(57)【要約】鏡像異性体の豊富なアミノペンタンニトリルを製造する方法を提供する。該方法は、リパーゼ、エステラーゼおよびアシラーゼを含む群より選択される酵素の存在下における、３−アミノペンタンニトリルの鏡像異性体混合物の選択的アシル化または３−アミノペンタンニトリルアミドの鏡像異性体混合物の選択的加水分解を含む。該方法は、医薬品を製造するのに用いることができるＲ−アミノペンタンニトリルを生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鏡像異性体の豊富な３−アミノペンタンニトリルを製造する方法であって、
Ｒ−３−アミノペンタンニトリル（Ｒ−ＡＰＮ）およびＳ−３−アミノペンタンニトリル（Ｓ−ＡＰＮ）を含有する鏡像異性体混合物を与え；そして
該鏡像異性体混合物とアシルドナーとを、酵素の存在下において反応させて、Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮの一方を選択的にアシル化する工程を含む方法。
【請求項２】
鏡像異性体混合物が、実質的に等しい量のＲ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮを含有するラセミ混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素が、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−１、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−５、２５０型ブタ膵臓およびＰＳ−３０を含む群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記反応工程が、Ｓ−ＡＰＮおよびアシル化Ｒ−ＡＰＮの混合物を生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ−ＡＰＮおよびアシル化Ｒ−ＡＰＮを分離する工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分離されたアシル化Ｒ−ＡＰＮを加水分解して、Ｒ−ＡＰＮを生じる工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解工程を、ヒドロラーゼの存在下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒドロラーゼが、リパーゼおよびエステラーゼを包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、リパーゼＡＬ、リパーゼＰＬ、リパーゼVII型、リパーゼＰＮ、リパーゼＴＬ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−８およびＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｅ−１を含む群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応工程が、Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮの混合物を生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮを分離する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離工程が、Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮの混合物と、ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩を生じることを包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
分離されたアシル化Ｓ−ＡＰＮを加水分解して、Ｓ−ＡＰＮを生じる工程を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記加水分解工程を、ヒドロラーゼの存在下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロラーゼが、リパーゼおよびエステラーゼを含む群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アシルドナーが、トリフルオロエチルブチレート；１，４−シクロヘキサンジカルボン酸ジトリフルオロエチル；安息香酸ビニルエステル；酪酸ビニルエステル；カプロン酸ビニルエステル；ラウリン酸ジビニルエステル；ブチルビニルカーボネート；２，６−フランジメタノールジビニルカーボネート；１，６−ヘキサンジオールジビニルカーボネート；酢酸エチル；酢酸ブチル；フェニル酢酸、フェニル酢酸メチル、フェノキシ酢酸メチル；およびフェニルアセトアミドを含む群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
酵素が、リパーゼおよびエステラーゼを含む群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
酵素が、リパーゼＡＬ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−１０、リパーゼＰＬ、リパーゼＱＬ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−１、リパーゼＬ−１０、リパーゼＡＹ−３０、リパーゼVII型、リパーゼ「ＣＶ」、リパーゼ「ＰＮ」、リパーゼ２５０型、リパーゼＰＳ−３０、リパーゼＴＬ、リパーゼ「ＲＮ」、リパーゼＡ−１０ＦＧ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−８、コレステロールエステラーゼおよびＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｅ−１を含む群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アシルドナーがトリフルオロエチルブチレートであり、そして酵素がリパーゼＴＬである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
反応工程を、有機溶媒の存在下で行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
有機溶媒が、メチル tert−ブチルエーテル、テトラヒドフラン、トルエン、ピリジン、および１，４−ジオキサン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、塩化メチレン、ベンゼンを含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
鏡像異性体混合物を上回るアシルドナーのモル過剰が、１〜３０倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
有機溶媒中の水分が、メチル tert−ブチルエーテルの０．４〜４容量％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
反応工程を、２５℃〜４５℃の温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
鏡像異性体混合物が、約０．０２Ｍ〜０．５Ｍの濃度範囲で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
鏡像異性体混合物が、約０．２５Ｍの濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アシルドナーが、約０．０４Ｍ〜０．５Ｍの濃度範囲で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
アシルドナーが、約０．２５Ｍの濃度で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アシルドナーが、鏡像異性体混合物の２倍量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記反応工程を、反応混合物中で行い、そしてここにおいて、酵素が、該反応混合物のｍＬにつき約１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
酵素が、ペニシリンアシラーゼを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
アシルドナーが、フェニル酢酸、フェニル酢酸メチル、フェノキシ酢酸メチルおよびフェニルアセトアミドを含む群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
反応工程を、有機溶媒の存在下で行う、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
有機溶媒が、メチル tert−ブチルエーテルである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
酵素が、固定化酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
分離されたＲ−ＡＰＮと、メタンスルホン酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成させ；そして該Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を回収する工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３７】
分離されたＲ−ＡＰＮと、メタンスルホン酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成させ；そして該Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を回収する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項３８】
鏡像異性体の豊富な３−アミノペンタンニトリルを製造する方法であって、
アシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮを含有する鏡像異性体混合物を与え；そして
酵素の存在下においてアシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮの一方を選択的に加水分解する工程を含む方法。
【請求項３９】
鏡像異性体混合物が、Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを含有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
酵素が、ペニシリンアシラーゼを包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記選択的加水分解工程が、Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮの混合物を生じる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮを分離する工程を更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
分離されたＲ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを加水分解して、Ｒ−ＡＰＮを生じる工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
分離されたＲ−ＡＰＮとメタンスルホン酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成させ；そして該Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を回収する工程を更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記加水分解工程を、ヒドロラーゼの存在下で行う、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
ヒドロラーゼが、リパーゼおよびエステラーゼを含む群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
鏡像異性体の豊富な３−アミノペンタンニトリルを製造する方法であって、
Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮを含有する第一鏡像異性体混合物を与え；
アシルドナーを用いたアシル化反応においてＲ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮをアシル化して、アシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮ含有する第二鏡像異性体混合物を生じ；そして
酵素の存在下においてアシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮのどちらか一方を選択的に加水分解する工程を含む方法。
【請求項４８】
アシルドナーが、フェニルアセチルクロリドであり、そして第二鏡像異性体混合物が、Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを含有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
酵素が、ペニシリンアシラーゼを包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記選択的加水分解工程が、Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮの混合物を生じる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮを分離する工程を更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
分離されたＲ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを加水分解して、Ｒ−ＡＰＮを生じる工程を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
分離されたＲ−ＡＰＮとメタンスルホン酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成させ；そして該Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を回収する工程を更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記加水分解工程を、酵素反応で行う、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
酵素反応を、ヒドロラーゼの存在下で行う、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ヒドロラーゼが、リパーゼおよびエステラーゼを含む群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キラルアミノペンタンニトリル化合物の生体触媒分割に関する。
発明の背景
ラセミ体アミンのキラル分割は、これらアミンが、種々の抗生物質の製造のためにまたは若干の神経障害を制御する抑制性伝達物質として有用な中間体であるので、製薬産業にきわめて重要な過程である。それら生物学的活性は、それらの絶対配置に強く依存していて、ＳおよびＲ双方の異性体が、可能性のある治療的用途を有する。伝統的には、化学的キラル分割は、それら異性体の一方と立体選択的に反応する酸などのキラル化合物を利用し、それによって鏡像異性体の分離を容易にすることによって達せられる。
【０００２】
３−アミノペンタンニトリル（ＡＰＮ）は、商業的に入手可能な化合物であり、二つの鏡像異性体Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮで存在しうる。典型的には、Ｒ−ＡＰＮのキラル分割は、Ｒ−ＡＰＮに優先的に結合するジベンゾイル−Ｌ−酒石酸と、ＡＰＮのラセミ混合物を反応させることによって達せられる。得られたＲ−ＡＰＮ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩を、単離し、そして引き続き、メタンスルホン酸と反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を生じることができる。
【０００３】
アミノペンタンニトリルのキラル分割に有効な、経済的な且つ好都合な代替法が要求される。酵素は、しばしば、優れたエナンチオ選択性を示すので、生体触媒法は、その要求されるものを与えることができる。更に、酵素反応は、それらの特異性および温和な反応条件について充分に特性決定される。ＡＰＮのキラル分割のための酵素の応用は、開示されている。
【０００４】
発明の概要
鏡像異性体の豊富なアミノペンタンニトリルを製造する方法を提供する。それら方法は、３−アミノペンタンニトリル（ＡＰＮ）の混合物を、生体触媒の存在下においてアシルドナーと反応させる選択的アシル化反応を含む。その反応は、アシル化された鏡像異性体と非アシル化鏡像異性体との混合物を生じる。そのアシル化鏡像異性体は、生体触媒の選択性に依存して、Ｒ−ＡＰＮアミドまたはＳ−ＡＰＮアミドでありうる。アシル化鏡像異性体は、非アシル化鏡像異性体から分離され、そして引き続き、加水分解されて、他の非アシル化鏡像異性体を生じることができる。
【０００５】
或いは、それら方法は、生体触媒の存在下におけるアシル化ＡＰＮの鏡像異性体混合物の選択的加水分解を含むことができる。その選択的加水分解は、アシル化鏡像異性体と非アシル化鏡像異性体との混合物を生じる。アシル化鏡像異性体は、非アシル化鏡像異性体から分離後、加水分解されて、他の非アシル化鏡像異性体を生じることができる。
【０００６】
更に、それら方法は、ＡＰＮの鏡像異性体混合物の化学的または酵素的アシル化に基づいて、アシル化ＡＰＮの鏡像異性体混合物を生じることができ、それを、上記の選択的加水分解の基質として用いる。
【０００７】
具体的には、本発明の一つの態様において、鏡像異性体の豊富なＡＰＮを製造する方法は、Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮを含有する鏡像異性体混合物を与え、そしてその鏡像異性体混合物とアシルドナーとを、酵素の存在下において反応させ、それら鏡像異性体のどちらか一方を選択的にアシル化して、Ｓ−ＡＰＮおよびアシル化Ｒ−ＡＰＮの混合物かまたは、Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮの混合物を生じる工程を含む。その方法は、更に、アシル化鏡像異性体および非アシル化鏡像異性体を分離して、鏡像異性体の豊富なアシル化Ｒ−ＡＰＮまたは非アシル化Ｒ−ＡＰＮを生じる工程を包含することができる。もう一つの工程は、アシル化Ｒ−ＡＰＮを加水分解して、Ｒ−ＡＰＮを生じることを含むことができる。ＡＰＮのアシル化にエナンチオ選択性を示す適する酵素には、リパーゼおよびエステラーゼが含まれる。もう一つの工程は、Ｒ−ＡＰＮとジベンゾイル−Ｌ−酒石酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩を生じることを含むことができ、更に、それをメタンスルホン酸と反応させて、メタンスルホン酸塩を形成させることができる。
【０００８】
別の態様において、鏡像異性体の豊富なＡＰＮを製造する方法は、アシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮを含有する鏡像異性体混合物を与え、そして生体触媒の存在下においてアシル化Ｒ−ＡＰＮかまたはアシル化Ｓ−ＡＰＮを選択的に加水分解する工程を包含する。具体的には、ペニシリンアシラーゼが適する酵素であり、それは、アシル化Ｓ−ＡＰＮの加水分解にエナンチオ選択性を有する。ペニシリンアシラーゼを用いた具体的な反応では、Ｒ−ＡＰＮ−アミドおよびＳ−ＡＰＮの混合物を生じる。
【０００９】
その方法は、更に、Ｒ−ＡＰＮ−アミドをＳ−ＡＰＮから分離し、Ｒ−ＡＰＮ−アミドを回収し、そして回収されたＲ−ＡＰＮ−アミドを非選択的に加水分解してＲ−ＡＰＮを生じる工程を包含することができる。その非選択的加水分解工程は、化学的または酵素的反応を含むことができる。酵素的反応の場合、その反応を触媒するのに用いることができる酵素には、ヒドロラーゼ（リパーゼ／アシラーゼ／エステラーゼ）が含まれてよい。
【００１０】
もう一つ別の態様において、鏡像異性体の豊富なＡＰＮを製造する方法は、Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮを含有する第一鏡像異性体混合物を与え、そして適するアシルドナーを用いてＲ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮを非選択的にアシル化して、アシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮを含有する第二鏡像異性体混合物を生じる工程で開始する。次に、その第二鏡像異性体混合物を、本明細書中の上に記載のように、適する酵素の存在下の選択的加水分解において基質として用いる。
【００１１】
鏡像異性体の豊富なＡＰＮを製造する方法は、回収されたＲ−ＡＰＮとメタンスルホン酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成させ、そしてＲ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を回収する工程を包含することができる。
【００１２】
本発明の他の目的および追加の利点は、次に記述される説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。
発明の詳細な記述
本発明の原理の理解を促すために、特殊な言葉を用いて、本発明の代表的な態様を記載する。それにもかかわらず、本発明の範囲がそれによって制限されるものではないということは理解されるであろう。本発明は、示されたデバイスおよび記載された方法におけるいずれかの変更および追加の修飾、そして更には、本発明が関する技術の熟練者が通常考えると思われる発明の原理の応用を包含する。
【００１３】
本発明は、鏡像異性体の豊富なＡＰＮを製造する方法であって、ＡＰＮの鏡像異性体の一方の優先的アシル化または優先的加水分解について立体選択的な酵素を利用した後、具体的な鏡像異性体の単離を行う方法を提供する。
【００１４】
アシル化または加水分解の立体選択性は、酵素分子の活性中心内の官能基の場所の具体的な特性に由来するが、それは、アシル化または加水分解反応において基質の一つの立体形の結合を他の形より好み且つこの立体形についてより高い反応性与える。
【００１５】
ＡＰＮの分子内の立体中心に結合したアミノ基のアシル化は、立体特異的方法において、ＡＰＮの鏡像異性体混合物とアシルドナーとを、ある選択された酵素の存在下および具体的な反応条件で反応させることによって達成することができる。ＡＰＮの典型的な鏡像異性体混合物は、実質的に等しい量のＲ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮを有するラセミ混合物である。そのアシル化反応は、次のように示すことができる。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
具体的な生体触媒およびアシルドナー（ＲＣＯＯＲ’）が、どの反応経路が起こるかを規定するであろうし、Ｓ−ＡＰＮがアシル化されて、Ｒ−ＡＰＮを未反応のままにするかまたは、Ｒ−ＡＰＮがアシル化されて、Ｓ−ＡＰＮを未反応のままにするであろう。どちらの場合にも、鏡像異性体の分離を行うことができる。更に、アシル化されたＲ−ＡＰＮまたはアシル化されたＳ−ＡＰＮを脱アシルするのに、追加の化学的工程が必要とされる。
【００１８】
酵素的方法の開発のために、酵素が、基質およびアシルドナーに作用できるか否かを知ることはきわめて重要である。更に、特定の鏡像異性体への何等かの優先性があるか否かを知ることも等しく重要である。アシルドナーであることが可能な化合物は、概して、知られているが、全ての既知のアシルドナーを、酵素的選択的アシル化に用いることができるわけではない。
【００１９】
実施例１（下の）に記載のように、いくつか可能性のあるアシルドナーを調べた。多数のアシルドナーは、ＡＰＮと自発的に反応するが、若干のものは、特定の酵素と適合性でない。リパーゼＢによって触媒される反応においてＡＰＮをアシル化することが分かっているアシルドナーには、トリフルオロエチルブチレート（ブチレートＴＦＥ）；１，４−シクロヘキサンジカルボン酸ジトリフルオロエチル；安息香酸ビニルエステル；酪酸ビニルエステル、カプロン酸ビニルエステル、ラウリン酸ビニルエステル、ブチルビニルカーボネート、２，６−フランジメタノールジビニルカーボネート、１，６−ヘキサンジオールジビニルカーボネート、酢酸エチルおよび酢酸ブチルが含まれる（表１を参照されたい）。更に、ＡＰＮのアシル化を触媒することができる酵素には、リパーゼＢ以外に、リパーゼＡＬ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−１０、リパーゼＰＬ、リパーゼＱＬ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−１、リパーゼＬ−１０、リパーゼＡＹ−３０、リパーゼVII型、リパーゼ「ＣＶ」、リパーゼ「ＰＮ」、リパーゼ２５０型、リパーゼＰＳ−３０、リパーゼＴＬ、リパーゼ「ＲＮ」、リパーゼＡ−１０ＦＧ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−８、コレステロールエステラーゼおよびＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｅ−１が含まれる（実施例２および表２を参照されたいが、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥは、Roche Corp., Basel, Switzerland の登録商標である）。
【００２０】
リパーゼＡＬ、リパーゼＰＬ、リパーゼVII型、リパーゼ「ＰＮ」、リパーゼＴＬ、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−８、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｅ−１は、Ｓ−ＡＰＮのアシル化に対して選択的であり、Ｒ−ＡＰＮを非アシル化状態のままにする（実施例３、表３Ａを参照されたい）。
【００２１】
対照的に、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−１、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−５、リパーゼ２５０型およびリパーゼＰＳ−３０は、Ｒ−ＡＰＮのアシル化に対して選択的であり、Ｓ−ＡＰＮを非アシル化状態のままにする（実施例３、表３Ｂを参照されたい）。
【００２２】
一般的に知られているように、酵素的アシル化の条件は、触媒の反応速度および立体選択性に強い影響力を示す。下は、リパーゼＴＬによって触媒される過程を特に重要視した、ブチレートＴＦＥでのＡＰＮの酵素的アシル化のエナンチオ選択性への多数の反応パラメーターの作用についての研究結果である。
【００２３】
温度。反応温度（２５〜４５℃の範囲内）は、溶媒としてのメチル tert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中のいろいろな酵素によって触媒されるＡＰＮアシル化の立体選択性に有意の影響力を示さなかった。
【００２４】
溶媒。ＭＴＢＥの代わりのアセトニトリルの適用は、ＡＰＮアシル化においてより小さいエナンチオ選択性を与えたが、ＭＴＢＥを、ＡＰＮの立体分割における反応溶媒として選択した。実際には、テトラヒドフラン（ＴＨＦ）、トルエン、ピリジン、１，４−ジオキサンおよびその他のような溶媒が、リパーゼおよびエステラーゼによって触媒される反応に可能性のある基剤として知られる。
【００２５】
試薬濃度。ブチレートＴＦＥの濃度は、ＭＴＢＥ中の Pseudomonas stutzeri 由来のリパーゼＴＬによって触媒される反応における酵素的アシル化の立体選択性を決定する場合に重要なパラメーターであった。ＡＰＮのラセミ混合物を上回るアシルドナーのモル過剰の増加（１〜３０倍）は、１．５〜２倍高い反応立体特異性を生じた。
【００２６】
酵素量。ブチレートＴＦＥでのＡＰＮアシル化の反応は、有機溶媒中に１０ｍｇ／ｍＬの固定化酵素の懸濁液の一定濃度で行ったが、反応エナンチオ選択性への酵素濃度の作用は研究されなかった。しかしながら、参考文献から知られるように、このパラメーター、更には、生体触媒を製造する方法（支持体上の酵素負荷、極性溶媒、界面活性剤等での固定化酵素の処理）は、酵素的アシル化の立体選択性に影響することがありうる。
【００２７】
水分。溶媒中に０．４〜４容量％（ｖｏｌ．％）の溶媒中水分は、有用である（実施例４を参照されたい）。
上記のアシルドナーおよび酵素に加えて、フェニル酢酸メチル、フェノキシ酢酸メチル、フェニルアセトアミドおよびフェニル酢酸を含めた他のアシルドナーを、ペニシリンアシラーゼのような特定の酵素と一緒に用いることができる（実施例５を参照されたい）。
【００２８】
ペニシリンアシラーゼは、ペニシリンアミダーゼ、ペニシリンＧアミダーゼ、ペニシリンアミドヒドロラーゼおよびペニシリンＶアシラーゼとしても知られている。その酵素は、固定化形も遊離形も、多数の商業的源より入手可能である（表２を参照されたい）。ペニシリンアシラーゼは、アミド結合に対してきわめて活性であり、広範囲のｐＨ（５．４〜１１．０）および中程度の温度（１０〜４５℃）にわたって活性である。ペニシリンアシラーゼに触媒される反応は、概して、水性相中で、または主に、１０〜３０ｖｏｌ．％に等しい量の水混和性有機溶媒を含む水性基剤中で行われる。極性有機溶媒の制御添加は、基質（ＡＰＮ）の混和性／溶解性がペニシリンアシラーゼを活性に保持することを容易にする。水性基剤の一般的な使用は、主に、この酵素が活性であるのに水性系が不可欠であるという予想のためである。しかしながら、その酵素は、非水性基剤中でも活性であることが判明した。ペニシリンアシラーゼを用いたアシル化反応は、アセトニトリル、メタノールまたはＭＴＢＥが含まれうる溶媒系中で（表５Ａ〜５Ｄを参照されたい）、またはＭＴＢＥ、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、塩化メチレンおよびベンゼンが含まれうる、主に無極性の有機系中で行うことができる。ＡＰＮ濃度は、０．０２〜０．５Ｍの範囲内でありうる。典型的なＡＰＮ濃度は、０．２５Ｍである。約０．０４〜０．５Ｍの濃度範囲のアシルドナーを用いることができる。典型的なアシルドナー濃度は、ＡＰＮ濃度の２倍である。酵素の量は、反応混合物中に１０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内でありうる。
【００２９】
ペニシリンアシラーゼによって触媒されるモデルアシル化反応を、実施例６に示す。この反応では、７時間の反応後に、約７２％までのｅｅＲ−ＡＰＮに達しうる（実施例６を参照されたい）。
【００３０】
ペニシリンアシラーゼは、実施例５および実施例６に示されるように、Ｓ−ＡＰＮのアシル化に対してエナンチオ選択性を示し、Ｒ−ＡＰＮを非アシル化状態のままにする。その未反応のＲ−ＡＰＮは、水溶液中にストリッピングすることによって、アシル化Ｓ−ＡＰＮから分離することができるし、またはメタンスルホン酸塩として容易に集めることができる（下に記載される）。ＲおよびＳ鏡像異性体の相対アシル化速度は、かなり異なるので、＞９９％ｅｅは、反応パラメーターの適当な変更で達成することができる。その反応は、バッチ法でかまたは連続カラム反応器中で行うことができる。
【００３１】
酵素的反応の経過中に形成されるＳ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドは、単離し且つ同酵素によって水の多い環境中で加水分解することができる。フェニル酢酸メチルのＭＴＢＥ溶液は、再循環させることができる。
【００３２】
別のアプローチにおいて、鏡像異性体の豊富なＡＰＮを製造する方法は、酵素の存在下における、アシル化Ｒ−ＡＰＮおよびアシル化Ｓ−ＡＰＮを含有する鏡像異性体混合物の選択的加水分解を含む。次の反応スキームに示されるように、ペニシリンアシラーゼは、選択的加水分解に適する酵素である。
【００３３】
【化２】
2006517393.tif 000003
【００３４】
その鏡像異性体混合物は、Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＳ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを含有してよい。ペニシリンアシラーゼは、Ｓ−ＡＰＮに対してより活性であるので、その酵素に触媒される鏡像異性体混合物の加水分解は、Ｓ−ＡＰＮおよびＲ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドの形成を引き起こすであろう（上の反応スキームを参照されたい）。いずれか適する慣用的な化学的技法を用いて、それら生成物を、Ｓ−ＡＰＮとＲ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドに分離することができ、それを更に、同酵素または他の化学的方法によって適する条件下で加水分解して、Ｒ−ＡＰＮを生じることができる。
【００３５】
選択的加水分解反応は、アセトニトリル、メタノール等のような、水性の水−水混和性溶媒（５〜３０ｖｏｌ．％）中において、または二相の水−水不混和性無極性有機溶媒中において一定範囲のＰＨにわたって行うことができる（実施例７を参照されたい）。
【００３６】
もう一つ別のアプローチにおいて、鏡像異性体の豊富な３−ＡＰＮを製造する方法は、ＡＰＮのラセミ混合物のアシル化で開始して、アシル化ＡＰＮのラセミ混合物を生じる。このアシル化工程は、選択的アシル化反応ではないので、Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮ双方がアシル化される。その非選択的アシル化は、化学反応を含んでよい（実施例８を参照されたい）。この反応に適するアシルドナーには、フェニルアセチルクロリドが含まれる。ドナーとしてのフェニルアセチルクロリドで、得られた鏡像異性体混合物は、実質的に等しい量のＳ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドおよびＲ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを含有する。得られたＡＰＮ−フェニルアセトアミドの鏡像異性体混合物は、上記のように、酵素によって選択的に加水分解することができる。
【００３７】
初めの方で述べられたように、本発明の方法は、ＡＰＮのアシル化鏡像異性体を非アシル化鏡像異性体から分離する工程を包含することができる。この分離工程は、いずれか適する分離手順を用いて行うことができる。一つの例は、アシル化Ｓ−ＡＰＮおよび非アシル化Ｒ−ＡＰＮの混合物と、Ｒ−ＡＰＮへの結合に対して選択的であるジベンゾイル−Ｌ−酒石酸とを反応させて、Ｒ−ＡＰＮ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩を生じることである。その塩を、沈殿させ且つ混合物から単離して、鏡像異性体の豊富なＲ−ＡＰＮ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩を生じることができる（実施例９を参照されたい）。Ｒ−ＡＰＮ−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩は、メタンスルホン酸と更に反応して、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成することができるが、それは、医薬分子の製造に有用な化合物である。
【００３８】
ＡＰＮのアシル化鏡像異性体および非アシル化鏡像異性体の混合物は、ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸と反応する工程を介することなく、メタンスルホン酸と直接的に反応することができると考えられる。この反応では、Ｒ−ＡＰＮは、メタンスルホン酸と反応して、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩を形成する（実施例１０を参照されたい）。
【００３９】
ＡＰＮまたはＡＰＮアミドのＲ鏡像異性体およびＳ鏡像異性体の相対量を決定するために、アシル化反応の生成物を、標準的なキラルおよびアキラル液体クロマトグラフィー技術を用いて分析する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、各々の鏡像異性体の相対比率を決定するのに用いることができる。
【００４０】
Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮの決定のための分析用プロトコールの一例は、次の通りである。最初に、ＡＰＮを、ｏ−フタルアルデヒドおよびＢｏｃ−Ｌ−システインで誘導体化し、ＨＰＬＣによって分析した。その誘導体化試薬は、１２８ｍｇのＮ−tert−ブトキシカルボニルＬ−システインを５０ｍｇのｏ−フタルアルデヒドに加えることによって調製し、１．０ｍＬのメタノール中に溶解させ、そしてｐＨ１０．４の０．４Ｎホウ酸カリウム緩衝液で５ｍＬに希釈した。このように調製された２０μＬの試薬を、３０μＬのＡＰＮ溶液に加え（約２μモル）、そして更に、４０μＬのｐＨ１０．４ホウ酸緩衝液で希釈した。誘導体化された試料を、４０℃で維持されたＺＯＲＢＡＸ  Ｃ−１８カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ）（ＺＯＲＢＡＸは、Du Pont company, Wilmington, DE の登録商標である）上に注入し、１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有するｐＨ６．２（０．０１５Ｍ）の７５：２５リン酸緩衝液で無勾配溶離した。その溶離プロフィールを、ＵＶ検出器を用いて３３８ｎｍの波長で追跡した。
【００４１】
ＨＰＬＣ分析の結果は、鏡像異性体過剰による光学純度（％ｅｅ）を、次の計算を用いて決定するのに用いることができる。
％ｅｅＲ−ＡＰＮ＝１００（［Ｒ−ＡＰＮ］−［Ｓ−ＡＰＮ］）／（［Ｒ−ＡＰＮ］＋［Ｓ−ＡＰＮ］）
％ｅｅＳ−ＡＰＮ＝１００（［Ｓ−ＡＰＮ］−［Ｒ−ＡＰＮ］）／（［Ｓ−ＡＰＮ］＋［Ｒ−ＡＰＮ］）
それら鏡像異性体の更なる識別は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術を用いて行うことができる。
【００４２】
実施例１
アシルドナースクリーニング
自発的にはＡＰＮと反応しないが、酵素によって触媒される反応に関与だけしうるアシルドナーを選択するために、６７種類の様々なアシルドナーを、ＡＰＮとの自発的反応の可能性について調べた。それらアシルドナーは、酢酸アルキル（ＯＡｃ）、ビニルエステル（ＶＥ）、炭酸ビニル（ＶｉＣａｒｂ）、およびいろいろなカルボン酸のトリフルオロエチルエステル（ＴＦＥ）の群より選択した。アシルドナーとＡＰＮ（Du Pont Nylon Specialties より与えられる分析証明書で示される９９．５％純度）の対照反応は、次のように設定した。０．５ｍＬのＡＰＮを、２０ｍＬのメチル tert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（０．２５Ｍ）中に溶解させた。０．２５ｍＬのこの溶液に、２０μＬまたは２０ｍｇのアシルドナーを加え、それら溶液または懸濁液を４０℃で一晩放置した。１４時間の反応時間後、試料を採取し、そしてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。６７種類のアシルドナーの内、２３種類のドナーは、ＡＰＮとの若干の自発的反応を示したので、追加の研究から除外した。次に、ＡＰＮの酵素的アシル化のための試薬を、残りの４４種類のアシルドナーから選択した。
【００４３】
次に、選択されたアシルドナーを、Candida antarctica リパーゼＢ（ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−２）によって触媒されるＡＮＰの酵素的アシル化において調べた。リパーゼＢは、この酵素が、異なったアシルアクセプターについてのアシル化反応におけるその高い活性および広範な基質特異性について知られているので、スクリーニング用に選択した。その酵素を、反応混合物に１０ｍｇ／ｍＬの量で加えた。ここで用いられたＧＣ法では、反応転化が確かめられたが、Ｓ−ＡＰＮおよびＲ−ＡＰＮによって形成されるアシル化生成物を分離分割できなかった。したがって、ＧＣトレースでの単一ピークは、Ｓ−ＡＰＮおよびＲ−ＡＰＮ双方のアシル化形の鏡像異性体混合物に相当する。表１に挙げた１３種類の化合物を、上記と同じ反応条件下におけるリパーゼＢによって触媒されるＡＰＮアシル化反応でのアシルドナーとして調べた。
【００４４】
【表１】
2006517393.tif 000004
【００４５】
いろいろな群のアシルドナーの中でも、トリフルオロエチルアセテート（ＴＦＥ）で最良の結果が得られ、ＡＰＮとの反応において単一生成物を示した（表１）。ブチレートＴＦＥは、充分な生成物を生じたＡＰＮとの反応が、かなり短時間で生じるので、可能性のある最良の試薬として選択したが、それは、ＡＰＮの立体分割の方法を開発するのに実際的に好都合でありうる。他のＴＦＥ化合物との反応は、より遅く進行するが、それらは、ＡＰＮの立体分離のためのアシルドナーとして用いることもできる。表１にある他のアシルドナーは、多数の反応生成物を形成するかもしれないので、ＡＰＮ立体分割の方法を開発するのにはあまり好都合でない。ビニルエステルとの反応では、付随するビニルエステル加水分解の結果として、少量のアセトアルデヒドが形成され、このアルデヒドは、ＡＰＮとの非酵素的反応において、酵素によって生じるアミドと一緒の副生成物としてシッフ塩基を形成することがありうる。カーボネート基の二官能性のために、ビニルカーボネートは、二つのアクセプター分子と反応することがあり、それも、いくつかの反応生成物を生じる。
【００４６】
実施例２
酵素（リパーゼ／エステラーゼ）スクリーニング
完全リパーゼ／エステラーゼスクリーニングを、アシルドナーとしてのブチレートＴＦＥおよびブチレート基のアクセプターとしてのＡＰＮを用いて設定した。全７０種類のリパーゼ／エステラーゼ触媒をスクリーニングした。そのスクリーニングは、次のように設定した。２．５ｍＬのブチレートＴＦＥおよび０．９ｍＬのＡＰＮ（前に記載のように調製される）を、３６ｍＬのＭＴＢＥに加え、その溶液を旋回させた。次に、０．４ｍＬのその溶液を、９ｘ８プレートで構成されたリパーゼ／プロテアーゼ粉末が入っている試験管に加え、それら反応を４５℃で振とうした。反応混合物のＧＣ分析は、いくつかの酵素が、ラセミ体ＡＰＮのアシル化をきわめて高い転化率（＞８０％）で触媒したということを示した（表２）。このことは、ＡＰＮ：Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮ双方の鏡像異性体が、アシル化に反応性であったということを意味する。これら酵素は、その反応において顕著なエナンチオ選択性を全く示さなかった。この理由のために、これら酵素を追加の実験で研究しなかった。多数のリパーゼおよびプロテアーゼは、低い転化率（＜２５％）を示したように、充分に活性ではなかった。したがって、低い転化率を示したそれら酵素は、追加のスクリーニング実験に含めなかった。
【００４７】
更なる触媒開発に最も有望なのは、反応の転化を約５０±１０％で示した酵素であった。この数字について考えられる説明は、これら反応において、鏡像異性体の一方だけ（Ｒ−ＡＰＮかまたはＳ−ＡＰＮ）がアシルドナーと反応し、もう一方の鏡像異性体は未反応のままであるということである。結果として、１３種類の酵素を識別し、それらを、ＡＰＮの光学的分割のための触媒として更に研究した（表２）。
【００４８】
表２のリストより選択された１３種類のリパーゼ／エステラーゼ触媒を、ブチレートＴＦＥでのＡＰＮアシル化反応で更に調べた。その反応転化率は、ＧＣ法と、反応混合物中の未反応のＲ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮの量の決定を可能にした Chiral ＨＰＬＣを用いて推定した。組み合わせて用いられるこれら方法の結果を分析することにより、Ｒ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮについて未反応の形およびアシル化形双方の量を計算することが可能である。
【００４９】
【表２】
2006517393.tif 000005
【００５０】
実施例３
選択された酵素のエナンチオ選択性
第一の目的は、Ｓ−ＡＰＮを特異的にアシル化して、できるだけ多くの未反応Ｒ−ＡＰＮを残した後、非アシル化Ｒ−ＡＰＮを、Ｓ−ＡＰＮおよびアシル化形のＲ−ＡＰＮおよびＳ−ＡＰＮから分離することができる酵素を発見することである。これら酵素は、高いｅｅＲ−ＡＰＮ値を与えるはずである。多数の試験された酵素は、このタイプのエナンチオ選択性を示すので、アシル化反応混合物中のＳ−ＡＰＮを上回るＲ−ＡＰＮの相対量を増加させるのに適用することができるということが判明した（表３Ａ）。それら高いｅｅＲ−ＡＰＮ値によれば、リパーゼＡＬおよびリパーゼＴＬは、この酵素群に属する最良の触媒の中にある。
【００５１】
【表３】
2006517393.tif 000006
【００５２】
第二の目的は、Ｒ−ＡＰＮを特異的にアシル化して、できるだけ多くの非アシル化Ｓ−ＡＰＮを残すことができる酵素を発見することである。次に、アシル化Ｒ−ＡＰＮおよび非アシル化Ｓ−ＡＰＮを分離することができる。次に、分離されたアシル化Ｒ−ＡＰＮを、化学的または酵素的方法を用いることによって、Ｒ−ＡＰＮへと加水分解することができる。ここで成功した適用について、それら酵素は、高いｅｅＳ−ＡＰＮ値を有するはずである。全ての試験されたリパーゼおよびエステラーゼの中で、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ  Ｌ−５およびリパーゼＰＳ−３０は、その触媒群からの最も有効な酵素であると考えられた（表３Ｂを参照されたい）。
【００５３】
【表４】
2006517393.tif 000007
【００５４】
実施例４
ラセミ体ＡＰＮの酵素的アシル化への水分の作用
いろいろな酵素によって触媒されるブチレートＴＦＥでのＡＰＮアシル化の立体選択性は、Karl Fisher 滴定を用いることによって決定された有機溶媒中の水分に依存した。この結論は、ＡＰＮの立体分割の実用的側面に有意の影響力を有するかもしれない。この結論を確かめるために、ＭＴＢＥに加えられるいろいろな量の水の存在下で反応を設定した。全ての他の条件には、次が含まれる。１ｍＬのＭＴＢＥ、２５μＬのラセミ体ＡＰＮ（前に記載のように調製される）、７５μＬのＴＦＥブチレート、５ｍｇの固定化リパーゼ、４５℃でインキュベートする。水で飽和した溶媒は、２ｍＬの乾燥ＭＴＢＥを２ｍＬの水と混合することによって調製した。表４の結果は、水分の増加が、酵素のエナンチオ選択性を減少させるということを示している。
【００５５】
【表５】
2006517393.tif 000008
【００５６】
実施例５
種々の緩衝液中のペニシリンアシラーゼによって触媒されるＡＰＮの選択的アシル化
いくつかのアシル化反応設定を、異なった溶媒および反応条件を用いて調製した。一つの反応設定において、各々の反応バイアルに加えたのは、３０ｍｇ／ｍＬのペニシリンアシラーゼ（ＰＧＡ−４５０）、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ＝６．０）またはホウ酸塩（ｐＨ＝１０．４）、０．０４ＭのＡＰＮラセミ混合物、０．０７Ｍのアシルドナー、および１．０ｍＬの反応にする量の溶媒であった。温度を、４５℃でかまたは室温で保持した。反応を２２時間行い、その後、反応試料を分析した。表５に報告された結果は、フェニル酢酸メチルまたはフェニルアセトアミドをアシルドナーとして用いた場合、ペニシリンアシラーゼが、ＡＰＮをアシル化するのに触媒作用を有するということを示している。更に示されるのは、その酵素が、Ｓ−ＡＰＮのアシル化に対して選択的であり、Ｒ−ＡＰＮを非アシル化状態のままにするということである。
【００５７】
【表６】
2006517393.tif 000009
【００５８】
別の反応設定において、反応バイアルは、１．０ｍＬの反応中にアシルドナーとしてフェニルアセトアミドおよびフェニル酢酸メチルで調製した。ＰＧＡ−４５０＝３０ｍｇ、０．２ｍＬ緩衝液（ｐＨ＝６．０，０．５Ｍ）を、２μＬのＡＰＮが入っている各々のバイアルに加えた。それら反応試料を、２４時間後に分析した。結果（表５Ｂ）は、ｐＨ６．０で、ペニシリンアシラーゼが、ＡＰＮのアシル化を触媒するのに有効であるということを示している。メタノールは、適する共溶媒であると考えられる。反応生成物は、１．２〜２６．７の％ｅｅＲ−ＡＰＮを示す。
【００５９】
【表７】
2006517393.tif 000010
【００６０】
別の反応設定において、溶媒系は、ＭＴＢＥを水で予め飽和させることによって調製した。全ての反応バイアル中に、０．６ｍＬのＭＴＢＥを、２０ｍｇのアシルドナー、１０ｍｇの酵素ＰＧＡ−４５０Ｐおよび２０μモルのＡＰＮと一緒に加えた。リン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０；０．５Ｍ）を加えて、相容積比を調整した。１８時間後、蒸発損失を補うために、水を各々のバイアルに加えて、全水分を全てのバイアル中で等しくした。混合後、ＡＰＮを誘導体化後の％ｅｅＲ−ＡＰＮについて、水性相を分析した。表５Ｃにあるデータは、フェニル酢酸メチルの他に、フェノキシ酢酸メチルおよびフェニル酢酸をアシルドナーとして用いうるということを示している。その二相系において、ペニシリンアシラーゼは、ＡＰＮのアシル化に有効であった。４５℃の温度で行われた反応は、通常、３３．６％に達しうるより高い％ｅｅＲ−ＡＰＮを生じた。
【００６１】
【表８】
2006517393.tif 000011
【００６２】
別の実験設定において、反応混合物は、水で飽和したＭＴＢＥ（０．６ｍＬ）、アシルドナーとしてのフェニル酢酸メチルおよび１０ｍｇのＰＧＡ−４５０で調製した。０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）を用いて、緩衝比率を調整した。各々のバイアル中の酵素を、その緩衝液で数分間予め平衡させた後、ＡＰＮおよびアシルドナーを加えて、１．０ｍＬの反応とした。その反応混合物を、１８時間の時点で分析し、％ｅｅＲ−ＡＰＮを決定した。結果（表５Ｄ）は、非水性基剤中において、ペニシリンアシラーゼに触媒された反応は、鏡像異性体過剰を＞９９％ｅｅＲ−ＡＰＮで生じうるということを示している。
【００６３】
【表９】
2006517393.tif 000012
【００６４】
実施例６
無極性有機溶媒中のＡＰＮのペニシリンアシラーゼに触媒されるアシル化のモデル反応
３．０ｇのペニシリンアシラーゼ酵素（ＰＧＡ−４５０）および０．１５ｍＬの水を、バイアルに加えた。次に、そのバイアルを１５分間振とうし、そして平衡させるために４℃で一晩保持した。５００ｍＬ三口フラスコに、１００ｍＬの水飽和ＭＴＢＥ、２．５ｍＬのＡＰＮおよび７．５ｍＬのフェニル酢酸メチルを加えた。その反応混合物を、室温においてオーバーヘッドスターラーで撹拌した。この混合物に、平衡した酵素を、連続撹拌しながら加えた。反応の進行は、反応溶液から採取した試料を、前の方に記載のキラル分割法を用いて分析することによって追跡した。いろいろな時間間隔でのＲ−ＡＰＮの鏡像異性体過剰を、表６に示す。
【００６５】
【表１０】
2006517393.tif 000013
【００６６】
実施例７
種々の緩衝液中のペニシリンアシラーゼによって触媒される選択的加水分解
３種類の反応設定を、概して、次のように調製した。緩衝化した基剤中の反応については、ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを、２．５ｍＬのガラスバイアルに入れ、このバイアルに、ペニシリンアシラーゼ（ＰＧＡ−４５０）を加えた後、緩衝液を加えた。緩衝液−溶媒混合物中の反応については、ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを、溶媒／水混合物中に溶解させ、そして一定計算量のこの溶液を、酵素ペニシリンアシラーゼ（ＰＧＡ−４５０）を加えて容量を１．０ｍＬとした後のバイアルに加え、そして内容物をマグネチックスターラーで連続撹拌した。
【００６７】
加水分解反応の進行は、いろいろな時間間隔において形成される３−アミノペンタンニトリルフェニルアセトアミドおよびフェニル酢酸の濃度をＨＰＬＣで決定することによって追跡した。アセトニトリルで希釈後の反応混合物を、ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ  Ｃ１８カラム（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸは、Phenomenex, Torrence, CA の商標である）上に注入し、双方とも（０．１％過塩素酸）を含有するアセトニトリル：水混合物（４０：６０）で溶離し、溶離プロフィールをＵＶ検出器で２５４ｎｍにおいて追跡した。
【００６８】
ある研究（表７Ａ）は、ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを、アセトニトリルなどの極性溶媒の存在下においてペニシリンアシラーゼによって加水分解することができるということを示している。それら結果は、ペニシリンアシラーゼが、Ｓ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドの加水分解に対してより活性であり、Ｓ−ＡＰＮの鏡像異性体過剰を生じ、Ｒ−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを未反応のままにするということを示している。この具体的な研究では、０．１Ｍ  ＡＰＮ−フェニルアセトアミドを用いた。そのｐＨは、０．５Ｍリン酸または重炭酸緩衝液で調整した。１８時間後に分析を行った。
【００６９】
【表１１】
2006517393.tif 000014
【００７０】
その研究（表７Ｂ）は、ＡＰＮ−フェニルアセトアミドの選択的加水分解が、ＭＴＢＥを含めた溶媒を用いて行うこともできるということを示している。その反応のｐＨは、約６〜約９であってもよい。この具体的な実験では、６５μモルのＡＰＮ−フェニルアセトアミドを、１０ｍｇの酵素ＰＧＡ−４５０と一緒に用いた。それら反応を、０．０２５ｍＬの０．５Ｍリン酸塩および重炭酸塩溶液で緩衝化した。％ｅｅ決定については、反応混合物の溶媒を、窒素流下で乾燥させ、水を加えて１．０ｍＬの容量とし、そしてＨＰＬＣによって分析した。
【００７１】
【表１２】
2006517393.tif 000015
【００７２】
表７Ｃにある研究は、ＡＰＮ−フェニルアセトアミドの選択的加水分解を、二相溶媒系において比較的低いｐＨ（４．７〜６．０）で行うことができるということを示している。この研究では、それら反応を、リン酸塩（ｐＨ＝６．０）、酢酸塩（ｐＨ＝４．７）、クエン酸塩（ｐＨ＝５．５）およびギ酸塩（ｐＨ＝５．５ｘ）によって緩衝化した。１０ｍｇのＰＧＡ−４５０、０．０２ｍＬの緩衝溶液（０．５Ｍ）および６５μモルのＡＰＮ−フェニルアセトアミドを、各々のバイアル中に入れた。１：１の比率のＭＴＢＥ対水性相を含有する二相溶媒系を用いた。水性相からの生成物を分析した（％ｅｅＳ−ＡＰＮを決定した）。
【００７３】
【表１３】
2006517393.tif 000016
【００７４】
実施例８
化学的反応による３−ＡＰＮ−フェニルアセトアミドの製造
アシル化（アミド化）反応は、次のように、Schotten-Baumann 条件下で行った。５ｇのＮａＯＨを５０ｍＬの水中に溶解させ、５ｍＬのＡＰＮラセミ混合物（４．６６５ｇ；ｄ＝０．９３３；０．０４７５モル；Ｍ．Ｗ．＝９８．１５）を加え、８ｍＬのフェニルアセチルクロリド（９．３ｇ；０．０６モル）を加え、そして室温で２時間撹拌する。アミドを酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出し、その酢酸エチル層を水で洗浄する。溶媒をロータリーエバポレーションによってアセトン／ドライアイストラップで除去する。数ｍＬのメタノールを加え且つ溶媒を除去した後、化合物を更に乾燥させた。形成された沈殿を集め、デシケーター中において真空下で乾燥させた。収量＝８．７グラム（８５％）で、生成物をＮＭＲによって確認した。
【００７５】
実施例９
Ｒ−アミノペンタンニトリルジベンゾイル−Ｌ−酒石酸塩の製造
ラセミ体ＡＰＮ（５ｍＬ）およびブチレートＴＦＥ（１５ｍＬ）を、０．２ＬのＭＴＢＥに加えた。次に、Meito Sangyo で製造され且つ Accurel 上に固定された１．０ｇのリパーゼＴＬ（Pseudomonas stutzeri）を加え、その懸濁液を、サーモスタット付きシェーカー（２５０ｒｐｍ）中において４５℃で８時間インキュベートした。懸濁液を２０℃に冷却し、そして固定化触媒をガラス漏斗上において濾紙で濾去することにより、反応を止めた。反応混合物を濃縮して油状物とした後、その油状物を、酢酸エチルで希釈した。次に、酢酸エチル／水（８：１）中の０．７ｍｅｑのジベンゾイル−Ｌ−酒石酸を加え、固体を集めた。その固体の Chiral ＨＰＬＣ分析は、２６％のＳ−ＡＰＮおよび７４％のＲ−ＡＰＮ（ｅｅ．４８％）を示した。
【００７６】
実施例１０
Ｒ−アミノペンタンニトリルメタンスルホン酸塩の製造
１００ｍＬの水飽和ＭＴＢＥ中のラセミ体ＡＰＮ（０．２５Ｍ）、フェニル酢酸メチル（０．５Ｍ）および３ｇのペニシリンアシラーゼ（ペニシリンＧアミダーゼ）を、室温で混合した。いろいろな時点に、試料を取り出し、ＨＰＬＣによって分析した。７時間後、生成物（Ｒ−ＡＰＮ）のｅｅが＞７２％となった時、酵素を濾去することによって反応を終えた。その酵素を、追加のＭＴＢＥで洗浄した後、それを反応溶液に加えた。
【００７７】
１１０ｍＬの反応溶液の試料を、減圧下で濃縮して油状物を生じた。この油状物を、７ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１．１ｍＬのメタンスルホン酸（ＭｓＯＨ）を加え、室温で１６時間撹拌した。そのスラリーを０〜５℃に冷却し、固体を濾過によって集めた。そのケーキをＥｔＯＡｃ（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて（４５℃、屋内真空）、Ｒ−ＡＰＮ−メタンスルホン酸塩（Ｒ−ＡＰＮ−ＭｓＯＨ）を含有する白色固体（０．６７ｇ，８７％ｅｅ，５９％収率）を生じた。
【００７８】
本発明を、前述の説明で詳しく示し且つ詳細に記載してきたが、同様のことは、特性を詳しく説明するものであって制限するものではないと考えられるべきである。代表的な態様だけを示し且つ記載したということ、および本発明の精神の範囲内にある全ての変更および修飾を保護することが望まれるということは理解されるはずである。
【国際調査報告】
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