(57)【要約】蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する、乾燥組成物が提供される。乾燥組成物を作製する方法が提供され、この方法は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液を乾燥する工程を包含する。一つの方法は、核酸基質上での反応を行うために提供され、この方法は、以下：（ａ）蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥された組成物を含む容器を提供する工程、および（ｂ）この容器に水性流体および核酸基質を添加する工程を包含する。核酸の配列を決定するために、一つのキットが提供され、このキットは、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する、乾燥組成物。
【請求項２】
前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをさらに含み、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、組成物。
【請求項６】
前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
四つのヌクレオシド三リン酸をさらに含有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
耐熱性核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、別の核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、グリセロールを実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
凍結防止剤をさらに含有する、請求項１または８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記色素が、構造
【化１】
2006502735.tif 000012
を有し、ここで、
Ｒ２１は、Ｃ１〜５のアルキルであり；
Ｚ１は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素であり；
Ｒ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系であり；
Ｒ２９は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり；そして
Ｚ２は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン；４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アクセプターが、４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、２０重量％より少ない溶媒含量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が、２０重量％より少ない水含量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、５重量％より少ない溶媒含量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、５重量％より少ない水含量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、２重量％より少ない溶媒含量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、２重量％より少ない水含量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１に記載の組成物を作製する方法であって、前記蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液を、乾燥させる工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをまとめて含有する一つ以上の溶液を乾燥させる工程をさらに包含し、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、方法。
【請求項３３】
前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
四種のヌクレオシド三リン酸をまとめて含有する一つ以上の溶液を乾燥させる工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥させる工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶液が、水溶液である、請求項２８もしくは３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液が、グリセロールを実質的に含まない、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液が、凍結防止剤をさらに含有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記乾燥させる工程の少なくとも一部の間、前記溶液の温度が０℃より低い、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥させる工程の少なくとも一部の間、該耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液の温度が０℃より低い、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記色素が、構造
【化２】
2006502735.tif 000013
を有し、ここで、
Ｒ２１は、Ｃ１〜５のアルキルであり；
Ｚ１は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素であり；
Ｒ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系であり；
Ｒ２９は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり；そして
Ｚ２は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン；４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記アクセプターが、４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記乾燥組成物が、２０重量％より少ない溶媒含量を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５２】
核酸基質における反応を実施する方法であって、該方法が、
（ａ）蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を含む容器を、提供する工程、ならびに
（ｂ）該容器に水性流体および核酸基質を添加する工程
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記反応が、核酸配列決定反応であり、ここで、前記方法が、核酸ポリメラーゼを用いて前記核酸基質にハイブリダイズしたプライマーを伸長する工程ならびに該核酸基質の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、前記乾燥組成物が、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをさらに含み、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、方法。
【請求項５８】
前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記乾燥組成物が、四種のヌクレオシド三リン酸をさらに含有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記乾燥組成物が、耐熱性核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記乾燥組成物が、グリセロールを実質的に含まない、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記乾燥組成物が、凍結防止剤をさらに含有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記色素が、構造
【化３】
2006502735.tif 000014
を有し、ここで、
Ｒ２１は、Ｃ１〜５のアルキルであり；
Ｚ１は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素であり；
Ｒ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系であり；
Ｒ２９は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり；そして
Ｚ２は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン；４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記アクセプターが、４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸基質が、細胞全体の溶解物由来の非濃縮核酸である、請求項５２に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞が、細菌細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が、動物細胞、真菌細胞、もしくは植物細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
請求項５２に記載の方法であって、ここで、前記核酸基質が、細胞全体の溶解物に由来し、かつ該細胞の溶解後直ちに、その細胞外抽出物における濃度に対して３倍以下に濃縮される、方法。
【請求項７７】
前記乾燥組成物が、２０重量％より少ない溶媒含量を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項７８】
核酸の配列を決定するためのキットであって、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を備える、キット。
【請求項７９】
前記ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一部である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記ヌクレオチドが、モノヌクレオチドである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８１】
前記ヌクレオチドが、チェーンターミネーターヌクレオチドである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８２】
請求項８１に記載のキットであって、前記乾燥組成物が、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをさらに含み、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結されており、ここで、該四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結されている、キット。
【請求項８３】
前記チェーンターミネーターヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
前記乾燥組成物が、四種のヌクレオシド三リン酸をさらに含有する、請求項８２に記載のキット。
【請求項８５】
前記乾燥組成物が、耐熱性核酸ポリメラーゼをさらに含有する、請求項７８に記載のキット。
【請求項８６】
前記ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記乾燥組成物が、実質的に、グリセロールを含まない、請求項７８に記載のキット。
【請求項８８】
前記乾燥組成物が、凍結防止剤をさらに含有する、請求項７８に記載のキット。
【請求項８９】
前記凍結防止剤が、トレハロースである、請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
前記凍結防止剤が、スクロースである、請求項８８に記載のキット。
【請求項９１】
前記色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含む、エネルギー転移色素である、請求項７８に記載のキット。
【請求項９２】
前記リンカーが、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
前記色素が、構造
【化４】
2006502735.tif 000015
を有し、ここで、
Ｒ２１は、Ｃ１〜５のアルキルであり；
Ｚ１は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素であり；
Ｒ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系であり；
Ｒ２９は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり；そして
Ｚ２は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素である、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
前記ドナーが、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である、請求項９１に記載のキット。
【請求項９５】
前記ドナーが、カルボキシフルオレセイン；４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である、請求項９１に記載のキット。
【請求項９７】
前記アクセプターが、４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
前記キットが、前記ヌクレオチドを含有する、３つ以上の実質的に同一の乾燥組成物を備え、該乾燥組成物が、固体支持体に規則的パターンで配置されている、請求項７８に記載のキット。
【請求項９９】
前記乾燥組成物が、２０重量％より少ない溶媒含量を含む、請求項７８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
ＤＮＡ配列決定は、生物学的調査、バイオテクノロジー、医療診断、法医学、および他の分野において、ますます重要となっている。ほとんどの配列決定は、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７；Ｓｌａｔｋｏら、１９９１）により行われる。配列決定反応は、通常、いくつかの液体アリコート：ポリメラーゼ、四種のデオキシヌクレオチド、四種のチェーンターミネーター、および時には、緩衝液もしくは他の成分の分配を含む。
【０００２】
配列決定は今日、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドターミネーターを、通常用いる。四種の蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドは、単一の反応混合物において使用され得、そして単一のレーンにおいて電気泳動により分光的に分離され得る。Ｂｅｒｇｏｔら、米国特許第５，３６６，８６０号参照。蛍光標識は、放射性標識よりも、ヌクレオチドの化学的変化に大きく貢献する。蛍光標識は、乾燥する工程の間、潜在的に傷害を受け得る複雑な基である。最近、エネルギー転移色素である改善された蛍光標識が、導入されている。Ｌｅｅら、米国特許第５，８００，９９６号；同第５，８６３，７２７号；同第５，９４５，５２６号および同第６，３３５，４４０号参照。エネルギー転移色素において、ドナー色素は、入射放射線を吸収し、そしてドナー色素に連結されたアクセプター色素へ、励起エネルギーを転移する。次いで、アクセプター色素は、ドナー色素の吸収ピークの波長よりも低いエネルギーの波長で、放射線を放射する。エネルギー転移色素は、配列決定反応において必要とされる四種の色素の、改善された蛍光収率およびより良い分光分解能を供給する。しかし、それらは、標準の色素よりも大きく、複雑な分子であり、したがって、より感受性であり得、乾燥もしくは他の環境ストレスにより傷害を受け得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
乾燥蛍光試薬を使用する、ＤＮＡ配列決定法、および（核酸の標識化を含む）他の核酸分析方法が必要とされている。ポリメラーゼおよび全ての試薬（四種の標識されたチェーンターミネーターを含む）を単一のウェルにおいて乾燥させ、ウェル間で溶液を移動させる必要を排除する方法もまた、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明の一つの実施形態は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を提供する。
【０００５】
本発明の別の実施形態は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を作製する方法を提供し、この方法は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液を乾燥させる工程を包含する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、核酸基質について反応を実施する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を含む容器を、提供する工程、ならびに（ｂ）この容器に水性流体および核酸基質を添加する工程。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、核酸の配列を決定するためのキットを提供し、このキットは、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方、ならびにジデオキシヌクレオチドおよび他のチェーンターミネーターヌクレオチドのような改変されたヌクレオチドを包含する。ヌクレオチドはまた、ポルヌクレオチド内のヌクレオチド残基を包含する。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、「蛍光色素」とは、蛍光によりその存在を検出し得る色素をいう。特定の実施形態において、本明細書中で使用される蛍光色素は、核酸配列決定に適切である。例えば、それぞれ異なる蛍光色素に連結された四種のチェーンターミネーターヌクレオチドを含有する組成物において、四種の蛍光色素の各々は、他の色素のピーク放出波長から分光的に分離可能な、ピーク放出波長を放出する。これらの色素はまた、いずれの色素からの放出のモニタリングをも妨害しない波長で、吸収し得る。
【００１０】
「溶液」とは、蛍光色素に連結されたヌクレオチドが、少なくとも部分的に溶解されている溶媒を含有する組成物、および／もしくは組成物の別の特定される成分が、少なくとも部分的に溶解されている溶媒を含有する組成物をいう。溶液はまた、懸濁しているか、沈殿しているか、さもなければ溶解していない他の成分を含み得る。溶液の一例は、水溶液である。
【００１１】
「溶媒」とは、乾燥組成物の成分が、溶解され得る物質をいう。溶媒は、昇華、蒸発、沸騰もしくは他の溶媒による抽出により乾燥組成物を作製するプロセスにおいて、実質的に除去され得る。溶媒の一つの例は、水である。
【００１２】
「乾燥組成物」とは、実質的に溶媒を含まない組成物をいう。特定の実施形態において、本発明の乾燥組成物は、２５重量％より少ない、２０重量％より少ない、１５重量％より少ない、１０重量％より少ない、７重量％より少ない、５重量％より少ない、３重量％より少ない、２重量％より少ない、もしくは１重量％より少ない溶媒総含量を有し得る。乾燥組成物中に存在する残りの溶媒は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドに錯化し得るか、または、糖質、タンパク質、塩、もしくは乾燥組成物の他の成分に錯化し得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「水溶液」とは、任意の量の（液体形態もしくは固体形態のいずれもにおいて）水を含有する組成物をいう。水性組成物はまた、水と混和可能なもしくは混和不可能な一つ以上の他の溶媒を含み得、それらの溶媒は、水性組成物中に、水よりも多い量もしくは少ない量で存在し得る。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「乾燥」とは、任意の手段による水もしくは他の溶媒の除去を言い、これらの手段としては、昇華、蒸発、沸騰、および溶媒抽出が挙げられる。
【００１５】
用語「核酸ポリメラーゼ」は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性もしくはＲＮＡ依存性（すなわち、逆転写酵素）であり得る。
【００１６】
用語「耐熱性核酸ポリメラーゼ」とは、５０℃で１０分間、適切な緩衝液中でのインキュベート後に、その活性の少なくとも９０％を維持するＤＮＡポリメラーゼをいう。特定の実施形態において、耐熱性核酸ポリメラーゼは、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、８０℃、もしくは９０℃で１０分間、適切な緩衝液中でのインキュベート後に、その活性の少なくとも９０％を維持する。
【００１７】
用語「Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ」（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼのようなＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの変異形態を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸基質」とは、化学反応もしくは酵素反応により改変される核酸、または化学反応もしくは酵素反応のための鋳型として役割を果たす核酸をいう。例えば、核酸配列決定反応において、ポリメラーゼにより伸長されるオリゴヌクレオチドおよび鋳型ヌクレオチドの両方は、この用語が本明細書中で使用される場合、「核酸基質」である。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「チェーンターミネーターヌクレオチド」とは、核酸ポリメラーゼにより伸長しているポリヌクレオチド鎖に組み込まれ得るヌクレオチドであって、かつヌクレオチドに組み込まれると、その３’末端にチェーンターミネーターヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼによる別のヌクレオチドの付加のための基質として役割を果たし得ないので、鎖を終結させるモノヌクレオチドをいう。代表的なターミネーターは、核酸塩基がプリン、７−デアザプリン、ピリミジン、通常の核酸塩基もしくはそれらの一般的なアナログであって、そして糖分子が、さらなる合成を妨害する３’−置換基を含むペントースであるターミネーター（例えば、ｄｄＮＴＰ）である。さらなる合成を妨害する置換基としては、アミノ基、デオキシ基、ハロゲン基、アルコキシ基およびアリールオキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なターミネーターとしては、糖リン酸エステル部分が、３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシリボース−５’−三リン酸もしくは２’，３’−ジデヒドロリボース−５’−三リン酸であるターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「エネルギー転移色素」とは、リンカーにより互いに結合されている二種の発蛍光団を含有する、色素をいう。通常、リンカーは、共有結合を形成する。ドナー発蛍光団は、励起エネルギーを吸収し、そしてアクセプター発蛍光団により吸収される波長を放出する。この光子の吸収後、アクセプター発蛍光団は、次いで、より長い波長を放出する。エネルギー転移色素の例は、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号および同第６，３３５，４４０号において見出され得る。
【００２１】
用語「凍結防止剤」とは、水溶液中に含まれる場合に、水溶液中に溶解されている酵素を、水溶液の乾燥もしくは凍結に起因する酵素活性の損失から防御する物質をいう。凍結防止剤の例としては、トレハロース、グルコース、スクロース、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびソルビトールのような糖質およびポリオールが挙げられる。
【００２２】
用語「不飽和五員環」、「不飽和六員環」、および「縮合環系」は、環原子が全て炭素である環系およびいくつかの環原子がヘテロ原子である環系を含む。環は、芳香族であっても、非芳香族であってもよい。用語「不飽和五員環」および「不飽和六員環」とは、環中に一つ以上の不飽和結合を有する部分をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「キサンテン色素」、「非対称ベンゾキサンテン色素」、「ローダミン色素」、「フルオレセイン色素」、「４，７−ジクロロローダミン色素」、「４，７−ジクロロフルオレセイン色素」、「カルボキシフルオレセイン色素」、「カルボキシローダミン色素」、「カルボキシＲ１１０色素」、「カルボキシＲ６Ｇ色素」、「カルボキシ−Ｘ−ローダミン色素」、「シアニン色素」、「フタロシアニン色素」、「スクアレイン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）色素」および「Ｃｙ５」は、参考として本明細書中において援用される、米国特許第６，３３５，４４０号において定義もしくは使用されるとおりである。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞全体の溶解物由来の非濃縮核酸」とは、細胞が溶解された後に、濃縮されていない、細胞全体の溶解物由来の核酸をいう。用語「非濃縮核酸」はまた、細胞全体の溶解後に、希釈された核酸も含む。
【００２５】
（説明）
本発明は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物に関する。本発明の乾燥組成物は、核酸配列決定反応のような核酸基質についての反応において使用され得る。配列決定反応において、本発明の乾燥組成物のいくつかの実施形態を用いることの利点は、乾燥組成物が、多量の鋳型の使用を許容すること、そしてそのために、より希釈された鋳型サンプルの使用を許容することである。この実施形態は、例えば、細胞全体の溶解物に直接由来する鋳型の配列決定を容易にする。細胞全体は、細胞のコロニーもしくは細胞の懸濁液に由来し得る。本発明の乾燥組成物によって、いくつかの実施形態において、鋳型は、細胞全体の溶解物の懸濁液から、濃縮することなく、より簡単に配列決定され得る。
【００２６】
本発明の乾燥組成物のいくつかの実施形態を用いることの別の利点は、配列決定反応のために必要とされる全ての成分が、単一の容器において乾燥され得ることである。本発明の特定の実施形態のこの局面は、時間を節約し、そして配列決定反応混合物に多数の成分を分配する工程において、実験者により生じ得るエラーを防ぐ。
【００２７】
本発明の乾燥組成物の特定の実施形態において、四種の異なる蛍光色素は、チェーンターミネーション配列決定反応における使用のために、例えば、四種の異なる２’，３’−ジデオキシヌクレオチドのようなチェーンターミネーターヌクレオチドに連結され、このチェーンターミネーション配列決定反応は、自動化蛍光検出核酸フラグメント分析器（例えば、ＡＢＩ  ３１００）により分析され得る。蛍光配列決定反応は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼを用いたサーマルサイクリングを含み得る。特定の実施形態において、鋳型以外および必要に応じて配列決定プライマー以外の、配列決定反応に必要とされる全ての成分（例えば、四種のヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、緩衝剤および塩、および必要に応じて、配列決定プライマー）は、四種の異なる色素に連結された四種のジデオキシヌクレオチドとともに乾燥させられ、マルチウェルプレートのウェルのような一つの容器において、単一の乾燥組成物を形成する。特定の実施形態において、この組成物はまた、トレハロースのような凍結防止剤も含む。次いで、水もしくは水溶液中の鋳型ＤＮＡ、および必要に応じて、配列決定プライマーは、ウェルに添加されて成分を再び懸濁し得、そして形成される懸濁液もしくは溶液は、配列決定反応において、直接使用され得る。別の例において、水（もしくは配列決定反応のために必要とされる他の成分を含有する水溶液）は、乾燥成分を再び懸濁するために使用され得、続いて鋳型ＤＮＡが添加され得る。
【００２８】
本発明の乾燥組成物は、予想外の安定性を示す。特定の実施形態において、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物は、２３℃で８週間（キャップされ、乾燥されそして光から遮光された）保存の後、実施例３に記載の核酸配列決定反応のような核酸配列決定反応において使用される場合、乾燥直後の対応する乾燥組成物または１週間、２３℃で保存後の対応する乾燥組成物、または全く乾燥されなかった対応する水性組成物の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の大きさの蛍光シグナル強度で、伸長されたポリヌクレオチド生成物を生成する。
【００２９】
蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物の一つの実施形態において、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部である。別の実施形態において、ヌクレオチドは、モノヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、モノヌクレオチドは、チェーンターミネーターヌクレオチドを含み得る。
【００３０】
一つの実施形態において、ヌクレオチドは、チェーンターミネーターヌクレオチドである。チェーンターミネーターヌクレオチドを含有する組成物の特定の実施形態において、組成物はまた、各々が蛍光色素に連結された、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドも含有し、ここで、チェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結される。特定の実施形態において、チェーンターミネーターは、２’，３’−ジデオキシヌクレオチドである。四種の蛍光色素に連結された、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドを有する組成物の一つの実施形態において、この組成物は、四種のヌクレオシド三リン酸をさらに含有する。
【００３１】
別の実施形態において、組成物は、核酸ポリメラーゼをさらに含有する。一つの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、耐熱性核酸ポリメラーゼである。ポリメラーゼが耐熱性である一つの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである特定の実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼである。一つの実施形態において、組成物は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび別の核酸ポリメラーゼを含有する。
【００３２】
一つの実施形態において、組成物は、凍結防止剤を含む。特定の実施形態において、凍結防止剤は、トレハロースもしくはスクロースである。
【００３３】
一つの実施形態において、組成物は、実質的に、グリセロールを含まない。特定の実施形態において、組成物は、グリセロールを含まない。組成物が実質的にグリセロールを含まない特定の実施形態において、組成物は、耐熱性核酸ポリメラーゼを含有し、そしてグリセロールの耐熱性核酸ポリメラーゼに対する比は、耐熱性核酸ポリメラーゼ一単位あたり、グリセロールが、２０μｇより小さく、１０μｇより小さく、５μｇより小さく、３μｇより小さく、１μｇより小さく、０．５μｇより小さく、もしくは０．１μｇより小さい。本明細書で使用される場合、核酸ポリメラーゼの単位は、３０分間に、その酵素にとって最適の温度および緩衝液条件で、１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを、酸不溶性物質に組み込む酵素量として、定義される。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの一単位は、３０分間に、７５℃で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および２００μｇ／ｍｌの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡ、ｐＨ８．８（２５℃で測定したｐＨ）中で、１０ｎｍｏｌのデオキシヌクレオチドを、酸不溶性物質に組み込む酵素量である。
【００３４】
本発明者らは、驚くべきことに、実質的にグリセロールを含まない乾燥組成物が、保存に対してより安定であり、核酸配列決定反応においてより強いシグナルを与え、そして核酸配列決定反応において、グリセロールを含有する匹敵する組成物よりも良好な配列決定の品質を与えることを見出した。理論により束縛されることを望むことなく、本発明者らは、グリセロールが周囲の水分を吸収し、そしてこのことが、乾燥組成物の成分（おそらく、ヌクレオチド、色素、もしくはヌクレオチドと色素との間のリンカー、または核酸ポリメラーゼの）を不安定化していると仮定する。例えば、吸収された水分により、水分中で溶解された塩もしくは緩衝液が、非常に高い濃度となる。高い塩濃度は、酵素を不安定化し得る。トリスのような緩衝剤は、しばしば、高濃度では、より低濃度で与えるｐＨと大きく異なるｐＨを与える。したがって、吸収された水分は、組成物に、組成物の成分を不安定化する極端なｐＨをもたせる。さらに、吸収された水分自体が、組成物の成分を不安定化し得る。それは、酵素の変性および加水分解、またはヌクレオチド、色素、もしくはリンカーの他の化学的改変を促進し得る。ほとんどの酵素がグリセロール中に保存され、そしてグリセロールは、透析、濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、もしくは他の手段によって除去され得ることが、留意されるべきである。
【００３５】
本組成物の一つの実施形態において、ヌクレオチドに連結された蛍光色素は、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含有するエネルギー転移色素である。特定の実施形態において、リンカーは、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系を含む。使用され得る五員環もしくは六員環の特定の例としては、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、およびオキサジンが挙げられるが、これらに限定されない。縮合環構造の例としては、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール、およびナフタレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本組成物の一つの実施形態において、蛍光色素は、構造
【００３７】
【化５】
2006502735.tif 000002
を有するエネルギー転移色素であり、ここで、
Ｒ２１は、Ｃ１〜５のアルキルであり；
Ｚ１は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素であり；
Ｒ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、不飽和五員環、不飽和六員環、もしくは縮合環系であり；
Ｒ２９は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり；そして
Ｚ２は、ＮＨ、硫黄、もしくは酸素である。
【００３８】
色素が、リンカーによりアクセプターに結合されたドナーを含有するエネルギー転移色素である本組成物の一つの実施形態において、ドナーは、フルオレセイン、ローダミン、もしくは非対称ベンゾキサンテン色素である。
【００３９】
特定の実施形態において、ドナーは、カルボキシフルオレセイン；４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である。
【００４０】
特定の実施形態において、アクセプターは、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である。アクセプターが、キサンテン、シアニン、フタロシアニン、もしくはスクアレイン色素である特定の実施形態において、アクセプターは、カルボキシフルオレセイン；４，７−ジクロロフルオレセイン；非対称ベンゾキサンテン；ローダミン；４，７−ジクロロローダミン；カルボキシローダミン；カルボキシＲ１１０；カルボキシＲ６Ｇ；もしくはカルボキシ−Ｘ−ローダミン色素；もしくはＣｙ５である。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を作製する方法であり、この方法は、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液を、乾燥させる工程を包含する。もし、乾燥組成物が、蛍光色素に連結されたヌクレオチドに加えて、他の成分を含有するなら、乾燥組成物を作製する方法において、乾燥組成物の他の成分はまた、一つ以上の溶液から乾燥され得る。蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液は、乾燥組成物の他の成分を含有する一つ以上の溶液の一つ以上と、同じであり得る。例えば、全ての成分が、乾燥される一つの溶液中にあり得、異なる成分が、一つの容器中で連続して乾燥される異なる溶液中にあり得、もしくは異なる成分が、異なる容器中で別々に乾燥される異なる溶液中にあり、そして続いて、乾燥成分が混合され得る。
【００４２】
乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、蛍光色素に連結されたヌクレオチドは、チェーンターミネーターヌクレオチドである。ヌクレオチドがチェーンターミネーターヌクレオチドである特定の実施形態において、この方法は、三種の他のチェーンターミネーターヌクレオチドをまとめて含む一つ以上の溶液を乾燥する工程をさらに包含し、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、蛍光色素に連結され、ここで、四種のチェーンターミネーターヌクレオチドの各々は、異なる蛍光色素に連結される。
【００４３】
乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、この方法は、四種のヌクレオシド三リン酸をまとめて含有する一つ以上の溶液を乾燥する工程を、さらに包含する。
【００４４】
乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、この方法は、核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥する工程をさらに包含する。特定の実施形態において、核酸ポリメラーゼは、耐熱性核酸ポリメラーゼである。ポリメラーゼが耐熱性である特定の実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００４５】
耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥する工程を包含する、乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、核酸ポリメラーゼを含有する溶液は、実質的に、グリセロールを含まない。必要に応じて、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液はまた、もしそれが別々の溶液であっても、実質的に、グリセロールを含まない。特定の実施形態において、乾燥前に、実質的にグリセロールを含まない出発溶液は、乾燥する工程の前に、２ｗ／ｖ％より少ない、１ｗ／ｖ％より少ない、０．７ｗ／ｖ％より少ない、０．３ｗ／ｖ％より少ない、０．２ｗ／ｖ％より少ない、０．１ｗ／ｖ％より少ない、もしくは０．０５ｗ／ｖ％より少ないグリセロールを含有するか、またはグリセロールを含有しない。
【００４６】
耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥する工程を包含する、乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液は、凍結防止剤を含有する。特定の実施形態において、凍結防止剤は、トレハロースもしくはスクロースである。
【００４７】
乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、水性組成物は、凍結防止剤をさらに含有する。特定の実施形態において、凍結防止剤は、トレハロースもしくはスクロースである。
【００４８】
乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、乾燥する工程の少なくとも一部の間の溶液の温度は、０℃より低い。耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液を乾燥する工程を包含する、乾燥組成物を作製する方法の特定の実施形態において、乾燥する工程の少なくとも一部の間は、耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する溶液の温度は、０℃より低い。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、核酸基質についての反応を実施する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する乾燥組成物を含む容器を、提供する工程、ならびに（ｂ）容器に水性流体および核酸基質を添加する工程。
【００５０】
反応を実施する方法の特定の実施形態において、この反応は、核酸配列決定反応であり、そしてこの方法は、耐熱性核酸ポリメラーゼを用いて、核酸基質にハイブリダイズしたプライマーを伸長する工程ならびに核酸基質の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定する工程を、さらに包含する。それにより、この反応は、蛍光色素を含有する、伸長された核酸生成物を形成する。特定の実施形態において、蛍光色素に連結されたヌクレオチドおよび耐熱性核酸ポリメラーゼを含有する乾燥組成物の、２３℃、８週間の（キャップされ、乾燥されそして光から遮光された）保存の後、この反応は、乾燥直後の乾燥組成物を用いて実施された同一の反応または２３℃で一週間保存した乾燥一週間後の乾燥組成物を用いて実施された同一の反応、または全く乾燥されなかった対応する水性組成物を用いて実施された同一の反応の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％の量の蛍光色素を含有する、伸長された核酸生成物を生成する。
【００５１】
核酸基質についての反応を実施する方法の特定の実施形態において、核酸基質は、細胞全体の溶解物由来の非濃縮核酸である。特定の実施形態において、細胞は、細菌細胞、動物細胞、真菌細胞、もしくは植物細胞である。非濃縮核酸は、細胞全体の溶解物の抽出物から、部分的に精製され得る。例えば、細胞溶解後、残屑は、遠心して除去され得る。所望されない成分はまた、例えば、沈殿により、もしくは固体基質への結合により、除去され得る。
【００５２】
別の実施形態において、核酸基質についての反応を実施する方法において使用される核酸基質は、細胞全体の溶解物に由来し、そして細胞の溶解後直ちに、細胞外抽出液におけるその濃度に対して３倍以下に濃縮される。例えば、核酸基質は、固体支持体に結合することにより、部分的に精製され得、そして次に、固体支持体から溶出され得、そして反応において使用され得る。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、核酸の配列を決定するためのキットを提供し、このキットは、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する、本明細書中に記載の乾燥組成物の一つを含有する。
【００５４】
特定の実施形態において、このキットは、蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する、三種以上の実質的に同一の乾燥組成物を備え、この乾燥組成物は、固体支持体上に一定のパターンで配置される。
【００５５】
必要に応じて、本発明の乾燥組成物は、空気交換を最低限にするためにキャップされ、乾燥され、そして光から遮光されて保存され得る。密封は、必ずしも絶対気密である必要はない。気体交換を最低限にすることは、十分であり得る。組成物はまた、アルゴンもしくは窒素のような不活性気体存在下で、保存され得る。
【００５６】
蛍光色素に連結されたヌクレオチドを含有する溶液を乾燥させるプロセスは、蛍光色素、ヌクレオチド、およびそれらの結合の安定性を維持する、任意の温度での任意のプロセスによっても行われ得る。同様に、核酸ポリメラーゼを含有する溶液および本発明のあらゆる他の成分を含有する溶液を乾燥するプロセスは、ポリメラーゼもしくは他の成分の安定性を維持する、任意の温度での任意のプロセスによっても行われ得る。「安定性の維持」によって、乾燥後、蛍光色素に連結されたヌクレオチド、ポリメラーゼ、およびあらゆる他の特定される成分が、核酸配列決定反応における使用のために、もしくは乾燥組成物の別の意図される使用において、まだ十分安定であることを意味する。溶液は、真空下で、風乾により、もしくは大気の下で不活性気体（例えば、窒素もしくはアルゴン）のような別の気体存在下、乾燥され得る。特定の実施形態において、溶液は、室温で、緩和な加熱により、もしくは低温で乾燥される。特定の実施形態において、溶液は、凍結され、そして次に、真空下で乾燥される（すなわち、凍結乾燥される）。乾燥させるプロセスは、組成物が、実質的に溶媒を含まなくなるまで続けられる。特定の実施形態において、乾燥させるプロセスの結果の乾燥組成物は、２５重量％より少ない、２０重量％より少ない、１５重量％より少ない、１０重量％より少ない、７重量％より少ない、５重量％より少ない、３重量％より少ない、２重量％より少ない、もしくは１重量％より少ない溶媒総含量を有し得る。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）として商業的に入手可能な、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼであった。
【００５８】
（実施例１−鋳型ＤＮＡと一緒にもしくは鋳型ＤＮＡなしで凍結乾燥した、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼ）
保存緩衝液（５０％ｗ／ｖグリセロール、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５％  ＴＷＥＥＮ  ２０、０．５％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）中の１０μＭ  Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼ溶液の１０μｌを、６μｌの１×緩衝液（８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、２．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および４μｌの１ｍＭ  ＦＡＳ１４（＋ＤＮＡサンプルおよびコントロール）もしくは水（−ＤＮＡサンプル）と混合した。ＦＡＳ１４は、鋳型ＤＮＡである。ＦＡＳ１４は、ヘアピンループを形成し、ポリメラーゼによりヘアピンループを伸長させる。
【００５９】
コントロールサンプルを、氷上に維持した。実験用の＋ＤＮＡサンプルおよび−ＤＮＡサンプルを液体窒素中で凍結し、そして次にＳＰＥＥＤＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ＳＶＣ  １００Ｈ）において、熱を加えずに乾燥させた。
【００６０】
コントロールサンプルおよび乾燥されたサンプルを、２ｍｌの１×緩衝液を用いてそれぞれ再構成し、そして６０℃で１０分間、インキュベートした。４μｌのＦＡＳ１４を−ＤＮＡサンプルに添加した。四種のｄＮＴＰ各々の２５ｍＭ溶液の８μｌを添加することにより、反応を開始した。５分後、５０μｌの６０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により、反応を停止させた。次に、伸長された生成物の存在について、サンプルを分析した。結果を以下に示す。
【００６１】
表１．凍結乾燥後のＴａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼ活性
【００６２】
【表１】
2006502735.tif 000003
この結果は、凍結乾燥されたＴａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼが、その活性の全てを保持したことを示す。酵素が鋳型ＤＮＡを伴って凍結されたかどうかにより、有意な差異は生じない。
【００６３】
（実施例２−エネルギー転移蛍光色素ターミネーターＤＮＡ配列決定キットへの、凍結乾燥および保存の影響）
ＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖｅｒｓｉｏｎ１．０（ＢＴＤキット）およびＴＭＡＮＯを添加したＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ１．０の配列決定サンプルを凍結し、そして１０μｌアリコートにおいて乾燥した。
【００６４】
配列決定サンプルを、４μｌのＴＡＱＦＳ／ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ  ＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸのプレミックスを用いて調製し、これに、水、プライマー、および必要に応じてトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）を添加し、１０μｌの最終容量とした。プライマーは、２１Ｍ１３プライマー（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’、配列番号：１）であった。存在する場合、ＴＭＡＮＯは、２Ｍの最終濃度であった。ＴＭＡＮＯは、変性タンパク質を元に戻すことを助けると報告されている。ＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ１．０は、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ピロホスファターゼ（ｐｙｒｏｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）、四種のｄＮＴＰローダミンアクセプター色素に連結されたフルオレセインドナー色素により標識された、四種のジデオキシターミネーターヌクレオチドを含有する。アクセプター色素は、ＡにはジクロロＲ６Ｇ、ＣにはジクロロＲＯＸ、ＴにはジクロロＴＡＭＲＡ、ＧにはジクロロＲ１１０である。
【００６５】
ＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸのプレミックスおよびプライマーおよび必要に応じてＴＭＡＮＯを含有する配列決定サンプルを、１０μｌアリコートにおいてドライアイス上で凍結し、そして次にＳＰＥＥＤＶＡＣで、熱を加えず、３時間、蒸発させて乾燥させた。
【００６６】
キャップされた（絶対気密ではない）バイアルで、乾燥されてそして光から遮光されて、室温で保存した翌日もしくは４５日後、乾燥された混合物を、４００ｎｇのｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）鋳型ＤＮＡを含有する１０μｌの水で再構成した。コントロール反応混合物を、凍結も乾燥もすることなく、配列決定反応において同様に使用した。配列決定反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００もしくは９７００で実施した。９５℃／１０秒、５０℃／５秒、そして６０℃／４分の２５サイクルを実施した。
【００６７】
サンプルを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にローディングした。シグナルを、ＤＹＥＳＥＴ  Ｅにより収集し、そして配列決定分析ソフトウェアにより分析した。結果を以下の表２に示す。
【００６８】
ＴＭＡＮＯなしの配列決定混合物は、ＳＰＥＥＤＶＡＣでの凍結および乾燥後、ほとんど完全な活性を保持した。ＴＭＡＮＯを混合物中に含めた場合、凍結および乾燥により、活性はわずかに多く損失した。しかし、ＴＭＡＮＯがあろうとなかろうと、乾燥された配列決定混合物は、４５日間の保存後、その約半分の活性を損失した。
【００６９】
表２．蛍光配列決定キットの凍結乾燥および室温での保存の、蛍光シグナル強度への効果
【００７０】
【表２】
2006502735.tif 000004
（実施例３−乾燥条件の比較）
ＤＮＡ配列決定におけるシグナル幅およびシグナルの質を最も良く保持させるための条件を同定するために、サンプルの乾燥を、種々の凍結防止剤および種々の乾燥条件を用いて試験した。
【００７１】
この実施例において、ＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用した。
【００７２】
配列決定サンプルを、３単位のＴａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ピロホスファターゼ、四種のｄＮＴＰ、および四種のＢＩＧＤＹＥジデオキシターミネーター（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰであり、それぞれ異なるエネルギー転移蛍光色素により標識されている）を含む、２μｌのＴＡＱＦＳ／ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ  ＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ３．０のプレミックスを用いて調製した。ＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ３．０において使用されたジデオキシターミネーターは、実施例２において使用されたｖ１．０において使用される色素とは、異なるエネルギー転移蛍光色素に結合されている。
【００７３】
２μｌのＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ３．０のプレミックスに、水、および必要に応じてプライマー、必要に応じてトレハロース、スクロース、もしくはグルコース、および必要に応じてトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）を添加し、５μｌの最終容量とした。プライマーは、２１Ｍ１３プライマー（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’；配列番号：１）であった。３．２ｐｍｏｌのプライマーを使用した。存在する場合、トレハロース、グルコースまたはスクロースは、２００ｍＭの最終濃度であった。存在する場合、ＴＭＡＮＯは、５００ｍＭの最終濃度であった。
【００７４】
５μｌの配列決定サンプルを、三種の方法で乾燥した：（１）凍結乾燥（ドライアイス上で凍結し、そして次に凍結乾燥機中で低温で乾燥させた）（２）加熱しないＳＰＥＥＤＶＡＣ乾燥（サンプルをドライアイス上で凍結し、次にＳＰＥＥＤＶＡＣで熱を加えずに乾燥させた。この処理において、サンプルは、乾燥の間に氷から液体になった。）（３）中程度に加熱するＳＰＥＥＤＶＡＣ乾燥（サンプルをドライアイス上で凍結し、次に中程度の加熱設定でＳＰＥＥＤＶＡＣで乾燥させた）（４）室温での風乾（風乾の前に、サンプルは凍結しない）。
【００７５】
乾燥後、サンプルを、２００ｎｇのｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）鋳型ＤＮＡを含有する５μｌの水により再構成した。
【００７６】
配列決定反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６００もしくは９７００で、９５℃／１０秒、５０℃／５秒、および６０℃／４分の２５サイクルで実施した。
【００７７】
サンプルを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にローディングした。全ての場合で、同じ体積のサンプルを配列決定機にローディングした。シグナルを、ＤＹＥＳＥＴ  Ｅにより収集し、そして配列決定分析ソフトウェアにより分析した。シグナルの質を、２０より大きいＰｈｒｅｄ２０スコアを有する塩基の数である、Ｐｈｒｅｄ２０スコアとして測定した。
【００７８】
結果を以下の表３〜６に示す。表４において、配列決定混合物は、乾燥前に体積の合計２μｌ（試薬は同じ濃度）であり、そして配列決定反応のために元の２μｌに再構成した。
【００７９】
【表３】
2006502735.tif 000005
【００８０】
【表４】
2006502735.tif 000006
【００８１】
【表５】
2006502735.tif 000007
【００８２】
【表６】
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表３のデータは、風乾の間もしくはＳＰＥＥＤＶＡＣによる室温での乾燥の間に、凍結防止剤を添加せずに乾燥したか、もしくはトレハロースを添加して乾燥されたサンプルについて、配列決定振幅にも配列決定の質にもほとんど差異はなかったことを示す。スクロースおよびグルコースを添加したサンプルは、風乾よりもＳＰＥＥＤＶＡＣ乾燥で、より良い性質を示した。
【００８３】
表４および５は、ＴＭＡＮＯ有りで、中程度の加熱設定でＳＰＥＥＤＶＡＣにより乾燥された反応混合物が、凍結防止剤を混合物に添加しない限り、質の低い配列決定結果を与えることを示す。トレハロースおよびスクロースは、グルコースよりも良い防御を与えた。グルコースはまた、凍結防止剤として、いくらかの効力を有していた。
【００８４】
表３の結果と表４および５の結果との比較は、より低温での乾燥は、ＳＰＥＥＤＶＡＣによる中程度の加熱での乾燥よりも効果的であったことを示す。表６において、凍結乾燥は、凍結防止剤の添加なしのサンプル、およびトレハロース有りのサンプルについて、ＳＰＥＥＤＶＡＣによる３時間の中程度の加熱での乾燥サンプルと比較される。凍結乾燥は、一般的に優れていることが明らかとなった。トレハロース有りのサンプルは、トレハロースなしのサンプルよりも優れた結果を与えた。
【００８５】
Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼに存在するグリセロールの結果として、配列決定サンプルは、最終濃度２．８％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含んでいた。しかし、表４、５および６の凍結防止剤なしの結果は、使用された濃度のグリセロールは、凍結防止剤として、特に効果的ではなかったことを示す。グリセロールを有するそれらの全てのサンプルが、完全に乾燥されたわけではないことが、留意された。乾燥後、サンプルは、乾燥粉末の代わりに、薄膜の形態である。グリセロールを除く効果を試験するために、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼを、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−１５遠心フィルターを通して、乾燥緩衝液で緩衝液交換した。乾燥緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ  ２０、１００ｍＭ  トレハロースであった。グリセロールを除去するための緩衝液交換の後、Ｔａｑ  Ｇ４６Ｄ  Ｆ６６７Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼを、グリセロールを欠くＴＡＱＦＳ／ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ  ＢＩＧＤＹＥ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ  ｖ３．０のプレミックスを調製するために、他の成分に添加し、これを、グリセロールを含有するプレミックスについて、上記に記載のように乾燥実験において使用した。結果を表７に示す。サンプルを、２００ｍＭのトレハロース有りでもしくはなしで、調製した。それらのサンプルを、凍結し、そして加熱せずにＳＰＥＥＤＶＡＣにより、中程度に加熱してＳＰＥＥＤＶＡＣにより、もしくは凍結乾燥機で（凍結乾燥）乾燥させた。トレハロース有りの凍結乾燥は、最も良い結果を与えた。しかし、全てのサンプルは、グリセロールなしでの乾燥後、良い配列決定結果を与えた。緩衝液交換ポリメラーゼにおけるトレハロースによって、表７における「水」のサンプルが、約１ｍＭのトレハロースを有することにもまた、留意されたい。
【００８６】
【表７】
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グリセロールの除去は、予想外に、優れた結果を与えた。グリセロールを透析した後に乾燥されたサンプルは、シグナル全体およびＰｈｒｅｄ２０スコアにより測定される場合、匹敵する条件において乾燥されているグリセロールを含有するサンプルよりも、良いシグナル強度および配列決定の質を有していた。
【００８７】
（実施例４−凍結乾燥後の保存についての、乾燥された配列決定混合物の安定性）
この実施例において、ＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ｖ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いた５μｌの配列決定反応混合物を、実施例３に記載のようにグリセロールなしで調製した。この配列決定反応混合物サンプルは、２００ｍＭのトレハロースおよび０．２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有していた。サンプルを、９６ウェル反応プレートに分配し、そして凍結乾燥機での凍結乾燥により乾燥させた。サンプルは、プライマー有りでもしくはプライマーなしで、乾燥させた。サンプルを、ＴＭＡＮＯを含まなかった。配列決定反応を、乾燥前、乾燥直後、または室温で、３７℃もしくは６０℃での８週間までの保存後に実施した。配列決定反応のシグナル強度およびＰｈｒｅｄ２０スコアを定量した。そして結果を表８および９に示す。
【００８８】
【表８】
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【００８９】
【表９】
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サンプルは、予想外に保存に対して安定であった。サンプルは、乾燥に起因するシグナル強度のいくらかの低下、および全ての温度での最初の週の保存におけるいくらかのさらなる低下を示した。しかし、その後は、それらのサンプルは、６０℃での８週間の保存後でさえも、未乾燥コントロールの約３分の２のレベルの安定したシグナル量を示した。配列決定の質はまた、６０℃での８週間の保存後でさえも安定しており、さらに、乾燥に起因する初期の低下も示さなかった。
【００９０】
引用文献：
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【００９１】
本明細書に参照される全ての参考文献は、参照によって参考として援用される。全ての本発明は、種々の特定の実施形態および技術に関して記載される。しかし、発明の意図および範囲から逸脱することなく、多くの変化および改変がなされ得ると考えられるべきである。
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月11日(2005.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006502735000001.app
【国際調査報告】
2006502735.tif 000016
2006502735.tif 000017