(57)【要約】この発明は、核酸サンプルの複数の異なるポリヌクレオチドを同時に分析するための方法および組成物に関する。主題の方法および組成物は、単一のポリヌクレオチドを分析または同定するのに適用され得るが、主題の方法および組成物は大きくて多様なポリヌクレオチドの集合物を分析するのに特に有用である。この発明の方法は、分析のために誘導オリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、その後、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を消化し、消化された部分を単離しかつ分析するステップを含む。誘導オリゴヌクレオチドが識別子配列および定常領域においてマークされることより、複数の標的ポリヌクレオチドを同時にテストし易くなる。当該特定のポリヌクレオチドの同定または発現は、誘導オリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとを組合せることによって得られる短い識別子配列を生成しかつ定量化することによって確認され得る。
2006508677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖または部分的に二本鎖の核酸を含む誘導オリゴヌクレオチドであって、標的相補的領域、定常領域、識別子配列、少なくとも１つの制限部位を含む、誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記少なくとも１つの制限部位は、異なる第１および第２の制限部位を含み、前記第２の制限部位は前記定常領域に隣接している、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記識別子配列は、各々の前記誘導オリゴヌクレオチドに対して特異的であり、第１の制限部位と第２の制限部位との間に位置する、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記定常領域は前記誘導オリゴヌクレオチドの最端の３′末端または５′末端に位置し、前記定常領域は、増幅プライマ配列に対して相補的であるかまたはこれと同一である配列を含む、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
５′または３′末端標識をさらに含む、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記末端標識はビオチンを含む、請求項５に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記識別子配列および第１の制限部位は標的相補的領域の一部である、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記識別子配列および第１の制限部位は標的相補的領域の一部ではない、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記誘導オリゴヌクレオチドの前記標的相補的領域にハイブリダイズされた標的配列鎖の消化を支援する付加的な酵素作用配列をさらに含む、請求項１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記付加的な酵素作用配列は制限部位を含む、請求項９に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記制限部位は、タイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位を含む、請求項１０に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記タイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位は二本鎖の制限酵素認識配列を含む、請求項１１に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
標的相補的領域上における前記制限部位の開裂部位のヌクレオチドが修飾され、これにより、修飾ヌクレオチドは開裂に対して耐性を有するものとなる、請求項１０に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記修飾ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含む、請求項１３に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記付加的な酵素作用配列は、標的がＲＮＡである場合、ＲＮアーゼＨ消化部位を含む、請求項９に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域はキメラＲＮＡおよびＤＮＡを含む、請求項１５に記載の誘導オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
複数の誘導オリゴヌクレオチドを含む誘導オリゴヌクレオチドの組であって、各々が標的特異的な標的相補的領域、誘導オリゴヌクレオチド特異的な識別子配列、同じ第１の制限部位、同じ第２の制限部位、および同じ定常領域配列を有する、誘導オリゴヌクレオチドの組。
【請求項１８】
サンプルにおけるポリヌクレオチドを分析する方法であって、前記方法は、
（ａ）上述の請求項のいずれかに従って誘導オリゴヌクレオチドまたは誘導オリゴヌクレオチドの組または誘導オリゴヌクレオチドの２つ以上の組を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするステップを含み、これにより前記誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域は、標的配列がサンプル内に存在する場合、二本鎖になり、前記方法はさらに、
（ｂ）二本鎖の第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップと、
（ｃ）第１の制限部位において第１の制限酵素で前記二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を消化するステップと、
（ｄ）識別子配列を含む消化された部分を分析するステップとを含む、方法。
【請求項１９】
第１の制限部位および識別子配列は誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の一部であり、前記ステップ（ｂ）は前記ステップ（ａ）の後に終了する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的ポリヌクレオチドはＲＮＡであり、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する前記ステップ（ｂ）は、ヌクレアーゼによってＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの標的ＲＮＡ鎖を消化し、核酸ポリメラーゼによって誘導オリゴヌクレオチド鋳型上において消化された鎖の３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼはＲＮアーゼＨである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
誘導オリゴヌクレオチドは付加的な制限部位を含み、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する前記ステップ（ｂ）は、制限酵素によって前記付加的な制限部位の制限消化部位において標的配列鎖を消化し、核酸ポリメラーゼによって誘導オリゴヌクレオチド鋳型上において消化された鎖の３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域は標的配列の遊離した３′末端にハイブリダイズし、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する前記ステップ（ｂ）は、前記誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによって標的配列の前記遊離した３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する前記ステップ（ｂ）は、一本鎖の標的配列３′を、エキソヌクレアーゼ活性で誘導オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた標識領域へとトリミングし、前記誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによってトリミングされた標的配列の３′末端を伸長させ
るステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記誘導オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ活性に耐性を有するよう、少なくとも最端の３′末端位置において少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは修飾ホスホジエステル結合を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後、末端標識によって固体支持部上における前記ポリヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドを捕捉し、ストリンジェントな条件で洗浄するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｃ）の後、識別子配列および定常領域を含む消化された部分を単離するステップをさらに含み、前記消化された部分は固体支持部上または上清に付着している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
識別子配列を含む消化された部分を分析する前記ステップ（ｄ）は、質量分析、電気泳動またはマイクロアレイによって前記消化された部分を検出するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
識別子配列を含む消化された部分を分析する前記ステップ（ｄ）は、核酸リガーゼによって前記消化された部分を互いにライゲートして少なくとも１つの連結された識別子フラグメントを生成し、誘導オリゴヌクレオチドの定常領域に対して相補的であるかまたはこれと同一であるプライマを用いて連結された識別子フラグメントを増幅し、増幅産物を分析するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅産物を分析するステップは、前記増幅産物のヌクレオチド配列を決定するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅産物を分析するステップは、第１および第２の制限酵素で前記増幅産物を消化して個々の識別子配列を解放し、検出方法によって前記識別子配列を検出しかつ定量化するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出方法は質量分析、電気泳動またはマイクロアレイを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅産物を分析するステップは、第２の制限酵素で前記増幅産物を消化して、連結された識別子フラグメントを解放し、前記連結された識別子フラグメントをライゲートしてコンカテマーを生成し、前記コンカテマーにおいて識別子配列のヌクレオチド配列を決定するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記コンカテマーにおいて識別子配列のヌクレオチド配列を決定する前記ステップは、クローニングし、配列を決定し、識別子配列の数をカウントするステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は概して核酸の定量分析のための方法および組成物に関し、より特定的には、誘導オリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとを組合わせることによって得られる配列タグを分析するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムを解読し、病気の遺伝的根拠と差異的な遺伝子発現に関連付けられる他の生理学的状態の宿主とを理解したいという要望は、核酸を分析するための高度な方法を開発するのに主要な原動力であった。ヒトゲノムは３０，０００を超える遺伝子を含むと推定されるが、そのうちの約１５〜３０％は所与のいずれの組織においても活性である。このように多数の遺伝子が発現することにより、たとえばマイクロアレイに対する遺伝子産物のハイブリダイゼーション、ダイレクトシーケンス分析などの利用可能な技術によって発現パターンの変化を追跡することが難しくなる。より一般的には、発現パターンは、初めに、差異的表示、指標付け、サブトラクションハイブリダイゼーション、または多数のＤＮＡフィンガープリント技術のうちの１つなどのより低解像度の技術によって分析される。次いで、より高解像度の分析が、このような技術を適用することによって同定されるｃＤＮＡクローンのサブセット上でしばしば実行される。
【０００３】
近年、遺伝子発現のパターンを分析するためのダイレクトシーケンス情報を提供しようと試みる２つの技術が実現された。その一方の技術においては、発現した遺伝子から相補的なポリヌクレオチドを捕捉するためにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのマイクロアレイが用いられる（たとえば、シェナ（Schena）他によるサイエンス（Science），２７０：４６７〜４６９（１９９５）；デリシ（DeRisi）他によるScience，２７８：６８０〜６８６（１９９７）；チー（Chee）他によるScience，２７４：６１０〜６１４（１９９６））。もう一方の技術においては、ｃＤＮＡから短い配列タグが切り出されかつ連結され、その後、連結されたタグの配列が従来どおりに決定される。すなわち連続的な遺伝子発現分析（ＳＡＧＥ）である（たとえば、ベルクレスク（Velculescu）他によるScience，２７０：４８４〜４８６（１９９５）；ザング（Zhang）他によるScience，２７６：１２６８〜１２７２（１９９７）；Velculescu他によるセル（Cell），８８：２４３〜２５１（１９９７））。上述の技術はともに、遺伝子発現を分析するための潜在的にロバストなシステムとして将来性を示した。しかしながら、両方の方策のために対処する必要のある技術的な問題が依然として存在する。たとえば、マイクロアレイシステムにおいては、モニターされるべき遺伝子が分かっており予め単離されなければならず、現在の世代のマイクロアレイに関して、当該システムは哺乳類の遺伝子発現を包括的に分析するための複雑さを欠き、容易には再利用できず、高価で特化されたデータ収集および分析システムを必要とするが、ただし、これらの過程は繰返し用いられてもよい。ＳＡＧＥシステムにおいては、特別な器具類は必要ではなく、大規模な設置基盤をもつＤＮＡシーケンサが用いられてもよいが、タイプＩＩｓタグ生成酵素の選択が制限され、現在のプロトコルにおける配列タグの長さ（１０個のヌクレオチド）が、固有に標識付け可能なｃＤＮＡの数を厳密に制限する。ＳＡＧＥの１つの限界は、情報を含まずたとえば大量のハウスキーピング遺伝子から得られる配列タグの配列を決定するのに費用と時間の大部分を費やしてしまうことであるかもしれない。加えて、ＳＡＧＥは、ｍＲＮＡの形として発現した遺伝子の一部分しか分析しないよう制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のことから、遺伝子発現、すなわちｍＲＮＡだけでなく他のすべての非ｍＲＮＡ遺
伝子発現をも迅速かつ安価に分析するための技術が必要とされることが明らかである。このような技術の利用可能性は医学的および科学的研究、創薬、ならびに多数の応用分野における遺伝子分析に直ちに応用されるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この発明は、核酸サンプルの複数の異なるポリヌクレオチドを同時に分析するための方法および組成物に関する。主題の方法および組成物はまた、単一のポリヌクレオチドを分析または同定するのに適用され得る。しかしながら、主題の方法および組成物は、大きくて多様なポリヌクレオチドの集合物を分析するのに特に有用である。この発明の大抵の実施形態は、分析のために誘導オリゴヌクレオチドを全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズし、その後、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を消化し、消化された部分を単離しかつ分析することを含む。誘導オリゴヌクレオチドが識別子配列領域および定常領域においてマークされることにより、特定の標的が存在するかどうか複数のポリヌクレオチドを同時に検査するのが容易になり得る。誘導オリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとを組合わせることによって得られる短い識別子配列を生成しかつ定量化することによって、当該特定のポリヌクレオチドの同定または発現が確認され得る。複数の同定配列を同時に得ることができ、これにより、多数の多様なポリヌクレオチドの迅速な特徴付けが可能となり得る。
【０００６】
誘導オリゴヌクレオチドは一本鎖または部分的に二本鎖の核酸であり、標的相補的領域、定常領域、識別子配列、少なくとも１つの制限部位を含む。上記少なくとも１つの制限部位は異なる第１および第２の制限部位を含み、上記第２の制限部位は上記定常領域に隣接している。
【０００７】
上記識別子配列は各々の上記誘導オリゴヌクレオチドに特異的なものであり、第１の制限部位と第２の制限部位との間に位置する。上記定常領域は、上記誘導オリゴヌクレオチドの最端の３′末端または５′末端に位置し、上記定常領域は、増幅プライマ配列に対して相補的であるかまたはこれと同一である配列を含む。
【０００８】
誘導オリゴヌクレオチドはさらに５′または３′末端標識を含み得る。上記末端標識はビオチンを含み得る。
【０００９】
識別子配列および第１の制限部位は標的相補的領域の一部であり得る。識別子配列および第１の制限部位は標的相補的領域の一部でなくてもよい。
【００１０】
誘導オリゴヌクレオチドは付加的な酵素作用部位をさらに含み得る。これは、上記誘導オリゴヌクレオチドの上記標的相補的領域にハイブリダイズされた標的配列鎖の消化を支援する。付加的な酵素作用部位は制限部位を含み得る。制限部位は、タイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位を含み得る。タイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位の酵素認識部位は、ヘルパープライマでのハイブリダイゼーションによって二本鎖にされ得る。標的相補的領域上における上記制限部位の開裂部位のヌクレオチドが修飾され得、これにより、修飾ヌクレオチドは開裂に対して耐性のあるものとなる。修飾ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含み得る。
【００１１】
上記付加的な酵素作用部位は、標的がＲＮＡである場合、ＲＮアーゼＨ消化部位を含み得る。上記誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域はキメラＲＮＡおよびＤＮＡを含み得る。
【００１２】
誘導オリゴヌクレオチドの組は複数の誘導オリゴヌクレオチドを含み、各々は、標的特異的な標的相補的領域、誘導オリゴヌクレオチド特異的な識別子配列、同じ第１の制限部
位、同じ第２の制限部位、および同じ定常領域配列を有する。
【００１３】
サンプルにおいてポリヌクレオチドを分析する方法は、（ａ）誘導オリゴヌクレオチドまたは誘導オリゴヌクレオチドの組または誘導オリゴヌクレオチドの２つ以上の組を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするステップを含み、これにより、上記誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域は、標的がサンプルに存在する場合、二本鎖になり、当該方法はさらに、（ｂ）二本鎖の第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップと、（ｃ）第１の制限部位上において第１の制限酵素で上記二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチドを消化するステップと、（ｄ）識別子配列および定常領域を含む消化された部分を分析するステップとを含む。
【００１４】
一実施形態においては、第１の制限部位および識別子配列は、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の一部を形成し、上記ステップ（ｂ）は上記ステップ（ａ）の後に終了する。
【００１５】
別の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドはＲＮＡであり、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する上記ステップ（ｂ）は、ヌクレアーゼによってＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの標的ＲＮＡ鎖を部分的に消化し、ＤＮＡポリメラーゼによって誘導オリゴヌクレオチド鋳型上において消化された鎖の３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。上記ヌクレアーゼはＲＮアーゼＨであり得る。
【００１６】
さらに別の実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドは付加的な制限部位を含み、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する上記ステップ（ｂ）は、上記付加的な制限部位の制限消化部位上において制限酵素によって標的配列鎖を消化し、ＤＮＡポリメラーゼによって誘導オリゴヌクレオチド鋳型上において消化された鎖の３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。
【００１７】
さらに別の実施形態においては、上記誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域が標的配列の遊離した３′末端にハイブリダイズし、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する上記ステップ（ｂ）は、上記誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによって標的配列の上記遊離した３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。
【００１８】
さらに別の実施形態においては、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成する上記ステップ（ｂ）は、一本鎖の標的配列３′を、エキソヌクレアーゼ活性で誘導オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた標的領域へとトリミングし、上記誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによってトリミングされた標的配列の３′末端を伸長させるステップを含み、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。この実施形態においては、上記誘導オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ活性に耐性を有するよう少なくとも最端の３′末端位置において少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは修飾ホスホジエステル結合を含む。
【００１９】
上記ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後、当該方法はさらに、末端標識によって固体支持部上で上記ポリヌクレオチドまたは上記オリゴヌクレオチドを捕捉し、ストリン
ジェントな条件で洗浄するステップを含み得る。
【００２０】
上記ステップ（ｃ）の後、当該方法はさらに、識別子配列および定常領域を含む消化された部分を単離するステップを含み得、上記消化された部分は固体支持部上または上清に付着している。
【００２１】
一実施形態においては、識別子配列および定常領域を含む消化された部分を分析する上記ステップ（ｄ）は、質量分析、電気泳動またはマイクロアレイによって上記消化された部分を検出するステップを含む。
【００２２】
別の実施形態においては、識別子配列および定常領域を含む消化された部分を分析する上記ステップ（ｄ）は、核酸リガーゼによって上記消化された部分を互いにライゲートして少なくとも１つの連結された識別子フラグメントを生成し、誘導オリゴヌクレオチドの定常領域に対して相補的であるかまたはこれと同一であるプライマを用いて、連結された識別子フラグメントを増幅し、増幅産物を分析するステップを含む。副次的な実施形態においては、増幅産物を分析する上記ステップは、上記増幅産物のヌクレオチド配列を決定するステップを含む。別の副次的な実施形態においては、増幅産物を分析する上記ステップは、第１および第２の制限酵素で上記増幅産物を消化して個々の識別子配列を解放し、ある検出方法によって上記識別子配列を検出しかつ定量化するステップを含む。上記検出方法は質量分析、電気泳動またはマイクロアレイを含み得る。さらに別の副次的な実施形態または好ましい副次的な実施形態においては、増幅産物を分析する上記ステップは、第２の制限酵素で上記増幅産物を消化して、連結された識別子配列を解放し、上記連結された識別子配列をライゲートしてコンカテマーを生成し、上記コンカテマーにおける識別子配列のヌクレオチド配列を決定するステップを含む。上記コンカテマーにおける識別子配列のヌクレオチド配列を決定する上記ステップは、クローニングし、配列を決定し、識別子配列の数をカウントするステップを含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
この発明は、複数の多様なポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド組成物の複数の異なるポリヌクレオチドを同時に分析するための方法および組成物に関する。主題の方法および組成物はまた、単一のポリヌクレオチドを分析または同定するのに適用され得る。しかしながら、主題の方法および組成物は、大きくて多様なポリヌクレオチドの集合物を分析するのに特に有用である。この発明の大抵の実施形態は、分析のために誘導オリゴヌクレオチドをＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズし、その後、二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を消化し、消化された部分を単離しかつ分析することを含む。誘導オリゴヌクレオチドがその識別子配列および定常領域においてマークされることにより、特定の標的が存在するかどうか複数のポリヌクレオチドを同時に検査するのが容易になり得る。当該特定のポリヌクレオチドの同定または発現は、誘導オリゴヌクレオチドから得られる短い識別子配列を生成しかつ定量化することによって確認され得る。複数の同定配列を同時に得ることができ、これにより、多数の多様なポリヌクレオチドの迅速な特徴付けが可能となり得る。
【００２４】
この発明の方法に従ったポリヌクレオチド集合物の分析を用いて、以下の種類の情報のうちの１つ以上を提供することができる。以下の種類の情報とはすなわち、（１）複合ポリヌクレオチド組成物における１つ以上のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、または（２）複合ポリヌクレオチド組成物における１つ以上の異なるポリヌクレオチドの相対濃度である。主題の方法による大きなポリヌクレオチドの複合集合物の分析を用いることによって、ポリヌクレオチド集合物間における相違を確認することのできるポリヌクレオチド集合物についての十分な情報をもたらすことができる。
【００２５】
誘導オリゴヌクレオチド
誘導オリゴヌクレオチドは、一般に３０〜１０００個のヌクレオチド、好ましくは約４０〜３００個のヌクレオチド、最も好ましくは約５０〜１５０個のヌクレオチドを含む線状の一本鎖または部分的に二本鎖の核酸分子である。誘導オリゴヌクレオチドの領域は、この発明の実施形態に有用な誘導オリゴヌクレオチドを生成する特異的な機能を有する。誘導オリゴヌクレオチドは一般に、標的相補的領域、定常領域、識別子配列、少なくとも１つの制限部位を含み、ここには、通常、５′または３末端標識の有無にかかわらず第１の制限部位および第２の制限部位と称される２つの制限部位が存在する。誘導オリゴヌクレオチドは付加的な酵素作用配列およびヘルパープライマを含み得る。
【００２６】
１．標的相補的領域
誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域は、当該標的ポリヌクレオチドの標的領域に対して相補的であるかまたは実質的に相補的である。選択される当該標的領域はいかなる所望の配列であってもよく、ＳＮＰ部位、変異配列、メチル化部位、スプライシング部位、制限部位および特定の当該配列を含み得る。
【００２７】
誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域は、誘導オリゴヌクレオチドと標的配列との間の特異的な安定したハイブリダイゼーションを支援するいかなる長さであってもよい。この目的のために、標的相補的領域用の９〜６０個のヌクレオチドの長さが好ましく、１５〜４０個のヌクレオチドの長さの標的相補的領域が最も好ましい。
【００２８】
誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域は、標的配列と誘導オリゴヌクレオチドとの間における特異的なハイブリダイゼーション後に二本鎖になる。一実施形態においては、第１の制限部位および識別子配列が標的相補的領域の一部を形成し（図１Ｂ）、誘導オリゴヌクレオチドを当該標的領域へハイブリダイズすると、第１の制限部位は二本鎖になり機能的になる。別の実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域にハイブリダイズする標的領域は、誘導オリゴヌクレオチドの付加的な酵素作用配列に作用する薬剤を消化することによって消化またはニッキングされる。次いで、消化された鎖の３′末端が、誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、これにより、下流の第１の制限部位および他の領域が二本鎖になる。さらに別の実施形態においては、標的相補的領域が標的配列の遊離した３′末端にハイブリダイズし、当該遊離した３′末端が、誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、これにより、下流の第１の制限部位および他の領域が二本鎖になる。
【００２９】
さらなる実施形態においては、標的配列はＲＮＡであり、標的相補的領域にハイブリダイズされると、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡにおける標的ＲＮＡ配列がさまざまな非特異的部位においてＲＮアーゼＨ消化によって部分的に消化され得る。標的相補的領域のある部分（好ましくは３′部分）がＲＮＡによって作成され得ることが好ましい。標的ＲＮＡ配列と標的相補的領域との間でハイブリダイズすると、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮアーゼＨでの消化に対して耐性を有するものとなる。これは、消化および発現が部分的に起こり得るように標的と誘導オリゴヌクレオチドとの間に形成されるハイブリッドにおける標的ＲＮＡが消化し尽くされないという点で有益である。
【００３０】
２．定常領域
定常領域は増幅のためのプライミング部位としての役割を果たす。言い換えれば、定常領域は、増幅に用いられるプライマ配列に対して相補的であるかまたはこれと同一である。このためには、定常領域用の１５〜５０個のヌクレオチドの長さが好ましく、１８〜３５個のヌクレオチドの長さが最も好ましい。「定常領域」は一定であると言われている。というのも、誘導オリゴヌクレオチドの組における定常領域は、増幅プライマに対するハ
イブリダイゼーション特異性に関して、この発明の方法において用いられるのと互いに機能的に同じであるからである。定常領域はいかなる所望の配列をも有し得る。一般に、定常領域の配列は、それが標的ポリヌクレオチドにおけるいかなる配列にも実質的に類似しないように選択され得る。
【００３１】
誘導オリゴヌクレオチドの定常領域は誘導オリゴヌクレオチドの最端の３′末端または５′末端に位置する。この発明の所与の実施形態における標的相補的領域に対する定常領域の相対的な配向の選択は、標的ポリヌクレオチドのどの部分が分析のために選択されるかに応じて異なるだろう。この発明のいくつかの実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドの組またはいくつかの組は同じ配向の定常領域を有するが、定常領域の配列はオリゴの組ごとに異なる（図２）。この発明の他の実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドの組またはいくつかの組は配向の異なる定常領域、ならびに誘導オリゴヌクレオチドの組ごとに配列の異なる定常領域を有する（図３および図４）。
【００３２】
この明細書中において用いられる「誘導オリゴヌクレオチドの組」という語は、互いに関連して用いられる複数の異なる誘導オリゴヌクレオチドを指す。当該組における各々の誘導オリゴヌクレオチドは機能的に同一の定常領域を有し、たとえば、定常領域はすべて、増幅プライマでのハイブリダイゼーションのために同一であるかまたは本質的に同じ性質を有し、当該組における各々の誘導オリゴヌクレオチドは、それらの標的配列へのハイブリダイゼーションのために類似の性質を備えた標的相補的領域を有し、たとえば、当該組における誘導オリゴヌクレオチドすべての標的相補的領域配列は同様のアニーリング温度を有する。誘導オリゴヌクレオチドの組における各々の誘導オリゴヌクレオチドは、同じ第１の制限部位および同じ第２の制限部位を有し得る。定常領域配列が好ましくは誘導オリゴヌクレオチドの組ごとに異なるのに対し、第１の制限部位および第２の制限部位は誘導オリゴヌクレオチドの組ごとに異なっていてもまたは同じであってもよい。
【００３３】
３．識別子配列
識別子配列は第１の制限部位と第２の制限部位との間に位置する。識別子配列は、誘導オリゴヌクレオチドに固有の長さをもついかなる配列をも含み得る。識別子配列は個々の誘導オリゴヌクレオチドを識別する役割を果たす。このためには、識別子配列用の４〜３０個のヌクレオチドの長さが好ましく、５〜２０個のヌクレオチドの長さが最も好ましい。識別子配列はいかなる所望の配列をも有し得る。この発明のいくつかの実施形態においては、識別子配列および第１の制限部位は標的相補的領域に隣接し、その一部を形成する。この発明の他の実施形態においては、識別子配列はランダムに選択可能であり、標的ポリヌクレオチドにかなり類似している配列はいずれも含み得ない。ある組における誘導オリゴヌクレオチドの識別子配列はすべて同じ長さである必要はない。識別子配列の同定はその長さおよび配列の両方によって決定され得る。
【００３４】
識別子配列は、特に標的配列に関連付けられる所与の誘導オリゴヌクレオチドに特に関連付けられているので、識別子配列は誘導オリゴヌクレオチドおよびその関連する標的のためのサインとして機能する。いくつかの実施形態においては、この発明の方法は、発現した遺伝子に対応する転写産物の存在比および性質を決定するのに用いられる。この発明の方法は、標的にハイブリダイズされた誘導オリゴヌクレオチドから得られる同定された配列の同定および特徴付けに基づいている。識別子配列は、たとえば細胞、組織または抽出物において発現した遺伝子のためのマーカである。
【００３５】
４．第１および第２の制限酵素部位
いかなる制限酵素部位も、第１および第２の制限酵素部位として用いることができる。概して、４塩基カッタおよび６塩基カッタが用いられてもよく、第１の制限部位には４塩基カッタが好ましい。第１の制限部位と第２の制限部位とは異なる。この発明のいくつか
の実施形態においては、識別子配列および第１の制限部位は標的相補的領域に隣接し、その一部を形成する。言い換えれば、標的相補的領域、第１の制限酵素および識別子配列は全体として標的配列をハイブリダイズするよう作用する。第１の制限部位は、標的相補的領域の内部または標的相補的領域の５′もしくは３′のどちらかの側に位置する。第２の制限部位は定常領域に隣接している。
【００３６】
５．末端標識およびヌクレオチド修飾
ある実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドは、５′末端もしくは３′末端に組込まれるかまたは誘導オリゴヌクレオチドの内部にある１つ以上の部分を含み得、これにより、関連しない部分からの標識に関連付けられる誘導オリゴヌクレオチドから得られる産物のアフィニティ分離が可能となる。好ましい捕捉部分は、特に同種のリガンドと相互に作用し得る部分である。たとえば、捕捉部分はビオチン、ジゴキシゲニンなどを含み得る。捕捉群の他の例には、リガンド、レセプタ、抗体、ハプテン、酵素、抗体またはアプタマーによって認識可能な化学群が含まれる。捕捉部分は、所望のいかなる基質上にも固定可能である。所望の基質の例には、たとえば、粒子、ビーズ、磁気ビーズ、任意にトラップされたビーズ、マイクロタイタープレート、スライドガラス、紙、試験紙、ゲル、他のマトリックス、ニトロセルロース、ナイロンが含まれる。たとえば、捕捉部分がビオチンである場合、基質はストレプトアビジンを含み得る。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドの１つ以上の位置においてヌクレオチドまたはホスホジエステル結合を修飾することが望ましい場合がある。たとえば、誘導オリゴヌクレオチドの少なくとも３′部分を修飾することが有利であり得る。このような修飾により、エキソヌクレアーゼ活性が誘導オリゴヌクレオチドのいかなる部分をも消化するのが防止される。少なくとも最端かつ末端のヌクレオチドまたはホスホジエステル結合が修飾されることが好ましい。別の実施例においては、標的相補的領域上における付加的な制限部位の開裂部位のヌクレオチドが修飾され得る。このような修飾により、エンドヌクレアーゼ活性が誘導オリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ消化部位を消化するのが防止される。このような修飾にはホスホロチオエート化合物が含まれ、これは、混ぜられると、誘導オリゴヌクレオチド上の３′エキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性を阻害する。エキソヌクレアーゼ活性をブロックすることのできる誘導オリゴヌクレオチドの他の修飾を用いて所望の酵素阻害を達成し得ることを当業者は理解するだろう。
【００３８】
ポリメラーゼによる誘導オリゴヌクレオチドの伸長は、その３′末端におけるブロック群によってブロックされ得る。誘導オリゴヌクレオチドの３′末端のブロックは、当該技術において公知のいずれの手段によっても達成可能である。ブロック群は化学的部分であり、これらが核酸に加えられると、核酸ポリメラーゼによって触媒作用が及ぼされる核酸ポリメライゼーションが阻害される。ブロック群は、典型的には、ヌクレオチドまたはその誘導体からなる誘導オリゴヌクレオチドの終端の３′末端に位置する。ブロック群を終端の３′ＯＨに付着させることにより、３′ＯＨ基はもはや、ポリメライゼーション反応の際にヌクレオシド三リン酸塩を受取るのに使用可能ではなくなる。プローブ配列の３′末端をブロックするために多数のさまざまな群が加えられてもよい。このような群の例には、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸、および３′ＯＨを欠くヌクレオチド誘導体（たとえばコルジセピン）が含まれる。
【００３９】
６．付加的な酵素作用配列
誘導オリゴヌクレオチドはさらに、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域にハイブリダイズされた標的配列鎖を消化またはニッキングするのを支援する付加的な酵素作用配列を含み得る。
【００４０】
付加的な酵素作用配列は制限部位を含み得る。付加的な制限部位は、標的相補的領域の内部または誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の３′もしくは５′のどちらかの側に位置し得る。標的相補的領域上における付加的な制限部位の開裂部位のヌクレオチドが修飾され得ることにより、修飾ヌクレオチドは開裂に対して耐性を有するものとなる。たとえば、誘導オリゴヌクレオチドの制限開裂部位を修飾することが有利であり得る。このような修飾により、エンドヌクレアーゼ活性が誘導オリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ消化部位を消化するのが防止される。エンドヌクレアーゼ消化部位のヌクレオチドまたはホスホジエステル結合が修飾されることが好ましい。このような修飾にはホスホロチオエート化合物が含まれ、これは、混ぜられると、誘導オリゴヌクレオチド上のエンドヌクレアーゼ活性を阻害する。エンドヌクレアーゼ活性をブロックすることのできる誘導オリゴヌクレオチドの他の修飾を用いて所望の酵素阻害を達成し得ることを当業者は理解するだろう。
【００４１】
付加的な制限部位はタイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位であり得る。タイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位の認識配列は二本鎖であってもよく、ヘルパープライマにハイブリダイズすることによって形成される。一実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドは付加的な酵素作用配列としてタイプＩＩＳ制限酵素部位を含み、これは標的相補的領域に対し５′に位置し、その認識配列はヘルパープライマにハイブリダイズすることによって二本鎖にされる（図１Ｃ）。タイプＩＩＳ酵素がその制限認識配列からいくつかの塩基を切り取るので、開裂部位は、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域上にあり得るかまたはその上に位置することが好ましい。標的相補的領域の開裂部位上のヌクレオチドを修飾して、誘導オリゴヌクレオチドの開裂をブロックし得る。機能的にするために、誘導オリゴヌクレオチドのタイプＩＩＳ制限部位は、その認識配列および開裂部位の両方のために二本鎖の形に変換されなければならない。標的と誘導オリゴヌクレオチドとの間におけるハイブリダイゼーションにより、タイプＩＩＳ制限酵素のために二本鎖の開裂部位が作り出される。タイプＩＩＳ制限認識配列はヘルパープライマへのハイブリダイゼーションによって二本鎖になる（図１Ｃ）。
【００４２】
付加的な酵素作用配列は、標的がＲＮＡである場合、ＲＮアーゼＨ活性のための消化部位を含み得る。実際には、ＲＮアーゼＨ消化部位は誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の一部を形成する。というのも、標的ＲＮＡと誘導オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおけるＲＮＡ鎖がＲＮアーゼＨ開裂を被るからである。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖上の標的ＲＮＡ配列はさまざまな非特異的な部位においてＲＮアーゼＨによって消化され得る。一実施形態においては、標的相補的領域の一部（好ましくは３′部分配列）はＲＮＡによって作り出されてもよい。標的ＲＮＡ配列と誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域との間のハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを有する部分とＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを有する部分とが形成される。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド上の標的ＲＮＡはＲＮアーゼＨ開裂に対し耐性があるので、標的ＲＮＡはＲＮアーゼＨによっては完全には消化し尽くされない。この方策では、ＲＮＡ配列の一部が損なわれないままにされるので、消化されたＲＮＡの３′末端をＤＮＡポリメラーゼによって伸長させることができる。
【００４３】
７．ヘルパープライマ
いくつかの実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドは、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域にハイブリダイズされた標的配列鎖の消化を支援する付加的な酵素作用配列を含み得る。付加的な酵素作用配列は制限部位を含み得、当該制限部位はさらにタイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位を含み得る。タイプＩＩＳ制限部位またはニッキング制限部位は二本鎖の制限酵素認識配列を含み得る。二本鎖の制限酵素認識配列は、誘導オリゴヌクレオチドとヘルパープライマとのハイブリダイゼーションによって形成
される。
【００４４】
ヘルパープライマは、誘導オリゴヌクレオチドの一部に対して相補的であるかまたは実質的に相補的である少なくとも１つの部分を含む。ヘルパープライマは、そのフランキング配列の有無にかかわらず付加的な酵素作用配列に対して相補的であるかまたは誘導オリゴヌクレオチドの付加的な酵素作用配列の一部に対して相補的である配列を含み得るが、これにより、ヘルパープライマと誘導オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって付加的な酵素作用配列が二本鎖または部分的に二本鎖にされる。付加的な作用配列がタイプＩＩＳ制限部位または制限ニッキング部位であることが好ましい。ヘルパープライマは、二本鎖の機能的認識配列を形成するタイプＩＩＳ制限部位または制限ニッキング部位の認識配列にハイブリダイズするのが好ましい。タイプＩＩＳ制限部位または制限ニッキング部位の二本鎖の認識配列により、誘導オリゴヌクレオチドと標的配列との間のハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリッド上で酵素が標的配列鎖を消化またはニッキングすることが可能となる。
【００４５】
ヘルパープライマはさらに少なくとも１つの標的相補的部分を含み得、これは、誘導オリゴヌクレオチドに対して相補的な標的領域に隣接するかまたは実質的に隣接する標的領域にハイブリダイズする。
【００４６】
随意には、ヘルパープライマはまた、固体支持部上に捕捉可能な１つ以上の位置においてリガンドを担持し得る。リガンド共役ヘルパープライマは、サンプルに存在する他の分子から標的ＤＮＡを単離する簡便な方法を提供する。リガンド共役ヘルパープライマ−標的配列ハイブリッドがリガンドによって固体支持部上にトラップされると、固体支持部は洗浄され、これにより、サンプルにおける他のすべての成分からハイブリッドが単離される。
【００４７】
酵素
この発明のいくつかの実施形態については、消化された標的配列鎖の伸長は核酸ポリメラーゼで実行される。この明細書中において用いられる語である「伸長」とは、核酸の３′ヒドロキシル末端にヌクレオチドを添加することであり、この添加は鋳型の核酸配列によって指示される。これらの目的のために好適な酵素は、たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ベント（登録商標）（エキソヌクレアーゼ・プラス）ＤＮＡポリメラーゼ、ベント（エキソヌクレアーゼ・マイナス）ＤＮＡポリメラーゼ、ディープベント（登録商標）（エキソヌクレアーゼ・プラス）ＤＮＡポリメラーゼ、ディープベント（エキソヌクレアーゼ・マイナス）ＤＮＡポリメラーゼ、９．ｄｅｇｒｅｅ．Ｎ．ｓｕｂ．ｍＤＮＡポリメラーゼ（New England BioLabs）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｉＤＮＡポリメラーゼ（Epicentre Technologies）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Replitherm.（登録商標）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を含むがこれらに限定されない。これらの薬剤のうちの１つ以上が伸長ステップにおいて用いられ得る。伸長ステップは、少なくとも機能的な第１の制限部位を有する二本鎖の核酸を生成する。
【００４８】
開示される方法により、また、二本鎖の核酸を開裂するための制限酵素（制限エンドヌクレアーゼとも称される）が用いられる。試薬を開裂する他の核酸を用いることもできる。試薬を開裂する核酸としては、配列特異的な態様で核酸分子を開裂するものが好ましい。多くの制限酵素が公知であり、開示された方法とともに用いることができる。制限酵素は一般に認識配列および開裂部位を有する。制限酵素認識配列は長さが異なっているが、二本鎖の配列を必要とする。制限酵素は広く市販されており、これらを用いるための手順は分子生物学の当業者には周知である。制限酵素が誘導オリゴヌクレオチドの第１の制限
部位において開裂を行なう場合、二本鎖は第１の制限酵素と称される。制限酵素が誘導オリゴヌクレオチドの第２の制限部位において開裂を行なう場合、二本鎖は第２の制限酵素と称される。
【００４９】
この発明のいくつかの実施形態においては、識別子配列および定常領域を有する消化された部分が核酸リガーゼによって互いにライゲートされて、少なくとも１つの連結された識別子フラグメントが生成される。いずれのＤＮＡリガーゼが用いられてもよく、好ましい酵素はＴ４ＤＮＡリガーゼである。
【００５０】
一実施形態においては、部分的には、予め定められたＲＮＡ配列におけるハイブリダイズされた標的ＲＮＡの消化は二本鎖のリボヌクレアーゼで実行される。このようなリボヌクレアーゼは、二本鎖のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイズされた鎖からリボ核酸配列をニッキングするかまたは切り出す。この発明を実施するのに有用なリボヌクレアーゼの例にはＲＮアーゼＨがある。ＲＮアーゼＨは、非配列特異的な態様でＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに見出されるＲＮＡを開裂するＲＮＡ特異的な消化酵素である。他のリボヌクレアーゼおよび酵素は、Ｅｘｏ  ＩＩＩおよび逆転写酵素などのＲＮＡ／ＤＮＡ鎖からＲＮＡをニッキングするかまたは切り出すのに好適であり得る。
【００５１】
別の実施形態においては、一本鎖のｃＤＮＡは標的ソースとして用いられる（図４）。ｃＤＮＡは、逆転写酵素およびビオチン化されたポリｄＴプライマを用いて逆転写によって形成される。ＲＮＡからｃＤＮＡを生成するのに好適ないかなる逆転写酵素が用いられてもよい。
【００５２】
標的ポリヌクレオチド
主題の方法によって分析される標的ポリヌクレオチド（核酸とも称される）は、いかなる細胞または細胞の集まりからも単離され得る。核酸のソースは精製された形であろうと精製されない形であろうといずれもテストサンプルとして利用可能である。たとえば、テストサンプルは、食物もしくは農産物またはヒトもしくは動物の臨床検査材料であり得る。典型的には、テストサンプルは、尿、血液、血漿、血清、唾液などの生体液である。代替的には、テストサンプルは当該核酸を担持する疑いのある組織標本であってもよい。テストサンプルにおいて検出されるべき核酸は、細菌、酵母、ウィルス、ならびに植物または動物などの高等生物の細胞または組織を含めてあらゆるソースからのメッセンジャーＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００５３】
細胞のソースからＲＮＡを単離するための当該技術において公知のさまざまな方法があるが、それらのうちいずれを用いてもこの方法を実施することができる。Chomczynski法、たとえば、オリゴｄＴストレプトアビジンビーズとともに用いられる（米国特許第４，８４３，１５５号に記載される）グアニジン・イソチオシアネートによる全細胞ＲＮＡの単離は例示的なｍＲＮＡ単離プロトコルである。ＲＮＡは、所望のとおり、逆転写酵素によって、たとえば、逆転写酵素によるポリ（ｄＴ）プライミングされた第１鎖ｃＤＮＡ合成によってｃＤＮＡに変換され得る。同様に、主題の方法のさまざまな実施形態において用いるのに適したゲノムＤＮＡを単離するための広範な技術がある。
【００５４】
この発明の多くの実施形態においては、複数の誘導オリゴヌクレオチドは、互いに関連して、すなわち誘導オリゴヌクレオチドの組で用いられるよう選択され、これにより、異なるオリゴヌクレオチドが互いに関連して用いられる場合に複数のポリヌクレオチドが同時に分析される。
【００５５】
この明細書中において用いられる「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」という語は、自然に発生するあらゆる核酸またはそのあらゆる合成類似物を指すのに広く用いられ、
当該合成類似物は、主題の方法で用いるのに必要とされる化学的性質、たとえば異なるポリヌクレオチドの配列を決定し、特にハイブリダイズするための能力を有する。したがって、オリゴヌクレオチドの例にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ホスホロチオエートＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホルアミドなどが含まれる。オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当業者には周知であり、このような合成の実施例は、たとえば、米国特許第４，４１９，７３２号、第４，４５８，０６６号、第４，５００，７０７号、第４，６６８，７７７号、第４，９７３，６７９号、第５，２７８，３０２号、第５，１５３，３１９号、第５，７８６，４６１号、第５，７７３，５７１号、第５，５３９，０８２号、第５，４７６，９２５号および第５，６４６，２６０号に見出すことができる。
【００５６】
この明細書中において用いられる「ライゲートする」または「結合する」という語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関して、連続した骨格で単一のより大きな核酸を生成するための２つの別個の核酸の共有結合を指す。好ましい連結方法にはリガーゼ（たとえば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）触媒反応がある。しかしながら、非酵素的ライゲーション法が用いられてもよい。非酵素的なライゲーション反応の例は、米国特許第５，７８０，６１３号および第５，４７６，９３０号に記載され引用によりこの明細書中に援用される非酵素的ライゲーション技術を含む。
【００５７】
上述の材料は、開示された方法を実行するのに有用なキットとして好適な組合せで一緒に包装され得る。
【００５８】
この発明の方法の実施例の概要が以下に述べられる。
【００５９】
一実施形態においては、誘導オリゴヌクレオチドの２つ以上の組が標的ＲＮＡまたはＤＮＡでインキュベートされる（図２）。誘導オリゴと標的ＲＮＡまたはＤＮＡとの間の標的特異的なハイブリダイゼーションは最適なハイブリダイゼーション条件下で行なわれる。随意には、標的特異的なハイブリダイゼーションの後、ビオチン化された誘導オリゴが固体支持部上に固定されたアビジンに結合され、ストリンジェントな条件の洗浄を受ける。標的がＲＮＡである場合、誘導オリゴの標的相補的領域上の二本鎖のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上における標的ＲＮＡ鎖は、ＲＮアーゼＨ活性によって部分的に消化またはニッキングされる。付加的な制限開裂またはニッキング部位が標的相補的領域内に位置する場合、誘導オリゴの標的相補的領域上の二本鎖のＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上における標的ＤＮＡ鎖は制限酵素消化によってニッキングされる。代替的には、誘導オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた標的領域に対する一本鎖の標的配列３′は、好ましくは多くの核酸ポリメラーゼに関連付けられる３′−５′エキソヌクレアーゼ活性であるエキソヌクレアーゼ活性でトリミングされる。消化、ニッキングまたはトリミングされた標的配列鎖の３′末端は、誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによって伸長され、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。結果として得られる誘導オリゴヌクレオチド中間体は、（上述のいずれかのステップにおいて捕捉されない場合）固体支持部上で固定されたアビジンに結合され、ストリンジェントな条件の洗浄を受ける。誘導オリゴの識別子配列および定常領域を有する部分は、第１の制限部位上における第１の制限酵素消化によって固体支持部から解放される。誘導オリゴの解放された消化された部分は、質量分析、電気泳動およびマイクロアレイなどのさまざまな方法によって直接検出され得る。代替的には、異なる組の誘導オリゴからの消化された識別子部分は、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションによってランダムに連結される。連結された部分は、誘導オリゴの定常領域に対して相補的であるかまたはこれと同一であるプライマを用いてＰＣＲまたは他の増幅方法によって増幅される。増幅後、アンプリコンが第１および第２の制限酵素によって消化されることにより個々の識別子配列が解放されるが、これら個々の識別子配列はさまざまな方法、たとえば質量分析で検出され得る。好ましくは、アンプリコンが第２の制限
酵素によって消化されることにより、連結された同定されたフラグメントが解放されるが、当該フラグメントはライゲーションによって連結可能である。コンカテマーがクローニングされ得、その配列が決定され得るので、識別子の同定および量が決定され得る。
【００６０】
別の実施形態（図３）においては、標的相補的領域の一部を形成する第１の制限部位および識別子配列を有する誘導オリゴヌクレオチドを用いて複合ポリヌクレオチドを分析するための方法が提供される。誘導オリゴヌクレオチドの２つの組は標的ＲＮＡまたはＤＮＡとともにインキュベートされる。誘導オリゴヌクレオチドの第１の組は、定常領域、第２の制限部位、識別子配列、第１の制限部位および標的相補的領域として５′末端から３′末端までのオーダで機能的領域を有する誘導オリゴヌクレオチドを含む。誘導オリゴヌクレオチドの第２の組は、標的相補的領域、第１の制限部位、識別子配列、第２の制限部位および定常領域として５′末端から３′末端までのオーダで機能的領域を有する誘導オリゴヌクレオチドを含む。誘導オリゴヌクレオチドの２つの組は同じ第１の制限部位、同じ第２の制限部位を含み得るが、異なる定常領域配列を含み得る。誘導オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡまたはＤＮＡとの間の標的特異的なハイブリダイゼーションは最適なハイブリダイゼーション条件下で行なわれる。随意には、標的特異的なハイブリダイゼーションの後、ビオチン化された誘導オリゴが固体支持部上に固定されたアビジンに結合され、ストリンジェントな条件の洗浄を受ける。二本鎖のＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは第１の制限部位において第１の制限酵素によって消化される。この消化により、識別子配列および定常領域を有する消化されたフラグメントが固体支持部から解放される。解放された消化された識別子フラグメントは、質量分析、電気泳動およびマイクロアレイなどのさまざまな方法によって直接検出され得る。代替的には、異なる組の誘導オリゴからの消化された識別子部分は、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションによってランダムに連結される。連結された部分は、誘導オリゴの定常領域に対して相対的であるかまたはこれと同一であるプライマを用いてＰＣＲまたは他の増幅方法によって増幅される。増幅後、アンプリコンが第１および第２の制限酵素によって消化されることにより個々の識別子配列が解放されるが、当該個々の識別子配列はさまざまな方法、たとえば質量分析で検出可能である。好ましくは、アンプリコンが第２の制限酵素によって消化されることにより、連結された同定されたフラグメントが解放されるが、当該フラグメントはライゲーションによって連結可能である。コンカテマーがクローニングされ得、その配列が決定され得るので、識別子の同定および量が決定され得る。
【００６１】
さらに別の実施形態（図４）においては、ビオチン化されたｃＤＮＡを分析するための方法が提供される。ｃＤＮＡは、逆転写酵素およびビオチン化されたポリｄＴプライマを用いてｍＲＮＡの逆転写によって生成される。ｃＤＮＡは２つのプールに分割され、各々が誘導オリゴヌクレオチドの組にハイブリダイズする。誘導オリゴヌクレオチドの２つの組は、配向の異なるさまざまな定常領域を有する。ｃＤＮＡはアビジンに結合することによって固体支持部上に固定される。次いで、ｃＤＮＡと誘導オリゴヌクレオチドとのハイブリッドが第１の制限エンドヌクレアーゼで消化される。誘導オリゴの識別子配列および定常領域を有する消化された部分が単離され、異なるプールからの単離された部分が混合され、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションによってランダムに連結される。連結された部分は、誘導オリゴの定常領域に対して相補的であるかまたはこれと同一であるプライマを用いてＰＣＲまたは他の増幅方法によって増幅される。増幅後、アンプリコンが第１および第２の制限酵素で消化されることにより個々の識別子配列が解放されるが、当該個々の識別子配列はさまざまな方法、たとえば質量分析で検出可能である。好ましくは、アンプリコンが第２の制限酵素で消化されることにより、連結された同定されたフラグメントが解放されるが、当該フラグメントはライゲーションによって連結可能である。コンカテマーがクローニングされ得、その配列が決定され得るので、識別子の同定および量が決定され得る。
【００６２】
方法の主要なステップが以下に記載される。
【００６３】
Ａ．標的特異的なハイブリダイゼーション
誘導オリゴヌクレオチドまたは誘導オリゴヌクレオチドの組または誘導オリゴヌクレオチドの２つ以上の組は、好適なハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの両方を含むサンプルでインキュベートされ、これにより、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域上における二本鎖のＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成される。
【００６４】
この発明のアッセイを実行するために標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを変性させることが必要である可能性がある。この場合、標的ポリヌクレオチドは二本鎖の形で見出されるか、または剛性の構造を維持する性質を有する。変性は一本鎖の核酸を生成するステップであり、当該技術において周知のいくつかの方法によって達成可能である（Sambrook et al. (1989) in "Molecular Cloning": A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y）。変性のための好ましい一方法は、たとえば摂氏９０〜１００度で約２〜２０分加熱することであり得る。
【００６５】
代替的には、核酸がＤＮＡである場合、塩基が変性剤として用いられてもよい。多くの公知の塩基溶液は変性に有用であり、当該技術において周知である。好ましい一方法においては、たとえば０．１〜２．０  Ｎの濃度のＮａＯＨなどの塩基が摂氏２０〜１００度の温度で用いられるが、この場合、５〜１２０分間インキュベートされる。水酸化ナトリウムなどの塩基での処理は、サンプルの粘度を下げてその後の酵素反応の反応速度を本質的に高めるだけでなく、サンプルにおける既存のＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊することによりサンプルをホモジナイズしかつバックグラウンドを減ずるのにも役立つ。
【００６６】
標的核酸分子は誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の標準的なハイブリダイゼーション条件下で行なわれる。オリゴヌクレオチドの核酸配列へのハイブリダイゼーションについての反応条件は、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の長さ、ＧおよびＣヌクレオチドの数、およびハイブリダイゼーション反応において用いられるバッファの組成物などの要因に応じてオリゴヌクレオチドごとに異なる。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に当業者には理解される。より高い特異性は、一般に、高温を有するインキュベーション条件、言換えれば、よりストリンジェントな条件を用いることによって達成される。有名な実験マニュアル（Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1990)）（参照によりここに援用される）の第１１章には、関連する要素と特異性を備えたハイブリダイゼーションを保証するのに必要なストリンジェンシーのレベルとの記載を含めて、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマのためのハイブリダイゼーション条件が詳細に示される。
【００６７】
ハイブリダイゼーションは典型的には緩衝水溶液中で実行され、そのための温度、塩濃度およびｐＨの条件は、誘導オリゴヌクレオチドが特に標的核酸配列にハイブリダイズするほど十分であるが他のいかなる配列にもハイブリダイズしないようなストリンジェンシーを与えるよう選択される。
【００６８】
誘導オリゴヌクレオチドがその３′末端または５′末端上に捕捉部分たとえばビオチンを含む場合、このような誘導オリゴヌクレオチドの組またはいくつかの組と標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションは単一の管において実行され得る。標的ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであり、ここではｃＤＮＡ合成のためのオリゴｄＴプライマがビオ
チン化されており、ある組または複数の組における誘導オリゴヌクレオチドがそれらの標的相補的領域内に位置する第１の制限部位と識別子配列とを有する場合、ｃＤＮＡは２つのプールに単離され、その各々は異なる組の誘導オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。異なる組における誘導オリゴヌクレオチドは異なるオーダの機能的領域を有する。たとえば、１つの組においては、誘導オリゴヌクレオチドの機能的領域は５′末端から３′末端までのオーダ、すなわち、定常領域、第２の制限部位、識別子配列、第１の制限部位および標的相補的領域３′を有するのに対して、別の組においては、誘導オリゴヌクレオチドの機能的領域は５′末端から３′末端のオーダ、すなわち、標的相補的領域、第１の制限部位、識別子配列、第２の制限部位および定常領域を有する（図４）。
【００６９】
Ｂ．二本鎖の第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体
第１の制限部位および識別子配列が誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の一部である場合、第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップ（Ｂ）は標的特異的なハイブリダイゼーションのステップ（Ａ）の後に終了する（図３および図４）。
【００７０】
標的がＲＮＡである場合、第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップ（Ｂ）は、ヌクレアーゼによってＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの標的ＲＮＡ鎖を消化し、核酸ポリメラーゼによって誘導オリゴヌクレオチド鋳型上において消化された鎖を伸長させるステップを含み得、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる（図２）。ヌクレアーゼはＲＮアーゼＨであり得る。ＲＮアーゼＨは、非配列特異的な態様でＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに見出されるＲＮＡを開裂させるＲＮＡ特異的な消化酵素である。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいてＲＮＡ鎖が完全に消化されるのを防ぐために、誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域の一部分がＲＮＡによって生成され得、こうして、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドがＲＮアーゼＨによる開裂に対して耐性を有するものとなる。
【００７１】
誘導オリゴヌクレオチドが付加的な制限部位を含む場合、第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップ（Ｂ）は、付加的な制限部位の制限消化部位上において制限酵素によって標的配列鎖を消化し、核酸ポリメラーゼによって誘導オリゴヌクレオチド鋳型上において消化された鎖を伸長させるステップを含み得、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。
【００７２】
誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域が標的配列の遊離した３′末端にハイブリダイズする場合、第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップ（Ｂ）は、上記誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによって標的配列の上記遊離した３′末端を伸長させるステップを含み得、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。
【００７３】
いくつかの実施形態においては、第１の制限部位を含む二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチド中間体を形成するステップ（Ｂ）は、一本鎖の標的配列３′を、エキソヌクレアーゼ活性で誘導オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた標的領域へとトリミングし、上記誘導オリゴヌクレオチドを鋳型として用いて核酸ポリメラーゼによってトリミングされた標的配列の３′末端を伸長させるステップを含み得、これにより、第１の制限部位を含む誘導オリゴヌクレオチドの標的相補的領域に対する下流の配列５′が二本鎖になる。これらの実施形態における誘導オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアー
ゼ活性に耐性を有するよう少なくとも最端の３′末端位置において少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは修飾ホスホジエステル結合を含み得る。
【００７４】
この発明のトリミングステップはさまざまな手段によって実行され得る。３′末端を縮小する最も一般的な方法においては、エキソヌクレアーゼの酵素活性が利用される。特に、特定の方向のエキソヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ−誘導オリゴヌクレオチドハイブリッドの３′−５′の縮小を容易にする。このようなエキソヌクレアーゼは当該技術の範囲内で公知であり、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼIIIおよびエキソヌクレアーゼVIIを含むがこれらに限定されない。しかしながら、多くの核酸ポリメラーゼに関連付けられる３′−５′エキソヌクレアーゼ活性が好ましい。このような核酸ポリメラーゼを用いることにより、反応に必要とされる酵素の数が減らされ、標的ＤＮＡの遊離した３′フランキング末端を縮小するよう適切な活性がもたらされる。
【００７５】
ステップ（Ａ）または（Ｂ）の後、当該方法はさらに、末端標識により固体支持部上において標的ポリヌクレオチドまたは誘導オリゴヌクレオチドまたはヘルパープライマを捕捉し、ストリンジェントな条件で洗浄するステップを含み得る。誘導オリゴヌクレオチドの３′末端または５′末端は、捕捉部分たとえばビオチンによって標識付けされ得る（図２および図３）。代替的には、標的ポリヌクレオチドは捕捉部分によって標識付けされ得る。たとえば、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡがビオチン化されたポリｄＴプライマを用いて形成される（図４）。標的特異的なハイブリダイゼーション後または機能的な第１の制限部位の形成後、ビオチン標識オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが固体支持部たとえばビーズ上においてストレプトアビジンに結合される。ストリンジェントな条件の洗浄を実行することにより、いかなる非特異的なハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも除去することができる。
【００７６】
Ｃ．第１の制限部位上での第１の制限酵素による二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチドの消化
二本鎖の機能的な第１の制限部位が形成されると、第１の制限酵素は第１の制限部位において二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチドに作用し、かつこれを開裂させる。
【００７７】
第１の制限部位上において第１の制限酵素で二本鎖または部分的に二本鎖の誘導オリゴヌクレオチドを消化した後、当該方法はさらに、識別子配列および定常領域を含み固体支持部上または上清に付着し得る消化された部分を単離するステップを含み得る。たとえば、ｃＤＮＡ合成のためのオリゴｄＴプライマがビオチン化されるかまたは誘導オリゴヌクレオチドがビオチン化される場合、ストレプトアビジンビーズを用いて、消化された部分を単離する。この明細書中に記載されるように消化された部分を単離するための他の類似の捕捉系（たとえば、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン）は当業者には公知であるだろう。
【００７８】
Ｄ．識別子配列および定常領域を含む消化された部分の分析
一実施形態においては、定常領域および識別子配列を含む誘導オリゴヌクレオチドの解放された消化された部分は、質量分析、電気泳動およびマイクロアレイなどのさまざまな方法によって直接検出され得る。
【００７９】
この発明の好ましい実施形態においては、定常領域および識別子配列を有する単離された消化された部分はＤＮＡライゲーションによって連結され得る。単離された消化された部分は、上述の反応をもつ１つのプールから、または上述の反応をもつさまざまなプールからのものであり得る。連結された識別子フラグメントは１つの組の誘導オリゴヌクレオチドからのものであり得るか、または、好ましくは、連結された識別子フラグメントは２
つの異なる組の誘導オリゴヌクレオチドからのものであり得る。この発明の方法は、ライゲーション後の連結された識別子フラグメントの増幅を必要とはしないが、好ましくはその増幅を含む。誘導オリゴヌクレオチドの定常領域は、増幅プライマのハイブリダイゼーションのための配列を含む。識別子フラグメントのライゲーションが、識別子配列に連結される異なる定常領域配列を有する異なる組の誘導オリゴヌクレオチドの間で実行されることが好ましい。遺伝子発現を分析する場合、各識別子は少なくとも１つの遺伝子を表わす。連結されたフラグメント内に識別子配列が存在するということは、誘導オリゴヌクレオチドに対応する配列を有する遺伝子が発現したことを示す。
【００８０】
連結された識別子フラグメントは、誘導オリゴヌクレオチドの定常領域に対して相補的であるかまたはこれと同一であるプライマを利用することによって増幅され得る。好ましくは、この増幅は、記載のとおり（米国特許第４，６８３，１９５号）標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって実行される。代替的には、連結された識別子フラグメントは、原核適合性ベクターにおけるクローニングまたは当業者に公知の他の増幅方法によって増幅され得る。
【００８１】
この明細書中において用いられる「プライマ」という語は、それが自然に発生するか合成的に生成されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドを指し、当該オリゴヌクレオチドは、核酸鎖に対して相補的なプライマ伸長産物の合成が導かれる、すなわちヌクレオチドとポリメライゼーションのためのＤＮＡポリメラーゼなどの薬剤とが存在する状態で好適な温度およびｐＨで引起される条件下に置かれる場合、合成の初期の時点で作用可能である。プライマは、好ましくは、増幅の最大の効率を得るために一本鎖にされる。好ましくは、プライマはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマは、ポリメライゼーションのための薬剤が存在する状態で伸長産物の合成をプライミングするのに十分に長くなくてはならない。プライマの正確な長さは、温度およびプライマのソースを含む多くの要因に依存するだろう。
【００８２】
次いで、増幅された連結されたフラグメントが、たとえば増幅産物のＤＮＡ配列を直接決定するようなさまざまな検出方法を用いて分析され得る。増幅ステップの前に形成される連結された識別子フラグメントを分析することにより、増幅たとえばＰＣＲによってもたらされる潜在的な歪みをなくす手段が提供される。代替的には、増幅された連結されたフラグメントの分析は、第１および第２の制限部位において第１および第２の制限酵素で当該増幅された連結されたフラグメントを消化して個々の識別子配列を解放し、質量分析、電気泳動またはマイクロアレイなどの検出方法によって識別子配列を検出しかつ定量化するステップを含み得る。
【００８３】
増幅された連結されたフラグメントの分析は、増幅された連結されたフラグメントを第２の制限酵素で消化して連結された識別子配列を解放し、連結された識別子配列をライゲートしてコンカテマーを生成し、コンカテマーにおいて識別子配列のヌクレオチド配列を決定するステップを含み得ることが好ましい。コンカテマーにおいて識別子配列のヌクレオチド配列を決定するステップは、クローニグし、配列を決定し、識別子配列の数をカウントするステップを含むことが好ましい。コンカテマーは、好ましくは３００ｂｐ〜３ｋｂのフラグメントとして単離され得、クローニングベクターにライゲートされてライブラリを作製し得る。特定のクローン中に存在する識別子配列は標準的な方法によって配列が決定され得る。
【００８４】
この発明の連結された識別子フラグメントまたはコンカテマーをクローニングするための標準的な手順には、プラスミドまたはファージなどのベクターへのフラグメントの挿入がある。この明細書中に記載される方法によって生成される連結された識別子フラグメントまたは連結された識別子フラグメントのコンカテマーはさらなる分析、たとえば配列分
析、プラーク／プラスミド・ハイブリダイゼーションのために、当業者に公知の方法によって組換えベクターにクローニグされる。
【００８５】
この発明はまた、この明細書中に記載されるポリヌクレオチド集合物を分析するためのさまざまな方法のうちの１つ以上を実行するためのキットを含む。キットは、一般に、主題の方法を実行するのに必要な２つ以上の試薬を含む。当該試薬は、再現性を高めるように個々のアッセイのための予め測定された量で供給され得る。
【００８６】
一実施形態においては、主題のキットは誘導オリゴヌクレオチドまたはプライマを含む。この発明のキットはまた、主題の方法のさまざまな実施形態に必要な１つ以上の付加的な試薬を含み得る。このような付加的な試薬は、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファ、ヌクレオチドなどを含むがこれらに限定されない。
【００８７】
実施例
マウスの脾臓から得た１μｇのｍＲＮＡが、製造業者のプロトコルにしたがってＢＲＬ
ｃＤＮＡ合成キットを用い、プライマビオチン−５′ポリ（Ｔ）１９−３′を用いて第１鎖ｃＤＮＡに変換された。第１鎖ｃＤＮＡ合成の後、ｍＲＮＡ鎖がＲＮアーゼＨによって消化された。第１鎖ｃＤＮＡは２つのプールに分割され、その各々は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で誘導オリゴヌクレオチドの組とともにインキュベートされた。第１の組は以下の誘導オリゴを含む：
【００８８】
【表１】
2006508677.tif 000003
【００８９】
第２の組は以下の誘導オリゴを含む：
【００９０】
【表２】
2006508677.tif 000004
【００９１】
定常領域は太字のイタリック体でマークされ、第１および第２の制限部位には下線が引かれている。
【００９２】
ハイブリダイゼーション後、ｃＤＮＡは、磁気を帯びたストレプトアビジンビーズ（Dynal）に結合することによって固体支持部上に固定された。ハイブリダイズされていない誘導オリゴヌクレオチドを除去するよう広範囲にわたって洗浄した後、ｃＤＮＡと誘導オリゴヌクレオチドとのハイブリッドが第１の制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ  ＩＩで消化された。このステップおよび他の消化ステップにおける消化反応は、オリゴをｃＤＮＡにアニールし続けるよう摂氏２５〜２７度で実行された。誘導オリゴの識別子配列および定常領域を有する消化された部分が単離されたが、これは摂氏４〜１８度で実行された。第１のプールにおいては、誘導オリゴの識別子配列および定常領域を有する消化された部分がビーズに結合されたのに対して、第２のプールにおいては、誘導オリゴの識別子配列および定常領域を有する消化された部分は上清中に存在した。２つのプールからの単離された部分が混合され、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションによってランダムに連結された。連結された部分はプライマ５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３′および５′−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３′を用いてＰＣＲによって３０サイクルにわたって増幅された。次いで、ＰＣＲ反応がポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され、所望の産物が切り出された。切り出されたアンプリコンが第２の制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉで消化され、連結された識別子フラグメントを含むバンドが切り出され、セルフライゲートされた。ライゲーション後、連結された連結識別子フラグメントがポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離され、３００ｂｐを超える産物が切り出された。これらの産物は、pBluescript（Stratagene）のＥｃｏＲ  Ｉ部位にクローニングされた。コロニーは、クローニング部位の外部におけるＴ７およびＴ３配列をプライマとして用いてＰＣＲによって挿入のためにスクリーニングされた。少なくとも２０個の連結された識別子フラグメントを含むクローンは、ＰＣＲ増幅によって同定され、その配列が決定された。
【００９３】
８２８個の識別子配列を含んだ５０個のクローンの配列が決定された。以下の表は８２８個の識別子配列の分析を示す。１０個の転写産物はすべて、マウスの脾臓における公知の機能をもつ遺伝子から得られ、それらの罹患率は脾臓ＲＮＡの事前の分析と一致した。
【００９４】
【表３】
2006508677.tif 000005
【００９５】
引用による援用
明細書中に引用されるすべての公報、特許出願および特許は、引用により援用されるべき個々の公報または特許出願が各々具体的かつ個々に示されたのと同程度に引用によりこの明細書中に援用されている。
【００９６】
等価物
この明細書中に言及されるすべての公報、特許出願および特許は、この出願に係わる当業者のレベルを示す。わずかな実施形態だけを上述に詳細に記載してきたが、分子生物学の当業者は、好ましい実施形態において多くの変形例がその教示から逸脱することなく可能であることを明瞭に理解するだろう。このような変形例はすべて、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。上述の明細書は、この発明に係わる当業者がこの発明を実施できるよう十分に考慮される。実際に、この発明を実行するための上述のモードのさまざまな変更例は分子生物学または関連する分野の当業者には明らかであるが、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】誘導オリゴヌクレオチドを示す概略図である。誘導オリゴヌクレオチドの機能的領域が示される。
【図２】この発明の方法に従った複合ポリヌクレオチドを分析する方法を示す概略図である。
【図３】標的相補的領域の一部を形成する第１の制限部位および識別子配列を有する誘導オリゴヌクレオチドを用いて複合ポリヌクレオチドを分析する方法を示す概略図である。
【図４】ビオチン化されたｃＤＮＡを分析する概略図である。
【図１】
2006508677.tif 000006
【図２−１】
2006508677.tif 000007
【図２−２】
2006508677.tif 000008
【図２−３】
2006508677.tif 000009
【図３−１】
2006508677.tif 000010
【図３−２】
2006508677.tif 000011
【図４−１】
2006508677.tif 000012
【図４−２】
2006508677.tif 000013
【配列表】
2006508677000001.app
【国際調査報告】
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