(57)【要約】本発明は、細胞の実際の状態を正確に提示するための方法およびシステムを提供することを課題とする。経時的および／またはリアルタイムで細胞内の情報を、複雑系という観点でそのままあるいは直接的に提示するシステムおよび方法を提供することもまた課題とする。  本発明によって、細胞状態を判定する方法であって、ａ）該細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして該細胞の経時プロファイルを得る工程；およびｂ）該転写状態の経時プロファイルから該細胞状態を判定する工程、を包含する、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞状態を提示する方法であって、
ａ）該細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子状態を経時的にモニターすることより、該細胞の経時プロファイルを得る工程；および
ｂ）該経時プロファイルを提示する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞を固相支持体に固定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記経時プロファイルは、リアルタイムで提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子は、転写制御配列を含み、前記遺伝子状態は、該遺伝子の発現を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞状態を判定する方法であって、
ａ）該細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得る工程；および
ｂ）該遺伝子状態の経時プロファイルに基づいて、該細胞状態を判定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記細胞を固相支持体に固定する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子は、転写制御配列を含み、かつ前記遺伝子状態は、前記遺伝子の発現を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記経時プロファイルと前記細胞状態とを、前記経時プロファイルを得る工程の前に相関付ける工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ゲノム中構造遺伝子の他のフランキング配列およびエキソン以外のゲノム配列からなる群より選択を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記転写制御配列は、構成的プロモーター、特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群より選択される少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記モニターされる転写制御配列は、少なくとも２つの転写制御配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記モニターされる転写制御配列は、少なくとも３つの転写制御配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記モニターされる転写制御配列は、少なくとも８つの転写制御配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記転写制御配列から、少なくとも１つの転写制御配列を任意に選択する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記経時プロファイルは、リアルタイムで提示される、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の前記状態は、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期および増殖状態からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、幹細胞および体細胞からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記固相支持体は、基板を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、前記転写制御配列および該転写制御配列と作動可能に連結されるレポーター遺伝子配列を含む核酸分子でトランスフェクトされる、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスフェクションは固相上または液相中で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程ｂ）は、前記経時プロファイルの、位相比較、信号処理法および多変量解析からなる群より選択される数学処理を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程ｂ）は、前記細胞の経時プロファイルとコントロールプロファイルとの差分を計算する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
外来因子と、該外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるための方法であって、該方法は：
ａ）該細胞を該外来因子に曝露する工程；
ｂ）該細胞に由来する転写制御因子からなる群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得る工程；および
ｃ）該外来因子と、該経時プロファイルとを相関付ける工程；
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記細胞は、固相支持体に固定化されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
外来因子の各々についての前記細胞の経時プロファイルを得るために、該細胞を少なくとも２つの外来因子に曝す工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも２つの経時プロファイルを種類に分割する工程、および該各々の経時プロファイルに対応する前記外来因子を種類に分類する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写制御因子は、構成性プロモーターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記転写制御因子は、誘導性プロモーターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記経時プロファイルは、リアルタイムで提示される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記工程ｃ）において、前記外来因子は、前記経時プロファイルの位相に基づいた経時プロファイルに関連する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞は、アレイ上で培養される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ｂ）は、前記アレイから画像データを得る工程を包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記（ｃ）は、前記経時プロファイルの相を、別の経時プロファイルの位相から区別する工程を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記外来因子は、温度変化、湿度変化、電磁波、電位差、可視光線、赤外線、紫外線、Ｘ線、化学物質、圧力、重力変化、ガス分圧および浸透圧からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化学物質は、生体分子、化学合成物または培地である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体分子は、ホルモンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体分子は、サイトカインである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体分子は、細胞接着因子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体分子は、細胞外マトリックスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学物質は、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
経時プロファイルに基づいて、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための方法であって、
ａ）該細胞を複数の既知の外来因子に曝露する工程；
ｂ）該細胞由来の転写制御因子からなる群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、既知の外来因子の各々に対する該細胞の経時プロファイルを得る工程；
ｃ）該既知の外来因子と、該経時プロファイルの各々とを相関付ける工程；
ｄ）該細胞を該未同定の外来因子に曝露する工程；
ｅ）該選択された転写制御配列の転写状態を経時的にモニターすることにより、該未同定の外来因子の経時プロファイルを得る工程；
ｆ）該工程（ｂ）で得られた経時プロファイルから、該工程（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；および
ｇ）該未同定の外来因子は、該工程（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子であることを判定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４４】
経時プロファイルに基づいて、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための方法であって、
ａ）該細胞に存在する転写制御配列から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関して、既知の外来因子と、該既知の外来因子に対応する該細胞の経時プロファイルとの間の相関関係に関するデータを提供する工程；
ｂ）該細胞を該未同定の外来因子に曝露する工程；
ｃ）該選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得る工程；
ｄ）該工程（ａ）において提供された、該経時プロファイルから、該工程（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；および
ｅ）該未同定の外来因子は、該工程ｄ）における該判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子であることを判定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４５】
細胞状態を提示するためのシステムであって、
ａ）該細胞に由来する転写制御配列からなる群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得るための手段；および
ｂ）該経時プロファイルを提示するための手段；
を備える、システム。
【請求項４６】
細胞状態を判定するためのシステムであって、
ａ）該細胞に由来する転写制御配列からなる群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得るための手段；および
ｂ）該経時プロファイルに基づいて、該細胞状態を判定するための手段、
を備える、システム。
【請求項４７】
外来因子と、該外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるためのシステムであって、
ａ）該細胞を該外来因子に曝露する手段；
ｂ）該細胞由来のプロモーターからなる群から選択される少なくとも１つのプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得るための手段；および
ｃ）該外来因子と、該経時プロファイルとを相関付けるための手段；
を備える、システム。
【請求項４８】
経時プロファイルに基づいて、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するためのシステムであって、
ａ）該細胞を複数の既知の外来因子に曝露するための手段；
ｂ）該細胞由来の転写制御因子からなる群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、既知の外来因子の各々に対する該細胞の経時プロファイルを得るための手段；
ｃ）該既知の外来因子と、該経時プロファイルの各々とを相関付けるための手段；
ｄ）該細胞を該未同定の外来因子に曝露するための手段；
ｅ）該選択された転写制御配列の転写状態を経時的にモニターすることにより、該未同定の外来因子の経時プロファイルを得るための手段；
ｆ）該手段（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、該手段（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定するための手段；および
ｇ）該未同定の外来因子は、該手段（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子であることを判定する手段；
を備える、システム。
【請求項４９】
経時プロファイルに基づいて、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するためのシステムであって、
ａ）該細胞に存在する転写制御配列から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関して、既知の外来因子と、該既知の外来因子に対応する該細胞の経時プロファイルとの間の相関関係に関するデータを提供するための手段；
ｂ）該細胞を該未同定の外来因子に曝露するための手段；
ｃ）該選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターすることにより、該細胞の経時プロファイルを得るための手段；
ｄ）該手段（ａ）において得られた、該経時プロファイルから、該手段（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定するための手段；および
ｅ）該未同定の外来因子は、該手段ｄ）における該判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子であることを判定するための手段；
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の解析技術の分野にある。より詳細には、細胞を連続的または経時的に観察し解析する方法およびそのためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の生存は、細胞外シグナルを認知し、そしてその細胞外シグナルに応答するそれらの能力に依存する。分子レベルにおいて、シグナルは、細胞のホメオスタシスを維持するように協同して作用し、そして増殖、分裂および分化のような活性を調節する相互作用タンパク質などのネットワークを介して、認知され、そして伝達される。生物学的シグナル伝達ネットワークを通した情報伝達は、主に、シグナルに応答して動的に集合および分解し得るタンパク質−タンパク質相互作用によって媒介され、外部事象を遺伝子発現における変化のような特定の内部出力に連結させる一過性の回路を作製する。これらのネットワークの基礎となるタンパク質−タンパク質相互作用をマップするために、多数の戦略が開発されている、そしてこれらの研究は、集合的に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅおよび他の生物について、ゲノム全体にわたるタンパク質−タンパク質相互作用の輪郭を描く豊富なデータを提供している。これらの手段は、非常に強力であるが、部分的に完成した像を提供するだけであって、おそらく、微妙な状況にある多くの相互作用（その相互作用は、それらの適切なシグナルが存在する場合にのみ、形成される）を見過ごしている。
【０００３】
変異または低分子によるタンパク質−タンパク質相互作用の崩壊は、細胞表現型における大きな変化を誘発するシグナル伝達ネットワークの小さな混乱を可能にする生物学的な支柱を作製し得るが、所定のシグナル伝達経路における全てのタンパク質−タンパク質相互作用がこの力を保有するわけではないようである。従って、細胞中へタンパク質またはペプチドを人工的に導入し（これは、目的の内因性調節相互作用と競合し、そしてその関係を崩す（ｔｉｔｒａｔｅ−ｏｕｔ））、それによって外部シグナルを細胞応答に連結させる正常な回路を破壊することによる、調節性タンパク質−タンパク質相互作用を同定することを目的とする補完的な戦略が、興味深い。機能的なアッセイ（例えば、シグナルに応答した遺伝子の活性化）とこの戦略を合わせることによって、機能的な妨害についてのスクリーニングは、調節性タンパク質−タンパク質相互作用を混乱させるペプチドを同定するために使用され得る。この戦略（しばしば、ドミナント妨害遺伝学またはドミナントネガティブ遺伝学と称される）は、いくつかのモデル生物において好首尾に使用され（ここで、高スループットのスクリーニング方法が、容易に適用されている、そして哺乳動物においてより少ない程度で使用されている（旧来、哺乳動物は、この型のスクリーニングの対象となりにくい）。ドミナントネガティブ戦略の１つの能力は、この戦略が機能的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用の「支柱の点」の位置を正確に示し、それによって、外部の因子による機能的な調節を受けやすいタンパク質ネットワークの大きな網の中で、少ない数の中心点をあらわにすることである。従って、ドミナントネガティブ戦略の結果は、特定の経路を規定する調節成分に関する極めて重大な情報を提供し得、そして薬物スクリーニングプログラムによって標的化するのに適した重要なタンパク質−タンパク質相互作用を解明し得る。
【０００４】
Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓは、いくつかの特許出願において、細胞の情報をプロファイルとして提供することを提案している（ＷＯ１０／００６０１３、ＷＯ０１／００５９３５、ＷＯ００／３９３３９、ＷＯ００／３９３３８、ＷＯ００／３９３３７、ＷＯ００／２４９３６、ＷＯ００／１７４０２、ＷＯ９９／６６０６７、ＷＯ９９／６６０２４、ＷＯ９９／５８７２０およびＷＯ９９／５９０３７）。しかし、このようなプロファイルにおいて、別々の細胞からの情報は、連続情報としてではなく、別個の情報断片の集合として処理される。したがって、この技術は、一個の（同じ）細胞に対して情報解析を行っていないという点で限界がある。特に、このような技術では、ある変化の前後の特定の各一時点のみで解析がなされており、ある一点（遺伝子）がとる時間的変化系列を解析するものではない。
【０００５】
プロファイリング技術については、近年の技術の進歩により、細胞の要素を正確に測定すること、それゆえに細胞情報をプロファイリングすることが可能になってきている（（例えば、Ｓｃｈｅｎａら，  １９９５，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，  １９９６，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６７５−１６８０；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，  １９９６，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｏ  ａｒｒａｙ：  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ’ｓ  ｓｅｃｒｅｔｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６４９；およびＷＯ０１／００６０１３）。ゲノム全体が知られている生物では、細胞内の全遺伝子の転写産物を分析することが可能である。ゲノムの情報が増えつつある他の生物の場合には、細胞内の多数の遺伝子を同時にモニタリングすることが可能である。
【０００６】
アレイ技術の進展により、薬物探索の分野などでもアレイが使用されている（例えば、Ｍａｒｔｏｎら，  １９９８，  Ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １９９８  Ｎｏｖ，４（１１）：１２９３−３０１およびＧｒａｙら，  １９９８，  Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｌｉｅｓ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８１：５３３−５３８）。プロファイルを用いた解析（例えば、米国特許第５，７７７，８８８号を参照）およびプロファイルのクラスター化は、細胞状態、移植、薬物の分子標的ならびに薬物候補および／または薬物の関連機能、薬物の効力および薬物の毒性に関する情報を与える。このような技術は理想的な薬物活性または疾患状態を表す共通のプロファイルを誘導するためにも使用され得る。プロファイルの比較は、患者の疾患を初期段階で検出するのに役立ち、そして、疾患があると診断された患者のための改善された臨床結果の予測を提供することができる。
【０００７】
しかし、新の意味で同じ細胞に関する情報し得る技術例はいまだない。上述の技術では、ヘテロな細胞集団の平均値としてデータが提示されることから、そのようなデータに基づく解析および評価は、正確性に欠ける。従って、細胞レベルでの情報を提供するための方法への需要が高まっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞の実際の状態を正確に提示するための方法およびシステムを提供することである。特に、本発明の目的は、この細胞が複雑系としてみなされる改変なしでかあるいは直接的に、経時的および／またはリアルタイムで、細胞レベルでの情報を提示するシステムおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記本発明の目的は、細胞に由来する転写制御配列から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターし、細胞の（転写状態の）経時プロファイルを提示することによって解決された。
【００１０】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１１】
（１）  細胞状態を提示する方法であって、
ａ）上記細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子の状態を経時的にモニターすることにより、上記細胞の経時プロファイルを得る工程；および
ｂ）上記経時プロファイルを提示する工程；
を包含する、方法。
【００１２】
（２）  上記細胞を固相支持体に固定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
【００１３】
（３）  上記経時プロファイルは、リアルタイムで提示される、項目１に記載の方法。
【００１４】
（４）  上記遺伝子は、転写制御配列を含み、かつ上記遺伝子の状態は、上記遺伝子の発現を含む、項目１に記載の方法。
【００１５】
（５）  細胞状態を判定する方法であって、
ａ）上記細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子の状態を経時的にモニターすることにより、上記細胞の経時プロファイルを得る工程；および
ｂ）上記遺伝子の状態の経時プロファイルに基づいて、上記細胞状態を判定する工程、
を包含する、方法。
【００１６】
（６）  上記細胞を固相支持体に固定する工程をさらに包含する、項目５に記載の方法。
【００１７】
（７）  上記遺伝子は、転写制御配列を含み、かつ上記遺伝子の状態は、上記遺伝子の発現を含む、項目５に記載の方法。
【００１８】
（８）  上記経時プロファイルを得る前に、上記経時プロファイルと上記細胞状態とを相関付ける工程をさらに包含する、項目５に記載の方法。
【００１９】
（９）  上記転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、他のゲノム中構造遺伝子のフランキング配列およびエキソン以外のゲノム配列からなる群より選択を含む、項目７に記載の方法。
【００２０】
（１０）  上記転写制御配列群は、構成的プロモーター、特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群より選択される少なくとも１つのプロモーターを含む、項目７に記載の方法。
【００２１】
（１１）  上記モニターされる転写制御配列は、少なくとも２つの転写制御配列を含む、項目７に記載の方法。
【００２２】
（１２）  上記モニターされる転写制御配列は、少なくとも３つの転写制御配列を含む、項目４に記載の方法。
【００２３】
（１３）  上記モニターされる転写制御配列は、少なくとも８つの転写制御配列を含む、項目７に記載の方法。
【００２４】
（１４）  上記転写制御配列群から、少なくとも１つの転写制御配列を任意に選択する工程をさらに包含する、項目７に記載の方法。
【００２５】
（１５）  上記経時プロファイルは、リアルタイムで提示される、項目５に記載の方法。
【００２６】
（１６）  上記細胞の上記状態は、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期および増殖状態からなる群より選択される、項目５に記載の方法。
【００２７】
（１７）  上記細胞は、幹細胞および体細胞からなる群より選択される、項目５に記載の方法。
【００２８】
（１８）  上記細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目５に記載の方法。
【００２９】
（１９）  上記固相支持体は、基板を含む、項目６に記載の方法。
【００３０】
（２０）  上記細胞は、上記転写制御配列および上記転写制御配列と作動可能に連結されるレポーター遺伝子配列を含む核酸分子でトランスフェクトされる、項目７に記載の方法。
【００３１】
（２１）  上記トランスフェクションは固相上または液相中で行われる、項目２０に記載の方法。
【００３２】
（２２）  上記工程ｂ）は、上記経時プロファイルの位相を比較することを包含する、項目５に記載の方法。
【００３３】
（２３）  上記判定工程ｂ）は、上記細胞の経時プロファイルとコントロールプロファイルとの差分をとる工程を包含する、項目５に記載の方法。
【００３４】
（２４）  外来因子と、外来因子に対する細胞の応答とを相関付ける方法であって、
ａ）上記細胞を外来因子に曝露する工程；
ｂ）上記細胞に存在する転写制御因子群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る工程；および
ｃ）上記外来因子と、上記経時プロファイルとを相関付ける工程；
を包含する、方法。
【００３５】
（２５）  上記細胞は、固相支持体に固定化された細胞である、項目２４に記載の方法。
【００３６】
（２６）  少なくとも２つの上記外来因子を使用して、各外来因子に対する経時プロファイルを得る工程を包含する、項目２４に記載の方法。
【００３７】
（２７）  上記少なくとも２つの経時プロファイルを類別することにより、上記経時プロファイルに対応する外来因子を類別する工程を包含する、項目２６に記載の方法。
【００３８】
（２８）  上記転写制御因子は、構成性プロモーターを含む、項目２４に記載の方法。
【００３９】
（２９）  上記転写制御因子は、誘導性プロモーターを含む、項目２４に記載の方法。
【００４０】
（３０）  上記経時プロファイルは、リアルタイムで提示される、項目２４に記載の方法。
【００４１】
（３１）  上記工程ｃ）において、上記外来因子は、上記経時プロファイルの位相に基づいた経時プロファイルに関連する、請求項２４に記載の方法。
【００４２】
（３２）  上記細胞は、アレイ上で培養される、項目２４に記載の方法。
【００４３】
（３３）  上記工程（ｂ）は、上記アレイから画像データを得る工程を包含する、項目３２に記載の方法。
【００４４】
（３４）  上記工程（ｃ）は、上記経時プロファイルの位相を互いに識別する工程である、項目２４に記載の方法。
【００４５】
（３５）  上記外来因子は、温度変化、湿度変化、電磁波、電位差、可視光線、赤外線、紫外線、Ｘ線、化学物質、圧力、重力変化、ガス分圧および浸透圧からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
【００４６】
（３６）  上記化学物質は、生体分子、化学合成物または培地である、項目３５に記載の方法。
【００４７】
（３７）  上記生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンからなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
【００４８】
（３８）  上記生体分子は、ホルモンである、項目３６に記載の方法。
【００４９】
（３９）  上記生体分子は、サイトカインである、項目３６に記載の方法。
【００５０】
（４０）  上記生体分子は、細胞接着因子である、項目３６に記載の方法。
【００５１】
（４１）  上記生体分子は、細胞外マトリクスである、項目３６に記載の方法。
【００５２】
（４２）  上記化学物質は、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目３５に記載の方法。
【００５３】
（４３）  経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための方法であって、
ａ）上記細胞を複数の既知の外来因子に曝露する工程；
ｂ）上記細胞に存在する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、既知の外来因子の各々に対する上記細胞の経時プロファイルを得る工程；
ｃ）上記既知の外来因子の各々と、上記経時プロファイルの各々とを相関付ける工程；
ｄ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する工程；
ｅ）上記選択された転写制御配列群に関連する転写状態を経時的にモニターして、未同定の外来因子に関する上記細胞の経時プロファイルを得る工程；
ｆ）上記工程（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、上記工程（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；および
ｇ）上記未同定の外来因子は、上記工程（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する工程；
を包含する、方法。
【００５４】
（４４）  経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための方法であって、
ａ）上記細胞に存在する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列群に関して、既知の外来因子と、上記既知の外来因子に対応する上記細胞の経時プロファイルとの相関関係に関するデータを提供する工程；
ｂ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する工程；
ｃ）上記選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る工程；
ｄ）上記工程（ａ）において提供された、上記経時プロファイルの中から、上記工程（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；および
ｅ）上記未同定の外来因子は、上記判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する工程；
を包含する、方法。
【００５５】
（４５）  細胞状態を提示するためのシステムであって、
ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手段；および
ｂ）上記経時プロファイルを提示する手段；
を備える、システム。
【００５６】
（４６）  細胞状態を判定するシステムであって、
ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手段；および
ｂ）上記転写状態の経時プロファイルから上記細胞状態を判定する手段、
を備える、システム。
【００５７】
（４７）  外来因子と、外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるためのシステムであって、
ａ）上記細胞を外来因子に曝露する手段；
ｂ）上記細胞に存在するプロモーター群から選択される少なくとも１つのプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手段；および
ｃ）上記外来因子と、上記経時プロファイルとを相関付ける手段；
を備える、システム。
【００５８】
（４８）  細胞の経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するためのシステムであって、
ａ）上記細胞を複数の既知の外来因子に曝露する手段；
ｂ）上記細胞に存在するプロモーター群から選択される少なくとも１つのプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、既知の外来因子の各々に対する上記細胞の経時プロファイルを得る手段；
ｃ）上記既知の外来因子の各々と、上記経時プロファイルの各々とを相関付ける手段；
ｄ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手段；
ｅ）上記選択されたプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、未同定の外来因子に関する上記細胞の経時プロファイルを得る手段；
ｆ）上記手段（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、上記手段（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手段；および
ｇ）上記未同定の外来因子は、上記手段（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手段；
を備える、システム。
【００５９】
（４９）  細胞の経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するためのシステムであって、
ａ）上記細胞に存在するプロモーター群から選択される少なくとも１つのプロモーターに関して、既知の外来因子と、上記既知の外来因子に対応する上記細胞の経時プロファイルとの相関関係に関するデータを提供する手段；
ｂ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手段；
ｃ）上記選択されたプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手段；
ｄ）上記手段（ａ）において提供された、上記経時プロファイルの中から、上記手段（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手段；および
ｅ）上記未同定の外来因子は、上記判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手段；
を備える、システム。
【００６０】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の実施形態は本明細書および添付の図面の記載、および当該分野において通常使用される方法に基づいて適切に実施され得ることを理解する。本発明が奏する作用および効果を、当業者は容易に理解する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
（発明の実施の形態）
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００６２】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００６３】
（細胞生物学）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６４】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。また、そのような細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物などであり得る。そのような細胞は、移植目的に使用されるものであってもよい。
【００６５】
本発明において、臓器が対象とされる場合、そのような臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明の多能性細胞から分化した細胞としては、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６６】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／-または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。
【００６７】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は胚性幹細胞であっても、組織幹細胞であってもよい。
【００６８】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００６９】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００７０】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用され得る。
【００７１】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００７２】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
【００７３】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００７４】
本明細書において細胞の「状態」とは、細胞の種々のパラメータ（例えば、細胞周期、外来因子に対する応答、シグナル伝達、遺伝子発現、遺伝子の転写など）に関する状況をさす。そのような状態としては、例えば、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期、増殖状態などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「遺伝子状態」とは、遺伝子に関連する任意の状態（例えば、発現状態、転写状態など）をいう。
【００７５】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。従って、本発明のＳｔｍ遺伝子は、未分化細胞のマーカーとして非常に有用であり得る。
【００７６】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【００７７】
（生化学・分子生物学）
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、サイクリン遺伝子というときは、通常、サイクリンの構造遺伝子およびサイクリンのプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００７８】
本明細書において配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００７９】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００８０】
本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。フィブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。
【００８１】
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。フィブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質などの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。また、トランスフェクションの対象となる分子もこのポリヌクレオチドである。
【００８２】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドの転写制御配列であれば、その転写制御配列の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
【００８３】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスサイクリン遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスサイクリン遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００８４】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００８５】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。その生物学的活性が転写調節活性である場合は、転写状態またはその変動を調節する活性をいう。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００８６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８７】
本明細書において「塩」は、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用いられ、無機塩および有機塩の両方を含む。塩は、通常、酸と塩基との中和反応によって生成する。塩には中和反応で生成するＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４などといったもののほかに、金属と酸との反応で生成するＰｂＳＯ４、ＺｎＣｌ２など種々の種類があり、これらは、直接中和反応によって生成したものでなくても、酸と塩基との中和反応から生成したとみなすことができる。塩としては、正塩（酸のＨや塩基のＯＨが塩に含まれていないもの、例えば、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｎａ２ＣＯ３）、酸性塩（酸のＨが塩に残っているもの、例えば、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＳＯ４、ＣａＨＰＯ４）、塩基性塩（塩基のＯＨが塩の中に残っているもの、例えば、ＭｇＣｌ（ＯＨ）、ＣｕＣｌ（ＯＨ））などに分類することができるがそれらの分類は、本発明においてはそれほど重要ではない。好ましい塩としては、培地を構成する塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸、ビタミン、緩衝液を構成する塩（例えば、塩化カルウム、塩化マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム）などが好ましい。細胞に対する親和性を保持または改善する効果がより高いからである。これらの塩は、単独で用いてもよいし、複数用いてもよい。複数用いることが好ましい。細胞に対する親和性が高くなる傾向があるからである。従って、ＮａＣｌなどを単独で用いるよりも、培地中に含まれる塩（例えば、塩化カルウム、塩化マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム）の複数を用いることが好ましく、より好ましくは、培地中に含まれる塩全部をそのまま使用することが有利であり得る。別の好ましい実施形態では、グルコースを加えてもよい。
【００８８】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００８９】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００９０】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９１】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００９２】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００９３】
本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原判定基をいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原判定基」または「抗原判定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを判定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を判定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを判定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて判定することができる。
【００９４】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【００９５】
本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９６】
本明細書において用いられる「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
【００９７】
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
【００９８】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：３７７）を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる。
【００９９】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
【０１００】
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１０１】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１０２】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１０３】
（プロファイルおよび関連技術）
本明細書において、細胞に関する「プロファイル」とは、細胞の生物学的状態の測定の集合をいう。特に、細胞のプロファイルという場合は、プロファイルとは、「細胞構成要素」のレベルを定量的に測定したものの測定値の集合あるいは連続であり得る。細胞構成要素には、生物学的系における遺伝子発現レベル、転写状態（転写制御配列の活性レベル）、特定の遺伝子をコードするｍＲＮＡの存在量、およびタンパク質発現レベルが含まれる。遺伝子をコードするｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現レベルなどの細胞の各種構成要素のレベルは、薬物による処置や他の細胞生物学的状態の刺激（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）または振動に応答して変化することが知られている。したがって、複数のそのような「細胞構成要素」の測定は、細胞の生物学的状態に対する刺激の効果に関する情報を豊富に含むことから、このプロファイルは、細胞の分析および詳細な解析においてますます重要となっている。哺乳動物細胞においては3万以上の異なる細胞構成要素が存在する。個々の細胞のプロファイルは通常複雑である。生物学的系の所定の状態のプロファイルは、しばしば、その生物学的系が刺激に付された後で測定される。そのような刺激としては、生物学的系と関係した実験的または環境的状態があり、例えば、生物学的系の薬物候補への暴露、外因性遺伝子の導入、時間の経過、系からの遺伝子の欠失、または培養条件の変更などがある。細胞構成要素の広範囲にわたる測定、つまり細胞における遺伝子の複製または転写、およびタンパク質の発現ならびにそれらの刺激に対する応答のプロファイルは、細胞自体の調査に加えて、薬物の効果の比較および検討、疾病の診断、患者の投薬法の最適化を含めて、広範な有用性がある。さらに、それらは基本的なライフサイエンスの研究においても有用である。
【０１０４】
本明細書において「経時プロファイル」とは、ある特定の細胞に関して言及するとき、その細胞に関するあるパラメータの経時変化を示すプロファイルをいう。そのような経時プロファイルとしては、例えば、転写状態の経時プロファイル、発現状態（翻訳状態）の経時プロファイル、シグナル伝達の経時プロファイル、神経電位の経時プロファイルなどがあるがそれらに限定されない。経時プロファイルを生成するためには、あるパラメータ（例えば、転写状態に関連する標識に起因する信号）を連続して記録し、プロファイル生成する必要がある。経時的に測定することは、連続的に測定することであるから、本明細書において「経時プロファイル」は、ときに、連続プロファイルとも称され得る。
【０１０５】
本明細書において「転写制御配列」とは、遺伝子の転写状態を調節することができる配列をいう。そのような配列は、少なくとも２ヌクレオチド長を有する。そのような配列としては、代表的に、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、他のゲノム構造中構造遺伝子のフランキング配列およびエキソン以外のゲノム配列、ならびにエキソン中の配列などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明において用いられる転写制御配列は、特定の種類に関するものではない。むしろ、転写制御配列として重要な情報は、その経時的な変動である。このような変動は、（細胞状態の変化）プロセスともいう。従って、本発明では、このような転写制御配列は、任意に選択することができる。そのような転写制御配列の中には、従来はマーカーとして使用されていなかったものを含んでいてもよい。好ましくは、転写制御配列は、転写因子に結合する能力を有する。
【０１０６】
本明細書において「転写因子」とは、遺伝子の転写の過程を調節する因子をいう。転写因子は、主として転写開始反応を調節する因子をさす。ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡ上のプロモーター領域に配置するために必要な基本転写因子群、および転写領域の上流や下流に存在するシス作用要素に結合してＲＮＡの合成開始頻度を調節する各種の転写調節因子に大別される。
【０１０７】
基本転写因子群はＲＮＡポリメラーゼの種類に応じて用意されているが，ＴＡＴＡ結合タンパク質は全転写系に共通であるとされている。転写因子の種類は多岐にわたるが、通常、構造上ＤＮＡ結合に必要な部分と転写活性化または抑制に必要な部分とからなることが多い。ＤＮＡ結合部位をもちシス作用要素に結合することができる因子を総称してトランス作用因子ともいう。
【０１０８】
転写活性化または抑制に必要な部分は、他の転写因子や基本転写因子群との相互作用に関与しており，ＤＮＡや転写開始複合体の構造変化を通して転写調節を果たしていると考えられている．これら各部の構造上の特性から転写調節因子はいくつかのグループあるいはファミリーに分類され、発生または細胞分化において重要な役割をもつ因子も多い。
【０１０９】
そのような転写因子としては、例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＧＡＳ、ＮＦＡＴ、Ｍｙｃ、ＡＰ１、ＣＲＥＢ、ＮＦκＢ、Ｅ２Ｆ、Ｒｂ、ｐ５３、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３、Ｎｋｘ−２、ＣＦ２−ＩＩ、Ｓｋｎ−１、ＳＲＹ、ＨＦＨ−２、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−３  Ｓｏｘ−５、ＨＮＦ−３ｂ、ＰＰＡＲγなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１０】
本明細書において「ターミネーター」とは、通常遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列をいう。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１１１】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を判定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。プロモーターとしては、例えば、構成的プロモーター、特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１２】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１１３】
本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有する配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなものを用いてもよく、サイレンサーを用いなくてもよい。
【０１１４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１１５】
本明細書では、他のゲノム構造中構造遺伝子のフランキング配列およびエキソン以外のゲノム配列、ならびにエキソン中の配列もまた重要であり得る。例えば、上述の特定の名称が付された配列以外の構造遺伝子のフランキング配列もまた、「プロセス」という観点では、転写制御に関連することが充分予想される。従って、そのようなフランキング配列もまた、本明細書では、転写制御配列に含まれる。エキソン以外のゲノム配列およびエキソン中の配列もまた、「プロセス」という観点では、転写制御に関連することが充分予想される。従って、エキソン以外のゲノム配列およびエキソン中の配列もまた、本明細書では、転写制御配列に含まれる。
【０１１６】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【０１１７】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【０１１８】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【０１１９】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【０１２０】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【０１２１】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【０１２２】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【０１２３】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【０１２４】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【０１２５】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
【０１２６】
本明細書において「経時的」とは、時間の経過に対して何らかの行為または現象を関連付けることをいう。
【０１２７】
本明細書において「モニター」とは、少なくとも１つのパラメータ（例えば、転写に起因する標識信号など）を指標に、細胞状態を観測することをいう。好ましくは、モニターは、検出機器または計測機器などの機器装置を用いて行われる。より好ましくは、このような機器は、データを記録および／または処理するためにコンピュータに接続される。モニターは、固相支持体（例えば、アレイ、プレートなど）の画像データを得る工程を含み得る。
【０１２８】
本明細書において「リアルタイム」とは、ある状態が、実質的に同時に別の形態で表示される（例えば、ディスプレイ上の画像としてあるいはデータ処理されたグラフとして）ことをいう。そのような場合、リアルタイムは、データ処理にかかる時間だけタイムラグが生じるが、このようなタイムラグは、実質的に無視できる場合は、リアルタイムに包含される。そのようなタイムラグは、通常１０秒以内であり、好ましくは１秒以内であり得るが、それらに限定されず、用途によっては、１０秒を超える場合もまたリアルタイムと称することがある。
【０１２９】
本明細書において細胞状態の「判定」は、種々の方法を用いて行うことができる。そのような方法は、数理的処理（例えば、信号処理法、多変量解析など）、経験的処理、位相の変化などを包含するが、それらに限定されない。
【０１３０】
本明細書において「差分」とは、あるプロファイルについて、コントロールプロファイル（例えば、刺激のない場合）の値を差し引いて提示するような数理的処理をいう。
【０１３１】
本明細書において「位相」とは、経時プロファイルについて言及されるとき、そのプロファイルが基準点（通常０とする）より増えているかまたは減っているかを判定し、それぞれ＋または−として表現することおよびそれによる解析をいう。
【０１３２】
本明細書においてプロファイル（例えば、経時プロファイル）と細胞状態との「相関付け」とは、あるプロファイル（例えば、経時プロファイル）またはその変化の特定の情報を、細胞状態に対応付けることをいい、そのような関係を相関関係という。従来、プロファイル（例えば、経時プロファイル）と細胞状態との間の相関付けることは、実質的に不可能であり、そのような関係は知られていなかったことから、本発明において、そのような相関付けを行うことができることは格別の効果といえる。
【０１３３】
本明細書において、相関付けは、少なくとも１つのプロファイル（例えば、経時プロファイル）またはその変動と、細胞、組織、臓器または生体の状態の変化（例えば、薬剤耐性）とを関連付けること、例えば、あるプロファイル（例えば、経時プロファイル）またはその変動と、細胞状態の少なくとも１つのパラメータとを定量的または定性的に対応付けることによって行うことができる。相関付けに使用される少なくとも１つのプロファイル（例えば、経時プロファイル）の数は、相関付けが行うことができる限り少ない数であってよく、通常少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つであり得るがそれらに限定されない。本発明では、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの少なくとも１つのプロファイル（例えば、経時プロファイル）を特定することによって、ほぼすべての細胞を特定するに充分であることが判明した。そのような効果は、点で見ていた従来のプロファイリングまたはアッセイでは予測不可能であったことであり、本発明によって初めてもたらされた格別の効果といえる。このような場合、少なくとも１つのプロファイル（例えば、経時プロファイル）と、細胞状態とを対応付ける場合は、行列式を利用して数学的処理を行ってもよい。１つの好ましい実施形態において、相関付けに使用する少なくとも１つのプロファイル（例えば、経時プロファイル）の数は少なくとも８つであることが有利であり得る。８種類の増減を観察することで、理論的には２５６種類の変化を対応付けることができ、生体を構成するといわれる３００種類程度の細胞の種類の数をほぼ網羅することができるからである。その意味において、そのような糖鎖構造の種類としては、少なくとも９種類、または少なくとも１０種類観察対象に含めることがさらに有利であり得る。
【０１３４】
相関付けの具体的方法としては、例えば、信号処理法（ウエーブレットなどによる）、多変量解析（クラスター解析など）などを利用する方法が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３５】
相関付けは、あらかじめ行っていてもよいが、細胞の判定ごとにコントロールを使用して行ってもよい。
【０１３６】
本明細書において「外来因子」とは、ある細胞について言及するとき、その細胞において通常内部に存在しない因子（例えば、物質、エネルギーなど）をいう。本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、電離線、放射線、光、音波などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、またはｍＲＮＡ、ＲＮＡｉのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。外来因子は、１つ用いられてもよいが、2つ以上の組み合わせを用いてもよい。本明細書において外来因子としては、温度変化、湿度変化、電磁波、電位差、可視光線、赤外線、紫外線、Ｘ線、化学物質、圧力、重力変化、ガス分圧および浸透圧などが挙げられるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態において、外来因子は、生体分子または化学合成物であり得る。
【０１３７】
本明細書において使用される「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。従って、本明細書では生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子（糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質など）などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子にはまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。通常、生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどであり得る。好ましくは、生体分子は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましくは、そのような生体分子は、ホルモンまたはサイトカインであり得る。
【０１３８】
本明細書において「化学合成物」とは、通常の化学技術を用いて合成され得るすべての物質をいう。そのような合成技術は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜そのような技術を組み合わせて化学合成物を製造することができる。
【０１３９】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。本明細書において用いられる「増殖因子」とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【０１４０】
本明細書において使用される「ホルモン」とは、当該分野において通常用いられる最も広い意味と同じ意味で用いられ、動植物の特定の器官または細胞で作られ，産出される部位からは隔たった器官にその特異的な生理作用をあらわす生理的有機化合物をいう。そのようなホルモンとしては、成長ホルモン、性ホルモン、甲状腺ホルモンなどが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなホルモンは、一部、上記サイトカインとそのさす範囲が重複し得る。
【０１４１】
本明細書において「アクチン作用物質」とは、細胞内のアクチンに対して直接的または間接的に相互作用して、アクチンの形態または状態を変化させる機能を有する物質をいう。そのような物質としては、例えば、細胞外マトリクスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなど）が挙げられるがそれらに限定されない。そのようなアクチン作用物質には、以下のようなアッセイによって同定される物質が含まれる。本明細書において、アクチンへの相互作用の評価は、アクチン染色試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）などによりアクチンを可視化した後、顕鏡し、アクチン凝集や細胞伸展を観察することによってアクチンの凝集、再構成および／または細胞伸展速度の向上という現象が確認されることによって判定される。これらの判定は、定量的または定性的に行われ得る。このようなアクチン作用物質は、トランスフェクションの効率を上昇させるために本発明において利用される。本発明において用いられるアクチン作用物質が生体に由来する場合、その由来は何でもよく、例えば、ヒト、マウス、ウシなどの哺乳動物種があげられる。
【０１４２】
本明細書において「細胞接着因子」もしくは「細胞接着分子」（Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または「接着因子」もしくは「接着分子」とは、互換可能に使用され、２つ以上の細胞の互いの接近（細胞接着）または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、細胞と細胞の接着（細胞間接着）に関する分子（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と，細胞と細胞外マトリックスとの接着（細胞−基質接着）に関与する分子（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に分けられる。本発明の方法では、いずれの分子も有用であり、有効に使用することができる。従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）も包含され、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における細胞接着分子または細胞接着分子の概念に入る。
【０１４３】
細胞間接着に関しては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの分子（ＮＣＡＭ、Ｌ１、ＩＣＡＭ、ファシクリンＩＩ、ＩＩＩなど）、セレクチンなどが知られており、それぞれ独特な分子反応により細胞膜を結合させることも知られている。
【０１４４】
他方、細胞−基質接着のために働く主要な細胞接着分子はインテグリンで，細胞外マトリックスに含まれる種々のタンパク質を認識し結合する。これらの細胞接着分子はすべて細胞膜表面にあり，一種のレセプター（細胞接着受容体）とみなすこともできる。従って、細胞膜にあるこのようなレセプターもまた本発明の方法において使用することができる。そのようなレセプターとしては、例えば、αインテグリン、βインテグリン、ＣＤ４４，シンデカンおよびアグリカンなどが挙げられるがそれに限定されない。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周知であり、例えば、細胞外マトリックス−臨床への応用−  メディカルレビュー社に記載されている。
【０１４５】
ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）ＰＤＲ法、ハイブリダイゼイション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを判定することにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１）、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれに限定されない。このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）ＰＤＲ法、ハイブリダイゼイション法というアッセイにおいて陽性となることを判定することにより判定することができる。
【０１４６】
細胞接着分子としては、例えば、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（ＣＤ  ２、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１など）；インテグリンファミリー分子（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ１、ＶＬＡ２、ＶＬＡ３、ＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＶＬＡ６など）；セレクチンファミリー分子（Ｌ−セレクチン，Ｅ−セレクチン，Ｐ−セレクチンなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４７】
本明細書において「細胞外マトリクスタンパク質」とは「細胞外マトリクス」のうちタンパク質であるものをいう。本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、当該分野において通常用いられる意味と同様の意味で用いられ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。従って、本発明において用いられる細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、弾性繊維、膠原繊維などが挙げられるがそれに限定されない。
【０１４８】
本明細書において「レセプター」とは、細胞上または核内などに存在し、外界からの因子または細胞内の因子に対する結合能を有し、その結合によりシグナルが伝達される分子をいう。レセプターは通常タンパク質の形態をとる。レセプターの結合パートナーは、通常リガンドという。
【０１４９】
本明細書において「アゴニスト」とは、ある生体作用物質（例えば、リガンド）のレセプターに結合し、その物質のもつ作用と同じ(あるいは類似の)作用を現わす因子をいう。
【０１５０】
本明細書において「アンタゴニスト」とは、ある生体作用物質（例えば、リガンド）のレセプターへの結合に拮抗的に働き、それ自身はそのレセプターを介した生理作用を現わさない因子をいう。拮抗薬、遮断剤（ブロッカー）、阻害剤（インヒビター）などもこのアンタゴニストに包含される。
【０１５１】
（デバイス・固相支持体）
本明細書において「デバイス」とは、装置の一部または全部を構成することができる部分をいい、支持体（好ましくは固相支持体）およびその支持体に担持されるべき標的物質などから構成される。そのようなデバイスとしては、チップ、アレイ、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、シャーレ、フィルム、ビーズなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１５２】
本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することができる材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１５３】
支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書において、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよく、コーティングされていなくてもよい。
【０１５４】
本明細書において「液相」とは、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用いられ、通常、溶液中での状態をいう。
【０１５５】
本明細書において「固相」とは、当該分野において用いられる意味と同じ意味で用いられ、通常、固体の状態をいう。本明細書において液体および固体を総合して流体ということがある。
【０１５６】
本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１５７】
プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。トランスフェクションアレイのためには、スライドグラスが好ましい。好ましくは、そのような基材は、コーティングされ得る。
【０１５８】
本明細書において「コーティング」とは、固相支持体または基板について用いられるとき、その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体および基板の品質向上（例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。そのようなコーティングのための物質としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体および基板自体に使用される物質のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ＭＡＳ（松浪硝子、岸和田、日本から入手可能）、疎水性フッ素樹脂）、シラン（ＡＰＳ（例えば、γ−アミノプロピルシラン））、金属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択することができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、（例えば、エポキシシランまたはメルカプトシラン、ＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン））、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利であり得る。このような物質は、細胞または細胞を含む物体（例えば、生体、臓器など）に適合する物質を用いることが好ましい。
【０１５９】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６０】
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の標的物質を含む組成物（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、トランスフェクト混合物）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のトランスフェクト混合物のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる抗体を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質を含む組成物は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の標的物質を含む組成物が固定され得る。
【０１６１】
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質（例えば、抗体のようなタンパク質）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える標的物質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、抗体のようなタンパク質）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって判定される。本発明では、細胞への導入が企図される標的物質を含む組成物は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
【０１６２】
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。
【０１６３】
本明細書において使用される「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
【０１６４】
各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、標的物質を含む組成物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
【０１６５】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
【０１６６】
マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール（実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座１）、ゲノム医科学とこれからのゲノム医療（実験医学増刊）などに広く概説されている。
【０１６７】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
【０１６８】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１６９】
（検出）
本発明の細胞分析または判定方法では、細胞またはそれに相互作用する物質に起因する情報を検出することができる限り、種々の検出方法および検出手段を用いることができる。そのような検出方法および検出手段としては、例えば、目視、共焦点顕微鏡、レーザー光源を用いた読取装置、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング、電気信号、化学的または生化学的マーカーを用いる方法および手段を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような検出装置の例としては、蛍光分析装置、分光光度計、シンチレーションカウンター、ＣＣＤ、ルミノメーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。生体分子を検出することができるあらゆる手段が使用され得る。
【０１７０】
本明細書において「マーカー」とは、目的とする物質または状態についてレベルまたは頻度を示す生物学的因子をいう。そのようなマーカーの例としては、遺伝子をコードする核酸、遺伝子産物、代謝産物、レセプター、リガンド、抗体などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１７１】
したがって、本明細書において細胞状態に関連する「マーカー」とは、転写制御因子のほか、細胞状態を示す細胞内因子（例えば、遺伝子をコードする核酸、遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質など）、代謝産物、レセプターなど）に対して相互作用する因子（例えば、リガンド、抗体、相補的な核酸など）が挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、このようなマーカーは、経時プロファイルを生成して解析するために使用され得る。そのようなマーカーは、好ましくは、目的とする因子と相互作用し得る。本明細書中で使用される場合、マーカーに対する「特異性」とは、類似の分子よりも目的の分子に対する相互作用の程度が有意に高いマーカーの性質をいう。本発明では、そのようなマーカーは、細胞内部に存在するが、細胞外に存在してもよい。
【０１７２】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別する因子（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げられるが、これらに限定されない。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質が標識のために使用される。各々の蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であり得ることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、好ましくは、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等が挙げられる。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識および目的とする対象に、適切な方法を用いてそのような改変を実施することができる。
【０１７３】
本明細書において「相互作用」には、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１７４】
本明細書において「相互作用のレベル」とは、２つの物質（細胞などを含む）の間の相互作用について言及する場合、その２つの物質の間の相互作用の程度または頻度をいう。そのような相互作用のレベルは、当該分野において周知の方法によって測定することができる。そのような方法としては、例えば、実際に相互作用し固定状態にある細胞の数は、例えば、限定されることなく、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡などを使用するか、あるいは細胞に特異的なマーカー、抗体、蛍光標識などで細胞を染色してその強度を測定することにより、直接または間接的（例えば、反射光強度）に計数される。これらのレベルは、マーカーから直接または標識を介して間接的に表示することができる。このようなレベルの測定値から、例えば、あるスポットにおいて実際に転写または発現する遺伝子の個数または頻度を算出することができる。
【０１７５】
（提示および表示）
本明細書において「表示」および「提示」とは、互換可能に使用され、本発明の方法に従って得られたプロファイルまたはそれに由来する情報を直接または間接的にあるいは情報処理をした形態で具現化することをいう。そのような表示の形態としては、グラフ、写真、表、アニメーションなど種々の方法があり、限定されない。そのような技術は、例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ．  ５６，  ｅｄ．  １９９８，  ｐｐ：１８５−２１５、Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｌｕｄｅｒ  ＆  Ｗｏｌｆ、Ｓａｌｍｏｎ）に記載され、顕微鏡を自動化し、カメラを制御するためのアプリケーションソフトウェアとともに、自動光学顕微鏡、カメラ、およびＺ軸フォーカス装置を含む、ハードウェアシステムの設計について議論されており、本発明において利用することができる。カメラによるイメージ取得は、Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｖｉｄｅｏ  Ｍｉｒｏｓｃｏｐｙ，２ｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９７に詳細に記載されており、本明細書において参考文献として援用される。
【０１７６】
リアルタイムの表示もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。例えば、全てのイメージが取得され、半永久的メモリに格納された後か、あるいはイメージの取得と実質的に同時に、イメージは、適切なアプリケーションソフトウェアで処理され、処理されたデータを得ることができる。例えば、データは、画像が中断されないシーケンスをプレイバックする、リアルタイムでイメージを表示する、または焦点面における変化および連続として、照射光を示す「ムービー」として表示するための方法により、処理することができる。
【０１７７】
別の実施形態では、測定および表示用アプリケーションソフトウェアは、通常刺激付与の条件または検出信号の記録条件を設定するためのソフトウエアを含んでいる。この測定および表示用アプリケーションによって、コンピュータは細胞に刺激を付与する手段と、細胞から検出された信号を処理する手段とを有するだけでなく、光学観察手段（ＳＩＴカメラおよび画像ファイル装置）および／または細胞培養手段の制御を行うこともできる。
【０１７８】
パラメータ設定画面では、キーボード、タッチパネルまたはマウスなどを用いて刺激条件を入力することにより、所望の複雑な刺激条件の設定が可能である。その他、細胞培養の温度、ｐＨなどの諸条件の設定をキーボード、マウスなどを用いて行うことができる。
【０１７９】
表示画面では、細胞から検出された経時プロファイルまたはそれに由来する情報をリアルタイムでまたは記録後に表示する。また、記録された別のプロファイルまたはそれに由来する情報を細胞の顕微鏡像に重ねて表示することもできる。記録情報の表示とともに、記録時の測定パラメータ（刺激条件、記録条件、表示条件、処理条件、細胞の諸条件、温度、ｐＨ等）もまたリアルタイムで表示することができる。温度またはｐＨが許容範囲を外れたときの警報機能も備えられていてもよい。
【０１８０】
データ解析画面では、種々の数理解析（例えば、フーリエ変換、クラスター解析、ＦＦＴ解析、コヒーレンス解析、コリレーション解析など）の条件を設定することが可能である。一時的なプロファイル表示機能、トポグラフィー表示機能、も備えていてもよい。これらの解析結果は、記録媒体に保存されている顕微鏡像に重ねて表示することができる。
【０１８１】
（遺伝子導入）
本明細書において、核酸分子を細胞に導入するために、あらゆる技術が使用され得、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。本明細書では、トランスフェクションが好ましい。
【０１８２】
本明細書において「トランスフェクション」とは、遺伝子ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡなどを、実質的に（ウイルス粒子を除く）裸の状態でかまたはこのような遺伝子物質を細胞の懸濁液に加えて、細胞に取り込ませて遺伝子導入またはトランスフェクションを行うことをいう。通常トランスフェクションによって導入された遺伝子は、一過的に細胞において発現するが、永続的に取り込まれる場合もある。
【０１８３】
そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット分析およびウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１８４】
本明細書において遺伝子操作について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有する。クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に従って、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて宿主の細胞中で作動し得る状態の種々の調節エレメントを含む核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。
【０１８５】
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示されるが、これらに限定されない。
【０１８６】
動物細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示されるが、これらに限定されない。
【０１８７】
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８８】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８））などが挙げられる。
【０１８９】
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、遺伝子導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に使用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９０】
遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法も使用され得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述の技術に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。他の分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１９１】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞において、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。「発現量」としては、本発明の抗体を用いた免疫学的測定方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法など）を含む任意の適切な方法により評価されるポリペプチドのタンパク質発現量、または分子生物学的測定方法（例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法など）を含む適切な方法により評価されるポリペプチドのｍＲＮＡ発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡ発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１９２】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の物質（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。
【０１９３】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的対象の免疫表現型分類のために利用され得る。遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用される。そのような技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１９４】
これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような細胞増殖および／または分化を起こし得るかまたは未分化状態への改変処置を行った未分化の細胞（例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞など）を含む細胞集団についてスクリーニングするために利用され得る。
【０１９５】
（診断）
本明細書において「診断」とは、被検体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、糖鎖構造を分析し、薬剤耐性レベルと相関付けることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。
【０１９６】
本発明の診断方法は、原則として、被検体の身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。
【０１９７】
（治療）
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、ある疾患または障害の現状維持、より好ましくは、ある疾患または障害の軽減、さらに好ましくはある疾患または障害を消長させることをいう。
【０１９８】
本明細書において「被検体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被検体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０１９９】
本明細書において、被験体の疾患、障害または状態に関する「原因」もしくは「病因」とは、その疾患、障害または状態に関連する因子をいい（総称して「病変」ともいい、または植物では「病変」ともいう）、原因または病因となる物質（病原因子）、疾患因子、疾患細胞、病原ウイルスなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２００】
本発明が対象とする「疾患」は、病原遺伝子が関連する任意の疾患であり得る。そのような疾患としては、癌、ウイルスまたは細菌による感染症、アレルギー、高血圧、高脂血症、糖尿病、心臓病、脳梗塞、痴呆症、肥満、動脈硬化性疾患、不妊症、精神神経疾患、白内障、早老症、紫外線放射線過敏症などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２０１】
本発明が対象とする「障害」は、病原遺伝子が関連する任意の障害であり得る。
【０２０２】
そのような疾患、障害または状態の具体例としては、例えば、循環器系疾患（貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、がん性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、がんまたは腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫）など）；神経系疾患（痴呆症、脳卒中およびその後遺症、脳腫瘍、脊髄損傷など）；免疫系疾患（Ｔ細胞欠損症、白血病など）；運動器・骨格系疾患（骨折、骨粗鬆症、関節の脱臼、亜脱臼、捻挫、靱帯損傷、変形性関節症、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨形成不全症、骨軟骨異形成症など）；皮膚系疾患（無毛症、黒色腫、皮膚悪性リンパ腫、血管肉腫、組織球症、水疱症、膿疱症、皮膚炎、湿疹など）；内分泌系疾患（視床下部・下垂体疾患、甲状腺疾患、副甲状腺（上皮小体）疾患、副腎皮質・髄質疾患、糖代謝異常、脂質代謝異常、タンパク質代謝異常、核酸代謝異常、先天性代謝異常（フェニールケトン尿症、ガラクトース血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症）、無アルブミン血症、アスコルビン酸合成能欠如、高ビリルビン血症、高ビリルビン尿症、カリクレイン欠損、肥満細胞欠損、尿崩症、バソプレッシン分泌異常、侏儒症、ウオルマン病（酸リパーゼ（Ａｃｉｄ  ｌｉｐａｓｅ）欠損症）、ムコ多糖症ＶＩ型など）；呼吸器系疾患（肺疾患（例えば、肺炎、肺がんなど）、気管支疾患、肺がん、気管支がんなど）；消化器系疾患（食道疾患（たとえば、食道がん）、胃・十二指腸疾患（たとえば、胃がん、十二指腸がん）、小腸疾患・大腸疾患（たとえば、大腸ポリープ、結腸がん、直腸がんなど）、胆道疾患、肝臓疾患（たとえば、肝硬変、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型など）、劇症肝炎、慢性肝炎、原発性肝がん、アルコール性肝障害、薬物性肝障害）、膵臓疾患（急性膵炎、慢性膵炎、膵臓がん、嚢胞性膵疾患）、腹膜・腹壁・横隔膜疾患（ヘルニアなど）、ヒルシュスプラング病など）；泌尿器系疾患（腎疾患（腎不全、原発性糸球体疾患、腎血管障害、尿細管機能異常、間質性腎疾患、全身性疾患による腎障害、腎がんなど）、膀胱疾患（膀胱炎、膀胱がんなど）など）；生殖器系疾患（男性生殖器疾患（男性不妊、前立腺肥大症、前立腺がん、精巣がんなど）、女性生殖器疾患（女性不妊、卵巣機能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮がん、子宮内膜症、卵巣がん、絨毛性疾患など）など）；循環器系疾患（心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋・心膜疾患、先天性心疾患（たとえば、心房中隔欠損、心室中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴）、動脈疾患（たとえば、動脈硬化、動脈瘤）、静脈疾患（たとえば、静脈瘤）、リンパ管疾患（たとえば、リンパ浮腫）など）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２０３】
本明細書において「癌」は、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは新しい身体の部位に転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、がんは固形がんおよび造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。
【０２０４】
本明細書において「固形がん」は、固形の形状があるがんをいい、白血病などの造血器腫瘍とは対峙する概念である。そのような固形がんとしては、例えば、乳がん、肝がん、胃がん、肺がん、頭頸部がん、子宮頸部がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道がん、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２０５】
本明細書において「がん治療」は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、放射線治療など）を投与することによって行われるか、または外科的に除去などをする外科的治療を包含する。
【０２０６】
本明細書において用いられる化学療法剤は、当該分野において周知であり、抗がん剤マニュアル第２版  塚越茂他編  中外医学社；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。そのような化学療法剤は、例えば、以下が挙げられる：１）アルキル化剤（ＤＮＡ，タンパク質などの細胞構成成分をアルキル化して細胞毒性を示す。例えば、シクロホスファミド，ブスルファン、チオテパ、ダカルバジンが挙げられるがそれらに限定されない）；２）代謝拮抗剤（おもに核酸の合成を阻害する薬剤（例えば、葉酸代謝拮抗剤としてメトトレキサートなど、プリン代謝拮抗剤として６−メルカプトプリンなど、ピリミジン代謝拮抗剤としてフルオロウラシル（５−ＦＵ）など）；３）ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、エトポシド（それぞれトポイソメラーゼＩ、ＩＩを阻害する））；４）チューブリン作用薬（微小管形成を阻害し、細胞分裂を抑制する。ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）；５）白金化合物（ＤＮＡおよびタンパク質との結合による細胞毒性を示す。シスプラチン、カルボプラチンなど）；６）抗がん抗生物質（ＤＮＡと結合し、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成を阻害する。アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンなど）；７）ホルモン剤（乳がん、子宮がん、前立腺がんなどホルモン依存性のがんに適応。タモキシフェン、リュープロレリン（ＬＨ−ＲＨ）など）；８）生物製剤（アスパラギン要求性血液悪性腫瘍に対して有効なアスパラギナーゼ、直接的な抗腫瘍作用と免疫増強による間接作用を示すインターフェロンなどがある）；９）免疫賦活剤（免疫応答能を増強し、間接的に抗腫瘍活性を示す。シイタケ由来の多糖体であるレンチナン、微生物由来のペプチドであるベスタチンなど）。
【０２０７】
本明細書において「抗がん剤」とは、がん（腫瘍）細胞の増殖を選択的に抑制し、がんの薬剤および放射線治療の両方を包含する。そのような抗がん剤は当該分野において周知であり、例えば、抗がん剤マニュアル第２版  塚越茂他編  中外医学社；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０２０８】
本明細書において「放射線治療」とは、電離放射線または放射性物質を利用した疾患の治療をいう。代表的な放射線療法としては、Ｘ線、γ線、電子線、陽子線、重粒子線、中性子捕捉療法が挙げられるがそれに限定されない。例えば、重粒子線治療が好ましい。しかし、重粒子線治療は大きな装置を必要とし、一般的には使用されない。放射線療法は当該分野において周知であり、例えば、放射線検査と治療の基礎；放射線治療と集学的治療:邵啓全(滋賀医大 放射線):総合消化器ケア  ６巻  ６号  Ｐａｇｅ  ７９−８９，６−７  （２００２．０２） に記載されている。本発明において同定される薬剤耐性は、通常化学療法が想定されるが、放射線療法による耐性もまた経時プロファイルと関連付けられることから、本明細書では、放射線療法は薬剤の概念の中に入る。
【０２０９】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤、農学的もしくは薬学的アジュバントなど。
【０２１０】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、薬剤耐性レベルに関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態またはタイプなどを参照して、当業者が容易に判定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に判定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０２１１】
本明細書において「指示書」は、本発明のテイラーメイド治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などをいつ投与するか（例えば、放射線治療直後または直前（例えば、２４時間以内など））が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０２１２】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための薬剤耐性レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
【０２１３】
本発明ではまた、得られた薬剤耐性に関する情報を元に、遺伝子治療を施すことも可能である。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被検体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２１４】
本発明では、いったん類似の種類（例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物に関し、ある特定の経時プロファイルの分析結果と、細胞状態とが相関付けられた場合、対応する経時プロファイルの分析結果と、細胞状態とが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【０２１５】
本発明はまた、そのような特定の経時プロファイルをもとに遺伝子治療に応用され得る。
【０２１６】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０２１７】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２１８】
（基本技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、本発明の技術範囲内にある。これらの技術は、フルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野において一般的に使用される。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
【０２１９】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（または、全体でもあり得る）が本明細書において参考として援用される。
【０２２０】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０２２１】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０２２２】
（遺伝子の同時調節の解析）
本明細書において用いられる数理処理は、例えば、生命システム解析のための数学、コロナ社、清水和幸（１９９９）などにおいて記載される周知技術を適用することができる。以下にそのようなもののなかから代表的な解析手法を説明する。
【０２２３】
１つの実施形態では、そのような数理処理は、回帰分析であり得る。回帰分析としては、線形回帰（単回帰分析法、重回帰分析法、ロバスト推定法などが挙げられる）、非線形推定法などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２４】
単回帰分析法では、ｎ組のデータ（ｘ１，ｙ１）〜（ｘｎ，ｙｎ）が、
ｙｉ＝ａｘｉ＋ｂ＋ｅｉ（ｉ＝１，２．．．ｎ）にフィットさせられ、ａおよびｂは、モデルパラメータであり、ｅｉは直線からのずれまたは誤差を表わす。パラメータａおよびｂは、代表的に、データ点と直線との距離の二乗和の平均値が最小となるように決定される。ａおよびｂを決めるという分析が通常行われる。このような場合、偏微分をして、連立一次方程式を立て、これらの方程式を、二乗誤差を最小にするようにａおよびｂについて解く。このような値を、最小二乗推定値という。
【０２２５】
次に、それぞれのデータから平均値を引いた値を元に、回帰直線を求める。
【０２２６】
ＡＳｉＸｉ＋Ｂ＝ＳＹｉ
に表わされる回帰直線を想定する。Ｂ＝０を仮定し、（ｘｉ，ｙｉ）（ｉ＝１，２，．．．ｎ）の中から平均値（ｘａｖｅおよびｙａｖｅ）を求め、ｘの分散ｓｘｘおよびｘ、ｙの共分散ｓｘｙを求める。次式により上記の回帰直線を求めることができる。
【０２２７】
ｙ−ｙａｖｅ＝（ｓｘｙ／ｓｘｘ）（ｘ−ｘａｖｅ）。
【０２２８】
ｒｘｙ＝ｓｘｙ／√（ｓｘｙｓｙｙ）により、相関係数ｒｘｙが表わされる。
この場合、Ｓｅｉ２／ｎ＝ｓｙｙ（１−ｒｘｙ２）の関係があることから、｜ｒｘｙ｜が１に近いほど、誤差は少なく、データは回帰直線でよく表せることを意味する。ここで、である。
【０２２９】
別の実施形態において使用される重回帰分析法は、ｙが１つの独立変数ではなく、２つまたはそれ以上の変数の関数と考えられ、例えば、
ｙ＝ａ０＋ａ１ｘ１＋ａ２ｘ２＋．．．＋ａｎｘｎ
であらわされるような式で表される。
【０２３０】
これを重回帰式という。ここで、ａ0などは(偏）回帰係数と呼ばれる。重回帰分析法では、最小二乗法を適用して、正規方程式を解くことによって、重みつき最小二乗推定が求められる。ここでも単回帰分析と同様の評価を行うことが可能である。
【０２３１】
別の実施形態において、ロバスト推定法が用いられる。最小二乗法は、測定値に偏りがなく、その測定誤差が正規分布をし、モデルにも近似の誤差がないという前提に基づいている。しかし、実際の場合には、測定ミスがあり得る。ロバスト推定法では、信頼できないデータを、大多数の信頼できるデータから、アウトライヤー（ｏｕｔｌｉｅｒ）として検出して除いたり、または統計処理の対象とする。このようなロバスト推定法もまた、本発明において利用され得る。
【０２３２】
非線形推定法もまた本明細書において用いられ得る。このような非線形推定法では、非線形モデルをベクトル方程式として表して解を求めることが可能である。
【０２３３】
本発明において用いられる数理処理としては、このほかに、主成分分析法、があり、二次元データの主成分分析、多次元データの主成分分析、特異値分解、一般化逆行列を利用する。あるいは、正準相関分析法、因子分析法、判別分析法、クラスター分析法などが利用され得る。
【０２３４】
（クラスター分析による遺伝子セット分類）
多くの用途に対して、広範な条件にわたって共同で制御される基準転写制御配列のセットを見出すことが所望され得る。このような基準転写制御配列セットを同定する実施形態としては、クラスター化アルゴリズムが挙げられる(クラスター化アルゴリズムの概説は、例えば、Ｆｕｋｕｎａｇａ、１９９０、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ａｎｄｅｒｂｅｒｇ、１９７３、Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｅｖｅｒｉｔｔ、１９７４、Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｅｄｕｃ．Ｂｏｏｋｓ；Ｈａｒｔｉｇａｎ、１９７５、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ；ＳｎｅａｔｈおよびＳｏｋａｌ、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎを参照）。
【０２３５】
転写制御配列セットは、転写制御機構に基づいて定義することもできる。調節領域に同一または類似の配列の転写因子結合部位を有している転写制御配列は、共同調節されやすい。ある好ましい実施態様では、目的とする転写制御配列の調節領域を、多重アラインメント分析を用いて比較し、可能な共有転写因子結合部位を解読することができる（Ｓｔｏｒｍｏ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｚｅｌｌ，  １９８９，  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｕｎａｌｉｇｎｅｄ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：１１８３−１１８７；Ｈｅｒｔｚ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｍｏ，  １９９５，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｕｎａｌｉｇｎｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  ａ  ｌａｒｇｅ−ｄｅｖｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｅｎａｌｉｚｉｎｇ  ｇａｐｓ，  Ｐｒｏｃ  ｏｆ  ３ｒｄ  Ｉｎｔｌ  Ｃｏｎｆ  ｏｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｌｉｍ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ編，  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，  ｐｐ．２０１−２１６）。
【０２３６】
種々の条件にわたって共同調節される基本転写制御配列セットを得ることが所望され得る。これにより、本発明の方法が、プロファイルに基づく判定において十分にかつ効率よく機能するようになる。このような基本転写制御配列セットを同定するための好ましい実施形態はクラスター化アルゴリズムを含む
クラスター分析を用いる実施形態において、生物学的対象に種々の刺激を施しながら、多数の転写制御配列の転写状態をモニターすることができる。転写制御配列の転写状態の測定を含むデータの表がクラスター分析に用いられる。種々の条件にわたって同時変化する転写制御配列を含む基本転写制御配列セットを得るためには、通常少なくとも２、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも10、さらに好ましくは50を超え、最も好ましくは100を超える刺激または条件を用いる。クラスター分析はｍ×ｋ次元を有するデータの表に対して行い、ここでｍは条件または刺激の合計数であり、かつｋは測定する転写制御配列の数である。
【０２３７】
多くのクラスター化アルゴリズムがクラスター化分析に有用である。クラスター化アルゴリズムは、対象間の相違点または距離をクラスター形成のために用いる。ある実施形態においては、用いられる距離は多次元空間におけるユークリッド距離：
【０２３８】
【数１】
2006522605.tif 000002
【０２３９】
であり、（ｘ，ｙ）は遺伝子Ｘと遺伝子Ｙとの（または、あらゆる他の細胞構成要素（例えば、転写制御配列）ＸとＹとの）間の距離であり；ＸｉおよびＹｉは刺激ｉに応答する遺伝子発現を表わす。ユークリッド距離を平方してさらに距離の増大とともに増大する重みをかけることができる。あるいは、距離基準は、例えば転写制御配列Ｘと転写制御配列Ｙとの間の距離、またはマンハッタン距離であってもよく、これは：
【０２４０】
【数２】
2006522605.tif 000003
【０２４１】
によって与えられる。ここでもやはり、ＸｉおよびＹｉは刺激ｉが適用される場合の転写制御配列応答または遺伝子発現応答を表わす。他の幾つかの距離の定義は、チェビシェフ距離、パワー距離および不一致率を含む。次元のデータが改変されることなく分類される場合、Ｉ（x,y）＝（Ｘｉ≠Ｙｉの数）／ｉとして定義される不一致率が本発明の方法において利用され得る。このような方法は、細胞応答に関連して特に有用である。他の有用な距離定義はＩ＝１−ｒであり、ここで、ｒは応答ベクトルＸ、Ｙ間の相関係数（例えば、正規化内積Ｘ・Ｙ／｜Ｘ｜｜Ｙ｜）である。具体的には、内積Ｘ・Ｙは式：
【０２４２】
【数３】
2006522605.tif 000004
【０２４３】
によって定義され、かつ｜Ｘ｜＝（Ｘ・Ｘ）１／２、かつ｜Ｙ｜＝（Ｙ・Ｙ）１／２である。
【０２４４】
最も好ましくは、距離基準を、例えば、同時変化するおよび／または同時調節される細胞構成要素（例えば、転写制御配列など）を同定するために、生物学的問題点に適合させる。例えば、特に好ましい実施形態において、距離は、遺伝子ＸおよびＹの加重内積を含む相関係数を有するＩ＝１−ｒを基準とする。具体的には、この好ましい実施形態において、ｒηは以下に示す式：
【０２４５】
【数４】
2006522605.tif 000005
【０２４６】
によって定義される。式中、σｌ（Ｘ）およびσｌ（Ｙ）は、実験ｉにおける遺伝子ＸおよびＹの測定の標準誤差を表わす。
【０２４７】
上記正規化および加重内積（相関係数）は、値＋１（２つの応答ベクトルが完全に相関する（すなわち、本質的に同一である））と−１（２つの応答ベクトルが相関していないかまたは同一方向を向いていない（すなわち反対を向いている））との間に拘束される。これらの相関係数は、同じ兆候または応答を有する細胞構成要素（例えば、転写制御配列など）セットまたはクラスターを求める本発明の実施形態に特に好ましい。
【０２４８】
別の実施形態において、同じ生物学的応答または経路を同時調節するかまたはそのような調節に関与しているが、類似するか、もしくは非相関の応答を含む細胞構成要素（例えば、転写制御配列）のセットまたはクラスターを同定することが好ましい。このような実施形態においては、上述の正規化または加重内積のいずれかの絶対値、すなわち｜ｒ｜を相関係数として使用することが好ましい。
【０２４９】
さらに他の実施形態においては、同時調節されるおよび／または同時変化する細胞構成要素（転写制御配列など）の間の関係はさらに複雑であり、多数の生物学的経路（例えばシグナル伝達経路）が同じ細胞構成要素（例えば、転写制御配列）に関与し、異なる結果を出し得る。そのような実施形態においては、同時変化するおよび／または同時調節される細胞構成要素（変化に関与しないコントロールとしての別の転写制御配列）を同定することができる、相関係数ｒ＝ｒ（変化）を用いることが好ましい。以下の式（数５）に特定される相関係数は、そのような実施形態において特に有用である：
【０２５０】
【数５】
2006522605.tif 000006
【０２５１】
種々のクラスター連関法則が本発明の方法において有用である。
【０２５２】
このような方法としては、例えば、単一連関法、最近接点法などが挙げられこれらの方法は、２つの最も近い対象物間の距離を測定する。あるいは、本明細書において使用され得る完全連関法は、異なるクラスターにある２つの対象物間の最大距離を測定する。この方法は、遺伝子または他の細胞構成要素が天然に別個の「凝集（clump）」を形成する場合には特に有用である。
【０２５３】
あるいは、非加重ペア群の平均が、２つの異なるクラスターにおける対象物ペア全ての間の平均距離を定義するために使用される。この方法もまた、天然に別個の「凝集」を形成する遺伝子または他の細胞構成要素をクラスター化するのに有用である。最後に、加重ペア平均法もまた利用可能である。この方法は、それぞれのクラスターのサイズを重みとして使用することを除けば非加重ペア平均法と同じである。この方法は、転写制御配列などのクラスターのサイズが非常に可変すると疑われる実施形態に特に有用である（ＳｎｅａｔｈおよびＳｏｋａｌ、１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．）。他のクラスター連関法則、例えば非加重および加重ペア群セントロイドおよびウオード法もまた本発明のいくつかの実施形態に有用である。例えば、Ｗａｒｄ，  １９６３，  Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔ  Ａｓｓｎ．５８：  ２３６；Ｈａｒｔｉｇａｎ，  １９７５，  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙを参照のこと。
【０２５４】
ある好ましい一つの実施形態において、クラスター分析はｈｃｌｕｓｔの周知技術（例えば、プログラムＳ−Ｐｌｕｓ，ＭａｔｈＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡからの「ｈｃｌｕｓｔ」の周知の手順を参照のこと）を用いて行うことができる。
【０２５５】
本発明により、クラスター化セットにおける刺激の多様性が大きくなっても、本発明を用いて解析した場合は、通常少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのプロファイルを解析しただけで、細胞状態を実質的に評価することができるということが見出された。刺激条件には、異なる濃度での薬剤処理、処理後の異なる測定時間、種々の遺伝子中の遺伝的変異に対する応答、薬剤処理と変異との組合せ、ならびに増殖条件の変化（温度、密度、およびカルシウム濃度など）が含まれる。
【０２５６】
本明細書において「有意に異なる」とは、２つの統計量について言及されるとき、２つの統計量が互いに統計的有意性を伴って異なることをいう。本発明の実施形態において、細胞構成要素の応答に関する実験のセットのデータを、モンテカルロ法で無作為化することにより、客観的試験を定義することができる。
【０２５７】
ある実施形態においては、客観的試験を以下の方法で定義することができる：  ｐｋｉを、実験ｉにおける構成要素ｋの応答とする。ＩＩ（ｉ）を実験のインデックスの無作為並べ替えとする。次いで、多数（約１００〜１０００）の異なる無作為並べ替えについて、ｐｋΠ（ｉ）をたてる。元のツリーの各分枝および各並べ替えに関して：  （１）並べ替えていない元のデータに対して用いたのと同じアルゴリズム（この場合は「ｈｃｌｕｓｔ」）を用いて階層的クラスター化を行う；
（２）１つのクラスターから２つのクラスターへ移動する際の、クラスター中心に関しての総分散における分別の改善ｆを計算する；
【０２５８】
【数６】
2006522605.tif 000007
【０２５９】
式中、Ｄｋは、構成要素が帰属するクラスターの中心に関しての構成要素ｋの距離基準（平均）の二乗である。上付の１または２は、全分枝の中心または２つのサブクラスターのうちのより好適なクラスターの中心を示す。このクラスター化法において使用する距離関数Ｄは、かなりの自由度がある。これらの例においては、Ｄ＝１−ｒであり、ｒは、実験セットを横断する１つの構成要素の応答間の、別の応答に対しての（または平均クラスター応答に対しての）相関係数である。
【０２６０】
詳細には、好ましくは客観的統計学的検定を用いてあらゆるクラスター化法またはアルゴリズムのグループ化判定の統計学的信頼性を判定することができる。好ましくは、同様の検定を、階層的および非階層的クラスター化法の双方に用いることができる。クラスターのコンパクト性は、例えば、「クラスターの平均値」からのクラスターのエレメントの距離の二乗の平均として、またより好ましくは、クラスターの平均値からのエレメントの距離の二乗の平均値の逆数として、定量的に定義される。特定のクラスターのクラスター平均値は、一般に、クラスターの全てのエレメントの応答ベクトルの平均値として定義される。しかし、特定の実施形態（クラスターの平均値に定義が疑わしい場合など）では、例えば、正規化または加重内積の絶対値を用いて、クラスター化アルゴリズムの距離関数(即ち、Ｉ=1−|r|)を評価する。通常、上記の平均値の定義は、応答ベクトルが反対方向を向き、上記に定義するクラスター平均値がゼロになる実施形態では問題が生じ得る。従って、このような実施形態では、クラスターのコンパクト性の異なる定義を選択することが好ましく、例えば限定はしないが、クラスター内のエレメントの全てのペア間の距離の二乗の平均値などがある。あるいは、クラスターのコンパクト性は、クラスターの各エレメント(例えば、細胞構成要素)とそのクラスターの他のエレメントとの間の平均距離(またはより好ましくは、平均距離の逆数)を意味すると定義することができる。
【０２６１】
本発明において用いられる統計的方法においても使用しうるその他の定義は、当業者には明らかである。
【０２６２】
別の実施形態では、本発明のプロファイルは、信号処理技術を用いて解析することができる。そのような信号処理技術では、相関関数を定義し、相関係数を計算し、自己相関関数および相互相関関数を定義し、これらの関数を、重み付けの総和が１になるように計算することによって、移動平均を求めることができる。
【０２６３】
信号処理において、時間領域および周波数領域を考慮することが重要である。自然現象、特に生命および生体の動特性解析において、リズムは重要であることが多い。ある時間関数ｆ（ｔ）が、次の条件を満たす場合、この関数を周期関数という。
【０２６４】
ｆ（ｔ）＝ｆ（ｔ＋Ｔ）
時間０において、関数の値はｆ（０）であり、その後種々の値をとった後時刻Ｔの時点で再びｆ（０）をとる。このような関数を周期関数と呼び、このような関数としては、再び、正弦様波が挙げられる。ここで、Ｔを周期と呼ぶ。ここで、関数は、Ｔ時間に１回のサイクルを有する。あるいは、単位時間当たりのサイクル数を意味する１／Ｔ（サイクル／時間）と表現してもその情報は失われない。このように単位時間当たりのサイクル数で表現される概念は周波数と呼ばれる。ここで周波数をｆとしてあらわすと、
ｆ＝１／Ｔ
で表現できる。
【０２６５】
ここで、周波数は時間の逆数であり、時間領域において時間を扱い、周波領域において周波数を扱う。電気工学的に周波数を表現することもできる。例えば、周期は、角度によって表現され、３６０°または２πラジアンに対応される。このような場合、ｆ（サイクル／秒）は２πｆ（ラジアン／秒）となり、これを一般にω（＝２πｆ）とあらわして、角周波数と呼ぶ。
【０２６６】
ここで、正弦波と余弦波とを比較すると、余弦波は正弦波を、９０°またはπ／２ラジアン平行移動させたものになる。ここで、正弦波は余弦波の時間遅れとしてあらわすことができ、この時間の遅れを位相（ｐｈａｓｅ）という。例えば、純粋な余弦波において位相を０とすると、正弦波では位相は９０°となる。例えば、正弦波と余弦波とを足したものは、生じた波の振幅が√２増え、位相がπ／４となる。
【０２６７】
このような解析において、フーリエ級数および周波数解析の手法が利用され得る。また、フーリエ変換、離散フーリエ変換およびパワースペクトルを利用することも可能である。フーリエ級数展開において、ウエーブレット変換の方法などが利用され得る。このような手法は、当該分野において周知であり、生命システム解析のための数学、コロナ社、清水和幸（１９９９）、臨床医学のためのウェーブレット解析、医学出版、石川康宏に記載されている。
【０２６８】
（好ましい実施形態の説明）
以下に、実施形態により本発明を記載する。以下に記載される実施形態は、例示の目的に過ぎず、従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を除く実施形態によっては限定されない。
【０２６９】
（細胞状態の提示）
１つの局面において、本発明は、細胞状態を提示する方法を提供する。このような方法は、ａ）上記細胞に由来する遺伝子（例えば、転写制御配列を含む）群から選択される少なくとも１つの遺伝子（例えば、上記転写制御配列を含む）に関連する遺伝子状態（例えば、遺伝子の発現（転写、翻訳など））を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る工程；およびｂ）上記経時プロファイルを提示する工程；を包含する。ここでは、例えば、モニターした結果得られる信号強度のプロファイルを区間微分することにより、変化の関数を得、表示することができる。この場合、好ましくは、例えば、構成的プロモーターなどの変化しないと仮定される転写制御配列を基準に差分を取ることによってそのような経時プロファイルを得ることができるがそれに限定されない。遺伝子群としては、異なる転写制御配列を含む群を用いることが好ましいがそれに限定されない。
【０２７０】
経時プロファイルの表示は、どのような方法を用いてもよいが、例えば、ディスプレイ装置を用いて視覚的に表示してもよく（例えば、ｘ軸に時間、ｙ軸に信号強度）、あるいは、数値表として表示してもよい。あるいは、信号強度を光強度としてディスプレイに表示することも可能である。
【０２７１】
好ましくは、細胞は、固相支持体（例えば、アレイ、プレート、マイクロタイタープレートなど）に固定されてモニターされる。そのような固定は、当該分野において公知の方法または本明細書において記載される方法に基づいて行うことができる。
【０２７２】
好ましい実施形態において、このような経時プロファイルは、リアルタイムで提示され得る。ここで、リアルタイム表示は、実質的に同時に表示することができる限り、ある程度のタイムラグが生じてもよい。許容されるタイムラグは、求められるリアルタイムの同時性によるが、例えば、最大で１０秒であり、より好ましくは最大で１秒である。
【０２７３】
（細胞状態の判定）
別の局面において、本発明は、細胞状態を判定する方法を提供する。このような細胞状態の判定は、従来においてはまったく観察されていなかった遺伝子（例えば、転写制御因子）の状態（たとえば、その遺伝子の発現（例えば、転写、翻訳など）の状態）の変化をモニターすることにより達成され、従って、本発明の細胞状態の判定方法は、従来観察することができなかった種々の状態を判定することを可能にする。このような方法は、ａ）上記細胞に由来する遺伝子（例えば、転写制御配列を含む）群から選択される少なくとも１つの遺伝子（例えば、上記転写制御配列を含むもの）に関連する遺伝子状態（例えば、遺伝子の発現（転写、翻訳など）状態）を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る工程；およびｂ）上記転写状態の経時プロファイルから上記細胞状態を判定する工程を包含する。遺伝子群としては、異なる転写制御配列を含む群を用いることが好ましいがそれに限定されない。
【０２７４】
好ましくは、細胞は、固相支持体（例えば、アレイ、プレート、マイクロタイタープレートなど）に固定された状態でモニターされる。そのような固定方法は、当該分野において公知の方法または本明細書において記載される方法を用いて行うことができる。
【０２７５】
好ましい実施形態において、本発明の細胞状態判定方法では、経時プロファイルと細胞状態とをその経時プロファイルを入手する前に相関付ける工程をさらに包含することが有利であり得る。あるいは、そのような相関付けの情報の既知情報があらかじめ提供されてもよい。そのような相関付けの工程は、相関情報はデータベースとして保存することができ、必要なときに使用することができる。
【０２７６】
好ましい実施形態では、転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、他のゲノム中構造遺伝子のフランキング配列およびエキソン以外のゲノム配列などであり得るがそれらに限定されない。プロモーターが好ましい。転写状態を直接測定することができるからである。
【０２７７】
特定の実施形態では、転写制御配列は、構成的プロモーター、特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターなどであり得る。ここで、プロモーターは、どのようなものでも使用され、本発明は、あらゆるタイプのプロモーターを使用できることで特徴付けられる。本発明の方法を用いることにより、プロファイルを「プロセス」という視点で解析することが可能となったことから、任意のプロモーターまたは任意のプロモーターのセットを用いて細胞状態を判定することが可能になった。そのような判定は、従来の技術では不可能であったことであり、本発明は、従来技術からは達成不可能であったことを達成したということからその有用性は高い。
【０２７８】
好ましい実施形態では、少なくとも２つの転写制御配列がモニターされる。少なくとも２つの転写制御配列を観察することによって、代表的に、８０％の細胞状態の同定が可能になる。より好ましくは、少なくとも３つの転写制御配列がモニターされる。少なくとも３つの転写制御配列を観察することによって、代表的に、少なくとも９０％の細胞状態を同定することが可能となる。最も好ましい実施形態において、少なくとも８つの転写制御配列がモニターされる。少なくとも８つの転写制御配列を観察することによって、通常、ほぼすべての細胞状態を同定することが可能となる。このように、任意の転写制御配列を選択したにもかかわらず、上述のような少ない数のみを選択し、それをモニターすることによって、ほぼすべての細胞状態を判定することができることは、予想されていなかったことであり、これは、時間点ごとに観察し、それをヘテロな集団として統計処理をした従来の判定方法に比較して、はるかに簡便で精密で正確な判定を提供することになる。
【０２７９】
従って、本発明の判定方法では、モニターする前に、遺伝子（例えば、転写制御配列を含む）群から、少なくとも１つの遺伝子（例えば、その転写制御配列を含む）を任意に選択する工程をさらに包含することが好ましい。本発明の１つの重要な特徴は、遺伝子（例えば、特定の転写制御配列を含む）として、点ごとの調査では特異性を示していないものでも使用可能であるという点にあるからである。
【０２８０】
好ましい実施形態において、このような経時プロファイルは、リアルタイムで提示され得る。ここで、リアルタイムは、実質的に同時に表示することができる限り、ある程度のタイムラグが生じてもよい。許容されるタイムラグは、求められるリアルタイム（同時性）によるが、例えば、最大で１０秒であり、より好ましくは最大で１秒であり得る。例えば、リアルタイムの診断が必要な治療などでは、そのタイムラグは、例えば、最大で３０秒であってもよい。
【０２８１】
好ましい特定の実施形態において、本発明の細胞状態判定方法で判定される状態としては、例えば、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期および増殖状態などが挙げられる。より詳細には、そのような状態としては、例えば、がん細胞の抗がん剤に対する応答、薬剤耐性、生物時間に対する応答、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞など）の分化状態、あるいは精製した幹細胞（例えば胚性幹細胞）の未分化状態などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２８２】
従って、好ましい実施形態では、本発明の細胞状態判定方法により判定される細胞としては、幹細胞または体細胞あるいはそれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２８３】
あるいは、そのような細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物であってもよい。
【０２８４】
１つの好ましい実施形態では、本発明の細胞状態判定方法は、固相支持体として基板上に固定された細胞を対象として行うことができる。そのような場合、固相支持体はチップと呼ばれ、細胞が基板上に整列して配置される場合は、その基板はアレイとも呼ばれる。
【０２８５】
特に好ましい実施形態において、本発明の細胞状態判定方法では、判定に供される転写制御配列は、作動可能に連結され、対象となる細胞にトランスフェクトされることが有利である。このような形態において、転写制御因子の転写状態がレポーター遺伝子の信号として測定することが可能となるからである。
【０２８６】
このようなトランスフェクトは、固相上または液相中で行われ得る。ここで、トランスフェクトのために、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための方法が利用され得る。本発明は、通常の条件下では、ほとんど細胞に導入されない標的物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、糖鎖またはそれらの複合物質など）を、フィブロネクチンのようなアクチン作用物質とともに細胞に提示する（好ましくは、接触させる）ことによって、その標的物質が効率よく細胞に導入されるという作用を利用する。従って、このトランスフェクション方法は、Ａ）標的物質（すなわち、転写制御配列を含むＤＮＡ）を提供する工程；Ｂ）アクチン作用物質（例えば、フィブロネクチン）を提供する工程を順不同に包含し、Ｃ）該標的物質および該アクチン作用物質を該細胞に接触させる工程をさらに包含する。ここで、標的物質およびアクチン作用物質は、一緒に提供されてもよく、別々に提供されてもよい。アクチン作用物質としては、上述の本発明の標的物質の細胞内への導入の効率を上昇させるための組成物において詳述した形態が適用され得る。そのような形態は、当業者は、本明細書の記載に基づけば、適切な形態を実施することができる。したがって、このようなアクチン作用物質は、本発明の標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成物において適用される形態で実施することができる。好ましくは、アクチン作用物質は、細胞外マトリクスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなど）またはその改変体であり得る。より好ましくは、フィブロネクチンまたはその改変体もしくはそのフラグメントが使用され得る。
【０２８７】
１つの実施形態において、本発明において使用される転写制御配列は、転写因子に結合する能力を有する。そのような転写因子としては、例えば、ＩＳＲＥ、ＲＡＲＥ、ＳＴＡＴ３、ＧＡＳ、ＮＦＡＴ、ＭＩＣ、ＡＰ１、ＳＲＥ，ＧＲＥ，ＣＲＥ、ＮＦκＢ、ＥＲＥ、ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ、Ｒｂ、ｐ５３などが挙げられるがそれらに限定されない。このような転写因子は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ  から市販されているものを利用することができる。ここで、ＩＳＲＥは、ＳＴＡＴ１／２と関連し、ＲＡＲＥはレチノイン酸と関連する。ＳＴＡＴ３は分化制御に関連し、ＧＲＥは糖代謝に関連する。ＣＲＥは、ｃＡＭＰに関連し、ＴＲＥは甲状腺ホルモンに関連する。Ｅ２Ｆは細胞周期に関連し、ｐ５３はＧ１チェックポイイントに関連する。従って、このような情報を元に、細胞状態を判定することが可能である。
【０２８８】
好ましい実施形態において、本発明における判定工程ｂ）は、上記経時プロファイルの位相を比較することを包含する。位相の算出は、本明細書において上述される一般方法、および実施例に記載される方法を参酌して、当業者が適宜行うことができる。
【０２８９】
別の好ましい実施形態において、本発明における判定工程ｂ）は、上記細胞の経時プロファイルとコントロールプロファイルとの差分をとる工程を包含する。差分の算出は、本明細書において上述される一般方法、および実施例に記載される方法を参酌して、当業者が適宜行うことができる。
【０２９０】
別の好ましい実施形態において、本発明における判定工程ｂ）は、信号処理法および多変量解析からなる群より選択される数学処理を包含する。このような数学処理を、当業者は、本明細書の記載を参酌して、容易に実施することができる。
【０２９１】
（データ生成）
1つの局面において、本発明は、細胞の情報に関するプロファイルデータを生成する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞を支持体上に提供して固定する工程；およびｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；を包含する。この局面の本発明の重要な特徴のひとつは、同一の細胞に関して継続して（例えば、経時的に）情報が得られるように、細胞を実質的に支持体上の同一の箇所に固定する点にある。これにより、細胞の生物学的因子およびその集合体の経時的モニターが可能となった。経時的モニターが可能となったことにより、細胞のプロファイルを得ることができ、デジタル細胞を構築することが可能となった。細胞を支持体に固定するために、本発明は、支持体において、例えば、塩のような固定化剤が使用され得る。塩と、正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体と、細胞との組み合わせで支持体に細胞が固定され得る。そのような塩としてはどのようなものでも使用することができ、例えば、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンなどが利用され得るがそれらに限定されない。そのような正に荷電した物質と負に荷電した物質との組み合わせとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される負に荷電した物質と、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される正に荷電した物質との複合体が挙げられるがそれらに限定されない。本発明において、好ましい実施形態では、対象となる生物学的因子が核酸分子または該核酸分子に由来する分子であり得る。核酸分子は、遺伝情報を司ることが多く、そのような遺伝情報に関し、細胞の情報を得ることができるからである。
【０２９２】
別の局面において、本発明は、ａ）細胞を支持体上に提供して固定する工程；およびｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；を包含する方法によって得られるデータに関する。このようなデータは、従来なかった方法によって得られるデータであり、新規のものである。従って、本発明は、このようなデータを含む記録媒体を提供する。
【０２９３】
別の局面において、本発明は、複数の同一環境にある細胞の情報に関するプロファイルデータを生成する方法に関する。この方法は、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体上に提供する工程；およびｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルのデータを生成する工程を包含する。この局面の本発明の重要な特徴のひとつは、同一環境にある複数の細胞の情報に関するプロファイルデータを得ることができる点にある。そのような環境を提供する技術もまた、本発明の範囲内にある。同一環境を複数の細胞に提供するために、本発明は、支持体において、例えば、塩のような固定化剤が使用され得る。塩と、正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体と、細胞との組み合わせで支持体に細胞が固定され得る。本発明において、そのような塩としてはどのようなものでも使用することができ、例えば、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンなどが利用され得るがそれらに限定されない。そのような正に荷電した物質と負に荷電した物質との組み合わせとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチド、化学化合物、及びその複合体からなる群より選択される負に荷電した物質と、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、カチオン性ポリアミノ酸及びその複合体からなる群より選択される正に荷電した物質との複合体が挙げられるがそれらに限定されない。本発明において、好ましい実施形態では、対象となる生物学的因子が核酸分子または該核酸分子に由来する分子であり得る。核酸分子は、遺伝情報を司ることが多く、そのような遺伝情報に関し、細胞の情報を得ることができるからである。
【０２９４】
好ましい実施形態において、本発明の方法では、対象となる細胞には、アクチン作用物質が提供されることが好ましい。アクチン作用物質は、細胞内のアクチンに作用し、細胞の内部骨格を変形させて、外来因子を導入することが容易になるという効果を有する。このようなアクチン作用物質の存在により、目的となる外来因子の細胞内での影響を調べることが可能となる。
【０２９５】
１つの実施形態において、本発明において対象とされる生物学的因子は、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質、低分子、それらの複合分子からなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む。
【０２９６】
好ましい実施形態において、本発明では、対象となる細胞は、モニター前に、ある程度の期間刺激なしで培養することが好ましい。対象となる細胞を同期化するためである。同期化に必要な期間としては、例えば、少なくとも１日間、より好ましくは、少なくとも２日間、さらに好ましくは少なくとも３日間、さらにより好ましくは少なくとも５日間培養することが有利であり得る。ただし、培養が長くなるにつれ、培養条件を維持する必要性が高くなる。同期化は、各細胞に供給される培地が同一であることが好ましいことから、培養中の培地は、常に同一であるか、あるいは、少なくとも同様に変化していることが好ましい。したがって、好ましくは、そのために、培地を対流させる手段を備え、使用してもよい。
【０２９７】
より好ましい実施形態において、本発明において細胞に提供される生物学的因子は、遺伝子をコードする核酸分子を含み得る。遺伝子をコードする核酸分子は、好ましくは、細胞にトランスフェクトされる。好ましくは、トランスフェクション試薬（遺伝子導入試薬）とともにこのような生物学的因子が提供され得る。さらに好ましくは、遺伝子をコードする核酸分子は、遺伝子導入試薬およびアクチン作用物質とともに細胞に提供され得る。このとき、細胞は、塩と、正に荷電した物質と負に荷電した物質と（ここでは、核酸分子と遺伝子導入試薬と）の複合体とともに提供されることが好ましい。このことにより、細胞および対象となる分子が支持体に固定され、さらに壁のない状態で別々の生物学的因子（例えば、核酸分子）が細胞内に導入されることが可能となった。ほぼ壁のない状態が使用される事から、実質的に同一の環境下で複数の細胞をモニターすることが可能となる。しかも、異なる生物学的因子を細胞内に導入することもできることから、そのような生物学的因子によって影響を受ける、細胞状態のプロファイルを取得することができるようになった。このようなプロファイルは、データとして格納することが可能であり、しかも、そのようなデータは、一定の規格でなされたデータであるから、再現および比較が可能となるという点で、従来の生物学的アッセイで得らなかった効果を有するといえる。しかも、そのような一定の規格で生成されたデータは、一度格納されると、何度でも多種多様な目的で取り出して使用することができることから、例えば、研究者が種々の解析を行うために、全く同一条件で実質的に無限大の条件の違いを考慮して「仮想実験」を行うことも可能となった。その上、仮想実験および結果が、生の形で格納されていることから、従来、ウェットな仕事でその学生生活の大半をすごさざるを得なかった、生物系の大学生および大学院生が、真の意味でのデータ解析教育を受けることも可能になった。また、上記の細胞プロファイルデータは、規格化することが容易であるので、世界中で同じ条件で実験を行ったと考えてよいデータをもとに研究を行うことが可能となった。そのようなデータは、規格化された形態で流通されてもよい。そのような規格化された形態は、通常のコンピュータ（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍａｃ、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＬＩＮＵＸなどの通常手に入るＯＳが装備されたもの）によって読み取り可能な形態であり得る。本発明で生成されるデータは、生成された細胞プロファイルデータ、生成の際に使用した実験条件に関する情報、細胞に関する情報、環境に関する情報などを含み得る。
【０２９８】
好ましい実施形態において、本発明が対象とするプロファイルは、遺伝子発現のプロファイル、アポトーシスシグナルのプロファイル、ストレスシグナルのプロファイル、分子（好ましくは、蛍光、燐光、放射性物質またはその組み合わせにて標識される）の局在化に関するプロファイル、細胞形態の変化、プロモーターのプロファイル、特定薬剤（例えば、抗生物質、リガンド、毒素、栄養素、ビタミン、ホルモン、サイトカインなど）依存性のプロモーターのプロファイル、分子間相互作用のプロファイルなどを含み得る。ここで、本発明の対象が、特定薬剤依存性のプロモーターのプロファイルを含む実施形態において、本発明は、好ましくはこの特定薬剤を投与するさらに工程を含んでいてもよい。
【０２９９】
好ましい実施形態において、本発明は、外来刺激が細胞に提供される工程をさらに包含してもよい。このような外来刺激は、生物学的因子であってもよく、そうでなくてもよい。外来因子は、任意の因子であり得、例えば、物質または他の要素（例えば、電離線、放射線、光、音波などのエネルギー）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３００】
１つの実施形態において、本発明において使用される外来因子は、ＲＮＡｉを含み得る。ＲＮＡｉは、実質的に任意の遺伝子の抑制を調べることができることから、存在する全ての遺伝子分のＲＮＡｉを作製してその遺伝子に対する効果を調べることもできる。ＲＮＡｉは当該分野において周知の方法によって作製することができる。
【０３０１】
別の実施形態において。本発明において使用される外来因子は、生体に存在しない化学物質を含み得る。このように生体に存在しない化学物質を、細胞に提供することによって、種々の情報を収集することができる。また、一旦収集されたデータは再利用することができることから、生体に存在しない化学物質がほとんど入手不可能な場合であっても、一旦本発明においてデータを取得することができれば、入手可能性を気にすることなく、研究を続けることが可能となる。
【０３０２】
１つの実施形態において、本発明が対象とし得る外来因子は、細胞のレセプターに対するリガンドを含み得る。リガンドを分析することによって、種々のシグナル伝達経路を調査することが可能である。したがって、このような場合、本発明によって得られるプロファイルは、レセプターリガンド相互作用のプロファイルを含む。
【０３０３】
好ましい実施形態において、本発明によって得られるプロファイルは、細胞形態であり、ここで、本発明の方法は、遺伝子の過剰発現、過小発現ノックダウン、外来因子の添加および環境の変化からなる群より選択され得る刺激を細胞に与える工程をさらに含んでいてもよい。
【０３０４】
より好ましい実施形態において、本発明によって得られるプロファイルは、細胞内に存在する分子間の相互作用のプロファイルを含む。このような分子間の相互作用のプロファイルとしては、例えば、シグナル伝達経路において登場する分子と分子との間の相互作用、レセプターとリガンドとの相互作用、転写因子と転写因子配列との相互作用などのプロファイルが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３０５】
別の好ましい実施形態では、本発明によって得られるプロファイルは、前記細胞内に存在する分子間の相互作用のプロファイルを含み、ここで、本発明はツーハイブリッド法、ＦＲＥＴおよびＢＲＥＴからなる群より選択される技術を用いた観察を行う工程をさらに包含する。ここで、ツーハイブリッド法は、分子間相互作用を細胞内において検出する。詳細に関しては、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ａ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている（この文献は、ＦＲＥＴも記載する）。ＦＲＥＴは、分子間、分子内の共鳴エネルギー移動を蛍光波長の変化として検出するという技術であり、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、前出、Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２００３  Ｍａｒ；４（３）：２９５−３０５．Ｒｅｖｉｅｗに説明されている。ＢＲＥＴは、分子間相互作用アッセイシステムであり、Ｂｏｕｔｅ  Ｎ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＢＲＥＴ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＲＥＴ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００２  Ａｕｇ；２３（８）：３５１−４に詳述されている。
【０３０６】
１つの好ましい実施形態において、本発明では、対象となる細胞が、支持体上にアレイ状に配置されていることが好ましい。この場合、好ましくは、本発明において対象となる複数の細胞は、各々が最大１０ｃｍ、より好ましくは、最大１ｃｍ、さらに好ましくは、最大１ｍｍもっとも好ましくは、最大０．１ｍｍの間隔をあけて配置され得る。細胞同士は、最低限の間隔をあけることが必要である。そのような間隔は、実質的に相互作用をしない程度に保つことが好ましい。
【０３０７】
１つの実施形態において、本発明で得られるプロファイルはリアルタイムに得られてもよいが、得られなくてもよい。リアルタイムプロファイルが有利であり得る。同時性が重要である場面ではそのようなリアルタイムでプロファイルを得ることは重要である。あるいは、格納することが目的の場合は、必ずしもリアルタイム性は必要ではない。
【０３０８】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞を固相支持体に固定する工程をさらに包含する。ここで、固体支持体への細胞の固定は、塩、複合体、アクチン作用物質などとともに行う。
【０３０９】
１つの実施形態において、本発明によって生成されるデータは、プロファイルに関する情報を含み得る。好ましい実施形態では、本発明によって生成されるデータは、モニターにおける条件に関する情報、細胞状態に関する情報、外来因子に関する情報、環境に関する情報などを含んでいてもよい。
【０３１０】
好ましい実施形態において、本発明においてモニターされる生物学的因子は、少なくとも２種の生物学的因子を含み、より好ましくは、少なくとも３種の生物学的因子を含み、さらに好ましくは、少なくとも８種の生物学的因子を含み得る。あるいは、ある特定のカテゴリーすべての生物学的因子（例えば、全ての嗅覚レセプター、全ての味覚レセプター）をモニターすることが好ましい。
【０３１１】
あるいは、別の好ましい実施形態では、本発明は、このような生物学的因子を任意に選択する工程をさらに包含してもよい。
【０３１２】
好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は、幹細胞および体細胞からなる群より選択され得る。
【０３１３】
１つの実施形態において、本発明において使用される支持体は、固相支持体であることが好ましい。細胞をこのような支持体に固定することが容易であるからである。そのような固相支持体は、当該分野において公知の任意の物質を材料として使用することができる。ここで、この支持体は、基盤の形態を採っていてもよい。
【０３１４】
１つの実施形態において、本発明では、上記生物学的因子は核酸であり、この細胞は、該核酸でトランスフェクトされることができる。このように核酸でトランスフェクトすることによって、その核酸が細胞に与える影響をリアルタイムであるいは規定化された格納可能な様式でデータまたはプロファイルとして収集することが可能となる。このようなことは、従来技術では実現不可能であった。好ましい実施形態では、このトランスフェクトは固相上または液相中で行われ得る。より好ましくは、このトランスフェクトは固相上で行われることが有利である。データ収集および規格化がより容易であるからである。
【０３１５】
本発明の好ましい実施形態では、プロファイルは、位相の比較、コントロールプロファイルとの差分計算、信号処理法および多変量解析からなる群より選択される処理により処理され得る。そのように処理されたデータもまた、本発明の範囲内にある。
【０３１６】
別の局面において、本発明は、複数の同一環境にある細胞の情報に関するプロファイルデータの提示方法を提供する。この方法は、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体上に提供する工程；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；およびｃ）該データを提示する工程、を包含する。
【０３１７】
ここで、複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体は、本明細書において別に詳述したとおりに実施することができる。データを生成する工程もまた、本明細書において別に詳述したとおりに実施することができる。データを提示する工程もまた、本明細書において別に詳述したとおりに実施することができる。そのようなデータ提示方法としては、例えば、視覚的、聴覚的、嗅覚的、触覚的、味覚的など種々の感覚手段を利用する方法が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、視覚的な提示手段が利用される。例えば、コンピュータのディスプレイなどが例示され得るが、これらに限定されない。
【０３１８】
好ましくは、本発明の提示方法では、提示はリアルタイムで行われ得る。あるいは、格納されたデータを呼び出して遅れて提示されてもよい。リアルタイムで提示が行われるべき場合は、データ信号が直接例えばディスプレイに送信され得る。
【０３１９】
別の局面において、本発明は、同一環境にある細胞状態を判定する方法を提供する。ここで、この方法は、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体上に提供する工程；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；およびｃ）該データから該細胞状態を判定する工程、を包含する。
【０３２０】
ここで、複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体は、本明細書において別に詳述したとおりに実施することができる。データを生成する工程もまた、本明細書において別に詳述したとおりに実施することができる。細胞状態を判定する工程は、例えば、生成されたデータと、細胞に関する情報とを相関付けるか、あるいは、標準的なデータと比較することなどによって判定を行うことができる。この場合、統計学的処理が行われてもよい。
【０３２１】
したがって、ある実施形態において、本発明は、本発明によって得られるプロファイルと細胞状態とを経時プロファイルを得る前に相関付ける工程をさらに包含する。判定を円滑に行うためには、本発明において対象とする細胞は、状態が既知の細胞を含むことが有利である。状態が既知の細胞に関するデータをすでに保持することが可能であることから、その既知細胞と未知細胞とのデータ比較により、判定を迅速に行うことが可能となるからである。
【０３２２】
判定の際には、好ましくは、対象となる生物学的因子は、少なくとも２種存在する。そのような生物学的因子が複数存在するとき、生物学的因子は、異種カテゴリー（例えば、タンパク質および核酸など）であってもよく、同種カテゴリーであってもよい。
【０３２３】
好ましくは、本発明は、生物学的因子を任意に選択する工程をさらに包含する。どのような生物学的因子を選択して使用しても、細胞状態は、ある程度特徴付けることができ、場合によっては同定することも可能であることから、本発明は、従来技術からは想像もつかない効果を奏する。
【０３２４】
ここで、本発明の判定方法では、好ましくは、データは、リアルタイムで生成される。データがリアルタイムで生成されることにより、未知物質または状態が未知の細胞の判定がリアルタイムで行われ得るからである。
【０３２５】
ここで、本発明の判定方法において、対象とされる細胞状態としては、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期および増殖状態などが挙げられるが、それらに限定されない。
【０３２６】
本発明において対象とされる細胞は、幹細胞であっても体細胞であってもよい。体細胞は、どのような細胞であってもよい。細胞の選択は、細胞を使う目的によって当業者が適宜選択することができる。
【０３２７】
本発明の判定方法で用いられる固相支持体は、基板を含む。基板とすることで、本発明は、コンピュータシステムの一部としてその基板を使用し、自動的に判定を行うことが可能となる。システム構成例は、図４４に示される。
【０３２８】
好ましい実施形態において、本発明の判定方法では、生物学的因子は核酸分子であり、前記細胞は該核酸分子でトランスフェクトされる。どのような物を利用してもよいが、好ましくは、遺伝子導入試薬、さらに好ましくは、塩、アクチン作用物質などを用いて固相支持体上でトランスフェクトされることが好ましい。トランスフェクトは固相上で行われても液相中で行われてもよいが、好ましくは固相上で行われ得る。
【０３２９】
本発明の判定方法では、対象とする生物学的因子は、別の生物学的因子に結合する能力を有するものであってもよい。このような性質を持っている生物学的因子を調べることによって、細胞中のネットワーク機構が解明され得る。
【０３３０】
本発明の判定方法でもまた、判定工程は、プロファイルの位相の比較、コントロールプロファイルとの差分収集、信号処理法および多変量解析からなる群より選択される数学処理を行うことを包含し得る。このような処理方法は、当該分野において周知であり、本明細書において詳細に説明されている。
【０３３１】
別の局面において、本発明は、外来因子と、該外来因子に対する細胞の応答とを相関付ける方法を提供する。ここで、この方法は、ａ）複数の細胞を、細胞を同一環境に保つことができる支持体上で、外来因子に曝露する工程；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；およびｃ）該外来因子と、該プロファイルとを相関付ける工程を包含する。ここで、外来因子への細胞の曝露は、細胞と外来因子とを接触する環境に配置することによって達成される。例えば、細胞が支持体上に固定されているとき、その支持体上にその外来因子を加えることによって、曝露が達成される。データの生成および相関付けの方法もまた、当該分野において周知であり、単独でかそれらを組み合わせて使用することができる。統計学的処理を行い、統計学的に有意なデータおよび情報を生成することが好ましい。
【０３３２】
好ましい実施形態において、本発明の相関付け方法では、細胞は、支持体に固定されていてもよい。固定されることによって、データの規格化が容易になり、データ処理が格段に効率化され得る。
【０３３３】
好ましい実施形態において、本発明の相関付け方法では、少なくとも２つの前記外来因子を使用して、各外来因子に対するプロファイルを得る工程をさらに包含し得る。このようなプロファイルを得る技術は、本明細書において充分に説明されている。
【０３３４】
より好ましくは、相関付け工程は、少なくとも２つのプロファイルを類別することにより、該プロファイルに対応する外来因子を類別する工程をさらに包含してもよい。類別化することによって、より規格化されたデータ処理が可能となる。
【０３３５】
好ましい実施形態では、本発明において得られるプロファイルはリアルタイムで提示され得るが、データの格納を目的とする場合は、特にリアルタイムでなくてもよい。
【０３３６】
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞は、アレイ上で培養され得る。したがって、そのような場合、細胞は培地で覆われていることが好ましい。培地としては、通常細胞に使用する培地であればどのような培地でも使用され得る。
【０３３７】
本発明の好ましい実施形態では、プロファイルをモニターする工程は、前記アレイから画像データを得ることを包含する。特に、プロファイルが、視覚情報（例えば、遺伝子発現による蛍光の発光）である場合は、画像データを得ることによって、プロファイルを得ることが可能になる。
【０３３８】
本発明の相関付け方法では、外来因子とプロファイルとを相関付ける工程は、前記プロファイルの位相を識別する工程を包含し得る。プロファイルの位相の判別は、本発明が同一環境で得られる経時的プロファイルを提供することによって達成される特徴である。
【０３３９】
本発明が対象とする外来因子は、温度変化、湿度変化、電磁波、電位差、可視光線、赤外線、紫外線、Ｘ線、化学物質、圧力、重力変化、ガス分圧および浸透圧からなる群から選択され得る。好ましくは、化学物質は、生体分子、化学合成物または培地であり得る。そのような生体分子としては、例えば、核酸分子、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどが挙げられるがそれらに限定されない。生体分子はまた、例えば、ホルモン、サイトカイン、細胞接着因子および細胞外マトリクスなどであってもよい。あるいは、化学物質は、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。
【０３４０】
別の局面において、本発明は、細胞のプロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を同定するための方法に関する。この方法は、ａ）細胞に、同一環境を保つことができる支持体上で、複数の既知の外来因子を曝露する工程；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターし、既知の外来因子の各々に対する該細胞のプロファイルを得て該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；ｃ）該既知の外来因子の各々と、該プロファイルの各々とを相関付ける工程；ｄ）該細胞を未同定の外来因子に曝露する工程；ｅ）外来因子に曝露された該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして、未同定の外来因子に関する該細胞のプロファイルを得る工程；ｆ）該工程（ｂ）で得られたプロファイルの中から、該工程（ｅ）で得られたプロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；およびｇ）該未同定の外来因子は、該工程（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子であることを判定する工程；を包含する。ここで、外来因子の曝露、データ生成、相関付け、未同定の外来因子の曝露などは、本明細書において他の場所において詳述されており、当業者はこれらの記述を参照して、目的に応じて適宜適切な形態を選択することができる。
【０３４１】
別の局面において、本発明は、細胞のプロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を同定するための方法を提供する。この方法は、ａ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体に関し、既知の外来因子と、該既知の外来因子に対応する該細胞のプロファイルとの相関関係に関するデータを提供する工程；ｂ）該細胞を未同定の外来因子に曝露する工程；ｃ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体をモニターして、該細胞のプロファイルを得る工程；ｄ）該工程（ａ）において提供された、該プロファイルの中から、該工程（ｃ）において得られたプロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；およびｅ）該未同定の外来因子は、該工程（ｄ）において判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子であることを判定する工程；を包含する。ここで、外来因子への曝露、データ生成、相関付け、未同定の外来因子への曝露などの方法は、本明細書において他の場所において詳述されており、当業者はこれらの記述を参照して、目的に応じて適宜適切な形態を選択することができる。
【０３４２】
別の局面において、本発明は、複数の同一環境にある細胞の情報に関するプロファイルを得る方法を提供する。この方法は、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体上に提供する工程；およびｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターして該細胞のプロファイルを得る工程を包含する。ここで、外来因子の曝露、データ生成、相関付け、未同定の外来因子の曝露などの方法は、本明細書において他の場所において詳述されており、当業者はこれらの記述を参照して、目的に応じて適宜適切な形態を選択することができる。
【０３４３】
別の局面において、本発明は、本発明の細胞プロファイルデータを生成する方法によって生成されたデータが格納される記録媒体に関する。データは、どのような格納形式に格納されてもよく、どのような記録媒体が使用されてもよい。例えば、そのような記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、フレキシブルディスク、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＭＯ、ミニディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−Ｒ、メモリースティック、ハードディスクなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明はまた、本発明の細胞プロファイルデータを生成する方法によって生成されたデータが格納される伝送媒体に関する。伝送媒体としては、例えば、イントラネット、インターネットなどのネットワークが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３４４】
本発明の記録媒体または伝送媒体は、前記モニターにおける条件に関する情報、前記プロファイルに関する情報、前記細胞状態に関する情報および前記生物学的因子に関する情報からなる群より選択される、少なくとも１つの情報断片に関するデータをさらに含んでいてもよい。このような情報に関するデータは、相互にリンクされた形態で格納されてもよい。好ましくは、これらのデータは規格化されることが有利であり得る。規格化されることによって、一定の流通経路に載せることが可能になる。上記リンクは各々の細胞ごとにリンクされるか、あるいは生物学的因子ごとにリンクされるか、あるいはその両方であってもよい。
【０３４５】
別の局面において、本発明は、本発明の細胞プロファイルデータを生成する方法によって生成されたデータに関する。このようなデータは、従来の技術では生成し得なかったデータであることから、新規である。
【０３４６】
別の局面において、本発明は、同一環境にある複数の細胞の情報に関するプロファイルデータを生成するシステムを提供する。このシステムは、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターする手段；およびｃ）該モニター手段から得られた信号から該細胞のプロファイルのデータを生成する手段；を備える。細胞を同一環境に保つことができる支持体は、本発明によって初めて提供された技術を用いて当業者が実施することができる。そのような技術とは、細胞を固定化し、壁のない状態で細胞を配列することができるという発見に起因する。モニター手段としては、例えば、顕微鏡（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡など）、電子顕微鏡、スキャナー、肉眼、赤外線カメラ、共焦点・非共焦点顕微鏡、CCDカメラ、などが挙げられるがそれらに限定されない。このようなシステムの構成例は、図４４に示される。
【０３４７】
本発明のシステムにおいて、該システムは、細胞を最初から含んでいる必要はないが、好ましくは、複数の細胞が含まれており、かつ、支持体に固定されていることが有利である。そのような場合、固定は、規格化されていることが好ましい。また、固定される場合、細胞間の距離としては、例えば、１ｍｍなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３４８】
好ましい実施形態では、支持体には、塩およびアクチン作用物質からなる群より選択される少なくとも１つの物質が付着されることが好ましい。塩およびアクチン作用物質のいずれか、好ましくは両方が付着される支持体に細胞が接着することによって、固定および／または細胞内物質導入の効果が増強される。
【０３４９】
本発明のシステムにおいて使用され得るモニター手段としては、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相顕微鏡、レーザー光源を用いた読取装置、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング、電気信号、化学的または生化学的マーカーのいずれかあるいは複数種を用いる手段、放射光、共焦点顕微鏡、非共焦点顕微鏡、微分干渉顕微鏡、実体顕微鏡、ビデオモニターおよび赤外線カメラなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、スキャナー（例えば、白色光源もしくはレーザーによって基盤表面をスキャンするスキャナー）を使用できる。スキャナーが好ましいのは、蛍光であれば励起エネルギーを効率よく伝達すること、顕微鏡技術を流用することが容易であり得るからである。さらに、細胞に対して大きなダメージを与えることなく測定できるという利点を有する。システム構成例は、図４４に示される。
【０３５０】
別の局面において、本発明は、複数の同一環境にある細胞の情報に関するプロファイルを提示するシステムを提供する。このシステムは、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターする手段；ｃ）該モニター手段から得られた信号から該細胞のプロファイルのデータを生成する手段；およびｄ）該データを提示する手段、を包含する。ここで、支持体、モニター手段、データ生成手段については、本明細書において他の場所に記載されるように実施することができる。データを提示する手段もまた、当該分野において周知の手段を利用することができる。そのようなデータ提示手段としては、コンピュータのディスプレイ、スピーカなどが挙げられるがそれらに限定されない。システム構成例は、図４４に示される。
【０３５１】
本発明の提示システムは、複数の細胞をさらに含み、該複数の細胞は前記支持体に固定されていることが好ましい。このような場合、好ましくは、支持体には、塩およびアクチン作用物質からなる群より選択される少なくとも１つの物質が付着される。塩、もしくはアクチン作用物質または好ましくはその両方を有する支持体に細胞を接着させることにより、固定が強化され、および／または外来物質の細胞内導入が増強され得るからである。
【０３５２】
モニター手段は、どのようなものであってもよく、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相顕微鏡、レーザー光源を用いた読取装置、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング、電気信号、化学的または生化学的マーカーのいずれかあるいは複数種を用いる手段などであり得る。
【０３５３】
データ提示手段は、どのようなものであってもよく、例えば、ディスプレイ、スピーカなどが挙げられる。
【０３５４】
別の局面において、本発明は、細胞状態を判定するシステムを提供する。このシステムは、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体；ｂ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターする手段；ｃ）該モニター手段から得られた信号からデータを生成する手段；およびｄ）該データから該細胞状態を外挿する手段、を備える。ここで、支持体、モニター手段およびデータ生成手段は、本明細書において他の場所において記載したように当業者は実施することができる。データから細胞状態を外挿する手段もまた、当該分野において周知の技術を用いて作製し、使用することができる。例えば、測定されたデータと、既知の細胞に関する標準データとを比較することによって外挿が達成され、そのような外挿のためのプログラムを格納したデバイスまたはそれを実行することができるコンピュータをそのような外挿手段として使用することができる。システム構成例は、図４４に示される。
【０３５５】
別の局面において、本発明は、外来因子と、該外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるシステムを提供する。このシステムは、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体；ｂ）細胞を外来因子に曝露する手段；ｃ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターする手段；ｄ）該モニター手段からの信号から、該細胞のプロファイルのデータを生成する工程；およびｅ）該外来因子と、該プロファイルとを相関付ける手段；
を備える。ここで、支持体、モニター手段、データ生成手段は本明細書において他の場所において説明したように実施することができる。細胞を外来因子に曝露する手段もまた、その外来因子の性質に応じて当業者が適宜設計し、実施することができる。相関付けの手段もまた、その相関付けのためのプログラムを格納した記録媒体またはそれを実行することができるコンピュータを利用することができる。好ましくは、本発明のシステムは、複数の細胞を含む。システム構成例は、図４４に示される。
【０３５６】
別の局面において、本発明は、細胞のプロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を同定するためのシステムを提供する。このシステムは、ａ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体；ｂ）既知の外来因子を曝露する手段；ｃ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターする手段；ｄ）外来因子の各々に対する該細胞のプロファイルを得て該細胞のプロファイルのデータを生成する手段；ｅ）該既知の外来因子の各々と、該プロファイルの各々とを相関付ける手段；ｆ）該細胞を未同定の外来因子に曝露する手段；ｇ）該手段（ｄ）で得られた既知の外来因子のプロファイルと、未知の外来因子のプロファイルとを比較し、既知の外来因子のプロファイルの中から、未知の外来因子のプロファイルを判定する手段であって、該判定された未同定の外来因子は、該判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子である、手段、を備える。ここで、支持体、曝露手段、モニター手段、データ生成手段、相関付け手段、他の曝露手段は、本明細書における他の場所の記載を参酌して、当業者は適宜適切な形態で実施することができる。また、対応するプロファイルを判定する手段もまた、そのような判定プロセスを実行し得るプログラムを格納した記録媒体とそのプログラムを実行し得るコンピュータとを利用することなどによって、実施することができる。好ましくは、本発明のシステムは、複数の細胞を含む。システム構成例は、図４４に示される。
【０３５７】
別の局面において、本発明は、細胞のプロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を同定するためのシステムを提供する。このシステムは、ａ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体に関し、既知の外来因子と、該既知の外来因子に対応する該細胞のプロファイルとの相関関係に関するデータが格納された記録媒体；ｂ）該細胞を未同定の外来因子に曝露する手段；ｃ）複数の細胞を同一環境に保つことができる支持体；ｄ）該細胞上または該細胞内の生物学的因子またはその集合体を経時的にモニターする手段；ｅ）該モニター手段から得られた信号から、該細胞のプロファイルを得る手段；ｆ）該記録媒体（ａ）において格納される該プロファイルの中から、未知の外来因子に関して得られたプロファイルに対応するプロファイルを判定する手段であって、該未同定の外来因子は、該判定されたプロファイルに対応する該既知の外来因子である、手段；を備える。ここで、支持体、曝露手段、モニター手段、データ生成手段、相関付け手段、他の曝露手段は、本明細書における他の場所の記載を参酌して、当業者は適宜適切な形態で実施することができる。また、対応するプロファイルを判定する手段もまた、そのような判定プロセスを実行し得るプログラムを格納した記録媒体とそのプログラムを実行し得るコンピュータとを利用することなどによって、実施することができる。好ましくは、本発明のシステムは、複数の細胞を含む。システム構成例は、図４４に示される。
【０３５８】
別の局面において、本発明は、複数の細胞の環境を同一に維持することができる支持体に関する。このような支持体は、本発明によって始めて提供された。このような支持体を利用することによって、複数の細胞の同一環境下での分析が可能になった。
【０３５９】
好ましくは、支持体上の細胞は、アレイ状に配置されている。規格化された分析が可能となるからである。この場合、上記支持体は、塩またはアクチン作用物質を含むことが好ましい。より好ましくは、上記支持体は、正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を含むことが有利である。上記支持体への細胞の固定が容易になり得るからである。アクチン作用物質は、細胞への外来因子の導入効率を上げることから特に内部を分析する際に好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、上記支持体は、塩およびアクチン作用物質を含み、さらに正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を含むことがさらに好ましい。
【０３６０】
本発明の支持体は、細胞が提供され、１ｍｍの間隔で配置され得るという特徴を有する。このような間隔で、壁のない環境を提示することは、従来不可能であった。したがって、本発明は、驚くべき効果および実用性を有するものである。
【０３６１】
好ましい実施形態では、本発明の支持体は、固定された細胞をさらに含み得る。より好ましい実施形態では、本発明の支持体は、固定された生物学的因子をさらに含み得る。
【０３６２】
好ましい実施形態では、上記生物学的因子は上記支持体に少なくとも２種類以上固定される。このような生物学的因子は、核酸分子、タンパク質、糖、脂肪、代謝物、低分子、それらの複合体、ならびに物理的要素および／または時間的要素が入った因子からなる群より選択される因子であってもよい。
【０３６３】
より好ましい実施形態において、本発明の支持体には、細胞および生物学的因子が混合して固定される。生物学的因子と細胞とは、ここでは、互いに相互作用し得るように提供され得る。そのような相互作用は、生物学的因子によって変動するが、当業者はその性質を見れば、どのように相互作用するかおよびどのように配置すれば相互作用するかを理解することができる。
【０３６４】
好ましい実施形態にひとつにおいて、本発明の支持体には、塩、正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体、およびアクチン作用物質とが、細胞および生物学的因子とともに固定される。
【０３６５】
より好ましい実施形態では、本発明の支持体には、塩、正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体、およびアクチン作用物質とが、細胞および生物学的因子とともにアレイ状に固定される。このような構成をとることによって、細胞プロファイルデータを生成することができる、細胞チップが提供される。この支持体は、塩、正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体、およびアクチン作用物質とが、細胞および生物学的因子とともにアレイ状に固定される構成を採り、そのような支持体は、「トランスフェクションアレイ」とも呼ばれる。
【０３６６】
ここで、本発明の支持体で使用される塩としては、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸およびビタミンなどが挙げられるがそれらに限定されない。この塩としては、好ましくは、塩化ナトリウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３６７】
本発明の支持体において使用される遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウム、オリゴフェクタミン；ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ  ＥＭ−１０１−００１、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ  ＥＭ−１０１−００２およびｓｉＦＥＣＴＯＲ１  ＥＭ−１０１−００４（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ）などが挙げられるがそれらに限定されない。この遺伝子導入試薬としては、好ましくは、リポフェクトアミン、オリゴフェクタミン、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ  ＥＭ−１０１−００１、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ  ＥＭ−１０１−００２およびｓｉＦＥＣＴＯＲ１  ＥＭ−１０１−００４（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３６８】
本発明の支持体において使用されるアクチン作用物質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンが挙げられるがそれらに限定されない。このアクチン作用物質としては、好ましくは、フィブロネクチンが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３６９】
本発明の支持体において使用される核酸分子としては、転写制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、遺伝子コード配列、非翻訳領域を含むゲノム配列、宿主ゲノムにコードされていない核酸配列（蛍光タンパク質遺伝子、大腸菌・酵母自己複製起点、GAL4ドメイン等）を含む核酸分子が挙げられるがそれらに限定されない。この核酸分子としては、好ましくは、転写制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、遺伝子コード配列、非翻訳領域を含むゲノム配列が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３７０】
本発明の支持体において使用される細胞としては、幹細胞、樹立細胞株、初代培養細胞、昆虫細胞、細菌細胞が挙げられるがそれらに限定されない。この細胞としては、好ましくは、幹細胞、樹立細胞株、初代培養細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３７１】
本発明の支持体の材料は、ガラス、シリカ、およびプラスチックなどが挙げられるがそれらに限定されない。この材料としては、好ましくは、コーティングされた上記材料が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３７２】
別の局面において、本発明は、固定された複数の細胞を含み、かつ、該細胞の環境を同一に維持し得る支持体を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）支持体を提供する工程；およびＢ）細胞を塩および正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を用いて該支持体上に固定する工程、を含む。支持体の提供は、市販のものを入手するか、あるいは、支持体材料を成型することによって達成され得る。支持体材料を調製する必要があるときは、必要とされる材料の原料の混合などによって調製することができる。固定する工程もまた、当該分野において公知の技術を用いて行うことができる。そのような固定技術としては、例えば、インクジェットプリント法、ピンアレイ法、スタンプ法が挙げられるがそれらに限定されない。そのような技術は、周知であり、当業者は適宜実施することができる。
【０３７３】
好ましい実施形態において、本発明における固定工程は、前記塩と、遺伝子導入試薬と、前記正に荷電した物質としてのアクチン作用物質と、前記負に荷電した物質としての核酸分子との複合体、および前記細胞との混合物を、アレイ状に固定することを含む。このような固定は、プリント技術を用いて達成され得る。
【０３７４】
別の局面において、本発明は、固定された複数の細胞を含み、かつ、該細胞の環境を同一に維持し得る支持体を生産する装置を提供する。この装置は、Ａ）支持体を提供する手段；およびＢ）細胞を塩および正に荷電した物質と負に荷電した物質との複合体を用いて該支持体上に固定する手段を備える。支持体は、上述の方法を行うことができる手段を用いて得られ得る。そのような手段としては、例えば、支持体の成型手段、材料の調製手段（例えば、混合手段）などが挙げられるがそれらに限定されない。成型手段は、当該分野において周知の技術を使用することができる。固定手段は、プリント手段を含み、そのような手段としては、市販のインクジェットプリンターを利用することが可能である。
【０３７５】
（外来因子の相関付け）
別の局面において、本発明は、外来因子と、外来因子に対する細胞の応答とを相関付ける方法を提供する。この方法では、ａ）上記細胞を外来因子に曝露する工程；ｂ）上記細胞に由来する転写制御因子群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る工程；およびｃ）上記外来因子と、上記経時プロファイルとを相関付ける工程が包含される。
【０３７６】
本発明において使用される外来因子は特に限定されない。そのような外来因子は、細胞に直接または間接的に適用可能であるものが好ましい。細胞の外来因子への曝露方法は当該分野において周知であり、その外来因子の種類などによって変動する。物質であれば、その物質を溶媒中に溶解し、その溶液を細胞を含む培地中に滴下することによって、細胞は、外来遺伝子に曝露され得る。
【０３７７】
本発明の相関付けの方法でもまた、経時プロファイルの生成は、上述のように行うことができる。
【０３７８】
本発明の相関付けの方法における、外来因子と、経時プロファイルとの相関付けは、種々の方法で行うことができる。簡便には、ある外来因子が滴下された場合のすでに得られた経時プロファイルをパターン化し、そのプロファイルからの相違が実質的に少ない場合には、その外来因子が同定されたと推定することができる。
【０３７９】
好ましくは、細胞は、固相支持体（例えば、アレイ、プレート、マイクロタイタープレートなど）に固定された状態でモニターされる。そのような固定方法は、当該分野において公知の方法または本明細書において記載される方法に基づいて行うことができる。
【０３８０】
好ましい実施形態において、本発明の相関付け方法では、少なくとも２つの外来因子を使用して、各外来因子に対する経時プロファイルを得る工程をさらに包含してもよい。このような外来因子は、ある実施形態では、好ましくは、少なくとも３つ、より好ましくは、４つ、さらにより好ましくは、少なくとも１０個用いられ得るがそれらに限定されない。
【０３８１】
特定の実施形態において、本発明の相関付けの方法は、少なくとも２つの経時プロファイルを類別することにより、該経時プロファイルに対応する外来因子を類別する工程を包含する。このような類別は、当業者は、本明細書の記載を参酌すれば、容易に行うことができる。このような類別により、本発明の方法を用いて、未知の外来因子の相関付けおよび同定を達成することができる。
【０３８２】
好ましい実施形態では、本発明において使用される転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、他のゲノム中構造遺伝子のフランキング配列およびエキソン以外のゲノム配列などであり得るがそれらに限定されない。プロモーターが好ましい。転写状態を直接測定することができるからである。
【０３８３】
特定の実施形態では、本発明で使用される転写制御配列群は、構成的プロモーター、特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターなどであり得る。ここで、プロモーターは、どのようなものでもよく、むしろ、種類を選ばないことが本発明の特徴である。本発明の方法を用いることにより、プロファイルを「プロセス」という視点で解析することが可能となったことから、任意のプロモーターまたはそのセットを用いて細胞状態を判定することが可能になった。そのような判定は、従来の技術では不可能であったことであり、本発明は、従来技術からは達成不可能であったことを達成したという意味でその有用性は高い。
【０３８４】
好ましい実施形態では、モニターされる転写制御配列は、少なくとも２つの転写制御配列である。少なくとも２つの転写制御配列を観察することによって、通常８０％以上の細胞状態の同定が可能になる。より好ましくは、モニターされる転写制御配列は、少なくとも３つの転写制御配列である。少なくとも３つの転写制御配列を観察することによって、通常９０％以上の細胞状態を同定することが可能となる。最も好ましい実施形態において、モニターされる転写制御配列は、少なくとも８つの転写制御配列を含む。少なくとも８つの転写制御配列を観察することによって、通常、ほぼすべての細胞状態を同定することが可能となる。このように、任意の転写制御配列を選択したにもかかわらず、上述のような少ない数のみを選択し、それをモニターすることによって、ほぼすべての細胞状態を判定することができるという特徴は、従来は、予想されていなかったことであり、これは、時間点ごとに観察し、それをヘテロな集団として統計処理をした従来の判定方法に比較して、はるかに簡便で精密で正確である。
【０３８５】
従って、本発明の判定方法では、モニターする前に、転写制御配列群から、少なくとも１つの転写制御配列を任意に選択する工程をさらに包含することが好ましい。本発明の１つの重要な特徴は、転写制御配列として、点ごとの調査では特異性を示していないものでも使用可能であるという点にある。
【０３８６】
好ましい実施形態において、このような経時プロファイルは、リアルタイムで提示され得る。ここで、リアルタイムは、実質的に同時に表示することができる限り、ある程度のタイムラグが生じてもよい。許容されるタイムラグは、求められるリアルタイムの同時性によるが、例えば、最大で１０秒であり、より好ましくは最大で１秒であり得る。例えば、リアルタイムの外来因子の同定が必要な環境測定などでは、その許容されるタイムラグは、例えば、最大で１秒または最大で０．１秒などであってもよい。
【０３８７】
好ましい実施形態において、本発明の相関付けの工程ｃ）では、外来因子との相関付けのための上記経時プロファイルの情報として、該経時プロファイルの位相が用いられる。位相は、ある周期における信号強度がプラスおよびマイナスの二種類で表示され、そのように単純化された方法を用いても、細胞を同定あるいは外来因子を同定することができることから、本発明の方法の精密性が実証される。
【０３８８】
好ましくは、本発明の方法では、細胞は、アレイ上で培養されることが有利である。アレイ上で培養することによって、多数の細胞の観察を一度に行うことができるからである。
【０３８９】
好ましい実施形態において、転写状態の経時的モニターは、上記アレイから画像データを得る工程を包含する。画像データを提供することによって、目視も可能になり、人間（特に、医師などの当業者）の目による判断を得ることが容易になるからである。
【０３９０】
本発明の好ましい実施形態において、外来因子と経時プロファイルとの相関付けの工程は、経時プロファイルの位相を識別することを包含できる。位相は上述したように、簡便なパラメータであり、その情報処理が簡便であるから、その簡便な情報処理によって、細胞を充分に同定することが可能である。
【０３９１】
好ましい実施形態において、本発明の方法において同定されるべき外来因子としては、温度変化、湿度変化、電磁波、電位差、可視光線、赤外線、紫外線、Ｘ線、化学物質、圧力、重力変化、ガス分圧および浸透圧などが挙げられるがそれらに限定されない。このような因子は、従来の方法では、充分に同定することができなかったが、プロセスを重視した本発明の細胞判定方法を用いることによって、充分に因子の細胞に対する影響を調査することが可能である。
【０３９２】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法において同定されるべき外来因子は化学物質であり得、そのような化学物質としては、生体分子、化学合成物または培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９３】
このような生体分子としては、例えば、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどが挙げられるがそれらに限定されない。このような生体分子は、生物に対して影響を与えることが公知であり、未知の生体分子であってもその可能性が充分に高いことから、調査対象として重要なものであると考えられる。
【０３９４】
特に好ましくは、細胞に影響を与えることが期待される、ホルモン、サイトカイン、細胞接着因子、細胞外マトリクス、レセプターのアゴニスト、アンタゴニストなどが調査されるべき生体分子として使用される。
【０３９５】
（外来因子の推定）
別の局面において、本発明は、細胞の経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための方法を提供する。本発明の方法は、ａ）上記細胞を複数の既知の外来因子に曝露する工程；ｂ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、既知の外来因子の各々に対する上記細胞の経時プロファイルを得る工程；ｃ）上記既知の外来因子と、上記経時プロファイルの各々とを相関付ける工程；ｄ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する工程；ｅ）上記選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、未同定の外来因子に関する上記細胞の経時プロファイルを得る工程；ｆ）上記工程（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、上記工程（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；およびｇ）上記未同定の外来因子は、上記工程（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する工程；を包含する。
【０３９６】
本発明の方法において、外来因子への細胞の曝露は、本明細書において上述し、以下の実施例において例示するように行うことができる。経時プロファイルの獲得もまた、本明細書において上述し、以下の実施例において例示するように行うことができる。相関付けもまた、本明細書において上述し、以下の実施例において例示するように行うことができる。既知の外来遺伝子に関する情報がそろったところに、未同定の外来因子について同様のモニターを行い、情報断片を比較して、その未同定の外来因子が既知のものであるかどうかを判定することが可能である。この場合、プロファイルがまったく同じであれば、当然に同じであると判断することが可能であるが、実質的に同じである場合もまた同じであると判定することが可能である。そのような判定は、その既知の外来因子に関する情報の量および質に依存する。そのような判定は、当業者には容易であり、種々の要素を考慮して判定することができる。
【０３９７】
（未同定の外来因子の推定）
別の局面において、本発明は、細胞の経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための方法を提供する。このような方法は、ａ）上記細胞に存在するプロモーター群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関して、既知の外来因子と、上記既知の外来因子に対応する上記細胞の経時プロファイルとの相関関係に関するデータを提供する工程；ｂ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する工程；ｃ）上記選択されたプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る工程；ｄ）上記工程（ａ）において提供された、上記経時プロファイルの中から、上記工程（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する工程；およびｅ）上記未同定の外来因子は、上記工程（ｄ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する工程を包含する。
【０３９８】
ここで、外来因子の曝露、プロファイル生成、相関付けなどは、本明細書において上述し、以下の実施例において例示するような技術を使用して実施することができる。
【０３９９】
（細胞状態の提示システム）
別の局面において、本発明は、細胞状態を提示するためのシステムを提供する。このようなシステムは、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手段；およびｂ）上記経時プロファイルを提示する手段を備える。
【０４００】
本発明の細胞状態提示方法を実行するコンピュータ構成あるいはそれを実現するシステムの例を図１７を参照して示す。図１７は、本発明の細胞状態提示方法を実行するコンピュータの５００の構成例を示す。
【０４０１】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０４０２】
コンピュータ５００によって実行される細胞状態提示の処理の概略を説明する。
【０４０３】
細胞状態提示方法を実行させるプログラム（以下、「細胞状態提示プログラム」という）は、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、細胞状態提示プログラムは、その構成コンポーネントが、それぞれ独立してあるいは一緒に、フロッピー（登録商標）ディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に記録された細胞状態提示プログラムは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２が細胞状態提示プログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、本発明の細胞状態提示方法の処理を実行する装置として機能する。
【０４０４】
入力部５０１を介して、細胞に関する情報などを入力する。また、得られたプロファイルのデータも入力される。必要に応じて、既知の情報に関する情報も入力してもよい。
【０４０５】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１で入力されるプロファイルデータおよび細胞の情報から表示データを生成し、メモリ５０４に表示データを格納する。その後、ＣＰＵ５０２は、これらの情報をメモリ５０４に格納し得る。その後、出力部５０３は、ＣＰＵ５０２が選択した細胞状態を表示データとして出力する。出力されたデータは、入出力装置５０６から出力され得る。
【０４０６】
（細胞状態の判定システム）
別の局面において、本発明は、細胞状態を判定するシステムを提供する。このようなシステムは、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手段；およびｂ）上記経時プロファイルから上記細胞状態を判定する手段、を備える。
【０４０７】
本発明の細胞状態判定方法を実行するコンピュータ構成あるいはそれを実現するシステムを図１７に示す。図１７は、本発明の細胞状態判定方法を実行するコンピュータの５００の構成例を示す。
【０４０８】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって相互に接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０４０９】
コンピュータ５００によって実行される細胞状態判定の処理の概略を説明する。
【０４１０】
細胞状態判定方法を実行させるプログラム（以下、細胞状態判定プログラムという）は、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、細胞状態判定プログラムは、その構成コンポーネントがそれぞれ独立してあるいは一緒に、フロッピー（登録商標）ディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に記録された細胞状態判定プログラムは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２が細胞状態提示プログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、本発明の細胞状態判定方法を実行する装置として機能する。
【０４１１】
入力部５０１を介して、細胞に関する情報などを入力する。また、得られたプロファイルのデータも入力される。必要に応じて、既知の情報も入力してもよい。
【０４１２】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１で入力されるプロファイルデータおよび細胞の情報から細胞状態を判定し、その結果を判定結果データとして生成し、メモリ５０４に判定結果データを格納する。その後、ＣＰＵ５０２は、これらの情報をメモリ５０４に格納し得る。その後、出力部５０３は、ＣＰＵ５０２が選択した細胞状態を判定結果データとして出力する。出力されたデータは、入出力装置５０６から出力され得る。
【０４１３】
（外来因子の相関付けシステム）
別の局面において、本発明は、外来因子と、外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるためのシステムを提供する。このシステムは、ａ）上記細胞を外来因子に曝露する手段；ｂ）上記細胞に由来するプロモーター群から選択される少なくとも１つのプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手段；およびｃ）上記外来因子と、上記経時プロファイルとを相関付ける手段を備える。このようなシステムもまた、上述のシステムと同様にコンピュータを用いて実現することができる。
【０４１４】
（外来因子の推定システム）
別の局面において、本発明は、経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するためのシステムを提供する。このようなシステムは、ａ）上記細胞を複数の既知の外来因子に曝露する手段；ｂ）上記細胞に由来する転写制御因子群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターして、既知の外来因子の各々に対する上記細胞の経時プロファイルを得る手段；ｃ）上記既知の外来因子と、上記経時プロファイルの各々とを相関付ける手段；ｄ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手段；ｅ）上記選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、未同定の外来因子に関する上記細胞の経時プロファイルを得る手段；ｆ）上記手段（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、上記手段（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手段；およびｇ）上記未同定の外来因子は、上記手段（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手段を備える。このようなシステムもまた、上述のシステムと同様にコンピュータを用いて実現することができる。
【０４１５】
（未同定の外来因子推定システム）
別の局面において、本発明は、経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するためのシステムを提供する。このようなシステムは、ａ）上記細胞に存在する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関して、既知の外来因子と、上記既知の外来因子に対応する上記細胞の経時プロファイルとの相関関係に関するデータを提供する手段；ｂ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手段；ｃ）上記選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手段；ｄ）上記手段（ａ）において得られた、上記経時プロファイルの中から、上記手段（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手段；およびｅ）上記未同定の外来因子は、上記手段（ｄ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手段を備える。このようなシステムもまた、上述のシステムと同様にコンピュータを用いて実現することができる。
【０４１６】
本発明が上述のようにシステム形態として提供される場合、各々の構成要件は、本発明の方法の詳細なまたは好ましい実施形態を適用して実施することが可能であり、そのようなシステムの好ましい実施形態の選択は、当業者には容易であり、当業者は、このようなシステムの好ましい実施形態を、本明細書の記載を参酌して容易に行うことができる。
【０４１７】
（プログラム記録媒体）
別の局面において、本発明は、コンピュータに細胞状態を提示する処理を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。ここで、この記録媒体には、少なくとも、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手順；およびｂ）上記経時プロファイルを提示する手順、を実行させるためのプログラムが記録されている。
【０４１８】
別の局面において、本発明は、コンピュータに、細胞状態を判定する処理を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。このような記録媒体には、少なくともａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手順；およびｂ）上記転写状態の経時プロファイルから上記細胞状態を判定する手順、を実行させるためのプログラムが記録されている。
【０４１９】
別の局面において、本発明は、外来因子と、外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるための処理を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。この記録媒体には、少なくともａ）上記細胞を外来因子に曝露する手順；ｂ）上記細胞に由来する転写制御因子群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手順；およびｃ）上記外来因子と、上記経時プロファイルとを相関付ける手順、を実行させるためのプログラムが記録されている。
【０４２０】
他の局面において、本発明は、コンピュータに、細胞の経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための処理を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。この記録媒体には、少なくともａ）上記細胞を複数の既知の外来因子に曝露する手順；ｂ）上記細胞に由来する転写制御因子群から選択される少なくとも１つの転写制御因子に関連する転写状態を経時的にモニターして、既知の外来因子の各々に対する上記細胞の経時プロファイルを得る手順；ｃ）上記既知の外来因子と、上記経時プロファイルの各々とを相関付ける手順；ｄ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手順；ｅ）上記選択された転写制御配列の転写状態を経時的にモニターして、未同定の外来因子の経時プロファイルを得る手順；ｆ）上記手順（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、上記手順（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手順；およびｇ）上記未同定の外来因子は、上記手順（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手順、を実行させるためのプログラムが記録されている。
【０４２１】
別の局面において、本発明は、経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための処理を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。この記録媒体には、少なくともａ）上記細胞に存在する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関して、既知の外来因子と、上記既知の外来因子に対応する上記細胞の経時プロファイルとの相関関係に関するデータを提供する手順；ｂ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手順；ｃ）上記選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手順；ｄ）上記手順（ａ）において得られた、上記経時プロファイルの中から、上記手順（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手順；およびｅ）上記未同定の外来因子は、上記工程（ｄ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手順、を実行させるためのプログラムが記録されている。
【０４２２】
本発明が上述のように記録媒体形態として提供される場合、各々の構成要件は、本発明の方法の詳細なまたは好ましい実施形態を適用して実施することが可能であり、そのような記録媒体の好ましい実施形態の選択は、当業者には容易であり、当業者は、このような記録媒体の好ましい実施形態を、本明細書の記載を参酌して行うことができる。
【０４２３】
（プログラム）
別の局面において、本発明は、コンピュータに細胞状態を提示する処理を実行させるためのプログラムを提供する。ここで、このプログラムは、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手順；およびｂ）上記経時プロファイルを提示する手順、を実行させる。
【０４２４】
別の局面において、本発明は、コンピュータに、細胞状態を判定する処理を実行させるためのプログラムを提供する。ここで、このプログラムは、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手順；およびｂ）上記転写状態の経時プロファイルから上記細胞状態を判定する手順、を実行させる。
【０４２５】
別の局面において、本発明は、外来因子と、外来因子に対する細胞の応答とを相関付けるための処理を実行させるためのプログラムを提供する。このプログラムは、ａ）上記細胞を外来因子に曝露する手順；ｂ）上記細胞に由来する転写制御因子群から選択される少なくとも１つのプロモーターに関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手順；およびｃ）上記外来因子と、上記経時プロファイルとを相関付ける手順、を実行させる。
【０４２６】
別の局面において、本発明は、経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための処理を実行させるためのプログラムを提供する。このプログラムは、ａ）上記細胞を複数の既知の外来因子に曝露する手順；ｂ）上記細胞に由来する転写制御因子群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、既知の外来因子の各々に対する上記細胞の経時プロファイルを得る手順；ｃ）上記既知の外来因子と、上記経時プロファイルの各々とを相関付ける手順；ｄ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手順；ｅ）上記選択された転写制御配列の転写状態を経時的にモニターして、未同定の外来因子の経時プロファイルを得る手順；ｆ）上記手順（ｂ）で得られた経時プロファイルの中から、上記手順（ｅ）で得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手順；およびｇ）上記未同定の外来因子は、上記手順（ｆ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手順、を実行させる。
【０４２７】
他の局面において、本発明は、経時プロファイルから、細胞に与えられた未同定の外来因子を推定するための処理を実行させるためのプログラムを提供する。このプログラムは、ａ）上記細胞に存在する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関して、既知の外来因子と、上記既知の外来因子に対応する上記細胞の経時プロファイルとの相関関係に関するデータを提供する手順；ｂ）上記細胞を未同定の外来因子に曝露する手順；ｃ）上記選択された転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして、上記細胞の経時プロファイルを得る手順；ｄ）上記手順（ａ）において得られた、上記経時プロファイルの中から、上記手順（ｃ）において得られた経時プロファイルに対応するプロファイルを判定する手順；およびｅ）上記未同定の外来因子は、上記手順（ｄ）において判定されたプロファイルに対応する上記既知の外来因子であることを判定する手順、を実行させる。
【０４２８】
本発明が上述のようにプログラム形態として提供される場合、各々の構成要件は、本発明の詳細なまたは好ましい実施形態を適用して実施することが可能であり、そのようなプログラム好ましい実施形態の選択は、当業者には容易であり、当業者は、このようなプログラムの好ましい実施形態を、本明細書の記載を参酌して容易に行うことができる。そのようなプログラムの記述形式は、当業者には周知であり、例えば、Ｃ＋＋言語などを応用することができる。
【０４２９】
（診断）
別の局面において、本発明は、被検体を診断する方法およびシステムを提供する。この診断方法は、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る工程；ｂ）上記転写状態の経時プロファイルから上記細胞状態を判定する工程；およびｃ）上記細胞状態から上記被検体の状態、障害または疾患を判定する工程、を包含する。この診断方法がシステムとして提供される場合、本発明のシステムは、ａ）上記細胞に由来する転写制御配列群から選択される少なくとも１つの転写制御配列に関連する転写状態を経時的にモニターして上記細胞の経時プロファイルを得る手段；ｂ）上記転写状態の経時プロファイルから上記細胞状態を判定する手段；およびｃ）上記細胞状態から上記被検体の状態、障害または疾患を判定する手段、を備える。このように、本発明は、薬剤耐性、適切な抗がん剤の選択、適切な移植細胞の選択などのテーラーメイド診断および治療に応用可能である。好ましくは、本発明の診断方法は、被検体に診断結果に応じて選択した治療または予防を被検体に施す工程を包含する治療または予防方法として提供される。別の好ましい実施形態では、本発明の診断システムは、診断結果に応じて選択した治療または予防を提供する手段を備える、治療または予防システムとして提供され得る。
【０４３０】
本発明の診断方法または治療方法を実行するコンピュータ構成あるいはそれを実現するシステムの例を図１７に示す。図１７は、本発明の細胞状態判定方法を実行するコンピュータの５００の構成例を示す。
【０４３１】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０４３２】
コンピュータ５００によって実行される相関付けの処理の概略を説明する。
【０４３３】
相関付け方法および／または処置もしくは予防の選択を実行させるプログラム（以下、それぞれ「相関付けプログラム」および「選択プログラム」という）は、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、相関付けプログラムおよび選択プログラムは、それぞれ独立してあるいは一緒に、フロッピー（登録商標）ディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に記録された相関付けプログラムおよび選択プログラムは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２が相関付けプログラムおよび選択プログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、本発明の相関付け方法および選択方法の処理を実行する装置として機能する。
【０４３４】
入力部５０１を介して、経時プロファイルの分析の結果（例えば、位相など）および細胞に関する情報などを入力する。必要に応じて、経時プロファイルと相関付けられる状態、障害または疾患などの副次的情報、処置および／または予防に関する情報も入力してもよい。
【０４３５】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１で入力された情報をもとに、経時プロファイルに関する情報と細胞状態または被検体の状態、障害または疾患に関する情報、および必要に応じて予防または治療方法とを相関付け、メモリ５０４に相関データを格納する。その後、ＣＰＵ５０２は、これらの情報をメモリ５０４に格納し得る。その後、出力部５０３は、ＣＰＵ５０２が選択した細胞状態に関する情報、被検体の状態、障害または疾患に関する情報、および必要に応じて予防または治療方法などを診断情報として出力する。出力されたデータは、入出力装置５０６から出力され得る。
【０４３６】
本明細書において引用された、全ての特許、特許出願および文献は、その全体が、記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０４３７】
理解の容易のために、本発明の好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は限定されず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。当業者は、以下の実施例から、適宜細胞、支持体、生物学的因子、塩、正に荷電した物質、負に荷電した物質、アクチン作用物質などを選択し、本発明を実施することができることを理解する。
【実施例】
【０４３８】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、松浪硝子（岸和田、日本）などから市販される。
【０４３９】
（実施例１：試薬）
この実施例１において調製した処方物は以下のとおりである。
【０４４０】
アクチン作用物質の候補として、種々の細胞外マトリクスタンパク質およびその改変体もしくはそのフラグメントを準備した。この実施例１において調製したものは以下のとおりである。フィブロネクチンなどは、市販のものを用い、フラグメントおよび改変体は、遺伝子操作して得られた。
１）フィブロネクチン（配列番号１１）；
２）フィブロネクチン２９ｋＤａフラグメント；
３）フィブロネクチン４３ｋＤａフラグメント；
４）フィブロネクチン７２ｋＤａフラグメント；
５）フィブロネクチン改変体（配列番号１１のうち、１５２位のアラニンをロイシンに変化させたもの）；
６）プロネクチンＦ（三洋化成、京都、日本）；
７）プロネクチンＬ（三洋化成）；
８）プロネクチンＰｌｕｓ（三洋化成）；
９）ラミニン（配列番号６）；
１０）ＲＧＤペプチド（トリペプチド）；
１１）ＲＧＤを含んだ３０ｋＤａペプチド；
１２）ラミニンの５アミノ酸（ＩＫＶＡＶ、配列番号２８）；
１３）ゼラチン。
【０４４１】
ＤＮＡとしてトランスフェクションのためのプラスミドを調製した。プラスミドとして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（ともにＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。これらのプラスミドでは、遺伝子発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の制御下にある。プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１  ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）中で増幅し増幅したプラスミドＤＮＡを複合体パートナーの一方として用いた。ＤＮＡは、ＤＮａｓｅもＲＮａｓｅも含まない蒸留水中に溶解した。
【０４４２】
使用したトランスフェクション試薬は以下の通りである：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ-２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８-０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１-３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ-ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）。トランスフェクション試薬は、上記ＤＮＡおよびアクチン作用物質にあらかじめ加えるかあるいはＤＮＡと複合体を先に生成した。
【０４４３】
このようにして調製した溶液を以下のトランスフェクションアレイを用いたアッセイに用いた。
【０４４４】
（実施例２：トランスフェクションアレイ−間葉系幹細胞を用いた実証）
本実施例では、固相におけるトランスフェクション効率の改善を観察した。実施例２におけるプロトコルを以下に示す。
【０４４５】
（プロトコル）
ＤＮＡの最終濃度は、１μｇ／μＬに調整した。アクチン作用物質は、ｄｄＨ２Ｏ中で１０μｇ／μＬの濃度のストックとして保存した。全ての希釈をＰＢＳ、ｄｄＨ２ＯまたはダルベッコＭＥＭ培地を用いて行った。希釈系列として、例えば、０．２μｇ／μＬ、０．２７μｇ／μＬ、０．４μｇ／μＬ、０．５３μｇ／μＬ、０．６μｇ／μＬ、０．８μｇ／μＬ、１．０μｇ／μＬ、１．０７μｇ／μＬ、１．３３μｇ／μＬ、などを調製した。
【０４４６】
トランスフェクション試薬は、それぞれの製造業者が提供する指示書に従って、使用した。
【０４４７】
プラスミドＤＮＡは、グリセロールストックから取り出して、１００ｍＬのＬ−ａｍｐ中で一晩増殖させ、Ｑｉａｐｒｅｐ  ＭｉｎｉｐｒｅｐまたはＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｘｉを用いて製造業者が提供する標準プロトコールによって精製した。
【０４４８】
実施例２では、以下の５種類の細胞を利用して、効果を確認した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ、ＰＴ-２５０１、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）、ヒト胚性腎細胞  （ＨＥＫ２９３、ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＮＩＨ３Ｔ３-３細胞  （ＲＣＢ０１５０，ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＨｅＬａ細胞（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）。これらの細胞は、Ｌ−ｇｌｕｔおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ／１０％ＩＦＳ中で培養した。
【０４４９】
（希釈およびＤＮＡのスポット）
トランスフェクション試薬とＤＮＡとを混合してＤＮＡ−トランスフェクション試薬複合体を形成させる。複合体形成にはある程度の時間が必要であることから、上記混合物を、アレイ作製機（ａｒｒａｙｅｒ）を用いて固相支持体（例えば、ポリ−Ｌ−リジンスライド）にスポットした。実施例２では、固相支持体として、ポリ−Ｌ−リジンスライドのほか、ＡＰＳスライド、ＭＡＳスライド、コーティングなしのスライドを用いた。これらのスライドは、松浪硝子（岸和田、日本）などから入手可能である。
【０４５０】
複合体形成およびスポット固定のために、真空乾燥機中で一晩スライドを乾燥させた。乾燥時間の範囲は、２時間から１週間とした。
【０４５１】
アクチン作用物質は、上記複合体形成時に使用してもよいが、実施例２では、スポッティングの直前に使用する形態も試験した。
【０４５２】
（混合液の調製および固相支持体への適用）
エッペンドルフチューブに、３００μＬのＤＮＡ濃縮緩衝液（ＥＣ緩衝液）＋１６μＬのエンハンサーを混合した。これをボルテックスによって混合し、５分間インキュベートした。５０μＬのトランスフェクション試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅなど）を加え、そしてピペッティングによって混合した。トランスフェクション試薬を適用するために、スライドのスポットのまわりにワックス環状バリヤーを引いた。スポットのワックスで囲まれた領域に３６６μＬの混合物を加え、室温で１０から２０分間インキュベートした。これにより、支持体への手動による固定が達成された。
【０４５３】
（細胞の分配）
次に、細胞を添加するプロトコルを示す。トランスフェクトのために細胞を分配した。この分配は、通常、フード内で減圧吸引して行った。スライドを皿に置き、そしてトランスフェクションのために細胞を含む溶液を加えた。細胞の分配は、以下のとおりである。
【０４５４】
濃度が２５ｍＬ中１０７細胞になるように、増殖中の細胞を分配した。四角の１００×１００×１５ｍｍのペトリ皿または半径１００ｍｍ×１５ｍｍの円形ディッシュ中で、スライド上に細胞をプレーティングした。約４０時間、トランスフェクションを進行させた。これは、約２細胞周期にあたる。免疫蛍光のためにスライドを処理した。
【０４５５】
（遺伝子導入の評価）
遺伝子導入の評価は、例えば、免疫蛍光、蛍光顕微鏡検査、レーザー走査、放射性標識および感受性フィルムまたはエマルジョンを用いた検出によって達成した。
【０４５６】
可視化されるべき発現されたタンパク質が蛍光タンパク質であるなら、それらを蛍光顕微鏡検査で見てそして写真を撮ることができる。大きな発現アレイに関しては、スライドをデータ保存のためにレーザースキャナーで走査し得る。発現されたタンパク質を蛍光抗体が検出し得るなら、免疫蛍光のプロトコールを引き続いて行うことができる。検出が放射能に基づくなら、スライドを上記で示したように付着し得、そしてフィルムまたはエマルジョンを用いたオートラジオグラフィーによって放射能を検出することができる。
【０４５７】
（レーザー走査および蛍光強度定量）
トランスフェクション効率を定量するために、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ４×４、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＭＩ）を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測定した後、表面積あたりの蛍光強度を計算した。
【０４５８】
（共焦点顕走査顕微鏡による切片観察）
使用した細胞を、組織培養ディッシュに最終濃度１×１０５細胞／ウェルで播種し、適切な培地を用いて（ヒト間葉系細胞の場合ヒト間葉系細胞基本培地（ＭＳＣＧＭ、ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ＰＴ−３００１、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．、ＭＤ）を用いた）培養した。細胞層を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、ＳＹＴＯおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，ＯＲ，ＵＳＡ）を細胞層に添加して、核およびＦアクチンを観察した。遺伝子産物によって発色する対象または染色された対象を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｒｄ、ピンホールサイズ＝Ｃｈ１＝１２３μｍ、Ｃｈ２＝１０８μｍ；画像間隔＝０．４）を用いて、切片像を得た。
【０４５９】
（結果）
図１にＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の種々のアクチン作用物質およびコントロールとしてのゼラチンを用いた結果を示す。
【０４６０】
結果から明らかなように、ゼラチンを用いた系ではトランスフェクションがあまり成功していないのに対して、フィブロネクチン、フィブロネクチンの改変体であるプロネクチン（プロネクチンＦ、プロネクチンＬ、プロネクチンＰｌｕｓ）およびラミニンでは、系において、顕著にトランスフェクションが起こっていた。従って、このような分子は、トランスフェクション効率を顕著に上昇させることが実証された。ＲＧＤペプチド単体では、その効果はほとんど見えなかった。
【０４６１】
図２および３に、フィブロネクチンのフラグメントを用いた場合のトランスフェクション効率を示す。図４にその結果をまとめた図を示す。２９ｋＤａおよび７２ｋＤａのフラグメントは、トランスフェクション活性が顕著に示され、４３ｋＤａフラグメントは、活性はあるものの、その程度は、低かった。従って、２９ｋＤａに含まれるアミノ酸配列がトランスフェクション効率の上昇に役割を果たしていることが示唆される。２９ｋＤａフラグメントは、夾雑がほとんど見られなかったのに対して、他の二つのフラグメント（４３ｋＤａおよび７２ｋＤａ）では、夾雑が見られた。従って、２９ｋＤａドメインのみをアクチン作用物質として使用することが好ましくあり得る。また、ＲＧＤペプチドのみではトランスフェクション効率上昇活性は示されなかったが、２９ｋＤａのペプチドでは活性が見られた。また、ラミニンの６アミノ酸をつけ高分子量にした系でもトランスフェクション活性が見られた。従って、これらのペプチド配列もまた、トランスフェクション効率上昇活性において重要な役割を果たし得るがそれに限定されない。このような場合、少なくとも５ｋＤａ、好ましくは少なくとも１０ｋＤａ，より好ましくは少なくとも１５ｋＤａの分子量がトランスフェクション効率上昇に必要であり得る。
【０４６２】
次に、細胞におけるトランスフェクション効率を調べた結果を図５に示す。図５では、従来トランスフェクションが可能な細胞としてＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、３Ｔ３細胞、ならびに従来トランスフェクションがほとんど不可能といわれていたＨｅｐＧ２細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた本発明のトランスフェクション方法の効果を示す。縦軸にはＧＦＰの強度を示した。
【０４６３】
図５では、本発明の固相支持体を用いたトランスフェクション法との比較対照として、従来の液相トランスフェクション法を示した対比した。従来型の液相トランスフェクションの方法は、キットを製造する製造会社の推奨する方法に従って行った。
【０４６４】
図５から明らかなように、従来トランスフェクション可能とされていたＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、３Ｔ３はもちろん、トランスフェクション不可能とされていたＨｅｐＧ２およびＭＳＣでも、ＨｅＬａおよび３Ｔ３に匹敵するトランスフェクション効率が達成された。このような効果は、従来のトランスフェクション系では決して達成されなかったことであり、事実上すべての細胞についてトランスフェクション効率を上昇させることができ、実用に耐え得るトランスフェクションをすべての細胞に提供する系が史上初めて提供されたことになる。また、固相条件を採用したことによって、相互夾雑も顕著に減少した。従って、固相支持体を使用する場合本発明は、集積化バイオアレイを製造するために適切な方法であることが実証された。
【０４６５】
次に図６として、種々のプレートを用いた場合のトランスフェクションの状態を示す結果を提供する。図６の結果からも明らかなように、コーティングをした場合、コーティングをしていない場合よりも夾雑が少なくなっており、トランスフェクション効率も上昇しているようであることが明らかになった。
【０４６６】
次に、図７として、フィブロネクチンの濃度を０、０．２７、０．５３、０．８、１．０７および１．３３（それぞれμｇ／μＬ）としてトランスフェクションを行った場合の結果を示す。図７では、ＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）およびＡＰＳでコーティングされたスライドおよびコーティングされていないスライドについて示す。
【０４６７】
図７の結果から明らかなように、トランスフェクション効率は、フィブロネクチン濃度の上昇に伴って上昇することが明らかになった。ただし、ＰＬＬコーティングおよびコーティングなしの場合には、０．５３μｇ／μＬを超えると効率がプラトーに達していることがわかる。他方、ＡＰＳの場合は、１．０７μｇ／μＬを超えても効果の上昇が見られた。
【０４６８】
次に図８として、フィブロネクチンの有無での、細胞接着プロファイルを示す写真を示す。図９には、切片写真を示す。接着細胞の形状は、顕著に異なることが明らかになった（図８）。細胞培養の最初の３時間で、フィブロネクチン有の方は、細胞が完全に伸展したのに対して、フィブロネクチン無のほうは、伸展が限られていた（図９）。アクチンフィラメントの挙動を観察した図９の結果について経時的に観察した結果を勘案すると、固相支持体上に沈着したフィブロネクチンのようなアクチン作用物質がアクチンフィラメントの形状および方向に影響を与え、トランスフェクション効率などの物質の細胞への導入効率を上昇させるものと考えられる。具体的には、フィブロネクチンの存在下では、アクチンフィラメントは、迅速に配置転換し、細胞伸展とともに核の下にある細胞質空間から消失する。フィブロネクチンのようなアクチン作用物質によって誘導される核周辺のアクチン枯渇によって、ＤＮＡなどの標的物質が細胞内および必要に応じて核内へ移行すると考えられる。理論に束縛されないが、これは、細胞質の粘性の低下および正に荷電したＤＮＡ粒子が負に荷電したアクチンフィラメントに捕捉されることを防止するという効果に起因すると考えられる。また、核の表面積は、フィブロネクチン存在下で顕著に拡大することから（図１０）、ＤＮＡなどの標的物質の核への移行が容易になるものと考えられる。
【０４６９】
（実施例３：バイオアレイへの応用）
次に、上述の効果がアレイを用いた場合でも実証されるかどうかを確認するために規模拡大して実験を行った。
【０４７０】
（実験プロトコル）
（細胞供給源、培養培地、および培養条件）
この実施例では、５種類の異なる細胞株を使用した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰＴ−２５０１、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）、ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３（ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＮＩＨ３Ｔ３−３（ＲＣＢ０１５０、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＨｅＬａ（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）。ヒトＭＳＣ細胞の場合、この細胞を、市販のヒト間葉細胞基底培地（ＭＳＣＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ＰＴ−３００１，Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）中で維持した。ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３−３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の場合、これらの細胞を、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、２９−１６７−５４、Ｌｏｔ  Ｎｏ．２０２５Ｆ、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＣＯ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有する高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）；１４２４６−２５、Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，ＪＰＮ）中で維持した。全ての細胞株を、３７℃、５％  ＣＯ２に制御されたインキュベーター中で培養した。ｈＭＳＣを含む実験において、本発明者らは、表現型の変化を回避するために、５継代未満のｈＭＳＣを使用した。
【０４７１】
（プラスミドおよびトランスフェクション試薬）
トランスフェクションの効率を評価するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターおよびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクター（カタログ番号６０８５−１、６９７３−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を使用した。共に遺伝子発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下であった。トランスフェクトされた細胞は、それぞれ、連続的にＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ２を発現した。プラスミドＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（２００２４９，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＴＸ）を使用して増幅し、そしてＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  １２３６２、ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）によって精製した。全ての場合において、プラスミドＤＮＡを、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。トランスフェクション試薬は以下のようにして得た：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号３０１４２５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）。
【０４７２】
（固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）生成）
「リバーストランスフェクション」につてのプロトコルの詳細は、ウェブサイト  ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｆｆａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓａｂａｔｉｎｉ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｒｅｖｅｒｓｅ＿ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍの「Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｈｏｍｅｐａｇｅ」；Ｊ．Ｚｉａｕｄｄｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，２００１，１０７；Ｒ．Ｗ．Ｚｕ，Ｓ．Ｎ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １２，Ｎｏ．１０，４８５に記載されている。本発明者らの固相系トランスフェクション（ＳＰＴＡ方法）において、疎水性フッ素樹脂コーティングによって分離した４８平方パターン（３ｍｍ×３ｍｍ）を有する３つの型のスライドガラス（シラン処理したスライドガラス；ＡＰＳスライド、およびポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライドガラス；ＰＬＬスライド、およびＭＡＳでコーティングしたスライド；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｄ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）を研究した。
【０４７３】
（プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製）
ＳＰＴＡを生成するための２つの異なる方法を開発した。その主な違いは、プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製にある。
【０４７４】
（方法Ａ）
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用する場合、プリンティング溶液は、プラスミドＤＮＡおよび細胞接着分子（４ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したウシ血漿フィブロネクチン（カタログ番号１６０４２−４１、Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、ＪＰＮ））を含んだ。上記の溶液を、インクジェットプリンタ（ｓｙｎＱＵＡＤＴＭ、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いてか、または手動で０．５〜１０μＬチップを用いて、スライドの表面に適用した。このプリントしたスライドガラスを安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。トランスフェクションの前に、総Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を、ＤＮＡプリントしたスライドガラス上に静かに注ぎ、そして室温にて１５分間インキュベートした。過剰のＥｆｆｅｃｔｅｎｅ溶液を、吸引アスピレーターを用いてスライドガラスから除去し、そして安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。得られたＤＮＡプリントしたスライドガラスを、１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約２５ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０４細胞／ｍＬ）を、このディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。
【０４７５】
（方法Ｂ）
他のトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．またはＥｘＧｅｎ）の場合、プラスミドＤＮＡ、フィブロネクチン、およびトランスフェクション試薬を、製造業業者が配布する指示書に示される比率に従って１．５ｍＬのマイクロチューブ中で均一に混合し、そしてチップ上にプリンティングする前に室温にて１５分間インキュベートした。プリンティング溶液を、インクジェットプリンターまたは０．５〜１０μＬチップを用いてスライドガラスの表面上に適用した。このプリントしたスライドガラスを、安全キャビネットの内側で室温にて１０分間かけて完全に乾燥させた。プリントしたスライドガラスを１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約３ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０４細胞／ｍＬ）を添加し、安全キャビネットの内側で室温にて１５分間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、新鮮な培地をこのディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。インキュベーション後、本発明者らは、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＰＲＯＭＡＲＫＥＴＩＮＧ，ＩＮＣ．，ＪＰＮ）を用いて、増強された蛍光タンパク質（ＥＦＰ、ＥＧＦＰ、およびＤｓＲｅｄ２）の発現に基づいてトランスフェクト体を観察した。位相差画像を同じ顕微鏡を用いて撮った。両プロトコルにおいて、細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定方法（ＰＢＳ中の４％  ＰＦＡ、処理時間は、室温にて１０分間）を用いることによって固定した。
【０４７６】
（レーザー走査および蛍光強度定量）
トランスフェクション効率を定量するために、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ４×４、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＭＩ）を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測定した後、単位表面積あたりの蛍光強度を計算した。
【０４７７】
（結果）
（フィブロネクチン支持局所的トランスフェクション）
トランスフェクションアレイチップを、図１１に示されるように構築した。トランスフェクションアレイチップは、ＰＬＬコーティングされたスライドグラス上でＤＮＡ／トランスフェクション試薬およびフィブロネクチンを含む細胞培養液をマイクロプリントすることによって構築した。
【０４７８】
種々の細胞をこの実施例において用いた。これらの細胞は、通常使用される培養条件で培養した。これらの細胞はスライドガラスに付着することから、細胞は、効率よく取り込まれ、そしてアレイ上に与えられた位置でプリントされたＤＮＡに対応する遺伝子を発現した。通常のトランスフェクション方法（例えば、カチオン性脂質またはカチオン性高分子媒介トランスフェクション）と比較すると、本発明の方法を用いた場合のトランスフェクション効率は、いずれも顕著に高かった。特に、トランスフェクトすることが困難とされていたＨｅｐＧ２、ｈＭＳＣなどのような組織幹細胞でも、効率よくトランスフェクトされることが見出されたことは、特に重要である。ｈＭＳＣの場合には、従来方法の約４０倍以上の効率上昇が見られた。また、高密度アレイに必要な高い集積度も達成された（すなわち、アレイ上で隣接するスポット同士の間の夾雑が顕著に減っていた）。これは、ＥＧＦＰおよびＤｓ−ＲＥＤのチェック状パターンのアレイを生成することによって確認した。ヒトＭＳＣをこのアレイにおいて培養し、実質的にすべての空間解像度が示されるように対応する蛍光タンパク質を発現させた。その結果図１２に示されるように、ほとんど夾雑していないことが明らかになった。プリント混合物の個々の成分の役割に関するこの研究に基づいて、トランスフェクション効率の最適化を行うことができる。
【０４７９】
（ヒト間葉系幹細胞の固相系トランスフェクションアレイ）
多様な種類の細胞に分化するヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の能力は、組織再生および組織復活を標的化する研究にとって特に興味深いものになっている。特に、これらの細胞の形質転換についての遺伝子解析は、ｈＭＳＣの多能性を制御する因子を解明する上で、関心が高まっている。従来のｈＭＳＣの研究は、所望の遺伝物質を用いたトランスフェクションが不可能な点にある。
【０４８０】
これを達成するために、従来の方法は、ウイルスベクターまたはエレクトロポレーションのいずれかの技術を含む。本発明者らが開発した複合体−塩という系を用いることにより、種々の細胞株（ｈＭＳＣを含む）に対して高いトランスフェクション効率ならびに密集したアレイ中での空間的な局在の獲得を可能にする固相系トランスフェクションが達成された。固相系トランスフェクションの概略を、図１３Ａに示す。
【０４８１】
固相系トランスフェクションにより、インビボ遺伝子送達のために使用され得る「トランスフェクションパッチ」の技術的な達成ならびにｈＭＳＣにおける高スループットの遺伝子機能研究のための固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）が可能になることが判明した。
【０４８２】
哺乳動物細胞をトランスフェクトするための多数の標準的な方法が存在するが、遺伝物質のｈＭＳＣへの導入については、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどの細胞株を比較して不便かつ困難であることが知られている。従来使用されるウイルスベクター送達またはエレクトロポレーションのいずれも重要であるが、潜在的な毒性（ウイルス方法）、ゲノムスケールでの高スループット分析を受けにくいこと、およびインビボ研究に対して制限された適用性（エレクトロポレーションに関して）のような不便さが存在する。
【０４８３】
固相支持体に簡便に固定することができ、かつ徐放性および細胞親和性を保持した固相支持体固定系が開発されたことにより、これらの欠点のほとんど克服することができた。
【０４８４】
上述の実験の結果の一例を、図１３Ｂに示す。マイクロプリンティング技術を使用する本発明者らの技術を用いて、選択された遺伝物質、トランスフェクション試薬および適切な細胞接着分子、ならびに塩を含む混合物を、固体支持体上に固定化し得た。混合物を固定化した支持体の上での細胞培養は、その培養細胞に対する、混合物中の遺伝子の取り込みを可能にした。その結果、支持体−接着細胞における、空間的に分離したＤＮＡの取り込みを可能にした（図１３Ｂ）。
【０４８５】
本実施例の結果、いくつかの重要な効果が達成された：高いトランスフェクション効率（その結果、統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、異なるＤＮＡ分子を支持する領域間の低い相互夾雑（その結果、個々の遺伝子の効果が、別々に研究され得る）、トランスフェクト細胞の長期生存、高スループットの互換性のある形式および簡便な検出方法。これらの基準を全て満たすＳＰＴＡは、さらなる研究のための適切な基盤となる。
【０４８６】
これらの目的の達成を明確に確立するために、上述のように本発明者らは、５種類の異なる細胞株（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２およびｈＭＳＣ）を、本発明者らの方法論（固相系でのトランスフェクション）（図１３Ａおよび図１３Ｃを参照のこと）および従来の液相系トランスフェクションの両方を用いて一連のトランスフェクション条件下で研究した。ＳＰＴＡの場合、相互夾雑を評価するために、本発明者らは、チェック模様のパターンでガラス支持体上にプリントした赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡ使用し、一方、従来の液相系トランスフェクションを含む実験の場合（ここで、本来、トランスフェクト細胞の自発的な空間的分離は達成され得ない）、本発明者らは、ＧＦＰをコードするＤＮＡを使用した。いくつかのトランスフェクション試薬を評価した：４つの液体トランスフェクション試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＬｏｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００）、２つのポリアミン（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ）、ならびに２つの型のポリイミン（ＪｅｔＰＥＩ（×４）およびＥｘＧｅｎ  ５００）。
【０４８７】
トランスフェクション効率：トランスフェクション効率を、単位面積あたりの総蛍光強度として判定した（図１４Ａ。図１４Ｂはそのイメージを示す。）。使用した細胞株に従って、最適な液相の結果を、異なるトランスフェクション試薬を用いて得た（図１４Ｃ−Ｄを参照のこと）。次いで、これらの効率的なトランスフェクション試薬を、固相系プロトコルの最適化に使用した。いくつかの傾向が観察された：容易にトランスフェクト可能な細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３）の場合、固相系プロトコルで観察されたトランスフェクション効率は、標準的な液相系プロトコルと比較してわずかに優れていたが、本質的に類似したレベルで達成されている（図１４）。
【０４８８】
しかし、細胞をトランスフェクトするのが困難な場合（例えば、ｈＭＳＣおよびＨｅｐＧ２）においてＳＰＴＡ方法論に最適化した条件を用いることによって、本発明者らは、細胞の特徴を維持しながら、トランスフェクション効率が４０倍まで増加したことを観察した（上述のプロトコルおよび図１４Ｃ−Ｄを参照のこと）。ｈＭＳＣの特定の場合（図１５）、最良条件は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬の使用を含んだ。予想したように、高いトランスフェクション効率を実現するための重要な因子は、ポリマー内の窒素原子（Ｎ）の数とプラスミドＤＮＡ内のリン酸残基（Ｐ）の数との間の電荷バランス（Ｎ／Ｐ比率）、ならびにＤＮＡ濃度である。一般的に、Ｎ／Ｐ比率および濃度における増大は、トランスフェクション効率の増大を生じる。並行して、本発明者らは、ｈＭＳＣの溶液トランスフェクション実験における高いＤＮＡおよび高いＮ／Ｐ比率の場合に、細胞生存率の有意な低下を観察した。これら２つの拮抗因子に起因して、ｈＭＳＣの液相系トランスフェクションの効率は、かなり悪い非常に低い細胞生存率（Ｎ／Ｐ比率＞１０で観察された）であった。しかし、ＳＰＴＡプロトコルは、細胞生存率にも細胞形態にも有意に影響を与えることなく、非常に高い（固体支持体に固定された）Ｎ／Ｐ比率およびＤＮＡ濃度を許容し（おそらく、細胞膜に対する固体支持体の安定化効果に起因する）、従って、このことがおそらく、トランスフェクション効率の劇的な改善の原因となっている。ＳＰＴＡの場合、１０のＮ／Ｐ比率が最適であることが見出され、細胞毒性を最小化しながら十分なトランスフェクションレベルを提供する。ＳＰＴＡプロトコルにおいて観察されたトランスフェクション効率の増大に関するさらなる理由は、高い局所的なＤＮＡ濃度／トランスフェクション試薬濃度（これは、液相系トランスフェクション実験において使用される場合は細胞死を生成する）の達成である。
【０４８９】
チップ上での高いトランスフェクション効率の達成のための重要な点は、使用されるコーティング剤である。ガラス製のチップを用いた場合、ＰＬＬが、トランスフェクション効率および相互夾雑の両方に関して、最良の結果を提供することを発見した（下記に考察する）。フィブロネクチンコーティングしない場合、少数のトランスフェクト体を観察した（他のすべての実験条件は一定に保った）。完全に確立したわけではないが、フィブロネクチンの役割はおそらく、細胞接着プロセスを加速し（データは示していない）、ゆえに、表面を離れたＤＮＡ拡散が可能になる時間を制限するということである。
【０４９０】
低い相互夾雑：ＳＰＴＡプロトコルで観察されたより高いトランスフェクション効率は別として、本技術の重要な利点は、別個に分離された細胞アレイの実現であり、その各位置では、選択した遺伝子が発現する。本発明者らは、フィブロネクチンでコーティングしたガラス表面上に、ＪｅｔＰＥＩ（「実験プロトコル」を参照のこと）およびフィブロネクチンと混合した２つの異なるレポーター遺伝子（ＲＦＰおよびＧＦＰ）をプリントした。得られたトランスフェクションチップを適切な細胞培養に提供した。最良であると見出された実験条件下において、発現されたＧＦＰおよびＲＦＰは、それぞれのｃＤＮＡがスポットされた領域に局在した。相互夾雑はほとんど観察されなかった（図１６）。しかし、フィブロネクチンまたはＰＬＬの非存在下において、固相でのトランスフェクションの障害となる相互夾雑が観察され、そしてトランスフェクション効率は、有意に低かった（図６を参照）。このことは、細胞接着および支持体表面から離れて拡散するプラスミドＤＮＡの相対的な割合が、高いトランスフェクション効率および高い相互夾雑の両方に対して重要な因子であるという仮説を立証する。
【０４９１】
相互夾雑のさらなる原因は、固体支持体上のトランスフェクション細胞の移動性であり得る。本発明者らは、数個の支持体上での細胞接着速度（図１６Ｃ）およびプラスミドＤＮＡの拡散速度の両方を測定した。その結果、最適条件下においてＤＮＡ拡散はほとんど生じなかった。しかし、高い相互夾雑条件下において、細胞接着が完了するまでの時間に、相当な量のプラスミドＤＮＡが拡散し、その結果、固相表面からプラスミドＤＮＡが涸渇した。
【０４９２】
この確立された技術は、経済的な高スループットの遺伝子機能スクリーニングの状況において特に重要である。実際に、必要とされる少量のトランスフェクション試薬およびＤＮＡ、ならびに全プロセス（プラスミドの単離から検出まで）を自動化する可能性は、上記の方法の有用性を増大する。
【０４９３】
結論として、本発明者らは、複合体−塩を用いた系で、ｈＭＳＣトランスフェクションアレイを好首尾に実現した。このことは、多能性幹細胞の分化を制御する遺伝子機構の解明など、固相系トランスフェクションを利用した種々の研究における高スループット研究を可能にすることになる。固相系トランスフェクションの詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリングに対するこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用可能であることが明らかになった。
【０４９４】
（実施例４：数理解析）
次に、実施例２および３の手法を用いて得られたデータをもとに経時プロファイルを生成した。
【０４９５】
（分化誘導）
各レポーターを固相支持体に固定し、未分化の間葉系幹細胞の維持培地（ＭＳＣＧＭ、ＰＴ−３００１、ＰＴ−３２３８、ＰＴ−４１０５、Ｃａｍｂｒｅｘ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＵＳＡ）において２日間培養後、分化誘導培地（ｈＭＳＣ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＰＴ−３００２、ＰＴ−４１２０、Ｃａｍｂｒｅｘ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＵＳＡ）に培地を換え、各レポーターの応答プロファイルを測定した。
【０４９６】
（数理解析法）
使用した数理解析法を図１８（図１８Ａ−Ｂ））に示す。
【０４９７】
（使用した転写因子）
図１９および図２４に示すように、１７種類の転写因子（ＩＳＲＥ、ＲＡＲＥ、ＳＴＡＴ３、ＧＡＳ、ＮＦＡＴ、ＭＩＣ、ＡＰ１、ＳＲＥ，ＧＲＥ，ＣＲＥ、ＮＦκＢ、ＥＲＥ、ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ、Ｒｂ、ｐ５３）を、ＧＦＰに作動可能に連結したプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販される）を用いて、間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を観察した。このとき得られた経時プロファイルを図１９に示す。また、転写因子レポーターの構築は、図２３に示されるように行った。
【０４９８】
転写因子のレポーターのアッセイを行った。これはＣｌｏｎｔｅｃｈにより公開されているコントロール条件（細胞、添加因子、培養条件など）にしたがって行った。
【０４９９】
その結果を図２５に示す。このようにＤＮＡのみと比較した場合、ほとんどの転写因子において誘導因子を添加したときに誘導がかかることが実証された。
【０５００】
次に、骨分化誘導の際の転写因子活性の経時的測定を行った。これは上述の条件に従って、分化誘導させたときに経時プロファイルを比較したものである。経時プロファイルは、各レポーター遺伝子を固相系トランスフェクション法を用いて導入し、２日間未分化維持培地にて培養を行い、骨芽細胞分化誘導培地と交換した。この時点を骨芽細胞分化開始時間とした。添加因子などに関しては、骨芽細胞分化誘導培地に推奨の濃度にて行った。その他の培養に関しては、Ｃａｍｂｒｅｘ社の指示書通りに行った。
【０５０１】
結果を図２６に示す。培地交換後１０時間〜３０時間では、図２６に左のようなプロファイルパターンを示していたのに対し、培地交換後５〜６日では、右のようなプロファイルパターンを示し、顕著に変動していることが明らかになった。これを、図２７に示される式を用いて、位相を算出し、その結果を図２７の右の表にまとめた。このように、分化に特に深い関係がある、ＩＳＲＥ、ＲＡＲＥ、ＳＴＡＴ３、ＧＲＥ、ＣＲＥ、ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ、およびｐ５３において、位相の反転が見られた。従って、位相を判定することは、プロセスの変化が起こる、つまり、転写制御が起こっていると判定することができることが明らかになった。
【０５０２】
（レポーターの任意性）
次に、分化誘導初期において任意に抽出される組み合わせを変化させるときの同定可能性を実証した。解析は、分化誘導初期において任意に抽出される組み合わせを変化させることによって行った。手短に説明すると、１７のレポーター群から任意のその数のレポーターを抽出し、図１８に示されるように、平均プロファイルを算出し、変動幅が５以上のものを誘導開始から０−３１．５時間、０−１７．５時間および１７．５−３１．５時間の区間で評価した。
【０５０３】
この結果を図２０に示す。この解析により、分化のごく初期に関しては、分化誘導を把握できない（他のノイズもあると考えられる）が、約１５時間後以降では、確認することが可能であることが判明した。変化を同定することができるのが１００％となったのは、本実施例では８以上であったが、抽出数が３のときでもすでに９０％を超える同定率を示しており、２のときでも８８％、１のときでも８２％を示していることから、１つでも、２つでも、あるいは少なくとも３つでも、細胞状態を判定または同定するのに充分であることが明らかになった。
【０５０４】
（未分化維持）
次に、未分化維持に関して、任意に抽出される転写調節因子の組み合わせを変化させて解析した。解析は図２０に記載されるものに準じて行った。
【０５０５】
この結果を図２１に示す。分化誘導時の結果と比べると大きく異なり、この比較によって、本実施例での処理により、幹細胞が分化誘導に向かっているのか未分化を維持しているのかが判断することができる。このような判断は、少なくとも１つの転写制御配列を用いることによって行うことができた。このように少ない数でも充分に細胞状態を判定することができることは、従来技術では達成できなかったことであり、本発明は、優れた効果を達成したということができる。
【０５０６】
このようにプロセスを解析することによって、図２２に示すように、細胞機能の形成は、種々の因子のカクテルパーティープロセスとして記述することが可能であることがわかる。このようなプロセス記述により、本発明は、薬剤応答プロセスおよび分化誘導プロセスの解析を行うことを可能にした。
【０５０７】
（実施例５：細胞を用いた、複数遺伝子のリアルタイム計測）
次に、リアルタイムで細胞からの信号を計測する装置を用いて、経時的データを取得し、そのデータからプロファイルを生成した。
【０５０８】
細胞として、ＨｅＬａ細胞（理化学研究所などから入手可能）を用いた。培地として、ナカライ  ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅを用い、これに血清（大日本製薬の１０％ＦＢＳ）を用いた。上記実施例に記載されるように、トランスフェクションアレイを構築し、２４種類の遺伝子発現およびシグナル伝達レポーターをＨｅＬａ細胞に導入した。細胞を４８時間培養し、培養ユニットをセットアップして経時観察を行った。測定は、図２８〜２９に示すような測定機により、レポーターの発現を蛍光強度として取得することによって行った。測定は、図３０に示すような手順を用いて行った。
【０５０９】
使用したアレイは、図３１に示すようなフォーマットの５７０グリッドアレイを使用した。例示的に、トランスフェクション後２日で、無血清培地中でリアルタイムモニタリングを行った。画像取得は、３０分おきに行った。使用した２４個の遺伝子（レポーターベクター）については、コントロール条件での測定を行い活性について確認されたものを使用した。画像取得の一例を図３２に示す。
【０５１０】
取得した画像から得た経時的データを各遺伝子について示す。図３８Ａは、各遺伝子をすべてまとめたグラフを示す。図３３Ｂは、生データを示す。図３８Ｃは、多項式近似の後の計算結果を示す。図３３Ｄは、1階微分および２階微分後のデータを示す。図３４−１から図３４−５４は、各々の遺伝子について、別々に示したものである。図３４−１〜図３４−５４には、同じ遺伝子を別の地点でデータ収集したものが含まれている。縦軸は、蛍光強度（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔ＝使用した機器から出力される単位）、横軸は時間（単位は時間（ｈｒ））を示す。
【０５１１】
図３４−１は、ＥＧＦＰ−Ｎ１の経時的データを示す。
【０５１２】
図３４−２は、ＡＰ１の経時的データを示す。
【０５１３】
図３４−３は、ＡＰ１（ＰＭＡ）の経時的データを示す。
【０５１４】
図３４−４は、ＣＲＥの経時的データを示す。
【０５１５】
図３４−５は、Ｅ２Ｆの経時的データを示す。
【０５１６】
図３４−６は、ｎｏｎｅ（なし）の経時的データを示す。
【０５１７】
図３４−７は、ＥＧＦＰ−Ｎ１の経時的データを示す。
【０５１８】
図３４−８は、ＡＰ１の経時的データを示す。
【０５１９】
図３４−９は、ＡＰ１（ＰＭＡ）の経時的データを示す。
【０５２０】
図３４−１０は、ＣＲＥの経時的データを示す。
【０５２１】
図３４−１１は、Ｅ２Ｆの経時的データを示す。
【０５２２】
図３４−１２は、ＥＲＥの経時的データを示す。
【０５２３】
図３４−１３は、ＧＡＳの経時的データを示す。
【０５２４】
図３４−１４は、ＧＲＥの経時的データを示す。
【０５２５】
図３４−１５は、ＨＳＥの経時的データを示す。
【０５２６】
図３４−１６は、ＩＳＲＥの経時的データを示す。
【０５２７】
図３４−１７は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５２８】
図３４−１８は、ＥＲＥの経時的データを示す。
【０５２９】
図３４−１９は、ＧＡＳの経時的データを示す。
【０５３０】
図３４−２０は、ＧＲＥの経時的データを示す。
【０５３１】
図３４−２１は、ＨＳＥの経時的データを示す。
【０５３２】
図３４−２２は、ＩＳＲＥの経時的データを示す。
【０５３３】
図３４−２３は、Ｍｙｃの経時的データを示す。
【０５３４】
図３４−２４は、ＮＦＡＴの経時的データを示す。
【０５３５】
図３４−２５は、ＮＦｋＢの経時的データを示す。
【０５３６】
図３４−２６は、ＲＡＲＥの経時的データを示す。
【０５３７】
図３４−２７は、Ｒｂの経時的データを示す。
【０５３８】
図３４−２８は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５３９】
図３４−２９は、Ｍｙｃの経時的データを示す。
【０５４０】
図３４−３０は、ＮＦＡＴの経時的データを示す。
【０５４１】
図３４−３１は、ＮＦｋＢの経時的データを示す。
【０５４２】
図３４−３２は、ＲＡＲＥの経時的データを示す。
【０５４３】
図３４−３３は、Ｒｂの経時的データを示す。
【０５４４】
図３４−３４は、ＳＴＡＴ３の経時的データを示す。
【０５４５】
図３４−３５は、ＳＲＥの経時的データを示す。
【０５４６】
図３４−３６は、ＴＲＥの経時的データを示す。
【０５４７】
図３４−３７は、ｐ５３の経時的データを示す。
【０５４８】
図３４−３８は、Ｃａｓｐａｓｅ３の経時的データを示す。
【０５４９】
図３４−３９は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５５０】
図３４−４０は、ＳＴＡＴ３の経時的データを示す。
【０５５１】
図３４−４１は、ＳＲＥの経時的データを示す。
【０５５２】
図３４−４２は、ＴＲＥの経時的データを示す。
【０５５３】
図３４−４３は、ｐ５３の経時的データを示す。
【０５５４】
図３４−４４は、Ｃａｓｐａｓｅ３の経時的データを示す。
【０５５５】
図３４−４５は、ＣＲＥＢ−ＥＧＦＰの経時的データを示す。
【０５５６】
図３４−４６は、ＩｋＢ−ＥＧＦＰの経時的データを示す。
【０５５７】
図３４−４７は、ｐｐ５３−ＥＧＦＰの経時的データを示す。
【０５５８】
図３４−４８は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５５９】
図３４−４９は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５６０】
図３４−５０は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５６１】
図３４−５１は、ＣＲＥＢ−ＥＧＦＰの経時的データを示す。
【０５６２】
図３４−５２は、ＩｋＢ−ＥＧＦＰの経時的データを示す。
【０５６３】
図３４−５３は、ｐｐ５３−ＥＧＦＰの経時的データを示す。
【０５６４】
図３４−５４は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５６５】
図３４−５５は、ｎｏｎｅの経時的データを示す。
【０５６６】
なお、上記においてｎｏｎｅとは、ネガティブコントロールを示す。
【０５６７】
このように、種々の遺伝子に関して、同時に経時的データを取得することができた。
【０５６８】
（実施例６：抗がん剤）
本実施例では、シスプラチンを抗がん剤の例として、培地に混ぜ、細胞に曝露した。用いた濃度としては、１μＭ、５μＭ、１０μＭなどを適宜採用して細胞の反応を見た。シスプラチンに耐性の細胞および感受性の細胞に対してシスプラチンを適用し、上述の実施例と同様にして経時プロファイルを観察した。その結果、シスプラチンの濃度および耐性／感受性の違いにより、顕著に経時プロファイルが変動することが明らかになった。
【０５６９】
（実施例７：ＲＮＡｉトランスフェクションマイクロアレイ）
実施例３に記載のようにアレイを作製した。遺伝物質として、プラスミドＤＮＡとｓｈＲＮＡとを混合して使用した。その組成を以下の表２に示す。
【０５７０】
【表２】
2006522605.tif 000008
【０５７１】
結果を図３５に示す。この図の結果を数値化したデータを、５種類の細胞について、図３６Ａ〜図３６Ｅにまとめた。
【０５７２】
このように、どのような細胞を用いたとしても、本発明の技術が適用可能であることが判明した。
【０５７３】
（実施例８：ＲＮＡｉマイクロアレイ＝ｓｉＲＮＡを用いた場合）
実施例３と同様のプロトコールを用いて、今度はｓｈＲＮＡの代わりにｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＡｉトランスフェクションマイクロアレイを構築した。
【０５７４】
表３の１８種類の転写因子レポーターおよびアクチンプロモータベクターを用いて、各転写因子に対しての２８種類のｓｉＲＮＡを合成した。また、コントロールとして、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡが標的転写因子をノックダウンするか評価した。また、ネガティブコントロールとしては、スクランブルＲＮＡを用いて、これらの比を取って評価した。
【０５７５】
【表３】
2006522605.tif 000009
【０５７６】
各細胞への固相系トランスフェクション後、2日間培養し、蛍光イメージスキャナーにて画像取得後、蛍光量を定量化した。
【０５７７】
（結果）
結果を図３７に示す。この結果を各遺伝子ごとにまとめたものを図３８Ａ〜３８Ｄに示す。
【０５７８】
図３７および３８Ａ〜３８Ｄから明らかなように、ＲＮＡｉを用いた場合、各遺伝子が特異的に発現が抑制されていることが示された。ＲＮＡｉを用いた複数の遺伝物質のアレイを実現することができ、ＲＮＡｉの細胞に対する効果の経時的解析が可能であることが判明した。
【０５７９】
（実施例９：ＰＣＲ断片を用いたトランスフェクションアレイ）
次に、ＰＣＲ断片を遺伝物質として用いた場合でも、本発明が実現可能であることを実証した。以下にその手順を示す。
【０５８０】
ＰＣＲにより、図３９に記載のような核酸断片を取得し、トランスフェクションマイクロアレイに用いる遺伝物質とした。その手順を以下に示す。
【０５８１】
ＰＣＲプライマーとしては、
ＧＧ  ＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴ  ＴＡＣＣＧＣＣＡＴＧ  ＣＡＴ（配列番号１２）と
ＣＣＣＴＡＴＣＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧ  ＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡ  ＧＡＣＣＧＡＧＡＴＡ  ＧＧＧ（配列番号１３）とを使用して、テンプレートとして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いた（図４０を参照）。ＰＣＲの条件は、表のとおりである。
【０５８２】
【表４】
2006522605.tif 000010
【０５８３】
サイクル条件：９４℃２分→（９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、３分）→４℃（括弧内を３０サイクル）。
【０５８４】
得られたＰＣＲ  フラグメントは、フェノール／クロロフォルム抽出を行い、エタノール沈殿法にて精製した。そのＰＣＲ断片の配列は、
【０５８５】
【表５】
2006522605.tif 000011
【０５８６】
に記載のとおりである。
【０５８７】
これを用いて作製したチップに、ＭＣＦ７を播種し、２日後に蛍光イメージスキャナーにて画像を取得した。その結果を図４１に示す。図４１では、環状ＤＮＡとＰＣＲフラグメントとの比較を行っている。どちらの場合も、トランスフェクションがうまく行われており、ＰＣＲ断片を遺伝物質として使用した場合でも、全長プラスミドと同様にトランスフェクションされ、細胞の経時的解析が可能であることが明らかになった。
【０５８８】
（実施例１０：テトラサイクリン依存性プロモーターを用いた遺伝子発現調節）
上記実施例と同様に、テトラサイクリン依存性プロモーターを用いて遺伝子発現調節がどのようになされるかをプロファイルとして生成することができることを実証した。使用した配列は以下のとおりである。
【０５８９】
テトラサイクリン依存性プロモーター（およびその遺伝子ベクター構築物）としては、のｐＴｅｔ  ｏｆｆおよびｐＴｅｔ  ｏｎベクター系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｃａｔｔｅｔ．ｓｈｔｍｌを参照）。ベクターは、ｐＴＲＥ−ｄ２ＥＧＦＰ（配列番号２９）を利用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｖｅｃｔｏｒｓＴ−Ｚ／ｐＴＲＥ−ｄ２ＥＧＦＰ．ｓｈｔｍｌに記載されている）。
【０５９０】
ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｋ１６２０−Ａ）
ＰＣＭＶを含むフラグメント：８６−６７３
テトラサイクリン応答転写活性化因子（ｔＴＡ）：７７４−１７８１
Ｃｏｌ  Ｅ１複製起源：２６０４−３２４７
アンピシリン耐性遺伝子：β−ラクタマーゼコード配列：４２５５−３３９５
ＳＶ４０ポリＡシグナル含有フラグメント：１７９７−２２５４
ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子：６４６２−５６６８
ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子の発現を制御するＳＶ４０プロモーター（ＰＳＶ４０）：７１２５−６７８２
ｐＴｅｔ−ＯＮ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｋ１６２１−Ａ）
ＰＣＭＶを含むフラグメント：  ８６−６７３
逆テトラサイクリン応答転写活性化因子（ｒｔＴＡ）：７７４−１７８１
ｐＵＣ複製起源：  ２６０４-３２４７
アンピシリン耐性遺伝子：β−ラクタマーゼコード配列：４２５５−３３９５
ＳＶ４０ポリＡシグナル含有フラグメント：１７９７−２２５４
ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子：６４６２−５６６８
ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子の発現を制御するＳＶ４０プロモーター（ＰＳＶ４０）：７１２５−６７８２
ｐＴＲＥ−ｄ２ＥＧＦＰ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  ６２４２−１）
ＰｈＣＭＶ＊−１  Ｔｅｔ応答性プロモーター：１−４３８
Ｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）：１−３１８
７種のｔｅｔＯ  １８マーの位置：１５−３３；５７−７５；９９−１１７；１４１−１５９；１８３−２０１；２２５−２４３；および２５７−２７５
ＰｍｉｎＣＭＶ含有フラグメント：３１９−４３８
ＴＡＴＡボックス  ３４１−３４８
不安定性促進緑色蛍光タンパク質（ｄ２ＥＧＦＰ）遺伝子
開始コドン：４４５−４４７；終止コドン：１２８８−１２９０
２位へのＶａｌの挿入：４４８−４５０
ＧＦＰｍｕｔ１変異（Ｐｈｅ−６４−Ｌｅｕ，  Ｓｅｒ−６５−Ｔｈｒ）：６３４−６３９
Ｈｉｓ−２３１−Ｌｅｕ：  １１３７  
マウスオルニチンデカルボキシラーゼ（ＭＯＤＣ）ＰＥＳＴ配列：１１６７−１２９０
ＳＶ４０ポリＡシグナル含有フラグメント：１３３０−１７８７（ポリＡシグナル：１４４８−１４５３とほぼ同じ座標）
Ｃｏｌ  Ｅ１複製起源含有フラグメント：２１３７−２７８０
アンピシリン耐性遺伝子
β−ラクタマーゼコード配列：２９２８−３７８８
開始コドン：３７８８−３７８６
終止コドン：２９２８−２９３０
（プロトコル）
アレイ基板上に、ｐＴｅｔ  ｏｆｆおよびｐＴｅｔ  ｏｎ（配列番号２６および２７）をプリントし、同一基板上においてテトラサイクリンによる遺伝子発現調節がされるかどうかをリアルタイムで計測した。その結果を、図４２に示す。図４２に示されるように、依存性プロモーターでのみ遺伝子発現の変化が測定された。図４３には、非依存性と依存性とにおける発現の実際の様子を写真として示す。このように、肉眼でもはっきりわかる程度に比較可能に変化が測定可能となる。
【０５９１】
（プロファールデータの測定）
リアルタイムに取得した画像をもとにして、細胞あたり、面積あたりの強度変化をグラフ化し、ノイズ除去などの一次変換の後、多変量解析、信号処理法などを適用し、プロファイルデータを提示することができる。これを現象ごと、細胞ごとに比較することで、細胞特有の応答や同一性を取得することができる。
【０５９２】
（実施例１１：遺伝子発現）
次に、構造遺伝子をコードする核酸分子を用いて細胞のプロファイルを作成した。ここでは、構造遺伝子として、嗅覚レセプターＩ７（配列番号１５、１６）を使用した。プロトコルは、上記実施例に準じた。
【０５９３】
その結果、プロモーターと同様に、遺伝子産物の量などを測定することで、細胞のプロファイルを作成することができることが実証された。
【０５９４】
（実施例１２：アポトーシスシグナル）
次に、細胞内にあるカスパーゼ３の活性化に着目してモニターしても、細胞のプロファイルを作成することができることを調べた。トランスフェクトおよびアレイの調製は上述の実施例と同様に行った。
【０５９５】
ここでは、ｐＣａｓｐａｓｅ３−Ｓｅｎｓｏｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ９４３０３；カタログ番号８１８５−１）を用いて、アポトーシスシグナルであるカスパーゼ３をモニターした。
【０５９６】
その結果、プロモーターと同様に、アポトーシスシグナルなどを測定することで、細胞のプロファイルを作成することができることが実証された。
【０５９７】
（実施例１３：ストレスシグナル）
次に、細胞内にあるＪＮＫ、ＥＲＫ、ｐ３８などのアポトーシスシグナルを転写因子レポーターを使用してストレスシグナルに関し細胞のプロファイルを作成することができることを調べた。トランスフェクトおよびアレイの調製は上述の実施例と同様に行った。
【０５９８】
ここでは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＡＰ１−ＥＧＦＰ、ｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ、ｐＳＲＥ−ＥＧＦＰを用いて、ストレスシグナルであるＪＮＫ、ＥＲＫ、ｐ３８をモニターした。
【０５９９】
その結果上述の実施例と同様に、ストレスシグナルなどを測定することで、細胞のプロファイルを作成することができることが実証された。
【０６００】
（実施例１４：分子局在化）
次に、蛍光タンパク質を目的遺伝子に融合させ、その発現プロファイルおよび細胞内における局在化を可視化することができることを実証した。
【０６０１】
ここでは、蛍光タンパク質として、ＧＦＰ，ＲＦＰ，ＣＦＰ，ＢＦＰを使用し、目的遺伝子として、ＫＩＡＡクローン、ｃＤＮＡライブラリーなどを使用し、これらを用いて遺伝子構築物を作製した。具体的に使用したものは以下のとおりである。
【０６０２】
ＫＩＡＡ  ｃＤＮＡクローン（ＫＩＡＡ＝かずさＤＮＡ研究所、かずさ、千葉から入手可能）
インビトロジェンのｃＤＮＡ市販ライブラリー
トランスフェクトおよびアレイの調製は上述の実施例と同様に行った。
【０６０３】
ここでは、ＫＩＡＡクローンの内のＫＩＡＡ１４７４を用いて、発現プロファイルおよび局在化をモニターした。
【０６０４】
その結果上述の実施例と同様に、意図的に構築した遺伝子構築物を用いて、意図した指標について、細胞のプロファイルを作成することができることが実証された。
【０６０５】
（実施例１５：細胞形態変化）
次に、ある遺伝子を発現させて、あるいは、ノックダウンし、あるいは、添加物質（ここでは、化学物質としてグリセロフォスフェートを使用し、サイトカインとしてデキサメタゾンを使用する）細胞形態の変化をプロファイルを生成することができることを実証した。細胞形態としては、細胞の多核化、伸展状態、伸展突起の伸長などを、三次元データとして取得し、解析した。
【０６０６】
ここでは、導入した核酸分子の具体的な配列は以下のとおりである。
【０６０７】
ＫＩＡＡクローン（前出）；および
転写因子に対するＲＮＡｉ（ＣＢＦＡ−１，ＡＰ１）。
【０６０８】
トランスフェクトおよびアレイの調製は上述の実施例と同様に行った。
【０６０９】
ここでは、上述の実施例で用いた間葉系幹細胞を用いて、骨芽細胞分化誘導した際の細胞形態をモニターした。
【０６１０】
その結果上述の実施例と同様に、意図的に構築した遺伝子構築物を用いて、意図した指標について、細胞のプロファイルを作成することができることが実証された。そして、このプロファイルデータをもとに、上記実施例で使用したような処理を用いて、イベントディスクリプタを作成することができる。
【０６１１】
（実施例１６：分子間相互作用）
次に、ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴなどの手法を用いて細胞のプロファイルを生成することができることを実証した。
【０６１２】
ここでは、導入した核酸分子の具体的な配列は以下のとおりである。
【０６１３】
嗅覚レセプター（配列番号１５〜１８）とＧタンパク質（配列番号１９〜２４）
トランスフェクトおよびアレイの調製は上述の実施例と同様に行った。
【０６１４】
ここでは、嗅覚レセプターとＧタンパク質の解離を臭い物質の誘導によってモニターし、これを蛍光波長の変化として用いて、細胞をモニターした。
【０６１５】
ここで使用したツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴおよびＢＲＥＴは、具体的には以下のようにして行った。
【０６１６】
ツーハイブリッドシステムは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｃａｔａｌｏｇ／００７００３００６．ｓｈｔｍｌ）。ＦＲＥＴおよびＢＲＥＴは、ベルトールドジャパンから入手可能な機器を用いて測定した。
【０６１７】
その結果上述の実施例と同様に、意図的に構築した遺伝子構築物を用いて、ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴなどによっても、細胞のプロファイルを作成することができることが実証された。
【０６１８】
（実施例１７：マイクロＲＮＡ）
次に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸分子を用いて細胞のプロファイルを作成する。ここでは、ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ−２３を使用する。プロトコルは、上記実施例に準ずる。
【０６１９】
マイクロＲＮＡは、１８−２５塩基の小さな非コード（Ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ）ＲＮＡ（タンパク質翻訳されないＲＮＡ）であり、線虫で初めて発見され動植物に広く保存されていることが判明している。線虫や植物においては、ｍｉＲＮＡが発生・分化に関わることが報告され、動物においても同様の機能が示唆されている。現在までに２００種類以上のｍｉＲＮＡが報告されている。
【０６２０】
Ｎａｔｕｒｅ  ４２３，  ８３８−８４２（２００３）には、ｍｉＲＮＡ−２３の標的がＨｅｓ１（幹細胞がニューロンに分化するのを抑制しているリプレッサー転写因子）遺伝子であることが報告されている。ｍｉＲＮＡ−２３は、この遺伝子の翻訳終始コドン付近に存在し、不完全な相補塩基対（７７％）を形成する。この不完全な相補塩基対がｍｉＲＮＡの機能に重要であり、実際に合成ｍｉＲ−２３をヒト胚性腫瘍細胞ＮＴ２細胞に導入するとＨｅｓ１の発現が抑制されることがわかっている。このような活性は、ｓｉＲＮＡなどを用いてノックダウンすることもできる。
【０６２１】
この原理をもとに、実際に、配列番号２５に記載のようなｍｉＲＮＡを作製した。
【０６２２】
このような系を用いて、ｍｉＲＮＡの挙動のプロファイルを生成し、関連する遺伝子産物の量などを測定することで、細胞のプロファイルを作成することができることが実証される。
【０６２３】
（実施例１８：生物学的系−リボザイム）
次に、リボザイム用いて細胞のプロファイルを作成する。ここでは、リボザイムとして、３０５  ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １２３（５）  ３０５―３１３  （２００３）  に記載されるようなリボザイムを使用する。プロトコルは、上記実施例１に準ずる。
【０６２４】
リボザイムは、テトラヒメナ（ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のグループＩ  イントロン（ｇｒｏｕｐ  Ｉ  ｉｎｔｒｏｎ）がＲＮＡ鎖の部位特異的切断及び結合反応を触媒していることから発見され、そのような酵素活性を有するＲＮＡをさす。リボザイムとしては、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム，ヘアピン型リボザイムなどが挙げられる。
【０６２５】
このような系を用いて、リボザイムの挙動のプロファイルを生成し、関連する遺伝子転写、遺伝子産物の量などを測定することで、細胞のプロファイルを作成することができることが実証される。
【０６２６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０６２７】
本発明により、驚くべきほど少ない因子を観察することによって、細胞状態を判定することが可能になった。このような判定により、診断、予防、治療に応用することが可能となり、その応用範囲は医療のみならず、食品、化粧品、農業、環境など種々の分野に及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【０６２８】
【図１】図１は、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合の種々のアクチン作用物質およびコントロールとしてのゼラチンを用いた結果の一例を示す。図１は、トランスフェクション効率についての各々の付着物質の効果を示す（ＨＥＫ細胞）。ＨＥＫ細胞は、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１でトランスフェクションされた。
【図２】図２は、フィブロネクチンのフラグメントを用いた場合のトランスフェクション効率の結果の一例を示す。
【図３】図３は、フィブロネクチンのフラグメントを用いた場合のトランスフェクション効率の結果の一例を示す。
【図４】図４は、図２および図３からまとめたフィブロネクチンのフラグメントを用いた場合のトランスフェクション効率の結果の一例を示す。
【図５】図５は、種々の細胞におけるトランスフェクション効率を調べた結果の一例を示す。
【図６】図６は、種々のプレートを用いた場合のトランスフェクションの状態を示す結果の一例を示す。
【図７】図７は、フィブロネクチンの濃度を０、０．２７、０．５３、０．８、１．０７および１．３３（それぞれμｇ／μＬ）として種々のプレート上でトランスフェクションを行った場合の結果を示す。図７は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションに対するフィブロネクチン濃度および表面改変の影響を示す。データは、４回の異なる平均を示す。
【図８】図８は、フィブロネクチンの有無での、細胞接着プロファイルを示す写真の一例を示す。
【図９】図９は、フィブロネクチンの有無での、細胞接着プロファイルを示す切片写真の一例を示す。共焦点走査顕微鏡を用いて、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の切片を観察した。ｈＭＳＣを、ＳＹＴＯ６１（青色蛍光）およびＴｅｘａｓ  ｒｅｄ−ｘファロイジン（赤色蛍光）により染色し、４％ＰＦＡで固定した。青色蛍光（核：ＳＹＴＯ６１）および赤色蛍光（核：Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ−ｘファロイジン）を、共焦点走査顕微鏡を用いて観察した（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，ピンホールサイズ＝１．０，画像間隔＝０．４）。
【図１０】図１０は、核の表面積の推移を示す。相対核表面積を、共焦点走査顕微鏡により観察されたｈＭＳＣ切片により判定した。ｈＭＳＣは、４％ＰＦＡで固定した。
【図１１】図１１は、トランスフェクションアレイチップとして構築して使用した場合のトランスフェクション実験の結果の一例を示す。
【図１２】図１２は、アレイ上での各スポット間の夾雑の様子を示す一例である。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、実施例４における本発明の固相トランスフェクションによって、空間的に分離したＤＮＡの細胞内への取り込みを示す図である。  図１３Ａは、固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）作製方法を模式的に示した図である。この図は、固相トランスフェクションの方法論を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、実施例４における本発明の固相トランスフェクションによって、空間的に分離したＤＮＡの細胞内への取り込みを示す図である。  図１３Ｂは、固相トランスフェクションの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞株を用いてＳＰＴＡを作製した結果を示す。緑色の部分は、トランスフェクションされた付着細胞を示す。この結果から、本発明の方法によって、空間的に分離された、異なる遺伝子によってトランスフェクトされた細胞の集団を調製することが可能となった。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、従来の液相トランスフェクションとＳＰＴＡとの間の差異を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび図１４Ｂは、液相トランスフェクションとＳＰＴＡの比較を示す結果である。  図１４Ａは、実験に用いた５つの細胞株について、ＧＦＰ強度／ｍｍ２を測定した結果を示す。図１４Ａは、トランスフェクション効率を、単位面積あたりの総蛍光強度として判定する方法を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび図１４Ｂは、液相トランスフェクションとＳＰＴＡの比較を示す結果である。  図１４Ｂは、図１４Ａの示すデータに対応する、ＥＧＦＰを発現する細胞の蛍光画像である。図１４Ｂにおいて、白丸で示された領域は、プラスミドＤＮＡを固定化した領域を示す。プラスミドＤＮＡを固定化した領域以外の領域では、細胞が固相に固定化されたにもかかわらず、ＥＧＦＰを発現する細胞は観察されなかった。白棒は、５００μｍを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、本発明のトランスフェクション法の一例を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、本発明のトランスフェクション法の一例を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、チップのコーティングによって相互夾雑が低減された結果を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＴ３Ｔ３細胞（「３Ｔ３」として示す）、ＨｅｐＧ２細胞、およびｈＭＳＣを用いて、液相トランスフェクション法およびＳＰＴＡを行った結果を示す。トランスフェクション効率を、ＧＦＰ強度で示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、チップのコーティングによって相互夾雑が低減された結果を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＴ３Ｔ３細胞（「３Ｔ３」として示す）、ＨｅｐＧ２細胞、およびｈＭＳＣを用いて、液相トランスフェクション法およびＳＰＴＡを行った結果を示す。トランスフェクション効率を、ＧＦＰ強度で示す。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、各スポット間の相互夾雑に関する様子を示す図である。ＡＰＳまたはＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）でコーティングしたチップに対して、所定の濃度のフィブロネクチンを含む核酸混合物を固定化し、その固定化したチップを用いて細胞トランスフェクションした結果、相互夾雑は観察されなかった（上段および中断）。これに対して、チップをコーティングしなかった場合、固定化核酸の有意な相互夾雑が観察された（下段）。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、各スポット間の相互夾雑に関する様子を示す図である。ＡＰＳまたはＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）でコーティングしたチップに対して、所定の濃度のフィブロネクチンを含む核酸混合物を固定化し、その固定化したチップを用いて細胞トランスフェクションした結果、相互夾雑は観察されなかった（上段および中断）。これに対して、チップをコーティングしなかった場合、固定化核酸の有意な相互夾雑が観察された（下段）。
【図１６Ｃ】図１６Ｃおよび図１６Ｄは、核酸の固定化において使用する混合物中に使用される物質の種類と、細胞接着速度との相関関係を示す。図１６Ｄのグラフは、時間経過に伴う、接着細胞の割合の増加を示す。グラフの傾きが緩やかな場合は、グラフの傾き急な場合と比較して、より多くの時間が細胞接着に必要なことを示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｃおよび図１６Ｄは、核酸の固定化において使用する混合物中に使用される物質の種類と、細胞接着速度との相関関係を示す。図１６Ｄのグラフは、時間経過に伴う、接着細胞の割合の増加を示す。グラフの傾きが緩やかな場合は、グラフの傾き急な場合と比較して、より多くの時間が細胞接着に必要なことを示す。
【図１７】図１７は、本発明の方法をコンピュータにおいて実行したときの一構成例を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、本発明の数理的解析法の一例を示す。蛍光強度変化を測定することにより、プロモーターのプロファイルを得た。上記プロファイルは、細胞または培地固有の蛍光を用いて標準化した。その後、レポーター発現波動の振幅を比較し、ここで、５以上の振幅（ＴＨ≧５）を有する発現波動は、変化の存在を示すと見なした。分化誘導開始後、初期（０時間〜１７．５時間）および後期（１７．５時間〜３１．５時間）、ならびに全時間（０時間〜３１．５時間）の間、上記測定を行った。５以上の振幅（ＴＨ≧５）を有する発現変動を、（＋）により表わし、５未満の振幅（ＴＨ＜５）を有する発現変動を、（−）により表わした。任意のレポーターを抽出する場合（Ａ＋Ｂ＋．．．＋ｎ）、ｎ個の波を積分し、合計をｎで割って平均波を形成した。閾値以上の波動を、変化と見なした。図１８Ｂにおいて、２つのレポータープロファイルを積分し、平均プロファイルを赤で示した。５以上の平均プロファイルの波動を、発現波動と見なした。波動は、２つのレポーターにより検出され得る。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、本発明の数理的解析法の一例を示す。蛍光強度変化を測定することにより、プロモーターのプロファイルを得た。上記プロファイルは、細胞または培地固有の蛍光を用いて標準化した。その後、レポーター発現波動の振幅を比較し、ここで、５以上の振幅（ＴＨ≧５）を有する発現波動は、変化の存在を示すと見なした。分化誘導開始後、初期（０時間〜１７．５時間）および後期（１７．５時間〜３１．５時間）、ならびに全時間（０時間〜３１．５時間）の間、上記測定を行った。５以上の振幅（ＴＨ≧５）を有する発現変動を、（＋）により表わし、５未満の振幅（ＴＨ＜５）を有する発現変動を、（−）により表わした。任意のレポーターを抽出する場合（Ａ＋Ｂ＋．．．＋ｎ）、ｎ個の波を積分し、合計をｎで割って平均波を形成した。閾値以上の波動を、変化と見なした。図１８Ｂにおいて、２つのレポータープロファイルを積分し、平均プロファイルを赤で示した。５以上の平均プロファイルの波動を、発現波動と見なした。波動は、２つのレポーターにより検出され得る。
【図１９】図１９は、本発明で用いたプロモーター含有プラスミド例および本発明の解析の一例を示す。
【図２０】図２０は、分化誘導初期における数理的解析結果の一例を示す。結果は、分化誘導初期の任意に抽出されたレポーターの組み合わせを変化させて得られた。１７のレポーターから、任意の数のレポーターを抽出した。図１８Ａおよび図１８Ｂに示す方法により、平均プロファイルを求めた。５以上の波動振幅を有するプロファイルを、０〜３１．５時間、０〜１７．５時間、および１７．５〜３１．５時間の間隔で評価した。各々の抽出条件下で、抽出数は１７であった（１７抽出による例示的な組み合わせを示す）。図１８Ａおよび図１８Ｂは、波動を生じると考えられる組み合わせの比率を示す。解析により、分化誘導は初期には検出されないが、１５時間後には検出された。抽出されたレポーターの数は８であり、確実に波動を生じる組み合わせの比率は、１００％であった。
【図２１】図２１は、未分化維持における数理的解析結果の一例を示す。任意に抽出されたレポーターを、未分化状態維持条件下で変化させた。結果は、図２０において分化誘導を実施した場合とは有意に異なっていた。図２０と比較することにより、細胞が分化誘導されるかまたは未分化状態に維持されるかを判定することが可能であると考えられる。
【図２２】図２２は、カクテルパーティープロセスの模式図を示す。
【図２３】図２３は、遺伝子転写スイッチレポーター（本発明において使用されるトランスフェクションプラスミド）の構築例を示す。
【図２４】図２４は、転写因子レポーターセットの構築例を示す。
【図２５】図２５は、転写因子レポーターのアッセイ例を示す。
【図２６】図２６は、骨分化過程における転写因子活性の経時的測定例を示す。ヒト間葉幹細胞（Ｏｓｉｒｉｓより入手可能）およびｈＭＳＣ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒより入手可能）を測定に使用した。
【図２７】図２７は、転写因子活性の振動現象および位相解析の例を示す。
【図２８】図２８は、細胞のリアルタイム計測装置の例である。
【図２９】図２９は、細胞測定装置の拡大模式図を示す。
【図３０】図３０は、細胞の測定のスキーム例を示す。
【図３１】図３１は、本発明において使用するグリッドアレイの例を示す。下には、使用した遺伝子名を示す。
【図３２】図３２は、本発明において、グリッドアレイを使用して得られた生データを示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、実施例５において取得した生データのグラフを示す。横縦軸は、蛍光強度（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔ）、横軸は時間（単位は、分）を示す。使用した遺伝子は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１，  ｐＡＰ１−ＥＧＦＰ，  ｐＡＰ１（ＰＭＡ）−ＥＧＦＰ，  ｐＥ２Ｆ−ＥＧＦＰ，  ｐＧＡＳ−ＥＧＦＰ，  ｐＨＳＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＭｙｃ−ＥＧＦＰ，  ｐＮＦｋＢ−ＥＧＦＰ，  ｐＲｂ−ＥＧＦＰ，  ｐＳＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐｐ５３−ＥＧＦＰ，  ｐＣＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＥＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＧＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＩＳＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＮＦＡＴ−ＥＧＦＰ，  ｐＲＡＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＳＴＡＴ３−ＥＧＦＰ，  ｐＴＲＥ−ＥＧＦＰ，  ｐＣＲＥＢ−ＥＧＦＰ，  ｐＩｋＢ−ＥＧＦＰ，  ｐｐ５３−ＥＧＦＰ（シグナルプローブ），  ｐＣａｓｐａｓｅ３−Ｓｅｎｓｏｒである。
【図３３Ｂ】図３３Ｂ〜図３３Ｅは、実施例５において取得したデータの生データを示す。
【図３３Ｃ】図３３Ｂ〜図３３Ｅは、実施例５において取得したデータの生データを示す。
【図３３Ｄ】図３３Ｂ〜図３３Ｅは、実施例５において取得したデータの生データを示す。
【図３３Ｅ】図３３Ｂ〜図３３Ｅは、実施例５において取得したデータの生データを示す。
【図３３Ｆ】図３３Ｆ〜図３３Ｉは、実施例５において取得したデータの多項式近似の後の計算結果を示す。
【図３３Ｇ】図３３Ｆ〜図３３Ｉは、実施例５において取得したデータの多項式近似の後の計算結果を示す。
【図３３Ｈ】図３３Ｆ〜図３３Ｉは、実施例５において取得したデータの多項式近似の後の計算結果を示す。
【図３３Ｉ】図３３Ｆ〜図３３Ｉは、実施例５において取得したデータの多項式近似の後の計算結果を示す。
【図３３Ｊ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｋ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｌ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｍ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｎ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｏ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｐ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｑ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｒ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｓ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｔ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３３Ｕ】図３３Ｊ〜図３３Ｕは、実施例５において取得したデータの1階微分および２階微分後のデータを示す。
【図３４Ａ】図３４−１〜図３４−５５は、実施例５において取得した生データを各々の遺伝子ごとに示す（ネガティブコントロールは、「ｎｏｎｅ」で表わされる）。  図３４−１は、ＥＧＦＰ−Ｎ１の経時的データを示す。  図３４−２は、ＡＰ１の経時的データを示す。  図３４−３は、ＡＰ１（ＰＭＡ）の経時的データを示す。  図３４−４は、ＣＲＥの経時的データを示す。
【図３４Ｂ】図３４−５は、Ｅ２Ｆの経時的データを示す。  図３４−６は、なし（なし（ｎｏｎｅ））の経時的データを示す。  図３４−７は、ＥＧＦＰ−Ｎ１の経時的データを示す。  図３４−８は、ＡＰ１のさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｃ】図３４−９は、ＡＰ１（ＰＭＡ）のさらなる経時的データを示す。  図３４−１０は、ＣＲＥのさらなる経時的データを示す。  図３４−１１は、Ｅ２Ｆのさらなる経時的データを示す。  図３４−１２は、ＥＲＥの経時的データを示す。
【図３４Ｄ】図３４−１３は、ＧＡＳの経時的データを示す。  図３４−１４は、ＧＲＥの経時的データを示す。  図３４−１５は、ＨＳＥの経時的データを示す。  図３４−１６は、ＩＳＲＥの経時的データを示す。
【図３４Ｅ】図３４−１７は、なし（なし（ｎｏｎｅ））のさらなる経時的データを示す。  図３４−１８は、ＥＲＥのさらなる経時的データを示す。  図３４−１９は、ＧＡＳのさらなる経時的データを示す。  図３４−２０は、ＧＲＥのさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｆ】図３４−２１は、ＨＳＥの経時的データを示す。  図３４−２２は、ＩＳＲＥの経時的データを示す。  図３４−２３は、Ｍｙｃの経時的データを示す。  図３４−２４は、ＮＦＡＴの経時的データを示す。
【図３４Ｇ】図３４−２５は、ＮＦｋＢの経時的データを示す。  図３４−２６は、ＲＡＲＥの経時的データを示す。  図３４−２７は、Ｒｂの経時的データを示す。  図３４−２８は、なし（なし（ｎｏｎｅ））のさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｈ】図３４−２９は、Ｍｙｃの経時的データを示す。  図３４−３０は、ＮＦＡＴのさらなる経時的データを示す。  図３４−３１は、ＮＦｋＢのさらなる経時的データを示す。  図３４−３２は、ＲＡＲＥのさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｉ】図３４−３３は、Ｒｂのさらなる経時的データを示す。  図３４−３４は、ＳＴＡＴ３の経時的データを示す。  図３４−３５は、ＳＲＥの経時的データを示す。  図３４−３６は、ＴＲＥの経時的データを示す。
【図３４Ｊ】図３４−３７は、ｐ５３の経時的データを示す。  図３４−３８は、Ｃａｓｐａｓｅ３の経時的データを示す。  図３４−３９は、なし（なし（ｎｏｎｅ））のさらなる経時的データを示す。  図３４−４０は、ＳＴＡＴ３の経時的データを示す。
【図３４Ｋ】図３４−４１は、ＳＲＥのさらなる経時的データを示す。  図３４−４２は、ＴＲＥのさらなる経時的データを示す。  図３４−４３は、ｐ５３のさらなる経時的データを示す。  図３４−４４は、Ｃａｓｐａｓｅ３のさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｌ】図３４−４５は、ＣＲＥＢ−ＥＧＦＰの経時的データを示す。  図３４−４６は、ＩｋＢ−ＥＧＦＰの経時的データを示す。  図３４−４７は、ｐｐ５３−ＥＧＦＰの経時的データを示す。  図３４−４８は、なし（ｎｏｎｅ）のさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｍ】図３４−４９は、なし（ｎｏｎｅ）のさらなる経時的データを示す。  図３４−５０は、なし（ｎｏｎｅ）のさらなる経時的データを示す。  図３４−５１は、ＣＲＥＢ−ＥＧＦＰのさらなる経時的データを示す。  図３４−５２は、ＩｋＢ−ＥＧＦＰのさらなる経時的データを示す。
【図３４Ｎ】図３４−５３は、ｐｐ５３−ＥＧＦＰのさらなる経時的データを示す。  図３４−５４は、なし（ｎｏｎｅ）のさらなる経時的データを示す。  図３４−５５は、なし（ｎｏｎｅ）のさらなる経時的データを示す。
【図３５】図３５は、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を示す。固相基板上に各レポーター遺伝子を一遺伝子あたり４スポットになるようプリントし、乾燥後、各転写因子に対してのｓｉＲＮＡ（２８種類）を対応した  レポーター遺伝子がプリントされている座標上にプリントし、乾燥させた。また、コントロールとして、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用い、ネガティブコントロールとしては、ｓｃｒａｍｂｌｅ  ＲＮＡをもちいた。その後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を各遺伝子プリント同一座標にプリントし乾燥させた。その後、フィブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリントし乾燥させた。これに、ＨｅＬａ−Ｋ細胞を播種し、２日間培養を行った後に、蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。
【図３６Ａ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対して全て行った結果を示している。Ｄ：ｐＤｓＲｅｄ２−１（プロモーターのないベクター：ｓｈＲＮＡに対するネガティブコントロール）。Ｇ：ｐＥＧＥＰ−Ｎ１（緑色蛍光タンパク質発現ベクター：本明細書中で使用されるｓｈＲＮＡの標的遺伝子）。ｓｈ：ｐＰＵＲ６ｉＧＦＰ２７２（ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するベクター型ＲＮＡｉ）。Ｄ＋Ｇなど：Ｄは、Ｇがプリントされる前にプリントされる（プリンティングオーダーが記載される）。Ｄ＋Ｇ（７：３）など：Ｄの対Ｇ比、ここで、Ｄ遺伝子およびＧ遺伝子の総量は、２μｇであり、Ｄ遺伝子の対Ｇ遺伝子比は、７：３であった。
【図３６Ｂ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対して全て行った結果を示している。Ｄ：ｐＤｓＲｅｄ２−１（プロモーターのないベクター：ｓｈＲＮＡに対するネガティブコントロール）。Ｇ：ｐＥＧＥＰ−Ｎ１（緑色蛍光タンパク質発現ベクター：本明細書中で使用されるｓｈＲＮＡの標的遺伝子）。ｓｈ：ｐＰＵＲ６ｉＧＦＰ２７２（ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するベクター型ＲＮＡｉ）。Ｄ＋Ｇなど：Ｄは、Ｇがプリントされる前にプリントされる（プリンティングオーダーが記載される）。Ｄ＋Ｇ（７：３）など：Ｄの対Ｇ比、ここで、Ｄ遺伝子およびＧ遺伝子の総量は、２μｇであり、Ｄ遺伝子の対Ｇ遺伝子比は、７：３であった。
【図３６Ｃ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対して全て行った結果を示している。Ｄ：ｐＤｓＲｅｄ２−１（プロモーターのないベクター：ｓｈＲＮＡに対するネガティブコントロール）。Ｇ：ｐＥＧＥＰ−Ｎ１（緑色蛍光タンパク質発現ベクター：本明細書中で使用されるｓｈＲＮＡの標的遺伝子）。ｓｈ：ｐＰＵＲ６ｉＧＦＰ２７２（ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するベクター型ＲＮＡｉ）。Ｄ＋Ｇなど：Ｄは、Ｇがプリントされる前にプリントされる（プリンティングオーダーが記載される）。Ｄ＋Ｇ（７：３）など：Ｄの対Ｇ比、ここで、Ｄ遺伝子およびＧ遺伝子の総量は、２μｇであり、Ｄ遺伝子の対Ｇ遺伝子比は、７：３であった。
【図３６Ｄ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対して全て行った結果を示している。Ｄ：ｐＤｓＲｅｄ２−１（プロモーターのないベクター：ｓｈＲＮＡに対するネガティブコントロール）。Ｇ：ｐＥＧＥＰ−Ｎ１（緑色蛍光タンパク質発現ベクター：本明細書中で使用されるｓｈＲＮＡの標的遺伝子）。ｓｈ：ｐＰＵＲ６ｉＧＦＰ２７２（ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するベクター型ＲＮＡｉ）。Ｄ＋Ｇなど：Ｄは、Ｇがプリントされる前にプリントされる（プリンティングオーダーが記載される）。Ｄ＋Ｇ（７：３）など：Ｄの対Ｇ比、ここで、Ｄ遺伝子およびＧ遺伝子の総量は、２μｇであり、Ｄ遺伝子の対Ｇ遺伝子比は、７：３であった。
【図３６Ｅ】図３６Ａ〜図３６Ｅは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター・各細胞に対して全て行った結果を示している。Ｄ：ｐＤｓＲｅｄ２−１（プロモーターのないベクター：ｓｈＲＮＡに対するネガティブコントロール）。Ｇ：ｐＥＧＥＰ−Ｎ１（緑色蛍光タンパク質発現ベクター：本明細書中で使用されるｓｈＲＮＡの標的遺伝子）。ｓｈ：ｐＰＵＲ６ｉＧＦＰ２７２（ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するベクター型ＲＮＡｉ）。Ｄ＋Ｇなど：Ｄは、Ｇがプリントされる前にプリントされる（プリンティングオーダーが記載される）。Ｄ＋Ｇ（７：３）など：Ｄの対Ｇ比、ここで、Ｄ遺伝子およびＧ遺伝子の総量は、２μｇであり、Ｄ遺伝子の対Ｇ遺伝子比は、７：３であった。
【図３７】図３７は、実施例８におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を示す。固相基板上に示す各レポーター遺伝子発現ユニットＰＣＲ断片を一遺伝子あたり４スポットになるようプリントし、乾燥後、各転写因子に対してのｓｉＲＮＡ（２８種類）を対応したレポーター遺伝子がプリントされている座標上にプリントし、乾燥させた。また、コントロールとして、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用い、ネガティブコントロールとしては、スクランブルＲＮＡをもちいた。その後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を各遺伝子プリント同一座標にプリントし乾燥させた。その後、フィブロネクチン溶液を同一座標に重ねてプリントした。これに、ＨｅＬａ−Ｋ細胞を播種し、２日間培養を行った後に、蛍光イメージスキャナにて画像を取得した。
【図３８Ａ】図３８Ａ〜図３８Ｄは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター各細胞に対してすべて行った結果を示している。
【図３８Ｂ】図３８Ａ〜図３８Ｄは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター各細胞に対してすべて行った結果を示している。
【図３８Ｃ】図３８Ａ〜図３８Ｄは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター各細胞に対してすべて行った結果を示している。
【図３８Ｄ】図３８Ａ〜図３８Ｄは、実施例７におけるＲＮＡｉトランスフェクションアレイのトランスフェクション結果を細胞ごとに示す。各レポーターの蛍光強度を画像解析によって定量化した後に、ネガティブコントロールであるスクランブルＲＮＡをプリントした各レポーターの強度に対する比率を算出した。これを、各レポーター各細胞に対してすべて行った結果を示している。
【図３９】図３９は、実施例９において得たＰＣＲ断片の構造を示す。
【図４０】図４０は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１の構造を示す。
【図４１】図４１は、環状ＤＮＡとＰＣＲ断片とを用いたトランスフェクションマイクロアレイのトランスフェクト効率の比較を示す。
【図４２】図４２は、テトラサイクリン依存性プロモーターを使用したときの変化の様子を示す。
【図４３】図４３は、テトラサイクリン依存性プロモーターおよびテトラサイクリン非依存性プロモーターを用いたときの、発現の様子を示す図である。
【図４４】図４４は、細胞プロファイルデータを生成するための本発明のシステム構成例である。
【配列表フリーテキスト】
【０６２９】
（配列表の説明）
配列番号１：フィブロネクチンの核酸配列（ヒト）
配列番号２：フィブロネクチンのアミノ酸配列（ヒト）
配列番号３：ビトロネクチンの核酸配列（マウス）
配列番号４：ビトロネクチンのアミノ酸配列（マウス）
配列番号５：ラミニンの核酸配列（マウスα鎖）
配列番号６：ラミニンのアミノ酸配列（マウスα鎖）
配列番号７：ラミニンの核酸配列（マウスβ鎖）
配列番号８：ラミニンのアミノ酸配列（マウスβ鎖）
配列番号９：ラミニンの核酸配列（マウスγ鎖）
配列番号１０：ラミニンのアミノ酸配列（マウスγ鎖）
配列番号１１：フィブロネクチンのアミノ酸配列（ウシ）
配列番号１２：実施例９で用いたプライマー１
配列番号１３：実施例９で用いたプライマー２
配列番号１４：実施例９のPCR反応できたPCR断片
配列番号１５：マウスの嗅覚レセプターＩ７（ｈｅｐｔａｎａｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）の核酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）ＡＦ１０６００７）
配列番号１６：配列番号１５に記載の核酸にコードされるタンパク質
配列番号１７：マウスの嗅覚レセプターＳ４６の核酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１２１９７９）
配列番号１８：配列番号１７に記載の核酸にコードされるタンパク質
配列番号１９：マウスのＧタンパク質αサブユニットの核酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３６７７８）
配列番号２０：配列番号１９に記載の核酸にコードされるタンパク質
配列番号２１：マウスのＧタンパク質βサブユニットの核酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８７２８６）
配列番号２２：配列番号２１に記載の核酸にコードされるタンパク質
配列番号２３：マウスのＧタンパク質γサブユニットの核酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ３７５２７）
配列番号２４：配列番号２３に記載の核酸にコードされるタンパク質
配列番号２５：実施例１６において示されるｍｉＲＮＡの例
配列番号２６：実施例１０において使用されるＴｅｔ−Ｏｆｆの配列
配列番号２７：実施例１０において使用されるＴｅｔ−ｏｎの配列
配列番号２８：ラミニンの５アミノ酸分子（実施例１）
配列番号２９：実施例１０において使用されるｐＴＲＥ−ｄ２ＥＧＦＰの配列
【図１１】
2006522605.tif 000012
【図１２】
2006522605.tif 000013
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【図１７】
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【図２８】
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【図３２】
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【図３５】
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【図３７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｊ】
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【図３３Ｋ】
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【図３３Ｌ】
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【図３３Ｍ】
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【図３３Ｎ】
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【図３３Ｏ】
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【図３３Ｐ】
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【図３３Ｑ】
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【図３３Ｒ】
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【図３３Ｓ】
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【図３３Ｔ】
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【図３３Ｕ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３４Ｉ】
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【図３４Ｊ】
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【図３４Ｋ】
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【図３４Ｌ】
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【図３４Ｍ】
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【図３４Ｎ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006522605.tif 000106
2006522605.tif 000107
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