(57)【要約】核酸の精製のための組成物および方法が開示されている。該組成物は、少なくとも１種のアルカリ剤と少なくとも１種の洗剤とを含む。また、該組成物は、好ましくは、常磁性粒子の懸濁液および酸性溶液も含む。該方法は、常磁性粒子とともに該組成物の使用を伴い、生物学的試料から核酸を抽出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料から核酸を精製する方法であって：
（ａ）  前記生物学的試料を、少なくとも１種のアルカリ剤および少なくとも１種の洗剤で処理する工程と；
（ｂ）  少なくとも１種の常磁性粒子の懸濁液を提供する工程と；
（ｃ）  酸性溶液を提供する工程と；
（ｄ）  前記懸濁液および前記酸性溶液を、前記処理された生物学的試料と組み合わせて、前記生物学的試料中の少なくとも１種の核酸分子を前記少なくとも１種の常磁性粒子と可逆的に結合する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の常磁性粒子が鉄を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種の常磁性粒子が鉄酸化物、鉄硫化物および鉄塩化物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鉄酸化物は、水酸化鉄（III）および酸化二鉄(III)一鉄(II)からなる群から選択されるを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｅ）  前記少なくとも１種の常磁性粒子から前記少なくとも１種の核酸分子を溶離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶離工程が、前記可逆的に結合した核酸を、トリス、ビシン、ＣＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、水、リン酸カリウム、トリシン、および分析用緩衝液からなる群から選択される反応剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｆ）  前記少なくとも１種の核酸分子を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（ｆ）  溶離後に前記少なくとも１種の核酸分子を増幅する工程をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリ剤が、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨおよびＣａ（ＯＨ）2からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗剤がアニオン性洗剤、非イオン性洗剤および両性イオン性洗剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン性洗剤がドデシル硫酸ナトリウムおよびドデシル硫酸リチウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非イオン性洗剤がポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ＮＰ−４０、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記両性イオン性洗剤が３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナートおよび両性イオン性界面活性剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルカリ剤および前記洗剤を添加して、前記生物学的試料を約７〜約１２のｐＨにすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
リン酸、硝酸、塩酸、硫酸、酢酸およびクエン酸からなる群から選択される酸を用いて前記核酸を抽出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
リン酸カリウムを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸がＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的試料が全血、血漿、血清、尿、精液、糞便、指爪、皮膚、痰、鼻咽頭吸引物、および頸管内、膣、眼、咽喉および口腔の綿棒採集標本を含む綿棒採集標本、毛髪、脳脊髄液、組織、細胞培養物、および細胞懸濁物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１種のアルカリ剤と少なくとも１種の洗剤とを含むことを特徴とする、生物学的試料から核酸を精製するための組成物。
【請求項２０】
少なくとも１種の常磁性粒子の懸濁液をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
酸性溶液をさらに含むことを特徴とする請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アルカリ剤および前記洗剤は液体の溶液中にあることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アルカリ剤および前記洗剤は乾燥形態にあることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アルカリ剤がＫＯＨであり、および前記洗剤がポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも１種のアルカリ剤と少なくとも１種の洗剤とを含むことを特徴とする、生物学的試料から核酸を精製するためのキット。
【請求項２６】
少なくとも１種の常磁性粒子の懸濁液をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
酸性溶液をさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記アルカリ剤がＫＯＨであり、および前記洗剤がポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項２９】
前記溶離工程は約７〜約１２のｐＨにおいて実施されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルカリ剤および前記洗剤は、工程（ａ）において前記生物学的試料を約７〜約１２のｐＨにすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記酸性溶液は、工程（ｃ）において前記生物学的試料／アルカリ剤／洗剤を約１〜約７のｐＨにすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルカリ剤が約１０ｍＭから約４００ｍＭまでの量で存在することを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記洗剤が約０．０５体積％から約１０．０体積％までの量で存在することを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記方法が単一の容器内で実施されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の常磁性粒子の懸濁液を提供する工程は、前記単一の容器に前記生物学的試料を添加することを含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、常磁性表面結合または他の核酸抽出方法による、血漿、全血および他の生物学的試料からの核酸（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）の抽出、単離または精製に関する。抽出された核酸は、核酸増幅および／または疾病の診断のための検出のような種々のＤＮＡ／ＲＮＡ用途に用いることができる
【背景技術】
【０００２】
核酸のような細胞成分へのアクセスは、核酸の配列決定、核酸ハイブリダイゼーションによる特定の核酸配列の直接的検出、および核酸配列増幅技術を含む種々の分子生物学的方法にとって不可避である。ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出、単離または精製は、多くの生化学的処置および診断処置における重要な工程である。たとえば、複雑な混合物（多くの場合に核酸が発見される）からの核酸の抽出および分離は、他の研究および処置（たとえばクローニング、配列決定、増幅、ハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ合成、検出など）に着手することができる前に、しばしば必要である。そのような複雑な混合物中の大量の細胞材料または他の汚染材料（たとえば、タンパク質または炭水化物）の存在は、分子生物学において用いられる反応および技術の多くを妨害する恐れがある。たとえば、血漿および全血は、核酸に基づく診断において一般的に用いられる臨床試料である。タンパク質の高い濃度およびＲＮアーゼ／ＤＮアーゼの高い濃度は、大量のタンパク質および／またはＲＮアーゼもしくはＤＮアーゼを有する他の試料と同様に、そのような試料を処理するための主たる障害である。
【０００３】
加えて、ＤＮＡはＲＮＡ調製を汚染する可能性があり、および逆も同様である。したがって、細胞、組織などのような複雑な混合物からの核酸の抽出、単離または精製のための方法は、調製の見地から望ましいのみならず、ＤＮＡまたはＲＮＡの同定に依拠する今日用いられている多くの方法（たとえば臨床診断、法科学、組織および血液の型別、遺伝的変異の検出など）の一部として望ましい。
【０００４】
核酸の抽出、単離または精製のために、多くの方法が知られている。一般的に、それら方法は、複雑な一連の抽出、単離または精製工程に依拠し、それら方法は実施するのに時間がかかり、かつ手間がかかる。さらに、そのような方法は、アルコールおよび他の有機溶媒、カオトロープ(chaotrope)およびプロテイナーゼのような材料の使用を伴い、それらの材料は多くの酵素反応および他の下流の処理(processing)用途を阻害する傾向があるので、それら材料の使用は不都合である。
【０００５】
複雑な出発物質（血液、血液製品、組織または他の生物学的試料のようなもの）からの核酸の抽出、単離または精製のための古典的方法は、おそらくはタンパク質分解酵素の存在下、洗剤またはカオトロープによる生物学的物質の溶解(lysis)、引き続いて有機溶剤（たとえばフェノールおよび／またはクロロホルム）を用いる数回の抽出、エタノール析出、遠心分離、および核酸の透析を行うことを伴う。ＤＮＡからのＲＮＡの精製は、たとえば、ＬｉＣｌを用いる選択的析出、またはフェノール抽出およびエタノール析出と組み合わせられる酸性グアニジニウムチオシアネートを用いる選択的単離のような追加の工程（それらに限定することを意図しない）を伴う可能性がある。そのような方法は、面倒かつ実施するのに時間がかかるだけでなく、必要とされる比較的多数の工程が、分解、試料の喪失、いくつかの試料を同時に処理する場合の試料の相互汚染のリスクを増大させる。ＲＮＡの単離の場合、ＤＮＡ汚染のリスクは比較的に高い。二本鎖のプラスミドＤＮＡ、一本鎖のファージＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、アガロースゲルＤＮＡフラグメントおよびＲＮＡの精製は、分子生物学において決定的な重要性を有する。理想的には、核酸を精製するための方法は、単純、迅速であるべきであり、かつ存在するとしても追加の試料操作をほとんど必要としないべきである。そのような方法によって得られる核酸は、直ちに、形質転換、制限分析、連結または配列決定に適用できるべきである。したがって、高純度のＤＮＡまたはＲＮＡを提供することができる方法は、高度に望ましい。
【０００６】
粗アルコール析出物からのプラスミドＤＮＡの調製のための別の精製方法は手間がかかり、最も多くの場合には、ＣｓＣｌ勾配、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、および反復されるアルコール析出工程を用いる。また、これらの方法は、ＣｓＣｌおよび他の塩、臭化エチジウムおよびアルコールを除去するために、相当の下流の試料調製を必要とする。これらの方法に関するさらなる問題点は、小さく、負に荷電した細胞成分がＤＮＡとともに共精製される可能性があることである。したがって、ＤＮＡが望ましくないレベルの汚染を有する可能性がある。
【０００７】
また、固相を用いて、核酸を精製することができる。慣用の固相抽出は、シリカ型表面を用い、該表面は（１）容易な回収を可能にするのに十分な量の核酸分子を吸着および保持することができない、あるいは（２）核酸分子に過度に付着し、それによってそれら分子の回収を妨げるかのいずれかであった。これらの問題を起こす慣用の表面は、ガラスおよびセライトのような表面を含む。この型の表面に対する核酸の適切な結合は、高濃度のカオトロープまたはアルコール類を用いることによってのみ達成することができるが、それらは一般的には毒性、焼灼性および／または高価である。たとえば、カオトロープの存在下で、ＤＮＡが破砕したガラス粉末およびガラス繊維フィルターに結合することが知られている。典型的には、カオトロピズムのイオンはアルコールで洗浄除去され、そしてＤＮＡは低塩溶液または水で溶離される。破砕ガラス粉末の使用における深刻な欠点は、その結合容量が低いことである。加えて、ガラス粉末は、多くの場合に、一貫性のない回収、ホウ酸緩衝液との不適合性および長いＤＮＡをニックする傾向という欠点を有する。同様に、ガラス繊維フィルターは、低いＤＮＡ結合容量を有する無孔性の表面を提供する。特許文献１〜４に開示されるようなシリカゲルならびに水和およびヒドロキシル化シリカ表面のような他のシリカ型表面は、表面結合のためにカオトロピック剤を必要としない（特許文献１〜４参照）。
【０００８】
ＤＮＡを精製するためには多くのプロトコルが存在する。たとえば、特許文献５は、タンパク質およびＤＮＡの溶液をヒドロキシル化された表面上を通過させ、タンパク質が結合され、ＤＮＡが溶離する、ＤＮＡを精製するための方法を開示している（特許文献５参照）。特許文献６は、アニオン交換体に対するＤＮＡの選択的結合および引き続く溶離によるＤＮＡの精製を開示している（特許文献６参照）。特許文献７は、水溶性ケトンを用いる析出によるＤＮＡの単離を開示している（特許文献７参照）。カオトロープおよび透析されたＤＮＡを用いるＤＮＡ精製手順が開示されている（特許文献８参照）
【０００９】
同様に、特許文献９および１０によって証明されているように、核酸の精製にケイ藻が用いられてきている（特許文献９および１０参照）。特許文献９は、核酸が、グアニジニウム塩のようなカオトロピック剤の存在下でシリカ粒子の形態にある固相に結合し、それによって試料の残部から分離される方法を開示している（特許文献９参照）。
【００１０】
そのような方法が核酸分離プロセスを加速するが、しかしながらアルコール、カオトロープおよび他の同様の剤に付随する不都合が存在する。カオトロープは一般に高いモル濃度において使用され、特にＲＮＡを取り扱う際に、取り扱うのが困難である可能性がある粘稠な溶液をもたらす。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅手順および他の酵素に基づく反応は、アルコールおよび他の剤の阻害または別の方法での妨害効果に対して非常に敏感である。さらに、アルコール析出に続いて必要とされる核酸ペレットの乾燥、および核酸を溶解させるのに付随する不都合もまた、ＰＣＲのような酵素に基づく手順において人工産物をもたらすことが知られている。核酸の精製のために用いられるさらなる技術は、特異的に適合させられる常磁性粒子に結合することである。そのような技術の例は特許文献１１および１２中に見いだされ、それら文献は、５％未満の粒径標準偏差を有する単分散の超常磁性粒子を記載している（特許文献１１および１２参照）。それぞれの粒子はオリゴヌクレオチドの複数の分子を運搬し、それぞれのオリゴヌクレオチドは、目的の標的核酸分子のプローブとして機能する部分を有する。
【００１１】
特許文献１３および１４は、特定の分子を分離する系での使用のための磁気応答性粒子を記載している。それら粒子は、安定なシリコーン被覆に取り囲まれた金属酸化物のコアを有し、該シリコーン被覆に対して有機および／または生物学的分子が結合してもよい。
【００１２】
特許文献１５は、混合された細胞集団から選択される細胞集団を区分および分離する方法を記載している。該方法は、細胞集団を選択するために抗体で被覆された小さい磁性粒子を用いる。
【００１３】
特許文献１６は、流体試料を分析するための自動装置および方法を記載している。該装置は、そこに結合した反応剤を有する微粒子材料を利用する。該微粒子材料は磁性を有し、および該反応剤は、反応混合物中の反応に参加する物質である。
【００１４】
特許文献１７は、細胞の磁気分離のための方法を記載している。該方法は、それに対して抗体が結合するブドウ球菌タンパク質Ａで被覆された磁気応答性微小球を利用する。
【００１５】
特許文献１８は、磁性ポリマー粒子を調製するための方法を記載している。該粒子は、鉄塩の溶液で処理される密集ポリマー粒子または多孔性ポリマー粒子である。
【００１６】
特許文献１９は、磁化可能な充填材のコアと、架橋した有機ポリシロキサンのシェルとを有する磁化可能な「コア−シェル型」微小球を記載している。
【００１７】
特許文献２０は、磁気応答性金属酸化物を含有するポリマーの層で均一に被覆されるポリマーのコアを有する磁気応答性蛍光性ポリマー粒子を記載している。
【００１８】
特許文献２１は、微粒子固体支持体およびアニオン性洗剤を用いて試料から核酸を単離するための方法を記載している。
【００１９】
特許文献２２は、官能基で覆われた表面を有する磁性粒子を用いるＤＮＡ精製および単離のための方法を記載している。
【００２０】
特許文献２３は、試験試料から核酸を分離するための方法を開示し、該方法は、金属酸化物支持体材料および結合性緩衝液に試料を接触させて、核酸／金属酸化物支持体材料複合体を形成する工程と、試験試料から該複合体を分離する工程と、金属酸化物支持体材料から核酸を溶離する工程とを含む。特許文献２３は、緩衝液が一般的にカオトロピック剤および洗剤を含むことを開示している。
【００２１】
特許文献２４は、核酸分子と可逆的に結合する組成物を開示している（該文献の全開示は、参照により本明細書の一部をなすものとする）。該組成物は、酸性環境中の常磁性粒子を含む。
【００２２】
核酸の酸化鉄による抽出は非特異的である。すなわち、酸化鉄は、その形態（ＲＮＡまたはＤＮＡ）あるいは配列に無関係に核酸と結合する。酸化鉄を用いる核酸の抽出は、血漿のような高タンパク質媒質において有効ではない。これは、（１）酸化鉄結合部位に関する核酸とタンパク質との間の競争、（２）高タンパク質溶液のより高い粘度に起因する減少した速度、（３）核酸上の内因性の試料ヌクレアーゼの効果、または（４）（１）〜（３）の任意の組み合わせに起因する。
【００２３】
核酸の抽出、単離または精製の改善された方法、特に、実施が迅速および単純であり、かつカオトロピック剤の使用およびアルコール析出を回避する方法に対する要求が存在する。また、同一の試料から両方の型の核酸の単離を可能にする方法に対する要求が存在する。
【００２４】
【特許文献１】欧州特許第０５１２７６７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７４，９９７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６９３，７８５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３５５，７９２号明細書
【特許文献５】米国特許第４，９２３，９７８号明細書
【特許文献６】米国特許第４，９３５，３４２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，９４６，９５２号明細書
【特許文献８】米国特許第４，９００，６７７号明細書
【特許文献９】米国特許第５，２３４，８０９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，０７５，４３０号明細書
【特許文献１１】欧州特許第０４４６２６０号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５１２，４３９号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，６７２，０４０号明細書
【特許文献１４】米国特許第４，６９５，３９３号明細書
【特許文献１５】米国特許第３，９７０，５１８号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，１４１，６８７号明細書
【特許文献１７】米国特許第４，２３０，６８５号明細書
【特許文献１８】米国特許第４，７７４，２６５号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，２３２，７８２号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，３９５，６８８号明細書
【特許文献２１】国際公開第９６／１８７３１号パンフレット
【特許文献２２】米国特許第５，７０５，６２８号明細書
【特許文献２３】国際公開第０１／４６４０４号パンフレット
【特許文献２４】米国特許第５，９７３，１３８号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
核酸の抽出、単離または精製のためのより効果的かつ効率的な技術を提供するために、本発明は、核酸分子の抽出および可逆的結合に有用な組成物を提供する。該組成物は、少なくとも１つのアルカリ剤と少なくとも１つの洗剤とを組み合わせて含む。また、好ましい実施形態において、組成物は、常磁性粒子の懸濁液をも含む。より好ましい実施形態において、該組成物は、酸性溶液をさらに含む。
【００２６】
また、本発明は、核酸分子に可逆的に結合する組成物を使用する方法に加えて、キットとして包装される組成物を含む。キットは、対象となる組成物の１つまたは複数の容器を有する包装単位を含む。いくつかの実施形態において、キットは、対象となる組成物とともに用いられて核酸を精製および検出する種々の反応剤の容器を含む。また、キットは１つまたは複数の以下の品目を収容してもよい：綿棒のような収集装置、生物学的試料の処理および分析のためのｐＨ指示薬および対照標準。キットは、本発明にしたがう方法を実施するのに適当な比率で混合される反応剤の容器を含んでもよい。反応剤容器は、好ましくは、対象となる方法を実施する際に計量工程を不要にする単位容量の反応剤を収容する。
【００２７】
本発明の方法は、生物学的試料から核酸を抽出および精製する工程を伴い、該工程は、少なくとも１つのアルカリ剤および少なくとも１つの洗剤と試料を接触させる工程と；少なくとも１つの常磁性粒子の懸濁液を提供する工程と；酸性溶液を提供する工程と；該懸濁液および該酸性溶液を処理された生物学的試料と組み合わせて、該生物学的試料中の少なくとも１つの核酸が該少なくとも１つの常磁性粒子と可逆的に結合するようにする工程とを含む。次いで、適切な緩衝液（たとえば、トリス(Tris)、ビシン(Bicine)、CAPS、HEPES、水、リン酸カリウム、トリシン(Tricine)、およびDMSOおよび／またはグリセロールを含有しても含有しなくてもよい分析用緩衝液）を用いて、所望されるＤＮＡまたはＲＮＡを少なくとも１つの常磁性粒子から溶離してもよい。本発明の方法は、カオトロープおよびアルコールのような焼灼剤の使用を必要としないという、従来の方法に優る利点を有する。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本明細書で用いられる際に、術語「常磁性粒子」は、磁場中に配置される際に、それらに与えられる磁気モーメントを有することができる粒子を意味する。そのような磁場中にある際に、常磁性粒子は、そのような場の作用の下で移動可能である。そのような移動は、異なる態様の試料処理において、結合した核酸分子を移動させるのに有用である。したがって、常磁性粒子に結合した核酸分子を、磁力の適用により最小限の直接的接触によって、別個の反応剤および／または条件で、所望されるように処理することができる。
【００３０】
本明細書で用いられる際に、術語「精製する」および「精製」は、抽出する／抽出および単離する／単離を含む。
【００３１】
本発明者らは、常磁性粒子との組み合わせの前に、生物学的試料を少なくとも１つのアルカリ剤および少なくとも１つの洗剤によって処理することが、試料を常磁性粒子と接触させる前にタンパク質の変性が起こることを可能にすることを見いだした。
【００３２】
本発明において有用な生物学的試料は、核酸を含有する任意の物質であってもよく、たとえば臨床試料、法医学(forensic)試料、および環境学的試料を含むが、それらに制限されるものではない。一般的に、試料は、原核細胞および真核細胞、ウィルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、およびオルガネラを含むウィルス性物質または細胞物質を含有してもよい生物学的試料である。したがって、そのような生物学的試料は、哺乳類動物および非哺乳類動物の細胞、植物細胞、藍藻類を含む藻類、菌類、細菌類、原生動物の全ての種類を含んでもよい。代表的な例は、全血ならびに血漿および血清を含む血液製剤、尿、精液、糞便、指爪、皮膚、痰、鼻咽頭吸引物、および頸管内、膣、眼、咽喉および口腔の綿棒採集標本を含む綿棒採集標本、毛髪、脳脊髄液または他の体液を含み、組織、細胞培養物、細胞懸濁物を含む。
【００３３】
本発明の組成物および方法は、より迅速かつより経済的な処理、および酵素的処理ではなく化学的処理の使用を含む、これまでに知られている組成物および方法を越える利点を提供する。また、本発明の組成物および方法は、より大きな試料体積の使用を可能にする。以前の方法は、酵素による消化の前に、血漿のような試料の５０％程度までの希釈を必要とした。対照的に、本発明は、常磁性粒子を用いる１００％血漿からの核酸の抽出を可能にする。また、本発明は、反応剤の乾燥を可能にし、該反応剤は管内で容易に保存することができ、かつ長期間にわたって安定なままであることができる。
【００３４】
本発明の生成物は、核酸抽出中に、タンパク質を変性させ、かつウィルスおよび細菌のような感染因子を溶解させる。アルカリ剤および洗剤の組み合わせが、そうでなければ核酸の抽出を妨害するであろうＲＮアーゼ／ＤＮアーゼを不活性化すると信じられる。したがって、本発明は、少なくとも１つのアルカリ剤および少なくとも１つの洗剤を含む組成物を指向する。本発明において有用である洗剤は、アニオン性洗剤、非イオン性洗剤、および両性イオン性洗剤を含む。適当なアニオン性洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウムおよびドデシル硫酸リチウムを含むが、それらに限定されるものではない。適当な非イオン性洗剤は、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（すなわちTween（登録商標）20）、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート（すなわちTween（登録商標）80）、NP-40、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル（すなわち、Triton X-20およびTriton X-100のようなTriton X洗剤）、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）を含むが、それらに限定されるものではない。適当な両性イオン性洗剤は、３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）および他の両性イオン性界面活性剤を含むが、それらに限定されるものではない。本発明に有用なアルカリ剤は、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、およびＣａ（ＯＨ）2のような塩基およびアルカリ性緩衝液、リン酸緩衝液、食塩緩衝液（saline buffers）、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液などを含むが、それらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明にしたがう組成物は、約１０ｍＭから約４００ｍＭの量のアルカリ剤と、約０．０５体積％から約１０体積％の量の洗剤とを含む。好ましくは、組成物は、約１００ｍＭから約２００ｍＭのアルカリ剤と、約０．１体積％から約３．０体積％の洗剤とを含む。
【００３６】
１つの実施形態によれば、組成物は、液体の溶液形態にあり、容器内に配置される。別の実施形態によれば、組成物の１つまたは複数の成分を、単独または組み合わせて、当該技術で知られている真空乾燥または凍結乾燥のような方法で乾燥してもよい。たとえば、溶液を凍結させ、そして次いで凍結後に、真空を適用しながらゆっくりと温めることにより、凍結乾燥された粉末が容器（たとえば、抽出管または血液収集管）内に残る。また、たとえばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはトレハロースであるがそれらに限定されるものではない賦形剤のような添加剤を、乾燥前の溶液に対して安定化剤として添加して、得られる安定化剤を容器中で乾燥してもよい。別の態様において、組成物または組成物のサブセットを形成して液体または懸濁液とし、容器の内部の１つまたは複数の表面上に散布または吹き付けてもよい。
【００３７】
好ましくは、組成物は常磁性粒子の懸濁液を含む。鉄粒子は、本発明における常磁性粒子として有用であり、および鉄は水酸化鉄（III）、酸化二鉄(III)一鉄(II)のような形態を有する鉄酸化物であってもよい。硫化鉄および塩化鉄のような他の鉄粒子もまた、本明細書中に記載の条件を用いて核酸を結合および抽出するのに適当である可能性がある。
【００３８】
常磁性粒子の形状は、本発明にとって決定的に重要ではない。常磁性粒子は、たとえば球、立方体、卵形、カプセル形状、タブレット形状、分類できない不定形などを含むがそれらに限定されるものではない種々の形状を有してもよく、および均一な形状を有しても不均一な形状を有してもよい。常磁性粒子の形状がどのようなものであろうと、その最も広い点における該粒子の直径は、一般的に約０．０５〜約２０．０ミクロンの範囲内である。
【００３９】
それら粒子の濃度は、生物学的試料に依存して変化する可能性がある。大抵の生物学的試料に対して、常磁性粒子の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬである。しかしながら、希釈された試料または濃縮された試料は、より少ないまたはより多い常磁性粒子を必要とする可能性がある。
【００４０】
本発明の組成物は、酸および酸性緩衝溶液のような酸性溶液をさらに含んでもよい。次いで、常磁性粒子を組み合わせた酸性溶液を用いて、試料を凝固させることなしにタンパク質の試料から核酸を抽出することができる。任意の酸を使用してもよい。例示的な酸は、リン酸、硝酸、硫酸、酢酸、およびクエン酸を含むが、それらに限定されるものではない。
【００４１】
常磁性粒子が有効かつ可逆的に核酸分子と結合する酸性環境は、種々の手段を用いて提供することが可能である。たとえば、酸性溶液に対して常磁性粒子を添加することができ、あるいは、粒子に対して酸性溶液を添加してもよい。あるいはまた、常磁性粒子が配置される環境を、酸性化剤の添加により酸性化することもできる。それら酸は、アルカリ剤／洗剤組成物のｐＨを酸性ｐＨ（すなわち約１〜約７の間）にするのに十分である。
【００４２】
前述のように、酸性環境において、陽性の常磁性粒子は陰性の核酸分子と結合する。したがって、核酸ハイブリダイゼーションおよび増幅の阻害剤のような該環境中の他の材料は、結合された核酸分子から分離される。そのような分離は、遠心分離、濾過または磁力の印加のような当業者に知られている手段によって達成することができる。
【００４３】
次いで、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応のようなさらなる操作のために、結合された核酸分子を適切な緩衝液中へと溶離することができる。そのような溶離は、結合された核酸を有する粒子を含有する環境を加熱すること、および／またはそのような環境のｐＨを上昇させることによって達成することができる。常磁性粒子からの核酸の溶離を援助するのに用いることができる剤は、水、緩衝液、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨおよびＣａ（ＯＨ）2のようなアルカリ剤、リン酸緩衝液、食塩緩衝液（saline buffers）、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液または陰性の核酸を粒子から除去するのに十分な程度まで環境のｐＨを上昇させる任意の化合物を含む。
【００４４】
常磁性粒子上の核酸の可逆的結合および溶離は、主として、媒体のｐＨを変化させることによって達成され、ここで、結合および溶離手順は、アルカリ剤／洗剤の前処理に続いて実施される。核酸は、酸性ｐＨにおいてこれら粒子の表面上に結合し、そして中性またはアルカリ性ｐＨにおいて溶離する。しかしながら、同様に結合および溶離に影響を及ぼす他の要因が存在する。たとえば、低下した温度は、固体表面上への核酸の結合を増大させ、および上昇した温度は、溶離プロセスを向上させる。同様に、前処理に用いられる洗剤の濃度も核酸結合において役割を果たす。洗剤およびアルカリ剤処理の組み合わせは、おそらく（１）ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼのようなタンパク質を変性させ、および（２）ビリオンおよび／または細菌細胞のような細胞および／または微生物を溶解する。洗剤およびアルカリ剤の濃度は、細胞およびビリオンの壁または膜を破壊し、タンパク質材料を変性させ、および標的とする核酸を可溶化させるのに十分に高くあるべきである。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態を例示する。当業者にとって自明であるように、種々の変更および修正が可能であり、およびそれらは本明細書に記載される発明の範囲内であると考えられる。
【実施例１】
【００４６】
以下の実施例は、本発明にしたがう化学的処理の使用を例示し、および血漿からのＨＩＶのＲＮＡの抽出中の酵素的消化に対して前記処理を比較する。ＲＮＡ抽出の効率は、ＨＩＶ  ＳＤＡ分析を用いて評価した。
【００４７】
（処理）
１．  ５０ｍＬチューブ中に、２２ｍＬのヒト血漿および１３．２ｍＬの３０ｍＭ  ＫＰＯ4（ｐＨ７．６）を分注する。
２．  該チューブ中に、８０μｇ／ｍＬの酵母キャリアＲＮＡを添加する。
３．  ヒト血漿に、１０００粒子／ｍＬの濃度でＨＩＶ粒子を加える。
４．  よく混合し、１６ｍＬの血漿混合物を２つのチューブ（チューブＡおよびチューブＢ）に分注する。
５ａ．  チューブＡ中に１．１ｍＬのプロテイナーゼＫ（６００単位／ｍＬ）を添加し、６回にわたってチューブを逆さにすることによって、よく混合する。
５ｂ．  チューブＡを７０℃の水浴中で３０分間にわたってインキュベートする。
５ｃ．  ８５０μＬの血漿混合物を、４０ｍｇの鉄酸化物を収容している２ｍＬの抽出チューブ中に移動する。
５ｄ．  ５分間の期間中、チューブを逆さにすることによって混合する。
６ａ．  チューブＢから８００μＬの血漿混合物を１６本の抽出チューブ（４０ｍｇの鉄酸化物、１００μモルのＫＯＨおよび１０μＬのトリトン(Triton）（これらの化学物質はチューブ中で乾燥されていた）を収容している）に分注する。
６ｂ．  ６回にわたってチューブを逆さにすることによって、よく混合する。
６ｃ．  ８本のチューブを７０℃の水浴中で３０分間にわたってインキュベートする。
６ｄ．  他の８本のチューブを室温で３０分間にわたってインキュベートする。
６ｅ．  ５分間の期間中、チューブを逆さにすることによって混合する。
７．  抽出の前に全てのチューブを、さらなる３０分間にわたり室温にて冷却する。
【００４８】
（結合および溶離）
１．  チューブ中に２７０μＬの結合用酸（６ＭのグリシンＨＣｌまたは６ＭのＨ3ＰＯ4のいずれか）を分注し、２５回混合する。
２．  鉄酸化物粒子をチューブ側面に磁気的に固定する。
３．  結合していない試料を吸引する。
４．  １０２０μＬの１ｍＭのグリシン−ＨＣｌまたは１ｍＭのＨ3ＰＯ4で、鉄酸化物粒子を洗浄する。
５．  鉄酸化物粒子をチューブ側面に磁気的に固定し、結合していない溶液を吸引する。
６．  １０２０μＬの１ｍＭのグリシン−ＨＣｌまたは１ｍＭのＨ3ＰＯ4で、鉄酸化物粒子を洗浄する。
７．  鉄酸化物粒子をチューブ側面に磁気的に固定し、結合していない溶液を吸引する。
８．  チューブ中に１２０μＬの溶離緩衝液（８５ｍＭ  ＫＯＨ／７５ｍＭビシン）を分注し、１５回混合する。
９．  鉄酸化物粒子をチューブ側面に磁気的に固定し、結合していない溶液を吸引する。
１０．  チューブ中に６０μＬの中和緩衝液（４６０ｍＭビシン）を分注し、試料を１５回混合する。
１１．  鉄酸化物粒子をチューブ側面に磁気的に固定し、結合していない溶液を吸引する。
１２．  溶離された試料は、ＳＤＡ分析の準備ができている（分析あたり５０μＬの試料）。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
結果は、本発明にしたがってアルカリ剤および洗剤を用いて処理して血漿中のＨＩＶ粒子からＲＮＡを抽出できることを示す。抽出されたＲＮＡを、ＳＤＡのような核酸増幅分析に用いることができる。結晶の化学的処理および結合剤としてのリン酸の使用の組み合わせは、酵素消化法と同等以上の結果を示した。
【００５１】
本発明の方法は、酵素の使用に依存しないという点において有利である。したがって、それほど高価ではなく、かつ一般的により頑強なプロセスであると期待される。また、室温において有用であることおよびインキュベーションのために長い時間を必要としないことの利点も有する。該プロセスは、多数の生物学的試料からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出に適用可能であると期待される。
【００５２】
この実験が希釈された血漿（６２．５％）を使用したことに注意されたい。プロテアーゼ法を用いて処理される１００％血漿を使用する試みは、酵素処理中に試料の凝固を起こし、それによって核酸抽出を極度に困難かつ非効率にした。しかしながら、本発明の化学的な「無プロテアーゼ」法の使用は、核酸抽出プロセス全体にわたる試料の可溶性を改善し、それによって試料のより大きなパーセンテージからの抽出を可能にし、それゆえにより高い検出感度を可能にする。
【００５３】
本明細書にて議論されているように、試料の体積を変化させることが可能である。たとえば、処理の前または後で３０ｍＭのリン酸カリウムのような緩衝液で試料を希釈することができる。同様にインキュベーション時間および温度も変化させることができる。アルカリ剤および洗剤の濃度および種類を変化させることができる。そのプロトコルを手動式または自動化された核酸抽出方法とともに用いることができる。酸の種類および濃度を変化させることができる。抽出された核酸は、種々の下流の用途のために用いることができる。
【実施例２】
【００５４】
以下の実施例は、本発明にしたがう化学的処理、具体的にはＫＯＨおよびＳＤＳによるクラミジアＬＧＶの溶解の使用を例示する。
【００５５】
チューブ中の尿試料に対して、洗剤（１％ＳＤＳ）および塩基（１００ｍＭのＫＯＨ−尿中の最終濃度）を添加した。該試料中にクラミジアを２６６７ＥＢ／ｍｌで加え、以下の第２表に示す温度および時間において水浴または熱ブロック（１１４℃）中でインキュベートした。４０ｍｇの鉄酸化物を収容している抽出チューブに対して、９５０μｌの尿を移した。次いで、そのチューブをBD VIPER（商標）自動試料処理装置（本願特許出願人から入手可能である）で処理し、そして、４７８ＥＢ／反応の送出量を用いてProbe Tec（商標）フォーマットで増幅した。
【００５６】
【表２】
2006517225.tif 000003
【００５７】
結果は、本発明にしたがうアルカリ剤および洗剤を用いて処理された尿からクラミジアを抽出できることを例示する。本発明にしたがう条件で処理された試料は、ＣＴ溶解のための現行の時間および温度である、３０分間にわたって１１４℃で溶解された試料に比べて、同等またはより良好なＭＯＴＡ値を示す。
【実施例３】
【００５８】
以下の実施例は、本発明にしたがう化学的処理、具体的にはＫＯＨおよびＳＤＳによるクラミジアＬＧＶの溶解の使用を例示する。
【００５９】
チューブ中の尿試料に対して、洗剤（１％ＳＤＳ）および塩基（１００ｍＭのＫＯＨ−尿中の最終濃度）を添加した。該試料中にクラミジアを２０００ＥＢ／ｍｌで加え、以下の第３表に示す温度および時間において水浴または熱ブロック（１１４℃）中でインキュベートした。４０ｍｇの鉄酸化物を収容している抽出チューブに対して、９５０μｌの尿を移した。次いで、そのチューブをBD VIPER（商標）自動試料処理装置（本願特許出願人から入手可能である）で処理し、そして、３５８ＥＢ／反応の送出量を用いてProbe Tec（商標）フォーマットで増幅した。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
結果は、本発明にしたがうアルカリ剤および洗剤を用いて処理された尿からクラミジアを抽出できることを例示する。
【実施例４】
【００６２】
以下の実施例は、本発明にしたがう化学的処理、具体的には洗剤および酸もしくは塩基によるクラミジアＬＧＶの溶解の使用を例示する。
【００６３】
以下の第４表に示される濃度の４０本のチューブ中の尿試料に対して、洗剤と、酸もしくは塩基のいずれかとを添加した。該試料中にクラミジアを２０００ＥＢ／ｍｌで加え、以下の第４表に示す温度および時間においてインキュベートした。８本のチューブ中の対照標準の尿試料には、クラミジアを２０００ＥＢ／ｍｌで加え、以下の第４表に示す温度および時間においてインキュベートした。次いで、化学的に溶解した試料および対照標準試料を、BD VIPER（商標）自動試料処理装置（本願特許出願人から入手可能である）で処理し、そしてProbe Tec（商標）CT系中で増幅した。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
【表５】
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【００６６】
結果は、本発明にしたがって処理された尿からのクラミジアの抽出が、クラミジアを溶解するための対照として有効であることを例示する。
【００６７】
本発明をいくつかの特定例に関して記載したが、本発明の範囲を逸脱することなしに、当業者にとって明白な修正を行うことができる。本発明の種々の特徴を添付の特許請求の範囲に記載する。
【国際調査報告】
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