(57)【要約】アデノウイルスベクター及びそのようなベクターの生産を提供する。特に、アデノウイルスベクターの効率的ターゲッティングのためのファイバーシャフト修飾が提供される。ファイバーシャフト修飾は、他の修飾、例えば、ファイバーノブ及び／又はペントン修飾と、完全に機能破壊された（脱ターゲッティングされた）アデノウイルスベクターを生産するために組み合わせてもよい。脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの増殖のためのスケールアップの方法がまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたアデノウイルスキャプシドタンパク質であって、
その修飾されていないスキャプシドタンパク質は、ヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）に結合し、そして
該修飾されたキャプシドタンパク質は突然変異を含み、それによりヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）への結合が変更されている、修飾されたアデノウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２】
ファィバータンパク質である請求項１記載の修飾されたタンパク質。
【請求項３】
修飾されたファィバータンパク質の結合が、修飾されていないタンパク質に比べて削除されているか又は減少させられている請求項２記載のキャプシドタンパク質。
【請求項４】
修飾されたファィバータンパク質の結合が、修飾されていないタンパク質に比べて削除されているか又は減少させられている請求項２記載の修飾されたタンパク質。
【請求項５】
アミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む請求項３記載の修飾されたタンパク質。
【請求項６】
突然変異がＨＳＰに結合するモチーフを変更し、それによりＨＳＰ相互作用が変更される請求項２記載の修飾されたタンパク質。
【請求項７】
モチーフがＢＢＸＢ又はＢＢＢＸＸＢであって、Ｂは、塩基性アミノ酸でありそしてＸは任意のアミノ酸である、請求項６記載の修飾されたタンパク質。
【請求項８】
モチーフがコンセンサス配列ＫＫＴＫを含む、請求項７記載の修飾されたタンパク質。
【請求項９】
ファィバーが、修飾されたＡｄ５又はＡｄ２ファィバーである、請求項２記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１０】
少なくとも２つの異なるアデノウイルスからのファィバータンパク質の一部を含むキメラファィバータンパク質である請求項２記載の修飾タンパク質であって、
シャフト又はその一部が、第１アデノウイルスからのものであり、それにより、得られるファィバーはＨＳＰに結合しないか、又は修飾されていないファィバータンパク質に比べて減少した親和性でＨＳＰに結合し、
該第１アデノウイルスからのシャフト又はその一部は、ＨＳＰに結合しないか、又は第２アデノウイルスに比べて減少した親和性でＨＳＰに結合し、
第２アデノウイルスはＨＳＰに結合し、そして
該一部は、得られたタンパク質のＨＳＰ結合を変更するのに十分な部分を含む、
請求項２記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１１】
修飾されたファィバータンパク質のＨＳＰへの結合が、修飾されていないタンパク質に比べて削除されているか又は減少させられている、請求項１０記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１２】
ファィバータンパク質の残部は、第２アデノウイルスからのものである、請求項１０記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１３】
更に、ＨＳＰに加えて１つ又はそれ以上の細胞表面タンパク質と得られたファィバーとの相互作用を減少させるか又は削除する１つ又はそれ以上の更なる修飾を含む請求項２、３，１０及び１１のいずれか１項記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１４】
更にリガンドを含み、それにより得られたファィバーは該リガンドの受容体に結合する、請求項１３記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１５】
リガンドがノブ領域に含まれる請求項１４記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１６】
リガンドは挿入されているか又は該リガンドはファィバーの一部と置き換わっており、それにより得られたファィバーは該リガンドの受容体に結合する、請求項１４記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１７】
ＨＳＰに対する親和性が、少なくとも、５倍、１０倍及び１００倍の減少の中から選ばれる量減少させられている、請求項１１記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１８】
第１アデノウイルスがサブグループＢ、Ｄ又はＦからなる群より選ばれ、そして第２アデノウイルスがサブグループＣである、請求項１１記載の修飾されたタンパク質。
【請求項１９】
第１アデノウイルスがＡｄ３、Ａｄ３５、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ４０、Ａｄ４１及びＡｄ４６からなる群より選ばれる、請求項１０記載の修飾されたタンパク質。
【請求項２０】
第２アデノウイルスがＡｄ５又はＡｄ２である、請求項１８記載の修飾されたタンパク質。
【請求項２１】
第２アデノウイルスがＡｄ５又はＡｄ２である、請求項１９記載の修飾されたタンパク質。
【請求項２２】
配列番号５２、５４、５６、５８、６２、６６、７０及び７２のいずれかに記載のアミノ酸の配列、又は
配列番号５２、５４、５６、５８、６２、６６、７０及び７２のいずれかに記載のアミノ酸の配列と９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列、又は
配列番号５２、５４、５６、５８、６２、６６、７０及び７２のいずれかに記載のアミノ酸の配列をコードするヌクレオチドの配列に、高いストリンジェンシーの条件下に少なくともその長さのおよそ７０％にハイブリダイズするヌクレオチドの配列によりコードされたアミノ酸の配列、
を含むファィバータンパク質からなる群より選ばれる、請求項１記載の修飾されたタンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜１２及び１４〜２２のいずれか１項記載の修飾されたタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２４】
請求項１３記載の修飾されたタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２５】
ベクターを含む請求項２３記載の核酸分子。
【請求項２６】
ベクターを含む請求項２４記載の核酸分子。
【請求項２７】
アデノウイルスベクターである請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２８】
アデノウイルスベクターである請求項２６記載の核酸分子。
【請求項２９】
サブグループＢ、Ｃ又はＤのアデノウイルスからのアデノウイルスベクターである、請求項２７記載のベクター。
【請求項３０】
サブグループＢ、Ｃ又はＤのアデノウイルスからのアデノウイルスベクターである、請求項２８記載のベクター。
【請求項３１】
請求項２３記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項３２】
請求項２４記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項３３】
真核細胞である請求項３１記載の細胞。
【請求項３４】
真核細胞である請求項３２記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が真核細胞であり、そして
パッケージング細胞である細胞である、
請求項２７記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項３６】
細胞が真核細胞であり、そして
パッケージング細胞である細胞である、
請求項２８記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項３７】
請求項１〜１２及び１４〜２２のいずれか１項記載の修飾されたタンパク質を含み、それによりＨＳＰへのウイルス粒子の結合が、修飾されていないファィバーを発現する粒子に比べて変更されているアデノウイルス粒子。
【請求項３８】
請求項１３記載の修飾されたタンパク質を含み、それによりＨＳＰへのウイルス粒子の結合が、修飾されていないファィバーを発現する粒子に比べて変更されているアデノウイルス粒子。
【請求項３９】
ファィバーに対する天然の受容体がコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）である、請求項３７記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４０】
キャプシドのＣＡＲ結合領域における突然変異を更に含む、請求項３９記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４１】
キャプシドのαvインテグリン結合領域における突然変異を更に含み、それによりインテグリンへの結合が削除されているか又は減少させられている、請求項３９記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４２】
キャプシドのαvインテグリン結合領域における突然変異を更に含み、それによりインテグリンへの結合が削除されているか又は減少させられている、請求項４０記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４３】
修飾されたキャプシドのＣＡＲ結合領域がファィバーノブにある、請求項３９記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４４】
ファィバーノブ修飾がＡＢループ又はＣＤループにある、請求項４３記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４５】
ファィバーノブ修飾がＫＯ１及びＫＯ１２からなる群より選ばれる、請求項４４記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４６】
アデノウイルスが、サブグループＣ、Ｄ又はＦのアデノウイルスである、請求項３９記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４７】
サブグループＣのウイルスがＡｄ２又はＡｄ５であり、サブグループＤのウイルスがＡｄ６であり、そしてサブグループＦのウイルスがＡｄ４１である、請求項４６記載のアデノウイルス粒子。
【請求項４８】
初期世代アデノウイルスベクター、ガットレスアデノウイルスベクター又は複製条件付きアデノウイルスベクターである、請求項２７記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４９】
初期世代アデノウイルスベクター、ガットレスアデノウイルスベクター又は複製条件付きアデノウイルスベクターである、請求項２８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５０】
複製条件付きアデノウイルスベクターが殺腫瘍アデノウイルスベクターである、請求項４８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５１】
複製条件付きアデノウイルスベクターが殺腫瘍アデノウイルスベクターである、請求項４９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５２】
異種核酸を含む請求項２７記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５３】
異種核酸を含む請求項２８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５４】
異種核酸がポリペプチドをコードする、請求項５２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５５】
異種核酸がポリペプチドをコードする、請求項５３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５６】
異種核酸が調節核酸を含むか又はコードする、請求項５２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５７】
異種核酸が調節核酸を含むか又はコードする、請求項５３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５８】
異種核酸がプロモーター又はＲＮＡを含むか又はコードする、請求項５２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５９】
異種核酸がプロモーター又はＲＮＡを含むか又はコードする、請求項５３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６０】
プロモーターが細胞又は組織特異的プロモーターである、請求項５９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６１】
プロモーターが複製に必須のアデノウイルスの遺伝子に作動可能的に連結されている、請求項５９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６２】
組織特異的プロモーターが腫瘍特異的プロモーターである請求項６０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６３】
ポリペプチドが治療用ポリペプチドである請求項５８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６４】
細胞を請求項５７記載のアデノウイルスベクターで形質導入することを含む、細胞において異種核酸を発現させる方法。
【請求項６５】
細胞が腫瘍細胞であり、
アデノウイルスベクターが殺腫瘍ベクターであり、そして
細胞を殺す、
請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
細胞が哺乳動物の細胞である請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
細胞が霊長類の細胞である請求項６４記載の方法。
【請求項６８】
細胞がヒト細胞である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
肝細胞上のヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰｓ）へのアデノウイルス粒子の結合を減少させるか又は削除することを含む、アデノウイルス粒子による肝細胞の形質導入を減少させる方法。
【請求項７０】
脱ターゲッティングされたアデノウイルス粒子の増殖のためのスケールアップ方法であって、
アデノウイルスベクターを複製し、成熟させそしてパッケージすることができる細胞を、該細胞へのアデノウイルス粒子の侵入を生じさせる試薬の存在下に、脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターで感染させ、
感染させた細胞を、該アデノウイルスベクターの増加、増大及び増殖に適当な条件下に培養し、そして
得られたアデノウイルス粒子を回収する、
ことを含むスケールアップ方法。
【請求項７１】
試薬がポリカチオンである請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
ポリカチオンが、ヘキサジメトリンブロミド、ポリエチレンイミン、プロタミンサルフェート及びポリ−Ｌ−リシンからなる群より選ばれる、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
試薬が、アデノウイルス粒子及び細胞上の受容体に結合する二官能性タンパク質である  請求項７０記載の方法。
【請求項７４】
二官能性タンパク質が、抗ファィバー抗体−リガンド融合体、抗ファィバーＦａｂ−ＦＧＦコンジュゲート、抗ペントン抗体リガンド融合体、抗ヘキソン抗体リガンド融合体及びポリリシン−ペプチド融合体からなる群より選ばれ、リガンドが受容体に結合するリガンドである、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
脱ターゲッティングされたアデノウイルス粒子が修飾されたキャプシドを発現し、それにより少なくとも１つの宿主細胞受容体への結合が野生型アデノウイルスに比べて減少させられているか又は削除されている、請求項７０〜７４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７６】
アデノウイルス粒子が、１つの宿主細胞受容体との結合を削除するか又は減少させるように修飾されている、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
アデノウイルス粒子が、２つの宿主細胞受容体との結合を削除するか又は減少させるように修飾されている、請求項７５記載の方法。
【請求項７８】
アデノウイルス粒子が、３つの宿主細胞受容体との結合を削除するか又は減少させるように修飾されている、請求項７５記載の方法。
【請求項７９】
αvインテグリン、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）及びヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）の１つ又はそれ以上との相互作用を減少させ又は削除する突然変異からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の突然変異により該粒子が修飾されている、請求項７５記載の方法。
【請求項８０】
突然変異が、ＰＤ１、ＫＯ１、ＫＯ１２及びＳ＊からなる群より選ばれる、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
突然変異がファィバーのシャフトにある請求項２記載の修飾されたタンパク質。
【請求項８２】
ＨＳＰに対する親和性が、少なくとも、５倍、１０倍及び１００倍の減少の中から選ばれる量減少させられている、請求項３記載の修飾されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
Stevenson, Susan C., Kaleko, Michael, Smith, Theodore 及びNemerow, Glen Rの「FIBER SHAFT MODIFICATIONS FOR EFFICIENT TARGETING」と題する２００２年１月２４日に出願された米国仮出願第60/350, 388号及びStevenson, Susan C., Kaleko, Michael, Smith, Theodore 及びNemerow, Glen Rの「FIBER SHAFT MODIFICATIONS FOR EFFICIENT TARGETING」と題する２００２年６月２６日に出願された米国仮出願第60/391, 967号に優先権の利益を主張する。この出願はStevenson, Susan C., Kaleko, Michael, Smith, Theodore 及びNemerow, Glen Rの「FIBER SHAFT MODIFICATIONS FOR EFFICIENT TARGETING」と題するこれと同じ日に出願された国際ＰＣＴ出願（代理人整理番号２２９０８−１２３６にも関連する。許される場合には、これらの出願の各々の主題事項は参照により本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般にアデノウイルスベクター及びこのようなベクターの製造の分野に関する。特に脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクター（detargeted adenoviral vectors）が提供される。
【背景技術】
【０００３】
すべてではないとしても、大抵のアデノウイルスベクター媒介遺伝子治療ストラテジーは特定の組織、例えば腫瘍又は器官に形質導入することを目的とする。全身的送達には正常なウイルストロピズム（tropism）の機能破壊（ablation）及び新規な特異性の付加を必要とするであろう。アデノウイルス粒子と宿主細胞間の多数の相互作用が効率的な細胞侵入を促進するのに必要である（Nemerow(2000)Virology 274: 1〜4）。アデノウイルス侵入経路は２つの別々の細胞表面イベントを包含すると考えられる。第１には、アデノウイルスファイバーノブ（adenoviral fiber knob）とコクサッキー−アデノウイルス受容体(coxsackie-adenovirus receptor)(ＣＡＲ)との間の高いアフィニティーの相互作用が細胞表面へのアデノウイルス粒子の結合を媒介する。共受容体として作用する細胞表面インテグリンαvβ3及びαvβ5とペントンのその後の結合はウイルスの内部化を助長する。グループＢ（例えば、Ａｄ３）及びグループＣ（例えば、Ａｄ５）アデノウイルスと相互作用する複数のアデノウイルスのファイバー受容体がある。これらのグループのアデノウイルスの両方とも内部化のためにインテグリンとの相互作用を必要とすると思われる。しかしながら、ＣＡＲ機能破壊は、インビボ（in vivo）のアデノウイルスベクターの生物的分布（biodistribution）及び毒性を変化させない。（Alemany et al.(2001)Gene Therapy3: 1347〜1353、２００１年５月３０日に出願されそして米国公開出願番号20020137213として公開された米国特許出願番号09/870, 203）。かくして、インビボ遺伝子導入のためのＣＡＲ相互作用の役割は明らかでない。最近公表された研究は矛盾する結果を記載している（Alemany et al.(2001)Gene Therapy3: 1347〜1353、Leissner et al.(2001)Gene Therapy 8: 49〜57、Einfeld et al.(2001)J.Virology75: 11284〜11291）。例えば、Ａｄ５ファィバーＡＢループにおけるＳ４０８Ｅ突然変異を含有するベクターは、培養中の細胞に対して非常に減少した形質導入効率を有するにもかかわらず、マウスにおける効率的な肝臓形質導入を生じさせることが示された。（Leissner et al.(2001)Gene Therapy 8: 49〜57）。対照的に、より広範なファイバーＡＢループ突然変異を含有するベクターは、肝臓遺伝子発現において１０倍の減少を示した（Einfeld et al.(2001)J.Virology75: 11284〜11291）。
【０００４】
二重に機能破壊された（doubly ablated）アデノウイルスが、ファイバーループのＣＡＲ結合領域及びペントンベース（penton base）のインテグリン結合領域を修飾することにより調製された（Einfeld et al.(2001)J.Virology75: 11284〜11291）。ＣＡＲ及びインテグリン相互作用を欠いているこの二重に機能破壊されたアデノウイルスは、種々の細胞型のインビトロ（in vitro）形質導入を欠いているのみならず肝臓細胞のインビボ形質導入も欠いていることが報告された。特に、二重に機能破壊されたアデノウイルスは、機能破壊されていないアデノウイルスに比べて肝臓形質導入が７００倍減少することが報告された。しかしながら、これらの結果は他の人によって再現されていない。
【０００５】
多くの用途で、最も臨床的に有用なアデノウイルスベクターは、全身系に、例えば、末梢静脈に送達可能でありそして身体の所望の場所にターゲッティングされ、そして他の場所へのターゲッティングから生じる望ましくない副作用を持たないであろう。インビボでのアデノウイルスベクターターゲッティングは遺伝子治療における主要な目標でありそしてこの目標を達成するためのストラテジーを開発するのに相当な努力が集中された。成功したターゲッティングストラテジーとは完全なベクターの投与量を適当な部位に方向付けそして、より低い、毒性の少ないベクター投与量の使用を可能にすることでベクターの安全プロファイルを改良し、これにより潜在的に免疫原性をより少なくすることもできるであろう。かくして、再方向付けされるアデノウイルスを製造するための基礎ベクターとして使用するためにインビボで完全に脱ターゲッティングされる（detargeted）アデノウイルスを開発する必要がある。
【０００６】
それ故、本発明の目的は中でも特に完全に脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクター、その製造方法及びその使用を提供することである。
【０００７】
要約
脱ターゲッティングされた及び完全に脱ターゲッティングされたアデノウイルス粒子、このような粒子を産生するアデノウイルスベクター、該ベクター及び粒子の製造方法及び該ベクター及び粒子の使用が提供される。キャプシド修飾、例えばファイバーシャフト（fiber shaft）修飾、及び、アデノウイルス粒子上に発現されるときにアデノウイルスベクターの脱ターゲッティングを与える、その結果により生じるタンパク質が提供されそして記載される。キャプシド修飾、例えば、ファイバーシャフト修飾は、ファイバーノブ（fiber knob）及び／又はペントン修飾の如き他の修飾と組み合わせて、完全に機能破壊された（脱ターゲッティングされた）アデノウイルス粒子を産生させることができる。かくして、キャプシドタンパク質、特にファィバーシャフト領域の修飾（１つ又は複数）により天然のトロピズムが機能破壊されているアデノウイルスベクター及びアデノウイルス粒子が提供される。
【０００８】
かくして、特定の受容体への結合を機能破壊するファィバーシャフト修飾を含み、それによりこのような修飾を有するキャプシドを含有するアデノウイルスベクターの効率的なターゲッティングを可能とするキャプシド突然変異が提供される。例えば、ファィバーシャフトのＨＳＰとの相互作用が特にインビボで機能破壊されている（減少されるか又は実質的に削除されている）アデノウイルスベクターが提供される。これらのファィバーシャフト修飾は、他の修飾、例えばファィバーノブ及び／又はペントン修飾と組み合わせて完全に機能破壊された（脱ターゲッティングされた）アデノウイルスベクターを産生することができる。脱ターゲッティングされたベクター及び粒子の選ばれた細胞及び／又は組織へのターゲッティングを与えるためのリガンド（１つ又は複数）を含む再ターゲッティングされた（retargeted）ベクター及び粒子も提供される。再ターゲッティングは、例えば、ファイバータンパク質を操作して特定の細胞型に対する受容体特異性を再方向付けすることにより行うことができる。
【０００９】
修飾されたファイバータンパク質及び修飾されたペントンタンパク質をコードする核酸も提供される。ＨＳＰ結合を機能破壊した修飾されたファィバーシャフトタンパク質及びそれと他の修飾されたファィバー領域又は他のタンパク質、例えば修飾されたファィバーノブ領域及び／又は修飾されたペントンタンパク質との組み合わせをコードする核酸も提供される。該核酸は、異種核酸配列、例えばプロモーター、又はポリペプチドをコードする核酸配列を含有することもできる。このようなシャフト修飾及び他の修飾を含有するファィバーを発現するウイルス粒子も提供される。
【００１０】
修飾されたファィバー及び修飾されたファィバーと修飾されたペントンとの組み合わせを発現するアデノウイルス粒子を作製する方法及び使用する方法も提供される。特にファィバーノブ修飾及びペントン修飾と組み合わせたファィバーシャフト修飾により、アデノウイルス粒子はそれらの自然の細胞受容体(１つ又は複数)への結合について機能破壊される、即ち、それらは脱ターゲッティングされる。次いでそれらはウイルスキャプシドへのリガンドの付加により特定の細胞型に再ターゲッティングされることができ、これはウイルスがこのような細胞に結合しそして感染することを引き起こす。リガンドは、例えば、キャプシドタンパク質遺伝子の遺伝子修飾により付加させることができる。
【００１１】
アデノウイルス媒介治療における肝臓毒性を減少させるための方法も提供される。Einfel et al（Einfeld et al.(2001)J.Virology 75: 11284〜11291）の結果とは対照的に、ＣＡＲ及びインテグリン相互作用を欠いている二重に機能破壊されたアデノウイルスはインビボで肝臓形質導入することができることが本発明では示される。肝臓形質導入の機能破壊は更なる及び／又は別の修飾（１つ又は複数）を必要とすることが本発明では示される。アデノウイルス媒介治療において肝臓毒性を減少させるための方法は、アデノウイルスベクターを修飾してインビボで肝臓細胞に対する天然のトロピズムを機能破壊することを含む。このようなベクターは検被体に投与することができる。修飾は本発明で記載された修飾を含む。
【００１２】
核酸、タンパク質、アデノウイルス粒子及びアデノウイルスベクターは種々の用途を有する。これらは、遺伝子治療を含む治療目的並びに細胞表面受容体の同定及び研究のため及び細胞とウイルス相互作用の様式の同定のために核酸を特定の細胞及び組織にターゲッティングするためのインビボ及びインビトロでの使用を含む。
【００１３】
特に、ＨＳＰ（ヘパリンサルフェートプロテオグリカン、ヘパリンサルフェートグリコサミノグリカンとも呼ばれる）とウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーシャフト修飾が提供される。これらの修飾は、ＨＳＰと相互作用するファィバーシャフトにおける個々のアミノ酸の突然変異又はＨＳＰ結合モチーフのＨＳＰと相互作用する能力を修飾するファィバーシャフトにおけるアミノ酸の突然変異を含む。アデノウイルスファィバーシャフト修飾は、例えば、ＨＳＰ結合部位を含有しないＡｄ３、Ａｄ３５及びＡｄ４１短ファィバーシャフトの如きアデノウイルスのファィバーシャフトを使用するファィバーシャフトの置換も含む。
【００１４】
ＣＡＲとウイルスの相互作用を機能破壊するファィバーノブ修飾と組み合わせた上記のごときＨＳＰとウイルスの相互作用を変える、特に機能破壊するアデノウイルスファィバーシャフト修飾も提供される。ファィバーノブ修飾は、（ａ）ＣＡＲと相互作用するファィバーループ（fiber loop）における個々のアミノ酸の突然変異、例えば、ＡＢ又はＣＤループ修飾、（ｂ）ＣＡＲ結合モチーフのＣＡＲと相互作用する能力を修飾するファィバーループにおける個々のアミノ酸の突然変異及び（ｃ）ＣＡＲと相互作用しないアデノウイルスを使用するファィバーノブの置換、例えば、Ａｄ３ファィバーノブ、Ａｄ４１短ファィバーノブ又はＡｄ３５ファィバーノブの置換を含む。
【００１５】
ａvインテグリンとウイルスの相互作用を機能破壊するペントン修飾と組み合わせた上記した如きアデノウイルスファィバーシャフト修飾も提供される。ペントン修飾は（ａ）αvインテグリンと相互作用する個々のアミノ酸の突然変異、（ｂ）αvインテグリン結合モチーフのαvインテグリンと相互作用する能力を修飾する個々のアミノ酸の突然変異及び（ｃ）αvインテグリンと相互作用しないアデノウイルスからのペントンタンパク質を使用するペントンタンパク質の置換を含む。
【００１６】
上記した如きファィバーノブ修飾及び上記した如きペントン修飾と組み合わせた上記した如きアデノウイルスファィバーシャフト修飾も提供される。
【００１７】
脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの増殖のためのスケールアップ方法も提供される。この方法は、組織培養培地に加えられるときアデノウイルス粒子のプロデューサー（producer）細胞への侵入を生じさせるポリカチオン及び／又は二官能性試薬を使用する。
【００１８】
ヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）への結合が修飾されていないキャプシドタンパク質を含有する粒子に比べて減少させられているか又は削除されている修飾されたキャプシドタンパク質を含有する組み換えウイルス粒子が提供される。修飾されたキャプシドタンパク質は、ＨＳＰへの結合が減少させられるか又は削除されるように修飾されたシャフトを有するファィバータンパク質を含む。
【００１９】
特定の態様の中でも特に下記のものが提供される。インビボ及び／又はインビトロでのヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）への結合又はヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）との相互作用を変える、典型的には減少又は削除するように修飾されているアデノウイルスキャプシドタンパク質が提供される。ＨＳＰｓは、肝細胞を含む種々の細胞上に発現される。ＨＰＳｓは肝細胞の如き細胞の形質導入を与えるか又は形質導入に関与することが本発明では示される。このような形質導入を削除するか又は減少させるのが望ましいことがありうるので、キャプシドタンパク質、例えばファイバータンパク質の修飾は、このような細胞からのこのようなタンパク質を発現する粒子の脱ターゲッティングを可能とする。
【００２０】
かくして、突然変異、例えば、アミノ酸の挿入、欠失、変更、置換又はそれらの組み合わせを含み、それによりヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）への結合又はヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）との相互作用が変更されている修飾されたアデノウイルスファィバータンパク質が提供される。特に、修飾されたファィバータンパク質のｈｅ結合は、修飾されていないタンパク質に比べて削除され又は減少させられている。これらの突然変異の例はファィバーのシャフトにおける突然変異であり、この場合にシャフトはテイル（tail）も含むことができる。突然変異は、ＨＳＰに対するファィバータンパク質のＨＳＰに対するアフィニティーを減少させるか又は変更させることができ、実質的にそれを削除することを含んで、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍以上減少させる。
【００２１】
本発明で与えられたとおり、ＨＳＰと相互作用するアデノウイルスからのファィバーは、モチーフ、例えば、ＢＢＸＢ又はＢＢＢＸＸＢ（ここでＢは塩基性アミノ酸でありそしてＸは任意のアミノ酸である）、特にＡｄ５及びＡｄ２におけるコンセンサス配列ＫＫＴＫを含むことができる。かくして、ＨＳＰとの相互作用を削除するか減少させるようにモチーフが変更されているファィバーが提供される。
【００２２】
ファィバーシャフト（又はファィバーシャフト及びテイル）がＨＳＰと相互作用しないファィバー、例えばＡｄ３、Ａｄ３５、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ４０、Ａｄ４１又はＡｄ４６ファィバー由来のものでありそして相互作用するファィバー、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２ファィバーと組み合わされてＨＳＰへの結合が減少又は削除されている完全なファィバーを形成しているキメラである請求項１の修飾されたファィバータンパク質も提供される。
【００２３】
本発明で提供される修飾されたキャプシドタンパク質のすべては、ＨＳＰに加えて、１つ又はそれ以上の細胞表面タンパク質、例えばＣＡＲ及びαvインテグリン又は特定の天然のファィバーが結合する他の受容体（それらに限定はされない）と得られたファィバーとの相互作用を減少させるか又は削除する１つ又はそれ以上の更なる修飾も含むこともできる。これらの修飾は、ＣＡＲ結合を減少させるか又は削除するファィバーに対する修飾及びαvインテグリン結合を減少させるか又は削除するペントンに対する修飾を含むが、それらに限定はされない。突然変異はファィバーノブ、シャフト、テイル及びシャフトにあることができ、そしてペントンにあることもできる。
【００２４】
本発明で提供される修飾されたキャプシドタンパク質のいずれか及びすべては、特定の受容体に結合するリガンドを更に含むことができ、それによりファィバー（又は他のキャプシドタンパク質）に結合特異性又はこのような受容体と相互作用する能力を付与することができる。リガンドは、挿入又は置換の如く、キャプシドタンパク質の任意の適当な部位に挿入することができる。例えば、ノブ領域にリガンドが挿入されたファィバーが例示される。いかなるこのようなリガンドも使用することができそして様々なものが本発明で例示される。
【００２５】
種々の修飾されたキャプシドタンパク質が本発明で例示される。これらは、配列番号５２、５４、５６、５８、６２、６６、７０及び７２のいずれかに記載されたアミノ酸の配列、又は配列番号５２、５４、５６、５８、６２、６６、７０及び７２のいずれかに記載のアミノ酸の配列との６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれより多くの配列同一性を有するアミノ酸の配列、又は配列番号５２、５４、５６、５８、６２、６６、７０及び７２のいずれかに記載のアミノ酸の配列をコードするヌクレオチドの配列に、高いストリンジェンシーの条件下に少なくともその長さのおよそ７０％にハイブリダイズするヌクレオチドの配列によりコードされたアミノ酸の配列を含有するファィバーを含むが、それらに限定はされない。
【００２６】
ファィバーを含むキャプシドタンパク質をコードする核酸も提供される。核酸はベクターとして、特にアデノウイルスベクターとして提供されうる。多くのアデノウイルスベクターが知られておりそして本発明の説明に従って必要に応じて修飾することができる。アデノウイルスベクターは、初期世代アデノウイルスベクター（early generation adenoviral vectors）、例えば、Ｅ１欠失ベクター、ガットレスアデノウイルスベクター（gutless adenoviral vectors）及び複製条件付アデノウイルスベクター（replication-conditional adenoviral vectors）、例えば、殺腫瘍アデノウイルスベクターを含むが、それらに限定はされない。アデノウイルスベクターは、治療産物の如き産物をコードするか又は与える異種核酸を含むこともできる。いかなる治療産物も意図されそして種々のものが例示として本発明に記載される。異種核酸はポリペプチドをコードすることができるか、あるいは調節配列、例えば、プロモーター又はＲＮＡ（このＲＮＡはＲＮＡｉ、低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ）、他の２本鎖ＲＮＡｓ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムを含む）を含むか又はコードすることができる。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター及び調節的プロモーター及び組織特異的プロモーターを含み、組織特異的プロモーターは腫瘍特異的プロモーターを含む。プロモーターは、例えば、複製のために必須のアデノウイルスの遺伝子に作動可能的に連結されることができる。
【００２７】
核酸分子を含有する細胞及びベクターを含有する細胞も提供される。このような細胞はパッケージング細胞を含む。細胞は原核細胞又は真核細胞であることができ、真核細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を含む霊長類細胞を含む。
【００２８】
本発明で提供される修飾されたキャプシドタンパク質を含有するアデノウイルス粒子も提供される。粒子は、修飾されたキャプシドタンパク質を含有しない粒子と比べてＨＳＰとの相互作用又は結合を変更している。ＨＳＰへの結合が変更されたこと、典型的には結合が減少又は削除されたことに加えて、粒子は、上記した如き他の受容体との相互作用が変更されたキャプシドタンパク質の如き、更なる修飾を含むことができる。特に粒子は、典型的にはＣＡＲ、αvインテグリン及び／又は他の受容体との相互作用を変更させられ、典型的には減少させられ又は削除されることができる。突然変異は、ファィバーノブ、ペントン及びヘキソンにおける突然変異を含む。例示的ファィバーノブ突然変異は、本発明で説明されるＫＯ１又はＫＯ１２の如きＡＢループ又はＣＤループにおける突然変異である。更に、粒子は、選ばれた受容体に再ターゲッティングするための追加のリガンドを含むことができる。アデノウイルス粒子はいかなる血清型又はサブグループからのものであってもよい。
【００２９】
細胞内で異種核酸を発現するための方法が提供される。これらの方法では、本発明で提供されるアデノウイルスベクターが細胞に形質導入されて核酸及び／又はコードされた産物を送達する。形質導入は、インビボ又はインビトロ又はエキソビボ（ex vivo）で行うことができ、そして遺伝子発現及び遺伝子治療の研究を含む種々の目的のためであることができる。細胞は原核細胞であることができるが、典型的には真核細胞であり、この真核細胞は哺乳動物細胞、例えばヒトを含む霊長類の細胞を含む。細胞は特定のタイプであることができ，例えば腫瘍細胞又は特定の組織の細胞であることができる。ベクターは腫瘍細胞を殺すための殺腫瘍ベクターであることができる。
【００３０】
本発明の修飾されたキャプシドタンパク質はＨＳＰへの結合を減少させられ又は削除されているので、このようなタンパク質を含有するウイルス粒子はインビトロ及びインビボでＨＳＰへの結合が機能破壊されていることを示す。かくして、キャプシドタンパク質、例えばファィバーを修飾してＨＳＰとの相互作用又ＨＳＰへの結合を削除するか又は減少させることにより、ＨＳＰを発現する細胞、例えば肝臓の肝細胞の形質導入を減少させる方法が提供される。このような減少は、肝細胞を含む、ＨＳＰを発現する細胞の形質導入を減少させるか又は削除する。
【００３１】
脱ターゲッティングされたアデノウイルス粒子、例えば本発明で提供される脱ターゲッティングされたアデノウイルス粒子の増殖のためのスケーアップ方法も提供される。この方法は、アデノウイルスベクターを複製し、成熟させそしてパッケージングすることができる細胞を、アデノウイルス粒子を細胞に侵入させる試薬、例えばポリカチオン及び／又は二官能性タンパク質又は他のこのような試薬の存在下に、脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターで感染させるか又は形質導入させ、そして感染した細胞を、アデノウイルスベクターの増加、増大及び増殖に適切な条件下に培養する工程を含む。得られるアデノウイルス粒子を回収することができる。ポリカチオンはヘキサジメトリンブロミド、ポリエチレンイミン、プロタミンサルフェート及びポリ−Ｌ−リシンを含むが、これらに限定はされない。二官能性タンパク質は、抗ファィバー抗体−リガンド融合体、抗ファィバーＦａｂ−ＦＧＦコンジュゲート、抗ペントン抗体リガンド融合体、抗ヘキソン抗体リガンド融合体及びポリリシン−ペプチド融合体を含むが、これらに限定はされない。リガンドは特定の受容体に結合するように選ばれる。
【００３２】
本発明で提供される修飾されたキャプシドを発現するウイルス粒子はこの方法により産生することができる。修飾は、例えば、αvインテグリン、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）及びヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）の１種又はそれより多くとの相互作用を減少させるか又は削除する突然変異から選ばれる１種又はそれより多くの突然変異を含む。このような突然変異は、例えば、ＰＤ１、ＫＯ１、ＫＯ１２及びＳ＊を含む。
【００３３】
詳しい説明
Ａ．定義
特記しない限り、本発明で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により普通に理解されるとおりの同じ意味を有する。本発明の開示の全体にわたり言及されたすべての特許、特許出願、公開された出願及び刊行物、ジェンバンク（Genbank）配列、ウエブサイト及び他の公表された資料は、特記しない限り、そのまま参照により組み込まれる。本発明での用語について複数の意味がある場合には、この節での定義が支配的である。ＵＲＬ又は他のこのような識別子（identifier）又はアドレスが参照される場合には、このような識別子は変わることができそしてインターネット上の特定の情報は現れてはすぐ消えたりするが、例えばインターネット及び／又は適当なデータベースをサーチすることにより、同等の情報が知られそして容易にアクセスされうることが理解される。それに参照がこのような情報の利用可能性及び公的普及を証明する。
【００３４】
本発明で使用された、「アデノウイルス」又は「アデノウイルス粒子」という用語は、ヒト又は動物に感染するいかなるアデノウイルスも含み、すべてのグループ、サブグループ及び血清型を含む、アデノウイルスとして分類されうるいかなる及びすべてのウイルスを含むように使用される。状況に依存して、「アデノウイルス」という表現はアデノウイルスベクターを含むことができる。いくつかのサブグループに分類される少なくとも５１の血清型のアデノウイルスがある。例えば、サブグループＡはアデノウイルス血清型１２、１８及び３１を含む。サブグループＣはアデノウイルス血清型１、２、５及び６を含む。サブグループＤはアデノウイルス血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、及び４２〜４９を含む。サブグループＥはアデノウイルス血清型４を含む。サブグループＦはアデノウイルス血清型４０及び４１を含む。これらの後者の２つの血清型は長いファィバータンパク質及び短いファィバータンパク質を有する。かくして、本発明で使用される、アデノウイルス又はアデノウイルス粒子はパッケージされたベクター又はゲノムである。
【００３５】
本発明で使用された、「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」及び「ビリオン」は、感染性ウイルス粒子であって、例えばこのような粒子を発生させるためにウイルスゲノムのすべてまたは一部を含有するベクターが適当な細胞又は細胞株に形質導入されるとき、形成される感染性ウイルス粒子を表すのに相互に交換可能に使用される。得られるウイルス粒子は種々の用途を有し、これらの用途はインビトロ又はインビボのいずれかで細胞に核酸を導入することを含むが、これに限定はされない。本発明の目的では、ウイルスは、アデノウイルスベクター、例えば本発明で提供されるいずれかがアデノウイルスキャプシドに被包されるときに形成される組換えアデノウイルスを含むアデノウイルスである。かくして、ウイルス粒子はパッケージングされたウイルスゲノムである。アデノウイルス粒子はウイルスの最小の構造単位又は機能単位である。ウイルスは、単一粒子、粒子のストック又はウイルスゲノムを表すことができる。アデノウイルス（Ａｄ）粒子は相対的に複雑でありそして種々のサブ構造に分解することができる。
【００３６】
アデノウイルス又はアデノウイルス粒子に含まれるのは、すべてのグループ、サブグループ及び血清型を含むヒト又は動物に感染するいかなるアデノウイルスも含むアデノウイルスとして分類されうるいずれかの及びすべてのウイルスである。かくして、本発明で使用される、「アデノウイルス」及び「アデノウイルス粒子」は、ウイルス自体及びその誘導体を表わし、そして特記する場合を除いては、すべての血清型及びサブタイプ及び自然に存在する形態及び組換え形態を包含する。ヒト細胞に感染するアデノウイルスが含まれる。アデノウイルスは野生型であることができ又は当該技術分野で知られているか又は本発明で開示された種々の方法で修飾されうる。このような修飾は、感染性ウイルスを産生するために粒子にパッケージされているアデノウイルスゲノムに対する修飾を含むが、それらに限定はされない。例示的修飾は、当該技術分野で知られている欠失、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３又はＥ４コード領域の１つ又はそれより多くの領域における欠失を含む。他の例示的修飾は、アデノウイルスゲノムのコード領域のすべての欠失を含む。このようなアデノウイルスは「ガットレス」アデノウイルス（“gutless” adenoviruses）として知られている。この用語は、或るタイプの細胞又は組織では優先的に複製するが、他のタイプにおいてはより少ない程度に複製するか又は全然複製しないウイルスである複製条件付アデノウイルスも含む。例えば、本発明で提供されるアデノウイルス粒子はなかでも特に、異常に増殖する組織、例えば固形腫瘍及び他の新生物（neoplasms）において複製するアデノウイルス粒子である。これらは米国特許番号5, 998, 205及び米国特許番号5, 801, 029に開示されたウイルスを含む。このようなウイルスは時には「細胞溶解」又は「細胞変性」ウイルス（又はベクター）と呼ばれ、そしてもしそれらが新生物細胞に対してこのような効果を有するならば、「殺腫瘍」ウイルス（又はベクター）と呼ばれる。
【００３７】
本発明で使用された、「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」及び「ベクター構築物」という用語は、当業者により理解されているとおり、遺伝子導入のために使用することができるいかなる核酸構築物も意味するように本発明で相互に交換可能に使用される。
【００３８】
本発明で使用された、「ウイルスベクター」という用語は、その技術分野で認められた意味に従って使用される。それは、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含みそしてウイルスベクター粒子にパッケージされうる核酸ベクター構築物を表す。ウイルスベクター粒子は、インビトロ又はインビボのいずれかでＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の核酸を細胞に導入する目的で使用することができる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、パピローマウイルスベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、シンドビスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター（semliki forest virus vectors）、ファージベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むが、それらに限定はされない。適切なウイルスベクターは、例えば、米国特許番号6, 057, 155、5, 543, 328及び5, 756, 086に記載されている。本発明で提供されるベクターはアデノウイルスベクターである。
【００３９】
本発明で使用された「アデノウイルスベクター」（adenovirus vector）及び「アデノウイルスベクター」（adenoviral vector）は相互に交換可能に使用されそしてアデノウイルスゲノムのすべて又は一部を含有するポリヌクレオチドを意味することが当該技術分野で十分に理解されている。アデノウイルスベクターは、完全なゲノム又は修飾されたゲノム又は、細胞に導入されるとき、特に粒子としてパッケージされるとき異種核酸を導入するのに使用することができるゲノムをコードする核酸を表す。アデノウイルスベクターは、裸のＤＮＡ、アデノウイルスキャプシドに被包されたＤＮＡ、他のウイルス又はウイルス様形態（例えば、ヘルペスシンプレックス及びＡＡＶ）にパッケージされたＤＮＡ、リポソームに被包されたＤＮＡ、ポリリシンと複合体を形成したＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体を形成したＤＮＡ、トランスフェリンとコンジュゲートした（conjugated）ＤＮＡ、免疫学的に分子を「マスクする」ため及び／又は半減期を増加させるためにＰＥＧの如き化合物と複合体を形成したＤＮＡ、又は非ウイルスタンパク質にコンジュゲートしたＤＮＡを含むが、それらに限定はされないいくつかの形態のいずれかにあることができる。
【００４０】
本発明で使用された、殺腫瘍アデノウイルスは腫瘍細胞において選択的に複製するアデノウイルスを表す。
【００４１】
本発明で使用された、種々の要求及び目的を持った種々のベクターが記載されている。例えば、１つのベクターは、染色体への安定な組込みのために特定の核酸分子をパッケージング細胞株に送達するのに使用される。これらのタイプのベクターは、相補性プラスミド（complementing plasmids）とも呼ばれる。更なるタイプのベクターはウイルスベクターを増殖させる目的で細胞株（例えば、パッケージング細胞株）において又は細胞株に核酸分子を運ぶか又は送達する。ゆえに、これらのベクターは本発明では送達プラスミドと呼ばれることもある。第三のタイプのベクターは、ウイルス核酸を被包するウイルス粒子の形態にありそして本発明で提供される如き修飾されたキャプシドを含んでなるベクターである。このようなベクターは、特定のポリペプチド、例えば、治療を必要とする検被体の特定の細胞又は細胞型に対する治療ポリペプチド又は調節タンパク質又は調節配列をコードしている異種核酸を含有することもできる。
【００４２】
本発明で使用された、「モチーフ」という用語は、特定の機能と関連した、不変のもしくは保存されている或る位置に隣接しているか又は整列することができる、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の組を表すのに使用される。モチーフは一次配列によってのみならず三次元折りたたみの結果としても生じうる。例えば、モチーフＧＸＧＸＸＧはヌクレオチド結合部位と関連している。このファィバーにおいては３量体であり、ゆえに、３量体構造がモチーフの形成に寄与することができる。あるいは、モチーフはタンパク質のドメインとみなすことができ、この場合に、ドメインは、例えば、受容体に結合するタンパク質分子の一部として、分子サブ構造の知識及び分子サブ構造との関係なしに、機能に基づいて境界を定められたタンパク質分子の領域である。本発明で示された、モチーフＫＫＴＫはＨＳＰとファィバーシャフトの相互作用のためのコンセンサス配列を構成する。
【００４３】
本発明で使用された、「結合する」又は「結合」は、１０−２〜１０−１５モル／ｌ、一般に１０-6〜１０-15、１０-7〜１０-15、典型的には、１０-8〜１０-15の範囲のＫｄ（及び／又は１０5〜１０12、１０7〜１０12、１０8〜１０12ｌ／モルのＫa）を有する、リガンドとその受容体との結合、例えば、Ａｄ５シャフトモチーフとＨＳＰ（ヘパリンサルフェートプロテオグリカン）との結合を表すのに使用される。
【００４４】
本発明で使用された特異的結合又は選択的結合は、特定のリガンドと１つの受容体の結合において相互作用（Ｋa又はＫeq）が他の受容体に対するよりも少なくとも２倍、一般に５、１０、５０、１００倍以上大きいことを意味する。特定のウイルスベクターが細胞又は組織にターゲッティングされているという記述は、宿主における又はインビトロでのこのような細胞又は組織に対するその親和性が、宿主において又はインビトロ条件下に他の細胞及び組織に対するよりも少なくとも約２倍、一般に５、１０、５０、１００倍以上大きいことを意味する。
【００４５】
本発明で使用された、「機能破壊する」又は「機能破壊された」という用語は、特定の細胞受容体に結合する能力が、対応する野生型アデノウイルスに比べて、減少させられるか又は削除されている、一般に実質的に削除されている（即ち、１０倍より多く、１００倍以上減少している）アデノウイルス、アデノウイルスベクター又はアデノウイルス粒子を表すのに使用される。機能破壊されたアデノウイルス、アデノウイルスベクター又はアデノウイルス粒子は、脱ターゲッティングされているとも言われる。即ち、修飾されたアデノウイルス、アデノウイルスベクター又はアデノウイルス粒子は野生型アデノウイルスの天然のトロピズムを持っていない。対応する野生型ファィバータンパク質及び／又は野生型ペントンタンパク質と比べて、突然変異されたアデノウイルスファィバータンパク質及び／又は突然変異されたアデノウイルスペントンタンパク質の細胞受容体に結合する能力の減少又は削除は、細胞受容体を有する細胞について、野生型ファィバータンパク質及び／又は野生型ペントンタンパク質を含有するアデノウイルス粒子に比べて突然変異されたファィバータンパク質及び／又は突然変異されたペントンタンパク質を含有するアデノウイルス粒子の形質導入効率（遺伝子導入及びマーカー遺伝子の発現）を比較することにより測定又は評価することができる。
【００４６】
本発明で使用された、アデノウイルスに関するトロピズムは、キャプシドタンパク質、例えば、ファィバータンパク質及び／又はペントンにより粒子に与えられる選択的感染性又は結合を表す。
【００４７】
本発明で使用された、「ペントン」又は「ペントン複合体」は、本発明ではペントンベース（Penton base）とファィバーの複合体を示すのに使用される。「ペントン」という用語はペントンベース及びペントン複合体を示すのに使用することもできる。「ペントン」単独の用語の意味はそれが使用されている状況から明らかとなるべきである。
【００４８】
本発明で使用される「実質的に削除された」という用語は、ＨｅＬａ細胞に対する野生型ファィバー含有ウイルスの形質導入効率の約１１％未満の形質導入効率を表す。ＨｅＬａ細胞に対する形質導入効率は測定することができる（例えば、２００１年５月３０日に出願され、そして米国公開出願番号20020137213として公開された米国特許出願シリアル番号09/870,203及び２００１年６月１日に出願された国際特許出願番号PCT/EP01/06286の実施例１参照）。簡単に言えば、ＨｅＬａ細胞を突然変異されたファィバータンパク質を含有するアデノウイルスベクターで感染させて、ＣＡＲ相互作用に対するファィバーアミノ酸突然変異の効果及びその後の遺伝子発現を評価する。１２ウエルのディッシュ中のＨｅＬａ細胞の単層を、例えば２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ０．３５mlの全容量において、例えば１０００粒子／細胞にて３７℃で２時間感染させる。次いで感染培地を単層から吸引し、そして１ウエルにつき１０％ＦＢＳを含有する完全ＤＭＥＭ１mlを加えた。細胞をβ−ガラクトシダーゼ発現を可能とするのに十分な時間、一般に約２４時間インキュベーションする。β−ガラクトシダーゼ発現は、化学発光レポーターアッセイ及び発色性基質による組織化学的染色により測定される。β−ガラクトシダーゼ活性の相対的レベルは適当なシステム，例えば、Galacto-Light化学発光レポーターアッセイシステム（Tropix、Bedford、Mass.）を使用して決定される。細胞単層をＰＢＳで洗浄しそして製造者のプロトコールに従って処理する。細胞ホモジェネートを微小分離管（microfuge tube）に移しそして遠心して細胞残がいを除去する。例えば、アッセイ標準としてウシ血清アルブミンを用いてビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Pierce, Inc., Rockford, III）を使用することにより、全タンパク質濃度を決定する。次いで等分小分けした各サンプルを９６ウエルプレート中でＴｒｏｐｉｘ  β−ガラクトシダーゼ基質と共に４５分間インキュベーションする。ルミノメーターを使用して、サンプルにより放出された相対光単位（ＲＬＵ）を決定し、次いで各サンプルにおける全タンパク質の量に対して正規化する（ＲＬＵ／ｕｇ全タンパク質）。組織化学的染色方法のために、細胞単層をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定し、次いでＰＢＳ０．５ml中のml当り１mgの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、５mMのフェロシアン化カリウム、５mMのフェリシアン化カリウム及び２mMのＭｇＣｌ2、の混合物と共にインキュベーションした。単層をＰＢＳで洗浄しそして青色細胞を、例えば、Ｚｅｉｓｓ  ＩＤ０３光学顕微鏡を用いて光学顕微鏡法により可視化する。一般に、効率は約９％未満でありそして典型的には約８％未満である。
【００４９】
本発明で使用された、「減少させる」又は「減少」という語句は、ＨｅＬａ細胞において、野生型ファィバーを含有するアデノウイルスに比べて突然変異されたファィバーを含有するアデノウイルスによる形質導入の効率が野生型の約７５％以下のレベルに変化することを表す。一般に、効率の変化は野生型の約６５％以下のレベルになる。典型的には、それは約５５％以下である。このシステムは、修飾されたファィバータンパク質及び／又は修飾されたペントンタンパク質をウイルス粒子の状況において所望のトロピズムについて迅速に分析することができる。
【００５０】
本発明で使用された、「突然変異させる」又は「突然変異」という用語又は同様な用語は、ＨＳＰと相互作用するファィバーシャフト領域の一部の少なくとも１個のアミノ酸の欠失、挿入又は変更を表す。アミノ酸は、置換により、又はアミノ酸を誘導体化する方法による修飾により変えることができる。かくして、例えば、アデノウイルスにおけるＢＢＸＢ又はＢＢＢＸＸＢモチーフ（ここでＢは塩基性アミノ酸である）を突然変異させてＨＳＰとウイルスの相互作用を機能破壊する。
【００５１】
本発明で使用された、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドをコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。該分子は調節配列を含むことができ、そして一般にＤＮＡである。このようなポリヌクレオチドは、本発明に含まれた教示と組み合わせて当業者により知られている技術により製造するか又は得ることができる。
【００５２】
本発明で使用された、アデノウイルスゲノムは、修飾されたファィバータンパク質を含むいかなるアデノウイルスベクター又はいかなる核酸配列も含むことを意図する。すべてのアデノウイルス血清型を、本発明のベクター及び方法において使用することを意図する。
【００５３】
本発明で使用された「ウイルスベクター」という用語は、その技術分野で認められた意味に従って使用される。それは、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含みそしてウイルスベクター粒子にパッケージされうる核酸ベクター構築物を表す。ウイルスベクター粒子は、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかでＤＮＡを細胞に導入するために使用することができる。
【００５４】
本発明で使用された、パッケージング細胞株は、アデノウイルスゲノム又は修飾されたゲノムをパッケージしてウイルス粒子を産生することができる細胞株である。それは欠失遺伝子産物又はその同等物を与えることができる。かくして、パッケージング細胞はアデノウイルスゲノムにおける欠失した遺伝子（例えば、修飾されたファィバータンパク質をコードする核酸）のための相補機能を与えることができそしてアデノウイルスゲノムをアデノウイルス粒子にパッケージすることができる。このような粒子の産生は、ゲノムが複製されること及び感染性ウイルスを組み立てるのに必要なこれらのタンパク質が産生されることを必要とする。粒子は、ウイルス粒子の成熟に必要な或るタンパク質も必要とすることがある。このようなタンパク質はベクター又はパッケージング細胞により与えられることができる。
【００５５】
本発明で使用された、脱ターゲッティングされたアデノウイルス粒子は、その天然の粒子と受容体との相互作用を機能破壊されている（減少させられるか又は削除されている）。完全に脱ターゲッティングされた粒子は２つ又はそれより多くの特異性を変えられている。インビボでは粒子は、粒子がいかなる細胞とも相互作用しないように完全に機能破壊はされないことが理解される。脱ターゲッティングされた又は完全に脱ターゲッティングされたものは、天然の受容体との相互作用を減少させられているか、典型的には実質的に減少させられているか又は削除されている。本発明の目的では、脱ターゲッティングされた粒子は、ＨＳＰ受容体に対する結合を減少させられている（２倍、５倍、１０倍、１００倍以上）か又はＨＳＰに対する結合を実質的に持たず、完全に脱ターゲッティングされたベクターは、他の受容体、例えば、ＣＡＲ及びインテグリン又は他の受容体との相互作用を削除するのに更なるキャプシド修飾を含む。この粒子はまだ細胞に結合するが、細胞のタイプ及び相互作用は減少している。
【００５６】
本発明で使用された、偽タイピング（pseudotyping）は、ベクター自体の血清型とは異なる血清型からの修飾されたキャプシドタンパク質（１つ又は複数）を有するアデノウイルスベクターの産生をいう。１つの例は、Ａｄ３７又はＡｄ３５ファィバータンパク質を含有するアデノウイルス５ベクター粒子の産生である。これは、種々のファィバータンパク質を発現するパッケージング細胞株においてアデノウイルスベクターを産生することにより達成することができる。本発明で与えれたとおり、ＨＳＰに結合するアデノウイルス５粒子又は他の血清型グループＣアデノウイルス又は他のアデノウイルスを脱ターゲッティングして、ＨＳＰｓに対する結合を減少させるか削除することは、Ａｄ５ファィバーのシャフト又は少なくともＨＳＰコンセンサス結合配列を含むすべて又は一部を、ＨＳＰに結合しないアデノウイルスファィバー又はその一部で置き換えることにより達成することができる。ＨＳＰと相互作用しないファィバーシャフトを有するアデノウイルスは、（ａ）サブグループＢのアデノウイルス、例えば、ＨＳＰとの相互作用を持たないＡｄ３、Ａｄ３５、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、（ｂ）サブグループＦのアデノウイルス、例えば、Ａｄ４０及びＡｄ４１、特に短ファィバーのアデノウイルス及び（ｃ）サブグループＤのアデノウイルス、例えば、Ａｄ４６を含む。
【００５７】
本発明で使用された、受容体は、他の分子に（と）特異的に又は選択的に結合する生物学的に活性な分子を表す。「受容体タンパク質」という用語は、特異的受容体のタンパク質に関係する性質をより特定的に示すのに使用されうる。
【００５８】
本発明で使用した、「環状ＲＧＤ（又はｃＲＧＤ）」という用語は、細胞の表面のαvインテグリンに結合しそして配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含有するいかなるアミノ酸も表す。
【００５９】
本発明で使用された、「異種ポリヌクレオチド」という用語は、アデノウイルス以外の生物学的供給源又は異なる株のアデノウイルスから誘導されたポリヌクレオチドを意味し、又は野生型ウイルスとは異なる座にあるポリヌクレオチドであることができる。異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチド、例えば、毒素又は治療タンパク質をコードすることができる。異種ポリヌクレオチドは、調節領域、例えば、プロモーター領域、例えば、特定の細胞又は組織、例えば殺腫瘍アデノウイルスに見出されるような腫瘍組織において活性なプロモーターを含有することができる。あるいは、異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、そしてコード領域に作動可能的に連結されたプロモーター領域を更に含有することができる。
【００６０】
本発明で使用された、アデノウイルスタンパク質におけるアミノ酸又はアデノウイルスゲノムにおけるヌクレオチドという言及は、特記しない限りＡｄ５に関するものである。他のアデノウイルス株及び修飾された株及びベクターにおける対応するアミノ酸及びヌクレオチドは当業者により同定されうる。かくして、突然変異の叙述は、対応する座をプロセシングするすべてのアデノウイルス株を包含することを意図する。
【００６１】
本発明で使用された、ＫＯ突然変異は、ＣＡＲへの結合をノックアウトするファィバーにおける突然変異を表す。例えば、ＫＯ１突然変異は、Ａｄ５ファィバーにおける突然変異及び他のファィバータンパク質における対応する突然変異を表す。Ａｄ５では、この突然変異は、ファィバーアミノ酸４０８及び４０９を置換させ、それらをセリン及びプロリンからそれぞれグルタミン酸およびアラニンに変える。本発明で使用された、ＫＯ１２突然変異は、Ａｄ５ファィバーにおける突然変異及び他のファィバータンパク質における対応する突然変異を表す。Ａｄ５では、この突然変異は、下記のとおりの４つのアミノ酸置換：Ｒ５１２Ｓ、Ａ５１５Ｇ、Ｅ５１６Ｇ及びＫ５１７Ｇである。他のＫＯ突然変異は実験的に認定することができ、又は当業者に知られている。
【００６２】
本発明で使用された、ＰＤ突然変異は、ＲＧＤトリペプチドを置き換えることにより、コードされているものによるαvインテグリンへの結合を機能破壊するペントン遺伝子における突然変異を表す。本発明で例示されたＰＤ１突然変異は、Ａｄ５ペントンタンパク質のアミノ酸３３７〜３４４、ＨＡＩＲＧＤＴＦ（配列番号９）を、アミノ酸ＳＲＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＴＳ（配列番号１０）により置換し、それによりＲＧＤトリペプチドを置き換える。
【００６３】
本発明で使用された、処置手段は、状態、障害又は疾患の症状を改善させるか又は有利に変えるいかなる方法も意味する。
【００６４】
本発明で使用された、治療的に有効な産物は、異種ＤＮＡによりコードされている産物であって、該ＤＮＡが宿主に導入されると、遺伝的又は後天的疾患の症状、兆候を有効に改善又は削除するかあるいは該疾患を治癒させる産物を発現させる、異種ＤＮＡによりコードされている産物である。
【００６５】
本発明で使用された、検被体は動物、例えば哺乳動物、典型的には患者を含むヒトである。
【００６６】
本発明で使用された、遺伝子治療は、このような治療を求めている障害又は状態を有する哺乳動物、特にヒトの或る細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの導入を包含する。該ＤＮＡは、該異種ＤＮＡが発現されそしてそれによりコードされている治療産物が産生されるように選ばれた標的細胞に導入される。あるいは、異種ＤＮＡは、治療産物をコードしているＤＮＡの発現をある方法で媒介することができ、異種ＤＮＡは、直接又は間接に治療産物の発現を或る方法で媒介する産物、例えばペプチド又はＲＮＡをコードすることができる。遺伝子治療は、遺伝子産物をコードしている核酸を送達して、欠陥のある遺伝子を置き換えるか又はそれが導入される哺乳動物又は細胞により産生される遺伝子産物を相補するのに使用することもできる。導入された核酸は治療化合物、例えば、通常哺乳動物宿主において産生されないか又は治療的有効量で産生されないか又は治療的に有用な時間に産生されない、成長因子、その阻害剤、又は腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えば、それらの受容体をコードすることができる。治療産物をコードする異種ＤＮＡは、苦痛を受けている宿主の細胞に導入する前に修飾して、産物又はその発現を高めるか又は変えることができる。
【００６７】
本発明で使用された、治療核酸は治療産物をコードする核酸である。産物は核酸、例えば調節配列もしくは遺伝子であることができ、又は治療活性もしくは効果を有するタンパク質をコードすることができる。例えば、治療核酸は、リボザイム、アンチセンス、二本鎖ＲＮＡ、タンパク質をコードする核酸及びその他であることができる。
【００６８】
本発明で使用された、「相同性」は、約２５％より大きい核酸配列同一性、例えば２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の核酸配列同一性を意味する。必要ならば、百分率相同性が特定されるであろう。「相同性」と「同一性」という用語はしばしば相互に交換可能に使用される。一般に、配列は、最高の整列一致（order match）が得られるように整列される（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1998; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, new Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von heinje, G., Academic Press, 1987; 及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48: 1073参照）。配列同一性により、保存されたアミノ酸の数は標準アラインメントアルゴリズムブログラムにより決定され、そして各供給者により確立された初期設定値のギャップペナルティーで使用される。実質的に相同性核酸分子は、関心のある核酸の端から端までの長さ又は完全な長さの核酸分子の少なくとも約７０％、８０％又は９０％に典型的には中程度のストリンジェンシー（moderate stringency）又は高いストリンジェンシーでハイブリダイズするであろう。ハイブリダイズしている核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドン（degenerate codons）を含有する核酸分子も包含される。
【００６９】
任意の２つの核酸分子が少なくとも、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％「同一である」ヌクレオチド配列を有するかどうかは、既知のコンピューターアルゴリズム、例えば、“ＦＡＳＴ  Ａ”プログラムを使用して、例えば、Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85: 2444における如くして初期設定パラメーターを使用して決定することができる（他のプログラムにはＧＣＧプログラムパッケージ（Devreux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(l): 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215: 403(1990); Guide to Huge Computers, Martin J.Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 及びCarillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48: 1073）を含む。例えば、National Center for Biotechnology Information  データベースのＢＬＡＳＴ機能を使用して同一性を決定することができる。他の商業的又は公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ“MegAlign”プログラム（Madison, WI）及びUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)“Gap”プログラム（Madison WI）を含む。タンパク質及び／又は核酸分子の百分率相同性又は同一性は、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することにより決定することができる（例えば、Smith and Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2: 482）により改定された、Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48: 443参照）。簡単に言えば、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のより短いものの記号（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の総数で割った、類似により整列した記号の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムのための初期設定パラメーターは、（１）ユナリー比較マトリックス（unary comparison matrix）（同一に対しては１そして非同一に対しては０の値を含む）及びSchwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp.353〜358(1979）により記載された如き、Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids.Res.14: 6745の加重比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー及び各ギャップの各記号について追加の０．１０のペナルティー；及び（３）端部ギャップについてはペナルティーなし、を含むことができる。ゆえに、本発明で使用された、「同一性」という用語は、試験及び参照ポリペプチド又はポリヌクレオチド間の比較を表す。
【００７０】
本発明で使用された、「に少なくとも９０％同一」という用語は、参照ポリペプチドに対して９０〜９９．９９％の百分率同一性を表す。９０％以上のレベルの同一性は、例示の目的で１００個のアミノ酸のテスト及び参照のポリヌクレオチド長さを比較すると仮定して、テストのポリペプチドのアミノ酸の１０％（即ち、１００個の内１０個）以下が参照のポリペプチドのアミノ酸と異なることを示している。テスト及び参照のポリヌクレオチド間で同様な比較をすることができる。このような相違はアミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異として表すことができるか、又はそれらは、許容しうる最大値、例えば１０／１００アミノ酸相違（約９０％同一性）までの様々な長さの１つ以上の場所における一団であってもよい。相違は核酸又はアミノ酸の置換又は欠失として定義される。約８５〜９０％以上の相同性又は同一性のレベルでは、結果はプログラム及びギャップパラメーターのセットには依存しないであろう。このような高いレベルの同一性はしばしばソフトウエアに頼ることなく容易に評価することができる。
【００７１】
本発明で使用された、パーセントミスマッチを決定する際のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは下記のとおりである：
１）高いストリンジェンシー：  ０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中間のストリンジェンシー：  ０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低いストリンジェンシー：  １．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
当業者は安定なハイブリッドのための洗浄工程を選ぶことを知っておりそしてＳＳＰＥの成分も知っている（例えば、Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press(1989), Vol.3, B.13，参照、普通に使用される実験室溶液を説明する多数のカタログも参照）。ＳＳＰＥは、ｐＨ７．４リン酸塩緩衝化０．１８Ｍ  ＮａＣｌである。更に、当業者は、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度及び温度の関数であるＴm（Ｔm＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ10[Ｎａ+]）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ））により決定され、それによりハイブリッド安定性に決定的な洗浄条件における唯一のパラメーターはＳＳＰＥ（又はＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度及び温度であるということを認識する。
【００７２】
別の緩衝液、塩及び温度を使用して同等なストリンジェンシーを達成することができることが理解される。限定するのではなく、例として、低いストリンジェンシーの条件を使用する方法は下記のとおりである（Shilo and Weinberg, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 6789-6792(1981）も参照）：ＤＮＡを含有するフィルターを３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５mMのＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ及び５００μg/mlの変性された鮭の精子ＤＮＡを含有する溶液中で４０℃で６時間予備処理する（１０×ＳＳＣは、７のｐＨに調節された１．５Ｍの塩化ナトリウム及び０．１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）。
【００７３】
ハイブリダイゼーションは下記の改良を伴う同じ溶液中で行われる：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μg/mlの鮭精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸及び５〜２０×１０6cpmの32Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で４０℃で１８〜２０時間インキュベーションし、次いで２×ＳＳＣ、２５mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５mMのＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液で置き換えそして６０℃で更に１．５時間インキュベーションする。フィルターを乾式ブロットしそしてオートラジオグラフィーに露出した。必要ならば、フィルターを６５〜６８℃で３回目の洗浄をし、フィルムに再露出する。使用することができる低いストリンジェンシーの他の条件は、当該技術分野で周知されている（例えば、異種間ハイブリダイゼーション（cross-species hybridizations）のために使用される如き）。
【００７４】
限定するのではなく例として、中程度のストリンジェンシーの条件を使用する方法は、例えば、下記の如き中程度のストリンジェンシーのこのような条件を使用する方法を含むがそれに限定はされない：ＤＮＡを含有するフィルターを６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔの溶液、０．５％ＳＤＳ、及び１００μg/mlの変性された鮭精子ＤＮＡを含有する溶液中で５５℃で６時間予備処理する。同じ溶液中でハイブリダイゼーションを行いそして５〜２０×１０6cpmの32Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で５５℃で１８〜２０時間インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で６０℃で３０分間２回洗浄する。フィルターを乾式ブロットしそしてオートラジオグラフィーに露出する。使用することができる中程度のストリンジェンシーの他の条件は当該技術分野で周知されている。フィルターの洗浄は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で３７℃で１時間行う。
【００７５】
限定するのではなくて例として、高いストリンジェンシーの条件を使用する方法は下記のとおりである：６×ＳＳＣ、５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１mMのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ及び５００μg/mlの変性された鮭精子ＤＮＡからなる緩衝液中で６５℃で８時間〜一夜、ＤＮＡを含有するフィルターの予備ハイブリダイゼーションを行う。フィルターを１００μg/mlの変性された鮭精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０6cpmの32Ｐ標識プローブを含有する予備ハイブリダイゼーション混合物中で６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ及び０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中で３７℃で１時間行う。次いで０．１×ＳＳＣ中で５０℃で４５分間洗浄し、次いでオートラジオグラフィーにかける。使用することができる高いストリンジェンシーの他の条件は当該技術分野で周知されている。
【００７６】
実質的に同一又は実質的に相同性又は類似という用語は、当業者により理解されているとおり状況と共に変わり、そして一般に少なくとも６０％又は７０％の同一性を意味し、好ましくは少なくとも８０％、８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。
【００７７】
本発明で使用された、産物と実質的に同一とは、関心のある性質が該産物の代わりに実質的に同じ産物を使用することができるように十分に変わらないように十分に類似していることを意味する。
【００７８】
本発明で使用された、実質的に純粋とは、このような純度を評価するために当業者により使用される標準的分析方法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により決定して容易に検出できる不純物を含まないことが明らかなように十分に均一であるか、又は更なる精製が物質の物理的及び化学的性質、例えば、酵素活性及び生物学的活性を検出可能に変えないように十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体又は異性体の混合物であることができる。このような場合には、更なる精製は化合物の特定の活性を増加させるかも知れない。
【００７９】
本発明で提供される方法及び産物の製造は、特記しない限り、当該技術の熟練の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の慣用の技術を使用する（例えば、Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al.(1992)Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York; Glover(1985)DNA Cloning I and II, Oxford Press; Anand(1992)Techniques for the Analysis of Complex Genomes(Academic Press); Guthrie and Fink(1991)Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press; Harlow and Lane(1988)Antibodies: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Jakoby and Pastan, eds.(1979)Cell Culture.Method in Enzymology 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jaovanovich, NY; Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984); Culture of Animal Cells(R.I.Freshney, AlanR.Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzynes(IRL Press, 1986); B.Perbal(1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Vols.154 and 155(Wue et al. eds.); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker eds., Academic Press, London, 1987); Handbook of Experinental Immunology, Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds., 1986); Hogan et al.(1986)Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.参照）。
【００８０】
Ｂ．  キャプシド修飾
アデノウイルスとその自然の受容体との相互作用を機能破壊するウイルスキャプシドの修飾が提供される。特に、ＨＳＰとアデノウイルスの相互作用の機能破壊をもたらすファィバー修飾が提供される。これらのファィバー修飾は、他のキャプシドタンパク質修飾、例えば、他のファィバー修飾及び／又はペントン及び／又はヘキソン修飾と組み合わせて、ウイルス粒子上に発現されるとき自然の受容体とウイルスの相互作用を完全に機能破壊させることができる。この修飾は、トリマー形成又は核へのファィバーの輸送を妨害するべきではない。
【００８１】
１．ファィバー遺伝子及びタンパク質
ファィバータンパク質はキャプシドから延びておりそして特異的な細胞受容体に結合することにより細胞表面へのウイルスの結合を媒介する（Philipson et al.(1968)J.Virol.2: 1064〜1075）。ファィバーは、アデノウイルスペントンベースと相互作用するＮ末端テイルドメイン、様々な長さの中心シャフトドメイン、及び細胞受容体結合部位を含有するＣ末端ノブドメインを含む３量体タンパク質である（Chroboczek et al.(1995)Curr.Top.Microbial.Immunol.199: 163〜200; Riurok et al.(1990)J.Mol.Viol.215: 589〜596; Stevenson et al.(1995)J.Virol.69: 2850〜2857）。アデノウイルス血清型２（Ａｄ２）、Ａｄ５、Ａｄ３、Ａｄ３５、Ａｄ１２、Ａｄ４０及びＡｄ４１を含む様々な血清型からのファィバー遺伝子の配列が知られている。Ｇｅｎｂａｎｋには少なくとも２１の異なるファィバー遺伝子がある。
【００８２】
認められるとおり、ファィバータンパク質は３つのドメインに分けることができる（例えば、Green et al.(1983)EMBO J.2: 1357〜1365参照）。保存されたＮ末端は、ペントンベースとの結合及び核局在化シグナルの原因となる配列を含有する。様々な長さのロッド状（rod-like）シャフトは１５アミノ酸β構造の反復を含有し、反復の数はＡｄ３の６からＡｄ５の２２までの範囲にある。配列ＴＬＷＴ（配列番号３６）を含むアミノ酸の保存された伸張（stretch）は、シャフトのβ構造の反復単位と球状ヘッドドメイン（head domain）との境界を示す。Ｃ末端ヘッドドメインは、サイズがＡｄ４１の短ファィバーの１５７アミノ酸残基からＡｄ１１及びＡｄ３４の１９３残基の範囲にある。ファィバースパイク（fiber spike）はホモ３量体でありそしてＣ末端はファィバーホモ３量体の３量体化の原因となると考えられ、そしてペントンベース複合体との結合を介して結合しているビリオン当り１２のスパイクがある。
【００８３】
ＨＳＰ相互作用の修飾
アデノウイルスファィバータンパク質はアデノウイルストロピズムの主要な決定因子である（Gall et al.(1996)J.Virol.70: 2116〜2133; Stevenson et al.(1995)J.Virol.69: 2850〜2857）。この分野の定説は、アデノウイルスの侵入はＣＡＲ及びインテグリンへの結合を介して起こるということであった。これは公表されたデータにより強調される（Einfeld et al.(2001)J.Virology 75: 11284〜11291）。しかしながら、これらの公表された侵入路はインビボで作用する支配的なものではないことが本発明で示される。更に、本発明で示されたとおり、インビボで肝細胞に対する主要な侵入路は、ヘパリンサルフェートプロテオグリカン結合を通してファィバーシャフト、例えばＡｄ５シャフトにより媒介された機構が関与する。
【００８４】
この結合の削除は肝細胞における如きＨＳＰ結合を介した侵入を削除することが本発明で示される。ＨＳＰとウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーシャフト修飾が提供される。かくして、本発明で提供されるとおり、インビボでのアデノウイルスの効率的な脱ターゲッティングが適当にデザインされたファィバータンパク質で達成されうる。本発明で説明される如き、適当な修飾は、野生型がＨＳＰと相互作用するいかなるアデノウイルスに関してもなされうる。
【００８５】
本発明で提供されるとおり、アデノウイルスベクターのＨＳＰと相互作用する能力が修飾される。特に、相互作用する能力が減少させられるか又は削除される。修飾は、野生型ファィバータンパク質のＨＳＰ結合に比べて、修飾されたファィバータンパク質のＨＳＰ結合が機能破壊されているようにファィバーシャフトの構造を変える、挿入、欠失、個々のアミノ酸の突然変異及び他の突然変異を含む。
【００８６】
この態様の第一の観点では、アデノウイルスファィバータンパク質は、ＨＳＰと相互作用するアミノ酸の１個以上を突然変異させることにより修飾される。例えば、修飾されたファィバータンパク質のＨＳＰ結合モチーフは細胞表面のＨＳＰともはや相互作用することができず、したがってＨＳＰとウイルスの相互作用を機能破壊する。例えば、アデノウイルスファィバーはサブグループＣのアデノウイルスからのものである。例えば、Ａｄ５ファィバーにおけるアミノ酸残基９１〜９４に位置したＫＫＴＫ配列（配列番号１）であるＨＳＰ結合モチーフのＨＳＰと相互作用する能力を修飾するために、ファィバーシャフトを突然変異させることにより、ＨＳＰへの結合は削除されるか又は減少されうる。ファィバータンパク質は、当業者により知られている化学的及び生物学的技術、例えばファィバーをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発又は本発明で説明された他の技術により修飾される。
【００８７】
この態様の別の観点では、ファィバーのＨＳＰと相互作用する能力は、野生型ファィバーシャフトをＨＳＰと相互作用しないアデノウイルスのファィバーシャフト又はその一部で置き換えてキメラファィバータンパク質を産生させることにより修飾される。該一部はＨＳＰとの相互作用を減少させるか又は削除するのに十分なのものである。ＨＳＰと相互作用しないファィバーシャフトを有するアデノウイルスの例は、（ａ）サブグループＢのアデノウイルス、例えば、ＨＳＰと相互作用しないＡｄ３、Ａｄ３５、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、しかしこれらに限定はされない、（ｂ）サブグループＦのアデノウイルス、例えば、Ａｄ４０及びＡｄ４１、特に短いファィバー、しかしこれらに限定はされない、及び（ｃ）サブグループＤのアデノウイルス、例えば、Ａｄ４６、しかしこれに限定はされない、を含む。他の態様では、ＣＡＲとウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーノブ修飾と組み合わせた、ＨＳＰとウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーシャフト修飾が提供される。ファィバーノブ修飾を含む適当なアデノウイルスファィバー修飾は当業者により知られておりそしてここに例示される（２００１年５月３０日に出願された米国特許出願シリアル番号09/870, 203、及び２００１年６月１日に出願された国際特許出願番号PCT/EP01/06286において、米国公開出願番号20020137213として公表された）。ファィバーの修飾は、サブグループＣ、Ｄ又はＥからのアデノウイルスの野生型ファィバータンパク質のＣＤループ又はサブグループＦからのアデノウイルスの長い野生型ファィバーにおける少なくとも１個のアミノ酸の突然変異を含み、それにより、ファィバータンパク質のＣＡＲに結合する能力は減少させられるか又は実質的に削除される。ＣＡＲ相互作用を機能破壊されたファィバータンパク質は、本発明で説明されそして上記の特許出願に記載されたとおり、当業者に知られた化学的及び生物学的技術により修飾される。
【００８８】
別法として、アデノウイルスファィバー修飾は、野生型ファィバーノブをＣＡＲと相互作用しないアデノウイルスのファィバーノブで置き換えることによりなされる。ファィバータンパク質は、それがＨＳＰと相互作用しないようにも選ばれるであろう。ＣＡＲと相互作用しないファィバーノブを有するアデノウイルスの例は、（ａ）サブグループＢのアデノウイルス、例えば、Ａｄ３、Ａｄ３５、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、（ｂ）サブグループＦのアデノウイルス、例えば、Ａｄ４０及びＡｄ４１、特に短いファィバーのアデノウイルスを含む。
【００８９】
他の態様では、αvインテグリンとウイルスの相互作用を機能破壊するペントン修飾と組み合わせた、ＨＳＰとウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーシャフト修飾が提供される。適当なアデノウイルスペントン修飾は、当業者に周知されているペントン修飾を含む（例えば、米国特許番号5, 731, 190; Einfeld et al.(2001)J.Virology 75: 11284〜11291; 及びBai et al.(1993)J.Virology 67: 5198〜5205も参照）。
【００９０】
例えば、αvインテグリンとペントンの相互作用は、ペントンおけるαv相互作用に必要なＲＧＤトリペプチドモチーフを、αvインテグリンと相互作用しない異なるトリペプチドで置換することにより機能破壊する（減少させるか又は削除する）ことができる。αvインテグリン相互作用を機能破壊されたペントンタンパク質は、当業者に知られた化学的及び生物学的技術により修飾される（例えば、記載された米国特許番号6, 731, 190及び本発明で説明されているのを参照されたい）。一般にアデノウイルスはサブグループＢ又はＣのアデノウイルスである。
【００９１】
ＣＡＲとウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーノブ修飾及びαvインテグリンとウイルスの相互作用を機能破壊するペントン修飾と組み合わせた、ＨＳＰとウイルスの相互作用を機能破壊するアデノウイルスファィバーシャフト修飾も提供される。これらの修飾は、上記に説明されており、そして当業者に知られているそして本発明で説明される化学的及び生物学的技術を使用して調製される。一般に、アデノウイルスはサブグループＢ又はサブグループＣのアデノウイルスである。
【００９２】
ＨＳＰ相互作用を削除するか又は減少させるように修飾されたファィバー及び他の受容体及び細胞表面タンパク質、例えば、ＣＡＲ及び／又はαvインテグリンとの相互作用を変えるように修飾されたファィバーの調製は下記の実施例にも記載されている。構造が下記に記載されている例示的な修飾されたファィバーの核酸及び／又はアミノ酸配列は下記のとおり配列番号４５〜７２として示される。
【００９３】
配列番号４５及び４６は、５ＦＫＯ１（式中５Ｆはアデノウイルス５ファィバーを表し、ＫＯ１は本発明で説明されたＣＡＲ相互作用部位の例示的突然変異である）と名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号４７及び４８は、再ターゲッティングを証明するためにＲＧＤリガンドを更に含む５ＦＫＯ１ＲＧＤと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号４９及び５０は、５ＦＫＯ１２（式中、５Ｆはアデノウイルス５ファィバーを表し、ＫＯ１２は本発明で説明したＣＡＲ相互作用部位の他の例示的突然変異である）と名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号５１及び５２は、５ＦＳ*ｎｕｃ（式中、５Ｆはアデノウイルス５ファィバーを表し、Ｓ*はＨＳＰへの結合を変えるシャフトの例示的突然変異である）と名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号５３及び５４は、更にＲＧＤリガンドを含む５ＦＳ*ＲＧＤｎｕｃと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号５５及び５６は、ＫＯ１及びＳ*突然変異を含む５ＦＫＯ１Ｓ*と名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号５７及び５８は、更にＲＧＤリガンドを含む５ＦＫＯ１Ｓ*ＲＧＤと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号５９及び６０は、Ａｄ３５ファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号６１及び６２は、更にＲＧＤリガンドを有する３５Ｆファィバーである３５ＦＲＧＤと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号６３及び６４は、Ａｄ４１短ファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号６５及び６６は、ＲＧＤリガンドを有する４１Ｆ短ファィバーである４１ｓＦＲＧＤと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号６７及び６８は、Ａｄ５ペントンのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、
配列番号６９及び７０は、Ａｄ５ファィバーテイル及びシャフト領域（５ＴＳ；アミノ酸１〜４０３）がＡｄ３５ファィバーヘッド領域（３５Ｈ；アミノ酸１３７〜３２３）に連結されて５ＴＳ３５Ｈキメラを形成しているキメラファィバーである５ＴＳ３５Ｈと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、そして
配列番号７１及び７２は、Ａｄ３５ファィバーテイル及びシャフト領域（３５ＴＳ；アミノ酸１〜１３６）がＡｄ５ファィバーヘッド領域（５Ｈ；アミノ酸４０４〜５８１）に連結されて３５ＴＳ５Ｈキメラを形成しているキメラファィバーである３５ＴＳ５Ｈと名付けられた修飾されたファィバーのコーディングヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【００９４】
配列番号１はＡｄファィバーのヌクレオチド配列を示し、配列番号２及び３は機能破壊されたＣＡＲ相互作用のための修飾されたファィバーノブを有するファィバーのコーディング核酸配列も示し（ＫＯ１について配列番号２及びＫＯ１２について配列番号３を参照されたい）、配列番号４は機能破壊されたａvインテグリンのための修飾されたペントンのコーディング核酸配列も示す（配列番号４）。
【００９５】
修飾されたファィバーは、ファィバータンパク質及び場合により追加のタンパク質を修飾することによりウイルス粒子上に表示される。これは、修飾されたキャプシドタンパク質を発現しそして修飾されたファィバーを有する粒子を産生するアデノウイルスベクターを調製すること、又はアデノウイルスベクター、特に１つ又はそれより多くのキャプシドタンパク質をコードしないアデノウイルスベクターを適当なパッケージング系においてパッケージすることにより達成されうる。したがって、下記に詳しく述べたとおり、ＨＳＰに結合しない修飾されたファィバーを有するアデノウイルスベクター及びウイルス粒子が提供される。
【００９６】
Ｃ．核酸、アデノウイルスベクター並びに該核酸を含有する細胞及び該ベクターを含有する細胞
修飾されたキャプシドタンパク質をコードしそして本発明で提供される修飾されたキャプシドタンパク質を発現するアデノウイルスの調製のためのベクターをコードするポリヌクレオチドも提供される。野生型アデノウイルスタンパク質の配列は当該技術分野で周知でありそして本発明に記載の如く修飾される。核酸分子、例えば、機能破壊されたＣＡＲ相互作用のための例示的な修飾されたファィバーノブ（ＫＯ１については配列番号２及びＫＯ１２については配列番号３参照）及び機能破壊されたａvインテグリンのための修飾されたペントン（配列番号４）をコードするｃＤＮＡが提供される。上記したとおり、ＣＡＲ及びαvインテグリンに対する変更されたトロピズムを有する修飾されたキャプシドタンパク質は知られておりそして本明細書に引用された特許、出願、及び文献に記載されておりそして当業者に知られている（例えば、米国特許番号5, 731, 190、米国公開出願番号20020137213として公開された米国出願シリアル番号09/870, 203及びBai et al.J.Virology 67: 5198〜5208参照）。
【００９７】
本発明で提供されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。このようなベクターは、部分的な又は完全なアデノウイルスゲノム及びプラスミドを含む。このようなベクターは当業者に知られている技術により及び本発明で説明された如くして構築される。全体のファィバータンパク質又はその一部を、ＨＳＰと相互作用しないアデノウイルスのファィバータンパク質又はその適当な一部で置き換えることにより修飾されたアデノウイルスベクターも提供される。ＨＳＰと相互作用しないアデノウイルスは、ファィバータンパク質及びアデノウイルスがＨＳＰと結合するか又は結合しないかを検出する本発明で説明された方法を使用することにより同定することができる。本発明で提供されるアデノウイルスベクターは、中でも、ＨＳＰ結合部分を含むファィバーシャフト又はその一部をコードする核酸が、Ａｄ３５の如き血清型からのファィバー又はその適当な一部をコードする核酸で置き換えられている、Ａｄ２及びＡｄ５を含むサブグループＣのアデノウイルスベクターである。
【００９８】
かくして、全体のファィバータンパク質をＣＡＲと相互作用しないアデノウイルスのファィバータンパク質で置き換えること、及び／又はＨＳＰ結合部分を結合しない部分で置き換えることにより、ウイルス粒子におけるアデノウイルスファィバー修飾がなされうる。一般に、該アデノウイルスは、サブグループＢ又はサブグループＣのアデノウイルスでありそしてサブグループＤのアデノウイルス、例えばＡｄ４６でもある。置き換えられたファィバーノブを有するＡｄ２及びＡｄ５の如きサブグループＣのアデノウイルスベクターは当該技術分野で周知された及び本発明で説明された技術を使用して調製される。
【００９９】
１．ウイルス粒子の調製
本発明で提供されるウイルスを産生するのに使用されるパッケージング細胞は、本発明で提供される突然変異されたファィバータンパク質を含むキャプシドタンパク質をコードする核酸を含有する。このような核酸は、一般にプラスミドの一部として細胞にトランスフェクションすることができ、又はそれはウイルスベクターにより細胞に感染させることができる。それは細胞のゲノムに安定に組み込まれることができ、かくして安定な細胞株を与える。別法として、突然変異されたキャプシドタンパク質をコードする核酸をゲノムから除去することができ、その場合に、一過性相補細胞（transient complementing cell）が使用される。
【０１００】
パッケージされるべきアデノウイルスゲノムは当業者に知られている技術によって相補細胞に導入される。これらの技術はアデノウイルスによるトランスフェクション又は感染を含む。突然変異されたファィバータンパク質をコードする核酸はパッケージング細胞中の代わりにこのゲノム中にあることができる。
【０１０１】
或る場合には、突然変異されたファィバーをコードする核酸がパッケージされるべきゲノム内にあるとき、パッケージング細胞がファィバータンパク質をコードすることも望ましいことがありうる。このようなタンパク質は感染性粒子の成熟及びパッケージングを助けることができる。このようなタンパク質は野生型ファィバータンパク質又は、ペントンベースタンパク質に結合することができないように修飾されたファィバータンパク質であることができ、そして使用のために、例えば、プロデューサー細胞中にあり、プロデューサー細胞においてはファィバーが含まれてパッケージング機能を与え、そしてベクターは完全な長さのファィバーをコードする。
【０１０２】
パッケージング細胞は所望のウイルス粒子の産生を可能とする条件下に培養される。ウイルス粒子は標準技術により回収される。本発明で提供されるアデノウイルス粒子を産生するための例示的な方法は下記のとおりである。アデノウイルスシャトルプラスミドにおける標準技術を使用して、突然変異されたファィバータンパク質をコードする核酸が作られる。このプラスミドは特に、Ｅ３領域の端部から右ＩＴＲまでのウイルスの右端を含有する。このプラスミドは、Ｅ１領域及び時にはＥ２領域以外のアデノウイルスゲノムの残りの部分を含有しそして対応する相同性の領域も含有するプラスミドと共に、大腸菌株、例えば、周知の大腸菌株ＢＪ５１８３（例えば、Degryse(1996)Gene170: 45〜50参照）のコンピテント細胞中に共トランスフェクションされる。２つのプラスミド間の相同的組換えは、全体のアデノウイルスベクターゲノムをコードする完全な長さのプラスミドを発生させる。
【０１０３】
この完全な長さのアデノウイルスベクターゲノムプラスミドは、次いで相補細胞株にトランスフェクションされる。トランスフェクションは、プロデューサー細胞へのアデノウイルス粒子の侵入を導く試薬の存在下に行うことができる。このような試薬は、ポリカチオン及び二官能性試薬、例えば、本発明で記載された試薬を含むが、それらに限定はされない。相補細胞は、例えば、アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の細胞（ＰＥＲ．Ｃ６は例えば、Crucell、The Netherlandsから入手可能であり、ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０の下に寄託されており、Fallaux et al.(1998)Hum.Gene Ther.9: 1909〜1907も参照され、米国特許番号5, 994, 128も参照されたい)又はAE1-2a細胞(Gorziglia et al(1996)J.Virology 70: 4173〜4178及びVon Seggern et al.(1998)J.Gen.Virol.79: 1461〜1468参照）である。
【０１０４】
ＡＥ１−２ａ細胞は、それぞれ、アデノウイルスＥ１及びＥ２ａ機能の相補を与える、プラスミドｐＧＲＥ５−２．Ｅ１（ＧＲＥ５−Ｅ１−ＳＶ−４０−Ｈｙｇｒｏ構築物とも呼ばれそして配列番号４１に記載された）及びｐＭＮｅｏＥ２ａ−３．１（ＭＭＴＶ−Ｅ２ａ−ＳＶ４０−Ｎｅｏ構築物とも呼ばれそして配列番号４２に記載された）の染色体挿入を伴うＡ５４９肺カルシノーマ系（ATCC # CCL 185）の誘導体である。
【０１０５】
アデノウイルス血清型５野生型ファィバータンパク質を安定に発現しそしてＡＥ１−２ａ細胞株から誘導された６３３細胞株（von Seggern et al.(2000)J.Virology 74: 354-362参照）は、相補細胞の他の例である。細胞株が６３３細胞である場合には、アデノウイルスベクターの最終継代は、野生型Ａｄ５ファィバーを発現しない他の相補細胞株（例えば、ＰｅｒＣ６）で行われる。
【０１０６】
トランスフェクションされた相補細胞は標準細胞培養条件下に維持される。アデノウイルスプラスミドは組換えしてパッケージされるアデノウイルスゲノムを形成する。粒子は感染性であるが、それらのゲノムは少なくともＥ１遺伝子を欠いているので、複製に欠陥がある。６３３細胞中で行われる場合に、粒子は野生型及び突然変異されたファィバータンパク質を含有する。それらは粗ウイルス溶解液から回収され、増幅されそして標準技術により精製される。
【０１０７】
回収された粒子はＰＥＲ．Ｃ６又はＡＥ１−２ａ細胞を感染させるのに使用することができる。これは、そのキャプシドが所望の突然変異されたファィバーのみを含有する粒子の回収を可能とする。この二段階法は本発明で提供されるアデノウイルス粒子の高い力価のバッチ（batch）を与える。アデノウイルス粒子は複製コンピテントであるか又は複製インコンピテント（replication incompetent）であることができる。
【０１０８】
１つの態様では、粒子は或る所定の標的組織においては選択的に複製するが、他の細胞及び組織においては複製インコンピテントである。特定の態様では、アデノウイルス粒子は、異常に増殖する組織、例えば、固形腫瘍及び他の新生物において複製する。複製条件付きアデノウイルスでは、複製に必須の遺伝子は、細胞又は組織特異的である異種プロモーターの制御下に置かれる。例えば、Ｅ１ａ遺伝子は腫瘍細胞中で活性なプロモーターの制御下に置かれて殺腫瘍アデノウイルス又は殺腫瘍アデノウイルスベクターを産生する。腫瘍細胞への殺腫瘍アデノウイルスベクターの投与は腫瘍細胞を殺す。このような複製条件付きアデノウイルス粒子及びベクターは当業者に知られた技術、例えば、上記した米国特許番号5, 998, 205及び5, 801, 029に開示された技術により産生することができる。これらの粒子及びベクターは上記したとおりアデノウイルスパッケージング細胞において産生することができる。一般に、パッケージング細胞は、野生型アデノウイルス粒子をもたらすことができる相同性組換えを制限するようにデザインされたパッケージング細胞である。このような細胞は周知されておりそしてＰＥＲ．Ｃ６（米国特許番号5, 994, 128及び6, 033, 908参照、ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０の下に寄託されている）として知られたパッケージング細胞を含む。殺殺腫瘍ベクターは或る細胞型においては複製コンピテントであるので、それらはＡｄ相補遺伝子を与えないで該細胞型から誘導された細胞株において増幅させることができる。
【０１０９】
２．アデノウイルスベクター及び粒子
アデノウイルスベクター及び粒子の産生のために本発明で使用されるアデノウイルスはいかなる血清型であってもよい。アデノウイルス又はアデノウイルスコートタンパク質、例えば、ファィバー及び／又はペントンベースの供給源として使用することができるアデノウイルスストックは、現在American Type Culture Collection(ATCC、Rockville、Md.）から入手可能なアデノウイルス血清型１〜４７から増幅することができ、又はいかなる他の供給源からも入手可能ないかなる他の血清型のアデノウイルスからも増幅することができる。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０、４１）であることができ、又はいかなる他のアデノウイルス血清型であってもよい。
【０１１０】
或る態様では、アデノウイルスはサブグループＢ又はサブグループＣのアデノウイルスである。本発明で記載の如き修飾されるサブグループＣのアデノウイルスは、Ａｄ２及びＡｄ５を含むが、それらに限定はされない。Ａｄ５では、突然変異は、アミノ酸残基９１〜９４間に位置したＫＫＴＫ配列（配列番号１）においてなされる。ファィバータンパク質は当業者に知られている化学的及び生物学的技術により修飾されうる。これらの方法は部位特異的突然変異誘発及び本発明で説明された技術を含むが、それらに限定はされない。
【０１１１】
アデノウイルス粒子は、一般に、上記したようにターゲッティングリガンドを含む。ターゲッティングリガンドの存在は、野生型アデノウイルス粒子が感染する細胞型とは異なる所望の細胞型への遺伝子の送達、又は野生型粒子が感染する細胞型と同じであるが、選択的方法で、即ち、非標的細胞型は有意に感染されない方式で、感染を許容する所望の細胞型への遺伝子の送達を可能とする。
【０１１２】
本発明で提供されるアデノウイルスベクターを使用してインビトロ又は種々の動物モデルにおいて細胞形質導入及び遺伝子発現を研究することができる。後者の場合は、細胞をインビトロで形質導入し、次いで動物に投与するエキソビボ技術を含む。それらはヒト又は他の動物における遺伝子治療を行うのに使用することもできる。このような遺伝子治療はエキソビボ又はインビボであることができる。インビボ遺伝子治療では、製薬学的に許容できる担体中のアデノウイルス粒子を治療的有効量でヒトに送達して、治療タンパク質をコードする異種遺伝子のこのようなヒトの細胞への導入によりヒトの疾患又は医学的状態を防止、治療又は改善する。アデノウイルスは約１粒子／kg体重〜約１０14粒子／kg体重の範囲の用量で送達される。一般に、アデノウイルスは約１０6粒子／kg体重〜約１０13粒子／kg体重の範囲の用量、典型的には、約１０8粒子／kg体重〜約１０12粒子／kg体重の範囲の用量で送達される。
【０１１３】
当業者に知られているいかなるベクターも、修飾されたファィバーを含むウイルス粒子を産生してＨＳＰへの結合を機能破壊する（減少させることを含む）のに使用することができる。いくらかの例示的なベクターは以下のとおりである。
【０１１４】
ａ．ガットレスベクター（gutless vectoes）
中身を抜き取られたアデノウイルスベクター（gutted adenovirus vectors）は大部分の又はすべてのウイルス遺伝子が欠失したアデノウイルスベクターである。それらは、「ヘルパー」ウイルス（例えばＥ１欠失Ａｄベクターを使用する）による産生細胞の共感染により成長させられ、その場合にパッケージング細胞がＥ１遺伝子産物を発現する。ヘルパーウイルスは、粒子組立てに必要なウイルス構造タンパク質の産生を含む、欠けているＡｄ機能をトランスで相補する。中身を抜き取られたアデノウイルスベクターキャプシドにキャプシド修飾を組み込むために、本発明で説明した如くヘルパーウイルスに対する変更がなされなければならない。修飾されたキャプシドタンパク質を含むすべての必要なＡｄタンパク質は修飾されたヘルパーウイルスにより与えられ、そして中身を抜き取られたアデノウイルス粒子は宿主細胞により発現された特定の修飾されたキャプシドを備えている。Ｅ１ａ、Ｅｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ及びＥ４は一般にウイルスの複製及びパッケージングに必要である。これらの遺伝子が欠失しているならば、パッケージング細胞はこれらの遺伝子又は機能的同等物を与えなければならない。
【０１１５】
ヘルパーアデノウイルスベクターゲノム及びガットレスアデノウイルスベクターゲノムはパッケージング細胞に送達される。該細胞は標準細胞維持又は成長条件下に維持され、それによりヘルパーベクターゲノム及びパッケージング細胞は一緒になってアデノウイルスベクター粒子のパッケージングのための相補タンパク質を与える。このようなガットレスアデノウイルスベクター粒子は標準技術により回収される。ヘルパーベクターゲノムは、標準トランスフェクション技術によりプラスミド又は同様な構築物の形態で送達される、又はそれはゲノムを含有するウイルス粒子による感染により送達されうる。このようなウイルス粒子は普通ヘルパーウイルスと呼ばれる。同様に、ガットレスアデノウイルスベクターゲノムはトランスフェクション又はウイルス感染により細胞に送達されうる。
【０１１６】
ヘルパーウイルスゲノムは本発明で開示された修飾されたアデノウイルスベクターゲノムであることができる。このようなゲノムは、それがアデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質をコードする遺伝子を欠くように調製又はデザインすることもできる。更に、ゲノムはアデノウイルスＥ３タンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子を更に欠くことができる。別法として、このようなタンパク質をコードする遺伝子は、存在することができるが、それらが機能的Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ及びＥ３タンパク質をコードしないように突然変異させることができる。更に、このようなベクターゲノムは他の機能的初期タンパク質、例えば、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ３及びＥ４タンパク質をコードすることができない。別法として、このような他の初期タンパク質をコードする遺伝子は存在することはできるが、それらが機能的タンパク質をコードしないように突然変異させることができる。
【０１１７】
ガットレスベクターを産生する際に、ヘルパーウイルスゲノムもパッケージされ、それによりヘルパーウイルスを産生する。産生されるヘルパーウイルスの量を最小にしそして産生されるガットレスベクター粒子の量を最大にするために、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージング配列を欠失させることができ、又はヘルパーウイルスゲノムのパッケージングが妨害されるかもしくは制限されるように修飾することができる。ガットレスベクターゲノムは修飾されていないパッケージング配列を有するので、それは優先的にパッケージされるであろう。
【０１１８】
これを行うための１つの方法は、パッケージング配列を含むヌクレオチドの１個以上を欠失させること、又は該配列を突然変異させてパッケージング機能を不活性化するかもしくは阻止することにより、パッケージング配列を突然変異させることである。１つの例示的なアプローチは、リコンビナーゼ（recombinase）標的部位がパッケージング配列に隣接するようにヘルパーゲノムを工学的に作り出し、そしてリコンビナーゼをパッケージング細胞中に与えることである。このような部位に対するリコンビナーゼの作用はヘルパーウイルスゲノムからパッケージング配列を除去する。リコンビナーゼはリコンビナーゼをコードするパッケージング細胞におけるヌクレオチド配列により与えることができる。このような配列はパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。様々な種類のリコンビナーゼが当業者により知られており、そして上記した如くパッケージング配列のいずれかの側に工学的に作り出されるいわゆるｌｏｘ部位に作用するＣｒｅリコンビナーゼを含むが、それに限定はされない（例えば、米国特許番号5, 919, 676、6, 080, 569及び5, 919, 676参照、例えば、Morsy and Caskey, Mlecular Medicine Today, Jan.1999, pgs.18〜24参照）。
【０１１９】
ガットレスベクターの例はｐＡｄＡＲＳＶＤｙｓである（Hacker et al.(1996)Hum Gene Ther.7: 1909〜1914)）。このプラスミドは、ＲＳＶプロモーターにより駆動されそしてＡｄ逆方向末端反復配列及びパッケージングシグナルが両側に位置した完全な長さのヒトジストロフィンｃＤＮＡを含有する。２９３細胞をヘルパーウイルスとして働く第一世代Ａｄで感染させ、次いで精製したｐＡｄＡＲＳＶＤｙｓ  ＤＮＡでトランスフェクションする。ヘルパーＡｄゲノム及びｐＡｄＡＲＳＶＤｙｓ  ＤＮＡはＡｄ染色体として複製され、そしてヘルパーウイルスにより産生されたウイルスタンパク質を使用して粒子にパッケージされる。粒子を単離し、そしてｐＡｄＡＲＳＶＤｙｓ含有粒子をそれらのより小さいゲノムサイズ、したがってＣｓＣｌ勾配における異なる密度によりヘルパーから分離する。ガットレスアデノウイルスベクターの他の例が知られている（例えば、Sandig et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(3): 1002〜7）。
【０１２０】
ｂ．殺腫瘍ベクター
簡単に言えば、腫瘍細胞中で選択的に複製するウイルスである殺腫瘍アデノウイルスは、投入ウイルス用量を腫瘍におけるウイルス複製により増幅するようにデザインされて、腫瘍塊全体にわたりウイルスを広がらせる。アデノウイルスのその場での（in situ）複製は細胞溶解に導く。このその場での複製は、相対的に低い無毒性用量が腫瘍細胞の選択的削除に高度に有効であることを可能とする。選択性を達成するための１つのアプローチは、非標的細胞においては増殖に必須のウイルス遺伝子に機能損失突然変異を導入するが、腫瘍細胞においてはそうしないことである（例えば、米国特許番号5, 801, 029参照）。このストラテジーはＥ１ｂ−５５ＫＤ遺伝子における欠失を有するＡｄｄｌ１５２０の使用により例示される。正常な細胞では、アデノウイルスＥ１ｂ−５５ＫＤタンパク質はｐ５３に結合してアポトーシスを防止するのに必要である。ｐ５３を欠失した腫瘍細胞では、ｐ５３へのＥ１ｂ−５５Ｋの結合は不必要である。かくして、Ｅ１ｂ−５５ＫＤの欠失は、ベクター複製をｐ５３を欠失した腫瘍細胞に制限するであろう。
【０１２１】
他のアプローチは、腫瘍選択性プロモーターを使用して複製に必要な初期ウイルス遺伝子の発現を制御することである（例えば、国際PCT出願番号WO 96/17053及びWO/25860参照）。かくして、このアプローチでは、もし複製に必須の遺伝子が腫瘍選択性であるプロモーター又は他の転写調節エレメントの制御下にあるならば、アデノウイルスは選択的に複製しそして腫瘍細胞を溶解させる。
【０１２２】
例えば、アデノウイルス複製に必須のアデノウイルス遺伝子に作動的に連結されたがん選択性調節領域を含有する殺腫瘍アデノウイルスベクターが知られている（例えば米国特許番号5, 998, 205参照）。複製に必須のアデノウイルス遺伝子はＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ及びＥ４を含むが、これらに限定はされない。例えば、例示的な殺腫瘍アデノウイルスベクターはＥ１ａ遺伝子に作動的に連結されたがん選択性調節領域を有する。他の態様では、殺腫瘍アデノウイルスベクターはＥ１ａ遺伝子に作動的に連結された本発明のがん選択性調節領域及びＥ４遺伝子に作動的に連結された第２がん選択性調節領域を有する。ベクターは、少なくとも１つの治療導入遺伝子を含むこともでき、この治療導入遺伝子は、例えば、腫瘍細胞に対する全身系免疫応答を刺激することができるＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインをコードするポリヌクレオチドであるが、これに限定はされない。
【０１２３】
他の例示的殺腫瘍アデノウイルスベクターは、複製に必須のアデノウイルス遺伝子の発現が、がん細胞において選択的にトランス活性化されるＥ２Ｆ応答性プロモーターにより制御される殺腫瘍アデノウイルスベクターを含む。かくして、配列順序：左ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、終結シグナル配列、組換えウイルスベクターの複製に必須の第１遺伝子、例えばＥ１ａに作動可能的に連結されているＥ２Ｆ応答性プロモーター及び右ＩＴＲ、において含有するアデノウイルス核酸骨格を含有するベクター（公開国際出願 WO02/06786及び米国特許番号5, 998, 205参照）。
【０１２４】
他の態様では、殺腫瘍アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ遺伝子に作動的に連結されたがん選択的調節領域及びＥ４遺伝子に作動的に連結された第２がん選択的調節領域を有する。ベクターは少なくとも１つの治療導入遺伝子を運ぶこともでき、この治療導入遺伝子は、例えば、腫瘍細胞に対する全身系免疫応答を刺激することができるＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインをコードするポリヌクレオチドであるが、これに限定はされない。
【０１２５】
３．パッケージング
本発明で提供されるウイルス粒子は、当業者に知られているいかなる方法によっても製造することができる。一般に、それらは、修飾されたファィバータンパク質をコードする核酸を含有するアデノウイルスベクターを標準アデノウイルスパッケージング細胞において成長させて、修飾されたファィバーを発現する粒子を産生することにより調製される。別法として、ベクターはファィバーをコードしない。このようなベクターはプロデューサー細胞においてパッケージされて、修飾されたファィバータンパク質を発現する粒子を産生する。
【０１２６】
検討したとおり、組換えアデノウイルスベクターは、少なくとも、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ領域を含むＥ１領域と呼ばれる第一ウイルス初期遺伝子領域の欠失を有する。ウイルスＥ１領域の欠失は、組換えアデノウイルスを複製について欠陥性にしそしてその後に感染される標的細胞において感染性粒子を産生できなくする。かくして、Ｅ１欠失アデノウイルスゲノム複製を発生させそしてウイルス粒子を産生するには、欠けているＥ１遺伝子産物を与える相補のシステムが必要である。Ｅ１相補は、典型的には、２９３と呼ばれるヒト胚腎臓パッケージング細胞株、即ち、上皮細胞株の如き、Ｅ１を発現する細胞株により与えられる。細胞株２９３は、該細胞株においてＥ１欠失ウイルスの成長を「支持する」ためにＥ１遺伝子領域産物を与えるアデノウイルスのＥ１領域を含有する（例えば、Graham et al., J.Gen.Virol.36: 59〜71, 1977）。更に、アデノウイルスＥ４領域の一部を有する欠陥性アデノウイルスの産生のために使用することができる細胞株が報告された（WO96/22378）。多重に欠陥のあるアデノウイルスベクター及び相補細胞株も記載されている（WO95/34671、米国特許番号5, 994, 106）。
【０１２７】
例えば，同時係属中米国出願シリアル番号09/482, 682（2000年1月14日に出願された国際PCT出願番号PCT/EP00/00265として出願され、国際PCT出願番号WO/0042208として公表されてもいる）は、ヘルパーウイルスを必要としないでウイルスゲノムの主要な部分の欠失を有するウイルスベクターを支持するパッケージング細胞株を提供し、そしてヘルパー依存性ベクターと共に使用するための細胞株及びヘルパーウイルスも提供する。パッケージング細胞株は細胞ゲノムの染色体に安定に組み込まれた異種ＤＮＡを有する。異種ＤＮＡ配列は、複製及びパッケージされるべきアデノウイルスベクターゲノムにおいて欠失又は突然変異された遺伝子を相補する１つ又はそれ以上のアデノウイルス調節及び／又は構造ポリペプチドをコードする。パッケージング細胞株は、例えば、１つ又はそれ以上のアデノウイルス構造タンパク質、ポリペプチド、又はその断片、例えば、ペントンベース、ヘキソン、ファィバー、ポリペプチドIIIａ、ポリペプチドＶ、ポリペプチドVI、ポリペプチドVII、ポリペプチドVIII、及び生物学的に活性なその断片を発現する。発現は、構成的であるか又は調節可能なプロモーターの制御下にあることができる。これらの細胞株は、治療産物の送達を意図した組換えアデノウイルスの発現のために特にデザインされる。本発明で使用するために、このようなパッケージング細胞株は、修飾されたキャプシドタンパク質、例えば、ＨＳＰへの結合が減少させられるか又は削除されているファィバータンパク質、及び／又は修飾されたペントン及びヘキソンタンパク質を発現することができる。
【０１２８】
特定のパッケージング細胞株は、アデノウイルス構造タンパク質、調節ポリペプチドＥ１Ａ及びＥ１Ｂ、及び／又は１種又はそれより多くの下記の調節タンパク質又はポリペプチド：Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ４又はその断片をコードするＤＮＡ配列の欠失又は突然変異を有するウイルスベクターを相補する。
【０１２９】
パッケージング細胞株は、各ＤＮＡ分子を細胞に導入し、次いで別の相補プラスミドを介してゲノムに導入することにより産生され、又は相補タンパク質をコードする複数のＤＮＡ分子を単一の相補プラスミドを介して導入することができる。本発明で興味深いのは、相補プラスミドがサブグループＤのＡｄウイルス、例えばＡｄ３７からのアデノウイルスファィバータンパク質（又はそのキメラもしくは修飾された変異体）、ポリペプチド又はその断片をコードするＤＮＡを含む変異である。
【０１３０】
適用、例えば治療に適用するために、送達プラスミド（delivery plasmid）は更に異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例示的送達プラスミドはｐＤＶ４４、ｐΔＥ１Ｂβ−ｇａｌ及びｐΔＥ１ｓｐ１Ｂを含むがそれらに限定はされない。同様な又は類似した方法で、治療用核酸、例えば、治療用の遺伝子をコードする核酸を導入することができる。
【０１３１】
細胞は、更に、本発明で意図したファィバーをコードする相補プラスミドを含み、該プラスミド又はその一部は細胞の細胞ゲノムの染色体（１つ又は複数）に組み込まれる。
【０１３２】
典型的には、パッケージング細胞株は、細胞ゲノムの染色体（１つ又は複数）に安定に組み込まれた、ファィバータンパク質又は修飾されたファィバータンパク質をコードする核酸を含有するであろう。パッケージング細胞株は、原核細胞株又は真核細胞株から誘導することができる。種々の態様は哺乳動物細胞、更に特定的には上皮細胞株の使用を示唆しているが、非上皮細胞株が種々の態様で使用される。かくして、種々の態様は２９３、Ａ５４９、Ｗ１６２、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、２１１及び２１１Ａ細胞株から選ばれる細胞株の使用を開示しているが、このような使用に適当ないかなる他の細胞株も同様に本発明において考慮される。
【０１３３】
Ｄ．ターゲッティングリガンドの付加
本発明に記載されている脱ターゲッティングされているウイルス粒子は、キャプシドに適当なターゲッティングリガンドを含ませることにより選ばれた細胞及び／又は組織に再ターゲッティングさせることができる。リガンドはキャプシドタンパク質、例えば、ファィバー、ヘキソン及びペントンのいずれかに含ませることができる。ａをコードする核酸を含ませるための座は種々のアデノウイルス血清型について当業者に知られており、必要ならば、適当な座及び他のパラメーターを経験的に決定することができる。
【０１３４】
リガンドは、キャプシドタンパク質をコードする核酸においてコーディング配列を含ませることにより融合物として産生することができ、又は例えばイオン性、共有結合又は他の相互作用によりキャプシドに化学的にコンジュゲートさせるか（conjugated）又はキャプシドに結合させる（bound）（Ａｂ−リガンド融合（ここでＡｂはキャプシドタンパク質に結合する）により、あるいはジスルフィド結合又は他の架橋部分もしくは化学により）ことができる。
【０１３５】
かくして、例えば、修飾されたファィバー核酸は、キャプシドにターゲッティングリガンドを含むウイルス粒子を産生するために、ターゲッティングリガンドをコードするヌクレオチドの配列を含むこともできる。ターゲッティングリガンド及びウイルスキャプシドにこのようなリガンドを含ませるための方法は周知されている。例えば、ファィバータンパク質にターゲッティングリガンドを含ませるのは、米国特許番号5, 543, 328及び5, 756, 086並びに米国公開出願番号20020137213として公表された米国出願シリアル番号09/870, 203及び国際特許出願番号PCT/EP01/06286に記載されている。アデノウイルスの種々の血清型及び株について、ターゲッティングリガンドを挿入するための座は実験的に決定することができる。種々の血清型及び株について、このような座は変わることができる。
【０１３６】
アデノウイルスファィバーは３量体構造を有するので、リガンドは、各成熟ファィバーについて３つまでのリガンドの分子が存在するように３量体構造を有するように選ばれるか又はデザインされることができる。このようなリガンドは当該技術分野で知られた方法を使用してファィバータンパク質に組み込むことができる（例えば、米国特許番号5, 756, 086参照）。ファィバーの代わりに、ターゲッティングリガンドはペントン又はヘキソンタンパク質に含ませることができる。ペントンにターゲッティングリガンドを含ませること（例えば、米国特許番号5, 731, 190及び5, 965, 431参照）及びヘキソンにターゲッティングリガンドを含ませること（例えば、米国特許番号5, 965, 541参照）は知られている。
１つの例示的態様では、リガンドは、本発明に記載のように突然変異されたファィバータンパク質であるファィバータンパク質に含まれる。本発明で示されたとおり、ターゲッティングリガンドは、例えば、ファィバータンパク質のＨＩループ内に含ませることができる。ＨＩループに適合しそしてなお機能的ウイルスを与えることができるいかなるリガンドも本発明で考慮される。このようなリガンドは、８０〜１００アミノ酸の長さであることができ又はそれより長くてもよい。（例えば、Belousova et al.(2002)J.Virol.76: 8621〜8631）。このようなリガンドは当該技術分野で知られている技術により付加される（例えば、公開された国際特許出願公開番号WO99/39734及び米国特許出願番号09/482, 682参照）。他のリガンドは当業者に知られている技術により発見されうる。これらの技術の非限定的な例は、ファージディスプレーライブラリー又は他のタイプのライブラリーをスクリーニングすることを含む。
【０１３７】
ターゲッティングリガンドは、アデノウイルス粒子を所望の細胞型及び／又は組織に優先的に方向付けるいかなる化学的部分も含む。このようなリガンドの種類はペプチド、ポリペプチド、一本鎖抗体及び多量体タンパク質を含むが、これらに限定はされない。特異的リガンドは、腫瘍壊死因子（又はＴＮＦ'ｓ）、例えば、ＴＮＦα及びＴＮＦβ、リンホトキシン（ＬＴ）、例えば、ＬＴ−α及びＬＴ−β、Ｆａｓ抗原に結合するＦａｓリガンド；Ｂリンパ球のＣＤ４０受容体に結合するＣＤ４０リガンド；ホジキンリンパ腫の新生物細胞のＣＤ３０受容体に結合するＣＤ３０リガンド；ＣＤ２７リガンド；ＮＧＦリガンド及びＯＸ−４０リガンドを含むリガンドのＴＮＦスーパーファミリー、腫瘍細胞、活性化されたT細胞及び神経組織細胞上に位置したトランスフェリン受容体に結合するトランスフェリン；肝細胞のＬＤＬ受容体に結合するＡｐｏＢ；肝細胞のＬＲＰ受容体に結合するα−２−マクログロブリン；肝臓のアシアログリコプロテイン受容体に結合するα−Ｉ酸性糖タンパク質；マクロファージのマンノース受容体に結合するマンノース含有ペプチド；活性化された内皮細胞のＥＬＡＭ−Ｉ受容体に結合するシアリル−ルイス−Ｘ抗原含有ペプチド；造血前駆体細胞のＣＤ３４受容体に結合するＣＤ３４リガンド；リンパ球のＬＦＡ−Ｉ（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）受容体又はマクロファージのＭａｃ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）受容体に結合するＩＣＡＭ−Ｉ；脾臓及び骨髄マクロファージのｃ−ｆｍｓ受容体に結合するＭ−ＣＳＦ；肝細胞の肝熱帯熱マラリア原虫受容体に結合するサーカムスポロゾイトタンパク質（circumsporozoite protein）；活性化された内皮細胞のＶＣＡＭ−Ｉ受容体に結合するＶＬＡ−４；Ｔヘルパー細胞のＣＤ４受容体に結合するＨIVｇｐ１２０及びＣｌａｓｓIIＭＨＣ抗原；アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）分子のＬＤＬ受容体結合領域；ＣＳＦ受容体に結合するコロニー刺激因子又はＣＳＦ；インシュリン様成長因子、例えば、それぞれ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−II受容体に結合するＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−II；それぞれ、インターロイキン１〜１４受容体に結合するインターロイキン１〜１４；免疫グロブリンのＦｖ抗原結合ドメイン；ゼラチナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤；ボンベシン、ガストリン放出ペプチド；サブスタンスＰ；ソマトスタチン；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；バソアクチブペプチド（VIＰ）；ガストリン；メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）；環状ＲＧＤペプチド及びすべての他のリガンド又は細胞表面結合（ターゲッティング）分子を含む。
【０１３８】
Ｅ．異種ポリヌクレオチド及び治療用核酸
パッケージされたアデノウイルスゲノムは関心のある産物、例えば治療用のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含有することもできる。異種ポリヌクレオチドを含有するアデノウイルスゲノムは周知されている（例えば、米国特許番号5, 998, 205、6, 156, 497、5, 935, 935及び5, 801, 029参照）。これらは、異種ポリヌクレオチドの産物又は異種ポリヌクレオチドのインビトロ及びインビボ送達のために使用することができる。
【０１３９】
かくして、本発明で提供されるアデノウイルス粒子を使用して細胞を、そうしなければ細胞が発現しないか又は十分な量で発現しないタンパク質を発現するように、工学的に作り出すことができる。この遺伝子工学は、所望の細胞を、アデノウイルス粒子であってそのゲノムが所望の異種ポリヌクレオチドを含むアデノウイルス粒子で感染させることにより達成される。次いで異種ポリヌクレオチドを遺伝子工学的に作り出された細胞において発現させる。本発明の使用では、細胞は一般に哺乳動物の細胞であり、そして典型的にはヒト細胞を含む霊長類の細胞である。細胞は動物の身体の内にあるか（インビボ）又は身体の外側にある（インビトロ）ことができる。異種ポリヌクレオチド（異種核酸配列とも呼ばれる）は粒子内のアデノウイルスゲノム内に含まれそして当該技術分野で知られている技術によりそのゲノムに付加される。興味あるいかなる異種ポリヌクレオチドも付加することができ、例えば、米国特許番号5, 998, 205に開示された異種ポリヌクレオチドを付加することができる。この特許は参照により本発明に組み込まれる。Ａｄゲノム又はベクターに導入されるポリヌクレオチドは興味あるタンパク質をコードするか又は調節配列であるいかなるポリヌクレオチドであってもよい。タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、免疫刺激タンパク質、例えば、インターロイキン、インターフェロン又はコロニー刺激因子、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、例えば、５，９０８，７６３Ｆ参照）を含むが、これらに限定はされない。一般に、このようなＧＭ−ＣＳＦは、ヒトＧＭ−ＣＳＦを含む霊長類ＧＭ−ＣＳＦである。他の免疫刺激遺伝子は、サイトカインＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＦＮ、ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ１２、ＩＬ１８及びｆｌｔ３、免疫細胞との相互作用を刺激するタンパク質（Ｂ７、ＣＤ２８、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ、ＭＨＣｃｌａｓｓII、ＴＡＰｓ）、腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１からの免疫原性配列、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラノサイト刺激ホルモン受容体、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０１、−フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、がん胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、テロメラーゼ逆転写酵素及びＰＳＭＡ）、抑制シグナルをブロックする（ＣＴＬＡ４妨害）抗体のｃＤＮＡｓ、ケモカイン（ＭＩＰ１、ＭＩＰ３、ＣＣＲ７リガンド及びカルレティキュリン）及び他のタンパク質、をコードする遺伝子を含むが、それらに限定はされない。
【０１４０】
治療用核酸、例えば興味ある治療用遺伝子を含む他のポリヌクレオチドは、抗血管新生遺伝子及び自殺遺伝子を含むが、それらに限定はされない。抗血管新生遺伝子は、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳ断片、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチン断片、ＰＥＤＦ、バソスタチン（vasostatin）、細胞外マトリックスタンパク質の種々の断片及び成長因子／サイトカイン阻害剤をコードする遺伝子を含むが、これらに限定はされない。細胞外マトリックスタンパク質の種々の断片は、アンギオスタチン（angiostatin）、エンドスタチン（endostatin）、キニノスタチン（kininostatin）、フィブリノーゲンＥ断片、トロンボスポンジン、タムスタチン（tumstatin）、カンスタチン（canstatin）及びレスチン（restin）を含むが、それらに限定はされない。成長因子／サイトカイン阻害剤は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、アンギオポイエチン／ティアンタゴニスト（angiopoietin/tie antagonist）、ｓＴｉｅ−２、ケモカイン（ＩＰ−１０、ＰＦ−４、Ｇｒｏ−β、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｇ）、ＩＦＮ、ＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニスト（ｓＦＧＦＲ）、Ｅｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈアンタゴニスト（ｓＥｐｈＢ４及びｓｅｐｈｒｉｎＢ２）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ及びＩＧＦ−１を含むが、それらに限定はされない。
【０１４１】
「自殺遺伝子」は、ジフテリアトキシンＡの発現の場合と同じく、細胞を死に導くことができるタンパク質をコードするか、又はタンパク質の発現は細胞をある種の医薬品に選択的に感受性にすることができ、例えば、ヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）の発現は、細胞を抗ウイルス性化合物、例えば、アシクロビル、ガンシクロビル及びＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）に感受性にする。他の自殺遺伝子は、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、シトクロムＰ４５０（ｃｙｔ−４５０）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ−ＴＫ）及びキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードする遺伝子を含むが、それらに限定はされない。あるいは、治療用核酸は、例えば、アンチセンスメッセージもしくはリボザイム、スプライシングもしくは３′プロセシング（例えばポリアデニル化）に影響を与えるタンパク質、又は例えば、ｍＲＮＡ蓄積速度の変更、ｍＲＮＡ輸送の変更及び／又は転写後の調節の変化を媒介することにより、細胞内の他の遺伝子の発現のレベルに影響を与えるタンパク質をコードすることによって、ＲＮＡのレベルでその効果を及ぼすことができる。ウイルスへの治療用核酸の付加は、追加の抗腫瘍作用機構を持つウイルスを生じさせる。かくして、単一体（即ち、治療用導入遺伝子を担うウイルス）で多重抗腫瘍機構を誘発することができる。他のコードされたタンパク質は、安全スイッチとして有用なヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）（１９９７年１１月１９日に出願され、PCT国際番号WO/9925860として公開された米国公開番号08/974, 391参照）、Ｎｏｓ、ＦａｓＬ及びｓＦａｓＲ（可溶性Ｆａｓ受容体）を含むが、それらに限定はされない。
【０１４２】
相乗性、相補性の及び／又はオーバーラップしない毒性を有する２つ又はそれより多くの導入遺伝子の組み合わせ及び作用の方法も考慮される。得られるアデノウイルスは、ウイルス殺腫瘍機能を保持することができ、そして、例えば、更に、免疫応答及び抗血管新生応答及び他の所望される応答を誘発する能力を与えられる。
【０１４３】
治療ポリヌクレオチド及び異種ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はタンパク質のレベルで効果を及ぼすそれらのポリヌクレオチドも含む。これらは、アポトーシスを開始することができる因子、他の能力の中でも特に、増殖に必須のタンパク質、例えば、構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼをコードするｍＲＮＡに向けることができるＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ及び他の二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス及びリボザイム、細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子、ヌクレアーゼ（例えばＲＮアーゼＡ）又はプロテアーゼ（例えば、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫ及びカルボキシペプチダーゼ）の工学的に作り出された細胞質変異体をコードする遺伝子を含む。他のポリヌクレオチドは細胞もしくは組織特異的プロモーター、例えば、殺腫瘍アデノウイルスに使用されるこれら（例えば、米国特許番号5, 998, 205参照。）を含む。
【０１４４】
ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドはコーディング領域に作動的に連結されたプロモーターを含有することもできる。一般に、プロモーターは、調節されたプロモーター及び転写因子発現システム、例えば公表されたテトラサイクリンで調節されたシステム、又はコードされたポリペプチドの調節された発現を可能にするための他の調節可能なシステム（ＷＯ０１／３０８４３）である。他のプロモーターの例は、組織選択性プロモーター、例えば米国特許番号5, 998, 205に記載の組織選択性プロモーターである。例示的な調節可能なプロモーターシステムはＴｅｔ−Ｏｎ（及びTet-Off(Clontech(Palo Alto, CA）から現在入手可能なシステム）である。このプロモーターシステムは、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体、例えば、ドキシサイクリンにより制御された導入遺伝子の調節された発現を可能にする。このシステムは、本発明で提供されるウイルス粒子及び核酸におけるコードされたポリペプチドの発現を制御するのに使用することができる。他の調節可能なプロモーターシステムが知られている（例えば、リガンド結合ドメイン及び転写調節ドメイン、例えばホルモン受容体からのこれら、を含有する遺伝子スイッチを説明している、“Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches”と題する公開された米国番号20020168714参照）。使用することができる他の適当なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター及び／又はＥ３プロモーター；又は異種プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター、例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；及びＡｐｏＡＩプロモーターを含むがそれらに限定はされない。
【０１４５】
治療用導入遺伝子は、ウイルス構築物及び得られる粒子に含ませることができる。これらの中でも特に、「突起付き」ウイルス（“armed” virus）を生じさせる遺伝子である。例えば、本発明で説明した或る態様におけるようにＥ３領域を欠失させるよりはむしろ、殺腫瘍アデノウイルスベクター（上記した）においてＥ３領域のすべて又は一部を保存させるか又は再挿入することができる。Ｅ３領域のすべて又は一部の存在は、アデノウイルスベクターの免疫原性を減少させることができる。それはまた腫瘍細胞における細胞変性効果を増加させそして正常細胞に対する毒性を減少させる。典型的には、このようなベクターはＥ３タンパク質の半分より多くを発現する。
【０１４６】
ヒトの治療のためのアデノウイルスを含む治療用アデノウイルスは知られている。このような既知のウイルスは、ＨＳＰｓ及び場合により追加の受容体との相互作用を減少させるか又は削除するように、本発明で提供されるように修飾することができる。ウイルス粒子を産生するのに使用されるアデノウイルスベクターは他の修飾を含むことができる。修飾は、アデノウイルスベクターを作るために粒子にパッケージされるアデノウイルスゲノムに対する修飾を含む。上記したとおり、様々な修飾を有するアデノウイルスベクター及び粒子が入手可能である。アデノウイルスベクターに対する修飾は、当該技術分野で知られている欠失、例えば、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３又はＥ４コーディング領域の１つ以上における欠失を含む。これらのアデノウイルスはときには初期世代アデノウイルスと呼ばれ、アデノウイルスゲノムのコーディング領域のすべての欠失を伴うアデノウイルス（前記した「ガットレス」アデノウイルス）を含み、そして複製条件付きアデノウイルスも含む。該複製条件付きアデノウイルスは、複製に必須のアデノウイルス遺伝子を異種プロモーターの制御の下に置く結果としてあるタイプの細胞又は組織では複製するが、他のタイプの細胞又は組織では複製しないウイルスである（前記した。米国特許番号5, 998, 205、米国特許番号5, 801, 029、米国特許出願番号60/348, 670及び対応する公表された国際PCT出願番号WO02/06786も参照）。これらは、前記した殺腫瘍ウイルスを含む、細胞溶解性、細胞変性ウイルス（又はベクター）を含む。
【０１４７】
あるいは、前記した如く、ベクターはＥ１ｂ遺伝子において突然変異又は欠失を含むことができる。典型的には、Ｅ１ｂ遺伝子におけるこのような突然変異又は欠失は、Ｅ１ｂ−１９ｋＤタンパク質が非機能的となるような突然変異又は欠失である。Ｅ１ｂ領域のこの修飾は、Ｅ３領域のすべて又は一部が存在するベクターと組み合わせることができる。
【０１４８】
殺腫瘍アデノウイルスベクターは、少なくとも１つの異種コーディング配列、例えは、治療産物をコードする異種コーディング配列を更に含むことができる。異種コーディング配列、例えば、治療用遺伝子は、一般に、必ずしもそうではないけれども、ｃＤＮＡの形態にあり、そしてベクターの感染性又は複製に不利に影響しないいかなる座にも挿入することができる。例えば、それは、Ｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、１９ｋＤ又は１４．７ｋＤＥ３遺伝子の少なくとも１つの代わりにＥ３領域に挿入することができる。
【０１４９】
Ｆ．増殖及びスケールアップ
ファィバー及び／又はペントンキャプシドタンパク質において突然変異を含有する二重に機能破壊されたアデノウイルスベクターは、ＣＡＲ／αvインテグリン侵入経路を介する効果のない細胞結合及び侵入をもたらすので、スケールアップ技術はこのようなベクターの増加及び増殖を改良して臨床的使用のために高力価のアデノウイルスベクターを産生する。かくして、脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの産生をスケールアップするための方法も提供される。脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターは、該ベクターと少なくとも１つの宿主細胞受容体との相互作用を、野生型アデノウイルスベクターと比べて、機能破壊するように修飾されたアデノウイルスベクターを含む。脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターは、該ベクターと１つ、２つ、３つ又はそれ以上の宿主細胞受容体との相互作用を機能破壊するように修飾されたアデノウイルスベクターを含むことができる。かくして、この方法は本発明で開示された脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターを産生するのに適当である。
【０１５０】
認められるとおり、二重に及び完全に機能破壊されたアデノウイルスベクターの成長及び増殖は新規なスケールアップ技術により高められる。二重に機能破壊されたベクターは、ＣＡＲ及びインテグリンを使用する正常な細胞侵入経路を介する効果のない細胞結合及び侵入をもたらすファィバー及びペントンキャプシドタンパク質における突然変異を含有する。これらのベクターはインビトロで完全に脱ターゲッティングされ、したがって、別の細胞侵入ストラテジーが高力価の調製物の効率的な増殖及び発生を可能にする。
【０１５１】
ファィバー及び／又はペントン修飾により脱ターゲッティングされたベクターをスケールアップするための２つのストラテジーが考えられてきた。これらは、（ａ）ベクター上に表示されたリガンドに結合する表面受容体を発現するように工学的に作り出された偽受容体細胞株の使用（例えば、国際PCT出願番号WO98/54346参照）及び（ｂ）天然のファィバーを発現するように工学的に作り出される並びに天然のファィバー及びペントンを発現するように工学的に作り出すことができる相補細胞株（例えば国際PCT出願番号WO00/42208参照）を含む。これらのシステムは機能破壊されたアデノウイルスベクターのスケールアップに対する見込みを示したけれども、治療に使用するために完全に脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの簡単で効率的な産生のためのシステムを開発する必要がある。
【０１５２】
脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの増殖のためのスケールアップ方法が本発明で提供される。この方法は、組織培養培地に加えられると、アデノウイルス粒子に結合しそしてそれらの侵入をプロデューサー細胞に向けるポリカチオン及び／又は二官能性試薬を使用する。
【０１５３】
試薬（培地添加剤とも呼ばれる）は、脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターで感染されるべきプロデューサー細胞を含有する組織培養培地に含ませることができる。あるいは、試薬をウイルスと前混合することができ、この混合物を次いで組織プロデューサー細胞に加える。試薬は、プロデューサー細胞を含有する組織培養培地に加えることができ、又は試薬を含有する組織培養培地にプロデューサー細胞を加えることができる。当業者に知られているいかなる適当なプロデューサー細胞も本方法において使用することができる。試薬は、プロデューサー細胞が脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターで感染されるのと同時に加えることができる。一般に、試薬は、脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターによる感染の前に組織培養培地中に存在させる。この培地添加剤は、ベクターの増加、増大及び増殖期間中、組織培養培地中に維持される。この方法により高力価収量のアデノウイルスベクターが得られる。
【０１５４】
この方法において有用な試薬はアデノウイルス粒子の侵入をプロデューサー細胞に方向付けことができる試薬である。このような試薬はポリカチオン及び二官能性試薬を含むが、それらに限定はされない。適当なポリカチオンは、ポリエチレンイミン；  プロタミンサルフェート；  ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩；  ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリド（Merquat(r)-100、Merquat(r)280、Merquat(r)550）；  ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩；  ポリ−Ｌ−ヒスチジン；  ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（４−ビニルピリジン）塩酸塩；  架橋されたポリ（４−ビニルピリジン）、メチルクロリド第四級塩；  ポリ（４−ビニルピリジン−コ−スチレン）；  ポリ（４−ビニルピリジニウムポリ（フッ化水素））；  ポリ（４−ビニルピリジニウム−Ｐ−トルエンスルホネート）；  ポリ（４−ビニルピリジニウム−トリブロミド）；  ポリ（４−ビニルピロリドン−コ−２−ジメチルアミノ−エチルメタクリレート）；  ポリビニルピロリドン、架橋された；  ポリビニルピロリドン、ポリ（メラミン−コ−ホルムアルデヒド）；  部分的にメチル化された；  ヘキサジメトリンブロミド；  ポリ（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）１：４臭化水素酸塩；  ポリ（Ｌｙｓ，Ａｌａ）３：１臭化水素酸塩；  ポリ（Ｌｙｓ，Ａｌａ）２：１臭化水素酸塩；  スクシニル化されたポリ−Ｌ−リシン；  ポリ（Ｌｙｓ，Ａｌａ）１：１臭化水素酸塩及びポリ（Ｌｙｓ，Ｔｒｐ）１：４臭化水素酸塩を含むが、それらに限定はされない。
【０１５５】
適当な二官能性試薬は、アデノウイルスキャプシドに結合しそしてプロデューサー細胞の特異的細胞表面受容体との相互作用できるリガンドも含有する抗体又はペプチドを含むが、それらに限定はされない。二官能性試薬の例は、（ａ）抗ファィバー抗体リガンド融合物、（ｂ）抗ファィバー−Ｆａｂ−ＦＧＦコンジュゲート物、（ｃ）抗ペントン抗体リガンド融合物、（ｄ）抗ヘキソン抗体リガンド融合物及び（ｅ）ポリリシン−ペプチド融合物を含むが、それらに限定はされない。リガンドは、プロデューサー細胞上に見出されるいずれの細胞表面受容体にも結合するすべてのリガンドである。
【実施例】
【０１５６】
下記の実施例は説明する目的でのみ与えられ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１５７】
実施例１
ファィバーＡＢループ、ＫＯ１及びペントン、ＰＤ１突然変異及びその誘導体を含有するＡｄ５ベクターの構築
ＫＯ１ファィバー又はＰＤ１ペントンベース突然変異を単独で又は組み合わせて含有する３つの組換えアデノウイルスベクターを調製し、これらのベクターはＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１、Ａｖ１ｎＢｇＰＤ１及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１と名付けられた。これらのベクターの構築は下記に説明されそして各ベクターの一般的説明は表１に示される。
【０１５８】
【表１】
2006500902.tif 000002
【０１５９】
Ａｖ１ｎＢｇ
これは周知のベクターであり、その配列は配列番号４３に記載されている。
Ａｖ３ｎＢｇ
これは周知のベクターであり、その配列は配列番号４４に記載されている。
Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１
Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を発生させるためのＫＯ１ファィバー突然変異の遺伝子組み込み
アデノウイルス血清型５ゲノムに基づくＥ１、Ｅ２ａ、Ｅ３欠失骨格においてアデノウイルスベクターＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を発生させた。それは、Ｅ１領域の代わりにＲＳＶプロモーター付き核局在化β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。更に、ファィバー遺伝子はＫＯ１突然変異を含有する。この突然変異は、それぞれ、セリン及びプロリンからグルタミン酸及びアラニンに変えるアミノ酸４０８及び４０９の置換を生じさせる。
【０１６０】
ベクターは下記の如くして構築された。最初に、プラスミドｐＳＫＯ１（図１）を制限酵素ＳｐｈＩ及びＭｕｎＩで切断した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルでの電気泳動により分離した。ファィバー遺伝子の５′末端を除くすべてを含有する１６０１ｂｐ断片をアガロースゲルから切り取りそしてＤＮＡを単離しそして精製した。次いで、断片を、ＳｐｈＩ及びＭｕｎＩで切断されたｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＲＧＤの９２３６ｂｐの断片と連結した。得られたプラスミドｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＫＯ１をＳｐｅＩ及びＰａｃＩで切断し、そしてファィバー遺伝子を含有する６８６７ｂｐの断片を単離した。断片をｐＮＤＳＱ３．１の２４，６３０ｂｐＳｐｅＩ−ＰａｃＩ断片と連結した。得られたプラスミドｐＮＤＳＱ３．１ＫＯ１（図２））をｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ（図３Ａ）と一緒に使用して完全な長さのアデノウイルスベクターゲノムをコードするプラスミドを作製した。しかしながら、最終プラスミドが５′ＩＴＲに隣接した唯一のＰａｃＩ部位を含有するように、ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ（図３Ａ）との組換えの前にｐＮＤＳＱ３．１ＫＯ１（図２）からＰａｃＩ部位を除去することが必要であった。ｐＮＤＳＱ３．１ＫＯ１のＰａｃＩ部位をＰａｃＩによる切断により除去し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化及び再連結を行った。得られたプラスミドはｐＮＤＳＱ３．１ＫＯ１（Ｐａｃと呼ばれた。
【０１６１】
全体のアデノウイルスゲノムを含有する完全な長さのプラスミドを作製させるために、ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ（図３Ａ）をＳａｌＩで切断しそして、ＢｓｔＢＩで切断されたｐＮＤＳＱ３．１ＫＯ１ΔＰａｃと共に大腸菌株ＢＪ５１８３のコンピテント細胞に共トランスフェクションした。２つのプラスミド間の相同的組換えは全体のアデノウイルスゲノムをコードする完全な長さのプラスミドを発生させ、これはｐＦＬＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１と呼ばれた。
【０１６２】
ｐＦＬＡｖ３ｎＢｇＫＯ１をＰａｃＩで線状化しそして６３３細胞にトランスフェクションした。ファィバー相補６３３細胞株では、ＫＯ１突然変異を含有する得られたウイルスＤＮＡは、野生型ファィバー及び突然変異ファィバータンパク質の混合物を含有する感染性ウイルス粒子にパッケージされることができる。６３３細胞における５回の増幅の後、細胞変性効果を観察した。６３３細胞でもう３回の増幅を行い、次いで標準ＣｓＣｌ遠心方法によりウイルスを精製した。このウイルス調製物を使用して、ファィバーを発現しないＡＥ１−２ａ細胞を感染させた。得られたウイルスはそのキャプシドに突然変異体ファィバータンパク質のみを含有していた。ウイルス粒子を標準ＣｓＣｌ遠心方法により精製した。
【０１６３】
Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１
ベクターＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１を上記したＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１と同様にして作成する。
Ａｖ１ｎＢｇＫＯ１２
追加のファィバーＡＢループ突然変異（Einfeld et al.(2001)J.Virology 75: 11284〜11291により記載された）をＡｖ１ｎＢｇのゲノムに組み込んだ。このＡＢループ突然変異は４つのアミノ酸置換、Ｒ５１２Ｓ、Ａ５１５Ｇ、Ｅ５１６Ｇ及びＫ５１７Ｇであり、そしてＫＯ１２と呼ばれる。ＫＯ１２突然変異は、鋳型としてプラスミドｐＳＱ１（図３Ｂ）を使用してＰＣＲ遺伝子オーバーラップ伸長反応によりファィバー遺伝子に組み込まれた。ｐＳＱ１プラスミドは、ｐＢＲ３２２骨格において塩基対３３２９から右ＩＴＲまで延びているＡｄ５ゲノムの大部分を含有する。最初に、Ｅ３領域内からファィバー遺伝子へと延びているＡｄ５ゲノムのセグメントを、下記の５ＦＦ：５′−ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＧＡ−３′  配列番号４）及び５ＦＲ：５′−ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  Ｇ−３′（配列番号６）と名付けたプライマーを用い、鋳型としてプラスミドｐＳＱ１を使用するＰＣＲにより増幅させた。プライマー５ＦＲは、５１２から５１７までの修飾されたファィバーＡＢループアミノ酸をコードする１８塩基の５′伸長部を含有する。鋳型としてｐＳＱ１を使用する第二ＰＣＲは、ＡＢループ置換のすぐ３′のそしてファィバー遺伝子停止コドンの４０塩基対３′に位置したＭｕｎＩ部位を通り過ぎて延びている領域を増幅した。この反応のために使用された２つのプライマーは、３ＦＦ：５′−ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＣ−３′（配列番号７）及び３ＦＲ：５′−ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＧＧ−３′（配列番号８）であった。プライマー３ＦＲは、５１２から５１７までの修飾されたファィバーＡＢループアミノ酸をコードする１８塩基対の５′伸長部を含有する。予想されたサイズの増幅された産物が得られ、そしてエンドプライマー（end primer）５ＦＦ及び３ＦＲを用いる第二ＰＣＲに使用されて断片を互いに連結した。ＫＯ１２ＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断し、ファィバーシャトルプラスミド、ｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）に直接クローニングして、ｐＳＱ１の８．８ｋＢ  ＥｃｏＲＩ断片を含有するプラスミドｐＦＢＳＥＫＯ１２を作製した。ｐＦＢＳＥＫＯ１２プラスミドをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで切断しそしてスリーウエイ連結（three-way ligation）を使用してｐＳＱ１にクローニングしてｐＳＱ１ＫＯ１２（図３Ｃ）を作製した。ＫＯ１２ｃＤＮＡを、ＣｌａＩで線状化されたｐＳＱ１ＫＯ１２とＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇとの相同的組換えにより、β−ガラクトシダーゼをコードしているＥ１及びＥ３が欠失したアデノウイルスベクター、Ａｖ１ｎＢｇのゲノムに組み込んで、Ａｖ１ｎＢｇＫＯ１２を作製した。該ＫＯ１２ベクターを６３３細胞にトランスフェクションし、ファィバーを発現しない細胞でスケールアップし、そしてＫＯ１について上記したとおりに精製した。
【０１６４】
Ａｖ１ｎＢｇＰＤ１
Ａｖ１ｎＢｇＰＤ１を作製するためのＰＤ１ペントン突然変異の遺伝子組み込み
アデノウイルスベクターＡｖ１ｎＢｇＰＤ１は、アデノウイルス血清型５のゲノムに基づくＥ１、Ｅ３欠失ベクターである。それは、Ｅ１領域にＲＳＶプロモーター付き核局在化β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有しそしてペントン遺伝子におけるＰＤ１突然変異も含有する。ＰＤ１突然変異は、ペントンタンパク質の３３７から３４４までのアミノ酸、ＨＡＩＲＧＤＴＦ（配列番号９）の、アミノ酸ＳＲＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＴＳ（配列番号１０）による置換を生じさせ、かくしてＲＧＤトリペプチドを置き換える（Einfeld et al.(2001)J.Virology 75: 11284〜11291参照）。ペントン遺伝子における突然変異は、アデノウイルス血清型５のペントン遺伝子を含有するプラスミドｐＧＥＭｐｅｎ５において作製した。突然変異を発生させるために、４つのオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの配列は下記のとおりであった：ペントン１：５′ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ３′（配列番号１１）；  ペントン２：５′ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣ  ３′（配列番号１２）；  ペントン３：５′ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ３′（配列番号１３）；  ペントン４：５′ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＴＡＧ  ＧＧＧ  ＴＡＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  Ｃ３′（配列番号１４）。相補性オリゴヌクレオチドペントン１及びペントン２を互いにアニーリングし、ペントン３及びペントン４も同様にした。ペントン３とペントン４をアニーリングすることにより発生した二本鎖は上記した３３７から３４４までのアミノ酸の置換をコードしていた。ペントン１とペントン２をアニーリングすることにより発生した二本鎖は、ペントン３とペントン４とをアニーリングすることにより発生した二本鎖における５塩基の５′突き出し部（overhang）にうまく合う５塩基の５′突き出し部を有していた。ペントン１とペントン２をアニーリングすることにより発生した二本鎖の反対側端部はＥａｒＩにうまく合う突き出し部を有していた。ペントン３とペントン４をアニーリングすることにより発生した二本鎖の反対側端部はＢｂｖＣＩにうまく合う突き出し部を有していた。２つの二本鎖を互いに連結しそして下記のようにｐＧＥＭｐｅｎ５骨格に連結した。最初に、ｐＧＥＭｐｅｎ５をＢｂｖＣＩ及びＰｓｔＩで切断し、得られるＤＮＡ断片をアガロースゲルでの電気泳動により分離した。３３６０ｂｐの断片をゲルから切り取りそして精製した。プラスミドｐＧＥＭｐｅｎ５をＰｓｔＩ及びＥａｒＩによっても切断し、そして得られる断片をアガロースゲルでの電気泳動により分離した。９５５ｂｐの断片をゲルから切り取りそして精製した。ｐＧＥＭｐｅｎ５プラスミドからのこれらの２つの断片を２対のアニーリングされたオリゴヌクレオチドで連結して、プラスミドｐＧＥＭｐｅｎ５ＰＤ１を作製した。
【０１６５】
突然変異されたペントン遺伝子を下記の如くファイブウエイ連結（5-way ligation）を使用してｐＧＥＭｐｅｎ５ＰＤ１からｐＳＱ１に移した。最初にＰＤ１突然変異を含有するペントン遺伝子の領域をＰｖｕＩ及びＡｓｃＩによる切断によりｐＧＥＭｐｅｎ５ＰＤ１から切り取った。ＰＤ１突然変異を含有する９７４ｂｐの断片を精製した。４つのＤＮＡ断片を下記の如くしてｐＳＱ１プラスミド（図３Ｂ）から調製した。このプラスミドをＣｓｐ４５Ｉ及びＦｓｅＩで切断しそして９４６５ｂｐの断片を精製した。更に、ｐＳＱ１をＦｓｅＩ及びＰｖｕＩで切断しそして２１２６ｂｐの断片を精製した。プラスミドｐＳＱ１をＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩで切断しそして５８９１ｂｐの断片を精製した。最後にｐＳＱ１をＢａｍＨＩ及びＣｓｐ４５Ｉで切断しそして１４６１０ｂｐの断片を精製した。５つの精製したＤＮＡ断片を互いに連結してプラスミドｐＳＱ１ＰＤ１（図４）を形成した。
【０１６６】
アデノウイルスベクターを作製するために、ｐＳＱ１ＰＤ１をＣｌａＩによる切断により線状化し、そしてＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ（図３Ａ）と共にＰｅｒＣ６細胞に共トランスフェクションした。ヘキサジメトリンブロミドを培地中で４μg/mlに維持した。細胞変性効果が観察されたとき、粗ウイルス溶解液をｐｅｒＣ６細胞上に更に広げた。ウイルスを標準ＣｓＣｌ遠心法により精製した。
【０１６７】
Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１
Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１を作製するためのペントンＰＤ１突然変異と組み合わたファィバーＫＯ１又はＫＯ１２突然変異の遺伝子組み込み
アデノウイルスベクターＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１及びＡｖ１ｎＢｇＫＯ１２ＰＤ１をＥ１、Ｅ３欠失アデノウイルス血清型５ゲノムにおいて作製した。両ベクターはＥ１領域にＲＳＶプロモーター付き核局在化β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有しそしてファィバー遺伝子においてＫＯ１又はＫＯ１２突然変異のいずれか及びペントン遺伝子においてＰＤ１突然変異も含有する。これらのベクターは下記の如く構築された。最初に、プラスミドｐＳＱ１ＰＤ１をＣｓｐ４５Ｉ及びＳｐｅＩで切断し、そしてＰＤ１突然変異されたペントン遺伝子を含有する２３９７６ｂｐの断片を精製した。更に、プラスミドｐＳＱ１ＫＯ１又はｐＳＱ１ＫＯ１２（図３Ｂ）をＣｓｐ４５Ｉ及びＳｐｅＩで切断しそしてＫＯ１又はＫＯ１２突然変異されたファィバー遺伝子を含有する９０９０ｂｐの断片を精製した。適当な精製された断片を互いに連結して、ＫＯ１（又はＫＯ１２）突然変異されたファィバー遺伝子及びＰＤ１突然変異されたペントン遺伝子を含有するプラスミドｐＳＱ１ＦＫＯ１ＰＤ１（図５Ａ）又はｐＳＱ１ＫＯ１２ＰＤ１（図５Ｂ）を形成した。ウイルスを作製するために、ｐＳＱ１ＦＫＯ１ＰＤ１又はｐＳＱ１ＫＯ１２ＰＤ１をＣｌａＩで線状化し、そしてＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ（図３Ａ）と共に６３３細胞において共トランスフェクションした。６３３細胞において３回の増幅の後、細胞変性効果観察し、次いで粗ウイルス溶解液をＰｅｒＣ６細胞上に広げた。ヘキサジメトリンブロミドを培地中で４μg/mlに維持した。各ウイルスを標準ＣｓＣｌ遠心法により精製した。
【０１６８】
実施例２
ＫＯ１及びＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターのインビトロ評価
いくつかの組換えアデノウイルスベクターをこの研究において使用してＫＯ１ファィバー突然変異の機能を証明し、そしてこれらのアデノウイルスベクターは、上記した、Ａｖ１ｎＢｇ、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１、Ａｖ１ｎＢｇＰＤ１及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１を含んでいた。ＫＯ１及び／又はＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターの形質導入効率を肺胞上皮細胞株Ａ５４９の細胞で評価した。該形質導入効率は、野生型ファィバー及びペントンを含有するアデノウイルスベクター、Ａｖ１ｎＢｇの形質導入効率と比較された。
【０１６９】
感染の前日、細胞を約１×１０5個の細胞／ウエルの密度で２４ウエルのプレートに接種した。感染の直前に、代表的なウエルの細胞を計数することによりウエル当りの細胞の正確な数を決定した。ベクター、Ａｖ１ｎＢｇ、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１の各々を使用して、細胞当り下記の粒子（ＰＰＣ）の割合：１００、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００の各々においてＡ５４９細胞に形質導入した。細胞単層を感染から２４時間後Ｘ−ｇａｌで染色しそしてβ−ガラクトシダーゼを発現している細胞の百分率を顕微鏡による観察及び細胞の計数により決定した。形質導入は三重で行われそして各ウエルにおいて３つの任意のフィールド（field）が計数され、ベクター当り総計９つのフィールドについて計数された。
【０１７０】
５００ＰＰＣの割合における結果は、図６に示されそしてＡｖ１ｎＢｇに比べてＫＯ１突然変異単独又はＰＤ１と組み合わせたときのＫＯ１突然変異を含有するベクターを使用する場合のＡ５４９細胞における有意に減少した形質導入効率を示す。ＰＤ１突然変異だけを含有するベクターは、インビトロでＡ５４９細胞のアデノウイルス形質導入に対して効果がなかった。
【０１７１】
実施例３
ＦＫＯ１及びＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターのインビボ分析
この実施例は、ＫＯ１及びＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターのインビボ生物的分布及びアデノウイルス媒介肝臓形質導入に対するそれらの影響を評価する実験を与える。結果は、ＣＡＲ及び／又はインテグリンとウイルスの相互作用を機能破壊することはインビボで肝臓からアデノウイルスベクターを完全に脱ターゲッティングさせるのに十分ではないことを示す。
【０１７２】
ポジティブコントロール群はＡｖ１ｎＢｇを受け取りそしてネガティブコントロール群はＨＢＳＳを受け取った。更に、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１２及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１２ＰＤ１ベクターをインビボで分析した。これらのベクターは、各々ＡＢループにおける４つのアミノ酸の置換を有するファィバータンパク質を含有する。更に、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１２ＰＤ１はペントンベースにおける突然変異を含有する。これらの突然変異の両方とも知られており（Einfeld et al.(2001)J.Virology 75: 11284〜11291参照）そしてそれぞれ肝臓形質導入を１０〜７００倍減少させると言われた。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は各々尾部静脈注射により１×１０13個の粒子／kgの用量で各ベクターを受け取った。該動物をベクター投与の約７２時間後二酸化炭素窒息により殺した。肝臓、心臓、肺、脾臓及び腎臓を各動物から収集した。肝臓の中葉を中性緩衝化ホルマリンに入れてβ−ガラクトシダーゼ免疫組織化学のためのサンプルを保存した。更に、各器官からの組織を凍結して、ベクター含有量を決定するためのヘキソンＰＣＲ分析用にそれを保存した。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ用にそれを保存した。
【０１７３】
β−ガラクトシダーゼ免疫組織化学のために、約２〜３ｍｍ厚さの肝臓のスライスを１０％中性緩衝化ホルマリンに入れた。固定の後、これらのサンプルをパラフィンに埋め込み、切片化しそしてβ−ガラクトシダーゼ発現について免疫組織化学により分析した。ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗体（ICN Pharmaceuticals, Inc, ; Costa Mesa, CA）の１：１２００希釈物を、Vectastain ABC kit(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）と共に使用して、ポジティブ細胞を可視化した。
【０１７４】
化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイはGalacto-Light PlusTM化学発光アッセイ（Tropix, Inc., Foster City, CA）システムを使用して行われた。組織サンプルを２つのセラミック球を含有する溶解用マトリックスチューブ（Bio101, Carlsbad, CA）中に集めそしてドライアイス上で凍結させた。組織を解凍しそしてGalacto-Light Plus kitからの溶解バッファー５００μlを各チューブに加えた。FastPrep System(Bio101, Carlsbad, CA）を使用して、組織を３０秒間ホモジナイズした。肝臓のサンプルを更に３０秒間ホモジナイズした。製造者のプロトコルに従って肝臓ホモジネートにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。
【０１７５】
ヘキソンＰＣＲ分析のために、Qiagen Blood and Cell Culture DNA Midi又はMini Kits(Qiagen Inc., Chatsworth, CA）を使用して組織からのＤＮＡを単離した。凍結した組織を一部解凍しそして無菌の使い捨てメスを使用して細かく切った。次いで組織を、０．２mg/mlのＲＮアーゼＡ及び０．１mg/ｍlのプロテアーゼを含有するQiagenバッファーＧ２中で５５℃で一夜インキュベーションすることにより溶解させた。溶解液を短時間ボルテックスし、次いでQiagen−ｔｉｐ  １００又はQiagen−ｔｉｐ  ２５カラムに加えた。カラムを洗浄しそして製造者の指示に記載のとおりにＤＮＡｓを溶出させた。沈殿の後、ＤＮＡｓを水に溶解し、そして濃度をＤＵ６００（Beckman Coulter, Inc, ; Fullerton, CA)又はSPECTRAmax PLUS(Molecular Devices, Inc, ; Sunnyvale, CA）分光光度計．２．３．２．で分光光度法により決定した（Ａ２６０及びＡ２８０）。
【０１７６】
アデノウイルスヘキソン配列に特異的なＰＣＲプライマー及びＴａｑｍａｎプローブを、Primer Express software v.1.0(Applied Biosystems, FosterCity, CA）を使用してデザインした。プライマー及びプローブは下記のとおりであった。
ヘキソンフォーワードプライマー：５′−ＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３′（配列番号３８）
ヘキソンリバースプライマー：５′−ＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＧ−３′（配列番号３９）及び
ヘキソンプローブ：５′−ＦＡＭ−ＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３′（配列番号４０）
【０１７７】
増幅は、下記の条件下に５０μlの反応容量で行った：サンプルＤＮＡ  １０ng（腫瘍）又は１μg（肝臓及び肺）、１×Taquman Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems）、６００nMのフォーワードプライマー、９００nMのリバースプライマー及び１００nMのヘキソンプローブ。熱サイクリング条件は、５０℃で２分間インキュベーション、９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の連続したインキュベーションの３５サイクルであった。データを集めそして7700Sequence Detection Sustem software v.1.6.3(Applied Biosystems）を使用して分析した。細胞ゲノムＤＮＡの適当なバッククラウンドにおいて１，５００，０００コピーから１５コピーまでのアデノウイルスＤＮＡの希釈物を含む標準曲線を使用してアデノウイルスのコピー数の定量化を行った。腫瘍組織の分析のために、１０ngのヒトＤＮＡのバックグラウンドにおける標準曲線を作製した。マウスの肝臓及び肺組織の分析のために、１μgのＣＤ−１マウスゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおける同じアデノウイルスＤＮＡ希釈物を使用して標準曲線を作製した。サンプルを三重で増幅させそして総コピーの平均数を、投入ＤＮＡ重量及び６×１０9ｂｐのゲノムサイズに基づいて細胞当りのコピー数に正規化した。
【０１７８】
これらのベクターによる肝臓形質導入についてβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイ及びアデノウイルスヘキソンＤＮＡ含有量の結果を図７Ａ及び７Ｂに示す。ＫＯ１又はＫＯ１２突然変異のみを含有するベクターは、平均して、Ａｖ１ｎＢｇに比べて肝臓形質導入のわずかな増加を示し、これはいくつかの先の実験と合致する。ＰＤ１突然変異を単独で又はＫＯ１もしくはＫＯ１２と組み合わせて含有するベクターは、肝臓形質導入においてＡｖ１ｎＢｇと比べてわずかな減少を示し、これは、インテグリンがアデノウイルスの肝臓の取り込みにある程度関係していることを示唆する。
【０１７９】
β−ガラクトシダーゼについての肝臓切片の免疫組織化学的染色の結果は、活性アッセイ（データは示されていない）と合致しておりそして遺伝子発現が特異的に肝細胞に局在化されていることを証明する。ＫＯ１又はＫＯ１２突然変異だけを含有するベクターは、より強いそして頻度の高い免疫組織化学的染色パターンにより示されるとおり肝臓形質導入のわずかな増加を示した。ＰＤ１突然変異を単独で又はＫＯ１もしくはＫＯ１２と組み合わせて含有するベクターは、Ａｖ１ｎＢｇに比べて形質導入に殆ど差はなかった。これらの結果は、ＣＡＲ及び／又はインテグリンとウイルスの相互作用を機能破壊することが、インビボでアデノウイルスベクターを肝臓から完全に脱ターゲッティングさせるのには十分でないことを証明する。
【０１８０】
要約すると、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１又はＡｖ１ｎＢｇＫＯ１２に含有されたファィバーＡＢループ突然変異は、インビトロでヒト及びマウスＣＡＲとの相互作用を機能破壊させそしてインビトロで形質導入を減少させた。しかしながら、インビボではファィバーＡＢループ突然変異は予想外に挙動した。何故ならば、このような突然変異は肝臓へのアデノウイルス媒介遺伝子導入を高めそしてベクターの効力を増加させることが見出されたからである。アデノウイルス内部化に関係した第２受容体との相互作用を機能破壊するペントンベースＰＤ１突然変異は、インビトロで効果がなくそしてインビボで殆ど効果なし〜効果なしであった。これらの研究は、インビボでは肝臓へのアデノウイルス遺伝子導入については他の受容体が原因となっていることを示した。
【０１８１】
実施例４
ファィバーシャフトのヘパリンサルフェート結合ドメインにアミノ酸置換を有するファィバーを含有するアデノウイルスベクターの説明
ＨＳＰとの潜在的相互作用を機能破壊させるために、Ａｄ５ファィバーシャフトの４個のアミノ酸のモチーフ中の４個のアミノ酸すべて（残基９１〜９４、ＫＫＴＫ、配列番号１）で置換を含むベクターを作製した。この突然変異はヘパリンサルフェートプロテオグリカンへの結合を潜在的に削除するので、ＨＳＰと名づけられる。ＨＳＰ突然変異のみを含有するベクター、及びＫＯ１突然変異（ＣＡＲ結合を機能破壊するファィバーノブＡＢループ突然変異）、ＰＤ１突然変異（ＲＧＤ／インテグリン相互作用を削除するペントン突然変異）と組み合わせてＨＳＰ突然変異を含有するベクター、及びトリプルノックアウトベクター（ＨＳＰ、ＫＯ１、ＰＤ１）を作製した。
【０１８２】
ＨＳＰファィバー突然変異の作製：突き出し伸長部による遺伝子スプライシングのＰＣＲをベースとするストラテジー（ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇ）を使用することによりファィバー遺伝子にＨＳＰ突然変異を組み込んだ。最初に、Ｅ３領域内からファィバー遺伝子の５′末端へと延びているＡｄ５ゲノムのセグメントを、鋳型としてプラスミドｐＳＱ１（図３Ｂ）を使用しそして５ＦＦ及び５ＨＳＰＲと名付けた２つのプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅させた。５ＦＦのＤＮＡ配列は下記のとおりである：５′ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＧＡ  ３′（配列番号５）。この配列はｐＳＱ１の塩基対２５，１９９〜２５，２１８に対応する。５ＨＳＰＲのＤＮＡ配列は下記のとおりである：５′ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  Ｔ  ３′（配列番号１５）。５ＨＳＰＲは５ＦＦに対するリバースプライマーであり、そしてＫＫＴＫ（配列番号１）領域に隣接したファィバーシャフトにおける領域に対応する。このプライマーは、天然のＫＫＴＫ（配列番号１によりコードされている）アミノ酸配列に対するＧＡＧＡ置換をコードする５′伸長部を含有する。鋳型としてｐＳＱ１を使用する第２ＰＣＲは、ＫＫＴＫ（配列番号１）のすぐ３′のそしてファィバー遺伝子の停止コドンの４０塩基対３′に位置したＭｕｎＩ部位を過ぎて延びている領域を増幅した。この反応に使用した２つのプライマーは３ＨＳＰＦ及び３ＦＲであった。３ＨＳＰＦのＤＮＡ配列は下記のとおりである：５′ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴ  ３′（配列番号１６）。それは５ＨＳＰＲの５′伸長部に相補性である５′伸長部を含有する。３ＦＲのＤＮＡ配列は下記のとおりである：５′ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＧＧ  ３′（配列番号８）。
【０１８３】
２つのＰＣＲ産物をプライマー５ＦＦ及び３ＦＲを使用するＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇにより連結した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩ及びＭｕｎＩにより切断した。２３５５ｂｐの断片をゲル精製し、そしてプラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）（図８）の６４７７ｂｐのＸｂａＩ〜ＭｕｎＩ断片と連結して、プラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰを作製した。プラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）は、プラスミドｐＳＱ１をＥｃｏＲＩで切断し、次いでゲル精製し、そしてファィバー遺伝子を含有する８．８ｋｂ断片を自己連結することにより作製した。次いで、ＨＳＰ突然変異を含有するファィバー遺伝子をスリーウエイ連結を使用してｐＦＢＳＥＨＳＰからｐＳＱ１に導入した。ｐＳＱ１の１６，４３１ｂｐのＥｃｏＲＩ〜ＮｄｅＩ断片、ｐＳＱ１の９０４３ｂｐのＮｄｅＩ〜ＸｂａＩ断片、及びｐＦＢＳＥＨＳＰの７５７１ｂｐのＸｂａＩ〜ＥｃｏＲＩ断片を単離しそして連結してｐＳＱ１ＨＳＰ（図９）を作製した。
【０１８４】
ファィバー遺伝子においてＨＳＰ突然変異を含有する組換えアデノウイルスベクターを作製するために、ｐＳＱ１ＨＳＰをＣｌａＩで切断し、そしてｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ（図３Ａ）をＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断し、次いで２つの切断されたプラスミドを６３３細胞（von Seggern et al.(2000) J.Virology 74: 354〜362）に共トランスフェクションした。２つのプラスミド間の相同的組換えは、Ａｄ５  Ｅ１Ａを誘導可能に発現しそして野生型ファィバータンパク質を構成的に発現する６３３細胞において複製することができる完全な長さのアデノウイルスゲノムを作製した。６３３細胞で増殖させた後、ウイルスキャプシドは野生型及び突然変異ファィバータンパク質を含有していた。ＨＳＰ突然変異を有する修飾されたファィバーのみを含有するウイルス粒子を得るために、ウイルス調製物を使用して、ファィバーを発現しないＰｅｒＣ６細胞に感染させた。Ａｖ１ｎＢｇＦＳ＊と名付けられた得られたウイルスを標準ＣｓＣｌ遠心法により精製した。
【０１８５】
ＨＳＰ及びＫＯ１突然変異を含有するベクターの作製
ファィバーにおけるＨＳＰ及びＫＯ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターを作製するために、プラスミドｐＳＱ１ＦＫＯ１を鋳型として使用したことを除いては、上記したストラテジーと同じＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇストラテジーを使用した。ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇ産物をＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断しそしてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）の６４７７ｂｐのＸｂａＩ〜ＭｕｎＩ断片と連結してｐＦＢＳＥＨＳＰＫＯ１を作製した。ＨＳＰ及びＫＯ１突然変異を含有するファィバー遺伝子を、ＨＳＰ突然変異単独について上記したストラテジーと同じスリーウエイ連結ストラテジーを使用して、ｐＦＢＳＥＨＳＰＫＯ１からｐＳＱ１骨格に導入してプラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１（図１０）を作製した。ＣｌａＩで切断されたｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１及びＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇを６３３細胞に共トランスフェクションすることにより、ファィバー遺伝子においてＨＳＰ及びＫＯ１突然変異を含有する組換えアデノウイルスベクターを作製した。ＨＳＰ突然変異のみを含有するベクターについて上記したようにアデノウイルスを増殖させそして精製した。得られるウイルスをＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊と名付けた。
【０１８６】
ＨＳＰ及びＰＤ１突然変異を含有するベクターの作製
下記のストラテジーを使用してファィバーＨＳＰ突然変異及びペントンＰＤ１突然変異を有する組換えアデノウイルスベクターを作製した。プラスミドｐＳＱ１ＰＤ１（図４）を制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ及びＳｐｅＩで切断しそして２３，９７６ｂｐの断片を単離しそして精製した。更に、プラスミドｐＳＱ１ＨＳＰもＣｓｐ４５Ｉ及びＳｐｅＩで切断しそして９０９０ｂｐの断片を単離し、精製し、そして２３，９７６ｂｐの断片に連結して、ファィバーＨＳＰ及びペントンＰＤ１突然変異を含有するプラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＰＤ１（図１１）を作製した。上記のようにしてアデノウイルスベクターを作製し、増殖させそして精製した。得られたウイルスをＡｖ１ｎＢｇＳ＊ＰＤ１と名付けた。
【０１８７】
ＨＳＰ、ＫＯ１及びＰＤ１突然変異を有するベクターの作製
ＨＳＰ、ＫＯ１及びＰＤ１突然変異を有するアデノウイルスベクターを作製するために、下記のストラテジーを使用した。最初に、プラスミドｐＳＱ１ＰＤ１をＣｓｐ４５Ｉ及びＳｐｅＩで切断しそして２３，９７６ｂｐの断片を単離しそして精製した。更に、プラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１をＣｓｐ４５Ｉ及びＳｐｅＩで切断しそして９０９０ｂｐの断片を単離しそして精製した。２つのＤＮＡ断片を連結してプラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１ＰＤ１（図１２）を形成した。上記のようにして組換えアデノウイルスベクターを作製し、増殖しそして精製した。得られたウイルスをＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＰＤ１と名付けた。
【０１８８】
実施例５
ＨＳＰファィバー突然変異を有するアデノウイルスベクターのインビトロ評価
ファィバー遺伝子におけるＨＳＰ突然変異を単独で又はＫＯ１及び／又はＰＤ１突然変異と組み合わせて含有するアデノウイルスベクターの形質導入効率をＡ５４９及びＨｅＬａ細胞で評価した。形質導入効率を野生型ファィバー及びペントンを含有するアデノウイルスベクターであるＡｖ１ｎＢｇの形質導入効率と比較した。感染の前日に、細胞をウエル当り約１×１０5個の細胞の密度で２４ウエルのプレートに接種した。感染の直前に、代表的なウエルの細胞を計数することによりウエル当りの細胞の正確な数を決定した。ベクター、Ａｖ１ｎＢｇ、（Stevenson et al.(1997)J.Virol.71: 4782〜4790）、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊ＰＤ１及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＰＤ１の各々を使用して、下記の細胞当りの粒子（ＰＰＣ）の割合：１００、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００の各々においてＡ５４９細胞に形質導入した。Ｈｅｌａ細胞は、上記ベクターの各々並びにＫＯ１突然変異のみを含有するベクター（Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１）及びＰＤ１突然変異のみを含有するベクター（Ａｖ１ｎＢｇＰＤ１）により２０００ＰＰＣで形質導入された。細胞単層を感染の２４時間後Ｘ−ｇａｌで染色しそしてβ−ガラクトシダーゼを発現している細胞の百分率を顕微鏡による観察及び細胞の計数により決定した。形質導入は３重でなされ、そして各ウエルにおける３つの任意のフィールドが計数され、ベクター当り総計９フィールドについて計数された。
【０１８９】
結果（図１３Ａ〜１３Ｂに示された）は、Ａｖ１ｎＢｇに比べてＨＳＰ突然変異を有するベクターを使用した場合にＡ５４９及びＨｅＬａ細胞における有意に減少した形質導入効率を示した。しかしながら、ＨＳＰ突然変異を有するベクターは、ＰＰＣ割合を増加させると形質導入を増加させるということで、Ａ５４９細胞に対する用量応答性を示した。
【０１９０】
競合実験を行って、どの受容体分子相互作用が種々のベクターによるＡ５４９細胞の形質導入に関係しているかを決定した。Ａｄ５ファィバーノブ、ＲＧＤトリペプチド領域にわたるアデノウイルス血清型２のペントンベースから誘導された５０アミノ酸のオリゴペプチド又はヘパリン（Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD）を含む種々の競合体（competitors）の存在下又は不存在下に形質導入を行った。Ａ５４９細胞の単層を１０％ＦＢＳを補充されたRichters培地で培養し、そして感染培地（ＩＭ，Ｒｉｃｈｔｅｒｓ培地＋２％ＦＢＳ）中でＡｖ１ｎＢｇ、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊ＰＤ１又はＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＰＤ１により形質導入した。種々のベクターについて種々のＰＰＣ割合を使用して測定可能な形質導入レベルを達成した。ＰＰＣ割合は下記のとおりであった：Ａｖ１ｎＢｇ：５００ＰＰＣ、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊：１０，０００ＰＰＣ、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊：２０，０００ＰＰＣ、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊ＰＤ１：１０，０００ＰＰＣ及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＰＤ１：２０，０００ＰＰＣ。ウイルスによる感染の前に室温で１０分間ファィバーノブ１６μg/mlを含有するＩＭ中で細胞を予備インキュベーションすることによりファィバーノブ競合を行った。ウイルスによる感染の前に室温で１０分間５００nMのペプチドを含有するＩＭ中で細胞を予備インキュベーションすることにより、ペントンベースペプチド競合を行った。ヘパリン３mg/mlを含有するＩＭ中で室温で２０分間各アデノウイルベクターを予備インキュベーションすることによりヘパリン競合を行った。すべての場合に、ウイルスが５％ＣＯ２中で３７℃で細胞単層上で揺すられるとき、競合物は１時間の感染期間中ＩＭ中に残っていた。感染の後、単層をＰＢＳで洗浄し、ウエル当り１mlの完全培地を加えそして細胞を更に２４時間インキュベーションしてβ−ガラクトシダーゼの発現を可能とした。次いで細胞単層を固定しそしてＸ−Ｇａｌで染色した。形質導入された細胞の百分率を上記した光学顕微鏡法により決定した。各条件は３重で行われそしてウエル当り３つの任意のフィールドが計数され、条件当り総計９つのフィールドについて計数された。高力価フィールド当りの形質導入の平均百分率を決定した。
【０１９１】
競合実験の結果は（図１３Ｃ）、ファィバーノブがＫＯ１突然変異を有するベクターを除いてすべてのベクターによる細胞の形質導入を抑制することを示した。ペントンベースペプチドはＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊による形質導入のみを抑制した。ヘパリンはＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＰＤ１による形質導入を抑制したが、他のウイルスのいずれによる形質導入にも影響を与えず、これは、アデノウイルスキャプシド上に追加のヘパリン結合部位の存在を示唆しているが、シャフトが主要部位を含有することを示唆している。
【０１９２】
実施例６
ファィバーにおけるＨＳＰ突然変異を有するアデノウイルスベクターのインビボ分析
この研究の目的は、ＨＳＰ突然変異を有するアデノウイルスベクターのインビボ生物的分布を評価することでありそしてこのシャフト修飾がアデノウイルス媒介肝臓形質導入に影響を与えるかどうかを決定することであった。更に、ＫＯ１もしくはＰＤ１と組み合わせたＨＳＰ突然変異を含有するベクター又は３つのすべての突然変異の組み合わせを含有するベクター並びにＫＯ１突然変異のみ及びＰＤ１突然変異のみを含有するベクターを評価した。ポジティブコントロール群はＡｖ１ｎＢｇを受け取りそしてネガティブコントロール群はＨＢＳＳを受け取った。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は各ベクターを１×１０13個の粒子／kgの用量で尾部静脈注射により受け取った。ベクター投与の７２時間後二酸化炭素窒息により該動物を殺した。各動物から肝臓、心臓、肺、脾臓及び腎臓を収集した。肝臓の中葉を中性緩衝化ホルマリンに入れてβ−ガラクトシダーゼ免疫組織化学のためのサンプルを保存した。更に、各器官からの組織を凍結して、ヘキソンリアルタイムＰＣＲ分析のためにそれを保存してベクター含有量を決定した。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイのためにそれを保存した。β−ガラクトシダーゼ免疫組織化学、ヘキソンリアルタイムＰＣＲ及び化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイを実施例３に記載のようにして行った。β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ（図１４Ａ）及びアデノウイルスヘキソンＤＮＡ含有率（図１４Ｂ）の結果は、ＨＳＰ突然変異を含有するベクターによる肝臓形質導入の劇的な減少を示した。ＨＳＰ突然変異のみを含有するベクターはアデノウイルス媒介肝臓遺伝子発現を約２０倍減少させた。ＫＯ１突然変異と組み合わせたとき（ＨＳＰ、ＫＯ１、ＰＤ１）、コントロールベクターＡｖ１ｎＢｇに比べて肝臓でのβ−ガラクトシダーゼ活性は約１０００倍減少した。ＫＯ１突然変異のみを含有するベクターは、Ａｖ１ｎＢｇに比べて肝臓形質導入において平均してわずかな増加を示し、これはいくつかの先の実験と合致している。ＰＤ１突然変異のみ又はＰＤ１突然変異をＫＯ１と組み合わせて含有するベクターは、Ａｖ１ｎＢｇに比べて肝臓形質導入のわずかな減少を示したが、この減少は統計的には有意ではなかった。肝臓アデノウイルスヘキソンＤＮＡ含有量（図１４Ｂ）はこれらの結果を確認した。
【０１９３】
β−ガラクトシダーゼについての肝臓切片の免疫組織化学染色の結果は、活性アッセイと一致しており（データは示されていない）そして遺伝子発現が肝細胞に特異的に局在化していることを示した。ＨＳＰ突然変異を、単独で又はＫＯ１及び／又はＰＤ１と組み合わせて含有するベクターは肝細胞形質導入の劇的な減少を示した。ＫＯ１突然変異のみを含有するベクターは、より強いそしてより頻度の高い免疫組織化学染色パターンにより示されるとおり肝臓形質導入のわずかな増加を示した。ＰＤ１突然変異を単独で又はＫＯ１と組み合わせて含有するベクターはＡｖ１ｎＢｇに比べて形質導入の差は殆どなかった。
【０１９４】
実施例７
ＫＯ１ファィバー突然変異を有する及び有さないそしてファィバーノブＨＩループにおけるｃＲＧＤターゲッティングリガンドを有する及び有さないＨＳＰファィバーシャフト突然変異を含有するアデノウイルスベクターの説明
ＨＳＰファィバーシャフト突然変異及びＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを含有するベクターの作製：下記のストラテジーを使用して、ＨＳＰシャフト突然変異を有するファィバー及びＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを含有するアデノウイルスベクターを作製した。プラスミドｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＲＧＤを制限酵素ＢｓｔＸＩ及びＫｐｎＩで切断しそして１１５７ｂｐの断片を単離しそして精製した。更に、上記実施例１で説明したファィバーシャトルプラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰをＢｓｔＸＩ及びＫｐｎＩで切断しそして４５４９ｂｐ及び３１５６ｂｐの断片を単離しそして精製した。３つの断片を連結して、ＨＳＰ突然変異及びＨＩループにおけるｃＲＧＤを含有するファィバーをコードするプラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰＲＧＤを作製した。このプラスミドからのファィバー遺伝子を下記の如くしてｐＳＱ１骨格に導入した。プラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰＲＧＤをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断しそして７６０１ｂｐの断片を単離しそして精製した。プラスミドｐＳＱ１（図３Ｂ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、そして１６，４３１ｂｐのＥｃｏＲＩ〜ＮｄｅＩ断片及び９０４３ｂｐのＮｄｅＩ〜ＸｂａＩ断片を単離しそして精製した。３つのＤＮＡ断片を連結してプラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＲＧＤ（図１５Ａ）を作製した。
【０１９５】
ＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドと共にファィバー遺伝子におけるＨＳＰ突然変異を含有する組換えアデノウイルスベクターを作製するために、プラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＲＧＤをＣｌａＩで切断しそして、ＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇと共に６３３細胞に共トランスフェクションした。６３３細胞で増殖させた後、ウイルスキャプシドは野生型及び突然変異体ファィバータンパク質を含有していた。ＨＳＰ突然変異及びｃＲＧＤリガンドを有する修飾されたファィバーのみを含有するウイルス粒子を得るために、ウイルス調製物を使用して、ファィバーを発現しないＰｅｒＣ６細胞に感染させた。Ａｖ１ｎＢｇＳ＊ＲＧＤと名付けられた得られるウイルスを標準ＣｓＣｌ遠心法により精製した。
【０１９６】
ＨＳＰファィバーシャフト突然変異、ＫＯ１ファィバーノブ突然変異及びＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを含有するベクターの作製
下記のストラテジーを使用して、ＨＳＰファィバーシャフト突然変異、ＫＯ１ファィバーノブ突然変異及びＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを有するファィバーを含有するアデノウイルスベクターを作製した。ｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＲＧＤを制限酵素ＢｓｔＸＩ及びＫｐｎＩで切断しそして１１５７ｂｐの断片を単離しそして精製した。更に、上記実施例１で説明したファィバーシャトルプラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰＫＯ１をＢｓｔＸＩ及びＫｐｎＩで切断しそして４５４９ｂｐ及び３１５６ｂｐの断片を単離しそして精製した。３つの断片を連結して、ＨＳＰ突然変異、ＫＯ１突然変異及びＨＩループにおけるｃＲＧＤを含有するファィバーをコードするプラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰＫＯ１ＲＧＤを作製した。このプラスミドからのファィバー遺伝子を下記の如くしてｐＳＱ１骨格に導入した。プラスミドｐＦＢＳＥＨＳＰＫＰＯ１ＲＧＤをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断しそして７６０１ｂｐの断片を単離しそして精製した。プラスミドｐＳＱ１（図３Ｂ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断しそして１６，４３１ｂｐのＥｃｏＲＩ〜ＮｄｅＩ断片及び９０４３ｂｐのＮｄｅＩ〜ＸｂａＩ断片を単離しそして精製した。３つのＤＮＡ断片を連結してプラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１ＲＧＤ（図１５Ｂ）を作製した。
【０１９７】
ＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドと共にファィバー遺伝子におけるＨＳＰ及びＫＯ１突然変異を含有する組換えアデノウイルスベクターを作製するために、プラスミドｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１ＲＧＤをＣｌａＩで切断し、そしてＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇと共に６３３細胞に共トランスフェクションした。６３３細胞で増殖させた後、ウイルスキャプシドは野生型及び突然変異体ファィバータンパク質を含有していた。ＨＳＰ及びＫＯ１突然変異及びｃＲＧＤリガンドを有する修飾されたファィバーのみを含有するウイルス粒子を得るために、ウイルス調製物を使用して、ファィバーを発現しないＰｅｒＣ６細胞に感染させた。Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＲＧＤと名付けられた得られるウイルスを標準ＣｓＣｌ遠心法により精製した。
【０１９８】
実施例８
ファィバーノブＫＯ１突然変異を有するか又は有さないそしてＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを有するか又は有さない、ＨＳＰファィバーシャフト突然変異を含有するアデノウイルスベクターのインビトロ評価
ファィバーＫＯ１突然変異を有するか又は有さないそしてＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを有するか又は有さない、ＨＳＰファィバーシャフト突然変異を含有するアデノウイルスベクターの形質導入効率をＡ５４９細胞で評価した。形質導入効率は、野生型ファィバーを含有するアデノウイルスベクター、Ａｖ１ｎＢｇの形質導入効率と比較された。感染の前日、細胞をウエル当り約１×１０5個の細胞の密度で２４ウエルのプレートに接種した。感染の直前に、代表的なウエルの細胞を計数することによりウエル当りの正確な細胞の数を決定した。ベクター、Ａｖ１ｎＢｇ、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊ＲＧＤ、及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＲＧＤの各々を使用して、細胞に対する粒子の割合が６２５０でＡ５４９細胞に形質導入した。細胞単層を感染の２４時間後Ｘ−ｇａｌで染色しそしてβ−ガラクトシダーゼを発現している細胞の百分率を顕微鏡による観察及び細胞の計数により決定した。形質導入は３重で行われそして各ウエルの３つの任意のフィールドが計数され、ベクター当り総計９つのフィールドについて計数された。結果（図１６）は、ｃＲＧＤリガンドが、ＨＳＰ突然変異を単独で又はＫＯ１突然変異と組み合わせて含有するベクターの形質導入効率を劇的に増加させることを示した。Ａｖ１ｎＢｇＳ＊は約２２％のポジティブ細胞を生じさせ、Ａｖ１ｎＢｇＳ＊ＲＧＤは約９５％のポジティブ細胞を生じさせた。同様に、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊は４％のポジティブ細胞しか生じさせず、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１Ｓ＊ＲＧＤは８５％のポジティブ細胞を生じさせた。ゆえに、シャフト突然変異を含有するベクターは生存可能でありそしてリガンドの付加により再ターゲッティングされることができる。
【０１９９】
実施例９
Ａｄ３５ファィバー及びその誘導体を含有するＡｄ５ベクターの構築
上記したＡｄ５ファィバータンパク質（５Ｆ）におけるＫＯ１及びＨＳＰ突然変異はＡｄ５ウイルスの正常なトロピズムの原因となる相互作用を機能破壊するようにデザインされた。ウイルスを脱ターゲッティングさせるための別のストラテジーは、Ａｄ５ファィバーを、ＣＡＲに結合しないそしてシャフト内にヘパリンサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ）結合ドメイン（ＫＫＴＫ；配列番号１）を持たない他の血清型からのファィバーで置き換えることである。アデノウイルス血清型３５のファィバー（３５Ｆ）はＣＡＲに結合せずそしてそのシャフトにおけるＨＳＰ結合ドメインを持たない。５Ｆの３５Ｆによる置き換えは、肝臓を脱ターゲッティングさせることができ、そしてベクターを所望の組織に再ターゲッティングするための適当なプラットホームを与える。
【０２００】
Ａｄ５ファィバーを含有するＡｄ５を基本とするベクターの作製：ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇストラテジーを使用して、Ａｄ５血清型に基づくがＡｄ５ファィバーの代わりにＡｄ３５ファィバーを含有するベクターを作製した。最初に、ＰＣＲを使用してｂｐ２５，３０９のＸｂａＩ部位とファィバー遺伝子の開始点との間のプラスミドｐＳＱ１の領域を増幅した。この反応に使用したプライマーはＰ−０００５／Ｕ及びＰ−０００６／Ｌであった。Ｐ−０００５／ＵのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′Ｃ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＡＧ  ３′（配列番号１７）。この配列はｐＳＱ１のｂｐ２５，３０８〜２５，３３４に対応する。Ｐ−０００６／ＬのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＴＧ  ３′（配列番号１８）。それはＡｄ３５ファィバー遺伝子の開始部に相補的な１０塩基対の５′伸長部を含有し、このプライマーの残部はｐＳＱ１のファィバー遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ５′の配列にアニーリングする。予想されたサイズ、５８３ｂｐのＰＣＲ産物が得られそしてこのＤＮＡをゲル精製した。第２ＰＣＲでは鋳型として野生型Ａｄ３５ウイルスから抽出されたＤＮＡを使用してＡｄ３５ファィバー遺伝子を増幅した。この反応に使用したプライマーはＰ−０００７／Ｕ及び３５ＦＭｕｎであった。Ｐ−０００７／ＵのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  Ａ  ３′（配列番号１９）。それは、Ａｄ５のファィバー遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ前の１０ｂｐに相同性である１０塩基対の５′伸長部を含有する。このプライマーの残部はＡｄ３５ファィバー遺伝子の開始部にアニーリングする。３５ＦＭｕｎのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＡＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  Ａ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  Ａ  ３′（配列番号２０）。それはファィバーの端部とファィバー遺伝子の４０ｂｐ下流のＭｕｎＩ部位との間のＡｄ５ゲノムの領域に相補的である４６塩基対の５′伸長部を含有する。更にこの５′伸長部はＡｄ５ファィバー遺伝子の最後のアミノ酸及び停止コドンをコードする。この領域は、それがファィバー遺伝子のためのポリアデニル化部位を含有するのでベクターに保持された。プライマーの残部は最後のアミノ酸コドンの隣までの、Ａｄ３５ファィバー遺伝子の３′端部にアニーリングする。予想されたサイズ、１０２７ｂｐのＰＣＲ産物が得られそしてこのＤＮＡをゲル精製した。２つのＰＣＲ産物を混合しそしてプライマーＰ−０００５／Ｕ及びＰ−０００９を使用するＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇにより互いに連結した。Ｐ−０００９の配列は下記のとおりであった：５′ＡＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  Ｇ  ３′（配列番号２１）。それはｐＳＱ１のｂｐ２７，６４８〜２７，６６９に対応しそしてその領域のＭｕｎＩ部位にオーバーラップする。予想されたサイズ、１５９０ｂｐのＰＣＲ産物が得られそしてゲル精製された。それを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｇ  Ｋｉｔ  を使用してプラスミドｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ  ）にクローニングした。この中間クローニング段階は、ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇ産物のＤＮＡ配列決定を簡単にした。ｐＴＯＰＯＡｄ３５Ｆと名付けられた得られたプラスミドをＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断しそして１５８５ｂｐの切断産物をゲル精製し、そしてＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断されたｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）の６４７７ｂｐの断片と連結して、プラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５Ｆを作製した。Ａｄ３５ファィバー遺伝子を下記の如くしてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５ＦからｐＳＱ１に導入した。プラスミドｐＳＱ１をＥｃｏＲＩで切断しそして２４，２１３ｂｐの断片をゲル精製した。プラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５ＦをＥｃｏＲＩで線状化しそしてｐＳＱ１からの２４，２１３ｂｐの断片と連結した。制限診断を行って、正しい方位でｐＳＱ１骨格に挿入されたＡｄ３５ファィバー遺伝子を含有する構築物部をスクリーニングした。正しい方位のＡｄ３５ファィバー遺伝子を含有するｐＳＱ１プラスミドをｐＳＱ１Ａｄ３５Ｆｉｂｅｒ（図１７Ａ）と名付けた。Ａｄ３５ファィバーを含有するアデノウイルスベクターを作製するために、ｐＳＱ１Ａｄ３５ＦｉｂｅｒをＣｌａＩで切断し、そしてＳａｌＩ及びＰａｃＩで切断されたｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇと共に６３３細胞に共トランスフェクションした。６３３細胞で増殖させた後、得られたウイルスはそのキャプシドにＡｄ５ファィバー及びＡｄ３５ファィバーを含有していた。ウイルスをＰｅｒＣ６細胞で増幅させて、そのキャプシドにＡｄ３５ファィバーのみを含有するウイルスを作製した。得られたウイルス調製物をＡｖ１ｎＢｇ３５Ｆと名付けた。
【０２０１】
Ａｄ５及びＡｄ３５由来のキメラファィバーを含有するアデノウイルスベクターの構築：鋳型として完全な長さのＡｄ５又はＡｄ３５ファィバーｃＤＮＡｓを含有するプラスミドを使用してＰＣＲ遺伝子オーバーラップ伸長反応により２つのキメラファィバー構築物を調製した。Ａｄ５ファィバーテイル及びシャフト領域（５ＴＳ；アミノ酸１〜４０３）をＡｄ３５ファィバーヘッド領域（３５Ｈ；アミノ酸１３７〜３２３）と連結して５ＴＳ３５Ｈキメラを形成し、そしてＡｄ３５ファィバーテイル及びシャフト領域（３５ＴＳ；アミノ酸１〜１３６）をＡｄ５ファィバーヘッド領域（５Ｈ；アミノ酸４０４〜５８１）と連結して３５ＴＳ５Ｈキメラを形成した。ファィバーシャフト−ヘッド接合部の保存されたＴＬＷＴ配列において融合を行った。
【０２０２】
５ＴＳ３５Ｈキメラの構築のために、鋳型としてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）プラスミドを使用しプライマーＰ１及びＰ２を使用して５′断片を作製した。鋳型としてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５プラスミドを使用しＰ３及びＰ４プライマーを使用して、３′断片を作製した。これらのキメラファィバーの構築に使用した各プライマーの配列は表２に列挙されている。予想されたサイズの増幅されたＰＣＲ産物を得そしてゲル精製した。エンドプライマーＰ１及びＰ４を使用して第２ＰＣＲを行って２つの断片を互いに連結した。第２ＰＣＲで作製したＤＮＡ断片をＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断しそしてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）に直接クローニングしてファィバーシャトルプラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ５ＴＳ３５Ｈを作り出した。
【０２０３】
【表２】
2006500902.tif 000003
【０２０４】
３５ＴＳ５Ｈキメラの構築のために、鋳型としてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５プラスミドを使用しＰ１及びＰ５プライマーを使用して５′断片を作製した。鋳型としてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）プラスミドを使用しＰ６及びＰ４プライマーを使用して３′断片を作製した。上記した同じ方法に従って、ファィバーシャトルプラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ３５ＴＳ５Ｈを作製した。
【０２０５】
３５ＴＳ５Ｈ及び５ＴＳ３５Ｈキメラのために、Ａｄ３５ファィバーを含有するベクターについて上記したようにして、ファィバー遺伝子をｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）骨格からｐＳＱ１に導入した。得られたプラスミドはｐＳＱ１３５Ｔ５Ｈ（図１８Ａ）及びｐＳＱ１５Ｔ３５Ｈ（図１８Ｂ）と呼ばれた。更に、上記した共トランスフェクションストラテジーを使用してアデノウイルスベクターを作製した。
【０２０６】
３５ＦファィバーノブのＨＩループにおけるｃＲＧＤターゲッティングペプチドを有するＡｄ３５ファィバーを含有するＡｄ５ベクターの構築：ｃＲＧＤターゲッティングペプチドをＡｄ３５ファィバーＨＩループに組み込むために、１０個のアミノ酸の配列ＨＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３０）をコードするＰ７及びＰ８オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。完全な長さのＡｄ３５ファィバーｃＤＮＡを含有するｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５プラスミドをＰＣＲ反応における鋳型として使用し、Ｐ１及びＰ７プライマー対又はＰ４及びＰ８プライマー対を使用して５′及び３′ＰＣＲ断片を作製した。ついでエンドプライマーＰ１及びＰ４を使用して第２ＰＣＲを行って２つの断片を互いに連結させた。得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断しそしてｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）にクローニングしてファィバーシャトルプラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ３５ｃＲＧＤを作り出した。修飾されたＡｄ３５ファィバー遺伝子を、上記したＥｃｏＲＩクローニングストラテジーを使用してｐＳＱ１に導入して、ｐＳＱ１Ａｄ３５ＦｃＲＧＤ（図１７Ｂ）を作製した。上記した共トランスフェクションストラテジーを使用してアデノウイルスベクターを作製した。
【０２０７】
実施例１０
３５Ｆ及びその誘導体を含有するアデノウイルスベクターのインビトロ評価
３５Ｆ又はその誘導体を含有するアデノウイルスベクターの形質導入効率をＡ５４９細胞で評価した。形質導入効率を、５Ｆファィバーを含有するアデノウイルスベクター、Ａｖ１ｎＢｇの形質導入効率と比べた。感染の前日、細胞をウエル当り約１×１０5個の細胞の密度で２４ウエルのプレートに接種した。感染の直前に、代表的なウエルの細胞を計数することによりウエル当りの細胞の正確な数を決定した。ベクター、Ａｖ１ｎＢｇ、Ａｖ１ｎＢｇ３５Ｆ、Ａｖ１ｎＢｇ５Ｔ３５Ｈ及びＡｖ１ｎＢｇ３５Ｔ５Ｈの各々を使用して細胞当り０〜１，０００個の粒子（ＰＰＣ）の割合でＡ５４９細胞に形質導入した。感染の２４時間後細胞単層をＸ−ｇａｌで染色しそしてβガラクトシダーゼを発現している細胞の百分率を顕微鏡による観察及び細胞の計数により決定した。形質導入は３重で行われそして各ウエルにおいて３つの任意のフィールドが計数され、ベクター当り総計９つのフィールドについて計数された。結果（図１９）は、Ａｖ１ｎＢｇと比べて、Ａｖ１ｎＢｇ３５Ｆ及びＡｖ１ｎＢｇ５Ｔ３５Ｈベクターを使用したＡ５４９細胞での同様な形質導入効率を示した。Ａｖ１ｎＢｇ３５Ｔ５Ｈは、Ａｄ３５シャフトドメインの結果としてＡｖ１ｎＢｇに比べてＡ５４９細胞におけるはるかに低い形質導入効率を示した。Ａｄ３５シャフトドメインはＨＳＰ結合モチーフを含有しておらず、そしてＡｖ１ｎＢｇ３５Ｔ５Ｈベクターはインビトロ及びインビボでＡｖ１ｎＢｇＳ＊と同様に挙動する。これらの研究は、ＨＳＰ結合部位を持たないファィバータンパク質を含有するベクターは完全に生存可能であることも示す。
【０２０８】
実施例１１
３５Ｆ及びその誘導体を含有するアデノウイルスベクターのインビボ評価
この研究の目的は、３５Ｆファィバー及びその誘導体を含有するアデノウイルスベクターのインビボ生物学的分布を評価して、これらのファィバーを含有するどのベクターがそれらのシャフト領域により肝臓形質導入を機能破壊するかを決定することであった。ポジティブコントロール群はＡｖ１ｎＢｇを受け取りそしてネガティブコントロール群はＨＢＳＳを受け取った。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は各ベクターを１×１０13個の粒子／kgの用量で尾部静脈注射により受け取った。ベクター投与の７２時間後二酸化炭素窒息により該動物を殺した。各動物から肝臓、心臓、肺、脾臓及び腎臓を収集した。肝臓の中葉を中性緩衝化ホルマリンに入れてβ−ガラクトシダーゼ免疫組織化学のためのサンプルを保存した。更に、各器官からの組織を凍結して、ヘキソンＰＣＲ分析のためにそれを保存してベクター含有量を決定した。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイのためにそれを保存した。β−ガラクトシダーゼ免疫組織化学、ヘキソンリアルタイムＰＣＲ及び化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイを実施例３に記載のようにして行った。
【０２０９】
β−ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果は、コントロールベクターＡｖ１ｎＢｇに比べて肝臓におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は約４倍〜２４倍減少したことで、Ａｄ３５ファィバー又は３５Ｔ５Ｈ誘導体を含有するベクターによる肝臓形質導入の劇的な減少を示した（図２０）。これらのデータは、ＨＳＰ結合部位のないシャフトドメインは肝臓のインビボ遺伝子導入を有効に機能破壊することができることを示す。特に、ＨＳＰは、インビボで肝臓に対する主要な侵入機構である。ＣＡＲ結合は重要ではない侵入経路である。
【０２１０】
実施例１２
Ａｄ血清型４１短ファィバー及びその誘導体を含有するＡｄ５ベクターの構築
ヒトアデノウイルス血清型４１は、２つの隣接した遺伝子によりコードされたそのキャプシドにおける２つの異なるファィバーを含有する。１つのファィバーは、６０ｋＤａの分子量を有し、長さが約３１５Ａであり、そして長ファィバーと呼ばれる。他のファィバーは４０ｋＤａの分子量を有し、長さが約２５０＋でありそして短ファィバーと呼ばれる。Ａｄ４１短ファィバーはＣＡＲに結合せずそしてそのシャフトにヘパリン結合ドメイン（ＫＫＴＫ）を持たない。ゆえに、このファィバーはアデノウイルスベクターターゲッティングのための有用なプラットホームを与える。
Ａｄ５に基づくがＡｄ４１短ファィバーを含有するアデノウイルスベクターの構築：ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇストラテジーを使用して、Ａｄ５ゲノムに基づくがＡｄ４１短（Ａｄ４１ｓ）ファィバーを含有するベクターを作製した。最初に、ＰＣＲを使用してｂｐ２５，３０９のＸｂａＩ部位とファィバー遺伝子の開始部との間のｐＳＱ１の領域を増幅した。ＰＣＲに使用されたプライマー対はＰ−０００５／Ｕ及びＰ−００１０／Ｌであった。Ｐ０００５／UのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′Ｃ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＡＧ  ３′（配列番号１７）。この配列はｐＳＱ１のｂｐ２５，３０８〜２５，３３４に対応しそしてその領域のＸｂａＩ部位にオーバーラップする。Ｐ−００１０／Ｌの配列は下記のとおりであった：５′ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  Ｔ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  Ｇ  ３′（配列番号３１）。それはＡｄ４１ｓファィバー遺伝子の最初の１０ｂｐに対応する５′伸長部を含有する。プライマーの残部はファィバー遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ５′のｐＳＱ１にアニーリングする。ＰＣＲ産物は予想されたサイズ（５８３ｂｐ）であった。第２ＰＣＲを使用して、鋳型としてプラスミドｐＤＶ６０Ａｄ４１ｓＦを使用してＡｄ４１ｓファィバーを増幅した。使用したプライマーはＰ−００１１／Ｕ及びＰ−００１２／Ｌであった。Ｐ−００１１／UのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＡＧ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ  ３′（配列番号３２）。それはｐＳＱ１におけるファィバー遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ５′のＤＮＡ配列に対応する１０ｂｐの５′伸長部を含有する。プライマーの残部はｐＤＶ６０Ａｄ４１ｓＦのＡｄ４１ｓファィバー遺伝子の開始部にアニーリングする。Ｐ−００１２／ＬのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＴＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  Ｃ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  Ａ  ３′（配列番号３３）。  それはファィバー遺伝子の最後のコドンからファィバー遺伝子の４０ｂｐ下流のＭｕｎＩ部位までのｐＳＱ１の配列に対応する５１ｂｐの５′伸長部を含有する。プライマーの残部はｐＤＶ６０Ａｄ４１ｓＦにおけるＡｄ４１ｓファィバー遺伝子の３′端部にアニーリングする。ＰＣＲ産物は予想されたサイズ（１２１９ｂｐ）であった。２つのＰＣＲ産物をプライマーＰ−０００５／Ｕ及びＰ−０００９／Ｌを使用してＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇにより連結した。Ｐ−０００９／ＬのＤＮＡ配列は上に記載した。ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇ反応は予想された１７８２ｂｐの産物を生じさせた。産物をｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯＡｄ４１ｓＦを生じさせた。次いで、ｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯＡｄ４１ｓＦをＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断し、そしてＡｄ４１ｓファィバー遺伝子を含有する１７７３ｂｐの断片をゲル精製した。この断片をｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）の６４７７ｂｐのＸｂａＩ〜ＭｕｎＩ断片と連結してｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡ��４１ｓＦを作製した。Ａｄ４１ｓファィバー遺伝子は下記のようにしてｐＳＱ１骨格に導入された。最初に、ｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦをＥｃｏＲＩを使用して線状化し、そしてこの断片をｐＳＱ１の２４，２１３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片と連結してｐＳＱ１Ａｄ４１ｓＦ（図２１Ａ）を作製した。上記した共トランスフェクションストラテジーを使用して、Ａｄ４１ｓファィバーを含有するアデノウイルスベクターを作製した。
【０２１１】
ＨＩループにｃＲＧＤターゲッティングリガンドを有するＡｄ４１短ファィバーを含有するＡｄ５アデノウイルスベクターの構築：ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇストラテジーを使用してＨＩループにｃＲＧＤを有するＡｄ４１ｓファィバーを含有する構築物を作製した。プラスミドｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦがＰＣＲ増幅のための鋳型として使用された。最初に、プライマー５ＦＦ及び４１ｓＲＧＤＲを使用して１７８２ｂｐの断片を増幅した。プライマー５ＦＦは上記した。それはファィバー遺伝子の上流のＸｂａＩ部位でｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦにアニーリングする。プライマー４１ｓＲＧＤＲのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ  ３′（配列番号３４）。それはｃＲＧＤターゲッティングリガンドをコードする３０ｂｐの５′伸長部を含有する。プライマーの残部はｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦのｂｐ２８７８〜２９０３にアニーリングする。第２ＰＣＲは、プライマー３ＦＲ及び４１ｓＲＧＤＦを使用してｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦの２７７ｂｐの領域を増幅した。プライマー３ＦＲは前に記載した。それはファィバー遺伝子の下流のＭｕｎＩでｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦにアニーリングする。４１ｓＲＧＤＦのＤＮＡ配列は下記のとおりであった：５′ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ３′（配列番号３５）。それは、ｃＲＧＤターゲッティングリガンドをコードしそして４１ｓＲＧＤＲ上の伸長部に相補的な３０ｂｐの５′伸長部を含有する。プライマーの残部はｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＦのｂｐ２９０４〜２９２４にアニーリングする。２つのＰＣＲ産物を、プライマー５ＦＦ及び３ＦＲを使用してＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇにより連結して、２０５９ｂｐの断片を作製した。この産物をＸｂａＩ及びＭｕｎＩで切断しそして１８０３ｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製した。断片をＸｂａＩ及びＭｕｎＩによるｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）の切断から得られた６４７７ｂｐの断片と連結した。得られたプラスミドをｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅＡｄ４１ｓＲＧＤと名付けた。このプラスミドをＥｃｏＲＩ切断により線状化し、そしてｐＳＱ１の２４，２１３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片と連結してｐＳＱ１Ａｄ４１ｓＲＧＤ（図２１Ｂ）を作製した。
【０２１２】
実施例１３
Ａｄ４１短ファィバー及びその誘導体を含有するＡｄ５ベクターのインビボ評価
この実施例は、４１ｓＦファィバー及びその誘導体を含有するアデノウイルスベクターのインビボ生物学的分布を評価して、これらのファィバーを含有するどのベクターが修飾されたシャフトモチーフにより肝臓形質導入を機能破壊するかを決定した。ポジティブコントロール群はＡｖ３ｎＢｇ（Gorziglia et al.(1996) J.Virology70: 4173〜4178参照）又はＡｄ５．βＧａｌ．ΔＦ／５Ｆを受け取りそしてネガティブコントロール群はＨＢＳＳを受け取った。Ａｄ５．βＧａｌ．ΔＦ／５Ｆは、Ａｄ５ファィバーを発現するように修飾されたファィバーレス（fiberless）ベクターＡｄ５．βＧａｌ．ΔＦ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２６３６）の誘導体である（例えば、国際PCT出願番号WO0183729参照）。
【０２１３】
Ａｄ５．βＧａｌ．ΔＦベクターをＡｄ４１ｓＦファィバータンパク質でシュードタイプ化し（pseudotyped）そしてインビボ注入した。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は各ベクターを１×１０13個の粒子／kgの用量で尾部静脈注射により受け取った。ベクター投与の約７２時間後二酸化炭素窒息により該動物を殺した。各動物から肝臓、心臓、肺、脾臓及び腎臓を収集した。肝臓の中葉を中性緩衝化ホルマリンに入れてβ−ガラクトシダーゼ免疫組織化学のためのサンプルを保存した。更に、各器官からの組織を凍結して、ヘキソンＰＣＲ分析のためにそれを保存してベクター含有量を決定した。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイのためにそれを保存した。β−ガラクトシダーゼ免疫組織化学、ヘキソンリアルタイムＰＣＲ及び化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイを実施例３に記載のようにして行った。
【０２１４】
ヘキソンＤＮＡ分析の結果は、両コントロールベクターに比べて肝臓アデノウイルスＤＮＡ含有率が約５倍減少したことで、Ａｄ４１ｓＦファィバーを含有するベクターによる肝臓形質導入の劇的な減少を示した（図２２）。
【０２１５】
上記実施例において、ベクターの正常なトロピズムを機能破壊するようにデザインされた様々なファィバー修飾を含有するいくつかの新規なアデノウイルスベクターが作製した。表３参照。ファィバーシャフトのヘパランサルフェート結合ドメインがアミノ酸置換により置き換えられているベクターを作製した。ＨＳＰと呼ばれるこの突然変異は、ＫＯ１突然変異（ＣＡＲ結合を機能破壊するファィバーノブＡＢループ突然変異）及びＰＤ１突然変異（ＲＧＤ／インテグリン相互作用を削除するペントン突然変異）とも組み合わされた。更に、３つのすべての突然変異（ＨＳＰ、ＫＯ１、ＰＤ１）を含有するベクターを作製した。ＨＳＰ突然変異を、単独で又は他のキャプシド修飾と組み合わせて含有するすべてのベクターは、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞での劇的に減少した形質導入効率を示した。更に、同じベクターはマウスへの全身系送達のあとで肝臓の劇的に減少した形質導入を示した。Ａｄ５をベースとするベクターの正常なトロピズムを機能破壊するための別法として、Ａｄ５ファィバーを、ＣＡＲに結合しないそしてシャフトにヘパリン結合ドメインを含有しない種々のアデノウイルス血清型からのファィバーにより置き換えた。かくして、Ａｄ３５ファィバー及びＡｄ４１短ファィバーを含有するベクターを作製した。ファィバーのＨＩループにｃＲＧＤターゲッティングリガンドを含有するこれらの２つのベクターのバージョンも産生させた。更に、キメラファィバーを含有するベクターを作製した。Ａｄ５ファィバーノブドメインに融合されたＡｄ３５ファィバーテイル及びシャフト領域を含有するベクター、並びにＡｄ３５ファィバーノブドメインに融合したＡｄ５ファィバーテイル及びシャフトを含有するベクターが構築された。全体のＡｄ３５又はＡｄ４１短ファィバーのいずれかを含有するベクターは尾部静脈を経由してマウスに送達した後肝臓形質導入の有意な減少を示した。ＨＳＰ突然変異、Ａｄ３５ファィバー又はＡｄ４１短ファィバーのいずれかを含有するベクターを使用する減少した肝臓形質導入の観察は、インビボでアデノウイルスベクターを脱ターゲッティングさせることの実行可能性を示す。ｃＲＧＤを有するＡｄ３５ファィバー又はＡｄ４１短ファィバーにかんするインビトロデータ（実施例１４参照）は、ウイルスが完全に生存可能である、即ち、それはＨＳＰ結合部位の不存在により損傷されずそして再ターゲッティング可能であることを示す。これらのデータは一緒になって、これらのベクターが再ターゲッティングストラテジーのための適当な土台を与えることを示唆する。
【０２１６】
【表３】
2006500902.tif 000004
【０２１７】
実施例１４
ＨＩループにｃＲＧＤリガンドを有するＡｄ４１ｓＦを含有するアデノウイルスベクターのインビトロ評価
ＨＩループにｃＲＧＤリガンドを有するＡｄ４１ｓＦファィバーを含有するアデノウイルスベクターの形質導入効率をＡ５４９細胞で評価した。該形質導入効率を、野生型ファィバーを含有するアデノウイルスベクターであるＡｖ１ｎＢｇ又は、ＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドと組み合わせてＫＯ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターであるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＲＧＤの形質導入効率と比較した。感染の前日、細胞をウエル当り約１×１０5個の細胞の密度で２４ウエルのプレートに接種した。感染の直前に、代表的なウエルの細胞を計数することによりウエル当りの細胞の正確な数を決定した。ベクター、Ａｖ１ｎＢｇ、Ａｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＲＧＤ及びＡｖ１ｎＢｇ４１ｓＦＲＧＤの各々を使用して細胞に対する粒子の割合０〜１０，０００でＡ５４９細胞に形質導入した。感染の２４時間後細胞単層をＸ−ｇａｌで染色しそしてβガラクトシダーゼを発現している細胞の百分率を顕微鏡による観察及び細胞の計数により決定した。形質導入は三重で行われそして各ウエルにおいて３つの任意のフィールドを計数し、ベクター当り総計９つのフィールドについて計数した。結果（図２３）は、Ａｖ１ｎＢｇ４１ｓＦＲＧＤベクターは検査したすべてのベクター用量でＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＲＧＤと同等なレベルに細胞を形質導入したことを示す。ＦＫＯ１もＡｄ４１ｓＦもＣＡＲに結合することができない。Ａｄ４１ｓＦは通常ＣＡＲと相互作用せずそして更にシャフトドメイン内のＨＳＰ結合モチーフを含有しない。これらのデータは、ＫＯ１及びＡｄ４１ｓＦのファィバーノブのループ領域に挿入されたターゲッティングペプチドはターゲッティングされた受容体を介する標的細胞の形質導入を可能にすることを示す。驚くべきことに、ＣＡＲ及びインテグリンでなくてＨＳＰがインビボでの主要な侵入経路であり、そしてＨＳＰ結合の機能破壊はアデノウイルスベクターのターゲッティングを可能とする。
【０２１８】
実施例１５
インビボでのアデノウイルスベクターの生物学的分布に対するシャフト修飾の効果
ファィバーヘッド、シャフト及びペントン突然変異を含有するアデノウイルスベクターのインビボでの生物学的分布に対するファィバー及びペントン修飾の影響を検査した。ＫＯ１もしくはＰＤ１と組み合わせたＨＳＰ突然変異又は３つのすべての突然変異の組み合わせを含有するベクター並びにＫＯ１突然変異のみ及びＰＤ１突然変異のみを含有するベクターを評価した。示されたアデノウイルスベクターを上記したようにＣ５７ＢＬ６マウスに全身系に投与した。ポジティブコントロール群はＡｖ１ｎＢｇを受け取りそしてネガティブコントロール群はＨＢＳＳを受け取った。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は各ベクターを１×１０13個の粒子／kgの用量で尾部静脈注射により受け取った。ベクター投与の７２時間後二酸化炭素窒息により該動物を殺した。各動物から肝臓、心臓、肺、脾臓及び腎臓を収集した。各器官からの組織を凍結して、リアルタイムＰＣＲ分析のためにそれを保存してアデノウイルスヘキソンＤＮＡ含有量を決定した。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイのためにそれを保存した。ヘキソンリアルタイムＰＣＲ及び化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイを実施例３に記載のようにして行った。
【０２１９】
肝臓から誘導された結果は、実施例６（図１４Ａ及びＢ）に示されておりそしてＡｖ１ｎＢｇの百分率コントロールとして結果が示されている図２６にも示される。他の器官ヘノアデノウイルスの生物学的分布に対するＳ＊シャフト修飾の効果は図２５に示される。平均アデノウイルスＤＮＡ含有量は細胞当りのアデノウイルスゲノムコピーとして決定されそしてＡｖ１ｎＢｇ（＋）コントロール値の百分率として表される。検査された各組織について平均百分率コントロール値＋標準偏差が示される（ｎ＝５／群）（図２５）。野生型ファィバーを有するＡｄ５をベースとするベクターの全身系送達は、細胞当り６４コピーで肝臓におけるベクターＤＮＡの優先的な蓄積をもたらし、他の器官では有意により少ないＤＮＡが見出され、肺では細胞当り１．３２コピーが見出され、脾臓では細胞当り２．１８コピーであり、心臓では細胞当り０．４７コピーが見出され、腎臓では細胞当り０．７２コピーである。ＰＤ１、Ｓ＊、ＫＯ１ＰＤ１、ＫＯ１Ｓ＊、Ｓ＊ＰＤ１及びＫＯ１Ｓ＊ＰＤ１で見出されるすべての差は、対応のないｔ検定分析（unpaired, t-test analysis）、Ｐ値（０．０２４）を使用して、Ａｖ１ｎＢｇ（＋）コントロールとは有意に異なっていた。Ａｖ１ｎＢｇコントロール値の百分率として表されるとき、各突然変異の影響は、個々に又は組み合わせにおいて、明らかになる。Ｓ＊突然変異はすべての４つの器官への遺伝子導入を劇的に減少させ、これに対してＫＯ１は減少させなかった。かくして、インビボでの形質導入に対するシャフトの重要性は、肝臓のほかの器官に及ぶ。最後に、肺、心臓及び腎臓への遺伝子導入はＰＤ１により減少させられたが、これは、これらの器官におけるベクター侵入においてインテグリン結合の役割を示唆している。
【０２２０】
実施例１６
インビボでＳ＊、シャフト修飾及び４１ｓＦファィバーを再ターゲッティングすること
ＨＳＰ突然変異を含有するベクターはインビボでアデノウイルスベクターを有効に脱ターゲッティングすることが示された（実施例６及び１５参照）。この研究の目的は、Ｓ＊修飾又はＡｄ４１ｓＦを含有するベクターをインビボで腫瘍に再ターゲッティングする能力を評価することであった。ｃＲＧＤペプチドをファィバーＨＩループに遺伝的に組み込みそしてインビボで評価した（実施例８及び１４）。次いでこれらの同じベクターを腫瘍を有するマウスにおいてインビボで評価した。無胸腺症ｎｕ／ｎｕ雌マウスに右後部わき腹に８×１０6個のＡ５４９細胞を注入した。腫瘍が約１００mm３の寸法に達したとき、それらを処理群にランダム化した。６匹のマウスの群は各ベクターを１×１０13個の粒子／kgの用量で尾部静脈注射により受け取った。ベクター投与の７２時間後二酸化炭素窒息により該動物を殺した。各動物から腫瘍、肝臓、心臓、肺、脾臓及び腎臓を収集した。各器官からの組織を凍結して、リアルタイムＰＣＲ分析のためにそれを保存してアデノウイルスヘキソンＤＮＡ含有量を決定した。ヘキソンリアルタイムＰＣＲを実施例３に記載のようにして行った。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイのためにそれを保存した。ヘキソンリアルタイムＰＣＲ及び化学発光β−ガラクトシダーゼ活性アッセイを実施例３に記載のようにして行った。
【０２２１】
各処理群について肝臓及び腫瘍へのアデノウイルスベクターの生物学的分布を図２７に示す。Ｓ＊、ＫＯ１Ｓ＊及び４１ｓＦファィバーを含有するベクターは、肝臓及び腫瘍を有効に脱ターゲッティングし、Ａｖ１ｎＢｇコントロールと比較して各組織において見出されるアデノウイルスＤＮＡの量を有意に減少させた。ｃＲＧＤターゲッティングリガンドを含有するベクターは、ターゲッティングされていないベクターにより達成されるレベルに匹敵するレベルに腫瘍の肝臓への形質導入を回復した。
【０２２２】
これらのデータは、腫瘍再ターゲッティングを伴った肝臓脱ターゲッティングの成功を示す。腫瘍再ターゲッティングの程度は使用されるリガンドのアフィニティ及びタイプに関係する。これらのデータは、インビボで腫瘍をターゲッティングするであろうターゲッティングされた全身系で送達可能なアデノウイルスベクターの開発の成功を証明する。
【０２２３】
実施例１７
脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの増殖のためのスケールアップ方法
二重又は三重に機能破壊されたアデノウイルスベクターの増加及び増殖には新規なスケールアップ技術が必要である。これらの脱ターゲッティングされたベクターは高力価の調製物の効率的な増加及び作製を可能にするための別の細胞侵入ストラテジーを必要とする。すべての脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターに一般的に適用可能であり、新規な細胞株の開発を必要とせずそしてターゲッティングされたベクターを作製するために使用することもできるベクターの増加のための方法が本発明で提供される。
【０２２４】
ファィバーもしくはペントンにおける単一の突然変異又は１つのベクターに組み合わされた両方の突然変異を含有する３つの組換えアデノウイルスベクターを調製した。これらのベクターは、それぞれ、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１、Ａｖ１ｎＢｇＰＤ１及びＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１と名付けられる。これらのベクターの構築は上に記載されておりそして各ベクターの一般的説明は上記表１に見出すことができる。
【０２２５】
脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターのスケールアップ：  ポリカチオン、特にヘキサジメトリンブロミドはSigma Chemical Co(St.Louis, MO)、Catalog No.52495から得られそしてトランスフェクション及び感染の進行期間中培地中で４μg/mlに維持された。脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの収量に対するヘキサジメトリンブロミドの効果を説明するために、下記の実験を行った。ＡＥ１−２ａアデノウイルスプロデューサー細胞（Gorziglia et al.(1996)J.Virology 70: 4173〜4178）の７つのプレートを細胞当り１０粒子の指示されたベクター（表４参照）の各々で形質導入した。各ベクターを、４μg/mlのヘキサジメトリンブロミドを含有する培地（２％ＨＩ−ＦＢＳを有するRichters）と共に感染前に室温で３０分間インキュベーションした。感染を２時間行った。４μg/mlのヘキサジメトリンブロミドを含有する完全培地を各プレートに加えた。これらの実験のすべてにおいてヘキサジメトリンブロミドの最終濃度は４μg/mlに維持された。力価は１×１０12個の粒子当りＡ２６０ｎｍにおける１０Ｄの換算を使用して分光光度法により決定した（Mitereder et al.(1996)J.Virology 70: 7498〜7509）。次いで総粒子収率を形質導入のために使用されたプレートの数について正規化した。
【０２２６】
感染の進行期間中培地にヘキサジメトリンブロミドを含ませることは、ファィバー及びペントン突然変異を単独で又は組み合わせて含有する脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの効率的な増殖を可能とする。ベクター収率に対するヘキサジメトリンブロミドの影響は表４に示される。培養培地にヘキサジメトリンブロミドが含まれるときＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１の収量の３５倍の向上が見出され、そしてプレート当り１．３×１０10から４．６×１０11までベクター収量を増加させた。ヘキサジメトリンブロミドは、ペントン、ＰＤ１突然変異を含有するＡｖ１ｎＢｇＰＤ１アデノウイルスベクターの収量に対しては最小の効果を有し、１．２倍の向上しか伴わなかった。ヘキサジメトリンブロミドを使用する最大の効果は二重に機能破壊されたアデノウイルスベクターＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１の増殖で見出され、殆ど検出できないレベルからプレート当り４．５３×１０10個のベクター粒子までのベクター収量の増加を伴う。これらのデータは、非特異的侵入機構の使用が脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの効率的なスケールアップを可能とすることを証明する。
【０２２７】
【表４】
2006500902.tif 000005
【０２２８】
プロタミンサルフェート及びポリリシンを含む替りのポリカチオン並びに二官能性タンパク質、例えば抗ペントン：ＴＮＦα融合タンパク質の使用を調査した。図２４は試験されたすべての試薬がＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ベクターの形質導入を高めることに対するいくらかの効果を有することを証明する結果を示す。これらの化合物のすべては、感染期間中培地中に維持されるとき、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの形質導入を高めた。
【０２２９】
二官能性試薬：  脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターの増殖のための二官能性試薬の使用は、抗ペントン：ＴＮＦα融合タンパク質を使用して検査された。この特定の試薬は、Ａｄ５ペントンに対する抗体と、安定にトランスフェクションされた昆虫細胞を使用して産生されるＴＮＦαタンパク質との融合タンパク質である。この試薬はペントンベースを介してアデノウイルスキャプシドに特異的に結合しそして細胞表面ＴＮＦ受容体に対する結合を可能とする。脱ターゲッティングされたベクターの増殖のためのこの試薬の使用は、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を使用して表５に示されている（図２４にも示されている）。Ｓ８細胞の単層を抗ペントン：ＴＮＦα融合タンパク質１μg/mlの存在下又は不存在下に細胞当り１０又は１００粒子のＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１又はコントロールベクターで感染させた。単層を、細胞変性効果（ＣＰＥ）の程度により示されるベクターの広がりについて時間と共に視覚により検査した。各時点におけるＣＰＥの百分率が示される。この二官能性試薬の使用は単層全体にわたりＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ベクターの広がりを明らかに高める。
【表５】
2006500902.tif 000006
【０２３０】
修飾は当業者には明らかであるので、本発明が特許請求の範囲によってのみ限定されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】ｐＳＫＯ１のプラスミドマップである。
【図２】ｐＮＤＳＱ３．１ＫＯ１のプラスミドマップである。
【図３Ａ】ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ．（図３Ａ）、ｐＳＱ１（図３Ｂ）及びｐＳＱ１ＫＯ１２（図３Ｃ）のプラスミドマップである。
【図３Ｂ】ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ．（図３Ａ）、ｐＳＱ１（図３Ｂ）及びｐＳＱ１ＫＯ１２（図３Ｃ）のプラスミドマップである。
【図３Ｃ】ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ．（図３Ａ）、ｐＳＱ１（図３Ｂ）及びｐＳＱ１ＫＯ１２（図３Ｃ）のプラスミドマップである。
【図４】ｐＳＱ１ＰＤ１のプラスミドマップである。
【図５Ａ】ｐＳＱ１ＦＫＯ１ＰＤ１（図５Ａ）及びｐＳＱ１ＫＯ１２ＰＤ１（図５Ｂ）のプラスミドマップである。
【図５Ｂ】ｐＳＱ１ＦＫＯ１ＰＤ１（図５Ａ）及びｐＳＱ１ＫＯ１２ＰＤ１（図５Ｂ）のプラスミドマップである。
【図６】ファィバーＡＢループノブ及び／又はペントン、ＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターを使用するＡ５４９細胞のインビトロでの形質導入効率を示す。これらの研究では下記のアデノウイルスベクターが使用された：Ａｖ１ｎＢｇ、ＦＫＯ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１、ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＰＤ１及びＦＫＯ１ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１。
【図７Ａ】ファィバーＡＢループノブ及び／又はペントン、ＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターを使用するインビボでのアデノウイルス媒介肝臓遺伝子発現（図７Ａ）及びヘキソンＤＮＡ含有量（図７Ｂ）を示す。この研究では下記のアデノウイルスベクターが使用された：Ａｖ１ｎＢｇ、ＦＫＯ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１、ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＰＤ１、ＦＫＯ１ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１、ＫＯ１２と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＫＯ１２及びＫＯ１２ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＫＯ１２ＰＤ１。
【図７Ｂ】ファィバーＡＢループノブ及び／又はペントン、ＰＤ１突然変異を含有するアデノウイルスベクターを使用するインビボでのアデノウイルス媒介肝臓遺伝子発現（図７Ａ）及びヘキソンＤＮＡ含有量（図７Ｂ）を示す。この研究では下記のアデノウイルスベクターが使用された：Ａｖ１ｎＢｇ、ＦＫＯ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１、ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＰＤ１、ＦＫＯ１ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＦＫＯ１ＰＤ１、ＫＯ１２と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＫＯ１２及びＫＯ１２ＰＤ１と呼ばれるＡｖ１ｎＢｇＫＯ１２ＰＤ１。
【図８】ｐＦＢｓｈｕｔｔｌｅ（ＥｃｏＲＩ）のプラスミドマップである。
【図９】ｐＳＱ１ＨＳＰのプラスミドマップである。
【図１０】ｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１のプラスミドマップである。
【図１１】ｐＳＱ１ＨＳＰＰＤ１のプラスミドマップである。
【図１２】ｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１ＰＤ１のプラスミドマップである。
【図１３Ａ】ファィバーシャフト、ノブ及び／又はペントン突然変異を含有するアデノウイルスベクターを使用するＡ５４９細胞及びＨｅＬａ細胞の形質導入効率示す。図１３ＡはＡ５４９細胞の形質導入効率の用量応答性を示す。図１３Ｂは２０００ｐｐｃにおけるＨｅＬａ細胞の形質導入効率を示す。図１３Ｃはファィバーシャフト突然変異を含有するアデノウイルスベクターの競合分析を示す。
【図１３Ｂ】ファィバーシャフト、ノブ及び／又はペントン突然変異を含有するアデノウイルスベクターを使用するＡ５４９細胞及びＨｅＬａ細胞の形質導入効率示す。図１３ＡはＡ５４９細胞の形質導入効率の用量応答を示す。図１３Ｂは２０００ｐｐｃにおけるＨｅＬａ細胞の形質導入効率を示す。図１３Ｃはファィバーシャフト突然変異を含有するアデノウイルスベクターの競合分析を示す。
【図１３Ｃ】ファィバーシャフト、ノブ及び／又はペントン突然変異を含有するアデノウイルスベクターを使用するＡ５４９細胞及びＨｅＬａ細胞の形質導入効率示す。図１３ＡはＡ５４９細胞の形質導入効率の用量応答を示す。図１３Ｂは２０００ｐｐｃにおけるＨｅＬａ細胞の形質導入効率を示す。図１３Ｃはファィバーシャフト突然変異を含有するアデノウイルスベクターの競合分析を示す。
【図１４Ａ】インビボアデノウイルス媒介肝臓遺伝子発現（図１４Ａ）及びヘキソンＤＮＡ含有量（図１４Ｂ）に対するファィバーシャフト突然変異の影響を示す。
【図１４Ｂ】インビボアデノウイルス媒介肝臓遺伝子発現（図１４Ａ）及びヘキソンＤＮＡ含有量（図１４Ｂ）に対するファィバーシャフト突然変異の影響を示す。
【図１５Ａ】ｐＳＱ１ＨＳＰＲＧＤ（図１５Ａ）及びｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１ＲＧＤ（図１５Ｂ）のプラスミドマップである。
【図１５Ｂ】ｐＳＱ１ＨＳＰＲＧＤ（図１５Ａ）及びｐＳＱ１ＨＳＰＫＯ１ＲＧＤ（図１５Ｂ）のプラスミドマップである。
【図１６】ＲＧＤターゲッティングリガンドの挿入はＨＳＰ結合シャフトＳ＊突然変異を含有するベクターの形質導入を回復させることができることを示す。
【図１７Ａ】ｐＳＱ１ＡＤ３５Ｆｉｂｅｒ（図１７Ａ）及びｐＳＱ１Ａｄ３５ＦｃＲＧＤ（図１７Ｂ）のプラスミドマップである。
【図１７Ｂ】ｐＳＱ１ＡＤ３５Ｆｉｂｅｒ（図１７Ａ）及びｐＳＱ１Ａｄ３５ＦｃＲＧＤ（図１７Ｂ）のプラスミドマップである。
【図１８Ａ】３５Ｆキメラファィバーをコードするプラスミドのマップである。図１８ＡはｐＳＱ１３５Ｔ５Ｈのプラスミドマップでありそして図１８ＢはｐＳＱ１５Ｔ３５Ｈのプラスミドマップである。
【図１８Ｂ】３５Ｆキメラファィバーをコードするプラスミドのマップである。図１８ＡはｐＳＱ１３５Ｔ５Ｈのプラスミドマップでありそして図１８ＢはｐＳＱ１５Ｔ３５Ｈのプラスミドマップである。
【図１９】Ａｄ３５ファィバー及びその誘導体を含有するＡｄ５ベクターのインビトロ分析の結果を示す。
【図２０】Ａｄ３５ファィバー及びその誘導体を含有するＡｄ５ベクターのインビボ分析の結果を示す。
【図２１Ａ】ｐＳＱ１Ａｄ４１ｓＦ（図２１Ａ）及びｐＳＱ１Ａｄ４１ｓＦＲＧＤ（図２１Ｂ）のプラスミドマップである。
【図２１Ｂ】ｐＳＱ１Ａｄ４１ｓＦ（図２１Ａ）及びｐＳＱ１Ａｄ４１ｓＦＲＧＤ（図２１Ｂ）のプラスミドマップである。
【図２２】Ａｄ４１短ファィバーを含有するＡｄ５ベクターのインビボ分析の結果を示す。
【図２３】ＨＩループにｃＲＧＤリガンドを含有するように工学的に再作成されたＡｄ４１短ファィバーを含有するＡｄ５を基本とするベクターのインビトロ分析を示す。
【図２４】ヘキサジメトリンブロミド（ＨＢ）、プロタミンサルフェート（ＰＳ）及びポリリシン−ＲＧＤ（Ｋ１４）又は抗ペントン−ＴＮＦα二官能性タンパク質（αｐｅｎ−ＴＮＦ）を使用して脱ターゲッティングされたアデノウイルスベクターＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１によるＡＥ１−２ａ細胞の高められた形質導入を示す。
【図２５】ＨＳＰ相互作用の機能破壊は他の器官へのアデノウイルス媒介遺伝子導入を減少させることを示す。
【図２６】β−ガラクトシダーゼをコードしそしてファィバー及び／又はペントンタンパク質に対する様々な突然変異を含有するアデノウイルスベクターによるインビボ肝臓形質導入を示す。結果は野生型と比べた百分率形質導入としてプロットされている。形質導入のレベルを決定するための２つの異なる方法を各ベクターについて示す。
【図２７】Ｓ＊、ＫＯ１Ｓ＊及び４１ｓＦファィバーを含有するベクターについて肝臓及び腫瘍に対するアデノウイルスベクターの生物的分布を示す。
【配列表】
2006500902.tif 000007
2006500902.tif 000008
2006500902.tif 000009
2006500902.tif 000010
2006500902.tif 000011
2006500902.tif 000012
2006500902.tif 000013
2006500902.tif 000014
2006500902.tif 000015
2006500902.tif 000016
2006500902.tif 000017
2006500902.tif 000018
2006500902.tif 000019
2006500902.tif 000020
2006500902.tif 000021
2006500902.tif 000022
2006500902.tif 000023
2006500902.tif 000024
2006500902.tif 000025
2006500902.tif 000026
2006500902.tif 000027
2006500902.tif 000028
2006500902.tif 000029
2006500902.tif 000030
2006500902.tif 000031
2006500902.tif 000032
2006500902.tif 000033
2006500902.tif 000034
2006500902.tif 000035
2006500902.tif 000036
2006500902.tif 000037
2006500902.tif 000038
2006500902.tif 000039
2006500902.tif 000040
2006500902.tif 000041
2006500902.tif 000042
2006500902.tif 000043
2006500902.tif 000044
2006500902.tif 000045
2006500902.tif 000046
2006500902.tif 000047
2006500902.tif 000048
2006500902.tif 000049
2006500902.tif 000050
2006500902.tif 000051
2006500902.tif 000052
2006500902.tif 000053
2006500902.tif 000054
2006500902.tif 000055
2006500902.tif 000056
2006500902.tif 000057
2006500902.tif 000058
2006500902.tif 000059
2006500902.tif 000060
2006500902.tif 000061
2006500902.tif 000062
2006500902.tif 000063
2006500902.tif 000064
2006500902.tif 000065
【図１】
2006500902.tif 000066
【図２】
2006500902.tif 000067
【図３Ａ】
2006500902.tif 000068
【図３Ｂ】
2006500902.tif 000069
【図３Ｃ】
2006500902.tif 000070
【図４】
2006500902.tif 000071
【図５Ａ】
2006500902.tif 000072
【図５Ｂ】
2006500902.tif 000073
【図６】
2006500902.tif 000074
【図７Ａ】
2006500902.tif 000075
【図７Ｂ】
2006500902.tif 000076
【図８】
2006500902.tif 000077
【図９】
2006500902.tif 000078
【図１０】
2006500902.tif 000079
【図１１】
2006500902.tif 000080
【図１２】
2006500902.tif 000081
【図１３Ａ】
2006500902.tif 000082
【図１３Ｂ】
2006500902.tif 000083
【図１３Ｃ】
2006500902.tif 000084
【図１４Ａ】
2006500902.tif 000085
【図１４Ｂ】
2006500902.tif 000086
【図１５Ａ】
2006500902.tif 000087
【図１５Ｂ】
2006500902.tif 000088
【図１６】
2006500902.tif 000089
【図１７Ａ】
2006500902.tif 000090
【図１７Ｂ】
2006500902.tif 000091
【図１８Ａ】
2006500902.tif 000092
【図１８Ｂ】
2006500902.tif 000093
【図１９】
2006500902.tif 000094
【図２０】
2006500902.tif 000095
【図２１Ａ】
2006500902.tif 000096
【図２１Ｂ】
2006500902.tif 000097
【図２２】
2006500902.tif 000098
【図２３】
2006500902.tif 000099
【図２４】
2006500902.tif 000100
【図２５】
2006500902.tif 000101
【図２６】
2006500902.tif 000102
【図２７】
2006500902.tif 000103
【国際調査報告】
2006500902.tif 000104
2006500902.tif 000105