(57)【要約】本発明は、細胞の集合体からバイオバーデンを除去して、ワクチンを製造するための生存能力と免疫原性を維持する無菌細胞を得る方法に関する。本発明は、さらに、固形腫瘍由来の無菌のワクチンを製造し、投与することを含む、免疫反応を誘発して転移の再発を防ぐ方法に関する。ガン患者から固形腫瘍を摘出し、酵素で腫瘍細胞を消化して分離した細胞を得、該分離した細胞に放射線を照射して該細胞が非腫瘍形成性である状態にし、細胞を滅菌することによって、ワクチンを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移の再発を防ぐ免疫反応を誘発する方法であって、
固形腫瘍組織をガン患者から摘出することと、
該腫瘍組織を処理して、内生のバイオバーデンを減少させることと、
該腫瘍組織を酵素で消化して、分離した腫瘍細胞を得ることと、
放射線量を前記分離した腫瘍細胞に加えて、前記腫瘍細胞を非腫瘍形成性にし、かつ無菌にすることと、
前記患者に、前記無菌の、１回分の用量の非腫瘍形成性細胞を、転移の再発を防ぐ免疫反応を誘発するのに十分な処方計画で投与することから成り、前記用量は、約107個の生存腫瘍細胞を含み、かつ少なくとも80％に生存能力がある腫瘍細胞集団から成ることを特徴とする、前記免疫反応を誘発する方法。
【請求項２】
界面活性剤を含む生理学的な溶液に少なくとも１回交換して前記腫瘍を洗浄して、摘出前にバイオバーデンを減少させることをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗菌活性を提供する一方で細胞毒性を最小限にする期間及び濃度で、殺菌剤溶液によって腫瘍を分離前に処理することをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
約107個の分離した結腸腫瘍細胞を薬剤的に受容可能な担体で含む、ヒト結腸ガン患者において免疫原性による反応をもたらす注射可能なワクチン組成物であって、前記腫瘍細胞は、無菌で、非腫瘍形成性で、前記患者に自家のものであって、トリパン・ブルー排除法によって測定した少なくとも80％の生存度を有し、前記組成物は、皮内注射によって前記患者に投与した際に免疫原性による反応を生じることを特徴とする、前記ワクチン組成物。
【請求項５】
前記組成物は、アジュバント又は免疫賦活剤も含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
生存腫瘍細胞の、無菌の、非腫瘍形成性の組成物を製造する方法であって、
腫瘍組織を得ることと、
該腫瘍組織を、微生物による組織の汚染を減らす殺菌剤で処理することと、
該組織を酵素で消化して、分離した腫瘍細胞を得ることと、
該分離した腫瘍細胞を凍結させることと、
凍結した細胞に、微生物及び腫瘍形成性を不活性化し、かつ細胞の生存能力を維持するのに十分な量の照射線量を加えて、無菌の、非腫瘍形成性の腫瘍細胞を得ることから成り、
前記無菌の、非腫瘍形成性の、免疫原性の腫瘍細胞は、トリパン・ブルー排除法によって測定される少なくとも80％の生存度を有することを特徴とする、前記組成物を製造する方法。
【請求項７】
界面活性剤を含む生理学的な溶液で前記腫瘍組織を洗浄することをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍を殺菌剤で処理することには、殺菌剤で分離前に前記腫瘍組織を処理することが含まれることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍組織は、結腸腫瘍組織であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
注射可能な免疫原性を有する用量の、無菌の非腫瘍形成性結腸腫瘍細胞を製造する方法であって、
界面活性剤を含む洗浄溶液で結腸腫瘍組織を洗浄することと、
結腸ガン患者から洗浄した腫瘍組織を摘出することと、
微生物による組織の汚染を減らす殺菌剤で摘出した腫瘍組織を処理することと、
少なくとも１種の抗生物質及び抗真菌剤の存在下において分離酵素で該腫瘍組織を消化して、少なくとも約107個の分離した腫瘍細胞を得ることと、
分離した腫瘍細胞を凍結させることと、
約150,000〜200,000ラッドの線量のガンマ線を凍結した腫瘍細胞に加えて、該腫瘍細胞を無菌にし、非腫瘍形成性にすることと、
該腫瘍細胞を、注射用の薬剤的に受容可能な担体と混合して、少なくとも約107個の分離した腫瘍細胞を含む注射可能な用量を製造することから成り、
前記用量は、トリパン・ブルー排除法によって測定される少なくとも80％の生存度を有する無菌の非腫瘍形成性腫瘍細胞を含み、かつ患者に注射した際に免疫原性による反応を誘発することを特徴とする、前記無菌の非腫瘍形成性結腸腫瘍細胞を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年２月２２日出願の米国仮出願第60/358,431号の優先権を主張するものであり、その開示内容全体を本願明細書に引用して援用する。
【０００２】
本発明は、概して、生物細胞の滅菌方法、及び生じた無菌細胞産物、より詳細にはガンのワクチンに関するがこれに限定されず、本発明は、無菌の、免疫原性の、生存能力があるが非腫瘍形成性の腫瘍細胞組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の、化学的、物理的又は生理学的な性質は、細胞の周囲環境の変動によって大幅に変化するので、予防及び治療目的で生物細胞組成物を滅菌することは困難である。例えば、エチレンオキシドを用いるガス滅菌は有毒であり、かつ発ガン性があることが知られている。微生物を死滅させるのに十分な間、約１〜３mRad（メガラッド）を照射すると、タンパク質、DNA、RNAなどの構造が変化し、細胞が生物学的に改変されるか、又は細胞が、その対象とする免疫原性もしくは他の生物機能について完全に不活性になる。使用される任意の化学的又は物理的手段によって、高水準の無菌性が達成されるだけでなく、細胞の代謝及び免疫原性の特性が実質的に減少しないことも重要である場合、さらに困難となる。
【０００４】
題名が“Active Specific Immunotherapy”である米国特許第5,484,596号（”'596特許”）は、切除可能な固形ガンでヒトの結腸ガン患者を治療して転移の再発と成立を阻害する方法に関する。前記方法は、結腸腫瘍組織をヒトのガン患者から外科的に除去することと、腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を得ることと、生存能力があるが非腫瘍形成性であるように腫瘍細胞を照射をすることと（20,000ラッドを用いて）、生存能力があるが非腫瘍形成性である腫瘍細胞含むワクチンを製造することと、ガン患者の免疫システムが外科手術から回復した後にワクチンを皮内注射することからなる。
【０００５】
大腸内の結腸腫瘍由来であることによって、'596特許の方法によって製造されたガンワクチンは無菌ではない。前記特許に従って製造されたワクチン産物（OncoVAX（登録商標））は、数百人のヒト患者にすでに投与されているが、監督機関は、そのようなワクチン産物は無菌でなければならないことを要求している。免疫原性細胞製剤を得るためには、腫瘍細胞は生存能力があり、かつ代謝的に活性がなければならない。従って、細胞を無菌にするどの処理も、効果に必要な細胞の必須の生物学的特徴を過度に危うくしてはならない。必要とされていることは、細胞製剤を無菌にする一方で、生存度と免疫原性を維持する方法である。そのような滅菌方法は、既存の製品製造工程に容易に組み入れることができるのが好ましい。
【０００６】
本発明は、腫瘍細胞の免疫原性特性が実質的に変化することなく、安全な、無菌の腫瘍細胞組成物を得ることを対象にする。これらの目的は、必ずしも両立できるとは限らない。例えば、滅菌することによって、微生物の感染を不活性化することができるだけでなく、哺乳類細胞も実質的に不活性化することが可能であり、殺菌剤が微生物を死滅させるだけでなく、哺乳類細胞も死滅させることができ、放射線によって、微生物の感染を不活性化することができるだけでなく、哺乳類細胞の免疫原性及び他の特性も大幅に改変することが可能である。したがって、細胞の必須の代謝特性及び免疫原性特性を実質的に妨げない無菌の、非腫瘍形成性の腫瘍細胞組成物を得る方法を提供することが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、治療薬及び予防薬を製造するための生存能力と免疫原性を保つ無菌の細胞組成物を得るために、腫瘍細胞からバイオバーデンを除去し、不活性化する化学的手段と物理的手段の高い効果を有する組み合わせを提供する。この滅菌処理方法は、幅広い種々の細胞の種類に有用であると考えられるが、ガンワクチンを製造するために固形腫瘍組織を滅菌するのに特に有用であると考えられ、該ガンワクチンの例として、'596特許の自家の結腸ガンワクチンがある。
【０００８】
本発明は、さらに、固形腫瘍由来の無菌のワクチンを投与することによって、ガンを治療し、かつ転移の再発を防ぐ方法に関し、該固形腫瘍として、結腸ガン、腎臓ガン、乳ガン、肺ガン、及び骨肉種を含む肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、本発明は、生体内原位置の腫瘍から始まり、微生物の増殖の形跡を全く示さない無菌の腫瘍細胞のワクチンをもたらす統合した多段階の方法を提供する。
【０００９】
本発明の更なる実施態様によれば、生体内原位置の結腸腫瘍を、生理食塩水と界面活性剤を含む洗浄溶液で強く洗浄する。洗浄溶液を含む袋に無菌のポート（port）を無菌で装着し、腫瘍及び周辺組織上へ当該溶液を“噴出する”ことによって、強力な洗浄を達成してもよい。適した界面活性剤として、例えば、Triton X-100、NP40及びTween 80が挙げられる。次に、管理された状態で、腫瘍を摘出し、ワクチン製造設備に輸送してもよい。
【００１０】
次に、摘出した腫瘍を切開し、化学的な殺菌剤で処理し、消化前に細分化して、個々の腫瘍細胞を遊離させる。殺菌剤の濃度及び処理期間は、抗菌活性を高める一方で、細胞毒性を最小限にするように選択される。適した殺菌剤として、クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）（オキシクロロセン（oxychlorosene）ナトリウム）（United-Guardian，Inc.）、次亜塩素酸ナトリウム、オキシゲン（Oxygene）（登録商標）（滅菌した二酸化塩素）（Oxyfresh Worldwide，Inc.）が挙げられるが、これらに限定されない。殺菌後、分離酵素を用いて、好ましくは抗生物質及び１種又はそれ以上の抗真菌剤の存在下において腫瘍を細分化し、消化する。適した分離酵素の例として、コラゲナーゼ及びトリプシンが挙げられる。分離中に使用する抗生物質及び抗真菌剤として、アミノグリコシド抗生物質（例えばゲンタマイシンなど）、β−ラクタムチエナマイシン抗生物質（例えば、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）（イミペネム）（Merck & Co., Inc.）など）、キノロン抗生物質（例えば、レバキン（Levaquin）（登録商標）（レボフロキサシン）（Ortho-McNeil）など）及び抗真菌剤（例えばアンホテリシンＢなど）が挙げられる。
【００１１】
分離後、懸濁した腫瘍細胞を、約-1℃／分で約-80℃の温度に速度を調整して凍結させることによって凍結保存してもよい。次に、好ましくはまだ凍結している間に、微生物及び腫瘍形成性を不活性化するのに十分な線量を腫瘍細胞に照射するが、細胞の生存度、代謝活性及び免疫原性に悪影響を及ぼさない。照射線量は、約100,000〜200,000ラッドのガンマ線であり、好ましくは約150,000〜200,000ラッドの範囲内であり、より好ましくは約190,000〜200,000ラッドの範囲内である。患者に投与する前に、照射した細胞を、解凍するまで低温貯蔵状態に保つ。
【００１２】
患者に、好ましくは１回の用量当たり約107個の生存腫瘍細胞数で解凍した無菌細胞をガンワクチンの形で皮内注射によって投与して、免疫反応を誘発し、転移の再発を防いでもよい。前記用量には、典型的には、トリパンブルー排除法（Trypan Blue exclusion）によって測定した少なくとも80％以上の生存度を有する腫瘍細胞が含まれる。最低３週間の間、１週間につき１回分の用量を含めて、数回分の用量でワクチンを患者に投与してもよい。免疫反応をさらに促進するために、用量を、アジュバント又は免疫賦活剤の生理食塩水溶液と混合してもよい。適したアジュバント及び免疫賦活剤の例として、BCG（Bacillus of Calmette and Guerin (Organon, Inc.)）、Corynebacterium parvum（GlaxoSmithKline）、KLH（keyhole limpet hemocyanin（Intracel Corp.））などの“ヘルパー（helper）”抗原、並びにGM-CSF（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（Leukine（登録商標））（Schering-Plough））及びインターフェロン（Avonex（登録商標）（Biogen，Inc.））などのリンフォカイン−サイトカインが挙げられる。
【００１３】
特に好ましい実施態様によれば、本発明の滅菌方法は、（１）生体内原位置の結腸腫瘍及び周囲の組織を、500mlの分量の無菌の標準生理食塩水で４回、１％のTriton X-100を含む生理食塩水の洗浄液で少なくとも１回以上強く洗浄することと、（２）0℃〜6℃の温度で腫瘍を輸送し、それによって外科的な摘出と分離処理の開始の間に48時間の間隔を置くことを可能にすること；（３）細分化の前に、0.4％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で２分間、腫瘍断片を処理することと（４）ゲンタマイシン、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）、レバキン（Levaquin）（登録商標）及びアンホテリシンＢの存在下で腫瘍を分離することと、（５）凍結している間に、分離した細胞に、200,000ラッドを照射することを含む。生じた無菌の腫瘍細胞を用いて生物学的等価試験を開始した。陽性の免疫原性の基準は、３回目の注射に対する5mmを超える遅延型皮膚過敏（Delayed Cutaneous Hypersensitivity，“DCH”）反応である。現在まで、１２人の患者を治療した。患者はすべて、陽性の免疫原性の反応基準を超えるDCH反応（平均14.6X13.4mm）を有していた。ガンの診断上の進度によって、患者は、１回目の注射から５〜９月後に４回目の治療を受けた。４回目の治療を受けた６人の患者のうち５人に平均で15.1x15.1mmのDCH反応があった。これらの反応は、滅菌した腫瘍細胞に対する長期の免疫が発生し、それ故に結腸直腸のガンの再発に対する免疫が発生していることを示す。
【００１４】
添付した図と共に以下に詳細に説明することにより、本発明のこれらの及び他の利益及び特徴がより容易に理解されるだろう。以下の例は、結腸腫瘍及び自家の結腸ガンのワクチン製剤について述べているが、本発明が教示することは、滅菌されるにもかかわらず、依然として生存能力を有し、代謝活性を有し、非腫瘍形成であり、免疫原性であることを目的とするどの固形腫瘍細胞にも適用できる。
【００１５】
図１は、ワクチン細胞の免疫原性の有効性を示し、本発明に従って製造したOncoVAX（登録商標）を開発するために使用した実験モデルで試験し、本来の無菌でないOncoVAX（登録商標）の方法によって製造したワクチン細胞の有効性と比較したものである。図で見られるように、改良した滅菌方法は、有効性に悪影響を全く与えなかった。実施例６に示すように、これらのデータは、本発明に従って製造したOncoVAX（登録商標）で治療したヒト患者の研究によって確認され、与えられた。
【００１６】
図２は、生物物質のバイオバーデンに対する洗浄条件の効果を示す。15個の腫瘍を、生体内原位置で、HBSS/Gを該腫瘍に浴びせることによって（P）、又は生理食塩水のみ（S）を、もしくはTriton X-100と混合した生理食塩水（T）を腫瘍に噴出することによって洗浄した。次に、腫瘍組織を分離した。細胞懸濁液内のバイオバーデンを、膜濾過方法を用いて検定し、TSA-SB及びSABプレート上に蒔いた。バイオバーデンは、107個の腫瘍細胞当たり、OncoVAX（登録商標）の約１回分の用量当たりのコロニー形成ユニット（colony forming units，（CFU））として表される。
【００１７】
図３は、生理食塩水のみを用いた腫瘍の洗浄サイクル数のバイオバーデンに対する効果を示す。５個の腫瘍を、切開前に生理食塩水を用いて５回洗浄した。各洗浄由来の流出液体を別々に回収し、TSA-SBプレート上に直接蒔くことによって、バイオバーデンについて検定した。各腫瘍ごとに、各洗浄において得られた生のコロニーの総数を、最初の洗浄におけるCFUで割って、データを標準化した。標準化したデータの平均と標準偏差をプロットした。
【００１８】
図４は、生理食塩水とTriton X-100を用いた腫瘍の洗浄サイクル数のバイオバーデンに対する効果を示す。５個の腫瘍を切開前に５回洗浄した。洗浄１、２、３、４及び５は、生理食塩水を含む。洗浄番号２は、１％Triton X-100の生理食塩水溶液である。各洗浄由来の流出液を別々に回収し、TSA-SBプレート上に直接蒔くことによって、バイオバーデンについて検定した。各腫瘍ごとに、各洗浄において得られた生のコロニーの総数を、最初の洗浄におけるコロニーの総数で割って、データを標準化した。標準化したデータの平均と標準偏差をプロットした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明における“無菌の”又は“滅菌”という用語は、組織又は細胞が、検出可能なすべての細菌、酵母及び菌類を含まないものになっていることを示すために用いられる。これは、すべての適用される規制要件に基づいている。
【００２０】
手術室の無菌手法によって、摘出した腫瘍細胞が外部から汚染される可能性を減少させる。結腸腫瘍に関しては、患者の抗生物質による治療と、手術前の腸の準備と、結腸の切除によって、内生のバイオバーデンと糞便汚染をさらに減少させることができる。しかしながら、解剖学的な位置と腸内微生物の存在のために、そのような手段は、有用であるが、ワクチンの開発に必要な程度、腫瘍を無菌にすることへの第一段階にすぎない。
【００２１】
腫瘍細胞の最初の病理学的な処理を行うのに好ましい場所は、無菌の手術室又はその他の制御された環境である。ここで、腫瘍及び生体内原位置の腫瘍を含む結腸又は他の器官を洗浄することによって、結腸から腫瘍を摘出する前に、残余の糞便物質、粘液性物質又は他の外来物質を除去することで、バイオバーデンを減少させることができる。強く洗浄することが好ましく、結腸を洗浄することによって、例えば噴出瓶を用いて腫瘍の表面及び周辺の組織に対して無菌の洗浄溶液を発射することによって、達成することができる。洗浄溶液は、例えば、無菌の、正常生理食塩水及び界面活性剤であってもよい。界面活性剤は、免疫組織化学を含むその後の組織学的な手法を過度に妨害してはならない。適した界面活性剤として、Triton X-100、NP40及びTween 80が挙げられるが、他の様々な界面活性剤を使用してもよい。
【００２２】
生体内原位置の腫瘍を強く洗浄するために、500mLの柔軟な袋に使用できる静脈注射用の生理食塩水に無菌のポート（port）を無菌で取り付けて、前記袋を噴出瓶に変えることができる。結腸を、例えば、垂直に又は水平に保持し（腫瘍を含む結腸部分をわずかに上げて）、いくつかの500ｍLの洗浄液を腫瘍上へ強く発射して、その後の切開の間に腫瘍をさらに汚染することが可能な糞便物質を除去することができる。異なる洗浄条件（強く洗浄することに対して洗浄溶液を浴びせること）、異なる洗浄サイクル数並びに異なる洗浄溶液及び量を含めて、本願明細書における教示を用いて、様々な量の洗浄溶液及び界面活性剤及び／又は抗生物質を使用してもよい。500mLの生理食塩水を強く噴出することによって生体内原位置の腫瘍を４回洗浄し、500mLの１％のTriton X-100の生理食塩水溶液を強く噴出することによって１回洗浄することによって、バイオバーデンを後の腫瘍処理のために十分に除去できることを見出した。
【００２３】
生体内原位置の腫瘍を洗浄した後、病理学者は、後に、ワクチン製造業者又はさらに処理をするための他の設備施設に輸送するために、手術室内で（又はその他の制御された環境で）腫瘍を除去し、切開してもよい。切開した腫瘍を、輸送中、適切な温度条件を維持する任意の適切な方法によって輸送してよい。好ましくは、腫瘍の輸送又は貯蔵の前に、ゲンタマイシンなどの抗生物質を輸送培地に添加する（例えば、ml当たり50μgのゲンタマイシンを含むハンクス緩衝塩類溶液（Hank's Balanced Saline Solution，HBSS）（HBSS/G））。適切な抗生物質を培地に添加し、切開した腫瘍を、約0℃〜6℃の範囲内の温度に保つ場合、外科病院から遠い設備施設まで、約48時間以上にわたって、切開した腫瘍を輸送できることが見出された。
【００２４】
さらに細分化し、分離する前に腫瘍断片を殺菌することによって、切開した腫瘍の表面汚染をさらに減少させる。しかしながら、化学的殺菌剤は全体に作用し、それ故に哺乳類細胞と細菌（又は菌類）の細胞を区別しない。その結果、抗生物質で処理するのとは異なり、化学的殺菌剤を殺菌濃度で分離した腫瘍細胞に対して使用すると、腫瘍細胞に対する受け入れ難い水準の毒性が生じる。
【００２５】
病理学者は、多くの場合腫瘍を切断して、浸透の最も深い限度を決定するので、摘出した腫瘍は、典型的にはいくつかの断片を包含する。これらの断片を、好ましくはHBSS/Gの存在下においてさらに切開して、殺菌工程を行う前に、外来の非腫瘍及び壊死組織はどれも除去してもよい。結腸腫瘍の管腔の表面は、典型的には最大量のバイオバーデンを含む。化学的殺菌剤は、曝露した腫瘍細胞と共に曝露したどの微生物も殺す。このように、殺菌剤を使用することによって、表面にバイオバーデンがある切開した腫瘍断片の外側部分を化学的に“麻痺させる”ことができる。切開した腫瘍を細分化する前にそのように処理することによって、最小の表面部分を殺菌剤に曝す一方で、腫瘍断片の表面が殺菌される。したがって、腫瘍のより深いところ（deeper aspects）は影響を受けず、それによって、生存腫瘍細胞の供給源を残す。ポリープの種類の結腸腫瘍は複数の陥入があるので、細菌が捕捉され、殺菌剤から保護される領域がある。したがって、適切な殺菌剤で処理することによって、内在のバイオバーデンは大幅に減少するが、完全に除去されない。
【００２６】
カレル−デーキン（Carrel-Dakin）液（緩衝化した0.5％の次亜塩素酸ナトリウム）及びクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）を含めて、種々の殺菌剤と量を種々の濃度及び曝露時間で用いてもよい。一実施態様では、切開した腫瘍断片を、0.4％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）に２分間曝露する。切開した腫瘍断片を、殺菌剤溶液（例えば、約125mLの0.4％クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標））が入っているフラスコ内に入れ、次に、約200rpmで約２分間、回転台シェーカー上で振盪することを含めて、どの適した方法によっても、殺菌を好都合に行うことができる。結腸腫瘍断片について、腫瘍の細分化及び分離前に、約0.4％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で２分間、１回処理することによって、有益な結果が得られることが見出された。通常は、化学処理した後、化学的殺菌剤を生理食塩水で洗浄することによって除去する。
【００２７】
腫瘍の殺菌を行った後に、ライン・クリアランス（line clearance）及び生物安全キャビネット（biological safety cabinet，BSC）の衛生化などの適切な無菌手法によって、再び汚染される可能性を減少させる。製造物を環境に曝す結果となるすべての工程をBSC内で行うべきであり、BSC内に物質を入れる前に、全ての物質に70％のイソプロピルアルコール又は他の適切な殺菌剤を噴霧するか、該物質を70％のイソプロピルアルコール又は他の適切な殺菌剤で拭うべきである。
【００２８】
次に、殺菌した腫瘍断片を、任意の適切な方法によって細分化して、分離処理のために小さい断片（約2〜4mm2）を得てもよい。細分化することによって、より大きい腫瘍の表面部分を分離酵素に曝すことで分離処理が促進される。断片を、例えば、HBSS/Gで濯ぎ、腫瘍を完全に細分化するまでクライオラック（Kryorack）内で約0℃〜+6℃に保ち、適切な量の、例えば約3.0グラムの腫瘍断片を、その後の分離酵素による消化のために得て、個々の腫瘍細胞を遊離させてもよい。
【００２９】
分離前に、腫瘍断片を、抗生物質（例えばゲンタマイシン）を含む生理学的な溶液（例えばHBSS）（HBSS/G）で洗浄してもよい。分離処理を行うためには、切り取り、細かく刻んで断片にした腫瘍断片を、フラスコ又は他の適した容器に移し、腫瘍細胞の懸濁溶液を形成するのに十分な時間、酵素分離培地とインキュベートする。期間は、酵素の濃度及び選択、並びに分離サイクルの数に左右される。酵素は、典型的には、コラゲナーゼ−DNaseのHBSS溶液（例えば、30〜40mlの0.14％（200ユニット／mL）コラゲナーゼ・タイプ１（Advance Biofacture）と0.1％（500Kunitz ユニット／ml）デオキシリボヌクレアーゼ・タイプ１（Sigma D-0876））であるが、任意の適した分離酵素溶液を用いてもよい。無菌のHBSSを、ゲンタマイシン又は別の抗生物質と共に用いて、酵素分離によって得られた細胞懸濁液を洗浄してもよい。一実施態様において、酵素分離培地（30mL）は、0.14％コラゲナーゼ、0.1％DNaseのゲンタマイシン含有HBSS（HBSS/G）溶液である。約2〜4mm2の腫瘍の断片について、36〜38℃で35〜45分間の３回の分離サイクルによって、約7.2x107個以上の腫瘍細胞が得られることが見出された。各分離サイクルの後に、細胞を遠心し、濯ぎ、無菌のHBSS/Gに再懸濁してもよい。
【００３０】
生じた細胞懸濁液を、望ましいのであれば、ナイロン・メッシュを用いてふるいにかけて、どんな細胞の塊も除去してもよい。小児の輸血キットなどの閉鎖システムを用いて、任意の汚染の可能性を減少させてもよい。次に、生じた分離細胞をバイアルに入れ（vialed）、品質管理目的で試験した製品を試験し、発売するために、無作為の品質管理サンプルを保持する。
【００３１】
腫瘍の陥入内に捕捉された微生物は、典型的には、細分化及び酵素分離の最中に放出される。酵素分離は、また、腸内微生物の増殖に好都合な条件下で起こる。分離中に抗生物質を存在させることによって、分離中に放出されるバイオバーデンを減少させ、分離中に微生物がさらに増殖するのを阻害することができることが見出された。抗生物質は、典型的には、長期間に渡って作用する。しかしながら、分離処理は比較的期間が短いものなので、特定の抗生物質と抗真菌剤のカクテルは、分離酵素とインキュベートする間に使用するのに好ましい。分離中に酵素とインキュベートするのに好ましい抗生物質及び抗真菌剤として、嫌気性菌に対して有効な抗生物質（プリマキシン（Primaxin）（登録商標）など）、グラム陽性好気性菌に対して有効な抗生物質（キノロン類の抗生物質、例えばレボフロキサシンなど）及び抗生物質が作用しない酵母に対して作用する抗真菌剤が挙げられる。好ましい抗真菌剤はアンホテリシンＢである。一実施態様において、酵素分離培地は、酵素分離培地1mL当たり25μgのレバキン（Levaquin）（登録商標）、100μgのプリマキシン（Primaxin）（登録商標）及び1μgのアンホテリシンＢを含む。
【００３２】
次に、凍結保存の前にさらに洗浄するために、分離した細胞の懸濁液を遠心する。遠心後、ペレットを、生物物質バイアル（biological substance vial）内で、適切な容量の凍結培地（15％のジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide，DMSO）と1％ヒト血清アルブミン（human serum albumin，HSA）を含む2xの凍結培地）とHBSS/Gに再懸濁してもよい。細胞を、凍結バイアル（cryovial）に入れ、約-１℃／分で約-80℃の温度に速度を調整して凍結させることによって凍結保存する。凍結保存サイクルは、バイアルと冷凍室が+4℃の温度に平衡化されるまで開始しない。生じた凍結懸濁液を例えば液体窒素内で保存してもよい。典型的には、患者に投与するために解凍するまで、細胞を凍結保存状態に保つ。前記細胞を、ドライアイスで、速度を調整した冷凍庫から液体窒素保存システムに可能な限り早く移すべきである。次に、凍結した生物物質を、凍結バイアルを照射するために解放する（released）。
【００３３】
照射線量は、腫瘍細胞を非腫瘍形成性にする（典型的には約20,000ラッド）だけでなく、分離細胞の懸濁液内のいかなる残余のバイオバーデンも不活性化するように選択される。しかしながら、メガラッドの放射線の線量は、生存し、代謝的に活性がある哺乳類細胞に不適合である。本発明による好ましい線量は、約100,000〜200,000ラッド、より好ましくは約150,000〜200,000ラッド、最も好ましくは190,000〜200,000ラッドのガンマ線である。このことによって、方法のうち、他のバイオバーデンを減少させる工程と共に細胞を無菌にする、凍結腫瘍細胞のバイアルを十分に殺菌する放射線量が与えられる。凍結の間に腫瘍細胞を照射することにも、患者の治療のために細胞を試験し、解放する（release）前に、照射を可能にする利益がある。これは、まさに患者の用量を処方する前に液体の細胞懸濁液に20,000ラッドを加える'596特許の方法と対照的である。
【００３４】
本発明の一実施態様において、分離した腫瘍細胞の凍結したバイアルを、液体窒素保存システムから取り出し、照射器の照射容器内に、2〜5cmのベッド（bed）のドライアイス上に置く。次に、バイアルをドライアイスで完全に覆って、照射容器をいっぱいにする。照射サイクルを開始し、必要であれば２時間ごとに、ドライアイスで容器を再びいっぱいにするために一時中断する。200,000ラッドを加えた後、バイアルを液体窒素に戻す。
【００３５】
１又はそれ以上の統合製造センターで照射を行うことが好ましい。このことによって外来患者の場所ごとに照射器の必要がなくなり、ワクチン又は他の無菌の細胞製品の製造業者による工程管理が可能になる。種々の品質管理試験を行って、無菌で、安全で、かつ有効なワクチン製品を保証してもよい。製品の発売前の、無作為に選択した品質管理サンプルのそのような試験として、典型的には、無菌試験、細胞の計数試験、内毒素試験、同定試験及び力価試験がある。
【００３６】
凍結し、照射した細胞を、完全な品質管理手順を行った後に、薬剤師、患者の介添人、又は他のワクチンの最終的な使用者に輸送して、治療を必要とする患者に製品を投与することができるので、最終的なワクチンの処方は、薬剤師が行うことができ、限られた施設を要する。
【００３７】
ワクチン処方の第１段階は、典型的には、無菌の、免疫原性の、非腫瘍形成性の腫瘍細胞を解凍することである。水浴を含む任意の適切な方法によって、凍結した腫瘍細胞を照射後に解凍してもよい。水に浮遊する汚染物質で腫瘍細胞のバイアルが汚染される可能性を最小限にするためには、ヒート・ブロックが好ましい。ここで、解凍した細胞を、連続サイクルの遠心分離と新鮮なHBSSへの再懸濁によって、HBSSでさらに洗浄してもよい。種々の投与計画、例えば'596特許に開示されているものに従って、患者に投与するための処方を調整するために、本願明細書の教示を考えれば、種々の手法を選択してもよい。特に好ましい実施態様において、上記方法によって製造された107個の生存能力のある無菌の結腸腫瘍細胞を、腫瘍が得られたガン患者に皮内注射する。３回分のこの自家ワクチンを１週間おきに注射する。最初の２回の注射は、約107個のBCG微生物も含み；３回目の注射はBCGを全く含まない。４回目にブースター注射を追加することは、'596特許に教示されておらず、該ブースター注射は、BCGが全くなく、自家の腫瘍細胞から成り、最初の治療から５月以上後に与えられるものである。
【００３８】
無菌の細胞懸濁液を、コールドパックで、外来患者向け診療所に迅速に輸送し、製造者及び患者の介添人が指示する特別な投与計画及び治療計画に従って投与する。
【実施例１】
【００３９】
（切開前における、生体内原位置での結腸及び腫瘍の洗浄）
静脈注射用の正常生理食塩水（HBSSとは異なる）は、500mLの柔軟な袋に使用できる。無菌のポート（port）（例えば、コンビポート（Combi-port））を袋に無菌で取り付け、袋を、本質的に、噴出瓶に変形させた。袋を圧迫することによって、生理食塩水の水流を力で噴出し、腫瘍及び周囲の結腸粘膜に向けてもよい。
【００４０】
最初の洗浄において、結腸を垂直に保持し、上から始めて下へ動かして、500mLの生理食塩水で洗浄した。予備試験において、２回目の500mLの洗浄は、正常食塩水又は1％のTriton X-100（生理食塩水溶液）のいずれかから成り、腫瘍及びそのすぐ近くの領域に向けて行った。この洗浄も、結腸を垂直に保持しながら行った。次に、結腸を水平に保持し、腫瘍を含む結腸の部分をわずかに上げた。次に、それぞれ500mLの生理食塩水から成る更なる洗浄（２−３）は、腫瘍に向けて行った。各洗浄からの流出液を別個の無菌のボウルに回収し、検定をし、バイオバーデンの除去の間接的な測定を行った。利用できる場合は、腫瘍を分離し、細胞懸濁液（凍結保存前）を、バイオバーデンについて検定し、手法の有効性の直接的な証拠を得た。
【００４１】
洗浄方法を評価するために、バイオバーデンの直接的な決定、すなわち、分離後の細胞懸濁液内の微生物数を定量化した。図２に見られるように、生理食塩水のみ用いて、又はTritonX-100と混合した生理食塩水を噴出した腫瘍から分離した細胞懸濁液よりも高いバイオバーデンが（107個の腫瘍細胞当たりのコロニー形成ユニット（CFU）として表される）、結腸及び結腸腫瘍にHBSS/Gを浴びせることによって洗浄した腫瘍から分離した細胞懸濁液において観察された。強力な洗浄方法に使用する容積（2000又は2500mL）は、生理食塩水を浴びせる方法に使用する容積（1000mL）より多いので、どの程度の減少が容積又は適用の方法によるものであるかに帰することができないことは明らかである。しかしながら、全体としてみると、新しい強力な洗浄方法がより優れていることが明らかに分かる。
【００４２】
洗浄処置は切開前に行う。洗浄工程は、切開処置中に腫瘍をさらに汚染することが可能な糞便物質を除去する工程に含まれるので、洗浄前に切開によって腫瘍を細分して、分離した細胞中のバイオバーデンの比較研究を達成するのは不適切である。さらに、腫瘍の半分を生理食塩水のみで洗浄し、もう半分を生理食塩水と混合したTriton X-100で洗浄すること、又は生体内原位置で数回又はそれ以上の洗浄をすることはできない。従って、同じ患者の材料に関する比較研究を行うことができなかった。各洗浄由来の流出液中のバイオバーデンを測定することによって、種々の洗浄溶液の有効性の証拠が示された。糞便フローラの量は患者によって異なるので、各実験における絶対的なバイオバーデンの水準はかなり異なっていた。各洗浄の相対的効果を評価するために、各洗浄のバイオバーデンの値を、洗浄＃１におけるバイオバーデンで割って、データを標準化した。生理食塩水のみを使用した（５個の腫瘍）場合、流出液中のバイオバーデンの量は一貫して減少した（図３）。洗浄＃２の平均は、洗浄＃１に存在するバイオバーデンの25％であった（3.6％〜74％の範囲）。洗浄＃３のバイオバーデンの平均は、洗浄＃１の7％であった（0.6〜13％の範囲）。対照的に、Triton X-100で処理した５個の腫瘍のうち２個については、最初の洗浄より、Triton X-100を含む２回目の洗浄に存在するバイオバーデンが多かった（241％及び513％）（図４）。３回目の洗浄におけるバイオバーデンは、さらに少なかった。これらのデータは、Triton X-100によってバイオバーデンの除去が促進されることを示唆している。Triton X-100を第２の洗浄工程で使用することが提案される。洗浄によって除去できるバイオバーデンの大部分は、最初の３回の洗浄で除去され、４回目または５回目の洗浄による貢献はほんの少ししかなかった。
【００４３】
上記の研究に基づいて、結腸及び腫瘍に洗浄溶液を浴びせる方法よりも強く噴出する方法が採用された。洗浄溶液の１つに界面活性剤のTriton X-100を添加することは十分に支持される。したがって、好ましい切開前の処理として、最初に500mLの生理食塩水で、次に、500mLの1％Triton X-100で洗浄し、生理食塩水のみでさらに２回（500mL）洗浄を行って終えることがある。
【実施例２】
【００４４】
（酵素分離前における結腸腫瘍の化学的な殺菌）
病理学的に段階づける（pathological staging）ために、病理学者は、腫瘍を切断して、浸透の最も深い縁を決定する。従って、摘出した腫瘍は、いくつかの断片の腫瘍組織から成る。前記組織を切開して、無関係の非腫瘍と壊死した腫瘍を除去する。切り取った腫瘍断片を、さらに細分して、均質性を達成し、実験計画による処理のために２〜４の群に分類する。組織を、サンプル間で、できる限り均等に分け、実験群の腫瘍断片ができる限り同一に見えるように注意する。切り取った断片を、40mLの殺菌剤を入れたチューブに添加し、それから回転台シェーカー上で200rpmで2分間振盪することによって処理した。次に、切り取った腫瘍断片をHBSSで３回洗浄し、その後分離した。分離した腫瘍の量を、分離前と、分離サイクルの終了後に腫瘍断片の重量を量ることによって決定した。分離後、百分率の腫瘍細胞生存度、生存腫瘍細胞数、腫瘍細胞の効力及びバイオバーデンについて、腫瘍細胞懸濁液のサンプルを取った。収量を、実際に分離した腫瘍のグラム当たり得られた生存腫瘍細胞数と定義した。バイオバーデンを、107個の腫瘍細胞、生成物の約１回分の用量当たりのCFUに標準化した。
【００４５】
最初の実験では、バイオバーデンを減少させるのに効果的な次亜塩素酸ナトリウムを濃くすることによって、コントロールに比べて腫瘍細胞の収量が大幅に減少した。試験した濃度において、クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）は、サンプル中のバイオバーデンを減少させ、コントロールと比べて腫瘍細胞の収量は中程度減少した。切り取った腫瘍断片を殺菌剤で処理すると、バイオバーデンは減少するが、腫瘍細胞懸濁液は無菌とならなかった。
【００４６】
殺菌剤実験の本来の目的は、単一工程として、分離した腫瘍細胞を無菌にすることである。アプローチを変えて、殺菌剤を、生成物を無菌にする統合した多段階の工程の一部として考える。したがって、分離前の腫瘍の殺菌剤に立ち返り、クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で得られた最初の結果を確認し、更なる実験研究によって拡張した。さらに、異なる生物機構によって作用する別の殺菌剤（クロロキシレノール）も評価した。クロロキシレノール、又はPCMXは、外科用スクラブ（scrub）であるテクニ−ケア（Techni-Care）（登録商標）（Care-Tech Labs., Inc.）の活性成分である。
【００４７】
本研究の結果を、表１に示す。腫瘍サンプルの500-0051-KNOを生理食塩水で洗浄し、次に、1％Triton X-100で洗浄し、その後、生理食塩水でさらに３回洗浄した（実施例１参照）。生じたバイオバーデンは、検定の検出限界以下であった。殺菌剤がバイオバーデンを除去する能力を評価するために、対数で１〜２のバイオバーデンをコントロール・サンプル中に検出できなければならない。腫瘍内において可能性のあるバイオバーデンを最大にし、かつ殺菌剤への負荷をより大きくするために、手法を以下のように修正した。すなわち、腫瘍を、病理学的に切開する前に、最低限洗浄し（500mLの量を１回）、ゲンタマイシンなしで分離を行った。
【００４８】
切り取った腫瘍断片をクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で処理した結果、バイオバーデンが、ほぼ３桁減少し、コントロールと比べて細胞の収量は中程度しか損失しなかった。腫瘍の500-052-EVAについてのコントロール・サンプルは、コントロールにおける収量が異常に低く、そのため、実験サンプルにおける収量の百分率（このコントロールと比べて）は異常に高かった。クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）の製造業者が薦める投与量は0.2〜0.4％である。本研究において0.8％で使用したとき、バイオバーデンの更なる減少は観察されなかったが、生存腫瘍細胞の収量はさらに減少した。このため、0.4％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）を、更なる研究で用いる濃度として選択した。0.8％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で処理したサンプルにおけるバイオバーデンの水準が時折高くなるのは、おそらく、バイオバーデンの水準が同一である均等な部分に腫瘍断片を分割することが本質的に困難であるためである。微生物の殺菌効果がほとんどないか、又は全くないにもかかわらず、PCMXは、クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）より細胞毒性が強く、収量を大幅に減少させた。
【００４９】
クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）を臨床的に使用することには、患部を新鮮な殺菌剤で洗い流すことが必要である。したがって、活性成分である、クロリンを消散させ、新鮮な殺菌剤を前記患部に塗布する。最後の研究では、それぞれ新鮮な0.4％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）を用いた２連続の２分間の処理を、通常行われる１回の２分間の処理と比較した。２回処理をする利益は全く見られなかった。
【００５０】
これらの研究に基づいて、断片化及び分離する前に、0.4％のクロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で腫瘍断片を１回、２分間処理することを、好ましい、統合した多段階方法の一部として行って、腫瘍細胞を無菌にした。
【００５１】
【表１】
2006507214.tif 000002
【実施例３】
【００５２】
（結腸腫瘍の分離中における抗生物質の存在の効果）
結腸腫瘍の陥入内に捕捉された腸内微生物を、酵素分離の処理中に解放する。さらに、酵素分離処理を、腸内微生物の増殖に好ましい条件（37℃）の下で行う。このため、抗生物質を分離酵素溶液に添加する効果、及び抗生物質を他の処理溶液に添加する効果を調査した。
【００５３】
抗生物質は、通常長期間に渡って使用される。最初に、短い曝露期間にわたって種々の抗生物質の有効性を評価するために、一連の実験を設計した。次の一連の実験では、分解酵素溶液に入っている際の抗生物質の効果を調査した。
【００５４】
適切な試験微生物を、4℃又は37℃で抗生物質と種々の期間インキュベートした。“非処理”のコントロールはHBSSとインキュベートした。処理終了後、5％ヒツジ血液を含むトリプティック・ソイ寒天培地（Typtic Soy agar containing 5％sheep blood，TSA-SB）とサブロー・デキストロース培地（Sabouraud's dextrose medium，SAB）上で、膜濾過方法によって、バイオバーデンについてサンプルを検定した。菌類を検出するために本実験に使用したSAB培地は、クロラムフェニコールを含まず、したがって、細菌の増殖も支援することが可能であった。
【００５５】
ゲンタマイシンがない凍結保存培地を混合する（等しい容積で）前に、ゲンタマイシン（50μg/mL）は、細胞を懸濁するのに使用したHBSSを含む全ての溶液中にあった。３種の他の抗生物質−抗真菌剤溶液を、腫瘍を分解するのに使用したコラゲナーゼ−DNase溶液にのみ添加した。酵素分離によって得られた細胞懸濁液を洗浄するのに使用したHBSSにはゲンタマイシンのみ含まれている。本実験に使用した、添加された抗生物質は、イミペネム（プリマキシン（Primaxin）（登録商標））（100μg/mL）、レボフロキサシン（レバキン（Levaquin）（登録商標））（25μg/mL）及びアンホテリシンＢ（1μg/mL）であった。これらの濃度を、培養した細胞について決定し、試験微生物を加え（spiked）、細胞毒性及び抗菌活性を探索した。
【００５６】
結腸腫瘍断片を、ゲンタマイシンを含むHBSS中で洗浄し、非腫瘍の材料又は壊死した材料がないように切り取り、細かく刻んで、断片にした。断片を、３個のフラスコに均等に分配した。断片の１の複製を、全ての抗生物質がないところで分離して、先の研究で使用したワクチンを産生するのに使用した条件を再現した。続いて、ゲンタマイシンが全くないHBSSで細胞を洗浄した。第２の断片のセットをゲンタマイシンの存在下で分離した。分離した細胞を洗浄するのに使用したHBSSは、ゲンタマイシンを含むものであった。第３の複製をゲンタマイシンと他の試験抗生物質の存在下で分離した。各分離サイクルが終了した後、細胞を、ゲンタマイシンのみ含むHBSSで再懸濁し、洗浄した。
【００５７】
最初に処理した４個の腫瘍について、ゲンタマイシン、又はゲンタマイシンと他の抗生物質の存在下で分離した細胞懸濁液の一部を同じ抗生物質と更なる時間（分離終了後）インキュベートした。この更なるインキュベーションを、バイオバーデンの減少が増大したかについて評価した。
【００５８】
ゲンタマイシンは、その耐熱性と幅広い抗菌スペクトラムのために、腫瘍を輸送する間に、及び洗浄溶液に使用するのに好ましい。ゲンタマイシンは、酵素分離溶液にも含まれる。したがって、追加する抗生物質は、ゲンタマイシンに対して補完的であることに基づいて選択される。
【００５９】
嫌気性菌は、結腸において優勢な微生物である。フラジール（Flagyl）（2.5及び5μg/mL）を、Bacteriodes vulgatusに対して試験し、該フラジールは、本実験で使用した好気的なインキュベーション条件下で効果がないことが分かった。次に、リンコマイシン（リンコシン塩酸塩）（Sigma-Aldrich Co.）及びプリマキシン（Primaxin）（登録商標）を、この嫌気性菌に対して試験した。一晩（4℃）又は追加されたインキュベーション（すなわち、37℃で40分、4℃で60分間、続いてさらに37℃で60分間）のいずれかでインキュベートした場合、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）は、リンコマイシンより大きな効果を示した。4℃において、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）（100μg/mL）は、対数で１の減少を誘導したが、リンコマイシン（150μg/mLまで）は全く効果を有していなかった。延長した条件下でインキュベートした場合、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）は、対数で２の減少が誘導されたが、リンコマイシンは、対数で１の減少を誘導した。
【００６０】
キノロン類の抗生物質のメンバーである、ノルフロキサシン（ノロキシン（Noroxin）（登録商標）（Merck ＆ Co., Inc.））とレボフロキサシン（レバキン（Levaquin）（登録商標）（Ortho-McNeil））の２つも評価した。予備実験において、ノルフロキサシンを、Enterococcus faecalis及びPseudomonas aeruginosaに対して試験した。37℃で１時間インキュベートしたノルフロキサシン（12.5〜50μg/mL）は、P. aeruginosaに対して非常に効果的であったが、E. faecalisに対して効果がなかった。E. faecalisに対して試験した際、レボフロキサシンは、軽微であるが、再現性のある阻害を示した。
【００６１】
酵母及びカビに対する作用に対して、アンホテリシンＢを選択した。アンホテリシンＢ（0.5〜1.0μg/mL）で処理してから１日後に、Candida albicansのコロニーが顕著に減少したことが観察された。しかしながら、この効果は、殺真菌（mycocidal）というよりもむしろカビ予防（mycostatic）のものであり、８日間培養後に観察した際、高濃度でもほんの少ししか阻害しなかった。
【００６２】
したがって、ゲンタマイシンに加えて、３種の抗生物質／抗真菌剤を、感受性のある微生物のそれらの異なるスペクトラムに基づいて選択し、最初に、実験室株の試験を行った。イミペネム（プリマキシン（Primaxin）（登録商標）（Merck））は、ベータラクタム類のチエナマイシン抗生物質である。それは、特に嫌気性菌に対してゲンタマイシンを補完する。レボフロキサシン（レバキン（Levaquin）（登録商標）（Ortho-McNeil））は、抗生物質のキノロン類のメンバーである。それは、グラム陽性好気性菌に対してゲンタマイシンとイミペネムの両方を補完する。最後に、抗真菌剤であるアンホテリシンＢは、抗生物質が作用しない酵母に作用するために含まれる。
【００６３】
７個の腫瘍を、上記の処方計画に従って分離した。表２で見られるように、すべての場合において、ゲンタマイシンの存在下で腫瘍を分離した場合、微生物のバイオバーデンが減少し、少なくとも１種以上の試験培地で検出された。
【００６４】
ゲンタマイシンの存在下で分離した腫瘍のうち４個は、残余のバイオバーデンを有していた。抗生物質（が全部揃っている所で）の完全なパネル（panel）の存在下でこれら４個の腫瘍から得られた３種の細胞懸濁液（ROC-99-0035、ROC-99-0038、ROC-99-0039）は、少しではあるが、バイオバーデンがさらに減少した。第４の腫瘍細胞懸濁液（ROC-99-0036［SAB］）中のバイオバーデンは変化しなかった。不可解なことに、第５の腫瘍（ROC-99-0041［TSA］）の場合、ゲンタマイシンのみ存在する中でよりも、全ての抗生物質が存在する中で生じた細胞懸濁液中にバイオバーデンが多かった。
【００６５】
表３で見られるように、ゲンタマイシンでさらにインキュベートした結果、２種の腫瘍調整物において、バイオバーデンがさらに少し減少した。CFUが80％減少したことがSAB（ROC-99-0035）において検出されたが、この腫瘍細胞懸濁液は、TSAプレート上に蒔いた際にはCFUが３倍以上増加していた。TSAプレート上でCFUが大幅に増加したことは、腫瘍細胞懸濁液ROC-99-0036でも観察された。したがって、ゲンタマイシン単独でさらにインキュベートすることは、有用であるというよりも、有害であるように思える。すべての抗生物質でさらにインキュベートすることは、SAB上で試験したROC-99-0036を除いては、バイオバーデンに全く効果がなかった。この唯一のサンプルで、バイオバーデンの著しい減少が観察された。
【００６６】
分離酵素及び分離処理後の溶液にゲンタマイシンをさらに添加すると、結腸腫瘍に存在する内生のバイオバーデンが一貫して減少する。更なる抗生物質の存在下において分離した腫瘍の全てではないがいくつかにおいて、バイオバーデンがさらに減少した。
【００６７】
【表２】
2006507214.tif 000003
【００６８】
【表３】
2006507214.tif 000004
【実施例４】
【００６９】
（分離した腫瘍細胞の照射）
放射線量を増加させることが実行可能であるかを評価するために、凍結保存した分離腫瘍細胞のバイアルに、20,000ラッド（約１時間）又は200,000ラッド（約10時間）の線量を凍結した状態で（ドライアイス上で）照射した。細胞を、検定するまで液体窒素の貯蔵庫に戻した。次に、バイアルを迅速に解凍し、細胞を、生存度；有効性；及び先に試験したバイオバーデンに応じて、無菌性、バイオバーデン又はその両方について試験した。生存度又は有効性における差は、異なる放射線量を照射した細胞の間に全く見られなかった（データ図示せず）。
【００７０】
表４から見られるように、１つを除いて、バイオバーデンは、200,000ラッドを照射した後、大幅に減少した。試験した５個の腫瘍のうち３個は、より高い照射線量によって無菌となった。他の２個の腫瘍は、バイオバーデンの顕著な減少を示した。不可解なことに、200,000ラッドを照射した１個のサンプル（患者ROC-00-0013）は、バイオバーデンが、20,000ラッドが与えられたサンプル（8CFU）より多く（40CFU）、対照的に、200,000ラッドにおける嫌気性菌のコロニー数が、20,000ラッドにおけるもの（168CFU）よりも劇的に低かった（≦2CFU）。
【００７１】
生体外での研究では、２種の放射線量を浴び、かつ多段階工程によって処理した細胞の間に、必須の生物学的特性において認識できる差が全く存在しなかったことが示されたが、このことを確認するために、臨床研究の基礎となるモルモットの肝臓ガンモデルにおける照射した細胞の免疫原性に対する影響を評価した（実施例５）。生物学的等価の第１〜第２相試験の暫定の結果を、実施例６に示す。
【００７２】
【表４】
2006507214.tif 000005
【実施例５】
【００７３】
（腫瘍細胞のチャレンジからモルモットを保護する無菌のONCOVAX（登録商標）方法の発明によって製造した系列１０のワクチン細胞の有効性）
本研究の目的は、ヒト結腸腫瘍ワクチンが無菌となるように設計した好ましい方法が、有効な製造物をもたらすかどうか決定することである。本実験は、分離し、照射した細胞が、致死量の移植したL-10細胞からモルモットを防御する能力に対する本発明の滅菌方法の効果を評価するために設計した研究の方法と結果を示す。腫瘍細胞製剤のこれまでの方法と対照的に、改良した方法では、腫瘍を1％Triton X-100で洗浄し、0.4％クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）で殺菌し、抗生物質／抗真菌薬剤（ゲンタマイシン、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）、レバキン（Levaquin）（登録商標）及びアンホテリシンＢ）の存在下において酵素分離を行い、200,000ラッドを照射する。ワクチンの有効性に対するこのような方法の変化の影響を、OncoVAX（登録商標）製品の開発となるすべての臨床前研究に用いた同じモルモットの活性のある特異的な免疫療法モデルにおいて評価した
【００７４】
２種類の試験材料、すなわち、腹水細胞及び固形腫瘍を生成して、この研究を行った。腹水細胞を用いて、免疫化の比較研究用の固形腫瘍を生成した。また、腹水細胞を使用して、免疫された動物にチャレンジした。固形腫瘍を、系列１０（L-10）の腹水細胞を筋肉内注射することによって生成した。生じた固形腫瘍を、本来の又は改良した無菌製造方法のいずれかに従って摘出し、処理し、分離した。次に、細胞を、速度を調整して凍結させることによって凍結保存した。20,000ラッド又は200,000ラッドを細胞に照射した。10系統（ten strain）の２種のモルモット（５匹のオスと５匹のメス）を、以下に示すものの１つを用いて皮内経路によって、２回（週１回の頻度で）免疫し、用いたのは
１．細胞を本来の方法によって製造し、これに20,000ラッドを照射し、BCGと混合したもの、又は
２．細胞を修正した無菌方法によって製造し、これに200,000ラッドを照射し、BCGと混合したもの、又は
３．BCGのみ
である。
【００７５】
免疫処方計画の終了から３週間後に、107個の照射していないL-10腹水細胞を動物に皮内投与した。動物の抗腫瘍反応をより十分にチャレンジし、それによって２つのワクチン製剤の方法の間におけるどんな差も明らかにするために、この高い腫瘍形成の用量を選択した。各チャレンジ注射部位における小瘤の直径を測定し、したがって腫瘍の発達を測定した。チャレンジから22日後に、BCGで処理した動物は、直径が20mmである小瘤を有していた。これらの動物を、その腫瘍が明らかに進行したか、又は退行したすべての動物と共に安楽死させた。腫瘍の進行と退行が不確かな動物は４匹いた。これらの動物を28日目まで観察した。
【００７６】
BCGのみを用いて免疫したすべての動物には、衰えずに進行した腫瘍が現れた。10匹の動物のうち１匹において進行した腫瘍は、本来の及び改良した方法の両方に従って製造し、照射した細胞を用いてあらかじめ免疫したものである。したがって、改良した無菌の製造方法は、腫瘍のチャレンジからの防御をもたらすワクチン細胞の能力に影響を与えず、それ故に、L-10モルモット肝臓ガン細胞の免疫原性に悪影響を及ぼさなかった。これらの結果に基づいて、ヒト結腸腫瘍が無菌となるように設計された新規の無菌方法によって、本来のOncoVAX（登録商標）方法によって製造されたワクチンと同じくらい有効なワクチンが得られるという結論に達した。
【００７７】
２種のL-10腫瘍細胞製剤、すなわち、腹水細胞及び固形腫瘍を本研究の実施のために用いた。腹水細胞を用いて、ワクチン用の固形腫瘍を生成し、腫瘍の負荷によって免疫した動物にチャレンジした。固形腫瘍を、L-10腹水細胞を筋肉内注射することによって生成した。固形腫瘍を、本来の又は修正した製造方法のいずれかに従って処理し、分離した。細胞に、20,000又は200,000ラッドを照射した。
【００７８】
L-10腹水細胞を解凍し、洗浄した。３匹のモルモット（４週齢）に、腹腔内経路によって、5x106個の細胞を接種した。さらに、４匹のモルモット（４〜９週齢）にL-10細胞（5x106個の細胞／部位、４部位／動物）を皮下注射した。筋肉内腫瘍を潜在的に伴う不安が少なく、腫瘍が局所的に成長すると考えられるので、処理用の固形腫瘍を生成するために、皮下経路によって動物に注射をした。さらに、これらの研究に必要とされる量の腫瘍を生成するために、より少ない動物が必要とされることが推定される。意外なことに、腫瘍細胞を皮下注射した動物は、局在化した腫瘍よりもむしろ胸水及び／又は腹膜の腹水を起こす。続いて、これらの動物を、腫瘍材料を全く得ることなく安楽死させた。10日後、腹腔内経路によって接種した動物を安楽死させ、腹水を回収し、速度を調整して凍結させることによって細胞を凍結保存した。これらの新鮮に凍結保存した腹水細胞を、ワクチン加工用の固形腫瘍を生成するのに将来的に使用するためだけではなく、研究の腫瘍のチャレンジ段階のために貯蔵した。
【００７９】
皮下経路による注射は、ワクチン加工用の固形腫瘍を製造するのに十分ではないので、筋肉内経路を用いた。L-10細胞を解凍し、洗浄した。13匹のモルモットの各大腿に、5x106個のL-10細胞を筋肉内注射した。17日後、動物を安楽死させた。９匹の動物から18個の腫瘍を摘出し（総重量109.2グラム）、本来の手法によって分離し、８個の腫瘍を４匹の動物から摘出し（63.5グラム）、新規無菌方法によって分離した。
【００８０】
本来の手法は以下の通りである。
【００８１】
各腫瘍を、無菌の正常生理食塩水10mLを４回交換することで、生体内原位置において洗浄した。生理食塩水を、25mLのピペットで強く噴出した。次に、腫瘍を摘出し、重さを量り、ゲンタマイシン（50μg/ml）含有HBSS（HBSS/G）中にある状態で、腫瘍処理研究室へ輸送した。次に、フェーズIIIの研究に用いるワクチンを生成するために使用する本来の方法に従って腫瘍を処理した。腫瘍を、HBSS/Gを３回交換して濯ぎ、非腫瘍と壊死した材料がないように切り取った。腫瘍断片を細分化し、再びHBSS/Gを３回交換して濯いだ。腫瘍断片の重さを量り、抗生物質が全てない所で、３サイクルの酵素分解を行った。分離工程後に使用した処理溶液はどれもゲンタマイシンを全く含んでいなかった。生じた細胞の生存度は96％であり、１バイアル当たり1.2x107個の細胞がある90本のバイアルが得られた。次に、分離した腫瘍細胞を凍結保存した。
【００８２】
好ましい新規の方法は以下の通りである。
【００８３】
各腫瘍を、それぞれ10mLずつ液体を分配して、生体内原位置において25mLのピペットで強く４回洗浄した。１回目、３回目及び４回目の洗浄は、無菌の正常生理食塩水から成る。２回目の洗浄は、正常生理食塩水で調整した無菌の1％Triton X-100から成る。次に、腫瘍を摘出し、重さを量り、HBSS/G中にある状態で腫瘍処理研究室へ輸送した。次に、修正した無菌方法によって腫瘍を処理した。腫瘍を、HBSS/Gを３回交換して濯ぎ、非腫瘍と壊死した材料がないように切り取った。切り取った腫瘍断片を、0.4％クロルパクチン（Clorpactin）（登録商標）（正常生理食塩水で調整）で、室温で２分間処理し（200rpmのオービタルシェイカーで）、次にHBSS/Gを３回交換して濯いだ。次に、腫瘍断片を細分化し、HBSS/Gで３回濯ぎ、重さを量り、３回のサイクルの酵素分離を行った。酵素分離溶液は、ゲンタマイシン、プリマキシン（Primaxin）（登録商標）、レバキン（Levaquin）（登録商標）及びアンホテリシンＢを含むものである。生じた細胞の生存度は94％であり、１バイアル当たり1.2x107個の細胞がある50本のバイアルが得られた。細胞を凍結保存した。
【００８４】
次に、凍結した細胞のバイアルを照射した。本来の分離方法によって得られた細胞に20,000ラッドを照射した。修正した分離方法によって得られた細胞に200,000ラッドを照射した。照射後、赤色の識別ライナー（liner）を、200,000ラッドを照射したバイアルの蓋に書き入れた。20,000ラッドを照射したバイアルには、黄色の識別蓋ライナー（liner）を取り付けた。
【００８５】
系統10の肝臓ガン細胞は、Sewall-Wright系統２のモルモットと同系であるので、試験動物のすべてはこの系統のものであった。各モルモットに１回目の免疫（0.2mL）を与え、右腋窩部分の上と後ろに皮内投与した。各グループは、10匹の動物（５匹のメスと５匹のオス）から成る。グループＣの動物に、本来の方法によって生成し、20,000ラッドを照射し、BCG（1x107CFU）と混合した細胞を注射した。グループＥの動物に、新規方法によって製造し、200,000ラッドを照射し、BCG（1x107CFU）と混合した細胞を注射した。最後に、グループＦのモルモットに、BCG（1x107CFU）のみを注射した。６日後、各ワクチン接種部位における硬結（２箇所の直径）を、目盛り付きキャリパーで測定した（表５）。
【００８６】
左の腋窩部分の上と後ろに投与したこと以外は１回目の免疫と同じである２回目の免疫をモルモットに与えた。６日後、それぞれの２回目のワクチン接種部位の硬結（２箇所の直径）を、目盛り付きキャリパーで測定した（表５）。
【００８７】
すべての動物に、腹水腫瘍から得られた生存能力のある、照射していないL-10細胞を用いてチャレンジした。チャレンジ注射を、２回目の免疫から21日後に行い、該チャレンジ注射は、1x107個の照射していない細胞（0.2mL）を皮内投与することから成る。40時間後、チャレンジ注射部位における硬結（２箇所の直径）を目盛り付きキャリパーで測定した（表６）。
【００８８】
モルモットを、死亡率と瀕死について日々観察した。照射していない腫瘍細胞を注射した後、チャレンジ注射部位（２箇所の直径）を、毎週２回、目盛り付きキャリパーで測定した。Bonferroniテスト（一元配置分散分析，one-way Analysis of Variance［ANOVA］）を使用して、処理グループにおける任意の差の統計的有意性を評価した。
【００８９】
表５で見られるように、BCGと混合した細胞の種々の製剤またはBCGのみを用いた各免疫から６日後に測定した硬結の大きさの有意差は全く見られなかった。対照的に、BCGと混合した腫瘍細胞を用いてワクチン接種した動物は、BCGのみを用いてワクチン接種した動物よりも、照射していない腫瘍細胞のチャレンジ注射に対する非常に大きな反応（48時間後に測定した硬結）があった（表６）。この腫瘍細胞に対する細胞の免疫の発生の兆候は、腫瘍細胞を用いてチャレンジした動物の運命によって実証される（表６、図１）。BCGのみを注射した10匹の動物（グループＦ）全てに、３週間の観察期間の間に、衰えずに進行した腫瘍が現れ、どれもチャレンジの腫瘍細胞を拒絶することができなかった。チャレンジ注射から22日後に測定した際、グループＦの動物における腫瘍の直径の平均（18.8mm［±1.05mm］）は、ワクチン処理したグループの小瘤より非常に大きかった。このグループの動物における腫瘍の大きさの平均も、11日目と18日目に測定した際に、他の３つのグループより非常に大きかった。本来の方法によって分離し、（20,000ラッドを）照射したL-10細胞（グループＣ）、又は新規方法によって分離し、（200,000ラッドを）照射したL-10細胞（グループＥ）のいずれかと混合したBCGを用いてワクチン接種した10匹のモルモットのうち１匹は進行した腫瘍を有していた。これら２つの各グループにおける他の９匹の動物は、107個の照射していない腫瘍細胞のチャレンジを拒絶することができた。22日目には、チャレンジ部位における小瘤の直径の平均は、グループＣでは1.3mm（±4.1mm）であり、グループＥでは3.6mm（±6.1mm）であった。この腫瘍の大きさの差は有意ではなく、さらに、他の時点でもグループＣとＥの間に有意差は見られなかった。22日目に、研究は、終了のプロトコールの基準の１つ（腫瘍の直径が2cmに達したとき）を満たした。この時点で、すべての動物における腫瘍の運命は、２つであるが、明確に決定することができ、動物の大半を安楽死させた。問題の２匹のモルモット（グループＥ#684、#689）は、変化しないか、又は非常にゆっくりと退行している腫瘍を有していた。これらの動物を、28日目まで観察した（研究終了の第２のプロトコールの基準）。25日目に、非常にゆっくりと退行している腫瘍（動物#689）は完全に消失し、他の動物（#684）の腫瘍は引き続き停止し、進行しなかった。28日目に調べた際、前記腫瘍（動物E#684）も完全に拒絶された。
【００９０】
本研究における動物に、高い用量の照射していない生存L-10細胞を用いてチャレンジして、ワクチン細胞の免疫原性における潜在的に小さい差を検出した。用量反応曲線を本研究に盛り込まなかったが、歴史上、106個のL-10細胞を、天然系統２のモルモットに皮内注射した場合、生命維持に重要な器官への転移のために、60〜90日で100％の動物が死亡した。本研究において、チャレンジ量は10倍多かった。使用した方法にかかわらず、すべてのL-10ワクチンは、BCG単独と比較して、その後の腫瘍細胞のチャレンジに対する統計的に有意な防御をもたらした。本来の手法（グループＣ）又は修正した手法（グループＥ）によって生成したワクチンで処理した動物内の腫瘍の進行において差は全く見られなかった。
【００９１】
要約すると、本来の製造方法をいくつかの工程において修正して、結腸腫瘍に内在する腸内微生物の汚染を減少させ、したがって、自家のワクチンを無菌とする。生体外での研究（生存度、同一性及び有効性など）はその価値を有し、２種の製造方法によって得られた細胞間における差を全く示さなかったが、ワクチン細胞の免疫原性は、効果の重要な基準である。高い用量のL-10細胞からの防御によって決定されるように、本来の滅菌方法又は改良した滅菌方法のいずれかによって単離し、処理したL-10細胞の免疫原性における差は全くなかった。L-10肝臓ガンの系統２のモルモットモデルは、OncoVAX（登録商標）の臨床応用の臨床前の基礎であるので、新規方法で処理したヒト結腸腫瘍は同様に有効であるという結論に達した。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
【表６】
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【実施例６】
【００９４】
（ワクチンの品質及び臨床適用に対する滅菌方法の影響）
（フェーズIとIIの生物学的等価試験の中間結果）
生物学的等価試験を開始した。これまで、12人の患者を、改良した無菌方法によって製造したOncoVAX（登録商標）で治療した。
【００９５】
ワクチンの効果の重要な要素は、生存腫瘍細胞の無名数と細胞の条件である。細胞は、免疫反応の発生のための臨界期の間、ワクチン接種部位で生き残ることが可能でなければならない。したがって、細胞は、生存能力があり、かつ代謝的に活性がなければならない。これらの重要なパラメータは受入規格の枠組みの役目を果たす（表７）。さらに、細胞が腺ガン由来のものであることを確認する同一性検定はQCテストのパネル（panel）の一部である。内毒素及び無菌性について試験することによって安全性を確かめた。
【００９６】
これらの規格のいくつかを、滅菌方法の導入後、より厳密なものとした。生存度の規格を70%以上から80％以上へ増加させ、有効性の規格を70％以上から90％以上へ増加させ、無菌性の規格を“参考まで（for information）”から増殖なしへ変更した。
【００９７】
32個の結腸腫瘍を、上記実施例に記載した通りに処理し、正式に有効な無菌性検定によって無菌性について試験した際、製剤のうち26個が無菌（81％）であった。先のデータに基づいて、これらの腫瘍が、'596特許の本来の手法で処理されたのであれば、26個の腫瘍はどれも無菌のOncoVAX（登録商標）製剤をもたらさなかったことが予想される。
【００９８】
３回目と４回目のワクチン接種は、照射し、生存し、無菌である自家の腫瘍細胞を、アジュバントのBCGを添加せずに投与することからなる。結果として、遅延型の皮膚過敏性（delayed cutaneous hypersensitivity，DCH）反応（硬結）はどれもワクチン細胞に対する患者の細胞の免疫反応を示す。フェーズIIIの試験より得られたデータは、硬結の大きさと臨床転帰との相関関係を示す。陽性の臨床転帰は、注射してから48時間後における３回目（又は４回目）の注射の部位で見られた直径が5mm以上である硬結と関係がある。この基準は、米国食品医薬品局によって、無菌のOncoVAX（登録商標）ワクチンの生物学的等価試験の成績について受け入れられた。
【００９９】
これらの無菌のワクチンのロットのうち12個を患者に投与し、該患者はすべて、少なくとも３回以上治療を受けた。登録した患者は、一度最初の注射を投与すると誰も試験を途中で止めなかった。患者の年齢は、38-88歳の範囲内であり、年齢の平均は65.5歳であった。12人の患者のうち５人はステージIIIの結腸ガンと診断され、残る７人の患者はステージIIであった。投与量の規定の範囲は0.7〜1.3x107個の生存腫瘍細胞である。用量は、0.76x107〜1.3x107個の生存腫瘍細胞の範囲内であり、平均用量は0.99x107個（平均＝0.98x107）であった。
【０１００】
３回目及び４回目の注射（分離した腫瘍細胞をBCGなしで投与）部位の、接種から２日間後における硬結（紅斑も）を測定した。表８に記載したように、３回のワクチン接種を受けた12人の患者はすべて、5mm以上の基準を超える、３回目の接種（BCGがない腫瘍細胞）に対する遅延型の皮膚過敏性（delayed cutaneous hypersensitivity，DCH）反応を示した。92％（12人のうち11人）は、10mmより大きいか、又は10mmと等しい大きさの反応を少なくとも１つ有していた。反応の平均は14.6x13.4mmであった。製品の無菌性がほとんど達成されていない128人のOncoVAX（登録商標）で治療した患者による先のフェーズIII試験と比較した場合、これは注目すべきことである。その試験において、ワクチンの大部分は、胃腸のミクロフローラによる汚染があった。３回目のワクチン接種から48時間後に測定したところ、10mm以上のDCH反応が86.7％に存在し、硬結の平均は17.3x18.0mmであった。したがって、本結果は、無菌のワクチンが免疫原性であり、該免疫原性は主に微生物の汚染と関係がなく、むしろ腫瘍と関連した抗原と関係があることを示している。
【０１０１】
ステージIIの結腸ガンを有する患者は、平均して１回目の接種から20週間後に４回目の治療を受ける。ステージIIIの結腸ガン患者は、化学療法を完了してから約１月後に４回目のワクチンを受けることになる。これまで治療した２人のステージIIIの患者は、１回目の治療から32〜36週間後に４回目の免疫を受けた。上記の12人の患者のうち７人が４回目の治療の時点に到達した。７人の患者のうち１人は４回目の治療を受けなかった。４回目の治療を受けた６人の患者のうち５人は有意なDCH反応を示した。これらの高い反応を示す患者のうち２人がステージIIIの疾病を有していた。それらの反応は、一連の化学療法の介入とワクチン投与の12〜16週間の遅れの影響を受けなかった。これら５人の４回目のワクチン接種に対する反応の平均は、15.1x15.1mmであった。残る患者である568-003は、４回目のワクチンに対する明らかなDCH反応がなかった。このステージIIの患者は平均より若く（53歳）、最も高いワクチン用量の１つ（1.24x107個の生存腫瘍細胞）が与えられ、３回目のワクチンに対する最も強いDCH反応の１つ（14.6mmx16.1mm）を示した。４回目のワクチンを投与する臨床医による技術がおそらく乏しいこと以外に、この患者による反応性が不足していることのもっともらしい理由がない。
【０１０２】
生体内原位置で結腸腫瘍を界面活性剤で処理することと、分離酵素で消化する前に切開した腫瘍を殺菌剤で殺菌することと、分離の最中に抗生物質に曝露することと、約200,000ラッドを照射することを含む、改良した滅菌方法は、ワクチンの効果に重要であることを先に示した必須の生物学的特性に対して悪影響を与えない。滅菌方法によって生成したワクチン細胞は、すべての患者において陽性の臨床転帰と相関する最低規定を超える免疫反応を誘発する能力がある。
【０１０３】
【表７】
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【０１０４】
【表８】
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【０１０５】
本源明細書において引用したすべての特許及び刊行物を参考のために示す。本発明が、上記に記載し、例示した特定の実施態様に限定されないことを容易にわかるだろう。本発明の精神及び範囲に反することなく、本発明を改変して、任意の数の腫瘍細胞の種類、細胞分離技術、殺菌剤及び洗浄方法、抗生物質及びここに記載されていない他のバリエーション、変更、置換又は均等物を本発明に組み込むことができる。例えば、本発明は、結腸腫瘍細胞ワクチンなどの無菌製造物について本発明を実施するための特定の好ましい実施態様について記載されているが、無菌で、生存し、かつ非腫瘍形成性でなければならない、無菌の腎臓ガン、肺ガン及び他の固形腫瘍細胞の製剤を製造することができる。したがって、本発明は、先の記載に限定されず、添付した特許請求の範囲のみによって限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、ワクチン細胞の免疫原性の有効性を示す図である。
【図２】図２は、生物物質のバイオバーデンに対する洗浄条件の効果を示す図である。
【図３】図３は、生理食塩水のみを用いた腫瘍の洗浄サイクル数のバイオバーデンに対する効果を示す図である。
【図４】図４は、生理食塩水とTriton X-100を用いた腫瘍の洗浄サイクル数のバイオバーデンに対する効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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