(57)【要約】たとえば、薬剤への反応、疾病、表現型及び／又は行動に関係する遺伝因子を同定するための方法。また、本発明の方法を実践するためのシステム及び装置も提供される。本発明は、ノックアウト／欠失／除去の戦略を用いて、新しい且つ情報を与える多型性（未だ同定されておらず、薬剤への反応、疾病、行動及び／又は表現型に関連する）又は突然変異を同定する。情報を与える多型性又は突然変異を持つＤＮＡ断片を捕捉する／トラップする／濃縮する工程がノックアウトに続く。本発明の効果は、たとえば、臨床試験において試験を受ける患者における、又は疾病に関係する新しい遺伝子を見つけるための、比較的低コストでの大規模な薬理ゲノミクスにおいて有益である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２の表現型とは異なる第１の表現型と関係する少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定する方法であって、前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子と前記第１の表現型の間の関係が未知であり、
実質的に多型性を欠く第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供すること；
前記第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び前記第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含むプールで変性／再アニーリングのサイクルを行なうこと；並びに
前記変性／再アニーリングのサイクルの後のプールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉し、捕捉された前記少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型と関係する前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を表すこと、
を含む方法。
【請求項２】
第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供することが、
第１の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供すること；
４塩基切断制限酵素で前記第１の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を消化して複数の  第１の表現型のＤＮＡ断片を作製すること；
前記複数の第１の表現型のＤＮＡ断片で変性／再アニーリングを少なくとも１サイクル行なうこと；
複数の再アニーリングした第１の表現型のＤＮＡ断片における１以上のミスマッチＤＮＡ領域を、前記１以上のミスマッチＤＮＡ領域に隣接するＤＮＡ配列を修飾しないで、除いて実質的に多型性を欠く前記第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を生じるように、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼで、前記複数の再アニーリングした第１の表現型のＤＮＡ断片を処理すること、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供することが、
第２の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供すること；
４塩基切断制限酵素で前記第２の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を消化して複数の第２の表現型のＤＮＡ断片を作製すること；
前記複数の第２の表現型のＤＮＡ断片で変性／再アニーリングを少なくとも１サイクル行なうこと；
複数の再アニーリングした第２の表現型のＤＮＡ断片における１以上のミスマッチＤＮＡ領域を、前記１以上のミスマッチＤＮＡ領域に隣接するＤＮＡ配列を修飾しないで、除いて実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を生じるように、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼで、前記複数の再アニーリングした第２の表現型のＤＮＡ断片を処理すること、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
捕捉されていない前記第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び捕捉されていない前記第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含む次のプールで次の変性／再アニーリングのサイクルを行なうこと；並びに
前記次の変性／再アニーリングのサイクルの後の前記次のプールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉し、前記少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型に関係する前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を表すこと、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の第１の表現型のＤＮＡ断片が平均すると約５００塩基対未満の長さである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の第１の表現型のＤＮＡ断片が平均すると約３００〜４００塩基対の長さである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の第２の表現型のＤＮＡ断片が平均すると約５００塩基対未満の長さである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の第２の表現型のＤＮＡ断片が平均すると約３００〜４００塩基対の長さである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の表現型が、疾病の素因、疾病への感受性、薬剤への反応の素因及び行動の素因の少なくとも１つである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子が多型性を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子が単一ヌクレオチド多型を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子が複数の多型を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子が複数の単一ヌクレオチド多型を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのミスマッチを捕捉することが、少なくとも１つのミスマッチをＤＮＡ修復タンパク質に暴露することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ修復タンパク質がミスマッチのＤＮＡに結合する種類である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ修復タンパク質がＭｕｔＳタンパク質である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び前記第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を区別して標識することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチを特徴付けることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチを特徴付けることが前記少なくとも１つのミスマッチの配列を決定することを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ミスマッチについてバイオインフォマティクス解析を行なうことをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子に関係する疾病を診断する方法であって、請求項１に記載の方法によって前記疾病に関係する前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子に関係する薬剤への反応を予測する方法であって、請求項１に記載の方法によって前記薬剤への反応に関係する前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子に関係する疾病の素因を予測する方法であって、請求項１に記載の方法によって前記疾病の素因に関係する前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項２４】
少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子に関係する疾病の感受性を予測する方法であって、請求項１に記載の方法によって前記疾病の感受性に関係する前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項２５】
第２の表現型とは異なる第１の表現型と関係する少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定する方法であって、前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子と前記第１の表現型の間の関係が未知であり、
関心のある多型について濃縮された第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供すること；
第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含むプールで変性／再アニーリングのサイクルを行なうこと；並びに
前記変性／再アニーリングのサイクルの後の前記プールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉し、前記少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型と関係する前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を表すこと
を含む方法。
【請求項２６】
第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供することが、
第１の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供すること；
４塩基切断制限酵素で第１の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を消化して複数の第１の表現型のＤＮＡ断片を作製すること；及び
前記複数の第１の表現型のＤＮＡ断片における１以上のミスマッチ領域を保持して、関心のある多型について濃縮された第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖を生じるように、少なくとも１サイクルで複数の第１の表現型のミスマッチＤＮＡ断片を捕捉すること
を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供することが、
第２の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供すること；
４塩基切断制限酵素で第２の表現型のＤＮＡの少なくとも１本の鎖を消化して複数の第２の表現型のＤＮＡ断片を作製すること；
前記複数の第２の表現型のＤＮＡ断片で変性／再アニーリングを少なくとも１サイクル行なうこと；
複数の再アニーリングした第２の表現型のＤＮＡ断片における１以上のミスマッチＤＮＡ領域を、前記１以上のミスマッチＤＮＡ領域に隣接するＤＮＡ配列を修飾しないで、除いて実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を生じるように、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼで、前記複数の再アニーリングした第２の表現型のＤＮＡ断片を処理すること、
を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
捕捉されていない第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び捕捉されていない第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含む次のプールで次の変性／再アニーリングのサイクルを行なうこと；並びに
前記次の変性／再アニーリングのサイクルの後の前記次のプールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉し、少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型に関係する少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を表すこと
をさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の第２の表現型のＤＮＡ断片が平均すると約５００塩基対未満の長さである請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の第２の表現型のＤＮＡ断片が平均すると約３００〜４００塩基対の長さである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の表現型が、疾病の素因、疾病への感受性、薬剤への反応の素因及び行動の素因の少なくとも１つを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子が多型性を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子が単一ヌクレオチド多型を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子が複数の多型を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子が複数の単一ヌクレオチド多型を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのミスマッチを捕捉することが、前記少なくとも１つのミスマッチをＤＮＡ修復タンパク質に暴露することを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ修復タンパク質がミスマッチのＤＮＡに結合する種類である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ修復タンパク質がＭｕｔＳタンパク質である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び前記第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を区別して標識することをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチを特徴付けることをさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチを特徴付けることが前記少なくとも１つのミスマッチの配列を決定することを含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチについてバイオインフォマティクス解析を行なうことをさらに含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子に関係する疾病を診断する方法であって、請求項２５に記載の方法によって前記疾病に関係する前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子に関係する薬剤への反応を予測する方法であって、請求項２５に記載の方法によって前記薬剤への反応に関係する前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子に関係する疾病の素因を予測する方法であって、請求項２５に記載の方法によって前記疾病の素因に関係する前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項４６】
少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子に関係する疾病の感受性を予測する方法であって、請求項２５に記載の方法によって前記疾病の感受性に関係する前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定することを含む方法。
【請求項４７】
第２の表現型とは異なる第１の表現型と関係する少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定する装置であって、前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子と前記第１の表現型の間の関係が未知であり、
実質的に多型性を欠く第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を作製するためのノックアウトＤＮＡ作製成分；
第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含むプールで変性／再アニーリングのサイクルを行なうためのＤＮＡ変性／再アニーリング成分；並びに
前記変性／再アニーリングのサイクルの後の前記プールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉する捕捉成分を含み、前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型と関係する少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を表す、装置。
【請求項４８】
第２の表現型とは異なる第１の表現型と関係する少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を同定するシステムであって、前記少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子と前記第１の表現型の間の関係が未知であり、
実質的に多型性を欠く第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を作製するためのノックアウトＤＮＡ作製成分；
第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含むプールで変性／再アニーリングのサイクルを行なうためのＤＮＡ変性／再アニーリング成分；
前記変性／再アニーリングのサイクルの後の前記プールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉し、前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型と関係する少なくとも１つのホモ接合体の遺伝因子を表す捕捉成分；並びに
前記ノックアウトＤＮＡ作製成分、前記ＤＮＡ変性／再アニーリング成分及び前記捕捉成分と連絡し合うプロセッシング成分であって、前記ノックアウトＤＮＡ作製成分、前記ＤＮＡ変性／再アニーリング成分及び前記捕捉成分の機能のモニタリング及び制御を提供する前記プロセッシング成分を含む、システム。
【請求項４９】
第２の表現型とは異なる第１の表現型と関係する少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定する装置であって、前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子と前記第１の表現型の間の関係が未知であり、
関心のある多型について濃縮された第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を作製するための捕捉ＤＮＡ／ノックアウトＤＮＡ作製成分；
第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含むプールで変性／再アニーリングのサイクルを行なうためのＤＮＡ変性／再アニーリング成分；並びに
前記変性／再アニーリングのサイクルの後の前記プールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉するための捕捉成分を含み、前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型と関係する少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を表す、装置。
【請求項５０】
第２の表現型とは異なる第１の表現型と関係する少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を同定するシステムであって、前記少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子と前記第１の表現型の間の関係が未知であり、
関心のある多型について濃縮された第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を作製するための捕捉ＤＮＡ／ノックアウトＤＮＡ作製成分；
第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を含むプールで変性／再アニーリングのサイクルを行なうためのＤＮＡ変性／再アニーリング成分；
前記変性／再アニーリングのサイクルの後の前記プールにおいて少なくとも１つのミスマッチを捕捉するための、前記捕捉された少なくとも１つのミスマッチが前記第１の表現型と関係する少なくとも１つのヘテロ接合体の遺伝因子を表す捕捉成分；並びに
前記ノックアウトＤＮＡ作製成分、前記ＤＮＡ変性／再アニーリング成分及び前記捕捉成分と連絡し合うプロセッシング成分であって、前記ノックアウトＤＮＡ作製成分、前記ＤＮＡ変性／再アニーリング成分及び前記捕捉成分の機能のモニタリング及び制御を提供する前記プロセッシング成分、を含むシステム。
【請求項５１】
実質的に多型性を欠く第１の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供することが、ＤＮＡ断片、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローニングした遺伝子又はそのほかの遺伝物質を提供することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
関心のある多型について濃縮された第１の表現型の捕捉ＤＮＡの少なくとも１本の鎖及び実質的に多型性を欠く第２の表現型のノックアウトＤＮＡの少なくとも１本の鎖を提供することが、ＤＮＡ断片、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローニングした遺伝子又はそのほかの遺伝物質を提供することを含む請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体を参照により本出願に組み込まれる、２００３年２月２６日に出願した係属中の仮特許出願、出願番号６０／４５０，６０６の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に遺伝的解析の分野に関する。さらに詳しくは、本明細書に記載される本発明は、遺伝的差異、たとえば、２以上の個体又は２以上の集団における薬剤への反応又は疾病の素因の差異を同定するための方法、システム及び装置を提供する。
【背景技術】
【０００３】
当該技術で周知のように、用語、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、個々のヌクレオチドレベルでの遺伝的変異を言う。今や、ゲノム全体の設計図が利用可能なので、遺伝子及び疾病に対するＳＮＰマッピングの適用は幾分容易になっている。現在、ＮＩＨのウエルカム財団及びそのほかによって数百万の推定上のＳＮＰが同定されている。創薬を促進するためにこの膨大な量の情報を利用するアプローチは、今後ますます重要になると思われる。
【０００４】
ＳＮＰを発見するための現在の戦略は２つの主なアプローチ：配列特異的アプローチ及び配列非特異的アプローチに大きく分けられる（１１〜１４）。配列非特異的アプローチは、たとえば、電気泳動や液体クロマトグラフィのような実験的方法を用いて、それがゲノムのどこに存在するかを識別しないで、ＳＮＰを検出する。配列特異的アプローチは主として遺伝子型解析に用いられる。
【０００５】
配列特異的なＳＮＰの遺伝子型解析のための既知の方法に関与する３つの工程がある。第１には、大規模な尽力を払って異なった供給源からのゲノムＤＮＡの配列決定を行なう。異なった供給源の配列を比較することによって大量のＳＮＰを同定し、保管することができる。第２の工程には通常、疾病又はそのほかの関心のある形質に関係する候補遺伝子を同定し、これらの遺伝子に関係するＳＮＰを同定する遺伝的検討が含まれる。第３には、同定されたＳＮＰを検出するための市販の技術を用いて、診断方法を開発することができる。
【０００６】
市場では、多数のＳＮＰの検出技術が利用可能である。ＳＮＰの検出技術はすべて、すでに同定されたＳＮＰに頼る。関心のある領域においてすでに同定されたＳＮＰについては、その検出に幾つかの技術を利用することができる。現在の解析の基本骨格には、（１）サイズ処理及び構造上の変異に基づいて断片を分離すること；（２）ハイブリッド形成；及び（３）アレイ及びビーズに基づいたアッセイが挙げられる。これらの基本骨格はすべて、ＳＮＰ周辺の配列を識別することに頼っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術のＳＮＰ検出技術は、多数の短所に悩まされている。これらの中で、ＳＮＰ検出のための現在の技術は、十分に強力ではなく、拡張性ではなく且つ感受性ではないことが認められている。アダプタ結合した増幅法を用いて異なる表現型の群の中で対立遺伝子頻度を計算する遺伝子クローニング法が以前開発された。多くの場合、遺伝的形質は、幾つかの異なったＳＮＰにより決定されてもよく、各ＳＮＰのみでは非常に少ない量の影響が形質に寄与するにすぎない。遺伝子と形質との関係は、多年の遺伝的検討を要し、形質に対するあらゆるエフェクターを同定するのは困難である。特定の形質に対するＳＮＰすべてを同定しないで、遺伝子型解析を実施するのは難しい。これらの限界性によって特定の重要な領域でのその適用が劇的に低下している。
【０００８】
上述の既知の方法は、標的ＳＮＰの先行同定を必要とする。このことは、表現型又は遺伝性疾患とＳＮＰを関係付けるのに必要とされる大量の遺伝的研究を前もって行なわなければならないことを意味する。いったんＳＮＰが同定されれば、それから、その検出に現在の技術を利用することができる。
【０００９】
ＳＮＰとの関係を有さない遺伝的障害については、現在のアプローチは実行可能な解決ではない。たとえば、アルツハイマー病の遺伝子が同定されていなければ、推定上のアルツハイマー患者においてどの遺伝子を改造すればいいのかを調べるために現在のＳＮＰ検出技術を利用することはできない。検出を能率化することができる高い処理能力の技術が現在利用可能であるけれども、それらは、検出することができる特定の量のＳＮＰに依然として限定されている。複雑な障害又は表現型は、数個の遺伝子、時には数百の突然変異の産物である。遺伝子座の情報がすべて利用可能であるとは限らないならば、又は関連するＳＮＰが分からないならば、小数の寄与因子の遺伝子型解析は無駄であることが分かる。
【００１０】
さらに、現在のＳＮＰ検出技術は、多量の配列決定法又はアレイに基づく走査方法に大きく頼っている。これらの同定されたＳＮＰは、それから、遺伝的障害の表現型とそれらとの関係を見い出すために検討される。そのような方法は、長い時間を要する可能性があり、コストが極めて高くなりうる。ヒトゲノムにおいて現在同定されている数百のＳＮＰによってさえ、どの単一ＳＮＰが特定の表現型又は遺伝的障害に寄与するのかを同定するのは困難である。ＳＮＰコンソーシアムからの研究の１つは、遺伝子型解析が幅広く利用されていない主な理由の１つが高いコストであることを指摘している。
【００１１】
従って、ＳＮＰの先行同定を必要とすることなく、コスト有効性のある、高い処理能力のＳＮＰスクリーニング能力を提供するＳＮＰ検出技術が当該技術に必要であることを理解することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
好ましい実施態様に従って、本発明は、たとえば、疾病、格差のある薬剤への反応、行動及び表現型に関係する遺伝因子を同定するための方法、システム及び装置を提供する。該方法は、個体又は集団のＤＮＡ断片、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローニングした遺伝子、又はそのほかの遺伝物質から直接、これらの因子を読み取る。該方法は、既存のアレイ技術を利用せず、実際それをあらかじめ避ける。
【００１３】
好ましい実施態様に従った方法の第１の工程は、たとえば、図１のように、個々のＤＮＡを利用し、あらゆるミスマッチ及び多型性をノックアウトする／除去する／破壊する／欠失させることである。我々はこの方法をノックアウトと呼ぶ（図１）。戦略は、１つの個体又は群又は集団において関連しない何百万もの変異があるという考えに基づく。たとえば、薬剤への反応を検討していて、２群を調べているとして（Ａ）薬剤ｘによく反応する；（Ｂ）重篤な副作用を有するとする。そのとき、Ａ及びＢ双方は、薬剤ｘへのＢ群の有害な反応と関係ない何百万もの変異をおそらく共有している。ホモ接合体のＳＮＰ又は突然変異を仮定すると、ノックアウト法は、背景にある雑音を減らし、ＳＮＰをほとんど含有しない又は全く含有しない「裸のゲノム」近いものを創出する（図２、工程２）。本明細書で使用するとき、「ノックアウトＤＮＡ」は、実質的に多型性を欠くＤＮＡを意味する。
【００１４】
先ず、４塩基切断制限酵素(four cutter restriction enzyme)によりＤＮＡを消化して平均サイズ３００〜４００ｂｐの断片を生成することによってノックアウトＤＮＡを創出する。次いで、ＤＮＡを変性→再アニーリングその後エンドヌクレアーゼ処理の対象としてＤＮＡへテロ二本鎖におけるニスマッチのヌクレオチド領域を特異的に除く（１−３）。この工程では、ミスマッチを取り囲むＤＮＡは切断されない。特定の表現型を持つ群又は集団が検討中であれば、ノックアウトサイクルの数が進むにつれて、高頻度で存在する対立遺伝子が低頻度の対立遺伝子を減らす又は除く傾向があるので、それらのＤＮＡをプールすることは回避すべきである。
【００１５】
方法の次の工程には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の捕捉（図１）、選抜又は濃縮が含まれる。この工程の基本的な前提は、疾病又は薬剤への反応に関連する多型性又は突然変異は、検討中の特定の表現型を持つ個体において異なった頻度で存在すると思われるということである。たとえば、薬剤ｘに有害に反応する個体の群は、薬剤ｘによく反応する又は反応を示さない個体よりも高い／低い頻度で表現型を持ちやすい幾つかの対立遺伝子を有すると思われる。我々は、劇的に異なる表現型を示す２つの集団における対立遺伝子頻度の逆転を見ることを予測している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、たとえば、疾病、格差のある薬剤への反応、行動及び表現型に関係する遺伝因子を同定するための方法、システム及び装置を提供する。本発明に係る方法は、個体又は集団のＤＮＡ断片、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローニングした遺伝子、又はそのほかの遺伝物質から直接、これらの因子を読み取る。
【００１７】
個体には７５０万を超えるＳＮＰがあるので、疾病又は薬剤への反応に関連する多型性（たとえば、５〜５０）を見い出す作業は、やる気をくじくような作業である。本明細書の方法は、以下に説明するようにＳＮＰの数を数百万から１００以下の候補に減らす：
【表１】
2006519019.tif 000003
【００１８】
方法における第１の新規の工程は、個体のＤＮＡを利用し、ミスマッチ及び多型性のすべてをノックアウトする／除去する／破壊する／欠失させることである。我々はこの方法をノックアウトと呼ぶ（図１）。戦略は、１つの個体又は群又は集団において関連しない何百万もの変異があるという考えに基づく。たとえば、薬剤への反応を検討していて、２群を調べているとして（Ａ）薬剤ｘによく反応する；（Ｂ）重篤な副作用を有するとする。そのとき、Ａ及びＢ双方は、薬剤ｘへのＢ群の有害な反応と関係ない何百万もの変異を共有していると思われる。ホモ接合体のＳＮＰ又は突然変異を仮定すると、ノックアウト法は、背景にある雑音を減らし、ＳＮＰをほとんど含有しない又は全く含有しない「裸のゲノム」近いものを創出する（図２、工程２）（すなわち、「ノックアウトＤＮＡ」）。
【００１９】
先ず、４塩基切断制限酵素によりＤＮＡを消化して平均サイズ３００〜４００ｂｐの断片を生成することによってノックアウトＤＮＡを創出する。次いで、ＤＮＡを変性→再アニーリングその後エンドヌクレアーゼ処理の対象としてＤＮＡへテロ二本鎖におけるニスマッチのヌクレオチド領域を特異的に除く（１−３）。この方法では、ミスマッチを取り囲むＤＮＡは切断されない。我々が特定の表現型を持つ群又は集団を見ているのであれば、ノックアウトサイクルの数が進むにつれて、高頻度で存在する対立遺伝子は低頻度の対立遺伝子を減らす又は除く傾向があるので、我々はそれらのＤＮＡをプールすることを回避すべきである。
【００２０】
方法の次の工程には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の捕捉（図１）、選抜又は濃縮が含まれる。この工程の基本的な前提は、疾病又は薬剤への反応に関連する多型性又は突然変異は、検討中の特定の表現型を持つ個体において異なった頻度で存在すると思われるということである。たとえば、薬剤ｘに有害に反応する個体の群は、薬剤ｘによく反応する又は反応を示さない個体よりも高い／低い頻度で表現型を持ちやすい幾つかの対立遺伝子を有すると思われる。我々は、劇的に異なる表現型を示す２つの集団における対立遺伝子頻度の逆転を見ることを予測している。
【００２１】
捕捉方法は規則に基づく。たとえば、
−集団Ａにおける遺伝子Ｘ及び集団Ｂにおける遺伝子Ｘが変異を有さななければ→捕捉しない。
−集団Ａにおける遺伝子Ｘは変異（ｉ）を有し、（ｉ）が集団Ｂにおける遺伝子Ｘに存在しなければ→捕捉する。
−集団Ａにおける遺伝子Ｘが変異（ｊ）を有さず、（ｊ）が集団Ｂにおける遺伝子Ｘに存在するのであれば→捕捉する。
【００２２】
ホモ接合体の形質（図２、工程７）については、２つの個体、群又は集団からのＤＮＡをプールすることによってノックアウト後に遺伝子の捕捉工程を実施する。次いで、プールしたＤＮＡを変性及び再アニーリングのサイクルの対象とする。各サイクルの間でミスマッチをかくまうｄｓＤＮＡを捕捉する。たとえば、ミスマッチを持つＤＮＡ断片に結合し、遺伝子捕捉工程に用いられるＤＮＡ修復タンパク質（たとえば、ＭｕｔＳ）を用いて、捕捉工程を達成することができる(４，５)。ＭｕｔＳはジーンチェック社（コロラド州、ボールダー）からの市販製品である。手順には、膜又はプレート又はマイクロビーズ上にタンパク質のスポットを作り、その後表面に結合したタンパク質にｄｓＤＮＡの断片を導入することが含まれる。さらに特性分析するために（たとえば、配列決定）、次いで、結合したミスマッチＤＮＡを溶出する。
【００２３】
ヘテロ接合体の遺伝多型性又は突然変異は、反復捕捉サイクル（図３、工程２及び７）によって同定する。たとえば、Ａ群及びＢ群（それぞれ、薬剤ｘに対する良好な応答者又は不良の応答者）が検討中であるならば、そのとき、各群を個々に反復捕捉サイクルの対象とする。次いで、捕捉されたＢ群のＤＮＡ断片を溶出されたＡ群のＤＮＡと混ぜ合わせて捕捉のさらなる回の対象とする。次いで、最終的に捕捉されたＤＮＡをさらに解析する。
【００２４】
次いで、二次元勾配ゲル電気泳動（２ＤＧＧＥ）を用いて、分子量及び配列に基づいて捕捉されたヘテロ二本鎖断片を分離する（６〜１０）。図２及び３に概説した二重標識戦略を用いて、集団Ａ〜集団Ｂのヘテロ二本鎖が、単一集団のみに由来するヘテロ二本鎖から識別される。単一の集団に由来するヘテロ二本鎖は単一の色を呈し、両方の集団に由来するヘテロ二本鎖は両方の色を呈する。次いで、標準の技術を用いて集団Ａ〜集団Ｂの二本鎖ＤＮＡ断片をポリアクリルアミド勾配ゲルから溶出し、マイクロタイタープレートの別々のウエルに入れる。
【００２５】
次いで、ＤＮＡ末端をポリッシュし、同様に平滑末端で線状化される適当なベクターにクローニングする。次いで、クローニングしたＤＮＡで大腸菌を形質転換し、増殖させ、標準の技術を用いて配列決定を行なった。
【００２６】
次いで、ＢＬＡＳＴを用いて公開されたドメイン情報とＤＮＡ配列を比較し、断片に関する関連情報を獲得する（すなわち、遺伝子ファミリー、位置、疾病との関係などを確認する）。これによって既知の遺伝子の関係を確認し、特有の遺伝子の関係を確定することができる。
【００２７】
今や、本発明に係る好ましいノックアウト及び捕捉方法を示す図１を参照する。２つの個体又は集団Ａ及びＢを［Ａ，Ｂ］で表す。Ａ及びＢのいずれかをノックアウト［Ａ＋及びＢ＋］又は非ノックアウト［Ａ−及びＢ−］の対象とする。次いで、Ａ及びＢは、ＤＮＡの捕捉［Ａ＋＋、Ｂ＋＋、Ａ−＋及びＢ−＋］又は非捕捉［Ａ＋−、Ｂ＋−、Ａ−−、Ｂ−−］を受ける。
【００２８】
図２は、集団Ａ及びＢにおけるホモ接合体の遺伝多型性及び突然変異を同定するための工程を説明するフローチャートを提供する。
【００２９】
集団Ａについて（たとえば、陽性の応答者）：
−集団における各人の個々のＤＮＡを回収する（工程１）；
−たとえば、ＳＡＵ３Ａのような４塩基カッター(four base cutter)を用いてＤＮＡを小さな断片に消化する(工程１）；
−断片におけるミスマッチをノックアウトする／欠失させる／除去する（工程２）；
−集団ＡのＤＮＡをプールする（工程３）；
−２つの集団を識別できるように断片の末端を標識する（すなわち、集団Ａ用の赤色の蛍光及び集団Ｂ用の緑色の蛍光）（工程４）。
【００３０】
集団Ｂについて（たとえば、陰性の応答者）
−集団における各人の個々のＤＮＡを回収する（工程１）；
−たとえば、ＳＡＵ３Ａのような４塩基カッターを用いてＤＮＡを小さな断片に消化する(工程１）；
−断片におけるミスマッチをノックアウトする／欠失させる／除去する（工程２）；
−集団ＢのＤＮＡをプールする（工程３）；
−２つの集団を識別できるように断片の末端を標識する（すなわち、集団Ａ用の赤色の蛍光及び集団Ｂ用の緑色の蛍光）（工程４）；
−集団Ａの断片と集団Ｂの断片を混ぜ合わせる（工程５）；
−断片を変性させ／アニーリングする（工程６）；
−ミスマッチが回収されるまで繰り返し捕捉する（工程７）；
−ゲルを用いてＡ／Ｂ鎖を含有する断片を分離する（工程８）
−断片をクローニングする（工程９）
−断片の配列決定を行なう（工程１０）；及び
−バイオインフォマティクス解析（工程１１）。
【００３１】
図３は、集団Ａ及びＢにおけるヘテロ接合体の遺伝多型性及び突然変異を同定するための工程を説明する
集団Ａについて（たとえば、陽性の応答者）：
−集団における各人の個々のＤＮＡを回収する（工程１）；
−たとえば、ＳＡＵ３Ａのような４塩基カッターを用いてＤＮＡを小さな断片に消化する(工程１）；
−ミスマッチがすべて捕捉されるまで繰り返し各個体についてミスマッチＤＮＡを捕捉する；断片においてミスマッチを有さない又はミスマッチをノックアウト／欠失／除去したそれらの断片のみを保持する（工程２）；
−同一表現型を有する群のＤＮＡをプールする（工程３）
−２つの集団を識別できるように断片すべてを標識する（すなわち、集団Ａ用の赤色の蛍光及び集団Ｂ用の緑色の蛍光）（工程４）。
【００３２】
集団Ｂについて（たとえば、陰性の応答者）
−集団における各人の個々のＤＮＡを回収する（工程１）；
−たとえば、ＳＡＵ３Ａのような４塩基カッターを用いてＤＮＡを小さな断片に消化する(工程１）；
−ミスマッチがすべて回収されるまで繰り返し各個体についてミスマッチＤＮＡを捕捉する；断片を回収する（工程２）；
−同一表現型を有する集団ＢのミスマッチＤＮＡをプールする（工程３）；
−２つの集団を識別できるように断片すべてを標識する（すなわち、集団Ａ用の赤色の蛍光及び集団Ｂ用の緑色の蛍光）（工程４）；
−集団Ａの断片と集団Ｂの断片を混ぜ合わせる（工程５）；
−断片を変性させ／アニーリングする（工程６）；
−ミスマッチが回収されるまで繰り返しミスマッチを捕捉する（工程７）；
−ＤＮＡゲルを用いてＡ／Ｂ鎖を含有する断片を分離する（工程８）
−断片をクローニングする（工程９）
−断片の配列決定を行なう（工程１０）；及び
−バイオインフォマティクス解析（工程１１）。
【００３３】
特定の好ましい実施態様を参照して本発明を示し、記載してきたが、本発明が関係する当業者に明白である、種々の追加、欠失及び改変は、本明細書に示されず、具体的に記載されていなくても、以下のクレームに包含されるような本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００３４】
＜参照文献＞
以下の参照文献をそれぞれその全体として本出願に組み入れる。
1. Youil R, Kemper B, Cotton RG. “Detection of 81 of 81 known mouse beta-globin promoter mutations with T4 endonuclease Vll-the EMC method.” Genomics. 1996 Mar 15;32(3):431-5.
2. Youil R, Kemper BW, Cotton RG. “Screening for mutations by enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII.” Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jan 3;92(1):87-91.
3. Babon JJ, McKenzie M, Cotton RG. “The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.” Mol Biotechnol. 2003 Jan;23(1):73-81
4. Wagner R, Debbie P, Radman M. “Mutation detection using immobilized mismatch binding protein (MutS).” Nucleic Acids Res. 1995 Oct 11 ;23(19):3944-8.
5. Bellanne-Chantelot C, Beaufils S, Hourdel V, Lesage S, Morel V, Dessinais N, Le Gall I, Cohen D, Dausset J. “Search for DNA sequence variations using a MutS-based technology.” Mutat Res. 1997 Sep;382(1-2):35-43.
6. Malloff C, Dullaghan E, Li A, Stokes R, Femandez R, Lam W. “Two-dimensional DNA displays for comparisons of bacterial genomes.” Biol Proced Online. 2003;5:143-152. Epub 2003 Jun 15.
7. Dullaghan EM, Malloff CA, Li AH, Lam WL, Stokes RW. “Two-dimensional bacterial genome display: a method for the genomic analysis of mycobacteria.” Microbiology. 2002 Oct;148(Pt 10):3111-7.
8. Myers RM, Lerman LS, Maniatis T. “A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments.” Science. 1985 Jul 19;229(4710):242-7.
9. Myers RM, Maniatis T, Lerman LS. “Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis.” Methods Enzymol. 1987;155:501-27.
10. Myers RM, Lumelsky N, Lerman LS, Maniatis T. “Detection of single base substitutions in total genomic DNA.” Nature. 1985 Feb 7-13;313(6002):495-8.
11. Lilleberg sL. “In-depth mutation and SNP discovery using DHPLC gene scanning.” Curr Opin Drug Discov Devel. 2003 Mar;6(2):237-52.
12. Shi MM. “Technologies for individual genotyping: detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes.” Am J Pharmacogenomics. 2002;2(3):197-205.
13. Shi MM. “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies.” Clin Chem. 2001 Feb;47(2):164-72.
14. Kwok pY. “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms.” Annu Rev Genomics Hum Genet. 2001;2:235-58.
【００３５】
本発明のそのほかの実施態様と同様に本発明の好ましい実施態様の性質が、以下の本発明の詳細な説明、添付のクレーム及び本明細書の図面を参照してさらに明瞭に理解されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ノックアウト及び捕捉方法の図解である。
【図２】ホモ接合体の遺伝多型性及び突然変異を同定するための工程を説明するフローチャートである。
【図３】ヘテロ接合体の遺伝多型性及び突然変異を同定するための工程を説明するフローチャートである。
【図１】
2006519019.tif 000004
【図２】
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【図３】
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