(57)【要約】哺乳動物における異常細胞を治療するための方法が提供される。この方法は、α２β１を前記細胞への感染性のために認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスで哺乳動物を治療することを含む。本発明の方法で用いるためのウイルスのスクリーニング方法、並びに本発明の方法で用いるための医薬組成物も提供される。
2006517189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における異常細胞を治療するための方法であって、α２β１を異常細胞への感染性のために認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスの効果的な量で哺乳動物を治療し、その結果、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるようにすることを含む方法。
【請求項２】
ウイルスを用いた多数の治療に哺乳動物を供することを含み、各治療におけるウイルスが同一または異なる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスが異常細胞に感染するさらなるウイルスとの組合せで哺乳動物に投与される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
異常細胞がＩＣＡＭ−１を発現し、さらなるウイルスが異常細胞への感染性のためにＩＣＡＭ−１を認識する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらなるウイルスがコクサッキーウイルスまたはその改変された形態である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コクサッキーウイルスが、Ａ１３，Ａ１５，Ａ１８およびＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーウイルス血清型である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異常細胞がガン細胞である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
異常細胞が、α２β１のアップレギュレーションされた発現を有する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスが、哺乳動物に対して局所的に、全身的に、または腫瘍内に投与される請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、ウイルスによって誘導される細胞死に対する感受性について哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをスクリーニングする方法であって： 
（ａ）異常細胞のサンプルを提供する工程；
（ｂ）ウイルスによる異常細胞への感染を可能にするのに十分な期間にわたって異常細胞をウイルスで治療する工程；および
（ｃ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程；
を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される方法。
【請求項１７】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
異常細胞に感染し、その死を生じさせるウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して、工程（ｂ）および工程（ｃ）に供された、α２β１を異常細胞への感染性のために認識する異なるウイルスと比較する工程をさらに含む請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
異なるウイルスが異なるエコーウイルスまたはその改変された形態である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
異常細胞がガン細胞である請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、哺乳動物に由来する異常細胞に感染し、その死を生じさせる能力についてウイルスをスクリーニングする方法であって：
（ａ）ウイルスを選択する工程；
（ｂ）ウイルスによる異常細胞への感染を可能にするのに十分な期間にわたって哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをウイルスで治療する工程；および
（ｃ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程；
を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスおよびその改変された形態から選択される方法。
【請求項２７】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
異常細胞に感染し、その死を生じさせるウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して、工程（ｂ）および工程（ｃ）に供された、α２β１を異常細胞への感染性のために認識する異なるウイルスと比較する工程をさらに含む請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
異なるウイルスが異なるエコーウイルスまたはその改変された形態である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
異常細胞がガン細胞である請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
α２β１を発現する異常細胞に対して哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、エコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスを哺乳動物における異常細胞に感染させることを含み、それにより少なくとも一部の異常細胞の溶解が引き起こされる方法。
【請求項３７】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
異常細胞が、α２β１のアップレギュレーションされた発現を有する請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ウイルスが異常細胞に感染するさらなるウイルスとの組合せで哺乳動物に投与される請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
異常細胞がＩＣＡＭ−１を発現し、さらなるウイルスが異常細胞への感染性のためにＩＣＡＭ−１を認識する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらなるウイルスがコクサッキーウイルスまたはその改変された形態である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
コクサッキーウイルスが、Ａ１３，Ａ１５，Ａ１８およびＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーウイルス血清型である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
異常細胞がガン細胞である請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ウイルスが、哺乳動物に対して局所的に、全身的に、または腫瘍内に投与される請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物における異常細胞を治療するための医薬組成物であって、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるように異常細胞を治療するためにウイルスを生じさせるための接種物を医薬的に許容され得るキャリアと一緒に含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される医薬組成物。
【請求項５１】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
ウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１，ＥＶ７，ＥＶ８およびＥＶ２２からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項５３または５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
異常細胞がガン細胞である請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
医薬組成物が局所投与または注入のためのものである請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
哺乳動物における異常細胞を治療するためのウイルスを生じさせるために哺乳動物に接種物を適用するためのアプリケーターであって、アプリケーターは、接種物が哺乳動物と接触するように接種物を染み込ませた領域を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるアプリケーター。
【請求項５９】
ウイルスを染み込ませた領域が、哺乳動物と接触した状態で保持されるための詰め物またはパッドを含む請求項５８に記載のアプリケーター。
【請求項６０】
異常細胞が異常皮膚細胞であり、アプリケーターが哺乳動物の皮膚に接着するための一つまたはそれ以上の接着性表面をさらに含む請求項５８または５９に記載のアプリケーター。
【請求項６１】
パッチまたは絆創膏の形態である請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のアプリケーター。
【請求項６２】
哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用であって、ウイルスが、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される使用。
【請求項６３】
哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用であって、ウイルスが、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識し、かつ細胞を殺すエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを利用して異常細胞を殺すことに関する。異常細胞が、ウイルスを用いた治療に対して感受性があるかどうかを確認するために異常細胞をスクリーニングする方法、並びに医薬組成物もまた記載される。本発明は、獣医学的使用、ならびにヒト医療分野において広範囲の適用が見出される。
【背景技術】
【０００２】
卵巣ガンは、女性集団における病的状態の主要な原因である。いくつかの悪性腫瘍が卵巣から生じる。卵巣の上皮ガン腫は最も一般的な婦人科学的悪性腫瘍の１つであり、女性におけるガン死亡の５番目に多い原因であり、全症例の半数が６５歳を越える女性において発生している。
【０００３】
卵巣ガンの約５％〜１０％が家族性であり、３つの異なる遺伝的パターンが同定されている：卵巣ガン単独、卵巣ガンおよび乳ガン、または、卵巣ガンおよび結腸ガンである。卵巣ガンについての最も重要な危険因子は、そのような疾患を有する第一度近親者（母親、娘または姉妹）の家族歴である。卵巣ガンを有する２人以上の第一度近親者を有する女性において、最も大きい危険性が高い。卵巣ガンを有する１人の第一度近親者および１人の第二度近親者を有する女性について、危険性は、若干少なくなる。乳卵巣ガン症候群または部位特異的な卵巣ガンに冒されたほとんどの家系では、遺伝的連鎖が染色体１７ｑ２１におけるＢＲＣＡ１遺伝子座に対して見出されている。ＢＲＣＡ２もまた、一部の遺伝性の卵巣ガンおよび乳ガンの原因であり、これは染色体１３ｑ１２に対する遺伝的連鎖によってマッピングされている。
【０００４】
ＢＲＣＡ１における生殖細胞系変異を有する患者において卵巣ガンを発症することについての生涯にわたる危険性は、一般集団については実質的に増大している。ＢＲＣＡ１における生殖細胞系変異を有する患者の２つの遡及的研究では、これらの女性は、ＢＲＣＡ１陰性の女性と比較した場合、生存期間が延びていることが示唆される。このデータを解釈するときには、ＢＲＣＡ１変異を有する女性の大部分は、おそらくは、卵巣ガンおよび／または乳ガンの病歴を有する家族メンバーを有することを考慮しなければならない。従って、これらの女性はより一層警戒しているかもしれず、また、より早期の検出をもたらし得るガンスクリーニングプログラムに参加を望んでいる可能性がある。危険性が増大した状態にある患者の場合、予防的な卵巣摘出が、出産が完了しているならば、３５歳以降では検討されることがある。しかしながら、予防的卵巣摘出の利点は未だに確立されていない。少ない割合の女性が、予防的卵巣摘出の後、卵巣ガンと外観が類似する原発性腹膜ガン腫を発症することがある（Ｘｉａｏ、Ｃ．他、２００１）。上皮ガン腫は最も一般的なタイプの卵巣ガンである。間質細胞腫瘍および生殖細胞腫瘍は比較的珍しく、症例の１０％未満を構成する。
【０００５】
卵巣ガンは、通常、腹膜腔内への局所的脱落、それに続く腹膜における着床によって、また、腸および膀胱への局所的な侵入によって拡大する。この腫瘍が非常に致死的であることは、この疾患の早期段階にある女性において症状がないためである。一次手術での陽性節の発生率は、第Ｉ期疾患の患者では２４％、第ＩＩ期疾患の患者では５０％、第ＩＩＩ期疾患の患者では７４％、第ＩＶ期疾患の患者では７３％もの高さであることが報告されている。腫瘍細胞はまた、横隔膜リンパ腺を遮断し得る。腹膜のリンパ排液の生じる障害は、卵巣ガンにおける腹水症の発生において役割を果たしていると考えられる。また、胸膜への経横隔膜拡大も一般的である。
【０００６】
卵巣ガンにおける予後はいくつかの要因によって影響されるが、多変量解析により、最も重要な好都合な要因には、より若い年齢、良好な成績状態、ムチン性細胞および明細胞でない細胞タイプ、より低い段階、良好に分化した腫瘍、何らかの外科的切除の前でのより小さい疾患体積、腹水症の非存在、そして、一次細胞量削減手術の後でのより小さい残存腫瘍が含まれることが示唆される。第Ｉ期疾患の患者の場合、最も重要な予後因子は悪性度であり、次いで、密集した付着および大きな体積の腹水症である。第Ｉ期患者および第ＩＩＡ期患者のＤＮＡフローサイトメトリー分析では、危険性の高い患者群が同定され得る。明細胞の組織学を有する患者は、より悪い予後を有するようである。移行上皮細胞ガンの有意な成分を有する患者は、より良好な予後を有するようである。
【０００７】
卵巣ガン関連抗原ＣＡ１２５は、診断時に測定されたときには予後の有意性を有していないが、第ＩＩＩ期または第ＩＶ期の疾患を有する患者に対する化学療法の３回目のクールの後の１ヶ月目で測定されたときには生存との大きな相関を有している（Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．他、２０００）。ＣＡ１２５の上昇が化学療法によって正常化する患者については、１よりも大きいその後の上昇したＣＡ１２５は活発な疾患を非常に予測する。しかし、このことは迅速な治療を命ずるものではない。
【０００８】
卵巣ガンはその早期段階では無症状であることが多いので、ほとんどの患者は、診断時には疾患が広範囲に広がっている。部分的にはこの結果として、卵巣ガンにおける年間死亡率は発生率の約６５％である。適切に切除されなかった第ＩＩＩ期患者および第ＩＶ期患者の長期間の追跡調査により、白金に基づく混合治療を用いた場合でさえ、５年生存率が１０％未満であることが明らかにされている。それにもかかわらず、この疾患の早期段階は、大きな割合の患者において治療可能である。
【０００９】
現在、後期段階の卵巣ガンに対する治療は、腹式子宮全摘出、漿膜表面の慎重な検査、および、白金アナログを含む混合化学療法が通常的には続き、完全に疾患全体を切除する試みが伴う。その場合、生存率は６ヶ月〜４０ヶ月の間であり、長期の生存は１０パーセント未満である。
【００１０】
良性および悪性の卵巣腫瘍において示差的に発現する分子を同定することを目的とした研究が進行中である。
【００１１】
卵巣ガン腫は、インテグリンα２β１を発現することが見出されている（Ｍｏｓｅｒ，Ｔ．Ｌ．他、１９９６；Ｃａｎｎｉｓｔｒａ，Ｓ．Ａ．他、１９９５；Ｂａｒｔｏｌａｚｚｉ，Ａ．他、１９９３）。α２β１は、１型コラーゲンとの特異的な結合相互作用によってヒト卵巣上皮ガン腫の転移性散在を促進させる（Ｓｃｈｉｒｏ、Ｊ．Ａ．他、１９９１；Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ，Ｐ．Ｍ．他、１９９２）。インテグリンα２β１のアップレギュレーションされた表面発現もまた、ヒト胃ガン腫について以前から観測されている。
【００１２】
α２β１と１型コラーゲンとの相互作用は、腹膜播種において、そして同様に、転移において非常に重要な役割を果たしている可能性があり、また、α２β１の過剰発現は、非転移性細胞において転移的性質を誘導することが示されている（Ｃｈａｎ，Ｂ．Ｍ．他、１９９１）。α２β１の阻止は、１型コラーゲンによる卵巣ガン腫の接着をほとんど阻害することが示されている。
【００１３】
悪性細胞の溶解を、その複製プロセスを介して誘導することができるウイルスは、腫瘍崩壊性ウイルスとして知られている。ほとんどの腫瘍崩壊性ウイルスは、同じ種または細胞系譜における増殖を要求する。ウイルスによる細胞の感染には、ウイルスキャプシドの脱殻を生じさせるか、またはウイルスキャプシドの脱殻と同時である付着および細胞内への取り込み、そして、それに続く細胞内での複製が伴う。
【００１４】
ガン細胞を殺す能力について評価された腫瘍崩壊性ウイルスには、ＨｅＬａ子宮／子宮頸部ガン細胞株において腫瘍崩壊活性を示したアデノウイルスのエジプト１０１亜型ウイルス、胃ガン腫、子宮ガン腫および皮膚ガン腫の治療のためのムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、卵巣ガンを治療するためのインフルエンザウイルス、ならびに、子宮頸部ガン腫を治療するためのアデノウイルス（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  Ｊ、１９９９）が含まれている。
【００１５】
他の報告では、アデノウイルスおよび弱毒化ポリオウイルス組換え体が悪性神経膠腫細胞の治療において使用され得ることが示されており（例えば、Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ  Ｓ．Ｓ．、１９９６）、また、レオウイルスは、Ｒａｓシグナル伝達経路が活性化されたヒトＵ８７神経膠芽細胞腫細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞において溶解能力を示すことが示されている（例えば、Ｓｔｒｏｎｇ  Ｊ．Ｅ．他、１９９８）。
【００１６】
ワクシニアの腫瘍崩壊物はまた、黒色腫（第ＩＩ期）患者を治療するために臨床試験で使用されている（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  Ｊ．、１９９９）。神経毒性を有しない改変された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が、脳腫瘍（頭蓋内黒色腫を含む）および皮下ヒト黒色腫の治療に関して有望であるとして報告されており（Ｒａｎｄａｚｚｏ  Ｂ．Ｒ．、１９９７）、その一方で、アデノウイルス感染は、植物の分裂毒素サポリンによって黒色腫細胞を殺すことを高めることが報告されている（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙ  Ｋ．、１９９７）。
【００１７】
アデノウイルスによって認識される標的細胞における受容体はアデノウイルスのタイプ毎に異なる。すなわち、例えば、アデノウイルスのＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦの亜群はＣＡＲ受容体を認識し、その一方で、アデノウイルス５型（Ｃ亜群）、アデノウイルス２型（Ｃ亜群）およびアデノウイルス９型（Ｄ亜群）は、主要組織適合性クラスＩＩ分子、αｍβ２インテグリンおよびαｖインテグリンをそれぞれ認識する。ＣＡＲ受容体は、黒色腫細胞株において発現することが知られている。
【００１８】
ヘパラン硫酸は、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型およびヒトヘルペスウイルス７、アデノ関連ウイルス２型によって認識される。ヒトヘルペスウイルス７に対する受容体はＣＤ４であり、一方、エプスタイン・バールウイルスは補体受容体Ｃｒ２（ＣＤ２１）を認識する。ポリオウイルス１型およびポリオウイルス２型はポリオウイルス受容体（Ｐｖｒ）を細胞接着のために認識し、一方、レオウイルスはシアル酸を認識する。Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスはシアル酸Ｎ−アセチルノイラミン酸を細胞接着のために認識する。対照的に、Ｃ型インフルエンザウイルスはシアル酸９−Ｏ−アセチルノイラミン酸を認識する。ワクシニアウイルスは上皮増殖因子受容体およびヘパラン硫酸の両方を認識する。コクサッキーウイルスのＡ１３、Ａ１５、Ａ１８およびＡ２１はＩＣＡＭ−１および補体調節タンパク質ＤＡＦ（ＣＤ５５）を認識する（例えば、Ｓｈａｆｒｅｎ  Ｄ．Ｒ．他（１９９７）を参照のこと）。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ００／０１４６１には、ＩＣＡＭ−１を細胞感染性のために認識するコクサッキーウイルスを、ＩＣＡＭ−１を発現する黒色腫細胞を溶解するために対象に投与することが記載される。ＤＡＦはまた、エンテロウイルス７０によって認識される（例えば、Ｆｌｉｎｔ  ＳＪ他（２０００）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を参照のこと）。
【００１９】
継代培養に対する卵巣細胞の適合性、および、ウイルスを検出するためのその潜在的使用を評価する研究が報告されている（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＥおよびＰｉｎｄａｋ，ＦＦ、１９７５）。その研究では、正常な卵巣細胞培養物が、ピコルナウイルス（例えば、Ａ型コクサッキーウイルス、Ｂ型コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルスおよびカルジオウイルス、ならびにそれらの様々な血清型など）；パラミクソウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルスなど）；アデノウイルスのヒト亜群の血清型３、４、７および２１；単純ヘルペスウイルス１型；トガウイルス（例えば、シンドビスおよびマラロ（Ｍａｒａｒｏ）など）；レオウイルスの血清型１〜３；およびワクシニアウイルスを含む広範囲の様々なウイルスで攻撃された。研究では、ヒト卵巣由来の細胞を、長期間、細胞培養で成長させることができ、かつ、インビトロでの様々なウイルスの増殖のために、限定されない回数、継代培養することができることが明らかにされ、また、そのような培養物は、ウイルスの病理発生およびウイルス感染の病理学を研究する目的のために有用であり得ることが提案された。報告ではさらに、ポリオウイルスおよびワクシニアなどの一部のウイルスはヒトの胎盤を越え、胎児に感染することが示されているので、培養における正常な卵巣細胞とのウイルス相互作用の研究は催奇性研究を進める手段であり得ることが示唆された。
【００２０】
転移による腫瘍拡大は、調節された組織分解と結合した一連の接着／脱着事象を伴う病理学的プロセスである。細胞外マトリックスへの付着および細胞外マトリックスを通過する遊走は、腫瘍が侵入するために不可欠である。進歩が悪性腫瘍の治療においてなされているにもかかわらず、卵巣悪性腫瘍を含むガンの治療は研究に対する大きな課題を提示しており、既存の治療法に代わる方法が依然として求められている。
【発明の開示】
【００２１】
本発明は、異常細胞（例えば、インテグリンα２β１を発現するガン細胞など）の著しい殺傷が、α２β１を細胞感染性のために認識するエコーウイルスを利用して達成され得るという観測結果に関連する。
【００２２】
従って、本発明の１つの態様において、哺乳動物において異常細胞を治療するための方法であって、α２β１を前記細胞への感染性のために認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスの効果的な量で哺乳動物を治療し、その結果、前記細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるようにすることを含む方法が提供される。
【００２３】
α２β１を認識する単独ウイルス血清型を哺乳動物に投与することができ、または、α２β１を認識する複数の異なるエコーウイルスを投与することができる。
【００２４】
用語「異常細胞」は、本発明の目的の場合、細胞がガン細胞であってもなくても、また、細胞が異常な速度で増殖してもしなくても、悪性の細胞、何らかの成長異常を有する細胞、および、その正常な表現型を発現する同じ細胞タイプの対応する正常な細胞と比較してインテグリンα２β１のアップレギュレーションされた異常発現を有する任意の細胞を含むように最も広い意味で理解しなければならない。従って、この用語は、前新生物性細胞および新生物細胞、ならびに、最終的にはガン細胞に発達し得る細胞、または最終的にはガン細胞に発達しなくてもよい細胞を包含する。成長異常は、例えば、良性または悪性の腫瘍であり得る。異常細胞は、通常、悪性の細胞である。一般に、異常細胞は、その異常細胞が見出される周囲の組織と比較した場合、α２β１の発現がアップレギュレーションされている。従って、ウイルスは、典型的には、そのような細胞におけるα２β１に接触する可能性がより大きいので、異常細胞に優先的に感染する。そのため、ウイルスを、異常細胞を効果的に標的化するために使用することができる。
【００２５】
本発明の方法は、患者における卵巣ガン、または、原発性卵巣腫瘍から転移しているガンを治療するために特に好適である。しかしながら、本発明はそのようなガンの治療に限定されず、本明細書中に記載される方法は、黒色腫および前立腺腫瘍、ならびに、乳ガン、結腸ガン、結腸直腸ガン、および、体内の他の部位にそれらから広がっている二次的なガンを含む他のガンの治療における適用が見出される。例えば、ウイルスを哺乳動物の皮膚以外の身体領域における黒色腫ガン細胞に投与することができる。従って、本発明の方法は、エコーウイルスによる感染を通常の場合には伴わない哺乳動物の体内の部位または組織に悪性腫瘍が転移している悪性腫瘍の治療に拡張される。
【００２６】
典型的には、ウイルスは、生きた完全なウイルスとして哺乳動物に投与される。あるいは、例えば、ウイルスゲノムをコードする核酸、またはウイルスの生成のために十分なその核酸を、細胞による取り込みおよび細胞内における生きた完全なウイルスの生成のために投与することができる。核酸は、単一のＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子、またはウイルスタンパク質の異なる分子をそれぞれコードする複数のそのような分子を含むことができる。
【００２７】
ウイルスはまた、異常細胞をスクリーニングして、例えば、ウイルスが、異常細胞が得られた哺乳動物を治療するために好適であり得るかどうかを確認するために、または、ウイルスを伴わない異なる治療プロトコルがより有益であり得るかどうかを確認するために使用することができる。逆に、異なるエコーウイルスおよび／またはその改変された形態もしくはそれらの組合せを、哺乳動物を治療するために最も適切なウイルスを選択するために、哺乳動物から採取された細胞のサンプルを使用してスクリーニングすることができる。
【００２８】
従って、本発明の別の態様において、異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、ウイルス誘導の細胞死に対する感受性について哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをスクリーニングする方法が提供され、この場合、この方法は、
（ａ）哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルを提供する工程；
（ｂ）ウイルスによる異常細胞への感染を可能にするために十分な期間にわたって異常細胞をウイルスで治療する工程；および
（ｃ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程
を含み、この場合、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態および組合せから選択される。
【００２９】
ウイルスはまた、所与のウイルスがサンプルにおける異常細胞の少なくとも一部に感染し、これを殺すことができるかどうかを試験することによって、本発明の方法における使用のために選択することができる。特に、そのような試験では、それぞれのウイルスを異常細胞のサンプルとそれぞれインキュベーションすることによって多数の異なるウイルスをスクリーニングし、そして、異常細胞がウイルスによる感染の結果として殺されているかどうかを明らかにすることが伴い得る。
【００３０】
従って、本発明のさらに別の態様において、異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、哺乳動物に由来する異常細胞に感染し、その死を生じさせる能力についてウイルスをスクリーニングする方法が提供され、この場合、この方法は、
（ａ）ウイルスを選択する工程；
（ｂ）ウイルスによる異常細胞への感染を可能にするために十分な期間にわたって哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをウイルスで治療する工程；および
（ｃ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程
を含み、この場合、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される。
【００３１】
この方法はまた、異常細胞に感染し、その死を生じさせる選択されたウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して工程（ｂ）および工程（ｃ）に供された、α２β１を異常細胞感染性のために認識する他のエコーウイルスまたはその改変された形態の能力と比較する工程を含むことができる。
【００３２】
細胞の死は、典型的には、ウイルスによる細胞への感染から生じ、ウイルスが細胞内で複製することによる細胞の溶解によるか、または、最も考えられるのは細胞カスパーゼの活性化の結果としての、感染が引き起こすアポトーシスによるかのいずれかによって引き起こされ得る。溶解されると、感染細胞の細胞質ゾルの内容物が、破裂した形質膜から流出し得るし、また、異常細胞に対する免疫応答を誘発することができる細胞表面抗原を含む様々な抗原が放出され得る。従って、本発明の方法に従った哺乳動物における異常細胞の治療は、異常細胞に対抗する哺乳動物の免疫性に対する追加抗原刺激を提供し得る。
【００３３】
従って、本発明の別の態様において、α２β１を発現する異常細胞に対して哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスを哺乳動物における異常細胞に感染させることを含み、少なくとも一部の異常細胞の溶解が引き起こされる方法が提供される。
【００３４】
一般に、ウイルスは、本発明の方法において使用される医薬組成物の形態で提供される。そのため、なおさらなる態様において、哺乳動物における異常細胞を治療するための医薬組成物であって、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるように異常細胞を治療するためにウイルスを生じさせるための接種物を医薬的に許容され得るキャリアと一緒に含む医薬組成物が提供され、この場合、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される。
【００３５】
本発明の別の態様において、哺乳動物における異常細胞をウイルスで治療し、その結果、異常細胞の少なくとも一部が殺されるようにするための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用が提供され、この場合、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される。
【００３６】
本発明のさらに別の態様において、哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用が提供され、この場合、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識し、かつそのような細胞を殺すエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される。
【００３７】
典型的には、本発明の方法に従って利用されるエコーウイルスは、エコーウイルスＥＶ１、エコーウイルスＥＶ８およびエコーウイルスＥＶ２２からなる群から選択されるエコーウイルスである。前記ウイルスは、通常、一般的な動物エコーウイルスであるが、本発明はそれらに限定されず、異常細胞に感染し、これを殺すことができように操作された組換えウイルス、または、例えば、それ以外にも、異常細胞に感染し、これを殺すその能力を高めるために改変されているウイルスを利用することができる。
【００３８】
同じウイルスを異なる治療クール期間中に哺乳動物に投与することができる。しかしながら、好ましくは、異なるウイルスが、投与された以前のウイルスに対する何らかの免疫応答の潜在的な影響を回避または軽減するために異なる治療クールについては使用される。ウイルスは、例えば、哺乳動物に対して、局所的に、腫瘍内に、または全身的に投与することができる。
【００３９】
本発明における哺乳動物は、本発明による治療を必要としている任意の哺乳動物であり得る。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【００４０】
本発明の方法は、異常細胞の別の治療（例えば、従来のガン治療など）の補助として使用することができ、または、他の治療的処置がない場合での治療として使用することができる。特に、本発明の方法は、従来の治療が好適もしくは実際的でない場合に、または、異常細胞の切除が、患者に受け入れがたい傷跡形成または外観の損傷を、特に患者の顔（例えば、患者の鼻または唇など）に残し得る場合に利用することができる。ウイルスは、異常細胞の切除の前および／または切除の後、患者に投与することができる。切除後の投与により、周囲の組織に残る残存する異常細胞を殺すことができる。
【００４１】
従って、本発明の１つまたは複数の実施形態において、早期段階および後期段階の悪性腫瘍の診断の両方の後で使用することができる代替的な治療的処置が提供され、また、手術前に異常細胞を殺し、かつ手術後に残存する異常細胞を殺すことにおける適用がさらに見出される。本明細書中記載されるようなプロトコルを使用して、当業者は、本発明の方法における使用のための好適なウイルスを容易に選択することができ、かつ、どの異常細胞が、その細胞の死をもたらす感染に対して感受性があるかを明らかにすることができる。
【００４２】
本発明のさらに別の態様において、哺乳動物における異常細胞を治療するためのウイルスを生じさせるために哺乳動物に接種物を適用するためのアプリケーターが提供され、この場合、アプリケーターは、接種物が哺乳動物と接触するように接種物を染み込ませた領域を含み、そして、ウイルスは、細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される。
【００４３】
本明細書を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変化形（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”など）は、言及された要素、完全体もしくは工程、または、要素、完全体もしくは工程の群を包含し、しかし、任意の他の要素、完全体もしくは工程、または、要素、完全体もしくは工程の群を除外しないことを意味することが理解される。
【００４４】
本明細書において述べられる刊行物はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置または物品などの議論は、単に、本発明のための背景を提供するという目的のためである。そのような議論は、本出願の各請求項の優先日よりも前にはどこかにでも存在していたので、これらの事項のいずれかまたはすべてが先行技術基盤の一部を形成しているか、または、本発明に関係する分野において共通する一般的な知識であったという承認として理解してはならない。
【００４５】
本発明の特徴および利点が本発明の好ましい実施形態の下記の記載からさらに明らかになる。
図面の簡単な記述
図１は乳ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。乳ガン細胞は、これらの受容体について特異的な対応するモノクローナル抗体の存在下または非存在下でヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとインキュベーションされた。コンジュゲートサンプルの幾何平均がエンテロウイルス受容体サンプルの幾何平均から引かれ、これにより、受容体の相対的な発現レベルが明らかにされた。
図２はエンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による乳ガン細胞の溶解感染を示す。５０パーセント終点力価が計算され、腫瘍崩壊は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ終点が１０４以上であった場合に有意であると見なされた。
図３は直腸結腸ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。直腸結腸ガン細胞は、これらの受容体について特異的な対応するモノクローナル抗体の存在下または非存在下でヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとインキュベーションされた。コンジュゲートサンプルの幾何平均がエンテロウイルス受容体サンプルの幾何平均から引かれ、これにより、受容体の相対的な発現レベルが明らかにされた。
図４はエンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による直腸結腸ガン細胞の溶解感染を示す。５０パーセント終点力価が計算され、腫瘍崩壊は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ終点が１０４以上であった場合に有意であると見なされた。
図５は前立腺ガン細胞または膵臓ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。前立腺ガン細胞または膵臓ガン細胞は、これらの受容体について特異的な対応するモノクローナル抗体の存在下または非存在下でヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとインキュベーションされた。コンジュゲートサンプルの幾何平均がエンテロウイルス受容体サンプルの幾何平均から引かれ、これにより、受容体の相対的な発現レベルが明らかにされた。
図６はエンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による前立腺ガン細胞および膵臓ガン細胞の溶解感染を示す。５０パーセント終点力価が計算され、腫瘍崩壊は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ終点が１０４以上であった場合に有意であると見なされた。
図７は卵巣ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。卵巣ガン細胞は、これらの受容体について特異的な対応するモノクローナル抗体の存在下または非存在下でヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとインキュベーションされた。コンジュゲートサンプルの幾何平均がエンテロウイルス受容体サンプルの幾何平均から引かれ、これにより、受容体の相対的な発現レベルが明らかにされた。
図８はエンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による卵巣ガン細胞の溶解感染を示す。５０パーセント終点力価が計算され、腫瘍崩壊は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ終点が１０４以上であった場合に有意であると見なされた。
図９Ａは、ＥＶ１の１０−１希釈物を７２時間感染させた卵巣ガン細胞単層物の顕微鏡写真を示す。このウイルス投入多重度において、細胞株Ａ２７８０を除いて、すべての細胞株がＥＶ１による腫瘍崩壊の著しいレベルを示した（右側）。図９Ｂは、ＥＶ１の１０−１希釈物を７２時間感染させた卵巣ガン細胞単層物の顕微鏡写真を示す。細胞株ＳＫＯＶ−３を除いて、すべての細胞株がＥＶ１による腫瘍崩壊の著しいレベルを示した（右側）。
図１０はＥＶ１を用いた卵巣ガン細胞への溶解感染を示す。１０個の細胞株のうちの７個が、ＥＶ１による腫瘍崩壊を受けやすいと見なされる。腫瘍崩壊は、ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）が１０４以上であると計算された場合に有意であると見なされた。
図１１はＥＶ１結合が抗α２β１の存在下で阻害されることを示す。抗α２β１ＭＡｂまたは抗ＤＡＦ  ＭＡｂのいずれかの存在下および非存在下での卵巣ガン細胞株に対する［３５Ｓ］−メチオニン標識ＥＶ１の結合。結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルが、１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定された。
図１２は抗α２β１ＭＡｂの存在下または非存在下でのＥＶ１による卵巣ガン細胞株のＯＷＡ−４２およびＩＧＲＯＶ−１への溶解感染を示す。感染後７２時間、抗α２β１ＭＡｂとプレインキュベーションされた細胞は完全に保護されたままであった。細胞の生存が、クリスタルバイオレットのメタノール溶液を用いた染色によって明らかにされた。
図１３は抗α２β１ＭＡｂの存在下または非存在下でのＥＶ１によるＯＷＡ−４２卵巣ガン細胞単層物への溶解感染を示す。顕微鏡写真が、感染後の２４時間、４８時間および７２時間において撮影され、これらは、α２β１受容体のモノクローナル抗体遮断によるＥＶ１感染からの細胞の完全な保護を明らかにしている。
図１４はＤＯＶ１３卵巣ガン細胞がリング状インサートの内側で培養され、ＨｅＬａ細胞（ヒト繊維芽細胞）がリングの外側において培養されたことを示す。ＥＶ１による感染後、生存細胞がクリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色された。ＥＶ１は卵巣ガン細胞に特異的に感染し、その一方で、ＨｅＬａ細胞は健康なままであった。
図１５は黒色腫細胞株ＳｋＭｅｌ２８における表面発現したα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。ＳｋＭｅｌ２８細胞は抗α２β１の存在下または非存在下でヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとインキュベーションされた。コンジュゲートサンプルの幾何平均がサンプルの幾何平均から引かれ、これにより、変化、従って、受容体の発現が明らかにされた。有意なα２β１発現が、幾何平均における変化により明らかにされる。
図１６は抗α２β１ＭＡｂまたは抗ＤＡＦ  ＭＡｂのいずれかの存在下および非存在下におけるＳｋＭｅｌ２８黒色腫細胞に対する［３５Ｓ］−メチオニン標識ＥＶ１の結合を示す。結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルが、１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）での液体シンチレーション計数によって測定された。α２β１遮断はＥＶ１結合の著しい阻害をもたらした。結果は三連サンプルの平均値±標準誤差として表される。
図１７はＥＶ１を用いたＳｋＭｅｌ２８黒色腫細胞への溶解感染を示す。細胞の生存がクリスタルバイオレットのメタノール溶液によって明らかにされた。著しい溶解を認めることができる。
図１８はＥＶ１を用いた卵巣ガン多細胞スフェロイドの治療を示す顕微鏡写真である。
図１９Ａは、１．０×１０６個のＯＶＨＳ−１細胞が、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＵＶ不活性化エコーウイルスＥＶ１または感染性ＥＶ１（１０５ＴＣＩＤ５０）のいずれかでのｉ．ｐ．経路による注射の３週間前に腹腔内（ｉ．ｐ）経路により投与されたＳＣＩＤマウスの体重変化を示すヒストグラムである。図１９Ｂは、ＯＶＨＳ−１細胞が注射され、ＰＢＳ、ＵＶ不活性化ＥＶ１またはＥＶ１で治療されたマウスと比較される正常なコントロールＳＣＩＤマウスの注射後５週間目に撮影された写真を示す。ＰＢＳまたはＵＶ不活性化ＥＶ１が投与された腫瘍保有マウスにおける腹膜腹水症の発症に留意すること。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
ウイルスが腫瘍の細胞に感染し、その死を生じさせることができるかどうかを明らかにするために、生検試料を腫瘍から採取することができ、細胞の調製物を、従来の技術を使用して調製し、その後、（ｉ）ウイルス受容体の細胞表面発現を確認することができ、また、（ｉｉ）ウイルスで細胞を攻撃し、所定のインキュベーション期間、典型的には約２日間（しかし、これは、使用されるウイルスに依存して変化し得る）、感染および細胞死について細胞をモニターすることができる。α２β１の発現はフローサイトメトリー分析によって容易に確認することができる。数多くのウイルスを、調製された悪性の細胞の種々のアリコートを使用して同時にこの方法でスクリーニングすることができ、そして、より大きな程度の感染性および細胞死を示すウイルスを、生検試料が採取された対象への投与のために選択することができる。同様に、異なる供給源から採取された生検試料に由来する種々の悪性の細胞の調製物を、特定のウイルスを使用するアッセイにおいて用いることができる。生検試料は、一人の個体の異なる部位から、または数多くの個体から採取することができる。
【００４７】
本明細書中に記載されるような方法において使用されるウイルスは、望ましくは、受容者において臨床的症状をほとんど生じさせないか、または、ほんの軽微な臨床的症状を生じさせるだけである。そのようなウイルスは、当業者に広く知られている商業的供給源から容易に入手可能であり、上記の様式で本発明の方法におけるその有効性についてスクリーニングすることができる。望ましくは、ウイルスは、通常の場合、エコーウイルスＥＶ１、エコーウイルスＥＶ７、エコーウイルスＥＶ８およびエコーウイルスＥＶ２２からなる群から選択されるエコーウイルスである。これらのウイルスはそれぞれが、細胞感染性のためにα２β１を認識する。例えば、ＥＶ１は、軽い上部気道疾患、そしてまた胸膜痛に関連している（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．他、２０００；ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  Ａ．Ｗ．他、１９６９）。
【００４８】
α２β１の発現は、中皮において遭遇する優勢なＩ型コラーゲンマトリックスのために卵巣ガン腫ではアップレギュレーションされると考えられている。数多くの悪性黒色腫はまた、アップレギュレーションされたレベルのα２β１を発現することが示されている（Ｋｒａｍｅｒ  Ｒ．Ｈ．およびＭａｒｋｓ  Ｎ、１９８９；Ｒａｍｏｓ  Ｄ．Ｍ．他、１９９０）。ＥＶ１およびコラーゲンは、α２β１サブユニットのドメインＩにおいて異なる残基を使用してα２β１に付着する（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ  Ｊ．Ｈ．、１９９３）。インテグリンα２β１はＥＶ１およびコラーゲンを同時に受け入れることができない。しかしながら、ウイルスは、コラーゲンと比較した場合、親和性において１０倍の増大でα２β１と結合する（Ｘｉｎｇ  Ｌ、２００２）。
【００４９】
所与のウイルスをスクリーニングして、そのウイルスが、悪性の細胞に感染し、その死を生じさせることができるかどうかを確認する目的のために、生検試料から単離された原発性の悪性の細胞よりもむしろ悪性細胞株を使用することができる。
【００５０】
選択されたウイルスは、好ましくは、ウイルスによる腫瘍の潜在的な感染のための領域を最大限にするために、悪性腫瘍上の多数の部位に対して直接的に注入される。完全なウイルスではなく、ウイルスを生じさせるための核酸を含むウイルスプラスミドまたは他のプラスミドまたは発現ベクターを、治療を達成するための腫瘍細胞による取り込みおよび細胞内における完全なウイルスの生成のために腫瘍内に注入することができる。好適な発現ベクターには、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）インサートの発現が可能であるプラスミドが含まれる。発現ベクターは、典型的には、挿入された核酸が機能的に連結される転写調節制御配列を含む。「機能的に連結される」によって、核酸インサートが、インサートの読み枠の変化を伴うことなく、挿入された配列（１つまたは複数）の転写を可能にするための転写調節制御配列に連結されることが意味される。そのような転写調節制御配列には、転写を開始させるためにＲＮＡポリメラーゼの結合を促進させるためのプロモーター、および、転写されたｍＲＮＡに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメントが含まれる。
【００５１】
より詳細には、本明細書中で使用される用語「調節制御配列」は、所与のＤＮＡ配列の転写を行わせ、かつその転写レベルを制御（すなわち、調節）することに関与する任意のＤＮＡを包含することが理解されなければならない。例えば、５’調節制御配列は、プロモーターおよび５’非翻訳リーダー配列を含み得る、コード配列の上流側に位置するＤＮＡ配列である。３’調節制御配列は、１つまたは複数のポリアデニル化シグナルを含む好適な転写終結（および／または）調節シグナルを含み得る、コード配列の下流側に位置するＤＮＡ配列である。本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、転写の開始時にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、そのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが（直接的または間接的に）結合する任意のＤＮＡ配列を包含する。プロモーターには、転写開始部位、ならびに、転写開始因子およびＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位が含まれ、また、プロモーターは、遺伝子発現調節タンパク質が結合し得る様々な他の部位または配列（例えば、エンハンサー）を含むことができる。
【００５２】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのために好適な数多くの発現ベクターがこの分野では知られている。哺乳動物細胞のトランスフェクションのために好適な発現ベクターには、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ−ＰＧｋ．ｐｕｒｏ、ｐＴｋ２、ならびに、ポリアデニル化部位および伸長因子１−ｘプロモーターを含む非複製性のアデノウイルスシャトルベクター、ならびに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを最も好ましくは含むｐＡｄＥａｓｙ型発現ベクターが含まれる（例えば、Ｈｅ他（１９９８）を参照のこと）。ポリペプチド伸長因子−α２をプロモーターとして用いるプラスミドｐＥＦＢＯＳもまた利用することができる。
【００５３】
ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ他（１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（米国、第１巻および第２巻）に記載されるようなこの分野で広く知られている組換え技術を使用して、ウイルスＲＮＡゲノムまたはそのフラグメントを逆転写することによって調製し、好適なベクターに組み込むことができる。
【００５４】
細胞は、ｃＤＮＡではなく、精製されたビリオンから抽出されたウイルスＲＮＡでトランスフェクションすることができ、または、例えば、ＲＮＡ転写物を、Ａｎｓａｒｄｉ，Ｄ．Ｃ．他（２００１）に記載されるように、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼを利用してｘＤＮＡテンプレートからインビトロで作製することができる。同様に、単一のプラスミドまたはＲＮＡ分子を、ウイルスタンパク質を発現させ、ウイルスを生じさせるために投与することができ、あるいは、ウイルスタンパク質の異なる分子をコードする複数のプラスミドまたはＲＮＡ分子を、細胞をトランスフェクションし、ウイルスを生じさせるために投与することができる。
【００５５】
プラスミドまたはＲＮＡは、細胞のトランスフェクションを促進させるためのキャリアビヒクルの非存在下で、またはそのようなビヒクルとの組合せでの腫瘍細胞による取り込みのために、局所的によるか、または注入によるかのいずれかで腫瘍に対して直接、投与することができる。好適なキャリアビヒクルには、この分野では従来から知られている油中水型エマルションとして典型的には提供されるリポソームが含まれる。リポソームは、典型的には、脂質（特に、リン脂質、例えば、高い相転移温度のリン脂質など）と、通常の場合には、膜安定性をリポソームに提供するための１つまたは複数のステロイドまたはステロイド前駆体（例えば、コレステロールなど）との組合せを含む。リポソームを提供するために有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシドおよびガングリオシドなどが含まれる。ジアシルホスファチジルグリセロールは、脂質成分が１４個〜１８個の炭素原子（より好ましくは１６個〜１８個の炭素原子）を含有し、飽和している場合、特に好適である。
【００５６】
リポソームと標的細胞との相互作用は受動的または能動的であり得る。能動的な標的化では、標的細胞により発現される対応するリガンドと結合するか、またはそうでない場合には相互作用する特異的なリガンドをリポソーム膜に取り込むことによるリポソームの改変が伴う。そのようなリガンドには、例えば、モノクローナル抗体またはその結合性フラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント）、糖成分または糖脂質成分、あるいはウイルスタンパク質が含まれ、α２β１に対して特異的なウイルスタンパク質またはモノクローナル抗体が特に好ましい。
【００５７】
通常、腫瘍の周りの組織はまた、悪性の細胞がそのような組織に存在する可能性を考えると、ウイルスが注入されるか、または、そうでない場合にはウイルスで治療される。腫瘍が比較的進行するまで、腫瘍が検出されない場合、周りの組織には、腫瘍自体の外科的切除の後、ウイルスを注入することができる。
【００５８】
悪性の腫瘍に対して直接的に注入するのではなく、接種物は、腫瘍への送達のために、腫瘍部位に隣接する位置における受容者の血流内への静脈内注射によって全身投与することができる。同様に、適当であると見なされるならば、接種物は、皮下に、腹腔内に、または、例えば、筋肉内に投与することができる。しかしながら、一般には、完全なウイルスが投与されるときには、ウイルスに対する特異的な抗体が存在する可能性、および、それにより、ウイルス送達の代わりの様式の潜在的な低下した効率を考えると、腫瘍内への直接的な注入が好まれる。
【００５９】
接種物はまた、単独、または腫瘍内への接種物の直接的な注入との組合せのいずれかで局所的に適用することができる。腫瘍の局所的治療は、接種物と、悪性の細胞に感染させるために接種物の一体性を維持するための好適な医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物の滴下適用によって、またはそのような組成物を含浸させたアプリケーターで腫瘍をなでることによって達成することができる。アプリケーターは、組成物に浸された好適な材料の詰め物またはパッドを含むことができる。皮膚における黒色腫を治療する場合、接種物は、接種物が皮膚と接触するように治療される悪性部位に対して保持されるために適合化されている、接種物を含浸させたアプリケーターによって塗布することができる。この場合、アプリケーターには、黒色腫の周りの皮膚に接着するために、絆創膏の場合などの接着性表面がさらに提供される、接種物を含浸させたパッチまたは詰め物などを含むことができ、それにより接種物を黒色腫との接触状態に保つことができる。典型的には、完全なウイルスが、治療を達成するために哺乳動物に投与される。
【００６０】
一般に、１つまたは複数の小さい切開部が悪性腫瘍および／または周りの組織に作製されて、それらへのウイルスのための進入部位が提供される。
【００６１】
卵巣ガンまたは卵巣の近くにおけるガンの場合、エコーウイルスを、カテーテルまたは他の好適な適用器具を使用して、カテーテルまたは選択された器具を対応するファロピウス管に沿って挿入することによって、卵巣または罹患部位に対して直接的に送達することができる。
【００６２】
ウイルスおよび／または核酸、または、標的細胞内においてウイルスを生じさせるためのウイルス核酸を含むプラスミドを受容者に接種するために使用される医薬的に許容され得るキャリアは、生理学的食塩水などの液体、または、適切であると見なされる任意の他の従来から知られている生理学的に許容され得る媒体、例えば、薬学的使用のために、また、接種物を治療部位に投与するために好適な市販のゲルなどであり得る。キャリアは、典型的には生理学的ｐＨに緩衝化され、好適な保存剤および／または抗生物質を含有することができる。
【００６３】
接種物は、一般に、１ｍｌの接種物あたり約１×１０２プラーク形成ユニット〜約１×１０１０プラーク形成ユニットを含有する。好ましくは、接種物は１ｍｌの接種物あたり約１×１０５プラーク形成ユニット以上を含有する。患者に投与される接種物の量は、患者の全体的な状態、悪性腫瘍の段階および存在位置を、ウイルスで治療される領域の全体的なサイズおよび分布と一緒に考慮に入れて、受け入れられている医療行為に従って主治医または外科医によって容易に決定することができる。典型的には、患者は、最初の用量のウイルスで治療され、続いて、ウイルスの最初の投与に対する患者の応答、ならびに、最初の治療から生じるウイルス感染および悪性細胞の死の程度などの要因が決定されるまで、好適な期間にわたってモニターされ、その後、さらなるウイルスを患者に投与するための決定がなされる。
【００６４】
望ましくは、個体は、所定の間隔で一定の期間、ウイルスで治療される。間隔は、それぞれの状況において適切であると決定されるように、毎日であり得るか、あるいは２４時間〜７２時間以上までに及び得る。異なるウイルスを、以前に投与されたウイルスに対する何らかの免疫応答の影響を回避または最小限にするために毎回、投与することができ、そして、治療の経過期間は、主治医によって決定され得るように、１週間〜２週間以上に及び得る。最も好ましくは、哺乳動物が以前にさらされてないウイルス、または、哺乳動物が、標準的な技術によって決定され得るような比較的軽微な免疫応答を生じるウイルスが投与される。
【００６５】
容易に入手可能な知られているエコーウイルスが本発明の方法において好適に用いられ得るが、従来の技術を使用して改変または操作されたウイルスもまた利用することができる。例えば、ウイルスは、さらなる細胞接着分子を細胞受容体として用いるために改変することができる。一例として、ウイルスは、ペプチドモチーフ「ＲＧＤ」がウイルスのキャプシド表面に発現されるように部位特異的変異誘発を使用して改変することができる。ＲＧＤモチーフはαｖインテグリンヘテロ二量体によって認識され、そして、このキャプシド改変は、例えば、ウイルスがインテグリンα２β１（α２β１を有するような黒色腫病巣においてアップレギュレーションされることが示されている細胞接着分子；Ｎａｔａｌｉａ  Ｐ．Ｇ．、１９９７）と結合することを可能にすることができ、これは、潜在的には、標的細胞によるウイルスの高まった取り込みを生じさせる。
【００６６】
本発明の本質がより明確に理解され得るために、次に、その好ましい形態が、下記の非限定的な実施例を参照して記載される。
【実施例】
【００６７】
（実施例１：材料および方法）
１．１．細胞株
ＩＧＲＯＶ−１、Ａ２７８０、ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、Ｔ４７−Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ３６１、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＣＦ−７のガン細胞株をＧａｒｖａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｙｄｎｅｙ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）から得た。ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ１５７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ−７５−１、ＨＣＴ１１６、ＬＩＭ２５３７、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、２００８、ＪＡＭ、ＯＶＣＡ−４２９、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＨＳ−１、ＯＷＡ−４２、ＳＫＯＶ−３およびＤＯＶ１３のガン細胞株をＰｅｔｅｒ  ＭａｃＣｕｌｌｕｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。ＳｋＭｅｌ２８細胞をＲａｌｐｈ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。ＨｅＬａ細胞をＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ（Ｅｎｔｅｒｏ−ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。α−ＭＥＭ培地で培養されるＢＴ−２０細胞、ならびに、ＤＭＥＭ培地で培養されるＳｋＭｅｌ２８細胞およびＨｅＬａ細胞を除いて、すべての細胞が、２％〜５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を含有するＲＰＭＩにおいて標準的な条件（５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃）のもとで培養された。使用された細胞はすべてが、ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、米国）によってマイコプラズマの存在について定期的に検査された。
【００６８】
１．２．ウイルス
コクサッキーウイルスＡ２１（ＣＡＶ２１）プロトタイプ株（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）プロトタイプ株（Ｎａｎｃｙ）、エコーウイルス（ＥＶ１）プロトタイプ株（Ｆａｒｏｕｋ）、エコーウイルス（ＥＶ７）プロトタイプ株（Ｗａｌｌａｃｅ）、およびポリオウイルス１（ＰＶ１）プロトタイプ株（Ｍａｈｏｎｅｙ）をＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ博士（Ｅｎｔｅｒｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。すべてのウイルスはＨｅＬａ細胞において増殖させられ、力価測定された。
【００６９】
１．３．モノクローナル抗体（ＭＡｂ）
抗ＤＡＦ  ＭＡｂのＶＩＩＩＡ７（これはＤＡＦの３番目のＳＣＲを認識する）はＴ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ博士（大阪大学、大阪、日本）から得られ、抗ＤＡＦ  ｍＡｂのＩＨ４はＢｒｕｃｅ  Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士（Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）からの譲渡物であった。抗ＣＡＲ  ＭＡｂのＲｍｃＢはＪ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ博士（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から得られた。抗β２−ミクログロブリンＭＡｂ９１８はＰ．Ｍｉｎｏｒ博士（ＮＩＢＳＣ、Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）から得られた。抗α２β１ＭＡｂのＡＫ７（これはα２サブユニットを認識する）およびコントロール抗体の抗ＧＰＩＶ（血小板膜糖タンパク質）ＭＡｂ  ＰＴＡ−１はＧｏｒｄｏｎ  Ｂｕｒｎｓ教授（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）から得られた。抗ＩＣＡＭ−１  ＭＡｂのＩＨ４はＡｎｄｒｅｗ  Ｂｏｙｄ博士（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、オーストラリア）から得られた。
【００７０】
１．４．フローサイトメトリー分析
ガン細胞におけるエンテロウイルス受容体の表面発現がフローサイトメトリーによって分析された。分散された細胞（１×１０６個）を、氷上で２０分間、適切なＭＡｂ（ＰＢＳにおいて希釈された５μｇ／ｍｌ）と２０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化し、その後、ヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｄａｋｏ，Ａ／Ｓ、デンマーク）の１：５０希釈物の１００μｌに再懸濁した。細胞を再び氷上で２０分間インキュベーションし、洗浄し、ペレット化して、ＰＢＳに再懸濁し、その後、フローサイトメトリー分析を行った。細胞表面での受容体の発現が、ＦＡＣＳｔａｒ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を使用して分析された。
【００７１】
１．５．ウイルス感染性アッセイ
ガン細胞株のコンフルエントな単層物に、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭにおけるＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７またはＰＶ１の１０倍連続希釈物（１００μｌ／ウエルを三連または四連で）を接種し、これらを５％のＣＯ２環境において３７℃で７２時間インキュベーションした。細胞の生存を測定するために、プレートを１００μｌ／ウエルのクリスタルバイオレットメタノール溶液（０．１％クリスタルバイオレット、２０％メタノール、２０％ホルムアルデヒド、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ））と２４時間インキュベーションして、蒸留水において洗浄した。
【００７２】
限界希釈アッセイの終点は、５０％の試験ユニットに影響を及ぼすウイルスの希釈度である。統計学的手法が、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法（参考文献）を使用して終点を計算するために用いられた。終点は５０％組織培養感染用量／ミリリットル（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）として表された。
【００７３】
抗受容体モノクローナル抗体で前処理された細胞単層物が要求される場合、細胞は１００μｌの抗α２β１ＡＫ７ＭＡｂ（ＰＢＳにおいて希釈された２０μｇ／ｍｌ）と３７℃で１時間インキュベーションされた。その後、細胞単層物は適切なウイルス希釈物の二連のサンプルに接種され、５％のＣＯ２環境において３７℃で７２時間インキュベーションされ、その後、上記のように染色された。
【００７４】
顕微鏡写真が、倒立型顕微鏡を使用して１００倍の倍率（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−ＦＬＡ）で、２４時間、４８時間または７２時間において撮影された。
【００７５】
１．６．ウイルス精製
ＤＯＶ１３細胞のコンフルエントな単層物を含有する６ウエル組織培養プレートに５００μｌのＥＶ１（感染多重度［ｍｏｉ］＝１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を３７℃で１時間にわたって接種した。非結合のウイルスを、メチオニン／システインを含まないＤＭＥＭ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｏｈｉｏ、米国）で３回洗浄することによって除き、細胞単層物を１．３ｍｌのこの培地において３７℃でさらに２時間インキュベーションし、その後、３００μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニントランスラベル（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｏｈｉｏ、米国）を加えた。感染した単層物を５％のＣＯ２環境において３７℃で一晩インキュベーションした。３回の凍結／融解サイクルの後、ウイルス溶解物をＢｅｃｋｍａｎＸＬ−９０超遠心分離器（ＳＷ４１ｔｉローター）における３６，０００ｒｐｍでの９５分間の速度遠心分離によって５％〜３０％スクロースグラジェントで精製した。分画物を各チューブの底から集め、液体シンチレーション計数（Ｗａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ、フィンランド）によってモニターして、ウイルス結合アッセイにおいて使用される１６０Ｓウイルス最大画分を捜し出した。
【００７６】
放射能標識されていないＥＶ１ビリオンを、プールされ、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に対して透析された最大感染画分を用いた並行するグラジェントで精製した。紫外（ＵＶ）光で不活性化されたＥＶ１を、６ウエルプレートにおいて、ＰＢＳにおける精製ＥＶ１の１．０ｍｌ／ウエル（５×１０５ＴＣＩＤ５０）を１５ワットのＵＶ光に３０秒間さらすことによって作製した。ウイルスの不活性化はマイクロタイタープレートでの溶解感染性の細胞アッセイによって評価された。
【００７７】
１．７．放射能標識されたウイルスの結合アッセイ
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する８００μｌのＲＰＭＩに再懸濁された約１×１０６個の細胞を、２０μｇ／ｍｌのＭＡｂ（ＰＢＳにおいて希釈された抗α２β１または抗ＤＡＦ）の存在下、４℃で１時間インキュベーションし、その後、３００μｌ（１×１０６個）の［３５Ｓ］−メチオニン標識された１６０Ｓ  ＥＶ１を加えた。４℃で２時間インキュベーションした後、細胞を血清非含有培地で４回洗浄し、細胞ペレットを２００μｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ−１％ＳＤＳに溶解し、その後、結合した［３５Ｓ］−メチオニン標識ウイルスのレベルを三連サンプルからの液体シンチレーション計数によって測定した（Ｗａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｒｏｂｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ、フィンランド）。結果が平均値±ＳＥとして表された。
【００７８】
１．１０．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
［３５Ｓ］−メチオニン標識されたウイルス画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析し、オートラジオグラフィーによって可視化した。［３５Ｓ］−メチオニン標識された１６０Ｓ  ＥＶ１画分をサンプル還元緩衝液（２５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．２ｇ（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、および０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）と９５℃で１０分間インキュベーションし、ビリオンを変性させた。変性処理された１６０Ｓウイルス最大画分を、その後、１８０Ｖで４５分間、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ染色済み中範囲タンパク質ラダー（ＧＩＢＣＯ、米国）と一緒に１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌプレキャストゲル（ＢＩＯＲＡＤ  Ｒｅａｄｙ−Ｇｅｌ、ＣＡ、米国）において分離した。主な構造タンパク質の可視化およびウイルス純度の分析が、９６時間の感光を行った後のＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国）におけるオートラジオグラフィーによって行われた。
【００７９】
１．１１．細胞の細胞傷害性アッセイ
ヒト末梢血リンパ球（ＯＶＨＳ−１細胞およびＤＯＶ−１３細胞）の細胞懸濁物をＥＶ１で攻撃し（ｍｏｉ＝１．０ＴＣＩＤ５０／細胞）、３７℃で２４時間インキュベーションした。細胞の細胞溶解のレベルを、製造者の説明書に従ってＣｙｔｏ−Ｔｏｘ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を使用することによって評価されるＬＤＨ（細胞溶解時に放出される安定な細胞質ゾル酵素）の放出の関数として計算した。
【００８０】
１．１２．スフェロイドの培養およびスフェロイド感染性アッセイ
ＤＯＶ−１３細胞を、２４ウエルプレートにおいて、５％ＦＣＳを含有する１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０においてウエルあたり５００個または５０００個の細胞で半固体の０．５％寒天層に接種した。細胞は、スフェロイドを形成させるために５％のＣＯ２環境において３７℃で４８時間インキュベーションされ、その後、ＥＶ１が添加された（１０５ＴＣＩＤ５０）。
【００８１】
１．１３．ＳＣＩＤマウスにおける腹腔内腫瘍異種移植片モデル
６週齢〜８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃＳＣＩＤマウスを、ニューカッスル大学動物管理倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って病原体非含有条件で飼育した。ＯＶＨＳ−１細胞を、０．０５％トリプシンを用いて集め、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩに再懸濁し、遠心分離によってペレット化した。細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、その後、マウスに１×１０６個の細胞を２００μｌにおいて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１４日後、マウスを３つの群（ｎ＝５）に分け、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で、またはＵＶ不活性化ＥＶ１もしくは感染性ＥＶ１のいずれかの１０５ＴＣＩＤ５０でｉ．ｐ．治療した。動物は、毎週、体重測定され、腫瘍がその体重の２０％を越えた時に屠殺された。治療されたマウスの体重が、腫瘍を有さない健康なＢＡＬＢ／ｃＳＣＩＤマウスと比較された。
【００８２】
１．１４．リアルタイムＰＣＲによるウイルス血症の決定
感染マウスから得られた血清を、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用してウイルス血症について分析した。簡単に記載すると、ウイルスＲＮＡを、製造者の説明書に従って、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｈｉｌｌ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）を使用して１０μｌの血清から抽出し、４０μｌの最終体積で溶出した。ＥＶ１のウイルスＲＮＡレベルを測定するためのプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ１．５ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を使用して設計され、以前に発表されたＥＶ１配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＦ０２９８５９）に基づいていた：フォワードプライマー（５’−ＣＡＡＧＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’）、リバースプライマー（５’−ＣＣＡＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’）および６−ＦＡＭ標識のＭＧＢプローブ（５’−ＣＣＡＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴ−３’）。ワンステップＲＴ−ＰＣＲが、ＡＢＩ７０００配列検出装置においてＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して行われた。標準曲線を作製するために、ＥＶ１ウイルスのストック物（１×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）の１０倍希釈物が、最適化された濃度のプライマーおよびプローブを用いて増幅された。２５μｌの体積において、反応混合物は、１×ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ反応混合物、５００ｎＭのフォワードプライマー、９００ｎＭのリバースプライマー、２５０ｎＭのプローブ、５００ｎＭのＲＯＸ、０．５μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌｕｓ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ、および５μｌの抽出されたＲＮＡを含んだ。熱サイクル条件は、６０℃で３０分、その後、９５℃で５分、次いで、９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルに供された。
【００８３】
（実施例２：ガン細胞のウイルス媒介による腫瘍崩壊）
２．１．乳ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現
エンテロウイルスによって使用される選択されたエンテロウイルス細胞表面受容体の相対的な発現レベルを明らかにするために、フローサイトメトリー分析が行われた。選択された受容体群は、ＣＡＶ２１によって用いられるＩＣＡＭ−１；ＥＶ７、ＣＡＶ２１、ＣＶＢ３によって用いられるＤＡＦ；ＣＶＢ３によって使用されるＣＡＲ；および、ＥＶ１によって使用されるインテグリンα２β１からなった。ＰＶＲ受容体に対するＭａｂを得ることができなかったため、ＰＶＲの発現レベルは測定されなかった。
【００８４】
９個の乳ガン細胞株が分析され、これらには、ＢＴ−２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ１５７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ３６１、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ４７−ＤおよびＺＲ−７５−１が含まれる。これらの細胞株は、抗ＩＣＡＭ−１（ＩＨ４）、抗ＣＡＲ（ＲｍｃＢ）、抗ＤＡＦ（ＶＩＩＩＡ７）または抗α２β１（ＡＫ７）のいずれかとインキュベーションされた。
【００８５】
ＩＣＡＭ−１の発現は９個の系統のうちの６個において顕著であり、一方、ＤＡＦは、これらすべての細胞株において相対的に低いレベルで発現しているようであった。中程度のレベルのＣＡＲ発現が９個の系統のうちの７個において明らかであり、一方、非常に小さいレベルのα２β１発現がこれらの乳ガン細胞株のうちの８個の表面に存在した（図１）。
【００８６】
２．２．選択されたエンテロウイルスによる乳ガン細胞の腫瘍崩壊
溶解感染性アッセイが、選択されたエンテロウイルス群（ＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１）に対するそれらの感受性を明らかにするために、９個すべての乳ガン細胞株に対して行われた（図２）。細胞株は、１ミリリットルあたり５０パーセント終点での組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）が１０４以上であると計算された場合、腫瘍崩壊を非常に受けやすいと見なされた。ＣＡＶ２１およびＣＶＢ３は９個の乳ガン細胞株のうちの６個において著しい溶解を誘導した。一般に、乳ガン細胞は、ＥＶ１に対する相当の感受性を明らかにした１つの細胞株Ｔ４７−Ｄを除いて、エコーウイルス（ＥＶ１およびＥＶ７）による溶解感染に対する感受性がなかった。ＰＶ１は９個の乳ガン細胞株のうちの８個において実質的な腫瘍崩壊を引き起こした（図２）。
【００８７】
２．３．結腸直腸ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現
４つの結腸直腸ガン細胞株（ＨＣＴ１１６、ＬＩＭ２５３７、ＳＷ４８０およびＳＷ６２０）が、フローサイトメトリーによって、ＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、α２β１およびＤＡＦの発現について分析された。著しいレベルのＩＣＡＭ−１発現およびＤＡＦ発現がこれらの細胞株のうちの２つにおいて観測された。中程度のレベルのＣＡＲが４つすべての系統において発現しているようであり、一方、著しいレベルのα２β１発現は観測されなかった（図３）。
【００８８】
２．４．選択されたエンテロウイルスによる結腸直腸ガン細胞の腫瘍崩壊
ＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１が、４つすべての結腸直腸ガン細胞株において力価測定された。ＣＶＢ３およびＰＶ１による著しいレベルの腫瘍崩壊がこれらの細胞株のすべてにおいて観測された（図４）。しかしながら、ＣＡＶ２１により誘導される著しい細胞溶解が４つの細胞株のうちの１つ（ＬＩＭ２５７３）のみにおいて生じた。この細胞株は最大レベルのＩＣＡＭ−１発現を示した。α２β１の非常に低い発現レベルにもかかわらず、ＥＶ１はこれらの細胞株のうちの３つに溶解感染し、一方、すべての細胞がＥＶ７感染に対して治療抵抗性があった。
【００８９】
２．５．前立腺ガン細胞および膵臓ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現
ＤＵ１４５およびＰＣ３を含む前立腺ガン細胞株、ならびに、ＡｓＰＣ−１およびＰＡＮＣ−１を含む膵臓ガン細胞株が、ＩＣＡＭ−１、ＤＡＦ、ＣＡＲおよびα２β１の発現について分析された。著しいレベルのＩＣＡＭ−１が両方の前立腺ガン細胞株および一方の膵臓ガン細胞株において発現していた。中程度のＣＡＲ発現およびＤＡＦ発現がこれらの細胞株の４つすべてにおいて見出され、一方、α２β１発現は非常に小さいようであった（図５）。
【００９０】
２．６．前立腺ガン細胞および膵臓ガン細胞の腫瘍崩壊
エンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１に対する２つの前立腺ガン細胞株および２つの膵臓ガン細胞株の感受性が、マイクロタイタープレートでの溶解感染において調べられた。前立腺ガン細胞株は、ＤＵ１４５の場合、ＥＶ７を除くすべてのウイルスに対して感受性があった。ＰＡＮＣ−１はＣＡＶ２１およびＰＶ１によって感染しただけであった。これに対して、もう一方の膵臓ガン細胞株ＡｓＰＣ−１は、ＥＶ７を除くすべてのウイルスによる腫瘍崩壊を示した（図６）。
【００９１】
２．７．卵巣ガン細胞の表面におけるエンテロウイルス受容体の発現
卵巣ガン細胞株が、エンテロウイルス受容体のＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１の発現について調べられた。９個の細胞株がこの研究では含まれた：Ａ２７８０、ＤＯＶ１３、ＩＧＲＯＶ−１、ＪＡＭ、ＯＶＣＡ−４２９、ＯＶＨＳ−１、ＯＷＡ−４２、ＳＫＯＶ−３および２００８。著しいレベルのＩＣＡＭ−１が９個の細胞株のうちの２個において発現し、一方、中程度のレベルのＣＡＲ発現が９個のうちの６個に存在した。ＤＡＦは、１個の卵巣ガン細胞株を除くすべてにおいて高レベル〜中程度のレベルで発現していた。９個の卵巣ガン細胞株のうちの８個がα２β１の中程度のレベル〜高レベルの発現を示し（図７）、さらなる卵巣ガン細胞株（ＯＶＣＡＲ−３）は著しいレベルのα２β１を発現していた（データは示されず）。
【００９２】
２．８．卵巣ガン細胞株の腫瘍崩壊
ＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１の腫瘍崩壊能力が９個の卵巣ガン細胞株のそれぞれにおいて評価された（図８）。ＣＡＶ２１の感受性が９個の細胞株のうちの２個において認められ、一方、ＣＶＢ３は９個の細胞株のうちの７個において著しい溶解を生じさせた。卵巣ガンは、感染したとき、エコーウイルスに対して特に感受性があるようであり、ＥＶ７は９個のガン細胞株のうちの４個において死を生じさせ、ＥＶ１は１０個の細胞株のうちの７個を著しく溶解させた（図９Ａ、図９Ｂおよび図１０）。ＰＶ１に対する攻撃されやすさが９個すべての卵巣ガン細胞株にわたって明らかにされた。顕微鏡写真が、ＥＶ１に感染した１０個すべての系統について撮影され（図９Ａおよび図９Ｂ）、そして、ＥＶ１を用いた１０個の卵巣ガン細胞株のマイクロタイタープレートでの溶解感染もまた観測された（図１０）。
【００９３】
２．９．卵巣ガン細胞株に対するＥＶ１の結合
卵巣ガン細胞株はＥＶ１による腫瘍崩壊を非常に受けやすかったので、ＥＶ１の細胞付着の性質を評価するためのさらなる研究が始められた。細胞を抗α２β１（ＡＫ７）モノクローナル抗体または抗ＤＡＦ（ＶＩＩＩＡ７）モノクローナル抗体のいずれかとプレインキュベーションし、その後、放射能標識されたＥＶ１を加えて、ＥＶ１の宿主細胞結合におけるこれらの受容体の関与を明らかにした。ＥＶ１の結合は、試験された１０個すべての細胞株において明らかであった。α２β１インテグリンを抗受容体抗体で阻止することによって、ＥＶ１の細胞付着が著しく阻害された。モノクローナル抗体ＶＩＩＩＡ７を用いた細胞表面受容体ＤＡＦの阻止はＥＶ１結合の著しい阻害を生じさせなかった（図１１）。
【００９４】
２．１０．α２β１インテグリンの抗体阻止は卵巣ガン細胞株のＥＶ１感染を阻害する
ＥＶ１感染におけるα２β１の機能を評価するために、細胞単層物が抗α２β１（ＡＫ７）モノクローナル抗体とプレインキュベーションされた溶解アッセイが行われた。ＯＷＡ−４２およびＩＧＲＯＶ−１の卵巣ガン細胞株が分析された。ウイルス感染後の７２時間後、細胞単層物は、ＭＡｂによる阻止が存在しない場合、ＥＶ１の溶解感染に対して非常に感受性があった。α２β１インテグリンのＭＡｂ阻止の後では、細胞株における腫瘍崩壊は、ＥＶ１の最も低い希釈度においてさえ全く示されなかった（図１２）。顕微鏡写真が、ＯＷＡ−４２細胞株の感染後の２４時間、４８時間および７２時間において撮影された（図１３）。
【００９５】
２．１１．非ガン性ヒト細胞はＥＶ１感染に対する感受性がない
実験が、ヒト繊維芽細胞にＥＶ１を感染させることによって明らかにされる、ＥＶ１が非ガン性ヒト細胞に対して有する効果を調べるために行われた。簡単に記載すると、６ウエル組織培養プレートが組織培養環状インサートとともに準備され、ＤＯＶ１３細胞がリングの内側に置かれ、ヒト繊維芽細胞のＨｅＬａ細胞（ＣＳＬ（オーストラリア）から得られる）がリングの外側に入れられ、これらは、コンフルエントな単層物が形成されるまで３７℃でインキュベーションされた。リングが除かれ、細胞に、３７℃で一晩、ＥＶ１を感染させた。生存細胞がクリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色された。ＥＶ１が感染したとき、ＤＯＶ１３卵巣ガン細胞は溶解され、これに対して、ＨｅＬａ細胞は健全なままであった（図１４）。このことは、ＥＶ１に対する卵巣ガン細胞の特異的な感受性を明らかにしている。
【００９６】
２．１２．黒色腫細胞株ＳｋＭｅｌ２８におけるα２β１の発現
黒色腫（皮膚のガン）は、α２β１の発現をアップレギュレーションすることが知られている。黒色腫細胞株ＳｋＭｅｌ２８が、フローサイトメトリーを使用して発現について調べられた。高レベルのα２β１発現が観測された。しかしながら、低いバックグラウンドレベルの結合がコントロールＭＡｂによって示された（図１５）。
【００９７】
２．１３．ＳｋＭｅｌ２８に対するＥＶ１の結合
ＳｋＭｅｌ２８細胞における表面発現のα２β１に対するＥＶ１付着の性質をさらに調べるために、放射能標識されたウイルスの結合アッセイが行われた。放射能標識されたＥＶ１はこの悪性黒色腫細胞株に著しく結合し、α２β１のＭＡｂ阻止は、結合したＥＶ１の量を大幅に激減させた（図１６）。
【００９８】
２．１４．ＥＶ１を用いたＳｋＭｅｌ２８の感染性アッセイ
溶解感染性アッセイが、ＥＶ１感染に対するＳｋＭｅｌ２８の感受性を明らかにするために行われた。この悪性黒色腫細胞株は、ＥＶ１が感染したとき、中程度の腫瘍崩壊を示した。クリスタルバイオレット色素は、溶解感染を受けていない細胞によって吸収され、これに対して、染色されないウエルは細胞単層物の完全な溶解を表している（図１７）。
【００９９】
２．１５．考察
卵巣ガン細胞株は、ＥＶ１による溶解感染に対して非常に感受性があることが見出され、試験された１０個の細胞株のうちの７個が著しい腫瘍崩壊を示した。卵巣ガン細胞株に対するＥＶ１の結合についてのさらなる研究では、α２β１が、ＥＶ１によって使用される一次受容体であることが確認された。放射能標識された結合研究では、α２β１がウイルス結合のために要求されたことがさらに示され、ＭＡｂ阻止アッセイでは、感受性の卵巣ガン細胞をα２β１モノクローナル抗体（Ｍａｂ）と前処理することによって、ＥＶ１感染が完全に阻害されたことが明らかにされた。ＤＡＦ  ＭＡｂのＶＩＩＩＡ７もまた、ＤＡＦが、エンテロウイルスのＣＡＶ２１およびＣＶＢ３に関して果たすようにＥＶ１結合において役割を果しているかどうかを明らかにするために、陰性コントロール治療として結合アッセイにおいて使用された。ＥＶ１結合の著しい阻止は、抗ＤＡＦ  ＭＡｂの前処理によって生じなかった。
【０１００】
卵巣ガン細胞をヒト繊維芽細胞と同時培養し、その後、ＥＶ１を感染させた場合、ヒト繊維芽細胞は、ウイルスが卵巣ガン細胞を特異的に溶解した環境においてさえ、ＥＶ１感染に対して感受性がないことが明らかにされた。
【０１０１】
黒色腫細胞株に対するＥＶ１媒介による腫瘍崩壊の効果もまた調べられた。データからは、α２β１がＳｋＭｅｌ２８黒色腫細胞株の表面でアップレギュレーションされたこと、および、この細胞はＥＶ１の溶解感染に対して感受性があったことが明らかにされた。卵巣ガン細胞に対するＥＶ１の結合は、放射能標識された結合アッセイによって示されるように、α２β１相互作用を介してであることが示された。ＥＶ１感染について許容性があった残りのガン細胞株は結腸ガン細胞株であり、４つの細胞株のうちの３つが、２つの前立腺ガン細胞株と同様に、非常に感受性があった。これらのガンタイプはともに、卵巣ガン細胞と同じ細胞外マトリックスに遭遇することがあり、従って、腹膜表面に見出されるＩ型コラーゲンが多い細胞外マトリックスを通過する転移のとき、それらのα２β１発現をアップレギュレーションし得る。
【０１０２】
数多くの変化および／または改変が、広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態において示されるような発明に対してなされ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の実施形態は、すべての点で、限定的ではなく、例示であると見なされるべきである。
【０１０３】
（実施例３：エコーウイルス（ＥＶ２）溶解感染の特異性）
３．１．ＥＶ１の相対的病原性
新生物細胞に対して比較される非悪性卵巣細胞のインビトロ培養物に対するＥＶ１の相対的な病原性が調べられた。ヒト乳頭腫ウイルス１６Ｅ６−Ｅ７のオープンリーディングフレームを使用して不死化された正常なヒト卵巣表面上皮（ＨＯＳＥ）細胞（Ｔｓａｏ，Ｓ．Ｗ．他、１９９５）が、明細胞卵巣ガン腫株（ＯＶＨＳ−１）および未分化卵巣ガン腫細胞（ＤＯＶ１３）と一緒に、ｍｏｉ５．０〜０．０５ＴＣＩＤ５０／細胞まで及ぶ投入多重度のＥＶ１で攻撃された。感染後４８時間において、顕微鏡検査により、両方の卵巣ガン腫株の単層物における全体的な細胞破壊および細胞溶解が、細胞あたり０．０５ＴＣＩＤ５０のＥＶ１もの低いウイルス攻撃においてさえ、明らかにされた。対照的に、ＨＯＳＥ細胞の細胞形態学における検出可能な変化は、最も大きいウイルス攻撃用量においてさえ、観測されなかった。
【０１０４】
ＥＶ１感染の特異性を明らかにするさらなる努力において、正常な末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ならびにＯＶＨＳ−１細胞およびＤＯＶ１３細胞がＥＶ１で攻撃された（ｍｏｉ＝１．０）。フローサイトメトリー分析により、ＰＢＬ細胞調製物は表面α２β１をほとんど発現しておらず、一方、両方の卵巣ガン腫細胞株は高レベルのα２β１を発現していることが明らかにされた。ＰＢＬおよび卵巣ガン細胞の懸濁物のＥＶ１媒介による細胞溶解が、ＬＤＨの放出を測定する細胞の標準的な細胞傷害性アッセイを使用することによって評価された。ＥＶ１攻撃は、ＥＶ１感染による卵巣培養物の細胞のほとんど完全な細胞溶解をもたらし、一方、バックグラウンドレベルの細胞溶解のみが、同じ負荷用量のＥＶ１にさらされた後のＰＢＬにおいて観測されただけであった。
【０１０５】
ＥＶ１が、検出可能な細胞溶解の非存在下でＰＢＬにおいて増殖感染を開始させたかどうかを明らかにするために、また、バックグラウンドレベルの細胞溶解が非特異的であり、ＥＶ１感染により媒介されなかったことを確認するために、ＰＢＬおよび２つの卵巣ガン腫株の懸濁物は、ＥＶ１が接種され（ｍｏｉ＝１．０）、子孫ウイルスの産生についてモニターされた。２つの卵巣ガン細胞株（ＯＶＨＳ−１およびＤＯＶ−１３）において、ＥＶ１力価が最初の細胞結合接種物よりも約１０４倍増大した。対照的に、子孫ウイルスは４８時間のインキュベーションにわたってＰＢＬによって産生されず、観測された感染性は、非特異的に結合した残存する投入接種物と一致した。
【０１０６】
（実施例４：卵巣ガン細胞のエコーウイルス（ＥＶ１）溶解）
４．１．インビトロ培養された卵巣ガン細胞スフェロイドのＥＶ１溶解
卵巣ガン細胞の多くのインビトロ培養物は多次元的スフェロイドとして増殖することができる（Ｃａｓｅｙ，Ｒ．Ｃ．他、２００１）。多細胞スフェロイドは、進行した段階の卵巣ガン腫を有する患者の腹水に一般的に見出される多細胞の凝集物を刺激する。卵巣細胞の単層培養物はＥＶ１による溶解感染を非常に受けやすいことが明らかにされているので、多卵巣ガン細胞スフェロイドをＥＶ１で攻撃した。フローサイトメトリー分析により、ＯＶＨＳ−１細胞が単層形成またはスフェロイド形成のいずれかで成長したとしても、ＥＶ１細胞受容体α２β１の表面発現レベルが比較可能であったことが明らかにされた。ＥＶ１（１０５ＴＣＩＤ５０）が、スフェロイドを取り囲む半固体アガロース培地に投与され、スフェロイド形態学の顕微鏡写真画像がウイルス攻撃後の様々な間隔で得られた。図１８は、コントロールの非感染スフェロイドが活発に増殖中であり、９日間のインキュベーション期間を通して体積の着実な増大をもたらしていることを示している。対照的に、ＥＶ１感染スフェロイドは、接種後の最初の７日の期間中、体積のわずかな減少を示し、著しい構造的解離および細胞破壊がその後の４８時間にわたって生じた。データは、ＥＶ１が、最初の接種前スフェロイド体積（すなわち、５×１０２細胞または５×１０３細胞）にもかかわらず、スフェロイドの成長を遅らせることにおいて効果的であるガン性スフェロイド内の細胞溶解感染に対して増殖性細胞を開始させることを示している。
【０１０７】
４．２．ヒト卵巣ガンの腹水モデルに対するエコーウイルス１の効果
転移性卵巣ガンの後期段階において、腫瘍細胞は腹膜腔の至るところに遊走し、かつ／または組織部位から離れてコロニーを形成する。ＥＶ１媒介の腫瘍崩壊が、腹膜卵巣ガンの進行した段階に対する効果的な治療であるかどうかを明らかにするために、ヒト卵巣ガン腫の異種移植片を有するＳＣＩＤマウス腹水症モデルが用いられた。ＳＣＩＤマウスには、腹腔内経路によって、２×１０６個のＯＶＨＳ−１細胞が、生ＥＶ１の投与の１４日前に投与された。実験治療様式は、腹腔内経路により注入されたＰＢＳ、ＵＶ不活性化ＥＶ１または生ＥＶ１（１０５ＴＣＩＤ５０）のいずれかの１回の投薬からなった。卵巣ガン異種移植片を有さないマウスの体重変化に対する、様々な治療を受けているマウスの体重変化が、腹水症負荷の発症のマーカーとして使用された。
【０１０８】
治療後３週間目において、ＰＢＳまたはＵＶ不活性化ＥＶ１が投与されたマウスは体重の著しい増大を示し、しかし、正常なマウスとＥＶ１治療マウスとの間には差が観測されなかった。ＰＢＳ群またはＵＶ不活性化ＥＶ１群の体重は増大し続け、ＰＩ４週間目において、腹水の蓄積による実質的な腹部膨満がすべてのマウスにおいて明らかであったが、残りの治療群では明らかではなかった（図１９Ａ）。ＰＩ５週間目において、ＰＢＳおよびＵＶ不活性化ＥＶ１に由来するすべてのマウスが過度の腹膜腹水症のために屠殺され、その一方で、検出可能な体重増大または腹水形成が、ＥＶ１治療マウスと、卵巣ガン異種移植片を有さない動物との間には観測されなかった（図１９Ｂ）。この研究の経過期間中を通して、劇的な疾患発症の徴候は、ウイルス接種物の用量よりも１０倍〜１００倍多い血清ウイルス負荷量が存在する場合でさえ、生ＥＶ１が注入されたマウスでは観測されなかった（ＰＩ７日目〜１４日目において；データは示されず）。
【０１０９】
４．３．考察
複製可能なウイルスを使用するウイルス腫瘍崩壊法を成功するための主要な必要条件の１つは、新生物細胞に対する大きな好みのほかに、宿主に対する低いウイルス病原性である。
【０１１０】
本研究では、ヒト卵巣ガン細胞のインビトロ細胞培養物の溶解感染を誘導する代表的なヒトエコーウイルスの能力が評価された。黒色腫細胞について非常に腫瘍崩壊性があるにもかかわらず、ＣＶＡ２１、およびＥＶ７のプロトタイプ株は、多数のヒト卵巣ガン細胞単層物において増殖性の溶解感染を誘導することにおいてＥＶ１ほど強力ではなかった。モノクローナル抗体阻止研究により、卵巣ガン細胞のＥＶ１媒介による溶解感染が、細胞表面に発現したインテグリンα２β１との特異的なウイルスキャプシド結合によって開始されたことが確認された。インテグリンα２β１はＥＶ１およびコラーゲンの両方と同時に結合することができないので、卵巣ガン細胞のＥＶ１溶解感染は迅速な細胞腫瘍崩壊を媒介するだけでなく、１型コラーゲンとインテグリンα２β１との間での相互作用を妨害することができ、それにより、腹膜表面の全域におけるガン細胞の散在を潜在的に低下させることができる。
【０１１１】
ＥＶ１攻撃による多細胞の三次元スフェロイドの破壊は、充実性卵巣腫瘍負荷のインビボ低下におけるＥＶ１媒介による腫瘍崩壊の有用性を反映している。卵巣スフェロイドにおける個々の細胞は、単層形成における細胞よりも強固であるようであり、そのため、放射線および化学物質により誘導されるアポトーシスに対する高まった抵抗性を有するということ（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．他、１９９７）を考えると、ＥＶ１による卵巣スフェロイドのこの効率的な溶解は見事である。
【０１１２】
治療的な腫瘍崩壊性ウイルスは、悪性の細胞を標的化するための識別機構を有さなければならない。選択的なＥＶ１媒介感染が、ＥＶ１は正常な上皮卵巣細胞株および末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の劇的な細胞溶解を誘導することができないことによって強調された。高力価の子孫ウイルスが、ＰＢＬの懸濁物からではなく、卵巣ガン細胞から産生することは、非新生物細胞に対するＥＶ１感染の特異性および低い病原性の性質を補強している。
【０１１３】
卵巣ガン腫に加えて、悪性の黒色腫細胞もまた、アップレギュレーションされたレベルの表面インテグリンα２β１を発現し、それにより、悪性の黒色腫細胞をＥＶ１攻撃に対して感受性にしている。ちょっとした逆説において、卵巣ガン細胞のＥＶ１感染は、黒色腫細胞におけるＣＶＡ２１に対する細胞標的化受容体であるＩＣＡＭ−１の増大した表面発現を誘導する（Ｐｉｅｔｉａｉｎｅｎ，Ｖ．他、２０００）。従って、生ＥＶ１および生ＣＶＡ２１の両方を含有する治療用調製物による卵巣ガンおよび／または黒色腫の悪性腫瘍の攻撃は、より強力な腫瘍崩壊感染をもたらし得る。
【０１１４】
ＥＶ１の腹腔内投与は、ＳＣＩＤマウスの腹膜腔における卵巣腫瘍異種移植片の発達を抑制することにおいて非常に効果的であった。生ＥＶ１が注入されたマウスはすべてが、（卵巣ガン異種移植片が注入されていないマウスと比較して）増大した体重増加を示さず、また、検出可能な腹膜腹水の発達を示さなかった。新生物性卵巣細胞のインビボ溶解感染によって生じた子孫ＥＶ１が、ＰＩ７日目にマウスの血液において検出された（データは示されず）。ウイルス血症ＥＶ１は、散らばった疾患を抑えるための魅力的なリザーバーと見なすことができ、そして、有意なレベル（約１０６ＴＣＩＤ５０）でのその検出はまた、１０５ＴＣＩＤ５０のウイルス投入用量が、腫瘍崩壊能を維持しながら著しく減少させられ得ることを示している。卵巣ガン異種移植片を有さないマウスにおいてウイルス血症ＥＶ１をＰＩ７日目に検出できないこと（データは示されず）は、感受性の新生物細胞が存在しない場合、ＥＶ１は全身循環から迅速かつ効果的に排除されつつあることを示唆している。
【０１１５】
全体として、これらの結果は、ＥＶ１による腫瘍崩壊治療が、腹膜卵巣ガンを抑えるためにインビトロおよびインビボにおいて非常に効果的であることを強調している。比較的非浸襲性のＥＶ１治療の使用は、混合化学療法が後に続く外科的減量化を伴う現行の治療様式に対する魅力的な代替法として見なすことができる。ＥＶ１治療はまた、手術手技の間に放出された新生物細胞の標的化および破壊に集中する腫瘍減量化手術後の補助治療として用いることができる。ＥＶ１腫瘍崩壊治療はまた、高レベルのインテグリンα２β１を発現する他のヒト悪性腫瘍の治療における新規な治療法として使用することができる。その上、ＥＶ１およびＥＶ８はインテグリンα２β１上の同じ結合エピトープについて競合するので、ＥＶ８は、卵巣ガン腫細胞の迅速な溶解感染を誘導するためのＥＶ１に対する代わりの選択となり得る。２つの別個のウイルス血清型が利用できることにより、最初のウイルス投与の結果として生じた保護免疫応答とは無関係に、インテグリンα２β１の標的化による卵巣ガン腫の逐次攻撃が可能になる。ＥＶ１に対する強力な抗エンテロウイルス薬（プレコナリル）が利用できること（Ｐｅｖｅａｒ，Ｄ．Ｃ．他、１９９９）は、非特異的なウイルス複製および散らばったウイルス子孫の直接的な抑制をもたらすので、この治療の魅力をさらに高める。プレコナリルとＥＶ１との間での潜在的な相乗作用はまた、非常に大きいウイルス投入多重度の全身注入、それに続く、ウイルスが悪性の細胞を標的化し、その溶解感染を開始した直後における（遊離ウイルスを不活性化するための）プレコナリルの投与を可能にし得る。
【０１１６】
数多くの変化および／または改変が、広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態において示されるような発明に対してなされ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の実施形態は、すべての点で、限定的ではなく、例示であると見なされるべきである。
【０１１７】
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【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】乳ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。
【図２】エンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による乳ガン細胞の溶解感染を示す。
【図３】直腸結腸ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。
【図４】エンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による直腸結腸ガン細胞の溶解感染を示す。
【図５】前立腺ガン細胞または膵臓ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。
【図６】エンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による前立腺ガン細胞および膵臓ガン細胞の溶解感染を示す。
【図７】卵巣ガン細胞の表面における表面発現したＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＤＡＦおよびα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】エンテロウイルスのＣＡＶ２１、ＣＶＢ３、ＥＶ１、ＥＶ７およびＰＶ１による卵巣ガン細胞の溶解感染を示す。
【図９ａ】ＥＶ１の１０−１希釈物を７２時間感染させた卵巣ガン細胞単層物の顕微鏡写真を示す。
【図９ｂ】ＥＶ１の１０−１希釈物を７２時間感染させた卵巣ガン細胞単層物の顕微鏡写真を示す。
【図１０】ＥＶ１を用いた卵巣ガン細胞への溶解感染を示す。
【図１１】ＥＶ１結合が抗α２β１の存在下で阻害されることを示す。
【図１２】抗α２β１ＭＡｂの存在下または非存在下でのＥＶ１による卵巣ガン細胞株のＯＷＡ−４２およびＩＧＲＯＶ−１への溶解感染を示す。
【図１３】抗α２β１ＭＡｂの存在下または非存在下でのＥＶ１によるＯＷＡ−４２卵巣ガン細胞単層物への溶解感染を示す。
【図１４】ＤＯＶ１３卵巣ガン細胞がリング状インサートの内側で培養され、ＨｅＬａ細胞（ヒト繊維芽細胞）がリングの外側において培養されたことを示す。
【図１５】黒色腫細胞株ＳｋＭｅｌ２８における表面発現したα２β１のレベルのフローサイトメトリー分析を示す。
【図１６】抗α２β１ＭＡｂまたは抗ＤＡＦ  ＭＡｂのいずれかの存在下および非存在下におけるＳｋＭｅｌ２８黒色腫細胞に対する［３５Ｓ］−メチオニン標識ＥＶ１の結合を示す。
【図１７】ＥＶ１を用いたＳｋＭｅｌ２８黒色腫細胞への溶解感染を示す。
【図１８】ＥＶ１を用いた卵巣ガン多細胞スフェロイドの治療を示す顕微鏡写真である。
【図１９】図１９Ａは、１．０ｘ１０６個のＯＶＨＳ−１細胞が、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＵＶ不活性化エコーウイルスＥＶ１または感染性ＥＶ１（１０５ＴＣＩＤ５０）のいずれかでのｉ．ｐ．経路による注射の３週間前に腹腔内（ｉ．ｐ）経路により投与されたＳＣＩＤマウスの体重変化を示すヒストグラムである。図１９Ｂは、ＯＶＨＳ−１細胞が注射され、ＰＢＳ、ＵＶ不活性化ＥＶ１またはＥＶ１で治療されたマウスと比較される正常なコントロールＳＣＩＤマウスの注射後５週間目に撮影された写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月4日(2005.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における異常細胞を治療するための方法であって、α２β１を異常細胞への感染性のために認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスの効果的な量で哺乳動物を治療し、その結果、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるようにすることを含む方法。
【請求項２】
ウイルスを用いた多数の治療に哺乳動物を供することを含み、各治療におけるウイルスが同一または異なる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスが異常細胞に感染するさらなるウイルスとの組合せで哺乳動物に投与される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
異常細胞がＩＣＡＭ−１を発現し、さらなるウイルスが異常細胞への感染性のためにＩＣＡＭ−１を認識する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらなるウイルスがコクサッキーウイルスまたはその改変された形態である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コクサッキーウイルスが、Ａ１３，Ａ１５，Ａ１８およびＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーウイルス血清型である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異常細胞がガン細胞である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
異常細胞が、アップレギュレーションされた発現α２β１を有する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスが、哺乳動物に対して局所的に、全身的に、または腫瘍内に投与される請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、ウイルスによって誘導される細胞死に対する感受性について哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをスクリーニングする方法であって： 
（ａ）異常細胞のサンプルを提供する工程；
（ｂ）ウイルスによる異常細胞への感染を可能にするのに十分な期間にわたって異常細胞をウイルスで治療する工程；および
（ｃ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程；
を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される方法。
【請求項１７】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
異常細胞に感染し、その死を生じさせるウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して、工程（ｂ）および工程（ｃ）に供された、α２β１を異常細胞への感染性のために認識する異なるウイルスと比較する工程をさらに含む請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
異なるウイルスが異なるエコーウイルスまたはその改変された形態である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
異常細胞がガン細胞である請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
異常細胞の治療のために哺乳動物にウイルスを投与することを評価するために、哺乳動物に由来する異常細胞に感染し、その死を生じさせる能力についてウイルスをスクリーニングする方法であって：
（ａ）ウイルスを選択する工程；
（ｂ）ウイルスによる異常細胞への感染を可能にするのに十分な期間にわたって哺乳動物に由来する異常細胞のサンプルをウイルスで治療する工程；および
（ｃ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染し、その死を生じさせたかどうかを明らかにする工程；
を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスおよびその改変された形態から選択される方法。
【請求項２７】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
異常細胞に感染し、その死を生じさせるウイルスの能力を、異常細胞の別のサンプルを利用して、工程（ｂ）および工程（ｃ）に供された、α２β１を異常細胞への感染性のために認識する異なるウイルスと比較する工程をさらに含む請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
異なるウイルスが異なるエコーウイルスまたはその改変された形態である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
異常細胞がガン細胞である請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
α２β１を発現する異常細胞に対して哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、エコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるウイルスを哺乳動物における異常細胞に感染させることを含み、それにより少なくとも一部の異常細胞の溶解が引き起こされる方法。
【請求項３７】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
異常細胞が、アップレギュレーションされた発現α２β１を有する請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ウイルスが異常細胞に感染するさらなるウイルスとの組合せで哺乳動物に投与される請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
異常細胞がＩＣＡＭ−１を発現し、さらなるウイルスが異常細胞への感染性のためにＩＣＡＭ−１を認識する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらなるウイルスがコクサッキーウイルスまたはその改変された形態である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
コクサッキーウイルスが、Ａ１３，Ａ１５，Ａ１８およびＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーウイルス血清型である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
異常細胞がガン細胞である請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ガン細胞が、卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、および結腸直腸ガンからなる群から選択されるガンの細胞であるか、または卵巣ガン、黒色腫、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、または結腸直腸ガンから広がっている請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ウイルスが、哺乳動物に対して局所的に、全身的に、または腫瘍内に投与される請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物における異常細胞を治療するための医薬組成物であって、異常細胞の少なくとも一部がウイルスによって殺されるように異常細胞を治療するためにウイルスを生じさせるための接種物を医薬的に許容され得るキャリアと一緒に含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される医薬組成物。
【請求項５１】
ウイルスがエコーウイルス血清型またはその改変された形態を含む請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
ウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
ウイルスが改変されたエコーウイルスである請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ウイルスが、異常細胞に感染するウイルスの能力を増大させるように改変されている請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
改変されたエコーウイルスが、ＥＶ１およびＥＶ８からなる群から選択される改変された形態のエコーウイルスである請求項５３または５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
異常細胞がガン細胞である請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
医薬組成物が局所投与または注入のためのものである請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
哺乳動物における異常細胞を治療するためのウイルスを生じさせるために哺乳動物に接種物を適用するためのアプリケーターであって、アプリケーターは、接種物が哺乳動物と接触するように接種物を染み込ませた領域を含み、ウイルスは、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択されるアプリケーター。
【請求項５９】
ウイルスを染み込ませた領域が、哺乳動物と接触した状態で保持されるための詰め物またはパッドを含む請求項５８に記載のアプリケーター。
【請求項６０】
異常細胞が異常皮膚細胞であり、アプリケーターが哺乳動物の皮膚に接着するための一つまたはそれ以上の接着性表面をさらに含む請求項５８または５９に記載のアプリケーター。
【請求項６１】
パッチまたは絆創膏の形態である請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のアプリケーター。
【請求項６２】
哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用であって、ウイルスが、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識するエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される使用。
【請求項６３】
哺乳動物における異常細胞に対する免疫応答を誘導するための医薬品を製造する際にウイルスを生じさせるための接種物の使用であって、ウイルスが、異常細胞への感染性のためにα２β１を認識し、かつ細胞を殺すエコーウイルスならびにその改変された形態およびそれらの組合せから選択される使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本明細書中に記載されるような方法において使用されるウイルスは、望ましくは、受容者において臨床的症状をほとんど生じさせないか、または、ほんの軽微な臨床的症状を生じさせるだけである。そのようなウイルスは、当業者に広く知られている商業的供給源から容易に入手可能であり、上記の様式で本発明の方法におけるその有効性についてスクリーニングすることができる。望ましくは、ウイルスは、通常の場合、エコーウイルスＥＶ１およびエコーウイルスＥＶ８からなる群から選択されるエコーウイルスである。これらのウイルスはそれぞれが、細胞感染性のためにα２β１を認識する。例えば、ＥＶ１は、軽い上部気道疾患、そしてまた胸膜痛に関連している（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．他、２０００；ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  Ａ．Ｗ．他、１９６９）。


【国際調査報告】
2006517189.tif 000027
2006517189.tif 000028
2006517189.tif 000029