(57)【要約】一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトをここに開示し、特許請求の範囲に記載する。同物質の調製方法、ならびにニューロン傷害を治療するためおよび寿命延長のための使用もここに開示し、特許請求の範囲に記載する。
2006518760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素であることを条件とする）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト。
【請求項２】
前記化合物が、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項１に記載のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト。
【請求項３】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＭｅから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは−Ｈおよび−ＣＯＯＭｅから成る群より選択されることを条件とする）のバックミンスターフラーレンの三重アダクト。
【請求項４】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素であることを条件とする）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む、ニューロン傷害の治療用化合物。
【請求項５】
Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素であることを条件とする）の化合物、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルを含むバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトならびに医薬適合性担体を患者に投与することにより（この場合、前記化合物は、前記組成物中に神経毒性傷害を治療するために有効な量で存在する）、神経毒性傷害を前記傷害に罹患している患者において治療する方法。
【請求項７】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１．５ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、経口投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、静脈内投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｃ３−ライトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素であることを条件とする）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルを含む化合物ならびに医薬適合性担体を含む組成物（この場合、前記化合物は、前記組成物中に神経毒性傷害を抑制するために充分な量で存在する）を患者に投与することにより、患者において、ニューロンのＮＭＤＡ受容体のグルタメートによる刺激に起因してニューロンが放出するフリーラジカル酸素種によって引き起こされる神経毒性傷害を抑制する方法。
【請求項１４】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１．５ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、経口投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、静脈内投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｃ３−ライトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素であることを条件とする）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む、哺乳類の生存期間を延ばすための化合物。
【請求項２１】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素であることを条件とする）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む組成物を後生動物に投与することを含む、後生動物または後生動物細胞の寿命を延ばすための方法。
【請求項２３】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルならびに医薬適合性担体（これらは、前記組成物中に治療的有効量で存在する）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、静脈内、筋肉内、皮下または経口投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内、筋肉内または皮下投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、約３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内、筋肉内または皮下投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量で経口投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、約１５ｍｇ／ｋｇの量で経口投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、毎日投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記後生動物が、脊椎動物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記後生動物が、哺乳類である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記後生動物が、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）水とメタノールと溶媒中のＣ３メチルエステルとを混合して、初期溶液を作ること；
ｂ）メタノール中の水酸化ナトリウムを前記初期溶液に添加すること；
ｃ）水を添加して、水性層と非水性層を形成すること；
ｄ）前記水性層を加熱すること；および
ｅ）前記加熱水性層からＨｅｘａ生成物を抽出すること
を含む、Ｈｅｘａを合成するための方法。
【請求項３５】
前記初期溶液を攪拌する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶媒が、トルエンおよびトルエン中の酢酸ｔ−ブチルから成る群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｃ３メチルエステルがもはや溶液状態でなくなるまで、前記初期溶液を水酸化ナトリウムとともに放置する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記水性層を加熱して、加水分解を完了させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記水性層をＮ２下、約６０℃で約２時間加熱して、加水分解を完了させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｈｅｘａが、約９４％より多い量で得られる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記非水性層をデカントして、一切の溶媒を除去する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
一切の残留溶媒を真空下でストリップする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）溶媒中のｅ，ｅ，ｅ−トリスジメチルマロニルフラーレン（Ｃ３エステル）の溶液にナトリウムメトキシドまたは水酸化ナトリウムを添加して、初期溶液を作ること；
ｂ）水を添加して、水性層と非水性層を形成すること；
ｃ）前記水性層と非水性層を分離すること；
ｄ）前記水性層を冷却して、硫酸で酸性化し、酢酸エチルで抽出して、酢酸エチル抽出物を作ること；
ｄ）前記酢酸エチル抽出物から一切の不純物を除去すること；および
ｅ）洗浄した抽出物を蒸発および乾燥させて、Ｈｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２を含む固体生成物を作ること
を含む、ＨｅｘａおよびＰｅｎｔａを合成するための方法。
【請求項４４】
前記初期溶液をＮ２下で混合する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記酢酸エチル抽出物を水で洗浄することにより前記不純物を除去する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
洗浄した抽出物を真空下、室温で蒸発および乾燥させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記初期溶液を約１時間混合する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
ａ）Ｃ６０をマロン酸ジ−ｔ−ブチルと反応させ、続いて、カラムクロマトグラフィーによりジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０とビス−ｔ−ブチルマロニルＣ６０を分離すること；
ｂ）溶媒中のジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０またはビス−ｔ−ブチルマロニルＣ６０にブロモマロン酸エステルを添加し、続いて、第三アミンまたは水酸化ナトリウムを添加して、反応混合物を作ること；
ｃ）溶媒中のシリカゲルのカラムに前記反応混合物を注入し、このカラムを溶媒で溶離すること；
ｄ）このカラムを酢酸エチル／溶媒混合物で溶離して、Ｃ３画分を作ること；
ｅ）Ｃ３画分を蒸発させ、次いで、溶媒を添加すること；
ｆ）溶媒中のＣ３画分に酸を添加し、次いで、加熱すること；
ｇ）追加の酸を添加すること；
ｈ）熱を加えながら、生成物を放置して沈殿させること；
ｉ）この沈殿から溶媒を除去すること；
ｊ）水および酢酸エチルをこの沈殿に添加して、酢酸エチル溶液を作ること；
ｋ）この酢酸エチル溶液を洗浄すること；
ｌ）真空下でこの酢酸エチル溶液を蒸発させて、固体を得ること；
ｍ）前記固体をアセトニトリル、水およびアセトンの混合物に溶解すること；
ｎ）溶解した固体を加熱すること；
ｏ）このアセトニトリル、水およびアセトン混合物からの沈殿を分離させること；
ｐ）アセトンを添加して、このアセトニトリル、水およびアセトン混合物からの沈殿を溶解すること；
ｑ）溶解したこのアセトニトリル、水およびアセトン混合物からの沈殿を加熱すること；
ｒ）一切の揮発性溶媒を真空下で除去すること；
ｓ）酢酸エチルを添加して、均質溶液を生じさせること；
ｔ）前記均質溶液を真空下で蒸発させて、酢酸エチルから固体を得ること；
ｕ）メタノールおよび水を含有する溶媒にこの酢酸エチルからの固体を溶解し、次いで、攪拌すること；
ｖ）メタノール中の水酸化ナトリウムを添加すること；
ｗ）水を添加して、水性層を形成すること；
ｘ）加熱しながらこの水性層を分離し、次いで、この分離した水性層を冷却すること；
ｙ）冷却した水性層に硫酸を添加すること；および
ｚ）生成物を酢酸エチルで抽出すること
を含む、Ｐｅｎｔａ  ＰａｉｒまたはＴｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔを合成するための方法。
【請求項４９】
前記ブロモマロン酸エステルが、ブロモマロン酸ジメチルである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ａ）において第三アミンを利用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第三アミンが、ＤＢＵである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記酸が、トルエン混和性の酸である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記酸が、ｐ−トルエンスルホン酸・一水和物、ＴＦＡおよびメタン硫酸から成る群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記溶媒が、トルエンおよびトルエン中の酢酸ｔ−ブチルから成る群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
約０．５％、約１．０％および約２．０％の酢酸エチル／溶媒混合物で前記カラムを溶離する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記生成物が、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔを含み、前記ブロモマロン酸エステル、ジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０および溶媒が、比率１：１：１である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記生成物が、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒを含み、前記ブロモマロン酸エステル、ジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０および溶媒が、比率１：２：２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記酢酸エチル溶液を洗浄して、前記酸を除去する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記酢酸エチル溶液を水で洗浄する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記水性層を約６０℃から約１１０℃に加熱する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
添加した酸と共に前記Ｃ３画分を約８８℃に加熱する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
前記アセトニトリル、水およびアセトンが、比率１：１：２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
溶解した固体を約７６．５℃で加熱する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６４】
Ｃ３誘導体のサンプルを加熱してＣ３−ライトを作ることを含む、Ｃ３−ライトを生産するための定方向方法。
【請求項６５】
前記Ｃ３誘導体のサンプルが、ニートであり、および約１５０℃の真空オーブンで加熱される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記サンプルを約１．５時間未満加熱する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプルを約１．５時間より長く加熱する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
−３０ｍｍＨｇでの、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｃ３誘導体が、溶液状態である、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｃ６０誘導体、こうした誘導体を調製する方法、および治療方法に関する。さらに詳細には、（ａ）新規なバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトおよび同物質を調製する方法、（ｂ）治療的有効量のバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトでニューロン傷害を治療する組成物および方法、および（ｃ）治療的有効量のバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトで後生動物のまたは後生動物細胞における予想される生存期間（または「寿命」と呼ばれる）の長さまたは期間を延長するための組成物および方法を、ここに開示し、特許請求の範囲に記載する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよびペット動物の総合的健康および寿命を増進させる方法は、非常に活発な研究分野になっている。この分野の現在の見解は、カロリー制限が後生動物の生存期間を延ばすために役立つことを提唱している。
【０００３】
後生動物全体にわたる細胞または発育方法の保存特性を仮定して、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を含む多数のモデル生物が、寿命の研究に利用されてきた。
【０００４】
例えば、Ｃ．エレガンスの遺伝子分析は、寿命決定に関与する幾つかの遺伝子を明らかにした。Ｄａｆ−２（インスリン受容体）およびＣｌｋ−１（「Ｃｌｏｃｋ  １」、発生および行動のタイミングに関する多数の側面に影響を与える遺伝子）における突然変異は成人の寿命を延ばすことが証明された。しかし、Ｃｌｋ−１突然変異体は、寿命初期での死滅率が高い。成長後期では、Ｃｌｋ−１突然変異体は寿命の増加を示し、これは、おそらく寿命初期での長寿個体の選別による。Ｃｌｋ−１寿命表現型は、スーパーオキシド／フリーラジカル代謝に関与する、カタラーゼをコードしている遺伝子の突然変異によって、完全に破壊される。加えて、Ｃ．エレガンス中で補酵素Ｑを排除すると、寿命が延びることが証明された。
【０００５】
Ｅａｔ遺伝子に突然変異を有するＣ．エレガンスも、寿命の増加を示したが、摂食量の低下および代謝の遅速も示した。この突然変異に随伴する寿命の増進は、カロリー制限に帰するものであり、後生動物においても寿命を増加させることが証明された。
【０００６】
ショウジョウバエ属では、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼの過発現が、ショウジョウバエの寿命を３５％増加させた。メトセラ遺伝子（「Ｍｔｈ」）の突然変異も、寿命を２０％増加させることが証明された。Ｍｔｈ、Ｇ蛋白共役受容体、の機能は不明であるが、突然変異体は、パラコート（スーパーオキシドラジカル傷害誘発物質）毒性に対する耐性増加を示し、これがストレス応答遺伝子であることを示唆している。
【０００７】
カロリー制限（ＣＲ）は、今日までに研究されたすべての動物（マウス、ラット、数種のサル、イヌ、ヒト、ならびに非後生動物種、例えばクモ、線虫およびショウジョウバエ）において寿命を２５から３５％増加させることが証明された。（注意：すべての動物は、後生動物である）。しかし、寿命への強い効果を達成するためには、カロリー摂取を３０％から４０％ほども減少させる必要がある。米国国立老化研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ（ＮＩＡ））におけるアカゲザルおよびセアカリスザルでの進行中の研究（Ｒｏｔｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｓ：１５，２０００）では、齧歯動物において報告された変化と同様の生化学的変化が、カロリー制限したサルに見出され、このため脊椎動物種全体にわたる生化学的方法に対するカロリー制限の普遍性を支持している。
【０００８】
最近、２−デオキシグルコースを使用して、経口摂取量を制限することなくカロリー制限をもたらした。２−デオキシグルコースで治療した動物には、カロリー制限した動物において観察される変化と同様の体温低下および血漿中インスリンレベル低下があった（Ｒｏｔｈら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２８：３０５，２００１）。寿命に対する２−デオキシグルコースの効果に関する科学的研究は終わっていないが、サイエンス（２００２年２月８日）における最近の論説は、これらの研究の主任研究員（Ｇｅｏｇｅ  Ｒｏｔｈ、ＮＩＡ）が、「２−デオキシグルコースで治療した彼のサルのうちの一匹が、平均生存期間の２５ヶ月ではなく、３８ヶ月生きた」と述べたことを引用した。しかし、こうした主張は、サンプルサイズが小さいことから、科学的に指示されない。対照集団の中で最も長く生きたサルの年齢に関するコメントもなかった。
【０００９】
マウスの予想される生存期間における２０％までの増加が、遺伝子操作または成長因子拮抗物質投与のいずれかによる成長因子剥奪によって示された。残念なことに、小人症が、成長因子剥奪の副作用である。ヒトにおいて、小人症または晩年期成長ホルモン欠損症は、寿命を減少させるようであり、このことが、成長因子剥奪が予想される生存の期間を増加させる１つの手段として有効であるか否かの論争をさらに混乱させている。
【００１０】
デプレニール（パーキンソン病の治療に使用される選択的モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）Ｂ阻害剤）が多くの種の寿命を増加させることを、幾つかの学術論文が示している（例えば、Ｋｎｏｌｌ，Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．４６：２３７，１９８８参照）。ある研究では、週齢９６週から死ぬまでラットのデプレニールでの長期治療が、「生存を増進した」。対照ラットは、１４７＋／−１週生き、これに対してデプレニールで治療したラットは、１９８＋／−２週生きた。しかし、この学術論文においてはっきりと述べられているこれらのラットの平均予想寿命は１８２週であった。このため、この研究における対照群は、早期死亡率を有したようである。これらの研究所からの他の研究では、高能力のラットを選択し、次いで、これらがデプレニール寿命試験に登録された。このために人為的に結果が歪められた可能性がある。
【００１１】
第二の研究は、３４４匹のＦｉｓｈｅｒラット（Ｋｉｔａｎｉら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５２：２８１，１９９３）を使用して、１８ヶ月齢でデプレニール治療を開始した。対照の平均生存は、２８ヶ月であり、治療動物の平均生存は、３０ヶ月であった。このことは、７％の寿命の増加を示している。しかし、これらの結果は、統計学的に有意ではないと証明された。
【００１２】
対照的に、同じ用量のデプレニールを用いた３４４匹のＦｉｓｈｅｒラットでの別の研究（Ｃａｒｉｌｌｏら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６７：２５３９，２０００）では、デプレニール治療動物において、より高い死亡率および短縮された寿命が観察された。さらに、ＮＩＡからの研究では、１８ヶ月齢で長期デプレニール治療を開始したＣ５７Ｂ６マウスにおいて何の生存利益も示されなかった（Ｉｎｇｒａｍら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  １４：４３１，１９９３）。同様に、ショウジョウバエ属におけるデプレニールの対照試験は、寿命の増加を示さなかった（Ｊｏｒｄｅｎら，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ２４：２２７，１９９９）。
【００１３】
同様に、ヒトでのデプレニール試験は、寿命に関して相反する結果を示した。パーキンソン病患者における「公開、非対照」試験は、９年で生存増加を示した（Ｂｉｒｋｍａｙｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．６４：１１４，１９８５）が、他の研究は、デプレニールを特にＬ−ドパと共に摂取しているＰＤ患者の死亡率増加を示唆している（例えば、Ｂｅｎ−Ｓｈｌｏｍｏら，ＢＭＪ  ３１６：１１９１，１９９８）。
【００１４】
全体的に見て、データは、デプレニールが寿命に対して弱い効果を及ぼすことがあり、または及ぼさないこともあることを示唆している。
【００１５】
マウスの幾つかの遺伝子は、「寿命」遺伝子として特定されており、これは、これらの遺伝子に突然変異を有するマウスが、対照マウスの予想される生存期間に比して長い平均寿命を有するからである。これらの遺伝子は、エイムズ矮性突然変異およびスネル矮性突然変異を含む。しかし、これらの突然変異によって、飼育が難しい小さく虚弱なマウスが生じることとなる。これらの突然変異によりもたらされる寿命は、本質的にカロリー制限に起因すると考えられる。遺伝子アレイ分析、または蠕虫、ハエおよび齧歯動物における寿命表現型に関連した遺伝子についての他の遺伝子スクリーニングを利用する最近の試みによって、多数の候補遺伝子が見つけ出された。しかし、一般に、これらは多くの場合、「ストレス応答」遺伝子である。
【００１６】
イチョウ（Ｇｉｎｇｋｏ）、ニンジン（Ｇｉｎｓｅｎｇ）、ビタミンＣなどの多数の化合物が、生存を改善するために提案されてきたが、これらの化合物に関する利点を報告する管理された、統計学的に有意な生存研究は、知られていない。ビタミンＣおよび多数の薬物は、一定の疾病状態、例えば心血管疾患の発生率を低下させ、このためおそらく総合的には寿命を増進するであろう。
【００１７】
バックミンスターフラーレン、Ｃ６０、は、芳香族系溶媒には可溶性であるが、水には可溶性ではない、１２の五角形および２０の六角形を有する炭素球である。
【００１８】
Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）ｎ（式中、ｎは、１から４の整数である）の使用は、ニューロン傷害の治療に関し、２００１年７月２４日に発行されたＣｈｏｉらの米国特許第６，２６５，４４３号に開示されている。前記特許は、この全文が本明細書に参考として援用されている。
【００１９】
この文献において報告されているＣ３ヘキサカルボン酸（「Ｃ３」または「Ｈｅｘａ」）の調製では、細胞培養スクリーニングでの再生能および変異機能が劣る、一部未確認のプロドラッグの混合物が生成される。
【発明の開示】
【００２０】
上記にかんがみて、下で説明し、特許請求の範囲に記載する組成物および方法を開発した。
【００２１】
第一の実施態様は、後生動物の寿命を増加する結果となる後生動物への組成物の投与を含み、前記組成物は、ペンダント炭素に結合しているｘ対の隣接した炭素原子を有するＣ６０化合物などのＣ６０フラーレンのカルボキシル化誘導体（「カルボキシフラーレン」）を含み、ここで、前記ペンダント炭素原子は、一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒ（Ｒは、−ＣＯＯＨおよびＨから成る群より独立して選択される）の２つの基にさらに結合しており、ならびにｘは、少なくとも１である。
【００２２】
有用な化合物の別の実施態様は、一般式Ｃ６０［（ＣＨＣＯＯＨ）］ｘ［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］ｙ（式中、ｘは、０から３の整数であり、ｙは、１から４の整数であり、ｘ＋ｙは、２から４の整数である）と記述され得る。
【００２３】
追加の実施態様は、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトである。さらに詳細な実施態様は、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライト  バックミンスターフラーレンのマロン酸／酢酸三重アダクト（後でより詳細に説明する）を含む。
【００２４】
追加の実施態様は、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＭｅからなる群から独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは−Ｈまたは−ＣＯＯＭｅである）のバックミンスターフラーレンの三重アダクトである。
【００２５】
さらなる実施態様は、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライト  バックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを調製する方法を含む。
【００２６】
さらに追加の実施態様は、ニューロン傷害を治療および寿命を延長するための（Ｃ３に類似した）新規バックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトの使用を含む。
【００２７】
バックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含むカルボキシフラーレンの使用は、カロリー制限の中での固有の難しさ（一般に、摂食量の厳格な制限ならびにヒトでの使用の実行不可能性が挙げられるが、これらに限定されない）からして、後生動物、特にヒトの寿命を実質的に増加させる方法として、カロリー制限を越える実質的な改善をもたらすと考えられる。新規バックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、Ｃ３トリスマロン酸Ｃ６０化合物に類似した望ましい特性を有するが、動物体内での半減期がより長く、その結果、インビボでの有効期間が延長されることも明らかにする。加えて、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトを含むバックミンスターフラーレンのｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、Ｃ３より親油性が高いため、脳などの高脂質組織内に集中することができる。
【００２８】
明細書に組み込まれており、この一部を形成している添付の図面は、本発明の様々な実施態様を説明するものであり、この記述とともに本発明の原理の説明に役立つ。
【００２９】
添付の図面を参照して示すと（同じ参照番号が同じ要素を示す）：
図１ａは、ＨＰＬＣによるＣ３調製物の分析を開示するものであり、（全体の９９％を上回る）３つの主成分が同定されている。
【００３０】
図１ｂは、３つのピークすべてが、Ｃ６０核へのｅ，ｅ，ｅ（Ｃ３）付加に特有の吸収スペクトルを有することを示すものであり、Ｃ３のこれら成分ピークが、Ｃ６０上のシクロプロパン炭素に結合している先端基が異なるｅ，ｅ，ｅ位置異性体を表すことを示している。
【００３１】
図１ｃ（１）から１ｃ（３）は、ＨＰＬＣによってＨｅｘａカルボン酸Ｃ３（１、８０％）と二つの異性体Ｐｅｎｔａカルボン酸（２および３、各１０％）に分離し、次いで、質量分析によって判定した化合物１〜３を示す。
【００３２】
図１ｄ（１）から１ｄ（３）は、前記Ｈｅｘａ異性体（１）および各Ｐｅｎｔａカルボン酸（２）、（３）に対して行った質量分析を示す。
【００３３】
図２は、２つのビス異性体、２つのトリス異性体、および１つのテトラ異性体を含む様々なカルボキシフラーレンを表す。
【００３４】
図３は、Ｃ３対称性を有するｅ，ｅ，ｅトリスマロン酸位置異性体（「Ｃ３」）を空間が詰まった構造と化学構造の両方として示すものである。
【００３５】
図４は、月齢１２ヶ月から死ぬまで飲み水に入れた食用着色剤（対照）またはＣ３（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで治療したＣ５７Ｂ６マウスの寿命を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。各マウスについての自然死の日付を記録し、これを使用して寿命を計算した。ＮＩＡ齧歯動物コロニーから受け取ったマウスには、誕生月の記録はあったが、具体的な誕生日の記録がなかったため、各マウスの寿命は月ごとに計算した。平均生存率を治療ごとに計算し、ｔ検定を用い、有意性をｐ＜０．０５（実際にはｐ＝０．０３３）に設定して平均寿命を比較した。第一群からのデータは、性別（Ａ、Ｂ）および混成（Ｃ）でグラフにし、各治療グループを同性の対照と比較した。治療および未治療マウスの体重（ｇ）は、（性による）差がなかった。例えば、１９ヶ月の体重は、雌については、対照：２７±１、Ｃ３治療：２９±１であり、雄については、対照：３５±４、Ｃ３治療：３５±６（平均±ＳＤ）であった。
【００３６】
図５は、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト上の官能基の立体配置の詳細図である。
【００３７】
図６は、Ｃ３−ライト（ｅ，ｅ，ｅトリス酢酸Ｃ６０）およびＣ３の構造を表す。Ｃ３−ライトは、３つのシクロプロパン炭素各々に結合しているカルボン酸の対のうちの１つがプロトンで置換されている点で、Ｃ３とは異なる。
【００３８】
図７は、Ｐｅｎｔａ−１化合物の構造を表す。ＨＯＭＯ−ＬＵＭＯエネルギー分布（上部）、および球と棒によるモデル（下部）。Ｐｅｎｔａ−１は、Ｃ３のマロン酸基のうちの１つが、酢酸によって置換されている。Ｐｅｎｔａ−１では、このプロトンが、二つのマロン酸基の方に向いている。
【００３９】
図８は、Ｐｅｎｔａ−２化合物の構造を表す。ＨＯＭＯ−ＬＵＭＯエネルギー分布（上部）、および球と棒によるモデル（下部）。Ｐｅｎｔａ−２は、Ｃ３のマロン酸基のうちの１つが、酢酸によって置換されている。Ｐｅｎｔａ−１では、このプロトンが、二つのマロン酸基とは反対の方に向いている。
【００４０】
図９は、大脳皮質細胞培養物におけるバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトＨｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２およびＣ３−ライトによる、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性に対する神経保護を表す。Ｃ３誘導体（０．０５から１００μＭ）を含有する、または含有しない２００μＭのＮＭＤＡに培養物を１０分間暴露した。１０分後、すべての薬物を洗浄除去し、細胞を２４時間、細胞培養器に戻した。次に、ニューロンを乾燥させることにより乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、神経細胞死を評価した。細胞死および保護は、死滅したニューロンのヨウ化プロピジウム染色を画像化することにより、および位相差顕微鏡を使用してニューロンの形態を評価することにより、確認した。各化合物についての用量応答曲線を示す。値は、ＮＭＤＡのみ（Ｃ６０誘導体を含有しないもの）に暴露した培養物において観察された細胞死％を表す。
【００４１】
図１０は、大脳皮質細胞培養物におけるバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトＨｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２およびＣ３−ライトによる、ＡＭＰＡ受容体媒介興奮毒性に対する神経保護を表す。Ｃ３誘導体（０．５から１００μＭ）を含有する、または含有しない６μＭのＡＭＰＡに培養物を２４時間暴露した。ニューロンを乾燥させることにより乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、２４時間での神経細胞死を評価した。細胞死および保護は、死滅したニューロンのヨウ化プロピジウム染色を画像化することにより、および位相差顕微鏡を使用してニューロンの形態を評価することにより、確認した。各化合物についての用量応答曲線を示す。値は、ＡＭＰＡのみ（Ｃ６０誘導体を含有しないもの）に暴露した培養物において観察された細胞死％を表す。
【００４２】
図１１は、Ｈｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２の血漿中薬物動態（ＡからＢ）およびＨｅｘａＣ３の組織分布（Ｃ）を表す。図１１（Ａ）は、８０％  Ｈｅｘａ、１０％  Ｐｅｎｔａ−１、１０％  Ｐｅｎｔａ−２を含有する１４Ｃ−Ｃ３を注射したマウスからの血漿のＨＰＬＣ分析である。サンプルは、ｔ＝０（注射前のＣ３サンプル）、ｔ＝２時間（Ｃ３の腹腔内注射から２時間後の血漿）、ｔ＝１８時間（注射から１８時間後の血漿）であった。図１１（Ｂ）は、Ｃ３の静脈内、腹腔内、皮下および経口投与後の血漿中レベルを表す。Ｈｅｘａ、Ｐｅｔｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２についての血漿中Ｔ１／２は、すべて８．２時間であった。図１１（Ｃ）は、腹腔内投与後、様々な時点でのＣ３の組織内レベルを表しており、肝臓および腎臓による蓄積を示している。
【００４３】
図１２は、Ｃ３−ライトの血漿中薬物動態および組織分布を表す。図（Ａ）は、１４Ｃ−Ｃ３−ライトの血漿中薬物動態を示すものであり、１５時間のＴ１／２を実証している。図１２（Ｂ）は、腹腔内投与後のＣ３−ライトの組織内分布を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
全体を通して、以下の用語を使用する：
「寿命」または「予想される生存期間」は、ある特定の環境において後生動物が、カルボキシフラーレンでの治療を受けなかった場合、生きることが予想される（生まれてから死ぬまでの）生涯（すなわち、「属に特有の」予想される生存期間）の予想平均長である。
【００４５】
「マロン酸／酢酸Ｃ６０誘導体」は、Ｃ６０の酢酸誘導体、Ｃ６０のマロン酸誘導体、およびＣ６０のマロン酸／酢酸混合型誘導体である。
【００４６】
「Ｈｅｘａ」およびＣ３は、Ｃ３（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）３を表し、この場合、マロン酸基は、すべて、ｅ，ｅ，ｅ位にある（化合物１、下記）。
【００４７】
「Ｐｅｎｔａ」または「Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ」は、（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））を意味し、この場合、Ｒ基は、ｅ，ｅ，ｅ位でシクロプロパン炭素に結合している。２つの立体異性体Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２がある（化合物２、下記）。
【００４８】
「Ｔｅｔｒａ」または「Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔ」は、（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））２を意味し、この場合、酢酸／マロン酸基は、ｅ，ｅ，ｅ位でシクロプロパン炭素に結合している。４つの立体異性体がある（化合物３、下記）。
【００４９】
「Ｃ３−ライト」は、（Ｃ６０（ＣＨＣＯＯＨ））３を意味し、この場合、酢酸基は、ｅ，ｅ，ｅ位でシクロプロパン炭素に結合している。４つの立体異性体がある（化合物４、下記）。
【００５０】
「バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト」または「マロン酸／酢酸Ｃ６０誘導体」は、マロン酸基（＞Ｃ（ＣＯＯＨ）２）および酢酸基（＞ＣＨＣＯＯＨ）から独立して選択される３つのペンダント基がｅ，ｅ，ｅ位にあるバックミンスターフラーレン、すなわち、
【００５１】
【化１】
2006518760.tif 000003
を意味する。
【００５２】
寿命の予想長または期間を延長するための、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含むカルボキシフラーレン
多数の重要な生物学的反応が、意図的に、または望ましくない毒性副生成物として、反応性酸素種を発生させる。スーパーオキシド（Ｏ２−●）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む反応性酸素種は、特定の生理機能に利用される一方で、細胞および組織の生存力および完全性に脅威を与え続けているという問題ももたらしている。これに応じて、細胞および生体は、自らをＯ２−●およびＨ２Ｏ２から防御する様々なメカニズムを発達させた。後生動物では、Ｏ２−●は、二つの金属酵素、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、およびＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ２）によって除去される。また、Ｈ２Ｏ２は、カタラーゼ（ヘム鉄含有金属酵素）またはグルタチオンペルオキシダーゼ（セレノシステインとグルタチオンを併用してＨ２Ｏ２をＯ２とＨ２Ｏに変換する蛋白質の一科）によって除去される。しかし、これらの内因性抗酸化物質防御系は、病的状態の下では圧倒されてしまうことがある。これは、細胞の抗酸化物質防御を補足する小分子としてのさらなる抗酸化物質（酸化を抑制する、または酸素もしくは過酸化物によって促進される反応を抑制する、有用な物質）を潜在的治療薬として開発する試みを導いた。
【００５３】
多数の水溶性Ｃ６０誘導体（スーパーオキシドジスムターゼ模擬体）は、これらの親フラーレン分子の抗酸化特性を保有しており、このため生体系においてこのフリーラジカルスカベンジ能力を利用することができ、その結果、細胞の損傷および死滅を減少させる因子としての機能を果たすことができる。
【００５４】
Ｃ６０誘導体、カルボキシフラーレンの１つの基は、Ｈ２Ｏ２およびＯ２−●の分解酵素としての機能を果たす。ＭｎＴＭＰｙｐを含むマンガン含有プロトポルフィリン化合物は、Ｏ２−●／Ｈ２Ｏ２の分解酵素としての機能を果たすと報告されているが、これらの化合物は、マンガン原子の酸化−還元に依存して分解を触媒する。Ｃ３は、非金属化合物であるが、同様の触媒性状を有することを、今般、本発明者らは発見した。本化合物は、こうした方法で動作する最初の非金属化合物であると考えられる。
【００５５】
多数の重要な生物学的反応が、意図的に、または望ましくない毒性副生成物として、反応性酸素種を発生させるため、潜在的治療薬として細胞の抗酸化物質防御を補足することができる抗酸化性分子は、治療上有用である。これは、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトなどのカルボキシフラーレンを含む。これらの新規カルボキシフラーレン組成物は、抗酸化特性を有する。本研究を通じて、Ｏ２−●およびＨ２Ｏ２とＣ３の反応性を特性付けした。Ｏ２−●に対するＣ３のＫｉを計算して、３ｘ１０６Ｍ−１秒−１になった。Ｏ２−●およびＨ２Ｏ２との相互作用後のＣ３の分析は、Ｃ６０部分においても、マロン酸基においても永続的な化学的または構造的変化が発生しないことを示した。これは、Ｃ３が真の触媒であるという本特許請求事項を支持している。マンガン含有プロトポルフィリンおよびサレン化合物も、Ｏ２−●／Ｈ２Ｏ２の分解のための触媒としての機能を果たすと報告されているが、これらの化合物は、金属原子の酸化−還元に依存して分解を触媒し、これに対して本マロン酸フラーレン誘導体は、反応性酸素種の分解を触媒するために金属原子を必要としない。
【００５６】
従って、上述の発見にかんがみて、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含むカルボキシフラーレンは、反応性酸素種、特に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびスーパーオキシド（Ｏ２−●）などの生理関連の反応性酸素種の排除に有用である。
【００５７】
後生動物または後生動物の細胞の寿命を延ばす結果となる、抗酸化物質の治療的有効量を投与することにより後生動物の予想される生存期間を増加させる方法を、ここで説明し、特許請求の範囲に記載する。詳細には、抗酸化性カルボキシフラーレンを含む組成物を治療薬として使用して、後生動物または後生動物細胞の寿命を増加させる。
【００５８】
従って、ここで有用な化合物は、このＣ６０フラーレンのｘ対の隣接炭素原子が、少なくとも１つのペンダント炭素に結合しており、このペンダント炭素原子が、一般式−ＣＯＯＨおよび−Ｒの２つの基にさらに結合している、カルボキシフラーレン化合物、これらの対応する塩およびエステルであり、この場合、Ｒは、−ＣＯＯＨおよび−Ｈから成る群より独立して選択され、ｘは、少なくとも１である。この一般式の異性体の例を図１から３に示す。一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトも、ここでは有用である。
【００５９】
従って、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを後生動物に投与することによる、哺乳動物およびさらに詳細にはヒトを含む後生動物または後生動物細胞の予想される生存期間を延ばす方法を提供する。
【００６０】
バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含むすべてのカルボキシフラーレン化合物は、活性化合物および前記化合物と相溶性の医薬適合性担体を含有する組成物として全身投与することができる。こうした組成物の調製では、従来どおりの医薬適合性担体を利用することができる。この薬物を経口投与する際には、一般に、一定の間隔を開けて投与する。
【００６１】
治療使用の際、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、薬物が従来投与されているあらゆる経路によって投与することができる。こうした経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、髄腔内経路、腹腔内経路、局所経路および経口経路が挙げられる。
【００６２】
本発明のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む医薬組成物は、経口投与のための固体形、例えば錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒などを含む、あらゆる従来型の形態で製造することができる。これらの医薬組成物は、滅菌することができ、ならびに／または保存薬、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、および／もしくは緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。
【００６３】
静脈内投与のための局所製剤は、水／緩衝溶液を含む滅菌水溶液であろう。静脈内用ビヒクルには、液体、栄養および電解質補充液が挙げられる。保存薬および他の添加剤、例えば抗生物質および抗酸化物質が存在してもよい。
【００６４】
ここで説明し、特許請求の範囲に記載するバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、医薬適合性の経口方式で有用である。これらの医薬組成物は、前記化合物と併せて相溶性の医薬適合性担体材料を含有する。あらゆる従来型担体材料を利用することができる。あらゆる従来型経口剤形、例えば錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒などを使用することができる。担体材料は、経口投与に適する有機または無機不活性担体材料であり得る。適する担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレン−グリコール、ワセリンなどが挙げられる。さらに、本医薬組成物は、他の薬学的に活性な薬剤を含有することができる。さらなる添加剤、例えば着香剤、保存薬、安定剤、乳化剤、緩衝剤などを、薬剤の調剤の一般に是認されているやり方に従って、添加してもよい。
【００６５】
経口剤形は、例えば錠剤、硬質もしくは軟質ゼラチン、メチルセルロースの、または消化管内で容易に溶解する別の適切な材料のカプセルを含む。考えられる経口投薬量は、処方する医師が判定するような個々の患者の必要性に従って変化するだろう。この経口剤形実施態様の一例は、５０から５００ｍｇのバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含有するカプセルまたは錠剤を含む。
【００６６】
本発明のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトでの治療方法は、一般には成人に毎日、好ましくは経口的、筋肉内的、皮下的または静脈内的に投与すことができる。筋肉内的、静脈内的または皮下的に投与する場合、治療薬は、約０．１ｍｇ／ｋｇほどの少ない量から３ｍｇ／ｋｇほどもの多い量で投与されることとなり、この正確な投薬量は、患者の必要性に依存して変化するであろう。経口投与の場合の日用量は、０．１ｍｇ／ｋｇほどの少ない量から１５ｍｇ／ｋｇほどもの多い量になると予想される。一般に、この療法は、無期限に、予防的に行うことができる。
【００６７】
本発明のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、常習的に（例えば毎日）投与してもよいし、または頻繁に（例えば一週間に一度）投与してもよい。Ｃ３  Ｈｅｘａ異性体、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトは、より有効な薬剤であると予想される。静脈内、筋肉内または皮下送達によって投与する場合、Ｃ３異性体の予想日用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３ｍｇ／ｋｇであろう。経口的に投与する場合、この日用量は、０．１ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇの間の範囲であると予想されよう。
【００６８】
上の投薬情報は、マウスにおいて行った薬物動態試験、マウスでの毒性試験およびラットでの毒性試験に基づくものである。マウスにおいて、Ｃ３、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２の血漿中半減期は、約８時間であると計算され、一方、Ｃ３−ライトの血漿中半減期は、約１５時間であった。１回のカルボキシフラーレン注射についての５０％致死量（ＬＤ５０）は、７０ｍｇ／ｋｇより上であった。Ｃ３、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２は、肝臓および腎臓による排泄によってマウスから一掃され、一方、Ｃ３−ライトは、肝臓および脂肪によって一掃された。この薬物動態データに基づく計算を用いると、治療的血漿中レベルは、０．１μｇ／ｍＬと１μｇ／ｍＬの間であるようである。本化合物を静脈内、腹膜内または皮下投与によって与えると、同量のカルボキシフラーレンが吸収されるが、（例えば、飲料水の中に入れて）経口投与すると、この用量の約１５分の１しか吸収されない。しかし、経口送達のためのカルボキシフラーレンの標準的な医薬調合物（例えば、カルボキシフラーレンを時間放出性錠剤に組み込んだもの）は、経口投与されるカルボキシフラーレンのバイオアベイラビリティを有意に増大させると予想される。加えて、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、Ｃ３より親油性が高く、このことが、これらを脳などの脂質豊富な組織に集中させる。
【００６９】
本特許請求の範囲に記載するこれらの方法は、脊椎動物、さらに具体的には、ヒトおよびペット動物を含む哺乳類を含む、すべての後生動物に有用である。
【００７０】
カルボキシフラーレンによって増加される寿命とは、後生動物が、カルボキシフラーレンで治療を受けなかった場合、生きることが予想される（生まれてから死ぬまでの）時間の予想平均長である。実施例２および図４の結果が示すように、この治療を受けたマウスは、２３．５ヶ月の対照マウスの寿命より約２０％長い寿命に相当する２８．７ヶ月の実際寿命を有した。この実施例で使用した対照マウスの寿命は、一般「予想寿命」を表す。
【００７１】
哺乳動物の生存期間を延ばすために有用な化合物の非限定的実施態様は、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む。バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトの非限定例には、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔ、Ｃ３−ライト、これらの立体異性体、これらの混合物などから成る群より選択される化合物が挙げられる。
【００７２】
さらなる非限定的実施態様は、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを少なくとも１つ含む組成物を後生動物に投与することを含む、後生動物または後生動物細胞の寿命を延ばす方法である。バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトの非限定例には、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｒｉ、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔ、Ｃ３−ライト、これらの立体異性体、これらの混合物などから成る群より選択される化合物が挙げられる。前記組成物は、少なくとも１つのバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルならびに医薬適合性担体を含み、これらの成分は、前記組成物中に治療的有効量で存在すると考えられる。バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、静脈内、筋肉内、皮下または経口投与することができる。この方法は、脊椎動物、哺乳類およびヒトを含む（しかし、これらに限定されない）すべての後生動物で使用することができる。
【００７３】
バックミンスターフラーレンのマロン酸／酢酸三重アダクト
Ｃ６０ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、増大した水溶性を含むさらなる望ましい特質を示す。１）Ｃ６０の酢酸誘導体および２）バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む、幾つかの新規Ｃ６０ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを合成し、特性付けした。「Ｐｅｎｔａ−１」（図７）および「Ｐｅｎｔａ−２」（図８）と呼ばれる２つの化合物（２）は、Ｃ６０に付加している２つのマロン酸基と１つの酢酸基を有するＣ６０のｅ，ｅ，ｅ誘導体である。Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２は、酢酸基のシクロプロパン炭素に結合しているプロトンが、マロン酸基の方に向いているか、マロン酸基とは反対の方に向いているかという点で異なる。第二組の４化合物「Ｔｅｔｒａ−Ｑｕａｒｔｅｔ」（３）は、ｅ，ｅ，ｅ位に１つのマロン酸基と２つの酢酸基を有する。第三組の化合物は、Ｃ６０のｅ，ｅ，ｅトリス酢酸誘導体（Ｃ３−ライト）（４）（図６）である。これらのバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトには、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２、４つのＴｅｔｒａおよびＣ３−ライト化合物、これらの医薬適合性の塩およびエステルが挙げられる。
【００７４】
バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトについての一般式は、Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）を含む。
【００７５】
神経保護性のバックミンスターフラーレンｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト
多数の重要な生物学的反応が、意図的に、または望ましくない毒性副生成物として、反応性酸素種を発生させるため、細胞の抗酸化防御を補足することができる抗酸化性分子は、潜在的治療薬として治療上有用である。
【００７６】
ここで説明し、特許請求の範囲に記載するバックミンスターフラーレン誘導体のｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを使用して、フリーラジカル、特にグルタメートの神経毒性（「興奮毒性」）の結果として放出されるときのフリーラジカルによって引き起こされるあらゆる疾病状態の進行を予防、治療または緩和することができる。興奮毒性傷害の治療は、周囲の細胞から放出されたグルタメートによって損傷した中枢神経に対する損傷の程度を低減させること意味する。興奮毒性などの神経毒性事象は、低酸素／虚血などの多数のタイプの急性神経性発作中に発生し得る。例えば、卒中、低血糖、癲癇または外傷中に発生する。神経毒性事象は、神経変性疾患、例えば、ハンチングトン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、およびＡＩＤＳの神経変成作用によって引き起こされる慢性神経障害にも関与し得る。従って、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、神経毒性傷害が発生する疾病の治療法にも有用である。
【００７７】
アラキドン酸（「ＡＡ」）は、グルタメートによるＮＭＤＡ受容体刺激によって引き起こされる神経細胞への過剰なＣａ２＋の流入に起因してニューロンにおいて放出される（このグルタメートは、神経毒性事象によって損傷したニューロン自体によって放出されたものである）。過剰なＣａ２＋の流入は、ホスホリパーゼＡ２（ＡＡを遊離する細胞膜を破壊するカルシウム依存酵素）を活性化する。内因性リポキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼによるＡＡの代謝は、ニューロンの損傷または死をもたらす神経脂質膜の過酸化性分解を開始させる酸素フリーラジカルの生成を導く。従って、フリーラジカル・スカベンジ性のバックミンスターフラーレンｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む組成物の投与による酸素由来フリーラジカルの低減は、グルタメート誘発神経毒性を抑制する代替メカニズムを提供する。
【００７８】
個体の寿命を増加させるための上記方法および組成物と同様に、神経毒性傷害に罹患している患者において神経毒性障害を治療するための組成物および方法は、前記患者に、この個体に対する治療的に有効な量のバックミンスターフラーレンｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む組成物を投与することを含む。さらに詳細には、これらの実施態様は、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを少なくとも１つ投与することを含む。更なる実施態様は、患者へのＣ３−ライト、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２およびＴｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔの投与を含む。これらの新規化合物での治療方法は、静脈内、筋肉内、皮下または経口送達することができる。
【００７９】
第一の実施態様は、ニューロン傷害治療用の化合物を含む。こうした化合物の非限定例には、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが挙げられる。バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトのさらなる非限定例には、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔ、Ｃ３−ライト、これらの立体異性体、これらの混合物などから成る群より選択される化合物が挙げられる。
【００８０】
第二の実施態様は、神経毒性傷害に罹患している患者において、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステル、ならびに医薬適合性の担体を含む組成物（この場合、前記化合物は、前記神経毒性障害を治療するために有効な量で前記組成物中に存在する）を前記患者に投与することによる、神経毒性障害の治療方法を含む。ニューロン傷害の治療に有用なバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトの非限定例には、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔ、Ｃ３−ライト、これらの立体異性体、これらの混合物などから成る群より選択されるバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが挙げられる。
【００８１】
上で示したように、この方法の化合物は、１日に約１．５ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇ、または１日に約１０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。
【００８２】
第三の実施態様は、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルを含む化合物ならびに医薬適合性担体を含む組成物（この場合、前記化合物は、前記組成物中に神経毒性傷害を抑制するために充分な量で存在する）を患者に投与することにより、患者において、ニューロンのＮＭＤＡ受容体のグルタメートによる刺激に起因してニューロンが放出するフリーラジカル酸素種によって引き起こされる神経毒性傷害を抑制する方法である。この方法に有用なバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトの非限定例には、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔ、Ｃ３−ライト、これらの立体異性体、これらの混合物などから成る群より選択される化合物が挙げられる。
【００８３】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトは、１日に約１．５ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇの量で、または１日に約１０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。
【００８４】
バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトの化学合成
文献に報告されているＣ３の調製では、細胞培養スクリーニングでの再生能および変異機能が劣る、一部正体未確認のプロドラッグの混合物が生産される。従って、特定の成分へのより信頼性できる、直接的な方法が必要である。
【００８５】
高濃度のＨｅｘａを合成する方法
下記合成方法を用いて、一般に９０、９４および９７％を超える結果で、大量のＨｅｘａを生じさせることができる。  
１つのこうした方法は、水、メタノールおよび溶媒中のＣ３メチルエステルの初期溶液の調製を含む。水のエステルに対するモル比は、約１００：１から約２０：１である。Ｃ３メチルエステルを溶解するために有用な溶媒には、芳香族系溶媒、例えばトルエン、トルエン中の酢酸ｔ−ブチルなどが挙げられる。次に、この初期溶液を完全に（約１時間）混合する。これは、最初は濁っているように見えることがある。次に、メタノール中、約１Ｍまでの水酸化ナトリウムを添加した後、この溶液を、溶液の着色がなくなるまで（約２時間以下）激しく攪拌する。反応の完了を確認するために、ＴＬＣを使用してもよい。
【００８６】
反応が完了したら、水を添加して非水性層と水性層を形成する。次に、デカント、および分液漏斗または層を分離するために有用な他のあらゆる器具の使用を含む（しかし、これらに限定されない）あらゆる標準法によって、これらの層を分離する。次に、一切の残留溶媒を真空下でストリップする。生成物を含有する水性層を、不活性雰囲気（Ｎ２など）中、約６０℃で約１から約２時間加熱する。
【００８７】
異性体配分は、ＨＰＬＣプロトコル１および２（下記）を使用して判定することができ、一般には９０、９４または９７％より上である。
【００８８】
脱カルボキシル化によるＰｅｎｔａ  ＰａｉｒまたはＴｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔの直接合成
溶解度を最大にするように選択された芳香族系溶媒、例えばトルエンまたはベンゼン中の（Ｂｉｎｇｅｌ、米国特許第５，７３９，３７６号（この全文が本明細書に参考として援用されている）により調製されるような）ジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０に、ブロモマロン酸のエステル（ブロモマロン酸ジメチルを含むが、これに限定されない）を先ず添加し、続いて、（Ｂｉｎｇｅｌの‘３７６、カラム４、４４から４５行目に開示されているとおり調製した）１，８−ジアザビシクロ（５，４，０）ウンデク−７−エン（「ＤＢＵ」）または水素化ナトリウムを含む（しかしこれらに限定されない）第三アミンを添加して、反応混合物を作ることにより、Ｐｅｎｔａ  ＰａｉｒまたはＴｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔを直接合成する。Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒを調製するためには、これらの反応物は、Ｃ６０対マロネート対塩基比１：２：２の濃度である。Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔを調製するためには、比率１：１：１を用いる。適切な時間（約３０分）を経過させて、確実にこの反応混合物を完全混合する。反応の終点は、ＴＬＣによって判定することができる。次に、この反応混合物を、上で選択した溶媒中のシリカゲルのカラムに注入する。ビス異性体を調製するために、このカラムは、すべてのビス異性体が出てくるまで溶媒で溶離しなければならない。次に、溶媒は、酢酸エチル／溶媒混合物に換えるべきであり、酢酸エチルの漸増濃度、例えば０．５％→１％→約２％で添加すべきである。これらの混合物は、次の４つの成分を溶出するであろう。Ｄ３（トランス−３，トランス−３，トランス−３  トリスマロン酸Ｃ６０）；ｅ，トランス−３，トランス−２；ｅ，トランス−４，トランス−３；およびＣ３エステル。溶出されたＣ３エステル画分を、次いで、真空下で蒸発させる。
【００８９】
次にｐ−トルエンスルホン酸・一水和物、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはメタンスルホン酸を含む（しかし、これらに限定されない）上記溶媒に混和可能な酸を、芳香族系溶媒（トルエンを含むが、これに限定されない）中のＣ３エステル画分の溶液に添加して、前記画分を溶解する。この溶液を約８８から８９℃に加熱する。より低い温度を用いてもよいが、反応は、より遅い速度で進行することになる。ＴＦＡを用いる場合、室温で充分であろう。反応が開始したら（約４５分後、またはアッセイにより判定する）、追加の酸を添加すべきである。約１０分後に沈殿が形成し始めるだろう。加熱は、反応が完了するまで（約９０分、またはＴＬＣもしくはＨＰＬＣなどのアッセイによって判定する）継続する。次に、溶媒をこの沈殿から除去する。これらの固体に水および酢酸エチルを添加し、酢酸エチル／水混合物を作る。この酢酸エチル溶液を分離し、次いで、水で洗浄して触媒の酸を除去する。必要な場合には、酢酸エチルを複数回、洗浄しなければならない。次いで、酢酸エチルを真空下で蒸発させて、固体を残す。
【００９０】
次に、固体を約１：１：２のアセトニトリル：水：アセトン混合物に溶解する。材料の可溶化を最大にするために、他の比率（アセトン単独使用を含む）を用いてもよい。この混合物を油浴、加熱マントルなどで約５０℃、約７６．５℃または約１００℃に加熱して、反応を完了させる。反応が完了していることを確認するために、アッセイを行ってもよい。次に、沈殿物を充分に溶解するために一定量のアセトンを添加する。加熱は、約５時間から約７．５時間、継続する。次に、一切の揮発性溶媒を（例えば真空下で）除去し、次いで、酢酸エチルを添加して均質な溶液を作る。次いで、この溶液を真空下で蒸発させて、固体を生じさせる。
【００９１】
次に、この固体を、メタノールおよび水を含有する芳香族系溶媒（トルエンまたはトルエン中５％の酢酸ｔ−ブチル（１ｍｇ／ｍＬ））に溶解する。様々な比率（１００：４．４：０．２など）を用いることができるが、二相の生成を回避するために、限られた量の水を使用すべきである。次いで、この溶液を、約１時間攪拌しながら充分に混合する。混合後、比率２０対１の１Ｍ  水酸化ナトリウム／メタノールを添加する。沈殿完了後（色が完全に消えたら（これは、約１時間から約２時間かかることがある））、水を添加する。次いで、溶媒層を完全に分離し、一切の残留溶媒を確実に除去する。水性層を約６０℃から約１１０℃で約２時間＋／−３０分間加熱する。アッセイを行って、反応の完了を判定する。
【００９２】
冷却後、硫酸などの強酸（酢酸エチルに抽出されないであろうもの）を、上からの塩基を中和させるために充分な量でこの溶液に添加する。最終生成物は、上で説明したように酢酸エチルで抽出する。
【００９３】
（溶液またはニートでの）Ｃ３−ライトの直接合成
Ｃ３−ライトは、Ｈｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２のＣ３誘導体の乾燥または溶解サンプルを加熱することにより、直接合成することができる。溶解サンプルを使用する場合、前記誘導体は、アセトニトリル：水の混合物に溶解すべきである。加熱マントル、油浴などを含む（しかし、これらに限定されない）あらゆる標準的加熱方法を用いることができる。得られた溶液／サンプルを、Ｃ３−ライトを生じさせるために充分な時間（約２４時間未満）、約６０℃から約７０℃から約８１度（アセトニトリルの沸点）で加熱する。次いで、溶媒を真空下で除去して、固体生成物を得る。
【００９４】
Ｃ３誘導体のニートサンプルを用いる場合、このサンプルは、約−３０ｍｍＨｇの真空オーブン内で、約１５０℃で加熱する。
【００９５】
Ｐｅｔｎａ、ＴｅｔｒａまたはＣ３−ライトを生じさせるための溶液中でのＣ３の熱分解
Ｐｅｔｎｔａ，ＴｅｔｒａまたはＣ３−ライトを含む生成物は、Ｈｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２を含有するＣ３誘導体のサンプルを、比率１：１のアセトニトリル：水に溶解することによって生成する。得られた溶液を約６０℃に加熱する。約１．５時間加熱後、Ｐｅｎｔａ濃度は、ほぼこの最大値である。加熱の適用が長いほど（約３．５時間から約５．５時間）、Ｐｅｎｔａ濃度は低下するであろうが、Ｃ３−ライトおよびＴｅｔｒａの濃度は、上昇するであろう。
【００９６】
所望の結果が得られたら、溶媒を真空下で除去して、固体生成物を得る。
【００９７】
ＨｅｘａとＰｅｎｔａの混合物を合成するためのＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨの使用
Ｎ２などの不活性ガス下、芳香族系溶媒中のｅ，ｅ，ｅ−トリスジメチルマロニルフラーレン（「Ｃ３エステル」）の溶液にナトリウムメトキシドまたは水酸化ナトリウムを添加して、初期溶液を作る。芳香族系溶媒は、トルエンおよびトルエン中の酢酸ｔ−ブチルから成る（しかし、これらに限定されない）群より選択することができる。ナトリウムメトキシドとＣ３エステルは、比率１６から２０：１である。赤橙色の沈殿が、直ぐに形成し始める。適切な時間（約１から２時間）の後、水を添加して、水性層と非水性層を形成する。あらゆる色が水性層に移るであろう。次に、層を分離する。水性層を氷浴などで０から５℃に冷却し、次いで、過剰な硫酸で約２のｐＨに酸性化する。次に、この酸性溶液を酢酸エチルで抽出して、すべての色を酢酸エチル抽出物に移す。次に、併せた酢酸エチル抽出物を水で洗浄して、一切の黄色不純物を除去する。次いで、この溶液を、真空下、ほぼ室温で蒸発および乾燥させる。
【００９８】
細胞スクリーニングのための溶液は、０．１Ｎの水酸化ナトリウムにこの固体を溶解することにより調製する。充分な塩基を添加して、すべてのカルボキシルを中和することができる。有効濃度は、トルエン中のこのエステルの前駆体で決定した吸光係数４４００を使用して、ｕｖなどのアッセイにより決定することができる。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて、Ｈｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１およびＰｅｎｔａ−２の百分率を判定することができる。この時、ＨＰＬＣによりこれら三成分を分離することができる。
【００９９】
ここでのデータは、開示するカルボキシフラーレンが、酸素由来のフリーラジカルを分解するユニークな能力を有する新しいクラスの抗酸化物質であること、およびこれらの化合物が、個体の寿命を延ばす、並外れた広い強力な能力を有することを証明している。
【０１００】
上記組成物および方法のさらなる特徴および利点、ならびに様々な実施態様の構造および操作は、添付の図面を参照しながら下で詳細に説明する。
【０１０１】
上の開示は、幾つかの好ましい実施態様を説明するものであり、いかなる点でも範囲を制限するものではない。熟練した技術者は、これらの方法および組成物の実施の際、本明細書には明白に開示されていない他の実施態様に気づくであろう。下に記載する実施例によって上の実施態様をさらに説明する。これらの実施例は、これらの実施態様を説明する意味を持つものであり、いかなる点でも範囲を制限するものとは解釈すべきでない。
【０１０２】
本明細書おいて言及するすべての参照および関連技術は、本技術の現状の一部であり、従って、これら全体が本明細書に援用されている。
【実施例１】
【０１０３】
Ｃ３カルボキシフラーレンの調製
材料
シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  グレード９３８５、２６０−４００、６０Ａ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉａｌｓ（ミズーリ州、セントルイス）から入手した。他の試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス）および他の標準的な供給業者から購入した。
【０１０４】
マロン酸Ｃ６０のＣ３位置異性体（ｅ，ｅ，ｅＣ６０［Ｃ（ＣＯＯＨ）２］３）は、一晩攪拌することによりＣ６（７２０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）をトルエンに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することによって合成した。ブロモマロン酸ジメチル（６３２．４ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデク−７−エン（ＤＢＵ、４９３ｍｇ、３．２４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を２時間攪拌し、シリカゲルのパッドに通して濾過し、真空下で濃縮した。残留物を、トルエン中で開始する、シリカゲルの４５０ｍＬカラム（Ｍｅｒｃｋ、２８０から４００メッシュ）でのクロマトグラフィーに付した。漸増量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）をトルエンに添加することにより、着色成分を分離した。Ｃ３画分は、トルエン中５％のＥｔＯＡｃで溶出した。Ｃ６０マロン酸エステル画分の純度をＴＬＣおよびＨＰＬＣでモニターした。このＣ３エステル（０．２５ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をトルエン（２５０ｍＬ）に溶解し、窒素でスパージした。ナトリウムメトキシド（２．２Ｍのものを２．２２ｍＬ、４．８８ｍｍｏｌ）の添加により、数分以内に沈殿が生じた。この混合物を窒素下、室温で１時間攪拌した。水（２０ｍＬ）を添加し、この混合物を一晩攪拌した。すべての着色生成物が、水性層に行った。層を分離し、水性層を冷却して、２０％硫酸（１．３２ｍＬ）で酸性化した。この溶液をＥｔＯＡｃで３回抽出した結果、すべての色が有機層に行った。この有機層を水で数回洗浄して、黄色の不純物を抽出した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を蒸発させ、残留物２２３．２ｍｇ（理論量の８９％）を凍結乾燥させた。
【実施例２】
【０１０５】
マウスでの寿命試験についての実験法
月齢１２ヶ月の雄および雌（同数）Ｃ５７Ｂ６ＮＩＨマウスを米国国立老化研究所（ＮＩＡ）齧歯動物老化コロニーから購入した。このコロニーから出荷されたマウスを健康、腫瘍または他の能力障害で一切選別せず、このコロニーから入手したすべてのマウスを、続いて、この研究に登録した。マウスは、同性のものを入れるケージに１ケージあたり２匹で無作為に配置し、識別のために耳にパンチし、計量した。次に、マウスを週２回の３セッションで、回転棒での訓練を行い、次いで、ベースラインの運動能力を測定するために３セッションで回転棒での試験を行った。次に、治療薬Ａまたは治療薬Ｂのいずれかを受けるように、これらの治療が何であるのか知らない観察者が、ケージを割り当てた。
【０１０６】
治療薬Ａは、水中のＣ３（２８．７５μＭ）の溶液であり、治療薬Ｂは、赤色のＣ３溶液に合うように添加した市販の食用色素であった。溶液が何かを知らない者が、溶液Ａまたは溶液Ｂを採水瓶に入れ、週に２回、瓶の口のところまで溶液を補充し、週に２回、濾過して一切の微粒子を除去した。週齢１９ヶ月でマウスを再び計量し、別のラウンドの回転棒訓練および試験を受けさせた。マウスを自然死させ、動物収容施設のスタッフがこの施設の一般操作手順の一部として死亡日を記録した。施設のスタッフは、動物には抗生物質溶液を用いたと信じており、この研究の目的を知らなかった。動物が死亡したとき、このゲージ番号、動物の由来、および死亡日を死亡通知に記録し、次いで、これを研究所に送り、そこで情報をデータベースに入力した。
【０１０７】
これらの実験の結果を図４に表示する。これらは、マウスの寿命の顕著な増加（約２０％）を示している。加えて、薬物の経口投薬により寿命が増加したので、これは、後生動物の寿命増加を達成する初めての実用的方法である。Ｃ３治療マウスの寿命増加は、体重減少を随伴しなかった。
【実施例３】
【０１０８】
ラットを用いる毒性研究
二系統のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙおよびＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ）を用いてＣ３のラット毒性試験も行い、前記ラットに３０日間、１０ｍｇ／ｋｇ以下を与えたが、毒性（すなわち、生存率低下、毛づくろいの欠陥、または摂食障害）は一切示さなかった。
【０１０９】
（実施例４から１３）
幾つかの新規バックミンスターフラーレンｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを下記で同定する。Ｃ３  Ｈｅｘａの調製からの主成分は、ほぼ等しい存在比での２つの異性ペンタカルボン酸（Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ）を含み、マイナーな生成物は、４つの異性テトラ酸（Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｄ）および４つの異性トリ−脱カルボキシル化生成物（Ｃ３−ライト）を含む。これらの生成物は、Ｃ３より水溶性が劣り（親油性が高く）、このことが、組織におけるこれら新規化合物の吸収および保持を増大させ得る。
【０１１０】
以下の方法は、９４＋％のヘキサカルボン酸濃度をもたらし、他の新規成分への直接的経路となる。Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトの含有率が高い混合物が、脱カルボキシル化により得られた。Ｐｅｎｔａ  ＰａｉｒおよびＴｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔは、ｔ−ブチル保護を用いる別戦略によっても得られた。
【０１１１】
誘導体を分析するためのＨＰＬＣ法
以下のすべてのＨＰＬＣ法に、四液ポンプ（Ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ  ｐｕｍｐ）およびダイオードアレイ検出器を具備するＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｋａｒｄ／Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ  ＨＰＬＣを使用した。分離は、室温で維持した、Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ４．６Ｘ２５０ｍｍカラム（パッキング  ５μｍ）（カラムＡ）またはＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８  ４．６Ｘ２５０ｍｍカラム（パッキング  ５μｍ）（カラムＢ）を用いて行った。すべての方法に、１ｍＬ／分の溶媒流量を用いた。
【０１１２】
プロトコル１  −  ＨｅｘａおよびＰｅｎｔａ化合物の分析
溶媒は、水中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ａ）、およびアセトニトリル９５％と水５％中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）であった。サンプルは、１５分間かけてＡ：Ｂ；４０：６０からＡ：Ｂ；１０：９０への勾配を用い、さらに１５分、Ａ：Ｂ；１０：９０でカラムから溶離した。化合物は、インラインダイオードアレイ検出器を使用してこれらのＵＶ−ｖｉｓ  吸収によりモニターし、同定した。
【０１１３】
プロトコル２  −  ＨｅｘａおよびＰｅｎｔａ化合物を分離するための別法
ＨＰＬＣ溶媒は、水中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ａ）、および２−プロパノール９５％と水５％中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）であった。化合物は、１０分かけてＡ：Ｂ；９５：５からＡ：Ｂ；５２：４８への勾配、１０分かけてＡ：Ｂ；５１：４９にさらに進め、次いで、５分かけてＡ：Ｂ；２１：７９にさらに進める勾配を用いて、（カラムＡまたはＢ）から溶離した。次に、これをさらに２分間、イソクラティックにしておいた。
【０１１４】
プロトコル３  −  Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔを分離するための方法
Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔの調製物は、水中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ａ）、およびアセトニトリル９５％と水５％中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）を使用して、（カラムＡまたはＢ）から溶離した。この溶媒組成を３５分間、Ａ：Ｂ；３０：７０で維持し、次いで、２分かけてＡ：Ｂ；５：９５への勾配、続いて、さらに１０分間、Ａ：Ｂ；５：９５で維持した。
【０１１５】
プロトコル４  −  Ｃ３−ライトの分析
Ｃ３−ライトの調製物は、（カラムＡまたはＢ）のいずれかでプロトコル１について説明したとおり溶媒を使用して分析した。勾配は、Ａ：Ｂ；９５：５で開始、５分間維持し、続いて、３０分かけてＡ：Ｂ；５：９５に勾配を変化させるように修正した。この溶媒組成をさらに３５分間、Ａ：Ｂ；５：９５のままにしておいた。
【０１１６】
プロトコル５  −  ｔ−ブチル、メチルエステルの分析
溶媒は、アセトニトリル５０％とジクロロメタン５０％（溶媒Ａ）であった。サンプルは、５分かけて１００％（溶媒Ａ）のイソクラティックプログラムで（カラムＡ）から溶離した。
【０１１７】
プロトコル６  −  部分メチルエステルの分析
ＨＰＬＣ溶媒は、アセトニトリル９５％と水５％中０．１％のＴＦＡ（溶媒Ａ）であった。サンプルは、１２０分かけてイソクラティック１００％（溶媒Ａ）溶液で（カラムＡまたはＢ）から溶離した。
【実施例４】
【０１１８】
Ｈｅｘａ異性体とＰｅｎｔａ異性体の混合物を合成すためのＭａＯＭｅ／ＭｅＯＨ法
ナトリウムメトキシド（２．２Ｍのもの１．８４ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）をＮ２下、２２４ｍＬのトルエン中のｅ，ｅ，ｅ−トリスジメチルマロニルフラーレン（Ｃ３エステル）（２２４．１ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。赤橙色の固体の沈殿が、直ぐに始まった。１時間後、水を添加し、すべての色が水性層に行った。層を分離して、水性層を冷却し、硫酸（３．７Ｍのもの１．１０ｍＬ、４．０７ｍｍｏｌ）で酸性化し、酢酸エチル（２ｘ４０ｍＬおよび１ｘ１０ｍＬ）で抽出した。併せた酢酸エチル抽出物を３ｘ４０ｍＬの水で洗浄し、これによって黄色の不純物を除去した。真空下、室温での蒸発および乾燥によって、１９９．２ｍｇ（Ｈｅｘａカルボン酸に基づく理論値の９６．１％）が生じた。細胞スクリーニング用の溶液は、この固体を０．１Ｎの水酸化ナトリウムに溶解して重量で約２５ｍＭの溶液を得ることによって調製した。次に、この有効濃度を、トルエン中のこのエステル前駆体を基に決定した吸光係数４４００を用い、ＵＶによって決定した。ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（ｎｍ）は４８８であり、ｍａｘ／ｍｉｎ比（４８８／４１４ｎｍ）は、２．１９であった。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて、この合成により６５．１％のＨｅｘａ異性体、１４．３％のＰｅｎｔａ−１および２０．６％のＰｅｎｔａ−２が生成されたと判定した。これら三成分をＨＰＬＣにより分離し、質量分析（表３）および１Ｈ  ＮＭＲ（表４）によって同定した。
【実施例５】
【０１１９】
９５％  Ｈｅｘａを生成させるためのトルエン、６％  ＭｅＯＨ、および等量の水とＮａＯＨ
５００ｍＬのトルエン中の水（０．２１６ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）、メタノール（１７．１ｍＬ）およびＣ３メチルエステルの溶液を１時間攪拌した。この溶液は、最初は濁っているように見えた。塩基を直ちに添加すると、Ｈｅｘａの収率は低下する。メタノール中の水酸化ナトリウム（０．９３Ｍのもの１２．９ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を添加した。１．５時間後、ＴＬＣおよび溶液の色によって評価すると、溶液中にエステルは残存しなかった。水１００ｍＬを添加した。トルエン層を分離し、水性層を濃縮してメタノールおよびトルエンを除去し、次いで、Ｎ２下、６０°２時間加熱して、加水分解を完了させた。抽出による処理によって、４９０．８ｍｇ（理論収率の７９．５％）を得た。ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘは、４８７ｎｍであり、ｍａｘ／ｍｉｎ比（４８７／４１１ｎｍ）は、３．１０であった。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて、異性体分配は、９５．２％  Ｈｅｘａ、１．７％  Ｐｅｎｔａ−１、および３．０％  Ｐｅｎｔａ−２であると判定した。
【実施例６】
【０１２０】
トルエン中５％の酢酸ｔ−ブチルを添加した後に混合した、等量のＮａＯＨと水および２％のＭｅＯＨを使用して、８８％  ＨｅｘａおよびＰｅｎｔａ異性体を生じさせる方法
水酸化ナトリウム（３．６７９ｇ、０．０９２ｍｏｌ）を９２ｍＬのメタノールおよび１．６５５ｍＬ（０．０９２ｍｏｌ）の水に溶解して、０．９８２Ｍ溶液を得た。この溶液の一部（１２．３ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、室温で、５％の酢酸ｔ−ブチルを含有する５８５ｍＬのトルエン（１．０ｍｇ／ｍＬと比較して１．１４ｍｇ／ｍＬ）に溶解したＣ３メチルエステル（６７０ｍｇ、０．６０４ｍｍｏｌ）に添加した。沈殿がゆっくりと形成した。１時間後、この反応混合物に水を添加した。相を分離し、水性層を濃縮してメタノールおよびトルエンを除去し、次いで、６０°で２時間加熱した。生成物５７３．３ｍｇ（理論値の９２．５％）を、上に記載した酢酸エチル抽出によって水性層から除去した。ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘは、４８９ｎｍであり、ｍａｘ／ｍｉｎ比（４８９／４１１ｎｍ）は、３．３７であった。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて、異性体分配は、８８．４％  Ｈｅｘａ、５．６％  Ｐｅｎｔａ−１、および６．０％  Ｐｅｎｔａ−２であると判定した。
【実施例７】
【０１２１】
酢酸ｔ−ブチルと５個の水分子を使用して９６％  Ｈｅｘａを生じさせる方法
９５０ｍＬの５％  酢酸ｔ−ブチル中に水（１．５２ｍＬ、８４．４ｍｍｏｌ）、メタノール（４０ｍＬ）およびＣ３メチルエステル（ＵＶにより０．８４５ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、Ｎ２下で３０分間攪拌した。メタノール中の水酸化ナトリウム（１Ｎのもの１６．９ｍＬ、１６．９ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、すべての色が沈殿した。水５０ｍＬを添加し、トルエンをデカントして、残留トルエンを真空下でストリップした。水性層をＮ２下、６０°で２時間加熱した。抽出による処理によって、７９８．１ｍｇ（理論値の９２．１％）を得た。ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘは、４８９ｎｍであり、ｍａｘ／ｍｉｎ比（４８９／４１２ｎｍ）は、２．７１であった。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて、異性体分配は、９６．７％  Ｈｅｘａ、１．５％の各Ｐｅｎｔａであると判定した。
【０１２２】
合計メタノール濃度は、６％である。塩基を直ぐに添加すると、またはエステルの添加前に塩基とすべてのメタノールを併せると、異性体分配は、より低いＨｅｘａ含有率へとシフトする（実施例６参照）。
【実施例８】
【０１２３】
トルエンのみを使用する９７％  Ｈｅｘａの別合成
この手順は、トルエン中５％の酢酸ｔ−ブチルの代わりにトルエンを使用したことを除き、実施例７と同じであった。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて、この生成物は、９７．２％  Ｈｅｘａ、１．３％  Ｐｅｎｔａ−１および１．５％  Ｐｅｎｔａ−２の異性体分配を有すると判定した。ＵＶ−ｖｉｓ  ｍａｘは、４９１ｎｍであり、ｍａｘ／ｍｉｎ比（４９１／４１２ｎｍ）は、２．９７であり、収率は、９０．５％であった。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｋ２ＣＯ３，Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：δ１７３．８４，１７３．７６，１５２．５５，１５１．３３，１４９．４９，１４９．４１，１４９．０５，１４８．９８，１４８．９２，１４８．７８，１４８．６１，１４８．１３，１４７．９６，１４６．５５，１４６．４６，１４５．８９，１４４．８１，１４３．８２，１４３．０７，１４２．９９，８０．６９，７９．８８，６９．５５。
【実施例９】
【０１２４】
Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ直接合成
段階１  −  ブロモマロン酸ジメチル（２８１．３ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、２００ｍＬのトルエン中のジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０（０．５９２ｍｍｏｌ）に添加し、続いて、ＤＢＵ（２０２．４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）を添加した（Ｂｉｎｇｅｌの‘３７６、カラム４、４４から４５行目）。３０分後、この反応混合物を、トルエン中のシリカゲルの４１０ｍＬ（４ｘ３１０ｃｍ）カラムに注入した。このカラムを、すべてのビス異性体（ＵＶ−ｖｉｓにより２５％）が出てくるまで、トルエンで溶離した。溶媒を酢酸エチル／トルエン混合物（０．５％対２％）に換えた。以下の成分の含有量が多いエステル調合物が溶出した（ＨＰＬＣプロトコル５を使用）：Ｄ３（トランス−３，トランス−３，トランス−３  トリスジメチルマロニルＣ６０）；ｅ，トランス−３，トランス−２  トリスジメチルマロニルＣ６０；ｅ，トランス−４，トランス−３  トリスジメチルマロニルＣ６０；およびＣ３。Ｃ３エステル画分（ＨＰＬＣプロトコル１）を真空下で蒸発させた。質量分析および１Ｈ  ＮＭＲデータは、表３および４にある。
【０１２５】
段階２  −  ｐ−トルエンスルホン酸・一水和物（２２．５ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）をトルエン中のＣ３画分の溶液（１５ｍＬ）に添加し、８８から８９°の油浴に入れた。４５分後、追加のｐ−トルエンスルホン酸・一水和物（１５．６ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を添加した。生成物は、１０分以内に沈殿し始めた。９０分間、加熱し続けた。沈殿からトルエンを除去し、これらの固体に水および酢酸エチルを添加した。この酢酸エチルを水で３回洗浄してｐ−トルエンスルホン酸を除去した。酢酸エチルを真空下で蒸発させることにより、１１８．２ｍｇの固体が残った。ＨＰＬＣプロトコル６を用いて化合物を分析した。
【０１２６】
段階３  −  これらの固体を、１０ｍＬの１：１：２  アセトニトリル：水：アセトンに溶解した。サンプル０．２ｍＬを分析用にとった。残りは、７６．５°の油浴で加熱した。３０分後、沈殿が始まって、分離した。アセトン（１０ｍＬ）を添加し、固体を溶解した。加熱を継続し、１．７５時間後、脱カルボキシル化は７３％完了した。合計７．５時間加熱した後、真空下で揮発性溶媒を除去し、酢酸エチルを添加して、均質溶液を得た。分析用に一部（１．９ｍｇ）をとった。残りは、真空下で蒸発させて、０．１３ｇの固体を得た。化合物をＨＰＬＣプロトコル１によって分析した。
【０１２７】
段階４  −  上記固体（０．１２５ｍｍｏｌ）を、メタノール（４．９ｍＬ）および水（０．１２８ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）を含有するトルエン（１２０ｍＬ）に溶解し、１時間攪拌した後、メタノール中の水酸化ナトリウム（１．０Ｍのもの２．３ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を添加した。５分以内に固体が沈殿し始めた。１時間後、水５０ｍＬを添加した。トルエンを分離し、水性層をメタノールおよびトルエンでストリップして、６０°で２時間加熱した。冷却した溶液に硫酸（３．７Ｍのもの０．６２１ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を添加し、上に記載したように酢酸エチルを用いて生成物を抽出した。この乾燥重量は、９１．１ｍｇであった。Ｕ−ｖｉｓ  λｍａｘ（ｎｍ）。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて化合物を分析した。質量分析および１Ｈ  ＮＭＲデータは、表３および４にある。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｋ２ＣＯ３，Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：δ１７５．３９，１７５．３６，１７３．９４，１７３．８８，１７３．８２，１７３．８０，１７３．７４，１７３．６８，１７３．６５，１５３．３９，１５２．４６，１５２．３２，１５２．２３，１５２．１５，１５１．３７，１５１．２２，１４９．６６，１４９．４６，１４９．３８，１４９．２４，１４９．１４，１４９．０４，１４８．９７，１４８．８６，１４８．５５，１４８．４５，１４８．４２，１４８．３６，１４８．３５，１４８．１３，１４７．９６，１４７．７８，１４７．０４，１４６．９６，１４６．８７，１４６．７０，１４６．６６，１４６．６０，１４６．４２，１４６．３８，１４６．０３，１４５．９４，１４５．７０，１４５．５５，１４５．２２，１４４．８６，１４４．７９，１４４．６７，１４４．５８，１４４．００，１４３．９２，１４３．８８，１４３．８１，１４３．７６，１４３．６２，１４３．０７，１４３．０２，１４２．９８，１４２．９３，１４２．１１，１４２．０５，８０．７２，８０．６９，８０．５８，７９．９７，７９．７５，７９．６７，７７．２１，７７．１２，７６．３８，７６．３０，６９．５２，６９．４４，６９．３８，６９．７２。
【実施例１０】
【０１２８】
Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔの合成
段階１  −  ブロモマロン酸ジメチル（３８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬのトルエン中のＣ６０のマロン酸ビス−ジ−ｔ−ブチル（ＵＶにより０．１６７ｍｍｏｌ）のサンプルに添加した。ＤＢＵ（２８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応をＴＬＣ（シリカゲルを用いて、トルエン中２％のＥｔＡｃ）によって追跡した。１時間後に反応が完了した。この反応混合物を、トルエン中のシリカゲルの３３０ｘ２．５ｃｍカラムに注入した。ビス画分（１２％、４成分、ＨＰＬＣプロトコル５）をトルエン中で回収し、次いで、溶離液をトルエン中０．５％の酢酸エチルに換えた。Ｄ３、ｅ，トランス−３，トランス−２、ｅ，トランス−４，トランス−３およびＣ３のエステルを含む画分を得た。Ｃ３画分は、ＨＰＬＣプロトコル１によると純度８８．５％であり、さらに精製せずに使用した。ＵＶ−ｖｉｓ（トルエン中０．５％のＥｔＡｃ）λｍａｘは、４８６ｎｍである、ｍａｘ／ｍｉｎ比は、３．５７であった。
【０１２９】
段階２  −  ｐ−トルエンスルホン酸・水和物（４．９ｍｇ、０．０２５８ｍｍｏｌ）を４．５ｍＬのトルエン中のＣ３エステル（０．０１５４ｍｍｏｌ）に添加し、この混合物を７７°の油浴に入れた。この温度を１５分かけて８５°に上昇させ、さらなるｐ−トルエンスルホン酸（５．９ｍｇ、０．０３１０ｍｍｏｌ）を添加した。５分以内に沈殿が開始した。３０分間加熱し続けた。この混合物を冷却し、トルエンをデカントした。水および酢酸エチルの添加によって、すべての色が酢酸エチル層にある二相混合物が生成した。この酢酸エチルを水で３回洗浄し、蒸発させて、１８．３ｍｇの固体を得た。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて化合物も分析した。
【０１３０】
段階３  −  この固体を５ｍＬの４：１  アセトニトリル：水に溶解し、０．５４６ｍＬを分析用にとった。残りを７４°の油浴で加熱した。６５分後、固体が存在した。３ｍＬのアセトニトリルの添加により、均質溶液を得、５．５時間加熱し続けた。この溶液の一部０．８ｍＬを分析用にとり、残り７．０ｍＬは濃縮して、アセトンおよびアセトニトリルを除去した。ＨＰＬＣ（９５：５：０．１，ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＴＦＡ，ｍｉｎ，％）１９．３４１（２６．２），３８．１８０（２５．１，４３．７９８（２２．２）および８０．８７４（２１．６）。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて化合物も分析した。
【０１３１】
段階４  −  水酸化ナトリウム（０．１Ｎのもの０．５９ｍＬ、０．０５９ｍｍｏｌ）を、約３ｍＬの水中の上で得られた物質の懸濁液に添加した。固体が溶解した。水酸化ナトリウム（１Ｎのもの０．６ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を６２℃で１時間加熱した。ＨＰＬＣは、加水分解の完了を示した。この溶液を冷却し、硫酸（３．７Ｍのもの０．１６２ｍＬ）で酸性化した。酢酸エチルでの抽出により、１１．４ｍｇの固体が生じた。ＨＰＬＣ（９５：５：０．１，ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＴＦＡ，ｍｉｎ，％）６．０７６（２６．４），１０．７８４（２４．５），１３．８８３（２６．０），２３．５８９（２３．１）。ＨＰＬＣプロトコル１を用いて化合物を分析した。質量分析および１Ｈ  ＮＭＲデータは、表３および４にある。
【実施例１１】
【０１３２】
溶液中でのＣ３−ライトの直接合成
Ｃ３のサンプル（３２９．７ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、７１  ％Ｈｅｘａ、１５％  Ｐｅｎｔａ  １および１４％  Ｐｅｎｔａ  ２）を６ｍＬの１：１  アセトニトリル：水に溶解し、７０℃の油浴に入れた。この反応の進行をＨＰＬＣ（プロトコル２）によってモニターした。２．２５時間後、反応は、ほぼ完了した。５時間後、固体が沈殿し始めた。２４時間加熱し続けた。真空下で溶媒を除去して、１９９．３ｍｇの生成物を得、これは、ＨＰＬＣプロトコル１によると以下の組成を有した。Ｃ３−ライト  ピーク１（１４．０％）、ピーク２（３９．４％）、ピーク３（３７．０％）、ピーク４（８．７％）。ＬＣ−ＭＳ  ｐｏｓ  ｍ／ｅは、各々８９５であり、ｎｅｇ  ｍ／ｅは、各々１００７であった（Ｍ＋ＴＦＡ−Ｈ）。すべてが、Ｃ３（Ｃ６０へのｅ，ｅ，ｅ付加）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを有した。１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析データは、表３および４にある。この固体は、水酸化ナトリウムに可溶性であり、アセトンおよび酢酸エチルには、中等度に可溶性であり、水、メタノールおよびアセトニトリルへの溶解性は乏しかった。
【実施例１２】
【０１３３】
Ｐｅｎｔａ、ＴｅｔｒａまたはＣ３−ライトを生じさせるための溶液中でのＣ３の熱分解
９７．４％  Ｈｅｘａ、１．２％  Ｐｅｎｔａ  １および１．３％  Ｐｅｎｔａ  ２を含有するＣ３のサンプル（７４．８ｍｇ）を１０ｍＬの１：１  アセトニトリル：水に溶解し、６０℃で加熱した。この組成を、プロトコル２および４を使用してＨＰＬＣによりモニターした（表１参照）。
【０１３４】
【表１】
2006518760.tif 000004
【実施例１３】
【０１３５】
Ｃ３からＣ３−ライトへのニート脱カルボキシル化
９３．８％  Ｈｅｘａ、３．５％  Ｐｅｎｔａ  １および２．７％  Ｐｅｎｔａ  ２を含有するＣ３のサンプルを乾燥粉末として、１５０℃、３０ｍｍＨｇの真空オーブンに入れた。この組成をＨＰＬＣプロトコル２によってモニターした。表２は、Ｃ３−ライトを含むＣ３の脱カルボキシル化生成物の時間依存性生成を示すものである（表２参照）。
【０１３６】
【表２】
2006518760.tif 000005
【０１３７】
【表３】
2006518760.tif 000006
【０１３８】
【表４】
2006518760.tif 000007
【０１３９】
【表５】
2006518760.tif 000008
【０１４０】
【表６】
2006518760.tif 000009
【０１４１】
【表７】
2006518760.tif 000010
【０１４２】
上記にかんがみて、上の実施態様および実施例の幾つかの利点が達成され、成し遂げられたことがわかるだろう。他の当業者が様々な実施態様において本発明を最良に利用することができ、考えられる特定の使用に適するよう様々な変更を施すことができるように、実施態様を選択し、記載して、本発明の原理およびこの実際の適用を最良に説明した。
【０１４３】
本明細書に記載し、説明する構造および方法に、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を施すことができるので、上記明細書に含まれているまたは添付の図面に示されているすべての事柄は、限定的なものではなく、説明的なものとして解釈されよう。例えば、上に記載したような方法は、ヒトを含む（しかし、これに限定されない）他の後生動物に容易に同じ結果で適用することができた。従って、本発明の広さおよび範囲は、上に記載した具体例としての実施態様のいずれによっても、当然、制限されず、本明細書に続く添付の請求項およびこれらに相当するもののみに基づいて定義されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１Ａ】３つの主カルボキシフラーレン成分を同定するＨＰＬＣによるＣ３調製物の分析を開示する図である。
【図１Ｂ】３つの主カルボキシフラーレン成分を同定するＨＰＬＣによるＣ３調製物の分析を開示する図である。
【図１Ｃ】３つの主カルボキシフラーレン成分を同定するＨＰＬＣによるＣ３調製物の分析を開示する図である。
【図１Ｄ】３つの主カルボキシフラーレン成分を同定するＨＰＬＣによるＣ３調製物の分析を開示する図である。
【図２】様々な有用なカルボキシフラーレンを示す図である。
【図３】Ｃ３トリスマロン酸位置異性体を示す図である。
【図４】対照溶液で治療したＣ５７Ｂ６マウスに対する経口Ｃ３で治療したＣ５７Ｂ６マウスの生存を表す図である。
【図５】バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト上の官能基の立体配置を表す図である。
【図６】Ｃ３−ライト（ｅ，ｅ，ｅトリス酢酸Ｃ６０）およびＣ３（ｅ，ｅ，ｅトリスマロン酸Ｃ６０）の構造を表す図である。
【図７】Ｐｅｎｔａ−１の構造を表す図である。
【図８】Ｐｅｎｔａ−２の構造を表す図である。
【図９】ＮＭＤＡ毒性に対するＨｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２およびＣ３−ライトによる神経保護を表す図である。
【図１０】ＡＭＰＡ毒性に対するＨｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２およびＣ３−ライトによる神経保護を表す図である。
【図１１】Ｈｅｘａ、Ｐｅｎｔａ−１、Ｐｅｎｔａ−２およびＣ３−ライトの血漿中動態、ならびにＣ３の組織分布の詳細図である。
【図１２】Ｃ３−ライトの血漿中薬物動態および組織分布の詳細図である。
【図１Ａ】
2006518760.tif 000011
【図１Ｂ】
2006518760.tif 000012
【図１Ｃ】
2006518760.tif 000013
【図１Ｄ】
2006518760.tif 000014
【図２】
2006518760.tif 000015
【図３】
2006518760.tif 000016
【図４】
2006518760.tif 000017
【図５】
2006518760.tif 000018
【図６】
2006518760.tif 000019
【図７】
2006518760.tif 000020
【図８】
2006518760.tif 000021
【図９】
2006518760.tif 000022
【図１０】
2006518760.tif 000023
【図１１】
2006518760.tif 000024
【図１２】
2006518760.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月20日(2004.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸三重アダクト、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅ酢酸三重アダクト、またはバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸三重アダクトとバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅ酢酸三重アダクトの混合物である、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、全Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは水素であり、全Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは、ＣＯＯＨまたはこのエステルである）のバックミンスターフラーレンの誘導体。
【請求項２】
前記化合物が、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））２、およびＣ６０（ＣＨＣＯＯＨ）３から成る群より選択される、請求項１に記載のバックミンスターフラーレンの誘導体。
【請求項３】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＭｅからなる群から独立して選択されるが、但し、全Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは−Ｈおよび−ＣＯＯＭｅから成る群より選択される）の化合物を含むバックミンスターフラーレンの三重アダクト。
【請求項４】
バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸三重アダクト、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅ酢酸三重アダクト、またはバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸三重アダクトとバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅ酢酸三重アダクトの混合物である、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、全Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは水素であり、全Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは、ＣＯＯＨまたはこのエステルである）のバックミンスターフラーレンの誘導体を含む組成物のニューロン傷害を治療するための使用。
【請求項５】
前記誘導体が、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））２、およびＣ６０（ＣＨＣＯＯＨ）３から成る群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
患者における神経毒性障害を治療する方法であって、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルを含む化合物ならびに医薬適合性担体を患者に投与する（この場合、前記化合物は、組成物中に神経毒性傷害を治療するために有効な量で存在する）ことによる、方法。
【請求項７】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１．５ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、経口投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、静脈内投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｃ３−ライトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
患者における神経毒性障害を抑制する方法であって、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨから独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルを含む化合物ならびに医薬適合性担体を含む組成物（この場合、前記化合物は、前記組成物中に神経毒性傷害を抑制するために充分な量で存在する）を患者に投与することにより、ここで前記障害は、ニューロンのＮＭＤＡ受容体のグルタメートによる刺激に起因してニューロンが放出するフリーラジカル酸素種によって引き起こされるものである、方法。
【請求項１４】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１．５ｍｇ／ｋｇから約１５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、１日に約１０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、経口投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、静脈内投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｃ３−ライトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸三重アダクト、バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅ酢酸三重アダクト、またはバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸三重アダクトとバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅ酢酸三重アダクトの混合物である、一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、全Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは水素であり、全Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは、ＣＯＯＨまたはこのエステルである）のバックミンスターフラーレンの誘導体を含む組成物の、哺乳類の生存期間を延ばすための使用。
【請求項２１】
前記バックミンスターフラーレン誘導体が、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））２、およびＣ６０（ＣＨＣＯＯＨ）３から成る群より選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
一般式Ｃ６０Ｒ３（式中、各Ｒは、式−ＣＲ１Ｒ２の基から独立して選択され、この場合の各Ｒ１およびＲ２は、−Ｈおよび−ＣＯＯＨからなる群から独立して選択されるが、但し、Ｒ１（複数）およびＲ２（複数）のうちの少なくとも１つは水素である）のバックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトを含む組成物を後生動物に投与することを含む、後生動物または後生動物細胞の寿命を延ばすための方法。
【請求項２３】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒ、Ｔｅｔｒａ  ＱｕａｒｔｅｔおよびＣ３−ライトから成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクト、この医薬適合性の塩および医薬適合性のエステルならびに医薬適合性担体（これらは、前記組成物中に治療的有効量で存在する）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、静脈内、筋肉内、皮下または経口投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量で静脈内、筋肉内または皮下投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、約３ｍｇ／ｋｇの量で静脈内、筋肉内または皮下投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量で経口投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、約１５ｍｇ／ｋｇの量で経口投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記バックミンスターフラーレン・ｅ，ｅ，ｅマロン酸／酢酸三重アダクトが、毎日投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記後生動物が、脊椎動物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記後生動物が、哺乳類である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記後生動物が、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）水とメタノールと溶媒中のＣ３メチルエステルとを混合して、初期溶液を作ること；
ｂ）メタノール中の水酸化ナトリウムを前記初期溶液に添加すること；
ｃ）水を添加して、水性層と非水性層を形成すること；
ｄ）前記水性層を加熱すること；および
ｅ）前記加熱水性層からＣ３（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）３）生成物を抽出すること
を含む、Ｃ３（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）３）を合成するための方法。
【請求項３５】
前記初期溶液を攪拌する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶媒が、トルエンおよびトルエン中の酢酸ｔ−ブチルから成る群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｃ３メチルエステルが溶液中になくなるまで、水酸化ナトリウムを含む初期溶液を放置する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記水性層を加熱して、加水分解を完了させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記水性層をＮ２下、約６０℃で約２時間加熱して、加水分解を完了させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｈｅｘａが、約９４％より多い量で得られる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記非水性層をデカントして、一切の溶媒を除去する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
一切の残留溶媒を真空下でストリップする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）溶媒中のｅ，ｅ，ｅ−トリスジメチルマロニルフラーレン（Ｃ３エステル）の溶液にナトリウムメトキシドまたは水酸化ナトリウムを添加して、初期溶液を作ること；
ｂ）水を添加して、水性層と非水性層を形成すること；
ｃ）前記水性層と非水性層を分離すること；
ｄ）前記水性層を冷却して、硫酸で酸性化し、酢酸エチルで抽出して、酢酸エチル抽出物を作ること；
ｄ）前記酢酸エチル抽出物から一切の不純物を除去すること；および
ｅ）洗浄した抽出物を蒸発および乾燥させて、Ｃ３（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）３）、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））またはこの立体異性体を含む固体生成物を作ること
を含む、Ｃ３（Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）３）およびＣ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））またはこの立体異性体を合成するための方法。
【請求項４４】
前記初期溶液をＮ２下で混合する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記酢酸エチル抽出物を水で洗浄することにより前記不純物を除去する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
洗浄した抽出物を真空下、室温で蒸発および乾燥させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記初期溶液を約１時間混合する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
ａ）Ｃ６０をマロン酸ジ−ｔ−ブチルと反応させ、続いて、カラムクロマトグラフィーによりジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０とビス−ｔ−ブチルマロニルＣ６０を分離すること；
ｂ）溶媒中のジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０またはビス−ｔ−ブチルマロニルＣ６０にブロモマロン酸エステルを添加し、続いて、第三級アミンまたは水酸化ナトリウムを添加して、反応混合物を作ること；
ｃ）溶媒中のシリカゲルのカラムに前記反応混合物を注入し、このカラムを溶媒で溶離すること；
ｄ）このカラムを酢酸エチル／溶媒混合物で溶離して、Ｃ３画分を作ること；
ｅ）Ｃ３画分を蒸発させ、次いで、溶媒を添加すること；
ｆ）溶媒中のＣ３画分に酸を添加し、次いで、加熱すること；
ｇ）追加の酸を添加すること；
ｈ）熱を加えながら、生成物を沈殿させること；
ｉ）この沈殿物から溶媒を除去すること；
ｊ）水および酢酸エチルをこの沈殿物に添加して、酢酸エチル溶液を作ること；
ｋ）この酢酸エチル溶液を洗浄すること；
ｌ）真空下でこの酢酸エチル溶液を蒸発させて、固体を得ること；
ｍ）前記固体をアセトニトリル、水およびアセトンの混合物に溶解すること；
ｎ）溶解した固体を加熱すること；
ｏ）このアセトニトリル、水およびアセトン混合物から沈殿物を分離させること；
ｐ）アセトンを添加して、このアセトニトリル、水およびアセトン混合物からの沈殿物を溶解すること；
ｑ）溶解したこのアセトニトリル、水およびアセトン混合物からの沈殿物を加熱すること；
ｒ）一切の揮発性溶媒を真空下で除去すること；
ｓ）酢酸エチルを添加して、均質溶液を生じさせること；
ｔ）前記均質溶液を真空下で蒸発させて、酢酸エチルから固体を得ること；
ｕ）メタノールおよび水を含有する溶媒にこの酢酸エチルからの固体を溶解し、次いで、攪拌すること；
ｖ）メタノール中の水酸化ナトリウムを添加すること；
ｗ）水を添加して、水性層を形成すること；
ｘ）加熱しながらこの水性層を分離し、次いで、この分離した水性層を冷却すること；
ｙ）冷却した水性層に硫酸を添加すること；および
ｚ）生成物を酢酸エチルで抽出すること
を含む、Ｃ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））２又はＣ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）２（Ｃ（ＣＨＣＯＯＨ））またはこの立体異性体を合成するための方法。
【請求項４９】
前記ブロモマロン酸エステルが、ブロモマロン酸ジメチルである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ａ）において第三級アミンを利用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第三級アミンが、ＤＢＵである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記酸が、トルエン混和性の酸である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記酸が、ｐ−トルエンスルホン酸・一水和物、ＴＦＡおよびメタン硫酸から成る群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記溶媒が、トルエンおよびトルエン中の酢酸ｔ−ブチルから成る群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
約０．５％、約１．０％および約２．０％の酢酸エチル／溶媒混合物で前記カラムを溶離する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記生成物が、Ｔｅｔｒａ  Ｑｕａｒｔｅｔを含み、前記ブロモマロン酸エステル、ジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０および溶媒が、比率１：１：１である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記生成物が、Ｐｅｎｔａ  Ｐａｉｒを含み、前記ブロモマロン酸エステル、ジ−ｔ−ブチルマロニルＣ６０および溶媒が、比率１：２：２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記酢酸エチル溶液を洗浄して、前記酸を除去する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記酢酸エチル溶液を水で洗浄する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記水性層を約６０℃から約１１０℃に加熱する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
添加した酸と共に前記Ｃ３画分を約８８℃に加熱する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
前記アセトニトリル、水およびアセトンが、比率１：１：２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
溶解した固体を約７６．５℃で加熱する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６４】
Ｃ３誘導体のサンプルを加熱してＣ３−ライトを作ることを含む、Ｃ３−ライトを生産するための示された方法。
【請求項６５】
前記Ｃ３誘導体のサンプルが、ニートであり、および約１５０℃の真空オーブンで加熱される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記サンプルを約１．５時間未満加熱する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプルを約１．５時間より長く加熱する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
−３０ｍｍＨｇで行う、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｃ３誘導体が、溶液中にある、請求項６４に記載の方法。
【国際調査報告】
2006518760.tif 000026
2006518760.tif 000027
2006518760.tif 000028
2006518760.tif 000029
2006518760.tif 000030