(57)【要約】ヒト乳頭腫ウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）に感染した患者の子宮頸がんを診断する方法が開示される。該方法は、患者から得た試料中のＨＰＶ−１６ゲノムのＣｐＧ部位にメチル化が存在するか否かを測定することを含む。メチル化が存在していないＣｐＧ部位が多いほど、子宮頸がんがより強く示される。同方法を実行するのに有用なプライマーおよびキットも開示される。ＨＰＶ−１６ゲノムの７８６２位のＣｐＧ部位のメチル化状態を測定することが好ましい。
2006522607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト乳頭腫ウイルスＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんを診断する方法であって、
１）前記患者の子宮頸部の細胞からＨＰＶ−１６ゲノムＤＮＡを含む試料を得るステップであって、ＨＰＶ−１６ゲノムが、７４９８位から１６１位までの間に１１個のＣｐＧジヌクレオチドを有することを特徴とするステップと；
２）試料中のＨＰＶ−１６ゲノムの前記１１個のＣｐＧ部位のうちの少なくとも１個にメチル化が存在するか否かを測定するステップであって、メチル化が存在しないＣｐＧ部位が多いほど、子宮頸がんであることがより強く示唆されることを特徴とするステップとを含む方法。
【請求項２】
前記１１個のＣｐＧジヌクレオチド全てにメチル化が存在すれば、子宮頸がんが存在しないことが示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＰＶ−１６ゲノムの３７位、４３位、５２位および５８位にＣｐＧジヌクレオチドが存在し、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１個にメチル化が存在しなければ、少なくともＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変が存在することが示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＰＶ−１６ゲノムが７８６２位にＣｐＧジヌクレオチドを有しており、７８６２位にメチル化が存在しなければ、少なくともＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変が示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ２）が、メチル化感受性エンドヌクレアーゼでＨＰＶ−１６ゲノムを消化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ２）が、
プライマーを試料に添加してＰＣＲを実行するステップであって、前記プライマーが、メチル化感受性エンドヌクレアーゼによる開裂を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むアンプリコンのいずれかの末端に相当するステップと；
前記ＰＣＲ法の結果を分析して、前記少なくとも１個のＣｐＧ部位が開裂しているかどうかを測定するステップと
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーが配列番号１９および２０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼがＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ステップ２）が、前記１１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基を、該ＣｐＧのメチル化状態に応じて選択的に修飾することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ２）が、シトシン残基を選択的に修飾した後、プライマーを試料に添加してＰＣＲ法を実施するステップを更に含み、前記プライマーが、少なくとも１個のＣｐＧ部位を含むアンプリコンのいずれかの末端に相当する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーが配列番号２７および２８である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ２）が、ＰＣＲ法を実施するステップの後に、前記プライマーを用いてアンプリコンを配列決定するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ２）が、前記１１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基を選択的に修飾するステップの後に、少なくとも１個のＣｐＧ部位を含むＨＰＶ−１６ゲノムの少なくとも一部を配列決定するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記１１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基を選択的に修飾するステップが、重亜硫酸ナトリウムを試料に添加して非メチル化シトシン残基を修飾してウラシル残基とすることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ２）が、
第１の融解温度で前記少なくとも１個のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができ、該ＣｐＧ部位のシトシン残基が修飾されている場合には第２の異なる融解温度で前記部位とハイブリダイズすることができる少なくとも１種類の検出プローブを添加するステップと；
修飾ステップの後に、前記検出プローブとＣｐＧ部位を含むＨＰＶ−１６ゲノムの一部とのハイブリダイゼーションをある温度範囲でモニタリングするステップと
を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１種類の検出プローブに隣接してＨＰＶ−１６ゲノム上の位置にハイブリダイズすることができる少なくとも１種類のアンカープローブを試料に添加するステップであって、前記検出プローブが、第１の波長の光を吸収することができるドナー色素と、第２の波長の光を発光することができるアクセプター色素とのうちの一方を含み、前記アンカープローブが、ドナー色素とアクセプター色素とのうちの他方を含み、該ドナー色素および該アクセプター色素は、互いに近接していると蛍光共鳴エネルギー移動が可能であることを特徴とするステップと；
試料を前記第１の波長の光に露光するステップと；
前記温度範囲にわたって第２の波長の光の発光を検出するステップと
を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料を１１個のサブサンプルに分割するステップと；
検出プローブおよび対応するアンカープローブを各サブサンプルに添加するステップであって、前記検出プローブが、ＨＰＶ−１６ゲノム上のそれぞれ７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができることを特徴とするステップと；
各サブサンプルを前記第１の波長の光に露光するステップと；
前記温度範囲にわたって各サブサンプルからの前記第２の波長の発光を検出するステップと
を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんの進行を評価する方法であって、
１）前記患者の子宮頸部の細胞からＨＰＶ−１６ゲノムＤＮＡを含む試料を得るステップと；
２）少なくともＨＰＶ−１６ゲノムの７８６２位のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するステップであって、前記ジヌクレオチドのメチル化が存在しなければ、少なくとも子宮頸がんの前駆病変が存在することが示唆されるステップと
を含む方法。
【請求項１９】
ＨＰＶ−１６ゲノムが７４９８位から１６１位までの間に１１個のＣｐＧジヌクレオチドを有し、ステップ２）が、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位までの間の１
１個のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するステップを更に含み、メチル化が存在しないジヌクレオチドの数が多いほど、患者の子宮頸がんがより進行していることが示唆されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１９、２０、２７および２８の配列からなる群から選択される配列を有するＤＮＡプライマー。
【請求項２１】
ＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんの進行を評価するためのキットであって、メチル化感受性エンドヌクレアーゼと、ＨＰＶ−１６ゲノム内のアンプリコンのいずれかの末端を規定するプライマー対とを含み、前記アンプリコンが、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位までの間の、メチル化感受性エンドヌクレアーゼによる開裂を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことを特徴とするキット。
【請求項２２】
前記プライマーが配列番号１９および２０である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
ＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんの進行を評価するためのキットであって、
ＣｐＧ部位のメチル化状態に応じて、該ＣｐＧ部位の配列を選択的に修飾することができる薬剤と；
アンプリコンのいずれかの末端を規定するプライマー対と、前記アンプリコンが、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位までの間の、前記薬剤による修飾を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことと
を含むキット。
【請求項２５】
前記プライマー対が、配列番号２７および２８である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも１種類の検出プローブを更に含み、前記検出プローブが、検出可能なマーカーを含み、第１の融解温度で前記ＣｐＧ部位とハイブリダイズすることが可能であり、該ＣｐＧ部位が修飾されている場合には第２の異なる融解温度で前記部位とハイブリダイズすることが可能であることを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
前記少なくとも１種類の検出プローブが、７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位からなる群から選択されるＨＰＶ−１６ゲノムの位置のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることが可能であることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
検出プローブが１１種類存在し、該検出プローブがＨＰＶ−１６ゲノムのそれぞれ７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることが可能であることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記少なくとも１種類の検出プローブに隣接してＨＰＶ−１６ゲノム上の位置にハイブリダイズすることができる少なくとも１種類のアンカープローブを更に含み、前記アンカープローブが検出可能なマーカーを含み、検出プローブの検出可能なマーカーがドナー色素とアクセプター色素とのうちの一方から選択され、アンカープローブの検出可能なマーカーがドナー色素とアクセプター色素とのうちの他方から選択され、該ドナー色素および該アクセプター色素は、互いに近接していると蛍光共鳴エネルギー移動が可能であることを特徴とする、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
ドナー色素がフルオレセインであり、アクセプター色素が、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ６４０およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ７０５からなる群から選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記検出プローブが、ＨＰＶ−１６ゲノムの７８６２位のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができる、請求項２７に記載のキット。
【請求項３２】
前記薬剤が、重亜硫酸ナトリウムおよび過マンガン酸カリウムからなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は子宮頸がんの診断に関し、子宮頸がんの進行を評価する方法にも関する。更に本発明は、子宮頸がんの診断において用いられるＤＮＡプライマーおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト乳頭腫ウイルス（ヒトパピローマウイルス）−１６（ＨＰＶ−１６）および関連のＨＰＶ型は発がん性であり、持続的なＨＰＶ−１６感染は、子宮頸がんの主たる原因である。ほとんどの女性がＨＰＶに感染するようになるが、これらの感染の一部が悪性に進行する一方で、ほとんどは不顕性のままであるか、あるいは前駆病変に誘導されるだけである（ツアハウゼン、エイチ．（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ，  Ｈ．）およびシッフマン、エム．エイチ．他（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，  Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．））。
【０００３】
これらの結果を決定する因子は、ほとんど理解されていない。ＨＰＶによる形質転換は、ＨＰＶオンコプロテインＥ６およびＥ７に依存し、Ｅ６およびＥ７の転写は、多数の転写因子およびエピジェネティックな（後成的）メカニズムによって調節される（バーナード、エイチ．ユー．（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ．Ｕ．））。腫瘍進行は、ステロイドによる（チャン、ダブリュ．ケイ．他（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．））、転写サイレンサの欠失による（メイ、エム．他（Ｍａｙ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．））、そしてＨＰＶゲノムが細胞内ＤＮＡに組込まれることによる（ベイカー、シー．シー．他（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ. ）およびステンケル、ダブリュ．他（Ｓｔｕｅｎｋｅｌ,   Ｗ.   ｅｔ  ａｌ．））、転写誘導を介してオンコプロテインの発現が刺激された結果である可能性がある。
【０００４】
現在では、子宮頸がんを早期に検出することが、その治療の重要な要素である。通常この早期検出は、いわゆる「Ｐａｐ」スミア（即ち、パパニコラウ染色子宮頸部スミア）をスクリーニングするプログラムによって行われる。この種の子宮頸がんスクリーニングに伴う問題は、スミアを検査するために熟練者が必要なことである。その上、形質転換細胞の視覚による同定は本質的に主観的判定であるため結果が信頼できない可能性があり、評価が分かれるところである。したがって子宮頸がんの代替スクリーニング法、特により客観的で信頼性のある方法が求められている。
【０００５】
子宮頸がんを診断する代替法の一つが開示されている（特許文献１参照）。ＨＰＶゲノムの特定の遺伝子の発現レベルをモニタリングおよび比較して、ＨＰＶ感染の良性腫瘍から悪性増殖への進行を見極める方法である。同様に、特定の配列マーカーの発現レベルを該マーカーの正常な発現レベルと比較し、２つのレベル間の有意差で子宮頸がんの存在を示すことによって、患者が子宮頸がんに罹っているかどうかを評価する方法が開示されている（特許文献２参照）。該配列マーカーは、ＨＰＶゲノムに存在する配列を含む。子宮頸がんをスクリーニングするためのこれらの代替法があるにもかかわらず、依然として更なるスクリーニング法が求められている。
【０００６】
腫瘍形成に関与してきた研究分野が、ＤＮＡメチル化である。哺乳類細胞は、メチル基をシトシン残基に共有結合的に付加することによって、ゲノムＤＮＡ配列を修飾することができる。このメチル基の付加は、シトシンがグアニン残基のすぐ５' 側の位置にある（即ちＣｐＧジヌクレオチドである）とき、シトシン環の５位で起こり得る。哺乳類では、ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡ−［シトシン−５］メチルトランスフェラーゼファミリー（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａおよびＤＮＭＴ３ｂ）によって仲介され（オカノ、エム．他（Ｏ
ｋａｎｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）およびリー，アイ．他（Ｒｈｅｅ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．））、グアニンの５' 側に位置するシトシン（ＣｐＧ）全ての２〜４％において生じる（バード、エイ．ピー．（Ｂｉｒｄ，  Ａ．  Ｐ．））。ＣｐＧジヌクレオチドは、哺乳類ゲノムで統計学的に予測される頻度の２０％しか存在せず（ショーデレット、ディー．エフ．他（Ｓｃｈｏｒｄｅｒｅｔ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．））、進化の過程で失われた原因がメチル化の有害な機能の結果であることが示唆されている。しかしながら、「ＣｐＧアイランド」として知られる特定の領域では、これらのジヌクレオチドの存在は、統計学的に予測されるレベルである。
【０００７】
遺伝子のサイレンシングをもたらすＣｐＧメチル化は、Ｘ染色体の不活性化およびゲノムインプリンティング（ゲノム刷込み）に関与する（ポールセン、エム．他（Ｐａｕｌｓｅｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．））。ＣｐＧメチル化により仲介される組織特異性遺伝子発現の珍しい例が、最近確認された（ヒュッシャー、ビー．ダブリュ．他（Ｆｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｂ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．））。その上、ＣｐＧメチル化は、組換えに対抗してゲノムを安定化させるために必要であり、反復配列の優先的メチル化に関与する（ヨーダー、ジェイ．エイ．他（Ｙｏｄｅｒ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．））。発がんの際、全体的な低メチル化および部分的な（即ちＣｐＧアイランドの）高メチル化（ハーマン、ジェイ．ジー．他（Ｈｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．））が観察されることが多い。ＣｐＧメチル化は、転写因子が同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）結合部位を認識するのを防ぐことによって（ロバートソン、ケイ．ディー．他（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．）およびタイン、エイ．他（Ｔｈａｉｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．））、またはメチル化ＤＮＡに結合する蛋白質（ＭｅＣＰ）によって（ヘンドリッヒ、ビー．他（Ｈｅｎｄｒｉｃｈ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．））、遺伝子発現におけるＣｐＧメチル化の機能を仲介し、ＨＤＡＣ１（ヒストンデアセチラーゼ）をリクルートして周辺のクロマチンを凝縮させる。
【０００８】
非ウイルス性の良性腫瘍およびショープ（ウサギ）乳頭腫ウイルスによって誘導された悪性腫瘍に関するウイルスＤＮＡのメチル化の程度に関する研究から、メチル化パターンが新生物の病期に相関することが見出された（ウェットステイン、エフ．オー．他（Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ，  Ｆ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．））。しかしその研究は、一般にメチル化の程度が乳頭腫（即ち良性腫瘍）よりもがんにおいて高いことを見出した。同様に、良性および悪性のウサギ腫瘍におけるショープ乳頭腫ウイルス（ＳＰＶ）ＤＮＡに関する別の研究から、乳頭腫ではＣｐＧ部位の１０〜４０％が、初期がんでは３０〜８０％が、そして可移植性のがんでは９０％を超えるＣｐＧ部位がメチル化されていることが見出された（スガワラ、ケイ．他（Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．））。つまりこれらの研究は、ＳＰＶ  ＤＮＡにおけるメチル化の存在が、がんの指標であることを示している。
【０００９】
対象から得られた核酸のメチル化状態を測定することによって、乳房組織の細胞増殖障害を診断する方法が開示されている（特許文献３参照）。しかしこの特許文献は、乳がんに関与する遺伝子についての所見のみに関するものであり、他の種類のがんをメチル化状態に基づいて診断する方法、またはメチル化状態に基づく診断が可能かどうかを示すものではない。
【００１０】
ＨＰＶ１６の制御に関しては、Ｅ６およびＥ７オンコジーンの転写を調節するシス応答エレメントが、長い制御領域（Ｌｏｎｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｉｏｎ）（ＬＣＲ）、つまりＬ１遺伝子からＥ６遺伝子までの８５０ｂｐのセグメント全体に広がっている。転写はＥ６プロモータＰ９７で開始するが、同プロモータは、１つのＳｐ１結合部位、およびＨＰＶにコードされる因子Ｅ２についての２つのＥ２結合部位によって調節される（タン、エス．エイチ．他（Ｔａｎ，  Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．）およびデメレット、シー．他（Ｄｅｍｅｒｅｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．））。Ｐ９７の活性は、ＡＰ１、ＮＦ１およ
びプロゲステロン受容体などの複数の細胞因子の結合部位を備えたエンハンサによって刺激される（タン他（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、チョウ他（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）、アプト、ディー．他（Ａｐｔ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．）およびグロス、ビー．他（Ｇｌｏｓｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．））。特異的な配置の２つのヌクレオソームが形成されてエンハンサおよびプロモータ全体を覆い（ステンケル、ダブリュ．他（Ｓｔｕｅｎｋｅｌ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．））、該ヌクレオソームがヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）によって修飾されている場合、転写を抑制することができる。ＨＤＡＣはＣＤＰに関係するが、ＣＤＰはエンハンサとプロモータの間のサイレンサに結合する（オコナー、エム．ジェイ．他（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．））。悪性腫瘍に進行する際にＨＰＶゲノムが細胞内ＤＮＡに組込まれると、Ｐ９７の下流に位置する核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）が強力な転写刺激因子となる（ステンケル他（Ｓｔｕｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．））。ＨＰＶ−１ａ  ＤＮＡのメチル化状態に関する研究が実施され、選択的なメチル化が見出された（バーネット他（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．））。それゆえＤＮＡメチル化がＨＰＶ−１ａ遺伝子の発現制御に関与することが予測されたが、その研究は結論に到っていない。
【００１１】
宿主ゲノムへのＨＰＶの組込みは、ＨＰＶが関係する子宮頸がんの発生における初期の重要な事象であると思われる。宿主特異的なＤＮＡメチル化がＨＰＶ遺伝子の調節において機能的役割を果たす可能性も仮定されている（ロスル他（Ｒｏｓｌ  ｅｔ  ａｌ．））。細胞内転写因子の結合を抑制することでＨＰＶ−１６調節領域がメチル化されて、ウイルスの転写が抑制される可能性も示唆されている（リスト、エイチ．ジェイ．他（Ｌｉｓｔ  Ｈ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．））。組込まれたＨＰＶ  ＤＮＡのＣｐＧメチル化の割合が、その宿主細胞が腫瘍を形成する可能性に相関し得ることも推測されている（タイン他（Ｔｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．））。ＨＰＶ−１ａ  ＤＮＡのメチル化状態に関する研究が実施され、選択的なメチル化パターンが見出された（バーネット他（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ
ａｌ．））。それゆえＤＮＡメチル化がＨＰＶ−１ａ遺伝子の発現制御に関与することが予測されたが、その研究は結論に到っていない。
【００１２】
その上、ｉｎ  ｓｉｔｕのＨＰＶゲノムのメチル化については、ＨＰＶの転写調節への潜在的関与が明らかであるにも関わらず、研究が行われてこなかった。第一に、ＣｐＧは、ヒト宿主と同様にＨＰＶでも出現頻度が低い。第二に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化されたＨＰＶ−１６  ＤＮＡで細胞をトランスフェクションすると、ある特定の一細胞株で研究されたＥｃｏＲＩ耐性ＨＰＶ−１６  ＤＮＡと同様の方法（リスト他（Ｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．））ではＨＰＶ−１６  ＤＮＡは発現されなかった（ロスル他（Ｒｏｓｌ  ｅｔ  ａｌ．））。
【００１３】
本発明者らは、細胞株および臨床試料におけるＨＰＶ−１６のＣｐＧメチル化の研究をここに完了し、ＨＰＶ−１６  ＤＮＡがＤＮＡメチル化の効率的な標的であること、そして優先的にメチル化された領域がゲノム全体に非対称的に分布していることを見出した。同様に本発明者らは、メチル化がＨＰＶ−１６ゲノムのエンハンサおよびプロモータと重複しているＣｐＧ部位で行われること、そしてＣｐＧメチル化の頻度ががんの進行期では低下することから、ＣｐＧメチル化が子宮頸がんの発症に関与し、有用な診断マーカーとなることも見出した。
【特許文献１】米国特許第６，３５５，４２４号明細書
【特許文献２】国際公開公報第０１／４２７９２号パンフレット
【特許文献３】国際公開公報第０２／０５９３４７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の目的は、子宮頸がんを診断する、または子宮頸がんの進行を評価する
代替法または改良法を提供することである。子宮頸がんを診断する、または子宮頸がんの進行を評価する代替キットまたは改良キットを提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した患者の子宮頸がんを診断する方法であって、
１）ヒト乳頭腫ウイルスゲノムＤＮＡを含む試料を、前記患者の子宮頸部の細胞から得るステップと；
２）試料中のヒト乳頭腫ウイルスゲノムのＣｐＧ部位にメチル化が存在するか否かを測定するステップであって、メチル化が存在しないＣｐＧ部位が多いほど、該試料が子宮頸がんであることがより強く示唆されることを特徴とするステップと
を含む方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、ヒト乳頭腫ウイルスはＨＰＶ−１６である。
好ましくは、ＨＰＶ−１６ゲノムが７４９８位から１６１位までの間に１１個のＣｐＧジヌクレオチドを有し、ステップ２）は、前記１１個のＣｐＧジヌクレオチドにメチル化が存在するか否かを測定することを含む。
【００１７】
有利には、前記１１個のＣｐＧジヌクレオチド全てにメチル化が存在すれば、子宮頸がんが存在しないことが示唆される。
好ましくは、ＨＰＶ−１６ゲノムの３７位、４３位、５２位および５８位にＣｐＧジヌクレオチドが存在し、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１個にメチル化が存在しなければ、少なくともＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変が存在することが示唆される。
【００１８】
好ましくは、ＨＰＶ−１６ゲノムが７８６２位にＣｐＧジヌクレオチドを有し、７８６２位にメチル化が存在しなければ、少なくともＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変が存在することが示唆される。
【００１９】
有利には、ステップ２）は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼでヒト乳頭腫ウイルスゲノムを消化するステップを含む。
好ましくは、ステップ２）は、
プライマーを試料に添加してＰＣＲ法を実行するステップであって、前記プライマーが、メチル化感受性エンドヌクレアーゼによる開裂を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むアンプリコンのいずれかの末端に相当することを特徴とするステップと；
前記ＰＣＲ法の結果を分析して、前記少なくとも１個のＣｐＧ部位が開裂しているかどうかを測定するステップと
を更に含む。
【００２０】
好ましくは、プライマーは配列番号１９および２０である。
有利には、メチル化感受性エンドヌクレアーゼはＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼである。
【００２１】
好ましくは、ステップ２）は、前記１１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基を、該ＣｐＧのメチル化状態に応じて選択的に修飾するステップを含む。
好ましくは、ステップ２）は、シトシン残基を選択的に修飾した後で、プライマーを試料に添加してＰＣＲ法を実行することを更に含み、前記プライマーは、ＣｐＧ部位を少なくとも１個含むアンプリコンのいずれかの末端に相当する。
【００２２】
有利には、プライマーは配列番号２７および２８である。
好ましくは、ステップ２）は、前記１１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基を選
択的に修飾するステップの後に、好ましくはＰＣＲ法と同じプライマーを用いて、ＣｐＧ部位を少なくとも１個含むヒト乳頭腫ウイルスゲノムの少なくとも一部を配列決定するステップを更に含む。
【００２３】
有利には、シトシン残基を選択的に修飾するステップは、重亜硫酸ナトリウムを試料に添加して非メチル化シトシン残基を修飾してウラシル残基とすることを含む。
好ましくは、ステップ２）は、
第１の融解温度で前記少なくとも１個のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることが可能であり、該ＣｐＧ部位のシトシン残基が修飾されている場合には第２の異なる融解温度で前記部位とハイブリダイズすることが可能な少なくとも１種類の検出プローブを添加するステップと；
修飾ステップの後に、前記検出プローブとＣｐＧ部位を含むヒト乳頭腫イルスゲノムの一部とのハイブリダイゼーションをある温度範囲でモニタリングするステップと
を更に含む。
【００２４】
好ましくは、ステップ２）は、
前記少なくとも１種類の検出プローブに隣接してヒト乳頭腫ウイルスゲノム上の位置にハイブリダイズすることができる少なくとも１種類のアンカープローブを試料に添加するステップであって、前記検出プローブが、第１の波長の光を吸収することができるドナー色素と、第２の波長の光を発光することができるアクセプター色素とのうちの一方を含み、前記アンカープローブが、該ドナー色素と該アクセプター色素とのうちの他方を含み、ドナー色素およびアクセプター色素が互いに近接していると蛍光共鳴エネルギー移動が可能であることを特徴とするステップと；
試料を前記第１の波長の光に露光するステップと；
前記温度範囲にわたって第２の波長の光の発光を検出するステップと
を更に含む。
【００２５】
有利には、ヒト乳頭腫ウイルスはＨＰＶ−１６であり、
試料を１１のサブサンプルに分割するステップと；
検出プローブおよび対応するアンカープローブを各サブサンプルに添加するステップであって、前記検出プローブがＨＰＶ−１６ゲノムの、それぞれ７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができることを特徴とするステップと；
各サブサンプルを前記第１の波長の光に露光するステップと；
前記温度範囲にわたって各サブサンプルから前記第２の波長で発光した光を検出するステップと
を更に含む。
【００２６】
本発明の第２の態様によれば、ＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんの進行を評価する方法であって、
１）ＨＰＶ−１６ゲノムＤＮＡを含む試料を、前記患者の子宮頸部の細胞から得るステップと；
２）ＨＰＶ−１６ゲノムの少なくとも７８６２位のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するステップであって、前記ジヌクレオチドにメチル化が存在しなければ、子宮頸がんの少なくとも前駆病変が存在することが示唆されるステップと
を含む方法が提供される。
【００２７】
好ましくは、ＨＰＶ−１６ゲノムが７４９８位から１６１位までの間に１１個のＣｐＧジヌクレオチドを有し、ステップ２）は、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位
までの間の１１個のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するステップを更に含み、メチル化が存在しないジヌクレオチドの数が多いほど、患者の子宮頸がんがより進行していることが示唆される。
【００２８】
本発明の第３の態様によれば、配列番号１９、２０、２７および２８からなる群から選択される配列のＤＮＡプライマーが提供される。
本発明の第４の態様によれば、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した患者の子宮頸がんの進行を評価するキットであって、メチル化感受性エンドヌクレアーゼと、ヒト乳頭腫ウイルスゲノムのアンプリコンのいずれかの末端を規定するプライマー対とを含み、前記アンプリコンが、メチル化感受性エンドヌクレアーゼによる開裂を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことを特徴とするキットが提供される。
【００２９】
好ましくは、プライマーは配列番号１９および２０である。
有利には、メチル化感受性エンドヌクレアーゼはＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼである。
【００３０】
本発明の第５の態様によれば、ヒト乳頭腫ウイルスに感染した患者の子宮頸がんの進行を評価するキットであって、
ＣｐＧ部位のメチル化状態に応じて、前記ＣｐＧ部位の配列を選択的に修飾することができる薬剤と；
ヒト乳腺腫ウイルスゲノムのアンプリコンのいずれかの末端を規定するプライマー対であって、前記アンプリコンが、前記薬剤による修飾を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことを特徴とするプライマー対と
を含むキットが提供される。
【００３１】
好ましくは、ヒト乳頭腫ウイルスはＨＰＶ−１６である。
好ましくは、プライマー対は配列番号２７および２８である。
有利には、本発明のキットは少なくとも１種類の検出プローブを更に含み、前記検出プローブは、検出可能なマーカーを含み、第１の融解温度で前記ＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができ、該ＣｐＧ部位が修飾されている場合には第２の異なる融解温度で前記部位とハイブリダイズすることができる。
【００３２】
好ましくは、ヒト乳頭腫ウイルスはＨＰＶ−１６であり、少なくとも１種類の検出プローブは、ＨＰＶ−１６ゲノムの、７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位からなる群から選択される位置のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができる。
【００３３】
有利には、ＨＰＶ−１６ゲノムの、それぞれ７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができる検出プローブが１１種類存在する。
【００３４】
好ましくは、本発明のキットは、前記少なくとも１種類の検出プローブに隣接してヒト乳頭腫ウイルスゲノム上の位置にハイブリダイズすることができる少なくとも１種類のアンカープローブを更に含み、前記アンカープローブは検出可能なマーカーを含み、前記検出プローブの検出可能なマーカーがドナー色素とアクセプター色素とのうちの一方から選択され、前記アンカープローブの検出可能なマーカーがドナー色素とアクセプター色素とのうちの他方から選択され、ドナー色素およびアクセプター色素が互いに近接していると蛍光共鳴エネルギー移動が可能になる。
【００３５】
好ましくは、ドナー色素はフルオレセインであり、アクセプター色素は、ＬｉｇｈｔＣ
ｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ６４０およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ７０５からなる群から選択される。
【００３６】
有利には、検出プローブは、ＨＰＶ−１６ゲノムの７８６２位のＣｐＧ部位とハイブリダイズすることができる。
好ましくは、薬剤は、重亜硫酸ナトリウムおよび過マンガン酸カリウムからなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
実施例のデータは、ＨＰＶ−１６ゲノムが細胞内ＤＮＡメチル化によって効率的に修飾されていることの明確な証拠を示し、ＤＮＡメチル化がＨＰＶ−１６の生態において有する役割と、子宮頸がんの病因を理解するため、および子宮頸がんを診断するためのメチル化の利用方法とを示している。
【００３８】
ＨＰＶ−１６ＤＮＡは、一つの物理的性質によってメチル化の標的として認識されるようになるのではなかろう。メチル化は、恐らく複製中のＨＰＶ−１６を含む無症候のスミアだけでなく、通常は染色体ＤＮＡ内に組込まれたＨＰＶ−１６ゲノムを含む浸潤性の腫瘍および細胞株においても観察されるため、ＨＰＶ−１６ＤＮＡは、単にエピソームとして標的にされるのではない（ツアハウゼン、エイチ．（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ，Ｈ．））。反復ＤＮＡが、ＣｐＧメチル化の好ましい標的であると考えられているが（ヨーダー他（Ｙｏｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．））、ｉｎ  ｓｉｔｕでは、ＳｉＨａ細胞株における単一のＨＰＶ−１６ゲノムの非転写部分に関する場合と同じように、モノマーのＨＰＶ−１６エピソームはメチル化されている。組換え事象によって新たなメチル化シグナルが生じることが提示されており（リーマス他（Ｒｅｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．））、該シグナルはおそらく一部の腫瘍におけるＨＰＶ−１６メチル化に対応している。
【００３９】
実施例に記載されたｍｅＣｐＧマッピングによって、ＨＰＶ−１６  ＬＣＲのメチル化が一つの単純なパターンに従うのではなく、他の位置および他の程度のＣｐＧ群が修飾されるようになり得ることが示されている。エンハンサの多数のＣｐＧがメチル化されていれば、その機能が抑制されていることを示す。しかしＣｐＧメチル化はＥ６プロモータ因子Ｓｐ１の結合を妨害しないため（ハリントン、エム．エイ．他（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．））、メチル化プロモータは、このエンハンサとは独立に転写活性を有しうると思われる。
【００４０】
通常のＨＰＶ−１６の生活環は、更にウイルスが生成されることはないため、無症候感染およびＣＩＮ病変に限定され、がんの進行は偶発的である。その結果、無症候の上皮におけるメチル化ＨＰＶ−１６ゲノムの存在率が高いのは、メチル化が正常なＨＰＶ−１６の生態の一部であることを示していると思われる。厳密な機序に縛られることは望ましくないが、２つの推論的かつ対極的観点によって、この所見について説明できる。
【００４１】
細胞は、ウイルスＤＮＡを異物として感知し転写抑制の標的とする、抗ウイルス性防御を実行することができる。あるいは、ＤＮＡメチル化は、ウイルス感染が不顕性で長期間維持される傾向にあるＨＰＶによって開発された多数の戦略のまた別の例かもしれない（バーナード他（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．））。そのようなモデルは、一種の潜伏期間の間に特定のプロモータがＤＮＡメチル化依存的にサイレンシングされることを含むＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ）の生活環を連想させる（ロバートソン、ケイ．ディー．（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｋ．Ｄ．））。
【００４２】
同様に、ＨＰＶゲノムは、ある条件下ではメチル化依存的な潜伏を誘導するが、異なる条件下ではこの機構が退けられるという分子特性を含む可能性がある。このことは、全て
の生殖器ＨＰＶの、保存された核マトリクス結合部位（ステンケル他（Ｓｔｕｅｎｋｅｌ
ｅｔ  ａｌ．）およびＥ６プロモータのＳｐ１部位（タン他（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．））によって実行することができる。いずれの要素も、特定の細胞内遺伝子に関連するＤＮＡメチル化に拮抗することが報告されている（ブランディーズ、エム．他（Ｂｒａｎｄｅｉｓ，  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）およびフォレスター、エム．他（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，  Ｗ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ））。後期遺伝子の優先的メチル化は、プロモータの差次的な使用、スプライシング、伸長およびｍＲＮＡ安定性に関与する多面的事象である初期から後期への転換における別の役割を示唆する可能性がある（ベイカー、シー．シー．他（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）およびオズバン他（Ｏｚｂｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．））。
【００４３】
しかし、ＨＰＶゲノムのメチル化に関する分子レベルの根拠とは無関係に、実施例のデータは、病理試料の根底にあるエピジェネティックな因子を解明することによる分子診断の能力を示している。
【００４４】
つまり、本発明は一般に、ヒト乳頭腫ウイルスＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんを診断する方法に関する。該方法は、患者の子宮頸部の細胞に含まれるＨＰＶ−１６ゲノムＤＮＡを含む試料を得ることを含む。好ましくは、試料は患者の子宮頸部スワブ検体から得られる。ヒト乳頭腫ウイルスＤＮＡは、幾つかの実施形態においては患者の細胞内ゲノムに組込まれたＨＰＶゲノムであり、または他の実施形態では患者の子宮頸部細胞内のエピソームとして存在するＨＰＶゲノムである。本発明の方法は、試料中のＨＰＶゲノムのＣｐＧ部位にメチル化が存在するか否かを測定するステップも含む。ゲノムの「ＣｐＧ」部位とは、グアニン残基のすぐ５’側に位置するシトシン残基から構成される部位である。本発明の異なる実施形態において、メチル化の有無の測定は、以下に説明するとおり異なる方法で実行される。
【００４５】
メチル化されていないＣｐＧ部位が多いほど、子宮頸がんの存在がより強く示唆されるか、または前駆病変の存在もしくは重症度の高い子宮頸部病変の存在など、ＨＰＶ感染の形質転換状態への進行がより強く示唆される。つまり、メチル化ＣｐＧ部位が少ないほど、不顕性感染から浸潤性子宮頸がんへの進行がより強く示唆される。逆にメチル化ＣｐＧ部位が多いほど、患者が無症候であることがより強く示唆される。
【００４６】
つまり本発明の幾つかの実施形態において、子宮頸がんの診断方法は、子宮頸がんの存在について定性的検査を提供するのではなく、むしろＨＰＶ感染の悪性腫瘍への進行についての定量的検査を提供するものである。本明細書において、用語「診断」が、疾患を明確に同定するステップだけでなく、疾患が何であるかを医師が考える際に利用し得る有力な情報をもたらすステップも意味することも理解されよう。
【００４７】
患者が感染したヒト乳頭腫ウイルスは、ＨＰＶ−１６である。ＨＰＶ−１６は、ロサンゼルス・ラボラトリー・セオレティカル・バイオロジー・アンド・バイオフィジックス・パピローマウイルス・データベース（Los Angeles Laboratory Theoretical Biology and
Biophysics Papillomavirus database ）内の配列に対応する配列を有するヒト乳頭腫ウイルスと定義されている。７４９８位から１６１位までの間のＨＰＶ−１６のエンハンサ・ プロモータ領域は、７５３５位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位
、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位の１１箇所にＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＨＰＶ−１６のエンハンサ・プロモータ領域は、長い制御領域（ＬＣＲ）、ならびにＨＰＶ内のＥ６オンコジーンおよびＥ７オンコジーンのプロモータＰ９７を含む。従って、これら１１個のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の有無を測定して、子宮頸がんの存在または進行の指標とする。これは、上記の特定のＣｐＧジヌクレオチドが、ＨＰＶ−１６感染が悪性腫瘍に向かっている状態を顕著に示すことが分かっているからである。
【００４８】
よって、好ましい実施形態において、上記の１１個のＣｐＧジヌクレオチド全てにメチル化が存在すれば、悪性腫瘍への進行は存在しないことが示唆される。
好ましい実施形態において、ＨＰＶ−１６ゲノムの３７位、４３位、５２位および５８位のＣｐＧジヌクレオチドのうち少なくとも１個にメチル化が存在しなければ、患者が少なくともＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変（即ち、子宮頸部上皮内腫瘍Ｉ）を有していることが示唆される。つまり、ＣＩＮ  Ｉ前駆病変、ＣＩＮ  ＩＩＩ前駆病変、または浸潤がんのいずれかの存在を示唆している。
【００４９】
ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位までの間の１１個のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１個が、７８６２位のＣｐＧジヌクレオチドである。７８６２位のＣｐＧジヌクレオチドは、患者のＨＰＶ感染が悪性腫瘍に進行することについて特に有益な情報を示すことが分かっている。従って、本発明の特に好ましい実施形態では、このＣｐＧジヌクレオチドのメチル化の有無が特異的に測定される。これらの実施形態において、７８６２位にメチル化が存在しなければ、患者が少なくともＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変を有していることが示唆される。つまり、その患者がＣＩＮ  Ｉ期の前駆病変もしくはＣＩＮ  ＩＩＩ期の前駆病変を有しているか、または浸潤がんを有していることを示唆している。
【００５０】
先に説明したとおり、ＣｐＧゲノムのメチル化の有無は、本発明の異なる実施形態においては異なる方法で測定される。
一つの実施形態において、メチル化の有無は、ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼでＨＰＶゲノムを消化することによって測定される。ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼは、メチル化感受性エンドヌクレアーゼであり、任意の間隔で第２のプリン‐ｍｅＣが存在するという条件下で、プリン‐ｍｅＣ配列の付近を切断する。平均すると、ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼは、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドについて１つおきにゲノムを開裂する。しかしながら、ＭｃｒＢＣの使用は本発明に不可欠なものではなく、別の実施形態においては、ＭｃｒＢＣの代わりに異なるメチル化感受性エンドヌクレアーゼが用いられる。
【００５１】
ＭｃｒＢＣによる消化の後、消化されたゲノムを、一対のプライマーを用いたＰＣＲ法で処理する。ＰＣＲ法に関しては、プライマーは、「アンプリコン」、即ちＰＣＲ法によって実際に増幅されるゲノムの領域のいずれかの末端を規定する。プライマーは、メチル化されるとＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼによる消化を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むアンプリコンを規定するように作製される。従って、ＣｐＧ部位が実際にメチル化され、ひいてはＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼによって開裂されると、ゲノムのアンプリコン領域が少なくとも２片（アンプリコンのＣｐＧ部位の数に依存する）に開裂されて完全なアンプリコン鎖の合成が阻止されるため、ＰＣＲ法は実際にほとんど不成功に終わることになる。このことによって、ＰＣＲ法の次のサイクルでその鎖が引き続き増幅されることも阻止される。一方、ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼ消化を受けやすいＣｐＧ部位が、全くメチル化されていなければ、アンプリコンはエンドヌクレアーゼによって開裂されず、ＰＣＲ法は通常どおりアンプリコンを増幅させる。
【００５２】
好ましい実施形態において、プライマーは、配列番号１〜２４から選択される。本発明の特に好ましい実施形態において、配列番号１９および２０のプライマーが用いられるが、これは、これらの２つのプライマーがＨＰＶ−１６のＥ６遺伝子のいずれかの末端の配列に相補的であるからである。従って、該プライマーは、メチル化されていることが子宮頸がんの存在または進行の指標であるＣｐＧ部位を含むことが示されているアンプリコンのいずれかの末端を規定する。
【００５３】
その後、ＰＣＲ法から得られた生成物を、例えばアガロースゲルで分離して分析し、アンプリコンが増幅されているか否かを測定する。アンプリコンが増幅されていれば、アン
プリコンは開裂されておらず、該アンプリコン内にＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼによって開裂可能なメチル化ＣｐＧ部位がなかったことが示される。逆にアンプリコンが増幅されていなければ、アンプリコンは開裂されており、該アンプリコン内にメチル化されたＣｐＧ部位が少なくとも１個存在していたことが示される。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、メチル化の有無は、試料に重亜硫酸ナトリウムを添加することによって測定される。重亜硫酸ナトリウムは、メチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾してウラシル残基にする作用を有する。重亜硫酸ナトリウムは、メチル化シトシン残基を修飾しない。この実施形態では、重亜硫酸ナトリウムを添加した後、ＣｐＧ部位を含むゲノム配列のいずれかの末端の位置に特異的なプライマーを用いて、ＨＰＶゲノムを増幅させる。その後、同じプライマーを用いて、得られたアンプリコンを配列決定する。ＣｐＧジヌクレオチドの一部であるシトシン残基の位置にウラシル残基が存在していれば、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていなかったことが示されるが、シトシンが存在していれば、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていたことが示される。この実施形態は、ＭｃｒＢＣ消化プロトコルに比べて、ＨＰＶゲノム内の全てのＣｐＧジヌクレオチドをメチル化について分析し得るという利点を有する。好ましい実施形態において、用いられるプライマーは、配列番号２７および２８のプライマーである。これらのプライマーにより、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位までの間の１１個のＣｐＧ部位を含むアンプリコンが生じる。
【００５５】
本発明の更なる実施形態においても、ＨＰＶゲノムのメチル化の有無を測定するステップでは、非メチル化シトシン残基を選択的に修飾してウラシル残基にするために重亜硫酸ナトリウムを添加することが必要である。しかしこの実施形態では、ＣｐＧ部位のメチル化状態を検出するために、好ましくはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システム（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いて一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が実施される。
【００５６】
これらの実施形態においては、一対のプライマーを用いて、ＨＰＶゲノムの、ＣｐＧ部位を少なくとも１個含む領域についてＰＣＲ法を実行する。ＨＰＶゲノムおよびプライマーの試料に検出プローブを添加するが、検出プローブは、ＣｐＧ部位およびその周囲のヌクレオチドの配列を含む標的に相補的な配列のプローブである。検出プローブは、その３' 末端にドナー色素（フルオレセインなど）が結合している。ドナー色素は、第１の波長の光を吸収する。ＣｐＧ部位がシトシン残基を含む場合と、シトシン残基が重亜硫酸ナトリウムによってウラシル残基に修飾されている場合との間で、プローブと標的とのハイブリッドの融解温度が異なるように、検出プローブの配列を作製する。ＨＰＶゲノムの、検出プローブに相補的な標的配列に隣接する部分に相補的な配列を有するアンカープローブも、試料に添加する。特に、アンカープローブは、ハイブリダイゼーションした時に検出プローブとの間が１〜５ヌクレオチドであるように、検出プローブの下流の配列に相補的である。アンカープローブは、５' 末端にアクセプター色素（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｒｅｄ６４０またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｒｅｄ７０５など）が結合している。アクセプター色素は、以下に記載する環境下では第１の波長とは異なる第２の波長の光を発光する。
【００５７】
使用の際は、２種類のプライマーによって規定されたＨＰＶゲノムのアンプリコンの増幅を、ＰＣＲ法によって完了させる。その後、試料の温度を緩やかに上昇させて、試料を第１の波長の光に露光する。検出プローブおよびアンカープローブの両方がアンプリコンとハイブリダイズすると、それぞれのプローブのドナー色素およびアクセプター色素が接近して、２つの色素の間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こる。こうしてドナー色素が第１の波長の光を吸収すると、ドナー色素が励起されて、励起エネルギーの一部がアクセプター色素に移動する。続いてアクセプター色素が、第２の異なる波長の光を発光する。一方
、プローブが標的とハイブリダイズしないか、または一方のプローブだけが標的とハイブリダイズする場合には、アクセプター色素とドナー色素とは蛍光共鳴エネルギー移動が起こるほど互いに空間的に接近することはなく、このため第１の波長の光は吸収されるが、第２の波長の光は発光されない。
【００５８】
試料の温度を徐々に上昇させながら、試料からの第２の波長の発光を測定する。ＣｐＧ部位がシトシン残基の代わりにウラシル残基を含んでいるか否かに応じて、検出プローブの融解温度が異なる。従って、試料の温度が上昇するにつれて、検出プローブは、ＣｐＧ部位がウラシル残基を含んでいるか否かに応じて異なる温度で標的配列から解離する。検出プローブが標的から解離すると、ドナー色素とアクセプター色素の距離が非常に大きくなり蛍光共鳴エネルギー移動が起こらないため、アクセプター色素からの発光が停止する。従って、第２の波長の光が検出されなくなると、該検出プローブの融解温度に達したこと、つまりＣｐＧ部位がシトシン残基の代わりにウラシル残基を含むか否かを正確に測定することができる。
【００５９】
好ましい実施形態において、子宮頸部細胞試料をサブサンプル１１個に分割して、それぞれに検出プローブおよび対応するアンカープローブを添加する。各サブサンプルに添加される検出プローブは配列が異なっており、各検出プローブはＨＰＶゲノムの７４９８位から１６１位までの間の１１個のＣｐＧ部位のうちの１個に相補的である。アンカープローブは、ＨＰＶゲノム内の対応する位置に相補的な配列を有している。こうして、各サブサンプルを上記のとおりモニタリングして、個々のＣｐＧ部位のメチル化状態を測定することができる。
【００６０】
別の実施形態においては、試料をサブサンプルに分割せず、その代わりに１１個の異なる検出プローブと該検出プローブに対応するアンカープローブを同試料に添加する。しかしこの実施形態において、各アクセプター色素は異なる波長で発光し、各波長は別個に検出される。つまり、一つの試料中で別個の検出プローブそれぞれの解離を同時にモニタリングすることができる。
【００６１】
これらの実施形態の利点は、個々のＣｐＧ部位のメチル化状態の測定が、ＤＮＡの配列決定を必要とする場合よりも極めて早いことである。
当然のことであるが、各ＣｐＧ部位のメチル化状態に応じて選択的にシトシン残基を修飾するために重亜硫酸ナトリウムを使用することは、本発明のこれらの実施形態に不可欠というわけではない。別の実施形態では、ＣｐＧ部位のメチル化状態に応じてＣｐＧ部位の配列を選択的に修飾することが可能な別の薬剤が用いられる。一実施形態では、メチル化シトシン残基をチミン残基に変換する過マンガン酸カリウムを用いる。過マンガン酸カリウムの使用には、重亜硫酸ナトリウムによる修飾について述べたものとは異なるプライマー配列およびプローブ配列が一塩基多型の検出に必要となるが、その他の点では用いられる方法は実質的に同じである。
【００６２】
用語「選択的に修飾する」は、修飾が試行されたがＣｐＧ部位がいずれも実質的に修飾されない状態も含んでいることも理解されよう。例えば、重亜硫酸ナトリウムが添加されても、ＣｐＧ部位のシトシン残基が全てメチル化されていればヌクレオチドの修飾は起こらない。
【００６３】
本発明の別の実施形態によれば、上記のＰＣＲ増幅ステップを実施するためのＤＮＡプライマーが提供される。ＤＮＡプライマーは、該プライマーが規定するアンプリコンがＣｐＧ部位を少なくとも１個含むように作製される。アンプリコンが、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９８位から１６１位までの間にＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことが好ましい。ＤＮＡプライマーは、配列番号１〜２４に記載の配列で構成されている。特にメチル化状
態がＭｃｒＢＣ消化によって測定される場合には、使用されるプライマーは配列番号１９および２０であることが好ましい。
【００６４】
メチル化感受性エンドヌクレアーゼによってＨＰＶ−１６ゲノムの配列を消化して、その配列のメチル化状態を決定する実施形態においては、配列が該エンドヌクレアーゼによる開裂を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことが重要である。これは、提案された配列と該エンドヌクレアーゼとを用いて適切な検査アッセイを実施し、該配列内のＣｐＧ部位がメチル化されている場合およびメチル化されていない場合に開裂が起こるかどうかを測定することによって決定することができる。例えば、エンドヌクレアーゼがＭｃｒＢＣである実施形態においては、実施例４に提供されるプロトコルを用いることができる。
【００６５】
適切な薬剤を用いてＣｐＧ部位のメチル化状態に応じてＣｐＧ部位の配列を選択的に修飾することによって、ＨＰＶ−１６ゲノムの配列のメチル化状態を測定する実施形態においては、配列が該薬剤による修飾を受けやすいＣｐＧ部位を少なくとも１個含むことが重要である。これは、提案された配列および該薬剤を用いて適切な検査アッセイを実施し、該配列内のＣｐＧ部位がメチル化されている場合およびメチル化されていない場合に選択的修飾が起こるかどうかを測定することによって決定することができる。例えば、薬剤が重亜硫酸ナトリウムである実施形態においては、実施例６に提供されるプロトコルを用いることができる。
【００６６】
ＨＰＶゲノムの重亜硫酸ナトリウム修飾が行われる実施形態においては、プライマーが配列番号２７および２８であることが好ましい。これらの配列は、それぞれ７４９８位から７５２２位までと、１６１位から１４０位までに対応し、エンハンサ−プロモータの一部またはＨＰＶ−１６の一部に及んでいる。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、子宮頸がんの疑いのある患者の子宮頸部細胞においてＨＰＶ−１６ゲノムのメチル化状態を検出するためのキットが提供される。従って、一実施形態において、キットは、メチル化感受性エンドヌクレアーゼ（例えばＭｃｒＢＣ）と、ＭｃｒＢＣ消化後のＰＣＲ増幅に好適であるとして先に記載したＤＮＡプライマーとを含む。好ましい実施形態において、キットは、ＨＰＶ−１６に感染した患者の子宮頸がんの存在または進行を検出するためのものであり、プライマーは、配列番号１９および２０である。
【００６８】
別の実施形態において、キットは、ＣｐＧ部位のメチル化状態に応じて該ＣｐＧ部位の配列を選択的に修飾することが可能な薬剤と；ＭｃｒＢＣ消化後のＰＣＲ増幅に好適であるとして先に記載したＤＮＡプライマーとを含む。つまり、該薬剤は、ＣｐＧ部位がメチル化されているか否かに応じて該ＣｐＧ部位のヌクレオチド（通常はシトシンヌクレオチド）を修飾する。例えば幾つかの実施形態においては、メチル化シトシン残基を修飾せずに、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に修飾する重亜硫酸ナトリウムが提供される。別の実施形態では、非メチル化シトシン残基を修飾せずに、メチル化シトシン残基をチミン残基に修飾する過マンガン酸カリウムが提供される。好ましい実施形態において、プライマーは配列番号２７および２８である。
【００６９】
好ましい実施形態において、キットは、上記のとおり個々のＣｐＧ部位のための検出プローブおよびアンカープローブも含む。検出プローブにはアクセプター色素およびドナー色素のうちの一方が結合しており、アンカープローブにはアクセプター色素およびドナー色素のうちの他方が結合している。特に好ましい実施形態において、キットは複数の検出プローブを含み、各検出プローブは、ＨＰＶ−１６ゲノムの異なるＣｐＧ部位に相補的である。例えば幾つかの実施形態において、検出プローブは、ＨＰＶ−１６ゲノムの７４９
８位から１６１位までの間の１１個のＣｐＧ部位に相補的である。各検出プローブ用に、対応するアンカープローブも提供される。
【００７０】
本発明のキットを用いて、容易に使用可能な様式で子宮頸がんが診断される。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本発明の更なる例示を提供するものであり、本発明をどのようにも限定しようとするものではない。
［実施例１］
制限酵素ＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩを用いて、ｍｅＣｐＧ（即ちメチル化ＣｐＧ）を検出することができる。該酵素はいずれも配列ＣＣＧＧを開裂するが、ＣｐＧメチル化はＨｐａＩＩによる開裂を阻害し、Ｍｓｐ１はメチル化の影響を受けない。ＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩによるＨＰＶ−１６ゲノムの消化を実施し、得られた断片を配列決定することによって、ＨＰＶ−１６のＬＣＲおよびＥ６遺伝子内の２つのＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ部位の位置を示す地図を作製し、これを図１に示している。
【００７２】
７９００ｂｐというゲノムサイズと４０％に近いＧ＋Ｃ含量から考えると、ＨＰＶゲノム内にＣｐＧ部位が約４００個見出されると予測することができる。しかし一般の乳頭腫ウイルス、ＨＰＶ−６型、１１型、１６型、１８型、３１型および４５型は、ＣｐＧをそれぞれ１６０個、１５５個、１１２個、１７２個、１２２個および１５４個有している（マイヤーズ、ジー．他（Ｍｙｅｒｓ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．））。これはヒト宿主と同様に予測された頻度より低く、生殖器ＨＰＶの生活環におけるＣｐＧの機能が示唆される。
【００７３】
［実施例２］
子宮頸がん細胞株ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａは、染色体ＤＮＡに組込まれたＨＰＶ−１６ゲノムをそれぞれ約５００個および１個含む。ＳｉＨａのＨＰＶ−１６ゲノムは、そのＥ２遺伝子が３１３２／３３８４位で中断されて組込まれおり、２５１ヌクレオチドのウイルス配列の欠失を伴っている（ベイカー他（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．））。
【００７４】
ＣａＳｋｉ内のＨＰＶ−１６ゲノムは、多数の遺伝子座に挿入されている。これらのほとんどについて、ＨＰＶ−１６は転写に関してサイレントであり、単一の遺伝子座からＥ６／Ｅ７転写物が生じているが（リーマス、アール．他（Ｒｅｍｕｓ，  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．））、これはおそらくエピジェネティックな抑制機序によるものである。
【００７５】
ＣａＳｋｉ細胞およびＳｉＨａ細胞は、ドイツ国ハイデルベルグ所在のジャーマン・キャンサー・リサーチ・センター（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）のエイチ．ツアハウゼン（Ｈ．ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ）氏から供与されたもので、同センターでは該細胞は１９８６年に凍結され、この研究のために直前に解凍された。細胞内ＤＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のゲノム用チップで精製した。各１５ｎｇおよび１５０ｎｇのこれらのＤＮＡをそれぞれＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩ（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））で消化し、酵素を熱失活させた後、ＰＣＲによって増幅させた。
【００７６】
Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の逆転写ＰＣＲを実施し、これをアガロースゲルで視覚化して図２に示している。比較のために１倍、１０倍および１００倍濃度のＳｉＨａ  ＨＰＶ−１６  ＤＮＡ、ならびに１倍濃度のＣａＳｋｉ  ＨＰＶ−１６  ＤＮＡのゲノムＰＣＲも実施した。結果をアガロースゲルで視覚化し、図３に示している。
【００７７】
図２を見て分かるとおり、ＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞は、ほぼ同量のＥ６およ
びＥ７転写物を生成したが、図３ではＣａＳｋｉ細胞のＨＰＶ−１６ＤＮＡレベルがＳｉＨａ細胞よりもかなり高いことが示されている。従って、この実施例から、ＣａＳｋｉ細胞でＨＰＶ−１６ゲノムがかなり過剰であるにもかかわらず、ＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞が、同レベルのＥ６およびＥ７転写物を発現することが確認された。
【００７８】
［実施例３］
ＣｐＧメチル化が実施例２の所見を説明し得るかどうかを調査するために、ＬＣＲおよびＥ６遺伝子の２つのＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ部位のメチル化状態を分析した。これらの部位は、両ＤＮＡ内のＰＣＲアンプリコンＰ５（Ｅ６遺伝子に相当）、Ｐ２（ＬＣＲを含む）、およびＰ１１（Ｅ６プロモータ配列そのものを含む）に存在する。Ｐ５、Ｐ２およびＰ１１アンプリコンの位置を、図１に模式的に示す。見て分かるとおり、これらのアンプリコンを用いて、エンハンサ−プロモータＥ６セグメントについて特異的に検討した。
【００７９】
ＳｉＨａ細胞およびＣａｓｋｉ細胞の染色体ＤＮＡを、切断されていない試料（対照：ＣＴ）、または２種の酵素のうち一方によって開裂された試料（それぞれＨｐａＩＩ：ＨおよびＭｓｐＩ：Ｍ）に分けた。その後、ＰＣＲ法を用いて該試料を増幅させ、アンプリコンＰ２、Ｐ５およびＰ１１を作製した。各プライマーを表１に示す。ＰＣＲプロトコルは以下に説明する。得られた試料をアガロースゲルで分離して視覚化したものを図４に示す。
【００８０】
ＳｉＨａ  ＤＮＡの場合、これらのアンプリコンは、２種類の酵素のどちらかで開裂した後には作製することができなかったが、ＣａＳｋｉ細胞の場合、ＤＮＡのほとんどがＨｐａＩＩに耐性であったがＭｓｐＩでは容易に開裂された。
【００８１】
これらの知見から、ＣａＳｋｉ細胞のほとんどのＨＰＶ−１６ゲノムではＬＣＲおよびＥ６遺伝子がＣｍｅＣＧＧを含むが、ＳｉＨａ細胞のＨＰＶ−１６ゲノムでは含まないことが示されている。つまりがん細胞株ＣａＳｋｉのほとんどのＨＰＶ−１６ゲノムがｍｅＣｐＧを含んでいるが、ＳｉＨａ細胞の単一のＨＰＶ−１６ゲノムはｍｅＣｐＧを含んでいない。
【００８２】
４種のｄＮＴＰをそれぞれ０．２ｍＭ、プライマー１０ｐｍｏｌ、製造業者（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって供給された緩衝液Ｂ２．５μｌ、ＭｇＣｌ２を２ｍＭおよびＴａｑ（プロメガ）０．７５単位を含む２５μｌ中で、ＭｃｒＢＣによって開裂されなかった、または開裂されたＳｉＨａ  ＤＮＡおよびＣａＳｋｉ  ＤＮＡ（それぞれ２５μｌまたは０．２５μｌ）を用いて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、開始時は９４℃で１分間、その後、増幅サイクルを３５回（変性：９４℃で１０秒、アニーリング：５８℃で３０秒、伸長：６８℃で４５秒をサイクル毎に１０秒間増加）行い、最後の伸長工程を６８℃で７分間行った。ＴａｑＧｏｌｄ（商標）を用いたＰＣＲの実施は、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰ  ５ｍＭ、プライマー１０ｐｍｏｌ、製造業者から供給されたマグネシウムイオン非含有緩衝液２．５μｌ、ＭａＣｌ２  ２ｍＭおよびＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ））１．２５単位を含む２５μｌ中で、９４℃で９分間、その後、増幅サイクルを４０回（変性：９４℃で１０秒、アニーリング：５８℃で３０秒、伸長：６８℃で４５秒をサイクル毎に１０秒間増加）、最後の伸長を６８℃で７分間とした。
【００８３】
【表１】
2006522607.tif 000003
【００８４】
［実施例４］
制限酵素ＭｃｒＢＣは、任意の間隔で第２のプリン‐ｍｅＣ（ＰｕｍｅＣ）が存在するという条件下でプリン‐ｍｅＣ配列の付近を切断するので、この酵素ＭｃｒＢＣを用いたスクリーニングは、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩによる分析よりも効果的である（サザーランド、イー．他およびスチュワート、エフ．ジェイ．他（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．））。結果としては、ＭｃｒＢＣはＰｕｍｅＣｐＧ残基対を認識し、平均してｍｅＣｐＧを１つおきに開裂するが、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ分析は、ＣｐＧ１６個のうちの１個のメチル化状態のみを解明する。
【００８５】
ＨＰＶ−１６ゲノムはＣｐＧを１１２個含み、これらのうち８１個がプリン−ＣｐＧ配列の一部であるため、メチル化だけでなくＭｃｒＢＣによる開裂の潜在的なターゲットである。ＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞のＨＰＶ−１６ゲノム全体のメチル化の分布を示す概略的な地図を作製するために、染色体ＤＮＡをＭｃｒＢＣで消化して、約１ｋｂの大きさのセグメントをＰＣＲ法を用いて増幅させた。
【００８６】
ＨＰＶ−１６ゲノムおよびＰＣＲ法によって生じた各アンプリコンＧ１〜Ｇ８を、図５に模式的に示す。これらのアンプリコンは重複しており、ＨＰＶ−１６ゲノム全体を包括的に含んでいる。各アンプリコンの末端を規定するプライマーを表１に示す。ＰＣＲ法の後、試料をアガロースゲルで分離した結果を図６に示す。
【００８７】
使用したＰＣＲプロトコルはＭｃｒＢＣ（ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ）による消化を除き実施例３と同様であった。ＭｃｒＢＣ（ニュー・イングランド・バイオラボラトリーズ）による消化は、ＳｉＨａまたはＣａＳｋｉ  ＤＮＡ  ２５０ｎｇを、ＮＥ緩衝液２（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ジチオトレイトール１ｍＭ、ｐＨ７．９）２５μｌ中で酵素３単位を用いて３７℃で１時間実施した。
【００８８】
ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩのデータから予測されたとおり、７１４５位から５５９位までのＬＣＲ−Ｅ６セグメントは、ＳｉＨａ  ＤＮＡでは消化されず、メチル化ターゲットが存在しないことが示された。ＣａＳｋｉ  ＤＮＡでは上記アンプリコンのほとんどが消化され、従ってメチル化されていたが、再現性が低く弱い未消化のバンドから、一部のコピーにメチル化が存在しないことが示された。そして５１５位から１５２８位まで、および１５０１位から２５２６位までのセグメントは、ＳｉＨａでは開裂されず、ＣａＳｋｉでは一部しか開裂されなかったため、Ｅ７およびＥ１遺伝子にわたるゲノム領域について、それぞれメチル化の欠如および部分的なメチル化が示唆された。２５０１位から３５０１位までのアンプリコンは、このセグメントの組換えから予測されたとおり、ＳｉＨａ  ＤＮＡでは増幅することができなかった。このアンプリコンのほとんどが、ＣａＳｋｉ  ＤＮＡで消化可能であった。残りのセグメントのうちの３個（３４７１位から４４７２位まで、５３６７位から６３７０位まで、および６３４８位から７１４３位まで）は、ＳｉＨａ
ＤＮＡおよびＣａＳｋｉ  ＤＮＡの両方についてほぼ完全に開裂されたが、第４のセグメント（４４０２位から５４０２位）は、一部が開裂された。後期遺伝子Ｌ２およびＬ１を含むゲノムのこの部分は、細胞内メチル化機構によって明らかに十分認識されている。ＳｉＨａにおいてこのセグメントは、（組換えによって）ウイルスプロモータの上流にあり、転写に関してサイレントであると思われる。
【００８９】
ｉｎ  ｓｉｔｕでＭｃｒＢＣ開裂の同様の分布が見出されるかどうかを検査するために、子宮頸がん（実施例７および表３の「Ｔ６」に相当する腫瘍６）のＤＮＡを分析した。これは、３３の腫瘍由来ＤＮＡのうちで、高度にメチル化されたＬＣＲ−Ｅ６セグメントを含んでいた唯一のＤＮＡ標本であった（以下参照）。この腫瘍ＤＮＡを、３４７１位から７１７３位までの間のセグメント全てが高度にメチル化されているＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞のＨＰＶ−１６ゲノムと同様の不均等な手法で選択的に開裂した。７１４５位から５５７位までのセグメント、および２５０１位から３５０１位までのセグメントは、中等度にメチル化されていたが、５１５から２５２６位までのセグメントではメチル化の割合は低かった（図６参照）。アンプリコンＧ１〜Ｇ８は、全て多数の潜在的ＭｃｒＢＣ部位（それぞれ１１、８、１５、１３、５、７、１０および１３個）を有しているため、ＭｃｒＢＣによる差次的な開裂が、ＭｃｒＢＣ部位の不均等な分布によって偏ったのではない。例えば、７つの部位を含むＧ６は、８つの部位を有するＧ２とは対照的に、ＣａＳｋｉ  ＤＮＡ、ＳｉＨａ  ＤＮＡおよびＴ６  ＤＮＡ内で効率的に開裂された。
【００９０】
検討したほぼ全ての腫瘍と同様に、ＬＣＲ−Ｅ６セグメントが検出可能なＤＮＡメチル化を含まない（以下参照）がん由来のＤＮＡも検査した。腫瘍４のＤＮＡは、ＨＰＶ−１６ゲノム全体がＭｃｒＢＣによって開裂されなかった（図６参照）。５３６７位から６３７０位までのセグメントが、弱いアンプリコンをわずかに誘導しただけであった。
【００９１】
前駆病変（子宮頸部上皮内腫瘍Ｉ、ＣＩＮ  Ｉ）のＨＰＶ−１６全ゲノムも分析した（図６参照）。当初は低度にメチル化されたＬＣＲ−Ｅ６領域を有することが見出されたこの試料のアンプリコンは、いずれもＭｃｒＢＣによって開裂されなかった。
【００９２】
この実施例から、ＨＰＶ−１６  ＤＮＡが、ＤＮＡメチル化によって広範囲に修飾され得ることが示される。メチル化は、ゲノムの異なる部分によって量的に変動し、高メチル化は、３種のＤＮＡ単離物では、後期遺伝子の位置と相関する。２種の病変、つまりＤＮＡが組み込まれていると思われる腫瘍およびＣＩＮ  ＩＩ病変のエピソームＤＮＡに検出可能なメチル化が存在しないことから示唆されるとおり、ＨＰＶ−１６  ＤＮＡのメチル化は必然ではなく、未知の環境に依存する。
【００９３】
［実施例５］
ＣｐＧメチル化が、細胞株および浸潤がん内では散発的にしか起こらないのか、または臨床検体では頻繁に見られるのかを測定するために、以下の実験を実施した。健常と分類された子宮頸部スミア（無症候のスミア）、軽度および重度の前駆病変（ＣＩＮ  ＩおよびＣＩＮ  ＩＩＩ）の生検、ならびに浸潤がんに由来するＤＮＡを、ＭｃｒＢＣ消化および表１に示したＰ４ＦおよびＰ１Ｒプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって分析した。この方法について図７に示す。その後、ＰＣＲ増幅の結果をアガロースゲルでの分離によって分析したが、その一部を図８に示す。図８を見て分かるとおり、浸潤がんの患者から得た試料のゲル上のバンドは、ＭｃｒＢＣによる消化の影響を受けなかった。しかし無症候の試料のゲル上のバンドは、ＭｃｒＢＣで消化したものよりも微弱であった。
【００９４】
米国ニューメキシコ州からの臨床検体４８例、およびブラジルからの３３例のＤＮＡを検査した。
ブラジルの試料（Ｌ．Ｌ．Ｖ．）は、ブラジル北東部の２都市における横断調査から得たもので、子宮頸部の掻爬検体および腫瘍生検からなるものであった。細胞学的分析および組織学的分析は、ベセスダシステム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ｓｙｓｔｅｍ）に従って行った。「無症候」に分類されたスミアについては、子宮膣部および子宮頸部の細胞をサイトブラシで採取した。組織生検を子宮頸部上皮内の病変（ＣＩＮ  ＩおよびＣＩＮ  ＩＩＩ）または浸潤がんに分類して、プロテイナーゼＫで消化した後、ＤＮＡを単離した。ＤＮＡ試料をスピンカラムクロマトグラフィーで精製し、特定のＨＰＶ型に関するＭＹ０９／１１  ＰＣＲプロトコルによって、ＨＰＶ  ＤＮＡの存在を検査した（バーナード、エイチ．ユー．他（Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｈ．Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．））。検体は全て、対象者のプライバシーを考慮して番号で暗号化した。米国ニューメキシコ州由来の無症候の試料および前駆病変試料を入手し、公表されている疫学的研究で特徴づけた（ペイトン、シー．エル．他（Ｐｅｙｔｏｎ  Ｃ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．））。浸潤性子宮頸がんの検体は、１９８０〜１９９９年に診断された同じ母集団について進行中の症例‐対照比較研究から得た（Ｃ．Ｍ．Ｗ．）。結果を表２に示す。
【００９５】
表２の上のパネルは、各集団の構成および分析を記載している。ＣｐＧメチル化は、制限酵素ＭｃｒＢＣによりＤＮＡ調製物を開裂させた後に、図７に示したプロモータおよびＥ６遺伝子に相当するＨＰＶ−１６ゲノムのセグメントをＰＣＲ増幅することによって測定した。表２の下のパネルは、両集団のデータをまとめ、かつＣＩＮ  ＩおよびＣＩＮ  ＩＩＩのデータを１つの前駆病変群とし、増幅できなかったＤＮＡ調製物を除外することによって作成した。
【００９６】
ブラジルの検体では、無症候のスミア１４例のうちの８例に高度にメチル化されたウイルスＤＮＡが含まれ、ＣＩＮ  Ｉ病変３例にはいずれも含まれず、がんの試料１６例のうち２例に含まれていた。これら２例のがんのＤＮＡのうちの一方は軽度にメチル化されており、もう一方の「ｔｕｍｏｒ６」は上述のように高度にメチル化されていた。ニューメキシコ州の試料では、無症候のスミア１１例のうち５例のＤＮＡにメチル化されたＨＰＶ−１６ゲノムが含まれ、ＣＩＮ  Ｉ病変１０例のうち３例とＣＩＮ  ＩＩＩ病変１０例のうち２例に含まれ、がん１７例にはいずれも含まれなかった。両集団を一緒にすると、無症候のスミア由来のＨＰＶ−１６ゲノムのうち５２％にメチル化ＤＮＡが含まれ、前駆病変では２１．７％、がんではわずか６．１％に含まれており、ＬＣＲおよびＥ６遺伝子のメチル化が感染の進行とともに減少することが示された。
【００９７】
無症候の患者の子宮頸部スミア由来ＨＰＶ−１６ゲノム全体のメチル化パターンのスキャンは、入手できたＤＮＡが少量であったため試行できなかった。
この実施例から、ＨＰＶ−１６のメチル化が、無症候のスミアでは頻繁に見られ、前駆病変では多くなく、がんではまれであることが示された。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
［実施例６］
重亜硫酸ナトリウム修飾の後に配列決定することによって、ｍｅＣｐＧを正確にマッピングすることができる（ヴァンタイン、ビー．エイ．他（Ｖａｎ  Ｔｉｎｅ，  Ｂ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ））。重亜硫酸ナトリウムは、非メチル化シトシン残基を修飾してウラシル残基にする作用を有する。多数の試料の中の７．９ｋｂのゲノムを完全に分析することは非常に煩雑であるため、選択した試料について、ゲノムの７４９８位から１６１位までのエンハンサ−プロモータ領域の分析だけにこの技術を用いた。この領域は、７５３７位、７５５４位、７６７７位、７６８３位、７６９５位、７８６２位、３１位、３７位、４３位、５２位および５８位の１１個のＣｐＧを含んでいる（図１参照）。これらのＣｐＧの最初の５個は、ＨＰＶ−１６エンハンサの重要なＡＰ１部位およびＮＦ１部位の付近にある（バーナード他（Ｂｒｎａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．）  、アプト、ディー．他（Ａｐｔ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．）およびグロス、ビー．他（Ｇｌｏｓｓ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ））。最後の５個のＣｐＧは、１個のＳｐ１結合部位および２個のＥ２結合部位と重複しているが、これらの部位は９７位での転写開始を調節している（ダーメレット、シー．他（Ｄｅｒｍｅｒｅｔ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）およびアプト、ディー．他（Ａｐｔ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．））。
【０１００】
メチル化シトシン残基のマッピングのために、インタージェン社（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｉｎｃ．，）のＣｐＧｅｎｏｍｅ（商標）ＤＮＡ修飾キットによってＤＮＡを修飾し、修飾されたＨＰＶ−１６  ＤＮＡに特異的なプライマーで反応生成物を増幅させた。Ｍｓｐ３Ｆ（ゲノムの４３２２‐４３４８位、ＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＴＴＧＡＡ、配列番号２５）およびｍｓｐ３Ｒ（４９７０‐４９４６位、ＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＣＡ、配列番号２６）は、Ｌ２遺伝子の一部に及んでおり、対照として用いた。Ｍｓｐ４Ｆ（７４９８‐７５２２位、ＴＡＧＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＡＴＧＧＴＴ、配列番号２７）およびｍｓｐ４Ｒ（１６１‐１４０位、ＡＣＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＴＡＡＣＴＡＴＡＡＴＡ、配列番号２８）によって、エンハンサ−プロモータを含むセグメントを増幅した。同じプライマーを用いて増幅生成物を直接配列決定した。
【０１０１】
ＳｉＨａでは、１１個のＣｐＧ全てが修飾され、即ち非メチル化状態であった。これに対し、ＣａＳｋｉ細胞のＨＰＶ−１６  ＤＮＡコピー５００個のうちのほとんどについては、７４９８位〜１６１位の同じ１１個のＣｐＧがメチル化されていた。１個または数個のＨＰＶ−１６ゲノムの未修飾で転写活性のあるバックグランドは、この実験では検出できなかった。Ｍｓｐ３ＦプライマーおよびＭｓｐ３Ｒプライマーによって規定されるＬ２遺伝子のセグメント（４３２２‐４９４６位）は対照の役割を果たし、このアンプリコンの４個のＣｐＧ全てがメチル化されていたためＳｉＨａとＣａＳｋｉとで差は無かった。
【０１０２】
［実施例７］
患者試料１５例を、実施例６と同じプロトコルを用いて重亜硫酸塩修飾によって検討した。結果を表３に示す。表３において「Ａｓ」は、無症候の患者からの試料を指し；「ＣＩＮ」は、その型の前駆病変を有する患者からの試料を指し；「Ｔ」は、子宮頸がん（即ち、浸潤がん）を有する患者からの試料を指す。記号は、＋：メチル化、−：非メチル化、−（＋）：同じ試料中にメチル化残基と非メチル化残基が存在する、を意味する。７５３５位から７５９６位までの間のＣｐＧ５個は、ウイルスのエンハンサのシス応答エレメントの付近にあり、３１位から５８位までの間のＣｐＧは、プロモータエレメントと重複している。７８６２位のＣｐＧは、それぞれエンハンサおよびプロモータと重なり合う２つの特異的位置のヌクレオソームの境界の間にある。
【０１０３】
無症候のスミア５例において、１１個のＣｐＧ全てがメチル化されていた。ＣＩＮ  Ｉ試料２例においては、プロモータのＣｐＧ５個のうちそれぞれ３個および４個がメチル化
されていなかったが、一つの試料ではエンハンサのＣｐＧが全てメチル化されており、もう一方の試料では２個のＣｐＧがメチル化されていた。ＣＩＮ  ＩＩＩ試料１例および腫瘍試料２例は、エンハンサおよびプロモータのＣｐＧ全てがメチル化されていたが、他の腫瘍試料５例は、メチル化パターンが不均等であった。特に、ＣＩＮ病変および浸潤がん病変の１０例全てにおいて、エンハンサとプロモータの間の唯一のＣｐＧ残基（７８６２位）が、非メチル化状態であった。この部位は、２個の特異的位置のヌクレオソームの間の唯一のＣｐＧジヌクレオチドであり、上皮分化の際の転写活性化に不可欠なＡＰ−１部位の付近である（バーナード、エイチ．ユー．他（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．）およびオコナー、エム．ジェイ．他（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）。他の腫瘍６例でも同じ部位が非メチル化状態であり、それらのほとんどが、エンハンサまたはプロモータセグメント内に複数の別の非メチル化ＣｐＧを有していた。
【０１０４】
本発明を上記実施形態によって例示してきた。しかし、当業者には当然のことであるが、本発明の思想および範囲内にある更なる実施形態を提供することが可能である。
【０１０５】
【表３】
2006522607.tif 000005
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
2006522607.tif 000007
【０１０８】
2006522607.tif 000008
【０１０９】
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【０１１０】
2006522607.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＨＰＶ−１６ゲノムの一部の概略図。この図には、ＨＰＶ−１６のＬＣＲ（７１５４位から７９０６／１位を経て９６位まで）およびＥ６遺伝子（９７位から５５９位まで）におけるＣｐＧの分布、ならびに２個のＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ部位の位置、つまりＥ６プロモータＰ９７エレメントと重複した一方の部位（５７位）とＥ６遺伝子の３’部分にある他方の部位（５０２位）が示されている。また、アプリコンＰ１１、Ｐ２およびＰ５も示されており、該アンプリコンそれぞれのプライマーは表１に示されている。
【図２】ほぼ同量のＥ６およびＥ７転写物がＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞によって生成されることを裏付ける、逆転写ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル像。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）を、細胞内転写物の対照として用いた。
【図３】１倍濃度のＣａＳｋｉ  ＨＰＶ−１６ＤＮＡと比較した、１倍、１０倍および１００倍濃度のＳｉＨａ  ＨＰＶ−１６ＤＮＡのゲノムＰＣＲの結果を示すアガロースゲル像。ＣａＳｋｉ細胞内の大過剰のＨＰＶ−１６ＤＮＡが確認されている。
【図４】ＰＣＲアプリコンＰ５（Ｅ６遺伝子に対応）、Ｐ２（ＬＣＲを含む）およびＰ１１（Ｅ６プロモータ配列そのものを含む）内のメチル化状態を分析した後のアガロースゲル像。（これらのアンプリコンは図１に概略的に示されている）。ＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞の染色体ＤＮＡを切断しないか（対照：ＣＴ）、または２種の酵素（ＨｐａＩＩをＨ、ＭｓｐＩをＭと表示）のいずれかによって開裂させて、ＰＣＲによって増幅させ、アンプリコンＰ２、Ｐ５およびＰ１１を作製した。３種の各アプリコンは、ＳｉＨａ細胞の場合には２種の酵素のいずれかによって開裂された後には作製することができなかった。このことは、メチル化されたＣＣＧＧ配列が存在しないことを示している。ＣａＳｋｉ細胞の場合、ＤＮＡのほとんどがＨｐａＩＩ消化に対して耐性であったが、ＭｓｐＩでは容易に開裂されたため、ＣａＳｋｉの５００個のＨＰＶ−１６コピーのほとんどにおいてこれら２つの部位がメチル化されていることが示された。
【図５】ＨＰＶ−１６（７９０６ｂｐ）のゲノム地図。遺伝子Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｌ２、Ｌ１および長い制御領域（ＬＣＲ）、ならびにアンプリコンＧ１〜Ｇ８の相対的位置を示している。アンプリコンＧ１〜Ｇ８の各プライマーは表１に示されている。
【図６】ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼ消化後のＨＰＶ−１６ゲノムのセグメントを示す、一組のアガロースゲル像。アンプリコンＧ１〜Ｇ８がＭｃｒＢＣにより開裂されており（試料の各対の右側レーン）、メチル化されていることが示され、開裂されていない対照と比較されている。開裂パターンから、ＣａＳｋｉ細胞および腫瘍６（Ｔｕｍｏｒ６）由来のＤＮＡではＨＰＶ−１６ゲノムのほとんど全体で高メチル化されていることが示されている。開裂パターンから、ＳｉＨａの単一ＨＰＶ−１６ゲノムの後期遺伝子が高メチル化されており、腫瘍４（Ｔｕｍｏｒ４）およびＣＩＮ  Ｉ病変では低メチル化状態であるか、またはメチル化されていないことが示されている。
【図７】７８５０〜５５９位のゲノムセグメントを含むアンプリコンＰ４の概略図。Ｅ６プロモータエレメント、Ｅ６オンコジーンおよびＥ６内のシス応答エレメント（図の左側）を共に示す。Ｐ４アンプリコンのプライマーは表１に示されている。
【図８】ＭｃｒＢＣで消化したＨＰＶ−１６ゲノムのセグメント（Ｍｃ）を対照（ＣＴ）と比較した１対のアガロースゲルを示す図。上のパネルは浸潤がん由来のＤＮＡから検出された、２種の典型的なＭｃｒＢＣ耐性（即ち非メチル化状態の）Ｐ４アンプリコンを示す。下のパネルは、無症候の子宮頸部スミア由来の２種の典型的なＭｃｒＢＣ感受性のメチル化Ｐ４アンプリコンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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