(57)【要約】  生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子の受容体もしくは成長因子結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。上記組織または細胞は、好ましくはニューロンであり、その場合には、上記受容体は、好ましくは受容体チロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）もしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体である。かかる組成物は、上記Ｔｒｋもしくはフラグメントまたはそれらの相同体に結合された１つまたはそれ以上のニューロトロフィンを含んでもよい。
2006517573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御されたニューロンの成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する受容体チロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）もしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
【請求項２】
前記Ｔｒｋが、ＴｒｋＡ、ＢまたはＣ、またはそれらのオルターナティブスプライシングされた形態、ｐａｎ−Ｔｒｋ、Ｔｒｋの機能的相同体、あるいは複数のタイプのＴｒｋの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔｒｋの前記フラグメントが、Ｉｇ様サブドメインを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記フラグメントが、ＴｒｋＡのＩｇ様サブドメイン２を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｉｇ様サブドメイン２が、アミノ酸ＶＳＦＳＰＶの挿入を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記フラグメントが、図２に示される配列またはそれらの機能的相同体を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｔｒｋまたはフラグメントまたは相同体へ結合された１つまたはそれ以上のタイプのニューロトロフィンを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ニューロトロフィンが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＮＴ４から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する１つまたはそれ以上の細胞外マトリックス構成成分を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックス構成成分が、コラーゲンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞外マトリックス構成成分が、配列ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲおよび／またはＩＫＶＡＶを含有するペプチドを含む、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記スカフォールドの前記材料は、生分解性かつ生体適合性のポリマーである、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリマーが、ポリヒドロキシ酸、多糖、ポリ（アミノ酸）、ポリ（擬似アミノ酸）、およびこれらのポリマーの任意のモノマーから調製されるコポリマーから選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ポリ（アルキレングリコール）とのブロックコポリマーである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコールと、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸−グリコール酸共重合体とのブロックコポリマーである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｔｒｋもしくはフラグメントまたは相同体が、１つまたはそれ以上の特異的分子相互作用によって、前記スカフォールドの前記表面に、または該表面に隣接して位置する、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記１つまたはそれ以上の特異的分子相互作用が、前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して結合された１つまたはそれ以上のアンカー分子と前記Ｔｒｋもしくはフラグメントまたは相同体に結合された１つまたはそれ以上のタグ分子との間で行われる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
タグ分子がビオチンであり、アンカー分子がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、あるいはそれらの逆である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タグおよび前記アンカーの両方に同時に結合することが可能であるアダプター分子が使用された、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記タグおよび前記アンカーの両方がビオチンであり、前記アダプターが、アビジンまたはストレプトアビジンである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記スカフォールドが、形状が管状である、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｔｒｋが、約２．５〜２５０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する成長因子の受容体もしくは成長因子結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
【請求項２４】
前記成長因子が、ニューロトロフィンである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｔｒｋまたは他の成長因子受容体が、前記ニューロンもしくは他の生物学的組織または細胞の成長、再生または修復の方向の制御を提供するように、前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して配置された、前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
治療における使用のための前述の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
神経成長、再生または修復を促進するための薬剤であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する前記Ｔｒｋもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるＴｒｋもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用。
【請求項２８】
神経成長、再生または修復を促進する方法であって、前記スカフォールドの表面上で、または該表面に隣接してＴｒｋ−ニューロトロフィン複合体を形成するように、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載の組成物をニューロトロフィンの供給源と接触させ、前記組成物を幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織と接触させ、そして前記幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織を、前記スカフォールドの表面上で、または該表面に隣接して成長、再生または修復させることを含む方法。
【請求項２９】
幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞または組織を移植する方法であって、ドナー幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞のサンプルを、適切なドナー培養物または被験体から採取し、前記スカフォールドの表面上で、または該表面に隣接してＴｒｋ−ニューロトロフィン複合体を有する請求項１ないし２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させて、前記ドナー細胞を成長、再生または修復させ、そしてかかるドナー細胞を必要とするレシピエント被験体に、前記ドナー細胞および組成物を配置することを含む方法。
【請求項３０】
Ｔｒｋもしくはフラグメントまたはそれらの相同体の制御された放出用の生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるリザーバ、および前記リザーバと密接に結合し、かつ／または前記リザーバの表面に、または該表面に隣接して位置するＴｒｋもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
【請求項３１】
治療における使用のための請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
上昇したニューロトロフィンレベルと関連した疾患の治療用の制御された放出薬剤であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるリザーバ、および前記リザーバと密接に結合され、かつ／または前記リザーバの表面に、または該表面に隣接して位置するＴｒｋもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるＴｒｋもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用。
【請求項３３】
治療されるべき前記疾患が、アルツハイマー病または疼痛障害である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記疼痛障害が、突発性神経性尿意促迫、間質性膀胱炎、関節炎、帯状疱疹、末梢性炎症、慢性炎症、腫瘍学的状態またはヘルペス後神経痛と関連する、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項２８に記載の方法により得られるか、もしくは得られ得る幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織。
【請求項３６】
生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する成長因子もしくは機能的フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
【請求項３７】
治療における使用のための請求項３６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的組織の再生および修復に関する。特に、限定的ではないが、本発明は、ニューロン組織の成長、再生および／または修復を促進するための生体適合性の組成物の使用に関する。
【０００２】
自家移植片材料を用いた神経修復は、ドナー部位病的疾患、機能の不適切な再発、および異常再生を含む幾つかの欠点を有する。自家移植片に代わる代替物が、神経間隙を埋めるのに使用するために求められている。多くのエンチューブレーション(entubulation)材料が研究されているが、自家移植片と比較して、一般的に期待に反する結果を伴う。近年、末梢神経の研究は、これらの問題を克服し得る合成神経誘導管の生成に焦点を当てている。様々な研究室では、分岐状末梢神経の修復用の優れたプロテーゼを創出するために、加水分解および分解生成物の溶解により操作（engineered）組織から除去される合成生分解性ポリマーがシュワン細胞と併用して使われている(Hadlock et al (1998) Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 124: 1081; Hadlock et al (2000) Tissue Eng, 6: 119; Bryan
et al (2000) Tissue Eng, 6:129)。神経および血管のような組織の機能は、細胞の制御された配向性に依存しており、多くの組織細胞型に関して、細胞対細胞の相互作用が確実に行われるように、空間構築が必要とされる。合成材料は、自然の発達中に遭遇する細胞微小環境を模倣するように操作され得る。例えば、生分解性ポリマー表面は、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含有するペプチドを提示するように操作することができる。この配列は、細胞表面上のインテグリン受容体に結合し、細胞接着、伸展および細胞内シグナル伝達を誘導し、したがって細胞対細胞外マトリックスの相互作用を模倣する。
【０００３】
生体分子をミクロンスケールの精度で表面上に固定化することができる一連の技法が存在する。これらの技法としては、光、イオンまたは電子のビームと表面の間の相互作用の位置を制限するようにパターン化されたマスクを使用するリソグラフィック方法、およびマイクロコンタクトプリンティング法が挙げられる。しかしながら、これらの技法は、リガンドのタイプおよびパターン化され得る表面を制限し得る。
【０００４】
ＷＯ９９／３６１０７号に示されるように、生分解性ブロックコポリマーの表面上に、ビオチン化したリガンドのミクロンスケールパターンを生成することが可能であり、ナノメートルの精度での生体分子の堆積の制御を達成する。これは、原子間力顕微鏡を用いたパターン化された表面上のタンパク質分子の分子解析により確認される。この系は、培養ウシ大動脈内皮細胞およびＰＣ１２神経細胞で試験されており、細胞発生に関して空間的制御を示す。ポリマー表面上のＰＣ１２細胞の神経突起伸長は、ＩＫＶＡＶ配列を含有するペプチドから構成されるパターンの特徴により方向付けることができる(Patel et al (1998) FASEB J, 12: 1447; Cannizaro et al (1998) Biotechnol Bioeng, 58: 529)。
【０００５】
上記系で使用されるポリマーは概して、成形（fabrication）後の表面操作としてビオチン−アビジンの高親和性カップリングを使用するビオチン化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリ乳酸（ＰＬＡ）とのブロックコポリマーである。これらのポリエステルは、酸を触媒とする加水分解に感受性であり、したがって生分解性である。生分解性の速度は制御することができ、したがってポリマーは、治療薬の制御された送達に使用することができる。関連種類のポリマーであるポリオルトエステルのｐＨ感度もまた、この目的で研究されている(Leadley et al (1998) Biomaterials, 19: 1353-60)。
【０００６】
しかしながら、これまでに使用される方法すべてに短所が存在する。ニューロンは、そ
れらの維持および神経突起伸長のために、様々な成長因子の存在を必要とする。細胞培養条件下で実施される実験は概して、ウシ胎児血清または添加した成長因子の存在下である。しかしながら、体内での正常な条件下では、循環する成長因子のレベルが低すぎて、神経再生に有効でない。
【０００７】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、ニューロトロフィンのファミリーの１つであり、他のファミリーの成員としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）およびニューロトロフィン−４（ＮＴ４、ＮＴ４／５またはＮＴ５として称されることもある）が挙げられる。ニューロトロフィンはすべて、共通の受容体であるｐ７５ＮＧＦＲに結合する。特異性は、受容体チロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）とのそれらの相互作用により規定され、その相互作用のＫｄは、およそ１０-10〜１０-11Ｍである。
【０００８】
ＴｒｋＡの特性は、ＷＯ９９／５３０５５号に記載されている。ＴｒｋＡ構造の略図を図１として添付する。免疫グロブリン（Ｉｇ）様結合ドメイン２（ＴｒｋＡＩｇ２）のヌクレオチド配列およびヌクレオチドから由来するアミノ酸配列を図２として添付する。
【０００９】
ＮＧＦは、ＴｒｋＡに結合し、ＢＤＮＦおよびＮＴ４は、ＴｒｋＢに結合し、ＮＴ−３は、ＴｒｋＣおよびあるいはそのＩｇ様結合ドメイン２において６個のアミノ酸ＶＳＦＳＰＶ（図２中で下線を付してある）の挿入を有するＴｒｋＡのスプライシングされた形態に結合する。
【００１０】
末梢神経および脊髄神経の大部分は、生存のために１つまたはそれ以上のニューロトロフィンの存在を必要とする。最近の研究により、神経栄養因子は、発達するのを助長するのに有意な役割を果たし、成体神経系が軸索切断後に生存することが示されている。再生前に、ニューロンは、まず軸索切断を生き延びる必要がある。ニューロトロフィンは、退行性細胞死から、未熟(Diener and Bregman (1994) Neuroreport, 5: 1913)および成熟(Shibayama et al (1998), J Comp Neurol, 390: 102)軸索が切断された中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンを救出する。末梢神経系（ＰＮＳ）におけるニューロンの軸索切断は、頻繁に再生関連遺伝子のアップレギュレーションを招き、再生を助長する。これらの遺伝子におけるほんの一過性の増加が、軸索切断後に細胞体に近接してＣＮＳで見られるが、損傷がより遠位である場合には見られない。再生関連遺伝子の延長された誘導が、この状況で再生に必要とされ得る。ニューロトロフィンは、再生関連遺伝子（例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＧＡＰ−４３、Ｔａ１チューブリン）の発現を増加させる。培養した成体後根神経節細胞（ＤＲＧ）では、軸索成長のタイプ（分岐または伸長）は、遺伝子発現の種々のパターンに依存する(Smith and Skene (1997) J Neurosci, 17: 646)。例えば、ＢＤＮＦは、ＧＡＰ−４３を増強して、分岐プロセスを支持する。
【００１１】
研究者等によっては、損傷部位でＮＧＦのような成長因子を分泌するように遺伝的に改変された細胞を移植してきたものもいる(Grill et al (1997) Exp Neurol, 148:444)のに対して、他の研究者等には、ＰＬＧＡ  ５０／５０、ＰＬＧＡ  ８５／１５、ＰＣＬおよびＰＣＬ／ＰＬＧＡ  ５０／５０のブレンドから調製されるミクロスフェアのような生分解性ポリマーミクロスフェアからのオボアルブミンと同時封入したＮＧＦの放出プロファイルを観察したものもいる(Cao and Schoichet (1999) Biomaterials, 20: 329)。ＮＧＦは、少なくとも３ヶ月間放出され、かつ生理活性であることがわかった。
【００１２】
他の研究者等は、脊髄における損傷部位に胎児細胞を移植することを試みてきた。脊髄損傷および移植後のｉｎ  ｖｉｖｏでの軸索突出のリモデリングは、神経栄養因子の利用可能性により調節される。成体では、外因性ＮＧＦは、脊髄への軸索切断された後根軸索の成長を増加させる(Oudega and Hagg (1996) Exp Neurol, 140: 218; Oudega et al (1994) Exp Neurol, 129; 194)。成体における脊髄半側切断および胎児索移植後に、ＢＤＮ
Ｆ、ＮＴ３およびＮＴ４の外因性投与は、胎児移植片への脊柱上の成長量を増加させた。繊毛由来神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、これを行うことができなかった。ＢＤＮＦおよびＮＴ３はまた、成体ラットにおいて胸郭部レベルの損傷へ配置されたシュワン細胞移植片への脳幹線維の再成長を支持する(Xu et al (1995) Exp Neurol, 134:261)。ＮＧＦおよびＮＴ３を分泌するように改変し、脊髄へ移植した細胞は、脊髄に関して突出するニューロンの軸索成長に影響を及ぼし(Tuszynski et al (1996) Exp Neurol, 137:157, Grill et al (1997) J Neurosci, 17: 5560)、運動機能の改善に関連する(Grill et al (1997) J Neurosci, 17: 5560)。
【００１３】
ＮＴ３およびＢＤＮＦはまた、挫傷損傷後の脊髄において軸索を再生するオリゴデンドロサイトの増殖および髄鞘形成を誘導する(McTigue et al (1998) J Neurosci, 18: 5354)。
【００１４】
最近の研究により、急性損傷のほかに、ニューロトロフィンは慢性損傷での再成長を助長し得ることが示されている(Ye and Houle (1997) Exp Neurol,143: 70; Houle et al (1997) Restorative Neurol Neurosci, 10: 205; Houle and Ye (1997) Neuroreport, 8:751)。
【００１５】
上述の従来技術は、ニューロンの生存、修復および再生における神経栄養成長因子の重要性を示しているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生分解性ポリマースカフォールド（scaffold）上でニューロン組織を成長させる可能性は、低い優勢成長因子濃度の条件下でどのようにしてニューロン細胞が効率的に成長し得るかという疑問を残したままである。さらに、ニューロン成長の速度および方向の制御については取り組まれていない。
【００１６】
本発明の目的は、ニューロン組織および他の組織ならびに細胞の成長、再生および／または修復を支持することが可能であり、かつ従来技術に関して確認される問題にさほど悩まない製品およびそれらの使用を提供することである。
【００１７】
したがって、本発明の第一の態様は、制御されたニューロンの成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、およびこのスカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する受容体チロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）もしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物を提供する。
【００１８】
本明細書中で使用する場合の「生分解性」という用語は、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０および温度２５〜３７℃で、生理学的または生理学的タイプの培地に暴露すると、破壊、断片化および／または溶解されることが可能であることを意味する。かかる破壊、断片化および／または溶解が起こる期間は、組成物の対象とする用途に依存する。典型的な期間は、約５年以下、大抵、１週間〜１年である。本明細書中で使用する場合の「生体適合性」という用語は、該用語が指す材料およびその生分解生成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合に、許容不可能に毒性でない、免疫原性でない、アレルギー原性でない、あるいは炎症誘発性でないことを意味する。本明細書中で使用する場合の「スカフォールド」という用語は、細胞がその上で、その内部でまたはそれを介して、成長、再生または修復のために支持され得る任意の構造を指す。
【００１９】
好ましくは、本発明の組成物は、ＴｒｋもしくはＴｒｋフラグメントまたは相同体に結合された１つまたはそれ以上のタイプのニューロトロフィンを含む。ニューロトロフィンは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３およびニューロトロフィン−４から選択され得る。
【００２０】
組成物のＴｒｋは、ＴｒｋＡ、ＢもしくはＣ、あるいはそれらのオルターナティブスプライシングされた形態、ｐａｎ−Ｔｒｋ（すなわち、ニューロトロフィンすべてを結合することが可能なＴｒｋ）、Ｔｒｋの機能的相同体または複数のタイプのＴｒｋの組合せであり得る。Ｔｒｋ相同体のフラグメント、Ｔｒｋフラグメントの相同体もまた包含される。好ましい実施形態では、Ｔｒｋのニューロトロフィン結合フラグメントは、ＴｒｋＡの免疫グロブリン（Ｉｇ）様サブドメイン、好ましくはＩｇ様サブドメイン２（ＴｒｋＡＩｇ２またはＴｒｋＡＩｇ２．６、アミノ酸２２〜１５０として図２に示す、６個のアミノ酸１３０〜１３５は、ＴｒｋＡＩｇ２．６スプライス変異体のみに存在）。あるいは、またはさらに、Ｔｒｋのニューロトロフィン結合フラグメントは、ＴｒｋＡのＩｇ様サブドメインの両方（ＴｒｋＡＩｇ１、２）を含んでもよい。ＴｒｋＡのかかるフラグメントはまた、好ましくはプロリンリッチ領域を含む。単独で、あるいはＩｇ様サブドメイン１とともに、ＴｒｋＡのＩｇ様サブドメイン２を使用する場合、好ましくはアミノ酸ＶＳＦＳＰＶの挿入を含む（ＴｒｋＡＩｇ２．６、挿入物は、図２ではアミノ酸１３０〜１３５として示される）。Ｔｒｋのニューロトロフィン結合フラグメントは、図２に示す完全配列（ＴｒｋＡＩｇ２．６−６Ｈｉｓ）を含んでもよく、または図２に示す完全配列（ＴｒｋＡＩｇ２．６−６Ｈｉｓ）から構成されてもよい。
【００２１】
組成物が１つまたはそれ以上のタイプのニューロトロフィンを含む際に、ＴｒｋＡまたはそれらのニューロトロフィン結合フラグメントを使用する場合、ニューロトロフィンは、ＮＧＦおよびＮＴ３から選択されることが好ましい。ＴｒｋＢまたはそれらのニューロトロフィン結合フラグメントを使用する場合、ニューロトロフィンは、好ましくはＢＤＮＦおよびＮＴ４から選択される。ＴｒｋＣまたはそれらのニューロトロフィン結合フラグメントを使用する場合、ＮＴ３が好ましい。
【００２２】
本発明の幾つかの実施形態では、組成物は、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する１つまたはそれ以上の細胞外マトリックス成分を含む。これらの細胞外マトリックス成分は、インテグリンまたは他の細胞表面受容体媒介性のニューロン伸長および成長因子応答を促進するために、配列ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲおよび／またはＩＫＶＡＶを含有するペプチドを含んでもよい。
【００２３】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ビオチンのような主に親水性の生体材料上で培養される細胞は、細胞を細胞表面に接着するのに、細胞外マトリックス分子のさらなる存在を必要とする。
【００２４】
かかる細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸および糖タンパク質（例えば、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）およびラミニン（ＬＮ））が挙げられる。これらの分子間で見出される短ペプチドドメインが、インテグリンとして知られる細胞表面接着受容体との相互作用を担う。これらの受容体の結合は、細胞接着を容易とするだけでなく、遊走、伸展および表現型発現のような細胞内事象を誘発する。全細胞外分子を成長因子修飾した表面と併用することができるが、インタクトの接着分子は通常、様々な特異性度で、広範囲の細胞型と相互作用する。したがって、標的とする細胞型と特異的に相互作用して、所定の応答を生じる材料を創出するために、単離した短ペプチド配列を使用することが好ましい。
【００２５】
インテグリン結合ペプチド配列の例としては、ほとんどの細胞型と相互作用する遍在性アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列、ならびにラミニンから単離され、かつニューロン発達を容易とすることが実証されているイソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン（ＩＫＶＡＶ）、ロイシン−アルギニン−グルタミン酸（ＬＲＥ）およびチロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン（ＹＩＧＳＲ）フラグメントが挙げられる。これらのペプチド配列は、組み合わせて使用してもよく、それらの活性は、配列の到達性（accessibility）を改善するための隣接ペプチド配列を使用すること
により増強され得る。
【００２６】
接着ペプチド修飾表面を設計する際、表面濃度を最適化しなくてはならない。最小密度の接着リガンドが、細胞接着および遊走に必須であり、高密度のペプチドは、接着の強度に起因して、細胞遊走を阻害する(Huttenlocher, Sandborg, Horwitz (1995) Adhesion in cell migration. Curr. Opin. Cell Biol., 7:697-706)。したがって、最大の細胞遊走速度を誘導するには、中間レベルの結合力が必要となる(Schense, Hubbell (2000) (Three-dimensional migration of neurites is mediated by adhesion site density and affinity). J. Biol. Chem., 275: 6813-6818; Palecek, Loftus, Ginsberg, Lauffenburger, Horwitz (1997) (Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness). Nature, 385:537-540)。
【００２７】
スカフォールドの材料は、好ましくは生分解性かつ生体適合性のポリマーである。生分解性かつ生体適合性のポリマーは、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロン酸、ポリε−カプロラクトン、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼンおよびポリリン酸塩）；多糖（例えば、ヒアルロン酸）；タンパク質（例えば、コラーゲン）；ポリアミノ酸；ポリ擬似アミノ酸（poly pseudo amino acids）；およびこれらのポリマーのいずれかのモノマーから調製されるコポリマーから選択され得る。乳酸またはグリコール酸のポリマー、あるいはこれらのモノマーのコポリマーが好ましい。上述のポリマーのいずれかと、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））とのブロックコポリマーが特に好ましい。ＰＥＧとポリ乳酸、ポリグリコール酸またはポリ乳酸−グリコール酸共重合体とのブロックコポリマーが最も好ましい。これらの各種ポリマーの特性および利点は、ＷＯ９９／３６１０７号に見出され得る。
【００２８】
Ｔｒｋまたはそれらのフラグメントは、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して、より好ましくは、ブロックコポリマーがスカフォールドを含む場合ポリアルキレングリコール鎖の末端に、生体適合性の生分解性の材料およびＴｒｋと適合性の任意の手段により位置され得る。かかる手段としては、共有結合、吸着または物理的捕捉が挙げられ得る。しかしながら、Ｔｒｋまたはフラグメントは、１つまたはそれ以上の特異的分子相互作用によって、表面に、またはその表面に隣接して結合されることが好ましい。「特異的分子相互作用」とは、２つまたはそれ以上の結合成分の１つと、例えば細胞培養でまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、該結合成分の１つが遭遇し得る別の分子との間の相互作用の親和性よりも、少なくとも１００倍高い親和性、好ましくは少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも２０００倍高い親和性を有する２つまたはそれ以上の結合成分間の相互作用を意味する。スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接してＴｒｋを結合する１つまたはそれ以上の特異的分子相互作用は、好ましくは、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して結合された１つまたはそれ以上のアンカー分子と、Ｔｒｋもしくはフラグメントに結合された１つまたはそれ以上のタグ分子との間で行われる。
【００２９】
アンカー分子およびタグ分子は、同じであってもよく、あるいは異なってもよい。ある特定の実施形態では、アンカーは、抗体またはそれらのフラグメントであり、タグは、相当する抗原またはハプテンであるか、あるいはその逆である。好ましくは、タグはビオチンであり、アンカーは、アビジンまたはストレプトアビジンであるか、あるいはその逆である。最も好ましくは、タグおよびアンカーの両方に同時に結合することが可能なアダプター分子もまた使用される。かかる場合では、タグおよびアンカーの両方は同じであり得る。好ましい実施形態では、タグおよびアンカーの両方がビオチンであり、アダプターがアビジンまたはストレプトアビジンである（アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンに対してそれらの結合において結合価４を有する）。
【００３０】
組成物が特異的分子相互作用に関連した利点から利益を得るために、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して、Ｔｒｋまたはフラグメントの結合において、１つの特異的分子相互作用のみを使用する必要があることが理解されよう。したがって、任意の他の分子相互作用（例えば、タグが特異的分子相互作用によりアダプターに結合する場合のアンカーとアダプター分子との間）は、特異的である必要はない。
【００３１】
スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接してアンカー分子を共有結合するのに、およびタグ分子をＴｒｋまたはフラグメントに共有結合するのに適した方法論は、当該技術分野で既知であり、ＷＯ９９／３６１０７号およびそこで引用される参照文献を参照とし得る。
【００３２】
本発明の組成物は、好ましくは管状スカフォールドを有し、ニューロンの再生は、好ましくは管状構造の管腔に沿って行われる。Ｔｒｋまたはフラグメントは、Ｔｒｋまたはフラグメントの溶液を、Ｔｒｋまたはフラグメントを結合することが可能であるように予め処理したスカフォールドを通して流動させることにより、管腔壁上に位置され得る。したがって、特異的分子相互作用の場合では、管腔壁がアンカー分子で標識されるように、スカフォールドを予め処理し、溶液中のＴｒｋをタグ分子で標識する。アダプター分子を使用する場合、タグ付けしたＴｒｋの前に、これをスカフォールドに提示する。
【００３３】
スカフォールドの表面上に、またはその表面に隣接して位置するべき任意のさらなる成分は、Ｔｒｋまたはフラグメントと同じ様式で結合され得る。組成物が１つまたはそれ以上のニューロトロフィンを含む場合、これらは、Ｔｒｋまたはフラグメントに結合されているか、あるいは先のＴｒｋまたはフラグメントの位置付けに続く別個の工程として、スカフォールドに導入される。Ｔｒｋ、タグ、アダプター、アンカー、ニューロトロフィンまたは組成物の任意の他の成分が溶液中でスカフォールドに導入される各場合では、一般に結合部位の適正な負荷を保証するために過剰量を導入することが有用である。続いて、過剰量（当然のことながら、それらの幾らかは、スカフォールドまたは他の構成成分に非特異的に結合されるようになっている）を流し出し得る。本発明で使用され得る調製法と類似した表面の調製法は、ＷＯ９９／３６１０７号に記載されている。特に、スカフォールドの表面上での、またはその表面に隣接したＴｒｋのパターン化は、ＷＯ９９／３６１０７号で使用される方法に類似した方法を用いて達成され得る。
【００３４】
組成物はまた、成長、再生もしくは修復中の神経細胞、あるいは神経細胞前駆体または多能性幹細胞を含んでもよい。
【００３５】
本発明の組成物は、ニューロン取込みに利用可能なニューロトロフィンの供給の準備が整っているという利点を有する。ニューロトロフィンは、スカフォールドに非共有結合的に結合され、したがって、ニューロンによる使用のために放出可能である。これは、予め想定されない形で、ニューロン用の神経栄養支持体を提供する。さらに、特に、空間的に配列されたか、もしくはパターン化されたＴｒｋまたはフラグメントの位置が使用される実施形態では、指向性のニューロン伸長が達成され得る。本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、ニューロンへの続く供給のためのニューロトロフィンの隔離物（sequesterer）として（最初にわずかなニューロトロフィンを結合しているか、またはニューロトロフィンを全く結合していない組成物が使用され得る場合）、およびニューロン用のニューロトロフィンの供給源として（組成物が、より高い比率のニューロトロフィンに結合したＴｒｋ分子またはフラグメントを含み得る場合）使用され得る。
【００３６】
循環するニューロトロフィンのレベルは低すぎて、生存を支持することができない。ニ
ューロトロフィンは通常、神経支配された組織から放出され、Ｔｒｋ受容体への結合後に、ニューロンにより内部移行される。続いて、この複合体は、細胞体へ輸送され、そこでその細胞生存効果を発揮すると考えられている。ｉｎ  ｖｉｖｏで神経を再生するためには、ニューロトロフィンの局部的な供給を提供することが必要である。本発明は、Ｔｒｋ分子またはフラグメントを介してスカフォールドに非共有結合されたニューロトロフィンを供給することが可能である。
【００３７】
本発明の第２の関連する態様では、治療における使用のための第１の態様の組成物が提供される。
【００３８】
第３の態様では、神経成長、再生または修復を促進するための薬剤であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する上記Ｔｒｋもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるＴｒｋもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用が提供される。
【００３９】
本発明はまた、第４の態様では、神経成長、再生または修復を促進する方法であって、スカフォールドの表面上で、またはその表面に隣接してＴｒｋ−ニューロトロフィン複合体を形成するように、本発明の第１の態様による組成物をニューロトロフィンの供給源と接触させ、上記組成物を幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織と接触させ、そして上記幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織を、上記スカフォールドの上記表面上で、またはその表面に隣接して成長、再生または修復させることを含む方法を提供する。
【００４０】
第４の態様の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。ニューロトロフィンの供給源は、組成物が上記方法のｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態で配置される神経支配された部位を含んでもよい。しかしながら、より好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ実施形態の両方で、ニューロトロフィンの供給源は、位置するＴｒｋまたはフラグメントを有するスカフォールドの表面を通って、またはその表面上を流されるニューロトロフィンの溶液を含む。上記方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏでの切断された神経の再生に使用される。
【００４１】
本発明はまた、本発明の第４の態様による方法により得られるか、または得られ得る幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織を提供する。
【００４２】
第５および関連の態様では、本発明は、幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞または組織を移植する方法であって、ドナー幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞のサンプルを、適切なドナー培養物または被験体から採取し、スカフォールドの表面上で、またはその表面に隣接してＴｒｋ−ニューロトロフィン複合体を有する本発明の第１の態様による組成物と接触させて、上記ドナー細胞を成長、再生または修復させ、そしてかかるドナー細胞を必要とするレシピエント被験体に、上記ドナー細胞および組成物を配置することを含む方法を提供する。
【００４３】
ドナー被験体およびレシピエント被験体は、同じ個体（すなわち、自己移植片）であってもよく、あるいは異なる個体（すなわち、異種移植片）であってもよい。
【００４４】
記載する本発明の組成物、方法および使用は、これまでのところこの分野の従来技術に関連した不足の幾つかを少なくとも部分的に回避する。かかる不足としては、自家移植片材料を用いた末梢神経修復の場合では、ドナー部位病的疾患、機能の不適切な再発、および異常再生が挙げられる。シュワン細胞と併用した合成生分解性ポリマーの使用は、細胞
培養のさらなるラウンドの必要性により、および治療されるべき部位への細胞の組み込みの必要性により限定される。神経移植片は、それらが患者を変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の危険性の増加に曝し得るため、可能であれば回避されるべきである。ＲＧＤ型ペプチドを提示する生分解性ポリマー表面に関する従来技術は、細胞伸展および再生を導く方法を提供するが、特にｉｎ  ｖｉｖｏ設定で、不可欠な成長因子がどのように提供され得るかについては取り組んでいない。ニューロンを成長、修復および／または再生することに必要とされる成長因子は、取り込みのためニューロン細胞表面で利用可能である必要がある。本発明を用いて、スカフォールド表面上で、またはその表面に隣接して、Ｔｒｋまたはフラグメントのパターンを形成し、それにより成長中のニューロンへの提示のための１つまたはそれ以上の各種ニューロトロフィンを保持することが可能である。
【００４５】
本発明の第６の態様では、Ｔｒｋもしくはフラグメントまたはそれらの相同体の制御放出用の生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるリザーバ、および上記リザーバと密接に結合され、かつ／または上記リザーバの表面に、またはその表面に隣接して位置するＴｒｋもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物が提供される。
【００４６】
リザーバは、上述のスカフォールドの好ましい特徴のいずれかを有し得る。Ｔｒｋは、上述のように、リザーバ表面に結合され得る。組成物は、表面に結合されたＴｒｋまたはフラグメント、およびリザーバの材料内に包埋したＴｒｋまたはフラグメントの両方を含有する。かかる混合系は、Ｔｒｋ放出速度の制御においてより優れた柔軟性を提供し得る。組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適切であり得る。
【００４７】
本発明はまた、治療における使用のための第６の態様による組成物を提供する。
【００４８】
第７および関連の態様では、本発明は、上昇したニューロトロフィンレベルと関連した疾患の治療用の制御放出薬剤であって、生分解性かつ生体適合性材料から形成されるリザーバ、および上記リザーバと密接に結合され、かつ／または上記リザーバの表面に、またはその表面に隣接して位置するＴｒｋもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるＴｒｋもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用を提供する。
【００４９】
本発明はまた、被験体における上昇したニューロトロフィンレベルと関連した疾患の治療方法であって、本発明の第６の態様による組成物を上記被験体へ投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
治療されるべき前記疾患は、アルツハイマー病または疼痛障害であり得る。疼痛は突発性神経性尿意促迫（idiopathic sensory urgency）（ＩＳＣ）、間質性膀胱炎、帯状疱疹、末梢炎症、慢性炎症、腫瘍学的疾患またはヘルペス後神経痛の症状であり得る。
【００５１】
第８の態様では、本発明は、生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子もしくは成長因子結合フラグメントまたはそれらの相同体に対する受容体を含む組成物を提供する。
【００５２】
成長因子は、ニューロトロフィンであり得る。
【００５３】
さらに、第９の態様では、本発明は、生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再
生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子もしくは機能的フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物を提供する。成長因子（これは、ニューロトロフィンであり得る）は、スカフォールドに共有結合的にまたは非共有結合的に結合され得る。本発明はまた、治療における使用のための第９の態様による組成物を提供する。
【００５４】
本発明はここで、ほんの一例として添付の図面を参照して、より詳細に記載する。
【００５５】
実施例１−ＴｒｋＡＩｇ２およびＴｒｋＡＩｇ２．６の構造
ＴｒｋＡおよびそれらの単離ドメインは、ＷＯ９９／５３０５５号（この開示は、参照により援用される）にさらに記載されている。添付の図１は、その構造を模式的に示す（同様に、Robertson et al (2001) BBRC, 282:131）。黒丸は、グリコシル化部位を表す。ＴｒｋＡＩｇ２は、Ｉｇ様サブドメイン２およびプロリンリッチ領域を含むものとしてこの実施例で定義される。図２に示す配列（ＴｒｋＡＩｇ２．６−６Ｈｉｓ）は、６×Ｈｉｓタグを有するＴｒｋＡＩｇ２のヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列を示す。ヒトＴｒｋＡ由来の配列を太字で示し、６個のアミノ酸の挿入された変異体には下線を付してある。この配列は、ヒトＴｒｋＡ配列（アミノ酸２２〜１５０）およびＮ末端６×ＨｉｓタグもコードするｐＥＴ１５ｂベクター由来の隣接配列（アミノ酸１〜２１）を含む。ベクター配列（コドン４５２〜４６８、図２）はまた、停止コドンも提供する。ヒトＴｒｋＡの推定細胞外ドメインは、６個のアミノ酸ＶＳＦＳＰＶの挿入が存在するかどうかに依存して、３７５アミノ酸長または３８１アミノ酸長であると捉えられている。
【００５６】
近年、２つの免疫グロブリン様ドメインおよび単独のプロリンリッチ領域から構成されるタンパク質が、完全な細胞外ドメインの親和性と類似した親和性でＮＧＦを結合することが可能であることが示されている(Holden et al (1997) Nature Biotechnology, 15: 668)。この領域は、本明細書ではＴｒｋＡＩｇ１、２として定義される。さらに、ＴｒｋＡＩｇ２と称されるＴｒｋＡのさらに小さなドメイン（アミノ酸２２〜１５０として図２に示す）は、完全な細胞外ドメインまたはＴｒｋＡＩｇ１、２領域に類似した多親和性でＮＧＦを結合することが可能であり、したがってこれらのより大きな物体（entities）の結合特性を主として担うことが見出されている。アミノ酸１３０〜１３５として図２に示す６個のアミノ酸ＶＳＦＳＰＶの挿入を含有するＴｒｋＡＩｇ２は、本明細書ではＴｒｋＡＩｇ２．６と称する。
【００５７】
実施例２−Ｔｒｋを用いたＮＧＦの固定化によるニューロン成長の増強
この研究は、生体材料表面へＮＧＦを固定化し、したがって末梢神経再生を刺激するための局在的環境を提供するためにＴｒｋフラグメントを使用することの実現可能性を実証する。リガンドの容易な表面パターン化が組織再生を空間的に制御することが可能であることがすでに実証されている（ＷＯ９９／３６１０７号）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ビオチンを基礎材料として使用して、実験を行った。この実施例では、使用したＴｒｋフラグメントは、ＴｒｋＩｇＡ２．６の６−Ｈｉｓタグ付き形態（ＴｒｋＩｇＡ２．６−６Ｈｉｓ）であった。
【００５８】
ＰＣ１２細胞を、１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、抗生物質／抗真菌剤およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、２〜５×１０5個の細胞／ｍｌの密度で成長させ、Ｔ７５フラスコはそれぞれ、培地１０〜２０ｍｌを含有していた。
【００５９】
神経突起伸長を可能にするためには、ＰＣ１２細胞は表面結合を必要とするため、組織培養プラスチックへそれらの非接着は、表面をコラーゲンまたはラミニンのような細胞外
マトリックス物質でプレコーティングしなくてはならないことを意味する。Ｔ−７５フラスコおよび２４ウェルプレートは、蒸留滅菌水中の０．０１％コラーゲンＩＶ型溶液を表面上に２時間置いた状態にしておき（それぞれ１０ｍｌおよび０．５ｍｌ）、続いて一晩風乾させることによりコラーゲンコーティングした。
【００６０】
ＴｒｋＡＩｇ２．６神経突起伸長研究の前に、コラーゲンでコーティングしたフラスコ上で成長させたＰＣ−１２細胞をＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で５日間準備刺激して（primed）、新鮮な培地およびＮＧＦを２４時間毎に添加した。
【００６１】
ＴｒｋＡ２．６−６Ｈｉｓ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０％グリセロール中）をＷＯ９９／５３０５５号および係属中の出願等ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４２１４号の方法を使用して調製し、Ｓｉｇｍａキットを用いて、標準的な手順を用いてビオチン化した。およそ２５０μｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。
【００６２】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ビオチンコーティングされたＩｗａｋｉ  Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  ２４ウェルプレートは、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中に溶解した２ｍｇ／ｍｌポリマー０．２５ｍｌを用いて、ウェルプレート上にドロップキャストして(dropcast)調製し、炉中で６０℃にて１時間乾燥させた。次に、プレートをＰＢＳで洗浄して、冷蔵庫で一晩保管した。ビオチン化したＴｒｋＡＩｇ２．６のバッチそれぞれに関して、３枚の試験プレートを用意した。
【００６３】
アビジンをＰＬＡ−ＰＥＧ−ビオチンコーティングされたプレートへ、蒸留水中の５００μｇ／ｍｌ溶液０．５ｍｌを用いて、３７℃で４５分間結合させた後、再びＰＢＳでプレートを洗浄した。
【００６４】
次に、上述のように調製したビオチン化ＴｒｋＡ１ｍｌを、蒸留水中０〜２５０μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１時間、プレートに添加した。続いて、プレートをＰＢＳで洗浄した。次に、ＰＢＳ中の０〜５０ｎｇ／ｍｌ（＝０〜１μｌ／ｍｌ）のＮＧＦ０．５ｍｌを３７℃で４５分間添加した後、最終的なＰＢＳ洗浄を行った。これに続いて、蒸留水中の０．００２５％コラーゲンＩＶ型０．２５ｍｌで１時間、すべてのウェルをコーティングした後、洗浄した。対照ウェルは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ビオチンまたは０．０１％コラーゲンの存在下でＮＧＦ培地を含有するが、ＴｒｋＡＩｇ２．６は含有しなかった。
【００６５】
細胞（継代１８）をウェル１つ当たり２．０×１０4個の細胞／ｍｌで播種した。２４時間後に、培地を新たな供給（ＮＧＦ０、０．１または１μｌを含有する）と取り替えた。
【００６６】
細胞に、３７℃／５％ＣＯ2に設定したインキュベータ中で４８時間かけて、神経突起を結合および伸長させた後、培地を吸引して、いかなるゆるく接着した細胞も除去して、再び取り替えた。次に、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００顕微鏡およびＤＮ１００デジタルカメラを用いて、０．４５倍Ｃマウントを用いて２０倍の倍率で画像を撮った。突起長および細胞数を、Ｌｅｉｃａ  Ｑｗｉｎ画像解析ソフトウェアを用いて測定した。
【００６７】
図３は、Ｔｒｋおよび続いてＮＧＦ修飾した一連の表面上での培養後のＰＣ１２神経細胞系からの神経突起伸長を示す。データは、表面固定化されたＮＧＦの量が増加するとともに、神経突起伸長が増加すること、および使用した範囲内に最適なＴｒｋ濃度が存在するようであることを示す。
【００６８】
この研究は、成長因子を表面に結合させるために受容体フラグメントを用いてＮＧＦを提示させることにより、修飾ＰＬＡ−ＰＥＧ−ビオチン表面上で培養した細胞から神経突起伸長を誘導することができることを示している。細胞外マトリックス分子もまた、細胞表面結合を増強するために、表面で提示されることが好ましい。
【００６９】
このデータ内では、Ｔｒｋ濃度依存性効果が、それぞれ異なるＮＧＦ濃度で見られ、最適なＴｒｋ濃度が存在するようである。ＴｒｋＡＩｇ２．６に関して、これは、実験条件に応じて２．５〜２５０μｇ／ｍｌであってもよく、およそ２５μｇ／ｍｌであってもよい。より高濃度での神経突起伸長の減少は、毒性効果、または固定化された受容体フラグメントと細胞自体との間のＮＧＦに関する競合の増加に起因し得る。
【００７０】
実施例３−神経再生スカフォールド
図４は、本発明による組成物に適したスカフォールドがどのようにして生成され得るかを模式的に示す。スカフォールドは、リガンドのパターン化されたチャネルを含むように（Ａ）、あるいはリガンドのパターン化された内層を有する管を含むように（Ｂ）成形され得る。図５は、本発明による組成物がどのようにして構築され（assembled）得るかを模式的に示す。簡潔に述べると、図４のポリマースカフォールドまたはマトリックス（ポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体のようなポリエステル、またはこれらのポリエステルとＰＥＧとのブロックコポリマー）を、ビオチン分子を用いてパターン化する（ＷＯ９９／３６１０７号に記載するように）。続いて、アビジンをスカフォールドに導入して、アビジンでパターン化された表面を生じる。次に、ビオチンで標識したＴｒｋＡＩｇ２．６をスカフォールドに通して、ビオチン標識物は、アビジン分子上の非占有結合部位に結合し、したがって、Ｔｒｋでパターン化された表面を生じる。最終的に、ニューロトロフィンを導入し、これらはＴｒｋＡＩｇ２．６に結合し、したがって、ニューロトロフィンでパターン化された生分解性ポリマースカフォールドを生じる。
【００７１】
図５に（およびさらに明確には図６に）示す例では、スカフォールドは、多数の管または導管（そのうちの１つを図示している）を含む構造を有する。神経細胞は、神経細胞が管／導管の管腔に沿って成長するように、調製した表面からニューロトロフィンを得て、管／導管の管腔に沿って成長することが可能である。図５では、ニューロトロフィンは、細胞の表面上で発現されるＴｒｋ分子を用いて、神経細胞により採取されることが分かる。本発明の組成物は、特に急性脊髄損傷、急性末梢損傷および慢性損傷後の神経再生に使用され得る。
【００７２】
実施例４−Ｔｒｋの制御放出配合物
ＴｒｋＡＩｇ２．６の移植可能なポリマー（ポリ乳酸−グリコール酸共重合体）リザーバを、ニューロン修復スカフォールドに関して実施例３で記載するように調製したが、但し、ニューロトロフィンを添加する最終工程は除いた。リザーバを、神経障害性疼痛のｉｎ  ｖｉｖｏモデルに移植した。Ｔｒｋの持続性放出および得られる痛覚脱失を観察した。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＴｒｋＡ構造の略図を示す図である。
【図２】Ｎ末端６Ｈｉｓタグおよび６個のアミノ酸ＶＳＦＳＰＶ（下線を付記）の挿入を含むＴｒｋＡＩｇ２のヌクレオチドおよびヌクレオチド由来のアミノ酸配列を提供する図である。
【図３】神経突起成長に対するＴｒｋ修飾およびＮＧＦ修飾した表面のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を観察する実験の結果を示す図である。
【図４】リガンドのパターン化されたチャネルまたはリガンドで裏打ちした管のいずれかを含む組織再生スカフォールドの生産に関するプロトコルを模式的に示す図である。
【図５】本発明による組成物の簡素化した部分的断面構造表示を示す図である。
【図６】本発明の組成物がどのようにしてニューロン成長および伸長を促進するのに使用され得るかを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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