(57)【要約】本発明は一般に、核酸の分野に、そして詳細にはアプタマー、およびアプタマーを選択するための方法、改変されたヌクレオチドを組み込むための方法に関する。本発明はさらに、例えば、特異的な標的に対するアプタマーが選択され得る、改変されたヌクレオチドを有するランダムなオリゴヌクレオチドのプールを酵素学的に産生するための材料および方法に関する。配列に組み込まれた改変ヌクレオチド三リン酸を有するアプタマー治療剤の生成のための材料および方法を提供する。本発明の方法によって産生されたアプタマーは、安定性および半減期が向上している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に対する修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドを同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）変異したポリメラーゼ、１つ以上の２’修飾ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、マグネシウムイオンおよび１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを含む転写反応混合物を調製する工程；
ｂ）該変異したポリメラーゼが、１つ以上の修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つを候補混合物の各々の核酸に組み込む条件下で、該１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを転写することによって、一本鎖核酸の該候補混合物を調製する工程であって、該候補混合物の各々の核酸が、２’位修飾ピリミジンおよび２’位修飾プリンからなる群より選択される２’修飾ヌクレオチドを含む、工程；
ｃ）該候補混合物と該標的分子とを接触させる工程；
ｄ）候補混合物の残部から、該候補混合物に関連する該標的分子に対する親和性が増大している核酸を分配する工程；ならびに、
ｅ）該親和性が増大した核酸をインビトロで増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得て、それによって該標的分子の核酸リガンドが同定される工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドが、２’−ＯＨ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ＮＨ２、２’−Ｆ、および２’−メトキシエチル修飾からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｆ修飾である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変異したポリメラーゼが、変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位におけるチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、７８４位におけるヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｈ７８４Ａ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位におけるチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異、および７８４位におけるヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端において固定された領域に組み込まれたリーダー配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リーダー配列が、全てのプリンリーダー配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記全てのプリンリーダー配列が、少なくとも６ヌクレオチド長；少なくとも８ヌクレオチド長；少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長からなる群より選択される長さを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記転写反応混合物が、マンガンイオンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
マグネシウムイオンの濃度が、前記マンガンイオンの濃度よりも３．０倍と３．５倍との間で大きい、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
各々のＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在し、前記マグネシウムイオンの濃度が５．０ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が１．５ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
各々のＮＴＰが１．０ｍＭの濃度で存在し、前記マグネシウムイオンの濃度が６．５ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
各々のＮＴＰが２．０ｍＭの濃度で存在し、前記マグネシウムイオンの濃度が９．６ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．９ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記転写反応混合物が、２’−ＯＨ  ＧＴＰをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写反応混合物が、さらにＧＭＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、さらに、以下：
ｆ）工程ｄ）および工程ｅ）を反復する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法に従って同定されたトロンビンに対する核酸リガンド。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法に従って同定された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する核酸リガンド。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法に従って同定されたＩｇＥに対する核酸リガンド。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法に従って同定されたＩＬ−２３に対する核酸リガンド。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法に従って同定された血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）に対する核酸リガンド。
【請求項２７】
前記２’修飾ヌクレオチド三リン酸が、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記２’修飾ヌクレオチド三リン酸が、２’−デオキシプリンヌクレオチド三リン酸、および２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド三リン酸の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記２’修飾ヌクレオチド三リン酸が、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記２’修飾ヌクレオチド三リン酸が、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびデオキシグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の混合物を含み、ここで、該デオキシグアノシン三リン酸が、グアノシン三リン酸集団全体のうち最大１０％を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記２’修飾ヌクレオチド三リン酸が、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｆグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記２’修飾ヌクレオチド三リン酸が、２’−デオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）変異したポリメラーゼ、１つ以上の２’修飾ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、マグネシウムイオンおよび１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを含む転写反応混合物を調製する工程；ならびに、
（ｂ）該変異したポリメラーゼが１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを核酸転写産物に組み込む条件下で、該１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを、該変異したポリメラーゼとを接触させる工程；
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドが、２’−ＯＨ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ＮＨ２、２’−Ｆおよび２’−メトキシエチル修飾からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｆ修飾である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記変異したポリメラーゼが、変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位におけるチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、７８４位におけるヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｈ７８４Ａ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位におけるチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異、および７８４位におけるヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、該オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端における固定された領域に組み込まれたリーダー配列をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記リーダー配列が、全てのプリンリーダー配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記全てのプリンリーダー配列が、少なくとも６ヌクレオチド長；少なくとも８ヌクレオチド長；少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長からなる群より選択される長さを有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記転写反応混合物が、マンガンイオンをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
マグネシウムイオンの濃度が、前記マンガンイオンの濃度よりも３．０倍と３．５倍との間で大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
各々のＮＴＰが各々０．５ｍＭの濃度で存在し、前記マグネシウムイオンの濃度が５．０ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が１．５ｍＭである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
各々のＮＴＰが各々１．０ｍＭの濃度で存在し、前記マグネシウムイオンの濃度が６．５ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．０ｍＭである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
各々のＮＴＰが各々２．０ｍＭの濃度で存在し、前記マグネシウムイオンの濃度が９．６ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．９ｍＭである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
前記転写反応混合物が、２’−ＯＨ  ＧＴＰをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記転写反応混合物が、さらにＧＭＰを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５３】
実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−ＯＨアデノシンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む、アプタマー組成物。
【請求項５４】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を含む、請求項５３に記載のアプタマー組成物。
【請求項５５】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を含む、請求項５３に記載のアプタマー組成物。
【請求項５６】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を含む、請求項５３に記載のアプタマー組成物。
【請求項５７】
実質的に全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンであり、かつ実質的に全てのピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む、アプタマー組成物。
【請求項５８】
前記アプタマーは、全てのプリンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシプリンであり、かつ全てのピリミジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列組成を含む、請求項５７に記載のアプタマー組成物。
【請求項５９】
前記アプタマーは、全てのプリンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシプリンであり、かつ全てのピリミジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列組成を含む、請求項５７に記載のアプタマー組成物。
【請求項６０】
前記アプタマーは、全てのプリンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシプリンであり、かつ全てのピリミジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列組成を含む、請求項５７に記載のアプタマー組成物。
【請求項６１】
実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を含む、アプタマー組成物。
【請求項６２】
前記アプタマーは、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を含む、請求項６１に記載のアプタマー組成物。
【請求項６３】
前記アプタマーは、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を含む、請求項６１に記載のアプタマー組成物。
【請求項６４】
前記アプタマーは、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を含む、請求項６１に記載のアプタマー組成物。
【請求項６５】
実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルグアノシンまたはデオキシグアノシンであり、実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンであり、ここで、該グアノシンヌクレオチドの約１０％未満がデオキシグアノシンである配列を含む、アプタマー組成物。
【請求項６６】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列組成を含む、請求項６５に記載のアプタマー組成物。
【請求項６７】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列組成を含む、請求項６５に記載のアプタマー組成物。
【請求項６８】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列組成を含む、請求項６５に記載のアプタマー組成物。
【請求項６９】
実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルアデノシン配列であり、実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジン配列であり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジン配列であり、かつ実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−Ｆグアノシン配列である配列を含む、アプタマー組成物。
【請求項７０】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列組成を含む、請求項６９に記載のアプタマー組成物。
【請求項７１】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列組成を含む、請求項６９に記載のアプタマー組成物。
【請求項７２】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列組成を含む、請求項６９に記載のアプタマー組成物。
【請求項７３】
実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−デオキシアデノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む、アプタマー組成物。
【請求項７４】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシ−アデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を含む、請求項７３に記載のアプタマー組成物。
【請求項７５】
前記アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を含む、請求項７３に記載のアプタマー組成物。
【請求項７６】
全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシ−アデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を含む、請求項７３に記載のアプタマー組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、核酸の分野に、そして詳細にはアプタマー、およびアプタマーを選択するための方法、改変されたヌクレオチドを組み込むための方法に関する。本発明はさらに、例えば、特異的な標的に対するアプタマーが選択され得る、改変されたヌクレオチドを有するランダムなオリゴヌクレオチドのプールを酵素学的に産生するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アプタマーは、古典的なワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用を通じて分子に対する特異的な結合親和性を有する核酸分子である。
【０００３】
アプタマーは、ファージディスプレイによって生成されるペプチドまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と同様に、選択された標的に対して特異的に結合し得、そして結合を通じて、それらの標的が機能する能力をブロックする。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからインビトロ選択プロセスによって作製された（図１）アプタマーは、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよびレセプターを含む１００を超えるタンパク質について生成されている。代表的なアプタマーは１０〜１５ｋＤａのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的とナノモル未満の親和性で結合して、密接に関連する標的と区別する（例えば、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質には代表的には結合しない）。一連の構造的研究によって、抗体−抗原複合体において親和性および特異性を駆動する同じタイプの結合相互作用（水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体排除など）をアプタマーが用いることができるということが示されている。
【０００４】
アプタマーは、治療剤（および診断剤）としての使用のために、高い特異性および親和性、生物学的有効性および優れた薬物動態学的特性を含む多数の所望の特徴を有する。さらに、それらによって、抗体および他のタンパク質の生物学を上回る特異的な競合的利点が得られる、例えば：
１）速度および制御。アプタマーは、完全にインビトロのプロセスによって産生され、これによって最初の（治療的）リードの迅速な生成が可能になる。インビトロの選択によって、アプタマーを厳密に制御する特異性および親和性が可能になり、そして毒性および非免疫原性標的の両方に対するリードの生成が可能になる。
【０００５】
２）毒性および免疫原性。アプタマーという分類は、毒性も免疫原性もほとんど、または全く示していない。高レベルのアプタマーを用いたラットまたはマーモット（ウッドチャック）の慢性投与（９０日間、毎日１０ｍｇ／ｋｇ）では、臨床でも、細胞でも生化学的測定でも毒性は観察されていない。多くのモノクローナル抗体の有効性は、抗体自体に対する免疫応答によって大きく制限され得るが、アプタマーに対して抗体を惹起することは極めて困難である（この理由は主に、アプタマーがＭＨＣを介してＴ細胞に提示されることができず、免疫応答は一般に核酸フラグメントを認識するようには教育されないからであろう）。
【０００６】
３）投与。現在承認されている全ての抗体治療剤は静脈内注入（代表的には２〜４時間にわたる）によって投与されるが、アプタマーは皮下注射によって投与できる。この相違は主に、ほとんどの治療用ＭＡｂについて溶解度が比較的低く、従って大きい容積が必要であることに起因する。高い溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）によって、アプタマーの毎週の用量は、０．５ｍｌ未満の容積で注射することによって送達され得る。皮下投与を介したアプタマーのバイオアベイラビリティーは、サルの研究では８０％を超えている（Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３〜１２，１９９９）。さらに、小さいサイズのアプタマーでは、抗体または抗体フラグメントが浸透できない高次構造の収縮の領域に浸透することが可能であり、これによって、アプタマーに基づく治療または予防法の別の利点が示される。
【０００７】
４）拡大性および費用。治療用アプタマーは化学的に合成され、結果として製品の要求を満たすのに必要である場合、容易に大規模化できる。産物を大規模生産することが困難であることによっていくつかの生物製剤の利用可能性は現在限定されており、大規模なタンパク質産生プラントの資本コストが膨大であるが、単一の大規模合成器で、１年あたり１００ｋｇを超えるオリゴヌクレオチドを産生可能であり、必要な初期投資額はそれほどでもない。キログラム規模でのアプタマー合成のための現在の製品の費用は、高度に最適化された抗体についての費用と匹敵して、１ｇあたり５００ドルと見積もられる。プロセスの開発における継続的な改良によって、５年で１ｇあたり１００ドル未満まで製品コストを低下させることが期待される。
【０００８】
５）安定性。治療用アプタマーは化学的に頑強である。それらは、熱、変性剤などに対する曝露後に活性を再獲得するようにもともと適合されており、そして凍結乾燥粉末として室温で長期間（＞１年）にわたって保管できる。対照的に、抗体は凍結保存しなければならない。
【０００９】
治療剤としてアプタマーを利用することを考慮すれば、インビボにおけるアプタマー治療剤の安定性を延長するか向上する材料および方法を有することが有利である。本発明によって、これらおよび他の必要性を満たす材料および方法が得られる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、オリゴヌクレオチドへの改変されたヌクレオチドの組みこみを促進する、本明細書で特定された条件下での転写による安定性の向上したオリゴヌクレオチドを産生する材料および方法を提供する。これらの改変されたオリゴヌクレオチドは、例えば、アプタマー、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子またはリボザイムであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドはアプタマーである。
【００１１】
一つの実施形態では、本発明は、特定の標的に対するアプタマーを選択することができる、改変されたヌクレオチドを取り込むオリゴヌクレオチドのランダムにされたプールを用いる、改良されたＳＥＬＥＸＴＭ法（「２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭ」）を提供する。
【００１２】
一つの実施形態では、本発明は、所定の設定の転写条件下でオリゴヌクレオチドに改変されたヌクレオチドを組み込む、改変された酵素を用いる方法を提供する。
【００１３】
一つの実施形態では、本発明は、変異したポリメラーゼを用いる方法を提供する。一つの実施形態では、この変異したポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。一つの実施形態では、６３９位において変異（チロシン残基からフェニルアラニン残基への変異、「Ｙ６３９Ｆ」）および７８４位において変異（ヒスチジン残基からアラニン残基への変異「Ｈ７８４Ａ」）を有することによって変異されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、本発明のオリゴヌクレオチドへの改変されたヌクレオチドの取り込みを生じる種々の転写反応条件で用いられる。
【００１４】
別の実施形態では、６３９位における変異（チロシン残基からフェニルアラニン残基によって改変されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、本発明のオリゴヌクレオチドへの改変されたヌクレオチドの取り込みを生じる種々の転写反応条件で用いられる。
【００１５】
別の実施形態では、７８４位における変異（ヒスチジン残基からアラニン残基によって改変されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、本発明のアプタマーへの改変されたヌクレオチドの取り込みを生じる種々の転写反応条件で用いられる。
【００１６】
一つの実施形態では、本発明は、本発明の改変された酵素による改変されたヌクレオチドの取り込みを増大する種々の転写反応混合物を提供する。
【００１７】
一つの実施形態では、転写反応混合物にマンガンイオンを添加して、本発明の改変された酵素による改変されたヌクレオチドの取り込みを増大する。
【００１８】
別の実施形態では、２’−ＯＨ  ＧＴＰを転写混合物に添加して、本発明の改変された酵素による改変されたヌクレオチドの取り込みを増大する。
【００１９】
別の実施形態では、ポリエチレングリコール、ＰＥＧを転写混合物に添加して、本発明の改変された酵素による改変されたヌクレオチドの取り込みを増大する。
【００２０】
別の実施形態では、ＧＭＰ（または任意の置換グアノシン）を転写混合物に添加して、本発明の改変された酵素による改変されたヌクレオチドの取り込みを増大する。
【００２１】
一つの実施形態では、テンプレートオリゴヌクレオチドの５’末端において固定された領域（好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長）の５’末端に組み込まれたリーダー配列を用いて、本発明の改変された酵素による改変されたヌクレオチドの取り込みを増大する。好ましくはこのリーダー配列は、約１０ヌクレオチド長より大きい。
【００２２】
一つの実施形態では、最大で１００％（１００％を含む）のプリンヌクレオチドから構成されるリーダー配列を用いる。
【００２３】
別の実施形態では、最大で１００％（１００％を含む）のプリンヌクレオチドから構成される少なくとも６ヌクレオチドのリーダー配列を用いる。
【００２４】
別の実施形態では、最大で１００％（１００％を含む）のプリンヌクレオチドから構成される少なくとも８ヌクレオチドのリーダー配列を用いる。
【００２５】
別の実施形態では、最大で１００％（１００％を含む）のプリンヌクレオチドから構成される少なくとも１０ヌクレオチドのリーダー配列を用いる。
【００２６】
別の実施形態では、最大で１００％（１００％を含む）のプリンヌクレオチドから構成される少なくとも１２ヌクレオチドのリーダー配列を用いる。
【００２７】
別の実施形態では、最大で１００％（１００％を含む）のプリンヌクレオチドから構成される少なくとも１４ヌクレオチドのリーダー配列を用いる。
【００２８】
一つの実施形態では、本発明は、改変されたヌクレオチドがそれらの配列に組み込まれているアプタマー治療剤を提供する。
【００２９】
一つの実施形態では、本発明は、改変されたヌクレオチドがそれらの配列に組み込まれているアプタマー治療剤の使用を提供する。
【００３０】
一つの実施形態では、本発明は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスでのアプタマー選択のための転写の種々のヌクレオチド組成物を提供する。一つの実施形態では、本発明は、ＡＴＰヌクレオチド、ＧＴＰヌクレオチド、ＣＴＰヌクレオチド、ＴＴＰヌクレオチドおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅ改変の組み合わせを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＡＴＰヌクレオチド、ＧＴＰヌクレオチド、ＣＴＰヌクレオチド、ＴＴＰヌクレオチドおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル改変の組み合わせを提供する。一つの実施形態では、本発明は、ＡＴＰヌクレオチド、ＧＴＰヌクレオチド、ＣＴＰヌクレオチド、ＴＴＰヌクレオチドおよびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２および２’−メトキシエチル改変の５６個の組み合わせを提供する。
【００３１】
本発明は、標的分子に対する核酸リガンドを同定するための方法に関しており、このリガンドとしては、ａ）変異したポリメラーゼ、１つ以上の２’改変ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、マグネシウムイオンおよび１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを含む転写反応混合物を調製する工程；ｂ）この変異したポリメラーゼが１つ以上の２’改変ヌクレオチドのうちの少なくとも１つを候補混合物の各々の核酸に組み込む条件下で、この１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを転写することによって一本鎖核酸の候補混合物を調製する工程であって、この候補混合物の各々の核酸が、２’位置改変ピリミジンおよび２’位置改変プリンからなる群より選択される２’改変ヌクレオチドを含む工程；ｃ）この候補混合物と標的分子とを接触させる工程；ｄ）この候補混合物に関して標的分子に対する親和性が増大している核酸を、この候補混合物の残りから、分画する工程と；ｅ）インビトロにおいて親和性の増大した核酸を増幅して核酸のリガンド富化混合物を得る工程、によって改変されたヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
２’位置改変ピリミジンおよび２’位置改変プリンとしては、２’−ＯＨ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ＮＨ２、２’−Ｆおよび２’−メトキシエチルの改変が挙げられる。好ましくは、２’改変ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆヌクレオチドである。
【００３３】
ある実施形態では、変異したポリメラーゼは、変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、６３９位においてチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ）を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ；７８４位においてヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｈ７８４Ａ）を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ；６３９位におけるチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異、および７８４位におけるヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００３４】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとしては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端において固定された領域の５’末端に組み込まれたリーダー配列が挙げられる。このリーダー配列は、例えば、全てプリンのリーダー配列である。このリーダー配列は、例えば、少なくとも６ヌクレオチド長；少なくとも８ヌクレオチド長；少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；または少なくとも１４ヌクレオチド長である。
【００３５】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、マンガンイオンを含む。例えば、マグネシウムイオンの濃度は、マンガンイオンの濃度よりも３．０〜３．５倍大きい。
【００３６】
転写反応混合物のある実施形態では、各々のＮＴＰは、０．５ｍＭの濃度で存在し、マグネシウムイオンの濃度が５．０ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が１．５ｍＭである。転写反応混合物の他の実施形態では、各々のＮＴＰが１．０ｍＭの濃度で存在し、マグネシウムイオンの濃度が６．５ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．０ｍＭである。転写反応混合物の他の実施形態では、各々のＮＴＰは、２．０ｍＭの濃度で存在し、マグネシウムイオンの濃度が９．６ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．９ｍＭである。
【００３７】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、２’−ＯＨ  ＧＴＰを含む。
【００３８】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、ポリアルキレングリコールを含む。このポリアルキレングリコールは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。
【００３９】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、ＧＭＰを含む。
【００４０】
ある実施形態では、標的分子に対する核酸リガンドを同定するための方法はさらに、ｄ）候補混合物に関して標的分子に対する親和性が増大している核酸を、この候補混合物の残りから分画する工程；ｅ）インビトロにおいて親和性の増大した核酸を増幅して核酸のリガンド富化混合物を得る工程とを繰り返す工程を包含する。
【００４１】
ある局面では、本発明は、本発明の方法によって同定されたトロンビンに対する核酸リガンドに関する。
【００４２】
ある局面では、本発明は、本発明の方法によって同定された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する核酸リガンドに関する。
【００４３】
ある局面では、本発明は、本発明の方法によって同定されたＩｇＥに対する核酸リガンドに関する。
【００４４】
ある局面では、本発明は、本発明の方法によって同定されたＩＬ−２３に対する核酸リガンドに関する。
【００４５】
ある局面では、本発明は、本発明の方法によって同定された血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）に対する核酸リガンドに関する。
【００４６】
ある実施形態では、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。
【００４７】
ある実施形態では、転写反応混合物は、２’−デオキシプリンヌクレオチド三リン酸および２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド三リン酸を含む。
【００４８】
ある実施形態では、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。
【００４９】
ある実施形態では、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびデオキシグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を含むが、このデオキシグアノシン三リン酸は総グアノシン三リン酸集団のうち最大１０％を含む。
【００５０】
ある実施形態では、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｆグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。
【００５１】
ある実施形態では、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。
【００５２】
本発明はまた、変異したポリメラーゼ、１つ以上の２’改変ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、マグネシウムイオンおよび１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートを含む転写反応混合物を調製する工程；この変異したポリメラーゼが１つ以上の２’改変ヌクレオチドを核酸転写産物に組み込む条件下で、この１つ以上のオリゴヌクレオチド転写テンプレートをこの変異したポリメラーゼと接触させる工程と：によって、１つ以上の改変されたヌクレオチドを含む核酸を調製するための方法に関する。
【００５３】
２’位置改変ピリミジンおよび２’位置改変プリンとしては、２’−ＯＨ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−ＮＨ２、２’−Ｆおよび２’  −メトキシエチル改変が挙げられる。好ましくは、２’改変ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆヌクレオチドである。
【００５４】
ある実施形態では、変異したポリメラーゼは、変異したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、６３９位においてチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ）を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ；７８４位においてヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｈ７８４Ａ）を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ；６３９位におけるチロシン残基からフェニルアラニン残基への変異、および７８４位におけるヒスチジン残基からアラニン残基への変異（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００５５】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチド転写テンプレートとしては、オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端において固定された領域の５’末端に組み込まれたリーダー配列が挙げられる。このリーダー配列は、例えば、全てプリンのリーダー配列である。このリーダー配列は、例えば、少なくとも６ヌクレオチド長；少なくとも８ヌクレオチド長；少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；または少なくとも１４ヌクレオチド長であり得る。
【００５６】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、マンガンイオンを含む。例えば、マグネシウムイオンの濃度は、マンガンイオンの濃度よりも３．０〜３．５倍大きい。
【００５７】
転写反応混合物のある実施形態では、各々のＮＴＰは、０．５ｍＭの濃度で存在し、マグネシウムイオンの濃度が５．０ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が１．５ｍＭである。転写反応混合物の他の実施形態では、各々のＮＴＰが１．０ｍＭの濃度で存在し、マグネシウムイオンの濃度が６．５ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．０ｍＭである。転写反応混合物の他の実施形態では、各々のＮＴＰは、２．０ｍＭの濃度で存在し、マグネシウムイオンの濃度が９．６ｍＭであり、かつマンガンイオンの濃度が２．９ｍＭである。
【００５８】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、２’−ＯＨ  ＧＴＰを含む。
【００５９】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、ポリアルキレングリコールを含む。このポリアルキレングリコールは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。
【００６０】
ある実施形態では、転写反応混合物はまた、ＧＭＰを含む。
【００６１】
本発明はまた、実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−ＯＨアデノシンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む、アプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を有する。別の実施形態では、アプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を有する。
【００６２】
本発明はまた、実質的に全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンであり、かつ実質的に全てのピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む、アプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、アプタマーは、全てのプリンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシプリンであり、かつ全てのピリミジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのプリンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシプリンであり、かつ全てのピリミジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列組成を有する。別の実施形態では、アプタマーは、全てのプリンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシプリンであり、かつ全てのピリミジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列組成を有する。
【００６３】
本発明はまた、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンであり、そして実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む、アプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、アプタマーは、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を有する。別の実施形態では、アプタマーは、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列組成を有する。
【００６４】
本発明はまた、実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルグアノシンまたはデオキシグアノシンであり、実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンであり、このグアノシンヌクレオチドの約１０％未満がデオキシグアノシンである配列を含む、アプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列組成を有する。
【００６５】
本発明はまた、実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−Ｆグアノシン配列である配列を含むアプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつ全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列組成を有する。
【００６６】
本発明はまた、実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−デオキシアデノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルシチジンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む、アプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシ−アデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を有する。別の実施形態は、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシ−アデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列組成を有する。
【００６７】
本発明はまた、実質的に全てのアデノシンヌクレオチドが２’−ＯＨアデノシンであり、実質的に全てのグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンであり、実質的に全てのシチジンヌクレオチドが２’−ＯＨシチジンであり、かつ実質的に全てのウリジンヌクレオチドが２’−ＯＨウリジンである配列を含む、アプタマー組成物に関する。一つの実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨ−アデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドのうちの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列組成を有する。別の実施形態は、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、かつ全てのウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列組成を有する。別の実施形態では、このアプタマーは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、かつウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列組成を有する。
【００６８】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の付随する説明に示す。本明細書に記載されるものと同様であるかまたは等価である任意の方法および物質は、本発明の実行または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料をここに記載している。本発明の他の特徴、目的および利点は、この説明から明らかである。本明細書では、単数形は、文脈が明確に他を示さない限り複数も包含する。他に規定しない限り、本明細書に用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、明細書が優先する。
【００６９】
（改変されたヌクレオチド転写物）
本発明は、改変されていないオリゴヌクレオチドよりも安定なオリゴヌクレオチドを作製する、改変されたヌクレオチド（例えば、２’位置において改変を有するヌクレオチド）を含む安定化されたオリゴヌクレオチド（例えば、アプタマーを含む）を生成するための材料および方法を提供する。本発明の材料および方法によって生成された安定化されたオリゴヌクレオチドはまた、酵素分解および化学分解に対して、そして熱分解および物理的分解に対してさらに安定である。
【００７０】
アプタマーが治療剤としての使用に適切であるためには、合成が安価であり、インビボにおいて安全かつ安定であることが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは代表的には、ヌクレアーゼによる分解に感受性であるせいで、インビボでは安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は２’位置に改変基を組み込むことによって大きく向上できる。フルオロ基およびアミノ基は、オリゴヌクレオチドライブラリーに首尾よく組み込まれており、これからアプタマーが引き続いて選択されている。しかし、これらの改変によって、得られたアプタマーの合成の費用は大きく増大し、その改変されたオリゴヌクレオチドの分解およびＤＮＡ合成のための基質としてのそのヌクレオチドのその後の使用によって、その改変されたヌクレオチドが宿主ＤＮＡ中で再循環され得る可能性のせいで、安全性の懸念が持ち上がるかもしれない。
【００７１】
２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチドを含むアプタマーは、これらの欠点の多くを克服する。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性であり、かつ合成が安価である。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、生物学的な系に偏在するが、天然のポリメラーゼは、生理学的な条件下で基質として２’−Ｏ−メチルＮＴＰを受容せず、従って、宿主ＤＮＡにおける２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの再循環を上回る安全性の懸念はない。２’−ＯＭｅヌクレオチドの一般式は図２に示す。
【００７２】
２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例は文献にあり、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６８３〜６９５，１９９５を参照のこと。これらは、Ｃ残基およびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、そしてＡ残基およびＧ残基が２’ＯＨである、改変された転写物のライブラリーのインビトロ選択によって生成された。一旦、機能的な配列を同定すると、各々のＡ残基およびＧ残基を２’−ＯＭｅ置換に対する耐性について試験し、そして２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換に抵抗する全てのＡ残基およびＧ残基を有するアプタマーを再合成した。この２工程の方式で生成したアプタマーのＡ残基およびＧ残基のほとんどが、２’−ＯＭｅ残基での置換に耐性であるが、平均して約２０％が耐性ではない。結果として、この方法を用いて生成したアプタマーは、２〜４の２’−ＯＨ残基を含む傾向であり、結果として安定性および合成の費用が損なわれる。アプタマーが選択されてＳＥＬＥＸＴＭ（および／または以下に記載されるその変異および改良を含む任意の変異および改良）によって富化される、オリゴヌクレオチドライブラリーにおいて用いられる、安定化されたオリゴヌクレオチドを生成する転写反応物に改変されたヌクレオチドを組み込むことによって、本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化する必要性を排除する（例えば、改変されたヌクレオチドを用いてアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによって）。
【００７３】
さらに、本発明の改変されたオリゴヌクレオチドは、選択プロセスが終了した後に、さらに安定化され得る。（以下、短縮、欠失および改変を含む、「ｐｏｓｔ−ＳＥＬＥＸＴＭ改変」を参照のこと）。
【００７４】
（ＳＥＬＥＸＴＭ法）
アプタマーを生成するために適切な方法は、図１に一般的に描写される「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）と題されたプロセスを用いる。このＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的分子に対する高度に特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であって、例えば、１９９０年６月１１日出願の米国特許出願第０７／５３６，４２８号、現在放棄された、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された、米国特許第５，４７５，０９６号および「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された、米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照のこと）に記載されている。各々のＳＥＬＥＸＴＭで同定した核酸リガンドは、所定の標的化合物または分子の特定のリガンドである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、核酸が、モノマーであろうとポリマーであろうと、種々の二次元構造および三次元構造を形成する十分な能力を有し、そしてそのモノマー内で利用可能な十分な化学的万能性を有して実質的に任意の化合物とのリガンドとして機能する（特定の結合対を形成する）という独創的な洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として働き得る。
【００７５】
ＳＥＬＥＸＴＭは起点として、標準的なＤＮＡシンセサイザーでの化学合成に由来するランダムである配列を含む単一の標準的なオリゴヌクレオチドテンプレートの大型ライブラリーに依存する。ある実施例では、１００％ランダムなオリゴヌクレオチドの集団をスクリーニングする。言い換えると、この集団中の各々のオリゴヌクレオチドは、ランダムな配列、および少なくとも１つの固定された配列をその５’末端および／または３’末端に含み、これがオリゴヌクレオチド集団の全ての分子によって共有される配列を含む。固定された配列としては、ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位のような配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、ＳＰ６など）、制限部位またはホモポリマー配列、例えば、ポリＡトラクトまたはポリＴトラクト、触媒性コア、アフィニティーカラムに対する選択的結合の部分、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にする他の配列が挙げられる。
【００７６】
オリゴヌクレオチドのランダムな配列部分は、任意の長さであり得、そしてリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、そして改変されるかまたは天然ではないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，６９８，６８７号；同第５，８１７，６３５号；および同第５，６７２，６９５号、およびＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いてホスホジエステル連結ヌクレオチドから合成し得る（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５〜５５７８（１９８６））。オリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法のような溶液相法を用いて合成できる（Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ，２８：２４４９（１９７８））。自動ＤＮＡ合成装置で行なった代表的な合成では１０１５〜１０１７個の分子が得られる。配列デザインにおけるランダムな配列の領域が十分大きければ、各々の合成された分子が固有の配列を示すと思われる確率が増大する。
【００７７】
ランダムな配列を合成するために、合成プロセスの間、４つ全てのヌクレオチドの混合物を各々のヌクレオチド添加工程で添加して、ヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。一つの実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含む；しかし、他の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないかまたは部分的にランダムな配列のストレッチを含み得る。部分的にランダムな配列は、各々の添加工程において種々のモル比で４つのヌクレオチドを添加することによって作製できる。
【００７８】
テンプレート分子は代表的には、３０〜５０個のランダムなヌクレオチドの内部領域に隣接する、固定された５’および３’末端の配列を含む。標準的な（１μモル）規模の合成によって、ほとんどのＳＥＬＥＸＴＭ装置に十分な１０１５〜１０１６個の個々のテンプレート分子が得られる。ＲＮＡライブラリーは、組み換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によってこの出発ライブラリーから生成される。次いで、このライブラリーを、結合に好適な条件下で標的と混合して、同じ一般的な選択スキームを用いて段階的な相互作用の結合、分画および増幅に供して、結合の親和性および選択性の実質的に任意の所望の基準を得る。好ましくはランダムになった配列のセグメントを含む、核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、結合に好適な条件下でこの混合物と標的とを接触させる工程、標的分子に特異的に結合している核酸から未結合の核酸を分画する工程、この核酸−標的複合体を解離する工程、この核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して核酸のリガンド富化混合物を得る工程、次いで結合、分画、解離および増幅の工程を、標的分子に対して高度に特異的に高い親和性核酸リガンドを得るために望まれる程度の回数、反復する工程とを包含する。
【００７９】
多数の可能性のある配列および構造を含む核酸混合物内には、所定の標的についての広範な結合親和性が存在する。天然の未改変のヌクレオチドのみを含む、例えば２０ヌクレオチドのランダムになったセグメントを含む核酸混合物は、４２０個の候補物の可能性を有し得る。標的に関してさらに高い親和性定数を有するものが、標的に結合する可能性が最も高い。分画、解離および増幅後、第二の核酸混合物を生成して、さらに高い結合親和性の候補物について富化する。１つまたは２〜３個のみの配列から主に構成される核酸混合物が得られるまで、選択の回数をさらに重ねて、徐々に最高のリガンドにしていく。次いで、これらをクローニングして、配列決定して、純粋なリガンドとしての結合親和性について個々に試験する。
【００８０】
選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返す。最も一般的な場合には、サイクルを繰り返しても、結合強度において有意な改善が得られなくなるまで選択／増幅を継続する。この方法を用いて、約１０１８個の異なる核酸種をサンプリングすることができる。試験混合物の核酸は好ましくは、ランダムな配列部分、および効率的な増幅のために必要な保存配列を含む。核酸配列改変体は、ランダムな核酸配列の合成、および無作為に切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む多数の方法で生成できる。可変性の配列部分は、完全にランダムな配列を含んでも、または部分的にランダムな配列を含んでもよい；この配列部分はまた、ランダムな配列と合体された保存された配列の部分を含んでもよい。試験核酸における配列の変動は、選択／増幅相互作用の前または間に突然変異誘発によって導入されても、または増大されてもよい。
【００８１】
ＳＥＬＥＸＴＭの一つの実施形態では、選択プロセスは従って、選択された標的に対して最も強力に結合する核酸リガンドを単離するのに効率的であり、選択および増幅の工程はわずか１サイクルしか必要でない。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型のプロセスにおいて得られるが、ここでは核酸がカラムに結合した標的と会合する能力は、このカラムが最高の親和性の核酸リガンドの分離および単離を可能にするのに十分であるような方式で作用する。
【００８２】
多くの場合に、単一の核酸リガンドが同定されるまで、ＳＥＬＥＸＴＭの反復工程を行なうことは必ずしも所望されない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存された配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響することなく置換または付加され得る多数の配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含んでもよい。終了の前にＳＥＬＥＸＴＭプロセスを終わらせることによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能になる。
【００８３】
種々の核酸の一次構造、二次構造および三次構造が存在することが公知である。非ワトソンクリック型の相互作用に最も共通して関与することが示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称性および非対称性のバルジ（ｂｕｌｇｅ）、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）およびそれらの多数の組み合わせとされる。このようなモチーフのほとんど全ての公知の場合に、わずか３０程度のヌクレオチドの核酸配列でそれらが形成され得るということが示唆される。この理由のために、連続的なランダムなセグメントを用いるＳＥＬＥＸＴＭ手順は、約２０〜５０ヌクレオチドのランダムなセグメントを含む核酸配列で開始されることがしばしば好ましい。
【００８４】
コアＳＥＬＥＸＴＭ法は、多数の特異的な目的を達成するように改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、特定の構造的特徴を有する核酸分子、例えばベントＤＮＡを選択するためのゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸＴＭの使用を記載している。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子に結合し得るか、そして／または標的分子に光架橋し得るか、そして／または標的分子を光不活性化し得る光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸＴＭに基づく方法を記載する。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許出願第０８／７９２，０７５号、１９９７年１月３１日出願の「Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸＴＭ」と題されたものは、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間で高度に効率的な分画を達成するＳＥＬＥＸＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスを行なった後、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３７号は、その標的に対してリガンドを共有結合するための方法を記載している。
【００８５】
ＳＥＬＥＸＴＭはまた、標的分子上の２つ以上の部位に結合する核酸リガンドを得るため、および標的上の特定部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るためにも用い得る。ＳＥＬＥＸＴＭは、タンパク質（核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸に結合することが知られていないタンパク質の両方を含む）補因子および他の低分子を含む高分子および低分子の生体分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、カフェインおよびその密接に関連するアナログであるテオフィリンに対して高い親和性で結合できる、ＳＥＬＥＸＴＭを通じて同定された核酸配列を開示する米国特許第５，５８０，７３７号を参照のこと。
【００８６】
Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸＴＭは、１つ以上の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸＴＭは、ａ）核酸の候補化合物を調製する工程；ｂ）この候補混合物と標的とを接触させる工程であって、この候補混合物に対して標的に対する親和性が増大している核酸が残りの候補混合物から分画され得る工程；ｃ）残りの候補混合物から親和性の増大した核酸を分画する工程；ｄ）親和性の増大した核酸と１つ以上の非標的分子とを接触させて、非標的分子（単数または複数）に対して特異的な親和性を有する核酸リガンドを除去する工程および；ｅ）この標的分子に対する特異的な親和性を有する核酸を増幅して、この標的分子に対する比較的高い親和性および特異性を有する核酸配列が富化された核酸混合物を得る工程とから構成される。
【００８７】
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する１つの潜在的な問題は、オリゴヌクレオチドがそのホスホジエステル型では、その所望の効果が現われる前に、体液中で、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼのような細胞内酵素および／または細胞外酵素によって迅速に分解され得るということである。従って、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、選択後、リガンドに改善された特徴、例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特徴を付与する改変されたヌクレオチドを含むように変更される、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。核酸リガンドの改変としては、限定はしないが、さらなる電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用および変動性を核酸リガンド基部に対して、または核酸リガンド全体に対して組み込む他の化学基を提供する改変が挙げられる。改変としては、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基部位での化学的置換、例えば、２’位糖改変、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格改変、ホスホロチオエートまたはリン酸アルキル改変、メチル化、通常ではない塩基対の組み合わせ、例えば、イソ塩基イソシチジンおよびイソグアニジンなどが挙げられる。改変はまたキャッピングのような３’および５’の改変を含んでもよい。
【００８８】
改変された糖基を含むオリゴヌクレオチドでは、例えば、１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエステルもしくはアミンとして官能化される。フラノース残基の２’位での置換の例としては、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−メチル）、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル、またはハロ基が挙げられる。２’改変糖の合成の方法は、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９：７３３〜７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９：２６２９〜２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８〜５１４５（１９７３）に記載されている。他の改変が当業者に公知である。
【００８９】
改変されたヌクレオチドを含むように選択後に合成した、ＳＥＬＥＸＴＭで同定した核酸リガンドは、ピリミジンの５’および２’位置において化学的に改変されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している、米国特許第５，６６０，９８５号に記載されている。さらに、米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’改変ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載しており；そして米国特許第５，５８０，７３７号は、２’アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）置換で改変された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する。
【００９０】
ＳＥＬＥＸＴＭ法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能的な単位と組み合わせる工程を包含する。ＳＥＬＥＸＴＭ法はさらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載されるように、診断または治療用の複合体に、選択された核酸リガンドと親油性または非免疫原性の高分子量化合物とを合わせる工程を包含する。診断または治療用の複合体において、ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールのような親油性の化合物と会合されているＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許第５，８５９，２２８号に記載されている。
【００９１】
グリセロール脂質のような親油性化合物、またはポリアルキレングリコールのような非免疫原性高分子量化合物と会合されるＶＥＧＦ核酸リガンドはさらに、米国特許第６，０５１，６９８号に記載されている。非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と会合されるＶＥＧＦ核酸リガンドはさらに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１８４８０に記載されている。これらの特許および出願は、広範なアレイのオリゴヌクレオチド形状および他の特性の組み合わせ、ならびに他の分子の所望の特性を有するオリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製の特性を記載している。
【００９２】
ＳＥＬＥＸＴＭ法を介した小さい可撓性のペプチドに対する核酸リガンドの同定も調査されている。小型のペプチドは、可撓性の構造を有し、そして通常、複数の配座異性体の平衡している溶液に存在しており、従って、結合親和性は、可撓性のペプチドを結合する際に失われる立体配置的なエントロピーによって制限され得ると最初は考えられた。しかし、溶液中で低分子ペプチドに対する核酸リガンドを同定する実現可能性は、米国特許第５，６４８，２１４号において実証された。この特許では、１１アミノ酸のペプチドであるサブスタンスＰに対する高い親和性のＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【００９３】
ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するために、改変されたオリゴヌクレオチドを用いてもよいし、１つ以上の置換ヌクレオチド間連結、変更された糖、変更された塩基、またはそれらの組み合わせを含み得る。一つの実施形態では、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート（ｔｈｉｏａｔｅ）」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート（ａｍｉｄａｔｅ）」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されているオリゴヌクレオチドが提供されるが、ここで各々のＲまたはＲ’は独立して、Ｈであるか、または置換されているか、または置換されていないアルキルである。連結基は、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−連結を通じて隣接するヌクレオチドに結合され得る。同定されるためにオリゴヌクレオチド中の全ての連結が必要であるわけではない。
【００９４】
核酸アプタマー分子は一般に、５〜２０サイクルの手順で選択される。一つの実施形態では、異質性は、最初の選択段階でのみ導入され、そして複製プロセス全体を通じては生じない。
【００９５】
ＤＮＡ合成の出発ライブラリーは、ＤＮＡシンセサイザーでの自動的な化学合成によって生成される。配列のこのライブラリーを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは改変されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでＲＮＡに転写して、そして精製する。一つの実施形態では、５’固定：ランダム：３’固定配列は、３０〜５０ヌクレオチドを有するランダムな配列を含む。
【００９６】
本発明のアプタマーへの改変されたヌクレオチドの組み込みは、選択プロセスの前（プレ）（例えば、プレ−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変）に達成される。必要に応じて、改変されたヌクレオチドがプレ−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって組み込まれている本発明のアプタマーはさらに、ポスト−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって改変されてもよい（すなわち、プレ−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変後のポスト−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変）。プレ−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって、ＳＥＬＥＸＴＭ標的に特異性を有する改変された核酸リガンドが得られ、そしてまたインビボ安定性が改善される。ポスト−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変（例えば、プレ−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって組み込まれたヌクレオチドを有する、以前に同定されたリガンドの改変）によって、プレ−ＳＥＬＥＸＴＭプロセス改変によって取り込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に有害に影響することなく、インビボ安定性のさらなる改善を得ることができる。
【００９７】
（改変されたポリメラーゼ）
６３９位置でのチロシン残基がフェニルアラニンに変換されている単独変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、基質として２’デオキシ、２’アミノ−、および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を容易に利用して、種々の適用のための改変されたＲＮＡを合成するために広範に用いられている。しかし、変異体Ｔ７ポリメラーゼは報告によれば、さらにバルキーな２’−置換、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）または２’−アジド（２’−Ｎ３）置換を有するＮＴＰを容易に利用（例えば、組み込み）できない。バルキーな２’置換の組み込みのために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位置のヒスチジンがアラニンまたは他の低分子アミノ酸残基に変化されている、二重Ｔ７ポリメラーゼ変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）は記載されており、そして改変されたピリミジンＮＴＰを組み込むために用いられている。７８４位置のヒスチジンがアラニン残基に変化されている単独変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載されている。（Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８）。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体およびＨ７８４Ａ単独変異体Ｔ７ポリメラーゼの両方において、さらに小さいアミノ酸残基へ変化するほど、さらにバルキーなヌクレオチド基質、例えば、２’−Ｏメチル置換ヌクレオチドの組み込みが可能になる。
【００９８】
本発明は、これら、および野生型ポリメラーゼよりも、２’位置フラノースでバルキーな置換を有する改変されたヌクレオチドの組み込み速度がさらに高い他の改変されたＴ７ポリメラーゼを用いるための方法および条件を提供する。一般には、本明細書において開示される条件下で、Ｙ６９３Ｆ単独変異体は、ＧＴＰを除いて全ての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組み込みのために用いることが可能であり、そしてＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体は、ＧＴＰを含む全ての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの組み込みのために用いることが可能である。Ｈ７８４Ａ単独変異体は、本明細書に開示される条件下で用いられる場合、類似の特性を保有することが期待される。
【００９９】
本発明は、改変されたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに酵素的に組み込むように改変されたＴ７ポリメラーゼのための方法および条件を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドで全体に合成されてもよいし、改変されたヌクレオチドのサブセットで合成されてもよい。この改変は同じでも異なってもよい。全てのヌクレオチドが改変されてもよく、そして全てが同じ改変を含んでもよい。全てのヌクレオチドは改変されてもよいが、異なる改変を含んでもよく、例えば、同じ塩基を含む全てのヌクレオチドが１タイプの改変を有してもよく、一方他の塩基を含むヌクレオチドは異なるタイプの改変を有してもよい。全てのプリンヌクレオチドは、１タイプの改変を有してもよい（または未改変である）が、全てのピリミジンヌクレオチドは別の異なるタイプの改変を有する（または未改変である）。この方法では、転写物または転写物のライブラリーは、改変の任意の組み合わせ、例えば、リボヌクレオチド、（２’−ＯＨ、「ｒＮ」）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドを用いて生成される。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む混合物は、「ｒＲｍＹ」と呼ばれる；デオキシＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む混合物は、「ｄＲｍＹ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む混合物は、「ｒＧｍＨ」と呼ばれる；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを交互に含む混合物は、「トグル（ｔｏｇｇｌｅ）」と呼ばれる；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、ＣおよびＧを含む混合物であってＧの最大１０％がデオキシである混合物は「ｒ／ｍＧｍＨ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを含む混合物は、「ｆＧｍＨ」と呼ばれ；そしてデオキシＡ、および２’−ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含む混合物は「ｄＡｍＢ」と呼ばれる。
【０１００】
好ましい実施形態は、２’−ＯＨ、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。さらに好ましい実施形態は、２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。なおさらに好ましい実施形態は、ピリミジンが２’−ＯＭｅである２’−デオキシおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドの任意の組み合わせを用いる（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＮまたはｄＧｍＨ）。
【０１０１】
（２’−改変ＳＥＬＥＸＴＭ）
本発明は、ポリメラーゼが２’改変ＮＴＰを受容する条件下で２’改変（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のライブラリーを生成する方法を提供する。好ましくは、ポリメラーゼはＹ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体またはＹ６９３Ｆ単独変異体である。他のポリメラーゼ、特にバルキーな２’−置換に高い抵抗性を示すポリメラーゼはまた、本発明において用いられ得る。このようなポリメラーゼは、本明細書において開示される転写条件下で改変されたヌクレオチドを組み込む能力をアッセイすることによって、この能力についてスクリーニングし得る。本明細書で開示される方法において有用な転写条件については多数の要因が重要であることが決定されている。例えば、得られた転写物のうち少なくともおよそ最初の６残基が全てプリンであるようにリーダー配列がＤＮＡ転写テンプレートの５’末端で固定された配列の５’末端に取り込まれる場合、改変された転写物の収率の大きな増大が観察される。
【０１０２】
改変されたヌクレオチドを組み込む転写物を得るための別の重要な要因は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの存在または濃度である。転写物は２つの相に分割できる：第一の相は開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）であり、この間にＮＴＰがＧＴＰ（または別の置換されたグアノシン）の３’−ヒドロキシル末端に付加されて、ジヌクレオチドが得られ、これが次いで約１０〜１２ヌクレオチドずつ伸長され、第二の相は伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）であり、その間に転写が最初のおよそ１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進行する。過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含む転写混合物に添加された少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰは、ポリメラーゼが２’−ＯＨ  ＧＴＰを用いて転写を開始することを可能にするのに十分であるが、一旦転写物が伸長相に入れば、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ  ＧＴＰとの間の識別の低下、および２’−ＯＨ  ＧＴＰを超える過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰによって、主に２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの取り込みが可能になる。
【０１０３】
転写物への２’−ＯＭｅの取り込みにおける別の重要な要因は、転写混合物における二価のマグネシウムおよびマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの濃度の種々の組み合わせが、２’−Ｏ−メチル化転写物の収率に影響することが見出されており、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適の濃度は、複合二価金属イオンであるＮＴＰの転写反応混合物における濃度に依存している。最大まで２’置換されたＯ−メチル化転写物の最大収率を得るために（すなわち、全てのＡ、ＣおよびＵならびにＧヌクレオチドの約９０％）、各々のＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合、約５ｍＭの塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭの塩化マグネシウムの濃度が好ましい。各々のＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、約６．５ｍＭの塩化マグネシウム濃度および２．０ｍＭの塩化マグネシウム濃度が好ましい。各々のＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、約９．６ｍＭ  の塩化マグネシウム濃度および２．９ｍＭの塩化マグネシウム濃度が好ましい。いずれの場合にも、これらの濃度から最大２倍までの逸脱であれば有意な量の改変された転写物が得られる。
【０１０４】
ＧＭＰまたはグアノシンでの転写のプライミングも重要である。この効果は、開始ヌクレオチドのポリメラーゼの特異性から生じる。結果として、この方式で生成された任意の転写物の５’末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇである可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は、０．５ｍＭであり、さらに好ましくは１ｍＭである。転写反応物のＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含むことが改変されたヌクレオチドの取り込みを最大化するために有用であることも見出されている。
【０１０５】
転写物中への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（約９０％）の取り込みを最大化するために（「ｒ／ｍＧｍＨ」）、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各々の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各々の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合、２．０ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）５００μＭ（さらに好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  ５００μＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。本明細書において用いる場合、１単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、または本明細書において特定される任意の他の変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）とは、ｒ／ｍＧｍＨ条件のもとで、転写物に１ナノモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを組み込むことが必要な酵素の量として規定される。本明細書において用いる場合、１単位の無機ピロホスファターゼとは、ｐＨ７．２で２５℃において１分あたり１．０モルの無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量として規定される。
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大組み込み（１００％）のためには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各々の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各々の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）５００μＭ（さらに好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。
転写物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大組み込み（１００％）のためには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（各々の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（各々の２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合、２．９ｍＭ）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）５００μＭ（さらに好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。
転写物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大組み込み（１００％）のためには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰおよび２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大組み込み（１００％）のためには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。
転写物へのデオキシ  ＡＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大組み込み（１００％）のためには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長の全てプリンのリーダー配列。
【０１０６】
上記の各々について、（１）転写は好ましくは、約３０℃から約４５℃の温度で少なくとも２時間行い、そして（２）５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写テンプレートを用いる（２００ｎｍのテンプレートを１回目に用いて多様性を増大し（３００ｎｍのテンプレートをｄＲｍＹ転写物に用いた）、その後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の約５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）。好ましいＤＮＡ転写テンプレートは、以下に記載する（ここではＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６は全て２’−ＯＭｅ条件下で転写し、ＡＲＣ２５５はｒＲｍＹ条件下で転写する）。
ＡＲＣ２５４：
５’−ＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号１）
ＡＲＣ２５５：
５’−ＣＡＴＧＣＡＴＣＧＣＧＡＣＴＧＡＣＴＡＧＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号２）
ＡＲＣ２５６：
５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４５３）
本発明のｒＮ転写条件下で、転写反応混合物は２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−ＯＨウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を用いて生成された改変されたオリゴヌクレオチドは、実質的に２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨ−シチジンおよび２’−ＯＨウリジン全てを含む。ｒＮ転写物の好ましい実施形態では、得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨ−シチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨである配列を含む。ｒＮ転写物のさらに好ましい実施形態では、本発明のこの得られた改変されたオリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写物の最も好ましい実施形態では、本発明の改変されたオリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【０１０７】
本発明のｒＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を用いて生成された改変されたオリゴヌクレオチドは、実質的に２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジン全てを含む。好ましい実施形態では、得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１０８】
本発明のｄＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は２’−デオキシプリン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルピリミジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を用いて生成された改変されたオリゴヌクレオチドは、実質的に２’−デオキシプリンおよび２’−Ｏ−メチルピリミジン全てを含む。好ましい実施形態では、本発明の得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのプリンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシプリンであり、そして全てのピリミジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、本発明の得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのプリンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシプリンであり、そして全てのピリミジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。最も好ましい実施形態では、本発明の得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのプリンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシプリンであり、全てのピリミジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。
【０１０９】
本発明のｒＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を用いて生成された改変されたオリゴヌクレオチドは、実質的に２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび２’−Ｏ−メチルアデノシンを全て含む。好ましい実施形態では、得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、そして全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、そして全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【０１１０】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸およびデオキシグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を用いて生成された得られた改変オリゴヌクレオチドは、実質的に２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを全て含み、ここでグアノシンヌクレオチドの集団は、最大約１０％のデオキシグアノシンを有する。好ましい実施形態では、本発明の得られたｒ／ｍＧｍＨ改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、そして全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのわずか約１０％だけがデオキシグアノシンである配列を含む。
【０１１１】
本発明のｆＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を用いて生成された改変オリゴヌクレオチドは、実質的に２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｆ−グアノシンを全て含む。好ましい実施形態では、得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆ−グアノシンである配列を含む。この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【０１１２】
本発明のｄＡｍＢ転写条件下で、転写反応混合物は２’−デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を用いて生成された改変オリゴヌクレオチドは、実質的に２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを全て含む。好ましい実施形態では、得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態では、本発明のこの得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、そして全てのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１１３】
各々の場合に、次いで転写産物をＳＥＬＥＸＴＭプロセスにおけるライブラリーとして用いて、アプタマーを同定するか、および／または所定の標的に対して結合特異性を有する配列の保存的モチーフを決定することができる。得られた配列は既に安定化されており、これによって、安定化されたアプタマー配列に達するためにこのプロセスからこの工程を排除して、結果としてさらに高度に安定化されたアプタマーを得る。２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの別の利点は、得られた配列が必要な２’−ＯＨヌクレオチドを配列中にほとんど有さず、おそらくはないと思われることである。
【０１１４】
以下に記載するとおり、上記の最適化条件以外の条件下でも２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドを完全に組み込む転写物のさらに低いが依然として有用な収率を得ることができる。例えば、上記の転写条件に対応するバリエーションとしては以下が挙げられる：
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は、０〜１Ｍに及んでもよい。本発明はまた、ｐＫａが５〜１０の間である他の緩衝剤、例えば、限定はしないがＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンの使用を考慮する。
【０１１５】
ＤＴＴ濃度は、０〜４００ｍＭに及んでもよい。本発明の方法はまた、他の還元剤、例えば、限定はしないがメルカプトエタノールの使用を提供する。
【０１１６】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は、０〜２０ｍＭの範囲に及んでもよい。
【０１１７】
ＰＥＧ−８０００濃度は、０〜５０％（ｗ／ｖ）にわたってもよい。本発明の方法はまた、他の親水性ポリマー、例えば、限定はしないが、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールの使用を提供する。
【０１１８】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は、０〜０．１％（ｗ／ｖ）にわたってもよい。本発明の方法はまた、他の非イオン性界面活性剤、例えば、限定はしないが他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤を含む、他の界面活性剤の使用を提供する。
【０１１９】
ＭｇＣｌ２の濃度は、０．５ｍＭ〜５０ｍＭにわたってもよい。ＭｎＣｌ２の濃度は、０．１５ｍＭ〜１５ｍＭにわたってもよい。ＭｇＣｌ２もＭｎＣｌ２も両方とも記載の範囲内で存在しなければならず、そして好ましい実施形態では、ＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２の比は約１０〜約３であり、好ましくはこの比は約３〜５、さらに好ましくは、この比は約３〜約４である。
【０１２０】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度（各々のＮＴＰ）は、５μＭ〜５ｍＭにわたってもよい。
【０１２１】
２’−ＯＨ  ＧＴＰの濃度は、０μＭ〜３００μＭにわたってもよい。
【０１２２】
２’−ＯＨ  ＧＭＰの濃度は、０〜５ｍＭにわたってもよい。
【０１２３】
ｐＨは、ｐＨ６からｐＨ９にわたってもよい。本発明の方法は、改変ヌクレオチドを組み込むほとんどのポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で実施され得る。
【０１２４】
さらに、本発明の方法は、転写反応条件においてキレート剤、例えば、限定はしないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＤＴＴの必要に応じた使用を行なう。
【０１２５】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本明細書に記載のアプタマー分子を含む薬学的組成物を包含する。ある実施形態では、この組成物は、内部使用に適切であり、有効量の薬理学的に活性な本発明の化合物を単独で、または１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この化合物は、もしあればそれが極めて低い毒性を有する場合に特に有用である。
【０１２６】
本発明の組成物は、疾患もしくは障害のような病理を処置もしくは予防するために、または患者においてこのような疾患もしくは障害の症状を緩和するために有用であり得る。本発明の組成物は、アプタマーが特異的に結合する標的に関連するか、もしくはそのような標的に由来する疾患もしくは障害に罹患したか、またはそのような素因のある被験体に対する投与のために有用である。
【０１２７】
例えば、標的は、病理に関与するタンパク質であり、例えば標的タンパク質は病理を引き起こす。
【０１２８】
本発明の組成物は、病理を有する患者を処置するための方法において用いられ得る。この方法は、この患者に対して、病理に関与する標的（例えば、タンパク質）に結合するアプタマーを含む組成物を投与し、その結果、この標的に対する組成物の結合がこの標的の生物学的機能を変更して、それによってこの病理を処置する工程を包含する。
【０１２９】
ある病理を有する患者、例えば、本発明の方法によって処置される患者は、哺乳動物、さらに具体的にはヒトであり得る。
【０１３０】
実際には、この組成物またはその薬学的に受容可能な塩を、その所望の生物学的活性を発揮するのに十分である量で投与する。
【０１３１】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与のためには、活性な薬物組成物を、経口の、非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア、例えば、エタノール、グリコール、水などと合わせてもよい。さらに、所望であるかまたは必要である場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤もこの混合物に組み込んでもよい。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然の糖、例えば、グルコースまたはβラクトース、コーン甘味料、天然および合成のゴム、例えば、アカシアゴム、トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投薬形態で用いられる潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石粉（タルカム）、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定はしないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などが挙げられる。希釈物としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンが挙げられる。
【０１３２】
注射用組成物は好ましくは、水溶性等張性溶液または懸濁液であり、そして坐剤は脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製するのが有利である。この組成物は、滅菌されてもよいし、そして／またはアジュバント、例えば、浸透圧および／または緩衝液を調製するための防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、塩を含んでもよい。さらに、それらの組成物はまた、他の治療上有用な物質を含んでもよい。この組成物は、それぞれ、従来の混合、顆粒化またはコーティングの方法に従って調製され、そして約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の活性成分を含む。
【０１３３】
本発明の化合物はまた、このような経口投薬形態において、時限性放出および徐放性の錠剤またはカプセル、丸剤、散剤、顆粒、エリキシル、チンキ剤、懸濁物、シロップおよびエマルジョンとして投与されてもよい。
【０１３４】
液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような薬学的に純粋な溶媒中に溶解するか、またはそれらの純粋な溶媒と混合し、これによって注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体に溶解するのに適切な固体型を処方してもよい。注射可能な組成物は好ましくは、水溶性の等張性溶液または懸濁液である。この組成物は、滅菌されてもよいし、そして／またはアジュバント、例えば、浸透圧および／または緩衝液を調節するための防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進因子、塩を含んでもよい。さらに、それらの組成物はまた、他の治療上有用な物質を含んでもよい。
【０１３５】
本発明の化合物は、全てが製薬業界の当業者に周知の形態を用いる、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下または筋肉内の形態で投与され得る。注射剤は、従来の形態で、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され得る。
【０１３６】
非経口注射剤投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内注射および注入のために用いられる。さらに、非経口投与のための１アプローチは、徐放性（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）のシステムの移植を使用し、これによって、本明細書に参考として援用される米国特許第３，７１０，７９５号に従い、一定レベルの投与量を維持することを確実にする。
【０１３７】
さらに、本発明に好ましい化合物は、適切な経鼻ビヒクルの局所使用を介して、経鼻形態で投与されても、または当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を用いて経皮経路を介して投与されてもよい。経皮送達システムの形態で投与するには、当然ながら、投与は、投薬レジメン全体にわたって間欠的ではなく連続的である。他の好ましい局所調製物としては、活性成分の濃度がｗ／ｗまたはｗ／ｖで０．０１％〜１５％にわたる、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられる。
【０１３８】
固体組成物のためには、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む賦形剤を用いてもよい。上記の活性な化合物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール、例えば、プロピレングリコールをキャリアとして用いる坐剤として処方されてもよい。ある実施形態では、坐剤は脂肪エマルジョンまたは懸濁物から調製することが有利である。
【０１３９】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達系の形態、例えば、小型単層小胞体、大型単層小胞体および多層小胞体で投与されてもよい。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む種々のリン脂質から形成され得る。ある実施形態では、米国特許第５，２６２，５６４号に記載のように、脂質成分のフィルムを薬物の水溶液で水和して、その薬物をカプセル化している脂質層を形成する。例えば、本明細書に記載されるアプタマー分子は、当該分野で公知の方法を用いて構築された親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸会合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。
【０１４０】
本発明の化合物はまた、標的可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを挙げることができる。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御された放出を得るのに有用なクラスの生分解性ポリマー、例えば、ポリ酢酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋されるかまたは両親媒性ブロックコポリマーにカップリングされてもよい。
【０１４１】
必要に応じて、投与されるべき薬学的組成物はまた、少量の非毒性の補助物質、例えば、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および例えば酢酸ナトリウム、トリエタノールアミン、オレイン酸塩のような他の物質を含んでもよい。
【０１４２】
この化合物を利用する投薬レジメンは、患者のタイプ、人種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置されるべき状態の重篤度；投与の経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに使用される特定の化合物またはその塩を含む種々の要因に従って選択される。通常の習熟した医師または獣医師は、この状態の進行を防止、対応または停止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定および処方できる。
【０１４３】
本発明の経口投薬は、示した効果のために用いる場合、経口で約０．０５〜１０００ｍｇ／日にわたる。組成物は好ましくは、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、５００．０ｍｇおよび１０００．０ｍｇの活性成分を含むスコア付けされた錠剤の形態で提供される。本発明の化合物の有効な血漿レベルは、１日あたり体重１ｋｇあたり０．００２ｍｇ〜５０ｍｇにおよぶ。
【０１４４】
本発明の化合物は、１日１回の用量で投与されてもよいし、または総１日投薬量は、１日に２回、３回または４回の分割用量で投与されてもよい。
【０１４５】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許文書は、そのような刊行物または文書の各々が、参考として本明細書に援用されるように詳細に、かつ個々に示されるかのように、本明細書に援用される。刊行物および特許文書の引用は、先行技術に関係することの承認と解釈されるべきではなく、その内容または日付についての承認であることもない。
【０１４６】
本発明は、書面の説明によってここに記載しているが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実行可能であること、ならびに前述の説明および以下の実施例が例示の目的であって、添付の特許請求の範囲の制限ではないことを理解する。
【実施例】
【０１４７】
（実施例）
（実施例１  トロンビンおよびＶＥＧＦ標的に対する２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
約３×１０１４個の特有の転写テンプレートのライブラリーは、各々が３０個連続するヌクレオチドのランダムな領域を含むが、これは、以下に記載のように合成して、ＰＣＲ増幅した。このライブラリーのクローニングおよび配列決定によって、このライブラリーにおけるランダムな領域の組成が各々のヌクレオチドの約２５％であることが実証された。ＤＮＡライブラリーをゲル濾過およびエタノール沈殿によって、未取り込みのｄＮＴＰから精製した。次いで、改変された転写物を、５００μＭの各々の４つの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ、すなわち、Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ、ならびに３０μＭの２’−ＯＨ  ＧＴＰを含む混合物から生成した（「ｒ／ｍＧｍＨ」）。さらに、改変された転写物は、部分改変されたヌクレオチドおよび部分リボヌクレオチドまたは全てのリボヌクレオチドを含む混合物、すなわち、全ての２’−ＯＨヌクレオチド（ｒＮ）を含む混合物；２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む混合物（ｒＲｍＹ）；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵ、ならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む混合物（ｒＧｍＨ）；ならびに交互に２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣおよび２’−ＦＧを含む混合物（「トグル（ｔｏｇｇｌｅ）」）；から生成した。次いで、これらの改変された転写物を、標的例えば、ＶＥＧＦおよびトロンビンに対してＳＥＬＥＸＴＭにおいて用いた。
【０１４８】
一般には、ゲル精製およびＤＮａｓｅ処理の後、これらの改変された転写物を、ＶＥＧＦについてはＰＢＳに、またはトロンビンについては１×ＡＳＢ（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）に溶解して、疎水性マスチウェルプレートの空のウェル中で１時間インキュベートして、プラスチック結合配列を取り除く。次いで、ＶＥＧＦについてはＰＢＳにおいて、またはトロンビンについてはＡＳＢＮＤ（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．４）中において室温で、事前に１時間インキュベートしておいたウェルにこの上清を移した。１時間のインキュベーション後、このウェルを洗浄して、結合した配列をサーモスクリプト（ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてインサイチュで１時間６５℃で逆転写した。次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、ゲル濾過によってｄＮＴＰから分離して、これを用いて次回の選択への入力のための改変された転写物を生成した。１０回の選択および増幅の後、ＶＥＧＦまたはトロンビンに対して得られたライブラリーが結合する能力を、Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔによって評価した。この時点で、ライブラリーをクローニングして、配列決定し、そして個々のクローンをＶＥＧＦまたはトロンビンに対する結合能力についてアッセイした。配列およびクローンの結合データのこの組み合わせを用いて、配列モチーフを同定した。
【０１４９】
ｒ／ｍＧｍＨおよびトグル選択の両方に共通する、ＡＲＣ２２４によって例示される１つのＶＥＧＦアプタマーモチーフを用いて、さらに小さい合成構築物を設計して、この構築物のＶＥＧＦに対する結合についてもアッセイして、ＶＥＧＦに対して最終的に最小化されたアプタマーである、両方が２３ヌクレオチド長であるＡＲＣ２４５およびＡＲＣ２５９を同定した。全ての２’−ＯＭｅ選択に共通する、ＡＲＣ２２６によって例示される別のＶＥＧＦアプタマーモチーフも同定した。本発明の方法によって生成したＡＲＣ２２４アプタマーは、配列
５’−ｍＣｍＧｍＡｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＣｍＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍＣｍＧ−３Ｔ（配列番号１８４）であって、「ｍ」は２’−Ｏ−メチル置換である、配列を有する。
【０１５０】
ＡＲＣ２２６アプタマーは、配列：
５−ｍＧｍＡｍＵｍＣｍＡｍＵｍＧｍＣｍＡｍＵＧｍＵｍＧｍＧｍＡｍＵｍＣｍＧｍＣｍＧｍＧｍＡｍＵｍＣ−［３Ｔ］−３’（配列番号１８６）を有する。
【０１５１】
ＡＲＣ２４５アプタマーは、配列：
５’−ｍＡｍＵｍＧｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＣｍＧｍＣｍＡｍＵ−［３Ｔ］−３’（配列番号１８７）を有する。
【０１５２】
ＡＲＣ２５９アプタマーは配列：
５’−ｍＡｍＣｍＧｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＣｍＧｍＣｍＧＭｕ−［３Ｔ］−３’（配列番号１８８）を有する。
【０１５３】
図３Ａは、ＡＲＣ２２４、ＡＲＣ２４５およびＡＲＣ２５９によるＶＥＧＦ結合のグラフである。これらのアプタマーの二次構造の模式図を、図３Ｂに提示する。
【０１５４】
ＡＲＣ２２４、ＡＲＣ２２６およびＡＲＣ２４５における全ての残基は、２’−ＯＭｅであり、そして全ての構築物（最初にＳＥＬＥＸＴＭによって同定された）は、固相化学合成によって生成した。ＰＢＳ中のドットブロットによって決定したこれらのアプタマーのＫＤ値は以下のとおりである：ＡＲＣ２２４  ３．９ｎＭ、ＡＲＣ２４５  ２．１ｎＭ、ＡＲＣ２５９  １．４ｎＭ。
【０１５５】
（試薬）他に示さない限り、全ての試薬をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１５６】
（オリゴヌクレオチド合成）Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて標準的なプロトコールによって、ＤＮＡ合成を行なった。本研究において用いたＤＮＡライブラリーは、以下の配列：ＡＲＣ２５４：５’−ＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号１）を有するが、ここで各々のＮは、４つのヌクレオチドの各々である可能性が等しい。２’−ＯＨヌクレオチドを含む、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡの合成は、３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて標準的プロトコールに従って行なった。ＰＣＲおよびＲＴプライマーを除いてＰＡＧＥを変性することによって、全てのオリゴヌクレオチドを精製した。
【０１５７】
（２’−ＯＭｅライブラリーの生成）合成ＤＮＡライブラリー（１．５ｎｍｏｌ）を以下のプライマーを用いる標準的な条件下でＰＣＲによって増幅した：３’プライマー５’−ＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号４５４）および５’プライマー５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴＴＣＴＣＧ−３’（配列番号４５５）。二本鎖転写テンプレートの得られたライブラリーを沈殿させて、ゲル濾過によって未取り込みのヌクレオチドから分離した。熱によっても、低塩条件への曝露によっても、どの時点でもライブラリーの変性はなかった。以下の条件：二本鎖ＤＮＡテンプレート２００ｎＭ、ＨＥＰＥＳ  ２００ｍＭ、ＤＴＴ  ４０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％スペルミジン、２ｍＭ  ２’−Ｏ−メチル  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ  ５００μＭ各々、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、ＧＭＰ  ５００μＭ、ＭｇＣｌ２  ５．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ  無機ピロホスファターゼ０．５単位を反応物１００μＬあたり、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  １．５単位を反応物ｐＨ７．５  １００μｌあたり、そして１０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧでｒ／ｍＧｍＨ転写を行ない、１回目の選択についてのテンプレートを生成し、そして３７℃で一晩インキュベートした。得られた転写物を変性１０％ＰＳＧＥによって精製して、ゲルから溶出し、ＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、とともにインキュベートし、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、沈殿して、ＰＢＳ中に採った。選択の開始のために、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡの直接化学合成によって転写物をさらに生成して、これらを変性１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製して、ゲルから溶出し、ＰＢＳ中に採った。
【０１５８】
ｒＮ、ｒＲｍＹおよびｒＧｍＨ転写物について、転写条件は以下のとおりであった、ここで１×Ｔｃ緩衝液は：２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５である。
【０１５９】
２’−ＯＨ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ（ｒＮ）条件を用いる場合、転写反応条件は、ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ、各ＮＴＰ  ５ｍＭ、１×  Ｔｃ緩衝液、１０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１．５単位、および５０〜２００ｎＭ二本鎖テンプレート（２００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて多様性を増大し、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の約５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）。
【０１６０】
２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  ＡおよびＧ（ｒＲｍＹ）条件を用いる場合、転写反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜２００ｎＭ二本鎖テンプレート（２００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて多様性を増大し、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化した約５０ｎＭの、ＰＣＲ反応物の１／１０希釈を用いた）、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ、ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭの各々の塩基、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０１６１】
２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  Ｇ（ｒＧｍＨ）条件を用いる場合、転写反応条件は、１００μｌの容積中において、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜２００ｎＭ二本鎖ＤＮＡテンプレート（２００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて多様性を増大し、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の約５０ｎＭ、１／１０希釈を用いた）、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ、ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭの各々の塩基、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ単独変異  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０１６２】
２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、Ｕおよび２’−Ｆ  Ｇ条件を用いる場合、転写反応条件は、０．５ｍＭ  ２’−Ｆ  ＧＴＰを２’−ＯＨ  ＧＴＰの代わりに用いること以外は、ｒＧｍＨと同様であった。
【０１６３】
（逆転写）ＳＥＬＥＸＴＭの間に用いる逆転写条件は以下のとおりである（１００μＬの反応容積）：１×Ｔｈｅｒｍｏ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４μＭのプライマー、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭの各々のｄＮＴＰ、２００μＭのバナジウム酸塩ヌクレオチドインヒビター、１０μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ酵素１．５単位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。逆転写反応の収率は、２’ＯＭｅテンプレートについては低い。ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりである：１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）、０．５μＭ  ５’プライマー、０．５μＭ  ３’プライマー０．２ｍＭの各々のＤＨＴＰ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ５単位（ＮＥＢ）。
【０１６４】
（２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロトコール）上述のとおり、全部で１０の選択について５種の転写物を用いて、２つの標的（ＶＥＧＦおよびトロンビン）の各々に対する改変された転写物でＳＥＬＥＸＴＭを行なった。５種の転写物は：「ｒＮ」（全て２’−ＯＨ）、「ｒＲｍＹ」（２’−ＯＨ  Ａ、Ｇ、２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕ）、「ｒＧｍＨ」（２’ＯＨ  Ｇ、２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕ、Ａ）、「ｒ／ｍＧｍＨ」（２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ  ５００μＭ、２’−ＯＨ  Ｇ  ３０μＭ）、「トグル」（あるいは、「ｒ／ｍＧｍＨ」および２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、Ｃ、２’−Ｆ  Ｇ）であった。
【０１６５】
ＶＥＧＦに対する選択の全てによって、ＶＥＧＦ特異的アプタマーを生成したが、トロンビンに対するｒＮおよびｒＲｍＹ選択のみでは、トロンビン特異的アプタマーが生成された。これらの選択において同定されたアプタマー配列を以下の表１〜５（ＶＥＧＦ）および表６〜１０（トロンビン）に示す。
【０１６６】
この配列は、トロンビンの「ｒＧｍＨ」、「ｒ／ｍＧｍＨ」および「トグル」は５回目から、ＶＥＧＦ「ｒ／ｍＧｍＨ」は１０回目から、そしてＶＥＧＦ「トグル」は８回目からであることを除けば、ＳＥＬＥＸＴＭの１１回目由来である。
【０１６７】
「ＮＵＮＣ  ＭＡＸＹ」プレートに対する疎水性吸着によってタンパク質を最初に固定すること、結合しなかったタンパク質を洗い流すこと、２’−ＯＭｅ置換転写物のライブラリーを固定されたタンパク質とともにインキュベートすること、結合しなかった転写物を洗い流すこと、プレート中でＲＴを直接実施すること、その後のＰＣＲ、およびその後得られた二本鎖ＤＮＡテンプレートを適切な転写条件下で転写することによって、選択を行なった。
【０１６８】
シラン処理したウェル中で種々のタンパク質濃度とともにインキュベートした微量の３２Ｐで本体標識した転写物を用いて、結合アッセイを行ない、ついでこれらをナイロン膜上のニトロセルロース膜のサンドイッチを通過させた。タンパク質結合ＲＮＡはＮＣ膜上で可視化され、未結合のＲＮＡはナイロン膜上で可視化される。次いで、結合割合を用いて親和性を算出する（図４、５および６を参照のこと）。例えば、ＡＲＣ２２４（全て２−ＯＭｅ）の種々の２’−ＯＨ  Ｇ改変体の結合特徴は図４に示す。命名法「ｍＧＸＧ」とは、５’末端から連続して番号付けした「Ｘ」位置における２’ＯＭｅ  Ｇについての２’−ＯＨ  Ｇの置換を示す。従って、ｍＧ７Ｇ  ＡＲＣ２２４は、７位に２’−ＯＨを有するＡＲＣ２２４である。ＡＲＣ２２５は、７位、１０位、１４位、１６位、１９位、２２位および２４位において２’−ＯＭｅから２’−ＯＨへの置換を有するＡＲＣ２２４である。全ての構築物（ＳＥＬＥＸＴＭによって最初に同定した）は、固相化学合成によって生成した。これらのデータは、ＰＢＳ中でのドット−ブロットによって生成した。完全に２’−ＯＭｅのアプタマーであるＡＲＣ２２４は、研究したいずれの２’−ＯＨ置換改変体に比べても優れたＶＥＧＦ結合特性を有する。
【０１６９】
図５は、ＶＥＧＦに対するＡＲＣ２２４およびＡＲＣ２２５の結合のプロットである。このグラフによって、ＡＲＣ２２４が、ＶＥＧＦの生物学的機能を阻害する様式でＶＥＧＦに結合することが示される。１２５Ｉ標識ＶＥＧＦをアプタマーとともにインキュベートし、次いでその混合物をヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とともにインキュベートした。その上清を除去して、細胞を洗浄し、結合したＶＥＧＦをシンチレーションカウンターでカウントした。ＡＲＣ２２５は、ＡＲＣ２２４と同じ配列を有し、５’末端から番号付けした７、１０、１４、１６、１９、２２および２４位における２’−ＯＭｅから２’−ＯＨへの置換を有する。これらのデータによって、ＡＲＣ２２４のＩＣ５０が約２ｎＭであることが示される。
【０１７０】
図６は、ＥＤＴＡの有無によるオートクレーブの前後のＶＥＧＦに対するＡＲＣ２２４結合の結合曲線プロットである。図６は、１２５℃のピーク温度で２５分のオートクレーブの前後の、機能的であるアプタマーの割合およびＶＥＧＦに対する結合のＩＣ５０の両方を示す。これらのデータは、ＰＢＳ中のドットブロットによって測定した、ＰＢＳ中の１ｎＭ  ＶＥＧＦに対する５’標識ＡＲＣ２２４の結合の未標識のＡＲＣ２２４による阻害によって決定した。示される場合、サンプルは１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ。全ての構築物（最初にＳＥＬＥＸＴＭによって同定した）は、固相化学合成によって生成した。このアッセイの限界内ではＡＲＣ２２４の分解を観察しなかった。
【０１７１】
分解研究によって、４日にわたる３７℃で血漿中でのインキュベーションによって、半減期の測定ができないが少なくとも４日以上であるようなわずかな分解が誘導される（例えば、図７を参照のこと）。図７Ａおよび図７Ｂは、ラット血漿において３７℃でインキュベートした場合の、それぞれＡＲＣ２２４およびＡＲＣ２２６の安定性のプロットである。この図で示すとおり、ＡＲＣ２２４およびＡＣＲ２２６の両方がラット血漿において４日後、検出可能な分解を示さなかった。これらの実験では、５’標識したＡＲＣ２２４およびＡＲＣ２２６をラット血漿中で３７℃でインキュベートして、変性ＰＡＧＥによって分析した。全ての構築物（ＳＥＬＥＸＴＭによって最初に同定した）を固相化学合成によって生成した。半減期は、１００時間を超えると思われる。
【０１７２】
以下の表１〜表１０は、示したとおり、種々のライブラリーから単離した転写されたアプタマー、すなわちｒＮ、ｒＲｍＹ、ｒＧｍＨおよびｒ／ｍＧｍＨに相当するアプタマーのＤＮＡ配列を示す。アプタマーの配列は、示したＤＮＡ配列においてチミジン残基に代わってウリジン残基を有する。表１１は、本発明の方法によって得られた安定化されたアプタマー配列を示す。本明細書において用いる場合、「３Ｔ」とは、５’位においてオリゴヌクレオチドホスホジエステル骨格に結合した逆位チミジンヌクレオチドをいい、この得られたオリゴは２つの５’−ＯＨ末端を有し、従って３’ヌクレアーゼに対して耐性である。
【０１７３】
他に言及しない限り、種々の表に列挙した個々の配列は、提供されたＳＥＬＥＸ条件下で選択されたアプタマーのｃＤＮＡクローンである。本発明に提供される実際のアプタマーは、本明細書に示すとおり、ｒＮ、ｍＮ、ｒＲｍＹ、ｒＧｍＨ、ｒ／ｍＧｍＨ、ｄＲｍＹおよび残基のトグル組み合わせを含む配列に相当する配列である。
【０１７４】
（２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭの結果）
（表１−ＶＥＧＦアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−全て２’−ＯＨ（ｒＮ））
【０１７５】
【表１−１】
2006508688.tif 000002
【０１７６】
【表１−２】
2006508688.tif 000003
（表２−ＶＥＧＦアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−２’−ＯＨ  ＡＧ、２’−ＯＭｅ  ＣＵ（ｒＲｍＹ））
【０１７７】
【表２−１】
2006508688.tif 000004
【０１７８】
【表２−２】
2006508688.tif 000005
（表３−ＶＥＧＦアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−２’−ＯＨ  Ｇ、２’−ＯＭｅ  ＣＵＡ（ｒＧｍＨ））
【０１７９】
【表３−１】
2006508688.tif 000006
【０１８０】
【表３−２】
2006508688.tif 000007
（表４−ＶＥＧＦアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−２’−ＯＭｅ  ＡＵＧＣ（ｒ／ｍＧｍＨ、各々のＧは、その中に２’−ＯＭｅ基を組み込んでいる確率が９０％である））
【０１８１】
【表４−１】
2006508688.tif 000008
【０１８２】
【表４−２】
2006508688.tif 000009
（表５−ＶＥＧＦアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−交互に「ｒ／ｍＧｍＨ」および２’−ＯＭｅ  ＡＵＣ、２’−Ｆ  Ｇ（トグル））
【０１８３】
【表５−１】
2006508688.tif 000010
【０１８４】
【表５−２】
2006508688.tif 000011
（表６−トロンビンアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−全て２’−ＯＨ（ｒＮ））
【０１８５】
【表６−１】
2006508688.tif 000012
【０１８６】
【表６−２】
2006508688.tif 000013
（表７−トロンビンアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−２’−ＯＨ  ＡＧ、２’−ＯＭｅ  ＣＵ（ｒＲｍＹ））
【０１８７】
【表７−１】
2006508688.tif 000014
【０１８８】
【表７−２】
2006508688.tif 000015
（表８−トロンビンアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−２’−ＯＨ  Ｇ、２’−ＯＭｅ  ＣＵＡ（ｒＧｍＨ））
【０１８９】
【表８−１】
2006508688.tif 000016
【０１９０】
【表８−２】
2006508688.tif 000017
（表９−トロンビンアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−２’−ＯＭｅ  ＡＵＧＣ（ｒ／ｍＧｍＨ、各々のＧは、その中に２’−ＯＭｅ基を組み込んでいる確率が９０％である））
【０１９１】
【表９−１】
2006508688.tif 000018
【０１９２】
【表９−２】
2006508688.tif 000019
（表１０−トロンビンアプタマー配列の対応するｃＤＮＡ−交互に「ｒ／ｍＧｍＨ」および２’−ＯＭｅ  ＡＵＣ、２’−Ｆ  Ｇ（トグル））
【０１９３】
【表１０−１】
2006508688.tif 000020
【０１９４】
【表１０−２】
2006508688.tif 000021
（表１１−安定化されたアプタマー配列（各々のＧ残基は、２’−ＯＭｅ基で置換されている確率が９０％であり、「３Ｔ」とは、５’位においてホスホジエステル骨格に結合した逆位チミジンヌクレオチドをいい、この得られたオリゴは２つの５’−ＯＨ末端を有し、従って３’ヌクレアーゼに対して耐性である）
【０１９５】
【表１１】
2006508688.tif 000022
（実施例２  ２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
転写テンプレートのライブラリーを用いて、種々の条件下で２’−Ｏ−メチＮＴＰを組み込んでいるＲＮＡオリゴヌクレオチドのプールを生成した。転写テンプレート（ＡＲＣ２５６）および転写条件は、ｒＲｍＹ（配列番号４５６）、ｒＧｍＨ（配列番号４６２）、ｒ／ｍＧｍＨ（配列番号４６３）、およびｄＲｍＹ（配列番号４６４）として以下に記載する。未改変のＲＮＡ転写物を配列番号４６８によって示す。
ＡＲＣ２５６：ＤＮＡ転写テンプレート
５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４５３）
ＡＲＣ２５６  ＲＮＡ転写産物は：
５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ−３’（配列番号４６８）である。
【０１９６】
転写条件は、１×Ｔｃ緩衝液が２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５であるように変更された。
【０１９７】
２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  ＡおよびＧ（ｒＲｍＹ）条件を用いる場合、転写反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜２００ｎＭの二本鎖テンプレート（２００ｎｍテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化した、約５０ｎＭの、ＰＣＲ反応物の１／１０希釈を用いた）、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭの各々の塩基、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼであった。１単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとは、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で転写物中に１ナノモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを取り込むのに必要な酵素の量として規定される。１単位の無機ピロホスファターゼとは、ｐＨ７．２で２５℃において１分あたり１．０モルの無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量として規定される。
【０１９８】
２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  Ｇ（ｒＧｍＨ）条件を用いる場合、転写反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜２００ｎＭ二本鎖ＤＮＡテンプレート（２００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ、ＭｎＣｌ２、２ｍＭの各々の塩基、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ単独変異  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼであった。１単位のＹ６３９Ｆ変異  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとは、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で転写物中に１ナノモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを取り込むのに必要な酵素の量として規定する。
【０１９９】
全ての２’−ＯＭｅヌクレオチド（ｒ／ｍＧｍＨ）の条件を用いる場合、反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜２００ｎＭ二本鎖テンプレート（２００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）、６．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭの各々の塩基、３０μＭ  ＧＴＰ、１ｍＭ  ＧＭＰ、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０２００】
デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン（ｄＲｍＹ）条件を用いる場合、反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜３００ｎＭ二本鎖テンプレート（３００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭ、１／１０希釈を用いた）、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭの各々の塩基、３０μＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  スペルミジン、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ単独変異  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０２０１】
次いで、これらのプールをＳＥＬＥＸＴＭにおいて用いて以下の標的に対するアプタマーを選択した：ＩｇＥ、ＩＬ−２３、ＰＤＧＦ−ＢＢ、トロンビンおよびＶＥＧＦ。標的ＩＬ−２３に対して結合する６、７、８回目のｄＲｍＹおよび未選択の配列のプロットを図１４に示し、そして標的ＰＤＧＦ−ＢＢに結合する６、７回目のｄＲｍＹおよび未選択の配列のプロットを図１４に示す。
【０２０２】
（実施例３  ＩｇＥに対するアプタマーのｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
完全に２’−ＯＭｅ置換したオリゴヌクレオチドは、最も安定な改変アプタマーであるが、デオキシプリンヌクレオチドでのプリンの置換によっても安定な転写物が生じる。ｄＲｍＹ（デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン）転写条件を用いる場合、この産物は極めてＤＮａｓｅ耐性であり、かつ安定な治療剤として有用である。この結果は驚くべきである。なぜならｄＲｍＹ転写物の組成は、ほぼ５０％ＤＮＡであり、周知のとおりヌクレアーゼによって容易に分解されるからである。また、ｄＲｍＹ転写条件を用いる場合、２’−ＯＨ  ＧＴＰスパイクの必要はない。研究によって、改変されたヌクレオチドを有するほぼ同じ量のｄＲｍＹ転写物が、２’−ＯＨ  ＧＴＰドーピングで２’−ＯＨ  ＧＴＰドーピングなしの場合と同様に生成されることが示されている。従って、ｄＲｍＹ転写条件下では、２’−ＯＨ  ＧＴＰドーピングは任意である。転写テンプレートのライブラリーを用いて、種々の転写条件下で、２’−Ｏ−メチルピリミジンＮＴＰ（ＵおよびＣ）およびデオキシプリン（ＡおよびＧ）ＮＴＰを組み込むオリゴヌクレオチドのプールを生成した。転写テンプレート（ＡＲＣ２５６）および転写条件はｄＲｍＹと同様に以下に記載する。
【０２０３】
ＡＲＣ２５６：ＤＮＡ転写テンプレート
５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４５３）
ＡＲＣ２５６  ｄＲｍＹ  ＲＮＡ転写物は：
５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ−３’（配列番号４６４）である。
【０２０４】
デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン（ｄＲｍＹ）条件を用いる場合、反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜３００ｎＭ二本鎖テンプレート（３００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭの各々の塩基、３０μＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  スペルミジン、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ単独変異  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０２０５】
次いで、これらのプールをＳＥＬＥＸＴＭにおいて用いて標的としてＩｇＥに対するアプタマーを選択した。上記のようにＳＥＬＥＸＴＭの６回目の後に得た配列を以下の表１２に列挙する。標的ＩｇＥ濃度の増大に伴って結合した６回目の配列のプロットを図８に示す。
【０２０６】
（表１２−ＩｇＥに対するｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６回目の配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２０７】
【表１２−１】
2006508688.tif 000023
【０２０８】
【表１２−２】
2006508688.tif 000024
【０２０９】
【表１２−３】
2006508688.tif 000025
（実施例４  トロンビンに対するアプタマーのｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
完全に２’−ＯＭｅ置換したオリゴヌクレオチドは、最も安定な改変アプタマーであるが、デオキシプリンヌクレオチドでのプリンの置換によっても安定な転写物が生じる。ｄＲｍＹ（デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン）転写条件を用いる場合、この産物は極めてＤＮａｓｅ耐性であり、かつ安定な転写物として有用である。この結果は驚くべきである。なぜならｄＲｍＹ転写物の組成は、ほぼ５０％ＤＮＡであり、周知のとおりヌクレアーゼによって容易に分解されるからである。また、ｄＲｍＹ転写条件を用いる場合、２’−ＯＨ  ＧＴＰスパイクの必要はない。転写テンプレートのライブラリーを用いて、種々の転写条件下で、２’−Ｏ−メチルピリミジンＮＴＰ（ＵおよびＣ）およびデオキシプリン（ＡおよびＧ）ＮＴＰを組み込むオリゴヌクレオチドのプールを生成した。転写テンプレート（ＡＲＣ２５６）および転写条件はｄＲｍＹと同様に以下に記載する。
【０２１０】
ＡＲＣ２５６：ＤＮＡ転写テンプレート
５’−ｄＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４５３）
ＡＲＣ２５６  ｄＲｍＹ  ＲＮＡ転写産物は：
５’ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ−３’（配列番号４６４）である。
【０２１１】
デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン（ｄＲｍＹ）条件を用いる場合、反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜３００ｎＭ二本鎖テンプレート（３００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の１／１０希釈を用いた）、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．９ｍＭ、ＭｎＣｌ２、２ｍＭの各々の塩基、３０μＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  スペルミジン、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ単独変異  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０２１２】
次いで、これらのプールをＳＥＬＥＸＴＭにおいて用いて標的としてトロンビンに対するアプタマーを選択した。上記のようにＳＥＬＥＸＴＭの６回目の後に得た配列を以下の表１３に列挙する。標的トロンビンに結合した６回目の配列のプロットを図９に示す。
【０２１３】
（表１３−トロンビンに対するｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６回目の配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２１４】
【表１３−１】
2006508688.tif 000026
【０２１５】
【表１３−２】
2006508688.tif 000027
【０２１６】
【表１３−３】
2006508688.tif 000028
（実施例５  ＶＥＧＦに対するアプタマーのｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
完全に２’−ＯＭｅ置換したオリゴヌクレオチドは、最も安定な改変アプタマーであるが、デオキシプリンヌクレオチドでのプリンの置換によっても安定な転写物が生じる。ｄＲｍＹ（デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン）転写条件を用いる場合、この産物は極めてＤＮａｓｅ耐性であり、かつ安定な転写物として有用である。この結果は驚くべきである。なぜならｄＲｍＹ転写物の組成は、ほぼ５０％のＤＮＡ  ＲＮＡであり、周知のとおりヌクレアーゼによって容易に分解されるからである。また、ｄＲｍＹ転写条件を用いる場合、２’−ＯＨ  ＧＴＰスパイクの必要はない。転写テンプレートのライブラリーを用いて、種々の転写条件下で、２’−Ｏ−メチルピリミジンＮＴＰ（ＵおよびＣ）およびデオキシプリン（ＡおよびＧ）ＮＴＰを組み込むオリゴヌクレオチドのプールを生成した。転写テンプレート（ＡＲＣ２５６）および転写条件はｄＲｍＹと同様に以下に記載する。
【０２１７】
ＡＲＣ２５６：ＤＮＡ転写テンプレート
５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ（配列番号４５３）
ＡＲＣ２５６  ｄＲｍＹ  転写産物は：
５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＵＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＧ−３’（配列番号４６４）である。
【０２１８】
デオキシプリン、ＡおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅピリミジン（ｄＲｍＹ）条件を用いる場合、反応条件は、１×Ｔｃ緩衝液、５０〜３００ｎＭ二本鎖テンプレート（３００ｎＭのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の１／１０希釈を用いた）、９．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭの各々の塩基、３０μＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  スペルミジン、１０％  ＰＥＧ−８０００、０．２５単位の無機ピロホスファターゼおよび１．５単位のＹ６３９Ｆ単独変異  ＲＮＡポリメラーゼであった。
【０２１９】
次いで、これらのプールをＳＥＬＥＸＴＭにおいて用いて標的としてＶＥＧＦに対するアプタマーを選択した。上記のようにＳＥＬＥＸＴＭの６回目の後に得た配列を以下の表１４に列挙する。標的ＶＥＧＦ濃度に結合した６回目の配列のプロットを図１０に示す。
【０２２０】
（表１４−ＶＥＧＦに対するｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６回目の配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２２１】
【表１４−１】
2006508688.tif 000029
【０２２２】
【表１４−２】
2006508688.tif 000030
（実施例６  ２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（ｍＮ）およびｄＲｍＹオリゴヌクレオチドの血漿安定性）
ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）に連結された２つの配列のオリゴヌクレオチドを２つのバージョンで合成した：（１）全て２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（ｍＮ）：５’−ＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号４５７）−［ＰＥＧ］−ＧＧＵＧＣＣＡＡＧＵＣＧＵＵＧＣＵＣＣ−３’（配列番号４５８）を有するバージョン、および（２）２’−ＯＨプリン  ＮＴＰおよび２’−ＯＭｅピリミジン（ｄＲｍＹ）ＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号４６５）−［ＰＥＧ］−ＧＧＵＧＣＣＡＡＧＵＣＧＵＵＧＣＵＣＣ−３’（配列番号４６６）を有するバージョン。これらのオリゴヌクレオチドを全長の安定性について評価した。図１１Ａは、３’ｉｄＴを有する全部２’−ＯＭｅのオリゴヌクレオチドの分解プロットを示しており、そして図１１Ｂは、ｄＲｍＹオリゴヌクレオチドの分解プロットを示している。オリゴヌクレオチドを３７℃で９５％ラット血漿中において５０ｎＭでインキュベートして、各々について４８時間よりかなり長い血漿半減期、そしてそれらが極めて類似の血漿安定性プロフィールを有することを示している。
【０２２３】
（実施例７  ヒトＩＬ−２３に対するｒＲｍＹおよびｒＧｍＨ  ２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕおよび２’−ＯＨ  Ｇ、Ａ（ｒＲｍＹ）、ならびに２’−Ｏ−メチルＡ、ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  Ｇ（ｒＧｍＨ）を含むアプタマーを同定するために選択を行なった。全ての選択は、疎水性プレート上に固定されているヒトＩＬ−２３タンパク質標的に対する直接選択であった。選択によって、ナイーブな未選択のプールに対するｈ−ＩＬ−２３結合について有意に富化されたプールを得た。ｈ−ＩＬ−２３についての個々のクローン配列を本明細書において報告しているが、個々のクローンについてのｈ−ＩＬ−２３結合データは示していない。
【０２２４】
（プール調製）ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭ  ＤＮＡシンセサイザーを用いて配列５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＴＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧ−３’（配列番号４５９）を有するＤＮＡテンプレートを合成して、標準的な方法によって脱保護した。テンプレートは、プライマーＰＢ．１１８．９５．Ｇ：５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６０）およびＳＴＣ．１０４．１０２．Ａ（５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号４６１）を用いて増幅し、次いで、Ｙ６３９Ｆ単独変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写のためのテンプレートとして用いた（２００ｎｍのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）。転写は、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５００μＭ  ＮＴＰ、５００μＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μｌの無機ピロホスファターゼおよびＹ６３９Ｆ単独変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて行なった。２つの異なる組成物であるｒＲｍＹおよびｒＧｍＨを転写した。
【０２２５】
（選択）各々の回の選択は、１００μＬの１×ダルベッコＰＢＳ中において室温で２時間のＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に対して２０ピコモルのｈ−ＩＬ−２３を固定することによって開始した。次いで、この上清を取り出して、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ、０．２％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて４回洗浄した。プールのＲＮＡを３分間９０℃に加熱して、１０分間室温に冷却して再折り畳みした。１回目には、陽性の選択工程を行なった。要するに、プールのＲＮＡの１×１０１４個の分子（０．２ナノモル）を、固定されたタンパク質標的とともにウェル中において１００μＬの結合緩衝液（１×ＤＰＢＳおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間インキュベートした。次いで、上清を回収して、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。その後の回には陰性の選択工程を含んだ。プールＲＮＡをまた、空のウェル中において室温で３０分間インキュベートして、陽性選択工程の前にプールから可撓性の結合配列を除いた。ストリンジェンシーを増大するために、洗浄回数は４回目の後には増やした。全ての場合において、固定されたｈ−ＩＬ−２３に結合したプールＲＮＡを、ＲＴ混合物（３’プライマー、ＳＴＣ．１０４．１０２．ＡおよびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、その後の６５℃での１時間のインキュベートの後に、選択プレート中に直接、逆転写した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いた（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）６０℃のアニーリング温度と組み合わせた「Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ（ホットスタート）」ＰＣＲ条件を用いて、プライマー−ダイマー形成を最小化した。製造業者の推奨する条件に従って、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐカラムを用いて、増幅したプールのテンプレートＤＮＡを脱塩して、次回の選択のためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために用いた。転写されたプールは、１０％ポリアクリルアミドゲル上で毎回ゲル精製した。表１５は、選択１回あたりに用いたＲＮＡプールの濃度を示す。
【０２２６】
（表１５−選択の１回あたりのＲＮＡプールの濃度）
【０２２７】
【表１５】
2006508688.tif 000031
サンドイッチフィルター結合アッセイを用いて選択の進行をモニタリングした。５’−３２Ｐ標識したプールのＲＮＡを９０℃で３分間再折り畳みして、室温に１０分間冷却した。次に、プールＲＮＡ（微量）をｈ−ＩＬ−２３  ＤＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡを加えたものと一緒に３０分間室温でインキュベートし、次いで、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）中でニトロセルロースおよびナイロンフィルターサンドイッチに加えた。ニトロセルロースに結合したプールのＲＮＡの割合を算出して、ほぼ３回ごとにシングルポイントスクリーンを用いてモニターした（＋／−２５０ｎＭ  ｈ−ＩＬ−２３）。プールＫＤ測定は、タンパク質の滴定および上記のようなドットブロット装置を用いて測定した。
【０２２８】
（選択）ｒＲｍＹ  ｈ−ＩＬ−２３選択は、４回目の選択後、ｈ−ＩＬ−２３結合対ナイーブなプールについて富化された。選択ストリンジェンシーを増大して、選択は８回以上の回について継続した。９回目にプールのＫＤは約５００ｎＭ以上であった。ｒＧｍＨ選択は１０回目にナイーブなプール結合を超えて富化された。プールのＫＤはまた、約５００ｎＭ以上である。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプールをクローニングして、個々の配列を生成した。図１２によって、ｒＧｍＨの１０回目およびｒＲｍＹの１２回目のプールについてのｈ−ＩＬ−２３に対するプール結合データが示される。解離定数を評価して、式：結合したＲＮＡ画分＝振幅＊ＫＤ／（ＫＤ＋［ｈ−ＩＬ−２３］）に対してデータをあてはめた。表１６は、ｒＲｍＹ選択の１２回目について個々のクローン選択を示している。４８個のクローンのうちに６つの複製配列の１群および２つの複数配列の４対が存在する。４８個の全てのクローンを標識して、２００ｍＭ  ｈ−ＩＬ−２３に対する結合について試験する。表１７は、ｒＧｍＨ選択の１０回目の個々のクローン配列を示す。結合データを図１４に示す。
【０２２９】
（表１６．ｒＲｍＹ選択の１２回目の個々のクローン配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２３０】
【表１６−１】
2006508688.tif 000032
【０２３１】
【表１６−２】
2006508688.tif 000033
（表１７．ｒＧｍＨ選択の１０回目の個々のクローン配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２３２】
【表１７−１】
2006508688.tif 000034
【０２３３】
【表１７−２】
2006508688.tif 000035
（実施例８  ヒトＩｇＥに対するｒＲｍＹ  ２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕおよび２’−ＯＨ  Ｇ、Ａ（ｒＲｍＹ）を含むアプタマーを同定するために選択を行なった。全ての選択は、疎水性プレート上に固定されていたヒトＩｇＥタンパク質標的に対する直接選択であった。選択によって、ナイーブな未選択のプールに対するｈ−ＩｇＥ結合について有意に富化されたプールを得た。ｈ−ＩｇＥについての個々のクローン配列を本明細書において報告しているが、個々のクローンについてのｈ−ＩｇＥ結合データは示していない。
【０２３４】
（プール調製）ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭ  ＤＮＡシンセサイザーを用いて配列５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＴＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧ−３’（配列番号４５９）を有するＤＮＡテンプレートを合成して、標準的な方法によって脱保護した。テンプレートは、プライマーＰＢ．１１８．９５．Ｇ：５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６０）およびＳＴＣ．１０４．１０２．Ａ（５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号４６１）を用いて増幅し、次いで、Ｙ６３９Ｆ単独変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写のためのテンプレートとして用いた（２００ｎｍのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）。転写は、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ５００μＭ  ＮＴＰ、５００μＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μｌの無機ピロホスファターゼおよびＹ６３９Ｆ単独変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて行なった。
【０２３５】
（選択）各々の回の選択は、１００μＬの１×ダルベッコＰＢＳ中において室温で２時間のＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に対して２０ピコモルのｈ−ＩｇＥを固定することによって開始した。次いで、この上清を取り出して、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ、０．２％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて４回洗浄した。プールのＲＮＡを３分間９０℃に加熱して、１０分間室温に冷却して再折り畳みした。１回目には、陽性の選択工程を行なった。要するに、プールのＲＮＡの１×１０１４個の分子（０．２モル）を、固定されたタンパク質標的とともにウェル中において１００μＬの結合緩衝液（１×ＤＰＢＳおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間インキュベートした。次いで、上清を回収して、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。その後の回には陰性の選択工程を含んだ。プールＲＮＡをまた、空のウェル中において室温で３０分間インキュベートして、陽性選択工程の前にプールから可撓性の結合配列を除いた。ストリンジェンシーを増大するために、洗浄回数は４回目の後には増やした。全ての場合において、固定されたｈ−ＩｇＥに結合したプールＲＮＡを、ＲＴ混合物（３’プライマー、ＳＴＣ．１０４．１０２．ＡおよびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、その後の６５℃での１時間のインキュベートの後に、選択プレート中に直接、逆転写した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いた（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）６０℃のアニーリング温度と組み合わせた「Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ」ＰＣＲ条件を用いて、プライマー−ダイマー形成を最小化した。製造業者の推奨する条件に従って、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐカラムを用いて、増幅したプールのテンプレートＤＮＡを脱塩して、次回の選択のためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために用いた。転写されたプールは、１０％ポリアクリルアミドゲル上で毎回ゲル精製した。
【０２３６】
ｈ−ＩｇＥに対するｒＲｍＹプール選択は、ナイーブなプール結合を超えて４回目後に富化された。選択のストリンジェンシーを増大して、選択を２回以上継続した。６回目のプールのＫＤは、約５００ｎＭ以上である。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプールをクローニングして、配列決定に供した。プールは、配列決定されたクローンの７１％までを構成した１つの主要なクローン（ＡＭＸ（１２３）．Ａ１）を含んだ。これらのさらなるクローンを試験したところ、主要なクローンよりも高い程度の結合が示された。プールのＫＤは約５００ｎＭであると算出された。解離定数はまた上記のように算出した。表１８は、ｈ−ＩｇＥに対する選択の６回後のｒＲｍＹプールクローンを示すが、ここでは主要なクローンが、８つの他の配列ファミリーとともに、９６個のクローンのうち４０％までを構成している、ＡＭＸ（１２３）．Ａ１であった。
【０２３７】
（表１８．ｈ−ＩｇＥに対する６回目の選択後、ｒＲｍＹプールクローンの個々のクローン配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２３８】
【表１８】
2006508688.tif 000036
（実施例９  ＰＤＧＦ−ＢＢに対するｒＲｍＹおよびｒＧｍＨ  ２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭ）
２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｕおよび２’−ＯＨ  Ｇ、Ａ（ｒＲｍＹ）、ならびに他の２’−Ｏ−メチルＡ、ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  Ｇ（ｒＧｍＨ）を含むアプタマーを同定するために選択を行なった。全ての選択は、疎水性プレート上に固定されていたヒトＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質標的に対する直接選択であった。選択によって、ナイーブな未選択のプールに対するｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ結合について有意に富化されたプールを得た。ＰＤＧＦ−ＢＢについての個々のクローン配列を本明細書において報告している。
【０２３９】
（プール調製）ＡＢＩ  ＥＸＰＥＤＩＴＥＴＭ  ＤＮＡシンセサイザーを用いて配列５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＴＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧ−３’（配列番号４５９）を有するＤＮＡテンプレートを合成して、標準的な方法によって脱保護した。テンプレートは、プライマーＰＢ．１１８．９５．Ｇ：５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６０）およびＳＴＣ．１０４．１０２．Ａ（５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号４６１）を用いて増幅し、次いで、Ｙ６３９Ｆ単独変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写のためのテンプレートとして用いた（２００ｎｍのテンプレートを１回目に用いて、そしてその後の回には、本明細書に記載の条件を用いて、最適化したＰＣＲ反応物の５０ｎＭの、１／１０希釈を用いた）。転写は、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ＰＥＧ−８０００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５００μＭ  ＮＴＰ、５００μＭ  ＧＭＰ、０．０１単位／μｌの無機ピロホスファターゼおよびＹ６３９Ｆ単独変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて行なった。２つの異なる組成物であるｒＲｍＹおよびｒＧｍＨを転写した。
【０２４０】
（選択）各々の回の選択は、１００μＬの１×ダルベッコＰＢＳ中における室温で２時間のＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面に対して２０ピコモルのＰＤＧＦ−ＢＢを固定することによって開始した。次いで、この上清を取り出して、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ、０．２％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて４回洗浄した。プールのＲＮＡを３分間９０℃に加熱して、１０分間室温に冷却して再折り畳みした。１回目には、陽性の選択工程を行なった。要するに、プールのＲＮＡの１×１０１４個の分子（０．２ナノモル）を、固定されたタンパク質標的とともにウェル中において１００μＬの結合緩衝液（１×ＤＰＢＳおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中でインキュベートした。次いで、上清を回収して、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。その後の回には陰性の選択工程を含んだ。プールＲＮＡをまた、空のウェル中において室温で３０分間インキュベートして、陽性選択工程の前にプールから可撓性の結合配列を除いた。ストリンジェンシーを増大するために、洗浄回数は４回目の後には増やした。全ての場合において、固定されたＰＤＧＦ−ＢＢに結合したプールＲＮＡを、ＲＴ混合物（３’プライマー、ＳＴＣ．１０４．１０２．ＡおよびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加、その後の６５℃での１時間のインキュベートの後に、選択プレート中に直接、逆転写した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いた（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）６０℃のアニーリング温度と組み合わせた「Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ」ＰＣＲ条件を用いて、プライマー−ダイマー形成を最小化した。製造業者の推奨する条件に従って、Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐカラムで増幅したプールのテンプレートＤＮＡを脱塩して、次回の選択のためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために用いた。転写されたプールは、１０％ポリアクリルアミドゲル上で毎回精製した。
【０２４１】
ナイーブなプールは、ＰＤＧＦ−ＢＢに結合するが、ｒＲｍＹ  ＰＤＧＦ−ＢＢ選択は、ナイーブなプール結合を超えて４回目後に富化された。選択のストリンジェンシーを増大して、選択を８回以上継続した。１２回目に、プールは、ナイーブなプールを超えて富化されるが、ＫＤは極めて高い。ｒＧｍＨ選択は、１０回目のナイーブなプール結合を超えて富化された。プールのＫＤはまた、約９５０ｎＭ以上である。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプールをクローニングして、配列決定に供した。ＰＤＧＦ−ＢＢプール選択の１２回後、クローンを転写して配列決定した。表１９はクローン配列を示す。図１３（Ａ）は、ｒＲｍＹプールＰＤＧＦ−ＢＢ選択についての１２回のプールの結合プロットを示し、そして図１３（Ｂ）は、ｒＧｍＨプールＰＤＧＦ−ＢＢ選択についての１０回のプールの結合プロットを示す。サンドイッチフィルター結合技術を用いて解離定数を再度測定した。解離定数（ＫＤ）を評価して、式：結合したＲＮＡ画分＝振幅＊ＫＤ／（ＫＤ＋［ＰＤＧＦ−ＢＢ］）に対してデータをあてはめてた。
【０２４２】
（表１９．ＰＤＧＦ−ＢＢに対する１２回の選択後ｒＲｍＹプールの個々のクローン配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２４３】
【表１９−１】
2006508688.tif 000037
【０２４４】
【表１９−２】
2006508688.tif 000038
（表２０．ＰＤＧＦ−ＢＢに対する１０回の選択後ｒＧｍＨプールの個々のクローン配列の対応するｃＤＮＡ）
【０２４５】
【表２０−１】
2006508688.tif 000039
【０２４６】
【表２０−２】
2006508688.tif 000040
本発明は、詳細な説明および前述の非限定的な実施例によって記載されているが、添付の特許請求の趣旨および範囲によってここに定義している。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロにおけるアプタマー選択（ＳＥＬＥＸＴＭ）プロセスの模式図である。
【図２】図２は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）改変ヌクレオチドを示しており、ここで「Ｂ」はプリン塩基またはピリミジン塩基である。
【図３】図３Ａは、３つの２’−ＯＭｅ  ＶＥＧＦアプタマーによるＶＥＧＦ結合のグラフである：ＡＲＣ２２４、ＡＲＣ２４５およびＡＲＣ２５９；図３Ｂは、これらのアプタマーの配列および推定の二次構造を示す。
【図４】図４は、ＡＲＣ２２４およびＡＲＣ２２５の種々の２’−ＯＨ  Ｇ改変体によるＶＥＧＦ結合のグラフである。
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦに対するＡＲＣ２２４の結合のグラフである。
【図６】図６は、ＥＤＴＡの有無における、オートクレーブの前後のＶＥＧＦに対するＡＲＣ２２４結合のグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ラット血漿中で３７℃でインキュベートした場合の、それぞれ、ＡＲＣ２２４およびＡＲＣ２２６の安定性のグラフである。
【図８】図８は、ＩｇＥに対するｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６回目の配列の結合のグラフである。
【図９】図９は、トロンビンに対するｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６回目の配列の結合のグラフである。
【図１０】図１０は、ＶＥＧＦに対するｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６回目の配列の結合のグラフである。
【図１１】図１１Ａは、９５％ラット血漿（クエン酸付加）中において３７℃で３’−ｉｄＴを用いた全ての２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチドの分解プロットであり、そして図１１Ｂは、９５％ラット血漿中における３７℃での対応するｄＲｍＹオリゴヌクレオチドの分解プロットである。
【図１２】図１２は、ｒＧｍＨ  ｈ−ＩｇＥ結合クローンのグラフである（６回目）。
【図１３】図１３Ａは、ｒＲｍＹプールのＰＤＧＦ−ＢＢ選択のための１２回目のプールのグラフであり、図１３Ｂは、ｒＧｍＨプールのＰＤＧＦ−ＢＢ選択のための１０回目のプールのグラフである。
【図１４】図１４は、ｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６、７、８回目および選択されない配列のＩＬ−２３に対する結合のグラフである。
【図１５】図１５は、ｄＲｍＹ  ＳＥＬＥＸＴＭの６、７回目および選択されない配列のＰＤＧＦ−ＢＢに対する結合のグラフである。
【図１】
2006508688.tif 000041
【図２】
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【図３】
2006508688.tif 000043
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006508688.tif 000047
【図８】
2006508688.tif 000048
【図９】
2006508688.tif 000049
【図１０】
2006508688.tif 000050
【図１１】
2006508688.tif 000051
【図１２】
2006508688.tif 000052
【図１３】
2006508688.tif 000053
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2006508688000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月10日(2005.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
本発明は、改変されたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに酵素的に組み込むように改変されたＴ７ポリメラーゼのための方法および条件を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドで全体に合成されてもよいし、改変されたヌクレオチドのサブセットで合成されてもよい。この改変は同じでも異なってもよい。全てのヌクレオチドが改変されてもよく、そして全てが同じ改変を含んでもよい。全てのヌクレオチドは改変されてもよいが、異なる改変を含んでもよく、例えば、同じ塩基を含む全てのヌクレオチドが１タイプの改変を有してもよく、一方他の塩基を含むヌクレオチドは異なるタイプの改変を有してもよい。全てのプリンヌクレオチドは、１タイプの改変を有してもよい（または未改変である）が、全てのピリミジンヌクレオチドは別の異なるタイプの改変を有する（または未改変である）。この方法では、転写物または転写物のライブラリーは、改変の任意の組み合わせ、例えば、リボヌクレオチド、（２’−ＯＨ、「ｒＮ」）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドを用いて生成される。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵおよび２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む混合物は、「ｒＲｍＹ」と呼ばれる；デオキシＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む混合物は、「ｄＲｍＹ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む混合物は、「ｒＧｍＨ」と呼ばれる；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを交互に含む混合物は、「トグル（ｔｏｇｇｌｅ）」と呼ばれる；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、ＣおよびＧを含む混合物であってＧの最大１０％がリボヌクレオチドである混合物は「ｒ／ｍＧｍＨ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣならびに２’−Ｆ  Ｇを含む混合物は、「ｆＧｍＨ」と呼ばれ；そしてデオキシＡ、および２’−ＯＭｅ  Ｃ、ＧおよびＵを含む混合物は「ｄＡｍＢ」と呼ばれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を用いて生成された得られた改変オリゴヌクレオチドは、実質的に２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンを全て含み、ここでグアノシンヌクレオチドの集団は、最大約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態では、本発明の得られたｒ／ｍＧｍＨ改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのわずか約１０％だけが２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。さらに好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、全てのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、そして全てのグアノシンヌクレオチドのうちわずか約１０％だけが２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態では、この得られた改変オリゴヌクレオチドは、全てのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、全てのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、そして全てのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、全てのグアノシンヌクレオチドのわずか約１０％だけが２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。


【国際調査報告】
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