(57)【要約】動物の生殖器官にトランスポゾンベクターを投与し、トランスジェニック動物を作製するための方法及び組成物。好ましい方法は、鳥類の卵管の管腔にトランスポゾンベクターを投与し、鳥類においてベクター由来トランス遺伝子を発現させ、かつ、その結果生じるポリペプチドを卵中に蓄積させることを包含する。本発明により、卵中に大量のタンパク質を蓄積させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポゾンベクターを含む組成物を動物の卵管又は卵巣に投与することを含む、トランスジェニック動物の生産方法。
【請求項２】
前記組成物は前記卵管又は前記卵巣に通じている動脈に注入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は卵管の管腔中に注入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物はさらにトランスフェクション試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスポゾンベクターは、
ａ）第一のプロモータと操作可能に連結された、トランスポザーゼをコードするトランスポザーゼ遺伝子、及び
ｂ）１又は複数の別のプロモータと操作可能に連結された１又は複数の目的遺伝子
を含み、該１又は複数の目的遺伝子及びそれらと操作可能に連結されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列に挟まれ、かつ、該第一のプロモータはＡＣＣＡＴＧ（配列番号１）を含む改変コザック配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスポザーゼ遺伝子は、先頭の１から２０番目のコドンにおいて、該コドンの第三塩基位置のヌクレオチドをアデニン又はチミンに、該コドンがコードするアミノ酸を変更することなく改変したものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスポゾンベクターは、
ａ）第一のプロモータ及び鳥類最適化ポリＡ配列と操作可能に連結された、トランスポザーゼをコードするトランスポザーゼ遺伝子、及び
ｂ）１又は複数の別のプロモータと操作可能に連結された１又は複数の目的遺伝子
を含み、
ｃ）前記１又は複数の目的遺伝子及びそれらと操作可能に連結されたプロモータはトランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列によって挟まれている
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のプロモータは構成的プロモータである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のプロモータはオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、ｇ２オボグロブリン、ｇ３オボグロブリン、オボフラボプロテイン及びオボスタチンから成る群から選択される卵管特異的プロモータである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１又は複数の目的遺伝子は第二のプロモータと操作可能に連結されていることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のプロモータはオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、ｇ２オボグロブリン、ｇ３オボグロブリン、オボフラボプロテイン及びオボスタチンから成る群から選択される卵管特異的プロモータである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスポゾンベクターは、卵移行配列、又は前記１又は複数の目的遺伝子と操作可能に連結されたエンハンサーをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
鳥類においてポリヌクレオチド配列の発現を増大させる方法であって、鳥類に最適化されたポリＡ配列と操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含む組成物を鳥類に投与することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法を用いて作製されるトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記動物が鳥である、請求項１４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
請求項１５に記載のトランスジェニック鳥により生産される卵。
【請求項１７】
前記トランスポゾンベクターによりコードされるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含有する、請求項１６に記載の卵。
【請求項１８】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの生産方法であって、
ａ）トランスポゾンベクターを含む組成物であって、該トランスポゾンベクターは第一のプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼをコードするトランスポザーゼ遺伝子、及び１又は複数の別のプロモータと操作可能に連結された１又は複数の目的遺伝子、を含むことを特徴とする組成物を、卵を産む動物の卵管に投与すること、及び
ｂ）前記１又は複数の目的遺伝子を、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに発現させること
を含む方法。
【請求項１９】
ａ）前記卵を産む動物から卵を収集すること、
ｂ）前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含有する卵白を収穫すること、及び
ｃ）前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを精製すること、
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物は鳥である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記動物は家禽鳥である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスポザーゼはＴｎ１０トランスポザーゼである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
トランスポゾンベクターを含む組成物を哺乳類の乳房内管系に投与することを含む、トランスジェニック哺乳類の生産方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法を用いて作製されるトランスジェニック哺乳類。
【請求項２５】
請求項２４に記載のトランスジェニック哺乳類により生産される乳。
【請求項２６】
前記乳は、前記トランスポゾンベクターによりコードされるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含有する、請求項２５に記載の乳。
【請求項２７】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの生産方法であって、
ａ）トランスポゾンベクターを含む組成物であって、該トランスポゾンベクターは第一のプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼをコードするトランスポザーゼ遺伝子、及び１又は複数の別のプロモータと操作可能に連結された１又は複数の目的遺伝子、を含むことを特徴とする組成物を、哺乳類の乳房内管系に投与すること、及び
ｂ）前記１又は複数の目的遺伝子をタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに発現させ
ること
を含む方法。
【請求項２８】
ａ）前記哺乳類から乳を集めること、及び
ｂ）前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを精製すること
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はおおむね、動物における生殖管へのトランスポゾンベクターの投与に関する。上記生殖管は、卵巣、卵巣内の卵、及び卵管を含む。このような投与により、動物の卵巣、卵管又は卵中に、上記ベクターに含まれる目的遺伝子が組み入れられる。いくつかの実施形態では、本発明はさらに、動物により生産される卵中での、上記遺伝子によりコードされるタンパク質の生産を包含する。
【０００２】
米国政府は、本発明に一定の権利を有する。本発明の開発は、一部米国農務省からのＨＡＴＣＨ助成金下で米国政府により資金提供され、一部米国農務省からのフォーミュラ１４３３基金で米国政府により資金提供され、且つ一部陸軍により授与される契約ＤＡＡＤ１９−０２０１６下で米国政府により資金提供された。
【０００３】
［発明の背景］
トランスジェニック動物は、薬学的、診断的及び産業的使用のための所望の分子を生成するための生物学的工場としての能力を含む種々の理由により望ましいものである。この能力は、所望の分子の組み換え製造に用いられる設備における不十分な生産能力、並びに薬学産業によるこれらの設備の使用に対する需要増大により、産業にとって魅力的なものになっている。トランスジェニック動物を生産するための多数の試みは、低い遺伝子組み入れ効率及び不安定な遺伝子組み込みを含めたいくつかの問題に直面している。したがって所望の分子の製造を目的としたトランスジェニック動物の開発のためには、遺伝子技術の改善が必要である。
【０００４】
動物及びヒトにおける疾患の治療のためには、遺伝子送達技術の改善も必要である。多数の疾患及び症状は、疾患及び症状に罹患している患者に目的遺伝子を提供する遺伝子送達技術を用いて治療され得る。かかる疾患の一例は、１型糖尿病である。１型糖尿病は、膵臓中のインスリン生産β細胞の破壊を最終的に生じる自己免疫疾患である。１型糖尿病患者はインスリン注射又はインスリンポンプを用いて適切に治療され得るが、しかしこれらの療法は部分的に有効であるに過ぎない。例えばインスリン注射又はポンプ投与によるインスリン補充は、高血糖状態において見出される血管内皮の不具合を完全には改善できない（Pieper et al., 1996, Diabetes Res. Clin. Pract. Suppl. S157-S162）。さらに、徹底的な家庭での血糖モニタリングにもかかわらず、高血糖及び低血糖症は高頻度で起こる。最後に、消費カロリーの適切な比率を保持するために、注意深い食事制約が必要とされる。これはしばしば、多数の糖尿病患者に対して大きな心理社会的ストレスを引き起こす。糖尿病患者の膵臓へのインスリン遺伝子の送達を提供する遺伝子療法の開発は、これらの問題の多くを克服し、平均寿命及び生活の質の改善を生じる可能性がある。
【０００５】
従来技術の遺伝子送達技術のいくつかは、潜在的に望ましくない副作用や安全性への懸念があるウイルスを用いたものであった。遺伝子療法に有用な最新の遺伝子送達技術のほとんどが、もはや複製しないよう弱毒化されたウイルス系の送達ベクター、例えばアデノウイルス及びアデノ関連ウイルス、レトロウイルス及びその他のウイルスによるものである（Kay, M.A., et al. 2001. Nature Medicine 7: 33-40）。
【０００６】
ウイルスベクターの使用に関連した多くの問題が存在する。第一に、ウイルスベクターは組織特異的ではない。実際、アデノウイルスを用いる遺伝子療法試験は、ベクターが患者の精子中に存在するため、近年中止された（療法が子供の遺伝子構成を変えるかもしれないという恐れにもかかわらず、続行される遺伝子試験。The New York Times, December
23, 2001）。第二に、ウイルスベクターは一過的な組み入れであると思われるため、規
定の時間間隔で患者を再治療する必要がある（Kay, M.A., et al. 2001. Nature Medicine 7: 33-40）。第三に、ウイルスベースのベクターは、病原型に戻り、疾患を引き起こし得る、という問題が存在する。第四に、ウイルスベースのベクターは、安定した組込みのためには分裂中の細胞が必要である。第五に、ウイルスベースのベクターは、種々の細胞中に無差別に組み込まれ、これが望ましくない生殖系列への組込みを生じ得る。第六に、所望の作用を達成するために必要とされる必要高力価は一患者の死を生じ、それら高力価は、別の試験結果からは、癌の誘導に関与するものと考えられている（Science, News of
the Week, October 4, 2002）。
【０００７】
したがって必要であるのは、安定に組み込まれた遺伝子を有するトランスジェニック動物及びヒトを生産することであり、さらにそれらの遺伝子を含有するベクターは疾患又はその他の望ましくない副作用を引き起こさないことである。動物及びヒトの組織及び細胞中に、例えば複製していない静止状態の細胞中に安定的に組み込まれるＤＮＡ構築物に対する必要性も存在する。さらに、動物及びヒトの特異的な組織及び細胞に遺伝子を送達し得るＤＮＡ構築物に対する必要性も当該技術分野では認識されている。
【０００８】
所望のタンパク質の生産のため動物中に目的遺伝子を組み込む場合、又は疾患の治療のために動物又はヒトに対して目的遺伝子を組み込む場合、組み込んだ遺伝子を誘導性プロモータを用いて選択的に活性化するのがしばしば望ましい。これらの誘導性プロモータは、遺伝子が組み込まれる細胞内の転写制御要素によって生産されるか又は認識される物質により調節される。多くの場合、組み込まれた遺伝子が所望の時間及び／又は特定の物質の影響下で選択的に活性化されるように遺伝子発現を制御することが、トランスジェニック動物又はヒトにおいて望まれる。したがって必要なのは、トランスジェニック動物又はヒトの細胞のゲノム中に導入された遺伝子を選択的に活性化する手段である。ここからさらに一歩進んで、組み込みを組織特異的であるようにし、患者（動物又はヒト）の身体全体にわたる広範囲の遺伝子組み込みを防止する。これは、治療に必要なＤＮＡの量を低減し、配偶体中への組み込みの機会を低減し、かつ目的遺伝子が機能することが必要とされる所望の組織を標的とした遺伝子の送達、組み込み及び発現を実現する。さらにまた必要であるのは、トランスジェニック動物の卵及び乳中の目的タンパク質又はペプチドを迅速に生産するための迅速な発現方法である。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、トランスジェニック動物を生産するための、かつ動物又はヒトにおける疾患を治療するための、新規の効果的で効率的な組成物を提供することにより、上記の問題に取り組んでいる。トランスジェニック動物としては、卵を産む動物及び乳を生産する動物が挙げられる。トランスジェニック動物としてはさらに、鳥類，魚類，両生類、爬虫類、昆虫類、哺乳類及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態では、動物は乳を生産する動物であり、例としてはウシ、ブタ、ヒツジ及びウマといった動物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、動物は鳥類である。別の好ましい実施形態では、動物は哺乳類である。動物は、所望のタンパク質の生産のための目的遺伝子の組入れのために設計されたトランスポゾンベクターを含む組成物を、許容可能な担体と一緒に投与することにより、トランスジェニック動物にされる。本発明の組成物は、動物の生殖系に導入される。本発明の組成物は、生殖器官、例えば卵管、卵巣に、又は乳腺の管系中に投与されるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、排泄腔を通して動物の生殖器官に投与されてもよい。本発明の組成物は、生殖器官に直接投与されてもよいし、又は生殖器官に通じる動脈に投与されてもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、鳥類の生殖系中に導入される。別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は哺乳類の乳腺内管系中に導入される。トランスフェクション試薬は、投与前に組成物に任意に付加される。
【００１０】
本発明のトランスポゾン系ベクターは、第一のプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ及び第二のプロモータと操作可能に連結された目的タンパク質又はペプチドをコードする配列を包含し、この場合、目的タンパク質又はペプチドをコードする配列及びそれらと操作可能に連結されたプロモータはトランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列により挟まれている。トランスポゾンベクターは以下の特徴も包含する：ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一のプロモータの３’末端に位置する１又は複数の改変されたコザック配列；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのＮ末端アミノ酸のコドンの改変（この場合、各コドンの第三塩基位置のヌクレオチドは対応するアミノ酸を変更することなくＡ又はＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を強化する、１又は複数の終止コドンの付加；及び／又はｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強する、トランスポザーゼと操作可能に連結された効果的ポリＡ配列の付加。いくつかの実施形態では、効果的なポリＡ配列は鳥類最適化ポリＡ配列である。
【００１１】
本発明は、目的遺伝子の組織特異的組み込み及び／又は発現も提供する。目的遺伝子の組織特異的組入れは、組織特異的プロモータの制御下にトランスポザーゼ遺伝子を置くことにより達成されてもよいが、一方、目的遺伝子の組織特異的発現は、組織特異的プロモータの制御下に目的遺伝子を置くことにより達成されてもよい。いくつかの実施形態では、目的遺伝子はオボアルブミン、又はその他の卵管特異的なプロモータの影響下で転写される。卵を産む動物における卵管特異的なプロモータへの目的遺伝子の結合により、所望の分子の合成及び発達中の卵における所望の分子の蓄積を生じる。
【００１２】
本発明は、安定的に組み込まれた目的遺伝子を有する多数のトランスジェニック動物を有利に生産する。トランスポゾン系ベクターが卵巣に投与されるいくつかの実施形態では、これらのトランスジェニック動物はそれらの子孫に所望の遺伝子を首尾よく伝達する。したがって本発明は、卵巣のトランスフェクションにより生殖系列に組入れられた目的遺伝子を有するトランスジェニック動物を得るのに用いられ得るし、又は本発明は、卵管中に組織特異的に組み込まれた目的遺伝子を有するトランスジェニック動物を得るのに用いられ得る。どちらのタイプであっても、本発明のトランスジェニック動物は、トランス遺伝子によりコードされる所望の分子を大量に生産する。卵を産むトランスジェニック動物、特に鳥類は、大量の所望のタンパク質を卵中に蓄積して生産するため、それらタンパク質の迅速な収穫及び精製が可能である。
【００１３】
トランスジェニック動物中で所望の分子を合成することを目的として、任意の所望の遺伝子が本発明の新規のトランスポゾンベクター中に組み込まれてもよい。タンパク質、ペプチド及び核酸は、本発明のトランスジェニック動物により生産される好ましい所望の分子である。特に好ましいタンパク質は、抗体タンパク質及びその他の免疫薬学的タンパク質である。
【００１４】
本発明は、実質的に多量の所望のタンパク質又はペプチドを生産し得るトランスジェニック雌鳥の生産に有用な組成物を提供する。工業的な量の所望の分子を製造する手段として、トランスジェニック鳥の一群全体を非常に迅速に開発することもできる。本発明は、分子の細菌生産のために用いられる発酵設備の不十分な生産能力に固有の問題を解決し、かつ所望の分子を製造するためのより効率的かつ経済的な方法を提供する。したがって本発明は、大量の治療用、診断用及び試薬用分子を製造する手段を提供する。
【００１５】
トランスジェニックニワトリは、タンパク質及びペプチドのような分子を製造するにあたっての利便性及び効率性に優れている。１個体のトランスジェニック雄鶏から開始して、一年以内に数千のトランスジェニック子孫が生産され得る（原理上は、４００万までの子孫がちょうど三世代で生産され得る）。各トランスジェニック雌は、少なくとも２５０個／年のペースで卵を産むと予測され、各々は潜在的に数百ミリグラムの目的タンパク質
を含有する。数十万にもおよぶニワトリの一群が、確立された商業システムにより容易に取り扱われる。卵を得る技術、またそれらを分画する技術も既知であり、広く一般に認識されている。したがって各々の治療用、診断用又はその他の目的タンパク質について、大量の実質的に純粋な物質が相対的に低いコスト増加で製造できる。
【００１６】
広範囲の組み換えペプチド及びタンパク質が、トランスジェニック卵を産む動物で生産され得る。酵素、ホルモン、抗体、成長因子、血清タンパク質、商品タンパク質、生体応答調整物質、ペプチド及び設計されたタンパク質は全て、本発明の実施により作製されうる。例えばおおよその見積もりとして、一ドル／グラムのオーダーでの増分コストに関して、成長ホルモン、インスリン又は因子ＶＩＩＩを大量に製造し、それらを卵白中に蓄積させることが可能である、ということが示唆されている。このような価格で、注射に代わって、吸入により、あるいは経口的に、このような医療用作用物質を投与することは考慮に値する。これらの方法によっては生物学的な利用効率が低い場合であっても、有効な使用量がより多くなることに対するコストが極端に高くなることはなかろう。
【００１７】
一実施形態では、産卵トランスジェニック動物は鳥類である。本発明の方法は、鳥類、例えば走鳥類、オウム目、タカ目、キツツキ目、フクロウ目、スズメ目、ブッポウソウ目、クイナ目（Ralliformes）、カッコウ目、ハト目、キジ目、カモ目及びサギ目（Herodiones）に用いられてよい。好ましくは、産卵トランスジェニック動物は、家禽鳥である。さらに好ましくは、該家禽鳥は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ又はウズラである。別の好ましい鳥は、走鳥類、例えばエミュー、ダチョウ、レア及びヒクイドリである。その他の好ましい鳥類は、ヤマウズラ、キジ、キーウィ、オウム、インコ、コンゴウインコ、ハヤブサ、ワシ、タカ、ハト、バタンインコ、鳴禽、カケス、クロウタドリ、フィンチ、ムシクイ、カナリア、オオハシ、ハッカチョウ又はスズメである。
【００１８】
したがって、新規のトランスポゾンベクターを提供することが本発明の一目的である。
【００１９】
所望のタンパク質又はペプチドをコードし、細胞中でそれらを生産させる新規のトランスポゾンベクターを提供することは、本発明の別の目的である。
【００２０】
トランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与によりトランスジェニック動物を生産することは、本発明の一目的である。
【００２１】
本発明の別の目的は、トランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与によりトランスジェニック動物を生産することであって、この場合、トランスジェニック動物は所望のタンパク質又はペプチドを生産する。
【００２２】
トランスポゾンベクターの卵巣内投与により、トランスジェニックな子孫を生産し得るトランスジェニック動物を生産する方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、トランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与により、所望の分子、例えばタンパク質、ペプチド又は核酸を生産し得るトランスジェニック動物を生産する方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、トランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与によりトランスジェニック動物を生産する方法を提供することであって、この場合、かかる投与は内因性遺伝子発現の変調を生じる。
【００２５】
トランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与により、タンパク質、ペプチド又は核
酸を生産し得るトランスジェニック鳥類を生産する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００２６】
抗体又はその断片をコードするトランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与によりトランスジェニック動物を生産することは、本発明の別の目的である。
【００２７】
本発明のさらに別の目的は、トランスポゾンベクターの卵管内又は卵巣内投与により、タンパク質又はペプチドを生産し、これらのタンパク質又はペプチドを卵中に蓄積し得るトランスジェニック鳥類を生産する方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、安定的に組み込まれたトランス遺伝子を含有するトランスジェニック鳥類を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、卵を生産するトランスジェニック鳥類に組み込まれたトランス遺伝子によりコードされる所望のタンパク質又はペプチドを含有する卵を提供することである。
【００３０】
トランスポゾンベクターの投与により、タンパク質、ペプチド又は核酸を生産し得る、乳を生産するトランスジェニック動物を生産する方法を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、トランスポゾンベクターの投与により、タンパク質又はペプチドを生産し、それらの乳中にこれらのタンパク質又はペプチドを蓄積し得る、乳を生産するトランスジェニック動物を生産するための方法を提供することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、安定的に組み込まれたトランス遺伝子を含有する、乳を生産するトランスジェニック動物を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、タンパク質又はペプチドを生産し、乳中にこれらのタンパク質又はペプチドを蓄積し得る、乳を生産するトランスジェニック動物を提供することである。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、乳を生産するトランスジェニック動物中に組入れられたトランス遺伝子によりコードされる所望の分子を含有する乳を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、乳を生産するトランスジェニック動物中に組入れられたトランス遺伝子によりコードされる所望のタンパク質又はペプチドを含有する乳を提供することである。
【００３６】
本発明の利点は、トランスジェニック動物が従来技術で観察されるよりも高い効率で生産されることである。
【００３７】
本発明の別の利点は、これらのトランスジェニック動物が多コピーのトランス遺伝子を保有することである。
【００３８】
本発明の別の利点は、トランスジェニック動物がトランス遺伝子によりコードされる所望の分子を大量に生産することである。
【００３９】
本発明のさらに別の利点は、所望の分子が従来の方法よりも効率的且つ経済的にトランスジェニック動物により生産され、それにより所望の分子、特にタンパク質及びペプチドの大規模製造のための一手段を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の利点は、本発明のベクターの導入により動物をトランスジェニックにした後速やかに所望のタンパク質及びペプチドが生産されることである。
【００４１】
本発明のこれらの及びその他の目的、特徴及び利点は、開示される実施形態及び特許請求の範囲の以下の詳細な説明の再検討後に明らかになるであろう。
【００４２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、目的遺伝子の組み込み及び所望の分子の生産を目的として設計されたトランスポゾンベクターを含む組成物の投与による、トランスジェニック動物、特に卵を産む動物及び乳を生産する動物を生産するための新規の有効且つ効率的な方法を提供する。トランスポゾンベクターは、生殖器官、例えば卵管、卵巣に、あるいは乳腺の管系中に投与されるが、これらに限定されない。ベクターは、生殖器官に直接投与され得るし、あるいは生殖器官に通じる動脈に、又は遺伝子的に変更されるべき細胞に近位のリンパ系に投与され得る。ベクターは、排出腔を通して動物の生殖器官に投与され得る。直接投与の一方法は注射によるものであり、一実施形態では、卵管の筒部の管腔にトランスポゾンベクターを注射する。直接投与の別の方法は、注射によるものであり、一実施形態では、卵管漏斗の管腔にトランスポゾンベクターを注射する。好ましい動脈内投与は、卵管又は卵巣に供給する動脈中への投与である。いくつかの実施形態では、卵管又は卵管に通じる動脈へのトランスポゾンベクターの投与は、卵管の上皮及び／又は分泌細胞中へのベクターの組み込みを生じる。他の実施形態では、卵巣又は卵巣に通じる動脈への又は卵巣に近位のリンパ系へのトランスポゾンベクターの投与は、卵巣内部の卵母細胞又は胚盤へのベクターの組み込みを生じる。
【００４３】
定義
本明細書中並びに特許請求の範囲で用いる場合、「一つの（ａ）」又は「一つの（ａｎ）」は、それが用いられる情況によって、１又は複数を意味し得る、と理解されるべきである。したがって例えば「一つの（ａ）細胞」という言及は、少なくとも１つの細胞が利用され得ることを意味し得る。
【００４４】
「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」という用語と互換的に用いられ、且つ一般的に「抗原」又は「免疫原」と呼ばれる外来物質の存在に応答して動物又は免疫系の細胞により合成されるタンパク質と本明細書中では定義される。抗体という用語は、抗体の断片を包含する。抗体は、抗原上の部位に対する特異的親和性により特徴付けられ、この場合、該部位は「抗原決定基」又は「エピトープ」と呼ばれる。抗原は、天然、又は人工的に設計される。人工的に設計された抗原としては、ハプテン、例えば高分子、例えばタンパク質、核酸又は多糖に結合される小分子、例えば小ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。天然抗体を人工的に処理して得た変異体、並びに人工的に設計された天然には生じない抗体は全て、本定義に含まれる。このような変異体としては、同類置換アミノ酸、並びにタンパク質及びポリペプチドに関する節に記載されるその他の形態の置換を包含する。
【００４５】
本明細書中で用いる場合、「卵を産む動物」という用語は、全ての羊膜動物、例えば鳥類、カメ類、トカゲ類及び単孔類を包含する。単孔類は卵を産む動物であり、例としてはカモノハシ及びハリモグラが挙げられる。「鳥(bird)」又は「鳥類(fowl)」という用語は、本明細書中で用いる場合、主に飛ぶことに適合した温血、産卵脊椎動物として特徴付けられる、鳥綱に分類される動物の一成員と定義される。鳥類としては、走鳥類、オウム目、タカ目、キツツキ目、フクロウ目、スズメ目、ブッポウソウ目、クイナ目、カッコウ目、ハト目、キジ目、カモ目及びサギ目が挙げられるが、これらに限定されない。「走鳥類」という用語は、本明細書中で用いる場合、いくつかの目を含む飛べない、大部分は大型
の走る鳥の一群と定義され、例としては、エミュー、ダチョウ、キーウィ及びヒクイドリが挙げられる。「オウム目」という用語は、本明細書中に用いる場合、オウムを含み、対指足を示し、強力な鉤形嘴を有する一科の目の鳥を指す。「オウム」とは、短く、ずんぐりした、強力な鉤状の嘴により区別される鳥類のオウム科（オウム目の単一科）の任意の成員と定義される。鳥類は、全ての家禽、特にニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ、アヒル及びウズラを包含する。「ニワトリ」という用語は、本明細書中で用いる場合、食用卵生産のためのニワトリ、例えば卵用ニワトリ、社会的食肉消費のために飼育されるニワトリ、又はブロイラー、並びに卵及び肉生産の両方のために飼育されるニワトリ（「二重目的」ニワトリ）を意味する。「ニワトリ」という用語は、一次ブリーダー会社により生産されるニワトリまたはそれらの親、祖父母、曽祖父母等にあたるニワトリであって、一般社会で食用卵、食肉のために飼育され、消費されるニワトリも意味する。
【００４６】
「卵」という用語は、鳥類及び爬虫類により生産される多孔性石灰質の又は堅い殻に取り囲まれた大型雌性細胞を包含する、と本明細書中では定義される。「卵子」という用語は、雌性配偶子と定義され、卵としても既知である。したがって鳥類及び爬虫類以外の全ての動物における卵生産は、本明細書中で用いる場合、卵巣からの卵子の生産及び排出、あるいは「排卵」と定義される。したがって、「卵」という用語は、本明細書中で用いる場合、鳥類又は爬虫類がそれを生産する場合は、多孔性石灰質の又は堅い殻に取り囲まれた大型雌性細胞と定義され、それが他の全ての動物により生産される場合、それは卵子である、と理解されるべきである。
【００４７】
「乳を生産する動物」という用語は、本明細書中では哺乳類を指し、例としてはウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ及び霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。乳を生産する動物としては、ウシ、ラマ、ラクダ、ヤギ、トナカイ、コブウシ、スイギュウ、ヤク、ウマ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
「遺伝子」という用語は、本明細書中では、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドに対するコード領域を含むよう定義される。
【００４９】
「トランスジェニック動物」という用語は、そのＤＮＡ中に組み込まれたトランスポゾンベクターの少なくとも一部を有する動物を指す。トランスジェニック動物はトランスポゾンベクターＤＮＡが生殖系列ＤＮＡ中に組み込まれた動物を包含するが、しかし、トランスジェニック動物は、１又は複数の細胞中に、トランスポゾンベクターＤＮＡの一部を含むＤＮＡを、任意の期間含有する動物も包含する。好ましい実施形態では、トランスポゾンベクターの一部分には目的遺伝子が含まれる。さらに好ましくは目的遺伝子は、少なくとも５年間、さらに好ましくは動物の繁殖期間中、最も好ましくは動物の一生を通じ、動物のＤＮＡ中に組み込まれた状態にある。さらに好ましい実施形態では、動物は鳥類である。
【００５０】
「ベクター」という用語は、「構築物」、「ＤＮＡ構築物」及び「遺伝子構築物」という用語と互換的に用いられ、遺伝子物質の操作、クローニング、サブクローニング、シーケンシング、又は細胞、組織又は生物体、例えば鳥への外来遺伝子物質の導入（ただしこれらに限定されない）のために用いられる合成ヌクレオチド配列を意味する。ベクターは合成ＤＮＡ配列、天然ＤＮＡ配列又はその両方を含有し得る、と当業者に理解される。本発明のベクターは、本明細書中に記載されるトランスポゾンベクターである。
【００５１】
２つのヌクレオチド配列に着目し、その１つが調節配列である場合、「操作可能に連結される（operably-linked）」という用語は、調節配列が他方のヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすように２つの配列が連結される、ということを意味するよう本明細書中では定義される。該操作可能に連結される配列は、介在配列（単数又は複数）を持たずに互
いに直接隣り合って存在することは必要ではない。
【００５２】
「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサー及びその他の発現制御要素、例えばポリアデニル化配列、マトリックス結合部位、単一構築物上の多遺伝子の発現のためのインシュレーター領域、リボソーム進入／結合領域、発現を増強し得るイントロン、並びにサイレンサーを包含する、と本明細書中では定義される。
【００５３】
トランスポゾンベクター
以下の記述に結び付けたくはないが、ＤＮＡ構築物の性質はトランスジェニック動物を首尾よく生産するのに重要な因子であると考えられる。全ての種、特に鳥類における遺伝子導入作業に従来ほぼ普遍的に用いられてきた「標準」型のプラスミド及びウイルスベクターは効率が低く、且つ従来観察された低率の形質転換の主な理由かもしれない。従来用いられたＤＮＡ（又はＲＮＡ）構築物はしばしば、宿主ＤＮＡ中に組み込まれず、又は低頻度でのみ組み込まれる。その他の因子により、標的細胞中へのベクターの不十分な進入といったようなことが生じていたかもしれない。本発明は、低頻度なトランス遺伝子組込みに関する従来技術の問題を克服する、動物に投与できるトランスポゾンベクターを提供する。トランスポザーゼ、目的遺伝子及びその他のポリヌクレオチド配列が導入され得る本発明の２つの好ましいトランスポゾンベクターは、ｐＴｎＭＣＳ（配列番号２）及びｐＴｎＭｏｄ（配列番号３）と呼ばれる。
【００５４】
本発明のトランスポゾンベクターは、従来のベクターで達成されたよりも高頻度の組込みをもたらす。特に従来技術のトランスポゾンベクターを用いて実施される精巣内注射（米国特許第５，７１９，０５５号に記載されている）は、４１％の精子陽性雄鶏を生じ、一方、本発明の新規のトランスポゾンベクターを用いて実施された精巣内注射は７７％の精子陽性雄鶏を生じた。実際の組込みの頻度は、精子からのＰＣＲシグナルの強度比較並びに定量的ＰＣＲによる精巣及び精子の組織学的評価のいずれか又は両方により概算した。
【００５５】
本発明のトランスポゾンベクターは、第一のプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子、並びに第二のプロモータと操作可能に連結された所望のタンパク質又はペプチドをコードする配列を包含し、この場合、所望のタンパク質又はペプチドをコードする配列及びその操作可能に連結されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列によりはさまれている。トランスポゾンベクターは、１又は複数の以下の特徴も包含する：ａ）トランスポザーゼの発現を増強するための、第一のプロモータの３’末端に位置する、ＡＣＣＡＴＧ（配列番号１）を含む１又は複数の改変されたコザック配列；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのＮ末端アミノ酸に対するコドンの改変（この場合、各コドンの第三塩基は対応するアミノ酸を変更することなくＡ又はＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を増強するための１又は複数の終止コドンの付加；及び／又はｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するための、トランスポザーゼと操作可能に連結された有効ポリＡ配列の付加。トランスポゾンベクターは、さらに又は代替的に、任意のプロモータ、例えばトランスポザーゼと操作可能に連結されたプロモータの３’末端に１又は複数の以下のコザック配列を含み得る：ＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号４）、ＡＡＧＡＴＧＴ（配列番号５）、ＡＣＧＡＴＧＡ（配列番号６）、ＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号７）、ＧＡＣＡＴＧＡ（配列番号８）、ＡＣＣＡＴＧＡ（配列番号９）及びＡＣＣＡＴＧＡ（配列番号１０）、ＡＣＣＡＴＧＴ（配列番号５２）。
【００５６】
図１は、トランスポゾンベクターのいくつかの構成成分の模式的表示である。本発明はさらに一つより多い目的遺伝子を含有するベクターを包含し、この場合、二次的な又はそれ以降の目的遺伝子は第二のプロモータと、又は別のプロモータと操作可能に連結される
。図に示されたトランスポゾンベクターは、本発明を代表するものであり、ベクターの因子（vector element）の順序は図に示されたものとは異なり、それらの要素は種々の配向で存在し得るし、且つベクターは図に示されていない付加的要素を含有し得る、ということも理解されるべきである。
【００５７】
トランスポザーゼ及び挿入配列
本発明のさらなる実施形態では、トランスポゾンベクター中に見出されるトランスポザーゼは、標的部位改変（altered target site）（ＡＴＳ）トランスポザーゼであり、挿入配列はＡＴＳトランスポザーゼにより認識されるものである。しかしながらトランスポゾンベクター中に位置するトランスポザーゼは改変型ＡＴＳトランスポザーゼに限定されず、任意のトランスポザーゼに由来し得る。従来技術で既知のトランスポザーゼとしては、ＡＣ７、Ｔｎ５ＳＥＱ１、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００（γδ）、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、点状トランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ｄＳｐｍトランスポゾン及びＩトランスポゾンに見出されるものが挙げられる。本発明に従って、これらのトランスポザーゼ及びそれらの調節配列は、以下の機能改善のために改変される：ａ）トランスポザーゼと操作可能に連結されるプロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号１）を含む１又は複数の改変されたコザック配列を付加する；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのアミノ酸に対するコドンを変更する（この場合、各コドンの第三塩基は対応するアミノ酸を変更することなくＡ又はＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を増強するための１又は複数の終止コドンの付加；及び／又はｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するための、トランスポザーゼと操作可能に連結された有効なポリＡ配列の付加。
【００５８】
以下の記述に結び付けたくはないが、トランスポザーゼ遺伝子の最初のいくつかのＮ末端コドンの改変は、一部は二本鎖解離を増大することにより、トランスポザーゼ遺伝子の転写を増大する、と考えられる。コードされたアミノ酸を変えることなく、各コドンの第三塩基がＡ又はＴに変更されるよう、トランスポザーゼの最初のＮ末端コドンの約１〜２０個、さらに好ましくは３〜１５個、最も好ましくは４〜１２個が改変されるのが好ましい。一実施形態では、トランスポザーゼ遺伝子の最初の１０個のＮ末端コドンがそのように改変される。米国特許第５，７１９，０５５号で考察されているように、トランスポザーゼが、好ましい挿入部位に対する特異性を低くしてトランス遺伝子の割合を増大するような突然変異を含有するのも好ましい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、トランスポゾンベクターは、ベクターＤＮＡのメチル化パターンを変更することにより、特定の宿主中での発現に関して最適化される。例えば原核生物によるメチル化は、メチル化能を欠損した生物を用いてトランスポゾンベクターを生産することで低減できる。トランスポゾンベクターは、真核生物宿主中での発現のため真核生物ＤＮＡに似せることを目的にメチル化されてもよい。
【００６０】
同じく改変され、用いられ得る他の類似の真核生物トランスポゾンベクター由来のトランスポザーゼ及び挿入配列は、例えば米国特許第号に開示されたショウジョウバエＰ因子（P element）由来ベクター、；Sherman et al. (1998)に記載されたショウジョウバエマリナー因子；あるいはＳｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。Hackett et al. (1999); D. Lampe et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11428-11433; S. Fischer et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 6759-6764; L. Zagoraiou et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 11474-11478;及びD. Berg et al.
(Eds.), Mobile DNA, Amer. Soc. Microbiol. (Washington, D.C., 1989)も参照された
い。しかしながら、レシピエント種における真核生物トランスポザーゼはトランス遺伝子のまわりにある原核生物挿入配列を認識する可能性が低いので、細菌トランスポゾンに基づく要素の方が好ましい、ということに留意すべきである。
【００６１】
多数のトランスポザーゼは異なる挿入配列を認識し、したがってトランスポゾンベクターは、トランスポゾンベクター中にも見出される特定のトランスポザーゼにより認識される挿入配列を含有する、と理解されるべきである。本発明の好ましい実施形態では、挿入配列は、通常１００をかなり上回る塩基対を有する挿入配列を含有する野生型トランスポゾンに見出されるものと比較して、約７０塩基対の長さに短縮されている。
【００６２】
以下に提供される例では、挿入事象後に破壊される「切断と挿入」型のＴｎ１０ベースのベクターを説明しているが、しかし本発明は、「回転複製（rolling replication）」型トランスポゾンベクターの使用も包含する。回転複製型トランスポゾンの使用により、単一のトランス遺伝子構築物及び挿入されたコピーから、多コピーのトランスポゾン／トランス遺伝子を作製できる。それにより、この型のトランスポゾンを基本とした系は、単一ゲノム中へのトランス遺伝子の多コピーの挿入を提供する。回転複製型トランスポゾンベクターは、目的遺伝子と操作可能に連結されたプロモータが宿主細胞に対して内因性のものであり、且つ高コピー数で存在するか又は高度に発現される場合に、選択され得る。しかしながら回転複製系の使用では、挿入事象を非致死レベルに限定するための厳しい制御が必要になりうる。Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ９、Ｔｎ２１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ５５１、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０及びＴｎ２６０３は回転複製型トランスポゾンの例であるが、しかしＴｎ５は回転複製型並びに切断及び挿入型トランスポゾンの両方であり得る。
【００６３】
終止コドン及びポリＡ配列
一実施形態では、トランスポゾンベクターは、トランスポザーゼ及び／又は目的遺伝子と操作可能に連結される２つの終止コドンを含有する。別の実施形態では、ＵＡＡ又はＵＧＡのうちの１終止コドンがトランスポザーゼ及び／又は目的遺伝子と操作可能に連結される。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「有効ポリＡ配列」は、アデニン塩基を含有する多数の及び連続したヌクレオチド（Ａのポリヌクレオチド鎖）を含有し、該配列と操作可能に連結された遺伝子の発現を増大する、合成又は非合成配列を指す。ポリＡ配列は、トランスポゾンベクター中の任意の遺伝子、例えばトランスポザーゼ遺伝子及び目的遺伝子（これらに限定されない）と操作可能に連結され得る。好ましいポリＡ配列は、宿主動物又はヒトに用いるために最適化される。一実施形態では、ポリＡ配列は、鳥類種、特にニワトリにおける使用のために最適化される。鳥類最適化ポリＡ配列は一般に、ポリＡヌクレオチド鎖に先行して、ポリＡヌクレオチド鎖から終止コドンを分離する最低４０の塩基対、好ましくは約４０〜数百の塩基対、さらに好ましくは約７５の塩基対を含有する。本発明の一実施形態では、ポリＡ配列は、配列１１で提供されるような、そしてGenBank寄託番号Ｙ００４０７、塩基対１０６５１〜１１０５８から得られるようなコンアルブミンのポリＡ配列を含む。別の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１２で示される合成ポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１３で提供される鳥類最適化ポリＡ配列を含む。ニワトリ最適化ポリＡ配列は、合成ポリＡ配列と比較して少数のＣＴリピートも有してよい。
【００６５】
このような鳥類最適化ポリＡ配列は、鳥類において、それが操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を非鳥類最適化ポリＡ配列と比較して増大する、ということは、本発明の意外な発見である。したがって本発明は、目的遺伝子の組み込みを増大する方法を包含し、この場合、目的遺伝子はトランスポザーゼを含有するトランスポゾンベクター中に
存在し、かつ該トランスポザーゼ遺伝子は鳥類最適化ポリＡ配列と操作可能に連結される。本発明は、鳥類において目的遺伝子の発現を増大する方法であって、鳥類に目的遺伝子を投与することを含み、ここで目的遺伝子は鳥類最適化ポリＡ配列と操作可能に連結される。鳥類最適化ポリＡヌクレオチド鎖は、Ａポリヌクレオチド鎖、並びにＡポリヌクレオチド鎖に先行する最低４０の塩基対、好ましくは約４０〜数百の塩基対、さらに好ましくは約６０の塩基対を含有するポリヌクレオチドである、と本明細書中では定義される。本発明はさらに、鳥類最適化ポリＡ配列と操作可能に連結された目的遺伝子又はトランスポザーゼ遺伝子を含有するトランスポゾンベクターを提供する。
【００６６】
プロモータ及びエンハンサー
トランスポザーゼ遺伝子と操作可能に連結された第一のプロモータ、並びに目的遺伝子と操作可能に連結された第二のプロモータは、構成的プロモータ又は誘導性プロモータであり得る。構成的プロモータとしては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）最初期プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ライソザイムプロモータ、初期及び後期ＣＭＶプロモータ、初期及び後期ＨＳＶプロモータ、β−アクチンプロモータ、チューブリンプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、並びに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモータとしては、組織特異的プロモータ、発生学的に調節されるプロモータ及び化学的誘導性プロモータが挙げられる。組織特異的プロモータの例としては、グルコース６ホスフェート（Ｇ６Ｐ）プロモータ、ビテロゲニンプロモータ、オボアルブミンプロモータ、オボムコイドプロモータ、コナルブミンプロモータ、オボトランスフェリンプロモータ、プロラクチンプロモータ、腎臓ウロモジュリンプロモータ及び胎盤ラクトゲンプロモータが挙げられる。一実施形態では、ビテロゲニンプロモータは、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を包含する。Ｇ６Ｐプロモータ配列は、GenBank寄託番号Ｕ５７５５２．１で提供されるラットＧ６Ｐ遺伝子非翻訳上流領域に起源を有し得る。発生学的に調節されるプロモータの例としては、ホメオボックスプロモータ及びいくつかのホルモン誘導性プロモータが挙げられる。化学的誘導性プロモータの例としては、生殖ホルモン誘導性プロモータ及び抗生物質誘導性プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ及び亜鉛誘導性メタロチオニンプロモータが挙げられる。
【００６７】
その他の誘導性プロモータ系としては、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）により誘導可能であるＬａｃオペレーターリプレッサー系（Cronin, A. et al. 2001. Genes and Development, v. 15）、エクジソンベースの誘導系（Hoppe, U.C. et al.
2000. Mol. Ther. 1: 159-164）；エストロゲンベースの誘導系（Braselmann, S. et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1657-1661）；ＧＡＬ４結合ドメイン及び単純ヘルペスウイルス転写活性化ドメインＶＰ１６、並びにリガンドを結合する能力を保持し、そしてＲＵ４８６により作動され得る切頭化形態のヒトプロゲステロン受容体から成るハイブリッドタンパク質であるキメラレギュレーターＧＬＶＰを用いたプロゲステロンベースの誘導系（Wang, et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8180-8184）；遺伝子発現を調節するための二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を用いたＣＩＤベースの誘導系、例えばラパマイシンが細胞タンパク質ＦＫＢ１２及びＦＲＡＰの二量体化を誘導する系（Belshaw, P.J. et al. 1996. J. Chem. Biol. 3: 731-738; Fan, L. et al. 1999. Hum. Gene Ther. 10: 2273-2285; Shariat, S.F. et al. 2001. Cancer Res. 61: 2562-2571; Spencer, D.M. 1996. Curr. Biol. 6: 839-847）が挙げられる。化学的に誘導可能なプロモータを活性化する化学物質は、当業者に既知の任意の方法により目的トランス遺伝子を含有する動物に投与され得る。
【００６８】
細胞又は組織特異的並びに構成的プロモータのその他の例としては、平滑筋ＳＭ２２プロモータ、例えばキメラＳＭ２２α／テロキンプロモータ（Hoggatt A.M. et al., 2002.
Circ Res. 91(12): 1151-9）；ユビキチンＣプロモータ（Biochim Biophys Acta, 2003.
Jan. 3; 1625 (1): 52-63）；Ｈｓｆ２プロモータ；マウスＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）プロモータ；初期Ｂ細胞特異的ｍｂ−１プロモータ（Sigvardsson M., et al., 2002. Mol. Cell Biol. 22(24): 8539-51）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモータ（Yoshimura I. et al., 2002, J. Urol. 168(6): 2659-64）；エクソロドプシンプロモータ及び松果体発現促進要素（Asaoka Y., et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99(24): 15456-61）；神経及び肝臓セラミダーゼ遺伝子プロモータ（Okino N. et al., 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299(1): 160-6）；ＰＳＰ９４遺伝子プロモータ／エンハンサー（Gabril M.Y. et al., 2002. Gene Ther. 9(23): 1589-99）；ヒトＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子のプロモータ（Kuriki C., et al., 2002. Biol. Pharm. Bull. 25(11): 1476-8）；ＶＬ３０プロモータ（Staplin W.R. et al., 2002. Blood October 24, 2002）；並びにＩＬ−１０プロモータ（Brenner S., et al., 2002. J. Biol. Chem. December 18, 2002）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
鳥類プロモータの例としては、卵白タンパク質、例えばオボアルブミン、オボトランスフェリン（コンアルブミン）、オボムコイド、ライソザイム、オボムチン、ｇ２オボグロブリン、ｇ３オボグロブリン、オボフラボプロテイン、オボスタチン（オボマクログロビン）、シスタチン、アビジン、チアミン結合タンパク質、グルタミルアミノペプチダーゼ小糖タンパク質１型、小糖タンパク質２型、の発現を制御するプロモータ；並びに卵黄タンパク質、例えばビテロゲニン、極低密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、コバラミン結合タンパク質、リボフラビン結合タンパク質、ビオチン結合タンパク質、の発現を制御するプロモータが挙げられるが、これらに限定されない（Awade, 1996. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 202: 1-14）。ビテロゲニンプロモータを用いる利点は、それが動物の生活環の産卵状態中に活性化していることから、目的タンパク質が適切なターゲッティング配列を有する場合には、卵黄中への目的タンパク質の移入と目的タンパク質の生産とを一時的に関連付けることができるという点である。いくつかの実施形態では、鳥類プロモータは卵管特異的プロモータである。本明細書中で用いる場合、「卵管特異的プロモータ」という用語は、オボアルブミン；オボトランスフェリン（コンアルブミン）；オボムコイド；０１、０２、０３、０４又は０５アビジン；オボムチン；ｇ２オボグロブリン；ｇ３オボグロブリン；オボフラボプロテイン；並びにオボスタチン（オボマクログロビン）プロモータを包含するが、しかしこれらに限定されない。
【００７０】
生殖系列の形質転換が卵巣内投与により引き起こされる場合、肝臓特異的プロモータは目的遺伝子と操作可能に連結されて、トランス遺伝子の肝臓特異的発現を達成し得る。本発明の肝臓特異的プロモータとしては、以下のプロモータが挙げられるが、これらに限定されない：ビテロゲニンプロモータ、Ｇ６Ｐプロモータ、コレステロール−７−α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ）プロモータ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）プロモータ、プロテインＣ遺伝子プロモータ、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）プロモータ、ビリルビンＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼプロモータ、アルドラーゼＢプロモータ、フリンプロモータ、メタロチオネインプロモータ、アルブミンプロモータ及びインスリンプロモータ。
【００７１】
乳を生産する動物の乳中への目的タンパク質の発現を標的化するために用いられ得るプロモータも、本発明に含まれ、例としてはβラクトグロビンプロモータ、乳清酸性タンパク質プロモータ、ラクトアルブミンプロモータ及びカゼインプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
生殖系列の形質転換が卵巣内投与により引き起こされる場合、免疫系特異的プロモータは目的遺伝子と作用可能に連結されて、トランス遺伝子の免疫系特異的な発現を達成し得る。したがって免疫系の細胞に関連したプロモータも用いられ得る。急性期プロモータ、例えばインターロイキン（ＩＬ）−１及びＩＬ−２が用いられ得る。Ｉｇ重鎖及び軽鎖の
ためのプロモータも用いられ得る。Ｔ細胞受容体構成成分ＣＤ４及びＣＤ８のプロモータ、Ｂ細胞プロモータ並びにＣＲ２（２型補体受容体）のプロモータも用いられ得る。免疫系プロモータは、好ましくは、所望のタンパク質が抗体タンパク質である場合に用いられる。
【００７３】
単一のプロモータ要素の重複、改変、又はその他の変更による改変プロモータ／エンハンサーも、本発明に含まれる。一実施形態では、オボアルブミンプロモータのステロイドホルモン結合ドメインが、約−６．５ｋｂから目的遺伝子の先頭のおよそ１０００塩基対内部にまで移動される。天然ではプロモータ中に見いだされないプロモータ／エンハンサー要素による既存のプロモータの改変、並びに完全合成プロモータの構築、あるいは非天然型主鎖上に種々の遺伝子からのプロモータ／エンハンサー要素をまとめて導入すること、は全て本発明に包含される。
【００７４】
したがって、本発明のトランスポゾンベクター内に含入されるプロモータは完全プロモータ配列又はプロモータ配列の断片であり得る、と理解されるべきである。例えば一実施形態では、目的遺伝子と操作可能に連結されるプロモータは、ニワトリオボアルブミンプロモータの約９００塩基対フラグメントである（配列番号１５）。トランスポゾンベクター内に含入される構成的及び誘導性プロモータは、ＡＣＣＡＴＧからなる１又は複数の改変コザック配列（配列番号１）の付加によっても改変され得る。
【００７５】
上記のように、本発明は、１又は複数のエンハンサーを含有するトランスポゾンベクターを含む。これらのエンハンサーは、それらの天然プロモータと操作可能に連結され得ることもそうでないこともあり、それらの操作可能に連結されたプロモータから任意の距離に置くことができる。エンハンサーと操作可能に連結されたプロモータ及び抑制的調節作用を排除するよう改変されたエンハンサーは、本明細書中では、「増強プロモータ」と呼ばれる。トランスポゾンベクター内に含入されるエンハンサーは、好ましくは鳥類に見出されるエンハンサーであり、さらに好ましくはオボアルブミンエンハンサーであるが、しかしこれらの種類のエンハンサーに限定されない。一実施形態では、オボアルブミンプロモータの約６７５塩基対のエンハンサー要素がエンハンサー及びプロモータを分離する３００塩基対のスペーサーＤＮＡと共にオボアルブミンプロモータの上流にクローニングされる。一実施形態では、本発明の一部として用いられるエンハンサーは、GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１からのニワトリオボアルブミンエンハンサーの塩基対１〜６７５を含む。このエンハンサーのポリヌクレオチド配列は、配列番号１６で提示される。
【００７６】
キャップ部位及びキャップ部位の断片も、本発明のトランスポゾンベクターのうちのいくつかに含まれる。一実施形態では、キャップ部位が存在する約５０塩基対の５’非翻訳領域が、増強プロモータ又はプロモータの３’末端に付加される。５’非翻訳領域の例は、配列番号１７で提示される。この５’非翻訳領域に存在する推定キャップ部位は、好ましくは配列番号１８で提示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
本発明の一実施形態では、トランスポザーゼ遺伝子と操作可能に連結された第一のプロモータは構成的プロモータであり、そして目的遺伝子と操作可能に連結された第二のプロモータは組織特異的プロモータである。第二の実施形態では、第一の構成的プロモータの使用は、トランスポザーゼ遺伝子の構成的な活性化並びに事実上全ての細胞型、例えばレシピエント動物の生殖系列への目的遺伝子の組み込みを可能にする。目的遺伝子は一般には生殖系列中に組み込まれるが、組織特異的な方式で発現されるだけかもしれない。トランスポザーゼ遺伝子と操作可能に連結された構成的プロモータを有するトランスポゾンベクターは任意の経路により投与され、一実施形態では、該ベクターは卵巣に、卵巣に通じる動脈に、あるいは卵巣に近位のリンパ系又はリンパ液に投与される。
【００７８】
本明細書中に記載したような細胞又は組織特異的発現は、好ましい細胞又は組織以外の細胞又は組織中で全く発現が認められないことを意味するわけではない、ということに留意すべきである。その代わり、「細胞特異的」又は「組織特異的」発現は、それぞれ、好ましい細胞又は組織中で特定の目的遺伝子の大多数が発現することを意味する。
【００７９】
生殖系列中への目的遺伝子の組み込みが好ましくない場合、トランスポザーゼ遺伝子と操作可能に連結された第一のプロモータは組織特異的プロモータであり得る。例えば卵管特異的プロモータ、例えばオボアルブミンプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子を含有するトランスポゾンベクターのトランスフェクションは、卵管の細胞中でのトランスポザーゼ遺伝子の活性化並びに目的遺伝子の組み込みをもたらすが、しかし一般的に生殖系列及びその他の細胞中での活性化及び組み込みはもたらさない。この実施形態では、目的遺伝子と操作可能に連結された第二のプロモータは、構成的プロモータ又は誘導性プロモータであり得る。好ましい実施形態では、第一のプロモータ及び第二のプロモータは共にオボアルブミンプロモータである。組織特異的発現又は組み込みが望ましい実施形態では、トランスポゾンベクターは目的組織に、目的組織に通じる動脈に、又は目的組織周囲の体液に直接投与される、というのが好ましい。好ましい実施形態では、目的組織は卵管であり、そして投与は卵管又は卵管に通じる動脈への直接注射により達成される。さらなる好ましい実施形態では、投与は、卵管の筒状部又は漏斗の管腔中への直接注射により達成される。卵管への間接的投与は、排出腔を通して行い得る。
【００８０】
したがって細胞特異的プロモータは、選定組織中での転写を増強するために用いられ得る。例えば鳥類では、ファロピウス管の細胞中に見出されるプロモータ、例えばオボアルブミン、コンアルブミン、オボムコイド及び／又はライソザイムは、ファロピウス管の上皮細胞及び管状腺細胞中での目的遺伝子の転写を保証して、遺伝子によりコードされる所望のタンパク質の合成並びに卵白中への蓄積を生じさせるために用いられ得る。哺乳類では、乳腺の腺胞の上皮細胞に特異的なプロモータ、例えばプロラクチン、インスリン、βラクトグロビン、乳清酸性タンパク質、ラクトアルブミン、カゼイン及び／又は胎盤ラクトゲンプロモータが、所望のタンパク質を乳中へ蓄積させて生産することを目的とした、これらの細胞のトランスフェクションに使用されるベクターの設計に用いられる。肝細胞では、タンパク質生産のための目的遺伝子の転写を促進するために、Ｇ６Ｐプロモータが用いられ得る。鳥類の肝臓中で製造されるタンパク質は、卵黄に送達され得る。
【００８１】
トランスポザーゼ遺伝子のより高度の又はより効率的な発現を達成するために、トランスポザーゼ遺伝子と操作可能に連結されたプロモータ及びその他の調節配列は、宿主由来のものであり得る。これらの宿主特異的調節配列は、上記のように組織特異的であり得るし、あるいは構成的なものであり得る。例えば鳥類のアクチンプロモータ及びその関連ポリＡ配列は、鳥類へのトランスフェクションのためのトランスポゾンベクター中のトランスポザーゼと操作可能に連結され得る。トランスポザーゼと操作可能に連結され得るその他の宿主特異的プロモータの例としては、ミオシン及びＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼプロモータが挙げられる。
【００８２】
移行配列
本発明のいくつかの実施形態では、目的遺伝子は、移行配列又は目的遺伝子がコードする所望のタンパク質に正しい立体構造を提供する配列と操作可能に連結される。本明細書中で用いる場合、「移行配列」という用語は、シグナル配列及びターゲッティング配列の両方を指す。卵移行配列としては、オボムコイドシグナル配列、オボアルブミンシグナル配列、セクロピンプレプロシグナル配列、及びビテロゲニンターゲッティング配列が挙げられるが、これらに限定されない。「シグナル配列」という用語は、アミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチド配列であって、該配列が結合するタンパク質を真核生物中の小胞体、さらに好ましくは小胞体中の転移孔（translocational pores）、あるい
は原核生物中の形質膜、あるいは例えばミトコンドリア性疾患の遺伝子療法のためにミトコンドリアに誘導する配列をいう。シグナル及びターゲッティング配列は、例えばトランスポゾンベクターが乳を生産する動物に投与される場合、乳中に所望のタンパク質を生産させるために用いられ得る。
【００８３】
シグナル配列は、例えばトランスポゾンベクターが鳥類又はその他の卵を産む動物に投与される場合、卵黄又は卵白中への組込みのための分泌経路中に所望のタンパク質を誘導するためにも用いられ得る。このようなトランスポゾンベクターの一例は図３に提示されており、この場合、目的遺伝子はオボムコイドシグナル配列と操作可能に連結されている。本発明は、シグナル配列を含有する二次遺伝子と操作可能に連結された目的遺伝子も包含する。このような実施形態の一例は図２に示されており、この場合、目的遺伝子はオボアルブミンシグナル配列を含有するオボアルブミン遺伝子と操作可能に連結される。トランスポゾンベクター中に含まれ得るその他のシグナル配列としては、オボトランスフェリン及びライソザイムシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シグナル配列はオボアルブミンシグナル配列、例えば配列番号１９で示される配列である。別の実施形態では、シグナル配列は改変オボアルブミンシグナル配列、例えば配列番号２０又は配列番号２１で示される配列である。
【００８４】
本明細書中でさらにまた用いる場合、「ターゲッティング配列」という用語は、アミノ酸配列又はアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指し、このアミノ酸配列は細胞の外側に位置する受容体により認識される。受容体とターゲッティング配列との結合は、ターゲッティング配列と操作可能に連結されたタンパク質又はペプチドの、細胞による取込みを生じる。ターゲッティング配列の一例は、卵母細胞の外側上のビテロゲニン受容体（又は低密度リポタンパク質受容体）により認識されるビテロゲニンターゲッティング配列である。一実施形態では、ビテロゲニンターゲッティング配列としては配列番号２２のポリヌクレオチド配列が挙げられる。別の実施形態では、ビテロゲニンターゲッティング配列としては、ビテロゲニン遺伝子の全部又は一部が挙げられる。その他のターゲッティング配列としては、ＶＬＤＬ及びＡｐｏＥが挙げられ、これらもビテロゲニン受容体と結合し得る。ＡｐｏＥタンパク質は鳥類では内生的には発現しないため、その存在は本発明のトランスポゾンベクターを保有する鳥を同定するために有利に用いられ得る。
【００８５】
所望のタンパク質をコードする目的遺伝子
安定な組み込みのために選択される目的遺伝子は、任意の所望のタンパク質又はペプチドをコードするよう、あるいは任意の細胞応答を調節するよう設計される。いくつかの実施形態では、所望のタンパク質又はペプチドは卵中又は乳中に蓄積される。本発明は、複数の目的遺伝子を含有するトランスポゾンベクターを包含する、と理解されるべきである。複数の目的遺伝子は、各々別個のプロモータ及びその他の調節配列（単数又は複数）と操作可能に連結されても良く、あるいは全て同一のプロモータ及びその他の調節配列（単数又は複数）と操作可能に連結されても良い。一実施形態では、多目的遺伝子は、単一のプロモータ及びその他の調節配列（単数又は複数）に連結され、そして各目的遺伝子は、切断部位又はシグナル配列の前部分により分離される。目的遺伝子は、目的遺伝子の最初の数個のＮ末端アミノ酸に対するコドンの改変を含有し、この場合、各コドンの第三塩基は、対応するアミノ酸を変えることなくＡ又はＴに変更される。
【００８６】
タンパク質及びペプチドホルモンは、本発明における好ましい部類のタンパク質である。このようなタンパク質及びペプチドホルモンは内分泌系により合成され、例としては視床下部ホルモン、脳下垂体刺激ホルモン、脳下垂体前葉、中葉及び後葉ホルモン、膵島ホルモン、消化管系で作られるホルモン、腎臓ホルモン、胸腺ホルモン、上皮小体ホルモン、副腎皮質及び髄質ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。特に本発明を用いて生産され得るホルモンとしては、絨毛性性腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、エ
リスロポエチン、グルカゴン、ＩＧＦ−１、オキシトシン、血小板由来増殖因子、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン及びその類似体、バソプレッシン、オクトレオチド、ソマトスタチン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ドーパミン、メラトニン、サイロキシン（Ｔ4）、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）、糖質コルチコイド、例えばコルチゾール、鉱質コルチコイド、例えばアルドステロン、アンドロゲン、例えばテストステロン、アドレナリン（エピネフリン）、ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）、エストロゲン、例えばエストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、カルシトロール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、神経ペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ3-36、アンジオテンシノーゲン、トロンボポエチン及びレプチンが挙げられるが、これらに限定されない。適切なポリヌクレオチド配列を用いることにより、トランスジェニック動物によって種特異的ホルモンを作れる可能性がある。
【００８７】
本発明の一実施形態では、目的遺伝子はプロインスリン遺伝子であり、そして所望の分子はインスリンである。プロインスリンは、３部分から成る：即ちＣペプチドと２本のアミノ酸鎖（α及びβ鎖）であり、後者はインスリン分子を生成するために一緒に結合するようになる。図２及び３は、それぞれオボアルブミンプロモータ及びオボアルブミンタンパク質又はオボムコイドプロモータ及びオボムコイドシグナル配列と操作可能に連結されたプロインスリンを含有するトランスポゾンベクターの模式図である。これらの実施形態では、プロインスリンは卵管管状腺細胞中で発現され、次に卵白中に蓄積される。プロインスリンポリヌクレオチド配列の一例は図２３に示されているが、この場合、Ｃペプチド切断部位は３１番目のＡｒｇから６５番目のＡｒｇに及ぶ。
【００８８】
血清タンパク質、例えばリポタンパク質、例えば高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＨＤＬ−ミラノ及び低密度リポタンパク質、アルブミン、血液凝固カスケード因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、フィブリノーゲン及びグロブリンも、本発明の所望のタンパク質の一群に含まれる。免疫グロブリンは所望のグロブリン分子の一クラスであり、例としてはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、λ鎖、κ鎖並びにその断片；Ｆｃ断片及びＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。所望の抗体としては天然抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びハイブリッド抗体が挙げられるが、これらに限定されない。天然抗体又はその断片の改変バージョンをコードする遺伝子並びに人工的に設計された抗体又はその断片をコードする遺伝子は、本発明のトランスポゾンベクター中に組み込むことができる。所望の抗体は、特定のリガンドを結合する能力を有する抗体、例えば癌関連分子に関連したタンパク質に対する抗体、例えば抗ｈｅｒ２又は抗ＣＡ１２５も包含する。したがって本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖をコードする１つ又は複数の遺伝子を含有するトランスポゾンベクターを包含する。さらに１より多い抗体をコードする１より多い遺伝子は、本発明の１又は複数のトランスポゾンベクター中に組み込まれて投与され得る。このようにして、卵は、卵白、卵黄又は両方に、１より多い型の抗体を含有し得る。一実施形態では、トランスポゾンベクターは、ともにプロモータと操作可能に連結されたＩｇの重鎖及び軽鎖を含有する。
【００８９】
治療試薬として用いられる抗体としては、特定の抗原に対する癌免疫療法に用いるための、あるいは感染性疾患又は毒性作用物質に対して動物又はヒトに受動免疫を提供するための抗体が挙げられるが、これらに限定されない。診断試薬として用いられる抗体としては、標識され、検出体により検出され得る抗体、例えば特定の波長に曝露後に検出され得る結合された蛍光標識を有する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。このような標識抗体は、特定の抗原に対する一次抗体、例えばローダミン標識ウサギ抗成長ホルモンであり得るし、あるいは標識二次抗体、例えばフルオレセイン標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ
であり得る。このような標識抗体は当業者に既知である。抗体との結合のために有用な標識も、当業者に既知である。これらの標識のうちのいくつかは、"Handbook of Fluorescent Probes and Research Products", ninth edition, Richard P. Haugland (ed) Molecular Probes, Inc. Eugene, OR（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００９０】
本発明を用いて生産される抗体は、多数の用途のための、例えばラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、イムノアフィニティーカラム、並びに当業者に既知のような抗体を要するその他の手法のための実験室試薬として用いられ得る。このような抗体としては、一次抗体、二次抗体及び三次抗体が挙げられ、これらは標識されてもされなくても良い。
【００９１】
本発明を実施することにより作成され得る抗体には、一次抗体、二次抗体、デザイナー抗体、抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＲＮＡ抗体、抗ホルモン抗体、抗下垂体刺激ペプチド、非天然抗体に対する抗体、抗脳下垂体前葉ホルモン抗体、抗脳下垂体後葉ホルモン抗体、抗毒液抗体、抗腫瘍マーカー抗体、並びに抗ウィルス、抗菌、抗原生動物、抗真菌、駆虫性、抗受容体、抗脂質、抗リン脂質、抗成長因子、抗サイトカイン、抗モノカイン、抗イディオタイプ、及び抗アクセサリー（提示）タンパク質抗体を含む、感染症に関連するエピトープに対する抗体が含まれるが、それらに限定されない。軽鎖であれ、重鎖であれ、本発明により作成される抗体を用いて酵素活性を阻害してもよい。
【００９２】
本発明を用いて生成され得る抗体には、以下のタンパク質に対して作成された抗体が含まれるが、それらに限定されない。ウシγ−グロブリン、血清；ウシＩｇＧ、血漿；ニワトリγ−グロブリン、血清；ヒトγ−グロブリン、血清；ヒトＩｇＡ、血漿；ヒトＩｇＡ1、ミエローマ；ヒトＩｇＡ2、ミエローマ；ヒトＩｇＡ2、血漿；ヒトＩｇＤ、血漿；ヒトＩｇＥ、ミエローマ；ヒトＩｇＧ、血漿；ヒトＩｇＧ、Ｆａｂフラグメント、血漿；ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、血漿；ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント、血漿；ヒトＩｇＧ1、ミエローマ；ヒトＩｇＧ2、ミエローマ；ヒトＩｇＧ3、ミエローマ；ヒトＩｇＧ4、ミエローマ；ヒトＩｇＭ、ミエローマ；ヒトＩｇＭ、血漿；ヒトイムノグロブリン、軽鎖κ、尿；ヒトイムノグロブリン、軽鎖κ及びλ、血漿；マウスγ−グロブリン、血清；マウスＩｇＧ、血清；マウスＩｇＭ、ミエローマ；ウサギγ−グロブリン、血清；ウサギＩｇＧ、血漿；及びラットγ−グロブリン。一実施形態では、トランスポゾンベクターは、ヒトセミノプロテインに対して特異性を示すマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコードする配列（軽鎖及び重鎖に対して、それぞれGenBank アクセッション番号  ＡＹ１２９００６及びＡＹ１２９３０４）を有する。
【００９３】
他の抗体を認識する抗体のさらなる非限定的なリストは以下の通りである。抗ニワトリＩｇＧ、重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖特異的（ヒツジ）；抗ヤギγ−グロブリン（ロバ）；抗ヤギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（ウサギ）；抗モルモットγ−グロブリン（ヤギ）；抗ヒトＩｇ、軽鎖、タイプκ特異的；抗ヒトＩｇ、軽鎖、タイプλ特異的；抗ヒトＩｇＡ、α鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＡ、Ｆａｂフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＡ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＡ、分泌性；抗ヒトＩｇＥ、ε鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＥ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃフラグメント特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ、Ｈ及びＬ鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ1、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ2、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ2、Ｆｄフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ3、ヒンジ特異的；抗ヒトＩｇＧ4、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＭ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＭ、μ鎖特異的；抗マウスＩｇＥ、ε鎖特異的；抗マウスγ−グロブリン（ヤギ）；抗マウスＩｇＧ、γ
鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；抗マウスＩｇＧ、Ｈ及びＬ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＭ、μ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＭ、Ｈ及びＬ鎖特異的（ヤギ）；抗ウサギγ−グロブリン（ヤギ）；抗ウサギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（ヤギ）；抗ウサギＩｇＧ、Ｈ及びＬ鎖特異的（ヤギ）；抗ラットγ−グロブリン（ヤギ）；抗ラットＩｇＧ、Ｈ及びＬ鎖特異的；抗アカゲザルγ−グロブリン（ヤギ）；及び抗ヒツジＩｇＧ、Ｈ及びＬ鎖特異的。
【００９４】
本発明を用いて生産され得る抗体の別の非限定的一覧は、Phoenix Pharmaceuticals, Inc.（www.phoenixpeptide.com; 530 Harbor Boulevard, Belmont, CA）、Peninsula Labs（San Carlos CA）、SIGMA（St.Louis, MO www.sigma-aldrich.com）、Cappel ICN（Irvine, California, www.icnbiomed.com）及びCalbiochem （La Jolla, California, www.calbiochem.com）といった会社の製品カタログに提示されている（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、科学文献、特許、及びデータベース、例えばGenBankから得てもよい。あるいは当業者は、所望の抗体中の各アミノ酸をコードするコドンを選択することにより、ゲノム中に組み込まれるべきポリヌクレオチド配列を設計してもよい。本発明のトランスジェニック動物により作られる抗体としては、例えば特定の抗原に対する癌免疫療法における治療試薬として、診断試薬として、並びに免疫中和、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降及びイムノアフィニティーカラムのような多数の用途に供される実験室試薬として用いられ得る抗体が挙げられる。これらの抗体のいくつかとしては、以下のリガンドと結合する抗体が挙げられる：アデノメジュリン、アミリン、カルシトニン、アミロイド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、胃酸分泌抑制ペプチド、胃酸放出ペプチド、インターロイキン、インターフェロン、コルチスタチン、ソマトスタチン、エンドセリン、サラフォトキシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ニューロキニン、サブスタンスＰ、レプチン、神経ペプチドＹ、メラニン凝集ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オルファニン、エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、ロイモルフィン、ペプチドＦ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、上皮小体ホルモン、ウロコルチン、コルチコトロピン放出ホルモン、ＰＨＭ、ＰＨＩ、血管活性腸管ポリペプチド、セクレチン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、アンジオスタチン、ボンベシン、エンドスタチン、ブラジキニン、ＦＭＲＦアミド、ガラニン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）関連ペプチド、ＧｎＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン、インヒビン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モチリン、ニ    ューロテンシン、オキシトシン、バソプレッシン、オステオカルシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、ペプチドＹＹ、プロオピオメラノコルチン、形質転換成長因子、血管内皮増殖因子、小胞性モノアミン輸送体、小胞性アセチルコリン輸送体、グレリン、ＮＰＷ、ＮＰＢ、Ｃ３ｄ、プロキネチカン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、β−リポトロピン、メラトニン、カリクライン、キニン、プロスタグランジン、エリスロポエチン、ｐ１４６（配列番号２４、アミノ酸配列、配列番号２５、ヌクレオチド配列）、エストロゲン、テストステロン、コルチコステロイド、鉱質コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、胸腺ホルモン、結合組織タンパク質、核タンパク質、アクチン、アビジン、アクチビン、アグリン、アルブミン、並びにそれらのプロホルモ���、プロペプチド、スプライス変異体、断片及び類似体。
【００９５】
以下は、本発明の方法により生成され得る抗体のさらに別の非限定的なリストである。アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）、アブシキシマブ抗血小板凝集モノクローナル抗体、抗ＣＤ１１ａ（ｈｕ１１２４）、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）抗体、抗ジゴキシン抗体、抗Ｂ型肝炎抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、ＧＤ３糖脂質に対する抗イディオタイプ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ−２Ｒ抗体、転移抑制ガン抗体（ｍＡｂ１７−１Ａ）、抗狂犬病抗体、抗呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）抗体、抗Ｒｈ
抗体、抗ＴＣＲ、抗ＴＮＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及びそのｆａｂ断面、ガラガラヘビ毒液抗体、クロゴケグモ毒液抗体、サンゴヘビ毒液抗体、超後期抗原−４（ＶＬＡ−４）に対する抗体、ＥＧＦ受容体に対するＣ２２５ヒト化抗体、ＴＮＦαに対するキメラ（ヒト及びマウス）抗体、ヒト血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体、ガンマグロブリン、抗Ｂ型肝炎イムノグロブリン、ヒト抗Ｄイムノグロブリン、黄色ブドウ球菌に対するヒト抗体、ヒト破傷風イムノグロブリン、上皮成長受容体−２に対するヒト化抗体、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに対するヒト化抗体、ヒト化抗体ＣＴＬＡ４ＩＧ、ＩＬ−２Ｒα−鎖に対するヒト化抗体、ヒト化抗ＣＤ４０−リガンドモノクローナル抗体（５ｃ８）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、ラウス肉腫ウィルスに対するヒト化ｍＡｂ、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）に対するヒト化組み換え抗体（ＩｇＧ１ｋ）、リンパ球イムノグロブリン（抗胸線細胞抗体）、リンパ球イムノグロブリン、因子ＶＩＩに対するｍＡｂ、ＨＥＲ−２に対するＭＤＸ−２１０二重特異性抗体、ＭＤＸ−２２、腫瘍上のＴＡＧ−７２に対するＭＤＸ−２２０二重特異性抗体、ＦｃγＲ１受容体に対するＭＤＸ−３３抗体、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性抗体、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性ヒト化抗体、ＭＤＸ−ＲＡ免疫毒素（リシンＡ結合）抗体、Ｔ細胞上のＣＤ２受容体に対するＭｅｄｉ−５０７抗体（ＢＴＩ−３２２のヒト化形態）、モノクローナル抗体ＬＤＰ−０２、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）抗体、ＰＲＯ５４２抗体、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）抗体、及びＴＮＦ−ＩｇＧ融合タンパク質。
【００９６】
本発明の方法を用いて調製される抗体はまた、当業者に既知の手段により検出できる特定の標識を有するよう設計してもよい。抗体はさらにまた、当業者に既知の手段による精製に有用な特定の配列を保有するよう設計してもよい。特定の抗原を結合するように設計された特異的抗体はまた、本発明のトランスポゾンベクターを用いてトランスジェニック動物中で生産され得る。
【００９７】
本発明のトランスポゾンベクターを用いたモノクローナル抗体の生産は、種々の方法により達成可能である。一実施形態では、２つのベクターが構築され得る：軽鎖をコードするものと、そしてモノクローナル抗体の重鎖をコードする第二のベクターである。これらのベクターは次に、本明細書中に開示された方法により標的動物のゲノム中に組み込まれ得る。別の実施形態では、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコードする配列は、単一ＤＮＡ構築物に包含され得る。例えば、ヒトセミノプロテインに対する特異性を示すマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコードする配列は、本発明のトランスポゾンを基礎とする構築物を用いて発現させることができる（それぞれ軽鎖及び重鎖に関してGenBank寄託番号ＡＹ１２９００６及びＡＹ１２９３０４）。
【００９８】
さらに、免疫系により合成されるタンパク質及びペプチド、例えば胸腺、リンパ節、脾臓及び胃腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）系により合成されるものが、本発明に包含される。本発明のトランスポゾンベクターを用いてトランスジェニック動物中で製造され得る免疫系タンパク質及びペプチドタンパク質としては、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、α−インターフェロンＡ、α−インターフェロン１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に含まれるその他のサイトカインとしては、カルジオトロフィン、ストロマ細胞由来因子、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、メラノーマ成長刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、２、３α、３β、４及び５が挙げられる。
【００９９】
溶解性ペプチド、例えばｐ１４６も、本発明の所望の分子に含まれる。一実施形態では
、ｐ１４６ペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。本発明は、配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含むｐ１４６核酸を含むトランスポゾンベクターも包含する。
【０１００】
酵素は、本発明のトランスポゾンベクターの使用により作製され得る別の部類のタンパク質である。かかる酵素としては、アデノシンデアミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ、ラクターゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、パンクレアチン、パパイン、ストレプトキナーゼＢ、サブチリシン、スーパーオキシドジスムターゼ、トロンビン、トリプシン、ウロキナーゼ、フィブリノリジン、グルコセレブロシダーゼ及びプラスミノーゲン活性因子が挙げられるが、これらに限定されない。酵素が有害な作用を有し得るいくつかの実施形態では、酵素機能の発現を防止するために、付加的なアミノ酸及びプロテアーゼ切断部位が目的の酵素のカルボキシ末端に付加される。その後プロテアーゼにより酵素を消化することで、該酵素の活性化が生じる。
【０１０１】
細胞外マトリックスタンパク質は、本発明の使用により製造され得る所望のタンパク質の一分類である。例としては、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチン並びにそれらのサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内タンパク質及び構造タンパク質は、本発明におけるその他の部類の所望のタンパク質である。
【０１０２】
成長因子は本発明の使用により製造され得る別の部類の所望のタンパク質であり、例としては、形質転換増殖因子−α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ酸性アイソフォーム１及び２、ＦＧＦ塩基性型２、並びにＦＧＦ４、８、９及び１０、神経成長因子（ＮＧＦ）、例えばＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓ及びβＮＧＦ、並びにニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、赤血球の生産の刺激のための増殖因子、白血球の生産の刺激のための増殖因子、骨成長因子（ＢＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、肝細胞増殖因子、神経膠細胞神経栄養増殖因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦα、β、β１、β２、β３、骨格成長因子、骨マトリックス由来増殖因子、骨由来増殖因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明の使用により製造され得る別の望ましい部類のタンパク質は、レプチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、腫瘍壊死因子α及びβ、ＥＮＢＲＥＬ、アンジオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、骨形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質２及び７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、並びにオステオカルシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
タンパク質のさらに別の所望の部類は、アルブミン、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）（接触活性化コファクター；フィッツジェラルド、Ｆｌａｕｊｅａｃ
Ｗｉｌｌｉａｍｓ因子）、因子Ｉ（フィブリノゲン）、因子ＩＩ（プロトロンビン）、因子ＩＩＩ（組織因子）、因子ＩＶ（カルシウム）、因子Ｖ（プロアクセレリン、不安定因子、促進性（Ａｃ−）グロブリン）、因子ＶＩ（Ｖａ）（アクセレリン）、因子ＶＩＩ（プロコンベルチン）、血清プロトロンビン変換促進因子（（ＳＰＣＡ）、コトロンボプラスチン）、因子ＶＩＩＩ（抗血友病因子Ａ、抗血友病グロブリン（ＡＨＧ））、因子ＩＸ（クリスマス因子、抗血友病因子Ｂ、血漿トロンボプラスチン成分（ＰＴＣ））、因子Ｘ（スチュアート−プロ−ワー因子）、因子ＸＩ（血漿トロンボプラスチン前駆体（ＰＴＡ））、因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）、因子ＸＩＩＩ（ロトランスグルタミナーゼ、フ
ィブリン安定因子（ＦＳＦ）、フィブリノリガーゼ）、フォン・ウィルブランド因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩを含む、血液タンパク質又は凝固カスケードタンパク質である。
【０１０５】
本発明の使用により製造され得るペプチド及びタンパク質の非限定的な一覧表は、Phoenix Pharmaceuticals, Inc.（www.phoenixpeptide.com; 530 Harbor Boulevard, Belmont, CA）、Peninsula Labs（San Carlos CA）、SIGMA（St.Louis, MO www.sigma-aldrich.com）、Cappel ICN（Irvine, California, www.icnbiomed.com）及びCalbiochem（La Jolla, California, www.calbiochem.com）といった会社の製品カタログに提示されている。これらの目的タンパク質及びペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、科学文献、特許、及びデータベース、例えばGenBankから得られる。あるいは当業者は、所望のタンパク質又はペプチド中の各アミノ酸をコードするコドンを選択することにより、ゲノム中に組み込まれるべきポリヌクレオチド配列を設計してもよい。
【０１０６】
本発明を用いることにより作成され得るこれら所望のタンパク質又はペプチドの中には、以下のものが含まれるがそれらに限定されない。アドレノメジュリン、アミリン、カルシトニン、アミロイド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、胃酸分泌抑制ペプチド、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン、インターフェロン、コルチスタチン、ソマトスタチン、エンドセリン、サラフォトキシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インシュリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ニューロキニン、サブスタンスＰ、レプチン、ニューロペプチドＹ、メラニン凝集ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オルファニン、エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、ロイモルフィン、ペプチドＦ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、上皮小体ホルモン、ウロコルチン、コルチコトロビン放出ホルモン、ＰＨＭ、ＰＨＩ、血管活性腸管ポリペプチド、セクレチン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、アンジオスタチン、ボンベシン、エンドスタチン、ブラジキニン、ＦＭＲＦアミド、ガラニン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）関連ペプチド、ＧｎＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン、インヒビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モチリン、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、オステオカルシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、ペプチドＹＹ、プロオピオメラノコルチン、形質転換成長因子、血管内皮成長因子、水疱性モノアミントランスポーター、水疱性アセチルコリントランスポーター、グレリン、ＮＰＷ、ＮＰＢ、Ｃ３ｄ、プロキネチカン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、ベータ−リポトロピン、メラトニン、カリクレイン、キニン、プロスタグランジン、エリスロポイエチン、ｐ１４６（配列番号２４、アミノ酸配列、配列番号２５、ヌクレオチド配列）、胸線ホルモン、結合組織タンパク質、核タンパク質、アクチン、アビジン、アクチビン、アグリン、アルブミン、アポリポタンパク質、アポリポタンパクＡ、アポリポタンパクＢ、並びにそれらのプロホルモン、プロペプチド、スプライスバリアント、断片及び類似体。
【０１０７】
本発明のトランスジェニック動物により作成され得る他の所望のタンパク質には、バシトラシン、ポリミキシンｂ、バンコマイシン、シクロスポリン、抗ＲＳＶ抗体、アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）、抗サイトメガロウィルス抗体、抗肝炎抗体、抗阻害剤凝固剤複合体、抗狂犬病抗体、抗Ｒｈ（Ｄ）抗体、アデノシンデアミナーゼ、抗ジゴキシン抗体、抗ガラガラヘビ科毒素（ガラガラヘビ毒液抗体）、抗ゴケグモ属毒素（クロゴケグモ毒液抗体）、抗ミクルルス属（micrurus）毒素（サンゴヘビ毒液抗体）、アプロチニン、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、ジフテリア抗毒素、リンパ球免疫グロブリン（抗胸線細胞抗体）、プロタミン、チロトロピン、カプレオマイシン、α−ガラクトシダーゼ、グラミシジン、ストレプトキナーゼ、破傷風トキソイド、チロトリシン、ＩＧＦ−１、水疱ワクチンのタンパク質、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−２ｒ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）抗体、ＴＮＦ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシ
マブ）抗体、ＡＣＴＨフラグメント１−２４、デスモプレッシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ヒストレリン、ロイプロリド、リプレシン、ナファレリン、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａを血小板に結合させるペプチド（インテグリリン）、ゴセレリン、カプレオマイシン、コリスチン、抗呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、リンパ球免疫グロブリン（チモグロビン、アトガム）、パノレックス、アルファ−アンチトリプシン、ボツリニン、肺胞界面活性剤タンパク質、腫瘍壊死受容体−ＩｇＧ融合タンパク質（エンブレル）、ゴナドレリン、インフルエンザワクチンのタンパク質、ロタウィルスワクチンのタンパク質、ヘモフィルスｂ共役ワクチンのタンパク質、ポリオウィルスワクチンのタンパク質、肺炎球菌共役ワクチンのタンパク質、髄膜炎菌性Ｃワクチンのタンパク質、インフルエンザワクチンのタンパク質、巨大核細胞成長及び発達因子（ＭＧＤＦ）、ニューロイムノフィリンリガンドＡ（ＮＩＬ−Ａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、レプチン（原生）、レプチンＢ、レプチンＣ、ＩＬ−１ＲＡ（インターロイキン−１ＲＡ）、Ｒ−５６８、新規赤血球生成促進タンパク質（ＮＥＳＰ）、ラウス肉腫ウィルスに対するヒト化ｍＡｂ（ＭＥＤＩ−４９３）、グルタミル−トリプトファンジペプチドＩＭ８６２、ＬＦＡ−３ＴＩＰ免疫抑制薬、ヒト化抗ＣＤ４０−リガンドモノクローナル抗体（５ｃ８）、ゲルソニン酵素、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、髄膜炎Ｂワクチンのタンパク質、転移抑制ガン抗体（ｍＡｂ１７−１Ａ）、ＴＮＦαに対するキメラ（ヒト及びマウス）ｍＡｂ、因子ＶＩＩに対するｍＡｂ、リラキシン、カプレオマイシン、グリコペプチド（ＬＹ３３３３２８）、組み換えヒト活性化タンパク質Ｃ（ｒｈＡＰＣ）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、アルテパーゼ、抗ＣＤ２０抗体、Ｃ２Ｂ８抗体、インシュリン様成長因子−１、心房性ナトリウム利尿ペプチド（アナリタイド）、テネクタプラーゼ、抗ＣＤ１１ａ抗体（ｈｕ１１２４）、抗ＣＤ１８抗体、ｍＡｂＬＤＰ−０２、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＡｂのｆａｂフラグメント、ＡＰＯ２リガンド（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発因子）、γＴＧＦ−β（形質転換成長因子−β）、アルファ−アンチトリプシン、アナナイン（パイナップル酵素）、ヒト化ｍＡｂ  ＣＴＬＡ４ＩＧ、ＰＲＯ５４２（ｍＡｂ）、Ｄ２Ｅ７（ｍＡｂ）、子ウシ腸アルカリホスファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｌ−ガラクトシダーゼ（ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、骨形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＨＩＶワクチンのタンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ペプチドワクチン、ＴＣＲペプチド、Ｖベータ３及びＶベータ１３．１．（ＩＲ５０２）、（ＩＲ５０１）、超後期抗原−４（ＶＬＡ−４）に対するＢＩ１０５０／１２７２ｍＡｂ、ＥＧＦ受容体に対するＣ２２５ヒト化ｍＡｂ、ＧＤ３糖脂質に対する抗イディオタイプ抗体、ピロリ菌に対する抗菌性ポリペプチド、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性ヒト化ｍＡｂ、抗サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Ｍｅｄｉ−４９１  Ｂ１９パルボウィルスワクチン、呼吸器合胞体ウィル��（ＲＳＶ）に対するヒト化組み換えｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）、尿路感染ワクチン（大腸菌株の「線毛」に対する）、ボレリア・ブルグドルフェリタンパク質に対するライム病ワクチンのタンパク質（ＤｂｐＡ）、Ｍｅｄｉ−５０１ヒト乳頭腫ウィルス−１１ワクチン（ＨＰＶ）のタンパク質、肺炎連鎖球菌ワクチン、Ｔ細胞上のＣＤ２受容体に対するＭｅｄｉ−５０７  ｍＡｂ（ＢＴＩ−３２２のヒト化形態）、ＦｃγＲ１受容体に対するＭＤＸ−３３  ｍＡｂ、ＭＤＸ−ＲＡ免疫毒素（リシンＡ結合）ｍＡｂ、ＨＥＲ−２に対するＭＤＸ−２１０二重特異性ｍＡｂ、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性ｍＡｂ、ＭＤＸ−２２、腫瘍上のＴＡＧ−７２に対するＭＤＸ−２２０二重特異性ｍＡｂ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（モルグラモスチム）、ＩＬ−２Ｒα−鎖に対するヒト化ｍＡｂ（バシリキシマブ）、ＩｇＥに対するｍＡｂ（ＩＧＥ０２５Ａ）、ミエリン塩基性タンパク変性ペプチド（ＭＳＰ７７１Ａ）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに対するヒト化ｍＡｂ、低分子量ヘパリン、抗血友病因子、及び殺細菌性透過性増大作用タンパク質（ｒ−ＢＰＩ）が含まれる。
【０１０８】
本発明を用いて製造されるペプチド及びタンパク質は、当業者に既知の標識及び技術を
用いて標識され得る。これらの標識のいくつかは、"Handbook of Fluorescent Probes and Research Products", ninth edition, Richard P. Haugland (ed) Molecular Probes, Inc. Eugene, OR（この記載内容は、全体として参照により本明細書中で援用される）に記載されている。これらの標識のいくつかは、選択されたタンパク質又はペプチドの発現のためにポリヌクレオチド配列中に遺伝子工学的に組み込んでも良い。ペプチド及びタンパク質は、標識することが困難であるか又は不可能であるタンパク質の標識を可能にするために組み込まれる、標識組込み「ハンドル」を有しても良い。
【０１０９】
種々の部類の所望のペプチド及びタンパク質、並びにこの節に記載された具体的なペプチド及びタンパク質は、トランスジェニック動物中に組み込まれた遺伝子中に、所望のアミノ酸置換を目的として選択したコドンを挿入することにより、以下に記すように改変しても良い、と理解されるべきである。
【０１１０】
本発明は、タンパク質及びペプチド以外の所望の分子を生産するためにも用いられ、例としてはリポタンパク質、例えば高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＨＤＬ−ミラノ、及び低密度リポタンパク質、脂質、炭水化物、ｓｉＲＮＡ及びリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態では、目的遺伝子は、所望の分子の生産を誘導する核酸分子又はタンパク質をコードする。
【０１１１】
本発明はさらに、内生の（即ち非ベクター）タンパク質生産を抑制するための抑制分子の使用を包含する。これらの抑制分子としては、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ及び抑制タンパク質が挙げられる。好ましい実施形態では、その発現が抑制される内生のタンパク質は卵白タンパク質であり、例としては、オボアルブミン、オボトランスフェリン及びオボムチンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、転写時に二本鎖ＲＮＡ分子を形成するオボアルブミンＤＮＡ配列を含有するトランスポゾンベクターは、動物、例えば鳥中にトランスフェクトされ、鳥での内生オボアルブミンタンパク質の生産は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により低減される。その他の実施形態では、トランスポゾンベクターは、１より多い卵白タンパク質の発現を抑制する抑制ＲＮＡ分子をコードする。例示的な一構築物は図４に示されており、この場合、「Ｏｖｇｅｎ」は約６０塩基対のオボアルブミン遺伝子を示し、「Ｏｖｏｔｒａｎｓ」は約６０塩基対のオボトランスフェリン遺伝子を示し、「オボムチン」は約６０塩基対のオボムチン遺伝子を示す。これらのオボアルブミン、オボトランスフェリン及びオボムチンは任意の鳥類種からのものであり、いくつかの実施形態では、ニワトリ又はウズラからである。「ｐｒｏ」という用語は、プレプロ配列のプロ部分を示す。例示的な一プレプロ配列は、セクロピンの配列であり、塩基対５６３〜７３３のセクロピンキャップ部位及びGenBank寄託番号Ｘ０７４０４で提示されるプレプロを含む。付加なセクロピンプレプロ及びプロ配列は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１で示される。さらに、内生タンパク質生産の低減又は抑制を達成するために、内生タンパク質の誘導性ノックアウト又はノックダウンが作製されてもよい。内生の卵白生産は、鳥類においていかなる時期でも抑制され得るが、しかし好ましくは卵の収穫に先立って、又は直前に抑制される。
【０１１２】
改変された所望のタンパク質及びペプチド
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」は、そのα炭素が、一アミノ酸のα炭素のカルボキシル基ともう一つのアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応により形成されるペプチド結合を介して結合されるアミノ酸（典型的にはＬ−アミノ酸）の鎖である。鎖の一端の末端アミノ酸（即ちアミノ末端）は遊離アミノ基を有する一方、鎖のもう一つの端の末端アミノ酸（即ちカルボキシ末端）は、遊離カルボキシル基を有する。このように、「アミノ末端」（略してＮ末端）という用語は、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸上の遊離αアミノ基を指すか、あるいはタンパク質内の任意の他の位置のアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与する場合にはイミノ基）を指
す。同様に、「カルボキシ末端」（略してＣ末端）という用語は、タンパク質のカルボキシ末端のアミノ酸上の遊離カルボキシル基を指すか、あるいはタンパク質内の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシル基を指す。
【０１１３】
一般的には、タンパク質を作り上げているアミノ酸は、アミノ末端から出発して、タンパク質のカルボキシ末端方向に漸増して、順に番号を付される。したがってあるアミノ酸が別のアミノ酸の「後ろにある」と言われる場合、そのアミノ酸は先行アミノ酸よりタンパク質のカルボキシ末端に近い方に位置する。
【０１１４】
「残基」という用語は、アミド結合によりタンパク質に組み込まれる、アミノ酸（Ｄ又はＬ）又はアミノ酸擬似体を指すのに本明細書中で使用される。したがって、残基は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、あるいは特に限定されない限りは、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する天然アミノ酸の既知の類似体（すなわち、アミノ酸擬似体）を包含し得る。さらに、アミド結合擬似体として、当業者に既知のペプチド骨格改変が含まれる。
【０１１５】
さらに、当業者は、コードされた配列における、単一アミノ酸又は少数のアミノ酸（好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満）を変更、付加又は欠失する、個々の置換、欠失又は付加は、同類に改変された変化であり、ここでこの変化は、アミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸での置換をもたらすことを理解するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する同類置換表が当該技術分野で既知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いに同類置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１１６】
同類置換は、置換するアミノ酸（天然又は改変）が、置換されるアミノ酸と構造的に関連する、即ち置換されるアミノ酸とほぼ同一のサイズ及び電子特性を有する置換である。したがって置換するアミノ酸は、側鎖中に、元のアミノ酸と同一又は類似の官能基を有する。「同類置換」は、置換されるアミノ酸と、側鎖中の官能基が適切な保護基で保護されている点を除いて同一の、置換するアミノ酸を利用することも指す。
【０１１７】
適切な保護基は、Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John
Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991（この教示内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。好ましい保護基は、例えばペプチドの親水性を低減し且つ親油性を増大することにより、膜を介してのペプチドの輸送を促し、そして加水分解により又は酵素的に切断され得るものである（Ditter et al., 1968. J. Pharm. Sci. 57: 783; Ditter et al., 1968. J. Pharm. Sci. 57: 828; Ditter et al., 1969. J. Pharm.
Sci. 58: 557; King et al., 1987. Biochemistry 26: 2294; Lindberg et al., 1989. Drug Metabolism and Disposition 17: 311; Tunek et al., 1988. Biochem. Pharm. 37:
3867; Anderson et al., 1985 Arch. Biochem. Biophys. 239: 538;及びSinghal et al., 1987. FASEB J. 1: 220）。好適なヒドロキシル基としては、エステル、カルボネート及びカルバメート保護基が挙げられる。好適なアミン保護基としては、Ｎ末端保護基に関して上記したように、アシル基及びアルコキシ又はアリールオキシカルボニル基が挙げられる。好適なカルボン酸保護基としては、Ｃ末端保護基に関して以下に記載されるように、脂肪族、ベンジル及びアリールエステルが挙げられる。一実施形態では、本発明のペプチド中の１つ又は複数のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の側鎖中のカルボン酸基は
、好ましくはメチル、エチル、ベンジル又は置換ベンジルエステルとして、さらに好ましくはベンジルエステルとして保護される。
【０１１８】
以下に提示されるのは、グループ中の各アミノ酸が同様の電気的及び立体的特性を有する天然及び改変アミノ酸のグループである。したがって同類置換は、あるアミノ酸を、同一グループの別のアミノ酸で置換することにより達成できる。これらのグループは非限定的であり、即ち各グループに包含され得る別の改変アミノ酸が存在する、と理解されるべきである。
【０１１９】
グループＩはロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、及び以下の側鎖、すなわちエチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチルを有する改変アミノ酸を含む。好ましくは、グループＩはロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンを含む。
【０１２０】
グループＩＩはグリシン、アラニン、バリン、及びエチル側鎖を有する変性アミノ酸を含む。好ましくは、グループＩＩはグリシン及びアラニンを含む。
【０１２１】
グループＩＩＩはフェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロへキシルメチルグリシン、及び置換されたベンジル又はフェニル側鎖を有する変性アミノ残基を含む。好ましい置換基には、以下の１つ又は複数が含まれる：ハロゲン、メチル、エチル、ニトロ、−ＮＨ2、メトキシ、及びＣＮ。好ましくは、グループＩＩＩはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含む。
【０１２２】
グループＩＶはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギン酸の置換又は無置換の脂肪族、芳香族、又はベンジル型エステル（たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロヘキシル、ベンジル、又は置換ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、−ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミン又はアスパラギン（たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル）、並びに側鎖−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨを有する変性アミノ酸、そのエステル（置換又は無置換の脂肪族、芳香族、又はベンジル型エステル）、そのアミド、及びその置換又は無置換のＮ−アルキル化アミドを含む。好ましくは、グループＩＶはグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル及びグルタミン酸メチル、グルタミン酸エチル及びグルタミン酸ベンジル、グルタミン及びアスパラギンを含む。
【０１２３】
グループＶはヒスチジン、リシン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、２−アミノ−４−グアニジノ酪酸、リシンの相同体、アルギニンの相同体、及びオルニチンの相同体を含む。好ましくは、グループＶはヒスチジン、リシン、アルギニン、及びオルニチンを含む。アミノ酸の相同体では１〜約３個のメチレンユニットが側鎖に追加されるか、あるいは除去される。
【０１２４】
グループＶＩはセリン、スレオニン、システイン、及びＯＨ又はＳＨで置換された炭素数１から５の直鎖又は分岐状アルキル側鎖（たとえば、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、又はＣＨ2ＣＨ2ＯＨＣＨ3）を有する改変アミノ酸を含む。好ましくは、グループＶＩはセリン、システイン、又はスレオニンを含む。
【０１２５】
別の態様では、アミノ酸残基に関する好適な置換としては、「厳密な」置換が挙げられる。「厳密な置換」は、置換されるアミノ酸と比較して、置換するアミノ酸（天然又は改変）が有意に異なるサイズ及び／又は電気的特性を有する置換である。したがって置換するアミノ酸の側鎖は置換されるアミノ酸の側鎖より有意に大きい（又は小さい）し、及び／又は置換されるアミノ酸と有意に異なる電気的特性を伴う官能基を有し得る。この型の
厳密な置換の例としては、アラニンに代わるフェニルアラニン又はシクロヘキシルメチルグリシンの、グリシンに代わるイソロイシンの、対応するＬアミノ酸に代わるＤアミノ酸の、あるいはアスパラギン酸に代わる−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ2）5−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−の置換が挙げられる。あるいは、官能基は、側鎖に付加されるか、側鎖から除去されるか、又は別の官能基と交換されても良い。この型の厳密な置換の例としては、バリン、ロイシン又はイソロイシンの付加、アミンによるアスパラギン酸又はグルタミン酸の側鎖中のカルボン酸の交換、あるいはリシン又はオルニチンの側鎖中のアミン基の欠失が挙げられる。さらにまた、置換するアミノ酸の側鎖は、置換されるアミノ酸の官能基と有意に異なる立体及び電子特性を有してもよい。このような改変の例としては、グリシンに代わるトリプトファン、アスパラギン酸に代わるリシン、及びセリンの側鎖に代わる−（ＣＨ2）4ＣＯＯＨが挙げられる。これらの例により何ら限定されることはない。
【０１２６】
別の実施形態では、たとえば２６アミノ酸残基のペプチドを合成する際、個々のアミノ酸は以下の方式に応じて置換されてもよい。
アミノ酸残基１はセリン、グリシン、アラニン、システイン、又はスレオニンであり、
アミノ酸残基２はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、又はセリンであり、
アミノ酸残基３はバリン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、リシン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、又は２−アミノ−４−グアニジノ酪酸であり、
アミノ酸残基４はプロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、又はメチオニンであり、
アミノ酸残基５はトリプトファン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、又はグリシンであり、
アミノ酸残基６はセリン、グリシン、アラニン、システイン、又はスレオニンであり、
アミノ酸残基７はプロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、又はメチオニンであり、
アミノ酸残基８はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、又はセリンであり、
アミノ酸残基９はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、又はセリンであり、
アミノ酸残基１０はロイシン、イソロイシン、メチオニン、又はバリンであり、
アミノ酸残基１１はセリン、グリシン、アラニン、システイン、又はスレオニンであり、
アミノ酸残基１２はロイシン、イソロイシン、メチオニン、又はバリンであり、
アミノ酸残基１３はロイシン、イソロイシン、メチオニン、又はバリンであり、
アミノ酸残基１４はグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
アミノ酸残基１５はアルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、又は２−アミノ−４−グアニジノ酪酸であり、
アミノ酸残基１６はプロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、又はメチオニンであり、
アミノ酸残基１７はセリン、グリシン、アラニン、システイン、又はスレオニンであり、
アミノ酸残基１８はグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
アミノ酸残基１９はアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
アミノ酸残基２０はバリン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、オル
ニチン、リシン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、又は２−アミノ−４−グアニジノ酪酸であり、
アミノ酸残基２１はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、又はセリンであり、
アミノ酸残基２２はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、又はセリンであり、
アミノ酸残基２３はヒスチジン、セリン、スレオニン、システイン、リシン、又はオルニチンであり、
アミノ酸残基２４はスレオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
アミノ酸残基２５はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
アミノ酸残基２６はシステイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、リシン、又はオルニチンである。
【０１２７】
これらのアミノ酸置換は、上記の先行例における２６量体より長いか又は短いペプチドについて、並びにタンパク質についてなされても良い、と理解されるべきである。
【０１２８】
本発明の一実施形態では、対応するアミノ酸を変えることなく各コドンの第三塩基がＡ又はＴに変更されるよう、トランスポザーゼの最初の数個のＮ末端アミノ酸のコドンが改変される。対応するアミノ酸を変えることなく各コドンの第三塩基がＡ又はＴに変更されるよう、目的遺伝子の最初のＮ末端コドンの約１〜２０個、さらに好ましくは３〜１５個、最も好ましくは４〜１２個が改変されるのが好ましい。一実施形態では、目的遺伝子の最初の１０個のＮ末端コドンはこのようにして改変される。
【０１２９】
数個の所望のタンパク質、タンパク質フラグメント又はペプチドがゲノム中に組み込まれるべき目的遺伝子中にコードされる場合、タンパク質、タンパク質フラグメント又はペプチドは、１又は複数のアミノ酸から成るスペーサー分子、例えばペプチドにより分離され得る、と当業者は理解する。一般にスペーサーは、所望のタンパク質、タンパク質断片又はペプチドを一緒に結びつけること、又はそれらの間の何らかの最小距離又はその他の空間的関係を保つこと以外の特定の生物学的活性を有さない。しかしながらスペーサーの構成アミノ酸は、分子の何らかの特性、例えばフォールディング、正味電荷又は疎水性に影響を及ぼすよう選択されても良い。スペーサーはまた、精製ハンドルを有するヌクレオチド配列内に含まれても良く、あるいはタンパク質分解性解裂部位のような解裂部位によりはさまれてもよい。
【０１３０】
かかるポリペプチドスペーサーは、約５〜約４０アミノ酸残基を有してもよい。ポリペプチド中のスペーサーは独立に選択されるが、好ましくは全て同一である。スペーサーは、空間中の柔軟な動きを可能にすべきであり、したがって一般的には小さいアミノ酸、例えばグリシン、セリン、プロリン又はアラニンに富んでいる。好ましくはペプチドスペーサーは、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％のグリシン又はアラニンを含有する。さらに、ペプチドスペーサーは一般に、生物学的活性及び抗原性の活性をほとんど又は全く有さない。好ましいスペーサーは、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）x（配列番号２６）及び（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）yであり、ここで、ｘは約３〜約９の整数であり、ｙは約１〜約８の整数である。適切なスペーサーの具体的な例としては、以下のものが挙げられる：
（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）3
配列番号２７    ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌ
ｙＧｌｙ
（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）3
配列番号２８    ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ、又は
（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）4
配列番号２９    ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ。
【０１３１】
発現した組み換えタンパク質の精製に有用であり得る残基の生成をコードするヌクレオチド配列も、ベクター中で構築され得る。このような配列は当該技術分野で既知であり、例としてはグルタチオンＳトランスフェラーゼからのグルタチオン結合ドメイン、ポリリジン、ヘキサ−ヒスチジン又はその他の陽イオン性アミノ酸、チオレドキシン、ヘマグルチニン抗原、及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。
【０１３２】
さらに、タンパク質又はペプチドがタンパク質分解的解裂に対するシグナルとなる１〜約６個のアミノ酸を含むように、組み込まれる目的遺伝子中にヌクレオチド配列が挿入され得る。このように、トランスジェニック動物中で１又は複数の目的ペプチド又はタンパク質を作成するように遺伝子が設計される場合、酵素により認識されるアミノ酸をコードする特定のヌクレオチド配列が遺伝子中に組み込まれて、大きいタンパク質又はペプチド配列が所望のペプチド又はタンパク質又はその両方へと切断されることを促す。例えば、シグナル配列が目的遺伝子によりコードされるタンパク質又はペプチドから切断され得るよう、タンパク質分解的解裂部位をコードするヌクレオチドを目的遺伝子中に導入することができる。ｐＨ感受性又は化学物質感受性を示すその他のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もベクターに付加されて、目的ペプチド又はタンパク質からのシグナル配列の分離を促し得る。
【０１３３】
タンパク質分解的解裂部位としては、エキソペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＩ及びジペプチジルアミノペプチダーゼ；エンドペプチダーゼ、例えばトリプシン、Ｖ８−プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、Ｘa因子、コラゲナーゼ、エンドプロテイナーゼ、ズブチリシン及びトロンビン；並びにプロテアーゼ、例えばプロテアーゼ３Ｃ  ＩｇＡプロテアーゼ（Ｉガーゼ）、ライノウイルス３Ｃ（プレ分離）プロテアーゼにより認識される切断部位が挙げられる。化学的解裂部位も、本明細書中で用いられるような切断の定義に含まれる。化学的解裂部位としては、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、蟻酸及び酢酸により切断される部位が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明の一実施形態では、ＴＡＧ配列は目的遺伝子に結合される。ＴＡＧ配列は、３つの目的に役立つ：１）それは単離されるべきペプチド又はタンパク質の自由回転を可能にし、したがってネイティブタンパク質又はシグナル配列、すなわちビテロゲニンからの干渉が全くなく、２）それはカラム精製を用いてタンパク質を単離するための「精製ハンドル」を提供し、そして３）それはシグナル及び精製配列から所望のタンパク質を除去するための解裂部位を含む。したがって、本明細書中で用いる場合、ＴＡＧ配列は、スペーサー配列、精製ハンドル及び解裂部位を含む。ＴＡＧタンパク質中のスペーサー配列は、配列番号３０で示される１又は複数の反復を含有する。好ましいスペーサー配列は、配列番号３１で提示される配列を含む。精製ハンドルの一例は、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループである。例としてｇｐ４１ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を、それぞれ配列番号３２及び配列番号３３で示す。しかしながら任意の抗原領域、例えばｇｐ４１の任意の抗原領域は、精製ハンドルとして用いられ得る、と理解されるべきである。好ましい精製ハンドルは、高度に特異的な抗体を誘導する。さらに解裂部位は、当業者に既知の任意のタンパク質解裂部位であり、例としてはＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ配列（
配列番号３４）を含むエンテロキナーゼ解裂部位、並びにフリン解裂部位が挙げられる。ＴＡＧ配列を含有する構築物は、図２及び３に示されている。本発明の一実施形態では、ＴＡＧ配列は配列番号３５のポリヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
トランスポゾンベクターの投与方法
上記のトランスポゾンベクターのほかに、本発明は、動物へのトランスポゾンベクター投与方法、目的遺伝子が動物の生殖系列に組み込まれるトランスジェニック動物の生産方法、並びに目的遺伝子が動物の生殖系列細胞以外の細胞（体細胞）に組み込まれるトランスジェニック動物の生産方法も包含する。本発明のトランスポゾンベクターは、当業者に既知の任意の方法により、動物の生殖器官に投与される。好ましい生殖器官としては、卵巣、卵管、乳腺及びファロピウス管が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、トランスポゾンベクターは生殖器官に直接投与される。直接投与は器官への注入を包含し、そして好ましい実施形態では、トランスポゾンベクターは卵管の管腔に、さらに好ましくは卵管の筒部又は漏斗の管腔に注入される。トランスポゾンベクターは、付加的に又は代替的に、生殖器官に供給する動脈中に入れられ得る。卵巣につながる動脈へのベクターの投与は、卵巣中の卵胞及び卵母細胞のトランスフェクションを生じて、生殖系列トランスジェニック動物を作製する。あるいは、卵管に通じる動脈を通してのベクターの供給は、好ましくは管状腺及び上皮細胞をトランスフェクトする。このようなトランスフェクト細胞は、卵白中への蓄積のための所望のタンパク質又はペプチドを製造し得る。一実施形態では、トランスポゾンベクターは、卵管の膨大部又は漏斗部の管腔中に、及び卵管につながる動脈に投与される。卵管上皮への間接的投与は、排出腔を通して生じる。乳腺への直接投与は、乳腺の管系への導入を包含する。
【０１３７】
トランスポゾンベクターの投与は、卵巣につながる動脈中で、及び／又は注入による卵巣への直接的卵胞膜内投与によって行っても良い。
【０１３８】
トランスポゾンベクターは、１回または複数回、連続的にまたは断続的に投与してもよい。トランスポゾンベクターは、注射により、カテーテルにより、浸透圧ミニポンプ又は任意のその他の方法により投与しても良い。いくつかの実施形態では、トランスポゾンベクターは動物に複数回投与され、各投与は該ベクター及び異なるトランスフェクト試薬を含有する。
【０１３９】
トランスポゾンベクターは、動物の一生の間の任意の時点で動物に投与してよいが、しかしながら、動物が性的成熟に達する前に投与するのが好ましい。標準的な家禽飼育操作による場合、トランスポゾンベクターは好ましくは約１４〜１６週齢のニワトリに、及び約５〜１０週齢、さらに好ましくは５〜８週齢、最も好ましくは５〜６週齢のウズラに投与される。ベクターは、鳥における早期性的成熟を誘導するために外性ホルモンを用いる場合には、より早期齢で投与してもよい。いくつかの実施形態では、トランスポゾンベクターは、卵管上皮細胞及び／又は管状腺細胞の増殖の増大後に投与される。このような増大は、通常、卵管の領域における生殖ホルモンの流入に引き続いて起こる。動物が鳥類である場合、トランスポゾンベクターは卵管上皮細胞の増殖の増大後に、且つ鳥類が卵白構成物質を生成し始める前に、投与される。
【０１４０】
好ましい実施形態では、動物は卵を産む動物、さらに好ましくは鳥類である。一実施形態では、約１〜１５０μｇの間で、１〜１００μｇ、１〜５０μｇ、好ましくは１〜２０μｇ、さらに好ましくは５〜１０μｇのトランスポゾンベクターＤＮＡが、鳥の卵管に投与される。最適範囲は、鳥の種類及び鳥の性的成熟段階に依存している。ニワトリでは、約１〜１００μｇ、又は５〜５０μｇが投与される、というのが好ましい。ウズラでは、約５〜１０μｇが投与されるのが好ましい。本発明のトランスポゾンベクターの卵管内投
与は、卵管組織中のＰＣＲ陽性シグナルにより立証されるように、卵管の細胞中への目的遺伝子の組み込みを生じる。他の実施形態では、トランスポゾンベクターは卵管につながる動脈に投与される。これらの投与方法は、トランスフェクションを助長するための任意の方法、例えば電気穿孔、遺伝子銃、裸のＤＮＡの注入、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用（これらに限定されない）と組み合わせても良い。
【０１４１】
本発明に従って、トランスポゾンベクターは許容可能な担体及び／又はトランスフェクション試薬とともに投与される。許容可能な担体としては、水、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）及びリオトロピック液晶が挙げられるが、これらに限定されない。用いられ得る、一般的な当業者に既知のトランスフェクション試薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：陽イオン性脂質トランスフェクション試薬、陽イオン性脂質混合物、ポリアミン試薬、リポソーム及びそれらの組合せ；SUPERFECT（登録商標）、Cytofectene、BioPORTER（登録商標）、NeuroPORTER（登録商標）及びパーフェクチン（Gene Therapy Systems）；リポフェクタミン、セルフェクチン、DMRIE-Cオリゴフェクタミン、TROJENE（登録商標）及びPLUS試薬（InVitrogen）；Xtreme遺伝子、フゲン、DOSPER及びDOTAP（Rohe）；Lipotaxi及びGenejammer（Strategene）；並びにEscort（SIGMA）。一実施形態では、トランスフェクション試薬はSUPERFECT（登録商標）である。ＤＮＡ対トランスフェクション試薬の割合は、投与方法に基づいて変わり得る。一実施形態では、トランスポゾンベクターは卵管に投与され、そしてＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比は１：１．５〜１：１５、好ましくは１：２〜１：５（全て、重量／容積として表す）であり得る。トランスフェクションは、一般的な当業者に既知のその他の手段、例えば電気穿孔、遺伝子銃、裸のDNAの注入、並びにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いても達成できるが、これらに限定されない。
【０１４２】
トランスフェクションの標的にする細胞又は組織型によって、トランスポゾンベクターの形態が重要な場合がある。細菌から得られるプラスミドは一般に閉環状スーパーコイル分子であり、そしてこれは、調製が容易であるため、遺伝子送達のためのベクターの好ましい状態である。いくつかの場合には、トランスポザーゼの発現及び挿入は、弛緩型閉環状立体形状において、又は線状立体構造においてより効率的であり得る。さらにその他の場合には、精製トランスポザーゼタンパク質は、より即時的な挿入のために目的遺伝子を含有するトランスポゾンベクターと同時注入しても良い。これは、精製トランスポザーゼタンパク質及びトランスポゾンベクターの両方と複合体化されたトランスフェクション試薬を用いることにより達成できるかもしれない。
【０１４３】
トランス遺伝子を保有する動物に関する試験及び繁殖
動物へのトランスポゾンベクターの投与後、動物からＤＮＡを抽出して、目的遺伝子の組込みを確認する。本発明により提供される利点としては、卵管内又は卵巣内経路により鳥に投与された場合（例えば卵管又は卵巣に通じる動脈への動脈内投与）の、目的遺伝子の高率の組込み又は組入れ及び転写が挙げられる。下記の実施例６は、硫酸アンモニウム沈殿及びイオン交換クロマトグラフィー後のトランスジェニック雌鳥からのプロインスリン／ＥＮＴ  ＴＡＧタンパク質の単離を記載する。図５は、雌鳥へのトランスポゾンベクターの成功裏の投与、目的遺伝子の成功裏の組込み、目的遺伝子によりコードされるタンパク質の成功裏の生産、及びトランスジェニック雌鳥により生産される卵白中のタンパク質の成功裏の蓄積を実証する。
【０１４４】
実際の組込みの頻度は、ＰＣＲシグナルの強度比較により、及び定量的ＰＣＲによる組織の組織学的評価により概算できる。トランス遺伝子の挿入率を概算するための別の方法は、いわゆるｐｒｉｍｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＰＲＩＮＳ）である。この方法は、どの細胞が目的トランス遺伝子を保有するかだけでなく、遺伝子が挿入された染色体はどれか、そして染色体のどの部分かも確定する。要するに、標識化プラ
イマーが１回のＰＣＲにより染色体展開物（スライドガラスに固着）とアニーリングし、次に該スライドは標準ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により現像される。この技法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の最良の特徴を組合せて、問題としている遺伝子の、染色体上の明確な位置及びコピー数を提供する。
【０１４５】
トランス遺伝子の生殖系列伝達が起きたか否かを確定するために、繁殖実験も実行される。本発明に従って実施される一般鳥類繁殖実験では、各雄鳥を、２〜３羽の異なる雌成鳥と各々３〜４日間接触させた。この手法は、合計６〜１２週間の間、異なる雌を用いて継続された。トランスジェニック雄への最終接触後１４日までの間、卵は毎日収集され、各卵は標準的なインキュベーター中で孵化させる。その結果生じる胚は、ＰＣＲを用いて３日目又は４日目にトランス遺伝子の存在について検査される。上記の手法は鳥以外の動物に合わせて変更できるし、さらに遺伝子コピー数及びタンパク質産出量を増幅するための選抜育種が実施できる、と理解されるべきである。
【０１４６】
卵白中の所望のタンパク質又はペプチドの生産
一実施形態では、本発明のトランスポゾンベクターは、卵白中の所望のタンパク質又はペプチドの生産を目的として、鳥に投与され得る。これらのトランスポゾンベクターは、好ましくは１又は複数のオボアルブミンプロモータ、オボムコイドプロモータ、オボアルブミンシグナル配列及びオボムコイドシグナル配列を含有する。卵管特異的オボアルブミンプロモータは、B. O'Malley et al., 1987. EMBO J., vol. 6, pp. 2305-12 ; A. Qiu et al., 1994. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), vol. 91, pp. 4451-4455; D. Monroe et al., 2000. Biochim. Biophys. Acta, 1517 (1): 27-32; H. Park et al., 2000. Biochem., 39: 8537-8545; 及びT. Muramatsu et al., 1996. Poult. Avian Biol. Rev., 6: 107-123に記載されている。卵白中の所望のタンパク質の生産のために設計されたトランスポゾンベクターの例は、図２及び３に示される。
【０１４７】
卵黄中での所望のタンパク質又はペプチドの生産
本発明は、卵黄中での低溶解性の組み換えペプチド及びタンパク質の生産に特に好都合である。かかるタンパク質としては、膜会合又は膜結合タンパク質、親油性化合物；付着因子、受容体及び二次メッセンジャー形質導入機構の構成成分が挙げられるが、これらに限定されない。低溶解性ペプチド及びタンパク質は、水ベースの親水性環境中で凝集するため、慣用的組み換えタンパク質生産技法（細胞及び組織培養）を用いて生産するのは非常に困難である。このような凝集により、組み換えにより生産されたタンパク質の変性及び再フォールディングを必要となるが、これはそれらの構造及び機能に有害に作用するかもしれない。さらに高度に可溶性の組み換えペプチド及びタンパク質であったとしても、組み換えタンパク質生産系中で十分に大量に生産される場合には、沈殿し、変性及び復元を要することがある。本発明は、大量の組み換えタンパク質の生産中のタンパク質及びペプチド溶解性の問題の好都合な解決法を提供する。
【０１４８】
生殖系列トランスフェクションがトランスポゾンベクターの卵巣内投与により得られる本発明の一実施形態では、卵黄中への所望のタンパク質の蓄積は、所望のタンパク質をコードする目的遺伝子に、卵黄ビテロゲニン受容体と結合し得るタンパク質をコードする配列を結合することにより、子孫において成し遂げられる。このトランスポゾンベクターは、卵母細胞による所望のタンパク質の受容体媒介性取り込みのために用いられ得る。好ましい実施形態では、ビテロゲニン受容体との結合を保証する配列は、ビテロゲニンタンパク質のターゲッティング配列である。本発明は、種々のビテロゲニンタンパク質及びそれらのターゲッティング配列を包含する。好ましい実施形態では、ニワトリビテロゲニンタンパク質ターゲッティング配列が用いられるが、しかしながらビテロゲニンタンパク質配列間の高度の保存、並びにそれらの卵黄受容体とのビテロゲニンターゲッティング配列の
既知の種間反応性のため、他のビテロゲニンターゲッティング配列と置換することが可能である。本発明のトランスポゾンベクター中に用いるための、そして卵黄中のインスリンタンパク質の蓄積のための構築物の一例は、ビテロゲニンプロモータ、ビテロゲニンターゲッティング配列、ＴＡＧ配列、プロインスリン配列及び合成ポリＡ配列を含有するトランスポゾン系ベクターである。本発明は、ビテロゲニンのＮ末端ドメイン中に、特にリポビテリンＩ中に存在するビテロゲニンターゲッティング配列を包含するが、これに限定されない。一実施形態では、ビテロゲニンターゲッティング配列は、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含有する。好ましい実施形態では、トランスポゾンベクターは、構成的プロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子、及び肝臓特異的プロモータと操作可能に連結された目的遺伝子、並びにビテロゲニンターゲッティング配列を含有する。
【０１４９】
所望のタンパク質又はペプチドの単離及び精製
タンパク質の大規模生産のためには、トランス遺伝子に関してホモ接合性である動物繁殖ストックが望ましい。このようなホモ接合性個体は、例えば標準的な動物繁殖法により生成され、ＰＣＲプロトコールにより同定される。
【０１５０】
一旦発現すると、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、当業者に既知の標準的な手法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、免疫沈降法等に従って精製され得る。約５０〜９９％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、８０〜９５％又はそれ以上の均質性が治療薬として用いるために最も好ましい。
【０１５１】
本発明の一実施形態では、所望のタンパク質が生産される動物は、卵を産む動物である。本発明の好ましい実施形態では、動物は鳥類であり、そして所望のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は卵白から単離される。外生のタンパク質又はペプチドを含有する卵白は、卵工業で既知の種々の方法のいずれかにより工業規模で、卵黄及びその他の卵構成要素から分離される（例えばW. Stadelman et al. (Eds.), Egg Science & Technology, Haworth Press, Binghamton, NY参照）。その他の卵白構成要素からの外生ペプチド又はタンパク質の単離は、当業者に既知の多数のポリペプチド単離及び精製方法のいずれかにより成し遂げられる。これらの技法としては、例えばクロマトグラフィー法、例えば、単独又は組合せでの、ゲル浸透、イオン交換、アフィニティー分離、金属キレート化、ＨＰＬＣ等が挙げられる。クロマトグラフィー分離法の代わりに又はそれに加えて、単離又は精製のために用いられ得る別の手段としては、電気泳動が挙げられる。単離及び精製の成功は、標準的な分析技法により、例えばＨＰＬＣ、質量分光分析及び分光測光法により確認できる。分離の第一段階が卵白の内生オボアルブミン画分の除去である場合、さらに精製されるべき総タンパク質含量が約５０％低減するので、しばしばこれらの分離方法が容易になる。
【０１５２】
所望のタンパク質又はペプチドの精製を促進するか又は可能にするために、トランスポゾンベクターは１又は複数の付加的エピトープ又はドメインを含んでもよい。このようなエピトープ又はドメインとしては、酵素的又は化学的解裂部位、例えばエンテロキナーゼ解裂部位をコードするＤＮＡ配列；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼからのグルタチオン結合ドメイン；ポリリジン；ヘキサ−ヒスチジン又はその他の陽イオン性アミノ酸；チオレドキシン；ヘマグルチニン抗原；マルトース結合タンパク質；ＨＩＶからのｇｐ４１のフラグメント；並びに当業者に一般に既知のその他の精製エピトープ又はドメインが挙げられる。
【０１５３】
代表的な一実施形態では、卵白からの所望のタンパク質の精製は、オボアルブミンキャリアタンパク質の抗原性、並びにオボアルブミンから所望のタンパク質にまで及ぶＴＡＧ
リンカー配列の特徴的な性質を利用する。ＴＡＧ配列は、１）高抗原性エピトープ、ＨＩＶからのｇｐ４１フラグメント（厳密なアフィニティー精製を可能にする）、並びに２）所望のタンパク質に直接並置されるエンテロキナーゼに関する認識部位、を含有するため、この方法において特に有用である。好ましい実施形態では、ＴＡＧ配列は約５０アミノ酸を含む。代表的なＴＡＧ配列を以下に提示する。
【０１５４】
【表１】
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【０１５５】
下線を付した配列は、ＨＩＶ  ｇｐ−４１のヘアピンループドメインから得られた（配列番号３３）。イタリック体の配列は、エンテロキナーゼによる切断部位を表す（配列番号３４）。ループドメインの上流のスペーサー配列は、（ＰｒｏＡｌａＡｓｐＡｓｐＡｌａ）（配列番号３１）の反復からなり、自由に回転し、オボアルブミン担体タンパク質由来のヘアピンループの表面利用性を促進する。
【０１５６】
所望のタンパク質の単離及び精製は、以下のように実施される：
１．  オボアルブミン、及びトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質、を含有する卵白タンパク質の濃縮。
２．  分子量の狭い範囲内のタンパク質のみを単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（過程１のさらなる濃縮）。
３．  オボアルブミンアフィニティークロマトグラフィー。オボアルブミンに対する高度に特異的な抗体は、オボアルブミン及びトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望タンパク質以外の全ての外生の卵白タンパク質を事実上排除する。
４．  抗ｇｐ４１抗体を用いるｇｐ４１アフィニティークロマトグラフィー。この過程の厳密な適用により、事実上純粋なトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望のタンパク質が生じる。
５．  トランス遺伝子産物の切断は２つの方法のうちの少なくとも１つで成し遂げられ得る：
ａ．トランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望タンパク質は過程４からのｇｐ４１アフィニティー樹脂（ビーズ）に付着したままであり、そこにプロテアーゼであるエンテロキナーゼが添加される。これはgp４１アフィニティー樹脂から目的のトランス遺伝子タンパク質を遊離するが、一方、オボアルブミン−ＴＡＧ配列は保持される。遠心分離（バッチ法）又はフロースルー（カラム精製）による分離は、所望のタンパク質をエンテロキナーゼと一緒に溶液中に残す。エンテロキナーゼは回収され、再使用される。
ｂ．あるいは、エンテロキナーゼは、プロテアーゼの非触媒領域へのポリリジン部分の付加により、樹脂（ビーズ）上に固定される。過程４のアフィニティーカラムから溶離されたトランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−所望タンパク質は次に、プロテアーゼ樹脂に適用される。プロテアーゼ作用は所望タンパク質からオボアルブミン−ＴＡＧ配列を切り出して、両構成要素を溶液中に残す。固定化エンテロキナーゼ樹脂は再装填され、再使用される。
ｃ．これらの選択肢は、トランス遺伝子標的タンパク質のサイズ及び化学組成に応じて選択される。
６．  これら２つの（５ａ又は５ｂ）タンパク質混合物の最終分離は、サイズ排除、又はエンテロキナーゼアフィニティークロマトグラフィーを用いてなされる。この過程は
、必要に応じて、脱塩、緩衝液交換及び／又は精製（polishing）を可能にする。
【０１５７】
エンテロキナーゼによるトランス遺伝子産物（オボアルブミン−ＴＡＧ−所望タンパク質）の切断は次に、２つの生成物：オボアルブミン−ＴＡＧ及び所望タンパク質、を生じる。ＴＡＧ標識を用いた単離のためのさらなる特定の方法は、実施例に提示される。いくつかの所望のタンパク質においては、当業者に既知の上記のようなアプローチの付加又は改変が必要になるかもしれない。これらの方法は、実験室作業台から試験的及び生産設備まで規模を拡大できる。適用される技術がこれら各々の設定において十分に説明されるためである。
【０１５８】
別の代表的な実施形態では、目的タンパク質を含有する卵白をプールし、当業者に既知の方法により、卵黄及びその他の卵構成要素から、任意の順序で分離した。種々のこのような方法は、当該技術分野で既知のマニュアルに、例えばEgg Science & Technology, W.
Stadelman, et al. (Eds.), Haworth Press, Binghamton, NY (1995)に記載されている。
【０１５９】
卵白から所望のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を単離する方法の非限定的一例を以下に示す。この方法は、本発明のトランスジェニック動物の卵から任意の所望のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を単離するために用いられ得る、と理解されるべきである。この本発明の例は、特定ＴＡＧ配列、又は別の親和性／解裂配列を介して目的タンパク質に結合される、担体としての、全オボアルブミンタンパク質の一部又は全オボアルブミン又は特定オボアルブミンエピトープを用いたトランス遺伝子を包含した。ＴＡＧ配列は、ＨＩＶ  Ｉからのヘアピンループエピトープと、その後に続くエンテロキナーゼ解裂部位を含有する。
【０１６０】
最初に、卵白を３１４０  ｃｐｓの低剪断力に付して粘度を低下させた（Tung et al.,
1969）。生じた注入可能溶液を次に濾過して、カラザ（chalazae）を除去した。次に硫酸アンモニウム沈殿を用いて、トランスジェニックタンパク質の画分を濃縮した（例えばPractical Protein Chemistry A Handbook A. Darbre (Ed.), John Wiley & Sons Ltd., 1986参照）。当該技術分野で既知の粗分画の方法も、必要な場合には用いられる。次にこの分離の上清を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分画し、トランスジェニック融合タンパク質画分を濃縮して、材料から硫酸アンモニウムを除去した。当業者に既知の方法を用いて、抗オボアルブミンアフィニティークロマトグラフィー（バッチ又はカラム）により、融合タンパク質を単離した。この過程は、オボアルブミントランス遺伝子融合タンパク質のほかに、天然型オボアルブミンを捕捉し得る。抗オボアルブミンアフィニティー樹脂からの溶離後、当業者に既知の方法により、抗ｇｐ４１アフィニティークロマトグラフィー（バッチ又はカラム）を用いてトランスジェニックタンパク質を特異的に単離した。
【０１６１】
担体及びＴＡＧ配列からのトランス遺伝子産物の切断を、少なくとも２つの方法のうちの１つで達成した：
１）トランスジェニックオボアルブミン−ＴＡＧ−トランス遺伝子標的タンパク質はｇｐ４１アフィニティー樹脂に付着したままであり、そこにプロテアーゼエンテロキナーゼを添加した。エンテロキナーゼによるトランス遺伝子の切断はgp４１アフィニティー樹脂からトランス遺伝子標的タンパク質を遊離したが、一方、オボアルブミン−ＴＡＧ配列は保持されたままであった。遠心分離（バッチ法）又はフロースルー（カラム精製）による分離は、トランス遺伝子標的タンパク質をエンテロキナーゼと一緒に溶液中に保持した。エンテロキナーゼを回収し、再使用した。
２）あるいは、エンテロキナーゼを、プロテアーゼの非触媒領域へのポリリジン部分の付加により、樹脂（ビーズ）上に固定した。トランスジェニックオボアルブミン−ＴＡ
Ｇ−トランス遺伝子標的タンパク質をｇｐ４１アフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶離し、次に、プロテアーゼ樹脂に適用した。プロテアーゼ作用はトランス遺伝子標的タンパク質からオボアルブミン−ＴＡＧ配列を切り出して、両構成要素を溶液中に残した。固定化エンテロキナーゼ樹脂を再装填し、再使用した。これらの選択肢は、トランス遺伝子標的タンパク質のサイズ及び化学組成に応じて、個々別々に選択される。
【０１６２】
これら２つの（過程１又は２）タンパク質混合物の最終分離を、サイズ排除クロマトグラフィー又はエンテロキナーゼアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施した。この過程は、必要に応じて、脱塩、濃縮、緩衝液交換及び／又は精製（polishing）も可能にする。
【０１６３】
本発明のトランスジェニック動物により生産される典型的な鶏卵は、少なくとも０．００１ｍｇ、約０．００１〜１．０ｍｇ、又は約０．００１〜１００．０ｍｇの外生タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを、卵白の正常構成要素のほかに（又はおそらくは正常構成要素の一部分と置き換わって）含有する、と考えられる。いくつかの実施形態では、鶏卵は５０〜７５ｍｇの外生タンパク質を含有する。
【０１６４】
生物学的発現後又は精製後、所望のタンパク質、その断片及びペプチドは、タンパク質、その断片及びペプチドの天然の立体配座とは実質的に異なる立体配座を保有し得る、と当業者は認識する。この場合、タンパク質を変性し、還元し、そして次にタンパク質を好ましい立体配座に再フォールディングさせることがしばしば必要である。タンパク質の還元、変性、そして再フォールディングを誘導する方法は、当業者には既知である。
【０１６５】
乳中でのタンパク質又はペプチドの生産
トランスジェニックタンパク質又はペプチドを含有する卵の生産方法のほかに、本発明は、トランスジェニックタンパク質又はペプチドを含有する乳の生産方法を包含する。これらの方法は、管系を介した哺乳類への上記のトランスポゾンベクターの投与を包含する。一実施形態では、トランスポゾンベクターは、構成的プロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ、並びに乳腺特異的プロモータと操作可能に連結された目的遺伝子を含有する。目的遺伝子としては、抗ウイルス及び抗細菌タンパク質及び免疫グロブリンが挙げられ得るが、これらに限定されない。その他の実施形態では、トランスポゾンベクターは動物の卵巣に投与され、そして生殖系列形質転換が達成される。これらの実施形態では、トランスフェクト動物の子孫は、乳腺特異的プロモータの制御下、乳腺中で目的遺伝子を発現する。
【０１６６】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために役立つが、しかしながら同時に、いかなる点でも本発明を限定するものでない。それどころか、本発明の精神を逸脱しない限り、種々の実施形態、修正及び等価物に対する方策をとり得ることは、本明細書中の記述を読めば当業者には明らかになる、と理解されるべきである。
【実施例１】
【０１６７】
トランスポゾンベクターの卵管内投与
本発明のトランスポゾンベクターの投与のために、ウズラ又はニワトリを選択した。外科的手術を実施する領域から羽毛を除去し、その領域を清浄にして、エタノール（アルコール）及び０．５％クロルヘキシジンですすぐことにより滅菌した。メスを用いて、約２ｃｍの長さで卵巣全体の皮膚に背外側切開を施した。先の丸い鋏を用いて、最後の２本の肋骨の間の筋肉に二次切開を施して、下にある卵管を曝露した。小動物開創器を用いて、いちばん後ろの２本の肋骨を広げて、下にある卵管を曝露した。開創器を用いて卵管をさらに曝露して、小腸を片側に引っ張った。
【０１６８】
トランスポゾンベクターとSUPERFECT（登録商標）とを含有する送達溶液を、手術直前に新たに調製した。各実験に用いたベクター及びSUPERFECT（登録商標）の具体的な割合を以下の実施例に示す。送達溶液を室温に温めた後、鳥に注射した。約２５０〜５００μｌの送達溶液を、２７ゲージ針を取り付けた１ｃｃ注射器を用いて卵管の筒部の管腔に注射した。創傷を閉鎖し、抗生物質クリームをたっぷりと創傷周囲の領域に塗布した。
【実施例２】
【０１６９】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭｏｄの調製
真核生物細胞のゲノム中に所望のコード配列を挿入するためにベクターを設計し、配列番号３として以下に示した。ｐＴｎＭｏｄと名付けた配列番号３のベクターを構築し、その配列を確認した。
【０１７０】
このベクターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを用いた。改変されたコザック配列（ＡＣＣＡＴＧ）（配列番号１）をプロモータに付加した。トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド三つ組コドン中のゆらぎ位置のヌクレオチドをアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）に変えたが、このことは、このコドンによりコードされるアミノ酸を変えない。２つの終止コドンを付加し、合成ポリＡを用いて、強力な終結配列を提供した。このベクターは、安定な組込みの可能性を増大するため（何らの誘導も伴わずに）細胞への進入直後から活性化するよう設計されたプロモータを用いる。付加的な終止コドン及び合成ポリＡは、下流の潜在的遺伝子まで通して読取ることなく、適正な終結を保証する。
【０１７１】
このベクターの構築の第一段階は、所望の変化を有するようトランスポザーゼを改変することであった。トランスポザーゼに対する改変は、高効率フォワードプライマー（Ｈｅｆ）改変トランスポザーゼ（ＡＴＳ）−Ｈｅｆ
５’  ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣ  ３’（配列番号３６）
及び改変トランスポザーゼ−高効率リバースプライマー（Ｈｅｒ）
５’  ＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴＡＡＣＣ  ３’（配列番号３７、相補的リバースプライマー）
の両プライマーを用いて達成した。５’フォワードプライマーＡＴＳ−Ｈｅｆでは、配列ＣＴＣＧＡＧ（配列番号３８）は、制限酵素ＸｈｏＩの認識部位であり、これは増幅遺伝子の方向性クローニングを可能にする。配列ＡＣＣＡＴＧ（配列番号１）は、コザック配列及びトランスポザーゼに対する開始コドンを含有し、そして下線を付した塩基は最初の１０個のアミノ酸に関するコドンのＡ又はＴへのゆらぎ位置における変化を表す（コドンによりコードされるアミノ酸の変化を伴わない）。プライマーＡＴＳ−Ｈｅｒ（配列番号３７）は、天然型終止コドンＴＧＡのほかに付加的終止コドンＴＡＡを含有し、そしてＢｃｌＩ制限部位ＴＧＡＴＣＡ（配列番号３９）を付加して、方向性クローニングを可能にする。これらのプライマーを、トランスポザーゼ及びＦａｉｌＳａｆｅ（登録商標）ＰＣＲ系（酵素、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2及びＰＣＲエンハンサーを含む；Epicentre Technologies, Madison, WI）のための鋳型として、ｐＴｎＬａｃ（ｐはプラスミドを意味し、ｔｎはトランスポゾンを意味し、そしてｌａｃはラクトース遺伝子のβフラグメントを意味する。これはマルチクローニングサイトを含有する）を用いるＰＣＲ反応に用いた。増幅ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して、紫外線トランスイルミネーターで可視化した。予測サイズに対応する帯域をゲルから切り出して、ザイモ・クリーンゲル回収キット（Zymo Clean Gel Recovery Kit）（Zymo Research, Orange, CA）を用いてアガロースから精製した。メーカーのプロトコールに従って、精製ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（５’）及びＢｃｌＩ（３’）（New England Biolabs, Beverly, MA）で消化した。ザイモＤＮＡクリーン及びコンセントレイターキット（Zymo Research）を用いて、消化ＤＮＡから制限酵素を除去して精製した。
【０１７２】
プラスミドｇＷｈｉｚ（Gene Therapy Systems, San Diego, CA）を、ＳａｌＩとＢａｍＨＩ（New England Biolabs）で消化した。これらは、ＸｈｏＩおよびＢｃｌＩと互換性を有するが制限部位は破壊される。消化されたｇＷｈｉｚをアガロースゲル上で分離し、所望の帯域を切り出して、上記と同様に精製した。このようにベクターを切断することにより、ＣＭＶプロモータと合成ポリＡの間に、改変トランスポザーゼ（ｍＡＴＳ）を容易に方向性クローニングすることができた。
【０１７３】
ｇＷｈｉｚ中のＣＭＶプロモータと合成ポリＡとの間にｍＡＴＳを挿入するため、StratageneＴ４リガーゼキット（Stratagene, Inc. La Jolla, CA）を用い、メーカーのプロトコールに従って、連結を行った。Invitrogenのプロトコールに従って化学的形質転換を用いて、連結生成物を大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）中に形質転換した。形質転換細菌を１ｍｌのＳＯＣ（Gibco BRL、カタログ番号＃１５５４４−０４２）培地中で３７℃で１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ（ルリア・ベルタニ培地（ブロス又は寒天））プレート（ＬＢ／ａｍｐプレート）に塗布した。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートし、その結果生じたコロニーをＬＢ／ａｍｐブロスにて３７℃で一晩増殖させた。アルカリ性溶解プロトコール（Sambrook et al., 1989）の変法を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、１％アガロースゲル上で電気泳動処理して、臭化エチジウムで染色後に、ＵＶトランスイルミネーターで可視化した。予測サイズ（約６．４ｋｂｐ）のプラスミドを生産するコロニーを少なくとも２５０ｍｌのＬＢ／ａｍｐブロス中で培養して、メーカーのプロトコール（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）に従って、Qiagenマキシ−プレップキット（カラム精製）を用いて、プラスミドＤＮＡを収穫した。カラム精製ＤＮＡをシーケンシングのための鋳型として用いて、トランスポザーゼ中に作製された変化が所望の変化であり、またＰＣＲ増幅に起因するさらなる変化又は突然変異は起きなかった、ということを確認した。シーケンシングのために、Perkin-Elmerのビッグダイシーケンシングキット（Big Dye Sequencing Kit）を用いた。パーキン・エルマー３７７型自動シーケンサーでのシーケンシングのために、全ての試料を、Gene Probes and Expression Laboratory（LEU School of Veterinary Medicine）に送った。
【０１７４】
クローンが正しい配向で所望のｍＡＴＳを含有することが確認されたら、
プライマーＣＭＶｆ−ＮｇｏＭ  ＩＶ（５’ＴＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴ（配列番号４０）；下線を付した塩基はＮｇｏＭ  ＩＶ認識部位を意味する）
及び
Ｓｙｎ−ポリＡ−ＢｓｔＥ  ＩＩ（５’ＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡ（配列番号４１）；下線を付した塩基はＢｓｔＥ  ＩＩ認識部位を意味する）
を用いて、ｐＴｎＬａｃ中のトランスポゾンの上流にクローニングするため、全ＣＭＶプロモータ、ｍＡＴＳ及び合成ポリＡをＰＣＲ増幅した。上記と同様にＦａｉｌＳａｆｅ（登録商標）を用いてＰＣＲを実行し、ザイモ・クリーン及びコンセントレイターキットを用いて精製し、末端をＮｇｏＭ  ＩＶ及びＢｓｔＥ  ＩＩ（New England Biolabs）で消化して、ザイモキットで再び精製し、以下のようにｐＴｎＬａｃ中のトランスポゾンの上流にクローニングした。
【０１７５】
プラスミドｐＴｎＬａｃをＮｇｏＭ  ＩＶ及びＢｓｔＥ  ＩＩで消化して、ｐｔａｃプロモータを除去して、トランスポザーゼ及びフラグメントをアガロースゲル上で分離した。ベクター及びトランスポゾンに対応する帯域を切り出して、アガロースから精製し、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs）で脱リン酸化して、自己アニーリングを防止した。ザイモＤＮＡクリーン及びコンセントレイター−５を用いて、ベクターから酵素を除去した。精製ベクター及びＣＭＶｐ／ｍＡＴＳ／ポリＡを、StratageneＴ
４リガーゼキットを用いて一緒に連結し、上記と同様に大腸菌中に形質転換した。
【０１７６】
この形質転換に起因するコロニーを上記と同様にスクリーニングし（ミニ−プレップ）、正しいサイズのクローンを、上記と同様にＤＮＡ配列分析により確認した。ベクターはｐＴｎＭｏｄ（配列番号３）と名付け、以下の構成成分を含む：
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）からのＦ１（−）ｏｒｉの残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に対応する；
塩基対１３１〜１３２は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結に由来する残基である；
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に対応する。ＣＭＶプロモータは、ＡＴＧの上流にＡＣＣ配列を付加することにより改変された；
塩基対１７７８〜１７７９は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結に由来する残基である；
塩基対１７８０〜２９８７は、トランスポザーゼｍＲＮＡの安定性およびタンパク質の発現を目的としたコドン最適化によってＴｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変された、トランスポザーゼをコードする配列である。特に、トランスポザーゼの先頭の１０個のアミノ酸に対するコドンの各々において、Ｇ又はＣをＡ又はＴに変更したが、ただし、このような置換によりコードされるアミノ酸が変わらない場合に限った；
塩基対２９８８〜２９９３は、２つの人工的な終止コドンである；
塩基対２９９４は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結に由来する残基である；
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚベクター（Gene Therapy Systems）から得られた合成ポリＡ配列であり、１０ｐＧＷｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に対応する；
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９の残余である非コードＤＮＡである；
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードλＤＮＡである；
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の左挿入配列である；
塩基対３８３２〜３８３７は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結に由来する残基である；
塩基対３８３８〜４５２７は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（２０）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対９２４〜２３５に対応する。このマルチクローニングサイトを用いて、任意の目的コード配列をベクター中に挿入しても良い；
塩基対４５２８〜４５３２は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結に由来する残基である；
塩基対４５３３〜４６０２は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の右挿入配列である；
塩基対４６０３〜４６４４は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードλＤＮＡである；
塩基対４６４５〜５４８８は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードＤＮＡである；
塩基対５４８９〜７６８９は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）をベースとしたベクター（Stratagene, Inc.）に由来し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に対応する。
【０１７７】
完成したｐＴｎＭｏｄは、複製のｃｏｌＥ Ｉ複製起点及び抗生物質耐性マーカー（ア
ンピシリン）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖である。
【０１７８】
上記の全ての非コードＤＮＡ配列は、任意のその他の非コードＤＮＡ配列（単数又は複数）で置き換えられ得る、ということに留意すべきである。上記構築物中から欠落しているヌクレオチド配列は、制限部位の残余を表す。
【０１７９】
標準的な手法により、全てのプラスミドＤＮＡを単離した。簡単に述べると、プラスミドを含有する大腸菌を、５００ｍＬのＬＢブロス（適切な抗生物質を補足）中で、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。メーカーのプロトコールに従って、Qiagenマキシ−プレプキット（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）を用いて、細菌からプラスミドＤＮＡを回収した。プラスミドＤＮＡを５００μＬのＰＣＲ等級水中に再懸濁して、使用されるまで−２０℃で保存した。
【実施例３】
【０１８０】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭＣＳ
真核生物細胞のゲノム中に所望のコード配列を挿入するために、別のトランスポゾンベクターを設計した。このベクターをｐＴｎＭＣＳと命名し、その構成要素を以下に提示する。ｐＴｎＭＣＳベクターの配列は、配列番号２で提示される。ｐＴｎＭＣＳベクターは、トランスポザーゼ遺伝子と操作可能に連結された鳥類最適化ポリＡ配列を含有する。鳥類最適化ポリＡ配列は、Ａヌクレオチド鎖に先行する約４０ヌクレオチドを含有する。
塩基対１〜１３０：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）の塩基対１〜１３０のＦ１（−）ｏｒｉの残部。
塩基対１３３〜１７７７：ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）の塩基対２２９〜１８７３から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対１７８３〜２９９１：Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）の塩基対１０８〜１３１６からのトランスポザーゼ。
塩基対２９９２〜３３４４：ベクターｐＮＫ２８５９からの非コードＤＮＡ。
塩基対３３４５〜３３８７：ｐＮＫ２８５９からのλＤＮＡ。
塩基対３３８８〜３４５７：Ｔｎ１０からの７０塩基対の左側ＩＳ１０。
塩基対３４６４〜３６７０：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイト、ＸｍａＩ部位まで、塩基対９２４〜７１８。
塩基対３６７１〜３７１５：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイト、ＸｍａＩ部位からＸｈｏＩ部位まで。これらの塩基対は、ｐＴｎＭＣＳにクローニングする場合、通常は失われる。塩基対７１７〜６７３。
塩基対３７１６〜４１５３：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイト、ＸｈｏＩ部位から、塩基対６７２〜２３５。
塩基対４１５９〜４２２８：Ｔｎ１０からの７０塩基対の右側ＩＳ１０。
塩基対４２２９〜４２７０：ｐＮＫ２８５９からのλＤＮＡ。
塩基対４２７１〜５１１４：ｐＮＫ２８５９からの非コードＤＮＡ。
塩基対５１１５〜７３１５：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）をベースとしたベクター（Stratagene, Inc.）の、塩基対７６１〜２９６１。
【実施例４】
【０１８１】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ  ＴＡＧ／ＰｒｏＩｎｓ／ＰＡ）−ニワトリ  の調製
鳥のゲノム中にニワトリオボアルブミンプロモータ制御下のヒトプロインスリンコード配列、並びにオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するための、配列番号４２として以下に示されるベクターを設計した。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）のＦ１（−）ｏｒｉの残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対１〜１
３０に対応する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に対応する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変されたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、２つの人工終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリＡ配列であり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に対応する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９の残余である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９の残余であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の左挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に対応する。
塩基対４０５０〜４９５１は、ニワトリオボアルブミンプロモータ（ＳＤＲＥを含む）であって、GenBank寄託番号Ｊ００８９５Ｍ２４９９９でニワトリオボアルブミンプロモータの塩基対４３１〜１３３２に対応する。
塩基対４９５８〜６１１５は、ニワトリオボアルブミンシグナル配列及びオボアルブミン遺伝子であって、GenBank寄託番号Ｖ００３８３．１の塩基対６６〜１２２３に対応する（終止コドンは省かれている）。
塩基対６１２２〜６２７１は、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位及びスペーサー（合成品）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２７２〜６５３１は、プロインスリン遺伝子である。
塩基対６５３９〜６８９１は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリアデニル化配列であり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に対応する。
塩基対６８９７〜７３２９は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に対応する。
塩基対７３３５〜７４０４は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の右挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対７４０５〜７４４６は、ｐＮＫ２８５９の残余であるλＤＮＡである。
塩基対７４４７〜８３１１は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードＤＮＡである。
塩基対８３１２〜１０５１２は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｓｋ（−）をベースとしたベクター（Stratagene, Inc.）であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に対応する。
【０１８２】
上記の全ての非コードＤＮＡ配列は、任意のその他の非コードＤＮＡ配列（単数又は複数）で置き換えられ得る、ということに留意すべきである。上記構築物中から欠落しているヌクレオチド配列は、制限部位の残余を表している。
【実施例５】
【０１８３】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−ＣＨＯＶｇ−ｅｎｔ−プロインスリン−ｓｙｎＰＡ）
鳥のゲノム中に、ウズラオボアルブミンプロモータ制御下のプロインスリンコード配列、並びにオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入することを目的とした、配列番号４３として以下に示されるベクターを設計した。
塩基対１〜４０４５：ベクターｐＴｎＭｏｄの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜５６９５：ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）の塩基対２３０〜１８６４から得られるＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対５７０２〜６８５５：GenBank寄託番号Ｖ００３８３の塩基対６６〜１２１９から得られたニワトリオボアルブミン遺伝子。
塩基対６８６２〜７０１１：合成スペーサー配列及び付加エンテロキナーゼ切断部位を有するＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対７０１２〜７２７２：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対７２７３〜７３１７：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対７３１８〜７６７０：クローニングベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対７６７２〜１１２７１：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【実施例６】
【０１８４】
プロインスリン遺伝子を含有するトランスポゾンベクターの卵管注射によるニホンウズラのトランスフェクション
Ｏｖａ１プロモータ／Ｏｖａ１遺伝子／ＧＰ４１  エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡ（配列番号４２）又はＣＭＶプロモータ／Ｏｖａ１遺伝子／ＧＰ４１  エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡ（配列番号４３）を含有するトランスポゾンベクターを用いて、ニホンウズラで２つの実験を実行した。
【０１８５】
第一の実験では、Ｏｖａ１プロモータ／Ｏｖａ１遺伝子／ＧＰ４１  エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡ含有構築物を、性的に成熟したウズラの卵管の管腔中に注入した；３羽の雌鳥には１：３ SUPERFECT（登録商標）比で５μｇを投与し、３羽には１：３ SUPERFECT（登録商標）比で１０μｇを投与した。本出願を記述した時点で、上記の構築物を投与された少なくとも１羽の鳥が、卵白中にヒトプロインスリンを生産しつつあった（他の鳥は未だ試験されていない）。この実験は、１）ＤＮＡは少なくとも３ヶ月間安定であった；２）タンパク質レベルは構成的プロモータ、例えばＣＭＶプロモータを用いて観察されたものに匹敵する；並びに３）性的に成熟した鳥に注射し、そして細胞培養を必要とせずに結果が得られる、ということを示す。各ウズラ卵は、約１．４μｇ／ｍｌのプロインスリンタンパク質を含有する、と見積もられる。トランスジェニック鶏卵は一つあたり目的遺伝子によりコードされるタンパク質５０〜７５ｍｇを含有する、ということも概算される。
【０１８６】
第二の実験では、ＣＭＶプロモータ／Ｏｖａ１遺伝子／ＧＰ４１  エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン／ポリＡを含有するトランスポゾンベクターを、性的に未成熟なニホンウズラの卵管の管腔中に注入した。合計９羽の鳥に注射した。８羽の生存鳥のうち、３羽が６週間に亘ってそれらの卵の卵白中にヒトプロインスリンを生成した。ＧＰ４１ペプチド配列は独特であり、正常卵白タンパク質の一部としては見出されないため、以下で詳細に記載するＥＬＩＳＡ検定を開発して、融合ペプチド（Ｏｖａ１遺伝子／ＧＰ４１  エンテロキナーゼＴＡＧ／プロインスリン）中のＧＰ４１を検出した。全てのＥＬＩＳＡ検定において、同一の鳥は陽性結果を生じ、対照は全て予測どおりに機能した。
【０１８７】
ＥＬＩＳＡ手法：個々の卵白試料を炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６で希釈し、総容積０．１ｍｌで９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに付加した。次にこれらのプレートを４℃で一晩放置し被覆を形成させた。ＥＬＩＳＡ反応前に、プレートを室温に温めた。コーティング溶液をデカントし、そして任意の余分量を吸い取
る時に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を付加することにより抗体の非特異的結合を遮断し、そしてそれを振盪しながら最低で４５分間インキュベートした。この遮断溶液をその後デカントし、新鮮なＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中で希釈した一次抗体（ヤギ抗ＧＰ４１  ＴＡＧ）の溶液と取り替えた。一次抗体を用いた２時間のインキュベーション後、自動プレート洗浄器中でＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液で各プレートを洗浄して、非結合抗体を除去した。次に二次抗体ウサギ抗ヤギアルカリホスファターゼ接合体をＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈して、１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０を用いた二次洗浄に付した。アルカリホスファターゼに関して、ジエタノールアミン基質緩衝液中のｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液を用いて抗原を検出し、３０分及び１時間目に吸光度を測定した。
【０１８８】
さらに、上記の構築物を用いて生産されたプロインスリン融合タンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて、卵白から単離した。単離された融合タンパク質の画分をプールし、図５のレーン４及び６に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。ゲルのレーン１及び１０は分子量標準を含有し、レーン２及び８は非トランスジェニック鶏卵白を含有し、一方、レーン３、５、７及び９はブランクである。
【実施例７】
【０１８９】
抗ＴＡＧカラムクロマトグラフィーを用いたヒトプロインスリンの単離
ｇｐ−４１ヘアピンループの形成を安定化するｇｐ−４１の天然ジスルフィド結合を含有するｇｐ−４１エピトープを含有する３０アミノ酸のペプチドを、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化１ｍＬカラム（Amersham）に負荷した。３０アミノ酸のｇｐ４１ペプチドは、配列番号３２として提示される。約１０ｍｇのペプチドをカップリング緩衝液（０．２ＭのＮａＨＣＯ3、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３）中に溶解し、０．５ｍＬ／分で室温で２時間、リガンドをカラムに循環させた。次に、６カラム容積の０．５Ｍのエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．３を用いて過剰な活性基を不活性化し、６カラム容積の酢酸塩緩衝液（０．１Ｍの酢酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．０）及びエタノールアミン（上記）で交互にカラムを洗浄した。１×ＰＢＳを用いてカラムを中和した。次にアフィニティー精製に用いられる緩衝液でカラムを洗浄した：７５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０及び溶離緩衝液、１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．７。最後に７５ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．０中でカラムを平衡化した。
【０１９０】
上記のｇｐ−４１ペプチドを接種することにより、ヤギにおいてｇｐ−４１に対する抗体を生産した。より具体的には、ヤギにｇｐ−４１を接種し、追加免疫注射を投与して、静脈穿刺により血液試料を得た。遠心分離により、血清を得た。約３０ｍＬのヤギ血清を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、０．５ｍＬ／分の速度でＴＡＧカラム上を通した。２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに達するまで、７５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０でカラムを洗浄した。３カラム容積（３ｍＬ）の溶離緩衝液（１００ｍＭのグリシン、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．７）を、その後、７５ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．０を、全て０．５ｍＬ／分の速度で適用した。１ｍＬ分画を収集した。分画を２００μＬの１Ｍトリス、ｐＨ９．０中に収集して、できるだけ迅速に酸性分画を中和した。溶離緩衝液の適用と同時に、大ピークがカラムから溶離した。画分をプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖構造を保持しながら、還元条件下では２つのフラグメントに分離する高分子量の種を示した。
【０１９１】
プールされた抗体因子を用いて、直列に連結された２つの１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化カラムに負荷した。ＴＡＧカラムに負荷するために用いたと同じ方法で、カップリングを実行した。
【０１９２】
卵白からのオボアルブミン−ＴＡＧ−プロインスリンの単離
ＣＭＶ−オボアルブミン−ＴＡＧ−プロインスリン構築物の卵管内注射により処置されたウズラ及びニワトリからの卵白をプールした。尿膜腔液を、孔サイズを連続的に小さくしたフィルターを用いて陰圧濾過し、最終的に０．２２μＭ孔サイズで仕上げることにより、粘性を低下させた。工程を通して、卵白を約１：１６に希釈した。清澄化試料を抗ＴＡＧカラムに負荷し、抗ＴＡＧ抗体の精製に関して記載したと同様の方法で溶離した。溶離緩衝液の適用と同時に起こる２８０ｎｍでの吸光度のピークは、タンパク質が抗ＴＡＧカラムから特異的に溶離していた、ということを示した。溶離ピークを含有する画分を、分析用にプールした。
【０１９３】
抗ＴＡＧアフィニティーカラムからプールした画分の特徴を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により調べた。プールした画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トランスジェニックタンパク質の予測分子量帯域と一致して、対照卵白液中には存在しない６０ｋＤａｌ分子量帯域を明示した。いくつかの夾雑帯域が観察されたが、しかし６０ｋＤａｌ種は、他のタンパク質と比較して非常に濃化されていた。プールした画分の一部をとり、プロテアーゼであるエンテロキナーゼを用いて、室温で一晩切断した。切断された生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、市販のヒトプロインスリン陽性対照と共移動した非切断物質中には存在しない帯域を明示した。ウエスタンブロット分析は、非還元条件下で６０ｋＤａｌ種との特異的結合を示した（ジスルフィド結合を保有することにより、ｇｐ−４１のヘアピンエピトープを保存した）。抗ヒトプロインスリン抗体による切断時に出現した低分子量種のウエスタンブロット分析は、切断されたフラグメントをヒトプロインスリンとして最終的に同定した。
【実施例８】
【０１９４】
インスリンに対する精製手法
Ｉ．卵の特徴付け／同定のためのＥＬＩＳＡデータ
卵の初期スクリーニングとそれを通じた陽性卵を産卵する雌鳥の同定のために、ＥＬＩＳＡを用いた。さらなる改変に関して、組み換えタンパク質量の初期定量のために、この手法を用いた。組み換えプロインスリン（ＲＰＩ）の初期ストックが良く精製されていたことにより、これらの手法をより容易に行うことができた。タンパク質のこのストックは、感度を増大し、検定のバックグラウンドを低減する二重抗体検定の開発に用いられる。結果的に陽性卵を産卵する雌鳥を同定してしまえば、収集された各卵をスクリーニングする必要性はなくなる。生産レベルが一定しているか否かを確定するために、定期的検査を要するだけである。
【０１９５】
ＩＩ．卵白（ＥＷ）又はアルブミン調製
Ａ．清澄化−オボムチン沈降
ＲＰＩを生産するとして陽性であると同定された雌鳥からの卵を、ＲＰＩ精製のためにプールする。初期精製段階には、プールした物質を１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で希釈して、最終濃度を５０ｍＭのトリスＨＣｌとすることが含まれた。次にこの溶液のｐＨを６に調整し、絶えず撹拌しながら、４℃で最低３時間（好ましくは一晩）、オボムチンを沈殿させた。沈殿オボムチンを次に２４００×ｇでの遠心分離にかけ、ペレット化して除去した。ＲＰＩを含有する上清の収集後、この溶液のｐＨを８に再調整した。
【０１９６】
Ｂ．濾過
カラムに負荷したときにそのカラムを詰まらせる可能性を最小限にするため、卵白溶液を少なくとも孔経０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０１９７】
最初に、オボムチンを沈殿させた卵白溶液を、使用する濾過膜の孔サイズを各工程で減少させる、連続した濾過工程に付した。この手法には、孔経０．４５μｍフィルターでの
濾過に到達するための時間並びに卵白溶液の希釈が含まれる。
【０１９８】
Amershamの中空繊維限外濾過装置を用いることにより、非希釈の出発溶液を用い、＜孔経０．２μｍのフィルターで濾過された、カラム適用可能な溶液を生成した。このアプローチは、カラム負荷用の卵白溶液を調製するために必要とされる時間及び溶液希釈を最小限にした。
【０１９９】
ＩＩＩ．精製
Ａ．アフィニティークロマトグラフィー
エンテロキナーゼ認識部位の後に置かれた合成ペプチドに対する特異性を有する抗体を用いて、初期精製計画は、ＲＰＩのための一段階カラム精製手法を開発することを包含した。
【０２００】
合成Ｅｎｔペプチドで免疫されたヤギを用いて、卵スクリーニングＥＬＩＳＡとその後の抗体精製に用いられる抗Ｅｎｔ  Ｔａｇ抗血清を生成した。精製ヤギ抗Ｅｎｔ  Ｔａｇ抗体をＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（Amersham）のマトリックスと共有結合させて、その後、ＲＰＩを特異的に結合させて精製するために用いた。
【０２０１】
初期の試みでは、オボアルブミン部分に特異的な抗体を用い、組み換えタンパク質のオボアルブミン部分に着目した第一の精製工程を実施した。本発明の精製計画では、古典的技法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーの組合せを用いた。
【０２０２】
初めにオボムチンを沈殿させた後、４０％硫酸アンモニウムを用いて、卵白溶液のタンパク質を沈殿させて分画した。沈殿したタンパク質をその後遠心分離により回収し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中に再懸濁した。再懸濁したタンパク質溶液を透析して残留した（ＮＨ4）2ＳＯ4を除去するか、あるいはゲル濾過に付して（ＮＨ4）2ＳＯ4を除去し、かつ残存する卵白タンパク質からＲＰＩを部分的に単離した。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中での、０から０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ＲＰＩをさらに単離した。２つの考え得る溶離プロフィールが観察された。１つは、（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿を伴わない０．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配の約２５％。第二のものは、４０％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿後の１６％未満（約７％）、かつより長い勾配で観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりＲＰＩを含有する画分を同定し、プールした。
【０２０３】
カラムサイズ及び分画範囲が異なる３つのゲル濾過カラムをＲＰＩ精製及び／又は脱塩に用いた：スーパーデックス（Superdex）７５  １０／３００ＧＬ、ハイロード２６／６０スーパーデックス７５及びハイロード２６／６０スーパーデックス２００。これらの個々のカラムを精製計画の異なる段階で用いて、工程の効率を増大させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＲＰＩを含有する画分を同定し、プールした。
【０２０４】
Sigmaからの精製エンテロキナーゼを用いて、ＲＰＩのエンテロキナーゼ認識部位の切断を達成した。エンテロキナーゼ（０．００４単位／μｌ／反応）を、プールされた、そして必要な場合には、濃縮されたタンパク質溶液に適用した。室温で（回転ハイブリダイゼーションオーブン中で３０℃まで）、最低１６時間、いくつかの場合には４８時間、インキュベートすることにより消化反応を行った。１６．５％トリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥペプチドゲルを用いて、消化効率を追跡調査した。ゲル染色は全て、簡易ブルークーマシー染色用液を利用した。消化後のゲル上で、遊離プロインスリンを観察した。
【０２０５】
その後のゲル濾過分離を用いて、精製プロインスリンを得て、そしてＲＰＩの残存オボアルブミン部分並びに残存している天然のＥＷタンパク質を除去する。二次元ベックマン
・コルタープロテオームＬａｂ  ＰＦ２Ｄタンパク質分画システムを用いて、精製工程中の選択した過程を分析した。
【実施例９】
【０２０６】
卵管内及び卵巣内動脈注射の最適化
群内の卵管及び卵巣の発達を同調させることにより、ニワトリ又はウズラ雌鳥の一群における卵管細胞の全体的なトランスフェクション効率を高める。卵管及び卵巣の発達が雌鳥の群全体で均一であり、かつ卵管及び卵巣発達の段階が確定又は予測され得る場合、注射の時機を最適化して、最大数の細胞をトランスフェクトする。したがって卵管発達を下記のように同調させ、大きく且つ均一な比率の卵管分泌細胞を目的遺伝子でトランスフェクトする。
【０２０７】
Oka and Schimke (T. Oka and RT Schimke, J. Cell Biol., 41, 816 (1969))、Palmiter, Christensen and Schimke (J Biol. Chem. 245(4): 833-845, 1970)に記載されたように、雌鳥をエストラジオールで処理して、卵管成熟を刺激する。具体的には、性的成熟の開始前、すなわち１〜１４週齢の期間に、１ｍｇの安息香酸エストラジオールを毎日反復して注射した。卵管の発達を最大にするのに十分な期間にわたって刺激を行った後、ホルモン処理を中止すると、卵管分泌細胞の退行が生じるが、しかし細胞数は減少しない。ホルモン中止後の最適時に、処置された雌鳥の卵管の管腔にトランスポゾンベクターを注射する。最適時の後に付加的なエストロゲン刺激を雌鳥に施すが、この間にトランスポゾンベクターが卵管分泌細胞中に取り込まれる。エストロゲンによる再刺激はトランスポゾン発現を活性化して、宿主ゲノム中への目的遺伝子の組込みを引き起こす。次いでエストロゲン刺激を中止すると、雌鳥は正常な性的発達を継続する。発生学的に調節されるプロモータ、例えばオボアルブミンプロモータを用いる場合、トランスポゾンベクターの発現は、性的成熟時に卵管中で開始する。この時期における卵巣内動脈注射は、卵巣濾胞の高度かつ一定の効率でのトランスフェクションを可能にし、生殖系列のトランスフェクションを、そしておそらくは卵管での発現をもたらす。
【０２０８】
卵管及び卵巣の発達又は退行を同調させて、高度かつ一定の効率でのトランスフェクションを可能にするためには、その他の手段も用いられる。例えば照明及び／又は給餌投与計画の変更は雌鳥を「換羽」させるが、換羽期間中には卵管及び卵巣は退行する。換羽は、トランスフェクションのために雌鳥を同調させるために用いられ、そして卵管及び卵巣の退行及び／又は発達を制御するために、その他のホルモン法と一緒に用いても良い。
【実施例１０】
【０２０９】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ  ＴＡＧ／ＰｒｏＩｎｓ／ＰＡ）の調製−ウズラ
鳥のゲノム中にウズラオボアルブミンプロモータ制御下のプロインスリン遺伝子、及びオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するための、配列番号４４として以下に示されるベクターを設計した。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）のＦ１（−）ｏｒｉの残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に対応する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に対応する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変されたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、人工的終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリ
Ａであり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に対応する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９からの残余である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残余であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の左挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に対応する。
塩基対４０５０〜４９３８は、ニホンウズラのオボアルブミンプロモータ（ＳＤＲＥ（ステロイド依存性応答要素）を含む）である。ニワトリオボアルブミンプロモータ（GenBank寄託番号Ｊ００８９５Ｍ２４９９９、塩基対４３１〜１３３２）との高度の相同性により、ニホンウズラオボアルブミンプロモータを単離した。ニワトリ配列と比較した場合、いくつかの欠失がウズラ配列中に認められた。
塩基対４９４５〜６０９２は、ウズラオボアルブミンシグナル配列及びオボアルブミン遺伝子であって、GenBank寄託番号Ｘ５３９６４．１の塩基対５４〜１２０１に対応する（終止コドンは省かれている）。
塩基対６０９３〜６２４６は、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位及びスペーサー（合成品）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２４７〜６５０７は、プロインスリン遺伝子である。
塩基対６５１４〜６８６６は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリアデニル化配列であり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に対応する。
塩基対６８６７〜７３０３は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に対応する。
塩基対７３０４〜７３７９は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の右挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対７３８０〜７４２１は、ｐＮＫ２８５９由来の残余であるλＤＮＡである。
塩基対７４２２〜８２８６は、ｐＮＫ２８５９か由来の残余である非コードＤＮＡである。
塩基対８２８７〜１０４８７は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ｓｋ（−）をベースにするベクター（Stratagene, Inc.）であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に対応する。
【０２１０】
上記の全ての非コードＤＮＡ配列は、任意のその他の非コードＤＮＡ配列（単数又は複数）で置換し得る、ということに留意すべきである。上記構築物中から欠落しているヌクレオチド配列は、制限部位の残余を表す。
【実施例１１】
【０２１１】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ  ＴＡＧ／ｐ１４６／ＰＡ）の調製−ニワトリ
鳥のゲノム中に、ニワトリオボアルブミンプロモータ制御下のｐ１４６遺伝子、及びオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するためのベクターを設計した。ベクター配列は、配列番号４５として以下に提供される。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）のＦ１（−）ｏｒｉの残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に対応する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に対応する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変されたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、人工終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリＡであり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に対応する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９由来の残余である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９由来の残余であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の左挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に対応する。
塩基対４０５０〜４９５１は、ニワトリオボアルブミンプロモータ（ＳＤＲＥ（ステロイド依存性応答要素）を含む）であって、GenBank寄託番号Ｊ００８９５Ｍ２４９９９でニワトリオボアルブミンプロモータの塩基対４３１〜１３３２に対応する。
塩基対４９５８〜６１１５は、ニワトリオボアルブミンシグナル配列及びオボアルブミン遺伝子であって、GenBank寄託番号Ｖ００３８３．１の塩基対６６〜１２２３に対応する（終止コドンは省かれている）。
塩基対６１２２〜６２７１は、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位及びスペーサー（合成品）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２７２〜６３１６は、２つの付加終止コドンを有するｐ１４６配列（合成品）である。
塩基対６３２４〜６６７６は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリアデニル化配列であり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に対応する。
塩基対６６８２〜７１１４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に対応する。
塩基対７１２０〜７１８９は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の右挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対７１９０〜７２３１は、ｐＮＫ２８５９由来の残余であるλＤＮＡである。
塩基対７２３２〜８０９６は、ｐＮＫ２８５９由来の残余である非コードＤＮＡである。
塩基対８０９７〜１０２９７は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ｓｋ（−）をベースとするベクター（Stratagene, Inc.）であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に対応する。
【０２１２】
上記の全ての非コードＤＮＡ配列は、任意のその他の非コードＤＮＡ配列（単数又は複数）で置き換えられ得る、ということに留意すべきである。上記構築物中から欠落しているヌクレオチド配列は、制限部位の残余を表す。
【実施例１２】
【０２１３】
トランスポゾンベクターｐＴｎＭｏｄ（Ｏｖａｌ／ＥＮＴ  ＴＡＧ／ｐ１４６／ＰＡ）の調製−ウズラ
鳥のゲノム中に、ウズラオボアルブミンプロモータ制御下のｐ１４６遺伝子、及びオボアルブミンシグナル配列を含むオボアルブミン遺伝子を挿入するためのベクターを設計した。ベクター配列は、配列番号４６として以下に示される。
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）のＦ１（−）ｏｒｉの残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に対応する。
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚの塩基対２２９〜１８７３に対応する。
塩基対１７８０〜２９８７は、Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変されたトランスポザーゼである。
塩基対２９８８〜２９９３は、人工終止コドンである。
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリＡであり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２２〜２３３７に対応する。
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９からの残余である非コードＤＮＡである。
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９からの残余であるλＤＮＡである。
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の左挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対３８３８〜４０４４は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対９２４〜７１８に対応する。
塩基対４０５０〜４９３８は、ニホンウズラオボアルブミンプロモータ（ＳＤＲＥ（ステロイド依存性応答要素）を含む）である。ニワトリオボアルブミンプロモータ（GenBank寄託番号Ｊ００８９５Ｍ２４９９９、塩基対４３１〜１３３２）とのその高度の相同性により、ニホンウズラオボアルブミンプロモータを単離した。
塩基対４９４５〜６０９２は、ウズラオボアルブミンシグナル配列及びオボアルブミン遺伝子であって、GenBank寄託番号Ｘ５３９６４．１の塩基対５４〜１２０１に対応する（終止コドンは省かれている）。
塩基対６０９７〜６２４６は、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループ、エンテロキナーゼ切断部位及びスペーサー（合成品）を含有するＴＡＧ配列である。
塩基対６２４７〜６２９１は、２つの付加終止コドンを有するｐ１４６配列（合成品）である。
塩基対６２９９〜６６５１は、ｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）からの合成ポリアデニル化配列であり、ｐＧＷｉｚの塩基対１９２０〜２２７２に対応する。
塩基対６６５７〜７０８９は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対６６７〜２３５に対応する。
塩基対７０９５〜７１６４は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０塩基対の右挿入配列（ＩＳ１０）である。
塩基対７１６５〜７２０６は、ｐＮＫ２８５９からの残余であるλＤＮＡである。
塩基対７２０７〜８０７１は、ｐＮＫ２８５９からの残余である非コードＤＮＡである。
塩基対８０７２〜１０２７２は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ｓｋ（−）をベースとしたベクター（Stratagene, Inc.）であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対７６１〜２９６１に対応する。
【０２１４】
上記の全ての非コードＤＮＡ配列は、任意のその他の非コードＤＮＡ配列（単数又は複数）で置き換えられ得る、ということに留意すべきである。上記構築物中から欠落しているヌクレオチド配列は、制限部位の残余を表す。
【実施例１３】
【０２１５】
動物への投与のための付加的なトランスポゾンベクター
以下の例は、本発明の種々のトランスポゾンベクター及び本発明のトランスポゾンベクター中への挿入のために作製されたいくつかの構築物の説明を提供する。これらの例は、いかなる点においても限定的であることを意味しない。トランスポゾンベクター中に挿入
するための構築物は、上記のクローニングベクターｐＴｎＭＣＳ中又はｐＴｎＭｏｄ中の両方に提供される。
【０２１６】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−ＣＨＯＶｇ−ｅｎｔ−ＰｒｏＩｎｓｕｌｉｎ−ｓｙｎＰＡ）（配列番号４７）
塩基対１〜３６７０：ベクターＰＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜５３２０：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対２３０〜１８６４から得られるＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対５３２７〜６４８０：GenBank寄託番号Ｖ００３８３の塩基対６６〜１２１９から得られるニワトリオボアルブミン遺伝子。
塩基対６４８７〜６６３６：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６６３７〜６８９７：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対６８９８〜６９４２：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対６９４３〜７２９５：クローニングベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対７２９６〜１０８９５：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２１７】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ｅｎｔ−ＰｒｏＩｎｓｕｌｉｎ−ｓｙｎＰＡ）
塩基対１〜３６７０：ベクターＰＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜５３２０：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対２３０〜１８６４から得られるＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対５３２６〜５４９６：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるキャップ部位／プレプロ。
塩基対５５０４〜５６５２：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対５６５３〜５９１３：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対５９１４〜５９５８：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対５９５９〜６３１０：クローニングベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対６３１３〜９９１２：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２１８】
ｐＴｎＭＣＳ（ニワトリＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎ  ポリＡ）
塩基対１〜３６７０：ベクターＰＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜４３５０：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１の塩基対１〜６７５から得られるニワトリオボアルブミンエンハンサー。
塩基対４３５７〜５６９２：GenBank寄託番号Ｊ００８９５Ｍ２４９９９の塩基対１〜１３３６から得られるニワトリオボアルブミンプロモータ。
塩基対５６９９〜６９１７：GenBank寄託番号Ｖ００３８３．１の塩基対２〜１２２０から得られるニワトリオボアルブミン遺伝子。
塩基対６９２４〜７０７３：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を
付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対７０７４〜７３３４：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対７３３５〜７３７９：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対７３８０〜７７３１：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対７７３３〜１１３３２：ベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２１９】
ｐＴｎＭＣＳ（ニワトリＯＶｅｐ＋ｐｒｅｐｒｏ＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎ  ポリＡ）
塩基対１〜３６７０：クローニングベクターＰＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜４３５０：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７の塩基対１〜６７５から得られるニワトリオボアルブミンエンハンサー。
塩基対４３５７〜５６９２：GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９の塩基対１〜１３３６から得られるニワトリオボアルブミンプロモータ。
塩基対５６９９〜５８６９：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるセクロピンキャップ部位及びプレプロ。
塩基対５８７６〜６０２５：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６０２６〜６２８６：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対６２８７〜６３３１：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対６３３２〜６６８３：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対６６８５〜１０２８４：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２０】
ｐＴｎＭＣＳ（ウズラＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ−ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
塩基対１〜３６７０：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜４３３３：ウズラオボアルブミンエンハンサー：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された６５８塩基対の配列であって、はるか上流のニワトリオボアルブミンエンハンサー（GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１）の塩基対１〜６７５とほぼ等価の配列（ニワトリと比較して、ウズラ配列中には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対４３４０〜５７０５：ウズラオボアルブミンプロモータ：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された１３６６塩基対の配列であって、ニワトリオボアルブミンプロモータ（GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９）の塩基対１〜１３３６にほぼ対応する配列（ウズラ及びニワトリ配列間には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対５７１２〜６９１０：ウズラオボアルブミン遺伝子、EMBL寄託番号Ｘ５３９６４の塩基対１〜１１９９（この配列は５’ＵＴＲを含み、推定キャップ部位塩基対５７１２〜５７６４を含有する）。
塩基対６９１７〜７０６６：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を
付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対７０６７〜７３２７：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対７３２８〜７３７２：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対７３７３〜７７２４：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対７７２６〜１１３２５：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２１】
ｐＴｎＭＣＳ（ウズラＯＶｅｐ＋ｐｒｅｐｒｏ＋ＥＮＴ−ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
塩基対１〜３６７０：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜４３３３：ウズラオボアルブミンエンハンサー：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された６５８塩基対の配列であって、はるか上流のニワトリオボアルブミンエンハンサー（GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１）の塩基対１〜６７５とほぼ等価の配列（ニワトリと比較して、ウズラ配列中には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対４３４０〜５７０５：ウズラオボアルブミンプロモータ：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された１３６６塩基対の配列であって、ニワトリオボアルブミンプロモータ（GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９）の塩基対１〜１３３６にほぼ対応する配列（ウズラ及びニワトリ配列間には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対５７１２〜５８８２：セクロピンキャップ部位及びプレプロ：Genbank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３。
塩基対５８８９〜６０３８：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６０３９〜６２９９：ヒトプロインスリン：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７。
塩基対６３００〜６３４４：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対６３４５〜６６９６：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対６６９８〜１０２９７：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２２】
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ｅｎｔ−ｐｒｏｉｎｓ−ｓｙｎＰＡ）
塩基対１〜４０４５：ベクターＰＴｎＭＣＳの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜５６９５：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対２３０〜１８６４から得られるＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対５７０１〜５８７１：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるキャップ部位／プレプロ。
塩基対５８７９〜６０２７：合成スペーサー配列及び付加エンテロキナーゼ切断部位を有するＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６０２８〜６２８８：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対６２８９〜６３３３：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（In
vitrogen）及びｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対６３３４〜６６８５：クローニングベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対６６８７〜１０２８６：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２３】
ｐＴｎＭＯＤ（ニワトリＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎ  ポリＡ）
塩基対１〜４０４５：ベクターｐＴｎＭｏｄの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜４７２５：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１の塩基対１〜６７５から得られるニワトリオボアルブミンエンハンサー。
塩基対４７３２〜６０６７：GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９の塩基対１〜１３３６から得られるニワトリオボアルブミンプロモータ。
塩基対６０７４〜７２９２：GenBank寄託番号Ｖ００３８３．１の塩基対２〜１２２０から得られるニワトリオボアルブミン遺伝子。（この配列は５’ＵＴＲを含み、推定キャップ部位塩基対６０７４〜６１３７を含有している。）
塩基対７２９９〜７４４８：合成スペーサー配列及び付加エンテロキナーゼ切断部位を有するＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対７４４９〜７７０９：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対７７１０〜７７５４：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対７７５５〜８１０６：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対８１０８〜１１７０７：クローニングベクターｐＴｎＭｏｄの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２４】
ｐＴｎＭＯＤ（ニワトリＯＶｅｐ＋ｐｒｅｐｒｏ＋ＥＮＴ＋ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎ  ポリＡ）
塩基対１〜４０４５：ベクターＰＴｎＭＣＳの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜４７２５：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１の塩基対１〜６７５から得られるニワトリオボアルブミンエンハンサー。
塩基対４７３２〜６０６７：GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９の塩基対１〜１３３６から得られるニワトリオボアルブミンプロモータ。
塩基対６０７４〜６２４４：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるセクロピンキャップ部位及びプレプロ。
塩基対６２５１〜６４００：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６４０１〜６６６１：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対６６６２〜６７０６：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対６７０７〜７０５８：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対７０６０〜１０６５９：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２５】
ｐＴｎＭＯＤ（ウズラＯＶｅｐ＋ＯＶｇ’＋ＥＮＴ−ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
塩基対１〜４０４５：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜４７０８：ウズラオボアルブミンエンハンサー：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された６５８塩基対の配列であって、はるか上流のニワトリオボアルブミンエンハンサー（GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１）の塩基対１〜６７５とほぼ等価の配列（ニワトリと比較して、ウズラ配列中には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対４７１５〜６０８０：ウズラオボアルブミンプロモータ：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された１３６６塩基対の配列であって、ニワトリオボアルブミンプロモータ（GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９）の塩基対１〜１３３６にほぼ対応する配列（ウズラ及びニワトリ配列間には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対６０８７〜７２８５：ウズラオボアルブミン遺伝子、EMBL寄託番号Ｘ５３９６４の塩基対１〜１１９９（この配列は５’ＵＴＲを含み、推定キャップ部位の塩基対６０８７〜６１３９を含有する）。
塩基対７２９２〜７４４１：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対７４４２〜７７０２：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対７７０３〜７７４７：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサーＤＮＡ。
塩基対７７４８〜８０９９：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対８１０１〜１１７００：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２６】
ｐＴｎＭＯＤ（ウズラＯＶｅｐ＋ｐｒｅｐｒｏ＋ＥＮＴ−ｐｒｏｉｎｓ＋ｓｙｎポリＡ）
塩基対１〜４０４５：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ、塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜４７０８：ウズラオボアルブミンエンハンサー：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された６５８塩基対の配列であって、はるか上流のニワトリオボアルブミンエンハンサー（GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１）の塩基対１〜６７５とほぼ等価の配列（ニワトリと比較して、ウズラ配列中には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対４７１５〜６０８０：ウズラオボアルブミンプロモータ：ウズラゲノムＤＮＡから社内で増幅された１３６６塩基対の配列であって、ニワトリオボアルブミンプロモータ（GenBank寄託番号Ｊ００８９５−Ｍ２４９９９）の塩基対１〜１３３６にほぼ対応する（ウズラ及びニワトリ配列間には多数の塩基対置換及び欠失が存在し、したがって塩基の数は正確には対応しない）。
塩基対６０８７〜６２５７：セクロピンキャップ部位及びプレプロ、EMBL寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３。
塩基対６２６４〜６４１３：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６４１４〜６６７４：GenBank寄託番号ＮＭ０００２０７の塩基対１１７〜３７７から得られるヒトプロインスリン。
塩基対６６７５〜６７１９：クローニングベクターｐＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩ（Invitrogen）及びｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）から人工物として得られるスペーサー
ＤＮＡ。
塩基対６７２０〜７０７１：クローニングベクターｇＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対１９２０〜２２７１からの合成ポリＡ。
塩基対７０７３〜１０６７２：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２７】
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
塩基対１〜４０４５：ベクターｐＴｎＭｏｄの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜５６９４：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対２３０〜１８７３から得られるＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対５７０１〜５８７１：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるキャップ部位／プレプロ。
塩基対５８７８〜６０１２：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６０１３〜６６６６：GenBank寄託番号Ｖ００５１９の塩基対１〜６５４から得られるヒト成長ホルモン。
塩基対６６７３〜７０８０：GenBank寄託番号Ｙ００４０７の塩基対１０６５１〜１１０５８から得られるコンアルブミンポリＡ。
塩基対７０８２〜１０６８１：クローニングベクターｐＴｎＭｏｄの塩基対４０９１〜７６９０から。
【０２２８】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＨＯＶｅｐ−ｐｒｅｐｒｏ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
塩基対１〜３６７０：ベクターＰＴｎＭＣＳ、塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜４３５０：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１の塩基対１〜６７５から得られるニワトリオボアルブミンエンハンサー。
塩基対４３５７〜５６９２：GenBank寄託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９の塩基対１〜１３３６から得られるニワトリオボアルブミンプロモータ。
塩基対５６９９〜５８６９：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるキャップ部位／プレプロ。
塩基対５８７６〜６０１０：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６０１１〜６６６４：GenBank寄託番号Ｖ００５１９の塩基対１〜６５４から得られるヒト成長ホルモン。
塩基対６６７１〜７０７８：GenBank寄託番号Ｙ００４０７の塩基対１０６５１〜１１０５８から得られるコンアルブミン。
塩基対７０８０〜１０６７９：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２２９】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
塩基対１〜３６７０：ベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対１〜３６７０から。
塩基対３６７６〜５３１９：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１の塩基対２３０〜１８７３から得られるＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対５３２６〜５４９６：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるキャップ部位／プレプロ。
塩基対５５０３〜５６３７：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対５６３８〜６２９１：GenBank寄託番号Ｖ００５１９の塩基対１〜６５４から得られるヒト成長ホルモン。
塩基対６２９８〜６７０５：GenBank寄託番号Ｙ００４０７の塩基対１０６５１〜１１０５８から得られるコンアルブミンポリＡ。
塩基対６７０７〜１０３０６：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳの塩基対３７１６〜７３１５から。
【０２３０】
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＨＯＶｅｐ−ｐｒｅｐｒｏ−ｅｎｔ−ｈＧＨ−ＣＰＡ）
塩基対１〜４０４５：ベクターｐＴｎＭｏｄの塩基対１〜４０４５から。
塩基対４０５１〜４７２５：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１の塩基対１〜６７５から得られるニワトリオボアルブミンエンハンサー。
塩基対４７３２〜６０６７：GenBank寄託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９の塩基対１〜１３３６から得られるニワトリオボアルブミンプロモータ。
塩基対６０７４〜６２４４：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４の塩基対５６３〜７３３から得られるキャップ部位。
塩基対６２５１〜６３８５：合成スペーサー配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を付加したＨＩＶ  ｇｐ４１のヘアピンループ。
塩基対６３８６〜７０３９：GenBank寄託番号Ｖ００５１９の塩基対１〜６５４から得られるヒト成長ホルモン。
塩基対７０４６〜７４５３：GenBank寄託番号Ｙ００４０７の塩基対１０６５１〜１１０５８から得られるコンアルブミンポリＡ。
塩基対７４５５〜１１０５４：クローニングベクターｐＴｎＭＯＤの塩基対４０９１〜７６９０から。
【０２３１】
ｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ／トランスポザーゼ／ＣｈｉｃｋＯｖｅｐ／ｐｒｅｐｒｏ／プロテインＡ／ＣｏｎポリＡ）
塩基対１〜１３０：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）の塩基対１〜１３０のＦ１（−）ｏｒｉの残部。
塩基対１３３〜１７７７：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）の塩基対２２９〜１８７３から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
塩基対１７８０〜２９８７：Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変されたトランスポザーゼ。
塩基対２９８８〜２９９３：人工的ＤＯＵＢＬＥ終止コドン。
塩基対２９９４〜３３４３：ベクターｐＮＫ２８５９由来の非コードＤＮＡ。
塩基対３３４４〜３３８６：ｐＮＫ２８５９由来のλＤＮＡ。
塩基対３３８７〜３４５６：Ｔｎ１０からの７０塩基対の左側ＩＳ１０。
塩基対３４５７〜３６７４：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）塩基対９２４−７０７からのマルチクローニングサイト。
塩基対３６７５〜５６９１：ニワトリオボアルブミンエンハンサー＋Ｔｏｐｏクローン１０ｍａｘｉ０４０３０３からのプロモータ（５’ＸｍａＩ、３’ＢａｍＨＩ）。
塩基対５６９８〜５８６５：ｐＭＯＮ２００  GenBank＃Ｘ０７４０４のセクロピンから増幅される、キャップ部位を有するプレプロ（５’ＢａｍＨＩ、３’ＫｐｎＩ）。
塩基対５８７２〜７３３８：GenBank＃Ｊ０１７８６の成熟ペプチドの塩基対２９２〜１７５５に由来するプロテインＡ遺伝子（５’ＫｐｎＩ、３’ＳａｃＩＩ）。
塩基対７３４５〜７７５２：GenBank＃Ｙ００４０７の、塩基対１０６５１〜１１０５８からのニワトリコンアルブミン  ポリＡからのＣｏｎポリＡ（５’ＳａｃＩＩ、３’ＸｈｏＩ）。
塩基対７７５３〜８１９５：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対６７７〜２３５からのマルチクローニングサイト。
塩基対８１９６〜８２６５：Ｔｎ１０からの７０塩基対の左側ＩＳ１０。
塩基対８２６６〜８３０７：ｐＮＫ２８５９からのλＤＮＡ。
塩基対８３０８〜９１５１：ｐＮＫ２８５９からの非コードＤＮＡ。
塩基対９１５２〜１１３５２：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）をベースとするベクター（Stratagene, Inc.）の塩基対７６１〜２９６１。
【０２３２】
上記で引用した特許、出版物及び抄録は全て、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。上記は本発明の好ましい実施形態に関するに過ぎず、特許請求の範囲に明示したような本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、多数の変更又は代替は本明細書中で成され得る、と理解されるべきである。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】第一のプロモータと操作可能に連結されたトランスポザーゼ、並びに第二のプロモータと操作可能に連結された目的遺伝子を含有し、目的遺伝子及び操作可能に連結されたプロモータはトランスポザーゼにより認識される挿入配列（ＩＳ）により挟まれる、トランスポゾンベクターを模式的に示す図である。「Ｐｒｏ」はプロモータを意味する。この図及びその後の図において、実際のヌクレオチド配列のサイズは、その配列を表すボックスのサイズに必ずしも比例しない。
【図２】卵白を標的としてポリペプチドを蓄積させるためのトランスポゾンベクターを模式的に示す図である。ここで、Ｏｖ  ｐｒｏはオボアルブミンプロモータであり、Ｏｖタンパク質はオボアルブミンタンパク質であり、そしてポリＡはポリアデニル化配列である。ＴＡＧ配列は、スペーサー配列、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループ、及びプロテアーゼ解裂部位を包含する。
【図３】卵白を標的としてポリペプチドを蓄積させるためのトランスポゾンベクターを模式的に示す図である。ここで、Ｏｖｏ  ｐｒｏはオボムコイドプロモータであり、Ｏｖｏ  ＳＳはオボムコイドシグナル配列である。ＴＡＧ配列は、スペーサー、ＨＩＶ  Ｉからのｇｐ４１ヘアピンループ、及びプロテアーゼ解裂部位を包含する。
【図４】ＲＮＡｉ分子の発現のためのトランスポゾンベクターを模式的に示す図である。「Ｔｅｔi  ｐｒｏ」はテトラサイクリン誘導性プロモータを示すが、その一方で「ｐｒｏ」は本明細書中に記載されたようなプレプロ配列のプロ部分を示す。「Ｏｖｇｅｎ」は約６０塩基対のオボアルブミン遺伝子を示し、「Ｏｖｏｔｒａｎｓ」は約６０塩基対のオボトランスフェリンを示し、そして「オボムチン」は約６０塩基対のオボムチン遺伝子を示す。
【図５】単離されたプロインスリン融合タンパク質のプールされた画分をレーン４及びレーン６で泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。ゲルのレーン１及び１０は分子量のスタンダードを含有し、レーン２及び８は非トランスジェニック鶏の卵白を含有し、そしてレーン３、５、７及び９はブランクである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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