(57)【要約】カリクレイン（１２）タンパク質、カリクレイン（１４）タンパク質およびカリクレイン（１５）タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸は、内分泌腺ガン（特に卵巣ガン）の検出において特に適用される。カリクレイン（１２）タンパク質、カリクレイン（１４）タンパク質およびカリクレイン（１５）タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸は、内分泌腺ガンの診断およびモニターリング（すなわち、内分泌腺ガンの進行または治療的処置をモニターすること）のための新しいバイオマーカーを構成する。
2006500036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における内分泌腺ガンに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸を検出するための方法であって、
（ａ）サンプルを患者から得ること、
（ｂ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸をサンプルにおいて検出または同定すること、および
（ｃ）検出された量を、標準について検出された量と比較すること
を含む方法。
【請求項２】
患者が内分泌腺ガンに冒されているか、または内分泌腺ガンに対する素因を有するかを評価する方法であって、
（ａ）患者から得られたサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル、および
（ｂ）コントロール被験者から得られた同じタイプのサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル
を比較することを含み、
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のコントロール被験者由来の対応するレベルに対して、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸の著しく変化したレベルにより、患者が内分泌腺ガンに冒されているということが示される、方法。
【請求項３】
カリクレイン１４のレベルが、コントロールの正常な被験者に由来するレベルと比較され、正常な被験者に対するレベルに対してカリクレイン１４の上昇したレベルにより、患者が乳ガンまたは卵巣ガンに冒されているということが示される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者における内分泌腺ガンの進行をモニターするための方法であって、
（ａ）患者から得られたサンプルにおけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸を第１の時点において検出すること、
（ｂ）その後の時点において工程（ａ）を繰り返すこと、および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）で検出されたレベルを比較し、それから、内分泌腺ガンの進行をモニターすること
を含む方法。
【請求項５】
内分泌腺ガンの攻撃性または無痛性を評価するための方法であって、
（ａ）患者サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル、および
（ｂ）コントロールサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル
を比較することを含み、
患者サンプルにおけるレベルと、コントロールサンプルにおけるレベルとの間における著しい差により、ガンが攻撃性または無痛性であるということが示される、方法。
【請求項６】
内分泌腺ガンが転移しているか、または、将来に転移する可能性があるかを決定するための方法であって、
（ａ）患者サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル、および
（ｂ）コントロールサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸の非転移性レベル
を比較することを含む、方法。
【請求項７】
被験者における卵巣ガン腫を診断およびモニターするための方法であって、被験者から得られたサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を測定することを含む方法。
【請求項８】
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５が、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいはその一部分と特異的に反応し得る抗体を使用して測定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
内分泌腺ガンについて被験者をスクリーニングするための方法であって、（ａ）生物学的サンプルを被験者から得ること；（ｂ）前記サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量を検出すること；および（ｃ）検出されたカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の前記量を所定の標準と比較することを含み、標準のレベルと著しく異なるレベルのカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５が検出されることにより、内分泌腺ガンが示される、方法。
【請求項１０】
カリクレイン１４のレベルが正常なレベルと比較され、正常なサンプルと比較してサンプルにおけるカリクレイン１４の上昇したレベルにより、卵巣ガンまたは乳ガンが示される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）被験者から得られた生物学的サンプルを、検出可能な物質で直接的または間接的に標識される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な第１の抗体、および、固定化されている、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な第２の抗体とインキュベーションすること、
（ｂ）検出可能な物質を検出し、それにより、生物学的サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を定量すること、および
（ｃ）定量されたカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を、所定の標準に対するレベルと比較すること
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験者から得られたサンプルにおける内分泌腺ガンを診断およびモニターするための方法であって、サンプルから核酸、好ましくはｍＲＮＡを単離すること、および、サンプルにおけるＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸を検出することを含む、方法。
【請求項１３】
標準またはコントロールと比較して、サンプルにおけるＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸の異なるレベルの存在により、疾患、疾患段階および／または予後が示される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験者における卵巣ガンの存在または非存在を決定するための方法であって、（ａ）被験者から得られたサンプルを、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと接触させること；および（ｂ）ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルを、所定のカットオフ値に対して、サンプルにおいて検出し、それから、被験者における卵巣ガンの存在または非存在を決定することを含む、方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであり、ポリヌクレオチドのレベルがポリメラーゼ連鎖反応によって検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡの量が、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５、あるいは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５の相補体にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション技術を使用して検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）被験者から得られたサンプルを、ＫＬＫ１４またはＫＬＫ１５の一方または両方にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと接触させること；および（ｂ）ＫＬＫ１４またはＫＬＫ１５の一方または両方にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルを、所定のカットオフ値に対して、サンプルにおいて検出し、それから、被験者における卵巣ガンの存在または非存在を決定すること
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＫＬＫ１４のｍＲＮＡおよびＫＬＫ１５のｍＲＮＡの一方または両方が、（ａ）サンプルからｍＲＮＡを単離し、該ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換するための試薬と一緒にすること；（ｂ）変換されたｃＤＮＡを、増幅反応試薬、ならびに、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５の一方または両方にハイブリダイゼーションする核酸プライマーで処理して、増幅生成物を得ること；（ｄ）増幅生成物を分析して、ＫＬＫ１４のｍＲＮＡおよびＫＬＫ１５のｍＲＮＡの一方または両方の量を検出すること；および（ｅ）ｍＲＮＡの量を、類似する核酸プライマーを使用して得られる正常な組織および悪性の組織に対する予測値のパネルに対して検出された量と比較することによって検出される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１９】
コントロールと比較して患者におけるＫＬＫ１４の上昇したレベルにより、早期段階の疾患（病期ＩまたはＩＩ）、最適な縮小化、より長い進行のない疾患生存および全生存が示され、かつ／または、被験者が化学療法に応答し得ることが示される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
コントロールと比較して患者におけるＫＬＫ１５の上昇したレベルにより、卵巣ガンが示される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
コントロールと比較して患者におけるＫＬＫ１５の上昇したレベルにより、低下した進行のない生存および全生存が示される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
卵巣ガンを画像化するためのインビボ方法であって、
（ａ）ガンを画像化するための標識を有する、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に結合する薬剤を患者に注射すること、
（ｂ）前記薬剤をインビボでインキュベーションし、ガンに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に結合させること、および
（ｃ）ガンに局在化した標識の存在を検出すること
を含む、方法。
【請求項２３】
内分泌腺ガンに寄与する試験化合物の潜在的可能性を評価する方法であって、
（ａ）内分泌腺ガン疾患細胞の個々のアリコートを試験化合物の存在下および非存在下で維持すること、および
（ｂ）アリコートのそれぞれにおける、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルを比較すること
を含み、
試験化合物の非存在下で維持されたアリコートに対して、試験化合物の存在下におけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルの著しい差により、試験化合物が、内分泌腺ガンに寄与する潜在的可能性を有するということが示される、方法。
【請求項２４】
患者における内分泌腺ガンを阻害するための試験薬剤の潜在的効力を評価するための方法であって、
（ａ）患者から得られ、試験薬剤に曝された第１のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーのレベル、および
（ｂ）患者から得られ、試験薬剤に曝されていない第２のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、場合によっては他のマーカーのレベル
を比較することを含み、
第２のサンプルに対して、第１のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーの発現レベルの著しい差により、試験薬剤が、患者における内分泌腺ガンを阻害するために潜在的に有効であるということが示される、方法。
【請求項２５】
患者における内分泌腺ガンを阻害するための治療の効力を評価するための方法であって、（ａ）治療の少なくとも一部を患者に施す前の患者から得られた患者由来のサンプルにおけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルと、（ｂ）治療後の患者から得られた第２のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルとを比較することを含む、方法。
【請求項２６】
患者における内分泌腺ガンを阻害するための薬剤を同定または選択するための方法であって、
（ａ）サンプルを患者から得ること、
（ｂ）サンプルのアリコートを複数の試験薬剤の存在下で個々に維持すること、
（ｃ）それぞれのアリコートにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーを比較すること、および
（ｄ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーのレベルを、他の試験薬剤に対して、その試験薬剤を含有するアリコートにおいて変化させる試験薬剤の１つを選択すること、
を含む、方法。
【請求項２７】
患者における内分泌腺ガンを阻害する方法であって、
（ａ）疾患細胞を含むサンプルを患者から得ること、
（ｂ）サンプルのアリコートを複数の試験薬剤の存在下で個々に維持すること、
（ｃ）それぞれのアリコートにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベルを比較すること、および
（ｄ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベルを、他の試験薬剤に対して、その試験薬剤を含有するアリコートにおいて変化させる試験薬剤の少なくとも１つを患者に投与すること、
を含む、方法。
【請求項２８】
サンプルが血清を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
内分泌腺ガンが卵巣ガンである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質に結合する薬剤、あるいは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５、あるいは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５にハイブリダイゼーションするプローブまたはプライマーを含む診断組成物。
【請求項３１】
卵巣ガンを処置するための医薬組成物を調製する際の、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の使用。
【請求項３２】
前記請求項のいずれかに記載されるような方法を行うためのキット。
【請求項３３】
患者における卵巣ガンまたは乳ガンの存在を決定するためのキットであって、カリクレイン１４に特異的に結合する結合性薬剤の既知量を含み、結合性薬剤が検出可能な物質を含むか、または、検出可能な物質に直接的もしくは間接的に結合する、キット。
【請求項３４】
患者における卵巣ガンの存在を決定するためのキットであって、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５の一方または両方に結合するオリゴヌクレオチドの既知量を含み、オリゴヌクレオチドが検出可能な物質で直接的または間接的に標識される、キット。
【請求項３５】
患者における卵巣ガンを阻害するための複数の薬剤のそれぞれの好適性を評価するためのキットであって、カリクレイン１４、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５を検出するための複数の薬剤および試薬を含む、キット。
【請求項３６】
薬物発見業務を行う方法であって、
（ａ）患者における内分泌腺ガンを阻害する薬剤を同定するために、請求項２６に記載される方法を提供すること、
（ｂ）動物における効力および毒性について、工程（ａ）において同定された薬剤またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを行うこと、および
（ｃ）許容され得る治療プロフィルを有するとして工程（ｂ）において同定された１つ以上の薬剤を含む医薬用調製物を配合すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内分泌腺ガンを診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮卵巣ガン腫は、すべての婦人科学的悪性腫瘍の中で最も一般的であり、かつ最も致死性である。卵巣腫瘍の３０％のみが早期段階（Ｉ期／ＩＩ期）で診断されるにすぎず、その場合、生存率は９０％に達する。残りは、進行した段階で診断され、生存率は２０％未満である（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ  ＲＴ、Ｈｉｌｌ−Ｈａｒｍｏｎ  ＭＢ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｔ他、２００１、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、２００１、５１：１５〜３６）。現在、十分に受け入れられている唯一の血清学的マーカーはＣＡ１２５（機能が不明な大きい糖タンパク質）である（Ｍｅｙｅｒ  Ｔ、Ｒｕｓｔｉｎ  ＧＪ、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００；８２：１５３５〜１５３８）。ＣＡ１２５には、診断ツール、予後ツールおよびスクリーニングツールとしては重大な制限がある（Ｈｏｌｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＣＨ、Ｂｅｒｅｋ  ＪＳ、Ｓｅｍｉｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ、２０００、１９：３〜１０）。従って、この悪性腫瘍の予後および進行を助けることができ、また、処置決定に到達することを助けることができ、また、処置後の応答をモニターすることを助けることができ、また、日常的な追跡調査時の再発を同定するために助けとなり得る新しいバイオマーカーを開発することが求められている。いくつかの推定的なマーカーが、ＣＡ１２５の制限を埋め合わせるために探し求められてきており、そのようなマーカーには、インヒビン、プロスタチン、ＯＶＸ１、ＬＡＳＡ、ＣＡ１５．３およびＣＡ７２−４が含まれる（Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｍｅｓｓｅｒｌｉａｎ  ＧＭ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２０００、１４２：３３１〜３３３；Ｍｏｋ  ＳＣ他、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、２００１、９３：１４５８〜１４６４；Ｘｕ  ＦＪ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１９９３、１１：１５０６〜１５１０；Ｐａｔｓｎｅｒ  Ｂ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、１９８８、３０：９８〜１０３；Ｗｏｏｌａｓ  ＲＰ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、１９９５、５９：１１１〜１１６；および、Ｎｅｇｉｓｈｉ  Ｙ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、１９９３、４８：１４８〜１５４）。卵巣ガン腫の管理におけるそれらの関連性は今後明らかにされなければならないが、これらの新規なマーカーは、診断／予後の全体的な能力を高めるために、ＣＡ１２５との組合せで使用され得る（Ｍｅｎｏｎ  Ｕ、Ｊａｃｏｂｓ  ＩＪ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２０００；１２：３９〜４２）。
【０００３】
カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）類は、ヒト、ラットおよびマウスでは高度に保存され、かつ、密にクラスター化した多重遺伝子ファミリーによってコードされる分泌型セリンプロテアーゼの１つのサブグループである。ヒトのカリクレイン遺伝子ファミリーは染色体１９ｑ１３．４に存在しており、１５個のメンバーから構成され、それらの遺伝子はＫＬＫ１〜ＫＬＫ１５として示され、対応するタンパク質はｈＫ１〜ｈＫ１５として示される（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２００１、２２：１８４〜２０４１；Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０００、２７６：１２５〜１３３；Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２０００、４６：１８５５〜１８５８）。カリクレインは広範囲の様々な組織において発現し、また、特定の基質をプロセシングすることが予測される多くの生物学的流体（例えば、脳脊髄液、血清、精漿、母乳など）において見出される。カリクレインは、消化、フィブリン溶解、凝固、創傷治癒およびアポトーシスに関与するカスケード反応と類似するカスケード反応に関係し得る（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２００１、２２：１８４〜２０４１）。多くのカリクレインが内分泌腺関連の悪性腫瘍において示差的に発現することが見出されている（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ、Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．、２００１、１：１８２〜１９０）：例えば、前立腺ガン（Ｂａｒｒｙ  ＭＪ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２００１、３４４：１３７３〜１３７７；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ  ＨＧ他、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ、１９９８、３５：２７５〜３６８；および、Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１、２７６：５３〜６１）、卵巣ガン（Ｋｉｍ  Ｈ他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００１、８４：６４３〜６５０；Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ  Ａ他、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１９９６、２：６２４〜６３６；Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｈ他、Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、８６：２０７４〜２０８２；Ｍａｇｋｌａｒａ  Ａ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、７：８０６〜８１１；Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、６１：７８１１〜７８１８；Ｌｕｏ  Ｌ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ、２００１、３０６：１１１〜１１８）、乳ガン（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、６１：３４２５〜３４３１；Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００、２７５：１１８９１〜１１８９８；および、Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０００、６９：３３１〜３４１）、および精巣ガン（Ｌｕｏ  ＬＹ他、２００１、８５：２２０〜２２４）。また、これまでに調べられた多くのカリクレイン遺伝子はステロイドホルモンの調節下にあり、このことから、内分泌腺に関連した組織におけるカリクレインに対する役割が示唆される（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．、２００１；２２：１８４〜２０４）。さらに、ｈＫ６、ｈＫ１０およ���ｈＫ１１が、最近、新規な血清学的な卵巣ガンバイオマーカーとして同定されている（Ｌｕｏ  Ｌ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ、２００１、３０６：１１１〜１１８；Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ他、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０００、３３：５７９〜５８３；および、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００２、６２：２９５〜３００）。
【０００４】
ＫＬＫ１２が最近クローン化されている（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０００（１１月１日）、６９（３）：３３１〜４１）。ＫＬＫ１２は、唾液腺、胃、子宮、肺、胸腺、前立腺、結腸、脳、心臓、甲状腺および気管を含む様々な組織において発現している。予備的研究では、ＫＬＫ１２の発現が乳ガン組織ではｍＲＮＡレベルでダウンレギュレーションされ、また、乳ガン細胞株および前立腺ガン細胞株ではステロイドホルモンによってアップレギュレーションされることが示唆される。
【０００５】
ＫＬＫ１４（以前にはＫＬＫ−Ｌ６として知られている）もまた最近クローン化された（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、６１：３４２５〜３４３１）。この遺伝子は、限られた組織発現パターンを有しており、中枢神経系（特に、脳、小脳および脊髄）ならびに内分泌腺関連組織（例えば、子宮、卵巣、胸腺および精巣など）において見出される。予備的研究では、ＫＬＫ１４が、（正常な組織と比較した場合）、前立腺ガン組織、精巣ガン組織、卵巣ガン組織および乳ガン組織では、また、２つの乳ガン細胞株ではｍＲＮＡレベルでダウンレギュレーションされることが示される（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、６１：３４２５〜３４３１）。これに関連して、ＫＬＫ１４は、乳ガンにおけるＫＬＫ３（ＰＳＡ）およびＫＬＫ１０と類似しており、また、卵巣ガンにおけるＫＬＫ９と類似している（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、６１：７８１１〜７８１８；Ｙｕ  Ｈ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９５、５５：２１０４〜２１１０；および、Ｄｈａｒ  Ｓ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、７：３３９３〜３３９８）。インシトゥハイブリダイゼーション研究では、ＫＬＫ１４が、良性前立腺ガンの分泌性上皮細胞、前立腺上皮内新生物、および悪性前立腺細胞によって発現されることが明らかにされた（Ｈｏｏｐｅｒ  ＪＤ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００１、７３：１１７〜１２２）。
【０００６】
ＫＬＫ１５（これは、「プロスチノゲン」とも名付けられたタンパク質であるｈＫ１５をコードする）は、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの最も最近にクローン化されたメンバーである（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６：５３〜６１、２００１；Ｔａｋａｙａｍａ  ＴＫ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０：１６７９〜１６８７、２００１）。ＫＬＫ１５は５個のコードエキソンから形成され、予測分子量が約２８ｋＤａであるセリンプロテアーゼをコードする。ＫＬＫ１５は、ＫＬＫ１３（これはまた前立腺特異的抗原ＰＳＡとして知られている）および他のカリクレインとの大きな程度の構造的類似性を有する。ＫＬＫ１３と同様に、しかし、他のトリプシン様セリンプロテアーゼとは異なり、ＫＬＫ１５はアスパラギン酸残基を基質結合ポケットに有しておらず、このことから、キモトリプシン様基質特異性が示唆される。予備的研究では、ＫＬＫ１５が前立腺ガンにおいてｍＲＮＡレベルでアップレギュレーションされることが示されている（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ、Ｓｃｏｒｉｌａｓ  Ａ、Ｊｕｎｇ  Ｋ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６：５３〜６１、２００１）。最近の報告では、ｈＫ１５は、アミノ末端のペプチド結合を切断することによりＰＳＡの前駆体を容易に活性化し得ることが示されている（Ｔａｋａｙａｍａ  ＴＫ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０：１６７９〜１６８７、２００１）。また、ＫＬＫ１５は、おそらくはアンドロゲン受容体（ＡＲ）を介したステロイドホルモンの制御下にあることが示されている。
【０００７】
本明細書中のいずれかの参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの容認ではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
簡単に述べると、本発明は、内分泌腺ガン（具体的には、卵巣ガン、乳ガンおよび前立腺ガン、より具体的には卵巣ガン）に対する新規なバイオマーカーに関する。本発明は、内分泌腺ガンを診断するための組成物および方法を提供する。
【０００９】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質およびカリクレイン１５タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸は、内分泌腺ガン（特に卵巣ガン）の検出において特に適用される。カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質およびカリクレイン１５タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸は、内分泌腺ガンの診断およびモニターリング（すなわち、進行または治療的処置のモニターリング）のための新しいバイオマーカーを構成する。本発明の１つの局面によれば、これらのタンパク質および核酸は、内分泌腺ガンの診断、モニターリング、進行、処置および予後のために使用され、また、手術前または再発後のバイオマーカーとして使用することができる。
【００１０】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸、ならびに、該タンパク質に結合する薬剤は、内分泌腺ガンを検出するために使用されることがあり、また、内分泌腺ガンの診断的評価において、そして、そのような障害に対する素因を有する被験者の同定において使用することができる。
【００１１】
本発明の方法によれば、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５が、例えば、（ａ）マーカーに対応するポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメント、（ｂ）マーカーに対応するポリペプチドによって直接的もしくは間接的に産生される代謝産物、（ｃ）マーカーが実質的に同一である一部分を少なくとも有する転写された核酸もしくはそのフラグメント、および／または、（ｃ）マーカーとハイブリダイゼーションする転写された核酸もしくはそのフラグメントの、サンプルにおける存在を明らかにすることによって評価され得る。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、患者における内分泌腺ガンに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５を検出するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）サンプルを患者から得ること、
（ｂ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５をサンプルにおいて検出または同定すること、および
（ｃ）検出された量を、標準について検出された量と比較すること
を含む。
【００１３】
用語「検出する」または用語「検出すること」は、標的であるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸、あるいはそのサブユニット、あるいは試薬が結合した標的の組合せなどをアッセイすること、画像化すること、または、そうでない場合には、それらの存在もしくは非存在を明らかにすること、あるいは、内分泌腺ガン、転移、段階または類似する状態の１つ以上の実際の特徴についてアッセイすること、そのような特徴を画像化すること、確認すること、明らかにすること、または、そうでない場合には、決定することを包含する。この用語は、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸についての診断適用、予後適用およびモニターリング適用を包含する。
【００１４】
従って、本発明は、患者が内分泌腺ガンに冒されているか、または内分泌腺ガンに対する素因を有するかを評価する方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られたサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル、および
（ｂ）コントロール被験者から得られた同じタイプのサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル
を比較することを含み、
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のコントロール被験者についてのレベルに対して、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸の著しく変化したレベルにより、患者が内分泌腺ガンに冒されているということが示される。
【００１５】
患者が、乳ガン、卵巣ガンまたは前立腺ガン（特に、卵巣ガンまたは乳ガン）に冒されているか、またはそのようなガンに対する素因を有するかを評価するための本発明の方法の特定の実施形態では、コントロール被験者のレベルに対して、サンプルにおけるカリクレイン１４の上昇したレベルにより、その患者が、乳ガン、卵巣ガンまたは前立腺ガン（特に、卵巣ガンまたは乳ガン）に冒されているということが示される。
【００１６】
患者が、卵巣ガンまたは乳ガンに冒されているかどうかを評価する本発明の方法の別の特定の実施形態（例えば、スクリーニング、再発の検出、映像試験）では、この方法は、
（ａ）カリクレイン１４のレベル、および
（ｂ）コントロールの非ガンサンプルにおけるカリクレイン１４の正常なレベル
を比較することを含む。
【００１７】
患者サンプルにおけるカリクレイン１４のレベルと、正常なレベルとの間での著しい差（例えば、患者サンプルの方が高いこと）により、その患者が内分泌腺ガンに冒されているということが示される。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、患者における内分泌腺ガンの進行をモニターするための方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られたサンプルにおけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸を第１の時点において検出すること、
（ｂ）その後の時点において工程（ａ）を繰り返すこと、および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）で検出されたレベルを比較し、それから、内分泌腺ガンの進行をモニターすること
を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ガンの攻撃性または無痛性を評価するための方法（例えば、ガンの段階を決定するための方法）を提供し、この方法は、
（ａ）患者サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル、および
（ｂ）コントロールサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル
を比較することを含む。
【００２０】
サンプルにおけるレベルと、コントロールサンプル（例えば、正常または良性）におけるレベルとの間での著しい差により、その内分泌腺ガンが攻撃性または無痛性であるということが示される。１つの実施形態において、カリクレイン１４のレベルが正常なレベルよりも高い。
【００２１】
本発明は、内分泌腺ガンが転移しているか、または、将来において転移する可能性があるかを明らかにするための方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベル、および
（ｂ）コントロールサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸の正常なレベル（または非転移性レベル）
を比較することを含む。
【００２２】
患者サンプルにおけるレベルと、正常なレベルとの間での著しい差により、その内分泌腺ガンが転移しているか、または、将来において転移する可能性があるということが示される。
【００２３】
本発明はまた、内分泌腺ガンを阻害するための試験薬剤の潜在的効力を評価するための方法、および、内分泌腺ガンを阻害するための薬剤を選択するための方法を提供する。
【００２４】
本発明ではまた、内分泌腺ガンに寄与する試験化合物の潜在的可能性を評価する方法が意図され、この方法は、
（ａ）内分泌腺ガン疾患細胞の個々のアリコートを試験化合物の存在下および非存在下で維持すること、および
（ｂ）アリコートのそれぞれにおけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルを比較すること
を含む。
【００２５】
試験化合物の非存在下で維持されたアリコートに対して、試験化合物の存在下で維持された（または試験化合物に曝された）アリコートにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルの著しい差により、その試験化合物が、内分泌腺ガンに潜在的に寄与することが示される。
【００２６】
本発明はさらに、患者における内分泌腺ガンを阻害するための治療の効力を評価する方法に関する。本発明の方法は、（ａ）治療の少なくとも一部を患者に施す前の患者から得られた患者由来のサンプルにおける、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルと、（ｂ）治療後の患者から得られた第２のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルとを比較することを含む。
【００２７】
第１のサンプルに対して、第２のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、該タンパク質をコードする核酸のレベルの著しい差により、その治療が、内分泌腺ガンを阻害するために有効であるということが示される。
【００２８】
１つの実施形態において、この方法は、乳ガン、卵巣ガンまたは前立腺ガン（特に、卵巣ガンまたは乳ガン）を阻害するための治療の効力を評価するために使用される。この場合、第１のサンプルに対して、第２のサンプルにおけるカリクレイン１４の低下したレベルにより、その治療が、そのようなガンを阻害するために有効であるということが示される。
【００２９】
「治療」は、治療薬、放射線、免疫療法、遺伝子治療、および組織の手術的除去（これらに限定されない）を含む、内分泌腺ガンを処置するための任意の治療であり得る。従って、本発明の方法は、治療前、治療中および治療後の患者を評価するために使用することができる。
【００３０】
１つの局面において、本発明は、被験者における卵巣ガン腫を診断およびモニターするための方法に関し、この方法は、被験者から得られたサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を測定することを含む。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、内分泌腺ガンについて被験者をスクリーニングするための方法が提供され、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを被験者から得ること；（ｂ）前記サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量を検出すること；および（ｃ）検出されたカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の前記量を所定の標準と比較することを含み、この場合、標準から著しく異なるレベルのカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５が検出されることにより、疾患が示される。
【００３２】
患者におけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５のレベルと、正常なレベルとの間での著しい差により、患者が内分泌腺ガンに冒されているか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するということが示される。
【００３３】
１つの実施形態において、この方法では、カリクレイン１４が検出され、検出されたカリクレイン１４の量が標準の量よりも高く、これにより内分泌腺ガン（より具体的には、卵巣ガンまたは乳ガン）が示される。
【００３４】
カリクレイン１４を伴う方法によれば、サンプルにおけるカリクレイン１４のレベルが、コントロールから得られた同じタイプのサンプル（例えば、ガンに冒されていない個体から得られたサンプル）におけるカリクレイン１４の正常なレベルと比較される。正常なレベルに対して、カリクレイン１４のサンプルにおける著しく変化したレベル（例えば、より高いレベル）により、ガンが示される。
【００３５】
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を検出するか、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に結合する試薬、具体的には結合性薬剤、より具体的には、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいはその一部分と特異的に反応し得る抗体を使用して測定することができる。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、患者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにするための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質に特異的に結合する結合性薬剤と接触させる工程；および（ｂ）結合性薬剤に結合するタンパク質の量を、所定の標準値またはカットオフ値に対して、サンプルにおいて検出し、それから、患者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにする工程を含む。
【００３７】
別の実施形態において、本発明は、被験者から得られた生物学的サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を定量することによって被験者における内分泌腺ガンを診断およびモニターするための方法を提供し、この方法は、（ａ）生物学的サンプルを、検出可能な物質で直接的または間接的に標識される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な結合性薬剤（例えば、抗体）と反応させること、および（ｂ）検出可能な物質を検出することを含む。
【００３８】
別の局面において、本発明は、抗体を使用して、サンプルにおけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質の発現を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体を、サンプルと、抗体：タンパク質複合体の形成を可能にする条件のもとで一緒にすること、および（ｂ）複合体形成を検出することを含み、この場合、複合体形成により、サンプルにおけるタンパク質の発現が示される。発現は標準と比較することができ、内分泌腺ガンの診断となる。
【００３９】
本発明のこれらの方法の実施形態では、（ａ）被験者から得られた生物学的サンプルを、酵素で直接的または間接的に標識される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体と反応させること、（ｂ）酵素に対する基質を加えること（この場合、基質は、基質、または、酵素および基質の反応生成物が蛍光性複合体を形成するように選択される）、（ｃ）蛍光性複合体からの蛍光を測定することによりサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を定量すること、および（ｄ）定量されたレベルを、被験者患者またはコントロール被験者に由来する他のサンプルについて得られたレベルと比較することが伴う。
【００４０】
別の実施形態において、定量されたレベルは、内分泌腺ガンを有しないコントロール被験者（正常または良性）について定量されたレベルと比較され、この場合、コントロール被験者と比較してカリクレイン１４レベルの増大は内分泌腺ガン（特に卵巣ガンまたは乳ガン）を示す。
【００４１】
本発明の特定の実施形態は下記の工程を含む：
（ａ）生物学的サンプルを、検出可能な物質で直接的または間接に標識される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な第１の抗体、ならびに、固定化される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な第２の抗体とインキュベーションする工程、
（ｂ）検出可能な物質を検出し、それにより、生物学的サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を定量する工程、および
（ｃ）定量されたカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を、所定の標準についてのレベルと比較する工程。
【００４２】
標準は、内分泌腺ガンを有さず、異なる疾患段階にあるコントロール被験者（正常または良性）から得られたサンプルについて定量されたレベル、または、被験者の他のサンプルから定量されたレベルに対応し得る。標準と比較してカリクレイン１４の増大したレベルにより、内分泌腺ガンが示される。
【００４３】
本発明の他の方法では、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることができる１つ以上のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸が用いられる。従って、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５を検出するための方法を、ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸を検出することによって内分泌腺ガンをモニターするために使用することができる。１つの局面において、ＫＬＫ１４、または、ＫＬＫ１５、または、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５が検出される。
【００４４】
従って、本発明は、被験者から得られたサンプルにおける内分泌腺ガンを診断およびモニターするための方法に関し、この方法は、サンプルから核酸（好ましくはｍＲＮＡ）を単離すること、および、サンプルにおけるＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸を検出することを含む。標準またはコントロールと比較して、サンプルにおけるＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸の異なるレベルの存在により、疾患、疾患段階、および／または陽性の予後、すなわち、より長い進行のない生存および全生存が示される。
【００４５】
本発明の１つの実施形態において、ＫＬＫ１４陽性腫瘍（例えば、ガン性組織または進行した段階のガンに由来する、コントロールと比較してＫＬＫ１４の上昇したレベル）は陽性の診断指標である。ＫＬＫ１４陽性腫瘍は、早期段階のガン（特に、早期段階の卵巣ガン）、最適な縮小化、化学療法に対する応答性、より長い進行のない生存および／または全生存を示し得る。
【００４６】
本発明の１つの実施形態において、ＫＬＫ１５陽性腫瘍（例えば、コントロールの正常な組織または良性組織と比較してＫＬＫ１５の上昇したレベル）は陰性の診断指標を示す。ＫＬＫ１５陽性腫瘍は、内分泌腺ガン（特に、卵巣ガン）、進行した段階の疾患、低下した進行のない生存および／または全生存を示し得る。
【００４７】
本発明は、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにするための方法を提供し、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルをサンプルにおいて検出すること、および、そのレベルを、所定の標準値またはカットオフ値と比較し、それから、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにすることを含む。１つの実施形態において、本発明は、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにするための方法を提供し、この方法は、（ａ）被験者から得られたサンプルを、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと接触させること、および（ｂ）所定のカットオフ値に対して、該核酸分子にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルをサンプルにおいて検出し、それから、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにすることを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態においては、ｍＲＮＡであるポリヌクレオチドの量が、例えば、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子、またはそのような核酸分子の相補体にハイブリダイゼーションする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって検出される。他の実施形態においては、ｍＲＮＡのレベルが、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、またはそのような核酸分子の相補体にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション技術によって検出される。
【００４９】
ｍＲＮＡ検出を使用する場合、この方法は、単離されたｍＲＮＡを、標準的な方法に従ってｃＤＮＡに変換するための試薬と一緒にすること、変換されたｃＤＮＡを、核酸プライマーの適切な混合物と一緒に容器において増幅反応試薬（例えば、ｃＤＮＡのＰＣＲ反応試薬など）で処理すること、容器の内容物を反応して、増幅生成物を生じさせること、および、増幅生成物を分析して、サンプルにおけるＫＬＫ１２マーカー、ＫＬＫ１４マーカーおよび／またはＫＬＫ１５マーカーの存在を検出することによって行うことができる。ｍＲＮＡの場合、分析工程は、内分泌腺のＫＬＫ１２マーカー、ＫＬＫ１４マーカーおよび／またはＫＬＫ１５マーカーの存在を検出するためのノーザンブロット分析を使用して達成することができる。分析工程はさらに、増幅生成物におけるＫＬＫ１２マーカー、ＫＬＫ１４マーカーおよび／またはＫＬＫ１５マーカーの存在を定量的に検出すること、および、検出されたマーカーの量を、類似するプライマーを使用して得られた正常な組織および悪性の組織における該マーカーの知られている存在または非存在についての予測値のパネルに対して比較することによって達成することができる。
【００５０】
従って、本発明は、ｍＲＮＡが、（ａ）サンプルからｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換するための試薬と一緒にすること、（ｂ）変換されたｃＤＮＡを、増幅反応試薬、ならびに、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションする核酸プライマーで処理して、増幅生成物を生じさせること、（ｄ）増幅生成物を分析して、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードするｍＲＮＡの量を検出すること、および（ｅ）ｍＲＮＡの量を、類似する核酸プライマーを使用して得られた正常な組織および悪性の組織についての予測値のパネルに対して比較することによって検出される方法を提供する。
【００５１】
本発明ではまた、画像化のために標識を有し、かつ、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、場合によっては内分泌腺ガンの他のマーカーに結合する画像化剤を細胞または組織に投与すること、および、その後、細胞または組織を画像化することを含む方法が意図される。
【００５２】
１つの局面において、本発明は、１つまたは複数のカリクレイン（特に、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５）を標的化するために構築された薬剤を被験者に投与することを含むインビボ方法を提供する。
【００５３】
従って、本発明では、画像化のために標識を有し、かつ、特定のカリクレイン（好ましくは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５）に結合する１つまたは複数の薬剤を哺乳動物に投与すること、および、その後、哺乳動物を画像化することを含むインビボ方法が意図される。
【００５４】
本発明の特定の局面によれば、内分泌腺ガンを画像化するためのインビボ方法が提供され、この方法は、
（ａ）内分泌腺ガンを画像化するための標識を有する、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に結合する薬剤を患者に注射すること、
（ｂ）前記薬剤をインビボでインキュベーションし、内分泌腺ガンに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に結合させること、および
（ｃ）内分泌腺ガンに局在化した標識の存在を検出すること
を含む。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において、薬剤は、カリクレインを認識する抗体である。本発明の別の実施形態において、薬剤は、カリクレインを認識する化学的実体である。
【００５６】
薬剤は、カリクレインおよび場合によっては他のマーカーを画像化するための標識を有する。画像化のために有用な標識の例には、放射性標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、核磁気共鳴活性な標識、陽電子放射断層撮影法（「ＰＥＴ」）スキャナーにより検出可能な陽電子放出同位体、化学発光剤（例えば、ルシフェリンなど）、および酵素マーカー（例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼなど）がある。短距離放射線放出体（例えば、短距離検出器プローブにより検出可能な同位体など）もまた用いることができる。
【００５７】
本発明ではまた、内分泌腺ガンについて多数のマーカーを使用する本明細書中に記載される位置特定法または画像化方法が意図される。
【００５８】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットに関する。１つの実施形態において、キットは、患者が内分泌腺ガン（特に、卵巣ガンまたは乳ガン）に冒されているかどうかを評価するためのものである。
【００５９】
本発明はまた、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸を含む診断組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物は、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４もしくはＫＬＫ１５、またはそのフラグメントに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、またはそのフラグメントについて特異的な抗体を含む。別の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応方法論を使用して、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４またはＫＬＫ１５を増幅することができる、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４またはＫＬＫ１５に特異的なプライマー対を含む組成物が提供される。これらのプローブ、プライマーまたは抗体は検出可能な物質で標識することができる。
【００６０】
なおさらに、本発明は、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、ならびに／あるいは、該タンパク質をコードする核酸分子、ならびに／あるいは、該タンパク質についての結合性薬剤を用いる、内分泌腺ガンのための治療的適用に関する。
【００６１】
１つの局面において、本発明は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５またはその一部分、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体を、医薬的に許容され得るキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物に関する。患者における内分泌腺ガンを処置または防止するための方法もまた提供され、この方法は、その必要性のある患者に、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５またはその一部分、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体、あるいは、本発明の組成物を投与することを含む。１つの局面において、本発明は、内分泌腺ガンに冒されている患者、または、内分泌腺ガンを発症する危険性を有する患者を処置する方法を提供し、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の発現を阻害することを含む。
【００６２】
１つの局面において、本発明は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する内分泌腺ガン細胞（例えば、卵巣ガン細胞または乳ガン細胞）を殺すか、またはその成長を阻害するために、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の活性を阻止するために治療的に使用することができる、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体を提供する。また、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する腫瘍の免疫媒介の破壊または成長阻害を促進させるための様々な免疫治療法において使用することができる。
【００６３】
本発明ではまた、内分泌腺ガンの防止または処置のための医薬品を調製または製造することにおいて、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５またはその一部分、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体を使用する方法が意図される。
【００６４】
本発明の別の局面は、内分泌腺ガンを防止するための、かつ／または内分泌腺ガンを処置するためのワクチンを調製する際に使用されるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、それに由来するペプチド、あるいは、化学的に製造された（合成）ペプチド、あるいは、これらの分子の任意の組合せの使用である。
【００６５】
本発明では、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５（特にカリクレイン１４）に対する抗体の産生を、ワクチンが投与される被験者において刺激または増強するためのワクチンが意図される。
【００６６】
本発明はまた、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５（特にカリクレイン１４）に対する抗体の産生を被験者において刺激または増強するための方法を提供する。この方法は、抗体の産生を刺激または増強するために効果的な用量で本発明のワクチンを投与することを含む。
【００６７】
本発明はさらに、内分泌腺ガンの再発を処置する方法、内分泌腺ガンの再発を防止する方法、または、内分泌腺ガンの再発を遅らせる方法を提供する。これらの方法は、内分泌腺ガンの再発を処置するために効果的な用量で、または、内分泌腺ガンの再発を防止するために効果的な用量で、または、内分泌腺ガンの再発を遅らせるために効果的な用量で、本発明のワクチンを被験者に投与することを含む。
【００６８】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法、組成物およびキットは、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５、ならびに／またはカリクレイン１４を使用する。
【００６９】
本発明ではまた、内分泌腺ガンに関連するさらなるマーカーを使用する本明細書中に記載される方法、組成物およびキットが意図される。本明細書中に記載される方法は、さらなるマーカーを検出するための試薬、またはそのようなマーカーに対する核酸を含めることによって改変することができる。他のマーカーには、ヒト角質層キモトリプシン活性酵素（ＨＳＣＣＥ）、ヘプトグロビンα、オステオポンチン、インヒビン、プロスタチン、脂質結合シアル酸（ＬＡＳＡ）、カリクレイン２、カリクレイン３、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、カリクレイン１１およびカリクレイン１３；ＣＡ１２５、ＣＡ１５．３、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、クレアチンキナーゼＢＢ、およびガン胎児性抗原（ＣＥＡ）が含まれる。特に、そのような他のマーカーは、カリクレイン類に対するマーカーである。本発明の１つの局面において、マーカーは、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン１０、カリクレイン１１およびカリクレイン１３、または、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン７、カリクレイン８、カリクレイン９およびカリクレイン１０をコードする核酸の１つまたは複数である。本明細書中に記載される方法は、これらのマーカーを検出するための試薬、またはこれらのマーカーに対する核酸を含めることによって改変することができる。
【００７０】
本発明の他の目的、特徴および利点が下記の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明の精神および範囲に含まれる様々な変化および改変がこの詳細な説明から当業者には明らかになるので、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ示されるだけであることを理解しなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、カリクレイン１２、カリレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸の発現と、ガン（特に、卵巣ガン、乳ガンまたは前立腺ガン）との間における新しく発見された相関に関する。本明細書中に記載されるマーカーは、ガンを検出するための高感度で、かつ／または特異的な方法を提供する。
【００７２】
様々な方法が、サンプルにおけるガンの存在を検出するために、サンプルにおけるガンの非存在を検出するために、ガンの段階を検出するために、ガンの悪性度を検出するために、ガンの良性または悪性を検出するために、ガンの転移の可能性を検出するために、ガンに伴う新生物の組織学的タイプを評価するために、ガンの無痛性または攻撃性を評価するために、そして、患者におけるガンの防止、診断、特徴づけおよび治療に関連するガンの他の特徴を評価するために提供される。また、様々な方法が、ガンを阻害するための１つ以上の試験薬剤の効力を評価するために、ガンに対する治療の効力を評価するために、ガンの進行をモニターするために、ガンを阻害するための薬剤または治療を選択するために、ガンに冒されている患者を処置するために、患者におけるガンを阻害するために、そして、試験化合物の潜在的発ガン能を評価するために提供される。
【００７３】
用語集
用語「サンプル」、用語「生物学的サンプル」および類似する用語は、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５、あるいは、カリクレイン１２、カリレイン１４および／またはカリクレイン１５（特に、内分泌腺ガンに関連するＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５、あるいは、カリクレイン１２、カリレイン１４および／またはカリクレイン１５）を発現または含有することが知られているか、または疑われる材料を意味する。試験サンプルは、供給源から得られるように、または、サンプルの特性を改変するための前処理の後で得られるように、直接的に使用することができる。サンプルは、任意の生物学的供給源から、例えば、組織、抽出物または細胞培養物などから得ることができ、これには、細胞（例えば、腫瘍細胞）、細胞溶解物、ならびに生理学的流体、例えば、全血、血漿、血清、唾液、眼のレンズ液、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水、滑液および腹膜液などが含まれる。サンプルは、動物から、好ましくは、哺乳動物から、最も好ましくはヒトから得ることができる。サンプルは、例えば、血漿を血液から調製し、粘性の流体を希釈するなどして、使用前に処理することができる。処理方法には、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などが伴い得る。核酸およびタンパク質をサンプルから単離することができ、本発明の方法において利用することができる。
【００７４】
本発明の実施形態において、サンプルは哺乳動物の組織サンプルである。別の実施形態において、サンプルはヒトの生理学的流体である。特定の実施形態において、サンプルはヒト血清である。
【００７５】
用語「被験者」、用語「個体」または用語「患者」は、本明細書中に記載されるような内分泌腺ガンまたは状態に冒されているか、あるいは、本明細書中に記載されるような内分泌腺ガンまたは状態を有することが疑われるか、あるいは、本明細書中に記載されるような内分泌腺ガンまたは状態に対する素因を有することが疑われる、哺乳動物など温血動物を示す。特に、これらの用語はヒトを示す。
【００７６】
用語「カリクレイン１２」、用語「カリクレイン１２ポリペプチド」または用語「カリクレイン１２タンパク質」は、ヒトのカリクレイン１２（「ｈＫ１２」）、具体的には、ヒトのカリクレイン１２の天然配列ポリペプチド、イソ型、キメラポリペプチド、すべてのホモログ、フラグメントおよび前駆体を包含する。天然ｈＫ１２に対するアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＦ０６０５５、同ＡＡＤ２６４２６および同ＡＡＦ０６０６６の配列、ならびに、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列が含まれる。
【００７７】
用語「カリクレイン１４」、用語「カリクレイン１４ポリペプチド」または用語「カリクレイン１４タンパク質」は、ヒトのカリクレイン１４（「ｈＫ１４」）、具体的には、ヒトのカリクレイン１４の天然配列ポリペプチド、イソ型、キメラポリペプチド、すべてのホモログ、フラグメントおよび前駆体を包含する。天然ｈＫ１４に対するアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＫ４８５２４および同ＡＡＤ５０７７３の配列、ならびに、配列番号５に示される配列が含まれる。
【００７８】
用語「カリクレイン１５」、用語「カリクレイン１５ポリペプチド」または用語「カリクレイン１５タンパク質」は、ヒトのカリクレイン１５（「ｈＫ１５」）、具体的には、ヒトのカリクレイン１５の天然配列ポリペプチド、イソ型、キメラポリペプチド、すべてのホモログ、フラグメントおよび前駆体を包含する。天然ｈＫ１５に対するアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＧ０９４６９、ＡＡＧ０９４７２、ＡＡＧ０９４７１および同ＡＡＧ０９４７０の配列、ならびに、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０に示される配列が含まれる。
【００７９】
「天然配列ポリペプチド」は、自然界から得られるポリペプチドの同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ポリペプチドは自然界から単離することができ、または、組換え手段もしくは合成的手段によって製造することができる。この用語は、具体的には、ポリペプチドの天然に存在する短縮型形態または分泌型形態、ポリペプチド変化体（天然に存在する変化型形態（例えば、選択的スプライシング形態またはスプライス変化体）を含む）、および、天然に存在する対立遺伝子変化体を包含する。
【００８０】
用語「ポリペプチド変化体」は、天然配列ポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が少なくとも約７０％〜８０％（好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）を有するポリペプチドを意味し、特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＦ０６０６５、同ＡＡＤ２６４２６、同ＡＡＦ０６０６６、同ＡＡＫ４８５２４、同ＡＡＤ５０７７３、同ＡＡＧ０９４６９、ＡＡＧ０９４７２、ＡＡＧ０９４７１および同ＡＡＧ０９４７０において特定され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０に示される配列に対するアミノ酸に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも７０％〜８０％、８５％、９０％、９５％であるポリペプチドを意味する。そのような変化体には、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０の全長配列または成熟型配列のＮ末端またはＣ末端に付加されているか、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０の全長配列または成熟型配列のＮ末端またはＣ末端から欠失しているポリペプチド（これには、他の種に由来する変化体が含まれる）が含まれ、しかし、天然配列ポリペプチドは含まれない。
【００８１】
対立遺伝子変化体もまた、１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失が、コードされるタンパク質に導入されるように、置換、付加または欠失を、天然ポリペプチド配列をコードする核酸に導入することによって作出され得る。変異を、部位特異的変異誘発法およびＰＣＲ媒介変異誘発法などの標準的な方法によって導入することができる。１つの実施形態において、保存的置換が１つ以上の予測された非必須アミノ酸残基において行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸はこの分野では知られており、これらには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＣｙｓ）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｓｏ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｓｏ）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ）が含まれる。変異はまた、例えば、飽和変異誘発法によって、天然配列の一部または全体に沿ってランダムに挿入することができる。変異誘発後、変化体ポリペプチドは組換え発現させることができ、ポリペプチドの活性が測定されることがある。
【００８２】
ポリペプチド変化体には、全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含む天然ポリペプチドのアミノ酸配列と十分に同一であるポリペプチド、または、そのような天然ポリペプチドのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの一部分は、長さが、例えば、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、５０アミノ酸、６０アミノ酸、７０アミノ酸、８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸またはそれ以上であるポリペプチドであり得る。ポリペプチドの様々な領域が欠失している部分を、組換え技術によって調製することができ、ポリペプチドについて特異的な抗体を形成する能力などの１つ以上の機能的活性について評価することができる。
【００８３】
天然に存在する対立遺伝子変化体は、天然ポリペプチド配列からの保存的アミノ酸置換を含有することができ、または、カリクレインポリペプチドホモログ（例えば、マウスのカリクレインポリペプチド）における対応する位置からのアミノ酸の置換を含有することができる。
【００８４】
本発明はまた、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＦ０６０６５、同ＡＡＤ２６４２６、同ＡＡＦ０６０６６、同ＡＡＫ４８５２４、同ＡＡＤ５０７７３、同ＡＡＧ０９４６９、ＡＡＧ０９４７２、ＡＡＧ０９４７１および同ＡＡＧ０９４７０の配列、ならびに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０に示される配列に対して実質的に同一であるポリペプチド（例えば、配列同一性が少なくとも約４５％であり、好ましくは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるポリペプチド）、および、特に、対応する天然配列ポリペプチドの免疫原活性を保持するポリペプチドを包含する。
【００８５】
本明細書中において特定される２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、配列をアラインメントし、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要な場合にはギャップを挿入した後、そして、配列同一性の一部としての保存的置換を何ら考慮しない場合のポリペプチド配列または核酸配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性またはパーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、様々な従来の方法で達成することができ、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１）：３８７、１９８４）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０、１９９０）を含む公開されているコンピューターソフトウエアを使用して達成することができる。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムがＮＣＢＩおよび他の提供元から公開されている（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．他、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ、２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０、１９９０）。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる何らかのアルゴリズムを含めて、アラインメントを評価するための適切なパラメーターを決定することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公開されているコンピュータープログラムにコード化される。
【００８６】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質およびカリクレイン１５タンパク質には、キメラタンパク質または融合タンパク質が含まれる。「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドではないポリペプチド）に機能的に連結された、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドの全体または一部分（好ましくは生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質において、用語「機能的に連結された」は、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドと、異種ポリペプチドとが互いに読み枠を一致させて融合されていることを示すことが意図される。異種ポリペプチドは、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。有用な融合タンパク質は、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドがＧＳＴ配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ融合タンパク質である。融合タンパク質の別の例には、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドの全体または一部分が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される免疫グロブリン融合タンパク質がある。キメラタンパク質および融合タンパク質は標準的な組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
【００８７】
カリクレインポリペプチドは、様々な供給源から、例えば、ヒト組織タイプまたは別の供給源から単離することができ、あるいは、組換え法もしくは合成的方法によって、または、これらの技術および類似する技術の任意の組合せによって調製することができる。
【００８８】
「ＫＬＫ１２」、「ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド」または「ＫＬＫ１２核酸分子」は、天然配列ポリペプチド、カリクレイン１２ポリペプチドの一部分を含むポリペプチド変化体、イソ型、前駆体およびキメラポリペプチドを含むカリクレイン１２をコードするポリヌクレオチドを示す。本発明において用いられる天然カリクレイン１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１３５０２５の核酸配列（配列番号４）またはそのフラグメントが含まれる。
【００８９】
「ＫＬＫ１４」、「ＫＬＫ１４ポリヌクレオチド」または「ＫＬＫ１４核酸分子」は、天然配列ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドの一部分を含むポリペプチド変化体、イソ型、前駆体およびキメラポリペプチドを含むカリクレイン１４をコードするポリヌクレオチドを示す。本発明において用いられる天然カリクレイン１４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１６１２２１および同ＡＦ２８３６７０の核酸配列（配列番号６および配列番号２１）またはそのフラグメントが含まれる。
【００９０】
「ＫＬＫ１５」、「ＫＬＫ１５ポリヌクレオチド」または「ＫＬＫ１４核酸分子」は、天然配列ポリペプチド、カリクレイン１５ポリペプチドの一部分を含むポリペプチド変化体、イソ型、前駆体およびキメラポリペプチドを含むカリクレイン１５をコードするポリヌクレオチドを示す。本発明において用いられる天然カリクレイン１５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ２４２１９５の核酸配列（配列番号１１）またはそのフラグメントが含まれる。
【００９１】
ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１５ポリヌクレオチドには、相補的な核酸配列、および、これらの配列と実質的に同一である核酸（例えば、配列同一性が少なくとも約４５％、好ましくは５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸）が含まれる。
【００９２】
ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１５ポリヌクレオチドにはまた、遺伝暗号の縮重性により、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１３５０２５、同ＡＦ１６１２２１、同ＡＦ２８３６７０および同ＡＦ２４２１９５の核酸配列（配列番号４、配列番号６、配列番号２１および配列番号１１）と異なる配列が含まれる。一例として、カリクレイン１２ポリペプチド、カリクレイン１４ポリペプチドまたはカリクレイン１５ポリペプチドのヌクレオチド配列におけるＤＮＡ配列多型は、アミノ酸配列に影響しないサイレントな変異をもたらし得る。１つまたは複数のヌクレオチドにおける様々な変化が、天然の対立遺伝子変化により、集団内の個体の間に存在し得る。カリクレインポリペプチドのアミノ酸配列の変化を生じさせるＤＮＡ配列多型もまた存在し得る。
【００９３】
ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１５ポリヌクレオチドにはまた、ストリンジェントな条件（好ましくは、高ストリンジェンシーの条件）のもとで、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１３５０２５、同ＡＦ１６１２２１、同ＡＦ２８３６７０および同ＡＦ２４２１９５の核酸配列（配列番号４、配列番号６、配列番号２１および配列番号１）にハイブリダイゼーションする核酸が含まれる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させる適切なストリンジェンシーの様々な条件が当業者には知られているか、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６）に見出され得る。例えば、６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃、その後、２．０ｘＳＳＣによる５０℃での洗浄を用いることができる。ストリンジェンシーは、洗浄工程で使用される条件に基づいて選択することができる。例として、洗浄工程における塩濃度を、５０℃における約０．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択することができる。また、洗浄工程における温度は、高ストリンジェンシーの条件では約６５℃であり得る。
【００９４】
ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１５ポリヌクレオチドにはまた、ＤＮＡに対応するｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる、そのような核酸の短縮型核酸または核酸フラグメントおよび変化形態が含まれる。
【００９５】
ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１５ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を包含することが意図され、二本鎖または一般鎖のいずれかであり得る。核酸は、さらなるコード配列または非コード配列を含む場合があり、しかし、そのような配列を含む必要はなく、あるいは、他の分子および／またはキャリア物質もしくは担体物質に連結される場合があり、しかし、それらに連結される必要はない。本発明の方法において使用される核酸は、特定の方法のために好適な任意の長さであり得る。特定の適用において、この用語は、アンチセンス核酸分子（例えば、センスのＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５に対して逆向きでのｍＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖）を示す。
【００９６】
コントロールまたは標準（例えば、正常なレベル、または患者由来の他のサンプルにおけるレベル）と比較して、患者サンプルまたは被験者サンプルにおける「統計学的に異なるレベル」、「著しく変化したレベル」、または、患者サンプルまたは被験者サンプルにおけるマーカーのレベルにおける「著しい差」は、検出アッセイの標準誤差よりも大きいレベルまたは低いレベル（特に、低いレベル）を表し得る。特定の実施形態において、レベルは、コントロールまたは標準の１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上または６倍以上、あるいは、１／１．５以下、１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下または１／６以下であり得る。
【００９７】
「結合性薬剤」は、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体などの物質を示す。物質が、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５と検出可能なレベルで反応し、かつ、無関係の配列または異なるカリクレインの配列を含有するペプチドと検出可能に反応しないならば、その物質は、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質に「特異的に結合」する。結合特性は、当業者によって容易に行われ得るＥＬＩＳＡを使用して評価することができる（例えば、Ｎｅｗｔｏｎ他、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、１９７：１〜１３、１９９３を参照のこと）。
【００９８】
結合性薬剤は、ペプチド成分を伴うか、または伴わないリボソーム、ＲＮＡ分子、あるいはポリペプチドであり得る。結合性薬剤は、カリクレイン１２配列、カリクレイン１４配列および／またはカリクレイン１５配列を含むポリペプチド、そのペプチド変化体、あるいは、そのような配列の非ペプチド模倣体であり得る。例として、カリクレイン１２配列は、カリクレイン１２により媒介される機能を調節することができるカリクレイン１２のペプチド部分であり得る。同様に、カリクレイン１４配列は、カリクレイン１４により媒介される機能を調節することができるカリクレイン１４のペプチド部分であり得るし、また、カリクレイン１５配列は、カリクレイン１５により媒介される機能を調節することができるカリクレイン１５のペプチド部分であり得る。
【００９９】
本発明において使用される抗体には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、免疫学的に活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）２フラグメント）、抗体重鎖、ヒト化抗体、抗体軽鎖、遺伝子操作された単鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４，９４６，７７８号）、キメラ抗体（例えば、マウス抗体の結合親和性を含有するが、残り部分がヒト起源である抗体）、あるいは誘導体（例えば、酵素コンジュゲート体、または標識された誘導体）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、フラグメントならびにキメラ体を含めて、当業者に知られている方法を使用して調製することができる。単離された天然型または組換え型のカリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５を、抗体を調製するために利用することができる。例えば、モノクローナル抗体の調製については、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒ他（１９８５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１：３１〜４２；Ｃｏｔｅ他（１９８３）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８０：２０２６〜２０３０；および、Ｃｏｌｅ他（１９８４）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、６２：１０９〜１２０を参照のこと；モノクローナルＦａｂフラグメントの調製については、Ｈｕｓｅ他（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと；また、抗体を同定するためのファージミド免疫グロブリンライブラリーまたはＢリンパ球免疫グロブリンライブラリーの調製については、Ｐｏｕｎｄ（１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照のこと。カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５について特異的な抗体はまた、科学的提供元または商業的提供元から得ることができる。
【０１０１】
本発明の１つの実施形態において、１０−７Ｍ以上のＫａで結合する場合、抗体は、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５に対して反応性を有する。
【０１０２】
「内分泌腺ガン」または「内分泌腺ガン腫」は、生殖器官のガン、例えば、卵巣ガン、乳ガンおよび前立腺ガンを包含するが、これらに限定されない。ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５に基づく特定の実施形態が卵巣ガンの適用のために有用である。ＫＬＫ１４に基づく特定の実施形態が卵巣ガンまたは乳ガンの適用のために有用である
方法
様々な方法を、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸を伴う内分泌腺ガンの診断的評価および予後評価のために、また、そのような障害に対する素因を有する被験者の同定のために用いることができる。そのような方法では、例えば、ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸、ならびにそのフラグメント、ならびに、ペプチドフラグメントを含めて、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５に対する結合性薬剤（例えば、抗体）が利用される。特に、これらの核酸および抗体は、例えば、（１）ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５の変異の存在の検出、あるいは、非障害状態に対して、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５のｍＲＮＡの過剰発現または過小発現のいずれかの検出、あるいは、特定の状態またはそのような状態に対する感受性と相関し得るＫＬＫ１２転写物、ＫＬＫ１４転写物および／またはＫＬＫ１５転写物の選択的スプライシンング形態の定性的または定量的な検出のために、また（２）非障害状態に対して、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５の過剰存在または過小存在のいずれかの検出、あるいは、障害の状態またはそのような状態に対する感受性と相関する改変された（例えば、全長未満の）カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５の存在の検出のために使用することができる。
【０１０３】
本発明ではまた、内分泌腺ガンを検出するための方法が意図され、この方法は、患者から得られた細胞におけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質またはカリクレイン１５タンパク質、ならびに／あるいは、該タンパク質をコードする核酸、ならびに内分泌腺ガンに関連する他のマーカーのレベルのプロフィルを作製すること、および、そのプロフィルを参照と比較して、疾患を示す試験細胞についてのプロフィルを同定することを含む。
【０１０４】
本明細書中に記載される方法は、例えば、宿主から新たに取り出された細胞群における悪性細胞または前悪性細胞の存在の可能性を評価するために使用することができる。そのような方法は、腫瘍を検出するために、その成長を定量するために、また、疾患の診断および予後を助けるために使用することができる。そのような方法は、ガン転移の存在を検出するために、ならびに、手術、ガン化学療法および／または放射線療法の後で、すべての腫瘍組織の非存在または除去を確認するために使用することができる。そのような方法はさらに、ガン化学療法および腫瘍再発をモニターするために使用することができる。
【０１０５】
本明細書中に記載される方法は、被験者から得られた生物学的サンプルにおけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸を検出することによって内分泌腺ガン腫を診断およびモニターするために適合させることができる。これらの適用は、試験されている被験者から得られたサンプルにおいて定量されたタンパク質または核酸分子の量を、所定の標準値またはカットオフ値と比較することが要求される。標準は、その被験者から得られた別のサンプルまたはより初期のサンプルについて定量されたレベル、あるいは、コントロールサンプルについて定量されたレベルに対応し得る。健康な被験者または内分泌腺ガン被験者から得られるコントロールサンプルに対するレベルは、予想的および／または遡及的な統計学的研究によって明らかにされ得る。臨床的に明白な疾患または異常を有しない健康な被験者が統計学的研究のために選択され得る。診断は、コントロールサンプル、または同じ被験者について定量された以前のレベルと比較して、検出されたカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５の統計学的に異なるレベルの発見によって行われ得る。
【０１０６】
本明細書中に記載される方法ではまた、内分泌腺ガンに対する多数のマーカーを使用することができる。従って、本発明では、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、ならびに、該カリクレインをコードする核酸、ならびに、内分泌腺ガンの特異的な指標である他のマーカーの存在について生物学的サンプルを分析するための方法が意図される。他のマーカーには、ヒト角質層キモトリプシン活性酵素（ＨＳＣＣＥ）、ヘプトグロビンα、オステオポンチン、インヒビン、プロスタチン、脂質結合シアル酸（ＬＡＳＡ）、カリクレイン２、カリクレイン３、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、カリクレイン１１およびカリクレイン１３；ＣＡ１２５、ＣＡ１５．３、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、クレアチンキナーゼＢＢ、およびガン胎児性抗原（ＣＥＡ）が含まれる。特に、そのような他のマーカーは、カリクレイン類に対するマーカーである。本発明の１つの局面において、マーカーは、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン１０、カリクレイン１１およびカリクレイン１３、または、カリクレイン４〜カリクレイン１０をコードする核酸の１つまたは複数である。本明細書中に記載される方法は、これらのマーカーを検出するための試薬、またはこれらのマーカーに対する核酸を含めることによって改変することができる。
【０１０７】
核酸法／アッセイ
本明細書中に記されるように、内分泌腺ガンを、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５のサンプル中のレベルに基づいて検出することができる。核酸分子を検出するための技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイなどがこの分野では広く知られている。
【０１０８】
プローブが、ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸を検出するためにハイブリダイゼーション技術において使用され得る。この技術では、一般に、患者または他の細胞供給源に由来するサンプルから得られた核酸（例えば、組換えＤＮＡ分子、クローン化された遺伝子）を、核酸内の相補的な配列に対するプローブの特異的なアニーリングのために有利な条件のもとでプローブと接触させ、インキュベーションすることが伴う。インキュベーション後、アニーリングしていない核酸が除かれ、プローブにハイブリダイゼーションした核酸の存在が、存在する場合には検出される。
【０１０９】
サンプル中の核酸配列の検出において使用されるヌクレオチドプローブは、この分野で知られている従来の方法を使用して構築することができる。好適なプローブは、ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸の様々な領域に由来する少なくとも５個の連続したアミノ酸をコードする核酸配列に基づき得る。好ましくは、プローブは１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドプローブは、検出可能な物質で標識することができ、例えば、適切なシグナルを提供し、かつ十分な半減期を有する放射性の標識（例えば、３２Ｐ、３Ｈまたは１４Ｃなど）などで標識することができる。使用され得る他の検出可能な物質には、特異的な標識された抗体によって認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識された抗原について特異的な抗体、および発光化合物が含まれる。適切な標識が、検出されるヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションおよび結合の速度、ならびにハイブリダイゼーションのために利用可能なヌクレオチドの量を考慮して選択され得る。標識されたプローブを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）において一般的に記載されるように、固体担体（例えば、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンメンブランなど）の表面において核酸にハイブリダイゼーションさせることができる。核酸プローブを、好ましくはヒト細胞において、ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸を検出するために使用することができる。ヌクレオチドプローブもまた、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５を伴う内分泌腺ガンの診断において、あるいは、そのような障害の進行をモニターすることにおいて、あるいは、治療的処置をモニターすることにおいて有用であり得る。
【０１１０】
ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸の検出では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法を使用して、特定の遺伝子配列を増幅し、その後、当業者に知られている技術を使用して、増幅された分子を分析することが伴い得る。好適なプライマーが当業者によって日常的に設計され得る。
【０１１１】
例として、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、サンプルに由来するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸の一部分を増幅するために、ＰＣＲに基づくアッセイでは用いられ得る。この場合、オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５をコードするポリヌクレオチドに対して特異的である（すなわち、ハイブリダイゼーションする）。増幅されたｃＤＮＡが、その後、ゲル電気泳動などのこの分野で広く知られている技術を使用して分離および検出される。
【０１１２】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを最大にするために、本発明の方法において用いられるプライマーおよびプローブは、一般には、少なくとも約６０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードするポリヌクレオチドの一部分に対して有する。すなわち、プライマーおよびプローブは長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドである。１つの実施形態において、プライマーおよびプローブは長さが少なくとも約１０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドである。
【０１１３】
本明細書中に記載されるハイブリダイゼーション技術および増幅技術は、ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸の発現の量的側面および質的側面をアッセイするために使用することができる。例えば、ＲＮＡを、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５を発現することが知られている細胞タイプまたは組織から単離し、本明細書中で示されるハイブリダイゼーション（例えば、標準的なノーザン分析）またはＰＣＲ技術を利用して調べることができる。
【０１１４】
プライマーおよびプローブは、上記の方法において、インシトゥで、すなわち、生検または切除から得られた患者組織の（固定および／または凍結された）組織切片に対して直接的に使用することができる。
【０１１５】
本発明の１つの局面において、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いる方法が提供される。この方法では、ＰＣＲが逆転写との組合せで適用される。一般には、ＲＮＡが、標準的な技術（例えば、ＣｈｏｍｃｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：１５６〜１５９、１９８７によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート抽出）を使用してサンプル組織から抽出され、逆転写されて、ｃＤＮＡが作製される。このｃＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして使用される。ｃＤＮＡは、カリクレイン１２配列、カリクレイン１４配列および／またはカリクレイン１５配列に対して少なくとも１つが特異的に設計される１組のプライマーにハイブリダイゼーションさせられる。プライマーおよびテンプレートがアニーリングすると、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマーから伸張させるために用いられ、１コピーのテンプレートが合成される。ＤＮＡ鎖が変性させられる。この手順が、十分なＤＮＡが生じて、臭化エチジウム染色およびゲル電気泳動による可視化を可能にするまで多数回繰り返される。
【０１１６】
増幅は、内分泌腺ガンが疑われる被験者、および、内分泌腺ガンに冒されていない個体から得られるサンプルに対して行うことができる。反応は、少なくとも２桁に及ぶ数個のｃＤＮＡ希釈物に対して行われ得る。非ガン性サンプルの同じ希釈物と比較して、被験者サンプルの数個の希釈物における発現の統計学的に著しい差は、内分泌腺ガンの存在について陽性であると見なすことができる。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明は、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにするための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得られたサンプルを、カリクレイン１４タンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと接触させること；および（ｂ）核酸分子にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルを、所定のカットオフ値に対して、サンプルにおいて検出し、それから、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにすることを含む。
【０１１８】
本発明は、カリクレイン１４のｍＲＮＡが、（ａ）サンプルからｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換するための試薬と一緒にすること、（ｂ）変換されたｃＤＮＡを、増幅反応試薬、および、カリクレイン１４をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションする核酸プライマーで処理して、増幅生成物を生じさせること、（ｄ）増幅生成物を分析して、カリクレイン１４をコードするｍＲＮＡの量を検出すること、および（ｅ）ｍＲＮＡの量を、類似する核酸プライマーを使用して得られた正常な組織および悪性の組織について予測値のパネルに対して検出された量と比較することによって検出される方法を提供する。
【０１１９】
カリクレイン陽性サンプルあるいはカリクレインの高まったレベル、特に、コントロール（例えば、ガン性組織）と比較して、患者におけるカリクレイン１４核酸の著しく高まったレベルは、早期段階の疾患（病期ＩまたはＩＩ）、最適な縮小化を示し、かつ／または、患者が化学療法に応答し得ることを示す。コントロール（例えば、ガン性組織またはカリクレイン陰性組織）と比較して、カリクレイン陽性サンプルまたはカリクレインの高まったレベルはまた、より長い進行のない疾患生存および全生存を示し得る。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明は、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにするための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から得られたサンプルを、カリクレイン１５をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと接触させること；および（ｂ）核酸分子にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルを、所定のカットオフ値に対して、サンプルにおいて検出し、それから、被験者における内分泌腺ガンの存在または非存在を明らかにすることを含む。
【０１２１】
本発明は、カリクレイン１５のｍＲＮＡが、（ａ）サンプルからｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換するための試薬と一緒にすること、（ｂ）変換されたｃＤＮＡを、増幅反応試薬、および、カリクレイン１５をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションする核酸プライマーで処理して、増幅生成物を生じさせること、（ｄ）増幅生成物を分析して、カリクレイン１５をコードするｍＲＮＡの量を検出すること、および（ｅ）ｍＲＮＡの量を、類似する核酸プライマーを使用して得られた正常な組織および悪性の組織について予測値のパネルに対して検出された量と比較することによって検出される方法を提供する。
【０１２２】
陽性サンプルあるいはカリクレインの高まったレベル、特に、コントロール（例えば、正常または良性）と比較して、患者におけるカリクレイン１５核酸の著しく高まったレベルは、内分泌腺ガンを示す。コントロール（例えば、正常または良性）と比較して、カリクレイン陽性サンプルまたはカリクレインの高まったレベルはまた、低下した進行のない疾患生存および全生存を示し得る。
【０１２３】
ＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長いフラグメントを、マイクロアレイにおいて標的として使用することができる。マイクロアレイは、非常に多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために、また、遺伝子の変化体、変異および多型を同定するために使用することができる。マイクロアレイから得られる情報は、遺伝子機能を明らかにするために、障害の遺伝的基礎を理解するために、障害を診断するために、また、治療剤を開発し、その活性をモニターするために使用することができる。
【０１２４】
マイクロアレイの調製、使用および分析は当業者には広く知られている（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ、Ｔ．Ｍ．他（１９９５）、米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ他（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：１０６１４〜１０６１９；Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ他（１９９５）、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９５／２５１１１６；Ｓｈａｌｏｎ、Ｄ．他（１９９５）、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９５／３５５０５；Ｈｅｌｌｅｒ、Ｒ．Ａ．他（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４：２１５０〜２１５５；および、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．他（１９９７）、米国特許第５，６０５，６６２号を参照のこと）。
【０１２５】
従って、本発明はまた、ＫＬＫ１２マーカー、ＫＬＫ１４マーカーおよび／またはＫＬＫ１５マーカー、ならびに、場合によっては他のガンマーカーを含むアレイを包含する。アレイは、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１４および／またはＫＬＫ１５の発現をアレイにおいてアッセイするために使用することができる。本発明は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の発現の定量を可能にする。
【０１２６】
１つの実施形態において、アレイは、ＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチドおよび／またはＫＬＫ１５ポリヌクレオチドの発現の時間的経過をアレイにおいてモニターするために使用することができる。これは、腫瘍進行などの様々な生物学的状況において行うことができる。
【０１２７】
アレイはまた、正常な細胞および異常な細胞におけるＫＬＫ１２ポリヌクレオチド、ＫＬＫ１４ポリヌクレオチドおよび／またはＫＬＫ１５ポリヌクレオチド、ならびに、場合によっては他のガンマーカーの示差的な発現パターンを確認するために有用である。これは、診断または治療的介入のための分子標的として役立ち得る１組の核酸を提供し得る。
【０１２８】
タンパク質法
結合性薬剤を様々な診断的適用およびアッセイ適用のために使用することができる。様々なアッセイ形式が、結合性薬剤を使用してサンプル中の標的分子を検出するために当業者には知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８］を参照のこと）。一般には、被験者におけるガンの存在または非存在を、（ａ）被験者から得られたサンプルを結合性薬剤と接触させること、（ｂ）結合性薬剤に結合しているポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出すること、および（ｃ）ポリペプチドのレベルを所定の標準値またはカットオフ値と比較することによって明らかにすることができる。
【０１２９】
本発明の特定の実施形態において、結合性薬剤は抗体である。
【０１３０】
１つの局面において、本発明は、被験者から得られた生物学的サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を定量することにより被験者における内分泌腺ガンをモニターまたは診断するための診断方法を提供し、この方法は、サンプルを、検出可能な物質で直接的または間接的に標識される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体と反応させること、および、検出可能な物質を検出することを含む。本発明の特定の実施形態において、カリクレイン１４が定量または測定される。
【０１３１】
本発明の１つの局面において、内分泌腺ガンを検出するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）前立腺ガンに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を含有することが疑われるサンプルを得ること、
（ｂ）前記サンプルを、抗体と結合し、かつ複合体を形成するために効果的な条件のもとで、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５と特異的に結合する抗体と接触させること、
（ｃ）複合体の量を定量することによって、サンプルに存在するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量を測定すること、および
（ｄ）サンプルに存在するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量を、コントロールにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量と比較すること
を含み、この場合、コントロールにおける量と比較して、サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量の変化または著しい差により、内分泌腺ガンが示される。
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明では、個体における内分泌腺ガンの進行をモニターするための方法が意図され、この方法は、
（ａ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に結合する抗体を、個体から得られたサンプルと接触させて、その結果、抗体と、サンプル中のカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５とを含む複合体を形成させるようにすること、
（ｂ）サンプルにおける複合体形成の存在または量を決定または検出すること、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）をその後の時点で繰り返すこと、および
（ｄ）工程（ｂ）の結果を工程（ｃ）の結果と比較すること
を含み、この場合、複合体形成の量の差により、前記個体における疾患、疾患段階、および／またはガンの進行が示される。
【０１３３】
複合体の量はまた、内分泌腺ガンの危険性がない個体、または種々の段階にある内分泌腺ガンに冒されている個体に由来する複合体の量を表す値と比較することができる。複合体形成の著しい差は、進行した疾患、例えば、進行した内分泌腺ガン、または好ましくない予後を示し得る。
【０１３４】
本発明の方法の実施形態において、カリクレイン１４がサンプルにおいて検出され、高まったレベル、特に、コントロール（例えば、正常または良性）と比較して著しく高まったレベルにより、内分泌腺ガンまたは乳ガンが示される。
【０１３５】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質と特異的に反応し得る抗体、または誘導体（酵素コンジュゲートまたは標識された誘導体など）を、様々なサンプル（例えば、生物学的材料）におけるカリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質を検出するために使用することができる。それらは診断試薬または予後試薬として使用することができ、また、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の発現レベルにおける異常、構造における異常、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の時間的、組織的、細胞的または細胞内の存在位置を検出するために使用することができる。抗体はまた、潜在的な治療化合物をインビトロでスクリーニングして、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質を伴う障害（例えば、内分泌腺ガン）、ならびに他の状態に対するその効果を明らかにするために使用することができる。インビトロ免疫アッセイもまた、特定の治療の効力を評価またはモニターするために使用することができる。
【０１３６】
抗体は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の抗原性決定基と抗体との間での結合相互作用に依拠する任意の知られている免疫アッセイにおいて使用することができる。流体サンプルにおける抗原のインビトロ検出のための免疫アッセイ手法もまたこの分野では広く知られている［例えば、免疫アッセイ手法の一般的な記載については、Ｐａｔｅｒｓｏｎ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．、３７：６５９（１９８６）；および、Ｂｕｒｃｈｅｌｌ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．、３４：７６３（１９８４）を参照のこと］。サンプル中のカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の定量的および／または定性的な測定は、直接的または間接的のいずれかの形式であっても、競合的または非競合的な免疫アッセイ手法によって達成することができる。抗体を使用する、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の検出は、フォワード様式、リバース様式または同時様式のいずれかで操作される免疫アッセイを利用して行うことができる。免疫アッセイの例には、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光、免疫沈殿、ラテックス凝集、赤血球凝集、組織化学的試験およびサンドイッチ（免疫測定）アッセイが含まれる。これらの用語は当業者によって十分に理解される。当業者は、過度な実験を伴うことなく、他の免疫アッセイ形式を理解するであろうし、または容易に認識することができる。
【０１３７】
本発明の１つの実施形態によれば、生物学的サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を検出するための免疫アッセイは、サンプル中のカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的に結合する結合性薬剤を、結合性薬剤と、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５とを含む第１の複合体の形成を可能にする条件のもとで接触させること、および、サンプルに含有されるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の量の大きさとしての複合体の存在または量を明らかにすることを含む。特定の実施形態において、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に対する結合性薬剤は、異なるように標識されるか、または、異なる標識に結合することができる。
【０１３８】
病理学的状態を診断および処置するために、抗体は、サンプル中のカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を検出および定量するために使用することができる。特に、抗体は、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質を検出するために、また、それらを特定の内分泌腺腫瘍細胞および内分泌腺腫瘍細胞組織ならびに特定の細胞内位置に突き止めるために、また、発現レベルを定量するために、例えば、細胞レベルおよび細胞内レベルで、免疫組織化学的分析において使用することができる。
【０１３９】
組織サンプルにおける抗原を検出するための免疫組織化学的方法がこの分野では広く知られている。例えば、免疫組織化学的方法が、Ｔａｙｌｏｒ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１０２：１１２（１９７８）に記載される。簡単に記載すると、本発明の関連では、内分泌腺に関連した問題を有することが疑われる被験者から得られた組織サンプルが、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を認識する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）と接触させられる。抗体が結合する部位が、標準的な免疫組織化学的手法によるサンプルの選択的染色によって明らかにされる。同じ手法が、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を認識する別の抗体を使用して同じサンプルに対して繰り返すことができる。あるいは、抗体が異なるように標識されているか、または、異なる標識に結合することができるならば、サンプルは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に対する抗体と同時に接触させることができる。本発明の１つの実施形態において、組織サンプルが患者の卵巣から得られる。組織サンプルは、正常な内分泌腺組織、ガン組織または良性の組織であり得る。
【０１４０】
本発明のサンドイッチ免疫アッセイでは、マウスのポリクローナル抗体およびウサギのポリクローナル抗体が利用される。
【０１４１】
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体を検出可能な物質で標識することができ、そして、検出可能な物質の存在に基づいて生物学的サンプルにおいて存在位置を突き止めることができる。検出可能な物質の例には、限定されないが、下記の物質が含まれる：放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランンタニド蛍光体）、発光性標識（例えば、ルミノールなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチニル基（これは、標識されたアビジンによって、例えば、蛍光マーカーを含有するか、または、光学的方法もしくは比色測定法によって検出され得る酵素活性を含有するストレプトアビジンによって検出することができる）、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体的障害を低下させるために、様々な長さのスペーサーアームを介して結合される。抗体はまた、電子顕微鏡観察によって容易に可視化される高電子密度物質（例えば、フェリチンまたはコロイド状金など）に結合させることができる。
【０１４２】
抗体が検出されるように標識され得る方法の１つは、抗体を酵素に直接的に連結することである。酵素は、後でその基質に曝されたとき、検出することができる生成物をもたらす。酵素である検出可能な物質の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスファート、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスファート、トリオースホスファートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコールオキシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがある。
【０１４３】
免疫アッセイシステムにおける増大した感度のためには、蛍光を放出する金属原子（例えば、Ｅｕ（ユーロピウム）および他のランタニドなど）を使用することができる。これらは、金属キレート化基によって、例えば、ＤＴＰＡまたはＥＤＴＡなどによって所望の分子に結合させることができる。
【０１４４】
生物発光化合物もまた、検出可能な物質として使用することができる。生物発光は、触媒作用タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物学的システムに見出される一種の化学発光である。生物発光分子の存在が、発光の存在を検出することによって明らかにされる。生物発光性の検出可能な物質の例には、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンがある。
【０１４５】
間接的な方法もまた用いることができ、この場合、一次の抗原−抗体反応が、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に対する反応性を有する抗体について特異性を有する第２の抗体の導入によって増幅される。例として、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に対する特異性を有する抗体がウサギのＩｇＧ抗体である場合、第２の抗体は、本明細書中に記載されるような検出可能な物質で標識されたヤギ抗ウサギγ−グロブリンであり得る。
【０１４６】
上記で議論された抗体をコンジュゲート化または標識するための様々な方法が当業者によって容易に達成され得る（例えば、抗体を酵素またはリガンド結合パートナーとコンジュゲート化または標識するための方法に関しては、Ｉｎｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３４巻、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ  Ｂ、ＪａｋｏｂｙおよびＷｉｃｈｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３０頁、１９７４；ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、“Ｔｈｅ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７１：１〜３２、１９８８を参照のこと）。
【０１４７】
光学顕微鏡観察および電子顕微鏡観察を使用して抗原の存在位置を突き止めるための、この分野で知られている細胞化学的技術を、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質を検出するために使用することができる。一般には、抗体を検出可能な物質で標識することができ、そして、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質を、検出可能な物質の存在に基づいて組織および細胞において突き止めることができる。
【０１４８】
本発明の方法に関連して、サンプル、結合性薬剤（例えば、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体）、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をキャリアまたは担体に固定化することができる。好適なキャリアまたは担体の例には、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、リポソーム、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ガブロス（ｇａｂｂｒｏｓ）、ろ紙、マグネタイト、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラス、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体、ナイロン、シルクなどがある。担体物質は、球状（例えば、ビーズ）、円筒状（例えば、試験管またはウエルの内側表面、あるいはロッドの外側表面）、または平坦状（例えば、シート、試験片）を含めて任意の可能な形態を有することができる。従って、キャリアは、例えば、チューブ、試験プレート、ウエル、ビーズ、ディスク、球体などの形態であり得る。固定化された抗体は、知られている化学的方法または物理的方法を使用して、例えば、臭化シアノゲンカップリングを使用して、材料を好適な不溶性キャリアと反応することによって調製することができる。抗ｈＫ５抗体を、この抗体について特異的な第２の抗体を使用して間接的に固定化することができる。例えば、マウス抗ｈＫ５抗体を、キャリアまたは担体に被覆されたヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）抗体を使用して固定化することができる。
【０１４９】
放射性の標識が検出可能な物質として使用される場合、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質はオートラジオグラフィーによってその存在位置を突き止めることができる。オートラジオグラフィーの結果は、様々な光学的方法によりオートラジオグラフにおける粒子の密度を測定することによって、または粒子を計数することによって定量することができる。
【０１５０】
時間分解蛍光測定法を、シグナルを検出するために使用することができる。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ＴＫおよびＤｉａｍａｎｄｉｓ  ＥＰ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９９２：６４：３４２〜３４６に記載される方法を、従来の時間分解型蛍光計とともに使用することができる。
【０１５１】
本発明の１つの実施形態によれば、カリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体が酵素で直接的または間接的に標識される方法が提供され、酵素に対する基質が添加される。この場合、基質は、基質、または、酵素および基質の反応生成物が、ランタニド金属（例えば、ユーロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム、好ましくはユーロピウムおよびテルビウム）との蛍光性複合体を形成するように選択される。ランタニド金属が添加され、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５が、蛍光性複合体の蛍光を測定することによってサンプルにおいて定量される。酵素は、ユーロピウムおよびテルビウムなどのランタニド金属との複合体を形成する酵素の基質の能力、または、酵素および基質の反応生成物の能力に基づいて選択される。蛍光性複合体をもたらす好適な酵素および基質が米国特許第５，３１１２，９２２号（Ｄｉａｍｎｄｉｓ）に記載される。好適な酵素の例には、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。好ましくは、酵素はアルカリホスファターゼである。
【０１５２】
そのような蛍光性複合体をもたらす酵素および酵素用基質の例が５，３１２，９２２号（Ｄｉａｍｎｄｉｓ）に記載される。例として、抗体がアルカリホスファターゼで直接的または間接的に標識されているとき、この方法において用いられる基質は、４−メチルウンベリフェリルホスファート、５−フルオロサリチルホスファート、またはジフルニサールホスファートであり得る。複合体の蛍光強度は、典型的には、時間分解型蛍光計を使用して、例えば、ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５免疫分析計（Ｎｏｒｄｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｋａｎａｔａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して測定される。
【０１５３】
カリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体はまた、酵素で間接的に標識することができる。例えば、抗体をリガンド結合対の一方のパートナーにコンジュゲート化することができ、酵素をリガンド結合対のもう一方のパートナーに結合させることができる。代表的な例には、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が含まれる。１つの実施形態において、抗体がビオチン化され、酵素がストレプトアビジンに結合される。別の実施形態において、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体について特異的な抗体が酵素で標識される。
【０１５４】
１つの実施形態によれば、本発明は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を免疫アッセイにより測定することによって、サンプル（特に、血清サンプル）におけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を明らかにするための手段を提供する。様々な免疫アッセイ方法が、血清中のカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を測定するために使用され得ることは当業者には明白である。一般に、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の免疫アッセイ方法は競合的または非競合的であり得る。競合的方法では、典型的には、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５に対する固定化抗体または固定化可能な抗体（抗カリクレイン１２、抗カリクレイン１４または抗カリクレイン１５）、および、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５の標識された形態が用いられる。サンプルのカリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５、および、標識されたカリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５は、抗カリクレイン１２、抗カリクレイン１４または抗カリクレイン１５に対する結合について競合する。抗カリクレイン１２、抗カリクレイン１４または抗カリクレイン１５に結合した得られる標識されたカリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５（結合画分）を、未結合のままである標識されたカリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５（非結合画分）から分離した後、結合画分または非結合画分のいずれかにおける標識の量が測定され、そして、任意の従来の様式によって、例えば、標準曲線との比較によって、試験サンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５の量と相関させられ得る。
【０１５５】
１つの局面において、非競合的方法が、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５の検出のために使用され、この場合、最も一般的な方法は「サンドイッチ」法である。このアッセイでは、２つの抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体または抗カリクレイン１５抗体が用いられる。抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体または抗カリクレイン１５抗体の一方が直接的または間接的に標識され（これは「検出抗体」と呼ばれることがある）、もう一方が固定化されるか、または固定化可能である（これは「捕獲抗体」と呼ばれることがある）。捕獲抗体および検出抗体は、試験サンプルと、同時または逐次的に接触させることができる。逐次的な方法は、捕獲抗体をサンプルとインキュベーションし、検出抗体をその後の所定の時間で加えることによって達成することができる（これは「フォワード」法と呼ばれることがある）。あるいは、検出抗体を最初にサンプルとインキュベーションすることができ、次いで捕獲抗体を加えることができる（これは「リバース」法と呼ばれることがある）。必要なインキュベーションが行われた後、アッセイを完了させるために、捕獲抗体が液体の試験混合物から分離され、標識が、分離された捕獲抗体相の少なくとも一部分において、または、液体の試験混合物の残り部分の少なくとも一部分において測定される。一般に、捕獲抗体は捕獲抗体相において測定される。これは、捕獲抗体相は、捕獲抗体および検出抗体が結合した（捕獲抗体および検出抗体の間で「サンドイッチ」になった）カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５を含むからである。１つの実施形態において、標識が、捕獲抗体および液体の試験混合物を分離することなく測定され得る。
【０１５６】
カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５に対する典型的な二部位免疫測定アッセイでは、捕獲抗体および検出抗体の一方または両方がポリクローナル抗体であり、あるいは、捕獲抗体および検出抗体の一方または両方がモノクローナル抗体である（すなわち、ポリクローナル／ポリクローナル、モノクローナル／モノクローナルまたはモノクローナル／ポリクローナル）。検出抗体において使用される標識は、この分野で従来から知られている標識のいずれかから選択することができる。標識は酵素または化学発光成分であり得るが、しかし、放射性同位体、蛍光団、および検出可能なリガンド（例えば、リガンドに対する標識された結合パートナーによる二次的な結合によって検出可能）などもまた可能である。好ましくは、抗体は、酵素および基質の反応生成物が蛍光性複合体を形成するように選択される基質を添加することによって検出される酵素で標識される。捕獲抗体は、試験混合物の残り部分から分離されるための手段を提供するように選択される。従って、捕獲抗体は、既に固定化された形態または不溶性の形態でアッセイに導入され得るか、あるいは、固定化可能な形態（すなわち、固定化がアッセイへの捕獲抗体の導入に続いて達成されることを可能にする形態）であり得る。固定化された捕捉抗体は、磁石粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートウエル、ビーズ、キュベットまたは他の反応容器などの固相に共有結合的または非共有結合的に結合した抗体を含むことができる。固定化可能な捕獲抗体の一例が、リガンド成分（例えば、ハプテンまたはビオチンなど）で化学的に修飾され、続いて、リガンドに対する結合パートナー（例えば、抗体またはアビジンなど）の固定化された形態との接触によって固定化され得る抗体である。１つの実施形態において、捕獲抗体は、固相に結合している捕獲抗体について種特異的な抗体を使用して固定化することができる。
【０１５７】
本発明の特定のサンドイッチ免疫アッセイ方法では、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５に対して反応し得る２つの抗体、酵素標識で標識された、カリクレイン１２、カリクレイン１４またはカリクレイン１５に対して反応し得る抗体に対する特異性を有する第２の抗体、および、酵素に対する蛍光生成基質が用いられる。１つの実施形態において、酵素はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）であり、基質は５−フルオロサリチルホスファートである。ＡＬＰは蛍光生成基質の５−フルオロサリチルホスファートからリン酸を切断して、５−フルオロサリチル酸（ＦＳＡ）をもたらす。その後、５−フルオロサリチル酸はＦＳＡ−Ｔｂ（３＋）−ＥＤＴＡの形態で非常に蛍光性の三元複合体を形成することができ、この複合体は、時間分解様式でＴｂ３＋の蛍光を測定することによって定量することができる。蛍光強度は、本明細書中に記載されるような時間分解型蛍光計を使用して測定される。
【０１５８】
上記の免疫アッセイ方法および免疫アッセイ形式は例示であることが意図され、限定ではない。
【０１５９】
コンピューターシステム
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては内分泌腺ガンの他のマーカーを含むコンピューター読み取り可能な媒体もまた提供される。「コンピューター読み取り可能な媒体」は、コンピューターによる直接的な読み取りおよびアクセスが行われ得る任意の媒体を示し、これには、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープなど）、光学記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭなど）、電気的記憶媒体（例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭなど）、および、これらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体など）が含まれるが、これらに限定されない。従って、本発明では、患者およびコントロールについて同定されたマーカーが記録されているコンピューター読み取り可能な媒体が意図される。
【０１６０】
「記録された」は、情報をコンピューター読み取り可能な媒体に保存するためのプロセスを示す。当業者は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーに関する情報を含む製造物を作製するために、情報をコンピューター読み取り可能な媒体に保存するための現在知られている方法のいずれかを容易に採用することができる。
【０１６１】
データー処理装置の様々なプログラムおよび形式を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、他の内分泌腺ガンマーカーに関する情報をコンピューター読み取り可能な媒体に保存するために使用することができる。例えば、そのような情報は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏＳｏｆｔ  Ｗｏｒｄなどの市販のソフトウエアでフォーマットされた文書作成処理用テキストファイルで表すことができ、あるいは、ＤＢ２、ＳｙｂａｓｅまたはＯｒａｃｌｅなどのデータベース適用で保存されたＡＳＣＩＩファイルの形態で表すことができる。いくつものデータプロセッサー構造化形式（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を、マーカー情報が保存されているコンピューター読み取り可能な媒体を得るために適合化することができる。
【０１６２】
マーカー情報をコンピューター読み取り可能な形態で提供することによって、様々な目的のためにその情報を日常的にアクセスすることができる。例えば、当業者は、治療時または治療後に得られたマーカー情報をデータ記憶手段内に保存されている情報と比較するために、コンピューター読み取り可能な形態における情報を使用することができる。
【０１６３】
本発明は、患者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにするための方法を行うための説明書を収容するための媒体を提供する。この場合、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーの存在または非存在を明らかにすること、そして、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに他のマーカーの存在または非存在に基づいて、患者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにすること、そして、場合によっては、内分泌腺ガンまたは前疾患状態についての処置を勧告することを含む。
【０１６４】
本発明はまた、患者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにするための方法を、電子的システムで、かつ／またはネットワークで提供する。この場合、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーの存在または非存在を明らかにすること、そして、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーの存在または非存在に基づいて、患者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにすること、そして、場合によっては、内分泌腺ガンまたは前疾患状態についての処置を勧告することを含む。
【０１６５】
本発明はさらに、患者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにするための方法をネットワークで提供する。この場合、この方法は、（ａ）被験者に関する表現型情報と、被験者由来のサンプルに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーに関する情報とを受け取ること、（ｂ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーに対応するネットワークから情報を取得すること、および（ｃ）表現型情報と、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーに関する情報とに基づいて、被験者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにすること、および（ｄ）場合によっては、内分泌腺ガンまたは前疾患状態についての処置を勧告することを含む。
【０１６６】
本発明はなおさらに、内分泌腺ガンの細胞または組織を同定する選択された記録を同定するためのシステムを提供する。本発明のシステムは、一般には、デジタルコンピューター、コンピューターに接続されたデータベースサーバー、データがそれに保存されるデータベースサーバーに接続されたデータベース（この場合、データは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーを含むデータの記録を含む）、および、所望の選択基準に基づく質問をデータベース内のデータファイルに適用して、所望の選択基準と合致する記録の報告をもたらすためのコード機構を含む。
【０１６７】
本発明の１つの局面において、プロセッサー、メモリー、ディスプレーおよび出入力デバイスを有するコンピューターを使用して内分泌腺ガンの組織または細胞を検出するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）内分泌腺ガンの細胞または組織を含有することが疑われるサンプルから単離されたカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーの記録を作成する工程、
（ｂ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーを含むデータの記録を含むデータベースを提供する工程、および
（ｃ）所望の選択基準に基づく質問をデータベース内のデータファイルに適用して、工程（ｂ）のデータベースの所望の選択基準の合致をもたらす工程（ａ）の記録の報告をもたらすためのコード機構を使用する工程
を含み、この場合、合致の存在は、工程（ａ）のマーカーが、内分泌腺ガンの細胞または組織である細胞または組織から単離されているということの肯定的な表示である。
【０１６８】
本発明では、被験者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにするための事業方法が意図され、この方法は、（ａ）被験者に関する表現型情報と、被験者由来のサンプルに関連するカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーに関する情報とを受け取ること、（ｂ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーに対応するネットワークから情報を取得すること、および（ｃ）表現型情報と、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーに関する情報と、取得された情報とに基づいて、被験者が内分泌腺ガンを有するか、または、内分泌腺ガンに対する素因を有するかを明らかにすること、および（ｄ）場合によっては、内分泌腺ガンまたは前疾患状態についての処置を勧告することを含む。
【０１６９】
本発明の１つの局面において、本明細書中に記載されるコンピューターシステム、構成要素および方法は、疾患をモニターするために、または疾患段階を決定するために使用される。
【０１７０】
画像化方法
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な結合性薬剤（特に抗体）は、内分泌腺ガンの管理における画像化方法論において使用することができる。本発明は、１つ以上のカリクレイン、好ましくは、内分泌腺ガンに関連するカリクレイン、最も好ましくは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、場合によっては、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、およびカリクレイン１１に関連する腫瘍を画像化するための方法を提供する。
【０１７１】
本発明ではまた、内分泌腺ガンについて多数のマーカーを使用する本明細書中に記載される画像化方法が意図される。例えば、内分泌腺ガンを画像化するための方法はさらに、ヒト角質層キモトリプシン活性酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５．３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、インヒビン、プロスタチン、ＯＶＸ１、ＬＡＳＡ、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）またはガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する薬剤の１つ以上を患者に注射することを含むことができる。好ましくは、それぞれの薬剤が、画像化時に識別され得るように標識される。
【０１７２】
１つの実施形態において、この方法はインビボ方法であり、被験者または患者には、画像化のための標識を有し、かつ、特定のカリクレインを標的化し、これに結合することができる１つ以上の薬剤が投与される。薬剤は、インビボでインキュベーションして、腫瘍（好ましくは、内分泌腺腫瘍）に関連するカリクレイン（１つまたは複数）に結合させることができる。標識の存在が内分泌腺ガンに局在化し、局在化した標識が、当業者に知られている画像化装置を使用して検出される。
【０１７３】
薬剤は、そのようなカリクレイン（１つまたは複数）を認識する抗体または化学的実体であり得る。本発明の１つの局面において、薬剤は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそのフラグメント、またはその構築物（これには、単鎖抗体、二機能性抗体、分子状の認識ユニット、および、ペプチド、またはペプチドを模倣する実体が含まれるが、これらに限定されない）である。本発明の方法において使用されるカリクレインについて特異的な抗体は科学的供給元または商業的供給元から得ることができ、あるいは、単離された天然のカリクレインまたは組換えカリクレインを、本明細書中に記載されるように、抗体などを調製するために利用することができる。
【０１７４】
薬剤は、特定のカリクレインについて特異的な抗体に対するエピトープを模倣し、かつ、そのカリクレインに結合するペプチドであり得る。ペプチドは、従来の固相化学を使用する市販の合成機で製造することができる。例として、Ｎ２Ｓ２キレートが錯体形成するチロシン、リシンまたはフェニルアラニンのいずれかを含むペプチドを調製することができる（米国特許第４，８９７，２５５号を参照のこと）。抗カリクレインペプチドコンジュゲートは、その後、放射性標識（例えば、９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸ナトリウムまたは１８８Ｒｅ−過レニウム酸ナトリウム）と一緒にされ、これは、カリクレイン産生腫瘍を探し出すために使用することができる。
【０１７５】
薬剤は、カリクレインを画像化するための標識を有する。薬剤は、放射性核種画像化における使用のために標識することができる。特に、薬剤は放射性同位体で直接的または間接的に標識することができる。本発明において使用され得る放射性同位体の例には、下記の放射性同位体が挙げられる：２７７Ａｃ、２１１Ａｔ、１２８Ｂａ、１３１Ｂａ、７Ｂｅ、２０４Ｂｉ、２０５Ｂｉ、２０６Ｂｉ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒ、１０９Ｃｄ、４７Ｃａ、１１Ｃ、１４Ｃ、３６Ｃｌ、４８Ｃｒ、５１Ｃｒ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１８Ｆ、１５３Ｇｄ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ｇａ、１９８Ａｕ、３Ｈ、１６６Ｈｏ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９Ｉｒ、１９１ｍＩｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１５Ｏ、１９１ｍ−１９１Ｏｓ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、３３Ｐ、４２Ｋ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８２ｍＲｂ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、２２Ｎａ、２４Ｎａ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、３８Ｓ、１７７Ｔａ、９６Ｔｃ、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、２０２Ｔｌ、１１３Ｓｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、８８Ｙ、９０Ｙ、６２Ｚｎおよび６５Ｚｎ。好ましくは、放射性同位体は、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉ、９９ｍＴｃ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、３２Ｐ、１５３Ｓｍ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、７７Ｂｒまたは１８Ｆであり、フォトスキャニング装置を用いて画像化される。
【０１７６】
生物学的薬剤を放射性同位体で標識するための様々な手法がこの分野では一般に知られている。米国特許第４，３０２，４３８号には、トリチウム標識化手法が記載される。マウスのモノクローナル抗体について適合化されたヨウ素化手法、トリチウム標識化手法および３５Ｓ標識化手法が、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ．Ｗ．（上掲、１２４頁〜１２６頁）およびそれに引用された参考文献に記載される。生物学的薬剤、例えば、抗体、その結合性部分、プローブまたはリガンドなどをヨウ素化するための他の手法が科学文献に記載される（ＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４〜１０２１（１９７４）；ならびに、米国特許第３，８６７，５１７号および同第４，３７６，１１０号を参照のこと）。様々な薬剤に対するヨウ素化手法が、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、８９：１１４〜１２３（１９６３）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１１３：２９９〜３０５（１９６９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８９〜２９７（１９７１）によって記載される。９９ｍＴｃ標識化手法が、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．他により、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．他（編）、Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｓｓｏｎ  １１１〜１２３（１９８２）に記載され、また、それに引用される参考文献に記載される。テクネチウム−９９ｍを用いた抗体またはフラグメントの標識化もまた、例えば、米国特許第５，３１７，０９１号、米国特許第４，４７８，８１５号、米国特許第４，４７８，８１８号、米国特許第４，４７２，３７１号、米国再発行特許第３２，４１７号および米国特許第４，３１１，６８８号に記載される。生物学的薬剤を１１１Ｉｎ標識化するための手法が、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：１４７〜１５７（１９８３）；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．他、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ、３５：５５４〜５５７（１９８４）；および、Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．他、Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．、１６６：２０２〜２０４（１９８４）によって記載される。
【０１７７】
薬剤はまた、本発明のインビボ方法の目的のために常磁性同位体で標識することができる。磁気共鳴画像化において有用である元素の例には、ガドリニウム、テルビウム、スズ、鉄またはそれらの同位体が含まれる（例えば、インビボ核磁気共鳴画像化に関する議論については、Ｓｃｈａｅｆｅｒ他（１９８９）、ＪＡＣＣ、１４、４７２〜４８０；Ｓｈｒｅｖｅ他（１９８６）、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．、３、３３６〜３４０；Ｗｏｌｆ，Ｇ  Ｌ．（１９８４）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ、１６、９３〜９５；Ｗｅｓｂｅｙ他（１９８４）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ、１６、１４５〜１５５；Ｒｕｎｇｅ他（１９８４）、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９、４０８〜４１５を参照のこと）。
【０１７８】
放射能標識された薬剤の場合、薬剤を患者に投与することができ、薬剤は、薬剤が結合する特定のカリクレインを有する腫瘍に局在化し、例えば、ガンマカメラまたは放射断層撮影法を使用する放射核スキャニングなどの知られている技術を使用してインビボで検出または「画像化」される［例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ他、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、６５頁〜８５頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照のこと］。陽電子放射トランスアキシアル断層撮影スキャナー（例えば、Ｐｅｔ  ＶＩ（これはＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに設置されている）と呼ばれるスキャナーなど）もまた、放射性標識が陽電子を放出する場合（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎ）、使用することができる。
【０１７９】
放射性同位体で標識された薬剤を使用する全身画像化技術を、原発性腫瘍および転移した腫瘍の両方を探し出すために使用することができる、カリクレインについて特異的な抗体、または同じエピトープ特異性を有するそのフラグメントが、好適な放射性同位体またはその組合せに結合させられ、非経口投与される。内分泌腺ガンの場合、投与は好ましくは静脈内である。標識の生体分布をシンチグラフィーによってモニターすることができ、そして、標識の蓄積が内分泌腺ガン細胞の存在に関係づけられる。全身画像化技術が米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３１１，６８８号に記載される。抗体および抗体フラグメントに結合させることができる、診断および治療的使用のために有用である薬剤の他の例には、メタロチオネインおよびフラグメントが含まれる（米国特許第４，７３２，８６４号を参照のこと）。これらの薬剤は、ガン（特に内分泌腺ガン）の診断的段階決定および可視化において有用であり、その結果、手術処置プロトコルおよび／または放射線処置プロトコルがより効率的に使用され得る。
【０１８０】
画像化剤は生物発光標識または化学発光標識を有することができる。そのような標識には、蛍光性、生物発光性または化学発光性であることが知られているポリペプチド、あるいは、特定の基質（試薬）に対して酵素として作用するか、または、蛍光分子、生物発光分子もしくは化学発光分子を生じさせることができるポリペプチドが含まれる。生物発光性標識または化学発光性標識の例には、ルシフェラーゼ、エクオリン、オベリン、ムネミオプシン、ベロビン、フェナントリジニウムエステル、およびそれらの変化体、ならびにそれらの組合せが含まれる。生物発光ポリペプチドまたは化学発光ポリペプチドに対する基質もまた本発明の方法において使用することができる。例えば、化学発光ポリペプチドはルシフェラーゼであり得るし、試薬はルシフェリンであり得る。生物発光標識または化学発光標識に対する基質は、薬剤の投与前に、または（例えば、同じ配合物での）薬剤の投与と同時に、または薬剤の投与後に投与することができる。
【０１８１】
画像化剤は、常磁性化合物、例えば、金属（例えば、メタロポルフィリン）にキレート化したポリペプチドなどを含むことができる。常磁性化合物はまた、単結晶ナノ粒子、例えば、ランタニド（例えば、Ｇｄ）または酸化鉄を含むナノ粒子；あるいは、ランタニドを含む金属イオンを含むことができる。「ランタニド」は、原子番号５８〜７０の元素、原子番号２１〜２９または原子番号４２または原子番号４４の遷移金属、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、あるいは、Ｆｅ族元素を含む元素を示す。常磁性化合物はまた、ネオジミウム鉄酸化物（ＮｄＦｅＯ３）またはジスプロシウム鉄酸化物（ＤｙＦｅＯ３）をも含むことができる。磁気共鳴画像化において有用である元素の例には、ガドリニウム、テルビウム、スズ、鉄またはそれらの同位体が含まれる（例えば、インビボ核磁気共鳴画像化に関する議論については、Ｓｃｈａｅｆｅｒ他（１９８９）、ＪＡＣＣ、１４、４７２〜４８０；Ｓｈｒｅｖｅ他（１９８６）、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．、３、３３６〜３４０；Ｗｏｌｆ，Ｇ  Ｌ．（１９８４）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ、１６、９３〜９５；Ｗｅｓｂｅｙ他（１９８４）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ、１６、１４５〜１５５；Ｒｕｎｇｅ他（１９８４）、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．、１９、４０８〜４１５を参照のこと）。
【０１８２】
画像が、コンピューター支援断層撮影法（ＣＡＴ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）画像、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または生物発光画像化（ＢＬＩ）もしくは同等な方法によって本発明の方法において作製され得る。
【０１８３】
この分野で広く知られているコンピューター支援断層撮影法（ＣＡＴ）およびコンピューター処理アキシアル断層撮影法（ＣＡＴ）のシステムおよび装置を本発明の実施において利用することができる（例えば、米国特許第６，１５１，３７７号、同第５，９４６，３７１号、同第５，４４６，７９９号、同第５，４０６，４７９号、同第５，２０８，５８１号、同第５，１０９，３９７号を参照のこと）。本発明はまた、ＭｉｃｒｏＣＡＴ（商標）（ＩｍＴｅｋ，Ｉｎｃ）などの動物画像化様式を利用することができる。
【０１８４】
この分野で広く知られている磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）のシステムおよび装置を本発明の実施において利用することができる。磁気共鳴法および磁気共鳴装置では、静磁場が、目的とする領域における磁気アラインメントの平衡軸を規定するために組織または身体に加えられる。高周波場が、その後、その領域において磁気共鳴を励起させるために、静磁場方向に直交する方向でその領域に加えられる。その後、得られる高周波シグナルが検出され、処理され、そして、励起用の高周波場が加えられる。得られるシグナルが、目的とする組織または身体領域の近くに置かれた高周波コイルによって検出される（ＭＲＩ法およびＭＲＩ装置の記載については、例えば、米国特許第６，１５１，３７７号、６，１４４，２０２号、同第６，１２８，５２２号、同第６，１２７，８２５号、同第６，１２１，７７５号、同第６，１１９，０３２号、同第６，１１５，４４６号、同第６，１１１，４１０号、同第６０２，８９１号、同第５，５５５，２５１号、同第５，４５５，５１２号、同第５，４５０，０１０号、同第５，３７８，９８７号、同第５，２１４，３８２号、同第５，０３１，６２４号、同第５，２０７，２２２号、同第４，９８５，６７８号、同第４，９０６，９３１号、同第４，５５８，２７９号を参照のこと）。様々なＭＲＩ装置および支援装置が、例えば、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＧＭＢＨ；Ｃａｐｒｉｕｓ；Ｅｓａｏｔｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｆｏｎａｒ；ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＧＥＭＳ）；Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｉｎｔｅｒｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｌｕｎａｒ  Ｃｏｒｐ．；ＭａｇｎｅＶｕ；Ｍａｒｃｏｎｉ  Ｍｅｄｉｃａｌｓ；Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ；Ｓｉｅｍｅｎｓ；Ｔｏｓｈｉｂａ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されており、これらは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓによる画像化システムを含む。本発明はまた、ミクロＭＲＩなどの動物画像化様式を利用することができる。
【０１８５】
この分野で広く知られている陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）のシステムおよび装置を本発明の実施において利用することができる。例えば、本発明の方法では、Ｐｅｔ  ＶＩ（これはＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに設置されている）と呼ばれるシステムを使用することができる。ＰＥＴのシステムおよび装置の記載については、例えば、米国特許第６，１５１，３７７号、同第６，０７２，１７７号、同第５，９００，６３６号、同第５，６０８，２２１号、同第５，５３２，４８９号、同第５，２７２，３４３号、同第５，１０３，０９８を参照のこと。ミクロＰＥＴ（Ｃｏｒｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）などの動物画像化様式もまた本発明において使用することができる。
【０１８６】
この分野で広く知られている単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のシステムおよび装置を本発明の実施において利用することができる（例えば、米国特許第６，１１５，４４６号、同第６，０７２，１７７号、同第５，６０８，２２１号、同第５，６００，１４５号、同第５，２１０，４２１号、同第５，１０３，０９８を参照のこと）。本発明の方法はまた、ミクロＳＰＥＣＴなどの動物画像化様式を利用することができる。
【０１８７】
生物発光画像化では、生物発光、蛍光または化学発光を検出することができる、生物発光、蛍光または化学発光あるいは他の光子の検出システムおよび検出装置が含まれる。高感度な光子検出システムを、生物発光タンパク質および蛍光タンパク質を外部から検出するために使用することができる（例えば、Ｃｏｎｔａｇ（２０００）、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、２：４１〜５２；Ｚｈａｎｇ（１９９４）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１２：８７〜９２を参照のこと）。本発明の方法は、そのような光子検出装置またはその変化型もしくは等価なものを使用して、あるいは、視覚的画像化を含む任意の知られている光子検出方法論と一緒に実施することができる。例として、画像処理装置に接続された増感電荷結合デバイス（ＩＣＣＤ）カメラを本発明において使用することができる（例えば、米国特許第５，６５０，１３５号を参照のこと）。光子検出装置もまた、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｈａｍａｍａｔｓｕから市販されている。
【０１８８】
スクリーニング方法
本発明ではまた、内分泌腺ガンを阻害するか、または、内分泌腺ガンに潜在的に寄与するその能力について試験薬剤または試験化合物を評価するための方法が意図される。試験薬剤または試験化合物には、ペプチド、例えば、Ｉｇテールの融合タンパク質を含む可溶性ペプチド、ランダムペプチドライブラリーのメンバー、Ｄ形態および／またはＬ形態のアミノ酸から作製されるコンビナトリアル化学由来の分子ライブラリーのメンバー、ホスホペプチド（ランダムまたは部分縮重の誘導されたホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む）、抗体［例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメント）］、ならびに、小さい有機分子または無機分子が含まれるが、これらに限定されない。これらの薬剤または化合物は、内因性の生理学的化合物、天然の化合物、または合成化合物であり得る。
【０１８９】
本発明は、患者における内分泌腺ガンを阻害することについて試験薬剤の潜在的効力を評価するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られ、試験薬剤に曝された第１のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーのレベル、および
（ｂ）患者から得られ、試験薬剤に曝されていない第２のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、場合によっては他のマーカーのレベル
を比較することを含み、この場合、第２のサンプルに対して、第１のサンプルにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他のマーカーの発現レベルの著しい差により、その試験薬剤が、患者における内分泌腺ガンを阻害するために潜在的に有効であるということが示される。
【０１９０】
第１のサンプルおよび第２のサンプルは、患者から得られる単一サンプルの一部分であり得るか、または、患者から得られるプールされたサンプルの一部分であり得る。
【０１９１】
１つの局面において、本発明は、患者における内分泌腺ガンを阻害するための薬剤を選択する方法を提供し、この方法は、
（ａ）サンプルを患者から得ること、
（ｂ）サンプルのアリコートを複数の試験薬剤の存在下で個々に維持すること、
（ｃ）アリコートのそれぞれにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーを比較すること、および
（ｄ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーのレベルを、他の試験薬剤に対して、その試験薬剤を含有するアリコートにおいて変化させる試験薬剤の１つを選択すること、
を含む。
【０１９２】
本発明のさらに別の局面により、薬物発見業務を行う方法が提供され、この方法は、
（ａ）患者における内分泌腺ガンを阻害する薬剤を同定するための１つ以上の方法またはアッセイシステムを提供すること、
（ｂ）動物における効力および毒性について、工程（ａ）で同定された薬剤またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを行うこと、および
（ｃ）許容され得る治療プロフィルを有するとして工程（ｂ）で同定された１つ以上の薬剤を含む医薬用調製物を配合すること
を含む。
【０１９３】
特定の実施形態において、本方法はまた、医薬用調製物を販売のために流通させるための流通システムを確立する工程を含むことができ、そして場合によっては、医薬用調製物を市販するための販売グループを確立することを含むことがある。
【０１９４】
本発明ではまた、内分泌腺ガンに寄与する試験化合物の潜在的可能性を評価する方法が意図され、この方法は、
（ａ）内分泌腺ガン疾患から得られた細胞または組織の個々のアリコートを試験化合物の存在下および非存在下で維持すること、および
（ｂ）アリコートのそれぞれにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーのレベルを比較すること
を含む。
【０１９５】
試験化合物の非存在下で維持されたアリコートに対して、試験化合物の存在下で維持されたアリコート（または、試験化合物に曝されたアリコート）おけるマーカーのレベルの著しい差により、その試験化合物は、内分泌腺ガンに寄与する潜在的可能性を有することが示される。
【０１９６】
キット
本発明ではまた、本発明の方法を行うためのキットが意図される。そのようなキットは典型的には、診断アッセイを行うために要求される２つ以上の構成要素を含む。構成要素には、化合物、試薬、容器および／または装置が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９７】
本明細書中に記載される方法は、本明細書中に記載される少なくとも１つの特異的なＫＬＫ１２核酸、ＫＬＫ１４核酸および／またはＫＬＫ１５核酸あるいは抗体を含む事前に包装された診断キットを利用することによって行うことができ、この場合、そのような診断キットは、例えば、臨床状況において、患者をスクリーニングおよび診断するために、また、障害を発症する素因を示すそのような個体をスクリーニングおよび同定するために都合よく使用することができる。
【０１９８】
１つの実施形態において、キットに伴う容器は、本明細書中に記載されるような結合性薬剤を含む。例として、キットは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに、場合によっては他の内分泌腺ガンマーカーのエピトープに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントと、酵素で標識されたそのような抗体に対する抗体と、酵素に対する基質とを含有することができる。キットはまた、マイクロタイタープレートウエル、標準物、アッセイ希釈液、洗浄緩衝液、接着性プレートカバー、および／または、キットを使用して本発明の方法を行うための説明書を含有することができる。
【０１９９】
本発明の１つの局面において、キットは、カリクレイン１２、カリクレイン１４およびカリクレイン１５のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体のフラグメントと、バイアルが１回以上の用量を含有し得る場合、使用前にさらに希釈され得る濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として、または使用濃度でのいずれかではあるが、腫瘍細胞に関連するそれらのエピトープに対する抗体の結合を検出するための手段とを含む。キットがインビボ使用のために意図される場合、単回投薬量が、薬剤の所望される量および濃度を有する滅菌された容器において提供され得る。直接的に使用される配合物を提供する容器は、通常、例えば、キットが、インビボ画像化のための放射能標識された抗体の調製物を含有する場合のように、他の試薬を必要としない。
【０２００】
キットは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子のサンプル中のレベルを検出するために設計され得る。そのようなキットは一般には、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする本明細書中に記載されるような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ法またはハイブリダイゼーション法において使用することができる。キットに存在し得るさらなる構成要素には、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするために、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬または容器が含まれる。
【０２０１】
化合物を評価するために本発明のスクリーニング方法を適用するために好適な試薬は、好適な容器に包装された必要な物質を提供する本明細書中に記載される従来のキットに包装することができる。
【０２０２】
従って、本発明は、患者における内分泌腺ガンを阻害することについて複数の試験化合物のそれぞれの好適性を評価するキットに関する。このキットは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、それをコードする核酸、ならびに、場合によっては複数の試験薬剤または試験化合物を評価するための試薬を含む。
【０２０３】
本発明では、内分泌腺ガン細胞の存在を評価するためのキットが意図され、この場合、キットは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について特異的な抗体、あるいは、それをコードする核酸に対するプライマーまたはプローブ、ならびに、場合によっては、内分泌腺ガンに関連する他のマーカーについて特異的なプローブ、プライマーまたは抗体を含む。
【０２０４】
また、本発明は、内分泌腺ガンに寄与する試験化合物の潜在的可能性を評価するためのキットを提供する。このキットは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、それをコードする核酸、ならびに、場合によっては、内分泌腺ガンに関連する他のマーカーを評価するための内分泌腺ガン細胞および試薬を含む。
【０２０５】
治療的適用
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質は、内分泌腺ガン免疫治療のための標的である。免疫治療法では、抗体療法、インビボワクチンおよびエクスビボ免疫治療法の使用が含まれる。
【０２０６】
１つの局面において、本発明は、内分泌腺ガンを処置するために全身的に使用され得るカリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体を提供する。好ましくは、腫瘍細胞を標的とし、しかし、周りの非腫瘍細胞および非腫瘍組織を標的としない抗体が使用される。従って、本発明は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現するガンに罹りやすいか、またはそのようなガンを有する患者を処置する方法を提供し、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的に結合する抗体の効果的な量を患者に投与することを含む。別の局面において、本発明は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的に結合する抗体を、腫瘍細胞の成長を阻害するために効果的な量で患者に投与することを含む。カリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体はまた、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する細胞の成長を選択的に阻害するか、またはそのような細胞を選択的に殺すための方法において使用することができ、この場合、この方法は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の抗体免疫コンジュゲートまたは免疫毒素を、細胞の成長を阻害するか、または細胞を殺すために十分な量で細胞と反応させることを含む。
【０２０７】
例として、コンジュゲート化されていないカリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体を、抗体が、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現するガン細胞に結合し、そのような細胞および腫瘍の成長阻害（その破壊を含む）、補体により媒介される細胞溶解、抗体依存性細胞傷害、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の生理学的機能を変化させること、ならびに／あるいは、リガンド結合またはシグナル伝達経路の阻害を含み得る機構によって媒介するように患者に導入することができる。コンジュゲート化されていないカリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体に加えて、治療剤にコンンジュゲート化されたカリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体（例えば、免疫コンジュゲート）もまた、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する腫瘍細胞に直接、薬剤を送達し、それにより、腫瘍を破壊するために治療的に使用することができる。そのような薬剤の例には、アブリン、リシンＡ、シュードモナスのエキソトキシン、またはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質；ならびに生物学的応答調節物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子または他の増殖因子などが含まれる。
【０２０８】
カリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体を使用するガン免疫療法では、ガンについて用いることに成功している様々な方法を利用することができる：そのようなガンには、結腸ガン（Ａｒｌｅｎ他、１９９８、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉ他、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｔｉ他、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、９０：２４３７〜２４４４）、胃ガン（Ｋａｓｐｒｚｙｋ他、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ他、１９９６、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９：９３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇ他、１９９６、Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ、２０：５８１〜５８９）、結腸直腸ガン（Ｍｏｕｎ他、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓ他、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５５：４３９８〜４４０３）、および乳ガン（Ｓｈｅｐａｒｄ他、１９９１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１：１１７〜１２７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０９】
本発明の方法の実施において、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現するガン細胞の成長を阻害することができる抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体がガン患者に治療効果的な量で投与され、この場合、患者の腫瘍は、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現または過剰発現する。本発明は、内分泌腺ガンのための特異的かつ効果的で、長く求められる処置を提供し得る。本発明の抗体治療法は、化学療法および放射線を含む他の治療と組み合わせることができる。
【０２１０】
患者は、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価を使用して、あるいは、本明細書中に記載されるような、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の定量的画像化を使用して、あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の発現の存在および／または程度を確実に示すことができる他の技術を使用して、腫瘍におけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の発現または過剰発現の存在およびレベルについて評価され得る。腫瘍の生検または手術標本の免疫組織化学的分析をこの目的のために用いることができる。
【０２１１】
ガンを処置することにおいて有用な抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体には、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始させることができる抗体、および、直接的な細胞毒性が可能である抗体が含まれる。これに関して、抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体は、エフェクター細胞Ｆｃ受容体部位または補体タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子の完全なＦｃ部分をともに要求する補体媒介細胞傷害性または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構による腫瘍細胞の溶解を誘発させることができる。また、腫瘍成長に対する直接的な生物学的作用を発揮する抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体は本発明の実施において有用である。そのような抗体は、作用を発揮するために、完全な免疫グロブリンを要求しないことがある。そのような直接的な細胞傷害性抗体が作用し得る潜在的な機構には、細胞成長の阻害、細胞分化の調節、腫瘍の血管形成因子プロフィルの調節、およびアポトーシスの誘導が含まれる。特定の抗ｈＫ５抗体が抗腫瘍作用を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、抗体依存性マクロファージ媒介細胞傷害（ＡＤＭＭＣ）、補体媒介の細胞溶解、およびこの分野で知られている他の作用を明らかにするために設計された数多くのインビトロアッセイを使用して評価することができる。
【０２１２】
特定の抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体の抗腫瘍活性、あるいは、抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体の組合せの抗腫瘍活性は、好適な動物モデルを使用してインビボで評価することができる。ヒトガン外植片または継代培養された異種組織が免疫低下動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなど）に導入される異種ガンモデルを用いることができる。
【０２１３】
本発明の方法では、１つだけの抗カリクレイン１２抗体、抗カリクレイン１４抗体および／または抗カリクレイン１５抗体、ならびに、異なる個々の抗体（例えば、異なるエピトープまたは他のカリクレインを認識する抗体など）の組合せまたは「カクテル」を投与することが意図される。そのようなカクテルは、異なるエピトープもしくはカリクレインに結合する抗体を含有し、かつ／または、そのようなカクテルでは、異なるエフェクター機構が利用されるか、もしくは、細胞傷害性抗体が、免疫エフェクター機能性に依拠する抗体と直接的に組み合わせられるので、そのようなカクテルは利点をいくつか有し得る。また、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的な抗体の投与は、化学療法剤、アンドロゲン遮断剤および免疫調節物質（例えば、ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ）（これらに限定されない）を含む他の治療剤と組み合わせることができる。カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的な抗体は、その「ネイクド」形態もしくは非コンジュゲート化形態で投与することができ、または、コンジュゲート化された治療剤を有し得る。
【０２１４】
本発明の方法の実施において使用される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的な抗体は、所望される送達方法のために好適なキャリアを含む医薬組成物に配合することができる。好適なキャリアには、抗体と組み合わせられたとき、抗体の抗腫瘍機能を保持し、かつ、被験者の免疫系との反応性を有しない任意の物質が含まれる。例には、滅菌リン酸塩緩衝化生理的食塩水および静菌水などの数多くの標準的な薬学的キャリアはどれも含まれる（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ａ．Ｏｓａｌ編、１９８０）を参照のこと）。
【０２１５】
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的な抗体の配合物は、抗体を腫瘍部位に送達することができる任意の経路によって投与することができる。投与経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内および皮内などが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、投与経路は静脈内注射による。抗体調製物は凍結乾燥して、無菌粉末として、好ましくは真空下で保存することができ、その後、例えば、ベンジルアルコール保存剤を含有する静菌水、または滅菌水で、注射前に再構成することができる。
【０２１６】
処置には、効果的な用量での静脈内注射（ＩＶ）などの許容され得る投与経路による抗体調製物の反復した投与が一般に伴う。投薬量は、当業者によって一般に理解される様々な要因に依存し、そのような要因には、ガンのタイプ、ガンの重篤度、悪性度または段階、使用された抗体の結合親和性および半減期、患者におけるカリクレイン１２発現、カリクレイン１４発現および／またはカリクレイン１５発現の程度、循環しているカリクレイン１２抗原、カリクレイン１４抗原および／またはカリクレイン１５抗原の程度、所望される定常状態での抗体濃度レベル、処置頻度、ならびに、本発明の処置方法との組合せで使用される何らかの化学療法剤の影響が含まれる。１日用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。１週間あたりの抗体が１０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲にある用量が効果的であり、十分に寛容され得る。だが、さらにより大きい１週間用量でさえも適切であり、十分に寛容され得る。適切な用量を決定することにおける決定因子は、特定の状況において治療的に効果的であるために必要な特定の抗体の量である。反復投与は、腫瘍の阻害または退行を達成するために要求され得る。カリクレイン１２抗体、カリクレイン１４抗体および／またはカリクレイン１５抗体の直接的な投与もまた可能であり、特定の状況では利点を有し得る。
【０２１７】
患者は、最も効果的な投薬計画および関連した要因の決定を助けるために、血清中のカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５について評価され得る。本明細書中に記載される、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５のアッセイ方法、あるいは類似するアッセイは、処置前の患者におけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の循環レベルを定量するために使用することができる。そのようなアッセイはまた、治療期間を通したモニターリングのために使用することができ、また、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５の血清レベルなどの他のパラメーターを評価することとの組合せで治療的成功を判定するために有用であり得る。
【０２１８】
本発明はさらに、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいはそのフラグメントを含有するために処方されたワクチンを提供する。
【０２１９】
１つの実施形態において、本発明は、カリクレイン１４に対して個体をワクチン接種する方法を提供し、この方法は、活性を有しないカリクレイン１４またはそのフラグメントを個体に接種する工程を含み、この場合、接種は個体における免疫応答を誘発し、それにより、個体がカリクレイン１４に対してワクチン接種される。
【０２２０】
液性免疫性および細胞媒介免疫性を生じさせるためのワクチンにおける腫瘍抗原の抗ガン治療での使用は広く知られており、例えば、ヒトＰＳＭＡ免疫原および齧歯類ＰＡＰ免疫原を使用して前立腺ガンにおいて用いられている（Ｈｏｄｇｅ他、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６３：２３１〜２３７；Ｆｏｎｇ他、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９：３１１３〜３１１７）。これらの方法は、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいはそのフラグメント、あるいは、カリクレイン１２免疫原、カリクレイン１４免疫原および／またはカリクレイン１５免疫原を発現し、かつ適切に提示するすることができる、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子および組換えベクターを用いることによって実施することができる。
【０２２１】
例として、ウイルス遺伝子送達システムを、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子を送達するために使用することができる。本発明のこの局面の実施において使用され得る様々なウイルス遺伝子送達システムには、限定されないが、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルスが含まれる（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６５８〜６６３）。非ウイルス送達システムもまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に（例えば、筋肉内に）導入される、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質あるいはそのフラグメントをコードするネイクドＤＮＡを使用することによって用いることができる。
【０２２２】
様々なエクスビボ方法もまた用いることができる。１つの方法では、カリクレイン１２抗原、カリクレイン１４抗原および／またはカリクレイン１５抗原を患者の免疫系に提示するために細胞の使用が伴う。例えば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩを発現する自己の樹状細胞を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、あるいは、ＭＨＣ分子に結合することができるそのペプチドでパルス処理し、それにより、ガン（例えば、内分泌腺ガン）、患者の免疫系を刺激することができる（例えば、Ｔｊｏａ他、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２８：６５〜６９；Ｍｕｒｐｈｙ他、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２９：３７１〜３８０を参照のこと）。
【０２２３】
カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的な抗イディオタイプ抗体もまた、ｈＫ５タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして抗ガン治療において使用することができる。抗イディオタイプ抗体の作製は、この分野では広く知られており、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質におけるエピトープを模倣する、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に特異的な抗イディオタイプ抗体を作製するために容易に適合させることができる（例えば、Ｗａｇｎｅｒ他、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１６：３３〜４０；Ｆｏｏｎ他、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、９６：３３４〜３４２；Ｈｅｒｌｙｎ他、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、４３：６５〜７６を参照のこと）。そのような抗体は、腫瘍抗原に向けられた他の抗イディオタイプ抗体を用いて現在実施されているような抗イディオタイプ治療において使用することができる。
【０２２４】
遺伝子免疫化方法を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現するガン細胞に対する予防的または治療的な液性免疫応答および細胞免疫応答を生じさせるために利用することができる。カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードするＤＮＡ分子を使用することにより、カリクレイン１２タンパク質／免疫原、カリクレイン１４タンパク質／免疫原および／またはカリクレイン１５タンパク質／免疫原ならびに適切な調節配列をコードするＤＮＡを含む構築物を、筋肉または皮膚の細胞が構築物を取り込み、コードされたカリクレイン１２タンパク質／免疫原、カリクレイン１４タンパク質／免疫原および／またはカリクレイン１５タンパク質／免疫原を発現するように個体の筋肉内または皮膚内に直接、注射することができる。カリクレイン１２タンパク質／免疫原、カリクレイン１４タンパク質／免疫原および／またはカリクレイン１５タンパク質／免疫原は、細胞表面タンパク質として発現させることができ、または分泌させることができる。カリクレイン１２タンパク質／免疫原、カリクレイン１４タンパク質／免疫原および／またはカリクレイン１５タンパク質／免疫原の発現はガンに対する予防的または治療的な液性免疫性および細胞免疫性を生じさせる。この分野で知られている様々な予防的または治療的な遺伝子免疫化技術を使用することができる。
【０２２５】
本発明はさらに、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する細胞の細胞活性（例えば、細胞増殖、活性化または伝播）を阻害するための方法を提供する。この方法は、本発明の免疫コンジュゲート（例えば、異種混合物または同種混合物）をそのような細胞と反応させ、その結果、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質が免疫コンジュゲートとの複合体を形成するようにすることを含む。新生物状態または前新生物状態を有する被験者を、細胞活性の阻害が細胞死をもたらすときには処置することができる。
【０２２６】
別の局面において、本発明は、本発明の免疫コンジュゲートのいずれか１つまたは組合せを、細胞を阻害するために十分な量で細胞と反応させることによって、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５を発現する細胞を選択的に阻害するための方法を提供する。量には、細胞を殺すために十分であるか、あるいは細胞の成長または増殖を阻害するために十分である量が含まれる。
【０２２７】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスに由来するベクター、あるいは様々な細菌プラスミドに由来するベクターを、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸分子を、標的化された器官、組織または細胞集団に送達するために使用することができる。当業者に広く知られている様々な方法を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５に対するアンチセンス核酸分子を発現する組換えベクターを構築するために使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上掲）およびＡｕｓｕｂｅｌ他（上掲）に記載される技術を参照のこと）。
【０２２８】
ベクターを細胞または組織に導入するための方法には、インビボ治療、インビトロ治療およびエクスビボ治療のために好適である本明細書中で議論されているそのような方法が含まれる。エクスビボ治療の場合、ベクターを、患者から得られ、同じ患者への自家移植のためにクローン増殖させられた幹細胞に導入することができる（米国特許第５，３９９，４９３号および同第５，４３７，９９４号を参照のこと）。トランスフェクションによる送達およびリポソームによる送達がこの分野では広く知られている。
【０２２９】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質をコードする遺伝子を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする所望のフラグメントを高レベルで発現するベクターで細胞または組織をトランスフェクションすることによって停止させることができる。そのような構築物により、細胞は、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列が充満し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合でさえ、そのようなベクターは、すべてのコピー体が内因性のヌクレアーゼによって無効にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続け得る。
【０２３０】
遺伝子発現の改変を、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーター、エンハンサーおよびイントロン）に対するアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計することによって得ることができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、転写開始部位から、例えば、リーダー配列の−１０領域と＋１０領域との間に由来する。アンチセンス分子はまた、転写物がリボソームに結合することを妨げることによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するために設計することができる。阻害はまた、「三重らせん」塩基対形成方法論を使用して達成することができる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子が結合するために十分に開く二重鎖の能力を損なう。三重鎖ＤＮＡを使用する治療的利点がＧｅｅ  ＪＥ他により総説された（Ｈｕｂｅｒ  ＢＥおよびＢＩ  Ｃａｒｒ（１９９４）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈｅｓ、Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｍｙ  Ｋｉｓｃｏ、Ｎ．Ｙ．において）。
【０２３１】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒する酵素活性ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、その後の内ヌクレオチド結合分解的な切断によって作用する。従って、本発明では、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解的な切断を特異的かつ効率的に触媒する操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が意図される。
【０２３２】
任意の潜在的なＲＮＡ標的における特異的なリボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣの配列を含むリボザイム切断部位について標的分子を調べることによって最初に同定することができる。そのような部位が同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子のその領域に対応する１５リボヌクレオチド〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを無効にし得る二次構造特徴について評価することができる。候補標的の好適性もまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用性を調べることによって明らかにすることができる。
【０２３３】
カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、ならびに、該タンパク質をコードする核酸、ならびに、それらのフラグメントは、被験者における内分泌腺ガンの処置において使用することができる。これらのタンパク質または核酸は、内分泌腺ガンに罹患している被験者に投与するための組成物に配合することができる。従って、本発明はまた、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸、あるいは、それらのフラグメントと、医薬的に許容され得るキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む組成物に関する。被験者における内分泌腺ガンを処置または防止するための方法もまた提供され、この方法は、それを必要としている患者に、カリクレイン１２タンパク質、カリクレイン１４タンパク質および／またはカリクレイン１５タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする核酸、あるいは、本発明の組成物を投与することを含む。
【０２３４】
本発明はさらに、患者における内分泌腺ガンを阻害する方法を提供し、この方法は、
（ａ）疾患細胞を含むサンプルを患者から得ること、
（ｂ）サンプルのアリコートを複数の試験薬剤の存在下で個々に維持すること、
（ｃ）それぞれのアリコートにおけるカリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベルを比較すること、および
（ｄ）カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５、ならびに／あるいは、カリクレイン１２、カリクレイン１４および／またはカリクレイン１５をコードする核酸のレベルを、他の試験薬剤に対して、その試験薬剤を含有するアリコートにおいて変化させる試験薬剤の少なくとも１つを患者に投与すること、
を含む。
【０２３５】
活性な物質を、従来の様式で、例えば、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与などによって投与することができる。投与経路に依存して、活性な物質は、活性な物質を不活性化する酵素の作用、酸、および他の天然の状態から活性な物質を保護するために、物質で被覆することができる。フリー塩基または医薬的に許容され得る塩としての活性な化合物の溶液を、好適な界面活性剤を用いて適切な溶媒において調製することができる。分散物を、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびその混合物において、またはオイルにおいて調製することができる。
【０２３６】
本明細書中に記載される組成物は、被験者に投与することができる医薬的に許容され得る組成物の調製についてそれ自体は知られている様々な方法によって調製することができ、その結果、活性な物質の効果的な量が、医薬的に許容され得るビヒクルとの混合物で組み合わせられるようにされる。様々な好適なビヒクルが、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、米国、１９８５）に記載される。これに基づいて、組成物には、１つ以上の医薬的に許容され得るビヒクルまたは希釈剤と一緒にされ、生理学的流体に関して好適なｐＨおよび等浸透圧を有する緩衝化された溶液に含有される活性な物質の溶液が含まれるが、これに限定されない。
【０２３７】
組成物は、単独で、または他の治療剤もしくは他の処置形態との一緒でのいずれかであって、治療剤として適応される。本発明の組成物は、同時に、または別個に、または、他の治療剤もしくは治療と連続して投与することができる。
【０２３８】
本発明の方法を使用して同定される組成物および薬剤／化合物の治療活性は、好適な動物モデルを使用してインビボで評価することができる。
【０２３９】
下記の非限定的な実施例は本発明の例示である。
【実施例１】
【０２４０】
ＫＬＫ１４の発現はアンドロゲン類およびプロゲスチン類によって主に調節される。速度論的実験および遮断実験により、このアップレギュレーションがアンドロゲン受容体によって媒介されることが示唆される。ＫＬＫ１４の発現が、１５５の連続した卵巣腫瘍における定量的ＲＴ−ＰＣＲによって研究され、これらの知見は、臨床病理学的パラメーター、化学療法に対する応答、および患者生存と相関させられた。段階的な低下が、正常な組織、良性組織およびガン性組織におけるＫＬＫ１４のｍＲＮＡのレベルにおいて観測された（ｐ＜０．００１）。発現レベルは、早期段階の疾患、最適な縮小化を有する患者、および、化学療法に応答する患者では著しく高くなっていた。カプラン・マイヤー生存曲線により、ＫＬＫ１４陽性腫瘍を有する患者は、ＫＬＫ１４陰性である患者と比較して、より長い進行のない生存および全生存を有することが明らかにされた（ｐ＜０．００１）。他の予後変数のすべてが多変量分析で管理されたとき、ＫＬＫ１４はその予後有意性を保持していた（進行のない生存および全生存についてそれぞれ、０．４３および０．５３の危険率、ならびに、０．０２７および０．０１４のｐ値）。弱い負の相関が、ＫＬＫ１４発現と血清ＣＡ１２５との間で見出された。従って、ＫＬＫ１４は、卵巣ガンに対する新しい独立した好都合な予後マーカーである。
【０２４１】
材料および方法
乳ガン細胞株およびホルモン刺激実験
乳ガン細胞株のＢＴ−４７４、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７４、Ｔ−４７ＤおよびＢＴ−２０ならびに卵巣ガン細胞株のＨＴＢ−７５（Ｃａｏｖ−３）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ＢＧ−１卵巣ガン細胞株がＨｅｎｒｉ  Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔ博士（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）から譲渡された。細胞は、グルタミン（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）およびウシ胎児血清（１０％）が補充されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）において、プラスチックフラスコで、ほぼコンフルエントになるまで培養された。その後、細胞は２４ウエル組織培養プレートに小分けされ、５０％のコンフルエンシーにまで培養された。実験の２４時間前に、培養培地を、１０％活性炭処理ウシ胎児血清を含有する培地に交換した。刺激実験のために、１００％エタノールに溶解された様々なステロイドホルモンを培養培地に１０−８Ｍの最終濃度で加えた。１００％エタノールで刺激された細胞がコントロールとして含められた。細胞は２４時間成長させられ、その後、ｍＲＮＡ抽出のために集められた。
【０２４２】
遮断実験および速度論的実験
遮断実験は下記のように行われた：（ａ）３つの異なる濃度（１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ）で個々にアンドロゲン受容体（ＡＲ）遮断剤（すなわち、ＲＵ５６，１８７およびニルタミド）の培養細胞への添加、（ｂ）１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍの濃度でのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）単独による刺激、（ｃ）上記のような３つの異なる濃度でのＡＲ遮断剤の１時間にわたる添加、その後、１／１００の濃度（１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）でのＤＨＴによる刺激。エタノールのみで刺激された細胞が、ＫＬＫ１４のベースライン発現を評価するためのコントロールとして含められた。細胞は２４時間後に分析のために集められた。
【０２４３】
速度論的実験の場合、ＢＴ−４７４細胞株が１０−８Ｍの最終濃度でＤＨＴによって刺激され、０時間（刺激直前）、２時間、６時間、１２時間および２４時間で集められた。エタノールで刺激されたコントロール細胞がすべての時点について含められた。すべての実験は２回繰り返された。
【０２４４】
研究集団
この研究では、Ｔｕｒｉｎ大学婦人科学学部（Ｔｕｒｉｎ、イタリア）で上皮卵巣ガン腫について外科的処置を受けている１５５名の連続した患者から得られた腫瘍標本が含まれた。診断は組織病理学的によって確認された。患者は手術前に処置を何ら受けていなかった。
【０２４５】
患者年齢は１９歳から８９歳まで及び、中央値が５８歳であった。残存腫瘍サイズは０ｃｍから９ｃｍまで及び、中央値が１．２ｃｍであった。組織学的タイプに関して、７０の腫瘍が漿性乳頭状であり、２８が子宮内膜様であり、２４が未分化型であり、１５がムチン性であり、１６が透明細胞であった。２つの腫瘍については、組織学的タイプが不明であった。本発明者らはまた、中央値年齢がそれぞれ５２歳および５４歳である患者に由来する１０個の正常な卵巣組織と、良性の卵巣病理に由来する１０個の組織とを含めた。組織学的タイプの分類は世界保健機関の基準に従った（Ｓｅｒｏｖ  ＳＦ、Ｓｏｒｂｉｎ  ＬＨ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒｓ、世界保健機関、１９７３）。すべての患者は、国際婦人科産科連盟（ＦＩＧＯ）の悪性度決定システムに従って悪性度が決定された（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  Ｆ．、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ、ストックホルム：国際婦人科産科連盟、１９９４）。悪性度決定情報が１４８名の患者について得られた：５３名（３６％）が悪性度１または悪性度２であり、一方、９５名（６４％）が悪性度３の卵巣ガン腫であった。悪性度決定は、Ｄａｙ他（Ｄａｙ  ＴＧ，Ｊｒ．、Ｇａｌｌａｇｅｒ  ＨＳ、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ＦＮ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｖａｒｙ：ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｇｒａｄｅ、Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒ、１９７５、４２：１５〜２１）に従ってそれぞれの卵巣腫瘍について明らかにされた。すべての患者は手術後の白金系薬物処方の化学療法で処置された。化学療法による初回の投薬療法では、８７名（５６％）の患者でのシスプラチン、４６名（３０％）でのカルボプラチン、６４名（４１％）でのシクロホスファミド、１１名（７％）でのドキソルビシン、１８名（１２％）でのエピルビシン、２５名（１６％）でのパクリタキセル、および２名（１％）でのメトトレキサートが含まれた。悪性度１およびＩ期の患者はさらなる処置を受けなかった。化学療法に対する応答は下記のように評価された：完全な応答が、少なくとも１ヶ月間にわたる疾患の全証拠の消散として定義された；新しい病巣の発生を伴うことなく、すべての測定可能な病巣の直径における少なくとも５０％の（少なくとも１ヶ月続く）低下が部分的応答と名付けられた。安定な疾患が、すべての測定可能な病巣の直径の積における２５％未満の低下として定義された。少なくとも２５％の増大は進行性疾患と名付けられた。調査はヘルシンキ宣言に従って行われ、産科婦人科施設審査委員会（Ｔｕｒｉｎ、イタリア）によって承認された。腫瘍標本は手術後直ちに液体窒素にスナップ凍結された。組織学的検査が手術中の凍結切片分析の時に行われ、これにより、８０％を超える腫瘍細胞を含有する各腫瘍の代表的な部分を分析までの保存のために選択することができた。
【０２４６】
総ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
サンプルは−８０℃で輸送および保存された。その後、サンプルはドライアイス上で解剖用メスで細切れにされ、直ちに２ｍｌのポリプロピレンチューブに移され、ホモジネートされた。その後、総ＲＮＡが、Ｔｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造者の説明書に従って使用して抽出された。ＲＮＡの濃度および純度を分光光度法によって測定した。２μｇの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）前増幅システム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。最終体積は２０μｌであった。
【０２４７】
定量的リアルタイムＰＣＲおよびＰＣＲ産物の連続モニターリング
ＫＬＫ１４の発表されたゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＦ１６１２２１）に基づいて、２つの遺伝子特異的プライマーを設計した［６Ｆ５：５’ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴ  ３’（配列番号１２）および６Ｒ５：５’ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＴＴ  ３’（配列番号１３）］。これらのプライマーは、ゲノムＤＮＡによる混入を避けるために３つ以上のエキソンにわたった。ＰＣＲ反応のリアルタイムモニターニングが、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、米国）、および、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合するＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ色素において行われた。蛍光シグナルは生成物の濃度に比例しており、固定されたサイクル数の後ではなく、各サイクルの終了時に測定される。テンプレートの開始量が大きいほど、閾値サイクル（これは、ベースラインよりも大きい一定の閾値を蛍光が超える部分サイクル数として定義される）に早く達する（Ｂｉｅｃｈｅ  Ｉ他、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＲＢＢ２−ｂａｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、１９９９、４５：１１４８〜１１５６）。各サンプルについて、ＫＬＫ１４の量および内因性コントロール（β−アクチン、ハウスキーピング遺伝子）の量が、校正曲線（下記参照）を使用して決定された。その後、ＫＬＫ１４の量が、正規化されたＫＬＫ１４値を得るために、内因性基準の量によって除された。
【０２４８】
標準曲線の構築
ＫＬＫ１４遺伝子の全長のｍＲＮＡ配列を、遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、製造者の説明書に従ってＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）にクローン化した。β−アクチンのｃＤＮＡを含有するプラスミドを同様に調製した。プラスミドを、ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。アクチンおよびＫＬＫ１４に対する異なる標準曲線を、他のところ（Ｂｉｅｃｈｅ  Ｉ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、１９９９；４５、１１４８〜１１５６）で記載されるようにプラスミドの連続希釈物を使用して構築した。これらの標準物がそれぞれの操作において含まれた。
【０２４９】
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応がＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システムにおいて行われた（図１）。それぞれの操作について、１μｌのｃＤＮＡ、２μｌのＬＣ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１ミックス、５０ｎｇのプライマー、および２．４μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するマスター混合物が氷上で調製された。反応混合物をガラスキャピラリー管に負荷した後、サイクル処理条件を、表１に示されるように行った。融解曲線の結果を確認するために、代表的なＰＣＲ産物が配列決定された。
【０２５０】
統計学的分析
最初に、最適なカットオフ値が、研究集団のＰＦＳおよびＯＳを予測するＫＬＫ１４値の能力に基づいて、χ２分析によって定義された。このカットオフ（１．０の任意設定ユニット；５０番目の百分位数）により、５０％の患者がＫＬＫ１４陽性であるとして同定される。
【０２５１】
臨床病理学的パラメーター（例えば、段階、悪性度、組織タイプおよび残存腫瘍など）とＫＬＫ１４発現との関連性が、適する場合にはχ２検定またはフィッシャーの直説法によって分析された。生存分析の場合、２つの異なる終点、すなわち、ガン再発（局所的再発または遠位転移のいずれでも）および死亡が、進行のない生存および全生存を計算するためにそれぞれ使用された。進行のない生存は、手術日と、再発疾患または転移疾患を確認した日との間の時間間隔として定義された。全生存は、手術日と死亡日との間の時間間隔として定義された。
【０２５２】
コックスの一変量および多変量の比例ハザード回帰モデル（Ｃｏｘ  ＤＲ、Ｒ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ．Ｂ．、１９７２；３４：１８７〜２０２）が、危険率（ＫＬＫ１４陽性群における再発または死亡の相対的リスク）を評価するために使用された。多変量分析では、モデルが、ＫＬＫ１４発現、臨床的段階、組織学的悪性度、残存腫瘍および年齢について調節された。
【０２５３】
カプラン・マイヤー生存曲線（Ｋａｐｌａｎ  ＥＬ、Ｍｅｉｅｒ  Ｐ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ、１９５８、５３：４５７〜４８１）がＫＬＫ１４陽性患者およびＫＬＫ１４陰性患者について構築された。さらなる分析のために、患者は、腫瘍の悪性度（悪性度１〜２対悪性度３）、腫瘍の段階（Ｉ期〜ＩＩ期対ＩＩＩ期〜ＩＶ期）、または縮小化の成功（最適な縮小化対最適でない縮小化）によって２つの群に分けられた。それぞれのカテゴリーにおいて、生存率（無疾患生存期間および全生存）がＫＬＫ１４陽性群とＫＬＫ１４陰性群との間で比較された。生存曲線間の差がログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ  Ｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ、１９６６；５０：１６３〜１７０）によって分析された。
【０２５４】
結果
ＫＬＫ１４遺伝子のホルモン調節
種々のプロモーター予測アルゴリズムを使用するＫＬＫ１４遺伝子プロモーターの配列分析により、推定されるアンドロゲン応答エレメント［ＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＣ（配列番号１４）］の存在が−３８６位（本発明者らのＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＦ１６１２２１に従った塩基番号付け）に示された。このエレメントは、ほぼ同じ位置に見出されるＰＳＡプロモーターのＡＲＥ−ＩＩと類似点を有する。従って、いくつかの他のカリクレインの場合と同様に、ＫＬＫ１４はアンドロゲン類によって調節され得る。
【０２５５】
このことを調べるために、ＫＬＫ１４遺伝子の発現が４つの乳ガン細胞株（ＢＴ−４７４、ＺＲ−７５、Ｔ−４７ＤおよびＢＴ−２０）ならびに２つの卵巣ガン細胞株（ＢＧ−１およびＨＴＢ−７５（Ｃａｖｏ−３））において調べられた。定量的ＰＣＲの結果は、ＫＬＫ１４が、ＡＲ陽性の乳ガン細胞株（ＢＴ−４７４、Ｔ−４７ＤおよびＺＲ−７５）ではアンドロゲン類（ＤＨＴ）によって、そして、より小さい程度ではあるが、プロゲスチン類によって主にアップレギュレーションされたことを示した（図２）。この遺伝子はまた、２つの卵巣ガン細胞株でもＤＨＴによってアップレギュレーションされた（図３）。ＫＬＫ１４の著しいアップレギュレーションは、ＡＲ陰性の細胞株ＢＴ−２０では見出されなかった（図２）。
【０２５６】
経時変化実験では、ＫＬＫ１４遺伝子の発現が、ホルモン刺激後の２時間もの早くから増大し始め、ｍＲＮＡレベルがその後の２４時間にわたって一様に増大することが示された（図４）。遮断実験の結果が図５に表される。使用された２つの抗アンドロゲン剤（ＲＵ５６，１８７およびニルタミド）は、ＤＨＴ刺激の前に１００倍過剰で添加された。ニルタミドは、ＤＨＴの刺激活性を約５０％阻止することができた。ＲＵ５６，１８７は、アンドロゲン刺激に対する影響をほとんど有していなかった。
【０２５７】
正常な組織、良性組織および卵巣ガン組織におけるＫＬＫ１４発現
正常な卵巣組織、良性の卵巣腫瘍およびガン性卵巣組織におけるＫＬＫ１４発現の比較が表２および図６に示される。ＫＬＫ１４のｍＲＮＡレベルの段階的な低下が、正常な組織（中央値＝７４任意ユニット）と、良性の卵巣腫瘍（中央値＝６．５ユニット）と、ガン性組織（中央値＝１．０ユニット）との間で観測された。これらの差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０２５８】
他の変数に関連するＫＬＫ１４発現
表３に示されるように、ＫＬＫ１４発現レベルは、早期段階（ＩまたはＩＩ）の疾患患者（ｐ＝０．０２０）、最適な縮小化を有する患者（ｐ＝０．０２０）、および、化学療法に対してより良好に応答した患者（ｐ＝０．００８）では著しく高くなっていた。著しい関連性は、ＫＬＫ１４発現と、悪性度、組織タイプ、残存腫瘍および閉経との間には見出されなかった。
【０２５９】
生存分析
この研究に含まれた１５５名の患者のうちから、追跡調査情報が１４７名について得られ、その中で、７９名（５４％）が再発し、５０名（３４％）が死亡した。カプラン・マイヤー生存曲線により、ＫＬＫ１４陽性腫瘍患者は、ＫＬＫ１４陰性である患者と比較して、より長いＰＦＳ生存期間（ｐ＜０．００１）および全生存（ｐ＜０．００１）を有することが明らかにされた（図７）。それぞれの個体の予後因子と、進行のない生存または全生存との間における関連性の強さが、表４において一変量分析で示される。疾患の段階、組織化学的悪性度、および残存腫瘍サイズは、ガン再発および死亡との強い関連性を示した（ｐ＜０．００１）。ＫＬＫ１４発現はまた、長期にわたる進行のない生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）の有意な予測因子であることが見出された（それぞれ、両者についてｐ＜０．００１で、０．３８および０．３３の危険率）。
【０２６０】
コックス多変量分析では、残存腫瘍サイズおよび悪性度のみが、ＫＬＫ１４に加えて、それらの予後有意性を保持していた（表４）。
【０２６１】
図８に示されるように、弱い負の相関が手術前の血清ＣＡ１２５レベルとＫＬＫ１４のｍＲＮＡレベルとの間で見出された（ｒＳ＝−０．２８、ｐ＝０．０２４）。
【０２６２】
考察
結果は、ＫＬＫ１４発現がステロイドホルモンの調節下にあることを示している。ＫＬＫ１４は、乳ガン細胞株および卵巣ガン細胞株ではアンドロゲン類およびプロゲスチン類によって主にアップレギュレーションされる。この調節はＡＲを介して媒介され得るという何らかの間接的な証拠もまた得られている。卵巣ガンは内分泌腺関連の悪性腫瘍であり、有力な証拠により、この疾患の発生および進行におけるステロイドホルモンの役割が裏付けられている（Ｓｌｏｔｍａｎ  ＢＪ、Ｒａｏ  ＢＲ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９８８、８：４１７〜４３；Ｒｉｓｃｈ  ＨＡ、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、１９９８、９０：１７７４〜１７８６）。また、ＡＲ遺伝子は卵巣ガンリスクの遺伝子調節物質のもっともらしい候補である（Ｌｅｖｉｎｅ  ＤＲ、Ｂｏｙｄ  Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１、６１：９０８〜９１１）。下流側のＡＲ調節遺伝子の同定は、アンンドロゲン類が卵巣ガンに関わる機構を理解することに対する重要な第１歩である。
【０２６３】
結果は、ＫＬＫ１４が卵巣ガンにおける好ましい予後の独立したマーカーであることを示している。
【０２６４】
現在では、１つだけのバイオマーカーが、卵巣ガン患者および他のガン患者における診断、予後、および処置方法の開発のための必要な情報のすべてを提供しないことが広く受け入れられている。代わりに、研究は、現在、卵巣ガンのバイオマーカーのパネルを考案することに集中している。人工ネットワークおよび他のコンビナトリアル方法はこの点に関して有望であるようである（Ｚｈａｎｇ  Ｚ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、１９９７、７３：５６〜６１；Ｗｏｏｌａｓ  ＲＰ他、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、１９９３、８５：１７４８〜１７５；Ｋｈａｎ  Ｊ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００１、７：６７３〜６７９）。また、ＫＬＫ１４は、ステロイド受容体およびホルモン治療と同様に、または、乳ガンにおけるＨＥＲ−２治療およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ治療と同様に、治療の予測可能なマーカーとして適用され得る（Ｃｏｂｅｌｅｉｇｈ  ＭＡ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１９９９、１７：２６３９〜２６４８）。
【０２６５】
データは、ＫＬＫ１４発現レベルが血清ＣＡ１２５濃度との負の相関を有することを示している（図８）。これらの結果は、より高い血清ＣＡ１２５レベルが卵巣ガンにおける不良な予後と関連することを示す以前の報告と一致している（ｄｅ  ｌａ  Ｃｕｅｓｔａ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ、１９９９、１４：１０６〜１１４）。他方で、高いＣＡ１２５発現レベルが漿液性組織学的タイプ（４８）と関連する一方で、ＫＬＫ１４レベルと組織学的タイプとの関係は見出されなかった（表３）。
【０２６６】
まとめると、より高いＫＬＫ１４発現は、卵巣ガンにおける好ましい予後値を有することが示された。
【実施例２】
【０２６７】
ＫＬＫ１５の発現が、１６８名の連続した上皮卵巣ガン患者における定量的ＲＴ−ＰＣＲによって研究された。１０名の良性の卵巣腫瘍患者もまたこの研究に含められた。５０番目の百分位数に等しいカットオフ値が、研究集団の進行のない生存および全生存を予測するＫＬＫ１５の能力に基づいて定義された。
【０２６８】
ＫＬＫ１５発現レベルは、良性の腫瘍と比較して、ガン性組織では著しく高くなっていた。カプラン・マイヤー生存曲線は、ＫＬＫ１５過剰発現が、低下した進行のない生存（ＰＦＳ）（ｐ＜０．００１）および全生存（ＯＳ）（ｐ＜０．００９）の有意な予測因子であることを示している。一変量分析および多変量分析では、ＫＬＫ１５がＦＰＳおよびＯＳの独立した予後因子であることが示される。弱い正の相関が、ＫＬＫ１５発現レベルと血清ＣＡ１２５レベルとの間で見出された。ＫＬＫ１５発現レベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価されたとき、卵巣ガンに対する好ましくない予後の独立したマーカーである。
【０２６９】
材料および方法
研究集団
この研究では、Ｔｕｒｉｎ大学婦人科学学部婦人科腫瘍学学科（Ｔｕｒｉｎ、イタリア）で上皮卵巣ガン腫について外科的処置を受けている１６８名の連続した患者から得られた腫瘍標本が含まれた。すべての腫瘍標本は組織病理学的によって確認された。患者は手術前に処置を何ら受けていなかった。
【０２７０】
患者年齢は２５歳から８９歳まで及び、中央値が５９歳であった。手術後の残存腫瘍サイズは０ｃｍから９ｃｍまで及び、中央値が２．０ｃｍであった。組織学的タイプに関して、７６の腫瘍が漿性乳頭状であり、２８が子宮内膜様であり、２８が未分化型であり、１７がムチン性であり、１５が透明細胞であった。中央値年齢が５２歳である女性から得られた１０個の良性の卵巣組織もまた含まれた。組織学的タイプの分類は世界保健機関の基準に従った（Ｓｅｒｏｖ  ＳＦ、Ｓｏｒｂｉｎ  ＬＨ、世界保健機関、１９７３）。すべての患者は、国際婦人科産科連盟（ＦＩＧＯ）の悪性度決定システムに従って悪性度が決定された（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  Ｆ：Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ、ストックホルム、国際婦人科産科連盟、１９９４）。悪性度決定情報が１６２名の患者について得られた：５４名（３３％）が悪性度１または悪性度２であり、一方、１０８名（６７％）が悪性度３の卵巣ガン腫であった。悪性度決定は、Ｄａｙ他（Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒ、４２：１５〜２１、１９７５）に従ってそれぞれの卵巣腫瘍について明らかにされた。すべての患者は手術後の白金系薬物処方の化学療法で処置された。化学療法による初回の投薬療法では、９５名（５６％）の患者でのシスプラチン、５０名（３０％）でのカルボプラチン、６９名（４１％）でのシクロホスファミド、１２名（７％）でのドキソルビシン、２０名（１２％）でのエピルビシン、２７名（１６％）でのパクリタキセル、および２名（１％）でのメトトレキサートが含まれた。悪性度１およびＩ期の患者はさらなる処置を受けなかった。化学療法に対する応答は下記のように評価された：完全な応答が、少なくとも１ヶ月間にわたる疾患の全証拠の消散として定義された；新しい病巣の発生を伴うことなく、すべての測定可能な病巣の直径における少なくとも５０％の（少なくとも１ヶ月続く）低下が部分的応答と名付けられた。安定な疾患が、すべての測定可能な病巣の直径の積における２５％未満の低下として定義された。少なくとも２５％の増大は進行性疾患と名付けられた。臨床的に測定可能な疾患を有しない患者においては、化学療法に対する応答が、血清ＣＡ１２５の一連の測定によって評価された。応答者（部分的または完全）は２サイクルの化学療法の後でそのＣＡ１２５を５０％以上低下させた。調査はヘルシンキ宣言に従って行われ、産科婦人科施設（Ｔｕｒｉｎ、イタリア）によって承認された。腫瘍標本は手術後直ちに液体窒素にスナップ凍結された。組織学的検査が手術中の凍結切片分析の時に行われ、これにより、８０％を超える腫瘍細胞を含有する各腫瘍の代表的な部分を分析までの保存のために選択することができた。手術前の血清ＣＡ１２５値が６７名の患者について得られた。
【０２７１】
総ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
サンプルは−８０℃で輸送および保存された。その後、サンプルはドライアイス上で解剖用メスで細切れにされ、直ちに２ｍｌのポリプロピレンチューブに移された。その後、サンプルをホモジネートし、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。ＲＮＡの濃度および純度を分光光度法によって測定した。２μｇの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）前増幅システム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。最終体積は２０μｌであった。
【０２７２】
定量的リアルタイムＰＣＲおよびＰＣＲ産物の連続モニターリング
ＫＬＫ１５の発表されたゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＦ２４２１９５）に基づいて、２つの遺伝子特異的プライマーを設計した［１５−Ｆ３：５’ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣ  ３’（配列番号１５）および１５−Ｒ３：５’ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ３’（配列番号１６）］。これらのプライマーは、ゲノムＤＮＡによる混入を避けるために３つ以上のエキソンにわたった。ＰＣＲ反応のリアルタイムモニターニングが、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、米国）、および、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合するＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ色素において行われた。蛍光シグナルは生成物の濃度に比例しており、固定されたサイクル数の後ではなく、各サイクルの終了時に測定される。テンプレートの開始量が大きいほど、閾値サイクル（これは、ベースラインよりも大きい一定の閾値を蛍光が超える部分サイクル数として定義される）に早く達する（Ｂｉｅｃｈｅ  Ｉ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４５：１１４８〜１１５６、１９９）。各サンプルについて、ＫＬＫ１５の量および内因性コントロール（β−アクチン、ハウスキーピング遺伝子）の量が、校正曲線（下記参照）を使用して決定された。その後、ＫＬＫ１５の量が、正規化されたＫＬＫ１５値を得るために、内因性基準の量によって除された。
【０２７３】
標準曲線の構築
ＫＬＫ１５遺伝子の全長のｍＲＮＡ配列を、遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、製造者の説明書に従ってＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）にクローン化した。プラスミドを、ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。アクチンおよびＫＬＫ１５に対する異なる標準曲線を、他のところ（Ｂｉｅｃｈｅ  Ｉ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４５：１１４８〜１１５６、１９９）で記載されるようにプラスミドの連続希釈物を使用して構築した。これらの標準物がそれぞれの操作において含まれた。一例が図９に示される。ＫＬＫ１５アッセイの信頼性が、操作内および操作間の正確性を評価することによって明らかにされた。すべての場合において、変動係数は１０％未満であった。
【０２７４】
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ反応がＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システムにおいて行われた。それぞれの操作について、１μｌのｃＤＮＡ、２μｌのＬＣ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１ミックス、５０ｎｇのプライマー、および１．２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するマスター混合物が氷上で調製された。最終体積は水で２０μｌに調節された。反応混合物をガラスキャピラリー管に負荷した後、サイクル処理条件を下記のように行った：９４℃で１０分間の最初の変性、その後、９４℃で０秒間の変性、６３℃で５秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸張からなる４５サイクル。温度移行速度は２０℃／秒で設定された。蛍光性生成物が、各サイクルの後、８８℃での単回取得モードによって測定された。その後、融解曲線が、段階で設定された単回取得モードを用いて、温度を７０℃で３０秒間保ち、その後、温度を９８℃に０．２℃／秒の速度で徐々に上げることによって行われた。融解曲線の結果を確認するために、ＰＣＲ産物の代表的なサンプルが精製され、配列決定された。
【０２７５】
統計学的分析
最初に、最適なカットオフ値が、研究集団のＰＦＳおよびＯＳを予測するＫＬＫ１５値の能力に基づいて、χ２分析によって定義された。このカットオフ（１．０の任意設定ユニット；５０番目の百分位数）により、５０％の患者がＫＬＫ１５陽性であるとして同定される。
【０２７６】
臨床病理学的パラメーター（例えば、段階、悪性度、組織タイプおよび残存腫瘍など）とＫＬＫ１５発現との関連性が、適する場合にはχ２検定またはフィッシャーの直説法によって分析された。生存分析の場合、２つの異なる終点、すなわち、ガン再発（局所的再発または遠位転移のいずれでも）および死亡が、進行のない生存および全生存を計算するためにそれぞれ使用された。進行のない生存は、手術日と、再発疾患または転移疾患を確認した日との間の時間間隔として定義された。全生存は、手術日と死亡日との間の時間間隔として定義された。
【０２７７】
コックスの一変量および多変量の比例ハザード回帰モデル（Ｃｏｘ  ＤＲ：Ｒ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ  Ｂ、３４：１８７〜２０２、１９７２）が、危険率（ＫＬＫ１５陽性群における再発または死亡の相対的リスク）を評価するために使用された。多変量分析では、モデルが、ＫＬＫ１５発現、臨床的段階、組織学的悪性度、残存腫瘍および年齢について調節された。
【０２７８】
カプラン・マイヤー生存曲線（Ｋａｐｌａｎ  ＥＬ、Ｍｅｉｅｒ  Ｐ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ、５３：４５７〜４８１、１９５８）がＫＬＫ１５陽性患者およびＫＬＫ１５陰性患者について構築された。さらなる分析のために、患者は、腫瘍の悪性度（悪性度１〜２対悪性度３）、腫瘍の段階（Ｉ期〜ＩＩ期対ＩＩＩ期〜ＩＶ期）、または縮小化の成功（最適な縮小化群対最適でない縮小化群）によって２つの群に分けられた。それぞれのカテゴリーにおいて、生存率（無疾患生存期間および全生存）がＫＬＫ１５陽性群とＫＬＫ１５陰性群との間で比較された。生存曲線間の差がログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ  Ｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ、５０：１６３〜１７０、１９６６）によって統計学的有意性について検定された
結果
良性組織および卵巣ガン組織におけるＫＬＫ１５発現
表５には、良性の卵巣組織および悪性の卵巣組織における平均値および中央値のＫＬＫ１５発現レベルが示される。発現レベルは、良性の卵巣組織（平均値＝０．０７７および中央値＝０．０５６任意ユニット）と比較して、ガン性組織では、はるかに高くなっていることが見出された（平均値＝３２８および中央値＝１．０任意ユニット）。卵巣ガンおよび良性組織におけるＫＬＫ１５発現の分布が図１０に示される。２つの群の中央値の差は非常に有意であった（ｐ＝０．０２１、マン・ウイトニーのＵ検定による）。
【０２７９】
他の変数に関連するＫＬＫ１４発現
表６に示されるように、有意な関連性は、最適な縮小化を有する患者と、最適でない縮小化を有する患者との間での弱い有意な差を除いて、ＫＬＫ１５発現レベルと、他の臨床変数との間には見出されなかった。
【０２８０】
生存分析
この研究に含まれた１６８名の患者のうちから、追跡調査情報が１６２名について得られ（６７ヶ月の中央値の追跡調査期間）、その中で、９６名（５９％）が再発し、６１名（３８％）が死亡した。
【０２８１】
カプラン・マイヤー生存曲線により、ＫＬＫ１５陽性腫瘍患者は、ＫＬＫ１５陰性である患者と比較して、実質的により低い進行のない生存（ＰＦＳ）（ｐ＜０．００１）および全生存（ＯＳ）（ｐ＜０．００９）を有することが明らかにされた（図１１）。それぞれの個体の予後因子と、進行のない生存または全生存との間における関連性の強さが、表７において一変量分析で示される。疾患の段階、組織化学的悪性度、および残存腫瘍サイズは、ガン再発および死亡との強い関連性を示した（ｐ＜０．００１）。ＫＬＫ１５発現はまた、より低いＰＦＳおよびＯＳの有意な予測因子であることが見出された（それぞれ０．００１未満および０．０１２のｐ値で、それぞれ２．３３および１．９６の危険率）。
【０２８２】
すべての混乱因子がコックスモデル（多変量分析、表７）に含められたとき、残存腫瘍サイズおよび悪性度のみが、ＫＬＫ１５に加えて、それらの予後有意性を保持していた。ＫＬＫ１５発現は、ＰＦＳおよびＯＳについてそれぞれ、２．２７および１．７９の危険率と、０．００１未満および０．０３９のｐ値とを示した。連続変数としてのＣＡ１２５は、ＯＳ（ｐ＝０．１４）についてではなく、ＰＦＳ（ｐ＝０．００７）について、コックス一変数分析において好ましくない予後指標であることが見出された。ＫＬＫ１５がコックスモデルに含められたとき、ＣＡ１２５はＰＦＳについてその有意性を保持していなかった（ＣＡ１２５についてｐ＝０．１３、ＫＬＫ１５についてｐ＝０．００１）（データは示されず）。
【０２８３】
図１２に示されるように、弱い正の相関が、ＫＬＫ１５レベルの発現レベルと、手術前の血清ＣＡ１２５レベルとの間で見出された（ｒＳ＝０．３７、ｐ＝０．００２）。
【０２８４】
コックス比例ハザード回帰分析が患者の部分群について適用されたとき（表８）、ＫＬＫ１５は、ＯＳではなく、低下したＰＦＳの有意な予測因子であることが、悪性度Ｉ〜ＩＩの患者群（ＨＲ：５．３５、ｐ＝０．００４）、悪性度ＩＩＩの患者群（ＨＲ：１．８９、ｐ＝０．００７）、Ｉ期〜ＩＩ期の患者群（ＨＲ：７．１、ｐ＝０．０１４）およびＩＩＩ期の患者群（ＨＲ：１．９３、ｐ＝０．００４）において見出された。ＫＬＫ１５は、他の混乱因子について調節した後、その予後有意性を保持していた（表８）。ＫＬＫ１５発現は、最適な縮小化を有する患者では、すべての他の混乱因子について調節した後でさえも、ＰＦＳおよびＯＳの両方について非常に統計学的に有意な予後値を保持していた（表８）。
【０２８５】
考察
結果は、ＫＬＫ１５が卵巣ガンにおける好ましくない予後の独立したマーカーであることを示している。
【０２８６】
ＫＬＫ１５は、ホルモンにより調節される遺伝子である（Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６：５３〜６１、２００１）。ＫＬＫ１５は、主にアンドロゲン類によって、また、より小さい程度ではあるが、プロゲスチン類によってアップレギュレーションされる。この調節は、おそらくは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）を介して媒介される。容易に評価される証拠では、アンドロゲン類が卵巣ガンの病因に関わっており（Ｒｉｓｃｈ  ＨＡ、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、９０：１７７４〜１７８６、１９９８）、また、アンドロゲン類と卵巣表面上皮との間での生理学的相互作用の存在が、卵巣の新組織形成におけるこの相互作用の考えられる役割と同様に裏付けられる（Ｌｅｖｉｎｅ  ＤＲ、Ｂｏｙｄ  Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：９０８〜９１１、２００１）。アンドロゲン類は、齧歯類卵巣上皮細胞の成長をインビボで刺激し、良性の卵巣新生物をもたらす（Ｓｉｌｖａ  ＥＧ他、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ、１０：８７９〜８８３、１９９７）。さらに、卵巣ガン患者は、ガンを有しない女性よりも高いレベルの循環アンドロゲン類をその診断前に有する（Ｈｅｌｚｌｓｏｕｅｒ  ＫＪ他、Ｊａｍａ、２７４：１９２６〜１９３０、１９９５）。また、卵巣ガンの大部分はＡＲを発現し（Ｃｈａｄｈａ  Ｓ他、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ、２４：９０〜９５、１９９３；および、Ｋｕｈｎｅｌ  Ｒ他、Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６：３９３〜３９７、１９８７）、卵巣ガンの細胞成長が抗アンドロゲン剤によってインビトロで阻害される（Ｓｌｏｔｍａｎ  ＢＪ、Ｒａｏ  ＢＲ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ、４５：２１３〜２２０、１９８９）。最近の観測結果はＡＲと卵巣ガン感受性との相関を示している（Ｋｕｈｎｅｌ  Ｒ他、Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６：３９３〜３９７、１９８７）。
【０２８７】
この研究では、５０番目の百分位数に等しい最適なカットオフ点が、進行のない生存および全生存を予測するＫＬＫ１５の能力に基づいて選択された。ＫＬＫ１５の予後値は、最適な縮小化を有する患者と、最適でない縮小化を有する患者との間における、卵巣ガンと良性組織との統計学的有意差によって、また、ＫＬＫ１５の発現レベルと、手術前の血漿ＣＡ１２５との間での正の相関によって裏付けられる。
【０２８８】
現在では、１つだけのバイオマーカーが、卵巣ガン患者についての診断、予後、および処置方法の開発のための必要な情報のすべてを提供しないことが広く受け入れられている。代わりに、研究は、現在、卵巣ガンのバイオマーカーのパネルを作製することに集中している。一群のバイオマーカーからの情報を組組み合わせ、解釈するための人工ネットワークは、より正確な診断および予後を可能にし、これは、現在進行中であり、かつ、既に有望な予備的結果をもたらしている方法である（Ｚｈａｎｇ  Ｚ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、７３：５６〜６１、１９９９；Ｗｏｏｌａｓ  ＲＰ他、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、８５：１７４８〜１７５１、１９９３；および、Ｋｈａｎ  Ｊ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、７：６７３〜６７９、２００１）。
【０２８９】
結果は、弱い正の相関をＫＬＫ１５発現レベルと血清ＣＡ１２５レベルとの間で示している（図１２）。これらの結果は、より高い血清ＣＡ１２５レベルが卵巣ガンにおける不良な予後と関連することを示す以前の報告（ｄｅ  ｌａ  Ｃｕｅｓｔａ  Ｒ他、Ｉｎｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ、１４：１０６〜１１４、１９９９）と一致している。他方で、高いＣＡ１２５発現レベルは漿液性の組織化学的タイプにだけ関連する（ｄｅ  ｌａ  Ｃｕｅｓｔａ  Ｒ他、Ｉｎｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ、１４：１０６〜１１４、１９９９）一方で、有意な関係が、ＫＬＫ１５レベルと、卵巣ガン腫の組織化学的タイプのいずれとの間には見出されなかった（表６）。このことから、ＫＬＫ１５の考えられる役割が、ＣＡ１２５が通常の場合には情報をもたらさない非漿液性卵巣ガン患者をモニターする際には関係する。
【０２９０】
まとめると、より高いＫＬＫ１５発現は、卵巣ガンにおける不良な予後の指標であることが見出された。
【実施例３】
【０２９１】
免疫学的試薬が、正常およびガン性の組織および生物学的流体におけるその発現を研究するためのＥＬＩＳＡ技術および免疫組織化学技術を開発するためにカリクレイン１４について作製された。組換えｈＫ１４が、ポリクローナル抗体作製のために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生させられ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され、マウスおよびウサギに注射された。マウスおよびウサギの抗血清が、サンドイッチ型免疫蛍光測定ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学的方法論がｈＫ１４について開発するために使用された。ＥＬＩＳＡは高感度で（０．１μｇ／Ｌの検出限界）、ｈＫ１４について特異的であり、０μｇ／Ｌから２０μｇ／Ｌまでの直線性を有し、操作間および操作内のＣＶが１０％未満であった。ｈＫ１４がヒトの組織抽出物および生物学的流体において定量された。非常に高いレベルが、乳房、皮膚、前立腺、精漿および羊水において観測され、正常な血清ではほとんど検出できないレベルであった。ｈＫ１４の濃度は、正常な卵巣組織と比較して、卵巣ガン組織の４０％において高くなっていた。血清ｈＫ１４レベルは、卵巣ガン患者の一部（６５％）および乳ガン患者の一部（４０％）において上昇していた。免疫組織化学的分析では、ｈＫ１４の強い細胞質染色が、正常および悪性の皮膚、卵巣、乳房および精巣の上皮細胞によって示された。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣＺαＡへのＫＬＫ１４のクローニング。ｈＫ１４タンパク質の成熟型形態の２２７アミノ酸（これはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＫ４８５２４のアミノ酸２５〜２５１に対応する）をコードするＫＬＫ１４ｃＤＮＡ（Ｙｏｕｓｅｆ、Ｇ．Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：３４２５〜３４３１、２００１）をベクター構築物ｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４（１０ｎｇ）からＰＣＲ増幅した。この構築物は、増幅された成熟型ＫＬＫ１４ｃＤＮＡをＥａｓｙｓｅｌｅｃｔ（商標）ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の発現ベクターｐＰＩＣＺαＡにクローン化することにより以前に構築されていた。反応は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ヌクレアーゼ非含有ＢＳＡ］、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１００ｎｇのプライマーＦＰ１４−Ｈｉｓ（５’ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧ  ３’［配列番号１７］）およびＲＰ１４−Ｈｉｓ（５’ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ３’［配列番号１８］）、ならびに０．５μＬ（１．２５Ｕ）のＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含有する５０μＬの反応混合物において、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマスターサイクラーで行われた。ＰＣＲサイクル処理条件は、９５℃で１分間、その後、４０サイクルについては、９５℃で３０秒間、５６℃で１分間および７２℃で１分間、そして、７２℃で７分間の最後の伸張であった。ＰＣＲ後、標準的な技術を使用して、増幅されたＫＬＫ１４を２％アガロースで臭化エチジウムにより可視化し、抽出し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化して、対応する制限酵素部位において発現ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ＫＬＫ１４インサートの５’末端が酵母のα因子分泌シグナルと一致した読み枠でクローン化され、３’末端がＣ末端のｃ−ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジン（Ｈｉｓ）６タグと一致した読み枠でクローン化されたので、構築物はｐＰＩＣＺαＡ  ＫＬＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓと名付けられ、組換えタンパク質はｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓと名付けられた。構築物内のＫＬＫ１４配列は、ベクター特異的プライマーを両方向で使用して自動ＤＮＡシーケンサーを用いて確認された。
タンパク質産生。ＰｍｅＩで線状化されたｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ならびに、空のｐＰＩＣＺαＡ（陰性コントロール）を化学的コンピテントなＰ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｘ−３３株に形質転換し、その後、それらを相同的組換えによって酵母染色体に組み込ませた。その後、形質転換されたＸ−３３細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（選択試薬）を含有するＹＰＤＳ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍソルビトール、２％寒天）平板に置床した。安定な酵母形質転換体を製造者の推奨法に従って選択し、そして、２５０ｒｐｍでのプレート振とう機において３０℃で一晩、ＢＭＧＹ培地［１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母窒素塩基、４０ｍｇ／ｌビオチンおよび１％グリセロール］に、ＢＭＭＹ（１％グリセロールが０．５％メタノールで置き換えられたことを除いてＢＭＧＹと同じ）でＯＤ６００＝１．０に希釈して接種し、上記と同じ条件のもとで６日間、１％メタノールを毎日補充しながらインキュベーションした。上清を４０００ｇで２０分間の遠心分離によって回収した。
タンパク質精製。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、Ｎｉ２＋−ニトリロ酢酸（ＮｉＮＴＡ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって酵母培養上清から精製した。簡単に記載すると、酵母培養上清を平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で４倍に希釈し、同じ緩衝液で事前に平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ樹脂を含有するカラムに負荷した。その後、カラムを５体積の平衡化緩衝液で２回洗浄し、吸着したｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、２０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭのイミダゾールステップグラジエントにより溶出させた。すべての分画物を下記において記載されるように分析し、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを含有する分画物をプールし、Ａｍｉｃｏｎ（商標）ＹＭ１０メンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いた限外ろ過によって濃縮した。続いて、総タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準とするＢｒａｄｆｏｒｄビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。
ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの検出。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの産生および精製をモニターするために、サンプルを、ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動システムおよび４〜１２％グラジエントポリアクリルアミドゲルを使用するドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に２００Ｖで３０分間供した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。タンパク質を、クーマシーＧ−２５０染色液のＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って用いて可視化した。ウエスタンブロット分析の場合、タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｅｘｔｒａニトロセルロースメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に３０Ｖで１時間転写した。メンブランは、５％脱脂乾燥乳が補充されたＴＢＳ−Ｔ［０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）］で、４℃で一晩ブロッキング処理された。続いて、メンブランは、（ＴＳＢ−Ｔで１：５０００希釈された）マウス抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、室温で１時間プローブされた。メンブランを、ＴＢＳ−Ｔで１５分間、３回洗浄した後、メンブランは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンンジュゲート化ヤギ抗マウス（ＴＢＳ−Ｔで１：２０，０００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で、室温で１時間処理された。最後に、メンブランは上記のように再び洗浄され、蛍光が、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＸ線フィルムにおいて検出された。
質量測定。ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの同一性が、組換えｈＫ１０（Ｌｕｏ，Ｌ．Ｙ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７：２３７〜２４６、２００１）について詳しく以前に記載されたように、タンデム質量分析法（ＭＳ−ＭＳ）によって確認された。
Ｎ末端配列決定。Ｎ末端配列分析が、組換えｈＫ１４ｍｙｃ−ＨｉｓのＮ末端におけるアミノ酸を同定するために行われた。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（２０μｇ／レーン）を最初にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、１００％メタノールに事前に浸されたポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に３０Ｖで１時間転写した。転写後、メンブランを取り出し、染色する前に、脱イオン水で、５分間、３回洗浄した。続いて、クーマシーブルーＲ−２５０（４０％メタノールにおける０．１溶液）を使用して、メンブランを染色し（５分）、その後、５０％メタノール溶液で脱染色した（５分）。その後、メンブランを脱イオン水で徹底的に洗浄し、風乾した。ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、Ｐｏｒｔｏｎ／Ｂｅｃｋｍａｎ気相マイクロシーケンサーでの５サイクルのエドマン化学反応からなる自動Ｎ末端エドマン分解、それに続く、ＨＰＬＣカラムでのフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）分析に供した。
グリコシル化状態。ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、Ｎ−グリカン鎖を糖タンパク質から［最も内側のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＡｓｎとの間で］切断する３６ｋＤａのアミダーゼであるペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）とインキュベーションした。簡単に記載すると、１５μｇの精製されたｈＫ１４を２μＬの変性緩衝液（５％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール）において１００℃で５分間変性させ、直ちに氷に移し、さらに５分間置いた。次いで、Ｇ７緩衝液［０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）］および１０％ＮＰ−４０の両方の１／１０量を加え、続いて１μｌのＰＮＧａｓｅＦを加えた。反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。
【０２９２】
１０μｇ／レーンの精製されたｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ、精製された脱グリコシル化ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ（約４０ｋＤａの糖タンパク質；陽性コントロール）およびダイズトリプシン阻害剤（約２１．５ｋＤａの非グルコシル化タンパク質；陰性コントロール）を含有する２つの同一のポリアクリルアミドゲルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。一方のゲルを、クーマシーＧ−２５０染色液であるＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、もう一方を、ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）糖タンパク質染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して染色した。後者は、ポリアクリルアミドゲルにおける糖タンパク質成分の検出を可能にする。このゲルは、糖タンパク質に存在するグリコールをアルデヒドに酸化する過ヨウ素酸で処理され、その後、酸性フクシンスルフィト（活性剤）を含有するＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）糖タンパク質染色に浸された。
【０２９３】
ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓに対する抗体の作製
精製された組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（約１００μｇ）を免疫原として使用し、ポリクローナル抗体を発達させるためにメスのＢａｌｂ／Ｃマウスおよびメスのニュージランド白ウサギに皮下注射した。タンパク質は、最初の注射のために完全フロイントジュバントで１：１希釈され、その後の注射のためには不完全フロイントジュバントで１：１希釈された。注射は、３週間間隔で、マウスについては３回、ウサギについては６回繰り返された。血液が２週間毎に動物から採取され、抗体生成について調べられた。マウスおよびウサギにおける抗ｈＫ１４ポリクローナル抗体の産生について調べるために、下記の免疫アッセイが使用された：ヒツジ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を９６ウエルの不透明ポリスチレンプレートに固定化した。その後、マウス／ウサギ血清を、１：２５０から１：１０００００に及ぶ種々の希釈度でプレートに加えた。インキュベーション（１時間）および洗浄の後、ビオチン化された組換えＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを各ウエルに加えた（５０ｎｇ／ウエル）。最後に、インキュベーション（１時間）および洗浄の後、アルカリホスファターゼコンジュゲート化ストレプトアビジンを加え、インキュベーションし（１５分間）、洗浄した。基質緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．１）、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２）におけるジフルニサールホスファート（１ｍｏｌ／Ｌ溶液の１００μＬ）を各ウエルに加えて、１０分間インキュベーションした。発色液（１００μＬ、これは、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ塩基、０．４ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｂＣｌ３および３ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡを含有する）をピペットで各ウエルに加え、１分間撹拌した。蛍光を時間分解型蛍光計のＣｙｂｅｒｆｌｕｏｒ６１５免疫アナライザー（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ、Ｋａｎａｔａ、ＯＮ）で測定した。校正およびデータ処理は、他のところ（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、Ｔ．Ｋ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ、Ｅ．Ｐ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、６４：３４２〜３４６、１９９２；Ｈａｓｓａｐｏｇｌｉｄｏｕ，Ｓ．他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８：１５０１〜１５０９、１９９３）で記載されるように自動的に行われた。
【０２９４】
ｈＫ１４に対するＥＬＩＳＡ
標準アッセイ手法
サンドイッチ型のポリクローナル（マウス／ウサギ）ＥＬＩＳＡが下記のように開発された：白色ポリスチレンマイクロタイタープレートを、１００μＬの被覆用抗体溶液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８０）に希釈された５００ｎｇの抗体を含有する）を各ウエルにおいて一晩インキュベーションすることによってヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で被覆した。その後、プレートを、３回、洗浄緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４０）における９ｇ／Ｌ  ＮａＣｌおよび０．５ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。マウス抗ｈＫ１４ポリクローナル抗血清を一般的な希釈液［６０ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、および０．５ｇ／Ｌ  アジ化ナトリウム］で２０００倍に希釈し、１００μＬを各ウエルに加えた。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。
【０２９５】
その後、ｈＫ１４校正物質またはサンプルをピペットで各ウエルに入れ（一般的な希釈液で１：１希釈した後、１００μＬ／ウエル）、振とうしながら１時間インキュベーションし、その後、６回洗浄した。続いて、緩衝液Ａ（一般的な希釈液＋２５ｍＬ／Ｌの正常マウス血清、１００ｍＬ／Ｌの正常ヤギ血清、および１０ｇ／ＬのウシＩｇＧの構成成分からなる）で２０００倍希釈されたウサギ抗ｈＫ１４抗血清の１００μＬを各ウエルに加え、１時間インキュベーションし、その後、プレートを上記のように洗浄した。最後に、緩衝液Ａで１０００倍希釈されたアルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の１００μＬ／ウエルを各ウエルに加え、３０分間インキュベーションして、上記のように洗浄した。基質緩衝液におけるジフルニサールホスファートを各ウエルに加え、１０分間インキュベーションし、その後、発色液をピペットで１分間加えた。蛍光をＣｙｂｅｒｆｌｕｏｒ６１５免疫アナライザーにより測定した。
【０２９６】
感度、特異性および直線性の測定
感度。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、校正曲線を作製するために使用された。ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ校正物質を、精製された組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを一般的な希釈液に希釈することによって調製した。その後、これらの校正物質を使用して、アッセイの検出限界を明らかにした。
特異性。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ、生物学的流体（精漿）、および、高いｈＫ１４レベルを含有する組織抽出物（乳ガン細胞質ゾル）が、開発された免疫アッセイの特性を明らかにするために使用された。これらのサンプルは最初に、上記で記載された標準アッセイ手法によって測定された。その後、引き続き、マウスおよびウサギの抗ｈＫ１４抗血清が、免疫化の前に得られた同じ動物に由来する血清（免疫化前血清）で置き換えられた。サンプルを再び測定し、蛍光カウント数が、標準アッセイにより得られた蛍光カウント数と比較された。このアッセイの特異性をさらに確認するために、組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（１μｇ、１００ｎｇおよび２０ｎｇ）を、マウスおよびウサギのポリクローナル免疫前抗血清および免疫抗血清（すべて、１：２０００希釈）を別個に一次抗体として使用するウエスタンブロット分析に供した。
【０２９７】
また、他の同族タンパク質の交差反応性が、精製された組換えｈＫ２〜ｈＫ１５（自家製）を使用して、すべて１０００ｇｇ／Ｌの濃度で調べられた。さらに、ｈＫ１４（これはｃ−ｍｙｃエピトープおよびＨｉｓエピトープを有さず、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓと類似する技術を使用して製造された）もまた測定された。
直線性。ｈＫ１４免疫アッセイの直線性を明らかにするために、血清、精漿、および、高いｈＫ１４レベルを有する乳ガン細胞質ゾルのサンプルが一般的な希釈液で連続希釈され、ｈＫ１４の量が、標準アッセイ手法を使用して測定された。
【０２９８】
ヒト組織細胞質ゾル抽出物および生物学的流体の調製
正常なヒト組織（すなわち、食道、扁桃、皮膚、精巣、腎臓、唾液腺、乳房、ファロピウス管、副腎、骨、結腸、子宮内膜、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、精嚢、小腸、脊髄、脾臓、胃、甲状腺、気管および子宮）、ヒト脳の様々な領域（すなわち、前頭皮質、小脳、海馬、延髄、中脳、後頭皮質、脳橋および側頭葉）、ならびに、ガン性の乳房組織および卵巣組織におけるｈＫ１４の存在が、このｈＫ１４免疫アッセイを使用して測定された。細胞質ゾル抽出物は下記のように調製された。様々な凍結ヒト組織（０．２ｇ）をドライアイス上で細かい粉末に粉砕化した。抽出緩衝液（１ｍＬ、これは、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１０ｇ／ＬのＮＰ−４０界面活性剤、１ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｇ／Ｌのアプロチニン、１ｇ／Ｌのロイペプチンを含有する）を組織粉末に加え、混合物を、振とうおよびボルテックス混合を１０分毎に繰り返しながら氷上で３０分間インキュベーションした。その後、混合物を、４℃で３０分間、１４，０００ｇで遠心分離した。その後、上清を回収した。卵巣ガン細胞質ゾルおよび乳ガン細胞質ゾルにおけるｈＫ１４のレベルもまた測定された。スクリーニングされた生物学的流体（精漿、羊水、母乳、脳脊髄液、濾胞液、血清、および、進行した卵巣ガンの女性から得られた腹水）は、日常的な生化学検査のために提出されたサンプルの残りであった。すべての細胞質ゾル抽出物および生物学的流体は使用まで−８０℃で保存された。
【０２９９】
回収
組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、一般的な希釈液（コントロール）、正常血清（男性および女性）、精漿、羊水および乳ガン細胞質ゾル抽出物に、異なる濃度（５μｇ／Ｌおよび１０μｇ／Ｌ）で加えて、このｈＫ１４免疫アッセイにより測定した。その後、回収量が、内因性濃度を引いた後で計算された。
【０３００】
免疫組織化学
免疫組織化学的染色が、一次抗体として、ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢＫｉｔペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）、および、酵母で産生された全長の組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓタンパク質に対して惹起されたｈＫ１４特異的なウサギポリクローナル抗体を使用するストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼプロトコルに従って行われた。簡単に記載すると、厚さが４μｍのパラフィン組織（非悪性および悪性の乳房、卵巣、精巣および皮膚を含む）切片をホルマリン中で固定し、その後、室温（ＲＴ）でキシレンの２回の交換を伴いながら、温キシレンにおいて５分間、脱パラフィン化し、そして、段階的なアルコールに移行することによって再水和した。内因性のペルオキシダーゼ活性をメタノールにおける０．５％のＨ２Ｏ２で１０分間ブロッキング処理した。その後、切片を、５分間、電子レンジにおいて１０ｍｍｏｌ／リットルのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．１）で前処理して、一次抗体（１：４００希釈）と４℃で一晩インキュベーションした。切片を５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）で２回洗浄した後、ビオチン化された結合体（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を１５分間加え、その後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートをさらに１５分間加えた。酵素反応を、ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ基質色素原溶液を使用して３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩の新しく調製された溶液において１０分間、発色させた（褐色）。その後、切片をヘマルムにより対比染色し、脱水し、キシレンにおいて透明化し、固定した。染色パターン、各組織における免疫染色の分布、および染色強度を詳しく調べた。
【０３０１】
結果
組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ
組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、ｈＫ１４の酵素活性な形態と、Ｃ末端のｃ−ｍｙｃと、Ｈｉｓタグとからなる、予測分子量が約２８ｋＤａの融合タンパク質としてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現システムで産生させた。ウエスタンブロット分析によって検出されるように、タンパク質が発現し、約２８ｋＤａおよび２５ｋＤａ（前者が優勢な化学種である）の２つの異なるバンドによって示される２つの形態で高発現性のＸ−３３Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンの培養培地に分泌された（図１３Ａ、レーン３〜５）。さらに、タンパク質は、レーン４〜５におけるより低分子量のバンド（２１．５ｋＤａ未満）によって図１３に示されるように、メタノール誘導の４日後には分解するようである。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓがメタノール誘導の１日後に培養上清において検出され（示されず）、最高レベルは６日後であった。ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓは、誘導前の細胞の上清（図１３Ａ、レーン２）において、またはｐＰＩＣＺαＡベクターのみで形質転換された誘導後の酵母細胞清（図１３Ａ、レーン６）においては観測されなかった
組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを、６日間のメタノール誘導の後、培養上清からＩＭＡＣによって精製し、２５０ｍＬの培養上清あたり１ｍｇの精製ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが平均して得られた。図１３Ｂに示されるように、精製されたｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、クーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて２８ｋＤａおよび２５ｋＤａの２つのバンドとして可視化される。これらのバンドを切り出し、トリプシンで消化して、ＭＳ−ＭＳによって配列分析した。ナノエレクトロスプレー質量スペクトル（示されず）における抽出されたトリプシン消化ペプチドのｍ／ｚ値により、それらの分子質量の計算が可能であった。配列帰属の確認が、選択された前駆体イオンについてのＭＳ−ＭＳを使用して達成された。これらのトリプシン消化ペプチドの部分配列が、隣接フラグメントイオン間のｍ／ｚ間隔から同定された。例えば、部分的に配列決定されたトリプシン消化ペプチド：ＳＳＱＰＷＱＡＡＬＬＡＧＰＲ［配列番号１９］およびＡＶＲＰＩＥＶＴＱＡＣＡＳＰＧＴＳＣＲ［配列番号２０］は、ｈＫ１４のアミノ酸配列３４〜４７およびアミノ酸配列１２６〜１４４とそれぞれ正確に一致した（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＫ４８５２４）。
【０３０２】
精製されたｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの２８ｋＤａ形態のＮ末端配列はＧｌｕ−Ａｌａ  Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ（配列番号２７）であった。同定された最初の２つのアミノ酸Ｇｌｕ−Ａｌａは、酵母分泌α−因子の最後の２つのアミノ酸に対応する。２つの潜在的な切断部位が酵母分泌α−因子の除去のために存在するが、この場合、α−因子の成熟化に関与しているジペプチジルアミノペプチダーゼ（Ｓｔｅ１３遺伝子産物）はＧｌｕのＮ末端側で切断し、α−因子の部分的な除去をもたらすだけであった。もう一つの切断部位がＡｌａのＣ末端側に存在するが、利用される場合、Ｇｌｕ−ＡｌａジペプチドはｈＫ１４ｍｙｃ−ＨｉｓのＮ末端において取り込まれていない。その次の２つのアミノ酸Ｇｌｕ−Ｐｈｅは、ＫＬＫ１４をクローン化するために使用されたＥｃｏＲＩ制限酵素部位のアミノ酸を表している。最後の２つのアミノ酸Ｉｌｅ−Ｉｌｅは、成熟ｈＫ１４のアミノ酸（タンパク質配列における残基２５および残基２６）と一致する。
【０３０３】
ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの２つの形態が産生されたこと、および、ｈＫ１４が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにより認識されたその一次配列における潜在的なグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ）を有することを考えれば、当初、２８ｋＤａの高分子量化学種はグリコシル化されているということが仮定された。このことを明らかにするために、精製されたｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、ＰＮＧａｓｅＦとのインキュベーションの前後で、２つの同一のポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、一方がクーマシーブルーによって染色され、もう一方が糖タンパク質染色で染色された（図１４）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（糖タンパク質）およびダイズトリプシン阻害剤（非グリコシル化タンパク質）もまた、陽性コントロールおよび陰性コントロールとしてそれぞれ含まれた。ＰＮＧａｓｅＦで処理したとき、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの分子量は変化しなかった（図１４Ａ）。さらに、陽性の糖タンパク質コントロールのみが、酸性フクシンスルフィトを用いた糖タンパク質について染色されたゲルにおいて可視化された（図１４Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓはグリコシル化されていないことを示している。組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの２つの形態はグルコシル化されていないので、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの２５ｋＤａ体は、自己切断により生じた分解種、または、酵母培養において存在する他のプロテアーゼによる切断によって生じた分解種であることが最も考えられる。しかしながら、これらの結果は、天然ＫＬＫ１４が、ｈＫ１（Ｌｕ、Ｈ．Ｓ．他、Ｊ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ、３３：２３７〜２４９、１９８９）、ｈＫ２（Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２４６：４４０〜４４６、１９９７；Ｅｅｒｏｌａ、Ｒ．他、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、３１：８４〜９０、１９９７）およびｈＫ３（Ｂｅｌａｎｇｅｒ，Ａ．他、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２７：１８７〜１９７、１９９５）を含む他の天然カリクレインと同様に、インビボでグリコシル化され得るという可能性を排除していない。
【０３０４】
ｈＫ１４  ＥＬＩＳＡの特性
形態
組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓに対するポリクローナル抗体の作製が、標準的な技術を使用して組換えタンパク質をマウスおよびウサギに注射することによって達成された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｅ．Ｐ．ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ（編）、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、９５頁〜１１５頁、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６］）。マウスおよびウサギの抗血清は、ｈＫ１４免疫反応性が、３回目の追加免疫注射を含めて、それまで増大し続けること（力価が大きくなること）が明らかにされた。バックグラウンドよりも著しく大きい免疫反応性は、免疫前のウサギ血清またはマウス血清がそれぞれの免疫血清の代わりに使用されたときには認められなかった。従って、３回目の追加免疫注射の後で得られたマウス抗体およびウサギ抗体が、ｈＫ１４の免疫蛍光測定アッセイを開発するために使用された。捕獲抗体がマウスにおいて作製され、かつ、検出抗体がウサギにおいて作製された「サンドイッチ型」のポリクローナル免疫アッセイ形態が採用された。アルカリホスファターゼで標識された二次のヤギ抗ウサギポリクローナル抗体もまた使用され、アルカリホスファターゼの活性が時間分解型蛍光計によって測定された（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｋ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、６４：３４２〜３４６、１９９２）。このアッセイ形態は、何らかの事前の抗体精製を必要せず、また、ｈＫ４（Ｏｂｉｅｚｕ，Ｃ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４８：１２３２〜１２４０、２００２）、ｈＫ５、ｈＫ６（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３３：３６９〜３７５、２０００）、ｈＫ８（Ｋｉｓｈｉ，Ｔ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４９：８７〜９６、２００３）、ｈＫ１０（Ｌｕｏ，Ｌ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７：２３７〜２４６、２００１）、ｈＫ１１（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、６２：２９５〜３００、２００２）およびｈＫ１３（Ｋａｐａｄｉａ，Ｃ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４９：７７〜８６、２００３）を含む他のカリクレインについて非常に特異的かつ高感度であることが以前には見出されていた。
【０３０５】
感度
このｈＫ１４  ＥＬＩＳＡについての典型的な校正曲線が図１５に示される。精製された組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、６０ｇ／ＬのＢＳＡにおいて、０．１μｇ／Ｌ、０．５μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌおよび２０μｇ／Ｌに希釈されて、校正物質として使用された。この範囲にわたって、アッセイは強い直線の関係を示した。検出限界は、９５％の信頼（ゼロ校正物質の平均値＋２ＳＤ）でゼロから区別することができるｈＫ１４の濃度として定義されたとき、０．１μｇ／Ｌであった。
【０３０６】
特異性
このｈＫ１４  ＥＬＩＳＡの特異性が、数回の実験を行うことによって確認された。最初に、免疫アッセイおよびウエスタンブロットが、免疫前または免疫のいずれかのマウス血清およびウサギ血清を使用して行われた。マウス抗血清およびウサギ抗血清が免疫アッセイにおいて免疫前のマウス血清およびウサギ血清で置き換えられたとき、組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（２０μｇ／Ｌ）およびｈＫ１４陽性サンプル（精漿および乳房組織抽出物）に関連する蛍光シグナル（約３５０，０００の任意ユニット）はバックグラウンドシグナル（約１６，０００の任意ユニット）に低下した（図１６）。この実験では、ｈＫ１４免疫アッセイにより生じた蛍光カウント数が、ｈＫ１４に対するマウスおよびウサギの抗ｈＫ１４ポリクローナル抗体の特異的な結合を表していることが明らかにされる。第２に、ウサギの免疫前血清および免疫血清を使用する精製された組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓのウエスタンブロット分析は、メンブランが免疫ウサギ血清でプローブされたときにだけ、ｈｋ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（１μｇおよび１００ｎｇ）に対応するバンドをもたらした（図１７）。ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを表すバンドは、メンブランが免疫前マウス血清または免疫マウス血清のいずれかとインキュベーションされたときには観測されなかった（データは示されず）。第３に、マウスおよびウサギのポリクローナル抗体の交差反応性が評価された。ｈＫ１４はヒトカリクレインファミリーのメンバーであるので、他のカリクレインとの著しいアミノ酸類似性を有する（特に、ｈＫ６に対しては、４８％のアミノ酸同一性を示す）。従って、組換えｈＫ２〜ｈＫ１５の交差反応性が調べられた。すべての組換えタンパク質は、ｈＫ１４よりも１０００倍大きい濃度でさえも、バックグラウンドのシグナルと匹敵する読み取り値をもたらした。さらに、交差反応性は、他のＨｉｓ標識タンパク質（例えば、組換えｈＫ５ｍｙｃ−Ｈｉｓ）が調べられたときには観測されなかった。また、組換えｈＫ１４（これはｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓエピトープを有しない）が試験されたが、この確立されたアッセイは、ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓエピトープ含有またはｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓエピトープ非含有のｈＫ１４を同等に検出することができた。実際、このデータから、この免疫アッセイが、ｈＫ１４を高い特異性で測定し、ｈＫ１４を他の類似するタンパク質から効率的に識別し、また、ポリヒスチジンタグを検出しないことが確認される。
【０３０７】
直線性および精度
このアッセイの直線性を評価するために、様々なサンプル（血清、精漿および乳ガン細胞質ゾル）が連続希釈され、ｈＫ１４が再測定された（データは示されず）。良好な希釈直線性が、このアッセイを用いて観測された。このことは、マトリックスの影響がないことを示唆している。操作内および操作間の精度が、様々なｈＫ１４校正物質および臨床サンプルを用いて評価された。すべての場合において、アッセイの不正確さ［変動係数（ＣＶ）］は１０％未満であった。
【０３０８】
ヒト組織抽出物および生物学的流体におけるｈＫ１４の同定
ヒト組織細胞質ゾル抽出物におけるｈＫ１４の分布
成人男性および成人女性の様々な組織におけるｈＫ１４のレベルが、開発された免疫アッセイを使用して定量された。データが図１８にグラフにより示される。これらの抽出物におけるｈＫ１４の量は、総タンパク質含有量について相関させられ、総タンパク質１ｇあたりのｈＫ１４のｎｇとして表された。非常に高いｈＫ１４レベルが乳房において観測され、次いで、皮膚、前立腺、中脳および腋窩リンパ節において観測された。より低いレベルが、肺、胃および精巣において見られた。免疫反応性は、調べられたそれ以外の組織では検出されなかった（材料および方法の節を参照のこと）。
【０３０９】
ｈＫ１４の免疫組織化学的局在化
ｈＫ１４は、様々な非悪性組織および悪性組織に由来する腺上皮細胞において免疫組織化学的に局在化が調べられた（図１９）。強い免疫染色が、一般には、これらの上皮細胞の細胞質において観測され、これに対して、間質は典型的には陰性であった。
【０３１０】
生物学的流体におけるｈＫ１４
様々な生物学的流体におけるｈＫ１４の濃度が、表９に示されるように定量された。このカリクレインの非常に高いレベルが精漿において見られ、次いで、羊水および濾胞液において見られた。より低いレベルが男性の血清サンプルにおいて得られ、一方、女性の血清、脳脊髄液、腹水および母乳はすべてがｈＫ１４について陰性であった（０．１μｇ／Ｌの検出限界よりも低い濃度）。
【０３１１】
生物学的流体からのｈＫ１４の回収
様々な生物学的流体におけるｈＫ１４の回収は不完全であり、男性の血清では２４％〜６４％の範囲であり、女性の血清では１８％〜３５％の範囲であり、精漿では３０％〜６０％の範囲であり、羊水では３５％〜４９％の範囲であり、乳ガン細胞質ゾルでは４０％〜５６％の範囲であった。
【０３１２】
ｈＫ１４のホルモン調節
ｈＫ１４のホルモン調節パターンを研究するために、乳ガン細胞株ＢＴ−４７４が培養され、様々なステロイドを１０−８ｍｏｌ／ｌの最終濃度で用いて刺激され、組織培養上清が、７日間のインキュベーションの後、ｈＫ１４免疫アッセイを用いて分析された。図２０に例示されるように、ベースラインｈＫ１４レベル（アルコール刺激）と比較して、ｈＫ１４濃度における最も著しい増大（３８倍）をもたらしたステロイドはエストラジオールであった。ＤＨＴはｈＫ１４レベルの４倍の増大を生じさせ、一方、ノルゲストレルは２．８倍の増大をもたらした。これらのデータは、ＫＬＫ１４遺伝子の発現がＢＴ−４７４乳ガン細胞株ではエストロゲン類によって主にアップレギュレーションされることを示唆している。
【０３１３】
正常な卵巣細胞質ゾル、良性の卵巣細胞質ゾル、およびガン性卵巣細胞質ゾルにおけるｈＫ１４発現
２０個の卵巣ガン組織抽出物におけるｈＫ１４のレベルが、１０個の正常な卵巣組織、および、良性疾患の患者から得られた１０個とともに、ｈＫ１４免疫アッセイを使用して定量された。ｈＫ１４値は、総タンパク質に関して相関させられ、総タンパク質１ｍｇあたりのｈＫ１４のｍｇとして表された。結果が図２１に示される。正常な卵巣組織抽出物におけるｈＫ１４のレベルは０．０３ｎｇ／ｍｇを超えなかった。良性疾患群から得られた１０個の抽出物のうちの５個がこのレベルを上回ったが、これらの値のうちの４つ（０．３３ｎｇ／ｍｇを示す１つの抽出物を除く）は０．８８ｎｇ／ｍｇ未満のままであった。興味深いことに、２０個の卵巣ガン組織抽出物のうちの８個（２０％）は、正常な組織および良性の組織（１つを除く）のレベルと比較して、さらにより高いレベルのｈＫ１４を含有し、そのすべてが０．１５ｎｇ／ｍｇよりも大きかった。このデータから、卵巣ガン患者では、正常または良性の疾患を有する患者とは対照的に、ｈＫ１４が一般には過剰発現していることが示唆される。
【０３１４】
ガン患者の血清におけるｈＫ１４
ｈＫ１４レベルが、様々な悪性腫瘍の患者に由来する合計で９１個の血清サンプル（これには、卵巣ガン（ｎ＝２０）、乳ガン（ｎ＝２０）、前立腺ガン（ｎ＝３１）、精巣ガン（ｎ＝１０）および結腸ガン（ｎ＝１０）が含まれる）、ならびに、健康で正常な男性被験者および女性被験者からそれぞれ得られた２７個および２８個の血清サンプルにおいて分析された。ｈＫ１４が正常な女性の血清では検出されず、調べられた健康な男性の血清では０．１６μｇ／Ｌの高いレベルに達していた（表９）。ガン患者の中で（表１０）、１３名（６５％）の卵巣ガン女性および８名（４０％）の乳ガン女性は、ｈＫ１４の上昇したレベル（それぞれ、０．１２μｇ／Ｌ〜１．５８μｇ／Ｌおよび０．１２μｇ／Ｌ〜０．３μｇ／Ｌ）が明らかにされた（図２２）。５名（１６％）の前立腺ガン者は、上昇したｈＫ１４レベル（０．２３μｇ／Ｌ〜０．６２μｇ／Ｌ）を示し、これに対して、２名（２０％）の結腸ガン患者（０．１８μｇ／Ｌおよび０．２６μｇ／Ｌ）および１名（１０％）の精巣ガン腫患者（０．４９μｇ／Ｌ）のみが顕著なｈＫ１４濃度を有していた。
【０３１５】
考察
この数十年間にわたる広範囲の研究は、ガンのスクリーニング、診断、モニターリング、予後を助けるために、そして究極的には患者の生存を増大させるために、腫瘍マーカーの同定に集中している。従来の腫瘍マーカーおよび明らかになりつつある腫瘍マーカーは、発ガンに原因的に関与するか、または、悪性形質転換の偶発的な副産物のいずれかであっても、ガン遺伝子、抑制因子遺伝子、サイトカイン、血管形成因子、炭水化物抗原およびプロテアーゼから、無細胞核酸、自己抗体、接着タンパク質、および循環しているガン細胞にまで及ぶ（Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｗ．およびＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｋ．、Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ［Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ、Ｈ．Ａ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｈ．Ｌｉｌｊａ、Ｄ．Ｗ．ＣｈａｎおよびＭ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ（編）、Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９頁〜１８頁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＡＡＣＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００２］）。特に、プロテアーゼは、腫瘍の進行および転移におけるその機能的役割のために非常に注目されている（Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｇ．、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１０：１４５〜１５５、１９９１；Ｎｏｅｌ，Ａ．他、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１７：２２１〜２３９、１９９７）。
【０３１６】
ヒト組織のカリクレインは、発ガンに関係しているセリンクラスのプロテアーゼに含まれる（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、１１：５４〜６０、２０００；Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２２：１８４〜２０４、２００１）。この酵素ファミリーには、確立された血清学的ガンバイオマーカー（ｈＫ３／ＰＳＡ）および予想される血清学的ガンバイオマーカー（ｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ８、ｈＫ１０およびｈＫ１１）、ならびに多くの潜在的な予後／予測指標が含まれる（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．およびＹｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４８：１１９８〜１２０５、２００２）。
【０３１７】
上記で記載されたように、ピキア・パストリス発現システムにおける組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが産生され、精製された。このタンパク質はまた、ポリクローナル抗体作製のために免疫源としてマウスおよびウサギに投与された。抗体は、生物学的流体および組織抽出物におけるｈＫ１４の定量のために好適な非常に高感度かつ特異的なＥＬＩＳＡを開発するために、また、免疫組織化学的研究を行うために使用された。
【０３１８】
このＥＬＩＳＡを使用して、ｈＫ１４がいくつかの生物学的流体において測定され、非常に高いレベルが精漿および羊水において測定された（表９）。この観測結果から、インビボでは、ｈＫ１４が分泌タンパク質であることが確認される。対照的に、健康な男性および女性の血清におけるｈＫ１４の濃度は、濾胞液および腹水における場合と同様に、極めて低く、免疫アッセイの検出限界（０．１μｇ／Ｌ）に近かった。生物学的流体からの組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの回収もまた不完全であり（１８％〜６４％の範囲）、このことは、ｈＫ３、ｈＫ６、ｈＫ８、ｈＫ１０、ｈＫ１１およびｈＫ１３を含む他のカリクレインの間における共通した知見であった（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：２９５〜３００、２００２；Ｌｕｏ，Ｌ．Ｙ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７：２３７〜２４６、２００１；Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３３：３６９〜３７５、２０００；Ｋｉｓｈｉ，Ｔ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４９：８７〜９６、２００３；Ｋａｐａｄｉａ，Ｃ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４９：７７〜８６、２００３；Ｙｕ，Ｈ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、３９：２１０８〜２１１４、１９９３）。この現象に対する１つの考えられる説明は、様々なｈＫ１４形態がプロテアーゼ阻害剤との複合体を形成し、それらを免疫アッセイによって検出できなくし、ｈＫ１４濃度の過小評価をもたらしているということである（Ｚｈａｎｇ，ＷＭ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４４：２４７１〜２４７９、１９８８）。ｈＫ２、ｈＫ３およびｈＫ６を含む他のカリクレインが、多くの場合には容易に定量されない複合体を形成する循環中のプロテアーゼ阻害剤（これには、α２−マクログロブリン、プロテインＣ阻害剤、α１−アンチキモトリプシン、α２−アンチプラスミン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンおよびプロテアーゼ阻害剤６が含まれる）によって（主に血清中では）封鎖されることが広く報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９４：７５５〜７６３、１９９０；Ｓｔｅｎｍａｎ，Ｕ．Ｈ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５１：２２２〜２２６、１９９１；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、３７：１６１８〜１６２５、１９９１；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｒ．Ａ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４２：６７５〜６８４、１９９６；Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｃ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ、９：１１３３〜１１４７、２０００；Ｓａｅｄｉ，Ｍ．Ｓ．他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、９４：５５８〜５６３、２００１；Ｃａｏ，Ｙ．他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１６１：２０５３〜２０６３、２００２；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｓ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４９：７４６〜７５１、２００３）。これらのカリクレインの遊離型形態ならびに結合型形態は、ガンを示差的に診断するための有用なバイオマーカーである（Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｃ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ、９：１１３３〜１１４７、２０００；Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ，Ｈ．Ｇ．他、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  ���ｃｉ、３５：２７５〜３６８、１９９８）。
【０３１９】
ｈＫ１４の組織発現パターンが、ＥＬＩＳＡを用いて成人組織抽出物のパネルを分析することによって明らかにされた。タンパク質が、少数の組織において、特に、乳房、皮膚、前立腺、中脳、腋窩リンパ節、肺、胃および精巣において検出可能であった。さらに、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１およびｈＫ１３については当てはまるように（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：２９５〜３００、２００２；Ｌｕｏ，Ｌ．Ｙ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７：２３７〜２４６、２００１；Ｈｅｎｔｔｕ，Ｐ．およびＶｉｈｋｏ，Ｐ．、Ａｎｎ  Ｍｅｄ、２６：１５７〜１６４、１９９４；Ｐｅｔｒａｋｉ，Ｃ．Ｄ．他、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４９：１４３１〜１４４１、２００１；Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｈ．他、Ｃａｎｃｅｒ、８６：２０７４〜２０８２、１９９９；Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：７８１１〜７８１８、２００１；Ｐｅｔｒａｋｉ，Ｃ．Ｄ．他、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５０：１２４７〜１２６１、２００２；Ｐｅｔｒａｋｉ，Ｃ．Ｄ．他、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、５１：４９３〜５０１、２００３）、ｈＫ１４は、ゴルジ装置内または分泌小胞内が可能性が高いが、健康およびガン性の両方で、様々な組織に由来する腺上皮細胞の細胞質に局在化することが免疫組織化学的に明らかにされた（図１９）。このことはさらに、このタンパク質が分泌されることを示唆している。これらの知見は互いに良く相関しており、また、ＫＬＫ１４が脳、乳房、前立腺および精巣において転写されることを示す、ＲＴ−ＰＣＲによるＫＬＫ１４のｍＲＮＡ発現に関する以前の研究と良く相関している（Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：３４２５〜３４３１、２００１）。
【０３２０】
以前の研究では、ＫＬＫ１４のｍＲＮＡレベルがＣＮＳ組織（すなわち、脳、小脳および脊髄）において非序に高いことが示されていた（Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：３４２５〜３４３１、２００１）。しかしながら、Ｈｏｏｐｅｒ他は、前立腺、脾臓および骨格筋におけるＫＬＫ１４の限定された発現を報告していた（Ｈｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｄ．他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７３：１１７〜１２２、２００１）。本明細書中に記載される結果は、ｈＫ１４タンパク質が、比較的低いレベルが観測される中脳を除いて、どのＣＮＳ組織においても検出されないことを示唆している（図１８）。さらに、ｈＫ１４は脳脊髄液において検出することができなかった（表９）。これらのデータは、ヒトカリクレイン１４は、タンパク質レベルでは、ＣＮＳにおいて顕著に発現しないことを示唆している。ＣＮＳにおけるＫＬＫ１４レベルとｈＫ１４レベルとの間における差は、１）ＫＬＫ１４遺伝子の翻訳後修飾的調節、２）（ｍＲＮＡの不安定、短い半減期による）ＫＬＫ１４のｍＲＮＡの迅速な分解でなく、効率的なＫＬＫ１４転写、または、３）合成直後の迅速な分解でなく、ｈＫ１４の効率的な翻訳に起因することが考えられ得る。
【０３２１】
カリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーのすべてではないが、そのほとんどが、調べられた前立腺ガン細胞株、乳ガン細胞株および卵巣ガン細胞株ではステロイドホルモンによって調節される（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、１１：５４〜６０、２０００；Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２２：１８４〜２０４、２００１）。いくつかの遺伝子がアンドロゲン類およびアンドロゲン性プロゲスチン類によって顕著にアップレギュレーションされ（例えば、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ１３およびＫＬＫ１Ｓ）、これに対して、他の遺伝子はエストロゲン類に対して主に応答性である（例えば、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ９、ＫＬＫ１０およびＫＬＫ１１）（Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２２：１８４〜２０４、２００１）。プロモーター／エンハンサー領域が、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２およびＫＬＫ３について特徴づけられているにすぎない。ＫＬＫ１４遺伝子に関しては、そのプロモーター領域の配列分析により、推定されるＡＲＥの存在が明らかにされ、予備的なホルモン調節研究により、ＫＬＫ１４のｍＲＮＡレベルが、調べられた乳ガン細胞株（ＢＴ−４７４細胞を含む）および卵巣ガン細胞株において、アンドロゲン類によって顕著にアップレギュレーションされることが示される。しかしながら、アンドロゲン受容体陽性およびエストロゲン受容体陽性の乳ガン細胞株のＢＴ−４７４の上清におけるｈＫ１４レベルの免疫蛍光測定での定量は、様々なステロイドホルモンによる刺激の後では、ＫＬＫ１４遺伝子がエストロゲン類によって著しくアップレギュレーションされ、次いで、アンドロゲン類（ＤＨＴ）およびアンドロゲン性プロゲスチン類（ノルゲストレル）によってアップレギュレーションされることを示していた。これらの結果から、ＫＬＫ１４はＢＴ−４７４ガン細胞株ではアンドロゲン応答性およびエストロゲン応答性の両方であることが示唆される。
【０３２２】
これらのデータは、乳房（エストロゲンにより調節される組織）において、また、前立腺（アンドロゲンにより調節される組織）（前立腺からは、ｈＫ１４がおそらくは分泌され、ｈＫ１４もまた高いレベルで見出される精漿の構成成分を形成する［Ｈｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｄ．他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７３：１１７〜１２２、２００１］）において、比較的高いレベルのｈＫ１４を示すｈＫ１４の組織発現パターンと一致している。
【０３２３】
ＥＬＩＳＡが、正常な卵巣組織、良性の卵巣組織およびガン性の卵巣組織の抽出物、ならびに、正常者、卵巣ガン患者および乳ガン患者から得られた血清におけるｈＫ１４を定量するために使用された。上昇したｈＫ１４レベルが、正常と比較して、卵巣ガン組織抽出物（図２２）において、また、卵巣ガン患者および乳ガン患者の一部の血清において見出された（表１０および図２１）。血清レベルが上昇した患者群はまた、その組織におけるｈＫ１４レベルが過剰発現している患者であり得る。これらの知見に基づいて、ｈＫ１４は、ｍＲＮＡレベルでのその予後値に加えて、卵巣ガンおよび乳ガンのバイオマーカーである。
【０３２４】
ｈＫ１４に加えて、他のカリクレインタンパク質もまた、ｈＫ５、ｈＫ６（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２１：１０３５〜１０４３、２００３；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｒ．他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８７：７６３〜７７１、２００２）、ｈＫ８（Ｋｉｓｈｉ，Ｔ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６３：２７７１〜２７７４、２００３）、ｈＫ１０（Ｌｕｏ，Ｌ．Ｙ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６３：８０７〜８１１、２００３）、ｈＫ１１（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：２９５〜３００、２００２）およびｈＫ１３（Ｋａｐａｄｉａ，Ｃ．他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４９：７７〜８６、２００３）を含めて、卵巣ガン患者の血清および／または組織では上昇している。血清ｈＫ５もまた、乳ガン患者の一部では高くなっており、一方、高くなったレベルのｈＫ３／ＰＳＡおよびｈＫ１０が、タモキシフェン治療に対する不良な応答に関連する（Ｆｏｅｋｅｎｓ，Ｊ．Ａ．他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、７９：８８８〜８９４、１９９９；Ｌｕｏ，Ｌ．Ｙ．他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８６：１７９０〜１７９６、２００２）。これらのカリクレインが同時に発現し、おそらくは協調して調節されることを考えれば、これらのカリクレインが、未だ知られていない機構による卵巣ガン発生および乳ガン発生に関与する酵素的なカスケード経路を形成し得ることを推測することは不当ではない（Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．およびＤｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．、Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２７：１５７〜１６６、２００２）。ｈＫ１４もまた、これらの致死性悪性腫瘍について診断／予後の可能性を改善するための、卵巣ガンおよび乳ガンの他のバイオマーカー（他のカリクレインを含む）とともにパネルに含まれ得る。
【０３２５】
まとめると、これは、ヒトカリクレイン１４をタンパク質レベルで定量的および定性的に研究するための特異的な試薬（組換えｈＫ１４、ポリクローナル抗体）および方法論（ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学）の開発を記載するための最初の証拠である。
【実施例４】
【０３２６】
組換えカリクレイン１４および組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−ＨｉｓのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける産生
ＫＬＫ１４ｃＤＮＡのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣＺαＡへのクローン化
組換えカリクレイン１４をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母発現システムで産生させた。疎水性および構造的相同性分析によって示唆されるように、カリクレイン１４は、２５１アミノ酸（ａａ）の分泌型トリプシン様セリンプロテアーゼであることが予測される。カリクレイン１４の成熟型酵素活性形態は、アミノ酸２５〜２５１に対応する２２７ａａから構成されることが考えられる（アミノ酸１〜１８はシグナルペプチドを構成し、アミノ酸１８〜２４は活性化ペプチドを構成する）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＫ４８５２４）（Ｙｏｕｓｅｆ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：３４２５〜３４３１、２００１）。カリクレイン１４のこの活性形態をコードするｃＤＮＡが、２組の遺伝子特異的プライマー（ＦＰＬ６／ＲＰＬ６およびＦＰ１４−Ｈｉｓ／ＲＰ１４−Ｈｉｓ）によって増幅され、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣＺαＡにクローン化された。
【０３２７】
ｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４およびｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの構築物は、サッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の分泌α−因子が、ＫＬＫ１５の５’末端と読み枠を一致させて、そのすぐ上流に存在するように、また、ｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの場合には、その３’末端がｐＰＩＣＺαＡプラスミドのＣ末端ｃ−ｍｙｃエピトープおよびＨｉｓタグと読み枠を一致するように操作された。従って、組換えカリクレイン１４の２つの型が作製された：非タグ化カリクレイン１４（２５ｋＤａの予測ＭＷ）、および、Ｃ末端融合タグを含有するカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（２８ｋＤａの予測ＭＷ）。組換えカリクレイン１４および組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−ＨｉｓのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現。
【０３２８】
遺伝子型および表現型の異なるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母株のＸ−３３、ＧＳ１１５およびＫＭ７１Ｈが、ＰｍｅＩで線状化された構築物ｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４および構築物ｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓならびに空のｐＰＩＣＺαＡ（コントロール）で形質転換された。１０コロニーのＸ−３３およびＧＳ１１５（これらはいずれかの構築物で形質転換された）のＭｕｔ表現型が、メタノールの非存在下および存在下におけるそれらの成長速度論を調べることによって決定された。得られた表現型はすべてが、ＡＯＸ１遺伝子座における遺伝子挿入または１回の交差組換えを示すＭｕｔ＋であった。Ｘ−３３およびＧＳ１１５の形質転換体のＭｕｔ表現型を評価することの重要性は、Ｍｕｔ＋株およびＭｕｔＳ株は異なる成長速度論を示し、従って、タンパク質産生のために異なる成長方法を必要とするという事実から生じている。
【０３２９】
組換えカリクレイン１４および組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、それぞれの形質転換Ｐｉｃｈｉａ株に由来する調べられた１０コロニーの大部分（約８５％）において、２５ｋＤａおよび２８ｋＤａのタンパク質として酵母培養上清においてそれぞれ検出された。両タンパク質は１日のメタノール誘導の後で同定可能であり、最大のレベルが６日後に得られた。一般に、組換えカリクレイン１４および組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの発現の最大レベルが、染色されたゲルまたはウエスタンブロットにおけるバンド強度を比較することによって決定されたとき、組換えＸ−３３株から得られた。２つのＸ−３３（Ｍｕｔ＋）クローンにおけるカリクレイン１４およびカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの最適な産生が、緩衝化された複雑な培地（ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ）において合計で６日間にわたって１％メタノール／日により発現を誘導することによって達成された。
【０３３０】
ウサギ抗カリクレイン１４ポリクローナルペプチド抗体の弱い感受性のために、銀染色されたポリアクリルアミドゲルが、組換えカリクレイン１４の産生をモニターするために使用された。カリクレイン１４は、約２８ｋＤａのバンドによって示されるように、メタノールにより誘導された酵母細胞の上清に存在するだけであり、誘導前の上清には存在しない。組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの産生に関しては、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体を使用するウエスタンブロット分析では、メタノール誘導後における約３１ｋＤａおよび約２８ｋＤａの２つの異なるバンドによって示されるように、このタンパク質の２つの形態が酵母培養上清に存在することが検出された。さらに、このタンパク質は、約２１．５ｋＤａの分子量マーカーよりも小さいバンドによって、メタノール誘導の４日後には分解し始める。重要なことではあるが、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓは、誘導前の細胞の上清において、または、ｐＰＩＣＺαＡベクターのみで形質転換された誘導後の酵母細胞においては観測されなかった。
【０３３１】
組換えカリクレイン１４タンパク質の精製
組換えカリクレイン１４が、６日間のメタノール誘導の後、ＦＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）システムでのカチオン交換によって高発現性Ｘ−３３形質転換体の酵母培養上清から精製され組換えカリクレイン１４タンパク質のｐＩが９．５２であることが予測されたので、カチオン交換媒体、および、タンパク質のｐＩよりも低い操作ｐＨ（この場合にはｐＨ７．５）を有するアニオン性緩衝液系が選ばれた。これにより、タンパク質を負荷電のＣＭセファロースカラムに結合させることができた。これは、タンパク質がそのｐＩよりも低いｐＨ値では正味の正荷電を帯びるからである。一般に、クロマトグラフィーシステム（例えば、ＦＰＬＣシステムなど）は、典型的には、回分技術よりも大きい分離能をもたらし、これにより、より高い純度がもたらされ得る（Ｄｕｎｎ  ＢＭ他［Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｇａｎ、ＢＭ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１巻、８．２．１頁〜８．２．３０頁：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７］）。組換えカリクレイン１４がＣＭセファロースカラムから０．３Ｍ〜０．４ＭのＫＣｌ濃度範囲で溶出され、最大レベルが０．３４Ｍにおいてであった。溶出分画物を一緒にし、さらに２０倍濃縮した。精製されたカリクレイン１４が約２５ｋＤａの単一バンドとして可視化される。
【０３３２】
組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、６日間のメタノール誘導の後、高発現性Ｘ−３３クローンの培養上清からＩＭＡＣによって精製された。Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスに対するカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの吸着が、Ｈｉｓタグのヒスチジル残基のイミダゾール窒素が非プロトン化形態にあり、ＮＴＡ基により固定化されているＮｉ２＋イオンに対するその結合を可能にするように、ｐＨ８において行われた。溶出が、イミダゾールとのリガンド交換によって達成された。一般に、融合Ｈｉｓタグは大きい選択性および効率を可能にし、これらにより、多くの場合には、９０％を超える純度でのタンパク質の１段階の精製がもたらされる（Ｇａｂｅｒｃ−Ｐｏｒｅｋａｒ，ＶおよびＭｅｎａｒｔ，Ｖ、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９：３３５〜３６０、２００１；Ｃｈａｇａ，ＧＳ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９：３１３〜３３４、２００１）。組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓタンパク質がＮｉ−ＮＴＡカラムから２０ｍＭおよび１００ｍＭのイミダゾール濃度で溶出された。その後、これらの２つの溶出物を一緒にして、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓをさらに濃縮した。精製されたカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、精製後、分子量が接近した２つのバンドとして可視化された。最終的には、１ｍｇの精製されたカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、平均して、２５０ｍＬの上清あたり得られた。
【０３３３】
組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの特徴づけ
質量測定
質量分析による組換えカリクレイン１４および組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの同定により、これらのタンパク質が実際にヒトカリクレイン１４であることが確認された。組換えカリクレイン１４の場合、配列決定されたトリプシン消化ペプチドＩＩＴＧＧＨＴＣＴＲ（配列番号２２）、ＱＶＴＨＰＮＹＮＳＲ（配列番号２３）、およびＱＡＣＡＳＰＧＴＳＣＲ（配列番号２４）は、カリクレイン１４タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＫ４８５２４）のアミノ酸配列２５〜３３、アミノ酸配列９７〜１０６およびアミノ酸配列１３４〜１４４にそれぞれ対応した。同様に、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓサンプルから得られたペプチドフラグメントのＳＳＱＰＷＱＡＡＬＬＡＧＰＲ（配列番号２５）およびＡＶＲＰＩＥＶＴＱＡＣＡＳＰＧＴＳＣＲ（配列番号２６）は、カリクレイン１４のアミノ酸配列３４〜４７およびアミノ酸配列１２６〜１４４とそれぞれ一致した。
【０３３４】
Ｎ末端配列決定
精製された組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−ＨｉｓのＮ末端配列がＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ（配列番号２７）であることが決定された。同定された最初の２つのアミノ酸Ｇｌｕ−Ａｌａは、酵母分泌α−因子の最後の２つのアミノ酸に対応する。２つの潜在的な切断部位が酵母分泌α−因子の除去ために存在するが、この場合、α−因子の成熟化に関与しているジペプチジルアミノペプチダーゼ（Ｓｔｅ１３遺伝子産物）はＧｌｕのＮ末端側で切断し、α−因子の部分的な除去をもたらすだけであった。もう一つの切断部位がＡｌａのＣ末端側に存在するが、利用される場合、Ｇｌｕ−Ａｌａジペプチドはカリクレイン１４ｍｙｃ−ＨｉｓのＮ末端において取り込まれていない。その次の２つのアミノ酸Ｇｌｕ−Ｐｈｅは、ＫＬＫ１４をクローン化するために使用されたＥｃｏＲＩ制限酵素部位のａａを表している。最後の２つのアミノ酸Ｉｌｅ−Ｉｌｅは、成熟型カリクレイン１４の最初の２つのａａ（タンパク質配列における残基２５および残基２６）と一致する。
【０３３５】
グリコシル化状態
カリクレイン１４が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにより認識されたその一次配列において潜在的なグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ）を有すること、および、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを表す２つのバンドがウエスタンブロットおよびクーマシーブルー染色のポリアクリルアミドゲルで可視化されたという事実を考えれば、当初、高分子量側のバンドがカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓのグリコシル化型に対応し得ることが提案された。このことを明らかにするために、カリクレイン１４ｍｙｃ−ＨｉｓがＰＮＧａｓｅＦによるインビトロ脱グリコシル化に供され、２つの同一のポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、一方がクーマシーブルーによって染色され、もう一方が糖タンパク質染色により染色された。西洋ワサビペルオキシダーゼ（糖タンパク質）およびダイズトリプシン阻害剤（非グリコシル化タンパク質）もまた、陽性コントロールおよび陰性コントロールとしてそれぞれ含まれた。結果は、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓはグルコシル化されていないことを示していた。少なくともインビトロ脱グリコシル化は、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓに存在する糖成分が除去された場合には予想されるようなカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの低分子量型をもたらさなかった。さらに、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを表すバンドは、糖タンパク質が染色されたゲルでは可視化されなかった。
【０３３６】
酵素活性
蛍光生成性合成基質のＢｏｃ−Ｖ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣ（配列番号２８）およびＢｏｃ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｆ−ＡＭＣ（配列番号２９）が、組換えカリクレイン１４および組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの酵素活性を分析するために使用された。カリクレイン１４がトリプシン様切断特異性を有することが予測されるということを考えれば、Ｂｏｃ−Ｖ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣ（トリプシン基質）およびＢｏｃ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｆ−ＡＭＣ（キモトリプシン基質）の使用はまた、カリクレイン１４の基質特異性の実験的決定を可能にした。
【０３３７】
酵素により媒介されるペプチド加水分解は、ペプチド基質からのＡＭＣの遊離によって得られる任意単位の蛍光カウント数に比例する。最初の実験の結果は、組換えカリクレイン１４が、トリプシン（陽性コントロール）と類似する効率で、トリプシン基質Ｖ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣ（配列番号３０）を効果的に切断し得ることを示している。蛍光カウント数は、それぞれの酵素の濃度が増大したとき、用量依存的な様式で増大した。従って、組換えカリクレイン１４は酵素活性である。逆に、カリクレイン１４ｍｙｃ−ＨｉｓはＶ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣを有意な程度に加水分解することができなかった。従って、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓは活性であるとは考えられない。実際、より高濃度のこの酵素が用いられたとき、蛍光カウント数が、陰性コントロール（基質のみ）の蛍光カウント数に匹敵するバックグラウンドのカウント数に低下した。
【０３３８】
この実験が、キモトリプシン基質Ａ−Ａ−Ｐ−Ｆ−ＡＭＣ（配列番号３１）を用いて繰り返されたとき、組換えカリクレイン１４または組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓのいずれも、陰性コントロール（基質のみ）の蛍光カウント数に匹敵する得られた任意単位でのバックグラウンド蛍光カウント数によって示されるように、使用された濃度のいずれにおいてもこのペプチドを加水分解しなかった。キモトリプシンは、予想されるように、用量依存的な様式でこのペプチド基質を効果的に切断した。この試験により、カリクレイン１４が、以前に予測されていたように、キモトリプシン様ではなく、トリプシン様の基質特異性を有することが確認される。
【０３３９】
続く速度論的分析では、組換えカリクレイン１４の酵素活性および基質特異性が、トリプシン基質Ｖ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣ（配列番号３０）をトリプシン（陽性コントロール）と一緒に、また、キモトリプシン基質Ａ−Ａ−Ｐ−Ｆ−ＡＭＣ（配列番号３１）をキモトリプシン（陽性コントロール）とともに使用し、そして、蛍光カウント数を３０秒間隔で合計で１５分間にわたって測定してさらに調べられた。Ｖ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣに関しては、類似する結果が、使用されたそれぞれの濃度で、組換えカリクレイン１４およびトリプシンの両方について得られた。蛍光カウント数が、上記に記載された最初の結果と一致して、用量依存的な様式で増大した。また、この実験では、Ｖ−Ｐ−Ｒ−ＡＭＣのカリクレイン１４媒介の加水分解およびトリプシン媒介の加水分解が経時的に増大することが明らかにされた。Ａ−Ａ−Ｐ−Ｆ−ＡＭＣ（配列番号３１）の場合、最初の実験から予想されるように、組換えカリクレイン１４ではなく、キモトリプシンのみがこのペプチドの加水分解を媒介する。キモトリプシン活性は、濃度の増大とともに、また、時間の経過とともに増大し、これに対して、カリクレイン１４は、実験を通してすべての濃度で、（基質のみを含有する陰性コントロールと同一の）バックグラウンド蛍光カウント数をもたらすだけである。これらの結果によりさらに、カリクレイン１４がトリプシン様セリンプロテアーゼであるという知見が立証される。
【０３４０】
カリクレイン１４免疫蛍光測定アッセイの特徴
形態
組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓに対するポリクローナル抗体の作製が、標準的な技術を使用して組換えタンパク質をマウスおよびウサギに注射することによって達成された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［ＥＰ  ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴＫ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ（編）、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、９５頁〜１１５頁、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６］）。マウスおよびウサギの抗血清は、カリクレイン１４免疫反応性が、３回目の追加免疫注射を含めて、それまで増大し続け（力価が大きくなり）、４回目、５回目または６回目の注射の後ではさらには増大しないことを明らかにした。バックグラウンド（６０ｇ／ｌのＢＳＡ溶液）よりも著しく大きい免疫反応性は、免疫前のウサギ血清またはマウス血清がそれぞれの免疫血清の代わりに使用されたときには認められなかった。従って、３回目の追加免疫注射の後で得られたマウス抗体およびウサギ抗体が、カリクレイン１４の免疫蛍光測定アッセイを開発するために使用された。捕獲抗体がマウスにおいて作製され、かつ、検出抗体がウサギにおいて作製された「サンドイッチ型」のポリクローナル免疫アッセイ形態が採用された（図２３）。アルカリホスファターゼで標識された二次のヤギ抗ウサギポリクローナル抗体もまた使用され、アルカリホスファターゼの活性が時間分解型蛍光計によって測定された（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，ＴＫおよびＤｉａｍａｎｄｉｓ，ＥＰ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、６４：３４２〜３４６、１９９２）。このアッセイ形態は、何らかの事前の抗体精製を必要せず、また、ｈＫ６（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，ＥＰ他、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３３：３６９〜３７５、２０００）、ｈＫ１０（Ｌｕｏ，ＬＹ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４７：２３７〜２４６、２００１）およびｈＫ１１（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，ＥＰ他、６２：２９５〜３００、２００２）を含む他のカリクレインについて非常に特異的かつ高感度であることが以前には見出されていた。
【０３４１】
感度
このカリクレイン１４免疫蛍光測定アッセイについての典型的な校正曲線が図２４に示される。精製された組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓが、６０ｇ／ＬのＢＳＡにおいて、０．１μｇ／Ｌ、０．５μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌおよび２０μｇ／Ｌに希釈されて、校正物質として使用された。この範囲にわたって、アッセイは強い直線の関係を示した。検出限界は、９５％の信頼（ゼロ校正物質の平均値＋２ＳＤ）でゼロから区別することができるカリクレイン１４の濃度として定義されたとき、０．１μｇ／Ｌであった。
【０３４２】
特異性
このカリクレイン１４免疫アッセイの特異性が、数回の実験を行うことによって確認された。最初に、免疫アッセイおよびウエスタンブロットが、免疫前および免疫の両方のマウス血清およびウサギ血清を使用して行われた。この免疫アッセイを用いて得られた結果は、マウス抗血清およびウサギ抗血清が免疫前のマウス血清およびウサギ血清で置き換えられたとき、組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（２０μｇ／Ｌ）およびカリクレイン１４陽性サンプル（精漿および乳房組織抽出物）の蛍光シグナル（約３５０，０００の任意ユニット）がバックグラウンドシグナル（約１６，０００の任意ユニット）に低下したことを示した（図１６）。この実験は、カリクレイン１４免疫アッセイにより生じた蛍光カウント数が、カリクレイン１４に対するマウスおよびウサギの抗カリクレイン１４ポリクローナル抗体の特異的な結合を表していることを明らかにしている。
【０３４３】
マウスおよびウサギの免疫前血清および免疫血清を使用する精製された組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓのウエスタンブロット分析は、メンブランが、免疫前のウサギ血清ではなく、免疫ウサギ血清でプローブされたときにだけ、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（１μｇおよび１００ｎｇ）に対応するバンドをもたらした。また、カリクレイン１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを表すバンドは、メンブランが免疫前マウス血清または免疫マウス血清のいずれかとインキュベーションされたときには観測されなかった（データは示されず）。
【０３４４】
第２に、マウスおよびウサギのポリクローナル抗体の交差反応性が評価された。カリクレイン１４はヒトカリクレインファミリーのメンバーであるので、他のカリクレインとの著しいアミノ酸類似性を有する（特に、ｈＫ６に対しては、４８％のａａ同一性を示す）。従って、組換えｈＫ２〜ｈＫ１５の交差反応性が調べられた。すべての組換えタンパク質は、カリクレイン１４よりも１０００倍大きい濃度でさえも、バックグラウンドのシグナルと匹敵する読み取り値をもたらした。さらに、交差反応性は、他のＨｉｓ標識タンパク質（例えば、組換えｈＫ５ｍｙｃ−Ｈｉｓ）が調べられたときには観測されなかった。また、組換えカリクレイン１４（これはｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓエピトープを有しない）が試験された。この確立されたアッセイは、ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓエピトープ含有またはｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓエピトープ非含有のカリクレイン１４を同等に検出することができた。実際、このデータから、このカリクレイン１４免疫アッセイが、カリクレイン１４を高い特異性で測定し、カリクレイン１４を他の類似するタンパ質から効率的に識別し、また、ポリヒスチジンタグを検出しないことが確認される。
【０３４５】
直線性および精度
このアッセイの直線性を評価するために、様々なサンプル（血清、精漿および乳ガン細胞質ゾル）が連続希釈され、カリクレイン１４が再測定された（図２５）。良好な希釈直線性がこのアッセイにより観測された。このことは、マトリックスの影響がないことを示唆している。操作内および操作間の精度が、様々なカリクレイン１４校正物質および臨床サンプルを用いて評価された。すべての場合において、アッセイの不正確さ［変動係数（ＣＶ）］は１０％未満であった。
【０３４６】
ヒト組織抽出物および生物学的流体におけるカリクレイン１４の同定
ヒト組織細胞質ゾル抽出物におけるカリクレイン１４の分布
成人男性および成人女性の様々な組織におけるカリクレイン１４のレベルが、開発された免疫アッセイを使用して定量された。データが図１８にグラフにより示される。これらの抽出物におけるカリクレイン１４の量は、総タンパク質含有量について相関させられ、総タンパク質１ｇあたりのカリクレイン１４のｎｇとして表された。非常に高いカリクレイン１４レベルが乳房において観測され、次いで、皮膚、前立腺、中脳および腋窩リンパ節において観測された。より低いレベルが、肺、胃および精巣において見られた。免疫反応性は、調べられたそれ以外の組織では検出されなかった。
【０３４７】
生物学的流体におけるカリクレイン１４
様々な生物学的流体におけるカリクレイン１４の濃度が、表９に示されるように定量された。このカリクレインの非常に高いレベルが精漿において見られ、次いで、羊水および濾胞液において見られた。より低いレベルが男性の血清サンプルにおいて得られ、一方、女性の血清、脳脊髄液、腹水および母乳はすべてがカリクレイン１４について陰性であった（０．１μｇ／Ｌの検出限界よりも低い濃度）。
【０３４８】
生物学的流体からのカリクレイン１４の回収
様々な生物学的流体におけるカリクレイン１４の回収は不完全であり、男性の血清では２３．５％〜５９．５％の範囲であり、女性の血清では１８％〜３５％の範囲であり、精漿では３０．５％〜６４％の範囲であり、羊水では３５％〜４９．２％の範囲であり、乳ガン細胞質ゾルでは４０％〜５５．５％の範囲であった。
【０３４９】
乳ガン細胞質ゾルにおけるカリクレイン１４発現
２７歳から９９歳に及ぶ年齢（平均年齢、６３．０５歳）の３４１名の組織学的に確認された乳ガン患者の腫瘍細胞質ゾルにおけるカリクレイン１４の発現レベルが、開発された免疫アッセイを使用して測定された（表１１）。カリクレイン１４発現の平均レベルは０．１８ｎｇ／ｍｇ総タンパク質であった（発現レベルは０．００から１６．７７ｎｇ／ｍｇ総タンパク質の範囲であった）。弱い正の相関が、カリクレイン１４の発現レベルと、ｈＫ３（ｒＳ＝０．１８６およびｐ＝０．００１）、ｈＫ６（ｒＳ＝０．１５５およびｐ＝０．００４）およびｈＫ１０（ｒＳ＝０．３８６およびｐ＜０．００１）を含む他のカリクレインの発現レベルとの間で観測された（図２６）。カリクレイン１４の発現レベルと、ＥＲ（ｒＳ＝−０．０８、ｐ＝０．１４）またはＰＲ（ｒＳ＝−０．０３３、ｐ＝０．５４）との間には相関が見出されなかった。カリクレイン１４の発現レベルは、患者年齢との何らかの統計学的に有意な相関を示さなかった。
【０３５０】
患者がＥＲ状態に従って階層化されたとき、カリクレイン１４の発現レベルにおける統計学的に有意な差が、患者のＥＲ陽性群とＥＲ陰性群との間で見出された（ｐ＝０．０３６）。すなわち、ＥＲ陰性患者のより大きな割合がカリクレイン１４陽性腫瘍を示した（表１２）。ＰＲ陰性患者のより大きな割合がカリクレイン１４陽性腫瘍を示しているが、結果は統計学的には有意でなかった。
【０３５１】
正常な卵巣細胞質ゾル、良性の卵巣細胞質ゾル、およびガン性卵巣細胞質ゾルにおけるカリクレイン１４発現
２０個の卵巣ガン組織抽出物におけるカリクレイン１４のレベルが、１０個の正常な卵巣組織、および、良性疾患の患者から得られた１０個とともに、カリクレイン１４免疫アッセイを使用して定量された。カリクレイン１４の値が、総タンパク質に関して相関させられ、総タンパク質１ｍｇあたりのカリクレイン１４のｎｇとして表された。結果が図２１に示される。正常な卵巣組織抽出物におけるカリクレイン１４のレベルは０．０３ｎｇ／ｍｇを超えなかった。良性疾患群から得られた１０個の抽出物のうちの５個がこのレベルを上回ったが、これらの値のうちの４つ（０．３３ｎｇ／ｍｇを示す１つの抽出物を除く）は０．０８ｎｇ／ｍｇ未満のままであった。興味深いことに、２０個の卵巣ガン組織抽出物のうちの８個（４０％）は、正常な組織および良性の組織（１つを除く）のレベルと比較して、さらにより高いレベルのカリクレイン１４を含有し、そのすべてが０．１５ｎｇ／ｍｇよりも大きかった。このデータから、卵巣ガン患者では、正常または良性の疾患を有する患者とは対照的に、カリクレイン１４が一般には過剰発現していることが示唆される。
【０３５２】
ガン患者の血清におけるカリクレイン１４
カリクレイン１４レベルが、様々な悪性腫瘍を有する患者に由来する合計で９１個の血清サンプル（これには、卵巣ガン（ｎ＝２０）、乳ガン（ｎ＝２０）、前立腺ガン（ｎ＝３１）、精巣ガン（ｎ＝１０）および結腸ガン（ｎ＝１０）が含まれる）、ならびに、健康で正常な男性被験者および女性被験者からそれぞれ得られた２７個および２８個の血清サンプルにおいて分析された。カリクレイン１４が正常な女性の血清では検出されず、調べられた健康な男性の血清では０．１６μｇ／Ｌの高いレベルに達していた（表９）。ガン患者の中で（表１０）、１３名（６５％）の卵巣ガン女性および８名（４０％）の乳ガン女性は、カリクレイン１４の上昇したレベル（それぞれ、０．１２μｇ／Ｌ〜１．５８μｇ／Ｌおよび０．１２μｇ／Ｌ〜０．３μｇ／Ｌ）が明らかにされた（図２２）。５名（１６％）の前立腺ガン者は、上昇したカリクレイン１４レベル（０．２３μｇ／Ｌ〜０．６２μｇ／Ｌ）を示し、これに対して、２名（２０％）の結腸ガン患者（０．１８μｇ／Ｌおよび０．２６μｇ／Ｌ）および１名（１０％）の精巣ガン腫患者（０．４９μｇ／Ｌ）のみが顕著なカリクレイン１４濃度を有していた。
【０３５３】
カリクレイン１４のホルモン調節
カリクレイン１４のホルモン調節パターンを研究するために、乳ガン細胞株ＢＴ−４７４が培養され、様々なステロイドを１０−８ｍｏｌ／Ｌの最終濃度で用いて刺激され、組織培養上清が、７日間のインキュベーションの後、カリクレイン１４免疫アッセイを用いて分析された。図２０に例示されるように、ベースラインのカリクレイン１４レベル（アルコール刺激）と比較して、カリクレイン１４濃度における最も著しい増大（３８倍）をもたらしたステロイドはエストラジオールであった。ＤＨＴはカリクレイン１４レベルの４倍の増大を生じさせ、一方、ノルゲストレルは２．８倍の増大をもたらした。これらのデータは、ＫＬＫ１４遺伝子の発現がＢＴ−４７４乳ガン細胞株ではエストロゲン類によって主にアップレギュレーションされることを示唆している。
【０３５４】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。そのような実施形態は、本発明の１つの局面の単に１つだけの例示として意図され、また、任意の機能的に等価な実施形態が本発明の範囲には含まれるからである。実際、本明細書中に示され、また、記載された改変に加えて、本発明の様々な改変が、前記の説明および添付されている図面から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれることが意図される。
【０３５５】
本明細書中に示されるすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が、その全体が参考として組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのようにそれと同じ程度に、その全体が参考として組み込まれる。本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、それらに報告されている、本発明と一緒に使用され得るドメイン、細胞株、ベクター、方法論などを記載および開示する目的のために参考として本明細書中に組み込まれる。本明細書中の事項はどれも、本発明は、先願発明によるそのような開示に先行することを認める権利を有しないということの承認として解釈すべきではない。
【０３５６】
本明細書中および添付された請求項において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈がそうでないことを明確に規定していない場合、複数の参照物を包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「宿主細胞」に対する参照は複数のそのような宿主細胞を包含し、「抗体」に対する参照は、１つまたは複数の抗体および当業者に知られているその均等物に対する参照である（他についても同様である）。
【０３５７】
下記の省略されていない引用文献は、本明細書中に示された参照について示される。
【０３５８】
【表１】
2006500036.tif 000003
【０３５９】
【表２】
2006500036.tif 000004
【０３６０】
【表３】
2006500036.tif 000005
【０３６１】
【表４】
2006500036.tif 000006
【０３６２】
【表５】
2006500036.tif 000007
【０３６３】
【表６】
2006500036.tif 000008
【０３６４】
【表７】
2006500036.tif 000009
【０３６５】
【表８】
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【０３６６】
【表９】
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【０３６７】
【表１０】
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【０３６８】
【表１１】
2006500036.tif 000013
【０３６９】
【表１２】
2006500036.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０３７０】
本発明は、次に、図面に関連して記載される。
【図１】図１は、リアルタイムＰＣＲによるＫＬＫ１４遺伝子発現の定量を示す。（Ａ）：サイクル数に対する蛍光シグナルの対数プロット。卵巣組織由来の総ＲＮＡ調製物の連続希釈物が（一度に１０倍づつ）作製され、任意に設定されたコピー数が希釈倍数に従って各サンプルに割り当てられた。各サンプルは二連で分析された。（Ｂ）：ＫＬＫ１４のｍＲＮＡ定量のための代表的な校正曲線。
【図２】図２は、１０−８Ｍの濃度でのステロイドによる刺激の２４時間後での４つの乳ガン細胞株におけるＫＬＫ１４のｍＲＮＡ濃度を示す。ＤＨＴ、ジヒドロテストステロン。
【図３】図３は、１０−８Ｍの濃度でのステロイドによる刺激の２４時間後での２つの卵巣ガン細胞株におけるＫＬＫ１４のｍＲＮＡ濃度を示す。ＤＨＴ、ジヒドロテストステロン。
【図４】図４は、１０−８Ｍの濃度でのジヒドロテストステロンによる刺激前（０）、ならびに刺激の２時間後、６時間後、１２時間後および２４時間後でのＢＴ−４７４乳ガン細胞株におけるＫＬＫ１４のｍＲＮＡ濃度を示す。
【図５】図５は、ニルタミドによる阻止を伴うジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）刺激、およびニルタミドによる阻止を伴わないジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）刺激の２４時間後でのＢＴ−４７４細胞株におけるＫＬＫ１４のｍＲＮＡ濃度を示す。ニルタミドは１０−６Ｍの濃度で加えられ、ＤＨＴは１０−８Ｍの濃度で１時間後に加えられた。アルコールがコントロールとして加えられた。
【図６】図６は、正常な卵巣組織、良性の卵巣腫瘍、および卵巣ガン組織におけるＫＬＫ１４のｍＲＮＡ濃度の分布を示す。水平線は中央値を示す。ｐがクラスカル・ウォリス検定によって計算された。Ｎ＝サンプル数。ｐ値はクラスカル・ウォリス検定によって計算された。Ｎ＝サンプル数。
【図７】図７は、ＫＬＫ１４陽性卵巣腫瘍患者およびＫＬＫ１４陰性卵巣腫瘍患者における進行のない生存（ＰＦＳ）（Ａ）および全生存（Ｂ）についてのカプラン・マイヤ生存曲線を示す。ｎ＝サンプル数。
【図８】図８は、血清ＣＡ１２５と、ＫＬＫ１４のｍＲＮＡの腫瘍レベルとの相関を示す。ｒＳ＝スピアマン相関係数。Ｎ＝患者数。
【図９】図９は、リアルタイムＰＣＲによるＫＬＫ１５遺伝子発現の定量を示す。（Ａ）：サイクル数に対する蛍光シグナルの対数プロット。（Ｂ）：ＫＬＫ１５のｍＲＮＡ定量のための代表的な校正曲線。曲線は、ＫＬＫ１５のｃＤＮＡを含有する（１０倍）連続希釈されたプラスミドを用いて得られた。
【図１０】図１０は、ガン性および良性の卵巣組織におけるＫＬＫ１５発現レベルの分布を示す。水平線は中央値を示す（ｐ＝０．０２１、マン・ウイトニーのＵ検定による）。
【図１１】図１１は、ＫＬＫ１５陽性卵巣腫瘍患者およびＫＬＫ１５陰性卵巣腫瘍患者における進行のない生存（ＰＦＳ）（Ａ）および全生存（Ｂ）についてのカプラン・マイヤ生存曲線を示す。ｎ＝サンプル数。
【図１２】図１２は、血清ＣＡ１２５と、ＫＬＫ１５発現の腫瘍レベルとの相関を示す。ｒＳ＝スピアマン相関係数。
【図１３】図１３は、組換えカリクレイン１４ｍｙｃ−ｈｉｓの発現および精製を示す。Ａ）抗Ｈｉｓ抗体を使用するウエスタンブロット分析による組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの検出。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＫＬＫ１４のｃＤＮＡを含有するｐＰＩＣＺαＡベクターで形質転換された酵母クローンから得られたメタノール誘導前の培養上清（０日目）；レーン３、レーン４およびレーン５は、１％メタノールによる誘導の２日目、４日目および６日目に対応する。レーン６、空のｐＰＩＣＺαＡで形質転換されたＸ−３３株（陰性コントロール）から得られた６日間のメタノール誘導（１％）の後の上清。Ｂ）タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、クーマシーブルーで染色された。レーン１、酵母培養上清からＩＭＡＣによって精製された組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ。溶出分画物は２０倍に濃縮された（１．５ｍｇ／ｍＬ、ＢＣＡ総タンパク質アッセイによって測定されたとき）。Ｍ＝分子量マーカー。
【図１４】図１４は、ＰＮＧａｓｅ−Ｆによる処理前および処理後の精製ｈＫ１４ｍｙｃ−ｈｉｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ａ）およびＢ）の両方において、レーン１は精製ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓに対応する；レーン２、ＰＮＧａｓｅ−Ｆとインキュベーションされた精製ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（３８ｋＤａ）；レーン３、西洋ワサビペルオキシダーゼ（４０ｋＤａ）、陽性コントロール；およびレーン４、ダイズトリプシン阻害剤（２１．５ｋＤａ）、陰性コントロール。（Ａのレーン２において、上側のバンドはＰＮＧａｓｅ−Ｆを表すことに留意すること）。Ａ）において、ゲルはクーマシーブルーで染色されたが、脱グリコシル化後に予想されるような、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓを表すバンドの移動がレーン２において認められない。Ｂ）において、ゲルは酸性フクシンスルフィトで染色された（糖タンパク質染色）。レーン３における糖タンパク質の西洋ワサビペルオキシダーゼ（陽性コントロール）のみが染色される。これにより、組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓはグリコシル化されていないことがさらに確認される。Ｍ＝分子量マーカー。
【図１５】図１５は、ｈＫ１４のＥＬＩＳＡに対する典型的な校正曲線を示す。バックグラウンド蛍光（校正物質が存在しないとき）がすべての測定値から引かれている。このアッセイのダイナミックレンジは０．１〜２０μｇ／Ｌである。
【図１６】図１６は、ｈＫ１４免疫アッセイの特異性を示す棒グラフである。免疫前および免疫後のマウス血清およびウサギ血清の免疫反応性が、マウスおよびウサギの免疫血清を用いた免疫アッセイを行うこと（白棒）によって、また、マウス血清を免疫前のマウス血清で置き換えること（縞棒）によって、また、ウサギ血清を免疫前のウサギ血清で置き換えること（灰色棒）によって評価された。免疫ｈＫ１４血清が免疫前血清で置き換えられたときの蛍光（免疫活性）の著しい減少に留意すること。
【図１７】図１７は、ウサギ抗ｈＫ１４ｍｙｃ−ｈｉｓポリクローナル抗体の特異性を示す。精製された組換えｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓ（レーン１、レーン２およびレーン３において、それぞれ、１０００ｎｇ／レーン、１００ｎｇ／レーンおよび２０ｎｇ／レーン）がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ニトロセルロースメンブランに転写され、免疫前ウサギ血清（Ａ）および免疫ウサギ血清（Ｂ）（１：２０００）でプローブされた。予想されたように、ｈＫ１４特異的抗体の非存在を示す、（Ａ）におけるバンドの非存在に留意すること。（Ｂ）では、ｈＫ１４特異的バンドが可視化される。バンドの強度が、ｈＫ１４ｍｙｃ−Ｈｉｓの量の減少とともに低下している。Ｍ＝分子量マーカー。
【図１８】図１８は、様々な成人組織におけるｈＫ１４の濃度を示す。
【図１９】図１９は、ポリクローナルｈＫ１４ウサギ抗体を用いた、正常な組織（ＡおよびＢ）および悪性の組織（ＣおよびＤ）におけるｈＫ１４の免疫組織化学的局在化を示す。Ａ）乳房の柱状管（ｄｕｃｔａｌ  ｃｏｌｕｍｎａｒ）および筋上皮細胞における細胞質免疫発現（２００倍の倍率）。Ｂ）皮膚のエクリン腺の上皮による強い免疫発現（２００倍の倍率）。Ｃ）卵巣の中程度に分化した嚢胞腺ガンによる染色（２００倍の倍率）。Ｄ）乳房のアポクリン異形成を伴う上皮による強い細胞質免疫発現（１００倍の倍率）。
【図２０】図２０は、乳ガン細胞株ＢＴ−４７４におけるｈＫ１４のホルモン調節を示す。ｈＫ１４は、主として、エストラジオールによって、次いでジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）およびノルゲストレルによってアップレギュレーションされる。
【図２１】図２１は、正常な卵巣組織、良性の卵巣組織、およびガン性の卵巣組織から得られた抽出物におけるｈＫ１４の濃度を示す。Ｎ＝抽出サンプルの数。最も高い正常な組織の抽出物と比較して、それよりも高いｈＫ１４レベルを含有するサンプルの割合が示される。
【図２２】図２２は、正常な女性と比較して、卵巣ガン患者および乳ガン患者における血清ｈＫ１４レベルを示す。（点線により示される）免疫アッセイの検出下限（０．１μｇ／Ｌ）に等しいカットオフ値を使用したとき、血清ｈＫ１４が卵巣ガン女性の６５％で上昇し、乳ガン女性の４０％で上昇している。
【図２３】図２３は、ｈＫ１４免疫アッセイの形態の概略図である。マイクロタイターウエルプレートがヒツジ抗マウスＩｇＧで被覆され、続いて、マウス抗ｈＫ１４ポリクローナル抗体、ｈＫ１４標準／サンプル、ウサギ抗ｈＫ１４ポリクローナル抗体、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ、およびＤＦＰ（ジフルニサールホスファート）とインキュベーションされた。リン酸エステル基がＤＦＰからＡＬＰによって除去された後、Ｔｂ３＋−ＥＤＴＡ（ランタニドキレート）との複合体が形成される。リガンドを３３６ｎｍで励起させた後、Ｔｂ３＋の蛍光（６２４ｎｍ）がＣｙｂｅｒｆｌｕｏｒ６１５回折型蛍光計で時間分解蛍光測定法により測定される。蛍光測定値は、励起後の最初の１００μｓ〜２００μｓを通して取得され、これにより、溶媒、キュベットおよび試薬、ならびに散乱された励起放射線による単寿命の蛍光バックグラウンドシグナルのすべてが除かれる。蛍光強度は、標準またはサンプルに存在するｈＫ１４の量に比例する。
【図２４】図２４は、ｈＫ１４免疫アッセイに対する典型的な校正曲線を示す。バックグラウンド蛍光（校正物質が存在しないとき）がすべての測定値から引かれている。このアッセイのダイナミックレンジは０．１〜２０μｇ／Ｌである。
【図２５】図２５は、ｈＫ１４免疫アッセイの直線性を示すグラフである。この図は、連続希釈された精漿サンプルにおけるｈＫ１４の濃度を示す。
【図２６】図２６は、乳腫瘍におけるｈＫ１４濃度と、ｈＫ３濃度との相関（Ａ）、ｈＫ６濃度との相関（Ｂ）、およびｈＫ１０濃度との相関（Ｃ）を示すグラフである。上記変数の間での関連性の強さが、スピアマン順位相関（ｒＳ）を用いて検定された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
2006500036.tif 000060
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2006500036.tif 000068
【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月22日(2005.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006500036000001.app
【国際調査報告】
2006500036.tif 000072
2006500036.tif 000073
2006500036.tif 000074
2006500036.tif 000075
2006500036.tif 000076
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