(57)【要約】実質的にすべての組織において蛍光タンパク質を発現するように改変された免疫無防備状態の齧歯動物を記載する。このような齧歯動物は遺伝子発現、腫瘍進行および血管新生のモデルとして有用である。第1の色の蛍光を発する異種組織を、実質的にすべての組織で第2の色の蛍光を発するように改変された宿主に移植するモデル系も与えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基本的にすべての組織において第1の蛍光タンパク質を発現するが、その免疫無防備状態の表現型は維持している、免疫無防備状態のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項２】
マウスである、請求項1に記載の齧歯動物。
【請求項３】
nu/nuマウスである請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
第１の蛍光タンパク質とは異なる発光スペクトルを有する第２の蛍光タンパク質を発現するよう改変された組織である、異種組織を移植された、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項５】
第１の蛍光タンパク質が緑色であり、第２の蛍光タンパク質が赤色である、請求項４に記載の齧歯動物。
【請求項６】
前記異種組織が腫瘍細胞を含んでなる、請求項４に記載の齧歯動物。
【請求項７】
前記腫瘍細胞が前記齧歯動物に同所移植される、請求項６に記載の齧歯動物。
【請求項８】
前記腫瘍細胞が腫瘍そのままの一部分である、請求項７に記載の齧歯動物。
【請求項９】
請求項６の齧歯動物を薬物と接触させること、前記第１および第２の蛍光タンパク質の発光を観察することによって腫瘍-宿主細胞相互作用を画像化すること、および結果として得られた画像を前記薬物と接触させなかった齧歯動物と比較することを含んでなる、薬物の腫瘍-宿主相互作用への影響をアッセイする方法。
【請求項１０】
前記観察が生きている無傷の動物の全身イメージングによる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
基本的にすべての組織で第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現し、前記第１蛍光タンパク質とは異なる発光スペクトルを有する第２の蛍光タンパク質を発現する異種組織の移植を受けた、トランスジェニック齧歯動物。
【請求項１２】
マウスである、請求項11に記載の齧歯動物。
【請求項１３】
第１の蛍光タンパク質が緑色であり、第２の蛍光タンパク質が赤色である、請求項１１に記載の齧歯動物。
【請求項１４】
異種組織が同系腫瘍細胞を含んでなる、請求項１１に記載の齧歯動物。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞が前記齧歯動物に同所移植される、請求項１４に記載の齧歯動物。
【請求項１６】
前記腫瘍細胞が腫瘍そのままの一部分である、請求項１５に記載の齧歯動物。
【請求項１７】
請求項１１の齧歯動物を薬物と接触させること、前記第１および第２の蛍光タンパク質の発光を観察することによって腫瘍-宿主細胞相互作用を画像化すること、および結果として得られた画像を前記薬物と接触させなかった齧歯動物と比較することを含んでなる、薬物の腫瘍-宿主相互作用への影響をアッセイする方法。
【請求項１８】
前記観察が生きている無傷の動物の全身イメージングによる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１の齧歯動物から組織を分離すること、およびそれを別の動物もしくは胚に移植することを含んでなる、第１の蛍光タンパク質を発現する細胞もしくは組織を増殖させる方法。
【請求項２０】
組織を連続して再分離し、別の動物もしくは胚に再移植することをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2003年2月7日提出の米国仮出願第60/445,583号の利益を請求する。この文書の内容は参考として本明細書に含めるものとする。
【０００２】
本出願は、免疫無防備状態を維持する一方で、複数の組織において蛍光タンパク質を可視的に発現する、胸腺欠損ヌードマウスを含めた免疫無防備状態のトランスジェニック齧歯動物の作製および使用に関する。こうした齧歯動物を、前記齧歯動物に存在する腫瘍ならびに転移、とりわけ選択的な発光スペクトルの蛍光タンパク質を供与された腫瘍の可視化を含めた、細胞および組織に関する全身の光学イメージングに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
基質なしで刺激となる照射のもとで発光する蛍光タンパク質は長年研究用ツールとして使用されてきた。もっともよく知られしかも最初に使用されたこのようなタンパク質が、発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）から単離された緑色蛍光タンパク質（GFP）であるが、広範な発光極大を示す多数の同様なタンパク質が他の起源から単離され、または合成によって得られており、その結果、歴史的用語であるGFPは赤、青および黄色を含めて目に見える色すべてのスペクトルに現れるタンパク質を表すように使用されてきている。たとえば、Delagrave, Sら、BioTechnology (1995) 13:151-154; Heim, Rら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:12501-12504を参照されたい。いくつかの生物を、このような蛍光タンパク質を発現するように改変することに成功している。上記は線虫Caenorhabditis elegans（Chalfie, Mら、Science (1994) 263:802-805）、キイロショウジョウバエDrosophila melanogaster（Wang, Sら、Nature (1994) 369:400-403）、ゼブラフィッシュ（Peters, K. G.ら、Dev. Biol. (1995) 171:252-257; Amsterdam, Aら、Dev. Biol. (1995) 171:123-129）、細胞性粘菌DictyosteliumおよびシロイヌナズナArabidopsis thaliana（Sheen, J.ら、Plant J. (1995) 8:777-784; Hu, W.ら、FEBS Lett. (1995) 369:331-334）を包含する。
【０００４】
Okabeら（FEBS Lett. (1997) 407:313-319）は、野生型GFPをpCAGGS（ニワトリβ-アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサー、β-アクチンイントロンならびにウシ グロビンポリアデニル化シグナルを含有する - Niwa, H.ら、Gene (1991) 108:193-199）内に挿入し、トランスジェニックマウス系統を作製した（Ikawa, M.ら、FEBS Lett. (1995) 375:125-128; およびIkawa, M., Dev. Growth Diff. (1995) 37: 455-459）。鮮やかな緑色発光が、上記トランスジェニックマウス系統のうち20を超える系統の筋肉および膵臓において観察されたが、GFP発現は常にどこにでも存在するわけではなく、他の組織では発光を肉眼で見ることはできなかった。しかしながら、改変型（EGFP）をこの発現系に使用したところ、そのトランスジェニックマウスは着床前の胚から成体段階に至るまで全身でEGFPトランスジーンを発現する。
【０００５】
緑色の雄の精子と受精した野生型卵は2細胞期には緑色でないが、その後、胚発生の次の段階の後に緑色となった。新生仔は緑色蛍光を発した。血管はEGFPを有する系統において「明らかな発色」と分類された。これらの動物の毛は緑色ではなかった。トランスジェニックマウスは毛および赤血球を除いて一様に緑色であった。脳、肝臓、腎臓、副腎および精巣、肺、筋肉、心臓、腸、ならびに脂肪組織、胸腺、脾臓および精細胞は青い励起光を照射したときに緑色蛍光を発した。
【０００６】
上記のトランスジェニックマウス系統は相当量のEGFPの発現にもかかわらず正常であった；したがってEGFPは無毒である。
【０００７】
本発明に記載の蛍光を示す免疫無防備状態の齧歯動物に関する一実施形態が、Yang, M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2003) 100:14259-14262 (11月25日発行) に報告されている。
【０００８】
本明細書において文書の引用は、いずれも関連先行技術であるとの自認を意図するものではない。日付に関するあらゆる記述、または文書の内容に関する説明は本出願人に入手可能な情報に基づいており、日付の正確さ、もしくは文書の内容に関する承認をなすものではない。
【発明の開示】
【０００９】
明らかでない理由によって、胸腺欠損nu/nuマウスのような免疫無防備状態のトランスジェニック齧歯動物はまれである。本発明はこのような免疫無防備状態の齧歯動物において蛍光タンパク質の生産を提供する。その結果得られた齧歯動物はin vivoでの細胞および組織のイメージングに有用であって、とりわけ移植された細胞もしくは組織、たとえば腫瘍のレシピエントとして有用であるが、これらは当該トランスジェニック齧歯動物のGFP発現細胞および組織を背景に観察されることになる。したがって、移植された細胞もしくは組織は、それに限定するわけではないが別の蛍光タンパク質のような、目に見える指標を発現する。移植された細胞もしくは組織は、本発明のトランスジェニック齧歯動物のGFP発現細胞および組織を背景として対比によって観察することもできる。移植された細胞もしくは組織は、その増殖特性および／または広がりをモニターすべき腫瘍細胞、またはそうでなければ癌性の細胞を包含することができる。
【００１０】
免疫無防備状態のトランスジェニック齧歯動物を使用して、宿主である齧歯動物の組織と移植された細胞もしくは組織との間の相互作用に対するさまざまな薬剤の効果をスクリーニングに使用することもできる。こうした薬剤の例としては、宿主-移植片相互作用を調節する、または移植された細胞もしくは組織の増殖および広がりを調節する、薬物もしくは候補薬物がある。
【００１１】
このような齧歯動物を、さらなる検討を目的とする、および／または別の動物もしくは胚への移植を目的とする、GFP発現細胞もしくは組織の供給源として使用することもできる。場合によっては、このような移植は事実上連続的であって、一実施形態として加齢を研究するために使用することができる。移植される細胞は胚性幹細胞および成体幹細胞を包含することができる。
【００１２】
ある実施形態において、GFPを発現する齧歯動物は、GFP発現マウスとnu/nuマウスとの初回交配によって得られた胸腺欠損nu/nuマウスである。そこで一代雑種(F1)を集め、相互に交配させてGFP発現nu/nuマウスを含めた子孫を生み出す。その後F1×F1交配から得られた雄および雌のGFP発現nu/nuマウスを用いて、GFP発現nu/nuマウス子孫を作り出す。これらの結果として得られたマウスをnu/nu GFP非発現nu/nuマウスと交配してGFP発現nu/nuマウスを維持することができる。
【００１３】
同様の戦略を用いて、他の免疫無防備状態の齧歯動物、たとえば免疫無防備ラットが得られるが、この場合免疫無防備な系統は、蛍光タンパク質を発現するように改変された正常な系統と交配される。
【００１４】
このように、ある態様において本発明は、免疫無防備状態の表現型を維持する一方で原則的にすべての組織において第1の蛍光タンパク質を発現する、免疫無防備トランスジェニックマウスに関する。別の実施形態において、本発明は、異種組織を移植された上記齧歯動物に関するが、前記異種組織は第1の蛍光タンパク質とは異なる発光スペクトルを有する第2の蛍光タンパク質を発現するよう改変されている。もう一つの態様において、本発明は、基本的にすべての組織において第1の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニック齧歯動物であって、前記第1の蛍光タンパク質とは異なる発光スペクトルを有する第2の蛍光タンパク質を発現する異種組織を移植されたトランスジェニック齧歯動物に関する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、第1の蛍光タンパク質を発現する齧歯動物であって、異なる色の第2の蛍光タンパク質を発現する腫瘍細胞を有する前記齧歯動物と接触することによって、腫瘍宿主相互作用に対する薬物の効果をアッセイする方法に関するが、この方法は前記齧歯動物を薬物もしくはプロトコールと接触させること、および宿主に含まれる腫瘍細胞への影響を観察することを含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、胸腺欠損nu/nuマウスのような、GFPを発現する免疫無防備状態の齧歯動物、ならびにそれらを作製し使用する方法に関する。この齧歯動物は基本的にすべての組織において、好ましくは発光を肉眼で見ることができるレベルで、GFPを発現する。それとは別にこの齧歯動物は免疫無防備状態、たとえば胸腺欠損nu/nuマウスであって、これをたとえば宿主として用いてヒト腫瘍組織の移植片もしくは他の異種移植片を受け入れることができる。
【００１７】
本明細書に記載されたのと同様の手法を用いて、GFPを発現する他の免疫無防備齧歯動物、たとえばラットが得られる。
【００１８】
「GFP」という用語は、緑色に見える蛍光タンパク質のみならず、一般に、入射励起光に反応して光を発する能力を有するいかなる色の蛍光タンパク質に対しても、便宜上頭文字として使用される。GFPが総称的な意味で使用されているのか、あるいは実際に緑色蛍光を認めるタンパク質を指して用いられているのかどうかは前後の文脈から明白であろう。
【００１９】
本明細書で使用される「GFP」は、どのような波長であれ蛍光を発する蛍光タンパク質および強化された形のGFP、ならびに発光オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質を表す。当業界で広く知られている、たとえば蛍光色素といった、目に見える指標で標識された移植された細胞もしくは組織の性状は、宿主において発現される蛍光タンパク質と比較して、移植される細胞もしくは組織において異なる色の蛍光タンパク質が使用されるように選択される。限定的でない例として、本発明のトランスジェニック齧歯動物において緑色GFPが発現されるならば、その場合移植される細胞もしくは組織は赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現することができる。
【００２０】
さらに、複数の細胞もしくは組織を移植する場合には、異なる色による標識が本発明によって与えられ、複数の細胞もしくは組織を同時に可視化、および／または追跡することを可能にする。限定的でない他の蛍光色の例は、黄、青および近赤外を包含する。他の蛍光指標の発現は状況に応じて個々の細胞型、遺伝子もしくは方法に特異的であってもよい。このような特異性を与える方法の限定的でない例は、蛍光指標をコードする配列を、細胞特異的なプロモーター、特定の活性化事象に対して反応するプロモーター、当該の特定の遺伝子発現を制御するプロモーター、および当該の細胞プロセスに含まれる遺伝子産物の発現を制御するプロモーターの調節制御下となるように機能的に連結することを包含する。
【００２１】
免疫無防備状態の齧歯動物を、GFPを発現する細胞および／または組織の供給源として使用することもできる。このような組織の限定的でない例は、胚もしくは胚組織；幹細胞、ならびに脳、肝臓、腎臓、副腎、精巣（精細胞を含める）、肺、筋肉、心臓、腸、卵巣および脾臓の細胞もしくは組織、ならびに脂肪組織を包含する。
【００２２】
宿主とは異なる発光スペクトルを有する蛍光タンパク質を含有するように改変された組織の移植は、免疫応答性被験体についても同様に、限られた範囲内で実施することができる。免疫応答性被験体において本発明の態様を実行するためには、移植される組織は同系でなければならず、あるいは観察を、移植片の拒絶を含めた、免疫応答もしくは他の反応の短期研究に制限しなければならない。
【００２３】
本発明の、トランスジェニックであってGFPを発現する免疫無防備状態の齧歯動物に話を戻すと、このような動物を使用して、可視化を記載するYangら（”Visualizing Gene Expression by Whole-Body Fluorescence Imaging.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97:12278-12282）によって示されたように、非侵襲的手法で遺伝子発現を可視化し、無傷の動物において導入遺伝子の発現を可視化することができる。そうしたシステムは、無傷の生きたマウスの主要な臓器において導入遺伝子発現の迅速な可視化を可能にするが、その可視化は簡単、迅速でしかも非常に割安である。GFPトランスジェニック動物を背景として、異なる色の蛍光タンパク質が脳、肝臓、膵臓、前立腺および骨髄といった細胞内に発現され、その蛍光は全身の光学画像として記号化される。限定的でない例として、透過照射エピ蛍光解剖顕微鏡を用いて高倍率のイメージングを行うことができる一方で、蛍光ライトボックス上で、さらに熱電冷却型カラー電荷結合素子（CCD）カメラによって直視して、またはもっと簡単なLEDベースの装置によって、低倍率のイメージングを行うことができる。
【００２４】
発現可能なベクターの媒介する、蛍光タンパク質をコードする核酸（たとえば、20-100μl PBSおよび10%グリセロール中の、蛍光タンパク質をコードするアデノウイルス発現系8×1010プラーク形成単位／mlであるがそれに限定されない）を、脳、肝臓、膵臓、前立腺もしくは骨髄といった組織内に直接注入することによって、蛍光トランスジェニック齧歯動物にテストされるべき発現系を供与することができる。注入後5-8時間以内に、脳のような組織内で発現されたGFPの蛍光が目に見えるようになり、全身画像がビデオの速度で記録される。GFP蛍光は少なくとも12時間増加を続け、4ヶ月に至るまで肝臓のような組織において検出可能な状態を保つ。外来の造影剤も放射性物質も長い処理時間も必要なしにリアルタイム記録をとることができる（この場合、ベクターのコードするGFPは齧歯動物組織において発現されるGFPと同じではない）。この方法は、調べられるべき、発現されるコード配列もしくはプロモーターがベクター媒介GFPと融合し、または機能しうるように結合していることのみを必要とし、それによって、比較的不透明な生物、もしくは本明細書の場合のような蛍光齧歯動物において、適当なタグを付けた遺伝子の治療上ならびに診断上の可能性に関する研究が可能になる。
【００２５】
別の態様において、全身の光学イメージングシステムを記載するYangら（”Whole-Body Optical Imaging of Green Fluorescent Protein-Expressing  Tumors and Metastases、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97:1206-1211）によって教示されるようにトランスジェニック齧歯動物を画像化して使用することもできる。このようなシステムは、これまでに例のない、細胞の増殖および広がりに関する連続視覚化モニタリングを与えるが、これは移植された（しかも場合によっては癌性の）細胞もしくは組織が示すものを包含し、この場合、無傷の動物体内で発現される異なる色のGFPによって標識される。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、蛍光齧歯動物は、生きた齧歯動物において増殖し転移する、移植された蛍光を発する腫瘍を含有する。このような腫瘍の限定的でない例は、Yangら（上記）に記載の非常に高レベルのGFPを安定して発現するヒトおよび齧歯動物の腫瘍を包含する。齧歯動物宿主において発現されるGFP以外のGFPを発現する腫瘍が使用される。上記のように、本発明の免疫無防備状態の蛍光齧歯動物がこの方法のために好ましく、結果として長期にわたって維持可能な、宿主の2重標識をもたらす；しかしながら、短期間の研究、もしくは齧歯動物に移植される齧歯動物腫瘍のように同系腫瘍を用いた研究のためには、たとえ免疫応答性トランスジェニック蛍光齧歯動物であっても、使用することができる。
【００２７】
限定的でない例として、B16F0-GFPマウス黒色腫細胞が6週齢の蛍光免疫無防備齧歯動物の尾静脈または門脈に注入される。全身の光学画像を用いて、たとえば脳、肝臓および骨に発現するような、転移病変が示される。B16F0-GFP細胞は容易に可視化され、上記器官のそれぞれにおいて腫瘍増殖のリアルタイムの定量的な測定を与える。
【００２８】
別の非限定的な例として、AC3488-GFPヒト大腸癌を外科的に同所移植することができる。全身光学画像を用いて、リアルタイムで、原発性大腸癌、ならびに肝臓および骨格におけるその転移病変の増殖を示すことができる。
【００２９】
本発明はまた、蛍光免疫無防備齧歯動物を用いて癌増殖のモジュレーターを同定し、またはスクリーニングする方法を提供する。ある実施形態において、可能性のある化学療法薬による阻害を確認するためにその方法を使用することができる。したがって、本発明の蛍光免疫無防備齧歯動物における腫瘍進行モデルが、トランスジェニック宿主によって与えられる背景の蛍光波長とは異なる波長の発光を示す蛍光タンパク質を発現する、癌細胞または腫瘍のそのままの一部分を好ましくは同所に移植することによって確立される。ひとたびモデルが確立されれば、候補となる化学療法薬またはプロトコールが宿主に与えられ、腫瘍の進行および転移に及ぼす影響が直接観察される。
【００３０】
Yangら（”Whole-Body and Intravital Optical Imaging of Angiogenesis in Orthotopically Implanted Tumors,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001) 98:2616-2621）によって教示されるように血管新生を画像化するために免疫無防備状態の蛍光齧歯動物を使用することもできる。したがって、本発明は腫瘍が引き起こす血管新生をアッセイする方法も提供するものである。こうした方法は、蛍光齧歯動物への移植のためにGFPで標識された腫瘍を使用することによって、同所移植モデルを血管新生の測定用に適合させるものである。宿主とは異なる色を発するGFPを使用することによって、宿主のGFP発現毛細血管が腫瘍の蛍光を背景として明確に可視化され、リアルタイムで、生体内でも、全身像によっても調べられる。好ましくは上記がヒトの腫瘍について実施され、本発明の免疫無防備状態の標識された宿主において、同所移植されたヒト膵癌の生体内画像が原発および転移部位に血管新生毛細血管を示すことが可能となる。血管新生の量的なタイムコースは、同所性に増殖するヒト前立腺腫瘍について測定することができ、19日間にわたって単一の齧歯動物の生体内で画像化される。
【００３１】
たとえば、蛍光性Lewis肺癌細胞を足蹠の皮下部位に注入することによって、腫瘍血管新生に関する全身の光学イメージングが示される。足蹠は比較的光透過性であって、内在する血管が比較的少なく、したがって無傷な動物において腫瘍血管新生の定量的なイメージングが可能となる。
【００３２】
もう一つの実施形態において、GFPを発現するヒト乳癌MDA-MB-435を脂肪体に同所移植することができるが、その後それを画像化して、20週間まで、またはそれを越えるような長期間にわたって連続的に血管密度の変化、特に増加を検出する。上記のように血管新生に対する薬剤の影響を観察することによって、このように効果的で臨床に適した血管新生ヌードマウスモデルを、生理的な微小環境において腫瘍血管新生を阻害または促進する薬剤のリアルタイムin vivo評価のために使用することもできる。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明の齧歯動物を、Yangら（”Direct External Imaging of Nascent Cancer, Tumor Progression, Angiogenesis, and Metastasis on Internal Organs in the Fluorescent Orthotopic Model,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2002) 99:3824-3829）によって記載されたのと同様に使用して、介在する組織、もっとも特徴的には皮膚、による光散乱に起因する外部イメージングの感度の限界を乗り越えることができる。したがって、本発明はシグナルの減衰を顕著に減少させ、検出感度を何倍にも高めるために光路に皮弁を切開することを提示する。観察可能な組織の深さが大きく増大し、以前は隠されていた多くの腫瘍が明瞭に観察可能となる。
【００３４】
皮弁は可逆的に開閉できる。一般的には、動物を麻酔した後、皮膚に円弧の形の切開を行い、皮下結合組織を分離して皮弁を開閉可能とする。皮弁は、縫合によって閉じることができる。このように、本発明は腫瘍モデル系の体内の器官に関して行う観察を提供する。
【００３５】
開放された皮弁から直接、標識された腫瘍細胞を観察できることは、本発明のモデル系の感度および解像度を大いに高める。このモデルを使用して、状況の進行を簡単にモニターすることができ、あるいは、まったく治療しない場合よりも否定的な結果をもたらしうる影響を評価するのはもちろん、可能性のある治療法を評価する手段としても使用することができる。この場合、化合物および／またはプロトコールが実験動物に与えられ、その化合物および／またはプロトコールの存在しない対照と比較される。腫瘍の進行、血管新生および／または転移を強めることは、その化合物および／またはプロトコールが当該被験体に対して有害であることを示し、同様に、上記の事項のいずれかを阻害することは、その化合物および／またはプロトコールを可能性のある治療法と認定する。
【００３６】
ある実施形態において、蛍光タンパク質を発現する単一の腫瘍細胞を脳に接種して、頭皮皮弁を通して画像化する。いくつかの細胞に相当する肺腫瘍の微小病巣が胸壁上の皮弁を通して見られる一方、対側転移は対応する皮弁を通して画像化される。膵臓腫瘍およびその血管形成微小血管は、腹膜壁皮弁を用いて画像化される。肝臓上の皮弁は、同所移植された腫瘍に由来する生理学的に関連性のある微小転移の画像化を可能にする。門脈内注入に起因する肝臓上の単一腫瘍細胞も検出可能である。2つの異なるGFPを発現する細胞もしくは組織、たとえば宿主組織と移植された組織、または2つの移植された組織、もまた皮弁を用いて可視化することができる。前立腺もしくは周辺領域の組織を可視化するために下腹部の皮弁を使用することが特に好ましい。
【００３７】
移植用の細胞または組織にGFPを与える方法は周知のことである。標準的な方法を用いて、腫瘍細胞に1または複数の蛍光タンパク質のための発現系を与えることができる。当該細胞にin vitroで形質導入し、in vitroもしくはin vivoで増殖させて腫瘍とし、その結果得られた腫瘍をモデル被験体に移植することができる。細胞を注入し、または外科的に移植することができる。腫瘍進行のモデルが求められる場合には外科的な同所移植が好ましい。しかしながら、蛍光タンパク質を安定して発現する、改変された腫瘍細胞をモデルに与える他の方法も使用することができる。さらに、宿主とは異なる発光のGFPタンパク質を発現させるために、動物内にすでに存在する腫瘍に感染させることによって、内因性腫瘍もしくは導入された腫瘍を有する本発明の齧歯動物にウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターを与えることができる。これは、たとえば米国特許第4,736,866号に記載の「オンコマウス（oncomouse）」のような腫瘍を生じやすい哺乳動物に関するモデルついて特に関連性がある。このベクターは、好ましくは、前から存在している腫瘍に局所的に直接導入される。
【００３８】
一般に、観察のために蛍光発光に依存する、腫瘍の進行、血管新生、および／または転移に関するモデルはいずれも、本発明の蛍光齧歯動物および方法とともに使用することができる。
【００３９】
多くの場合、単一腫瘍の転移を観察するために単一色が用いられる。しかしながら、本発明の方法はそれぞれ異なる色の蛍光タンパク質で標識された2個以上の腫瘍を同時に観察することを包含する。この方法を利用することによって、複数の腫瘍進行に関する複数の観察が得られるのみならず、それぞれの腫瘍の他に対する効果もしくは干渉を直接観察することもできる。
【００４０】
本発明の方法は多くの利点を有する。第1に、感度が高まったことによって、蛍光を発する宿主細胞および組織を背景として、わずかに１もしくは2つの移植細胞の観察が可能となる。第2に、血管新生が直接観察可能であって、これは化合物およびプロトコール案の治療上の有効性を評価する際にきわめて重要である。第3に、複数の移植された組織（たとえば腫瘍）を同時に観察することが可能である。このことは、異なる組織もしくは腫瘍の間に干渉現象があるために、特に重要である。複数の異なる色を使用することができるため、別々の組織もしくは腫瘍の相互作用を直接観察することができる。第4に、免疫無防備状態の蛍光齧歯動物において相当長期間にわたって観察を行うことが可能であるため、活発に増殖する細胞と休止細胞を区別することができる。したがって、本発明の方法によって休止細胞の存在を確定することができる。
【００４１】
もう一つの態様において、ヌードマウス組織のGFPを背景として画像を生じさせるために、蛍光を発する宿主に、検出可能な、好ましくは肉眼で見える、化合物を注入することができる。限定的ではない例として、目に見える指示薬、たとえば色素を本発明のマウスの血流に注入して循環系のすべてもしくは一部を可視化することができる。これは、齧歯動物の赤血球が目に見えるGFPを発現せず、血流が検出可能な発光のない状態となっている場合に特に適している。
【００４２】
下記の実施例は本発明を説明するために与えられるものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００４３】
GFP発現ヌードマウスの作製
C-57 B6-GFPマウス（Okabe, Mら、FEBS Lett (1997)467:313-319）をnu/nuマウスと交配した。C-57 B6-GFPマウスは、大阪大学微生物病研究所から入手した。このマウスは、ニワトリβ-アクチンプロモーターおよびCMVエンハンサーの制御下で発光オワンクラゲ（A. victoria）GFPを発現した。赤血球および毛を除いてすべての組織が励起光のもとで緑色の蛍光を発した。
【００４４】
F1世代を集めて相互に交配した。2匹のまれなGFP nu/nuマウス、1匹の雄と1匹の雌が得られた。このGFP nu/nu雄およびGFP nu/nu雌を互いに交配して、同腹の6匹のGFP nu/nuマウスを作製した。
【００４５】
雄のGFP nu/nuマウスを雌のnu/nu非GFPマウスと交配した。9匹のヌードnu/nu出生仔が生まれた。すべてが組織において全体的に蛍光を発現した。非GFP nu/nuをGFP nu/nuと対照する図3を参照されたい。
【実施例２】
【００４６】
赤色蛍光タンパク質を有する腫瘍の調製
赤色蛍光タンパク質（RFP）、DsRed2（Clontech）をpLNCX2（Clontech）内のEglIおよびNotI部位に挿入した。
【００４７】
飽和量の、上記の結果得られたベクター、pLNCX2- DsRed2を、DOTAP試薬（Boehringer Mannheim）および70%コンフルエントのPT67パッケージング細胞の沈澱混合物とともに18時間インキュベートした。PT67細胞は、10 A1ウイルスエンベロープを発現するNIH 3T3由来パッケージング細胞株であって、10%熱不活化FBSを添加したDMEM（Irvine Science）中で培養された。この時点で新しい培地を補充し、トランスフェクションの48時間後に蛍光顕微鏡法によって細胞を調べた。高力価のレトロウイルス上清を生じる、明るい蛍光を発する細胞を選択するために、RFP発現パッケージング細胞を、段階的に増加する500-2,000μg/ml G418（Life Technologies, Grand Island, NY）の存在下で7日間培養した。
【００４８】
20%コンフルエントの望ましい腫瘍細胞株を、PT67細胞のレトロウイルス上清、および10% FBS（Gemini Biological Products）を含有するRPMI 1640もしくは他の培地（GIBCO）の1:1沈澱混合物とともに72時間インキュベートした。この時点で新しい培地を補充した。トリプシン／EDTAを用いて腫瘍細胞を集め、選択培地中に1:15の割合で入れて継代培養したが、この選択培地は50μg/ml G418を含有した。明るい蛍光を発する細胞を選択するために、G418の濃度を800μg/mlまで段階的に増加させた。クローニングシリンダー（Bel-Art Products）を用いてトリプシン／EDTAによって、RFPを発現するクローンを分離し、従来の培養法によって増殖させて選択試薬のない状態に移行させた。
【００４９】
こうして赤色蛍光細胞として得られた腫瘍細胞は下記を包含した：
齧歯動物B16F0黒色腫細胞；
マウスMMT060562乳腺腫瘍細胞；
マウスDunning前立腺癌細胞；
ヒトPC-3前立腺癌細胞；および
ヒトHCT-116大腸癌細胞。
【実施例３】
【００５０】
腫瘍進行の二重標識モデル
HCT-116-RFP、すなわち赤色蛍光タンパク質で標識されたヒト大腸癌細胞をトリプシン処理によって回収し、冷たい無血清培地で3回洗浄し、無血清RPMI1640培地に再懸濁した。細胞は、回収から40分以内に6週齢のトランスジェニック雌GFPヌードマウス（実施例1で作製）に、左下腹部切開により結腸を露出させることによって注入された。106 HCT-116-RFP細胞(50μl)を25μlシリンジを用いて下行結腸漿膜下に注入した。腹壁の切開を6-0縫合糸で一層縫合した。外科処置中、動物はケタミン麻酔下とした。
【００５１】
470nmの光ファイバー照明（Lightools Research, Encinitas, CA）で照らされた蛍光ライトボックス内で全身イメージングを行った。放射された蛍光はロングパスフィルターGG475（Chroma Technology, Brattleboro, VT）を通してHamamatsu C5810 3-チップ冷却型カラーCCDカメラ（Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ）に集められた。1,024/724ピクセルの高解像度画像がIBM PC上に直接取り込まれ、画像はコントラストと明度を加工処理して、Image Pro Plus 3.1ソフトウェア（Media Cybernetics, Silver Spring, MD）を用いて分析した。
【００５２】
図1は移植後10週間の同所的に増殖したHCT-116-RFPヒト大腸癌の全身画像を示す。画像は蛍光ライトボックス内でCCDカメラによって得られた。図から明らかなように、このシステムは宿主と腫瘍を容易に識別する。
【実施例４】
【００５３】
マクロファージと前立腺腫瘍との相互作用
PC-3-RFP、すなわち赤色蛍光タンパク質で標識されたヒト前立腺癌細胞をトリプシン処理によって回収し、冷たい血清含有培地で3回洗浄し、氷上においた。40分以内に、30μl中106細胞を下記のように、実施例1で得られた免疫無防備マウスの膀胱および前立腺に注入した：下腹部正中切開の後、膀胱および前立腺を露出させた；注入後
切開を6-0縫合糸で閉じたが、動物はイソフルラン麻酔下とした。
【００５４】
観察のために、新鮮な組織を切断しておよそ1mm3の組織片とし、蛍光顕微鏡法のためにスライドガラス上に押しつけた。顕微鏡による可視化では、100W水銀灯電源装置を備えたOlympus BH 2-RFCA蛍光顕微鏡を使用して、GFPおよびRFP蛍光の両方を同時に可視化した。励起光はD425/60バインドパスフィルター、470 DCXRダイクロイックミラーを通して発生した。放射された蛍光はロングパスフィルターGG475（Chroma Technology）を通して集められた。1,024/724ピクセルの高解像度画像がHamamatsu C5810 3-チップ冷却型カラーCCDカメラ（Hamamatsu Photonics）によって記録され、そのままIBM PCに記憶された。画像はコントラストと明度を加工処理して、Image Pro Plus 4.0ソフトウェア（Media Cybernetics）を用いて分析した。
【００５５】
トランスジェニックヌードマウスであるために緑色蛍光を発するマクロファージと、腫瘍細胞との相互作用を図2に示す。この写真は移植の35日後に撮られた。パネルAはRFP癌細胞と接触する宿主GFPマクロファージを示す；パネルBはRFP癌細胞を貪食するGFPマクロファージを示す；パネルCはGFPマクロファージによって貪食されたRFP癌細胞を示し、パネルDはマクロファージによるRFP癌細胞の最終的な消化を示す。
【実施例５】
【００５６】
蛍光免疫応答性マウスにおける研究
同系移植を用いる場合、免疫応答性被験体についてデュアルカラーイメージングによる短期検討を行うことができる。Okabeによって記載されたマウスモデルにおいて、C57/B6-GFPマウスが作製された。106 RFP発現マウスB16F0黒色腫細胞、106 RFP発現マウスMMT060562乳腺腫瘍細胞および106 RFP発現Dunning（ラット）前立腺癌細胞を用いて検討を行った。上記の技法を用いて、B16F10-RFP黒色腫細胞の注入後3週間、生きたままの腫瘍組織における血管新生を観察することができ、新鮮な腫瘍組織における宿主樹状細胞と腫瘍細胞の相互作用も同様に観察された。乳癌モデルについてはリンパ球浸潤が観察された。
【００５７】
このように、免疫系と移植された腫瘍との相互作用のみならず腫瘍血管新生における初期事象のデュアルカラー画像を観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図1は、免疫無防備マウスに移植された後、同所増殖したヒト大腸癌の全身画像である。腫瘍は赤色蛍光タンパク質を発現し、他方宿主は緑色光を発する蛍光タンパク質の全身発現を示す。
【図２】図2A-2Dは、緑色蛍光タンパク質で標識された免疫無防備宿主におけるマクロファージのリアルタイム相互作用を示すが、その中で癌細胞は赤色蛍光で標識されている。図は、最初の接触（図2A）、貪食（2B）、マクロファージ内に貪食された癌細胞（2C）、およびマクロファージによって消化された癌細胞（2D）を示す。
【図３】図3は、本発明のトランスジェニックマウスを非トランスジェニックヌードマウスと対比して示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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