(57)【要約】この発明は、組織保護活性を仲介するヘテロ多量体受容体複合体を用いて、組織保護活性を有する化合物を同定する方法に関する。この複合体は、少なくとも１つのβc受容体と複合した少なくとも１つのEPO-Rから構成される。組織保護化合物を同定するアッセイに使用するこれらの化合物には、限定されるものでないが、小分子と生物学的分子が含まれる。これらのアッセイを利用して同定される化合物を用いて、中枢および末梢神経系ならびに他のエリスロポエチン応答性もしくは興奮性細胞、組織、および器官の様々な疾患、障害、または症状を治療または予防することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させるステップ；
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を、試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を測定することにより測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験化合物を標識しかつ標識した試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を試験化合物に結合した標識を検出することにより測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を、試験化合物と組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を測定することにより測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；および
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して組織保護サイトカイン受容体複合体活性を増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項６】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を細胞増殖アッセイにより測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が遺伝子組換え操作されて少なくとも１つのEPOまたはβ共通受容体を発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、内在的にEPO受容体を発現し、そして(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が内在的にβ共通受容体を発現し、そして(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)EPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が前記細胞と同じ種に由来する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、遺伝子組換え操作されてEPO受容体を発現する細胞と接触させるステップであって、該細胞が(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されるステップ；
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞がステップ(a)の細胞と同じ細胞型でありかつ(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されないステップ；および
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１２】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、β共通受容体を発現する遺伝子組換え細胞と接触させるステップであって、該細胞が(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)EPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されるステップ；
(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ；
(c)対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞がステップ(a)の細胞と同じ細胞型でありかつ(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換されないステップ；および
(d)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１３】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体活性と関連する調節エレメントと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；
(b)試験化合物の不在のもとで測定したレポーター遺伝子発現のレベルと比較して、レポーター遺伝子の発現のレベルを増加または減少させる試験化合物を同定するステップ；および
(c)同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１４】
調節エレメントが血清応答エレメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、(i)転写アクチベーターのDNA結合ドメインに特異的な結合部位と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子を含む核酸配列；
(ii)(A)転写アクチベーターのDNA結合ドメインと(B)第１の組織保護サイトカイン受容体ポリペプチドまたはその断片を含む第１の融合タンパク質；および
(iii)(A)転写アクチベーターの活性化ドメインと(B)第２の組織保護サイトカイン受容体を含む第２の融合タンパク質；を含む細胞と接触させるステップ；ならびに
(b)レポーター遺伝子発現を検出するステップを含んでなり、
もし(b)のレポーター遺伝子発現が試験化合物不在のもとで検出したレポーター遺伝子発現と比較して異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項１６】
細胞が原核生物細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が真核生物細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
真核生物細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が組織保護サイトカイン受容体複合体の少なくとも１つの受容体を内在的に発現する、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がBaF3細胞である、請求項５、１１、１２、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、(i)組織保護サイトカイン受容体複合体応答性プロモーターと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードしかつ(ii)組織保護サイトカイン受容体複合体を発現するヌクレオチド配列を含有する改変された酵母株の細胞と接触させるステップ；ならびに
(b)レポーター遺伝子発現のレベルを測定することにより組織保護サイトカイン受容体複合体の活性のレベルを決定するステップを含んでなり、
もし該化合物の存在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルが、該化合物の不在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルと比較して増加または減少すれば、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２２】
組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、(a)結合を誘導する条件下で、組織保護サイトカイン受容体複合体を(i)第１標識を結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドおよび(ii)第２標識を結合した試験化合物の当量と接触させるステップ；(b)未結合の物質を組織保護サイトカイン受容体複合体から除去するステップ、ならびに(c)第１および第２標識のレベルを検出するステップを含んでなり、
ここで、もし第２標識が存在して該化合物が該複合体と結合すれば、ならびに、もし第１標識のレベルが、結合を誘導する条件下で試験化合物の不在のもとで標識リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させた場合における未結合物質を除去した後の第１標識のレベルと比較して減少すれば、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物が同定される上記方法
【請求項２３】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と、１以上の試験化合物の存在のもとで、結合を誘導する条件下で接触させるステップ；および
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体と結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を測定するステップを含んでなり；
もし(b)で測定した結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量と異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２４】
結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド特異的抗体を用いて測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに結合した標識を検出することにより測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、標識したリガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに結合した標識を検出することにより測定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
標識が蛍光である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)組織保護サイトカイン受容体複合体を1種以上の試験化合物と接触させるステップ、および、
(b)組織保護サイトカイン受容体複合体活性を測定するステップを含んでなり、
もし(b)で測定した活性が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性と異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物が同定される上記方法。
【請求項２９】
組織保護サイトカイン受容体複合体活性を細胞増殖または細胞分化により測定する、請求項１、５、１１、１２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
測定される組織保護サイトカイン受容体複合体活性が組織保護サイトカイン受容体複合体の組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと相互作用する能力である、請求項１、５、１１、１２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップが細胞内のヌクレオリンの存在を検出することを含む、請求項１、５、１１、１２、１３、２２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップが細胞内のニューログロビンまたはサイトグロビンの活性レベルの増加を検出または測定するステップを含む、請求項１、５、１１、１２、１３、２２、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
組織保護サイトカイン受容体複合体が溶液中にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
組織保護サイトカイン受容体複合体が細胞中にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を阻害する、請求項２３または２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を増強する、請求項２３または２８１項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ(a)で接触させる組織保護サイトカイン受容体複合体が細胞表面上にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
組織保護サイトカイン受容体複合体が単離された細胞膜上にある、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
組織保護サイトカイン受容体複合体が固体表面に固定化されている、請求項１、２２、２３、または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
固体表面がマイクロタイターディッシュである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
固体表面がチップである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、
(a)試験化合物を、リガンドが結合している組織保護受容体複合体断片と接触させるステップであって、該組織保護受容体複合体断片が固体支持体に結合したFcフラグメントと融合した少なくとも１つのEPO受容体細胞外ドメインおよび少なくとも１つのβ共通受容体細胞外ドメインを含むステップ；および
(b)未結合の試験化合物を固体支持体から除去するステップ；
(c)組織保護サイトカイン受容体複合体断片と結合した化合物を同定するステップを含んでなり、ここで、固体支持体と結合した化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物として同定する上記方法。
【請求項４３】
試験化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
試験化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である、請求項１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
試験化合物が小分子である、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
試験化合物がペプチドである、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物がライブラリーのメンバーである、請求項１、５、１１、１２、１３、１５、１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドがEPOである、請求項１６、２２、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する、請求項１、５、１１、１２、１３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと結合する、請求項１６、２３、２８、または４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
哺乳動物において組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(a)傷害を加えた直後に第１動物に該化合物を投与するステップであって、ここで第１動物は内在的に組織保護サイトカイン受容体複合体を発現するステップ、および
(b)該化合物をステップ(a)と同じ傷害を加えた直後に第２動物に投与するステップであって、ここで第２動物は組織保護サイトカイン受容体複合体を発現しないステップを含んでなり、
もし傷害からの回復がステップ(b)の動物と比較してステップ(a)の動物において異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法
【請求項５２】
ヒトの疾患または障害を治療または予防する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を、かかる治療または予防を必要とするヒトに投与することを含む、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５３】
前記疾患または障害が興奮組織を冒す疾患または障害である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ヒトにおいて興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を、それを必要とするヒトに投与することを含んでなり、ここで該興奮細胞、組織または器官の機能の増強は連合学習または記憶の増強をもたらす、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５５】
該ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする方法であって、該複合体の活性をモジュレートする化合物を、かかる治療または予防を必要とするヒトに投与することを含む、但し該化合物がEPOでない、上記方法。
【請求項５６】
ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる、ヒトの疾患また障害を治療または予防する方法。
【請求項５７】
ヒトにおいて組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる、ヒトの興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法。
【請求項５８】
前記化合物を請求項１〜５、１１〜１５、２１〜２３、２８、および４２のいずれか１項に記載の方法により同定する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が抗体組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記化合物が小分子、ペプチド、またはライブラリーのメンバーである、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を増強する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を妨害する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物をEPOと一緒に投与する、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患または障害が気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動性障害、アルツハイマー病、加齡または認知機能不全である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患または障害が低酸素、発作障害、神経変性疾患、神経毒中毒、多発性硬化症、低血圧、心停止、照射、または低血糖症が原因である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患または障害が虚血または脳卒中である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患または障害が神経変性症状である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
神経変性症状が脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳または脊髄外傷、AIDS痴呆、加齢に関係する認知機能の喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作障害、アルコール中毒、加齢、またはニューロンの喪失である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患または障害が神経筋または筋肉症状である、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
神経筋または筋肉症状が心臓組織のものである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患または障害が心臓のものである、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患または障害がうっ血性心不全、冠動脈疾患、虚血、心筋梗塞
狭心症、先天性心疾患、プリンズメタル型狭心症、心臓破裂、脈管炎、不整脈、頻脈-徐脈不整脈、上室性、心室性伝導異常、心筋炎、肺性心、または鈍傷および穿通外傷である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患または障害が眼のものである、請求項５２、５３、または５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患または障害が視神経炎、鈍傷および穿通損傷、感染、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、黄斑変性症、網膜色素変性症、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧、糖尿病性網膜症、および黄斑浮腫である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
興奮組織が中枢神経系組織または末梢神経系組織である、請求項５４または５７に記載の方法。
【請求項７８】
末梢神経系組織が胎盤組織、網膜組織、または心臓組織である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
投与が経口、局所、頭蓋内、管内、吸入、非経口、静脈内、末梢、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、粘膜下または皮内投与である、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
投与を医療、外科、または自然処置に先立って行う、請求項５２、５３、５４、または５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
外科処置が腫瘍切除、動脈瘤修復、または冠動脈バイパス処置である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
医療処置が化学療法である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
自然処置が分娩または娩出である、請求項８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法のもとで2003年4月25日に出願された米国仮特許出願第60/465,891号に与えられた優先権を主張する、2003年9月30日に出願された同時係属中の米国特許出願第10/676,694号の優先権を主張するものであり、それぞれの特許の全内容が本明細書に参照によりそのまま全て組み入れられる。
【０００２】
1.  序
本発明は、薬物スクリーニング／発見および治療または予防の方法のために、少なくとも１つのベータ共通(beta common;βc）受容体（CD131としても知られる）と少なくとも１つのエリスロポエチン（EPO）受容体を有する組織保護サイトカイン受容体複合体を標的とする方法に関する。特に、本発明は組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの相互作用をモジュレートする化合物を同定およびスクリーニングする方法に関する。本発明の方法はまた、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば本発明のスクリーニング方法により同定された化合物を用いて、疾患または障害を治療または予防する方法も包含する。本発明はまた、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば本発明のスクリーニング方法により同定された化合物を用いて、興奮組織機能を増強する方法も包含する。
【背景技術】
【０００３】
2.  発明の背景
いくつかの確証は、エリスロポエチンがサイトカインスーパーファミリーの一メンバーとして、エリスロポエチン受容体(EPO-R)との相互作用が介在する重要な生理学的機能を果たすことを示唆する。これらの作用には、赤血球の産生、細胞分裂誘発、平滑筋および神経細胞中へのカルシウム流入のモジュレーション、ならびに中間代謝に与える効果が含まれる。
【０００４】
EPO-Rは68kDaタンパク質であり、かつI型サイトカイン受容体ファミリーに属する。このファミリーには、インターロイキン(IL)、すなわちIL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、白血病抑制因子（LIF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、トロンボポエチン、成長ホルモンおよびプロラクチンに対する受容体が含まれる。これらの受容体は、その細胞外ドメインが相同性をもつので一緒のグループにまとめられている。これらの受容体の保存された細胞外ドメインは、ほぼ200個のアミノ酸の長さを有し、アミノ末端領域に4個の位置的に保存されたシステイン残基（Cys294、Cys283、Cys248、Cys238）および膜貫通ドメインに近接したTrp-Ser-X-Trp-Serモチーフを含有する。この4個のシステインは、受容体の維持と構造的完全性にとって極めて重要であると思われる（Murray, 1996, 「ハーパーの生化学（Harpers Biochemistry）」 第24版. pp.524-526, Appilion & Lange, Ltd.；Caravellaら, 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401）。
【０００５】
I型サイトカイン受容体ファミリー内の多くの受容体の様に、EPO-Rは内在リガンドEPOとの相互作用により活性化されると思われる。二量体のうちの第１のEPO-RがEPOと高親和力で結合し、次いで第２のEPO-Rがその複合体と低親和力で結合する。このEPO-Rの二量化は、EPO-Rと会合するJak2チロシンキナーゼを近接した会合位置に置き、それらのリン酸転移を誘導する。この活性化はいくつかのタンパク質のチロシンリン酸化をもたらし、次いでいくつかの異なる経路、例えばホスファチジルイノシトール（PI）3-キナーゼ経路、Ras/MAPキナーゼ経路、およびSTAT経路を活性化する。これらの経路は、エリスロポエチンが介在する生理学的機能をトリガーする（Kiritoら, 2002, Blood 99:102-110；Livnahら, 1999, Science 283:987-990；Narandaら, 2002, Endocrinology 143:2293-2302；Remyら, 1999, Science 283:990-993；およびYoshimuraら, 1996, The Oncol. 1:337-339）。
【０００６】
多量体を形成するのに加えて、I型ファミリーのメンバーの多くは、３つの異なるシグナル伝達受容体成分（gp130、ベータ共通受容体（βc受容体）、またはIL2受容体のガンマサブユニット（γc受容体））の１つをその受容体複合体中に組み込む。例えば、GM-CSFの受容体複合体は、GM-CSF受容体、２つのβc受容体、およびGM-CSFリガンドから構成される。EPO-Rは、βc受容体と複合体を形成することが知られている（Yutakaら, 1995, Bioch. Biophys. Res. Com. 208:1060-1066；Jubinskyら, 1997, Blood 90:1867-1873；D’Andreaら, 1998, J. Clin, Invest.102:1951-1960を参照）。しかし、これらの複合体は生理学的に重要な効果を生じなかったと報じられている（Scottら, 2000, Blood, 96:1588-1590）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
3.  概要
本発明は、薬物スクリーニング／発見のための「組織保護サイトカイン受容体複合体」（定義は後記）のターゲティング、ならびに、in vivoでの組織保護もしくは修復、例えば、ヒト被験者もしくは他の哺乳動物における、様々な疾患、障害および症状の治療もしくは予防、または興奮組織の機能の改善を達成する方法に関する。本発明は、一つには、EPO受容体/βc受容体複合体が興奮組織を保護する役割を果たすという本出願人らの発見に基づく。本明細書に記載の実験は、EPOがEPO受容体とβc受容体を発現する野生型細胞において保護効果を有した、すなわち、アポトーシスを緩和したこと；しかしながらEPOはβc受容体を欠く細胞において保護効果を有しなかったことを実証する。動物研究において、虚血性脊髄傷害を、野生型マウス（両方の受容体を発現する）およびβc受容体ノックアウトマウス（βc受容体を発現しない）に加えた。カルバミル化EPO（この化合物は非赤血球新生性であってEPO受容体二量体と結合しない）の投与は、野生型マウスに回復の改善をもたらした。しかし、EPOまたはカルバミル化EPOのいずれの投与も、βc受容体ノックアウトマウスには回復の効果を与えなかった。これらの結果は、βc受容体の発現が組織保護効果を達成するために必須であることを実証した。
【０００８】
一態様において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する無細胞スクリーニングアッセイにおける、EPO受容体とβc受容体を含んでなる組織保護サイトカイン受容体複合体の利用に関する。他の態様において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする（すなわち増強または阻害する）かまたは組織保護活性を示す化合物を同定するための細胞に基づくスクリーニングアッセイにおける、EPO受容体とβc受容体を含んでなる組織保護サイトカイン受容体複合体の利用に関する。他の態様において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体に依存して組織保護活性を示す化合物を同定するための動物に基づくスクリーニングアッセイにおける、EPO受容体とβc受容体を含んでなる組織保護サイトカイン受容体複合体の利用に関する。他の特定の態様において、本発明のスクリーニング方法により同定される化合物は、組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの相互作用をモジュレートしかつ組織保護活性を示す。他の実施形態において、本発明は疾患、障害または症状を治療または予防する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を投与することを含んでなる上記方法を提供する。他の態様において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を投与することにより、興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法を提供する。
【０００９】
本発明のスクリーニング方法のある特定の実施形態においては、試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体のリガンド、例えば、限定されるものでないがEPOの存在および／または不在のもとで、組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させる。かかるアッセイを用いて、リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体の相互作用をモジュレートする化合物を同定することができる。
【００１０】
無細胞アッセイを用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定することができる。かかる実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体またはかかる複合体の膜調製物を試験化合物と接触させ、そして結合の指標を測定する。アッセイは、化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させる直接結合アッセイであってもよい。競合結合アッセイでは、2種の化合物（例えば、試験化合物とリガンド、または2種の試験化合物）を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させて、2種の化合物のいずれがより大きい結合親和力を有するかを決定する。アッセイは置換結合アッセイであってもよく、その場合、第１化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触して複合体と結合させ、そして第２化合物をアッセイに加えて、第２化合物が第１化合物と置換する能力を有するかどうかを測定する。結合アッセイにおいて、結合はアッセイに加える化合物を標識することおよび／または組織保護サイトカイン受容体複合体を標識することにより測定することができる。
【００１１】
細胞に基づくアッセイを用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体に対するリガンドの存在および／または不在のもとで、組織保護サイトカイン受容体複合体をターゲティングする化合物を同定することができる。かかる実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞を、試験化合物と接触させる。試験化合物が細胞内で組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートするかどうかを決定するために、読み出し情報を観察または測定する。読み出し情報は、試験化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体との結合の単純な測定値であってもよい。ある特定の実施形態においては、試験化合物を標識して、標識した試験化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、試験化合物に付した標識を検出することにより測定する。他の実施形態において、読み出し情報は、表現型変化、例えば細胞サイズ、形状の変化、または細胞のアポトーシスである。さらに他の実施形態において、読み出し情報はレポーター遺伝子の発現または細胞内に装入されたもしくは培地に含まれた指示薬色素の変化である。かかる実施形態においては、アッセイに用いる細胞を遺伝子操作して、組織保護サイトカイン受容体複合体が活性化するとレポーター遺伝子産物を発現するようにする。他の実施形態においては、読み出し情報を細胞の酵素反応により決定する。かかる実施形態においては、アッセイに用いる細胞を試験化合物と接触させた後に溶解する。次いで細胞溶解物を、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性化の指標について試験する。例えば、細胞溶解物を、複合体と結合する抗体に曝してもよく、その抗体も複合体が固着している支持体と結合することができる。他の抗体を次いでアッセイに加えて、組織保護サイトカイン受容体複合体が活性化されているかどうかを検出することができる。例えば、抗ホスホチロシン抗体は複合体のリン酸化部分および／またはEPO/β共通受容体複合体の下流成分と結合することができる。ある特定の実施形態においては、複合体のβ共通受容体部分のリン酸化部分と結合することができる抗体および／またはEPO受容体のリン酸化部分と結合することができる抗体を用いる。ある特定の実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞を、β共通受容体および／またはEPO受容体のリン酸化部分と結合することができる抗体と接触させる。ある特定の実施形態においては、単離した組織保護サイトカイン受容体複合体を、β共通受容体および／またはEPO受容体のリン酸化部分と結合することができる抗体と接触させる。ある特定の実施形態においては、EPO受容体のリン酸化部分と結合することができる抗体はPY-JAK2抗体である。組織保護サイトカイン受容体複合体の下流サイトカイン活性化標的は同定されているので、本発明のスクリーニング方法の読み出し情報は、下流細胞成分のリン酸化の検出であってもよい。
【００１２】
下流細胞産物の存在を利用して、組織保護サイトカイン受容体複合体を標的とする化合物を同定することができる。例えば、化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させた後、その細胞を他の細胞産物、例えば、組織保護サイトカイン受容体複合体活性化の指標であるヌクレオリンまたはニューログロビンの存在について試験することができる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法のある特定の実施形態においては、細胞を組換え遺伝子操作して、少なくとも１つのEPO受容体またはβ共通受容体を発現させる。ある特定の実施形態においては、細胞を組換え遺伝子操作して、β共通受容体ポリペプチドまたはEPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸を過剰発現させる。ある特定の実施形態においては、細胞を組換え遺伝子操作をして、β共通受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸およびEPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸を過剰発現させる。過剰発現は、その核酸をプロモーターと機能しうる形で連結することにより達成することができ、その遺伝子操作は標準の形質転換技術、すなわち、内在遺伝子の遺伝子活性化を達成する標的を定めた相同的組換え、またはランダム組込みと活性化遺伝子をもつ細胞の選択により行うことができる。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は細胞と同じ種から誘導される。ある特定の実施形態においては、細胞は内在的にβ共通受容体および／またはEPO受容体を発現する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物をβ共通受容体ノックアウト細胞において同定する方法であって、上記化合物を、内在的に組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する第１細胞に投与してその直後にその細胞を有害な薬剤で処理するステップ、および上記化合物を、第１細胞と同じタイプであるが組織保護サイトカイン受容体複合体を発現しない（すなわち、β共通受容体を発現しない）第２細胞に投与してその直後にその細胞を第１細胞と同じ有害な薬剤で処理するステップを含んでなり、もし第１細胞の細胞生存率が第２細胞と比較して異なれば、上記化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体を標的とする化合物であると同定する上記方法を提供する。一実施形態において、細胞はβ共通受容体ノックアウト動物から誘導される。
【００１５】
アッセイを動物モデルで実施して、組織保護サイトカイン受容体複合体を標的とする化合物を同定することができる。一実施形態において、本発明は、組織保護活性をモジュレートする化合物を、哺乳動物において同定する方法であって、傷害を加えた直後に、上記化合物を、内在的に組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する第１動物に投与するステップ、および、第１動物に加えたのと同じタイプの傷害を加えた直後に、上記化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現しない第２動物に投与するステップを含んでなり、もし第１動物における傷害からの回復が第２動物と比較して異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法を提供する。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法に用いることができる組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞としては、限定されるものでないが、哺乳動物、昆虫、真核生物、原核生物、真菌、または細菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態においては、ヒト細胞、例えば、限定されるものでないが、プレB細胞、293細胞、293T細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、K562細胞、または3T3細胞を用いる。他の実施形態においては、マウス細胞、例えば、限定されるものでないが、BaF3細胞を用いる。他の実施形態においては、真菌細胞、例えば、限定されるものでないが、サッカロミセス（Saccharomyces）（出芽酵母）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）（分裂酵母）、ピチア（Pichia）（メタノール資化酵母）、およびハンセヌラ（Hansenula）（メタノール資化酵母）属由来の細胞を用いる。
【００１７】
本発明の他の態様によると、ヒトにおける疾患または障害を予防または治療する方法であって、かかる治療または予防を必要とするヒトに、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を投与することを含んでなる上記方法が提供される。ある特定の実施形態において、上記疾患または障害は興奮組織を冒す疾患または障害である。
【００１８】
一実施形態において、本発明はヒトにおける興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法であって、それを必要とするヒトに、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物の治療上有効な量を投与することを含んでなり、ここで上記興奮細胞、組織または器官の機能の増強は連合学習または記憶の増強をもたらす上記方法を提供する。
【００１９】
他の実施形態において、本発明はヒトにおける組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする方法であって、かかる治療または予防を必要とするヒトに、上記複合体の活性をモジュレートする化合物を投与することを含んでなる上記方法を提供する。
【００２０】
さらに他の実施形態において、本発明は、ヒトにおける疾患または障害を予防または治療する方法であって、ヒトにおける組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる上記方法を提供する。
【００２１】
なお他の実施形態において、本発明は、ヒトにおける興奮細胞、組織、または器官の機能を増強する方法であって、ヒトにおける組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートすることを含んでなる上記方法を提供する。
【００２２】
疾患もしくは障害を予防または治療するか、興奮細胞、組織もしくは器官の機能を増強するか、または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートするための本発明の実施形態において、投与する化合物は、組織保護効果を有するかまたは組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定する上記スクリーニング方法のいずれか１つの方法により同定することができる。関係する実施形態において、上記化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体である。関係する実施形態において、上記化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに特異的な抗体である。関係する実施形態において、上記化合物は小分子、ペプチド、またはライブラリーのメンバーである。関係する実施形態において、上記化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する。関係する実施形態において、上記化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を増強する。関係する実施形態において、上記化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を妨げる。関係する実施形態において、上記化合物はEPOと一緒に投与される。ある特定の実施形態において、投与する化合物はEPOである。ある特定の実施形態において、投与する化合物はEPOでない。関係する実施形態において、投与する化合物は改変されたEPOまたはEPO突然変異体でない。改変されたEPOおよびEPO突然変異体の例としては、限定されるものでないが、5.4.1.1節に記載した化合物が挙げられる。投与する化合物がEPO、改変されたEPOまたはEPO誘導体である本発明のある特定の実施形態において、投与する化合物はEPO受容体と結合しない。投与する化合物がEPO、改変されたEPOまたはEPO誘導体である本発明の関係する実施形態において、投与する化合物はEPO受容体二量体と結合しない。治療、予防、興奮組織の機能の増強、および組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションのための本発明の方法のある特定の実施形態において、投与する化合物は、EPO、すなわちいずれかのEPO、改変されたEPOまたは突然変異したEPO、またはそれらの誘導体でない。
【００２３】
疾患障害もしくは症状の治療もしくは予防、興奮組織の機能の増強、または組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションのための本発明の方法のある特定の実施形態において、投与する化合物はEPO受容体と結合しない。疾患障害もしくは症状の治療もしくは予防、興奮組織の機能の増強、または組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションのための本発明の方法のある特定の実施形態において、投与する化合物は、２つのEPO受容体から構成される二量体と結合しない。疾患障害もしくは症状の治療もしくは予防、興奮組織の機能の増強、または組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションのための本発明の方法のある特定の実施形態において、投与する化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する。
【００２４】
疾患または障害を治療または予防するための本発明の実施形態において、上記疾患または障害は、気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動性障害、アルツハイマー病、加齡または認知機能不全である。関係する実施形態において、疾患または障害は、低酸素、発作障害、神経変性疾患、神経毒中毒、多発性硬化症、低血圧、心停止、照射、または低血糖症が原因である。関係する実施形態において、疾患または障害は虚血または脳卒中である。関係する実施形態において、疾患または障害は神経変性症状である。関係する実施形態において、神経変性症状は脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳または脊髄外傷、AIDS痴呆、加齢に関係する認知機能の喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作障害、アルコール中毒、網膜虚血、加齢、緑内障またはニューロンの減少である。他の関係する実施形態において、疾患または障害は神経筋または筋肉症状である。ある特定の実施形態において、神経筋または筋肉症状は心臓組織のものである。疾患障害もしくは症状の治療もしくは予防、興奮組織の機能の増強、または組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションのための本発明のある特定の実施形態において、疾患障害、症状、または興奮細胞、組織、または器官は大脳のものでない。疾患障害もしくは症状の治療もしくは予防、興奮組織の機能の増強、または組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションのための本発明のある特定の実施形態において、疾患障害、症状、または興奮細胞、組織、または器官は、中枢神経系のものでなく、限定されるものでないが、腎組織、心臓組織、内皮組織、網膜組織、血管組織、肺組織、膵臓組織、骨組織、皮膚組織、胚組織、胎性組織、腎組織、横紋筋組織、肝組織、胃腸組織、生殖路組織、または内分泌組織を含む。
【００２５】
興奮細胞、組織、または器官の機能を増強するための本発明の実施形態において、興奮組織は中枢神経系組織または末梢神経系組織である。ある特定の実施形態においては、末梢神経系組織は胎盤組織、網膜組織、または心臓組織である。
【００２６】
疾患もしくは障害を治療もしくは予防する、興奮細胞、組織もしくは器官の機能を増強する、または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートするための本発明の実施形態において、投与は、経口、局所、頭蓋内、管内、吸入、経鼻、非経口、静脈内、末梢、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、粘膜下または皮内投与である。関係する実施形態において、投与は医学的または外科処置に先立って行われる。ある特定の実施形態において、外科処置は腫瘍切除、動脈瘤修復、または冠動脈バイパス処置である。本発明のある特定の実施形態において、医療処置は分娩または娩出である。
【００２７】
3.1 用語
本明細書に使用される用語「組織保護活性」は、細胞、組織、または器官の損傷または死を阻止するまたは遅延させる効果を意味する。組織保護活性は、例えば、5.5節に記載した、様々な症状、疾患、ならびに細胞、器官、および／または組織の障害に対するものであってもよい。組織保護活性は、組織保護サイトカイン受容体複合体を有する興奮組織、細胞、および／または器官、例えば、限定されるものでないが、中枢神経系の組織に特異的であってもよい。
【００２８】
本明細書に使用される用語「組織保護サイトカイン受容体複合体」は、少なくとも１つのエリスロポエチン受容体および少なくとも１つのβ共通受容体を含んでなる複合体を意味する。組織保護サイトカイン受容体複合体は複数のエリスロポエチン受容体および／またはβ共通受容体、ならびに本明細書の5.1.3節に記載の他のタイプの受容体を含有することができる。
【００２９】
用語「組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド」は、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合し、そして複合体を活性化するかまたは公知の活性化リガンドによる活性化を阻害するいずれかの化合物を意味する。「組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド」はいずれのタイプの化合物、例えば、限定されるものでないが、タンパク質、ペプチド、小分子、有機分子、または非有機分子であってもよい。組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの限定するものでない例にはEPOが含まれ、その突然変異体、化学修飾物、または組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する断片が含まれる。組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの他の例は、複合体に特異的な抗体である。
【００３０】
用語「疾患、障害、または症状を予防する」は、その発症を遅延させ、進行を妨げ、出現を妨げ、それに対して保護し、発現を阻害するかまたは排除し、またはかかる疾患、障害または症状の発生を少なくすることを意味する。用語「予防」の使用は、予防療法を受けた患者集団の全ての患者が予防の標的とした疾患、障害または症状を決して発生しないことを示唆するのでなく、むしろ患者集団が疾患、障害または症状の発生の減少を示しうることを意味する。例えば、多くのインフルエンザワクチンは、ワクチンを投与した患者集団にインフルエンザを100％予防する効果はない。予防はまた興奮組織の保護も包含する。当業者であれば、予防療法が有効である患者と状態を容易に確認することができ、例えば、限定されるものでないが、外科を計画している患者、遺伝性疾患、障害もしくは症状のリスクをもつ患者、環境因子により予想される疾患、障害もしくは症状のリスクをもつ患者、または特定の疾患、障害もしくは症状のリスクをもつ集団、例えば高齢者、幼児、または免疫系の弱い者に属する患者、または疾患、障害もしくは症状に対する遺伝的もしくは他のリスク因子をもつ患者が含まれる。
【００３１】
本発明の方法の文脈における用語「と一緒に投与する」は、疾患、障害または症状の発症の前に、発症と同時に、および／または発症の後に化合物を投与することを意味する。  4.  図面の簡単な説明
図面の簡単な説明は後記参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
5.  発明の詳細な説明
本発明は、組織保護化合物の組織保護活性を仲介するヘテロ多量体受容体複合体を利用する方法に関する。本発明は、かかる組織保護化合物を同定するスクリーニング方法およびかかる化合物の疾患、障害または症状の治療または予防における使用またはかかる化合物の興奮細胞、組織および器官の機能を増強する方法における使用を提供する。本発明はまた、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば、限定されるものでないが、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物を投与することによる、疾患、障害または症状の治療または予防の方法も提供する。本発明はまた、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば、限定されるものでないが、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物を投与することによる、興奮細胞、組織または器官の機能を増強する方法も提供する。本発明はまた、組織保護サイトカイン受容体複合体をモジュレートするかまたは標的とする化合物を投与することによる、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする方法も提供する。
【００３３】
本発明は、興奮細胞ならびに脳、脊髄および心臓などの組織内で、EPO受容体がβc受容体と複合体を形成するという本発明者らによる発見に基づく。複合体は、少なくとも１つのβc受容体と複合した少なくとも１つのEPO-Rから構成される。βc受容体に加えて他のシグナル伝達受容体を用いることができ、それには、限定されるものでないが、γc受容体およびGP130、限定されるものでないが、GM-CSF、IL-3、IL-5などを含む他のI型サイトカイン受容体、ならびに、限定されるものでないが、ROR1、NR6、HM74などを含むオーファン受容体が含まれる。本発明のスクリーニング方法は、かかる組織保護サイトカイン受容体複合体を、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定するアッセイに利用することができる。かかるアッセイには、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物またはそのリガンドを同定する結合アッセイが含まれる。本出願人らの発見は、疾患、障害および症状の治療および予防ならびに興奮細胞、組織および器官の増強に用いるのに特別に有効な化合物を同定する手段を提供する。
【００３４】
組織保護サイトカイン受容体複合体の活性化は、保護タンパク質、限定されるものでないが、ヌクレオリンおよびグロビン、例えばニューログロビンおよびサイトグロビン（ヒストグロビン）の産生のアップレギュレーションをもたらしうる。本明細書に先に記載した本発明の方法のある特定の実施形態において、組織保護活性をアッセイする場合、同定した化合物を組織保護活性についてアッセイするステップは、細胞中のヌクレオリンの存在を検出することを含む。
【００３５】
本明細書に記載した本発明の方法のある特定の実施形態において、組織保護活性をアッセイする場合、同定された化合物を組織保護活性についてアッセイするステップは、細胞中のニューログロビンまたはサイトグロビンの活性のレベルの増加を検出または測定することを含む。従って、組織保護活性をもつ化合物を同定するためのスクリーニング方法はかかるタンパク質のアップレギュレーションの検出を利用することができる。
【００３６】
この組織保護サイトカイン受容体複合体および下流レギュレーターをアッセイに用いて、限定されるものでないが、小分子および生物学的物質を含む組織保護化合物を同定することができる。これらのアッセイにより同定した化合物を用いて、中枢および末梢神経系ならびに他の興奮細胞、組織および器官の様々な症状を治療することができる。
【００３７】
5.1組織保護サイトカイン受容体複合体
本発明の方法に利用する受容体複合体は、少なくとも１つのEPO受容体と少なくとも１つのβc受容体を含んでなる。様々なタイプの天然の、改変された、および／または突然変異したEPO受容体およびβc受容体を組合わせて、かかる様々な数の受容体から構成される複合体を作ることができる。限定するものでない組織保護サイトカイン受容体複合体の例を以下に記載する。
【００３８】
5.1.1  EPO-R
哺乳動物のEPO-Rを本発明に用いることができる。EPO-RのcDNAはマウス肝から（Tojoら, 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm. 148: 443-48）、およびヒト胎児肝から（Jonesら, 1990, Blood, 76:31-35; Winkelmannら, 1990, Blood, 76:24-30）単離されている。このヒトcDNAはほぼ55kDa MWのポリペプチド鎖をコードし、508個のアミノ酸を有する。単離されかつ配列決定されているヒトEPO-Rの他のゲノムクローンも本発明で考慮されている（PennyおよびForget, 1991, Genomics 11:974-80；Noguchiら, 1991, Blood 78:2548-2556）。これらのEPO-Rの共通構造は、シグナルペプチド中のほぼ24個のアミノ酸残基、細胞外ドメイン中のほぼ226個のアミノ酸、膜貫通ドメイン中のほぼ23個のアミノ酸、および細胞質ドメイン中のほぼ235個のアミノ酸から構成される（D'AndreaおよびZon, 1990, J. Clin. Invest., 86:681-687；Jonesら, 1990, Blood, 76:31-35；PennyおよびForget, 1991, Genomics, 11:974-80）。成熟ヒトEPO-Rタンパク質はほぼ484個のアミノ酸を有する。EPO-RはBD Biosciences Clonetech（Palo Alto、CA）から市販されていてかつジーンバンク（gene bank）受託番号M60459およびSwissProt受託番号P19235を有する。
【００３９】
本発明の実施に有用なEPO-Rの型は、ヒトおよび他の哺乳動物EPO-R関係分子の天然、合成および組換え型を包含する。さらに、本発明の実施に有用なEPO-Rの型には機能的に同等の遺伝子産物であるタンパク質が含まれる。かかる機能的に同等の遺伝子産物としては突然変異EPO-Rおよび化学的に改変されたEPO-Rが挙げられる。突然変異EPO-Rは、内部欠失を含む欠失、融合タンパク質を生じる付加を含む付加、またはアミノ酸配列内および／または隣接したアミノ酸残基の保存的置換を含有してもよいが、機能的に同等のEPO-Rを産生するという点で「サイレント」な変化しか生じない。かかるアミノ酸置換は、関わる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性を基準にして行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；正電荷の（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれ；そして負電荷の（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。米国特許第5,292,654号に開示されたような他の公知のEPO-R突然変異体も本発明に包含される。
【００４０】
さらに、Harrisら 1992, J. Biol. Chem. 267:15205；Yang & Jones, 1993, Blood 82:1713；および米国特許出願公開第20020031806号に開示されたような、細胞外ドメインだけを含有するEPO受容体の（末端切断された）可溶型も、本発明における使用が考慮されている。
【００４１】
5.1.2  βc受容体
βc受容体は典型的には、ヒトGM-CSF、IL-3およびIL-5と結合するシグナル伝達受容体として同定されている。これらのサイトカインに加えて、βc受容体（例えば、Swiss受託番号P32927またはGenebank番号M59941）は、ある特定の事例においてEPO-Rと結合することが実証されている。βc受容体の保存領域は、細胞外リガンド結合領域の全てまたは一部分を構成する。本発明は、一つには、EPO-Rとβc受容体が脳（図２参照）および脊髄（図３および４参照）などの数種の興奮細胞内で共存するという本出願人らによる実証に基づく。本出願人らはまた、EPO-Rとβc受容体の複合体がこれらの複合体を発現する組織を保護しかつ修復する生理学的プロセスをもたらす機構に役立つことも発見した（図13および14を参照）。
【００４２】
本発明の実施に有用なβc受容体の形態は、ヒトおよび他の哺乳動物のβc受容体関係分子の天然、合成および組換え型を包含する。さらに、本発明の実施に有用なβc受容体の形態には、機能的に同等の遺伝子産物であるタンパク質が含まれる。かかる機能的に同等の遺伝子産物としては突然変異βc受容体および化学的に改変されたβc受容体が挙げられる。突然変異βc受容体は、内部欠失を含む欠失、融合タンパク質を生じる付加を含む付加、またはアミノ酸配列内および／または隣接したアミノ酸残基の保存的置換を含有してもよいが、機能的に同等のEPO-Rを産生するという点で「サイレント」な変化しか生じない。突然変異βc受容体としては、限定されるものでないが、1374N、FIΔ、ΔGA、H544R、V449、A459D、L445Q、CRD4点突然変異体（I374N、L356P、W358N、Q375P、Y376N、W383R、およびL399P）、および細胞外末端切断体（1GH7）が挙げられる（R.J. D’AndreaおよびT.J. Gonda、2000、Experimental Hematology 28:231-243；D’Andreaら、1998、J. Clin. Invest. 102:1951-1960；Jenkinsら、1999、J. Biol. Chem. 274:8669-8677を参照）。
【００４３】
また、限定されるものでないが、γc受容体およびGP-130、ならびにオーファン受容体を含む他の公知のシグナル伝達受容体サブユニットを本発明内で同様に利用しうることも考慮している。 
5.1.3  ヘテロ多量体受容体複合体の構造
βc受容体は、結合することが従来公知である多くの受容体、すなわち、GM-CSF、IL-3、およびIL-5受容体と多量体を形成する。例えば、GM-CSFとの受容体複合体は、GM-CSF受容体、２つのβc受容体、およびGM-CSFリガンドから構成される。EPO-Rがβc受容体と複合体を形成することは公知である（Yutakaら, 1995, Biochem. Biophy. Res. Com. 208:1060-1066；Jubinskyら, 1997, Blood, 90:1867-1873；D’Andreaら, 1998, J. Clin, Invest. 102:1951-1960を参照)。同様に、本発明によれば、βc受容体はEPO-Rとヘテロ多量体を形成して、組織保護受容体複合体を形成する。これは、βc受容体とEPO-R受容体が共沈降することを実証する免疫沈降研究に基づく（図５を参照）。
【００４４】
この組織保護受容体複合体は少なくとも１つのEPO-Rと少なくとも１つのβc受容体を含む。好ましくは、図６に示したように、組織保護受容体複合体は１以上のβc受容体を含みうる。１以上のEPO-Rを含む組織保護受容体複合体コンフィギュレーションも本発明で考慮している。本発明で考慮している組織保護受容体複合体の例としては、限定されるものでないが、EPO-R2/βc受容体2、EPO-R/βc受容体2、およびEPO-R/βc受容体3が挙げられる。組織保護受容体複合体の最も示唆されるコンフィギュレーションは、図６に描写したEPO-R/βc受容体2である。ここに示したように、いずれの特定の理論により束縛されることなく、組織保護化合物が組織保護受容体複合体と結合する可能な機構は、組織保護化合物が最初にEPO-Rと結合し、次いで２つのβc受容体がその複合体と結合することを含む。この描写は、リガンドが組織保護受容体複合体と結合する方法を単に説明するものであり、当業者であれば、結合が起こりうる他の機構を合理的に想像することができよう、例えば、受容体複合体（EPO-Rと２つのβc受容体）がリガンドと結合する前に前形成されてもよい。
【００４５】
本発明の受容体ポリペプチドは、全長受容体、受容体断片（例えば、リガンド-結合断片）および融合ポリペプチドを含めて、慣用の技術により、遺伝子操作した宿主細胞において産生させることができる。例えば、EPO受容体のエリスロポエチン結合断片は同定されている（Baroneら, J. Biol. Chem. 272:4985-4992）。βc受容体とも複合するかかる断片を本発明のスクリーニング方法に用いることができる。
【００４６】
5.2  スクリーニングアッセイ
組織保護サイトカイン受容体複合体、例えば、限定されるものでないが、以上記載した複合体を、組織保護活性を有する化合物を同定するスクリーニングアッセイに利用することができる。これらのアッセイで同定された化合物は、複合体の活性をモジュレートする、例えば、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合するかまたは組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと複合体の相互作用をモジュレートしうる。さらに、同定された化合物自体が組織保護活性を有しうる。
【００４７】
本発明は、様々な薬物スクリーニング技術のなかでも、EPO受容体-βc受容体複合体を利用することにより化合物をスクリーニングするのに特に有用である。かかる試験に使用する受容体複合体は、溶液中に遊離していても、固体支持体と結合していても、細胞表面上に埋もれていても、または細胞内に位置していてもよい。薬物スクリーニングの一方法は、ポリペプチドまたは断片を発現する組換体核酸により安定して形質転換した真核生物細胞を利用する。薬物を、かかる形質転換した細胞に対して競合結合アッセイでスクリーニングする。生存したまたは固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに利用することができる。例えば、受容体と試験する薬剤との間の複合体の形成を測定しても、または組織保護サイトカイン受容体複合体と適当な細胞系との間の複合体形成の減少を試験してもよく、これらは当技術分野では周知である。例えば、以下の6節および7節を参照。
【００４８】
上記の5.1節に記載した組織保護サイトカイン受容体複合体を同様に生物学的活性を決定するアッセイに利用することができ、例えば、ハイスループットスクリーニング用の複数受容体のパネルにおいて、生物液中の組織保護化合物のレベルを定量するように設計したアッセイにおいて、試薬（標識した試薬を含む）として、対応する組織保護化合物を優先的に発現する（構成的にまたは組織分化もしくは発生の特定段階にまたは疾患状態に）組織のマーカーとして、および、勿論、関係するリガンドを単離するために利用することができる。
【００４９】
上に掲げたアッセイを実施する方法は当業者にとって周知である。かかる方法を開示する参考文献としては、限定するものでなく、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. FritschおよびT. Maniatis 編, 1989、ならびに「酵素学の方法：分子クローニング技術の手引き（Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques）」, Academic Press, Berger, S. L.およびA. R. Kimmel 編, 1987が挙げられる。
【００５０】
ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の本発明のアッセイを用いて組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物を同定することができる。かかるアッセイは組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの不在のもとで行うことができる。相互作用は、例えば、試験化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体との結合または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性であってもよい。かかる実施形態においては、試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させる。同定する化合物は読み出し情報、例えば、限定されるものでないが、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性化、レポーター遺伝子の転写、細胞増殖、または組織保護活性を生じる化合物である。かかるアッセイは典型的には、化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させていない対照とともに実施する。化合物を伴うか伴わないかによって読み出し情報に差がある場合、組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物が同定される。あるいは、組織保護サイトカイン受容体複合体を試験化合物と接触させる前に、読み出し情報、例えば、限定されるものでないが、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性の標準レベルを測定し、そして化合物を加える前後の読み出し情報の差を用いて化合物を同定することができる。
【００５１】
ある特定の他の実施形態においては、本発明のアッセイを用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体の間の相互作用をモジュレートする、すなわち、増強するかまた妨害する化合物を同定する。かかるアッセイは、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド、例えばEPOまたは組織保護サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体の存在のもとで実施することができる。かかる実施形態においては、試験化合物の存在と不在のもとでの読み出し情報のレベルの差を検出することができる。次いで読み出し情報のレベルをEPOの不在のもとでのレベルと比較することができる。もし化合物を伴ってと伴わないで検出した読み出し情報のレベルの差がEPOの存在に依存すれば、その時は組織保護サイトカイン受容体複合体のそのリガンドとの相互作用をモジュレートする化合物が同定される。例えば、読み出し情報がEPOの存在に応じて増加する場合、もし検出した読み出し情報のレベルの差が化合物の存在のもとで読み出し情報の増加から生じれば、組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの間の相互作用のアゴニストが同定される。あるいは、読み出し情報がEPOの存在に応じて減少する場合、もし検出した読み出し情報のレベルの差が化合物の存在のもとで読み出し情報の減少から生じれば、組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの間の相互作用のアンタゴニストが同定される。読み出し情報がネガティブ読み出し情報である実施形態においては、状況が逆転する。例えば、化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体に効果を与えないときは読み出し情報が存在し、そしてかかる効果を与える化合物がアッセイに組み込まれると読出し情報が不在である、従って、ネガティブ読み出し情報は、所望の効果をもつ化合物が同定されたことを示しうる。
【００５２】
組織保護サイトカイン受容体複合体を利用するこれらのアッセイのいずれかまたは全ては、研究および／または臨床製品としての商業化に向けて、試薬グレードまたはキットフォーマットに発展させることができる。
【００５３】
5.2.1  無細胞アッセイ
本明細書に記載した組織保護サイトカイン受容体複合体を無細胞アッセイに利用して、組織保護活性を有する化合物を同定することができる。無細胞アッセイのある特定の実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体は溶液中で遊離していてもまたは固体支持体に結合していてもよい。組織保護サイトカイン受容体複合体の活性は様々な方法で測定することができる。例えば、活性は化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する能力または組織保護サイトカイン受容体複合体と化合物の結合親和力であってもよい。ある特定の実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体を、組織保護サイトカイン受容体複合体を含有する単離膜の形態で結合アッセイに加える。
【００５４】
一実施形態において、本発明は、組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させるステップ、組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ、試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加または減少する試験化合物を同定するステップ、ならびに同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップを含んでなる上記方法を提供する。
【００５５】
直接結合アッセイにおいては、リガンドおよび／または組織保護サイトカイン受容体複合体のいずれかを、試験化合物のリガンドまたは受容体との結合を可能にする条件下で試験化合物と接触させる。結合は溶液中または固体表面上で起こってもよい。好ましくは、試験化合物を予め検出のために標識する。いずれの検出可能な化合物、例えば、限定されるものでないが、発光、蛍光、または放射性同位元素または上記を含有する基、または酵素または色素などの非同位体標識を標識付けに用いることができる。結合が起こるために十分なインキュベーション期間の後に、反応物を、過剰分または非特異的に結合した試験化合物を除去する条件に曝して処置する。典型的には、適当なバッファーを用いて洗浄する。最終的に、試験化合物と結合したリガンド（例えば、EPO-試験化合物）または試験化合物と結合した組織保護サイトカイン受容体複合体の存在を検出する。
【００５６】
競合結合アッセイにおいては、試験化合物を、リガンド（例えば、EPO）の組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を破壊または増強する能力についてアッセイする。標識したリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）を組織保護サイトカイン受容体複合体またはその断片と混合し、それらの間の相互作用が通常起こる条件のもとに、試験化合物と共におよび試験化合物無しで、置くことができる。組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する標識したリガンド（例えば、EPO）の量を、試験化合物の存在または不在のもとで結合した量について比較することができる。
【００５７】
好ましい実施形態において、複合体形成と検出を容易にするために、結合アッセイは、１以上の成分を固体表面上に固定して行う。様々な実施形態において、固体支持体は、制限されるものでないが、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミドおよびアガロースであってもよい。支持体コンフィギュレーションは、ビーズ、膜、微粒子、マイクロタイタープレート、試験管または他の反応容器などのような反応容器の内部表面であってもよい。組織保護サイトカイン受容体複合体、または他の成分の固定は、共有結合または非共有結合を介して行うことができる。一実施形態においては、結合は間接的で、すなわち、結合した抗体を介してもよい。他の実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体およびネガティブ対照に、エピトープ、例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）のタグを付し、固体表面との結合に市販抗体、例えば抗GST（Santa Cruz Biotechnology）を介在させてもよい。
【００５８】
例えば、かかる親和結合アッセイは、固体支持体に固定した組織保護サイトカイン受容体複合体を用いて実施することができる。典型的には、結合反応の固定される成分、この場合、リガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）または試験化合物を標識して検出できるようにする。様々な標識方法、例えば、発光、発色団、蛍光、または放射性同位元素または上記を含有する基、および酵素または色素などの非同位体標識を入手し利用することができる。好ましい実施形態においては、試験化合物を蛍光体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC、Sigma Chemicals、St. Louisより市販）を用いて標識する。
【００５９】
標識した試験化合物、またはリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）＋試験化合物を、次いで特異的結合が起こる条件下で、固体支持体と接触させる。結合反応が行われた後に、非結合および非特異的結合の試験化合物を、表面を洗浄する方法により分離する。結合パートナーの固体相との結合は、当業者に公知の様々な方法で実施することができ、限定されるものでないが、化学架橋、プラスチック表面との非特異的接着、固体相に結合した抗体との相互作用、結合パートナー（ビオチンなど）に付着したリガンドと固体相に付着したリガンドと結合するタンパク質（アビジンまたはストレプトアビジンなど）との間の相互作用などが含まれる。
【００６０】
好ましくは、組織保護サイトカイン受容体複合体は、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する無傷の細胞（5.2.2節に記載のアッセイを参照）で、または組織保護サイトカイン受容体複合体を含有する単離した膜の形態で、結合アッセイに加えられる。従って、組織保護サイトカイン受容体複合体との直接結合、または試験化合物のリガンド-組織保護サイトカイン受容体複合体（例えば、EPO-組織保護サイトカイン受容体複合体）をモジュレートする能力は、培養または動物モデル中の無傷の細胞において、試験化合物の存在および不在のもとでアッセイすることができる。標識したリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）を、かかる細胞から得た粗抽出物と混合し、そして試験化合物を加えることができる。単離した膜を用いて組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物を同定することができる。例えば、単離した膜を用いる典型的な実験においては、細胞を遺伝子操作して組織保護サイトカイン受容体複合体を発現させることができる。膜を標準技術により採取してin vitro結合アッセイに用いることができる。標識したリガンド（例えば、125I-標識EPO）を膜と結合させて、特異的活性についてアッセイし；特異的結合を、過剰の無標識（非放射性）リガンドの存在のもとで実施した結合アッセイとの比較により決定する。
【００６１】
可溶性組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを遺伝子組換えにより発現させることもでき、無細胞に基づくアッセイに利用して、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと結合する化合物を同定することができる。あるいは、遺伝子操作により発現した組織保護サイトカイン受容体複合体のリガンド結合ドメイン、または組織保護サイトカイン受容体複合体の断片を、無細胞に基づくスクリーニングアッセイに用いることができる。他の代わりの実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体の１以上の結合ドメインに対応するペプチド、または組織保護サイトカイン受容体複合体の１以上の結合ドメインを含有する融合タンパク質を無細胞に基づくアッセイ系に用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体の細胞質部分と結合する化合物を同定することができ、かかる化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体のシグナル伝達経路をモジュレートするのに有用でありうる。無細胞に基づくアッセイにおいては、遺伝子組換えにより発現させた組織保護サイトカイン受容体複合体を固体基質、例えば試験管、マイクロタイターウエル、またはカラムに、当業者に周知の方法（Ausubelら, 1998, 「分子生物学における現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, NYを参照）によって付着させる。次いで試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する能力についてアッセイする。
【００６２】
あるいは、結合反応を溶液中で実施することができる。本アッセイにおいては、標識した成分を、溶液中でその結合パートナーと相互作用させる。もし標識した成分とその結合パートナーとの間にサイズ差があって分離が可能であれば、結合反応の生成物を、限外濾過膜を通過させることにより分離を実施することができ、ここで上記限外濾過膜は細孔が無結合の標識成分の通過を許すがその結合パートナーまたはそのパートナーと結合した標識成分の通過を許さないものである。分離はまた、標識成分の結合パートナーを溶液から捕捉することができるいずれかの試薬、例えば結合パートナーに対する抗体、結合パートナーに予め結合したリガンドと相互作用しうるリガンド結合タンパク質などを用いて実施することもできる。
【００６３】
一実施形態において、例えば、ファージライブラリーは、連続ファージディスプレイライブラリーから得たファージを、固体相、例えばプラスチックビーズに連結した精製組織保護サイトカイン受容体複合体、またはその断片もしくはドメインを含有するカラムを通過させることにより、スクリーニングすることができる。洗浄バッファーのストリンジェンシーを変えることにより、組織保護サイトカイン受容体複合体と高い親和力をもつペプチドを発現するファージを濃縮することが可能である。カラムから単離されたファージをクローニングし、短いペプチドの親和力を直接測定することができる。１以上のオリゴヌクレオチドの配列を組合わせて、組織保護サイトカイン受容体複合体またはそのリガンドとの複合体に対するさらに高い親和結合について試験することができる。どのアミノ酸配列が組織保護サイトカイン受容体複合体に対する最強の結合を与えるかを知ると、コンピューターモデルを用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体と試験化合物の間の分子的接触を同定することができる。これにより、これらの接触を模倣する非タンパク質化合物の設計が可能になろう。かかる化合物は、ペプチドと同じ活性を有しうるので、治療に用いて有効でありかつ生産コストの低い利点を有しうる。
【００６４】
本発明の態様の他の特定の実施形態において、固体支持体は、組織保護サイトカイン受容体複合体を含有しかつマイクロタイターディッシュに付着している膜である。試験化合物、例えば、ライブラリーメンバーを発現する細胞を、ライブラリーメンバーの発現を可能にする条件下で、マイクロタイターディッシュに入れて培養する。タンパク質（または核酸もしくは誘導体）と結合するライブラリーメンバーを採取する。かかる方法は、例を挙げると、ParmleyおよびSmith, 1988, Gene 73:305-318；Fowlkesら, 1992, BioTechniques 13:422-427；PCT公開第WO 94/18318号に記載されていて、本明細書に参照により引用される。
【００６５】
最後に、固体表面上に残る標識を、当技術分野で公知のいずれかの検出方法により検出することができる。例えば、もし試験化合物を蛍光体を用いて標識すれば、蛍光光度計を用いて複合体を検出することができる。
【００６６】
様々なin vitroアッセイを用いて、化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する能力、組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの相互作用をモジュレートする能力、または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする能力を同定しかつ立証することができる。
【００６７】
本発明の他の実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体またはリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）と試験化合物の間の相互作用をin vitroでアッセイすることができる。既知または未知の分子を、組織保護サイトカイン受容体複合体、またはその断片に対する特異的結合について結合を誘導する条件下でアッセイし、次いで、組織保護サイトカイン受容体複合体と特異的に結合する分子を同定する。これらの２成分は、様々な方法で測定することができる。一手法として、成分の１つを容易に検出可能な標識を用いて標識し、それを結合が起こりうる条件下で試験化合物と一緒に置き、結合した標識成分を、無結合の標識成分から分離する分離ステップを実施し、次いで結合した成分の量を測定する。一実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体を標識して、結合が起こりうる条件下で試験薬に加えることができる。試験薬の結合を、ポリアクリルアミドゲル分析を用いて決定し、試験薬の存在および不在のもとで形成される複合体を比較することができる。
【００６８】
複数のin vitroアッセイを同時にまたは逐次的に実施し、化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体が介在するプロセスに与える効果を評価することができる。その評価は、組織保護サイトカイン受容体複合体活性、例えば、試験化合物の組織保護サイトカイン受容体複合体との結合、細胞増殖、細胞分化、および保護タンパク質、例えばグロビンのアップレギュレーションを測定または検出することにより行うことができる。好ましい実施形態においては、本明細書に記載したin vitroアッセイをハイスループットフォーマットで（例えば、マイクロタイタープレート中で）実施する。
【００６９】
5.2.2  細胞に基づくアッセイ
組織保護サイトカイン受容体複合体を培養細胞において発現させ、その細胞を次いで受容体複合体に対するリガンド（天然リガンド、ならびに天然リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストを含む）についてスクリーニングすることができる。
【００７０】
細胞に基づくアッセイに対する手法を総括すると、受容体をコードするcDNAまたは遺伝子を、その発現に必要な他の遺伝子エレメント（例えば、転写プロモーター）と組合わせ、そして得られる発現ベクターを宿主細胞中に挿入する。EPO受容体またはβ共通受容体をコードするベクターを合成し、これを利用して本発明の方法に使用する目的のベクターにより宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトすることができる。安定な形質転換体の使用が好ましい。
【００７１】
DNAを発現しかつ機能性受容体を産生する細胞を選択し、そして、以下に開示する様々な可能なスクリーニング系とともに使用する。
【００７２】
組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの相互作用をモジュレートする化合物を同定するための細胞に基づく方法の一例は、次のステップ：(a)試験化合物を、リガンドおよび組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ；および(b)細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップを含んでなり、そこで、もし(b)で測定した活性のレベルが試験化合物の不在のもとでの組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと異なれば、組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの相互作用をモジュレートする化合物が同定される。
【００７３】
組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法の他の例は、試験化合物をEPO受容体またはβ共通受容体を発現するように組換え遺伝子操作された細胞と接触させるステップであって、上記細胞は(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体またはEPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸で形質転換される上記ステップ、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを測定するステップ、対照細胞で測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルと比較して、細胞内の組織保護サイトカイン受容体複合体活性のレベルを増加するかまたは減少する試験化合物を同定するステップであって、対照細胞は試験化合物と接触させた細胞と同じ細胞型であり、(i)プロモーターと機能しうる形で連結されかつ(ii)β共通受容体またはEPO受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸で形質転換されない上記ステップ、および同定した試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップを含んでなる。
【００７４】
あるいは、細胞に基づくアッセイを用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物を同定することができる。例えば、試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させ、結合親和力、細胞増殖またはレポーター遺伝子転写物の存在により測定した組織保護サイトカイン受容体複合体の活性を決定することができる。試験化合物の不在のもとでの組織保護サイトカイン受容体複合体の活性と比較して、もし組織保護サイトカイン受容体複合体の活性が異なる、例えば、増加するかまたは減少するのであれば、そこで組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物が同定される。
【００７５】
本明細書に以上記載した本発明の方法の、組織保護サイトカイン受容体複合体活性を測定するある特定の実施形態においては、かかる活性を細胞増殖または細胞分化により測定する。
【００７６】
本明細書に以上記載した本発明の方法の、組織保護サイトカイン受容体複合体活性を測定するある特定の実施形態において、測定されるかかる活性は、組織保護サイトカイン受容体複合体の組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと相互作用する能力である。
【００７７】
細胞に基づくスクリーニングアッセイは、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドの両方を検出するために有用である。アゴニスト（天然リガンドを含む）およびアンタゴニストは、in vitroおよびin vivoの両方の応用において非常に大きな可能性を有する。受容体アゴニストと同定された化合物はin vitroおよびin vivoにおいて標的細胞の増殖および発生を刺激するために有用である。例えば、アゴニスト化合物は規定細胞培地の成分として有用であり、単独でまたは他のサイトカインおよびホルモンと組合わせて細胞培養で通常使われる血清と置換えるのに用いることができる。アゴニストは、培養におけるEPO-応答細胞（限定されるものでないが、神経、心臓および網膜由来の細胞を含む）の増殖および／または発生を特に促進するのに有用でありうる。アンタゴニストは、リガンド-受容体相互作用の部位を特徴づけるための研究試薬として有用である。in vivoで、受容体アゴニストまたはアンタゴニストは、神経、心臓および／または網膜疾患の治療に使用されうる。様々な好適なアッセイが当技術分野において公知である。これらのアッセイは標的細胞における生物学的応答の検出に基づくものであってもよい。
【００７８】
一実施形態においては、リガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）の組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、動物モデルの無傷の細胞でアッセイすることができる。標識したリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）を、試験化合物と共にまたは試験化合物なしで動物に直接投与することができる。組織保護サイトカイン受容体複合体と結合するリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）の下流効果、例えば、組織保護または細胞増殖を、試験化合物の存在および不在のもとで測定することができる。これらのアッセイについては、試験化合物を加える相手の宿主細胞は、組織保護サイトカイン受容体複合体および／またはリガンド（例えば、EPOまたはカルバミル化EPO）を発現するように遺伝子操作されていてもよく、一過的、誘導性もしくは構成的、または安定的であってもよい。本発明のスクリーニング方法の目的のために、多様な宿主細胞を用いることができ、限定されるものでないが、組織培養細胞、哺乳動物細胞、および酵母細胞が含まれる。組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する哺乳動物細胞、例えば、脳細胞またはその他の細胞は、本発明のアッセイを行うのに好ましい細胞型である。 
5.2.2.1  細胞
好ましい実施形態において、本発明の方法に使用する細胞は哺乳動物細胞である。さらに好ましい実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は目的の組織またはその他の生物学的サンプルから単離した一次細胞である。当業者であれば、色々な細胞型を、化合物をスクリーニングまたは同定する方法に使用することができるのを理解するであろう。使用する細胞型は、内在的にEPO受容体、β共通受容体、EPO受容体とβ共通受容体の両方を発現してもよくまたはEPO受容体もしくはβ共通受容体を発現しなくてもよい。好ましい実施形態において、宿主細胞は興奮組織から誘導される。好ましい実施形態において、宿主細胞は興奮神経組織から誘導される。
【００７９】
限定するものでない例示として、応答または興奮細胞は、神経、網膜、筋肉、心臓、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎皮質、副腎髄質、毛細管内皮、精巣、卵巣、膵臓、骨、皮膚、または子宮内膜の細胞または組織であってもよい。さらに、限定するものでない応答または興奮細胞の例としては、光受容体（桿体および錐体）、神経節、双極性、水平、アマクリン、ミュラー（Muller）、プルキンエ（Purkinje）、心筋、ペースメーカー、洞房結節、洞結節、接合部組織、房室結節、ヒス束、肝細胞、星状、クッパー（Kupffer）、メサンギウム、腎上皮、管状間質、杯（goblet）、腸腺（陰窩）、腸内分泌、球状帯、束状化、網状帯、クロム親和性、周皮細胞、ライディヒ（Leydig）、セルトーリ（Sertoli）、精子、グラーフ卵胞、始原卵胞、ランゲルハンス島、α-細胞、β-細胞、γ-細胞、F-細胞、前骨芽細胞、破骨細胞、骨芽細胞、子宮内膜間質、子宮内膜、幹および内皮細胞が挙げられる。
【００８０】
組織保護サイトカイン受容体複合体を発現しかつ受容体が介在するシグナルを伝達するために用いる好適な哺乳動物細胞は、機能性組織保護受容体複合体を形成するために使われる受容体サブユニットの少なくとも１つを発現する細胞を含む。これらのサブユニットは、クラスIサイトカイン受容体のサブユニットを含む。本発明のある特定の実施形態においてはまた、発現させる受容体と同じ種由来の細胞を使用することも好ましい。好ましい実施形態において、細胞はその増殖を外因的に供給される造血成長因子に依存する。ある特定の好ましい実施形態においては、この型の細胞系はヒトTF-1細胞系（ATCC番号CRL-2003）およびAML-193細胞系（ATCC番号CRL-9589）であり、これらはGM-CSF-依存性ヒト白血病細胞系である。別の実施形態においては、好適な宿主細胞を遺伝子操作して、必要な受容体サブユニットまたは所望の細胞応答に必要とされる他の細胞成分を産生させることができる。例えば、マウス細胞系BaF3（PalaciosおよびSteinmetz, 1985, Cell 41:727-734；Mathey-Prevotら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135）またはベビーハムスター腎（BHK）細胞系をトランスフェクトして必要なEPO-Rおよびβc受容体を発現させることができる。後者の手法は、細胞系を遺伝子操作していずれの種由来の受容体サブユニットでも発現させることができ、それにより種特異性から生じる潜在的制限を克服するので有利である。別の実施形態においては、BaF3細胞系のマウスcDNAのように、ヒト受容体cDNAの種オルソログを同じ種内でクローニングして利用することができる。従って、造血増殖因子、例えばGM-CSFに依存する細胞系を遺伝子操作して、組織保護受容体複合体リガンド依存性にすることができる。
【００８１】
同様に当業者は、上記アッセイが、類似の方法で形質転換することができる他の細胞系中で実施できることを理解するであろう。さらに、細胞増殖アッセイは、EPOとβc受容体の両方を有することが分かっている細胞において実施することができる。かかる細胞としては、好ましくは、神経細胞の細胞系（限定されるものでないが、P-19、PC-12、および星状細胞を含む）またはEPO応答性であることが分かっている他の細胞系（限定されるものでないが、網膜および心細胞を含む）が挙げられる。これらの細胞系におけるEPOとβc受容体の両方の存在は、当業者に周知の免疫沈降法を用いて確認することができる。
【００８２】
遺伝子組換えにより組織保護サイトカイン受容体複合体を産生させるために利用するかまたは本発明のスクリーニング手法に利用することができる他の宿主細胞としては、限定されるものでないが、ハイブリドーマ、プレB細胞、293細胞、293T細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、K562細胞、3T3細胞が挙げられる。好ましい実施形態において、宿主細胞は、ある供給源、例えば、組織から誘導された不死化細胞系である。さらに本発明に使用することができる他の宿主細胞としては、限定されるものでないが、酵母細胞、ウイルス感染細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または植物細胞が挙げられる。
【００８３】
好ましい哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものでないが、ヒト、サルおよびげっ歯類（例えば、Kriegler M. in 「遺伝子導入と発現：実験室マニュアル（Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual）」, New York, Freeman & Co. 1990を参照）、例えば、SV40により形質転換したサル腎細胞系（COS-7、ATCC受託番号CRL 1651）；ヒト胚腎細胞系（増殖のために懸濁培養中にサブクローニングした293、293-EBNA、または293細胞、Grahamら, 1977, J. Gen. Virol., 36:59）；ベビーハムスター腎細胞（BHK、ATCC受託番号CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞-DHFR（CHO、UrlaubおよびChasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77；4216）；マウスセルトーリ（sertoli）細胞（Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）；マウス線維芽細胞（NIH-3T3）、サル腎細胞（CVI、ATCC受託番号CCL 70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76、ATCC受託番号CRL-1587）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA、ATCC受託番号CCL 2）；イヌ腎細胞（MDCK、ATCC受託番号CCL 34）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A、ATCC受託番号CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC受託番号CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2、HB 8065）；およびマウス乳癌細胞（MMT 060562、ATCC受託番号CCL51）由来の細胞が挙げられる。好適な培養哺乳動物細胞としては、COS-1（ATCC番号CRL 1650）、BHK（ATCC番号CRL 1632）、およびBHK 570（ATCC番号CRL 10314）、293（ATCC番号CRL 1573；Grahamら, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）細胞系が挙げられる。さらなる好適な細胞系が当技術分野では公知であり、American Type Culture Collection, Manassas, Vaなどの公的寄託機関から利用することができる。
【００８４】
他の有用な真核生物宿主-ベクター系は酵母および昆虫系を含む。酵母では、構成または誘導プロモーターを含有する多数のベクターを、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）（メタノール資化酵母）、およびハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（メタノール資化酵母）とともに用いることができる。概説については、「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, Vol.2, 1988, 編 Ausubelら, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch.13；Grantら, 1987, 「酵母用の発現および分泌ベクター（Expression and Secretion Vectors for Yeasts）」 ,「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」, Wu & Grossman編, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol.153, pp.516-544；Glover, 1986, 「DNAクローニング（DNA Cloning）」, Vol.II, IRL Press, Wash., D.C., Ch.3；およびBitter, 1987, 「酵母における異種遺伝子発現（Heterologous Gene Expression in Yeast）」, 「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」, 編. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684；および「酵母サッカロミセスの分子生物学（The Molecular Biology of Yeast Saccharomyces）」, 1982, 編 Strathernら, Cold Spring Harbor Press, Vol.IおよびII.を参照されたい。
【００８５】
酵母細胞、そして特にサッカロミセス属の細胞を含む真菌細胞も、本発明内で、例えば、受容体ポリペプチド、受容体断片、ポリペプチド融合体、または複合体を産生させるために、および組織保護サイトカイン活性をモジュレートする化合物を同定する細胞に基づくアッセイに使用することができる。酵母細胞を外因性DNAを用いて形質転換してそれから組換体ポリペプチドを産生させる方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；およびMurrayら、米国特許第4,845,075号に開示されている。形質転換された細胞を、選択マーカーにより確認した表現型（通常、薬物耐性または特定の栄養（例えば、ロイシン）不在のもとでの増殖能力）によって選択される。酵母に用いる好ましいベクター系は、Kawasakiら（米国特許第4,931,373号）に開示されたPOT1ベクター系であって、このベクター系は形質転換した細胞のグルコース含有培地での増殖による選択を可能にする。酵母に用いる好適なプロモーターおよびターミネーターとしては、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものが挙げられる。また、米国特許第4,990,446号；第5,063,154号；第5,139,936号および第4,661,454号も参照されたい。ハンスネラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・メタノリカ（Pichia Methanolica）、ピチア・ギレルモンジイ（Pichia guillermondii）およびカンジダ・モルトーサ（Candida Moltosa）を含む、他の酵母用の形質転換系も本発明における使用に利用可能である（例えば、Gleesonら, 1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465、およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照）。アスペルギルス属（Aspergillus）細胞を、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法によって利用することもできる。アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号により開示されている。パンカビ属（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。
【００８６】
目的の核酸配列を宿主細胞中に導入する標準的な方法を利用することができる。形質転換は、例えばウイルスにポリヌクレオチドをパッケージングしそして宿主細胞にそのウイルスを形質導入する方法を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するいずれの公知の方法によってもよく、かつポリヌクレオチドを直接取込んでもよい。使用する形質転換手法は、形質転換される宿主に依存する。直接取込みによる哺乳動物細胞形質転換（すなわち、トランスフェクション）は、Graham & Van der Eb, 1978, Virol. 52:546のリン酸カルシウム沈降法、またはその様々な公知の変法を用いて実施することができる。組換えポリペプチドを細胞、特に哺乳動物細胞中に導入する他の方法としては、デキストランを介するトランスフェクション、リン酸カルシウムを介するトランスフェクション、ポリブレンを介するトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内封入、およびポリヌクレオチドの核中への直接マイクロインジェクションが挙げられる。かかる方法は当業者に周知である。
【００８７】
好適な宿主細胞は、培養で増殖した外因性DNAを用いて形質転換もしくはトランスフェクトすることができる細胞型であって、それらには真菌細胞および培養された高等真核生物細胞が含まれる。真核生物細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローニングしたDNA分子を操作しかつ外因性DNAを様々な宿主細胞中に導入する技術は、Sambrookら, 「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989、およびAusubelら, 編, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987に開示されている。
【００８８】
形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を従来の手法によって、選ばれた宿主細胞の増殖に要求される栄養および他成分を含有する培地で培養する。規定培地および複合培地を含む様々な好適な培地が当技術分野で公知であり、これらは一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含有する。培地はまた、必要によって、増殖因子または血清などの成分も含有する。
【００８９】
培養哺乳動物細胞は本発明内の好ましい宿主である。外因性DNAを哺乳動物宿主細胞中に導入する方法としては、リン酸カルシウムを介するトランスフェクション（Wiglerら, 1978, Cell 14:725；CorsaroおよびPearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603；GrahamおよびVan der Eb, 1973, Virology 52:456）、エレクトロポレーション（Neumannら, 1982, EMBO J. 1:841-845）、DEAE-デキストランを介するトランスフェクション（Ausubelら, 編, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987）、およびリポソームを介するトランスフェクション（Hawley-Nelsonら, 1993, Focus 15:73；Ciccaroneら, 1993, Focus 15:80）が挙げられる。本発明の受容体複合体の成分であるポリペプチドを含む組換えポリペプチドの培養哺乳動物細胞における産生は、例えば、Levinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；およびRingold、米国特許第4,656,134号により開示されている。一般的に強力な転写プロモーター、例えばSV-40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターが好ましい（例えば、米国特許第4,956,288号を参照）。他の好適なプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター（米国特許第4,579,821号および第4,601,978号）およびアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。一般的に増殖培地は、外因的に加えられたDNAを含有する細胞を、例えば、薬物選択または必須栄養の欠如により選択し、これは発現ベクターで運ばれるかまたは宿主細胞に共トランスフェクトされた選択マーカーにより補完される。
【００９０】
好ましい実施形態においては、目的の構築物を含有する安定な細胞系をハイスループットスクリーニング用に作製する。かかる安定な細胞系は、細胞に選択マーカーを含有する構築物を導入し、細胞を1〜2日間富栄養培地で増殖し、次いで細胞を選択培地で増殖することにより作製される。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を与え、細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にするので、次いでこの増殖巣をクローニングして細胞系に拡大することができる。
【００９１】
一般的に、薬物選択が外来DNAが挿入されている培養哺乳動物細胞を選択するために利用される。かかる細胞は通常「トランスフェクタント（transfectant）」と呼ばれる。選択剤の存在のもとで培養されていてかつ目的の遺伝子を子孫に継代することができる細胞は「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。多数の選択系を利用することができ、限定されるものでないが、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子を、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞に使用することができる。また、抗代謝耐性を選択の基礎として用いることができ、dhfr遺伝子はメトトレキセート耐性を与え（Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O’Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；gpt遺伝子はミコフェノール酸耐性を与え（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；neo遺伝子はアミノグリコシドG-418耐性を与え（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）；そしてhygro遺伝子はハイグロマイシン耐性を与える（Santerreら, 1984, Gene 30:147）。好ましい選択マーカーの１つは抗生物質ネオマイシン耐性をコードする遺伝子である。選択を、ネオマイシン型薬物、例えばG-418などの存在のもとで実施することができる。目的の遺伝子の発現レベルを増加する選択系、「増幅」と呼ばれるプロセスも利用することができる。増幅は、トランスフェクタントを低レベルの選択剤の存在のもとで培養し、次いで選択剤の量を増加することにより実施し、導入した遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択する。好ましい増幅可能な選択マーカーはメトトレキセート耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬物耐性遺伝子（例えば、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も利用することができる。
【００９２】
ある特定の実施形態においては、BaF3、すなわちβc受容体を持つインターロイキン3依存性プレB細胞系を、組換えEPO-Rを用いてトランスフェクトすることができる。次いでEPO-Rの存在をゼオシン（2mg/mlにて）およびピューロマイシン（2μg/mlにて）などの化合物に対する耐性により選択することができる。
【００９３】
5.2.2.2  BaF3細胞アッセイ
BaF3細胞アッセイはまた、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定するために利用することもできる。
【００９４】
例えば、受容体複合体を介するシグナル伝達経由のBaF3細胞増殖を試験するアッセイは、次のように実施することができる。96ウエルプレートに、増殖培地（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン）のみによる8種類の1:2連続希釈液、および目的の小分子、生体化合物または化合物を入れる。それぞれの希釈液の最終容積をほぼ100μlとする。
【００９５】
BaF3親細胞系およびEPO-Rを用いてトランスフェクトしたBaF3細胞を、次いで増殖培地（上記参照）で3回洗浄し、そしてペレットを増殖培地中に再懸濁し、そして細胞を計数し、増殖培地中に希釈して5,000細胞/100μlとすることができる。次いで希釈した細胞の100μlを、それぞれのサンプル希釈液に加えることができる。次いでアッセイプレートを3〜4日間、37℃培養器に入れてインキュベートすることができる。Alomarブルーの20μlアリコートをそれぞれのウエルに加えることができ、そのプレートを一夜37℃にてインキュベートする。プレートを、蛍光プレートリーダー上で544の励起波長と590の発光波長にて読み取る。
【００９６】
もし化合物が組織保護活性を示せば、BaF3細胞は、目的の小分子、生体化合物または化合物に曝すと増殖するはずである。
【００９７】
組織保護受容体複合体に対する天然リガンドはまた、その受容体複合体を発現する細胞系を突然変異させて自己分泌増殖について選択する条件下でそれを培養することにより同定することができる（WIPO公開WO 95/21930を参照）。典型的な手法として、組織保護受容体複合体および必要な追加サブユニットを発現するBaF3細胞を、例えば2-エチルメタンスルホン酸（EMS）を用いて突然変異させる。次いでその細胞をIL-3の存在のもとで回収し、次いでIL-3およびIL-4を欠く培地へ移す。生存細胞を組織保護受容体複合体リガンドの産生についてスクリーニングし、そのスクリーニングは、例えば可溶性受容体を培地に加えることによるかまたは野生型BaF3細胞および受容体を発現するBaF3細胞について馴化培地をアッセイすることによる。
【００９８】
5.2.2.3  レポーター遺伝子アッセイ
本発明のある特定の実施形態においては、さらにレポーター遺伝子を発現するように遺伝子操作した細胞を、組織保護活性をもつ化合物を同定するアッセイに使用する。レポーター遺伝子を受容体連結経路に応答するプロモーターエレメントと連結すると、そのアッセイはレポーター遺伝子の転写活性化を検出する。
【００９９】
例えば、本発明の方法に整合するレポーター遺伝子アッセイは、その活性化複合体が宿主細胞中の転写因子の産生をもたらす組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を試験するのに関わってもよい。宿主細胞はまた、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と機能しうる形で連結されかつその発現が転写アクチベーターにより制御されるSREプロモーターも含み、そしてルシフェラーゼ遺伝子産物が組織保護サイトカイン受容体複合体を活性化する化合物の存在に応答して、細胞中でオンまたはオフ（すなわち、存在もしくは不在であるかまたは異なる量で存在）のいずれかであるようにする。
【０１００】
本発明はその上さらに、組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、試験化合物を、組織保護サイトカイン受容体複合体活性と関連する制御エレメントと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて形質転換されている組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞と接触させるステップ、試験化合物の不在のもとで測定したレポーター遺伝子発現のレベルと比較してレポーター遺伝子発現のレベルを増加させるかまたは減少させる試験化合物を同定するステップ、および同定された試験化合物を組織保護活性についてアッセイするステップを含んでなる上記方法を提供する。本発明の方法の特定の実施形態において、制御エレメントは血清応答エレメントである。本発明はその上さらに、組織保護活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、試験化合物を、(i)転写アクチベーターのDNA結合ドメインに対する特異的結合部位と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子を含んでなる核酸配列、(ii)(A)転写アクチベーターのDNA結合ドメインと(B)第１組織保護サイトカイン受容体ポリペプチドまたはその断片を含む第１融合タンパク質、ならびに(iii)(A)転写アクチベーターの活性化ドメインと(B)第２組織保護サイトカイン受容体を含む第２融合タンパク質を含んでなる細胞と接触させるステップ、ならびに遺伝子発現を検出するステップを含んでなり、もし試験化合物の存在のもとで検出したレポーター遺伝子発現が試験化合物の不在のもとで検出したレポーター遺伝子発現と比較して異なれば、組織保護活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法を提供する。
【０１０１】
当業者に周知のいずれのレポーター遺伝子を、化合物の組織保護サイトカイン介在プロセスまたは保護グロブリンのアップレギュレーションに与える効果を確認するレポーター遺伝子構築物に用いてもよい。この関係で好ましいプロモーターエレメントは血清応答エレメント、またはSREである（例えば、Shawら, 1989, Cell 56:563-572を参照）。かかるレポーター遺伝子の好ましい型はルシフェラーゼ遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ（renilla）ルシフェラーゼ、およびコメツキムシ（click beetle）ルシフェラーゼ）である（de Wetら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:725）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、発光により当技術分野で公知の方法を用いて検出する（例えば、Baumgartnerら, 1994, J. Biol. Chem. 269:29094-29101；Schenborn and Goiffin, 1993, Promega Notes 41:11）。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Promega Corp.（Madison, Wis）から市販されている。この型の標的細胞系を用いて化学品のライブラリー、細胞馴化培地、真菌培養液、土壌サンプル、水サンプルなどをスクリーニングすることができる。例えば、細胞馴化培地サンプルのバンクを標的細胞についてアッセイしてリガンドを産生する細胞を同定することができる。次いでポジティブ細胞を用いて哺乳動物発現ベクターのcDNAライブラリーを作り、これをプールに分割し、そして宿主細胞中にトランスフェクトして発現させる。次いでトランスフェクトした細胞から得た培地サンプルをアッセイし、続いてプールの分割、再トランスフェクション、二次培養およびポジティブ細胞の再アッセイを行い、リガンドをコードするcDNAクローンを単離する。
【０１０２】
レポーター遺伝子の例としては、限定されるものでないが、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および青色蛍光タンパク質）、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）、ホースラッディシュペルオキシダーゼ（HRP）およびアルカリホスファターゼ（AP）が挙げられる。あるいはまた、レポーター遺伝子が、例えば、限定されるものでないが、myc、His、FLAG、またはGSTのようなタンパク質タグとなることもでき、これによって、ナンセンス抑制がペプチドを産生し、ELISA、ウェスタンブロット、またはタンパク質タグを検出するいずれか他のイムノアッセイにより、そのタンパク質をモニターすることもできる。かかる方法は当業者に周知である。
【０１０３】
本発明のスクリーニング方法はまた、他のレポーター遺伝子の使用も包含する。レポーター遺伝子を得て、そのエレメントのヌクレオチド配列を当業者に周知のいずれかの方法により決定することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、文献またはGenBankなどのデータベースから得ることができる。あるいは、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを好適な供給源から得た核酸から作製することができる。もし特定のレポーター遺伝子をコードする核酸を含有するクローンを利用できないがレポーター遺伝子の配列が判っていれば、レポーター遺伝子をコードする核酸を化学的に合成するかまたは好適な供給源（例えば、cDNAライブラリー、好ましくはレポーター遺伝子を発現するいずれかの組織または細胞から単離したポリA+RNAから作製したcDNAライブラリーまたは核酸）からPCR増幅により得ることができる。一旦、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列が決定されれば、ヌクレオチド配列を操作する当技術分野で周知の方法、例えば、組換えDNA技術、位置指定突然変異、PCRなどを用いて、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を操作し（例えば、Sambrookら, 1990, 「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら, 編, 1998, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照、上記両文献は参照により本明細書にその全てが組み入れられる）、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作るための様々なアミノ酸配列を有するレポーター遺伝子を作製することができる。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、上記のレポーター遺伝子アッセイを、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの不在のもとで実施することができる。かかる実施形態において、同定される試験化合物は組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物である。ある特定の実施形態において、上記のレポーター遺伝子アッセイを組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド、例えばEPOの存在のもとで実施することができる。かかる実施形態において、試験化合物の存在および不在のもとでのレポーター遺伝子の転写レベルの差を検出することができる。次いで転写産物のレベルをEPOの不在のもとでのそのレベルと比較することができる。もし化合物有りおよび無しで検出される転写産物レベルの差がEPOの存在に依存するのであれば、そこで、組織保護サイトカイン受容体複合体とEPOの相互作用をモジュレートする化合物が同定される。例えば、もし検出される転写レベルの差が化合物の存在のもとで増加し、その増加がEPOの存在に依存すれば、そこで、EPOと組織保護サイトカイン受容体複合体の間の相互作用に対するアゴニストが同定される。
【０１０５】
5.2.2.4  酵母ツーハイブリッドアッセイ
「ツーハイブリッド」系を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）中のタンパク質-タンパク質相互作用を検出することができる（FieldsおよびSong, 1989, Nature 340:245-246；FieldsおよびSongによる米国特許第5,283,173号）。相互作用が酵母中でスクリーニングされるので、この系で検出される分子内タンパク質相互作用は哺乳動物細胞中の条件を模倣する生理学的条件下で起こる（Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9578-9581）。このアッセイは、転写アクチベーターの２つの機能性ユニットであるDNA-結合ドメインおよび活性化ドメインに融合されている２つのタンパク質ドメインの相互作用を介して、GAL4の様な転写アクチベーターの再構築を利用する（Johnston, 1987, Microbiol. Rev. 51:458-476）。これはGAL4のような特定の転写因子の２部分（bipartite）特性によって可能である。２部分の特徴は、DNA結合と活性化機能が別々のドメイン中に存在しかつトランス作用で機能し得ることを意味する（Keeganら, 1986, Science 231:699-704）。転写アクチベーターの再構築は、レポーター遺伝子、例えば、転写アクチベーターのDNA結合ドメインに対する結合部位を含有するプロモーター（上流活性化配列またはUAS）の制御下にあるlacZ遺伝子の活性化によりモニターされる。この方法は、2種の既知のタンパク質間の相互作用を検出するため（FieldsおよびSong, 1989, Nature 340:245-246）または既知のタンパク質と結合しうる集団からの相互作用するタンパク質を同定するため（Durfeeら, 1993, Genes Dev. 7:555-569；Gyurisら, 1993, Cell 75:791-803；Harperら, 1993, Cell 75:805-816；Vojtekら, 1993, Cell 74:205-214）に、最も一般的に用いられている。本明細書に記載の酵母ツーハイブリッドアッセイの方法の変法および酵母ツーハイブリッドアッセイのその他の方法は当業者に周知であり、そして本発明のスクリーニング方法に利用することができる。
【０１０６】
改良酵母ツーハイブリッド系による相互作用タンパク質の同定は、レポーター遺伝子の発現の検出に基づくものであり、上記レポーター遺伝子の転写は、転写レギュレーターの半分づつとそれぞれ融合した２種のタンパク質の相互作用による転写レギュレーターの再構築に依存する。「餌タンパク質（bait）」（すなわち、本発明の組織保護サイトカイン受容体複合体またはその誘導体または類似体）および「獲物タンパク質（prey）」（餌タンパク質と相互作用する能力を試験するタンパク質）をそれぞれDNA結合部位ドメインおよび転写制御ドメイン（または逆でもよい）との融合タンパク質として発現させる。
【０１０７】
特定の実施形態においては、無作為なペプチドを発現する組換え生物学的ライブラリーを獲物核酸の供給源として利用することができる。
【０１０８】
一般的に、餌タンパク質および獲物タンパク質集団は、それぞれの予め選択した配列に近接するタンパク質を含む融合（キメラ）タンパク質（好ましくはキメラコード配列の遺伝子組換え発現による）として提供される。１つの集団について、予め選択される配列はDNA結合ドメインである。DNA結合ドメインは、プロモーター内のDNA配列を特異的に認識する限り、いずれのDNA結合ドメインであってもよい。例えば、DNA結合ドメインは転写アクチベーターまたはインヒビターのDNA結合ドメインである。他の集団について、予め選択された配列は、それぞれ転写アクチベーターまたはインヒビターのアクチベーターまたはインヒビタードメインである。制御ドメイン単独（タンパク質配列との融合体としてでなく）とDNA結合ドメイン単独（タンパク質配列との融合体としてでなく）とは検出しうる相互作用の無いことが好ましい（アッセイでの偽陽性を避けるために）。アッセイ系はさらに、転写アクチベーター（またはインヒビター）のDNA結合ドメインに対する結合ドメインを有するプロモーターと機能しうる形で連結されているレポーター遺伝子を含む。従って、本発明の本方法において、組織保護サイトカイン受容体複合体融合タンパク質の獲物タンパク質融合タンパク質との結合は、転写アクチベーター（またはインヒビター）の再構築をもたらし、レポーター遺伝子の発現を活性化（または阻害）する。レポーター遺伝子の転写の活性化（または阻害）は細胞内で、例えば原核生物または真核生物細胞内、好ましくは細胞培養内で起こる。
【０１０９】
レポーター遺伝子のヌクレオチド配列と機能しうる形で連結されたプロモーターは、ヌクレオチド配列の天然型または非天然型のプロモーターであってよく、融合タンパク質のDNA結合ドメイン部分により認識されるDNA結合部位はプロモーターに対して天然型のものであっても（もしプロモーターが通常かかる結合部位を含有すれば）またはプロモーターに対して非天然型のものであってもよい。あるいは、所望の遺伝子の転写活性化結合部位を除去してGAL4結合部位により置き換えてもよい（Bartelら, 1993, BioTechniques 14:920-924、Chasmanら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:4746-4749）。
【０１１０】
本アッセイに用いる活性化ドメインおよびDNA結合ドメインは、これらの転写アクチベーターが分離可能な結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有する限り、様々な転写アクチベータータンパク質から誘導することができる。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のGAL4タンパク質（Maら, 1987, Cell 48:847-853）、酵母サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のGCN4タンパク質（Hope &  Struhl, 1986, Cell 46:885-894）、酵母サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のARD1タンパク質（Thukralら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2360-2369）、およびヒトエストロゲン受容体（Kumarら, 1987, Cell 51:941-951）は分離可能なDNA結合と活性化ドメインを有する。融合タンパク質に用いるDNA結合ドメインと活性化ドメインは同じ転写アクチベーター由来である必要はない。特定の実施形態においては、GAL4またはLEXA DNA結合ドメインを用いる。他の実施形態においては、GAL4または単純ヘルペスウイルスVP16（Triezenbergら, 1988, Genes Dev. 2:730-742）活性化ドメインを用いる。特定の実施形態において、GAL4のアミノ酸1-147（Maら, 1987, Cell 48:847-853；Ptashneら, 1990, Nature 346:329-331）がDNA結合ドメインであり、そしてVP16のアミノ酸411-455（Triezenbergら, 1988, Genes Dev. 2:730-742; Cressら, 1991, Science 251:87-90）が活性化ドメインを含む。
【０１１１】
特定の実施形態においては、様々な融合タンパク質集団をコードするプラスミドを、１以上のレポーター遺伝子を含有する単一の宿主細胞（例えば、一倍体の酵母細胞）中に同時形質転換によって同時に導入し、タンパク質-タンパク質相互作用についてのアッセイを実施することができる。または、好ましくは、２つの融合タンパク質集団を、接合（例えば、酵母細胞に対する）または細胞融合（例えば、哺乳動物細胞の）によって単一細胞中に導入する。接合型アッセイにおいて、結合ドメイン融合表現構築物（好ましくはプラスミド）と活性化（またはインヒビター）ドメイン融合発現構築物（好ましくはプラスミド）をそれぞれ用いて形質転換されている逆接合型の一倍体酵母細胞の接合は、同二倍体細胞中に両方の構築物を送達しうる。酵母株の接合型は、HO遺伝子を用いる形質転換により操作することができる（HerskowitzおよびJensen, 1991, Meth. Enzymol. 194:132-146）。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、酵母相互作用接合アッセイを、２つの異なる型の宿主細胞、すなわち酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のａ型株とα型株を用いて行う。宿主細胞は好ましくは、それぞれ、（例えば、転写アクチベーターの）DNA結合ドメインに対する１以上の結合部位を持つ少なくとも２つのレポーター遺伝子を含有する。アクチベータードメインおよびDNA結合ドメインは、タンパク質の２つの個別の集団から形成されるキメラタンパク質のそれぞれの部分である。宿主細胞の１つの株、例えばａ型株は、ヌクレオチド配列のライブラリーの、転写アクチベーター（例えばGAL4）のDNA結合ドメインとの融合体を含有する。このセットの宿主細胞に発現されるハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子構築物中のプロモーターまたはエンハンサー領域のDNA結合部位を認識することができる。酵母宿主細胞の第２のセット、例えばα型株は、転写アクチベーターの活性化ドメインと融合したDNA配列のライブラリーの融合体をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【０１１３】
特定の実施形態において、本発明は、１以上のタンパク質-タンパク質相互作用を検出する方法であって、(a)遺伝子組換えにより、第１接合型である酵母細胞の第１集団に、組織保護サイトカイン受容体複合体の配列またはその断片およびDNA結合ドメインを含有する第１融合タンパク質を発現させるステップであって、上記酵母細胞の第１集団は、上記DNA結合ドメインにより認識される１以上のDNA結合部位により駆動されるプロモーターと機能しうる形で連結された第１ヌクレオチド配列を含有するので、上記第１融合タンパク質の、転写活性化ドメインを含んでなる第２融合タンパク質との相互作用は、第１核酸配列の転写の増加をもたらすことを特徴とする上記ステップ；(b)上記第１ヌクレオチド配列の転写の増加が上記第２融合タンパク質の不在のもとで起こる上記第１集団の酵母細胞を排除するようにネガティブに選択するステップ；(c)上記第１接合型と異なる第２接合型の酵母細胞の第２集団に、複数の上記第２融合タンパク質を遺伝子組換えにより発現させるステップであって、それぞれの第２融合タンパク質はタンパク質の断片、誘導体または類似体の配列および上記第２融合タンパク質と同じである転写アクチベーターの活性化ドメインを含んでなる上記ステップ；(d)上記酵母細胞の第１集団を上記酵母細胞の第２集団と接合させて二倍体酵母細胞の第３集団を形成させるステップであって、上記二倍体酵母細胞の第３集団は、上記DNA結合ドメインにより認識されるDNA結合部位により駆動されるプロモーターと機能しうる形で連結された第２ヌクレオチド配列を含有するので、上記第１融合タンパク質の第２融合タンパク質との相互作用は、上記第２ヌクレオチド配列（ここで、第１と第２ヌクレオチド配列は同じであっても異なっていてもよい）の転写の増加をもたらすことを特徴とする上記ステップ；ならびに(e)上記第１および／または第２ヌクレオチド配列の上記転写の増加を検出し、それにより上記第１融合タンパク質と上記第２融合タンパク質との間の相互作用を検出するステップを含んでなる上記方法を提供する。
【０１１４】
一実施形態において、本発明は組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、試験化合物を、(i)組織保護サイトカイン受容体複合体-応答プロモーターと機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含有しかつ(ii)組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する改変酵母株の細胞と、接触させるステップ、およびレポーター遺伝子発現のレベルを測定することにより組織保護サイトカイン受容体複合体の活性のレベルを決定するステップを含んでなり、そして、もし化合物の存在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルが、化合物の不在のもとでのレポーター遺伝子活性のレベルと比較して増加または減少すれば、そこで組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物が同定される上記方法を提供する。
【０１１５】
受容体複合体を、既知のタンパク質と結合するタンパク質を同定する相互作用トラップアッセイ（例えば、Gyurisら, 1993, Cell 75:791-803に記載）に用いて、結合相互作用のインヒビターを同定することができる。この系は、上記の改変ツーハイブリッド系であり、第１ヌクレオチド配列としてLEU2レポーター遺伝子および第２ヌクレオチド配列としてlacZレポーター遺伝子を利用し、そして転写アクチベーター系の再構築をもたらすタンパク質-タンパク質相互作用をロイシンを欠く細胞中で選択してβ-ガラクトシダーゼを発現させることができる。DNA結合ドメインはLexA DNA結合ドメインであってもよいとともに、アクチベーター配列はB42転写活性化ドメイン（MaおよびPtashne, 1987, Cell 51:113-119）から得てもよい。レポーター遺伝子のプロモーターはLexA結合配列を含有して機能性転写アクチベーターの再構築により活性化される。この系の他の特徴として、DNA結合ドメイン融合タンパク質をコードする遺伝子は誘導プロモーター、例えばGALプロモーターの影響下にあるので、確認試験を誘導および非誘導条件下で実施することができる。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明は、EPOと組織保護サイトカイン受容体複合体の相互作用をモジュレートする化合物を検出する方法を提供する。第１融合タンパク質を含んでなる酵母細胞の第１集団は、EPO受容体などの第１組織保護サイトカイン受容体、およびLexA DNA結合ドメインの配列を含有する。酵母細胞の第２集団は、β共通などの第２組織保護サイトカイン受容体の配列と融合したB42転写活性化ドメインを含有する第２融合タンパク質を含んでなる。LEU2レポーター遺伝子およびlacZレポーター遺伝子は、LexA結合配列を含有するプロモーターと機能しうる形で連結されていて、第１融合タンパク質の第２融合タンパク質との相互作用は上記レポーター遺伝子の転写の増加をもたらす。融合タンパク質を含んでなる細胞の集団を、ロイシン欠乏培地中で増殖させて選択する。その培地はEPOを含有し、アッセイは試験化合物の存在および不在で実施する。転写レベルが試験化合物の存在のもとで異なる場合には、そこでEPOと組織保護性サイトカイン受容体複合体の相互作用をモジュレートする化合物が同定される。
【０１１７】
さらにツーハイブリッド手法の他のバージョンが有り、例えば、「条件付き複製アッセイ（Contingent Replication Assay）」が報じられている（Nallurら, 1993, Nucleic Acids Res. 21:3867-3873；Vasavadaら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10686-10690）。この事例では、２つの融合タンパク質の相互作用による哺乳動物細胞中の転写因子の再構築は、SV40 T抗原の転写の活性化をもたらす。この抗原は、活性化ドメイン融合プラスミドの複製を可能にする。哺乳動物細胞を用いるツーハイブリッド手法の他の改変は「核質相互作用選択方法（Karyoplasmic Interaction Selection Strategy）」であり、これも転写アクチベーターの再構築を利用する（Fearonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7958-7962）。この事例で利用されるレポーター遺伝子としては、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、細胞表面抗原CD4の遺伝子、およびハイグロマイシンB耐性をコードする遺伝子が挙げられる。両方の哺乳動物系において、再構築される転写因子はハイブリッド転写アクチベーターであって、この場合、DNA結合ドメインはGAL4由来でありかつ活性化ドメインはVP16由来である。転写活性化系の単離および集団内の可能なタンパク質-タンパク質相互作用の一覧が記載されていて、かかる２集団間の相互作用の比較が可能である（1997年12月18日公開されたPCT公開WO 97/47763を参照）。
【０１１８】
5.2.3  リガンド／組織保護サイトカイン受容体複合体アッセイ
本明細書に記載の無細胞スクリーニング方法および細胞に基づくスクリーニング方法において、組織保護サイトカイン受容体複合体のリガンドをアッセイに用いて、組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの相互作用をモジュレートする化合物を同定することができる。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物を同定する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体を(i)第１標識を付した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドおよび(ii)第２標識を付した試験化合物の当量と、結合を誘導する条件下で接触させるステップ；未結合の物質を組織保護サイトカイン受容体複合体から除去するステップ、ならびに第１および第２標識のレベルを検出するステップを含んでなり、ここでもし第２標識が、化合物が複合体と結合したことを示し、かつ、もし第１標識のレベルが、未結合の物質の除去後に、結合を誘導する条件下で試験化合物の不在のもとで、標識したリガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と接触させた場合の第１標識のレベルと比較して減少すれば、そこで組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物が同定される上記方法を提供する。
【０１２０】
さらに他の実施形態において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物を同定する方法であって、１以上の試験化合物の存在のもとで、結合を誘導する条件下で、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを組織保護サイトカイン受容体複合体と、接触させるステップ、および組織保護サイトカイン受容体複合体と結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量を測定するステップを含んでなり、そして、もし1以上の試験化合物の存在のもとで測定された結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定された結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量と異なれば、そこで、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの組織保護サイトカイン受容体複合体との結合をモジュレートする化合物が同定される上記方法を提供する。
【０１２１】
本明細書に記載した本発明の方法のある特定の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと接触させた組織保護サイトカイン受容体複合体の結合を測定する場合、結合した組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの量は、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンド特異的抗体を用いて測定する。
【０１２２】
本明細書に以上記載した本発明の方法の特定の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと接触させた組織保護サイトカイン受容体複合体の結合を測定する場合、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに付した標識を検出することにより測定する。
【０１２３】
本明細書に以上記載した本発明の方法の特定の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと接触させた組織保護サイトカイン受容体複合体の結合を測定する場合、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドを標識し、標識したリガンドの組織保護サイトカイン受容体複合体との結合を、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドに付した標識を検出することにより測定する。関係する実施形態においては、その標識が蛍光である。
【０１２４】
一実施形態において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物を同定する方法であって、組織保護サイトカイン受容体複合体を１以上の試験化合物と接触させるステップ、および、組織保護サイトカイン受容体複合体活性を測定し、そして、もし１以上の試験化合物の存在のもとで測定した活性が、１以上の試験化合物の不在のもとで測定した組織保護サイトカイン受容体複合体活性と異なれば、そこで、組織保護サイトカイン受容体複合体と組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの間の相互作用をモジュレートする化合物が同定されるステップを含んでなる上記方法を提供する。
【０１２５】
本明細書に記載した本発明の方法のある特定の実施形態においては、化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する。本明細書に以上記載した本発明の方法のある特定の実施形態においては、化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと結合する。
【０１２６】
5.2.4  ハイスループットスクリーニングアッセイ
本明細書に記載した細胞に基づくアッセイおよび無細胞に基づくアッセイをハイスループットフォーマットに利用して化合物のライブラリーをスクリーニングし、組織保護サイトカイン受容体複合体活性をモジュレートするかまたは組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体の間の相互作用をモジュレートする化合物を同定することができる。ハイスループットスクリーニングアッセイに用いることができる化合物のライブラリーの例は、以下の5.4節に開示されている。
【０１２７】
標識したプローブを用いるハイスループットスクリーニングを利用して、特定の機能部位の形成に影響を与える化合物を同定することができる。機能部位プロファイルを、薬物を用いて処理した細胞と無処理の細胞または対照細胞の間で比較して、薬物および薬物候補を同定することができる。さらに、特定の機能部位が組織保護活性と関連している場合、かかる部位に特異的なプローブを利用して部位の状態を薬物処置の前後に決定し、機能部位の状態を改変するため、細胞、組織、または器官保護の療法に有用である薬物を同定することができる。ある特定の実施形態において、薬物を用いる処置によって、機能部位の状態は対照サンプルにおいて観察される状態まで回復する。
【０１２８】
本発明のスクリーニングアッセイはまた、組織保護サイトカイン受容体複合体活性のモジュレーターを同定するハイスループットスクリーニングおよびアッセイも包含する。この実施形態によれば、次に記載の系をキットに仕立てることができる。この目的のためには、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞またはその溶解物を、様々な容器、例えばバイアル、チューブ、マイクロタイターウエルプレート、ボトルなどに入れて包装することができる。他の試薬；例えば、ポジティブ対照サンプル、ネガティブ対照サンプル、バッファー、細胞培養液などを別々の容器に入れてキットとともに提供することができる。本発明のアッセイを最初に小規模で（すなわち、試験管中で）最適化し、次いでハイスループットアッセイ用にスケールアップすることができる。
【０１２９】
5.3  化合物を同定するかまたはスクリーニングアッセイで同定した化合物を試験するアッセイ
5.3.1  生物学的スクリーニングまたはアッセイ
組織保護サイトカイン受容体複合体活性に影響を与えることが同定された化合物または組織保護サイトカイン複合体とリガンドの間の相互作用をモジュレートすることが見出された化合物を、組織保護活性、例えば、細胞、組織または器官の保護活性について試験することができる。保護活性をさらにin vitroおよびin vivoアッセイで試験することができる。組織保護活性の指標となるin vitro試験としては、例えば、細胞増殖アッセイ、細胞分化アッセイ、または、組織保護サイトカイン受容体複合体活性によりアップレギュレートされたタンパク質または核酸、例えば、ヌクレオリン、ニューログロビン、およびサイトグロビンの存在を検出する試験が挙げられる。ニューログロビンは、例えば、酸素の輸送または短期間貯蔵の促進に関わりうる。従って、酸素輸送または貯蔵アッセイを、組織保護サイトカイン活性をモジュレートする化合物を同定またはスクリーニングするアッセイとして利用することができる。
【０１３０】
ニューログロビンは、中枢神経系の細胞および組織中に低酸素または虚血に応答して発現され、傷害からの保護を与えることができる（Sunら 2001, PNAS 98:15306-15311；Schmidら, 2003, J. Biol. Chem. 276:1932-1935）。サイトグロビンも保護において同様の役割を果たしうるが、様々な組織で様々なレベルで発現される（Pesceら, 2002, EMBO 3:1146-1151）。本発明の一実施形態においては、細胞内でアップレギュレートされたタンパク質のレベルを、同定した試験化合物と細胞とを接触する前後に測定することができる。ある特定の実施形態においては、細胞中の組織保護活性に関連してアップレギュレートされるタンパク質の存在を利用して化合物の組織保護活性の存在を確認することができる。
【０１３１】
ヌクレオリンは細胞を損傷から保護することができる。ヌクレオリンは、細胞において多数の役割を果たし、その役割としては、転写プロセス、配列特異的RNA-結合タンパク質、細胞質分裂、核形成、シグナル伝達、T細胞により誘導されるアポトーシス、クロマチン再構築、または複製のモジュレーションが挙げられる。ヌクレオリンはまた、細胞表面受容体DNA/RNAヘリカーゼ、DNA-依存性ATPアーゼ、タンパク質シャトル、転写因子構成要素、または転写リプレッサーとして機能することもできる（SrivastavaおよびPollard, 1999, FASEB J., 13:1911-1922；およびGinistyら, 1999, J. Cell Sci., 112:761-772）。
【０１３２】
アップレギュレートされたタンパク質の発現を、細胞内のタンパク質に対応するmRNAレベルの検出により検出することができる。mRNAを、アップレギュレートされるタンパク質をコードする核酸と特異的に結合するプローブとハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーションとしては、例えば、ノーザンブロット、サザンブロット、アレイハイブリダイゼーション、アフィニティクロマトグラフィ、またはin situハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１３３】
他の実施形態においては、試験化合物を組織保護サイトカイン受容体複合体を活性化する能力についてスクリーニングするための迅速および定量アッセイ系を利用することができる。例えば、米国特許第5,763,198号に記載のかかるアッセイは、抗ホスホチロシン抗体およびタンパク質基質に特異的な抗体を用いてタンパク質基質のチロシンリン酸化状態を測定することにより、シグナル伝達に関わるチロシンキナーゼまたはホスファターゼ活性のモジュレーションを検出する。これらのアッセイは全細胞系または無細胞系で実施することができる。
【０１３４】
他の実施形態において、本発明は、組織保護サイトカイン受容体複合体を発現する細胞を接触させ、その細胞を溶解し、そして組織保護サイトカイン受容体複合体がリン酸化されているかどうかを確認する方法を提供する。関係する実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体を、抗EPO受容体抗体を用いて沈降させ、そして沈降した複合体をβc受容体に対する抗ホスホチロシン抗体を用いて標識する。
【０１３５】
動物モデル系を利用して、本明細書に記載の本発明のスクリーニング方法により同定した化合物の組織保護活性を実証するか、または化合物の安全性および有効性を実証することができる。次いでアッセイで同定した化合物を生物学的活性について、目的の組織損傷、疾患、症状、または症候の型に対する動物モデルを用いて試験することができる。これらのモデルには、遺伝子操作して機能的な読み出し情報系と結合させた組織保護サイトカイン受容体複合体を含有する動物、例えばトランスジェニックマウスが含まれる。
【０１３６】
同定した化合物の細胞または組織保護活性の有効性を試験するために利用することができる動物モデルとしては、例えば、Lewisラットの急性実験アレルギー脳脊髄炎（EAE）発症に対する保護、脳外傷を受けたマウスの認知機能低下からの回復もしくは保護（Brinesら, 2000, PNAS, 97:10295-10672）、および誘導された網膜虚血からの保護（Rosenbaumら,1997, Vis. Res. 37:3443-51）が挙げられる。かかるアッセイは、PCT公開第WO02/053580号にさらに詳細に記載されており、参照により本明細書にその全文が組み入れられる。上記参照に記載のin vivo試験はEPOの投与に関するものであるが、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性に影響を与えることが同定されている試験化合物をEPOの代わりに投与して組織保護活性を試験することができる。化合物の組織保護活性を決定する他のアッセイは当業者に周知である。
【０１３７】
同定した化合物の組織保護活性を測定するために設計したアッセイは、同定した化合物が組織保護サイトカイン受容体複合体と相互作用する化合物であるかまたは組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体の相互作用をモジュレートする化合物であるかに応じて、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドの存在または不在のもとで実施することができる。
【０１３８】
ある特定の実施形態においては、さらなる組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドをアッセイに加えて、その組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドと組織保護サイトカイン受容体複合体の相互作用に対する化合物のモジュレーション活性をさらに確認する。
【０１３９】
5.3.2  細胞結合アッセイ
あるいは、先の5.2.2.1節に開示した細胞を使用する細胞結合アッセイを同様に利用することができる。例えば、BaF3細胞をEPOとβc受容体を用いて先に考察したようにトランスフェクトすることができる。さらに、目的の小分子、生物学的または化学的化合物を、蛍光または放射標識したマーカーなどの生物学的マーカーと結合させるべきである。
【０１４０】
96ウエルプレートに増殖培地（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン）のみによる8種類の1:2連続希釈液、および目的の小分子、生物学的物質または化合物を入れ、それぞれの希釈液の最終容積をほぼ100μlとする。
【０１４１】
BaF3親細胞系およびEPO-Rを用いてトランスフェクトしたBaF3細胞を、次いで増殖培地（上記参照）中で3回洗浄し、ペレットを増殖培地中に再懸濁し、細胞を計数し、そして増殖培地に5,000細胞/100μlまで希釈した。次いで希釈した細胞100μlをそれぞれのサンプル希釈液に加えることができる。次いでアッセイプレートを37℃のインキュベーター中で3〜4日間インキュベートすることができる。次いで細胞を洗浄し、次いでプレートを蛍光プレートリーダー上でまたは他の好適な方法により読み取って目的の化合物に結合したバイオマーカーを検出することができる。
【０１４２】
同様に、競合アッセイを利用して、化合物が組織保護性であるかを決定することができる。競合アッセイでは、限定されるものでないが、米国特許出願第10/188,905号および第10/185,841号に開示の組織保護サイトカインを含む組織保護性であることが公知の化合物に好適なバイオマーカーを結合させることができる。
【０１４３】
96ウエルプレートに、増殖培地（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン）のみによる8種類の1:2連続希釈液を有し、そして残りのウエルは、組織保護化合物/バイオマーカー、組織保護化合物/バイオマーカーと過剰の目的の小分子、生物学的物質または化合物を有する。それぞれの希釈液の最終容積をほぼ100μlとする。再度、BaF3細胞を先に開示したようにプレート中にまいてインキュベートする。適当な時間を経た後に、細胞を洗浄し、次いでプレートを蛍光プレートリーダー上でまたはバイオマーカーを検出する好適な方法により読み取る。もし組織保護化合物/バイオマーカーと目的の化合物を含有するプレートの読み出し情報が組織保護化合物/バイオマーカーを単独で含有するプレートの読み出し情報より低ければ、その時は、目的の化合物は組織保護性である。
【０１４４】
5.3.3  サイトカインおよび細胞増殖/分化活性
本発明の受容体複合体は、サイトカイン、細胞増殖（誘導性または阻害性のいずれか）または細胞分化（誘導性または阻害性のいずれか）アッセイにおいて、組織保護化合物（小分子、タンパク質、化学的薬剤）を同定するのに有用でありうる。今まで発見された多数のタンパク質因子は、全ての既知のサイトカインを含めて、１以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を示しているので、これらのアッセイはサイトカイン活性の好都合な確認法として役立つ。化合物の活性は、細胞系に対する多数の慣用的な因子依存性細胞増殖アッセイのいずれかにより確証することができ、上記細胞系としては、限定されるものでないが、32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7eおよびCMKが挙げられる。これらの細胞を試験化合物の存在または不在のもとで培養し、そして細胞増殖を、例えば、トリチウム化チミジンの組み込みを測定することにより、または3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の代謝分解に基づく比色試験により検出する（Mosman, 1983, J. Immunol. Meth. 65:55-63）。組織保護サイトカイン受容体複合体の活性は、他の方法のなかでも特に、化合物またはリガンドの組織保護サイトカイン受容体複合体との結合、細胞増殖、細胞分化、組織保護効果または組織保護活性を有するタンパク質のアップレギュレーションにより測定することができる。
【０１４５】
5.3.4  融合タンパク質
受容体細胞外ドメインを、免疫グロブリン重鎖定常域、典型的には、Fcフラグメント（２つの定常域ドメインと１つのヒンジ域を含有するが可変域を欠く）との融合体として発現させることができる。かかる融合体は、典型的には多量体分子として分泌され、ここで、Fc部分はお互いにジスルフィド結合されかつ２つの受容体ポリペプチドはお互いに近接して配列される。本発明によれば、融合体上の受容体ポリペプチドは少なくとも１つのEPO-R細胞外ドメインと１つのβc受容体細胞外ドメインを含む。この型の融合体を用いてコグネイトリガンドを溶液から精製することができ、in vitroアッセイツールとして、特異的にリガンドを滴定除去することにより、in vitroでシグナルを遮断すること、およびin vivoでアンタゴニストとしてこれを非経口で投与することにより、循環するリガンドと結合させてそれを循環からクリアすることができる。リガンドを精製するためには、組織保護受容体複合体キメラを、受容体-リガンド結合を促進する条件（典型的には、生理学的に近い温度、pH、およびイオン強度）下で、リガンドを含有するサンプル（例えば、細胞-馴化培地または組織抽出物）に加える。次いでキメラ-リガンド複合体を、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定したタンパク質Ａを用いて、混合物より分離する。次いでリガンドを従来の化学技術、例えば塩またはpH勾配を用いて溶出する。別の方法としては、キメラ自体を固体支持体と結合させて上記のように溶出を行うことができる。高い結合親和力をもつキメラは、非経口投与される（例えば、筋肉内、皮下または静脈内注射により）。循環する分子はリガンドと結合し、通常の生理学的プロセスにより循環からクリアされる。アッセイで利用するためには、キメラをFc域を経由して支持体と結合させてELISAフォーマットに使用する。
【０１４６】
リガンド結合受容体複合体融合タンパク質またはリガンド結合受容体複合体断片を使う好ましいアッセイ系は、市販のバイオセンサー計器（BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.）を利用し、この場合には融合タンパク質を受容体チップの表面上に固定する。この計器の使用は、Karlsson, 1991, J. Immunol. Methods 145:229-240、ならびにCunninghamおよびWells, 1993, J. Mol. Biol. 234:554-563に開示されている。融合タンパク質を、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金薄膜に付着しているデキストラン繊維と共有結合で付着させる。試験サンプルを、セルを通過させる。もしリガンドがサンプル中に存在すれば、リガンドは固定された融合タンパク質と結合し、媒質の屈折率の変化を引き起こし、この変化は金薄膜の表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系はオンおよびオフ速度の測定を可能にし、これから結合親和力を計算し、結合の化学量論的評価をすることができるする。
【０１４７】
リガンド結合融合タンパク質はまた、当技術分野で公知の他のアッセイ系にも利用することができる。かかる系としては、結合親和力を測定するためのスキャッチャード解析（Scatchard analysis）（Scatchard, 1949, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672を参照）および熱量測定アッセイ（Cunninghamら, 1991, Science 253:545-548；Cunninghamら, 1991, Science 254:821-825）が挙げられる。
【０１４８】
受容体リガンド結合融合タンパク質はまた、リガンドの精製に利用することができる。融合タンパク質を固体支持体、例えばアガロースビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ系樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下で安定である同様の材料上に固定する。ポリペプチドを固体支持体と連結する方法は当技術分野で公知であり、アミン化学、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、およびヒドラジン活性化が含まれる。得られる媒体は一般的にカラムの形状であり、リガンドを含有する液をカラムに１回以上通過させ、リガンドを受容体ポリペプチドと結合させる。次いでリガンドを、塩濃度またはpHの変化を用いて溶出させて、リガンド-受容体結合を破壊する。
【０１４９】
5.3.5  他のアッセイ
当業者であれば、本発明の受容体複合体を、限定されるものでないが、「免疫学の現行プロトコル（Current Protocols In Immunology）」, vol.4,  Chapter 18, 2001, John E. Coligan 編. John Wiley and Sonsに開示されたリガンド-受容体アッセイを含む、いくつかの周知のアッセイに利用しうることを認識するであろう。
【０１５０】
もし化合物が組織保護活性を示せば、当業者は、その結果を、当業者に周知の神経保護および組織保護アッセイ、例えば、限定されるものでないが、P-19、PC-12、TF-1、およびUT-7細胞アッセイの１つを用いて立証することが好都合であることを認識するであろう。さらに、様々なin vivoモデル、例えば、脊椎損傷、虚血脳卒中、末梢神経損傷、ならびに心臓および眼に関する動物モデルが単離された組織保護化合物をさらに特徴付けるのに役立ちうる。好適なin vitroおよびin vivoアッセイは米国特許出願第10/188,905号および第10/185,841号に開示されている。
【０１５１】
5.3.5.1  βc(-/-)ノックアウト動物を用いるアッセイ
本発明はまた、動物の内在βc受容体の発現を阻害または「ノックアウト」するおよび／またはヒトβc受容体（またはその突然変異体)を発現するように遺伝子操作した宿主細胞および動物の使用にも関する。かかるトランスジェニック動物を、神経保護経路および神経保護経路を活性化する化合物を同定する方法に使用することができる。
【０１５２】
内在標的遺伝子の発現はまた、標的を定めた相同組換えを用いて、標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより低下させることもできる（例えば、Smithiesら, 1985, Nature 317, 230-234；Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512；Thompsonら, 1989, Cell 5, 313-321を参照；上記文献はそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。例えば、内在標的遺伝子の相同DNA（標的遺伝子のコード領域または調節領域）に隣接された突然変異、非機能性標的遺伝子（または完全に無関係のDNA配列）を用いて、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーとともにまたは無しで、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞をトランスフェクトすることができる。標的を定めた相同組換えを経由するDNA構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化をもたらす。かかる手法は特に、ES（胚幹）細胞に好適な改変であり、不活性標的遺伝子をもつ動物子孫を作製するために利用することができる（例えば、Thomas & Capecchi, 1987およびThompson, 1989、前掲を参照）。しかしこの手法は、組換えDNA構築物を直接投与するかまたは適当なウイルスベクターを用いてin vivoで所要の部位に標的を定めることを条件とすれば、ヒトに使用することができる。
【０１５３】
一旦、βc受容体(-/-)ノックアウト動物が作製されると、標準技術を利用して組換えβc受容体遺伝子の発現をアッセイすることができる。最初のスクリーニングをサザンブロット分析またはPCR技術により実施して動物組織を分析し、内在遺伝子のノックアウトが起こっているかどうかをアッセイすることができる。トランスジェニック動物の組織のトランスジーンのmRNA発現のレベルはまた、限定されるものでないが、動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション分析、およびRT-PCR（逆転写PCR）を含む技術を用いて評価することができる。βc受容体遺伝子発現組織のサンプルも、βc受容体トランスジーン産物に特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価することができる。
【０１５４】
本発明の一実施形態においては、βc受容体(-/-)ノックアウト動物をアッセイに用いて組織保護活性に関わる経路および／または化合物を同定する。例えば、正常な動物とβc受容体(-/-)ノックアウト動物の両方に組織損傷を生じることが公知な薬剤または力、例えば、虚血を与える。次いで両方の動物に化合物を投与し、化合物の組織保護活性を測定する。組織保護活性を確認する方法は当業者に周知であり、かかる方法の例は、PCT公開第WO02/053580号に開示されていて、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。もし組織保護活性が正常な動物に観察されるが同じ化合物を投与したβc受容体(-/-)ノックアウト動物に観察されなければ、そこでβc受容体に依存する組織保護活性をもつ化合物が同定される。同定されたβc受容体依存性組織保護経路のさらなる研究は、化合物がβc受容体もしくはその複合体と結合するかを確認する研究、または組織保護活性を示す動物だけに存在するタンパク質またはmRNA転写物を同定する研究から構成されうる。本出願人らは、組織保護のための二次または重複経路が存在しうるのであって、βc受容体(-/-)ノックアウト動物を用いてかかる経路を研究することができると考える。
【０１５５】
5.4  化合物
化合物をスクリーニングおよび同定する本発明の方法は、多数の型の化合物を利用することができ、それらとしては、限定されるものでないが、小分子、有機分子、非有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体（非天然のアミノ酸、例えば、D-アミノ酸、D-アミノリン酸などのアミノ酸のリン類似体、および非ペプチド結合を有するアミノ酸、を含有するペプチドを含む）、ホスホロチオン酸などの核酸類似体、ならびにPNAが含まれる。
【０１５６】
本明細書に記載の方法により試験しかつ同定することができる化合物には、限定されるものでないが、商業供給元から得られる化合物が含まれ、上記供給元としては、Aldrich（Milwaukee、WI 53233）、Sigma Chemical（St. Louis、MO）、Fluka Chemie AG（Buchs、Switzerland）、Fluka Chemical Corp.（Ronkonkoma、NY）、Eastman Chemical Company、Fine Chemicals（Kingsport、TN）、Boehringer Mannheim GmbH（Mannheim、Germany）、Takasago（Rockleigh、NJ）、SST Corporation（Clifton、NJ）、Ferro（Zachary、LA 70791）、Riedel-deHaen Aktiengesellschaft（Seelze、Germany）、PPG Industries Inc.、Fine Chemicals（Pittsburgh、PA 15272）が挙げられる。さらに微生物、真菌、植物または動物抽出物を含むいずれの種の天然物も、本発明の方法を用いてスクリーニングすることもできる。
【０１５７】
ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーも本発明のアッセイに利用することができる。例えば、試験化合物は、小分子、有機分子、非有機分子、またはペプチドであってもよい。本発明の方法によってスクリーニングすることができるかかる化合物のライブラリーの例としては、限定されるものでないが、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ジベルソマー（diversomer）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなど；ビニル系（vinylogous）ポリペプチド；非ペプチド性ペプチドミメチック；オリゴカルバマート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；炭水化物ライブラリー；および小分子ライブラリー（小有機または非有機分子ライブラリー）が挙げられる。かかるライブラリーの例としては、限定されるものでないが、ランダムペプチドライブラリー；(例えば、Lamら, 1991, Nature 354:82-84；Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86を参照)、ならびに、D-および／またはL-立体配置のアミノ酸から構成されるコンビナトリアル化学から誘導された分子ライブラリー、ホスホペプチド（限定されるものでないが、ランダムまたは部分的に変性し、定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む；例えば、Songyangら, 1993, Cell 72:767-778を参照）、抗体（限定されるものでないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは単鎖抗体、およびFAb、F(ab')2およびFAb発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを含む）、ならびに小有機または非有機分子が挙げられる。
【０１５８】
本発明の一実施形態においては、ペプチドライブラリーを、組織保護サイトカイン受容体複合体、例えばEPO-組織保護サイトカイン受容体複合体相互作用のモジュレーターについてスクリーニングするために使用できる試験化合物の供給源として利用することができる。多様性ライブラリー、例えばランダムまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーを、組織保護サイトカイン受容体複合体と特異的に結合する分子についてスクリーニングすることができる。利用することができる多数のライブラリーが当技術分野で公知であり、例えば、化学的に合成したライブラリー、遺伝子組換え体（例えばファージディスプレイライブラリー）、およびin vitro翻訳に基づくライブラリーがある。
【０１５９】
化学的に合成したライブラリーの例は、Fodorら, 1991, Science 251:767-773；Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86；Lamら, 1991, Nature 354:82-84；Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710；Gallopら, 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251；Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926；Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426；Houghtenら, 1992, Biotechniques 13:412；Jayawickremeら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618；Salmonら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712；PCT公開第WO 93/20242号；ならびにBrennerおよびLerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383に記載されている。
【０１６０】
ファージディスプレイライブラリーの例は、Scott & Smith, 1990, Science 249:386-390；Devlinら, 1990, Science, 249:404-406；Christianら, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718；Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157；Kayら, 1993, Gene 128:59-65；および1994年8月18日付けPCT公開第WO 94/18318号に記載されている。
【０１６１】
非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Buninら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712を参照）を適合させて利用することができる。ペプトイドライブラリー（Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371）も利用することができる。ペプチドのアミド官能基が過メチル化されていて、化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーを作製するために利用することができるライブラリーの他の例は、Ostreshら（1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142）に記載されている。
【０１６２】
ライブラリーのスクリーニングは、様々な公知の方法のいずれによって実施してもよい。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する次の参考文献を参照されたい：Parmley & Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218；Scott & Smith, 1990, Science 249:386-390；Fowlkesら, 1992；BioTechniques 13:422-427；Oldenburgら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397；Yuら, 1994, Cell 76:933-945；Staudtら, 1988, Science 241:577-580；Bockら, 1992, Nature 355:564-566；Tuerkら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992；Ellingtonら, 1992, Nature 355:850-852；全てLadnerらに与えられた米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、および米国特許第5,198,346号；Rebar & Pabo, 1993, Science 263:671-673；およびPCT公開第WO 94/18318号。
【０１６３】
好ましい実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは小有機分子分子ライブラリー、例えば、限定されるものでないが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、およびベンゾジアゼピンである。他の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ペプトイド；ランダムバイオ-オリゴマー；ベンゾジアゼピン；ジベルソマー（diversomer）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなど；ビニル性（vinylogous）ポリペプチド；非ペプチド性ペプチドミメチック；オリゴカルバマート；ペプチドホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；炭水化物ライブラリーを含む。コンビナトリアルライブラリーそれ自体が市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, New Jersey；Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Missouri；ChemStar, Ltd, Moscow, Russia；3D Pharmaceuticals, Exton, Pennsylvania；Martek Biosciences, Columbia, Maryland；などを参照）。
【０１６４】
好ましい実施形態においては、ライブラリーを予め選択してライブラリーの化合物が細胞に取込まれ易くする。例えば、化合物を特定のパラメーター、例えば、限定されるものでないが、サイズ、親油性、親水性、および水素結合に基づいて選択し、化合物の細胞中に取り入れられる確率を向上させる。他の実施形態においては、化合物を三次元または四次元コンピュータープログラムにより解析する。
【０１６５】
一実施形態においては、本発明の方法に用いるコンビナトリアル化合物ライブラリーを合成することができる。薬理学的、生物学的または他の活性についてスクリーニングすることができる小有機化合物の大コレクション、またはライブラリー、の作製に関する合成法は大きな関心がある。巨大なコンビナトリアルライブラリーを作製するために使用される合成方法は溶液中でまたは固体相、すなわち固体支持体で実施される。固相合成は多段階反応をより容易に実施しかつ反応を高収率で完了させる。何故なら、過剰の試薬を容易に加えかつ各反応段階後に洗浄除去することができるからである。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製およびスクリーニングを改善する傾向もある。しかし、より伝統的な溶液相化学は、固相化学より多様な有機反応を支援する。
【０１６６】
本発明のコンビナトリアル化合物ライブラリーは、Kilcoinの米国特許第6,190,619号（本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）に記載の装置を用いて合成することができる。米国特許第6,190,619号は、多数の個別化合物の平行合成用または化合物のコンビナトリアルライブラリー用の複数反応容器を保持することができる合成装置を開示する。
【０１６７】
一実施形態においては、コンビナトリアル化合物ライブラリーを溶液中で合成することができる。Bogerらの米国特許第6,194,612号に開示された方法（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）は、コンビナトリアルライブラリーの溶液相合成用のテンプレートとして有用な化合物を特徴付けている。テンプレートは、反応生成物を未反応の反応物から、液／液または固／液抽出を利用して容易に精製できるように設計されている。コンビナトリアル合成により生産される化合物は好ましくは小有機分子であろう。ライブラリー中のいくつかの化合物は非ペプチドまたはペプチドの効果を模倣することができる。コンビナトリアル化合物ライブラリーの固相合成とは対照的に、液相合成は多段階固相合成の個々の段階をモニターする特別なプロトコルの使用を必要としない。（Egnerら, 1995, J.Org. Chem. 60:2652；Andersonら, 1995, J. Org. Chem. 60:2650；Fitchら, 1994, J. Org. Chem. 59:7955；Lookら, 1994, J. Org.  Chem. 49:7588；Metzgerら, 1993, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 32:894；Youngquistら, 1994, Rapid Commun. Mass Spect. 8:77；Chuら, 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:5419；Brummelら, 1994, Science 264:399；Stevanovicら, 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:431）。
【０１６８】
本発明の方法に有用なコンビナトリアル化合物ライブラリーを固体支持体上で合成することができる。一実施形態においては、分割合成方法、すなわち、合成中、固体支持体を分離しかつ混合するプロトコルを用いて固体支持体上の化合物のライブラリーを合成する（例えば、Lamら, 1997, Chem. Rev. 97:41-448；Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926およびそれらに引用された参考文献を参照）。最終ライブラリー中のそれぞれの固体支持体は、その表面に結合した実質的に１タイプの化合物を有する。１つの生成物がそれぞれの支持体に結合している固体支持体上のコンビナトリアルライブラリーを合成する他の方法は当業者に公知であろう（例えば、Nefziら, 1997, Chem. Rev. 97:449-472を参照）。
【０１６９】
本明細書で使用する用語「固体支持体」は、特定のタイプの固体支持体に限定されるものでない。どちらかと言えば多数の支持体が利用可能であってかつ当業者に公知である。固体支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、ワタ、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、および多糖類が挙げられる。好適な固体支持体は、所望の最終用途および様々な合成プロトコルとの適合性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成用には、固体支持体は、p-メチルベンズヒドリルアミン（pMBHA）樹脂（Peptides International、Louisville、KY）、ポリスチレン類（例えば、Bachem Inc., Peninsula Laboratoriesから入手したPAM-樹脂など）（クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンを含む）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）グラフト化スチレンコジビニルベンゼン（例えば、Aminotech、Canadaから得られるPOLYHIPE樹脂）、ポリアミド樹脂（Peninsula Laboratoriesから得られる）、ポリエチレングリコールをグラフト化したポリスチレン樹脂（例えば、TENTAGELまたはARGOGEL、Bayer、Tubingen、Germany）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Milligen/Biosearch、Californiaから得られる）、またはセファロース（Pharmacia、Sweden）などの樹脂であってもよい。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態においては、化合物を、固体支持体とリンカーを介して結合させることができる。リンカーは一体であって固体支持体の部分であってもよく、またはリンカーは一体でなくて固体支持体上に合成したものまたは合成後に結合させたものであってもよい。リンカーは化合物の固体支持体との結合点を提供するだけでなく、色々なグループの分子がリンカーの特性に応じて色々な条件下で固体支持体から切断されるようにするためにも有用である。例えば、リンカーは、とりわけ、求電子的に切断、求核的に切断、光分解、酵素的に切断、金属による切断、還元条件下で切断または酸化条件下で切断性されうる。好ましい実施形態においては、化合物のハイスループットスクリーニングの前に、化合物は固体支持体から切断される。
【０１７１】
ある特定の実施形態において、本発明の化合物はサイトカインである。スクリーニング方法および本発明の治療または予防方法に利用することができるサイトカインの例としては、限定されるものでないが、IL-1α、IL-1β、IL-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質-2、β-神経成長因子、毛様体神経栄養因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子（酸性）、線維芽細胞成長因子（塩基性）、顆粒球-コロニー刺激因子、顆粒球-コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子、肝細胞増殖因子、インターフェロン-α2a、インターフェロン-α2b、インターフェロン-α1b、インターフェロン-β1a、インターフェロン-β1b、インターフェロン-γ、インスリン様成長因子-I、インスリン様成長因子-II、ケラチノサイト成長因子、ニューロトロフィン-3、血小板由来成長因子-bb、幹細胞因子、壊死因子α、腫瘍壊死因子-β、血管内皮成長因子、レプチン、またはプロラクチンが挙げられる。ある特定の実施形態においては化合物がサイトカインであり、化合物を遺伝子組換えによって産生させる。ある特定の実施形態においては化合物がサイトカインであり、化合物はヒト由来である。
【０１７２】
化合物が小分子である本発明の方法の実施形態において、小分子はReceptron（Receptron, Inc. Mountain View、CA）から入手しうるもののように、EPO受容体に特異的であってもよい。他の小分子の例としては、Goldbergら（2002, J. Amer. Chem. Soc. 124:544-555）およびBogerおよびGoldberg（2001, Bioorg. and Org. Chem. 9:557-562）に開示されている小分子が挙げられる。
【０１７３】
5.4.1.1  改変されたEPOおよびEPO突然変異体
本発明のある特定の実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体とそのリガンドの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイに用いる試験化合物および／または組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、化学的に改変されたEPO、突然変異EPO、またはそれらの組合わせである。例えば、2003年4月17日に20030072737-A1として公開された米国特許出願第10/188,905号、および米国特許出願第10/612,665号は化学的に改変されたEPOおよび／または突然変異EPOを開示し、これらは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。かかる化学的に改変されたおよび／または突然変異体分子を、本明細書に記載のスクリーニングアッセイに利用することができる（PCT出願第PCT/US01/49479号、米国特許出願第10/188,905号、および第10/185,841号も参照、これらは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。これらの組織保護サイトカインは、限定されるものでないが、神経、網膜、筋肉、心臓、腎臓の細胞または組織を含むエリスロポエチン応答性哺乳動物細胞、組織および器官の機能および／または生存を保護し、維持し、増強しおよび／または回復する。
【０１７４】
本発明の方法に利用することができる化学的に改変されたEPO分子には、例えば、天然エリスロポエチンと比較して、そして好ましくは天然ヒトエリスロポエチンと比較して、少なくとも１つの改変により変化したエリスロポエチンが含まれる。上記少なくとも１つの改変は、エリスロポエチン分子の少なくとも１つのアミノ酸の改変、またはエリスロポエチン分子の少なくとも１つの炭水化物の改変であってもよい。勿論、本発明の目的に有用である化学的に改変されたEPOは、天然分子と比較して複数の改変、例えば、該分子のアミノ酸部分の複数の改変、該分子の炭水化物部分の複数の改変、該分子のアミノ酸部分の少なくとも１つの改変、該分子の炭水化物部分の少なくとも１つの改変を有してもよい。化学的に改変されたEPO分子は、応答性哺乳動物細胞の機能または生存を保護し、維持し、増強し、または回復する能力を保持し、しかし、上述の、所望される特性と無関係なエリスロポエチン分子の１以上の特性は天然分子と比較して不在であってもよい。好ましい実施形態において、化学的に改変されたEPOは、エリスロポエチンの骨髄に与える影響、すなわち、ヘマトクリットの増加（赤血球新生）、血管狭窄（高血圧）、血圧上昇、血小板の過剰活性化、プロ血液凝固活性、および血小板産生増加を欠く。さらに好ましくは、化学的に改変されたEPOは赤血球新生を欠き、最も好ましくは、化学的に改変されたEPOはエリスロポエチンの骨髄に与える全ての影響を欠く。
【０１７５】
例示として、本発明の化学的に改変されたEPOはアシアロエリスロポエチンであってもよい。他の例においては、本発明の化学的に改変されたEPOは、天然エリスロポエチンまたはアシアロエリスロポエチンのアミノ酸残基の１以上のアミノ基を改変する１以上の試薬と反応させたエリスロポエチンまたはアシアロエリスロポエチンであってもよい。好ましい実施形態において、化学的に改変されたEPOは非赤血球新生性である。
【０１７６】
一実施形態において、化学的に改変されたEPOはシアル酸部分を有しないエリスロポエチンである。好ましい実施形態において、化学的に改変されたEPOは、アシアロエリスロポエチン、そして最も好ましくは、ヒトアシアロエリスロポエチンである。他の実施形態において、化学的に改変されたEPOは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個のシアル酸部分を有する。かかる部分的に脱シアル酸化したエリスロポエチンを、本明細書では低シアロエリスロポエチン（hyposialoerythropoietin）と呼ぶ。低シアロエリスロポエチンは、天然エリスロポエチンの化学的または酵素的改変により調製することができるか、または分子を全くシアル酸化しないかもしくは部分的にしかエリスロポエチンをシアル酸化しない系における発現によって得ることができる。本発明のアシアロエリスロポエチンおよび低シアロエリスロポエチンは、その分子を調製する方法に関係なく包含される。
【０１７７】
他の好ましい実施形態において、化学的に改変されたEPOは、エリスロポエチン分子の少なくとも１以上のリシン残基の改変またはN末端アミノ基の改変を含み、かかる改変はリシンεアミノ基またはN末端アミノ基のアミノ基改変剤との反応がもたらすような改変である。改変されたリシン残基または改変されたN末端アミノ基をさらに化学的に還元することができる。好ましい一実施形態においては、エリスロポエチンを、１以上のリシン基においてまたはN末端基においてビオチン化、カルバミル化、スクシニル化またはアセチル化する。他の好ましい実施形態においては、リシンをアルデヒドまたは還元糖と反応させてイミンを生成させ、これを、場合によっては、次いで化学的還元により、例えば、水素化シアノホウ素ナトリウムを用いることにより安定化してN-アルキル化リシン残基、例えばグルシトリルリシンを生成させるか、または還元糖の場合には、AmadoriまたはHeyns転位により安定化してα-デオキシα-アミノ糖、例えばα-デオキシα-フルクトシルリシンを生成させる。他の好ましい実施形態においては、リシンまたはN末端アミノ基を、シアン酸イオンとの反応によりカルバミル化（カルバモイル化）し、アルキル-イソシアネート、アリール-イソシアネート、またはアリール-イソチオシアネートとの反応により、それぞれアルキル-カルバミル化、アリール-カルバミル化、またはアリール-チオカルバミル化するか、あるいは反応性アルキルカルボン酸またはアリールカルボン酸誘導体、例えば無水酢酸、無水コハク酸または無水フタル酸との反応によりアシル化することができる。少なくとも１つのリシン基またはN末端アミノ基はまた、トリニトロベンゼンスルホン酸、または好ましくはその塩の１つとの反応によりトリニトロフェニルに改変することもできる。他の実施形態においては、リシン残基をグリオキサールとの反応、例えば、グリオキサール、メチルグリオキサールまたは3-デオキシグルコソンとの反応により改変して対応するα-カルボキシアルキル誘導体を生成させることができる。
【０１７８】
他の実施形態において、化学的に改変されたEPOは、少なくとも１つのエリスロポエチンのチロシン残基を求電子試薬を用いて改変する、例えば、限定されるものでないが、ニトロ化または沃素化により改変して芳香族環位置を改変することにより作製することができる。
【０１７９】
以上記載したように、本発明の目的に有用な組織保護薬は、少なくとも１つの上記改変を有しうるが、１以上の上記改変を有してもよい。分子のアミノ酸部分に１つの改変を持ちかつ分子の炭水化物部分に任意の改変を持つ化学的に改変されたEPOを例示すると、化学的に改変されたEPOは、カルバミルエリスロポエチン、カルバミルアシアロエリスロポエチン、カルバミル低シアロエリスロポエチン、アセチルエリスロポエチン、アセチルアシアロエリスロポエチン、アセチル低シアロエリスロポエチン、スクシニルエリスロポエチン、スクシニルアシアロエリスロポエチン、スクシニル低シアロエリスロポエチン、ビオチニルエリスロポエチン、ビオチニルアシアロエリスロポエチン、ビオチニル低シアロエリスロポエチン、ヨードエリスロポエチン、ヨードアシアロエリスロポエチン、ヨード低シアロエリスロポエチン、N-ε-カルボキシメチルエリスロポエチン、N-ε-カルボキシメチルアシアロエリスロポエチン、N-ε-カルボキシメチル低シアロエリスロポエチン、およびグルシトリルエリスロポエチン、グルシトリルアシアロエリスロポエチン、グルシトリル低シアロエリスロポエチンである。これらの化合物は、本発明の改変されたエリスロポエチンの単なる例示である。以上の慣用名は天然エリスロポエチン分子の改変の代表的なものに過ぎず、本明細書に記載したように、アミノ基の改変は１以上のリシン残基のεアミノ基もしくはN末端アミノ基に関するか、またはニトロもしくはヨード改変エリスロポエチンの場合には１以上のチロシン残基に関するものである。以上のいずれの組み合わせも本発明に包含される。本発明はまた、１以上の上記化学的改変を含む化学的に改変されたEPOも包含する。
【０１８０】
本発明の他の態様においては、応答性哺乳動物細胞の機能または生存を保護、維持、増強または回復する方法であって、１以上の上記化学的に改変されたEPO、または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば本発明のスクリーニング方法により同定された化合物の有効量を投与することによる上記方法が提供される。本発明の方法の１つの特定の態様において、応答性哺乳動物細胞とその関連する細胞、組織または器官は、強固な内皮細胞バリアのために血管系の遠位にある。他の特定の態様においては、細胞、組織、器官または他の身体の部分は、これらの移植または再結合を意図している哺乳動物身体から単離される。限定するものでない例示として、応答細胞または組織は、神経、網膜、筋肉、心臓、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎皮質、副腎髄質、毛細管内皮、精巣、卵巣、膵臓、皮膚、骨、または子宮内膜の細胞または組織であってもよい。これらの応答細胞の例は単なる説明のためのものである。特定の実施形態において、応答細胞またはその関連細胞、組織、または器官は興奮細胞、組織または器官でないか、または興奮細胞または組織を主に含まない。他の特定の実施形態において、上記の化学的に改変されたEPO、または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば本発明のスクリーニング方法により同定された化合物を投与する哺乳動物細胞、組織または器官は、細胞、組織または器官の生存に有害な少なくとも１つの条件下で時間を過ごしたかまたは過ごす細胞、組織または器官である。かかる条件としては、外傷性in-situ低酸素もしくは代謝機能不全、外科的誘導in situ低酸素もしくは代謝機能不全、またはin-situ毒素曝露を挙げることができ；後者は化学療法または照射療法に関連しうる。一実施形態において、本発明は心肺バイパスから生じる有害な症状を保護する。
【０１８１】
本発明はまた、化学的に改変されたEPOを使用するスクリーニング方法であって、上記化学的に改変されたEPOがi)シアル酸部分を欠くエリスロポエチン；ii)N-結合またはO-結合炭水化物を欠くエリスロポエチン；iii)天然エリスロポエチンの少なくとも１つのグリコシダーゼによる処理により低下した炭水化物含量を有するエリスロポエチン；iv)少なくとも１以上の酸化炭水化物を有するエリスロポエチン；v)少なくとも１以上の化学的に還元された酸化炭水化物を含有するエリスロポエチン；vi)少なくとも１以上の改変されたアルギニン残基を含有するエリスロポエチン；vii)少なくとも１以上の改変されたリシン残基またはエリスロポエチン分子のN末端アミノ基の改変を含有するエリスロポエチン；viii)少なくとも１つの改変されたチロシン残基を含有するエリスロポエチン；ix)少なくとも改変されたアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含有するエリスロポエチン；x)少なくとも改変されたトリプトファン残基を含有するエリスロポエチン；xi)少なくとも１つのアミノ基が除去されているエリスロポエチン；xii)エリスロポエチン分子中の、少なくとも１つのシスチン結合が開裂されているエリスロポエチン；またはxiii)末端切断されたエリスロポエチンである上記スクリーニング方法も提供する。
【０１８２】
一実施形態において、本発明の方法に使用する化学的に改変されたEPOは、アシアロエリスロポエチンまたはフェニルグリオキサール-エリスロポエチンである。他の実施形態において、化学的に改変されたEPOは内皮細胞関門を横断することができる。内皮細胞関門は、血液-脳関門、血液-眼関門、血液-精巣関門、血液-卵巣関門、および血液-子宮関門からなる群から選択することができる。
【０１８３】
本発明はまた、化学的に改変されたEPO、または組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物、例えば、本発明の方法において使用するための本発明のスクリーニング方法により同定された化合物、すなわちエリスロポエチン類も提供する。好ましい実施形態において、化合物はアシアロエリスロポエチンである。好ましい実施形態において、化合物はヒトアシアロエリスロポエチンである。化学的に改変されたEPOは、好ましくは、N-結合型炭水化物のないエリスロポエチンである。化学的に改変されたEPOは好ましくはO-結合型炭水化物のないエリスロポエチンである。一実施形態において、化学的に改変されたEPOは少なくとも１つのグリコシダーゼを用いて処理されたエリスロポエチンである。他の実施形態において、化学的に改変されたEPOは過ヨウ素酸酸化されたエリスロポエチンである。過ヨウ素酸酸化されたエリスロポエチンは好ましくは水素化シアノホウ素ナトリウムを用いて化学的に還元される。一実施形態において、化学的に改変されたEPOは、１以上のアルギニン残基上にR-グリオキサール部分（ここでRはアリールまたはアルキル部分である）を含有するエリスロポエチンである。そのエリスロポエチンは好ましくはフェニルグリオキサール-エリスロポエチンである。他の実施形態において、化学的に改変されたEPOは、少なくとも１つのアルギニン残基が2,3-ブタンジオンおよびシクロヘキサンジオンからなる群から選択される隣接ジケトンとの反応により改変されているエリスロポエチンである。さらに他の実施形態において、本発明の化学的に改変されたEPOは、少なくとも１つのアルギニン残基が3-デオキシグルコソンと反応するエリスロポエチンである。さらに他の実施形態において、化学的に改変されたEPOは、少なくとも１つのビオチン化されたリシンまたはN末端アミノ基を含有するエリスロポエチン分子である。エリスロポエチン分子はビオチン化エリスロポエチンであってもよい。
【０１８４】
本発明はまた、グルシトリルリシンエリスロポエチンまたはフルクトシルリシンエリスロポエチンである化学的に改変されたEPOも提供する。
【０１８５】
本発明の方法の一実施形態において、化学的に改変されたEPOは、少なくとも１つのカルバミル化リシン残基を有するエリスロポエチンである。他の実施形態において、カルバミル化エリスロポエチンは、α-N-カルバモイルエリスロポエチン；N-ε-カルバモイルエリスロポエチン；α-N-カルバモイル,N-ε-カルバモイルエリスロポエチン；α-N-カルバモイルアシアロエリスロポエチン；N-ε-カルバモイルアシアロエリスロポエチン；α-N-カルバモイル,N-ε-カルバモイルアシアロエリスロポエチン；α-N-カルバモイル低シアロエリスロポエチン；N-ε-カルバモイル低シアロエリスロポエチン；およびα-N-カルバモイル,N-ε-カルバモイル低シアロエリスロポエチンからなる群から選択される。
【０１８６】
一実施形態においては、本発明の方法の化学的に改変されたEPOは、少なくとも１つのリシン残基がアシル化されたエリスロポエチンである。他の実施形態においては、上記エリスロポエチンのリシン残基はアセチル化されている。さらに他の実施形態においては、アセチル化エリスロポエチンは、α-N-アセチルエリスロポエチン；N-ε-アセチルエリスロポエチン；α-N-アセチル,N-ε-アセチルエリスロポエチン；α-N-アセチルアシアロエリスロポエチン；N-ε-アセチルアシアロエリスロポエチン；α-N-アセチル,N-ε-アセチルアシアロエリスロポエチン；α-N-アセチル低シアロエリスロポエチン；N-ε-アセチル低シアロエリスロポエチン；およびα-N-アセチル,N-ε-アセチル低シアロエリスロポエチンからなる群から選択される。
【０１８７】
一実施形態において、本発明の化学的に改変されたEPOはスクシニル化リシン残基を含有するエリスロポエチンである。一実施形態において、上記エリスロポエチンは、α-N-スクシニルエリスロポエチン；N-ε-スクシニルエリスロポエチン；α-N-スクシニル,N-ε-スクシニルエリスロポエチン；α-N-スクシニルアシアロエリスロポエチン；N-ε-スクシニルアシアロエリスロポエチン；α-N-スクシニル,N-ε-スクシニルアシアロエリスロポエチン；α-N-スクシニル低シアロエリスロポエチン；N-ε-スクシニル低シアロエリスロポエチン；およびα-N-スクシニル,N-ε-スクシニル低シアロエリスロポエチンからなる群から選択される。
【０１８８】
一実施形態において、本発明の方法の化学的に改変されたEPOは、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸塩により改変された少なくとも１つのリシン残基をもつエリスロポエチンである。本発明の１つの態様において、上記塩は2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
【０１８９】
他の実施形態においては、本発明の方法の化学的に改変されたEPO、少なくとも１つのチロシン残基がニトロ化および／またはヨウ素化されているエリスロポエチンである。
【０１９０】
さらに他の実施形態において、本発明の方法の化学的に改変されたEPOは、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基をカルボジイミドと反応させ、続いてアミンと反応させたエリスロポエチンである。本発明の１つの態様において、上記アミンはグリシンアミドである。
【０１９１】
突然変異EPO分子を使用することもでき、例えば、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、遺伝子組換えにより産生した突然変異EPOであって、配列番号10の位置11〜15［配列番号1］、配列番号10の位置44〜51［配列番号2］、配列番号10の位置100〜108［配列番号3］、または配列番号10の位置146〜151［配列番号4］の間に１以上の改変されたアミノ酸残基を含む上記突然変異EPOであってもよい。
【０１９２】
他の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、配列番号10の次の位置：7、20、21、29、33、38、42、59、63、67、70、83、96、126、142、143、152、153、155、156、または161の１以上において改変されたアミノ酸残基を含んでなる突然変異EPOである。
【０１９３】
さらに他の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、次の変化の１以上をもつ配列番号10のアミノ酸配列を含んでなる突然変異EPOである（改変された配列は各々、別々の配列同定番号を割付けられている）：配列番号10の残基6におけるアラニン（配列番号15）；配列番号10の残基7におけるアラニン（配列番号16）；配列番号10の残基7におけるセリン（配列番号17）；配列番号10の残基10におけるイソロイシン（配列番号18）；配列番号10の残基11におけるセリン（配列番号19）；配列番号10の残基12におけるアラニン（配列番号20）；配列番号10の残基13におけるアラニン（配列番号21）；配列番号10の残基14におけるアラニン（配列番号22）；配列番号10の残基14におけるグルタミン酸（配列番号23）；配列番号10の残基14におけるグルタミン（配列番号24）；配列番号10の残基15におけるアラニン（配列番号25）；配列番号10の残基15におけるフェニルアラニン（配列番号26）；配列番号10の残基15におけるイソロイシン（配列番号27）；配列番号10の残基20におけるグルタミン酸（配列番号28）；配列番号10の残基20におけるアラニン（配列番号29）；配列番号10の残基21におけるアラニン（配列番号30）；配列番号10の残基24におけるリシン（配列番号31）；配列番号10の残基29におけるセリン（配列番号32）；配列番号10の残基29におけるチロシン（配列番号33）；配列番号10の残基30におけるアスパラギン（配列番号34）；配列番号10の残基32におけるトレオニン（配列番号35）；配列番号10の残基33におけるセリン（配列番号36）；配列番号10の残基33におけるチロシン（配列番号37）；配列番号10の残基38におけるリシン（配列番号38）；配列番号10の残基83におけるリシン（配列番号39）；配列番号10の残基42におけるアスパラギン（配列番号40）；配列番号10の残基42におけるアラニン（配列番号41）；配列番号10の残基43におけるアラニン（配列番号42）；配列番号10の残基44におけるイソロイシン（配列番号43）；配列番号10の残基45におけるアスパラギン酸（配列番号44）；配列番号10の残基45におけるアラニン（配列番号45）；配列番号10の残基4
6におけるアラニン（配列番号46）；配列番号10の残基47におけるアラニン（配列番号47）；配列番号10の残基48におけるイソロイシン（配列番号48）；配列番号10の残基48におけるアラニン（配列番号49）；配列番号10の残基49におけるアラニン（配列番号50）；配列番号10の残基49におけるセリン（配列番号51）；配列番号10の残基51におけるフェニルアラニン（配列番号52）；配列番号10の残基51におけるアスパラギン（配列番号53）；配列番号10の残基52におけるアラニン（配列番号54）；配列番号10の残基59におけるアスパラギン（配列番号55）；配列番号10の残基62におけるトレオニン（配列番号56）；配列番号10の残基67におけるセリン（配列番号57）；配列番号10の残基70におけるアラニン（配列番号58）；配列番号10の残基96におけるアルギニン（配列番号59）；配列番号10の残基97におけるアラニン（配列番号60）；配列番号10の残基100におけるアルギニン（配列番号61）；配列番号10の残基100におけるグルタミン酸（配列番号62）；配列番号10の残基100におけるアラニン（配列番号63）；配列番号10の残基100におけるトレオニン（配列番号64）；配列番号10の残基101におけるアラニン（配列番号65）；配列番号10の残基101におけるイソロイシン（配列番号66）；配列番号10の残基102におけるアラニン（配列番号67）；配列番号10の残基103におけるアラニン（配列番号68）；配列番号10の残基103におけるグルタミン酸（配列番号69）；配列番号10の残基104におけるアラニン（配列番号70）；配列番号10の残基104におけるイソロイシン（配列番号71）；配列番号10の残基105におけるアラニン（配列番号72）；配列番号10の残基106におけるアラニン（配列番号73）；配列番号10の残基106におけるイソロイシン（配列番号74）；配列番号10の残基107におけるアラニン（配列番号75）；配列番号10の残基107におけるロイシン（配列番号76）；配列番号10の残基108におけるリシン（配列番号77）；配列番号10の残基108におけるアラニン（配列番号78）；配列番号10の残基108におけるセリン（配列番号79）；配列番号10の残基116におけるアラニ
ン（配列番号80）；配列番号10の残基126におけるアラニン（配列番号81）；配列番号10の残基132におけるアラニン（配列番号82）；配列番号10の残基133におけるアラニン（配列番号83）；配列番号10の残基134におけるアラニン（配列番号84）；配列番号10の残基140におけるアラニン（配列番号85）；配列番号10の残基142におけるイソロイシン（配列番号86）；配列番号10の残基143におけるアラニン（配列番号87）；配列番号10の残基146におけるアラニン（配列番号88）；配列番号10の残基147におけるリシン（配列番号89）；配列番号10の残基147におけるアラニン（配列番号90）；配列番号10の残基148におけるチロシン（配列番号91）；配列番号10の残基148におけるアラニン（配列番号92）；配列番号10の残基149におけるアラニン（配列番号93）；配列番号10の残基150におけるアラニン（配列番号94）；配列番号10の残基150におけるグルタミン酸（配列番号95）；配列番号10の残基に151おけるアラニン（配列番号96）；配列番号10の残基152におけるアラニン（配列番号97）；配列番号10の残基152におけるトリプトファン（配列番号98）；配列番号10の残基153におけるアラニン（配列番号99）；配列番号10の残基154におけるアラニン（配列番号100）；配列番号10の残基155におけるアラニン（配列番号101）；配列番号10の残基158におけるアラニン（配列番号102）；配列番号10の残基160におけるセリン（配列番号103）；配列番号10の残基161におけるアラニン（配列番号104）；または配列番号10の残基162におけるアラニン（配列番号105）。一実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、配列番号15〜105および119のアミノ酸残基置換の１以上を持つ配列番号10のアミノ酸配列を含んでなる突然変異EPOである。
【０１９４】
さらなる他の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、配列番号10のアミノ酸残基44〜49の欠失した配列番号10のアミノ酸配列を含んでなる突然変異EPOである。
【０１９５】
さらなる他の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、少なくとも１つの次の変化を持つ配列番号10のアミノ酸配列を含んでなる突然変異EPOである（改変された配列は各々、別々の配列同定番号を割付けられている）：
i)配列番号10の残基45におけるアスパラギン酸、および残基100におけるグルタミン酸（配列番号106）；ii)配列番号10の残基30におけるアスパラギン、残基32におけるトレオニン（配列番号107）；iii)配列番号10の残基45におけるアスパラギン酸、残基150におけるグルタミン酸（配列番号108）；iv)配列番号10の残基103におけるグルタミン酸、および残基108におけるセリン（配列番号109）；v)配列番号10の残基140におけるアラニンおよび残基52におけるアラニン（配列番号110）；vi)配列番号10の残基140におけるアラニン、残基52におけるアラニン、残基45におけるアラニン（配列番号111）；vii)配列番号10の残基97におけるアラニン、および残基152におけるアラニン（配列番号112）；viii)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン（配列番号113）；ix)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン、および残基52におけるアラニン（配列番号114）；x)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン、残基52におけるアラニン、および残基140におけるアラニン（配列番号115）；xi)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン、残基52におけるアラニン、残基140におけるアラニン、残基154におけるアラニン、残基24におけるリシン、残基38におけるリシン、残基83におけるリシン、残基24におけるリシンおよび残基15におけるアラニン（配列番号116）；xii)配列番号10の残基24におけるリシン、残基38におけるリシン、および残基83におけるリシン（配列番号117）；またはxiii)配列番号10の残基24におけるリシンおよび残基15におけるアラニン（配列番号118）。一実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、配列番号106〜118のアミノ酸残基置換の少なくとも１つを持つ配列番号10のアミノ酸配列を含んでなる突然変異EPOである。
【０１９６】
組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは突然変異EPOであってかつ次の変化、すなわち置換の少なくとも１つを持つ配列番号10のアミノ酸配列を含んでもよい（列挙した変化または変化の組合わせはそれぞれ、別々の配列同定番号を割付けられている）：i)各配列番号10の残基45におけるアスパラギン酸、および残基100におけるグルタミン酸（配列番号106）；ii)配列番号10の残基30におけるアスパラギン、残基32におけるトレオニン（配列番号107）；iii)配列番号10の残基45におけるアスパラギン酸、残基150におけるグルタミン酸（配列番号108）；iv)配列番号10の残基103におけるグルタミン酸、および残基108におけるセリン（配列番号109）；v)配列番号10の残基140におけるアラニンおよび残基52におけるアラニン（配列番号110）；vi)配列番号10の残基140におけるアラニン、残基52におけるアラニン、残基45におけるアラニン（配列番号111）；vii)配列番号10の残基97におけるアラニン、および残基152におけるアラニン（配列番号112）；viii)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン（配列番号113）；ix)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン、および残基52におけるアラニン（配列番号114）；x)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン、残基52におけるアラニン、および残基140におけるアラニン（配列番号115）；xi)配列番号10の残基97におけるアラニン、残基152におけるアラニン、残基45におけるアラニン、残基52におけるアラニン、残基140におけるアラニン、残基154におけるアラニン、残基24におけるリシン、残基38におけるリシン、残基83におけるリシン、残基24におけるリシンおよび残基15におけるアラニン（配列番号116）；xii)配列番号10の残基24におけるリシン、残基38におけるリシン、および残基83におけるリシン（配列番号117）；またはxiii)配列番号10の残基24におけるリシンおよび残基15におけるアラニン（配列番号118）。
【０１９７】
本発明の他の態様によれば、組織保護サイトカイン受容体複合体リガンドは、次のアミノ酸残基置換の少なくとも１つを含んでなる突然変異EPOである（列挙したそれぞれの変化または変化の組み合わせはそれぞれ、別々の配列同定番号を割付けられている）：配列番号10の残基152におけるトリプトファン（配列番号98）；配列番号10の残基14におけるアラニンおよび残基15におけるアラニン（配列番号119）；配列番号10の残基6におけるアラニン（配列番号15）；配列番号10の残基7におけるアラニン（配列番号16）；配列番号10の残基43におけるアラニン（配列番号42）；配列番号10の残基42におけるアラニン（配列番号41）；配列番号10の残基48におけるアラニン（配列番号49）；配列番号10の残基49におけるアラニン（配列番号50）；配列番号10の残基32におけるトレオニン（配列番号35）；配列番号10の残基133におけるアラニン（配列番号83）；配列番号10の残基134におけるアラニン（配列番号84）；配列番号10の残基147におけるアラニン（配列番号90）；配列番号10の残基148におけるアラニン（配列番号92）；配列番号10の残基150におけるアラニン（配列番号94）；配列番号10の残基151におけるアラニン（配列番号96）；配列番号10の残基158におけるアラニン（配列番号102）；配列番号10の残基161におけるアラニン（配列番号104）;または配列番号10の残基162におけるアラニン（配列番号105）。
【０１９８】
5.4.1.2  抗体
本発明のある特定の実施形態において、上記スクリーニングアッセイで試験される化合物は抗体である。既知リガンドの組織保護受容体サイトカイン受容体複合体との相互作用をモジュレートする化合物を同定するように設計されたスクリーニングアッセイにおいて、リガンドはまた、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体に特異的な抗体であってもよい。かかる抗体を産生させる方法を本明細書に記載している。同定された抗体はまた、組織保護に対しても有用でありうる。同定された抗体はまた疾患、障害または症状を治療または予防する方法における化合物としても有用でありうる。
【０１９９】
かかる抗体としては、限定されるものでないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’）2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより作られたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。かかる抗体を、上記のように、例えば、化合物スクリーニングスキームと一緒に、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体の活性または組織保護活性に与える試験化合物の効果を評価するために利用することができる。
【０２００】
組織保護受容体サイトカイン受容体複合体に特異的抗体の産生について、様々な宿主動物を、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体、またはその部分を用いる注射により免疫感作することができる。組織保護受容体サイトカイン受容体複合体の抗原性部分は当技術分野で公知のアルゴリズムにより容易に予想することができる。
【０２０１】
宿主動物としては、限定されるものでないが、いくつかを名指せば、ウサギ、マウス、およびラットを挙げることができる。様々なアジュバントを用いて、宿主種に応じて、免疫応答を増加することができ、アジュバントとしては、限定されるものでないが、フロイント（Freund）の（完全および不完全）アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）が挙げられる。
【０２０２】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば組織保護受容体サイトカイン受容体複合体、またはその抗原機能性誘導体を用いて免疫感作した動物の血清から誘導される抗体分子の不均質集団である。ポリクローナル抗体の産生のためには、上記の宿主動物を、同じく上記のアジュバントを補充した組織保護受容体サイトカイン受容体複合体またはその一部分を用いる注射により免疫感作することができる。
【０２０３】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、連続細胞系の産生を提供するいずれかの技術によって得ることができる。これらの技術としては、限定されるものでないが、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技術、（1975, Nature 256, 495-497；および米国特許第4,376,110号）、ヒトB-細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら, 1983, Immunology Today 4: 72；Coleら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030）、およびEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら, 1985, 「モノクローナル抗体および癌療法（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）」, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。かかる抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含むいずれの免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスであってもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマをin vitroまたはin vivoで培養することができる。in vivoで高力価mAbの産生ができると本発明において好ましい産生の方法となる。
【０２０４】
さらに、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312: 604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314: 452-454）を利用することができ、これらの技術は適当な抗原特異性をもつマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性をもつヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる技術である。キメラ抗体は、色々な部分が色々な動物種から誘導された分子であり、例えば、マウスmAbから誘導された可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する（例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；およびBossら, 米国特許第4,816,397号を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２０５】
本発明のさらなる実施形態においては、モノクローナル抗体を無菌動物中に産生させることができる（1989年12月12日に公開されたPCT国際公開第WO 89/12690号を参照）。本発明によれば、ヒト抗体を利用できることができ、モノクローナル抗体はヒトハイブリドーマを利用することによって（Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030）またはヒトB細胞をEBVウイルスによりin vitroで形質転換することによって（Coleら, 1985, in 「モノクローナル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」, Alan R. Liss, pp. 77-96）得ることができる。「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312: 604-608；Takedaら, 1985, Nature, 314: 452-454）も利用することができ、これらの技術は組織保護受容体サイトカイン受容体複合体に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性をもつヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる技術であり、かかる抗体は本発明の範囲内にある。
【０２０６】
ヒト化抗体も提供される（Winterによる米国特許第5,225,539号も参照）。免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域により中断された「フレームワーク」から構成される。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に規定されている（「免疫学で注目されるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, Kabat, E.ら, U.S. Department of Health and Human Services (1983)を参照）。簡単に説明すると、ヒト化抗体は、１以上の非ヒト種由来のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である。かかるCDRグラフト化抗体は様々な抗原に対して成功裏に構築されていて、例えば、IL-2受容体に対する抗体（Queenら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029に記載）；細胞表面受容体CAMPATHに対する抗体（Riechmannら, 1988, Nature 332:323に記載）；B型肝炎に対する抗体（Coら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869に記載）；ならびに呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原に対する抗体（Tempestら, 1991, Bio-Technology 9:267に記載）が挙げられる。ヒト化抗体がヒトにおける治療用に最も好ましい。
【０２０７】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242: 423-426；Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883；およびWardら, 1989, Nature 334: 544-546）を、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体、またはその部分に特異的な単鎖抗体を産生させるために適合させることができる。単鎖抗体は、Fv域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結して単鎖ポリペプチドを得ることにより形成する。
【０２０８】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製することができる。例えば、かかるフラグメントとしては、限定されるものでないが、抗体分子のペプシン消化により作製することができるF(ab’)2フラグメント、およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製することができるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築して（Huseら, 1989, Science, 246: 1275-1281）所望の特異性を持つモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にすることができる。
【０２０９】
次いで、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体に対する抗体を利用して、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体を「模倣」する抗イディオタイプ抗体を、当業者に周知の技術を用いて作製することができる（例えば、Greenspan & Bona, 1993, FASEB J 7(5）:437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438を参照)。例えば、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体と結合しかつEPOまたは他の既知のリガンドの組織保護受容体サイトカイン受容体複合体との結合を競合して阻害する抗体を用いて、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体の結合ドメインを「模倣」し、従って、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体リガンドと結合して中和する抗イディオタイプを作製することができる。かかる中和抗イディオタイプまたはかかる抗イディオタイプのFabフラグメントを治療法に用いて天然リガンドを中和し、その後に、本発明の方法により同定した、天然リガンドにより与えられる保護と比較して優れた組織保護を与える化合物を投与することができる。あるいは、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体活性のアゴニストとして作用することができる組織保護受容体サイトカイン受容体複合体に対する抗体を作製することができる。かかる抗体は組織保護受容体サイトカイン受容体複合体と結合し受容体複合体のシグナル伝達活性を活性化しうる。さらに、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体活性のアンタゴニストとして作用する抗体、すなわち、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体の活性化を阻害する抗体は、組織保護受容体サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を同定するアッセイにおいて、陰性対照として有用でありうる。かかるアゴニストおよびアンタゴニストをアッセイする方法は、以上の節に詳細に記載されている。
【０２１０】
5.4.2  化合物の構造の特徴付け
本発明のスクリーニング方法により同定される試験化合物の構造は、当業者に公知の様々な方法により決定することができる。例えば、X線結晶学を利用して化合物の構造を解明することができる。X線結晶学の総説については、例えば、Blundellら 2002, Nat Rev Drug Discov 1(1):45-54を参照されたい。
【０２１１】
ある特定の実施形態においては、振動分光法（例えば、限定されるものでないが、赤外（IR）分光またはラマン分光法）を利用して化合物の構造を解明することができる。改良ラマン分光計がFinkらの米国特許第5,786,893号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み入れられる。振動分光顕微鏡は、可視顕微鏡と分光計の統合により、空間分離方式で単一ビーズにアドレスして測定することができる。顕微赤外分光計はReffnerらの米国特許第5,581,085号に記載されていて、この特許は参照により本明細書にその全文が組み入れられる。１つのサンプルの顕微赤外および顕微ラマン分析を同時に実施する計測器はSostekらの米国特許第5,841,139号に記載されていて、この特許は参照により本明細書にその全文が組み入れられる。本方法の一実施形態においては、化合物を、化学的に改変したスチレンモノマーをドーピングしたポリスチレンビーズ上で合成して、得られるビーズがそれぞれ振動（IRまたはラマン）スペクトルの吸収線の特徴的パターンを持つようにするのであって、限定されるものでないが、Fenniriら, 2000, J. Am. Chem. Soc. 123:8151-8152に記載の方法によって行う。当業者に馴染みのあるスプリット-プール合成法を用いて、化合物のライブラリーを、ビーズの分光学的パターンがビーズ上の化合物の成分の１つを同定するように調製する。組織保護サイトカイン受容体複合体と結合するその能力に従って分離されたビーズを、その振動スペクトルにより同定することができる。
【０２１２】
質量分析計（例えば、エレクトロスプレイイオン化（ESI）およびマトリックス支援レーザー脱着イオン化（MALDI）、フーリエ変換サイクロトロン共鳴（FT-ICR）を、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物のハイスループットスクリーニングおよび該化合物の構造解明の両方に利用することができる。
【０２１３】
MALDIは、イオンを脱着するためのパルスレーザーおよび飛行時間分析計を用いて、非共有結合のtRNA:アミノ-アシル-tRNAシンターゼ複合体の検出に利用されている（Gruic-Sovuljら, 1997, J. Biol. Chem. 272:32084-32091）。しかし、非共有結合の複合体はMALDIプロセス中に解離しうるので、通常、標的核酸と化合物の間の共有結合架橋が検出のために必要である。
【０２１４】
ESI質量分光計（ESI-MS）は、MALDIプロセスと異なり、ESI-MSは少ししか乃至全く断片化してない分子イオンを発生するので、非共有結合分子相互作用を研究するためには遥かに有用である（Xavierら, 2000, Trends Biotechnol. 18(8):349-356）。ESI-MSは、HIV Tatペプチドおよびタンパク質とTAR RNAにより形成される複合体を研究するのに利用されている（Sannes-Loweryら, 1997, Anal. Chem. 69:5130-5135）。
【０２１５】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT-ICR)質量分析計は、高分解能スペクトル、同位体分離前駆体イオン選択、および正確な質量割付を提供する（Xavierら, 2000, Trends Biotechnol. 18(8):349-356）。FT-ICRは、アミノグリコシド抗生物質と同種および非同種RNAとの相互作用を研究するために利用されている（Hofstadlerら, 1999, Anal. Chem. 71:3436-3440；Griffeyら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10129-10133）。本明細書で考察した全ての質量分光法について言えるように、FT-ICRは組織保護サイトカイン受容体複合体または化合物の標識付けを必要としない。
【０２１６】
質量分光法の利点は、化合物の構造の解明だけでなく、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合した化合物の構造決定もすることにある。かかる情報は、組織保護サイトカイン受容体複合体と特異的に結合する化合物のコンセンサス構造の発見を可能にする。
【０２１７】
NMR分光法も、組織保護サイトカイン受容体複合体と会合する化合物を特徴づけるために利用することができる。例えば、特に緩和効果を用いて測定した距離から化学シフトの変化を定性的に決定することにより複合体分子を試験することができるので、NMRに基づく手法はタンパク質薬物標的の小分子バインダーの同定に利用されている（Xavierら, 2000, Trends Biotechnol. 18(8):349-356）。NMRによる構造活性相関（SAR）の決定が、記載されているNMRの第１の方法であり、この方法では、隣接するサブサイトと結合する小分子を標的タンパク質の二次元1H-15Nスペクトルにより同定する（Shukerら, 1996, Science 274:1531-1534）。結合した分子のシグナルをスペクトル線広がり(line broading)、移動NOE（transferred NOE）およびパルス場勾配拡散測定を用いてモニターする（Moore, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10:54-58）。小分子のライブラリーを用いてNMRによるリード作製の方法が最近記載されている（Fejzoら, 1999, Chem. Biol. 6:755-769）。
【０２１８】
本発明に利用することができるNMR法の他の例としては、限定されるものでないが、一次元、二次元、三次元、四次元NMR法ならびに相関分光法（COSY）、および核オーバーハウザー効果（NOE）分光法が挙げられる。化合物の構造決定のかかる方法は当業者に周知である。
【０２１９】
質量分光法と同様に、NMRの利点は化合物の構造の解明だけでなく、組織保護サイトカイン受容体複合体と結合する化合物の構造決定もすることにある。 
5.5  治療用途
当業者であれば、本発明のアッセイにより同定した化合物は、様々な疾患、障害、および症状を治療または予防する治療薬として有用であることを認識しよう。当業者であればまた、かかる化合物を用いて組織保護サイトカイン受容体複合体のモジュレーションを達成することができることも認識しよう。本発明のある特定の実施形態において、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性のモジュレーションを、複合体と複合体リガンドとの相互作用を増強または阻害する化合物により達成することができる。例えば、以上開示した本発明のアッセイにより同定した化合物の治療適応症を評価するために利用することができるin vitroおよびin vivo技術は、本明細書に参照により組み入れられるPCT出願第PCT/US01/49479号、米国特許出願第10/188,905号および第10/185,841号に開示されている。
【０２２０】
本発明の方法により同定した上述の化合物は、一般的に、主に神経学的症状または精神医学的症状を有する中枢神経系または末梢神経系、眼疾患、心血管疾患、心肺疾患、呼吸器疾患、腎、泌尿器および生殖器疾患、骨疾患、皮膚疾患、胃腸疾患ならびに内分泌および代謝異常の、ヒト疾患または障害の予防、治療処置、または予防処置に対して有用でありうる。用途の例としては、限定されるものでないが、外傷からもたらされた傷害、ならびに脳（虚血脳卒中、鈍的外傷、クモ膜下出血）、脊髄（虚血、鈍力外傷）、末梢神経（坐骨神経傷害、糖尿病性神経障害、手根管症候群）、網膜（黄斑性浮腫）、および心臓（心筋梗塞、慢性心不全）に対する炎症からもたらされた傷害に対する保護および修復が挙げられる。特に、かかる疾患、障害、および症状には低酸素症状、すなわち、興奮組織、例えば中枢神経系組織、末梢神経系組織の興奮組織、または心臓組織もしくは網膜組織、例えば、脳、心臓、または網膜/眼に有害な影響を与える低酸素症状が含まれる。従って、本発明の方法により同定した化合物を用いて、様々な症状および環境における低酸素条件から生じる興奮組織の損傷を治療または予防することができる。限定するものでないかかる症状および環境の例を、本明細書の以下の表に掲げる。
【０２２１】
本発明の方法により同定した化合物を用いて治療および予防しうる神経組織病理の保護の例には、神経組織の酸素添加低下から生じる病理が含まれる。ストレス、損傷、および最終的に神経細胞死をもたらす、神経組織への酸素の利用能を低下させるいずれの症状でも、本発明の方法により同定した化合物を用いて治療することができる。一般的に、低酸素および／または虚血と呼ばれる症状は、限定されるものでないが、脳卒中、血管閉塞、出生前または出生後酸素欠乏、窒息（suffocation）、窒息（choking）、溺水後の初期蘇生、一酸化炭素中毒、煙吸入、外科および放射線治療法を含む外傷、仮死、癲癇、低血糖症、慢性閉塞性肺疾患、気腫、成人型呼吸窮迫症候群、低血圧ショック、敗血症ショック、、アナフィラキシーショック、インスリンショック、鎌状赤血球発症、心停止、リズム障害,窒素性ナルコーシス、および心肺バイパスが原因である神経学的欠乏から生じる。
【０２２２】
一実施形態においては、例えば、本発明の方法により同定し本発明のアッセイを用いて同定した化合物を、単独でまたは組成物の部分として投与して、外科処置または医療処置の前、中、または後の外傷または組織損傷のリスクから生じる外傷または組織損傷を予防することができる。例えば、外科処置には、腫瘍切除または動脈瘤修復、化学療法などの医療処置、および分娩または娩出などの自然プロセスが含まれうる。低血糖が原因であるかまたはこれから生じる他の病理であって、本発明の方法により同定した化合物を用いて治療可能である病理には、インスリン過剰投与（医原性高インスリン血症とも呼ぶ）、インスリノーマ、成長ホルモン欠損、低コルチゾール症、薬物過剰投与、およびいくつかの腫瘍が含まれる。
【０２２３】
興奮神経組織損傷から生じる他の病理には、発作障害、例えば、癲癇、痙攣、または慢性発作障害が含まれる。他の治療可能な症状および疾患には、限定されるものでないが、脳卒中、多発性硬化症、低血圧、心停止、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳または脊髄外傷、AIDS痴呆、加齢に関係する認知機能喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作障害、アルコール中毒、網膜虚血、緑内障から生じる視神経傷害、および神経喪失が含まれる。
【０２２４】
特定の本発明の方法により同定した化合物を用いて、病状または様々な外傷から生じる炎症、例えば物理的または化学的に誘導された炎症を治療または予防することができる。かかる外傷としては、血管炎、慢性気管支炎、膵炎、骨髄炎、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、視神経炎、側頭動脈炎、脳炎、髄膜炎、横断脊髄炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、肝炎、および壊死性腸炎が挙げられる。
【０２２５】
本発明の方法により同定した化合物を用いて、網膜組織の症状、およびその傷害を治療または予防することができる。かかる障害には、限定されるものでないが、網膜虚血、黄斑変性症、網膜剥離、網膜色素変性症、動脈硬化性網膜症、高血圧網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧、および糖尿病性網膜症が含まれる。
【０２２６】
他の実施形態においては、本発明の方法により同定した化合物および本発明の原理を用いて、興奮組織への照射から生じる外傷を予防または治療することができる。本発明の方法により同定した化合物はさらに、神経毒素中毒、例えば、ドモイ酸貝毒、神経ラチリズム、およびグアム病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病の治療に利用することができる。
【０２２７】
上述したように、本発明はまた、上記の組織保護サイトカインの末梢投与により哺乳動物の興奮性組織機能を増強するために使用する本発明の方法により同定した化合物にも関する。様々な疾患および症状が、この方法を使用して治療可能であり、そしてさらに、いずれの症状または疾患も無い場合にこの方法は、認知機能を増強するために有用である。本発明のこれらの用途は以下に詳しく記載され、それにはヒトおよび非ヒト哺乳動物の学習および訓練の増強が含まれる。
【０２２８】
本発明の方法により同定した化合物を用いて治療可能または予防可能な中枢神経系に関する症状および疾患としては、限定されるものでないが、気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意欠陥多動性障害、および認知機能不全が挙げられる。これらの症状は、神経機能の増強により改善される。本発明の教示に従って治療可能な他の障害としては、睡眠障害、例えば睡眠時無呼吸および旅行関連障害；くも膜下出血および動脈瘤出血、低血圧ショック、脳震盪傷害、敗血症ショック、アナフィラキシーショック、および様々な脳炎と髄膜炎の後遺症、例えば結合組織疾患関連脳炎、例えばループスが挙げられる。他の用途としては、神経毒素中毒、例えばドモイ酸貝毒、神経ラチリズム、およびグアム病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病；塞栓性もしくは虚血性傷害の術後治療；全脳照射；鎌状赤血球発症；および子癇が挙げられる。
【０２２９】
本発明の方法により同定した化合物を用いて治療可能又は予防可能である症状のさらなるグループには、神経損傷と死を典型とする様々な神経疾患の原因となる遺伝性または後天性のミトコンドリア機能不全が含まれる。例えば、リー病（亜急性壊死性脳症）は、神経脱落および筋症による進行性の視覚喪失と脳症が特徴である。これらの症例において、欠陥性ミトコンドリア代謝は、興奮性細胞の代謝のエネルギーとなるのに充分な高エネルギー基質を供給することができない。エリスロポエチン受容体活性モジュレーターは、様々なミトコンドリア疾患において欠損した機能を最適化する。上述のように、低酸素症状は興奮組織に有害な影響を与える。興奮組織には、限定されるものでないが、中枢神経系組織、末梢神経系組織、および心臓組織が含まれる。上記症状以外に、本発明の方法により同定した化合物は、一酸化炭素および煙吸入のような吸入性中毒、重症の喘息、成人型呼吸窮迫症候群、ならびに窒息、および溺水後の初期蘇生に有用である。低酸素症状を作り出すかまたは他の手段で興奮性組織の傷害を誘導する症状には、インスリンの不適当な投与で、またはインスリン産生性新生物（インスリノーマ）とともに起きる低血糖症が含まれる。
【０２３０】
興奮性組織損傷から生じると考えられる様々な神経心理学的障害は、本発明の方法により同定した化合物を用いて治療可能である。神経傷害が関わりかつ本発明により治療または予防が提供される慢性障害には中枢神経系および／または末梢神経系に関係する障害が含まれ、年齢に関係する認知機能喪失および老人性痴呆症、慢性発作障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、結節性硬化症、ウィルソン病、脳および進行性核上麻痺、グアム病、レーヴィ小体痴呆、海綿状脳症、例えばクロイツェルフェルトヤコブ病などのプリオン病、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、フリードリッヒ運動失調および他の運動失調、ならびにジル・ド・ラ・トゥーレット症候群、癲癇および慢性発作障害などの発作障害、脳卒中、脳または脊髄外傷、AIDS痴呆、アルコール中毒、自閉症、網膜虚血、緑内障、高血圧および睡眠障害などの自律神経機能障害、ならびに、限定されないが、統合失調症、統合失調感情障害、注意欠陥障害、気分変調障害、大鬱病障害、躁病、強迫症、精神活性物質使用障害、不安、パニック障害、ならびに単極性または双極性情動障害などの神経精神障害が挙げられる。さらなる神経精神および神経変性障害としては、例えば「アメリカ精神医学協会の精神障害の診断および統計マニュアル（American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders）」（DSM）（この最新版は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に掲げられたものが挙げられる。
【０２３１】
他の実施形態においては、エリスロポエチンを含有する組換えキメラ毒素分子を、毒素の治療用送達に用いて、増殖性障害、例えば癌、またはウイルス障害、例えば亜急性硬化性全脳炎を治療または予防することができる。
【０２３２】
次表は、上述の組織保護サイトカインにより治療可能である様々な症状および疾患に関する、さらなる例示の、限定するものでない適応症を掲げる。
【表１】
2006524827.tif 000002
【０２３３】
2006524827.tif 000003
【０２３４】
2006524827.tif 000004
【０２３５】
2006524827.tif 000005
【０２３６】
上述したように、これらの疾患、障害または症状は、単に本発明の方法により同定した化合物が与える利益の範囲を説明するものである。従って、本発明は、一般的に機械的外傷またはヒトの疾患の結果の予防、治療処置もしくは予防処置を提供する。CNSおよび／または末梢神経系の疾患、障害または症状の予防または治療処置もしくは予防処置が意図されている。精神医学的要素を有する疾患、障害または症状の予防または治療処置もしくは予防処置が提供される。限定されるものでないが、眼、心血管、心肺、呼吸器、腎臓、泌尿器、生殖器、胃腸、内分泌、または代謝の構成要素を有するものを含む疾患、障害または症状の予防または治療処置もしくは予防処置が提供される。
【０２３７】
一実施形態においては、組織保護サイトカイン受容体複合体の活性をモジュレートする化合物を含有するかかる医薬組成物を全身投与して標的細胞、組織または器官を保護することができる。かかる投与は、非経口で、吸入または粘膜経由で、例えば、口内、鼻腔内、直腸内、膣内、舌下、粘膜下、又は経皮投与などであってもよい。好ましくは、投与は非経口で、例えば、静脈内もしくは腹腔内注射経由であり、また、限定されるものでないが、動脈内、筋肉内、皮内及び皮下投与も含む。
【０２３８】
好ましい有効用量または化合物の量の選択は、当業者に公知のいくつかの要素を考慮して、当業者が決定することができる。そのような要素には、エリスロポエチンの特定の型および／または本発明の方法により同定した化合物、および薬物動態パラメータ、例えば、生物利用能、代謝、半減期などがあり、これらは、医薬の承認を得るために典型的に用いられる通常の開発過程で確立されているであろう。用量を考慮する上でのさらなる要素には、治療すべき症状または疾患、または正常な個体で達成されるべき利点、患者の体重、投与経路、投与は急性かまたは慢性か、併用薬物、および投与される医薬の効能に影響を与えることがよく知られている他の要素が含まれる。従って正確な用量は、医師の判断およびそれぞれの患者の環境、例えば個々の患者の症状と免疫状態に応じて、かつ標準的臨床技術に従って決定される。
【０２３９】
本発明は、本発明の例示として提供される非限定の実施例を参照することによりさらによく理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより詳しく説明するために提示するものである。しかし、これらの実施例を、広い本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【０２４０】
6.  実施例
6.1  実施例１：競合EPOバイオアッセイ
以下に記載した競合結合アッセイを実施して、カルバミル化EPOがEPO-Rと結合するかどうかを決定した。EPO-Rを発現するUT-7細胞を利用して、カルバミル化EPOがrhEPOのEPO-Rとの結合を競合的に阻害するかどうかを決定した。rhEPOがEPO-Rと結合すると、細胞は増殖を示す。増殖の阻害は競合結合の指標となる。
【０２４１】
方法
競合結合アッセイのために、赤白血病UT-7細胞（Komatsu, N.ら, 1991, Cancer Res., 51:341-8）をDSMZ（Braunschweig, Germany, ACC137）から入手した。カルバミル化EPOおよびrhEPOのアッセイを、Levequeら（1996, Hematol Oncol 14:137-46）に記載の通り48時間にわたり実施した。WST-1還元（Roche #1 644 807）を用いて生細胞を定量した。アッセイのシグナル対ノズル比は8〜15であり、少なくとも6点の薬物濃度を用いる濃度応答曲線から4パラメーター適合により、カルバミル化EPOとrhEPOの半最大有効濃度値を決定した。この特定のアッセイにおいては、アッセイをrhEPOを用いて実施し、次いで、別にカルバミル化EPOを用いて実施し、そして次いで、rhEPOとカルバミル化EPOの両方を用いて実施した。
【０２４２】
その結果は、rhEPOを投与したときならびにカルバミル化EPOおよびrhEPOの両方をアッセイに組み入れたときに、細胞増殖がそれぞれ0.6倍および1.7倍大きくなることを示した。カルバミル化EPO単独では、たとえ濃度を増加したときでも、細胞増殖に影響を与えないことを実証した。
【０２４３】
図１は、x軸の試験化合物（rhEPOおよびカルバミル化EPO）濃度を、y軸の細胞増殖に対してプロットして示す。図１は、カルバミル化EPOとrhEPOによる競合アッセイは細胞増殖の減少を示さなかったので、アッセイ内でカルバミル化EPOの存在がUT-7細胞の増殖を刺激するrhEPOの能力に影響を与えないことを明らかに示す。
【０２４４】
これらの結果は、カルバミル化EPOが、UT-7細胞上に存在する古典的EPO-R二量体複合体と結合しないことを示す。
【０２４５】
6.2  実施例２：ラット脳膜のウェスタンブロット
ラット脳細胞はEPOに対して応答性のあることが示された。ラット脳細胞の膜タンパク質を単離し、これらのEPO応答細胞がβc受容体、またはIL-3特異的受容体成分と会合したβc受容体のいずれかを発現するかどうかを決定した。
【０２４６】
方法
ラット膜タンパク質は次のプロトコルを用いて単離した。ラット脳を、プロテアーゼインヒビター（25μg/mlロイペプチン(5mg/ml、ストック）、10μg/mlアプロチン（1mg/ml、ストック）、1mM PMSF（100mM、ストック））20Xを含有するPBS中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織を次いで3,800rpmにて5分間、4℃にて遠心分離した。上清を次いで採集し、そしてさらに14,000pmにて30分間、4℃にて遠心分離する。遠心分離で得られるペレットを次いでプロテアーゼインヒビターおよび1％Triton X-100を含有するPBS中でホモジナイズする。このホモジネートを次いでさらに14,000pmにて30分間4℃にて遠心分離する。得られる上清は膜タンパク質を含有する。
【０２４７】
膜タンパク質を次いでゲル電気泳動により分離した。膜タンパク質を一夜、1Xカゼインを用いて4℃にてブロックした（Vector 10Xカゼイン溶液、Cat#:SP-5020）。アビジン/ビオチンブロッキングキット（Cat#:SP-2001）を用いてアビジンとビオチンブロックを作製した。アビジンブロックを、1X PBS-0.1％ Tween-20/1X カゼイン10ml当たりアビジン2滴を加えることにより20分間作製し、1X PBS-0.1％ Tween-20/1Xカゼインを用いてブロックを簡単にすすぎ洗いし、次いでブロックを10分間洗浄した。ビオチンブロックを、同様な方法で、1X PBS-0.1％ Tween-20/1Xカゼイン10ml当たりビオチン2滴を加えることにより20分間で作製し、1X PBS-0.1％ Tween-20/1X カゼインを用いてブロックを簡単にすすぎ洗いし、次いでブロックを10分間洗浄した。一次抗体（コモンβユニットK-17（Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Santa Cruz、CA）、希釈1:200）とともに、1時間、室温にてインキュベートした。ブロックを次いで4回、それぞれ10分間、1X PBS-0.1％ Tween-20/1Xカゼインを用いて洗浄した。二次インキュベーションを、VECTASTAIN ABCキット（ペルオキシダーゼ、ウサギIgG（Peroxidase Rabbit IgG）、Cat#: PK-4001）の1:1000希釈（1X PBS-0.1％ Tween-20/1Xカゼイン60ml中に1滴）を用いて、1時間、室温にて実施した。次いでブロックを3回、それぞれ10分間、1X PBS-0.1％ Tween-20を用いて洗浄した。洗浄中に、AB試薬を1X PBS-0.1％ Tween-20中に調製した、すなわち、キットの試薬Aの2滴を10ml 1X PBS-0.1％ Tween-20に加え、よく混合し、試薬Bの2滴を加え、よく混合し、そして30分間、室温にてインキュベートして複合体を形成させた。次いで膜を30分間、室温にてインキュベートし、次いで3回、それぞれ10分間、1X PBS-0.1％ Tween-20を用いて洗浄した。ブロットに加える直前に、Vectorペルオキシダーゼ基質キットDABから蒸留水中の基質溶液を調製した（バッファーストック溶液2滴を蒸留水10mlに加え、混合し、DABストック溶液4滴を加え、混合し、過酸化水素溶液2滴を加え、混合した）。次いで、ブロットを基質とともに室温にて10分間または発色するまでインキュベートした。次いでブロットを、毎回換えた蒸留水を用いて2回洗浄した。この操作をまた、IL-3特異的サブユニット（T-20、Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Santa Cruz、CA）に対する一次抗体を用いて繰返した。
【０２４８】
この結果は、βc受容体およびIL-3に特異的なβc受容体の両方がラット脳細胞膜に同定されたことを示した。
【０２４９】
図２は、別々の膜タンパク質のポリアクリルアミドゲルの写真を示す。第１ゲルはβc受容体に対応する130KDタンパク質を示す。第２ゲルはIL-3受容体タンパク質に特異的なβc受容体の形態に対応する70KDタンパク質を示す。この結果は、明らかに、エリスロポエチン応答性細胞(脳)中にβc受容体(130kDにバンド)の存在を示す。この知見は、EPO受容体とβc受容体の両方が脳細胞膜に存在するので、組織保護サイトカイン受容体複合体が脳細胞膜に形成しうることを示す。
【０２５０】
6.3  実施例３：ラット脊髄中のβc受容体に対する免疫組織化学
ラット脊髄切片を、βc受容体の存在を試験するために染色した。
【０２５１】
方法
ラットの脊髄を除去してパラフィンで固定した。包埋した組織を次いで切片化した（6μm）。脊髄の切片を次いで抗βc受容体抗体（K-17、Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Santa Cruz、CA.）を用いて染色した。
【０２５２】
図３は、抗βc受容体抗体を用いてβc受容体を染色した切片化脊髄の写真を示す。染色は、βc受容体が脊髄中に存在することを示す。
【０２５３】
図４は、切片化した脊髄の染色領域の拡大写真を示し、抗βc受容体抗体との反応性を示す。
【０２５４】
この知見は、βc受容体とEPO受容体がこれらの組織に存在するので、脊髄組織における組織保護サイトカイン受容体複合体の存在を示す。
【０２５５】
6.4.  実施例４：EPO-Rとβc受容体の共沈降
EPO受容体とβc受容体が細胞中で互いに会合しているどうかを決定するために、受容体抗体を用いて両方の受容体を発現する細胞からの複合体を共沈降させた。P-19細胞由来の膜タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分離し、ウェスタンブロットを実施してEPO受容体とβc受容体を染色した。
【０２５６】
方法
P-19細胞（神経様胚性腫瘍細胞）由来のEPO-Rおよびβc受容体の共沈降を、Jubinskyら, 1997, (Blood 90:1867-1873)に概説されたプロトコルに従い実施した。上記6.3節に記載の受容体に特異的な抗体を用いた。免疫沈降物を次いでポリアクリルアミドゲル上で泳動し、ウェスタンにより転写し、そしてEPO受容体とβc受容体に特異的な抗体を用いて染色した。
【０２５７】
図５は、EPO-Rおよびβc受容体抗体を用いて共沈降させたサンプルのウェスタンブロットである。レーン１はEPOの不在のもとでβc受容体抗体（上部）とEPO-R抗体（下部）を用いたウェスタンブロット上でのEPO-Rの共沈降の結果を示す。βc受容体を表すバンドを明らかにゲル上に見ることができる（該当するバンドに当てた矢印、上部）。βc受容体抗体を用いて染色した上部ゲル上の矢印は、もしサンプル中にEPO受容体が存在すればEPO受容体が移動する位置を示す。レーン２はEPOの存在のもとでβc受容体抗体（上部）およびEPO-R抗体（下部）を用いたウェスタンブロット上でのEPO-Rの共沈降の結果を示す。レーン３は、逆免疫沈降を示し、バンド（下部）はβc受容体抗体を用いて免疫沈降したサンプル中のEPO-Rの存在を示す。EPO-R抗体を用いて染色した下部ゲルの第１矢印は、ほぼ103kDにヌクレオリンとして同定されたバンド（以下の実施例10を参照）を示す。EPO-R抗体を用いて染色した下部ゲルの第２矢印は、ほぼ68kDにEPO受容体として同定されたバンド（以下の実施例10を参照）を示す。
【０２５８】
この結果は、EPO-Rおよびβc受容体が、両方の受容体が発現される細胞中で複合体を形成することを示す。最後に、EPO自体が存在してもしなくても複合体が形成され（レーン１とレーン２を比較されたい）、EPOは組織保護サイトカイン受容体複合体の形成に必要でないことを示す。
【０２５９】
6.5  実施例５：βc受容体を持つまたは持たない心筋細胞のアポトーシス
心筋細胞のアポトーシスを、正常マウス由来の野生型心筋細胞およびβc鎖ノックアウト(-/-)マウス由来の心筋細胞に誘導し、βc受容体が、細胞に与えるアポトーシスを防止するかまたは遅延させるEPOの保護活性に役立つかどうかを決定した。
【０２６０】
方法
心筋細胞を、野生型C57BL/6-129Svまたは株一致の共通β鎖ノックアウトβc(-/-)マウス（Robbら, 1995, P.N.A.S. U.S.A. 92:9565-9569）から記載のように単離した(Fiordalisoら, 2001, Diabetes 50:2363-2375)。アポトーシス細胞死は、スタウロスポリン（Sigma、0.1μM）中で、エリスロポエチン（100ng/ml）の存在または不在のもとでインキュベートすることにより誘導した。アポトーシスを誘導しなかった野生型およびβc(-/-)心筋細胞を対照とした（図７のカラム１および２）。アポトーシスを、野生型およびβc(-/-)心筋細胞（図7のカラム3および4）、EPOまたはカルバミル化EPOの存在のもとでの野生型心筋細胞（図7のカラム5および6）、およびEPOの存在のもとでのβc(-/-)心筋細胞（図7のカラム7）において誘導した。
【０２６１】
16時間インキュベーション後に、細胞を固定し、TUNEL（Roche Diagnostics）を用いて断片化DNAのin situ検出の処理をした。
【０２６２】
その結果を図７に示すが、この図は、正常およびβc受容体ノックアウトマウス由来の単離した心筋細胞のEPOの存在および不在のもとでの％アポトーシス（y軸）を示す（カラム3〜7）。アポトーシスをEPOの存在のもとで誘導したβc(-/-)心筋細胞の％アポトーシス（カラム7）は、EPOの不在のもとでの野生型およびβc(-/-)心筋細胞の％アポトーシス（カラム3および4）と有意差がなかった。
【０２６３】
この結果は、EPOの組織保護活性がこれらの細胞中のβc受容体の存在に依存することを示す。
【０２６４】
6.6  実施例６：EPO受容体を介する下流キナーゼ活性化
様々な濃度のEPOおよびカルバミル化EPOが、EPO受容体を発現する細胞において下流キナーゼ活性を誘導することができるかどうかを決定するために、EPO受容体を発現する細胞を、EPOおよびカルバミル化EPOの存在のもとで、活性化キナーゼ、リン酸化Jak2の存在について試験した。
【０２６５】
方法
BaF3/EPOR細胞を10分間、様々な濃度のEPOまたはカルバミル化EPOを用いて刺激した。Jak2の活性化は、細胞ライセートのウェスタンブロットにより、チロシン-リン酸化Jak2を認識する抗体（PY-Jak2）を用いて分析した。膜を剥がし、Jak2に対する抗体を用いて再プローブして等しいローディングを確認した。
【０２６６】
図８は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、PY-Jak2抗体を用いて染色した細胞タンパク質の、ウェスタンブロットを示す。上部は、5nMおよび50nMの濃度のEPOで刺激した細胞中にリン酸化Jak2が存在したことを示す。
【０２６７】
この結果は、カルバミル化EPOは、EPO受容体を発現する細胞中で古典的EPO受容体ホモ二量体の下流活性化を誘導することができないことを示す。これは、カルバミル化EPOが古典的EPO受容体ホモ二量体と結合しないことを示す。
【０２６８】
6.7  実施例７：BaF3/EPOR細胞-結合アッセイ
EPO受容体を発現する細胞がEPOおよびカルバミル化EPOと結合するかどうかを決定するために、BaF3細胞をそれぞれのリガンドと接触させ、結合親和力を競合結合アッセイで測定した。
【０２６９】
方法
0.1nM 125I EPOならびに段階的用量の無標識EPOおよびカルバミル化EPOとともにそれぞれ、30分間、室温にて106ウエルのPBS中でインキュベートした。膜をフィルター上で洗浄し、膜に結合した125I EPOをガンマカウンターで計数した。放射性リガンドの受容体結合分率を、無標識リガンドの段階的用量に対する結合125I EPOとしてプロットした。
【０２７０】
図９は、EPO受容体を発現するBaF3細胞に対するリガンド結合親和力のグラフを示す。リガンド濃度(nM)（x軸）を、EPO受容体リガンドEPOおよびカルバミル化EPOと接触させたBaF3 EPO受容体発現細胞との結合（cpm）（y軸）に対してプロットした。
【０２７１】
BaF-3/EPO-R細胞はEPOとほぼ1nMの親和力で結合するが、カルバミル化EPO結合は検出されなかった。この結果は、カルバミル化EPOが、EPOのEPO受容体を発現する細胞との結合を競合阻害しないことを示す。
【０２７２】
6.8  実施例８：UT-7膜アッセイ
古典的EPO受容体二量体を発現する細胞がEPOおよびカルバミル化EPOと結合するかどうかを決定するため、UT-7細胞膜をそれぞれのリガンドと接触させ、結合親和力を競合結合アッセイで測定した。
【０２７３】
方法
100μgのUT-7膜を、30分間、室温にて200μl PBS中でそれぞれ0.1nM 125I EPOならびに段階的用量の無標識EPOおよびカルバミル化EPOとともにインキュベートした。膜をフィルター上で洗浄し、膜に結合した125I EPOをガンマカウンターで計数した。放射性リガンドの受容体結合分率を、無標識リガンドの段階的用量に対する結合125I EPOとしてプロットした。UT-7膜はEPOと0.1〜0.5nMの親和力で結合する。対照的に、カルバミル化EPOの結合は検出されなかった。
【０２７４】
図10は、EPO受容体を有するUT-7細胞膜に対するリガンド結合親和力のグラフを示す。nMで表したリガンド濃度（x軸）を、EPO受容体リガンドEPOおよびカルバミル化EPOと接触させたUT-7 EPO受容体発現細胞膜との結合（cpm）（y軸）に対してプロットした。
【０２７５】
この結果は、カルバミル化EPOが、EPOの古典的EPO受容体二量体の両方を発現する細胞との結合を競合阻害しないことを示す。
【０２７６】
6.9  実施例９：ヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度
マウスにEPOと改変EPOとを投与してカルバミル化EPOまたはアシアロEPOがEPOと同じ赤血球新生能力、すなわち、ヘマトクリットの増加およびおヘモグロビンの増加を有するかどうかを決定した。
【０２７７】
方法
マウスに、静脈内に毎週5回、50μg/kgのEPO、カルバミル化EPOおよびアシアロEPOを4週間注射した。血清ヘモグロビン濃度およびヘマトクリットを、ヘモグロビノメーターにより、イソフルラン麻酔下で眼窩後方から採取した血液（<50μl）を用いて測定した。
【０２７８】
図11は、対照（ビヒクル）、EPO、カルバミル化EPO、およびアシアロEPO（x軸）投与後のマウスにおける、11A、ヘマトクリットの％容量により測定したヘマトクリットレベル（y軸）、および11B、mMの濃度で測定したヘモグロビンレベル（y軸）のヒストグラムを示す。
【０２７９】
この結果は、マウスに投与したカルバミル化EPOおよびアシアロEPOは、EPOを投与したマウスに現れるヘマトクリットおよびヘモグロビンの増加を誘導しないことを示す。これは、カルバミル化EPOおよびアシアロEPOが、EPOと比較して、in vivoで細胞と異なって相互作用することを示す。上記結合アッセイの実験結果を組合わせると、これらの結果は、カルバミル化EPOおよびアシアロEPOがEPO受容体と結合せず、従って、EPOの血管新生活性を与えることはできないことを立証する。
【０２８０】
6.10  実施例１０：ヌクレオリンの存在の検出
実施例４に記載のウェスタンブロットとβc受容体抗体を用いる沈降物をさらに分析した。特に、図５の、5つのレーン1（上部）に示される103KDバンドに対応するタンパク質をさらに分析し、サンプル中の共沈降していた他のタンパク質の正体を決定した。
【０２８１】
方法
P19細胞を完全培地中で70％集密まで増殖した。これらの細胞を10ng/ml EPOまたは生理食塩水（C）を用いて15分間処理し、次いでフラスコをタッピングして剥がし、7分間700rpmにて遠心分離し、そして溶解バッファー（プロテアーゼインヒビター、2mM CaCl、1％Tritonおよび1％NP40を含むTBS）中に再懸濁化して、1mgタンパク質/mlの最終濃度とした。CaCl2が溶解バッファー中に存在し、凍結またはボルテキシングを防いでタンパク質相互作用を維持した。10分間、120000rpmでの遠心分離により、細片を除去した後に、ライセートをプロテインAセファロース（Pharmacia、10μL排出ゲル/ml）とともに1時間、室温にてインキュベートして非特異的結合を除去した。
【０２８２】
次いで上清を、予め抗体と1時間カップリングさせたタンパク質Aセファロース（10μLゲル/ml）とともにインキュベートし、溶解バッファーを用いて3回洗浄した。β共通鎖に対する抗体（K17、Santa Cruz Biotechnologies）またはEPO-Rに対する2種の抗体の混合物（M20およびh194、Santa Cruz Biotechnologies）のいずれかを1:200の最終希釈で使い、一夜、4℃にてインキュベーションを行った。次いでタンパク質Aセファロースビーズを低界面活性剤溶解バッファー（0.5％Tritonを含有しNP40を含有しないことを除くと上記溶解バッファーと同じ）を用いて5回洗浄し、そして結合したタンパク質を、5％β-メルカプトエタノールとともに2x Laemmliサンプルバッファー30μLの添加により解離し、そして10％SDS-PAGE上で泳動した。
【０２８３】
103kDバンドをクーマシーブルー染色したゲルから切除し、数時間、25mM炭酸水素アンモニウム/40％エタノール中で脱染色し、そして逐次増加する百分率のアセトニトリルを用いて洗浄した。タンパク質を一夜、30℃にて、25mM炭酸水素アンモニウム/10％アセトニトリル溶液中の12ng/mlの濃度のトリプシン（Promega、Madison WI）を用いて、ゲル中で消化した。ペプチドマスフィンガープリント（PMF）を、Bruker ReflexIIITMマトリックス支援レーザー脱着／イオン化（MALDI）質量分析計で、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（Bruker Daltonics Billerica、MA）をマトリックスとして用いて作製した。質量スペクトルを、1000〜3000Daの範囲の7種の標準ペプチドの混合物を用いて外部較正した。作製したデータを、プログラムMascot（http://www.matrixscience.com）およびProfound（http://prowl.rockefeller.edu/）を利用し、最高1個の未達成のトリプシン切断（missed trypsin cleavage）および質量許容度±0.2Daまで許容して、データベース（NCBInr）検索で処理した。質量スペクトルを用いてヌクレオリンの同一性を決定した。
【０２８４】
この結果は、組織保護サイトカイン受容体複合体を形成するEPO受容体とβc受容体を発現するP19細胞がEPOの投与に応答してヌクレオリンを産生することを示す。図12は丸で囲んだ103KDヌクレオリンタンパク質を伴うSDS-PAGEゲルの写真を示す。
【０２８５】
6.11  実施例１１：βc受容体ノックアウトマウスにおける脊髄傷害
脊髄傷害をβc鎖ノックアウト(-/-)マウスおよび正常（野生型）マウスに誘導して、βcノックアウトマウス由来の心筋細胞における上記結果をさらに研究し、βc受容体が脊髄傷害後のEPOの保護活性の役割を果たすかどうかを決定した。
【０２８６】
方法
脊髄傷害をマウスに、Farooque（2000, Acta Neuropathol (Berl) 100:13-22）のプロトコル改変法を用いて加えた。この技術によって、損傷した興奮細胞、組織および器官のEPOおよびカルバミル化EPOを用いる治療を試験するための動物モデルを生産した。具体的には、8〜16週齢のC57/bl6（野生型）またはβc受容体ノックアウト（ゼロ）マウスを用いた。各動物を、尾から採取したDNAのPCR分析によりゼロであることを確認した。脊髄傷害を、それぞれ4〜9マウスを含む5グループのマウス（2グループの野生型マウスおよび3グループのゼロマウス）に加えた。脊髄傷害中、動物をイソフルランを用いて麻酔しかつ正常な深部温度を維持した。椎弓切除をT3で実施し、2mmステンレス鋼ロッドを硬膜に15グラムの力で4分間適用し、その後、除去した。
【０２８７】
傷害の直後に、カルバミル化EPOの１回用量を第１グループのゼロマウスに投与し、EPOの１回用量を第２グループのゼロマウスに投与し、PBSを対照として第３グループのゼロマウスに投与し、カルバミル化EPOの１回用量を第１グループの野生型マウスに投与し、PBSの１回用量を第２グループの野生型マウスに投与した。
【０２８８】
動物を次いで42日間、Bassoら（1995, J. Neurotrauma 12:1-21）のスコアリングシステムを用いて評価した。Basso、Beattie、Bresnahan（BBB）スケールは、脊髄傷害後の機能回復の尺度に通常使われている正常な地上歩行運動を試験するための21ポイントスケールである。BBBスコアは非常に高感度で微細な運動性不足を検出しかつまた脊髄傷害後の回復の程度も評価する。動物の全グループについて、BBB運動スコアを傷害後日数に対してプロットした。次いで臨床重症度を、「BBB」対「傷害後日数」のプロットの曲線下面積（AUC）を測定して計算した。マウスのグループ間の臨床重症度値の差を統計的に解析し、かつ各グループの臨床重症度値を示す棒グラフを作製した。
【０２８９】
この結果は、心筋細胞で得た結果を確証し、かつEPOの組織保護活性が動物中のβc受容体の存在に依存することを示す。結果を図13に示し、この図は「BBB運動スコア（y軸）」対「日数で表した傷害後の時間（x軸）」を示す。カルバミル化EPOを投与したマウスの野生型グループは、全ての他のグループと比較して、42後傷害時間全体にわたり運動スコアの増加を示した。結果を図14に示し、この図は曲線下面積（AUC）で測定した臨床重症度（y軸）とマウスのグループ（x軸）を示す。カルバミル化EPOを投与したマウスの野生型グループ（カラム１）は、全ての他のグループ（カラム２〜５）と比較して、臨床重症度値の有意な増加（すなわち、より低い重症度）を示した。EPOを投与したゼロマウスのグループ（カラム５）は、全ての他のグループと比較して、非常に高い死亡率を示した。この結果は、βc受容体が傷害を治療する上でEPOの治療利益を達成するために必要であることを示唆する。
【０２９０】
本発明は、本発明の個々の態様を単一の例示として示す具体的実施形態によりその範囲が限定されることはなく、かつ機能的に同等の方法および構成要素は本発明の範囲内に包含される。本発明の様々な変更は、本明細書に示しかつ記載したものに加えて、以上の説明と添付の図面とから当業者には明らかであろう。かかる変更は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。
【０２９１】
本明細書中のすべての引用文献は、参照により本明細書にその全文が全ての目的に対して組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】EPOとカルバミル化EPOとの間の競合アッセイの結果を示し、カルバミル化EPOはEPO-Rと結合しないことを示す。
【図２】ラット脳膜内のβc受容体の存在を示す。
【図３】βc受容体の存在について染色したラット脊髄組織を示す。
【図４】βc受容体の存在について染色したラット脊髄組織の拡大図を示す。
【図５】EPO-Rおよびβc受容体の共沈降を示す。
【図６】組織保護受容体複合体の可能な立体構造を示す。
【図７】正常およびβc受容体ノックアウトマウスからEPOの存在および不在のもとで単離された心筋細胞のアポトーシスを示す。
【図８】ホスホチロシン(PY)-Jak2抗体を用いてポリアクリルアミドゲルにより分離した細胞タンパク質のウェスタンブロットの写真を示す。トップ（上部）ゲルは、リン酸化Jak2が、5nMおよび50nM濃度のEPOを用いて刺激した細胞中に存在したことを示す。ボトム（下部）ゲルは、膜をストリップしてJak2に対する抗体により再プローブし、等しいローディングを確認するために実施した対照を示す。
【図９】EPO受容体を発現しているBaF3細胞に対するリガンド結合親和力のグラフを示す。nMで表したリガンド濃度(x軸)を、EPO受容体リガンドであるEPOおよびカルバミル化EPOと接触させたEPO受容体を発現するBaF3細胞との結合(cpm)（y軸）に対してプロットした。
【図１０】EPO受容体を有するUT-7細胞膜に対するリガンド結合親和力のグラフを示す。nM(x軸)で表したリガンド濃度を、EPO受容体リガンドであるEPOおよびカルバミル化EPOと接触させたEPO受容体を発現するUT-7細胞膜との結合(cpm)（y軸）に対してプロットした。
【図１１Ａ】対照（ビヒクル）、EPO、カルバミル化EPO、およびアシアロEPO（x軸）投与後のマウスにおける、ヘマトクリットの容積（％）により測定したヘマトクリット（y軸）のヒストグラムを示す。
【図１１Ｂ】対照（ビヒクル）、EPO、カルバミル化EPO、およびアシアロEPO（x軸）投与後のマウスにおける、mMで表した濃度で測定したヘモグロビンレベル（y軸）のヒストグラムを示す。
【図１２】103KDヌクレオリンタンパク質（丸で囲んだバンド）のSDS-PAGEゲルの写真を示す。
【図１３】５グループのマウス（２グループの野生型と３グループのβcノックアウト）にPBS、EPO、またはカルバミル化EPOのいずれかを脊髄傷害直後に投与した場合の、「BBB運動スコア（y軸）」対「脊髄傷害後日数で表した測定時間（x軸）」のグラフを示す。カルバミル化EPOを投与した野生型グループのマウスは、全ての他のグループと比較して、傷害後42日間を通して運動スコアの増加を表した。
【図１４】図１３の上記の５グループに対して、曲線下面積(AUC)で測定した臨床重症度（y軸）とマウスグループ（x軸）のヒストグラムを示す。カルバミル化EPO（第１列）を投与した野生型グループのマウスは、他の全てのグループ（カラム２〜５）と比較して、臨床重症度値の有意な増加（すなわち、より低い重症度）を表した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月30日(2006.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006524827000001.app
【国際調査報告】
2006524827.tif 000169