(57)【要約】  本発明は急性炎症性疾患の予防または治療のための方法であり、急性炎症性疾患の進行を阻害および／または低下させるために、医薬的に許容される物体の表面に存在するまたは存在し得る有効量のリン酸含有基を有する有効量の該物体を患者に投与することからなり、該リン酸含有基が複数のリン酸グリセロール基またはかかる基に変換し得る基を含み、該物体が約２０ナノメートル（ｎｍ）から５００マイクロメートル（μｍ）の大きさである、該物体の方法を提供する。
2006528136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物患者の急性炎症性疾患の予防薬または治療薬製造において、急性炎症性疾患の進行を阻害および／または低下させるために、医薬的に許容される物体の表面に存在するまたは存在し得る有効な数のリン酸含有基を有する有効量の該物体の使用であって、
該リン酸含有基が複数のリン酸グリセロール基またはかかる基に変換し得る基を含み、
該物体が約２０ナノメートル（ｎｍ）から５００マイクロメートル（μｍ）の大きさである該物体の使用。
【請求項２】
該急性炎症性疾患が少なくとも１つの炎症促進性サイトカインのアップレギュレーションを特徴とする、請求項１の使用。
【請求項３】
該炎症促進性サイトカインがＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１およびＩＬ−１２から選択される、請求項２の使用。
【請求項４】
該急性炎症性疾患が少なくとも１つの抗炎症性サイトカインのダウンレギュレーションを特徴とする、請求項１の使用。
【請求項５】
該抗炎症性サイトカインがＴＧＦ−β、ＩＬ−１０およびＩＬ−４から選択される、請求項４の使用。
【請求項６】
該抗炎症性サイトカインがＴＧＦ−βである、請求項５の使用。
【請求項７】
該物体がリン酸含有表面基以外に医薬的に活性なものが本質的にない、請求項１〜６のいずれかの使用。
【請求項８】
該リン酸グリセロール基が、該物体上の６０％〜１００％のリン酸含有表面基で構成される、請求項１〜７のいずれかの使用。
【請求項９】
該リン酸グリセロール基が式：
−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ
に相当する請求項１〜８のいずれかの使用。
【請求項１０】
該物体が式：
【化１】
2006528136.tif 000005
［式中、ＲおよびＲ１は独立して、飽和または不飽和で、直鎖または限られた数の分枝を含んだＣ１−Ｃ２４炭化水素鎖から選択され、少なくとも１つの鎖が１０から２４個の炭素原子を有する］
に相当するフォスファチジルグリセロールリン脂質の６０〜１００重量％の範囲で構成されるリポソームである、請求項１〜９のいずれかの使用。
【請求項１１】
該急性炎症性疾患が、環境アレルゲンとの表面接触からのまたはアナフィラキシーショックを通じての薬物からの急性アレルギー性反応または毒性反応である、請求項１〜１０のいずれかの使用。
【請求項１２】
該急性炎症性疾患がアレルギー性接触性皮膚炎または急性過敏症である、請求項１１の使用。
【請求項１３】
該急性炎症性疾患が急性神経炎症傷害である、請求項１〜１０のいずれかの使用。
【請求項１４】
該急性炎症性疾患が人工心肺手術による急性神経細胞傷害である、請求項１〜１０のいずれかの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、哺乳動物患者における急性炎症症状の軽減の方法および軽減のための組成物に関する。
【０００２】
（背景技術）
本明細書で用いられ、通常の医学用語により用いられる用語「急性炎症性症状」とは、急性に発症し、重症である炎症症状をいう。患者の通常状態から炎症症状の重篤な徴候が現れるまでの発症の期間は、約７２時間までの任意である。急性炎症性症状は、疾患がほとんど変化を示さないかまたはゆっくりと進む長期間の炎症性症状である慢性炎症性症状と対照的である。急性と慢性症状の区別は、たとえ数字による規定で素早く識別できなくても医学の専門家によく知られている。
【０００３】
多くの炎症性症状が哺乳動物の体内での様々なサイトカインの異常な分泌レベルに関与していることは知られている。専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、樹状細胞およびマクロファージに含まれ、抗原を活発に捕らえ処理し、細胞片を取り除き、瀕死細胞からの残渣を含む感染性の生物および瀕死細胞を取り除く。このプロセスの間、ＡＰＣは、抗原もしくは食菌された物質の性質に応じて、およびＡＰＣ成熟／活性化のレベルに応じて、炎症Ｔｈ１炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γなど）；または反応を抑える調節性のＴｈ２／Ｔｈ３抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＴＧＦ−βなど）のいずれかの生成を刺激し得る。
【０００４】
（発明の要約）
本発明は、リン酸グリセロールヘッド基を有する、リポソーム、ビーズまたは類似の粒子のような医薬的に許容される物体(body)が、哺乳動物患者に投与されて、ＴＧＦ−βのような抗炎症性サイトカインレベルの素早い上昇および／または逆にＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２のような炎症性サイトカインレベルの素早い降下を引き起こし、その効果は投与後最初の１２時間以内に著しくなる。したがってそれらは、急性炎症性疾患を治療し、および／またはかかる疾患に関連する症状を遅らせ、および／または改善するのに用いられ得る。
【０００５】
好ましい態様において、本発明は、変更されたサイトカインのプロファイルによって明らかにされるように、約２０ナノメートル（ｎｍ）から５００マイクロメートル（μｍ）の大きさの医薬的に許容される物体(body)を含む物(matter)の組成物を患者に投与することからなり、該物体が該物体の表面に存在するまたは存在し得るような相互作用または反応ができる有効な数のリン酸含有基を有する(carrying)ような、哺乳動物患者において素早い抗炎症性反応を示すプロセスについて述べる。該リン酸含有基は複数のリン酸グリセロール基またはかかる基に変更し得る基を含む。好ましくは、該物体はリン酸含有基以外に医薬的に活性なもの(entity)が本質的にない。哺乳動物への投与に続いて、リン酸グリセロール基を通して該物体は、サイトカインのプロファイルにおける変化で明らかなように、免疫系との素早く相互作用して、抗炎症性反応の素早い展開が生じると考えられている。
【０００６】
一つの態様において、本発明は急性炎症性疾患の予防または治療のための方法であり、急性炎症性疾患の進行を阻害および／または低下させるために、医薬的に許容される物体(body)の表面に存在するまたは存在し得る有効な数のリン酸含有基を有する(carrying)有効量の該物体を患者に投与することからなり、該リン酸含有基が複数のリン酸グリセロール基またはかかる基に変換し得る基を含み、該物体が約２０ナノメートル（ｎｍ）から５００マイクロメートル（μｍ）の大きさである、該物体の方法を提供する。
【０００７】
本発明は更に、急性炎症性疾患の進行を阻害および／または低下させるために、有効な数のリン酸グリセロール基またはかかる基に変換し得る基を有する(carrying)有効量の医薬的に許容される該物体(body)を患者に投与することからなり、複数のリン酸グリセロール基を含み、該物体が約２０ナノメートル（ｎｍ）から５００マイクロメートル（μｍ）の大きさである、急性炎症性疾患の治療方法について述べる。
【０００８】
適宜、上述の物体は、更に不活性な構成表面基および／または他のリン酸含有基のような構成表面基を含んでいてもよく、それらは例えばフォスファチジルセリンのように別のメカニズムと通して活性である。（例えば、Fadok et al., International Publication WO 01/66785を参照。）かかる構成表面基は、存在するなら、官能表面基の全量の約４０％以上からは構成されず、リン酸グリセロールを釣り合わせない。
【０００９】
別の態様として、本発明は、急性炎症性疾患の治療薬の製造において、急性炎症性疾患の進行を阻害および／または低下させるために、該物体(body)が約２０ナノメートル（ｎｍ）から５００マイクロメートル（μｍ）の大きさである、有効な数のリン酸グリセロール基またはかかる基に変換し得る基を有する(carrying)医薬的に許容される物体の使用を提供する。
【００１０】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明によれば、その表面にリン酸グリセロール基を有する(carrying)医薬的に許容される物体(body)は、炎症性サイトカインレベルの増加および／または抗炎症性サイトカインレベルの減少を伴って、急性炎症性疾患を患った患者に投与される。
【００１１】
本発明のプロセスで用いられる好ましい医薬的に許容される物体(body)には、典型的で、これのみではないが、扁円および扁長の回転楕円体、曲がりくねったもの、腎臓形のものなどを含む回転楕円体、円柱型、長円体である形を有する合成および半合成の物体を含み、好ましくは最も長い軸で計って直径が約２０ナノメートルから約５００ｐｍの大きさで、その表面にリン酸グリセロール基を含む。かかる合成および半合成物体は、以下に開示され、また例えば文献（Bolton et al. , U.S.S.N.: 10/348,600 および U.S.S.N.: 10/348,601：これらは本明細書にそのまま引用される）でもある。
【００１２】
医薬的に許容される物体(body)は、外面にあらかじめ決まっている特徴のリン酸グリセロール基を有する。いずれか１つの理論に制限されることなく、これらの基は、インビボで抗原を提供する細胞上、排他的にＰＳ受容体以外の適当な受容体との相互作用することができると考えられている。これらの基の構造は、合成的に改良され得、本来のリン酸グリセロール基の修正された型のすべてまたは一部が含まれる。例えば、リン酸グリセロール基のリン酸基の負電荷の酸素は、リン酸エステルヘッド基（例えば、Ｌ−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）（ＯＲ’’’）［式中、Ｌは以下に記載するリン脂質の脂質−グリセロール残基であり、Ｒ’は−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ’’’は１〜４個の炭素原子のアルキル、または２〜４個の炭素原子および１〜３個のヒドロキシル基のヒドロキシル置換されたアルキルであるが、但しＲ’’’はＲ’基よりも容易にインビボで加水分解される］）、二リン酸エステルを含む二リン酸基（例えば、Ｌ−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ”）２［式中、ＬおよびＲ’は上記と同義であり、各Ｒ”は独立して、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル、または２〜４個の炭素原子および１〜３個のヒドロキシル基のヒドロキシル置換されたアルキルであるが、但し第二のリン酸基［−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ”）２］は、Ｒ’基よりも容易にインビボで加水分解される］）、または三リン酸エステルを含む三リン酸基（例えば、Ｌ−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ”）ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ”）２［式中、ＬおよびＲ’は上記と同義であり、各Ｒ”は独立して、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル、または２〜４個の炭素原子および１〜３個のヒドロキシル基のヒドロキシル置換されたアルキルであるが、但し第二および第三のリン酸基はＲ’基よりも容易にインビボで加水分解される］）などに変換され得る。かかる合成的に改変したリン酸グリセロール基はインビボでリン酸グリセロールを発現でき、したがって、かかる改変した基はリン酸グリセロール可変基である。
【００１３】
フォスファチジルグリセロールは公知の化合物である。例えば、天然に存在するＰＧのカルジオリピンの二量体をホスホリパーゼＤで処理して生成できる。また、ホスホリパーゼＤを用いてフォスファチジルコリンから酵素的合成によっても製造できる（参照：例えば米国特許第5,188,951号Tremblay, et al.）。化学的にそれは、リン酸グリセロールヘッド基および類似しているが相異するＣ１８−Ｃ２０脂肪酸鎖を有する。
【００１４】
本明細書で用いられる用語「ＰＧ」とは、少なくとも１個の広範囲の脂肪酸鎖を有するリン酸グリセロール基を保有するリン脂質をカバーするが、但し、生じたＰＧ体はリポソームの構造の構成要素として関与し得ることを意図する。好ましくは、かかるＰＧ化合物は式Ｉ：
【化１】
2006528136.tif 000003
［式中、ＲおよびＲ’は独立して、Ｃ１−Ｃ２４炭化水素鎖（飽和または不飽和の、直鎖または少なくとも１個の鎖が１０〜２４個の炭素原子を有する制限された量の分枝を含む）から選択される］で表される。本質的に脂肪鎖ＲおよびＲ１は、活性な構成要素よりむしろリポソームの構造的構成要素を形成する。したがって、これらは、構造的機能を満たすことを条件に、同一または異なる２つまたは１つのかかる脂肪鎖を含むために変化し得る。好ましくは、脂肪鎖は、長さ約１０から約２４個の炭素原子で、飽和、モノ不飽和またはポリ不飽和の、直鎖または制限された量の分枝を含むものであり得る。ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、アラキジン酸（Ｃ２０）、ベヘン酸（Ｃ２２）およびリグノセラート（Ｃ２４）は、本発明に用いるＰＧのための有用な飽和脂肪鎖の例である。パルミトレイン酸（Ｃ１６）およびオレイン酸（Ｃ１８）は、適当なモノ不飽和脂肪鎖の例である。リノール酸（Ｃ１８）、リノレン酸（Ｃ１８）およびアラキドン酸（Ｃ２０）は、本発明のリポソームにおけるＰＧの使用のための適当なポリ不飽和脂肪鎖の例である。単一のかかる脂肪鎖を有するリン脂質は、本発明においても有用であり、リゾリン脂質として知られている。
【００１５】
本発明はまた、その中で活性成分がＰＧの二量体であるリポソームの使用をカバーすること、すなわち式Ｉの他の二量体でないカルジオリピンも適当であることを意図している。好ましくは、かかる二量体はマレイミドのような合成架橋剤と合成的に架橋せず、むしろ文献（Lehniger, Biochemistry, p. 525 (1970)）に記載され、以下の反応で図示しているようなグリセロールユニットの除去によって架橋される。
【化２】
2006528136.tif 000004
（式中、各ＲおよびＲ１は独立して、上記と同義である。）
【００１６】
いずれかの理論に制限されることないが上記で重ねて述べたように、ＰＧ基およびその二量体は、タンパク質または他の分子（「ＰＧ受容体」）上の特定の部位に結合すると考えられている、結果的にフォスファチジルグリセロールのこの分子（およびその二量体）が本明細書で時折「リガンド」または「結合基」として述べられているので、リガンドであると考えられている。かかる結合はリン酸グリセロール基 −Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨによって生じると考えられており、これらは本明細書では時折「ヘッド基(head group)」、「活性基」または「結合基」として述べられている。上記の観点から、本明細書で述べる「結合」、「結合基」または「リガンド」は、作用のメガにズムまたは様式を推断するものではない。それにもかかわらず、上記のリン酸グリセロールヘッド基は、患者の免疫系の構成成分と素早く相互作用するために、本発明の物体の外表面に存在すると考えられている。この相互作用は、抗原を提供する細胞上のフォスファチジルセリン受容体とのアポトーシス細胞の特定相互作用と同じではないことに留意すべきである。
【００１７】
「三次元物体(body)部分」または「医薬的に許容される物体(body)」の例には、医薬産業界で共通して用いられるような、天然または合成の生体適合性物質の、リポソーム、固体のビーズ、中空のビーズ、充填ビーズ、粒子、顆粒剤および微粒子のような生体適合性の合成または半合成のもの(entity)が含まれる。該ビーズは固体もしくは中空、または生体適合性物質で充填され得る。用語「生体適合性」とは、用いる量において、無毒性またはインビボでの使用が許容されるような許容毒性プロファイルを有する物質(substance)をいう。同様に、「医薬的に許容される物体(body)」に関連して用いられる用語「医薬的に許容される」とは、医薬的に許容される１またはそれ以上の物質(material)を含む物体(body)いう。かかる物体には、ＰＧの１つである、脂質で形成したリポソームが含まれ得る。あるいは、医薬的に許容される物体は、生体適合性物質の固体のビーズ、中空のビーズ、充填ビーズ、粒子、顆粒剤および微粒子であり、該生体適合性物質には、リン酸グリセロール基を有した、ポリエチレングリセロール、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンおよび他の天然、半合成および合成物質の広範囲のような１またはそれ以上の生体適合性物質が含まれる。
【００１８】
上記で述べたように、修飾した活性ヘッド基を有したフォスファチジルグリセロール類似体は、ＰＧまたは受診者の身体に素早い抗炎症性反応を生じる他のものと同じ受容体経路を通じて抗原を提供する細胞上のＰＧ受容体とも相互作用し、用語フォスファチジルグリセロールの範囲内であると考えられる。これには、これらに制限されないが、ヒドロキシル基および／またはリン酸基の１つまたはそれ以上が誘導体化されるか、塩の形体である化合物が含まれる。かかる化合物の多くは、投与してまたは投与後にインビボで遊離のヒドロキシル基を形成するので、従って変換できるリン酸グリセロール基を含む。
【００１９】
本発明のプロセスに用いられる物質の好ましい組成物は、様々な脂質から構成され得るリポソームである。しかしながら、好ましくは脂質はいずれも陽電荷でない。リポソームの場合、フォスファチジルグリセロールＰＧは、それのリン酸グリセロールヘッド基部分が外に提供され、脂質鎖が構造壁を形成するように、適応されたリポソーム層または壁の大部分または全部分を構成してもよい。
【００２０】
リポソームまたは脂質小胞は、ミクロンまたはサブミクロンの範囲でサックスシール(sealed sacs)され、それの壁（単層または多層）は適当な両親媒性物質からなる。本発明では内容物は重要でなく、一般的に不活性であるけれども、それらは水性の媒体を通常含んでいる。従って、好ましい態様においては、リポソーム、並びに他の医薬的に許容される物体(body)は、非脂質の医薬活性体が本質的になく（例えば＜１％）、より好ましいのは、非脂質の医薬活性体のないことである。かかるリポソームは、活性なヘッド基がリポソーム体の外に提供されるように、調製され、処理される。このようにして、本発明の好ましい態様のリポソームにおけるＰＧは、リポソーム自身のリガンドおよび構造の構成成分の両方として用いられる。
【００２１】
このように本発明の好ましい態様では、結合基として作用するために、その表面で１またはそれ以上のリン酸グリセロールヘッド基をさらすか、さらすように処理または誘導され得るリポソーム体を用いる。フォスファチジルグリセロールは、不活性な成分であるバランス成分（例えばフォスファチジルコリンＰＣ）、または異なるメカニズムで作用するバランス成分（例えばフォスファチジルセリンＰＳ）、またはそれらの混合物を含有する、リポソームの１０％〜１００％からなるべきである。
【００２２】
かかるリポソームの少なくとも１０重量％がＰＧを構成し、好ましくは５０％〜９５％、より好ましくは６０〜９０％、最も好ましくは７０〜９０％から構成され、最も好ましい態様の１点は、約７５重量％のＰＧで、バランス成分が好ましくはＰＣである。
【００２３】
不活性なリポソームとのおよび／または異なるメカニズムを通して作用するリン脂質のリポソームとのＰＧリポソームの混合物も、用いられ得る。
【００２４】
本発明に用いられる非リポソーム体に関しては、記載されているようなものには、生体適合性の個体または適当な大きさの空中のビーズが含まれる。生体適合性の非リポソームの合成または半合成物体は、その表面に結合するリン酸グリセロール基を有した、ポリエチレングリコール、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンおよび他の天然、半合成および合成物質の広範囲から選択してもよい。かかる物質には、特許文献（Dunn, et al. U.S. Patent 4,938,763、これは本明細書にそのまま引用される）に開示されているような生物分解性のポリマーが含まれる。
【００２５】
生物分解性ポリマーは、先行技術に開示されており、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリアンハイドライド、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカルボネート、ポリオルトカルボネート、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンシュウ酸、ポリアルキレンコハク酸、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、キチン、キトサン、およびコポリマー、ターポリマーおよびその組合せのような直鎖ポリマーが挙げられる。他の生物分解性ポリマーには、例えばゼラチン、コラーゲンなどが含まれる。
【００２６】
リン脂質またはヘッド基もしくは結合基を有したそれの部分と三次元物体に結合するための誘導体化のための適当な物質は、例えば、ポリサイエンシス社（Polysciences Inc., 400 Valley Road, Warrington, PA 18976）またはシグマアルドリッチファインケミカル（Sigma Aldrich Fine Chemicals）から購入可能である。誘導体化の方法は当該技術分野で公知である。かかる方法の具体的な好ましい例は、国際特許出願（PCT/CA02/01398 Vasogen Ireland Limited；これは本明細書に引用される）に開示されている。
【００２７】
患者は哺乳動物であり、ヒトに限らず、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなど家畜を含み得ることが考慮される。
【００２８】
リン脂質は両親媒性分子（すなわち両親媒性物質）であり、このことは該化合物が疎水性炭化水素鎖に結合する極性水溶性基を有する分子を含むことを意味している。マトリックスの層として用いられる両親媒性物質は、極性および無極性部位を定義する。両親媒性物質には、本発明に用いられるＰＧに加えて、活性なヘッド基を有する(carrying)リン脂質と共にまたは別のものと組合せて用いられる他の脂質が含まれ得る。リポソームの層として用いられる両親媒性物質は、不活性で、構造を与える(structure-conferring)合成化合物であり得、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステルおよびショ糖ジエステルである。
【００２９】
適当な大きさのリポソームの製造方法は当該技術分野で公知であり、本発明の部分を形成しない。様々な教科書および様々な主題の文献記事、例えば、レビュー記事［Yechezkel BarenholzおよびDaan J. A. Chrommelin著「Liposomes as Pharmaceutical Dosage Forms」］および本明細書に引用される文献、例えば［New, R. C.著「Liposomes : A Practical Approach」, IRL Press at Oxford University Press (1990)］を引例としてもよい。
【００３０】
本発明の好ましい態様の使用のために、リポソーム、並びに他の医薬的に許容される物体の直径は、約２０ｎｍから約５００μｍ、より好ましくは約２０ｎｍから約１０００ｎｍ、より好ましくは約５０ｎｍから約５００ｎｍ、最も好ましくは約８０ｎｍから約１２０ｎｍである（好ましくは最大軸で測定）。１つの態様では、リポソームの直径は６０ｎｍから５００μｍである。
【００３１】
医薬的に許容される物体は、医薬的に許容される担体、例えば滅菌生理食塩水、滅菌水、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リン酸緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝剤を含む滅菌水溶液）中、並びに医薬製剤に用いられる他の無毒性の融和基質、例えばアジュバント、緩衝剤、保存剤などと懸濁してもよい。好ましくは、医薬的に許容される物体は、緩衝生理食塩水のような滅菌生体適合性液体中の液体懸濁液中に構成され、１またはそれ以上の免疫系の構成成分にそれを曝すいずれかの適当な経路、例えば、動脈内、静脈内または最も好ましくは筋肉内または皮下注で患者に投与される。 
【００３２】
医薬的に許容される物体を本発明のプロセスで投与用に後に再懸濁し得るようにフリーズドライまたは凍結乾燥していてもよいと考えられる。凍結乾燥またはフリーズドライされた結合基を有する物体は、医薬的に許容される担体、例えば滅菌生理食塩水、滅菌水、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リン酸緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝剤を含む滅菌水溶液）中、並びに医薬製剤に用いられる他の無毒性の融和基質、例えばアジュバント、緩衝剤、保存剤などを含み得る。当該技術分野で公知のフリーズドライ用の保護剤、例えば乳糖またはショ糖も、含んでもよい。
【００３３】
医薬的に許容される物体を患者に投与する好ましい方法は、注射であり、好ましくは筋肉内または皮下で、１日２回、毎日、週数回、毎週または毎月患者に投与し、数日から数週間の範囲の期間にわたって投与される。投与の過程の頻度および期間は、患者の間で、並びに処置される急性の症状およびその重篤さによって変化し得る。その計画および最適化は在籍している医師の技術の十分範囲内である。筋肉内注射、特に臀部の筋肉からの注射が最も好ましい。本発明の適応の少なくともいくつかにおいて、一つの具体的な注射スケジュールは、臀部の筋肉を通して、適量の物体を１日目、更に２日目、および更に１４日目に注入し、次いで急性症状の再発の予防が適切なら、１月の間隔で「ブースター」注入がされる。
【００３４】
本発明の多くの態様において、リン酸グリセロールヘッド基を表面の結合基として含む医薬的に許容される物体は、ワクチンの場合と同様に、患者の免疫系の修飾因子として作用することが要求される。従って、それらは十分な量で、そして導入の部位での物体の十分な局在化した濃度を提供するための投与方法で、用いられる。免疫系修飾に十分なかかる物体の量は、受診者の身体の大きさに直接相関し得ず、従って、患者の血中および組織中での活性物質の治療レベルを提供するようにされている薬物の投与量とはっきり区別される。薬物投与量は従って、免疫系を修飾する投与量よりずっと多いようである。
【００３５】
リポソームの重さとリポソームの数の相関は、リポソーム形成技術の当業者に受け入れられている、直径１００ｎｍの二重層の小胞が小胞あたり８１，２３０の脂質分子を有し、二重層間で約５０：５０で分配するという知見から導き出せる［参照：Richard Harrigan著−１９９２年ブリティッシュ コロンビア大学ＰｈＤ学位論文「Transmembrane pH gradients in liposomes (microform): drug-vesicle interactions and proton flux」カナダ オタワのカナダ国立図書館で公開(1993)；University Microfilms order no. UMI00406756; Canadiana no. 942042220, ISBN 0315796936］。このことから、例えば、５×１０８個の小胞が４.０６×１０１３個の脂質分子に相当することが計算できる。グラム分子（ｍｏｌｅ）における脂質分子の数としてのアボガドロ数６.０２３×１０２３を用いて、これが、かかる投与量でＰＧの分子量７２９において約４.９２×１０−８ｇｍまたは４９.２ナノグラムのＰＧである６.７４×１０−１１ ｍｏｌｅを表すことを決定する。以下の具体的なインビボの実施例で用いられる用量のオーダーである６×１０５個の小胞の用量では、対応する計算で５.８９×１０−１１ｇｍまたは０.０５９ナノグラムの重さが出る。
【００３６】
投与される医薬的に許容される物体の量は、治療しようとする急性炎症性疾患の性質、並びに患者の個性および特性によって変化する。好ましくは、医薬的に許容される物体の有効量は、患者に対して無毒性で、免疫系を圧倒するほど多くないことである。医薬的に許容される物体の無菌水懸濁液を動脈内、静脈内、皮下または筋肉内投与使用する場合は、各投与につき約０.１〜５０ｍＬの液体を投与することが好ましい。好ましくは、ヒト患者への送達ごとの投与される物体の数は、約５００から約２.５×１０９（＜２５０ｎｇの物体、リポソームの場合、物体の他の態様の密度の差で比例分配）、より好ましくは約１，０００から約１，５００，０００，０００、更により好ましくは１０，０００から約１００，０００，０００、最も好ましくは約２００，０００から約２，０００，０００の範囲である。
【００３７】
医薬的に許容される物体は、本発明のプロセスの中で、免疫系修飾因子として、本質的にワクチンの範囲で作用すると考えられるので、各投与用の注入部位に投与されるかかる物体の数は、一個体の患者の体重当たり物体の数または重さより意味のある量であるかも知れない。同じ理由で、小動物使用での物体の有効量または数が、体重比に基づいて大型の哺乳動物（すなわち５ｋｇ超）の有効量に直接移行できないと今現在は考えられる。
【００３８】
本発明は、不適当なサイトカイン発現が含まれている急性炎症の哺乳動物疾患に対する治療または予防の方法である。これらの疾患は、炎症細胞（例えば、Ｔｈ−１細胞）から分泌されるサイトカインＩＬ−１β、ＩＦＮ−γおよび／またはサイトカインによって媒介される急性炎症が一般的に特徴である。かかる疾患の患者は治療のために選択してよい。
【００３９】
「治療（処置）」には、例えば、症状の数における縮小、特定の疾患の少なくとも１つの症状の重症度における減少、または特定の疾患の少なくとも１つの症状の更なる進行の遅延が含まれる。
【００４０】
本発明のプロセスが治療するか、または防御を助ける急性炎症性疾患の一例は、環境もしくは職場のアレルゲンまたはアナフィラキシーショックを通じての薬物との表面接触からの急性アレルギーまたは毒性反応である。かかる障害のより具体的な例には、アレルギー性接触性皮膚炎、急性過敏症および呼吸器のアレルギーが含まれる。
【００４１】
本発明のプロセスが治療するか、または防御を助ける急性炎症性疾患の第二の例は、急性感染が原因の疾患のような急性神経炎症傷害である。
【００４２】
本発明のプロセスが治療するか、または防御を助ける急性炎症性疾患の第三の例は、急性心筋梗塞である。
【００４３】
別の例は、人工心肺手術から生じた急性神経細胞傷害の予防または治療である。
【００４４】
本発明はまた、有害な化学含有環境および虫の群がった区域のような、急性炎症性疾患発生を導きそうな状態に遭遇する環境に入りそうなプレコンディショニングする個体にも有用であり得る。
【００４５】
本明細書に記載されている予防または治療方法は、１またはそれ以上の他の薬剤の使用を組み合わせて投与してもよい。他の好ましい様式の例には、これらに限らないが、非ステロイドおよびステロイド型の抗炎症剤が含まれる。組合せの投与には、例えば、他の１またはそれ以上の薬剤の投与の前、途中または後に、本明細書に記載された組成物の投与が含まれる。当業者は投与スケジュールおよび用量を決定できる。
【００４６】
実施例１
平均直径１００±２０ｎｍで、２５重量％フォスファチジルコリンおよび７５重量％ ＰＧ（フォスファチジルグリセロール）を含むリポソームを、当該技術分野で公知の標準的な方法により製造した。１ｍＬ中４.８×１０１４個のリポソームを含むリポソーム組成物のストック懸濁液をＰＢＳで希釈し、５０マイクロリットル当たり６×１０５個のリポソームを含む注射懸濁液を得た。該リポソームの懸濁液を、６〜８週齢の１９〜２３ｇの体重の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Jackson Laboratories）に注入し、急性ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）で引き起こされる炎症モデルであるマウスにおいて、リンパ節でのサイトカイン調節する効果を決定した。
【００４７】
これらの動物は２つのＡ群およびＢ群の１つに、各群２０匹を割り当てた。Ａ群は、ＰＢＳおよびＤＮＦＢの５０マイクロリットル注入の刺激剤の処置を受け、リポソームは受けていない正対照群であった。Ｂ群はＤＮＦＢで処置され、約６×１０５個の上記で示されたリポソームを含むＰＢＳの５０マイクロリットルの注入を受けた。
【００４８】
注入の直前、Ａ群およびＢ群の動物を５ ｍｇ／ｍｌペントバルビタール ナトリウム ０.２ ｍＬで腹腔内に麻酔した。マウスの腹部の皮膚を７０％ＥｔＯＨで噴霧し、メスの刃を用いて腹部から直径約１インチの体毛の断片を除いた。毛を剃った部位を次いで、ピペットの先端を用いて０.５％ ２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）のアセトン：オリーブ油（４：１）の溶液２５μｌで塗布した。
【００４９】
上記生成物を外側腓腹筋（右足）に注射で投与した。各群から注射２時間後４匹の動物を、６時間後更に４匹を、２４時間後更に４匹を、４８時間後残った４匹を屠殺した。各屠殺した動物から、注射をしたのと同じ側からの流入鼠径リンパ節を収集した。そのＲＮＡはリンパ節から抽出し、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２、並びに抗炎症性サイトカインであるＴＧＦ−βの発現のためのＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。結果は、１００％レベルで発現することが知られる標準的なレポーター遺伝子ＧＡＰＤＨと比較して測定した。
【００５０】
時間に対する様々なサイトカインについての、サイトカイン／ＧＡＰＤＨのデータは、添付の図面に表している。
【００５１】
図１はＴＮＦ−α測定に関する。これらを、２時間、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の時間ポイントでの時間に対して、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対する比として縦軸に表している。各ポイントは４つの測定の平均を表す。四角で表されたポイントの曲線はＢ群の動物、すなわち、本発明の好ましい態様に従って、刺激剤で処置し、リポソームを注入された動物から得られたものである。２時間でさえ有意に低く、１２時間でリポソーム剤なしに刺激剤およびＰＢＳを受けたＡ群の動物から得られた三角での曲線より顕著である（ｐ＝０. ０００１）。これにより、ＤＮＦＢの投与による結果としてアップレギュレートされた炎症促進性サイトカインのＴＮＦ−αが、リポソーム剤によって素早くダウンレギュレートされることが示される。このことは、哺乳動物患者における急性ＴＮＦ−α関連障害に立ち向かう本発明のプロセスの可能性を示している。
【００５２】
図２は同様に、別の炎症促進性サイトカインであるＩＦＮ−γの測定結果を表示している。ここでリポソーム製剤の効果は６時間で顕著で有意であり、２４時間（ｐ＝０.００２）および４８時間（ｐ＝０.０１１）でより明白となり、急性炎症性疾患、特にＩＦＮ−γが重要な役割となっている疾患の治療において、本発明の可能性の更なる表示となる。
【００５３】
図３は同様に、抗炎症サイトカインであるＴＧＦ−βの測定の結果を表示している。Ｂ群の動物の曲線は、刺激剤とその刺激剤の効果に立ち向かうためのリポソーム剤の両方を受けており、刺激剤を受けリポソーム剤を受けていないＡ群の動物の上記の曲線と一致している。１２時間および２４時間で、Ａ群の動物の結果（２４時間でｐ＝０.００１）と比較してＴＧＦ−βの大幅な増加があり、急性炎症性疾患の治療における本発明の好ましいプロセスによって、治療の可能性を明白に示している。
【００５４】
図４は同様に、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２の測定の結果を表示している。ここでは図３と比較すると逆の効果が観察されている。Ｂ群の動物の曲線は、Ａ群の動物の下記の結果（１２時間でｐ＝０.００１；２４時間でｐ＝０.０４２）と一致しており、測定の１２〜４８時間にわたってこの炎症促進性サイトカインの阻害またはダウンレギュレーションが示されている。
【００５５】
実施例２
Ｕ９３７は、ホルボールエステルの投与によってマクロファージ中に分化され得る単球の白血病細胞株である。グラム陰性細菌の細胞壁の構成物であるリポ多糖類（ＬＰＳ）でのこれらのマクロファージの処置は、炎症反応を刺激する。インビトロでの炎症性または抗炎症性サイトカインの測定によるこの炎症反応、およびこの反応における試験物質の投与の効果の判定は、試験物質の抗炎症性の特徴の測定を提供する。
【００５６】
Ｕ９３７細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地中の発育で培養した。これらは５×１０５細胞／ｍｌの濃度で６ウェルのプレートにシードした。これらは２〜３日間１５０ｎＭ 酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）で処置して、マクロファージ中に分化した。マクロファージが分化した後その細胞培地を交換し、ＰＭＡで誘導された遺伝子／タンパク質のいずれかのアップレギュレーションを減少させるように、リポソーム添加の前に２４時間完全培地で交換した。
【００５７】
標準サイズ１００±２０ｎｍのリポソームは、当該技術分野で公知の標準的な方法に従い、７５％フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）、２５％フォスファチジルコリン（ＰＣ）からなる１セットと１００％ＰＣからなる別のセットで製造された。１ｍＬ中２.９３×１０１４個のリポソームのストック濃度を用いた。これを１ｍＬ中２.９３×１０８個のリポソームの実施濃度にＰＢＳで希釈した。
【００５８】
分化したＵ９３７マクロファージはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下、ＰＧ／ＰＣリポソームの用量範囲で処置し、その他は同じ量のＬＰＳの存在下および不存在下でＰＣリポソームの類似の用量範囲で処置した。１８時間後、細胞上清を集めて、凍結し、続いてＴＮＦ−αを分析した。ＴＮＦ−αの測定はＲ＆Ｄシステムズから購入したクアンチキン エリサ キット(Quantikine Elisa kits)で行った。
【００５９】
添付した図面の図５はＰＧ／ＰＣリポソームおよび様々な投薬を用いて得られた結果の棒グラフである。縦軸はＴＮＦ−αの量である（ピコグラム／ｍｌ）。ＬＰＳが不存在のリポソームを用いた対照実験ではＴＮＦ−α含量を示さなかった。Ａの棒はＬＰＳのみの投与の対照実験である。他の棒は、ＬＰＳと共に細胞に投与されたリポソームのストック懸濁液の様々なマイクロモル濃度の結果を示す。結果は、１８時間後、急性炎症の本モデルにおいて炎症性サイトカインのＴＮＦ−αの有意な縮小を示し、アレルギー性反応から得られる皮膚の急性炎症性症状の治療においてこれらのリポソームの有用性が示唆される。添付された図面の図５Ａは同様に、ＰＣリポソームを用いた実験の結果を表し、これらのリポソームによって、あるとしても炎症性サイトカイン産生がほんのわずか減少するのみである。すべての場合に、データは４つの別の実験の中間値である。
【００６０】
実施例３
平均４月齢の雄のウィスターラット（バイオレソース ユニット，アイルランド ダブリン トリニティ大学）をこれらの実験に用いた。動物を１２時間の明暗周期の条件下４から６の群に収容し；周囲温度は２２℃と２３℃の間でコントロールされ、ラットは試験中獣医の監視下維持した。実験は健康と子供省(the Department of Health and Children)（アイルランド）で発行された許可証の下実施した。
【００６１】
ラットは４つの処置群に無作為に割り当てられた。これらの群の２つにおけるラットに、実施例３で用いたようにＰＧ／ＰＣリポソームと共に、麻酔前に１４日、１３日および２４時間に後ろ足上方に筋肉内で、ミル(mil)あたり６×１０６個の粒子のＰＢＳ中の懸濁液１５０マイクロリットルを注入した。コントロールラット群は同様に生理食塩水を注入した。麻酔は１.５ｇ／ｋｇでウレタンの腹腔内注入で行った。ペダルの反映がなくなったので、深い麻酔状態であると考えられた。麻酔が十分効いた後、リポソーム処置されたラットの一群および生理食塩水処置されたラットの一群はＬＰＳ（１００マイクログラム／キログラム）の腹腔内注入が施され、残りの２群は腹腔内に生理食塩水が施された。
【００６２】
麻酔から約６時間後、ラットを断頭して屠殺し、素早く脳を取り出した。海馬を全脳から切り離し、；横断片（３５０マイクロメートル四方）をマッキルベイン組織チョッパー（McIlwain tissue chopper）を用いて調製し、先に記載したように、分析するまで−８０℃で塩化カルシウムおよび１０％ ＤＭＳＯを含有するクレブス緩衝液中保存した（Haan, E. A. and Bowen, D. M., J. Ncurochem. 37, 243-246）。
【００６３】
ＩＬ−４濃度は海馬のホモジネート中で評価した。分析はＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）システムズで行った。海馬片は解凍し、氷冷のクレブス溶液中で３回すすいだ。ホモジネート中のタンパク質濃度を均等にし（Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254）、３つのアリコート（１００μｌ）をＥＬＩＳＡで用いた。値はホモジネート試料中のタンパク質濃度に補正し、タンパク質のミリグラムあたりのピコグラムとして表された。
【００６４】
添付した図面の図６は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−４の分析結果を図示している。ＩＬ−４濃度における有意な増加は、生理食塩水で対照とされるＬＰＳ処理されたラットと比較して、リポソームの前注入を受けたＬＰＳ処理されたラットからの海馬抽出物において観察される。このことは脳への虚血性傷害から生じる症状のような海馬の急性炎症性症状の予防または治療に本発明が使用できることを示唆している。
【００６５】
生理的組織において、抗炎症性サイトカインＩＬ−４のアップレギュレーションは、炎症サイトカインＩＬ−１βのダウンレギュレーションに相関している（参照、例えば、Goletti D, Kinter AL, Coccia EM, Battistini A, Petrosillo N, Ippolito G and Poli G, Cytokine, 2002 Jan. 7; 17 (1) : 28-35）。
【００６６】
実施例４
４０匹の雄のウィスターラットを４つの群の１つに割り当てた。第１群は生理食塩水処理だけを受け、第２群はリポソームだけを受け、第３群はＬＰＳだけを受け、そして第４群はＬＰＳおよびリポソームを受けた。注入は、実施例３で記載したようにそれぞれの物質の同量を用いて腹腔内で行った。第４群のリポソーム注入はＬＰＳの注入１時間前に行った。ラットは十分に認識している自分のケージに戻された。ラットは６時間後屠殺され、体の血液が集められ、血清が調製された。血清は公知の標準的な技術を用いてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）でＩＦＮ−γ含量を分析した。
【００６７】
血清中のＩＦＮ−γ測定の結果は、添付した図面の図７に図示している。本発明によるリポソームで前処置されたＬＰＳ処置群におけるＩＦＮ−γの濃度における有意な減少は、６時間後の血清において顕著である。このことは、全身急性炎症性症状の予防または治療に本発明が潜在的に使用できることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
添付の図面は、以下の実施例１の結果を図示し、本発明の好ましい態様に従って、ＤＮＦＢがリポソームを用いるマウス実験の接触性炎症反応モデルを誘発した。
より具体的には
【図１】図１は、時間に対する、動物のリンパ節におけるＴＮＦ−αサイトカイン生成のグラフである。
【図２】図２はサイトカインＩＦＮ−γの同様のグラフである。
【図３】図３はサイトカインＴＧＦ−βの同様のグラフである。
【図４】図４はサイトカインＩＬ−１２の同様のグラフである。
【図５】図５は、本明細書の実施例２における、マクロファージからのＴＮＦ−α濃度の図示である。
【図５Ａ】図５Ａは実施例２に詳述される比較実験の同様の図示である。
【図６】図６は、実施例３に従って処置されたラットからの海馬ＩＬ−４濃度の図示である。
【図７】図７は、実施例４に従って処置されたラットの血清のＩＦＮ−γ濃度の同様の図示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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