特定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、または抗体である。他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学染料、放射性化合物、化学発光化合物、磁性化合物、常磁性化合物、プロ磁性（ｐｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ）化合物、有色生成物を生成する酵素、化学発光生成物を生成する酵素、または磁性生成物を生成する酵素である。
【００１６】
この態様の一定の実施形態では、多剤耐性細胞は新生物細胞である。特定の実施形態では、新生物細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、骨髄腫癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、または癌腫癌細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、または卵巣細胞である。特定の実施形態では、患者は、多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者などのヒトである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、試験新生物細胞における多剤耐性の診断または検出用キットを提供する。キットは、ＨＳＣ７０検出のための第１のプローブおよびヌクレオホスミンまたはビメンチン等の別の多剤耐性マーカーの検出のための第２のプローブを含む。一定の実施形態では、本発明のこれらのキットは、ＨＳＣ７０検出のための第１のプローブおよびＭＤＲ１、ＭＤＲ３、ＭＲＰ１、ＭＲＰ５、またはＬＲＰなどの別の多剤耐性マーカーの検出のための第２のプローブを含む。特定の実施形態では、キットは、ＨＳＣ７０の検出用プローブとして抗ＨＳＣ７０抗体を含む。他の実施形態では、キットは、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）を含む。さらなる実施形態では、キットは、第２の非ＨＳＣ７０多剤耐性マーカーの検出用プローブとしてヌクレオホスミン抗体またはビメンチン抗体を含む。他の実施形態では、第２のプローブは、ヌクレオホスミンリガンド（タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）、ＲＮＡ、網膜芽腫タンパク質、ＩＲＦ−１、またはＲｅｘタンパク質のＮ末端核局在化シグナルなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）など）またはビメンチンリガンド（修飾ＬＤＬ、ＮＬＫ１タンパク質、ビメンチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質、ペリフェリン、フィンブリン、ＲｈｏＡ結合キナーゼα、またはタンパク質ホスファターゼ２Ａなど）であり得る。
【００１８】
本発明のこの態様の別の実施形態では、キットは、試験新生物細胞の表面上に存在するＨＳＣ７０を検出するプローブを含む。他の実施形態では、キットは、試験ＭＤＲ新生物細胞の表面上に存在する別の（非ＨＳＣ７０）マーカーを検出する第２のプローブを含む。一定の実施形態では、キットは、ＭＤＲ１抗体、ＭＤＲ３抗体、ＭＲＰ１抗体、ＭＲＰ３抗体、またはＬＲＰ抗体である第２の抗体を含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、患者の細胞表面ＨＳＣ７０の検出のための細胞表面ＨＳＣ７０ｉｎ ｓｉｔｕ検出プローブを提供する。この細胞表面ＨＳＣ７０プローブは、ｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのＨＳＣ７０結合成分および検出可能な標識（例えば、テクネチウム標識）を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は抗体である。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、多剤耐性新生物の治療または防止のための細胞表面ＨＳＣ７０標的薬を提供する。このＨＳＣ７０標的薬は、ＨＳＣ７０結合成分が治療成分を多剤耐性新生物にターゲティングし、それにより多剤体積新生物を治療するように互いに作用するＨＳＣ７０結合成分および治療成分の両方を含む。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は抗ＨＳＣ７０抗体である。他の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドなどのＨＳＣ７０リガンドである。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、またはタンパク質である。
【００２１】
本発明のこの態様の一定の有用な実施形態では、治療成分は、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エポエチン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タキソール、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンなどの化学療法薬である。特定の実施形態では、治療成分はリポソーム処方物中に存在する。
【００２２】
他の実施形態では、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、211Ａｔ、または213Ｂｉなどの放射性同位体である。
【００２３】
さらに他の実施形態では、治療成分は、標的化多剤耐性新生物細胞を死滅することができるかその死滅を誘導することができる毒素である。本発明で使用されるこのような毒素には、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、植物リシン毒素、植物アブリン毒素、植物サポリン毒素、植物ゲロニン毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。
【００２４】
特に有用な実施形態では、細胞表面ＨＳＣ７０標的治療薬のＨＳＣ７０結合成分が標的細胞の表面に結合し、治療エレメントが内在化されて前記細胞の成長を停止させ、細胞の生存度に悪影響を与えるか、前記細胞を死滅させる。
【００２５】
別の態様では、本発明は、上記の細胞表面ＨＳＣ７０標的化治療薬を任意の細胞に投与することによる、被験体の多剤耐性新生物を治療または防止する方法を提供する。この態様の一定の実施形態では、新生物は、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽腫、肝癌、神経膠腫、中皮腫、または癌腫である。さらなる実施形態では、新生物細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。特定の実施形態では、被験体は、多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者などのヒト患者である。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはそのＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能なワクチン成分を含む、多剤耐性新生物の治療または防止のためのワクチンを提供する。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはポリペプチドサブシーケンスは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＨＳＣ７０ポリペプチド配列である。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスは少なくとも８アミノ酸長であり、一定の実施形態では、ハプテンとして機能する。
【００２７】
一定の実施形態では、ワクチン処方物には、アジュバントまたは他の薬学的に許容可能なワクチン成分が含まれる。特定の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、オイルエマルジョン、細菌産物、全不活化細菌、内毒素、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系化合物、植物油、モノホスホリル脂質Ａ、サポニン、またはスクアレンである。
【００２８】
別の態様では、本発明は、上記の任意のＨＳＣ７０ワクチンの投与による被験体の多剤耐性新生物を治療または防止する方法を提供する。この態様の一定の実施形態では、処置すべき新生物は、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽腫、肝癌、神経膠腫、中皮腫、または癌腫である。さらなる実施形態では、新生物は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。特定の実施形態では、被験体は、多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者などのヒト患者である。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、所与の起源または細胞型の試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルの測定および同一の起源または細胞型の非耐性細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルとの比較による、試験細胞が新生物であるかどうかを検出する方法を提供する。試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルが同一の所与の起源または細胞型の非新生物細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルよりも高い場合、試験細胞は新生物である。
【００３０】
一定の実施形態では、細胞からの細胞質膜画分の単離および細胞質膜画分中のＨＳＣ７０レベルの測定によって、試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。他の実施形態では、細胞と抗ＨＳＣ７０抗体との接触および細胞表面ＨＳＣ７０に結合した抗体レベルの測定によって、試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。例えば、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する抗体レベルを、免疫蛍光放射または放射性標識によって測定することができる。
【００３１】
本発明のこの態様の一定の実施形態では、試験細胞は、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、または卵巣細胞である。他の実施形態では、試験細胞は、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽腫細胞、肝癌細胞、骨髄腫細胞、神経膠腫細胞、中皮腫細胞、または癌腫細胞である。本発明のさらに他の実施形態では、試験細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、検出可能な標識に作動可能に連結されたＨＳＣ７０結合剤を患者に投与することによる、患者の新生物細胞の検出方法を提供する。標識は、患者の新生物細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０に特異的に結合するＨＳＣ７０結合剤に作動可能に連結され、その後検出され、それにより患者の新生物細胞の存在（存在する場合）を位置づける。一定の実施形態では、使用したＨＳＣ７０結合剤は抗体またはそのフラグメントである。他の実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドである。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、または抗体である。他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学染料、放射性化合物、化学発光化合物、磁性化合物、常磁性化合物、プロ磁性化合物、有色生成物を生成する酵素、化学発光生成物を生成する酵素、または磁性生成物を生成する酵素である。
【００３３】
この態様の一定の実施形態では、新生物細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、骨髄腫癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、または癌腫癌細胞である。一定の実施形態では、新生物細胞は、前骨髄球白血病細胞、Ｔリンパ芽球様細胞、乳房上皮細胞、または卵巣細胞である。特定の実施形態では、患者は、新生物細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者などのヒトである。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＨＳＣ７０検出のための少なくとも１つのプローブおよびヌクレオホスミンまたはビメンチン等の別の新生物マーカーの検出のための少なくとも１つの他のプローブを含む、新生物の診断または検出用キットを提供する。１つの実施形態では、ＨＳＣ７０の検出用プローブは、抗ＨＳＣ７０抗体またはその結合フラグメントである。他の実施形態では、ＨＳＣ７０の検出用プローブは、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドである。
【００３５】
一定の実施形態では、非ＨＳＣ７０新生物マーカーの検出用の第２のプローブは、ヌクレオホスミン抗体またはＨＳＣ７０抗体である。他の実施形態では、非ＨＳＣ７０新生物マーカーの検出用の第２のプローブは、ヌクレオホスミンリガンド（タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）、ＲＮＡ、網膜芽腫タンパク質、ＩＲＦ−１、またはＲｅｘタンパク質のＮ末端核局在化シグナルなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）など）およびＨＳＣ７０リガンドである。さらに他の実施形態では、非ＨＳＣ７０新生物マーカーの検出用の第２のプローブは、ビメンチンリガンド（修飾ＬＤＬ、ＮＬＫ１タンパク質、ビメンチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質、ペリフェリン、フィンブリン、ＲｈｏＡ結合キナーゼα、またはタンパク質ホスファターゼ２Ａなど）である。
【００３６】
特に有用な実施形態では、キットは、新生物である場合に試験細胞の表面上に存在するＨＳＣ７０を検出する第１のプローブおよび新生物である場合に試験細胞の表面上に存在する別の（非ＨＳＣ７０）マーカーを検出する第２のプローブを含む。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、癌性新生物細胞成長の治療のための細胞表面ＨＳＣ７０標的薬を提供する。細胞表面ＨＳＣ７０標的薬は、一般に、ＨＳＣ７０結合成分および治療成分を含む。ＨＳＣ７０結合成分が治療成分を新生物細胞成長にターゲティングし、それにより前記新生物を治療する。したがって、ＨＳＣ７０結合成分および治療成分は、ＨＳＣ７０結合成分が治療成分を新生物にターゲティングし、それにより新生物を治療するように互いに作用する。
【００３８】
一定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は抗ＨＳＣ７０抗体である。他の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドである。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、またはタンパク質である。
【００３９】
本発明のこの態様の一定の有用な実施形態では、治療成分は、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エポエチン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タキソール、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンなどの化学療法薬である。特定の実施形態では、治療成分はリポソーム処方物中に存在する。
【００４０】
他の実施形態では、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、211Ａｔ、または213Ｂｉなどの放射性同位体である。
【００４１】
さらに他の実施形態では、治療成分は、標的化多剤耐性新生物細胞を死滅することができるかその死滅を誘導することができる毒素である。本発明で使用されるこのような毒素には、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、植物リシン毒素、植物アブリン毒素、植物サポリン毒素、植物ゲロニン毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。
【００４２】
特に有用な実施形態では、細胞表面ＨＳＣ７０標的治療薬のＨＳＣ７０結合成分は標的細胞の表面に結合し、治療エレメントが内在化されて前記細胞の成長を停止させ、細胞の生存度に悪影響を与えるか、細胞を死滅させる。
【００４３】
別の態様では、本発明は、上記の細胞表面ＨＳＣ７０標的化治療薬を任意の細胞に投与することによる、被験体の新生物を治療する方法を提供する。この態様の一定の実施形態では、新生物は、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽腫、肝癌、神経膠腫、中皮腫、または癌腫である。さらなる実施形態では、新生物は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。特定の実施形態では、被験体は、新生物の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者などのヒト患者である。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、新生物の治療または防止のためのワクチンを提供する。本発明のこれらのワクチンには、ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはそのＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能なワクチン成分が含まれる。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはポリペプチドサブシーケンスは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＨＳＣ７０ポリペプチド配列である。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスは少なくとも８アミノ酸長であり、一定の実施形態では、ハプテンとして機能する。
【００４５】
一定の実施形態では、ワクチン処方物には、アジュバントまたは他の薬学的に許容可能なワクチン成分が含まれる。特定の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、オイルエマルジョン、細菌産物、全不活化細菌、内毒素、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系化合物、植物油、モノホスホリル脂質Ａ、サポニン、またはスクアレンである。
【００４６】
別の態様では、本発明は、上記の任意のＨＳＣ７０ワクチンの投与による被験体の新生物を治療または防止する方法を提供する。この態様の一定の実施形態では、処置すべき新生物は、乳癌、卵巣癌、骨髄腫、リンパ腫、黒色腫、肉腫、白血病、網膜芽腫、肝癌、神経膠腫、中皮腫、または癌腫である。さらなる実施形態では、新生物は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。特定の実施形態では、被験体は、多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者などのヒト患者である。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、所与の起源または細胞型の試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルの測定および同一の起源または細胞型の非損傷細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルとの比較による、試験細胞における損傷（例えば、病原体感染）の検出方法を提供する。試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルが同一の所与の起源または細胞型の非損傷細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルよりも高い場合、試験細胞は損傷している（例えば、感染している）。
【００４８】
一定の実施形態では、損傷細胞は病原体に感染している。特定の実施形態では、細胞からの細胞質膜画分の単離および細胞質膜画分中のＨＳＣ７０レベルの測定によって、試験細胞中の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。一定の実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体により、インタクトな試験細胞上に存在する細胞表面ＨＳＣ７０レベルを測定する。例えば、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する抗体レベルを、免疫蛍光放射または放射性標識によって測定することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、損傷細胞は、ウイルス、細菌、または寄生虫である病原体に感染している。一定の実施形態では、病原体は、ＨＩＶ、ウェストナイルウイルス、またはデングウイルスなどのウイルスである。他の実施形態では、病原体は、マイコバクテリア、リケッチア、またはクラミジアなどの細菌である。さらに他の実施形態では、病原体は、プラスモジウム、リシューマニア、またはタキソプラズマなどの寄生虫である。
【００５０】
一定の他の実施形態では、試験細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に由来する。特定の実施形態では、試験細胞はヒトに由来する。特定の実施形態では、ヒト患者は、病原体感染細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している。
【００５１】
別の態様では、本発明は、検出可能な標識に作動可能に連結されたＨＳＣ７０結合剤を患者に投与することによる、患者の損傷（例えば、病原体感染）細胞の検出方法を提供する。標識は、患者の損傷（例えば、病原体感染）細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０に特異的に結合するＨＳＣ７０結合剤に作動可能に連結され、その後検出され、それにより患者の損傷（例えば、病原体感染）細胞の存在（存在する場合）を位置づける。一定の実施形態では、使用したＨＳＣ７０結合剤は抗体またはそのフラグメントである。他の実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドである。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合剤は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、または抗体である。他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学染料、放射性化合物、化学発光化合物、磁性化合物、常磁性化合物、プロ磁性化合物、有色生成物を生成する酵素、化学発光生成物を生成する酵素、または磁性生成物を生成する酵素である。
【００５２】
別の態様では、本発明は、試験細胞における病原体の診断または検出用キットを提供する。キットは、ＨＳＣ７０検出のための第１のプローブおよびヌクレオホスミンまたはビメンチン等の別の損傷（例えば、病原体感染）マーカーの検出のための第２のプローブを含む。特定の実施形態では、キットは、ＨＳＣ７０の検出用プローブとして抗ＨＳＣ７０抗体を含む。他の実施形態では、キットは、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）を含む。さらなる実施形態では、キットは、第２の非ＨＳＣ７０損傷（例えば、病原体感染）マーカーの検出用プローブとしてヌクレオホスミン抗体またはＨＳＣ７０抗体を含む。他の実施形態では、第２のプローブは、ヌクレオホスミンリガンド（タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）、ＲＮＡ、網膜芽腫タンパク質、ＩＲＦ−１、またはＲｅｘタンパク質のＮ末端核局在化シグナルなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）など）またはビメンチンリガンド（修飾ＬＤＬ、ＮＬＫ１タンパク質、ビメンチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質、ペリフェリン、フィンブリン、ＲｈｏＡ結合キナーゼα、またはタンパク質ホスファターゼ２Ａなど）であり得る。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、または抗体もしくはそのフラグメントである。
【００５３】
さらに別の態様では、本発明は、病原体による感染の治療のための細胞表面ＨＳＣ７０標的薬を提供する。ＨＳＣ７０標的薬は、ＨＳＣ７０結合成分および治療成分を含む。ＨＳＣ７０結合成分は、治療成分を病原感染細胞にターゲティングし、それにより感染症を治療する。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は抗ＨＳＣ７０抗体である。他の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、アルツハイマーτタンパク質、ＢＡＧ−１、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）、オーキシリン、または免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）などのＨＳＣ７０リガンドである。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、または抗体もしくはそのフラグメントである。
【００５４】
特定の実施形態では、治療成分は、抗菌薬、抗ウイルス薬、または抗寄生虫薬である。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０結合成分は、標的細胞表面に結合し、治療エレメントが内在化されて病原体の成長を停止させ、病原体の生存度に悪影響を与えるか、病原体感染細胞を死滅させる。
【００５５】
さらに別の態様では、本発明は、病原体による感染症の治療または防止のためのワクチンを提供する。これらのワクチンは、ＨＳＣ７０ポリペプチドまたはＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンス、少なくとも１つの薬学的に許容可能なワクチン成分を含む。一定の実施形態では、ＨＳＣ７０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＨＳＣ７０ポリペプチド配列である。特定の実施形態では、ＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスは少なくとも８アミノ酸長であり、一定の実施形態では、ハプテンとして機能する。
【００５６】
一定の実施形態では、ワクチン処方物には、アジュバントまたは他の薬学的に許容可能なワクチン成分が含まれる。特定の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、オイルエマルジョン、細菌産物、全不活化細菌、内毒素、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系化合物、植物油、モノホスホリル脂質Ａ、サポニン、またはスクアレンである。
【００５７】
別の態様では、本発明は、上記の任意のＨＳＣ７０ワクチンの投与による被験体の感染症を治療または防止する方法を提供する。この態様の一定の実施形態では、被験体はヒト患者である。特定の実施形態では、ヒト患者は、感染の存在に起因する疾患または障害を罹患しているヒト患者である。一定の実施形態では、感染は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣などの組織に存在する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本明細書中で言及した特許および化学論文により、当業者に利用可能な知識が確立される。本明細書中で引用した発行米国特許、許可された出願、公開外国出願、および引用文献（ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列が含まれる）は、それぞれが具体的且つ個別に参考として援用されるのと同程度に本明細書中で参考として援用される。
【００５９】
特に、本出願は、以下の特許出願のその全体を参考として援用する：２００２年１２月１３日提出で発明の名称が’’Ｖｉｍｅｎｔｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄａｍａｇｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ’’の米国特許出願番号６０／４３３，４８０号；２００２年１２月１３日提出で発明の名称が"Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄａｍａｇｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ"の米国特許出願番号６０／４３３，３５１号ならびに２００３年１２月１５日提出で発明の名称が’’Ｖｉｍｅｎｔｉｎ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ’’の米国特許出願番号  ＹＹ／ＸＸＸＸＸＸ、２００３年１月１日提出で発明の名称が’’ＨＳＣ７０  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄａｍａｇｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ’’の米国特許出願番号６０／４３８，０１２号ならびに２００３年１２月１５日提出で発明の名称が’’Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ’’の米国特許出願番号ＹＹ／ＸＸＸＸＸＸ号。
【００６０】
本発明は、癌の診断、検出、防止、および／または治療ならびに損傷細胞、非癌細胞、および癌細胞の天然に存在するＭＤＲ表現型および薬物誘導性ＭＤＲ表現型発生の診断、検出、防止、および／または治療のための方法および試薬に関する。本発明により、多剤耐性腫瘍および病原体感染の臨床管理が改良される。さらに、本発明は、新生物細胞または損傷細胞（ＭＤＲ細胞が含まれる）を有する患者を同定し、それにより多剤耐性癌ならびに病原体およびウイルスの感染の治療、モニタリング、診断、および医学的画像診断が改良される試薬を提供する。
【００６１】
したがって、本発明の態様は、試験損傷細胞中の多剤耐性の検出方法を提供する。方法は、特定の型の試験損傷細胞上の全長熱ショック同族タンパク質７０（ＨＳＣ７０）の細胞表面発現レベルを測定する工程と、同一の細胞型の薬物感受性損傷細胞上のＨＳＣ７０タンパク質の細胞表面発現レベルを測定する工程と、薬物感受性損傷細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルと比較して細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルの増加が認められる場合に試験損傷細胞が多剤耐性であるかどうかを決定する工程を含む。特定の実施形態では、試験損傷細胞および薬物感受性損傷細胞の細胞成分の画分への分離および細胞質膜または原形質膜を含む細胞画分中のＨＳＣ７０の存在レベルの測定によって、細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。
【００６２】
一定の実施形態では、試験損傷細胞は病原体に感染している。特定の実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、または寄生虫である。ウイルスの例には、ＨＩＶ、ウェストナイルウイルス、およびデングウルスが含まれるが、これらに限定されない。細菌の例には、マイコバクテリア、リケッチア、またはクラミジアが含まれるが、これらに限定されない。寄生虫の例には、プラスモジウム、リシューマニア、またはタキソプラズマが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、試験損傷細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する。一定の実施形態では試験損傷細胞はヒトに由来する。特定の実施形態では、ヒトは、試験損傷細胞の存在に起因する疾患を罹患している。
【００６３】
本発明はまた、試験新生物細胞における多剤耐性の検出方法を提供する。方法は、特定の型の試験新生物細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する工程と、同一の細胞型の薬物感受性新生物細胞の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、薬物感受性新生物細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルと比較して細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルの増加が認められる場合に試験新生物細胞が多剤耐性であることを決定する工程を含む。特定の実施形態では、試験新生物細胞および薬物感受性新生物細胞の画分への分離および細胞の細胞質膜または原形質膜を含む細胞画分中のＨＳＣ７０の存在レベルの測定によって、細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルを測定する。
【００６４】
新生物細胞の例には、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽腫細胞、肝癌細胞、骨髄腫細胞、神経膠腫細胞、中皮腫細胞、および癌腫細胞が含まれるが、これらに限定されない。一定の実施形態では、試験新生物細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、または卵巣からなる群から選択される組織に由来する。
【００６５】
一定の実施形態では、試験新生物はヒトに由来する。特定の実施形態では、ヒトは、試験新生物細胞の存在に起因する癌を罹患している。
【００６６】
本発明は、さらに、患者の多剤耐性細胞の検出方法を提供する。方法は、検出可能な標識に作動可能に連結されたＨＳＣ７０タンパク質と特異的に結合する結合剤を投与する工程と、薬物感受性細胞表面上のＨＳＣ７０タンパク質に結合した結合剤と比較して患者中の多剤耐性細胞表面上のＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合した結合剤の結合の増加を検出する工程とを含む。本発明のこの実施形態では、医学的に画像診断デバイスまたはシステムにより、患者中の多剤耐性細胞の細胞表面に特異的に結合した結合剤を検出する。結合剤の例には、天然リガンド、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、およびそのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一定の実施形態では、結合剤は抗体である。
【００６７】
検出可能な標識の例には、フルオロフォア、化学染料、放射性化合物、化学発光化合物、磁性化合物、常磁性化合物、有色生成物を生成する酵素、化学発光生成物を生成する酵素、または磁性生成物を生成する酵素が含まれるが、これらに限定されない。一定の実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、多剤耐性細胞は、損傷細胞または新生物細胞である。特定の実施形態では、損傷細胞は病原体に感染している。病原体の例には、ウイルス、細菌、および寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスの例には、ＨＩＶ、ウェストナイルウイルス、およびデングウルスが含まれるが、これらに限定されない。細菌の例には、マイコバクテリア、リケッチア、およびクラミジアが含まれるが、これらに限定されない。寄生虫の例には、プラスモジウム、リシューマニア、およびタキソプラズマが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
特定の実施形態では、新生物細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、および癌腫癌細胞からなる群から選択される。特定の実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、多剤耐性細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している。
【００６９】
本発明はまた、新生物細胞の検出方法を提供する。方法は、癌と疑われる特定の細胞型の試験細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、同一の型の正常な細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルと比較して細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルの増加が認められる場合に試験細胞が癌であることを決定する工程とを含む。いくつかの実施形態では、試験細胞は、血球（例えば、白血球、赤血球、星状細胞、またはナチュラルキラー細胞）、肝細胞、腎臓細胞、脳細胞、皮膚細胞、胃腸管由来の細胞、眼細胞、乳房細胞、卵巣細胞、または前立腺細胞である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、試験細胞および正常細胞の細胞成分の画分への分離および細胞の細胞質膜画分または原形質膜画分中に存在するＨＳＣ７０レベルの測定によって細胞表面発現ＨＳＣ７０を測定する。
【００７１】
一定の実施形態では、試験細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣からなる群から選択される組織に由来する。１つの実施形態では、試験細胞はヒト由来である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、試験細胞の細胞成分を、検出可能な結合剤と接触させ、同一の型の正常な細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルと比較して試験細胞上に細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルの増加が認められるかどうかを決定するために結合剤を検出する。特定の実施形態では、インタクトな新生物と疑われる細胞を、検出可能な結合剤に接触させる。
【００７３】
本発明により、このようなＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞を有する患者も最初に同定される。例えば、このような細胞を有すると同定された患者は、感染症（例えば、Ｂ型肝炎）治療を受けているか感染症治療を受けていた無症候患者である場合、本発明により症状の回復前にこれらの患者を同定し、このようなＭＤＲ細胞が検出された場合に治療計画を変更することができるように薬物治療中にこれらの患者をモニタリングすることが可能である。同様に、このような細胞を有すると同定された患者が癌（例えば、乳癌または白血病患者）が緩和した患者であるか、癌を治療する場合、本発明により、その癌の回復および／または進行前にこれらの患者を同定し、治療計画を変更することができるように薬物での治療中にこれらの患者をモニタリングすることが可能である。
【００７４】
本発明は、細胞表面発現ＨＳＣ７０が細胞の多剤耐性のマーカーとして有用であるという認識に由来する。ＨＳＣ７０タンパク質細胞表面マーカーの重要な利点は、体内の正常細胞内で見出され、且つその細胞表面で発現しないという点である。この発現プロフィールは、異なる正常組織の細胞表面上に種々のレベルで存在する（肝臓、腎臓、幹細胞、および血液脳関門上皮細胞の表面上での高レベルでの存在が含まれる）Ｐ糖タンパク質およびＭＲＰなどの他の公知のＭＤＲマーカーを使用した条件と対照的である（Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３８：１２７７−１２８７，１９９０；Ｎａｋａｍａｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ＆  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，３０：４−６，２００２）。結果として、Ｐ−糖タンパク質などのＭＤＲ癌細胞マーカーおよびＭＲＰに対して指向する細胞傷害薬は、高レベルの細胞表面Ｐ−糖タンパク質およびＭＲＰも発現する正常な細胞を死滅する副作用によって制限されている（例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４２８８−４２９２，１９８７を参照のこと）。ＨＳＣ７０マーカーは、薬物感受性非癌性正常細胞上の非常に低いか無視できるレベルと比較して、ＭＤＲ癌細胞およびＭＤＲ非癌性損傷細胞（例えば、ウイルス感染細胞）表面上で高レベルで発現し、薬物感受性癌細胞の細胞表面上で中程度のレベルで発現するので、本発明によりこの問題が克服される。したがって、本発明は、ＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞ならびに薬物感受性新生物細胞および損傷細胞を死滅させ、且つ正常な細胞が無傷のままである、細胞表面発現ＨＳＣ７０に指向する細胞傷害薬を提供する。
【００７５】
同一のＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞は１つを超えるＭＤＲマーカーを同時に発現することができるか（例えば、ＨＳＣ７０およびＰ−糖タンパク質の両方を発現することができる）、ＭＤＲマーカーを単独で発現することができることに留意すべきである。同一のＭＤＲ細胞上での異なるマーカーの同時発現（ｊｏｉｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）により、１つを超える細胞表面ＭＤＲマーカーに指向する結合剤を組み合わせることが可能である。例えば、致死未満量のＨＳＣ７０に特異的に結合する結合剤を、致死未満量のＰ−糖タンパク質に特異的に結合する結合剤と組み合わせることができる。正常な細胞がその細胞表面上でＨＳＣ７０を発現しないので、これらの細胞はＨＳＣ７０に特異的に結合する結合剤に悪影響を受けない。むしろ、細胞表面上にＰ−糖タンパク質およびＨＳＣ７０の両方を発現するＭＤＲ細胞のみがこの併用療法で死滅する。
【００７６】
本明細書中で使用される、用語「多剤耐性の」および「多剤耐性」を、新生物細胞または損傷細胞における多数の異なる薬物（新生物細胞または損傷細胞に一度も曝露されていない薬物が含まれる）に対する耐性の発生をいうために使用する。例えば、ビンクリスチンで治療した白血病患者がビンクリスチンおよび患者が一度も投与されていない他の化学療法薬（例えば、メトトレキセートまたはメルカプトプリン）に耐性を示す白血球を発生する場合、患者の白血球は多剤耐性を示す。同様に、ペニシリンで治療した結核患者がペニシリンおよび患者が一度も投与されていない他の化学療法薬（例えば、エリスロマイシン）に耐性を示す結核菌感染細胞を発生する場合、患者の結核菌感染細胞は多剤耐性を示す。顕著には、多剤耐性（ＭＤＲ）には、広範な薬物（元の薬物との構造またはさらには機能がほとんど類似しない薬物が含まれる）に耐性を示し、考慮される全ての薬剤の有効性が減少する獲得同時耐性が含まれ得る。
【００７７】
用語「多剤耐性の」および「多剤耐性」を、古典的経路（すなわち、Ｐ−糖タンパク質または別のＭＤＲタンパク質を含む）またはＰ−糖タンパク質を含まない非定型機構（非古典的機構）（例えば、ＭＲＰ１多剤耐性マーカーを含む非定型機構）のいずれかによって多剤耐性を示す新生物細胞または損傷細胞を説明するために使用することに留意のこと。さらに、本発明によれば、多剤耐性を生じる細胞（例えば、新生物細胞または損傷細胞）は、薬物への曝露（例えば、化学療法薬または抗生物質）またはこのようなＭＤＲの天然の発生（すなわち、薬物に曝露しない）のいずれかによってこのようなＭＤＲ状態を生じることができる。
【００７８】
本明細書中で使用される、用語「ＭＤＲタンパク質」には、薬物（多剤）耐性に関与する任意のいくつかの内在性ＡＢＣ型膜貫通糖タンパク質が含まれる。これらには、ＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質またはＰ−糖タンパク質１）（多剤耐性細胞中の薬剤蓄積の減少を担うエネルギー依存性流出ポンプ）が含まれる。ＭＤＲ１の例には、ヒトＭＤＲ１（例えば、データベースコードＭＤＲ１＿ＨＵＭＡＮ，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０８１８３，１２８０アミノ酸（１４１．３４ｋＤａ）を参照のこと）が含まれる。他のＭＤＲタンパク質には、薬物蓄積を減少させるが、それ自体によって薬物耐性を付与することができないエネルギー依存性流出ポンプであるＭＤＲ３（またはＰ−糖タンパク質３）が含まれる。ＭＤＲ３の例には、ヒトＭＤＲ３（例えば、データベースコードＭＤＲ３＿ＨＵＭＡＮ，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２１４３９，１２７９アミノ酸（１４０．５２ｋＤａ）を参照のこと）が含まれる。他のＭＤＲ関連タンパク質は、薬物の細胞内小器官への能動輸送に関連する。ヒト由来の例には、ＭＲＰ１（多剤耐性関連タンパク質１）データベースコードＭＲＰＪＨＵＭＡＮ，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３３５２７，１５３１アミノ酸（１７１．４７ｋＤａ）が含まれる。
【００７９】
本発明によれば、多剤耐性を生じる細胞（例えば、新生物細胞または損傷細胞）は、薬物への曝露（例えば、化学療法薬または抗生物質）またはこのようなＭＤＲの天然の発生（すなわち、細胞が耐性を生じる薬物に曝露しない）のいずれかによってこのようなＭＤＲ状態を生じることができる。この態様では、本発明により、新生物の治療前でさえも新生物の潜在的な多剤耐性特性を検出可能である。同様に、本発明により、例えば、新生物を治療して薬物耐性を示す前でさえも潜在的に多剤耐性を示す新生物を有効に治療可能である。
【００８０】
正常な細胞が死滅せず、それにより治療による副作用が軽減または排除されるので、細胞表面発現ＨＳＣ７０は、その細胞表面上のＨＳＣ７０マーカーを有するＭＤＲ新生物細胞およびＭＤＲ損傷細胞を死滅させる治療法（免疫毒素療法など）で使用される優れたマーカーである。同様に、細胞表面ＨＳＣ７０マーカーを使用したＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞の診断および画像診断はより高感度且つ正確であり、正常な組織上でも発現するＰ−糖タンパク質またはＭＲＰなどのＭＤＲマーカーを使用したＭＤＲ新生物細胞および損傷細胞の診断および画像診断と比較して擬陽性がより少ない。さらに、細胞表面ＨＳＣ７０は、その細胞表面にＨＳＣ７０を発現する新生物細胞または損傷細胞組織に対する患者へのワクチン接種のための抗ＭＤＲ癌ワクチン抗原または抗ＭＤＲ損傷細胞ワクチン抗原として有用である。
【００８１】
本発明により、新生物細胞または損傷細胞が多剤耐性を獲得している患者の同定も可能である。いくつかの状況では、患者が治療に使用した薬物にもはや応答しない場合に患者を同定する。例えば、化学療法薬（例えば、ビンクリスチン）で治療して緩和した乳癌患者または白血病患者は、化学療法薬で継続的に治療しているにもかかわらず、突然緩和から脱し得る。不運なことに、このような患者は、他の化学療法薬（患者が最初から一度も治療されていない薬剤が含まれる）にも応答しないことがしばしば見出されている。勿論、これらの患者が多剤耐性を示した後、その再発した癌または損傷細胞によって発症した疾患を制御するためにこれらの患者を治療することは困難であり、放射線療法または手術（例えば、骨髄移植または壊死組織の切除）等のより根本的な治療法が必要であり得る。
【００８２】
本発明により、患者の新生物細胞または損傷細胞上のＨＳＣ７０の細胞表面発現の検出による多剤耐性の早期診断が可能である。このような早期診断により、最初に薬物に応答して薬物治療に感受性を示す患者を最初に薬物に応答しない患者と区別することが可能である。したがって、薬物非応答患者を、より有効な治療で治療することができる。さらに、ＨＳＣ７０マーカーは、同一の癌細胞または損傷細胞上で他のＭＤＲマーカーと共にまたは独立して生じ得るので、ＨＳＣ７０ならびに他のＭＤＲ癌マーカーおよび損傷マーカー（例えば、Ｐ−糖タンパク質およびＭＲＰ）に同時に指向する併用療法が可能である。
【００８３】
さらに、ＨＳＣ７０細胞表面発現を使用した診断手順を使用して、治療薬に耐性を示し、且つ一連の薬物治療時に誘発されるＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞の発生および出現を追跡することもできる。例えば、このような手順は、ＡＺＴで治療し、その後広範な抗ウイルス薬、抗菌薬、および抗癌薬に対して多剤耐性を示すことが報告されているＡＩＤＳ患者の治療に有用である（Ｇｏｌｌａｐｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７１：１００２−１００７，１９９０；Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８：１８３９−１８４４，１９９２を参照のこと）。
【００８４】
別の例では、ＨＳＣ７０細胞表面発現の診断アッセイは、新生物細胞または損傷細胞の治療法を含む臨床研究での患者の選択に有用である。したがって、患者の細胞の細胞表面上のＨＳＣ７０の存在により、患者を所与の臨床研究に含めることが適格であるか判断される。
【００８５】
したがって、１つの態様では、本発明は、多剤耐性が疑われる試験損傷細胞における多剤耐性の検出方法を提供する。方法は、特定の細胞型の試験損傷細胞表面上の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、薬物感受性損傷細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、薬物感受性損傷細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルと比較して細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルの増加が認められる場合に試験損傷細胞が多剤耐性を示すことを決定する工程とを含む。
【００８６】
別の態様では、本発明は、多剤耐性が疑われる試験新生物細胞における多剤耐性の検出方法を提供する。方法は、特定の細胞型である場合に試験新生物細胞表面上の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、同一の型の薬物感受性新生物細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質レベルを測定する工程と、薬物感受性新生物細胞上の細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルと比較して細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルの増加が認められる場合に試験新生物細胞が多剤耐性を示すことを決定する工程とを含む。
【００８７】
別の態様では、本発明は、癌（すなわち、新生物）が疑われる試験細胞における癌の検出方法を提供する。方法は、試験細胞および正常な細胞（癌でないことが既知の細胞）の表面上の細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質を測定する工程と、同一細胞型の正常な有核細胞上に存在する細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルと比較して細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルが増加する場合に試験細胞が癌性を示すことを決定する工程とを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、試験損傷細胞または試験新生物細胞は、正常な細胞または非ＭＤＲ損傷細胞もしくは非ＭＤＲ新生物細胞上の熱ショック同族タンパク質７０の細胞表面発現レベルよりも少なくとも２倍の量のＨＳＣ７０をその細胞表面上に発現する。このような細胞表面発現レベルの決定を、多数の公知の方法（下記の方法が含まれるが、これらに限定されない）によって行うことができる。
【００８９】
本発明で使用される、「損傷細胞」を、非癌性であるが損傷している細胞を意味するために使用する。例えば、非新生物性損傷細胞は、ウイルス、細菌、または寄生虫などの病原体に感染した細胞であり得る。１つの非限定的な例では、細胞は、多細胞寄生虫による感染によって損傷を受けるか、寄生虫の感染の影響によって損傷を受け得る。このような非限定的な寄生虫には、プラスモジウム、リシューマニア、およびタキソプラズマが含まれる。このような非限定的なウイルスには、ＨＩＶ、ウェストナイルウイルス、およびデングウルスが含まれ、このような非限定的な細菌には、マイコバクテリア、リケッチア、およびクラミジアが含まれる。
【００９０】
一定の実施形態では、試験損傷細胞は、組織（例えば、損傷組織（例えば、壊死組織）の生検）または病原体に感染した細胞型に由来する。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスは、典型的には、肝細胞のみに感染するので、損傷細胞（すなわち、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞）は、組織（すなわち、肝臓）に由来する。同様に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、典型的には、ＣＤ４+Ｔ細胞およびマクロファージのみに感染するので、損傷細胞（例えば、ＨＩＶに感染したＣＤ４+Ｔ細胞）は、組織（すなわち、血液または骨髄）に由来する。
【００９１】
いくつかの限定された状況では、ウイルス感染により細胞が癌になり得ることに留意のこと。例えば、いくつかのＢ細胞は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に感染した場合、癌になる。このような新生物性Ｂ細胞は、ウイルス感染によって損傷を受けているにもかかわらず、本明細書中では「新生物細胞」に含まれる。
【００９２】
本明細書中で使用される、「新生物細胞」は、細胞成長の増大などの異常な細胞成長を示す細胞である。新生物細胞は、過形成細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長の接触阻害を欠く細胞）、ｉｎ ｖｉｖｏで転移することができない腫瘍細胞、またはｉｎ ｖｉｖｏで転移することができる癌細胞であり得る。新生物細胞の制限されない例には、黒色腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽腫細胞、肝臓癌細胞、骨髄腫細胞、神経膠腫細胞、中皮腫細胞、癌腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、骨髄腫細胞、骨髄球細胞白血病細胞、Ｔリンパ芽球症候群細胞、リンパ芽球腫細胞、および胸腺腫細胞が含まれる。
【００９３】
一定の実施形態では、試験新生物細胞は、組織（例えば、過形成組織（乳房のしこり）の生検）に由来する。試験新生物細胞が由来し得る組織の非限定的な例には、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、脳、皮膚、胃腸管、眼、乳房、前立腺、および卵巣が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
本発明によれば、損傷細胞は、ヒトなどの患者に由来する。一定の実施形態では、患者は、損傷細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している。例えば、損傷細胞が病原体に感染している場合、疾患は、病原体に感染した損傷細胞の存在またはその非存在に起因する感染症である（例えば、ＨＩＶウイルスに感染したＣＤ４＋Ｔ細胞の欠如に起因するＡＩＤＳ）。
【００９５】
本発明によれば、試験新生物細胞は、ヒトなどの患者に由来する。一定の実施形態では、患者は、新生物細胞の存在に起因する疾患または障害を罹患している。例えば、新生物細胞が新生物性黒色腫細胞である場合、疾患は、黒色腫細胞の癌である（すなわち、癌は、新生物細胞の異常な細胞成長および転移に起因する黒色腫である）。
【００９６】
本明細書中で使用される、「疾患または障害を罹患した患者」は、疾患または障害の臨床徴候および／または症状を有する患者を意味する。一定の状況では、疾患または障害を有する患者は、無症候であり、且つ疾患または障害の臨床徴候を依然として有し得る。例えば、白血病患者は症候性ではない可能性があるが（例えば、調子が悪くなく、弱ってもいない可能性がある）、患者は、年齢および体重が同じ健常な個体と比較して白血球数が非常に多いという点で臨床徴候を示す。別の非限定低的な例では、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）に感染した患者は、症候性ではない可能性があるが（例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞数が減少しない可能性がある）、患者が抗ＨＩＶ抗体を有するという点で臨床徴候を示す。
【００９７】
本発明によれば、癌となったこれらの新生物細胞は、細胞表面上の全長ＨＳＣ７０タンパク質発現の増加によって正常な有核細胞と識別可能である。
【００９８】
本発明によれば、多剤耐性を示すようになった損傷細胞または新生物細胞を、多剤耐性細胞の細胞表面上の全長ＨＳＣ７０タンパク質発現の増加によって多剤耐性を示さない細胞と区別可能である。ＨＳＣ７０の代表的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１４に示す（ＧＩ５７２９８７７およびＧＩ１３９８２９７も参照のこと）。したがって、細胞成分を分離する場合、多剤耐性を示す細胞はその細胞質膜画分または原形質膜画分上にＨＳＣ７０を含む。ＨＳＣ７０タンパク質の細胞表面発現を、ＦＡＣＳ分析、細胞表面ビオチニル化およびその後の二次元ゲル、免疫沈降（実施例を参照のこと）、または固定臨床試料の免疫蛍光分析、および当業者によって実施される他の型の日常的方法などの非限定的方法によって日常的に検出することもできる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、試験損傷細胞または試験新生物細胞の表面上のＨＳＣ７０タンパク質発現レベルの測定は、試験細胞の細胞成分の画分への分離およびその後の原形質膜または細胞質膜を含む細胞画分中のＨＳＣ７０レベルの測定を含む。
【０１００】
あるいは、試験損傷細胞または試験新生物細胞の表面上のＨＳＣ７０発現レベルの測定は、試験細胞からの細胞表面発現ＨＳＣ７０タンパク質の酵素的消化生成物の分離を含む。１つの非限定的な例では、患者由来のインタクトな細胞を酵素で消化する。消化した表面曝露タンパク質由来のペプチドを、細胞の迅速なスピンによる沈殿および上清中の消化ペプチドの除去によって単離する。これらの消化ペプチドを、ＨＳＣ７０が細胞表面上に発現するかどうかを決定するための種々の方法（例えば、免疫学的方法または質量分析）によって分析することができる。
【０１０１】
任意の標準的な分離手順（薄層クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、ペーパークロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、および以下の実施例に記載の手順が含まれるが、これらに限定されない）によって、細胞成分を分離することができる。分離手順は一般的に公知である（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  １９９４を参照のこと）。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、試験損傷細胞表面上のＨＳＣ７０タンパク質発現レベルの測定は、インタクトな試験損傷細胞または試験新生物細胞とＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する検出可能な結合剤との接触を含む。したがって、検出可能な結合剤は、その細胞表面上でＨＳＣ７０を発現する細胞に特異的に結合する。
【０１０３】
本発明によれば、正常な細胞はその細胞表面上にＨＳＣ７０を全く発現しないか無視できる量で発現する一方で、新生物細胞または損傷細胞はその細胞表面上でより多くのＨＳＣ７０を発現する。さらに、このような新生物細胞または損傷細胞が多剤耐性を示すようになった場合、これらはその細胞表面上にさらにより高レベルの完全な全長ＨＳＣ７０タンパク質を発現する。ＨＳＣ７０特異的結合剤は、全タンパク質が多剤耐性新生物細胞または損傷細胞の細胞表面上で発現するので、ＨＳＣ７０タンパク質の任意の部分に特異的に結合する。
【０１０４】
勿論、ＨＳＣ７０は正常な細胞、薬物感受性新生物細胞、および薬物感受性損傷細胞の内部にも発現するので、このような正常な細胞および薬物感受性の新生物細胞または損傷細胞を最初に溶解するか、結合剤の添加前にその膜を透過処理する場合、結合剤は正常な細胞および薬物感受性の新生物細胞または損傷細胞中の細胞内ＨＳＣ７０にも結合する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、その細胞表面上にＨＳＣ７０を発現するＭＤＲ新生物細胞またはＭＤＲ損傷細胞は、ＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞が、新生物細胞または損傷細胞の起源組織由来の正常細胞よりも少なくとも２倍のレベルまたは起源組織由来の薬物感受性新生物細胞または損傷細胞よりも少なくとも２倍のレベルでその細胞表面上に全長ＨＳＣ７０タンパク質を発現するという点で、他の細胞型と識別可能である。例えば、白血病性Ｔ細胞は、正常なＴ細胞よりもその細胞表面上に多くのＨＳＣ７０を発現する。さらに、下記のように、ＭＤＲ白血病性Ｔ細胞は、多剤耐性を示さない白血病性Ｔ細胞よりもその細胞表面上に少なくとも２倍のＨＳＣ７０を発現する。同様に、以下の実施例に記載のように、ＭＤＲ乳癌細胞は、その薬物感受性対照物（すなわち、薬物感受性対照物は多剤耐性ではない）としてその細胞表面上に少なくとも２倍のＨＳＣ７０を発現する。このような細胞の細胞成分を（例えば、膜画分およびサイトゾル画分に）分離する場合、非多剤耐性細胞が正常細胞、新生物細胞、または損傷細胞のいずれであるかに関係なく、その細胞表面にＨＳＣ７０を発現するＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞は、その膜画分中に多剤耐性を示さない同一の組織由来の他の細胞よりも２倍またはそれ以上のレベルのＨＳＣ７０を含む。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤を提供する。本明細書中で使用される、「特異的に結合する」は、結合剤（例えば、抗体）がＨＳＣ７０タンパク質を認識して結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識して結合しないことを意味する。したがって、本発明のこのような結合剤は、その細胞表面上でＨＳＣ７０を発現するＭＤＲ細胞表面に結合する。ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する有用な結合剤は、水中、生理学的条件下、またはイオン強度に関して近似する条件下（例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）で、少なくとも１０6Ｍ-1、少なくとも１０7Ｍ-1、少なくとも１０8Ｍ-1、または少なくとも１０9Ｍ-1、の親和性でＨＳＣ７０タンパク質と会合する。
【０１０７】
「結合剤」は、ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する限り、いかなる特定のサイズもいかなる特定の構造も有する必要はない。したがって、「結合剤」は、ＨＳＣ７０タンパク質に優先的に結合する限り、任意の領域（例えば、三次元構造、アミノ酸配列、または特定の小化学基）に結合する分子である。結合剤の非限定的な例には、天然リガンド（ホルモンまたはＧＴＰなど）、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、およびホルモンなどのタンパク質、抗体、およびその一部が含まれる。典型的には、結合剤がエピトープに特異的に結合する能力は、高相補性構造に基づく。すなわち、結合剤の形状は、結合剤が特異的に結合する抗原上の一部に相補的な構造を含む。抗体が結合する抗原部分は、「エピトープ」と呼ばれる。
【０１０８】
一定の実施形態では、結合剤は抗体である。ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤が抗体である場合、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作抗体、二重特異性抗体（二重特異性抗体の特異性の１つがＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する場合）、抗体フラグメント（「Ｆｖ」、「Ｆ（ａｂ’）2」、「Ｆ（ａｂ）」、および「Ｄａｂ」が含まれるが、これらに限定されない）、抗体の反応部分を示す一本鎖（「ＳＣ−ＭＡｂ」）であり得るが、これらに限定されない。抗体および他の結合剤の作製方法は周知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ，１９９１；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｍａｒｘ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：４５５−４５６，１９８５；Ｒｏｄｗｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：９９−１００，１９８９；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｂｒ．Ｊ．Ｒ１ｌｅｕｍａｔｏｌ．３０５２：３６−３９，１９９１；Ｒｅｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６，１９８８を参照のこと）。
【０１０９】
本明細書中で使用される、「検出可能に標識された」は、本発明の結合剤が検出可能な部分に作動可能に連結されることを意味する。「作動可能に連結された」は、一部が共有結合または非共有結合（例えば、イオン結合）のいずれかによって結合剤に結合することを意味する。共有結合の作製方法は公知である（一般的プロトコールについては、例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１；Ｂｕｒｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｏｒＡｍｉｎｏｐｌａｓｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ  １９９９を参照のこと）。
【０１１０】
本発明によれば、検出可能に標識された結合剤には、検出可能部分に抱合した結合剤が含まれる。別の検出可能に標識された本発明の結合剤は、一方のパートナーが結合剤であり、他方のパートナーが検出可能な標識である融合タンパク質である。検出可能に標識された結合剤のなおさらなる非限定的な例は、結合剤および第２の部分に高親和性を示す第１の部分を含む第１の融合タンパク質ならびに第２の部分および検出可能な標識を含む第２の融合タンパク質である。例えば、ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤をストレプトアビジン部分に作動可能に連結することができる。第２の融合タンパク質と結合剤−ストレプトアビジン融合タンパク質との組み合わせにより検出可能に標識された結合剤（すなわち、検出可能な標識に作動可能に連結された結合剤）が得られる場合、フルオレセイン部分に作動可能に連結されたビオチン部分を含む第２の融合タンパク質を結合剤−ストレプトアビジン融合タンパク質に添加することができる。
【０１１１】
本発明によれば、検出可能な標識は、検出することができる部分であり、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、ローダミン）、化学染料、放射性、化学発光性、磁性、常磁性、プロ磁性を示す化合物、有色性、化学発光性、および磁性を示し得る生成物を生成する酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、検出可能な標識を、医学的画像診断デバイスまたはシステムによって検出する。例えば、医学的画像診断システムがＸ線装置である場合、Ｘ線装置で検出することができる検出可能な標識は放射性標識（例えば、32Ｐ）である。結合剤は検出可能な部分に直接抱合する必要がないことに留意のこと。例えば、それ自体が検出可能な二次結合剤（例えば、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体）に特異的に結合する結合剤（例えば、マウス抗ヒトＨＳＣ７０抗体）を、検出可能部分（すなわち、ＦＩＴＣ部分）に作動可能に連結する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、試験損傷細胞表面上のＨＳＣ７０タンパク質の発現レベルの測定は、インタクトな試験損傷細胞とＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する検出可能な結合剤との接触を含む。例えば、検出可能な結合剤フルオロフォアへの作動可能な連結によって検出可能に標識される場合、フルオロフォアで染色された細胞（すなわち、結合剤に特異的に結合した細胞）を、蛍光標示式細胞分取器（実施例を参照のこと）またはスライド上に調製した臨床試料の日常的蛍光顕微鏡法によって同定することができる。
【０１１３】
検出可能部分に加えて、本発明の結合剤に作動可能に連結することができる他の非限定的な部分には、毒素（例えば、放射性同位体）、酵素、抗体（またはその一部）、細胞傷害薬、またはこれらの抱合体が含まれるが、これらに限定されない。毒素が本発明の結合剤に作動可能に連結される場合、本発明の結合剤に作動可能に連結することができる毒素の非限定的な例には、放射性同位体、ジフテリア毒素、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼ）、プロテアーゼ、分解酵素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、リシンＡ鎖またはＢ鎖、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、およびリボヌクレアーゼＡが含まれる（Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ  Ｄ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．７：８７−９５，１９９６）。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、結合剤は、免疫毒素（例えば、抗体−毒素抱合体または抗体−薬物抱合体）である。免疫毒素の非限定的な例には、抗体−アントラサイクリン抱合体（Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，欧州特許第ＥＰ０３９８３０５号）、抗体−サイトカイン抱合体（Ｇｉｌｌｅｓ  Ｓ．Ｄ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９５３９５８号）、およびモノクローナル抗体−ＰＥ抱合体（Ｒｏｆｆｌｅｒ  Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４００１−４００７，１９９１）が含まれる。
【０１１５】
さらなる態様では、本発明は、細胞傷害薬、ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤、および薬学的に許容可能なキャリアを含む治療組成物を提供する。このような薬学的に許容可能なキャリアの非限定的な例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００１（ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２）（標準的な参考書）により詳細に記載されている。一定の実施形態では、結合剤の結合は、薬物感受性または多剤耐性であるかに関係なく損傷細胞に有毒である。いくつかの実施形態では、結合剤の結合は、薬物感受性または多剤耐性であるかに関係なく新生物細胞に有毒である。一定の実施形態では、組成物の結合剤は、毒素に作動可能に連結される。
【０１１６】
治療薬の実際の調製方法は、当業者に公知であるか明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２００１（ｓｕｐｒａ）およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９５）に詳述されている。本発明の治療組成物は、投与に適切な任意の形態（錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシルの形態が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。
【０１１７】
本発明の治療組成物の細胞傷害薬は全ての細胞に細胞傷害性を示す必要はないことに留意のこと。いくつかの実施形態では、治療組成物を、損傷細胞の存在に起因する疾患を罹患した患者に投与する場合、治療組成物の細胞傷害薬は抗病原体薬または抗菌薬である。いくつかの実施形態では、損傷細胞が病原体（例えば、ウイルス、細菌、または多細胞寄生虫）に感染している場合、疾患は感染に起因する。損傷細胞が病原体に感染している場合、薬物の非限定的な例は、感染病原体によって異なるが、アシクロビル、アンフォテリシン、アンピシリン、アントラサイクリン、ｂ−ラクタム抗生物質、セファロチン、クロラムフェニコール、クロロキン（ＣＱ）、シドフォビル（ＣＤＶ）、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルコナゾール、５−フルシトシン、フルオロキノロン、フォスカーネット、ガンシクロビル、ハロファントリン、イトラコナゾール、ラミブジン、マクロライド、メフロキン、メチシリン、メトロニダゾール、ミコナゾール、ネルフィナビル、オフロキサシン、ペニシリン、プリマキン、キノリン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テイコプラニン、テルビナフィン、テトラサイクリン、バンコマイシン、ボリコナゾールが含まれ得る。このような薬物の治療有効量は、熟練した医師および薬剤師に公知である。さらに、このような情報は、薬物の製造者またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．（毎年発行）から得ることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、治療組成物を新生物細胞の存在に起因する癌を罹患した患者に投与する場合、治療組成物の細胞傷害薬は抗癌薬である。このような抗癌薬には、化学療法薬および放射線治療薬が含まれるが、これらに限定されない。このような抗癌薬の非限定基的な例には、アクチノマイシン、アドリアマイシン（ＡＲ）、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エポエチン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン（ＭＩＴＯ）、ミトーテン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タキソール、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。このような薬物の治療有効量は、熟練した医師および薬剤師に公知である。さらに、このような情報は、薬物の製造者またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．（毎年発行）から得ることができる。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、損傷細胞の存在に起因する疾患を罹患した患者の治療方法を提供する。この方法は、患者に治療有効量の薬物および治療有効量のＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、結合剤が多剤耐性を示す損傷細胞を死滅させる一方で、薬物が薬物感受性を示す損傷細胞を死滅させる。勿論、ＨＳＣ７０タンパク質は薬物感受性損傷細胞上で中程度のレベルで発現するので、いくつかの実施形態で薬物と異なる結合剤もまた薬物感受性損傷細胞を死滅させる。この方法によれば、患者は非治療患者と比較して疾患の予後が改善される。薬物および結合剤を、異なる時間に任意の順序で個別に投与するか一度に投与することができる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
【０１２０】
一定の実施形態では、患者の損傷細胞は病原体（ウイルス、細菌、または寄生虫など）に感染している。
【０１２１】
さらに別の態様では、本発明は、新生物細胞の存在に起因する疾患（例えば、癌）を罹患した患者の治療方法を提供する。この方法は、患者に治療有効量の薬物および治療有効量のＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、結合剤が多剤耐性を示す新生物細胞を死滅させる一方で、薬物が薬物感受性を示す新生物細胞を死滅させる。ＨＳＣ７０タンパク質は薬物感受性新生物細胞上で発現するので、いくつかの実施形態で薬物と異なる結合剤もまた薬物感受性新生物細胞を死滅させる。この方法によれば、患者は非治療患者と比較して疾患の予後が改善される。薬物および結合剤（例えば、抗体）を、異なる時間に任意の順序で個別に投与するか一度に投与することができる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
【０１２２】
一定の実施形態では、患者の新生物細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、骨髄腫癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、または癌腫癌細胞である。
【０１２３】
一定の実施形態では、本発明の方法によって患者に投与される結合剤は抗体である。いくつかの実施形態では、結合剤は毒素に作動可能に連結されている。このような毒素の非限定的な例を上に記載する。
【０１２４】
本明細書中で使用される、用語「治療有効量」を、損傷細胞の死滅に有効な投薬量および期間での薬物の公知の治療を示すために使用する。投与は、任意の経路（静脈内、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、眼内、膣内、直腸内、動脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。
【０１２５】
医師が決定する場合、本発明の結合剤、薬物、および／または治療組成物の用量および投薬計画は、主に、疾患または癌の症状の程度、使用薬物の型（例えば、化学療法薬、放射線療法薬、または抗生物質）、患者（例えば、患者の性別、年齢、および／または体重）、患者の病歴、治療に対する患者の応答に依存する。結合剤、薬物、および／または治療組成物の用量は、単回用量または複数回用量であり得る。複数回用量を使用する場合、投与頻度（投薬計画）は、例えば、患者、応答の型、および使用薬の型に依存する。患者によっては１週間に１回の投与が有効であり得るのに対して、毎日、１日おき、または３日おきの投与が有効であり得る場合もある。当業者は、日常的実験においてどの投与経路および投与頻度が任意の特定の症例で最も有効であるかを確認することができる。
【０１２６】
さらに別の態様では、本発明は、患者における多剤耐性細胞の検出方法を特徴とする。方法は、ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤を多剤耐性細胞を含むと疑われる患者に投与する工程と、結合剤が医学的画像診断デバイスまたはシステムによって検出可能な標識に作動可能に連結されることと、医学的画像診断デバイスまたはシステムで患者を試験する工程とを含む。本方法によれば、医学的画像診断デバイスまたはシステムにより、患者中の多剤耐性細胞の細胞表面に特異的に結合する結合剤（例えば、抗体）が検出される。
【０１２７】
このようなシステムによって検出可能な標識である場合、医学的画像診断デバイスおよびシステムは公知である。上記で考察されるように、このようなシステムおよび標識の１つの非限定的な例は、放射性標識結合剤を検出することができるＸ線装置である。医学的画像診断システムの他の非限定的な例には、（ａ）Ｘ線ベースのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、これらのテクノロジーの新規の組み合わせおよび改良型（ＰＥＴ+ＣＴ、スパイラルＣＴ、単光子放出ＣＴ（ＳＰＥＣＴ）、高分解能ＰＥＴ（マイクロＰＥＴ）、および免疫シンチグラフィ（放射性標識抗体を使用（Ｃｚｅｒｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：８９−１１２，２００２；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  ８０（１２）：２４３１−２４３５，１９９７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．２５：１４２８−１４３７，２００１；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ．１１１（５）：８９−９０，９３−６，２００２）；（ｂ）磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）（Ｈｅｌｂｉｃｈ，Ｔ．Ｈ．，Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．３４：２０８−２１９，２０００；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．２５：１４２８−１４３７，２００１；Ｎａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３０（１）：３−９，２００２）；超音波画像診断法（ＵＳ）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｃｌｉｎ．Ｒａｄｉｏｌ．５７：１５７−１７７，２００２；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．２５：１４２８−１４３７，２００１）；（ｃ）光ファイバー内視鏡（Ｓｈｅｌｈａｓｅ  Ｄ．Ｅ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１４：３２７−３３，２００２）；（ｄ）γシンチレーション検出器（γ線放出（例えば、１９２−Ｉｒ）を検出）、およびβシンチレーション検出器（β線放出（例えば、９０−Ｓｒ／Ｙ）を検出）（Ｈａｎｅｆｅｌｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：２４９３−６，２００２）が含まれる。
【０１２８】
一定の実施形態では、患者はヒトである。患者は、例えば、多剤耐性細胞の存在に起因する疾患を罹患した患者であり得る。例えば、患者は、多剤耐性新生物細胞の存在に起因する疾患を罹患した患者であり得る。このような多剤耐性新生物細胞には、卵巣癌細胞、骨髄腫癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、肉腫癌細胞、白血病癌細胞、網膜芽腫癌細胞、肝臓癌細胞、神経膠腫癌細胞、中皮腫癌細胞、または癌腫癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、多剤耐性細胞は損傷細胞であり、患者はこのような多剤耐性新生物細胞の存在に起因する疾患を罹患している。細胞が損傷し得る非限定的方法には、病原体による感染または新生物による損傷が含まれる。特定の実施形態では、損傷細胞は、病原体（例えば、ウイルス、寄生虫、または細菌）に感染している。例えば、患者は、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの多剤耐性株に起因する結核に罹患し得る。
【０１３０】
本発明の実施には、他で記載しない限り、当業者の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。
【０１３１】
ＨＳＣ７０抗体
本発明は、癌および損傷（例えば、病原体感染）細胞の検出、画像診断、および治療で使用するためのＨＳＣ７０に指向する抗体を提供する。本発明で使用される抗ＨＳＣ７０抗体はいくつかの業者から市販されている。例えば、ＣＨＥＭＩＣＯＮ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）は共にこのような抗ヒトＨＳＣ７０マウスモノクローナル抗体および／またはウサギポリクローナル抗体を製造している。
【０１３２】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、特に１つの抗ＨＳＣ７０モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにポリペプチド特異性を有する抗ＨＳＣ７０抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、およびＦｖ）および抗ＨＳＣ７０抗体組成物（結合および非結合抗体が含まれる）を対象とする。本明細書中で使用される、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得た抗体（すなわち、集団を含む各抗体は少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である）をいう。モノクローナル抗体は、特異性が高く、１つの抗原部位に指向する。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の１つの決定基に指向する。新規のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、原則的にＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡなどの全ての免疫グロブリンクラスまたはＩｇＧサブクラスなどのサブクラスもしくはその混合物を意味する。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧＭなどのＩｇＧおよびそのサブクラスが含まれる。ＩｇＧサブタイプであるＩｇＧ１／κおよびＩｇＧ２ｂ／κも実施形態として含まれる。
【０１３３】
本明細書中のモノクローナル抗体には、所望の生物活性を示す限り、種の起源または免疫グロブリンクラスまたはサブクラス名および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、およびＦｖ）と無関係に、抗ＨＳＣ７０抗体の可変ドメイン（超可変ドメインが含まれる）と定常ドメインとのスプライシング（例えば、「ヒト化」抗体）、軽鎖と重鎖とのスプライシング、またはある種由来の鎖と別の種由来の鎖とのスプライシング、異種タンパク質との融合によって産生されたハイブリッド抗体および組換え抗体が含まれる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅ ＆ Ｌａｍｏｙｉ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）。したがって、修飾「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法によって抗体が産生される必要があると解釈すべきではない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、組換えＤＮＡ法によって作製することができる（米国特許第４，８１６，５６７号）。「モノクローナル抗体」を、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用して作製したファージライブラリーから単離することもできる。
【０１３４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど）である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒトＦＲ残基に置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体や輸送されたＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。抗体の性能をさらに洗練および至適化するためにこれらの修飾を作製する。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ残基はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、少なくとも免疫グロブリン定常領域の一部（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。
【０１３５】
ＨＳＣ７０または抗ＨＳＣ７０モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、原則的に、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡなどの全ての免疫グロブリンクラスまたはＩｇＧサブクラスなどのサブクラスもしくはその混合物を意味する。ＩｇＧおよびそのサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧＭ、などである。ＩｇＧサブタイプＩｇＧ１／κおよびＩｇＧ２ｂ／κも実施形態として含まれる。言及することができるフラグメントは、哺乳動物ＨＳＣ７０に対して結合性および結合活性が高い１つまたは２つの抗原相補結合部位を有する全ての短縮または修飾抗体フラグメント（抗体に対応し、且つ軽鎖および重鎖によって形成された結合部位を有する抗体の一部（Ｆｖ、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）2フラグメント、または一本鎖フラグメントなど）など）である。短縮二本鎖フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）2などである。これらのフラグメントを、例えば、パパインまたはペプシンなどの酵素での抗体のＦｃ部分の除去による酵素的手段、化学的酸化、または抗体遺伝子の遺伝子操作によって得ることができる。遺伝子操作した非短縮フラグメントの使用も可能であり且つ有益である。抗ＨＳＣ７０抗体またはそのフラグメントを単独または混合物として使用することができる。
【０１３６】
新規の抗体、抗体フラグメント、その混合物または誘導体は、ＨＳＣ７０に対して解離定数が約１×１０-11Ｍ（０．０１ｎＭ）〜約１×１０-8Ｍ（１０ｎＭ）または約１×１０-10Ｍ（０．１ｎＭ）〜約３×１０99Ｍ（３ｎＭ）の対数範囲以内の親和性を有することが有利である。
【０１３７】
遺伝子操作のための抗体遺伝子を、例えば、当業者に公知の様式でハイブリドーマ細胞から単離することができる。この目的のために、抗体産生細胞を培養し、細胞の光学密度が十分になった時点で、チオシアン酸グアニジニウムでの細胞の溶解、酢酸ナトリウムでの酸性化、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールでの抽出、イソプロパノールでの沈殿、およびエタノールでの洗浄によって公知の様式にてｍＲＮＡを細胞から単離する。次いで、逆転写を使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成ｃＤＮＡを、例えば、部位特異的変異誘発、適切な動物、真菌、細菌、またはウイルスベクターへの挿入、逆位、欠失、または塩基交換によって直接または遺伝子操作後に挿入し、適切な宿主生物中で発現することができる。遺伝子クローニングにはｐＢＲ３２２ベクター、ｐＵＣ１８／１９ベクター、ｐＡＣＹＣ１８４ベクター、λベクターまたは酵母μベクターなどの細菌または酵母ベクターを用い、Ｅ．コリなどの細菌またはサッカロミセス・セレビシエなどの酵母で発現させることが好ましい。
【０１３８】
さらに、本発明は、ＨＳＣ７０抗体を合成する細胞に関する。これらには、上記の形質転換後の動物細胞、真菌細胞、細菌細胞、または酵母細胞が含まれる。これらは、ハイブリドーマ細胞またはトリオーマ細胞が有利であり、ハイブリドーマ細胞が好ましい。これらのハイブリドーマ細胞を、例えば、公知の様式でＨＳＣ７０で免役化した動物から産生し、その抗体産生Ｂ細胞を単離し、ＨＳＣ７０結合抗体についてこれらの細胞を選択し、その後例えばヒトまたは動物（例えば、マウス骨髄種細胞、ヒトリンパ芽球様細胞、またはヘテロハイブリドーマ細胞）にこれらの細胞を融合させるか（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９６を参照のこと）、これらの細胞に適切なウイルスを感染させて不死化細胞株を産生することができる。融合によって産生されたハイブリドーマ細胞株は特に有用であり、マウスハイブリドーマ細胞株は非常に有用である。本発明のハイブリドーマ細胞株は、ＩｇＧ型の抗体を分泌する。本発明のｍＡｂ抗体は、ＨＳＣ７０と高親和性で結合する。
【０１３９】
本発明は、さらに、好ましくはそのＨＳＣ７０結合活性を保持しながら医薬品としてのその使用に関連する１つまたは複数の他の性質（例えば、血清の安定性または産生効率）が変化したこれらの抗ＨＳＣ７０の誘導体を含む。このような抗ＨＳＣ７０抗体誘導体の例には、固体または液体キャリア（ポリエチレングリコール、ガラス、合成ポリマー（ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなど）、天然ポリマー（セルロースなど）、セファロースまたはアガロースなど）に結合した抗体の抗原結合領域由来のペプチド、ペプチド模倣物、抗体、フラグメント、もしくはペプチド、または酵素、毒素、放射性マーカー、もしくは非放射性マーカー（3Ｈ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、5lＣｒ、36Ｃｌ、57Ｃｏ、55Ｆｅ、59Ｆｅ、90Ｙ、99ｍＴｃ（テクネチウム９９の準安定性イソ型）、75Ｓｅなど）との抱合体、または蛍光／化学発光標識（ローダミン、フルオレセイン、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレサミン、金属キレート、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンなど）に共有結合した抗体、フラグメント、もしくはペプチドが含まれる。
【０１４０】
新規の抗体、その抗体フラグメント、混合物、および誘導体を、直接、乾燥後（例えば、凍結乾燥）、上記キャリアへの結合後、または薬学的調製物を産生するための他の薬学的に活性な物質および補助物質での処方後に使用することができる。列挙することができる活性物質および補助物質の例は、他の抗体、一般に抗生物質などの抗菌もしくは静菌作用を有する抗生物質活性物質、スルホンアミド、抗腫瘍薬、水、緩衝液、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、不活性賦形剤、または非経口生成物に一般的な他の物質（アミノ酸など）、増粘剤、または糖である。これらの薬学的調製物を使用して、疾患、好ましくは関節障害、有利には関節軟骨を制御する。
【０１４１】
本発明の抗ＨＳＣ７０抗体を、経口または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、または腹腔内）で投与することができる。
【０１４２】
抗体、抗体フラグメント、その混合物、または誘導体を、直接または上記の固体もしくは液体キャリア、酵素、毒素、放射性もしくは非放射性標識、または蛍光／化学発光標識への結合後に治療または診断で使用することができる。広範な種々の細胞型（特に、新生物細胞）においてＨＳＣ７０を検出することができる。本発明のヒトＨＳＣ７０モノクローナル抗体を以下のように得ることができる。当業者は、ＨＳＣ７０抗体を得るための他の等価な手順も利用可能であり、本発明に含まれることを認識する。
【０１４３】
第１に、哺乳動物をヒトＨＳＣ７０で免役化する。精製ヒトＨＳＣ７０は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｃａｔａｌｏｇ Ａ６１５２）および他の業者から市販されている。ヒトＨＳＣ７０を、ヒト胎盤組織から容易に精製することができる。さらに、高度に精製されたＨＳＣ７０免疫原を得るための免疫親和性精製方法が公知である（例えば、Ｖｌａｄｕｔｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）５：１４７−５９  Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．を参照のこと）。抗ヒトＨＳＣ７０抗体の惹起に使用される哺乳動物は制限されず、霊長類、マウス、ラット、もしくはウサギなどのげっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはイヌであり得る。
【０１４４】
次に、脾臓細胞などの抗体産生細胞を、免役化動物から取出し、骨髄腫細胞と融合する。骨髄腫細胞は、当該分野で周知である（例えば、ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、ＮＳ−１、またはＰ３Ｕ１細胞を使用することができる）。周知の従来の方法によって細胞融合を操作することができる。
【０１４５】
細胞融合操作に供した後、細胞を、ハイブリドーマを選択するためにＨＡＴ選択培地中で培養する。抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。このスクリーニングを、例えば、産生されたモノクローナル抗体をヒトＨＳＣ７０が固定されたウェルに結合させるサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）などによって行うことができる。この場合、二次抗体として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素で標識した免役化動物の免疫グロブリンに特異的な抗体を使用することができる。標識酵素とその基質との反応および発色の測定によって標識を検出することができる。基質として、３，３−ジアミノベンジジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール、４−アミノアンチピリン、またはｏ−フェニレンジアミンなどを産生することができる。
【０１４６】
上記操作によって、抗ヒトＨＳＣ７０抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。次いで、従来の限界希釈法または軟寒天法によって選択したハイブリドーマをクローン化する。所望ならば、クローン化したハイブリドーマを、血清含有培地または無血清培地を使用して大量に培養することができるか、マウスの腹腔に摂取して腹水から回収し、それによって多数のクローン化ハイブリドーマを得ることができる。
【０１４７】
選択された抗ヒトＨＳＣ７０モノクローナル抗体から、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する能力を有するものをさらなる分析および操作のために選択する。
【０１４８】
本明細書のモノクローナル抗体には、所望の生物活性を示す限り、抗ＨＳＣ７０抗体の可変ドメイン（超可変ドメインが含まれる）の定常ドメインとのスプライシング（例えば、「ヒト化」抗体）または軽鎖の重鎖とのスプライシング、またはある種由来の鎖と別の種由来の鎖とのスプライシング、異種タンパク質（種の起源または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定と無関係）ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、およびＦｖ）との融合によって産生されたハイブリッドおよび組換え抗体がさらに含まれる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅ  ＆  Ｌａｍｏｙｉ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）。
【０１４９】
したがって、用語「モノクローナル」は、得られた抗体の特徴が実質的に均一な抗体集団に由来し、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されないことを示す。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法で作製するか、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」を、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用して作製したファージライブラリーから単離することもできる。
【０１５０】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒトＦＲ残基と置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体や移入されたＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。抗体性能をさらに洗練および至適化するためにこれらの修飾を行う。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ残基はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ残基である、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部も含む。
【０１５１】
非ヒト抗体のヒト化方法は当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の抗体に移入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基を、しばしば、「移入」残基といい、典型的には「移入」可変ドメインから受け継ぐ。本質的に、対応するヒト抗体配列のげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列への置換によるＷｉｎｔｅｒａｎｄｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）にしたがってヒト化を行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、対応する非ヒト種由来の配列に置換されるインタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないキメラ抗体である。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基に置換されたヒト抗体である。
【０１５２】
ヒト化抗体の作製で使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少するために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法にしたがって、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してげっ歯類抗体の可変ドメイン配列をスクリーニングする。ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として、げっ歯類配列に最も密接なヒト配列が許容される（Ｓｉｍｓ  ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全ヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同一のフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８９：４２８５；およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
【０１５３】
抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的性質を保持する抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するために、本方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念ヒト化産物の分析プロセスによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者に周知である。選択した候補免疫グロブリン配列の可能な三次元配座構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析）が示される。この方法では、標的抗原に対する親和性の増加などの所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に対する影響に直接且つほとんど実質的に関与する。
【０１５４】
ＨＳＣ７０に指向するヒト抗体も本発明に含まれる。このような抗体を、例えば、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体産生用のヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６−９５に記載されている。例えば、ファージディスプレイ、トランスジェニックマウステクノロジー、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイテクノロジー（リボゾームディスプレイまたは共有結合ディスプレイなど）を使用したこのようなヒト抗体の特定の作製方法が記載されている（Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔａｌ．（２００３）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ８：８４５−５１；Ｍａｙｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｎａｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９−７６；ならびに米国特許第４，８３３，０７７号、同第５，８１１，５２４号、同第５，９５８，７６５号、同第６，４１３，７７１号、および同第６，５３７，８０９号を参照のこと）。
【０１５５】
現在、免疫化の際に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠損によって内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。このような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原攻撃誘発時にヒト抗体が産生される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３を参照のこと）。
【０１５６】
あるいは、ファージディスプレイテクノロジー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３）を使用して、非免役化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技術にしたがって、抗体Ｖドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージの大または小外殻タンパク質遺伝子（Ｍ１３またはｆｄなど）のいずれかにインフレームでクローン化し、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントを表示する。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によってもこれらの性質を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する。種々の形式でファージディスプレイを行うことができる（概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，３：５６４−５７１を参照のこと）。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイに使用することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８）は、免役化マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小ランダム組み合わせライブラリーから抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した。非免役化ヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリーを構築し、本質的にＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：７２５−７３４）に記載の技術にしたがって抗原の種々のアレイ（自己抗原が含まれる）に対する抗体を単離することができる。
【０１５７】
天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い比率で変異を蓄積する（体細胞超変異）。移入されたたいくつかの変化によってより高い親和性が付与され、高親和性表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が優先的に複製され、その後の抗原攻撃誘発時に分化する。この天然のプロセスを、「鎖シャフリング」として公知の技術の使用によって模倣することができる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３を参照のこと）。この方法では、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子の非免役化ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異型のレパートリー（レパートリー）への連続的置換によって改良することができる。この技術により、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントが産生される。非常に巨大なファージ抗体レパートリーの作製ストラテジーは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６）に記載されている。
【０１５８】
遺伝子シャフリングを使用して、げっ歯類抗体から出発げっ歯類抗体と類似の親和性および特異性を有するヒト抗体を誘導することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子を、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーに置換してげっ歯類−ヒトキメラを作製する。抗原の選択によって、機能的抗原結合部位を保持することができる（すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする））ヒト可変領域を単離する。残存するげっ歯類Ｖドメインを置換するためにプロセスを繰り返すとヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ を９３／０６２１３号を参照のこと）。ＣＤＲグラフティングによるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化と異なり、この技術により、げっ歯類起源のフレームワークもＣＤＲ残基も含まない完全なヒト抗体が得られる。
【０１５９】
本発明の上記モノクローナル抗体の使用により、サンプル中のヒトＨＳＣ７０を検出または定量することができる。本発明のモノクローナル抗体とヒトＨＳＣ７０との間の特異的結合反応を使用した免疫アッセイによって、サンプル中のヒトＨＳＣ７０を検出または定量することができる。種々の免疫アッセイが当該分野で周知であり、任意のこれらを使用することができる。免疫アッセイの例には、一次抗体および二次抗体としてモノクローナル抗体および別のモノクローナル抗体をそれぞれ使用するサンドイッチ法、一次抗体および二次抗体としてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するサンドイッチ法、金コロイドを使用した染色法、凝集法、ラテックス法、および化学発光が含まれる。これらのうち、詳細にはサンドイッチＥＬＩＳＡである。周知のように、この方法では、一次抗体は、例えば、ウェルの内壁に固定され、その後サンプルを固定化一次抗体と反応させる。洗浄後、二次抗体を、ウェル中に固定した抗原−抗体複合体と反応させる。洗浄後、固定化二次抗体を定量する。一次抗体として、ヒトＨＳＣ７０と特異的に反応する抗体を使用することが好ましい。
【０１６０】
二次抗体が得られる動物の免疫グロブリンに特異的な標識抗体（例えば、酵素標識抗体）と二次抗体との反応およびその後の標識の測定によって二次抗体を定量することができる。あるいは、標識（例えば、酵素標識）抗体を二次抗体として使用し、二次抗体上の標識の測定によって二次抗体を定量することができる。
【０１６１】
ＨＳＣ７０結合剤
別の態様では、本発明は、ＨＳＣ７０タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する結合剤を提供する。本明細書中で使用される、「特異的に結合する」は、結合剤がＨＳＣ７０タンパク質またはそのフラグメントを認識して結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識および結合しないことを意味する。したがって、本発明の結合剤は、その細胞表面上でＨＳＣ７０を発現するＭＤＲ細胞表面に特異的に結合する。有用な結合剤は、生理学的条件下またはイオン強度に関して生理学的条件下に近い条件下（例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）で、水中で少なくとも約１０6Ｍ−１、少なくとも約１０7Ｍ−１、少なくとも約１０8Ｍ−１、または少なくとも約１０9Ｍ−１の親和性でＨＳＣ７０タンパク質と会合する。本明細書中で使用される、「結合剤」は、ＨＳＣ７０タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合または付着する分子である。
【０１６２】
結合剤は、ＨＳＣ７０タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する限り、いかなる特定のサイズまたはいかなる特異的構造も有する必要はない。したがって、「結合剤」は、ＨＳＣ７０タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する限り、任意の領域（例えば、三次元構造、アミノ酸配列、または特定の小化学基）に特異的に結合または付着する分子である。結合剤の非限定的な例には、天然のリガンド（ホルモンまたはＧＴＰなど）、合成小分子、化学物質、核酸、ペプチド、ホルモンなどのタンパク質、抗体、およびその一部が含まれる。
【０１６３】
当該分野で公知の非抗体ＨＳＣ７０結合剤の多数の例が存在する。当該分野で公知の非抗体ＨＳＣ７０結合剤の多数の例が存在する。例えば、アルツハイマーτタンパク質（Ｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｎｏｖ．１０，２００３  ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＢＡＧ−１（Ｔａｋａｍｕｒａ ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２３：１３０１−８）、小グルタミンリッチテトラトリコペプチド反復含有タンパク質（ＳＧＴ）（Ｔｏｂａｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７７：７２５４−６０）、ロタウイルスＶＰ５タンパク質の（ａａ６４２〜６５８）（Ｚａｒａｔｅ  ｅｔａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：７２５４−６０）、オーキシリン（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６１４１−５）、および免疫抑制５−デオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５３：１７６−８０）。
【０１６４】
ＨＳＣ７０ターゲティング診断
本発明により、さらに、このようなＭＤＲ新生物細胞または損傷細胞を有する患者を早期に同定する。例えば、このような細胞を有すると同定された患者が癌寛解患者であるか癌治療を受けている場合（例えば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病などの患者）、本発明により、癌の再発および／または進行前にこれらの患者を同定し、治療計画を変更することができるように薬物での治療中にこれらの患者をモニタリングすることが可能である。同様に、このような細胞を有すると同定された患者が感染症（例えば、Ｂ型肝炎）治療を受けているか感染症治療を受けていた無症候患者である場合、本発明により、症状の復活前にこれらの患者を同定し、このようなＭＤＲ細胞が検出された場合に治療計画を変更することができるように、薬物治療中のこれらの患者をモニタリングすることが可能である。さらに、本発明の診断への適用により、細胞表面ＨＳＣ７０マーカーを使用して、新生物細胞、ＭＤＲ新生物細胞、または損傷細胞（例えば、病原体感染細胞）を早期に診断および画像診断することが可能である。
【０１６５】
本発明の診断への適用は、抗ＨＳＣ７０抗体などのＨＳＣ７０結合剤に連結するプローブおよび他の検出可能な薬剤を含む。本明細書中で使用される、用語「検出可能に検出された」は、本発明の結合剤が検出可能な部分に作動可能に連結されていることを意味する。「作動可能に連結された」は、共有結合または非共有結合（例えば、イオン結合）のいずれかによって一部が結合剤に結合していることを意味する。共有結合の作製方法は公知である（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１；Ｂｕｒｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｏｒ  Ａｍｉｎｏｐｌａｓｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ  １９９９に記載の一般的プロトコールを参照のこと）。
【０１６６】
本発明によれば、本発明の検出可能に標識された結合剤には、検出可能な部分と抱合した結合剤が含まれる。本発明の別の検出可能に標識された結合剤は、一方のパートナーが結合剤であり、且つ他方のパートナーが検出可能な標識である融合タンパク質である。検出可能に標識された結合剤のなおさらなる非限定的な例は、結合剤および第２の部分に対する親和性が高い第１の部分を含む第１の融合タンパク質および第２の部分および検出可能な標識を含む第２の融合タンパク質である。例えば、ＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する結合剤を、ストレプトアビジン部分に作動可能に連結することができる。蛍光部分に作動可能に連結されたビオチン部分を含む第２の融合タンパク質を、結合剤−ストレプトアビジン融合タンパク質に添加することができ、第２の融合タンパク質と結合剤−ストレプトアビジン融合タンパク質との組合わせにより、検出可能に標識された結合剤（すなわち、検出可能な標識に作動可能に連結された結合剤）が得られる。
【０１６７】
本発明の検出可能な標識は、追跡することができる部分であり、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、ローダミン）、化学染料、放射性、化学発光性、磁性、常磁性、プロ磁性を示す化合物、有色性、化学発光性、および磁性を示し得る生成物を生成する酵素が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、検出可能な標識は、医学的画像診断デバイスまたはシステムで検出可能である。例えば、医学的画像診断システムがＸ線装置である場合、Ｘ線装置で検出することができる検出可能な標識は放射性標識（例えば、32Ｐ）である。結合剤は検出可能な部分に直接抱合する必要がないことに留意のこと。例えば、それ自体が検出可能な二次結合剤（例えば、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体）に特異的に結合する結合剤（例えば、マウス抗ヒトＨＳＣ７０抗体）を、検出可能部分（すなわち、ＦＩＴＣ部分）に作動可能に連結する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、試験損傷細胞表面上のＨＳＣ７０タンパク質の発現レベルの測定は、インタクトな試験損傷細胞とＨＳＣ７０タンパク質に特異的に結合する検出可能な結合剤との接触を含む。例えば、検出可能な結合剤がフルオロフォアへの作動可能な連結によって検出可能に標識される場合、フルオロフォアで染色された細胞（すなわち、結合剤に特異的に結合した細胞）を、蛍光標示式細胞分取分析（実施例を参照のこと）またはスライド上に調製した臨床試料の日常的蛍光顕微鏡法よって同定することができる。
【０１６９】
このようなシステムによって検出可能な標識である場合、医学的画像診断デバイスおよびシステムは公知である。上記で考察されるように、このようなシステムおよび標識の１つの非限定的な例は、放射性標識結合剤を検出することができるＸ線装置である。医学的画像診断システムの他の非限定的な例には、（ａ）Ｘ線ベースのコンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、これらのテクノロジーの新規の組み合わせおよび改良型（ＰＥＴ+ＣＴ、スパイラルＣＴ、単光子放出ＣＴ（ＳＰＥＣＴ）、高分解能ＰＥＴ（マイクロＰＥＴ）、および免疫シンチグラフィ（放射性標識抗体を使用（Ｃｚｅｒｎｉｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｅ．Ｐｈｅｌｐｓ（２００２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５３：８９−１１２；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  ８０（１２）：２４３１−２４３５；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２５：１４２８−１４３７；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＭＬ  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｌ  ＥＧ（２００２）Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ１１１（５）：８９−９０，９３−６）；（ｂ）磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）（Ｈｅｌｂｉｃｈ，Ｔ．Ｈ，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｖ  ３４：２０８−２１９；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２５：１４２８−１４３７；Ｎａｂｉ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｚｕｂｅｌｄｉａ，Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（１）：３−９）；超音波画像診断法（ＵＳ）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｃ．Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ５７：１５７−１７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２５：１４２８−  １４３７）；（ｃ）光ファイバー内視鏡（Ｓｈｅｌｈａｓｅ  ＤＥ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １４：３２７−３３）；（ｄ）γシンチレーション検出器（γ線放出（例えば、１９２−Ｉｒ）を検出）、およびβシンチレーション検出器（β線放出（例えば、９０−Ｓｒ／Ｙ）を検出）（Ｈａｎｅｆｅｌｄ  Ｃ，Ａｍｉｒｉｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：２４９３−６，２００２）が含まれる。
【０１７０】
ＨＳＣ７０ポリペプチドに特異的に結合する標識抗体ならびにその誘導体およびアナログを診断目的で使用して、細胞表面ＨＳＣ７０の異常発現に関連する疾患および／または障害を検出、診断、またはモニタリングすることができる。本発明は、（ａ）１つまたは複数のＨＳＣ７０に特異的な抗体を使用して個体の細胞または細胞表面膜画分中の目的のポリペプチド発現をアッセイする工程と、（ｂ）前記遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現レベルとを比較し、それにより標準的な発現レベルと比較したアッセイした細胞表面ＨＳＣ７０発現レベルの増減が異常な発現の指標となることとを含む、細胞表面ＨＳＣ７０の異常な発現の検出を提供する。例えば、新生物細胞の多剤耐性を検出すべき場合、比較すべき「標準的発現レベル」は、同一または類似の起源または細胞型の非多剤耐性新生物細胞である。同様に、試験細胞中の新形成を検出すべき場合、比較すべき「標準的発現レベル」は、同一または類似の起源または細胞型の非新生物細胞である。さらに、試験細胞中の「損傷」（例えば、病原体感染）を検出すべき場合、比較すべき「標準的発現レベル」は、同一または類似の起源または細胞型の非損傷細胞（例えば、非感染細胞）である。
【０１７１】
癌に関して、個体由来の生検組織または試験細胞中の比較的大量の細胞表面ＨＳＣ７０の存在は、疾患発症の素因を示し得るか、実際の臨床症状の出現前の疾患の検出手段を提供することができる。この型のより確実な診断により、医療従事者が予防措置またはより早期の積極的な治療を使用して癌の発症またはさらなる進行を防止可能である。
【０１７２】
当業者に公知の古典的免疫組織学的方法を使用して生体サンプル中のタンパク質レベルをアッセイするために、本発明の抗体を使用することができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６を参照のこと）。ＨＳＣ７０タンパク質発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイが含まれる。適切な抗体アッセイ標識は当該分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ）などの放射性同位体；ルミノールなどの発光標識；フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識；およびビオチンが含まれる。
【０１７３】
本発明の１つの態様は、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物中の細胞表面ＨＳＣ７０の異常な発現に関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態では、診断は、ａ）有効量の標識抗ＨＳＣ７０抗体または動物中の細胞表面ＨＳＣ７０に特異的に結合する他のＨＳＣ７０結合剤を被験体に投与する（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）工程と、ｂ）ポリペプチドが発現された被験体中の部位で標識分子を優先的に濃縮する（そして非標識分子をバックグラウンドレベルに除去する）ために投与後に一定間隔を置く工程と、ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程と、ｄ）被験体中の標識分子を検出する工程と、バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出は、被験体が目的のポリペプチドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを示すこととを含む。種々の方法（検出された標識分子の量と特定の系について以前に決定された標準値との比較が含まれる）によってバックグラウンドレベルを決定することができる。
【０１７４】
放射性同位体（例えば、131Ｉ、111Ｉ、99mＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質などの適切な検出可能な画像診断部分で標識したＨＳＣ７０特異的抗体または抗体部分を障害を試験すべき哺乳動物に移入する（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）。一般に、画像診断および検出に適切な放射性同位体には、α線、β線、またはγ線を放出する放射性同位体が含まれる。γ線は、特に現在のテクノロジーを使用して容易に画像診断することができる。例は、ガリウム、インジウム、テクネチウム、イットリウム、イッテルビウム、レニウム、白金、タリウム、およびアスタチン由来の放射性同位体（例えば、67Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、90Ｙ、86Ｙ、169Ｙｂ、188Ｒｅ、195mＰｔ、201Ｔｉ、および211Ａｔ）である。被験体のサイズおよび使用画像診断システムによって診断画像の作製に必要な画像診断部分の量が決定されることが当該分野で理解される。ヒト被験体のための放射性同位体部分の場合、９９ｍＴｃの注入した放射線量は、通常は約５から２０ミリキュリーまでの範囲である。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、細胞表面ＨＳＣ７０タンパク質を発現する細胞の位置で優先的に蓄積される。ｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、ｉｎ ｓｉｔｕ）での腫瘍画像診断のための試薬および方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）"Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．"（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に記載されている。例えば、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）αタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ画像診断のための抗体標識またはマーカーには、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲで検出可能なものが含まれる。Ｘ撮影法のための適切な標識には、検出可能な放射線を放射するが被験体に明らかに有害ではないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーには、関連ハイブリドーマのための栄養素の標識によって抗体に組み込むことができるデュートリウムなどの検出可能な特徴的スピンを有するものが含まれる。
【０１７５】
通常業務を使用して至適化することができるいくつかの可変要因（使用標識の型および投与様式が含まれる）に依存して、被験体中の部位で標識分子を優先的に濃縮するためおよび非標識分子をバックグラウンドレベルに除去するための投与後の時間間隔は、６時間〜４８時間、６時間〜２４時間、または６時間〜１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５日〜２０日または５日〜１０日である。
【０１７６】
一定の実施形態では、例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、または最初の診断から１年後などの疾患または障害の診断方法の繰り返しによって疾患または障害のモニタリングを行う。
【０１７７】
有意には、ｉｎ ｖｉｖｏスキャニングのための当該分野で公知の方法を使用して、患者中の標識抗ＨＳＣ７０抗体または他のＨＳＣ７０結合の存在を検出することができる。これらの方法は、使用標識の型に依存する。当業者は、特定の標識の適切な検出方法を決定することができる。本発明の診断方法で使用することができる方法およびデバイスには、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）、および超音波検査法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
例えば、特定の実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体を、放射性同位体で標識し、放射線応答性手術装置を使用して患者中で検出する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５４４１，０５０号）。別の実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体を蛍光化合物で標識し、蛍光反応スキャニング装置を使用して患者中で検出する。別の実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体を陽電子放出金属で標識し、陽電子放出断層撮影法を使用して患者中で検出する。なおさらに別の実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体を常磁性体標識で標識し、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。
【０１７９】
ＨＳＣ７０ターゲティング療法
本発明は、ＨＳＣ７０タンパク質細胞表面マーカーは体内の正常細胞の表面上に無視できるレベルでのみ存在するが、新生物細胞、正確には、多剤耐性新生物細胞の細胞表面上に存在するという事実を巧みに利用する。対照的に、他のマーカー、特にＰ−糖タンパク質および多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）などのＭＤＲマーカーは、多数の異なる正常細胞および組織の表面上に種々のレベルで存在する（肝臓、腎臓、幹細胞、および血液脳関門上皮細胞の表面上での高レベルでの存在が含まれる）。したがって、本発明は、細胞表面ＨＳＣ７０に結合する結合剤を使用した治療薬の新生物細胞、特に多剤耐性新生物細胞の特異性の高いターゲティングを提供する。
【０１８０】
本発明の方法によってＨＳＣ７０にターゲティングすべき治療薬には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロローダミ ン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
抗ＨＳＣ７０抗体
１つのアプローチでは、損傷細胞（例えば、病原体感染）、新生物細胞、およびＭＤＲ新生物細胞上で発現する細胞表面発現ＨＳＣ７０に特異的な抗ＨＳＣ７０抗体を、癌患者に全身投与する。腫瘍細胞への抗体の接着は、補体系の活性化（補体媒介細胞傷害性）またはＴ細胞の活性化（抗体依存性細胞媒介細胞傷害性）によって細胞を死滅させる。他の抗体誘導抗腫瘍効果には、アポトーシスの誘導、第２の薬剤（例えば、抗癌化学療法薬）の細胞傷害効果の増強、および抗イディオタイプネットワーク応答の誘導が含まれる。一定の実施形態では、ヒト化抗ＨＳＣ７０抗体を使用することができる。ヒト化抗体により、ヒト患者が抗動物（例えば、抗マウスまたは抗ラット）抗体を産生する潜在的問題が回避される。ヒト抗体からなるヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の相補性決定領域を含む。
【０１８２】
多数の症例で抗体ベースの療法が首尾よく使用されている。例えば、リツキシマブは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（若年者および高齢者の両方が罹患する比較的一般的な悪性腫瘍）を治療するために使用される遺伝子操作されたモノクローナル抗ＣＤ２０抗体である。典型的にはこれらのＢリンパ腫上に存在するＣＤ２０抗原は、形質細胞、Ｂ細胞前駆体、幹細胞、または樹状細胞（抗原提示細胞）上に存在しないので、理想的なターゲティング抗原として役立つ。リツキシマブ抗体（またはリツキサン）は、ＮＨＬ細胞によって放出も内在化もされず、抗原結合後に修飾されない。リツキサンは、再発性または難治性ＣＤ２０陽性Ｂ細胞ＮＨＬおよび低悪性度または濾胞性リンパ腫の治療用として１９９７年にＦＤＡで承認された（Ａｂｏｕ−Ｊａｗｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．２５：２１２１−３７；およびＫｉｍ（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１８６：２６４−６８を参照のこと）。これは、抗体依存細胞傷害性の媒介、細胞成長の阻害、毒素および化学療法薬に対する化学抵抗性細胞の感作、および用量依存様式でのアポトーシスの誘導によって機能する（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５２：１２５−４５；Ｐｒｅｓｓ（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（Ｓｕｐｐｌ  １４）：５８−６５）。
【０１８３】
抗腫瘍抗原抗体療法の別の例はアレムツズマブである。アレムツズマブは、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者、流行形態の成人悪性腫瘍患者の治療用として２００１年にＦＤＡで承認されたヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体である（Ａｂｏｕ−Ｊａｗｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．２５：２１２１−３７を参照のこと）。ＣＤ２５機能が十分に同定されていないにもかかわらず、アレムツズマブは巨大病変の存在下でさえも腫瘍応答を誘発することが示されている（Ｆｅｒｒａｊｏｌｉ  ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１０５９−１０６５）。
【０１８４】
抗腫瘍抗原抗体療法のさらに別の例は、トラツズマブ（ヘルセプチン）（転移性乳癌の治療用として１９９８年にＦＤＡで承認された組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）である（Ａｂｏｕ−Ｊａｗｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．２５：２１２１−３７；およびＫｉｍ（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｓ．１８６：２６４−６８を参照のこと）。ＨＥＲ２は、多数の乳癌によって発現される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーであるので、この抗体療法は充実性腫瘍に有効である。いくつかの無作為化比較研究を行い、トラツズマブで治療したＨＥＲ２陽性乳癌患者の生活の質に有効性および改善が認められた（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：７１９−２６）。
【０１８５】
最後に、セツキシマブは、いくつかのＨＥＲ１／ｅｒｂ−Ｂ１発現充実性腫瘍（直腸結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、および頭頸部癌が含まれる）の治療に有効なキメラ抗ＨＥＲ１モノクローナル抗体である（例えば、Ｏ’ｄｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（Ｓｕｐｐｌ．１４）：１０−１７を参照のこと）。セツキシマブは、ＥＧＦＲ結合を競合し、内在化の刺激およびそれによる増殖成長および転移を担う細胞プロセスの破壊によって細胞膜から受容体を除去する（Ａｂｏｕ−Ｊａｗｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．２５：２１２１−３７を参照のこと）。
【０１８６】
（ＨＳＣ７０ターゲティング抗体およびリガンド抱合体）上記の「裸の（ｎａｋｅｄ）」抗体アプローチに加えて、抗体を、生物毒もしくは化学毒または放射性同位体に抱合するか「作動可能に」連結することができる。抗ＨＳＣ７０抗体またはその抗体フラグメントを、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制薬または細胞破壊薬）、治療薬、または放射性金属イオンなどの治療部分と抱合するか作動可能に連結することができる。「作動可能に連結された」は、共有結合または非共有結合（例えば、疎水性結合またはイオン結合）のいずれかによって治療部分を結合剤に結合することを意味する。共有結合の作製方法は公知である（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１；Ｂｕｒｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｏｒＡｍｉｎｏｐｌａｓｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ  １９９９に記載の一般的プロトコールを参照のこと）。全身投与後、抗体によって治療を癌細胞（またはＭＤＲ癌細胞）または損傷（例えば、病原体感染）細胞にターゲティングする。
【０１８７】
本発明は、さらに、ＨＳＣ７０ターゲティングエレメントおよび毒物（生物毒素、化学毒素、または放射性同位体など）から作製されたＨＳＣ７０ターゲティング薬を含む。細胞毒素または細胞傷害薬には、細胞に有毒な任意の薬剤が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそのアナログまたはホモログが含まれる。生物毒素は、抗体および他の腫瘍マーカー局在化薬に抱合されているかインフレームで遺伝的に融合されている。これらの生物毒素には、リシン、ジフテリア毒素、およびシュードモナス外毒素が含まれる。細胞表面ＨＳＣ７０への結合後、一般に、毒素は細胞膜を通過し、その後プロセシングされてターゲティングした細胞を死滅させることができる。毒作用は、典型的には、活性生物毒素によるタンパク質合成の阻害に起因する。
【０１８８】
例えば、１つの実施形態では、抗ＨＳＣ７０抗体を、コブラ毒因子に抱合する。本発明によれば、コブラ毒因子に抱合したＨＳＣ７０特異的抗体を使用して、癌（特に、ヒトの多剤耐性癌が含まれる）を治療する。コブラ毒因子への抗体の抱合方法は、米国特許第５，７７３，２４３号に教示されている。いくつかの実施形態によれば、結合剤は、免疫毒素（例えば、抗体−毒素抱合体または抗体−薬物抱合体）である。免疫毒素の非限定的な例には、抗体−アントラサイクリン抱合体（Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第ＥＰ０３９８３０５号）、抗体−サイトカイン抱合体（Ｇｉｌｌｅｓ  Ｓ．Ｄ．，ＰＣＴ  公開番号ＷＯ９９５３９５８号）、およびモノクローナル抗体−ＰＥ抱合体（Ｒｏｆｆｌｅｒ  Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４００１−４００７，１９９１）が含まれる。
【０１８９】
抗体への他の治療部分の抱合技術は当該分野で周知である（例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ"，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ"，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；"Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），およびＴｈｏｒｐｅｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ"，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。あるいは、Ｓｅｇａｌに付与された米国特許大４，６７６，９８０号（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、抗体を二次抗体に抱合して抗体ヘテロ抱合体を形成することができる。
【０１９０】
薬物結合
薬物および治療薬の結合および放出に対する多数のアプローチが文献に記載されており、可溶性ポリマー−薬物抱合体で使用されるストラテジーが最近概説された（Ｓｏｙｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９６６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２１：  ８１−１０６）。多数のこれらの抱合方法の化学（抗体の結合部位）は、テキストブックに記載されている（例えば、Ｒｅｆ．Ｗｏｎｇ（１９９１）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。
【０１９１】
最も使用されている部位は、反応性チオール基を導入することができるカルボジイミドなどのアミド結合形成試薬またはＮ−スクシニミジル１−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性薬（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１７３：７２３−７３７）による化学的使用に都合がよいリジン残基のε−アミノ基部位である。抗体は、抗体全体に広がった種々の数のリジン残基を有し、より反応性の高い残基の任意のサブセットについては明らかではない。その結果、活性部位のリジン残基は抗体活性を喪失させる任意の他の残基で修飾される可能性が高く、修飾リジン残基数が多いほど結合喪失の可能性が高くなる。リジンε−アミノ基への結合は他の効果も有し得る。最初のタンパク質上の正電荷の中和によって構造に影響を与えることができるか、抗体の溶解性に影響を与えることができるが（Ｈｕｄｅｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１：１９７−２０４）、電荷を変えることなくチオール官能性を提供する２−イミノチオランなどの試薬の使用によってこれを克服することができる（Ｊｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：５３９９−５４０６）。最後に、修飾リジン残基数は統計に基づくので、残基の修飾範囲は抗体分子集団内で得られ、単一の調製物中の薬物結合量および結合活性の喪失量が様々となる（Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＢＲ９６−  Ｄｏｘ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３９：２５１−２５９）。
【０１９２】
第２の修飾部位は、抗体のヒンジ領域に結合する糖残基である。これは抗体結合部位から離れて存在する固有の化学反応部位であるので、これは結合に有用な領域である。これは、多数のカップリング手順で使用することができるアルデヒド基を得るための糖の過ヨウ素酸塩酸化によっていくつかのグループで利用されている（Ｏ’Ｓｈａｎｅｓｓｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：２７３−２７７；Ｏ’Ｓｈａｎｅｓｓｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９９：１５３−１６１；ａｎｄ  Ｒｏｄｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２６３２−２６３６）。ノイラミニダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含む酵素反応によって、免疫グロブリン上でアルデヒド基を作製することもできる（Ｒｏｄｗｅｌｌ，ｅｔａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２６３２−２６３６およびＳｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１１５−１２１）。抗体は、キャリア−薬物分子の結合のためにより好ましく位置づけられると報告されている新規のオリゴサッカリド部位を産生するための遺伝子工学によっても修飾されている（Ｑｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１３：１３１−１４４）。
【０１９３】
第３の主要な結合可能性は、抗体内の内部ジスルフィド結合によるものである。ジスルフィド結合は、鎖間および鎖内結合の両方が得られる抗体の構造で重要な役割を果たす。抗体ドメイン構造を安定化する鎖内結合を、ジチオスレイトールにて抗体鎖を相互に保持する鎖間ジスルフィドに影響を与えることなく選択的に切断することができる。この手順は、より良好な結合活性を有し、且つ１抗体分子あたりの所定数の薬物を有するより溶解性の高い抱合体を得るために（Ｗｉｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：５２１−５２７）によって利用されている。驚いたことに、この手順は、抗体の安定性および免疫反応性に検出可能な影響を与えなかった。抗体サブクラスに依存して利用することができる最大数の鎖内ジスルフィド部位が存在する。分岐鎖ヒドラゾンリンカーは、化学結合することができる薬物分子数の倍増によってこの結合部位をさらに利用することも記載されていなかった（Ｋｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：２７９−２８８）。
【０１９４】
抗体フラグメントは、多くの薬物ターゲティング研究でも使用されている。抱合の観点から、薬物または他の高分子への結合に容易に使用することができる１つの遊離スルフヒドリル基を保有するＦａｂ’フラグメントは特に都合がよい（Ｈａｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３）。
【０１９５】
最も簡単な結合方法の１つは、カルボジイミドなどのペプチド結合形成試薬またはメトトレキセート（ＭＴＸ）などのカルボキシル含有薬の結合に使用されている活性エステルの使用である。ポリリジン抱合体を使用した初期の研究は、生分解性ＭＴＸ−ポリ（−L−リジン）はいくらか細胞傷害性を示すが、ＭＴＸ−ポリ（−D−リジン）は無毒であり、ポリマーの切断によって遊離薬物が放出されたことが示唆されることが示された（Ｒｙｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  ４５：１２０７−１２１１）。その場合には、本発明者らもアルブミンおよび免疫グロブリンなどの生体分子が切断されて遊離の薬物を放出すると予想する。この原理を使用したＭＴＸ−免疫グロブリン（Ｋａｎｅｌｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７５：３１９−３３２）およびＭＴＸ−ＨＳＡ−免疫グロブリン（Ｇａｒｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３１：６６１−６７０）抱合体が報告されている。これらの反応は、単一の生成物を手際よく生成せず、不安定なエステル結合および安定なアミド結合の混合物が形成される（Ｅｎｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：３３３０−３３３５およびＨｕｄｅｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６：１２８−１３２）。エステル結合材料は、２４％までの抱合薬物を形成することができ、４℃で２０日間にわたる保存中の加水分解によって抱合体から段階的に放出される（Ｈｕｄｅｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６：１２８−１３２）。塩化アンモニウムならびにリソソームプロテアーゼインヒビターであるロイペプチンおよびＥ６４による抱合体細胞傷害性の阻害（Ｇａｒｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：３−１２）により、リソソーム区画における分解によって遊離薬物が放出されることが示唆される。しかし、ＨＳＡ−ＭＴＸ抱合体からのＭＴＸの放出に関する詳細な研究（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １０：１１−２４）は、ラット肝臓トリトソーム（ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）によって放出される低分子量薬物量は非常に少ない（５５時間で５．６％）ことを示した。さらに、放出材料のたった約１０％が遊離ＭＴＸであり、アミノ酸である残りは酵素によって薬物から容易に切断されず、未修飾メトトレキセートよりも細胞傷害性が有意に低い（Ｒｏｓｏｗｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：８８８−８９３）。これらのＭＴＸのアミノ酸誘導体を放出するようにデザインした抱合体も遊離ＭＴＸ放出抱合体よりも細胞傷害性が低かった。抗体−ＭＴＸ抱合体からのＭＴＸおよびＭＴＸ誘導体の放出はより低く、同期間で０．０５％未満と評価され、これはメトトレキセートの低置換率（Ｒｏｓｏｗｓｋｙ，ｅｔａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：８８８−８９３）およびトリトソームによる抗体のＦａｂ領域の低分解性（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８８��３８０−３８７）の両方に寄与する。したがって、抱合体から遊離薬物を特異的に放出するリンカーは、ターゲティングした薬物抱合体の重要な成分である。種々の結合型が報告されている。
【０１９６】
アルデヒド／シッフ塩基結合を使用して、治療薬と抗体または他の局在化薬と結合することもできる。近接水酸基を有する糖残基を、過ヨウ素酸塩での酸化によってアルデヒド基に変換することができる（Ｏ’Ｓｈａｎｅｓｓｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：２７３−２７７）。これにより、デキストランなどのポリサッカリド中の糖残基もしくは薬物中の糖部分（例えば、フルオロウリジン中のヌクレオチド糖基）またはダウノルビシン中のアミノ糖により有用なアルデヒド基を挿入することができる。アルデヒドは、ヒドラジドと容易に反応してヒドラゾンを形成するか、アミンと反応してシッフ塩基を形成する。シッフ塩基自体は比較的安定であり（Ｃｏｒｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２８４３−２８４８）、その出発材料を再形成することができるので、通常は結合を安定化するために水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノボロ水素化ナトリウムなどの試薬で還元する。グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドを使用して、薬物と高分子の間または高分子間を架橋することもできるが、この場合、生成物の結合は通常不可逆的である（Ｗｏｎｇ，（１９９１）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １０１−１０２）。架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用は、ホモ二官能性試薬であり、望ましくない架橋および凝集を容易に引き起こし得るという不都合もある。
【０１９７】
スルフヒドリル結合を使用して、治療薬と抗体または他の局在化薬を結合することもできる。ジスルフィド結合は植物毒素鎖を連結することが見出されており、その活性に不可欠であので（Ｍａｓｕｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：１５８３−１５９１）、酵素Ａ鎖が結合鎖から解離して原形質に侵入することができる。この結合の必要性により、これは、細胞内区画中の抗体またはポリマー分子から薬物を放出させることが可能な方法であることが示唆される。ジスルフィド結合を介したメトトレキセートとポリ（D−リジン）との抱合は細胞傷害性であることが示された（Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０９０５−１０９０８）。これらの抱合体の切断は、細胞表面で最初に起こることが示されたが、エンドソームまたはリソソーム区画内で起こらなかった（Ｆｅｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８７８０−１８７８５）。ゴルジ装置が切断部位である可能性が最も高いことが示唆された。細胞内で切断可能であるにもかかわらず、この結合は、循環時に不安定であることが示されているので、この問題を軽減するためにジスルフィド結合が阻止されている（Ｔｈｏｒｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１およびＷｏｒｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：１７９−１８８）。抱合体について、スルフヒドリル基を介した安定な化学的に都合がよいカップリングが必要な場合、チオエーテル結合がより安定であり、マレイミド（Ｈａｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３およびＬａｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：１２９９−１３０４）またはヨードアセテート（Ｒｅｃｔｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：３２１−３３６）カップリング剤の使用によって生成することができる。
【０１９８】
酸不安定性結合を使用して、治療薬と抗体または他の局在化薬とを結合することもできる。化学的に不安定な結合を使用して、より酸性度の高い条件下で薬物を放出させることができる。これらの条件は、健康な組織および血液よりも０．５〜１のｐＨ単位でより酸性度が高いことが報告されている腫瘍条件下（Ｌａｖｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ．３３：２２３−２３０およびＡｓｈｂｙ（１９６６）Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ：３１２−３１５）またはエンドソーム／リソソーム区画の通過時（それぞれｐＨ６〜６．８および４．５〜５．５）のいずれかで起こり得る。酸不安定性結合使用の主な欠点は、切断速度がｐＨに比例し、各ｐＨ単位の減少によって速度が１０倍異なると予想することができる速度依存性現象であることである。これは、加水分解が常に細胞内区画中の低ｐＨでの高速と血清安定性のための低速との間の妥協であることを意味する。
【０１９９】
記載の第１の酸感受性リンカーは、Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｒｙｓｅｒ（Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４）によって記載されたシス−アコニチル結合であった。ダウノルビシンが最初に無水シス−アコニット酸と反応し、その後水溶性カルボジイミドを使用してポリリジンとカップリングした。この結合の半減期は、ｐＨ４で３時間未満であり、ｐＨ６で９６時間超であることが報告された。しかし、約５０％の薬物しかａｆｆｉ−ｇｅｌマトリクスから放出されなかった。これは、ゲルマトリクスとこのリンカーからの酸感受性放出を担う残存シス−カルボキシル基との不適切な結合に起因し得る。この試薬の至適使用条件は、（Ｈｕｄｅｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１：１９７−２０４）に詳細に記載されている。毒素分子のカップリングのためのヘテロ二官能性薬としてのこの放出機構の改良バージョンも（Ｂｌａｔｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：１５１７−１５２４）に記載されている。この方法では、シス−アコニット酸塩の第３のカルボキシルを介した抱合を、シス−カルボニル基の酸放出特性の不活化の可能性を排除する特定のマレイミド基に置換した。
【０２００】
オルトエステル、アセタール、およびケタールに基づいた毒素免疫抱合体を酸感受性放出させるように最初に調製した酸感受性ホモ−およびヘテロ二官能性薬の範囲は、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｃｈａｒによって記載されている（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｃｈｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：２５０１−２５０９）。これらはまた、潜在的に化学免疫抱合体の構築に有用であり得る。これらの試薬は、細胞内区画中で見出されるｐＨでのその加水分解速度が変化する。ヒドラゾン結合を使用して、抗体または他の局在化薬へ治療薬を結合することもできる。
【０２０１】
ヒドラジド誘導体も酸不安定性であり、ビンデシン抱合体およびアドリアマイシン抱合体の両方の生成に使用されている（Ｌａｇｕｚｚａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２：５４８−５５５およびＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６６００−６６０７）。前者では（Ｌａｇｕｚｚａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２：５４８−５５５）、ビンデシンをヒドラジンと最初に反応させ、その後ヒドラジド誘導体を抗体の酸化糖残基と反応させる。アドリアマイシン抱合体では（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６６００−６６０７）、チオール化抗体と反応させたＳＰＤＰヒドラジン誘導体を調製した。これらの両抱合体では、酸性条件下で低分子量の薬物が放出された。前者の場合、３７℃で７日間にわたりｐＨ５．３では約３０％までのビンカヒドラジドが放出され、後者の場合、ｐＨ４．５〜５．５で未修飾アドリアマイシンが抱合体から急速に放出された。種々のリンカーの酸不安定性が、アシルヒドラジン＞セミカルバジド＞カルボン酸ジヒドラジド＞チオセミカルバジド＞カルボン酸ヒドラジン＝アリールヒドラジド（全て唯一の生成物としてアドリアマイシンを放出する）であることを示す、アドリアマイシンの異なるヒドラゾン誘導体研究が報告されている（Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２：１３３−１４１）。アリールヒドラジドを除いて、全てのこれらの化合物は、ｐＨ７．４で安定であった。アシルヒドラジドは、ｐＨ５．０、３７℃、３時間で理論薬物量の８５％を放出し、抗トランスフェリン受容体抗体に抱合した場合、遊離アドリアマイシンの細胞傷害性に近似した。血清中でより安定であり、且つ抗体中の還元鎖内ジスルフィド基に容易に結合することができるチオエーテル結合抱合体を得るために、マレイミドカプロイルヒドラゾン誘導体も合成した（Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＢＲ９６−Ｄｏｘ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３９：２５１−２５９）。アントラサイクリンの抱合のためのさらなる長鎖アリールヒドラジドリンカーは、（Ｌａｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：１２９９−１３０４）によって記載されている。
【０２０２】
酵素分解性リンカーを使用して、抗体または他の局在化薬に治療薬を結合することもできる。結合および高分子からの薬物放出の判断基準は、血清中で安定であるが特定の酵素で細胞内切断することができるリンカーである。種々のアミノ酸を含むこのリンカー型が記載されている。これらのリンカーのうちのいくつかは、ターゲティングされた抗体との薬物抱合体で使用されているが、その他はポリマー−薬物抱合体のみで使用されている。ダウノルビシン（Ｄａｕ）の切断可能なアミノ酸プロドラッグは、Ｌｅｖｉｎ ａｎｄ Ｓｅｌａ（Ｌｅｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．９８：１１９−１２２）によって最初に生成されたが、これらは低分子量プロドラッグと命名された。リソソーム消化についてのアミノ酸の配列および長さを調査した第１の系統的研究が、（Ｍａｓｑｕｅｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１１６６−１１７０）によって報告された。これらの研究により、２時間のリソソーム加水分解酵素によって元の遊離薬物に変換することができるＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｄａｕ誘導体が同定された。活性は、リソソームジペプチドであるアミノペプチドに起因した。これらのジペプチド誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤａｕよりもさらに強力でなく、これらはｉｎ ｖｉｖｏでより強力な有効性を示した（Ｂａｕｒａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１１７１−１１７４）。このグループによって報告されたさらなる研究（Ｔｒｏｕｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６２６−６２９）により、１〜４つのアミノ酸のスペーサーアームによってダウノルビシンがスクシニル化血清アルブミンに結合した抱合体が得られた。最小トリまたはペプチドスペーサーは、良好な薬物放出に不可欠であることが見出された。血清の存在下で安定なＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄａｕ結合を有するアルブミン抱合体（２４時間で２．５％しか薬物を放出しない）を使用して、８時間で７５％の遊離薬物が放出された。リソソーム酵素によってペプチドスペーサーを含まないスクシニル化血清アルブミンと抱合したＤａｕから薬物は放出されなかった。
【０２０３】
別のテトラペプチド治療スペーサーは、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］コポリマーからのモデル薬物としてのｐ−ニトロアニリンの放出を調査したＤｕｎｃａｎとＫｏｐｅｃｅｋの長期共同研究に由来した（Ｄｕｎｃａｎ（Ｄｕｎｃａｎ，（１９８６）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔ．２：１２７−１４５））に記載）。これらの研究により、リソソーム酵素の特異性および５０時間のインキュベーションにわたり８０％の結合ｐ−ニトロアニリンが放出されるＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｄａｕリンカーの開発がより深く理解された。その後、抗体キャリア薬物抱合体としてダウノルビシンをポリマー送達系に結合させた（Ｄｕｎｃａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：１６５−１７４）。
【０２０４】
（Ｕｍｅｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：６７７−６８４）によってテトラペプチドスペーサーをモノクローナル抗体−メトトレキセート抱合体に組み込んだ。これは、Ｔｒｏｕｅｔによって記載されたテトラペプチドベースのＭＴＸ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ヒドラジドリンカーである。しかし、Ｔｒｏｕｅｔの研究では、ＤａｕをペプチドのＣ末端に結合し、この抱合体では、ＭＴＸをペプチドのＮ末端に結合した。さらに、抱合体の薬物−リンカー部分をいくらか酸感受性に放出させることができる結合に組み込まれたヒドラジドも存在する。このリンカー上のリソソーム酵素の効果および放出された生成物は何か、および生成物の放出速度について報告した研究は存在しなかった。しかし、これらのリンカーは、直接結合したＭＴＸと比較して抱合体の有効性を実質的に増加させ、ロイペプチンなどのインヒビターによって放出がリソソームにて媒介されることが示された。
【０２０５】
ＨＡＳキャリア分子のためのさらなるテトラペプチドスペーサーの開発は、（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １０：１−９）によって記載されている。タンパク質への抱合モデルとしてε−アミノリジン残基へのペプチド鎖の末端残基の結合を使用した、リソソーム酵素分解系を使用して適切なスペーサーを開発した。この系を使用して、ＭＴＸのカルボキシル基に結合した種々のアミノ酸によって遊離薬物を放出することができ、遊離薬物の放出速度はスペーサーの長さに依存し、テトラペプチドスペーサーによって約９０％の遊離薬物が放出されることが示された。ＨＡＳへのＭＴＸ−テトラペプチドの抱合によって、４８時間にわたる遊離薬物の放出速度が約３０％にさらに減少した。これらの実験は、テトラペプチドスペーサーによってポリマー分子の立体障害が克服されるだけでなく、酵素活性部位への切断部位の結合効率も比例することを示す。
【０２０６】
オキシム結合による有効且つ一般的なペプチドへのアントラサイクリンの結合方法は（Ｉｎｇａｌｌｉｎｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：１３４３−１３４６）によって記載されているが、この結合を使用した免疫抱合体は報告されていなかった。
【０２０７】
一般に、最も簡単な免疫抱合体の産生方法は、抗体への薬物の直接結合である。これは、薬物の官能基と抗体上の１つの官能基との間の直接結合を含み得るか、抱合体のこれらの２つの部分の間へのリンカーまたはスペーサー基の介在を含み得る。リンカー基を単に使用して化学結合が可能であるが、薬物の特定の放出型が得られる第２の官能基を有し得る。放出が細胞内または細胞外のいずれかに存在する酵素によって媒介される場合、基はスペーサー基と呼ばれ、その目的は、酵素が関連する結合に適切に接近することができるように十分なスペースをあけるか立体障害を減少させることである。
【０２０８】
メトトレキセートは、抗体に結合された第１の細胞傷害薬の１つであった。これらの初期の研究では、ジアゾ化または混合無水物手順のいずれかを介した結合を有する免疫血清（Ｍａｒｔｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９５８）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２４６：１６２６−１６２８およびＢｕｒｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：９５０−９５２）を使用する。これらの両方の手順によって、マウスモデル中に治療活性抱合体が得られた。
【０２０９】
生成された抱合体は、多数の概説に記載されている（例えば、Ｍａｇｅｒｓｔａｄｔ（１９９１）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  ７７−２１５；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８３：６７−１２３；およびＰｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６：３０１−３８７）。ビンブラスチン−抗体抱合体を使用した初期の研究では、薬物と抗体との種々の抱合方法が使用され、いくつかの報告では遊離薬物と比較した抱合体の細胞傷害性の増加が示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４４：３７２）。ビンブラスチン抱合体に関する臨床研究が報告されている。第１のこれらの研究は、至適化したＤＡＶＬＢＨＹよりもむしろＤＡＶＬＢのヘミコハク酸誘導体を使用したマウスモノクローナル抗体ＫＳ１／４との抱合体を含んでいた（Ｓｃｈｎｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．４７：３６−４１）。
【０２１０】
抗体抱合体で使用した２つの主なアントラサイクリンは、ダウノマイシン（ダウノルビシンの同意語）およびアドリアマイシン（ドキソルビシンの同意語）であり、側鎖の末端Ｃ１４のみが異なり、これらは前者がメチル基であり、後者が疎水性の低いメトキシル基である。ダウノルビシン（Ｄａｕ）は、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）よりも細胞傷害性が高いと報告されている。イダルビシンおよびエピルビシンは、ＤａｕまたはＤｏｘと比較して細胞傷害性プロフィールが改良された細胞傷害性がわずかにより高い誘導体である（Ａｒｃａｍｏｎｅ，（１９８５）Ｃａｉｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ａｗａｒｅ  Ｌｅｃｔｕｒｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：５９９５−５９９９）。モルホリノドキソルビシンおよびシアノモルホリノドキソルビシンは、細胞傷害性の高い誘導体であると報告されている（Ｎｅｗｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１５４４−１５４６）。
【０２１１】
アントラサイクリン（ＤａｕおよびＤｏｘ）と免疫グロブリンとの免疫抱合体調製物を、以下のように評価した（Ｈｕｒｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３５：１１７５−１１８１）：（１）薬物の糖部分の過ヨウ素酸酸化、抗体のリシル基との抱合、およびその後のシッフ塩基還元による還元、（２）糖アミノ基と抗体のリシル基との間のグルタルアルデヒドカップリング。薬物活性はグルタルアルデヒド活性を使用して最良に保存されたが、過ヨウ素酸塩酸化およびグルタルアルデヒド結合抱合体は、標的細胞に対して良好な活性を示した。過ヨウ素酸塩酸化抱合体を、より詳細に評価し（Ｌｅｖｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３５：１１８２−１１８６）、遊離薬物の活性が約５０％保持され、免疫抱合体への短時間の曝露を含む細胞傷害性アッセイにおいて特異性を有することが示された。ＰＣ５ Ｂ細胞白血病に対する抱合体の抗腫瘍効果は、遊離薬物よりも良好であった。
【０２１２】
イダルビシン（Ｉｄａ）免疫抱合体を、ＭＲが１〜５の抗ｌｙ２．１抗体を使用して１４−ブロモ−イダルビシンから調製した（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：９２６−９３１）。
【０２１３】
抱合体は、Ｅ３標的細胞に対して遊離薬物よりも低い活性を示す選択的細胞傷害性を示した（それぞれ、ＩＣ50＝４３０および１２０ｎＭ）。Ｉｄａのみよりも高い腫瘍成長速度の減少によってＥ３胸腺腫異種移植片に対する抗腫瘍活性を示した。抗ＣＤ１９抗体から調製したＩＤＡ免疫抱合体を使用したさらなる研究によって、遊離Ｉｄａの１２ｎＭと比較して免疫抱合体では２４０ｎＭの活性が得られた（Ｒｏｗｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：１９５−２０２）。
【０２１４】
アントラサイクリンは、ターゲティング送達のために一般に選択される。モルホリノ基は、抱合のために一般的に使用される糖アミノ基を利用不可能にするので、側鎖上のＣ１３を介したリンカーを使用した。
【０２１５】
スクシニル化ＦＵＤＲの活性エステル誘導体と抗ｌｙ１．２モノクローナル抗体とを反応させてＭＲが７〜９の薬物と抗体との抱合体を得ることによって、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ）との免疫抱合体を構築した（Ｋｒａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１３２−１３７）。抗原陽性Ｅ３細胞株では、スクシニル化ＦＵＤＲおよび免疫抱合体は共に遊離薬物（０．４Ｍ）の約１／１０の類似の細胞傷害性を示した（それぞれ、ＩＣ50＝５およびｎＭ）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、免疫抱合体を使用したＥ３胸腺腫の腫瘍成長は、同量の遊離薬物を使用した場合よりも阻害された。
【０２１６】
タキソール免疫抱合体は、Ｇｕｉｌｌｅｍａｒｄ ａｎｄ Ｓａｒａｇｏｖｉ（Ｇｕｉｌｌｅｍａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６９４−６９９）によって報告されている。薬物への切断可能なエステル結合を得るために、タキソールをグルタル酸無水物で最初に修飾し、その後カルボジイミドを使用して抗体に直接抱合した。抗マウスおよび抗ラットＩｇＧとの免疫抱合体を、抗体に対するＭＲが１の薬物を使用して作製した。細胞傷害性試験により、抱合体は遊離薬物よりも細胞傷害性が高いことを示すようであった。ｉｎ ｖｉｖｏでは、免疫抱合体は、神経芽細胞腫異種移植片に対して腫瘍成長を小さいが有意に減少させた。
【０２１７】
抗体濃度は、薬物取り込み速度の重要な決定要因であるので、１抗体分子あたりより多数の薬物分子を抱合することができる場合、細胞傷害性が増加するはずである。しかし、抗体結合活性の喪失は、薬物分子数における律速因子であるので、ターゲティングした薬物抱合体のためのキャリア分子の使用によってこの問題が解決される。大部分はキャアリア分子としてデキストラン、ヒト血清アルブミン、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）ならびに薬物ドキソルビシンまたはメトトレキセートを使用して多数の抱合体型が調査されている。最も初期のキャリア抱合体は、４５：１のモル置換比を示すポリグルタミン酸キャリアを介したフェニレンジアミンマスタードと抗体との抱合体であった（Ｒｏｗｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５５：４８７−４８８）。
【０２１８】
癌細胞を死滅させるための十分な薬物分子の送達の困難さの別の解決法は、細胞を死滅させるための薬物分子がより少数しか必要ないより強力な薬物を使用することである。多数のこれらの分子が発見されており、潜在的な抗腫瘍薬として調査されている。これらには、デュオカルマイシンなどのＣＣ−１０６５様アルキル化剤；エネジイン（ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、カリケアミシン／エスペラミシン、および色素タンパク質が含まれる）（Ｂｏｒｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（例えば、ネオカルジノスタチンおよびカリケアミシン）、ならびにゲルダナマイシンおよびメイタンシンなどのマクロライド系抗生物質が含まれる。
【０２１９】
腫瘍ターゲティング細胞傷害性療法の適用は、多数の腫瘍抗原を首尾よく使用している。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用されるゲムツズマブ・オゾガミシンは、カリケアミシン（抗腫瘍化学療法薬）に結合した抗ＣＤ３３抗体から構成される。ＣＤ３３抗原は、骨髄系前駆細胞上に存在するが、造血幹細胞上に存在しないので、ＣＤ３３ターゲティング療法はＡＭＬ細胞に選択性を示す一方で、重要な正常細胞型を阻害しない。この薬剤のＡＭＬ細胞上に存在するＣＤ３３抗原への結合により、細胞に内在化される複合体が形成される。内在後、この薬剤の抗腫瘍部分は、骨髄細胞に放出され、細胞を死滅させる（Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４：１４６３６−４３）。この薬物は、６０歳を超える患者の再発性または難治性ＡＭＬの治療についてＦＤＡで承認されている（Ａｂｏｕ−Ｊａｗｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．２５：２１２１−３７）。さらに、ゲムツズマブ・オゾガミシンは再発性ＡＭＳの治療に有利であるので、多数の患者を助けることができる。
【０２２０】
免疫毒素
治療薬または薬物部分は、古典的な化学療法薬または放射線療法薬に制限されると解釈すべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素に加えて、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、血栓症薬、または抗血管形成薬（例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン）などの生物活性を有する他のタンパク質；または例えば、リンホカイン、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子などの生物反応修飾物質が含まれ得る。
【０２２１】
免疫毒素は、タンパク質毒素に結合する成長因子、モノクローナル抗体、または抗体のフラグメントなどのリガンドを含む。リガンドサブユニットが標的細胞表面に結合した後、分子は内在化し、毒素が細胞を死滅させる。癌細胞にターゲティングされた細菌毒素には、組換え一本鎖または二本鎖融合毒素形成に十分に適合したシュードモナス外毒素およびジフテリア毒素が含まれる。植物毒素には、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンが含まれ、一般にジスルフィド結合化学によってリガンドに結合している。広範な種々の成長因子受容体および抗原を介した血液系の悪性腫瘍および充実性腫瘍をターゲティングするための免疫毒素が産生されている。
【０２２２】
免疫毒素療法の目的は、細胞傷害薬を細胞傷害薬を内在化する細胞表面分子にターゲティングして細胞を死滅させることである。免疫毒素は化学療法薬とその作用様式および毒性プロフィールが非常に異なるので、免疫毒素によって腫瘍の全身治療が改善される。
【０２２３】
免疫毒素を、毒素および抗体を含むタンパク質と簡単に定義することができる。本明細書中で概説した毒素には、標的細胞を死滅させる植物または細菌によって産生される触媒タンパク質が含まれる。用語「免疫毒素」は、一般に、インタクトなＩｇＧ、Ｆａｂフラグメント、もしくはＦｖフラグメントのいずれかによってターゲティングされた毒素をいい、成長因子もしくは他のリガンドによってターゲティングされた毒素を「キメラ毒素」ともいう。いくつかの免疫毒素またはキメラ毒素では、リガンドと毒素とを化学的に結合し、タンパク質を「化学的抱合体」ということができる。さもなければ、結合が遺伝子操作によって作製されたペプチド結合である場合、タンパク質を「組換え毒素」または「融合毒素」という。最後に、免疫毒素の選択基は、毒素に融合したＦｖ配列を含み、免疫毒素および組換え毒素の両方であるこれらのタンパク質はしばしば「組換え免疫毒素」という。
【０２２４】
その非常に高い有効性により、タンパク質毒素は十分に適合する。細胞質に注射した場合に１つまたは複数のタンパク質毒素分子で細胞を死滅させることができることが示されている（Ｙａｍａｉｚｕｍｉ，ｅｔａｌ．，（１９７８）Ｃｅｌｌ  １５：２４５−２５０およびＥｉｋｌｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１２６：３２１−３２６を参照のこと）。
【０２２５】
植物毒素は、完全毒素および半毒素として自然界に存在する。完全毒素（活性化タンパク質中のクラスＩＩリボゾームともいわれる）には、酵素ドメインとジスルフィド結合した結合ドメインを含むリシン、アブリン、ミスデトー（ｍｉｓｄｅｔｏｅ）、レクチン、およびモデクチン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）が含まれる。ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、およびゲロニンなどの半毒素は、酵素を含むが結合ドメインを含まない。
【０２２６】
免疫毒素を作製するために、一般に、植物毒素をリガンドに化学的に抱合する（例えば、Ｋｒｅｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．．３１：５３−８８を参照のこと）。
【０２２７】
一般に、免疫毒素を作製するために使用した２つの細菌毒素には、緑膿菌によって産生されるシュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア菌によって産生されるジフテリア毒素（ＤＴ）が含まれる。ＰＥおよびＤＴは共に細胞質ゾル中のＥＦ−２のＡＤＰリボシル化を触媒する（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６２：８７０７−８７１１；Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７５：９０１−９０３；およびＵｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：３８３８−３８４４を参照のこと）。
【０２２８】
ＤＴおよびＰＥの変異形態および短縮形態を使用することもできる（Ｋｒｅｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，３１：５３−８８を参照のこと）。例えば、毒素の結合ドメインが欠失されているか、変異によって機能性が喪失した変異毒素をデザインする。ＤＴの場合、これを、毒素のトリプシン処理およびＡ鎖の精製によって化学的に行うことができる（Ｍａｓｕｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９０：３２０−３２６を参照のこと）。全長であり、且つ変異結合ドメインを含む組み換え毒素には、ＰＥの５７位、２４６位、２４７位、および２４９位に塩基性残基をグルタミン酸に置換したＰＥ4E、ＤＴの３９０位のロイシンおよび５２５位のセリンをフェニルアラニンに置換したＣＲＭ１０７が含まれる（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：５３６−５３９およびＣｈａｕｄｈａｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３０６−１６３１０を参照のこと）。
【０２２９】
広範な種々の微量免疫毒素および組換え毒素を作製し、悪性腫瘍標的細胞に対して試験した（Ｋｒｅｉｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，３１：５３−８８を参照のこと）。
【０２３０】
次世代の免疫毒素には、組換え毒素、抗体または抗体フラグメントなどを含む免疫毒素が含まれ、毒素と化学的に抱合したＦａｂ’はいくつかの欠点を有する。第１に、その巨大なサイズ（１００〜２００ｋＤａ）のためにしばしば腫瘍浸透性が減少する。第２に、抗体への抱合のために、ＰＥ４０およびＰＥ３８などの毒素を、リジン残基（その多くがカルボキシル末端付近に存在する）を修飾する試薬で誘導体化しなければならない。同様に、抗体には、抗原結合ドメイン内のリジン残基の誘導体化が必要であり得る。したがって、得られた免疫毒素は、抗体および毒素の結合部位ならびに１免疫グロブリン分子あたりの毒素および抗体成分の数に関して不均一な混合物である。最後に、毒素および抗体を個別に分離し、抱合し、生成物を再精製しなければならないので、化学抱合体は生成が困難である。
【０２３１】
リガンドおよび毒素の両方が１つのポリペプチド単位として結合している場合、リガンドおよび毒素を化学的に抱合することなく毒素を細胞にターゲティングすることができる。
【０２３２】
細菌毒素ＰＥおよびＤＴは、各毒素がジスルフィドループ内に内在化後に残りの毒素から触媒ドメインを分離して細胞質ゾルに効率的に転位置させるタンパク質プロセシング部位を含むので、これらの融合毒素の作製に最適である（Ｃｈｉｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８１６７−１８１７６）；Ｆｒｙｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４９７−５０２；Ｏｇａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５３９６−２５４０１；およびＷｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０６７３−２０６７７を参照のこと）。
【０２３３】
１９８１年に、Ｍａｂ Ｂ３／２５を短縮ＤＴまたはＲＴＡに抱合し、ヌードマウスにおいてこれを使用してヒト黒色腫の成長が阻害されたことが報告された（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：１７１−１７３を参照のこと）。これらおよび類似の免疫毒素は、種々の充実性腫瘍（胃腸腺癌、中皮腫、子宮頸癌、およびグリア芽腫が含まれる）に抗腫瘍活性を示した（Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．７：５５９−５６７；Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：４２６６−４２７０；およびＭａｒｔｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：１３４８−１３５３を参照のこと）。Ｍａｂ ＨＢ２１を全長ＰＥに抱合し、ヒト卵巣癌を保有するマウスの生存率を増加させるために腹腔内に送達させた（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，．ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：６６２７−６６３０を参照のこと）。ＨＢ２１ならびにそのＦａｂ’、（Ｆａｂ’）2、およびＦｖフラグメントも短縮ＰＥまたはＤＴに抱合または融合し、種々のモデルで抗腫瘍活性を引き起こすことが示された（Ｂａｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８５４５−８５４９；Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：５３７９−５３８５；およびＢａｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２２００−２２０５を参照のこと）。
【０２３４】
種々の抗原をターゲティングする免疫毒素の標的である多数の細胞株は、化学療法薬に比較的耐性を示す。細胞からの化学療法薬の搬出の増加を担うｐ−糖タンパク質分子のターゲティングによっても、複数の化学療法薬に耐性を示す細胞を特異的にターゲティングするための免疫毒素が作製されている。ＰＥと抱合したＭａｂ ＭＲＫ１６は、ｐ−糖タンパク質の発現によって化学療法薬に最も高い耐性を示す細胞株に高い細胞傷害性を示した（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４２８８−４２９２を参照のこと）。この免疫毒素は、ＭＤＲトランスジェニックマウスにおいて多剤耐性癌細胞も死滅させた（Ｍｉｃｋｉｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４９：１７４−１７８を参照のこと）。この抗体をサポリンと抱合して骨髄から多剤耐性細胞を除去することができる免疫毒素も形成されている（Ｄｉｎｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：２９１−４２９４を参照のこと）。
【０２３５】
ターゲティング放射線療法
ＨＳＣ７０ターゲティング療法のための細胞傷害薬として放射性同位体を使用することもできる。本発明の抗ＨＳＣ７０抗体を１つまたは複数の治療薬と結合することができる。これに関する適切な薬剤には、放射性核種が含まれる。適切な放射性核種には、90Ｙ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、211Ａｔ、および212Ｂｉが含まれる。ＨＳＣ７０ターゲティング薬への結合を促進するための放射性核種薬に特異的なキャリアには、放射性ハロゲン化小分子およびキレート化化合物が含まれる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化小分子およびその合成を開示する。放射性核種キレートを、キレート化化合物（金属、金属酸化物、放射性核種への結合のためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものが含まれる）から形成することができる。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化化合物およびその合成を開示する。
【０２３６】
理想的な放射性リガンド療法薬は、標的細胞中に選択的に蓄積される。放射線療法の有効性は、細胞ＤＮＡへの照射誘導性損傷に起因する分裂細胞の破壊に起因する（例えば、Ｗ．Ｄ．Ｂｌｏｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）"Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ａｎ  Ｅａｒｌｙ  Ａｓｃｉｔｅｓ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｍｏｄｅｌ，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  １２：５１３−２５を参照のこと）。治療および画像診断への適用の両方において、任意の非結合循環放射性リガンドは、排泄系によって迅速にクリアランスされて、正常な器官および組織の保護の一助となる。放射性リガンドを、遊離放射性同位体のクリアランスを増加させる体内プロセスによって分解することもできる（Ｇ．Ａ．Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）"Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  ＭＩＢＧ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，"Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．ＸＸＶ，Ｎｏ．３，ｐｐ．２７２−２７８を参照のこと）。
【０２３７】
治療上の処置に最も適切な放射性同位体には、オージェ電子放射放射性同位体（例えば、125Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、129Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、77Ｂｒ、および他の放射性標識ハロゲン）が含まれる。種々の要因（照射型、放射エネルギー、エネルギー付与距離、および放射性同位体の物理的半減期が含まれる）に基づいて、適切な放射性同位体の選択を至適化することができる。一定の例では、使用した放射性同位体は、ＨＳＣ７０ターゲティング療法の生物学的半減期に対応するかこれより長い放射能半減期を有するものである。例えば、一定の例では、放射性同位体の半減期は、約１時間と６０日間の間、好ましくは５時間と６０日間の間、より好ましくは１２時間と６０日間の間である。125Ｉは、患者の入院および隔離を必要とする高エネルギーγ線を発生する他の放射体（すなわち、111Ｉｎおよび131Ｉ）よりも有利である。125Ｉにより、身体より漏れ出す線量がかぎられていることに起因する外来患者ベースの治療を開発可能である。
【０２３８】
放射性標識治療薬を、典型的には、静脈内注射、ボーラス注射によって投与した（例えば、Ｈ．Ｐ．Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｕｉｄｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｇｌｉｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ"Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｖｏｌ．３０，ｐｐ．１６３−６４５；Ｌ    Ｖｉｒｇｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）"Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ"Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．３３１，ｐｐ．，１１１６−２１；Ｇ．Ａ．Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）"Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  ＭＩＢＧ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ"Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．ＸＸＶ，ｎｏ．３，ｐｐ．２７２−７８；Ｓ．Ｗ．Ｊ．Ｌａｍｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）"Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ"Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１２６−４９；Ｅ．Ｐ．Ｋｒｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）"Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｄｉｕｍ−１１１−ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−ｌ−Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｍａｎ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２３−Ｔｙｒ−３−Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ"Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｖｏｌ．３３，ｐｐ．６５２−５８；Ｅ．Ｐ．Ｋｒｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）"Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ，"Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ｖｏｌ．１９８９，ｎｏ．１，ｐｐ．２４２−２４４を参照のこと）。
【０２３９】
ターゲティング遺伝子療法
ＨＳＣ７０ターゲティング療法のための細胞傷害薬として遺伝子ベクターを使用することもできる。例えば、腫瘍細胞内の抗体遺伝子（またはそのフラグメント）をコードする遺伝子ベクター。導入遺伝子発現産物は、細胞内タンパク質（例えば、癌遺伝子由来のもの）に結合し、それによって癌遺伝子のタンパク質発現を下方制御する。アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターをターゲティングするための二官能性架橋剤の使用、短いターゲティングペプチドおよびより巨大なポリペプチド結合ドメインの多数の異なるウイルスベクターの外殻タンパク質への挿入、ならびに複製コンピテントベクターの使用によって、ターゲティング遺伝子療法を容易にすることができる（Ｗａｎｄ  ａｎｄ  Ｌｉｕ（２００３）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ３５（４）：３１１−６を参照のこと）。他の非ウイルス療法薬（ＤＮＡ複合体および細菌賦形剤が含まれる）も開発されている。ＨＳＣ７０ターゲティング組成物のための遺伝子治療方法および本発明の方法を、当該分野で公知の遺伝子治療方法から適合させるか、米国特許第５，８７１，７２６号、同第５，８８５，８０６号、同第５，８８８，７６７号、同第５，９８１，２７４号、同第６，２０７，４２６号、同第６，２１０，７０８号、同第６，２３２，１２０号、同第６，４９８，０３３号、同第６，５３７，８０５号、同第６，５５５，１０７号、および同第６，５６９，４２６号から適合させることができる。
【０２４０】
１つのアプローチでは、ターゲティング複製または非複製ウイルスベクターを使用して、遺伝子療法薬を送達することができる。例えば、アデノウイルス遺伝子療法ベクターを、新生物細胞のターゲティングに適合させる（Ｒｏｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８７：１５９−１６５を参照のこと）。アデノウイルスベクターの選択的ターゲティングにより、より低用量のウイルスを使用することができるので、ウイルスベクターに対する炎症反応および免疫応答が制限されて治療の毒性が減少する。通常、アデノウイルス線維タンパク質（ｋｎｏｗと呼ばれる）ならびに一次細胞受容体、コクサッキーＢウイルス、およびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）のＣ末端部分による標的細胞の結合によって、アデノウイルス感染を開始する。この工程後、ウイルスペントンベースタンパク質のＲＧＤ（ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ）配列と細胞インテグリンとの相互作用によってウイルスが細胞に侵入する。アデノウイルスベクターの選択的ターゲティングを行うことができる。アデノウイルスベクターへのＨＳＣ７０特異的抗体の結合（例えば、抱合）により、得られた構築物がＨＳＣ７０発現新生物細胞、ＭＤＲ新生物細胞、および損傷（例えば、病原体感染）細胞にターゲティングされる。例えば、このストラテジーは、上皮細胞接着分子（ＥＧＰ−２）に対する抗体への中和抗線維タンパク質抗体の抱合による、腫瘍細胞上に存在するＥＧＰ−２抗原へのアデノウイルスのターゲティングに首尾よく適合させた（Ｈｅｉｄｅｒｍａｎ  ｅ  ｔａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：３４２−５１）。得られたＥＧＰ−２アデノウイルスを、ＥＧＰ−２を発現する癌細胞にターゲティングし、感染はＣＡＲと無関係であることが示された。別のストラテジーは、治療遺伝子送達ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）に細胞表面ＨＳＣ７０を架橋するための二重特異性抗体の使用である（例えば、Ｈａｉｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  ７：９０１−４；Ｇｒｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：６４１−５０；Ｋｒａｓｎｙｋｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８４４−５２；およびｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１９４０−４６を参照のこと）。
【０２４１】
一般に、用語「ウイルスベクター」および「ウイルス」を、タンパク質合成機能またはエネルギー発生機構を持たない任意の偏性細胞内寄生体をいうために本明細書中で交換可能に使用する。ウイルスゲノムは、脂質膜の外殻タンパク質構造と共に含まれるＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。用語「ウイルス」および「ウイルスベクター」を、本明細書中で交換可能に使用する。本発明の実施で有用なウイルスには、好ましくは、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、またはアデノウイルス科から選択される組換え改変包膜または非包膜ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれる。ウイルスは天然に存在するウイルスであり得るか、そのウイルスゲノムを、外因性導入遺伝子発現を含めるための組換えＤＮＡ技術によって改変することができ、複製欠損条件複製、または複製コンピテントであるように操作することができる。それぞれの親ベクターの特性の有利な要素を利用するキメラウイルスベクター（例えば、Ｆｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８６６−８７０を参照のこと）はまた、本発明の実施で有用であり得る。本発明の実施にしたがって、ウイルス骨格がウイルスベクターのパッケージングに必要な配列のみを含み、且つ任意選択的に導入遺伝子発現カセットを含み得る最小ベクター系を産生することもできる。一般に治療すべき種由来のウイルスを使用することが好ましいが、いくつかの例では、好ましい病原体特性を有する異なる種由来のベクターを使用することが有利であり得る。例えば、ヒト遺伝子治療用のウマヘルペスウイルスベクターは、１９９８年８月５日公開のＷＯ９８／２７２１６号に記載されている。ウマウイルスはヒトに対する病原性がないので、このベクターはヒトの治療に有用であると記載されている。同様に、ヒトアデノウイルスベクターに対する抗体を回避することが主張されているので、ヒツジアデノウイルスベクターをヒト遺伝子治療で使用することができる。このようなベクターは、１９９７年４月１０日公開のＷＯ９７／０６８２６号に記載されている。
【０２４２】
用語「複製欠損」は、野生型哺乳動物中で複製することができないベクターをいう。このようなベクターを大量に産生するために、産生細胞株をヘルパーウイルスと同時トランスフェクトするか、失われた機能を補足するように改変しなければならない。例えば、２９３細胞を、２９３細胞中のＥ１欠失複製欠損アデノウイルスベクターを増殖させるアデノウイルスＥ１欠失を補足するように操作した。用語「複製コンピテントウイルスベクター」は、感染細胞の感染、ＤＮＡ複製、パッケージング、および溶解が可能なウイルスベクターをいう。用語「条件付きで複製するウイルスベクター」を、特定の細胞型で選択的に発現する一方で、都合の悪い広範な感染を回避するようにデザインした複製コンピテントベクターをいうために本明細書中で使用する。このような条件付き複製を、初期遺伝子（例えば、アデノウイルスベクターのＥ１遺伝子）への組織特異的配列、腫瘍特異的配列、もしくは細胞型特異的配列、または他の選択的に誘導される調節配列の作動可能な連結によって行うことができる。
【０２４３】
ターゲティングに加えて、ウイルス複製のリプレッサーを駆動する経路応答プロモーターの使用によって、ウイルスベクターとの細胞型の特異性を改良することができる。用語「経路応答性プロモーター」は、一定のタンパク質に結合して、近隣遺伝子を正常細胞内のタンパク質結合に対して転写的に応答させるＤＮＡ配列をいう。転写因子が結合する配列である応答エレメントの組み込みによって、このようなプロモーターを作製することができる。このような応答は、一般に誘導性であるが、タンパク質レベルの増加によって転写が減少する場合もある。経路応答プロモーターは、天然に存在するか合成であり得る。経路応答プロモーターを、典型的には、ターゲティングされる経路または機能タンパク質に関連して構築する。例えば、天然に存在するｐ５３経路応答プロモーターには、ｐ２１またはｂａｘプロモーターなどの機能的ｐ５３の存在によって活性化される転写調節エレメントが含まれる。あるいは、最小プロモーター上流のｐ５３結合部位（例えば、ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックス領域）を含む合成プロモーターを使用して、合成経路応答プロモーターを作製することができる。合成経路応答プロモーターを、一般に、コンセンサス結合モチーフに適合する１つまたは複数の配列コピーから構築する。このようなコンセンサスＤＮＡ結合モチーフを容易に決定することができる。このようなコンセンサス配列を、一般に、数個の塩基対によって分断された直接または頭−尾反復として配置する。
【０２４４】
本発明の実施で有用な経路応答プロモーターの例には、コンセンサスインスリン結合配列を含む合成インスリン経路応答プロモーター（Ｊａｃｏｂ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７７７３−２７７７９）、サイトカイン経路応答プロモーター、糖質コルチコイド経路応答プロモーター（Ｌａｎｇｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５６７３−８０）、ＩＬ１およびＩＬ６経路応答プロモーター（Ｗｏｎ  Ｋ．−Ａ  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｈ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３９６５−３９７８）、Ｔ３経路応答プロモーター、コンセンサスモチーフを含む甲状腺ホルモン経路応答プロモーター、ＴＰＡ経路応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＴＧＦ−β経路応答プロモーター（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７：４６９−４８０に記載）が含まれる。さらに、天然または合成のＥ２Ｆ経路応答プロモーターを使用することができる。Ｅ２Ｆ経路応答プロモーターの例は、４つのＥ２Ｆ結合部位を含むＥ２Ｆ−１プロモーターを記載しているＰａｒｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：１１４５−１１４９）に記載されており、報告によれば迅速に循環する腫瘍細胞で活性である。他の経路応答プロモーターの例は当該分野で周知であり、インターネットによってｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｍｂ．ｒｓｓｉ．ｒｕ／ＴＲＲＤでアクセス可能なＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅｓで同定することができる。
【０２４５】
本発明の一定の適用では、ウイルスベクターはアデノウイルスである。用語「アデノウイルス」は、用語「アデノウイルスベクター」と同義であり、アデノウイルス科のウイルスをいう。用語「アデノウイルス科」は、集合的にマストアデノウイルス属の動物アデノウイルスをいい、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルアデノウイルス亜属が含まれるが、これらに限定されない。特に、ヒトアデノウイルスには、Ａ〜Ｆ亜属および各血清型が含まれ、各血清型およびＡ〜Ｆ亜属には、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、８型、９型、１０型、１１（ＡｄｌｌＡ  ａｎｄ  Ａｄ  １１Ｐ）型、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、１９ａ型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型、および９１型が含まれるが、これらに限定されない。用語「ウシアデノウイルス」には、ウシアデノウイルス１型、２型、３型、４型、７型、および１０型が含まれるが、これらに限定されない。用語「イヌアデノウイルス」には、イヌ１型（ＣＬＬ株、Ｇｌａｘｏ株、ＲＩ２６１株、Ｕｔｒｅｃｔ株、Ｔｏｒｏｎｔｏ２６−６１株）および２型が含まれるが、これらに限定されない。用語「ウマアデノウイルス」には、ウマ１型および２型が含まれるが、これらに限定されない。用語「ブタアデノウイルス」には、ブタ３型および４型が含まれるが、これらに限定されない。用語「ウイルスベクター」には、複製欠損ウイルスベクター、複製コンピテントウイルスベクター、および条件付き複製ウイルスベクターが含まれる。
【０２４６】
ヒトアデノウイルス２型および５型由来のベクターが特に有用である。これらのベクターを、その治療潜在能力を増強するために特定の改変を行うことができる。例えば、これらには、Ｅ１およびＥ１ｂ遺伝子の欠失が含まれ得る。特定の特徴を得るために、一定の他の領域を増強または欠失することができる。例えば、Ｅ３領域の上方制御により、ヒト被験体に投与したヒトアデノウイルスベクターに関連する免疫原性が減少すると説明される。Ｅ４領域は、ＣＭＶプロモーター由来の導入遺伝子の発現に重要と見なされているが、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質は、Ｅ１ｂ巨大タンパク質の存在下で標的細胞中のｐ５３を分解させると説明されている（Ｓｔｅｅｇｅｎｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：３４５−３４７）。
【０２４７】
送達すべき治療遺伝子は、一般に、細胞傷害性遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、プロアポトーシス遺伝子、プロドラッグ活性化遺伝子、またはサイトカイン遺伝子である。用語「細胞傷害性導入遺伝子」は、標的細胞内でのその発現により細胞の溶解またはアポトーシスを誘導するヌクレオチド配列をいう。用語「細胞傷害性導入遺伝子」には、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、プロドラッグ活性化遺伝子、またはアポトーシス遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。本発明のベクターを使用して、ＩＲＥＳエレメントの使用または独立して調節されるプロモーターのいずれかによって縦列に１つまたは複数の治療導入遺伝子を産生することができる。
【０２４８】
用語「腫瘍抑制遺伝子」は、標的細胞内でのその発現により新生物表現型の抑制および／またはアポトーシスの誘導が可能なヌクレオチド配列をいう。本発明の実施で有用な腫瘍抑制遺伝子の例には、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：６４２）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質（米国特許第５，７８３，６６６号）、欠失結腸癌（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３でマッピングされた鼻咽頭癌腫瘍抑制遺伝子（Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：３０４２−  ３０４７）、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ２遺伝子、およびＶＨＬ遺伝子が含まれる。
【０２４９】
用語「毒素遺伝子」は、細胞内でのその発現により毒作用を生じるヌクレオチド配列をいう。このような毒素遺伝子の例には、シュードモナス外毒素、リシン毒素、およびジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【０２５０】
用語「プロアポトーシス遺伝子」は、その発現により細胞がプログラム細胞死するヌクレオチド配列をいう。プロアポトーシス遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、およびカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【０２５１】
用語「プロドラッグ活性化遺伝子」は、その発現により非治療化合物を治療化合物に変換して外部要因によって細胞を死滅感受性にするか細胞内を有毒条件にすることができるタンパク質が産生されるヌクレオチド配列をいう。プロドラッグ活性化遺伝子の例は、シトシンデアミナーゼ遺伝子である。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシル（強力な抗腫瘍薬）に変換する。腫瘍細胞の溶解により、腫瘍の局在点で５ＦＣを５ＦＵに変換して多数の周囲の腫瘍細胞を死滅させることができるシトシンデアミナーゼの局在化バーストが得られる。これにより、アデノウイルスを使用してこれらの細胞に感染させることなく多数の腫瘍細胞が死滅する（いわゆる「バイスタンダー効果」）。さらに、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞がガンシクロビルの投与による選択的死滅に感受性を示すチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（米国特許第５，６３１，２３６号および同第５，６０１，８１８号を参照のこと）を使用することができる。
【０２５２】
用語「サイトカイン遺伝子」は、細胞内での発現によりサイトカインを産生するヌクレオチド配列をいう。このようなサイトカインの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（詳細には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロンα、β、およびγのサブタイプ（詳細には、インターフェロンα−２ｂ）、およびインターフェロンα−２−α−１などの融合物が含まれる。
【０２５３】
野生型タンパク質の機能的サブフラグメントをコードするための上記遺伝子に対する修飾および／または欠失を、本発明の実施での使用に容易に適合させることができる。例えば、ｐ５３遺伝子の参考例には、野生型タンパク質だけでなく修飾ｐ５３タンパク質も含まれる。このような修飾ｐ５３タンパク質の例には、核保持を増加するためのｐ５３修飾、カルパインコンセンサス切断部位を排除するためのδ１３〜１９アミノ酸などの欠失、オリゴマー形成ドメインに対する修飾（Ｂｒａｃｃｏ，ｅｔａｌ．ＰＣＴ公開出願ＷＯ９７／０４９２号または米国特許第５，５７３，９２５号に記載）が含まれる。
【０２５４】
本発明は、さらに、遺伝子ターゲティング非ウイルスベクターの使用を含む。本発明のこの態様での使用のための「非ウイルスベクター」には、通常のゲノムと異なり、且つ標的細胞中でのＤＮＡ配列の発現に影響を与え得る非選択的条件下での細胞生存に不必要な自律複製染色体外環状ＤＮＡ分子が含まれる。プラスミドは、細菌産生を促進するために細菌中で自律的に複製される。組換えベクターの存在について選択またはスクリーニングするために薬物耐性をコードする遺伝子などのさらなる遺伝子を含めることができる。このようなさらなる遺伝子には、例えば、ネオマイシン耐性、多剤耐性、チミジンキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が含まれ得る。
【０２５５】
治療遺伝子を新生物細胞、ＭＤＲ新生物細胞、および損傷（例えば、病原体感染）細胞にターゲティングするために、一定の例では、さらなるエレメントを細胞ターゲティングを容易にする非ウイルス遺伝子送達系に組み込むことが有利である。例えば、脂質カプセル化発現プラスミドは、ターゲティングを容易にするためにＨＳＣ７０抗体またはリガンドを組み込むことができる。単純なリポソーム処方物を投与することができるが、本発明の所望の組成物を充填または与えられたリポソームを全身投与することができるか、目的の組織に指向させ、その後リポソームは選択された治療／免疫原性ペプチド組成物を送達する。この適用で使用するためのＨＳＣ７０抗体およびリガンドには、抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、またはその機能的部分（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’）が含まれる。あるいは、Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，１６６，３２０号および同第５，６３５，３８３号に記載のように、非ウイルスベクターを、ポリリジン部分を介してターゲティング部分に連結することができる。
【０２５６】
リポソーム処方物
治療薬のＨＳＣ７０ターゲティング送達のために使用することができる別のストラテジーは、免疫リポソームの使用である。免疫リポソームは、腫瘍関連抗原に対する抗体を他の不活性プロドラッグを活性化する治療薬または酵素を保有するリポソームに組み込む（例えば、Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１２７５−７６を参照のこと）。多数の前臨床報告では、免疫リポソーム薬物を使用した首尾の良いターゲティングおよび抗癌有効性の増強が報告されている（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７４：９７８−８４）；Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３４：７４−８０；Ｏｔｓｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：４０−４４；Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３２０−３０）。
【０２５７】
あるいは、修飾ＬＤＬなどの非抗体ＨＳＣ７０結合剤を、治療薬のリポソーム処方物のターゲティングにおける腫瘍特異的リガンドとして使用することができる。例えば、葉酸結合リポソームを使用して、葉酸受容体を過剰発現する腫瘍に治療薬をターゲティングすることができる。葉酸結合リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで葉酸受容体過剰発現癌細胞に首尾よく送達された（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｏｗ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１９８−２０４；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｏｗ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３３：１３４−４４；Ｒｕｉｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１１２１３−１８；およびＧａｂｉｚｏｎｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：２８９−９８）。実際、いくつかの前臨床報告では、このようなリガンドに結合したリポソーム薬の首尾の良いターゲティングが記載されている（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：４０１−４；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．７：１０７−１１；Ｒｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１１２１３−１８；およびＧａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｉ．Ｃｈｅｍ．１０：２８９−９８）。ｉｎ ｖｉｖｏで種々の癌細胞型にリポソーム薬を指向させるためのターゲティングリガンドとしてトランスフェリンが使用されている（Ｉｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｍａｒｕｙａｍａ（１９９８）Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ５６：６５７−６２；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：６６−７５）。ＰＥＧの遠位末端に結合した抗トランスフェリン抗体を含むＰＥＧ−免疫リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣ６神経膠腫（ｇｌｉｍａ）細胞と優先的に会合し、ドキソルビシンを含む腫瘍特異的長期循環リポソームでの治療後に神経膠腫ドキソルビシン取り込みが有意に増加した（Ｅａｖａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５１：１０−１４）。
【０２５８】
リポソームミセル／薬物処方物の形成方法は、当該分野で公知である。例えば、治療薬ミセルを、治療薬とホスファチジルグリセロール脂質誘導体（ＰＧＬ誘導体）との組み合わせによって形成することができる。簡単に述べれば、治療薬およびＰＧＬ誘導体を、１：１〜１：２．１の範囲で混合して治療薬混合物を形成する。あるいは、治療薬：ＰＧＬ誘導体比は、１：１．２、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．８、１：１．９、１：２．０、または１：２．１の範囲である。混合物を、有効量の少なくとも２０％有機溶媒（エタノール溶液など）と組み合わせて、治療薬を含むミセルを形成させる。免疫リポソームを産生するための抗体または腫瘍ターゲティングリガンドのミセル処方物への封入方法は当該分野で公知であり、以下にさらに記載する。例えば、免疫リポソームの調製方法および使用は、米国特許第４，９５７，７３５号、同第５，２４８，５９０号、同第５，４６４，６３０号、同第５，５２７，５２８号、同第５，６２０，６８９号、同第５，６１８，９１６号、同第５，９７７，８６１号、同第６，００４，５３４号、同第６，０２７，７２６号、同第６，０５６，９７３号、同第６，０６０，０８２号、同第６，３１６，０２４号、同第６，３７９，６９９号、同第６，３８７，３９７号、同第６，５１１，６７６号、および同第６，５９３，３０８号に記載されている。
【０２５９】
本明細書中で使用される、用語「ホスファチジルグリセロール脂質誘導体（ＰＧＬ誘導体）」は、ミセルを形成する能力を有し、且つ正味で負電荷の末端基を有する任意の脂質誘導体である。これには、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、およびジカプリルホスファチジルグリセロールが含まれるが、これらに限定されない。１つの態様では、１０個〜２８個の炭素鎖および不飽和脂肪族側鎖を含むホスファチジル誘導体は、本発明の範囲内である。正味が正電荷（１：１）、中性（１：２）、またはわずかに負電荷（１：２．１）の粒子が得られる分子比の変動物（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する負電荷のホスファチジルグリセロール脂質での治療薬の複合体化によって、投与後に体内の異なる組織をターゲティングすることが可能である。しかし、負電荷のＰＧＬでの治療薬の複合体化は、多くの場合治療薬の溶解性を高めることが示されているので、有効な抗新生物療法に必要な薬物の体積が減少する。さらに、治療薬と負電荷ＰＧＬとの複合体形成により、カプセル化効率が非常に高くなるので、製造プロセス時の薬物損失が最小になる。これらの複合体は安定であり、沈殿を形成せず、４℃で少なくとも４ヶ月の保存後も治療有効性を保持する。細網内皮系（ＲＥＳ）による血液循環からの急速なクリアランスの回避によって最大の治療有効性を達成するために、免疫リポソーム薬処方物にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの成分を組み込むことができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６８：２３５−７；Ｍａｙｕｒｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１２８：４４−４９；Ａｌｌｅｎｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６６：２９−３６を参照のこと）。免疫リポソームへのＰＥＧ抱合は、血中リポソーム循環を延長し、リポソーム薬の治療有効性を増強することが示されている（Ｄａｅｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．４４：１−９；Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：１１１−１１５；Ｖａａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７５：４８２−６；Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：９８７−９２）。長期循環免疫リポソームを、以下の２つの型に分類することができる：脂質頭部の成長に関連する抗体を有するもの（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７４：９７８−８４）；およびＰＥＧの遠位末端に結合した抗体を含むもの（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２４：２３５−４２）。一定の例では、ＰＥＧ鎖の立体障害の回避よって有効な標的結合を得るために、ＰＥＧポリマーの遠位末端に腫瘍特異的抗体を位置づけることが有利であり得る。この免疫リポソーム処方物型は、肺（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３４：７４−８０；脳（Ｈｕｗｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４１６４−６９）；および腫瘍（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．２３：１０７３−７９）へのｉｎ ｖｉｖｏターゲティングにおいて首尾よく使用されている。
【０２６０】
免疫リポソーム処方物による薬物の有効な送達を、一般に、エンドサイトーシスを介した結合免疫リポソームの能動的取り込みによって増強する。組み込まれた免疫リポソームの至適なターゲティングおよび送達を確実にするためのファージディスプレイライブラリー由来の腫瘍細胞への至適化された内在化のために、ヒトｓｃＦｖ抗体を選択することができる（Ｐｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１：１１４９−６１；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７を参照のこと）。
【０２６１】
抗体媒介腫瘍ターゲティングに関する別のストラテジーは、腫瘍細胞膜から近位に高濃度の抗癌薬が得られるようにデザインした２工程治療アプローチである抗体指向性酵素プロドラッグ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏ−ｄｒｕｇ）（ＡＤＥＰＴ）である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２２：３５１−６４）。このストラテジーを使用して、所与の腫瘍結合抗原と優先的に結合する酵素−抗体抱合体を最初に投与し、その後にターゲティングされた酵素の作用によって活性化される非毒性プロドラッグを注射する。酵素−抗体抱合体の代わりにプロドラッグ活性化酵素のターゲティングキャリアとして免疫リポソームを使用した改良ＡＤＥＰＴが開発および試験された（Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２４：２２５−３１；Ｖｉｎｇｅｒｈｏｅｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３３６：４８５−９０）。
【０２６２】
治療
本発明は、治療または予防有効量の抗ＨＳＣ７０抗体または前記抗体をコードする核酸分子の投与による、癌（新生物、腫瘍、転移、または制御不能の細胞成長によって特徴づけられる任意の疾患もしくは障害、特にその多剤耐性形態が含まれるが、これらに限定されない）の治療または防止を提供する。本発明のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬で治療される癌および増殖障害型の例には、白血病（例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、および慢性リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、形成異常、および過形成が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の治療化合物を、前立腺癌（例えば、前立腺炎、良性前立腺肥大、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺傍神経節腫、前立腺癌、前立腺上皮内新形成、前立腺−直腸瘻、および非定型前立腺間質病変）の男性に投与する。癌の治療および／または防止には、癌に関連する症状の緩和、癌進行の抑制、癌退行の促進、および免疫応答の促進が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、市販または天然に存在する抗ＨＳＣ７０抗体、その機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体を本発明で使用する。
【０２６３】
ＨＳＣ７０治療薬を、単独または他の癌治療薬型（例えば、放射線療法薬、化学療法薬、ホルモン療法薬、免疫療法、および抗腫瘍薬）と組み合わせて投与することができる。抗腫瘍薬の例には、シスプラチン、イホスファミド、パクリタキセル、タキサン、トポイソメラーゼＩインヒビター（例えば、ＣＰＴ−１１、トポテカン、９−ＡＣ、およびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、およびタキソールが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、１つまたは複数の抗ＨＳＣ７０抗体を、癌の外科的切除後に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。別の実施形態では、１つまたは複数のＨＳＣ７０抗体を、化学療法または放射線療法と組み合わせて動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。別の実施形態では、癌の防止または治療のために、１つまたは複数の抗ＨＳＣ７０抗体を、動物の血漿への投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。
【０２６４】
癌の防止または治療のために、本明細書中に記載の抗ＨＳＣ７０抗体および他のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、および／または１つまたは複数の補体成分の動物への投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与することができる。別の好ましい実施形態では、１つまたは複数の抗ＨＳＣ７０抗体を、１つまたは複数の癌細胞抗原に免疫特異的な抗体の投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。さらに別の好ましい実施形態では、癌の防止または治療のために、１つまたは複数の抗ＨＳＣ７０抗体を、現在癌治療で使用されている抗体の投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。このような抗体の例には、ヘルセプチン、レツキサン（Ｒｅｔｕｘａｎ）、オバレックス、パノレックス、ＢＥＣ２、ＩＭＣ−Ｃ２２５、ビタキシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）、キャンパスＩ／Ｈ、スマートＭＩ９５、リムホシド（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ）、スマートＩＤ１０、およびオンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６５】
本発明は、さらに、治療または予防有効量の本明細書中に記載の抗ＨＳＣ７０抗体もしくは前記抗体をコードする核酸分子または他のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬の投与を含む、動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）のウイルス感染症および他の病原体の感染症の治療または防止方法を提供する。本発明にしたがって治療または防止することができるウイルス感染症の例には、レトロウイルス（例えば、ヒトＴ細胞リンパ栄養ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型およびＩＩ型、エプスタイン−バーウイルス、ならびにサイトメガロウイルス）、アレナウイルス（例えば、ラッサ熱ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、モルビリウイルス、ヒトＲＳウイルス、およびニューモウイルス）、アデノウイルス、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コロナウイルス、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱ウイルス、および日本脳炎ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、オルトミクソウイルス（例えば、センダイウイルスおよびインフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣ）、パポーバウイルス（例えば、乳頭腫ウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス、エンテロウイルス、およびＡ型肝炎ウイルス）、ポックスウイルス、レオウイルス（例えば、ロタウイルス）、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、およびラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）に起因するウイルス感染症が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染症の治療および／または防止には、感染に関連する症状の緩和、ウイルス複製の阻害または抑制、および免疫応答の増強が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６６】
本明細書中に記載のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、単独または他の抗ウイルス薬型または他の病原体薬型と組み合わせて投与することができる。抗ウイルス薬の例には、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ）；逆転写酵素のインヒビター（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、Ｄ４Ｔ、ｄｄＣ、ｄｄＩ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ、アデフォビル、エファビレンツ、デラビルジン、ネビラピン、アバカビル、および他のジデオキシヌクレオシドまたはジデオキシフルオロヌクレオシド）；リバビリンなどのウイルスｍＲＮＡキャッピングのインヒビター；このようなＨＩＶインヒビターなどのプロテアーゼインヒビター（例えば、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビル）；アンホテリシンＢ；糖タンパク質プロセシングインヒビターとしてのカスタノスペルミン；インフルエンザウイルスノイラミニダーゼインヒビターなどのノイラミニダーゼインヒビター（例えば、ザナミビルおよびオセルタミビル）；トポイソメラーゼＩインヒビター（例えば、カンプトテシンおよびそのアナログ）；アマンタジン、およびリマンタジンが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ウイルス感染症の防止または治療のために、１つまたは複数の抗ＨＳＣ７０抗体−薬物抱合体を、動物への血漿の投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。
【０２６７】
他の例では、ウイルス感染症の防止または治療のために、１つまたは複数のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、および／または１つまたは複数の補体成分の動物への投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。別の好ましい実施形態では、ウイルス感染症の防止または治療のために、抗ＨＳＣ７０抗体を、１つまたは複数のウイルス抗原に免疫特異的な抗体の投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。ウイルス抗原に免疫特異的な抗体の例には、シナギス（Ｓｙｎａｇｉｓ）、ＲＴＭ、ＰＲＯ５４２、オスタビル（Ｏｓｔａｖｉｒ）、およびプロトビル（Ｐｒｏｔｏｖｉｒ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６８】
本発明は、さらに、治療または予防有効量の抗ＨＳＣ７０ターゲティング治療薬の投与を含む、動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）の微生物感染症の治療または防止方法を提供する。本発明にしたがって治療または防止することができる微生物感染症の例には、酵母感染症、真菌感染症、原生動物感染症、および細菌感染症が含まれるが、これらに限定されない。微生物感染症を引き起こす細菌には、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・ニューモニエ、淋菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、クレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）、クレブシエラ・リノスクレロモティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍｏｔｉｓ）、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、カンピロバクター（ビブリオ）・フィタス、カンピロバクター・ジェジュニ、エロモナス・ヒドロフィラ、バチルス・セレウス、エドワージエラ・タルダ、腸炎エルシニア、ペスト菌、偽結核菌、シゲラ・ディゼンテリエ、シゲラ・フレキシネリ、シゲラ・ソンネイ、ネズミチフス菌、トレポネーマ・パリダム、フランベジアトレポネーマ、トレポネーマ・カラテノイム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｎｅｕｍ）、ボレリア・ビンセンチイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ、黄疸出血性レプストピラ、結核菌、トキソプラズマ・ゴンディ、ニューモシスチス・カリニイ、野兎病菌、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・スイス、ブルセラ・メリテンシス、マイコプラズマ属、腸チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、クラミジア属、およびヘリコバクター・ピロリが含まれるが、これらに限定されない。微生物感染症の治療および／または防止には、感染に関連する症状の緩和、複製の阻害もしくは抑制、および免疫応答の増強が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
ＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、単独または他の抗菌薬型と組み合わせて投与することができる。抗菌薬の例には、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、メトロイダゾール、ケトコナゾール、およびペンタミジンなどの抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、細菌感染症の防止または治療のために、ＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、血漿の動物への投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。
【０２７０】
一定の場合、細菌感染症の防止または治療のために、１つまたは複数のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、および／または１つまたは複数の補体成分の動物への投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。他の例では、細菌感染症の防止または治療のために、１つまたは複数のＨＳＣ７０ターゲティング治療薬を、１つまたは複数の細菌抗原に免疫特異的な抗体の投与前（例えば、１分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１２時間前、２４時間前、２日前、または１週間前）、投与後（例えば、１分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、２日後、または１週間後）、または同時に動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に投与する。細菌抗原に免疫特異的な抗体の例には、ＬＰＳおよび莢膜性ポリサッカリド５／８に免疫特異的な抗体が含まれるが、これらに限定されない。一定の実施形態では、ウイルスまたは細菌感染リスクが増加した動物に、本発明の組成物を投与する。このような動物の例には、ヒト火傷患者、乳児、免疫無防備もしくは免疫不全のヒト、および高齢者が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７１】
キット
本発明は、さらに、新形成および多剤耐性新形成のための診断または予後および治療方法で使用するためのキットを提供する。診断キットは、例えば、患者サンプルまたは患者におけるｉｎ ｓｉｔｕで細胞表面ＨＳＣ７０発現新形成の検出および多剤耐性細胞の発生のモニタリングに有用である。例えば、患者に対する一連の化学療法時に、本明細書中に記載の細胞表面ＨＳＣ７０および他のＭＤＲ関連マーカーのモニタリングによって、治療有効性および多剤耐性発生の回避に関する貴重な情報が得られる。例えば、キットは、生体サンプル中の細胞表面ＨＳＣ７０タンパク質を検出することができる標識化合物または薬剤；サンプル中の細胞表面ＨＳＣ７０量の決定手段；およびサンプル中のＨＳＣ７０の量と標準（例えば、通常の非新生物細胞または非ＭＤＲ新生物細胞）の量との比較手段を含み得る。化合物または薬剤を、適切なコンテナにパッケージングすることができる。キットは、さらに、細胞表面ＨＳＣ７０タンパク質および他のＭＤＲ関連マーカーを検出するためのキットの使用説明書を含み得る。このようなキットは、例えば、細胞表面ＨＳＣ７０タンパク質の少なくとも一部に特異的に結合することができる１つまたは複数の抗体を含み得る。
【０２７２】
ＨＳＣ７０ワクチン
免疫学的組成物（ワクチンが含まれる）およびＨＳＣ７０タンパク質またはその一部を含む他の薬学的組成物は、本発明の範囲内に含まれる。ワクチン分野の当業者に公知の方法および材料を使用して、１つまたは複数のＨＳＣ７０タンパク質またはその活性もしくは抗原性のフラグメント、またはその融合タンパク質を処方し、単独または他の抗原と組み合わせてパッケージングすることができる。治療または予防に免疫応答を使用することができ、Ｔリンパ球などによって産生される抗体免疫または細胞性免疫を得ることができる。
【０２７３】
免疫原性を増強するために、タンパク質を、キャリア分子に抱合することができる。適切な免疫原性キャリアには、アルブミン、ヘモシアニン、チログロブリン、およびその誘導体などのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））、ポリサッカリド、炭水化物、ポリマー、および固相が含まれる。他のタンパク質由来または非タンパク質由来の物質は、当業者に公知である。免疫原性キャリアの分子量は、典型的には少なくとも１，０００ダルトン、好ましくは１０，０００ダルトンを超える。キャリア分子は、しばしば、ハプテンとの共有結合性抱合を容易にするための反応基を含む。アミノ酸のカルボン酸基またはアミン基または糖タンパク質の糖基をしばしばこの様式で使用する。このような基を欠くキャリアを、しばしば、これらを産生するために適切な化学物質と置換することができる。好ましくは、免疫原を動物（マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ニワトリ、および他の動物など、最も好ましくはマウスおよびウサギ）に注射した場合、免疫応答が得られる。あるいは、タンパク質もしくはポリペプチドの複数のコピーまたは抗原的または免疫学的に等価なポリペプチドを含む複数の抗原ペプチドは、キャリアを使用せずに免疫原性を改良するのに十分に抗原性を示し得る。
【０２７４】
ＨＳＣ７０タンパク質またはその一部（コンセンサスまたは可変配列アミノ酸モチーフなど）またはタンパク質の組み合わせを、抱合体に対する免疫応答を増強するのに有効な量のアジュバントと共に投与することができる。ヒトで広く使用されている１つのアジュバントは、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）である。サポニンおよびその精製成分（ＱｕｉＡ）、フロイント完全アジュバント、および研究および獣医学的適用で使用される他のアジュバントも利用可能である。ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質Ａ、リン脂質抱合体などの化学的に定義された調製物（Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（本明細書中で参考として援用される）に記載されているものなど）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９−１７４４（本明細書中で参考として援用される）に記載のプロテオリポソーム内の抱合体のカプセル化、およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）脂質小胞（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，Ｎ．Ｈ．）などの脂質小胞中へのタンパク質のカプセル化も有用であり得る。
【０２７５】
本発明は、図１２Ａに示すＨＳＣ７０ポリペプチドフラグメントまたはインタクトなＨＳＣ７０ポリペプチドのサブシーケンスを含む（配列番号１）。ＤＮＡワクチンの場合、このようなＨＳＣ７０ポリペプチドサブシーケンスまたはこれらをコードする対応核酸配列を、免疫原性が高くなるように選択することが好ましい。抗ＨＳＣ７０ワクチンの産生目的のための抗原性の原理を、本明細書中に記載のＨＳＣ７０ベースの診断および治療法で使用するための抗ＨＳＣ７０ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用するためのＨＳＣ７０ポリペプチド配列の使用にも適用する。
【０２７６】
ポリペプチド配列の抗原性を予想するためのコンピュータ支援アルゴリズムを広範に利用可能である。例えば、「ａｎｔｉｇｅｎｉｃ」は、Ｋｏｌａｓｋａｒの方法を使用して潜在的な抗原性領域を検索する（Ｋｏｌａｓｋａｒ  ａｎｄ  Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７６：１７２−１７４"Ａ  ｓｅｍｉ−ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ"を参照のこと）。その最初の研究では、Ｋｏｌａｓｋａｒ ａｎｄ Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒは、１６９種の抗原性領域を実験的に試験した。１決定基あたり２０個未満のアミノ酸を有する１５６種の領域を選択した（全部で２０６６残基）。抗原決定基中の各残基の出現頻度としてｆ（Ａｇ）を計算した（ｆ（Ａｇ）＝エピトープ＿発生／２０６６）。親水性、近づき易さ、および可塑性の値は、Ｐａｒｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ｐａｒｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３２を参照のこと）に由来する。所与のタンパク質では、各七量体の平均を計算し、値を七量体の中央の残基に割り当てる。任意の七量体の値がタンパク質の平均を超える場合、残基は表面上に存在すると見なす。これらの結果を使用して、表面上のアミノ酸の出現頻度としてｆ（ｓ）を得た。予測アルゴリズムは、以下の工程を含む：各重複七量体の平均傾向を計算して七量体の中央の残基（ｉ＋３）に結果を割り当てる工程と、全タンパク質の平均を計算する工程と、全タンパク質の平均が１．０を超える場合に１．０を超える全ての残基は潜在的に抗原性であることと、全タンパク質の平均が１．０未満である場合に全タンパク質の平均を超える全ての残基（注釈：元の論文ではここに式の残骸がある。）は潜在的に抗原性であることと、全残基が工程３によって選択された場合、六量体が見出されること。
【０２７７】
ポリペプチドサブシーケンスの抗原性の別の決定方法は、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１５２−６）のアルゴリズムである。ユーザー入力ポリペプチド配列のＨｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ分析および得られた分析物の都合の良いグラフィカルな出力についての公的に利用可能なウェブサイトが存在する（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅｔｏｗｎ．ａｏｌ．ｃｏｍ／＿ｈｔ＿ａ／ｌｕｃａｔｏｌｄｏ／ｍｙｈｏｍｅｐａｇｅ／ＪａＭＢＷ／３／１／７を参照のこと）。図１４Ａに示す全長ヒトＨＳＣ７０配列を分析するためにこのアルゴリズムを使用して、免疫原性に適切な長さのＨｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ抗原指数の高いいくつかの適切な配列が明らかとなった。これらには、ＨＳＣ７０アミノ酸残基：２４０〜２６０（すなわち、ＨＦＩＡＥＦＫＲＫＨＫＫＤＩＳＥＮＫＲＡＹ）；および４８０〜５００（すなわち、ＩＤＡＮＧＩＬＮＶＳＡＶＤＫＳＴＧＫＥＮＫ）が含まれる。
【０２７８】
さらに、本発明は、適切なアジュバントと組み合わせた本発明のＨＳＣ７０タンパク質またはそのポリペプチドフラグメントを含む組成物を提供する。このような組成物は、本明細書中に記載の薬学的に許容可能なキャリア中に存在し得る。本明細書中で使用される、「アジュバント」または「適切なアジュバント」は、被験体が副作用を起こすことなく被験体の免疫応答を増強するためにＨＳＣ７０タンパク質またはポリペプチドと組み合わせることができる物質を説明する。適切なアジュバントは、例えば、免疫刺激サイトカインである５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクアレン（ＤＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ，Ｌ１２１ポリマー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、および０．２％ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水から構成されるＳＹＮＴＥＸアジュバント処方物１（ＳＡＦ−１）であり得るが、これらに限定されない。他の適切なアジュバントが当該分野で周知であり、ＱＳ−２１、フロイントアジュバント（完全および不完全）、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥという）、細菌由来の３つの抽出成分（モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート（ｔｒｅａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）、および細胞壁骨格）（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液を含むＲＩＢＩが含まれる。免疫刺激サイトカインなどのアジュバントを、ＨＳＣ７０タンパク質またはＨＳＣ７０コード核酸の投与前、ＨＳＣ７０タンパク質またはＨＳＣ７０コード核酸の投与と同時、ＨＳＣ７０タンパク質またはＨＳＣ７０コード核酸の投与の５日後までに被験体に投与することができる。ミョウバン、完全フロイントアジュバント、ＳＡＦなどと同様に、ＱＳ−２１を融合タンパク質投与の数時間以内に投与することができる。
【０２７９】
本発明はまた、アジュバントの組合わせ（ＨＳＣ７０タンパク質またはＨＳＣ７０コード核酸の投与前、投与後、または同時に被験体に投与された免疫刺激サイトカインなど）を使用することができる。例えば、免疫刺激サイトカインなどのアジュバントの組み合わせは、２つまたはそれ以上の本発明の免疫刺激サイトカイン（ＧＭ／ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターフェロン−γ、インターロイキン−４、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１、造血因子ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１同時刺激分子、およびＢ７．２同時刺激分子など）からなることができる。アジュバントまたはアジュバントの組み合わせの有効性を、本明細書中に記載の標準的手順を使用したアジュバントまたはアジュバントの組み合わせを使用するか使用しないＨＳＣ７０ポリペプチドに指向する免疫応答の測定によって決定することができる。
【０２８０】
さらに、本発明は、ＨＳＣ７０タンパク質またはＨＳＣ７０コード核酸および免疫刺激サイトカインなどのアジュバントまたは免疫刺激サイトカインなどのアジュバントをコードする核酸を含む組成物を提供する。このような組成物は、本明細書中に記載の薬学的に許容可能なキャリア中に存在し得る。本発明で使用される免疫刺激サイトカインは、ＧＭ／ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターフェロン−γ、インターロイキン−４、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１、造血因子ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１同時刺激分子、およびＢ７．２同時刺激分子であり得るが、これらに限定されない。
【０２８１】
本明細書中で使用される、用語「ワクチン」には、ＨＳＣ７０またはその抗原性部分（任意のコンセンサスまたは可変配列アミノ酸モチーフなど）をコードする核酸分子を含む薬学的組成物を患者に投与するＤＮＡワクチンが含まれる。遺伝子免役化のために、当業者に公知の適切な送達方法には、プラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３，）、特定のタンパク質キャリアと複合体化したＤＮＡの送達（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５）、リン酸カルシウムでのＤＮＡの同時沈殿（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｈｅｆ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９５５１）、リポソームへのＤＮＡのカプセル化（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５，）、粒子衝突（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２およびＥｉｓｅｎｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７９１）、およびクローン化レトロウイルスベクターを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ感染（Ｓｅｅｇｅｒ  ｅｔａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：５８４９）が含まれる。
【０２８２】
別の実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの真核生物組織へのポリヌクレオチドの移入時にＨＳＣ７０または免疫刺激遺伝子産物を産生するために発現することができる連続核酸配列を含むポリヌクレオチドである。コードされた遺伝子産物は、免疫応答を生じることができる免疫刺激物質または抗原のいずれかとして作用することが好ましい。したがって、本実施形態における核酸配列は、免疫原性エピトープ、および任意選択的にサイトカインまたはＴ細胞刺激エレメント（タンパク質のＢ７ファミリーのメンバーなど）をコードする。
【０２８３】
遺伝子産物よりもむしろ遺伝子を使用した免疫化の利点には、以下が含まれる。第１に、免疫系に対して天然またはほぼ天然の抗原が存在することができ、比較的単純である。細菌、酵母、またはさらに哺乳動物細胞中で組換え発現される哺乳動物タンパク質には、しばしば、適切な抗原性を確実にするためのさらなる処理が必要である。ＤＮＡ免疫化の第２の利点は、ＭＨＣクラスＩ経路に侵入して細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起する免疫原の可能性である。インフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードするＤＮＡでのマウスの免疫化によって、ＮＰに対するＣＤ８+応答を惹起し、異種インフルエンザ株での攻撃誘発からマウスを防御した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４３（３）：２８５−９２およびＵｌｍｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ  １５（８）：７９２−７９４）。細胞媒介免疫は、感染の制御で重要である。ＤＮＡ免疫化によって体液性および細胞性媒介免疫応答の両方を惹起することができるので、その最高の利点は、そのワクチンとしての潜在性について多数のＨＳＣ７０遺伝子および遺伝子フラグメントを調査する比較的単純な方法が得られることであり得る。
【０２８４】
本発明はまた、癌の治療または防止のための腫瘍抗原ワクチンの公知の調製および使用方法を含む。例えば、癌の治療または防止に有効な免疫系を誘発するためのタンパク質または核酸ワクチンのいずれかとして投与するケモカインおよび腫瘍抗原を含む融合ポリペプチドの使用を教示する米国特許第６，５６２，３４７号。ケモカインは、炎症刺激によって誘導され、炎症応答を媒介する血液感染性白血球の選択的移動、漏出、および活性化の統合に関与する通常小分泌タンパク質（７〜１５ｋＤａ）のグループである（Ｗａｌｌａｃｋ（１９９３）  Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７８を参照のこと）。ケモカインは、特異的細胞表面受容体タンパク質との相互作用によってその機能を媒介する（２３）。ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、およびＣＸ3Ｃ（Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）と呼ばれるシステイン特徴モチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｍｏｔｉｆ）によって定義された少なくとも４つのケモカインサブファミリーが同定されている。構造研究により、少なくともＣＸＣおよびＣＣケモカインが非常に類似した三次構造（単量体）を共有するが、四次構造（二量体）が異なることが明らかとなった。ほとんどの部分について、高次構造の相違は、ループまたはＮ末端の切片に局在する。本発明では、例えば、ヒトＨＳＣ７０ポリペプチド配列（図１２Ａに示すものなど）またはそのポリペプチドフラグメントおよびケモカイン配列を互いに融合し、免疫化ワクチンで使用する。融合物のケモカイン部分は、ヒト単球走化性タンパク質３、ヒトマクロファージ由来ケモカイン、またはヒトＳＤＦ−１ケモカインであり得る。融合物のＨＳＣ７０部分は、好ましくは、日常的スクリーニングにおいて強力な抗原潜在性を有することが示された部分である。
【０２８５】
薬学的処方物および治療方法
本発明は、新生物疾患を有する被験体の予防および治療方法を提供する。このような疾患のリスクがある被験体を、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイによって同定することができる。新生物の発達を防止するかその進行を遅延させるように、新生物に特徴的な症状の出現前に予防薬を投与することができる。一般に、予防または治療方法は、新生物細胞、特に多剤耐性新生物細胞上に存在する細胞表面ＨＳＣ７０に結合することができるＨＳＣ７０ターゲティング成分を含み、治療成分に連結した有効量の化合物を被験体に投与する工程を含む。
【０２８６】
ＨＳＣ７０ターゲティング成分の例には、モノクローナル抗ＨＳＣ７０抗体およびそのフラグメントが含まれる。適切な治療化合物の例には、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エポエチン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、タキソール、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンなどの伝統的な化学療法薬が含まれる。適切な治療成分の他の例には、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、植物リシン毒素、植物アブリン毒素、植物サポリン毒素、植物ゲロニン毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質などの免疫毒素が含まれる。このような免疫毒素は、細胞表面ＨＳＣ７０の結合および細胞への取り込み時の治療化合物のＨＳＣ７０ターゲティング成分によってＨＳＣ７０発現新生物細胞または多剤耐性新生物細胞にターゲティングし、新生物細胞を死滅させるかその成長を遮断するように機能する。
【０２８７】
有効用量
このような化合物の毒性および治療有効性を、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ50（集団の５０％致死用量）およびＥＤ50（集団の５０％治療有効用量）の決定）によって決定することができる。毒作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比で示すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞への潜在的損傷を最小にし、それにより副作用を減少させるために罹患組織部位にこのような化合物をターゲティングする送達系をデザインするように注意を払うべきである。
【０２８８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトへの使用のための投薬量範囲の処方で使用することができる。このような化合物の投薬量は、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ50を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。投薬量は、使用した投薬形態および使用投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用した任意の化合物のために、細胞培養アッセイから治療有効用量を最初に評価することができる。細胞培養で決定したＩＣ50（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための動物モデルにおける用量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィによって血漿レベルを測定することができる。
【０２８９】
処方物および使用
本発明で使用するための薬学的組成物を、１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用した従来の様式で処方することができる。例えば、注射、吸入もしくは吸息（ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ）投与（口または鼻のいずれかによる）または経口投与、口腔投与、非経口投与、または直腸投与による投与のために、化合物およびその生理学的に許容可能な塩および溶媒を処方することができる。
【０２９０】
このような療法のために、本発明の化合物を、種々の投与負荷（全身および局所もしくは局部投与が含まれる）のために処方することができる。一般に、技術および処方を、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出すことができる。全身投与には注射（筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下が含まれる）が好ましい。注射のために、本発明の化合物を、溶液中、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合可能な緩衝液中に処方することができる。さらに、化合物を固体形態中に処方し、使用直前に再溶解または再懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。
【０２９１】
経口投与のために、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、予めα化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；または崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤を使用した従来の手段によって調製した錠剤またはカプセルの形態をとることができる。当該分野で周知の方法によって、錠剤をコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることができるか、使用前の水または他の適切な賦形剤での構成のための乾燥生成物として存在することができる。このような液体調製物を、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性賦形剤（例えば、アチオンドオイル（ａｔｉｏｎｄ ｏｉｌ）、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を使用した従来の手段によって調製することができる。必要に応じて、調製物は、緩衝塩、香味物質、着色料、および甘味料も含み得る。
【０２９２】
経口投与用調製物を、活性化合物が徐放するように適切に処方することができる。口腔投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。吸入による投与のために、本発明で使用するための化合物を、適切な噴射剤（例えば、）を使用して加圧パックまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で都合良く送達する。加圧エアゾールの場合、バルブから定量を送達させることによって投薬単位を決定することができる。化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤から構成される粉末混合物を含む、吸入器または注入器用の例えばゼラチンのカプセルおよび薬包を処方することができる。
【０２９３】
注射（例えば、ボーラス注射または持続注入）による非経口投与のための混合物を処方することができる。注射用処方物は、防腐剤を添加した単位投薬形態（例えば、アンプルまたは多用量コンテナ（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ））で存在することができる。組成物は、油性もしくは水性賦形剤を含む懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方薬を含み得る。あるいは、有効成分は、使用前の適切な賦形剤（例えば、滅菌無発熱物質水）で構成するための粉末形態であり得る
例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座剤用基剤を含む座剤または保持浣腸剤などの直腸組成物中に化合物を処方することもできる。
【０２９４】
前記処方物に加えて、化合物を持続性調製物として処方することもできる。このような長期作用処方物を、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容可能なオイルを含む乳濁液）、もしくはイオン交換樹脂を使用するかやや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導体として化合物を処方することができる。他の適切な送達系には、長時間にわたり薬物を局所的に非浸襲性送達することが可能なミクロスフィアが含まれる。このテクノロジーは、冠動脈カテーテルを介して炎症または虚血を引き起こすことなく、例えば心臓または他の器官の任意の選択部分に注射することができる前毛細血管サイズのミクロスフィアを使用する。投与された治療薬は、これらのミクロスフィアからゆっくりと放出され、周辺組織細胞（例えば、内皮細胞）によって取り込まれる。
【０２９５】
経粘膜手段または経皮手段によって全身投与を行うこともできる。経粘膜投与または経皮投与のために、処方物中で透過すべき関門に適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は、当該分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与用胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれ、さらに、透過を容易にするために界面活性剤を使用することができる。鼻腔用スプレーまたは座剤を使用して経粘膜投与を行うことができる。局所投与のために、本発明のオリゴマーを、当該分野で一般に公知の軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに処方する。治癒を促進するために、損傷または炎症を治療するための洗浄液を局所的に使用することができる。
【０２９６】
薬物使用状況下で、ＨＳＣ７０ターゲティング治療薬のための治療薬および遺伝子送達系を、任意の多数の方法（それぞれ当該分野で周知である）によって患者に導入することができる。例えば、ＨＳＣ７０ターゲティング治療薬の薬学的調製物を、例えば、静脈内注射によって全身に導入することができる。
【０２９７】
本発明のＨＳＣ７０ターゲティング治療化合物の薬学的調製物は、本質的に、化合物を含む許容可能な希釈剤からなり得るか、遺伝子送達賦形剤または化合物が包埋された徐放性基質を含み得る。
【０２９８】
所望ならば、組成物は、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含み得るパックまたは調剤デバイス中に存在し得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたは調剤デバイスは、投与説明書を同封することができる。
【０２９９】
（実施例）以下の実施例によって本発明をさらに例示するが、これらは本発明を制限すると解釈すべきではない。本願で引用した全ての引用文献、特許、および公開特許出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。本明細書中で参照した公的データベースに寄託したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列も本明細書中で参照として援用される。当業者は、日常的実験のみを使用して、本明細書中に記載の特定の物質および手順の多数の等価物を認識するか確認することができる。このような等価物は、以下の実施例にしたがって特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例１】
【０３００】
（多剤耐性癌細胞膜中の７１ｋＤａタンパク質の過剰発現）存在するならばその薬物感受性対照物と比較して多剤耐性腫瘍細胞株中で何というタンパク質が差分発現するかを決定するための研究を行った。
【０３０１】
Ａ．細胞。７つの異なる使用細胞株を以下の表１に記載する。
【０３０２】
【表１】
2006512579.tif 000003
１０％〜１５％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴから市販されている）を含むＲＰＭＩ培地またはα−ＭＥＭ培地中で細胞を成長させた。抗生物質の非存在下の５％ＣＯ2および９５％大気の湿潤条件下で細胞を成長させ、培養物が１×１０6細胞／ｍｌとなった時点で継代した。多剤耐性（ＭＤＲ）細胞（ＨＬ６０／ＡＲ、ＮＢ４／ＶＬＢ、ＮＢ４／ＤＯＸ、ＣＥＭ／ＶＬＢ、ＣＥＭ／ＤＯＸ、Ｍｏｌｔ４／ＶＬＢ、Ｍｏｌｔ４／ＤＯＸ、ＨＳＢ２／ＶＬＢ、ＨＳＢ２／ＤＯＸ）（Ａｕｒｅｌｉｕｍ  ＢｉｏｐｈａｒｍａＩｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ  （Ｑｕｅｂｅｃ），Ｃａｎａｄａ）を、適切な濃度の細胞傷害薬と共に連続的に成長させた。同様に、接着細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ＭＣＦ−７）またはＤＭＥＭ（ＭＤＡ）で成長させた。多剤耐性細胞（ＭＣＦ−７／ＡＲ、ＭＤＡ／ＡＲ、およびＭＤＡ／ＭＩＴＯ）を、適切な濃度の細胞傷害薬と共に連続的に成長させた。全ての細胞株を、製造者（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の説明書にしたがって、ＰＣＲベースのマイコプラズマ検出キットを使用して、マイコプラズマ汚染について試験し、マイコプラズマが存在しないと判断した。全ての多剤耐性細胞株を、異なるクラスの薬物を示す異なる薬物のパネルを使用して、多剤耐性について日常的に試験した。ＭＤＲ細胞は、その細胞表面に、ＨＳＣ７０に加えて他のＭＤＲマーカーも発現した。
【０３０３】
Ｂ．細胞調製物。各細胞型から異なる抽出物型を調製した。標準的な手順によって細胞を濃縮および溶解して、細胞から全細胞抽出物を得た（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ  １９９３）。あるいは、最初に細胞表面をビオチニル化し、その後溶解して、ビオチニル化全細胞抽出物を得た（以下の実施例に示す）。これらの研究を行うために、インタクトな薬物感受性細胞（ＣＥＭおよびＨＬ６０）および多剤耐性細胞（ＣＥＭ／ＶＬＢおよびＨＬ６０／ＡＲ）を、膜不透過性ビオチニル化薬スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でビオチニル化した。細胞を、５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ８）で３回の洗浄によってビオチニル化した。次に、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、細胞に添加した。回転させながら４℃で１時間スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンとインキュベーションし続けた。１０ｍＭグリシンを含む細胞の５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ８）で１回の洗浄およびグリシンを含まない５０ｍｌ ＰＢＳで数回の洗浄によって反応を停止させた。次いで、細胞を、プロテアーゼインヒビター（１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌベンズアミジン、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を含む２００μｌの緩衝液Ａ（１％ＳＤＳおよび０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で溶解し、氷上で５分間インキュベートした。細胞溶解物を、Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ超音波処理機（Ｓｏｎｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ）にて、振幅４０（設定番号２５）で３×１０秒間（ショットの間は氷上で１分間）超音波処理した。超音波処理した溶解物を、プロテアーゼインヒビターを含む８００μｌの緩衝液Ｂ（１．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１９０ｍＭ ＮａＣｌ）と混合し、氷上で５分間インキュベートした。次いで、細胞溶解物を、エッペンドルフ微量遠心管中にて１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、製造者（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の説明書にしたがってＢＩＯＲＡＤのＤＣタンパク質アッセイキットを使用して、そのタンパク質濃度を決定した（Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−７５，１９５１も参照のこと）。
【０３０４】
このスルホ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチニル化薬の使用により、細胞表面上に露呈したタンパク質中のリジン側鎖上のεアミノ基を確実に修飾したが、対照的に、このスルホ−ビオチンがインタクトな細胞の細胞膜を通過することができないので、細胞内タンパク質はビオチニル化されないと予想された。
【０３０５】
さらに、各型の表面ビオチニル化細胞または非ビオチニル化細胞から原形質膜調製物を調製した。これを行うために、（各細胞型の）３×１０9個の細胞を、１２．５ｍｌの低張緩衝液I（１０ｍＭ ＭａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））に懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を、ＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーＢ型（１５ｍｌ）で均質化した。顕微鏡下での細胞の試験によって、細胞溶解度を決定した。約８５％の細胞を破壊するのに約４０ストロークが必要であった。均質化直後、半量（６．２５ｍｌ）の２．５×緩衝液ＩＩ（緩衝液１×：２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭスクロース、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））を細胞ホモジネートに添加し、混合する。ホモジネートを、ＳＳ３４ローターを使用したＳｏｒｖａｌｌ遠心分離機中、１３００×ｇ（３３００ＲＰＭ）で５分間スピンした。核画分を含むペレットを、細胞膜およびオルガネラを含む上清から分離した。核後上清を、ＳＳ３４ローターを使用したＳｏｒｖａｌｌ遠心分離機中、１７０００×ｇ（１１９００ＲＰＭ）で１５分間スピンまたは遠心分離した（ブレーキオフ）。ミトコンドリアが豊富なペレットを、膜が豊富な上清画分（ミトコンドリア後画分）から分離した。キャップをかぶせたチューブ（カタログ番号０３９８９Ｓ／Ｌ ＰＡ（３５ｍｌ））中の後者の上清を、Ｔ−１２５０ローターを使用したＳｏｒｖａｌｌ超遠心分離機中、１００，０００×ｇにて４℃で２時間遠心分離した。サイトゾルが豊富な上清を慎重に除去し、膜が豊富な膜ペレットを３００μｌの上記緩衝液１に再懸濁し、２７ゲージニードルを使用して十分に混合した。不連続なショ糖密度勾配（１６％、３１％、４５％、６０％ｗ／ｖスクロース／緩衝液１）上への最後の膜ペレットの再溶解によって、細胞膜をさらに豊富にした。簡単に述べれば、１００，０００×ｇの遠心分離工程後、同体積（約３５０μｌ）の３２％ｗ／ｖのスクロースを含む緩衝液１（最終濃度１６％ｗ／ｖ）を、富化した膜物質の再懸濁ペレットに添加した。６．９ｍｌの６０％スクロースをチューブの底に入れ、その後９．９ｍｌの４５％スクロース、１３．９ｍｌの３１％スクロース、および６．９ｍｌの１６％スクロースの順でショ糖密度勾配を調製した。次に、粗原形質膜を含む１６％スクロース溶液を、勾配の上方からゆっくりと注ぎ、サンプルを、ＡＨ−６２９ローターおよびＰＡ ＵｌｔｒａＣｌｅａｒチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎカタログ番号３４４０５８）を使用したＳｏｒｖａｌｌ超遠心分離機中、４℃、１００，０００×ｇで１８〜２０時間スピンした。高度に富化した細胞膜を含む１６％と３１％の間の相間を回収し、緩衝液１での遠心分離によって１回洗浄した。超遠心分離機における１００，０００×ｇでの遠心分離後、高度に富化した細胞膜ペレットを、適切な体積（約５０μｌ）の緩衝液１に再懸濁し、−８０℃で保存した。原形質膜抽出物を同様に非ビオチニル化およびビオチニル化細胞から調製した（実施例２、図１に示す）。
【０３０６】
あるいは、全膜抽出物を、表面ビオチニル化または非ビオチニル化細胞から調製した。各細胞型について、細胞を５０ｍｌの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、プロテアーゼインヒビターを含む１００μｌＰＢＳに再懸濁した。細胞を、それぞれ２０秒間で３回超音波処理し、２０，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間スピンした。プロテアーゼインヒビターを含む４％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳにペレットを再溶解し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０３０７】
Ｃ．ゲル電気泳動。同量の表面ビオチニル化（ｔｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）全細胞抽出物（ビオチニル化および非ビオチニル化タンパク質を含む）および原形質膜由来のタンパク質または各細胞型（ＨＬ６０、ＨＬ６０／ＡＲ、ＮＢ４、ＮＢ４／ＤＯＸ、ＣＥＭ、ＣＥＭ／ＶＬＢ、ＣＥＭ／ＤＯＸ、Ｍｏｌｔ４、Ｍｏｌｔ４／ＡＲ、Ｍｏｌｔ４／ＶＬＢ、ＨＳＢ２、ＨＳＢ２／ＶＬＢ、ＨＳＢ２／ＤＯＸ、ＭＣＦ７、ＭＣＦ７／ＡＲ、ＭＤＡ、ＭＤＡ／ＡＲ、ＭＤＡ／ＭＩＴＯ）由来の膜調製物を、二次元電気泳動によって分析し、青色もしくは銀染色または抗ＨＳＣ７０抗体またはストレプトアビジン−ＨＲＰ抱合体（ストレプトアビジンはビオチンに結合する）を使用した免疫ブロッティングによって視覚化した。これにより、第１の次元でのその等電点の相違および第２の次元での分子量の相違によってタンパク質サンプルを分離した。第１の次元について、１３ｃｍの固定ｐＨ勾配ストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して等電点電気泳動を行った。簡単に述べれば、セラミック製のストリップホルダー中で１３ｃｍのストリップをタンパク質サンプル（０．５〜２ｍｇタンパク質）を含む２５０μｌの再水和緩衝液中、３０ボルトで１５時間再水和した。次いで、各電極上に電極パッドを置き、ＩＰＧｐｈｏｒユニットにて以下のプログラムを使用してタンパク質を分離した。
１３ｃｍストリップ（ｐＨ４〜７）：−５００Ｖで５００Ｖｈ
−１０００Ｖで１０００Ｖｈ
−８０００Ｖで１６０００Ｖｈ
次いで、ストリップを水で穏やかにリンスし、１％ＤＴＴを含む平衡化緩衝液中で１５分間平衡化し、その後４％ヨードアセトアミドを含む平衡化緩衝液中で１５分間平衡化した。
【０３０８】
第２の次元のために、上記等電点電気泳動ストリップを、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５，１９７０）にしたがって、８％または１０％ゲルを使用したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。２×３ｍｍの濾紙上に分子量マーカーをロードし、ストリップの一方の端に置いた。次いで、０．５％アガロース溶液を含む泳動緩衝液を含むポリアクリルアミドゲル上のストリップおよび分子量マーカー濾紙をはがした。室温、３０Ｖで１時間タンパク質をストリップからゲルにゆっくりと移し、８％または１０％のゲルについて４〜８℃、７０Ｖまたは７５Ｖで１７〜１８時間分離した。
【０３０９】
次に、ゲルを青色染色または銀染色で染色し、写真撮影した。（以下の実施例に記載のように、この時点でゲル分離タンパク質をＨｙｂｏｎｄＣニトロセルロースメンブレン上に移し、抗体またはストレプトアビジン−ＨＲＰで免疫ブロッティングを行うこともできるに留意のこと）。
【０３１０】
Ｄ．結果。図１に示すように、約７１ｋＤａタンパク質の２つのイソ型に対応する２つのタンパク質は、ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞の原形質膜細胞抽出物中に存在した。イソ型１は最初にＵＲ４と命名し、イソ型２は最初にＮＣと命名した。イソ型１および２のｐＩは、それぞれ５．５８および５．５１であった。多剤耐性Ｔリンパ芽球様ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞は、薬物感受性ＣＥＭ細胞よりも少なくとも２倍のレベルでイソ型２を発現した。
【実施例２】
【０３１１】
（Ｔリンパ芽球様癌細胞の７１ｋＤａタンパク質のＨＳＣ７０としての同定）Ｔリンパ芽球様ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞の約７１ｋＤａタンパク質（図１Ａおよび１Ｂに示すゲル上の矢印で示したスポット）の同一性を発見するために、ＣＥＭ／ＶＬＢ原形質膜抽出物を使用して二次元ゲル電気泳動を行い（２×７５０μｇ、ｐＩ４〜７、１０％ゲル）、ゲルを銀染色し、７１ｋＤａのスポットを切り出した。スポットを、ゲルの染色／脱色、トリプシン消化、ペプチド抽出、およびペプチド精製のための最適な手順を使用して処理した。簡単に述べれば、製造者の説明書にしたがって、ＳｉｖｅｒＱｕｅｓｔ銀染色（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ゲルを染色した。目的のタンパク質スポットを、清潔な（酸洗浄）カミソリで切り出し、清潔なガラスプレート上で小片に刻み、２００μｌ ＰＣＲチューブ（ＭｅＯＨ処理）に移し、５０μｌ脱色液Ａおよび５０μｌ脱色液Ｂ（ＳｉｖｅｒＱｕｅｓｔキットに同封）（または新たに調製した１００μｌの脱色液プレミックス）と混合し、震盪せずに室温で１５分間インキュベートした。洗浄物を除去した。ゲル片に水を添加し、混合し、室温で１０分間インキュベートした。後者の工程を３回繰り返した。次いで、ゲル片を、１００μｌの１００％メタノール中にて室温で５分間脱水し、その後３０％メタノール／水で５分間再水和した。次いで、ゲル片を、水中で１０分間を２回および２５ｍＭ Ａｍｂｉｃ（重炭酸アンモニウム）／３０％アセトニトリル中で２回洗浄し、その後ゲル乾燥工程を実施した。脱色および洗浄したゲル片を、１体積のゲル片への１体積のトリプシン溶液（１３０ｎｇの酵素を含む２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、５ｍＭ ＣａＣｌ2）の添加によってトリプシン消化し、サンプルを氷上で４５分間静置した。３７℃で１５〜１６時間消化を進行させた。消化ペプチドを、アセトニトリルで震盪しながら室温で１５分間抽出した。ゲル片／溶媒を５分間超音波処理し、超音波処理を使用しないで２５ｍＭ Ａｍｂｉｃ／５０％アセトニトリルで再抽出した。消化ペプチドを、新たに調製した５％ギ酸／５０％アセトニトリル／４５％水にて撹拌しながら室温で１５分間さらに消化した。混合物を１体積のアセトニトリルと完全に混合し、ゲル片／溶媒を５分間超音波処理し、超音波処理を用いない同一の方法で再抽出した。回収した材料を合わせ、乾燥させた。抽出されたペプチドを、０．２％トリフルオロ酢酸（または０．５％ギ酸）を含む５％メタノール中で再懸濁し、平衡化Ｃ１８ベッド（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＺｉｐｔｉｐ）にロードした。ロードしたＺｉｐｔｉｐを、０．２％ＴＦＡ（または０．５％ギ酸）を含む５％アセトニトリルで洗浄し、１０μｌの６０％アセトニトリルで溶離した。溶離ペプチド溶液を乾燥させ、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して分析した（Ｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０：４３７−７３，２００１）。
【０３１２】
７１ｋＤａのイソ型２スポットの質量分析（精製およびプロテアーゼ消化後）は、２０種のトリプシンペプチド（そのうちの１２ペプチドは７１ｋＤａタンパク質に由来し、残りのペプチドはトリプシン自己消化生成物である）からなった。７１ｋＤａペプチドを、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（商標）と呼ばれる配列データベース検索シェアウェアソフトウェアプログラムを使用してさらに分析した。ＰｒｏＦｏｕｎｄを使用して、タンパク質配列の公的データベース（例えば、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩｎｒ）の非冗長配列コレクション）を検索した。ＮＣＢＩｎｒデータベースは、Ｇｅｎｂａｎｋで保持されている全ＤＮＡ配列コレクション由来の翻訳タンパク質配列形態を含み、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、およびＰＩＲデータベースのタンパク質配列形態も含む。
【０３１３】
図２Ａに示すように、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（商標）プログラムを使用して、２５％のＨＳＣ７０完全アミノ酸配列を対象とする１２トリプシンペプチド配列の分析に基づいて、９９パーセンタイルの位置の確率Ｚスコアが２．３６である７１ｋＤａのイソ型２タンパク質をＨＳＣ７０と同定した（図２ＢおよびＣ）。以下のＰｒｏＦｏｕｎｄ（商標）分析結果を評価する場合に以下の２つの値を考慮する：Ｚ確率スコアおよび対象率（％ｃｏｖｅｒａｇｅ）（同定されたタンパク質の完全アミノ酸配列と比較したペプチドのアミノ酸配列の割合）。Ｚ＝１．６５〜２．４３は、許容可能なスコア範囲である。Ｚ＝１．６５は、結果が９５パーセンタイル内に存在することを意味し、Ｚ＝２．４３は結果が９９．９パーセンタイル内に存在することを意味する。したがって、２．３６のＺスコアは、７１ｋＤａのスポットペプチド配列が高い確率でＨＳＣ７０のペプチド配列に相当することを示した。
【０３１４】
ＨＳＣ７０タンパク質のアミノ酸配列を、１２トリプシンペプチド配列の位置も太字で示す図３に示す。１２ペプチドの配列は、ＨＳＣ７０分子全体に広がり、２５％の完全なＨＳＣ７０タンパク質のアミノ酸と互いに対応するので、同定されたタンパク質は全長タンパク質であり、フラグメントや融合タンパク質ではなかった。
【実施例３】
【０３１５】
（７１ｋＤａタンパク質は多剤耐性前骨髄球性白血病の癌細胞の細胞表面上に発現する）ＨＳＣ７０が細胞膜の内側または外側のいずれに存在するかを決定するために、上記のようにインタクトな前骨髄球性白血病の腫瘍細胞（ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ）をリジンと反応する膜不透過性ビオチニル化試薬で処理し、薬物感受性（ＨＬ６０）と多剤耐性（ＨＬ６０／ＡＲ）の両方由来の全細胞抽出物を調製した。
【０３１６】
ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲの二次元ゲルの２つの等価な組を調製し、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ番号２４５９２、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染色した。図４は、二次元ゲル上のＨＳＣ７０の推定される位置に対応する領域を示す（ＭＷ＝７１．１１ｋＤａ、ｐＩ＝５．４）。薬物感受性ＨＬ６０細胞と比較して、多剤耐性ＨＬ６０／ＡＲ細胞の全抽出物中の約７１ｋＤａタンパク質の発現は２倍であった（図４（Ａ）および４（Ｂ））。
【０３１７】
このタンパク質同一性を発見するために、上記の実施例２に記載のように、ＭＡＬＤＩ分析用サンプルを調製するために７１ｋＤａスポット（図４（Ａ）および４（Ｂ）上に矢印で示す）を切り出して処理した。７１ｋＤａスポットの質量分析（トリプシン消化およびペプチド精製後）は、２０種のトリプシンペプチド（そのうちの１２ペプチドは７１ｋＤａタンパク質に由来し、残りのペプチドはトリプシン自己消化生成物である）からなった。７１ｋＤａペプチドを、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（商標）と呼ばれる配列データベース検索シェアウェアソフトウェアプログラムを使用してさらに分析した。
【０３１８】
図５Aおよび図５Bに示すように、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（商標）プログラムを使用して、２６％のその完全アミノ酸配列を対象とする１２トリプシンペプチド配列の分析に基づいて、９９．９パーセンタイルの位置の確率Ｚスコアが２．４３である７１ｋＤａタンパク質をＨＳＣ７０と同定した（図５Ｃ）。２．４３のＺスコアは、７１ｋＤａのスポットペプチド配列が高い確率でＨＳＣ７０のペプチド配列に相当することを示した。図５Ｃに示すように、１２ペプチドのうちの３つをビオチニル化した。
【０３１９】
ＨＳＣ７０タンパク質のアミノ酸配列を、ビオチニル化していない９つのトリプシンペプチド（太字）およびビオチニル化した３つのペプチド（斜体）の位置および配列も示す図６に示す。１２ペプチドの配列は、ＨＳＣ７０分子全体に広がり、２６％の完全なＨＳＣ７０タンパク質のアミノ酸と互いに対応するので、同定されたタンパク質は全長タンパク質であり、フラグメントや融合タンパク質ではなかった。図６中の斜体で示すビオチニル化領域を２つの方法で検出した。第１に、結合ビオチン部分は非ビオチニル化ペプチドと比較してそれを含むペプチドの分子量が変化し、第２に、ビオチニル化ペプチドはストレプトアビジンビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ番号２０３４７から市販されている固定化ストレプトアビジンビーズ）に結合するのに対して非ビオチニル化ペプチドは結合しない。
【０３２０】
ＨＳＣ７０がＨＬ６０／ＡＲ細胞表面で過剰発現することを証明するために、全膜抽出物および原形質膜抽出物を一次元ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、抗ＨＳＣ７０（ＳＰＡ−８１５，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）でブロッティングした。図７は、ＨＳＣ７０がＨＬ６０と比較して多剤耐性ＨＬ６０／ＡＲの全膜抽出物および原形質膜抽出物で過剰発現することを示す。
【実施例４】
【０３２１】
（ＨＳＣ７０は多剤耐性前骨髄球性白血病の癌細胞の細胞表面上に発現する）ＨＳＣ７０が細胞膜の外側に存在することを確認するために、上記の実施例１に記載のようにインタクトな前骨髄球性白血病の腫瘍細胞（ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ）をアミノ酸リジンと反応する膜不透過性ビオチニル化試薬で処理し、薬物感受性（ＨＬ６０）と多剤耐性（ＨＬ６０／ＡＲ）の両方由来の全細胞抽出物を調製した。
【０３２２】
これを行うために、細胞を、５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ８）で３回の洗浄によってビオチニル化した。次に、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、細胞に添加した。回転させながら４℃で１時間スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンとインキュベーションし続けた。１０ｍＭグリシンを含む細胞の５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ８）で１回の洗浄およびグリシンを含まない５０ｍｌ ＰＢＳで数回の洗浄によって反応を停止させた。次いで、細胞を、プロテアーゼインヒビター（１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌベンズアミジン、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を含む２００μｌの緩衝液Ａ（１％ＳＤＳおよび０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で溶解し、氷上で５分間インキュベートした。細胞溶解物を、Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ超音波処理機にて、振幅４０（設定番号２５）で３×１０秒間（ショットの間は氷上で１分間）超音波処理した。超音波処理した溶解物を、プロテアーゼインヒビターを含む８００μｇの緩衝液Ｂ（１．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１９０ｍＭ ＮａＣｌ）と混合し、氷上で５分間インキュベートした。次いで、細胞溶解物を、エッペンドルフ微量遠心管中で１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を破棄し、製造者（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の説明書にしたがってＢＩＯＲＡＤのＤＣタンパク質アッセイキットを使用して、そのタンパク質濃度を決定した（Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−７５，１９５１も参照のこと）。
【０３２３】
さらに、固定化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号２０３４７またはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＲＰＮ１２３１から市販されている）を使用して、ストレプトアビジン精製ビオチニル化タンパク質を、ＨＬ６０およびＨＬ／ＡＲの表面ビオチニル化全細胞抽出物から調製した。これを行うために、５００μｇ〜２ｍｇのタンパク質を含む５０μｌサンプルを、プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液Ｃ（上記緩衝液ＡおよびＢが１：４ｖ／ｖ）で最終的に４５０μｌに希釈した。次いで、サンプルを、エッペンドルフ微量遠心管中、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を新規のエッペンドルフチューブに移し、１００μｌのストレプトアビジン結合セファロースビーズと混合した。結合セファロースビーズを含むタンパク質溶解物を、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。混合物を、エッペンドルフ微量遠心管中にて１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。上清を除去し、タンパク質負荷ビーズを緩衝液Ｃで３回洗浄し、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで洗浄し、緩衝液Ｃで再度洗浄した。１０分間のボイル後、ＳＤＳサンプル緩衝液を使用して、ストレプトアビジン結合ビーズからタンパク質を溶離した。溶離を繰り返し、これらをプールした。
【０３２４】
ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ（前骨髄球性白血病）細胞表面ビオチニル化全タンパク質抽出物（図８Ａ）およびストレプトアビジン精製細胞表面ビオチニル化抽出物（図８Ｂ）由来の同量のタンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ（前出）の方法にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティング分析に供し、抗ＨＳＣ７０抗体（ラットモノクローナルＳＰＡ−８１５，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）（図８Ａおよび８Ｂ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（ビオチニル化タンパク質に特異的に結合する、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＲＰＮ１２３１）（図８Ｄ）で探索した。これを行うために、Ｔｏｗｂｉｎ（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４３５０−４３５４，１９７９）の方法にしたがって、分離したタンパク質を含むゲルを、ＨｙｂｏｎｄＣニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移した。次いで、ニトロセルロースメンブレンを、抗体またはＨＲＰ−ストレプトアビジンで探索した。抗体の結合を、ペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ラット二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ａ５７９５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出した。Ｐｉｅｒｃｅから市販されているＥＣＬ化学発光検出キットを使用して、二次抗体およびＨＲＰ結合ストレプトアビジンの両方を検出した。暗所でのＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）への曝露によって、相対タンパク質レベルを検出した。
【０３２５】
図８Ａに示すように、抗ＨＳＣ７０抗体は、ＨＬ６０細胞と比較して、多剤耐性ＨＬ６０／ＡＲ細胞の表面ビオチニル化全細胞抽出物中で有意に高いレベルで発現するＨＳＣ７０タンパク質に結合した。ＨＳＣ７０はまた、ＨＬ６０細胞と比較して、ＨＬ６０／ＡＲ細胞のストレプトアビジン精製細胞表面ビオチニル化タンパク質中で過剰発現した（図８Ｂ）。
【０３２６】
細胞表面上に存在するＨＳＣ７０が確かにビオチニル化されることを確認するために、ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞由来の表面ビオチニル化全細胞抽出物を、抗ＨＳＣ７０抗体を使用して免疫沈降を行い（図８Ｃおよび８Ｄ）、免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティングを行った。これを行うために、ストレプトアビジンビーズの代わりにプロテインＡセファロースビーズを使用して、上記のようにサンプルを調製した。上記のように、プロテインＡセファロースビーズからタンパク質を溶離するために、ロードしたビーズを、緩衝液Ｄ（０．０３％ＳＤＳ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ画分Ｖ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で５回洗浄し、プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液Ｅ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で１回洗浄した。室温で１分毎にボルテックスしながら１０分間インキュベートした後、ＳＤＳサンプル緩衝液を使用してビーズからタンパク質を溶離した。ビーズからのタンパク質溶離を再度繰り返し、これらをプールした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ＨＳＣ７０モノクローナル抗体またはＨＲＰ標識ストレプトアビジンのいずれかを使用して上記のようにウェスタンブロッティングを行った。
【０３２７】
ブロットを、抗ＨＳＣ７０抗体（図８（Ｃ））およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（図８Ｄ）で探索した。予想どおり、両細胞型由来の免疫沈降物中でＨＳＣ７０が検出されたが（図８Ｃ）、ＨＬ６０細胞と比較して、ＨＬ６０／ＡＲ細胞由来の抗ＨＳＣ７０免疫沈降物中に有意により多数の細胞表面ビオチニル化ＨＳＣ７０が存在した（図８Ｄ）。
【０３２８】
これらの結果を合せると、原形質膜を介した細胞表面へのＨＳＣ７０の転位置およびＨＳＣ７０のさらなるｄｅ ｎｏｖｏ合成がＨＬ６０／ＡＲ細胞の多剤耐性に関連することが示唆される。
【実施例５】
【０３２９】
（ＨＳＣ７０はＴリンパ芽球様癌細胞の細胞表面上に発現する）ＨＳＣ７０が細胞膜の内側または外側のいずれに存在するかを決定するために、インタクトなＴリンパ芽球様癌細胞（ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ）をアミノ酸リジンと反応する膜不透過性ビオチニル化試薬で処理し、薬物感受性（CEＭ）と多剤耐性（ＣＥＭ／ＶＬＢ）の両方由来の全細胞抽出物を調製した。さらに、上記のように、ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞の表面ビオチニル化全細胞抽出物からストレプトアビジン精製ビオチニル化タンパク質および抗ＨＳＣ７０免疫沈降物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上に移した。
【０３３０】
図９Ａに示すように、抗ＨＳＣ７０抗体は、ＣＥＭ細胞と比較して、多剤耐性ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞の表面ビオチニル化全細胞抽出物中でわずかに高いレベルで発現するＨＳＣ７０タンパク質に結合した。ＨＳＣ７０はまた、ＣＥＭ細胞と比較して、ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞のストレプトアビジン精製細胞表面ビオチニル化タンパク質中でわずかに過剰発現した（図９Ｂ）。さらに、免疫沈降物ブロットを、抗ＨＳＣ７０抗体（図９Ｃ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（図９Ｄ）で探索した。予想どおり、ＣＥＭ細胞と比較して、ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞由来の抗ＨＳＣ７０免疫沈降物中に有意により多数の細胞表面ビオチニル化ＨＳＣ７０が存在した。
【０３３１】
これらの結果を合せると、原形質膜を介した細胞表面へのＨＳＣ７０の転位置およびＨＳＣ７０のさらなるｄｅ ｎｏｖｏ合成がＣＥＭ／ＶＬＢ細胞の多剤耐性に関連することが示唆される。
【実施例６】
【０３３２】
（多剤耐性前骨髄球性白血病の癌細胞の細胞表面上のＨＳＣ７０発現の特徴づけ）２つの細胞株上の熱ショック同族タンパク質の細胞表面発現の相違を決定するための細胞表面染色および分析によって、ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞を分析した。これを行うために、一次抗体として１０μｇ、２０μｇ、および４０μｇの抗ＨＳＣ７０（ラット抗ＨＳＣ７０，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ ＳＰＡ−８１５，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびその後ウサギ抗ラットＩｇＧ ＦＩＴＣ抱合二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｆ１７６３）を使用して間接的免疫蛍光分析を行った。
【０３３３】
細胞を、５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3で３回洗浄し、計数した。１×１０6細胞／サンプルを、１００μｌ ＰＢＳおよび０．１％ＮａＮ3を含む１２×７５ｍｍチューブまたは深型９６ウェルプレートに入れた。第１の抗体を添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。３ｍｌ（または１．２５ｍｌを含むプレート）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3を添加し、混合物を５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。上清を破棄し、ペレットを１００μｌＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3に再懸濁した。
【０３３４】
第２の抗体（ＦＩＴＣ抱合）を添加した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3での２倍希釈によって混合物を調製し、最大速度にて４℃で３０分間スピンした。ペレットを分離し、染色のために１／１０を使用した。３７℃で２０分間インキュベートした。３ｍｌ（または１．２５ｍｌを含むプレート）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3を添加し、混合物を５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。上清を破棄し、さらなるＰＢＳおよびＮａＮ3の添加を繰り返した。混合物を再度５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。
【０３３５】
１μｇ〜２μｇ／μｌのＥＭＡを添加した。混合物を白色灯下にて氷上で１０分間インキュベートした。３ｍｌ（または１．２５ｍｌを含むプレート）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3を添加し、混合物を５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。上清を破棄し、さらなるＰＢＳおよびＮａＮ3の添加を繰り返した。混合物を再度５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンし、５００μｌＰＢＳ（ｐＨ７．２）／２％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、４℃の暗所で保存した。各サンプルについて、蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｅｒＸＬ ＭＣＬ）を使用して１０，０００細胞を分析した。特異的染色細胞に対応する蛍光放射を、ラットＩｇＧ２ａイソ型で染色した５３０ｎｍで細胞について測定された放射の減法によって計算した（Ｃｙｍｂｕｓ，番号ＣＢＬ６０５）。
【０３３６】
図１０Ａに示すように、どの程度の一次抗体を使用したかに依存して、薬物感受性ＨＬ６０細胞表面上での発現よりも多剤耐性ＨＬ６０／ＡＲ細胞の表面上で約３倍〜１０倍のレベルでＨＳＣ７０が発現した。
【０３３７】
ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲの表面上で発現したＨＳＣ７０の分子数を、ビーズおよび細胞について飽和量の抗体でのＱｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒフローサイトメトリー定量キット（Ｓｉｇｍａ  ＃ＱＳＣ２０（分子数６９５１〜２１３３６９）を使用したＦＡＣＳによって決定した。ＱＳＣシステムは、ヤギ抗マウス抗体に結合したリンパ球のサイズとほぼ同一のマイクロビーズからなる。異なる既知量のヤギ抗マウス抗体を保有する５組のマイクロビーズ集団がキットに含まれる。マイクロビーズを、飽和量の目的のマウスモノクローナル抗体とインキュベートする。マイクロビーズを使用して得られた蛍光強度をプロットして、ビーズ上に結合した抗体分子数に対する蛍光強度の標準曲線を作成する。次いで、標準曲線を使用して細胞（飽和量）を使用して得られたシグナルを、細胞表面上に存在する抗原数に対応する細胞に結合した抗体分子数と相関させる。６０μｇのマウス抗ＨＳＣ７０ＩｇＧ２ａ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７２９８）を２つの独立した実験で使用し、細胞と同一の条件下で、Ｓｉｇｍａ（分子数６９５１〜２１３３３６９）から購入したＱＳＣビーズを使用して３０μｇの抗体を試験した。ビーズを使用して得られた検量線を使用して、ＲＦＩを分子数に変換した。図１０Ｂに示すように、ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲの表面上のＨＳＣ７０の平均分子数は、ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲについてそれぞれ２５４１±１１８４分子および７１８９±５９０分子であった。
【実施例７】
【０３３８】
（多剤耐性リンパ球性白血病の癌細胞の細胞表面上のＨＳＣ７０発現の特徴づけ）２つの細胞株上のＨＳＣ７０の細胞表面発現の相違を決定するための細胞表面染色およびＦＡＣＳ分析によって、ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞を分析した。これを行うために、一次抗体として１μｇ、２．５μｇ、および５μｇの抗ＨＳＣ７０（ラットモノクローナル抗体、ＳｔｒｅｓｓｇｅｎＳＰＡ−８１５）およびその後ＦＩＴＣ抱合二次抗体を使用して間接的免疫蛍光分析を行った。細胞を、５０ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3で３回洗浄し、計数した。１×１０6細胞／サンプルを、１００μｌ ＰＢＳおよび０．１％ＮａＮ3を含む１２×７５ｍｍチューブまたは深型９６ウェルプレートに入れた。第１の抗体を添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。３ｍｌ（または１．２５ｍｌを含むプレート）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3を添加し、混合物を５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。上清を破棄し、ペレットを１００μｌＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3に再懸濁した。
【０３３９】
第２の抗体（ＦＩＴＣ抱合）を添加した。混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3で２倍希釈し、最大速度にて４℃で３０分間スピンした。ペレットから上清を分離し、染色のために１／１０を使用した。３７℃で２０分間インキュベートした。３ｍｌ（または１．２５ｍｌを含むプレート）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3を添加し、混合物を５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。上清を破棄し、さらなるＰＢＳおよびＮａＮ3の添加を繰り返した。混合物を再度５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。
【０３４０】
１μｇ〜２μｇ／μｌのＥＭＡを添加した。混合物を白色灯下にて氷上で１０分間インキュベートした。３ｍｌ（または１．２５ｍｌを含むプレート）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１％ＮａＮ3を添加し、混合物を５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。上清を破棄し、さらなるＰＢＳおよびＮａＮ3の添加を繰り返した。混合物を再度５分間（１０００ｒｐｍ／２００×ｇ）スピンした。５００μｌＰＢＳ（ｐＨ７．２）／２％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、４℃の暗所で保存した。
【０３４１】
各サンプルについて、蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｅｒＸＬ ＭＣＬ）を使用して１０，０００細胞を分析した。特異的染色細胞に対応する蛍光放射を、ラットＩｇＧ２ａイソ型で染色した５３０ｎｍで細胞について測定された放射の減法によって計算した（Ｃｙｍｂｕｓ，番号ＣＢＬ６０５）。
【０３４２】
図１１Ａに示すように、薬物感受性ＣＥＭ細胞表面上での発現よりも多剤耐性ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞の表面上で約２倍のレベルでＨＳＣ７０が発現した。
【０３４３】
ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢの表面上で発現したＨＳＣ７０の分子数を、ＣＥＭ／ＶＬＢとＨＬ６０／ＡＲとを比較した場合に得られた相違の倍率（図１１Ｂ）をＨＬ６０／ＡＲについて得られた分子数に適用することによって決定した（実施例６を参照のこと）。図１１Ｃに示すように、ＣＥＭ／ＶＬＢの表面上に存在するＨＳＣ７０の分子数は１０９７２分子であった。
【実施例８】
【０３４４】
（多剤耐性乳癌細胞の細胞表面上のＨＳＣ７０発現の特徴づけ）２つの多剤耐性乳癌細胞株上のＨＳＣ７０の細胞表面発現の相違を決定するための細胞表面染色およびＦＡＣＳ分析によって、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＲ、ＭＤＡ、およびＭＤＡ／ＡＲ乳癌細胞を分析した。これを行うために、一次抗体として１０μｇのラットモノクローナル抗ＨＳＣ７０（ＳＰＡ−８１５−Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）およびその後の抗ラットＩｇＧ ＦＩＴＣ抱合二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｆ１７６３）を使用して間接的免疫蛍光分析を行った。さらに、１μｇのマウスモノクローナル抗Ｐｇｐ（番号８０１−００８−Ｃ１５０、クローンＭＲＫ−１６、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびその後のヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ抱合二次抗体（ＡＰ１８１Ｆ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して間接的免疫蛍光分析を行った。正のコントロールとして多剤耐性マーカーＰｇｐを並行して試験した。
【０３４５】
上記のようにＦＡＣＳ分析のための細胞を調製した。各サンプルについて、蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｅｒＸＬ ＭＣＬ）を使用して１０，０００細胞を分析した。特異的染色細胞に対応する蛍光放射を、１０μｇのラットＩｇＧ２ａ（Ｃｙｍｂｕｓ、番号ＣＢＬ６０５）または１μｇのマウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ９１４４）イソ型コントロール（それぞれＨＳＣ７０およびＰｇｐのため）で染色した５３０ｎｍで細胞について測定された放射の減法によって計算した。
【０３４６】
ＦＡＣＳ分析の結果を、図１２Ａおよび１２Ｂに棒グラフで示す。認められるように、ＭＣＦ−７細胞の表面上で発現したＨＳＣ７０レベルよりも３倍のレベルでＭＣＦ−７／ＡＲ細胞の表面上でＨＳＣ７０を発現した(図１２A)。図１２Ｂは、ＭＤＡ／ＡＲ細胞のＦＡＣＳの結果を示し、ＭＤＡ細胞の表面上で発現したＨＳＣ７０レベルよりも２倍のレベルでＭＤＡ／ＡＲ細胞の表面上でＨＳＣ７０を発現することを示す。
【実施例９】
【０３４７】
（ＨＳＣ７０は血液癌細胞の細胞表面上で発現し、ＭＤＲ血液癌細胞上でより高いレベルで発現するが、正常細胞上に存在しない）次に、細胞表面発現ＨＳＣ７０レベルの相違を決定するために、正常な白血球を血液癌細胞およびＭＤＲ血液癌細胞と比較した。これを行うために、一次抗体として５μｇのラットモノクローナル抗体（ＳＰＡ−８１５、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）およびその後のウサギ抗ラットＦＩＴＣ抱合二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｆ１７６３）を使用して間接的免疫蛍光分析を行った。
【０３４８】
ヒト血液サンプル（ヘパリンチューブ中に採血）をドナーから入手し、１時間処理した。簡単に述べれば、Ｆｉｃｏｌｌ ｈｙｐａｑｕｅ勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ Ｓｉｇｍａ １０７７−１）によって白血球および血漿から赤血球を分離した。詳細には、１５ｍｌの血液を、ｐＨ７．４で２倍希釈し、同体積のＦｉｃｏｌｌ勾配の上にのせた。室温での４００×ｇで３０分間の遠心分離によって細胞を分離した。血漿／Ｆｉｃｏｌｌ境界から０．５ｃｍまでの上層（血漿）を除去した。次いで、５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに単核球（境界）を回収した。Ｆｉｃｏｌｌを除去し、赤血球（チューブの底）を回収した。全細胞型を、２５０ｇ、４℃で１０分間のスピンによってＰＢＳで２回洗浄し、計数した。次いで、白血球を１×１０7細胞／ｍｌに再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析のために１００μｌ（１×１０6細胞）アリコートを使用した。
【０３４９】
上記のようにＦＡＣＳ分析のための細胞を調製した。各サンプルについて、蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｅｒＸＬ ＭＣＬ）を使用して１０，０００細胞を分析した。特異的染色細胞に対応する蛍光放射を、５μｇのラットＩｇＧ２ａ（Ｃｙｍｂｕｓ、番号ＣＢＬ６０５）で染色した５３０ｎｍで細胞について測定された放射の減法によって計算した。
【０３５０】
いくつかのコントロール（単独で自己蛍光を決定するための細胞；分析中の死滅細胞を同定するための細胞＋ＥＭＡ；二次抗体に起因する非特異的相互作用を同定するための細胞＋二次抗体（Ａｂ）のみ；抗体（Ａｂ）または適切な宿主一次抗体コントロールに適合する細胞＋イソ型；細胞（単核球）＋ＣＤ４５−ＰＣ５マウスモノクローナル抗体、異なる白血球集団を確立して通門するためのフィコエリトリン−シアニン５抱合体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ＰＮ ＩＭ２６５３）が含まれる）を使用して、各ＦＡＣＳを行った。
【０３５１】
正常なＷＢＣ上のＨＳＣ７０の発現レベルを種々の血液癌またはＭＤＲ血液癌細胞上のＨＳＣ７０の発現レベルと比較した場合、血液癌細胞およびＭＤＲ血液癌細胞と比較して、正常な細胞はその細胞表面上にＨＳＣ７０を発現しない（図１３Ｂを参照のこと）。
【実施例１０】
【０３５２】
（ＭＤＲ血液癌細胞に対するワクチン抗原としてのＨＳＣ７０の使用）実施例１０：ＭＤＲ血液癌細胞およびＭＤＲ哺乳動物腺癌細胞に対するＨＳＣ７０ベースのワクチン保護。
【０３５３】
ＭＤＲ血液癌細胞の細胞表面上に発現した全長ＨＳＣ７０タンパク質がＭＤＲ血液癌細胞に対して動物を免疫化するためのワクチン抗原として有用かどうかを決定するために、精製ＨＳＣ７０タンパク質を、アジュバント（例えば、フロイント）と組み合わせ、血液癌細胞の存在に起因する血液癌マウス群に投与する。１つのこのような非限定的な血液癌は、急性白血球性白血病である。
【０３５４】
これを行うために、マウスに、マウスＭＨＣ型に適合する血液腫瘍細胞を注射する（またはＳＣＩＤマウスに注射する）。いくつかのマウスは、精製全長マウスＨＳＣ７０タンパク質で免疫化する前に腫瘍細胞を注射し、別のマウスでは精製全長マウスＨＳＣ７０タンパク質での免疫化後に血液腫瘍細胞を注射した。精製ＨＳＣ７０タンパク質をアジュバントと共に投与することができることに留意のこと。各マウス群について適切なコントロールを実施する（すなわち、一方のコントロール群には精製マウスＨＳＣ７０タンパク質のみを投与し、別の群には血液腫瘍細胞のみを注射する）。
【０３５５】
マウス中で形成される腫瘍を秤量または測定する（例えば、腫瘍細胞数を計数するか、腫瘍を切除して秤量するか、カリパスによって腫瘍を測定する）。腫瘍細胞の注射前にＨＳＣ７０をワクチン接種したマウスは、腫瘍細胞の注射前にＨＳＣ７０でワクチン摂取していない腫瘍と比較して治療後により小さな腫瘍を有することが見出される。
【０３５６】
さらなる研究では、ＭＤＲ乳腺腫細胞（ＭＣＦ／ＡＲ）に対する抗原としてのＨＳＣ７０の有効性を評価する。簡単に述べれば、１、７、１４、２１、２８、および３５日目に、６週齢のメスマウスに、アジュバントを含むか含まない３０〜２５０μｇの全ＨＳＣ７０またはコントロール抗原をＳ．Ｃ．およびＬＰまたは後ろ足の蹠球に注射する。種々の間隔後、抗ＨＳＣ７０抗体アッセイのために、球後（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）静脈叢から血液サンプルを採取する。５９日目に、右側腹にＳ．Ｃ．投与した１．５×１０4個の生きたＭＤＲ乳腺癌細胞（ＭＣＦ／ＡＲ）でマウスを攻撃誘発する。マウスを週に２回試験し、マウスの保有腫瘍数から腫瘍発生率を決定する。ノギスを使用して腫瘍サイズを測定した。腺癌での攻撃誘発から８０日後までの生存率を測定する。
【実施例１１】
【０３５７】
（ＭＤＲ血液癌細胞に対するＨＳＣ７０ターゲティング療法）細胞表面ＨＳＣ７０への治療薬のターゲティングが既存の癌病態の治療で有用かどうかを決定するために、血液腫瘍細胞をＭＨＣ適合マウスに投与し、腫瘍を形成させる。次に、マウスの腫瘍細胞をほとんどであるが全てではない腫瘍細胞を死滅させると予想される投薬量でマウスにビンクリスチン（または別の化学療法薬）を投与する。発達した多剤耐性腫瘍細胞を有すると同定されたこれらのマウスにビンクリスチンおよびマウスＨＳＣ７０に特異的に結合するリシン毒素に作動可能に連結された結合剤を含む組成物を投与する。
【０３５８】
組成物を投与したマウスは、結合剤のみまたはビンクリスチンのみを投与したマウスと比較して、より良好な予後（すなわち、より小さな腫瘍またはより少ない腫瘍細胞）を示す。
【０３５９】
さらなる研究では、ＭＤＲ乳腺癌細胞（ＭＣＦ／ＡＲ）の治療におけるＨＳＣ７０ターゲティング治療薬の有効性を評価する。簡単に述べれば、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ異種移植片のために胸腺欠損ヌードマウスを使用する。５〜７週齢で１８〜２２ｇの雄マウスを使用する。０．５×１０6細胞／接種を使用して、マウスの肩の下に細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射する。細胞のｓ．ｃ．移植後、ｓ．ｃ．腫瘍のサイズが約５．５ｍｍである場合、マウスを、コントロールおよびビンクリスチンまたはドキソルビシンのみ（４ｍｇ／ｋｇ）を２日毎に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与する群、抗ＨＳＣ７０のみ（１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ）、またはビンクリスチンまたはドキソルビシンおよび抗ＨＳＣ７０ｍＡｂの両方（１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．投与する群を含む４つの治療群に無作為に選択する。４日毎に動物の体重を測定する。各動物の耳にタグをつけ、実験を通して個別に追跡する。腫瘍成長の測定を治療１日目から開始し、異種移植片の体積を４日毎にモニタリングする。コントロール群において平均腫瘍重量が１ｇを超えた場合、マウスを麻酔し、屠殺する。マウスから腫瘍組織を切り出し、その重量を測定する。
【実施例１２】
【０３６０】
（多剤耐性乳癌細胞の細胞表面上の熱ショック同族タンパク質（ＨＳＣ７０）発現の特徴づけ）２つの細胞株上の熱ショック同族タンパク質７０の細胞表面発現の相違を決定するための免疫染色によって、ＭＣＦ−７細胞およびＭＣＦ−７／ＡＲ細胞を分析した。これを行うために、透過性および非透過性細胞に対する一次抗体としての０．５μｇの抗ＨＳＣ７０（ラット抗ＨＳＣ７０，ＳｔｒｅｓｓｇｅｎＳＰＡ−８１５）を使用して免疫蛍光を行った。モノアジ化エチジウム（ＥＭＡ）を使用して、透過性細胞または損傷細胞の核を染色した。
【０３６１】
図１５ＡおよびＢは、細胞を染色するために使用した工程を示す流れ図を示す。コントロール細胞は、０．５μｇラットＩｇＧ２ａで染色したＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＡＲであり、コントロール細胞では透過性細胞または非透過性細胞のいずれにおいても染色は認められなかった（データ示さず）。図１６に示すように、ＭＣＦ−７がいかなる染色も示さない場合、インタクトな多剤耐性ＭＣＦ−７／ＡＲ細胞の表面上でＨＳＣ７０は明らかに発現した。透過性細胞は、ウェスタンブロットによって確認された等価なＨＳＣ７０の全プールを示した（図１９）。
【０３６２】
種々の感受性および耐性癌細胞ならびに正常組織についてのＨＳＣ７０の全プールの比較を図１９に示す。同量の各抽出物を、１０％ＳＤＳゲルで分離した。ＢＤ（脳番号６３５３０１、肺番号６３５３０４、卵巣番号６３５３４４、乳腺番号６３５３０８、前立腺番号６３５３６６）から正常組織の抽出物を得て、健常なドナーから得た血液から精製した細胞から白血球の抽出物を調製した（ＷＢＣ精製手順は前記実施例９に記載）。全抽出物（ＢＤから購入したものを除く）を、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターカクテルを補足した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、４％ＣＨＡＰＳ中に調製した。溶解細胞を氷上で超音波処理し、ＤＮアーゼＩで処理し、溶解物を８Ｍ尿素に入れた。図１９は、ＨＳＣ７０は試験した全ての感受性および耐性癌細胞株で過剰発現するのに対して、正常な細胞はＨＳＣ７０を検出不可能なほど非常に少量発現することを示す。全プールは感受性細胞株と耐性細胞株との間で有意に変化しないので、ＭＣＦ−７細胞およびＭＣＦ−７／ＡＲ細胞について測定した表面曝露におけるＨＳＣ７０増加はタンパク質の細胞内プールの増加によって誘発されないことに注目すべきである。
【実施例１３】
【０３６３】
（ＭＤＲ乳癌細胞における細胞表面ＨＳＣ７０発現の定量分析）２つの細胞株上のＨＳＣ７０の細胞表面発現の相違を決定するために、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＡＲ細胞を分析した。これを行うために、透過性および非透過性細胞に対する一次抗体としての０．５ｍｇの抗ＨＳＣ７０を使用して免疫蛍光を行った。モノアジ化エチジウム（ＥＭＡ）を使用して、透過性細胞または損傷細胞の核を染色した。
【０３６４】
コントロール細胞は、０．５ｍｇマウスＩｇＧ１で染色したＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＡＲであり、透過性細胞または非透過性細胞のいずれにおいても染色は認められなかった（データ示さず）。インタクトな多剤耐性ＭＣＦ−７／ＡＲ細胞の表面上でＨＳＣ７０は明らかに発現し、ＭＣＦ−７ではいかなる染色も示さない。
【実施例１４】
【０３６５】
（ＭＤＲ前骨髄芽球性白血病癌細胞における細胞表面ＨＳＣ７０発現の定量分析）細胞表面への１２５ヨウ素標識抗ＨＳＣ７０の直接結合によって、ＨＳＣ７０の表面曝露についてＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞を分析する。これを行うために、抗ＨＬ６０／ＡＲ、マウスＩｇＧ１（イソ型適合負のコントロール、Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０３５）、および抗ＣＤ３３（正のコントロール、Ｓｅｒｏｔｅｃ，番号ＭＣＡ１２７１）を、製造者が提供した手順に従って、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）プレコートヨード化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ，番号２８６０１）を使用してヨード化する（得られた平均放射線量：７．５ｍＣｉ／ｍｇ）。
【０３６６】
細胞をＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、同一培地中で１０６細胞／１００ｍＬに再懸濁する。トリパンブルー染色によって生存率を評価し、５％未満である。細胞（１×１０６）をホウケイ酸処理チューブに等分し、１ｍｇの放射性標識抗ＨＬ６０／ＡＲ、ＩｇＧ１、または抗ＣＤ３３の存在下にて氷上で１時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を１ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄し、細胞ペレットをガンマーカウンターで計数する。
【０３６７】
ＩｇＧ１バックグラウンドを減じた細胞ペレットについて得られた１分あたりのカウント数としてインタクトな細胞放射性免疫アッセイの結果を示す。薬物感受性ＨＬ６０細胞表面上に発現したＨＬ６０レベルよりも高いレベルで耐性ＨＬ６０／ＡＲ細胞の表面でＨＳＣ７０が発現する。
【実施例１５】
【０３６８】
（ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞に対する放射性ヨード化抗ＨＳＣ７０の細胞傷害効果）細胞をＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、同一培地中で１０６細胞／１００ｍＬに再懸濁する。トリパンブルー染色によって生存率を評価し、５％未満である。細胞（１×１０６）をホウケイ酸処理チューブに等分し、５ｍｇの滅菌濾過抗ＨＳＣ７０、ＩｇＧ１、または抗ＣＤ３３の存在下にて３７℃で４時間（０．５％ＣＯ2）インキュベートする（上記実施例にヨード化手順を記載する）。インキュベーション後、細胞を１ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳ、１ｍＭ ＨＥＰＥＳで１回洗浄し、１ｍｌの同一培地に再懸濁し、平底組織培養９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルを播種する。７２時間後にＭＴＴベースのアッセイにおいて放射性標識抗体の細胞傷害性を評価する。抗体の表面結合の正のコントロールとして抗ＣＤ３３を使用し、細胞傷害性の正のコントロールとして１２０ｎＭドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）を使用する。
【０３６９】
細胞傷害性アッセイの結果を、生存率を示す値として示す。抗ＨＳＣ７０および抗ＣＤ３３抗体−１２５Ｉ抱合体を使用した生存率の値を、放射性標識ＩｇＧ１について得られた値に対して正規化する（非有意バックグラウンド結合、１００％生存）。抗癌薬ドキソルビシンを使用して得られた値を、薬物で処置していない細胞について得られた値に対して正規化する。
【０３７０】
結果は、放射性標識抗ＨＳＣ７０がその表面上でＨＳＣ７０を発現するＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲに対して細胞傷害効果を有することを示す。
【実施例１６】
【０３７１】
（薬物感受性および薬物耐性乳癌細胞株および卵巣癌細胞株における細胞表面ＨＳＣ７０分子の定量）乳癌ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＲ、ＭＤＡ、ＭＤＡ／ｍｉｔｏ、および卵巣ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ／Ｔ３２０（タキソール耐性）、２００８、および２００８／Ｔ３２０（タキソール耐性）細胞を、細胞表面への１２５ヨウ素標識抗ＨＳＣ７０の直接結合によってＨＳＣ７０の表面曝露について分析する。これを行うために、抗ＨＳＣ７０およびマウスＩｇＧ１（適合負のコントロール Ｓｉｇｍａ，Ｍ−９０３５）を、製造者が提供した手順に従って、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）プレコートヨード化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ，番号２８６０１）を使用してヨード化する（得られた平均放射線量：７．５ｍＣｉ／ｍｇ）。
【０３７２】
９６Ｓｔｒｉｐｗｅｌｌ（商標）プレート（Ｃｏｓｔａｒ，番号９１０２）に２０，０００細胞／ウェルで細胞を播種する。完全培地中で一晩の成長後（３７℃、０．５％ＣＯ2）、ウェルを１％ＦＢＳを含む１００ｍｌ培地で穏やかに洗浄し、１％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムならびに１００ｎｇの放射性ヨード化抗ＨＳＣ７０（またはＩｇＧ１）を含む１００ｍＬの培地にて３７℃で１時間インキュベートする（０．５％ＣＯ2）。トリパンブルー染色によってインキュベーション前に死亡率をチェックし、１％未満である。インキュベーション後、培地を破棄し、ウェルを１％ＦＢＳを含む３５０ｍＬ培地で２回洗浄し、それぞれガンマーカウンターで計数する。
【０３７３】
インタクトな細胞放射性免疫アッセイにおいて漸増量の放射性抗ＨＳＣ７０を使用して、ＭＤＡ／ｍｉｔｏ細胞に対して結合研究を行う。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用して、見かけ上の解離定数（Ｋｄ）および１細胞あたりの結合抗体分子数を計算する。細胞あたりの平均抗ＨＳＣ７０結合数を、５つの独立したＳｃａｔｃｈａｒｄ測定の平均から得た。
【０３７４】
ＭＤＡ／ｍｉｔｏ細胞の表面上に存在するＨＳＣ７０エピトープの平均数を、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロットから決定する。
【０３７５】
ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＲ、ＭＤＡ、ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ／Ｔ３２０、２００８、および２００８／Ｔ３２０上に存在するＨＳＣ７０エピトープ数を、これらの細胞株とＭＤＡ／ｍｉｔｏとの間の表面曝露の相違倍率から計算する。この倍率を、１００ｎｇの放射性標識ＨＳＣ７０を使用した上記のインタクトな細胞の放射性免疫アッセイを使用した同数のＭＤＡ／ｍｉｔｏ細胞および上記細胞（約２０，０００細胞）の試験によって決定する。結果は、ＭＤＲ細胞株は、同一の細胞または起源の非ＭＤＲ新生物細胞株よりも多数の細胞表面ＨＳＣ７０エピトープを発現することを示す。
【実施例１７】
【０３７６】
（乳癌細胞および卵巣癌細胞におけるＨＳＣ７０の細胞表面曝露の誘導）これらの薬物がＭＤＡおよびＳＫＯＶ３細胞株中でＨＳＣ７０の表面曝露を誘導することができるかどうかを決定することはさらに興味深い。これを行うために、９６Ｓｔｒｉｐｗｅｌｌ（商標）プレート（Ｃｏｓｔａｒ，番号９１０２）に２０，０００個の細胞を播種する。５時間後、培養培地を除去し、種々の薬物を含む培養培地と置換し、３７℃で１２〜１６時間インキュベートする（０．５％ＣＯ2）。インキュベーション後、ウェルを１％ＦＢＳを含む１００ｍＬ培地で穏やかに洗浄し、１％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムならびに１００ｎｇの放射性ヨード化抗ＨＳＣ７０（またはＩｇＧ１）を含む１００ｍＬの培地にて３７℃で１時間インキュベートする（０．５％ＣＯ2）。トリパンブルー染色によってインキュベーション前に死亡率をチェックし、典型的には１％未満である。インキュベーション後、培地を破棄し、ウェルを１％ＦＢＳを含む３５０ｍＬ培地で２回洗浄し、それぞれガンマーカウンターで計数する。それにより、ＭＤＡ細胞を１または１０ｍＭタキソール、１または１０ｍＭドキソルビシン、または０．１または１ｍＭミトキサントロンとインキュベートした場合ＨＳＣ７０の表面曝露を決定した。値は、ＩｇＧ１との非特異的結合について補正した。
【実施例１８】
【０３７７】
（ＭＣＦ−７／ＡＲ、ＭＤＡ、ＭＤＡ／ＡＲ、およびＭＤＡ／ｍｉｔｏ細胞による125Ｉ標識抗ＨＳＣ７０の内在化）懸濁液中に保持された乳癌細胞または９６ウェルプレート中に接着した細胞における細胞表面ＨＳＣ７０の内在化を測定する。解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，番号１３１５０−０１６）を使用して１０６細胞を継代し、ホウケイ酸処理チューブに移し、ＰＢＳで洗浄し、１ｍｇの放射性ヨード化抗ＨＳＣ７０、内在化の正のコントロールとしての１ｍｇの抗ムチン−１、またはバックグラウンドコントロールとしての１ｍｇのＩｇＧ１を含む３％ＢＳＡを含む２００ｍｌのα−ＭＥＭに再懸濁する。ムチン−１（ＣＤ２２７）は、多数のヒト組織中に遍在し、腫瘍細胞ではしばしば高レベルで産生されて異常なグリコシル化パターンが認められる高度にグリコシル化されたタンパク質である。マウス抗体を、このような癌の治療目的のために臨床試験で使用し、これは市販されている（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）。４℃で１時間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、４℃または３７℃でさらに４時間インキュベートする。放射性標識ＩｇＧとのインキュベーション前の細胞のトリパンブルー染色による細胞生存率は１００％である。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ガンマーカウンターでのサンプルの計数によって放射性標識を決定する。次いで、５０ｍＭ Ｌ−Ｇｌｙ（ｐＨ２．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌにて室温で１０分間細胞を剥ぎ取り、洗浄し、残存活性をガンマーカウンターで計数する。４℃および３７℃でのＭＣＦ−７／ＡＲ細胞についての表面結合放射性標識率（Ｌ−Ｇｌｙで剥ぎ取る）および内在化率（剥ぎ取り後の残存）を決定する。内在化率を、４℃および３７℃で測定した内在化の相違から得て、これは有意である。
【０３７８】
結果は、放射性核種治療薬（または診断プローブ）に結合した抗ＨＳＣ７０抗体は多剤耐性乳房上皮新生物細胞の表面上に存在する細胞表面ＨＳＣ７０に結合し、温度依存様式で能動的に内在化されることを示す。温度依存性により、抗体−１２５Ｉ抱合体はエンドサイトーシスによって能動的に取り込まれることが示唆される。取り込み機構と無関係に、結果は、このような細胞の治療（または診断検出）のために抗ＨＳＣ７０抗体が治療薬（または診断薬）を認識してＭＤＲ新生物細胞に輸送することができることを示す。したがって、これらの結果は、新生物細胞およびＭＤＲ新生物細胞の両方のための結合治療薬および診断薬のターゲティングおよび取り込みについての抗ＨＳＣ７０抗体の有用性をさらに支持する。
【０３７９】
（等価物）当業者は、日常的実験しか使用せずに、本明細書中に詳細に記載の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３８０】
【図１Ａ】原形質膜細胞抽出物由来のＣＥＭ細胞に由来する二次元ゲル分析の写真である。
【図１Ｂ】原形質膜細胞抽出物由来の多剤耐性ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞に由来する二次元ゲル分析の写真である。
【図２Ａ−２Ｂ】図１Ｂに示す二次元ゲル由来のイソ型２（ＮＣ）に対応するスポットのＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析に由来する印刷されたレポートを示す図である。
【図２Ｃ】１２個のトリプシンペプチドから得た配列データの略図である。
【図３】ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞由来のＭＡＬＤＩ分析に由来するトリプシンペプチド配列を示すＨＳＣ７０タンパク質のアミノ酸配列の略図である。
【図４Ａ】Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｅｕ染色ビオチニル化ＨＬ６０全細胞抽出物の二次元ゲルの写真である。
【図４Ｂ】Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｅｕ染色ビオチニル化ＨＬ６０／ＡＲ全細胞抽出物の二次元ゲルの写真である。
【図５Ａ】ＨＬ６０／ＡＲ細胞から単離した二次元ゲルスポット由来のＨＳＣ７０に対応するスポットのＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析に由来する印刷されたレポートを示す図である。
【図５Ｂ】ＨＬ６０／ＡＲ細胞から単離した二次元ゲルスポット由来のＨＳＣ７０に対応するスポットのＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析に由来する印刷されたレポートを示す図である。
【図５Ｃ】１２個のトリプシンペプチドから得た配列データの略図である。
【図６】ＨＬ６０／ＡＲ細胞由来のＭＡＬＤＩ分析に由来するトリプシンペプチド配列を示すＨＳＣ７０タンパク質のアミノ酸配列の略図である。
【図７】特異的抗ＨＳＣ７０ラットモノクローナル抗体で免疫ブロッティングしたＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離膜画分の写真である。
【図８Ａ】ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞から調製し、抗ＨＳＣ７０抗体で探索した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離ビオチニル化全細胞抽出物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図８Ｂ】ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞由来のストレプトアビジン精製全細胞抽出物から調製し、抗ＨＳＣ７０抗体で探索した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離ストレプトアビジン精製抽出物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図８Ｃ】ＨＳＣ７０を含むＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞に由来し、抗ＨＳＣ７０抗体で探索した表面ビオチニル化全細胞抽出物の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離免疫沈降物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図８Ｄ】ＨＳＣ７０を含むＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞に由来し、ストレプトアビジン−ＨＲＰで探索した表面ビオチニル化全細胞抽出物の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離免疫沈降物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図９Ａ】ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞から調製し、抗ＨＳＣ７０抗体で探索した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離ビオチニル化全細胞抽出物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図９Ｂ】ＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞由来の表面ビオチニル化全細胞抽出物から調製し、抗ＨＳＣ７０抗体で探索した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離ストレプトアビジン精製抽出物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図９Ｃ】ＨＳＣ７０を含むＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞に由来し、抗ＨＳＣ７０抗体で探索した表面ビオチニル化全細胞抽出物の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離免疫沈降物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図９Ｄ】ＨＳＣ７０を含むＣＥＭおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞に由来し、ストレプトアビジン−ＨＲＰで探索した表面ビオチニル化全細胞抽出物の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離免疫沈降物のウェスタンブロッティング分析の写真である。
【図１０Ａ】ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞株に対する一次抗体として１０μｇ、２０μｇ、および４０μｇのモノクローナル抗ＨＳＣ７０抗体を使用した、ＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】ＨＬ６０およびＨＬ６０／ＡＲ細胞株に対する飽和量のマウスモノクローナル抗ＨＳＣ７０抗体でのＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１１Ａ】一次抗体として１μｇ、２．５μｇ、および５μｇの抗ＨＳＣ７０を使用した、ＣＥＭおよび多剤耐性ＣＥＭ／ＶＬＢ細胞株のＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＨＬ６０／ＡＲおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞株に対するＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１１Ｃ】ＨＬ６０／ＡＲおよびＣＥＭ／ＶＬＢ細胞株に対するＨＳＣ７０の分子数を示すグラフである。
【図１２Ａ】ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＡＲ細胞株に対する１０μｇモノクローナル抗ＨＳＣ７０抗体および１μｇＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）を使用した、ＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】ＭＤＡおよびＭＤＡ／ＡＲ細胞株に対する１０μｇモノクローナル抗ＨＳＣ７０抗体および１μｇ Ｐｇｐを使用した、ＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１３】正常な白血球、ＨＬ６０、ＨＬ６０／ＡＲ、ＣＥＭ、およびＣＥＭ／ＶＬＢ０．１細胞株に対するモノクローナル抗ＨＳＣ７０抗体を使用した、ＨＳＣ７０の表面発現についてのＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図１４Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ１７８９８に対応するヒトＨＳＣ７０のポリペプチド配列（配列番号１）の略図である。
【図１４Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３５２８３２に対応するヒトＨＳＣ７０コード核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号２）の略図である。ビメンチンタンパク質の読み取り枠の開始コドンおよび終止コドンに下線を引く。
【図１５Ａ】透過性および非透過性接着細胞の免疫染色に使用した段階的様式のプロトコールを示す流れ図である。
【図１５Ｂ】透過性および非透過性接着細胞の免疫染色に使用した段階的様式のプロトコールを示す流れ図である。
【図１６】図１５Ａおよび１５Ｂに記載の手順を使用して抗ＨＳＣ７０抗体（ラットＩｇＧ２ａ、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ ＳＰＡ−８１５）で免疫染色した透過性および非透過性ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＡＲ細胞の写真である。ネガティブコントロールとしてラットＩｇＧ２ａを使用し、いかなる染色も示さなかった（示さず）。ＭＣＦ−７／ＡＲのみが表面発現ＨＳＣ７０を示す。
【図１７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した種々の正常細胞、感受性細胞、および耐性癌細胞抽出物のウェスタンブロット分析の写真である。
【図１８】薬物耐性細胞において、ＨＳＣ７０ｍＲＮＡレベルが、その関連感受性細胞と比較して増加することを示すグラフである（それぞれにおける耐性細胞対非耐性細胞における増加倍率を示す）。
【図１Ａ】
2006512579.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
2006512579.tif 000041
【図１８】
2006512579.tif 000042
【配列表】
2006512579000001.app
【国際調査報告】
2006512579.tif 000043
2006512579.tif 000044
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