(57)【要約】【課題】ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用活性成分の使用法を提供する。【解決手段】本発明はウイルス性疾患の予防及び／治療用の、好ましくは少なくとも一つの活性成分の使用に関し、この活性成分がウイルス増殖を阻害するように転写因子ＮＦ−ｋＢ活性化に関する細胞信号伝達経路の少なくとも一成分を阻害する。本発明は、更に、ウイルス増殖の阻害に関し、本発明による活性成分の局所的、好ましくは経気投与に関する。本発明の活性成分は、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用の、更に少なくとも一つの、抗ウイルス性有効物質と混合しても良い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのウイルス性疾患の予防及び／又は治療用薬剤成分調合に関して、ウイルス増殖を阻害するようにＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分を阻害する少なくとも
一つの活性成分の使用。
【請求項２】
ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分を“腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＮＦ−ｋＢ誘発キナーゼ（ＮＩＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１（ＭＥＫＫＫ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ３（ＭＥＫＫＫ３）、ＡＫＲマウス胸腺腫キナーゼ（ＡＫＴ）、ＴＧＦβ活性化キナーゼ（ＴＡＫ１）、ＮＦ−ｋＢキナーゼアルファ阻害剤（ＩＫＫアルファ）、ＮＦ−ｋＢキナーゼベータ阻害剤（ＩＫＫベータ）、ＮＥＭＯ、ｋＢの阻害剤（ＩｋＢ），ＲＥＬＡ（ｐ６５）、Ｃ−ＲＥＬ、ＲＥＬＢ、ＮＦ−ｋＢ１（ｐ１０５）、ＮＦ−ｋＢ２（ｐ１００）、ｐ５０、ｐ５２“から成るグループから選択する請求項１による少なくとも一つの活性成分の使用。
【請求項３】
一つ又は複数の活性成分を“ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路キナーゼ阻害剤、例えばフェニルアルキル酸誘導体、例えばスリンダク又はスリンダクスルフォキサイド、スリンダクスルホン、スリンダク硫化物又はベンジルアミドスリンダク類似体のようなスリンダク誘導体の様なフェニルアルキル酸誘導体、サルチル酸又はアセチルサルチル酸、サルチルアミド、サルアセトアミド、エテンザミド、ジフルニサル、オルサラジン又はサラゾスフファピリジン、クルクミンの様なサルチル酸誘導体、ピロリジンジチオカーバメート（ＰＤＴＣ）、例えばピロキシカムの様なオキシカム、ビタミンＥとペンタメチルヒドロキシクロマン（ＰＭＣ）の様なその誘導体、１７ベータエストラジオール及びその誘導体、例えば（−）エピガロカテキンー３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）の様な茶ポリフェノール、Ｂａｙ１１−１７８２の様な抗酸化剤のようなＮＦ―ｋＢ活性化を阻害する非ステロイド系抗炎症物質、例えばＮＥＭＯ結合ペプチド、ＰＳ―３４１及びラクタシスチンの様なプロテオソーム阻害剤の様なＮＦ―ｋＢ信号伝達経路の少なくとも二成分の相互作用を阻害するペプチド、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の一成分をコード化するＤＮＡ配列又は伝令ＲＮＡ配列に特異的に添加したアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばｐ６５又はｐ５０に特異的なアンチセンスヌクレオチド配列、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分の優性阻害突然変異体、ＲＮＡi技術によりＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分の伝令ＲＮＡの特異的分解に適した二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分に特異的な抗体又は抗体断片、又は少なくとも一個の抗体断片を含む融合タンパク質、例えばＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分を阻害するＦｖ断片”からなるグループから選んだ請求項１又２の一つによる少なくとも一つの活性成分の使用。
【請求項４】
ウイルス性疾患がＲＮＡ又はＤＮＡウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス感染で起こる請求項１乃至３の一つによる少なくとも一つの活性成分の使用。
【請求項５】
少なくとも二つの異なる活性成分を含み、少なくとも一つの活性成分が請求項３のグループから選ばれ、調合剤が混合物の形で又は各成分として同時又は非同時に同一又は異なる場所で使用できる少なくとも一つのウイルス性疾患の予防及び／又は治療用調合剤。
【請求項６】
少なくとも一つの抗ウイルス的作用物質が、１−アダマンタンアミン、リマンタジン、ノイラミダーゼ阻害剤、又はリバビリンのようなヌクレオチド類似体である請求項５による調合剤。
【請求項７】
マイナス鎖ＲＮＡウイルス、特にインフルエンザウイルス又はボルナ病ウイルスによる感染の予防及び／又は治療に関する請求項１乃至６の一つによる活性成分又は調合剤の使用。
【請求項８】
経鼻、気管支又は経気投与の調合において、調合剤の活性成分濃度が０．１から４ｍＭであり、投与単位当たりの全活性成分量が好ましくは０．１乃至７０ｍｇの範囲であり、薬剤成分がヒトへの一日用量が７０ｍｇを越えない様に調整調合する請求項１乃至７の一つによる活性成分又は調合剤の使用。
【請求項９】
ウイルス増殖を実質的に阻害するようにＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分に作用する活性成分の同定用試験システムで、（ａ）少なくとも一つのウイルスで少なくとも一つの細胞が感染でき、この細胞がＮＦ−ｋＢ信号伝達経路と細胞に感染する少なくとも一つウイルスを含有するか、又は（ｂ）少なくとも一つのウイルスで少なくとも一つの細胞が感染され、この細胞がＮＦ−ＫＢ信号伝達経路を過剰発現する事からなる試験システム。
【請求項１０】
ウイルスがＲＮＡ又はＤＮＡウイルス、好ましくはインフルエンザウイルスである請求項９による試験システム。
【請求項１１】
細胞がＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一つの過剰発現成分を常時活性突然変異形として含有する請求項９又は１０による試験システム。
【請求項１２】
試験システムが細胞を含有し、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分の少なくとも一つの優性阻害突然変異体をコード化する少なくとも一つの遺伝子を過剰発現する請求項９乃至１２の一つによる試験システム。
【請求項１３】
試験システムが細胞を含有し、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分での発現が過剰発現される請求項９乃至１２の一つによる試験システム。
【請求項１４】
ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用の少なくとも一つの活性成分同定法で、この活性成分が実質的にウイルス性疾患のウイルス増殖を阻害し、以下の手続きを含む。（ａ）少なくとも一つの見込みのある活性成分を請求項９乃至１３の一つによる少なくとも一つの試験システムと接触させ、（ｂ）ウイルス増殖への効果を決定し、（ｃ）もしウイルス増殖が、見込みのある活性成分無しか又は活性参照成分又は対照物質を用いて手続き（ａ）の遂行に比べて低下した場合、見込みのある活性成分を選択する方法。
【請求項１５】
少なくとも一つのウイルス性疾患の予防及び／又は治療用薬剤の調整法で、この薬剤がウイルス性疾患の場合ウイルス増殖を阻害し、以下の手続きを含む。（ａ）請求項９乃至１４の一つによる試験システムを遂行し、（ｂ）生理的に有効な用量の一つ又は複数の同定活性成分を少なくとも一つの補助及び／又は追加物質及び確定生薬調合剤と反応する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療に適した活性成分同定用試験システム、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用薬剤成分調整のためのこの活性成分の使用、この薬剤成分の調合及びこの薬剤成分調合法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスによる感染はヒト及び動物の健康に大きな脅威である。例えばインフルエンザウイルスやボルナ病ウイルスの様なマイナス鎖ＲＮＡウイルスはＲＮＡウイルスに属する。インフルエンザウイルス感染は、今なお人類の大疫病に属し且つ年々多数の死者を出す。この感染は、例えば、病気で働けない事で、経済的に重大なコスト要因となる。特にウマやヒツジを襲うボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）感染も、既にヒトの場合は、神経疾患と関連して、隔離さているが、非常に経済的に重要である。
【０００３】
特にＲＮＡウイルス制御の問題は、ウイルスポリメラーゼの不良率が高いために起こるウイルス適応能力なので、適合ワクチンの調整のみならず抗ウイルス物質の設計も非常に難しい。
【０００４】
更に抗ウイルス物質の使用により、ウイルス機能に対して直ちに立ち向かい、治療初期には、かなりの抗ウイルス効果があるが、突然変異により非常に急速に耐性変異株を選ぶことが見いだされている。例としては、ウイルスの膜貫通タンパク質に対して立ち向かう抗インフルエンザ薬アマンタジン及びその誘導体がある。その使用後短時間で、ウイルスの耐性変異株が生成する。
【０００５】
他の例としては、インフルエンザウイルス表面タンパク質ノイラミニダーゼ阻害のインフルエンザ反応用の新規治療薬がある。例えばリレンザがこれに属する。既にリレンザ耐性変異株が患者に見いだされている（グバレバ（Ｇｕｂａｒｅｖａ）等、ジャーナル・オブ・インフェクシャスデジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）、１７８巻、１２５７−１２６２頁、１９９８年）。この治療薬に託された望みは実現できなかった。
【０００６】
大抵の場合これらが非常に小さいゲノムであり、それ故、複製に必要な機能に関するコード化能力が限定されているため、全ウイルスはこれらの宿主細胞機能に強く依存せざるをえない。ウイルスの複製に必要なこの細胞機能に影響する事により、感染細胞でのウイルス複製にマイナスの影響が起こる。従ってウイルスが選択強制を避けるため順応して、特に突然変異によって欠落細胞機能を置換する可能性はない。この事は、細胞キナーゼ及びメチル基転移酵素に対する比較的非特異的な阻害物質によるインフルエンザＡ、の例で既に示されている（ショルテイゼックおよびムラー（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ）、アーカイブウイロロジー（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．）、１１９巻、１１１−１１８頁、１９９１年）。
【０００７】
細胞は多数の信号伝達経路を有し、これにより細胞への作用信号が細胞核に伝達する事が知られている。その結果細胞は外部刺激に反応して細胞増殖、細胞活性化、分化又は制御された細胞死を起こす事ができる。
【０００８】
これらの信号伝達経路は、リン酸化により少なくとも一つのタンパク質を活性化し、その後信号を伝達する少なくとも一つのキナーゼを有する点で共通である。
【０００９】
ウイルス感染後に起こる細胞過程を観察すると、多くのＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが感染宿主細胞で、好ましくは、確定信号伝達経路、つまりＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼ信号伝達経路、を活性化すると考えられる。この信号伝達経路は、細胞の最も重要な信号伝達経路の一つであり、且つ増殖及び分化過程で重要な役割を果たす（コーエン、（Ｃｏｈｅｎ）、トレンド・イン・セルバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）、７巻、３５３−３６１頁、１９９７年、ロビンソン及びコブ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｂｂ）、カレントオピニオン・オブ・セルバイオロジー（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、９巻、１８０−１８６頁、１９９７年、トリースマン（Ｔｒｅｉｓｍａｎｎ）、カレントオピニオンオブセルバイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、８巻、２０５−２１５頁、１９９６年）。
【００１０】
細胞決定過程でのこの信号伝達経路の役割研究によりＭＥＫ水準で、即ち比較的信号伝達経路の初期段階で、その他の場所もあるが信号伝達経路を阻害する幾つかの薬理的阻害剤が同定された（アレッシ（Ａｌｅｓｓｉ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７０巻、２７４８９−２７４９４、１９９５年、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）、トレンド・イン・セルバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）、７巻、３５３−３６１頁、１９９７年、 ダッドリー（Ｄｕｄｌｅｙ）等、プロシーディング・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、９２巻、７６８６−７６８９頁、１９９５年、ファバタ（Ｆａｖａｔａ）等、 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２７３巻、１８６２３−１８６３２頁、１９９８年）。
【００１１】
新規データによりＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ―ＥＲＫ信号伝達経路阻害又はＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫ信号伝達経路の様な他の信号伝達経路阻害がこの信号伝達経路に含まれるキナーゼの一つ、例えばＭＥＫか又はＳＥＫを比較して選択阻害する活性成分により核内複製マイナス鎖ウイルス、例えばインフルエンザＡウイルス及びボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）の細胞内増殖を大幅に阻害できる事が示された（プレシュカ（Ｐｌｅｓｃｈｋａ）等、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、３巻、３０１−３０５頁、２００１年、プランツ（Ｐｌａｎｚ）等、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、１０巻、４８７１−４８７７頁、２００１年、ＰＣＴドイツ特許（ＰＣＴ／ＤＥ）０１／０１２９２、ドイツ特許１０１３８９１２）。
【００１２】
今までインフルエンザウイルスは、好ましくは、その増殖にＲａｆ−ＭｅＫ−ＥＲＫ信号伝達経路又はＭＥＥＫ／ＳＥＫ信号伝達経路を使用し、それ故、これら信号伝達経路の阻害によってウイルス増殖の完全阻害をもたらす事が知られている。しかし細胞での信号伝達経路は、それ自身内に閉じこめた機能を殆ど持たず、一つの信号伝達経路の活性化で、更なる信号伝達経路が交差結合し、更に活性化されるので、細胞と同様にウイルスは阻害化信号伝達経路を迂回でき、且つある信号伝達経路を阻害する事によって、ウイルス増殖を阻害する活性成分の治療効果が、限定されるのを原理的には排除できない。
【００１３】
それ故、細胞信号伝達経路、例えばＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ信号伝達経路、又はＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫ信号伝達経路キナーゼを阻害する物の追加として、又は補充として働く抗ウイルス性活性成分の同定と使用に対する必要性は大きい。このような活性成分は既に、公文書ＰＣＴドイツ特許（ＰＣＴ／ＤＥ）０１／０１２９２及びドイツ特許１０１３８９１２に記載されている。
【００１４】
細胞の最も重要な信号伝達経路の一つは、核因子カッパーＢ（ＮＦ−ｋＢ）信号伝達経路である。この伝達経路の中心成分は一方では、ｐ５０（ＮＦ−ｋＢ１（ｐ１０５）のタンパク質分解により形成される）、又はｐ５２（ＮＦ−ｋＢ２（ｐ１００）のタンパク質分解により形成される）から、他方ではｐ６５（ＲＥＬＡ）、ｃ−ＲＥＬ又はＲＥＬＢからなるヘテロ二量体ＮＦ−ｋＢ転写タンパク質複合体である。最も一般的なＮＦ−ｋＢ複合体は、ｐ５６とｐ６５からなる。
【００１５】
このＮＦ−ｋＢ複合体の転写活性は、ＮＦｋＢの阻害タンパク質（ＩｋＢ）をｐ６５の核結合配列と結合する事により阻害される。その結果、この複合体は細胞質内に残る。例えば成長因子、ケモカイン、ＴＮＦアルファ、Ｉｌ−１、Ｃ４０配位子、ＬＰＳ、或いはウイルス感染による細胞活性化により“ＮＦ−ｋＢ誘発キナーゼ”（ＮＩＫ）、キナーゼＴＡＫ、キナーゼＡＫＴの様なキナーゼ及び多分キナーゼＭＥＫＫ１の活性化をもたらす。これらキナーゼによりＩＫＫアルファ、ＩＫＫベータ及びＮＥＭＯからなる“ｋＢキナーゼ阻害剤（ＩｋＢ）“（ＩＫＫ）複合体の活性化をもたらす。活性化ＩＫＫはＩｋＢをリン酸化し、その結果、その分解をもたらし、ｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体の放出、核転位及び転写活性の活性化をもたらす。他のＮＦ−ｋＢ複合体は、ｐ１００とＲＥＬＢからなる。リンホトキシンによる細胞活性化により恐らく、好ましくはＮＩＫの仲介でＩＫＫアルファの活性化をもたらす。活性化ＩＫＫはリン酸化を、その結果ｐ１００のｐ５２へのタンパク質分解を誘発し、次いでＲＥＬＢとの複合体で細胞核に転位し、そこで転写因子として作用する。
【００１６】
Ｎｆ−ｋＢ信号伝達経路の活性化は（ｉ）スリンダク（ＮＳＡＩＤ）（山本（Ｙａｍａｍｏｔｏ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７４巻、２７３０７−２７３１４頁、１９９９年、ベルマン（Ｂｅｒｍａｎ）等、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、８巻、３５４−３６０、２００２年）、スリンダクスルフォキサイド、スリンダクスルホン、スリンダク硫化物又はベンジルアミドスリンダク類似体のようなスリンダク誘導体（ムーンおよびレルナー（Ｍｏｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、６２巻、５７１１−５７１９、２００２年）、アセチルサルチル酸又はサルチル酸（イン（Ｙｉｎ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９６巻、７７−８０頁、１９９８年）又はクルクミン（オンコーゲン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１８巻、６０１３−６０２０頁、１９９９年）の様な非ステロイド系抗炎症薬で、ＩＫＫベータを阻害するか、（ii）ＮＥＭＯ結合ペプチド（メイ（Ｍａｙ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８９巻、１５５０−１５５４頁、２０００年）、ＰＳ―３４１の様なプロテオソーム阻害剤（タンおよびウォルダーマン（Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ）、 キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、６２巻、１０８３−１０８６頁、２００２年、アダムス（Ａｄａｍｓ）、トレンド・イン・モレキュラー・メディスン（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ）、８巻、４９−５４頁、２００２年）、又は(iii)ｐ６５又はｐ５０に特異的なアンチセンスヌクレオチド配列（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー（ＰＮＡＳ−ＵＳＡ）、９０巻、９９０１―９９０５、１９９３年）に.より阻害できる事がこれまでに判っている。現在までこれら阻害剤は、しかし、関連細胞がＮＦ−ｋＢ信号伝達経路活性の増加を炎症と腫瘍増殖の両者で示唆していたため、この両者に影響する活性成分としてのみ、その使用試験が行われてきた（カリン（Ｋａｒｉｎ）  等、ネイチャー・レビュー・キャンサー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ）、２巻、３０１−３１０頁、２００２年）。
【００１７】
現在まではウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染はＩＫＫの活性化によりＮＦ−ＫＢ信号経路を活性化し、且つこの信号経路がついでこの感染により増加した抗ウイルス性活性タンパク質、例えばインターフェロンの発現を明確に伴うという提案があった（チュウ（Ｃｈｕ）、等、イミューニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、１１巻、７２１−７３１頁、１９９９年）。インターフェロンβプロモーターのインフルエンザウイルス誘発活性が、ＩＫＫ２又はＩｋＢアルファのトランスドミナントネガティブ変異を発現する細胞で大いに低下する、と云う結果はこの提案と一致する（ウオン（Ｗａｎｇ）等、ウイロロジー（Ｖｉｒｏｌ．）、７４巻、１１５６６−１１５７３、２０００年）。一方ＩＫＫ阻害剤として知られるアセチルサルチル酸が又細胞培養液中で、５−１０ｍＭ（０．９−１．８ｍｇ／ｍｌに対応）で始まる濃度でのみインフルエンザウイルス感染を阻害できると云うこれら提案及び結果と矛盾する手がかりもある。このような濃度はアセチルサルチル酸の経口投与による大きな副作用無しには血液中で実際には達成できない（フアンおよびディーシュ（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｅｔｓｃｈ）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ）、３１９巻、７９７頁、１９８８年）。アセチルサルチル酸は、最小治療濃度幅をもつ現在自由に入手できる全鎮痛薬の内で最も毒性が高いと考えられる（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）, アメリカンジャーナル・オブ・セラピューティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．）、９巻、２４５―２５７頁、２００２年）。フアンとディーシュは、エアロゾル投与により気道内で局所的に、より高濃度で且つ抗ウイルス性効果の高くなると推測した。現在までの既知臨床的副作用自身では、有毒とは思えないアセチルサルチル酸用量１００ｍｇを投与後、ウイルスインフルエンザの場合、特に幼児の場合アスピリンを飲むなと云う警告（アセチルサルチル酸（ＡＳＡ）調合アスピリン（登録商標）に関するバイエル社（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）の使用者情報番号１４，２５２）となるので、これら提案は現在の所実現していない。
【特許文献１】ＰＣＴドイツ特許（ＰＣＴ／ＤＥ）０１／０１２９２
【特許文献２】ドイツ特許１０１３８９１２
【非特許文献１】グバレバ等、ジャーナル・オブ・インフェクシャスデジーズ、１７８巻、１２５７−１２６２頁、１９９８年
【非特許文献２】ショルテイゼックおよびムラー、アーカイブウイロロジー、１１９巻、１１１−１１８頁、１９９１年
【非特許文献３】コーエン、トレンド・イン・セル・バイオロジー、７巻、３５３−３６１頁、１９９７年
【非特許文献４】ロビンソンおよびコブ、カレントオピニオン・オブ・セル・バイオロジー、９巻、１８０−１８６頁、１９９７年
【非特許文献５】トリースマン、カレントオピニオン・オブ・セル・バイオロジー、８巻、２０５−２１５頁、１９９６年
【非特許文献６】アレッシ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、２７０巻、２７４８９−２７４９４、１９９５年
【非特許文献７】ダッドリー等、プロシーディング・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー、９２巻、７６８６−７６８９頁、１９９５年
【非特許文献８】ファバタ等、 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７３巻、１８６２３−１８６３２頁、１９９８年
【非特許文献９】プレシュカ等、ネイチャー・セル・バイオロジー、３巻、３０１−３０５頁、２００１年
【非特許文献１０】プランツ等、ジャーナル・オブ・ウイロロジー、１０巻、４８７１−４８７７頁、２００１年
【非特許文献１１】山本等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７４巻、２７３０７−２７３１４頁、１９９９年
【非特許文献１２】ベルマン等、クリニカル・キャンサー・リサーチ、８巻、３５４−３６０、２００２年
【非特許文献１３】ムーンおよびレルナー、キャンサー・リサーチ、６２巻、５７１１−５７１９、２００２年
【非特許文献１４】イン等、ネイチャー、３９６巻、７７−８０頁、１９９８年
【非特許文献１５】オンコーゲン、１８巻、６０１３−６０２０頁、１９９９年
【非特許文献１６】メイ等、サイエンス、２８９巻、１５５０−１５５４頁、２０００年
【非特許文献１７】タンおよびウォルダーマン、 キャンサー・リサーチ、６２巻、１０８３−１０８６頁、２００２年
【非特許文献１８】アダムス、トレンド・イン・モレキュラー・メディスン、８巻、４９−５４頁、２００２年
【非特許文献１９】ヒギンス等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエー、９０巻、９９０１―９９０５、１９９３年
【非特許文献２０】カリン等、ネイチャー・レビュー・キャンサー、２巻、３０１−３１０頁、２００２年
【非特許文献２１】チュウ、等、イミューニティ、１１巻、７２１−７３１頁、１９９９年
【非特許文献２２】ウオン等、ウイロロジー、７４巻、１１５６６−１１５７３、２０００年
【非特許文献２３】フアンおよびディーシュ、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン、３１９巻、７９７頁、１９８８年
【非特許文献２４】ジョーンズ, アメリカン・ジャーナル・オブ・セラピューティックス、９巻、２４５―２５７頁、２００２年
【非特許文献２５】ピート等、バイオロジカル・ケミストリー、３７８卷、１２３７−１２４５頁、１９９７年
【非特許文献２６】リュウ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１３巻、---、２００２年
【非特許文献２７】服部等、バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・インターナショナル、３５巻、１７７−１８３頁、１９９５年
【非特許文献２８】デシファンデ等、アメリカン・ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・インミュノロジー、３８巻、４６−５４頁、１９９７年
【非特許文献２９】リン等、バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー、５８巻、９１１−９１５頁、１９９９年
【非特許文献３０】ミスラおよびピッツォ、アーカイブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス、３８６巻、２２７―２３２頁、２００１年
【非特許文献３１】モリスおよびグリシャム、ジャーナル・オブ・クリニカル・ガストロエンテロロジー、２７巻、８７―９０頁、１９９８年
【非特許文献３２】ツシュル等、ジーンズ・デブロプメント、１３巻、３１９１−３１９７頁、１９９９年
【非特許文献３３】ザモーア等、セル、１０１巻、２５−３３頁、２０００年
【非特許文献３４】スッカー、エッチ、薬学テクノロジー第２版、ゲオルグティーメ社、１９９１年
【非特許文献３５】デンク等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７６巻、２８４５１−２８４５３頁、２００１年
【非特許文献３６】カス等、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・インミュノロジー、２９巻、３０７７−３０８８頁、１９９９年
【非特許文献３７】グリグナーニ等、キャンサー・リサーチ、５８巻、１４−１９頁、１９９８年
【非特許文献３８】ルドウイッヒ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７６巻、１０９９０−１０９９８頁、２００１年
【非特許文献３９】ウエバー等、ガストロエンテロロジー、１１９巻、１２０９−１２１８頁、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
それ故ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用改良活性成分を見いだす試験システムを提供し、その示度となる薬剤成分及び調合を指定する事が本発明の技術目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、(ｉ)細胞ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路を阻害する活性成分が、生物体のウイルス増殖を阻害でき、（ｉｉ）本発明による使用活性成分が、試験管内データに基づくものより低濃度で、局所投与により抗ウイルス的に有効であり、（ｉｉｉ）本発明による使用活性成分アセチルサルチル酸を濃度０．１乃至４ｍＭで経気的に投与すると、このような濃度では試験管的には、いかなる抗ウイルス効果も示さないにもかかわらず、肺及び全生物体でのインフルエンザウイルス増殖を顕著に阻害し、且つ一般的状態を害する事無しに全身治癒効果をもたらす、という驚異的知見に基づく。アセチルサルチル酸のより多くの投与量では、例えばアセチルサルチル酸濃度が１０ｍＭでは、比較的強くなく、より多くの投与量（５０ｍＭ迄）でさえ、抗ウイルス的効果は、本発明のより低い濃度よりも明らかによくない。更に濃度が２０ｍＭ以上では、経気投与により有毒となった。
【発明の実施形態】
【００２０】
本発明の主題は、従って、少なくとも一つのウイルス性疾患の予防及び／又は治療用薬剤組成を調合するために、少なくとも一つの活性成分を使用し、一つ又は複数の活性成分が、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分に作用し、その結果、生物体のウイルス増殖を阻害する事である。ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分は、例えば、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＮＦ−ｋＢ誘発キナーゼ（ＮＩＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１（ＭＥＫＫＫ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ３（ＭＥＫＫＫ３）、ＡＫＲマウス胸腺腫キナーゼ（ＡＫＴ）、ＴＧＦβ活性化キナーゼ（ＴＡＫ１）、ＮＦ−ｋＢキナーゼアルファ阻害剤（ＩＫＫアルファ）、ＮＦ−ｋＢキナーゼベータ阻害剤（ＩＫＫベータ）、ＮＥＭＯ、ｋＢ阻害剤（ＩｋＢ），ＲＥＬＡ（ｐ６５）、Ｃ−ＲＥＬ、ＲＥＬＢ、ＮＦ−ｋＢ１（ｐ１０５）、ＮＦ−ｋＢ２（ｐ１００）、ｐ５０、ｐ５２がある。
【００２１】
本発明による使用活性成分に属する物質は、例えばＮＦ−ｋＢ信号伝達経路キナーゼ阻害剤（フェニルアルキル酸誘導体、例えばスリンダク（山本（Ｙａｍａｍｏｔｏ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７４巻、２７３０７−２７３１４頁、１９９９年、バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）等、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、８巻、３５４−３６０、２００２年）又はスリンダクスルフォキサイド、スリンダクスルホン、スリンダク硫化物又はベンジルアミドスリンダク類似体のようなスリンダク誘導体（ムーンおよびレルナー（Ｍｏｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、６２巻、５７１１−５７１９、２００２年）、サルチル酸自身又はアセチルサルチル酸（イン（Ｙｉｎ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９６巻、７７−８０頁、１９９８年）、サルチルアミド、サルアセトアミド、エテンザミド、ジフルニサル、オルサラジン又はサラゾスフファピリジン、又はクルクミン（オンコーゲン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１８巻、６０１３−６２０２０頁、１９９９年）の様なサルチル酸誘導体、ピロリジンジチオカーバメート（ＰＤＴＣ）（ピート（Ｐｉｅｔｔｅ） 等、バイオロジカル・ケミストリー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、３７８卷、１２３７−１２４５頁、１９９７年）、例えばピロキシカムの様なオキシカム（リュウ（Ｌｉｕ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１３巻、---、２００２年）、ペンタメチルヒドロキシクロマン（ＰＭＣ）（服部（Ｈａｔｔｏｒｉ）等、バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・インターナショナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．）、３５巻、１７７−１８３頁、１９９５年）の様なビタミンＥとその誘導体、１７ベータエストラジオール及びその誘導体（デシファンデ（Ｄｅｓｐｈａｎｄｅ）等、アメリカン・ジャーナル・オブ・リプロダクティブ・インミュノロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏ.Ｉｍｍｕｎｏｌ）、３８巻、４６−５４頁、１９９７年）、例えば（−）エピガロカテキンー３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）（リン（Ｌｉｎ）等、バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、５８巻、９１１−９１５頁、１９９９年）の様な茶ポリフェノール、Ｂａｙ１１−１７８２（ミスラおよびピッツォ（Ｍｉｓｒａ  ａｎｄ  Ｐｉｚｚｏ）、アーカイブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）、３８６巻、２２７―２３２頁、２００１年）の様な抗酸化剤、ＮＦ―ｋＢ活性化を阻害する非ステロイド系抗炎症物質を含むＮＦ−ｋＢ信号伝達経路キナーゼの阻害剤、例えばＮＥＭＯ結合ペプチド（メイ（Ｍａｙ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８９巻、１５５０−１５５４頁、２０００年）、ＰＳ―３４１の様なプロテオソーム阻害剤（タンおよびウォルダーマン（Ｔａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｅｒｍａｎ）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、６２巻、１０８３―１０８６頁、２００２年、アダムス（Ａｄａｍ���）、トレンド・イン・モレキュラー・メディスン（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、８巻、４９−５４頁、２００２年）及びラクタシスチン（モリスおよびグリシャム（Ｍｏｒｉｓｅ  ａｎｄ  Ｇｒｉｓｈａｍ）、ジャーナル・オブ・クリニカル・ガストロエンテロロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．）、２７巻、８７―９０頁、１９９８年）を含むＮＦ―ｋＢ信号伝達経路の少なくとも二成分の相互作用を阻害するペプチド、例えばｐ６５又はｐ５０に特異的なアンチセンスヌクレオチド配列（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエイ（ＰＮＡＳ−ＵＳＡ）、９０巻、９９０１−９９０５、１９９３年）の様なＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分コード化ＤＮＡ配列又は伝令ＲＮＡ配列に特異的に添加し且つその転写又は翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分の優性阻害突然変異体、ツシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）等（ジーンズ・デブロプメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）、１３巻、３１９１−３１９７頁、１９９９年）及びザモーア（Ｚａｍｏｒｅ）等、（セル（Ｃｅｌｌ）、１０１巻、２５−３３頁、２０００年）が記述した方法により、ＲＮＡi技術を用いるＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分の伝令ＲＮＡの特異的分解に適した二本鎖オリゴヌクレオチド、ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路成分に特異的な抗体、又は抗体断片、又は例えばＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分を阻害するＦｖ断片のような、少なくとも一つの抗体断片を含む融合タンパク質がある。
【００２２】
本発明の意味する活性成分は、ウイルス増殖を実質的に阻害するＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分に直接作用できる物質である。更に、本発明の意味する活性成分は、例えば酵素分裂により本発明の活性成分に形質転換する活性成分誘導体である。本発明の意味する活性成分は、更に、本発明の活性成分に代謝的に形質転換する事前段階の活性成分である。
【００２３】
ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス、好ましくはマイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばインフルエンザウイルス、又はボルナ病ウイルスにより起こるウイルス性疾患の予防、又は治療に本発明の少なくとも一つの活性成分を使用するのが好ましい。この目的のために、本発明の活性成分を全身に、又は局所的に、例えば経皮的に、経鼻的に、経気的に体腔又は組織に投与する。
【００２４】
インフルエンザウイルス性疾患の予防、又は治療にアセチルサリチル酸の使用が更に好ましく、ここでアセチルサルチル酸を好ましくは０．１から４ｍＭの濃度で経鼻的に又は気管支を通して（経気的に）投与する。ヒト一日当たりの全投与量は好ましくは０．１乃至３０ｍｇ（経鼻）或いは０．１乃至７０ｍｇ（気管支）の範囲内でなければならない。下限値は処理法に依存するが、それぞれ０．１と２０ｍｇ又は５０ｍｇの間である。上限値は処理法に依存するが、それぞれ１ｍｇ又は２ｍｇと上述の最大値の間である。一日の投薬量は、好ましは１回乃至８回投与し、１６時間の起きている時間内に適当に割り当てる。治療は１日乃至７日間か、それより長期間適当に行う。本発明は今のところ生薬調合の投与単位からなり、且つ投与単位に存在する活性成分量は上節の治療計画に従い容易に計算できる。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用調合剤に関し、少なくとも二つの抗ウイルス的作用活性成分を含み、且つ少なくとも一つの抗ウイルス的作用活性成分が生物体中のウイルス増殖を阻害するようＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分を阻害する。好ましくはこの抗ウイルス的作用活性成分は、既に上述の本発明の活性成分から選択する。本発明の少なくとも一つの更なる活性成分及び／又は以下の様な少なくとも一つの抗ウイルス活性成分は、本発明の調合剤中の更なる抗ウイルス的作用活性成分に属する。それらはインフルエンザウイルス表面タンパク質ノイラミニダーゼを阻害するインフルエンザ感染用治療薬のリマンタジンの様な幾つかのインフルエンザＡウイルスの膜貫通タンパク質に対抗するアマンタジン（１−アダマンタンアミン）及びその誘導体である。これらに属する物は例えばＰＣＴ／ドイツ特許（ＰＣＴ／ＤＥ）０１／０１２９２に記載さている様に、Ｕ＝１２６の様なＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ信号伝達経路阻害剤であるレレンザ又は他の阻害剤、ドイツ特許１０１３８９１２に記載されている様に、ＭＥＫＫ／ＳＥＫ信号伝達経路阻害剤又は更なる信号伝達経路成分阻害剤及び３−デアザアデノシン及びリバビリンの様な合成ヌクレオシド類似体がある。
【００２６】
調合剤は混合物の形か各成分として、同一又は異なる場所で全身又は局所的に同時又は非同時に処理使用できる。投薬形態に関する上記の説明は同様に適用できる。
【００２７】
調合剤は活性成分混合物として投与できる。活性成分は、しかし、同じ場所で互いに投与ごとに分けて投与でき、例えば静脈注射により全身に、或いは例えば経鼻、経気又は経皮投与により局所的に、或いは組織への注射により投与でき、先ず投与物質が例えば３日間有効である時には異なる場所で一定期間内に同時に又は非同時に投与できる。
【００２８】
本発明による活性成分の特別な形の投与は経気法、即ち経気感染であるこれらウイルス感染の予防、又は治療用活性成分の経鼻又は気管支投与である。この目的のために技術の熟知者には十分既知である活性成分の生薬補助手段及び噴霧器を使用する。
【００２９】
本発明の他実施形態は、ウイルス増殖を阻害する様にＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分を阻害する活性成分の同定用試験システムに関し、（ａ）少なくとも一つのウイルスにより感染する少なくとも一つの細胞で、この細胞がＮＦ−ｋＢ信号伝達経路及び細胞を感染する少なくとも一つのウイルスを含有するか又は（ｂ）ＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分が欠落しているか、又は欠陥的に変異した少なくとも一つのウイルスにより感染した少なくとも一つの細胞からなる。
【００３０】
本発明の意味する細胞は、異なる器官及び組織の細胞、例えば血管又はリンパ管細胞、体腔被膜細胞である。更に細胞培養液、特に細胞バンクから入手できる物が含まれ、ＡＴＣＣ、特に許容真核細胞培養液、例えばＡ５４９，２９３、２９３Ｔ及び２９３Ｔ７（ヒト）、マウスのＢ８２，ＮＩＨ、３Ｔ３、Ｌ９２９、コモンハムスターのＢＨＫ、 チャイニーズハムスターのＣＨＯ、イヌのＭＤＣＫ、及びサバンナモンキーのベロ、ＣＯＳ−１及びＣＯＳ−７及びニワトリの一次胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）がある。
【００３１】
活性成分同定用の本発明による試験システムにおいて、例えば物質が細胞を損傷する事無しにウイルス増殖を阻害できるかどうかを、好ましくは濃度０．００１μＭ乃至１００μＭの物質と選択細胞の同定に適した粒子数のウイルスを添加する事により確かめる。
【００３２】
好ましくは本発明の試験システムで使用のウイルスは、ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス、好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００３３】
好ましい実施形態では、（ａ）本発明による試験システムの細胞はＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一つの過剰発現成分を、特にコード化する一つの遺伝子か又は幾つかの遺伝子を導入することにより、この成分の構成的活性突然変異体の形で含む。この過剰発現により、この成分を強く阻害すると共に過剰発現成分阻害のために細胞内で高濃度に達する物質を検出する。確認に関しては（ｂ）本発明の試験システムの細胞においてＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分に関する発現が、例えばアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの導入により、或いはＮＦ−ｋＢ信号伝達経路の少なくとも一成分の少なくとも一つの優性阻害突然変異体をコード化する少なくとも一つの遺伝子の導入により阻害される。
【００３４】
本発明の他実施形態は、ウイルス性疾患の予防及び／又は治療用の本発明による少なくとも一つの活性成分同定法に関し、この一つ又は複数の活性成分はウイルス性疾患の場合、ウイルス増殖を阻害し、次の手続きからなる。（ａ）少なくとも一つの可能性のある活性成分を本発明による少なくとも一つの試験システムと接触させ、且つ（ｂ）ウイルス増殖に対する効果を決定する。
【００３５】
本発明の意味する、接触させる、と云うことは、例えば活性成分を細胞培養の栄養培地に添加するか又は活性成分を生物体に局所又は全身投与する事により起こる。
【００３６】
本発明の意味する、接触させる、と云うことは、更に物質を無傷細胞に導入できる先行技術の既知法、例えば感染、形質導入、形質移入及び／又は形質転換及び技術の熟知者には既知の更なる方法を含む。もし物質がウイルス、裸の核酸、例えばアンチセンスＤＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡ、ウイロイド、ビロゾーム及び／又はリポソームであれば、これらの方法は特に好ましく、且つビロゾーム及びリポソームは又核酸分子以外に細胞に更なる活性成分を導入するのに適している。
【００３７】
ウイルス増殖に対する効果の決定は、例えばプラーク分析又は処理と非処理感染細胞のウイルス力価を比較するＨＡ単位の決定により行う。
【００３８】
本発明の他の好ましい実施形態は、少なくとも一つのウイルス性疾患の予防及び／又は治療用薬剤調整法に関し、この薬剤はウイルス性疾患の場合ウイルス増殖を阻害し、以下の手続きからなる。（ａ）本発明の試験システムを実行し、且つ（ｂ）生理的有効量で投薬した一つ又は複数の同定活性成分を少なくとも一つの補助及び／又は追加物質及び同定生薬製剤と反応する。
【００３９】
好ましくは本発明の活性成分は、薬剤に関する技術の熟知者には既知の方法及び補助及び／又は追加物質を用いて生物体中に局所又は全身投与するよう調合する。
【００４０】
例えば薬剤又は診断用試薬の安定化や保存に役立つ適切な補助及び追加物質は、この技術の熟知者には良く知られている（例えばスッカー、エッチ（Ｓｕｃｋｅｒ  Ｈ．）、（１９９１年）、薬学テクノロジー（Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）、第２版、ゲオルグティーメ社（Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）、シュトゥットガルトを参照）。この補助及び／又は追加物質の例としては、生理食塩水、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖、リンゲル乳酸糖、脱塩水、安定剤、抗酸化剤、複合体形成剤、抗菌性化合物、プロティナーゼ阻害剤及び／又は不活性ガスがある。
【００４１】
局所投与により、例えば経鼻的に又は経気的に皮膚や粘膜上に投与し、体腔、臓器、関節或いは結合組織に導入する。全身投与により好ましくは血液循環、腹膜腔又は腹腔へ導入する。
【００４２】
本発明による活性成分の薬剤調合は、活性成分のタイプ及び投与法に依存し、例えば溶液、懸濁液、軟膏、粉末、噴霧又は他の吸入調合がある。好ましくは技術の熟知者にはよく知られた方法で、ヌクレオチド配列をウイルスベクター又はプラスミドに挿入し、且つ細胞形質移入用の補助物質と反応する。例えばカチオンポリマー或いはカチオン性脂質がこれら補助物質に属する。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＤＮＡ分解酵素又はＲＮＡ分解酵素による酵素分解から保護するため技術の熟知者には精通している方法で誘導化する。
【００４３】
本発明の活性成分は塩、エステル、アミドの形又は事前段階として存在でき、好ましくは患者に過剰毒性、刺激或いはアレルギー反応を起こさない改良のみを活性物質に用いる。
【００４４】
活性成分は応用に依存するが、減菌状態で生理的に容認された担体物質及び見込みのある保存剤、緩衝液又は推進試薬と混合する。技術の熟知者は薬物調合用のこのような担体物質に精通している。
【００４５】
好ましくは本発明の活性成分は一回限りで、特に好ましくは数回に分けて投与し、且つ各用量はヒトへの各活性成分の最大耐用量（ＭＴＤ）を越えない。好ましくは用量がＭＴＤの半分であるように選ぶ。一日量を一日に一度に、又は一日に何回かに分けて、好ましくはほぼ同じ時間間隔で投与する。
【００４６】
本発明によると投与は局所的か又は全身的に、一日に又は数日間に亘って毎日か、又は数週間に渡り二日又は三日目ごとに、治療効果が明らかになるまで行う。
【実施例１】
【００４７】
抗ウイルス活性成分の同定用試験システム
【００４８】
ヒト肺上皮細胞Ａ５４９、イヌ腎臓上皮細胞ＭＤＣＫ及びサル脂肪ベロのレトロウイルス形質導入により、ＩＫＫの優性阻害形（ＩＫＫ  ＫＤ）か又はＮＦ−ｋＢ阻害剤の優性妨害変異形、ｍＩｋＢのいずれかを安定に発現する細胞株を作成した。更にＩＫＫの活性形（ＩＫＫ  ＥＥ）を発現する対応株を作成した。細胞のＮＦ−ｋＢ仲介遺伝子発現に関する構成物更にはその効率については既に記載されている（デンク（Ｄｅｎｋ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７６巻、２８４５１−２８４５３頁、２００１年）。
【００４９】
安定な細胞株作成にはＩＫＫ  ＫＤ、ｍＩｋＢ及びＩＫＫ  ＥＥ用の各相補ＤＮＡをレトロウイルス発現ベクターｐＣＦＧ５  ＩＥＧＺに順方向でクローンした（カス（Ｋｕｓｓ）等、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・インミュノロジー （Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２９巻、３０７７−３０８８頁、１９９９年）。“関心遺伝子”のメッセンジャーＲＮＡの他に、ベクターＤＮＡをタンパク質合成時に内部リボソーム結合部位により発現する“緑色蛍光タンパク質”（ＧＦＰ）のメッセンジャーＲＮＡにコード化する。これにより安定形質導入細胞を流動細胞計測法で同定できる。更にこのベクターは抗生物質ゼオシンに対する耐性を調節する。種々の発現構成物及び空ベクターをリン酸カルシウム沈殿法によりウイルス生成細胞株ΦＮＸ（グリグナーニ（Ｇｒｉｇｎａｎｉ）等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、５８巻、１４−１９頁、１９９８年）に形質移入した（デンク（Ｄｅｎｋ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７６巻、２８４５１−２８４５８頁、２００１年）。形質移入効率を２４時間後ＧＦＰ発現法によって調べ、ほぼ７０−８０％程度であった。それから細胞を培地で約２週間ゼオシン１ｍｇ／ｍｌを用いて選択した。
【００５０】
種々の対象細胞（Ａ５４９、ＭＤＣＫ、ベロ）の組み替えウイルスによる感染に関しては、ウイルス生成細胞株のレトロウイルス含有培地上澄み液を濾過し、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）  (シグマ社（Ｓｉｇｍａ）)５μｇ／ｍｌと反応し新鮮な細胞上に加えた。２日続けてそれぞれ３時間２回遠心分離（１，０００ｇ）する間に感染した。培地上澄み液でゼオシン４００―６００μｇ／ｍｌを用いて、更に、２週間感染後２４時間で安定形質移入細胞を選択した。安定細胞株生成を実施した後、後者と同様に野生型インフルエンザＡウイルスを以下に記載するように感染し、且つベクターＩＫＫ  ＫＤ、ｍＩｋＢ及びＩＫＫ  ＥＥを安定に有する細胞のウイルス力価を決定し野生型細胞上澄み液の力価と比較した。
【００５１】
同時にＭＤＣＫ細胞を標準法（ルドウイッヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７６巻、１０９９０−１０９９８頁、２００１年）により形質移入試薬リポフェクタミン（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて同じ構成物で一時的に形質移入した。形質移入効率は６０％以上であった。形質移入後２４時間で安定株と同様に、感染効率１（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１）のインフルエンザＡウイルス株家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）により感染した。感染後更に２４時間で、細胞培地上澄み液の新規生成ウイルスの力価をＭＤＣＫ細胞用の標準プラーク分析により調べた。ここで又空ベクターかＩＫＫ  ＫＤ、ｍＩｋＢ及びＩＫＫ  ＥＥ発現構成物のいずれかで形質移入したインフルエンザＡウイルス感染細胞のウイルス力価を比較した。
【００５２】
以下の結果が得られた。空ベクターか又はＩＫＫ  ＫＤか又はｍＩｋＢ発現構成物のいずれかで前もって形質移入したインフルエンザＡ感染ＭＤＣＫ細胞のウイルス力価を比較すると、ＩＫＫ  ＫＤかｍＩｋＢ発現細胞ではウイルス増殖は２４時間後には５０乃至７０％阻害される事が示された。これに対しＩＫＫの活性形発現細胞ＩＫＫ  ＥＥでは、ウイルス増殖の増加が見られた。これらの結果は幾つかの独立バッチで再現できた。相当する結果が又ＩＫＫ  ＫＤ、ｍＩｋＢ、又はＩＫＫ  ＥＥ発現の安定なＡ５４９、ＭＤＣＫ及びベロ細胞株でも得られ、且つ最大効果が安定形質移入のＡ５４９細胞で見られた。ここにＩＫＫ  ＫＤ又はｍＩｋＢによるＮＦ−ｋＢ活性化阻害によりウイルス力価を１０分の１まで低下する一方、ＩＫＫ  ＥＥの安定発現による信号経路の常時活性化によりウイルス収率は１０倍まで増加した。これらの知見によりＩＫＫ及びＮＦ−ｋＢ活性化がインフルエンザウイルス増殖には不可欠であり且つＩＫＫ／ＮＦ−ｋＢ信号構成要素の特異的阻害によりウイルス生成の大幅な減少をもたらす事が判る。
【実施例２】
【００５３】
ウイルスＮＦ−ｋＢ活性化阻害と体外でのインフルエンザウイルスの削減
【００５４】
２．１  アセチルサルチル酸（ＡＳＡ）
【００５５】
ＡＳＡやスルファサラジンの様なサルチル酸塩は、痛み軽減剤及び炎症薬として広く臨床的に使用されている。最近の出版物によるとこれら物質はＩＫＫの直接的で有効な阻害剤であり（イン（Ｙｉｎ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９６巻、７７−８０頁、１９９８年、ウエバー（Ｗｅｂｅｒ）等、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１１９巻、１２０９−１２１８頁、２０００年）且つ体外でインフルエンザウイルス増殖を阻害できる（フアン及びディーシュ（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｅｔｓｃｈ）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、３１９巻、７９７頁、１９８８年）ことが示された。従ってＡＳＡを正の対照として用いた。肺上皮細胞Ａ５４９をＡＳＡ濃度０．０１ｍＭ乃至５ｍＭの範囲で増加しながら処理した。全実験において、培地でのこれら濃度はそのままであった。処理１時間後に感染効率１（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１）のインフルエンザＡウイルス株家禽プラークウイルス（ＦＰＶ）により感染させた。感染後更に２４時間で、細胞培地上澄み液の新規生成ウイルスの力価をＭＤＣＫ細胞用標準プラーク分析で調べた。
【００５６】
第二バッチでＭＤＣＫ細胞を感染前１時間又は感染後２時間及び４時間にＡＳＡ５ｍＭで処理した。新規生成ウイルスの感染及び検出を上記の様に行った。
【００５７】
以下の結果が得られた。ＡＳＡ未処理細胞とＡＳＡ処理細胞の滴下注入後２４時間でのＡ５４９培養物上澄み液の力価を比較すると、５ｍＭでのみ明白になり、且つ１００倍となるウイルス増殖の濃度依存性阻害が見られた。５ｍＭＡＳＡの対応阻害効果（１００倍以上）が、又感染ＭＤＣＫ細胞でも観察され、且つ感染後４時間でＡＳＡ添加によりウイルス力価は１０分の１に減少した。
【００５８】
２．２  ピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）
【００５９】
ピロリジンジチカルバメート（ＰＤＴＣ）の様な抗酸化剤はＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤として十分に知られている（調査はピート（Ｐｉｅｔｔｅ）等、バイオロジカル・ケミストリー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、３７８巻、１２３７−１２４５頁、１９９７年、に見いだされる）。それ故この物質類が又インフルエンザウイルス増殖を阻害するかどうかを調べた。Ａ５４９細胞を感染前１時間にＰＤＴＣ濃度３−２４ミクロモルで処理した。全実験でのＰＤＴＣ存在又は不在下にＡＳＡに関して記載したように滴下注入後２４時間での新規生成ウイルスの感染と検出を行った。
【００６０】
以下の結果が得られた。ＰＤＴＣ処理も又Ａ５４９細胞でのウイルス力価の濃度依存性阻害をもたらし、最大使用濃度２４ミクロモルの投与で約１０分の１まで低下した。これらデータによりＩＫＫ及びＮＦ−ｋＢ阻害剤ＡＳＡ及びＰＤＴＣは、ＮＦ−ｋＢ信号構成要素の優性阻害突然変異体の効果と類似して、細胞培養物でのインフルエンザウイルス増殖に大なる阻害効果を持つ事が示された。
【実施例３】
【００６１】
マウスのインフルエンザ感染へのＡＳＡの効果
【００６２】
３．１  腹腔内／非経口投与
【００６３】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスをインフルエンザウイルス（家禽プラークウイルス、ＦＰＶ）５，０００ｐｆｕ/２０μｌで経鼻的に感染した。感染前３０分にＡＳＡ（５０ｍＭ＝９ｍｇ／ｍｌリン酸緩衝食塩水、シグマーアルドリッチスタインハイム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ））５００μｌで腹腔内に注射し、ＡＳＡ（５０ｍＭ＝９ｍｇ／ｍｌ）を飲料水に継続的に投与した。対照目的でリン酸緩衝食塩水を注射又は投与した。体重、死亡率及び生存時間を決定した。１グループ当たり３０匹のマウスを処理した。
【００６４】
以下の結果が得られた。対照グループの全動物は、インフルエンザで死亡する一方、ＡＳＡグループでは約２０％の動物が感染で生き残った。更に死亡した動物の平均生存時間は、対照グループより明らかに長かった。しかし５０ｍＭ濃度の投与では毒性用量のため体重が明白に減少した。
【００６５】
３．２  経気的投与
【００６６】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスをインフルエンザウイルス（家禽プラークウイルス、ＦＰＶ）をそれぞれ５，０００pfu／２０μｌ及び１０，０００ｐｆｕμｌで経鼻的に感染した。処理日ゼロで感染後３０分に麻酔薬（ケタミン／ロンプン３００μｌの腹腔内注射、セーラムベルクベルンブルグ、（Ｓｅｒｕｍ  Ｗｅｒｋ  Ｂｅｒｎｂｕｒｇ）,バイエル社（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）、レーバークーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ））を用いてマウスの気管に導入し、噴霧器（ユーゴザッハエレクトロニクーハーバードアパラタス社（Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐ. ＧｍｂＨ）、マルヒーフグステッテン（Ｍａｒｃｈ−Ｈｕｇｓｔｅｔｔｅｎ））を用いてＡＳＡ（シグマーアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、スタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ））２ｍＭ（＝０．３６ｍｇ／ｍｌリン酸緩衝食塩水）、１０ｍＭ、２０ｍＭ又は５０ｍＭからなるエアロゾル（６００μｌ投与）か又は対照目的でリン酸緩衝食塩水を単独で投与した。試験物質のこの経気的投与を幾つかのグループでは１日，２日、３日目又は１日，２日，５日及び６日目に繰り返した。他のグループでは感染後ＡＳＡ処置を３日、４日、５日、６日目に行った。グループ当たり５―６匹の動物を処置した。体重、死亡率及び生存時間を決定した。他の実験では１日目のＡＳＡ処置後、動物は３日目に死亡し且つ肺組織のウイルス濃度を決定した。
【００６７】
以下の結果が得られた。より少量のＡＳＡ投与量の方がより多量の投与より明らかに肺でのウイルスは減少した。ＡＳＡは２０ｍＭから有毒であった（体重の減少）。対照グループの全動物は、インフルエンザで死亡する一方、ＡＳＡの低非毒性投与量（２ｍＭ）での処置グループでは約４０％が感染で生存した。更にＡＳＡ処置後の死亡動物の平均生存時間は対照グループより明らかに長かった。
【００６８】
実施例３．１及び３．２による体内実験結果によるとＡＳＡの一日の一回又は多数回（３回まで）の低非毒性用量での経気投与、即ち０．１ｍｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇ体重、特に１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、例えば３０ｍｇ／ｋｇであると、インフルエンザウイルスの経鼻投与により起きる致死的疾患に対し顕著な治療効果をもたらす事が示された。その処方は経気投与する薬剤組成がＡＳＡ濃度２ｍＭ以下、好ましくは０．０１ｍＭ乃至１．９９ｍＭ、最も好ましくは０．１ｍＭ又は０．５ｍＭ乃至１．５ｍＭ、例えば１ｍＭからなるように選ばねばならない。エアロゾルの液相量は上記の一日用量により液相での使用濃度を考慮して計算し且つ求めねばならない。後者は例えば確定量の溶液をエアロゾルとして噴霧する従来の噴霧器を用いて得られる。
【国際調査報告】
2006517204.tif 000002
2006517204.tif 000003
2006517204.tif 000004
2006517204.tif 000005
2006517204.tif 000006
2006517204.tif 000007
2006517204.tif 000008
2006517204.tif 000009
2006517204.tif 000010
2006517204.tif 000011
2006517204.tif 000012
2006517204.tif 000013
2006517204.tif 000014
2006517204.tif 000015