(57)【要約】【課題】  生物体の遺伝子間の関係を判断する方法を提供する。【解決手段】  経時変化発現データ及び線形微分方程式の組を用いて生物体の遺伝子間のネットワーク関係を推定するのに使用することができる方法の実施形態を提供する。Ａｋａｉｋｅの情報判断基準及びマスクツールを用いて、調査の条件下でどの要素がゼロ又は有意に変化しないかを判断することによりマトリックスの要素の数を低減することができる。提案されたネットワーク関係の有意性を評価するために最大尤度推定及び新しい統計的方法が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子間のネットワーク関係を推定する方法であって、
（ａ）生物体の一組の遺伝子に対して、該遺伝子の組の各遺伝子の発現の経時変化に基づく発現結果を含み、該遺伝子の相互の平均的影響及び各時間点の変動性の尺度を定量化する定量的経時変化データライブラリを準備する段階と、
（ｂ）ゼロの係数が除去された疎マトリックスを前記ライブラリから作成する段階と、
（ｃ）前記マトリックスから一組の線形微分方程式を生成する段階と、
（ｄ）前記方程式の組を解いてネットワーク関係を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ゼロの係数は、Ａｋａｉｋｅの情報判断基準（ＡＩＣ）を用いて識別されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微分方程式は、
【数１】
2006507605.tif 000069
であり、ここで、ベクトルｘ（ｔ）は、発現ｃＤＮＡの量を時間の関数として含み、マトリックス
2006507605.tif 000070
は、秒-1の単位を有する定数であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックスは、要素Λijを含み、
Λijは、遺伝子ｉに対する遺伝子ｊの影響を表し、
［Λij］-1は、前記遺伝子ｉへの遺伝子ｊの影響に対する反応時間を表すものである、
ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微分方程式の解は、
2006507605.tif 000071
であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記指数
2006507605.tif 000072
は、以下の式
【数２】
2006507605.tif 000073
によって解かれることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微分方程式は、以下の微分方程式
2006507605.tif 000074
を解くことにより推定されることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記疎マトリックスは、以下の式
2006507605.tif 000075
による推定誤差を更に含むことを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記誤差は、以下の式
【数３】
2006507605.tif 000076
による時間に独立な正規分布を有し、標準偏差σは、前記遺伝子の各々に対して常に等しいことを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分散σ2の最大尤度推定値は、以下の式
【数４】
2006507605.tif 000077
により、対数尤度関数をσ2に関して最大にすることによって判断することができることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記分散σ2は、以下の式
【数５】
2006507605.tif 000078
によって判断されることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＩＣは、以下の式
ＡＩＣ＝２・［推定モデルの対数尤度］＋２・［推定パラメータの数］
によって最小にされることを特徴とする請求項２から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
マスク
2006507605.tif 000079
は、以下の式
【数６】
2006507605.tif 000080
により、
【数７】
2006507605.tif 000081
のマトリックス要素をゼロに等しく設定するのに用いられ、ここで、○は要素毎の積を表し、マスク
2006507605.tif 000082
は、要素が１又はゼロのマトリックスであることを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
マトリックス要素は、以下の式
【数８】
2006507605.tif 000083
を最小にし、それによって最大尤度推定値
【数９】
2006507605.tif 000084
をもたらすことにより生成されたマスク
2006507605.tif 000085
を適用することによってゼロに設定されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＩＣは、以下の式
【数１０】
2006507605.tif 000086
によって最小にされることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記マスク
2006507605.tif 000087
は、ＡＩＣを最小にするように選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
媒体上に記憶された請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた遺伝子間のネットワーク関係の１つ又はそれ以上の結果を含む媒体。
【請求項１８】
ネットワーク関係の統計的有意性を判断する方法であって、
（ａ）各時間点で各遺伝子に対して発現の平均対数比を計算する段階と、
（ｂ）全ての測定値から標準偏差を計算する段階と、
（ｃ）同時確率を計算する段階と、
（ｄ）統計的有意性に対する判断基準を採用する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記段階（ａ）は、以下の式
【数１１】
2006507605.tif 000088
を用いて判断されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ｂ）は、以下の式
【数１２】
2006507605.tif 000089
を用いて判断され、ここで、ｘji［ｋ］は、遺伝子ｊに対する時間点ｉでの測定ｋのデータ値を表すことを特徴とする請求項１８又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
【数１３】
2006507605.tif 000090
が、測定値
【数１４】
2006507605.tif 000091
よりも絶対値で大きくなる同時確率は、以下の式
【数１５】
2006507605.tif 000092
を用いて計算され、ここで、ｅｒｆは誤差関数であることを特徴とする請求項１８から請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
有意性レベルαが選択されることを特徴とする請求項１８から請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｐｉ＜αの場合は帰無仮説を却下することを特徴とする請求項１８から請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｐ＜αnの場合は帰無仮説が却下され、ここで、ｎは遺伝子発現を評価する時間点の数であることを特徴とする請求項１８から請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ネットワーク関係の統計的有意性を判断する方法であって、
（ａ）各時間点での各遺伝子の発現の測定値の平均対数比を以下の式
【数１６】
2006507605.tif 000093
を用いて計算する段階と、
（ｂ）前記測定値の標準偏差を、ｘji［ｋ］が遺伝子ｊに対する時間点ｉでの測定ｋのデータ値である場合に、以下の式
【数１７】
2006507605.tif 000094
を用いて計算する段階と、
（ｃ）ｅｒｆが誤差関数である場合に、以下の式
【数１８】
2006507605.tif 000095
を用いて計算される、
【数１９】
2006507605.tif 000096
が、測定値
【数２０】
2006507605.tif 000097
よりも絶対値で大きくなる同時確率を計算する段階と、
（ｄ）帰無仮説を却下するか否かを判断するために、統計的有意性に対する判断基準を適用する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
Ｐ＜αnの場合に帰無仮説が却下され、ここで、ｎは遺伝子発現を評価する時間点の数であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
実質的に本明細書に説明したような遺伝子ネットワークを推定する方法。
【請求項２８】
実質的に本明細書に説明したようなネットワーク関係の統計的有意性を判断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）」の下で、２００２年１１月２５日出願の米国特許仮出願出願番号第６０／４２８，８２７号に対する優先権を請求するものである。この出願は、本明細書においてその全内容が引用により組み込まれている。
本発明は、生物体の遺伝子間の関係を判断する方法に関する。特に、本発明は、微分方程式の線形システムを用いて経時変化遺伝子発現データから遺伝子調節ネットワークを推定するための新しい方法を含むものである。
【背景技術】
【０００２】
生命科学、医学、薬剤の発見及び開発、及び薬品工業における現在の研究及び開発の最も重要な態様の１つは、大量の生データを解釈し、このようなデータに基づいて結論を導出する方法及び装置を開発する必要性である。生命情報科学は、システム生物学の理解に大きく貢献しており、生体系の構成要素間の複雑な関係の理解を更に深めるのに有望である。特に、発現遺伝子をすばやく検出し、遺伝子の発現を定量化するための新しい方法の出現と共に、生命情報科学は、特定遺伝子が有機体の生物学で果たす正確な役割を確実に知ることなく潜在的な治療ターゲットを予測するのに用いることができる。
【０００３】
遺伝子系のシミュレーションは、システム生物学の中心的問題である。シミュレーションは、生物学的知識に基づくことができるために、ネットワーク推定法は、予め分からない関係を予測又は推定することにより生物学的シミュレーションをサポートすることができる。
特に、マイクロアレイ技術の開発により、様々な生物体からの多くの遺伝子の発現の研究が可能になった。生物体からのいくつかの遺伝子から大量の生データを得ることができ、遺伝子発現は、突然変異、疾病、又は薬物の何れかで介入することによって研究することができる。特定の遺伝子の発現が特定の疾病で又は特定の介入に応答して増大することを見出すことにより、その遺伝子が疾病過程又は薬物反応に直接関わっていると考えることができる。しかし、生物学的な生物体では、多くの遺伝子が特定の介入により影響を及ぼされる可能性があるという点で、遺伝子がこのような介入のいずれによっても独立に調節されることはほとんどない。多くの異なる遺伝子がこのように影響される場合があるために、このような研究では、遺伝子間の原因及び結果の関係を理解することは非常に困難である。従って、遺伝子が生物学的現象の中心であり、遺伝子の発現が研究中の生物学的過程に対して末梢的であるところの遺伝子間の原因及び結果の関係を判断する方法の開発に多大な努力が為されている。このような末梢的遺伝子の発現は、生物学的又は病態生理学的状態のマーカとして有用である場合があるが、このような遺伝子が生理学的又は病態生理学的状態での中心的存在でない場合には、このような遺伝子に基づいて薬物を開発するように努めても報われないであろう。逆に、過程に中心的であると識別された遺伝子に対しては、薬物又は他の介入の開発は、遺伝子の発現の変化に付随する状態に対する治療の開発に決定的である場合がある。
【０００４】
マイクロアレイ技術により、遺伝子発現レベルを多数の遺伝子に対して同時に測定することができる。マイクロアレイ分析は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて容易に実行することができるが、ＲＮＡマイクロアレイを用いても遺伝子発現を研究することができる。使用可能な遺伝子発現データの量は急速に増大したが、このようなデータを分析する技術は依然として開発途中である。発現遺伝子間の関係を判断するのに、次第に数学的方法が用いられるようになってきている。しかし、遺伝子発現データから遺伝子調節ネットワークを正確に導出することは困難である可能性がある。
【０００５】
時間順遺伝子発現測定では、遺伝子発現の時間的パターンは、少数の時間点で遺伝子発現レベルを測定することにより調べることができる。例えば、周期的に変化する遺伝子発現レベルは、酵母菌「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」の細胞サイクルの間に測定されている（参考文献１参照）。ゆっくりと変化する環境への遺伝子応答は、同じ酵母菌のジオキシー遷移の間に測定されている（参考文献２参照）。生物体の環境の急激な変化に応答する時間的遺伝子発現パターンを測定した実験もある。一例として、外部光の強度が突然変化した後のシアノバクテリア「Ｓｙｆｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３」の遺伝子発現応答が測定されている（参考文献３及び４参照）。
【０００６】
発現データから遺伝子相互関係を推定するためのいくつかの方法が提案されている。クラスター分析（参考文献２、５、及び６参照）では、遺伝子は、遺伝子発現プロフィール間の類似性に基づいて群に分けられる。測定した遺伝子発現データからのブーリアン又はベイジアンネットワーク推定（参考文献７、８、９、１０、及び１１、及び本明細書においてその全内容が引用により組み込まれる米国特許出願出願番号第１０／２５９，７２３号及び代理人ドケット番号ＧＥＮＮ１００８ＵＳ１ＤＢＢの２００３年１１月１８日出願の「時系列遺伝子発現データからの遺伝子ネットワークの非線型モデリング」という名称の特許出願を参照）、並びに微分方程式の任意システムを用いる遺伝子発現データのモデリング（参考文献１２参照）がこれまでに開示されている。しかし、このような微分方程式の任意システムを確実に推定するためには、長い系列の時間順遺伝子発現データを必要とするであろうが、これは、多くの場合に現時点では未だ利用可能ではない。
【０００７】
【特許文献１】米国特許仮出願出願番号第６０／４２８，８２７号
【特許文献２】米国特許出願出願番号第１０／２５９，７２３号
【特許文献３】代理人ドケット番号ＧＥＮＮ１００８ＵＳ１ＤＢＢの２００３年１１月１８日出願の特許出願
【非特許文献１】Ｐ．Ｔ．Ｓｐｅｌｌｍａｎ、Ｇ．Ｓｈｅｒｌｏｃｋ、Ｍ．Ｑ．Ｚｈａｎｇ、Ｖ．Ｒ．Ｉｙｅｒ、Ｋ．Ａｎｄｅｒｓ、Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎ、Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、及びＢ．Ｆｕｔｃｈｅｒ：「マイクロアレイハイブリッド形成による酵母菌「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」の細胞サイクル調節遺伝子の包括的識別」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、第９巻（１９９８）、３２７３〜３２９７頁
【非特許文献２】Ｊ．Ｌ．ＤｅＲｉｓｉ、Ｖ．Ｒ．Ｉｙｅｒ、及びＰ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎ：「遺伝子規模での遺伝子発現の代謝及び遺伝子調節の調査」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７８巻（１９９７）、６８０〜６８６頁
【非特許文献３】Ｙ．Ｈｉｈａｒａ、Ａ．Ｋａｍｅｉ、Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ａ．Ｋａｐｌａｎ、及びＭ．Ｉｋｅｕｃｈｉ：「強い光に順化中のシアノバクテリアの遺伝子発現のＤＮＡマイクロアレイ分析」、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、第１３巻（２００１）、７９３〜８０６頁
【非特許文献４】Ｍ．Ｊ．Ｌ．ｄｅ  Ｈｏｏｎ、Ｓ．Ｉｍｏｔｏ、及びＳ．Ｍｉｙａｎｏ：「線形スプラインを用いる少数の組の時間順遺伝子発現データの統計的分析」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｉｎａｔｉｃｓ、近刊
【非特許文献５】Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎ、Ｐ．Ｔ．Ｓｐｅｌｌｍａｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎ、及びＤ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ：「ゲノム幅発現パターンのクラスター分析及び表示」、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ紀要、第９５巻（１９９８）、１４８６３〜１４８６８頁
【非特許文献６】Ｐ．Ｔａｍａｙｏ、Ｄ．Ｓｌｏｎｉｍ、Ｊ．Ｍｅｓｉｒｏｖ、Ｑ．Ｚｈｕ、Ｓ．Ｋｉｔａｒｅｅｗａｎ、Ｅ．Ｄｍｉｔｒｏｖｓｋｙ、Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ、及びＴ．Ｒ．Ｇｏｌｕｂ：「自己組織化マップを用いる遺伝子発現のパターンの解釈：造血分化への方法及び応用」、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ紀要、第９６巻（１９９９）、２９０７〜０２９１２頁
【非特許文献７】Ｓ．Ｌｉａｎｇ、Ｓ．Ｆｕｈｒｍａｎ、及びＲ．Ｓｏｍｏｇｙｉ：「遺伝子ネットワーク構造を推定するための一般リバースエンジニアリングアルゴリズム」、Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．ｏｎ  Ｂｉｏｃｏｎｉｐｕｔｉｎｇ紀要、第３巻（１９９８）、１８〜２９頁
【非特許文献８】Ｔ．Ａｋｕｔｓｕ、Ｓ．Ｍｉｙａｎｏ、及びＳ．Ｋｕｈａｒａ：「遺伝子ネットワーク及び代謝経路における定性的関係の推定」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１６巻（２０００）、７２７〜７３４頁
【非特許文献９】Ｎ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｍ．Ｌｉｎｉａｌ、Ｉ．Ｎａｃｈｍａｎ、及びＤ．Ｐｅ’ｅｒ：「ベイジアンネットワークを用いる発現データの分析」、Ｊ  Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．、第７巻（２０００）、６０１〜６２０頁
【非特許文献１０】Ｓ．Ｉｍｏｔｏ、Ｔ．Ｇｏｔｏ、及びＳ．Ｍｉｙａｎｏ：「ベイジアンネットワーク及びノンパラメトリック回帰の使用による遺伝子ネットワーク及び遺伝子間の機能的構造の推定」、Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．ｏｎ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ紀要、第７巻（２００２）、１７５〜１８６頁
【非特許文献１１】Ｓ．Ｉｍｏｔｏ、Ｓ．−Ｙ．Ｋｉｍ、Ｔ．Ｇｏｔｏ、Ｓ．Ａｂｕｒａｔａｎｉ、Ｋ．Ｔａｓｈｉｒｏ、Ｓ．Ｋｕｈａｒａ、及びＳ．Ｍｉｙａｎｏ：「遺伝子ネットワークの非線型モデリングのためのベイジアンネットワーク及びノンパラメトリック異分散回帰」、ＩＥＥＥ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ紀要（２００２）、２１９〜２２７頁
【非特許文献１２】Ｅ．Ｓａｋａｍｏｔｏ及びＨ．Ｉｂａ：「遺伝的プログラミングによる微分方程式としての生物学的ネットワークの進化的推定」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１２巻（２００１）、２７６〜２７７頁
【非特許文献１３】Ｔ．Ｃｈｅｎ、Ｈ．Ｌ．Ｈｅ、及びＧ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ：「微分方程式を用いる遺伝子発現のモデリング」、Ｐａｃ、Ｓｙｍｐ．ｏｎ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ紀要、第４巻（１９９９）、２９〜４０頁
【非特許文献１４】Ｒ．Ａ．Ｈｏｒｎ及びＣ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ：「マトリックス解析」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ケンブリッジ、英国（１９９９）
【非特許文献１５】Ｈ．Ａｋａｉｋｅ：「情報理論及び最大尤度原理の拡張」、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ、第４６号、統計数理研究所、東京（１９７１）、掲載：Ｂ．Ｎ．Ｐｅｔｒｏｖ及びＦ．Ｃｓａｋｉ（編）「２ｎｄ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．ｏｎ  Ｉｎｆ．Ｔｈｅｏｒｙ」、Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋｉｉａｄｏ、ブダペスト（１９７３）、２６７〜２８１頁
【非特許文献１６】Ｈ．Ａｋａｉｋｅ、「統計モデル識別における新しい視点」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ａｕｔｏｍａｔ．Ｃｏｎｔｒ．、ＡＣ−１９巻（１９７４）、７１６〜７２３頁
【非特許文献１７】Ｍ．Ｂ．Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ：「スペクトル解析及び時系列」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン（１９９４）
【非特許文献１８】「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｉｃａｄｏ）」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｍｉｇ．ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｂｄｓｉ／Ｍｉｃａｄｏ／
【非特許文献１９】Ｉ．Ｍｏｓｚｅｒ、Ｐ．Ｇｌａｓｅｒ、及びＡ．Ｄａｎｃｈｉｎ：「ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ：「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」ゲノムのための相関的データベース」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４１巻（１９９５）、２６１〜２６５頁
【非特許文献２０】Ｉ．Ｍｏｓｚｅｒ：「「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」の全ゲノム：塩基配列注釈からデータ管理及び分析まで」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３０巻（１９９８）、２８〜３６頁
【非特許文献２１】Ｔ．Ｗ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＪ．Ｄ．Ｆｉｎｎ：「データの新しい統計解析」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９６）
【非特許文献２２】Ｈ．Ｍａｔｓｕｎｏ、Ａ．Ｄｏｉ、Ｙ．Ｈｉｒａｔａ、及びＳ．Ｍｉｙａｎｏ：「生物学的経路のＸＭＬ文書化及び「Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｎｅｔ」でのそれらのシミュレーション」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１２巻（２００１）、５４〜６２頁
【発明の開示】
【０００８】
従来技術の欠点を克服するために、本発明のいくつかの態様では、微分方程式の線形システム及び遺伝子発現データから導出した情報を用いて遺伝子ネットワークを推定する方法が開発された。この手法は、微分方程式に固有の定量性及び因果関係の利点を維持しながら、計算的に扱いやすいほどに単純である。また、遺伝子調節ネットワークに関わる仮説を試験するための新しい方法が開発された。
特定の実施例を参照して本発明の態様を説明する。本発明の他の特徴は、図を参照することにより理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
線形微分方程式を用いる生物学的データのモデリングは、Ｃｈｅｎ（参考文献１３参照）により理論的に考察された。このモデルでは、ｍＲＮＡ及びタンパク濃度の両方が、線形微分方程式のシステムにより説明されている。このようなシステムは、以下のように説明することができる。
【００１０】
【数１】
2006507605.tif 000002
【００１１】
ここで、ベクトルｘ（ｔ）は、時間の関数としてｍＲＮＡ及びタンパク濃度を含み、マトリックス
2006507605.tif 000003
は、［秒］-1単位の定数である。この方程式は、レベルの数が２値の代わりに無限である、ブーリアンネットワークモデルの一般化と見なすことができる。
【００１２】
ｃＤＮＡマイクロアレイ実験では、対応するｍＲＮＡ濃度を測定することにより遺伝子発現レベルのみが判断され、通常、タンパク濃度は未知である。従って、本発明人は、遺伝子相互作用のみを示す微分方程式のシステムに着目する。次に、マトリックス要素Λijは、遺伝子ｉに対する遺伝子ｊの影響を表し、［Λij］-1は反応時間である。
測定したデータからこの微分方程式のシステムの係数を推定するために、微分方程式のシステムを離散化し、測定したｍＲＮＡ及びタンパク濃度を置換し、得られる方程式の線形システムを解いて線形微分方程式のシステムの係数Λijを見出すことが以前に提案されている（参考文献１３参照）。この方程式のシステムは、通常は過少決定システムである。遺伝子調節ネットワークは疎であるべきであるという付加的な要件を用いて、Ｃｈｅｎは、Ｏ（ｍh+1）の時間でモデルを構築することができることを示し、ここで、ｍは遺伝子数、ｈは、このシステムの各微分方程式に許された非ゼロ係数の数である（参考文献１３参照））。
【００１３】
２つの予想外の結果を有するパラメータｈを臨時に選択する。マトリックス
2006507605.tif 000004
の各行が正確にｈ個の非ゼロ要素を有することになるので、ネットワークの全ての遺伝子又はタンパク質がｈ個の親遺伝子又はタンパク質を有し、その結果、ネットワークの最上部には遺伝子もタンパク質も存在することができないことになる。第２に、全ての遺伝子が必然的にフィードバックループの一員であることになる。遺伝子調節ネットワーク内にフィードバックループが存在する可能性が高いが、人為的に生成されたものでなく測定されたデータからその存在を判断すべきである。
【００１４】
一方、ベイジアンネットワークには、ループが存在することができない。ベイジアンネットワークは、条件付確率分布の積に分解することができる推定ネットワークの同時確率分布に依存する。この分解は、ループが存在しない場合にのみ可能である。更に、ベイジアンネットワークは、多くのパラメータを含む傾向があり、従って、確実に推定するためには大量のデータが必要であることにも注意されたい。
【００１５】
従って、本発明人は、ネットワークのループの存在を考慮するが、必ずしも存在しなくてもよい方法を見出すことを目的とした。式１を用いて、システムに表れる可能性がある非ゼロ係数の数を制限することにより、疎マトリックスを構築した。臨時にこの数を選択する代わりに、Ａｋａｉｋｅの「情報判断基準（ＡＩＣ）」を用いて、データから相互作用マトリックスでどの係数がゼロであるかが推定され、遺伝子調節経路の数が各遺伝子に対して異なることを可能にした。
【００１６】
本発明の方法の態様を応用して、個々の遺伝子間のネットワーク、並びに遺伝子のクラスター間の調節ネットワークを見出すことができる。一例として、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」の経時変化データを用いて遺伝子のクラスター間の遺伝子調節ネットワークを推定することができる。クラスターは、ｋ平均クラスター化アルゴリズムを用いて作成することができる。クラスターの生物学的機能は、各クラスターに属する遺伝子の機能カテゴリから判断することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ベクトルｘ（ｔ）が時間ｔでのｍ遺伝子の発現比を含む微分方程式の線形システム（式１）により、ｍ遺伝子間の調節ネットワークを考える。この微分方程式のシステムは、以下のように解くことができる。
2006507605.tif 000005
ここで、ｘ0は時間ゼロでの遺伝子発現比を含む。この式では、マトリックス指数関数は、以下のようにテイラー展開によって定められる（参考文献４参照）。
【００１８】
【数２】
2006507605.tif 000006
【００１９】
式２が
2006507605.tif 000007
に非線型に依存するので、測定データｘ（ｔ）に関して
2006507605.tif 000008
を解くのは困難であることになる。微分方程式（式１）をＣｈｅｎ（参考文献１３参照）により考察された形の差分方程式
2006507605.tif 000009
又は
2006507605.tif 000010
で置換することにより近似解を見出すことができる。マトリックス
2006507605.tif 000011
が疎であることを統計的に判断するために、データに一定に存在することになる誤差ε（ｔ）が明示的に加えられる。
2006507605.tif 000012
この式を用いることにより、多次元線形マルコフモデルに関して有効に遺伝子調節ネットワークを説明することができる。
【００２０】
以下に示すように、誤差は、標準偏差σが常に全ての遺伝子に対して等しい、時間に独立な正規分布を有すると仮定することができる。
【００２１】
【数３】
2006507605.tif 000013
【００２２】
次に、ｎ時間点でｉ∈｛１，．．．，ｎ｝の時間ｔiでの一連の時間順測定値ｘiに対する対数尤度関数は、
【００２３】
【数４】
2006507605.tif 000014
【００２４】
であり、ここで、
【００２５】
【数５】
2006507605.tif 000015
【００２６】
は、測定データから推定した時間ｔiでの測定誤差である。
【００２７】
分散σ2の最大尤度推定値は、対数尤度関数をσ2に関して最大にすることにより見出すことができる。これによって、以下のようになる。
【００２８】
【数６】
2006507605.tif 000016
【００２９】
これを対数尤度関数（式８）に代入すると、以下が得られる。
【００３０】
【数７】
2006507605.tif 000017
【００３１】
マトリックス
2006507605.tif 000018
の最大尤度推定値
【００３２】
【数８】
2006507605.tif 000019
【００３３】
を見出すために、式９を用いて全二乗誤差
【００３４】
【数９】
2006507605.tif 000020
【００３５】
を以下のように書き、
2006507605.tif 000021
に関して微分する。
【００３６】
【数１０】
2006507605.tif 000022
【００３７】
すると以下のように
2006507605.tif 000023
に関する線形方程式が得られる。
【００３８】
【数１１】
2006507605.tif 000024
【００３９】
ここで、マトリックス
2006507605.tif 000025
及び
2006507605.tif 000026
は、以下のように定められる。
【００４０】
【数１２】
2006507605.tif 000027
【００４１】
誤差がない場合には、推定マトリックス
【００４２】
【数１３】
2006507605.tif 000028
【００４３】
は、真のマトリックス
2006507605.tif 000029
に等しい。生物学から遺伝子調節ネットワーク、従って
2006507605.tif 000030
が疎であることが公知である。しかし、推定マトリックス
【００４４】
【数１４】
2006507605.tif 000031
【００４５】
の全ての要素は、真のマトリックス
2006507605.tif 000032
内の対応する要素がゼロであっても、ノイズが存在するために非ゼロである場合がある。
【００４６】
いくつかの実施形態では、式１２で与えられる全二乗誤差の得られる増大が小さい場合は、マトリックス要素をゼロに等しく設定することができる。形式的には、以下のようなＡｋａｉｋｅの「情報判断基準」（参考文献１５及び１６参照）を用いて、どのマトリックス要素をゼロに等しくすべきかが判断されると考えられる。
ＡＩＣ＝２・［推定モデルの対数尤度］＋２・［推定パラメータの数］    （１６）
ＡＩＣを用いて、推定モデルの全誤差をモデルに用いたパラメータの数に比較することにより、モデルがデータに過適合するのを避けることができる。ＡＩＣが最低のモデルが最適であると考えられる。ＡＩＣは情報理論に基づいており、統計的モデル識別、特に時系列モデル当て嵌めに広く用いられている（参考文献１７参照）。
【００４７】
次に、マスク
2006507605.tif 000033
を用いて、
【００４８】
【数１５】
2006507605.tif 000034
【００４９】
のマトリックス要素を以下のようにゼロに等しく設定することができる。
【００５０】
【数１６】
2006507605.tif 000035
【００５１】
ここで、○はアダマール（要素毎の）積を表し（参考文献１４参照）、マスク
2006507605.tif 000036
は、その要素が１又はゼロのマトリックスである。対応する全二乗誤差
【００５２】
【数１７】
2006507605.tif 000037
【００５３】
は、式１２において、
【００５４】
【数１８】
2006507605.tif 000038
【００５５】
を
【００５６】
【数１９】
2006507605.tif 000039
【００５７】
で置換することにより見出すことができる。全二乗誤差は、マスク
2006507605.tif 000040
が与えられれば、以下の方程式の組を解くことにより最小にすることができ、
【００５８】
【数２０】
2006507605.tif 000041
【００５９】
これは、最大尤度推定値
【００６０】
【数２１】
2006507605.tif 000042
【００６１】
をもたらす。この式において、
2006507605.tif 000043
及び
2006507605.tif 000044
は、測定遺伝子発現レベルｘiを用いて式１４及び式１５から決められるものである。次に、式１１からの推定対数尤度関数を式１６に代入することにより、以下のように
2006507605.tif 000045
に対応するＡＩＣが計算され、
【００６２】
【数２２】
2006507605.tif 000046
【００６３】
推定パラメータは
【００６４】
【数２３】
2006507605.tif 000047
【００６５】
であり、マトリックス
【００６６】
【数２４】
2006507605.tif 000048
【００６７】
の要素は非ゼロとすることができる。この式から、二乗誤差が減少すると、非ゼロ要素が増大するにつれてＡＩＣが増大する可能性があることが分る。ここで、ＡＩＣの値を最小にするマスク
2006507605.tif 000049
を見出すことにより、遺伝子発現データから遺伝子調節ネットワークを推定することができる。
【００６８】
最も単純な場合を除くあらゆる場合に、可能なマスク
2006507605.tif 000050
の数は極めて大きく、網羅的に検索して最適なマスクを見出すことは実行不可能である。代わりに、貪欲検索法を用いることができる。最初に、各マスク要素に対して、ゼロ又は１に等しい確率で無作為にマスクを選択することができる。各マスク要素Ｍijを変化させることにより、ＡＩＣを低減することができる。ＡＩＣをそれ以上低減することができない最終的なマスクが見出されるまで、この過程を継続することができる。このアルゴリズムは、異なる（例えばランダム）初期マスクから出発して繰り返すことができ、これを用いて、対応するＡＩＣが最小になる最終的なマスク
2006507605.tif 000051
を判断することができる。この最適なマスクが数十の試みで見出されれば、これ以上優れたマスクは存在しないと合理的に結論することができる。
【００６９】
測定遺伝子発現データから微分方程式の線形システムの形で遺伝子調節ネットワークを推定する方法を説明して明らかにした。一般的に測定を行う時間点の数が制限されているために、遺伝子調節ネットワークを見出すことは、通常は過少決定問題である。生物学的には、得られる遺伝子調節ネットワークは疎であると予想されるために、マトリックスエントリのいくつかをゼロに等しく設定し、非ゼロエントリのみを用いてネットワークを推定する。非ゼロエントリの数、従ってネットワークが疎である程度は、何ら臨時パラメータを用いることなく、Ａｋａｉｋｅの「情報判断基準」を用いてデータから判断された。
【００７０】
微分方程式に関して遺伝子ネットワークを説明することには、少なくとも３つの利点がある。第１に、微分方程式の組は遺伝子間の因果関係を示し、係数マトリックスの係数Λijにより遺伝子ｉに対する遺伝子ｊの影響が決まる。第２に、明示的な数値の形で遺伝子相互作用が説明される。第３に、微分方程式のシステムには大量の情報が存在するために、それから他のネットワークの形を容易に導出することができる。更に、推定ネットワークを「Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｎｅｔ」（参考文献２２参照）のような他の分析又は視覚化ツールに関連付けることができる。
【００７１】
上述の方法では、ループを見出すことができないか（ベイジアンネットワークモデルにおけるように）、又は方法がネットワークに人為的にループを生成する。本明細書に記載の方法では、ネットワーク内にループを存在させることができるが、必ずしも存在する必要はない。ループは、データにより正当化された場合にのみ見られるものである。例えば、ＭＭＧＥ媒体内での「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」の経時変化データを用いて遺伝子クラスター間の調節ネットワークを推定する場合、クラスターのなかには、ループの一部であるものもあり、そうでないものもあることが見出されている（以下の実施例及び図２参照）。
【００７２】
遺伝子の数ｍが実験の数ｎに等しいか又はそれ以上の場合は、式１８のマトリックス
2006507605.tif 000052
は特異となる。次に、この問題は過少決定となり、相互作用マトリックス
【００７３】
【数２５】
2006507605.tif 000053
【００７４】
は、全誤差
【００７５】
【数２６】
2006507605.tif 000054
【００７６】
がゼロであり、ＡＩＣが−∞として見出される可能性がある。本発明の方法のこのような破綻は、十分に少数の遺伝子又は遺伝子クラスターに応用することによるか、又はネットワークの親の数を制限することにより避けることができる。
【００７７】
ネットワーク関係の統計的有意性を評価する方法
本発明の他の実施形態では、ネットワーク関係の分析の統計的有意性を判断する方法が提供される。帰無仮説下では、遺伝子が実験操作で影響されないと仮定することができる。従って、異なる時間点で測定した対数比は同等である。更に、対数比が平均値ゼロの正規分布を有すると仮定することができる。場合によっては、時間点毎にスチューデントのｔ検定のような統計的試験を行い、どの対数比がゼロと有意に異なるかを判断することになる。しかし、スチューデントのｔ検定は、数個の測定値しかないデータセットでは信頼が置けないことになる。従って、各時間点で２つの測定値のみを有するデータセットを含むいくつかの実施形態において、本発明人は新しい統計的試験を考案し、複数の時間点での測定値を組み込んでいる。特に、実施例２に示すように、本方法を８つの時間点全てのデータに応用した。本方法を他の種類の実験に用いることができることを認めることができ、それを本明細書において以下に説明する。
【００７８】
本方法を実施するための段階を以下に説明する。
段階１：各時間点で平均対数比を以下のように計算する。
【００７９】
【数２７】
2006507605.tif 000055
【００８０】
帰無仮説下では、
【００８１】
【数２８】
2006507605.tif 000056
【００８２】
（ある時間点での２つの遺伝子発現対数比の平均）は、ゼロ平均の正規分布と、推定標準偏差
【００８３】
【数２９】
2006507605.tif 000057
【００８４】
とを有するランダム変数である。
【００８５】
段階２：次に、全ての測定値（例えば、実施例１に含まれるデータセットでは８×２＝１６）から以下のように標準偏差を推定する。
【００８６】
【数３０】
2006507605.tif 000058
【００８７】
ここで、ｘji［ｋ］は、遺伝子ｊに対する時間点ｉでの測定ｋのデータ値を表すものである。
段階３：次に、
【００８８】
【数３１】
2006507605.tif 000059
【００８９】
が、測定値
【００９０】
【数３２】
2006507605.tif 000060
【００９１】
よりも絶対値で大きくなる同時確率は、以下のようになり、
【００９２】
【数３３】
2006507605.tif 000061
【００９３】
ここで、ｅｒｆは誤差関数である。この積の単一因子Ｐiに対して、通常は有意レベルαを選択し、Ｐi＜αならば帰無仮説を却下することになるであろう。
【００９４】
段階４：帰無仮説を却下するためのＰ＜αnという判断基準を採用する。これは、この遺伝子に対する全ての利用可能なデータを使用することにより、実験中に遺伝子の発現レベルが変化したか否かを判断することを可能にする。
段階５：遺伝子変化の発現レベルが有意であるか否かを判断する。
遺伝子間のネットワーク関係を判断する方法及び新しい統計的方法は、新しい診断を開発し、製薬産業でのリード化合物を選択するために、診断学を含む生物医学の研究に用いることができる。
【００９５】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態も開発することができ、本発明の方法及びその変形は、「Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ」及び他の生物体の異なる遺伝子の調節ネットワークを推定するために過度の実験を行うことなく用いることができる。全てのこのような実施形態は、本発明の一部と見なされるものである。
【実施例１】
【００９６】
「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」における遺伝子ネットワーク
遺伝子発現データを用いて遺伝子調節ネットワークを見出すための本発明の実施形態は、近年、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」のＭＭＧＥ遺伝子発現実験で測定された（参考文献１８参照）。ＭＭＧＥは、炭素及び窒素源としてグルコース及びグルタミンを含む合成最少培地である。この培地では、アミノ酸のような小分子の生合成に必要な遺伝子の発現が誘発される。この実験では１時間間隔の８つの時間点で４３２０個のＯＲＦの発現レベルを測定し、各時間点で２つの測定値を得た。
【００９７】
データ準備及び分析
データに存在する測定ノイズの影響を低減するために、測定した背景レベルに対して各遺伝子の発現レベルを比較した。赤又は緑チャンネルのいずれかで平均遺伝子発現レベルが平均背景レベルよりも低い遺伝子は分析から除去された。
次に、３８２３個の残存遺伝子に大域的正規化を行い、遺伝子発現比の底２の対数を計算した。測定した対数比に統計的試験を行い、ゼロと有意な差があるか否かを判断した。
【００９８】
上述の方法のための流れ図を以下の要約で再び説明する。
段階１：各時間点で各遺伝子に対して発現の平均対数比を計算する。
段階２：全ての測定値から標準偏差を計算する。
段階３：同時確率を計算する。
段階４：統計的有意性のための判断基準を採用する。
段階５：遺伝子変化の発現レベルが有意であるか否かを判断する。
この実施例では、予想される偽陽性の数（０．０００２５×３８２３＝１）が許容可能であるように有意レベルα＝０．０００２５を選択した。この判断基準を３８２３遺伝子に適用することにより、６８４遺伝子が有意に影響を受けることが見出された。
【実施例２】
【００９９】
「Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ」の遺伝子のクラスター化
続いて、ｋ平均クラスター化を用いて「Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ」の６８４遺伝子を５つの群にクラスター化した。遺伝子間の距離は、ユークリッド距離を用いて測定し、クラスターの重心は、クラスター内の全ての遺伝子の中央値によって定めた。クラスターの数は、有意な重複が避けられるように選択した。異なるランダム初期クラスター化から始めてｋ平均法アルゴリズムを１，０００，０００回繰返した。最適な解は８１回見出された。全てのクラスター化の結果は、「ｈｔｔｐ：／／ｂｏｎｓａｉ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／〜ｍｄｅｈｏｏｎ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｃｌｕｓｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ．」で入手可能である。
【０１００】
作成したクラスターの生物学的機能を判断するために、各クラスターの全ての遺伝子に対して「ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ」データベース（参考文献１９及び２０参照）の機能的カテゴリを考慮した。表１は、形成された５つのクラスターに対する主要機能カテゴリを列記するものである。
図１は、各クラスターに対して時間の関数として遺伝子発現の対数比を示すものである。クラスターＩ、ＩＩ、及びＶの発現レベルは、経時変化の間に相当変化するが、クラスターＩＩ及びＩＩＩは、かなり一定の発現レベルである。クラスターＩＶは、特に、他のクラスターに十分に適合しない遺伝子が割り当てられるキャッチオールクラスターと見なすことができる。
【０１０１】
（表１）
2006507605.tif 000062
【０１０２】
2006507605.tif 000063
【０１０３】
図１は、測定遺伝子発現データから判断された時の各クラスターに対する時間の関数としての遺伝子発現の対数比を示すものである。
【０１０４】
サブセクションネットワーク構築
これらの１２個の遺伝子の測定対数比から、マトリックス
2006507605.tif 000064
及び
2006507605.tif 000065
を構築し、マトリックス
【０１０５】
【数３４】
2006507605.tif 000066
【０１０６】
を計算した。マスク
2006507605.tif 000067
を計算する処理は、ランダム初期マスクから開始して１０００回繰返した。最適な解は５５回見出された。従って、ＡＩＣが小さい他のマスクが存在する可能性は小さい。可能性のあるマスクの合計数は、２25＝３３，５５４，４３２であることに注意されたい。
【０１０７】
見出されたネットワークを図２に示す。ネットワークのクラスターの親の数は、ゼロと５の間で変化する。クラスターＩＩＩ及びＩＶは、ネットワークの最上部に見られ、クラスターＩ、ＩＩ、及びＶは連結されてループになっている。このネットワークは、以前に提案された方法（参考文献１３参照）、又はベイジアンネットワークモデルのいずれによっても生成することができないことに注意されたい。
ネットワークの２つの最も強力な相互作用は、クラスターＩＶのそれぞれクラスターＶ及びクラスターＩＩに及ぼす正及び負の影響である。クラスターＩＩ及びＶの遺伝子発現レベルの反対の挙動は、クラスターＩＩとＶの間の直接相互作用ではなく、クラスターＩＶにより引き起こされる可能性が最も高い。
【０１０８】
図２は、ＭＭＧＥ経時変化データ及び本発明の方法から判断された５つの遺伝子クラスター間のネットワークを示すものである。この値は、１つの遺伝子クラスターが他の遺伝子クラスターにどれほど強い影響を及ぼすかを示しており、相互作用マトリックス
【０１０９】
【数３５】
2006507605.tif 000068
【０１１０】
内の対応する要素により与えられる。事実、このマトリックスは、遺伝子発現レベルが互いにどの程度迅速に応答するかを表すものである。一例として、クラスターＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの発現レベルが変化しなければ、クラスターＩの遺伝子発現レベルの変化により、１／（５．０時間-1）＝１２分以内にクラスターＶの発現レベルがかなり変化することになる。
【０１１１】
参考文献
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２２．Ｈ．Ｍａｔｓｕｎｏ、Ａ．Ｄｏｉ、Ｙ．Ｈｉｒａｔａ、及びＳ．Ｍｉｙａｎｏ：「生物学的経路のＸＭＬ文書化及び「Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｎｅｔ」でのそれらのシミュレーション」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１２巻（２００１）、５４〜６２頁、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｎｅｔ」：「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＧｅｎｏｍｉｃＯｂｊｅｃｔ．ｎｅｔ」で利用可能
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ」からの遺伝子の５つのクラスターの遺伝子発現の時間的グラフである。
【図２】本発明の方法を用いて導出した図１に示す遺伝子の５つのクラスターの遺伝子ネットワークを示す図である。
【符号の説明】
【０１１３】
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ  クラスター
【図１】
2006507605.tif 000098
【図２】
2006507605.tif 000099
【国際調査報告】
2006507605.tif 000100
2006507605.tif 000101