(57)【要約】本発明は、新規な保護基を有するリボヌクレオシド誘導体、および当該リボヌクレオシド誘導体の製造方法を提供する。前記リボヌクレオシド誘導体は一般式（Ｉ）：【化１】2006507334.tif 000021［式中、Ｒ１は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、Ｒ２は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、Ｒ３は、プロトンまたは５’位にある酸素原子の保護基であり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、互いに連結して環状であってもよく；そして、ここで、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６置換基のうち少なくとも１つは、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む］で示される。
2006507334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2006507334.tif 000016
［式中、
Ｒ１は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、またはかかる塩基の誘導体、あるいは核酸塩基代替物としての役割を果たす任意の他の残基であり、
Ｒ２は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、
Ｒ３は、プロトンまたは５’位の酸素原子の保護基であり、
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、互いに連結して環状であってもよく；そして
Ｒ４、Ｒ５またはＲ６置換基のうち少なくとも１つは、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む］
で示されるリボヌクレオシド誘導体。
【請求項２】
Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子を包含する前記置換基が、４〜２４個の炭素原子を含んでなる、請求項１記載のリボヌクレオシド誘導体。
【請求項３】
Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子を包含する前記置換基が、ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘプチル、ｔｅｒｔ−オクチル、ｔｅｒｔ−ノニル、ｔｅｒｔ−デシル、ｔｅｒｔ−ウンデシル、ｔｅｒｔ−ドデシルからなる群から選択されるアルキル置換基である、請求項１または２記載のリボヌクレオシド誘導体。
【請求項４】
Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子を包含する前記置換基が、１，１−ジメチルエチル、１，１−ジメチル−プロピル、１，１−ジメチル−ブチル、１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘキシル、１，１，２−トリメチル−プロピル、１，１，２−トリメチル−ブチル、１，１，２−トリメチル−ペンチル、１，１，２−トリメチル−ヘキシル、１，１，２，２テトラメチル−プロピル、１，１，２，２−テトラメチル−ブチルからなる群から選択される、請求項１、２または３記載のリボヌクレオシド誘導体。
【請求項５】
Ｓｉ原子と隣接する前記置換基が置換ヘテロ原子を含んでなる、請求項１記載のリボヌクレオシド誘導体。
【請求項６】
Ｓｉ原子と隣接する前記置換基が置換二価ヘテロ原子を含んでなる、請求項５記載のリボヌクレオシド誘導体。
【請求項７】
前記ヘテロ原子が酸素である、請求項６記載のリボヌクレオシド誘導体。
【請求項８】
請求項１記載のリボヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
式
【化２】
2006507334.tif 000017
［式中、Ｒ１およびＲ３は請求項１に定義のとおりである］
で示されるヌクレオシドを、
式
【化３】
2006507334.tif 000018
［式中、Ｙは適切な脱離基であり、そして
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、互いに連結して環状であってもよい］
で示されるシリルオキシメチル誘導体と反応させることを含む方法。
【請求項９】
前記Ｙがハロゲンである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が合わせて、３〜３０個の炭素原子を含んでなる、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が、Ｓｉ原子と隣接する少なくとも１つの置換ヘテロ原子を含んでなる、請求項８または９記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘテロ原子が二価原子である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘテロ原子が酸素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リボヌクレオシド誘導体が、ホスホン酸の誘導体を包含する群で３’位の酸素をさらに置換されてなる、請求項１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
リボヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
式
【化４】
2006507334.tif 000019
で示されるリボヌクレオシド誘導体を、求電子的活性化させてから、式：
【化５】
2006507334.tif 000020
で示される化合物と反応させることを含む、方法
［式中、Ｒ１は請求項１に定義のとおりであり、Ｒ７はアルキル基またはアリール基、あるいはアルキル−アリール基であり、
Ｒ２は保護基であり、
Ｒ３は保護基であり、
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一のまたは異なるアルキルあるいはアリールであるか、またはアルキル置換基およびアリール置換基の組合せであり、それらはヘテロ原子でさらに置換されていてよく、かつ互いに連結して環状であってもよい］。
【請求項１６】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が請求項１〜７に定義のとおりである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記リボヌクレオシド誘導体が、ホスホン酸の誘導体を包含する群で３’位の酸素をさらに置換されてなる、請求項１５または１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は核酸化学の分野に属し、新規の保護基を有するリボヌクレオシド誘導体の製造方法および使用方法に関する。本発明の化合物は、特にオリゴリボヌクレオチドの自動化された製造方法に適している。
【０００２】
背景技術
合成核酸に関する出願は多くあり、それらは生物学的プロセスの理解の手掛かりとなっている。これらの出願の中で、ｍＲＮＡに対する合成オリゴヌクレオチドの細胞内での特異的ハイブリダイゼーションによるタンパク質の特異的下方制御を目的とした合成オリゴヌクレオチド使用は、アンチセンス・メカニズムとして知られており、かつ既報（１）により周知である。ごく最近、ｓｉＲＮＡとして知られているｄｓＲＮＡを用いた技術であるＲＮＡ干渉が、哺乳動物ｍＲＮＡのそのタンパク質への翻訳を阻害するために成功裏に用いられた（２）。合成オリゴリボヌクレオチドの効率的かつコスト効率の良い製造方法の開発の必要性から、有望なＲＮＡ技術が考案された。
【０００３】
オリゴリボヌクレオチド合成は、オリゴデオキシヌクレオチド合成よりも難しい。その主な原因は、デオキシリボ核酸には存在しないがリボ核酸に存在する２’−ＯＨ基である。オリゴリボヌクレオチドの化学合成は通常、固相上に固定した保護されたリボヌクレオシド誘導体に基づいており、そこに所望の長さの鎖が達成されるまで１つの合成サイクルの連続した工程にて、保護されたリボヌクレオチド誘導体がさらに結合される。効率的な合成を確実にし、そして製造過程中のＲＮＡ分解を避けるために、２’−ＯＨ基の保護基戦略では、他の保護基と完全に直交（orthogonal）していなければならず、かつ前記保護基はその過程内で可能な限り最後に取り除かれなければならない。これまでに、主に以下タイプの保護基が、２’−ＯＨ基の保護に用いられている：
【０００４】
２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ化学は、ＲＮＡ合成に関して通常用いられる保護基である（３）。それは、他の保護基と直交している。しかしながら、オリゴリボヌクレオチド合成中における２’−３’リン酸基移行が既報（４）により報告されている。さらに、反応性ホスホアミダイトに近いｔ−ブチルジメチルシリル基の立体障害が、カップリング効率を著しく低下させる。後者の制限は減少させうるが、その代償として例えば（５）に記載のように、より長いカップリング時間が必要であり、より高いモル過剰の試薬および５−（ベンジルメルカプト）−１Ｈ−テトラゾールのような特定のホスホアミダイト活性化剤の使用が必要である。
【０００５】
２’−Ｏ−ＡＣＥ化学は、Caruthersらの既報（６）にＴＢＤＭＳ化学の代替物として記載されている。そこでは、２’−ＯＨは、酸不安定型オルトエステルにより保護されている。ＴＢＤＭＳと比較して、その保護基のより低い障害がより高いカップリング率を可能とする。２’オルトエステルの酸不安定型は、５’−ＯＨの酸不安定型でない一時的な保護を必要とする。これは、フッ素含有溶液によってそれぞれのカップリング・サイクルの最後に除去される三置換シリル基により達成される。その結果、２’−Ｏ−ＡＣＥ構成単位の製造のための試薬は、特別にスケールアップされなければならない。かかる５’脱保護は、いくつかの場合に問題となり得る：例えばフッ素イオンに耐性のある専用の合成装置を必要とし、一般に用いられるシリカベースの支持体（多孔性ガラスビーズ（Controlled Pore Glass）など）の使用は不可能である。
【０００６】
２’−Ｏ−ＴＯＭ化学は、Pitschらの既報（６）により報告されている。２’−ＯＴＢＤＭＳ保護基戦略に関して、２’−Ｏ−ＴＯＭ保護基は、フッ素イオンで処理して除去される。もともとは、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳで観察された２’−３’リン酸基移行なしに長鎖ＲＮＡの合成を可能とするために開発された。この場合、ヌクレオシドと保護基間の結合のアセタール特性のために、リボヌクレオシド誘導体の異なる位置、特に３’−Ｏ−位置の近隣への保護基の移行は起こりえない。かかる異性化は、２’−Ｏ−シリル−置換ＲＮＡ−ユニットの常套的合成方法における問題として周知である。
【０００７】
この保護基のさらに重要な利点は、２’−酸素と巨大なトリイソプロピルシリル基間のアセタール・スペーサーによる、保護基のより低い障害である。
【化１】
2006507334.tif 000003
【０００８】
２’−Ｏ−ＴＯＭと２’−Ｏ−ＡＣＥは共に、オリゴデオキシヌクレオチド合成にて観察されるのに近いカップリング収率を与える。十分なカップリング収率はまた、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ化学でも得られるが、その代償として独特の活性化剤の使用が必要であるか、または構成単位のより高モル濃度過剰の使用を必要とする。すべての場合において、記載した構成単位は、オリゴリボヌクレオチドの製造コストに大きく関与している。第二に、オリゴリボヌクレオチドの合成後プロセシングは、オリゴデオキシリボヌクレオチドのプロセシングと比較してより困難である。後者の局面は、要求される高生産性が満たされなければならない場合に特に重要であり得る。
【０００９】
手頃な値段で、かつ容易に合成後プロセシングを達成し得る、改善されたＲＮＡ構成単位が必要とされている。
置換シリルオキシメチル基は、既報（７，８）にてヒドロキシル基の保護基として用いられている。Ｓｉ原子における置換基の立体障害は、保護基の安定性および除去条件を変化させる。例えば、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素を有するシリルオキシメチルが、既報（７）にて報告されており、これらの場合において、保護基の除去率は、一般にＴＢＤＭＳ保護で観察されるものと比較して最適状態には及ばず、そして明らかに固相オリゴリボヌクレオチド合成には適していない。
【００１０】
本発明はここに、リボヌクレオシド誘導体の２’−ＯＨ位を保護する新規かつ改善された基を提供し、それは、特に自動化されたオリゴリボヌクレオチド固相合成に適している。これらの構成単位を製造する新しい方法を提供する。最後に、ＲＮＡ固相合成におけるこれらの構成単位の使用を開示する。
【００１１】
発明の概要
１つの局面にて、本発明は、式
【化２】
2006507334.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、
Ｒ２は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、
Ｒ３は、プロトンまたは５’位にある酸素原子の保護基であり、
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキルまたはアリールであるか、またはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、互いに連結して環状であってもよく；
そして
ここで、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６置換基のうち少なくとも１つは、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子またはヘテロ原子を含む。］
で示されるリボヌクレオシド誘導体を提供する。
【００１２】
好適な局面にて、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子を包含する置換基は、炭素原子数４〜２４、より好ましくは炭素原子数５〜２４、さらにより好ましくは炭素原子数６〜２４を含む。より好適な局面にて、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子を包含する置換基は、ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘプチル、ｔｅｒｔ−オクチル、ｔｅｒｔ−ノニル、ｔｅｒｔ−デシル、ｔｅｒｔ−ウンデシル、ｔｅｒｔ−ドデシルからなる群から選択されるアルキル置換基である。他の好適な局面にて、Ｓｉ原子と隣接する三級炭素原子を包含する置換基は、１，１−ジメチルエチル、１，１−ジメチル−プロピル、１，１−ジメチル−ブチル、１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘキシル、テキシル（１，１，２−トリメチル−プロピル）、１，１，２−トリメチル−ブチル、１，１，２−トリメチル−ペンチル、１，１，２−トリメチル−ヘキシル、１，１，２，２テトラメチル−プロピル、１，１，２，２−テトラメチル−ブチルからなる群から選択される。さらに好適な実施態様にて、上述の基の置換基は少なくとも５つの炭素原子、より好ましくは少なくとも６つの炭素原子を含む。
【００１３】
関連する局面にて、本発明は、Ｓｉ原子と隣接する置換基が置換ヘテロ原子を含むリボヌクレオシド誘導体を提供する。好適な局面にて、Ｓｉ原子と隣接する置換基は、置換二価ヘテロ原子を含み、より好適な局面にて、この置換基は酸素である。
【００１４】
他の局面にて、本発明は、リボヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
式
【化３】
2006507334.tif 000005
［式中、Ｒ１およびＲ３は、上記に定義のとおりである］
で示されるヌクレオシドを、
式
【化４】
2006507334.tif 000006
［式中、Ｙは適した脱離基であり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキルおよびアリールまたはヘテロ原子の組合せであり、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は互いに連結して環状であってもよい］
で示されるシリルオキシメチル誘導体と反応させることを含む方法を提供する。好適な実施態様にて、Ｙはハロゲンである。他の好適な実施態様にて、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は共に、炭素原子数６〜３０を含む。さらに好適な実施態様にて、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、少なくとも１つのＳｉ原子と隣接する置換ヘテロ原子を含み、その置換ヘテロ原子は、好ましくは二価原子であり、より好ましくは酸素である。前記リボヌクレオシド誘導体は、ホスホン酸の誘導体を含む群で３’位の酸素をさらに置換されていてよい。
【００１５】
本発明のもう１つの局面では、リボヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
式
【化５】
2006507334.tif 000007
で示されるリボヌクレオシド誘導体を、求電子的活性化させてから、式：
【化６】
2006507334.tif 000008
で示される化合物と反応させることを含む方法を提供する
［式中、Ｒ１は上記に定義のとおりであり、Ｒ７はアルキル基またはアリール基、あるいはアルキル−アリール基であり、
Ｒ２は保護基であり、
Ｒ３は保護基であり、
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記に定義のとおりである］。
【００１６】
好適な実施態様にて、前記リボヌクレオシド誘導体は、ホスホン酸の誘導体を含む群で３’位の酸素をさらに置換されている。
【００１７】
発明の詳しい説明
略語：
ＴＢＤＭＳ      ｔ−ブチルジメチルシリル
ＡＣＥ          ビス［２−（アセチルオキシ）エトキシ］メチル
ＴＯＭ          （トリイソプロピルシリル）オキシメチル
ＴＨＥＸ        ［（（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリル）］−オキシメチル
ＤＣＡ          ジクロロ酢酸
ｄｓＲＮＡ      二本鎖ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ      小さい干渉ＲＮＡ（Small interfering ＲＮＡ）
【００１８】
本発明は、以下の一般的な構造式：
【化７】
2006507334.tif 000009
［式中、
Ｒ１は、プリンまたはピリミジンに属する塩基、あるいはかかる塩基の誘導体、もしくは核酸塩基代替物としての役割を果たす他の残基であり、Ｒ２は、プロトンまたはホスホン酸の置換誘導体であり、Ｒ３は、プロトンまたは５’位の酸素原子の保護基であり、そして、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してアルキル基またはアリール基であるか、あるいはアルキル−アリール基であり、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、互いに連結して環状であってもよい］
を有するＤ−またはＬ−リボース単位を含む、リボ核酸の化学合成に用いるための２’−Ｏ−シリルオキシメチル・リボヌクレオチド誘導体に関する。
【００１９】
前記５’−Ｏ−位置の保護基Ｒ３は、例えば、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であるか、あるいは異なる、適した基（それは、鎖に付加される次の単位をカップリングするための結合部位を遊離させるために、鎖構築の間に伸長している配列から取り除かれる）である。
【００２０】
リボヌクレオシド誘導体の塩基成分Ｒ１は、好ましくはプリンまたはピリミジンに属する塩基、例えば５つの核酸塩基、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル、グアニンのうちの１つであるか、またはそれらの誘導体、あるいは核酸塩基の代替物としての役割を果たす他の任意の残基である。それは、鎖構築後に除去され得るアシル−置換基により保護され得る。
【００２１】
３’−Ｏ−位置にて、Ｒ２は、ホスホン酸の誘導体、例えばＮ，Ｎ−置換ホスホアミダイト基およびＯ−置換ホスホアミダイト基であり、ここでＮ−置換基は、さらに置換され得る、および／または互いに連結して環状であり得る、アルキル基またはアリール基である。二置換アミノ基の窒素の活性化により、リン酸化中心は、伸長中の鎖に前記単位をカップリングするために活性化される。
【００２２】
本発明はここに、新しく利点のある２’−Ｏ−シリルオキシメチル保護基を提供し、ここで、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６は、独立してアルキル−置換基またはアリール−置換基であるか、あるいはアルキル−アリール−置換基またはアリール−アルキル−置換基もしくは置換ヘテロ原子置換基であり、そして
Ｒ４、Ｒ５またはＲ６置換基のうち少なくとも１つは、式
【化８】
2006507334.tif 000010
［式中、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、アルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキル−アリール−置換基またはアリール−アルキルもしくは置換ヘテロ原子であり、ここで、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’はＨではなく、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、同一であるかまたは異なっていて良く、炭素原子数１〜１２、好ましくは炭素原子数１〜６、より好ましくは炭素原子数１〜４を含む置換基が好適であり、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’はまた、互いに連結して環状であっても良く、例えばＲ’は、Ｒ’’またはＲ’’’と連結して環状であってよく、またはＲ’’は、Ｒ’’’と連結して環状であってよい］
で示され得るヘテロ原子または三級炭素原子を含む。好適な実施態様にて、２つの置換基は同一であり、そして炭素原子数１〜６、好ましくは炭素原子数１〜４を含む。３番目の置換基は、好ましくは炭素原子数が少なくとも３、好適には炭素原子数３〜１２、より好適には炭素原子数３〜６を含んでなる。
【００２３】
故に、１つの実施態様にて、置換基Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６のうち少なくとも１つは（Ｃ４〜Ｃ２４）−三級−アルキルおよび／またはアリールであり、好ましくは（Ｃ５〜Ｃ１８）−三級−アルキルおよび／またはアリールであり、より好ましくは（Ｃ６〜Ｃ１２）−三級−アルキルおよび／またはアリールであり、ここで前記三級炭素原子は、Ｓｉ原子と隣接している。かかる置換基の例としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘプチル、ｔｅｒｔ−オクチル、ｔｅｒｔ−ノニル、ｔｅｒｔ−デシル、ｔｅｒｔ−ウンデシル、ｔｅｒｔ−ドデシル、テキシル（１，１，２−トリメチル−プロピル）、１，１，２−トリメチル−ブチル、１，１，２−トリメチル−ペンチル、１，１，２−トリメチル−ヘキシル、１，１，２，２−テトラメチル−プロピル、１，１，２，２−テトラメチル−ブチルが含まれ得るが、これらの基に限定されることを意図しない。好適な実施態様にて、前記置換基は、ｔｅｒｔ−ペンチルまたはより高級な基であり、より好適な実施態様にて、前記置換基は、ｔｅｒｔ−ヘキシルまたはより高級な基である。より好適な例としては、例えば、１，１−ジメチル−エチル、１，１−ジメチル−プロピル、１，１−ジメチル−ブチル、１，１−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ヘキシル、１，１，２−トリメチル−プロピル、１，１，２−トリメチル−ブチル、１，１，２−トリメチル−ペンチル、１，１，２−トリメチル−ヘキシル、１，１，２，２−テトラメチル−プロピル、１，１，２，２−テトラメチル−ブチルが含まれる。他の実施態様にて、Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６は、ヘテロ原子を含む。
【００２４】
三級炭素原子を含まない置換基（複数可）は、同一または異なる置換基であってよい。これらの置換基は、好ましくはアルキル−置換基またはアリール−置換基であるか、あるいはアルキル−アリール−置換基である。好適には、置換基が炭素原子数１〜１２、好ましくは炭素原子数１〜８、より好ましくは炭素原子数１〜４を含む。かかる置換基の例としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ペンチルが含まれるが、これらの基に限定されることを意図しない。
【００２５】
他の実施態様にて、Ｒ４、Ｒ５および／またはＲ６は、置換ヘテロ原子、例えばシリコン、ゲルマニウム、錫、鉛、窒素、酸素、硫黄を含み、例えば、
式：
【化９】
2006507334.tif 000011
［式中、Ｘは、ＳｉまたはＧｅ、ＳｎあるいはＰｂであり、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は式２に定義のとおりであり、そしてＲ４およびＲ６は上記に定義にとおりである］
で示される「四価」ヘテロ原子として表すことができる。置換基Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のいずれかは、Ｓｉ原子と隣接するヘテロ原子を含んでいてよく、好適には１つのみが、式３に例示したとおりである。酸素のような「二価」ヘテロ原子、あるいは窒素のような三価ヘテロ原子について、式３を、当業者に容易に理解されるように適合させてよい。本発明の好適な実施態様にて、Ｘは酸素である。
【００２６】
前記化合物は、当業者に周知の方法、例えば有機金属経路を介して製造され得る。この経路は、例えば国際特許出願ＷＯ９９／０９０４４号に記載されている（６）。反応４→５ａ／５ｂ→６は、有機金属経路を介して本発明の化合物を製造する例である。簡単に説明すると、５’−Ｏのリボヌクレオシド保護は、例えば、本発明の適切な有機金属塩、例えばジブチル錫ジクロイドまたはジブチル錫オキシド中におけるクロロメチル［ジメチル−（１，１，２−トリメチルプロピル）シリル］エーテル（またはＴＨＥＸ−Ｃｌ）と反応させる。ＴＨＥＸ−Ｃｌ自身は、既報（７）の方法に従ってＴＯＭ−Ｃｌと同様の方法で製造される。しかしながら、ＴＯＭ−Ｃｌとは異なっており、ＴＨＥＸ−Ｃｌの製造では、リボヌクレオシドとの反応の前に最終的な蒸留工程が必要なく、そのことは大幅な簡略化を意味する。５’−Ｏ−保護リボヌクレオシドとＴＨＥＸ−Ｃｌの反応にて、２’−および３’−保護リボヌクレオシドの混合物が得られ、ここで２’−置換リボヌクレオシドは、例えばクロマトグラフィー法により精製される。次工程にて、精製した化合物５ａの３’−ＯＨ基は、当業者に周知の方法に従いホスホアミダイト６に変換される（Sinha，N.D．et al.，Tetrahedron Lett.1983，24，5843; Sinha, N.D．et al.，Nucleic Acid Res．1984，12，4539）。
【００２７】
この方法は、置換シリルオキシメチル・エーテル（ここに、置換基が、アルキル、アリールまたはアリールアルキル基を含み、そして互いに連結して環状であってよい）の使用を必要とする。さらなる実施態様にて、この方法は、シリルオキシメチルエーテル（ここに、置換基のうち少なくとも１つが、例えばシリコン、ゲルマニウム、錫、鉛、窒素、酸素、硫黄などの少なくとも１つの置換ヘテロ原子を含む）に応用することができる。
【化１０】
2006507334.tif 000012
【００２８】
前記反応は、溶液中でまたは固相上で、あるいはポリマー担持試薬の使用により実施できる。溶媒は、炭化水素溶媒、エーテル溶媒、ニトリル溶媒、塩素化溶媒、ヘテロ環式溶媒、スルホキシド溶媒などであり得る。適切な溶媒の特定の例としては、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ジクロロエタンおよび塩化メチレンが含まれる。ジクロロエタンの使用が、好ましい。
【００２９】
前記反応は、室温で実施され得るが、０〜１５０℃の温度で、好ましくは１０〜１００℃の温度で実施されてもよい。
【００３０】
本発明のさらなる局面にて、本発明の化合物は、反応７→８→９→１０→６に例示のような新しい優れた方法により製造される。
【化１１】
2006507334.tif 000013
【００３１】
本方法は、２’−Ｏ−アルキルチオメチル基、アリールチオメチル基、アルキルアリールチオメチル基またはアリールアルキルチオメチル基をまず用いることにより２’−ＯＨ保護基の選択的導入を可能にする。それは、有機金属経路に記載の非選択的工程を避ける。この新しい方法は、一般的に、リボヌクレオシドの２’−ＯＨ基に選択的にオキシメチル誘導体を導入することに適用可能であり、それは上記のような保護基の導入に限られない。保護されたリボヌクレオチドの製造方法は、現在、例えば有機金属経路として当業者に周知であり、それは、保護基の導入に関して２’−３’選択性はない。この方法は、２’位にメチルチオメチル基を選択的に導入することを可能にし、それにより合成スキームの最後の非選択的工程を避けることが可能となる。
【００３２】
この新しい経路にて、
式
【化１２】
2006507334.tif 000014
［式中、Ｒ７は、アルキルまたはアリールであるか、アルキルおよびアリールの組合せである］
で示され得る２’−Ｏ−アルキルチオメチル−リボヌクレオシドを、一般式ＨＯＳｉＲ４Ｒ５Ｒ６のシラノールと反応させる。好適な実施態様にて、Ｒ７は（Ｃ１〜Ｃ２０）−であり、より好適には（Ｃ１〜Ｃ１０）−アルキルおよび／またはアリールである。他の好適な実施態様にて、Ｒ７は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチルである。シラノールの置換基Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なるアルキルまたはアリールであるか、あるいはアルキル置換基およびアリール置換基の組合せであり、または置換ヘテロ原子であり、そして互いに連結して環状であってもよい。好適な実施態様にて、３つの置換基は共に、それぞれ炭素原子数３〜３０を含んでなる。
【００３３】
他の好適な実施態様にて、化合物１１を、上記に定義した置換基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６を有する一般式ＨＯＳｉＲ４Ｒ５Ｒ６のシラノールと、当業者に周知の適切な条件下で反応させる。これらは、求電子的活性化試薬、または限定されないが、例えばＮ−ハロスクシンイミドおよび触媒量の酸などの試薬の組合せを含む。前記反応は、溶液中でまたは固相上で、あるいはポリマー担持試薬を用いて実施され得る。溶媒は、炭化水素溶媒、エーテル溶媒、ニトリル溶媒、塩素化溶媒、ヘテロ環式溶媒、スルホキシド溶媒などであり得る。適切な溶媒の特定の例としては、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ジクロロエタンおよび塩化メチレンが含まれる。ジクロロエタンの使用が、好ましい。前記反応は、室温で実施され得るが、−７８℃〜１００℃の温度で、好ましくは０〜５０℃の温度で実施されてもよい。
【００３４】
２’−ＯＨ基のアルキルチオメチル−置換基は、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ１２）−アルキル基および／またはアリール基、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキル基および／またはアリール基を含む。好適な置換基の例としては、メチルチオメチル、エチルチオメチル、プロピルチオメチル、イソプロピルチオメチルまたはブチルチオメチルを含む。
【００３５】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いかなる場合もその範囲を限定するものではない。
【００３６】
実施例
１．  有機金属経路によるＴＨＥＸ構成単位の製造
スキーム１は、５’−Ｏ−ＤＭＴｒウリジンのＴＨＥＸ保護基の導入、およびそれに続くホスフィチレーション(phosphitylation)に関する合成スキームを示す。
（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリルオキシメチル・クロリド（ＴＨＥＸ−Ｃｌ）の製造
エタンチオール １１．１ｍｌ（０．１５ｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド ４．５ｇ（０．１５ｍｏｌ）の懸濁液を、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ（３０％）２滴で処理し、４０℃で１時間撹拌した。冷却後、ＣＨ２Ｃｌ２ １５０ｍｌおよびイミダゾール２２．６６ｇ（０．３３３ｍｏｌ）を添加した。１０分後、（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリル・クロリド ３２．６６ｇ（０．１６７ｍｏｌ）を滴下添加した。生じた懸濁液を室温で２４時間撹拌し、ｎ−ヘキサン ３００ｍｌで希釈した。２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４溶液 ２００ｍｌを添加後、撹拌し（１５分間）、相を分離し、有機相をＮａ２ＳＯ４で濃縮乾燥した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２ １００ｍｌに溶解し、塩化スルフリル １２．３ｍｌ（２０．４ｇ、０．１５２ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌ中に滴下処理した。１時間後、混合液を濃縮した。産物を、蝋状物として得た（３１．５ｇ）。
1H-NMR (400 MHz，CDCl3)：0.5 (s，6H，SiMe2)； 0.65 (12H，CH3)；1.40 (sept，1H，CH)；5.43 (s，2H，CH2)
【００３７】
１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−［（（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリル）］−オキシメチル−ベータ−Ｄ−リボフラノシル］−ウラシル（５ａ）の製造
１，２−ジクロロエタン ２００ｍｌ中５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化ウリジン（１）９．５ｇ（１７．４ｍｍｏｌ）の溶液を、ヒューニッヒの塩基 １１．２３ｇ（８７ｍｍｏｌ）で処理し、その後、ジブチル−錫ジクロリド ５．８１ｇ（１９．２ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、混合液を８０℃に加熱し、ジクロロエタン ５０ｍｌ中（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリルオキシメチル・クロリド（ＴＨＥＸ−Ｃｌ）４．２ｇ（２２．６ｍｍｏｌ）で処理し、８０℃で２時間撹拌した。冷却後、混合液をＣＨ２Ｃｌ２ ４００ｍｌで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液 ３５０ｍｌを添加した。３０分撹拌後、相を分離し、有機相を濃縮した。残渣を、０．１％Ｎ−メチルモルホリンを含む酢酸エチル／ヘキサン（３：１）を用いて、シリカゲル上でクロマトグラフィーした。産物を、固形泡状物で得た（４．５２ｇ）。
1H-NMR (400 MHz，CDCl3)：0.1 (s，6H，CH3)；0.6−0.8 (sおよびd，12H，CH3)；1.45 (m，1H，CH)；3.15 (d，2H，CH2)；3.64 (s，6H，OCH3)；3.85 (q，2H，CH2)；4.05 (m，1H，CH)；4.15 (m，1H，CH)；4.80 (q，2H，CH2)；5.12 (d，1H，OH)；5.30 (q，1H，CH)；5.78 d，1H CH)；6.8−5.3 (m，13H)；7.6 (d.1H)
【００３８】
１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−［（（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリル）］−オキシメチル−ベータ−Ｄ−リボフラノシル］−ウラシル−３’−（２−シアノエチルジイソプロピル）ホスホアミダイト（６）の製造
ＣＨ２Ｃｌ２ １５０ｍｌ中保護されたウリジン（２）４．０ｇ（５．５６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアミノテトラゾリド １．１４ｇ（６．６８ｍｍｏｌ）およびビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシ・ホスフィン ２．０１ｇ（６．６８ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で２４時間撹拌した。混合液をＣＨ２Ｃｌ２ １００ｍｌで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍｌで２度洗浄した。乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）有機相を濃縮し、その後、残渣を、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、３：２。０．１％Ｎ−メチルモルホリンを添加）した。産物を固形泡状物で得た（４．１２ｇ）。
31P-NMR (400 MHz，CDCl3)：151.183 (秒)および151.537 (秒)
【００３９】
２．  ２’−Ｏ−メチルチオメチル経路によるＴＨＥＸ構成単位の製造
３’，５’−Ｏ−ジアセチル−２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン（８）
ピリジン ５０ｍｌ中２’−Ｏ−メチルチオメチル・ウリジン７（８）４．５３ｇ（１４．８ｍｍｏｌ）の溶液を、Ａｃ２Ｏ ３．０４ｇ（２９．７ｍｍｏｌ）で処理した。２４時間撹拌後、溶液を濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ４０ｍｌで希釈し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、純粋な標記化合物を得た（５．０５ｇ）。
【００４０】
３’，５’−Ｏ−ジアセチル−２’−Ｏ−［（（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリル）−オキシメチル］−ウリジン（９）
ＴＨＦ ３ｍｌ中 Ｎ−ヨードスクシンイミド ０．３３ｇ（１．４７ｍｍｏｌ）を、０．５ｇ（１．２８７ｍｍｏｌ）の８、（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチル・シラノール ０．９７８ｇ（６．１ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌおよびＭｅＯＳＯ３Ｈ １滴の溶液に添加した。２時間撹拌後、ＮａＨＳＯ３（３７％）２ｍｌを添加し、その後ＣＨ２Ｃｌ２ １００ｍｌを添加した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、溶液を濃縮し、５５２ｍｇの純粋な標記化合物を得た。
【００４１】
２’−Ｏ−［（（１，１，２−トリメチル−プロピル）−ジメチルシリル）−オキシメチル］−ウリジン（１０）
１８７ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）の９、ＭｅＯＨ ２０ｍｌおよびＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ（３０％）０．１３５ｍｌ（０．７４ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で３０分撹拌した。濃縮後、残渣を小さなシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、４：１）に通してろ過し、粉末として１４０ｍｇの１０を得た。
【００４２】
３．  ホスホアミダイト化学によるオリゴデオキシヌクレオチド中への６の挿入、およびその早い脱保護の方法
オリゴヌクレオチド合成は典型的に、ＡＢＩ３９４自動化ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems）にて行った。ＤＮＡホスホアミダイト、ＴＨＥＸ保護したウリジン・ホスホアミダイト（６）またはＴＯＭ保護したウリジン・ホスホアミダイト（Xeragon, Inc.）を、５％ｗ／ｖ濃度で乾燥アセトニトリル中に溶解した；カップリングを、アセトニトリル中０．２Ｍのベンズイミダゾリウム トリフレート（９）溶液を用いたホスホアミダイトの活性化により行った。カップリング時間は、１〜５分であった。最初のカップリングを、標準的なカップリング試薬を用いて行った。酸化を、ＴＨＦ／水／ピリジン（１：１：１）中０．１Ｍヨウ素溶液を用いて行った。２番目のカップリングを酸化の後に行った。次のカップリングの前の脱トリチル化を、ジクロロエタン中２％ジクロロ酢酸で行った。
【００４３】
オリゴヌクレオチド鎖伸長の完了後、固体支持体をエッペンドルフチューブに移した。
ＴＨＥＸ保護したウリジン・ホスホアミダイト（６）で製造した場合、以下のようにオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した：
１．  ３２％アンモニア水溶液／ＥｔＯＨ、３：１（０．２μｍｏｌｅスケールにつき２５０μｌ）、室温、２時間、凍結乾燥乾固。
２．  ＴＨＦ中１Ｍテトラブチル・フッ化アンモニウム（０．２μｍｏｌｅスケールにつき２５０μｌ）、３０分、室温。
３．  １Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４（０．２μｍｏｌｅスケールにつき２５０μｌ）。
ＴＯＭ保護したウリジン・ホスホアミダイトで製造した場合、以下のようにオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した：
１．  ３２％アンモニア水溶液／ＥｔＯＨ、３：１（０．２μｍｏｌｅスケールにつき２５０μｌ）、室温、２時間、凍結乾燥乾固。
２．  ＴＨＦ中１Ｍテトラブチル・フッ化アンモニウム（０．２μｍｏｌｅスケールにつき２５０μｌ）、６時間、室温。
３．  １Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４（０．２μｍｏｌｅスケールにつき２５０μｌ）。
【００４４】
生じた粗溶液を、キャピラリー・ゲル電気泳動により分析した。
結果を表１にまとめた。
【表１】
2006507334.tif 000015
表１、および図１〜４に示したように、ＴＨＥＸ保護したウリジン・ホスホアミダイト６およびＴＯＭ保護したウリジン・ホスホアミダイトで得られた粗物質の量は、ほとんど同じであった。
２’−Ｏ−ＴＨＥＸ保護基の方法の使用は、３５℃で６時間（既報６に記載のように）〜室温で３０分間に、２’脱保護の縮小を可能とした。
【００４５】
参考文献
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【国際調査報告】
2006507334.tif 000022
2006507334.tif 000023
2006507334.tif 000024