(57)【要約】プロシアニジンＢ２の合成、単離および精製のための方法が開示される。合成方法はエピカテキンを出発原料として利用して、プロシアニジンＢＺを高収率で製造する。単離方法はカギカズラ属の植物体からの樹皮粉末の試料よりプロシアニジンＢ２を抽出する。単離されたおよび／もしくは合成されたプロシアニジンＢ２を使用して、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような、アミロイド疾患を処置する。合成されたおよび／もしくは単離されたプロシアニジンＢ２を含有する医薬組成物がまた開示される。
2006507357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロシアニジンＢ２を合成する方法であって、
ａ)５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを生成するようにエピカテキンをエステル化すること；
ｂ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを保護すること；
ｃ)４''‐置換,５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成するように付加物の前駆体を５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第一の部分と結合すること；
ｄ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成するように５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第二の部分を４''‐置換,５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンと二量化すること；および
ｅ)プロシアニジンＢ２を生成するように５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを脱保護すること：
の工程を含む、方法。
【請求項２】
エステル化工程が５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アセチル‐エピカテキンを生成するようにエピカテキンのアセチル化工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護工程が５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを生成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アセチル‐エピカテキンを保護する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
保護工程が５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを生成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを水の存在下において塩化ベンジルと反応させる工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
保護工程が５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを含む反応混合液を形成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを約４.０〜約４.２当量の塩化ベンジルと約２４時間〜約７２時間の間反応させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
保護工程が反応混合液を酸と混ぜ合せる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
反応混合液を塩酸と混ぜ合せる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
塩酸が約０.０１Ｍ〜約３Ｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
塩酸が約−１０℃〜約＋１０℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
保護工程が、
ａ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを含む反応混合液を形成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを水の存在下において約４.０〜約４.２当量の塩化ベンジルと約２４時間〜約７２時間の間反応させること；および
ｂ)塩酸が約０.０１Ｍ〜約３Ｍでありそして約−１０℃〜約＋１０℃である、反応混合液を塩酸と混ぜ合せること：
の工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
結合工程が５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化４‐(２‐ヒドロキシエトキシ)エピカテキンを生成するようにエチレングリコールを５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第一の部分と結合させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
二量化工程が
ａ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを結晶化すること；および
ｂ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンをカラムクロマトグラフィーを用いて単離すること：
の工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
プロシアニジンＢ２を合成する方法であって、
ａ)５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アセチル‐エピカテキンを生成するようにエピカテキンをアセチル化すること；
ｂ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを含む反応混合液を形成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アセチル‐エピカテキンを水の存在下において約４.０〜約４.２当量の塩化ベンジルと約２４時間〜約７２時間の間反応させること；
ｃ)塩酸が約０.０１Ｍ〜約３Ｍでありそして約−１０℃〜約＋１０℃である、精製された５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを生成するように反応混合液を塩酸と混ぜ合せること；
ｄ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジル‐４‐(２‐ヒドロキシエトキシ)エピカテキンを生成するようにエチレングリコールを精製された５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンの第一の部分と結合させること；
ｅ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを生成するように５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンの第二の部分を５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジル‐４‐(２‐ヒドロキシエトキシ)エピカテキンと二量化すること；
ｆ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを結晶化すること； 
ｇ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンをカラムクロマトグラフィーを用いて単離すること；および
ｈ)プロシアニジンＢ２を生成するように５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを脱保護すること：
の工程を含む、方法。
【請求項１４】
５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを合成する方法であって、
ａ)５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを生成するようにエピカテキンをエステル化すること；および
ｂ)５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成するように５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを保護すること：
の工程を含む、方法。
【請求項１５】
プロシアニジンＢ２を単離する方法であって、
ａ)抽出液を生成するようにカギカズラ属の植物体からの樹皮粉末の試料をアルコールで抽出すること；
ｂ)抽出物の複数のフラッシュ真空画分を形成するようにフラッシュ真空分別を用いて抽出液を分別することおよびプロシアニジンＢ２を含むフラッシュ真空画分を決定するように複数のフラッシュ真空画分を分析すること；
ｃ)複数のシリカゲル画分を形成するようにプロシアニジンＢ２を含む少なくとも一つのフラッシュ真空画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別することおよびプロシアニジンＢ２を含むシリカゲル画分を決定するように複数のシリカゲル画分を分析すること；および
ｄ)複数のSephadex LH20画分を形成するようにプロシアニジンＢ２を含む少なくとも一つのシリカゲル画分をSephadex LH20カラムクロマトグラフィーを用いて分別すること：
の工程を含む、方法。
【請求項１６】
抽出工程が、
ａ)カギカズラ属の植物体からの樹皮粉末の試料およびメタノールの混合液を攪拌すること；および
ｂ)ろ液を得るように混合液をろ過すること、
の工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
攪拌した混合液をろ過の前に沈着させる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
攪拌した混合液をろ過の前に遠心分離する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
フラッシュ真空分別工程が薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)からなる群より選択される技法により複数のフラッシュ真空画分を分析する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
シリカゲル分別工程が薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)からなる群より選択される技法により複数のシリカゲル画分を分析する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
Sephadex LH20分別工程が薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)からなる群より選択される技法により複数のSephadex LH20画分を分析する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の有効量で原繊維を処置する工程を含む、アミロイド原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法。
【請求項２３】
アミロイド原繊維がＡβアミロイド原繊維である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アミロイド原繊維がＩＡＰＰアミロイド原繊維である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の有効量で原繊維を処置する工程を含む、シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法。
【請求項２６】
シヌクレイン原繊維がα−シヌクレイン原繊維である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための方法。
【請求項２８】
アミロイド疾患がＡβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミンおよびプロカルシトニンからなる群より選択されるアミロイドタンパク質の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アミロイド疾患がＡβアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アミロイド疾患がＩＡＰＰアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
アミロイド疾患がアルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスからなる疾患群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
アミロイド疾患がアルツハイマー病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
シヌクレイノパチーがシヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
シヌクレイノパチーがα−シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、およびグアムのパーキンソン痴呆複合からなる疾患群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
投与されるプロシアニジンＢ２の量が一日当り約０.１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１０００ｍｇ／体重ｋｇである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
投与されるプロシアニジンＢ２の量が一日当り約１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
投与されるプロシアニジンＢ２の量が一日当り約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の有効量で原繊維を処置する工程を含む、アミロイド原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法。
【請求項４２】
アミロイド原繊維がＡβアミロイド原繊維である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アミロイド原繊維がＩＡＰＰアミロイド原繊維である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の有効量で原繊維を処置する工程を含む、シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法。
【請求項４５】
シヌクレイン原繊維がα−シヌクレイン原繊維である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置する方法。
【請求項４７】
アミロイド疾患がＡβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミンおよびプロカルシトニンからなる群より選択されるアミロイドタンパク質の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
アミロイド疾患がＡβアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
アミロイド疾患がＩＡＰＰアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
アミロイド疾患がアルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスからなる疾患群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
アミロイド疾患がアルツハイマー病である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
シヌクレイノパチーがシヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
シヌクレイノパチーがα−シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、およびグアムのパーキンソン痴呆複合からなる疾患群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳動物がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
投与されるプロシアニジンＢ２の量が一日当り約０.１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１０００ｍｇ／体重ｋｇである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
投与されるプロシアニジンＢ２の量が一日当り約１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
投与されるプロシアニジンＢ２の量が一日当り約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
ａ)請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２；および
ｂ)薬学的に許容される薬学的に許容される添加物：
を含む医薬組成物。
【請求項６１】
ａ)請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２；および
ｂ)薬学的に許容される添加物：
を含む医薬組成物。
【請求項６２】
アミロイド原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置するための医薬品の製造における請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項６３】
アミロイド原繊維がＡβアミロイド原繊維である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
アミロイド原繊維がＩＡＰＰアミロイド原繊維である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６５】
シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置するための医薬品の製造における請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項６６】
シヌクレイン原繊維がα−シヌクレイン原繊維である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
哺乳動物におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための医薬品の製造における請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項６８】
アミロイド疾患がＡβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミンおよびプロカルシトニンからなる群より選択されるアミロイドタンパク質の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
アミロイド疾患がＡβアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
アミロイド疾患がＩＡＰＰアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７１】
アミロイド疾患がアルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスからなる疾患群より選択される、請求項６７に記載の使用。
【請求項７２】
アミロイド疾患がアルツハイマー病である、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
シヌクレイノパチーがシヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項６７に記載の使用。
【請求項７４】
シヌクレイノパチーがα−シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、およびグアムのパーキンソン痴呆複合からなる疾患群より選択される、請求項６７に記載の使用。
【請求項７６】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
アミロイド原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置するための医薬品の製造における請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項７８】
アミロイド原繊維がＡβアミロイド原繊維である、請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
アミロイド原繊維がＩＡＰＰアミロイド原繊維である、請求項７７に記載の使用。
【請求項８０】
シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置するための医薬品の製造における請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項８１】
シヌクレイン原繊維がα−シヌクレイン原繊維である、請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
哺乳動物におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための医薬品の製造における請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項８３】
アミロイド疾患がＡβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミンおよびプロカルシトニンからなる群より選択されるアミロイドタンパク質の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項８２に記載の使用。
【請求項８４】
アミロイド疾患がＡβアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
アミロイド疾患がＩＡＰＰアミロイドの生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項８３に記載の使用。
【請求項８６】
アミロイド疾患がアルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスからなる疾患群より選択される、請求項８２に記載の使用。
【請求項８７】
アミロイド疾患がアルツハイマー病である、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
シヌクレイノパチーがシヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項８２に記載の使用。
【請求項８９】
シヌクレイノパチーがα−シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である、請求項８８に記載の使用。
【請求項９０】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、およびグアムのパーキンソン痴呆複合からなる疾患群より選択される、請求項８２に記載の使用。
【請求項９１】
シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
治療的に有効な量のプロシアニジンＢ２を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における疼痛、炎症、ウイルス感染症、関節炎、リウマチ、滑液包炎、痛風、日和見感染症、皮膚腫瘍および嚢腫、がん、エイズ、クローン病、呼吸器感染症、アレルギー、ヘルペス、前立腺疾患、狼瘡、エプスタイン・バーウイルス、慢性疲労症候群、ならびに胃および腸の障害を処置するための方法。
【請求項９３】
哺乳動物における疼痛、炎症、ウイルス感染症、関節炎、リウマチ、滑液包炎、痛風、日和見感染症、皮膚腫瘍および嚢腫、がん、エイズ、クローン病、呼吸器感染症、アレルギー、ヘルペス、前立腺疾患、狼瘡、エプスタイン・バーウイルス、慢性疲労症候群、ならびに胃および腸の障害を処置するための医薬品の製造におけるプロシアニジンＢ２の使用。
【請求項９４】
ａ)請求項１にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２；および
ｂ)意図する処置方法を指示するラベル：
を含む製品。
【請求項９５】
ａ)請求項１５にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２；および
ｂ)意図する処置方法を指示するラベル：
を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(政府の特許実施権利)
本明細書中に記載された仕事は、国立老化研究所(National Institute on Aging)により授与された２  Ｒ４４  ＡＧ１６５５１−０２のもとに政府の援助で為された。米国政府は、本明細書中に提供される対象事項に特定の権利を有し得る。
【０００２】
（技術分野）
本明細書中に提供されるものは、プロシアニジンＢ２(また、エピカテキン‐４β→８‐エピカテキンまたはプロシアニジンＢ２ダイマーもしくはエピカテキン−エピカテキンダイマーともいう)の単離および合成の新方法ならびにその使用である。単離方法においては、プロシアニジンＢ２は、ウンカリア・トメントーサ(Uncaria tomentosa)(また、キャッツ・クローとして知られている)および関連植物から単離される。合成においては、プロシアニジンＢ２は、以前に報告されてきたものよりさらに短くてそしてプロシアニジンＢ２の５倍高い収率の合成をもたらす合成ルートを介して作成される。プロシアニジンＢ２およびプロシアニジン関連体の使用は、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような、アミロイドおよびα‐シヌクレインの疾患の処置ならびに予防のための方法ならびに組成物に関し、さらに特にそれは、アミロイドおよびα‐シヌクレインの疾患の処置ならびに予防のためのプロシアニジンＢ２および関連化合物に関する。
【０００３】
（背景技術）
アルツハイマー病は、細胞外のアミロイドプラークおよび脳血管の壁内のアミロイドとして存在する、ベータアミロイドタンパク質もしくはＡβと呼称される３９〜４３個のアミノ酸ペプチドの繊維状の蓄積により特徴づけられる。アルツハイマー病における繊維状Ａβアミロイド沈着は患者にとって有害であり、そしてアルツハイマー病の顕著な特徴である毒性および神経細胞死に最終的に至ると信じられている。累積しつつある証拠は、アミロイドが、より具体的にはＡβ原繊維の生成、沈着、蓄積および／もしくは残存が、アルツハイマー病の病因の主要な要因であるとして結びつける。加えて、アルツハイマー病以外にも、ダウン症候群、コンゴレッド親和性血管障害を伴う障害、オランダ型の遺伝性脳出血、および封入体筋炎を含む、多数の他のアミロイド疾患がＡβ原繊維の蓄積を伴う。
【０００４】
パーキンソン病は、アミロイドの特徴の多くを示すところの異常な原繊維状タンパク質の沈着物の生成、沈着、蓄積および／もしくは残存により特徴づけられるもう一つのヒトの障害である。パーキンソン病においては、α−シヌクレイン／ＮＡＣ(即ち、非アミロイド成分)の繊維より成る細胞質内レビ小体の蓄積が発病においておよび治療標的として重要であると信じられている。α−シヌクレイン／ＮＡＣの生成、沈着、蓄積および／もしくは残存を阻害するかまたは予生成のα−シヌクレイン／ＮＡＣ(もしくはその一部)を分裂させることのできる新しい薬剤または化合物は、パーキンソン病の処置のための潜在的治療薬とみなされる。
【０００５】
多様な他のヒト疾患がまた、アミロイド沈着を示し、そして通常全身器官(即ち、中枢神経系の外に位置する器官もしくは組織)を器官の機能障害または不全に至るアミロイド蓄積に関連させる。多数の異なる器官および組織における著しいアミロイド蓄積に至るこれらのアミロイド疾患(以下に考察する)は、全身性アミロイドーシスとして知られている。他のアミロイド疾患においては、２型糖尿病を持つ患者の９０％における膵臓のように、単一の器官が冒され得る。このタイプのアミロイドーシスにおいては、膵臓中のランゲルハンス氏島中のベータ細胞が、ラ氏島アミロイドポリペプチド(ＩＡＰＰ)として知られるタンパク質より主として成る原繊維性アミロイド沈着物の蓄積により破壊されると信じられている。そのようなアミロイド蓄積を阻害するかもしくは低減することは、２型糖尿病の新しい有効な処置に至ると信じられている。アルツハイマー病、パーキンソン病、および"全身性"アミロイド疾患においては、現在治療法もしくは有効な処置は何も無く、そして患者は通常、疾患の発症から３〜１０年以内に死亡する。
【０００６】
(概要)
その態様の一つでは、本明細書は、エピカテキンをエステル化して、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを生成する、プロシアニジンＢ２を合成する方法に関する。５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを保護して、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。次いで、付加物前駆体を５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第一の部分と結合させて、４''‐置換、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第二の部分を４''‐置換、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンと二量化させて、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを脱保護して、プロシアニジンＢ２を生成する。一つの実施態様では、エピカテキンをアセチル化によりエステル化させて、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アセチル‐エピカテキンを生成する。もう一つの実施態様では、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンをベンジル化により保護して、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを生成する。
【０００７】
もう一つの実施態様では、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンの水の存在下における塩化ベンジルとの反応により５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを保護する。もう一つの実施態様では、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを約４.０〜４.２当量の塩化ベンジルと約２４時間〜約７２時間反応させて、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンを含む反応混合物を生成する。なおもう一つの実施態様では、反応混合物を塩酸(例えば、約０.０１Ｍ〜約３Ｍの塩酸)のような酸と混ぜ合せる。もう一つの実施態様では、酸を冷却する(例えば、約−１０℃〜約＋１０℃)。さらなる実施態様では、エチレングリコールを５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第一の部分と結合させて、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化４‐(２‐ヒドロキシエトキシ)エピカテキンを生成する。さらなる実施態様では、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンダイマーを、結晶化およびカラムクロマトグラフィーを用いる単離により精製する。
【０００８】
その態様のもう一つでは、本明細書は、エピカテキンをエステル化して、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを生成する、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを合成する方法に関する。次いで、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを保護して、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。
【０００９】
その態様のなおもう一つでは、本明細書は、カギカズラ属の植物体からの樹皮粉末の試料をアルコールで抽出して抽出液を形成する、プロシアニジンＢ２を分離する方法に関する。抽出液をフラッシュ真空分別を用いて分別して、抽出物の複数のフラッシュ真空画分を形成する。フラッシュ真空画分を分析して、どのフラッシュ真空画分がプロシアニジンＢ２を含有するかを決定する。次いで、プロシアニジンＢ２を含有すると確認された一つもしくはそれ以上のフラッシュ真空画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別して、複数のシリカゲル画分を形成する。シリカゲル画分を分析して、どのシリカゲル画分がプロシアニジンＢ２を含有するかを決定する。次いで、プロシアニジンＢ２を含有すると確認された一つもしくはそれ以上のシリカゲル画分をSephadex LH20カラムクロマトグラフィーを用いて分別して、複数のSephadex LH20画分を形成する。一つの実施態様では、樹皮粉末の試料およびメタノールの混合液を攪拌し、そして混合液をろ過することにより、抽出を実施して、ろ液を得る。特別な実施態様では、攪拌した混合液をろ過の前に沈着させる。これに代わる実施態様では、攪拌した混合液をろ過の前に遠心分離する。もう一つの実施態様では、フラッシュ真空画分、シリカゲル画分、および／もしくはSephadex LH20画分を薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)および／もしくは高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により分析する。
【００１０】
その態様のもう一つでは、本明細書は、原繊維が、本明細書中に開示される方法にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の有効量で処置される、アミロイド原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法に関する。一つの実施態様では、アミロイド原繊維はＡβアミロイド原繊維である。これに代わる実施態様では、アミロイド原繊維はＩＡＰＰアミロイド原繊維である。
【００１１】
加えて、本明細書は、シヌクレイン原繊維が、本明細書中に開示される方法にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の有効量で処置される、シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法に関する。一つの実施態様では、シヌクレイン原繊維はα−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維である。
【００１２】
その態様のなおさらには、本明細書は、本明細書中に開示される方法にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の治療的有効量が哺乳動物に投与される、哺乳動物(例えばヒト)におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための方法に関する。一つの実施態様では、アミロイド疾患は、Ａβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミン、および／もしくはプロカルシトニンの生成、沈着、蓄積または残存に関連する疾患である。特別な実施態様では、アミロイド疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスからなる疾患群より選択される。
【００１３】
これに代わる実施態様では、シヌクレイノパチーは、例えば、α−シヌクレイン原繊維のような、シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である。特別の実施態様では、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、およびグアムのパーキンソン痴呆複合からなる疾患群より選択される。なおもう一つの実施態様では、投与されるプロシアニジンＢ２の量は、一日当り約０.１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１０００ｍｇ／体重ｋｇ；一日当り約１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇ；もしくは一日当り約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇである。
【００１４】
また、本明細書は、原繊維が、本明細書中に開示される方法にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の有効量で処置される、アミロイド原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法に関する。一つの実施態様では、アミロイド原繊維はＡβアミロイド原繊維である。これに代わる実施態様では、アミロイド原繊維はＩＡＰＰアミロイド原繊維である。
【００１５】
その態様のなおさらには、本明細書は、シヌクレイン原繊維が、本明細書にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の有効量で処置される、シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置する方法に関する。一つの実施態様では、シヌクレイン原繊維はα−シヌクレイン原繊維である。
【００１６】
これに加えて、本明細書は、本明細書中に開示される方法にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の治療的有効量が哺乳動物に投与される、哺乳動物(例えばヒト)におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための方法に関する。一つの実施態様では、アミロイド疾患は、Ａβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミン、および／もしくはプロカルシトニンの生成、沈着、蓄積または残存に関連する疾患である。特別な実施態様では、アミロイド疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスからなる疾患群より選択される。
【００１７】
これに代わる実施態様では、シヌクレイノパチーは、例えば、α−シヌクレイン原繊維のような、シヌクレイン原繊維の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である。特別の実施態様では、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、およびグアムのパーキンソン痴呆複合からなる疾患群より選択される。なおもう一つの実施態様では、投与されるプロシアニジンＢ２の量は一日当り約０.１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１０００ｍｇ／体重ｋｇ；一日当り約１ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇ；もしくは一日当り約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜一日当り約１００ｍｇ／体重ｋｇである。
【００１８】
本明細書は、本明細書中に開示される方法にしたがって合成および／もしくは分離されたプロシアニジンＢ２ならびに適当な添加物を含有する医薬組成物に関する。
【００１９】
本明細書はまた、アミロイド原繊維(例えば、Ａβアミロイド原繊維および／もしくはＩＡＰＰアミロイド原繊)ならびに／またはシヌクレイン原繊維(例えば、α−シヌクレイン原繊維)の生成、沈着、蓄積または残存を処置するための医薬品の製造における本明細書中に開示される方法にしたがって合成されたプロシアニジンＢ２の使用に関する。
【００２０】
加えて、本明細書は、哺乳動物におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための医薬品の製造における本明細書中に開示される方法にしたがって合成されるプロシアニジンＢ２の使用に関する。一つの実施態様では、アミロイド疾患は、Ａβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミン、および／もしくはプロカルシトニンの生成、沈着、蓄積または残存に関連する疾患である。特別な実施態様では、アミロイド疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに／もしくは内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスである。もう一つの実施態様では、シヌクレイノパチーは、シヌクレイン原繊維(例えば、α−シヌクレイン原繊維)の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である。特別の実施態様では、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、および／もしくはグアムのパーキンソン痴呆複合である。
【００２１】
本明細書はまた、アミロイド原繊維(例えば、Ａβアミロイド原繊維および／もしくはＩＡＰＰアミロイド原繊)ならびに／またはシヌクレイン原繊維(例えば、α−シヌクレイン原繊維)の生成、沈着、蓄積もしくは残存を処置するための医薬品の製造における本明細書中に開示される方法にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の使用に関する。
【００２２】
さらに、本明細書は、哺乳動物におけるアミロイド疾患もしくはシヌクレイノパチーを処置するための医薬品の製造における本明細書中に開示される方法にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２の使用に関する。一つの実施態様では、アミロイド疾患は、Ａβアミロイド、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、ＩＡＰＰアミロイド、α２−ミクログロブリンアミロイド、トランスチレティン、プレアルブミン、および／もしくはプロカルシトニンの生成、沈着、蓄積または残存に関連する疾患である。特別な実施態様では、アミロイド疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ボクサー痴呆、多系統萎縮症、封入体筋炎、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血、Ｃ型ニーマン・ピック病、脳β−アミロイドアンギオパチー、皮質基底破壊に関連する痴呆、２型糖尿病のアミロイドーシス、慢性炎症のアミロイドーシス、悪性疾患および家族性地中海熱のアミロイドーシス、多発性骨髄腫およびＢ細胞悪液質のアミロイドーシス、プリオン病のアミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールー、スクレイピー、手根管症候群に関連するアミロイドーシス、老人性心アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、ならびに／もしくは内分泌腫瘍に関連するアミロイドーシスである。もう一つの実施態様では、シヌクレイノパチーは、シヌクレイン原繊維(例えば、α−シヌクレイン原繊維)の生成、沈着、蓄積もしくは残存に関連する疾患である。特別の実施態様では、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、家族性パーキンソン病、レビ小体病、アルツハイマー病のレビ小体異型、レビ小体を伴う痴呆、多系統萎縮症、および／もしくはグアムのパーキンソン痴呆複合である。
【００２３】
その態様のもう一つでは、本明細書は、治療的に有効な量のプロシアニジンＢ２が哺乳動物に投与される、哺乳動物における疼痛、炎症、ウイルス感染症、関節炎、リウマチ、滑液包炎、痛風、日和見感染症、皮膚腫瘍および嚢腫、がん、エイズ、クローン病、呼吸器感染症、アレルギー、ヘルペス、前立腺疾患、狼瘡、エプスタイン・バーウイルス、慢性疲労症候群、ならびに胃および腸の障害を処置するための方法に関する。
【００２４】
本明細書はまた、哺乳動物における疼痛、炎症、ウイルス感染症、関節炎、リウマチ、滑液包炎、痛風、日和見感染症、皮膚腫瘍および嚢腫、がん、エイズ、クローン病、呼吸器感染症、アレルギー、ヘルペス、前立腺疾患、狼瘡、エプスタイン・バーウイルス、慢性疲労症候群、ならびに胃および腸の障害を処置するための医薬品の製造におけるプロシアニジンＢ２の使用に関する。
【００２５】
なおさらに、本明細書は、本明細書中に開示される方法にしたがって合成および／もしくは分離されたプロシアニジンＢ２ならびに意図する処置方法を指示するラベルを含有する製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、Tuckmantel等(1999)により以前に記述されたように、プロシアニジンＢ２を製造する６工程の合成法の概略表示である。
【図２】図２は、本明細書にしたがって、プロシアニジンＢ２を製造する５工程の方法の概略表示である。
【図３】図３は、図２の合成ルートの第１工程の後のエピカテキン５酢酸エステル中間体の１３Ｃ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)である。
【図４】図４は、図２の合成ルートの第２工程の後のテトラベンジルエピカテキン中間体の１３Ｃ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)である。
【図５】図５は、図２の合成ルートの第３工程の後のエチレングリコール付加物中間体の１３Ｃ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)である。
【図６】図６は、図２の合成ルートの第４工程の後の保護化ダイマー中間体の１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)である。
【図７】図７は、図６の５.２〜７.１ｐｐｍの領域を拡大した、図２の合成ルートの第４工程の後の保護化ダイマー中間体の１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)である。
【図８】図８は、図６の２.０〜５.２ｐｐｍの領域を拡大した、図２の合成ルートの第４工程の後の保護化ダイマー中間体の１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)である。
【図９】図９は、図２の合成ルートの第５工程の後のプロシアニジンＢ２のＨＰＬＣ追跡(１０.３分に主要ピーク)である。８０％のプロシアニジンＢ２が、少量の１２.４分でのエピカテキンおよび１７.６分のプロシアニジン三量体Ｃ１と共に観測された。
【図１０】図１０は、図２の合成ルートおよびLH20カラムクロマトグラフィーによる最終精製の後のプロシアニジンＢ２のＨＰＬＣ追跡である。
【図１１】図１１は、図２の合成ルートにより合成されて、LHカラムクロマトグラフィーを用いる最終精製に引き継がれたプロシアニジンＢ２の１Ｈ−ＮＭＲ[(ＣＤ３)２ＣＯ]である。
【図１２】図１２は、図２の合成ルートのプロシアニジンＢ２の負電圧電子イオン電気スプレーマススペクトルである。
【図１３】図１３は、Ａβ原繊維の分裂／分解に対して、合成のプロシアニジンＢ２が植物材料から単離されたプロシアニジンＢ２と同様に効果的であることを立証するチオフラビンＴ蛍光光度法アッセイである。
【図１４】図１４は、Ａβ原繊維の分裂／分解に対して、合成のプロシアニジンＢ２が植物材料から単離されたプロシアニジンＢ２と同様に効果的であることを立証するコンゴレッド結合アッセイである。
【図１５】図１５は、本明細書にしたがって、キャッツ・クロー(即ち、ウンカリア・トメントーサ)の樹皮粉末からプロシアニジンＢ２を単離する工程の概略表示である。
【図１６】図１６は、クロロホルム中の６０％メタノールでシリカゲル６０Ｈを溶出した、実施例１２の画分７のＨＰＬＣ分析である。この画分は、幾らかのプロシアニジンＢ４(９.５８９分)と共に、プロシアニジンＢ２(１０.３６８分)を含有すると示される。
【図１７】図１７は、クロロホルム中の６０％メタノールでシリカゲル６０Ｈを溶出した、実施例１２の画分８のＨＰＬＣ分析である。この画分は、図１６の画分７より、さらに少ないプロシアニジンＢ２(１０.２５６分)およびなおさらに少ないプロシアニジンＢ４(９.５０４分)を含有する。
【図１８】図１８は、適切な溶媒でシリカゲル６０Ｈを溶出した、実施例１２の画分３〜８のＴＬＣプロフィールである。純粋なプロシアニジンＢ２が標準としてまた操作された。ＴＬＣは、プロシアニジンＢ２(＊)は画分７に主に観測され、画分６および８ではさらに少ないことを立証する。
【図１９】図１９は、クロロホルム中の２０〜４０％メタノールでシリカ３００メッシュカラムを溶出した、実施例１２の合併した画分１８〜２５のＨＰＬＣ分析である。これらの画分は、幾らかのプロシアニジンＢ４と共にプロシアニジンＢ２を主として含有する。
【図２０】図２０は、適切な溶媒でシリカ３００メッシュカラムを溶出した、実施例１２の画分１１〜３４のＴＬＣプロフィールである。純粋なプロシアニジンＢ２が標準としてまた操作された。ＴＬＣは、プロシアニジンＢ２(＊)は画分１８〜２５に主に観測されることを立証した。
【図２１】図２１は、Sephadex LH20カラムを９５％エタノールで平衡化しかつ溶出した、実施例１２の画分６〜５０のＴＬＣプロフィールである。純粋なプロシアニジンＢ２が標準としてまた操作された。ＴＬＣは、純粋なプロシアニジンＢ２が画分２８〜３３に観測されることを立証する。
【図２２】図２２は、実施例１２のSephadex LH20カラムクロマトグラフィーによる精製の後のプロシアニジンＢ２のＴＬＣプロフィールである。プロシアニジンＢ２は＞９５％収率で存在する。
【図２３】図２３は、実施例１２に記載されるように分離されたプロシアニジンＢ２の負電圧電子イオン電気スプレーマススペクトルである。
【図２４】図２４は、本明細書にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２がＡβ原繊維の分裂／分解に対して効果的であることを立証するチオフラビンＴ蛍光光度法アッセイである。
【図２５】図２５は、本明細書にしたがって単離されたプロシアニジンＢ２がＡβ原繊維発生の阻害に対して効果的であることを立証するコンゴレッド結合アッセイである。
【００２７】
(詳細な説明)
(定義)
特に別に定義しないかぎり、本明細書中に使用される全ての技術的および科学的用語は、開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の全体的開示を通して引用される全ての特許、特許出願、公開された出願および公告、Genbank配列、ウェブサイトならびに他の出版物は、特記しないかぎり、出展明示によりその全体を本明細書の一部とする。本明細書中の用語について複数の定義がある場合には、この章の定義が優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスを引用する場合には、そのような識別子は変化し得て、インターネット上の特定の情報は行き来し得るが、同等な情報は公知であり、そしてインターネットおよび／もしくは適切なデータベースを検索することによるように、容易にアクセスされ得る。そこへの引用は、そのような情報の使用可能性および公共的普及を証明する。
【００２８】
プロアントシアニジンは、フラボノイドファミリーの化合物に属するポリフェノール系分子である。プロアントシアニジンは、プロシアントシアニン、ロイコアントシアニン、アントシアノゲンおよびプロシアニジンとしてまた知られている；これらの用語は互換性をもって使用され得る。
【００２９】
"単離されたプロシアニジンＢ２"とは、本明細書中に開示される方法により精製されたかもしくは単離されたプロシアニジンＢ２(またはエピカテキン‐４β−８‐エピカテキンまたはエピカテキンダイマーもしくはエピカテキンＢ２ダイマー)を指す。
【００３０】
"合成されたプロシアニジンＢ２"とは、本明細書中に開示される方法により製造されたプロシアニジンＢ２(またはエピカテキン‐４β−８‐エピカテキンまたはエピカテキンダイマーもしくはエピカテキンＢ２ダイマー)を指す。
【００３１】
本明細書中で使用される際には、"エピカテキン"は、両方の非置換および置換のエピカテキンを指す。置換エピカテキンには、式Ｉのエピカテキン[式中、Ｒ１およびＲ２は水素およびヒドロキシルから独立して選択され；Ｒ３は水素、(任意に置換された)−グリコシル、‐Ｃ(Ｏ)‐(任意に置換されたアリール)および‐Ｃ(Ｏ)‐(任意に置換されたヘテロアリール)から選択され；ならびにＲ４は水素、カテキン、エピカテキン、エピアフゼレチン、ならびにカテキンおよびエピカテキンの没食子酸エステル]が含まれる(例えば、U.S. patent application Serial No. 10/077,596, published on January 23, 2003 as Publication No. US 2003/0017998を参照)。加えて、"エピカテキン"は、(＋)‐エピカテキン、(−)‐エピカテキンおよび(±)‐エピカテキンを含むものとする。
式１
【化１】
2006507357.tif 000003
【００３２】
"哺乳動物"および"哺乳動物の対象"には、限定するものではないが、ヒトならびにコンパニオン・アニマル(ネコ、イヌ等)、実験動物(マウス、ラット、モルモット等のような)および家畜(ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等)のような、非ヒト哺乳動物が含まれる。
【００３３】
"薬学的に許容される添加物"とは、一般的に安全で、非毒性のかつ望ましいところの医薬組成物を作製するのに有用である添加物を意味し、そして家畜使用ならびにヒトの医薬使用について許容される添加物を含む。そのような添加物は、固形で、液状で、半固形でもしくは、エーロゾル組成物の場合には、ガス状であり得る。
【００３４】
"薬学的に許容される塩"とは、薬学的に許容され得る塩を意味し、そして望ましい薬理学的性質を有する。そのような塩には、化合物内に存在する酸性のプロトンが無機もしくは有機の塩基と反応する能力があるときに形成され得る、塩が含まれる。適当な無機塩には、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムならびにアルミニウムと共に形成されるものが含まれる。適当な有機塩には、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、Ｎ‐メチルグルカミン等のような有機塩基と共に形成されるものが含まれる。そのような塩にはまた、無機酸(例えば、塩酸および臭化水素酸)ならびに有機酸(例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸のようなアルカン‐およびアレーン‐スルホン酸)と共に形成される酸付加塩が含まれる。二つの酸性基が存在するときには、薬学的に許容される塩は、モノ−酸−モノ塩もしくは二塩であり得る；そして同様に、三つ以上の酸性基が存在するときには、そのような基のいくつかもしくは全部が塩化され得る。
【００３５】
"治療的に有効な量"とは、疾患を処置するために対象もしくは動物に投与されるときに、疾患に対して望ましい程度の処置を及ぼすのに十分である、量を一般に意味する。"治療的に有効な量"もしくは"治療的に有効な投与量"は好ましくは、非処置の対象に比べて、少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、よりさらに好ましくは少なくとも６０％、なおさらに好ましくは少なくとも８０％、患者において、アミロイドーシス；原繊維の生成、沈着、蓄積および／もしくは残存；またはα−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維の生成に関連する疾患を阻害し、低減し、分裂しおよび／もしくは分解する。広範囲の開示される組成物の投与量は、安全でかつ有効の両方であると信じられている。例えば、プロアントシアニジンもしくはプロシアニジン、または哺乳動物の対象の処置のために開示される他の組成物の有効量は、対象の約１ｍｇ〜約１０,０００ｍｇ／体重ｋｇであるが、さらに好ましくは、約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇである。
【００３６】
疾患の"処置すること"もしくは"処置"には、疾患に罹りやすいかもしれないがまだ疾患の症状を経験するかもしくは示さない哺乳動物において疾患が起こることを防止すること(予防的処置)、疾患を阻害すること(その進行を遅くするかもしくは静止すること)、疾患の症状もしくは副作用からの軽減を提供すること(対症処置を含む)、および疾患を軽減すること(疾患の退行を引き起こすこと)が含まれる。アミロイドーシスもしくは"アミロイド疾患"を"処置すること"には、以下：本明細書で言及されるＡβおよび他のアミロイドのような、アミロイド原繊維およびアミロイドタンパク質の沈着物を防止すること阻害すること、低減すること、分解すること、分裂することおよび脱凝集させること、のいずれか一つもしくはそれ以上が含まれる。
【００３７】
α−シヌクレイン疾患を"処置すること"または"α−シヌクレインもしくはＮＡＣの原繊維発生を処置すること"には、以下：レビ小体病、パーキンソン病および多系統萎縮症におけるそれらのような、α−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維およびα−シヌクレイン／ＮＡＣ−関連タンパク質の沈着物を防止すること、阻害すること、低減すること、分解すること、分裂することおよび脱凝集させること、のいずれか一つもしくはそれ以上が含まれる。
【００３８】
"ＮＡＣ"(非−アミロイド成分)は、α−シヌクレインの３５個のアミノ酸のペプチド画分であって、それはまた、α−シヌクレインのように、３７℃で培養されるときには、アミロイド様原繊維を形成する能力を有し、そしてコンゴレッド(偏光下に見るときに、赤色／緑色の複屈折を示して)およびチオフラビンＳ(陽性の蛍光を示して)のようなアミロイド染色に陽性である(Hashimoto et al., Brain Res. 799:301-306, 1998; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A  90:11282-11286, 1993)。ＮＡＣ原繊維の生成、沈着、蓄積、凝集、および／もしくは残存の阻害は、パーキンソン病、レビ小体病および多系統萎縮症のような、α−シヌクレインを伴う数多くの疾患のための有効な処置であると信じられている。
【００３９】
"原繊維発生"とは、アミロイド原繊維またはα−シヌクレインおよび／もしくはＮＡＣを含有して生成される原繊維の存在を指す。そのような原繊維発生の治療化合物での阻害には、限定するものではないが、哺乳動物の対象におけるそのようなアミロイド、α−シヌクレインおよび／もしくはＮＡＣの原繊維の生成、沈着、蓄積、凝集および／もしくは残存を処置すること、阻害すること、防止することもしくは管理することが含まれる。
【００４０】
"薬学的薬剤"もしくは"薬理学的薬剤"または"医薬組成物"とは、好ましくは純粋なもしくは純粋に近い形で、処置に用いられる化合物または化合物の組み合せを指す。本明細書においては、薬学的もしくは薬理学的な薬剤には、例としてプロアントシアニジンおよびプロシアニジンが含まれる。開示される薬学的もしくは薬理学的な化合物または組成物中の化合物は好ましくは、８０％均一性まで、そしてさらに好ましくは９０％均一性まで精製される。９９.９％均一性まで精製される化合物および組成物は有利であると信じられている。試験もしくは確認として、ＨＰＬＣ上での純粋な化合物は単一のシャープピークのバンドを与えるであろう。
【００４１】
開示される化合物および組成物は、一つもしくはそれ以上のキラル中心を所有し得て、そしてそれ故に、出発原料の個別の立体異性体もしくは立体異性体の混合物が使用されるかどうかに依存して、個別の立体異性体としてもしくは立体異性体の混合物として製造され得る。他に指示しないかぎり、化合物もしくは化合物群の記載または命名は、個別の立体異性体および立体異性体の混合物(ラセミもしくは別の)を含むこととする。立体化学の決定方法および立体異性体の分離は当業者に周知である[例えば、March J:「最新有機化学第４版」(Advanced Organic Chemistry, 4th ed.) John Wiley and Sons, New York, NY, 1992の第４章の議論を参照]。
【００４２】
アミロイド疾患の薬理学的もしくは薬学的処置のためまたはα−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維発生の処置のために開示される化合物には、限定するものではないが、プロアントシアニジン、プロシアニジン、アントシアニン、縮合タンニン、ロイコアントシアニジン、ロイコシアニン、アントシアノゲン、エピカテキン−カテキンのポリマーもしくはオリゴマー、フラバノイド、フラバン‐３,４‐ジオール、プロペラルゴニジン、ならびにＡ型、Ｂ型およびＣ型のプロシアニジンが含まれるであろう。
【００４３】
プロアントシアニジンＢ２を含有する組成物および化合物は、薬学分野の当業者に周知の標準技法を用いて本明細書にしたがって作成され得る。そのような組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重および状態のような要素ならびに投与経路を考慮して、当業者に周知の投与量でおよび技法により投与され得る。組成物は、他の潜在的な抗−アミロイド薬剤もしくは抗−α−シヌクレイン／ＮＡＣ薬剤と共に；再び特定の患者の年齢、性別、体重および状態のような要素ならびに投与経路を考慮して、共−投与されるかまたは逐次的に投与され得る。
【００４４】
開示される目的を成し遂げるのに有用な組成物の例には、それに本明細書が良く適し得る、カプセル剤、錠剤、丸剤等ならびに咀嚼性固形製剤のような経口投与用の固形組成物；懸濁剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤のような開口部、例えば、経口、経鼻投与用の液体製剤；ならびに殺菌懸濁剤もしくは乳剤のような非経口的な、皮下の、皮内の、筋肉内のもしくは静脈の投与(例えば、注射投与)用の製剤が含まれる。活性なプロアントシアニジン化合物は、無菌水、生理食塩水等のような適当な担体、賦形剤もしくは添加物との混合物であり得る。本明細書の活性な抗−アミロイド化合物は、例えば、等張の、水性の、塩水の緩衝液の中での再溶解のための凍結乾燥形で供与され得る。
【００４５】
これらの化合物は、本明細書に記載されるように合成され、単離されもしくは精製され得、例えば、化合物もしくはそれらの組み合せは実質的に純粋であり得る；例えば、合成されてから明らかな均一性にまで精製され得る。純度は相対的な概念であり、そして数多くの実施例は、発明の化合物もしくはそれらの組み合せの単離、ならびに、例示される方法により当業者が実質的に純粋な化合物もしくはそれらの組み合せを取得し得るかまたはそれらを明らかな均一性(例えば、ＨＰＬＣによる純度；単一のクロマトグラフピークの観察)にまで精製し得るように、それらの精製を立証する。本明細書中で定義されるように、実質的に純粋な化合物もしくは化合物の組み合せは、少なくとも約７０％純粋で、さらに好都合には少なくとも約８０％純粋で、さらに好ましくは９０％以上純粋で、例えば、少なくとも９０〜９５％純粋で、もしくは９５％以上純粋で、例えば、９９.９９％純粋であるようになおさらに純粋である。
【００４６】
さらに、オリゴマーの立体異性体は、開示の範囲内に包含される。オリゴマーのフラバノイドモノマー上の置換基の立体化学は、それらの相対的な立体化学、"アルファ／ベータ"もしくは"シス／トランス"によって、または絶対的な立体化学、Ｒ／Ｓによって記載され得る。用語"アルファ"は、置換基がフラバン環の面の下に配置されることを示す一方で、"ベータ"は、置換基がフラバン環の面の上に配置されることを示す。用語"シス"は、二つの置換基が環の同じ面上に配置されることを示す一方で、"トランス"は、二つの置換基が環の反対の面上に配置されることを示す。用語のＲおよびＳは、立体性もしくは"キラル"中心について置換基の配列を、立体性中心に直接付着する原子の原子番号にしたがう基の格付に基づいて、表示するために用いられる。例えば、ポリフェノール、(＋)‐カテキン、は、(２Ｒ,トランス)‐２‐(３',４'‐ジヒドロキシフェニル)‐３,４‐ジヒドロ‐２Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐３,５,７−トリオールとして、もしくは(２Ｒ,３Ｓ)‐フラバン‐３,３',４',５,７‐ペンタオールとして、定義され得る。インターフラバン(ポリフェノール−ポリフェノール)結合は、相対的用語のα／βもしくはシス／トランスを用いてしばしば特色化される；α／βは、インターフラバン結合の相対的な立体化学を指定するために本明細書中で用いられる。
【００４７】
モノマーの第４位置ならびに隣接するモノマーの第６および第８位置の間に複数の立体化学的結合があり、そしてモノマー単位間の立体化学的結合は、直鎖のオリゴマーについて(４α→６)もしくは(４β→６)または(４α→８)もしくは(４β→８)として指定される。カテキンがもう一つのカテキンもしくはエピカテキンに結合するときには、結合は好都合には(４α→６)もしくは(４α→８)である。エピカテキンがカテキンもしくはもう一つのエピカテキンに結合するときには、結合は好都合には(４β→６)もしくは(４β→８)である。
【００４８】
炭素の第４位置に加えて、炭素の第２位置への結合はアルファもしくはベータの立体化学を有し、そして炭素の第３位置への結合はアルファもしくはベータの立体化学を有する(例えば、(−)‐エピカテキンもしくは(＋)‐カテキン)。
【００４９】
開示されるものは、プロシアニジンＢ２の合成、単離および精製に関する方法ならびに単離され、精製されおよび合成されたプロシアニジンＢ２がアミロイド原繊維発生の強力な阻害剤であることの発見である。プロシアニジンＢ２の合成、単離、精製および使用の方法は、アルツハイマー病、２型糖尿病、パーキンソン病、全身性ＡＡアミロイドーシスならびにアミロイド原繊維の生成および蓄積を伴う疾患の治療的介入についてまた開示されて、特にプロシアニジンＢ２および関連化合物の単離および合成のならびにそれらの化合物の使用への方法が開示される。
【００５０】
プロシアニジンＢ２の合成の本方法は、以前に記載された方法の制限の多くを克服する。プロシアニジンＢ２の合成について本明細書中で記載される方法は、１)以前より異なる出発原料(即ち、カテキンの代わりにエピカテキン)で始まり、２)以前に記載されてきたよりさらに短い合成ルートを伴い(新しい合成ルートは、以前に記載された６−工程合成の代わりに５−工程合成である)そして３)以前に記載されたより５倍さらに高い合成収率を提供する(第一工程の後で収率は、以前に記載されたルートについての２０％に比べて、本明細書中で記載される方法については７５％である；さらに、本明細書中で記載される５−工程合成についての通算収率は、以前に記載された合成についての約２％だけの通算収率に比べて、１０％である)。
【００５１】
前述のリストは例示的であり、そして本明細書中で記載される方法により作成され得る化合物のタイプを図示するために提供されていて、本明細書により包含される化合物の網羅的なリストとして意図するものではないことは、詳細な説明から理解されるであろう。
【００５２】
(タンニン、フラバノイド、プロアントシアニジンおよびプロシアニジン)
タンニンは２グループに古典的に分けられる。加水分解されるタンニンは、フェノール酸およびポリオール、通常はグルコースのエステルである。フェノール酸は、ガロタンニン中の没食子酸もしくはエラジタンニン中のガロイル残基の酸化から誘導される他のフェノール酸のどちらかである。タンニンの第二のグループを形成する、プロアントシアニジンは、我々の食物の中にはるかにさらに一般的である。それらは、基本的なフラバン‐３‐オール単位から作られたポリマーである。プロアントシアニジンの重要な特徴は、それらが酸性の媒体中での加熱でアントシアニジンを、したがってそれらの名前を、与えることである(Santos-Buelga and Scalbert, J. Sc. Food Agri. 80:1094-1117,2000に総説されている)。
【００５３】
構造的に、タンニンは、相対分子質量の１０００単位当り１２〜１６個のフェノール基および５〜７個の芳香族環を所有する(E. Haslam、「実用ポリフェノイックス−構造から分子認識および生理作用まで」(Practical Polyphenoics-from Structure to Molecular Recognition and Physiological Action)、Cambridge University Press, Cambridge, 1998)。この特徴は、それらの高分子量と一緒に、明らかに、タンニンおよび赤ワインもしくは紅茶のような加工産物の中に見出される同様なフェノール性ポリマーを、低分子量のフェノール酸および単分子的フラバノイドから構造および性質の両方において異なるようにする。簡単なフラバノール、プロアントシアニジンおよび他のフェノール性化合物の酵素的ならびに／もしくは化学的変換により生成された、フェノール性ポリマーは、タンニン様化合物と呼ばれる。
【００５４】
プロアントシアニジンは、果物、ベリーおよび他の植物材料の中で天然に産出するポリフェノール性分子である。これらの分子は、フラバノイドファミリーの化合物に属する。フラバノイドのポリフェノール類には、カテキン、アントシアニン、およびプロアントシアニジンが含まれる。プロアントシアニジンは、縮合タンニン、ロイコアントシアニジン、ロイコデルフィニン、ロイコシアニン、アントシアノゲン、エピカテキン−カテキンポリマーおよびプロシアニジンとして当分野でまた知られている。プロシアニジンおよびプロアントシアニジンの総説については、Santos-Buelga and Scalbert, J. Sc. Food Agri. 80:1094-1117,2000を参照されたい。
【００５５】
プロアントシアニジンのポリマーもしくはオリゴマーは、さまざまな数のフラバノイド単位を有すると知られていて、そして例えば、Mattice et al, Phytochem. 23:1309-1311, 1984; Czochanska et al, J.C. S. Chem. Comm. 375, 1979; and Jones et al, Photochemistry, 15:1407-1409, 1976に報告されてきている。本抗−アミロイド活性に有用なプロアントシアニジンのオリゴマーもしくはポリマーは、ロイコアントシアニジンの単量体単位から成っている。ロイコアントシアニジンは一般的に、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、ガロエピカテキン、フラボノール、フラバン‐３,４‐ジオール、ロイコシアニジンおよびアントシアニジンを含む、単量体のフラバノイドである。治療的に効果的なプロアントシアニジンポリマーは、２〜２０個のフラバノイド単位、そしてさらに好ましくは２〜１１個のフラバノイド単位を有する。
【００５６】
プロアントシアニジンとしてまた呼ばれるプロシアニジンは、エピカテキンおよびカテキンの残基から成るポリマー性もしくはオリゴマー性の化合物である。開示される化合物には、エピカテキンおよびカテキンの残基の二量体ならびにエピカテキンの三量体が含まれる。カテキンおよびエピカテキンの残基は、全ての可能な組み合わせで約１０,０００ダルトンまでの分子量へのポリマー性プロシアニジンに結合され得る。プロアントシアニジンポリマーは、さまざまな数のフラバノイド単位を有すると知られている。ポリマーは好ましくは、２〜１５個の単量体のフラバノイド単位、最も好ましくは２〜１０個のサブ単位を含有する。
【００５７】
プロアントシアニジンは、その基本的単位がＣ−Ｃおよび時としてＣ−Ｏ−Ｃ結合により連結されている、ポリマー性フラバン‐３‐オールである。フラバン‐３‐オール単位は、典型的なＣ６−Ｃ３−Ｃ６フラバノイド骨格を有する。三つの環は文字のＡ，ＢおよびＣにより区別される。それらは、両方の芳香性環上のヒドロキシル基の数および複素環上の不斉炭素の立体化学にしたがって構造的に異なる。食物中の最もありふれたプロアントシアニジンは、Ｂ環上に３',４'‐ジヒドロキシ置換を持つプロシアニジンおよび３',４',５'‐トリヒドロキシ置換を持つプロデルフィニジンである。プロシアニジンもしくは混合プロシアニジン／プロデルフィニジンは食物中の最もありふれている。４'‐ヒドロキシＢ環を持つプロペラルゴニンは、食物源の中では比較的珍しいが、エピアフゼレクチンの形で本明細書中で特に開示されている。フラバノール複素環の三つの炭素のＣ２、Ｃ３、Ｃ４は不斉であり、そして異なる立体配置で起こり得る。或る非常に少ない例外をもって、Ｃ２の立体配置はＲである。２Ｓ立体配置を持つフラバン‐３‐オール単位は、接頭語のエナンチオ(ent-)により区別される。Ｃ２−Ｃ３結合の立体化学は、それぞれ、(＋)-(ガロ)カテキンおよび(−)-エピ(ガロ)カテキンポリマーにおけるように、トランス(２Ｒ,３Ｓ)もしくはシス(２Ｒ,３Ｒ)のどちらかであり得る。Ｃ４におけるインターフラバン結合は、Ｃ３におけるヒドロキシ基に関して常にトランスである(E. Haslam、「実用ポリフェノイックス−構造から分子認識および生理作用まで」(Practical Polyphenoics-from Structure to Molecular Recognition and Physiological Action)、Cambridge University Press, Cambridge, 1998)。
【００５８】
最も普通のフラバノール間結合は、一つのフラバノイド単位("延長もしくは上部の単位")のＣ４により設立されたＣ−Ｃ結合である。そのようなプロアントシアニジンは、所謂Ｂ型(二量体の)およびＣ型(三量体の)のプロアントシアニジンに属する。二重に連結した単位(一つのＣ−Ｃおよび一つのＣ−Ｏ；"Ａ型結合")を持つ化合物はまた、茶の葉っぱ、ココアおよびクランベリー果実のような或る食物源の中に報告されてきている(LJ. Porter、「１９８６年からの研究におけるフラバノイドの進歩」(The Flavanoids-Advances in Research Since 1986), Ed. by JB Harborne, Chapman and Hall, London, pp. 23-55, 1994、中のフラバンおよびプロアントシアニジン)。これらのＡ型プロアントシアニジンにおいては、普通のＣ４−Ｃ８もしくはＣ４−Ｃ６結合に加えて、上部の単位のＣ２および下部のものの酸素を保持するＣ７またはＣ５の間にさらに別のエーテル結合が形成されている。
【００５９】
初めには、オリゴマー性プロアントシアニジンは、フラバノール間結合のタイプを記載するための文字Ａ、ＢもしくはＣと共にアルファ−数値システムにより命名されていた；数値はそれらが検出されるにつれて文字に加えられた(Thompson et al, J. Chem. Soc. Perkins Trans. 1: 1387-1399, 1972)。新しい命名法を後で導入して、多糖について利用されたものに基づいて、増加する数値の新しい構造を命名した(Hemingway et al, J. Chem. Soc. Perkins Trans. 1:1387-1399, 1972)。この命名法においては、オリゴマーの基本的単位は、対応するフラバン‐３‐オール単量体の名前をもって指名される。インターフラバノール結合およびその方向性は、矢印(４→)で示され、そしてＣ４におけるその立体配置は∝もしくはβとして記載される。Ａ型の二重に連結されたプロアントシアニジンにおいては、両方の結合が示される。さらに別のエーテル結合の中の酸素を示すことは、それはカテキンの下部単位の置換パターンから明白であるので、不必要である(「１９８６年からの研究におけるフラバノイドの進歩」(The Flavanoids-Advances in Research since 1980), Ed. by JB Harborne, Chapman and Hall, London, pp. 21-62, 1988、におけるLJ Porter)。例えば、この命名法にしたがって、プロシアニジン二量体Ｂ１はエピカテキン４β→８‐カテキンとなり、そして二量体Ａ２はエピカテキン２β→７,４β→８‐エピカテキンとなる。
【００６０】
フラバノール単位は、種々のアシルもしくはグリコシル置換基を保持し得る。最もありふれたアシル置換基は、茶(Nonaka et al, Chem. Pharmaceutic. Bull. 31:3906-3914, 1983)およびワイン(Prieur et al, Phytochem. 36:781-784, 1994)におけるように、Ｃ３位置のヒドロキシルとエステルを形成する、没食子酸である。数個のグリコシル化プロアントシアニジンオリゴマーがまた特性化されてきている。糖はＣ３位置においてヒドロキシル基と一般的に連結するが(Ishimaru et al, Phytochem. 26:1167-1170, 1987; Zhang et al, Phytochem. 27:3277-3280, 1988)、またＣ５位置においても連結する(Gujer et al, Phytochem. 25:1431-1436, 1986)。プロアントシアニジンのヘテロシドは他のフラバノイドのグリコシドよりさらに少なく報告されているけれども、それらの産出は、糖が精製されたプロアントシアニジンポリマーとしばしば関連するので、過小評価され得る(Porter et al, Phytochem. 24:567-569, 1985; Mathews et al, J. Agric. Food Chem. 45:1195-1201, 1997)。そのような変形および本明細書中で開示される他の変形は、開示されるプロアントシアニジンの開示の範囲の中に含まれる。
【００６１】
(プロシアニジンＢ２の合成方法)
本明細書にしたがって、プロシアニジンＢ２をエピカテキンのエステル化により合成して、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを生成する。適当なアシル基には、アセチル、他の短鎖アシル基(例えば、Ｃ１〜Ｃ６(即ち、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６)アシル基)、ベンゾイルおよび置換ベンゾイル基が含まれる。次いで、５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アシル‐エピカテキンを保護して、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。適当な保護基には、ベンジルおよび置換ベンジル基が含まれる。次いで、付加物の前駆体を５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第一の部分と結合して、４''‐置換,５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。適当な付加物の前駆体には、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、エチレングリコール、水を含む他のアルコールおよびチオールが含まれる。５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンの第二の部分を４''‐置換,５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンと二量化して、５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを生成する。次いで、二量化５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐保護化エピカテキンを脱保護して、プロシアニジンＢ２を生成する。
【００６２】
一つの特別な実施態様では、エステル化はペンタアシル化エピカテキンを製造する。正常な条件下での(即ち、ピリジン中の無水酢酸)エピカテキンのアセチル化は、８７％収率の五酢酸エピカテキンを与える。この五酢酸エステルの典型的なベンジル化条件下(室温で２４時間の間、ジメチルホルムアミド中の少なくとも１０当量の水素化ナトリウムと共に８.０当量の塩化ベンジル)での処理はベンジル化に至る。しかしながら、この方法を用いるカテキンの報告されたベンジル化は四ベンジル化生成物を大抵生じる一方で(Kawamoto et al, Synthetic Comm. 26(3):531-534, 1996)、本明細書中で記載されるようにエピカテキンで出発することは優先的に五ベンジル化生成物の生成に至る。反応時間を約１時間〜約３時間に短縮することは、低および過ベンジル化副生成物と一緒に、約４０％収率で望ましい四ベンジル化生成物を与える。約４.０〜約４.２当量の塩化ベンジル(例えば、約４.１当量の塩化ベンジル)およびさらに長い反応時間(例えば、約２４時間〜約７２時間の反応時間)を用いて、さらに高い７５％収率の四ベンジル化生成物が得られた。Tuckmantelによる以前の研究は、カテキンの出発原料から四ベンジル化生成物を生成したが、２０％収率に過ぎなかった。本明細書中で開示される合成方法を用いて、１０〜２０％の反応性生物がＣ−３で異性化するが、この問題は、反応混合液を氷冷の１Ｍ塩酸の上に注ぐことによるような、反応の後処理条件を変えることにより回避され、して７５％収率でテトラベンジル‐エピエピカテキン中間体(２)の生成に至る。これらの反応条件下では、Ｃ−３上の酢酸エステル基は３‐ヒドロキシル基に加水分解されることに注目しなければならない。
【００６３】
四塩化チタンを用いるエチレングリコール付加物と四倍過剰のテトラベンジル‐エピエピカテキンとのカップリング(第４工程、図２)は、３９％収率の保護化二量体を与える。先ず過剰の反応物を結晶化により除去して、次いで、母液のカラムクロマトグラフィーによる分離による発表された後処理手順の修飾は、保護化二量体(４)の単離を期待されないほど劇的に改良する。ベンジル基の従来の水素化分解による脱保護は、プロシアニジンＢ２生成物(５)の生成に至る。粗生成物のＨＰＬＣクロマトグラム(図９)で検出される単量体のエピカテキンおよび三量体のプロシアニジンＣ１の存在をもって、或る程度の不均一化が観察される。次いで、遊離の二量体プロシアニジンＢ２をSephadex LH20クロマトグラフィーの上のカラムクロマトグラフィーにより５０％収率で任意に精製して、純粋なプロシアニジンＢ２二量体を与える(図１０)。
【００６４】
要約すると、本明細書中で開示されるプロシアニジンＢ２の製造のための合成方法は、以前の合成方法(Tuckmantel et al, J. Am. Chem. Soc. 121:12073-12081, 1999)とは少なくとも以下のように異なる：
１)プロシアニジンＢ２の製造のために本明細書中で開示される合成方法は、出発原料としてエピカテキンで始める一方で、先行技術方法は、出発原料としてカテキンを使用した；
２)プロシアニジンＢ２の製造のために本明細書中で開示される合成方法は、第１工程の後で、五アシル化生成物を生成する一方で、先行技術方法は、五アシル化生成物では無くて主として四ベンジル化生成物を製造した。
３)プロシアニジンＢ２の製造のために本明細書中で開示される合成方法は、市販のエピカテキンから二工程で合成された５,７,３',４'‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンの７５％収率での生成に至る一方で、先行技術方法は、この生成物をカテキンから単なる２０％収率で製造しかつ三工程を要した。
４)プロシアニジンＢ２の製造のために本明細書中で開示される合成方法は、第１工程で、反応混合液を氷冷の１Ｍ塩酸の上に注ぐことを含む一方で、先行技術方法は、この工程を使用しないで、主として酸化／還元反応を用いて、四ベンジル化生成物を生成した。
５)プロシアニジンＢ２の製造のために本明細書中で開示される合成方法は、第４工程で、過剰の反応物を結晶化により除去して、次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる二量体を精製することを含む一方で、先行技術方法はこの方法論を用いなかった；ならびに
６)プロシアニジンＢ２の製造のために本明細書中で開示される合成方法は、先行技術方法(単に約２％)に比較して、プロシアニジンＢ２の収率で通算で５倍の増加(即ち、１０％)を与える。
【００６５】
(プロシアニジンＢ２の単離方法)
本明細書にしたがって、プロシアニジンＢ２を、カギカズラ属の植物体からの樹皮粉末の試料をアルコールで抽出することにより単離して、抽出液を形成する。適当なアルコールには、例えば、メタノール、エタノールおよびプロパノールのようなＣ１〜Ｃ６アルコール；水；アセトン；ならびに酢酸エチルが含まれる。抽出液をフラッシュ真空分別を用いて分別して、複数のフラッシュ真空画分を形成する。フラッシュ真空画分を分析して、プロシアニジンＢ２を含有するフラッシュ真空画分を決定する。次いで、プロシアニジンＢ２を含む少なくとも一つのフラッシュ真空画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別して、複数のシリカゲル画分を形成する。次いで、シリカゲル画分を分析して、プロシアニジンＢ２を含むシリカゲル画分を決定する。プロシアニジンＢ２を含む少なくとも一つのシリカゲル画分をSephadex LH20カラムクロマトグラフィーを用いて分別して、複数のSephadex LH20画分を形成する。Sephadex LH20画分を任意に分析して、プロシアニジンＢ２を含むSephadex LH20画分を決定する。画分を分析するための適当な方法には、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、低圧および高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、電気スプレー(ＥＳ)質量分析法(ＭＳ)、ならびに核磁気共鳴(ＮＭＲ；例えば、１Ｈおよび１３Ｃ)が、単独もしくは組み合せてのどちらかで、含まれる。
【００６６】
(アミロイドおよびアミロイドーシス)
アミロイドは、全てが共通の形態学的性質、染色特性、およびＸ線解析スペクトルを有する、多様だが特異的な細胞外のタンパク質沈着物のグループを指す一般用語である。沈着したアミロイドタンパク質の性質に無関係に、全てのアミロイドは以下の特色を有する：１)ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いてエオシン好性に見えて、光学顕微鏡のレベルで非晶質外観を示すこと；２) コンゴレッドで染色してかつ偏光下に見るときに、赤色／緑色の複屈折を示すこと(Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10:355-364, 1962)；３)優先的なベータ−プリーツシート二次構造を含有すること；ならびに４)無限長で７〜１０ｎｍの直径を持つ非分岐の原繊維から超構造的に成ること。
【００６７】
アミロイドーシスおよび"アミロイド病"は今日では、沈着した特異的なアミロイドタンパク質にしたがって分類される。アミロイドには、限定するものではないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血および封入体筋炎に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはベータアミロイドタンパク質もしくはＡβとして呼ばれる)、慢性炎症、種々の型の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはＡＡアミロイドもしくは炎症関連アミロイドとして呼ばれる)、多発性骨髄腫および他のＢ細胞悪液質に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはＡＬアミロイドとして呼ばれる)、２型糖尿病に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはアミリンもしくはラ氏島アミロイドとして呼ばれる)、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールーおよびスクレイピーを含むプリオン病に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはＰｒＰアミロイドとして呼ばれる)、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはベータ２−ミクログロブリンアミロイドとして呼ばれる)、老人性心アミロイドおよび家族性アミロイドポリニューロパチーに関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはプレアルブミンもしくはトランスチレティンアミロイドとして呼ばれる)、ならびに甲状腺の髄様がんのような内分泌腫瘍に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはプロカルシトニンの変異体として呼ばれる)が含まれる。
【００６８】
臨床異常におけるアミロイド沈着物は、ベータ−プリーツシート立体配座の存在に関する共通の物理的性質を共有するけれども、多くの異なる化学タイプが存在し、そしてさらに別のものは将来で多分記載されることが今や明らかである。一般にアミロイドーシスにおいて機能しつつあり得る数個の共通な病原性機構があると現在考えられている。多くの場合には、循環している前駆体タンパク質は、無傷のもしくは異常な分子(例えば、血漿細胞悪液質において)のどちらかの過剰生産、減少した分解もしくは排泄(長期血液透析での或る二次的アミロイド症候群およびベータ２−ミクログロブリンにおける血清アミロイドＡ)、または変種タンパク質に関連する遺伝的異常(例えば、家族性アミロイドポリニューロパチー)に起因する。さらに大きいタンパク質前駆体分子のタンパク質分解は多くのタイプのアミロイドーシスで起こって、通常は細胞外位置において、重合してそして組織沈着物としてベータ−プリーツシート立体配座を想定するところの低分子量の画分の生産をもたらす。関与する正確な機構ならびにタンパク質分解の処理および／もしくは翻訳修飾における変化に至る異常な原因は大抵のアミロイドにおいて知られている。
【００６９】
慢性炎症、種々の型の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド(即ち、ＡＡアミロイドもしくは炎症関連アミロイドーシス)(Benson and Cohen, Arth. Rheum. 22:36-42, 1979; Kamei et al, Acta Path. Jpn. 32:123-133, 1982; McAdam et al., Lancet 2:572-573, 1975; Metaxas, Kidney Int. 20:676-685, 1981)、ならびに多発性骨髄腫および他のＢ細胞悪液質に関連するアミロイド(即ち、ＡＬアミロイド)(Harada et al., J. Histochem. Cytochem. 19:1-15, 1971)を例として含む、全身的アミロイド疾患は、中枢神経系の外に一般的に位置する種々の異なる器官および組織においてアミロイド沈着を伴うと知られている。これらの疾患でのアミロイド沈着は、例えば、肝臓、心臓、膵臓、消化管、腎臓、皮膚および／もしくは肺の中で起こり得る(Johnson et al, N. Engl. J. Med. 321:513-518, 1989)。大抵のこれらのアミロイドーシスに対して、明らかな治療法もしくは有効な処置は何も無く、そしてアミロイド沈着の結果は患者に有害であり得る。例えば、腎臓中でのアミロイド沈着は腎不全に至り得る一方で、心臓中でのアミロイド沈着は心不全に至り得る。これらの患者について、全身的器官におけるアミロイドの蓄積は一般的に３〜５年内に究極的な死に至る。
【００７０】
他のアミロイドーシスは、アルツハイマー病およびダウン症候群を持つ患者の脳に見出されるＡβアミロイド沈着物；クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群およびクールーを持つ患者の脳に見出されるＰｒＰアミロイド沈着物；２型糖尿病を持つ患者の９０％の膵臓の中のランゲルハンス島に見出されるラ氏島アミロイド(アミリン)沈着物(Johnson et al, N. Engl. J. Med. 321:513-518, 1989; Lab. Invest. 66:522 535, 1992)；長期血液透析を受けている患者に見出されるように手根管症候群に至る内側神経中のベータ２−ミクログロブリンのアミロイド沈着物(Geyjo et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129:701-706, 1985; Kidney Int. 30:385-390, 1986)；老人性心アミロイドを持つ患者の心臓の中に観察されるプレアルブミン／トランスチレティンアミロイド；ならびに家族性アミロイドポリニューロパチーを持つ患者の末梢神経の中に観察されるプレアルブミン／トランスチレティンアミロイド(Skinner and Cohen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 99:1326-1332, 1981; Saraiva et al, J. Lab. Clin. Med. 102:590-603, 1983; J. Clin. Invest. 74:104-119, 1984; Tawara et al, J. Lab. Clin. Med. 98:811-822, 1989)と共に観察されような単一の器官もしくは組織を冒し得る。
【００７１】
(アルツハイマー病および老人人口)
アルツハイマー病は、老人の痴呆の主要な原因であって、６５歳の年齢以上の人口の５〜１０％を冒している(「アルツハイマー病および関連障害の理解への指針」(A Guide to Understanding Alzheimer's Disease and Related Disorders), Jorm, ed., New York University Press, New York, 1987)。アルツハイマー病においては、記憶、注意、言語、および推論のような認知のプロセスに必須な脳の部分が退化して、独立性を含む、我々をヒトとするものの多くを犠牲者から略奪する。アルツハイマー病の或る遺伝型においては、発症は中年齢であるが、さらに通常には、症状は６０代半ば以上から現れる。アルツハイマー病は今日では、４〜５百万人のアメリカ人を冒して、これらの人々の半数よりわずかに多くが自宅で看護を受ける一方で、他の者は多くの異なる保健医療施設の中にいる。アルツハイマー病および他の痴呆の罹患率は、６５歳を超えると５年度とに倍増し、そして最近の研究は８５歳以上の全人口のほぼ５０％がアルツハイマー病の症状を有することを示す(「アルツハイマー病について２０００年の進展報告」(2000 Progress Report on Alzheimer's Disease), National Institute on Aging/National Institute of Health)。加えて、米国の全人口の１３％(３千３百万人)は６５歳以上であって、この割合は、２０２５年までに２０％に上昇するであろう(「アルツハイマー病について２０００年の進展報告」(2000 Progress Report on Alzheimer's Disease))。
【００７２】
アルツハイマー病はまた、社会に重い経済的負担をかける。最近の研究は、在宅でもしくは養護ホームにおいて、重篤な認知障害を持つ一人のアルツハイマー病患者についての看護費用は、一年当り＄４７,０００以上であると推定する(「アルツハイマー病および関連障害の理解への指針」(A Guide to Understanding Alzheimer's Disease and Related Disorders))。２〜２０年に渡り得る疾患に対して、アルツハイマー病の家族へのおよび社会への通算費用は驚異的である。保健医療の出費ならびに患者およびそれらの看護者両方の損失賃金の面で米国におけるアルツハイマー病の年間経済的料金は、８００〜１０００億ドルと推定される(「アルツハイマー病について２０００年の進展報告」(2000 Progress Report on Alzheimer's Disease))。それ故に、アルツハイマー病患者に対してさらに効果的な処置の必要性があることは明らかである。
【００７３】
(アルツハイマー病に対する治療標的としてのアミロイド)
アルツハイマー病は、ベータ−アミロイドタンパク質、Ａβもしくはβ／Ａ４と呼ばれる３９〜４３個のアミノ酸ペプチドの沈着および蓄積により特性化される(Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890, 1984; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249, 1985; Husby et al., Bull. WHO  71:105-108, 1993)。Ａβは、数個のそれに代わって接合した変異体がある、ベータ−アミロイド前駆体タンパク質(もしくはβＰＰ)と呼ばれるさらに大きい前駆体タンパク質からプロテアーゼ分解により誘導される。βＰＰの最も豊富な型には、６９５、７５１および７７０個のアミノ酸のタンパク質が含まれる(Tanzi et al., Nature 331:528-530, 1988; Kitaguchi et al., Nature 331:530-532, 1988; Ponte et al., Nature 331:525-527, 1988)。
【００７４】
小さいＡβペプチドは、アルツハイマー病を持つ患者の脳の中に"プラーク"のアミロイド沈着物を作成する主要な成分である。加えて、アルツハイマー病は、神経細胞質中に異常に蓄積するところの一対の螺旋フィラメントから成る、数多くの神経原繊維"濃縮体"の存在により特性化される(Grundke-Iqbal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917, 1986; Kosik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4044-4048, 1986; Lee et al., Science 251:675-678, 1991)。それ故に、アルツハイマー病の病理学的な顕著な特徴は、プラークの心型の中に沈着されているアミロイドを持つ、"プラーク"および"濃縮体"の存在である。アルツハイマー病の脳の中に見出される他の主要なタイプの病変は、脳実質内および脳の外に位置する髄膜管の壁の中の両方で、血管の壁の中におけるアミロイドの蓄積である。血管の壁に局部化しているアミロイド沈着物は、脳血管性アミロイドもしくはコンゴレッド親和性血管障害と呼ばれる(Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45:79-90, 1986; Pardridge et al., J. Neurochem. 49:1394-1401, 1987)。
【００７５】
多年の間に、アルツハイマー病における"アミロイド"の重要性について、ならびにこの疾患に特色的な"プラーク"および"濃縮体"が疾患の原因であったかもしくは単に結果であったかについて進行中の科学的討論が行われている。過去２、３年の内に、研究は、アミロイドは実際にアルツハイマー病の原因的要素であって、単に無害な局外者として考えるべきではないことを今や示している。細胞培養液中のアルツハイマーのＡβタンパク質は、短期間の内に神経細胞の劣化を引き起こすと示されてきている(Pike et al., Br. Res. 563:311-314, 1991; J. Neurochem. 64:253-265, 1995)。研究は、神経毒作用に責任があるのは、全てのアミロイドに特色的な、繊維状構造(優先するベータ−プリーツシート二次構造から成る)であることを示唆する。Ａβはまた、海馬体の切片培養液の中で神経毒であると見出されてきていて(Harrigan et al., Neurobiol. Aging 16:779-789, 1995)、そしてトランスジェニックマウスにおいて神経細胞死を誘発する(Games et al., Nature 373:523-527, 1995; Hsiao et al., Science 274:99-102, 1996)。ラットの脳の中へのアルツハイマーのＡβの注射はまた、記憶障害および神経機能不全を引き起こす(Flood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3363-3366, 1991; Br. Res. 663:271-276, 1994)。
【００７６】
多分、Ａβアミロイドがアルツハイマー病の病因に直接に関与することの最も確信的な証拠は遺伝研究から来る。Ａβの生産は、その前駆体、ベータアミロイド前駆体タンパク質、をコード化する遺伝子中の変異が原因であることが発見されてきている(Van Broeckhoven et al., Science 248:1120-1122, 1990; Murrell et al., Science 254:97-99, 1991; Haass et al., Nature Med. 1:1291-1296, 1995)。早発生の家族性アルツハイマー病を引き起こす、ベータアミロイド前駆体タンパク質遺伝子における変異の確認は、アミロイドがこの疾患の根底をなす病理学的プロセスに中心的であるという最も強い論拠である。家族性アルツハイマー病を引き起こすことにおけるＡβの重要性を示すところの四つの報告された疾患を引き起こす変異が今や発見されてきている(Hardy, Nature Genet. 1:233-234, 1992に総説がある)。全てのこれらの研究は、ヒトの患者の脳の中で繊維性Ａβの生成、沈着、蓄積および／もしくは残存を削減する、除去するかまたは防止するために薬物を与えることは効果的な治療として役立つであろうことを示唆する。
【００７７】
(パーキンソン病およびα−シヌクレイン原繊維形成)
パーキンソン病は、細胞質内レビ小体の存在により生理学的に特色化される、神経変性障害であって(Lewy in Handbuch der Neurologie, M. Lewandowski, ed., Springer, Berlin, pp. 920-933, 1912; Pollanen et al., J. Neuropath. Exp. Neurol. 52:183-191, 1993)、その主要成分は、α−シヌクレイン(Spillantini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6469-6473, 1998; Arai et al., Neurosc. Lett. 259:83-86, 1999)、１４０個のアミノ酸タンパク質(Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:11282-11286, 1993)、から成るフィラメントである。家族性の早発生パーキンソン病を引き起こすα−シヌクレインにおける二つの優勢変異が記載されてきていて、レビ小体が、パーキンソン病におけるニューロンの変性に機構的に寄与することを示唆している(Polymeropoulos et al., Science 276:2045-2047, 1997; Kruger et al., Nature Genet. 18:106-108, 1998)。最近、インビトロの研究は、組換えα−シヌクレインが実際にレビ小体様原繊維を形成し得ることを立証してきている(Conway et al., Nature Med. 4:1318-1320, 1998; Hashimoto et al., Brain Res. 799:301-306, 1998; Nahri et al., J. Biol. Chem. 274:9843-9846, 1999)。最も重要なことに、両方のパーキンソン病依存性のα−シヌクレイン変異は、そのようなインビトロの研究がパーキンソン病の病因と関連を有し得ることを示唆する、この凝集プロセスを加速する。
【００７８】
α−シヌクレインの凝集および原繊維の形成は、核形成依存性重合プロセスの基準を満足する(Wood et al., J. Biol. Chem. 274:19509-19512, 1999)。この関係において、α−シヌクレインの原繊維の形成は、アルツハイマーのベータアミロイドタンパク質(Ａβ)原繊維、α−シヌクレイン組換えタンパク質およびα−シヌクレインの３５個のアミノ酸ペプチド画分である、非−アミロイド成分(ＮＡＣとして知られる)の形成と似ていて、両方が３７℃で培養されるときには、原繊維を形成する能力を有し、そしてコンゴレッド(偏光下に見るときに、赤色／緑色の複屈折を示して)およびチオフラビンＳ(陽性の蛍光を示して)のようなアミロイド染色に陽性である(Hashimoto et al., Brain Res. 799:301-306, 1998; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A  90:11282-11286, 1993)。
【００７９】
加えて、α−シヌクレイン／ＮＡＣの蓄積はまた、レビ小体病および多系統萎縮症に共通な細胞病理学的特徴である(Wakabayashi et al, Acta Neuropath. 96:445-452, 1998; Piao et al, Acta Neuropath. 101:285-293, 2001)。多系統萎縮症は、α−シヌクレイン／ＮＡＣを含有する、神経性および神経膠の細胞質内封入体により特色化される成人における散発性神経変性疾患である。
【００８０】
パーキンソン病のα−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維は、アルツハイマー病のＡβ原繊維のように、優先するベータ−プリーツシート構造からまた成っている。それ故に、アルツハイマー病のＡβアミロイド原繊維の形成を阻害すると見出された化合物はまた、α−シヌクレインおよび／もしくはＮＡＣの原繊維生成の阻害に有効であると期待され得る。それ故に、それらの化合物はまた、アルツハイマー病および他のアミロイド障害に対する治療薬としての有効性を有することに加えて、パーキンソン病に対する治療薬として役立つであろう。
【００８１】
(ラ氏島アミロイドポリペプチド(ＩＡＰＰ)および２型糖尿病)
ラ氏島アミロイド沈着物は、良く確立された２型糖尿病を持つ患者の約９０％に観察され、そして疾患プロセスの特性的特長であるように見えるであろう(Westermark, J. Med. Sci. 77:91-94,1972; Clark et al, Diabetes Res. 9:151-159,1988)。多くの患者において、この沈着物は普及していて、多くのラ氏島を冒す。アミロイドにより置換されてきているラ氏島(優先的にβ細胞)団塊の程度は、最大のラ氏島団塊の減少およびアミロイド形成を有するインスリン処置を必要とするそれらの個人に対して、糖尿病プロセスの重篤性のマーカーであり得る(Westermark, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1:47-60,1994)。ラ氏島アミロイドは、異なる母集団から得られた剖検試料の中に観察されてきているので、それは、症候群を持つ個人の部分母集団に対するよりむしろ疾患に対して共通な現象であるように見える(Westermark, J. Med. Sci. 77:91-94,1972; Clark et al, Diabetes Res. 9:151-159,1988)。ラ氏島アミロイド沈着物の罹患率は、年齢と共に増加しているが(Bell, Am. J. Path. 35:801-805, 1959)、それは正常な老化が、グルコース耐性の劣化および２型糖尿病の増加する罹患率(Davidson, Metabolism 28:687-705, 1979)に関連するので、驚くべきことではない。
【００８２】
ラ氏島アミロイド中の主要タンパク質は、ラ氏島アミロイドポリペプチド(ＩＡＰＰ)もしくはアミリンとして知られる３７個のアミノ酸ペプチドである。ＩＡＰＰは、インスリンを保有する細胞質顆粒の中に貯蔵される(Clark et al, Cell Tissue Res. 257:179-185, 1989)ところの膵臓のβ細胞の公知で正常な分泌産物(Kanh et al, Diabetes 39:634-638,1990)である。ラ氏島アミロイドの沈着が２型糖尿病の病因に関与するかもしくは単にその結果であるかどうかが長く問われてきている。しかしながら、数多くの研究は、事実、ラ氏島アミロイドの生成、沈着および残存が、β細胞の機能不全および細胞死、高血糖症、に至るならびに２型糖尿病の発生における重要な原発性要素であり得ることを今や示唆する。
【００８３】
ＩＡＰＰは、β細胞機能の障害およびβ細胞団塊の減少を通して２型糖尿病の病因において重要な役割を有すると仮定されてきている(Johnson et al, N. Engl. J. Med. 321:513-518,1989)。β細胞団塊を置換するラ氏島アミロイド沈着物を生成することができる他に、アミロイド原繊維はラ氏島を直接に損傷するように見える。ラ氏島をヒトもしくはラットのＩＡＰＰの存在下に培養した研究は、ヒトＩＡＰＰが濃度依存様式でアミロイド原繊維を生成し、そして膵臓のラ氏島β細胞の死亡に関連したことを立証した(Lorenzo et al, Nature 368:756-760,1994)。細胞死は、アミロイド原繊維を生成しない、ラットのＩＡＰＰの存在下においては起こらなかった(Lorenzo et al, Nature 368:756-760,1994)。
【００８４】
トランスジェニックマウスモデルを伴う研究は、２型糖尿病の病因においてラ氏島アミロイドの役割の中にさらなる洞察を許容してきている。さらに最近の研究は、ＩＡＰＰ−誘導ラ氏島アミロイドの発生は高血糖症に依存しないで、進行性であることを示唆する(Verchere et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3492-3496, 1996)。これらの後の研究においては、高血糖症は、唯３１％の雄トランスジェニックマウスおよび１４％の雄非トランスジェニックマウスにおいて発生した。これらのマウスからの膵臓切片を検査したときに、ラ氏島アミロイドは糖尿病を持つあらゆるトランスジェニックマウス中に見出された、しかしながら、血糖正常であった雄トランスジェニック動物の三分の二はまた、ラ氏島アミロイド沈着物を発生して、高血糖症はラ氏島アミロイドの生成の前提条件でなかったことを示した。
【００８５】
これらのおよび他の研究からのデ−タは、ヒトＩＡＰＰ原繊維がβ細胞に細胞毒性を示し得て、かくしてラ氏島の機能に早期の変化を齎すかもしれないことをさらに示唆した(Lorenzo et al, Nature 368:756-760, 1994; Janson et al, Diabetes 47:A250, 1998)。ラ氏島アミロイド沈着は、２型糖尿病のラ氏島病変の初期の特徴であるように見え、そしてラ氏島アミロイドの進行性蓄積は、さらなるβ細胞団塊の減少に関連する(Clark et al, Diabetes Res. 9:151-159,1988; Westermark and Wilander, Diabetologia 15:417-421,1978)。かくして、増加したアミロイド沈着により引き起こされるラ氏島団塊における進行性減少は、インスリン分泌、グルコース耐性の減少、および究極的に空腹時高血糖症の発生における進行性障害に関連する。トランスジェニック動物における研究は、単に高血糖症はラ氏島アミロイドの発生に関連することだけでなく、アミロイドはβ細胞を置換することにより高血糖症の発生に寄与することを示唆する。これらの研究は全体として、ラ氏島アミロイドの生成が２型糖尿病のβ細胞不全の発生に中心的役割を演じることを示唆する。それ故に、ラ氏島アミロイド(即ち、ＩＡＰＰもしくはアミリン)の生成、沈着、蓄積もしくは残存を阻害するかまたは分裂させることができる薬剤または化合物は、２型糖尿病に対して新しい潜在的な処置に至り得る。
【００８６】
(薬理学および有用性)
開示されるプロシアニジンＢ２化合物は、アミロイド原繊維の生成を阻害するかもしくは防止する、アミロイド原繊維の生長を阻害するかもしくは防止する、ならびに／または予生成のアミロイド原繊維およびのアミロイドタンパク質沈着物の分解、分裂および／もしくは脱凝集を引き起こすように作用する。それらの活性を、実施例７〜９、１４および１５で議論されるもののような方法によりインビトロで測定できる一方で、アミロイドーシスに対するインビトロのそれらの活性を、アルツハイマー病のそれらのような動物モデルで、およびヒトでは実施例９で開示されるもののような方法により測定することができる。
【００８７】
アミロイド疾患にはまた、限定するものではないが、ダウン症候群、オランダ型のアミロイドーシスを持つ遺伝性脳出血および封入体筋炎(Askanas et al, Ann. Neurol. 43:521-560, 1993)に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはベータアミロイドタンパク質もしくはＡβとして呼ばれる)、慢性炎症、種々の型の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはＡＡアミロイドもしくは炎症関連アミロイドとして呼ばれる)、多発性骨髄腫および他のＢ細胞悪液質に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはＡＬアミロイドとして呼ばれる)、２型糖尿病に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはアミリンもしくはラ氏島アミロイドポリペプチドとして呼ばれる)、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー症候群、クールーおよび動物スクレイピーを含むプリオン病に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはＰｒＰアミロイドとして呼ばれる)、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはベータ２−ミクログロブリンアミロイドとして呼ばれる)、老人性心アミロイドおよび家族性アミロイドポリニューロパチーに関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはトランスチレティンもしくはプレアルブミンとして呼ばれる)、ならびに甲状腺の髄様がんのような内分泌腫瘍に関連するアミロイド(そこでは、特異的アミロイドはプロカルシトニンの変異体として呼ばれる)が含まれる。
【００８８】
加えて、原繊維を生成してコンゴレッドおよびチオフラビンＳに陽性である、α−シヌクレインタンパク質は、パーキンソン病、レビ小体病(Lewy in Handbuch der Neurologie, M. Lewandowski, ed., Springer, Berline pp. 920-933, 1912; Pollanen et al, J. Neuropath. Exp. Neurol. 52:183-191, 1993; Spillantini et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6469-6473, 1998; Arai et al, Neurosc. Lett. 259:83-86, 1999)、ならびに多系統萎縮症(Wakabayashi et al, Acta Neuropath. 96:445-452, 1998)を持つ患者の脳の中にレビ小体の部分として見出される。この開示の目的のためには、パーキンソン病は、原繊維(コンゴレッドおよびチオフラビンＳに陽性であり、そして優先的なベータ−プリーツシート二次構造を含有するところの)がこの疾患を持つ患者の脳の中で発生するという事実に因り、アミロイド様疾患の特色をまた示す、疾患として考えられるべきである。
【００８９】
特異的プロシアニジンもしくはプロアントシアニジンは、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む種々のアミロイドーシスに対してアミロイドならびにα−シヌクレイン原繊維を破壊する／の分解を引き起こすために有効な薬剤である。一つのプロシアニジン、即ちプロシアニジンＢ２(エピカテキン‐４β→８‐エピカテキンとまた呼ばれる)は、Ａβ(即ち、ベータアミロイドタンパク質)およびα−シヌクレイン原繊維発生の阻害剤として非常に有効である。しかしながら、使用されるプロシアニジンＢ２は市販で入手可能ではなくて、多量の原料および完成に長時間を必要とする、方法により植物材料から分離されねばならなかった。さらに、プロシアニジンＢ２を合成するために入手可能な唯一つの発表方法(Tuckmantel et al, J. Am. Chem. Soc., 121:12073-12081, 1999)は、非常に低い収率(出発原料の約２％)有したし、それ故にプロシアニジンＢ２の相当な量(グラム〜キログラム)を生産するためには大量の出発原料(即ち、カテキン)を必要とした。
【００９０】
これらの問題を回避するためにならびにアルツハイマー病、パーキンソン病および他のアミロイド障害の処置のための潜在的な新治療薬としてプロシアニジンＢ２の増加した生産をするために、プロシアニジンＢ２の生産のための迅速且つさらに効率的な単離方法が必要であった。本明細書中で提供されるのは、植物材料から、さらに特異的に、ウンカリア・トメントーサ(即ち、キャッツ・クロー)からの、プロシアニジンＢ２の新分離方法である。加えて、本明細書中で提供されるのは、プロシアニジンＢ２の新合成方法である。本明細書中で提供されるのは、本明細書中で提供される合成ルートが、１)前より異なる出発原料(即ち、カテキンの代わりにエピカテキン)で始めて、２)以前に記載してきたものよりさらに短い合成ルートであって、３)以前に記載したものよりさらに高い収率を提供することにおいて、以前に記載されたものから異なる、プロシアニジンＢ２への合成ルートである。
【００９１】
(ウンカリア・トメントーサ(キャッツ・クロー))
"Una de Gato"(スペイン語で)もしくは"Cat's claw(キャッツ・クロー)"(英語で)としてまた知られている、薬草のウンカリア・トメントーサは、ペルーのアマゾンの熱帯雨林内で成長する木本性蔓を指す。このゆっくり成長する蔓は、成木になるのに２０年掛かって、それがそれ自身を天然木の周りに付着させて且つ巻きつけるときには長さで１００フィート以上に成長することができる。それは、２〜８千フィートの高さでの丘陵地帯に豊富に見出される。この蔓は、その葉の元から突き出る特有の曲がった爪様の棘のために、"キャッツ・クロー"と呼ばれる。
【００９２】
本明細書中で提供されるのは、アルツハイマー病、２型糖尿病、全身性ＡＡアミロイドーシスおよび他のアミロイド疾患に関連するアミロイドーシスの処置のための、ならびに、パーキンソン病を持つ患者に観察されるもののような、α−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維の生成および蓄積の処置のための、プロシアニジンおよびプロアントシアニジンを含む、ウンカリア・トメントーサから誘導される化合物である。
【００９３】
(プロシアニジンＢ２を合成するために以前に使用された方法)
一般にプロシアニジン、および特にプロシアニジンＢ２、への最も早期の合成ルートは、大抵は低収率を持ったし、そして構造を確認するために少量を得るように主としてデザインされた。後からの仕事は、二量体のさらに効率的な生成が、過剰のエピカテキンおよび酸でエピカテキンポリマー(例えば、無毛カナメモチ(Photinia glabrescens)から)を処理することから得ることができたことを見出した(Hemingway et al, J.C.S. Perkin 1:1209-1216, 1982)。同じ方法論のもう一つの適用において、エピカテキンの予め形成させたチオエーテル(ポリマーから形成させた)を酸の中の過剰のエピカテキンと処理することにより、なおさらに効率的な反応が得られ得たことが見出された(Fletcher et al, J.C.S. Perkin 1:, 1628-1637, 1977; Steynberg, Tetrahedron 54:8153-8158, 1998)。これらの方法は、粗製のエピカテキンもしくはカテキンのポリマーの供給に依存して、生成物を精製するために手間の掛かる分離技法の使用を必要とした。
【００９４】
簡単なフロログルシノールから誘導された出発原料から作成されたプロシアニジンへの或る合成的アプローチがある(Steynberg, Tetrahedron 54:8153-8158, 1998; Nay et al, J. Org. Chem. 2379-2384, 2001; Arnaudinaud, Tettrahedron Letters 42:5669-5671, 2001)。これらのアプローチは全て、望ましい生成物の単一の鏡像異性体を得るために光学分割工程のしばしば長くて時には非能率的な使用を必要とする。これらのアプローチはまた、カテキンベースの二量体を合成するために単に使用されてきて、そしてエピカテキン二量体のプロシアニジンＢ２を作成するためには容易に適用され得ない。
【００９５】
プロシアニジンＢ２の合成のためのさらに最近の合成ルートが、Tuckmantel等(J. Am. Chem. Soc. 121:12073-12081, 1999)による文献に報告されている(Tuckmantelの合成ルートについては図１を参照)。プロシアニジンＢ２のTuckmantelの合成はカテキンの直接ベンジル化から出発して、市販のカテキンから約２％の通算収率をもたらすに過ぎない。この合成ルートは、大部分の化学的性質をさらに容易に取り扱える低極性の化合物の上で行うことを許容する、保護基を利用して、既に光学活性のフラバノールのカテキンから出発した。しかしながら、この発表された合成ルートには二つの主要な制限がある。記載された方法における第一の制限は、テトラベンジルカテキンの低収率、合成ルートの第一工程の単なる２０％、であって、それは商業的生産(キログラム量)をあまりに高価にする。以前に記載された方法における第二の制限は、重要中間体、テトラベンジル‐エピカテキン２を与えるためのＣ−３における立体化学の二工程反転の必要性である。テトラベンジル‐エピカテキンの通算収率は、カテキンの出発原料からたったの約１５％であった。これは、中間体２が四倍過剰に必要であるので(図１、第５工程を参照)、プロシアニジンＢ２  ５の合成の有効性を制限して、それは反応中間体２(即ち、テトラベンジル化生成物)(図１)のいかなる改良合成もなおさらに有用にする。それ故に、テトラベンジル化エピカテキン生成物は、プロシアニジンＢ２の合成のための重要な中間体である。
【００９６】
加えて、ウンカリア・トメントーサもしくはキャッツ・クローは、免疫支持性の、抗炎症性の、抗ウイルス性の、抗変異性のおよび抗酸化性の性質を有すると期待される。抗炎症性の性質は、例えば、関節炎、リウマチ、滑液包炎および痛風の処置に有益であると期待される。理論に縛られること無しに、関節炎痛を処置するのにその有益な効果は、部分的に、消化管を清浄にして身体から毒素を除去するのを助けるその能力に因り得ると信じられる。
【００９７】
さらに、ウンカリア・トメントーサもしくはキャッツ・クローは、疼痛を軽減すると期待される。それ自体では、Una de Gatoは、例えば、化学療法、放射線処置およびＡＺＴの使用に関連する疼痛を軽減するのに役立つと期待される。(「ウンカリア・トメントーサから新しいキノン性グリコシド」、("New Quinovic Glycosides from Uncaria tomentosa"), Journal of Natural Products, 51 (2):257-261, 1988)
【００９８】
ウンカリア・トメントーサもしくはキャッツ・クローはまた、初期段階でのウイルス感染を停止させる、エイズ患者における日和見感染と戦う、ならびに或る皮膚腫瘍および嚢腫の見える大きさを減少させるのに有用であると期待される。
【００９９】
ウンカリア・トメントーサはまた、がん、エイズ、クローン病、呼吸器感染症、アレルギー、ヘルペス、前立腺疾患、狼瘡、エプスタイン・バーウイルス、慢性疲労症候群、ならびに種々の胃および腸の障害を含む、種々の病気を処置するために使用され得る。
【０１００】
(医薬組成物および投与)
一般に、単離された、精製されたおよび／もしくは合成のプロシアニジンＢ２化合物は、単独でまたはこの開示の少なくとも一つの他の化合物ならびに／または処置される疾患に対する少なくとも一つの他の従来の治療薬剤との組み合せのどちらかで、当分野で公知の普通のモードにより治療的に有効な量で投与される。治療的に有効な量は、疾患、その重篤度、処置される動物の年齢および相対的健康度、化合物(複数を含む)の効力ならびに他の要因に依存して広く変わり得る。抗−原繊維薬剤として、この開示の化合物の治療的に有効な量は、１〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ；例えば、１０〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、に分布し得る。当業者は、必要以上の実験無しに、その技能およびこの開示を考慮して、アミロイドーシスもしくはα−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維生成の処置のための化合物の治療的に有効な量を従来から決定することができるであろう。
【０１０１】
一般に、単離された、精製されたおよび／もしくは合成のプロシアニジンＢ２化合物は、以下のルートの一つによって医薬組成物として投与されるであろう：経口、局所、全身(例えば、経皮、鼻腔内もしくは坐薬)、または注射(例えば、筋肉内、皮下、もしくは静脈注射)。組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固形製剤、散剤、徐放性製剤、溶液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアゾール剤もしくは他の適切な組成物の形を取り得て；そして少なくとも一つの薬学的に許容される添加物と組み合せて少なくとも一つのこの開示の化合物を含み得る。適当な添加物は当業者に周知であり、そしてそれら、および組成物を製剤化する方法はAlfonso AR：「レミントンの製薬科学１７版」(Remington's Pharmaceutical Sciences 17th ed.), Mack Publishing Company, Easton PA, 1985のような標準的文献に見出され得る。特に注射溶液のための、適当な液体担体には、水、生理食塩水、デキストロース水溶液およびグリコールが含まれる。
【０１０２】
特に、化合物(複数を含む)は、例えば、錠剤、トローチ剤、口内錠、水性のもしくは油性の懸濁剤、分散性の散剤もしくは顆粒剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として、経口的に投与され得る。一つの実施態様では、唯一つのそのような化合物が、任意の特定な投与剤型で投与される。経口使用を意図する組成物を、医薬組成物の製造の分野で公知の任意の方法にしたがって調製することができて、そしてそのような組成物は、薬学的に優美な且つ美味な製剤を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤からなる群より選択される一つもしくはそれ以上の薬剤を含有し得る。
【０１０３】
錠剤は、錠剤の製造に適するところの非毒性の薬学的に許容される添加物と混合して化合物を含有する。これらの添加物には、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムもしくはリン酸ナトリウムのような不活性な賦形剤；顆粒化および崩壊剤、例えば、トウモロコシでん粉もしくはアルギン酸；結合剤、例えば、トウモロコシでん粉、ゼラチンもしくはアカシア；ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸または滑石が含まれる。錠剤を被膜しないかもしくはそれらを公知の技法により被膜して、消化管の中での崩壊および吸収を遅らせて、それ故に長期に亘り徐放性作用を提供することができる。例えば、モノステアリン酸グリセロールもしくはジステアリン酸グリセロールのような時間遅延材料を使用することができる。経口使用のための製剤をまた、化合物を非活性な固体賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合する、硬ゼラチンカプセル剤として、または有効成分を、水または油性媒体、例えば、ピーナツ油、液体パラフィンもしくはオリーブ油、と混合する、軟ゼラチンカプセル剤として、提供することができる。
【０１０４】
水性の懸濁剤は、水性の懸濁剤の製造に適する添加物と混合して化合物を含有する。そのような添加物には、例えば、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴム、ならびに天然に産出するリン脂質であるところの分散もしくは湿潤剤、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、もしくはエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、もしくはエチレンオキシドの脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、もしくはエチレンオキシドの脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビトールが含まれる。水性の懸濁剤はまた、一つもしくはそれ以上の保存剤、例えば、p‐ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはプロピル、一つもしくはそれ以上の着色剤、一つもしくはそれ以上の着香剤、および／またはショ糖もしくはサッカリンのような、一つもしくはそれ以上の甘味剤を含有することができる。
【０１０５】
油性の懸濁剤を、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油の中でまたは液体パラフィンのような鉱物油の中で化合物を懸濁させることにより製剤することができる。油性の懸濁剤は、増粘剤、例えば、蜂蜜、固形パラフィンもしくはセチルアルコール、を含有し得る。下に示すようのもののような、甘味剤および着香剤を加えて、美味な経口製剤を提供することができる。これらの組成物を、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存することができる。
【０１０６】
水の添加により水性の懸濁剤の調成に適する分散可能な散剤および顆粒剤は、分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤および一つもしくはそれ以上の保存剤と混合して活性成分を提供する。適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁化剤は、既に上で記述したものにより例示される。さらに別の添加物、例えば、甘味剤、着香剤および着色剤がまた存在し得る。
【０１０７】
化合物はまた、水中油乳剤の形であり得る。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくは落花生油、または鉱物油、例えば、液体パラフィン、またはそれらの混合液であり得る。適当な乳化剤は、天然に産出するガム、例えば、アカシアゴムもしくはトラガカントゴム、天然に産出するリン脂質、例えば、大豆、レシチン、ならびに、脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導されるエステルもしくは部分エステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、ならびに当概部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。乳剤はまた、甘味剤および着香剤を含有し得る。シロップ剤およびエリキシール剤を、甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトールもしくはショ糖、と共に製剤化することができる。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存剤ならびに着香剤および着色剤を含有し得る。
【０１０８】
化合物をまた、注射または点滴、皮下、もしくは静脈、もしくは筋肉内、もしくは胸骨内もしくは鼻腔内のどちらかで、または無菌注射性もしくは油脂性懸濁剤の形における点滴技法により投与することができる。化合物は、無菌注射の水性もしくは油脂性懸濁剤の形であり得る。これらの懸濁剤を、上に記載されてきているもののような、適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いて公知の技術にしたがって製剤化することができる。無菌の注射製剤はまた、無毒の注射的に許容される希釈剤もしくは溶媒の中の無菌の注射溶液または懸濁剤で、例えば、１,３‐ブタンジオール中の溶液として、あり得る。使用され得る、許容されるビークルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液ならびに等張食塩水がある。加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒もしくは懸濁化媒体として従来から使用される。この目的のためには、合成的なモノ−もしくはジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油が従来から使用され得る。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製に用途を見出す。投与レジメンを調整して、最適な治療応答を与えることができる。例えば、数個の分割した投与量を毎日投与できるし、もしくは投与量を、治療状況の緊急性により指示されるように比例して減少させることができる。
【０１０９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために化合物を投与単位形で製剤することは特に有利である。本明細書中で使用される際には、投与単位形とは、処置される対象に対して単位的投与量として適する物理的に個別の単位を指して、それぞれが、治療的に有効な量の化合物および少なくとも一つの薬学的添加物を含有する。
【０１１０】
薬物製品は、アルツハイマー病のようなアミロイド疾患、もしくはパーキンソン病のようなα−シヌクレイン／ＮＡＣ原繊維の生成に関与する疾患の処置のような、意図する処置方法を指示するラベルを貼るか添付している、容器内に投与単位形を含むであろう。化合物を、包装材料、例えば、アミロイド疾患の処置に有効であるところの本明細書中で提供される化合物を包装材料内で、および、化合物が、例えば、アミロイド疾患を処置するために使用されることを指示するラベルを含有する製造品目として包装し得る。
【０１１１】
以下の非限定的実施例は、例示の目的のみで示されて、この開示の限定とは考えられないで、その多くの明らかな変形例は、その精神および範囲から逸脱することなく可能である。
【実施例】
【０１１２】
(実施例１)
(プロシアニジンＢ２の合成に用いられる一般的実験手順およびおＨＰＬＣ条件)
全ての溶媒を、使用前に蒸留して、そして３５℃までの温度でロータリー蒸発により除去した。オクタデシル機能化シリカゲル(Ｃ１８)を逆相(ＲＰ)フラッシュクロマトグラフィーに使用し、そしてメルクシリカゲル６０，２００〜４００メッシュ、４０〜６３μｍ、をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに使用した。薄層クロマトグラフィーをMerck DC-plastikfolien Kieselgel 60 F254を用いて行って、先ず紫外線(ＵＶ)ランプで、次いで、バニリン溶液(エタノール中の１％バニリン、１％硫酸)中に侵して、加熱することにより、可視化した。旋光度を、Perkin-Elmer 241旋光度計上で測定した。質量、ＵＶおよび赤外(ＩＲ)スペクトルを、それぞれ、Kratos MS-80、 Shimadzu UV 240およびPerkin-Elmer 1600 FTIR機器上で記録した。ＮＭＲスペクトルを、２５℃で、Varian INOVA-500もしくはVXR-300分光計上で、１Ｈについては５００もしくは３００ＭＨｚで、そして１３Ｃについては１２５もしくは７５ＭＨｚで、記録した。化学シフトを、７.２５でのＣＨＣｌ３ならびに７７.０ｐｐｍでのＣＤＣｌ３もしくは２.１５での(ＣＨ３)２ＣＯおよび３０.５ｐｐｍでの(ＣＤ３)２ＣＯの溶媒ピークを参照にするδスケールのｐｐｍで示した。
【０１１３】
高速液体クロマトマトグラフィー(ＨＰＬＣ)分析を伴う全ての研究については、分析用ＨＰＬＣ装置は、Omegaソフトウェアーにより制御される、Waters 717オートサンプラー,600ポンプおよびコントローラーならびに2487 ＵＶ検出器で構成された。試料を、３０℃で取り付けたガードカラム(C18 ODS ４×３ｍｍ、５μｍカラムを含有するPhenomenex SecurityGuardカートリッジ)を持つRP-18半分取カラム(Phenomenex Jupiter 5 μｍ C18 300A、２５０×１０ｍｍ)を用いて分析した。試料(５μＬ)を、２８０ｎｍにおけるＵＶ検出でもって、５.０ｍｌ／分の移動相の流速を用いて分析した。Ａ溶媒は、０.１％ＴＦＡを含有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ(９５：５)で構成された。Ｂ溶媒は、０.１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏで構成された。時間の関数として移動相の組成を表１に示す。
【０１１４】
【表１】
2006507357.tif 000004
【０１１５】
(実施例２)
(５,７,３',４',３''‐ペンタ‐Ｏ‐アセチルエピカテキンの作成(図２、第１工程))
ピリジン(１０ｍｌ)中のエピカテキン(２.５ｇ)の懸濁液に、攪拌しながら無水酢酸(１０ｍｌ)を滴下した。混合液を室温でさらに４８時間攪拌してから、氷水(２００ｍｌ)上に注ぎ、室温にまで来させて、次いで、さらに２時間放置した。混合液を酢酸エチル(２００ｍｌ)で抽出し、次いで、それを塩酸水溶液(１Ｍ、２００ｍｌ)で洗浄し、分離し、乾燥して、真空で蒸発すると、五酢酸エピカテキン(１)を微黄色のガム(４.５g、８７％収率)として与えた。
１３Ｃ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)１７０.３，１６８.９，１６８.３，１６８.０，１６７.９，１５４.８，１４９.６，１４９.５，１４１.９，１４１.７，１３５.７，１２４.３，１２３.１，１２１.９，１０９.５，１０８.６，１０７.９，７６.５，６６.５，２５.８，２０.９，２０.６，２０.６，２０.４および２０.４(図３)。
【０１１６】
(実施例３)
(５,７,３',４',‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンの作成(図２、第２工程))
ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(５０ｍｌ)中の五酢酸エピカテキン(１)(４.５ｇ)および塩化ベンジル(４.１ｍｌ)の０℃で攪拌した溶液に、水素化ナトリウム(油中の８０％分散剤、２.５ｇ)を１０分間で加え、次いで、水(０.５４ｍｌ)を３０分で滴下した。混合液を室温にし、さらに４８時間攪拌してから、塩酸(２００ｍｌ、１Ｍ)および氷(２００ｇ)の上に注いだ。室温にまで来させ２時間放置した後に、混合液を、酢酸エチル(２×２００ｍｌ)の中に抽出し、乾燥して、真空で蒸発すると、桃色のガムを与えた。高度真空下に終夜さらなる蒸発は桃色の結晶性固体を与えた。シクロヘキサン／ジクロロメタン(１：１)に引き続くジクロロメタン(１００％)で留出するシリカゲル上のクロマトグラフィーによる精製は、テトラベンジルエピカテキン(２)を微黄色の結晶性固体(４.２g、７５％収率)として与えた。
１３ＣＮＭＲ−(ＣＤＣｌ３)１５８.７，１５８.３，１５５.２，１４９.０，１４８.８，１３７.２，１３７.１，１３６.９，１３６.９，１３１.４，１２８.５，１２８.４，１２７.９，１２７.８，１２７.７，１２７.５，１２７.２，１２７.２，１１９.４，１１５.０，１１３.５，１００.９，９４.６，９４.０，７８.３，７１.３，７１.２，７０.１，６９.９，６６.３および２８.２(図４)
【０１１７】
(実施例４)
(５,７,３',４',‐テトラ‐Ｏ‐ベンジル‐４‐(２‐ヒドロキシエトキシ)エピカテキンの作成(図２、第３工程))
無水ジクロロメタン(ＣＨ２Ｃｌ２)(３０ｍｌ)中のテトラベンジルエピカテキン(２)(３ｇ)の塩化カルシウム(ＣａＣｌ２)管下で攪拌した溶液に、室温で、エチレングリコール(１.５ｍｌ)を加えて、次いで、２,３‐ジクロロ‐５,６‐ジシアノ‐１,４‐ベエゾキノン(ＤＤＱ)(２.１ｇ)を良好な攪拌下で一挙に加えた。２時間の激しい攪拌の後に、４−(ジメチルアミノ)ピリジン(ＤＭＡＰ)(１.１２５ｇ)を加えて、攪拌を１５分間継続した。次いで、混合液をフラッシュ真空カラムに流下させて、ＣＨ２Ｃｌ２(５０ｍｌ)、ＣＨ２Ｃｌ２の中の１０％酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)(２×５０ｍｌ)、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２の中の２０％ＥｔＯＡｃ(２×５０ｍｌ)で留出すると、粗製生成物を与えた。増加する比率のＥｔＯＡｃを含有するＣＨ２Ｃｌ２で留出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製は、エチレングリコール付加物(３)を微桃色のガム(１.３５g、４１％収率)として与えた。
１３ＣＮＭＲ−(ＣＤＣｌ３)１６０.５，１５９.５，１５６.０，１４８.９，１４８.７，１３７.１，１３７.１，１３６.５，１３６.３，１３０.８，１１９.６，１１４.９，１１３.７，１０１.８，９４.４，９４.２，７４.６，７１.３，７１.１，７０.５，７０.４，７０.４，６９.９，６８.０および６１.８ (図５)。
【０１１８】
(実施例５)
(５,７,３',４',‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキン‐４β→８‐５,７,３',４',‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキンの作成(図２、第４工程))
無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)(１２ｍｌ)および無水ＣＨ２Ｃｌ２(１５ｍｌ)中の５,７,３',４',‐テトラ‐Ｏ‐ベンジル‐４‐(２‐ヒドロキシエトキシ)エピカテキン(３)(１.０ｇ)および５,７,３',４',‐テトラ‐Ｏ‐ベンジルエピカテキン(２)(４.０ｇ)の溶液に、攪拌しながら０℃で窒素下四塩化チタン(ＴｉＣｌ４)(ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ、２.８ｍｌ)を滴下した。混合液を室温に暖めてから、さらに２時間攪拌し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム(ＮａＨＣＯ３)水溶液(２０ｍｌ)および水(４０ｍｌ)で失活させた。さらに多くのＣＨ２Ｃｌ２(１００ｍｌ)を加え、有機層を分離し、乾燥して、真空中で蒸発すると、粗製生成物を与えた。生成物を熱い酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)／エタノール(ＥｔＯＨ)(６ｍｌ／１０ｍｌ)中に溶解して、終夜放置して、結晶化させた。結晶をろ去して、最少量の冷溶媒で洗浄して、次いで、母液を蒸発乾固した。母液からの二量体(４)のシクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ(１３：１３：１)で留出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製は、ベンジル化二量体(４)を微黄色のガム(０.７０g、３９％収率)として与えた。
１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)(２つの回転異性体、約３：１から成る、ＭＲ＝主要の回転異性体，ｍｒ＝少量の回転異性体)６.８２，６.４６(Ａｂｑ，２Ｈ，ＭＲ，Ｊ８Ｈｚ，Ｂ部分Ｊ１.５Ｈｚでｄ)，６.３７(ｓ，１Ｈ，ＭＲ)，６.２５，６.０９(ＡＢｑ，２Ｈ，ｍｒ，Ｊ２.５Ｈｚ)，６.２０(ｓ，１Ｈ，ｍｒ)，６.０２，５.７１(Ａｂｑ，２Ｈ，ＭＲ，Ｊ２Ｈｚ)，５.５４(ｓ，１Ｈ，ＭＲ)，５.３１(ｓ，１Ｈ，ｍｒ)，４.６５，４.４７(ＡＢｑ，２Ｈ，ＭＲ，Ｊ１１Ｈｚ)，４.６５，４.４１(ＡＢｑ，２Ｈ，ｍｒ，Ｊ１２Ｈｚ)，４.３４(ｍ，１Ｈ，ｍｒ)，４.０９(ｂｒ重なり，１Ｈ，ＭＲ)，４.０８(ｓ，１Ｈ，ＭＲ)，３.９８(ｂｒ  ｄ，１Ｈ，ｍｒＪ６Ｈｚ)，３.８８(ｍ，１Ｈ，ＭＲ)および３.１２２.８６(ｍ，２Ｈ，ＭＲ＋ｍｒ)(図６〜８)。
【０１１９】
(実施例６)
(エピカテキン‐４β→８‐エピカテキンの作成(図２、第５工程))
テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)(３０ｍｌ)中のベンジル化ダイマー(７００ｍｇ)の溶液に、メタノール(ＭｅＯＨ)(３０ｍｌ)、水(１.５ｍｌ)および炭素上の水酸化パラジュウム(Ｐｄ(ＯＨ)２／Ｃ)(２０％、５０％までの水を含み、３００ｍｇ)を加えた。混合液を水素雰囲気下に２時間振り混ぜて、セライトを通してろ過して、それをメタノールで洗浄した。乾燥した生成物のＨＰＬＣ分析(図９)は、それが、全ては純粋な試料と同一である、１２.４分に少量のエピカテキンおよび１７.６分にプロシアニジン三量体Ｃ１と一緒に、１０.３分に約８０％のプロシアニジン二量体Ｂ２を含有することを示した。
【０１２０】
生成物の最終精製をSephadex LH20上のカラムクロマトグラフィーにより達成したとき、９５％エタノールは、プロシアニジン二量体Ｂ２を４５〜５６画分にて溶出した(１４０ｍg、５０％収率)。精製したプロシアニジン二量体Ｂ２は図１０のＨＰＬＣ写図で１０.３分に観測される。
１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤ３)２ＣＯ：２.８３(１Ｈ，ｄ，Ｊ１７)，２.９６(１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５，１７)，３.７６(１Ｈ，ｍ，ＯＨ)，３.８３(１Ｈ，ｍ，ＯＨ)，４.１０(１Ｈ，ｄ，Ｊ５)，４.４１(１Ｈ，ｂｒ  ｓ)，４.８３(１Ｈ，ｓ)，５.０７(１Ｈ，ｂｒ  ｓ)，５.２０(１Ｈ，ｂｒ  ｓ)，６.０７(１Ｈ，ｓ)，６.０９(１Ｈ，ｓ)，６.１１(１Ｈ，ｓ)，６.８３(３Ｈ，ｓ)，７.００(１Ｈ，ｂｒ  ｓ)，７.０８(１Ｈ，ｓ)，７.２０(１Ｈ，ｓ)，７.８１(１Ｈ，ｓ，ＯＨ)，７.８７(１Ｈ，ｓ，ＯＨ)，７.９１(１ｈ，ｓ，ＯＨ)，８.０２(１Ｈ，ｂｒ  ｓ，ＯＨ)および８.２８(２Ｈ，ｓ，ＯＨ)(図１１)。
負電圧電子電気スプレーマススペクトル５７７(Ｍ＋−Ｈ，１００％)(図１２)
［α］１７５８９ｎｍ＋３０.２°，［α］１７５７７ｎｍ＋２０.８°，［α］１７５４６ｎｍ＋７.３°，［α］１７４３５ｎｍ−７７.２°，［α］１７４０４ｎｍ−９１.０°。このデータは、プロシアニジンＢ２を確認する文献データ(Tuckmantel et al, J. Am. Chem. Soc. 121:12073-12081, 1999)と良く相関している。
【０１２１】
(実施例７)
(合成のプロシアニジンＢ２は、Ａβ原繊維の強力な阻害剤／分裂剤)
本明細書にしたがって記載されるように合成された、合成のプロシアニジンＢ２(即ち、エピカテキン‐４β→８‐エピカテキン)は、アルツハイマー病のベータアミロイドタンパク質(Ａβ)原繊維の強力な阻害剤／分裂剤である。研究の最初のセットにおいて、合成のプロシアニジンＢ２の有効性は、"ＰＴＩ−７７７"として呼ばれる特異的なウンカリア・トメントーサ(即ち、キャッツ・クロー)の抽出物より単離されたプロシアニジンＢ２とおよびウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より直接に単離されたプロシアニジンＢ２と、アルツハイマー病の予生成のベータアミロイド原繊維(例えば、Ａβ１−４２原繊維から成る)の分解／分裂を引き起こすそれらの能力について、直接に比較された。
【０１２２】
一つの研究において、チオフラビンＴ蛍光光度法を用いて、ＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２、キャッツ・クローの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２、本明細書中で開示されるように合成されたプロシアニジンＢ２およびＥＤＴＡ(負の対照として)の効果を測定した。このアッセイにおいては、チオフラビンＴは、繊維状アミロイドと特異的に結合し、そしてこの結合は、生成されたアミロイド原繊維の量と直接に比例するところの４８５ｎｍにおける蛍光の増強をもたらす。蛍光が高いほど、生成されたアミロイド原繊維の量は多い(Naki et al, Lab. Invest. 65:104-110, 1991; Levine III, Protein Sc. 2:404-410, 1993; Amyloid Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995)。
【０１２３】
この研究においては、２５μＭの予繊維化したＡβ１−４２(Bachem Inc)を、単独で、またはａ)ＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２、ｂ)キャッツ・クローの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２、ｃ)合成のプロシアニジンＢ２およびｄ)ＥＤＴＡ(１：１、１：０.１、１：０.０１もしくは１：０.００１のＡβ：試験化合物の重量比において)の存在下におけるかのどちらかで３７℃で１週間培養した。共培養の３日後に、それぞれの培養混合液５０μｌを、蒸留水１５０μｌおよび５０μｌのチオフラビンＴ溶液(即ち、２５０ｍＭリン酸塩緩衝液中の５００ｍＭチオフラビンＴ)(ｐＨ６.８)を含有する９６穴のマイクロタイタープレートの中に移入した。ブランクとして、緩衝液単独もしくは化合物単独との引き算の後にＥＬＩＳＡプレート蛍光計を用いて、蛍光を４８５ｎｍ(４４４ｎｍの励起波長)において読み取った。
【０１２４】
３日目の培養の結果を示す(図１３)。ＥＤＴＡは、全ての試験した濃度においてＡβ１−４２原繊維の有意な阻害を何も引き起こさなかった一方で、合成のプロシアニジンＢ２は、キャッツ・クローの樹皮粉末よりもしくはＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２と同様に、予生成のＡβ１−４２原繊維の用量依存性の分裂／分解を引き起こした(図１３)。合成のプロシアニジンＢ２は、１：１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０１)８４.５＋／−７.９％の分裂をおよび１：０.１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０５)３１.５＋／−１３.５％の分裂を引き起こした。この研究は、本明細書中で開示される方法により製造された合成のプロシアニジンＢ２は、アルツハイマー病型Ａβ原繊維の強力な破壊剤であり、そして用量依存性様式でその効果を発揮することを示した。
【０１２５】
その単量体形においてさえ、Ａβ１−４２の破壊は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング方法(示していない)の使用を伴う研究により確認された。この後者の研究では、予繊維化したＡβ１−４２(２５μＭ)の三組の試料を、単独で、またはａ)ＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２、ｂ)キャッツ・クローの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２、ｃ)合成のプロシアニジンＢ２もしくはＥＤＴＡの存在下におけるかのどちらかで３７℃で３および７間培養した。次いで、それぞれの試料のアリコート５μｇを０.２μｍフィルターを通してろ過した。次いで、ろ液から回収したタンパク質を、１０〜２０％のトリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に充填して操作し、ニトロセルロースへブロッティングして、Ａβ−抗体(クローン６Ｅ１０；Senetek)を用いるＥＣＬにより検出した。この研究においては、Ａβ１−４２は、単独でもしくはＥＤＴＡの存在下において、３および７日間の両方での培養の後で約４キロダルトンのバンド(即ち、単量体のＡβ)として検出された。Ａβ１−４２は、ａ)ＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２、ｂ)キャッツ・クローの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２もしくはｃ)合成のプロシアニジンＢ２のいずれかと共に７日間の共培養による(示していない)Ａβ１−４２の培養の後で検出されないで、これらの化合物が単量体のＡβ１−４２の消滅を引き起こす能力があったことを示唆した。この研究は、合成のプロシアニジンＢ２がまた、単量体のＡβ１−４２の破壊／除去を引き起こす能力があったことを確認した。
【０１２６】
(実施例８)
(合成のプロシアニジンＢ２はコンゴレッドに結合する繊維状Ａβの強力な阻害剤)
コンゴレッド結合アッセイ(下に記述するように)では、与えられた試験化合物がアミロイド(この場合には、Ａβ)のコンゴレッドへの結合を変更する能力が定量化される。このアッセイにおいては、Ａβ１−４２＋／−試験化合物が３日間培養されて、次いで、０.２μｍフィルターを通して真空ろ過された。次いで、ろ紙中に残されたＡβ１−４２(即ち、"残物")の量を、ろ紙のコンゴレッドでの染色の後で定量化した。ろ紙の適切な洗浄後に、試験化合物の存在下におけるろ紙上のコンゴレッド色のいかなる低下も(試験化合物の不在下におけるアミロイドタンパク質のコンゴレッド染色に比較して)、凝集し且つコンゴレッド親和性のＡβの量を消滅させる／変更する試験化合物の能力の指標であった。
【０１２７】
一つの研究において(図１４)、増加する量のａ)ＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２、ｂ)キャッツ・クローの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２、ｃ)合成のプロシアニジンＢ２またはｄ)ＥＤＴＡ(１：１、１：０.１、１：０.０１もしくは１：０.００１のＡβ：試験化合物の重量比において)の不存在下または存在下におけるＡβ原繊維のコンゴレッドへ結合する能力が測定された。３日目の培養の結果を示す(図１４)。ＥＤＴＡは、全ての試験した濃度においてＡβ１−４２原繊維のコンゴレッドへの結合の有意な阻害を何も引き起こさなかった一方で、合成のプロシアニジンＢ２は、キャッツ・クローの樹皮粉末よりもしくはＰＴＩ−７７７より単離されたプロシアニジンＢ２のいずれかで観測されたものよりさらに大きくてさえ、繊維状Ａβ１−４２のコンゴレッドへの結合の用量依存性の阻害を引き起こした(図１４)。合成のプロシアニジンＢ２は、１：１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０１)４６.３＋／−４.３％のＡβ１−４２原繊維へのコンゴレッドの結合の阻害をおよび１：０.１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０１)３０.３＋／−８.０％のコンゴレッドの結合の阻害を引き起こした。比較では、樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２は、１：１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに３６.３＋／−４.３％だけそして１：０.１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意ではなく,Ａβ１−４２原繊維のコンゴレッドへの結合を阻害した。この研究は、本明細書中で開示される方法により生産された合成のプロシアニジンＢ２は、アルツハイマー病型Ａβ原繊維のコンゴレッドへの結合の強力な阻害剤であり、そして用量依存性様式でその効果を発揮することを示す。
【０１２８】
(実施例９)
(合成のプロシアニジンＢ２のさらなるインビトロおよびインビボ試験)
さらなるインビトロおよびインビボアッセイを用いて、限定するものではないがアルツハイマー病を含む、アミロイド疾患の処置における合成のプロシアニジンＢ２および関連化合物のそれらの有効性を試験することができる。さらなるインビトロ試験の例としては、ペプチド(１ｍＭ)の原液をパイロジェンフリーの無菌水の中で調製し且つ決められた培養液中の指示濃度へ希釈することができる。ラットの海馬回の培養液(インビトロで１０〜１４日)をペプチドもしくはビークルで４日間処置することができる。ラットの大脳皮質性培養液の生存能力を、位相差顕微鏡により可視的に評価し且つ培養液の中に放出された乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)を測定することにより定量化できた。
【０１２９】
(第１アッセイ)
主なラットの海馬回のニューロンを標準的な細胞培養技法でインビトロで培養することができた。ベータアミロイドタンパク質(Ａβ)１−４２もしくは１−４０を、正常で有毒な濃度の２５〜５０μＭで培養細胞へ加えることができた。４日の処置の後で、生存能力を、培養液中に放出された乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)の測定により評価できた。ＬＤＨを、９６穴形式中で標準的な３４０ｎｍの速度論的ＬＤＨアッセイ(Sigma Catalog #228-20)を用いて、順化し決められたＤＭＥＭのアリコート２０μｌ中で測定できた。アッセイを、データ解析用にDelta Soft II software (v.3.30B, BioMetallics, Inc.)を用いて、ＰＣ稼動のEL340 Microplate Biokineticsプレートリーダー(Bio-Tek Instruments)の中で３７℃で実施することができた。正常のおよび高いレベルの血清ＬＤＨ(例えば、Sigma Enzyme Controls 2Nおよび2E)を含有する品質管理標準を全てのアッセイと共に作動することができた。結果を、１単位がアッセイ条件下で１分当り１マイクロモルのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生成を触媒するであろう酵素の量として定義される、ＬＤＨ／Ｌの単位として表すことができた。予防の研究のためには、合成のプロシアニジンＢ２を、Ａβ処置の前におよび／もしくはと同時に培養液に加えることができた。試験化合物の活性を、対照に比べて比較して、培地の中に放出されたＬＤＨ(神経毒性の指標)の減少により例示することができた。
【０１３０】
(第２アッセイ)
臨床試験のために５〜５０人の婦人を選択することができた。婦人は、閉経後で、即ち、試験の開始前の６〜１２ヶ月の間に月経が停止していて、初期アルツハイマー病(ＡＤ)と診断されて、そして試験期間内にＡＤの症状が悪化すると期待されていなければならないが、その他では良好な一般健康にあらねばならない。この試験は、プラセボ対照群を有することができた、即ち、婦人は二つの群に分けられたが、その一つはこの開示の合成のプロシアニジンＢ２を受け取りそして他はプラセボを受け取る。患者を、ＡＤに関連する記憶、認知、推論および他の症状について基準化することができた。試験群の婦人は、経口もしくは静脈ルートにより１日当り治療的用量の化合物を受け取るであろう。彼女らは、この治療を６〜３６月の間継続しなければならない。両方の群における基準化された症状について正確な記録を保存すべきであって、試験の終わりにこれらの結果を比較することができた。結果をそれぞれの群のメンバーの間で比較することができた。加えて、それぞれの患者についての結果を試験を開始した前にそれぞれの患者により報告された症状と比較することができた。プロシアニジンＢ２の試験化合物の活性を、ＡＤに関連する典型的な認知の下落および／もしくは行動性分裂の減衰により例示することができた。
【０１３１】
(実施例１０)
(ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末よりプロシアニジンＢ２の迅速な単離の新方法に関して得られた一般方法論および結果)
ウンカリア・トメントーサ(即ち、キャッツ・クロー)の樹皮粉末に存在する主要なプロシアニジン化合物の、粗製メタノール抽出液からの、三段階の単離手順を開示する。プロシアニジンＢ２(即ち、エピカテキン‐４β→８‐エピカテキン)を、下記に開示する方法論を用いて、ウンカリア・トメントーサの粉砕樹皮粉末より分離して精製した。ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末中のプロシアニジンＢ２の収量は０.０５％(重量で)であると推定された。
【０１３２】
ウンカリア・トメントーサの樹皮抽出液の主要なプロシアニジンの成分、プロシアニジンＢ２、は高速液体クロマトマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によるモニタリングと共に、一連のクロマトグラフ的技術により単離された。ウンカリア・トメントーサからの粉砕樹皮粉末(２００ｇ)をメタノール(２リットル)で三回続けて抽出して、粗製の抽出液を与えた(図１５)。次いで、この抽出液をシリカゲル６０上のフラッシュ真空クロマトグラフィーにより分離すると、主要なプロシアニジンが濃縮された画分を与える(図１５〜１８)。さらなる分離をシリカゲル上の重力カラムクロマトグラフィーにより達成したときに、クロロホルム中の２０％〜４０％メタノールはプロシアニジンＢ２およびプロシアニジンＢ４の富化した画分(１.２１ｇ)を与えた(図１９および２０)。次いで、９５％水性エタノールで溶出するSephadex LH20上のカラムクロマトグラフィーはプロシアニジンＢ２の純粋な試料(８９〜１５０ｍｇ)を与えた(図２１〜２３)。
【０１３３】
(実施例１１)
(ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末よりプロシアニジンＢ２の単離に用いられた一般実験手順)
全ての溶媒を、使用前に蒸留して、そして３０℃までの温度でロータリー蒸発により除去した。メルクシリカゲル６０、２００〜４００メッシュ、４０〜６３μｍ、(Sigma Chem. Co. , St. Louis MO, USA; catolog #S057もしくはAldrich catolog #28.8594)をシリカゲル重力カラムクロマトグラフィーに使用し、そしてメルクシリカゲルＴＬＣ級６０Ｈ、５〜４０μｍ、(Sigma Chem Co. catolog #S6628もしくはAldrich catolog #40,3709)をシリカゲル真空フラッシュクロマトグラフィーに使用した。ＴＬＣをMerck DC-plastikfolien Kieselgel 60 F254、(Sigma Chem Co., catalog #Z29,299-0)を用いて行って、先ず観察キャビネット(Aldrich Cat #Z16,943-9)中の紫外線(ＵＶ)ランプで可視化し、次いで、２０％エタノールを加えた８０％硫酸中の１％バニリンで噴霧して、１２０℃で１０〜２０分間かもしくは十分な色の強度が得られるまで加熱した。これに代えて、ＴＬＣプレートのスポットを５％塩化第二鉄水溶液中に浸漬することにより可視化できた。
【０１３４】
旋光度を、Perkin-Elmer 241旋光度計上で測定した。質量、ＵＶおよび赤外(ＩＲ)スペクトルを、それぞれ、Kratos MS-80、 Shimadzu UV 240およびPerkin-Elmer 1600 FTIR機器上で記録した。ＮＭＲスペクトルを、２５℃で、Varian INOVA-500もしくはVXR-300分光計上で、１Ｈについては５００もしくは３００ＭＨｚで、そして１３Ｃについては１２５もしくは７５ＭＨｚで、記録した。化学シフトを、３.３０でのＣＨ３ＯＨ、４９.３ｐｐｍでのＣＨ３ＯＤ、７.２５でのＣＨＣｌ３ならびに７７.０ｐｐｍでのＣＤＣｌ３；２.１５での(ＣＨ３)２ＣＯおよび３０.５での(ＣＤ３)２ＣＯの溶媒ピークを参照にするδスケール上のｐｐｍで示した。
【０１３５】
(ＨＰＬＣ条件)
分析用ＨＰＬＣ装置は、Omegaソフトウェアーにより制御される、Waters 717オートサンプラー、600ポンプおよびコントローラーならびに2487 ＵＶ検出器で構成された。試料を、３０℃で取り付けたガードカラム(C18 ODS ４×３ｍｍ、５μｍカラムを含有するPhenomenex SecurityGuardカートリッジ)を持つRP-18半分取カラム(Phenomenex Jupiter 5 μｍ C18 300A、２５０×１０ｍｍ)を用いて分析した。試料(５μＬ)を、２８０ｎｍにおけるＵＶ検出でもって、５.０ｍｌ／分の移動相の流速を用いて分析した。Ａ溶媒は、５％Ｈ２Ｏおよび０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含有するＣＨ３ＣＮで構成された。Ｂ溶媒は、０.１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏで構成された。時間の関数として移動相の組成を表２に示す。
【０１３６】
【表２】
2006507357.tif 000005
【０１３７】
これに代えて、分析用ＨＰＬＣ装置は、ダイオードアレー検出器を持つHewlit Packard (HP)1100 series HPLCで構成された。試料を、２５℃で取り付けたガードカラム(C18 ODS ４×３ｍｍ、５μｍカラムを含有するPhenomenex SecurityGuardカートリッジ)を持つRP-18分析用カラム(Phenomenex LUNA 5 μｍ C18 100A、２５０×４.６ｍｍ)を用いて分析した。試料(５μＬ)を、２８０ｎｍおよび２１０ｎｍにおけるＵＶ検出でもって、１.０ｍｌ／分の移動相の流速を用いて分析した。Ａ溶媒は、０.１％ＴＦＡを含有するＣＨ３ＣＮで構成された。Ｂ溶媒は、０.１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏで構成された。時間の関数として移動相の組成を表３に示す。
【０１３８】
【表３】
2006507357.tif 000006
【０１３９】
(実施例１２)
(ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末よりプロシアニジンＢ２の単離方法)
(ウンカリア・トメントーサからの粉砕樹皮粉末の抽出)
ウンカリア・トメントーサ(即ち、キャッツ・クロー)２００ｇからの樹皮粉末の試料を、メタノール２リットルで30分間攪拌し、次いで、混合液を３０分間静置することにより抽出した(図15を参照)。次いで、これをWhatmanろ紙41(またはVWRブランド等級＃４１５もしくは４１７もしくは４１０もしくは３１５もしくは３１３もしくは４５４もしくは４７４、４９４、または任意の他の性能があるろ紙)を用いるろ過に引き続いた。このプロセスをさらに二回残渣について繰り返した。次いで、ろ液を合併して、３０℃以下で真空で(即ち、ロータリーエバポレーターを用いて)、およそ１００ｍｌの容積に蒸発した。
【０１４０】
(フラッシュ真空シリカゲルカラムの調製)
乾燥シリカゲルＴＬＣ級６０Ｈの２００グラムを、シリカビーズのサイズが１０μｍであるので、６μｍのフリットを持つ大きい焼結ガラスのブフナー漏斗(９ｃｍ×１０.５ｃｍ、もしくはさらに大きい)の中に置いた。シリカゲルを、＃１４ゴム栓を用いて均等に突き固めた。焼結ガラスの漏斗を一つの穴を持つ＃６.５ゴム栓を用いて５００ｍｌの真空フラスコへ連結した。次いで、真空(６５０ｍｍＨｇ)を真空フラスコにかけて、溶媒(３５０ｍｌ)を全部一度に加えた。溶媒の先端が一直線にカラムを下って移動するのが見られた。真空を、カラムが再び乾くまでかけた(もしも溶媒の先端が均等で無かったならば、シリカを再び突き固めねばならなかった)。シリカの表面を試験し且つ順化するのに使用した３５０ｍｌの溶媒をこの時点で廃棄した。
【０１４１】
(メタノール抽出液のフラッシュ真空シリカゲル分別)
メタノール抽出液約１００ｍｌ(粉砕樹皮粉末２００ｇの抽出から)へ、ＴＬＣ級シリカゲル６０Ｈの５０ｇを加えて、溶媒を３０〜４０℃で真空で除去した(図１５)。次いで、残渣を粉末に破砕して、クロロホルム中の１０％メタノール(３５０ｍｌ)の中で調製した(上述した)シリカゲル６０Ｈフラッシュ真空カラム(２００ｇ)の上に乾いたまま充填した。このカラムのクロロホルム中の１０％メタノール(２×２５０ｍｌ)(即ち、画分＃１および＃２)、クロロホルム中の２０％メタノール(２×２５０ｍｌ)(即ち、画分＃３および＃４)、クロロホルム中の４０％メタノール(２×２５０ｍｌ)(即ち、画分＃５および＃６)、次いで、クロロホルム中の６０％メタノール(２×２５０ｍｌ)(即ち、画分＃７および＃８)、での溶出は８個の画分を与えた。
【０１４２】
全て一度に、注意深く(もしくは、カラムの表面を乱さないように、８〜９ｃｍ幅の端を持つ、逆さにした漏斗の助けで)、真空下で、加えることにより、第一の溶媒混液(即ち、クロロホルム中の１０％メタノール２５０ｍｌ)で第一の画分を溶出して、真空をカラムが再び乾くまで継続した。最初の溶出試料(即ち、画分＃１)を含有する５００ｍｌの真空フラスコを分析のために保存した。次いで、第二の溶媒混液(即ち、クロロホルム中の１０％メタノール２５０ｍｌ)を用いて、第二の画分を溶出して、また分析のために保存した。同様に、第三から第八の溶媒混液(上述のように)を用いて、合計８個の画分を溶出した。
【０１４３】
プロシアニジンＢ２の純粋な試料と比較する、クロロホルム中の４０％メタノールで溶出する画分の薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)分析は、プロシアニジンＢ２が画分７(１.５〜５.０ｇ)中に主として、画分６および８の中にさらに少ない量で、含まれることを示した(図１８)。これはＨＰＬＣ分析により確認された(図１６および１７)。
【０１４４】
(このカラムの重要な特徴)
溶媒の画分は、カラムの表面を溶媒の添加の間に乾燥させてしまうこと無しに、全て一度に有利に加えられる。カラムは好ましくは、画分の間に乾燥に戻される。それは、画分の間に極性の迅速な変更により最善に作用する。
【０１４５】
(フラッシュ真空画分６もしくは７のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分別)
メタノール(２ｍｌ)中の画分７(約３グラム)の溶液を、クロロホルム中で調製された、シリカゲル(４０ｇ)重力カラム(３×３０ｃｍもしくは４.８×３０ｃｍもしくは２.５×３０ｃｍ)へ加えた。画分６もしくは７中の物質の量は１.５〜５.０グラムにわたり変化するので、画分６もしくは７から出る試料の量の増減に対してシリカの量を対応させる必要がある。例えば、もし画分７から出る物質の量が３グラムであるならば、シリカの量は４０グラムであるべきである。このカラムを用いる試料の適用および分取を容易にするために、試料を２重量当量のシリカ(２００〜４００メッシュ)の中で、上述のようにフラッシュクロマトグラフィーを用いて実施されたように、乾燥する。シリカの中で乾燥された試料を、クロロホルム中で平衡化されたシリカゲル(２００〜４００メッシュ)カラムの上にきれいに加えた。適用後に、試料をクロロホルム中の１０％メタノール(２０ｇのシリカカラムについて１００ｍｌ、４０ｇのシリカカラムについて２００ｍｌ、５０ｇのシリカカラムについて２５０ｍｌ、等)で溶出し、引き続いてクロロホルム中の２０％メタノール(２０ｇのシリカカラムについて１００ｍｌ、４０ｇのシリカカラムについて２００ｍｌ、５０ｇのシリカカラムについて２５０ｍｌ、等)で溶出して、引き続いてクロロホルム中の４０％メタノール(２０ｇのシリカカラムについて１００ｍｌ、４０ｇのシリカカラムについて２００ｍｌ、５０ｇのシリカカラムについて２５０ｍｌ、等)で溶出したが、全てが好ましくはギ酸(５０ｍｌ当り１滴)を含有した。画分(２０ｇのシリカカラムについて１２ｍｌ／画分、４０〜５０ｇのシリカカラムについて２４ｍｌ／画分、等)を収集し、そして１μｌ／画分をクロロホルム中の４０％メタノールで溶出するＴＬＣにより分析して、プロシアニジンＢ２およびＢ４を探し当てた。プロシアニジンＢ２およびＢ４は、２０ｇのシリカカラムを用いるときには画分１３〜２１の中に、もしくは４０〜５０ｇのシリカカラムを用いるときには画分１８〜２５の中に含有されると見出された(図２０)。プロシアニジンＢ２を主として含有する画分を合併して、ＨＰＬＣ分析により確認された(図１９)、褐色のガム(１.２０〜２.４０ｇ)を与えた。
【０１４６】
(シリカゲル画分のSephadex LH20カラム分別)
シリカゲル画分１３〜２１(１.２０〜２.４ｇ)(２０ｇのシリカカラムを用いるとき)もしくは画分１８〜２５(４０〜５０ｇのシリカカラムを用いるとき)を９５％水性エタノール２ｍｌ中に溶解して、次いで、９５％水性エタノール中で調製された、５０ｇのSephadex LH20カラムの上に充填した。カラムを９５％水性エタノール１８００ｍｌで溶出して、２４ｍｌの画分を２０分毎に収集した。ＨＰＬＣ分析は、画分２８〜３３が純粋のプロシアニジンＢ２(８９ｍｇ)含有することを示し(図２１)、これはＨＰＬＣ(図２２)および質量分光(図２３)分析により確認された。
【０１４７】
(実施例１３)
(ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末よりプロシアニジンＢ２の代替えの単離方法)
(ウンカリア・トメントーサからの粉砕樹皮粉末の抽出)
第１代替え法
ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末(２００ｇ)の試料を、メタノール(２０００ｍｌ)中で終夜攪拌し、引き続いてWhatmanろ紙41(またはVWRブランド等級＃４１５もしくは４１７もしくは４１０もしくは３１５もしくは３１３もしくは４５４もしくは４７４、４９４、または同様の性能があるろ紙)を用いるろ過をした。このプロセスを好ましくはさらに二回残渣について繰り返した。ろ液を合併した後、３０℃以下で真空で、１００ｍｌの容積に蒸発した。
【０１４８】
第２代替え法
ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末(２００ｇ)の試料を、メタノール(２０００ｍｌ)中で終夜攪拌し、引き続いて３０００×ｇで２０分間の遠心分離およびWhatmanろ紙41(またはVWRブランド等級＃４１５もしくは４１７もしくは４１０もしくは３１５もしくは３１３もしくは４５４もしくは４７４、４９４、等のろ紙)を用いるろ過をした。このプロセスを好ましくはさらに二回残渣について繰り返した。ろ液を合併した後、３０℃以下で真空で、１００ｍｌの容積に蒸発した。
【０１４９】
第３代替え法
ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末(２００ｇ)の試料を、メタノール(２０００ｍｌ)中で０.５〜１時間攪拌し、引き続いて残渣を０.５時間沈着させた。残渣の無い上部部分をWhatmanろ紙41(またはVWRブランド等級＃４１５もしくは４１７もしくは４１０もしくは３１５もしくは３１３もしくは４５４もしくは４７４、４９４、等のろ紙)を用いてろ過した。このプロセスを好ましくはさらに三回残渣について繰り返した。ろ液を合併した後、３０℃以下で真空で、１００ｍｌの容積に蒸発した。
【０１５０】
第４代替え法
ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末(２００ｇ)の試料を、メタノール(４０００ｍｌ)中で０.５〜１時間攪拌し、引き続いて３０００×ｇで２０分間の遠心分離をした。残渣の無い上部部分をWhatmanろ紙41(またはVWRブランド等級＃４１５もしくは４１７もしくは４１０もしくは３１５もしくは３１３もしくは４５４もしくは４７４、４９４、等のろ紙)を用いてろ過した。このプロセスをさらに三回残渣について繰り返した。ろ液を合併した後、３０℃以下で真空で、１００ｍｌの容積に蒸発した。
【０１５１】
第５代替え法
ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末(６００ｇ)の試料を、メタノール(６０００ｍｌ)中で０.５〜１時間攪拌し、引き続いて残渣を０.５時間沈着させた。残渣の無い上部部分をWhatmanろ紙41(またはVWRブランド等級＃４１５もしくは４１７もしくは４１０もしくは３１５もしくは３１３もしくは４５４もしくは４７４、４９４、等のろ紙)を用いてろ過した。このプロセスをさらに三回残渣について繰り返した。ろ液を合併した後、３０℃以下で真空で、１００ｍｌの容積に蒸発した。
【０１５２】
(メタノール抽出液のフラッシュ真空シリカゲル分別)
第１代替え法
ＴＬＣ級シリカゲル１０〜４０μｍ  Ｈ型(５０ｇ)(Sigma Chemical Co. St. Luis, MO.)を、２５０ｍｌの真空フラスコ中のメタノール抽出液(粉砕したキャッツ・クロー樹皮２００ｇの抽出から)(１００ｍｌ)へ加えた。混合液をへらを用いて混合し、そして真空管をフラスコに取り付けて、９番のゴム栓でフラスコの口に蓋をすることにより、真空で乾燥した。真空フラスコを５０℃の水浴の中で加熱することは乾燥を容易にした。
【０１５３】
真空フラッシュシリカゲルカラムをセットアップするために、ガラスフリット(６μｍのカットオフ)(Thomas Scientific)を持つブフナー漏斗(９×１０.５ｃｍ)を一つ穴のKjeldahlゴム栓の中に挿入した。シリカ塵粒子への露出を避けるために、透明なプラスチックバッグの内側で、ブフナー漏斗を２００ｇのＴＬＣ級シリカゲル１０〜４０μｍ  Ｈ型(５０ｇ)(Sigma Chemical Co. St. Luis, MO.)で充填した。シリカの上層を、Ｂ１４ゴム栓もしくは任意の同様な平坦面の物を用いて均等に突き固めた。次いで、充填されたシリカを持つブフナー漏斗を５００ｍｌの真空フラスコへ取り付けた。真空下に、クロロホルム中の１０％メタノール３５０ｍｌを全部一度に加えた。溶媒の先端が一直線の水平線としてカラムを下るのが見られた。シリカが再び乾くまで、真空をかけた。もしも溶媒の先端が均等で無かったならば、シリカを再び突き固めて、カラムを再び作成した。
【０１５４】
乾燥したシリカに付着した抽出物(試料)を突き固めたシリカを含有するブフナー漏斗上に加えて、試料をＢ１４ゴム栓で真空下に突き固めた。次いで、画分を以下の溶媒で溶出した：
１.  クロロホルム中の１０％メタノール２５０ｍｌ
２.  クロロホルム中の１０％メタノール２５０ｍｌ
３.  クロロホルム中の２０％メタノール２５０ｍｌ
４.  クロロホルム中の２０％メタノール２５０ｍｌ
５.  クロロホルム中の４０％メタノール２５０ｍｌ
６.  クロロホルム中の４０％メタノール２５０ｍｌ
７.  クロロホルム中の６０％メタノール２５０ｍｌ
８.  クロロホルム中の６０％メタノール２５０ｍｌ
それぞれの溶媒(上述のような)を、表面の突き固めたシリカをかき乱さないように、真空下に注意して且つ一度に加えて、シリカが再び乾くまで、真空を継続した。次の溶媒の前に真空を切って、シリカを含有するブフナー漏斗を次の画分のための新しい真空フラスコへ移動した。画分を含有する真空フラスコを分析用に保存した。このプロセスを、全ての８個の画分が採集されるまで繰り返した。カラムもしくはブフナー漏斗の中のシリカは画分の間に好ましくは乾燥される。
【０１５５】
第２代替え法
ＴＬＣ級シリカゲル１０〜４０μｍ  Ｈ型(１５０ｇ)(Sigma Chemical Co. St. Luis, MO.)を、５００ｍｌの真空フラスコ中のメタノール抽出液(粉砕したキャッツ・クロー樹皮６００ｇの抽出から)(２００ｍｌ)へ加えた。混合液をへらを用いて混合し、そして真空管をフラスコに取り付けて、９番のゴム栓でフラスコの口に蓋をすることにより、真空で乾燥した。真空フラスコを５０℃の水浴の中で加熱することは乾燥を容易にした。
【０１５６】
真空フラッシュシリカゲルカラムをセットアップするために、ガラスフリット(６μｍのカットオフ)(Thomas Scientific)を持つブフナー漏斗(１２.５×１４.７ｃｍ)を一つ穴の９番ゴム栓の中に挿入した。シリカ塵粒子への露出を避けるために、透明なプラスチックバッグの内側で、ブフナー漏斗を６００ｇのＴＬＣ級シリカゲル１０〜４０μｍ  Ｈ型(Sigma Chemical Co. St. Luis, MO.)で充填した。シリカの上層を、Ｂ１６ゴム栓もしくは任意の同様な平坦面の物を用いて均等に突き固めた。次いで、充填されたシリカを持つブフナー漏斗を２ｌの真空フラスコへ取り付けた。真空下に、クロロホルム中の１０％メタノール１リットルを全部一度に加えた。溶媒の先端が一直線の水平線としてカラムを下るのが見られた。カラムが再び乾くまで、真空をかけた。もしも溶媒の先端が均等で無かったならば、シリカを再び突き固めて、カラムを再試験した。
【０１５７】
乾燥したシリカに付着した抽出物(試料)を突き固めたシリカを含有するブフナー漏斗の上に加えて、試料をＢ１６ゴム栓で真空下に突き固めた。次いで、画分を以下の溶媒で溶出した：
１.  クロロホルム中の１０％メタノール７５０ｍｌ
２.  クロロホルム中の１０％メタノール７５０ｍｌ
３.  クロロホルム中の２０％メタノール７５０ｍｌ
４.  クロロホルム中の２０％メタノール７５０ｍｌ
５.  クロロホルム中の４０％メタノール７５０ｍｌ
６.  クロロホルム中の４０％メタノール７５０ｍｌ
７.  クロロホルム中の６０％メタノール７５０ｍｌ
８.  クロロホルム中の６０％メタノール７５０ｍｌ
【０１５８】
上述のようなそれぞれの溶媒を、表面の突き固めたシリカをかき乱さないように、真空下に注意して且つ一度に加えて、シリカが再び乾くまで、真空を継続した。次の溶媒の前に真空を切って、シリカを含有するブフナー漏斗を次の画分のための新しい真空フラスコへ移動した。画分を含有する真空フラスコを分析用に保存した。このプロセスを、全ての８個の画分が採集されるまで繰り返した。
【０１５９】
(それぞれの画分のＴＬＣ分析)
上の画分のそれぞれを、蛍光指示剤を持つシリカゲル６０の２５０μｍの層を含有するシリカＴＬＣプレート(５×１０ｃｍ)(Aldrich)を用いる薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)により分析した。それぞれの画分約２μｌを、熱風ドライヤーを用いて間に乾かして１回に付き１μｌを、端から１ｃｍのプレートの領域に、ドットした。試料を、それらが０.５ｃｍ離れるように、加えた。純粋なプロシアニジンＢ２の試料をまた同様な方式でドットして、内部標準として役立たせた。プレートを、クロロホルム中の４０％メタノール５０ｍｌを含有する１２×１１×８ｃｍの密閉したＴＬＣガラス展開チャンバー中で展開した。溶媒の先端がプレートの上端から１ｃｍ離れたときに、展開を中止した。シリカが蛍光を出す蛍光光(２５４ｎｍ)下に化合物を可視化したが、その間は化合物を持つスポットは消光して暗いスポットをもたらした。
【０１６０】
プレートをまた、２０％エタノールを加えた濃硫酸中の１％(ｗ／ｖ)バニリンで散布して、引き続いて、暗いスポットが最強の色強度に達するまで(１０〜２０分)、１２０℃(８００Ｗのオーブン)で加熱することができる。これに代えて、水もしくはアルコール中０.１〜５重量％のＦｅＣｌ３をプレートの上に散布して、暗いスポットを与えるプロシアニジンＢ２を検出できる。これに代えて、プレートをこの溶液中に素早く浸漬して、ヘヤードライヤーを使用するか、もしくはそれを室温で単に放置することによるかのどちらかで、乾燥することができる。データの記録のために、スキャナーかもしくは普通のカメラで画像を撮影できる。これらの条件下では、プロシアニジンＢ２は正常には画分６もしくは７に見出される。この画分を真空中で乾燥すると、乾燥物質１.５〜５グラムをもたらして、メタノール中で２〜６ｍｌに作成した。
【０１６１】
(フラッシュ真空画分６もしくは７のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分別)
第１代替え法
画分６もしくは７(１.５４ｇを含有する)のメタノール溶液２ｍｌを、クロロホルム中で調製された、シリカゲル重力カラム(２０ｇ、Aldrichからのシリカゲル２００〜４００メッシュ、６０ＡもしくはSigmaからのシリカゲル２３０〜４００メッシュ、３８〜６３μｍのビーズサイズを持つ６０Ａ細孔)へ加えた。このカラムを一度調整すると、それはクロマトグラフィー操作の間は乾燥することを許されなかった。画分を、次の順番で、５０ｍｌ当り１滴のギ酸を含有する溶媒で溶出した。
１.  クロロホルム中の１０％メタノール１００ｍｌ
２.  クロロホルム中の２０％メタノール１００ｍｌ
３.  クロロホルム中の４０％メタノール１００ｍｌ
画分(それぞれ１２ｍｌ)を収集して、上のようにＴＬＣにより分析した。プロシアニジンＢ２およびＢ４は普通、画分１３〜２１に観測された。
【０１６２】
第２代替え法
画分６もしくは７(１.５ｇを含有する)のメタノール溶液２ｍｌを、２５０ｍｌの真空フラスコ中の、シリカゲル(３ｇ、Aldrichからのシリカゲル２００〜４００メッシュ、６０ＡもしくはSigmaからのシリカゲル２３０〜４００メッシュ、３８〜６３μｍのビーズサイズを持つ６０Ａ細孔)へ加えた。混合液をへらを用いて混合し、そして真空管をフラスコに取り付けて、９番のゴム栓でフラスコの口に蓋をすることにより、真空で乾燥した。真空フラスコを５０℃の水浴の中で加熱して、乾燥を容易にした。
【０１６３】
シリカゲル重力カラム(２０ｇ、Aldrichからのシリカゲル２００〜４００メッシュ、６０ＡもしくはSigmaからのシリカゲル２３０〜４００メッシュ、３８〜６３μｍのビーズサイズを持つ６０Ａ細孔)(４.８×３０ｃｍ)をクロロホルム中で調製した。上のシリカ中に付着した試料を床の上でクロロホルム５ｍｌと共にカラムに加えた。このカラムを一度調整すると、それはクロマトグラフィー操作の間は乾燥することを許されなかった。画分を、次の順番で、５０ｍｌ当り１滴のギ酸を含有する溶媒で溶出した。
１.  クロロホルム中の１０％メタノール１００ｍｌ
２.  クロロホルム中の２０％メタノール１００ｍｌ
３.  クロロホルム中の４０％メタノール１００ｍｌ
画分(それぞれ１２ｍｌ)を収集して、上のようにＴＬＣにより分析した。プロシアニジンＢ２およびプロシアニジンＢ４は普通、画分１３〜２１に観測された。
【０１６４】
第３代替え法：スケールアップ
画分６もしくは７(５ｇを含有する)のメタノール溶液６ｍｌを、２５０ｍｌの真空フラスコ中の、シリカゲル(１０ｇ、Aldrichからのシリカゲル２００〜４００メッシュ、６０ＡもしくはSigmaからのシリカゲル２３０〜４００メッシュ、３８〜６３μｍのビーズサイズを持つ６０Ａ細孔)へ加えた。混合液をへらを用いて混合し、そして真空管をフラスコに取り付けて、９番のゴム栓でフラスコの口に蓋をすることにより、真空で乾燥した。真空フラスコを５０℃の水浴の中で加熱して、乾燥を容易にした。
【０１６５】
シリカゲル重力カラム(６０ｇ、Aldrichからのシリカゲル２００〜４００メッシュ、６０ＡもしくはSigmaからのシリカゲル２３０〜４００メッシュ、３８〜６３μｍのビーズサイズを持つ６０Ａ細孔)(４.８×３０ｃｍ)をクロロホルム中で調製した。上のシリカ中に付着した試料を床の上でクロロホルム５ｍｌと共にカラムに加えた。このカラムを一度調整すると、それはクロマトグラフィー操作の間は乾燥することを許されなかった。画分を、次の順番で、５０ｍｌ当り１滴のギ酸を含有する溶媒で溶出した。
１.  クロロホルム中の１０％メタノール３００ｍｌ
２.  クロロホルム中の２０％メタノール３００ｍｌ
３.  クロロホルム中の４０％メタノール３００ｍｌ
画分(それぞれ３６ｍｌ)を収集して、上のようにＴＬＣにより分析した。プロシアニジンＢ２およびＢ４は普通、画分１３〜２１に観測された。
【０１６６】
第４代替え法：スケールアップ
画分６もしくは７(７.５ｇを含有する)のメタノール溶液１０ｍｌを、クロロホルム中で平衡化した、Chromazone Flash chromatography  System (Varian)に取り付けたシリカゲルカートリッジ(１００ｇ、Varian)へ充填した。このカラムを一度調整すると、それは、クロマトグラフィー操作の間は乾燥することを許されなかった。画分を、次の順番で、０.１％(ｖ／ｖ)のギ酸を含有する溶媒で約２０ｍｌ／分で溶出した。
１.  クロロホルム中の１０％メタノール５００ｍｌ
２.  クロロホルム中の２０％メタノール５００ｍｌ
３.  クロロホルム中の４０％メタノール５００ｍｌ
画分(それぞれ６０ｍｌ)を収集して、上のようにＴＬＣにより分析した。プロシアニジンＢ２およびＢ４は普通、画分１３〜２１に観測された。
【０１６７】
(Sephadex LH20カラム分別)
画分１３〜２１(１.２ｇ)を９５％水性エタノール(２ｍｌ)中に溶解した後、９５％水性エタノール中で調製された、Sephadex LH20(４０ｇ)カラム(２.５×３７ｃｍ)の上に充填した。カラムを９５％水性エタノール(１０００ｍｌ)で重力により溶出して、画分を１０分毎(１２ｍｌ)に収集した。これらの条件では、ＴＬＣにより測定されて、ＨＰＬＣにより確認されたときに、画分４４〜４９が純粋のプロシアニジンＢ２を含有した。
【０１６８】
(ＨＰＬＣ分析)
分析用ＨＰＬＣ装置は、ダイオードアレー検出器を持つＨＰ１１００シリーズで構成された。試料を、２５℃で取り付けたガードカラム(C18 ODS ４×３ｍｍ、５μｍカラムを含有するPhenomenex SecurityGuardカートリッジ)を持つRP-18分析用カラム(Phenomenex LUNA 5 μｍ C18 100A、２５０×４.６ｍｍ)を用いて分析した。試料(５μＬ)を、上述のように、２８０ｎｍおよび２１０ｎｍにおけるＵＶ検出でもって、１.０ｍｌ／分の移動相の流速を用いて分析した。
【０１６９】
(実施例１４)
(単離され且つ精製されたプロシアニジンＢ２は、Ａβ原繊維の強力な阻害剤／分裂剤)
本明細書中に記載されるように単離された、精製されたプロシアニジンＢ２(即ち、エピカテキン‐４β→８‐エピカテキン)は、アルツハイマー病のベータアミロイドタンパク質(Ａβ)原繊維の強力な阻害剤／分裂剤である。研究の最初のセットにおいて、ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より直接に単離されたプロシアニジンＢ２の有効性を、アルツハイマー病の予生成のベータアミロイド原繊維(即ち、Ａβ１−４２原繊維から成る)の分解／分裂を引き起こすそれらの能力について、ＥＤＴＡと比較した。
【０１７０】
一つの研究において、チオフラビンＴ蛍光光度法を用いて、ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２(本明細書中で開示されるように精製された)およびＥＤＴＡ(負の対照として)の効果を測定した。このアッセイにおいては、チオフラビンＴは、繊維状アミロイドと特異的に結合し、そしてこの結合は、生成されたアミロイド原繊維の量と直接に比例するところの４８５ｎｍにおける蛍光の増強をもたらす。蛍光が高いほど、生成されたアミロイド原繊維の量は多い(Naki et al, Lab. Invest. 65:104-110, 1991; Levine III, Protein Sc. 2:404-410, 1993; Amyloid Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995)。
【０１７１】
この研究においては、２５μＭの予繊維化したＡβ１−４２(Bachem Inc)を、単独で、またはウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２およびＥＤＴＡ(１：１、１：０.１、１：０.０１もしくは１：０.００１のＡβ：試験化合物の重量比において)の存在下におけるかのどちらかで３７℃で１週間培養した。共培養の３日後に、それぞれの培養混合液５０μｌを、蒸留水１５０μｌおよび５０μｌのチオフラビンＴ溶液(即ち、２５０ｍＭリン酸塩緩衝液中の５００ｍＭチオフラビンＴ)(ｐＨ６.８)を含有する９６穴のマイクロタイタープレートの中に移入した。ブランクとして、緩衝液単独もしくは化合物単独との引き算の後にＥＬＩＳＡプレート蛍光計を用いて、蛍光を４８５ｎｍ(４４４ｎｍの励起波長)において読み取った。
【０１７２】
３日目の培養の結果を図２４に示す。ＥＤＴＡは、全ての試験した濃度においてＡβ１−４２原繊維の有意な阻害を何も引き起こさなかった一方で、ウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２は、予生成したＡβ１−４２原繊維の用量依存性の分裂／分解を引き起こした。単離されたプロシアニジンＢ２は、１：１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０１)９５.５＋／−２.７％の分裂をおよび１：０.１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０５)６１.６＋／−５.８％の分裂を引き起こした。この研究は、本明細書中で開示される方法により生産された単離プロシアニジンＢ２は、アルツハイマー病型Ａβ原繊維の強力な破壊剤であり、そして用量依存性様式でその効果を発揮することを示した。
【０１７３】
その単量体形においてさえ、Ａβ１−４２の破壊は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング方法(示していない)の使用を伴う研究により確認された。この後者の研究では、予繊維化したＡβ１−４２(２５μＭ)の三組の試料を、単独で、またはウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２もしくはＥＤＴＡの存在下におけるかのどちらかで３７℃で３および７間培養した。次いで、それぞれの試料のアリコート５μｇを０.２μｍフィルターを通してろ過した。次いで、ろ液から回収したタンパク質を、１０〜２０％のトリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に充填して操作し、ニトロセルロースへブロッティングして、Ａβ−抗体(クローン６Ｅ１０；Senetek)を用いるＥＣＬにより検出した。この研究においては、Ａβ１−４２は、単独でもしくはＥＤＴＡの存在下において、３および７日間の両方での培養の後で、約４キロダルトンのバンド(即ち、単量体のＡβ)として検出された。Ａβ１−４２単量体は、ウンカリア・トメントーサ樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２と共に７日間の共培養による(示していない)Ａβ１−４２の培養の後で検出されないで、この化合物が単量体のＡβ１−４２の消滅を引き起こす能力があることを示唆する。この研究は、精製されたプロシアニジンＢ２がまた、単量体のＡβ１−４２の破壊／除去を引き起こす能力があったことを確認した。
【０１７４】
(実施例１５)
(単離されたプロシアニジンＢ２はコンゴレッドに結合する繊維状Ａβの強力な阻害剤)
コンゴレッド結合アッセイ(下に記述するように)では、与えられた試験化合物がアミロイド(この場合には、Ａβ)のコンゴレッドへの結合を変更する能力が定量化される。このアッセイにおいては、Ａβ１−４２＋／−試験化合物が３日間培養されて、次いで、０.２μｍフィルターを通して真空ろ過された。次いで、ろ紙中に残されたＡβ１−４２(即ち、"残物")の量を、ろ紙のコンゴレッドでの染色の後で定量化した。ろ紙の適切な洗浄後に、試験化合物の存在下においてろ紙上のコンゴレッド色のいかなる低下も(試験化合物の不在下においてアミロイドタンパク質のコンゴレッド染色に比較して)、凝集し且つコンゴレッド親和性のＡβの量を消滅させる／変更する試験化合物の能力の指標であった。
【０１７５】
一つの研究において(図２５)、増加する量のウンカリア・トメントーサの樹皮粉末より単離されたプロシアニジンＢ２またはＥＤＴＡ(１：１、１：０.１、１：０.０１もしくは１：０.００１のＡβ：試験化合物の重量比において)の存在下または不存在下におけるＡβ原繊維のコンゴレッドへ結合する能力が測定された。３日目の培養の結果を図２５に示す。ＥＤＴＡは、全ての試験した濃度においてＡβ１−４２原繊維のコンゴレッドへの結合の有意な阻害を何も引き起こさなかった一方で、単離されたプロシアニジンＢ２は、繊維状Ａβ１−４２のコンゴレッドへの結合の用量依存性の阻害を引き起こした。単離されたプロシアニジンＢ２は、１：１のＡβ：プロシアニジンＢ２の重量／重量比において用いたときに有意な(ｐ＜０.０１)３６.３３＋／−４.３％のＡβ１−４２原繊維へのコンゴレッドの結合の阻害を引き起こした。この研究は、本明細書中で開示される方法により生産された単離プロシアニジンＢ２は、アルツハイマー病型Ａβ原繊維のコンゴレッドへの結合の強力な阻害剤であり、そして用量依存性様式でその効果を発揮することを示した。
【０１７６】
この開示は特定の実施態様および実施例と連携して記述されてきている一方で、このこの開示に関して、特異的に開示された材料および技術の同等物はまた、この開示に適用可能であろうこと；およびそのような同等物は添付の請求項の中に含まれるものとすることは当業者にとって明らかであろう。
【図１】
2006507357.tif 000007
【図２】
2006507357.tif 000008
【図３】
2006507357.tif 000009
【図４】
2006507357.tif 000010
【図５】
2006507357.tif 000011
【図６】
2006507357.tif 000012
【図７】
2006507357.tif 000013
【図８】
2006507357.tif 000014
【図９】
2006507357.tif 000015
【図１０】
2006507357.tif 000016
【図１１】
2006507357.tif 000017
【図１２】
2006507357.tif 000018
【図１３】
2006507357.tif 000019
【図１４】
2006507357.tif 000020
【図１５】
2006507357.tif 000021
【図１６】
2006507357.tif 000022
【図１７】
2006507357.tif 000023
【図１８】
2006507357.tif 000024
【図１９】
2006507357.tif 000025
【図２０】
2006507357.tif 000026
【図２１】
2006507357.tif 000027
【図２２】
2006507357.tif 000028
【図２３】
2006507357.tif 000029
【図２４】
2006507357.tif 000030
【図２５】
2006507357.tif 000031
【国際調査報告】
2006507357.tif 000032
2006507357.tif 000033
2006507357.tif 000034
2006507357.tif 000035
2006507357.tif 000036