(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの腫瘍部位を有する対象において腫瘍細胞を除去するための組成物および方法に関する。より具体的には、この方法は、溶解条件下で、少なくとも１つの腫瘍中の腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された腫瘍を形成するステップ；およびこの処置された腫瘍に充分なｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された腫瘍を形成するステップを含む。対象における局所的腫瘍もしくは遠位転移腫瘍またはそれら両方を収縮させるための組成物および方法が含まれる。好ましい実施形態において、対象において腫瘍を収縮させるための方法は、刺激された腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させるステップを含む。腫瘍細胞に対する刺激は、腫瘍細胞中のシャペロン・タンパク質のレベルを増大させ得る。溶解因子と腫瘍細胞刺激との組み合わせは、直接処置された腫瘍の収縮を引き起こし、ここでこの刺激は、同時にかまたは連続的にかのいずれかで適用される。さらに、直接処置されていない遠位腫瘍すなわち転移腫瘍もまた、第１の腫瘍（「処置された腫瘍」または「局所的腫瘍」）中の刺激された腫瘍細胞中に溶解因子を導入することによって減少される。溶解因子の導入および腫瘍細胞の刺激を含む好ましい方法ステップは、腫瘍収縮効果を最大化するために反復される。
2006519784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの腫瘍部位を有する対象において腫瘍細胞を除去するための方法であって、
（ａ）溶解条件下で、少なくとも１つの腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された腫瘍を形成するステップ；および
（ｂ）前記処置された腫瘍に充分なｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された腫瘍を形成するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に行われるか、または前記腫瘍に前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが、前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップの前に行われるか、または前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップおよび前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させるステップの後であるが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に、第１の時間待機するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下の方法ステップ：
（ａ）前記処置された腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで前記溶解因子と接触させるステップ；
一定の時間待機するステップ；および
（ｂ）前記処置された腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップ、
を第１の回数反復するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の回数が１回から約５回の範囲内である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の時間が約１日間から約１０日間である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記処置された腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を第２の回数適用するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の回数が約１回から約１６回の範囲内である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激を適用するステップが、約１５分間から約９０分間にわたる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が、鼻咽頭癌、軟骨肉腫、結腸癌、デュークＤおよび非小細胞肺癌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、小細胞肺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、腹水症または黒色腫の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解因子が、前記腫瘍細胞中で複製しかつ非腫瘍細胞中で複製から阻害されている単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、機能的ウイルス性オンコプロテインを有さないアデノウイルスを含み；前記腫瘍細胞が、機能的ｐ５３遺伝子産物または機能的ＲＢ遺伝子産物を欠く、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能的ウイルス性オンコプロテインが、ｐ５３結合タンパク質またはＲＢ結合タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶解因子が、配列番号１と少なくとも９５％同一の配列または配列番号２と少なくとも９５％同一の配列を有する単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、単離された単純疱疹ウイルス、単離されたレオウイルス、単離されたニューカッスル・ウイルス、単離されたポリオウイルス、単離された麻疹ウイルスまたは単離された水胞性口炎ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解因子が腫瘍溶解性細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍溶解性細菌が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶解因子が、アポトーシス遺伝子、細胞溶解遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、陰性Ｉ−κ−β遺伝子、カスパーゼ遺伝子、γ−グロブリン遺伝子またはｈα−１アンチトリプシンを含む遺伝子をコードする単離された核酸発現構築物を含み、前記コードされた遺伝子が腫瘍溶解の目的のために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が、前記対象についての正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内の局所的温熱を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が高周波数電磁パルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が無線周波数ジアテルミーを含み、前記無線周波数が０．１ＭＨｚから１００ＭＨｚの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激がマイクロ波ジアテルミーを含み、前記マイクロ波が１００ＭＨｚから２，４５０ＭＨｚの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記刺激が超音波ジアテルミーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が全身的温熱を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記刺激が、無酸素処置、放射線処置、アルコール処置もしくはグルタミン処置、または感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記刺激された腫瘍が、前記刺激を適用するステップの前の前記腫瘍のレベルと比較して上昇したレベルで少なくとも１種のシャペロン・タンパク質を発現し、前記シャペロン・タンパク質がヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒート・ショック・タンパク質が、ＨＳＰ７０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも第１の腫瘍および遠位腫瘍を有する対象において腫瘍細胞を除去するための方法であって、前記方法は、
（ａ）溶解条件下で、前記第１の腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された第１の腫瘍を形成するステップであって、前記遠位腫瘍は前記溶解因子と接触させないステップ；および
（ｂ）前記処置された第１の腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された第１の腫瘍を形成するステップであって、前記遠位腫瘍は刺激されないステップ、
を含む方法。
【請求項３０】
前記第１の腫瘍の前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に行われるか、または前記腫瘍に前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが、前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップの前に行われるか、または前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップおよび前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが同時に行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させるステップの後であるが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に、第１の時間待機するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
以下の方法ステップ：
（ａ）前記第１の腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで前記溶解因子と接触させるステップ；
一定の時間待機するステップ；および
（ｂ）前記処置された第１の腫瘍に前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップ、
を第１の回数反復するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の回数が１回から約５回の範囲内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の時間が約１日間から約１０日間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記処置された第１の腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を第２の回数適用するステップを反復するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の回数が約１回から約１６回の範囲内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記刺激を適用するステップが、約１５分間から約９０分間にわたる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の腫瘍が、鼻咽頭癌、軟骨肉腫、結腸癌、デュークＤまたは非小細胞肺癌であり、前記遠位腫瘍がそれらの転移を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の腫瘍の前記腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、小細胞肺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、腹水症または黒色腫の細胞であり、前記遠位腫瘍がそれらの転移を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶解因子が、前記腫瘍細胞中で複製しかつ非腫瘍細胞中で複製から阻害されている単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、機能的ウイルス性オンコプロテインを有さないアデノウイルスを含み；前記腫瘍細胞が、機能的ｐ５３遺伝子産物または機能的ＲＢ遺伝子産物を欠く、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記機能的ウイルス性オンコプロテインが、ｐ５３結合タンパク質またはＲＢ結合タンパク質を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶解因子が、配列番号１と少なくとも９５％同一の配列または配列番号２と少なくとも９５％同一の配列を有する単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、単離された単純疱疹ウイルス、単離されたレオウイルス、単離されたニューカッスル・ウイルス、単離されたポリオウイルス、単離された麻疹ウイルスまたは単離された水胞性口炎ウイルスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記溶解因子が腫瘍溶解性細菌を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍溶解性細菌が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶解因子が、アポトーシス遺伝子、細胞溶解遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、陰性Ｉ−κ−β遺伝子、カスパーゼ遺伝子、γ−グロブリン遺伝子またはｈα−１アンチトリプシンを含む遺伝子をコードする単離された核酸発現構築物を含み、前記コードされた遺伝子が腫瘍溶解の目的のために使用される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が、前記対象についての正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内の局所的温熱を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が高周波数電磁パルスを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が無線周波数ジアテルミーを含み、前記無線周波数が０．１ＭＨｚから１００ＭＨｚの範囲内である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激がマイクロ波ジアテルミーを含み、前記マイクロ波が１００ＭＨｚから２，４５０ＭＨｚの範囲内である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記刺激が超音波ジアテルミーを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が全身的温熱を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５４】
前記刺激が、無酸素処置、放射線処置、アルコール処置もしくはグルタミン処置、または感染である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５５】
前記刺激された第１の腫瘍が、前記刺激を適用するステップの前の前記腫瘍のレベルと比較して上昇したレベルで少なくとも１種のシャペロン・タンパク質を発現し、前記シャペロン・タンパク質がヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヒート・ショック・タンパク質が、ＨＳＰ７０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
遠位鼻咽頭癌および第１の鼻咽頭癌を有する対象において前記遠位鼻咽頭癌を収縮させるための方法であって、
（ａ）前記第１の鼻咽頭癌を単離された腫瘍溶解性アデノウイルスと接触させて、処置された癌を形成するステップ；
（ｂ）第１の時間待機するステップ；
（ｃ）前記処置された癌に第２の時間にわたって刺激を適用するステップであって、前記刺激が、前記対象の正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内で、前記処置された癌の局所温度を上昇させるステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を第１の回数反復するステップ；ならびに
（ｅ）ステップ（ｃ）を第２の回数反復するステップを含み、
前記第１の時間が約１日間から約１０日間の範囲内であり、前記第２の時間が約１５分間から約９０分間であり、前記第１の回数が１回から約５回の範囲内であり、前記第２の回数が約１回から約１６回の範囲内である方法。
【請求項５８】
前記単離された腫瘍溶解性アデノウイルスが配列番号１または配列番号２を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記刺激が前記処置された癌に限局され、前記刺激が、高周波数電磁パルス、０．１Ｍｈｚから１００Ｍｈｚの範囲内の無線周波数、１００Ｍｈｚから２，４５０Ｍｈｚの範囲内のマイクロ波ジアテルミーまたは超音波ジアテルミーからなる群から選択され、前記刺激が前記第１の腫瘍中のシャペロン・タンパク質のレベルを増大させ、前記シャペロン・タンパク質がＨｓｐ７０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号１と少なくとも９５％同一の配列または配列番号１の縮重改変体を含む、単離された核酸。
【請求項６１】
配列番号２と少なくとも９５％同一の配列または配列番号２の縮重改変体を含む、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全内容が本明細書により参照として援用される、２００３年１月２８日出願の米国仮特許出願第６０／４４３０９５号、表題「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ」に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の一態様は、転移腫瘍の処置のための免疫療法に関する。本発明の免疫療法の作用剤および方法は、同時または逐次のいずれかでの生理学的ストレス（例えば熱）および遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルスの処置領域への投与に関し、これは、その後局所的および遠位の両方での腫瘍退縮を生じる。
【０００３】
癌は、ヒトまたは動物の身体の任意の場所の悪性新生物として規定され得る。局所的に広がる癌または身体の遠位部分に広がる癌は、転移と呼ばれる。転移の例は、血流またはリンパ液による悪性腫瘍からの細胞の移動である。身体組織または代謝を破壊する細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる種々の癌（例えば、肝臓癌、乳癌、白血病など）が存在し、これらの癌において、増殖は隣接組織を破壊し、最終的に脈管および器官の物理的遮断によって身体の死を引き起こす（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ（２０００）．Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  １００．５７−７０）。したがって、癌細胞の２つの主要な特徴は、それらの不死性および転移を形成する能力である。
【０００４】
Ｉ．癌に対する利用可能な処置。癌は数千年間にわたって知られてきたが、現代の技術的な専門知識が癌の可能な処置を考慮するようになったのはごく最近である。さらに、これらの多様な疾患についての作用機構は、直接的な分子介入が可能であるという点まで理解されてきている。現時点で、癌についての臨床的に利用可能な処置は、手術、放射線療法、温熱療法、化学療法、遺伝子治療、免疫療法およびその他である。
【０００５】
手術。現在、癌の最も有効な治療はなお、放射線療法、化学療法、免疫療法、温熱療法などと組み合わせた手術である。癌が早期に診断された場合、外科的処置後の５年生存率は、種々のタイプの癌患者について８０％ほどの高さであり得る。不運にも、ほとんどの場合には、患者が診断されるときにはこの疾患はすでに後期段階（ステージＩＩＩまたはＶＩ）にまで発達している。後期段階の癌細胞は典型的に、血管またはリンパ管を介して身体中の離れた位置にすでに移動しており、外科的処置は、この疾患の制御において実用的でも有効でもない。外科的処置の別の欠点は、広がった麻疹様転移癌には手術が適用できないことである。外科的処置に対するさらなる欠点は、手術後の患者における身体的合併症および癌転移のリスクの増大である。
【０００６】
放射線療法：放射線療法は、手術によっては安全または完全に除去できない孤立性癌を収縮または破壊するために使用される処置である。これはまた、化学療法によって影響を受けない癌を処置するためにも使用される。放射線療法は、胸部ｘ線を実施するために使用される量よりも数千倍高いレベルで放射線を利用する。この強烈な放射線は、細胞が分裂および増殖する能力を破壊する。正常な細胞および癌細胞の両方が影響を受けるが、この放射線処置は、腫瘍殺滅効果を最大化し、正常組織殺滅効果を最小化するように設計される。腫瘍殺滅効果を最大化することが、放射線療法が１回の処置ではなく一連の処置で与えられる１つの理由である。癌細胞に加えて、いくつかの正常細胞もまた放射線によって殺滅される。いくつかの副作用が、これらの正常細胞が殺滅されることに起因して見られ得る。通常、これらの副作用は一時的であり、癌細胞を殺滅する利点のほうが勝る。しかし、放射線療法は放射された領域中の癌細胞を殺滅するだけであるが、放射された領域から離れた癌細胞には影響を与えないことに注目すべきである。さらに、癌細胞のいくつかの特定の生物学的特徴（例えば、放射線に対する抵抗性、腫瘍のサイズ、癌中の無酸素細胞の割合）は、特定の癌を放射線療法に対する感受性が低いものにし得る。
【０００７】
温熱療法：温熱療法または熱療法は、当該分野で公知の種々の手段によって全身または局所的領域の温度を上昇させる。局所的領域の温度を上昇させる温熱技術は主に、異なるエネルギー範囲（例えば、超音波、マイクロ波、無線周波数など）での放射である。癌の処置のための温熱療法の機構は完全に理解されていないものの、温熱単独または他の処置（例えば、放射線療法および化学療法）と組み合わせた温熱は、抗癌効果を有することが実証されている（ＦａｌｋおよびＩｓｓｅｌｓ（２００１）Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｄ  ７：１−１８）。理論によって束縛されることを望まないが、温熱は、癌細胞の微小環境を変化させ、変質および壊死／アポトーシスを引き起こす。現在、温熱の条件を最適化することはなお困難である。例えば、温熱処置は、深部にある悪性腫瘍については困難であり、腫瘍および直ぐ隣接する組織中の実際の温度分布の測定は一貫しない可能性がある。さらに、先行技術では、熱が適用される部位から離れた癌を処置するのに温熱が有効であることが実証されていない。
【０００８】
化学療法：化学療法は、癌細胞を破壊するための抗癌（細胞傷害性）薬物の使用である。現在、５０種を越える異なる化学療法薬物が利用可能である。いくつかの化学療法薬物は単独で投与されるが、いくつかの薬物を組み合わせることも多い（すなわち、併用化学療法）。特定の処置のタイプは、癌のタイプ、癌がその起源からどれだけ遠くに広がっているかを含む、多数のことに依存する。化学療法は、速く分裂する癌細胞ならびに速く分裂する正常細胞（例えば、血球、皮膚細胞および胃腸細胞）を殺滅する。したがって、癌を処置するための化学薬物の適用には、重篤な副作用が伴う。化学療法は、転移癌を処置するのにあまり有効でないこともまた見出されている。アポトーシス抵抗性癌細胞は、高い用量でさえ化学薬物に対して感受性でない。なぜなら、ほとんどの化学薬物の機構は、癌細胞のアポトーシスを誘導することだからである。
【０００９】
遺伝子治療：遺伝子治療は、癌に対する新たなタイプの処置として迅速に開発された。癌細胞を特異的に標的化する治療的遺伝子を送達するための多数のタイプのベクターが存在する。これらのベクターには、アデノウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルスおよびリポソームが含まれる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８）Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０）。しかし、これらのベクターの種々の種類の副作用および低い送達効率は未だ克服されていない。したがって、遺伝子治療の臨床的適用は限定されている。癌を処置するために腫瘍溶解性ウイルスを使用する概念は、１０年前に明らかにされた（ＢａｒｋｅｒおよびＢｅｒｋ（１９８７）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ１Ｂ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｏｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６：１０７−２１）。以降、腫瘍溶解性ウイルスの臨床的適用は大きく進歩し、約１２種の異なる腫瘍溶解性ウイルスが臨床試験に入っている（Ｋｉｒｎら（２００１）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｒｉｓｋ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ７：７８１−７８７）。これらの腫瘍溶解性ウイルスの中で、アデノウイルスｄｌ１５２０が最もよく研究されている。野生型アデノウイルスとは対照的に、ｄｌ１５２０は、Ｅ１ｂ領域中の８２７ｂｐのフラグメントが欠失した改変体アデノウイルスであり、その結果、ｄｌ１５２０はＥ１ｂ−５５ｋＤａタンパク質を発現しない。改変体アデノウイルスｄｌ１５２０は正常細胞中で複製しないが、腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３が機能不全である癌細胞中で選択的に複製し、最終的に癌細胞を溶解させる。臨床試験により、以下のことが実証されている：（１）腫瘍溶解性ウイルスが患者および環境に対して安全であること；（２）改変体アデノウイルスｄｌ１５２０が腫瘍増殖を抑制する効力が予測したほど良好ではないこと；（３）化学抗癌薬物と腫瘍溶解性ウイルスｄｌ１５２０との併用処置が、癌をある程度まで処置するのに有効であること（ＲｉｅｓおよびＫｉｒｎ（２００２）ＯＮＹＸ−０１５：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ８６：５−１１）。ウイルスに基づく治療によって新生物状態を処置するための方法および組成物は、米国特許第５６７７１７８号（「ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの１７８号特許」）、表題「Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｏｆ  Ｎｅｐｌａｓｉａ」（これは、１９９７年１０月１４日に発行され、発明者としてＭｃＣｏｒｍｉｃｋらが列挙されている）中に開示されている。ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの１７８号特許において、ウ���ルスに基づく治療によって新生物状態を処置するための方法および組成物が提供されている。ｐ５３またはＲＢに結合し、かつ／またはこれらを不活化するウイルス性タンパク質を欠く変異体ウイルスが、ｐ５３機能および／またはＲＢ機能を欠く細胞を含む新生物を有する患者に投与される。この変異体ウイルスは、新生物細胞において複製表現型を実質的に生じ得るが、本質的に正常なｐ５３機能および／またはＲＢ機能を有する非複製性の非新生物細胞においては複製表現型を実質的に生じることができない。新生物細胞における複製表現型の優先的な発生は、直接的にかまたはウイルス複製表現型を発現する細胞における細胞傷害性遺伝子の発現によってかのいずれかで、新生物細胞の優先的な殺滅を生じる。しかし、遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルスが、ウイルスが投与される部位から離れた腫瘍を処置するのに有効であることを実証する先行技術の報告はこれまで存在しない。
【００１０】
免疫療法：約９０％の癌患者が転移によって死亡し、癌転移に対して有効な処置は事実上存在しない。免疫療法は古典的に、アレルゲンに対する感受性を低下させる目的のために、漸増する量のアレルゲンにアレルギー患者を曝露するプロセスである。癌処置のための免疫療法の概念は、免疫系が癌に対して身体を保護することおよびすでに発達した癌と闘うことにおいて中心的な役割を果すことを明らかにした同様の研究に基づく。この後者の役割は充分に理解されていないものの、腫瘍の増殖および広がりを遅延させる免疫系の役割を支持するゆるやかな証拠が存在する。化学療法は、速く分裂する癌細胞ならびに速く分裂する正常細胞を殺滅するが、これは、癌の転移をある程度まで阻害することができる。しかし、化学療法の重度な毒性は、ほとんどの患者にとって不耐性である。患者自身の免疫防御系が、癌の転移と闘う最良の方法であると長い間考えられてきた。現時点で、最も一般に使用される免疫療法は、以下の３つのカテゴリーに分割され得る：（１）サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロンなど）の投与を介した免疫操作；（２）１つまたはいくつかの癌関連抗原（「ＣＲＡ」）に対して特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫治療；および（３）ＣＲＡを用いたワクチン接種（Ｙｉｎｇら（２００１）Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １５：８１９−３１）。
【００１１】
免疫操作。インターフェロンは、サイトカインとして公知のタンパク質の群に属する。インターフェロンは、感染、炎症または刺激に応答して、身体中（または実験室中）で白血球によって天然に産生される。インターフェロン−αは、抗腫瘍効果を示す第１のサイトカインの１つであり、腫瘍の増殖を直接遅延させ、免疫系を活性化することを助け得る。インターフェロン−αはＦＡＤによって承認されており、多数の癌（多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、ヘアリー・セル白血病および悪性黒色腫を含む）の処置のために現在一般に使用されている。インターフェロン−βおよびインターフェロン−γは、調査された他のタイプのインターフェロンである。抗腫瘍活性を有する他のサイトカインには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２）および腫瘍壊死因子が含まれる。ＩＬ−２は、腎臓癌および黒色腫を処置するために頻繁に使用される。サイトカインは、免疫系を癌と特異的に闘うように直接操作するのではなく、特定の免疫応答のカスケードを調節するので、癌を処置するためにサイトカインが使用される場合、所望されない副作用が一般に観察される。これらのサイトカイン（多数のインターフェロンおよびインターロイキンを含む）での問題点のいくつかは、それらの副作用（不定愁訴およびインフルエンザ様症候群を含む）である。高い用量で与えられる場合、これらの副作用は大きく強められ得る。
【００１２】
モノクローナル抗体。別の重要な生物学的治療剤には、癌細胞または癌関連標的に対する抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、特定の標的（「抗原」）に対する人工抗体であり、実験室で産生される。最初の方法は、抗体産生の工場として作用するハイブリドーマ細胞（２つの異なるタイプの細胞の融合物）を含んでいた。この分野における主な進歩は、元来マウス・ハイブリドーマ細胞から作製されたこれらの抗体を、本発明者らの天然抗体とより密接に類似した「ヒト化」抗体へと変換する能力であった。なおより新しい技術が、ヒト抗体遺伝子を含む遺伝子操作されたマウスまたは細菌からヒト抗体を生成するために使用され得る。モノクローナル抗体は、癌の科学的研究ならびに癌診断において広く使用されてきた。癌に対する治療剤として、モノクローナル抗体は、癌細胞を探し出すために患者に注射されて、癌細胞活性の破壊または癌に対する免疫応答の増強を潜在的に導き得る。このストラテジーは、１９７０年代のモノクローナル抗体の最初の発明以来、大きな興味を持たれてきた。長年にわたる臨床試験の後、研究者らは、改良されたモノクローナル抗体が特定の癌の処置を補助するために有効に使用され得ることを示している。ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（「Ｒｉｔｕｘａｎ」）と称される抗体は、非ホジキン・リンパ腫の処置において有用であり得るが、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（「Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ」）は特定の乳癌に対して有用である。他の新たなモノクローナル抗体の試験が活発に行われている。しかし、特定のタイプの癌関連抗原（「ＣＲＡ」）に対するモノクローナル抗体を使用することの欠点の１つは、ＣＲＡのタイプおよび各タイプのＣＲＡの量が、患者によって異なる可能性があることである。同じ患者についてさえ、異なる発達段階におけるＣＲＡのタイプおよび各タイプのＣＲＡの量は異なり得る。したがって、モノクローナル抗体を用いて癌を処置するには、少なくとも２つの欠点が存在する。第一に、ほんの数種のＣＲＡだけがモノクローナル抗体で標的化される場合、効力が損なわれる。ほとんどの癌には複数の遺伝子が関係すると考えられているので、これは特に欠点である。第二に、異なる患者は異なるＣＲＡを有し、特異的モノクローナル抗体のうち１種または１群が、限定数の癌患者にとって有効なだけである。
【００１３】
癌ワクチン。インターフェロンおよびモノクローナル抗体のような免疫療法剤は標準的な癌処置の一部になっているが、他の多数のタイプの免疫療法剤（例えば、癌ワクチン）は実験的なままである。一般に、ワクチンは多数の重要な感染症（ポリオ、天然痘およびジフテリアを含む）の発症を予防することによって公衆衛生に大変革をもたらした。しかし、癌を予防するためまたは癌を有する患者を処置するために有効なワクチンを開発することは、かなりより困難であった。何十年もの実験作業にもかかわらず、癌ワクチンを開発するための試みは、首尾よい結果を出していない。これにもかかわらず、以前に利用可能であったものよりも洗練された有望なワクチン・ストラテジーを導いた免疫学または癌生物学の領域における最近の進歩によって、興味の顕著な増大が生じている。現時点で、癌ワクチンを作製するための以下の３つの基本的ストラテジーが存在する：（１）癌関連抗原（「ＣＲＡ」）のうち１種または１群を用いたワクチン接種；（２）同じ患者の癌組織溶解物でパルスした樹状細胞（「ＤＣ」）を用いて患者にワクチン接種すること；（３）同じ患者から単離したヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）とＣＲＡとの複合体を用いて患者にワクチン接種すること。
【００１４】
（１）ＣＲＡを用いたワクチン接種。癌ワクチンは、癌関連抗原（「ＣＲＡ」）に対する免疫応答をさらに刺激する他の成分と共に、ＣＲＡの供給源から典型的になる。挑戦は、よりよいＣＲＡを見出すこと、ならびにＣＲＡを有する癌細胞と闘うように患者の免疫系を増強するような方法で抗原をパッケージングすることであった。ますます、癌ワクチンは、特定の抗原に対する免疫応答を改善し得ることが示されている。この免疫学的効果の結果は、癌の進行を逆転するのに常に充分であるわけではない。しかし、癌ワクチンは一般に充分許容されており、いくつかの状況において有用な抗癌効果を提供し得る。例えば、悪性リンパ腫において、多数の実験室の研究により、「イディオタイプ」と称されるリンパ腫関連タンパク質を使用したワクチン接種が、リンパ腫の発症をマウスが耐えるのを補助するのに充分にマウスの免疫系を刺激し得ることが示されている。臨床試験において、イディオタイプ・ワクチンは試験され続けており、幾人かのリンパ腫患者において臨床的利益の指標と関連している。悪性黒色腫において、広範な種々のワクチン・ストラテジーが臨床試験に導入されており、いくつかは、癌に対する免疫応答を刺激することが見出されている。
【００１５】
種または１群のＣＲＡを用いて患者にワクチン接種することの不利益は、癌を処置するためにモノクローナル抗体を使用する場合と同じである：（１）ほんの数種のＣＲＡだけが標的化される場合、効力が損なわれること；および（２）異なる患者が異なるＣＲＡを有すること、および（３）得られたワクチンが、限定数の癌患者にとって有効なだけであること。
【００１６】
（２）癌組織溶解物でパルスした樹状細胞（「ＤＣ」）を用いたワクチン接種。ワクチン構築および免疫刺激のための多数の新たなストラテジーは、臨床的に有用な癌ワクチンの出現を導き得る。黒色腫および他の癌において試験されている１つの刺激的な新たなアプローチの例は、樹状細胞ワクチンの使用である。樹状細胞（「ＤＣ」）は、免疫応答の「スイッチを入れる」のを補助する。樹状細胞は、ナイーブＴ細胞を活性化するその強力な能力によって特徴付けられる抗原提示細胞（「ＡＰＣ））の１つのタイプである（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１）。実験動物におけるＣＲＡでパルスしたＤＣでの投与により、これらの動物の癌は減じられた（ＦｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｍａｎ（２０００）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２４５−２７３）。同様の結果が、ヒト患者について実証されている（Ｎｅｓｔｌｅら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−  ｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８−３３２）。ＤＣはまた癌細胞へと融合され得、ＣＲＡがＤＣ中にパルスされる（Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：５５８−５６１）。ＣＲＡでパルスしたＤＣは転移癌を抑制する能力を有することが示されている（Ｋｕｇｌｅｒ（２０００）ら、Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：３３２−３３６）。ワクチン接種技術は、以下の４ステップのプロセスである：（１）患者からのＤＣの単離および単離されたＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖；（２）ＤＣ成熟状態のｅｘ  ｖｉｖｏ操作；（３）同じ患者由来のＣＲＡとのＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション；（４）ＣＲＡでパルスしたＤＣを同じ患者に戻し注入すること。したがって、同じ患者由来の癌組織溶解物でパルスしたＤＣを用いたワクチン接種は、局所的癌ならびに転移癌を処置するのに非常に有効であり、有害な毒性のリスクが低い可能性が高い。各個々の患者のＣＲＡの全セットが同じ患者の免疫系に対して提示されるので、このようなワクチンは、「個別ワクチン」と呼ばれている。しかし、個別ワクチンの不利益は以下である：（１）高いコスト、（２）時間がかかること、（３）汚染によってしばしば妨害される、ｅｘ  ｖｉｖｏ調製の洗練された冗長なプロトコル、および（４）各個々の患者のためにワクチンをカスタマイズする必要があること（すなわち、これらの個別ワクチンの概念に基づいた薬物を開発できないこと）（ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＪａｉｋａｒｉａ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５６：１７５−１８６）。
【００１７】
（３）ヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）と複合体化したＣＲＡを用いたワクチン接種。ヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）の１群または任意の環境刺激（物理的刺激、化学的刺激および生物学的刺激を含む）によるストレス・タンパク質の上昇した発現は、ヒート・ショック応答またはストレス応答として規定される。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらは以下を見出した：（１）ヒート・ショック・タンパク質（特にＨＳＰ７０）は、癌特異的タンパク質のエピトープ・ペプチドを結合して複合体を形成し得、これらの複合体は、ｅｘ  ｖｉｖｏで精製され得る；（２）これらの精製された複合体の注入は、エピトープ・ペプチドが、ＨＳＰと複合体化したＣＲＡとしてｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣに移動するという結果を生じる；（３）ＤＣはこれらのＣＲＡを免疫系に提示し、癌に対する免疫を誘導する（ＢａｓｕおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ（２０００）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ  ｆｏｕｎｔａｉｎｈｅａｄ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  ＆  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ５：４４３−４５１）。
【００１８】
Ｈａｖｉｖらは、ＨＳＰ７０が、培養された癌細胞を殺滅する腫瘍溶解性ウイルスの能力を増強し得ることを報告した（Ｈａｖｉｖら（２００１）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ａｎｄ  Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｉ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：８３６１−８３６５）。しかし、彼らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ＨＡＰ７０が、動物またはヒトの正常な生物学的機能に損傷を与えることなく癌を処置する腫瘍溶解性ウイルスの効力を増強し得るか否かを決定し得ない。さらに、彼らは培養された癌細胞（肺癌系統Ａ５４９、Ｈ４６０およびＨ１５７）に対する実験しか行っていないので、高いレベルのＨＳＰ７０を含む癌細胞のウイルス性腫瘍溶解が癌に対する全身免疫応答を誘導することを実証できておらず、結果として局所的癌および転移癌を処置できなかった。
【００１９】
全ての癌患者のＣＲＡの完全セットのその癌患者自身の免疫系への提示を導き得、したがって癌に対する免疫を誘導し得る単一の因子を開発することに興味が持たれている。最近、ＣｈｅｎおよびＨｕは、ほとんど全ての癌患者のＣＲＡの完全セットをその癌患者自身の免疫系に提示し得、その患者自身の癌に対する免疫応答を誘導し得るウイルス性因子を開発した（中国特許出願第０１１４１６９６．３号およびＰｃｔ／ｃｎ０１／０１６１６号）。動物試験は、このウイルス性因子が処置された腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることを実証した。このウイルス性因子は、外因性ＨＳＰ７０遺伝子を保有する腫瘍溶解性アデノウイルスである。理論によって束縛されることを望まないが、この腫瘍溶解性ウイルスは癌細胞を溶解させ得、このウイルスによって発現されたＨＳＰ７０はＣＲＡを捕捉し得る。腫瘍溶解性ウイルスが感染した癌細胞の溶解の後に、ＨＳＰ７０と複合体化したＣＲＡがＤＣに対して提示され、引き続いて、癌細胞に対する免疫応答を惹起する。理論によって束縛されることを望まないが、このヒート・ショック応答は複雑な多工程のプロセスであり、このプロセスにおいて、ＨＳＰ７０は、複合体化ＣＲＡ−ＨＳＰの適切な提示を担う経路における１つの重要なタンパク質であるにすぎない可能性がある。結果として、処置された組織中のヒート・ショック・タンパク質（例えば、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１１０など）の全セットを誘導して、転移癌を首尾よく処置するのに適切な免疫応答を得ることが必要であり得る。
【００２０】
ＩＩ．内因性ＨＳＰの発現を上昇させるために現在利用可能な技術：理論によって束縛されることを望まないが、ＨＳＰの内因性発現を増大させるためにヒート・ショック・カスケードを誘導し得るいくつかの既知の環境刺激が存在する。これらの刺激には、温熱、アルコール、エネルギー代謝のインヒビター、重金属、酸化ストレス、炎症などが含まれる（Ｚｙｌｉｃｚら（２００１）ＨＳＰ７０  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０：４６３４−４６３８）。熱病感染と癌からの同時の寛解との間の相関が観察されており、最近の刊行物は、この相関をＨＳＰの発現に帰している（Ｈｏｂｏｈｍ（２００１）Ｆｅｖｅｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：３９１−３９６）。他の非毒性化学物質（例えば、グルタミンおよびアミノ酸アナログ）もまた、ＨＳＰの発現レベルを上昇させ得る（Ｗｉｓｃｈｍｅｙｅｒ（２００２）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １８：２２５−２２８；ｖａｎ  Ｒｉｊｎら（２０００）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｚｅｔｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １６：３０５−３１８）。さらに、アルベンダゾールのようなミトコンドリア非結合因子は体温を上昇させ、したがって、ＨＳＰの発現を増大させる（Ｗａｌｌｅｎら（１９９７）Ｏｘｉｄａｎｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １３：５１７−２４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
まとめると、先行技術は、種々の技術および処置を利用する限定された能力で癌状態を処置することが可能であるが、これらの処置の多くはいくつかの有意な欠点を有することを示している。本明細書中に記載される本発明の一態様は、悪性腫瘍に適用される適切にタイミングを合わせた温熱に関し、この態様において、遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルスもまた投与されており、熱とウイルスとの組み合わせが癌に対する免疫応答を惹起する。結果として、温熱とウイルス性腫瘍溶解との組み合わせは、局所的に処置された腫瘍ならびに遠位の処置されていない転移を抑制するのに有効である。本発明の別の態様は、ウイルス性腫瘍溶解と組み合わせたＨＳＰの内因性発現を上昇させる他の刺激（例えば、物理的刺激、化学的刺激または生物学的刺激）に関し、ここで、局所的処置は、局所的腫瘍および遠位腫瘍を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
広く言うと、本発明は、少なくとも１つの腫瘍部位を有する対象において腫瘍細胞を除去するための組成物および方法に関する。より具体的には、この方法は、溶解条件下で、少なくとも１つの腫瘍中の腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された腫瘍を形成するステップ；およびこの処置された腫瘍に充分なｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された腫瘍を形成するステップを含む。
【００２３】
本発明の一態様は、対象において腫瘍を収縮させるための方法であって、この方法は、腫瘍中に溶解因子を導入するステップを含み、一旦溶解の最大プロセスが生じると、次いで刺激が第１の時間にわたってこの腫瘍に適用される。腫瘍に適用される刺激は通常、この腫瘍中のヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）のレベルを上昇させ得る。この第１の時間は、一般に約１５分間〜９０分間である。好ましい実施形態において、腫瘍を収縮させるための方法は、以下の方法ステップを含む：（１）第１の回数（例えば、約１回〜１０回）にわたって腫瘍中に溶解因子を導入するステップ；（２）第２の回数（例えば、約１回〜２０回）にわたって毎日反復され得る刺激を、溶解因子の第１の導入の２日後から開始して、第１の時間（例えば、約１５分間〜９０分間）にわたってこの腫瘍に適用するステップ。
【００２４】
本明細書中に記載される方法は、特定のタイプの腫瘍に適用され得る。理論によって束縛されることを望まないが、欠損した腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、欠損したｐ５３）、活性化されたオンコジーン（例えば、ｒａｓまたはｍｙｃ）からなる腫瘍は、この治療方法にとっての良好な候補である。本明細書中に記載される発明は、鼻咽頭癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、腹水症または黒色腫によって例示されるがこれらに限定されない腫瘍について有用である。特定の実施形態において、この溶解因子は、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルスもしくは水胞性口炎ウイルス）または腫瘍溶解性細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、または任意のタイプの腫瘍溶解性因子のいずれかを含む。この腫瘍溶解性ウイルス／腫瘍溶解性細菌は、野生型または遺伝子操作された形態のいずれかであり得る。さらに、この溶解因子は、治療的遺伝子（例えば、アポトーシス遺伝子、腫瘍壊死についての遺伝子、腫瘍細胞を餓死させるための遺伝子、細胞溶解遺伝子、陰性Ｉ−κ−β、カスパーゼ、γグロブリン、ｈα−１アンチトリプシンまたはアデノウイルスのＥ１ａ）を含み得る。
【００２５】
腫瘍を刺激する方法ステップには以下が含まれる：局所的温熱；全身的温熱；高周波数電磁パルス；無線周波数ジアテルミー；超音波ジアテルミー；無酸素、放射線、アルコール、グルタミン、感染または任意の種類の物理的刺激、化学的刺激もしくは生物学的刺激。特定の実施形態において、局所的温熱は、対象の正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内である。一般に、この刺激は、刺激された腫瘍中でヒート・ショック・タンパク質（例えば、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０）を上昇させる。本発明の方法に従うことによって、対象における腫瘍の収縮が達成され得る。
【００２６】
本発明の別の態様は、対象において「処置されていない腫瘍」（すなわち転移）を収縮させるための方法であって、この方法は、腫瘍（「処置された腫瘍」）中に溶解因子を導入するステップを含む。一旦溶解のプロセスが生じると、次いで刺激がこの処置された腫瘍に適用される。処置された腫瘍に適用される刺激は、この処置された腫瘍中のヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）のレベルを上昇させ得る。好ましい実施形態において、処置されていない腫瘍を収縮させるための方法は、以下の方法ステップを含む：（１）第１の回数（例えば、約１回〜１０回）にわたって腫瘍（処置された腫瘍）中に溶解因子を導入するステップ；（２）第２の回数（例えば、約１回〜２０回）にわたって毎日反復され得る刺激を、溶解因子の第１の導入の２日後から開始して、第１の時間（例えば、約１５分間〜９０分間）にわたってこの処置された腫瘍に適用するステップ。理論によって束縛されることを望まないが、溶解因子を導入するステップと刺激を適用するステップとの同期によって惹起された特異的免疫は、処置されていない腫瘍を収縮させる。本明細書中に記載される方法は、特定のタイプの遠位腫瘍に適用されることが本発明者らによって企図されている。理論によって束縛されることを望まないが、欠損したｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、欠損したｐ５３）、活性化されたオンコジーン（例えば、ｒａｓまたはｍｙｃ）からなる処置された腫瘍または処置されていない腫瘍は、この治療方法にとっての良好な候補である。本明細書中に記載される発明は、鼻咽頭癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、腹水症または黒色腫によって例示されるがこれらに限定されない腫瘍について有用である。特定の実施形態において、この溶解因子は、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルスもしくは水胞性口炎ウイルス）または腫瘍溶解性細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、または任意のタイプの腫瘍溶解性因子のいずれかを含む。この腫瘍溶解性ウイルス／腫瘍溶解性細菌は、野生型または遺伝子操作された形態のいずれかであり得る。さらに、この溶解因子は、治療的遺伝子（例えば、アポトーシス遺伝子、腫瘍壊死についての遺伝子、腫瘍細胞を餓死させるための遺伝子、細胞溶解遺伝子、陰性Ｉ−κ−β、カスパーゼ、γグロブリン、ｈα−１アンチトリプシンまたはアデノウイルスのＥ１ａ）を含み得る。
【００２７】
第１の腫瘍を刺激する方法ステップは、本発明者らによって以下を含むことが企図された：局所的温熱；全身的温熱；高周波数電磁パルス；無線周波数ジアテルミー；超音波ジアテルミー；無酸素、放射線、アルコール、グルタミン、感染または任意のタイプの刺激。特定の実施形態において、局所的温熱は、対象の正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内である。一般に、この刺激は、刺激された腫瘍中でヒート・ショック・タンパク質（例えば、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０）を上昇させる。本発明の方法に従うことによって、対象における処置されていない腫瘍の収縮が達成され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本明細書中で使用される全ての用語は、科学界によって一般に同意される定義をいう。本明細書中で使用される用語が誤って解釈されないことを確実にするために、これらの用語の定義を以下のように与える：
用語「アジュバント」とは、本明細書中で使用する場合、抗原と一緒に使用され得る物質またはそれ自体免疫を惹起するための抗原として使用され得る物質をいう。
【００２９】
用語「抗原」とは、本明細書中で使用する場合、免疫応答（抗体産生、特定の免疫学的細胞の活性化またはこれら２つの組み合わせを含む）を惹起するある種の物質をいう。抗原は、生物学的高分子、生物学的高分子の一部、生物の破片などであり得る。
【００３０】
用語「抗原提示細胞」とは、本明細書中で使用する場合、その機能が抗原をプロセシングし、Ｔ細胞およびＢ細胞に対して抗原を提示することであるある種の細胞をいう。このタイプの細胞には、樹状細胞、マクロファージ細胞およびＢ細胞が含まれる。
【００３１】
用語「癌」とは、本明細書中で使用する場合、不死的に転移および増殖する悪性腫瘍をいう。癌は罹患した組織によって分類される１群の疾患であり、これには、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、肺癌、直腸癌、鼻咽頭癌、胃癌、胸膜滲出、卵巣癌、腹水症および黒色腫が含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
用語「癌遺伝子治療」とは、本明細書中で使用する場合、治療的遺伝子を保有するベクターが癌細胞に感染して癌細胞を破壊することをいう。これらの治療的遺伝子には、細胞のアポトーシス、細胞の溶解、細胞の自殺などに関連する遺伝子が含まれる。これらの治療的遺伝子にはまた、陰性ｉ−κ−β遺伝子、カスパーゼ遺伝子、γ−グロブリン遺伝子またはα−１アンチトリプシン遺伝子、腫瘍溶解性アデノウイルスについてのＥ１ａ遺伝子などが含まれる。
【００３３】
用語「癌関連抗原」とは、本明細書中で使用する場合、癌細胞の独自の特徴を示す抗原をいう。癌関連抗原はＣＲＡと略される。
【００３４】
用語「癌ワクチン」とは、本明細書中で使用する場合、ＣＲＡまたはＣＲＡと遭遇した免疫学的細胞をいう。ＣＲＡは、癌細胞の独自の特徴を示す分子またはこのタイプの分子のエピトープであり得る。適切に操作された組成物において、癌ワクチンは、癌に対する患者の免疫を惹起し得る。
【００３５】
用語「シャペロン」とは、本明細書中で使用する場合、正確な折り畳み、アセンブリ、修復、膜を横切る転位および他のタンパク質の分解を媒介し、かつ同時にそれらの機能的成分ではない、無関係のタンパク質の１群をいう。一実施形態は、シャペロンの１つのタイプとして「Ｈｓｐ７０」多遺伝子ファミリーを記載する。特定のタイプのシャペロンに対する利点は本発明の特定の実施形態において特徴付けられるが、これらの実施形態は限定することを意図しない。
【００３６】
用語「外因性遺伝子」または「トランス遺伝子」とは、本明細書中で使用する場合、特定の位置で遺伝子治療のベクター中に挿入された目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をいう。外因性遺伝子は、ベクター自体に由来し得るが、このベクターのゲノム上で再編成されている。しかし、外因性遺伝子はよりしばしば、別の生物のゲノム由来のＤＮＡフラグメントである。外因性遺伝子の配列は、化学的合成／生化学的合成によって、天然供給源からの精製によって、クローニングによって、または任意の他の方法によって調製され得る。
【００３７】
用語「ヒート・ショック・タンパク質」とは、本明細書中で使用する場合、細菌からヒトまでのほとんど全ての種類の生物において普遍的に発現されるタンパク質のファミリーをいう。これらは「ストレス・タンパク質」とも称され、ＨＳＰと略される。ＨＳＰの発現は、環境刺激および発達上の影響（例えば、温熱、無酸素、アルコール、グルコース飢餓（ＨＳＰのサブグループでもあるグルコース調節タンパク質（すなわちＧＲＰ）について）、組織損傷、感染など）によって調節される。ＨＳＰは、タンパク質の折り畳みおよびタンパク質代謝において重要な役割を果す。これらは、細胞膜上にＨＳＰに対するレセプターを有するＤＣ細胞に免疫原を輸送し得る。温熱処置後に個々にかまたは組み合わせてかのいずれかで上昇した発現レベルを有するヒート・ショック・タンパク質には、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６およびＨｓｐ１１０が含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
用語「Ｈｓｐ７０」とは、本明細書中で使用する場合、シャペロンの多遺伝子ファミリーをいうが、全てのメンバーが以下の４つの共通した特徴を有する：高度に保存された配列、約７０ｋＤａの分子量、ＡＴＰａｓｅ活性ならびに折り畳まれていないポリペプチド鎖の疎水性セグメントを結合および放出する能力。
【００３９】
用語「溶解因子」とは、本明細書中で使用する場合、腫瘍細胞を破裂させ得る組成物をいう。
【００４０】
用語「天然に存在する」とは、対象について適用する場合に本明細書中で使用する場合、対象が自然界に見出され得るという事実をいう。例えば、自然界の供給源から単離され得、実験室中で人為的に故意に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。本明細書中で使用する場合、用語「組換え体」とは、ポリヌクレオチド構築物（および、例えばアデノウイルス・ゲノム）が人為的な故意の改変によって一部生成されていることを示す。
【００４１】
用語「処置されていない腫瘍」とは、本明細書中で使用する場合、それが原発腫瘍であるか転移腫瘍であるかに関わらず、腫瘍溶解性因子およびＨＳＰの発現を上昇させる環境刺激が直接的に適用されていない腫瘍をいう。処置されていない腫瘍は、腫瘍溶解性因子およびＨＳＰの発現を上昇させる環境刺激の適用の部位から離れていてもよい。用語「遠位腫瘍」もまた、相互交換可能に利用され得る。
【００４２】
用語「腫瘍溶解性細菌」とは、本明細書中で使用する場合、癌細胞中で不死的に複製してこれらの癌細胞を殺滅し得る遺伝子操作された細菌をいう。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＹＳ７２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍがその例であり、他の例は、本明細書中でその全内容が参考として援用される、Ｂｅｒｍｕｄｅｓらによる論文（Ｂｅｒｍｕｄｅｓら（２００２）Ｌｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．５（２）：１９４−９）中に記載されている。
【００４３】
用語「腫瘍溶解技術」とは、本明細書中で使用する場合、アポトーシスおよび壊死を含む腫瘍細胞の溶解または死を誘導し得る全ての種類の有効なプロトコルをいう。これらのプロトコルには、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性細菌および癌細胞の溶解または死を引き起こす任意の他の因子の適用が含まれる。
【００４４】
用語「腫瘍溶解性ウイルス」とは、本明細書中で使用する場合、癌細胞中で不死的に複製してこれらの癌細胞を殺滅し得る、遺伝子操作されたウイルスをいう。アデノウイルスｄｌ１５２０は、腫瘍溶解性ウイルスの一例である。
【００４５】
用語「ｐ５３機能」とは、本明細書中で使用する場合、本質的に正常なレベルのｐ５３遺伝子によってコードされるポリペプチド（すなわち、同じ組織学的タイプの非新生物細胞と比較して）を有する特性をいい、ここで、このｐ５３ポリペプチドは、野生型アデノウイルスのＥ１ｂ  ｐ５５タンパク質を結合し得る。例えば、ｐ５３機能は、ｐ５３の不活性（すなわち変異体）形態の産生によってか、またはｐ５３ポリペプチドの発現の実質的な減少もしくは全体的な喪失によって失われ得る。また、ｐ５３機能は、野生型ｐ５３タンパク質をコードするｐ５３対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に存在しない可能性がある。例えば、ｐ５３遺伝子座の遺伝的変更の外観（例えば、ｐ５３の異常な細胞内でのプロセシングまたは局在化を生じる変異（例えば、核以外の細胞質中のｐ５３の局在化を優勢に生じる変異））が、ｐ５３機能の喪失を生じ得る。
【００４６】
用語「配列同一性の百分率」は、本明細書中で使用する場合、比較ウインドウにわたって適切に整列された２つの配列を比較し、ここで、この比較ウインドウ中の配列の部分は、比較されている２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、「ギャップ」）を含み得る。百分率同一性は、同一の残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数をウインドウ中の位置の総数によって除算し、そしてその結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算される。次いで、総同一性が、完全問い合わせ配列をカバーするウインドウの全てにわたる平均同一性として決定される。理論によって束縛されることを望まないが、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのようなコンピュータ・ソフトウェア・パッケージもまた、配列同一性を決定するために利用され得る。
【００４７】
用語「ＲＢ機能」とは、本明細書中で使用する場合、本質的に正常なレベルのＲＢ遺伝子によってコードされるポリペプチド（すなわち、同じ組織学的タイプの非新生物細胞と比較して）を有する特性をいい、ここで、このＲＢポリペプチドは、野生型アデノウイルスのＥ１ａタンパク質を結合し得る。例えば、ＲＢ機能は、ＲＢの不活性（すなわち変異体）形態の産生によってか、またはＲＢポリペプチドの発現の実質的な減少もしくは全体的な喪失によって失われ得る。また、ＲＢ機能は、野生型ＲＢタンパク質をコードするＲＢ対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に存在しない可能性がある。例えば、ＲＢ遺伝子座の遺伝的変更の外観（例えば、ＲＢの異常な細胞内でのプロセシングまたは局在化を生じる変異）が、ＲＢ機能の喪失を生じ得る。
【００４８】
用語「複製欠損ウイルス」とは、本明細書中で使用する場合、ウイルス複製表現型の発現を支持する所定の細胞集団（例えば、ｐ５３機能および／またはＲＢ機能を実質的に欠く細胞）において、優先的に細胞増殖を阻害するかまたはアポトーシスを誘導し、かつ非複製性の非形質転換細胞に特徴的な正常なｐ５３機能およびＲＢ機能のレベルを含む細胞において、細胞増殖を阻害することもアポトーシスを誘導することも複製表現型を発現することも実質的にできないウイルスをいう。典型的に、複製欠損ウイルスは、正常なＲＢ機能および／またはｐ５３機能を含む細胞に対して、プラーク形成効率の実質的な低下を示す。
【００４９】
用語「複製表現型」とは、本明細書中で使用する場合、複製欠損アデノウイルスのようなウイルスが感染した細胞の、以下の表現型特徴のうち１つまたは複数をいう：（１）ウイルス後期遺伝子プロモーターから開始される後期遺伝子産物（例えば、カプシド・タンパク質（例えば、アデノウイルス・ペントン・ベース・ポリペプチド））またはＲＮＡ転写物の実質的な発現、（２）ウイルス・ゲノムの複製または複製中間体の形成、（３）ウイルス・カプシドまたはパッケージングされたビリオン粒子のアセンブリ、（４）感染細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現、（５）ウイルス溶菌サイクルの完了、および（６）機能的オンコプロテインをコードする野生型の複製能のあるＤＮＡウイルスが感染した非新生物細胞におけるｐ５３機能またはＲＢ機能の排除の際に典型的に起こり得る他の表現型変更。複製表現型は、列挙された表現型特徴のうち少なくとも１つ、好ましくはこれらの表現型特徴のうち１つより多くを含む。
【００５０】
用語「Ｓ−９８」と「Ｈ１０１」とは、相互交換可能に使用され得る。
【００５１】
用語「刺激」とは、本明細書中で使用する場合、生物、器官、細胞またはそれらの一部において活性を引き起こすかまたは活性を変化させる任意の作用または因子をいう。一般に、特定の実施形態において記載される刺激は、腫瘍細胞への溶解因子の導入から生じる任意の変化または衝撃に「加えた」ものである。本明細書中に記載される一実施形態は、刺激として外部温熱を利用する。本明細書中に記載される別の実施形態は、刺激として全身的温熱を利用する。なお別の実施形態において、利用される刺激は、腫瘍細胞中のシャペロン・タンパク質のレベルを増大させる。特定のタイプの刺激に対する利点は、本発明の特定の実施形態において特徴付けられるが、これらの実施形態は限定することを意図しない。
【００５２】
用語「処置された腫瘍」とは、本明細書中で使用する場合、それが原発腫瘍であるか転移腫瘍であるかに関わらず、腫瘍溶解性因子およびＨＳＰの発現を上昇させる環境刺激が直接適用される指定された腫瘍をいう。いくつかの実施形態において、「第１の腫瘍」は処置された腫瘍と同義である。
【００５３】
用語「Ｔリンパ球」とは、本明細書中で使用する場合、胸腺由来の細胞の１種をいい、一連の免疫応答に関与し得る。
【００５４】
本発明は、少なくとも１つの腫瘍部位を有する対象において腫瘍細胞を除去するための組成物および方法に一般に関する。より具体的には、この方法は、溶解条件下で、少なくとも１つの腫瘍中の腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された腫瘍を形成するステップ；およびこの処置された腫瘍に充分なｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された腫瘍を形成するステップを含む。理論によって束縛されることを望まないが、この刺激された腫瘍は、刺激を適用するステップの前の腫瘍のレベルと比較して上昇したレベルで少なくとも１種のシャペロン・タンパク質を発現する。このシャペロン・タンパク質は、溶解された腫瘍細胞由来のＣＲＡを結合して対象の免疫系にＣＲＡを提示し、それによって増殖する腫瘍の存在に対して対象の免疫系を変更させるヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）を含み得る。
【００５５】
本発明は、異なる種類の腫瘍溶解とＨＳＰの発現を上昇させる異なる技術との間の同期に関する。より具体的には、本発明は以下に関する：（１）指定された癌でのウイルス、細菌または任意の種類の因子による腫瘍溶解；（２）その結果充分なＨＳＰが充分なＣＲＡを捕捉してＨＳＰ−ＣＲＡ複合体を形成する、腫瘍溶解性因子が投与された腫瘍への、任意の種類の物理的刺激、化学的刺激または生物学的刺激（例えば、温熱、ＨＳＰの発現を上昇させるグルタミン）のタイミングのよい適用；（３）ＨＳＰの上昇した発現と腫瘍溶解との同期はＨＳＰ−ＣＲＡの充分な放出を生じ、放出されたＣＲＡは、患者のＣＲＡの完全セットを正確に示す；（４）次いで、充分量のＨＳＰ−ＣＲＡがＤＣ細胞に内因的に提示され、最終的に免疫系に提示される；（５）免疫系に提示されたＨＳＰ−ＣＲＡのシグナルが、癌に対する免疫応答を惹起するのに充分に免疫原性である；（６）癌に対するこの免疫学的処置は、それが原発腫瘍であるか転移腫瘍であるかに関わらず、処置された腫瘍および処置されていない腫瘍の両方に対して使用され得る。
【００５６】
腫瘍溶解技術。正常組織に対する限定された毒性を有する、癌細胞に対して選択的な新規癌治療の開発は、腫瘍学の研究者にとって挑戦である。腫瘍細胞または腫瘍の微小環境に対する選択性を有する微生物（例えばウイルス）は、数十年にわたって可能性のある兵器庫として調査されてきた。遺伝的に改変された非病原性細菌が、直接的な殺腫瘍効果を提供するかまたは殺腫瘍分子を送達するかのいずれかのための、可能性のある抗腫瘍因子として出現し始めている。弱毒化したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、腫瘍において選択的に増大して腫瘍の増殖を阻害し得、癌処置についての新たなアプローチを示す。腫瘍組織に対するそれらの選択性に起因して、これらの細菌は、治療的タンパク質を腫瘍に送達するための理想的なベクターでもある。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉシトシン・デアミナーゼ（ＣＤ）を発現するＶＮＰ２０００９（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの弱毒化株）およびその誘導体ＴＡＰＥＴ−ＣＤは特に有望であり、現在癌患者における第Ｉ期臨床試験を受けている（Ｂｅｒｍｕｄｅｓら（２００２）Ｌｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．５（２）：１９４−９）。腫瘍溶解性細菌の他の例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍによって例示され得るがこれらに限定されない。
【００５７】
癌細胞中で選択的に複製し得る任意のウイルス、細菌または他の因子が、腫瘍溶解の目的のために使用され得る。本発明において言及される腫瘍溶解性ウイルスは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、水胞性口炎ウイルス（「ＶＳＶ」）などであり得る。
【００５８】
理論によって束縛されることを望まないが、先行する報告は、ｐ５３遺伝子の変異が、癌患者について最も一般的な遺伝子変異の１つであることを実証している。Ｐ５３遺伝子の変異は、癌の症例の半分より多くにおいて存在する。この遺伝子上に変異を有する癌を標的化する腫瘍溶解技術の１つは、タンパク質Ｅ１ｂ−５５ＫＤをコードするＥ１ｂ領域中に変更を有するヒトＡｄ５アデノウイルスから改変された腫瘍溶解性ウイルスである。この腫瘍溶解性アデノウイルスは、ｐ５３遺伝子変異を有する癌細胞中で選択的に複製し、したがって、癌細胞を高い特異性で溶解させる。タンパク質Ｅ１ｂ−５５ｋｄをコードするＥ１ｂ領域中に変更を有する２つの改変体Ａｄ５ウイルスＳ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）が、本発明において例として使用される。
【００５９】
さらに、適切なベクターによって癌細胞に選択的に送達される場合、多数の治療的遺伝子（アポトーシスについての遺伝子、細胞溶解についての遺伝子、腫瘍壊死についての遺伝子、腫瘍細胞を餓死させるための遺伝子、陰性Ｉ−κ−β遺伝子、カスパーゼ遺伝子、γグロブリン遺伝子、ｈα−１アンチトリプシン遺伝子、アデノウイルスのＥ１ａ遺伝子などによって例示されるがこれらに限定されない）が、腫瘍溶解の目的のために使用され得る。
【００６０】
ＨＳＰの発現を上昇させる技術。理論によって束縛されることを望まないが、局所的温熱および全身的温熱が、ヒトおよび動物においてＨＳＰの発現を上昇させ得ることが実証されている（Ｌｉら（１９９５）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １１（４）：４５９−４８８）。したがって、５分間〜９０分間にわたる局所的温熱（温度範囲：３８℃〜４５℃）および全身的温熱（体温４２℃未満）を、局所的腫瘍および転移腫瘍を処置するために腫瘍溶解と同期して使用した。
【００６１】
高周波数電磁放射線（例えば、無線周波数（０．１ＭＨｚ〜１００ＭＨｚ）ジアテルミーおよびマイクロ波（１００ＭＨｚ〜２，４５０ＭＨｚ）ジアテルミー）は、その高い効率、深い透過性、容易に制御される投薬量および操作の単純さに起因して、局所的温熱のために最も頻繁に使用される。無線周波数ジアテルミーは深部にある腫瘍に適切であり、マイクロ波ジアテルミーは表層の腫瘍に適する。さらに、超音波ジアテルミーは、表層の腫瘍および深部にある腫瘍の両方に対して使用され得るが、骨またはガスで満たされた腔（例えば、腸もしくは肺）の後ろを含むほとんどの腫瘍については適切でない。本発明について、温熱が、局所および遠位の癌細胞を直接的に殺滅するためには使用されないが、ＨＳＰのより高い発現を誘導するために使用されることに注目すべきである。したがって、本発明において選択される温熱技術は、腫瘍溶解性微生物（例えば、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍溶解性細菌および遺伝子治療のための他のベクター）の腫瘍溶解効率に対して障害を有するべきではない。
【００６２】
理論によって束縛されることを望まないが、ＨＳＰの発現を増大させる他の代替法は、無酸素、放射線、アルコール、エネルギー代謝の特定のインヒビター、グルタミンおよび局所温度または全身温度を上昇させ得かつヒトにとって安全である任意の他の因子によって例示されるがこれらに限定されない。ＨＳＰの発現をアップレギュレートし得る任意の生物学的手段（例えば、ヒート・ショック転写因子、感染など）もまた、癌に対する免疫を惹起するために、腫瘍溶解と同期して使用され得る可能性がある。
【００６３】
腫瘍溶解とＨＳＰの上昇した発現との同期。本発明の実施プロトコルは、上記２つの技術の任意の同期であり得る。１つまたは複数の腫瘍溶解技術と同期されたＨＳＰの発現を上昇させる技術の１つは、原発癌および転移癌を処置するために癌細胞に対する免疫応答を惹起する。
【００６４】
原発癌および転移癌に対する最適化された処置の一態様は、温熱とＥ１ｂ−５５ＫＤ変更を有する改変体アデノウイルスによる腫瘍溶解との同期を含む。温熱はＨＳＰの発現を増大させ、Ｅ１ｂ−５５ＫＤ変更を有する改変体アデノウイルスは、癌細胞を選択的に溶解させる。腫瘍溶解性アデノウイルスが高いレベルで癌細胞を溶解させる場合、機能的ＨＳＰの量もまた高いレベルであるべきである。これら２つの「高いレベル」が同期される場合にのみ、充分なＨＳＰ−ＣＲＡは、癌に対する免疫応答を惹起するために免疫系に充分な免疫原性シグナルを提示する。
【００６５】
理論によって束縛されることを望まないが、以下が実証されている：（１）ＨＳＰの発現を増大させる最適な条件は、３８℃〜４５℃の温度範囲内および１５分間〜９０分間の時間範囲内であること（ＬｉおよびＭａｋ（１９８５）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５（８）：３８１６−３８２４）；（２）ＨＳＰの上昇した発現は、温熱処置の終了後数分で開始し、ＨＳＰの上昇したレベルは、２４時間〜４８時間持続し得ること（Ｌｉ（１９８４）Ｔｈｅｒｍａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｎｅｅｄｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（補遺）４４（８）：４８８６５−４８９３５）；（３）本発明の発明者らは、腫瘍溶解性アデノウイルスの最大の腫瘍溶解効果がウイルス注射の後４日〜１０日で生じることを決定していること。したがって、本発明者らは、ウイルス性の腫瘍溶解とＨＳＰの上昇した発現とを最大限に同期するためのプロトコルを企図している。簡潔なプロトコルは、以下に概説したプロトコルを含む：５日間にわたって１日１回、腫瘍に腫瘍溶解性アデノウイルスを注射すること；および次いで３８℃〜４５℃の温度範囲内で１５分間〜９０分間にわたって、ウイルス注射の腫瘍に温熱を適用すること。温熱処置は、第１のウイルス注射の２日後から開始し、８日間〜１６日間にわたって持続する。
【００６６】
本発明中の一態様は、癌患者の腫瘍中に注射されるＥ１ｂ−５５ＫＤ変更を有する腫瘍溶解性アデノウイルスＳ９８−００１（配列番号１）を含み、無線周波数ジアテルミー（波長範囲４μｍ〜２４μｍ、透過範囲４ｍｍ〜５ｍｍ）がまた、３８℃〜４５℃の温度範囲内で１５分間〜９０分間同じ腫瘍に供され、処置された腫瘍の増殖および処置されていない腫瘍の増殖を制御した。
【００６７】
腫瘍溶解性因子またはＨＳＰの発現を上昇させる因子を送達するために、種々の経路（例えば、腫瘍内注射、非経口投与（筋内注射、静脈内注射および皮下注射を含む）、経口投与ならびに経皮投与、鼻腔内投与および坐剤を介した投与を含む他の全身投与）が使用され得る。これらの組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体、粉末、徐放性調製物、溶液、懸濁物、エアロゾルまたは任意の他の適切な形態であり得る。癌に対する免疫は、腫瘍溶解のための因子およびＨＳＰの発現を増大させる因子の両方を含む組成物または医薬製剤（例えば、腫瘍溶解性ウイルスおよびグルタミンの投薬形態）によって惹起され得る。これらの組成物において使用される賦形剤は、任意の固体、液体、半固体またはエアロゾルの存在下の気体であり得る。
実施例
【００６８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において充分機能するように本発明者らによって示され、したがって、その実施のために好ましい様式を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるはずである。しかし、当業者は、本発明の開示に照らして、多数の変化が開示された特定の実施形態においてなされ得、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様の結果または類似の結果をなお得ることを理解するはずである。
【実施例１】
【００６９】
一般に、アデノウイルスは、ヒトまたは動物において呼吸器、腸および眼の感染を引き起こす、二本鎖ＤＮＡゲノムを有するウイルスのクラスに属する。風邪を引き起こすウイルスはアデノウイルスである。本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子操作されたアデノウイルスＡｄ５改変体を含む。Ａｄ５ウイルスの特定の操作された改変体が本発明のために使用され、この改変体は、Ｓ９８−００１（配列番号１）またはＳ９８−００２（配列番号２）を含む。理論によって束縛されることを望まないが、野生型Ａｄ５によるヒト身体の感染は、内因的に治癒可能であることが知られている。さらに、Ａｄ５アデノウイルスは、遺伝子治療のためのベクターとして慣用的に使用されている。なぜなら、Ａｄ５ゲノムのＤＮＡフラグメントが、ヒト細胞のゲノム中に組み込まれ得るという報告が存在しないからである。したがって、特定の腫瘍溶解性ウイルスを注射することと注射部位の癌およびウイルス注射部位から離れた癌を阻害するための温熱との同期が、本発明において利用される。腫瘍溶解性Ａｄ５改変体が特定の例として使用されるが、他の溶解因子は、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルスもしくは水胞性口炎ウイルス）または腫瘍溶解性細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）または任意のタイプの腫瘍溶解性因子のいずれかを含む。この腫瘍溶解性ウイルス／腫瘍溶解性細菌は、野生型または遺伝子操作された形態のいずれかであり得る。さらに、溶解因子は、治療的遺伝子（例えば、アポトーシス遺伝子、腫瘍壊死についての遺伝子、腫瘍細胞を餓死させるための遺伝子、細胞溶解遺伝子、陰性Ｉ−κ−β、カスパーゼ、γグロブリン、ｈα−１アンチトリプシンまたはアデノウイルスのＥ１ａ）を含み得る。
【００７０】
遺伝子操作されたアデノウイルス改変体Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）。野生型Ａｄ５のゲノム（配列番号３）は、約３５，９３５ｂｐからなる。癌細胞中で選択的に複製し得る、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）と少なくとも９５％の相同性を有する遺伝子操作されたＡｄ５の変異および改変体を、本発明について例として考慮する（図１）。野生型Ａｄ５（配列番号３）を改変体Ｓ９８−００１（配列番号１）と比較する場合の１つの相違点は、この改変体のＥ１ｂ領域中にある位置２０２５での余分なＴＧＡ終止コドンである。Ｓ９８−００１（配列番号１）はまた、以下の２つの欠失を保有する：一方は位置２，５０１と位置３，３２８との間のＥ１ｂ領域中であり；他方は、全Ｅ３領域を含む位置２７，８６５と位置３０，９９５との間である。５５ＫＤのタンパク質が、Ｅ１ｂ領域中のＤＮＡ配列によってコードされる。このタンパク質をＥ１ｂ−５５ＫＤと命名する。正常細胞において、Ｅ１ｂ−５５ＫＤは、腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３によってコードされるタンパク質を結合して不活化し、ウイルス複製を開始する。Ｓ９８−００１（配列番号１）において、Ｅ１ｂ領域におけるこれら２つの変更は、改変体Ｅ１ｂ−５５ＫＤタンパク質の発現を引き起こす。この改変体Ｅ１ｂ−５５ＫＤタンパク質は、ｐ５３タンパク質との非常に低い結合親和性を有する。したがって、Ｓ９８−００１（配列番号１）は、正常細胞中で複製できない。しかし、Ｓ９８−００１（配列番号１）は、ｐ５３タンパク質が機能不全である癌細胞において迅速に複製する。Ｅ３領域の機能は、アデノウイルスが免疫系の監視から逃れる能力に関する。Ｓ９８−００１（配列番号１）におけるＥ３領域の完全な欠失は、免疫系がこのウイルスを識別および排除するのをより容易にする。したがって、Ｓ９８−００１（配列番号１）は、Ｅ１ｂ−５５ＫＤ領域中に変更を有するだけの改変体Ａｄ５ウイルスと比較すると、感染する可能性および正常細胞を溶解させる可能性が低い。癌細胞と正常細胞との間の細胞溶解の比率は、Ｓ９８−００１（配列番号１）について約１００：１〜約１，０００：１の範囲内であることが実証されている。Ｓ９８−００１（配列番号１）は癌細胞のみを溶解させるので、これは腫瘍溶解性ウイルスである。
【００７１】
Ｓ９８−００２（配列番号２）は、別の遺伝子改変された改変体Ａｄ５である。Ｓ９８−００２（配列番号２）は以下の２つの欠失を有する：一方は、位置２５０１と位置３３２８との間のＥ１ｂ−５５ＫＤをコードする領域中であり；そして他方は、全Ｅ３領域を含む位置２７，８６５と位置３０，９９５との間である。Ａｄ５改変体Ｓ９８−００２（配列番号２）を調製する目的は、腫瘍溶解性アデノウイルスの別の実施形態が生成され得ることを実証することである。Ａｄ５の改変体ＤＮＡ配列はヒト・ゲノム中に組み込まれ得ないが、Ａｄ５改変体Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）は、癌細胞中で選択的に複製する。したがって、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）は、ヒトおよび動物における使用について安全である。
【００７２】
腫瘍溶解性Ａｄ５改変体の調製。（１）Ｓ９８ウイルスの構築。ｐＸＣ−１およびｐＢＨＧ１１をＭｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した。ｐＸＣ−１は、５型アデノウイルス（Ａｄ５）配列（ｂｐ２２〜５，７９０）を含む。ｐＢＨＧ１１は、以下の２つの欠失を有するＡｄ５配列を含む：ウイルス・カプシド・タンパク質のパッケージング・シグナルをコードするＥ１領域中のｂｐ１８８〜１３３９；およびＥ３領域の欠失（ｂｐ２７，８６５〜３０，９９５）。ｐＢＨＧ１１は感染性ではない。しかし、ｐＸＣ−１とｐＢＨＧ１１との同時トランスフェクションは、相同組換えに基づいて感染性ウイルスを生じる。
【００７３】
ｐＸＣ−１上のｂｐ１，３３８〜２，５０１のＡｄ５  ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法によって増幅するために、以下の２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを使用した：
ＨＺ１（配列番号４）（５’−ＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＣＧＡＣ−３’）および、
ＨＺ２（配列番号５）（５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＣ−３’；ＢｇｌＩＩ部位に下線を付した）。
【００７４】
次いで、合成されたＤＮＡ配列をベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングして、プラスミドＨＺ１０２を得た。ＨＺ１０３を、ＨＺ１０２のＸｂａ１／ＢｇｌＩＩ消化フラグメントをｐＸＣ−１のＸｂａ１／ＢｇｌＩＩ消化フラグメントに連結することによって構築した。ｂｐ２０２５でｐＸＣ−１上に終止コドンを生成するために、プラスミドＨＺ１０４を、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を用いて生成した。このステップにおいて使用した２つのプライマーは以下であった：
ＨＺ３（配列番号６）（５’−ＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣ−３’）および、
ＨＺ４（配列番号７）（５’−ＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＣ−３’）。
【００７５】
ＨＺ１０４の変化された配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認されている。ＨＺ１０４のＸｂａ１／ＢｇｌＩＩ消化フラグメントをｐＸＣ−１のＸｂａ１／ＢｇｌＩＩ消化フラグメントに連結してＨＺ１０５を生成した。
【００７６】
Ｓ９８ウイルスを、相同組換えによって２つの重複するプラスミドを使用して生成し、次いで、プラークをつつき、ＨＹＨ細胞中で増幅させた。ＨＹＨはＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質の両方を通常発現するので、全てのＳ９８ウイルスは、ＨＹＨ細胞において有効にプラークを形成し得る。ウイルスＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＰＣＲおよびサザン・ブロットによって分析した。
【００７７】
ｐＢＨＧ１１およびＨＺ１０５による細胞系統２９３の同時トランスフェクションにより、Ｓ９８−００１（配列番号１）を生成した。ｐＢＨＧ１１およびＨＺ１０３による同時トランスフェクションによりＳ９８−００２（配列番号２）を生成し、ｐＢＨＧ１１およびｐＸＣ−１による同時トランスフェクションによりＳ９８−１００を生成した。
【００７８】
Ｓ９８−１００はＥ１ｂ領域中に変更を有さず、その結果、これはＥ１ｂ−５５ＫＤを正常に発現するが、そのＥ３領域は欠失されている。結果的に、Ｓ９８−１００は野生型アデノウイルスと同様に複製する。すなわち、Ｓ９８−１００は癌細胞中だけでなく正常細胞中でも複製する。したがって、Ｓ９８−１００は野生型Ｓ９８とみなすべきである。Ｓ９８−１００を陽性対照として使用して、Ｓ９８ウイルスについて腫瘍溶解特異性を決定した。
【００７９】
Ｅ１ｂ領域中の２つの変更（位置２０２５における余分なＴＧＡ終止コドンおよび位置２５０１と位置３３２８との間の欠失）は、タンパク質４９５Ｒ（タンパク質Ｅ１ｂ−５５ＫＤ）をコードするＤＮＡ配列ならびにタンパク質４９５Ｒ合成関連ｍＲＮＡ−１３Ｓ、１４Ｓおよび１４．５ＳをコードするＤＮＡ配列の一部を欠くＳ９８−００１（配列番号１）を作製する。その一方で、位置２５０１と位置３３２８との間のＥ１ｂ領域における欠失は、タンパク質４９５Ｒ（タンパク質Ｅ１ｂ−５５ＫＤ）をコードするＤＮＡ配列の一部を欠くＳ９８−００２（配列番号２）を作製する。したがって、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）は共に、腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３が機能不全である癌細胞中で選択的に複製する。
【００８０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏプラーク形成試験。ｉｎ  ｖｉｔｒｏプラーク形成試験を使用して、ｐ５３欠損細胞におけるＳ９８ウイルスの増殖能を決定した。この一連の試験において使用した細胞系統は以下であった：ＯＶＣＡＲ−３（卵巣のう腫細胞系統、ｐ５３欠損）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝腫細胞系統、ｐ５３欠損）、Ｕ３７３（神経膠腫細胞系統、ｐ５３欠損）、ＳＷ６２０（結腸癌細胞系統、ｐ５３欠損）、ＲＫＯ（結腸癌細胞系統、野生型ｐ５３）、ＨＢＬ−１００（正常胸部細胞系統、野生型ｐ５３）。
【００８１】
Ｓ９８−１００を陽性対照として使用して、Ｓ９８ウイルスについて腫瘍溶解特異性を決定した。Ｓ９８−１００は、癌細胞中および正常細胞中で正常に複製するからである。同様に、ＨＹＨを、試験した細胞系統についての陽性対照として使用した。全てのＳ９８ウイルスはＨＹＨ細胞において有効にプラークを形成するからである。Ｓ９８ウイルスの複製の程度を定量的に比較するために、ＨＹＨ細胞培養物において形成されたＳ９８−１００ウイルスのプラークを、任意に１００と規定した。任意の他のタイプの細胞系統（「Ｚ」）における他のＳ９８ウイルス（「Ｓ９８−ＸＸＸウイルス」）についてのプラーク数を、細胞系統「Ｚ」中のＳ９８−ＸＸＸウイルスから形成されたプラーク数の、ＨＹＨ細胞中のＳ９８−１００のプラーク数に対する百分率として表した。この百分率を以下のように表す：
【００８２】
【数１】
2006519784.tif 000003
【００８３】
したがって、定義により、より多数のウイルス・プラークは、より速いウイルス複製を示す。表１は、ｐ５３欠損を有するヒト癌細胞における遺伝子操作されたＳ９８アデノウイルスの選択的複製が、プラーク形成試験によって測定され得ることを示す。例えば、表１中に示されるように、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）は、ｐ５３欠損を有さない細胞系統中よりも、ｐ５３欠損を有する細胞系統において優勢に速く複製する。例えば、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）は、ＲＫＯ（結腸癌細胞系統、野生型ｐ５３）細胞系統およびＨＢＬ−１００（正常胸部細胞系統、野生型ｐ５３）細胞系統と比較して、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣のう腫細胞系統、ｐ５３欠損）細胞系統、Ｈｅｐ３Ｂ（肝腫細胞系統、ｐ５３欠損）細胞系統、Ｕ３７３（神経膠腫細胞系統、ｐ５３欠損）細胞系統およびＳＷ６２０（結腸癌細胞系統、ｐ５３欠損）細胞系統においてかなりより迅速に複製する。理論によって束縛されることを望まないが、正常なｐ５３を有する細胞において形成されたプラークは、Ｓ９８−１００と比較して、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）についてかなり非常に限定されている。例えば、ＲＫＯ細胞（結腸癌細胞系統、野生型ｐ５３）におけるＳ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）のプラーク数は、Ｓ９８−１００のプラーク数のそれぞれ４７０分の１および２５０分の１にすぎない。同様に、ＨＢＬ−１００細胞（正常胸部細胞系統、野生型ｐ５３）におけるＳ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）のプラーク数は、Ｓ９８−１００のプラーク数のそれぞれ３０００分の１および１０００分の１にすぎない。
【００８４】
【表１】
2006519784.tif 000004
【００８５】
これらのプラーク形成試験の結果は以下であることを示す：（１）Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）は、ｐ５３欠損を有する癌細胞において選択的に複製する；（２）機能的ｐ５３を有する細胞において、Ｓ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）の複製速度は、野生型アデノウイルスと類似の複製速度を有するＳ９８−１００とは対照的に、非常に低い。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験。この一連の試験の目的は、正常細胞に対するＳ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）の毒性を決定することである。ヒト微小血管内皮細胞（ｈＭＶＥＣ）をこれらの試験のために選択した。ｈＭＶＥＣはヒト肺組織に起源し、再生しない初代細胞の１種である。漸増する感染多重度（「ＭＯＩ」）で細胞にＳ９８ウイルスを感染させ、細胞培養物の病理学的状態を連続的に追跡した。野生型アデノウイルスは、０．０１のＭＯＩでのウイルス感染の後１０日で、培養ｈＭＶＥＣの単層を完全に溶解させることが実証された。対照的に、病理学的変化は、０．０１、０．１、１．０および１０のＭＯＩでのＳ９８−００１（配列番号１）またはＳ９８−００２（配列番号２）での感染の１０日後ほど遅くても観察されなかった。したがって、正常細胞に対するＳ９８−００１（配列番号１）およびＳ９８−００２（配列番号２）の毒性は、野生型アデノウイルスよりもかなり低かった。
【実施例２】
【００８７】
本発明の組成物および方法を用いて処置されるべき動物（例えば、ヒトを含む）についての有効な投薬プロトコルを決定するために、５つの用量レベルをＨ１０１（配列番号１）について使用した。組換えアデノウイルスを、進行した固形腫瘍を有する患者への腫瘍内注射によって投与した。１つの目的は、Ｈ１０１（配列番号１）の腫瘍内注射の最大耐用量（「ＭＴＤ」）および安全性を決定することであった。使用したＨ１０１（配列番号１）の５つのレベルを表２に示し、投薬量上昇曲線を図３に示す。５つの別個の用量レベルの各々について３人の患者を含んだ。ＭＴＤは、２人の患者がＤＬＴを経験した用量であるとし、ここで、ＤＬＴは、Ｈ１０１（配列番号１）に起因するインフルエンザ様症候群についてのグレード４の毒性、Ｈ１０１（配列番号１）注射部位での局所的反応についてのグレード４の毒性またはＨ１０１（配列番号１）に起因するグレード３の重症度の任意の他の毒性を含む。３人の患者のうち１人がＤＬＴを有した場合、その集団について合計６人の患者を処置した。
【００８８】
【表２】
2006519784.tif 000005
【００８９】
図４は、種々のタイプの腫瘍を有する１５人の患者を登録したことを示す。効力評価腫瘍査定を、Ｈ１０１（配列番号１）を注射した腫瘍でのみ実施した。なぜならこれは、非従来的な測定を使用した、１．５×１０１２（ウイルス粒子）のレベルでの１の部分的応答（「ＰＲ」）；５．０×１０１１（ウイルス粒子）のレベルで１の最小応答（「ＭＲ」）を有する局所的注射のための産物であるからである。
【００９０】
Ｈ１０１（配列番号１）の投与後の免疫反応および排泄されたＨ１０１の環境影響汚染もまた決定した。Ｈ１０１の投与後に採取した全てのサンプル（口腔咽頭のスワブ、尿を含む）は陰性であった。Ｈ１０１投与の４日後に採取した血漿サンプルは陰性であった。理論によって束縛されることを望まないが、これらのデータは、Ｈ１０１（配列番号１）が、循環中にも尿中にも持続しなかったことを示唆する。
【実施例３】
【００９１】
温熱と同期して腫瘍溶解性ウイルスＳ９８−００１（配列番号１）を使用した癌患者の処置。この患者の生年月日は１９４３年６月１０日であった。この男性患者は、１９９０年に「鼻咽頭癌」と診断された。放射線療法による処置期間の後に、原発腫瘍の進行は臨床的に制御された。しかし、右頚部および上部鎖骨の領域中の２つの腫瘍は、これらの年月の間にゆっくりと進行していた。２００１年後期に、これら２つの腫瘍を、温熱と組み合わせて放射線療法（コバルト６０、ＤＴ  ３４  Ｇｙ／１７Ｆ／２４ｄ）によって処置した。不運にも、これら２つの腫瘍の進行は、これらの処置によって抑制されなかった。この患者は２００２年２月初旬に入院し、この患者についての身体検査を、温熱と同期した腫瘍溶解性ウイルスＳ９８−００１（配列番号１）の投与によって処置する前に実施した。この患者の全般的な身体的状態は良好であったが、その鼻咽頭組織は、結核により厚くなっており、僅かに充血していた。これら２つの腫瘍の表面は粗く、厚くなり硬化していた。これら２つの腫瘍はそれぞれ、４７×２６×２２ｍｍ３および３３×２５×６ｍｍ３の寸法を有しており、腫瘍１および腫瘍２と示された。臨床検査をこの患者に対して実施し、これらの試験の結果は以下のとおりである：血液Ｒｔ−正常；尿Ｒｔ−正常；排泄Ｒｔ−正常；肝臓および腎臓の機能−正常（ＧＬＯ  ２４．２、ＡＬＴ  ４５以外）；細胞免疫学−正常（ＣＤ３  ６０、ＣＤ４  ３９以外）；胸部Ｘ線−正常；超音波−正常（脾臓の僅かな腫大以外）；ＥＣＧ−右脚の完全な遮断；ＣＴ−右頚部および上部鎖骨の２つの大きい腫瘍、境界は不明瞭。
【００９２】
この患者は、右肩および右頚部に転移を有する進行した鼻咽頭癌と診断された。患者の同意を得て、この患者を、温熱と同期したＳ９８−００１（配列番号１）の腫瘍内投与によって処置した。処置過程において、患者の腫瘍１に、この過程の１日目から開始して連続する５日間にわたって、１．０×１０１２ウイルス粒子のＳ９８−００１（配列番号１）を腫瘍内注射した。対照的に、腫瘍２にはＳ９８−００１（配列番号１）を投与しなかった。次いで、腫瘍１を、この過程の２日目から開始して連続する１３日間にわたって、４１℃〜４４℃で９０分間局所的に加熱した。４μｍ〜４２μｍの波長および４ｍｍ〜５ｍｍの透過性を有するスペクトル・ジェネレータを温熱のために使用した。腫瘍１を加熱する一方で、腫瘍２を、この腫瘍に温熱処置が適用されていないことを確実にするために遮蔽した。この過程の２２日目に、この患者の身体的状態を再度調べた。Ｓ９８−００１（配列番号１）の注射および局所的温熱を含む処置は腫瘍１のみに適用したが、腫瘍１（処置された腫瘍）および腫瘍２（処置されていない腫瘍）の両方が可視的に退縮したことが見出された。さらなる測定により、腫瘍１のサイズが、４７×２６×２２ｍｍ３から４４×１８×１０ｍｍ３へと退縮したことが明らかとなった（７０．５％の減少）。より顕著なことに、腫瘍２（処置されていない腫瘍）もまた、３３×２５×６ｍｍ３から２３×１７×５ｍｍ３へと退縮した（５２．６％の減少）。
【００９３】
理論によって束縛されることを望まないが、本発明の利点は、以下のようにまとめられる：（１）温熱によって誘導されるＨＳＰへの患者のＣＲＡの完全な曝露、ならびにその後の、腫瘍溶解性ウイルスによる癌細胞の溶解の際にＨＳＰおよびＤＣによって媒介される免疫系へのＣＲＡの完全セットの提示；（２）癌に対する免疫応答を惹起するための、ＨＳＰの発現と、免疫系に提示されるＣＲＡの充分なシグナルを確実にする腫瘍溶解性ウイルスによる癌細胞の溶解との同期；（３）以前に議論した個別ワクチン接種の２つの技術の冗長な手順を回避する全くのｉｎ  ｖｉｖｏプロセス；（４）全ての腫瘍患者について個々の腫瘍のＣＲＡの完全セットに対する免疫を惹起するために温熱と同期した単一の因子（腫瘍溶解性ウイルス）；（５）この免疫学的治療は、原発腫瘍ならびに転移腫瘍について有効である。
【００９４】
この症例は、温熱と同期した腫瘍溶解が、この処置が直接適用される処置された腫瘍について有効であることを実証している。さらに、この方法は、第１の腫瘍が「処置されて」いるが、処置されていない腫瘍すなわち遠位腫瘍にＳ９８−００１（配列番号１）の注射も温熱も適用されていない場合、遠位腫瘍についても有効である。
【実施例４】
【００９５】
軟骨肉腫。この女性患者は１９８２年に誕生した。２００１年４月に、この患者の左腰部に腫瘍が見出され、手術後、この患者は「難組織肉腫」と診断された。２００１年１０月に、この腫瘍は再発し、サイズが増大した。２００２年２月に、この腫瘍のサイズは、身体検査によって決定したとき２１ｃｍ×３５ｃｍであった。腫瘍生検の病理学により、これが悪性腫瘍であり、おそらく脱分化軟骨肉腫であることが示された。ＣＴにより、腫瘍寸法が１５ｃｍ×１１ｃｍであり、いくつかの近傍の肋骨が糜爛していたことが示された。さらに、右肺の上葉上に、０．６ｃｍ×０．８ｃｍの寸法を有する２つの転移病変が検出された。放射線療法による処置の後、２００２年３月のＣＴにより、腫瘍寸法が１３ｃｍ×１１ｃｍであり、近傍の肋骨が糜爛していたことが示され、右肺の上葉上に、１．０ｃｍ×１．０ｃｍの寸法を有する２つの転移病変が検出された。２００２年３月に、この患者は、ＩＦＯ  ２ｇ  ｄ１〜３＋Ｅ−ＡＤＭ  ４０ｍｇ  ｄ１〜３＋ＤＴＩＣ  ２００ｍｇ  ｄ１〜５のようなレジメンで化学療法により処置された。副作用は患者が耐えられないほど重篤であった。患者の同意を得て、この患者を、２００２年７月から、温熱と同期したＳ９８−００１の腫瘍内投与によって処置した。処置サイクルにおいて、左腰部の腫瘍に、このサイクルの１日目から開始して連続する５日間にわたって５．０×１０１１ウイルス粒子でＳ９８−００１を腫瘍内注射した。約５ＭＨｚ〜約１５ＭＨｚの範囲内の周波数で作動する無線周波数温熱システムを使用して、注射された病変を次いで、このサイクルの６日目から開始して連続する７日間にわたって４１℃〜４４℃で７０分間にわたって局所的に加熱した。２００２年１２月のＣＴにより、腫瘍のサイズが８．０ｃｍ×６．０ｃｍであり（すなわち、６６％の減少）、いくつかの近傍の肋骨が糜爛していたことが示された。右肺の上葉上に、１．０ｃｍ×１．０ｃｍの寸法を有する２つの転移病変が検出された。２００３年７月のＣＴにより、右肺の上葉上の２つの転移病変が消失したことが示された。この症例は、温熱と同期した腫瘍溶解が、この処置が原発腫瘍に直接適用される場合に処置された腫瘍について有効であることを実証する。さらに、この実施例は、本発明の組成物および方法が遠位腫瘍（転移）についても有効であることを実証し、ここで、この遠位腫瘍にはＳ９８−００１が直接注射されておらず、温熱が適用されていない。
【実施例５】
【００９６】
非小細胞肺癌。この男性患者は１９３３年に誕生した。この患者は、２００２年１２月に、病理学的試験の後に「右肺の腺癌」と診断された。病期は、６０のＫＰＳスコアを有するＴ３Ｎ１Ｍ１／ＩＶであった。ＣＴスキャンにより、寸法（３ｃｍ×２ｃｍ）を有する肺の上葉中の腫瘍塊および寸法（１ｃｍ×１ｃｍ）を有する左肺の下葉中の転移病変が検出された。患者の同意を得て、この患者を、２００３年１月から、温熱と同期したＳ９８−００１の腫瘍内投与によって処置した。処置サイクルにおいて、右肺上の腫瘍に、このサイクルの１日目および８日目に、１．５×１０１２ウイルス粒子でＳ９８−００１を腫瘍内注射した。約５ＭＨｚ〜約１５ＭＨｚの範囲内の周波数で作動する無線周波数温熱システムを使用して、注射された病変を次いで、注射後連続する２日間にわたって４１℃〜４４℃で局所的に加熱した。２サイクルの処置の後、ＣＴスキャンにより、左肺の下葉中の転移病変が消失し、注射された病変が安定なままであったことが示された。２００３年１０月の来院時のＣＴにより、左肺の下葉中の転移病変が消失して完全な応答（「ＣＲ」）を示したことが示され、ここで、（３ｃｍ×１ｃｍ、５０％のサイズの減少）の寸法を有する注射された病変の客観的応答は部分的応答（「ＰＲ」）であった。この症例は、温熱と同期した腫瘍溶解が、処置が腫瘍に直接適用される場合に処置された腫瘍について有効であることを実証する。さらに、この方法は遠位腫瘍についても有効である。
【実施例６】
【００９７】
結腸癌。この男性患者は１９８３年に誕生した。この患者は、２００１年４月の根治手術の後に、「結腸（Ｓ字）、小腸および骨盤腔侵襲の癌、デュークＤならびに中等度分化腺腫」と診断された。手術後、２００１年７月から２００２年４月まで、この患者を化学療法によって処置し、ここで、５−ＦＵ、ＣＤＤＰ、ＭＭＣを、レバミゾール、カペシタビン、ＣＰＴ−１１、Ｔａｘｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ化合物およびＣｏｉｘ  ｌａｃｈｒｙｍａｊｏｂｉ油と共に使用した。２００２年１０月に、不完全な腸閉塞の症状と共に、この患者の腹壁上に、３．５ｃｍ×５．０ｃｍのサイズを有する転移病変が見出された。患者の同意の下に、この患者を、２００２年の１１月１２日から１１月１８日まで、温熱と同期したＳ９８−００１の腫瘍内投与によって処置した。処置サイクルにおいて、この原発腫瘍に、１．５×１０１２ウイルス粒子でＳ９８−００１を腫瘍内注射した。次いで、注射された病変を、注射後連続する２日間にわたって、４１℃〜４４℃で７０分間にわたって局所的に加熱した。２００２年１１月２１日から、低投薬量の化学療法を、４サイクルにわたって５−ＦＵ  ０．３  ２４ｈ  ｄ１〜５＋ＤＤＰ  ５ｍｇ  ｄ１〜５＋ＣＰＴ−１１  ０．１  ｄ１，８のレジメンで使用した。１サイクル中に３週間を含めた。２００２年１０月２８日のＣＴにより、寸法３．５ｃｍ×５．０ｃｍを有する腹壁病変、直腸領域腫瘍１．２ｃｍ×１．０ｃｍ（処置前）が示された。２００２年１２月３０日に、腹壁病変が３．７ｃｍ×２．０ｃｍまで減少し、直腸領域腫瘍が寸法１．２ｃｍ×１．０ｃｍを有することが示された。２００３年２月１１日のＣＴにより、腹壁病変が２ｃｍ×２．５ｃｍまで減少し、直腸領域腫瘍が１．２ｃｍ×１．４ｃｍまで減少したことが示された。２００３年１月２０日のＣＴおよび２００３年２月２１日のこの領域の微細針生検により、腹壁病変および直腸領域腫瘍の両方が肉芽組織の増殖にすぎず、癌細胞が見出されなかったことが示された。この患者の症状は緩和され、この患者は通常の食餌に移行した。この症例は、温熱と同期した腫瘍溶解が、処置が直接適用される場合に処置された腫瘍について有効であることを実証する。さらに、この方法は遠位腫瘍についても有効である。
【００９８】
理論によって束縛されることを望まないが、本発明の組成物および方法の利点は以下のようにまとめられる：（１）温熱によって誘導されるＨＳＰへの患者のＣＲＡの完全な曝露、ならびに腫瘍溶解性ウイルスによる癌細胞の溶解の際にＨＳＰおよびＤＣによって媒介される免疫系へのＣＲＡの完全セットの引き続く提示；（２）癌に対する免疫応答を惹起するための、ＨＳＰの発現と、免疫系に提示されるＣＲＡの充分なシグナルを確実にする腫瘍溶解性ウイルスによる癌細胞の溶解との同期；（３）以前に議論した個別ワクチン接種の２つの技術の冗長な手順を回避する全くのｉｎ  ｖｉｖｏプロセス；（４）全ての腫瘍患者について個々の腫瘍のＣＲＡの完全セットに対する免疫を惹起するために温熱と同期した単一の因子（腫瘍溶解性ウイルス）；（５）この免疫学的治療は、原発腫瘍ならびに転移腫瘍について有効である。
【００９９】
引用文献
以下の米国特許文献および刊行物が、本明細書中で参考として援用される。
【０１００】
米国特許文献
米国特許第５６７７１７８号、１９９７年１０月発行、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋらが発明者として列挙される。
【０１０１】
米国特許第５７５０１１９号、１９９８年５月発行、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらが発明者として列挙される。
【０１０２】
米国特許第５７８８９６３号、１９９８年８月発行、Ｍｕｒｐｈｙらが発明者として列挙される。
【０１０３】
米国特許第６０１７５４０号、２０００年１月発行、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらが発明者として列挙される。
【０１０４】
他の刊行物
Ａｌｅｍａｎｙら（２０００）Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：７２３−７２７
Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８）Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１
ＢａｒｋｅｒおよびＢｅｒｋ（１９８７）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ１Ｂ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｏｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６：１０７−２１
Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９９）Ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｈａｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎ  ｐ５３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：３７３−６
ＢａｓｕおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ（２０００）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ  ｆｏｕｎｔａｉｎｈｅａｄ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  ＆  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ５：４４３−４５１
Ｂｅｒｍｕｄｅｓら（２００２）Ｌｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．５（２）：１９４−９
ＦａｌｋおよびＩｓｓｅｌｓ（２００１）Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １７：１−１８
ＦｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｍａｎ（２０００）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２４５−２７３
Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：５５８−５６１
ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ（２０００）．Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  １００．５７−７０
Ｈａｖｉｖら（２００１）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ａｎｄ  Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｉ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：８３６１−８３６５
Ｈａｗｋｉｎｓら（２００２）Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３：１７−２６
Ｈｏｂｏｈｍ（２００１）Ｆｅｖｅｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：３９１−３９６
Ｋｉｒｎら（２００１）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｒｉｓｋ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ７：７８１−７８７
Ｋｕｇｌｅｒら（２０００）Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：３３２−３３６
Ｌｉ（１９８４）Ｔｈｅｒｍａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｎｅｅｄｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（補遺）４４（８）：４８８６５−４８９３５
ＬｉおよびＭａｋ（１９８５）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５（８）：３８１６−３８２４
Ｌｉら（１９９５）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １１（４）：４５９−４８８
ＬｉｎｄｑｕｉｓｔおよびＣｒａｉｇ（１９８８）Ｔｈｅ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ；２２：６３１−７７．
Ｎｅｓｔｌｅら  １９９８  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−  ｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８−３３２
ＲｉｅｓおよびＫｉｒｎ（２００２）ＯＮＹＸ−０１５：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ８６：５−１１
ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＪａｉｋａｒｉａ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５６：１７５−１８６
ｖａｎ  Ｒｉｊｎら（２０００）Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｚｅｔｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １６：３０５−３１８
Ｗａｌｌｅｎら（１９９７）Ｏｘｉｄａｎｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １３：５１７−２４
Ｗｅｌｃｈ（１９９２）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２（４）：１０６３−８１．
Ｗｉｓｃｈｍｅｙｅｒ（２００２）Ｇｌｕｔａｍｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １８：２２５−２２８
Ｙｉｎｇら（２００１）Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １５：８１９−３１
Ｚｙｌｉｃｚら（２００１）ＨＳＰ７０  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０：４６３４−４６３８
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】遺伝的に改変されたＳ９８アデノウイルスの図解を示す図である。
【図２】正常細胞における遺伝的に改変されたＳ９８アデノウイルスの複製を示す図であり、図中、ＭＯＩは感染多重度の略号である。
【図３】Ｈ１０１（配列番号１）について使用した５つの用量レベルについての、腫瘍内注射投薬量上昇曲線を示す図である。
【図４】投薬量上昇曲線を決定するための研究に登録した腫瘍患者の数およびタイプを示す図である。
【図１】
2006519784.tif 000006
【図２】
2006519784.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月1日(2005.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの腫瘍部位を有する対象において腫瘍細胞を除去するための方法であって、
（ａ）溶解条件下で、少なくとも１つの腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された腫瘍を形成するステップ；および
（ｂ）前記処置された腫瘍に充分なｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された腫瘍を形成するステップ、
を含み、前記対象がヒトまたは動物である方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に行われるか、または前記腫瘍に前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが、前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップの前に行われるか、または前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップおよび前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させるステップの後であるが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に、第１の時間待機するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下の方法ステップ：
（ａ）前記処置された腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで前記溶解因子と接触させるステップ；
一定の時間待機するステップ；および
（ｂ）前記処置された腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップ、
を第１の回数反復するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の回数が１回から約５回の範囲内である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の時間が約１日間から約１０日間である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記処置された腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を第２の回数適用するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の回数が約１回から約１６回の範囲内である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激を適用するステップが、約１５分間から約９０分間にわたる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が、鼻咽頭癌、軟骨肉腫、結腸癌、デュークＤおよび非小細胞肺癌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、小細胞肺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、腹水症または黒色腫の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解因子が、前記腫瘍細胞中で複製しかつ非腫瘍細胞中で複製から阻害されている単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、機能的ウイルス性オンコプロテインを有さないアデノウイルスを含み；前記腫瘍細胞が、機能的ｐ５３遺伝子産物または機能的ＲＢ遺伝子産物を欠く、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能的ウイルス性オンコプロテインが、ｐ５３結合タンパク質またはＲＢ結合タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶解因子が、配列番号１と少なくとも９５％同一の配列または配列番号２と少なくとも９５％同一の配列を有する単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、単離された単純疱疹ウイルス、単離されたレオウイルス、単離されたニューカッスル・ウイルス、単離されたポリオウイルス、単離された麻疹ウイルスまたは単離された水胞性口炎ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解因子が腫瘍溶解性細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍溶解性細菌が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶解因子が、アポトーシス遺伝子、細胞溶解遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、陰性Ｉ−κ−β遺伝子、カスパーゼ遺伝子、γ−グロブリン遺伝子またはｈα−１アンチトリプシンを含む遺伝子をコードする単離された核酸発現構築物を含み、前記コードされた遺伝子が腫瘍溶解の目的のために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が、前記対象についての正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内の局所的温熱を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が高周波数電磁パルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が無線周波数ジアテルミーを含み、前記無線周波数が０．１ＭＨｚから１００ＭＨｚの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激がマイクロ波ジアテルミーを含み、前記マイクロ波が１００ＭＨｚから２，４５０ＭＨｚの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記刺激が超音波ジアテルミーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が全身的温熱を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記刺激が、無酸素処置、放射線処置、アルコール処置もしくはグルタミン処置、または感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記刺激された腫瘍が、前記刺激を適用するステップの前の前記腫瘍のレベルと比較して上昇したレベルで少なくとも１種のシャペロン・タンパク質を発現し、前記シャペロン・タンパク質がヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒート・ショック・タンパク質が、ＨＳＰ７０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも第１の腫瘍および遠位腫瘍を有する対象において腫瘍細胞を除去するための方法であって、
（ａ）溶解条件下で、前記第１の腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させて、処置された第１の腫瘍を形成するステップであって、前記遠位腫瘍は前記溶解因子と接触させないステップ；および
（ｂ）前記処置された第１の腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用して、刺激された第１の腫瘍を形成するステップであって、前記遠位腫瘍は刺激されないステップ、
を含み、前記対象がヒトまたは動物である方法。
【請求項３０】
前記第１の腫瘍の前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に行われるか、または前記腫瘍に前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが、前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップの前に行われるか、または前記腫瘍細胞を溶解因子と接触させるステップおよび前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップが同時に行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで溶解因子と接触させるステップの後であるが、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップの前に、第１の時間待機するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
以下の方法ステップ：
（ａ）前記第１の腫瘍中の前記腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで前記溶解因子と接触させるステップ；
一定の時間待機するステップ；および
（ｂ）前記処置された第１の腫瘍に前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を適用するステップ、
を第１の回数反復するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の回数が１回から約５回の範囲内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の時間が約１日間から約１０日間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記処置された第１の腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏ刺激を第２の回数適用するステップを反復するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の回数が約１回から約１６回の範囲内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記刺激を適用するステップが、約１５分間から約９０分間にわたる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の腫瘍が、鼻咽頭癌、軟骨肉腫、結腸癌、デュークＤまたは非小細胞肺癌であり、前記遠位腫瘍がそれらの転移を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の腫瘍の前記腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、悪性肝腫、食道の癌、小細胞肺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、腹水症または黒色腫の細胞であり、前記遠位腫瘍がそれらの転移を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶解因子が、前記腫瘍細胞中で複製しかつ非腫瘍細胞中で複製から阻害されている単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、機能的ウイルス性オンコプロテインを有さないアデノウイルスを含み；前記腫瘍細胞が、機能的ｐ５３遺伝子産物または機能的ＲＢ遺伝子産物を欠く、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記機能的ウイルス性オンコプロテインが、ｐ５３結合タンパク質またはＲＢ結合タンパク質を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶解因子が、配列番号１と少なくとも９５％同一の配列または配列番号２と少なくとも９５％同一の配列を有する単離された腫瘍溶解性ウイルスを含み；前記溶解条件が感染条件を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離された腫瘍溶解性ウイルスが、単離された単純疱疹ウイルス、単離されたレオウイルス、単離されたニューカッスル・ウイルス、単離されたポリオウイルス、単離された麻疹ウイルスまたは単離された水胞性口炎ウイルスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記溶解因子が腫瘍溶解性細菌を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍溶解性細菌が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＹｅｒｓｉｎｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶解因子が、アポトーシス遺伝子、細胞溶解遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、陰性Ｉ−κ−β遺伝子、カスパーゼ遺伝子、γ−グロブリン遺伝子またはｈα−１アンチトリプシンを含む遺伝子をコードする単離された核酸発現構築物を含み、前記コードされた遺伝子が腫瘍溶解の目的のために使用される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が、前記対象についての正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内の局所的温熱を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が高周波数電磁パルスを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が無線周波数ジアテルミーを含み、前記無線周波数が０．１ＭＨｚから１００ＭＨｚの範囲内である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激がマイクロ波ジアテルミーを含み、前記マイクロ波が１００ＭＨｚから２，４５０ＭＨｚの範囲内である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記刺激が超音波ジアテルミーを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激が全身的温熱を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５４】
前記刺激が、無酸素処置、放射線処置、アルコール処置もしくはグルタミン処置、または感染である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５５】
前記刺激された第１の腫瘍が、前記刺激を適用するステップの前の前記腫瘍のレベルと比較して上昇したレベルで少なくとも１種のシャペロン・タンパク質を発現し、前記シャペロン・タンパク質がヒート・ショック・タンパク質（「ＨＳＰ」）を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヒート・ショック・タンパク質が、ＨＳＰ７０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
遠位鼻咽頭癌および第１の鼻咽頭癌を有する対象において前記遠位鼻咽頭癌を収縮させるための方法であって、
（ａ）前記第１の鼻咽頭癌を単離された腫瘍溶解性アデノウイルスと接触させて、処置された癌を形成するステップ；
（ｂ）第１の時間待機するステップ；
（ｃ）前記処置された癌に第２の時間にわたって刺激を適用するステップであって、前記刺激が、前記対象の正常体温を約１℃から約７℃上回る範囲内で、前記処置された癌の局所温度を上昇させるステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を第１の回数反復するステップ；ならびに
（ｅ）ステップ（ｃ）を第２の回数反復するステップを含み、
前記第１の時間が約１日間から約１０日間の範囲内であり、前記第２の時間が約１５分間から約９０分間であり、前記第１の回数が１回から約５回の範囲内であり、前記第２の回数が約１回から約１６回の範囲内である方法。
【請求項５８】
前記単離された腫瘍溶解性アデノウイルスが配列番号１または配列番号２を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記刺激が前記処置された癌に限局され、前記刺激が、高周波数電磁パルス、０．１Ｍｈｚから１００Ｍｈｚの範囲内の無線周波数、１００Ｍｈｚから２，４５０Ｍｈｚの範囲内のマイクロ波ジアテルミーまたは超音波ジアテルミーからなる群から選択され、前記刺激が前記第１の腫瘍中のシャペロン・タンパク質のレベルを増大させ、前記シャペロン・タンパク質がＨｓｐ７０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６またはＨｓｐ１１０である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号１と少なくとも９５％同一の配列または配列番号１の縮重改変体を含む、単離された核酸。
【請求項６１】
配列番号２と少なくとも９５％同一の配列または配列番号２の縮重改変体を含む、単離された核酸。
【国際調査報告】
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