(57)【要約】本発明は、ブドウ球菌の壁テイコイン酸（ＷＴＡ）を含むワクチン；ＷＴＡに特異的に結合する抗体を含むワクチン；ＷＴＡ欠失ブドウ球菌生物；および、ブドウ球菌に感染していることが疑われる患者を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のブドウ球菌感染を治療する方法であって、患者の鼻孔に、ＷＴＡに特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを含む組成物の治療有効量を点滴注入することを含み、その治療により定着が緩和またはブロックされる、前記方法。
【請求項２】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合する複数種のＭＡｂを含み、前記ＭＡｂのアミノ酸配列は同一ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するキメラ抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するヒト化抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するヒト抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の抗ブドウ球菌薬の点滴注入をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ブドウ球菌薬は、リソスタフィンおよびナイシンから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブドウ球菌感染は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳＦｖ、および、ｓｃＦｖから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ブドウ球菌感染は、Ｓ．アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
患者の鼻孔に、可溶性型のＷＴＡ全体またはＷＴＡのフラグメントを含む組成物の治療有効量を点滴注入することを含み、その治療により定着が緩和またはブロックされる、患者のブドウ球菌感染を治療する方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の抗ブドウ球菌薬の点滴注入をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ブドウ球菌薬は、リソスタフィンおよびナイシンから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ブドウ球菌感染は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ブドウ球菌感染は、Ｓ．アウレウス感染である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＷＴＡに特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントの治療有効量を含む組成物であって、前記抗体またはそれらのフラグメントは、患者へ投与されるとブドウ球菌の定着を緩和またはブロックする、前記組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合する複数種のＭＡｂを含み、前記ＭＡｂのアミノ酸配列は同一ではない、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するキメラ抗体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するヒト化抗体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、ＷＴＡに特異的に結合するヒト抗体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
前記フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳＦｖ、および、ｓｃＦｖから選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ブドウ球菌の定着は、Ｓ．アウレウス感染を引き起こす、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２８】
（ａ）請求項１８に記載の組成物；および、
（ｂ）製薬上許容できるキャリアー、
を含むワクチン。
【請求項２９】
前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記ブドウ球菌の定着は、Ｓ．アウレウス感染を引き起こす、請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３１】
可溶性型のＷＴＡ全体またはそれらのフラグメントの治療有効量を含む組成物であって、前記ＷＴＡまたはそれらのフラグメントは、患者へ投与されるとブドウ球菌の定着を緩和またはブロックする、前記組成物。
【請求項３２】
前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ブドウ球菌の定着は、Ｓ．アウレウス感染を引き起こす、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
（ａ）請求項３１に記載の組成物；および、
（ｂ）製薬上許容できるキャリアー、
を含むワクチン。
【請求項３５】
前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
前記ブドウ球菌の定着は、Ｓ．アウレウス感染を引き起こす、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３７】
構築の際にｔａｇＯ遺伝子が不活性化された、単離された構築されたＷＴＡ欠失Ｓ．アウレウス生物。
【請求項３８】
ΔｔａｇＯである、請求項３７に記載の単離されたＳ．アウレウス生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本願は、２００２年１２月２日付で出願された米国仮出願第６０／４３０，２２５号を基礎にしており、その利益を主張する。この仮出願の全体の開示は参照により本発明の開示に含まれる。
【０００２】
発明の記述
本発明は、免疫学および感染症の分野において、グラム陽性細菌に特異的な抗体、特に表面に壁テイコイン酸（Wall Teichoic Acid: ＷＴＡ）を有する細菌に関する。本発明は、ポリクローナル抗体を含む。本発明はまた、モノクローナル、キメラおよびヒト化抗体、同様に、それらのフラグメント、領域および誘導体も含む。本発明はさらに、ＷＴＡ欠失グラム陽性細菌に関する。本発明はまた、ＷＴＡで構成されるワクチン、および、ＷＴＡに特異的な抗体で構成されるワクチンに関する。本発明の抗体はまた、治療用途だけでなく、診断および予防用途に用いることもできる。
【０００３】
発明の背景
細菌感染と戦う物質の検索は、時間がかかり骨の折れるものであった。切断術に伴う敗血症が死亡率の５０パーセントに関連していた時代から、我々は抗生物質の開発を行ってきた。しかしながら、今日の問題は、スタフィロコッカス属の仲間などの抗生物質耐性細菌の発生が増加していることである。
【０００４】
ブドウ球菌は、ヒトや動物によく定着し、ヒトの病的状況や死亡の重要な原因であるため、特にやっかいである。ブドウ球菌は皮膚や粘膜の内面へ蔓延するために、ブドウ球菌は完全に配置され、局所感染と全身感染の両方を起こす。ブドウ球菌のなかでも、Ｓ．アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，コアグラーゼ陽性菌）、および、Ｓ．エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，コアグラーゼ陰性種）の両方が最も問題が多い。
【０００５】
実際に、Ｓ．アウレウスは、最も毒性の高いスタフィロコッカスであり、正常な患者や免疫無防備状態の患者の両方において、重度の、場合によっては致死性の病気を引き起こす。高い病原性を有するブドウ球菌種のＳ．アウレウスはしばしば、初期の生態的地位としてヒトの前鼻孔で発見される。Ｓ．アウレウスの鼻での定着は、Ｓ．アウレウス感染罹患に関する重要な危険因子であり、多剤耐性Ｓ．アウレウスが集団に蔓延する媒体であることがよく証明されている。
【０００６】
免疫応答に欠陥のある患者、または、異物を体に装着することが治療に含まれている患者（例えば、連続的な通院で腹膜透析を受けている患者、および、中心静脈カテーテルを通じて非経口栄養を摂取している患者）において、Ｓ．エピデルミディスは、病院での（院内）感染の主要な原因となりつつある（６４）。実際に、現在Ｓ．エピデルミディスは、新生児の院内の敗血症の共通の原因と認識されており、非経口栄養を摂取していた未熟児で感染が頻繁に起こる。その上、ここ数年、新生児の感染におけるＳ．エピデルミディスの関与が劇的に増加しており、実際に、誕生後の７日またはそれ以上で、乳児１０人に１人が細菌性の敗血症と診断され（産後に細菌に晒されたことを示す）、そのうち６人がＳ．エピデルミディスに感染している。新生児における未治療のスタフィロコッカス感染により、２〜３日のうちに多臓器不全や死に陥る可能性がある。抗生物質はほんの部分的に有効ではあるが、不幸にも、スタフィロコッカスの多剤耐性株が増加することにより、抗生物質治療の有効性が次第に低くなる。
【０００７】
抗生物質耐性の問題は、一般誌で話題になるほど深刻である。例えば、Ｔｈｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｐｏｓｔ，“Ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｓｈｏｗ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，”１９９７年５月２９日；Ｔｈｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｔｉｍｅｓ，“Ｄｅａｄｌｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｕｔｗｉｔｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，”１９９７年５月２９日を参照。加えて、この関心は、科学文献から生じている。Ｌ．Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｔｈｅ  Ｃｏｍｉｎｇ  Ｐｌａｇｕｅ，“Ｔｈｅ  Ｒｅｖｅｎｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍｓ  ｏｒ  Ｊｕｓｔ  Ｋｅｅｐ  Ｉｎｖｅｎｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ”１３章，４１１〜４５６頁，Ｆａｒｒａｒ，ＳｔｒａｕｓおよびＧｉｒｏｕｘ，ＮＹ編（１９９４年）を参照。ある研究において、敗血症の幼児の血液培養物から単離されたブドウ球菌のほとんどが、複数の抗生物質に耐性であった（３３）。その他の研究では、メチシリン耐性のＳ．アウレウスを説明している（７５）。臨床的に隔離されているなかでの抗生物質耐性の出現は、治療を困難にすることに疑いはない（４７）。
【０００８】
上述したように、ブドウ球菌感染は、依然として主要な健康上の問題であり、ほとんどの利用可能な抗生物質に対してブドウ球菌は新たな耐性を獲得するため、その代わりのアプローチが必要なのは明らかである。ブドウ球菌感染と戦うための少なくとも３つの戦略がそれら自体にある。まず初めに、体は、それ自体の免疫系によって感染を撃退するようになっているが、これは、ワクチンによって達成されてもよい。第二に、病原体の感染プロセスを数段階のプロセスで妨害することができる。例えば、感染プロセスが開始する機会すら与えないように、病原体による最初の付着／定着を防いでもよい。第三に、定着してしまった感染は、様々な手段によって処理することができ、このような手段としては、これらに限定されないが、抗生物質が挙げられ、病原体を除去することができる。しかしながら、薬物ベースの治療に対して生じた耐性により、有効性が低くなる。ワクチン開発または付着／定着予防の戦略は、以下で示すように、実行可能な代替法に留まっている。
【０００９】
ワクチン：抗体を直接的に患者に投与してもよい。あるいは、細菌または細菌の成分と特異的に反応する抗体の生産を刺激する抗原組成物を患者にワクチン注射することによって、抗体を誘導してもよい。抗体は、細菌上の抗原を認識し、それに結合することによって細菌の攻撃に対して防御し、それによって、食細胞活動というプロセスによる細菌の除去または「排除」を促進することができ、このプロセスにおいて、食細胞（主として好中球およびマクロファージ）は、感染された細菌を同定し、それを取り込み、続いて破壊する。抗体はまた、いくつかの重要な宿主／病原体の相互作用をブロックすることによって感染プロセスを妨害する作用を有していてもよい。しかしながら、細菌は、食細胞活動を回避するメカニズムを発達させており、このようなメカニズムとしては、例えば、食細胞が付着できないような「莢膜(capsule)」の生産、または、実際に侵入した食細胞を蝕むような毒素の生産が挙げられる。抗体は、例えば、毒素に結合して毒素を中和することによって、これらの防御に打ち勝つ。さらに重要なことには、オプソニン作用というプロセスにおいて、抗体そのものが莢膜に結合して莢膜をコーティングし、それによって、食細胞に対する細菌の感受性を極端に高くし、それらの血流からの排除速度を高めてもよい。
【００１０】
しかしながら、文献において、受動的に投与された抗体、または、ワクチン注射によって誘導された抗体の使用に混乱をもたらす対立する報告がなされている。例えば、Ｆａｔｔｏｍ等の免疫化研究によれば、Ｓ．アウレウスやその他の莢膜が形成されたグラム陽性細菌、例えばストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）と同様に、Ｓ．エピデルミディスのオプソニン作用は、特定の莢膜のタイプに関連するということが示されている（２９）。その他の研究において、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ等は、Ｓ．エピデルミディスの、オプソニン性モノクローナル抗体を誘導する表面タンパク質を同定した（８８）。Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ等はまた、非相同なＳ．エピデルミディス株に結合するその他のモノクローナル抗体も同定したが、生産された相同な株に対するモノクローナル抗体だけがオプソニン抗体であり、従って、オプソニン作用は、相同な株に対してのみ高められたが、異種株では高められなかった。従って、Ｆａｔｔｏｍ等とＴｉｍｍｅｒｍａｎ等の研究、および、当分野におけるその他の研究（我々の研究所の、米国特許第５，５７１，５１１号および５，９５５，０７４号に記載の研究とは異なって）に基づけば、Ｓ．エピデルミディスの複数の株とＳ．アウレウスに広い反応性を有する抗体が、いずれの株に対してもオプソニン活性を有するとは考えにくい。これは特に、コアグラーゼ陽性と、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方に結合する抗体に当てはまる。
【００１１】
さらに問題を難しくしているのは、ブドウ球菌上の共通の表面抗原の役割が不明確なことである。例えば、Ｓ．アウレウスの細胞壁のほとんどがリポテイコイン酸およびテイコイン酸で構成されているのにも関わらず、リポテイコイン酸およびテイコイン酸に対する抗体を防御的に扱っている先願はない。実際には、抗テイコイン酸抗体はしばしば、コントロールとして用いられてきた。例えば、Ｆａｔｔｏｍ等は、テイコイン酸、および、Ｓ．ホミナス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｕｓ）に対して誘導された抗体をコントロールとして用いて、Ｓ．エピデルミディスの型特異的な莢膜の多糖類に対して誘導された抗体のオプソニン活性を試験している。野生型に特異的な抗体は高いオプソニン活性を有しており、抗テイコイン酸抗体は、抗Ｓ．ホミナス抗体とは機能的に異なっていなかった（２９）。
【００１２】
同様に、Ｋｏｊｉｍａ等において、その著者等は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌によるカテーテル関連の菌血症に対する、莢膜の多糖類に対する抗体の防御作用／付着を評価し、特に、コントロールとして、テイコイン酸を発現するＳ．エピデルミディス株を用いた（（４４）；４３６頁の「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」の左の欄の第一段落；右の欄の第三段落を参照）。その後の研究で、Ｔａｋｅｄａ等（８６）において著者等は、抗テイコイン酸抗体の有用性に対してより明白な結論に到達している：
ＰＳ／Ａではなくテイコイン酸に対する抗体を惹起するように設計された免疫化プロトコールは、菌血症または心内膜炎に対する防御を生じなかった（８６）。
【００１３】
従って、グラム陽性細菌、特にブドウ球菌（例えばＳ．アウレウスおよびＳ．エピデルミディス）による感染に対する防御における抗体の役割は不明確であるため、当業界において、このような細菌感染に対して防御するため、および、このような感染に対するこのような抗体の役割の解明を助けるためのポリクローナルおよびモノクローナル抗体が必要である。
【００１４】
付着／定着の防止：様々な病原性ブドウ球菌種が、それらの病原性プロセスにおける第一工程として、宿主の要素または人工的な表面へ付着する。この患者と病原体との最初の相互作用をブロックすることは、感染を予防する有効な方法である。ブドウ球菌の患者への最初の付着に関与する多くのブドウ球菌の要素が同定されているが、患者と病原体との相互作用の多くは未だ解明されていない。
【００１５】
ブドウ球菌感染は、特に病院、学校および診療所のような環境において、病的状況や死亡の重要な原因である。特に危険な状態の患者としては、幼児、年配の人、免疫無防備状態の人、免疫抑制された人、および、頻繁な病院滞在が必要な慢性的な症状を有する人が挙げられる。さらに、スタフィロコッカス・アウレウスの多剤耐性株の出現により、このような感染を適切なタイミングでブロックすることと、それらの治療に対する懸念と必要性が高まっている。実際に、近年の世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）による「Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  Ａｓｔｉｏｎｉｃｒｏ  Ｏｒａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」というタイトルの報告に、薬剤耐性のレベルの増加は、ここ数十年の医療の進歩を蝕む脅威であるという懸念が詳述されている。その問題のなかでも、入院患者における感染が高まっている。米国だけでも、毎年約１４，０００人の人が病院で獲得した薬剤耐性微生物に感染しており（いわゆる院内感染）、死亡している。世界的に、院内感染の６０％もが、薬剤耐性微生物が原因である。
【００１６】
Ｓ．アウレウスによって生じる感染において、Ｓ．アウレウスの主要な生態的地位および貯蔵庫は、ヒトの前鼻孔のようである。ブドウ球菌の鼻の保菌(carriage)は、感染の疫学と病因論において主要な役割を果たす（１２、３０、４２、５９、８７、９１、９２、９４）。健康な被検体において、Ｓ．アウレウスの鼻の保菌は、時間経過で３パターンに分類することができる：約２０％の人は持続性のキャリアーであり、約６０％の人は断続的なキャリアーであり、約２０％の人は見かけ上はＳ．アウレウスのキャリアーではない（４２）。
【００１７】
ブドウ球菌の鼻の保菌は、Ｓ．アウレウス感染の罹患に関する重要な危険因子である。最大の危険状態にある患者としては、入院または外来で外科手術を受けた患者、集中治療室（ＩＣＵ）に入っている患者、連続的な血液透析を受けている患者、ＨＩＶに感染した患者、ＡＩＤＳ患者、やけどの被害者、治療または病気によって先天免疫が衰えた人、慢性的に病気状態の患者または衰弱した患者、老人病の人、免疫系が未成熟な幼児、および、血管内に装置を有する人が挙げられる（１２，３０，３５，４２，４３，５２，５９，９２，９４）。ＩＣＵ患者のある研究によれば（２０）、入院時、患者７５２人のうち１６６人（２２％）がＳ．アウレウスの鼻のキャリアーであったことが発見された。これらの患者のブドウ球菌感染を発症させる確率は、ノンキャリアーに比べて顕著に大きかった（ｐ＜０．０００１，相対的な危険度は５９．６）。引き続きブドウ球菌に感染した３０ケースのうち２８ケースにおいて、鼻孔に定着しているＳ．アウレウス株と、感染から単離された株との同一性が発見された。さらにより著しいのは、Ｍｅｓｔ等（５６）により、４６５人のブドウ球菌の鼻の保菌に関して陰性の患者群のうちＳ．アウレウス感染はわずか６人（１．３％）であったことに対して、ＩＣＵに入っている１９人のＳ．アウレウスに関して鼻の培養物が陽性の患者のうち５人（２６％）が引き続きブドウ球菌感染を発症させたことが示されている。
【００１８】
Ｃｈａｎｇ等（１１）は、肝臓に移植ユニットを入れた８４人の肝硬変患者を研究した。全体で３９人（４６％）がＳ．アウレウスの鼻のキャリアーであり、これらの患者の２３％が引き続きＳ．アウレウス感染を発症させた（ノンキャリアーではわずか４％であった）。ＨＩＶ患者の研究（５９）によれば、患者の４９％（２９６人中の１１４人）が、Ｓ．アウレウスに関して陽性の鼻の培養物を少なくとも１つ有していたことが示された。２０１人の患者の３４パーセントが鼻のキャリアーとみなされ、これらの３８％が持続性のキャリアーであり、６２％が断続的なキャリアーであった。Ｓ．アウレウス感染の２１のエピソードが、これらの患者のうち１３人で生じた。分子的に株を分類したところ、７人の感染した患者のうち６人において、感染した部位から単離されたＳ．アウレウス株が、以前に鼻孔から培養されたものと同一であったことが示された。鼻のＳ．アウレウスのキャリアー患者は、Ｓ．アウレウス感染を発症させる傾向が相当に強い（Ｐ＝０．０４；確率＝３．６；寄与危険度危険＝０．４４）。この発見により、著者等は、ＨＩＶ患者において、鼻の保菌は、Ｓ．アウレウス感染に関する重要な危険因子であると結論付けた（５９）。
【００１９】
上述したように、抗生物質耐性は、依然としてブドウ球菌感染における主要な問題であり、同様に、これらの株の初期の生態的地位は前鼻孔である。メチシリン耐性のＳ．アウレウス（「ＭＲＳＡ」）は、十分に立証された公共の健康上の問題である。療養施設で行われたある研究において、居住者の２９％が鼻孔にＳ．アウレウスを保有しており、その単離したもの３１％がＭＲＳＡであった（４７）。別の術後の腹腔内感染の研究において、ＭＲＳＡが術後の腹腔内感染の原因となる病原体である可能性があり、これは、鼻での定着に関連する可能性がある、と結論付けられた（３０）。
【００２０】
現在の技術は、鼻でのブドウ球菌定着を除去するためにムピロシン軟膏を使用している。実際に、抗生物質様のムピロシンは、鼻腔内の抗菌剤として、Ｓ．アウレウスのメチシリン感受性と耐性株との両方の鼻の保菌の根絶にうまく用いられてきた（２３，３０，５２，８１，９２）。しかしながら、多くの異なる地域でＳ．アウレウスのムピロシン耐性株が出現している（１３，１９，２２，５１）。
【００２１】
これまでに、鼻での定着に関与するブドウ球菌の要素はわかっていなかった。現在、ＷＴＡ（ペプチドグリカンに共有結合した複合表面が露出したポリマー）、は、Ｓ．アウレウスの鼻での定着に重要であることが発見された。これは、ブドウ球菌の鼻での定着に重要な要素の初めての実証である。ＷＴＡは、Ｓ．エピデルミディスおよびその他のタイプの細菌の生存に重要であることが示されてはいたが、これまでに、定義されたＷＴＡ突然変異体は構築されていない。化学的な変異誘発により、Ｓ．アウレウス突然変異体５２Ａ５が得られ（１５）、これは、ＷＴＡの結合単位の形成を触媒する酵素を欠失していることが証明されている（９）。しかしながら、結合単位の生合成に介在する推定の酵素に連鎖している可能性がある遺伝子はわかっていない。Ｓｏｌｄｏとその協力者等によれば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｔａｇＯ相同体は、バチルス・ズブチリスにおける全ての陰イオン性の細胞壁ポリマーの合成に関与しており、Ｂ．ズブチリスにおけるＷＴＡ結合単位の形成を触媒していることが示された（８２，８３）。しかしながら、Ｂ．ズブチリスにおいてｔａｇＯは重要であり、安定して欠失させることができなかった。この新しい研究は、この役割をＷＴＡに関連付け、この分子はＳ．アウレウスの病原性プロセスにおいて重要であると定義した最初の決定的な研究である。
【００２２】
従って、当業界において、ブドウ球菌に関する病気のためのさらなる介入の明確な必要性がある。
発明の概要
本発明の特徴は、ワクチン候補としてのＷＴＡを提供することである。このようなワクチンによって生産された抗体は、鼻およびその他の上皮へのＳ．アウレウスの結合をブロックし、それによって感染プロセスにおける第一工程を予防するという二重の役割を果たす。
【００２３】
本発明のその他の特徴は、Ｓ．アウレウス感染に対して防御するために、食細胞活動を高めるオプソニン抗体を生成するワクチンを提供することである。一実施形態において、本ワクチンは、ＷＴＡを含んでもよい。他の実施形態において、ＷＴＡは、多数のキャリアー分子に連結していてもよい。さらなる他の実施形態において、ＷＴＡは、単独で用いてもよい。
【００２４】
さらに本発明のその他の特徴は、ＷＴＡに対して生じたポリクローナルまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を提供することである。一実施形態において、本ＭＡｂは、キメラ化されていてもよい。他の実施形態において、本ＭＡｂは、ヒト化されていてもよい。これらのキメラ化またはヒト化ＭＡｂを用いることによって、例えば、ヒトにおいて、患者の表面へのＳ．アウレウスの付着を妨害するための使用が可能になる。ＭＡｂは、Ｓ．アウレウス・ニューモニエにおける第一工程のような鼻での定着およびその他の気道での定着をブロックするのに用いてもよい。他の実施形態において、これらのＭＡｂは、例えば異物に関連する汚染のようなその他のＳ．アウレウスに関する病気を治療するために、全身に用いてもよい。本発明はまた、ブドウ球菌感染を治療する方法を提供し、本方法は、ＷＴＡと特異的に結合する抗体またはその抗体のフラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を、ブドウ球菌に感染していることが疑われる患者に点滴注入することを含む。
【００２５】
本発明のさらなるその他の特徴は、ＷＴＡに結合するヒトのリガンドの同定、同様にそのリガンドを提供することである。このようなリガンドは、これらのリガンドに対するＭＡｂを誘導するための抗原として作用し、そのＭＡｂがＳ．アウレウスが、ＷＴＡを介してこのリガンドに結合することをブロックする、という同じ作用を有するようにできる。
【００２６】
さらに本発明のその他の特徴は、合成で、または化学的に生産された可溶性型のＷＴＡ全体またはＷＴＡのフラグメントを提供することであり、これらは、様々な表面（ヒトの、および人工的な）へのＳ．アウレウスの付着を直接的に妨害し、様々なブドウ球菌と患者との相互作用（例えば、鼻での定着やその他の組織または留置デバイスへの付着）をブロックするのに用いられる。これは、ＷＴＡが結合したＳ．アウレウスと、それらの受容体に関して競合する可溶性ＷＴＡまたはそれらのフラグメントによって達成される。本発明はまた、ブドウ球菌感染を治療する方法を提供し、本方法は、可溶性型のＷＴＡ全体またはＷＴＡのフラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を、ブドウ球菌に感染していることが疑われる患者に点滴注入することを含む。
【００２７】
本発明のさらなる特徴は、Ｓ．アウレウスにおけるＷＴＡの生産を妨害する物質の同定、およびその物質を提供することである。これらの物質はまた、細菌がヒトにおいて鼻の上皮およびその他の表面に結合する能力を失わせ、その感染プロセスを妨害することもできる。
【００２８】
本発明のその他の特徴は、単離されたＷＴＡ欠失ブドウ球菌生物であり、ｔａｇＯ遺伝子は、完全に欠失している、部分的に欠失している、または、非機能的にされている。
上記の本発明の形態は、単にＳ．アウレウスと患者とのＷＴＡを介した相互作用の妨害に関する可能性を説明することを意図したものであり、本願の範囲を限定するものとみなすべきではない。これらの理念は、ヒトと獣医学的な環境の両方において用途を有する。
【００２９】
図面の簡単な説明
図１は、Ｓ．アウレウスのＷＴＡの構造と、ＷＴＡ生産の崩壊を示す。Ａ．Ｓ．アウレウスのＷＴＡの構造である。リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＤ−アラニン部分は、灰色の囲みで強調されている。ＭｕｒＮＡｃは、Ｎ−アセチルムラミン酸である。Ｂ．Ｓ．アウレウスのｔａｇＯ遺伝子の位置、および、それをｅｒｍＢカセットで置換する戦略である。Ｃ．アルシアンブルー染色手順と銀染色手順の組合わせで染色した、ＷＴＡ製剤を含むポリアクリルアミドゲルである。Ｄ．ΔｔａｇＯ突然変異体は、ＷＴＡが欠失している。Ｓ．アウレウスＳａ１１３野生型（ＷＴ）、ΔｔａｇＯ突然変異体（Ｍ）、および、プラスミドｐＲＢｔａｇＯで補足されたΔｔａｇＯ（ＭＣ）由来のＷＴＡ製剤における、ホスフェート、ＧｌｃＮＡｃおよびリビトールの含量の解析である。少なくとも５つの独立した実験の平均およびＳＤ（ホスフェート，ＧｌｃＮＡｃ）、または、１回の実験で４回カウントした値の平均（リビトール）を示す。リビトール含量は、ＷＴとＭサンプルのみで決定された。
【００３０】
図２は、Ｓ．アウレウス野生型とΔｔａｇＯの成長の特徴を示す。Ａ．複合培地（ＢＭ）または最小培地（ＩＭＤＭ）中で３０℃で通気した状態の、Ｓ．アウレウス野生型（黒丸）、および、ΔｔａｇＯ（白丸）の成長曲線である。Ｂ．バッチ式培養における、野生型（黒丸）、および、ΔｔａｇＯ（白丸）の長期の生存の速度論である。
【００３１】
図３は、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡ突然変異体の上皮細胞への付着が減少したことを示す。Ａ．初期のヒト気管支の上皮細胞（ＮＨＢＥ）である。５つの独立した実験の平均および標準偏差（ＳＤ）を示す。Ｂ．初期のヒトの鼻の上皮細胞（ＨＮＥＣ）である。５つの独立した実験の結果を示す。Ｃ．ヒトの気道の上皮細胞系Ａ５４９である。少なくとも５つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。これら５つの実験のうち３つのデータは、先願の第６０／４３０，２２５号に記載されている。野生型サンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ０．００１）のアスタリスクによって示される。
【００３２】
図４は、Ａ．野生型ＷＴＡによる、Ｓ．アウレウスの上皮細胞への結合の阻害を示す。Ａ５４９細胞またはＨＮＥＣが密集した層を、ＷＴＡ製剤の量を増加させながらプレインキュベートし、Ｓ．アウレウス株の付着をＡと同様にして解析した。野生型またはΔｄｌｔＡからのＷＴＡ（０，１２５，２５０および５００μｇ／ｍｌ）、または、ＷＴＡが欠失していること以外は同じ条件で製造されたΔｔａｇＯからの等量のサンプルを用いた。少なくとも３つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。コントロールサンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ＜０．００１）のアスタリスクによって示される。Ｂ．ＷＴＡでコーティングしたラテックスビーズの、ＨＮＥＣおよびＡ５４９細胞への付着である。蛍光ビーズを、野生型（黒いバー）もしくはΔｄｌｔＡ（灰色のバー）からのＷＴＡ製剤、または、ＷＴＡが欠失している以外は同じ条件下で製造されたΔｔａｇＯからの等量のサンプル（白色のバー）でコーティングし、疎水性のビーズ領域をＢＳＡでブロックした。ＷＴＡなしでインキュベートしたビーズの付着（バックグラウンド）を差し引いた。少なくとも５つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。Ｃ．Ｓ．アウレウス野生型またはΔｔａｇＯとのインキュベートによる、ＨＮＥＣにおけるＩＬ−８の誘導である。３〜４つの実験の平均およびＳＤを示す。Ｄ．ＷＴＡが改変もしくは欠失した、または、フィブロネクチン結合タンパク質が欠失したＳ．アウレウス株の付着を、フィブロネクチンでコーティングされたマイクロタイタープレートへの付着に関して試験した。ΔｆｂｐＡ／ΔｆｂｐＢ８３２５−４で誘導された突然変異体は、２種のＳ．アウレウスのＦｎ結合タンパク質をコードするｆｂｐＡとｆｂｐＢが欠失している。
【００３３】
図５は、Ａ．鼻の抗菌ペプチドに対するＳ．アウレウス株の感受性を示す。同数の野生型（黒い四角）、ΔｔａｇＯ（白丸）およびΔｄｌｔＡ（灰色の三角）細菌を、１００μｇ／ｍｌのヒトデフェンシンｈＮＰ１−３、１０μｇ／ｍｌのカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）ＬＬ−３７、または、５００μｇ／ｍｌのラクトフェリンと共にインキュベートし、生存可能な細菌を、様々なインキュベート時間後にカウントした。少なくとも３つの独立した実験の平均を示す。野生型サンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ＜０．００１）のアスタリスクによって示される。Ｂ．Ｓ．アウレウスＳＡ１１３野生型（黒い記号）、および、ΔｔａｇＯ（白い記号）のリソスタフィンが介在する溶解である。Ａ600＝１の細菌懸濁液を、濃度１μｇ／ｍｌのリソスタフィン有り（丸）、または、リソスタフィン無し（四角）で、３０℃で１時間インキュベートした。その値は、最初のＡ600のパーセンテージとして示される。
【００３４】
図６は、Ａ．ＢＭブロス中で、クロラムフェニコール存在下（黒丸）または非存在下（白丸）で繰り返し培養した後の、プラスミドｐＲＢｔａｇＯの安定性を示す。ＳＤを含む。Ｂ．コトンラットの鼻孔に精製したＷＴＡをプレ点滴注入することによる、鼻での定着の阻害である。１０、６または２０匹の動物を、それぞれ実験１、２または３に用いた。鼻１つあたり１０ＣＦＵを超えるＳ．アウレウスを含む動物のパーセンテージを示す。特定の実験における動物の半分は、ＰＢＳ単独（薄い灰色のバー）、または、ＰＢＳに溶解させたＷＴＡ（濃い灰色のバー）のいずれかで前処理した。実験の設定におけるさらなる違いは、方法の章で詳細に説明する。
【００３５】
発明の詳細な記述
定義
本発明において用いられる用語「壁テイコイン酸」（ＷＴＡ）は、ブドウ球菌の細胞壁においてペプチドグリカンに共有結合した、複合表面が露出したポリマーを意味する。ＷＴＡはまた、可溶性ＷＴＡ全体またはそれらのフラグメントも意味する。一実施形態において、ＷＴＡは、合成で生産されてもよい。他の実施形態において、ＷＴＡは、ブドウ球菌から単離してもよく、このようなブドウ球菌としては、これらに限定されないが、Ｓ．アウレウスが挙げられる。他の実施形態において、ＷＴＡは、ブドウ球菌生物以外から単離してもよく、このような生物としては、これらに限定されないが、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。ＷＴＡ製剤は、可溶性ＷＴＡ全体またはそれらのフラグメントで構成される。
【００３６】
本発明で用いられる用語「抗体」は、全長の抗体およびそれらの部分を意味する。全長の抗体は、１対のポリペプチド鎖、または、より一般的には２対のポリペプチド鎖を有し、それぞれの対は軽鎖と重鎖を含む。各重鎖または軽鎖は２つの領域、可変領域（抗原認識と結合を付与する）と、定常領域（局在化と細胞の相互作用に関連する）に分けられる。従って、全長の抗体は通常、２つの重鎖定常領域（ＨCまたはＣH）、２つの重鎖可変領域（ＨVまたはＶH）、２つの軽鎖定常領域（ＬCまたはCL）、および、２つの軽鎖可変領域（ＬVまたはＶL）を含む。軽鎖は、ラムダまたはカッパ鎖のいずれかであり得る。従って、本発明の実施形態において、抗体は、抗体がＷＴＡのような抗原結合するように、少なくとも１つの重鎖可変領域と、１つの軽鎖可変領域を含む。
【００３７】
本発明のその他の形態は、交互の相補鎖決定領域またはＣＤＲ、および、フレームワーク領域またはＦＲを含む可変領域を含む。ＣＤＲは、可変領域内の、一般的に抗原特異性を付与する配列である。
【００３８】
本発明はまた、抗体の、抗原と結合するのに十分な可変領域配列を含む部分も包含する。抗体の部分としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳＦｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）が挙げられ、これらは、タンパク質分解によるインタクト抗体の切断（例えばパパインまたはペプシンによる切断）によって生産されてもよいし、または、組換え方法によって生産されてもよく、このような組換え方法においては、インタクト重鎖および軽鎖に関するｃＤＮＡは、重鎖および軽鎖のフラグメントが、別々に、または、同じポリペプチドの一部として生産されるように操作される。
【００３９】
本発明の範囲に含まれる抗体は、ヒト抗体、動物抗体、およびそれらの組合わせに対応する配列を含む。一実施形態において、抗体製剤は、ポリクローナル抗体を含む。他の実施形態において、抗体製剤は、モノクローナル抗体を含む。さらなる実施形態において、抗体製剤は、キメラ抗体を含む。他の実施形態において、抗体製剤は、ヒト化抗体を含む。本発明において用いられる用語「キメラ抗体」は、その他の分子（例えばヒト抗体）から得られた定常ドメインに融合した、動物抗体（例えばラットまたはマウス抗体）から得られた可変領域を有するモノクローナル抗体から得られた抗体を意味する。キメラ抗体の一つの型である「ヒト化抗体」は、ヒト可変領域の既知の配列と（できるだけ多く）マッチするように変更された（変異誘発またはＣＤＲのグラフト化によって）可変領域を含ませてある。ＣＤＲのグラフト化は、望ましい特異性を有する抗体からのＣＤＲを、ヒト抗体のＦＲ上にグラフト化すること、それによって、非ヒト配列のほとんどをヒト配列で置換することを含む。それゆえに、ヒト化抗体は、既知のヒト抗体の配列とより近接してマッチする（アミノ酸配列において）。マウスモノクローナル抗体をヒト化することによって、ヒト抗マウス抗体またはＨＡＭＡ応答の厳密性は減少する。本発明はさらに、ＨＡＭＡ応答をできる限り回避する完全ヒト抗体を含む。
【００４０】
改変された抗体は、例えば、トランケーションされた、または、改変された抗体をコードする遺伝子によってコードされたタンパク質またはペプチドを含む。このようなタンパク質またはペプチドは、本発明の抗体と同様に機能し得る。その他の改変、例えば、エフェクター機能（ブドウ球菌による鼻での定着をブロックする、または、緩和する能力など）を高めることができるその他の配列の付加も本発明の範囲内である。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列へのアミノ酸の付加、抗体のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、抗体のアミノ酸配列における１またはそれ以上のアミノ酸のその代わりのアミノ酸での置換、アイソタイプスイッチ、および、クラススイッチが挙げられる。
【００４１】
特定の実施形態において、抗体は、そのＦｃ領域において、細菌のタンパク質への結合が予防されるように改変されていてもよい。Ｆｃ領域は通常、好中球、マクロファージ、その他のアクセサリー細胞、相補成分、および、免疫系の受容体のための結合部位を提供する。抗体が細菌に結合し、それらをオプソニン化すると、アクセサリー細胞はコーティングされた細菌を認識し、感染に応答する。アクセサリー細胞が結合している位置の近くで細菌のタンパク質がＦｃ領域と結合すると、これらの細胞の正常な機能は阻害される。例えば、プロテインＡ（Ｓ．アウレウスの細胞膜で見出される細菌のタンパク質）は、アクセサリー細胞結合部位の近くでＩｇＧのＦｃ領域と結合する。そうすることにおいて、プロテインＡはこれらのアクセサリー細胞の機能を阻害するため、細菌の排除を妨害する。このような抗菌性の免疫応答による妨害を回避するために、本発明の抗体のＦｃ部分は、アクセサリー細胞への結合を保持したままプロテインＡの非特異的な結合を予防するように改変されていてもよい（１５）。
【００４２】
これらの様々な形態の観点において、本発明の抗体は、全長抗体、抗体部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および、改変された抗体のクローンを含む。集合的に、これらは、特に他の指定がない限り「ＭＡｂ」またはモノクローナル抗体ともいう。
【００４３】
本発明で用いられる用語「エピトープ」は、ＷＴＡに対する抗体によって結合する、ＷＴＡの領域を意味する。このような結合する領域は、分子の隣接する部分に存在してもよいし、またはそうでなくてもよい。
【００４４】
本発明で用いられる用語「抗原」は、ポリペプチド配列、非タンパク様分子、または、免疫系によって認識可能なあらゆる分子を意味する。抗原は、フルサイズのブドウ球菌のタンパク質または分子、またはそれらのフラグメントが可能であり、前記フラグメントは、全長より短いタンパク質をコードする組換えｃＤＮＡから生産される；フルサイズの分子またはタンパク質から誘導される；合成で生産される；また、生物（例えば、これらに限定されないが、ブドウ球菌）から単離する。フラグメントはまた、タンパク質分解のような酵素でのプロセシングを介して生産されてもよい。抗原はまた、ブドウ球菌のタンパク質のエピトープを包含するポリペプチド配列であってもよく、前記エピトープは、タンパク質の一次ポリペプチド配列と隣接していなくてもよい。抗原をコードするＤＮＡ配列を、当業界周知の手順によって、同定し、単離し、クローニングし、および、発現のために原核または真核細胞にトランスファーしてもよい（６４）。
【００４５】
抗原またはそれらのエピトープは、ブドウ球菌の分子またはタンパク質のアミノ酸配列の領域と１００％同一でもよいし、または、少なくとも９５％同一、または、少なくとも９０％同一、または、少なくとも８５％同一でもよい。また、抗原は、天然のブドウ球菌の分子またはタンパク質に結合する抗体を惹起する能力は保持しながら、ブドウ球菌の分子またはタンパク質のアミノ酸配列と、９５％未満、９０％未満または８５％未満の同一性を有していてもよい。ペプチド抗原のパーセント同一性は、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム（バージョン６．０）を用いて、標的抗原またはエピトープの配列と、ブドウ球菌の配列の類似部分とを比較することによって決定することができ、このプログラムは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等によって説明されており（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４年）、ウィスコンシン大学のジェネティック・コンピューター・グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ；ＵＷＧＣＧ）より入手可能である。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアライメント方法を利用しており（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）、これは、Ｓｍｉｔｈおよびｗａｔｅｒｍａｎによって改訂されており（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１年）、本発明において参照されているタンパク質またはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するのに適用することができる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターとしては、以下が挙げられる：（１）ヌクレオチドについては単項比較マトリックス（同一性については値１、非同一性については値０に等しい）、および、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６年）の加重比較マトリックス、これらは、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３〜３５８頁，１９７９年によって説明されている；（２）各ギャップには３．０のペナルティー、および、各ギャップにおける各記号にはさらなる０．１０のペナルティー；および、（３）末端のギャップにはペナルティー無し。
【００４６】
あるいは、１０まで、または２０ユニットまでの短い領域、または、比較的高い相同性の領域（例えば抗体配列間）を簡単に比較するためには、ペプチドまたはヌクレオチド配列の定義された領域にわたるパーセント同一性は、マッチするアミノ酸またはヌクレオチドの数を、並べられた配列の全長で割り、１００％を掛けることによって決定してもよい。例えばＣＤＲ中またはＣＤＲに隣接して、ＭＡｂ鎖中に１、２または３個のアミノ酸の挿入またはギャップが存在する場合、その挿入またはギャップは１つのアミノ酸ミスマッチとしてカウントされる。
【００４７】
抗原としては、これらに限定されないが、表面抗原、病原性抗原、および、付着抗原が挙げられる。表面抗原とは、抗原が完全なインタクト細菌の構成に含まれる場合、すなわち、抗原が細胞質内に存在しない場合に抗体接触可能な抗原である。病原性抗原とは、患者において病気を引き起こす病原性プロセスに関与する抗原である。病原性抗原としては、例えば、リポテイコイン酸（Lipoteichoic Acid: ＬＴＡ）、ペプチドグリカン、毒素、フィンブリア、鞭毛、および、付着抗原が挙げられる。ＷＴＡのような付着抗原は、ブドウ球菌の上皮表面（例えば前鼻孔の上皮表面）へ付着する能力に介在する。抗原は、ブドウ球菌の非タンパク様成分（例えば炭水化物または脂質）であってもよい。例えば、ペプチドグリカン、ＬＴＡ、および、ＷＴＡは、ブドウ球菌の細胞壁で見出される非タンパク様抗原である。抗原は、それらが免疫応答を惹起しさえすれば、非タンパク様分子のフラグメントで構成されてもよいし、または、それらを含んでもよい。
【００４８】
本発明において用いられる抗原は、ＷＴＡへの抗体応答を惹起できる分子を含む。抗原としては、ＷＴＡそのもの、または、それらのフラグメントもしくは部分が可能である。抗原はまた、無関係の分子も可能であり、すなわちいくつかの構造的な類似性によって、ＷＴＡに結合する抗体を惹起することができる分子である。従って、ＷＴＡへの結合は、このようなペプチドのエピトープのミミックへの結合によって評価してもよく、例えば、米国特許出願第０９／８９３．６１５号で説明されている（この参照により開示に含まれる）。本発明の特定の実施形態において、抗原は、細菌の表面でＷＴＡに結合する抗体を惹起する。本発明において特定に用いられる抗原は、抗体（ＷＴＡに特異的な抗体など）に特異的に結合できるあらゆる分子である。
【００４９】
分析（例えばＥＬＩＳＡ分析）によって、抗体が、バックグラウンドシグナルより、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または、少なくとも１０倍大きいシグナルを生じる場合、すなわち、非特異的結合に起因するシグナルより少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または、少なくとも１０倍大きいシグナルを生じる場合、抗体は、抗原、エピトープまたはタンパク質に特異的に結合すると言う。メタノール固定細菌のＥＬＩＳＡもしくは生きた細菌のＥＬＩＳＡ、または、その他の分析によって、抗体が、バックグラウンドシグナルより、少なくとも１．５倍、２倍、または、３倍大きいシグナルを生じる場合、抗体は細菌に特異的に結合すると言う。
【００５０】
本発明で用いられる「高められた食細胞活動」は、本願における方法またはその他の比較分析によって分析されたバックグラウンドレベルを越える、食細胞活動の増加を意味する。有用と思われるレベルは、細菌のタイプや感染の重症度などの特定の感染状況に応じて適宜変化し得る。例えば、高められた食細胞活性について、一実施形態において、高められた応答は、バックグラウンドの食細胞活動を越えて７５％と同等であるか、または、それより大きい。他の実施形態において、高められた応答は、バックグラウンドの食細胞活動を越えて８０％または８５％と同等であるか、または、それより大きい。他の実施形態において、高められた応答は、バックグラウンドの食細胞活動を越えて９０％または９５％と同等であるか、または、それより大きい。高められた食細胞活動はまた、バックグラウンドの食細胞活動を越えて５０％、５５％、６０％、６５％、または、７０％と同等であるか、または、より大きくてもよい。他の実施形態において、高められた食細胞活動は、バックグラウンドの食細胞活動、または、非特異的な、または、非オプソニン性コントロール抗体での食細胞活動と比較して、食細胞活性の統計学的に有意な増加を含む。抗体が抗原に結合することができ、抗原の食細胞への付着が促進され、それによって食細胞活動が高められる場合に、抗体は「オプソニン活性」を有する。本発明において用いられるように、オプソニン活性はまた、オプソニン性食細胞の殺菌活性に介在する好中球を測定する分析によって評価されてもよい。
【００５１】
「統計学的に有意な」結果の特定の測定または同定は、用いられる統計学的な試験の正確性に依存することもある。当業者であれば、用いられたあらゆる統計学的な試験の環境において、試験それ自体のパラメーターによって決定された統計学的に有意な結果を容易に認識することができる。これらの周知の統計学的な試験の例としては、これらに限定されないが、χ2試験（カイ二乗検定）、スチューデントのｔ検定、Ｆ検定、Ｍ検定、フィッシャーの直接確率検定、二項の直接確率検定、ポアソンの直接確率検定，一元または二元配置反復測定分散分析、および、相関係数の計算（ピアソンおよびスピアマン）が挙げられる。
【００５２】
本発明の抗体製剤、および、本発明のＷＴＡ製剤は、患者における全身および局所的なブドウ球菌感染の治療に有用である。局所感染は、患者の体の特定のエリア（例えば、これらに限定されないが、鼻など）で見出される。本発明において用いられる「患者」は、細菌感染の宿主のヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含み、このような細菌としては、これらに限定されないが、ブドウ球菌感染が挙げられる。本発明において用いられる「治療」は、現存する感染のあらゆる減少、改善、または、「緩和」、同様に、将来的な感染に対する「ブロック」または予防を包含する。この観点において、ブドウ球菌に晒される前に、晒されるのと同時に、または、晒された後に、本発明のＭＡｂまたはＷＴＡ製剤を投与することによって哺乳動物の鼻孔内のコロニー数を減少させることができる場合に、本発明の抗体製剤または本発明のＷＴＡ製剤を用いた治療は、ブドウ球菌の定着「を緩和する」と言い、この場合、上述の晒されることは、スタフィロコッカスの意図的な点滴注入によるものでもよいし、または、全身に晒されることによるものでもよい。例えば、以下で説明されている鼻での定着の動物モデルにおいて、抗体製剤またはＷＴＡ製剤を投与した後に、定着の程度、または、鼻の組織のサンプルから成長することができる細菌のコロニーの数が減少する場合に、その抗体製剤またはＷＴＡ製剤は、定着を緩和するとみなされる。抗体製剤またはＷＴＡ製剤が、本発明で説明されている鼻での定着の分析において、コロニーの数を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または、少なくとも９０％減少させる場合、その抗体製剤またはＷＴＡ製剤は定着を緩和している。１００％の緩和はまた、根絶とも呼ばれる。
【００５３】
抗体製剤またはＷＴＡ製剤は、抗体製剤またはＷＴＡ製剤が、ブドウ球菌に晒される前に、または、晒されるのと同時に投与されることによって、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の鼻での定着を予防することができる場合、ブドウ球菌の定着を「ブロックする」と言い、この場合、上記の晒されることは、鼻孔への意図的な点滴注入でなされてもよいし、または、その他の方法でなされてもよい。本発明で説明されている鼻での定着の分析と同様に、コントロール哺乳動物と比較して、長期間（例えば１２時間もしくはそれ以上、または、２４時間もしくはそれ以上）本発明のＭＡｂで処理された哺乳動物から採取された鼻の組織のサンプルから成長することができるブドウ球菌のコロニーが存在しない場合、その抗体製剤またはＷＴＡ製剤は定着をブロックする。また、本発明で説明されている鼻での定着の分析において、抗体製剤またはＷＴＡ製剤によって、定着された動物の数がコントロール動物と比べて減少した場合、抗体製剤またはＷＴＡ製剤は定着をブロックする。例えば、抗体製剤またはＷＴＡ製剤およびグラム陽性細菌を投与した後に、定着された動物の数が、コントロール動物に比べて少なくとも２５％、少なくとも５０％および少なくとも７５％減少する場合、または、長期間（例えば１２時間または２４時間もしくはそれ以上）処理された個体から採取されたサンプルから成長することができるコロニーが存在しない場合、抗体製剤またはＷＴＡ製剤は、定着をブロックするとみなされる。
【００５４】
臨床的な環境において、患者における鼻での定着の存在または非存在は、鼻の綿棒を適切な細菌用の培地で培養することによって決定される。これらの培養物は、ブドウ球菌のコロニーの存在または非存在に関してスコア付けされる。このタイプの定性分析システムにおいて、ブドウ球菌の定着のブロックと緩和との区別が困難な場合がある。従って、定性分析（例えば鼻の綿棒）の目的で、抗体製剤またはＷＴＡ製剤が、長期間（１２または２４時間もしくはそれ以上）にわたり、それまで定着の兆候を示していないヒト患者における将来的な定着を予防する場合、定着を「ブロックする」。本発明の抗体製剤またはＷＴＡ製剤が投与される前に、すでにブドウ球菌に関して陽性であるヒト患者から採取された陽性の培養物の数が、はっきりと減少した場合、抗体製剤またはＷＴＡ製剤は、定着「を緩和する」。
【００５５】
本発明において用いられる「ワクチン」は、抗体または抗原を含む医薬組成物を含む。一実施形態において、ワクチンは、可溶性ＷＴＡ全体またはそれらのフラグメントの製剤を含む。他の実施形態において、ワクチンは、ＷＴＡに特異的に結合する抗体の製剤を含む。他の実施形態において、ＷＴＡに特異的に結合する抗体の製剤を含むワクチンは、受動免疫療法で用いられる。さらなる他の実施形態において、ワクチンはまた、以下でさらに説明するような製薬上許容できるキャリアーも含む。
【００５６】
ワクチンは、グラム陽性細菌に対して高められた食細胞活性を有するオプソニン抗体の生産を刺激する場合、防御的な免疫応答を付与するとみなされる。オプソニン抗体の生産は、本ワクチンを投与されていないコントロールと比較した、本ワクチンを投与された試験被検体の血清中の上記抗体の存在によって測定してもよい。血清中のオプソニン抗体の存在は、例えば、米国特許第６，６１０，２９３号で説明されているようなオプソニン性食細胞の殺菌性の分析によって測定してもよい。あるいは、このような分析は、成人の静脈血液から単離された好中球を用いて、ＰＭＮ分離培地（ロビンズ・サイエンティフィック（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），カタログ番号１０６８−００−０）を用いた沈降によって行ってもよい。抗体、血清、またはその他の免疫グロブリン源を様々な希釈度で加え、丸底のマイクロタイタープレートのウェルを複製する。次に、好中球（約２×１０6細胞／ウェル）を各ウェルに加え、その後すぐに、トリプシンソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）またはその他の適切な細菌用の増殖培地（１０μｌ）中の約３×１０4の中期対数期の細菌を加える。免疫グロブリンを枯渇させたヒト血清を、活性な補体の源として加える。（免疫グロブリンは、本分析での使用前に、血清をタンパク質Ｇ−アガロースとタンパク質Ｌ−アガロースと共にプレインキュベートすることによってヒト血清の補体から除去される。この免疫グロブリンの枯渇により、補体中の抗ブドウ球菌抗体の濃度が最小化され、それによって補体溶液中の固有の抗体によって生じる細菌の死滅が減少する）。
【００５７】
プレートを３７℃で一定して強く撹拌しながらインキュベートする。ゼロ時間、最初にサンプル抗体を加えた時、およびインキュベートの２時間後に、アリコートを各ウェルから採取する。各サンプルウェルから回収された各アリコート中の生存可能な細菌の数を決定するために、各アリコートを０．１％のＢＳＡ水溶液で２０倍に希釈する（ＰＭＮを溶解させるため）、迅速なピペッティングによって強く混合し、血液寒天プレートで、３７℃で一晩培養する（レメル（Ｒｅｍｅｌ），カタログ番号０１−２０２、またはそれと同等のもの）。オプソニン活性は、２時間で採取したサンプルから観察された細菌のコロニーの数と、ゼロ時間で採取したサンプルから観察された細菌のコロニーの数とを比較することによって測定される。コロニーは、ＩＰＩミニカウントコロニーカウンター（ＩＰＩ  Ｍｉｎｉｃｏｕｎｔ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて数える。
【００５８】
ワクチン注射されていない患者のコントロール血清に比べて、ワクチンを投与することによって生成された試験血清によって、少なくとも５０％多くの細菌、７５％多くの細菌、および、少なくとも１００％多くの細菌を死滅させる場合、ワクチンは免疫を高める。
【００５９】
発明の詳細な記述
本発明は、グラム陽性ブドウ球菌のＷＴＡに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体、ならびに、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体など）、それらのフラグメント、誘導体および領域を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、ブドウ球菌のＷＴＡが結合する患者のリガンドに結合する。これらの抗リガンド抗体は、例えば、ＷＴＡとそのリガンドとの相互作用を阻害することによって、ブドウ球菌の患者の表面への結合を阻害することができる。グラム陽性細菌は、グラム陰性細菌とは異なり、細胞壁の構造における差の結果としてグラム染色を吸収する。グラム陰性細菌の細胞壁は、２つの対向するリン脂質−タンパク質リーフレット(phospholipid-protein leaflets)からなる独特な外部膜で構成されており、内部リーフレット中には通常のリン脂質が含まれるが、外部リーフレット中には極めて毒性のリポ多糖類が含まれる。グラム陽性細菌の細胞壁は、２つの主要な成分、ペプチドグリカンおよびテイコイン酸を含み、加えて、種に応じてさらなる炭水化物およびタンパク質を含み、比較の点ではるかに簡単のように思われる。様々なブドウ球菌の種間でＷＴＡの構造は異なるが、Ｓ．アウレウスのＷＴＡに対して生じた抗体は、多少の共通したＷＴＡの改変（例えばＤ−アラニンエステルまたはＧｌｃＮＡｃの改変）を認識することができ、その他のブドウ球菌種由来のＷＴＡと交差反応することができる。その上、抗ＷＴＡ抗体はまた、非ブドウ球菌種と特異的に結合することができる。例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、Ｓ．アウレウスと同じＷＴＡ構造を有する。従って、Ｓ．アウレウスのＷＴＡに特異的に結合する抗体は、Ｌ．モノサイトゲネスにも特異的に結合することができる。
【００６０】
本発明の抗体が標的とするグラム陽性ブドウ球菌としては、Ｓ．アウレウス（コアグラーゼ陽性菌）およびＳ．エピデルミディス（コアグラーゼ陰性菌）が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、グラム陽性細菌のＷＴＡに結合する抗体に関する。他の実施形態において、これらの抗体は、このような細菌の食細胞活動を高める。これらの抗ＷＴＡ抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、ＭＡｂ、および、その他のＭＡｂ抗体、例えばキメラ、ヒト化、完全ヒト抗体、抗体フラグメント、および、改変された抗体が挙げられる。キメラまたはその他のモノクローナル抗体は、マウス抗体の発達を回避できる点で有利である。少なくとも１つの研究において、マウス抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）モノクローナル抗体を投与され、抗マウス抗体を発生させた患者は、投与された抗体に応答する（２８）。このタイプの治療計画に対する免疫応答は、一般的には、ヒト抗マウス抗体応答、または、ＨＡＭＡ応答と呼ばれており、治療の有効性を減少させ、治療を完全に無効にすることもある。ヒト化またはキメラヒト／非ヒトモノクローナル抗体は、ＨＡＭＡ応答を顕著に減少させ、治療の有効性を増加させることが示されている（４９）。
【００６１】
従って、本発明の一形態において、キメラ重鎖は、ヒト重鎖ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域の少なくとも一部に連結した、本発明の抗ＷＴＡ抗体の重鎖可変領域の抗原結合領域を含んでもよい。このヒト化またはキメラ重鎖は、ヒト軽鎖カッパまたはラムダ定常領域の少なくとも一部に連結した抗ＷＴＡ抗体の軽鎖可変領域の抗原結合領域を含むキメラ軽鎖と組み合わされていてもよい。典型的な実施形態としては、これらに限定されないが、ヒトＩｇＧ1定常領域に融合したマウス重鎖可変領域、および、ヒトカッパ軽鎖定常領域に融合したマウス軽鎖可変領域を有する抗体が挙げられる。
【００６２】
本発明のキメラ抗体およびその他のＭＡｂは、１価、２価または多価の免疫グロブリンであり得る。例えば、１価キメラ抗体は、上述したように、ジスルフィド架橋を介してキメラＬ鎖と連結したキメラＨ鎖によって形成された二量体（ＨＬ）である。２価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して連結した２つのＨＬ二量体によって形成された四量体（Ｈ２１−２）である。多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｏｒ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）キメラ抗体は、鎖の集合体がベースになっていてもよく、キャリアーまたは足場を有してもよいし、有していなくてもよい。
【００６３】
本発明のＭＡｂとしては、２種の異なる抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体が挙げられる。一実施形態において、重鎖および軽鎖可変領域は、同じ分子（例えばＷＴＡ）に結合する２種の抗体由来である。
【００６４】
上記抗体に加えて、本発明はまた、本抗体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、同様に、そのＤＮＡによってコードされたポリペプチドも包含する。
本発明は、全長の抗体およびそれらの部分に関するペプチド配列、および、全長の抗体およびそれらの部分をコードするＤＮＡ配列、同様に、これらのＭＡｂに関するＣＤＲおよびＦＲを含む。本発明はさらに、これらの配列に相同なＤＮＡおよびペプチド配列を含む。一実施形態において、これらの相同ＤＮＡおよびペプチド配列は、約７０％同一であるが、他の実施形態は、約７５％、８０％、８５％、８８％、９０％および９５％またはそれ以上同一な配列を含む。上述したように、ＤＮＡおよびペプチド配列の両方に関する同一性のレベルを決定することは、十分に当業者の習慣的な技術の範囲内である。
【００６５】
他の実施形態において、本発明は、ＭＡｂ、軽鎖、重鎖、およびそれらの部分の生産系を考慮しており、本生産系は、１）細胞（例えば、細菌、酵母、微生物、真核細胞系、トランスジェニック植物または動物など）を含み、これは、２）本発明のＭＡｂまたは関連するポリペプチドのいずれかの発現を指示することができる少なくとも１つの組換え核酸に連結されている。
【００６６】
本発明のＤＮＡ配列は、当業界周知の手順によって、同定し、単離し、クローニングし、および、発現のための原核または真核細胞にトランスファーすることができる。このような手順は、一般的に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、同様に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（５，７６）で説明されており、これは、参照により開示に含まれる。より特定に本発明の配列の操作に関連するガイダンスは、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（８，３９）で見出すこともでき、これらはいずれも、それらの全体を参照により開示に含まれる。特定の実施形態において、当業界において標準的な技術を用いて、ＣＤＲがインタクト抗体と同じ結合特異性を維持するような方法で、あらゆるヒト抗体フレームワーク領域にＣＤＲをグラフト化することができる。上記したように、そのＣＤＲがヒトフレームワーク領域にグラフトされた抗体は、「ヒト化（された）」と言う。一般的に、ヒト化、および、完全ヒト抗体はまた、ヒト定常領域も含み、従って、ヒト由来の抗体のパーセンテージを最小化させ、ＨＡＭＡ応答も最小化させる可能性がある。
【００６７】
加えて、本発明の抗体（例えば、モノクローナルおよびキメラ抗体のいずれか、ヒト化および完全ヒト抗体のいずれか）のＤＮＡおよびペプチド配列が抗体「誘導体」の基礎を形成してもよく、このような誘導体としては、例えば、トランケーションされた、または、改変された遺伝子によってコードされたタンパク質またはペプチドが挙げられる。このようなタンパク質またはペプチドは、本発明の抗体と同様に機能し得る。その他の改変、例えばエフェクター機能（細菌の食細胞活動および／または死滅など）を高めることができるその他の配列の付加も、本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明はまた、製薬上許容できるキャリアーと共にＷＴＡに特異的な抗体を含むワクチンも開示しており、ここで、抗体は、モノクローナルまたはキメラ抗体、ヒト化または完全にヒトの抗体のいずれでもよい。一実施形態において、ＷＴＡに特異的な抗体を含むワクチンを用いて、患者の表面へのブドウ球菌の付着ブロックすることもでき、このような表面としては、これらに限定されないが、鼻孔、皮膚および気道上皮（例えば肺における気道上皮）が挙げられる。一実施形態において、肺に感染しやすい患者に本抗体ワクチンを用いて、細菌感染をブロックまたは治療してもよく、このような患者としては、これらに限定されないが、嚢胞性線維症を有する患者が挙げられる。他の実施形態において、これらに限定されないがカテーテルおよびプロテーゼ（すなわち人工ひざまたは股関節）などの異物に関連するブドウ球菌の汚染をブロックまたは緩和するために、ＷＴＡに特異的な抗体を含むワクチンを患者の全身治療に用いてもよい。
【００６９】
あるいは、本発明のワクチンは、製薬上許容できるキャリアーと共に、単離されたＷＴＡまたはそれらの部分を含んでもよい。一実施形態において、ＷＴＡワクチンを用いて、ＷＴＡに結合する抗体の生産を誘導してもよい。本発明はまた、ＷＴＡを含む医薬組成物も含む。一実施形態において、医薬組成物は、表面をＷＴＡでコーティングすることによってブドウ球菌と表面との相互作用を妨害してもよい。表面としては、これらに限定されないが、患者の表面、および、人工的な表面、例えばプロテーゼまたはカテーテルで見出される表面が挙げられる。本ワクチンのＷＴＡは、ブドウ球菌の細胞壁で、その表面への結合に関してＷＴＡと競合する。
【００７０】
製薬上許容できるキャリアーとしては、滅菌した液体が挙げられ、例えば水、油、例えば石油、動物性の油、植物性の油、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などである。また、塩類溶液、デキストロース水溶液、および、グリセロール溶液も、特に注射用溶液のための液体キャリアーとして用いることができる。適切な製薬用キャリアーは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（３６）で説明されており、これは、参照により本発明の開示に含まれる。
【００７１】
加えて、様々な運搬担体および／またはキャリアーを用いて本発明を実施してもよい。このような担体は、貯蔵中の、および、投与の際の本ＭＡｂまたはＷＴＡの半減期を増加させることができ、上記投与としては、これらに限定されないが、皮膚、創傷、眼、肺、または、鼻もしくは消化管の粘膜への用途、または、鼻孔への吸入法または点滴注入の際、が挙げられる。これらのキャリアーは、天然ポリマー、半合成ポリマー、合成ポリマー、リポソーム、および、半固体の投薬形態を含む（５５，５７，７４，７８，８４，８５）。天然ポリマーとしては、例えば、タンパク質および多糖類が挙げられる。半合成ポリマーは、改変された天然ポリマーであり、例えばキトサンであり、これは、天然多糖類のキチンの脱アセチル化型である。合成ポリマーとしては、例えば、ポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリスチレンスルホネート、および、ポリ（ラクチドコグリコリド）が挙げられる。半固体の投薬形態としては、例えば、デンドリマー、クリーム、軟膏、ゲル、および、ローションが挙げられる。これらのキャリアーはまた、本ＭＡｂをマイクロカプセル化したり、本ＭＡｂに共有結合させるのに用いることもできる。
【００７２】
本発明は、ブドウ球菌生物のようなグラム陽性細菌に感染した、または、グラム陽性細菌に感染した疑いがある患者を治療する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、抗ＷＴＡ免疫グロブリン（モノクローナル、キメラ、ヒト化、または、完全にヒトのいずれでもよく、それらのフラグメント、領域および誘導体も含む）、および、製薬上許容できるキャリアーを含むワクチンの治療有効量を投与することを含む。他の実施形態において、本方法は、ＷＴＡまたはそれらのフラグメント、および、製薬上許容できるキャリアーを含むワクチンの治療有効量を投与することを含む。典型的な患者としては、Ｓ．アウレウス、または、その他のブドウ球菌もしくはグラム陽性感染の影響を受けるあらゆる哺乳動物または保菌者が挙げられ、例えば、ヒトおよびヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、霊長類、反芻動物、例えば肉牛および乳牛、スイギュウ、ラクダ、同様に、毛皮動物、群れをなす動物、実験用動物、動物園の動物、および、農場の動物、家畜小屋や畜舎で飼育された動物、家庭用のペット、および、獣医学的な動物が挙げられる。
【００７３】
治療有効量とは、感染の治療において、ある程度の軽減、援助、予防または予防作用を合理的に提供すると考えられている量である。治療有効量は、細菌感染をブロックするのに十分であると考えられている量であり得る。同様に、治療有効量は、細菌感染を緩和するのに足ると考えられる量であり得る。このような治療は、上記または下記で説明されるように、ブドウ球菌感染、様々な物質または無関係の病気によって生じる感染の抗生物質治療のようなさらなる治療に対する初期的な治療、または補足的な治療であってもよい。実際に、その他の抗体との併用療法は、特別に本発明の範囲内で考慮される。
【００７４】
本発明の抗体製剤およびＷＴＡ製剤は、以下と併せて投与してもよい：その他の抗生物質性の抗ブドウ球菌薬、例えば、ムピロシンおよびバシトラシンのような抗生物質；リソスタフィン、リゾチーム、ムタノライシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）、および、セロジル（ｃｅｌｌｏｚｙｌ）ムラミダーゼのような抗ブドウ球菌剤；ナイシンのような抗菌ペプチド；および、その他のランチビオティクス、または、あらゆるその他のランチオン（ｌａｎｔｈｉｏｎｅ）を含む分子、例えばナイシンまたはスブチリン。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態は、このような感染を予防する方法であり、本方法は、抗ＷＴＡ抗体（モノクローナル、キメラ、ヒト化、または、完全にヒトのいずれでもよい）、および、製薬上許容できるキャリアーを含むワクチンの予防有効量を投与することを含む。他の実施形態において、本発明は、このような感染を予防する方法であり、本方法は、ＷＴＡまたはそれらのフラグメント、および、製薬上許容できるキャリアーを含むワクチンの予防有効量を投与することを含む。
【００７６】
予防有効量とは、ある程度のグラム陽性細菌による感染の予防を合理的に提供すると考えられている量である。このような治療は、上記または下記で説明されるように、ブドウ球菌感染、様々な物質または無関係の病気によって生じる感染の抗生物質治療のようなさらなる治療に対する初期的な治療、または補足的な治療であってもよい。実際に、その他の抗体との併用療法は、特別に本発明の範囲内で考慮される。
【００７７】
本発明のワクチンは、静脈内、腹膜内、体内注射、関節内、心室内、髄腔内、筋肉内または皮下注射、または、鼻腔内、皮膚、皮内、膣内、経口的、または、あらゆるその他の有効な投与方法によって投与することができる。本組成物はまた、例えば筋肉内または皮下のいずれかによって感染した特定のエリアへ注射することによって、局所投与してもよい。投与は、本ワクチンを、患者に直接的に、綿棒などでの塗布（ｓｗａｂｂｉｎｇ）、浸すこと（ｉｍｍｅｒｓｉｎｇ，ｓｏａｋｉｎｇ）、または、塗りつけること（ｗｉｐｉｎｇ）によって投与することを含んでもよい。このような治療はまた、患者の体内に設置された物体に適用することもでき、このような物体としては、例えば、留置カテーテル、心臓弁、髄液シャント、関節プロテーゼ、その他の体へのインプラント、または、グラム陽性細菌への感染を引き起こす危険がある、または、患者にこのような感染を誘発する危険があるあらゆるその他の物体、器具もしくは装置が挙げられる。
【００７８】
本発明の組成物（抗ＷＴＡ抗体を含む医薬組成物であって、前記抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒト化または完全にヒトのいずれでもよい）を用いた治療の特に有用な結果は、グラム陽性細菌のＷＴＡの誘導により生じるサイトカイン放出の減少であってもよい（５４）。ＷＴＡは、サイトカインを誘導することができる。従って、本発明の組成物は、以下の３つのレベルで防御を高めることができる：（１）細菌にＷＴＡが結合し、それにより上皮細胞への最初の結合をブロックし、その後の細菌の侵入を予防する；（２）細菌にＷＴＡが結合し、それにより細菌のオプソニン作用を高め、組織および／または血液から細菌を排除する；および／または（３）ＷＴＡに結合して、サイトカイン放出を部分的または完全にブロックし、炎症性応答を調節し、ショックと組織の破壊を予防する。
【００７９】
最終的に、本発明は、ＷＴＡ欠失ブドウ球菌生物を提供する。一実施形態において、ブドウ球菌生物はＳ．アウレウスである。本発明において用いられる用語「ＷＴＡ欠失」は、ブドウ球菌生物が、細胞壁にＷＴＡを含まないことを意味する。ＷＴＡ欠失ブドウ球菌生物は、当業者既知の組換えＤＮＡ技術のような技術を用いて「構築する」ことができる。例えば、ＷＴＡ欠失ブドウ球菌生物は、ＷＴＡ合成または細菌の細胞壁へのＷＴＡの取り込みに関与する生物学的産物を生産するブドウ球菌の遺伝子を不活性化することによって構築することができる。このような遺伝子としては、これらに限定されないが、ｔａｇＯ遺伝子が挙げられる。遺伝子がコードする生物学的産物が細胞に存在しない場合、または、生物学的産物が細胞中でその正常な機能を果たさなくなっている場合、その遺伝子は「不活性化されている」。遺伝子は、数種の方法によって不活性化することができる、このような方法としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ブドウ球菌生物のゲノムから遺伝子全体またはその遺伝子の一部のいずれか欠失させること；１またはそれ以上のヌクレオチド位置で遺伝子のヌクレオチド配列を変化させること；または、追加のヌクレオチド配列を遺伝子のヌクレオチド配列に付加すること（すなわち、遺伝子を壊すために）。ＷＴＡ欠失ブドウ球菌生物を用いて、例えば、ＷＴＡ欠失突然変異体への免疫応答と、そのＷＴＡ欠失突然変異体を生成した野生型株への免疫応答とを比較することによって、患者のブドウ球菌に対する免疫応答へのＷＴＡの作用を研究することができる。
【００８０】
本発明を一般的に説明したが、本発明は、発明の背景の段落で説明されている、抗生物質耐性グラム陽性細菌を発生させてしまう可能性のある深刻な問題のいくつかを克服していることは明らかである。上述したように、ブドウ球菌や連鎖球菌（例えばＳ．フェカーリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ））は、抗生物質への耐性をますます高めており、近年の薬剤耐性株の蔓延により、抗生物質治療がすっかり効力を失う可能性もある。
【００８１】
ここに、本発明の特定の形態を以下の材料および方法、同様に、特定の実施例の形態で示す。もちろん、これらは単に説明する目的で示されたものであり、本発明を限定する意図はない。
【００８２】
材料および方法
細菌株および成長条件：
Ｓ．アウレウスＳＡ１１３および８３２５−４は、実験的な感染研究で頻繁に用いられている実験用株である（６１）。近年、ＳＡ１１３ｄｌｔＡ突然変異体と、その突然変異体の補足のために用いられたプラスミドｐＲＢｄｌｔ１は、詳細に説明されている（６８）。８３２５−４で誘導された突然変異体（２種のＳ．アウレウスのＦｎ結合タンパク質をコードするｆｂｐＡおよびｆｂｐＢが欠失している）は、Ｔｉｍ  Ｊ．Ｆｏｓｔｅｒ氏（ダブリン，アイルランド）のご好意によって提供された（３７）。全ての細菌株を、ＬＢブロス（１％トリプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％ＮａＣｌ）、または、ＢＭブロス（ＬＢに、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4および０．１％グルコースを添加）中で、特に他の規定がない限り３７℃で、成長させた。野生型細菌と突然変異型細菌との世代時間を比較するために、複合培地（ＢＭ）または合成最小培地（フェノールレッド非含有のＩＭＤＭ，ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ，カールスバッド，カリフォルニア州）に、一晩の培養液を体積比１／１００で植え付け、サンプル（２００μｌ）を、９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、３０℃または３７℃で強く撹拌した。数々のタイムポイントで細菌の密度をマイクロプレートリーダーで測定し、対数期の成長のために世代時間を計算した。
【００８３】
ｔａｇＯ突然変異体の生成および補足：
Ｓ．アウレウスのゲノム由来の遺伝子ＳＡ０７０２（２７）は、Ｂ．ズブチリスｔａｇＯと６２％類似性を示す。それに相当する遺伝子を不活性化するために、ＳＡ０７０２の１００１ｂｐ上流、および、１００２ｂｐ下流からなるＤＮＡフラグメントを、Ｓ．アウレウスＳＡ１１３（ＡＴＣＣ３５５５６）のＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ＫｐｎＩ／ＳａｌＩ（上流）とＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ（下流）制限部位を用いて、ＫｐｎＩ／Ｘｂａｌで消化した温度感受性シャトルプラスミドｐＢＴ２へ、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで消化したＴｎ５５１由来のｅｒｍＢ遺伝子と共にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５ａへクローニングした後、ＰＣＲ産物の配列を確認した。得られたプラスミドｐＢＴΔｔａｇＯをＳ．アウレウスＳＡ１１３に形質転換し、相同組換えによってゲノムへのｅｒｍＢ遺伝子の統合を達成した。突然変異体を２．５μｇ／ｍｌエリスロマイシン存在下で４２℃で培養することによって濃度を高めた。ｔａｇＯよりかなり大きいｅｒｍＢの適切な統合は、ＰＣＲ解析によって確認した。１０５５ｂｐのＴａｇＯ全体をコードするフラグメントは欠失された。Ｅ．ｃｏｌｉおよびスタフィロコッカスに特異的なプラスミドベクターならびに分子学的方法は、以前に説明されている（４，５，１０，６１，６７）。近年、実質的に説明されているようにして、突然変異体のクローニング、相同組換え、および確認の手順を行った（１０，６８，６９）。
【００８４】
プラスミドｐＲＢｔａｇＯを、推定のプロモーター領域（４６０ｂｐの非コーディング上流ＤＮＡ）と共にｔａｇＯ遺伝子を有する１７２０ｂｐのＰＣＲフラグメントをクローニングすることによって構築した。ＰＣＲプライマーは、Ａｓｐ７１８１（上流）およびＨｉｎｄＩＩＩ（下流）制限部位を誘導するように改変された。プライマー配列は以下の通りである：
ＴＯ−ＰＣＲ１（Ａｓｐ７１８１）
５’ＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡＧＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧ  ３’（配列番号１）
ＴＯ−ＰＣＲ２（ＨｉｎｄＩＩＩ）
５’ＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＡＣＴ  ３’（配列番号２）
これらのＰＣＲプライマーにより、上記フラグメントが、同じ制限部位で消化されたシャトルベクターｐＲＢ４７３へライゲーションされた（６７）。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５ａ中でｐＲＢｔａｇＯを構築し、エレクトロポレーションによってＳ．アウレウスＳＡ１１３へ形質転換した（４）。プラスミドｐＢＲｔａｇＯの安定性を解析するために、細菌を２４時間ごとに１：１００で植え付けることによる連続培養（抗生物質を含まない）で細菌を培養した。希釈した細菌懸濁液を、寒天（クロラムフェニコール含有または非含有）上にプレーティングすることによって、生存可能な細菌をカウントした。
【００８５】
ＷＴＡの単離および特徴付け：
近年説明されている通りに、ブドウ球菌のテイコイン酸を単離し、解析した（６８）。簡単に言えば、細菌を、０．３％グルコースを含むＢＭブロスで一晩成長させ、酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ４．６）に再懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕した。２％ＳＤＳを用いて粗細胞溶解産物を抽出し、続いて酢酸ナトリウム緩衝液で全般的に洗浄することによって、細胞壁を調製した。５％トリクロロ酢酸で細胞壁を処理することによって細胞壁テイコイン酸  を放出させた。以前に説明されている通りに、比色分析によってテイコイン酸サンプル中のリンおよびヘキソサミンの量を決定した（１８，６８，８０）。ガスクロマトグラフィーによって、リビトール含量を決定した。ＷＴＡ製剤（１００μｌ）を６ＮのＨＣｌ（１００μｌ）と共に１１０℃で２３時間加熱した；これらの条件下で、リビトールは完全に無水リビトールに変換される。メタノール（１００μｌ）と、ｔｅｒｔ−ブタノール（１０μｌ）を加え、サンプルを真空遠心分離機で乾燥させた。次に、リビトールを、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド／アセトニトリル（１：１）を（５０μｌ）用いて、１１０℃で２時間誘導体化した。サンプルを、ｎ−テトラコサン（内部標準）（２０μｇ）を含む塩化メチレン（１００μｌ）で希釈し、ＤＢ５石英ガラスキャピラリー（３０ｍ×０．２５ｍｍ；ｄf＝０．１μｍ；Ｊ＋Ｗサイエンティフィック（Ｊ＋Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），フォルサム，カリフォルニア州）で、キャリアーガスとしてＨ2を用いた水素炎イオン化検出器を備えたＨＰ５８９０ガスクロマトグラフ（ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ），パロアルト，カリフォルニア州）で、解析した。同一のサンプル製剤の条件下で、ｎ−テトラデカンに対するリビトールの応答要素を測定した。
【００８６】
いくつかの分析のために、以前に説明されている通りに、エタノール沈殿によってＷＴＡをさらに精製した（５４）。簡単に言えば、体積比１／１０で３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１）を添加し、体積３の９５％氷冷エタノールを添加した後に、ＷＴＡを１５時間沈殿させる。８０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した後に、ＷＴＡを８０％エタノールで３回洗浄し、凍結乾燥した。
【００８７】
ＷＴＡを分離するために、実質的にいずれかで説明されている通りに、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって、沈殿したＷＴＡを、サンプル緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１０％グリセロール，２．５％ブロモフェノールブルー）に溶解させ、１８％アクリルアミド含有、およびＳＤＳ非含有を含むトリス／トリシンゲルにアプライし（７７）、アルシアンブルーと銀染色を併用して可視化した（７０）。
【００８８】
標準的な手順に従って（３４，６１）、ファージ３Ａ，Φ１１および８５をＳ．アウレウスＳＡ１１３野生型で増殖させ、近年説明されている通りに（１８）、それらの活性を、芝状のＳ．アウレウス株にファージ懸濁液を滴下することによって研究した。一晩培養したものを１／１００で培地に植菌した後に、ＢＭブロス（１％トリプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％ＮａＣｌ，０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、および、０．１％グルコース）またはＩＭＤＭ（ギブコ−ＢＲＬ）で、強く通気させながら、細菌の成長を研究した。定常期における生存率を、ＢＭブロスを用いた同じ方法で調査した。
【００８９】
鼻での定着のコトンラットモデル：
近年、鼻での定着のコトンラットモデルが詳細に説明されている（４５）。簡単に言えば、２％ＮａＣｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ），セントルイス，ミズーリ州）を添加したコロンビア寒天（ＢＤ，スパークス，メリーランド州）でＳ．アウレウスを一晩成長させ、莢膜形成を誘導した。プレートで成長した細菌を、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ，バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｋｅｒ））で、懸濁液の透過性（％）が１０％未満になるように懸濁することによって洗浄した。点滴注入する予定の動物１匹あたり１ｍｌに相当する量の懸濁された細菌を、遠心分離によってペレット化し、次にこれを、点滴注入する予定の動物１匹あたり１０μｌの、抗生物質を含まないＰＢＳ、または、別の実験において、２．５μｇ／ｍｌエリスロマイシン、３００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、または、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＰＢＳ、または、ΔｔａｇＯ、ΔｄｌｔＡ、または、補足されたΔｔａｇＯそれぞれを含むＰＢＳに再懸濁した。６週齢の雌コトンラット（Ｓｉｇｍａｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）  を、ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）、マレイン酸アセプロマジンおよびケタミン（それぞれ２．５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）を併用して麻酔した。再懸濁されたＳ．アウレウス（１０9ＣＦＵ）のアリコート（１０μｌ）を、鼻腔内に滴状で点滴注入し、麻酔した動物の鼻孔それぞれに等しく分布させた。
【００９０】
細菌を鼻へ点滴注入してから７日間後に、動物を殺し、鼻の領域を７０％エタノールで徹底的に洗い、Ｓ．アウレウスの表面への定着を除去し、鼻を外科的に除去した。鼻孔をはさみで二等分し、次に、切り出された鼻を、０．５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（シグマ）を含むＰＢＳ（５００μｌ）中に置いた。鼻をボルテックスで、３回、それぞれ２０秒間、強く撹拌し、定着した細菌を分離させ、上清５０〜１００μｌを、７．５％ＮａＣｌを添加した、血液寒天（レメル，レネクサ，カンザス州）またはトリプシンのダイズ寒天（ＴＳＡ，ＢＤ）にプレーティングした。いくつかの実験において、特定の研究で用いられたＳ．アウレウス株の単離を補助するために、抗生物質（スペクチノマイシン３００μｇ／ｍｌ、エリスロマイシン２．５μｇ／ｍｌ、または、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌ、シグマ）、または、リソスタフィン（１μｇ／ｍｌ）を、ＴＳＡに加えた。ＮａＣｌが添加されたＴＳＡプレートを３７℃で４８時間インキュベートし、Ｓ．アウレウスを成長させた。
【００９１】
抗生物質耐性ではない野生型Ｓ．アウレウスＳＡ１１３の点滴注入による鼻での定着と、固有のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）の鼻での定着とを区別するために、サブトラクティブ技術を用いた。解剖された、野生型ＳＡ１１３を点滴注入された鼻からの上清を、ＴＳＡ＋７．５％ＮａＣｌ（１μｇ／ｍｌリソスタフィン含有および非含有）にプレーティングした。このリソスタフィン濃度で、Ｓ．アウレウスの成長が阻害されたが、コトンラットの鼻由来のＣｏＮＳは阻害されなかった（４５）。鼻での定着を、ＴＳＡ（リソスタフィン非含有）のＣＦＵから、ＴＳＡ（リソスタフィン含有）のＣＦＵを引いた値として決定した。本願で説明した動物実験においては、ＵＳＤＡと、Ｂｉｏｓｙｎｅｘｕｓ  ＩＡＣＵＣとの両方のガイドライン全てに従った。
【００９２】
予備実験によれば、点滴注入の前に、ストレプトマイシンまたはナフシリンで天然の鼻のフローラを除去することは、それに続くＳ．アウレウスによる鼻での定着に大した影響は与えなかったことが実証されている。その上、Ｓ．アウレウスの鼻での定着は、天然フローラに対して明白な影響を有さなかった。
【００９３】
補足されたΔｔａｇＯ突然変異体を用いた実験において、突然変異体と、補足された突然変異体の両方に、抗生物質（それぞれ２．５μｇ／ｍｌエリスロマイシン、または、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を添加したＰＢＳを点滴注入し、ｔａｇＯ遺伝子を有するプラスミドに選択的的な圧力を維持した。
【００９４】
ＷＴＡによる鼻での定着の緩和を研究するために、コトンラットの鼻に、３つの異なる実験において、細菌を点滴注入する前に、精製したＷＴＡを５分間点滴注入した。比較的少数の細菌を用いて、予め点滴注入されたＷＴＡにより効率的に競合させた。ストレプトマイシン耐性により寒天プレート上で容易に同定することができるＳ．アウレウスＳＡ１１３野生型（３×１０4ＣＦＵ）（４５）、または、臨床的な分離株ＭＢＴ５０４０（５×１０5ＣＦＵ）のいずれかを、それぞれ実験１または２、および、実験３に用いた。ＰＢＳ（１０μｌ）中のＳＡ１１３野生型由来のＷＴＡ（実験１および３では５０μｇ、または、実験２では２００μｇ）をアプライした。実験１において、ＷＴＡ（５０μｇ）での処理を、１２日目と２日目に繰り返した。１０、６および２０匹の動物を、それぞれ実験１、２および３に用いた。各実験において、５０％の動物を、ＷＴＡのＰＢＳ溶液、または、ＰＢＳ単独（コントロールとして）で前処理した。
【００９５】
ｈＮＰ１−３、ＬＬ−３７、および、ラクトフェリンを用いた感受性の研究：
感受性の実験用の細菌を調製するために、ミューラーヒントンブロスに、一晩の細菌培養物を体積比１／１００で植え付け、中期対数期になるまで３７℃で強く撹拌した。細菌を、０．０５％ＨＳＡを含むリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．５）で３回洗浄した。濃度１×１０6ＣＦＵ／ｍｌの細菌を、同じ緩衝液中の１００μｇのｈＮＰ１−３／ｍｌ、１０μｌのＬＬ−３７／ｍｌ、または、５００μｇのラクトフェリン／ｍｌと共に、全ての化合物を３７℃で予備加熱した後にインキュベートした。それぞれ１０μｌのサンプルを３７℃で撹拌し、様々なタイムポイントで氷冷リン酸カリウム緩衝液で２５倍希釈することによって死滅を止めた。適切な希釈物をＬＢ寒天にプレーティングして２４時間後に、生存可能な細菌をカウントした。ヒトラクトフェリンをシグマ（セントルイス，ミズーリ州）から購入した。近年説明されている通りに、ｈＮＰ１−３を、ヒト顆粒球から精製した（６３）。Ｆｍｏｃ／Ｂｕ1法、および、Ｒｉｎｋアミド樹脂を含むポリスチレン樹脂を用いた固相ペプチド合成によってＬＬ−３７を合成した（２）。脱保護した後に、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）Ｃ４カラム（１５０×１０ｍｍ）での逆相分離用ＨＰＬＣによってペプチドを精製した。分析用逆相ＨＰＬＣによってペプチドの純度を調べ、その製剤が９７％純粋であることがわかった。ペプチドの同一性を、エレクトロスプレーマススペクトロメトリーとＭＡＬＤＩ−ＭＳによって確認した。同数のＳ．アウレウスＳＡ１１３野生型、ΔｔａｇＯ、および、ΔｄｌｔＡ細菌を、１００μｇ／ｍｌのヒトデフェンシンｈＮＰ１−３、ｘμｇ／ｍｌカテリシジンＬＬ−３７、または、５００μｇ／ｍｌのラクトフェリンと共にインキュベートした、生存可能な細菌を、様々なインキュベート時間後にカウントした。
【００９６】
上皮細胞への付着：
樹立されたヒト肺胞の上皮細胞系Ａ５４９（４５）を、１０％熱で不活性化されたウシ胎仔血清（バイオクロム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ），ベルリン，ドイツ）、および、２ｍＭグルタミンが添加されたダルベッコ改変イーグル培地ＮｕｔミックスＦ−１２（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）（ギブコ−ＢＲＬ，カールスバッド，カリフォルニア州）中で培養した。初期のヒト気管支の上皮細胞（ＮＨＢＥ）と、必要な培地成分を、クロンティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ウォーカーズビル，メリーランド州）から購入した。それらを、製造元の説明書に従って、ＢｕｌｌｅｔＫｉｔが添加された気管支の上皮細胞の増殖培地（ＢＥＧＭ）中で培養し、継代数４までを用いた。初期のヒトの鼻の上皮細胞（ＨＮＥＣ）と、必要な培地成分を、オリジーン（Ｏｌｉｇｅｎｅ，ベルリン，ドイツ）から購入した。製造元の説明書に従ってＨＮＥＣを培養し、継代数４までを用いた。全てのタイプの上皮細胞を、５×１０4／ウェル（Ａ５４９）、２×１０4／ウェル（ＮＨＢＥ）、または、１×１０4／ウェル（ＨＮＥＣ）の細胞数で２４−ウェル培養プレートに蒔き、３７℃で、５％ＣＯ2下でインキュベートした。密集してきたら、単層を、ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）で３回洗浄し、付着の分析に用いた。
【００９７】
付着実験用の細菌を調製するために、ミューラーヒントンブロスに、体積比０．０１の一晩の細菌培養物を植え付け、中期対数期になるまで３７℃で強く撹拌した。細菌のペレットを３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。それに続いて、０．１ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を加え、細菌を３７℃で１時間標識した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細菌をＲＰＭＩに再懸濁し、ノイバウエル計算板を用いて同じ細胞数に調節した。
【００９８】
以下の標準化したプロトコールを用いて細菌の付着の分析を行った：２４−ウェルマルチウェルプレート（約６．４〜７×１０4のＮＨＢＥ細胞／ウェル；７×１０5の５４９細胞／ウェル；４×１０4のＨＮＥＣ細胞／ウェル）で成長させた密集した上皮細胞単層をＲＰＭＩで２回洗浄し、ＦＩＴＣで標識された細菌を植え付け、ＲＰＭＩに懸濁した。細菌の付着の用量依存性を、５〜１００の範囲で重複感染度（ＭＯＩ）を高めることによって確認し（データ示さず）、最終的に、Ａ５４９、および、ＨＮＥＣまたはＮＨＢＥ細胞それぞれに５０または１００のＭＯＩを用いた。３７℃で１時間、５％ＣＯ2下でインキュベートした後に、ウェルをＲＰＭＩで３回洗浄し、細胞を３．５％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定した。この手順の後に、ＲＰＭＩを含むが、細菌を含まないコントロールウェルにおいて、細胞の形態学的な変化は観察されなかった。ＰＬ  Ｆｌｕｏｔａｒ  Ｌ６３×０．７対物（ライカ・マイクロシステムズ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ），ヴェッツラー，ドイツ）を備えた、ライカＤＭＲＩＢＤＥ蛍光顕微鏡を用いて、付着した細菌／ｍｍ2をカウントした。実験を三連で行い、各ウェルで１０までのランダムフィールドをカウントした。これらの条件下で、アプライされたＳ．アウレウス野生型細胞の１０．０±１．０％が、ＨＮＥＣに付着した（５回の実験の平均およびＳＤ）。
【００９９】
上皮細胞へのＳ．アウレウスの付着に対する精製したＷＴＡの作用を評価するために、以下の改変を行った。密集して成長したＡ５４９またはＨＮＥＣ細胞を、異なる濃度の、ＲＰＭＩに溶解させたＳ．アウレウスＳＡ１１３野生型のまたはΔｄｌｔＡの精製したＷＴＡ（１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、または、５００μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。ΔｔａｇＯ突然変異体の場合において、同じ方法（ただしＷＴＡ欠失）で製造された等量のサンプルを上皮細胞にアプライした。１時間インキュベートした後に、上述したように細胞を洗浄し、ＦＩＴＣで標識された細菌を植え付けた。
【０１００】
ＩＬ-８誘導：
ＩＬ−８誘導を、付着の研究に関して上記で説明されている条件下で研究した（ただし、細菌を標識せず、ＨＮＥＣをＳ．アウレウス株と共にインキュベートし、１時間後にゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加し、続いてさらに８時間インキュベートすることによって不活性化したことを除く）。ＩＬ−８  をＥＬＩＳＡによって定量した（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），ミネアポリス，ミネソタ州）。
【０１０１】
ＷＴＡでコーティングしたマイクロスフェアの付着：
アミンで修飾された蛍光マイクロスフェア（フルオスフェアズ（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ），直径１．０μｍ，黄〜緑色の蛍光，モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），ユージーン，オレゴン州）をＷＴＡでコーティングするために、ビーズを、リン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ）（１０ｍＭ，ｐＨ７．５）で洗浄し、室温で３０分間、ＷＴＡ（５００μｇ／ｍｌ）（２００μｌ）と共に、ゆっくり撹拌しながらインキュベートした。ＷＴＡはエタノール沈殿し、ＰＰＢに溶解した。ＷＴＡでコーティングしたビーズを２回洗浄し、１％ＢＳＡ（シグマ）を含むＰＰＢに再懸濁し、疎水性エリアをブロックした。ＢＳＡなしでＷＴＡでコーティングしたビーズ（１００μｌ）を１００℃で１０分間沸騰させることによって放出されたＧｌｃＮＡｃの量を測定することによって、吸着したＷＴＡの量を決定した。ＷＴＡでコーティングしたビーズを、ＲＰＭＩで希釈し、ノイバウエル計算板を用いて決められた濃度に調節し、様々なサンプルを同じ蛍光に関して試験した。このサンプルを、ＦＩＴＣで標識された細菌について説明されたのと同様にして、密集して成長したＡ５４９細胞（ＭＯＩ＝５０，２５および１２．５）、または、ＨＮＥＣ（ＭＯＩ＝６０，３０および１５）への付着の分析に用いた。５０５／５１５ｎｍ／ウェルでの相対的な蛍光を、フルオロリーダー（ＦＬ６００，バイオ−ＴＥＫインスツルメンツ（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），ウィノースキ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ），バーモント州）を用いて定量した。結果を評価するために、数回の実験で、上述したようにＦＩＴＣで標識された細菌をカウントすることによって（すなわち顕微鏡でカウントすることによって）ビーズ数／ｍｍ2上皮細胞を決定した。
【０１０２】
フィブロネクチン（Ｆｎ）への付着：
細菌の固相Ｆｎへの付着を、Ｗｏｌｚ等によって説明されている通りに研究した（９３）。簡単に言えば、９６−ウェルマイクロタイタープレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ），アクトン，マサチューセッツ州）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の２０μｇのＦｎ／ウェルで、４℃で１５時間コーティングした。それに続いて、ウェルを、３％ＢＳＡのＴＢＳ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ，１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７，５）溶液で２時間ブロックし、ＴＢＳで２回洗浄した。細菌を、ＩＭＤＭ中で中期対数期になるまで成長させ、ＴＢＳで２回洗浄し、ノイバウエル計算板を用いて１×１０9細胞／ｍｌに調節した。細菌懸濁液（２００μｌ）を各ウェルに加えた。３７℃でのインキュベートの１時間後に、ウェルをＴＢＳで３回洗浄し、サフラニンで１分間染色し、マイクロプレートリーダー（スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）３６０ｐｃ，モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ），サニーベール，カリフォルニア州）でＡ４９２を決定した。
【０１０３】
ｈＮＰ１−３、ＬＬ−３７、および、ラクトフェリンを用いた死滅の研究：
死滅の実験用の細菌を調製するために、ミューラーヒントンブロスに、体積比１／１００の一晩の細菌培養物を植え付け、中期対数期になるまで３７℃で強く撹拌した。細菌を、０．０５％ＨＳＡを含むリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．５）で３回洗浄した。濃度１×１０8ＣＦＵ／ｍｌの細菌を、同じ緩衝液中の、１００μｇのｈＮＰ１−３／ｍｌ、５００μｇのラクトフェリン／ｍｌ、または、１００μｌのＬＬ−３７／ｍｌと共に、全ての化合物を３７℃で予備加熱した後にインキュベートした。それぞれ１０μｌのサンプルを３７℃で撹拌し、様々なタイムポイントで氷冷リン酸カリウム緩衝液で２５倍希釈することによって死滅を止めた。適切な希釈物をＬＢ寒天にプレーティングして２４時間後に、生存可能な細菌をカウントした。ヒトラクトフェリンをシグマから購入した。近年説明されている通りに、ｈＮＰ１−３を、ヒト顆粒球から精製した（１８，６８）。ＬＬ−３７を固相ペプチド合成によって合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。ＬＬ−３７のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ（配列番号３）
ペプチドの純度および同一性を、ＨＰＬＣとマススペクトロメトリーによって確認した。ラクトフェリンをシグマから購入した。
【０１０４】
突然変異体のリソスタフィンに対する感受性：
Ｓ．アウレウス野生型およびΔｔａｇＯに対するリソスタフィンの活性を比較するために、Ｂ培地（Ｂ−ｍｅｄｉａ）に、体積比１／１００で一晩の培養物を植え付け、中期対数期になるまで３７℃で撹拌した。細菌をＰＢＳ中で３回洗浄した。全ての工程を４℃で行った。Ａ600＝１の細菌を、１μｇ／ｍｌリソスタフィン（メルク（Ｍｅｒｃｋ））含有または非含有のＰＢＳ中で、３０℃で１時間インキュベートした。Ａ600の減少を、１０分間ごとに、マイクロプレートリーダー（スペクトラマックス３６０ｐｃ，モレキュラーデバイス，サニーベール，カリフォルニア州）で測定した。
【０１０５】
実施例を参照することによって、上記で説明した本発明をよりよく理解することができる。以下の実施例は単に説明することを意図したものであり、いずれにしても本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【０１０６】
実施例１：ＷＴＡ欠失Ｓ．アウレウスの生成と特徴付け
人口の３０〜４０％における前鼻孔の定着は、重度のスタフィロコッカス・アウレウス感染の発症に関する主要な危険因子である。しかしながら、鼻孔における付着および生存に介在するメカニズムは未だにわかっていない。
【０１０７】
本発明は、第一の突然変異体を、壁テイコイン酸（ＷＴＡ，表面が露出したブドウ球菌の細胞壁ポリマー）の生産が欠失したものとを定義し、コトンラットモデルにおいて、ＷＴＡは鼻での定着に重要であることを実証する。ＷＴＡの欠失は、デフェンシンやその他の鼻の抗菌分子に対する感受性に影響を与えなかったが、ヒトの気道の上皮細胞への付着を抑制しなかった。これらのデータは、Ｓ．アウレウスによる鼻での定着の分子機構に新たな光を当て、Ｓ．アウレウス感染を予防する、および、それと戦うための戦略を提供する。
【０１０８】
スタフィロコッカス・アウレウスは、血流による感染および敗血症の頻度と重症度の観点で、最も毒性のあるヒトの細菌の病原体の一つであり、転移性の、場合によっては慢性的な感染、および、高い死亡率を伴う。近年、バンコマイシン耐性株が出現するなど、Ｓ．アウレウスの複数の抗生物質耐性分離株の発生が増加していることから、治療不可能なＳ．アウレウス感染の恐怖が高まっており、新規の予防および抗感染の戦略の開発の緊急性が増加している（４０）。従って、Ｓ．アウレウス感染に関する主要な危険因子の一つである鼻の保菌に対して、関心が高まっているが（９０）、鼻の上皮への付着の分子機構、および、鼻の上皮での増殖は不明確なままである。数種の研究では、健康な成人群の２０％は持続性Ｓ．アウレウスのキャリアーであり、一方、その他の６０％は断続的に前鼻孔に定着させていることを立証している。このキャリアーの状態は、例えば、外科手術または透析を受けた患者、および、ＨＩＶに感染した患者などにおけるＳ．アウレウス感染の危険の増加に関連する（６５）。従って、患者やヘルスケア従事者の鼻からＳ．アウレウスを除去するのに、多大な労力がかけられてきた。抗生物質ムピロシンがＳ．アウレウスの局所的な根絶に有効とされており、Ｓ．アウレウス感染の危険を減少させることができるが、ムピロシン耐性が広く蔓延したため、Ｓ．アウレウスによる鼻での定着を妨害する新たな戦略が必要とされている（５１）。
【０１０９】
ブドウ球菌細胞のエンベロープは、表面タンパク質に加えて、テイコイン酸を含み、このテイコイン酸、複合表面が露出したポリマーであり、細菌の病因論および生理学におけるその役割は、まだ完全には解明されておらず、その生合成に関してはわずかな注目しか浴びていない（３１，５８，７１）。テイコイン酸は、ペプチドグリカンに共有結合しているテイコイン酸（壁テイコイン酸，ＷＴＡ）、または、膜のグリコリピドに連結しているテイコイン酸（リポテイコイン酸，ＬＴＡ）のいずれかである（３１）。スタフィロコッカス・エピデルミディス（３２）、および、バチルス・ズブチリス（５３）における遺伝子置換の障害の研究により、ＷＴＡは、全てグラム陽性細菌の重要な成分の一つであるという仮説が導かれたが、１９６０年代後期にＷＴＡ欠失Ｓ．アウレウス突然変異体が説明されている（１４）。しかしながら、突然変異した遺伝子や、逆突然変異の起こり得る比率に関する情報がなかったために、この研究の妥当性は疑問のままであった。Ｓ．アウレウスは、その他の全てブドウ球菌種のＷＴＡとは異なるＷＴＡを生産する。このユニークな構造は、Ｓ．アウレウスの病原性メカニズムに関与する可能性がある。このユニークなＷＴＡは、〜４０リビトールホスフェート反復単位で構成され、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＤ−アラニンで修飾されている（３１）（図１Ａ）。近年、ＷＴＡおよびＬＴＡにおいてＤ−アラニン修飾が欠失したＳ．アウレウス突然変異体が説明されている（３８）。この突然変異体の特徴付けにより、アラニン修飾は、デフェンシンおよびその他の陽イオン性の宿主防御要素による死滅の回避（６８）、バイオフィルム形成（３８）、および、マウス敗血症モデルにおける生存（１８）において、主要な役割を果たすことが実証された。
【０１１０】
ＷＴＡ欠失突然変異体の生成
病原性におけるテイコイン酸の役割を徹底的に研究するために、我々は、ＷＴＡ生合成遺伝子ｔａｇＯを同定し、第一の定義されたＷＴＡ欠失突然変異体を生成した。それに続く以下の実施例で述べられるように、この定義された突然変異体（ΔｔａｇＯ）は、コトンラットモデルにおける、Ｓ．アウレウスの鼻での定着におけるＷＴＡの役割を実証している。
【０１１１】
Ｂ．ズブチリスにおける以前の研究において、条件付きの突然変異体を生成することによりＷＴＡ生合成に関するいくつかの遺伝子が同定された（３２，４６，７２，８３，９５）。しかしながら、生合成経路の多くの遺伝子は未だに特徴付けられていない（７１）。生化学的な研究に従って（９，１７，９５）、第一の酵素は、ＧｌｃＮＡｃを、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから普遍的な細菌の脂質キャリアー、バクトプレノールへトランスファーする膜タンパク質のはずである。近年、このタイプの酵素に相同なＢ．ズブチリスの遺伝子のｔａｇＯが、生存率に重要であることが示されており、この遺伝子の転写を抑制すると、放射活性ＷＴＡ前駆体の、細胞壁への取り込みが減少した（８２）。そこで我々は、Ｓ．アウレウスと、ＷＴＡを生産する全てのグラム陽性細菌のゲノムにおいて、関連する遺伝子を同定した（データ示さず）。
【０１１２】
Ｓ．アウレウスＳａ１１３において、Ｓ．アウレウスのｔａｇＯ相同体をエリスロマイシン耐性カセットで置き換え（図１Ｂ）、それらのＷＴＡ生合成への関与の可能性を評価した。野生型Ｓ．アウレウスＳａ１１３、および、ΔｔａｇＯ突然変異体由来の細胞壁を製造し、酸性化によってＷＴＡを分離させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば、ΔｔａｇＯ突然変異体でＷＴＡは検出不可能であったが、プラスミド（ｔａｇＯ遺伝子を有するｐＲＢｔａｇＯ）で補足されるとＷＴＡが再出現した（図１Ｃ）。ΔｔａｇＯ突然変異体のホスフェートとＧｌｃＮＡｃの含量の解析により、野生型のホスフェート（８．２５％）と、ＧｌｃＮＡｃ（８．１４％）がほんのわずかな量で存在することが明らかになった（図１Ｄ）。これらのわずかな量は恐らく、残留した核酸やペプチドグリカン汚染にから生じたものである。ＷＴＡの特徴であるリビトールは、突然変異体からのサンプル中でほとんど検出不可能であった（１ｍｇの細胞壁（乾燥重量）あたり、野生型においては１６８ｎｍｏｌリビトールであったのに対し、突然変異体においては０．７６ｎｍｏｌリビトールであった）（図１Ｄ）。このリビトールの残留した量は検出限界に近く、それ以前のその他のサンプルの泳動で、ガスクロマトグラフィーキャピラリーに残留した不純物である可能性がある。数種のＳ．アウレウスファージ、例えば３Ａ５２およびΦ１１は、細菌の細胞の感染のための受容体としてＷＴＡを用いることがわかっている（６１，６３）。ｔａｇＯ突然変異体はこれらのファージに対してまったく耐性であったが、野生型株および補足された突然変異体は、ファージに感染しやすかった（データ示さず）。総合すると、これらのデータにより、ｔａｇＯ突然変異体はＷＴＡを欠失していることが実証された。ＴａｇＯのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼに対する類似性（８２）により、ＷＴＡ合成、ＧｌｃＮＡｃの細菌の脂質キャリアー、バクトプレノールへのトランスファーの第一の工程における役割が示される。
【０１１３】
ＷＴＡ欠失突然変異体の最初の特徴付け
野生型およびΔｔａｇＯにおける細胞壁に固定されたタンパク質のパターンにおいては、主要な差は示されなかった（データ示さず）。Ｓ．アウレウスＳＡ１１３野生型と、ΔｔａｇＯ突然変異体の成長の特徴を、複合培地（基礎培地，ＢＭ）と、最小培地（イスコフ改変ダルベッコ培地，ＩＭＤＭ）とで比較した。前鼻孔に適切な条件下で（３０℃，通気良好）、世代時間は両方の株で極めて類似しており（図２Ａ）、これは、ＷＴＡは、Ｓ．アウレウス細胞複製においてわずかな役割しか果たさないことを示す。３７℃で、リッチな培地で、ΔｔａｇＯ突然変異体のラグフェーズはほんのわずか増加し、世代時間は減少した（突然変異体においては６１±３分間であるのに対し、野生型にいおては５０±４分間；平均±ＳＤ）。定常期における野生型とΔｔａｇＯの生存率は、少なくとも６日間にわたって極めて類似していた（図２Ｂ）。
【０１１４】
実施例２：ＷＴＡは、上皮細胞への付着に重要である  
Ｓ．アウレウスＳＡ１１３のその他の突然変異体、ΔｄｌｔＡが説明されている（６８）。この突然変異体は、ＷＴＡ、および、膜に固定されたリポテイコイン酸においてＤ−アラニン修飾が欠失している（図１Ａ）。それらが、ヒトの気道の上皮細胞（正常なヒト気管支の上皮細胞、ＮＨＢＥ）（図３Ａ）、および、ヒトの鼻の上皮細胞（ＨＮＥＣ）（図３Ｂ）へ付着する能力に関して、ΔｔａｇＯとΔｄｌｔＡ突然変異体を解析した。ＨＮＥＣにおいては、両方の突然変異体の付着効率は、野生型に比べてかなり低かった（ΔｔａｇＯ，８０％の付着の減少；ΔｄｌｔＡ，５５％の付着の減少；図３Ｂ）。失われた遺伝子が補足された突然変異体株は、野生型レベルの付着を示す。初期のヒト気管支細胞への付着を解析したら、類似しているが著しくはない差が見出された（図３Ａ）。
【０１１５】
また、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡ突然変異体も、それらがヒトの気道の上皮細胞系Ａ５４９に付着する能力に関して解析した（図３Ｃ）。両方の突然変異体の付着効率は、野生型株に比べてかなり低かったが（ΔｔａｇＯ，５１％の付着の減少；ΔｄｌｔＡ，６６％の付着の減少；データを＃１に示す）、一方で、各突然変異体の補足された株は、野生型レベルを示した。
【０１１６】
Ａ５４９細胞を、野生型Ｓ．アウレウスから単離されたＷＴＡと共にプレインキュベートすることによって、細胞に結合する野生型Ｓ．アウレウスの数が用量依存性の減少を起こした（図４Ａ）。しかしながら、ｄｌｔＡ突然変異体由来のＷＴＡ製剤、または、同じ方法で製造されたが、ＷＴＡを欠失しているｔａｇＯ突然変異体由来の製剤を、同じ分析に用いても、このような、野生型Ｓ．アウレウスの真核細胞への結合の減少は観察されなかった。野生型ＷＴＡでコーティングしたラテックスビーズは、コーティングされていないビーズと比べて、Ａ５４９への結合において強い用量依存性の増加を示したが、一方で、ΔｔａｇＯ、または、ΔｄｌｔＡからのサンプルでのコーティングは、結合を起こさなかったか、または、極めて弱い結合の増加しか示さなかった（図４Ｂ）。これは、野生型ＷＴＡと上皮細胞との特異的な相互作用があることを示し、これはさらに、鼻にＷＴＡをプレ点滴注入することによって、Ｓ．アウレウスがコトンラットの鼻に定着する能力が著しく減少することによって実証されている（図６Ｂ）。
【０１１７】
Ａ５４９において、Ｓ．アウレウス野生型、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡによる前炎症性サイトカインの誘導に有意差はなく（図４Ｃ）、これは、これら３つの株の前炎症性に関する能力は類似していることを示す。
【０１１８】
フィブロネクチン（Ｆｎ）が介在する相互作用は、Ｓ．アウレウスのヒト細胞への結合において役割を果たし（２４）、Ｓ．エピデルミディスのＷＴＡは、固定されたＦｎへの付着を高めることが示されている（４１）。しかしながら、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡは、インビトロにおいてＦｎに結合する能力の減少をまったく示さず（図４Ｄ）、これは、Ｆｎが関与する相互作用以外の相互作用は、Ｓ．アウレウスの上皮細胞へのＷＴＡが介在する結合に関与することを示す。
【０１１９】
実施例  ３：抗菌ペプチドおよびリソスタフィンに対する突然変異体の感受性
ヒトおよび齧歯類動物からの鼻の分泌物は、多数の陽イオン性抗菌ペプチドおよびタンパク質を含む（１６，８９）。ヒトおよび齧歯類動物からの気道上皮は、デフェンシン、カテリシジン、ラクトフェリンなどの多数の抗菌性物質を生産する。テイコイン酸Ｄ−アラニンエステルは、Ｓ．アウレウスのこのクラスの宿主防御要素に対する耐性において主要な役割を果たす（６８，１８）。加えて、インテグリンとのＦｎが介在する相互作用は、Ｓ．アウレウスの上皮細胞への結合において役割を果たすことが示されている（２５）。以下の実施例４で実証されているように、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡのコトンラットの鼻に定着する能力は、野生型と比較すると減少している。これは、突然変異体の先天的な宿主防御要素に対する感受性が増加したためによる可能性がある。従って、Ｓ．アウレウス野生型、ΔｄｌｔＡ、および、ΔｔａｇＯの、ヒトデフェンシンｈＮＰ１−３、カテリシジンＬＬ−３７およびラクトフェリンに対する感受性を比較した（図５Ａ）。ＬＬ−３７が最も効力のある化合物であったが、それぞれｈＮＰ１−３およびラクトフェリンと類似した抗菌活性を達成するのに１０または５０倍多い量が必要であった。ΔｄｌｔＡ突然変異体は、全ての３種の物質に比べてかなり感染しやすかった。それに対して、ΔｔａｇＯにおけるＷＴＡの欠失は、野生型株と比較して、３種のペプチドの活性には影響がなかった（図５Ａ）。この結果により、鼻の患者の防御に対して、Ｓ．アウレウスのΔｔａｇＯの感受性が増加したことは恐らく、この突然変異体が、コトンラットの鼻に定着できないこととは関与していないことが示される。
【０１２０】
また、リソスタフィンに対するＳ．アウレウス野生型の感受性（黒い記号）、および、ΔｔａｇＯの感受性（白い記号）も比較した（図５Ｂ）。Ａ600＝１の細菌懸濁液を、リソスタフィン有り（丸）、または、リソスタフィン無し（四角）で、濃度１μｇ／ｍｌで３０℃で１時間インキュベートした。図５Ｂの値は、最初のＡ600に対するパーセンテージとして示される。ＷＴＡ欠失突然変異体（ΔｔａｇＯ）は、野生型と比べて、リソスタフィンでの溶解に対する耐性を増加させた。実際に、ΔｔａｇＯ細菌培養物へのリソスタフィンの添加によって、１時間インキュベートした後に残存した細菌の量の差はほとんど生じなかった。
【０１２１】
実施例４：鼻での定着におけるＷＴＡの役割
１９８０年代の間接的なデータが、ヒトの気道の上皮細胞への結合におけるテイコイン酸に関与しており（２）鼻での定着におけるＷＴＡの可能性のある役割を示している。近年開発された、Ｓ．アウレウスの鼻での定着のコトンラット（Ｓｉｇｍａｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）モデルにより、一貫して持続性のハイレベルな鼻での定着が可能である（４５）。コトンラットの鼻孔は、扁平上皮，円柱上皮に対する立方骨，円柱上皮、および、多列円柱上皮エリアにおいてヒトと類似した組織学的な特性を有するため、コトンラットモデルは、ヒトのＳ．アウレウスのキャリアーにおける状況をよく反映している（７３）。コトンラットは、多くの細菌性およびウイルス性の呼吸器のヒト病原体に感染しやすく、ヒトで観察される病気の経過と類似した経過をたどることが示されている（６０）。
【０１２２】
表１で示されるように、６週齢の雌コトンラットの鼻腔内に、同数のＳ．アウレウスＳＡ１１３野生型、または、定義されたＳＡ１１３突然変異体のいずれかを点滴注入した。７日間後に、鼻での定着を数えた。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
野生型細菌を点滴注入された全ての動物（１５匹中１５匹）の鼻は、平均６０１１ＣＦＵ／鼻で定着が起こったが、ΔｔａｇＯが点滴注入されたコトンラットの鼻ではＳ．アウレウス細菌は検出されなかった。
【０１２５】
追跡実験で、プラスミドｐＲＢｔａｇＯが補足されたΔｔａｇＯによる鼻での定着を試験した。点滴注入の７日間後に、５匹の動物のうち５匹に、補足された突然変異体での定着が起こったが（表１）、野生型細菌よりも低いレベルであった。このより低いレベルの定着は、鼻における抗生物質選択的な圧力が失われ、それにより補足しているプラスミドの欠如が起こる、ということによって説明することができる。この説明は、ｐＲＢｔａｇＯは、インビトロにおいて抗生物質での選択が行われていない状態で、数日後には限定されたわずかな安定性しか示さないという発見によっても裏付けされている（図６A）。補足された突然変異体を点滴注入された動物から回収された全ての細菌はプラスミドを保持していたことに留意すべきであり、これは、ＷＴＡの存在は、継続的な鼻での定着に必須であることを示す。
【０１２６】
また、ΔｄｌｔＡが点滴注入した動物のほとんどがＳ．アウレウスがなく、１０匹のコトンラットのうちわずか４匹しか、鼻の定着が起こらず、これらの４匹の動物の平均ＣＦＵは３３ＣＦＵ／鼻と低かった。これらのデータは、Ｓ．アウレウスによる鼻での定着において、インタクトのテイコイン酸は重要な役割を有することを示す。
【０１２７】
その他の実験において、Ｓ．アウレウス野生型およびΔｔａｇＯによる鼻での定着の時間経過を比較した。細菌の点滴注入の後、１２日目および２日目に、ΔｔａｇＯを点滴注入した動物における鼻での定着は、野生型を点滴注入した動物と比べて、それぞれ９０．７±１．４％、および、９８．３±０．３％低く（野生型またはΔｔａｇＯに感染した少なくとも１０匹の動物の平均およびＳＤ）、これは、ＷＴＡ欠失により、コトンラットの鼻からの細菌の迅速な除去が起こったことを示す。
【０１２８】
Ｓ．アウレウスに晒される前にコトンラットの鼻孔をＷＴＡでプレコーティングすることの効果を決定した。鼻へＷＴＡをプレ点滴注入することによって、Ｓ．アウレウスのコトンラットの鼻に定着する能力の著しい減少が起こった（図６Ｂ；ＰＢＳ単独（薄い灰色のバー）と、ＷＴＡでの処理（濃い灰色のバー）との比較）。従って、鼻孔へＳ．アウレウスを誘導する前にコトンラットの鼻孔をＷＴＡ製剤で処理することによって、ブドウ球菌感染が緩和された。
【０１２９】
実施例５
ＷＴＡに特異的に結合する抗体
ＷＴＡに特異的に結合する抗体は、当業者周知の方法によって生成される。米国特許第６，６１０，２９３号を参照（この参照により開示に含まれる）。例えば、ＷＴＡを特異的に認識するポリクローナル抗体は、マウスの皮下にＷＴＡ製剤を植え付けることによって生成される。ＷＴＡ製剤は、ＷＴＡまたはＷＴＡフラグメント、および、完全フロインドアジュバントで構成される。例えば、１０μｇ、５０μｇ、または、１００μｇの範囲の量の抗原が投与される。この最初の植菌に続いて、約１〜２ヶ月のインターバルで、１回またはそれ以上のブースター植菌が行われる。ブーストされる抗原製剤は、不完全フロインドアジュバント中に、ＷＴＡまたはＷＴＡフラグメントを含む。様々な抗原の量の組合わせと、ブーストスケジュールを実行することによって、最適なＷＴＡへの免疫応答が生じる投与およびブーストスケジュールを決定することができる。ポリクローナル抗体は、ワクチン注射されたマウスの血液を回収し、血液サンプルを遠心分離して、細胞成分から血清を分離することによって血清を調製することによって製造される。ポリクローナル抗体はまた、類似の方法によってウサギで生産してもよい。
【０１３０】
モノクローナル抗体は、ワクチン注射されたマウスの脾臓を取り出し、回収された脾細胞からハイブリドーマ細胞系を生産させることによって製造される。例えば、ハイブリドーマは、一般的な方法によって製造される（６，７９）。一般的に、ワクチン注射されたマウスからのトータルで２．１３５×１０8の脾細胞を、２．３５×１０7のＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ１５８１）と混合し、遠心分離（４００×ｇ，室温で１０分間）によってペレット化し、血清非含有培地で洗浄した。滅菌５０ｍｌ遠心分離用コニカル中で、ほとんど乾燥するまで上清を除去し、１ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ；ｍｗ１４００；ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を６０〜９０秒間にわたり添加することによって細胞混合物の融合体を達成する。血清非含有培地を、連続的に１，２，４，８，１６および１９ｍｌゆっくり添加することによってＰＥＧを希釈する。このハイブリドーマ細胞懸濁液を培地へ穏かに再懸濁、遠心分離（５００×ｇ，室温で１０分間）によって細胞をペレット化する。上清を除去し、１０％熱で不活性化されたウシ胎仔血清、０．０５ｍＭヒポキサンチンおよび１６μＭチミジンが添加された培地ＲＰＭＩ１６４０（ＨＴ培地）に細胞を再懸濁する。ハイブリドーマ細胞（１００μｌ）を９６−ウェル組織培養プレートの７６０ウェルへ植えた。８ウェル（プレートＡのカラム１）に、１００μｌ中の約２．５×１０4ＳＰ２／０細胞を与えた。ＳＰ２／０細胞は、２４時間後に加えられる選択培地による死滅に対するコントロールとして役立つ。
【０１３１】
ハイブリドーマを製造して２４時間後に、１００μｌの、１０％の熱で不活性化されたウシ胎仔血清、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．８μＭアミノプテリン、および、３２μＭチミジンが添加されたＲＰＭＩ１６４０（ＨＡＴ培地）を各ウェルに加える。ハイブリドーマを製造して９６時間後に、コントロールＳＰ２／０細胞を細胞死に関して調べる（これは、ＨＡＴ選択培地が、融合されていないＳＰ２／０細胞をうまく死滅させているかどうかを示す）。
【０１３２】
ハイブリドーマを製造して１１日間後に、全てのウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＷＴＡ製剤に反応する抗体の存在に関して試験する。この予備的な分析の結果に基づき、陽性クローンのさらなる成長とＭＡｂの単離のために、２０ウェルからの細胞を２４−ウェルの培養皿にトランスファーする。
【０１３３】
キメラ抗体は、ハイブリドーマ細胞からトータルＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを製造し、次に、ＰＣＲの使用によって抗体の軽鎖可変領域と、抗体の重鎖可変領域をクローニングすることによって生成させてもよい。米国特許第６，６１０，２９３号を参照。一般的に、第一の鎖のｃＤＮＡ合成産物は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−３０濃縮装置（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を用いて精製する。回収されたｃＤＮＡ４０μｌのうち、５μｌを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いる。典型的なＰＣＲ増幅反応（１００μｌ）は、テンプレートＤＮＡ、適切なプライマー（５０ｐモル）、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（パンベラ（ＰａｎＶｅｒａ））（２．５ユニット）、１×ＥｘＴａｑ反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む。最初の９６℃で５分間のインキュベートによってテンプレートを変性させる。その産物を、５５℃で３０秒、７０℃で３０秒、次に９６℃で１分の熱サイクルを１５回、続いて７０℃で１分、次に９６℃で１分間の工程サイクルを２５回行うことによって増幅させる。次に、得られたＰＣＲ産物をキャリアープラスミドへクローニングし、増幅したＰＣＲ産物の配列解析を促進する。
【０１３４】
次に、重鎖および軽鎖可変領域を、組換えキメラ抗体分子を生産するための哺乳動物発現プラスミドベクターへクローニングする。得られたベクターは、ＣＭＶプロモーターにより転写を起こして両方の抗体鎖を発現する。ネオマイシン耐性は、哺乳動物細胞のトランスフェクトに関する優性な選択マーカーとして役立つ。さらなる詳細は、米国特許第６，６１０，２９３号を参照。従って、ヒト化抗体は、当業者周知の技術によって生産することもできる（８，３９）。ＷＴＡに結合するヒト抗体は、ヒト抗体を生産する動物（例えばヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウス）を免疫化することによって生産することもできる。
【０１３５】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体製剤のオプソニン性食細胞の殺菌活性は、当業者既知の様々な分析によって試験することもできる。米国特許第６，６１０，２９３号を参照。例えば、好中球が介在する殺菌性の分析を用いてもよい。一般的に、デキストラン沈降、および、フィコール−ハイパック密度遠心分離によって、成人の静脈血液から好中球を単離する。洗浄した好中球を、中期対数期の約３×１０4細菌（すなわちＳ．アウレウス）と共に、マイクロタイタープレートの丸底のウェルに加える（約１０6細胞／ウェル）。Ｓ．エピデルミディスに対する抗体の非存在を確認するためにスクリーニングされた子羊の血清（１０μｌ）を活性な補体の源として用いる。
【０１３６】
免疫グロブリン（または血清）４０μｌを様々な希釈度で加え、プレートを３７℃で一定して強く撹拌しながらインキュベートする。サンプル１０μｌを、ゼロ時間で、および、インキュベートの２時間後に、各ウェルから採取する。それぞれを希釈し、強くボルテックスで撹拌し、細菌を分散させ、血液寒天プレートで３７℃で一晩培養すし、生存可能な細菌の数を定量する。オプソニン性食細胞活性は、観察された細菌のコロニー数の、コントロールサンプルと比べた場合の減少（％）として示される。
【０１３７】
ブドウ球菌感染を全身的に緩和する能力は、ラットで評価することもできる。一般的に、２日齢のウィスターラットに、〜１０6個のＳ．アウレウス（タイプ５，ＡＴＣＣ１２６０５）をちょうど頭側から尾にかけて皮下注射する。感染の前の約３０分間、および、感染の後の２４時間および４８時間に、約３２０μｇの抗ＷＴＡのＭＡｂを腹腔内投与する。コントロール動物には、等量の塩類溶液、または、ブドウ球菌に対するものではないコントロールＭＡｂを投与する。全ての動物を５日間毎日観察して、生存しているかどうかを決定する。
【０１３８】
抗体製剤が、本ＭＡｂのプレ点滴注入によって鼻孔のブドウ球菌の定着を緩和する能力は、ＷＴＡの有効性の決定に関して説明されている技術と類似した技術を用いて測定することもできる。一般的に、コトンラットの鼻に、塩類溶液、または、抗ＷＴＡのＭＡｂを含む塩類溶液（２〜３ｍｇの精製ＩｇＧ／マウス用量１〜３×１０8細菌）を５分間点滴注入し、その後、３つ異なる実験で細菌を点滴注入する。比較的少数の細菌を用いて、予め点滴注入されたＭＡｂにより効率的に競合させる。Ｓ．アウレウスＳＡ１１３野生型（３×１０4ＣＦＵ）、または、ストレプトマイシン耐性により寒天プレート上で容易に同定できる臨床的な分離株ＭＢＴ５０４０（５×１０5ＣＦＵ）（４５）のいずれかを用いる。各実験において、動物の５０％は、ＰＢＳ中のＷＴＡ、または、ＰＢＳ単独（コントロールとして）で前処理される。
【０１３９】
加えて、株化されたブドウ球菌の鼻の感染を緩和するＭＡｂの有効性を測定してもよい。一般的に、マウスに、６×１０7のＳ．アウレウスが点滴注入される。細菌を点滴注入して１日目および３日目、塩類溶液または塩類溶液中の抗ＷＴＡのＭＡｂを定着したマウスの鼻孔に点滴注入する。５日目に、マウスを殺し、上述したように鼻を調製し、プレーティングしてＳ．アウレウスの存在を検出する。
【０１４０】
結論
行われた実験の結果により、鼻での定着において、ＷＴＡおよびＷＴＡのｄ−アラニンエステル、および／または、ＬＴＡが顕著な役割を有することが実証される。我々の知見にとって、ＷＴＡは、鼻での定着に重要であると同定された第一の要素である。ΔｄｌｔＡ突然変異体による鼻での定着の欠失を、この突然変異体の陽イオン性の抗菌成分に対する感受性の増加によるものと結論付けることもできるが、ΔｔａｇＯ突然変異体の、鼻の上皮で見出される抗菌成分に対する感受性は、Ｓ．アウレウス野生型より低かった。この観察は、耐性の減少以外の理由は、壁テイコイン酸の突然変異体は、コトンラットの鼻孔へ定着できないことに関連していることを示す。
【０１４１】
突然変異したＷＴＡではなく野生型ＷＴＡとプレインキュベートした場合に、ΔｔａｇＯ突然変異体の初期の上皮細胞および上皮細胞系への付着が減少すること、ラテックスビーズのＷＴＡが介在する付着、および、上皮細胞への付着の用量依存性の減少により、ＷＴＡは、Ｓ．アウレウスと、気道の上皮細胞との相互作用を仲介することが示される。これらの観察はまた、ＷＴＡポリマーと、患者の要素との特異的な相互作用にも向けられる。Ｓ．アウレウスのＷＴＡが、相補的な患者の細胞の受容体と直接相互作用するかどうか、または、その他の分子がこの相互作用に関与するかどうかを決定するべきである。いずれの場合において、フィブロネクチンおよびインテグリンは、Ｓ．アウレウスの、鼻の上皮へのＷＴＡが介在する付着に直接的に関与していないようである。これは、テイコイン酸は、Ｓ．アウレウスのフィブロネクチンに関する受容体であると示唆していた初期の研究とは対照的である（３）。また、鼻の細胞上には２種のＳ．アウレウスのための受容体があり、その一方は、テイコイン酸の影響を受けないことも示唆されている（７）。この研究では、この仮説に対向して議論されているか、または、少なくともテイコイン酸は両方の相互作用を必要とすることが示唆されている。特定の哺乳動物のスカベンジャー受容体は、Ｓ．アウレウス細胞、精製されたリポテイコイン酸と相互作用することが報告されており、そのうちのいくつかは、上皮細胞上で同定されている（６６）。それらは、ＷＴＡと結合することができるかどうか、および、これらの受容体またはその他の受容体は、Ｓ．アウレウスの鼻の上皮への結合に関与するかどうかを決定するべきである。
【０１４２】
テイコイン酸のＤ−アラニンエステルは、鼻での定着において、主要な、ただし重要ではない役割を果たすようである。ΔｔａｇＯもΔｄｌｔＡも、野生型細菌と比べて上皮細胞への付着の効率は低かったことから、２種の突然変異は、同様の方法で定着を妨害する可能性がある。しかしながら、ΔｄｌｔＡは、様々な鼻の抗菌性物質への感受性がかなり高いため、患者の鼻における防御による、この株の不活性化の増加は、そのコトンラットの鼻孔に定着する能力の減少が原因である可能性がある。
【０１４３】
テイコイン酸の上皮への付着における直接的な役割に関するさらなる証拠は、テイコイン酸のｄ−アラニンエステルが、上皮細胞への結合に関与するリステリア・モノサイトゲネスに由来する（１）。肺炎球菌は、ユニークなコリン含有ＷＴＡおよびＬＴＡを生産し、これらは、コリン残基のＰＡＦ受容体への付着によって内皮細胞に結合する（２１）。数種の哺乳動物のレクチン様受容体は、Ｓ．アウレウス細胞、精製したテイコイン酸または類似のポリマーと相互作用することが報告されている（６２）。このタイプの受容体は、Ｓ．アウレウスの鼻の細胞への付着に介在するという推測もできる。
【０１４４】
上記の実験は、Ｓ．アウレウスと、患者の細胞との分子的な相互作用と、これまで不明確であった、ブドウ球菌細胞のエンベロープにおけるＷＴＡの役割に新たな光を当てるものである。様々なブドウ球菌種は、それらのＷＴＡ構造の点で極めて多様であり（２６）、これらの差が、特定の宿主生物、および、皮膚または粘膜の特定のエリアに関して、所定の種の指向性において役割を果たす可能性がある。実際に、ポリリビトールホスフェートＷＴＡは、Ｓ．アウレウスに特有であり、その他のブドウ球菌種ではまったく見出されない（２６）。ポリマー組成に関係なく、細胞壁とＷＴＡとの間の結合単位は保存されており、ｔａｇＯの相同体は、リステリア属、エンテロコッカス、連鎖球菌、杆菌、および、クロストリジウム属などの全てのＷＴＡを生産するグラム陽性細菌で見出される。Ｓ．エピデルミディスおよびＢ．ズブチリスは、生存のためにその存在が必要のようであることから、Ｓ．アウレウスは、ＷＴＡの非必須性の点でユニークといえる（３２，８２）。従って、ｔａｇＯは、殺菌性であってもなくてもよいが、それらの定着する能力を妨げることができる新規の抗菌性物質の興味深い標的の一つである。その上、Ｓ．アウレウスのＷＴＡは、能動的または受動的なワクチン注射の新規の標的とみなすこともできる。
【０１４５】
以上、本発明を十分に説明したが、当業者であれば、同等の範囲内で、および、本発明の本質および範囲から逸脱せず、かつ過度の実験を必要としない条件下で本発明を実施できることを認識でき、加えて、本発明を特定の実施形態および実施例の観点で説明したが、本発明者等は、さらなる改変が可能であると考える。本願は、上述の原則に従った本発明のあらゆる改変法、使用、または、改変を含むことを意図している。
【０１４６】
ここで開示された本発明の明細書および実施を考察することによって、本発明の他の実施形態は当業者には明白である。明細書および実施例は単なる典型例とみなされ、本発明の真の範囲および本質は以下の請求項によって示されるものとする。以下の引用文献は、特に、参照により本発明の開示に含まれる：
【０１４７】
【表２】
2006514636.tif 000003
【０１４８】
【表３】
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【０１４９】
【表４】
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【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
【表９】
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【０１５５】
【表１０】
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【０１５６】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｓ．アウレウスのＷＴＡの構造を示す。リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＤ−アラニン部分は、灰色の囲みで強調されている。ＭｕｒＮＡｃは、Ｎ−アセチルムラミン酸である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｓ．アウレウスのｔａｇＯ遺伝子の位置、および、それをｅｒｍＢカセットで置換する戦略である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、アルシアンブルー染色手順と銀染色手順の組合わせで染色した、ＷＴＡ製剤を含むポリアクリルアミドゲルである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ΔｔａｇＯ突然変異体が、ＷＴＡが欠失している。Ｓ．アウレウスＳａ１１３野生型（ＷＴ）、ΔｔａｇＯ突然変異体（Ｍ）、および、プラスミドｐＲＢｔａｇＯで補足されたΔｔａｇＯ（ＭＣ）由来のＷＴＡ製剤における、ホスフェート、ＧｌｃＮＡｃおよびリビトールの含量の解析である。少なくとも５つの独立した実験の平均およびＳＤ（ホスフェート，ＧｌｃＮＡｃ）、または、１回の実験で４回カウントした値の平均（リビトール）を示す。リビトール含量は、ＷＴとＭサンプルのみで決定された。
【図２】図２は、Ｓ．アウレウス野生型とΔｔａｇＯの成長の特徴を示す。Ａは、複合培地（ＢＭ）または最小培地（ＩＭＤＭ）中で３０℃で通気した状態の、Ｓ．アウレウス野生型（黒丸）、および、ΔｔａｇＯ（白丸）の成長曲線である。Ｂは、バッチ式培養における、野生型（黒丸）、および、ΔｔａｇＯ（白丸）の長期の生存の速度論である。
【図３Ａ】図３Ａは、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡ突然変異体の上皮細胞への付着が減少したことを示す。初期のヒト気管支の上皮細胞（ＮＨＢＥ）である。５つの独立した実験の平均および標準偏差（ＳＤ）を示す。野生型サンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ０．００１）のアスタリスクによって示される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡ突然変異体の上皮細胞への付着が減少したことを示す。初期のヒトの鼻の上皮細胞（ＨＮＥＣ）である。５つの独立した実験の結果を示す。野生型サンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ０．００１）のアスタリスクによって示される。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ΔｔａｇＯおよびΔｄｌｔＡ突然変異体の上皮細胞への付着が減少したことを示す。ヒトの気道の上皮細胞系Ａ５４９である。少なくとも５つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。これら５つの実験のうち３つのデータは、先願の第６０／４３０，２２５号に記載されている。野生型サンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ０．００１）のアスタリスクによって示される。
【図４Ａ】図４Ａは、野生型ＷＴＡによる、Ｓ．アウレウスの上皮細胞への結合の阻害を示す。Ａ５４９細胞またはＨＮＥＣが密集した層を、ＷＴＡ製剤の量を増加させながらプレインキュベートし、Ｓ．アウレウス株の付着をａにおけると同様にして解析した。野生型またはΔｄｌｔＡからのＷＴＡ（０，１２５，２５０および５００μｇ／ｍｌ）、または、ＷＴＡが欠失していること以外は同じ条件で製造されたΔｔａｇＯからの等量のサンプルを用いた。少なくとも３つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。コントロールサンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ＜０．００１）のアスタリスクによって示される。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＷＴＡでコーティングしたラテックスビーズの、ＨＮＥＣおよびＡ５４９細胞への付着である。蛍光ビーズを、野生型（黒いバー）もしくはΔｄｌｔＡ（灰色のバー）からのＷＴＡ製剤、または、ＷＴＡが欠失している以外は同じ条件下で製造されたΔｔａｇＯからの等量のサンプル（白色のバー）でコーティングし、疎水性のビーズ領域をＢＳＡでブロックした。ＷＴＡなしでインキュベートしたビーズの付着（バックグラウンド）を差し引いた。少なくとも５つの独立した実験の平均およびＳＤを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｓ．アウレウス野生型またはΔｔａｇＯとのインキュベートによる、ＨＮＥＣにおけるＩＬ−８の誘導である。３〜４つの実験の平均およびＳＤを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＷＴＡが改変もしくは欠失した、または、フィブロネクチン結合タンパク質が欠失したＳ．アウレウス株の付着を、フィブロネクチンでコーティングされたマイクロタイタープレートへの付着に関して試験した。ΔｆｂｐＡ／ΔｆｂｐＢ８３２５−４で誘導された突然変異体は、２種のＳ．アウレウスのＦｎ結合タンパク質をコードするｆｂｐＡとｆｂｐＢが欠失している。
【図５】図５は、Ａでは、鼻の抗菌ペプチドに対するＳ．アウレウス株の感受性を示す。同数の野生型（黒い四角）、ΔｔａｇＯ（白丸）およびΔｄｌｔＡ（灰色の三角）細菌を、１００μｇ／ｍｌのヒトデフェンシンｈＮＰ１−３、１０μｇ／ｍｌのカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）ＬＬ−３７、または、５００μｇ／ｍｌのラクトフェリンと共にインキュベートし、生存可能な細菌を、様々なインキュベート時間後にカウントした。少なくとも３つの独立した実験の平均を示す。野生型サンプルと対比した有意差（両側でのスチューデントのｔ検定で計算された）は、１つ（ｐ＜０．０５）、２つ（ｐ＜０．０１）、または、３つ（ｐ＜０．００１）のアスタリスクによって示される。
【０１５８】
Ｂでは、Ｓ．アウレウスＳＡ１１３野生型（黒い記号）、および、ΔｔａｇＯ（白い記号）のリソスタフィンが介在する溶解である。Ａ600＝１の細菌懸濁液を、濃度１μｇ／ｍｌのリソスタフィン有り（丸）、または、リソスタフィン無し（四角）で、３０℃で１時間インキュベートした。その値は、最初のＡ600のパーセンテージとして示される。
【図６】図６は、Ａでは、ＢＭブロス中で、クロラムフェニコール存在下（黒丸）または非存在下（白丸）で繰り返し培養した後の、プラスミドｐＲＢｔａｇＯの安定性を示す。ＳＤを含む。
【０１５９】
Ｂでは、コトンラットの鼻孔に精製したＷＴＡをプレ点滴注入することによる、鼻での定着の阻害である。１０、６または２０匹の動物を、それぞれ実験１、２または３に用いた。鼻１つあたり１０ＣＦＵを超えるＳ．アウレウスを含む動物のパーセンテージを示す。特定の実験における動物の半分は、ＰＢＳ単独（薄い灰色のバー）、または、ＰＢＳに溶解させたＷＴＡ（濃い灰色のバー）のいずれかで前処理した。実験の設定におけるさらなる違いは、方法の章で詳細に説明する。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月3日(2005.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＴＡと特異的に結合する抗体もしくはそれらのフラグメント、または、それらの組合わせの治療有効量を含む医薬組成物であって、前記抗体もしくはそれらのフラグメントは、患者へ投与されるとブドウ球菌の定着を緩和またはブロックする、前記組成物。
【請求項２】
前記組成物は、ＷＴＡと特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物は、ＷＴＡと特異的に結合するキメラ、ヒト化、または、ヒト抗体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳＦｖ、および、ｓｃＦｖから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
可溶性型のＷＴＡ全体もしくはそれらのフラグメント、または、それらの組合わせの治療有効量を含む医薬組成物であって、前記ＷＴＡ、または、それらのフラグメント、または、それらの組合わせは、患者へ投与されるとブドウ球菌の定着を緩和またはブロックする、前記組成物。
【請求項６】
前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項１または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ブドウ球菌の定着は、Ｓ．アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染を引き起こす、請求項１または５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
（ａ）請求項１または５に記載の医薬組成物；および、（ｂ）製薬上許容できるキャリアーを含むワクチン。
【請求項９】
前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ブドウ球菌の定着は、Ｓ．アウレウス感染を引き起こす、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１１】
患者のブドウ球菌感染を予防または治療する方法であって、ＷＴＡに特異的に結合する抗体もしくはそれらのフラグメント、または、それらの組合わせを含む組成物の治療有効量を、患者の鼻孔に患者の鼻孔に点滴注入することを含み、その治療により、ブドウ球菌の定着が緩和またはブロックされる、前記方法。
【請求項１２】
前記組成物は、ＷＴＡと特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、ＷＴＡと特異的に結合するキメラ、ヒト化、または、ヒト抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳＦｖ、および、ｓｃＦｖから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
患者のブドウ球菌感染を予防または治療する方法であって、可溶性型のＷＴＡ全体もしくはＷＴＡのフラグメント、または、ＷＴＡの組合わせを含む組成物の治療有効量を、患者の鼻孔に点滴注入することを含み、治療によって、定着が緩和またはブロックされる、前記方法。
【請求項１６】
少なくとも１種の抗ブドウ球菌薬の点滴注入をさらに含み、前記抗ブドウ球菌薬は、単独で、または、前記組成物と組合わせて治療効果を提供する、請求項１１または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ブドウ球菌薬は、リソスタフィン、および、ナイシン、またはそれらの組合わせから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ブドウ球菌感染は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択される、請求項１１または１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ブドウ球菌感染は、Ｓ．アウレウス感染である、請求項１１または１５に記載の方法。
【請求項２０】
構築の際にｔａｇＯ遺伝子が不活性化される、単離された構築されたＷＴＡ欠失Ｓ．アウレウス生物。
【請求項２１】
ΔｔａｇＯである、請求項２０に記載の単離されたＳ．アウレウス生物。
【国際調査報告】
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