(57)【要約】本発明は、ウイルス疾患および癌の治療のための化合物および方法を提供する。
2006507255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物：
2006507255.tif 000025
（式中、
Yは、C、CH、およびNから選択されるメンバーであり；
Zは、C、CH、およびBから選択されるメンバーであり；
R1は、H、アシル、OR9、SR9、NHNH2、NR9R10、=Oおよび=NR9から選択されるメンバーであって、
R9およびR10が独立してH、置換または非置換アルキル、アシル、置換または非置換ヘテロアルキル、および置換または非置換アリールから選択されるメンバーであり；
R2は、存在するかまたは存在せず、H、アシル、置換または非置換アルキル、OR11、SR11、NR11a、NR12a、ハロゲン、および=Oから選択されるメンバーであって、R11は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーであり；
R11aおよびR12aは、独立してH、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーであり；
R3は、H、アシル、置換または非置換アルキル、NR12R13、NR12OR13、Sr12、(=O)、およびOR12から選択されるメンバーであって、
ここでR12およびR13は、独立してH、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーであり；
R4およびR4aは、独立してH、ハロゲン、OMe、およびOHから選択されるメンバーであり；
R5およびR6は、独立してHおよびOR14から選択されるメンバーであって、
ここでR14は、H、置換または非置換アルキル、アシル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、およびP(O)(R15)(R16)から選択されるメンバーであり、
ここでR15およびR16は、独立してOR17、NR17R18、OCH2CH2CN、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヌクレオシドから選択されるメンバーであり、
ここでR17およびR18は、独立してH、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーであり、
R5およびR3；R6およびR3；並びにR15およびR16から選択されるメンバーは、これらが付着する原子と共に、任意に結合して、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造を形成し；
R7およびR8は、存在するかまたは存在せず、独立してH、アシル、置換または非置換アルキル、並びにR1およびR8であって、これらが付着する原子と共に、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造へと任意に結合する。）
【請求項２】
以下の式を有する、請求項1記載の化合物：
2006507255.tif 000026
【請求項３】
以下の式を有する、請求項1記載の化合物：
2006507255.tif 000027
【請求項４】
R11が、シリル基、および置換または非置換アルキルエーテルから選択されるメンバーである、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
以下の式を有する、請求項1記載の化合物：
2006507255.tif 000028
【請求項６】
以下の式を有する請求項5記載の化合物：
2006507255.tif 000029
(式中、
R19、R20、およびR21は、独立してH、アシル、および置換または非置換アルキルから選択されるメンバーである。）
【請求項７】
以下の式を有する、請求項5記載の化合物：
2006507255.tif 000030
【請求項８】
R6が以下の式を有する請求項1記載の化合物：
2006507255.tif 000031
(式中
R22は、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり；
Lは、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり；かつ、
Arは、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。）
【請求項９】
Lが細胞に化合物の侵入後にインビボで切断される部分を含む、請求項8記載の化合物。
【請求項１０】
R6が以下の式を有する、請求項1記載の化合物：
2006507255.tif 000032
(式中
R22は、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり；
Lは、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり；かつ、
nは、1〜30の整数である。）
【請求項１１】
Lが細胞に化合物の侵入後にインビボで切断される部分を含む、請求項10記載の化合物。
【請求項１２】
請求項1記載の化合物および式A-Bを有する第2の化合物の製剤
(式中
Aは、疎水性ドメインであり；かつ、
Bは、Aに共有結合した親水性ドメインである)。
【請求項１３】
ポリカチオン種をさらに含む、請求項12記載の製剤。
【請求項１４】
ポリカチオン種がデンドリマーのポリアミンである、請求項13記載の製剤。
【請求項１５】
製剤が水性製剤である、請求項12記載の製剤。
【請求項１６】
ウイルス疾患を治療するための方法であって、このような治療を必要とする被検者に請求項1記載の化合物の治療上有効な量を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
化合物が経口的に与えられる、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
化合物が腸溶製剤である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
化合物が経口浸透圧性のドラッグ送達装置で送達される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ウイルス疾患が、RNAウイルスおよびDNAウイルスから選択されるメンバーのウイルスによって引き起こされる、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス疾患がレトロウイルスによって引き起こされる、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
ウイルス疾患がHIVによって引き起こされる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
HIVがヌクレオチド逆転写酵素阻害剤に対して耐性である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ウイルス疾患がフラビウイルス科ファミリーのウイルスによって引き起こされる、請求項16記載の方法。
【請求項２５】
ウイルス疾患がC型肝炎である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス疾患がパラミクソウイルス科ファミリーのウイルスによって引き起こされる、請求項16記載の方法。
【請求項２７】
DNAウイルスがB型肝炎ウイルスである、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
DNAウイルスが天然痘／ワクシニアウイルスである、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
これは、2002年9月24日に出願された米国仮出願第60/413,337号の非仮出願であり、その開示は、全ての目的のためにその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
RNAウイルス疾患は、エイズ、肝炎、気道のライノウイルス感染、インフルエンザ、麻疹、ポリオ、およびその他を含む、人間のウイルス疾患のウイルス罹患率および死亡率の大半に関与している。B型およびC型肝炎、ならびにT細胞ヒト白血病などの治療が困難であるRNA中間体を介して複製するRNAまたはDNAウイルスにより引き起こされる慢性の持続的な疾患がその他にも数多く存在する。多くの一般的なヒト疾患は、ウイルスにコードされるRNAレプリカーゼにより複製されるRNAウイルスにより引き起こされる。この群に含まれるのは、インフルエンザ（Zurcherら、J.Gen.Virol.77:1745(1996)）、デング熱（Becker、Virus-Genes 9:33(1994)）およびライノウイルス感染（Horsnellら、J.Gen.Virol.、76:2549(1995)）である。動物の重要なRNAウイルス疾患には、ネコ白血病および免疫不全、ヒツジのビスナ・マエディ、ウシのウイルス性下痢、ウシ粘膜疾患、ならびにウシ白血病が含まれる。DNAウイルスに関してはいくつかのワクチンが利用可能であるが、B型肝炎などの疾患は依然として蔓延している。B型肝炎は、RNA中間体を通して自己のゲノムを複製するDNAウイルスにより引き起こされる（SummersおよびMason、Cell 29:4003(1982)）。効果的なワクチンが予防薬として存在するが、持続的な慢性HBV感染の効果的な治療法は存在しない。
【０００３】
鎖終結ヌクレオシド類似体は、DNAウイルスおよびレトロウイルスによる感染症の治療のために広範囲に使用されている。これらの類似体は、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素によってDNAに組み込まれる。一旦組み込まれるると、これらは、さらに伸張されることができず、したがってDNA合成を終結する。残念ながら、このような鎖終結類似体に対する耐性の発生に対して、速効性の選択圧が存在し、ウイルス・ポリメラーゼに突然変異を発生させて、ヌクレオシドの類似体の組み込みを防げてしまう。
【０００４】
代わりのストラテジーでは、ウイルスゲノムに優先して組み込まれる変異原性のデオキシリボヌクレオシド(MDRN)または変異原性のリボヌクレオシド(MRN)を利用する。MDRNは、ウイルス逆転写酵素によって、またはDNAポリメラーゼ酵素によってDNAに組み込まれる。MRNは、ウイルスRNAレプリカーゼによってウイルスRNAに組み込まれる。その結果、ウイルスゲノムの突然変異は、永続し、それぞれのウイルス複製サイクルで蓄積される。ウイルス感染のそれぞれのサイクルで、ウイルスゲノムの突然変異数の鎖様の増加が起こる。最終的に、それぞれのウイルスゲノムの突然変異数は、活性なウイルスによりコードされるタンパク質が産生されないほど多い。
【０００５】
5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-アザ-dC)は、白血病患者で試験された抗悪性腫瘍薬であり、主にDNAを脱メチルすることによって作用すると考えられる。また、5-アザ-シチジン(5-アザ-C)は、白血病患者を治療するために使用されてきた。メチル化は、腫瘍成長抑制因子および分化遺伝子をサイレンスさせると考えられる。面白いことに、5-アザ-2'-デオキシウリジン(5-アザ-dU)に対する5-アザ-dCの脱アミノ化は、抗悪性腫瘍活性の減少を生じることが示された(たとえば、Momparler, et al., Leukemia. 11：1-6 (1997)を参照されたい)。
【０００６】
また、5-アザ-シチジン(5-アザ-C)は、白血病患者を治療するために使用されてきた。5-アザ-Cおよび5-アザ-dCは両者とも、インビトロでHIV複製を阻害することを示されているが、作用機序は決定されていなかった(たとえば、Bouchard et al, Antimicrob. Agents Chemother. 34：206-209 (2000)を参照されたい)。より最近には、5-アザ-Cは、口蹄疫ウイルスに対して変異原性であることが示された(たとえば、Sierra et al., J. Virol. 74(18)：8316-8323 (2000)を参照されたい)。5-アザ-Cおよび5-アザ-dCは両者とも、不安定な化合物である。5-アザ-dCは、再構成によって迅速に分解される。pH 7.0では、25℃および50℃の温度において、それぞれ5時間および0.5時間後に10%の分解が生じる(たとえば、Van Groeningen et al., Cancer Res. 46：4831-4836 (1986)を参照されたい)。したがって、5-アザ-Cおよび5-アザ-dCの治療的な使用は、ウイルス疾患および癌の治療に限定される。本発明は、この課題およびその他の課題を解決する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の種類並びに抗ウイルス剤および抗癌化学療法薬として類似体を使用する方法を提供する。
【０００８】
したがって、第1の側面において、式Iに記載の化合物が提供される：
2006507255.tif 000003
【０００９】
式Iにおいて、破線の円は、環構造が、環内部の原子の原子価が満たされるように、いずれかの位置で1つまたは複数の二重結合を含んでもよいことを示す。環構造は、芳香族化合物(たとえば、ヘテロアリール)または非芳香族化合物であってもよい。置換基R2、R7、R8は、選択された環構造に対する結合価の法則を適用することによって指示されるとおり、存在するか、または存在しない。
【００１０】
記号Yは、C、CH、またはNを表し、および記号Zは、C、CH、またはBを表す。R1は、H、アシル、OR9、SR9、NR9NHR10、NR9R10、=O、および=NR9から選択されるメンバーであり、式中R9およびR10は、独立してH、置換または非置換アルキル、アシル、置換または非置換ヘテロアルキル、および置換または非置換アリールから選択されるメンバーである。
【００１１】
記号R2は、H、アシル、置換または非置換アルキル、OR11、SR11、NR11a、NR12a、ハロゲン、および=Oから選択されるメンバーの置換基を表す。記号R11は、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーを表す。R11aおよびR12aは、独立してH、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。
【００１２】
R3は、H、アシル、置換または非置換アルキル、NR12R13、NR12OR13、SR12、(=O)、およびOR12から選択されるメンバーである。記号R12およびR13は、独立してH、置換もしくは非置換アルキル、アシル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーを表す。
【００１３】
R4およびR4aは、独立してH、ハロゲン、OMe、およびOHから選択されるメンバーである。好ましい態様において、ハロゲンは、Fである。
【００１４】
R5およびR6は、独立してH、およびOR14から選択されるメンバーである。記号R14は、H、置換もしくは非置換アルキル、アシル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、または置換もしくは非置換アリール、およびP(O)(R15)(R16)を表す。R15およびR16は、独立してOR17、NR17R18、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヌクレオシドから選択される。R17およびR18は、独立してH、CH2CH CN、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。
【００１５】
R5およびR3；R6およびR3；並びにR15およびR16から選択されるメンバーは、これらが付着する原子と共に、任意に結合して、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造を形成する。例示的態様において、環構造は、5または6員環構造である。
【００１６】
R7およびR8は、独立してH、アシル、置換または非置換アルキルから選択される。R1およびR8は、これらが付着する原子と共に、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造に接続されていてもよい。
【００１７】
もう一つの本発明の側面において、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体(たとえば、式Iの化合物)は、ウイルス疾患患者に対して式Iの化合物の治療上有効な量を投与することによってウイルス疾患を治療するために使用される。一部の態様において、化合物は、経口的に与えられる。その他の態様において、化合物は、腸溶製剤で与えられる。さらなる態様において、化合物は、経口浸透圧性のドラッグ送達装置に送達される。
【００１８】
化合物が経口的に与えられるときは、通常、これらが投与された用量の約15%を超える生物学的利用能を有することが好ましく、約20%を超えることがより好ましい。例示的態様において、化合物は、酸付加塩、たとえば第四級アンモニウム塩として処方される。塩は、通常、ミネラルまたは有機酸と化合物を接触させることによって形成される。好ましい態様において、酸は、パルミチン酸などのカルボン酸である。
【００１９】
ウイルス疾患は、RNAウイルス、DNAウイルス、またはレトロウイルスによって引き起こされるウイルス疾患であることができる。一部の態様において、ウイルス疾患は、HIVによって引き起こされる。さらなる態様において、HIV株は、ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤または非核酸系逆転写酵素阻害剤もしくはプロテアーゼ阻害剤を含むHIV感染症のその他の治療に抵抗性である。その他の態様において、ウイルス疾患は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスによって引き起こされる。さらなる態様において、ウイルス疾患は、C型肝炎である。その他の態様において、ウイルス疾患は、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスによって引き起こされる。さらなる側面において、ウイルスは、B型肝炎ウイルスまたは天然痘／ワクシニアウイルスである。
【００２０】
本発明のもう一つの側面において、式Iの化合物は、癌、たとえば造血性の癌を治療するために使用される。
【００２１】
本発明のその他の側面、目的、および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００２２】
発明の詳細な説明
導入
本発明は、5-アザ-シチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、並びにこれらの誘導体および変種の加水分解的に安定な誘導体および製剤を使用して、ウイルス突然変異誘発を誘導する方法であって、細胞培養において、並びに動物およびヒトの治療において有用な方法に関する。この方法は、DNAまたはRNAウイルス(すなわち、DNAまたはRNAゲノムを有するウイルス)に対して有用であるという点で有利である。一つの態様において、本発明の方法は、RNAウイルス(RNAゲノムを有するウイルス)、レトロウイルス、または別のRNA中間体によって複製されるその他のウイルスをターゲットするために使用したときに有利である。もう一つの態様において、本発明の方法は、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびパピローマウィルスなどのDNAウイルスをターゲットするために有利である。作用機序に制されないが、一つの態様において、本発明の方法は、たとえば塩基の誤対合を促進する互変異性によって、ウイルスにコードされたもの、および細胞にコードされたウイルスゲノムの核酸の両方に組み込まれたミスコードしたヌクレオシドおよびヌクレオチド群を利用し、これによりゲノムウイルスの子孫コピーにミスコードを引き起こす(たとえば、Moriyama et al, Nucleic Acids Symposium 42： 131-132 (1999)； Robinson et al., Biochemistry 37： 10897-10905 (1998)； Anensen et al., Mutation Res. 476： 99-107 (2001)； Lutz et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Letts. 8： 499-504 (1998) ；および Klungland et al., Toxicology Letts. 119： 71-78 (2001)を参照されたい)。
【００２３】
ウイルスは、ウイルスゲノム核酸が細胞ゲノム中に組み込まれたものであり得る。その細胞ゲノムを組み込むウイルスの例にはレトロウイルスが含まれるが、これに限定されない。1つの特に好ましい態様において、ウイルスはHIVである。他の好ましいウイルスには、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-II、およびSIVが含まれる。別の態様において、ウイルスは、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えばHSV、CMV、EBV）、痘瘡ウイルス、またはパピローマウイルス（例えばHPV）などのDNAウイルスである。または、ウイルスゲノムはエピソーム性でもよい。これらには、多くのヒトおよび動物の病原体、例えばフラビウイルス（例えばデング熱、西ナイルウイルス、および黄熱病）、ペスチウイルス（フラビウイルス科の一属）（例えばBVDV（ウシウイルス性下痢ウイルス））、C型肝炎ウイルス（同様にフラビウイルス科の一属）、フィロウイルス（例えばエボラウイルス）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（呼吸器合胞体ウイルスを含む）、麻疹、流行性耳下腺炎、ピコルナウイルス（エコーウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルスを含む）、トガウイルス（脳炎、コロナウイルス、風疹を含む）、ブンヤウイルス、レオウイルス（ロタウイルスを含む）、ラブドウイルス、アレナウイルス（例えばリンパ球性脈絡髄膜炎）ならびにヒトおよび動物のその他のRNAウイルスが含まれる。
【００２４】
標的化されうるレトロウイルスには、ヒトT細胞白血病（HTLV）ウイルス、例えばHTLV-1およびHILV-2、成人T細胞白血病（ATL）、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV-1およびHIV-2、ならびにサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。いくつかの態様において、HIVウイルスは非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤に対して耐性である。一部の態様において、ウイルスはA型肝炎またはB型肝炎である。例えば、Fields Virology（第3版、1996）を参照されたい。ウイルス疾患およびその複製に関するさらなる情報は、WhiteおよびFenner、Medical Virology、第4版、Academic Press（1994）およびPrinciples and Practice of Clinical Virology、Zuckerman、BanatvalaおよびPattison編、John Wiley and Sons(1994)に見出すことができる。さらに、本発明の化合物は癌の治療に使用することができる。
【００２５】
ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の変異原性の可能性を検出するためのアッセイ法が提供される(たとえば、実施例1を参照されたい)。本アッセイ法では、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を核酸鋳型の存在下においてウイルス核酸に組み込み、核酸は、細胞またはウイルスのポリメラーゼによって合成し、組み込みにより子孫ウイルスに突然変異を引き起こすかどうかに関して決定がなされる。任意に、天然に存在するヌクレオチド(すなわち、G、A、U、および／またはC)も核酸重合体に組み込まれる。本方法は、任意に、アッセイ法において、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体および天然に存在するあらゆるリボヌクレオシドを核酸に組み込む割合を比較することを含む。アッセイ法のさらなる例については、たとえばUS Patent No. 6,132,776、6,130,036、6,063,628、および5,512,431、並びに特許出願USSN 10/226,799および60/314,728を参照されたい(これらの全体において参照として本明細書に組み入れられる)。
【００２６】
本発明の方法に使用される例示的な化合物は、5-アザ-シチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、並びにこれらの誘導体および変種を含む。
【００２７】
定義
置換基は、これらの従来の化学式によって特定される場合、左から右に書かれており、これらは、右から左に構造を記述することによって生じる化学的に同一の置換基を等しく含み、たとえば、-CH2O-は、-OCH2-も具陳することが企図され；-NHS(O)2-は、-S(O)2HN-も表すこと、その他が企図される。
【００２８】
本明細書において使用されるものとして、「結合メンバー」とは、アルキレン単位または少なくとも1つのヘテロ原子を含む共有結合性の化学結合をいう。例示的な結合メンバーは、C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-などを含む。
【００２９】
「ターゲッティング基」という用語は、(1)標的領域、たとえば細胞に対してその部分が付着される実体(たとえば、治療薬、またはマーカー)に導くことができるか；または(2)標的領域、例えばウイルス感染領域で優先して活性化される部分を意味することが企図される。ターゲティング基は、小分子であることができ、これには、非ペプチドおよびペプチドの両方を含むことが企図される。また、ターゲティング基は、巨大分子であることができ、これには、糖類、レクチン、受容体、受容体に対するリガンド、BSAなどのタンパク質、抗体などを含む。
【００３０】
「アルキル」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特記しない限り、直鎖または分岐鎖または環式の炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味し、これは完全に飽和しているか、モノ不飽和またはポリ不飽和であってよく、かつ指定した炭素原子数を有する二価または多価の基を含むことができる（すなわちC1-C10は1個から10個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの相同体および異性体などの基が含まれるがこれらに限定されない。不飽和アルキル基は、1つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例には、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、およびより高級な相同体および異性体が含まれるが、これらに限定されない。「アルキル」という用語は、特記しない限り、以下により詳細に定義したアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むことを意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００３１】
「アルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、-CH2CH2CH2CH2-により例示されるがこれに限定されない、アルカンに由来する二価基を意味し、かつ「ヘテロアルキレン」として後述する基がさらに含まれる。一般的には、アルキル（またはアルキレン）基は、1個から24個の炭素原子を有し、10個またはそれ未満の炭素原子を有するような基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般的に8個またはそれ未満の炭素原子を有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【００３２】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）なる語は、その慣用的な意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りに付着されるアルキル基を意味する。
【００３３】
「アシル」とは、酸素原子が除去されたカルボン酸の残りの部分、すなわち、-C(O)Rであって、式中Rは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであるものをいう。
【００３４】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体または別の語と組合わせて、特記しない限り、記載の炭素原子数およびO、N、Si、およびSからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分岐鎖または環式の炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味し、ここで窒素原子および硫黄原子は選択的に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は選択的に4級化されてもよい。ヘテロ原子（群）O、N、およびSおよびSiは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、またはアルキル基が分子の残りに付着される位置に配置され得る。例には、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、および-CH=CH-N(CH3)-CH3が含まれるがこれらに限定されない。2つまでのヘテロ原子が連続してもよく、例えば、-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3が挙げられる。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、-CH2-CH2-S-CH2CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-により例示されるがこれらに限定されない、ヘテロアルキルに由来する二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子は、鎖末端の一方または両方を占有することもできる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の式が記載されている方向は、連結基の配向を暗示するわけではない。例えば、式-C(O)2R'-は、-C(O)2R'-および-R'C(O)2-の両方を示す。
【００３５】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体または他の語との組合せで、特記しない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式形を示す。さらに、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りに付着される位置を占有できる。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるがこれらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例には、1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
「アリール」という用語は、特記しない限り、単環または一緒に縮合されているかもしくは共有結合的に連結した多環（三環まで）であり得る、多不飽和の典型的には芳香族の炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、N、O、およびSから選択された0個から4個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を意味し、窒素原子および硫黄原子は選択的に酸化されており、かつ窒素原子は選択的に4級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通して残りの分子に付着されうる。アリール基およびヘテロアリール基の非制限的な例には、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソキサゾリル、4-イソキサゾリル、5-イソキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルが含まれる。前記したアリールおよびヘテロアリール環系の各々の置換基は、下記の許容可能な置換基の群より選択される。
【００３７】
簡潔にするために、「アリール」という用語は他の用語と組合わせて使用した場合（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、前記に定義したようなアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。従って、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子により置換されているアルキル基（例えばフェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど）を含む、アルキル基にアリール基が付着している基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意味する。
【００３８】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（C1-C4）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどが含まれるがこれらに限定されないことを意味する。
【００３９】
アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含む）の置換基は、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'-、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CN、および-NO2から選択されるがこれらに限定されない0から（2m'＋1）の範囲の数の多様な1つまたは複数の基であり得、ここでm'はこのような基における炭素原子の総数である。R'、R''、R'''、およびR''''は、各々好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、例えば1個から3個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が例えば2つ以上のR基を含む場合、R'基、R''基、R'''基、およびR''''基が2つ以上存在する場合の各々と同様に、各R基は独立して選択される。R'およびR''が同じ窒素原子に付着している場合、それらは窒素原子と合わせて、5、6、または7員環を形成することができる。例えば、-NR'R''は、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルを含むがこれらに限定されないことを意味する。置換基に関する前記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など）を含むことを意味すると理解する。
【００４０】
アルキル基について記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は種々であり、0から芳香族環系上の開いた原子価の総数までの数の、例えば、ハロゲン、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CN、および-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキシ、およびフルオロ(C1-C4)アルキルから選択される。本発明の化合物が例えば複数のR基を含む場合、R'基、R''基、R'''基、およびR''''基が複数存在する場合の各々と同様に、R基はそれぞれ独立して選択される。
【００４１】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の2つの置換基は選択的に、式-T-C(O)-(CRR')q-U-の置換基で置換され得；ここでTおよびUは、独立して、-NR-、-O-、-CRR'-、または単結合であり、qは0から3の整数である。または、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の2つの置換基は、選択的に、式-A-(CH2)r-B-の置換基で置換され得、ここでAおよびBは、独立して、-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-、または単結合であり、rは1から4の整数である。このように形成された新しい環の単結合の1つは、選択的に、二重結合で置換されてもよい。または、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の2つの置換基は選択的に式-(CRR')s-X-(CR''R''')d-の置換基で置換され得、ここでsおよびdは、独立して、0から3の整数であり、Xは、-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。置換基R、R'、R''、およびR'''は、好ましくは独立して、、水素または置換もしくは非置換(C1-C6)アルキルから選択される。
【００４２】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という用語は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）、およびケイ素（Si）を含む。
【００４３】
「部分」とは、別の部分に付着される分子の基をいう。
【００４４】
記号「R」とは、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的な略語である。
【００４５】
「反応性の官能基」とは、本明細書に使用されるものとして、以下の基を含む基をいうが、これらに限定されない：オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハライド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアナート、イソシアネート、チオシアナート、イソチオシアナート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、硫化物、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、サルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン(ynamines)、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物。また、反応性の官能基は、生物抱合体(bioconjugates)、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを調製するために使用されるものを含む。これらの各々の官能基を調製する方法は、当該技術分野において周知であり、特定の目的のためにこれらを適用することまたは修飾することは、当業者の能力の範囲である(たとえば、Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989を参照されたい)。
【００４６】
「保護基」とは、本明細書に使用されるものとして、特定の反応条件下で実質的に安定である基質の一部であるが、異なる反応条件下で基質から切断されるものをいう。また、保護基は、本発明の化合物の芳香環成分の直接の酸化に関与するように選択することができる。有用な保護基の例については、たとえば、Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991を参照されたい。
【００４７】
本明細書に使用されるものとして、「ヌクレオシド」という用語は、天然に存在するヌクレオシドおよびこれらの修飾を含む。修飾は、ヌクレオシドに対してさらなる電荷、分極率、水素結合、および静電的相互作用を組み込む化学基を提供するものを含むが、これらに限定されない。このような修飾は、ペプチド核酸(PNAs)、2'位の糖修飾、5位のピリミジン修飾、8位のプリン修飾、環外のアミン修飾、4-チオウリジンの置換、5-臭化ウラシルまたは5-ヨード-ウラシルの置換；バックボーンの修飾、メチル化、イソシチジンおよびイソグアニジンなどの等塩基などを含むが、これらに限定されない。また、「ヌクレオシド」とは、たとえば、ニトロインドールなどの非天然の塩基を含むことができる。また、修飾は、消光剤、フルオロフォア、または別の部分による誘導体化を含むことができる。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。また、ヌクレオシドの修飾の多くは、ヌクレオチドに対して行うことができる。
【００４８】
記号
2006507255.tif 000004
は、結合として利用されるか、または結合に対して直角を示すかにかかわらず、示された部分が分子、固体担体、その他の残部に付着される位置を示す。
【００４９】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載した化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物が比較的酸性の官能性を含む場合、中性型のこのような化合物を、十分量の所望の塩基と、ニートでまたは適切な不活性溶媒中で接触させることにより塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウムの塩、または類似の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能性を含む場合、中性型のこのような化合物を、十分量の所望の酸と、ニートでまたは適切な不活性溶媒中で接触させることにより酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸由来の塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒性の有機酸由来の塩が含まれる。また、アルギネートなどのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えばBergeら、「薬学的塩（Pharmaceutical Salts）」、Journal of Pharmaceutical Science、1977、66、1-19を参照されたい）。本発明の一部の特定の化合物は、化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする、塩基性官能性および酸性官能性の両方を含む。
【００５０】
中性型の化合物は、好ましくは、塩を塩基または酸と接触させて、慣用的な方法で親化合物を単離することにより再生される。親型の化合物は、極性溶媒中での溶解度などの一部の物理的特性において種々の塩型とは異なるが、その他の点では、本発明の目的に関して塩は親型の化合物と等価である。
【００５１】
塩型の他に、本発明は、プロドラッグ型の化合物を提供する。本明細書に記載した化合物のプロドラッグは、生理的条件下で化学的変化を容易に受けて本発明の化合物を与える化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境における化学的または生化学的な方法により、本発明の化合物に変換されうる。例えば、プロドラッグは、経皮パッチレザバー中に適切な酵素または化学的試薬と共に配置された場合に、本発明の化合物ヘとゆっくりと変換されることができる。
【００５２】
本発明の化合物の一部は、非溶媒和型ならびに溶媒和型（水和型を含む）として存在できる。一般に、溶媒和型は非溶媒和型と等価であり、かつ本発明の範囲内に包含される。本発明の化合物の一部は、複数の結晶型または無定型で存在し得る。一般に、全ての物理的形状は、本発明により考えられる用途において同等であり、本発明の範囲内であることが意図される。
【００５３】
本発明の化合物の一部は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し；ラセミ体、ジアステレオ異性体、幾何学的異性体、および個々の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
【００５４】
本発明の化合物は、単一の異性体(たとえば、鏡像異性体、シス-トランス、位置的な、ジアステレオマ)として、または異性体の混合物として調製されてもよい。好ましい態様において、化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体的に純粋な化合物を調製する方法は、当該技術分野において既知である。たとえば、鏡像異性的に濃縮された混合物および純粋な鏡像異性化合物は、キラル中心で立体化学を不変のままにするか、またはその完全に逆位を生じさせるかのいずれかの反応と組み合わせて鏡像異性的に純粋な合成中間体を使用して調製することができる。または、合成の経路に沿って、最終産物または中間体を単一の立体異性体に分離することができる。特定の立体中心(stereocenter)を逆位するか、または不変のままにするための技術、および立体異性体の混合物を分離するための技術は、当該技術分野において周知であり、十分に、当業者が特定の状況に対して適切な方法を選択する能力の範囲内である。一般的には、Furniss et al. (eds.), VOGEL'S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5TH ED., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, pp. 809-816;およびHeller, Acc. Chem. Res. 23： 128 (1990)を参照されたい。
【００５５】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する1つまたは複数の原子において、非天然的な割合の原子同位体を含み得る。例えば、本化合物は、放射性同位体、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素-125(125I)、または炭素-14（14C）で放射標識され得る。本発明の化合物の同位体変種の全ては、放射性であってもなくても、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００５６】
「ウイルス疾患」という用語は、ウイルスによって引き起こされる症状をいう。ウイルス疾患は、DNAウイルス、RNAウイルス、またはレトロウイルスによって引き起こすことができる。一部の態様において、ウイルス疾患は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスを含む。フラビウイルス科ファミリーは、ファミリーに3つの属、フラビウイルス、ペスチウイルス(たとえば、BVDV)、およびC型肝炎ウイルス(たとえば、HCV)を含む。パラミクソウイルス科ファミリーは、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、おたふくかぜウイルス、およびはしかウイルスを含むが、これらに限定されない。DNAウイルスは、ポックスウイルス科ファミリーを含む。ポックスウイルス科ファミリーのメンバーは、ワクシニアウイルスおよび小さな痘瘡を引き起こし得る痘瘡ウイルスを含む。DNAウイルスは、RNA中間体を介してそのゲノムを複製するB型肝炎ウイルス含むが、これに限定されない。レトロウイルスは、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-II、およびSIVを含む。
【００５７】
好ましい態様において、本発明の化合物は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)に対して耐性であるHIV株を治療するために使用される。
【００５８】
RNAおよびDNAにおける4つの「天然に存在するヌクレオチド」は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、またはシトシンを含む。互いに相補的なヌクレオチドとは、互いの間に相補的水素結合を形成する傾向を有するものであり、具体的には、Aに対する天然相補体はUまたはTであり、Uに対する天然相補体はAであり、Tに対する天然相補体はAであり、Cに対する天然相補体はGであり、Gに対する天然相補体はCである。
【００５９】
「核酸」とは、一本鎖型または二本鎖型いずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーであり、特に制限しない限り、天然ヌクレオチドの類似体を包含する。
【００６０】
本明細書において使用される「ヌクレオシド類似体」は、以下でより詳細に定義されるが、これにはリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの類似体ならびにそれらの一リン酸、二リン酸、および三リン酸（ヌクレオチド）が含まれる。前記したように、これらは天然でも非天然でもよく、天然供給源に由来しても合成されてもよい。これらのモノマー単位は、ヌクレオシド類似体（またはリン酸化に関与するモノマーが考えられる場合には「ヌクレオチド」類似体）である。例えば、構造基は、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために、ヌクレオシドの糖または塩基に任意で付加され、例えば糖の2'-O位におけるメチル基またはアリル基、または2'-O基を置換するフルオロ基、またはヌクレオシド塩基上のブロモ基などがある。ホスホジエステル結合、すなわちオリゴヌクレオチド類似体の「糖-リン酸骨格」は、例えば、メチルホスホネートまたはO-メチルホスフェートで置換または修飾される。
【００６１】
「ゲノム核酸」とは、ウイルス粒子によりパッケージングされた天然核酸ポリマー（RNAまたはDNA）をコードする核酸に相同的である核酸ポリマーである。典型的には、パッケージングされた核酸は、ウイルス複製に必要ないくつかまたは全ての成分をコードしている。ゲノム核酸は任意でヌクレオチド類似体を含む。共通の配列（「先祖」核酸）を有する核酸から先祖核酸の天然修飾または人工修飾によって得られた場合に、核酸は相同的である。レトロウイルスゲノム核酸は任意で、レトロウイルス粒子によってパッケージングされる能力を有するRNAをコードする。このような核酸は、パッケージング部位と、選択した核酸とを組換え結合することにより構築され得る。
【００６２】
「ウイルス感染細胞」とは、ウイルス核酸が形質導入された細胞である。核酸は任意で、細胞ゲノムに組み込まれるか、または任意でエピソーム性である。
【００６３】
ウイルスまたは核酸の「突然変異率」は、例えばポリメラーゼにより、核酸がコピーされる時に生じる変化の数を意味する。典型的には、これは経時的に測定される、すなわち、ウイルスの複数回のコピー中および複数世代中に生じる変化の数である。
【００６４】
「ポリメラーゼ」とは、既存の鋳型ポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）に相補的なポリヌクレオチド配列を産生する酵素（DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ）を意味する。例えば、RNAポリメラーゼとは、RNAウイルスポリメラーゼもしくはレプリカーゼまたはRNA細胞性ポリメラーゼである。「細胞性ポリメラーゼ」とは、細胞に由来するポリメラーゼである。細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。細胞性RNAポリメラーゼは、典型的には、PolIIまたはPolIIIなどのRNAポリメラーゼである。PolII酵素が最も好ましい。「哺乳動物RNAポリメラーゼII」とは、哺乳動物に由来するRNAポリメラーゼIIである。「ヒトRNAポリメラーゼII」とは、ヒトに由来するRNAポリメラーゼIIである。「ネズミRNAポリメラーゼII」とは、マウスに由来するRNAポリメラーゼIIである。ポリメラーゼは任意で、天然であるか、または人工的に（例えば組換え的に）作製される。
【００６５】
「細胞培養物」とは、動物の体外に存在する細胞群である。これらの細胞は、任意で、細胞バンク、動物、もしくは血液バンクから単離された一次細胞、またはこれらの供給源の1つから培養された二次細胞、または、広く入手可能である人工的に維持された長期生存（long-lived）インビトロ培養物である。
【００６６】
「生存度の漸進的な低下」とは、経時的な、ウイルス群の複製能または感染能の測定可能な低下を意味する。
【００６７】
「ウイルス粒子」とは、RNAウイルスまたはRNA中間体を有するウイルス、例えばBVDV、HCV、またはHIVにより実質的にコードされるウイルス粒子である。粒子中の非ウイルス成分または細胞成分の存在は、細胞膜からの出芽を典型的に含む、ウイルス複製プロセスの共通の結果である。
【００６８】
「HIV粒子」とは、HIVにより実質的にコードされるレトロウイルス粒子である。粒子中の非HIVウイルス成分または細胞成分の存在は、細胞膜からの出芽を典型的に含む、HIV複製プロセスの共通の結果である。一部の用途において、レトロウイルス粒子は、2つ以上のウイルス（しばしばHIVおよびVSV）由来のウイルスタンパク質の同時発現により作為的に「シュードタイプ化（pseudotyped）」され、得られるレトロウイルス粒子の宿主範囲は拡大する。HIV粒子中の非HIV成分の有無は粒子の本質的な性質を変化させない、すなわち粒子は依然として、HIV複製の一次産物として産生される。
【００６９】
以下で考察した方法においては配列整列化（alignment）が必要であるが、比較のためのこのような配列整列化法は当技術分野において公知である。比較のための最適な配列整列化は、SmithおよびWaterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所相同性アルゴリズムにより；NeedlemanおよびWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性整列化アルゴリズムにより；PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性探索法により；これらのアルゴリズムのコンピューター実行（Intelligenetics、カリフォルニア州マウンテンビューによるPC/GeneプログラムのCLUSTAL、ウィスコンシンGenetics Software Package、Genetics Computer Group(GCG)、575Science Dr.Madison、米国ウィスコンシンのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAを含むがこれに限定されない）により実行されうる。CLUSTALプログラムは、HigginsおよびSharp(1988)Gene、73:237-244およびHigginsおよびSharp(1989)CABIOS 5:151-153；Corpetら（1988）Nucleic Acids Research 16、10881-90；Huangら（1992）Computer Applications in the Biosciences 8、155-65、およびPearsonら（1994）Methods in Molecular Biology 24、307-31により十分に記載されている。一般的には、アラインメントを視覚的に検査し、コンピューターを利用して調整した後に、手動で精緻化する。
【００７０】
配列同一率（％）および配列類似率（％）を決定するのに適した好ましいアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これはAltschulら、Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)およびAltschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)にそれぞれ記載されている。BLASTおよびBLAST2.0を、本明細書に記載のデフォルトパラメータと共に使用して、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一率（％）を決定する。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により公共的に入手可能である。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff&Henikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照されたい）、アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
【００７１】
本明細書において使用されるものとして、「癌」とは、固形腫瘍および血液の悪性腫瘍を含む。前者は、乳癌、結腸癌、および卵嚢癌などの癌を含む。後者は、白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含む造血性の悪性腫瘍を含む。本発明は、様々なタイプの癌の治療および／または予防のための、新たな効果的な方法、組成物、およびキットを提供する。
【００７２】
白血病およびリンパ腫などの血液の悪性腫瘍は、造血細胞の異常な増殖および成熟によって特徴づけられる。
【００７３】
白血病は、一般に造血幹細胞の新生性の障害であり、成人および小児の急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、毛様細胞性白血病、および二次白血病を含む。顆粒球性白血病は、造血系の新生細胞による血液、骨髄、およびその他の組織の浸潤によって特徴づけられる。CLLは、末梢血中に成熟した排臨(appearing)リンパ球が蓄積することによって特徴づけられ、骨髄、脾臓、およびリンパ節の浸潤と付随している。
【００７４】
具体的な白血病には、急性非リンパ球性の白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人T細胞白血病、無白血病、白血球血症性白血病(leukocythemic leukemia)、好塩基球白血病、芽球白血病、牛白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、毛様細胞性白血病、赤芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、急性リンパ球性白血病、リンパ性白血病、リンパ向性白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞白血病、肥胖細胞性白血病、骨髄巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄球性の顆粒球性白血病、単球性白血病、ネーゲリ白血病、プラズマ細胞性白血病、プラズマ細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞白血病を含む。
【００７５】
リンパ腫は、通常、主にリンパ組織に存在する細胞の腫瘍性の形質転換である。リンパ腫の中で、2つの主要な異なった群：非ホジキンリンパ腫(NHL)およびホジキン病がある。リンパ腫は、免疫系の腫瘍であり、一般にT細胞およびB細胞の両方に関連した疾患として存在する。典型的には、骨髄、リンパ節、脾臓、および循環細胞が、全て含まれる。治療プロトコルは、患者からの骨髄の除去、およびその腫瘍細胞をパージすること(たいてい腫瘍細胞タイプに存在する抗原に対する抗体を使用する)、続く貯蔵を含む。次いで、患者には、中毒量の放射線療法または化学療法がなされ、次いで患者の造血系が以前のように存在するように、パージした骨髄を再注入する。
【００７６】
他の血液癌には、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性症候群(MPS)、および孤立性骨髄腫および多発性骨髄腫などの骨髄腫が含まれる。多発性骨髄腫(プラズマ細胞骨髄腫とも呼ばれる)は、骨格系に関与し、その系の全体にわたって点在する新生性の形質細胞の複数の腫瘍状集団によって特徴づけられる。また、これは、皮膚などのリンパ節およびその他の部位にまで広がっている可能性もある。孤立性骨髄腫は、多発性骨髄腫と同じ位置に生じる傾向がある孤立病変を含む。
【００７７】
血液悪性腫瘍は、通常、骨髄不全および器官不全を含む種々の症状を生じる深刻な障害である。白血病およびリンパ腫を含む大多数の血液悪性腫瘍の治療は、困難なままであり、既存の治療は、全般的に有効でない。特異的な免疫療法を含む治療は、かなりの潜在性を有するが、このような治療は、悪性腫瘍に関連した抗原が既知である小数のものに限定される。さらに、このような血液悪性腫瘍をこれらの初期段階で検出する能力は、非常に困難であり得るし、特定の病気に依存している。従って、B細胞白血病およびリンパ腫および多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍の治療のための改善された方法の必要性が、当該技術分野に残ったままである。本発明は、当該分野におけるこれらおよびその他の要求を満たす。
【００７８】
また、その他の癌も重要であり、有効な治療に関する限り、同様の問題点がある。このような癌は、固形腫瘍によって特徴づけられるものを含む。重要なその他の癌の例は、黒色腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌である。また、頭頸部の上皮性の癌腫も本発明に含まれる。これらの癌は、典型的には頭頸部の粘膜表面から生じ、唾液腺腫瘍を含む。
【００７９】
また、本発明は、肺癌を含む。肺癌は、扁平上皮癌または類表皮癌、小細胞癌、腺癌、および大細胞癌を含む。また、乳癌は、浸潤性乳癌および非浸潤性乳癌、たとえばインサイチュウでの管癌腫および小葉異常増殖を含む。
【００８０】
また、本発明は、消化管癌を含む。消化管癌は、食道癌、胃腺癌、原発性胃リンパ腫、結直腸癌、小腸腫瘍、および肛門の癌を含む。また、膵癌および肝細胞癌を含む肝臓に影響を及ぼす癌も重要である。また、本発明は、膀胱癌および腎細胞癌の治療を含む。
【００８１】
また、本発明は、前立腺癌および精巣癌を含む。
【００８２】
また、卵嚢癌、卵管癌、子宮癌、および子宮頚癌を含む婦人科の悪性腫瘍も本発明に含まれる。
【００８３】
骨および軟組織の肉腫の治療は、本発明によって含まれる。骨肉腫は、骨肉腫、軟骨肉腫、およびユーイング肉腫を含む。
【００８４】
また、本発明は、乳頭癌、瀘胞状癌、および未分化癌を含む甲状腺の悪性腫瘍を含む。
【００８５】
一部の態様において、「治療を必要とする被検者」とは、致命的であるか、または健康を害するか、または哺乳類の寿命を短くするウイルス疾患をもつ哺乳類である。その他の態様において、「治療を必要とする被検者」とは、致命的であるか、または健康を害するか、または哺乳類の寿命を短くする癌をもつ哺乳類である。
【００８６】
「薬学的に許容される」成分は、妥当な利益／危険比で釣り合った、過度の有害な副作用(毒性、刺激、およびアレルギー応答など)のないヒトおよび／または動物での使用に適したものである。
【００８７】
「安全かつ有効な量」とは、本発明の方法に使用するときに妥当な利益／危険比で釣り合った、過度の有害な副作用のない(毒性、刺激、およびアレルギー応答など)所望の治療反応を得るために十分な成分の量をいう。いくつかの態様において、「治療上有効な量」とは、所望の治療反応を得るために有効な成分の量、たとえばウイルスの突然変異誘発を増強するために、またはウイルスの能力を減弱させて活性なタンパク質を産生するために、またはウイルスの複製を阻害するために、またはウイルスが感染性粒子を産生する能力を除去もしくは減弱させるために、またはウイルスもしくはウイルスに感染した細胞を死滅させるために有効な量をいう。その他の態様は、その他の治療反応、たとえば、癌の増殖を停止もしくは遅延させるために、または癌を縮小させ、もしくは転移させないために有効な成分の量を含む。具体的な安全かつ有効な量または治療上有効な量は、治療される特定の症状、患者の身体状態、治療される哺乳類のタイプ、治療の期間、併用治療の性質(ある場合)、および使用される具体的な製剤および化合物またはその誘導体の構造などの因子によって変化する。
【００８８】
「腸溶性製剤」とは、化合物が胃の酸性環境において安定であり、胃を通過した後に、活性型の化合物が腸管での吸収に利用できる化合物の製剤である。「経口浸透圧性の薬剤投与装置」とは、本明細書に使用されるものとして、pH 3.5未満を有する消化管の領域に制御された割合で薬物を送達し、次いで3.5よりも大きいpHを有する消化管の連続する領域中で直ちに全ての薬物を送達する装置をいう。経口浸透圧性の薬剤投与装置を製作して使用する方法は、たとえばU.S. Pat. No. 4,587,117(本明細書に参照として組み入れられる)に見いだされる。
【００８９】
化合物
本発明は、抗ウイルス活性を示す化合物、加えてこのような化合物の塩およびプロドラッグを提供する。化合物は、通常、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、これらの塩、およびプロドラッグである。本発明者らは、非常に活性であるが、生物学的に不安定なヌクレオシドまたはヌクレオチド、およびヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を含む抗ウイルス性のファルマコフォアが、選択されたファルマコフォアの性質を変えることによって有用な治療薬に変換されることを認識した。例示的態様において、ファルマコフォアは、ファルマコフォアを含む活性種を、ファルマコフォアの親油性を増大する修飾基に付着させることによって安定化される。ファルマコフォアと修飾基の組み合わせは、好ましくはプロドラッグ形式のファルマコフォアを提供する。
【００９０】
プロドラッグは、活性な薬物を不活性にし、および／または薬物に溶解度またはいくつかのその他の性質を与える化学基がプロドラッグ上に存在する、活性な薬物の不活性な形態を含む。プロドラッグは、通常、不活性であるか、親化合物よりも活性が低いが、一旦化学基がプロドラッグから(たとえば、周囲の環境において加水分解、熱、キャビテーション、圧力、または酵素によって)切断されると、活性な薬物を生じる。プロドラッグは、可逆的薬物誘導体としてデザインされてもよく、部位特異的な組織への薬物輸送を増強するための修飾子として利用してもよい。プロドラッグは、当該技術分野において、たとえば、Sinkula et al., J. Pharm. Sci 64： 181-210 (1975)に、および2003年6月20日に出願したU.S. Provisional Patent Application No. 60/480,037(これらは、全ての目的で本明細書に参照として組み入れられる)に記載されている。
【００９１】
したがって、本発明は、なかでも、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の性質を修飾する基に共有結合で付着された新規のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体を提供する。例示的態様において、「修飾基」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその類似体の安定性または生物学的利用能を増強する。以下の考察において、本発明は、親油性の修飾基に関して例示してある。考察の焦点は、説明を明確にするためのものであり、当業者であれば、本明細書において論議した親油基以外の修飾基を含む化合物が本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【００９２】
したがって、第1の側面において、式Iに記載の化合物が提供される：
2006507255.tif 000005
【００９３】
式Iにおいて、破線の円は、環構造が、環内部の原子の原子価が満たされるように、いずれかの位置で1つまたは複数の二重結合を含んでもよいことを示す。環構造は、芳香族化合物(たとえば、ヘテロアリール)または非芳香族化合物であってもよい。置換基R2、R7、R8は、選択された環構造に対する結合価の法則を適用することによって指示されるとおり、存在するか、または存在しない。
【００９４】
記号Yは、C、CH、またはNを表し、および記号Zは、C、CH、またはBを表す。R1は、H、アシル、OR9、SR9、NR9NHR10、NR9R10、=O、および=NR9から選択されるメンバーであり、式中R9およびR10は、独立してH、置換または非置換アルキル、アシル、置換または非置換ヘテロアルキル、および置換または非置換アリールから選択されるメンバーである。
【００９５】
記号R2は、H、アシル、置換または非置換アルキル、OR11、SR11、NR11a、NR12a、ハロゲン、および=Oから選択されるメンバーの置換基を表す。記号R11は、H、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーを表す。R11aおよびR12aは、独立してH、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。
【００９６】
R3は、H、アシル、置換または非置換アルキル、NR12R13、NR12OR13、SR12、(=O)、およびOR12から選択されるメンバーである。記号R12およびR13は、独立してH、置換もしくは非置換アルキル、アシル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーを表す。
【００９７】
R4およびR4aは、独立してH、ハロゲン、OMe、およびOHから選択されるメンバーである。好ましい態様において、ハロゲンは、Fである。
【００９８】
R5およびR6は、独立してH、およびOR14から選択されるメンバーである。記号R14は、H、置換もしくは非置換アルキル、アシル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、または置換もしくは非置換アリール、およびP(O)(R15)(R16)を表す。R15およびR16は、独立してOR17、NR17R18、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヌクレオシドから選択される。R17およびR18は、独立してH、CH2CH CN、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。
【００９９】
R5およびR3；R6およびR3；並びにR15およびR16から選択されるメンバーは、これらが付着する原子と共に、任意に結合して、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造を形成する。例示的態様において、環構造は、5または6員環構造である。
【０１００】
R7およびR8は、独立してH、アシル、置換または非置換アルキルから選択される。R1およびR8は、これらが付着する原子と共に、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造に接続されていてもよい。
【０１０１】
例示的態様において、本発明は、式IIに記載の化合物を提供する：
2006507255.tif 000006
式中、各々の基は、上記のものと実質的に同一である。
【０１０２】
もう一つの例示的態様において、式IIIに記載の化合物が提供される：
2006507255.tif 000007
【０１０３】
式IIIに記載の例示的な化合物において、R11は、切断可能な部分、たとえばシリル基、または置換もしくは非置換アルキルエーテル、たとえば、
2006507255.tif 000008
である。
【０１０４】
なおさらなる例示的態様において、本発明は、式IVの化合物を提供する：
2006507255.tif 000009
【０１０５】
上記の式に記載の例示的な化合物は、以下を含む：
2006507255.tif 000010
【０１０６】
ポリヌクレオチド様の形式に基づいたさらなる例示的な化合物は、以下を含む：
2006507255.tif 000011
【０１０７】
さらなる態様において、本発明は、式Vに記載の化合物を提供する：
2006507255.tif 000012
式中、R19、R20、およびR21は、独立してH、アシル、および置換または非置換アルキルから選択されるメンバーである。
【０１０８】
式Vに記載の化合物は、窒素「保護基」の除去によって活性化合物を提供する：
2006507255.tif 000013
R=H、OH；R' 脱離基は、Oアルキル、Oアリール、Oヘテロアリール、Sアルキル、Sアリール、S(O)ヘテロアリール、S(O)2ヘテロアリール、S(O)2アルキル、S(O)アリール、S(O)2ヘテロアリール、Cl、Br、I、N(アルキル)2；R”、R”'、およびR””は、窒素保護基である。
【０１０９】
例示的態様において、R6は、式VIまたは式VIIに記載の構造を有する：
2006507255.tif 000014
式中、R22は、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分を表す。記号Lは、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーを表し；並びにArは、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。記号nは、1〜30の整数を表す。
【０１１０】
例示的なリンカー前駆体は、反応性の官能基に由来する少なくとも2つの連結基を含む。典型的には、リンカーの一方の連結基は、ホスフェート(リン酸ジエステル)の酸素に対して結合するが、リンカー他方の連結基は、医薬品の化学的官能基に対して結合する。リンカー基の化学的官能基の例は、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基、およびメルカプト基を含む。
【０１１１】
例示的なリンカー基は、6-アミノヘキサノール、6-メルカプトヘキサノール、10-ヒドロキシデカン酸、グリシンおよびその他のアミノ酸、1,6-ヘキサンジオール、β-アラニン、2-アミノエタノール、システアミン(2-アミノエタンチオール)、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、3-マレイミド安息香酸、フタリド、α置換されたフタリド、カルボニル基、アミナールエステルなどを含む。その他の「二機能性の」リンカー基は、糖などの部分(たとえば、反応性のヒドロキシルによってポリオール)、アミノ酸、アミノアルコール、カルボキシアルコール、アミノチオールなどの基を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
一般に、少なくとも1つのリンカー基の化学的官能基により、修飾基またはファルマコフォアが活性化されて、ファルマコフォア-リンカー-修飾基複合体の形成が可能になる。当業者であれば、ヒドロキシ基、アミノ基、およびカルボキシ基を含む種々の化学的官能基を種々の標準的な方法および条件を使用して活性化することができることを認識するであろう。たとえば、リンカーまたはファルマコフォアのヒドロキシル基は、ホスゲンで処理して対応するクロロホルメートを形成すること、またはp-ニトロフェニルクロロホルメートで処理して対応するカルボナートを形成することによって活性化することができる。
【０１１３】
例示的態様において、本発明の化合物は、カルボキシル官能基を含むリンカーを含む。カルボキシル基は、たとえば対応するハロゲン化アシル、イミダゾリド、または活性なエステルへの転換によって活性化してもよい。この反応は、March, 前記 pp. 388-89に例示したように種々の条件下で行ってもよい。好ましい態様において、ハロゲン化アシルは、塩化オキサリルとカルボキシル含有基の反応を介して調製される。当業者であれば、カルボキシル含有薬の使用は、単に例示するだけであること、および多くのその他の官能基を有する薬剤を本発明の化合物に組み込むことができることを認識するであろう。
【０１１４】
典型的には、本発明の化合物は、これらのそれぞれの化学的官能基を介して各種成分を接続するための標準的な化学的技術を使用して調製される。当業者であれば、最初にリンカーをファルマコフォアに、または修飾基に付着することができることを認識するであろう。表1において示した例示的な化学的官能基は、使用される合成スキームに応じてファルマコフォア、リンカー、または修飾基に存在することができる。表1は、ファルマコフォアまたは置換基のいずれかの成分である第1の化学的官能基、およびファルマコフォアまたは置換基のいずれかの成分である第2の化学的官能基の例を提供する。表1に記載した例示的な結合は、化学的官能基1と2の共有結合性の相互作用によって生じる。
【０１１５】
また、表1に記載した基は、一般に「活性基」を代表し、これは本発明において有用なコア部分に見いだされる。
【０１１６】
（表１）
2006507255.tif 000015
【０１１７】
当業者であれば、これらの結合の多くが、さまざまな方法で作製されてもよく、種々の条件を使用していてもよいことを容易に認識する。エステルの調製については、たとえば、March, 前記, 1157を参照されたい；チオエステルについては、March, 前記, 362-363、491、720-722、829、941、および1172を参照されたい；カルボナートについては、March, 前記, 346-347を参照されたい；カルバメートについては、March, 前記, 1156-57を参照されたい；アミドについては、March, 前記, 1152を参照されたい；尿素およびチオ尿素については、March, 前記, 1174を参照されたい；アセタールおよびケタールについては、Greene et al., 前記, 178-210およびMarch, 前記, 1146を参照されたい；アシルオキシアルキル誘導体については、PRODRUGS： TOPICAL AND OCULAR DRUG DELIVERY, K.B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992を参照されたい；エノールエステルについては、March, 前記, 1160を参照されたい；N-スルホニルイミダートについては、Bundgaard et al., J. Med. Chem., 31：2066 (1988)を参照されたい；無水物については、March, 前記, 355-56、636-37、990-91、および1154を参照されたい；N-アシルアミドについては、March, 前記, 379を参照されたい；N-マンニッヒ塩基については、March, 前記, 800-02、および828を参照されたい；ヒドロキシメチルケトンエステルについては、Petracek et al. Annals NY Acad. Sci., 507：353-54 (1987)を参照されたい；ジスルフィドについては、March, 前記, 1160を参照されたい；および、ホスホン酸エステルおよびホスホンアミダート(phosphonamidate)については、たとえば、同時係属出願番号第07/943,805号(これは、明白に参照として本明細書に組み入れられる)を参照されたい。
【０１１８】
特定の態様において、1つまたは複数の活性基が、本発明の化合物を構築するための反応の1つまたは複数の工程の間に保護されている。当業者であれば、選択した反応条件のセットを妨害しないように、どのように特定の官能基を保護するかを理解している。有用な保護基の例については、たとえば、Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991を参照されたい。
【０１１９】
また、リンカーは、本発明の化合物にさらなる分子量および化学的官能基を導入するために役立ち得る。一般に、さらなる質量および官能基は、化合物の血清半減期およびその他の性質に影響を及ぼす。したがって、リンカー基の慎重な選択によって、血清半減期の範囲で本発明の化合物を生成することができる。
【０１２０】
もう一つの例示的態様において、本リンカーは、本発明の化合物をインビボでの分解に感受性にさせる結合を含む。好ましい態様において、結合は、可逆性である(たとえば、容易に加水分解される)か、または部分的に可逆性である(たとえば、部分的に、またはゆっくり加水分解される)。結合の切断は、生物学的または生理的方法によって生じさせることができる。その他の態様において、生理的方法は、薬剤とデンドリマーの間の結合を切断する前に、複合体内のその他の位置で結合を切断し(たとえば、エステル基または他の感受性の化学的官能基に結合されているその他の保護基を除去し)、部分的に分解された複合体を生じる。また、たとえば、スペーサーと薬剤、およびスペーサーとデンドリマーの間で、その他の切断を生じさせることができる。
【０１２１】
投与後に複合体を迅速に分解させるために、血漿中の循環酵素を使用して、デンドリマーを医薬品から切断することができる。これらの酵素は、非特異的なアミノペプチダーゼおよびエステラーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、血液凝固カスケードのプロテアーゼなどを含むことができる。
【０１２２】
または、切断は、非酵素的な方法によって生じさせてもよい。たとえば、送達後の複合体が遭遇するpHの差異によって、化学的加水分解を開始させてもよい。この種の場合、医薬品-デンドリマー複合体は、生理的pH 7.4で高度に化学的に不安定であるが、送達装置の貯蔵所内の酸性または塩基性pHでは高い安定性を示すことによって特徴づけられてもよい。このようなプロセスで切断される例示的な医薬品-デンドリマー複合体は、そのフレームワーク内にN-マンニッヒ塩基結合を組み込んでいる複合体である。
【０１２３】
ほとんどの場合、化合物の切断は、投与の間またはその直後に生じる。しかし、特定の態様において、複合体が医薬品の作用点に達するまで切断は生じない。
【０１２４】
本発明の化合物の分解に対する感受性は、結合していない医薬品に対して、本複合体の加水分解性または酵素性の転換を研究することによって確認することができる。一般に、インビトロとインビボの活性の間の良好な相互関係は、この方法を使用して見いだされる。たとえば、Phipps et al., J. Pharm. Sciences 78：365 (1989)を参照されたい。転換の割合は、たとえば分光光度計法によって、またはガス-液体もしくは高圧液体クロマトグラフィーによって容易に決定されるであろう。次いで、半減期およびその他の動力学的パラメータを、標準的な技術を使用して算出してもよい。たとえば、Lowry et al. MECHANISM AND THEORY IN ORGANIC CHEMISTRY, 2nd Ed., Harper & Row, Publishers, New York (1981)を参照されたい。
【０１２５】
好ましい態様において、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド(または類似体)コアの置換基(修飾基)の1つまたは複数は、脂質であるか、または親油性；置換基が脂質などの疎水性種である本発明の化合物を参照することで例示される本発明の態様である。
【０１２６】
本発明の組成物を調製する際に、多様な脂質を使用してもよい。脂質は、天然、合成、または半合成の起源であってもよく、たとえば脂肪酸、脂肪族アルコール、中性脂肪、ホスファチド、油、糖脂質、界面活性剤(界面活性物質)、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン、およびステロイドを含む。
【０１２７】
本発明の化合物を調製するために使用してもよい例示的な脂質は、たとえば以下のものを含む：脂肪酸、リゾ脂質(lysolipids)、フルオロ脂質、1-アルキル-2-アセトイル-sn-グリセロ 3-ホスホコリン、および1-アルキル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ 3-ホスホコリンを含む血小板活性化因子(PAF)と関係するものなどのホスホコリン(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala.)；ジオレイルホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルコリン；ジペンタデカノイル-ホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)；ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)；およびジアラキドニルホスファチジルコリン(DAPC)を含む飽和および不飽和の脂質を有するホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン(DPPE)およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)などのホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ジステアロイルホスファチジル-グリセロール(DSPG)を含むホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質；ガングリオシドGM1およびGM2などの糖脂質；グルコリピド；スルファチド；スフィンゴ糖脂質；ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)およびジステアロイル-ホスファチジン酸(DSPA)などのホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；キチン、ヒアルロン酸、ポリビニル-ピロリドン、またはポリエチレングリコール(PEG)などの脂質を有する重合体であって、本明細書において「ペグ化された(pegylated)脂質」とも称され、好ましい脂質を有する重合体は、DPPE-PEG(DPPE-PEG)(これは、それに対して付着されたPEG重合体を有する脂質DPPEをいう)を含み、たとえばDPPE-PEG5000(これは、約5000平均分子量を有するPEG重合体がそれに対して付着されたDPPEをいう)を含む脂質を有する重合体；脂質を有するスルホナートの単糖類、二糖類、オリゴ糖類、または多糖類；コレステロール、コレステロール硫酸、およびコレステロールヘミスクシナート；トコフェロールヘミスクシナート；エーテルおよびエステルに結合された脂肪酸を有する脂質；重合脂質(種々のものが、当該技術分野において周知である)；ジセチルホスフェート；ステアリルアミン；カルジオリピン；長さが約6〜約8炭素の短鎖脂肪酸を有するリン脂質；たとえば一方が約6炭素のアシル鎖および他方が約12炭素のアシル鎖などの非対照のアシル鎖を有する合成のリン脂質；セラミド；ポリオキシアルキレン(たとえば、ポリオキシエチレン)脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン(たとえば、ポリオキシエチレン)脂肪族アルコール、ポリオキシアルキレン(たとえば、ポリオキシエチレン)脂肪族アルコールエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル(たとえば、ICI Americas, Inc., Wilmington, Del.から商業的に入手可能なツイーン20、ツイーン40、およびツイーン80を含むツイーン(商標)と呼ばれる化合物類など)(ポリオキシエチル化されたソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアラート、グリセロールポリエチレングリコールリシノリアート、エトキシル化された大豆ステロール、エトキシル化されたヒマシ油、ポリオ���シエチレン-ポリオキシプロピレン重合体、およびポリオキシエチレン脂肪酸ステアラートを含む)などのニオソーム(niosomes)を含む非イオン性のリポソーム；コレステロール硫酸、コレステロールブチラート、コレステロールイソブチレート、コレステロールパルミタート、コレステロールステアラート、ラノステロールアセテート、エルゴステロールパルミタート、およびフィトステロールn-ブチラートを含むステロール脂肪酸エステル；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、7-デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、コレステロールグルコナート、ラノステロールグルコナート、およびエルゴステロールグルコナートを含む糖酸のステロールエステル；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコナート、ミリストイルグルコナート、およびステアロイルグルコナートを含む糖酸とアルコール類のエステル；ショ糖ラウレート、フルクトースラウレート、ショ糖パルミタート、ショ糖ステアラート、グルクロン酸、グルコン酸、およびポリウロン酸を含む糖と脂肪酸のエステル；サルササポゲニン、スミラゲニン(smilagenin)、ヘデラゲニン、オレアノール酸、およびジギトキシゲニンを含むサポニン；グリセロールトリパルミタート、グリセロールジステアレート、グリセロールトリステアレート、グリセロールジミリステート、グリセロールトリミリステートを含む、グリセロールジラウレート、グリセロールトリラウレート、グリセロールジパルミタート、グリセロール、およびグリセロールエステル；n-デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、およびn-オクタデシルアルコールを含む長鎖状アルコール；6-(5-コレステン-3β-イルオキシ)-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；6-(5-コレステン-3β-イルオキシ)-ヘキシル-6アミノ-6-デオキシ-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド；6-(5-コレステン-3β-イルオキシ)ヘキシル-6-アミノ-6-デオキシ1-1-チオ-α-D-マンノピラノシド；12-(((7'-ジエチルアミノ-クマリン-3-イル)-カルボニル)-メチルアミノ)-オクタデカン酸；N-[12-(((7'-ジエチルアミノ-クマリン-3-イル)-カルボニル)-メチルアミノ)-オクタデカノイル]-2-アミノパルミチン酸；コレステリル(4'-トリメチル-アンモニオ)-ブタノアート；N-スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノール-アミン；1,2-ジオレオイル-sn-グリセリン；1,2-ジパルミトイル-sn-3-スクシニルグリセロール；1,3-ジパルミトイル-2-スクシニルグリセロール；1-ヘキサデシル-2-パルミトイルグリセロ-ホスホエタノールアミン、およびパルミトイルホモシステイン、および／またはこれらの任意の組み合わせ。
【０１２８】
重合脂質の例は、約50炭素原子までを含むアルケニルまたはアルキニルなどの不飽和の親油性の鎖を含む。さらなる例は、重合可能な基を有するホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質などのリン脂質、並びに例えばヒマシ油および麦角油を含むd-12-ヒドロキシオレイン酸のトリグリセリドなどのヒドロキシル基を有する飽和および不飽和の脂肪酸誘導体である。重合は、生分解によって生じるバックボーン残基が水溶性であるように分散能を(dispersability)を増強するために、カルボキシル基またはヒドロキシル基などの親水性の置換基を含むようにデザインされていてもよい。また、適切な重合可能な脂質は、たとえばKlaveness et al, U.S. Pat. No. 5,536,490に記載されている。
【０１２９】
必要に応じて、本発明の化合物は、たとえば、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、1,2-ジオレイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)；および1,2-ジオレイル-3-(4'-トリメチルアンモニオ)-ブタノイル-sn-グリセリン(DOTB)などの陽イオン性脂質を含んでいてもよい。
【０１３０】
例示的な陰イオン性脂質は、ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロール並びにこれらの脂肪酸エステル、アナンダミドおよびメタナンドアミド(methanandamides)などのホスファチジルエタノールアミンのアミド、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよびこれらの脂肪酸エステル、カルジオリピン、ホスファチジルエチレングリコール、酸性のリソ脂質(lysolipids)、スルホリピド、およびスルファチド、飽和および不飽和の遊離脂肪酸、並びにこれらの負に荷電した誘導体を含む。ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロールおよびこれらの脂肪酸エステルは、好ましい陰イオン性脂質である。
【０１３１】
陽イオン性脂質の例は、先に一覧を示したものを含む。凝集体を形成するための好ましい陽イオン性脂質は、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」)である。また、合成の陽イオン性脂質を使用してもよい。これらは、1つまたは複数の塩基性官能基を含むように誘導体化された一般的な天然の脂質を含む。このように修飾することができる脂質の例は、ジメチルジオクタデシル-臭化アンモニウム、スフィンゴ脂質(sphinolipids)、スフィンゴミエリン、リソ脂質(lysolipids)、ガングリオシドGM1、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、およびコレステロールのエステルおよび塩などの糖脂質類、N-スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール、1,3-ジパルミトイル-2-スクシニルグリセロール、1,2-ジパルミトイル-sn-3-スクシニルグリセロール、1-ヘキサデシル-2-パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、並びにパルミトイルホモシステインを含む。
【０１３２】
特別に合成された陽イオン性脂質も、本発明の態様において機能する。これらには、たとえば、テトラヨウ化N,N'-ビス(ドデシルアミノカルボニル(dodecyaminocarbonyl)-メチレン)-N,N'-ビス(β-N,N,N-トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン-エチレン-ジアミン；ヘキサヨウ化N,N”-ビス(ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N',N”,-トリス；テトラヨウ化N,N'-ビス(ドデシルアミノカルボニルメチレン)-N,N”-ビス(β-N,N,N-トリメチル-アンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン)シクロヘキシレン-1,4-ジアミン；ヘプタヨウ化1,1,7,7-テトラ-(β-N,N,N,N-テトラメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン)-3-ヘキサデシル-アミノカルボニルメチレン-1,3,7-トリアザヘプタン；および、テトラヨウ化N,N,N',N'-テトラホスホ-エタノールアミノカルボニルメチレン)ジエチレントリアミンがある。
【０１３３】
陽イオン性で、かつ非陽イオン性の脂質が利用される態様において、上記した多種多様な脂質を非陽イオン性の脂質として使用してもよい。好ましくは、非陽イオン性の脂質は、1つまたは複数のDPPC、DPPE、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを備えている。上記一覧を示した陽イオン性脂質の代わりに、ポリリジンまたはポリアルギニンなどの脂質を有する陽イオン性ポリマー、並びにホスホン酸アルキル、次亜リン酸アルキル、および亜リン酸アルキルを安定化物質に使用してもよい。当業者であれば、本開示からみて、正に荷電された部分を有するその他の天然および合成の変種も、本発明において機能するであろうことを認識すると考えられる。
【０１３４】
本化合物に使用してもよい飽和および不飽和の脂肪酸は、好ましくは直鎖状または分枝の形態の約12炭素原子〜約22炭素原子を含む部分を含む。また、イソプレノイド単位および／またはプレニル基からなる炭化水素基を使用することができる。適切な飽和脂肪酸の例は、たとえば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸を含む。適切な不飽和脂肪酸の例は、たとえばラウロイル酸、フィセテリン酸(physeteric acid)、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸(petroselinic acid)、およびオレイン酸を含む。適切な分枝脂肪酸の例は、たとえば、イソラウリン酸、イソミリスチン酸、イソパルミチン酸、およびイソステアリン酸を含む。
【０１３５】
その他の有用な脂質またはこれらの組み合わせは、当業者にとって明らかであり、本発明の精神を維持する限り、本発明にも含まれる。たとえば、U.S. Pat. No. 4,310,505(この開示は、その全体がここで参照として本明細書に組み入れられる)に記載されているように、炭水化物を有する脂質を使用してもよい。
【０１３６】
上に記載した脂質に加えて、本発明の化合物は、タンパク質またはこれらの誘導体から全体または部分的に由来する部分を含んでもよい。本発明に使用される適切なタンパク質は、たとえば、アルブミン、ヘモグロビン、α-1-アンチトリプシン、α-フェトプロテイン、アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、C反応性タンパク質、癌胎児抗原、セルロプラスミン、補体、クレアチンホスホキナーゼ、フェリチン、フィブリノーゲン、フィブリン、トランスペプチダーゼ、ガストリン、血清グロブリン、ミオグロビン、免疫グロブリン、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、リポタンパク質、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、α-1-血清タンパク質画分、α-2-血清タンパク質画分、β-タンパク質画分、γ-タンパク質画分、およびγ-グルタミルトランスフェラーゼを含む。本発明に使用してもよいタンパク質から作り出されるその他の安定化物質およびベシクルは、たとえば、U.S. Pat. Nos. 4,572,203、4,718,433、4,774,958、および4,957,656に記載されている。その他のタンパク質に基づいた部分は、本開示からみて、上記したもの、および上述した特許に記載されたものに加えて、当該技術分野の当業者にとって明らかである。
【０１３７】
本明細書において論議した脂質およびタンパク質に加えて、本発明の態様は、重合体を含んでいてもよく、これは、天然、半合成(修飾された天然のもの)、または合成の起源であってもよい。重合体は、2つ以上の繰り返し単量体単位、および好ましくは10以上の繰り返し単量体単位からなる化合物を意味する。半合成の重合体(または修飾された天然の重合体)は、いくつかの様式で化学的に修飾された天然の重合体を意味する。適切な天然の重合体の例は、たとえば、以下のものなどの天然に存在する多糖体を含む：アラビナン、フルクタン、フカン(fucans)、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン(たとえば、イヌリンなど)、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラトカロロース(galatocarolose)、ペクチン酸、アミロースを含むペクチン、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、ブドウ糖、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、パスツラン(pustulan)、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デンナタン(dennatan)、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンゴム、澱粉、および以下のアルドース、ケトース、酸、またはアミンの1つまたは複数を含むものなどの種々のその他の天然のホモ重合体またはヘテロ重合体：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、ブドウ糖、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ショ糖、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸、並びにこれらの天然に存在する誘導体。従って、適切な重合体は、たとえば、アルブミンなどのタンパク質を含む。例示的な半合重合体には、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチル-セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、およびメトキシセルロースが含まれる。本発明に使用される適切な例示的な合成重合体は、ポリホスファゼン、ポリエチレン(たとえば、ポリエチレングリコールなど(たとえば、BASF, Parsippany, N.J.から商業的に入手可能なPLURONICS(商標)と呼ばれる化合物類を含む)、ポリオキシエチレン、およびポリエチレンテレフタラート)、ポリプロピレン(たとえば、ポリプロピレングリコールなど)、ポリウレタン(たとえば、ポリビニルアルコール(PVA)、塩化ビニル、およびポリビニルピロリドンなど)、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ化炭化水素重合体、フッ化炭素重合体(たとえば、ポリテトラフルオロエチレンなど)、アクリレート、メタクリレート、およびポリメチルメタクリレート、並びにこれらの誘導体を含む。好ましくは、以下のものなどの単量体から調製される生体適合性の合成重合体または共重合体：アクリル酸、メタクリル酸、エチレンイミン、クロトン酸��アクリルアミド、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、乳酸、グリコール酸、ε-カプロラクトン、アクロレイン、シアノアクリラート、ビスフェノールA、エピクロロヒドリン、ヒドロキシアルキル-アクリラート、シロキサン、ジメチルシロキサン、エチレンオキサイド、エチレングリコール、ヒドロキシアルキル-メタクリレート、N置換されたアクリルアミド、N置換されたメタクリルアミド、N-ビニル-2-ピロリドン、2,4-ペンタジエン-1-オール、ビニルアセテート、アクリロニトリル、スチレン、p-アミノ-スチレン、p-アミノ-ベンジル-スチレン、ナトリウムスチレンスルホナート、ナトリウム2-スルホキシエチル-メタクリレート、ビニルピリジン、アミノエチルメタクリレート、2-メタクリロイルオキシ-トリメチルアンモニウムクロリド、およびポリビニリデン、並びに以下のものなどの多官能基の架橋用モノマーである：N,N'-メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、2,2'-(p-フェニレンジオキシ)-ジエチルジメタクリレート、ジビニルベンゼン、トリアリルアミン、およびメチレンビス-(4-フェニルイソシアネート)(これらの組み合わせを含む)。好ましい重合体は、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリ(ε-カプロラクトン)、エポキシ樹脂、ポリ(エチレンオキサイド)、ポリ(エチレングリコール)、およびポリアミド(ナイロン)重合体を含む。好ましい共重合体は、ポリビニリデン-ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン-ポリアクリロニトリル-ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン-ポリアクリロニトリル、およびポリd-1、ラクチドコ-グリコリド重合体である。好ましい共重合体は、ポリビニリデン-ポリアクリロニトリルである。その他の適切な生体適合性の単量体および重合体は、本開示から当業者に明らかであろう。
【０１３８】
なおさらなる例示的態様において、本発明は、式VIIに記載の三環式化合物であって、式中基は、実質的に上記の通りである化合物を提供する。
2006507255.tif 000016
【０１３９】
製剤
多くの薬物は、本質的に疎水性であり、それ故、限られた溶解度または水性媒体での分散能を有し、これらの生物学的利用能を減少させ、これらを処方または投与することが困難となって、これらの有用性が減少してしまう。反対に、経口的に与えられるときに、他剤は、過度に親水性であり、十分に吸収されない。従って、本発明によって提供される特定の化合物は、故意に疎水性に作製してある。同様に、多くの潜在的に有用な生物活性な分子は、十分に安定ではないか、または生物学的媒体中でも半減期が短すぎて十分な治療ができず、また、これらの用途が限定される。これらのおよびその他の薬物動態、生物学的利用能、特異性、その他の問題がある結果、生理活性な物質もしくは機能的な物質の輸送または送達を助けることができる分子を開発する必要がある。
【０１４０】
したがって、もう一つの側面において、本発明は、本発明の化合物の製剤を提供する。本発明の化合物に加えて、製剤は、その水溶性などの化合物の特徴を変えるために本発明の化合物と相互作用する第2の種を含む。例示的態様において、本発明の化合物は、上記した通りの脂質部分を含む。第2の種は、本発明の化合物の脂質部分と相互作用する親油性ドメインを含む。また、第2の種は、本発明の化合物と第2の種との間で形成される複合体の水溶性を増強する親水性部分を含む。
【０１４１】
例示的態様において、本発明は、本発明の化合物および以下の式を有する第2の化合物を含む製剤を提供する：
A-Bであって、
式中、Aは、疎水性ドメインであり；かつ、Bは、Aに共有結合した親水性ドメインである。
【０１４２】
本発明の製剤の例示的態様を図2に記載してあり、それは、疎水性の修飾基によって修飾されたファルマコフォアとポリカチオンなどのポリイオンとの間で形成された本発明の複合体の具体例である。もう一つの例示的態様を図3によって提供してあり、それは、疎水性の修飾基によって修飾されたファルマコフォアとデンドリマーの(dendrimeric)ポリイオンとの間で形成された本発明の複合体の具体例である。
【０１４３】
好ましい態様において、本発明の製剤は、水性製剤である。
【０１４４】
必要に応じて、製剤は、凝集体を形成してもよい。このような製剤の例は、1つまたは複数の脂質を有する荷電した重合体から、1つまたは複数の荷電した脂質と結合して、任意に1つまたは複数の中性脂質と結合して構築される。荷電した脂質は、陰イオン性または陽イオン性のいずれであってもよい。典型的には、脂質は、荷電した脂質と正反対に荷電した対イオンなどの、多価の種の存在下において凝集される。インビボでの選択的な部位へのプロドラッグおよび／または生理活性薬の送達のためには、好ましくは2ミクロン以下、より好ましくは、0.5ミクロン以下、およびさらに好ましくは200nm以下の凝集体が要求される。最も好ましくは、脂質凝集体は、200nm以下のサイズであり、5〜10nmのサイズ程度に小さくてもよい。
【０１４５】
荷電した脂質が陰イオン性であるときは、多価の(二価の、三価の、その他)陽イオン性の材料を、凝集体の形成に使用してもよい。これらの通常の価電子状態における全ての陽イオンは、本発明の化合物の凝集体を形成するために適していることが想定される。
【０１４６】
荷電した脂質が陽イオンであるときは、陰イオン性の材料を、たとえば凝集体の形成に使用してもよい。好ましくは、陰イオン性の材料は、たとえば二価などの多価である。有用な陰イオン性の材料の例は、カルボキシラートイオン、硫化物イオン、亜硫酸イオン、硫酸イオン、酸化物イオン、窒化物イオン、炭酸イオン、およびリン酸イオンなどの一原子および多原子の陰イオンを含む。また、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、および1,4,7,10-テトラアゾシクロドデカン-N',N',N”,N”-四酢酸(DOTA)の陰イオンを使用してもよい。有用な陰イオン性材料のさらなる例には、アクリル酸、メタクリル酸、その他のポリアクリラートおよびメタクリラート、スルホナートポリスチレンなどのペンダントSO3H基を有する重合体、およびカルボン酸基を含むポリスチレンの重合体および共重合体の陰イオンを含む。
【０１４７】
例示的態様において、本発明の組成物は、荷電されたポリイオンであり、たとえば荷電されたデンドリマーが凝集体を形成させるために使用される。デンドリマーは、正確に定義された組成物を有し、かつ正確に定義された分子量を有する、球面またはその他の三次元形状の重合体である。デンドリマーは、内外の部分の適切な選択によって水に可溶性の巨大分子として合成することができる。U.S. Pat. Nos. 4,507,466および4,568,737を参照されたい(本明細書に参照として組み入れられる)。第1のよく定義された対称形のデンドリマー・ファミリーは、Dow Chemical Companyによって製造されるポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマーであった。第1のデンドリマーの合成および特徴づけにより、多様なサイズおよび組成物のデンドリマーの大規模なアレイが製造されている。たとえば、Liu M. and Frechet J.M.J., Pharm. Sci. Tech. Today 2 (11)： 393 (1999)を参照されたい。
【０１４８】
樹状の巨大分子は、高度に枝分れした、多数の鎖末端を有する階層構造によって特徴づけられる。デンドリマーは、非常に定型的で、ほとんどサイズが単分散の構造によって明確に定義されているが、高度に枝分かれした重合体は、あまり定義されておらず、広い多分散を有する。樹状の巨大分子は、通常ABX単量体から構築される。高度に枝分かれした重合体は、一般に単一の一連の生長段階において生じる重合反応を経て得られる。デンドリマーは、一般に多岐にわたる(Tomalia et al., U.S. Patent No. 4,435,548； 4,507,466, 4,558,120； 4,568,737； 5,338,532)または収束性の生長アプローチ(Hawker et al., U.S. Patent No. 5,041,516)のいずれかを使用する多段の反復性の合成によって得られる。
【０１４９】
デンドリマーは、診断または治療的な適用のために選択された体位置に対して抱合体を向けるように機能するであろう種々の薬学的材料と共に、並びに種々のターゲティング分子と共に抱合されていた。たとえば、WO 8801178(本明細書に参照として組み入れられる)を参照されたい。デンドリマーは、腫瘍の治療および診断のために放射標識した抗体の比活性を増大するための手段として、合成ポルフィリン(たとえば、ヘム、クロロフィル)を抗体分子に共有結合で結合するために使用されてきた。Roberts et al., Bioconjug. Chemistry 1：305-308 (1990)； Tomalia et al., U.S. Patent No. 5,714,166。
【０１５０】
本発明の本態様に有用な例示的なデンドリマーは、一つには、これらがイオンによって荷電された種に簡単にトランスフォーメーションする結果として、周知のPAMAMポリ(アミドアミン)デンドリマーまたはASTRAMOLポリ(プロピレンイミン)が含まれる。
【０１５１】
例示的態様において、成分Bの親水性ドメインは、親水性オリゴマーまたは重合体を含む。適切な親水性基は、たとえば以下のものを含む：たとえばポリエチレングリコール(PEG)およびポリプロピレングリコール(PPG)などのポリアルキエンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、たとえばポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどのポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリラート、ポリメタクリル酸ヒドロキシプロピル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリ(ヒドロキシアルキルカルボン酸)、ポリオキサゾリジン、ポリアスパルトアミド、並びにシアル酸の重合体(ポリシアル酸)。親水性の重合体は、好ましくはPEG、PPG、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドン、並びにこれらの共重合体からなる群から選択され、PEGおよびPPG重合体がより好ましく、PEG重合体がさらに好ましい。
【０１５２】
もう一つの例示的態様において、本発明の化合物は、少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%の投与用量の経口生物学的利用能を有する。所望の経口生物学的利用能を提供する本発明の化合物の例示的な製剤は、本発明の複素環化合物の酸付加塩である。酸付加塩は、鉱酸または有機酸、たとえばカルボン酸の塩であってもよい。
【０１５３】
上記態様によれば、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の化合物のカルボン酸塩が所望の経口生物学的利用能を提供するということを発見した。表2に示すように、DHAdCの例示的なカルボン酸塩の経口生物学的利用能は、約23%であり、対応する塩基の経口生物学的利用能の2倍以上である。
【０１５４】
(表２α)
2006507255.tif 000017
α  ラットに非経口的に(IV)に、および経口的にDHAdC-パルミタートを与えた5,6-ジヒドロ-5-アザ-2'デオキシシチジン(DHAdC)塩基の薬物動態の比較。Cmax：血漿中の最大濃度、AUC：曲線下面積
【０１５５】
担体分子
また、本発明の化合物およびこれらの製剤は、体もしくは組織内の特異的な領域に、またはインビトロで選択された種もしくは構造にファルマコフォアをターゲットするために有用な担体分子を含むことができる。ターゲットされる領域に対して親和性を有する種に対してこれと付着することによる薬剤の選択的なターゲティングは、当該技術分野において周知である。小分子および重合体のターゲティング薬が本発明に使用される。
【０１５６】
例示的態様において、本発明の化合物は、これを体の細胞、器官、または領域に選択的に分配するターゲティング薬に結合される。抗体、受容体のためのリガンド、レクチン、糖類、抗体などの例示的なターゲティング薬が、当該技術分野において認識されており、本発明を実施する際に限定されずに有用である。他のターゲティング薬は、リガンドに分子量を付加する、ポリ(エチレングリコール)、多糖体、ポリアミノ酸などの巨大分子を含む、特異的な分子認識モティーフを含まない化合物の分類を含む。本発明のリガンド-ターゲティング薬の抱合体は、核酸-リガンド抱合体を使用することによって例示される。リガンド-オリゴヌクレオチド抱合体の焦点は、説明を明確にするためのものであり、本発明のリガンド(または複合体)を抱合することができるターゲティング薬の範囲を限定しない。さらに、「リガンド」とは、遊離リガンドおよびその金属錯体をいうことが理解される。
【０１５７】
例示的な核酸ターゲティング薬は、アプタマー、アンチセンス化合物、および三重ヘリックスを形成する核酸が含まれる。典型的には、糖残基のヒドロキシル基、塩基残基からのアミノ基、またはヌクレオチドのリン酸の酸素は、リガンドに対してヌクレオチドに基づいたターゲティング薬を結合するために必要とされる化学的官能基として利用される。しかし、当業者であれば、その他の「非天然の」反応性の官能基が従来の技術によって核酸に追加することができることを容易に認識するであろう。たとえば、糖残基のヒドロキシル基は、当該技術分野において周知の技術を使用してメルカプト基またはアミノ基に変換することができる。
【０１５８】
アプタマー(または核酸抗体)は、特異的な分子標的を結合する一本鎖もしくは二本鎖DNAまたは一本鎖RNA分子である。一般に、アプタマーは、血液中に循環する標的のプールに対して結合することによって、分子標的、たとえばタンパク質の作用を阻害することによって機能する。アプタマーは、化学的官能基を有し、したがって、本明細書に記載したように、共有結合でリガンドに結合することができる。
【０１５９】
小分子薬物、代謝産物、補因子、毒素、糖類に基づいた薬物、ヌクレオチドに基づいた薬物、糖タンパク質などを含む多様な分子標的が、アプタマーと非共有結合性に、しかし特異的に結合を形成できるが、通常、分子標的は、血清タンパク質、キニン、エイコサノイド、細胞表面分子などを含むタンパク質またはペプチドを含むと考えられる。アプタマーの例は、Gileadの抗トロンビン阻害剤GS 522およびその誘導体(Gilead Science, Foster City, Calif.)を含む。また、Macaya et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：3745-9 (1993)； Bock et al. Nature (London) 355：564-566 (1992)および Wang et al. Biochem. 32：1899-904 (1993)も参照されたい。
【０１６０】
所与の生体分子に特異的なアプタマーは、当該技術分野において既知の技術を使用して同定することができる。たとえば、Toole et al. (1992) PCT Publication No. WO 92/14843； Tuerk and Gold (1991) PCT Publication No. WO 91/19813； Weintraub and Hutchinson (1992) PCT Publication No. 92/05285；およびEllington and Szostak, Nature 346：818 (1990)を参照されたい。簡単には、これらの技術は、典型的にはランダムなオリゴヌクレオチドの混合物と分子標的の複合体形成を含む。アプタマー-分子標的の複合体を、複合体を形成していないオリゴヌクレオチドから分離する。アプタマーを分離された複合体から回収し、増幅する。このサイクルを繰り返して、分子標的に対して最も高い親和性を有するアプタマー配列を同定する。
【０１６１】
不適切な遺伝子の発現によって生じる疾患については、このような遺伝子の発現の特異的な予防または減少が、理想的な治療の代表例である。原理的には、mRNA内のアクセスできる配列、もしくはプレmRNA処理に必須の転写物内の配列に対して、または遺伝子自体の中の配列に対して相補的な一本鎖デオキシヌクレオチドまたはリボデオキシヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることによって、特定の遺伝子産物の産生を阻害、減少、または遮断してもよい。遺伝子制御のためのこのパラダイムは、アンチセンスまたは抗遺伝子阻害と称されることが多い。本発明のものなどのアルキル化剤の核酸に抱合することによって、さらなる効能が与えられる。
【０１６２】
アンチセンス化合物は、特定のタンパク質の産生を担うmRNAに結合し、かつ不能にするか、またはその産生を防止するように設計された核酸である。アンチセンス化合物は、アンチセンスRNAもしくはDNA、一本鎖もしくは二本鎖、のオリゴヌクレオチド、またはこれらの類似体を含み、これらは、個々のmRNA種に特異的にハイブリダイズして、mRNA種の転写および／またはRNAプロセシング、および／またはコードされるポリペプチドの翻訳を防止することができ、これによりそれぞれのコードされるポリペプチドの量の減少を生じさせる。Ching et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86： 10006-10010 (1989)； Broder et al. Ann. Int. Med. 113： 604-618 (1990)； Loreau et al. FEBSLetters 274： 53-56 (1990)； Holcenberg et al. WO91/11535； WO91/09865； WO91/04753； WO90/13641； WO 91/13080, WO 91/06629,およびEP 386563)。これらの精巧な標的感受性および選択性により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のリガンドなどの治療薬を所望の分子標的に送達するために有用である。
【０１６３】
核酸(たとえば、アンチセンス化合物、および三重ヘリックス薬)の部位特異性は、ホスホジエステル結合の修飾によって、またはオリゴヌクレオチド末端の化学修飾によって有意な影響を受けない。従って、これらの核酸は、化学的に修飾し；全体の結合安定性を増強すること、化学分解に関する安定性を増大すること、オリゴヌクレオチドが細胞に輸送される割合を増大すること、および分子に化学反応性を与えることができる。アンチセンス療法に有用な種々の核酸を構築する一般的な方法は、van der Krol et al., Biotechniques 6： 958-976 (1988)およびStein et al. Cancer Res. 48： 2659-2668 (1988)によって概説されている。従って、例示的態様において、本発明のリガンドは、ホスホジエステル結合の修飾によって核酸に抱合される。
【０１６４】
さらに、本発明の化合物を有するアプタマー、アンチセンス化合物、および三重ヘリックス薬は、関連した標的配列との特異的なハイブリダイゼーションまたは結合が、オリゴヌクレオチドの機能特性として保持される限り、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、または転位を含むことができる。たとえば、いくつかの態様では、これらの天然に存在するリン酸ジエステル対応物よりもヌクレアーゼによる分解に耐性のホスホロチオネート類似体を使用しており、したがってインビボでの高い持続性およびより優れた能力を有することが予想される(たとえば、Campbell et al., J. Biochem. Biophys. Methods 20： 259-267 (1990)を参照されたい)。また、オリゴヌクレオチドのホスホラミダイト誘導体も、相補的なポリヌクレオチドと結合することが既知であり、さらに共有結合性に付着されたリガンド種に適応する能力を有し、本発明の方法に受け入れられると考えられる。たとえば、Froehler et al., Nucleic Acids Res. 16 (11)： 4831 (1988)を参照されたい。
【０１６５】
また、末端修飾は、核酸にファルマコフォア抱合して、オリゴヌクレオチド医薬品の細胞タイプ特異性、薬物動態、核透過性、および絶対細胞取込み速度を修飾するための有用な手段を提供する。たとえば、5'および3'末端に反応性基を含めるための置換のアレイが、知られており、これにより細胞毒を共有結合することができる。たとえば、OLIGODEOXYNUCLEOTIDES： ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, (1989) Cohen, Ed., CRC Press； PROSPECTS FOR ANTISENSE NUCLEIC ACID THERAPEUTICS FOR CANCER AND AIDS, (1991), Wickstrom, Ed., Wiley-Liss； GENE REGULATION： BIOLOGY OF ANTISENSE RNA AND DNA, (1992) Erickson and Izant, Eds., Raven Press；および ANTISENSE RNA AND DNA, (1992), Murray, Ed., Wiley-Lissを参照されたい。アンチセンス化合物に関係する一般的な方法については、ANTISENSE RNA AND DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。
【０１６６】
もう一つの例示的態様において、本発明は、ペプチドに基づいたターゲティング部分を利用する。一般的に言って、リガンドをターゲティングするために特に有用なペプチドは、血管を循環するエステラーゼ、アミダーゼ、またはペプチダーゼによる分解に対して耐性のさらなる様式を組み込む天然のペプチドか、天然の修飾されたペプチドか、または合成のペプチドを含む。適切なターゲティング・リガンド、およびこれらの調製のための方法は、本明細書の開示から見て、容易に当業者には明らかであろう。本発明の例示的なターゲティング・リガンドは、細胞接着分子(CAM)、なかでもたとえばサイトカイン、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリン、およびセレクチンが含まれる。
【０１６７】
特定の細胞タイプ、たとえば内皮細胞にターゲットすることに関して、適切なターゲティング・リガンドは、たとえば、以下の1つまたは複数を含む：たとえば、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、トランスフォーミング成長因子-α(TGF-α)、トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)、血小板由来の内皮細胞成長因子(PD-ECGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、およびヒト成長因子(HGF)を含む成長因子；アンジオゲニン；腫瘍壊死因子α(TNF-α)および腫瘍壊死因子β(TNF-β)を含む腫瘍壊死因子、並びにたとえば、TNF-R1、TNF-R2、FAS、TNFR-RP、NGF-R、CD30、CD40、CD27、OX40、および4-1BBを含む、腫瘍壊死因子(TNF)受容体1または2ファミリーに対する受容体の抗体およびこれらの断片；約4,500の分子量を有する銅含有ポリリボヌクレオチドアンギオトロピン、並びに1-ブチリルグリセリンなどの低分子量の非ペプチド血管原性因子；たとえば、プロスタグランジンE1(PGE1)およびプロスタグランジンE2(PGE2)を含むプロスタグランジン；ニコチンアミド；アデノシン；ジピリダモール；ドブタミン；たとえばヒアロビウロン酸を含む、β-結合の加水分解から生じる分解生成物などのヒアルロン酸分解生成物；たとえば、コラゲナーゼ阻害剤を含む血管形成阻害剤；ミノサイクリン；メドロキシプロゲステロン；6-O-サルフェートおよび6-O-カルボキシメチル基で化学的に修飾したキチン；テトラヒドロコルチゾールなどのアンジオスタチン性(angiostatic)ステロイド；および、たとえばステロイド(例えばたとえばコルチゾンまたはヒドロコルチゾン)と混合されて、約6,000の分子量を有する断片などの、ヘパリンの断片を含むヘパリン；アンジオインヒビン(angioinhibin：AGM-1470-アンジオスタティック抗生物質)を含む血管形成阻害剤；血小板因子4；プロタミン；アルトバクター(Arthobacter)種の細菌壁に由来する硫酸化された多糖体ペプチドグリカン複合体；アスペルギルス‐フミガーツスに由来するフマギリンなどの真菌由来の血管形成阻害剤；D-ペニシラミン；チオリンゴ酸金；トロンボスポンジン；ビタミンD3類似体；たとえば、α-インターフェロン、βインターフェロン、およびγ-インターフェロンを含むインターフェロン；たとえば、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン5(IL-5)、およびインターロイキン8(IL-8)を含むインターロイキンなどのサイトカインおよびサイトカイン断片；エリスロポエチン；天然のサイトカインに対する受容体またはアンタゴニストに結合するための20-merより小さなペプチド；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)；LTB4白血球受容体アンタゴニスト；ヘパリンの低分子量の断片またはヘパリンの類似体を含むヘパリン；α-、β-およびγ-シクロデキストリンを含むシクロデキストリンなどの単純な硫酸化された多糖体；テトラデカサルフェート；トランスフェリン；フェリチン；血小板因子4；プロタミン；銅と複合体を形成したGly-His-Lys；セルロプラスミン；(12R)-ヒドロキシエイコサトリエン酸；オカダ酸；レクチン；抗体；CD11a／CD18；並びに最後期活性化インテグリン-4(VLA-4)。インターロイキン-1(IL-1)受容体に結合するペプチドを使用してもよい。
【０１６８】
また、たとえばE-、N-、およびP-カドヘリン、カドヘリン-4、カドヘリン-5、カドヘリン-6、カドヘリン-7、カドヘリン-8、カドヘリン-9、カドヘリン-10、およびカドヘリン-11；および最も好ましくはカドヘリンC-5を含む、カドヘリンファミリーの細胞接着分子をターゲッティング・リガンドとして使用してもよい。さらに、特定の内皮細胞によって局所的に発現されたカドヘリンを認識するために、たとえばモノクローナル抗体Ec6C10などのカドヘリンに対する抗体を使用してもよい。
【０１６９】
多種多様な異なるターゲティング・リガンドを、ELAM分子の細胞質ドメインに結合するように選択することができる。ターゲティング・リガンドは、この点に関して、レクチン、多種多様な炭水化物または糖残基、抗体、抗体断片、たとえば、Fab'2などのFab断片、およびたとえばターゲットされて創傷治癒するであろうアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(R-G-D)を含む合成ペプチドを含んでもよい。これらの材料の多くは、天然の供与源に由来するであろうが、一部は、分子生物学的の組換え技術によって合成されてもよく、他も合成起源のものであってもよい。ペプチドは、現在当該技術分野において既知の種々の異なるコンビナトリアル・ケミストリー技術によって調製してもよい。CD11a／CD18および白血球細胞表面糖タンパク質(LFA-1)などのヒト白血球起源に由来するか、または修飾されたターゲティング・リガンドは、内皮細胞受容体ICAM-1と結合することが既知であるので、これらを使用してもよい。また、免疫グロブリンスーパーファミリーのサイトカイン誘導性のメンバーの、単核白血球選択性であるVCAM-1をターゲティング・リガンドとして使用してもよい。VCAM-1をターゲットするためにヒト単球に由来するVLA-4を使用してもよい。
【０１７０】
上で論議した内皮細胞と同様に、多種多様なペプチド、タンパク質、および抗体を、上皮細胞をターゲットするためのターゲティング・リガンドとして使用してもよい。好ましくは、合成の、半合成の、または天然に存在するペプチドを含む、上皮細胞標的受容体に対して高親和性を有するペプチドを選択してもよく、合成ペプチドであることがより好ましい。これらの好ましい態様に関して、約5〜約15アミノ酸残基を有するペプチドが好ましい。抗体は、天然または組換え起源のいずれかで、全体の抗体または抗体断片、たとえばFabまたはFab'2として使用してもよい。天然起源の抗体は、動物もしくはヒト起源のものであってもよく、またはキメラ(マウス／ヒト)であってもよい。ヒト組換えまたはキメラ抗体は、好ましく、断片は、全体の抗体よりも好ましい。
【０１７１】
本発明の一つの態様において、ターゲティング・リガンドは、リンパ球(T細胞またはB細胞であってもよい)に向けられ、好ましい標的はT細胞である。ターゲットされたリンパ球のクラスを選択するために、そのクラスに特異的な親和性を有するターゲティング・リガンドが使用される。たとえば、抗CD-4抗体は、CD-4受容体を有するT細胞のクラスを選択するために使用することができ、抗CD-8抗体は、CD-8受容体を有するT細胞のクラスを選択するために使用することができ、抗CD-34抗体は、CD-34受容体を有するT細胞、その他のクラスを選択するために使用することができる。好ましくは低分子量リガンド、たとえばFabまたはペプチド断片が使用される。たとえば、OKT3抗体またはOKT3抗体断片を使用してもよい。
【０１７２】
T細胞またはT細胞のクローンのクラスのための受容体を選択するときに、ステロイド・プロドラッグは、そのクラスの細胞に対して送達される。HLAに由来するペプチドの使用により、たとえばHLAタンパク質に対して反応性を表す細胞のターゲットされたクローンを選択することができる。
【０１７３】
ターゲットされたプロドラッグ送達のためのもう一つの有用な領域は、インターロイキン2(IL-2)系を含む。IL-2は、抗原または分裂促進因子で誘導されるリンパ球の刺激に続いて産生されるT細胞成長因子である。CD4+およびCD8+T細胞、および大型顆粒リンパ球、並びに特定のT細胞腫瘍は、IL-2を産生する細胞タイプの一つである。IL-2受容体は、応答性細胞に発現される糖タンパク質である。これらは、IL-2に結合したときに、リソソーム封入内に容易にエンドサイトーシスされるので、これらは本発明と顕著に関連している。このエンドサイトーシスの最終的な効果は、標的細胞に依存するが、インビボ効果のうちの顕著なものは、移植可能なマウスの腫瘍、ヒト黒色腫、または腎細胞癌の退行である。また、IL-2は、抗菌薬および抗ウイルス療法に関与しており、同種移植片拒絶反応において役割を果たしている。IL-2受容体に加えて、好ましい標的には、抗IL-2受容体抗体、天然のIL-2、およびIL-2受容体と結合するファージディスプレイによって作製された20-mer以下のペプチドのIL-2断片が含まれる。
【０１７４】
特定の操作理論のいずれによっても制限されることは企図しないが、IL-2は、プロドラッグおよび／またはその他の送達媒体に抱合させることができ、したがってIL-2受容体を有する細胞のターゲティングを媒介することができる。次いで、リガンド-受容体複合体のエンドサイトーシスにより、ステロイドがターゲットされた細胞に送達されて、これによりIL-2が単独で促進するいずれの増殖性または活性化の効果とも独立し、およびこれに取って代わってアポトーシスを介したその死滅を誘導する。
【０１７５】
さらに、IL-2受容体に対して結合親和性を有するIL-2ペプチド断片は、ステロイド・プロドラッグの反応性部分へ直接接着することによって、またはアミン、ヒドロキシル、もしくはカルボン酸官能基などの反応性末端を有するスペーサーもしくはリンカー分子を経て組み込むことができる。このようなリンカーは、当該技術分野において周知であり、3〜20アミノ酸残基を含んでいてもよい。または、標的組織におけるタンパク質分解を回避するD-アミノ酸または誘導体化されたアミノ酸を使用してもよい。
【０１７６】
本発明に使用することができるさらに他の系は、たとえば、Wallner et al, J. Experimental Med., 166： 923-932 (1987)(その開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる)によって記載されている、B細胞のIgMを媒介したエンドサイトーシス、またはT細胞受容体がCD2であり、かつリガンドがリンパ球機能関連抗原3(LFA-3)である、上記したリガンド-受容体の相互作用の変種を含む。
【０１７７】
ターゲティング・リガンドは、種々の方法で本安定化材料に組み込まれていてもよい。一般的に言って、ターゲティング・リガンドは、たとえば、プロドラッグ、脂質、タンパク質、重合体、界面活性物質、および／または補助安定化材料を含む組成物に含まれる安定化材料の1つもしくは複数と、共有結合でまたは非共有結合で結合されることによって本安定化材料組み込まれていてもよい。好ましい形態において、ターゲティング・リガンドは、本安定化材料に含まれる上述した材料のうちの1つまたは複数と共有結合で結合されてもよい。本発明の好ましい安定化材料は、プロドラッグ、脂質、タンパク質、重合体、または界面活性物質化合物を含む。これらの組成物において、ターゲティング・リガンドは、好ましくはプロドラッグ、脂質、タンパク質、重合体、または界面活性物質化合物を有する関連した共有結合である。
【０１７８】
プロドラッグ、および脂質成分を含む本組成物のファルマコフォアにターゲティング・リガンドを共有結合で結合することは、本開示から当該技術分野の当業者に直ちに明らかな有機合成技術を使用して達成される。たとえば、ターゲティング・リガンドは、周知のカップリングまたは活性化薬剤の使用を経て脂質を含む材料に結合してもよい。当業者には既知であるとおり、活性化剤は、通常、求電子性であり、共有結合の形成を誘発するために使用することができる。例示的な活性化剤は、たとえばカルボニルジイミダゾール(CDI)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、塩化メチルスルホニル、カストロ試薬、および塩化ジフェニルホスホリルを含む。
【０１７９】
共有結合は、任意に架橋および／または重合を含む。架橋とは、好ましくは、共有結合性の化学結合によって鎖の特定の炭素原子に結合するエレメント、基、または化合物からなる架橋によって重合体分子の2つの鎖を付着することをいう。たとえば、架橋は、シスチン残基のジスルフィド結合によって接続されるポリペプチドに生じるであろう。架橋は、たとえば(1)化学物質(架橋剤)を添加し、混合物を熱に曝露すること、または(2)高エネルギー放射線に重合体を供することによって達成されるであろう。種々の架橋剤、または異なる長さおよび／または官能性の「つなぎ」が、たとえば、R.L. Lunbland, Techniques in Protein Modification, CRC Press, Inc., Ann Arbor, Mich., pp. 249-68 (1995)(この開示は、その全体が、ここに参照として本明細書に組み入れられる)に記載されている。例示的な架橋剤は、たとえば、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)、ジメチルスベルイミダート(dimethyl suberimidate)、およびこれらの炭化水素長に基づくこれらのバリエーション、並びにビス-N-マレイミド-1,8-オクタンを含む。
【０１８０】
2つの独特の末端官能基を有するリンカー基を利用して、ターゲティング・リガンドを本発明の化合物に結合するために、標準的なペプチド方法論を使用してもよい。標準的な有機合成法を使用して、二官能性の親水性重合体、および特に二官能性のPEGsを合成してもよい。加えて、これらの材料の多くは、たとえばShearwater Polymers (Huntsville, Ala.)から商業的に入手可能であるα-アミノ-ω-カルボキシ-PEGなど、商業的に入手できる。連結基としてPEG材を使用することの利点は、エチレングリコールの単量体のサブユニットの数が、少数、たとえば約5程度であるか、または多数、たとえば、約500もしくはそれ以上の程度であるようにPEGのサイズを変えることができるということである。従って、「つなぎ」または結合の長さは、所望のものとして多様であってもよい。これは、たとえば使用される特定のターゲティング・リガンドに応じて重要であろう。
【０１８１】
例示的態様において、ポリエチレングリコールエチルアミンなどの親水性のスペーサー末端は、アミンまたはヒドロキシル基などの反応性基を含み、ターゲティング・リガンドを本発明の化合物に結合するために使用される。たとえば、スペーサーに有用なカップリング基を導入するために、ポリエチレングリコールエチルアミンをN-スクシンイミジルビオチンまたはp-ニトロフェニルビオチンと反応させてもよい。
【０１８２】
また、担体分子は、たとえば本発明の化合物の二量体、三量体、四量体、およびより高い相同体などの種を含む多価または多原子価の種である本発明の化合物のためのバックボーンとして使用してもよい。多価および多原子価の種は、本発明の単一の種または複数の種から構築することができる。たとえば、二量体の構築物は、「ホモ二量体」または「ヘテロ二量体」であることができる。さらに、本発明の化合物、またはこれらの反応性の類似体がオリゴマーまたは重合体のフレームワーク(たとえば、ポリリジン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンなど)に付着されている多価および多原子価の構築物も、本発明の範囲内である。フレームワークは、好ましくは多官能性である(すなわち、本発明の化合物を付着するための反応部位のアレイを有する)。さらに、フレームワークは、本発明の単一の種または本発明の複数の種によって誘導体化することができる。
【０１８３】
さらに、担体分子の性質は、同様の官能性を与えていない類似化合物と比較して水への溶解度の増強させる化合物を与えるように選択することができる。したがって、本明細書に記載のいずれかの置換基を増強された水溶性を有する類似の基と置換することができる。たとえば、ジオールとヒドロキシル基、または第四級アミン、ヒドロキシルアミン、もしくは同様のより水溶性の成分とアミンを置換することも、たとえば本発明の範囲内である。好ましい態様において、さらなる水溶性は、本明細書に記載された化合物のイオンチャネルに向けた活性に必須ではない部位において、本化合物の水溶性を増強する部分と置換することによって与えられる。有機化合物の水溶解度を増強する方法は、当該技術分野において既知である。このような方法は、永久に荷電される部分、たとえば、四級アンモニウム、または生理的に関連したpHで荷電される基、たとえばカルボン酸、アミンで有機核に官能性をもたせることを含むが、これらに限定されない。その他の方法は、有機核に、ヒドロキシルまたはアミン含有基、たとえばアルコール類、ポリオール、ポリエーテルなどを追加することを含む。代表例は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(エチレングリコール)、およびポリ(プロピレングリコール)を含むが、これらに限定されない。これらの化合物のための適切な官能性付与の化学およびストラテジーは、当該技術分野において既知である。たとえば、Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991を参照されたい。
【０１８４】
薬学的製剤
もう一つの好ましい態様において、本発明は、デンドリマー-薬剤の抱合体を含む薬学的製剤および薬学的に許容される担体を提供する。
【０１８５】
本明細書に記載されている化合物、またはこれらの薬学的に許容される付加塩類もしくは水和物は、多種多様な経路または投与様式を使用して患者に送達することができる。適切な投与経路は、吸入、経皮、経口、直腸、経粘膜、腸、並びに筋肉内、皮下、および静脈内の注射を含む非経口的投与を含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
本明細書に記載されている化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩類、および／または水和物は、単独で、本発明のその他の化合物と結合して、および／またはその他の治療薬と組み合わせたカクテル中に投与してもよい。もちろん、本発明の化合物と共に同時投与することができる治療薬の選択は、一部には、治療される状態に依存する。
【０１８７】
たとえば、癌治療を受けている患者に投与するときは、化合物は、抗癌剤および／または補充増強する薬剤などのその他の生物活性剤を含むカクテル中に投与してもよい。また、化合物は、鎮吐薬、放射保護剤、その他などの放射線療法の副作用を治療する薬剤を含むカクテル中に投与してもよい。
【０１８８】
適切なその他の生理活性な薬剤は、たとえば以下を含む：白金化合物(たとえば、スピロプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン)などの抗悪性腫瘍薬、メトトレキセート、アドリアマイシン、タキソール、マイトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロランブシル、メルファラン(たとえば、PAM、L-PAM、またはフェニルアラニンマスタード)、メルカプトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジンダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、プリカマイシン(plicamycin)(ミトラマイシン)、アミノグルテチミド、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン(m-AMSA)、アスパラギナーゼ(L-アスパラギナーゼ)Erwinaアスパラギナーゼ、エトポシド(VP-16)、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、テニポシド(VM-26)、硫酸ビンブラスチン(VLB)、硫酸ビンクリスチン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、およびアラビノシル；非経口的鉄、ヘミン、ヘマトポルフィリンおよびこれらの誘導体などの血液製剤；ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド、微生物の細胞壁成分、リンホカイン(たとえば、リポ多糖、マクロファージ活性化因子などの菌体内毒素)、細菌(マイコバクテリアおよびコリネバクテリアなど)のサブユニット、合成のジペプチドN-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミンなどの生体応答調節剤；ケトコナゾール、ニスタチン、グリセオフルビン、フルシトシン(5-fc)、ミコナゾール、アンフォテリシンB、リシン、およびβ-ラクタム抗生剤(たとえば、サルファゼシン(sulfazecin))などの抗真菌薬；成長ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、およびリン酸ベタメタゾンナトリウム、リン酸ベタメタゾン二ナトリウム、リン酸ベタメタゾンナトリウム、酢酸コルチゾン、デキサメサゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルンソリド(flunsolide)、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンシピオネート、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸ブレドニゾロン、リン酸ブレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンジアセテート、トリアムシノロンヘキサセトニド(triamcinolone hexacetonide)、および酢酸フルドロコルチゾンなどのホルモン類およびステロイド；シアノコバラミンネイノイック(neinoic)酸、レチノイドおよびパルミチン酸レチノールなどの誘導体、並びにα-トコフェロールなどのビタミン；マンガンスーパーオキシドジムターゼなどのペプチド；アルカリホスファターゼなどの酵素；アメレキサノクス(amelexanox)などの抗アレルギー薬；フェンプロクーモンおよびヘパリンなどの抗凝血薬剤；プロプラノロールなどの循環器系作用薬；グルタチオンなどの代謝増強物質；パラ-アミノサリチル酸、イソニアジド、硫酸カプレオマイシンサイクロセリン、塩酸エタンブトールエチオナミド、ピラチナミド、リファンピン、および硫酸ストレプトマイシンなどの抗結節薬(tuberculars)；アシクロビル、アマンタジンアジドチミジン(AZTまたはジドブジン)、リバビリン、アマンタジン、ビダラビン、およびビダラビン一水和物(アデニンアラビノシド、ara-A)などの抗ウイルス薬；ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、四硝酸エリトリチル、二硝酸イソソルビドジ、ニトログリセリン(三硝酸ニトログリセロール)、および四硝酸ペンタエリトリトールなどの抗狭心症薬；フェンプロクーモン、ヘパリンなどの血液凝固阻止剤；ダプソン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セフラジンエリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ジクロキサシリン、シクラシリン、ピクロキサシリン(picloxacillin)、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンG、ペニシリンV、チカルシリンリファンピン、およびテトラサイクリンなどの抗生物質；ジフィニサル(diffinisal)、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート(meclofenamate)、メフェナム酸、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アスピリン、およびサリチル酸塩などの抗炎症薬；クロロキン、ヒドロキシクロロキン、メトロニダゾール、キニーネ、およびメチルグルカミン・アンチモン酸塩などの抗原生動物薬；ペニシラミンなどの抗リウマチ薬；アヘン安息香チンキなどの麻薬；コデイン、ヘロイン、メサドン、モルヒネ、およびアヘンなどのアヘン剤；デスラノシド、ジギトキシン、ジゴキシン、ジギタリン、およびジギタリスなどの強心配糖体；アトラクリウムベシラート(atracurium besylate)、ガラミントリエチオダイド、臭化ヘキサフルオレニウム、ヨウ化メトクリン、臭化パンクロニウム、塩化スクシニルコリン(塩化スキサメトニウム)、塩化ツボクラリン、臭化およびベクロニウムなどの神経筋遮断薬；アモバルビタール、アモバルビタールナトリウム、アプロバルビタール、ブタバルビタールナトリウム、水酸化クロラール、エトクロルビノール、エチナメート、塩酸フルラゼパム、グルテチミド、塩酸メトトリメプラジン、メチプリロン、塩酸ミダゾラム、パラアルデヒド、ペントバルビタール、ペントバルビタールナトリウム、フェノバルビタールナトリウム、セコバルビタールナトリウム、タルブタール、テマゼパム、およびトリアゾラムなどの鎮静剤(催眠薬)；塩酸ブピバカイン、塩酸クロロプロカイン、塩酸エチドカイン、塩酸リドカイン、塩酸メピバカイン、塩酸プロカイン、および塩酸テトラカインなどの局所麻酔薬；ドロペリドール、エトミデート、ドロペリドールを有するクエン酸フェンタニール、塩酸ケタミン、メトヘキシタールナトリウム、およびチオペンタールナトリウムなどの全身麻酔薬；並びに、ストロンチウム、ヨウ素レニウム、およびイットリウムなどの放射性粒子またはイオン。特定の好ましい��様において、生物活性剤は、メラノーマ抗原に対して結合できるモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体である。
【０１８９】
本発明の活性化合物(類)は、それ自体、または活性化合物(類)が1つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈液との混合物中にある薬学的組成物の形態で投与される。本発明に従って使用される薬学的組成物は、典型的には、薬学的に使用することができる製剤中に活性化合物をプロセスすることを容易にする賦形剤および補助を含む1つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して、従来法で処方される。適当な製剤は、選択される投与経路に依存的である。
【０１９０】
注射のためには、本発明の薬剤は、水溶液中に、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中に処方してもよい。経粘膜投与のためには、バリヤーを透過するために適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、通常、当該技術分野において既知である。
【０１９１】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物(類)を当該技術分野において周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に処方することができる。このような担体により、本発明の化合物を、治療される患者による経口摂取のためのタブレット、ピル、ドラジェー、カプセル、液体、ゲル類、シロップ剤、泥漿、懸濁液などとして処方することができる。経口的使用のための薬学的製剤は、デンドリマーを固体の賦形剤と組み合わせて得られることができ、任意に生じる混合物を粉砕し、および必要に応じて、適切な助剤を加えた後に顆粒混合物を加工して、タブレットまたはドラジェーコアを得ることができる。適切な賦形剤は、たとえばラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填材；たとえば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース製剤である。必要に応じて、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１９２】
ドラジェーコアは、適切なコーティングによって提供される。この目的のために、濃縮砂糖溶液を使用してもよく、これは、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリ(エチレンオキサイド)、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶剤または混合溶媒を含んでいてもよい。異なる活性化合物の用量の組み合わせを同定のために、または特徴づけるために、色素または染料をタブレットまたは糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０１９３】
経口的に使用することができる薬学的製剤は、ゼラチンでできているプッシュフィットカプセル、並びに柔らかい、ゼラチンおよびグリセリンまたはソルビトールなどの可塑剤でできている密封されたカプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填材、澱粉などのバインダー、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに任意に、安定剤を有する混合物の中の活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解してもよく、または懸架してもよい。加えて、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、このような投与に適した用量であるべきである。
【０１９４】
頬側投与のためには、組成物は、従来法で処方されたタブレットまたはロゼンジの形態をとってもよい。
【０１９５】
吸入による投与のためには、本発明に従った使用のための化合物は、適切な噴霧剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを使用して、加圧されたパックまたは噴霧器からエアゾールスプレー提示の形態で便利に送達される。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。吸入または注入に使用するためのカプセルおよびカートリッジ、たとえばゼラチンは、化合物と、ラクトースまたは澱粉などの適切な粉末ベースとの粉混合を含むように処方してもよい。
【０１９６】
化合物は、注射によって、たとえば大量瞬時投与または連続的な注入によって非経口投与するために処方してもよい。注射のための製剤は、単位用量形態で、たとえばアンプルに、または複数投与用コンテナに、防腐剤を添加して提示してもよい。組成物は、油性もしくは水性の媒体中に、懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合薬を含んでもよく、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩などを添加してもよい。
【０１９７】
薬学的な非経口投与用製剤は、水溶性の形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製してもよい。適切な親油性の溶媒または媒体は、ゴマ油、またはエチルオレエートもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルなど脂肪油、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘性を増大する物質を含んでいてもよい。任意に、懸濁液は、また、適切な安定剤または非常に濃縮された溶液を調製することができる化合物の溶解度を増大する薬剤を含んでいてもよい。
【０１９８】
または、活性成分は、使用前に適切な媒体、たとえば無菌の発熱性物質を伴わない水で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１９９】
また、化合物は、たとえば、カカオ脂もしくはその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む、坐薬または保持浣腸などの直腸組成物中に処方してもよい。
【０２００】
以前に記載されている製剤に加えて、化合物は、また、デポー製剤として処方してもよい。このような長時間作用性の製剤は、移植または経皮的な送達(たとえば、皮下に、または筋肉内に)、筋肉内注射、または経皮パッチによって投与してもよい。したがって、たとえば、化合物は、適切な重合体または疎水性の材料(たとえば、許容される油中のエマルジョン)もしくはイオン交換樹脂と共に、またはわずかに可溶性誘導体として、たとえばわずかに可溶性塩として処方してもよい。
【０２０１】
また、薬学的組成物は、適切な固体もしくはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。このような担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリ(エチレンオキサイド)などの重合体を含むが、これに限定されない。
【０２０２】
マイクロアレイ
また、本発明は、本発明の固定された化合物および本発明の化合物によって官能性を持たせた化合物を含むマイクロアレイを提供する。さらに、本発明は、本発明の化合物によって官能性を持たせたプローブを使用するマイクロアレイを問い合わせる(interrogating)方法を提供する。固定された種およびプローブは、小分子、ペプチド、酵素核酸などを含む(しかし、これらに限定されない)実質的にいずれのタイプの分子からも選択される。
【０２０３】
多くの固定された核酸からなる核酸マイクロアレイは、ゲノム情報を作製するための革命的なツールであり、Debouck et al., in supplement to Nature Genetics, 21： 48-50 (1999)を参照されたい。考察では、核酸マイクロアレイと連動した本発明の化合物の使用に焦点を当てている。この焦点は、例示であり、本発明の本態様を実施することができる材料の範囲を限定することは企図されない。
【０２０４】
したがって、もう一つの好ましい態様において、本発明の化合物は、マイクロアレイ形式で利用される。本発明の化合物、もしくは本発明の化合物を有する種は、それ自体マイクロアレイの成分であることができ、またはこれらは、マイクロアレイの成分をスクリーニングするためのツールとして利用することができる。
【０２０５】
例示的態様において、マイクロアレイは、同一または異なる核酸配列を含むn個のプローブを含む。または、マイクロアレイは、同一および異なる核酸配列の同一の核酸配列の群を含むn個のプローブの混合物を含み得る。好ましい態様において、nは、2〜100、より好ましくは10〜1,000、より好ましくは100〜10,000の数である。さらに好ましい態様において、n個のプローブは、基体上に、各々のn個の位置の同一性を確認することができる方法で、n個の異なった位置にパターン化される。
【０２０６】
さらにもう一つの好ましい態様において、本発明は、また、n個のプローブのマイクロアレイを調製するための方法を提供する。本方法は、選択された基体の領域にプローブを付着することを含む。生体高分子のアレイを作製するために、アレイ核酸分子などの種々の方法が現在利用可能である。
【０２０７】
基体上に整列されたプローブのアレイを作製するための1つの方法は、「ドットブロット」法である。この方法では、真空マニホールドにより、3ミリメートルの直径ウェルから基体に対して多くの、たとえば96個のプローブの水性試料を移す。プローブは、膜を焼くこと、または紫外線にこれを曝露することによって、多孔性膜上に固定される。この手順の一般的な変種は、ウェルが非常に細長い小判胴形を有する「スロット-ブロット」法である。
【０２０８】
整列されたプローブのアレイを作製するために使用されるもう一つの技術では、多孔性膜などの基体に試料のアレイを移すために、ウェル、たとえば96ウェルのマイクロタイタープレートに浸漬したピンのアレイを使用する。1つのアレイは、22×22cmの領域に9216点のアレイを作製するために、ねじれた様式の膜をスポットするように設計されているピンを含む。Lehrach, et al., HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SEQUENCING, GENOME ANALYSIS, Vol. 1, Davies et al, Eds. , Cold Springs Harbor Press, pp. 39-81 (1990)を参照されたい。
【０２０９】
整列されたプローブのアレイを作製する別の方法は、Pirrung et al. (U.S. Patent No. 5,143,854, issued 1992)に記載されており、Fodor et al., (Science, 251： 767-773 (1991))によっても記載されている。この方法は、粒子またはその他の基体の異なる別々の領域で、異なるプローブを合成することを含む。この方法は、好ましくは比較的短い、たとえば20塩基未満のプローブ分子で使用される。関連した方法は、Southern et al. (Genomics, 13: 1008-1017 (1992))によって記載されていた。
【０２１０】
Khrapko, et al., DNA Sequence, 1： 375-388 (1991)は、ポリアクリルアミドの薄層上へDNAをスポットすることによって核酸マトリックスを作製する方法を記載している。スポッティングは、マイクロピペットによって手動でなされる。
【０２１１】
また、基体をフォトリソグラフィ(Kleinfield et al., J. Neurosci. 8： 4098-120 (1998))、光エッチング法、化学エッチング法、およびマイクロコンタクトプリンティング法(Kumar et al., Langmuir 10： 1498-511 (1994))などの技術を使用してパターン化することができる。基体上にパターンを形成するためのその他の技術は、当業者に直ちに明らかであろう。
【０２１２】
基体上のパターンのサイズおよび複雑さは、利用する技術の解像度およびパターンが企図する目的のみによって限定される。たとえば、マイクロコンタクトプリンティング法を使用すると、200nm程度の特徴が基体上に層状化される。Xia, Y., J. Am. Chem. Soc. 117：3274-75 (1995)を参照されたい。同様に、フォトリソグラフィを使用すると、1μm程度の特徴を有するパターンが作製される。Hickman et al., J. Vac. Sci. Technol. 12：607-16 (1994)を参照されたい。本発明に有用なパターンは、ウェル、エンクロージャ、分割部、凹部、入口部、出口部、チャネル部、谷部、回折格子などの特徴を含むものを含む。
【０２１３】
好ましい態様において、パターニングを使用して、プローブを含むための複数の隣接したウェル、へこみ、または穴を有する基体を作製する。一般に、これらの各々の基質は、隆起した壁または仕切によってその他のウェルから単離されており、ウェルは、流体的に連通していない。したがって、特定のウェルに配置された粒子、またはその他の物質は、実質的にそのウェルに閉じこめられたままである。もう一つの好ましい態様において、パターニングにより、装置を介してチャネルを作製することができ、これにより分析物もしくはその他の物質を装置に入れること、および／または出すことができる。
【０２１４】
もう一つの態様において、プローブは、基体上に直接これらを「プリンティング」することによって固定するか、または代わりに、「リフトオフ」技術を利用することができる。リフトオフ技術では、パターン化されたレジストを基体上に敷き、有機物層をレジストによってカバーされていない領域に置き、その後にレジストを除去する。本発明の基体の用途に適したレジストは、当業者に既知である。たとえば、Kleinfield et al., J. Neurosci. 8： 4098-120 (1998)を参照されたい。フォトレジストの除去に続き、第1のプローブとは異なる構造を有する第2のプローブを、最初にレジストで被覆した領域の基体に結合することができる。この技術を使用することにより、異なる特徴を有するプローブのパターンの基体を作製することができる。基体上へ直接所望の特徴を有する層をマイクロプリントすることで、同様の基体配置に到達することができる。Mrkish et al. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25：55-78 (1996)を参照されたい。
【０２１５】
方法
本発明の化合物は、ウイルス疾患を治療するために使用することができる。加えて、本発明の化合物は、癌およびその他の調節解除された細胞増殖疾患を治療するために使用することができる。
【０２１６】
理論に拘束されることは望まないが、ウイルス疾患の治療のために、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体がウイルスゲノムに組み込まれる。ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル結合を有するか、またはこれらが組み込まれて、ポリメラーゼによって伸張することでホスホジエステル結合を得る。ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、改変された塩基対形成の性質を有し、ウイルスゲノムに突然変異を組み入れて、劇的にウイルス突然変異率を増大することができる。ウイルス突然変異率増加により、子孫ウイルスの生存度の減少が生じ、これによりウイルス複製を阻害する。好ましい態様において、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン、およびこれらの誘導体および変種は、DNAウイルス、RNAウイルス、およびレトロウイルスの感染症を治療するために使用される。
【０２１７】
また、本発明の化合物は、癌を治療するために使用することができる。理論に拘束されることは望まないが、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、癌細胞のDNAまたはRNAのいずれかの核酸に組み込まれる。ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル結合を有するか、またはこれらが組み込まれて、ポリメラーゼによって伸張することでホスホジエステル結合を得る。一つの態様において、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、改変された塩基対形成の性質を有し、癌細胞のゲノムに突然変異を組み入れて、劇的に癌細胞の突然変異率を増大することができる。突然変異率の増大により、子孫細胞の生存度の減少を生じ、癌細胞の死を引き起こし、または増殖速度を減弱させ、または転移することができない。もう一つの態様において、突然変異は、転写産物、たとえばタンパク質の翻訳に有用なタンパク質またはtRNA分子をコードするmRNA分子に組み込まれる。変異された転写産物は、変異されたタンパク質、たとえば、改変されたアミノ酸配列を有するか、または切り詰められたタンパク質をコードし、タンパク質の不活性化を引き起こす。また、癌細胞が活性なタンパク質を常にコードすることができないと、癌細胞の死滅を生じ、または増殖速度を減弱させ、または転移することができず、または増殖することができない。
【０２１８】
変異原性ヌクレオシドおよびヌクレオチドのためのアッセイ法
一つの態様において、本発明の好ましいヌクレオシド類似体には、5-アザ-シチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、並びに取り込まれてポリメラーゼによって伸張することができるヌクレオチドを含むこれらの誘導体および変種が含まれる。一般に、このような類似体は、ホスホジエステル結合を有し、RNAまたはDNAにこれらを組み入れた後にポリメラーゼ分子によってこれらを伸張することができる。したがって、鎖終止を引き起こす特定のウイルス阻害剤とは異なり(たとえば、3'-ヒドロキシル基を欠いている類似体)、本発明の好ましい類似体は、一般にこれらの取り込みによってRNAまたはDNA合成の終結を生じない非鎖終結類似体である。代わりに、これらは、DNAまたはRNA産物に組み込まれるが、これらの組み込み位置において効率的に塩基対形成の性質を変化させることができることにより、組み込み部位にRNAまたはDNA配列のエラーの導入を引き起こすという、エラー誘導性の類似体であることが好ましい。
【０２１９】
ヒトRNAポリメラーゼIIおよびウイルスポリメラーゼ／複製物などのポリメラーゼによって改変されたヌクレオチドの組み入れ、または細胞のキナーゼによるヌクレオシド類似体のリン酸化に関するパラメータの決定は、DNAポリメラーゼによるデオキシヌクレオシド三リン酸の組み入れのために使用するものと類似する方法によってなされる(Boosalis, et al., J. Biol. Chem. 262： 14689-14698 (1987))。当業者であれば、このようなアッセイ法を使用して、化合物が細胞ポリメラーゼを阻害する能力を決定すること、または改変されたヌクレオチドで処理されたウイルスの複製能を決定することができることも認識するであろう。選択条件下において、ウイルスゲノムに導入された突然変異の頻度の直接の測定を行うことができる(Ji and Loeb, Virol., 199： 323-330 (1994))。
【０２２０】
ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体は、細胞ポリメラーゼまたはウイルスポリメラーゼによって、少なくとも約0.1%、好ましくは少なくとも約5%、および最も好ましくは、インビトロでのアッセイ法において等量で比較したときに、天然に存在する相補的核酸のものに匹敵する効率で、ゲノムの核酸のDNAまたはRNAコピーに組み込まれる。したがって、ウイルスの突然変異誘発を増強するためには、1000以上の塩基に約1つのエラー率で十分である。ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体が誤った塩基対形成を引き起こす能力は、DNAまたはRNAに類似体を組み込むことによって生じる突然変異の頻度および性質を試験し、検査することによって決定してもよい。たとえば、溶解性のRNAウイルス(インフルエンザA型などの)における突然変異率は、DNAウイルスにおけるよりも約300倍高いことが報告されていた(Drake, PNAS, USA 90： 4171- 4175 (1993))。しかし、レトロウイルスは、通常、溶解性のRNAウイルスよりも明らかに約1桁低い平均レートで変異する。同上。
【０２２１】
たとえば、HIVの場合、ウイルスRNAまたは組み込まれたHIV DNAは、逆転写酵素および次いで、相補的プライマーおよび全4種のデオキシヌクレオシド三リン酸でのPCR反応を使用するDNAポリメラーゼによって複製される。複製されるゲノム領域は、逆転写酵素遺伝子の600ヌクレオチドのセグメントに対応する。70ラウンドのPCR後の複製されたDNAまたはRNAを制限酵素で処理して、プライマー配列を切断し、プラスミドに結合する。大腸菌のトランスフェクション後、個々のクローンを得て、プラスミド内の増幅されたセグメントをシーケンスする。この領域内の突然変異を計算機支援解析によって決定し、RNA類似体の不存在下で同じウイルスを平行して培養することによって得られた対照ウイルス配列と個々配列を比較する。それぞれのヌクレオチドの決定は、経時的な10ラウンドのウイルス継代後に、またはウイルス検出のための絶滅の時点で行う。関心対象のその他のウイルスのために類似の手順が有効であると考えられ、当業者に直ちに明らかであろう。
【０２２２】
細胞またはウイルスのRNAポリメラーゼによるか、逆転写酵素(またはその他のウイルス酵素)によるか、またはDNAポリメラーゼによる、類似体の組み込みを直接または別々に比較してもよく、その後に別々の試験結果を比較してもよい。関心対象のポリメラーゼ間での類似体の組み込みの比較は、ヌクレオチド組み込みのための「マイナス」シーケンシング・ゲル・アッセイ法を一部修正したものを利用して行うことができる。5'32P-ラベルしたプライマーを4つのヌクレオシド三リン酸のうちの3つ、および三リン酸の形態の類似体を含む反応中で伸張させる。鋳型は、適宜RNAまたはDNAのいずれかであることができる。反応から取り除かれるヌクレオチドに相補的な鋳型・ヌクレオチドを越えたプライマーの伸長は、類似体の組み込みに依存し、かつ比例する。類似体の組み込み量は、シーケンシング・ゲル上である位置から次の位置まで延長されるオリゴヌクレオチドのパーセントの関数として算出される。組み込みは、オートラジオグラフィー、続く濃度測定または各々のバンドを外へ切断し、液体シンチレーション分光法によって放射能を計数することによって決定される。当業者であれば、同様の実験を行って、本発明の化合物の癌細胞の核酸への組み込みを決定できることを認識するであろう。
【０２２３】
本発明のヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を、インビトロで、またはインビボでウイルスに感染した細胞に投与されると、複製された相同的なウイルス核酸の非常に変異性の集団を含む細胞集団が産生される。この非常に変異性の細胞の集団は、ウイルスに感染した細胞に変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を投与することによって生じ、ウイルス集団の突然変異率を増大する。したがって、ウイルスの非常に変異性の集団は、ウイルスの突然変異率がヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の投与によって増大されたことの指標である。集団の変異性の測定により、ウイルス集団の生存度の評価を実現する。そして、ウイルス集団の生存度は、細胞群の健康の予後の指標である。たとえば、ヒト患者においてHIV集団の生存度が低いことは、患者の見通しの改善に対応する。
【０２２４】
一部の態様において、選択の変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体は、水溶性であり、迅速に標的細胞に入る能力を有する。また、脂溶性類似体も本発明に包含される。ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体は、細胞キナーゼによってリン酸化され、必要に応じて、RNAまたはDNAに組み込まれる。
【０２２５】
ウイルス複製のアッセイ法
当業者であれば、ウイルス複製または感染力は、ウイルスが疾患を引き起こす能力と相関することを認識するであろう。すなわち、高度に感染性のウイルスは、より感染性でないウイルスよりも疾患を引き起こす可能性が高い。好ましい態様において、本発明の化合物での処理の結果として、そのゲノムに組み込まれた突然変異を有するウイルスは、未処理のウイルスと比較して、ウイルス感染力の減弱がもたらされると考えられる。当業者であれば、ウイルスの感染力をアッセイするための方法を知っているであろう。(たとえば、Condit, Principles of Virology, in Fields Virology, 4th Ed. 19-51 (Knipe et al., eds., 2001を参照されたい))。
【０２２６】
たとえば、ウイルスの感染力を測定するために、プラーク形成アッセイ法を使用することができる。簡単には、ウイルス試料を適切な培地に希釈して、段階希釈を細胞のコンフルエントな単層上にまく。それぞれのプラークが単一のウイルス感染から発生するように、感染細胞を半固形培地で覆う。インキュベーション後、プラークを視覚化し、計数することができるように、プレートを適切な染料で染色する。
【０２２７】
いくつかのウイルスは、細胞を死滅させず、むしろこれらを形質転換する。形質転換表現型は、たとえば接触阻害がなくなった後の病巣形成を検出することができる。ウイルスを連続的に希釈し、接触阻害された細胞の単層上にまく。ウイルスの感染力を決定するために、病巣を適切な染料で検出し、計数することができる。
【０２２８】
ウイルスの感染力を決定するためのもう一つの方法は、エンドポイント法である。本方法は、プラークまたは病巣を形成しないが、培養細胞、孵化鶏卵培養、もしくは動物において検出可能な病状または細胞変性効果(CPE)を有するウイルスに適している。丸くなる、収縮、屈折性の増大、融合、シンシチウム形成、凝集、付着の減少、または溶解を含む多くの表現型が、CPEとして測定可能である。ウイルスの段階希釈を適切なアッセイ系に適用して、インキュベーション後に、CPEをアッセイする。ウイルスの正確な希釈が細胞の50%感染に必要とされることを決定するために、統計学的方法を利用できる。(たとえば、Spearman, Br. J. Psychol. 2：227-242 (1908)；および Reed and Muench, Am. J. Hyg. 27：493-497 (1938)を参照されたい)。
【０２２９】
薬物がウイルスの複製または感染力を阻害する能力は、薬物のEC50、または50%のウイルス複製を防止する有効濃度として表される。ウイルスの感染力を決定するために上記した方法は、薬物のEC50を決定するために有用である。
【０２３０】
薬物が細胞を死滅させる能力は、IC50、または細胞増殖を阻害する薬物の濃度として表される。薬物のIC50を決定する方法は、当業者に既知であり、薬物の濃度の範囲でインキュベーション後に細胞生存度を決定することを含む。
【０２３１】
ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤に対して耐性のHIV株の治療
本発明の化合物は、HIV感染症およびその他のレトロウイルスの感染症を治療するために使用することができる。本発明の化合物は、特にヌクレオシド逆転写酵素阻害剤に対して耐性であるHIV株を治療することによく適している。
【０２３２】
2001年より、16の抗ウイルス剤がHIV感染症の治療用に認可された。7つは、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体鎖の停止剤またはヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)であり、6つは、プロテアーゼ阻害剤であり、3つは、非核酸系逆転写酵素阻害剤(NNRTI)である。
【０２３３】
最近まで、ジドブジンは、抗HIV薬の主力であった。HIV疾患の進行した患者に対するジドブジンの投与は、生存を延長すること、神経機能を改善すること、一過性にCD4+リンパ球数を改善すること、および抗原血症の割合を減少させることが示された。しかし、ジドブジン単独療法では、短期の利益が観察され、慢性的な治療の間にジドブジン耐性の出現を伴い、HIV感染症の制御を延長するためには、併用化学療法が必要とされることが示唆された(たとえば、Loveday et al., Lancet. 345： 820-824 (1995)； Volberding, et al., J. Infect. Dis. 171： S150-S154. (1995)を参照されたい)。
【０２３４】
1996年に、プロテアーゼ阻害剤が患者の血液中のHIV量を激減させることができ、併用療法が、いくつかのケースにおいて、PCRによる検出不可能なウイルスRNAとなることを、臨床試験結果が示した。サキナビル、ジドブジン、およびザルシタビン(zalcitabine)の併用化学療法の臨床試験では、CD4+数を増大し、およびウイルス負担を減少し、2剤併用療法よりも有意に優れていたことを証明した(たとえば、Collier et al., New Engl. J. Med. 334： 1011-1017 (1996)を参照されたい)。しかし、ヌクレオシド類似体と同様に、交さ抵抗性がプロテアーゼ阻害剤に発生するという証拠がある(たとえば、Condra et al., Nature 374： 569-571 (1995)を参照されたい)。実際に、プロテアーゼ阻害剤およびNRTIに対する抵抗をコードするHIVゲノムの同時突然変異が記載されている(Shafer et al., Ann. Intern. Med. 128： 906-911 (1998))。注目すべきは、併用療法(非常に活性な抗レトロウイルス療法またはHAART)は、典型的には3種のの薬物療法によって開始され、高価であり、これらの複雑さおよび副作用のために、患者の生活の質に悪影響を与える。最高の治療利益には、用量、頻度、タイミング、および多くの薬剤の食事制限についての完全に近い順守が必要であろう(たとえば、Stone Clin. Infect. Dis. 33： 865-872 (2001)を参されたい)。さらに、3種治療の間にウイルス学的、免疫学的、または臨床的な失敗が生じた場合は、5種以上の薬物、いわゆるメガHAARTが必要であろう(BHIVA Writing Committee. HIV Med. 1： 76-101 (2000))。
【０２３５】
したがって、低いウイルス耐性の可能性を有する新規のHIV治療が市場において必要とされる。本発明の一つの態様は、従来のNRTIに耐性のHIV株のパネルに対する活性について、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体の新規のクラスを記載する。
【０２３６】
HIV LAIに対して、候補の5-アザ-dC製剤および誘導体のルーチンのスクリーニングを行った。また、HIV LAIに対して高い活性を有する候補を、既存のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)に対する耐性を有するHIV株に対してスクリーニングした。
【０２３７】
NRTIに耐性のHIV株は、既知であり、抵抗の原因となる逆転写酵素(RT)酵素中の突然変異も解析されている。HIV RTにおける耐性の突然変異は、新たなものを作製するのではなく、既存の野生型RTの能力を増大するだけであると思われる。NRTIに対する耐性の2つの機構が記載されている：NRTIと天然に存在するヌクレオシドの間の識別の効率の増加、およびヌクレオチドの存在下におけるピロ加リン酸分解によるNRTIの切除(たとえば、Isel et al., J. Biol. Chem. 276： 48725-48732 (2001)を参照されたい)。NRTIに対するHIV RTの親和性の減少は、通常類似体の糖残基の変化、たとえば、突然変異M184VまたはQ151Mを含む(たとえば、Sluis-Cremer et al., Cell. Mol. Life Sci. 57： 1408-1422 (2000)を参照されたい)。または、鎖停止剤を、ピロ加リン酸分解、または逆ヌクレオチド重合によって除去してもよく、ここでは、ピロリン酸は鎖停止剤の除去のためのアクセプター分子として作用する。鎖停止剤の除去により、RTが自由に天然のヌクレオチド基質を組み込み、ウイルス複製をレスキューする。また、ATPは、鎖停止剤の除去のためにアクセプター分子として提案され、プライマー非ブロック化と称する(たとえば、Naeger et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 20： 635-639 (2001)を参照されたい)。
【０２３８】
ウイルスの耐性は、NRTIでの治療後よりも、変異原性のヌクレオチド類似体での治療後に現れる可能性が低い。たとえば、変異原性のヌクレオチド類似体では、耐性の変種の出現について、ウイルス集団に対して、直ちにウイルス複製を停止させることを試みる承認された抗ウイルス剤よりも少ない選択圧を適用する。変異原性のヌクレオチド類似体は、全てのウイルスタンパク質に悪影響を与える。修飾されたヌクレオシド糖に対するHIV RTの減少した親和性は、ウイルスの耐性の1つの機構である。変異原性のヌクレオチド類似体は、無修飾糖を有する。たとえば、RTは、3'-OH基が存在しないことを認識し、鎖停止剤の交さ抵抗性を生じることが示された(たとえば、Huang et al., Science 282： 1669-75 (1998)を参照されたい)。天然のds様の変異原性のヌクレオチド類似体は、3'-OHを有する。変異原性のヌクレオチド類似体は、複製を終了しないので、ピロ加リン酸分解、従来のヌクレオシドの類似体に対するウイルスの耐性のその他の主要な機構がMDRNに適用される可能性はない。RTによるピロ加リン酸分解は、DNA鎖の伸長を妨げる鎖停止剤の切除を生じる。
【０２３９】
野生型HIV株の、および1つまたは複数のNRTIに耐性のHIV株の変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体のEC50を決定することによって、NRTIと変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体との間の交さ抵抗性を試験することができる。変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体のEC50が、野生型株のものよりもNRTI耐性株でたかい場合、交さ抵抗性が生じたことを示唆する。実験では、交さ抵抗性がNRTIと変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体との間で発生する可能性がないことを証明した。耐性株がピロ加リン酸分解またはRT識別の増強によって達成される、3種のHIV NRTI耐性株のパネル(AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH)を使用して、5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-アザ-dC)、変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の効果を試験した。これらの株は、ルーチンの臨床試料に存在するNRTIに対する感受性の突然変異の大部分を有する(たとえば、Hertogs,. Antiviral Drug Discovery and Development Summit. Strategic Research Institute, NY, NY. (2001)を参照されたい)。すなわち：1) HIV-1 LAI-M184V：M184V突然変異は、ラミブジン(3TC)に対する耐性を与える。また、M184Vは、オキサチオラン環の硫黄との相互作用によって3TC-TPの組み込む可能性を減少させるが、面白いことにまた、ピロ加リン酸分解活性を減少させることによって、おそらくジドブジンに対する感受性を増強する(たとえば、Boyer et al., J. Virol. 76： 3248-3256 (2002)を参照されたい)。2) HIV-1 RTMDR1は、74V、41L、106A、および215Yの突然変異を有する。RTMDR1は、ジドブジン、ジダノシン、ネビラピン、およびその他の非核酸系逆転写酵素阻害剤に対して耐性である。鋳型／プライマーの位置を変えることにより、ジダノシンの74Vの突然変異に関連したDNA合成進化性の減少の役割を果たすであろう。41Lおよび215Yの耐性の突然変異は、ピロ加リン酸分解を増強する(たとえば、Sluis-Cremer et al., supraを参照されたい)。3) HIV-1 RTMCは、67N、70R、215F、および219Qの突然変異を有する。RTMCは、ジドブジンに対して耐性である。これらの突然変異の全ては、ピロ加リン酸分解を増強する(同上)。野生型HIV株LAIに対する5-アザ-dCのEC50は、NRTI耐性株に対する5-アザ-dCのEC50と同じであった。対照的に、野生型HIV株LAIに対するAZTまたは3TCのEC50は、適切なNRTI耐性株(たとえば、RTMC、M184V、もしくはRTMDR1)に対するAZTまたは3TCのEC50とは、著しく異なった。その他のNRTI変異体も利用することができ、同様の方法でアッセイすることができる(Gonzales et al., Program and Abstracts of the Forty-Second Interscience Conference on Antimicrobials and Chemotherapy. Abstract No. 3300 (2002))。突然変異には、以下を含む：M41L、E44D、A62V、K65R、D67N、T69DN、T69_SS、K70R、L74V、V75I、F77L、Y115F、F116Y、V118I、Q151M、M184V、L210W、T215F、およびK219QE。
【０２４０】
癌の治療
本発明の化合物は、癌を治療するために使用することができる。悪性細胞は、非悪性の細胞よりも迅速に複製するので、本発明の化合物は、悪性細胞に優先して組み込まれる。好ましい態様において、白血病およびその他の造血性の癌が、本発明の化合物を使用して治療される。理論によって拘束されることは望まないが、本発明のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、癌細胞の核酸、DNAまたはRNAのいずれかに組み込まれる。ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル結合を有するか、またはホスホジエステル結合を得て、これらを組み込み、ポリメラーゼによって伸張される。一つの態様において、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体は、改変された塩基対形成特性を有し、癌細胞のゲノムに突然変異を組み込むことができ、劇的に癌細胞の突然変異率を増大する。突然変異率の増大により、子孫細胞の生存度の減少を生じ、癌細胞の死を引き起こし、または増殖速度を減弱させ、または転移することができない。もう一つの態様において、突然変異は、転写産物、たとえばタンパク質の翻訳に有用なタンパク質またはtRNA分子をコードするmRNA分子に組み込まれる。変異された転写産物は、変異されたタンパク質、たとえば改変されたアミノ酸配列を有するか、または切り詰められたタンパク質をコードし、タンパク質の不活性化を引き起こす。また、癌細胞が活性なタンパク質を常にコードすることができないと、癌細胞の死滅を生じ、増殖速度を減弱させ、または転移することができず、または増殖することができない。
【０２４１】
当業者であれば、癌を治療する際に化合物の効果を試験するための方法を知っている。たとえば、関心対象の癌細胞を培養液中で培養すること、本発明の化合物の濃度を変化させて存在させ、インキュベートすることができる。細胞の生存度および細胞増殖を決定するために、MTTなどの生体染料の取り込みが頻繁に使用される。細胞増殖の阻害が見られるときは、本質的に上記したとおりに、化合物のIC50を決定することができる。また、当業者であれば、動物モデル、たとえば形質転換細胞を注射したヌードマウスにおいて本発明の化合物を試験することを知っている。データを組織培養モデルで収集し、ヒト患者に使用するために、動物モデルを当業者が推定することができる。
【０２４２】
併用療法
また、本発明の化合物は、ウイルス疾患または癌を治療するために、他剤と組み合わせて使用することができる。
【０２４３】
たとえば、変異原性ヌクレオシド類似体は、以下のものなどのその他の抗ウイルス療法薬と組み合わせて使用することができる：ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(たとえば、ジドブジン(ZDVまたはAZT)、ジダノシン(ddI)、ザルシタビン(Zalcitabine：ddC)、スタブジン(d4T)、ラミブジン(3TC)、アバカビル(Abacavir：ABC)、およびテノフォビルテノフォビルジソプロキシルフマルレート(Tenofovir tenofovir disoproxil fumarate：TDF)、非核酸逆転写酵素阻害剤(たとえば、ネビラピン(NVP)、デラビルジン(Delavirdine：DLV)、およびエファビレンツ(EFV))、プロテアーゼ阻害剤(たとえば、インビラーゼ、フォルトバーゼ(Fortovase)、ノルビル(Norvir)、クリキシバン、ビラセプト(Viracept)、アジネラーゼ(Agenerase)、カレトラ(Kaletra)、ライアタズ(Reyataz)、フォサムプレナビル(fosamprenavir)、およびチプラナビル(tipranavir))、インテグラーゼ阻害剤、融合阻害剤、またはインターフェロンなどの免疫調節物質。また、ジアシルグリセロール類似体などのウイルス複製を誘導する薬物(たとえば、Hamer et al. Journal of Virology. 77：10227-10236 (2003))は、ウイルス変異誘発物質との組み合わせの利益を受けるかもしれない。これらの薬物は、ウイルス貯蔵所のサイズを減少させる際に有用性を有しているであろう。また、変異原性ヌクレオシド類似体は、IL-2などのサイトカインと組み合わせて使用することができる。(たとえば、Kedzierski and Crowe, Antiviral Chem. & Chemo. 12：133-150 (2001)を参照されたい)。ウイルス変異誘発物質とこのような化合物の組み合わせにより、ウイルスゲノムに変異原性ヌクレオシドを組み込んであまり適切でないウイルスを産生させることができ、最終的にウイルスの絶滅を生じさせる。
【０２４４】
癌治療法のために、変異原性ヌクレオシドの類似体をその他の抗癌治療、たとえば放射線、化学療法薬、ホルモン類似体、免疫賦活薬、インターフェロン、サイトカイン、および抗体と組み合わせて使用することができる。
【０２４５】
投与
薬学的製剤は、単位用量形態であることが好ましい。このような形態において、製剤は、適切な量の活性効分を含む単位用量に再分割される。単位用量形態は、パッケージされた製剤、パケット単位に区切られたタブレット、カプセル、およびバイアルまたはアンプル中の粉末などの別々の量の製剤を含むパッケージであることができる。また、単位用量形態は、それ自体がカプセル、タブレット、カシェ剤、もしくはロゼンジであることができ、またはパッケージされた形態のこれらのいずれかの適切な数であることができる。
【０２４６】
化合物(これらの組成物の形態のもの)は、当該技術分野において既知の通常の手段によって、たとえば、経口的に、または注射、輸液、浸潤、灌注などによって患者に投与される。注射および／または浸潤または輸液による投与のためには、本発明に従った組成物または製剤を懸架してもよく、または注射および／または浸潤または輸液のために適した媒体に周知のように溶解してもよい。このような媒体は、等張性の塩類、緩衝化されたもの、または緩衝化されていないものなどを含む。使用目的に応じて、これらは、当該技術分野において既知のように、等張性薬剤、塩化ナトリウム、pH変更因子、着色材、保存剤、抗体、酵素、抗生物質、抗菌類、抗ウイルス薬、その他の抗感染剤、および／または放射線不透過性の染料、放射性ラベルされた薬剤などの診断補助物などの、その他の活性成分を含むその他の成分を含んでいてもよい。しかし、本発明の組成物は、化合物の単純な溶液もしくは懸濁液または化合物の薬学的に許容される塩の、蒸留水または塩類溶液を含んでいてもよい。
【０２４７】
または、治療的化合物は、鼻腔内、吸入によって、またはリポソーム、ナノカプセル、小胞などの形態などで、他の手段によって送達してもよい。鼻腔内の投与のための組成物は、通常活性化合物のドロップ、液体状態を含むスプレー(溶液、懸濁液、エマルジョン、リポソーム、その他)の形をとる。吸入による投与は、活性な治療薬を含む蒸気、霧、乾燥粉末、またはエアゾールの形成を一般に含み、また、溶液、懸濁液、エマルジョンなどを含んでいてもよい。
【０２４８】
本明細書に記載されている治療組成物の投与の経路および頻度、並びに用量は、個体毎に異なると考えられ、標準的な技術を使用して容易に確立されるであろう。好ましくは、1〜100の間の用量を52週間にわたって投与してもよい。ウイルス疾患を治療するときは、適切な用量は、上記の通りに投与したときに、ウイルスを死滅させるか、または感染力を制限することができる化合物の量である。癌を治療するときは、適切な用量は、上記の通りに投与したときに、癌もしくは癌細胞を死滅させるか、または増殖を減速することができる化合物の量である。
【０２４９】
一般に、適切な用量および治療法では、治療および／または予防の利益を提供するために十分な量の活性化合物(類)を提供する。反応は、治療した患者において、無処置の患者と比較して改善された臨床結果(たとえば、より長期間ウイルス疾患がなく生存すること、または癌患者において、より頻繁な緩解、完全もしくは部分的に、長期間疾患がなく生存すること)を確立することによってモニターすることができる。
【０２５０】
本出願に記載されている化合物の治療的な量は、所望の治療反応を生じさせるために有効な量、たとえばウイルス疾患を治療するときに、ウイルスを死滅させるか、または感染力を制限するために有効な量を意味する。癌患者を治療するときは、本出願に記載されている化合物の治療的な量は、たとえば癌の増殖を遅延するか、もしくは停止させ、または癌の縮小を生じさせ、または転移させないために有効な量である。ウイルス疾患および癌の治療のためには、投与されたものが化合物(または化合物類)でないが、化合物(または化合物類)の鏡像異性体、プロドラッグ、塩、または代謝産物である場合、「治療上有効な量」という用語は、患者において、化合物自体の治療上有効な量の投与によって生じる、同じ血中濃度で問題の化合物を生じるこのような材料の量を意味する。同様に、組成物の鏡像異性体、プロドラッグ、もしくは代謝産物、または組成物もしくはその他の化合物のいずれかの塩が投与される場合、このような化合物の1つの治療上有効な量は、患者において治療的に関連した組成物の血中濃度を生じる量である。経口投薬は、ウイルス疾患または癌の治療のためには、任意に500mg〜2グラムで変更する。当業者であれば、経口投与によって、または薬物投与のその他の何らかの方法、たとえば、静脈内投与もしくは非経口投与によって、治療を必要とする患者に適した用量範囲を生じるルーチン試験を知っている。また、当業者であれば、治療を必要とする患者のためのおおよその用量を推定するために、インビトロまたはインビボでの実験モデルによって提供される結果を使用することができることを知っている。
【０２５１】
本出願に記載された化合物、並びに本発明の方法に従ったこのような化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、鏡像異性体、および代謝産物で治療することができる患者は、たとえば、HIV感染症、B型肝炎、C型肝炎、または小痘、またはワクシニアウイルスを有すると診断された患者を含む。
【０２５２】
本出願に記載された化合物、並びに本発明の方法に従ったこのような化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、鏡像異性体、および代謝産物で治療することができるその他の患者は、たとえば、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚もしくは眼内の黒色腫、子宮癌、卵嚢癌、直腸癌または肛門部の癌、胃癌、大腸癌、乳癌、女性生殖器腫瘍(たとえば、子宮肉腫、卵管癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌もしくは外陰部の癌)、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌(たとえば、甲状腺、副甲状腺、もしくは副腎の癌)、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性もしくは急性の白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または輸尿管の癌(たとえば、腎細胞癌、腎盂癌)、または中枢神経系の新生物(たとえば、一次CNSリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、または下垂体腺腫)を有すると診断された患者を含む。
【０２５３】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載されている組成物は、成人および小児のAML、CML、ALL、CLL、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性症候群(MPS)、二次白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を含む血液癌を治療するために使用してもよい。
【０２５４】
このような方法では、典型的には薬学的組成物が患者に投与される。本明細書において使用されるものとして、「患者」とは、いずれの温血動物も、好ましくはヒトをいう。
【０２５５】
化合物を投与するためのキットは、問題の化合物、またはこれらのいずれかの鏡像異性体、プロドラッグ、代謝産物、もしくは薬学的に許容される塩の組成物または製剤を、治療成分を投与するための従来製品と共に含むように調製してもよい。
【０２５６】
本明細書において言及した全ての参照および特許刊行物は、本明細書に参照として組み入れられる。上記に提供した開示から分かるように、本発明は、多種多様な適用を有する。従って、以下の実施例は説明の便宜上提供され、いずれにせよ本発明に対する限定として解釈されることは企図されない。
【０２５７】
実施例
実施例1：HIVの有力な変異誘発物質である5-アザ-dC
5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-アザ-dC)は、一回の継代でHIVを根絶することができる有力なウイルス変異誘発物質である。
【０２５８】
抗ウイルス活性の試験のためのウイルス株
一次薬物スクリーニングのために使用するHIV-1の株は、HIV-1 LAIまたは交さ抵抗性の研究のためのNRTI耐性のHIVの適切な株である。ウイルス株を作製するために、ウイルスをMT-2細胞に対して0.01の感染効率(MOI)で増殖させた。簡単には、MT-2細胞を10%のウシ胎児血清、ストレプトマイシン、およびペニシリン(cRPMI)を補ったRPMI 1640培地中に懸濁し、5%のCO2を含む37℃のインキュベータにおいて培養する。ウイルスの段階希釈およびMT-2細胞の感染に続き、HIV-1(p24)のカプシドタンパク質を検出するELISAを行い、ウイルス株(50%の組織培養感染用量(TCID50))の力価を決定するために使用した。ELISAは、製造業者の説明書に従って行った。また、HIV-1増殖(たとえば、シンシチウム形成)の細胞変性効果を視覚化するために、MT-2細胞を使用する。
【０２５９】
変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体によるHIV-1に感染した細胞の治療
0.1mlの3×105細胞/ml MT-2細胞懸濁液を3×104細胞/ウェルで96ウェルプレートにまいた。アッセイする化合物をスクリーンのために必要とされる10倍(10×)濃度で別々の96ウェルに希釈した。次いで、22μlの10×化合物を、非感染性MT-2細胞(3つのウェル)単独および未処置のHIVに感染したMT-2細胞(3つのウェル)を含む6つの対照ウェルを除いて、3つのウェルに添加した。これに続いて、非感染の対照として供給した3つのウェルを除いて0.01のMOIでHIV-1を添加した。非感染ウェルには、ウイルスの代わりに0.1mlの cRPMIを添加した。ウイルスの添加後に、96ウェルプレートを1,200×gで2時間遠心し、MT-2細胞によるウイルスの吸着を増強させた(たとえば、O' Doherty, J. Virol. 74：10074-10080 (2000)を参照されたい)。遠心分離工程後に、次いで、96ウェルプレートを5%のCO2を含む37℃のインキュベータ内で3日間インキュベートした。この期間の終わりに、ウイルスと細胞を穏やかなピペット操作によって混合し、続いて、600×gで1分間スピンして細胞をペレットにした。次いで、それぞれのウェルの上清を96ウェルプレートに1000倍に段階希釈して、その後の継代のための種菌として供給し、産生されるp24の量をELISAによってアッセイした。次の継代を、細胞に感染させるために使用したウイルスが1000倍希釈に由来したこと以外上記の通りに行った。EC50値を作製するために、一回の継代でウイルスを根絶することができる変異原性ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体の半ログ濃度を上記の通りに試験して、用量-反応曲線を作製する。
【０２６０】
以下の化合物についてEC50値を決定した：5-アザ-dC、5-アザ-dU、DH-アザ-dC、および5-メチル-5,6-ジヒドロ-5-アザデオキシシチジン(MeDHAdC)。5-アザ-dcは、野生型HIV株LAIに対して、3nMのEC50(50%のウイルス複製を防止する有効濃度)を有する。結果を図4に示してある。その他の化合物のEC50値は、DHAdCについて3μM、およびMeDHAdCについて10μMである。
【０２６１】
変異原性ヌクレオシド類似体によって誘導されるウイルスゲノムに対する突然変異の頻度の評価
デオキシリボヌクレオシドの類似体5-アザ-dC(30μM)で処理した細胞からのウイルスゲノムDNAをQiagen DNeasy(登録商標)キットを使用して精製した。1μgのゲノムDNAを使用して、1kbのPCRによってHIV-1 RTプロウイルスDNA領域を増幅した。次いで、PCR産物をTOPO(登録商標)クローニングベクターにクローン化した。ミリポア・ミニプレップ・キットを使用して、プロウイルス挿入断片を含むプラスミドを精製した。約45個の陽性クローンをベックマン・クールターCEQ 8000によって両方向にシーケンスした。シーケンシング結果を解析し、DNASTAR Stagmanプログラムを使用してアセンブルした。それぞれの変異された塩基を計数し、シーケンスされたヌクレオチドの総数を通じて突然変異率を算出した。結果を未処置の対照ウイルスから作製したバックボーン突然変異率と比較し、表3に示してある。5-アザ-dC処理した細胞でシーケンスした26,187塩基に、61個の突然変異が見いだされた。薬物のない対照では、1つの突然変異のみを両方向のシーケンシングによって確認することができ、したがって、対照の突然変異率は、過大評価されたのであろう。したがって、HIVの逆転写酵素をコードする核酸断片のシーケンシングにより、5-アザ-dCは、ウイルスゲノムに対して変異原性であることが確認された。
【０２６２】
(表３)
2006507255.tif 000018
【０２６３】
変異原性ヌクレオシド類似体細胞障害性の評価
それぞれの化合物について、MT-2細胞で細胞障害性を評価した。MT-2細胞を96ウェルプレートに3×104細胞／ウェルで接種した。3つの100μM〜32μMの半ログ段階希釈で、細胞を化合物で処理した。5%のCO2を含む37℃のインキュベータ内で5日間培養後、MTTを0.5mg/mlの終濃度に添加し、次いで37℃で4時間インキュベートした。10%のSDSの0.02 N HCl溶液を添加して、37℃で細胞を一晩溶解した。プレートを570nm／650nmの波長で、Tecan Geniusマイクロプレートリーダーで読み込んだ。処理した細胞を未処置の対照と比較することによって、用量反応曲線をグラフに示し、それぞれの化合物についてIC50を決定した。5-アザ-dcについては、IC50は、10μMよりも大きかった。DHadCについては、IC50は、1mMよりも大きかった。5-Me-DHAdCについては、IC50は、未検であった。
【０２６４】
実施例2：野生型HIV株およびNRTI耐性のHIV株に対して有効である5-アザ-dc
変異原性ヌクレオシド類似体に対するNRTI耐性のHIV株の感受性の評価
変異原性ヌクレオシド類似体に対するHIV NRTI耐性株の抵抗性があるかどうかを決定するために、NRTI耐性株を5-アザ-dCの存在下において培養し、5-アザ-dCのEC50がWT株(HIV-1 LAI)と異なるかどうかを決定した。NRTI耐性の株のEC50は、WT株に対するよりも高いことから、5-アザ-dCと特定のNRTIとの間で交さ抵抗性があることを示唆する。HIV-LAIに対しての薬物スクリーンのために上記した方法と同様の方法でEC50実験を行った。適切な濃度のNRTIの存在下におけるHIV NRTI耐性株の増殖をポジティブ対照として使用した。
【０２６５】
3種のHIV NRTI耐性株(HIV-1 LAI-M184V、74V、41L、106A、および215Yの突然変異を有するHIV-1 RTMDR1、並びに67N、70R、215F、および219Qの突然変異を有するHIV-1 RTMC)を使用して、5-アザ-dCの効果を試験した。結果を表4に示してある。これらの実験は、NRTIに対する耐性を有するHIV株が5-アザ-dCと交さ抵抗性でないことを証明する。野生型HIV株LAIに対する5-アザ-dCのEC50は、NRTI耐性株に対する5-アザ-dCのEC50と同じであった。対照的に、野生型HIV株LAIに対するAZTまたは3TCのEC50は、適切なNRTI耐性株(たとえば、RTMC、M184V、またはRTMDR1)に対するAZTまたは3TCのEC50とは、著しく異なった。その他のNRTI変異体も利用することができ、同様の方法でアッセイすることができる(Gonzales et al., Program and Abstracts of the Forty-Second Interscience Conference on Antimicrobials and Chemotherapy. Abstract No. 3300 (2002))。突然変異には、以下を含む：M41L、E44D、A62V、K65R、D67N、T69DN、T69S_SS、K70R、L74V、V75I、F77L、Y115F、F116Y、V118I、Q151M、M184V、L210W、T215F、およびK219QE。
【０２６６】
(表４)5-アザ-dC対ジドブジン(AZT)、並びに野生型HIV LAIおよび薬剤耐性の株に対するラミブジン(3TC)のEC50
2006507255.tif 000019
【０２６７】
実施例3：リボウイルスに対して有効である5-アザ-C
5-アザ-Cは、2つのモデルリボウイルス：はしかウイルスおよび牛ウイルス性下痢ウイルスに対して有効であった。
【０２６８】
抗ウイルス活性の試験のためのウイルス株
はしかウイルス(Mv)および牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)は、2つの異なったリボウイルス・ファミリー、パラミクソウイルス科およびフラビウイルス科のメンバーである。一次スクリーニングのために、これらの2つのウイルスに対して薬物活性を試験した。
【０２６９】
MV Nagahata株を薬物試験のために使用した。いくつかの研究室株と比較して、このウイルス株は、急性感染症の間に、初代ヒト胚肺細胞において溶解性に複製し、広範な細胞変性効果を引き起こす。ウイルス株は、0.01のMOIでCV-1細胞でウイルスを増殖させることによって調製した。ウイルス株の力価は、段階希釈後にプラーク形成アッセイ法によって決定した。
【０２７０】
薬物試験のために使用したBVDV株は、Singer株であった。このウイルスも、測定可能な細胞変性効果を引き起こし、感染のレベルを推定することができる。目に見える細胞病理は、50%の組織培養感染用量(TCID50)によってウイルスを滴定するための指標として使用することができる。BVDVは、ウシの鼻甲介(BT細胞)で増殖した。ウイルスのTCID50は、終末点希釈で細胞変性の効果を計数して決定した。簡単には、96ウェルプレート内のコンフルエントなBT細胞を8つの独立した10倍の段階希釈でウイルスに感染させた。全てのプレートを5%のCO2において37℃で5日間インキュベートした。それぞれのウェルを目に見える細胞変性効果のポジティブまたはネガティブな出現として記録した。力価は、Reed and Muench, Am. J. Hyg. 27：493-497 (1938)の方法によって算出し、それぞれの薬剤濃度並びにポジティブおよびネガティブ対照について、3つの繰り返しのそれぞれについての平均力価および標準偏差を算出した。
【０２７１】
変異原性ヌクレオシドの類似体でのMV-またはBVDV-感染細胞の処理
ウイルス感受性の細胞(CV-1またはBT細胞)を2×104細胞／ウェルで96ウェルプレートにまいた。ウイルスを0.001〜0.002のMOIで細胞単層上に接種し、それぞれのウェルにおいて30プラーク形成単位(pfu)を維持した。種菌を37℃において約1時間維持し、上清を廃棄した。適切な薬剤濃度を含む新しい培地をそれぞれのウェルに添加した。未処置の対照も平行して行った。それぞれの薬物を3回試験した。感染の3日後、細胞変性の効果(CPE)を無処置の対照ウエルで検査した。無処置の対照細胞が、90%のCPE以上を示したときに、感染細胞を回収した。細胞内ウイルスを放出するために、プレートを1サイクルの「凍結融解」に通した。ウイルス株は、次の継代ラウンドのために取っておいた。ウイルス力価は、上記の通りに決定した。ウイルスは、この方法によって105〜106pfu/mlの力価で産生した。
【０２７２】
以下の結果が得られた。5-アザ-Cは、C型肝炎ウイルスの代用物として、BVDVに対して有効であり、10μMのEC50であった。5-アザ-Cは、はしかウイルスに対して有効であり、15μMのEC50であった。
【０２７３】
リボヌクレオシド類似体によって誘導されるウイルスゲノムに対する突然変異の頻度の評価
抗ウイルス活性を示す試験類似体の変異原性を評価する。リバビリンでの研究では、突然変異率が導入された類似体の濃度に関連することを示す(たとえば、Crotty et al., Nature Med. 8 (12)：1375-1379 (2000)を参照されたい)。実験の期間を短くするために、高い突然変異率を達成することができるように、感染細胞を2mMの試験類似体で処理する。この用量は、通常細胞に有毒であり、子孫ウイルスは産生されない。細胞にはBVDVまたはMVを接種し、4時間インキュベートした。インキュベーションにより、ウイルスが、ウイルスRNA複製のために必要なタンパク質を発現することができる。次いで、試験類似体を添加して、さらに24時間インキュベートする。ウイルスRNAをQiagen RNeasyキットで抽出する。約1μgのRNAをウイルス遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドでプライムし、cDNAをM-MLV逆転写酵素を使用して合成する。BVDV可変領域E2、および保存領域NS3をカバーする約1kbの断片を、PCRによって1μg cDNAから増幅する。PCR産物をInvitrogen Topo(登録商標)クローニングベクターにクローン化する。ミリポア・ミニプレップ・キットを使用して、ウイルス挿入物を含むプラスミドをスクリーニングする。約40個の陽性クローンをシーケンシング反応に供する。それぞれの試料は、2方向からシーケンスする。シーケンス結果をDNASTAR Stagmanプログラムを使用してアセンブルする。それぞれの変異された塩基を計数し、シーケンスされたヌクレオチドの総数を通じて突然変異率を算出する。結果を未処置の対照ウイルスから作製したバックグラウンド対照と比較する。
【０２７４】
細胞障害性の評価
それぞれの試験類似体について、BT細胞で細胞障害性を評価する。BT細胞を24ウェルプレートに1×104、4×104、1×105細胞／ウェルでまく。次の日に、細胞を0,100μM、300μM、および1000μMの濃度の薬物で処理する。それぞれの用量を2回試験する。細胞を3世代の間培養した後に、1μg/μlの最終濃度でMTTを培地に添加して、細胞を3時間インキュベートした。10% SDSの0.02NのHCl溶液を添加して、細胞を一晩溶解する。プレートを570/650nmの波長でTecan Geniusマイクロプレートリーダーで読み込む。用量応答曲線は、処理した細胞を未処置の対照と比較してグラフで示してある。次いで、50%の細胞増殖を阻害する用量(IC50)を決定する。抗ウイルス活性を示すこれらの類似体について、同法を用いてTリンパ性CEM細胞において細胞障害性をさらに検査する。
【０２７５】
実施例4：合成
材料および方法
5-アザシチジン(1)および2'-デオキシ-5-アザシチジン(2)(スキーム1)は、Sigmaから商業的に入手可能である。
【０２７６】
5-アザウリジン(3)
化合物3は、文献の手順に従って合成した(Nucl. Acid Chemistry (L.B. Townsend and R.S. Tipson Eds) Part 1, p 455-459, N-Y 1978)。
【０２７７】
5,6-ジヒドロ5-アザウリジン(4)
化合物4は、(Piskala A., ?esnekova B., Vesely J. Nucl. Acids Symp. Ser. No 18 (1978) pp 57-60)に従って5-アザウリジンから合成した。
【０２７８】
実施例4a：1-(2-デオキシ-3,5-ジ-O-p-トルオイル-β-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2-ジヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(5)の合成
所望の化合物を白い結晶粉末m.p. 195-196°(酢酸エチルから)として合成した(Niedballa U., Vorbruggen H.J. Org. Chem. Vol. 39, No. 25, 1974, pp 3672-3674)。
【０２７９】
実施例4b：1-(2-デオキシ-3,5-ジ-O-p-トルオイル-α-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2-ジヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(6)の合成
上記の化合物5の合成からの副反応物として所望の化合物を白い結晶性粉末m.p.210-211°(CH2Cl2-ヘキサンから)、220°(エタノールから)として単離した。
2006507255.tif 000020
【０２８０】
実施例4c：1-(2-デオキシ-3,5-ジ-O-p-トルオイル-β-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2,5,6-テトラヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(7)(スキーム2)合成
5(5ml)の酢酸溶液(0.50g、1.08mmol)の懸濁液に、NaBH4を氷冷した2つの部分に15分間隔で添加した(2×0.040g、2.11 mmol)。混合物を0℃でさらに15分間撹拌し、蒸発させた。残った油をCHCl3(150ml)に懸濁させ、飽和NaHCO3溶液(70ml)で洗浄し、Na2SO4を通して乾燥させた。溶液をセライトを通してろ過し、部分的に蒸発することによって濃縮して、シリカゲルカラム(1.5×22cm)に適用した。カラムをCH2Cl2-MeOH混合物で溶出した(5〜15%のv/v MeOH、700mL)。生成物画分を合わせて蒸発し、MeOH-エーテル(1：2) から結晶化させて0.3gの固体の7を得た。MS ES+ 467 [M+H+]。
【０２８１】
実施例4d：1-(2-デオキシ-3,5-ジ-O-p-トルオイル-α-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2,5,6-テトラヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(8)の合成
化合物8は、6から開始して7と同様に合成した。
2006507255.tif 000021
【０２８２】
実施例4e：1-(2-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2,5,6-テトラヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ5-アザシチジン)(9)
方法A(2の還元)。2'-デオキシ-5-アザシチジン(2)(0.045g、0.2mmol)の96%のエタノール(2.9mL)溶液の懸濁液にNaBH4(40mg、1.06 mmol)を添加し、混合物をRTで10分間撹拌した。水(4mL)を混合物に添加して透明溶液を得て、これをMeCNの0.1Mトリエチルアンモニウム炭酸水素塩緩衝液の勾配を使用するRP HPLC精製に直接使用した。蒸発後の主な画分では0.04gの固体の9を提供した。MS ES+ 231 [M+H+]。
【０２８３】
方法B(7の脱保護、スキーム3)
7(50mg)のMeOH(5mL)溶液に、25%の水溶液NH3(2mL)を添加し、懸濁液を得て、一晩を撹拌することによって溶液になった。混合物を蒸発させて、水に再融解し、MeCNの0.1Mトリエチルアンモニウム炭酸水素塩緩衝液の勾配を使用するRP調製用HPLCによって精製した。蒸発後の主な画分では、0.03gの固体の9を得た。MS ES+ 231 [M+H+]。
【０２８４】
方法C(リボ-化合物1の還元を経て、スキーム4、5工程)
工程1. 3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5-アザシチジン(11)の合成
化合物11は、化合物2のTIPS-保護のために(Goggard A.J., Marquez V.E. Tetrahedron Letters, vol. 29, No. 15, 1988, pp 1767-1770)に記載されている方法と同様に調製した。化合物11を無色固体としてm.p.249°で得た。
【０２８５】
工程2. 3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5,6-ジヒドロ-5-アザシチジン(12)の合成
0.57gの3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5-アザシチジンを窒素下で10mLのTHFに懸濁させた。NaBH4(0.34g、9mmol、7.7当量)を添加して、反応混合物を3分間超音波処理した。室温で2h撹拌した後に、100mLの飽和したNaClを添加し、混合物を150mLのEtOAcで3回抽出した。有機分画を、Na2SO4を通して乾燥し、濾過して蒸発させた。生成物をMeOH勾配を有するEtOAcシリカゲルLCによって単離した。MS ES- 487.0 [M-H+]、12の収率は、0.27g(47%)である。
【０２８６】
工程3. 3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザシチジン(13)の合成(スキーム5)
265mgの3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5,6-ジヒドロ-5-アザシチジンをピリジンおよびジクロロメタン(10mL)の1：1混合液に溶解し、0℃に冷却した。クロロトリメチルシラン(344μL、5当量)を添加し、続いて15分後に塩化イソブチリルを添加した(341μL、6当量)。1.5hの撹拌後、反応を10mLのMeOHで停止させ、蒸発させて、EtOAc(100mL)に溶解し、飽和したNaCl(50mL)で2回抽出した。Na2SO4を通して有機物層を乾燥させ、蒸発させて、残渣をMeOHに再融解して、室温で一晩放置した。次いで、溶液を蒸発させて、生成物をフラッシュクロマトグラフィ(MeOHのジクロロメタン溶液の勾配)によって単離した。MS ES- 557. 1 [M-H+]、収率180mg(59%)。
【０２８７】
工程4. 3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザシチジン(14)の合成 
80mgの3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザシチジンを4mLの乾燥DMFに溶解し、1,1'-チオカルボニルジイミダゾール(77mg、3当量)を添加した。反応混合物を外界温度で一晩インキュベーション後、50mLのEtOAcで希釈し、水(4×50mL)で抽出した。Na2SO4を通して有機分画を乾燥し、ろ過して、油に蒸発させ、トルエンで2回同時蒸発させて、10mLのトルエンに溶解した。溶液を45分間アルゴンで脱気し、107μLのトリブチルスズヒドリド(5当量)および13mgの2,2'-アゾビス(イソブチロニトリル)を添加した。反応混合物を80℃で3h加熱し、冷却して蒸発させて、シリカゲル(MeOHのジクロロメタン溶液の勾配)にフラッシュクロマトグラフィによって分離した。主な生成物は、予想された543.3[M+H+]および565.5[M+Na+]のES+ MSシグナルを示し、収率18mg(23%)。
【０２８８】
工程5. 2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-5-アザシチジン(9)の合成
6mgの3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザシチジンを2mLのMeOHに溶解し、6mLの25%の水溶性NH3で室温で16h以上処理した。溶液を乾燥まで蒸発させて、トルエンと共に同時蒸発させて、2mLのTHFに溶解した。溶液に、0.5mLの1Mフッ化テトラブチルアンモニウムを添加し、反応混合物を1h間インキュベートした。溶媒を蒸発によって除去し、生成物をRP HPLCによって単離した。適切な画分をプールし、乾燥まで蒸発させて、MeOHと共に同時蒸発させて、生成物を調製用のTLCプレートで精製した(1×250×250mm、イソプロパノール-水-濃NH4OH(15：4：1)で溶出)。生成物を含むバンドをかき出して、生成物をMeOH-水(7：3)混合物で溶出した。MS ES+ 231.0 [M+H+]、253.2 [M+Na+]、収率1.7mg(67%)。MS ES+ 231[M+H+]。
【０２８９】
実施例4f：1-(2-デオキシ-α-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2,5,6-テトラヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(10)の合成
化合物10は、方法Bを使用するアンモニアでの8の脱保護によって、9の調製と同様に合成した。化合物10を固体として得た。
【０２９０】
実施例4g：3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザ-5-N-メチルシチジン(15)の合成
18mgの3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザシチジン、0.1mLのN,N-ジイソプロピル-N-エチルアミン、および1.0mLのジメチル硫酸を室温で1h間インキュベートした。生成物をシリカゲル(MeOHのジクロロメタン溶液の勾配)によるフラッシュクロマトグラフィによって単離した。573.2[M+H+]、595.3 [M+Na+]、および1167.2[2M+Na+]でES+ MSシグナル、収率14mg(77%)。
【０２９１】
実施例4h：5,6-ジヒドロ-5-アザ-5-N-メチルシチジン(16)の合成
14mgの3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザ-5-N-メチルシチジンを2mLのMeOHに溶解し、室温で16h間、6mLの濃縮NH4OHで処理した。溶液を乾燥まで蒸発させて、トルエンと共に同時蒸発させて、2mLのTHFに溶解した。溶液に、0.5mLの1Mフッ化テトラブチルアンモニウムを添加し、反応混合物を1h間インキュベートした。溶媒を蒸発によって除去し、生成物をRP HPLCによって単離した。適切な画分をプールし、乾燥まで蒸発させて、MeOHと共に同時蒸発させて、生成物を調製用のTLCプレートで精製した(1×250×250mm、イソプロパノール(15)：水(4)：濃NH4OH(1)で溶出)。生成物を含むバンドをかき出して、生成物をMeOH(7)：水(3)の混合物で溶出した。MS ES+ 261.0[M+H+]、520.9 [2M+H+]、収率5.5mg(86%)。261.0の質量イオンのMS／MSは、5,6-ジヒドロ-5-アザ-5-N-メチルシトシン塩基に対応したm/z 128.9を有する期待される断片を生じた。
【０２９２】
実施例4i：3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザ-5-N-メチルシチジン(17)の合成
3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5-アザシチジン(14)(11mg)、0.1mLのN,N-ジイソプロピル-N-エチルアミン、および1.0mLのジメチル硫酸の混合物を室温で1h間インキュベートした。生成物17をシリカゲル(MeOHのジクロロメタン溶液の勾配)によるフラッシュクロマトグラフィによって単離した。557.3[M+H+]および579.3[M+Na+]でES+ MSシグナル、収率9mg(80%)。
【０２９３】
実施例4j：2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-5-アザ-5-N-メチルシチジン(18)の合成
3',5'-O-(1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-N4-イソブチリル-5アザ-5-N-メチルシチジン(17)(9mg)のMeOH溶液(2ml)を濃縮NH4OH(6mL)で処理し、16h間室温で保持した。溶液を乾燥まで蒸発させて、トルエンと共に同時蒸発させ、THF(2mL)に溶解して、1Mフッ化テトラブチルアンモニウムのTHF(0.5mL)溶液で処理した。反応混合物を1h間室温で放置した。溶媒を蒸発によって除去し、生成物をRP HPLCによって単離した。適切な画分をプールし、乾燥まで蒸発させて、MeOHと共に同時蒸発させて、生成物を調製用のTLCプレートで精製した(1×250×250mm、イソプロパノール-水-濃NH4OH(15：4：1)で溶出)。生成物を含むバンドをかき出して、生成物をMeOH-水(7：3)混合物で溶出した。MS ES+ 245.0[M+H+]、267.1[M+Na+]、収率18は3.7mg(93%)であった。245.0の質量イオンのMS／MSは、5,6-ジヒドロ-5-アザ-5-N-メチルシトシン塩基に対応したm/z 128.9を有する期待される断片を生じた。
【０２９４】
実施例4k：6-メチル-5-アザシトシン(19)の合成(スキーム6)
8.4gのジシアンジアミドを16mLのAc2Oおよび1mLのAcOHの混合物に懸濁させた。反応混合物を16h還流した。冷却した後に、反応混合物を乾燥まで蒸発させた。生成物を調製用のRP HPLC(0.1Mのトリエチルアンモニウム炭酸水素塩緩衝液(pH 7.0)の20分にわたるCH3CNの0〜20%勾配)によって単離した。保持時間は、6.7min、λmax=237nm、MS ES-= 125、収率30%であった。
【０２９５】
実施例4l：6-メチル-5-アザシチジン(20)
化合物20は、6-メチル-5-アザシトシン(19)から開始して、8%の収率で(Hanna N.B., Zajicek J., Piskala A. Nucleosides & Nucleotides 16, 1997, p.129-144)に従って合成された。
【０２９６】
実施例4m：6-メチル-2'-デオキシ-5-アザシチジン(21)の合成
30mgの6-メチル-5-アザシトシン、5mgの(NH4)2SO4、および5mLのヘキサメチルジシラザンを125℃(オイルバスの外部温度)で一晩還流した。透明溶液を固体まで蒸発させて、5mlのキシレンと共に同時蒸発させた。70mgの3,5-ビストルオイル-1-クロロ-2-デオキシリボースを添加し、混合物を2mLのCH3CN中に懸濁させた。撹拌しながらインキュベーションを24h続け、次いで173mgのAcONaおよび0.3mLのAcOHの混合物を水で1mLに希釈して添加した。1h後、混合物を20mlの水で希釈し、20mLの酢酸エチルで2回抽出した。Na2SO4を通して有機物層を乾燥し、ろ過して、蒸発させ、生成物をシリカゲルクロマトグラフィによって分離した。β-アノマーの収率25%、α-アノマー(23%)。
【０２９７】
保護されたヌクレオシドを0.02MのNaOMeのMeOH溶液で4h処理して、トルオイル保護基を除去した。生じるヌクレオシドをPR HPLCによって単離した。
【０２９８】
実施例4n：6-フェニル-5-アザシトシン(22)および6-フェニル-5-アザシチジン(23)(スキーム7)の合成は、発行された方法(Hanna N.B., Masojidkova M., Fiedler P., Piskala A. Collect. Czech. Chem. Commun. 63, 1998, p.222-230)に従って行った。塩基の収率は、43%、ヌクレオシド-16%であった。
【０２９９】
実施例4o：5-アザシチジンおよび6-メチル-5-アザシチジン・プロドラッグ(スキーム8)の合成
8.3mgのヌクレオシドを1mLのTHFに懸濁させ、N-メチルイミダゾールの11μL(4当量)を添加した。反応混合物を-78℃に冷却し、4-ブロモフェニル-N-メトキシアラニルホスホロクロリダート(15mg)の0.5mLのTHFを30minの間滴状に添加した。1h後、ホスホロクロリダートをさらに10mg添加し、混合物を室温に暖めて、一晩インキュベートした。混合物を蒸発させて、RP HPLCによって分離した。5-アザシチジンのプロドラッグは、23min(23minの0〜20% CH3CN)で溶出された、λmax=226nm、収率約15%。6-メチル-5-アザシチジンのプロドラッグは、24minで溶出された、λmax 225nm、収率約12%。
【０３００】
5-アザシチジン・リン脂質プロドラッグは、スキーム9によって合成される。生物学的な還元によって活性化された5-アザシチジン・プロドラッグは、スキーム10によって合成される。
【０３０１】
実施例4p：1(β-D-リボフラノシル)-4-アミノ-1,2,5,6-テトラヒドロ-1,3,5-トリアジン-2-オン(5,6-ジヒドロ-5-アザシチジン)(23)および6-オキソ-5-アザシチジン(24)(スキーム11)は、(Beisler, J.A., Abbasi, M.M., Kelley, J.A., Driscoll, J.S. J. Carbohydrates. Nucleosides. Nucleotides, 4 (5), 1977, pp 281-299)によって合成された。
【０３０２】
実施例4q：2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-5-アザウリジン(26)は、化合物3から4の還元と同様に2'-デオキシ-5-アザウリジン(25)の還元によって合成される(Piskala A., ?esnekova B., Vesely J. Nucl. Acids Symp. Ser. No 18 (1978) pp 57-60)。
実施例4r：2'-デオキシ-5,6-ジヒドロ-5-アザシチジンパルミタート(27)の合成
(9)の溶液に(0.26g、1.13mmol)のMeOH溶液(50mL)に、パルミチン酸(0.29g、1.13 mmol)の熱いMeOH(10mL)溶液を添加し、蒸発させた。残渣をエーテルで完全に粉砕し、ろ過して、m.p.123-124°を有する0.57gの無色の生成物(定量的収率)を得た。MS ES+ 231[M+H+]。
【０３０３】
実施例5：インビトロでのアッセイにおける、DHAdCがHIV感染症に対して安全かつ有効であることの証明
DHAdCのインビトロでの継代アッセイ法
インビトロでウイルスの根絶が可能であることを証明するために、継代実験をDHAdC(SN1212とも称する)に対して行った。実験は、100nMの濃度で、SN1212の存在下において四つの組で行った。p24のレベルは、継代8まで持続的に検出限界(4ng/ml)以下に低下した。感染性のウイルスは、継代12回の後に回収されなかった(データ示さず)。
【０３０４】
DHAdCはウイルス変異誘発物質である
DHAdCのウイルス変異原性の評価は、上記5-アザ-dCについて記載したとおりに行った。HIV NL4-3の逆転写酵素の0.9kbの断片のセンス鎖の突然変異誘発をSN1212(50μM)中で一回継代後に決定し、無処置の対照と比較した。結果を表5に示してある。
【０３０５】
(表５)
2006507255.tif 000022
【０３０６】
HIV RTにおいて50μMのSN1212によって誘導される突然変異率は、対照よりも1.4倍高い(0.0015のDHAdC処理、対0.0011の対照)。優性突然変異は、C⇔T遷移である(SN1212によって4.6倍を増強された)、少数の塩基転換(ピリミジン⇔プリン)を伴う。対照的に、5-OH-dcは、バックグランドを超えて全体の突然変異率に1.14倍の増加のみを示した。
【０３０７】
DHAdCは細胞DNAの有意な突然変異誘発を引き起こさない
SN1212は、大部分のDNA合成の役割を担う細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ-αの乏しい基質である(データ示さず)。また、DHAdCによる細胞DNAの突然変異誘発を試験するために、hgprtアッセイ法を行った。本アッセイ法は、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞で行い、6‐チオグアニン(6-TG)に対する耐性について変異体を選択した。既知の変異誘発物質のEMS(エチルメチルスルホナート)をポジティブ対照として使用した。SN1212は、1mMの濃度で、バックグランドよりも細胞遺伝子hgprtの突然変異体頻度を増大しなかった(データ示さず)。HIVに対するDHAdCのEC50は、10nM以内であるが、細胞DNAに対する有意な突然変異は、1mMで10,000倍の差を示すことに留意されたい。
【０３０８】
また、ミトコンドリアの毒性は、ヌクレオシド類似体に関して、安全である。また、SN1212をミトコンドリアの毒性について解析した。SN1212は、試験した最高の用量の320μMでも、乳酸産生の増加またはミトコンドリアDNAの阻害のいずれかによるミトコンドリア毒性の証拠を示さない(データ示さず)。
【０３０９】
DHAdCは野生型HlV株およびNRTI耐性のHIV株に対して有効である
DHAdCの効果を、実施例2に記載したように、野生型HIV株およびNRTI耐性のHIV株に対して試験した。以下の株を試験した：HIV-1 LAI、野生型；ラミブジン(3TC)に対する耐性を有するHIV-1 LAI-M184V-M184V突然変異株；ジドブジン、ジダノシン、ネビラピン、およびその他の非核酸系逆転写酵素阻害剤に対する耐性を有するHIV-1 RTMDR1-74V、41L、106A、および215Y突然変異株；並びに、ジドブジンに対する耐性を有するHIV-1 RTMC-67N、70R、215F、および219Q。結果を表6に示してある。
【０３１０】
(表６)
2006507255.tif 000023
【０３１１】
SN1212のEC50は、野生型および3つの変異体HIV株で同じであり、SN1212とNRTIの間の交さ抵抗性の欠如が確認された。さらに、SN1212で行った耐性株の出現を支持するように設計されたHIV継代実験に基づくと、SN1212に対して新規の耐性は発生しそうにないようである。
【０３１２】
実施例6：インビボでのアッセイ法は、DHAdC、またはこれらのプロドラッグが、HIV感染症に対して安全かつ有効であることを証明する。
DHAdCは、マウスモデルにおいてHIV感染症を治療する際に有効である。
SN1212は、SCID-Hu Thy／Livマウスに100mg/kg/日皮下までで21日間投与し、いずれの有意な毒性も示されなかった。この毒物学実験の完了後、SN1212をHIVに感染したSCID-Huマウスにおいて試験した。SN1212は、p24またはHIV RNAの減少を示さなかったが、10mg/kgの用量で、無処置の動物と比較したときに、ウイルス感染力の有意な減少を示した(たとえば、表7を参照されたい)。ウイルス感染力と、p24またはHIV RNAなどのウイルス負荷の従来の代わりのマーカーとの間の不一致は、インビトロでこれが観察されていたので、驚くべきことではなく、SN1212の存在下において非伝染性のウイルス粒子の比率が増大されたことを反映する。また、処置群において、SN1212群の免疫プロフィールが非感染性の群のものと最もよく似ていることを示すことも興味深い。これは、あまり「適当」でないウイルスへの感染により、細胞性免疫を保持することによって比較的臨床的に利益がもたらされるという知見と適合する。
【０３１３】
(表７)
2006507255.tif 000024
* 薬物対照なし。**p <0.05
【０３１４】
SN1212、SN1461のプロドラッグは動物において有毒でない
SN1461は、ヒトにおいて、主に肝臓でSN1212に変換されるプロドラッグである。多くの動物種において、SN1461の薬物動態学的な特徴を試験した。ラットでは、SN1461は、3.9時間の半減期および43%の経口生物学的利用能を有するが、ビーグルでは；SN1461は、製剤強化の前に2.1時間の半減期および51%の経口生物学的利用能を有する。用量段階的拡大研究では、SN1461の単一用量を経口的に、ラットに1g/kgまで、およびイヌに2g/kgまで、毒性の証拠を伴わずに与えられた。
【０３１５】
本発明は、変異原性化合物の新規クラス、およびこれらの化合物を使用し、調製する方法を提供する。具体例が提供されているが、上記明細書は、例示であり限定的でない。先に述べた態様の特徴のいずれか1つまたは複数は、本発明のその他のいかなる態様の1つまたは複数の特徴を有するいずれの方法と組み合わせることができる。さらに、本発明の多くの変化は、明細書の総説によって当業者には明らかであろう。従って、本発明の範囲は、上記明細書を参照せずに決定されるべきであり、その代わりにこれらの完全な均等の範囲とともに添付の請求の範囲を参照して決定されるべきである。
【０３１６】
本出願に引用した全ての刊行物および特許文献は、全ての目的についてあたかも個々の刊行物または特許文献がこのように個々に意味されているのと同じ範囲でこれらの全体が参照として組み入れられる。この文書内のこれらの種々の参照の引用によっては、出願人は、任意の特定の参照がこれらの発明に対する「従来技術」であることを意味しない。
【図面の簡単な説明】
【０３１７】
【図１】本発明の選択された組成物の疎水性-疎水性スタッキング相互作用の具体例である。
【図２】疎水性の修飾基で修飾されたファルマコフォアとポリイオンとの間に形成される本発明の複合体の具体例である。
【図３】疎水性の修飾基で修飾されたファルマコフォアとデンドリマーのポリイオンとの間で形成される本発明の複合体の具体例である。
【図４】野生型HIVウイルスに対する5-アザ-dC、DHAdC、および5-Me-DHAdCのEC50値を示す。実験は、HIV株LA1に感染したMT-2細胞で行った。
【図５】化合物1〜4の具体例である。
【図６】化合物7および8の例示的な合成のスキームである。
【図７】化合物9および10のための例示的な合成のスキームである。
【図８】化合物9および11〜14のための例示的な合成のスキームである。
【図９】化合物14〜18のための例示的な合成のスキームである。
【図１０】化合物20〜21のための例示的な合成のスキームである。
【図１１】化合物20〜21のための例示的な合成のスキームである。
【図１２】修飾されたリン酸ジエステル基を含む本発明の化合物のための例示的な合成のスキームである。
【図１３】疎水性部分によって誘導体化された修飾されたリン酸ジエステル基を含む本発明の化合物のための例示的な合成のスキームである。
【図１４】本発明の化合物を調製するための逆合成のスキームである。
【図１５】化合物23、24、および26のための例示的な合成のスキームである。
【図１】
2006507255.tif 000033
【図２】
2006507255.tif 000034
【図３】
2006507255.tif 000035
【図４】
2006507255.tif 000036
【図５】
2006507255.tif 000037
【図６】
2006507255.tif 000038
【図７】
2006507255.tif 000039
【図８】
2006507255.tif 000040
【図９】
2006507255.tif 000041
【図１０】
2006507255.tif 000042
【図１１】
2006507255.tif 000043
【図１２】
2006507255.tif 000044
【図１３】
2006507255.tif 000045
【図１４】
2006507255.tif 000046
【図１５】
2006507255.tif 000047
【国際調査報告】
2006507255.tif 000048
2006507255.tif 000049