(57)【要約】流出口を横切るように跨るシート部材を通過する開口部を有する生体外出血時間測定装置、投入口を通して血液サンプル受け取る内室が設けられた装置を備える血液凝固分析システム、及び血液凝固分析方法を提供する。シート部材の少なくとも一部に、コラーゲン１型、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びフォン・ヴィルブラント因子を含むコーティングを施す。シート部材は装置内の単一の流出口を通る流路に跨るように配置される。装置内の圧力及び／または流速を制御装置によって制御する。装置内室内へ供給された血液を装置流出口に跨るシート部材を通過する開口部を通して流出させる。制御装置を用いて開口部を閉塞する血餅形成中における装置中への流速を制御することにより装置内の圧力及び／または流速を制御する。
2006518034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シート厚を有し及び、周辺部分によって囲まれ、かつシート厚に亘る、幅が約６０μｍないし１２０μｍで長さが５００μｍ未満である矩形の開口部を有する内側部分を有するシート部材と、
前記シート部材の第一面の少なくとも一部上へ施されるコラーゲン１型、フィブリノーゲン、フィブロネクチン及びフォン・ヴィルブラント因子を含み、かつ４型コラーゲンを含まないコーティングを備えて構成される生体外出血時間測定装置。
【請求項２】
内室と流体連絡された投入口及び前記内室と流体連絡された単一の流出口を備えるハウジングをさらに含み、前記シート部材が前記流出口を通過する流路に跨るように配置され、及び前記シート部材の前記第一面が前記内室へ露出状態で向けられていることを特徴とする請求項１項記載の装置。
【請求項３】
採集容器をさらに含み、前記ハウジングが前記採集容器中へ挿入され、前記シート部材を通って前記開口部を通過する血液が前記採集容器内に集められることを特徴とする請求項２項記載の装置。
【請求項４】
前記ハウジングが前記採集容器中へ密閉状態で挿入されることを特徴とする請求項３項記載の装置。
【請求項５】
前記ハウジングが本体部及び外縁部から成り、前記内室が前記本体部内に設けられ、前記外縁部が前記採集容器と密閉状態で接触し、及び前記採集容器が前記ハウジングの外縁部を通る通気開口部を通して通気されることを特徴とする請求項４項記載の装置。
【請求項６】
前記内室に対する検知を行うための、感知圧力センサ及び流速センサの少なくとも一方から成るセンサをさらに含むことを特徴とする請求項２項記載の装置。
【請求項７】
前記シート部材がナイロンから成ることを特徴とする請求項１項記載の装置。
【請求項８】
前記シート部材が本質的に無孔性であることを特徴とする請求項１項記載の装置。
【請求項９】
前記シート部材が孔径約６μｍの孔をもつナイロン膜から成り、前記コーティングによって前記膜の孔が塞がれて本質的に無孔性な膜が生成されることを特徴とする請求項１項記載の装置。
【請求項１０】
血液サンプルを受け取るための内室、前記内室と流体連絡された投入口、及び前記内室と流体連絡された単一の流出口を備える受取装置、
前記内室内の流体圧及び流速の少なくとも一方を検出するように構成されたセンサ、
前記単一流出口と連携状態にあり、前記単一流出口を通る流路に跨るように配置され、かつシートの厚さに亘る開口部が設けられたシート部材、及び
前記センサからの情報を受け取り及び前記内室内の流速及び圧力の少なくとも一方を制御するように構成された制御装置、から構成される血液凝固分析システム。
【請求項１１】
前記受取装置の内室と流体連絡された採集容器をさらに含み、前記内室内の圧力が前記採集容器から前記内室内への流体の流れを調節することによって制御されることを特徴とする請求項１０項記載のシステム。
【請求項１２】
前記採集容器にシリンジが含まれ、前記受取装置に前記シリンジへ取外し可能に取付けできる取付け部材が備えられていることを特徴とする請求項１１項記載のシステム。
【請求項１３】
前記センサが前記採集容器と前記受取装置との間に配置されることを特徴とする請求項１１項記載のシステム。
【請求項１４】
前記圧力が０ｍｍＨｇないし約２００ｍｍＨｇの範囲内の実質的に一定な圧力に維持されることを特徴とする請求項１０項記載のシステム。
【請求項１５】
前記圧力が約１００ｍｍＨｇ以下の実質的に一定な圧力に維持されることを特徴とする請求項１４項記載のシステム。
【請求項１６】
前記実質的に一定な圧力が約５ｍｍＨｇないし約８０ｍｍＨｇの範囲内にあることを特徴とする請求項１５項記載のシステム。
【請求項１７】
前記シート部材がナイロン及びコーティング混合液から成り、前記コーティング混合液にコラーゲン１型が含まれることを特徴とする請求項１０項記載のシステム。
【請求項１８】
前記混合液にフィブリノーゲン、フィブロネクチン及びフォン・ヴィルブラント因子の１または２以上がさらに含まれることを特徴とする請求項１７項記載のシステム。
【請求項１９】
前記内室中への血液サンプルの流入開始から前記流出口を通る流れが実質的に止まる時点までの時間間隔に基づいて出血時間が測定されるように構成されることを特徴とする請求項１０項記載のシステム。
【請求項２０】
前記時点が前記センサからの情報に基づいて測定されることを特徴とする請求項１９項記載のシステム。
【請求項２１】
内室、前記内室と流体連絡された投入口、及び前記内室と流体連絡された単一の流出口から構成される装置を設ける工程と、
前記投入口を通して前記内室と選択的に流体連絡される血液源を設ける工程と、
前記内室内の圧力及び流速の少なくとも一方を検知するように構成されたセンサを設ける工程と、
前記流出口の断面に跨るように配置され、かつシートを通る流路を与える単一の開口部が設けられたシート部材を設ける工程と、
前記血液源から前記装置中への血液の送流を開始する工程と、
前記内室内の圧力情報及び流速情報の少なくとも一方を前記センサを介して制御装置へ一定経路に従って送る工程と、
前記開口部に血餅を形成して閉塞させる工程と、
血餅形成期間中、前記制御装置を用いて前記血液源から前記投入口を通って流入する血液の流速を制御する工程から構成される血液凝固分析方法。
【請求項２２】
前記血液源がシリンジであることを特徴とする請求項２１項記載の方法。
【請求項２３】
前記シート部材が、シート面の少なくとも一部上にコラーゲン１型を含むが４型コラーゲンは含まない物質を含んで成ることを特徴とする請求項２１項記載の方法。
【請求項２４】
前記物質にフィブリノーゲン、フィブロネクチン及びフォン・ヴィルブラント因子の１または２以上がさらに含まれることを特徴とする請求項２３項記載の方法。
【請求項２５】
前記装置内の流速が約１ｍｌ／分ないし約１０ｍｌ／分の範囲内の一定値に維持されることを特徴とする請求項２１項記載の方法。
【請求項２６】
血液送流の開始から前記開口部を通る血液流の停止までの経過時間に対応して最初の測定を決める工程をさらに含むことを特徴とする請求項２１項記載の方法。
【請求項２７】
前記時間間隔を測定する工程に血液流の停止による圧力増加を検出する工程が含まれることを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項２８】
前記時間間隔を測定する工程に血液流の停止を視覚的に検出する工程が含まれることを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項２９】
血液が個人から採取され、前記個人に対する手術前に前記方法を用いて血液分析を実施することを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項３０】
血液が個人から採取され、前記個人に対する手術中に前記方法を用いて血液分析を実施することを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項３１】
血液が個人から採取され、前記個人に対する手術後に前記方法を用いて血液分析を実施することを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項３２】
血液が個人から採取され、及び
測定された時間間隔が正常であると判断される所定時間範囲内であるかどうかを判定する工程と、
さらにプロトロンビン時間、全血球計数及び部分トロンボプラスチン時間から選択される少なくとも１つの付加的手法を用いて、前記個人から採取した血液をさらに分析して補足データを取得する工程がさらに含まれることを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項３３】
前記血液が個人から採取された血液の第一サンプルであり、前記装置が第一装置であり、前記シート部材が第一シート部材であり、及び
第二内室、前記内室と流体連絡された投入口、及び前記第二内室と流体連絡された単一の流入口から構成される第二装置を設ける工程と、
前記第二装置の流入口の断面に跨り、かつ第二シートを通る流路を与える単一の開口部が設けられた前記第二シート部材を設ける工程と、
前記個人から採取した血液の第二サンプルを用いて前記第二装置中への血液の送流を開始する工程と、
血餅を形成して前記第二シート部材を通る前記開口部を閉塞させる工程と、
前記第二装置中への血液送流の開始から前記第二シート部材を通る前記開口部中への血液流の停止までの時間経過に対応して第二の時間測定を決める工程から構成されることを特徴とする請求項２６項記載の方法。
【請求項３４】
前記第一装置内において第一流速が維持され、及び前記第二装置内において第二流速が維持され、前記第二流速が前記第一流速とは異なることを特徴とする請求項３３項記載の方法。
【請求項３５】
第一装置内において第一せん断速度が維持され、及び前記第二装置内において第二せん断速度が維持され、前記第二せん断速度が前記第一せん断速度よりも高速であることを特徴とする請求項３３項記載の方法。
【請求項３６】
前記第一せん断速度が約１０００／秒以下であることを特徴とする請求項３５項記載の方法。
【請求項３７】
前記第二せん断速度が約１０００／秒以上であることを特徴とする請求項３６項記載の方法。
【請求項３８】
前記第二せん断速度が約２０００／秒以上であることを特徴とする請求項３７項記載の方法。
【請求項３９】
前記第二せん断速度が約８０００／秒以上であることを特徴とする請求項３７項記載の方法。
【請求項４０】
前記第一装置が第一時間に設けられ、及び前記第二装置が第二時間に設けられ、前記第二時間は前記第一時間から一定時間間隔を空けられ、及び前記方法を用いて医療処置あるいは治療のいずれか一方の期間中に出血時間がモニターされることを特徴とする請求項３３項記載の方法。
【請求項４１】
個人へ投薬された抗凝固薬、抗血小板治療薬、非ステロイド系抗炎症薬、デスモプレッシン類、ドナー血小板、人工血小板及び血小板代用品から選択された少なくとも１つの潜在止血作用薬の効果をモニターするために用いられることを特徴とする請求項３３項記載の方法。
【請求項４２】
前記第一シート部材の少なくとも一部がコラーゲン１型を含む第一コーティング物質でコーティングされ、前記第二シート部材の少なくとも一部がコラーゲンを含む第二コーティング物質でコーティングされ、前記第二コーティング物質に前記第一コーティング物質中に存在しない１または２以上のコラーゲン剤がさらに含まれることを特徴とする請求項３３項記載の方法。
【請求項４３】
前記１または２以上のコラーゲン剤が、フィブリノーゲン、フォン・ヴィルブラント因子、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片あるいはペプチド、プロトロンビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、アンクロッド、プレカレクレイン、高分子量キニノーゲン、レプチラーゼ、凝固因子１２、活性化凝固因子１２、凝固因子９、活性化凝固因子９、凝固因子８、活性化凝固因子８、凝固因子５、活性化凝固因子５、凝固因子７、活性化凝固因子７、組織トロンボプラスチン、組織因子／因子７複合体、リン脂質、インテグリン類、抗体、免疫グロブリン超科分子、アデノシン二リン酸、トロンボキサン、アラキドン酸、リストセチン、ボトロセチン、及び列挙されたタンパク質因子のいずれかと薬剤との組換え型から選択されることを特徴とする請求項４３項記載の方法。
【請求項４４】
前記第一時間測定及び前記第二時間測定を比較する工程がさらに含まれることを特徴とする請求項４２項記載の方法。
【請求項４５】
前記第二装置中への血液の送流開始前に前記第二サンプルへ、フィブリノーゲン、フォン・ヴィルブラント因子、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片あるいはペプチド、プロトロンビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、アンクロッド、プレカレクレイン、高分子量キニノーゲン、レプチラーゼ、凝固因子１２、活性化凝固因子１２、凝固因子９、活性化凝固因子９、凝固因子８、活性化凝固因子８、凝固因子５、活性化凝固因子５、凝固因子７、活性化凝固因子７、組織トロンボプラスチン、組織因子／因子７複合体、リン脂質、インテグリン類、抗体、免疫グロブリン超科分子、アデノシン二リン酸、トロンボキサン、アラキドン酸、リストセチン、ボトロセチン、及び列挙されたタンパク質因子のいずれかと薬剤との組換え型から選択される１または２以上の凝固剤を添加する工程がさらに含まれることを特徴とする請求項３３項記載の方法。
【請求項４６】
前記第一時間測定及び前記第二時間測定を比較する工程がさらに含まれることを特徴とする請求項４５項記載の方法。
【請求項４７】
コラーゲン１型、フォン・ヴィルブラント因子、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンを含む第一混合液でコーティングされた第一面の少なくとも一部を有し、かつ長さが約５００μｍ未満であり及び幅が約６０μｍないし約１２０μｍの範囲内である矩形を呈して第一膜を貫通する開口部を備える第一膜を設ける工程と、
コラーゲン１型を含むがフォン・ヴィルブラント因子が欠損している第二コーティング混合液でコーティングされた第一面の少なくとも一部を有し、かつ第二膜を貫通する少なくとも１つの矩形開口部が設けられた前記第二膜を設ける工程と、
個人から採取された血液サンプルを与える工程と、
前記血液サンプルの第一部分を用いて前記第一膜を通した前記開口部中への血液の送流を開始する工程と、
前記第一膜を通した前記開口部中への血液の送流の開始から前記第一膜を通る流れが実質的に停止するまでの時間を示す第一時間期間を測定する工程と、
前記血液サンプルの第二部分を用いて前記第二膜を通した前記開口部中への血液の送流を開始する工程と、
前記第二膜を通した前記開口部中への血液の送流の開始から前記第二膜を通る流れが実質的に停止するまでの時間を示す第二時間期間を測定する工程から構成される、フォン・ヴィルブラント因子活性の分析方法。
【請求項４８】
プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間、全血球計数、ヘマトクリット、因子８凝固剤フォン・ヴィルブラント抗原、フォン・ヴィルブラントリストセチン補助因子、高分子量マルチマー、及びリストセチン誘導血小板凝集の各試験から選択される少なくとも１つの追加試験を実施する工程がさらに含まれることを特徴とする請求項４７項記載の方法。
【請求項４９】
前記測定された第一時間期間、前記測定された第二時間期間、及び前記少なくとも１つの追加試験の結果を分析して、フォン・ヴィルブラント病１型、２Ａ型、２Ｂ型、２Ｍ型、２Ｎ型、３型、血友病Ａ及び疑性フォン・ヴィルブラント病からフォン・ヴィルブラント病の特定の型を予測する工程がさらに含まれることを特徴とする請求項４８項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体外出血時間測定装置、血液凝固分析システム、及び血液凝固分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固、血餅形成及び止血は多くの過程から成る反応系である。この複雑な反応系には内因性経路及び外因性経路と呼ばれる２つの生化学的経路が関与している。それぞれ多数のタンパク質因子を含むこれら２つの経路は血餅形成の調節に重要な役割を果たしている。
【０００３】
血餅形成は一般的には創傷によってひき起こされる。前記２つの経路に関与する種々タンパク質因子を活性化する事象の連続あるいは「カスケード」によって、前駆体であるフィブリノーゲンからフィブリンが形成される。創傷によって活性化される血小板とフィブリンの橋かけ形成及び相互作用によって、凝固した血小板と絡み合ったフィブリンから成る血餅あるいは「不溶性フィブリン」が生成される。
【０００４】
前記凝固カスケードに関与する一定因子あるいは事象が阻害あるいは遮断されると、血餅形成が損なわれ出血時間が長引くことになる。出血時間の延長に関連する多数の医学的条件がカスケード事象の障害と関わりがあることが明らかにされている。前記障害は、他の面では正常な凝固因子が不足、欠損あるいは過剰であることの他に、活性が減じられあるいは失活した１または２以上の凝固因子が存在すること、あるいは投薬あるいは他の薬剤の影響あるいは干渉によっても起こる可能性がある。
【０００５】
これまで凝固効率を測定するための試験が数多く行われてきた。出血時間試験として知られる生体外試験はこれまで広範に行われてきた試験である。この出血時間試験では、患者の腕に小さな切り傷を作ってから出血が止まるまでに要する時間が測定される。切り傷の方向、深さ及び長さ等が等質でないこと、また試験実施者の相違による試験の不整合性のため、この出血時間試験は不明確あるいは不正確になることが多い。また、この出血時間試験は傷痕を生ずるため、長期間に亘る血液状態のモニタリングには用いられない。
【０００６】
前記凝固カスケードのある程度の全般的性状に関する情報が得られる生体外試験方法が開発されてきた。そのような試験方法の一つとして前記外因性経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）法がある。また別の方法として前記内因性経路を測定する部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）法がある。
【０００７】
さらに血小板凝固について調べる試験方法も開発されている。これらの試験では、血小板の凝固能を調べるために１または２以上の凝固誘導あるいは増進剤（例えばＡＤＰ、コラーゲン、エピネフィリン及びリストセチン）が一般的に用いられる。しかしながら、血小板の凝固能は血餅形成の単なる一観点でしかないため、血小板に関する調査では生理的血餅形成に関して限られた情報しか得られない。また、血小板のガラス等の異物への付着能を測定する血小板付着試験によっても限られた情報しか得られず、かかる試験では全く結論が得られず、また予測できない結果を生ずる可能性がある。
【０００８】
創傷部位における事象をより正確にシミュレーションできる生体外止血試験方法が開発されることが望ましい。また、特定の凝固因子及び／または血小板因子の不足を検出する試験方法が開発されることがさらに望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、一定の厚さと周辺部分によって囲まれた内側部分をもつシート部材を含んだ生体外出血時間測定装置に関する。前記内側部分には前記シートの厚さに及ぶ開口部がある。前記シート部材片面の少なくとも一部には、コラーゲン１型、フィブリノーゲン、フィブロネクチン及びフォン・ヴィルブラント因子を含むがタイプ４コラーゲンを欠くコーティングが施されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は一態様として血液凝固分析システムに関する。このシステムは血液サンプルを受け取るための内室を有しかつ前記内室と流体連絡された投入口を有する受取装置が設けられている。また、この受取装置には前記内室と流体連絡された１個の流出口がある。さらに、前記内室内の液圧及び／または流速を検出するためのセンサも配置されている。前記流出口にはシート部材が付随配置され、このシートは前記流出口を通る流路に跨るように配置されている。前記シート部材には該シートの厚さに及ぶ開口部が設けられている。制御装置が配置され、この制御装置によって前記センサからの液圧及び／または流れに関する情報が受け取られ、及び前記内室内の圧力及び／または流れが調節される。
【００１１】
本発明の別の一態様は血液凝固分析方法に関する。本方法では、内室及び該内室と流体連絡された投入口が設けられた装置が使用される。この装置には前記内室と流体連絡された単一の流出口がある。血液源またはサンプルが前記投入口を通して前記内室へ選択的に流体連絡されるように供給される。前記内室に関して圧力及び／または流速を検知するためセンサが配置される。前記流出口の断面に跨るようにシート部材を設け、このシート部材には該シートを通って流体が通過できる１個の開口部が設けられる。前記血液源から前記装置中へ血液の送流が開始され、圧力及び／または流速情報がセンサを介して前記内室から制御装置へ送られる。血餅による前記開口部の封鎖が起るため、前記制御装置を用いて血餅形成中に前記血液源から前記投入口を通って流れる流速を制御することによって前記内室内の圧力及び／または流れを制御する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下において、添付図面を参照しながら本発明の好ましい実施態様について説明する。
【００１３】
本発明は生体外出血時間試験の実施に用いられる装置及び方法を提供する。テスター装置では損傷を受けあるいは切断された血管が模倣されている。前記テスター装置及び試験システムを用いて血小板血栓形成（または一次止血）、血小板付着及び／または血小板凝固、血餅形成、血液凝固時間を測定し、及び／または特定の血液凝固因子（個別あるいは組合せ）のレベルを判定することができる。前記テスター装置は使い捨て形式に構成でき、また本発明において記載された装置及びシステムにおける使用のため大量生産可能である。
【００１４】
本発明の一態様に従ったシステム８について図１を参照しながら全般的に説明する。システム８を用いて出血時間を測定することにより血液凝固を分析することが可能である。装置８を用いて得られた測定値から、個別に得られた血液サンプルの出血時間が短いか、正常であるか、あるいは長いかが判定でき、あるいは判定に役立たせることができる。ここで用語「正常」とは、出血時間あるいは凝固時間等のレベルあるいは測定値が、凝固障害のない個人あるいは集団、及び／または血液凝固がその時点で薬物療法あるいは血液凝固促進剤あるいは阻害剤の投薬による影響がない個人あるいは集団について一般的に得られる範囲内であることを意味する。個別的意味において、用語「正常」とはある個人にとって典型的な範囲内の測定値あるいはレベルにあることを指すと言える。また前記用語「長い」とは、出血時間が一般的に正常と考えられるレベルよりも長いことを指す。いくつかの態様において前記用語「長い」は、対象となる個人について測定された相対的に短い時間に対してある個人によって示された出血時間が長いことを指している。また、前記用語「短い出血時間」は、正常と考えられる時間範囲よりも出血時間が短いこと、または対象となる個人について先に測定された出血時間よりも短いことを指す。
【００１５】
システム８を用いて種々の医療処置及び／または治療期間中における凝固能及び／または出血時間のモニタリングが可能である。システム８を用いた試験結果によって独立した測定が行える他、前記試験結果をプロトロンビン時間（ＰＴ）試験、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）試験、血小板凝固試験、血小板付着試験、生体内出血時間試験、全血球計算（ＣＢＣ）試験、血液型（例えばＡＢＯ）試験、因子８凝固（Ｆ８：Ｃ）試験、フォン・ヴィルブラント抗原（ｖＷＦ：ａｇ）試験、フォン・ヴィルブラントリストセチン補助因子（ｖＷＦ：Ｒｃｏｆ）試験、フォン・ヴィルブラント因子コラーゲン結合活性試験、高分子量マルチマー（ＨＭＷ）試験、あるいはリストセチン誘導血小板凝集（ＲＩＰＡ）試験等の従来試験方法の１または２以上と組合せることも可能である。
【００１６】
いくつかの態様では、システム８を用いて個人から得た血液サンプル中における１または２以上の凝固因子の活性低下、量的減少あるいは欠損を検出することが可能である。従って、以下に限定されないが、種々形態のフォン・ヴィルブラント病、種々形態の貧血症、適切あるいは不適切な投薬レベル、免疫性血小板減少性紫斑病、種々形態の血小板減少症、血小板凝固異常、尿毒症、肝臓病、先天性血小板欠陥（例えばグランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ病）、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症性症候群、及び播種性血管内凝固を含む種々血液状態の検出、予測あるいは診断、類別あるいはモニター（あるいは検出、予測、モニタリング、類別あるいは診断補助）を、前記システム８を用いて行うことが可能である。上記の試験は手術前血液スクリーニングだけでなく、診断及びモニターを目的としても極めて重要である。
【００１７】
図１に示すように、血液凝固分析システム８にはサンプルテスター装置１０が含まれている。前記装置１０にはサンプル源５０から血液サンプルを受け取るように構成された受取装置（以下において説明）を備えることが可能である。サンプル源５０は好ましくは個人から採取した血液サンプルから成る。サンプル源５０から血液をサンプルテスター装置中へ流し込み、特定の用途においては該サンプルテスター装置中の圧力及び／または流速を検出するためのセンサ６０が設けられる。
【００１８】
図２〜５を参照しながらテスター装置１０についてより詳細に説明する。まず図２に示すように、装置１０へ受取装置１２を設けることが可能である。この受取装置１２は第一部分１６をもつハウジング１４から構成可能である。試験装置とも言える受取装置１２は採集容器１８と連結して用いることができ、また容器１８の外部へ配置された前記第一部分１６及び第二部分２０が採集容器１８内部へ挿入されるように受取装置１２を構成することも可能である。ハウジング１４は種々材料から作製可能である。受取装置１２のハウジングは好ましくは血液及び血液成分の付着が無視できる程度か最小限に抑えられる材料を用いて作製される。ハウジング１４に用いる材料の例としてはポリカーボネートあるいは他のプラスチックを挙げることができる。
【００１９】
採集容器１８は特定種類の容器に限定されず、例えば円錐形ガラス瓶または試験管等のガラスまたはプラスチック容器でもよい。装置１０は好ましくは完全な使い捨てであり、血液サンプルの試験完了後には装置１０全体を１個のユニットとして処理可能である。装置１０を使い捨て形態にすることにより血液検体の混入が最小限に抑えられるので有利である。
【００２０】
図３は試験装置１２の例示的構成を示す。ハウジングユニット１４には投入口２２及び流出口２４を設けることが可能である。試験装置１２にはさらに、下面３０及び上面２８を備えかつ縁部２６の厚さに亘る少なくとも１個の通気孔３２が設けられた縁部あるいは突出端部２６を設けることも可能である。前記試験装置１２にはさらにシート部材３４を含めることができ、該シート部材にはそれを貫通する１個の開口部３６が設けられる。図３に示すように、前記シート３４を流出口２４の外側部分中へ挿入できるようにハウジング１４を作製することが可能である。シート３４は好ましくは流出口２４の断面に広がり、該流出口を通過する流路に跨っている。また、シート３４は、投入口２２を通って試験装置１２中を通過する流体がすべて開口部３６を通るように流出口内に密閉状に嵌め込めることが好ましい。図３に示すように、シート３４を嵌め込む一法としてＯリング３８を利用することが可能である。
【００２１】
試験装置１２は円形の投入口及び円形の流出口を有する円筒形のハウジングを備えるように図示されているが、種々形状のハウジング及び開口部を用いて別の構成にできることが理解されるべきである。従って、膜３４の形状は図示されたように円形であってもよいし、また別にデザインされた流出口の形状に適する別の形状としてもよい。また、Ｏリング３８の形状を、開口部２４内へ挿入できて流出口内へシート３４を密閉状に嵌め込めるような形状に作ることも可能である。また、試験装置１２は流出口２４内に挿入されたシート３４をもつように図示されているが、本発明では例えば膜３４をハウジング１４の外側へ嵌め込み、例えば出口キャップ（図示せず）を用いて取り付ける別の構成とすることも考えられる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態においては、開口部３６は好ましくは矩形の切り込みから構成される。膜３４を流出口２４へ広がるように配置して切り込み３６をハウジング１４の長軸に対していずれの方向であっても配列させることが可能である。しかしながら、切り込み３６は、装置間の変動を最小限に減じ試験間の直接比較が行い易くなるように作製された各装置に実質的に同一に位置決めされることが好ましい。さらに、切り込み３６は好ましくはハウジング１４の長軸に対して実質的に垂直となるように開口部２４内に位置決めされる。ハウジング１４の長軸に垂直に位置決めされた切り込みを有する装置１２を垂直配列と言うことができる。前記垂直配列は、サンプル試験が完全な垂直（縁部２６の表面３２が実質的に水平である）位置にある装置１２を用いて実施される本発明の実施態様において好ましいことに注意すべきである。前記実質的な垂直配列で装置１２を用いて試験を実施する際にシート３４を実質的に垂直配列することにより、シートの変形及び／または試験中の前記切り込みの開きを最小限に抑えることが可能である。あるいは、装置１２が試験中垂直以外の状態で使用される場合は、前記垂直配列を用いるか、あるいはシート３４を開口部２４中へ挿入して、切り込み３６を垂直にするか、あるいは切り込み３６をハウジング１４の長軸に対して別の配列に置くことも可能である。
【００２３】
図４は組み立てられた状態の試験装置１２を示した図である。試験装置１２は、外側部分を含むハウジング１４の本体と図２に示した容器１８等の採取ガラス瓶中へ挿入可能な部分を有して構成される。前記本体に加えて、ハウジング１４にはリップ２６を貫通する通気開口部３２備える突出状縁部あるいはリップを設けることができる。図４に示すように、リップ部分２６へ内径部分３９及び周辺部分４０を設けることができる。図４に示すリップ部分２６の例示的構成においては、前記内径部分３９の厚さは該内径部分３９を採取容器内へ挿入できるように外側部分４０よりも厚くなっている。好ましくは、面３０の外側部分４０は採取装置の上面と接触する。好ましくは、面３０の周辺部分４０と前記採取容器の接触部分とは密閉状態となる（流体の貫流を遮断する）。
【００２４】
図４には内径部分３９より薄い外側周辺部分４０を備えるようにリップ２６が図示されているが、リップ２６が均等な厚さをもち及び／または下面３０全体が単一面上にある別の実施態様としてもよいことが理解されるべきである。
【００２５】
図４に示すように、リップ部分２６には１個の通気開口部３２を設けることができる。別態様として２以上の通気開口部（図示せず）を設けることも可能である。通気開口部３２の形状は特定の形状に限定されず、例えば図示されたような円形とすることができる。通気開口部３２の位置は、リップ部分２６内であればどこでも構わない。いくつかの実施態様においては、通気開口部３２は好ましくは作製容易性の観点からリップ２６の周縁部に配置される。例示として、周縁部通気開口部を、Ｕ字形の弧を内側半径方向にもち、かつリップ２６の最も外側端部まで延びるＵ字形状構造とすることができる。
【００２６】
図５に示すように、試験装置１２には血液サンプルを受け取るための内室４２が設けられている。内室４２は投入口２２及び流出口２４と流体連絡状態にある。好ましくは、試験装置１２は内室内における圧力検知及び圧力制御ができるように内室４２からの流出口は１個のみとなるように構成される。図５に示したように、シート３４は、流出口２４を通る流路に跨るように配置することができる。このように構成することにより、血液が好ましくはシート３４中の開口部だけを通って試験装置１２外へ出ることが可能となる。血餅の形成によってシート３４中の開口部が遮断されると、内室４２において生じた圧力あるいは流れの変化を検出することができ、この変化をシート３４を貫通する開口部の血餅閉塞の形成及び／または完成の表示に利用することができる。
【００２７】
図１に示すように、採集容器へ連結されたテスター装置を含めてサンプルテスター装置１０は適当な廃棄部７０へ単一ユニットとして処理可能である。サンプル源５０は個人から採取した血液サンプルで構成可能である。サンプル源５０は、サンプルテスター装置１０の受取装置に対して血液を与える位置関係となるように配置することができる。センサ６０をサンプル源５０とサンプルテスター装置１０との間に配置してテスター装置の内室から圧力情報及び／または流速情報を受け取ることが可能である。この圧力及び／または流れに関する情報は、例えばコンピュータで構成可能なシステム制御装置８０へ一定経路を経て伝達可能である。
【００２８】
前記システム制御装置は、例えば流速制御装置９０を用いてサンプルテスター内の圧力及び／または流れを順に制御することができる。流速制御装置９０に用いられる前記ユニットの型式はサンプル源５０の構成次第で決めることができる。一例として、サンプル源５０をポンプシステムで構成し、流速制御装置９０をポンプ制御装置で構成することができる。流速制御装置９０及びサンプル源５０は独立に構成してもよいし、あるいは単一ユニット（図示せず）に一体化してもよい。同様に、システム制御装置８０及び流速制御装置９０を単一ユニット（図示せず）に一体化してもよいし、あるいは独立に構成してもよい。
【００２９】
一例として、サンプル源５０をシリンジで構成し、また流速制御装置９０をシリンジ駆動装置で構成することができる。本発明のかかる態様について図６を参照しながら説明する。テスター装置１０はシリンジ５０へ取り付け可能である。シリンジ５０には、血液サンプルを保持しかつ前記試験装置１２中へ供給するための円筒部５２とプランジャー５４から構成することができる。前記試験装置１２中への流れは、例えばシリンジ駆動装置で構成される流速制御装置９０を用いて、円筒部５２中を通したプランジャー５４の押下げを調節することによって制御可能である。
【００３０】
試験装置１２の内室内の圧力は、シリンジ５０と試験装置１２との間に配置されたセンサ６０によってモニターすることができる。別態様として、センサ６０を流速センサで構成することも可能である。特別な用途によってはセンサ６０を流速センサ及び圧力センサの双方で構成でき、これらセンサはそれぞれ独立したユニット（図示せず）であっても、あるいは一体化されたセンサユニットであってもよい。
【００３１】
試験装置１２から出た血液は採集容器１８内に集められる。図１に示したシステム８は、一定材料から成るシートを貫通する開口部全域での血餅形成による試験装置１２の流出口の閉塞に対応した圧力増加によって流れが停止するように構成することができる。前記システム８はさらに、試験装置１２中への最初の流れと血餅形成によって起こった閉塞による流れの停止との間の時間が特定サンプルについて生ずる出血時間として測定されるように構成することも可能である。
【００３２】
特定の態様において、試験装置１２の内室内の条件が一定範囲の流速あるいは特定の圧力に維持されることが好ましい場合がある。生体内における凝固事象を予測するために、内室圧が生理的範囲内あるいは特定の生理的数値、あるいはそれらの至近に維持されることが好ましい場合がある。そのため、内室４２の圧力を望ましくは０ｍｍＨｇ以上ないし約３００ｍｍＨｇ以下に維持することができる。用途によっては圧力を１０ｍｍＨｇ以上かつ２００ｍｍＨｇ以下に維持することが好ましい場合もあり、また特定例として圧力を約５ｍｍＨｇから約８０ｍｍＨｇの範囲内の一定圧力に維持できる場合もある。
【００３３】
生理的血管壁せん断速度は、一部血管の径によって左右されるが、約３０／秒ないし約１０，０００／秒の範囲内である。一次止血（初期血小板栓形成）及び血餅形成の生理的機序はせん断力による影響を受ける。さらに、特定の凝血因子の効果及び血液状態を治療しあるいは凝血に作用させるために用いられる種々投薬あるいは薬剤の効果もせん断力による影響を受ける。せん断力は圧力及び流速に依存するため、試験装置１２を通る血液の流速をモニターし及び／または制御することが好ましい場合がある。試験装置１２中を通る流速は、例えば約ｍｌ／分ないし約１０ｍｌ／分の範囲内である。さらに、試験装置１２を種々所定の流速及び／または圧力範囲で用いて特定の生体内せん断条件をシミュレーションすることも可能である。また、試験装置１２内の圧力及び流速を制御することにより、特定のせん断力を得ること及び／または維持することも可能である。圧力、流れ及びせん断力等のパラメータは凝固現象の速度及び／または能力に影響を与えるため、これらパラメータの相違を利用して試験を実施することは重要である。従って、圧力及び／または流速を（好ましくは生理的範囲内で）変えながら一連の独立した試験を実施することができる。異なる流速／圧力パラメータ下で得られた結果の比較及び／または典型的あるいは正常時の結果の比較を行うことにより、特定の血液状態の予測あるいは確認に補助的に役立たせることができる。
【００３４】
図７は本発明に従った血液凝固及び出血時間分析の実施に用いることができる例示的シート３４を示した図である。シート３４は放射状の内側部分４４及び内側部分３４を取り囲む周辺部分４５から構成することができる。内側部分４４と周辺部分４５の相対面積比は特定の数値に限定されない。周辺部分４５は、テスター装置のハウジングの一部と接触しているかあるいは該ハウジングの一部で被覆されているシート３４の一部と一致していてもよい。シート３４はその内側部分内に開口部３６を有している。この開口部３６は好ましくは図示したような長い切れ込み形状に構成することができる。しかしながら、本発明では２以上の開口部を用いること、及び／または開口部の形状を別形状にすることも可能である。開口部３６に使用可能な別形状としては、例えば円形、四角形あるいは不規則形状を挙げることができる。２以上の開口部を使用する場合、開口部は内側部分４４全域に分散されてもよいし、あるいは開口部を並べて１または２以上の開口部の列に形成してもよい。単一の血餅形成によって開口部が閉塞され、また単一の血餅形成に基づいて出血時間が個々の試験について決めることができるように、単一開口部をもつことが好ましい場合がある。
【００３５】
開口部サイズ及び形状はせん断力に影響を与えるため、開口部は試験実施期間中の形状及び寸法整合性を高められる適当なサイズ及び形状とすることが有利である。１つのシートから、試験期間中さらに形状を維持して整合性があり、信頼できかつ再現性のある結果を与える次のシートへと正確に再現できるサイズの単一開口部をもつシート３４を設けるとさらに有利である。従って、シート３４は単一開口部をもち、及び前記開口部は幅が約６０〜約１２０μｍであり長さが約５００μｍ未満である矩形の切り込みであることが好ましい。さらに好ましくは、前記切り込みの長さは約３００〜約４００μｍの範囲内である。前記矩形状の寸法にすることによって切り込みの広がり及び／または縮みが防止できるので有利である。
【００３６】
図８はシート３４の厚さ方向に切断した場合の該シートの断面を示した図である。シート３４は第一面４７及び対向面４８を有する基板材料４６から構成することができる。前記基板材料４６の厚さは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍ、好ましくは約０．１５ｍｍに構成するこができる。いくつかの態様においては、図８に示すようにシート３４にはさらに前記面４７の全面及び前記面４８の全面に亘ってコーティング材料４９を含めることが可能である。あるいは別態様として、基板材料４６の片側の一部あるいは全面へコーティング混合物４９を含ませることも可能である。好ましくは、第一面４７の少なくとも内径部分４４（図７）へコーティング材料を含ませ、第一面４７を前記試験装置の内室へ向くように配置する。より好ましくは、コーティング材料４９は基板４６の各面の少なくとも一部へ処理される。前記基板及びコーティングを含むシート４９の厚さは０．３ｍｍ〜約０．６ｍｍの範囲内であるが、特別な用途においては、好ましくは約０．４５ｍｍとすることも可能である。
【００３７】
前記基板材料４６は少なくとも当初（コーティング材料４９処理前）においては無孔性材料あるいは有孔性材料で構成することができる。前記基板４６へ含ませることができる例示的材料としては、これらに限定されないが、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ＰＶＤＦ疎水性膜、及びナイロン膜材料等のナイロン材料を挙げることができる。一実施態様として、約３〜１０μｍの孔サイズをもつナイロン膜を基板４６として用いることができる。いくつかの態様において好ましい前記開口サイズは約６〜約８μｍの範囲内であり、また特別な実施態様では前記孔サイズは８μｍである。前記膜が本発明に従ったコーティング混合物（以下において述べる）でコーティングされている場合にコーティングされた膜がより正確に容器壁を複製できるためには、別の材料よりも比較的孔サイズの大きいナイロン膜材料を用いることが有利である。コーティングを目的とする場合、ナイロン材料へのタンパク質の付着を高めるためには、カルボン酸エステル末端基に対してアミノ基の比率の高いナイロン材料を用いることが有利である。基板４６に用いることができるナイロン材料の例としてＮＯＶＹＬＯＮ（登録商標）（Ｃｕｎｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、メリデン、ＣＴ、ＵＳＡ）を挙げることができる。
【００３８】
コーティング材料４９には、血小板付着、血小板凝集、血小板栓形成及び血餅形成の１または２以上をひき起こし、活性化し、及び／または高める物質あるいは混合物質を含めることが可能である。コーティング材料４９には好ましくはコラーゲンが含まれる。血液中に存在する血小板は特定タイプのコラーゲンに付着し、コラーゲン４型等の別のタイプのコラーゲンは血小板への付着能がより低いかあるいは殆ど無いため、コーティング材料４９から４型等のコラーゲンを除外することが有利である。さらに、結果の分析を簡略化し、及び容器壁に似せたシートの作製を簡略化するためには、コーティング材料４９中にコラーゲン１型等の単一タイプのコラーゲンを用いることが有利である。しかしながら、本発明においては、血小板付着能のある例えばコラーゲン２型及び／またはコラーゲン３型等の１または２以上をさらに追加しあるいは代替として用いることも考慮されていることを理解すべきである。
【００３９】
特定例において、本発明に従った凝固分析及び／または出血時間測定を所謂「コラーゲンだけの膜」を用いて実施することができる。このコラーゲンだけの膜は、コラーゲン１型を含み及び他の凝固因子あるいは凝固に影響を与える他の作用物質を全く欠くコーティング混合物を用いて少なくとも部分的にコーティングされたナイロン膜から作製することができる。
【００４０】
本発明に含まれる前記コラーゲンだけの膜は例示的に下記方法によって作製することができる。全面の寸法が２５ｃｍ×２０ｃｍであるナイロン膜へ１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ-トルエンスルホネート（ＣＤＩ）２０ｍｇ／ｍｌ蒸留水溶液（以下ＣＤＩ溶液と記載する）を注ぐ。過剰のＣＤＩ溶液を流出させ、前記膜をコラーゲン１型粉末４０ｇ、ＣＤＩ溶液２００ｍｌ及びグリセロール４ｍｌを含む第一コラーゲンコーティング混合液１５ｍｌを加えて処理する。
【００４１】
前記コラーゲンだけの膜を作製するためのコラーゲン１型は好ましくはサイズが揃って滑らかであり、また塊りがなく０．５ｍｍ以上の粒子がない粉末である。本発明の目的のために用いることができる例示的コラーゲン１型粉末は、乾燥し最小限３回ボールミルで粉砕して微粒化した子牛アキレス腱から調製することができる。現在ではシグマアルドリッチ社、セントルイス、ＭＯから適する粉末が入手可能である。
【００４２】
前記第一コラーゲン混合液１５ｍｌを前記膜上へ混合し該膜面上へ平らにならす。次いで膜を例えばテフロンコーティング面あるいはステンレススチール面等のくっつかない面上へひっくり返す。次いで膜を上側からならして下側面から過剰のタンパク質を除去あるいは減らし、気泡を減らしあるいは取り除き、膜面全体に均質なコーティングを施す。さらに前記第一コラーゲン混合液１５〜２０ｍｌを膜上へ追加する。追加された第一コラーゲン混合液を混合し、前記と同様に膜上にならしてから乾燥させる。乾燥は好ましくは約４０〜約４５℃の温度範囲内で実施される。
【００４３】
乾燥後、コーティングされた膜材料の片側をコラゲナーゼで処理して約４０〜約４５℃の温度範囲内で約１〜約２時間熱処理する。コラゲナーゼ処理を受けた膜を塩水あるいはプロテアーゼ阻害剤を含んだ塩水で濯ぐ。濯ぎ後、前記膜を約４０〜約４５℃の温度範囲内で（例えば一昼夜）再度乾燥する。
【００４４】
前記コーティング処理によって、好ましくは孔開口が満たされ、水を透過する検出可能な孔のない本質的に無孔性の膜となる。
【００４５】
前記コーティング処理における表面積と反応物の相対量について述べる。前記量は、代用法として比例するように秤量して他の部分の基板材料を処理することができる。前記コーティング形成前あるいは形成後に基板材料から、本発明に従った装置に用いるために適当なサイズ及び形状のシートを切断することができる。
【００４６】
前記コラーゲンだけの膜中への切り込み開口部の形成は前記膜材料のコーティング前あるいはコーティング形成後に実施可能である。切り込み形成方法の一例として、好ましくは正確に０．０１５ｍｍ以内に面取り及び／またはツーリングされたパンチを用いて切り込みが形成される。
【００４７】
別の作製方法においては、図８におけるコーティング混合物へ、血小板栓形成、凝血及び／または血餅生成の１または２以上を活性化し、活性化を補助し、増大し、刺激し、さもなければ影響を与えることができる１または２以上の物質をさらに含ませることが可能である。前記物質の例としては、以下に限定されないが、フィブリノーゲン、フォン・ヴィルブラント因子、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片あるいはペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドを含み、これに限定されない）、プロトロンビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、アンクロッド、プレカレクレイン、高分子量キンニノーゲン、レプチラーゼ、凝固因子１２、活性化凝固因子１２、凝固因子９、活性化凝固因子９、凝固因子８、活性化凝固因子８、凝固因子５、活性化凝固因子５、凝固因子７、活性化凝固因子７、組織トロンボプラスチン、組織因子／因子７複合体、リン脂質（例えばウサギ脳セファリン、血小板活性化因子（１−Ｏ−パルミチル−２-アセチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）及び３−Ｏ−パルミチル−２−アセチル−ｓｎ-グリセロ−１−ホスホコリン）、インテグリン類（例えば糖タンパク質２ｂ−３ａ）、抗体（例えば抗糖タンパク質３ｂ-３ａ）、免疫グロブリン超科分子（例えば血小板内皮細胞付着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、トロンボキサン、アラキドン酸、リストセチン、ボトロセチン、あるいは列挙されたタンパク質因子のいずれかと薬剤との組換え型を挙げることができる。
【００４８】
コラーゲン１型に加えて凝固促進因子を含むコーティング材料４９を有する図７及び８に示したシート部材３４の一例を内皮下膜（ＳＥＭ）と呼ぶことができる。このＳＥＭを具現化するためのコーティング４９には、コラーゲン１型に加えて、フォン・ヴィルブラント因子、フィブロネクチン及びフィブリノーゲンを含ませることができる。ＳＥＭ膜の例示的作製方法について以下に述べる。
【００４９】
市販のＡ群プラズマを用いて寒冷沈降物を生成する。前記プラズマを凍結させて寒冷沈降物を生成し及び約４℃まで解凍した後、前記寒冷沈降物を約４℃で遠心分離して集め、任意に複数のドナーから得た寒冷沈降物サンプルと混合する。前記寒冷沈降物の採集及び混合後、該寒冷沈降物をさらに凍結を行うことなく約４℃に維持する。あるいは、寒冷沈降物を使用まで凍結保存することも可能である。以下に述べるコーティング混合物の調製に用いられる適当な寒冷沈降物懸濁液あるいは溶液のタンパク質濃度は下記のように調製可能である。すなわち、フィブリノーゲン４００〜６００ｍｇ／ｄＬ、フォン・ヴィルブラント因子１００〜４００Ｕ／ｄＬ、及びフィブロネクチン含量約２２ｍｇ／ｍｌ程度。なお、以下の説明においてこの混合液を寒冷沈降物溶液と呼ぶ。
【００５０】
濃縮混合液は次のように調製することができる。ＣＤＩ溶液（前記同様の２０ｍｇ／ｍｌ水溶液）２００ｍｌへ前記コラーゲン１型粉末約４０ｇを加えながら撹拌してコラーゲン／ＣＤＩ溶液を調製する。このコラーゲン／ＣＤＩ溶液へ前記寒冷沈降物溶液１８０ｍｌをゆっくり加えて混合して微粒状スラリーを調製する。この調製中、前記混合液を４５℃以下の温度まで加熱することも可能である。前記混合は典型例として約６０分間かけて行われる。次いでグリセロール４ｍｌを添加し、さらに４５℃以下の温度で約６０分間攪拌する。この濃縮混合液は直ぐ使用することができるが、約４℃において数ヶ月の期間保存することも可能である。
【００５１】
ナイロン基板材料をコーティングして以下のようにしてＳＥＭを形成することができる。ＳＥＭの作製を表面積２５ｃｍ×２０ｃｍのナイロン膜材料を用いる場合について説明する。但し、以下に説明する作製方法は表面積がそれより大きいかあるいは小さいものであっても大きさに比例する割合で同様に作製できることが理解されるべきである。表面積２５ｃｍ×２０ｃｍのナイロン膜材料を用いて、この材料へ約２０ｍｌのＣＤＩ溶液を注ぐ。濃縮ＳＥＭ溶液１５ｍｌを加えて前記膜上で混合してから該膜面上へ平らにならす。次いで前記膜をテフロンコーティング面あるいはステンレススチール面等のくっつかない面上へひっくり返す。前記膜をその上側から平らにならして下面から過剰のタンパク質を減らしあるいは取り除き、気泡を除去あるいは減らして表面のコーティングを均質にする。
【００５２】
濃縮ＳＥＭ混合液３０ｍｌ、寒冷沈降物溶液４ｍｌ及びＣＤＩ溶液１０ｍｌを混合して第二混合液を調製する。この第二混合液を前記膜の上側へ広げ、例えば渦を巻かせあるいは振り回して均質なコーティングを形成させる。次いで前記膜を約４５℃において約５日間処理する。次いで前記膜の第一面上へＣＤＩ溶液１０ｍｌを加え、さらに前記膜の対向面上へ同溶液１０ｍｌを加えて前記膜を完全に濡らす。完全に濡れたら直ぐに過剰のＣＤＩ溶液を切り、前記膜へ第三の混合液を加える。この第三の混合液は、濃縮ＳＥＭ混合液３０ｍｌ、寒冷沈降物４ｍｌ及びＣＤＩ溶液約１５〜約２０ｍｌから成る。前記第三の混合液の添加後、前記膜を渦を巻くように振ってコーティングを均質にし、乾燥するまであるいはそれ以上長く４５℃に維持された恒温器中に約１週間置く。
【００５３】
切り込み形成及び適当サイズのＳＥＭへの切断は、前記コラーゲンだけの膜について説明した方法と同様の方法で行うことができる。
【００５４】
前記において作製されたコラーゲンだけの膜及びＳＥＭシート部材に加え、例えば前記コラーゲンだけの膜あるいは前記内皮下コーティングの作製に際して列挙された凝固因子の１または２以上を加えることにより、コーティング混合物中へ１または２以上の追加因子を含ませることができる。
【００５５】
前記形成されたコーティングシートの厚さは約０．３〜約０．６ｍｍの範囲内とすることができる。前記コーティングされたシート部材は室温で保存可能であり、また保存前後に切断して適当な形状とすることができる。さらに、適当な形状に切断したシート部材を保存前にテスター装置の採集容器部分を任意に含む試験装置へ組み立てることも可能である。
【００５６】
前記試験装置は出血時間の測定に利用可能である。特定の例において、前記試験装置を用いて凝固異常を検出し、１または２以上の凝固因子の対応正常値に対しての量における減少、活性低下あるいは欠損を予測及び／または診断し、及び／または治療または医療処置あるいは手術前後、あるいは処置あるいは手術中における出血時間の測定またはモニターを行うことが可能である。
【００５７】
本発明方法論に従った個人から採取した血液サンプルの凝固分析では、それぞれが同様なあるいは異なる前記コーティング混合物を用いる１または２以上の試験装置を用いることが可能である。さらに、複数の装置を用いて複数の圧力／流れ条件下で、例えばせん断力の一次止血、血餅形成及び／または出血時間に対する影響の分析等の試験を別個に実施することが可能である。
【００５８】
図１を再度参照しながら、本発明に従った出血時間測定方法及び／または血餅形成分析方法について説明する。テスター装置１０中にコラーゲンだけの膜を備える試験装置８を用いた例示的試験について述べる。なお、ここで述べる試験方法では前述した別のコーティングによるシート部材のいずれもが使用可能であることを理解されたい。
【００５９】
シリンジ等の血液サンプル源５０へ試験対象となる個人から採取した血液サンプルが供給される。圧力／流れセンサ６０がシリンジ５０とサンプルテスター装置１０との間に取り付けられる。流れ制御装置９０によってサンプル源５０からサンプルテスター装置への血液の送流が開始される。初期流速は例えば約１ｍｌ／分〜１０ｍｌ／分の範囲内とされる。サンプル源５０からサンプルテスター装置への血液の送流中、該テスター装置内室内の圧力及び流速はセンサ６０によって検知される。センサ６０はシステム制御装置８０へ圧力情報、流速情報、あるいは双方を与えるように構成され、前記制御装置８０により次いで流速制御装置９０を用いてサンプル源５０から送られる流速が制御されることにより内室内の圧力及び流速が所望の数値に制御あるいは維持される。
【００６０】
システム制御装置８はさらに、センサ６０からの圧力及び／または流れ情報に基づいてテスター装置１０中に設けられた前記切り込みの閉塞を検知するように構成可能である。すなわち、システム制御装置８０は、前記切り込み開口部が閉塞された際にサンプルテスター装置１０への流れを中断させるように構成可能である。流速開始及びテスター装置への流れの中断間の時間経過は、コラーゲンだけの膜を通る特定血液サンプルについての出血時間として制御装置８０によって記録される。また任意であるが、前記膜を通る流れの停止を視覚的及び／または光学的に検知できるようにシステム８を構成することも可能である。
【００６１】
前記出血時間試験は約３０〜約３８℃の温度範囲内で実施可能である。生体内で起こる事象を最大限正確に表示及び予測するため、前記試験は好ましくは生理的温度あるいはその付近温度において実施される。従って、血液サンプルは生理的温度において与えられ、及び／または前記試験装置中の全体において生理的温度に維持される。前記システム８（図示せず）中にヒーターを設けることも可能であるし、制御装置８０を試験期間中の温度をモニター及び／または制御するように構成することも可能である。
【００６２】
同一サンプルの第二分量または同一個人から別途採取したサンプルを用いて前記コラーゲンだけの膜試験を反復することにより出血時間の変化をモニターあるいは検出することができる。あるいは、サンプルテスター装置をＳＥＭタイプの膜あるいは前記した別の代替膜を備えるサンプルテスター装置へ置き換えた前記方法を用いてこの試験を反復するも可能である。
【００６３】
特定用途において一定個人から採取した血液について単一タイプの膜を用いて一連の試験を実施することにより個人の血液凝固を一定期間モニターすることができる。このような個人に対する一連の試験を行うことにより、例えば治療処置あるいは出血時間及び凝固能に対する他の医療処置の影響についてモニターすることが可能である。
【００６４】
また、前記した膜の２以上のタイプを用いて個別試験あるいは一連の試験を実施することも可能である。２以上のタイプの膜を用いて得られた結果を比較して個人の血液の凝固能に関する情報を提供することも可能である。本発明方法を用いて凝固異常を検出することが可能であり、また組合せにより、本発明方法によって得られた結果を用いて個人における特定凝固因子あるいは他の凝固作用因の量及び活性における欠損を予測あるいは診断することが可能である。
【００６５】
本発明の別の態様において、最初の個別あるいは一連の試験を前記と同様に実施することが可能である。例えば１または２以上の試験において凝固時間延長が認められたことにより潜在的異常状態が検出された場合、追加試験を実施して前記異常状態の起こり得る原因を予測しあるいは絞り込むことが可能である。この追加試験は前記したコーティング中に凝固作用因が添加された膜を用いて実施される。あるいは、異常の認められた個人から採取した血液サンプルを用意し、ＳＥＭ、コラーゲンだけの膜、あるいはそれらの双方を用いた試験前に、１または２以上の血液凝固作剤を前記サンプル中へ添加することができる。前記試験実施前に前記サンプルへ添加可能な凝固剤の例としては、任意なコーティング成分に関して前に明記した剤のいずれかを挙げることができる。前記サンプル（あるいは膜）への剤の添加によって生ずる出血時間における差異を利用して、個人の血液中の特定因子の活性あるいは量の正常値に対しての低下を測定あるいは予測することができる。
【００６６】
特定の例において、個人から採取した血液サンプルについて流速及び圧力パラメータの第一の組合せを用いて第一試験を実施して第一出血時間を得る。同一個人から採取した血液サンプルについて少なくとも圧力及び流速の一方が第一試験とは異なるパラメータの第二の組合せを用いて第二試験を実施して第一試験におけるよりも高い第二せん断速度を生成する。第一及び第二試験で得られた出血時間を相互に及び／または対応する同様なパラメータに基づいて正常な個人から得られた試験結果と比較する。かかる比較は特定の血液状態の予測あるいは確認に有益である。なお、本発明の目的において、低せん断速度とは約１０００／秒以下を言い、高せん断条件とは約１０００／秒以上のせん断速度を言い、及び極めて高いせん断力とは約８０００／秒以上のせん断速度を言う。
【００６７】
異なるせん断力条件下で試験を行うことの用途例として、フォン・ヴィルブラント因子欠損の検出あるいは確認がある。フォン・ヴィルブラント因子は比較的高いせん断力下における一次止血において大きな役割を果たしているため、フォン・ヴィルブラント因子欠損によるせん断力増大下で血小板栓の形成能の低下が起こる可能性がある。従って、低せん断力条件で実施される前記第一試験よりも高いせん断力条件下で実施される第二試験において得られた出血時間延長から異常フォン・ヴィルブラント因子（量あるいは活性）について示すことが可能である。
【００６８】
前述した種々試験方法を用いて得た結果を１または２以上の従来の血液試験方法と組み合わせることができる。これら方法及び結果を組み合わせることは特定条件の分析あるいは予測にとって有用である。特定の障害の検出、予測あるいは診断を行うため試験を組合せ及び結果を利用する例を図９に示す。
【００６９】
図９に示すように、前記生体外方法（生体外一次止血（ＩＶＰＨ）試験とも呼ばれる）を用いた試験結果を、プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分的トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）及び全血球計算（ＣＢＣ）の各試験の１または２以上から得た結果と組み合わせることが可能である。前記試験結果を図９に図解されたように組合せ及び分析することにより種々状態を予測あるいは示すことが可能である。図９中にさらに加えられた種々略語の使用対象は以下の通りである。ＴＴＰ：血栓性血小板減少性紫斑病、ＨＵＳ：溶血性尿毒症性症候群、ＤＩＣ：播種性血管内凝固障害、ＰＬＴ：血小板、Ｈ／Ｈ：ヘモグロビン／ヘマトクリット、ＷＢＣ：白血球数、ＢＵＮ：血中尿素窒素、Ｃｒｅａｔ．：クレアチニン、ＮＬ：正常、及びＡＴ３：抗トロンビン３。図示されているように、正常、延長及び短縮時間を種々組合せることは、先天性血液欠陥、異常血小板凝集、薬物療法の有効または無効、薬物療法レベル、貧血等の状態の予測に役立つ。
【００７０】
図９に概略示された方法例に加えて、本発明に従った試験は患者を苦しめる別のタイプのフォン・ヴィルブラント病の予測及び判定にも利用可能である。数型のフォン・ヴィルブラント病に対する試験及び分析方法の概要を図１０に示す。図示したように、コラーゲンだけの膜を用いて実施した試験結果を、ＳＥＭを用いて実施した結果と、また数例においてはＰＴ、ＰＴＴ、血液型ＡＢＯ、ＣＢＣ、ヘマトクリット、凝血因子８（Ｆ８：Ｃ）、フォン・ヴィルブラント抗原（ｖＷＦ：ａｇ）、フォン・ヴィルブラントリストセチン補助因子（ｖＷＦ：Ｒｃｏｆ）、高分子量マルチマー（ＨＭＷ）、及びリストセチン誘導血小板凝集（ＲＩＰＡ）の各試験の１または２以上の追加試験を実施した結果と比較することにより、フォン・ヴィルブラント病の１型、２Ａ型、２Ｂ型、２Ｍ型、２Ｎ型及び３型、血友病Ａ、及び偽牲フォン・ヴィルブラント病を茎別することが可能である。
【００７１】
前記方法及び装置は、手術前に出血及び／または止血を分析して出血時間延長あるいは他の止血障害をもつ出血性素因者を検出することにも有用である。本発明方法はさらに手術中及び／または手術後の出血の検出にも利用可能である。前記試験ではさらに血小板に起因する微粒子の検出に利用でき、及びそれによって個人の動脈血栓の潜在可能性を予測するための生体内血小板活性化の分析にも利用することができる。
【００７２】
前記試験方法が特に有用なさらに他の用途として、意図的にあるいは気付かずに抗凝血性、抗血小板及び／または出血効果を生じあるいは増大する投薬等の作用因に対して影響する潜在的止血効果を検出、測定あるいはモニターするための利用を挙げることができる。前記投薬の例としては、抗糖タンパク質２ｂ−３ａ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）、イーライリリー、インディアナポリス、インディアナ州）、糖タンパク質２ｂ−３ａ阻害剤、抗糖タンパク質ＩＢ、抗糖タンパク質ＩＢ阻害剤、クロピドグレル（ＰＬＡＶＩＸ（登録商標）、エルフサノフィコーポレーション、パリ、フランス）、チクロピディン（ＴＩＣＬＩＤ（登録商標）、サノフィコーポレーション、パリ、フランス）、ディピリダモール、シロスタゾール（ＰＬＥＴＡＬ（登録商標）、大塚製薬、東京、日本）、及び非ステロイド系抗炎症薬（例えばアスピリン、ナプロシン等）を挙げることができる。個人血液及び／または潜在的止血に影響する薬剤効果のモニタリングは、治療あるいは薬物療法期間中に一定時間間隔を置いて、あるいは必要とされるいかなる期間においても前記試験を実施することで果たされる。
【００７３】
前記試験及び方法のさらに特に有用な用途として、薬物療法及び／または意図的に血液凝固を生成あるいは増大させるために投与される潜在止血に影響する剤効果の検出、測定及び／またはモニタリングがある。例えば前記方法によってフォン・ヴィルブラント病に苦しんでいる患者中のフォン・ヴィルブラント因子量を増加させるために投与されるデスモプレッシンの効果をモニターすることができる。
【００７４】
前記試験方法はまた、ドナー血小板、保存ドナー血小板、人工血小板あるいは血小板代用品（例えばＣＹＰＬＥＸ（登録商標）、サイプレス・バイオサイエンス・インク、サンディエゴ、カリフォルニア）等の血液血小板製品の効果の検出、測定及び／またはモニタリングに特に有用である。かかる用途において本発明は、血小板製品の患者への投与（例えば輸血による）後の分析のみならず、血小板製品の品質管理目的にも利用することができる。
【００７５】
上記において本発明はその構成及び方法的特徴に関して幾分特定的に説明されてきた。しかしながら、本願において開示された手段は本発明を実施するための好ましい態様にすぎないのであるから、本発明は上記図示され説明された具体的特徴に限定されないことが理解されるべきである。従って、本発明は添付の特許請求の範囲により限定される適正範囲内に含まれるあらゆる形態及び変形について権利化を求めるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の特定の態様に従ったシステムを説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の一態様に従って組み立てられたテスターの透視図である。
【図３】本発明の一態様に従ったテスター装置の分解組立図である。
【図４】図３に示したテスター装置が組み立てられた状態を示す透視図である。
【図５】図４に示したテスター装置の線５−５に沿った断面図である。
【図６】図２に示したテスター装置がソースシリンジへ取り付けられた状態を示した透視図である。
【図７】本発明の一態様に従ったコーティングされたシートの平面図である。
【図８】図７に示したコーティングされたシートの断面図である。
【図９】図９は図９Ａと図９Ｂの配置図である。
【図９Ａ】本発明の一態様に従った例示的な血液状態予測方法論を表した図式である。
【図９Ｂ】本発明の一態様に従った例示的な血液状態予測方法論を表した図式である。
【図１０】図１０は図１０Ａと図１０Ｂの配置図である。
【図１０Ａ】本発明の第二の態様に従った例示的な血液状態予測方法論を表した図式である。
【図１０Ｂ】本発明の第二の態様に従った例示的な血液状態予測方法論を表した図式である。
【図１】
2006518034.tif 000003
【図２】
2006518034.tif 000004
【図３】
2006518034.tif 000005
【図４】
2006518034.tif 000006
【図５】
2006518034.tif 000007
【図６】
2006518034.tif 000008
【図７】
2006518034.tif 000009
【図８】
2006518034.tif 000010
【図９】
2006518034.tif 000011
【図９Ａ】
2006518034.tif 000012
【図９Ｂ】
2006518034.tif 000013
【図１０】
2006518034.tif 000014
【図１０Ａ】
2006518034.tif 000015
【図１０Ｂ】
2006518034.tif 000016
【国際調査報告】
2006518034.tif 000017