(57)【要約】本発明は、化学走性又は化学侵襲性をモニタリングするための装置を開示する。本発明はさらに、生物学的相互作用及び生体系を試験するのに使用することができるフレキシブルなアッセイ・システム及び多数のアッセイを提供する。in vivoで存在する勾配状況を模倣する層流勾配が採用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学走性又は化学侵襲性をモニタリングする方法であって、
ハウジングを含む装置であって、該ハウジング中にある複数のチャンバのそれぞれが
1つ以上の第1ウェルを含む第1ウェル領域と；
1つ以上の第2ウェルを含む第2ウェル領域と；
該第1ウェル領域と該第2ウェル領域とを互いに接続する1つ以上のチャネルを含むチャネル領域と
を含み、該ハウジングが該複数のチャンバを画定している、前記装置を準備し；
該1つ以上の第1ウェル又は該1つ以上のチャネル内に1つ以上の可溶性試験物質を導入し；
該チャンバの長手方向軸に沿って動的溶液濃度勾配を形成し；
該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入し；そして
該細胞の化学走性又は化学侵襲性をモニタリングすること
を含むことを特徴とする、化学走性又は化学侵襲性をモニタリングする方法。
【請求項２】
該1つ以上のチャネルがゲル・マトリックスを含有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
動的溶液濃度勾配の形成が：
該複数のチャンバのうちの1つ以上のチャンバ内に、第1物質の第1濃度を有する第1流体流を導入し；そして
該複数のチャンバのうちの1つ以上のチャンバ内に、第2物質の第2濃度を有する第2流体流を導入すること
を含み、ここで、該第1濃度と該第2濃度とが互いに異なる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該第1物質と該第2物質とが同じである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
該第1物質と該第2物質とが異なる、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
該第1流体流と該第2流体流とが合流して、該複数のチャンバのうちの1つ以上と流体連通する単一の第3流体流となり、該第3流体流が該第1及び第2物質の濃度勾配を含み、該濃度勾配が、該第3流体流の流動方向に対して実質的に垂直である、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
該第1流体流と該第2流体流とが合流して単一の第3流体流となり、該第3流体流が次いで分岐して、別個の第4、第5及び第6流体流になり、該第4、第5及び第6流体流が次いで再び合流して単一の第7流体流となり、該単一の第7流体流は、実質的に層流の条件下で、該複数のチャンバのうちの1つ以上と流体連通する、請求項3に記載の方法。
【請求項８】
該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入することが、該チャンバの長手方向軸に沿って、該1つ以上のチャネル上に細胞をパターン化することを含み、そして、該1つ以上の第1ウェル又は該1つ以上のチャネル内に可溶性試験物質を導入することが、層流によって、該1つ以上のチャネル内に可溶性試験物質を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入することが、該1つ以上のチャネル内に単一の細胞型を配置することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入することが、該1つ以上のチャネル内に複数の細胞型の混合物を配置することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
該1つ以上のチャネルが複数のチャネルであり、そして該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、異なる細胞型を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
該複数のチャネルのそれぞれに異なる細胞型を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに異なる細胞型を異なる濃度で導入することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
該複数のチャネルのそれぞれに異なる細胞型を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに異なる細胞型を同じ濃度で導入することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
該1つ以上のチャネルが複数のチャネルであり、そして該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに単一の細胞型を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
該複数のチャネルのそれぞれに単一の細胞型を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに該単一の細胞型を異なる濃度で導入することを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該複数のチャネルのそれぞれに単一の細胞型を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに該単一の細胞型を同じ濃度で導入することを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
該1つ以上のチャネルが複数のチャネルであり、そして該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に細胞を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、細胞の混合物を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
該複数のチャネルのそれぞれに該細胞混合物を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、同じ細胞混合物又は異なる細胞混合物を導入することを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
該1つ以上のチャネルが複数のチャネルであり、該1つ以上の可溶性試験物質が複数の試験物質であり、そして該1つ以上の第1ウェル又は該1つ以上のチャネル内に該1つ以上の可溶性試験物質を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、該複数の試験物質の異なる物質を導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
該複数のチャネルのそれぞれに、該複数の試験物質の異なる物質を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、該複数の試験物質の異なる物質を異なる濃度で導入することを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
該複数のチャネルのそれぞれに、該複数の試験物質の異なる物質を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、該複数の試験物質の異なる物質を同じ濃度で導入することを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
該1つ以上のチャネルが複数のチャネルであり、該1つ以上の可溶性試験物質が複数の同じ可溶性試験物質であり、そして該1つ以上の第1ウェル又は該1つ以上のチャネル内に該1つ以上の可溶性試験物質を導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに、該複数の同じ試験物質の1つを導入することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
該複数のチャネルのそれぞれに該複数の同じ可溶性試験物質の1つを導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに該複数の同じ可溶性試験物質の1つを異なる濃度で導入することを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
該複数のチャネルのそれぞれに該複数の同じ可溶性試験物質の1つを導入することが、該複数のチャネルのそれぞれに該複数の同じ可溶性試験物質の1つを同じ濃度で導入することを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
該ハウジングが支持部材と上部部材とを含み、該上部部材は、該支持部材と実質的に流体密に共形接触するように配置されることにより、該支持部材に取り付けられている、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2002年10月22日付けで出願された米国仮出願第60/419,980号及び同第60/419,976号の優先権を主張する。これらの内容を参考のため本明細書中に引用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は総体的に、化学走性及び/又は化学侵襲性をモニタリングするための装置に関する。本発明はまた総体的に、ミクロ流体システム内に形成された勾配中で実施される生物学的アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞遊走に使用されるような試験装置がよく知られている。このような装置は、例えば米国特許第6,329,164号明細書、同第6,238,874号明細書及び同第5,302,515号明細書に開示されている。
【０００４】
細胞遊走に関与する3つのプロセスが、化学走性、走触性及び化学侵襲性である。化学走性は、可溶性化学走性刺激の濃度勾配によって誘発される細胞の運動として定義されている。走触性は、基質に結合された刺激の濃度勾配に応答する細胞の運動として定義されている。化学侵襲性は、バリア又はゲル・マトリックス内への細胞の運動、及び/又はバリア又はゲル・マトリックスを通る細胞の運動として定義されている。細胞遊走、及びこのような挙動に対する外部刺激の効果に関する調査は、現代の生物学的研究の中で広く行われている。一般にこの研究は、細胞を外部刺激に露出し、細胞の反応を調査することに関与する。生きている細胞を種々の環境中に置き、これを異なる外部刺激に露出することにより、細胞の内部の働きと、細胞に対する外部刺激の効果との両方を測定し、記録し、そしてよりよく理解することができる。
【０００５】
化学的刺激に応答する細胞遊走は、種々の疾患のプロセスを理解し、従ってこれらの疾患の治療薬候補を開発して評価するために考察すべき特に重要な事項である。化学的刺激、例えば治療薬に応答した細胞又は細胞群の遊走を記録することにより、化学的刺激の効果をよりよく理解することができる。典型的に、種々の医学分野における疾患プロセスの研究、例えば癌研究、免疫学、血管形成、創傷治療、及び神経生物学は、生きている細胞の化学走性及び化学侵襲性の分析を含む。例えば、癌研究の分野では、細胞遊走は、転移のプロセスを理解する上で重要な考察事項である。転移中、典型的な固形腫瘍の癌細胞は、隣接細胞との付着を緩め、起源の組織から逃れ、血管又はリンパ管に達するまで他の組織の細胞外マトリックスを分解することによってこれらの組織を侵襲し、管の基底層及び内皮内層を横切ることにより、循環に入り、体内の他の場所で循環から出て、そしてこれらの細胞が最終的に存在する新しい環境内で生き残り、増殖しなければならない。従って、癌細胞遊走の研究は、転移プロセスを理解し、そしてこのプロセスを潜在的に阻害する治療薬を開発する上で助けになり得る。炎症性疾患分野では、細胞遊走は、また炎症応答を理解する上で重要な考察事項である。炎症応答中、白血球は損傷組織部位に遊走し、そして感染と戦い又は創傷を治すのを支援する。白血球は毛細血管を通って遊走し、毛細血管の内側を覆う内皮細胞に付着する。次いで白血球は内皮細胞間を押し進み、消化酵素を使用することにより、基底層を横切って這い進む。したがって、内皮細胞を横切って遊走し、そして基底層を侵襲する白血球を研究することは、炎症プロセスを理解し、炎症性疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、リウマチ様関節炎、及び炎症性皮膚疾患におけるこのプロセスを阻害する治療薬を開発する上での助けとなり得る。細胞遊走はまた血管新生分野における重要な考察事項である。既存の小さな血管から毛細血管が発芽すると、内皮細胞は最初、新しい毛細血管分岐を発生させながら既存の小血管の壁から延び、仮足が毛細血管芽の成長を周囲の結合組織内に案内する。これらの毛細血管の新しい成長は、癌の成長が拡大して広がることを可能にし、例えば糖尿病に伴うおそれのある失明に寄与する。逆に、毛細血管生成の欠乏は、例えば心臓発作後の心筋内の組織死に寄与することがある。したがって、新しい毛細血管が既存の毛細血管から形成されるのに伴う内皮細胞の遊走を研究することは、血管新生を理解し、血管成長をブロックするか又は血管機能を改善する薬物を最適化する上での助けとなり得る。加えて、細胞遊走の研究は、組織再生、臓器移植、自己免疫疾患、並びにその他の多くの変性疾患及び状態のプロセスへの洞察を可能にすることもできる。
【０００６】
これらのタイプの研究を行う際には、細胞遊走アッセイがしばしば用いられる。このようなアッセイを形成するための商業的に入手可能な装置は、トランスウェル・システム(上側区画と下側区画とを形成するために薄い多孔質膜によって仕切られた容器)に基づくか、又はこれを採用することがある。細胞の化学走性を研究するために、細胞を上側区画に置き、そして遊走性刺激物質を下側区画におく。十分なインキュベーション時間後、細胞を固定し、染色し、そしてカウントすることにより、膜を横切る細胞化学走性に対する刺激の効果を研究する。
【０００７】
化学侵襲性を研究するためには、MATRIGEL(登録商標)マトリックスの均一層を膜にかぶせることにより、膜の孔を塞ぐ。上側区画内のMATRIGEL(登録商標)マトリックス上に細胞を播き、そして化学誘引物質を下側区画内に置く。侵襲性細胞はマトリックスに付着し、侵襲して、多孔質膜を通過する。非侵襲性細胞は、塞がれた孔を通して遊走することはない。十分なインキュベーション時間後、細胞を固定し、染色し、そしてカウントすることにより、膜を横切る細胞の侵襲に対する刺激の効果を研究する。
【０００８】
トランスウェルの使用はいくつかの欠点を有している。トランスウェルを採用するアッセイは、ハイスループットスクリーニング及びプロセッシングに容易には適合できない手間のかかるプロトコルを必要とする。トランスウェル・システムの構造により、既存のロボット式液体取扱いシステム及び自動画像取得システムを一体化することは難しい。したがって、スクリーニング及び処理、例えば細胞のカウントのほとんどは手によって行われ、この作業は時間がかかり、単調で高価なプロセスである。細胞のカウントはまた主観的であり、しばしば統計的概算を伴う。具体的には、フィルター全体を調べるのに伴う時間と費用とにより、ランダムに選択された代表領域しかカウントされないことがある。さらに、これらの領域がカウントされても、フィルターを通って部分的にだけ遊走した細胞を考慮に入れる場合には、技術者自身が判断を下さなければならない。
【０００９】
トランスウェルに基づくアッセイは、トランスウェル・システムにおいて利用される薄膜によって課せられる内在的制限を有する。膜の厚さは50〜30ミクロン(μm)にすぎず、膜を横切って形成される化学濃度勾配は一時的なものであり、短時間しか継続しない。細胞化学走性アッセイが、化学走性勾配が長い距離(>100〜200μm)にわたって生成され、しかも2時間以上にわたって安定であることを必要とする場合、現在利用可能なトランスウェル・アッセイは満足のいく実施をすることはできない。
【００１０】
上記にかからわず、おそらくトランスウェルの最も顕著な欠点は、化学走性及び化学侵略性がリアルタイムで観察されないことである。特に、化学走性発生中の細胞形態の変化を、トランスウェルを用いた場合にはリアルタイムで観察することができない。トランスウェルの場合、細胞が観察のために必要となるスライドに固定されると、これらの細胞は殺されてしまう。その結果、一旦細胞が観察されると、この細胞はもはやアッセイには再導入されず、或いは続いて行われる試験薬に対する露出の時間に研究されることはない。したがって、試験薬に応答した細胞の進行及び細胞の形態の変化を研究するためには、試験薬の導入前及び導入後の種々の時間に観察する予定のサンプルについて同時に実施することが必要である。それぞれの試験に複数の試料が必要となることに照らして、信頼性の高いデータを得るのに必要な陽性及び陰性の対照に加えて、単一の化学走性アッセイが何ダースものフィルターを必要とすることがある。フィルターのそれぞれは個々に検査されてカウントされる必要があり、これは煩わしい、時間のかかる作業である。
【００１１】
最近、化学走性及び化学侵襲性を測定するための装置が入手可能になった。これらの装置は、2つのウェルが互いに水平方向にずらされている構成を採用している。装置のこのような構成は、1977年にSally Zigmondによって導入され(以後これを「Zigmond装置」と呼ぶ)、幅4mm及び深さ1mmの2つの溝を備えた25ミリメートル(mm) x 75mmのスライドガラスから成っており、これらの溝は1mmのブリッジによって分離されている。溝の一方には誘引物質を満たし、他方の溝には対照溶液を満たし、こうしてブリッジを横切って濃度勾配を形成する。そして細胞を他方の溝に加える。ピンクランプを受容するために、スライドの各端部には2つの孔が設けられている。クランプは細胞のインキュベーション中及び観察中には、カバー・ガラスを所定の位置に保持する。Zigmondチャンバのサイズ及び構成により、このチャンバは、既存のロボット式液体取扱いシステム及び自動画像取得システムとの一体化を可能にはしない。さらに、トランスウェルに基づくシステムと同様に、化学走性発生中の細胞形態の変化は、Zigmondチャンバを用いた場合にはリアルタイムで観察することはできない。それというのも、細胞が観察のためにスライドに固定されるからである。加えて、ピンクランプはアレンレンチで組み立てなければならず、従って装置はアッセイ実施前に特別な取扱い、位置決め及び整合を必要とする。スライドガラス上のカバーガラスのこのような取扱い及び位置決め、並びにカバー・ガラスの剛性は、ブリッジ上の表面処理を潜在的に損傷するか、又はこれを妨害するおそれがある。
【００１２】
リアルタイム観察が行われないという問題を解決しようとする化学走性装置が、「Dunnチャンバ」である。Dunnチャンバは、中央の円形シンクと同軸的な環状溝とを備えた、特別に構成されたミクロスライドから成っている。Dunnチャンバを使用するアッセイでは、細胞は、Dunnチャンバ上に逆さにして置かれたカバーガラス上で、化学走性刺激に向かって遊走する。細胞は、画像取込みボードを備えたコンピュータに接続されたビデオカメラを備えた位相差顕微鏡を使用して、一晩にわたって監視される。
【００１３】
カバーガラスが剛性であり、また既存のロボット式液体取扱いシステムに一体化されないという問題点に加えて、Dunnチャンバ・アッセイに伴う主要な問題点は、極めて少数の細胞(典型的には10個)しかモニタリングされないことである。この極めて少数のサンプルの平均挙動は、個体群全体としては典型的なものではない。第2の主要な問題は、複製が極めて限定されることである。各対照チャンバ及び各処理チャンバを、それぞれがカメラ及びコンピュータを同様に備えた別個の顕微鏡で見なければならない。
【００１４】
当業者に知られた別の化学走性装置が、米国特許第6,238,874号明細書(Jarnigan他)('874特許)に開示されている。'874特許は、化学走性をモニタリングするのに使用することができる試験装置の種々の実施態様を開示する。しかし、Jarnigan他の装置は、シール、組立て、剥離、及び分解が容易にはできないので不都合である。したがって、組立て中に化学的又は生物学的に調製される表面を維持することは難しい。したがって'874特許の試験装置は単回使用により適している。また細胞に損傷を与えずに、又は細胞位置を妨げずに、分解しそして細胞を捕集するのは難しい。
【００１５】
従来技術は、組立て及び分解が容易な試験装置、例えば化学走性及び/又は化学侵襲性をモニタリングするための装置を提供することに失敗している。加えて従来技術は、化学走性/化学侵襲性に対する化学誘引物質、化学忌避物質及び化学刺激物質の効果を測定することに限定されない、細胞遊走をモニタリングするための試験装置を提供することに失敗している。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明は、化学走性又は化学侵襲性をモニタリングする方法であって、ハウジングを含む装置であって、該ハウジング中にある複数のチャンバのそれぞれが1つ以上の第1ウェルを含む第1ウェル領域と、1つ以上の第2ウェルを含む第2ウェル領域と、該第1ウェル領域と該第2ウェル領域とを互いに接続する1つ以上のチャネルを含むチャネル領域とを含み、該ハウジングが該複数のチャンバを画定している、上記装置を準備することを含む方法を提供する。この方法はさらに、該1つ以上の第1ウェル又は該1つ以上のチャネル内に1つ以上の可溶性試験物質を導入し、そして該チャンバの長手方向軸に沿って動的溶液濃度勾配を形成することを含む。この方法はさらに、該1つ以上の第2ウェル又は該1つ以上のチャネル内に、細胞を含む第1試料を導入し、そして該細胞の化学走性又は化学侵襲性をモニタリングすることを含む。
【００１７】
本発明は、上述の実施態様のチャネル内にゲル・マトリックスを任意に含むことを可能にする。
【００１８】
実施態様の詳細な説明
図1Aに示すように、本発明の1の実施態様によれば、化学走性/化学侵襲性をモニタリングするための装置10が、ハウジング10aを含む。ハウジング10aは支持部材16と上部部材11とを含み、上部部材11は、支持部材16と実質的に流体密に共形接触するように配置されることにより、支持部材16に取り付けられている。本発明の関連において、「共形接触」は、実質的に形状が適合した、実質には流体密な接触を意味する。支持部材16及び上部部材11は、これらが一緒に図示のように不連続的なチャンバ12を画定するように構成されている。図1Bの実施態様に一例として示すように、好ましくは化学走性/化学侵襲性装置10は、複数の不連続的なチャンバを含む。不連続的なチャンバ12は、1つ以上の第1ウェル13を含む第1ウェル領域13aと、1つ以上の第2ウェル14を含む第2ウェル領域14aとを含む。第2ウェル領域はさらに、装置の試験配向において、第1ウェル領域に対して水平方向にずらされている。装置の「試験配向」は、試験中の装置の空間的配向を意味する。図1Cに示すように、装置10はさらに、第1ウェル領域13aと第2ウェル領域14aとを互いに接続する1つ以上のチャネル15を含むチャネル領域15aを含む。図1A〜2Cの実施態様の場合、それぞれのウェル領域は単一のウェルを含み、チャネル領域は単一のチャネルを含む。図1Cに示すようにそれぞれのウェルは、ウェル13及びウェル14にそれぞれ対応する、上部部材11に設けられた貫通孔と、支持部材16の上面Uとによって画定されている。具体的には、各ウェル13及び14の側面は、上部部材11の貫通孔の壁によって画定されており、ウェル13及び14の底部は支持部材16の上面Uによって画定されている。なお、本発明に関しては「上部(頂)」「底」「上」及び「側方」は、装置の試験配向に対して定義される。図1A及び1Cにまとめて示すように、チャネル領域15aの長さLは、チャネル領域15aの長手方向軸方向において定義され、チャネル領域15aの深さDは、支持部材16の上面Uに対して法線方向において定義され、幅Wは、チャネル領域15aの長さL及び深さDに対して法線方向において定義される。本発明の1の実施態様によれば、チャンバの第1ウェル13は、化学走性又は化学侵襲性に潜在的に影響を与える可溶性試験物質及び/又は固定化された試験生体分子である試験薬を受容するように適合されている。生体分子の一例としては、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、炭水化物、細胞、化学物質、生化学物質、及び小分子が挙げられる。チャンバの第2ウェル14は、細胞生体試料を受容するように適合されている。固定化された生体分子は、支持部材16を取り囲む環境中に存在する引力、例えば溶媒和力及び乱流力よりも強い引力で支持部材16に引き付けられる生体分子である。試験薬の一例としては、化学忌避物質、化学走性阻害物質、及び化学誘引物質、例えば成長因子、サイトカイン、ケモカイン、栄養素、小分子及びペプチドが挙げられる。或いは、チャンバの第1ウェル13は、細胞の生体試料を受容するように適合され、そしてチャンバの第2ウェル14は、試験薬を受容するように適合される。
【００１９】
本発明の1の実施態様の場合、試験薬として可溶性試験物質が使用され、チャネル領域15aは好ましくはゲル・マトリックスを含有する。ゲル・マトリックスは、溶質がより高濃度の領域(ウェル領域13a)から半透過性マトリックス(ゲル・マトリックス)を通してより低濃度(ウェル領域14a)に拡散するにつれて、第1ウェル領域13aから第2ウェル領域14aに向かって溶液濃度勾配の形成を可能にする。可溶性試験物質が化学誘引物質を含む場合、細胞がマトリックスを通って溶液濃度勾配の方向にウェル領域13aに向かって遊走するように、細胞は、酵素、例えばマトリックス・メタロプロテアーゼを放出することにより、このマトリックスを分解しなければならない。続いてこの細胞の化学走性及び化学侵襲性を観察し、測定し、そして記録することができる。
【００２０】
試験薬として固定化生体分子を利用する本発明の1の実施態様の場合、生体分子は好ましくは、チャネル領域15aの下側、及びウェル領域13aの貫通孔の下側に位置する支持部材16の部分上に固定化又は結合される。生体分子濃度は、装置の長手方向軸に沿って、ウェル領域13aからウェル領域14aに向かって減少して、固定化生体分子の表面濃度勾配を形成し、そして細胞生体試料はこの表面勾配に対して潜在的に応答する。続いてこの細胞の走触性を観察し、測定し、そして記録することができる。
【００２１】
装置10の特定の仕様に関しては、上部部材11は、支持部材16との共形接触、好ましくは可逆的な共形接触をもたらすように適合された材料から形成される。本発明の実施態様によれば、特にこのような材料の柔軟性は、上部部材を支持部材16の上面Uに形状適合した状態で付着させることにより、支持部材16との実質的な流体密なシールを形成するのを可能にする。共形接触は好ましくは、支持部材表面上の上部部材のスリップを防止するのに十分に強力であるべきである。共形接触が可逆的な場合には、上部部材は、これが単純な剥離プロセスによって除去されるのを可能にするための構造完全性を有する材料から形成することができる。これにより、上部部材11が除去され、所定の位置にある細胞が捕集されるのが可能になる。剥離プロセスは、支持部材16のいかなる表面処理又は細胞位置も妨害しないことが好ましい。物理的な条痕、ポケット、SAM、ゲル、ペプチド、抗体、又は炭水化物を支持部材16上に配置することができ、続いて、これらの構造に損傷を与えることはなく、上部部材11を支持部材16に被せることができる。加えて、上部部材11と支持部材16との共形接触によって上部部材11と支持部材16との間にもたらされた実質的に流体密なシールは、流体が1つのチャンバから隣接チャンバに漏れるのを防止し、また、汚染物質がウェルに入るのも防止する。シール作用は外部圧を維持する必要なしに、事実上瞬時に発生することが好ましい。共形接触は、上部部材11と支持部材16との間をシールするためにシーリング剤を使用する必要性を排除する。本発明の実施態様はシーリング剤の使用を包含するが、好ましい実施態様に従ってシーリング剤の使用が防がれるという事実は、コストを削減して時間を節約する別の実施態様を提供し、そしてさらに、シーリング剤による各チャンバ12の汚染の危険性を排除する。好ましくは、上部部材11は、劣化することがなく、また複数の試験で使用されることによって容易に損傷されることがなく、しかも製造中に上部部材の構造にかなりの可変性をもたらす材料から形成される。より好ましくは、材料は、上部部材がフォトリソグラフィを用いて形成されるのを可能にするように選択することができる。好ましい実施態様において、材料はエラストマー、例えばシリコーン、天然又は合成ゴム、又はポリウレタンを含む。より好ましい実施態様の場合、材料はポリジメチルシロキサン(「PDMS」)である。
【００２２】
本発明の別の実施態様の場合、装置10は、チャンバを画定するハウジングを含み、チャンバは、1つ以上の第1ウェルを含む第1ウェル領域と；1つ以上の第2ウェルを含む第2ウェル領域と；第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに接続する複数のチャネルを含むチャネル領域とを含む。好ましくは、第2ウェル領域は、装置の試験配向において、第1ウェル領域に対して水平方向にずらされている。
【００２３】
本発明の方法の好ましい実施態様によれば、標準的なフォトリソグラフィ手順を用いることにより、上部部材11の任意の所望の構成のネガ像であるシリコン・マスターを形成することができる。例えば、チャンバ12の寸法、例えばウェル領域13a及び14aのサイズ、又はチャネル領域15aの長さを変更することにより、任意の有利な仕様に適合することができる。マスターの好適な構成を選択し、この構成に従ってマスターを製作したら、材料をマスター上にスピンキャスト、射出、又は注入し、そして硬化させる。型を形成したら、このプロセスは必要なだけ頻繁に繰り返すことができる。このプロセスは、上部部材の構成において高い柔軟性を提供するだけではなく、上部部材が大量に複製されることをも可能にする。本発明は、例えばe-ビームリソグラフィ、レーザーアシストエッチング、及び転写印刷を含む、装置10の種々異なる製造方法をも検討する。
【００２４】
装置10は好ましくは、工業用標準マイクロタイター・プレートのフットプリントに適合する。このようなものとして、装置10は好ましくは、工業用標準マイクロタイター・プレートと同じ外側寸法及びサイズ全体を有している。加えて、チャンバ12が複数のチャンバを含む場合、チャンバ12自体、又はそれぞれのチャンバ12のウェルは、工業用標準マイクロタイター・プレートのピッチと同じピッチを有していてよい。本明細書に使用される「ピッチ」という用語は、装置の試験配向において隣接するチャンバ又は隣接するウェルの間のそれぞれの鉛直方向中心線間の距離を意味する。図1Bに示された装置10の実施態様は、標準的な96ウェルプレートのフォーマットで構成された48個のチャンバを含み、それぞれのウェルは、プレートの各マクロウェルの空間に適合している。複数のチャンバ12のサイズ及び数は、標準的な24-、96-、384-、768-及び1536-ウェルマイクロタイター・プレートのフットプリントに対応することができる。例えば、96ウェルプレートの場合、装置10は48個のチャンバ12を含むことができ、したがって48の試験を行うことができ、また、384ウェルプレートの場合、装置10は192個のチャンバ12を含むことができ、したがって192の試験を行うことができる。本発明はまた、任意の好適な構成で配置された任意の他の数のチャンバ及び/又はウェルを検討する。例えばピッチ又はフットプリントの標準が変わり、或いは新しい用途が新しい寸法を要求する場合、これらの新しい寸法に見合うように装置10を容易に変化させることができる。標準マイクロタイター・プレートの正確な寸法及び仕様に一致させることにより、装置10の実施態様は、流体取扱い、保管、登録及び検出の既存のインフラ基盤に有利に適合することになる。したがって、装置10の実施態様は、ロボットによる流体取扱い及び自動的な検出及びデータ分析を可能にするので、ハイスループットスクリーニングを導くことができる。上部部材11は加えて、いくつかの異なる変更形及び実施態様を採用することができる。試験パラメーターに応じて、例えば化学走性又は化学侵襲性がモニタリングされることになっている場合には、細胞型、細胞数、又は化学走性又は化学侵襲性が必要とされる距離に応じて、上部部材11のチャンバ12は種々の実施態様を有することができる。これらのうちのいくつかを本明細書中で論じる。不連続的なチャンバ12に関しては、チャネル領域15aにおけるチャネルの形状、寸法、位置、表面処理及び数、並びにウェル13及び14の形状及び数が変化してよい。
【００２５】
チャネル領域15aの形状に関して、チャネル領域15aにおけるそれぞれのチャネル15は、その長手方向軸に対して垂直な平面内で見て、特定の断面形状に限定されることはない。例えば、任意の所与のチャネル15の断面は、六角形、円形、半円形、長円形、長方形、正方形、又はその他の任意の多角形又は湾曲形状であってよい。
【００２６】
チャネル15の寸法に関して、所与のチャネル15の長さLは、種々の試験パラメーターに応じて変化することができる。例えば、所与のチャネル15の長さLは、化学走性の発生が必要とされる距離に関連して変化することができる。例えば、所与のチャネル15の長さLの範囲を約3μm〜約18mmにすることにより、細胞が十分な距離を移動することが可能になり、ひいては、細胞の化学走性及び化学侵襲性を観察するのに十分な機会を提供することができる。所与のチャネル15の幅W及び深さDは、種々の試験パラメーターの関数として変化することもできる。例えば、所与のチャネル15の幅W及び深さDは、化学走性/化学侵襲性装置において、被験細胞のサイズ、及び所与のチャネル15にゲル・マトリックスが添加されるか否かに応じて変化してよい。一般に、所与のチャネル15の幅W及び深さDは、概ね被験細胞の直径の範囲内にあってよい。ランダムな細胞運動を低減するために、所与のチャネル15の幅W及び深さDの少なくとも一方は、所与のチャネル15内にゲル・マトリックスが配置されていない場合、細胞の直径よりも小さいことが望ましく、これにより、細胞はこれが活性化されると、所与のチャネルを「押し分けて」通り試験薬に向かうことができる。所与のチャネル15がゲル・マトリックスを含有する場合には、所与のチャネル15の深さD及び幅Wは、被験細胞の直径よりも大きくてよい。例えば図1A〜2Cの実施態様を参照すると、直径約3〜12μmの懸濁細胞、例えば白血球がウェル14内に存在し、チャネル15がゲルを含有しない場合、チャネル15の幅Wの範囲は約3〜約20μmであるべきであり、そしてチャネル15の深さDの範囲は約3〜約20μmであるべきであるが、しかし、チャネル15の深さD又は幅Wの少なくともいずれかは、細胞の直径よりも小さくあるべきである。白血球がウェル14内に存在し、そしてチャネル15がゲル・マトリックスを含有している場合、チャネル15の幅Wの範囲は約20〜約100μmであるべきであり、そしてチャネル15の深さDの範囲は約20〜約100μmであるべきであり、そして、チャネル15の幅W及び深さDの両方は、被験細胞の直径よりも大きくあることができる。同様に、粘着前の直径3〜10ミクロンの粘着細胞、例えば内皮細胞がウェル14内に存在し、そしてチャネル15がゲルを含有しない場合、チャネル15の幅W及び深さDの範囲は約3〜約20μmであることができるが、しかし、チャネル15の幅W又は深さDの少なくともいずれかは、被験細胞の直径よりも小さくあるべきである。粘着細胞がウェル14内に存在し、そしてチャネル15がゲル・マトリックスを含有している場合、チャネル15の幅W及び深さDの範囲は約20〜約200μmであるべきであり、そして、チャネル15の幅W及び深さDの両方は、被験細胞の直径よりも大きくてよい。
【００２７】
図2A〜2Cに見られるように、チャネル15はウェルの各側方で(図2A及び2C)、又はウェルの中心領域で(図2B)、第1ウェル13を第2ウェル14に接続することができる。
【００２８】
ウェル領域13a及び14aの間のチャネル領域15aにおけるチャネルの数は、変わることもできる。チャネル領域15aは、例えば図3A〜3Cに示すように、複数のチャネルを含むことができる。図3Aに見られるように、好ましい構成において、ウェル13とウェル14との間の各チャネル15i〜nの長さLは同一である。図3Bに見られるような別の実施態様において、チャネル領域15aの各チャネル15i〜15nの長さLは、チャンバ12の側方部分12aに設けられたチャネル15iから出発して、チャンバ12の側方部分12bに設けられたチャネル15nに向かって見て、ウェル14の方向で増大する。1の実施態様の場合、図3Bに見られるように、チャンバ12の複数のチャネル15における連続したそれぞれのチャネルの長さLは、複数のチャネルのうちの先行するチャネルに対してチャネルの幅W方向で増大するので、第1ウェル領域及び第2ウェル領域のうちの一方、例えば図示のウェル領域13aに設けられたそれぞれのチャネル入口は、チャネルの幅W方向に沿って整列される。この構成において、任意の特定のチャネル内で移動する細胞はチャネルを出て、互いに長手方向にずらされた地点でウェル14に入るが、ウェル領域13aに最も近接したチャネル領域15aの区分は、種々異なるチャネルに最終的に入る細胞がチャネルの幅W方向で整列されて、これらのチャネルの間に長手方向のずれがないように位置決めされる。したがって、隣接する2つのチャネルを比較すると、チャネル15iに入る第1細胞群は、チャネル15jに入る異なる第2細胞群に対して長手方向にずらされていない進入位置を有しているが、しかし、チャネル15iを出る第1細胞群は、チャネル15jを出る第2細胞群から長手方向にずらされた出口点を有している。図3Cに示された本発明の異なる実施態様の場合、それぞれのチャネル15i〜15nの幅Wは、チャンバ12の側方部分12aに設けられたチャネル15iから出発して、チャンバ12の側方部分12bに設けられたチャネル15nに向かって増大する。好ましくは、複数のチャネルの連続したそれぞれのチャネルの幅W又は深さDは、複数のチャネルのうちの先行のチャネルに対して、チャネルの幅W方向で増大する。或いは、連続したそれぞれのチャネルの深さDが、チャネルの幅W方向に沿って増大することもできる(図示せず)。当業者には明らかなように、チャネル領域15aにおけるチャネルの寸法を変更する種々の実施態様は、本発明の範囲内にある。例えば、チャネル15i〜15nの長さは、図3Bに示すように、チャネル15iから15nまで連続的に増大する必要はない。その代わりに、チャネル15i〜15nは、特定の順序又はパターンに従わずに変化する長さを有することができる。
【００２９】
所与のチャネル15の表面処理に関して、細胞が他の細胞によって取り囲まれているin vivo条件をシミュレートするために、所与のチャネル15の側壁に細胞、例えば図4Bに見られるような内皮細胞40をコーティングすることができる。内皮細胞の一例としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞又は高内皮細胞性細静脈細胞が挙げられる。別の実施態様の場合、所与のチャネル15には、ゲル・マトリックス、例えばゼラチン、アガロース、コラーゲン、フィブリン、任意の天然又は合成の細胞外タンパク質性マトリックス、或いは、一例としてMATRIGEL(登録商標)(Becton Dickenson Labware)又はECM GEL(Sigma, ミズーリ州セントルイス)を含む基底膜擬似体、或いは所定の因子、例えばサイトカイン、成長因子、抗体、細胞表面受容体のためのリガンド、又はケモカインを含有するその他のヒドロゲルが充填される。好ましくは、ゲルは実質的に高い含水率を有し、そして細胞の化学走性又は化学侵襲性を可能にするのに十分に多孔質である。上述のように、可溶性試験物質を含む試験薬がウェル13内に配置されると、ゲルは、チャンバ12の長手方向軸に沿った溶液濃度勾配の形成を容易にする。加えて、所与のチャネル15にゲル・マトリックスを添加することにより、体内の自然環境がシミュレートされる。それというのも、細胞外マトリックスを通した酵素分解は、侵襲プロセスにおける重要なステップであるからである。
【００３０】
本発明によれば、それぞれのウェル領域13a又は14aの個々のウェルは、任意の形状及びサイズを有することができる。例えば、所与のウェルの上面輪郭は、図1A〜2Cに示すように円形であるか、或いは図5及び6に示すように台形であってよい。或いは、所与のチャンバの上面輪郭は図7に示すように、概ね「8の字」の形状であってもよい。好ましくは試験薬として可溶性試験物質を使用する場合、ウェル13の形状は、可溶性試験物質がチャネル15に容易にアクセス可能であり、これにより、チャネル15の長さLに沿って必要な溶液濃度勾配を形成するようになっている。好ましくはウェル14の形状は、細胞が例えばウェル14のコーナー、側方又はその他のデッドスペースに蓄積することにより、第1ウェル14からの遊走を遅らされ、引きとめられ、又は妨げられることがないようになっている。ウェル14のデッドスペースにおいて生じ得る細胞の蓄積は、いかなる特定の細胞数にも限定されないが、多数の細胞が使用される場合、ウェル14のコーナーに細胞が蓄積するおそれがより大きい。したがって、濃度勾配に対するアクセス可能性を最大化し、且つ大型細胞試料を利用するときの細胞の「浪費」を最小化するために重要なのは、十分に高いパーセンテージの細胞、具体的にはチャネル15から最も隔たったウェル14の領域内の細胞が、ウェル14から遊走することができるように、ウェル14の形状を形成することである。細胞の浪費の問題にも対処する、異なる実施態様の場合、ウェル14は、全ての細胞が濃度勾配にアクセスするより高い確率を有するように成形することができる。例えば図8に見られるように、頂面図におけるウェル14の長さLwは、ウェルの表面積を減少させるように最小化されている。このようなものとして、細胞は、チャネル15内に形成された濃度勾配に一層近接する。好ましい実施態様の場合、頂面図におけるウェル14のLwは、約1mm〜約2mmである。
【００３１】
不連続的なチャンバ12の構成部分の変化に加えて、本発明は、チャンバ12全体における変化、並びにチャンバ間の変化をも検討する。チャンバ12全体に関しては、1の実施態様の場合、チャンバ12のサイズは、完全な状態のチャンバ12が、96ウェルプレートの単一のウェルに通常必要とされる面積に適合するように形成される。この構成において、96の異なるアッセイを96ウェルプレート内で実施することもできる。別の実施態様の場合、チャンバ12を改変することにより、前述の実施態様において存在するような1:1の第1ウェルと第2ウェルとの比が変えられる。例えば図9に見られるように、装置10は、互いに接続された複数の第1ウェル102, 103, 104及び105を有する第1ウェル領域13aと、複数のウェル106, 107, 108及び109を有する第2ウェル領域14aと、第1ウェルのそれぞれを第2ウェルのそれぞれに接続する複数のチャネル15を有するチャネル領域15aとを備えたチャンバ12を含む。第1ウェル領域13aのそれぞれのウェルは、同じ試験薬を受容することができ、第2ウェル領域14aのそれぞれのウェルは、異なる細胞型を受容することができる。或いは、第1ウェル領域13aのそれぞれのウェルは、異なる試験薬を受容することができ、第2ウェル領域14aのそれぞれのウェルは、同じ細胞型を受容することができる。この構成は、いくつかの異なる細胞型又は異なる試験薬が同時に試験されるのを可能にする。図10に見られる別の実施態様の場合、チャネル領域15aの各チャネル15は、図示のサブチャネルを含む。この配置は、いくつかの異なる細胞型又は異なる試験薬が同時に試験されるのを可能にするだけではなく、それぞれの試験薬又は細胞型のいくつかの試験をも行う。
【００３２】
図11は、本発明の別の実施態様による化学走性/化学侵襲性装置の別のチャンバ構成を示す。この実施態様の場合、チャンバ12は、単一のチャネル15を含むチャネル領域15aによって、単一のウェル14を含む第2ウェル領域14aに接続された第1ウェル領域13aを含む。第1ウェル領域は複数の第1ウェル17a, 18a及び19a、並びに、第1周辺毛管17と中央毛管18と第2周辺毛管19とを含む複数の毛管を含有し、これらの毛管は、複数の第1ウェルのそれぞれに接続されている。3つの毛管全ては接合点で合流してチャネル15になる。チャネル15は、第2ウェル領域14aと接続されている。ウェル領域13aは、3つだけの毛管を含有するものに限定されるものではなく、任意の数の付加的な毛管(図示せず)を含有することができる。第1ウェル17a〜19aを例えば、試験生体分子の溶液を受容するように適合させることができる。生体分子はチャネル15内に流入し、そして試験生体分子を含有する溶液が流れる表面の領域に非特異的に吸着するのが可能になる。第1ウェル17a〜19aはまた、続いて細胞を受容するように適合される。
【００３３】
チャンバ間の変化に関しては、1の実施態様の場合、各チャネル15の長さLは、1つのチャンバから隣接チャンバへ向かって見て、上部部材11の1つ以上の次元に沿って増大する。別の実施態様の場合、全てのチャンバ12は同じ長さLのチャネル15を有している。それぞれのチャネル15の幅Wは、1つのチャンバから隣接チャンバへ向かって見て、上部部材11の1つ以上の次元に沿って変化し、増大することもできる。別の実施態様の場合、全てのチャンバ12は同じ幅Wのチャネル15を有している。図4Aは、上部部材11内で異なるチャンバが種々のチャネルのサイズ及び形状を有している本発明の1の実施態様の頂面図であり、このようなサイズ及び形状は、特定の順序、パターン又は配置を成していない。このような変更された構成を採用することによって、所与の試験のための最良のチャネル領域構成を得ることができる。換言すれば、最適なチャネル領域構成が決定された場合には、それらの仕様だけに合わせて構成された新しいアッセイ・プレートを採用することができる。
【００３４】
装置10の支持部材16は、上部部材11を載置させる支持体を提供し、そしてこの機能に適した任意の材料から形成することができる。好適な材料は当業者に知られており、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、PMMA、ポリアクリレート及びその他のプラスチックである。装置10が化学走性、走触性及び/又は化学侵襲性装置である場合、支持部材16は、支持部材16の表面上に配置できる細胞と適合性を有する材料を含むことが好ましい。好適な材料は細胞生物学において使用される標準的な材料、例えばガラス、セラミック、金属、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、並びに高分子薄膜を含むその他のプラスチックを含むことができる。好ましい材料は厚さ約0.1mm〜約2mmのガラスである。それというのもガラスは、光学顕微鏡技術で細胞を見ることを可能にするからである。
【００３５】
上部部材11と同様に、支持部材16もいくつかの異なる実施態様を有することができる。具体的には、支持部材16の構成及び表面処理は可変である。
【００３６】
図12に示す支持部材16の側面図に見られるように、上部部材11の下側に位置する支持部材16の上面Uは所定の領域で、水平平面に対して90°未満の角度を成して傾斜している。図示の実施態様の場合、所定の領域はそれぞれのウェルの底面、つまりウェル13の底面に相当する表面16a、及びウェル14の底面に相当する表面16bに対応する。表面16cは、チャネル15の底面に相当する。この実施態様の場合、所与の構成は、懸濁細胞が支持部材16の上面16bの下向きの傾斜の方向で流れるのを容易にし、これにより、懸濁細胞は濃度勾配により容易に露出されるようになる。可溶性試験物質が装置10のウェル13内の試験薬として使用される場合、支持部材16の上部表面16aも、水平平面に対して90°未満の角度を成して下向きに傾斜することにより、チャネル15に対する試験物質の露出を容易にして、溶液濃度勾配の形成を容易にすることができる。
【００３７】
支持部材16はその表面上に、又は表面内に埋め込まれた状態で、処理手段を有することもできる。この処理手段は、例えば被験細胞の配置、付着又は運動を容易にすること、及びin vivo条件をシミュレートすることを含む数多くの機能を担うことができる。数多くの表面構成及び化学物質を単独で、又はこの処理手段とともに使用することができる。
【００３８】
例えば、1の実施態様において、支持部材16は金表面又はその他の好適な材料上に、パターン化された自己組織化単分子膜(SAM)を含む。SAMは、典型的にはそれぞれが特定表面に選択的に付着する官能基を有する分子から形成された単分子膜であり、各分子の残りは単分子膜内の隣接する分子と相互作用することにより、比較的秩序正しいアレイを形成する。SAMを使用することにより、生物学的相互作用の種々の制御を採用することができる。例えば、種々の「頭部」を有するようにSAMを配列又は改変して、生体不活性な頭部領域によって取り囲まれた生体特異的表面の「島」を生成することができる。さらに、「切換え可能な表面」を有するようにSAMを改変することができる。「切換え可能な表面」は、細胞を捕捉するように構成し、次いで、捕捉された細胞を放出するように改変することができる。さらに、生体不活性な支持部材材料を利用して、細胞、タンパク質又は任意のその他の生体物質の非特異的吸着に抵抗することが望ましい場合もある。従って、支持部材16上でSAMを使用することが有利な場合がある。
【００３９】
本発明はまた、図13に見られるように、当業者に知られた任意のシステムを使用することにより、細胞の化学走性及び化学侵襲性を検出して分析することを検討する。具体的には本発明は、当業者に知られた任意のシステムを使用することにより、細胞がチャネル15を横切って運動するのに伴う細胞形態の変化を視覚化すること、チャネル15内の細胞移動距離を測定すること、及びチャネル15内の特定の地点に移動する細胞の数を定量することを検討する。このようなものとして、本発明は、化学走性及び化学侵襲性の「リアルタイム」及び「終点」分析を検討する。1の実施態様において、装置122は観察システム120とコントローラ121とを含む。コントローラ121は、ライン122を介して観察システム120と接続されている。コントローラ121及び観察システム120を位置決めしてプログラミングすることにより、装置内の細胞の化学走性及び化学侵襲性を観察し、記録し、そして分析することができる。観察システム120は、顕微鏡、高速ビデオカメラ、及び一連の個々のセンサーを含む、多数のシステムのいずれかであってよい。顕微鏡の一例としては、位相差、蛍光、発光、微分干渉、暗視野、共焦点レーザースキャニング、デジタル・デコンヴォルーション、及びビデオ顕微鏡が挙げられる。これらの実施態様のそれぞれは、試験薬の導入前、導入中及び導入後の細胞の運動及び挙動を観察又は感知することができる。同時に、観察システム120は、コントローラ121が解釈して分析するための信号を生成することができる。この分析は、所定の時間にわたる細胞の物理的運動、並びに形状、活性レベル又は任意のその他の観察可能な特性における細胞の変化を測定することを含むことができる。それぞれの事例において、被験細胞の挙動はリアルタイムで、又は後で、又はその両方で観察することができる。観察システム120及びコントローラ121は、モニターを介したリアルタイム観察を可能にする。これらは、これらの構成部分と一体化された、又はこれらの構成部分に連結された何らかの種類の記録システムを介して、続いて再生するのを可能にする。例えば、1の実施態様の場合、所望の観察期間中の細胞挙動が、標準的なビデオカメラによってVHS形式のビデオテープに記録される。ビデオカメラは、三接眼レンズ複合顕微鏡の垂直接眼筒内、又は倒立顕微鏡の本体内に位置決めされ、高品質ビデオレコーダに取り付けられる。次いでビデオレコーダはデジタル化手段、例えばPCIフレーム取込み器内に取り込まれて、アナログデータがデジタル形式に変換される。電子読み出し可能な(デジタル化された)データは、次いで好適な動画像分析システム、例えば米国特許第5,655,028号明細書に開示されたシステムによってアクセスされ処理される。上記明細書全体を参考のため本明細書中に引用する。このようなシステムは、Solltech Inc.(アイオワ州オークランド)から、DIAS(登録商標)の商標のもとに商業的に入手可能である。試料中に存在し得る破片及びその他の検出アーチファクトから細胞を区別するのを支援可能なソフトウエアは特に有利であるはずである。いずれの場合にも、これらの構成部分は、細胞が試験薬に対する反応を介して進行するのに伴って、これらの細胞を分析することもできる。
【００４０】
1の実施態様の場合、本発明は、図15に示すような自動分析システムを使用することにより、チャネル15内の細胞移動距離を測定するデータを分析すること、及び、チャネル15内の特定地点まで移動する細胞の数を定量することを考慮する。図15は、例えば画像前処理段110と、対象識別段120と、遊走分析段130とを含む自動分析システム100のブロック線図である。画像前処理段110は、デジタル・カメラ又は上述のその他の画像形成装置から、チャンバ12のデジタル画像データを受信することができる。データは典型的には、種々の空間的位置(略して「画素」と呼ばれる)に複数の画像試料を含み、そして色データ又はグレースケール・データとして提供されることができる。画像前処理段110は、捕捉された画像データを変化させることにより、他の段のアルゴリズムが動作するのを可能にすることができる。対象識別段120は、画像データ内部から対象を識別することができる。実施されるべき試験に基づいて、種々の対象を識別することができる。例えば対象識別子はチャネル15、細胞又は細胞群を、画像データ内部から識別することができる。遊走分析段130は、試験に際して指定された遊走分析を実施することができる。
【００４１】
図15は、画像前処理段110内部に含むことができる多数のブロックを示す。事実上、画像前処理段110は、画像形成器又は装置における不完全性の結果として、捕捉画像データ中に存在し得る画像アーチファクトを相殺する。1の実施態様の場合、画像前処理段110は画像等化ブロック140を含んでよい。等化140は、捕捉画像データのサンプル値が、データのために利用可能な全量子化範囲を占めない実施態様で利用することができる。例えば8-ビット・グレースケール・システムは、入力データに対応する256の異なる量子化レベル(0-255)を可能にする。画像形成プロセスにおける不完全性により、画素値は狭い範囲、すなわち最初の20の量子化レベル(0-20)に制限されることがあり得る。等化140は、サンプル値を再スケーリングして、これらの値が8-ビット・システムにおいて利用可能な全範囲を占めることを保証することができる。
【００４２】
別の実施態様の場合、等化ブロック140は、色又は波長に基づいてサンプル値を再スケーリングすることができる。慣用の細胞分析技術はしばしば、細胞を所定の色又は所定の波長で出現させる。このことは、画像形成器によって捕捉された他の物質から、これらの細胞を区別するのを可能にする。例えば蛍光を適用する場合、細胞は所定の波長で発光する。核染色を適用する場合、細胞核は、所定の色を有する画像データで細胞核を出現させる材料で染色される。等化ブロック140は、予期されるこれらの色又は波長と一致する成分を有するサンプル値を再スケーリングすることができる。こうすることにより、等化ブロック140は、他の色又は波長を効果的に除去し、後で行われる画像処理において有利となり得る結果をもたらす。
【００４３】
画像の回転は、不完全な画像形成装置から生じ得る別の画像アーチファクトである。チャネル15は一般には画像データ中の画素の列及び行と整列される可能性が高いが、この整列が改善されると、更なる分析を容易にすることができる。従って、1の実施態様の場合、画像前処理段110は画像整列ブロック150を含み、画像整列ブロック150は捕捉画像データを回転させることにより、このアーチファクトを相殺する。捕捉画像データから回転アーチファクトが除去されると、次いで、個々のチャネル15からの画像は、画素データの規則的な行又は列アレイと一致する可能性が高い。
【００４４】
図16は、本発明の1の実施態様に基づく画像整列ブロック150のための操作方法を示す。この操作方法は、図17に示す画像データ例との関連において記載される。図17の例において、チャネル15は一般に、回転アーチファクトがなければ、画像データの行と整列される。回転アーチファクトを相殺するために、画像前処理装置は、第2ウェル14とチャネル15自体との間の境界と一致する画像データ帯域を識別することができる(ブロック1010)。図17の場合、この帯域は列310を構成することができる。一般に、第2ウェル14の領域は、ここに存在する細胞の数がより多いため、チャネル15の領域に比べて明るくなる。こうして、チャネル15の推定される方向に沿った画像データ値のヒストグラムが、図18に示すように現れることができる。帯域310は、この方向に沿った画像データ値の突然の変化から識別することができる。
【００４５】
考慮されるべき画像データの列を識別すると、その列310を2つの境界ボックス320, 330に分割することができる(ブロック1020)。2つの境界ボックスのそれぞれの画像データの強度を合計し、合計値を互いに比較することにより、回転アーチファクトの配向を見極めることができる(ブロック1030, 1040)。図17の例の場合、回転アーチファクトにより、さらなる第2ウェル14が、境界ボックス330ではなく境界ボックス320の領域内に入ることになる(時計回りのアーチファクト)。それぞれの境界ボックス320, 330の合計値のバランスがとれるまで、画像データを反時計回りに回転させることができる。
【００４６】
第1境界ボックスの画像強度が第2境界ボックス330の画像強度よりも高い場合、画像データは第1の方向に回転させることができる(ブロック1050)。第2境界ボックス330の画像強度が第1境界ボックス320の画像強度よりも高い場合、画像データは第2の方向に回転させることができる(ブロック1060)。そして画像強度のバランスがとれると、方法1000は終結することができ、回転アーチファクトは補正されている。
【００４７】
図15に戻ると、画像前処理段110は、画像をトリミングしてチャネル15自体によって占有された面積にすることにより、捕捉画像データを処理することもできる(ブロック160)。上述のように、各試験床は、複数のチャネルによって相互接続されたウェル対を含むことができる。遊走分析のほとんどの場合、チャネル15内部だけの細胞の運動又は活性を測定すれば十分である。第2ウェル14又は第1ウェル13内の活性を考慮する必要はない。このような実施態様の場合、画像前処理段110は画像データをトリミングすることにより、チャネル15の外側に位置する画素を除去することができる。
【００４８】
画像前処理段110は、画像データ上で閾値検出を実施する閾値処理ブロック170を含んでもよい。閾値処理ブロック170は、所定の閾値を上回らない再スケーリングされた値を有するいかなる試料をもゼロに切り捨てることができる。このような閾値処理は、捕捉画像データからノイズを除去するために有用である。1の実施態様の場合、閾値処理ブロック170は上述の等化ブロック140と一体化することができる。閾値処理ブロック170は、別個の要素として存在する必要はない。いくつかの実施態様の場合、具体的には等化ブロック140が波長成分に従って画素値をスケーリングする実施態様において、閾値処理ブロック170は完全に省くことができる。画像前処理段110の出力は、対象識別段120への入力であってよい。
【００４９】
対象識別段120は、チャネル自体及び場合により個々の細胞を含む対象を、画像データ内部から識別する。1の実施態様によれば、蛍光システム内の主軸に沿って蛍光のヒストグラムを作成することにより(ブロック180)、蛍光システム内でチャネル15を識別することができる。図19は、図17の例から測定されることができる画像データを示す。主軸は、細胞を受容するのに適合されたウェルと、チャネル領域との間の境界と一致することができる。チャネル領域15a内部からの光強度をこの軸に沿って合計し、図19に示されたデータセットを得ることができる。第2段において、データセットは「拡張」される(ブロック190)。データセット又は任意の他の類似技術に高域通過フィルターを適用することにより、拡張を達成することができる。図20は、拡張された図19のデータセットを示す。
【００５０】
図20のデータセットから、チャネルを識別することができる。候補チャネル15の位置を、データセットの相対最大値と一致するものとして識別することができる。或いは、図20のデータセット内からの相対最小値から、チャネル15間の境界の候補位置を見極めることもできる。チャネル領域15a自体について知られているパラメータ集合から、チャネル15位置の最終的な組を見極めることができる。例えば、チャネル15が、チャネル15間に規則的な間隔を有していることが知られている場合、この間隔を侵害することになるいかなる候補チャネル15位置をも、考慮から外すことができる。
【００５１】
図15に戻ると、チャネル15を識別することに加えて、個々の細胞は画像データ内で識別することができる(ブロック200)。核染色で細胞をマーキングする適用において、個々の細胞の識別に際して必要となるのは、画像処理装置が、マーキングされた核の数を識別してカウントすることだけである。核の外観は、所定の色の多数の点である。蛍光細胞を用いる適用では、個々の細胞の識別は一層複雑になる。個々の細胞は比較的容易に識別することができ、これらの細胞は画像データにおいて比較的均一な領域の対象として出現する。一緒にクラスター化された多数の細胞を識別することはより難しい。この場合、画像データにおけるクラスターの面積又は半径から、細胞数を見極めることができる。クラスターは、いくらかの面積又はクラスター半径を有する画像内に出現する可能性が高い。クラスターの面積又は半径を、個々の細胞の面積又は半径と比較することによって、細胞数に手を加えることができる。もちろん、個々の細胞の識別は、遊走分析の要件に応じて省くことができる。
【００５２】
画像処理システム内の最終段は、遊走分析130自体である。1の実施態様の場合、チャネル15内の各細胞の座標データを収集し、記録することができる。しかし、いくつかの試験はこのように複雑なことは必要としない。第1の実施態様の場合、チャネル15内に存在する細胞の数を識別するだけで十分である。この場合には、個々の細胞の識別は、各チャネル15内で検出された蛍光の量を合計するだけで回避することができる。この測定から、個々の細胞を識別する処理費用を投資することなしに細胞数を導き出すことができる。上記の説明は、被験単一チャネル15に関連する画像分析を提供する。もちろん、遊走分析130の要件に応じて、種々異なる多数のチャネル15の画像試料を生成することが望ましい場合がある。さらに、異なる時点に単一チャネル15の画像試料を生成することが望ましい場合がある。上記画像処理を異なるチャネル15及び異なる時点に関して繰り返すことにより、このような試験シナリオに対応することができる。
【００５３】
1の実施態様によれば、画像処理は、個々のチャネル15の製造上の欠陥を考慮に入れることができる。画像処理中、製造上の欠陥は細胞がチャネル15内に遊走するのを妨げるおそれがある。1の実施態様の場合、システム100がチャネル15内の多数の細胞をカウントする(又は識別された細胞位置からその数を導出する)と、システム100は、その数を期待閾値と比較することができる。その数が期待閾値を下回ると、システム100は遊走分析からチャネル15を排除することができる。実際、この期待閾値は、試験条件が遊走分析下で分析されると考えた場合、適正に構成された細胞に入る可能性が高い細胞の最低数として確立することができる。実際の細胞数がその閾値を下回ると、チャネル15を遮断する条件が存在するものと結論付けることができる。
【００５４】
分析システム100の上述の作業及びプロセスは、、ソフトウエアを実行する多目的処理装置、例えばコンピュータ、ワークステーション又はサーバーによって実施することができる。或いは作業及びプロセスのうちのいくつかは、デジタル信号プロセッサ又は特定用途向け集積回路(口語的に「ASIC」)において提供することもできる。加えて、具体的には画像前処理と関連するこれらの作業及びプロセスは、デジタル顕微鏡システムのプロセッサ内で割り当てることができる。このような変更形は本発明の範囲内に完全に含まれる。
【００５５】
本発明は、化学走性/化学侵襲性の種々の要素をアッセイするために装置10の前述の実施態様を使用することをも検討する。総体的に見て、本発明は、試験薬が化学走性/化学侵襲性に影響を与えるかどうかを見極めるために、試験薬をハイスループットスクリーニングすることを含む第1アッセイを提供する。試験薬は一般に、可溶性試験物質又は固定化試験生体分子を含み、一般には装置10のチャンバ12の第1ウェル領域13a内に配置される。化学誘引物質として作用し、そして化学走性/化学侵襲性を促進又は開始することによって、又は、化学忌避物質として作用し、そして化学走性/化学侵襲性をはね除けることによって、又は阻害物質として作用し、そして化学走性/化学侵襲性を停止又は阻害することによって、どの試験薬が化学走性/化学侵襲性に影響を与えるのかを見極めたあと、第2アッセイを実施して、試験化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物は一般に治療薬又は化学走性/化学侵襲性阻害物質を含み、そして一般には、細胞生体試料を含有する第2ウェル領域14a内に導入される。試験化合物をスクリーニングすることにより、これらが試験薬に応答する細胞の遊走に影響を与えるか否か、そしてどのように影響を与えるかを見極める。
【００５６】
具体的には、本発明の1の実施態様に基づく化学走性/化学侵襲性アッセイは、支持部材16に取り付けられた上部部材11を含むハウジングを含む装置10を含む。上部部材及び支持部材は、これらが一緒に不連続的なアッセイ・チャンバ12を画定するように構成されている。不連続的なアッセイ・チャンバ12は、チャネル15によって第2ウェル領域14aに接続された第1ウェル領域13aを含む。第1ウェル領域13aは1つ以上の第1ウェル13を含み、1つ以上の第1ウェル13のそれぞれは、試験薬を受容するように適合されている。第2ウェル領域14aは、装置の試験配向において、第1ウェル領域13aに対して水平方向にずらされた1つ以上の第2ウェル14を含む。1つ以上の第2ウェル14のそれぞれは、細胞試料を受容するように適合されている。チャネル15は、第1ウェル領域13aと第2ウェル領域14aとを互いに接続する1つ以上のチャネルを含む。第1ウェル13内に受容される試験薬は、可溶性試験物質及び/又は固定化試験生体分子である。試験薬が固定化試験生体分子を含む場合、生体分子は、ウェル領域13aの底面を構成する支持部材16の上面U、並びに、チャネル領域15aの底面を構成する支持部材16の上面U上に固定化される。
【００５７】
細胞生体試料の一例としては、リンパ球、単球、白血球、マクロファージ、マスト細胞、T細胞、B細胞、好中球、好塩基球、好酸球、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン、腫瘍細胞、運動性配偶子、細菌及び真菌の運動形、転移に関与する細胞、及び炎症、負傷及び感染に対する応答に関与する任意のその他の細胞型が挙げられる。ウェル領域14aは、上述の細胞型の例のうちのただ1つの細胞型又は任意の組み合わせを受容することができる。例えば、上述のように、混合型細胞個体群を提供することにより、in vivo条件に類似する環境をより効果的に形成することがしばしば望まれる。ウェル領域14aは、特定の細胞周期相における細胞を受容することもできる。例えば、ウェル領域14aは、G1相又はG0相における白血球を受容することができる。
【００５８】
可溶性試験物質の一例としては、化学誘引物質、化学忌避物質、又は化学走性阻害物質が挙げられる。上記で説明したように、化学誘引物質は細胞を誘引する化学走性物質であり、ウェル領域14a内に配置されると、細胞をウェル領域14aに向かって遊走させる。化学忌避物質は、細胞をはね返す化学走性物質であり、ウェル領域14a内に配置されると、ウェル領域14aから離反する方向に細胞を遊走させる。化学走性阻害物質は、化学走性を阻害又は停止させる化学走性物質であり、ウェル領域14a内に配置されると、ウェル領域14aから細胞が遊走するのを阻害するか又は遊走させなくする。化学誘引物質の一例としては、ホルモン、例えばT3及びT4、エピネフリン及びバソプレシン；免疫学的物質、例えばインターロイキン-2、上皮成長因子、及びモノクローナル抗体；成長因子；ペプチド；小分子；及び細胞が挙げられる。細胞は、化学走性因子を放出することにより化学誘引物質として作用することができる。例えば1の実施態様の場合、癌細胞を含む試料をウェル13に添加することができる。異なる細胞型を含む試料をウェル14に添加することができる。癌細胞が成長するのに伴って、これらはウェル14内の細胞を、ウェル13に向かって遊走するように誘引する化学誘引物質として作用する因子を放出することができる。別の実施態様の場合、ウェル13に内皮細胞が添加され、そして化学誘引物質、例えばTNF-α又はIL-1をウェル13に添加することにより、内皮細胞は活性化される。白血球がウェル14に添加され、この白血球はウェル13内の内皮細胞に誘引されることができる。
【００５９】
化学忌避物質の一例としては、刺激剤、例えば塩化ベンザルコニウム、プロピレングリコール、メタノール、アセトン、ドデシル硫酸ナトリウム、過酸化水素、1-ブタノール、エタノール及びジメチルスルホキシド；並びに毒素、例えばシアニド、カルボニルシアニドクロロフェニルヒドラゾン、内毒素及び細菌性リポ多糖体；ウイルス；病原体；及び発熱物質が挙げられる。
【００６０】
固定化生体分子の一例としては、上述のような化学誘引物質、化学忌避物質、及び化学走性阻害物質が挙げられる。固定化化学誘引物質の更なる一例としては、ケモカイン、サイトカイン及び小分子が挙げられる。化学誘引物質の更なる一例としては、IL-8、GCP-2、GRO-α、GRO-β、MGSA-β、MGSA-γ、PF4、ENA-78、GCP-2、NAP-2、IL-8、IP10、I-309、I-TAC、SDF-1、BLC、BRAK、ボレカイン、ELC、LKTN-1、SCM-1β、MIG、MCAF、LD7α、エオタキシン、IP-110、HCC-1、HCC-2、Lkn-1、HCC-4、LARC、LEC、DC-CK1、PARC、AMAC-1、MIP-2β、ELC、エキソダス-3、ARC、エキソダス-1、6Ckine、エキソダス-2、STCP-1、MPIF-1、MPIF-2、エオタキシン-2、TECK、エオタキシン-3、ILC、ITAC、BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、RANTES、エオタキシン-1、エオタキシン-2、TARC、MDC、TECK、CTACK、SLC、リンホタクチン及びフラクタルカイン；並びにその他の細胞が挙げられる。化学忌避物質の更なる一例としては、受容体アゴニスト及びその他の細胞が挙げられる。
【００６１】
試験、例えば可溶性試験物質を利用した化学走性及び/又は化学侵襲性アッセイを実施するために、試験装置10が先ず製作される。本発明による装置の製造方法の好ましい実施態様を以下に説明する。標準的なフォトリソグラフィ手順により、上部プレート11のネガであるマスターを製作することができる。マスター上には所定の材料がスピンコーティング又は射出成形される。所定の材料を次いで硬化し、マスターから剥離することにより上部部材11を形成し、これを支持材料16上に置く。
【００６２】
標準マイクロタイター・プレートのフットプリントを有する剛性フレームが、好ましくは上部部材11の外周面の周りに配置される。1の実施態様の場合、ウェル領域13a内にゲル・マトリックスを注入し、これにより、ゲル・マトリックスがチャネル領域15a内に流入するのを可能にする。ゲル・マトリックスを設置した後、過剰のゲルをウェル領域13a, 14aから除去する。別の実施態様の場合、チャネル領域15aにゲル・マトリックスを添加しない。続いて、細胞生体試料をウェル領域14a内に置き、そして試験物質をウェル領域13a内に置く。1の実施態様の場合、低濃度の試験物質をウェル領域14a内に置くことにより、細胞を活性化してアッセイの開始を促進する。或いは、被験細胞及び使用される可溶性試験物質に応じて、細胞をウェル領域14a内に置いている間又は置いた後に、可溶性試験物質を導入することができる。可溶性試験物質が導入されると、拡散法により試験物質の溶液濃度勾配が、試験薬を含有するウェル領域13aから細胞生体試料を含有するウェル領域14aに向かって、チャネル領域15aの長手方向軸に沿って形成される。この溶液勾配の二次効果は、物理吸着(固定化)された勾配の形成である。この溶液勾配が確立されると、試験物質の溶質のいくらかの部分が支持部材16上に吸着することができる。試験溶質のこの吸着層も、化学走性及び化学侵襲性に貢献することができる。細胞生体試料はこの濃度勾配に応答し、そして試験物質のより高い濃度に向かって遊走するか、又は、試験物質のより高い濃度とは離反する方向に遊走するか、又は試験物質のより高い濃度に応答して運動の阻害を示すことができる。勾配に応答したこのような化学走性を介して、化学走性物質の化学走性的な影響を測定することができる。細胞移動距離、及び、細胞がチャネル領域15a内の所定の地点に達するのにかかる時間、又は細胞がウェル領域14a内の所定の地点に達するのにかかる時間量を測定する(化学走性物質から離反する方向に細胞を運動させる化学忌避物質の場合)ことにより、化学走性がアッセイされる。
【００６３】
チャンバ12の別の構成を含む装置10の別の実施態様を利用して、ミクロ流体チャネル領域の網状構造を用いて溶液濃度勾配を形成する。図14に見られるこの実施態様の場合、チャンバ12の第1ウェル領域13aは、ミクロ流体毛管23の網状構造によってチャネル15に接続された第1ウェル20, 21及び22を有している。具体的には、第1ウェル領域13aは複数の第1ウェルを含み、これらの第1ウェルは、複数の第1ウェルのうちのそれぞれに接続された複数の毛管24と、複数のサブ毛管25とによって接続されている。これらのサブ毛管25は、これらのそれぞれが一方の端部では複数の毛管のそれぞれに接続され、そして他方の端部ではチャネル15に接続されるように分岐されている。それぞれの第1ウェル20, 21, 22は異なる濃度の可溶性試験物質を受容する。3つの第1ウェル20, 21, 22に3種の異なる濃度の可溶性試験物質が同時に注入されたあと、溶液流は、チャネル領域網状構造を下って移動し、連続的に分裂し、混合し、そして再併合する。いくつかの分岐サブ毛管生成の後、可溶性試験物質の異なる個体群を含有するそれぞれのサブ毛管が、単一チャネル15に合流され、流れ方向に対して垂直に、チャネル15を横切って濃度勾配を形成する。
【００６４】
走触性をモニタリングするための本発明の別の実施態様によれば、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、支持部材16、好ましくはチャネル15及びウェル領域13aの底面を構成する上面Uの部分上に、生体分子を固定化する。生体分子の濃度は、ウェル領域13aの底面を構成する支持部材16の上面から、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面Uに向かって、装置の長手方向軸に沿って増大又は減少し、ひいては表面勾配を形成する。試験生体分子を支持部材16上に固定化したあと、上部部材を支持部材16上に載置し、そして標準マイクロタイターのフットプリントを有する剛性フレームを、上部部材11の外周面の周りに配置し、そしてウェル領域14aに細胞を添加する。別の実施態様では、試験生体分子を支持部材16上に固定化し、上部部材を支持部材16に被せた後、ゲル・マトリックスをチャネル領域15aに添加する。続いて細胞をウェル領域14aに添加する。細胞生体試料は、固定化生体分子の濃度勾配に潜在的に応答し、そして試験生体分子のより高い濃度に向かって遊走するか、又は、試験生体分子のより高い濃度とは離反する方向に遊走するか、又は試験生体分子のより高い濃度に応答して運動の阻害を示す。表面勾配は、線形に、又は二次、三次、又は対数関数として増大するか、或いは、段階的に上昇又は下降させて概算することができる任意の表面プロフィールを成して増大することができる。
【００６５】
K. Efimenko及びJ.Genzer,「How to Prepare Tunable Planar Molecular Chemical Gradient」13 Applied Material, 2001, 第20号、10月16日；米国特許第5,514号明細書(参考のため本明細書中に引用)に記載されているような、当業者に知られた種々の特異的又は非特異的アプローチによって、支持部材16の上面U上に試験生体分子を結合させることができ、そして試験生体分子はこの上面U上に表面勾配を形成することができる。例えば、マイクロコンタクト印刷技術、又は当業者に知られた任意の他の方法を用いて、支持部材16の上面U上に、ヘキサデカンチオールを提供するSAM層を固定化することができる。次いで支持部材16を、所望の勾配マイクロパターンのフォトリソグラフィ・マスク又は白から黒への連続的なグラデーションを有するグレースケール・マスクを通して、高エネルギー光に露出する。マスクを除去すると、ヘキサデカンチオールを提供するSAMの表面勾配が残される。次いで支持部材16を、エチレングリコールを末端基とするアルカンチオールの溶液中に浸す。ヘキサデカンチオールを提供するSAMを有する支持部材16の領域は、生体分子を急速に吸着させ、そしてエチレングリコール基のオリゴマーを提供するSAMを有する支持部材の領域は、タンパク質の吸着に抵抗することになる。次いで支持部材16を所望の試験生体分子の溶液中に浸し、そしてこの生体分子は、ヘキサデカンチオールを提供するSAMを含有する支持部材16の領域にだけ急速に吸着し、固定化された生体分子の表面勾配を形成する。
【００６６】
別の実施態様の場合、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、上部部材11が支持部材16に被された後、試験生体分子が支持部材16上に固定化され、そして表面濃度勾配が形成される。この実施態様の場合、試験生体分子を含有する不連続的な濃度の溶液を、連続してウェル領域14a内に置き、試験生体分子が支持部材16に非特異的に吸着するのを可能にする。例えば、第1に、1ミリグラム/ミリリットル(mg/ml)の溶液を先ずウェル領域14a内に置くことができ；第2に、1マイクログラム/ミリリットル(μg/ml)の溶液をウェル領域14a内に置くことができ；最後に、1ナノグラム/ミリリットル(ng/ml)の溶液をウェル領域14a内に置くことができる。溶液中の試験生体分子の濃度が異なる結果、支持部材16上の吸着量も異なることになる。
【００６７】
図11に見られるようなチャンバ12の別の構成を含有する装置10の別の実施態様を利用して、複数の平行な液体流から成る層流という概念(当業者に知られた方法)に基づいて、固定化生体分子表面勾配を形成する。この概念に基づいて、低レイノルズ数の2つ以上の流れが合流してやはり低レイノルズ数の単流になると、併合された流れは乱流混合なしに互いに平行に流れる。1の実施態様によれば、化学走性生体分子の溶液を17a及び19aに置き、そしてタンパク質溶液を18aに置く。これらの溶液は、ウェル領域14aで穏やかな吸引の影響を受けながら、チャネル領域15a内に流入するのが可能になる。生体分子は、生体分子含有溶液がその上を流れる表面領域に非特異的に吸着し、表面勾配を形成する。次いで、ウェルに細胞の懸濁液を満たし、そして、生体分子の増大する濃度勾配に向かう細胞の走触性を観察してモニタリングする。S. Takayama 他、「Patterning Cell and their Environment Using Multiple Laminar Fluid Flows in Capillary Networks」Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 第96巻、第5545-5548頁、1999年5月、を全体的に参照されたい。
【００６８】
本発明はまた、可溶性濃度勾配及び表面濃度勾配の両方を用いて、可溶性試験物質又は固定化試験生体分子のどちらが細胞遊走に大きい影響を与えるかを見極めるアッセイを検討する。この実施態様の場合、上述の表面勾配を形成することによりアッセイを実施し、上述の溶液勾配を形成することによりアッセイを実施し、両タイプの勾配を形成することによりアッセイを実施し、そしてこれら3種のアッセイの結果を比較する。組み合わせ勾配アッセイに関して、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、ウェル領域13aの底面を構成する支持部材16の上面U及びチャネル領域15aの下側に位置する支持部材16の上面に、試験生体分子が固定化され、生体分子の濃度は、チャンバ12の長手方向軸に沿って、ウェル領域13aからウェル領域14aに向かって減少する。加えて、可溶性試験物質をウェル領域13aに添加する。このような実施態様は、同じ方向で減少する表面濃度勾配及び可溶性化学走性濃度勾配を形成する。組み合わされた濃度勾配が細胞遊走に対して相乗効果を有する場合には、両勾配は、可溶性化学走性物質の化学走性リガンドに結合する細胞受容体と、固定化生体分子に結合する細胞受容体との両方をスクリーニングするのに使用されるべきである。両タイプの受容体は重要なものとして識別され、そして、これらの両受容体を標的とする治療薬、又は一方が1つの受容体を標的とし、他方が別の受容体を標的とする治療薬の組み合わせをスクリーニングすることができる。組み合わせ濃度勾配が相乗効果を有さない場合には、細胞遊走をより強力に促進する個々の勾配を識別することができ、その勾配を形成する試験薬の化学走性リガンドに結合する細胞受容体を標的とすることができる。
【００６９】
化学走性リガンドと受容体との最適な対を識別することは、細胞遊走に関連する生物学的経路を理解し、そしてこれらの経路を標的とする治療薬を開発する上で重要である。したがって、本発明は総体的に、化学走性試験薬を使用して、細胞表面上に発現されたどの化学走性受容体が化学走性及び/又は化学侵襲性に最も大きな影響を与えるかを見極めることを可能にする。1の実施態様の場合、本発明は、所定のクラスの化学誘引物質のハイスループットスクリーニングを可能にする。この化学誘引物質は、このクラス中の各化学誘引物質に対する細胞表面上の受容体を有する特定の細胞型を誘引することが知られている。このようなスクリーニングにより、どの受容体が化学走性及び/又は化学侵襲性プロセスにより強く関与しているかが識別される。この受容体を識別した後、本発明は、化学走性及び/又は化学侵襲性が促進されることが望まれるのか、或いは防止されることが望まれるのかに応じて、この受容体を潜在的にブロックするか又はこの受容体に結合する治療薬のハイスループットスクリーニングを検討する。別の実施態様の場合、本発明は、特定の細胞型の表面上の同じ受容体に結合することが知られている異なる化学誘引物質のハイスループットスクリーニングを可能にし、これによりどの化学誘引性リガンド/受容体対が、化学走性及び/又は化学侵襲性により大きな影響を与えるかが見極められる。このリガンド/受容体対の識別後、本発明は、この受容体を標的とし、しかも化学走性及び/又は化学侵襲性が促進されることが望まれるのか、或いは防止されることが望まれるのかに応じて、この受容体をブロック又は活性化する治療薬のハイスループットスクリーニングを検討する。
【００７０】
本発明はまた、どの受容体が化学走性及び/又は化学侵襲性プロセスにより強く関与しているかを識別するための、細胞表面上に種々の化学走性受容体を有する特定の細胞型の化学走性を阻害することが知られている所定のクラスの化学走性阻害剤のハイスループットスクリーニングをも考慮する。この受容体を識別した後、本発明は、この受容体を同様に潜在的にブロックする治療薬のハイスループットスクリーニングを可能にする(このような作用が望まれる場合)。
【００７１】
本発明の1実施態様の場合、試験化合物が癌細胞侵襲性を阻害するかどうかを見極めるためにアッセイを行う。この実施態様の場合、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示された実施態様のいずれか1つにおいて、未処理の癌細胞をチャンバ12のウェル領域14a内に置き、試験薬をウェル領域13a内に置く。細胞の化学走性及び侵襲性を測定し、そして記録する。好適な試験薬(癌細胞を化学的に誘引する試験薬)を識別した後、別のアッセイをチャンバ12内で行う。この後続のアッセイにおいて、癌細胞をウェル領域14a内に置き、試験化合物、例えば治療薬もウェル領域14a内に置く。別の実施態様の場合、試験化合物はチャネル領域15aにも置く。チャネル領域15aにゲル・マトリックスを添加するようになっている場合、装置10の製作中にゲルがチャネル領域15aと接触する前に、試験化合物をゲル・マトリックスと混合することができる。第1アッセイにおいて識別された試験薬の次の試料を、ウェル領域13a内に置き、試験化合物で処理された細胞の化学走性及び侵襲性を、試験化合物で処理されていない細胞の化学走性及び侵襲性と比較する。処理済癌細胞の化学走性及び侵襲速度が未処理癌細胞よりも遅いかどうかによって、試験化合物の抗癌潜在力を測定する。
【００７２】
本発明の化学走性及び化学侵襲性装置の別の使用例に関して、炎症応答に対する細胞の応答をアッセイするために装置を使用することができる。身体の任意の組織における局所的な感染又は傷害は、炎症応答の一部として、損傷組織中に白血球を誘引する。炎症応答は、マスト細胞、血小板、神経終末及び白血球によって損傷組織部位内に生成された種々のシグナル分子により媒介される。これらのメディエーターは毛細血管内皮細胞に作用し、これらの細胞が隣接内皮細胞との結合を緩めるようにするので、毛細血管は透過性がより高くなる。内皮細胞はまた、刺激されて特異的炭水化物を認識する細胞表面分子を発現させる。これらの炭水化物は血中の白血球の表面上に存在し、これらの白血球を内皮細胞に付着させる。損傷組織から放出された他のメディエーターは、化学誘引物質として作用し、結合された白血球を毛細血管内皮細胞間を通って損傷組織内に遊走させる。白血球の化学走性を調査するために、1の実施態様の場合、チャネル領域15aを処理することにより、炎症応答中のヒト毛細血管内の条件をシミュレートする。例えば、チャネル領域15aの側壁に、例えば図4Bに示すような細胞表面分子、例えばセレクチンを発現させる内皮細胞をコーティングする。次いで、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示された実施態様のいずれか1つにおいて、白血球をウェル領域14aに添加し、既知の化学誘引物質をウェル領域13aに添加する。ウェル領域14aに添加できる他の好適な細胞型は、好中球、単球、T及びBリンパ球、マクロファージ、又は傷害又は炎症に対する応答に関与する他の細胞型である。チャネル領域15aを横切ってウェル領域13aに向かう白血球の化学走性を観察する。調査すべき感染のタイプに応じて、種々異なるカテゴリーの白血球を使用することができる。例えば、細菌感染に応答する細胞化学走性を検査する1の実施態様の場合、ウェル領域14aは好中球を受容する。ウイルス感染に応答する細胞化学走性を検査する別の実施態様の場合、ウェル領域14aはT細胞を受容する。
【００７３】
血管新生のプロセスをシミュレートする別の実施態様の場合、当業者に知られているように、角膜に適用される成長因子は、角膜を取り囲む高密度血管新生組織の周縁から、角膜中心の低密度血管新生組織に向かって新しい血管の成長を誘導する。したがって、化学走性及び化学侵襲性装置を利用する別のアッセイ例の場合、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示された実施態様のいずれか1つにおいて、角膜組織由来の細胞をウェル領域13a内に置き、内皮細胞をウェル領域14aに置く。成長因子をウェル領域13aに添加し、そして内皮細胞の化学走性を観察し、測定し、そして記録する。或いは、血管新生は腫瘍成長においても(酸素及び栄養素を腫瘍塊に供給するために)重要なので、成長因子をウェル領域13aに添加する代わりに、血管新生因子、例えば血管内皮細胞成長因子(VEGF)を生成する角膜組織に由来する癌細胞をウェル領域13aに添加し、正常な内皮細胞をウェル領域14aに添加することができる。やはり血管形成の検査に関連する別の実施態様の場合、マスト細胞、マクロファージ、及び、組織修復中、炎症中及び組織成長中に線維芽細胞成長因子を放出する脂肪細胞をウェル領域13aに置き、そして内皮細胞をウェル領域14aに置く。血管新生中に毛細血管芽は周囲の結合組織内に成長するので、in vivo条件をさらにシミュレートするために、チャネル領域15aにゲル・マトリックスを充填することができる。
【００７４】
上述のアッセイの変更形及び実施態様がいくつかある。1の実施態様は、装置10のチャンバ12のウェル領域13aとウェル領域14aとを接続するチャネルの数に関与する。図3A〜3Cの1に示すような1の実施態様の場合、ウェル領域13aとウェル領域14aとを接続するチャネルが複数ある。複数のチャネルによって、1つの細胞生体試料を用いて複数のアッセイを同時に実施することができる。このような実施態様の場合、全てのアッセイは均一で一貫した条件下で実施され、したがって統計的により正確な結果を提供する。例えば、それぞれのアッセイは、正確に同じ数の潜在的に遊走性の細胞と、正確に同じ濃度の試験薬とで始まる。濃度勾配が形成されると、それぞれのアッセイは、同じ時間にわたって勾配に露出される。これらの複数のチャネルはまた、アッセイが失敗した場合の余剰分を提供する。
【００７５】
本発明の細胞侵襲性及び化学走性アッセイの別の実施態様は、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示された実施態様のいずれか1つにおいて、チャンバ12のウェル領域14a内に細胞を置くことを含む。細胞は、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面U上に特定のアレイを成すようにパターン化することができる。或いは細胞は、ウェル領域14a内に、特定のパターン又は配列を成さずに単に堆積させることができる。細胞が、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面上に特定のアレイを成すようにパターン化される場合、好ましくは装置10の製作中に、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面を先ず細胞でパターン化し、次いで上部部材11を支持部材16に被せる。所定の「出発」位置からの細胞の運動をモニタリングすることにより、細胞が移動する距離及び時間を正確に測定することが望ましい。このようなものとして、1の実施態様の場合、細胞の生存可能性が維持され、細胞の位置が定義され得るように、第1ウェルの下側に位置する支持部材上に細胞を固定化又はパターン化するので、化学走性及び侵襲性を観察することができる。細胞を固定化してパターン化することにより、不連続的なアレイを支持部材上に形成するためのいくつかの技術が当業者に知られている。好ましい技術は、同時係属中の出願第60/330,456号明細書に記載されている。1の実施態様の場合、細胞位置パターン化部材を使用することにより、上部部材11のウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面U上に、定義可能な領域内に細胞をパターン化する。
【００７６】
例えば、標準的な96ウェルマイクロタイター・プレートのフットプリントで上部部材11が製作されることにより、ウェル13及び14がマイクロタイター・プレート(図示せず)のマクロウェルのサイズ及び形状に対応するようになっている場合、細胞位置パターン化部材は、ウェル13及び14のサイズ及び形状に対応し、したがってマイクロタイター・プレートのマクロウェルのサイズ及び形状に対応する、輪郭付けされた領域を有する。それぞれの輪郭付け領域はミクロ貫通孔を有し、この貫通孔を通って細胞がパターン化されることになる。細胞をパターン化するために、細胞位置パターン化部材は支持部材16と接触させられ、細胞位置パターン化部材の輪郭付け領域は、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面Uの部分と整列され、そして上部部材11が支持部材16と接触させられると、輪郭付け領域はウェル領域14aに最終的に対応することになる。次いで、細胞位置パターン化部材上に細胞を堆積させることができ、これらの細胞は、細胞位置パターン化部材の貫通孔を通って、チャンバ12の第2ウェル領域14aに対応する貫通孔に対応する領域の下側に位置する支持部材上に徐々に出ることができる。次いで貫通孔14aが細胞がパターン化される支持部材16の領域上に位置するように、上部部材11を支持部材16に被せる。これらのパターン化工程の結果、ウェル領域14a内に細胞の不連続的なアレイが形成される。
【００７７】
好ましくは、細胞位置パターン化部材はエラストマー材料、例えばPDMSを含む。パターン化部材のためにPDMSを使用すると、パターン化部材と支持部材との間に実質的に流体密なシールが提供される。この実質的に流体密なシールはこれらの2つの成分間で好ましい。なぜならば、このようなシールがパターン化部材と支持部材との間に存在するならば、ウェル内に置かれた細胞が隣接ウェルに侵入する可能性が少ないからである。パターン化部材のミクロ貫通孔の配置は、矩形、六角形、又は、細胞がこれらのそれぞれの形状でパターン化されることになる別のアレイであってよい。各ミクロ貫通孔の幅は、細胞型及びパターン化されるべき細胞の数に応じて変化してよい。例えば、細胞及び貫通孔双方の幅が10ミクロンである場合、ただ1つの細胞がそれぞれのミクロ貫通孔を通って堆積することになる。こうして、この例の場合、ミクロ貫通孔の幅が100ミクロンの場合、最大約100個の細胞を堆積させることができる。
【００７８】
本発明はまた、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面上に、2種以上の細胞型をパターン化することを検討する。1つの型の細胞はin vivoでは分離状態ではめったに存在せず、その代わり、他の細胞型と接触して連通しているので、身体の環境により類似した環境内で細胞をアッセイできるシステムを有することが望ましい。例えば癌細胞は分離状態では決して見いだされず、正常細胞によって取り囲まれているので、癌細胞に対する薬物の効果を試験するように構成されたアッセイは、そのアッセイにおける癌細胞が正常細胞によって取り囲まれていれば、より正確になる。抗癌剤の試験の場合、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面上に、癌細胞をパターン化し、次いで、別個のパターン化手順によって、癌細胞を間質細胞によって取り囲むことができる。ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面上に、2種の異なる細胞型をパターン化するために、上述のようなミクロ細胞位置パターン化部材を支持部材16と接触させ、細胞位置パターン化部材の輪郭付け領域を、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面U部分と整列させ、そして上部部材11が支持部材16と接触させられると、輪郭付け領域はウェル領域14aに最終的に対応することになる。次いで、細胞位置パターン化部材上に第1型の細胞を堆積させることができ、これらの細胞は、パターン化部材のミクロ貫通孔を通って、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面Uの部分上に徐々に出ることができる。次いで、ミクロ細胞位置パターン化部材を支持部材16から除去することができる。ウェル13及び14のサイズ及び形状に対応する輪郭付け領域を有するマクロ細胞位置パターン化部材は、したがって96ウェルマイクロタイター・プレートのマクロウェルのサイズ及び形状に対応することができる。マクロ細胞位置パターン化部材はマクロ貫通孔を有する。マクロ細胞位置パターン化部材のマクロ貫通孔は、ミクロ細胞位置パターン化部材のミクロ貫通孔によって画定された表面積よりも大きな面積を包含するが、しかし、チャンバ12のウェル領域14aによって画定された表面積よりも小さい。次いでマクロ細胞位置パターン化部材を支持部材16と接触させることができる。次いで、マクロ細胞位置パターン化部材上に第2型の細胞を堆積させることができ、そして上部部材11が支持部材16と接触させられると、これらの細胞は、マクロパターン化部材のマクロ貫通孔を通って、ウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面Uの部分上に徐々に出ることができる。このようなパターン化配置の結果、第2型細胞が第1型細胞を取り囲み、「積み重なる」ことができる。もし第2型細胞に第1型細胞を積み重ねることだけが望まれるのであれば、第1細胞型を堆積させるのに使用されたミクロ細胞位置パターン化部材、又は第1型細胞を堆積させるのに使用されたパターン化部材と正確に同じ構成を有する、異なるミクロ細胞位置パターン化部材を使用して、第2型細胞を堆積させることができる。細胞が支持部材16上にパターン化された後、上部部材11を支持部材16と接触させることにより、ウェル領域14aに対応する上部部材11の貫通孔は、細胞でパターン化された領域を包含することになる。この結果、細胞は事実上、ウェル領域14a内に特定のアレイを成して固定化される。
【００７９】
いかに多くの種々異なる細胞型がウェル領域14aの底面を構成する支持部材16の上面上にパターン化されようとも、細胞は、当業者に知られたいくつかの方法によって支持部材上にパターン化されることができる。例えばSAMを使用することにより、支持部材16上に細胞をパターン化することができる。SAMを使用することにより細胞をパターン化するための当業者に知られたいくつかの技術がある。これらのうちの数例の技術が、米国特許第5,512,131号明細書(Kumar他)、同第5,620,850号明細書(Bambad他)、同第5,721,131号明細書(Rudolph他)、同第5,776,748号明細書及び同第5,976,826号明細書(Singhvi他)に開示されており、これらの明細書を参考のため本明細書中に引用する。
【００８０】
前述のパラメーターを観察し、測定するために細胞を標識付けするいくつかの方法が、当業者に知られている。1の実施態様の場合、当該細胞型を含有する未精製試料を、種々の細胞型によって異なる状態で吸収される染色剤と一緒にインキュベートする。次いで、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、細胞をチャンバ12のウェル領域14a内に置く。個別の染色された細胞を、任意の好適な顕微鏡技術を用いて、色又は強度コントラストに基づいて検出し、そしてこのような細胞に位置座標を割り当てる。別の実施態様の場合、未精製細胞試料を、1つ以上の検出可能なレポーターと一緒にインキュベートする。それぞれのレポーターは、当該特異的細胞型に選択的に結合し、そして特徴的な蛍光を全ての標識付き細胞に付与することができる。次いで、本発明の試験装置の実施態様、例えば図1A〜14に示す実施態様のいずれか1つにおいて、細胞をチャンバ12のウェル領域14a内に置く。次いで、適切な波長の光を試料に当て、蛍光細胞を検出し、そしてこれらの細胞に位置座標を割り当てる。当業者には明らかなように、選択された細胞を未精製試料中のその他の成分から区別する種々の方法を利用することができる。例えば、これらの方法は色素、放射同位体、蛍光剤、化学発光剤、ビーズ、酵素及び抗体を含むことができる。細胞型の特異的標識付けは、例えば蛍光標識付け抗体を利用して達成することができる。細胞の標識付けプロセスは、特定の細胞型の標識付けのために使用できる種々の蛍光色素のように、当業者に知られている。
【００８１】
選択された型の細胞は、混合された細胞の個体群中で、例えばこのような細胞に選択的且つ/又は優先的に結合する検出可能なレポーター、又は検出可能なレポーターの選択された組み合わせを用いて差別化することもできる。例えば、発現されたCD、抗原及び受容体などに選択的に結合するモノクローナル抗体を使用して、標識付けを達成することができる。腫瘍細胞抗原の例は、骨髄性細胞上に存在するCD13及びCD33；B-細胞上に存在するCD10及びCD19；並びにT-細胞上に存在するCD2、CD5及びCD7を含む。当業者には明らかなように、種々の既知の細胞マーカーを識別する多数のマーカーが利用可能である。さらに、更なるマーカーが続いて発見されている。細胞を標識付けするのに有用なこのようなマーカーは、現在既知であるものも、将来発見されるものも、いずれも本発明を実施するのに活用することができる。
【００８２】
単一の細胞型だけに対して絶対的に特異的なマーカーはもしあるとしても僅かなので、2種以上のマーカーを標識付けして、それぞれのマーカーが各選択された細胞型ごとに異なる標識を有するようにするのが望ましい。選択されたそれぞれの細胞型に対応する複数の標識を検出することは、化学走性及び化学侵襲性分析が当該細胞だけに限定されることを確実にするのを助けるはずである。
【００８３】
本発明はさらに、支持手段；支持手段と流体密に共形接触するように配置されることにより支持手段に取り付けられた、支持手段と不連続的なチャンバを画定するための手段とを提供する。不連続的なチャンバは、1つ以上の第1ウェルを含む第1ウェル領域と；装置の試験配向において、第1ウェル領域に対して水平方向にずらされた、1つ以上の第2ウェルを含む第2ウェル領域と；第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに接続する1つ以上のチャネルを含むチャネル領域とを含む。支持手段の一例は、図1A、1B、12及び13に示された支持部材16を含むのに対し、支持手段に取り付けられた手段の一例は、図1A〜11、13及び14に示された上部部材11を含む。他のこのような手段は当業者には明らかである。
【００８４】
別の実施態様の場合、本発明は勾配形成及び/又は流動条件に依存する、又は勾配形成及び/又は流動条件に反応する生物学的現象をアッセイし、且つ研究する方法を提供する。このような生物学的現象は、体内のプロセスの多く、例えば、白血球の付着中及びローリング中に発生するような細胞表面相互作用を含む。加えて、化学走性、走触性及び細胞遊走に関与する研究には、勾配及び/又は流動条件の存在下においてこのような細胞運動を研究するアッセイがより大きく役立つ。
【００８５】
種々のタイプの勾配が生体系の研究において有用である。このような有用な勾配は静的勾配を含む。静的勾配は、固定又は設定された、或いは実質的に固定又は設定された濃度を有している。静的勾配の一例は、表面上の固定化分子の勾配である。静的勾配の一例としては、固定化生体分子(タンパク質、抗体及び核酸など)又は固定化化学物質部分(薬物及び小分子)の異なる濃度を使用することが挙げられる。他の有用な勾配は動的勾配を含む。動的勾配は、変化され得る濃度を有する。動的勾配の一例は、濃度の変動する分子を有する流体流の勾配である。流体勾配の一例としては、濃度が変動する生体分子、例えば成長因子、毒素、酵素、タンパク質、抗体、炭化水素、薬物、又は他の化学物質及び小分子を含有する流体流の使用が挙げられる。
【００８６】
本発明の1の実施態様の場合、動的/溶液に基づく勾配が、層流技術によって形成される。層流技術は典型的には、2つ以上の異なる源に由来する2つ以上の流体流を伴う。これらの流体流は一緒に単流にされ、そして乱流混合なしに互いに平行に流れるように形成される。異なる特性、例えば変化する低レイノルズを有する流体が並行して流れ、これらの流体は、乱流が存在しなければ混合することはない。流体は混合しないので、擬似チャネル(流体間に物理的分離がないという事実により擬似)を形成する。溶液及び表面勾配の生成は、米国特許出願第2002/0113095号明細書、及び論文(Jeon, Noo Li他、Langmuir, 16, 8311-8316(2000))に論じられている。これらの参考文献双方全体を参考のため、本明細書中に引用する。
【００８７】
これらの関連において、PDMSミクロ流装置を利用して、毛管ミクロ流体網状構造を通して勾配を発生させた。種々異なる化学物質を含有する複数の溶液を3つの別個の入口内に導入し、そしてこれらの溶液が毛管網状構造を通流することが可能になった。流体流を繰返し併合し、混合し、そして分割することにより、分岐チャネルのそれぞれに、区別可能な組成物を有する区別可能な混合物をもたらした。分岐のすべてを再併合すると、濃度勾配が流れ方向に対して垂直に、出口チャネルを横切って確立された。図22を参照されたい。
【００８８】
本発明の装置を、動的勾配の形成と組み合わせることにより、装置の任意の部分に変更を加えることによって、膨大な数のアッセイ・パラメーターを生成することができる。例えば、本明細書中に開示された装置を、動的勾配の導入と共に、細胞パターン化技術と組み合わせることによって、多数の生物学的相互作用を試験するために種々の条件を形成することができる。さらにこれらの装置及びアッセイは、薬物発見及び薬物試験に有用である。それというのも、細胞又は生体物質がin vivoで存在し、ひいては勾配及び流動条件に露出されているときと比較して、細胞又は生体物質が勾配に露出されていないときには、多くの細胞又は生体物質はex vivoで異なる状態で挙動するからである。
【００８９】
従って、本発明の1の実施態様の場合、チャネルを横切って細胞をパターン化することができる。当業者に知られている方法、並びに本発明において開示された方法(例えばマイクロコンタクト印刷又はエラストマー・ステンシルの使用)によって、細胞パターン化を達成することができる。次いで任意の所望の生体分子又は化学物質/薬物を含有する溶液を、パターン化された細胞を横切るように流動させることができる。加えて生体分子、例えばアクチベータによって先ず処理することにより、細胞は生体系をより厳密に再現する。続いてこれらの細胞を化学物質又は薬物に露出することができる。例えば層流によって勾配を形成することにより、種々異なる量の生体分子又は化学物質/薬物を、パターン化された細胞に供給することができ、ひいては、それぞれの生体分子又は化学物質/薬物の濃度の効果を同時に互いに比較して試験することができる。従って、並行して同時に行われるこのような比較は、アッセイ間の条件の可変性を低減する。
【００９０】
本発明の装置と組み合わせて層流で動的勾配を形成することにより、多数のアッセイ構成が提供される。例えば、表面上の細胞、チャネル内の生体分子及びチャネル内の化合物の組み合わせを変化させることにより、膨大な数のアッセイを形成することができる。
【００９１】
固定化細胞又はその他の固定化生体分子、例えばタンパク質、抗体、核酸などに関して、種々異なるアッセイ構成が可能である。1の実施態様の場合、チャネル領域全体にわたって単一の細胞型が固定化される。別の実施態様の場合、領域1つ当たり1つの細胞型が位置するように、細胞型混合物が固定化される。別の実施態様の場合、チャネル領域全体にわたって細胞型混合物が固定化される。これは細胞間の相互作用をモニタリングする上で有利な場合がある。さらに別の実施態様の場合、それぞれの異なる領域において、種々異なる細胞型が固定化される。
【００９２】
種々の固定化スキームに加えて、アッセイ・デザインの更なる柔軟性の中心は、チャネル内に存在する生体分子にもある。例えば、1の実施態様の場合、1つの型の生体分子が同じ濃度でそれぞれのチャネル内に存在する。別の実施態様の場合、1つの型の生体分子が異なる濃度でそれぞれのチャネル内に存在する。別の実施態様の場合、異なる型の生体分子がそれぞれのチャネル内に存在する。別の実施態様の場合、それぞれのチャネル内に生体分子の混合物がある。各チャネルは、同じ混合物又は異なる混合物を有していてよい。同じ混合物の場合、種々異なる生体分子の比又は濃度は、各チャネルにおいて異なっていてよい。
【００９３】
同様に化合物、例えば薬物又は試験物質に関しても、本発明はアッセイ・デザインの柔軟性を提供する。例えば1の実施態様の場合、単一の化合物が一貫して同じ濃度で、チャネル全てに存在する。別の実施態様の場合、同じ化合物がチャネル全てに存在するが、しかし各チャネルはその化合物を異なる濃度で有している。別の実施態様の場合、各チャネルは異なる化合物を有している。別の実施態様の場合、2種以上の化合物がある。2種以上の化合物がある場合、それぞれのチャネルは同じ化合物混合物を有することができるか、或いは異なる化合物混合物を有することができる。さらに、化合物混合物が同じ場合には、各チャネルは異なる濃度のその混合物を受容することができる。またさらに、各チャネルは、化合物の混合物を、各チャネルが互いに異なる化合物比を有する状態で受容することができる。
【００９４】
このようなアッセイ・システムを使用することにより、多数の生物学的相互作用の中から、細胞又はその他の生体分子に対する化学物質又は薬物の効果を試験することができる。例えば本発明の装置及びアッセイによって、固定化生体分子を横切るように流された、低濃度から高濃度で存在する化合物の層流勾配を用いることにより、化合物のIC50を測定することができる。
【００９５】
前記から明らかになるように、本発明の新規の概念の真の思想及び範囲を逸脱することなしに、多数の改変形及び変更形を提供することができる。例えば本発明の装置の種々異なる実施態様を組み合わせることができる。本発明の実施態様は、異なるタイプのアッセイ、例えば試験薬が化学走性剤の代わりに緩衝液を含むようなアッセイを検討する。このようなアッセイの場合、チャネル領域15aを通る細胞遊走が、化学走性勾配の存在なしに観察される。
【００９６】
言うまでもなく、本発明の開示は、本発明の例示を意図するものであり、該例示は、本発明を特定の実施態様に限定するように意図するものではない。開示内容は、添付の特許請求の範囲、及びその思想に含まれる全ての改変形によって補われるものとする。
【実施例】
【００９７】
実施例1:化学侵襲装置の製作手順
シリコン・ウェハー(6インチ)にフォトレジスト(SU8-50)を2000rpmで45秒間にわたってスピンコートする。ウエハーを熱板上で115℃で10分間にわたってベーキングした後、ウェハーを室温まで冷ましておく。マスク・アライナー(EVG620)を使用して、フォトマスクを介してフォトレジスト・フィルムを露光する。45秒間の露光に続いて、10分間にわたって115℃でさらに硬質ベーキングを行う。シリコン・ウェハーを、30分間超にわたって室温まで冷ましておく。プロピレングリコールメチルエーテルアセテート(PGMEA)を使用して、この未架橋フォトレジストを除去する。ウェハーを窒素流下で乾燥させ、そしてパターン化されたフォトレジストは続く処理への準備が整う。
【００９８】
1の実施態様の場合、パターン化されたフォトレジストに、別のSU8-100層を1500rpmで45秒間にわたってスピンコートする。マスク・アライナーを使用して、上部部材のマクロ構成要件(すなわちウェル)を選択的に露光するが、しかし、ウェルを接続するチャネル領域、及び上部部材の他の領域は露光しない。露光後処理及びフォトレジスト除去の後、マスターは複数の層状構成要件を含有する。この工程を繰り返すことにより、マスター上に高さ約3mmのマクロ構成要件を導入する。
【００９９】
PDMSプレポリマーをマスターにキャストすると、PDMSプレポリマーはマスター内の構成要件を忠実に複製する。キャスト時には、マクロ構成要件の高さよりもわずかに低い量で、PDMSを添加する。4時間にわたって65℃でPDMSを硬化した後、PDMSをシリコン・マスターから剥離し、石けん及び水で徹底的に清浄化し、そして100%エタノールですすぐ。ガラス支持部材も清浄化してエタノールですすぐ。PDMS膜及びガラス支持部材を1分間にわたってプラズマで酸化する。この場合互いに結合される側が上を向くようにする。次いでPDMS膜をガラス支持部材上に置き、圧力を加えることにより、PDMS膜とガラス支持部材との間に形成されているおそれのあるいかなる気泡をも除去する。組み立てられた装置を次いで4℃まで冷ます。PDMS膜及びガラス支持部材をプラズマ酸化する15分間以内に、第1ウェル内に20マイクロリットル(μl)のMatrigel(その他のヒドロゲルも使用可能)を注ぎ、これを毛管内に流し込んでおく。装置を15分間にわたって室温に置くことにより、Matrigelを硬化させる。次いで、真空及びパスツール・ピペットを使用して、上部部材のウェルから余剰のゲルを除去する。
【０１００】
実施例2：細胞化学侵襲性アッセイ
チャンバ内の細胞及び試験薬の配置
上部部材のチャンバの第1及び第2のウェルに、リン酸緩衝食塩水、PBSを満たす。第2ウェルの底部をフィブロネクチン(1mg/ml)又はその他の細胞外マトリックス・タンパク質で、30分間にわたって処理し、続いてPBSで2回洗浄することができる。PBSを吸引した後、第2ウェル内の加熱されたばかりの培地50μl中に、星状細胞腫細胞(U87-MG)を入れる(24ウェル・プレートの1ウェル当たり25,000個の細胞、1ウェル当たり容積50μlの培地)。細胞はチャンバの第2ウェルを通して堆積され、そして第2ウェルの底部に付着する。
【０１０１】
37℃のインキュベータ内に一晩にわたって、細胞を放置して第2ウェル内に付着させて広げる。試験開始時、細胞培地を、血清なしの新鮮な培地と交換する。培地1ml当たり10μgのbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)を各チャンバの第1ウェルに添加する。
【０１０２】
画像取得及びデータ分析
AXIOCAM(登録商標)を使用して、Zeiss倒立顕微鏡でデジタル画像を撮る。AXIOVISION(登録商標)ソフトウェアでデータを分析する。低速度撮影画像を4日間にわたって同じ時間に毎日撮る。
【０１０３】
実施例3：溶液勾配を使用した細胞化学侵襲性阻害アッセイ
チャンバ内の細胞及び試験薬の配置
3つのチャンバに関して、上部部材の各チャンバのウェルにPBSを満たす。第2ウェルの底部をフィブロネクチン(1mg/ml)又はその他の細胞外マトリックス・タンパク質で、30分間にわたって処理し、続いてPBSで2回洗浄することができる。PBSを吸引した後、第2ウェル内の加熱されたばかりの培地50μl中に、U87-MGを入れる(24ウェル・プレートの1ウェル当たり10,000個の細胞、1ウェル当たり容積50μlの培地)。細胞は各チャンバの第2ウェルを通して堆積され、そして第2ウェルの底部に付着する。
【０１０４】
37℃のインキュベータ内に一晩にわたって、細胞を放置して第2ウェル内に付着させて広げる。試験開始時、細胞培地を、血清なしの又は1%血清の新鮮な培地と交換する。培地1ml当たり1μgのbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)をチャンバの第1ウェルに添加する。溶液勾配を1時間にわたって形成させておく。
【０１０５】
3つの異なるチャンバに関して、チャンバ#1の第2ウェル内には100μMのLY294002を入れ、チャンバ#2の第2ウェル内には10μMのLY294002を入れ、チャンバ#3の第2ウェル内には1.0μMのLY294002を入れる。
【０１０６】
画像取得及びデータ分析
AXIOCAM(登録商標)を使用して、Zeiss倒立顕微鏡でデジタル画像を撮る。AXIOVISION(登録商標)ソフトウェアでデータを分析する。低速度撮影画像を4日間にわたって同じ時間に毎日撮る。
【０１０７】
実施例4：支持部材上の生体分子の固定化
上述のような装置の組立て後、(CH3CH2O)3Si(CH2)3NH2を含有するエタノール溶液を、チャネル領域に満たす。20分後に室温で、エタノールを使用してチャネル領域を洗浄する。装置を105℃で1時間にわたってインキュベートすることにより、支持部材上に形成されたシロキサン単層を架橋する。装置をエタノールで洗浄することにより、残留物を除去する。チャネル領域に、ジイソシアネート、つまりヘキサメチレンジイソシアネート又はトリルジイソシアネートの溶液(アセトニトリル中又はN-メチルピロリジノン中1%)を満たす。ジイソシアネートを、支持部材上に形成されたシロキサン単層の末端アミノ基と2時間にわたって反応させておく。ジイソシアネートを洗い流す。チャネル領域に、ヘパラン硫酸又はその他の硫酸化炭水化物(例えばヘパリン、ヘパリン・フラグメント、硫酸化糖を含有するレクチンなどのジアセチル化形)を満たす。ヘパラン硫酸を支持部材と反応させておくことにより、固定化種を形成する。ヘパラン硫酸溶液及びその他の試薬を洗い流す。チャネル領域内にケモカイン溶液(CC, CXC, CX3C又はXC群から選択された任意のケモカインが使用可能である)を導入する。静電的相互作用によって、pIがより高い(〜9-10)ケモカインが、負荷電された硫酸化支持部材上に吸着する。
【０１０８】
実施例5：表面勾配を使用した化学走性阻害アッセイ
2つのウェルに50μlのPBSを満たし、そして静水学的圧力を平衡化させておく。第1ウェルに5μlの抗hisx6抗体を添加し、そして第2ウェルに5μlの緩衝液を添加することにより、静水学的圧力を平衡化させる。拡散により、抗体濃度は第1ウェルから第2ウェルへの勾配を形成する。室温で2時間後、50μlの緩衝液を第2ウェルに添加し、そして第1ウェルから50μlを除去することにより、2つのウェルを洗浄する。物理吸着により溶液勾配を表面上に移し、これにより表面勾配を形成する。濃度25μg/mlのIL-8(HISx6融合標識を有する組換えヒトIL-8、R+D システム、カタログ番号968-IL)の溶液をチャネル領域に添加する。溶液を30分間にわたって室温でインキュベートしておく。余剰のIL-8ケモカインを洗い流し、結合されたIL-8で表面を装飾する。第2ウェルに(健康なドナーから分離されたばかりの)好中球を添加する。典型的には20,000〜100,000個の細胞を容積範囲10〜550μlで添加する。好中球を支持部材に付着させておき、そしてIL-8のより高い濃度に向かって遊走させておく。LI-8に対するポリクローナル抗体を添加することにより、遊走を阻害する。
【０１０９】
実施例6：層流により形成された勾配中にTNF-αを供給することによる、内皮細胞の選択的活性化
本発明の装置の表面に、内皮細胞をコーティングし、これらの細胞を密集するまで成長させておいた(細胞の「芝生」の形成)。層流を介して内皮細胞の芝生にTNF-αを供給することにより、内皮細胞を「活性化」した。TNF-αを含有する溶液のそれぞれの流れは異なる濃度であり、したがってチャネルに対して垂直に勾配を形成した。この勾配は内皮細胞の芝生にTNF-αを、細胞の芝生上の異なる位置には異なる濃度で効果的に供給した。次いで、活性化された内皮細胞の芝生上に白血球を流した。TNF-αによって活性化された内皮細胞だけが、白血球に対する好適な「付着」部位を提供する。白血球は、芝生全体に同等に付着することはなく、高濃度のTNF-αに露出されている内皮細胞芝生領域には付着し、低濃度のTNF-αに露出されている内皮細胞芝生領域、又はTNF-αに全く露出されていない領域には付着しなかった。これらの結果は、層流によるTNF-αの濃度勾配が確かに形成されたことを示す。図21を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
本発明の種々の特徴は、下記説明と添付の図面とを同時に参照することにより最も明らかになる。
【図１Ａ】図1Aは、本発明による試験装置の1の実施態様の一部を部分横断面にして示す、頂面斜視図である。
【図１Ｂ】図1Bは、本発明の試験装置の1の実施態様を示す頂面斜視図である。
【図１Ｃ】図1Cは、図1Bの試験装置のチャンバの1つを長手方向に横断面にして示す側方立面図である。
【図２Ａ】図2Aは、本発明の試験装置において定義されたチャンバの別の実施態様であって、チャネル領域が単一のチャネルを画定する実施態様を示す概略的な頂面図である。
【図２Ｂ】図2Bは、図1Bに基づく試験装置の実施態様において定義されたチャンバの実施態様であって、チャネル領域が単一のチャネルを画定する実施態様を示す概略的な頂面図である。
【図２Ｃ】図2Cは、本発明の試験装置において定義されたチャンバの別の実施態様であって、チャネル領域が単一のチャネルを画定する実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図３Ａ】図3Aは、本発明の試験装置において定義されたチャンバの別の実施態様であって、チャネル領域が同一の長さを有する複数のチャネルを画定する実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図３Ｂ】図3Bは、チャンバの一方の側からチャンバの他方の側に向かって長さが増大する複数のチャネルを画定するチャネル領域を示す、図3Aと同様の図である。
【図３Ｃ】図3Cは、チャンバの一方の側からチャンバの他方の側に向かって幅が増大する複数のチャネルを画定するチャネル領域を示す、図3Aと同様の図である。
【図４Ａ】図4Aは、本発明による試験装置の別の実施態様を示す、図1Bと同様の図である。
【図４Ｂ】図4Bは、チャネルの側方の細胞を示す、図4Aのチャネルの拡大概略頂面図である。
【図５】図5は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、ウェルがその頂面図では台形である実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図６】図6は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、ウェルがその頂面図では台形である実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図７】図7は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、チャンバがその頂面図では図8の形状を成す実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図８】図8は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、一方のウェルがその頂面図では矩形であり、他方のウェルがその頂面図では円形である実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図９】図9は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、第1ウェル領域及び第2ウェル領域がそれぞれ複数のウェルを画定し、チャネル領域がそれぞれのウェル領域の各ウェルを接続する複数のチャネルを画定する実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図１０】図10は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、チャネル領域がそれぞれのウェル領域の各ウェルを接続する複数のチャネルを画定する実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図１１】図11は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、第1ウェル領域が複数のウェルと、それぞれのウェルに対応する各毛管とを有し、チャネル領域が単一のチャネルを有し、そして第2ウェル領域が単一のウェルを有する実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図１２】図12は、本発明による支持部材の一部の実施態様であって、この支持部材部分を本発明に基づくチャンバの長手方向軸に沿って示す、側方横断面図である。
【図１３】図13は、本発明の1の実施態様に基づく捕集システムを示す等角図である。
【図１４】図14は、本発明の試験装置において画定されたチャンバの別の実施態様であって、第1ウェル領域が毛管網状構造によって相互接続された複数のウェルを含み、該チャネル領域が単一のチャネルを含み、そして第2ウェルが単一のウェルを含む実施態様を示す、図2Aと同様の図である。
【図１５】図15は、本発明の1の実施態様に基づく自動分析システムを示すブロック線図である。
【図１６】図16は、本発明の1の実施態様に基づく方法のフローチャートである。
【図１７】図17は、画像データ例であって、これに基づいて図16の方法を実施することができる例を示す図である。
【図１８】図18は、図17の画像データから得ることができるヒストグラムを示す図である。
【図１９】図19は、画像データ例を示す図である。
【図２０】図20は、図19の画像データ例から得ることができるヒストグラムを示す図である。
【図２１】図21は、TNF-αの濃度勾配を層流を介して生成することを含む試験の結果を示す図である。TNF-αは内皮細胞の密集した「芝生」に供給された。TNF-αによって接触された内皮細胞は活性化され、ひいては白血球と結合可能になる。次いで内皮細胞には白血球が送達された。図面に示すように、白血球は、高濃度のTNF-αを受容する内皮細胞領域には結合されるのに対して、TNF-αに全く又はほとんど露出されない内皮細胞領域は、白血球には結合しなかった。
【図２２】図22は、層流勾配を形成するためのミクロ流体装置を示す図である。
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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