(57)【要約】候補分子を持続的に発現する増殖細胞からなる単離された前駆細胞集団または幹細胞集団を得る方法、および結果として得られた候補分子を持続的に発現する増殖細胞からなる単離された前駆細胞集団または幹細胞集団。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子産物（例えば、タンパク質）産生の新規の産物、および神経疾患または神経変性疾患の症状の治療も提供される。図１５は本発明で用いられるベクターを示す。このベクターには、ＩＲＥＳ−ｎｅｏ配列が、マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子座の（エキソン２８に隣接する）３’非コード配列にクローニングされた。
2006517101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体性幹細胞または前駆細胞において相同組換えを得る方法であって、
幹細胞または前駆細胞を培養において増殖させる工程；
目的の遺伝子をコードする核酸を、体性幹細胞または前駆細胞に挿入する工程；
相同組換えを起こして、相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を得る工程；および
挿入された核酸を有する相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞を選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
目的の少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸を挿入するために、未分化なままであり、ＴＥＲＴを発現し、テロメラーゼ活性を維持し、自己複製能を示す体性幹細胞または前駆細胞を同定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的の少なくとも１つの遺伝子によりコードされる産物を産生する相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を同定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
相同組換えされた幹細胞または前駆細胞と、薬学的に許容可能な担体を会合する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を被検体に導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記導入する工程がｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導入する工程がｉｎ  ｖｉｖｏ送達を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
目的の少なくとも１つの遺伝子によりコードされる産物を産生することができない被検体を選択する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
産物がタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
目的の少なくとも１つの遺伝子によりコードされる産物を正常レベルで発現することができない被検体を選択する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
相同組換えされた幹細胞または前駆細胞と薬学的に許容可能な担体とを被検体に導入する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞用の選択剤含有増殖培地を含む選択培地を供給する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
グリア前駆細胞、間葉系幹細胞、星状細胞前駆細胞、およびその混合物からなる群から体性幹細胞または前駆細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
体性幹細胞または前駆細胞がグリア前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸を体性幹細胞または前駆細胞に挿入する工程が、相同組換えを可能にするベクターを使用する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ベクターが、幹細胞または前駆細胞のＤＮＡと相同な領域を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
相同な領域がＲｏｓａ遺伝子座、ＲＮＡｐｏｌＩＩ遺伝子座、およびβ−アクチン遺伝子座からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
相同な領域がＲＮＡ  ｐｏｌｒ２ａ遺伝子座に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
エレクトロポレーション、リポフェクション、細胞融合、レトロウイルス感染、カチオン性薬剤導入、ＣａＰＯ４、トランスフェクション、およびその組み合わせからなる群から選択される方法によって核酸を挿入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
方法がエレクトロポレーションである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
体性幹細胞または前駆細胞に核酸を挿入する前に、体性幹細胞または前駆細胞の核酸の遺伝子座にＩＲＥＳタンパク質を導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
核酸の中のプロモーターを同定し、目的の少なくとも１つの遺伝子によりコードされる産物の発現を変えるためにプロモーターを改変する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
プロモーターの少なくとも一部を、目的の少なくとも１つの遺伝子によりコードされる産物の発現をさらに調節することができる産物で置換する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
導入する工程が、相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を被検体の脳に導入する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
導入する工程が、相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を被検体の脊髄に導入する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
目的の少なくとも１つの遺伝子が少なくとも１つの増殖因子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの増殖因子が、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、脳由来神経栄養増殖因子、グリア由来神経栄養因子、および毛様体神経栄養因子からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
複数の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を得る工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
複数の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を被検体に導入する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏで産物を送達する効力を評価する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
選択された産物を発現することができる目的の遺伝子をコードする、相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３２】
相同組換えによって体性幹細胞または前駆細胞に組み込まれた核酸によりコードされる内在性タンパク質を発現することができる、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞
または前駆細胞。
【請求項３３】
体性幹細胞または前駆細胞がグリア前駆細胞、間葉系幹細胞、または星状細胞前駆細胞からなる群から選択される、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３４】
体性幹細胞または前駆細胞がグリア前駆細胞である、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３５】
ＭＨＣクラス抗原を発現することができない、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３６】
分化することができる、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３７】
ＴＥＲＴを発現することができる、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３８】
テロメラーゼ活性を維持することができる、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項３９】
幹細胞または前駆細胞が自己複製することができる、請求項３１に記載の相同組換えされた幹細胞または前駆細胞。
【請求項４０】
医学的処置のために、相同組換えされた幹細胞または前駆細胞を使用する工程を含む、治療方法。
【請求項４１】
相同組換えされた幹細胞または前駆細胞が、相同組換えによって幹細胞または前駆細胞に組み込まれた核酸によりコードされる内在性タンパク質を発現する、請求項４０に記載の治療方法。
【請求項４２】
相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞を、相同組換えされたグリア前駆細胞、相同組換えされた星状細胞前駆細胞、および相同組換えされた間葉系幹細胞からなる群から選択する工程をさらに含む、請求項４０に記載の治療方法。
【請求項４３】
相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞が相同組換えされたグリア前駆細胞である、請求項４２に記載の治療方法。
【請求項４４】
相同組換えされた幹細胞または前駆細胞が、神経疾患または神経変性疾患の治療に用いられるように適合される、請求項４０に記載の治療方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の方法によって作成された、請求項３１に記載の相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、バイオテクノロジーに関し、詳細には、体性幹細胞を治療および使用する様々な方法、ならびに治療用産物を送達する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、グリア前駆細胞、間葉系幹細胞、および星状細胞前駆細胞における相同組換えの使用を含み、結果として得られた細胞を含む。
【背景技術】
【０００２】
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）によって、２００３年１月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／４４０，１５２号の利益を主張する。
［背景］
疾患を治療するための治療用タンパク質の送達は、一般的に、遺伝子送達ビヒクルとしてウイルスベクターを使用することを含む。治療用タンパク質は、該タンパク質をコードする外来性ＤＮＡを適切な細胞に導入することによって産生することができる。しかしながら、ウイルスベクターの使用には、複製可能なウイルスがベクターの生成中に生じる可能性があるなどの制約がある。同様に、導入されたウイルスと、内在性レトロウイルスゲノムとの間で組換えが起こる場合があり、新規の細胞特異性、宿主域、または増大した病原性（ビルレンス）および細胞傷害性を有する感染因子が生じる可能性がある。ウイルスはまた単独で多数の細胞に組み込むこともでき、レトロウイルスでの限られたクローニング能は治療への応用の制約となっている。さらに、目的の（関心の対象となる）産物がｉｎ  ｖｉｖｏ発現する期間は短い。従って、ウイルスベクターとは関係の無い、新たな治療用タンパク質送達法が有用であると理解することができる。
【０００３】
幹細胞は、親幹細胞と同様の自己複製能および分化能の特性を有する娘細胞を生じることができる自己複製細胞である。造血幹細胞などのある特定の幹細胞の自己複製能は長期間にわたるのに対して、他の幹細胞の自己複製能は短い。幹細胞は、由来する組織および分化能に基づいて分類されている。多能性胚性幹細胞（「ＥＳＣ」）はどのタイプの組織にも分化することができる。ＥＳＣは分化するにつれて、その系列を特定のタイプの細胞に次第に制限することができる。例えば、神経幹細胞は中枢神経系の派生物を生じることができるのに対して、神経冠幹細胞は末梢神経系の派生物、肝臓幹細胞、肝細胞、および膵臓幹細胞を生じる。皮膚、血液、骨、消化管、および筋肉を含む多数の組織から幹細胞が同定されており、部分的なリストを表１に示す。
【０００４】
分化の間に、幹細胞は、さらに限定された前駆細胞（precursor ）（「前駆」細胞（progenitor cell ）とも知られる）を生じることができる。前駆細胞は、限られた自己複製を起こすことができるが、分化のレパートリーはさらに制限されている。例えば、グリア前駆細胞は多くの種類のグリア細胞（すなわち、星状細胞およびオリゴデンドロサイト）に分化することができるが、ニューロンには分化できないのに対して、ニューロン前駆細胞は多くの種類のニューロンを生じることができるが、星状細胞もオリゴデンドロサイトも生じることができない。制限された前駆細胞も多数の組織から同定されており、部分的なリストを表２に示す。
【０００５】
幹細胞および前駆細胞は、様々な治療パラダイム（精製または濃縮された混合物からの細胞の単離、および特定の組織または臓器への細胞の直接移植または一定期間培養した後の細胞の移植を含む）に用いられている。場合によっては、さらなる操作（例えば、細胞への遺伝子のトランスフェクションもしくは感染、色素もしくは抗体による細胞の標識、または増殖因子およびサイトカインによる細胞の前処理）の後に、細胞が移植される。
【０００６】
外来性遺伝子の発現は細胞の内在機構（例えば、メチル化、ヘテロクロマチン再構築、および異物として認識され安定に発現する細胞の消失）によってダウンレギュレートまたは抑制されるので、細胞において遺伝子を発現させる大部分の方法には制約がある。長期間維持される細胞において安定した発現を得る代替法の評価が、多数の研究室における進行中の研究プログラムである（非特許文献１を参照のこと）。
【０００７】
相同組換えを細胞への遺伝子の挿入に使用することができるという可能性は１９８０年代初期から断続的に議論され、試みられてきた。例えば、マリオ−カペッキ（Mario Capecchi）らは、相同組換えが生じた細胞を選択する方法を開発した。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５を参照のこと（これらの全ての内容は本明細書に参考として援用される）。しかしながら、遺伝子ターゲティングが非効率であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは幹細胞の天然量が少なく、低効率の相同組換え事象を選択するために必要な細胞分裂数のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞または前駆細胞を未分化状態で維持することが難しいという理由で、幹細胞ではあまりうまくいかなかった。さらに、幹細胞を含む体細胞の相同組換えははるかに難しいことが分かっている。
【０００８】
現在に至るまで、相同組換えは、３つの主な理由のために胚性幹細胞に限定されてきた。第１に、体細胞（例えば、不死化線維芽細胞）において遺伝子置換技術を使用する最初の取り組みが期待の持てるものではなかった。成功するのは容認できないほど少なく、いくつかの有力な研究室の失敗によって、カペッキ（Capecchi）法を体細胞に適合させるという重大な試みが頓挫した。このことは、相同組換え効率が非常に細胞の種類に特異的であるということを立証していると思われる。
【０００９】
第２に、相同組換えの最も一般的な使用の場合、体細胞には、ＥＳＣと比較してかなり多くの面倒な問題がある。ＥＳＣとは異なり、体細胞は、ある特定の遺伝子の２個の対立遺伝子が確実に置換されるために、細胞培養操作を必要とする。多くの理由が、体細胞に関する困難（細胞を長期間増殖できないこと、および適切で効率的なベクターを選択できないことを含む）に起因してきた。従って、相同組換えの最もよく認識されている使用の場合、体細胞における手順はＥＳＣより本質的に難しく、かなり複雑である。
【００１０】
第３に、最良の条件下で、哺乳動物ＥＳＣでの相同組換えは出発細胞集団１００万個あたりおおよそ１回の頻度で生じる。相同組換え手順を任意の特定の種類の初代細胞での使用に首尾よく適合させられれば、この細胞種は培養において少なくとも２４回の細胞分裂を経て、おおよそ１０００万個の細胞を生じるはずである。最もよく特徴付けられている骨髄由来造血幹細胞の場合、２〜３回以下の細胞分裂が培養において達成されている。しかしながら、ＥＳＣは、政治的および倫理的な問題を提起する胚に由来するので理想的な治療候補ではない。さらに、ＥＳＣは自発的に増殖して腫瘍を形成することがあり、ｉｎ
ｖｉｖｏ分化シグナルに適切に反応しないことがある。
【特許文献１】米国特許第５，４６４，７６４号
【特許文献２】米国特許第５，４８７，９９２号
【特許文献３】米国特許第５，６２７，０５９号
【特許文献４】米国特許第５，６３１，１５３号
【特許文献５】米国特許第６，２０４，０６１号
【非特許文献１】ヤネツ・アール・ジェイ（Yanez, RJ ）およびポーター・エイ・シー（Porter, AC）、「治療遺伝子ターゲティング（Therapeutic Gene Targeting）」Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ.   １９９８年２月５日（２）、ｐ．１４９−１５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ＥＳＣ以外の細胞において候補分子を持続的に発現させるストラテジーを特定することが必要であると理解することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［発明の開示］
本発明は、体細胞での相同組換え法を使用して、幹細胞または前駆細胞において分子を安定に発現させる新規の方法を含む。体細胞または前駆細胞は、未分化な状態のままで、ＴＥＲＴを発現し、テロメラーゼ活性を維持し、自己複製能を示すように培養で増殖させることができる。１つの実施態様において、幹細胞または前駆細胞は、グリア前駆細胞、間葉系幹細胞、星状細胞前駆細胞、およびその任意の混合物を含んでもよい。
【００１３】
目的のタンパク質の発現が構成的に活性のある遍在性プロモーターまたは細胞種特異的プロモーターによって調節できるように、目的の遺伝子を構築物またはベクターバックボーンにクローニングすることができる。ベクターは、エレクトロポレーション、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、商標）、細胞融合、レトロウイルス感染、カチオン性薬剤導入、ＣａＰＯ４、トランスフェクション、およびその組み合わせを含むがそれらに限定されない様々な方法によって、培養された幹細胞または前駆細胞に挿入することができる。ベクターの設計は、ベクターがヒトゲノム、ラットゲノム、またはマウスゲノムの特定の配列と相同な領域を含むような設計でもよい。１つの実施態様において、相同な領域は１００％の相同性を有してもよい。このような相同配列として、Ｒｏｓａ遺伝子座、ＲＮＡｐｏｌＩＩ遺伝子座、およびβ−アクチン遺伝子座を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの相同配列を使用すると、細胞が複製する時に、挿入されたＤＮＡと染色体ＤＮＡの中の相同配列との間で組換えが可能になる。本発明はまた、この方法によって作成された体細胞または前駆細胞を含む。
【００１４】
本発明はまた、選択遺伝子マーカーを用いて単離および選択することができる、相同部位にＤＮＡが挿入された幹細胞または前駆細胞も含む。次いで、該細胞は後の実験に用いられてもよい。後の実験として、遺伝子産物の置換により異常または欠損が修正されるような、被検体への幹細胞または前駆細胞の移植が挙げられるが、これに限定されない。このような異常または欠損の例として、触媒酵素の消失、増殖因子またはその受容体の濃度の低下、および、あるタンパク質が同タンパク質を通常発現しない細胞において新たに発現することが挙げられる。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、少なくとも１つの配列が幹細胞または前駆細胞のゲノムの選択された部位に配置され、同じ選択部位が繰り返し標的となり得るように、少なくとも１回の相同組換え事象が首尾よく生じた幹細胞株および前駆細胞株を作成することを含む。例えば、第１の相同組換え事象によって、同じ位置での後の相同組換え事象を促す遺伝子配列が挿入されてもよい。挿入された遺伝子配列は、再現可能なやり方で第３の遺伝子または第４の遺伝子で置換されてもよい。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様は、体細胞において相同組換えを試みること、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖因子の送達効力を評価し、かつ遺伝子発現を直接比較するために、様々な候補増殖因子を発現する複数の種類の細胞クローンを得ることを含む。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、特定の遺伝子座において相同組換えを試み、次いで、第１の組換え事象によって導入された変化を第２の対立遺伝子において繰り返す第２の組換え事象のために、得られたクローンを再選択することを含む。このようなホモ接合性変異細胞は、高濃度の選択剤を使用して再選択するか、または同じ細胞株において第１の組換えプロセスと同様に第２の組換えプロセスを試みることによって得ることができる。別の実施態様は、目的の遺伝子の発現を制御することができるプロモーターを改変することを含む
。この改変は、プロモーターの少なくとも一部を、遺伝子産物の発現をさらに調節することができる産物で置換することを含んでもよい。
【００１８】
被検体は、目的の遺伝子を産生できなくてもよいし、正常レベルの目的の遺伝子を発現できなくてもよい。相同組換えが生じた後に、目的の遺伝子は、体細胞または前駆細胞の精製または濃縮された集団を用いて被検体に送達されてもよい。送達は、目的の遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達またはｉｎ  ｖｉｖｏ送達を含んでもよい。１つの実施態様において、送達は、被検体において目的の遺伝子を発現させることを含んでもよい。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、相同組換えによって導入された内在性タンパク質を発現することができるグリア前駆細胞の単離された集団を含む。グリア前駆細胞にはＭＨＣ発現が無くてもよい。グリア前駆細胞は、分化、ＴＥＲＴの発現、テロメラーゼ活性の維持、および自己複製が可能であってもよい。
【００２０】
本発明の別の実施態様は、相同組換えによって導入された内在性タンパク質を発現することができる間葉系幹細胞の単離された集団を含む。間葉系幹細胞にはＭＨＣ発現が無くてもよい。間葉系幹細胞は、分化、ＴＥＲＴの発現、テロメラーゼ活性の維持、および自己複製が可能であってもよい。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、相同組換えによって導入された内在性タンパク質を発現することができる星状細胞前駆細胞の単離された集団を含む。星状細胞前駆細胞にはＭＨＣ発現が無くてもよい。星状細胞前駆細胞は、分化、ＴＥＲＴの発現、テロメラーゼ活性の維持、および自己複製が可能であってもよい。本発明はまた、神経疾患または神経変性疾患を含む疾患の治療に使用するための、相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞も含む。
【００２２】
本発明はまた、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のために、相同組換えによって細胞に導入された内在性タンパク質を発現するグリア前駆細胞、間葉系幹細胞、星状細胞前駆細胞、またはその混合物の単離された集団を使用することを含む、遺伝子療法の方法も含む。
【００２３】
本発明の相同組換えされた体性幹細胞または前駆細胞と薬学的に許容可能な賦形剤とを使用することを含む、神経疾患または神経変性疾患を治療するための医薬品を製造する方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
［発明の最良の実施態様］
トランスジェニックマウスを作成するために、ならびに細胞株およびある体細胞の遺伝子座を標的とするために、相同組換えが用いられてきた。しかしながら、成功は一定せず、特定の細胞の種類に適した条件およびベクターの開発に左右されてきた。一般的に、細胞は、相同組換えの生存可能な候補となるために、選択可能かつ低密度で増殖可能なように、十分な数の細胞分裂を経なければならない。これらの基準を満たす細胞はほとんどなく、結果として、相同組換えの成功は、胚性幹細胞、不死化細胞株、および線維芽細胞に限られてきた。
【００２５】
説明したように、ＥＳＣは、一つには分化シグナルに適切に反応しないことがあるという理由で、理想的な治療候補ではない。しかしながら、中間的な系列のグリア前駆細胞は、グリア組織の形成に限定された分化レパートリーを有し、通常、成人の脳および脊柱に存在し、そこでｉｎ  ｖｉｖｏシグナルに反応する。さらに、オリゴデンドロサイトのサブタイプは、中枢神経系（「ＣＮＳ」）の神経線維を取り囲む保護鞘であるミエリンの産生を主に担っている。オリゴデンドロサイトの細胞機能の消失は、多発性硬化症などの脱
髄疾患の発症において大きな役割を果たしている。
【００２６】
グリアに限定された前駆細胞の精製集団を単離する方法が示されており、体細胞での相同組換えを阻む従来の障害を解決する可能性をもたらす。なぜなら、グリア前駆細胞はその特徴を保持しながら長期間培養で維持できることが示されているからである。さらに、グリア前駆細胞は不死化することができ、外来遺伝子を導入することができ、その細胞を外来遺伝子の発現について選択できることが最近証明された。ウー（Wu）ら、「グリアに限定された三分化能細胞株の胚脊髄培養物からの単離（Isolation of a Glial-Restricted Tripotential Cell Line from Embryonic Spinal Cord Cultures）」、ＧＬＩＡ  第３８巻、ｐ．６５−６９（２００２年）を参照のこと。同文献の内容は本明細書に参考として援用される。さらに、グリア前駆細胞は高レベルのテロメラーゼを発現する。セディビイ（Sedivy）、「末端は手段を正当化できるか  哺乳動物細胞におけるテロメアならびに複製老化および不死化の機構（Can Ends Justify the Means? Telomeres and the Mechanisms of Replicative Senescence and Immortalization in Mammalian Cells ）」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第９５巻、ｐ．９０７８−９０８１（１９９８年８月）を参照のこと。同文献の内容は本明細書に参考として援用される。本発明によれば、少なくとも２０継代自己複製し、グリア細胞に分化することができ、テロメラーゼ陽性の前駆細胞が相同組換え事象の候補である（図８を参照のこと）。
【００２７】
９０％をこえるＣＮＳ細胞がグリアであり、グリア細胞治療は、脱髄疾患および神経変性疾患を含む広範囲の神経疾患の治療において潜在的に重要である。グリア細胞は、ニューロンの生存および正常機能の維持、神経伝達物質代謝の調節、ならびにニューロン間の最適なシグナル伝達を維持するためのミエリンの合成に極めて重要である。グリア機能の消失は、多発性硬化症、脊髄損傷、皮質下脳卒中、脳性麻痺、および遺伝病（白質萎縮を含む）に及ぶ脱髄疾患において主な役割を果たしている。グリア機能不全はまた、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、ハンチントン舞踏病を含む神経変性疾患、ならびにリソソーム蓄積症（テイ−サックス病、ハーラー症候群、ゴーシェ病、ファブリー病、および晩期幼児型神経セロイドリポフスチノーシス（「ＬＩＮＣＬ」）を含むが、これに限定されない）における主な要因である。従って、グリア前駆細胞は理想的な治療候補である。
【００２８】
グリア前駆細胞はまた、並外れた増殖能、感染部位への移動能、ならびにオリゴデンドロサイトサブタイプおよび星状細胞サブタイプへの分化能のために、理想的な治療用送達ビヒクルでもある。上記の疾患が、様々なやり方（外来性タンパク質因子を発現するようにグリア前駆細胞を遺伝学的にコード化し、その細胞を損傷組織に送達すること、誘導性増殖因子を送達することによって内在性前駆幹細胞を動員すること、および／または細胞補充療法を含む）で治療できることが意図される。しかしながら、このような治療を妨げている主因は、適切な治療候補が無いことであった。本発明は、生存可能な治療候補を作成するために相同組換えを使用する方法を提供する。
【００２９】
幹細胞または自己複製前駆細胞（初代細胞）において相同組換えが成功する鍵の１つは、これらの細胞を培養において本質的に変えずに何世代も増殖できることを実現することである。これは、直接、培養において細胞を実際に何世代も継代することによって達成することができ、または不死細胞を特徴付ける酵素テロメラーゼの高い発現レベルから推測することができる。グリア前駆細胞は３０世代を超えて培養で維持することができるうえに、高レベルのテロメラーゼ（細胞不死性の生化学マーカー）を発現することが最近示された。間葉細胞もまた培養において無限に（４０世代を超えて）増殖することができ、高いテロメラーゼレベルを示す。星状細胞前駆細胞を含むがこれに限定されない他のクラスの幹細胞および前駆細胞も同様の特徴を示すと予想される。ソマー（Sommer）およびラオ（Rao ）、「神経幹細胞および細胞数の調節（Neural Stem Cells and Regulation of Ce
ll Number ）」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻、ｐ．１−１８（２００２年）を参照のこと。
【００３０】
体細胞における相同組換えの最初の失敗は、重要な実験パラメータの重要性についての理解が無かったことに起因するかもしれない。例えば、実験によって操作された標的配列と細胞内の標的配列は１００パーセントマッチすることが必要な場合がある。（ヤネツ・アール・ジェイ（Yanez, RJ ）およびポーター・エイ・シー（Porter, AC）、「治療遺伝子ターゲティング（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ.   １９９８年２月５日（２）、ｐ．１４９−１５９を参照のこと）。本発明は、グリア前駆細胞、間葉系幹細胞、および星状細胞前駆細胞において、相同組換えが少なくとも１つの特定の遺伝子座において効率的に生じることを証明する。
【００３１】
制御された薬物送達のための導入遺伝子（トランスジーン）の組込みを対象とした相同組換えの使用は、幹細胞研究および相同組換えのほとんど重複しない分野において本質的に無視されてきた。本発明は、培養における幹細胞集団および前駆細胞集団の増殖特性の新たな特徴付け、ならびに増殖している幹細胞および前駆細胞において候補分子を持続的に発現させる従来にないストラテジーを特徴とする相同組換え法を提供する。
【００３２】
一般的に、相同組換えプロセスは、目的のＤＮＡが導入される細胞から開始すると特徴付けることができる。本発明において、出発細胞は、グリア型の細胞に分化し、かつテロメラーゼ陽性である任意の自己複製体性幹細胞でよい。例示的な細胞として、グリア前駆細胞、間葉系幹細胞、および星状細胞前駆細胞が挙げられるが、これに限定されない。本明細書の実施例から得られたデータに基づいて、本発明による相同組換えは、自己複製能を有し、テロメラーゼを発現し、グリア細胞分化能を有する全ての前駆細胞において可能であると予想される。
【００３３】
ＤＮＡが導入された後、細胞のＤＮＡと導入されたＤＮＡの間で相同組換えが生じ、その結果、細胞は、挿入されたＤＮＡにコードされる産物を発現することができる。本発明において、ＤＮＡは、細胞のＤＮＡのある特定の遺伝子座であってその前駆細胞またはその分化した前駆細胞において発現される遺伝子座に導入可能である。このような遺伝子座の例として、Ｒｏｓａ遺伝子座、ＲＮＡｐｏｌＩＩ、および前駆型の細胞に特異的な遺伝子（例えば、サイクリックヌクレオチドジホスファターゼ（「ＣＮＰ」）、ミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）、およびプロテオリピッドタンパク質（「ＰＬＰ」）があるが、これに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３４】
本発明によれば、ＤＮＡは、エレクトロポレーション、リポフェクション（商標）、細胞融合、レトロウイルス感染、カチオン性薬剤導入、ＣａＰＯ４、トランスフェクション、およびその組み合わせを含むが、これに限定されない様々な方法によって細胞に挿入することができる。細胞に導入しようとするＤＮＡは、ＤＮＡ構築物、ＤＮＡプラスミド、λファージ、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、およびＹＡＣ（酵母人工染色体）を含むが、これに限定されない様々な形で導入することができる。
【００３５】
相同組換えされた幹細胞または前駆細胞は、当該技術分野で周知の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と組み合わせることができる。適切な薬学的担体として、不活性固形希釈剤または増量剤、滅菌水溶液、および様々な有機溶媒が挙げられる。相同組換えされた幹細胞または前駆細胞と薬学的に許容可能な担体を組み合わせることによって形成された薬学的組成物は、錠剤、散剤、ロゼンジ、シロップ、注射液などの様々な剤形で投与することができる。治療されている被検体の体重、年齢、および状態、疾患の重篤度、ならびに選択された特定の投与経路などの既知の注意事項を考慮に入れて、当業者は投与を行うことができる。
【００３６】
特定の実施態様では、組換えられた遺伝子が内在性プロモーターによって調節されるように、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）タンパク質が、相同組換えが生じる特定の遺伝子座に挿入される（図４）。
【００３７】
相同組換えはまた、細胞内の目的の遺伝子のプロモーターを取り替える、または改変するために使用することができる。このような相同組換え事象により、例えば、目的の遺伝子の誘導性制御が可能となる。胚性幹細胞での相同組換えにおいて従来用いられているベクターを体性幹細胞において使用することができる。目的の遺伝子の例として、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３８】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに理解することができる。
【実施例１】
【００３９】
［実施例Ｉ］
グリア前駆細胞が培養において増殖する能力を試験するために、テロメラーゼ活性のレベル、培養において長期間分裂する能力、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション（商標）、およびレトロウイルス感染を用いて細胞にＤＮＡを送達する能力を評価した。ラオ（Rao ）ら、「三分化能グリア前駆細胞は発生中の脊髄に存在する（A Tripotential Glial Precursors is Present in the Developing Spinal Cord）」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第９５巻、ｐ．３９６６−４００１（１９９８年３月）；ラオおよびメイヤー−プロスシェル（Mayer-Proschel）、「グリアに限定された前駆細胞は神経上皮多能性幹細胞に由来する（Glial-Restricted Precursors are Derived from Multipotent Neuroepithelial Stem Cells ）」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第１８８巻、ｐ．４８−６３（１９９７年）；米国特許第６，３６１，９９６号および米国特許第６，２３５，５２７号を参照のこと。これらの全ての内容は本明細書に参考として援用される。
【００４０】
図８は、テロメラーゼ活性を発現するＧＲＰ細胞を示す。ＮＥＰ細胞およびＥ１４混合細胞は、解剖されたばかりのＥ１０. ５胚およびＥ１４胚から入手した。Ａ２Ｂ５陽性ＧＲＰ細胞は、フローサイトメトリーによって分取されたＥ１４混合細胞から選択された。１０００個の細胞に相当する抽出物のテロメラーゼ活性を標準的なＴＲＡＰアッセイで分析した。活性レベルを定量し、表の形式で示した（図８，パートｂ）。「ＨＩ」試料は熱で不活化した対照である。ＴＥＲＴの発現を、遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図８，パートｃ）。従って、グリア前駆細胞は相同組換え事象の候補である。
【実施例２】
【００４１】
［実施例ＩＩ］
相同組換えのためにベクターを設計し、この設計されたベクターを用いて、特定の部位で組換えを起こすことができることを示す。タンパク質の発現が構成的に活性のある遍在性プロモーターまたは細胞種特異的プロモーターによって調節されるように、目的の遺伝子がベクターバックボーンにクローニングされる。ベクターは、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション（商標）、および／または細胞融合によって、培養した前駆細胞に挿入される。ベクターの設計は、特定の被検体（例えば、ヒト、ラット、またはマウス）のゲノムの特定の配列と相同な領域を含むような設計である。このような相同配列として、Ｒｏｓａ遺伝子座、ＲＮＡｐｏｌＩＩ遺伝子座、およびβ−アクチン遺伝子座が挙げられるが、これらに限定されない。これらの相同配列を使用すると、細胞が複製する時に、挿入されたＤＮＡと染色体ＤＮＡの中の相同配列との組換えが可能になる。
【００４２】
部位特異的組込みには、部位特異的組換え事象が生じた細胞を首尾よく選択するために、十分な期間、培養で増殖することができる十分な数の細胞が得られることが必要とされる。本発明者らは、グリア前駆細胞、星状細胞前駆細胞、および間葉系幹細胞について、自己複製し、トランスフェクトされた遺伝子を発現することができ、ネオマイシンおよびピューロマイシンを用いて選択可能な細胞を多数得ることができることを示した。図１は、ＤＮＡを細胞に挿入するのにエレクトロポレーションを使用できることを示すプロトタイプベクターの例を図示する。試験されたＤＮＡ挿入法は、エレクトロポレーション、リポフェクション（商標）、ウイルス導入、およびリン酸カルシウムを介した導入を含む。このことは、少なくとも２０％の効率を有する他の任意の市販の遺伝子送達薬剤を本発明に従って使用できることを示唆している。
【００４３】
任意のクローニングされた目的の遺伝子座を標的とできることを示すために、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＲＮＡｐｏｌＩＩ、およびＧＡＰＤＨ遺伝子座を標的とする構築物が開発された。このようなプラスミドのいくつかの変形が用いられた。プロモーターを含む構築物（スプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプターを含む、または含まない）、あるいはプロモーターを含まない構築物（スプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプターを含む、または含まない）のいずれかを使用することができる。ＩＲＥＳ部位またはｆｌｏｘｅｄ遺伝子産物を有する構築物は、詳細に説明されていてかつ当業者によって容易に入手可能な方法を用いて作成することができる。相同組換えに用いられるベクターおよび構築物の詳細な概説はコート（Court ）ら、２００２年、コープランド（Copeland）ら、２００１年で述べられており、ベクターのいくつかの変形物の例を本明細書で説明する（図２）。
【００４４】
ベクターは、内在性エンハンサー（例えば、Ｒｏｓａ２６）の下流に組み込まれるように、エンハンサーを有さないプロモーターを含まないベクターでもよい。本発明によれば、ベクターは、プロモーターを含まないベクターのように内在性エンハンサーによってもたらされる制御に加えて、遺伝子発現を外因的に制御することができる追加のエンハンサーエレメントを有する構築物でもよい。プロモーター（ＣＭＶ、ＰＧＫ、プリオンタンパク質、または前駆細胞集団において発現を駆動するのに適した任意のプロモーターを含むが、これに限定されない）は、内在性遺伝子（例えば、ＧＤＮＦをコードする内在性遺伝子）の上流に組み込むことができる。
【００４５】
ベクターは、標的遺伝子座の特定の領域への組込み後に発現を可能にするスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を有する構築物でもよい。ベクターは、内在性遺伝子の特定の領域への組込み後に所望のタンパク質の効率的な発現を可能にするＩＲＥＳ部位を有する構築物でもよい。さらに、本発明によれば、適切なベクターは、このような構築物の任意の変形物でもよい。このような組換えの例を図３〜６に示す。
【実施例３】
【００４６】
［実施例ＩＩＩ］
相同組換えのためにベクターを設計した。マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子座を標的とする配列を構築するために、ＩＲＥＳ−ｎｅｏ配列を、マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子座の（エキソン２８に隣接する）３’非コード配列にクローニングした（図１５）（配列番号１）。詳細に述べると、本発明者らは、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）に連結した内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを、Ｐｏｌｒ２ａ遺伝子の最後の３つのエキソンおよび３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含むゲノムＤＮＡ断片に挿入した（図３；３’ＵＴＲは斜線のついた囲みで示され、ｐＡはポリアデニル化シグナルである）。ｎｅｏ遺伝子にはプロモーター配列が無く、ＩＲＥＳエレメントを用いて第２シストロンから翻訳され、その発現はゲノムへの適切な（すなわち、内在性プロモーターの３’側への）組み込み
に左右される。このストラテジーは、ある特定の遺伝子座での相同組換え頻度を著しく高める（テブルディック（Tvrdik）およびカペッキ（Capecchi）、未公表の観察）。本発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットをコードするＰｏｌｒ２ａ遺伝子を選択した。なぜなら、Ｐｏｌｒ２ａ遺伝子は、十分に高発現な極めて重要な遺伝子であり十分なレベルのネオマイシン耐性を確かなものにするからである。最終的なターゲティングベクターを直線化し、エレクトロポレーション（実験４ａおよび実験４ｂ）またはリポフェクション（実験４ｃ）を用いてＧＲＰ細胞に導入した。細胞を２４時間回復させ、次いで、７０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に入れた。実験１では、１０８個のＧＲＰについてエレクトロポレーションを実施した。実験２ａおよび２ｂでは、２×１０７個のＧＲＰを使用した。
【実施例４】
【００４７】
［実施例ＩＶ］
哺乳動物体性幹細胞において相同組換えによる導入遺伝子の標的化組込みを行った（実験４ａ、実験４ｂ、および実験４ｃ）。これは、マウス胚の脳から単離されたグリア前駆幹細胞（ＧＲＰ）のＰｏｌｒ２ａ遺伝子の３’非翻訳配列にある特定の配列への導入遺伝子の組込みを標的とした。
【００４８】
マウスＧＲＰを単離および培養する手順は以前に公表されている。凍結初代細胞の融解および継代によって増殖させたＧＲＰを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１Ｘ  Ｎ２添加物、１Ｘ  Ｂ２７添加物、２０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性ＦＧＦ、ならびに１Ｘペニシリンおよびストレプトマイシンにおいて培養した。実験４ｂおよび４ｃでは、レチノイン酸を含まないＢ２７添加物を使用した。細胞は、エレクトロポレーションによって（生存細胞の約４０％がレポーター遺伝子を一過的に発現する）、またはＦｕｇｅｎ（商品名）トランスフェクション試薬を用いたリポフェクション（商標）によって（細胞の約１２％がレポーターを一過的に発現した）効率的にトランスフェクトすることができた。
【００４９】
ＧＲＰ初代培養はネオマイシン感受性であり（図１３）、従って、細胞のトランスフェクション後にＧ−４１８耐性を選択すると、安定に組み込まれたネオマイシン耐性マーカーを発現する細胞クローンを単離することができる（図１４）。
【００５０】
細胞を、エレクトロポレーションを用いて（実験４ａおよび実験４ｂ）、またはリポフェクション（商標）を用いて（実験４ｃ）、実施例ＩＩＩのベクターでトランスフェクトし、２４時間回復させ、次いで、７０μｇ／ｍｌのＧ４１８中に置いた。実験４ａでは、１０（８）ＧＲＰをエレクトロポレーションした。実験４ｂおよび実験４ｃでは、２×１０（７）ＧＲＰを使用した。
【００５１】
ネオマイシン陽性クローンは、３つの独立したトランスフェクション実験全てにおいて観察された（図１４は実験４ａからの例を示す）。５７個のクローンが実験４ａで見られ、２９個が実験４ｂで見られ、約１００個が実験４ｃで見られた（実験４ｃの場合、細胞クローンは近接しすぎて容易に区別できないことが多かった）。単離されたクローンから細胞をつついて採取し、２つの組織培養ウェルに播種するのに使用した。一方のウェルは凍結させ、他方のウェルは、特定のクローンにおけるＩＲＥＳ−ｎｅｏ配列の組込みがどういったものであるかを分析するために使用した。
【００５２】
実験４ａでは、９個のクローンが、図１５に示したオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによる分子分析に十分なレベルまで増殖した。クローンの増殖におけるこの成功の低さは、Ｂ２７添加物に含まれるレチノイン酸の存在によるものであった。レチノイン酸を含まないＢ２７添加物を使用した実験４ｂおよび４ｃでは、つついて採取した後に、５３個のクローンのうち４０個が勢いよく増殖した。
【００５３】
図１６では、Ｐｏｌｒ２ａ配列に対応するオリゴヌクレオチド（一方はターゲティングベクターに含まれ（ＱＴ２６）、他方はＰｏｌｒ２ａにおいて約２. ６ｋｂ離れている（ＱＴ２３））を用いて、ＰＣＲ反応を行った。相同組換えが生じた場合、野生型Ｐｏｌｒ２遺伝子座で見られる２. ６ｋｂのＰＣＲ断片の間に１. ５ｋｂのＩＲＥＳ−ｎｅｏ配列が入り、従って、約４. １ｋｂ断片が生じると予想された。
【００５４】
実験４ａでは、１１個のクローン（Ａ〜Ｋ）からＤＮＡを調製し、ＰＣＲ分析の成功に十分なゲノムＤＮＡを示す対照バンドが無いことに基づいて、このうち２個（ＢおよびＪ）を考慮の対象から外した。残った９個のクローンの全てが、２. ６ｋｂのＰＣＲ増幅断片によって証明されるように少なくとも１つの野生型Ｐｏｌｒ２ａ対立遺伝子の存在を示した。しかしながら、４個（Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＫ）はさらに４. １ｋｂのバンドを示し、このバンドは２. ６ｋｂのＰｏｌｒ２ａ断片へのＩＲＥＳ−ｎｅｏの相同組換えを介した標的化組込み後に生じると予想されたものである。
【００５５】
実験４ｂおよび４ｃから分析された１７個のクローンのうちの２個には、ＩＲＥＳ−ｎｅｏがＰｏｌｒ２ａ遺伝子座に組み込まれていた。これらの２個のうちの１個は相同組換えから生じたものであった（図１７）。実験４ｂおよび４ｃにおいて、１５個のクローン（４ｂおよび４ｃからのプールした結果）からＤＮＡを調製し、ＰＣＲによって分析した。この分析では、２つの独立したＰＣＲ増幅反応を行った。最初に、実験４ａと同様に、Ｐｏｌｒ２ａでの推定ＩＲＥＳ  ｎｅｏ組込みに隣接するオリゴヌクレオチド対を使用した。オリゴヌクレオチド配列の一方（ＱＴ２６）はオリジナルのターゲティングベクターに含まれ、Ｐｏｌｒ２配列に含まれる他方のオリゴヌクレオチド配列（ＱＴ２３）はベクターに含まれないものとした。分析された１５個全てのクローンにおいて、野生型Ｐｏｌｒ２ａ対立遺伝子に由来する対照の２. ６バンドが観察された（図１７，パートＡ）。これらのクローンのうちの２個（２，１３）では、さらに大きなバンドが観察された。クローン１３のバンドは約４. １ｋｂであり、相同組換えを介した標的化組込みの後に予想されるものと全く同じであった。クローン２の場合、バンドは６ｋｂより大きかった。従って、クローン２は、Ｐｏｌｒ２ａ遺伝子は破壊されているが、１回の相同組換え事象の後に生じたとは思われない。
【００５６】
クローン２には付加的な再編成が関与しているが、クローン１３では関与しなかったことを、第２のＰＣＲ分析によってさらに証明する。第２のＰＣＲ分析（図１７，パートＢ）では、標的化組込みが生じたクローン由来のテンプレートＤＮＡにおいてのみＰＣＲ増幅断片が見られるようにオリゴヌクレオチド対を選択した。従って、オリゴヌクレオチドプライマーの一方はＩＲＥＳそのものの中にあり、他方は、ターゲティングベクターに隣接するがベクター中には含まれないＰｏｌｒ２ａ配列に対応するものである。ＩＲＥＳ−ｎｅｏが相同組換によって正確に組み込まれた場合、２. ８ｋｂのバンドが予想される。この２. ８ｋｂバンドはクローン１３においてはっきりと見ることができる。クローン２では、ＩＲＥＳ−ｎｅｏがＰｏｌｒ２ａに組み込まれたことを示す断片が増幅された。しかしながら、この断片はかなり大きかった。この分析から、クローン２では、ＩＲＥＳ−ｎｅｏのＰｏｌｒ２ａへの組込みに部分的なＤＮＡのさらなる再編成を伴ったが、クローン１３では伴わなかったという追加証拠が得られる。他の１３個のどのクローンでも断片は増幅されなかった。これは図１７のパートＡのデータと一致し、これらのクローンにおけるＩＲＥＳ−ｎｅｏの組込みが標的化機構ではない機構によって生じたことを示している。
【００５７】
クローン１３からのＩＲＥＳ−Ｐｏｌｒ２ａ増幅断片（図１７，パートＢ）を配列決定することによって、この断片がＰｏｌｒ２ａ遺伝子座に由来し、ＰＣＲデータの解釈を裏付けるものであることが確かめられた。Ｐｏｌｒ２ａ遺伝子座は比較的高い相同組換え頻
度を可能にする唯一のものであると思われない。というのも、胚性幹細胞における約２００個の遺伝子座が、転写に関してサイレントでない大部分の遺伝子について同等の組換え率を有することが報告されているからである。
【実施例５】
【００５８】
［実施例Ｖ］
このように、体性幹細胞（特に、マウスグリア前駆細胞）での首尾よい相同組換えが実現可能であることが証明された。この技術は、ヒト（Homo sapiens）を含む全ての哺乳動物のグリア幹細胞に容易に一般化され、同様に他のクラスの体性幹細胞にも容易に一般化される。実施例Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの結果を考慮して、幹細胞および前駆細胞が高レベルのテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）を発現し、ＴＥＲＴ（染色体の先端部を修復する酵素であり、この酵素がなければ細胞が分裂するごとに先端部が短くなる）を合成し、少なくとも１０世代の間、未分化な状態で維持され、他の前駆細胞集団での相同組換えが可能なように、幹細胞を維持および培養する方法が最適化される。この仮説を試験するために、間葉系幹細胞および星状細胞前駆細胞が用いられ、相同組換えがこれらの種類の細胞で可能なことが示される。
【実施例６】
【００５９】
［実施例ＶＩ］
外来ＤＮＡを細胞に挿入し、次いでその外来ＤＮＡに基づいて細胞を選択することができる。さらに、外来ＤＮＡの挿入は、改変された細胞の特性全体を変えはしない（図９，図１０；ウー（Wu）ら「グリアに限定された三分化能細胞株の胚脊髄培養物からの単離」、ＧＬＩＡ  第３８巻、ｐ．６５−６９（２００２年））。相同な部位にＤＮＡが挿入された幹細胞または前駆細胞を単離し、選択遺伝子マーカーを用いて選択する。次いで、後の実験のために細胞を使用する。後の実験として、遺伝子産物の置換が異常または欠損を治すような、被検体への幹細胞または前駆細胞の移植が挙げられるが、これに限定されない。このような異常の例として、触媒酵素の消失、増殖因子またはその受容体の濃度の低下、および、あるタンパク質が同タンパク質を通常発現しない細胞において新たに発現することが挙げられる。本発明において、ｎｅｏは、グリア前駆細胞のＰｏｌｒ２ａ遺伝子座において発現される。
【実施例７】
【００６０】
［実施例ＶＩＩ］
関連した実験では、治療用鎮痛性ペプチドをコードするＤＮＡが、相同組換えによってグリア前駆細胞のＲｏｓａ遺伝子座に組み込まれる。グリア前駆細胞は、実施例ＶＩのプロトコールに従ってスクリーニングされ、げっ歯類などの被検体の脊椎に移植される。グリア前駆細胞は、組み込まれたタンパク質を分泌し、げっ歯類疼痛モデルにおいて効力が試験される。
【実施例８】
【００６１】
［実施例ＶＩＩＩ］
さらなるサブクローンを開発するために、再度、細胞を遺伝子挿入の標的とすることができる（図１１；ウーら「グリアに限定された三分化能細胞株の胚脊髄培養物からの単離」ＧＬＩＡ  第３８巻、ｐ．６５−６９（２００２年））。少なくとも１つの外来性配列がグリア前駆細胞ゲノムの選択された部位に配置され、同じ選択された部位が繰り返し標的化されるように、少なくとも１回の相同組換え事象が首尾よく生じた前駆細胞株が作成される。例えば、挿入された遺伝子配列は、再現可能なやり方で第３の遺伝子または第４の遺伝子で置換される。
【００６２】
ある部位が特異的に標的化され、組換えが成功したら、同じ部位を、実質的にさらに高
い効率で再標的化することが可能である。これを実現する方法の１つは、目的の遺伝子座を含むＢＡＣ（細菌人工染色体）を（細菌内での相同組換えを用いて）標的部位に別の配列を含むように操作し、次いで、グリア前駆細胞において相同組換えを行うようにしてこれらの新たなＢＡＣを使用することによる方法である。もう１つの方法は、組換えがｆｌｏｘｅｄ遺伝子座で高い効率で生じ、既存の遺伝子座を新たなＤＮＡで置換するように、「ｆｌｏｘｅｄ遺伝子」（Ｃｒｅ／ｌｏｘ系）、およびΦＣ３１／ＡｔｔＰ／ＡｔｔＢまたはＦｌγ／ＦＲＴを含む他の系を使用する方法である。標的部位での新たなＤＮＡは、単一部位の突然変異を導入するように働いてもよく、既存のエキソンまたは遺伝子全体に取って代わるように働いてもよい。新たなＤＮＡは既存の配列に取って代わってもよく、既存の配列に加わってもよい。このようなストラテジーの１つの図を図７に示す。数種類のやり方で反復標的化を行うことができ、Ｆｌｏｘｅｄ部位を用いた一例を示してあることに留意のこと。反復標的化の別の例を図１２に示す。ここでは、新たなＤＮＡ配列を付加するために１個のｆｌｏｘ部位が用いられる。図７および図１２に示した技法は同時にまたは別々に使用することができる。
【００６３】
図４は、内在性プロモーターから転写物を直接発現させるためにＩＲＥＳを含むベクターを使用する例を示す。
【実施例９】
【００６４】
［実施例ＩＸ］
相同組換えがグリア前駆細胞で行われ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖因子送達の効力を評価し、遺伝子発現を直接比較するために様々な候補増殖因子を発現する複数の細胞クローンが得られる。従って、グリア前駆細胞は、遺伝子によって発現される発現タンパク質の送達ビヒクルとして働く。このプロセスは、間葉系幹細胞および星状細胞前駆細胞でも再現される。
【００６５】
候補因子として、グリア前駆細胞の分裂および分化を誘導し、従って、ＭＳ、ＡＬＳ、および白質萎縮を含むグリア消失疾患を治療する可能性のある増殖因子であるＰＤＧＦが挙げられる。このような因子として、ＧＤＮＦ、グルタミン酸トランスポーター、および白質萎縮またはリソソーム蓄積症に関与する酵素も挙げられる。別のクラスの治療用候補因子は、グリア細胞によって生産される治療用因子の分泌を増大させる。このような分子として、ドミナントネガティブ型マンノース−６−リン酸受容体が挙げられる。ドミナントネガティブ型マンノース−６−リン酸受容体は、多数の様々なリソソームプロ酵素の分泌を誘導することによって、いくつかの異なるリソソーム蓄積症の治療に有用な細胞を生じることができる。
【００６６】
グリア前駆細胞に血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）をコードする遺伝子を組み込み、この細胞を被検体の脳または脊髄に導入する。導入された細胞は、グリア前駆細胞の増殖およびオリゴデンドロサイトへの分化を促進するＰＤＧＦを発現する。例えば、米国特許第４，８８９，９１９号、米国特許第４，８４５，０７５号、米国特許第４，７６６，０７３号、米国特許第４，８０１，５４２号、米国特許第４，３５０，６８７号、米国特許第５，０９６，８２５号、米国特許第５，４３９，８１８号、米国特許第５，２２９，５００号、米国特許第６，０７７，８２９号、米国特許第５，４３８，１２１号、米国特許第５，１８０，８２０号、米国特許第６，２２１，３７６号、米国特許第６，０９３，８０２号、米国特許第６，３６２，３１９号、および米国特許第４，９９７，９２９号を参照のこと。これらの各内容は本明細書に参考として援用される。
【００６７】
グリア前駆細胞に、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）をコードする遺伝子を組み込み、この細胞を被検体の脳に導入する。導入された細胞は、神経幹細胞を増殖状態に維持するＥＧＦを発現する。
【００６８】
グリア前駆細胞に、脳由来神経栄養因子（「ＢＤＮＦ」）をコードする遺伝子を組み込み、この細胞を被検体の脳に導入する。導入された細胞は、脳室下領域でのニューロン前駆細胞の生存および分化を促進するＢＤＮＦを発現する。これは、ハンチントン舞踏病の治療における可能性のある役割を意味している。
【００６９】
グリア前駆細胞に、毛様体神経栄養因子（「ＣＮＴＦ」）をコードする遺伝子を組み込み、この細胞を被検体の脳に導入する。導入された細胞はＣＮＴＦを発現する。
グリア前駆細胞に、トリペプチジルアミノペプチダーゼ−１（ＴＰＰ−１）などのリソソーム酵素をコードするｃＤＮＡを組み込む。導入された細胞は、ＬＩＮＣＬ／バッテン病の多くの型の治療に有益なＴＰＰ−１を過剰発現および分泌する。
【００７０】
グリア前駆細胞に、可溶性細胞質外型のマンノース−６−リン酸受容体をコードするｃＤＮＡを組み込む。導入された細胞は、多数の様々なリソソームプロ酵素を高レベルで分泌し、様々なリソソーム病に関連した神経系欠陥を治療するのに有用な可能性がある。
【実施例１０】
【００７１】
［実施例Ｘ］
相同組換えがグリア前駆細胞の第１の遺伝子座で行われ、次いで、得られたクローンは、第１の組換え事象によって導入された変化を第２の対立遺伝子において繰り返す第２の組換え事象について再選択される。このようなホモ接合性変異細胞は、高濃度の選択剤を用いて再選択するか、または同じ細胞株において第１の組換えプロセスと同様に第２の組換えプロセスを試みることによって得ることができる。
【００７２】
培養細胞での相同組換えは、一般的に、目的の遺伝子座の一方の対立遺伝子を標的とする。この遺伝子座でホモ接合性の細胞株を得るために、２つのストラテジーのうち１つを試みることができる。ホモ接合体を得るために高濃度の選択剤での増殖が用いられてもよいし、その部位が前記のように第２の組換え事象において再度標的化されてもよい。
【００７３】
様々な例示的な実施態様および実施例を用いて説明してきたが、本発明は必ずしもこのように限定されるとは限らない。
【００７４】
【表１】
2006517101.tif 000003
【００７５】
【表２】
2006517101.tif 000004
【００７６】
【表３】
2006517101.tif 000005
【００７７】
2006517101.tif 000006
【００７８】
2006517101.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】体細胞での相同組換え用の市販のプラスミドの例を示す図。複数のプロモーターを使用することができ、ターゲティング構築物を含むバックボーンは異なってもよいことに留意のこと。プラスミドは、エレクトロポレーション、リポフェクション（商標）、リン酸カルシウムを介したＤＮＡ移入、またはレトロウイルスによって体細胞に導入することができる。
【図２】本発明に従って使用することができるベクターの例を示す図。ベクターは、内在性プロモーターを利用するように設計されてもよく、異所性プロモーターを提供するように設計されてもよく、または内在性プロモーターを特定するように設計されてもよい。
【図３】置換された遺伝子が、細胞種特異的な発現を駆動する内在性プロモーター配列を利用する組換えの一例を示す図。
【図４】内在性プロモーターから転写物を発現させるためにＩＲＥＳ部位を含むベクターを使用する一例を示す図。
【図５】内在性遺伝子を破壊し、所望の転写物または融合転写物を生じるためのＳＡ部位の利用を示す図。
【図６】隣接選択配列を除去するためのＣｒｅを介した組換えによる細胞種特異的な発現の一例を示す図。ΦＣ３１／ＡｔｔＰ／ＡｔｔＢまたはＦｌγ／ＦＲＴを含む他の系も使用できることに留意のこと。
【図７】反復相同組換えの一例を示す図。数種類のやり方で反復標的化を行うことができることに留意のこと。Ｆｌｏｘｅｄ部位を用いた一例を示す。
【図８】テロメラーゼ活性を発現するグリア前駆幹細胞（「ＧＲＰ」）を示す図（パートＡ）。ＮＥＰ細胞およびＥ１４混合細胞は、解剖されたばかりのＥ１０. ５胚およびＥ１４胚から得た。Ａ２Ｂ５陽性ＧＲＰ細胞は、フローサイトメトリーによって分取されたＥ１４混合細胞から選択された。１０００個の細胞に相当する抽出物のテロメラーゼ活性を、標準的なＴＲＡＰアッセイで分析した。レベルを定量し、表の形式で表した（パートｂ）。「ＨＩ」試料は熱で不活化した対照である。ＴＥＲＴの発現は、遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって評価した（パートｃ）。
【図９】Ａ２Ｂ５免疫反応細胞の不死化を示す図。Ａ２Ｂ５免疫反応細胞はイムノパニングによって精製され、不死化がん遺伝子であるｖ−ｍｙｃによって不死化された。一部の細胞をテトラサイクリンの存在下で増殖させ、その増殖速度をＢＲＤＵの取り込みによって評価したのに対して（パートＣおよびパートＤ）、他の不死化細胞はＰＤＧＦ／Ｔ３、ＦＢＳ、またはＣＮＴＦの存在下で１週間培養し、オリゴデンドロサイト（パートＥ）ならびに星状細胞（パートＦおよびＧ）への分化を促進した。パートＡは、単離物がＡ２Ｂ５免疫反応細胞（ ９５％）からなることを示すために、Ａ２Ｂ５（赤）およびＤＡＰＩ（青）で染色された代表的な視野を示す。パートＢは、不死化サブクローンを得るために用いられた手順の概略を示す。パートＣおよびＤは、ＢＲＤＵの取り込み（赤）によって評価された増殖速度がテトラサイクリン依存性であることを示す。このことから、テトラサイクリン調節性ｖ−ｍｙｃが機能していることが分かる。パートＥ、Ｆ、およびＧは、不死化細胞がオリゴデンドロサイト（パートＥ：Ｇａｌ−Ｃ，赤）、Ａ２Ｂ５ 星状細胞（パートＦ：ＧＦＡＰ，緑；Ａ２Ｂ５，赤）、およびＡ２Ｂ５ 星状細胞（パートＧ：ＧＦＡＰ，緑；Ａ２Ｂ５，赤）に分化できることを示す。Ａ２Ｂ５ 星状細胞集団とＡ２Ｂ５ 星状細胞集団の形態の違いに留意のこと（パートＦおよびＧを比較のこと）。
【図１０】不死化細胞の特徴を示す図。Ａ２Ｂ５不死化細胞を継代（Ｐ７）し、ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において増殖させた。細胞を培養して５１０日後に採取し、様々なマーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲ（パートＡおよびＢ）または免疫細胞化学法（パートＤ〜Ｊ）によって試験した。一部の実験では、不死化細胞を分化させ、マーカーの獲得を評価し（パートＣおよびＨ）、他の実験では、発現を不死化していない細胞での発現と比較した（パートＪ）。不死化細胞はＰＤＧＦ−ＲもＮＦもｏｌｉｇ−２も発現せず（パートＡおよびＢ）、細胞の一部だけがＮｋｘ２. ２（パートＧ：Ｎｋｘ２. ２，赤；Ａ２Ｂ５，緑）またはＧＤ−３（パートＩ：ＧＤ−３，赤；ＤＡＰＩ，青）を発現する（これは、Ｅ１４. ０で非不死化細胞において見られたＧＤ−３の発現（パートＪ：ＧＤ−３，赤；Ａ２Ｂ５，緑）に似ている）。ほとんどの不死化細胞はネスチン（パートＡ；パートＤおよびＤ を比較のこと）、４Ｄ４（パートＦ）、およびＨＮＫ−１（パートＥ）を発現する。他のグリア前駆細胞マーカー（例えば、Ｎｇｎ３、ｏｌｉｇ−１、およびＰＬＰ／ＤＭ２０）の発現も見ることができる。ＤＭ２０スプライス型のＰＬＰ／ＤＭ２０転写物だけがＰＣＲによって検出することができ（パートＡ）、より成熟した出現細胞だけが分化状態でＰＬＰ／ＤＭ２０抗体と免疫反応することに留意のこと。
【図１１】ＧＦＰ標識サブクローンが星状細胞およびオリゴデンドロサイトに分化できることを示す図。ＧＦＰを発現するＡ２Ｂ５不死化細胞を記載のように単離し、継代した（Ｐ１０）細胞を、ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において増殖させ、培養５〜１０日後に細胞を採取し（パートＢおよびＢ ）、ｖ−ｍｙｃの組み込みをサザンブロットハイブリダイゼーションによって評価した（パートＡ）。細胞を、星状細胞への分化を促進する条件[ パートＣおよびＣ ；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＭＰ（１０ｎｇ／ｍｌ）] またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件[ パートＤおよびＤ ；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および増殖因子] で再度プレート培養した。ＧＦＰ発現細胞は、３種類の制限酵素を用いて単一の組込み部位を示し（パートＡ）、実質的に全てのＧＦＰ発現細胞が増殖条件下でＡ２Ｂ５を発現し続ける（パートＢおよびＢ ）。ＧＦＰ発現細胞は、適切な増殖条件下で星状細胞（パートＣおよびＣ ）またはオリゴデンドロサイト（パートＤおよびＤ ）に分化することができる。このことから、ＧＦＰを発現しても、このクローンが星状細胞およびオリゴデンドロサイトに分化する能力は変わらないことが分かる。
【図１２】反復相同組換えの一例を示す図。数種類のやり方で反復標的化を行うことができることに留意のこと。１個のＦｌｏｘｅｄ部位を用いた一例を示す。
【図１３】ＧＲＰのネオマイシン感受性を示す図。パートＡは、指数増殖しているＧＲＰを高倍率で示す。パートＢは、ネオマイシン（Ｇ４１８）非存在下でプレート培養されたＧＲＰを低倍率で示す。パートＣは、ネオマイシン（Ｇ４１８）存在下でプレート培養されたＧＲＰを低倍率で示す。
【図１４】ＧＲＰの安定なトランスフェクションを示す図。パートＡは、トランスフェクトされていないＧＲＰを示す。パートＢおよびＣは、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性クローンを示す。
【図１５】本発明の一実施態様で用いられるベクターを示す図。このベクターにおいて、ＩＲＥＳ−ｎｅｏ配列をマウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子座の（エキソン２８に隣接する）３’非コード配列にクローニングした。
【図１６】マウスグリア前駆細胞における相同組換えによる導入遺伝子の標的化導入を示す図。
【図１７】本発明の一実施態様からのＰＣＲの結果を示す図。パートＡは、推定ＩＲＥＳ−ｎｅｏ挿入部に隣接するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを示す。２種類のクローン（２および１３）が野生型より大きなバンドを示した。パートＢでは、ＩＲＥＳ−ｎｅｏ内のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的ベクターに隣接するＰｏｌｒ２ａ配列中のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、さらなるＰＣＲを行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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