(57)【要約】結合すべきオリゴヌクレオチドに相補的、または部分的に相補的な骨格オリゴヌクレオチドの存在下での２種以上のオリゴヌクレオチドの結合を含む、ポリヌクレオチドの構築方法および／または標識方法およびそのためのキット。完全長のオリゴヌクレオチドのテンプレートは必要とされない。骨格オリゴヌクレオチドと結合すべき少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとの間に安定な二重鎖を形成させない条件下で結合を実施できる。これら不安定な結合条件下では、これら２種のオリゴヌクレオチド調製物中の切断された、もしくは非結合性の混入物は、所望のオリゴヌクレオチド産物の形成をそれほど阻害しない。本発明の方法により、結合反応におけるオリゴヌクレオチドを精製することなく利用できる。また、本発明の方法により、標的オリゴヌクレオチドの一端または両端に対するオリゴヌクレオチドの末端特異的付加も可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断体含有オリゴヌクレオチド合成産物の集団を用いてポリヌクレオチド産物を構築する方法であって：
一本鎖領域を、骨格オリゴヌクレオチドの第１末端および第２末端の双方に残すように、該第１末端および該第２末端を有するサブテンプレート長の骨格オリゴヌクレオチドと５’末端および３’末端を有する中心オリゴヌクレオチドとを部分的に二重鎖化する工程；ならびに
該部分的二重鎖化骨格オリゴヌクレオチドの両端に一本鎖領域を有する切断体含有オリゴヌクレオチド合成産物のそれぞれ第１および第２の集団をサンプリングすることにより該中心オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端にそれぞれ第１および第２のオリゴヌクレオチドを結合する工程、を包含し、
該サンプリングは、該骨格オリゴヌクレオチドの両端における一本鎖領域に対する該第１および第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが不安定であり、該骨格オリゴヌクレオチドに対する該中心オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが安定である条件下、リガーゼの存在下で実施され、
該第１のオリゴヌクレオチドは、該骨格オリゴヌクレオチドの第１末端における一本鎖領域に対する配列が完全相補的な領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドは、該骨格オリゴヌクレオチドの第２末端における一本鎖領域に対する配列が完全相補的な領域を含む、方法。
【請求項２】
前記部分的二重鎖化および前記結合が、単一工程で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨格オリゴヌクレオチドからのポリヌクレオチド産物のサイズを分離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨格オリゴヌクレオチドの両端における一本鎖領域の各々が、１０ヌクレオチド長以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記骨格オリゴヌクレオチドの両端における一本鎖領域の各々が、７ヌクレオチド長以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記骨格オリゴヌクレオチドの両端における一本鎖領域の各々が、５ヌクレオチド長以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結合工程の条件が、少なくとも３０℃の温度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記結合工程の条件が、少なくとも４２℃の温度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記結合工程の条件が、少なくとも５０℃の温度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド産物が、前記骨格オリゴヌクレオチドの各々の末端を越えて少なくとも１０ヌクレオチド伸長している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド産物が、前記骨格オリゴヌクレオチドの各々の末端を越えて少なくとも２５ヌクレオチド伸長している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチド産物が、前記骨格オリゴヌクレオチドの各々の末端を越えて少なくとも７５ヌクレオチド伸長している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のサンプリング集団が、第１の複数のオリゴヌクレオチド合成の産物を含み、該第１の複数の合成の少なくとも２つの完全長合成産物の配列が異なっており、前記第２の集団が、第２の複数のオリゴヌクレオチド合成の産物を含み、該第２の複数合成の少なくとも２つの完全長合成産物の配列が異なっている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨格オリゴヌクレオチドおよび前記中心オリゴヌクレオチドを前記第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させる前に、該骨格オリゴヌクレオチドの第１末端および第２末端の双方に一本鎖領域が残るように、該骨格オリゴヌクレオチドが、該中心オリゴヌクレオチドに対し部分的に二重鎖化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
切断体含有オリゴヌクレオチド合成産物の集団を用いて少なくとも１種のポリヌクレオチド産物を構築する方法であって：
中心オリゴヌクレオチド、少なくとも１種の第１のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種の第２のオリゴヌクレオチドを共に結合する工程を包含し、
該第１オリゴヌクレオチド、該中心オリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドが、結合時に共通の骨格オリゴヌクレオチドにアニールされ、
該骨格オリゴヌクレオチドは、形成された該二重鎖が結合条件下で安定であるように、該中心オリゴヌクレオチドの全長に相補的であり、
該骨格オリゴヌクレオチドは、形成された該二重鎖が結合条件下で不安定であるように、限定数のヌクレオチドの範囲にわたってのみ該第１および第２のオリゴヌクレオチドに相補的であり、
該骨格オリゴヌクレオチドは、該第１のオリゴヌクレオチドの実質的完全長に沿って相補性ヌクレオチドを提供せず、かつ、該第２のオリゴヌクレオチドの実質的完全長に沿って相補性ヌクレオチドを提供しない、方法。
【請求項１６】
一本鎖ポリヌクレオチドの一端に少なくとも１種の伸長オリゴヌクレオチドを付加する方法であって：
該伸長オリゴヌクレオチドと該一本鎖ポリヌクレオチドとを、骨格オリゴヌクレオチドと組合わせる工程であって、該一本鎖ポリヌクレオチドと該伸長オリゴヌクレオチドの双方が該骨格オリゴヌクレオチドに対して塩基対合する場合、結合のためにそれらが正しく整列されるように、該骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの一部に沿って該一本鎖ポリヌクレオチドに対して相補的であり、また、該骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの他の部分に沿って該伸長オリゴヌクレオチドに対して相補的である、工程；および
該一本鎖ポリヌクレオチドに該伸長オリゴヌクレオチドを結合させる工程、
を包含する方法。
【請求項１７】
前記骨格オリゴヌクレオチドが、前記一本鎖ポリヌクレオチドと不安定な二重鎖を形成し、該骨格オリゴヌクレオチドが、前記伸長オリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成する溶液条件下で前記結合工程を実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨格オリゴヌクレオチドが、前記一本鎖ポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し、該骨格オリゴヌクレオチドが、前記伸長オリゴヌクレオチドと不安定な二重鎖を形成する溶液条件下で前記結合工程を実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記伸長オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応増幅における使用のためのプライマー結合部位を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記伸長オリゴヌクレオチドが、ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼに対する結合部位を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記伸長オリゴヌクレオチドが、バーコード配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記伸長オリゴヌクレオチドが、標識オリゴヌクレオチドを含み、該標識オリゴヌクレオチドが検出可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
一本鎖ポリヌクレオチドの５’末端に少なくとも１種の第１の伸長オリゴヌクレオチドを付加させ、該一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端に少なくとも１種の第２の伸長オリゴヌクレオチドを付加させる方法であって：
該第１の伸長オリゴヌクレオチドと該一本鎖ポリヌクレオチドとを、第１の骨格オリゴヌクレオチドと組合わせる工程であって、該一本鎖ポリヌクレオチドと該第１の伸長オリゴヌクレオチドとの双方が該第１の骨格オリゴヌクレオチドに対して塩基対合する場合、結合のためにそれらが正しく整列されるように、該第１の骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの一部に沿って該一本鎖ポリヌクレオチドの５’末端領域に対して相補的であり、また、該第１の骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの他の部分に沿って該第１の伸長オリゴヌクレオチドに対して相補的である、工程；
該第２の伸長オリゴヌクレオチドと該一本鎖ポリヌクレオチドとを、第２の骨格オリゴヌクレオチドと組合わせる工程であって、該一本鎖ポリヌクレオチドと該第２の伸長オリゴヌクレオチドとの双方が該第２の骨格オリゴヌクレオチドに対して塩基対合する場合、結合のためにそれらが正しく整列されるように、該第２の骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの一部に沿って該一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端領域に対して相補的であり、また、該第２の骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの他の部分に沿って該第２の伸長オリゴヌクレオチドに対して相補的である、工程；および
該一本鎖ポリヌクレオチドに該第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドを結合させる工程、を包含する方法。
【請求項２４】
前記第１および第２の骨格オリゴヌクレオチドが、前記一本鎖ポリヌクレオチドと不安定な二重鎖を形成し、該第１および第２の骨格オリゴヌクレオチドが、それぞれ前記第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成する溶液条件下で前記結合工程を実施する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１および第２の骨格オリゴヌクレオチドが、前記一本鎖ポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し、該第１および第２の骨格オリゴヌクレオチドが、それぞれ前記第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドと不安定な二重鎖を形成する溶液条件下で前記結合工程を実施する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドの各々が、ポリメラーゼ連鎖反応増幅における使用のためのプライマー結合部位を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の伸長オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位が、前記第２の伸長オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位と同一ではない請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドの各々が、ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼに対する結合部位を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の伸長オリゴヌクレオチドのＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼが、前記第２の伸長オリゴヌクレオチドのＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼと同一ではない請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１および第２の伸長オリゴヌクレオチドの各々が、バーコード配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の伸長オリゴヌクレオチドのバーコード配列が、前記第２の伸長オリゴヌクレオチドのバーコード配列と同一ではない請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１種以上の被標識オリゴヌクレオチドを標識化するキットであって：
検出可能な、少なくとも１種の標識オリゴヌクレオチド；
標識骨格オリゴヌクレオチドであって、該被標識オリゴヌクレオチドと該標識オリゴヌクレオチドとの双方が該標識骨格オリゴヌクレオチドに対して塩基対合する場合、結合のためにそれらが正しく整列されるように、該標識骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの一部に沿って該被標識オリゴヌクレオチドに対して相補的であり、また、該標識骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの他の部分に沿って該標識オリゴヌクレオチドに対して相補的である、標識骨格オリゴヌクレオチド；および
該標識オリゴヌクレオチドと該被標識オリゴヌクレオチドとを、該標識骨格オリゴヌクレオチドと組合わせ；
該標識骨格オリゴヌクレオチドが、該被標識オリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成し、該標識骨格オリゴヌクレオチドが、該標識オリゴヌクレオチドと不安定な二重鎖を形成する溶液条件下で、該標識オリゴヌクレオチドを該被標識オリゴヌクレオチドに結合させるための；
ユーザー向けの取扱い説明書
を包含する、キット。
【請求項３３】
１種以上の被標識オリゴヌクレオチドを標識化するキットであって：
検出可能な、少なくとも１種の標識オリゴヌクレオチド；
標識骨格オリゴヌクレオチドであって、該被標識オリゴヌクレオチドと該標識オリゴヌクレオチドとの双方が該標識骨格オリゴヌクレオチドに対して塩基対合する場合、結合のためにそれらが正しく整列されるように、該標識骨格オリゴヌクレオチドがその長さの一部に沿って、該被標識オリゴヌクレオチドに対して相補的であり、また、該標識骨格オリゴヌクレオチドが、その長さの他の部分に沿って該標識オリゴヌクレオチドに対して相補的である該標識骨格オリゴヌクレオチド；および
該標識オリゴヌクレオチドと該被標識オリゴヌクレオチドとを、該標識骨格オリゴヌクレオチドと組合わせ；
該標識骨格オリゴヌクレオチドが、該被標識オリゴヌクレオチドと不安定な二重鎖を形成し、該標識骨格オリゴヌクレオチドが、該標識オリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成する溶液条件下で、該標識オリゴヌクレオチドを該被標識オリゴヌクレオチドに結合させるための；
ユーザー向けの取扱い説明書
を包含する、キット。
【請求項３４】
少なくとも１種の第１のオリゴヌクレオチドを、第２のオリゴヌクレオチドに結合する方法であって：
該第１のオリゴヌクレオチドを該第２のオリゴヌクレオチドと組合わせる工程；および
該第１のオリゴヌクレオチドの１０倍モル過剰の切断体の存在が、３つ未満の因子により、該第２のオリゴヌクレオチドに対する該第１のオリゴヌクレオチドの結合を阻害する条件下で、該第１のオリゴヌクレオチドを該第２のオリゴヌクレオチドに結合させる工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対するクロス・リファレンス）
本出願は、２００２年９月３０日出願の米国仮特許出願第６０／４１５、０４３号および２００３年２月７日出願の米国仮特許出願第６０／４４６，１８４号の利益を主張し、それらの開示は参照としてそれらの全体を本明細書に組み込んである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野にあり、遺伝的プローブとしての利用および他の目的に好適なポリヌクレオチドの構築に関する。より具体的には、本発明は、第一にオリゴヌクレオチド精製を必要路せずに、また、ポリヌクレオチドのテンプレートを必要とせずに、より短いオリゴヌクレオチドの結合によりポリヌクレオチドを構築する方法に関する。また本発明は、一本鎖ポリヌクレオチドの一端または両端にオリゴヌクレオチドを結合する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
種々の現代分子生物学的方法は、比較的長い一本鎖プローブを必要としている。
【０００４】
例えば、国際公開第０２／０５７４９１号およびＨａｒｄｅｎｂｏｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：ｐ．６７３−６７８（２００３）に記載された遺伝子型法においては、各プローブが、核酸標的に相補的な少なくとも２つの標的ドメイン、および少なくとも１つの一般的プライミング部位を含み、またそれに加えてさらに、一般的プライミング部位、１つ以上の遺伝子型標識（「バーコード」配列）、および他の配列を含み得るため、プローブは長さが優に８０ｎｔ超であり得る。種々の型の複合ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、ＲＮＡプロファイリング法および遺伝子発現採点法も同様に長い一本鎖（「ｓｓ」）プローブを必要とする。
【０００５】
これらの種々の方法において、複数の長い一本鎖プローブを合わせて、混合物またはライブラリとして複合分析に用いる。
【０００６】
長い一本鎖ポリヌクレオチドを構築する現在の方法は、扱いにくく非効率的であり、特にこのようなプローブを複数含むライブラリの調製ではそうである。
【０００７】
必要な長さのポリヌクレオチドの直接的な化学合成では、全体的な収率が低く、ヌクレオチドの一端または両端における１種以上のヌクレオチドを欠如した切断オリゴヌクレオチド混入の割合が高い。例えば、１つの結合サイクル当たり９９％の効率であっても、１２０塩基のオリゴヌクレオチド合成では、完全長産物の収率はわずか３％であり、３０倍モル過剰の切断体を伴うと考えられる。低収率のため十分な最終産物を得るために費用のかかる大規模合成が必要であり、また、切断体の割合が高いため、完全長産物の精製が必要である。それらが低収率であることに加え、これらの化学的合成法では各プローブの個別の合成が必要であり、その後、複合分析用にそれらを合わせなければならない。
【０００８】
直接的化学合成の代替法であるＰＣＲ合成は、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングポリメラーゼを用いたとしてもエラーを生じ易い。さらに増幅に基づく合成法には、所望のプローブ配列の全体の長さに相補的なテンプレートポリヌクレオチドが必要である。プローブ長のテンプレートが天然源から入手できない場合は、このテンプレートを、典型的には化学合成しなければならず、長いオリゴヌクレオチドの直接的化学合成に本来含まれている問題や不利な点を繰り返すことになる。
【０００９】
直接的化学合成のもう１つの代替法であるテンプレート方向性結合（ＴＤＬ）は、所望のポリヌクレオチド産物の全体の長さに相補的なポリヌクレオチドテンプレートに対するハイブリダイゼーションにより、結合のために整列する多数のオリゴヌクレオチドの結合を含む。米国特許第５，９９８，１７５号は、五量体オリゴヌクレオチドを用いてＴＤＬに基づく方法を記載しているが、切断体はこのような短いオリゴヌクレオチドの合成産物の小フラクションしか含まないため、このような五量体オリゴヌクレオチドは、混入切断体から精製されることなく、結合する上で十分短い。しかし、ＰＣＲを用いる場合、一連のポリヌクレオチドプローブの各メンバーに対して異なった配列を有する別々のテンプレートが必要であるため、長い一本鎖プローブの合成にとってＴＤＬは実行不可能であり、特にこのようなプローブの全体ライブラリの合成ではそうである。
【００１０】
また、完全長テンプレートが必要な方法は、同一の、または等価に近い長さのテンプレートからプローブを単離する問題も示す。
【００１１】
結合に基づく他の方法では、完全長テンプレートの必要性は除かれる。この方法では、２つの短い基質オリゴヌクレオチドが、結合すべき両端において各基質オリゴヌクレオチドに相補的な第３のオリゴヌクレオチドに対する安定なハイブリダイゼーションにより、結合に適切な区域に保持され、この第３のオリゴヌクレオチドは、サブテンプレートの長さである。
【００１２】
このような方法により、完全長テンプレートの必要性は除かれるが、基質オリゴヌクレオチドが、結合前に切断体から精製されることが必要である。混入切断体、特に結合すべき末端にわずか１つか２つの末端ヌクレオチドまたは末端リン酸塩基を欠いているものは、第３のオリゴヌクレオチドと安定して未生成複合体を形成することができ、所望の完全長ポリヌクレオチド産物を形成するための完全長オリゴヌクレオチドの結合を強く阻害するからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、長い一本鎖ポリヌクレオチドを構築する効率的で経済的な方法に対する必要性が存在している。前記方法は、所望の各プローブに対する別々の完全長ポリヌクレオチドテンプレートの前構築を要するものであってはならない。前記方法は、混入切断体分子からの前精製なしでオリゴヌクレオチドを使用できなくてはならない。可能ならば、前記方法は、幾つかの分析法において、各プローブ分子における大多数の配列は、検出すべき遺伝変異体または分析すべき座に係らず同一であり、配列の変化は、プローブ内の十分規定された部分に特異的であるように限定されているという事実を利用すべきである。前記方法は、ライブラリにおける配列全体領域が別々の反応ではなく、同一の合成反応において、同時に創製できる複合フォーマットにおいて使用できるものでなければならない。前記方法は、高い結合効率を示し、所望のポリヌクレオチドプローブの高収率をもたらすものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、３種の短いオリゴヌクレオチドを結合することによって、遺伝子プローブとしての使用に好適なポリヌクレオチド構築のための方法を提供することにより、当業界におけるこれらの、および他の必要性を満たす。結合すべき３種のオリゴヌクレオチド全てに相補的、または部分的に相補的な骨格オリゴヌクレオチドが提供される。完全長テンプレート鎖は必要ない。すなわち、骨格オリゴヌクレオチドは、長さにおいてサブテンプレートである。骨格オリゴヌクレオチドは、前記３種の骨格オリゴヌクレオチドを結合のために適切に整列させる上で役立つが、所望の結合産物の全体の長さを伸長させることはない。前記骨格に対する外側オリゴヌクレオチドのアニーリングが不安定であるように、結合条件が選択される。このような条件により、結合反応は、オリゴヌクレオチド調製物における非結合性混入物による阻害に抵抗性となり、これは非精製オリゴヌクレオチドが使用できるということを意味する。
【００１５】
一実施形態において、結合すべき第１のオリゴ、中心オリゴおよび第２のオリゴを、中心オリゴの全長に相補的だが、その（骨格オリゴヌクレオチドの）末端においては、第１および第２のオリゴ各々の一端における短い領域に対してのみ相補的である骨格オリゴヌクレオチドにアニールする。骨格オリゴおよび中心オリゴを、それらの合成反応の混合産物中に存在する切断体および他の結合不完全体から精製する。第１のオリゴおよび第２のオリゴは、それら各々のオリゴヌクレオチド合成反応の、切断体および他の結合不完全混入物を含む全集団として、精製せずに用いられる。
【００１６】
結合条件およびオリゴヌクレオチド間の相補性領域の長さは、結合中に前記骨格が、第１および第２のオリゴに対して不安定にアニールされるように選択される。このような不安定なアニーリングは、第１および第２のオリゴヌクレオチドに対して、切断体を含む合成産物の集団をサンプリングする一つの過程であるが、このような条件下では、二重鎖体は迅速に形成し、解離する。混入している結合不完全オリゴによって形成した二重鎖は、結合にとって良好な基質とはならず、迅速に解離する。その結果、第１および第２のオリゴヌクレオチド合成反応混合物中の所望の完全長合成産物は、骨格と共に二重鎖を形成し、中心オリゴヌクレオチドに結合する。このような結合は、過剰な混合物の存在に係らず、リガーゼ酵素が所望の完全長合成産物と選択的に結合することのできるサンプリング過程である。このような条件下で実施される結合反応は、「サンプリング結合」と称することができる。
【００１７】
リガーゼ酵素と適切な補因子、塩および緩衝剤を加え、結合が実質的に完了するまで、前記反応液を適切な温度に温置する。次いで場合によっては、前記完全長結合産物を変性、および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）またはカラムクロマトグラフィなどのサイズに基づく分離によって、骨格オリゴヌクレオチドおよび他の非結合オリゴヌクレオチドから単離できる。第１オリゴヌクレオチド、中心オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドの結合により構築された所望の完全長結合産物は、ポリヌクレオチド産物と称される。
【００１８】
前記方法は、オリゴヌクレオチドの連続的添加によって実施できるか、または、単一の工程で実施できる。骨格と第１または第２のオリゴとの間の相補性領域は、例えば、５ｎｔから１０ｎｔの長さで変化でき、また結合は、例えば２０℃から６０℃の種々の温度で実施できる。骨格と第１および第２のオリゴとの間の不安定なアニーリングにとっての唯一の要件は、結合温度が安定な二重鎖形成を防ぐ上で十分高いことである。前記方法は、第１および第２のオリゴ各々に関する単一のオリゴヌクレオチド合成反応の産物と共に使用できるか、または、完全長産物の配列が互いに異なる複数のオリゴヌクレオチド合成と共に使用できる。５つから１００の別個のオリゴヌクレオチド合成の産物をプールして、サンプリングすべき第１または第２のオリゴヌクレオチドの集団を形成できる。
【００１９】
また、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの３’末端、５’末端またはそれら双方に結合することにより、標的一本鎖ポリヌクレオチドを伸長させるためにも用いることができる。３’末端および５’末端に関して、別個の骨格オリゴヌクレオチドを用い、標的ポリヌクレオチドの反対の末端に異なる伸長オリゴヌクレオチドを付加することが可能となる。結合は、骨格オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに不安定にアニールする条件下で実施できる。
【００２０】
標的ポリヌクレオチドに付加されたオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー結合部位、バーコード配列、またはＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼ結合部位などの引き続く実験操作において有用な配列を含有し得る。
【００２１】
また、前記方法は、例えば、放射性標識または蛍光標識の付加により、１つのオリゴヌクレオチド、または複数のオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかを標識化するために用いることもできる。
【００２２】
また、本発明の方法は、１種以上の切断体の１０倍モル過剰までの存在下で２種以上のオリゴヌクレオチドを、切断体なしで実施された同一の結合反応に比して３倍未満の結合効率の低下で結合するためにも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
図１に、ポリヌクレオチド構築の幾つかを先行法を概略的に示している。これらの先行法は、遺伝子プローブとしての使用に好適な異なる種のポリヌクレオチド種の全体ライブラリを生成するには非効率的である。図１Ａは、米国特許第５，９９８，１７５号の方法の一実施形態を示し、図１Ｂは、米国特許第６，１１０，６６８号の方法の一実施形態を示しており、これらの開示は、参照としてそれらの全体を本明細書に組み込んである。これら２つの方法は、上に相補鎖、すなわちポリヌクレオチド産物を構築する完全長テンプレート鎖を必要とする。図１Ｃは、米国特許第５，３８０，８３１号の方法の一実施形態を示し、図１Ｄは、Ｃｈａｌｍｅｒｓら、２００１年、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：ｐ．２４９の方法の一実施形態を示しており、これらの開示は、参照としてそれらの全体を本明細書に組み込んである。後者のこれら２つの方法は、所望のポリヌクレオチド産物と共に、完全長テンプレートの合成を伴う。これら４つの方法は全て、ポリヌクレオチド産物が一本鎖遺伝子プローブとして使用できる前に、テンプレート鎖がポリヌクレオチド産物から分離され、除去されることを必要とする。
【００２４】
図１Ａ〜１Ｄに示された方法もまた、ポリヌクレオチド産物の構築に使用されるオリゴヌクレオチドが使用前に構築されるか、または非常に短いオリゴヌクレオチドのみの使用を必要とする。このような精製には時間がかかり、また費用もかかる。各々を比較的少量のみ必要とする遺伝子プローブとして使用される多数の異なるポリヌクレオチド種のライブラリ構築にとって、完全長テンプレートと結合前のオリゴヌクレオチド精製を必要とする方法は不適当である。
【００２５】
本発明は、一態様において、遺伝子スクリーニングにおけるプローブとしての使用に好適なポリヌクレオチドのライブラリ構築の方法を提供する。前記方法は、３種の短いオリゴヌクレオチドの速度論的サンプリング結合を含むが、３種のうちの２種は精製せずに、遺伝子プローブとしての使用に好適な産物ポリヌクレオチドに入ってもよい。
【００２６】
図２Ａおよび２Ｂは、前記方法の２つの態様を示している。図２Ａについて述べると、第１および第２のオリゴを中心オリゴヌクレオチドの各々、５’末端および３’末端に結合させる。３種のオリゴヌクレオチドの結合は、中心オリゴヌクレオチドの全長に相補的であり、中心オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の双方を越えて延長する骨格オリゴヌクレオチドの存在下で実施される。
【００２７】
中心オリゴヌクレオチドと骨格オリゴヌクレオチドのアニーリングによって形成した二重鎖をコア二重鎖と称する。コア二重鎖は、中心オリゴヌクレオチドと骨格オリゴヌクレオチドを第１および第２のオリゴヌクレオチドと接触させる（例えば、混合）前に、中心オリゴヌクレオチドを骨格オリゴヌクレオチドに部分的に二重鎖化することによって形成できる。（本明細書において、用語の接触、混合、調合は、同義に用いられる）。あるいは、コア二重鎖は、第１および第２のオリゴヌクレオチドの存在下で形成できる。
【００２８】
中心オリゴヌクレオチドの５’末端を越えて延長しているオリゴヌクレオチド骨格の塩基は、第１のオリゴに相補的であり、中心オリゴヌクレオチドの３’末端を越えて延長しているものは、第２のオリゴに相補的である。示された実施形態において、結合すべき３種のオリゴヌクレオチド全てが、骨格オリゴヌクレオチドと塩基対になっている場合、骨格上に対合していない塩基はなく、第１および第２のオリゴの末端は、各々中心オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に対する効率的結合にとって適切に配置される。
【００２９】
結合に用いられるオリゴヌクレオチドは、典型的にはホスホラミダイト合成などの従来の固相自動化学合成によって得られるが、他の方法で得られたオリゴヌクレオチドを用いることもできる。前記方法により、未精製の第１および第２のオリゴヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチドを固相支持体から開裂させた後、所望の完全長オリゴヌクレオチド合成産物から切断オリゴヌクレオチドもしくは不完全オリゴヌクレオチドを分離および除去する試みを行わなかったオリゴヌクレオチド合成反応産物の粗製集団の使用が可能となる。このような化学合成反応産物の混合物は、固相支持体からの開裂前に行われる脱保護、洗浄および濯ぎなどのいずれの工程に係らず、本明細書において未精製と称される。また、反応産物は、固相支持体からの開裂後に行われる脱塩または洗浄などの工程が切断合成産物の除去を意図したものではない限り、それらの工程に係らず、未精製と称される。
【００３０】
本明細書に用いられる用語の「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、特定の数々のヌクレオチドを表す意図はなく、同義に用いられる。すなわち、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」の双方とも、任意の長さの分子を称し得る。本明細書に用いられる用語の「オリゴ」は、「オリゴヌクレオチド」と同義である。
【００３１】
たいていの適用において、骨格オリゴヌクレオチドは化学的に合成され、図２Ａに示したように、他のオリゴヌクレオチドと所望の相補性を提供する必要はもはやない。しかし、他の実施形態において、天然源から得た一本鎖オリゴヌクレオチドを骨格オリゴヌクレオチドとして用いてもよい。このような骨格オリゴヌクレオチドは、それらの３’末端、５’末端または双方に追加のオリゴヌクレオチドを含み得る。これらの追加のオリゴヌクレオチドは、骨格オリゴヌクレオチドの相補性領域を越えて、第１および第２のオリゴヌクレオチドへと伸長し、結合反応の所望産物の配列に相補性はなく、ポリヌクレオチド産物の合成に役割を演じることはない。
【００３２】
次に、第１オリゴと第２オリゴが、骨格オリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成しない条件下でコア二重鎖、第１オリゴおよび第２オリゴ、リガーゼ、塩類、緩衝剤および補因子を温置する。一実施形態においては、これらの条件下で中心オリゴヌクレオチドと骨格オリゴヌクレオチドは、安定なコア二重鎖を形成する。しかし、結合条件下で、コア二重鎖が安定か不安定かは、本発明の本質的な点ではない。
【００３３】
コア二重鎖と第１および第２オリゴとの間の安定な二重鎖形成を可能としない条件下での結合は、本明細書において、速度論的サンプリング結合または単にサンプリング結合と称され、図２Ｂに示される。簡略化するため、サンプリング結合は、第２のオリゴの結合に関してのみ示しており、点線の囲みは、コア二重鎖に関する部分を表している。コア二本鎖の他の末端では、第１のオリゴで類似の過程が行われる（示していない）。
【００３４】
示されるように、切断体を含む第２オリゴに関する合成産物の未精製混合物をコア二重鎖に加えると、コア二重鎖と切断体または完全長第２オリゴとの間の複合体となる。切断複合体はギャップを含み、それらが結合されることを防ぐが、一方、完全長複合体はそうではない。１個の塩基を欠如している切断体の１種のみを図２Ｂに示しているが、オリゴヌクレオチド合成産物の未精製混合物は、２つ以上の塩基を欠如している切断体も含有し得る。完全長第２オリゴヌクレオチドのみが結合して、所望のポリヌクレオチド産物を形成できる。次いで切断体オリゴヌクレオチドとの複合体に残留している未結合コア二本鎖は、残留している切断体および完全長の第２オリゴと再平衡化し、図２Ｂの最初の再平衡化工程に示されるように、切断体と完全長オリゴ複合体との混合物を再び生成する。そして再び、完全長の第２オリゴを含有している複合体のみが結合してポリヌクレオチド産物を形成することができる。
【００３５】
コア二重鎖に対して、過剰の完全長第２オリゴが存在するという条件で、このような結合と再平衡の多数のサイクル後、全ての、または相当なパーセンテージのコア二重鎖が、完全長第２オリゴと結合して所望のポリヌクレオチド産物を形成する。図２Ｂには、このような再平衡化工程の３つだけが示されているが、このような工程の実際の数は、限定はしないが、オリゴヌクレオチド合成産物混合物中の混入切断体の割合などの多数の実験変数に依存する。
【００３６】
前記結合反応は、所望の収量の完全長ポリヌクレオチド産物が得られるまで進行させるが、典型的には、数時間以下の長さで実施されることが典型的には好都合である。図２Ｂに関しては、結合と再平衡化の十分なサイクルを行って所望の収量のポリヌクレオチド産物を得るまで、反応を進行させる。前記反応条件は、結合反応が好都合な時間内に完了できる十分に迅速な再平衡化を保証するように選択される。前記反応の完了の程度は、生成した完全長ポリヌクレオチド産物量の定量的測定、例えば、ゲル電気泳動によって容易に評価できる。
【００３７】
結合条件としては、温度、塩濃度、イオン強度、分子密集化剤の有無、ｐＨおよび核酸塩基対合の安定性に影響を与える他の全ての因子が挙げられる。第１または第２オリゴと骨格との間に形成した二重鎖の長さは、核酸二重鎖の安定性、したがってコア二重鎖と切断体および完全長の第１ならびに第２オリゴとの再平衡化の割合に影響を与える他の変数である。結合反応の時間枠に比して迅速に再平衡化する二重鎖は、不安定な二重鎖と言われる。
【００３８】
不安定な二重鎖化オリゴの結合は、完全長オリゴヌクレオチドの切断体を含有するオリゴヌクレオチドの混合物を結合させる場合、著しい利点を有する。このような切断体は、オリゴヌクレオチドの化学合成において常に生成し、合成されているオリゴヌクレオチドの長さが増加するにつれて切断体は、全反応産物のうちのより大きなパーセンテージを含む。切断体の存在が所望の反応を阻害する先行法においては、およそ２０以上のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを、使用前に混入切断体から典型的には精製しなければならない。このようなオリゴヌクレオチドの精製は、時間および労力集約的であり、したがって費用のかかる分取スケールの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、典型的に達成される。
【００３９】
本発明の方法において、第１および第２のオリゴヌクレオチド合成産物の集団における非結合性混入物によって形成された不安定な二重鎖は、結合反応の時間に関して比較的迅速に解離し（すなわち、再平衡化が生じ）、したがって、完全長の第１または第２のオリゴによる二重鎖形成を永続的に妨害することはない。完全長の第１または第の２オリゴによって形成された二重鎖もまた、短命であるが、結合が不可逆的であるため、図２Ｂに示されるように、このような一時的な「不安定な」二重鎖の比較的まれな結合であっても結局、結合される得る核酸鎖の結合の全てとは言わなくてもほとんどのものとなる。
【００４０】
本発明によるサンプリング結合反応は動的である。すなわち、コア複式と第１および第２オリゴとの間の多くの短命な二重鎖が結合反応の進行中に形成され、解離する。結合反応の長さと同等の半減期を有する混入切断オリゴの長命な二重鎖形成を防ぐのは、この動的な再平衡化であり、これが完全長オリゴの結合を防ぐと考えられる。このようにして、速度論的サンプリング結合は、混入切断体による所望の完全長結合産物の形成阻害を防ぐ。本明細書の下記の実施例１は、本発明のサンプリング結合法の一実施形態を用いた遺伝子プローブとしての使用に好適なポリヌクレオチド構築を証明している。二重鎖形成が「安定」であるか「不安定」であるかを決定する実験法は下記で検討され、図３に示され、実施例３で証明されている。
【００４１】
安定な二重鎖条件下での伝統的結合とは異なり、本発明においては、切断体の存在が、所望の結合産物の形成を妨げない。この理由から、本発明により、切断体含有オリゴヌクレオチド合成産物の集団を第１および第２オリゴとして用いることが可能である。実施例３は、本発明のこの特徴を示している。
【００４２】
一実施形態において、本発明の方法において用いられる結合反応条件により安定なコア二重鎖が形成され、その温度は、リガーゼ活性を許容する上で十分低い。他の実施形態おいて、コア二重鎖における中心オリゴヌクレオチドと骨格オリゴヌクレオチドとの間の相補的な塩基数は、コア二重鎖と第１または第２のオリゴいずれかとの相補的な塩基数よりも多いため、コア複式は安定であるが、第１および第２オリゴとの複合体は不安定である結合温度が存在することになる。
【００４３】
本発明の一実施形態において、第１および第２のオリゴヌクレオチドの添加前の最初の工程において、中心オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド骨格にアニールさせてコア二重鎖を形成する。このように形成されたコア二重鎖を引き続き、幾つかの異なる合成反応に使用するために保存できる。
【００４４】
ハイブリダイゼーションと同様に、アニーリングは、核酸の相補鎖間の塩基対形成を言う。アニールされた鎖を二重鎖と称することができ、二重鎖を創製する過程を二重鎖化と称することができる。片方または双方の鎖の全塩基未満の塩基が対合する場合、この結果は部分的二重鎖となり、部分的二重鎖を創製する過程を、部分的二重鎖化と称することができる。アニーリング、塩基対合、ハイブリダイジングおよび二重鎖化は、本明細書においては同義に用いられ、アニールする、塩基対合する、ハイブリダイゼーションするおよび二重鎖化するも同様である。アニーリング、塩基対合、ハイブリダイジングおよび二重鎖化は、安定であるか、不安定であるかのいずれかであり得る。別に示されない限り、核酸の相補鎖は平行な二重鎖ではなく、逆平行の二重鎖を形成するとみなされる。
【００４５】
全ての配列の違いを第１および第２のオリゴに組み込み、その結果、プローブライブラリの全メンバーにとって中心オリゴヌクレオチドおよび骨格オリゴヌクレオチドが同じであるように遺伝子プローブライブラリをデザインできる場合、共通コア二重鎖の形成は、特に有利である。次いで、同じコア二重鎖を用い、用いられる第１および第２オリゴを単に交換するだけでプローブライブラリの全メンバーを構築することができる。他の実施形態では、中心オリゴヌクレオチドの単一種を種々の骨格オリゴヌクレオチドの混合物にアニールさせて、骨格の一本鎖「接着性末端」領域だけが異なるコア二重鎖のファミリーを形成することができる。
【００４６】
次に、前記複式に、第１オリゴ、第２オリゴまたは双方を加える。一実施形態において、第１および第２のオリゴの双方とも結合において、中心オリゴヌクレオチドの少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、さらに少なくとも１０倍モル過剰で存在する。
【００４７】
本発明の他の実施形態では、中心オリゴヌクレオチドおよび骨格オリゴヌクレオチドと共に第１オリゴ、第２オリゴまたは双方の同時添加を含む。しかし、第１、第２、中心および骨格オリゴヌクレオチドの添加順序は、本発明の本質的な点ではなく、いずれの順序も本発明の範囲内に入る。
【００４８】
次にリガーゼを、このリガーゼに必要な塩類、緩衝剤および補因子と共に加える。他の実施形態は、反応の異なった時点でのリガーゼ、塩類、緩衝剤および補因子の添加を含むが、添加のタイミングは、本発明の本質的な点ではない。結合は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、もしくは熱安定性Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、または他の任意の生物の任意の酵素、またはオリゴヌクレオチドを繋ぎ合わせることのできる任意の合成酵素などのリガーゼ酵素を使用することによって実行できる。結合すべきオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡリガーゼの基質である場合は、ＲＮＡリガーゼもまた使用できる。結合温度は、少なくとも２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４２℃、５０℃または６０℃であり得る。
【００４９】
上記のとおり、中心オリゴヌクレオチドおよび骨格オリゴヌクレオチドを含むコア二重鎖は、比較的大量にバルクで調製でき、数種の異なる反応に使用するために保存でき、また、保存してそのアリコートを多数回使用できる。中心および骨格オリゴヌクレオチドは、コア形成前に切断体から精製できる。本発明の一実施形態において、中心および骨格オリゴヌクレオチドが遺伝子プローブライブラリの全メンバーに共通であるため、これら２種のオリゴヌクレオチドは、時間と労力の最少の消費で精製できる。例えば、５０個の遺伝子プローブライブラリでは、５０種の第１オリゴおよび５０種の第２オリゴが必要とされるが、必要とされる中心オリゴヌクレオチドは１種だけであり、骨格オリゴヌクレオチドも１種だけであると考えられる。必要とされる１０２種のオリゴヌクレオチドのうち、精製が必要なものは２種だけである。これは、切断体の存在による複雑化を防ぐために各オリゴヌクレオチドの精製を必要とする先行法に較べて、精製の労力が９８％節約されることを表している。
【００５０】
完全長の産物ポリヌクレオチドを形成するために第１オリゴヌクレオチド、中心オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを結合した後、骨格オリゴヌクレオチドおよび他の未結合オリゴヌクレオチドを、産物ポリヌクレオチドから分離できるが、産物ポリヌクレオチドのその後の使用意図に依っては分離しない。一実施形態においては、骨格オリゴヌクレオチドおよび他のオリゴヌクレオチドを除去するために変性ＰＡＧＥなどのサイズに基づく分離を用いることができる。骨格オリゴヌクレオチドは、完全長産物ポリヌクレオチドよりかなり短く、したがって容易に分離される。また、分離は、変性条件下での液体クロマトグラフィによっても実施できる。精製時に完全長産物を用意に検出できるようにするため、中心オリゴヌクレオチドを蛍光標識することができる。
【００５１】
結合されるオリゴヌクレオチドに存在している混入切断体による妨害を受け易い、ポリヌクレオチド構築の先行法に較べて、本発明は多数の利点を有している。多くの先行オリゴヌクレオチド合成法は、結合時の安定な二重鎖形成を保証するために、比較的低い温度、または伸長した相補性領域に頼っている。例えば、図１Ｃに例示した米国特許第５，３８０，８３１号では、１５℃で４〜５塩基対の二重鎖結合を実施しているが、このような複式は、３７℃から４２℃よりも比較的安定である。図１Ｂに例示した米国特許第６，１１０，６６８号では、５２℃において８０から１３０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを結合する方法を開示している。これらのオリゴヌクレオチドの８０から１３０の塩基の全てが、結合時に塩基対となっており、その結果、５２℃でもこの様式は安定である。
【００５２】
先行結合法は、安定な二重鎖条件を採用した。なぜならば、結合のための基質として働く複合体が長命であれば、結合はより効率的であるであろうと考えられたからである。短命な複合体は、非効率的にしか結合しないと考えられたであろうし、したがって、本発明に用いられる不安定な結合条件で得られる結合産物は、ほんのわずかであるか、または全くないと考えられたかもしれない。驚くべきことに、本発明による不安定なサンプリング結合は、好結果の結合をもたらすのみならず、切断体が所望の完全長第１および第２オリゴの結合を妨害することを防ぐという予想外の利点を有している。
【００５３】
また、多くの先行法が完全長テンプレートの入手可能性または合成を必要とするが、本発明はそれを必要としない。テンプレートは、所望の産物鎖の実質的な全長に沿ってその産物鎖に相補的な一本鎖ポリヌクレオチドであり、したがって、所望の産物とほぼ同じ長さである。図１Ａ〜１Ｄは、ポリヌクレオチド構築のそのような先行法の幾つかにおける完全長テンプレートの役割を例示している。
【００５４】
本発明の骨格オリゴヌクレオチドは、サブテンプレートの長さである。すなわち、それは、所望のポリヌクレオチド産物の実質的全長に沿って伸長していない骨格オリゴヌクレオチドは、中心オリゴヌクレオチドの全長に相補的であるが、その中心オリゴヌクレオチドの両端を越えて伸長するのは一般に少しだけである。このような一本鎖接着性末端は、第１および第２オリゴによる複式を簡便な実験室条件下で不安定にできるほど、典型的に十分短いことになる。本発明の実施形態では、５、６、７、８、９、１０のヌクレオチドの骨格オリゴヌクレオチドの両端における一本鎖領域が用いられる。（上記で検討したように、本発明の幾つかの実施形態においては、所望の完全長結合産物に相補的でない骨格オリゴヌクレオチドの一端または両端から、追加のヌクレオチドが伸長することに注意されたい。それにもかかわらず、このような骨格オリゴヌクレオチドもまた、「サブテンプレート」の長さであると称される。速度論的サンプリング結合反応に関する領域、すなわち、他のオリゴに相補的な領域が、所望のポリヌクレオチド産物の実質的全長に伸長していないからである。そのような配列が、速度論的サンプリング結合反応に関与するオリゴヌクレオチドのアニーリングを妨害しないという条件で、骨格オリゴヌクレオチドの両端におけるこのような追加配列は、骨格としてのオリゴヌクレオチドの使用と無関係である）。
【００５５】
本発明の方法の一連の実施形態において、オリゴヌクレオチドの全ライブラリが、複合的結合を用いて同時に合成される。プローブのライブラリの全メンバーを創製するために、共通のコア二重鎖が用いられ、したがって、ライブラリのメンバーのうち、配列変異全ては、骨格オリゴヌクレオチドを越えて伸長している第１および／または第２のオリゴの部分に局在化する。第１および第２のオリゴ、したがって、完全長ポリヌクレオチド産物は、骨格オリゴヌクレオチドを越えて一端または両端において、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５またはそれ以上のヌクレオチドだけ伸長できる。
【００５６】
幾つかの実施形態において、単一の予め決定された第２のオリゴ種の存在下、任意の数の種々の第１オリゴ種を、中心オリゴヌクレオチドに結合させることができるか、または単一の予め決定された第１のオリゴ種の存在下、任意の数の種々の第２オリゴ種を、中心オリゴヌクレオチドに結合させることができる。その結果、生じる反応産物は、一端に規定された配列を有し、他端に多数の配列変異体を有するポリヌクレオチド産物を含むこととなる。
【００５７】
例えば、同一の結合反応において、幾つかの異なる遺伝子座に特異的なプローブを創製するために、複合的結合を実施することが可能である。分析すべき各遺伝子座に関して、第１のオリゴ種と第２のオリゴ種を合成する。第１および／または第２のオリゴヌクレオチドは、一般にバーコードタグと称される１つ以上の遺伝子型標識などの配列を、場合によってはさらに含むことができる。各々のタグの相補体を有するミクロアレイ上の区別を最大化するためにアルゴリズム上、デザインされた短い配列であり、タグ配列と第１および／または第２のオリゴヌクレオチド間の１：１対応により、そのように標識された各オリゴヌクレオチドを、それと独自に会合しているバーコードの検出によって検出することができる。例えば、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４（４）：ｐ．４５０−６（１９９６）；欧州特許第０７９９８９７号；Ｆａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：ｐ．８５３−６０（２０００）；および米国特許第６，１５０，５１６号を参照されたく、これらの開示は参照として全体が本明細書に組み込まれている。第１および／または第２のオリゴヌクレオチドは、さらにまた、場合によっては、１つ以上の増幅プライマー結合部位を含む。
【００５８】
また、第１および第２のオリゴは全て、骨格オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端各々における領域に相補的な末端領域も含む。第１および第２のオリゴの全ては、同一の反応混合物中で共通のコア二重鎖と結合する。生じた産物の混合物は、第１および第２のオリゴが供給される各遺伝子座に対する完全長遺伝子プローブを含有することになる。この実施形態は、比較的少数のみの遺伝子座に対するプローブの同時構築にとって特に十分好適である。
【００５９】
さらに他の実施形態においては、共通のコア二重鎖ではなくて異なる骨格オリゴヌクレオチドが用いられる。異なる骨格オリゴヌクレオチドの各々が中心オリゴヌクレオチドの全長に対して完全に相補的であるが、中心オリゴヌクレオチドを越えて伸長している一本鎖領域において、他の各骨格オリゴヌクレオチドと異なっている、幾つかの異なる骨格オリゴヌクレオチドに共通の中心オリゴヌクレオチドがアニールする。合成が望まれる各ポリヌクレオチドプローブに対して、異なる骨格オリゴヌクレオチドが含まれる。その結果、異なるコア複式の混合物となる。
【００６０】
次に最終結合混合物中に、各骨格オリゴヌクレオチド種に対して正確に１つの第１のオリゴ種および正確に１つの第２のオリゴ種が存在するように、第１および第２のオリゴの幾つかの異なる組を加えることができる。結合後、加えられた各骨格オリゴヌクレオチドに対して、１種の完全長ポリヌクレオチド産物が存在することになる。遺伝子座を探るためにポリヌクレオチドがデザインされる実施形態においては、関心対象の各遺伝子座に対して、１つの完全長プローブ種が存在することになる。この実施形態は、多数の遺伝子座に対するプローブの同時構築にとって典型的に好ましい。
【００６１】
あるいは、所与の標的遺伝子座に対して、第１および第２のオリゴ双方の幾つかの変異体を用いることができる。
【００６２】
本発明の多くの実施形態において、第１および第２のオリゴは、精製せずに用いられることから、実際には、単一の分子種ではなくて、用いられるオリゴヌクレオチド合成反応産物の混合物である。本明細書で用いられる用語の第１オリゴおよび第２オリゴは、このような産物の混合物を含む。第１または第２のオリゴの複数種の混合物は、合成された各種に関する合成反応産物の混合物を含む。本発明の種々の実施形態における複数の結合反応に用いることのできるこのようなオリゴヌクレオチド合成産物の混合物の数は、１つから、２、５、１０、２５、５０、７５、１００またはそれ以上の範囲にある。
【００６３】
さらに他の実施形態においては、複数の骨格オリゴヌクレオチドの各々に対して、複数の第１オリゴ種と単一の第２オリゴ種、または複数の第２オリゴ種と単一の第１オリゴ種が含まれる。第１および／または第２のオリゴヌクレオチドが遺伝子座に相補的な領域を含む実施形態においては、生じた産物の混合物は、各関心対象座に対するプローブのライブラリを含み、このようなライブラリは、一端に単一の規定された配列を有し、他端に種々の配列を有する。
【００６４】
第１および第２のオリゴ全ての長さが、ほぼ同一の長さの完全長産物を与えるように選択されるという条件で、複合的結合の完全長ポリヌクレオチド産物の多様な種の全てを、変性ＰＡＧＥまたは寒天ゲル電気泳動により、短い混入オリゴヌクレオチドおよび未反応オリゴヌクレオチドから精製することができる。変性ＰＡＧＥまたは変性寒天ゲル電気泳動法は、種々の産物間の配列の違いに係らず、全ての完全長産物を短い混入物および未反応オリゴヌクレオチドから効果的に分割する。しかし、所望の完全長産物の精製は、本発明にとって本質的ではない。
【００６５】
任意の特定のオリゴヌクレオチド対によって形成された二重鎖が、何らかの所与の結合反応条件のセット下で安定か不安定化かは、結合競合実験によって評価することができる。結合競合は、図３を参照して理解できるであろう。このような結合競合の結果は、実施例３に示している。
【００６６】
結合競合反応を実施するためには、先ず骨格オリゴヌクレオチドへの中心オリゴヌクレオチドのアニーリングによりコア二重鎖を形成する。次に２つの結合反応を実施する。１つは、第２オリゴのみの添加によるものであり、他の１つは、第２オリゴと１０倍モル過剰の非結合性競合オリゴの添加によるものである。図３は、５’末端から１個のヌクレオチドを欠いている第２オリゴの切断体の添加を例示しているが、５’リン酸塩基を欠くオリゴヌクレオチド（すなわち、５’−ＯＨ体）もまた、使用できる。図３では、１つの完全長第２オリゴヌクレオチドに対して、５つの非結合性競合体のみを示しているが、１０倍過剰を示すことを意図している。特定の試験すべき結合条件下、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、３７℃〜４２℃、３０分で結合が実施される。次いで、生じた結合産物を、変性ＰＡＧＥにより分析する。もし、１０倍モル過剰の切断体（または５’−ＯＨオリゴヌクレオチド）の存在により、３つ以上の因子によって形成された結合産物（中心オリゴと第２オリゴを含む）の量が減少すれば、この結合条件は、第２オリゴと骨格との間の安定な二重鎖形成を支持している。もし、１０倍モル過剰の切断体（または５’−ＯＨオリゴヌクレオチド）の存在下で、３つ以下の因子によって形成された結合産物の量が減少すれば、この結合条件は、第２オリゴと骨格との間の不安定な複式形成を支持している。
【００６７】
第１オリゴヌクレオチドの３’末端における１個のヌクレオチドを欠いている切断体の１０倍過剰を添加することにより、第１オリゴヌクレオチドに対して、類似の結合競合（示していない）を実施することができる。
【００６８】
未精製オリゴヌクレオチド中の主な混入物は切断体であるため、本明細書に記載された結合競合試験によって評価されたとおり不安定な二重鎖形成が示されたことは、未精製オリゴヌクレオチド調製物中のこのような混入物は、試験された結合条件下で所望の結合産物の形成を有意に阻害しないことを示唆している。したがって、このような条件下では、結合すべきオリゴヌクレオチドを精製する必要はなく、その結果、時間、労力、費用の節約となる。
【００６９】
サンプリング結合、すなわち、第１および第２のオリゴが骨格に対して不安定に二重鎖化する条件での結合の利点は、実施例３で証明されている。前記実施例では、骨格に相補的な７個または１８個の塩基を末端に有する第１および第２のオリゴの結合効率を比較している。前記反応条件（３７℃と４２℃）下では、７塩基対二重鎖が、１８塩基対二重鎖よりもはるかに不安定であると予想されるであろう。以下の表１に示されるように、７個だけの相補性塩基を有するオリゴヌクレオチドの結合が有意に阻害されない条件下で、１８個の相補性塩基を有するオリゴヌクレオチドの結合は、混入切断体によって阻害される。競合混入物の存在による影響を受けにくいことが、不安定二重鎖条件下での結合の主な利点である。
【００７０】
他の態様において、本発明は、３’末端、５’末端、または双方にオリゴヌクレオチドを結合することにより、一本鎖ポリヌクレオチドを伸長させるための速度論的サンプリング結合法に関する。
【００７１】
他の態様において、本発明は、このような伸長反応を実施するためのキットに関する。
【００７２】
３’末端および５’末端に隣接し、それらを含む一本鎖ポリヌクレオチドの部分は、各々、一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端領域および５’末端領域と称される。これらの「伸長オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲプライマーに対する結合部位、バーコード、ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼ、または所望の性質を有する他の任意の核酸配列を含み得る。（本明細書に用いられる「ＰＣＲ」とは、使用される酵素に係らず、二重鎖核酸増幅の任意の方法を言う）。下記でさらに詳しく検討するように、伸長オリゴヌクレオチドは標識化することもできる。
【００７３】
幾つかの実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチド合成反応の産物である。他の実施形態において、伸長オリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチド合成産物の混合物であり、その完全長産物は、互いに配列が異なっている。５から１００の別個のオリゴヌクレオチド合成産物は、伸長オリゴヌクレオチド混合物を形成するためにプールできる。
【００７４】
ＩＩＳ型の制限酵素では、ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとが異なる。すなわち、それらは、ある特定の配列を認識するが、ある一定の離れた距離で開裂する。Ｓｚｙｂａｌｓｋｉら、Ｇｅｎｅ  １００：ｐ．１３−２６（１９９１）にレビューされ、その開示は、参照としてその全体を本明細書に組み込んである。本発明の目的に有用なＩＩＳ型の制限酵素としては、限定はしないが、Ａａｒｌ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡｃｌＷＩ、Ａｃｕｌ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＸＩ、ＡｓｕＨＰＩ、ＢｂｓＩ、Ｂｂｖ１６Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、Ｂｃｏ３５Ｉ、ＢｃｏＫＩ、ＢｆｉＩ、ＢｆｕＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｉｎＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＡＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｃＡＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｐ６ＩＩ、Ｂｓｐ２２Ｉ、Ｂｓｐ２８Ｉ、Ｂｓｐ４３２Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｔＶＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＥＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｔＶ１Ｉ、ＢｓｔＶ２Ｉ、ＢｔｈＩＩ、ＢｔｓＩ、Ｂｓｕ６Ｉ、ＣｒｅＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｗｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｃｏ１１２Ｉ、Ｅｃｏ１２５Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｆＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎＧＵＩＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＩＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＬｌａＩ、ＬｗｅＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｃｕＩ、ＮｇｏＢＩ、ＮｇｏＶＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｓＩ、Ｒａｌ８Ｉ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｃｅＩ、ＳｃｈＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｍｕＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｃｅＩ、ＴｓｐＧＷＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｕｂａ１１０９ＩおよびＶｐａｋ３２Ｉが挙げられる。
【００７５】
図４Ａに例示された一実施形態において、第１および第２のＰＣＲプライマーに対する結合部位を含んでいる伸長オリゴヌクレオチドを、一本鎖標的ポリヌクレオチドの３’末端と５’末端の各々に結合する。簡略化のため、伸長すべきｓｓポリヌクレオチドの１種だけが図４Ａに示されているが、本法は多くの異なるｓｓポリヌクレオチド種の混合物と共に使用し得る。図４Ａに例示された実施形態では、標的ｓｓポリヌクレオチド（「標的」）を、前形成された第１の伸長二重鎖（第１の伸長骨格オリゴにアニールした第１の伸長オリゴを含む）および前形成された第２の伸長二重鎖（第２の伸長骨格オリゴにアニールした第２の伸長オリゴを含む）と合わせる（例えば、混合する）。しかし、他の実施形態においては、いずれかの二重鎖種を前形成するか、または前形成せずに個々のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを任意の順序で添加し得る。
【００７６】
標的オリゴと伸長オリゴとが、各々の伸長骨格に塩基対合する際に、伸長オリゴと標的との接合部に塩基対合の「ギャップ」が存在しないように、図４Ａに例示された伸長骨格オリゴは、それら（伸長骨格）の長さの一部に沿って、伸長オリゴに相補的であり、また、それら（伸長骨格）の長さの他の一部に沿って、標的ポリヌクレオチドに相補的である。伸長骨格による二重鎖形成により、標的ポリヌクレオチドと伸長オリゴヌクレオチドとは、効率的結合のために適切な方向と近接性を得る。このようなオリゴヌクレオチドは、結合に対して適切に整列化される。次いで、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと適切な補因子の添加ならびに３７〜４２℃における３０分温置によって、伸長オリゴを標的ポリヌクレオチドに結合する。
【００７７】
図４Ａの骨格オリゴヌクレオチドは、伸長オリゴまたは標的のいずれかに相補的な塩基を越えて塩基を有さない。このような骨格オリゴヌクレオチドは、化学的に合成し得る。しかし、他の実施形態において、伸長オリゴまたは標的のいずれかに相補的でない追加塩基が、骨格オリゴヌクレオチドの第１の末端および／または第２の末端から伸長する。一実施形態において、骨格オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの一本鎖断片を含む。
【００７８】
結合後、一本鎖ポリヌクレオチド産物は単離でき、直接使用できるか、または（部分的）二本鎖産物を得るために、相補体を合成できる。
【００７９】
伸長オリゴが、ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼに対する結合部位を含む一実施形態において、図４Ａの二本鎖結合産物は、ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼによって消化でき、クローニングに好適な二本鎖ＤＮＡ断片が得られる。３’末端で使用されるものとは異なる伸長配列を５’末端で使用することにより、前記分子の両端に異なる制限部位を導入することが可能となり、方向づけクローニングの助けとなる。
【００８０】
伸長オリゴがＰＣＲ結合部位を含む実施形態においては、図４Ａに示された二本鎖産物は、ＰＣＲによって増幅できるか、または二重鎖産物を創製する別の工程なしに、単離された一本鎖産物を、ＰＣＲ反応において直接増幅できる。
【００８１】
このような実施形態において、３’末端で使用されるものとは異なる伸長配列を５’末端で使用することにより、５’末端と３’末端とに異なるＰＣＲプライマー結合部位を有することが可能となる。このことによって、各鎖の３’末端が必ず５’末端の逆の相補体である増幅すべきＤＮＡ断片の両端に、同一のプライマー結合配列が存在する場合に生じ得る型の擬似鎖内「ヘアピン」形成の可能性が減少する。一本鎖断片は屈曲でき、ＰＣＲ増幅や制限消化などの引き続く操作を妨害し得るヘアピン（３’末端と５’末端との間の逆平行複式）を形成させる。さらに、ヘアピン形成は、前記断片の長さおよび配列組成に依存するため、全ての配列断片が等しく影響を受けるとは限らない。ヘアピン形成の可能性が著しく異なっている広範囲の断片混合物を用いる場合、この不等性は、結果のゆがみをもたらし得る。ゲノムＤＮＡの全ての断片が等しくクローン化されていることをクローンライブラリが表していることが望ましいゲノム配列のランダムクローニング（下記に図４Ｂを参照して検討）などの操作において、ゆがみは特に有害である。末端に異なるＰＣＲプライマー結合部位を有する断片は、このようなヘアピン関連物の影響を受けにくい。
【００８２】
伸長オリゴが、バーコード配列を含む実施形態においては、所与の任意の標的一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド産物は、関心対象の標的ポリヌクレオチドに結合した独特のバーコード配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含有するアレイに対するハイブリダイゼーションによって検出できる。
【００８３】
図４Ｂは、図４Ａに示された方法の実際的な一つの適用、すなわち、ゲノムＤＮＡのランダムクローニングを示している。図示された前記実施形態において、関心対象の二本鎖ＤＮＡサンプルを、所望のサイズの断片を得る上で十分な時間、ＤＮアーゼＩにより消化する。次にその結果生じた、ランダムに刻みをつけられた二本鎖ＤＮＡを変性させて、図４Ａで示した方法による伸長に好適な一本鎖ポリヌクレオチドの混入物を生成させる。
【００８４】
異なる種類の骨格オリゴヌクレオチドは、単一の知られた標的配列の伸長のために使用するよりもむしろ、ランダムクローニングに使用する。図４Ａの方法に従って、単一の知られた配列を伸長しようとする時、骨格オリゴヌクレオチドの短い接着性末端を、標的ポリヌクレオチドの知られた配列に相補的であるように合成する。しかし、ゲノムＤＮＡをランダムにクローニングする場合、伸長すべきＤＮアーゼ断片の両端の配列は可変的であり、一般に未知である。したがって、クローン化されるＤＮアーゼ断片の末端における可能な配列全てに対して相補的な骨格オリゴヌクレオチドが存在することを保証するために、接着性末端の各位置における４つの塩基全ての混合物と共に骨格オリゴヌクレオチドを合成する。一実施形態において、接着性末端は、７ヌクレオチド長であり、したがって、各骨格オリゴヌクレオチド混合物は、１６，０００種以上の異なる接着性末端配列を含有する。他の実施形態において、ランダム化した接着性末端は、４、５、６、８、１０、１２またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
【００８５】
次にランダム化した接着性末端を有する骨格オリゴヌクレオチドの混合物を用い、また、標的ポリヌクレオチドとしてゲノムＤＮＡ断片の混合物を用いて、図４Ａの方法を行う。ＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼ結合部位を任意に含む伸長配列を、ゲノムＤＮＡ断片に結合する。相補鎖を合成し、二本鎖産物を、適切な制限エンドヌクレアーゼによって消化する。２つの末端を開裂させる酵素が異なっており、異なる消化後に末端を提供する実施形態において、そのような制限断片を、一定の方向で、ベクター内にクローン化できる。
【００８６】
本発明の他の態様において、速度論的サンプリング結合法を用いて、５’末端もしくは３’末端のいずれか、または双方におけるポリヌクレオチドを標識化する。
【００８７】
他の態様において、本発明は、このような標識化反応を実施するためのキットに関する。
【００８８】
遺伝子プローブとして使用するポリヌクレオチドを創製する場合、プローブを標識化することが望ましい場合が多い。しかし、５’末端を標識化するために用いられる現行法は、５’末端と３’末端との間の固有な構造的な相違により、３’末端の標識化に用いられる方法とは著しく異なっている。例えば、標識ヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ反応または末端トランスフェラーゼ反応を用いて、ポリヌクレオチドの３’末端に放射性標識または蛍光標識を酵素的に付加できる。対照的に、ポリヌクレオチドの５’末端の標識化は、キナーゼ反応を用いる放射性標識化に限定されることが多い。ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかを標識化する化学的な代替法は存在するが、このような方法は費用がかかることが多く、ポリヌクレオチド自体を損傷する可能性がある。
【００８９】
本発明によるポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端または双方を標識化する方法は、図５Ａおよび５Ｂに示されており、実施例４および５で証明されている。図５Ａおよび５Ｂは、サンプリング結合によるポリヌクレオチドの３’末端標識化に関する本発明の幾つかの方法を示している。当業者は、同じ原理を適用してポリヌクレオチドの５’末端を標識化するために前記方法を改造することもできるであろう。複合的標識法は示されていないが、本発明の範囲内にあり、同一の標識化反応における複数の異なるオリゴヌクレオチド種の同時標識化を含む。
【００９０】
図５Ａおよび５Ｂに示された実施形態において、標識化反応は、１）３’末端に被標識オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、２）好ましくは３’末端に、所望の標識ですでに標識化されている標識オリゴヌクレオチド、および３）標識骨格オリゴヌクレオチドから構成される。標識骨格オリゴヌクレオチドは、被標識オリゴヌクレオチドおよび標識オリゴヌクレオチドを、結合のために適切に整列化する目的で相補的塩基を提供するという点で、図２Ａおよび上記に示した方法における骨格オリゴヌクレオチドと同じ役割を演じる。
【００９１】
図５Ａに示した方法において、標識骨格は結合条件下、その３’末端に安定な二重鎖を形成する上で十分長い被標識オリゴヌクレオチドに相補的な領域を有し、その５’末端に安定な二重鎖を形成する上で十分な長さではない標識オリゴヌクレオチドに相補的な領域を有している。図５Ｂに示した方法において、標識骨格は結合条件下、その５’末端に、安定な二重鎖を形成する上で十分長い標識オリゴヌクレオチドに相補的な領域を有し、その３’末端に安定な二重鎖を形成する上で十分な長さではない被標識オリゴヌクレオチドに相補的な領域を有している。一実施形態において、標識骨格は、標識オリゴヌクレオチドに相補的な７ｎｔ領域を有し、標識化すべきオリゴヌクレオチドに相補的な２０ｎｔ領域を有している。他の実施形態において、標識骨格は、被標識オリゴヌクレオチドに相補的な７ｎｔ領域を有し、標識オリゴヌクレオチドに相補的な２０ｎｔ領域を有している。
【００９２】
標識オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識付加などの、検出を助ける任意の方法において、それを標識化することにより検出可能にすることができる。
【００９３】
検出可能な標識としては、例えば、放射性核種、発蛍光団、蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）タンデム発蛍光団、ＦＲＥＴ供与体および／または受容体、または質量タグが挙げられる。間接的に検出可能な標識としては、例えば、酵素、遺伝子型標識、またはハプテンが挙げられる。
【００９４】
前記標識は、例えば、３３Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなどの放射性核種であり得る。
【００９５】
前記標識は、それらの代わりに発蛍光団であり得る。標識オリゴヌクレオチド内に容易に組み込まれる商品として入手可能な蛍光ヌクレオチド縁体としては、例えば、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）−７−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（商標）Ｒ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）（商標）ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）−５−ｄＵＴＰ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−１２−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６−１４−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−５−ＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）−７−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−１４−ＵＴＰ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）−５−ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−５−ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６−１４−ＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国オレゴン州ユージーン所在）が挙げられる。他の発蛍光団を有するヌクレオチドの慣例的合成に関するプロトコルは入手可能である。Ｈａｎｅｇａｒｉｕら、「Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：ｐ．３４５−３４８（２０００）の開示は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【００９６】
合成後、付加に関して入手可能な他の発蛍光団としては、とりわけＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｄａｎｓｙｌ、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から入手できる、米国オレゴン州ユージーン所在）、およびＣｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在、および他社）が挙げられる。
【００９７】
ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＡＰＣ−Ｃｙ７などのＦＲＥＴタンデム発蛍光団もまた使用できる。
【００９８】
質量分析によって検出可能な標識、「質量タグ」もまた使用できる、質量タグは、質量分析で識別可能な数百の種を提供するようにデザインでき、極めて複合化した反応を可能にし、標識核酸から分割、典型的には光学的に分割できるようにデザインでき、分析を簡略化する。例えば、参照のため、その開示の全体が本明細書に組み込まれているＫｏｋｏｒｉｓら、Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．５（４）：ｐ．３２９−４０（２０００）およびＰｕｓｃｈら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３（４）：ｐ．５３７−４８（２００２）を参照されたい。
【００９９】
標識オリゴヌクレオチドは、それらの代わりに、またはそれらに追加して、少なくとも１種の間接的に検出可能な標識を含んでもよい。
【０１００】
例えば、前記オリゴヌクレオチドは、酵素を含んでもよい。
【０１０１】
比色検出に有用な酵素はよく知られており、アルカリホスファターゼ、βーガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびウレアーゼが挙げられる。肉視検出可能な産物の製造および沈積のための典型的基質としては、ｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）；ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）；ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）；３’，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）；ＡＢＴＳ（登録商標）；ＢｌｕｏＧａｌ；ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）；ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）；フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）；フェノールナフタレインモノホスフェート（ＰＭＰ）；テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）；Ｘ−Ｇａｌ；Ｘ−Ｇｌｕｃ；およびＸ−グルコシドが挙げられる。
【０１０２】
発光検出のために酵素を使用してもよい。
【０１０３】
例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、ルミノールなどの環状ジアシルヒドラジド類の酸化を触媒でき、その後発光を伴う。発光の強い増強が、フェノール性化合物などのエンハンサーによって生じ得る。Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３３：ｐ．３３１−５３（１９８６）；Ｋｒｉｃｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １７（１）：ｐ．６７−８３（１９９６）；およびＬｕｎｄｑｖｉｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．１０（６）：ｐ．３５３−９（１９９５）の開示が参照として、その全体が本明細書に組み込まれている。核酸のこのような化学発光および増強化学発光検出のためのキットが商品として入手できる。
【０１０４】
標識が、標識骨格に対する標識オリゴヌクレオチドのアニーリングまたは被標識オリゴヌクレオチドに対する標識オリゴヌクレオチドの結合を妨害しない限り、標識を標識オリゴヌクレオチドの末端または内部に付加することができる。一実施形態において、図５Ａに関連して上記で検討したように、被標識オリゴヌクレオチドと標識骨格との間の安定な二重鎖形成を可能にするが、標識オリゴヌクレオチドと標識骨格との間では可能としない条件下で、結合反応を実施する。一実施形態において、３７℃〜４２℃で３０分間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合を実施する。次に被標識オリゴヌクレオチドに対する標識オリゴヌクレオチドの結合によって形成された産物量を、例えば、ＰＡＧＥによって決定する。
【０１０５】
一実施形態において、本発明による結合反応は、単一の結合混合物中、複合体において、すなわち、被標識複数のオリゴヌクレオチド種と共に実施される。複数のオリゴヌクレオチド種は、２４、９６またはそれ以上など、２つ以上のオリゴヌクレオチド種を含む。
【０１０６】
相補的オリゴヌクレオチドのアレイに対するハイブリダイゼーションにより、または他の任意の好適な方法によりオリゴヌクレオチドの標識化効率を場合によっては評価してもよい。
【０１０７】
標識化されたオリゴヌクレオチドは、分取変性ＰＡＧＥ、または変性寒天ゲル電気泳動により、場合によっては精製してもよい。分取電気泳動は、単一の標識化されたオリゴヌクレオチド、複合反応において標識化された複数のオリゴヌクレオチド、または２つ以上の標識化反応産物の混合物について実施できる。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、例示のために提供されるものであって限定ではない。
【０１０９】
（実施例１：単一のオリゴヌクレオチド合成反応の未精製産物を用いた遺伝子プローブとしての使用に好適なポリヌクレオチドの構築）
蛍光標識ゲル精製３７ｎｔ中心オリゴヌクレオチドを、ゲル精製５１ｎｔ骨格オリゴヌクレオチドにアニールし、中心オリゴヌクレオチドの全長にわたって前記骨格の各末端に７ｎｔ残存一本鎖を有する二重鎖を形成する。これらの一本鎖７ｎｔ領域は、接着性末端と称される。
【０１１０】
一連の４８対の第１および第２のオリゴヌクレオチドを合成し、精製することなく用いる。４８対のオリゴヌクレオチドは、配列、長さ、および純度が変化する。第１のオリゴヌクレオチドの長さは、２５ｎｔから３２ｎｔまで変化し、第２のオリゴヌクレオチドの長さは、５１ｎｔから５８ｎｔまで変化する。オリゴヌクレオチド合成時に、単一の塩基添加の推定効率９８％に基づいて、完全長産物収率は、３２マーに関しては多くて５２％、５８マーに関しては３０％であり残りは種々の切断体であるはずである。しかしながら、実際の合成では、完全長のオリゴヌクレオチド産物の収率は、かなり低くなり得、劇的に変化し得る。他に示さない限り、この例および他の例において、リン酸基が５’末端に存在するように、全てのオリゴヌクレオチドを合成する。
【０１１１】
各完全長の第１オリゴは、その３’末端に骨格オリゴヌクレオチドの３’末端の７ｎｔ接着性末端に相補的な７ｎｔ領域を有し、また、各完全長の第２オリゴは、その５’末端に骨格オリゴヌクレオチドの５’末端の７ｎｔ接着性末端に相補的な７ｎｔ領域を有する。
【０１１２】
４８対の第１および第２の各オリゴをコア二重鎖の中心オリゴヌクレオチドに結合させるように個々の結合反応を実施する。５０ｍＭトリスアセテート（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ酢酸Ｍｇ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および１ｍＭ  ＡＴＰからなるリガーゼ緩衝液中、中心オリゴヌクレオチドと骨格オリゴヌクレオチド（各０．１μＭ）との間で予め形成されたコア複式溶液に第１および第２の各オリゴ（各１μＭ）を同時に加える。この例および他の例に掲げた全ての濃度は、全ての成分が加えられた後の最終反応混合物中の濃度である。前記結合反応混合物を４２℃に加熱し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州ビバリー所在）を８０００単位／ｍｌに加え、この反応を３０分間進行させる。本明細書に用いられるリガーゼ単位は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓにより定義された接着性末端結合単位である。次いで反応産物を、変性７Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分割する。蛍光スキャナで前記ゲルを走査することによりバンドを検出する。
【０１１３】
結果を図６に示す。バンドは、示されるように未結合中心オリゴヌクレオチドまたは第１オリゴ、第２オリゴまたは双方のオリゴに結合した中心オリゴヌクレオチドのいずれかを表している。いちばん左の５本のレーンは、（左から右へ）未結合中心オリゴヌクレオチド、１つの第２オリゴ種に結合した中心オリゴヌクレオチド、異なる第２オリゴ種に結合した中心オリゴヌクレオチド、１つの第１オリゴ種に結合した中心オリゴヌクレオチド、異なる第１オリゴ種に結合した中心オリゴヌクレオチドで装填されたコントロール群のレーンである。コントロール群の右端のレーンは空であり、続いてコア二重鎖および一連の対の第１オリゴおよび第２オリゴで実施された結合反応産物により装填された、各レーンごとに異なる４８本のレーンである。１６番目と３２番目の結合反応混合物で装填されたレーンの右端のレーンは、装填されないままである。
【０１１４】
４８対の第１および第２のオリゴのうち４６対は、使用された第１および第２のオリゴヌクレオチド合成反応産物の混合物中、配列、長さおよび純度が異なるにもかかわらず、形成された完全長産物の割合がほとんど変化せずに結合に成功し、完全長ポリヌクレオチド産物となっている。
【０１１５】
（実施例２：完全長結合産物の精製）
本発明の方法に従って構築された完全長ポリヌクレオチド産物は、過剰の第１および第２のオリゴヌクレオチドおよび結合副産物などの結合反応の他の成分から任意に精製できる。ポリヌクレオチドは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製できる。水または緩衝液中にゲルを浸漬することにより尿素を除去しない限り、変性ゲル中の尿素の存在は、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国オレゴン州ユージーン所在）などの標準的なＤＮＡ染色剤を用いるＤＮＡの検出を妨害する。提供したこの方法は、反応産物の直接的視覚化を含み、尿素を除去するためにゲルの浸漬を必要とせずに、バンドをゲルから切断することを可能にする。
【０１１６】
一実験において、１０μＭの第１および第２のオリゴヌクレオチドを、５０μＬ反応容量中、２μＭのコア二重鎖複合体と混合する。反応は、実施例１に記載されたとおりに進める。等容量のホルムアミドを、反応の終末時に加える。この混合物を、９５℃で２分間予め加熱してから、氷冷し、１０％分取変性ポリアクリルアミドゲル上に装填する。分離完了後、ゲルをプラスチック製クリングラップの層間に置いて、蛍光ＴＬＣプレートに載せ、手持ち型ＵＶランプの２５４ｎｍ  ＵＶ光で照明する。ポリヌクレオチドは、ＵＶ光の陰影づけにより、すなわち、ポリヌクレオチドが位置するゲル領域下のＴＬＣプレートの蛍光減少により見ることができる。完全長ポリヌクレオチドに相当する移動性バンドは、実施例１に記載された全ての結合反応において見ることができる。
【０１１７】
中心オリゴヌクレオチドをフルオレセインで標識化する場合、ＵＶ光源上にゲルを置いて蛍光を検出することにより、上記の方法よりも少ない量の完全長ポリヌクレオチドを検出することが可能である。照明とフィルタ類との他の有効な組合わせは、フルオレセイン標識を視覚化するために任意に使用できる。検出手段が何であっても、完全長ポリヌクレオチド産物に相当するバンドをゲルから切断し、抽出する。
【０１１８】
（実施例３：安定な結合条件下および不安定な結合条件下における非結合性競合オリゴヌクレオチドによる結合阻害）
７ｎｔ接着性末端を有するコア二重鎖を、実施例１のとおり作製する。２つの１８ｎｔ接着性末端を有する異なるコア二重鎖は、同じ中心オリゴヌクレオチドを７３ｎｔ骨格オリゴヌクレオチドにアニールすることに作製する。両方の骨格オリゴヌクレオチドの接着性末端は、第１オリゴの３’末端および第２オリゴの５’末端に完全に相補的である。２倍モル過剰の骨格骨格を蛍光標識された中心オリゴヌクレオチドに加え、８０℃に２分間、次いで４６℃でさらに３０分間加熱することによりコア二重鎖を形成する。コア二重鎖は、最終結合反応において、凡そ０．１μＭで使用される。
【０１１９】
第１のオリゴ、第２のオリゴ、双方のオリゴ、またはオリゴなしを、７ｎｔ粘着性末端を有するコア二重鎖に加え、また、別個の反応において、１８ｎｔ接着性末端を有するコア二重鎖に、各々の場合、１μＭ（コア二重鎖に対し１０倍モル過剰）の濃度で加える。この結果は、第１のオリゴ、第２のオリゴ、双方のオリゴ、またはオリゴなしと、２つのコア二重鎖のうちの１つとを含んでなる８つの個々の結合反応である。
【０１２０】
非結合性競合オリゴヌクレオチドを、第１のオリゴおよび第２のオリゴに対し１０倍モル過剰（１０μＭ）で加えること以外、上記のものとそれぞれ同一の条件で追加の結合反応を実施する。これらの非結合性オリゴは、混入物をシミュレートする。第１のオリゴに関して、非結合性競合オリゴは、３’末端においてヌクレオチドを１つ欠くこと以外、完全長第１オリゴと同一である。この競合性オリゴは、「第１（ｎ−１）オリゴ」と称される。第２のオリゴに関して、非結合性競合オリゴは、５’末端においてリン酸基を１つ欠くこと以外、完全長第２のオリゴと同一である。この競合性オリゴは、「第２（５’−ＯＨ）のオリゴ」と称される。第１オリゴのみを含む反応は、第１（ｎ−１）オリゴのみと競合し、第２オリゴのみを含む反応は、第２（５’−ＯＨ）オリゴのみと競合する。第１および第２のオリゴ双方を含む反応は、双方の非結合性競合オリゴと競合する。非結合性競合オリゴのみを含有するコントロール結合、すなわち、第１または第２のオリゴを加えないこと以外、前述のような結合もまた実施する。
【０１２１】
４００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを各５０μＬ反応液に加える。ＡＴＰおよびＢＳＡを、それぞれ１ｍＭおよび２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加える。前述の結合反応の全ての複製を、３７℃で１回、他は４２℃で実施する。１０分と３０分の時点で取り出し、ブロムフェノールブルーを含有する３倍容量ホルムアミドの添加により中止する。次いでサンプルを、７Ｍ尿素を含有する１０％ＰＡＧＥゲル上に装填する。ゲルの結果は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）蛍光スキャナを用いて定量化する。スキャン後、各バンドの強度を、対応するピーク下面積の積算により決定する。１０分と３０分の結果平均を、表１に提供している。
【０１２２】
（表１  完全長ポリヌクレオチド産物の形成パーセント）
【０１２３】
【表１】
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表１は、１０倍モル過剰の非結合性競合オリゴヌクレオチドを含有する反応で得られた完全長結合産物量を競合性オリゴヌクレオチドを欠く同一の反応で得られた完全長結合産物量のパーセンテージとして提供している。３７℃および４２℃の双方において、第１（および第２）オリゴと骨格との間の不安定な二重鎖形成を含む反応、すなわち、７ｎｔ接着性末端を含む反応は、シミュレートされた混入物の存在による阻害が有意に少ない。１０倍過剰の第１（ｎ−１）オリゴは、中心オリゴヌクレオチドに対する第１オリゴの結合に何ら影響を及ぼさず、同様に過剰の第２（５’−ＯＨ）オリゴは、中心オリゴヌクレオチドに対する第２オリゴの結合を、１２〜１７％だけ減少させる。双方をシミュレートした混入物の存在は、不安定な７ｎｔ接着性末端を含む反応に対して完全長産物形成を１９〜２３％減少させる。
【０１２４】
対照的に、１８ｎｔ接着性末端を含む結合は、シミュレートされた混入物により大きく損なわれる。１０倍過剰の第１（ｎ−１）オリゴは、中心オリゴヌクレオチドに対する第１オリゴの結合を、３倍以上の６８〜７８％まで減少させる。同様に過剰の第２（５’−ＯＨ）オリゴは、中心オリゴヌクレオチドに対する第２オリゴの結合を、１２倍から１４倍減少させる。双方をシミュレートした混入物の存在は、４２℃での反応に関しては３０倍、３７℃での反応に関しては検出限界以下（＞４０倍）まで完全長産物形成を減少させる。
【０１２５】
不安定な結合を使用することのさらなる予想外の利点は、中心オリゴヌクレオチドのアデニル化がほとんど全く生じないことであり、一方、安定な結合条件ではかなりのアデニル化を生じる。アデニル化は、リガーゼ−ＡＭＰ中間体から結合されるオリゴヌクレオチドのうちの１つの５’末端へのＡＭＰ部分の移動に関与する望ましくない副反応である。成功した結合反応において、ＡＭＰ部分は、２つのオリゴヌクレオチド間のホスホジエステル結合形成時、すなわち、鎖の結合時に遊離する。しかしながら、幾つかの条件下での結合反応は、ホスホジエステル結合形成へと進行することができず、アデニル化５’末端を残す。このようなアデニル化鎖は、ＰＡＧＥにおける特有の移動性に基づいて確認できる。
【０１２６】
図７は、結合反応産物を装填したゲルのレーンの濃度測定走査を示しているが、アデニル化中心オリゴヌクレオチドの形成（矢印により示される）が示されている。番号は、ゲル上のレーンを指している。レーン２、３、６〜９、１２および１３における左端のピークは、完全長ポリヌクレオチド産物であり、全てのレーンにおける右端ピークは、中心オリゴヌクレオチドである。レーン１〜７は、反応条件（３７℃）下で第１および第２オリゴと不安定な二重鎖を形成する７ｎｔ接着性末端を有するコア二重鎖を用いて実施された結合反応産物を示している。認められるほどの量のアデニル化中心オリゴヌクレオチド形成はない。レーン８〜１３は、反応条件下で第１および第２オリゴと安定な二重鎖を形成する１８ｎｔ接着性末端を有するコア二重鎖を用いて実施された結合反応産物を示している。レーン１０〜１３に示されているように、安定な二重鎖形成および第１オリゴの切断体を含む反応のみが、アデニル化中心オリゴヌクレオチドをかなり形成していることを示している。レーン１０〜１３に示される反応においては、中心オリゴヌクレオチドの８０％までがアデニル化される。アデニル化されると、このようなオリゴヌクレオチドは、その後５’末端に結合できない。
【０１２７】
理論に拘束される意図はないが、骨格オリゴヌクレオチドと１７ｂｐ二重鎖を形成できる１８ｎｔ接着性末端反応における第１（ｎ−１）オリゴは、他の場合では結合すると考えられる末端間の一つの塩基ギャップにもかかわらず、安定な複合体を形成することが可能である。このギャップ形成二重鎖により、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ結合および中心オリゴヌクレオチドの５’末端へのＡＭＰ移動（アデニル化）を可能にするが、ホスジエステル結合形成はできないと考えられる。７ｎｔ接着性末端反応において第１（ｎ−１）オリゴヌクレオチド間の類似の複合体は、６ｂｐ二重鎖のみを形成できるであろうが、それはＴ４  ＤＮＡリガーゼによる結合およびＡＭＰ移動を可能にするには不安定すぎると考えられる。分子機構がどうであろうと、本発明の方法は、不安定な結合条件（７ｎｔ接着性末端）を用いる場合、安定な結合条件（１８ｎｔ接着性末端）を用いる場合のように、中心オリゴヌクレオチドが、アデニル化により不可逆的に不活化されることはないという利点を有する。
【０１２８】
（実施例４：速度論的サンプリング結合による未精製オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の標識化）
６種の異なる未精製オリゴヌクレオチドを、速度論的サンプリング結合により３’末端に標識化し、他の６種は、５’末端に標識化する。図５Ａおよび５Ｂは、オリゴヌクレオチドの３’末端を標識化する２つの方法を示している。オリゴヌクレオチドの５’末端を標識化する類似の方法に関する図式は提供していない。
【０１２９】
第１の６種のオリゴヌクレオチドの３’末端を標識するために、６種の個々の２７ｎｔ標識骨格オリゴヌクレオチドおよび１種の標識オリゴヌクレオチドを合成する。骨格オリゴヌクレオチドの各々は、その３’末端に標識化される６種のオリゴヌクレオチドのうちの１種の３’末端に相補的な異なる２０ｎｔ配列、およびその５’末端に標識オリゴヌクレオチドの５’末端に相補的な７ｎｔの共通の配列を含有する。３’末端標識のための標識オリゴヌクレオチドは２０ｎｔの長さがあり、その３’末端に付加されたフルオレセインを有する。
【０１３０】
第２の６種のオリゴヌクレオチドの５’末端を標識するために（図式は示していない）、６種の個々の２７ｎｔ標識骨格オリゴヌクレオチドおよび１種の標識オリゴヌクレオチドを合成する。骨格オリゴヌクレオチドの各々は、その５’末端に標識化される６種のオリゴヌクレオチドのうちの１種の５’末端に相補的な異なる２０ｎｔ配列、およびその３’末端に標識オリゴヌクレオチドの３’末端に相補的な７ｎｔの共通の配列を含有する。５’末端標識のための標識オリゴヌクレオチドは１０ｎｔの長さがあり、その５’末端に付加されたフルオレセインを有する。
【０１３１】
５’末端をフルオレセインで標識されるオリゴヌクレオチドを除いて、合成時にこの例で用いられる全てのオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を化学的に結合する。この例に用いられるオリゴヌクレオチドは、標識オリゴヌクレオチド以外は精製されない。
【０１３２】
個々の反応において、３’末端に標識される５２ｎｔから５８ｎｔの長さの範囲の６種のオリゴヌクレオチドの各々、また、５’末端に標識される２５ｎｔから３２ｎｔの長さの範囲の６種のオリゴヌクレオチドの各々を、対応する標識骨格オリゴヌクレオチドにアニールする。被標識オリゴヌクレオチドは、０．１μＭで使用され、標識骨格オリゴヌクレオチドは０．５μＭで使用される。リガーゼ緩衝液を加え、３’末端または５’末端標識オリゴは、０．２μＭまでそれぞれの反応に対して加える。反応液を４２℃に加熱し、次いで４００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを、各５０μＬの反応液に添加する。４２℃で３０分間の温置後、反応産物を１０％ＰＡＧＥにより分析する。
【０１３３】
実験結果を、図８に提供する。レーン１〜６は、６種の３’末端標識化反応の産物であり、レーン７〜１２は、６種の５’末端標識化反応の産物である。各レーンにおけるバンドの下方のクラスタ群は、未反応標識オリゴヌクレオチドであり、各レーンにおける上方の濃いバンドは、所望の標識結合産物である。１２種全てのオリゴヌクレオチドは、どちらの末端が標識されるとしても、等しく良好に標識化される。完全末端を有するオリゴヌクレオチドのみが、結合できることから、記載されたサンプリング結合による標識化は、各標識反応に関して１つの特異的結合産物をのみを生成する。任意の切断オリゴヌクレオチド混入物と標識オリゴヌクレオチドとの間のギャップは、標識骨格オリゴヌクレオチドにアニールされる際に残存して切断体の結合を防ぎ、したがって標識化も防ぐ。
【０１３４】
（実施例５：速度論的サンプリング結合による未精製オリゴヌクレオチドの３’または５’末端の複合的標識）
本発明の標識反応の複合的態様においては、オリゴヌクレオチドをプールし、標識化は、別々の反応において各オリゴヌクレオチドに対してではなく、単一反応において混合物（複数のオリゴヌクレオチドを含有）に対して実施される。
【０１３５】
５００種以上の異なるオリゴヌクレオチドが、一連の２４式の速度論的サンプリング結合反応において３’末端に標識される。５’末端を標識化する複合的速度論的サンプリング結合標識の操作法は記載していないが、実施例４（上記）と類似して実施される。オリゴヌクレオチドのデザイン、アニーリングおよび結合は、以下の変更を行って実施例４のとおり実施され、図５Ｂに例示される。
【０１３６】
標識オリゴヌクレオチドは２１ｎｔの長さがあり、その３’末端に蛍光染料標識を有する。骨格オリゴヌクレオチドは２８ｎｔの長さであり、その５’末端は、標識オリゴヌクレオチドの全長に相補的である。標識オリゴヌクレオチドにアニールする際に、骨格オリゴヌクレオチドの３’末端に７ｎｔの一本鎖領域が残る。
【０１３７】
被標識オリゴヌクレオチドは、２８塩基の長さであり、３’は全てのオリゴヌクレオチドで同一の大部分７ｎｔを有する。この７ｎｔ領域は、骨格オリゴヌクレオチド（ここでは「標識骨格」とも呼ばれる）の３’、大部分７ｎｔに相補的である。この結果は、全ての被標識オリゴヌクレオチドが、５’末端において２１ｎｔ異なるが、全てが、３’末端において同一の骨格オリゴヌクレオチドにアニールできるということである。
【０１３８】
標識オリゴヌクレオチドを、２７μＭ標識オリゴヌクレオチド、３２μＭ標識骨格オリゴヌクレオチドおよび４．１×Ｔ４プローブ緩衝液を含有する１００μｌの反応液中、骨格オリゴヌクレオチドにアニールする。１０×Ｔ４プローブ緩衝液は、５００ｍＭトリスアセテートｐＨ７．６、１００ｍＭ酢酸Ｍｇおよび５０ｍＭ  ＤＴＴを含んでなる。アニーリング反応は、８０℃に２分間加熱してから、３７℃で３０分間加熱し、最後に氷冷する。標識オリゴヌクレオチドと骨格オリゴヌクレオチドとの対合から生じる二重鎖は、標識コア二重鎖と称される。
【０１３９】
前記反応液を、１．５×Ｔ４プローブ緩衝液中、１０μＭ標識コア二重鎖へと希釈する。次いで４μＭ標識コア二重鎖、合計で２μＭの標識されるオリゴヌクレオチドおよび１×Ｔ４プローブ緩衝液を含有する反応液を調製する。２４式の標識反応に関して、標識される個々のオリゴヌクレオチドは、それぞれ凡そ８３ｎＭで存在する。反応混合物を、４２℃に加熱し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを４単位／μｌまで加え、反応液を４２℃で３０分間温置する。次にこの結合反応液を、７０℃で１０分間加熱し、４℃に冷却する。この結合により、３’末端に蛍光標識および５’末端に２１ｎｔの可変領域を有する一連の４９ｎｔオリゴヌクレオチドが生成する。２４式全ての速度論的サンプリング標識反応の産物をプールし、ＰＡＧＥにより精製する。
【０１４０】
個々のオリゴヌクレオチド配列の標識の相対的効率は、混合物をオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズすることにより決定される。このアレイは、固体支持体上の個々の位置に固定された一連のオリゴヌクレオチドを含んでなる。このアレイに結合されたオリゴヌクレオチドの配列は、混合物の配列に相補的であるように選択される。各位置における蛍光シグナル強度は、その特定の位置に固定されたオリゴヌクレオチドに相補的な標識オリゴヌクレオチドの標識効率を反映する。
【０１４１】
複合標識オリゴヌクレオチドサンプルを、６×ＳＳＰＥ（６０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、９００ｍＭ塩化ナトリウム）中、４０℃で一晩オリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズさせる。次いで前記アレイを洗浄し、各位置における蛍光シグナル強度を定量化するために走査する。
【０１４２】
図９は、各配列に関してプロットされた、任意の単位で蛍光強度を有するアレイハイブリダイゼーションの結果を示す。各配列は、データの提示を容易にするために任意の数的指定に割り当てる。全番号を数的指定に用いているのではない。すなわち、配列番号付けにはギャップがある。図９は、シグナル強度が全配列に関して比較的均一であることを示し、調べられた配列に関して比較的均一な標識効率を示している。
【０１４３】
２４式の速度論的サンプリング結合標識のさらなる試験として、一群のオリゴヌクレオチドを、単式法および２４式法の双方を用いて標識化する。単式反応の産物をプー産物をプールし、２４式標識の産物のように上記の相補的オリゴヌクレオチドの任意のアレイにハイブリダイズする。
【０１４４】
両セットの標識オリゴヌクレオチドに関するシグナル強度分布を、図１０に示している。規準化シグナルを、各オリゴヌクレオチドに関してプロットする：規準化値は、各オリゴヌクレオチドに関する蛍光シグナル強度（任意の単位で）を、同じ方法（すなわち、単式または多式）で標識された全てのオリゴヌクレオチドに関する平均値で割ることにより算出される。シグナル強度の分布は、個々に標識されたオリゴヌクレオチドと２４式で標識されたものとの間で同等であり、オリゴヌクレオチドは、労力と費用が結果として節約される２４式反応で十分に標識化できることを示している。２４種以上のオリゴヌクレオチドもまた、恐らく複式で標識できると思われる。
【０１４５】
具体的に述べない限り、本発明の方法のいずれの工程も、物質添加の特定の順序、または工程実施の特定の順序を必要としない。本明細書に挙げられた全ての特許、特許刊行物、および他の公表文献は、各々を参照として個々に、具体的に組入れたように、それらの全体が参照として本明細書に組入れてある。
【０１４６】
本明細書に用いられる、オリゴヌクレオチドまたは配列の特定数（例えば、１つ、２つなど）存在の言及は、存在する分子数ではなくて存在する異なる種の数を指している。
【０１４７】
実施例は、本発明を例示するために意図されており、本発明の請求項の範囲を実施例の詳細により限定するものではない。本発明の好ましい例示的実施形態を記載しているが、種々の変更および修飾が、本発明から逸脱することなく成し得ることは当業者に明らかであろう。また、本発明の真の精神および範囲に入るこのような全ての変更および修飾を包含することが、添付の請求項において意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
本発明のこれら、および他の目的および利点は、付随する図面と合わせて、以下の詳細な説明を考慮すれば明らかとなろう。これら図面全てにおいて類似の図式は類似の構造を表す。
【図１】図１は、ポリヌクレオチドを構築するために用いられる、幾つかの先行法の略図である。図１Ａは、米国特許第５，９９８，１７５号の方法を示しており；図１Ｂは、米国特許第６，１１０，６６８号の方法を示しており；図１Ｄは、Ｃｈａｌｍｅｒｓら、２００１年、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：ｐ．２４９の方法を示している。本明細書におけるこれらと全ての略図において、共に直線状に並んでいる垂直破線対は、一般に塩基対を示すことが意図されており、破線の数は、塩基対の特定の数を表す意図はない。また、略図は、描かれているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの相対的長さを正確に表す意図もない。全ての略図において、他に示されない限り、上鎖の左端は５’末端を表し、右端は３’末端を表す。下鎖の方向性は逆転しており、左端が３’末端を表し、右端が５’末端を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明による結合法の略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、速度論的サンプリング結合の原理の略図である。この略図に係らず、本発明は理論に制限されない。
【図３】図３は、速度論的サンプリング結合反応において、完全長産物形成に及ぼす非結合混入オリゴヌクレオチドの効果を試験するためにデザインされた一組の結合反応の略図である。描かれているオリゴヌクレオチド分子の数は、この反応におけるそれらの分子比を正確に表すことを意図するものではない。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明による一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端と５’末端双方を伸長させる方法の略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ランダムクローニングのために、ゲノムＤＮＡから一本鎖断片を調製する略図である。生成した断片は、図４Ａに示した方法による伸長に好適である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明によりオリゴヌクレオチドの３’末端を標識化する方法の略図である。標識は、標識オリゴヌクレオチドの３’末端に付加するように描かれているが、結合反応を妨害しないという条件で、標識オリゴヌクレオチドの他の位置に付加してもよい。
【図５Ｂ】５Ｂは、本発明によりオリゴヌクレオチドの３’末端を標識化する方法の略図である。標識は、標識オリゴヌクレオチドの３’末端に付加するように描かれているが、結合反応を妨害しないという条件で、標識オリゴヌクレオチドの他の位置に付加してもよい。
【図６】図６は、本発明によって実施された結合反応産物のポリアクリルアミドゲルを示している。
【図７】図７は、結合反応時のアデニル化オリゴヌクレオチド形成を示す電気泳動ゲルレーンのデンシトメトリー走査を示している。
【図８】図８は、本発明によって実施された標識化反応産物のポリアクリルアミドゲルを示している。
【図９】図９は、本発明によって実施された一連の複合標識化反応の結果を示すプロットである。
【図１０】図１０は、複合標識化反応の結果を各々、本発明によって実施された同一オリゴヌクレオチドの単式標識化と比較するプロットである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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