(57)【要約】本発明は、リゾチームＣタンパク質と高い配列同一性を共有する精巣特異的タンパク質(ＳＬＬＰ)のファミリーに関する。本願は、ＳＬＬＰタンパク質、ＳＬＬＰポリペプチドについて特異的な抗体を含む組成物、ＳＬＬＰポリペプチドの使用および避妊薬剤としてかかるペプチドに関する抗体を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子と卵母細胞との結合を阻害するための組成物であって、
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、およびかかる配列の生物活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、
組成物。
【請求項２】
該ポリペプチドが、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該ポリペプチドが、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１からなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドフラグメントからなる、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該ポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：１６、または配列番号：２の生物活性フラグメントである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２およびかかる配列の生物活性フラグメントからなる群から選択される第二のアミノ酸配列をさらに含む、請求項４記載の組成物。 
【請求項６】
医薬的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１-５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
該ポリペプチドが、検出し得る標識によって直接的または間接的に標識されている、請求項１-５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
プロピレングリコール、２〜４個の炭素原子を有する一価アルコール、乳酸、チオグリコール、脂肪酸グリセリド、およびソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１-５のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
該抗体が検出し得る標識によって直接的または間接的に標識されている、請求項９または１０記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１１の抗体および医薬的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１３】
ＳＬＬＰポリペプチドの天然リガンドを同定するための方法であって、
下記工程：
ヒトＳＬＬＰポリペプチドを、生理学的条件下で、卵母細胞から単離された化合物と接触すること、ここで該ＳＬＬＰポリペプチドは配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２およびかかる配列の生物活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ヒトＳＬＬＰポリペプチドを、非結合および非特異的な結合物質を除去するために洗浄すること、
ヒトＳＬＬＰポリペプチドとの結合を維持している化合物を単離すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
卵母細胞から単離された化合物が、哺乳類の卵母細胞から抽出されたタンパク質を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該ヒトＳＬＬＰポリペプチドが固体表面上に固定されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類精子細胞と哺乳類卵母細胞との結合を低下させる方法であって、哺乳類の配偶子をＳＬＬＰ活性の阻害剤を含む組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１７】
該投与された組成物がＳＬＬＰポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
投与された組成物が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２およびかかる配列の生物活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
投与された組成物が配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、およびかかる配列の生物活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
投与された組成物が、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１からなる群から選択されるアミノ酸配列含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される核酸配列に作動可能に結合された非天然プロモーターを含む、組換え体ヒトＳＬＬＰ遺伝子構築体。
【請求項２２】
請求項２１記載の構築体を含む、トランスジェニック細胞。
【請求項２３】
哺乳類における個体の受精能力を低下させる免疫応答を誘導するための組成物であって、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２からなる群から選択されるＳＬＬＰポリペプチドのエピトープおよび医薬的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項２４】
アジュバンドをさらに含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
哺乳類の受精能力を低下させる方法であって、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるＳＬＬＰポリペプチドのエピトープを含む組成物を該哺乳類に投与することによって、哺乳類における免疫応答を誘導する工程を含む、方法。
【請求項２６】
個体の受精能力を調節するための組成物であって、配列番号：２および配列番号：４からなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドフラグメントを含む、組成物。
【請求項２７】
配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２の８〜１５個のアミノ酸配列と同一である８〜１５個のアミノ酸配列を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
該ペプチドフラグメントが脂肪酸と結合する、請求項２６または２７記載の組成物。
【請求項２９】
イン・ビボでの卵母細胞を画像化するための方法であって、
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組成物を雌に投与する工程を含み、
該アミノ酸配列が検出し得る標識によって直接的または間接的に標識されている、方法。
【請求項３０】
該組成物が膣投与される、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
米国政府の権利
本発明は、国立健康研究所によって授与された、助成金番号ＨＤ３８３５３およびＵ５４ ２９０９９のもとに、米国政府の援助によりなされたものである。米国政府は本発明に関して一定の権利を持つ。
【０００２】
関連出願
本願は、35 USC §119(e)の下で、２００３年１月１６日に出願した米国仮特許出願６０/４４０,５８５号の優先権を主張するものである。なお、該出願の開示内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００３】
背景技術
哺乳動物における受精において、受精能を獲得した精子は、まず、卵母細胞の周囲を囲んでいる大量の卵丘細胞、次いで透明帯の厚い細胞外マトリックスを通過していかねばならない。透明帯に到達し、結合する精子は、アクロソーム反応を受けるためのシグナルを受容し、透明帯から受精チャンネルの加水分解を促進するように作用する酵素を放出する。受精チャンネルから出現によって、アクロソーム反応性精子が囲卵腔を横切り、卵膜と融合する。アクロソーム反応性精子のみが卵黄付近のマトリックスで見出されており、アクロソーム反応性精子だけが、結合および融合事象を媒介すると現在考えられる赤道部とオーバーレイする細胞膜ドメインと融合性である。すなわち、受精は、精子と卵母細胞表面タンパク質との間で直接的な相互作用によって完了される。配偶子リガンドおよびレセプターおよびこれらの事象に重要な分子相互作用は、大きな研究努力の主題である。
【０００４】
本明細書の一部とした開示物である、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１７１６に記載のように、ヒト・アクロソームに存在する２つの新規ｃ型リゾチーム様タンパク質(ｈＳＬＬＰ１＆ｈＳＬＬＰ２)は以前に発見されていた。さらに、この遺伝子ファミリーの４つのメンバーが、現在単離されている（ｈＳＬＬＰ３−６)。各ＳＬＬＰファミリーメンバーの発現は、精巣に限定されており、ここで記載したように精子および卵母細胞膜の結合および融合において機能することがわかった。従って、本発明の一つの態様は、避妊薬を単離するための標的として、これらのタンパク質の使用に関する。
【０００５】
本発明の多様な実施態様の要約
本発明は、ＳＬＬＰ１、ＳＬＬＰ２、ＳＬＬＰ３(先に報告されたＣ１９、Ｃ２３およびＣ２４)、ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５、ＳＬＬＰ６と称する６つの精子-特異的リゾチーム様タンパク質、それらのタンパク質をコードしている核酸配列、および該タンパク質に対して生成される抗体に関する。本来のＳＬＬＰ１、ＳＬＬＰ２、ＳＬＬＰ３、ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５およびＳＬＬＰ６ペプチドを含む組成物は、避妊薬製剤に使用され得る。さらに、ＳＬＬＰ１、ＳＬＬＰ２、ＳＬＬＰ３、ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５およびＳＬＬＰ６に対して生成した抗体は、診断薬として使用され得るか、精子細胞と卵母細胞との結合を干渉するために使用される組成物に処方されうる。
【０００６】
定義
本発明の説明および請求項において、下記技術用語は、下記の定義に従って使用される。
【０００７】
本明細書中で用いるとき、用語「精製した」および同様の語は、元の環境において分子または化合物と通常付随する他成分に比して、分子または化合物が豊富になることに関連する。該用語「精製した」は、特定分子の完全な純度が該過程中で達成されていることを必ずしも意味するものではない。本明細書中で用いるときに、「高度に精製した」化合物は、９０％以上純粋である化合物を示す。
【０００８】
本明細書中で用いるとき、用語「医薬的に許容し得る担体」は、あらゆる標準的な医薬的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水型または水／油型などのエマルジョン、および種々の型の湿潤剤を包含する。該用語は、米国連邦政府の管理機関によりヒトを包含する動物に使用するために使用を認可されたあらゆる薬剤や、米国局方に列挙されたあらゆる剤を包含する。
【０００９】
ポリリンカーは、連続した３つ以上の接近した位置にある制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む核酸配列である。
「作動可能に結合した」は、該成分がそれらの通常の機能を行うように配置された並置を示す。すなわち、コード化配列に作動可能に結合したコントロール配列またはプロモーターは、コード化配列の発現を有効にし得る。
【００１０】
本明細書中で用いるとき、「核酸」「ＤＮＡ」および同様の語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステル以外のバックボーンを有するアナログを包含する。例えば、当分野では既知であり、バックボーンにホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００１１】
用語「ペプチド」は、３以上のアミノ酸の配列を包含し、この場合、当該アミノ酸は、天然または合成の(非天然)アミノ酸である。ペプチド擬態は１以上の下記の修飾を有するペプチドを包含する：
【００１２】
１．１以上のペプチジル−Ｃ(Ｏ)ＮＲ−結合が、例えばＣＨ２カルバメート結合(−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−)、ホスホン酸塩結合、ＣＨ２スルホンアミド(−ＣＨ２Ｓ(Ｏ)２ＮＲ−)結合、尿素(−ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ−)結合、−ＣＨ２−二次アミン結合のような非ペプチジル結合によって置換されるか、またはアルキル化ペプチジル結合(−Ｃ(Ｏ)ＮＲ−)（式中、ＲはＣ１−Ｃ４アルキルである）によって置換されている、ペプチド、
【００１３】
２．Ｎ末端が、−ＮＲＲ１基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ基、−ＮＲＳ(Ｏ)２Ｒ基、-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ基、式中、ＲおよびＲ１は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであるが、但しＲおよびＲ１両方が水素ではない、に誘導されているペプチド；
【００１４】
３．Ｃ末端が、−Ｃ(Ｏ)Ｒ２（式中、Ｒ２はＣ１-Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）、ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４は、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択される）に誘導されているペプチド。
【００１５】
ペプチド中の天然アミノ酸残基は、下記のように、ＩＵＰＡＣ ＩＵＢ Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨されているとおりに略される：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦである；ロイシンはＬｅｕまたはＬである；イソロイシンはＩｌｅまたはＩである；メチオニンはＭｅｔまたはＭである；ノルロイシンはＮｌｅである；バリンはＶａｌまたはＶである；セリンはＳｅｒまたはＳである；プロリンはＰｒｏまたはＰである；スレオニンはＴｈｒまたはＴである；アラニンはＡｌａまたはＡである；チロシンはＴｙｒまたはＹである；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨである；グルタミンはＧｌｎまたはＱである；アスパラギンはＡｓｎまたはＮである；リシンはＬｙｓまたはＫである；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤである；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥである；システインはＣｙｓまたはＣである；トリプトファンはＴｒｐまたはＷである；アルギニンはＡｒｇまたはＲである；グリシンはＧｌｙまたはＧである、そしてＸは任意のアミノ酸である。他の天然アミノ酸は、実施例の方法では、４-ヒドロキシプロリン、５-ヒドロキシリシンおよび類似物を包含する。
【００１６】
合成または非天然アミノ酸は、イン・ビボで天然に存在しないアミノ酸のことをいうが、いうまでもなく、本明細書に記載のペプチド構造に導入され得るアミノ酸である。得られる「合成ペプチド」は、ペプチドの１、２またはそれ以上の位置でアミノ酸を遺伝的にコードした、２０個の天然アミノ酸以外のアミノ酸を含有する。例えば、ナフチルアラニンはトリプトファン（trytophan）に置換されて、合成を促進し得る。ペプチド内で置換され得る他の合成アミノ酸は、Ｌ-ヒドロキシプロピル、Ｌ-３,４-ジヒドロキシフェニルアラニル、α-アミノ酸、例えばＬ-α-ヒドロキシリシル（hydroxylysyl）およびＤ-α-メチルアラニル、Ｌ-α-メチルアラニル、β-アミノ酸およびイソキノリルを包含する。Ｄ-アミノ酸および非天然合成アミノ酸もまた、ペプチドに導入され得る。他の誘導体は、２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸(または、あらゆるＬまたはＤ-アミノ酸)の天然側鎖と別の側鎖との置換を包含する。
【００１７】
本明細書中で用いるとき、用語「保存アミノ酸置換」は、下記５つの群のうちの１つの中のアミノ酸交換として、本明細書中に定義される:
Ｉ．小分子脂肪族（small aliphatic）、非極性または弱い極性残基:
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、陰性荷電残基およびそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性、陽性荷電残基:
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大分子脂肪族、非極性残基:
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大分子芳香族基:
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００１８】
本明細書中で用いるとき、用語「抗体」は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメントをいう。
本明細書中で用いるとき、用語「ＳＬＬＰポリペプチド」は、配列番号：１６、配列番号１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１からなる群から選択される配列を含むアミノ酸配列をいう。
【００１９】
本明細書中で用いるとき、用語「ＳＬＬＰ抗体」は、配列番号：２、配列番号４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体をいう。
【００２０】
本明細書中で用いるとき、ＳＬＬＰポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」または「生物活性フラグメント」なる用語は、それらの天然リガンドに特異的に結合し得る天然または合成の一部の完全長タンパク質を包含する。
【００２１】
本明細書中で用いるとき、用語「非天然プロモーター」は、コード化配列およびプロモーターが天然に関連していない(すなわち、組換え体プロモーター/コード化配列構築体)コード化配列に作動可能に結合したあらゆるプロモーターをいう。
【００２２】
本明細書中で用いるとき、トランスジェニック細胞は、導入された核酸配列によりコードされた遺伝子の発現を可能にする様式で、該細胞に導入された核酸配列を含む、あらゆる細胞である。
【００２３】
本明細書中で用いるとき、用語「処置する」は、特定の異常または病状に関連する徴候を緩和すること、および／または該徴候を予防または除去することを包含する。例えば、癌を処置することは、癌細胞の増殖および／または分裂を予防または遅延させること、さらに癌細胞を死滅させることを包含する。
【００２４】
実施態様
精巣に特異的であり、リゾチームＣのパラログであると思われる６つのヒト精子タンパク質(ＳＬＬＰ１-６)が近年単離された。これらのタンパク質は、別のリゾチームＣにおいて見出された重要なアミノ酸を高度に保存していることから、リゾチームのパラログと分類される。しかし、それらは、既知のヒトのリゾチームＣとは核酸およびアミノ酸配列において大きく異なり、それらの遺伝子は異なる染色体上に位置づけられる。
【００２５】
全ての既知のリゾチームＣの配列(＞７５)のうち、２０個のアミノ酸残基は不変である。ＳＬＬＰ１は、それらの不変アミノ酸の２つ(Ｅ３５Ｔ、Ｄ５２Ｎ)以外の全てを含有している。該アミノ酸３５−Ｅは、触媒機能(すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸との間の多糖結合を解裂する）について重要なアミノ酸であると考えられている。ＳＬＬＰ２は、２０個の保存アミノ酸の１つ(Ｄ５２Ｅ)以外の全てを含有する。ヒトにおけるアミノ酸５３-Ｌは、触媒機能に重要なアミノ酸であると考えられている；しかし、ｇ型リゾチームは対応する位置にＤを持たない。また、ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２の相同遺伝子は、他の哺乳類（例えば、マウス)から、我々によって単離され、これらの遺伝子の触媒残基において同様の変異を含有している。
【００２６】
ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２タンパク質は、５.２および５.９のｐＩを各々有し、１５ｋＤａである。該タンパク質は、後に解裂されるＮ末端シグナルペプチドを伴って発現される。ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２の完全長および成熟形態は、各々配列番号：２と１６および配列番号：４と１７として提供される。両タンパク質は、既知のヒトのリゾチームＣと配列のホモロジーを有する；しかし、ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２は、染色体１７およびＸ−染色体に各々位置づけられている、すなわちこれらの２つの遺伝子は、新規のヒトのリゾチーム様遺伝子である。
【００２７】
組換えＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２を、E.coliおよび酵母中で発現させた。酵母で発現したタンパク質は、培地中に分泌される形で生成され、そして培地から精製し、リゾチーム活性について試験するためのアッセイに使用した。Pichia pastoris由来のＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２の単離された推定処理形態(ＳＬＬＰ２は組成物として得た)は、リゾチーム基質としてMicrococcus lysodeikticusを用いると、ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２はリゾチーム活性を持たないことが明らかとなった。詳細には、Micrococcus lysodeikticusを、ペトリ皿上でコンフルエントになるまで増殖させ、該細胞を、３３０ＵのヒトのリゾチームＣ(ポジティブコントロールとして)、試薬ブランク(ネガティブコントロールとして)および１６５０Ｕの精製した可溶性ＳＬＬＰ１タンパク質（yrＳＬＬＰ１)と接触させた。リゾチーム活性は、導入サンプルのまわりの阻止円によりヒトのリゾチームＣ(ポジティブコントロール)部分で観察されたが、yrＳＬＬＰ１またはyrＳＬＬＰ２について活性は検出されなかった。同様に、リゾチーム活性はE.coli合成ＳＬＬＰ１またはＳＬＬＰ２について検出されなかった。
【００２８】
同様に、E.coli系からの発現を基にしたＳＬＬＰ３は、リゾチーム活性を欠くことがわかった。ＳＬＬＰ３は、５.４のｐＩを有し、１５.０ｋＤａであり、染色体１７上の座１７ｑ１１.２に位置づけられる。ＳＬＬＰ３は、後に解裂されるＮ末端シグナルペプチドを伴って発現される。ＳＬＬＰ３の完全長および成熟形態は、各々配列番号：６と１８として提供される。ＳＬＬＰ３は、ヒトのリゾチームと４４％；ＳＬＬＰ１と４５％；ＳＬＬＰ２と４７％のアミノ酸配列ホモロジーを共有し、両方の触媒性アミノ酸を包含する全ての保存性アミノ酸２０個を含有する。組換えＳＬＬＰ１、ＳＬＬＰ２およびＳＬＬＰ３は、本アッセイにおいてリゾチーム活性を示さなかったが、これらの化合物は、未知のメカニズムにより抗菌性/抗ウイルス活性を依然示し得る。
【００２９】
ＳＬＬＰ４は、８.４のｐＩを有し、１４.８ｋＤａであり、染色体１０上の座１０p１２.１に位置づけられる。ＳＬＬＰ４は、後に解裂されるＮ末端シグナルペプチドを伴って発現される。ＳＬＬＰ４の完全長および成熟形態は、各々配列番号：８と１９として提供される。ＳＬＬＰ４は、ヒトのリゾチームと４８％；hＳＬＬＰ１と２と４７％；hＳＬＬＰ３と４２％のアミノ酸配列ホモロジーを共有し、両方の触媒性アミノ酸を包含する全ての２０個の保存性アミノ酸を含有する。ＳＬＬＰ５は、８.４のｐＩを有し、１４.８ｋＤａであり、染色体１０上の座１０p１１.２３に位置づけられる。ＳＬＬＰ５は、後に解裂されるＮ末端シグナルペプチドを伴って発現される。ＳＬＬＰ５の完全長および成熟形態は、各々配列番号：１０＆２０として提供される。ＳＬＬＰ５は、ヒトのリゾチームと４８％；hＳＬＬＰ１と４６％；hＳＬＬＰ２と４７％；hＳＬＬＰ３と４３％；hＳＬＬＰ４と９７％のアミノ酸配列ホモロジーを共有し、両方の触媒性アミノ酸を包含する全ての２０個の保存性アミノ酸を含有する。ＳＬＬＰ６は、８.４のｐＩを有し、１４.６ｋＤａであり、染色体３上の座３p２１.３３に位置づけられる。ＳＬＬＰ６は、後に解裂されるＮ末端シグナルペプチドを伴って発現される。ＳＬＬＰ６の完全長および成熟形態は、各々配列番号：１２＆２１として提供される。ＳＬＬＰ６は、ヒトのリゾチームと４０％；ＳＬＬＰ１と４９％；ＳＬＬＰ２と４０％；ＳＬＬＰ３と４８％；ＳＬＬＰ４と４１％；ＳＬＬＰ５と４２％のアミノ酸配列ホモロジーを共有し、この２つの触媒アミノ酸の１つのみを包含する２０個のうちの１６個のアミノ酸を含有する。ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５およびＳＬＬＰ６は、リゾチーム活性について試験されていない。
【００３０】
本発明の一つの実施態様に従って、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存アミノ酸置換により、それらのいずれの配列とも異なるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチドが提供される。別の実施態様に従って、精製ポリペプチドは、５より少ない保存アミノ酸置換により、またさらなる実施態様において、２より少ない保存アミノ酸置換により、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２とは異なるアミノ酸配列を含む。本発明の一つの実施態様に従って、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のアミノ酸配列、または配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のフラグメント、あるいは１〜１０個の保存アミノ酸置換により配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１とは異なるアミノ酸配列からなる精製ポリペプチドが提供される。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、組換え的に産生されたポリペプチドの安定化および／または精製を促進するよう別のアミノ酸配列を包含してもよい。これらの追加配列は、当業者には既知の細胞間または細胞内の標的化ペプチドまたは様々なペプチドタグを包含し得る。一つの実施態様において、精製ポリペプチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２およびペプチドタグ（該ペプチドダグはＳＬＬＰペプチド配列に結合する）からなる群から選択されるアミノ酸を含む。かかる融合タンパク質を発現する適当な発現ベクターおよび適当なペプチドタグは、当業者には知られており、市販購入し得る。一つの実施態様において、該タグはＨｉｓタグを含む。
【００３２】
別の実施態様において、本発明は、ＳＬＬＰポリペプチドのアミノ酸フラグメントを含む精製ポリペプチドに関する。より具体的には、該ＳＬＬＰポリペプチドフラグメントは、配列番号：６、列番号８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択される完全長の天然または合成部分のポリペプチドからなり、これはそれらの天然リガンドと特異的に結合し得る。一方、該フラグメントは、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドの抗原フラグメントを含み得る。 
【００３３】
一つの実施態様において、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１およびそれらの生物活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドが提供され、該アミノ酸配列は疎水性化合物と結合される。一つの実施態様において、該疎水性化合物は、脂肪酸グリセリドおよびソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択される。一つの実施態様において、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１のアミノ酸配列またはそれらの生物活性フラグメントは、グリセロールのモノまたはジエステルあるいは６〜１２個の炭素原子を有する脂肪酸と結合する。かかるグリセロールおよび脂肪酸の具体的な例示は、カプロン酸のモノまたはジグリセリド、カプリル酸のモノまたはジグリセリド、カプリン酸のモノまたはジグリセリド、およびラウリン酸のモノまたはジグリセリドである。
【００３４】
一つの実施態様に従って、組成物はＳＬＬＰポリペプチドに対して免疫応答を誘導するために提供される。一つの実施態様において、該組成物は、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２およびそれらの配列の抗原性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる精製ペプチドを含む。一つの実施態様において、該ペプチドは、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１の群から選択される配列からなる。該組成物は、医薬的に許容し得る担体またはアジュバンドと組合され、哺乳類に投与されて、免疫応答を誘導し得る。
【００３５】
本発明は、ヒトＳＬＬＰをコードする核酸配列も包含する。一つの実施態様において、核酸配列は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１の配列またはそれらのフラグメントを含む核酸配列が提供される。別の実施態様において、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される精製核酸配列が提供される。
【００３６】
本発明は、組換え体ヒトＳＬＬＰ遺伝子構築体に関する。一つの実施態様において、該組換え体遺伝子構築体は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１またはそれらのフラグメントからなる群から選択される核酸配列に作動可能に結合する非天然プロモーターを含む。別の実施態様において、非天然プロモーターは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される核酸配列に作動可能に結合される。非天然プロモーターは、予め決定された宿主細胞において発現を可能にする強力な構成的プロモーターが好ましい。これらの組換え体遺伝子構築体は、ＳＬＬＰ遺伝子生成物を合成するトランスジェニック細胞系を生成する宿主細胞に導入され得る。宿主細胞は、広範で多様な真核生物および原核生物から選択されてよく、２つの好ましい宿主細胞は、E.coliおよび酵母細胞である。
【００３７】
一つの実施態様に従って、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される核酸配列は、遺伝子配列を適切な調節配列に作動可能に結合する様式で真核生物または原核生物発現ベクター中に挿入され、ヒトＳＬＬＰは、真核生物または原核生物宿主細胞中で発現される。適当な真核生物宿主細胞およびベクターは、当業者には知られている。バキュロウイルス系は、トランスジェニック細胞を産生し、本発明のＳＬＬＰ遺伝子を合成するのに適当でもある。本発明の一態様は、ヒトＳＬＬＰおよびヒトＳＬＬＰコード化配列のフラグメントを発現する組換え体遺伝子を含有するトランスジェニック細胞系に関する。本明細書中で使用する場合、トランスジェニック細胞は外来導入された核酸配列を含むあらゆる細胞である。
【００３８】
一つの実施態様において、導入された核酸は、トランスジェニック細胞において十分に安定であり、後代細胞に伝搬される(すなわち、細胞ゲノムに導入されるか、あるいは高複製プラスミド中に存在する)。該細胞は、標準的細胞培養方法を用いるか、別の実施態様において、イン・ビトロで伝搬され得る。該宿主細胞は真核生物細胞であり、植物または動物（例えば、トランスジェニック動物を包含する）の部分として増殖される。一つの実施態様において、該トランスジェニック細胞は、ヒトの細胞であり、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される核酸配列を含む。本発明は、１以上の細胞のトランスジェニック生物体がヒトＳＬＬＰ生成物を発現する組換え体遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック生物体も包含する。
【００３９】
本発明は、ヒトＳＬＬＰを産生する方法を包含する。該方法は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９および配列番号：１１からなる群から選択される配列と作動可能に結合されたプロモーターを含む核酸配列を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を、導入されたヒトＳＬＬＰ遺伝子の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。一つの実施態様において、該プロモーターは、条件的または誘導性プロモーターであり、一方該プロモーターは、組織特異性または暫定的に制限されたプロモーター(すなわち、作動可能に結合された遺伝子は、特異的組織または特定時間においてのみ発現する)であってよい。合成されたＳＬＬＰは、標準的技術を用いて精製されうるし、ＳＬＬＰ活性の阻害剤を識別するために高処理量スクリーニング（high throughput screens）で使用され得る。あるいは、一つの実施態様において、組換え産生されたＳＬＬＰポリペプチドまたはそれらのフラグメントを使用して、ＳＬＬＰポリペプチドに対する抗体を生成する。組換え産生されたＳＬＬＰタンパク質は、結晶構造を得るために使用され得る。かかる構造は、ＳＬＬＰ機能を阻害するための特異的な薬剤の設計へと導く結晶学的分析を可能にする。
【００４０】
好ましくは、ＳＬＬＰをコードしている核酸配列は、予め選択された宿主細胞中における発現に適切な調節配列と遺伝子配列を作動可能に結合する様式で適当な発現ベクターに挿入される。適当な宿主細胞、ベクターおよびＤＮＡ構築体を細胞に導入する方法は、当業者には知られている。特に、ＳＬＬＰタンパク質をコードしいている核酸配列は、例えば、リポソーム、ウイルスベースベクターまたはミクロ注入などの送達メカニズムを用いて、細胞またはイン・ビトロまたはイン・ビボの細胞に添加され得る。
【００４１】
本発明の別の実施態様は、１以上の哺乳類ＳＬＬＰに特異的な抗体に関する。ヒトＳＬＬＰに対する抗体は、当業者にはよく知られている方法を用いて生成され得る。１つの実施態様によれば、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるポリペプチドに結合する抗体が提供される。一つの実施態様において、該抗体は、ポリペプチドの配列番号：８および配列番号：１０に特異的に結合する。一つの実施態様において、該抗体は、配列番号：６のペプチド配列に特異的に結合する。一つの実施態様において、該抗体は、配列番号：８のペプチド配列に特異的に結合する。一つの実施態様において、該抗体は、配列番号：１０のペプチド配列に特異的に結合する。一つの実施態様において、該抗体は、配列番号：１２のペプチド配列に特異的に結合する。一つの実施態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。該抗体は、修飾して用いるか、または修飾せずに使用され、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子とそれらを結合することによって標識され得る。さらに、該抗体は、標準的担体を用いて処方され、所望により治療用または診断用組成物を調製するために標識される。
【００４２】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、担体または希釈剤と組み合わせて、組成物を形成し得る。一つの実施態様において、該担体は、医薬的に許容し得る担体である。かかる担体および希釈剤は、界面活性剤の添加を伴うか、または添加を伴わないこともあり、滅菌液体、例えば水および油、および他の薬学的かつ生理学的に許容し得る担体、例えばアジュバンド、賦形剤または安定剤を包含する。例示的な油としては、石油、動物、植物または合成の起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、または鉱油がある。一般的には、水、生理食塩水、水性デキストロース、関連の糖溶液、およびグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどが液体担体として、特に注射可能溶液として好まれる。
【００４３】
本発明は、ヒトＳＬＬＰの存在を検出するための方法も提供する。該方法は、サンプルをヒトＳＬＬＰに特異的に結合する標識抗体と接触させ、非結合物質および非特異的結合物質を除去し、そして標識抗体の存在を検出する工程を含む。一つの実施態様において、標識化合物は、直接的または間接的(すなわち、標識された二次抗体を介して)に標識されている抗体を含む。特に、本発明のＳＬＬＰ抗体は、ＳＬＬＰの発現さらにその細胞局在性を確認するために使用され、または、避妊手段としてＳＬＬＰ阻害剤組成物が投与される個体のＳＬＬＰレベルをモニターするアッセイにおいて使用される。
【００４４】
ＳＬＬＰ１および２のノーザン・ブロット分析は、精巣において独占的に産生されないとしても、これらのタンパク質は精巣に非常に豊富であることを示した。ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２の発現をさらに特性分析すると、抗体がＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２に対して生成されていた。それらの抗体は、標的ペプチドに特異的であり、各々他のリゾチーム様タンパク質各々と交差反応しない。ＳＬＬＰ１免疫蛍光およびＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２ＥＭ局在試験は、ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２タンパク質の発現が、精子アクロソームに局在することを示す。さらに、ＥＳＴデータを基にすると、ＳＬＬＰ３-６は、精巣中で主に発現されることもわかる。より具体的には、ＳＬＬＰアミノ酸配列のブラスト探査により、ＥＳＴ配列は主に精巣に存在することがわかった(すなわち、ＳＬＬＰ３について：２１精巣および１骨髄、ＳＬＬＰ４：１５精巣および１骨髄、ＳＬＬＰ５：１６精巣、１６胚細胞腫瘍および５他腫瘍組織、ＳＬＬＰ６：８精巣、９胚細胞腫瘍および骨髄、網膜および脾臓由来の１つのＥＳＴ)。これにより、ＳＬＬＰタンパク質は受精過程においてそれらの役割を決定するため、それらの活性を調節する薬物の開発のための最適な標的となる。
【００４５】
ＳＬＬＰポリペプチドは精子に特別な機能を有すると予測され、すなわち、それらは避妊薬組成物における用途をもたらし、および／または避妊薬剤を生み出す標的として役立つこと考えられる。一つの実施態様において、ＳＬＬＰポリペプチドまたはフラグメントを含む組成物は、直接的または免疫応答の誘導を介してのいずれかにより避妊薬効果を与えるように投与される。例えば、一つの実施態様によれば、１以上の個々のＳＬＬＰポリペプチドまたはそれらの抗原性フラグメントを含む組成物は、能動免疫応答を誘起させるために対象に送達される。該抗原組成物に対する応答において生じた免疫応答は、本発明のＳＬＬＰタンパク質機能に関する一過的および可逆的アンタゴニストとして作用する。かかるワクチンは、対象の能動免疫化に使用され、抗体応答をおこして、卵細胞膜抗原への精子の接近を一時的に阻害する。本発明の一態様において、ＳＬＬＰエピトープは、月の一定期間、例えば雌対象の排卵中に投与し、受精を妨害し得る。一方、避妊法は、１以上のＳＬＬＰポリペプチドについて特異的な抗体を含む組成物の投与によって受動免疫を通じて効果をもたらし得る。
【００４６】
本発明の別の態様において、ＳＬＬＰポリペプチド(別々にまたは組み合わせて)は、オトリテック（othoritic）効果を有し、不可逆的不妊方法として有用な、卵細胞または精子に対するＴ細胞媒介アタックを誘起するために使用され得る。Ｔ細胞特異的応答を発生させる方法、例えば、養子免疫治療のための方法は、当業者にはよく知られている(例えば、Vaccine Design, Michael F. Powell and Mark J. Newman Eds., Plenum Press, New York, 1995, pp 847-867を参照されたい)。このような技術は、単回用量の予防接種が望まれる獣医用避妊薬または不妊目的のためには特に有用であり得る。
【００４７】
本発明は、ＳＬＬＰ機能の小分子阻害剤および避妊薬剤としてのそれらの使用を包含する。本発明の一態様によれば、該ＳＬＬＰファミリーは、新規薬物の開発のための標的として使用され、一つの実施態様においては、それらの天然のリガンドへの結合からＳＬＬＰを特異的に阻害する化合物である。高処理量スクリーニグと組み合わせた組合化学方法を用いた小分子ライブラリー生成の分野における進歩は、理想的な細胞透過性阻害剤についての探索を促進してきた。さらに、結晶学的方法を用いる構造ベースの設計により、リガンド設計のために活用しうるリガンド-タンパク質相互作用部位を詳細に特徴分析する能力が改良された。
【００４８】
一つの実施態様において、本発明は、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２またはそれらの生物活性フラグメントからなる群から選択される配列を含むポリペプチドと相互作用する、薬剤、小分子またはタンパク質をスクリーニングする方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１またはかかる配列の生物活性フラグメントからなる群からなる配列を含むポリペプチドと相互作用する、薬剤、小分子またはタンパク質スクリーニングする方法を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「生物学的に活性なフラグメント」または「生物活性フラグメント」は、各々の天然のＳＬＬＰポリペプチドの少なくとも１つの天然リガンドに特異的に結合し得る天然ペプチドの天然または合成部分を包含する。本発明は、ＳＬＬＰに結合するか、ＳＬＬＰの活性を調節し、そのようにして受精能力に対する治療上または診断用のマーカーとして有用である小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリーンするためのイン・ビボおよびイン・ビトロアッセイの両方を包含する。本明細書中で使用する場合、ＳＬＬＰの活性を調節することは、ＳＬＬＰリガンド結合特性を干渉するかまたは変化させることを包含する。
【００４９】
本発明の一つの実施態様において、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、および配列番号：１２からなる群から選択されるＳＬＬＰポリペプチドを用いて、生理学的条件下でＳＬＬＰタンパク質に結合するリガンドを単離するのに使用される。スクリーニング方法は、生理学的条件下で、ＳＬＬＰポリペプチドと化合物の混合物と接触させ、非結合物質および非特異的結合物質を除去し、そしてＳＬＬＰポリペプチドへの結合を維持している化合物を単離する工程を含む。一般的に、該ＳＬＬＰポリペプチドは、標準的技術を用いて固体支持体に結合され、迅速な化合物のスクリーニングに可能にする。該固体支持体は、生物学的化合物を固定するのに使用されてきたあらゆる表面から選択され得る。該固体支持体は、ポリスチレン、アガロース、シリカまたはニトロセルロースを包含するが、これに限定するものではない。一つの実施態様において、該固体表面は、機能修飾されたシリカまたはアガロースビーズを含む。かかる化合物のためのスクリーニングは、医薬薬剤のライブラリーおよび当業者には既知の標準的技術を用いて達成され得る。
【００５０】
次いで、ＳＬＬＰポリペプチドに結合するリガンドは、実施例２および実施例３に記載した結合および融合アッセイを用いて、それらが精子/卵母細胞結合と干渉するかどうかを決定するために、さらに分析され得る。ＳＬＬＰ活性の阻害剤は、避妊薬剤として使用される可能性を有する。かかる阻害剤は、医薬組成物として処方され得るし、精子/卵細胞結合および融合を遮断するために対象に投与され、そうして避妊のための手段を提供することができる。
【００５１】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳類卵母細胞への哺乳類精子の結合および融合を低下させる方法が提供され、ここで、ＳＬＬＰタンパク質の活性が、例えばそれらの天然リガンドを有するＳＬＬＰの結合活性を含めて、阻害される。一つの実施態様において、哺乳動物はヒトであり、医薬組成物はＳＬＬＰ活性の阻害剤を含む。該阻害剤は、抗体、小分子、アンタゴニスト、またはＳＬＬＰポリペプチドそれ自体、さらにＳＬＬＰポリペプチドの発現を阻害する化合物またはヌクレオチド構築体（転写ファクター阻害剤、アンチセンスおよびリボザイム分子、または遺伝子または調節配列置換構築体を包含するが、これに限定するものではない）を含み得る。
【００５２】
一つの実施態様において、動物におけるＳＬＬＰ遺伝子の発現を防止するか中断させるアンチセンスまたは干渉ＲＮＡを含み、精子/卵細胞結合および／または融合を阻害する組成物が提供される。哺乳類系中の干渉ＲＮＡには、１９−２２ｎｔの二本鎖ＲＮＡ分子からなる短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、またはループ配列と結合される１９−２９ｎｔのパリンドローム配列からなるsｈＲＮＡの存在が包含される。遺伝子発現のダウンレギュレーションは、相同なｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡとの対を形成することにより、配列特異的手法で達成される。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの安定な発現のための系は、トランスジェニック動物を作成するのに利用され(Hasuwa et al. FEBS Lett 532, 227 30 (2002), Rubinson et al. Nat Genet 33, 401 6 (2003) および Carmell et al. Nat Struct Biol 10, 91 2 (2003))、そして受精能力が制御され得る動物を作成するために本発明に従って使用され得る。条件的ＲＮＡｉベース形質転換系は、該動物の生存中に与えられるどのような段階でも、遺伝子発現のレベルを制御し得るさらなる価値を提供する。
【００５３】
別の実施態様において、１以上のＳＬＬＰに対する抗体を含む、精子/卵細胞結合および／または融合を阻害する組成物が提供される。一つの実施態様によると、６つ全てのＳＬＬＰポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。一方、該組成物は、１または２つの個体のＳＬＬＰポリペプチドに特異的である抗体を含み得る。一方、一つの実施態様において、ＳＬＬＰ１またはＳＬＬＰ２ (すなわち、配列番号：２および４のアミノ酸配列) 以外のＳＬＬＰ３、ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５およびＳＬＬＰ６ポリペプチド(すなわち、配列番号：６、８、１０および１２のアミノ酸配列)に特異的に結合する抗体が提供される。別の実施態様によれば、ＳＬＬＰ４およびＳＬＬＰ５に特異的に結合する抗体が提供される。別の実施態様において、ＳＬＬＰ３に特異的に結合する抗体が提供される。別の実施態様において、ＳＬＬＰ６に特異的に結合する抗体が提供される。一つの実施態様において、ＳＬＬＰ３、ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５またはＳＬＬＰ６のポリペプチド、それらのフラグメント、または他の誘導体、またはそれらのアナログは、免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用される。本発明の一つの実施態様において、抗原化合物は、抗体を生成するために提供され、該化合物は、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２ (またはそれらの抗原フラグメント) からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。生成された抗体は、標準的担体と共に処方され、また所望により治療用または診断用組成物を調製するために標識される。
【００５４】
ＳＬＬＰポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対する抗体は、当業者にはよく知られた方法を用いて生成され得る。抗体生成のために、様々な宿主動物（ここで、ウサギ、マウス、ラットなどを包含するが、これに限定するものではない）は、ＳＬＬＰポリペプチドまたはそれらのペプチドフラグメントによる注射によって免疫され得る。様々なアジュバンドは、宿主種により、免疫学的応答を増加させるために使用され、アジュバンドは、フロイントのアジュバンド(完全なおよび不完全な)、無機ゲル、例えばアルミニウム水酸化物、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバンド、例えばＢＣＧ(bacille Calmette-Guerin)およびcorynebacterium parvum.を包含するが、これに限定するものではない。
【００５５】
モノクローナル抗体の製造のために、培養のセルライン系によって抗体分子の生成のためのあらゆる技術が用いられ得る。例えば、ハイブリドーマ技術は、ヒトモノクローナル抗体を産生するために、当初、Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497)によって開発され、さらにトリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）により開発され、ヒトモノクローナル抗体を生成する。本発明のさらなる実施態様において、モノクローナル抗体は、最近の技術(ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５)を利用して無菌動物中で産生され得る。本発明に従って、ヒト抗体を用いて、ヒトハイブリドーマ（Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030）を用いるか、ヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスを用いて (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibody and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96) イン・ビトロで形質転換することによって得られる。実際、本発明によれば、ＳＬＬＰポリペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技術(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)を用い得る；例えば「ヒト化」抗体は本発明の範囲内である。
【００５６】
本発明によれば、１本鎖抗体の製造のために記載された技術(米国特許番号４９４６７７８)は、ＳＬＬＰタンパク質に特異的な１本鎖抗体を生成するために適用し得る。本発明のさらなる実施態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築体のために記載された技術を利用し(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)、卵細胞表面タンパク質、誘導体、またはアナログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ簡単な同定を可能にする。 
【００５７】
分子の遺伝子型を含有する抗体フラグメントは、既知の技術によって生成され得る。例えば、かかるフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって製造され得るＦ(ａｂ')２フラグメント;Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ’フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤によって処理することによって生成され得るＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメントを包含するが、これに限定するものではない。
【００５８】
抗体の生成において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当業者には既知の技術、例えば、ＥＬＩＳＡ(酵素-結合免疫吸着剤アッセイ)によって達成され得る。前述の抗体は、本発明のＳＬＬＰポリペプチドの局在性および活性に関連する当業者には既知の方法、例えばこれらのタンパク質を画像化し、適切な生理学的サンプル中のレベルの測定、診断方法などに使用され得る。
【００５９】
本発明に従って生成された抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ(すなわち、「ヒト化」抗体)、一本鎖(組換え体)、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントを包含し得るが、これに限定されない。これらの抗体は、ＳＬＬＰポリペプチドの発現または過剰発現によって特徴付けられる症状または疾患を診断するための診断剤として、またはＳＬＬＰポリペプチドレセプターアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の有効性をモニターするためのアッセイにおいて使用され得る。診断目的のための有用な抗体は、治療のために上記と同じ方法で調製され得る。該抗体は、修飾するかまたは修飾しないで使用され、そしてレポーター分子と、共有結合または非共有結合のいずれかで、それらを結合することによって標識され得る。
【００６０】
一つの実施態様において、ＳＬＬＰポリペプチドに対する抗体は、精子細胞と卵細胞との結合を防止する避妊薬剤として使用される。ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２に対する抗体が、ヒト精子の卵に結合する(実施例２を参照されたい)能力と干渉するかどうかを決定するために実験を行った。該アッセイを、イン・ビトロでヒトの精子とハムスターの卵を用いて行った。ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２は、アクロソーム膜上に存在し、アクロソームの透過化処理時に唯一暴露される。精子の約１／３のみが、イン・ビトロでのアクロソーム反応を受ける。実施例２に示されるように、ＳＬＬＰ１に対する抗体は、ハムスターの卵細胞に結合する精子細胞と有意に干渉される。ＳＬＬＰ２に対して生成された抗体については、効果は全く観察されなかった。これらの結果は、ＳＬＬＰ１タンパク質について特異的なレセプターが哺乳類卵細胞上に存在し、このレセプターそれ自体が避妊薬剤に対する標的として働き得ることを示唆する。
【００６１】
組換え体ヒトＳＬＬＰ１は、酵母およびＥ.coliで発現しており、該組換えタンパク質は、マウスおよびハムスターの卵細胞両方の卵細胞マトリックス付近に結合することがわかった。組換え体ヒトのリゾチームは、Ｅ.coliで発現されるが、このタンパク質はマウスの卵細胞に結合できない。従って、卵細胞に結合しているＳＬＬＰ１は、透明帯の物理的除去後であっても残存する特異的な相互作用が存在するようである。推定基質結合残基の保持を包含する類似のｃリゾチーム様配列および組織を有するヒト精子のアクロソームにおいてＳＬＬＰ１の処理形態が、ヒト、マウス、ラットにわたって保存されているという発見は、この分子がサッカリド、Ｎ−アセチルグルコサミンに対するレセプター候補として機能し得るという仮説に導く。Ｎ−アセチルグルコサミンは、卵細胞膜の上の過剰の細胞性マトリックス、囲卵腔、透明帯細孔および卵丘層において見出された。１以上のＳＬＬＰポリペプチドとそれらの天然リガンドの間の天然の相互作用を遮断することは、避妊法の有効な手段を提供することが予測される。さらに、ヒトＳＬＬＰの他種への交雑種結合により、ヒトＳＬＬＰを基にした避妊薬組成物が、他の非ヒト哺乳類について効果的な避妊薬でもあると予測される。それ故に、該ＳＬＬＰを基にした避妊薬は、ヒトだけでなく獣医学用、より具体的には家畜を包含する哺乳類における妊娠を防止するために使用され得る。
【００６２】
本発明の一つの実施態様は、ＳＬＬＰポリペプチドまたはこれらタンパク質の天然リガンド/レセプターの機能を阻害するために（すなわち、ＳＬＬＰ１、ＳＬＬＰ２、ＳＬＬＰ３、ＳＬＬＰ４、ＳＬＬＰ５、ＳＬＬＰ６タンパク質の発現を阻害するか、または該タンパク質の機能と干渉する）、精子または卵母細胞と接触する場所に置かれ得る組成物、に関する。一つの実施態様において、該ＳＬＬＰ阻害化組成物は、ＳＬＬＰポリペプチドのペプチドフラグメントまたは精子または卵細胞によって取り込まれるそれらのアナログを含み、ＳＬＬＰポリペプチドの天然リガンドとの結合に競合する。一つの実施態様は、外来的に加えられたＳＬＬＰペプチドは、天然のＳＬＬＰと精子および卵細胞の結合および融合に干渉する。従って、ＳＬＬＰポリペプチド阻害剤を含む組成物は、個体の受精能力を調節するのに使用し得るし、一つの実施態様において、該阻害剤は、男性避妊医薬として機能する。一つの実施態様において、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２からなる群から選択される配列の８〜１５個の連続するアミノ酸配列と同一の８〜１５個のアミノ酸配列、および医薬的に許容し得る担体を含む組成物が提供される。
【００６３】
一つの実施態様において、該組成物は、精子の卵母細胞への結合を阻害するために処方され、該組成物は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、およびかかる配列の生物活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。より具体的には、該組成物は、哺乳類精子の哺乳類卵細胞への結合を阻害し、一つの実施態様において、該組成物を使用して、ヒト精子のヒト卵細胞への結合を阻害する。
【００６４】
一つの実施態様において、精子/卵細胞干渉組成物は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドフラグメントを含むか、または一つの実施態様において、該組成物は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０および配列番号：２１からなる群から選択されるアミノ酸配列のペプチドフラグメントからなる。例えば、該ペプチドフラグメントは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列内に含まれる連続する配列と同一の、約５０〜約１００、約４〜約４０、約５〜約２０、約６〜約１５または約８〜１２個のアミノ酸長範囲のアミノ酸配列を示し得る。本明細書中で使用する場合、該用語「ペプチドフラグメント」は、親ポリペプチドの酵素的フラグメント、合成された組換え体ペプチドフラグメント、または化学的に合成されたポリアミノ酸のいずれか製造された親ポリペプチドのアミノ酸サブセットを包含すると意図される。一つの実施態様において、該組成物は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の実施態様において、該組成物は、配列番号：２、配列番号：１６のアミノ酸配列、または配列番号：２の生物活性フラグメントからなるポリペプチドを含む。配列番号：２のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントを含む該組成物は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１のペプチドフラグメントからなる群から選択される第二ポリペプチドと、さらに組み合され得る。
【００６５】
該精子/卵細胞干渉組成物は、通常、医薬的に許容し得る担体を包含する。さらに、該組成物はまた、安定化剤およびペプチド送達を促進する薬剤も包含し得る。一つの実施態様において、該ＳＬＬＰポリペプチドまたはそれらのペプチドフラグメントは、経皮的に送達されるように製剤され得る。かかる製剤において、該ＳＬＬＰ組成物は、ポリエチレングリコール、２〜４個の炭素原子を有する一価アルコール、乳酸、チオグリコール、脂肪酸グリセリド、およびソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択される化合物を含み得る。かかる阻害剤ペプチドは、精子細胞および／または卵細胞膜を通過する際に該ペプチドをアシストするために脂肪酸側鎖を包含するように修飾され得る。
【００６６】
本発明の経皮投与の医薬組成物は、一般的に、懸濁液またはゲルを製造するために非毒性の医薬的に許容し得る液体基材中に、薬学的に活性な物質および他の成分を分散することによって製造される。経皮製剤を製造するための技術は、米国特許番号６１０６８５６および４６３７９３０（出典明示により、本明細書の一部とする）で記載されているように、当業者には既知である。一つの実施態様において、該ＳＬＬＰポリペプチド/ペプチドは、ポリエチレングリコール、cisオレイン酸、ジメチルイソソルバイド（dimethylisosorbide）およびプロピレングリコールからなる群から選択される化合物と組合される。各成分の比率は、０.１〜９８mole分画％の間で変化され得る。一つの実施態様において、該処方は、ポリエチレングリコール中に分散された１〜１０mole％のcis-オレイン酸および１〜１０mole％のジメチルイソソルビタンを包含する。
【００６７】
別の実施態様において、ＳＬＬＰポリペプチド／ペプチドおよびプロピレングリコール、２〜４個の炭素原子を有する一価アルコール、乳酸、チオグリコール、中鎖脂肪酸グリセリド、およびソルビタン中鎖脂肪酸エステルおよび尿素からなる群から選択される化合物を含む経皮製剤が調製され、該液体は経皮製剤状態において存在する。本発明における使用のための、２〜４個の炭素原子を有する一価アルコールの例は、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどである。本発明における使用のための、中鎖脂肪酸グリセリドの例は、グリセロールのモノまたはジエステルおよび６〜１２個の炭素原子を有する脂肪酸である。かかるグリセロールおよび脂肪酸の特定の例は、カプロン酸モノまたはジグリセリド、カプリル酸モノまたはジグリセリド、カプリン酸モノまたはジグリセリド、およびラウリン酸モノまたはジグリセリドである。これらの物質は、単に、２以上の物質の混合物として使用され得る。例えば、５４.３％のカプリル酸モノグリセリドおよび３７％カプリル酸ジグリセリドの混合物は、商標名「Nikkol MGK」(Nikko Chemicals Co.製造)として市販購入でき、また８５％以上のカプリル酸モノグリセリドを含有する製品は商標名「Sunsoft No. 700p-2」(Taiyo Kagaku K.K.製造)として市販購入し得る。本発明において使用するための、ソルビタン中鎖肪酸エステルとして、ソルビトールのモノまたはジエステルおよび６〜１２個の炭素原子の脂肪酸が存在する。これらのエステルの特定の例は、ソルビタンモノカプロン酸エステル、ソルビタンジカプロン酸エステル、ソルビタンモノカプリル酸エステル、ソルビタンジカプリル酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステル、ソルビタンジカプリン酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステル、およびソルビタンジラウリン酸エステルである。それらは、単独でまたはそれらの混合物として使用され得る。
【００６８】
ＳＬＬＰ含有組成物は、直接膣に投与されるように処方されてもよい。一つの実施態様に従って、子宮頸または膣への局所的非全身投与のためにＳＬＬＰポリペプチドを含む自己投与し得る避妊組成物が提供される。該組成物は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６および配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、および堅くない医薬的に許容し得る粘性ゲル、クリーム、泡沫または起沸性型座薬ビヒクルを含む。適当なゲル、クリーム、泡沫および座薬送達ビヒクルは、当業者にはよく知られており、本発明の局所的な避妊組成物を調製するのに使用され得る。
【００６９】
本発明の別の実施態様において、ＳＬＬＰポリペプチドの特異的卵細胞結合特性は、それらを、イン・ビボで卵巣および卵母細胞を画像化するための使用を可能にする。一つの実施態様において、画像化組成物（イメージング組成物）は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらの生物活性フラグメントを含んでおり、このアミノ酸配列は、検出し得る標識により直接または間接的のいずれかで標識される。本明細書中で使用する場合、該用語「標識」は、検出し得る(好ましくは、定量し得る)「シグナル」を提供するのに使用され、タンパク質に結合され得るあらゆる原子または分子をさす。標識は、蛍光、放射活性、比色形、重量測定、Ｘ線回析または吸収、磁力、酵素活性などによって検出し得る「シグナル」を提供し得る。本発明は、非侵襲性手段の使用によりイン・ビボで検出し得る標識を必要とするほかは、任意の特定の検出系や標識に限定するという意図はない。かかる標識および検出系は、当業者には既知である。例えば、該ポリペプチドは、金属イオン源、例えば、三塩化ガドリニウム、三塩化ジスプロシウムまたはテクネチウム（technicium）またはインジウム誘導体で標識され得る。
【００７０】
一つの実施態様によれば、標識ＳＬＬＰポリペプチドの使用による卵母細胞の画像化は、雌の卵巣に存在する卵母細胞の数を定量化するのに使用されるか、または別の実施態様において、卵巣癌を検出するために使用され得る。卵母細胞の画像化は、早発閉経に罹患する患者を同定するための重要な診断用ツールであり得る、すなわち、全ての卵母細胞を消失する前の処置を可能にする。一つの実施態様によれば、イン・ビボでの卵母細胞画像化の非侵襲的方法は、雌患者に標識ＳＬＬＰポリペプチドを含む組成物を投与し、次いで該組成物の投与後に予め決められた期間の後に該標識を検出する工程を含む。一つの実施態様によれば、該粗成物は局所薬剤として膣に投与されるが、直接注射または、卵巣または経皮投与に近接する注射を含む他の投与経路が当業者には知られており、該組成物の投与に使用され得る。
【００７１】
本発明の別の態様において、ＳＬＬＰ５およびＳＬＬＰ６に対応するＥＳＴが腫瘍組織において検出されるので、これらのタンパク質の体腔発現は、新生物疾病のマーカーとして機能し得る。従って、本発明の一つの実施態様は、新生物疾病、例えば癌についての診断用マーカーとして、ＳＬＬＰ、特にＳＬＬＰ５およびＳＬＬＰ６の使用に関する。該方法は、体腔組織におけるＳＬＬＰの発現を包含するＳＬＬＰの高レベルのまたは適切な発現についてスクリーニングする工程を含む。かかるスクリーンは、ＳＬＬＰポリペプチドについて特異的な抗体を用いて行い得る。一方、ＳＬＬＰポリペプチドに対する抗体は、治療効果をモニターするために、抗癌治療に処置されている患者をモニターするためのアッセイに使用され得る。
【００７２】
実施例１
ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２タンパク質の単離
材料および方法
ヒト精子タンパク質の可溶化および電気泳動
精子試料の調製および精子タンパク質の可溶化を、文献のとおりに実施した(Naaby-Hansen et al, Biol Reprod 1997; 56:771787)。分析的二次元電気泳動のために、洗剤/尿素抽出タンパク質を、二次元ゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)の前にアクリルアミドチューブゲルで等電点(ＩＥＦ)により分離した。これは、Protean II xi Multi-Cell 装置(Bio-Rad, Richmond, CA)で行うか、またはこれらは分画用２Ｄゲル電気泳動にも用いられる大きなフォーマットゲル上(23 x 23 cm) (Investigator 2-D Electrophoresis System, ESA)で行った。ニトロセルロース膜への電気的転写、続く金染色によるタンパク質の視覚化を前記したとおりに完了し(Naaby-Hansen et al, 1997)、Matsudaira (1987)の転写緩衝液組成物(１０ｍＭ ３-[シクロヘキシルアミノ]-１-プロパンスルホン酸、１０％ メタノール、ｐＨ１１)を用いてＰＶＤＦ膜(０.２mm孔サイズ, Pierce)への電気的転写をHenzel ら(1993)によって記載されたとおりに実施した。該固定化タンパク質を、０.１％Commassie R250、４０％メタノールおよび０.１％酢酸を含有する溶液で１分間染色し、次いで１０％酢酸および５０％メタノールの溶液で３分間３回脱染色することによって視覚化した。
【００７３】
ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２タンパク質の微量配列決定
ＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２染色タンパク質スポットを、１.５ mm厚の２Ｄ ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルから抜き取り、小片に断片化した。該タンパク質を、メタノールで脱染色し、１０ｍＭ ジチ雄レイトールで還元し、０.１Ｍ 二酸化アンモニウム中の５０ｍＭ ヨウ化アセトアミドでアルキル化した。該試薬の除去後、該ゲル片を５０ｍＭ 二酸化炭素アンモニウム中の１２.５ ng/ml トリプシン溶液と共に、終夜３７℃でインキュベートした。ペプチドをゲル片から５％蟻酸中５０％アセトニトリルに抽出し、バージニア大学の生体分子研究施設で、タンデム質量分析およびエドマン分解により微量配列決定した。配列中のロイシンおよびイソロイシンの区別を、ＨＰＬＣ単離ペプチドのエドマン分解の配列決定によって決定した。縮重デオキシイノシン含有プライマーを用いて、微量配列決定データを基にして、ＰＣＲ技術を用いてＳＬＬＰ１およびＳＬＬＰ２cＤＮＡクローンを単離した。
【００７４】
ノーザンおよびドット・ブロット分析
８つの選択されたヒト組織由来の２mgのポリ(Ａ)＋ＲＮＡを含有するノーザン・ブロットをClontechから得た。ノーザン・ブロットを、３２Ｐ−標識したＳＬＬＰ１ cＤＮＡまたは３２Ｐ−標識したＳＬＬＰ２cＤＮＡでプローブした。プローブを、ランダムオリゴヌクレオチオド・プライム標識によって調製した(Feinberg and Vogelstein, 1983)。ハイブリダイゼーションを、Express Hyb溶液 (Clontech)中で６８℃１時間行い、その後２xＳＳＣ、０.０５％ＳＤＳにおいて室温３回洗浄し、０.１x ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにおいて２０分間５０℃で２回洗浄した。
【００７５】
５０個の異なるヒト組織由来の８９〜５１４ngのｍＲＮＡを含有する標準化ＲＮＡドット・ブロットを、Clontechから得て、３２Ｐ−標識したＳＬＬＰ１ cＤＮＡまたは３２Ｐ−標識したＳＬＬＰ２cＤＮＡでプローブした。グリッド上に存在する標準化したポリ-(Ａ)＋ｍＲＮＡ(１００-５００ng)を、次の組織を含む多様な組織源から単離した：全脳、骨髄へん桃核、尾状核、小脳、大脳皮質、前頭葉、海馬、延髄、後頭葉、被殻、黒質、側頭葉、視床、視床下核、脊髄、心臓、大動脈、骨格筋肉、結腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、精巣、卵巣、膵臓、脳下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、腎臓、肝臓、小腸、脾臓、胸腺、末梢白血球、リンパ節、骨髄、虫垂、肺、気管、胎盤、胎児の脳、胎児の心臓、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の脾臓、胎児の胸腺、胎児の肺、および１００ng 酵母全ＲＮＡ、１００ng 酵母ｔＲＮＡ、１００ng E.coli ｒＲＮＡ、１００ng E.coli ＤＮＡ、１００ ng ポリｒ（Ａ)、１００ng Ｃｏｔ１ヒトＤＮＡ、１００ng ヒトＤＮＡ、５００ng ヒトＤＮＡ。該ブロットを、サケ精子ＤＮＡおよびヒト胎盤Ｃot-１ＤＮＡを含有するExpressHyb 溶液 (Clontech)中、終夜６５℃でハイブリダイズした。次いでブロットを、２xＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、６５℃で３回洗浄し、次いで該フィルターをＸ線フィルムに暴露する前に５５℃で０.１xＳＳＣ、０.５％ ＳＤＳでさらに２回洗浄した。ハイブリダイゼーションは、精巣のＲＮＡドット中で唯一検出された。
【００７６】
実施例２
透明帯不含ハムスター卵を用いるヒト精子結合および融合アッセイ
精子調製:
運動性ヒト精子をBronson and Fusi(1990)のスイム・アップ方法によって収集した。簡単にいうと、精子サンプル（５００ ml）を、５mg/ml ＨＳＡを含有するＢＷＷ培地（２ml）に下においた。精子を１.５-２時間泳がせた。泳ぎきった精子を回収し、ＢＷＷ＋５mg/ml ＨＳＡ（８ml）を添加した。該組成物を、８分間室温で６００xg回転させ、該上清を除去し、培地（８ml）をペレットに添加した。該再懸濁ペレットを、８分間室温で６００xg回転させた。該上清を除去し、ＨＳＡ（３０mg/ml）を含有するＢＷＷ（５０ ml）をペレットに添加した。全精子細胞を計測し、次いで２０ｘ１０６精子/mlの濃度でＢＷＷ＋３０mg/ml ＨＳＡにおいて終夜インキュベートした。
【００７７】
卵細胞収集：
雌ハムスターを、３０ＩＵ ＰＭＳＧ、続いて７２時間後３０ＩＵ ｈＣＧのi.p.注射を与えた。ｈＣＧ注射の１４-１６時間後、ハムスターを屠殺し、卵管を５mg/ml ＨＳＡ含有ＢＷＷ培地中に回収した。卵丘細胞を１mg/mlのヒアルロニダーゼを用いて除去し、卵細胞を洗浄し、透明帯を１mg/mlトリプシンにより除去した。次いで、該卵細胞を完全に洗浄し、インキュベーター内で休ませた。
【００７８】
精子/抗体インキュベーション:
精子を、２０ｘ１０６精子/mlに希釈し、パラフィン油被覆微小液滴中で１時間、前免疫性(はじめに、血清の１:１０および１:５０希釈を試験した)または免疫性血清の適切な希釈物と共にインキュベートした。
【００７９】
ハムスターの卵を、精子＋抗体を含有する該液滴に添加した。次いで、該配偶子を３時間共インキュベーションした。
【００８０】
結合および融合の評価:
卵細胞を、５(５０ ml)洗浄滴を通して連続的通過により結合していない、また弱い結合の精子を洗い流した。同じピペットを、個々の実験で洗浄した全ての卵細胞に用いた。次いで、卵細胞を、ＢＳＡ／ＢＷＷ(３０mg/ml)中１ｍＭアクリジンオレンジ-３％ＤＭＳＯへの短時間(５-１５秒)の暴露によって染色し、４（５０ml)洗浄滴によって洗浄し、２２ｘ２２mmのカバースリップ下に埋めた。ＵＶ照射下、卵膜-付着精子の膨張していない頭部を計測した、卵細胞質を通過した精子は膨張した緑色頭部を示した。全ての実験を３回反復した。
【００８１】
結果
hＳＬＬＰ１抗体の１:１０希釈
卵細胞あたりに結合した精子の数
前免疫性        ３８.２          免疫性            ２１.８
Ｐ値＝７.７８x１０６
卵細胞あたりに融合した精子の数
前免疫性          ３.２          免疫性              ２.９
Ｐ値＝０.６
hＳＬＬＰ２抗体の１：１０希釈
卵細胞あたりに結合した精子の数
前免疫性        ２８.７          免疫性              ２７.４
Ｐ値＝０.７９
卵細胞あたりに融合した精子の数
前免疫性        １.８              免疫性の            １.６ 
Ｐ値＝０.７１
【００８２】
実施例３
hＳＬＬＰ１のマウス・オルトログの単離
受精においてｃリゾチーム様ＳＬＬＰタンパク質の機能を分析するために、マウスＳＬＬＰオルトログを単離し、マウス受精実験を行った。該新規アクロソーマル中のｃリゾチーム様タンパク質hＳＬＬＰ１は、両方の触媒残基を欠いていたが８つのシステイン全てを包含するｃリゾチームの２０個の不変残基のうち１７個を有する。しかし、ｃリゾチームにおける基質結合に必要な候補残基のほとんどがhＳＬＬＰ１中に残っている。hＳＬＬＰ１(mＳＬＬＰ１)のネズミ・オルトログはクローンされ、アクロソーム反応前後の雄配偶子に局在していた。イン・ビトロの受精アッセイを、recmＳＬＬＰ１だけでなくmＳＬＬＰ１に対する単一特異的抗体の存在下で実施した。さらに、mＳＬＬＰ１について相補的な結合部位を、マウスの雌配偶子について同定した。
【００８３】
材料および方法
ｍＳＬＬＰ１のクローニングおよび発現
ブラスト検索ツール(Altschul et al. 1990)を用て、ヒトＳＬＬＰ１のマウス・オルトログを、the NCBI GenBank データベースで探求し、候補遺伝子を同定した。各々ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有する１つの遺伝子特異的フォワード(５'ＣＡＴ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＴＧ；配列番号：１４)およびリバース(５’ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＣＡ ＧＴＣ；配列番号：１５)プライマーを設計して、マウスＳＬＬＰ１の推定処理形態（９４〜２２１の１２８アミノ酸）を増幅した。プライマーをInvitrogenから得た(Carlsbad, CA)。マウス精巣ｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した(Clontech, Palo Alto, CA)。用いたサイクルパラメーター、９４℃で２分間；９４℃で３０秒；５１℃で１分；そして６８℃で１.５分を、４０サイクル行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロースゲル上で分離し、〜４００bpのバンドを単離し、再度増幅し、ｐＣＲ２.１ ＴＯＰＯベクター中でサブクローニングした(Invitrogen)。多重ｃＤＮＡクローンを、Perkin-Elmer Applied Biosystems ＤＮＡ シークエンサー(Biomolecular Research Facility, Univ. of Virginia Health System, VA)でベクター誘導プライマーを用いて、両方向で配列決定した。次いで、挿入部を制限消化し、ゲル精製し、予め消化したｐＥＴ２８ｂ＋ベクター中にライゲートし、コンピータントＢＬ２１ＤＥ３ 細胞(Novagen, Madison)を使用して形質転換した。最終構築体には、Ｎ末端で２つのアミノ酸残基、および６つのヒスチジンタグを包含している８残基をＣ末端で加えた。
【００８４】
シングルコロニーからの２Ｌの培養物を、５０μg/mlのカナマイシン存在下Luria broth(LB)中で、３７℃６００nmで、光学密度〜０.８になるまで培養した。イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)(Sigma, St. Louis, MO)を１ｍＭまでの終濃度で添加し、発現を誘導した。３時間の誘導後、細菌を遠心分離によって回収した。該組換えタンパク質をＥ.coliの可溶性分画から単離し、８Ｍ尿素の結合緩衝液(２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ、ｐＨ７.９、５ｍＭイミダゾールおよび０.５Ｍ ＮａＣｌ)中に溶解し、製品の使用法を修飾してＨｉｓ結合Ｎｉ２＋ キレート化親和性樹脂カラム上で精製した(Novagen, Madison, WI）。次いで、該溶出物を、ＰＢＳを３回取り替えて終夜透析した。透析したタンパク質を、使用するまで−２０℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用い、Coomassie Plus-200によって決定した(Pierce, Rockford, IL)。
【００８５】
ポリクローナル抗体生成物およびウェスタン・ブロット分析
５匹の成体の未出産雌モルモットを、精製recmＳＬＬＰ１に対する抗体生成に用いた。前免疫性血清を、心臓穿刺により回収し、続いて各動物を完全なフロイントのアジュバンド中の精製recmＳＬＬＰ１（２００μg）を注射し、不完全なフロイントのアジュバンド中の同量のタンパク質を用いて１４日のインターバルで２回ブーストした。全ての免疫化について、半量の抗原エマルジョンを脚に筋肉内注射し、半量を背の２箇所に皮下注射した。次いで、全ての動物を、最終免疫後９日目に心臓穿刺によって全採血し、血液を血清分離チューブに回収した(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。遠心分離（１７５０g, １０分）した後、該血清を取り出して分注し、必要になるまで凍結させておく。
【００８６】
抗血清の特異性をrecmＳＬＬＰ１に対して試験し、マウス精子を１ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥ ウェスタンブロッティングの後に抽出した。RecmＳＬＬＰ１(０.１μg/レーン)または精巣上体尾部マウス精子(１０μg/レーン)をLaemmli 緩衝液(２x)に可溶化し、タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分解し、２０ｍＡで分離した。次いで、タンパク質をニトロセルロースにブロッティングし、ポンソー染色した。全てのブロットを、３０分間室温で０.０５％ Tween 20(ＰＢＳ−Ｔ)を有するＰＢＳ中で５％無脂肪乾燥乳を用いて遮断した。recmＳＬＬＰ１精製タンパク質のイムノブロッティングについて、抗recmＳＬＬＰ１ モルモット血清の１：１５０００または１:３００００希釈物を試験したが、マウス精子タンパク質については、血清の１:５０００または１:１００００希釈物を使用した。次いで、該ブロットをＰＢＳ−Ｔで３回１０分洗浄し、１:５０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ二次抗体を用いて１時間インキュベートし、２回１０分ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。該ブロットをＥＣＬ試薬(Amersham, Corp., Buckinghamshire, UK)、次いでＴＭＢペルオキシダーゼ基質(３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)で顕色させた。
【００８７】
イン・ビトロ受精アッセイのための培地および試薬
イン・ビトロ受精アッセイのために使用した培地は３％ＢＳＡを添加したWhittingham's培地(Fraser and Drury, 1975)のFraser's 修飾であり、培養等級のＨ２Ｏと分析等級の試薬とを用いて調製した。ＴＹＨ培地(Toyoda et al., 1971)を、精子-卵膜（oolemma）結合アッセイのために使用した。妊娠した雌の血清性腺刺激ホルモン(ＰＭＳＧ)、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(ｈＣＧ)、ＢＳＡ、培養等級のＨ２Ｏ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、Hoeschst dye 33342および全ての他の試薬をSigmaから得た。
【００８８】
イン・ビトロアッセイのための配偶子調製
ハイブリッドＦ１マウス(ＣＢ５７ＢＬ／６ＪｘＣＢＡ)を、全ての実験で使用した。性的に成熟した雄マウス由来の精巣上体の精子の懸濁液を、単離された卵母細胞の授精のために調製した。過剰排卵した２８日令の雌から得た卵母細胞を、１０ ＩＵ ＰＭＳＧおよび１０ ＩＵ ｈＣＧを用いて４８時間別に腹腔内注射した。この雌をｈＣＧ注射１６時間後に屠殺し、両方の卵管を、直ちに除去し、鉱油に置いた。
【００８９】
イン・ビトロでの卵丘-卵母細胞複合体との受精
卵丘のインタクトな卵母細胞を用いるイン・ビトロでの受精を、パラフィン油下で受精培地液滴中（２００μｌ）に５分おいた精巣上体尾部から分散された精子を用いて行った。該精子懸濁液を、２００μlの容量中１０６精子/mlの濃度に希釈し、次いで給湿した組織培養インキュベーター（３７℃、空気中５％ＣＯ２）中で１２０分間インキュベートして受精能を与えた。recmＳＬＬＰ１血清を試験した実験では、精子を、受精能獲得後の最後の４５分間、脱補体化（decomplemented）免疫性または前免疫性の血清濃度を変えてインキュベートした。recmＳＬＬＰ１を評価した実験において、精子を標準的な受精能獲得条件下でインキュベートした。
【００９０】
卵丘塊体を、パラフィン油下で１３５μlの液滴の受精培地(１滴あたり１集団)に置き、免疫または前免疫性血清と共に４５分、授精前にrecmＳＬＬＰ１の存在または非存在中でインキュベートした。次いで、精子懸濁液(終濃度：１０５精子/ml)（１５μl）を、各卵丘塊体の液滴に添加した。すなわち、血清または組換えタンパク質は、配偶子相互作用の間、インキュベーション液滴中で存在した。６時間後の授精卵母細胞を、鉱油下で受精培地の液滴（１００μｌ）に移した。終夜インキュベーション後に、卵細胞を、１０μg/mlのHoeschst 染料中で１０分染色し、受精培地で３回洗浄した。次いで、該卵細胞を、顕微鏡スライドと上部のカバースリップとの間に受精培地液滴（５μｌ）に置いて、光学と蛍光顕微鏡を用いて(Zeiss Axioplan)１６０ｘで可視化した。２つの細胞胚を受精したとして評点し、一方、１つの細胞した卵母細胞を非受精と評点した。
【００９１】
帯不含卵を用いるイン・ビトロ受精
精子-卵膜結合アッセイのために、２つの精巣上体尾部を、パラフィン油下で液滴（９００μl）の受精培地に置き、濃縮した精子の塊を３時間自由に流した。卵丘卵母細胞複合体を、パラフィン油下でＴＹＨ培地液滴（２００μl）においた。卵丘細胞を、１mg/mlのヒアルロニダーゼのＴＹＨ培地中で３分間卵母細胞を処置することによって除去し、次いで５０μlの液滴で８回洗浄した。透明帯を、１分間ＴＹＨ培地中の１０μg/mlのキモトリプシンで卵母細胞を処置することによってばらばらにし、ばらばらになった透明帯を吸引パスツールピペットで機械的攪拌により取り出した。次いで、該卵母細胞を１０回洗浄し、ＴＹＨ培地で３時間インキュベーションすることによってキモトリプシン処置から回復に供し、続いてそれらを１０μg/ml のHoeschst 染料で１０分染色して、穏やかに洗浄した。
【００９２】
抗recmＳＬＬＰ１ 血清を試験した実験で、精子を、受精能獲得の最後の３０分に脱補体化免疫性または前免疫性血清の濃度を変えてインキュベートした。次いで、無処置卵母細胞を、終濃度２.５x１０４精子/mlを有する処理精子を含有するインキュベーション液滴に添加した。recmＳＬＬＰ１またはリゾチームのいずれかを評価したこれらの実験において、標準的受精能獲得条件下で精子をインキュベートした。卵母細胞を、recmＳＬＬＰ１(０.１〜２００μg/ml)またはトリまたはヒトのリゾチーム(５０μg/ml、１００μg/ml)を用いて、４５分間授精前にプレインキュベートした。次いで、非処理精子を、終濃度２.５x１０４精子/mlを有する処理卵を含有するインキュベーション液滴に加えた。このように行った、全ての実験で血清、組換えタンパク質またはリゾチームは、配偶子相互作用中のインキュベーション液滴中に添加した。配偶子の共インキュベーション３０分後、卵母細胞を、ＴＹＨ培地中で５回穏やかに洗浄し、顕微鏡スライドと上部のカバースリップの間に置き１６０ｘで可視化した。卵母細胞への結合を、位相差を用いて卵母細胞あたり結合精子の全数を計測することによって評点した。卵細胞との融合を、蛍光顕微鏡を用いて各卵母細胞内の非縮合精子頭部の数を計測することによって評点した。
【００９３】
マウス精子および卵母細胞の間接的免疫蛍光試験
固定化精子上の標識化:
精巣上体尾部マウスの精子を、カルシウム(ＰＢＳ;ｐＨ=７.４)を含まないリン酸緩衝生理食塩水液滴(０.９ml)(液滴あたり２つのepididymidies)におき、５％ＣＯ２の大気中５分間３７℃でインキュベートした。アクロソーム反応を誘導するために、精子を、ＴＹＨ培地中で９０分間インキュベートし、５μＭのカルシウムイオン透過担体 A23187を添加してさらに１５分インキュベートした。次いで、各液滴を回収し、１０分５００ｇで遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した；この洗浄方法を３回繰り返した。ＰＢＳ中のマウス精子の最終懸濁液の塗抹標本を、顕微鏡スライド上で室温空気乾燥し、ＰＢＳ中２％w/v パラホルムアルデヒド中に１０分固定した。ＰＢＳで６回洗浄後、精子を３０分３７℃で、正常ヤギ血清(ＮＧＳ)(ＰＢＳ中５％ v/v)と共にインキュベートし、次いでモルモット(２００μg/ml)からの抗recmＳＬＬＰ１ ＩｇＧと共に１時間インキュベートした。該スライドを、ＰＢＳで３回洗浄し、精子をロバ由来のテキサス・レッド結合ポリクローナル抗体(1:200, Jackson Laboratories)と１時間３７℃でインキュベートした。次いで、スライドを洗浄し、ピーナッツ凝集素レクチン(ＰＮＡ)(１:５０) (Molecular Probes)と共に室温で３０分インキュベートし、洗浄し、Slowfade（登録商標）(Molecular Probes)にマウントし、Zeiss 標準 18 紫外顕微鏡下で可視化した。画像をMrGrab (Carl Zeiss Vision GmbH, Germany)を用いて捕捉した。
【００９４】
卵細胞標識化：
分裂中期ＩＩの卵細胞を、文献に記載したとおりに得て(Coonrod et al, 1999)、５％ ＮＧＳ／培地を用いて３０分インキュベートした。卵母細胞を５回ＴＹＨ培地で洗浄し、１００μg/mlのrecmＳＬＬＰ１または１００μg/ml リゾチームと、４５分３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。卵母細胞を５回洗浄し、５％ＮＧＳ／培地においてモルモット抗recmＳＬＬＰ１ ポリクローナル抗体(１:５０)、ヒツジ抗ヒトのリゾチーム(１:２５)またはウサギ抗-チキン リゾチーム(１：４００)と１時間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。卵母細胞を５回洗浄し、５％ＮＧＳ／培地中でロバ抗モルモット/Texas Red 抗体(１:２００)またはヤギ抗モルモット/ＦＩＴＣ抗血清(１:２００)、ロバ抗ヒツジおよびヤギ抗ウサギＦＩＴＣ−標識した二次抗体(１:２００) (Jackson ImmunoResearch)を各々用いて、１時間、３７℃でおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。卵母細胞を洗浄し、ガラススライド上で培地中にマウントし、Zeiss 標準的１８紫外顕微鏡下で可視化した。画像をMrGrab 1.0 (Carl Zeiss Vision GmbH, Germany)を用いて捕捉した。
【００９５】
共焦顕微鏡走査
卵細胞標識化：
免疫蛍光試験に用いた分裂中期ＩＩ卵を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ(ＰＢＳ／ＢＳＡ)で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ-ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)に、２０分間室温で固定した。固定後、卵をＰＢＳ／ＢＳＡで５回洗浄し、次いで２０分間室温でＰＢＳ中０.５％ Triton X-100を用いて透過性にした。次いで卵細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで５回洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中０.４ mg/ml ＲＮａｓｅ中に３０分おき、次いで２０ｎＭ Sytox (Molecular Probes, Eugene, OR)で１０分間染色した。次いで、卵細胞を十分洗浄し、おおよそ１分間スロー・フェード（slow fade）(Molecular Probes, Eugene, OR)平衡化培地におき、次いでスロー・フェード・マウント培地中のスライド上にマウントした。画像をZeiss 410 Axiovert 100 microsystems LSM 共焦顕微鏡上で得た。各パネルに対して、アテニュエーション、コントラスト、明度およびピンホール開口は一定のままである。各パネルに対して、４秒のスキャンを、２つの倍率を備えた６３ｘ油レンズを用いてラインあたり４回平均した。
【００９６】
分裂中期ＩＩの卵細胞への結合中の精子標識化: 
イン・ビトロの受精試験に用いた受精能獲得精子により授精した帯不含マウスの卵細胞を、２％パラホルムアルデヒド中１０分室温で固定した。配偶子をＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄し、５％ＮＧＳ／ＰＢＳ−ＢＳＡを用いて３０分３７℃でインキュベートし、次いでrecmＳＬＬＰ１ ＩｇＧ(２００μg/ml)と共に１時間インキュベートした。該スライドを３回ＰＢＳで洗浄し、配偶子を１時間３７℃でロバ抗モルモット・テキサス・レッド結合ポリクローナル抗体(１:２００，Jackson Laboratories)と共にインキュベートした。次いで、配偶子を５回ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、ＲＮａｓｅ（０.４ mg/ml）ＰＢＳ／ＢＳＡに３０分間おき、次いで２０ｎＭ Sytox (Molecular Probes, Eugene, OR)で１０分染色した。配偶子を十分洗浄し、スロー・フェード(Molecular Probes, Eugene OR)平衡化培地におおよそ１分間おき、次いでスロー・フェード・マウント培地中スライド上にマウントした。画像を、上記のZeiss 410 Axiovert 100 microsystems LSM 共焦顕微鏡で得た。
【００９７】
結果
マウスＳＬＬＰ１は、hＳＬＬＰ１の真のオルトログであり、類似特性をｃリゾチームと共有する
mＳＬＬＰ１の完全な推定アミノ酸配列を、配列番号：１３として提供する。mＳＬＬＰ１のＮ末端は、推定された膜内外ドメインを含有し、そのすぐ後にアラニン９３とリジン９４結合間のプロテアーゼ解裂候補部位まで続く。Accelrys Gap (Seq/Web version 2)アルゴリズムを用いる完全長hＳＬＬＰ１およびmＳＬＬＰ１配列の比較により、mＳＬＬＰ１がhＳＬＬＰ１の６４.２％の類似性および５８.８％の同一性であることがわかった。プロテアーゼ解裂部位（１２８aa）直後に始まるmＳＬＬＰ１の推定処理形態は、hＳＬＬＰ１の処理形態と、８２.８％の同一性および７５.８％同一性を共有する。導き出されたmＳＬＬＰ１配列は、３つの偽ミリストイル化部位、カゼインキナーゼＩＩ(Ｓ９７)およびプロテインキナーゼＣ（Ｓ６６、Ｓ９０、Ｓ１５２およびＳ１５３）に対する潜在的リン酸化部位およびα-ラクトアルブミン/リゾチームＣファミリーとしての特徴配列を含有する。さらに、成熟mＳＬＬＰ１の推定分子量（１４ｋＤａ）およびｐＩ（５.２）はhＳＬＬＰ１に類似する。
【００９８】
さらに、the GenBank databaseにおけるブラスト検索および選択された成熟ｃリゾチームの複数アラインメントにより、成熟mＳＬＬＰ１が、各々マウス、ヒトおよびニワトリのリゾチームと４６％、４８％および５０％の同一性があることが明らかになった。これらの３つのｃリゾチームと共にmＳＬＬＰ１の成熟形態のアラインメントにより、４４個の同一残基の存在が明らかとなったが、リゾチームの主な触媒残基(Ｅ３５およびＤ５２)はmＳＬＬＰ１ではＴ３５およびＮ５２で置換された。リゾチームの６つの潜在的基質-結合残基(３７位置、６３位置、６４位置、１０２位置、１０９位置および１１５位置の残基)の中の５つは、mＳＬＬＰ１中に保存されていたことから、mＳＬＬＰ１がｃリゾチームと密接に関係され得ることが示唆される。
【００９９】
mＳＬＬＰ１の発現および抗体の特異性
６つのＨｉｓＮ末端タグを有するが、残基９４〜２０１(シグナルペプチドおよび推定膜貫通ドメインを欠いている)を処理した成熟mＳＬＬＰ１タンパク質をコードしているcＤＮＡ配列を、E.coliで発現させ、Ｎｉ＋＋アフィニティー精製後に〜１５ｋＤａの組換えタンパク質を得た。recmＳＬＬＰ１調製物の純度を評価するために、精製タンパク質のアリコートを１-Ｄ電気泳動によって分離し、ゲルを銀染色し、抗his抗体でブロッティングした。約１５ｋＤａの顕著なバンドとおおよそ３０ｋＤａで非常にわずかな偽ダイマーに注目した。これらの結果は、この試験に使用したrecmＳＬＬＰ１調製物が精製されたことを示した。
【０１００】
recmＳＬＬＰ１に対してモルモットにおいて生成した抗体の特異性を、組換え体免疫原およびマウス精子タンパク質の両方に対するウェスタンブロッティングによって試験した。該免疫性血清は、１５ｋＤａ組換えＳＬＬＰ１を認識し、さらに偽３０ｋＤａダイマーは、調製物中で見出され、一方該前免疫性血清、さらにアジュバンド単独により注射されたモルモットから該血清は、recＳＬＬＰ１と免疫反応性を示さなかった。マウス精子抽出物において、該免疫性血清は、おおよそ１５ｋＤａバンドにのみ反応し、一方さらにアジュバンド単独により注射されたモルモットからの血清、さらに前免疫性血清は、反応性を示さなかった。これらの結果は、特異的免疫試薬が精子タンパク質抽出物に対して１本鎖バンドを与えるrecmＳＬＬＰ１に生じたことを示しており、少量はE.coliで発現中に生じるが、mＳＬＬＰ１ダイマー化は精子中で生じないことを示唆した。また、アフィニティー精製および再折りたたみ後にE.coliで発現したmＳＬＬＰ１は、元々のmＳＬＬＰ１と抗体交差反応を生じさせるに十分な数の免疫原エピトープを含有していることを示した。
【０１０１】
マウス精子アクロソームおよび赤道部と関連するマウスＳＬＬＰ１
recmＳＬＬＰ１に対するモルモットＩｇＧを用いて固定したマウス精子の間接免疫蛍光分析では、受精能を獲得していない精子の前方のアクロソームに主にmＳＬＬＰ１が局在した。しかし、２１.５％の受精能を獲得していない精子は、mＳＬＬＰ１の赤道部近傍に分布を示し、２.５％は染色しなかった。ＰＮＡレクチンのアクロソームにおいて蛍光の欠如によって決定されたアクロソーム反応精子は、recmＳＬＬＰ１との赤道近傍部の反応性を示した。しかし、１９％のアクロソーム反応精子は、mＳＬＬＰ１の前方のアクロソーム染色分布を保持し、５％が染色しなかった。その結果、アクロソーム前方における染色の消失は、受精能獲得およびアクロソーム反応がおきてから赤道部における染色の顕性と一致することがわかった。これは、赤道近傍部のＳＬＬＰ１が、アクロソームのインタクトな精子においてマスクされるか、前方アクロソームから赤道部への再分布の後にイオン透過担体誘導性アクロソーム反応をうけるかのいずれかを示唆し得る。重要なことには、共焦分析は、マウスの卵に結合するマウス受精能獲得した精子においてmＳＬＬＰ１の透明な赤道部の局在性を示し、このタンパク質は精子卵膜の結合と関係し得るという考えを強調するものである。
【０１０２】
RecmＳＬＬＰ１および抗recmＳＬＬＰ１血清は、マウスの卵丘インタクトな卵の受精を阻害する
受精中のmＳＬＬＰ１の役割を決定するために、精子および卵丘のインタクトな卵母細胞の両方を、授精４５分前に抗recmＳＬＬＰ１血清または前免疫性血清とプレインキュベートした。受精を該抗体の存在下で行った。６時間後の卵を、受精培地の液滴（１００μl）にうつし、終夜インキュベートした。１：１０または１：５０希釈の免疫性血清により処置した群において、２つの細胞胚の％は有意に減少した(各々６１％および１７％の阻害)。しかし、有意な効果は１:１００希釈(表１Ａ)では観察されなかった。
【０１０３】
次いで、卵丘のインタクトな卵母細胞を、受精過程中に存在した２つの濃度のrecmＳＬＬＰ１を用いてインキュベートした。recmＳＬＬＰ１（２００μg/ml）による卵丘-卵母細胞複合体の処置は、コントロール群において４５％、recmＳＬＬＰ１処置群において１２％に受精率を減少し、一方、コントロールと５０μg/ml組換えタンパク質によって処置された群の間の受精％について低下を示したが、有意な相違は観察されなかった。さらに、receＰＡＤ(２００μg/ml)の存在下でプレインキュベートされた卵母細胞、コントロールの組換えタンパク質として使用された卵細胞質タンパク質は、受精において低下しないことを示した(表１Ｂ)。まとめて考えると、これらの結果は、mＳＬＬＰ１が受精において機能し、配偶子融合の用量範囲試験を刺激することを示唆した。表１Ａおよび１Ｂに示したデータについて、血清または組換えタンパク質は受精中に存在する。２つの細胞胚を、２４時間後受精されたとして評点した。(＊)Ｐ＜０.０５(Anova test:分散分析検定)。抗recmＳＬＬＰ１血清およびrecmＳＬＬＰ１の両方は、マウスにおけるイン・ビトロ受精を有意に阻害した。
【０１０４】
【表１】
2006518193.tif 000002
表１Ａ：種々の濃度のrecmＳＬＬＰ１（ＰＩ）または免疫（Ｉ）血清を授精４５分前に両方の配偶子に添加した。
【０１０５】
【表２】
2006518193.tif 000003
表１Ｂ：種々の濃度のrecmＳＬＬＰ１またはＰＢＳを、無処理の受精能獲得マウス精子と共に授精４５分前に卵母細胞に添加した。いくつかの場合において、卵母細胞を、２００μg/mlの細胞質性卵母細胞タンパク質、receＰＡＤ(ネガティブコントロール)の存在下で４５分、プレインキュベートした。
【０１０６】
精子-卵細胞結合における役割を持つマウスＳＬＬＰ１
卵丘-卵細胞複合体を用いて、recmＳＬＬＰ１タンパク質、さらにrecmＳＬＬＰ１に対する抗体による受精の有意な阻害を示すために、我々は、mＳＬＬＰ１はその効果を発揮した受精カスケードの段階での決定に注目した。それ故に、我々は、抗recmＳＬＬＰ１血清およびrecmＳＬＬＰ１タンパク質が、受精能を獲得したマウス精子によって、透明帯不含マウス卵における精子-卵細胞結合を遮断するかまたは融合するかどうかを試験した。１：１０および１：５０希釈の抗recmＳＬＬＰ１免疫性血清の存在下で両配偶子が共インキュベーションされた場合に観察された。
融合ではないが(図２を参照されたい)、結合に対して有意な阻害(図１を参照されたい)を観察したが、１：１００希釈は有意な効果を示さなかった。種々の濃度のrecmＳＬＬＰ１(０.１-２００μg/ml)と透明帯不含マウス卵をインキュベートし、次いで無処理の受精能獲得マウス精子と授精した場合に最も強い効果を観察した。卵母細胞とrecmＳＬＬＰ１とのインキュベーションは、１μg/mlで観察された有意な効果および５０μg/mlでの１００％阻害を有し、精子結合(図３を参照されたい)または卵細胞に対する融合(図４を参照されたい)の％における濃度依存性の低下を生じた。透明帯不含マウス卵母細胞は、コントロールとして使用したrecmＳＬＬＰ１非存在下または２００μg/mlでreceＰＡＤの存在下でインキュベートした。receＰＡＤを２００μg/mlで試験した場合に阻害は検出されなかった。卵の結合につづいて融合するが、抗recmＳＬＬＰ１またはrecmＳＬＬＰ１タンパク質が影響しなかったということを示唆するコントロールと比較して運動性のある精子の％において違いは観察されなかった。まとめると、これらの結果は、受精前にマウス卵表面での結合事象においてmＳＬＬＰ１の関与を支持する。
【０１０７】
受精しなかった卵母細胞と受精した卵母細胞に対する相補的な結合部位を有するマウスＳＬＬＰ１
卵細胞表面上のmＳＬＬＰ１-結合部位の可能な局在性を試験するために、受精していない卵母細胞と前核段階でイン・ビトロ受精卵母細胞とを一緒に、精製した組換えタンパク質mＳＬＬＰ１と４５分インキュベートし、洗浄し、次いで抗recmＳＬＬＰ１に暴露した。未受精の卵母細胞は、囲卵腔内に、また多くの卵母細胞表面上で蛍光標識を示した。しかし、蛍光の全くないエリアを一貫して検出した。Hoesch 染色は、このネガティブ領域が、分裂中期板の上にある卵母細胞膜のエリアと常に関連するとことが明らかになった。こうして、mＳＬＬＰ１-結合部位は卵細胞の膜融合（fusogenic）領域に限定され、精子-卵細胞結合の際にmＳＬＬＰ１相互作用のための一つの役割をさらに示唆した。対照的に、イン・ビトロで受精した透明帯を有する卵母細胞あるいは有さない卵母細胞は、卵細胞表面全体に局在する強力な蛍光を示した。３つの異なる処置に供した卵母細胞をコントロールとして用い、そして、それらは、抗recmＳＬＬＰ１に暴露しただけでrecmＳＬＬＰ１への暴露を欠いた卵母細胞も含めて、蛍光の証拠を示すものは全くなかった。卵母細胞をrecmＳＬＬＰ１と共にインキュベートし、次いで前免疫性血清に暴露し、卵母細胞をreceＰＡＤとインキュベートし、次いで各特異的抗体とインキュベートした。
【０１０８】
共焦分析を実施し、mＳＬＬＰ１結合部位の局在性を細かく区別した。受精していない卵母細胞の断面の評価は、mＳＬＬＰ１-結合部位が囲卵腔に優性的に局在したことを示した。弱い蛍光標識を卵細胞の透明帯で観察したが、我々はこの弱い蛍光が特異的な結合によるどうかを確定することはできなかった。ウェスタン・ブロット分析による帯結合アッセイは、この問題解明の助けとなる。対照的に、蛍光は受精した卵の囲卵腔内では検出されなかったが、該卵膜のいたるところにある斑点パターンは明確な特性であった。
【０１０９】
ｃリゾチームは、配偶子融合を遮断しないか、マウス卵細胞に結合しない
マウスＳＬＬＰ１は、６つの基質結合残基のなかの５つを包含するｃリゾチームのほとんどの特性を共有するリゾチーム様タンパク質である。精子-卵細胞結合のｃリゾチームの結合特性を評価するために、我々は、ヒトおよびニワトリのリゾチームが受精能を獲得したマウス精子によって透明帯不含マウスの卵の結合を遮断するかどうかを試験した。結合または融合に対する有意な効果を５０または１００μg/mlの天然タンパク質で観察しなかった。この機能アッセイに従って、マウス卵母細胞は、ヒトまたはニワトリのリゾチームおよびそれらの各々の抗体とインキュベートした場合、ポジティブな蛍光染色を示さなかった。
【０１１０】
考察
この試験の結果は、mＳＬＬＰ１がhＳＬＬＰ１真のオルトログであり、リゾチームファミリーと類似特性を共有することを示した。マウスＳＬＬＰ１オルトログは、タンパク質の処理領域において、ヒトＳＬＬＰ１に対して８２.８％類似性および７５.８％同一性を共有し、Ｎ−アセチルグルコサミンに対して重要な基質結合残基の保存を包含するいくつかの特性を共有し、２つの突然変異した重要な残基を保存することを示した。マウスゲノムデータベースの探索は、さらにhＳＬＬＰ１に対してより大きなホモロジーを持つ遺伝子を全く示さなかった。これらの考察をあわせて、ヒトＳＬＬＰ１の真のネズミ・オルトログを同定したという結論を支持するものである。
【０１１１】
哺乳類の受精において、透明帯を通過した全ての精子はアクロソーム反応性であり、アクロソームのインタクトな精子は卵膜と融合しない(Yanagamachi, R. Adv. Biophys, Vol 37:49-89, 2003)。精子細胞膜と卵細胞膜との融合は、赤道近傍部の上にある細胞膜ドメインとともに開始する。この特異的ドメインが膜融合性となる分子的メカニズムは現在未知であるが、仮定的経路が提案された(R. Yanagimachi 1994 Frontiers in Endocrinology Vol 8, p15)。これはアクロソーム反応中に放出されたアクロソーマルマトリックスの内容物を、赤道近傍部に再分配するという仮定を包含するものである。マウスＳＬＬＰ１は、主にアクロソーム・インタクト・マウス精子の前方のアクロソームに局在化し、イオン透過担体に誘導されたアクロソーム反応の後に赤道部に再配置する。我々は、この再配置が、mＳＬＬＰ１が内部と外部アクロソーマル膜の間の裂け目に暴露される赤道近傍のマトリックスへの再分布を包含するか、細胞膜の上部または両方に再分配するどうかはまだ判らない。従って、卵の細胞膜に対して受精能を獲得し、結合した精子は、mＳＬＬＰ１タンパク質を保持しており、膜結合においてmＳＬＬＰ１に対する機能を示唆するものである。
【０１１２】
卵丘のインタクトな卵母細胞を用いて、受精過程中、recmＳＬＬＰ１に対する抗血清によって配偶子の両方をインキュベートした場合に、イン・ビトロでの受精が遮断された。recmＳＬＬＰ１が受精過程中に存在した場合に受精が遮断されたというイン・ビトロの受精試験とは別の重要な知見は、mＳＬＬＰ１が受精に関係することを示唆するものである。recmＳＬＬＰ１がＰＢＳに対して透析したので、ＰＢＳがコントロール卵母細胞に添加されたことに注目されたい。結果として、ＰＢＳ群について得られた受精％は予測よりも低かった(５０％対７５％)。
【０１１３】
透明帯不含精子-卵細胞結合および融合アッセイは、recmＳＬＬＰ１に対する抗体が精子と透明帯不含マウス卵との融合ではなく、結合を有意に阻害することを示した。さらに、recmＳＬＬＰ１の存在下でインキュベートされた卵母細胞は、濃度依存様式で卵に結合する精子を阻害した。この試験の最も重要な知見は、両方の配偶子を５０μg/ml recmＳＬＬＰ１とインキュベートしたときに、精子-卵細胞結合について１００％の阻害が観察されたことである。我々の実験条件下において、観察したrecmＳＬＬＰ１の融合過程に対する効果は、結合し得る精子がどこで卵膜に融合し得るかであるため、融合レベルではなく結合レベルであった。考えあわせると、該イン・ビトロのデータは、精子-卵細胞結合事象の間に少なくとも一つのmＳＬＬＰ１が受精において影響することを示唆する。
【０１１４】
精子-卵細胞の相互作用のための多数の可能候補結合パートナーが記載されてきたが、これらの分子の正確な役割は、明確には確立されていなかった。それ故、配偶子相互作用に関係する別の分子、特にアクロソーム反応後に保持される分子の同定は、受精に関する理解を大きく増強させ得るであろう。ＳＬＬＰ１は、この基に対する魅力的な付加であり、我々の知見から、mＳＬＬＰ１結合部位は卵膜上に存在することを示した。結合部位は、減数分裂紡錘体の上にある細胞膜の領域、融合がまれに起こる領域と一致するネガティブ領域以外の、囲卵腔および受精していないマウスの卵母細胞の全表面に局在した。この一致は、受精卵母細胞上のネガティブ領域の蛍光消失によって支持される。さらに、受精した卵母細胞上の卵細胞全表面で蛍光標識の離散斑点を観察した。
【０１１５】
実施例４
哺乳類精子/卵細胞結合に対する交差種ＳＬＬＰポリペプチドの効果
出願人は、様々な哺乳類の精子細胞がハムスター卵細胞に結合し得ることを示した。より具体的には、ハムスター精子に加えてマウス精子はイン・ビトロ実験中にハムスター卵細胞に結合し得る。組換え体ヒトＳＬＬＰ１を、酵母およびE.coli 発現系の両方を用いて作成し、合成タンパク質を使用して、哺乳類の卵に結合し得るかし得ないかを調査した。両方の組換え的に作成したヒトＳＬＬＰ１タンパク質は、組換えＳＬＬＰ１（１００μg/ml）および実施例３に記載の方法を用いて、透明帯不含および透明帯含有のインタクトなマウスの卵細胞に結合し、さらに透明帯不含および透明帯含有のインタクトなハムスターの卵細胞に結合することを見出した。さらに、コントロールとして、出願人は、ヒトのリゾチームがＳＬＬＰ１結合実験に使用したものと同様の条件下でマウスの卵に細胞に結合できないことを示した。
【０１１６】
次いで、実施例３に記載の方法を用いて、マウス精子卵細胞結合および融合に対する組換えＳＬＬＰ１タンパク質を発現したE.coliの効果を調べた。簡単には、ＳＬＬＰ１遺伝子を担持する組換え体細胞を、ＩＰＴＧにより誘導した。封入体を、尿素またはグアニジン−ＨＣｌ中に回収し、可溶化した。次いで、タンパク質を、Ｈｉｓ結合樹脂上でアフィニティー精製した。該樹脂をイミダゾールで洗浄した。３〜６時間のグラジエント溶出を用いて、カラムから尿素/グアニジンの完全除去を達成した。折りたたまれた(可溶性）タンパク質の溶出を尿素非存在下でイミダゾールによって達成した。次いで、溶出培地を、溶出したタンパク質に適当な緩衝液を用いて交換した。図５および６に示したように、ヒト組換えＳＬＬＰ１(hrＳＬＬＰ１)は、用量依存様式においてマウス精子-卵細胞の結合および融合を阻害した。従って、ＳＬＬＰポリペプチドは、交差様式において、精子-卵細胞結合および融合と干渉し、活性な避妊薬剤の投与に適当であるこれらのタンパク質自体を作成し得ることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、実施例３に記載のマウス精子−卵細胞結合実験から得られるデータを示す棒グラフである。成熟マウスの卵細胞からの透明帯は、キモトリプシンでの短いインキュベーション後の機械的剪断によって取り出した。種々の濃度の抗recmＳＬＬＰ１血清とプレインキュベートした受精能を獲得したマウス精子は、帯不含マウスの卵細胞と共インキュベートし、卵細胞と結合する精子細胞の数が決定された。
【０１１８】
【図２】図２は、実施例３に記載のマウス精子-卵細胞融合実験から得たデータを示す棒グラフである。成熟マウス卵細胞からの透明帯を、キモトリプシとの短いインキュベーション後の機械的剪断によって取り出した。受精能を獲得したマウス精子、種々の濃度の抗recmＳＬＬＰ１血清とプレインキュベートした受精能を獲得したマウス精子は、帯不含マウスの卵細胞と共インキュベートし、卵細胞と結合する精子細胞の数が決定された。
【０１１９】
【図３】図３は、マウス精子-卵細胞結合に対するマウス組換えＳＬＬＰ１の効果を試験する実験(実施例３を参照されたい)から得たデータを示す棒グラフである。帯不含マウスの卵をＳＬＬＰ１タンパク質の提示濃度とプレインキュベートし、次いで受精能を獲得したマウス精子と授精された。全ての場合で、血清または組換えタンパク質は、配偶子相互作用の間存在していた。卵細胞を処理し、精子結合について分析した。データは、３つの異なる実験からの平均±ＳＥを示す。（＊）Ｐ＜ ０.０５、(＊＊) Ｐ＜ ０.０１（スチューデントＴ検定）。コントロール：前免疫血清または非タンパク質またはreceＰＡＤ(細胞質卵細胞タンパク質)。
【０１２０】
【図４】図４は、組換えＳＬＬＰ１のマウス精子-卵細胞融合に対する効果を試験する実験(実施例３を参照されたい)から得たデータを示す棒グラフである。帯不含マウスの卵を、recmＳＬＬＰ１タンパク質の提示濃度とプレインキュベートし、次いで受精能を獲得したマウス精子と授精した。全ての場合で、血清または組換えタンパク質は、配偶子相互作用の間存在していた。卵細胞を処理し、精子融合について分析した。データは、３つの異なる実験からの平均±ＳＥを示す。（＊）Ｐ＜０.０５、（＊＊）Ｐ＜０.０１(スチューデントＴ検定）。コントロール：前免疫血清または非タンパク質またはreceＰＡＤ(細胞質性卵細胞タンパク質)。
【０１２１】
【図５】図５は、ヒト組換えＳＬＬＰ１のマウス精子-卵細胞結合に対する効果を試験する実験から得たデータを示す棒グラフである(実施例４を参照されたい)。帯不含卵を、rechＳＬＬＰ１タンパク質の提示濃度とプレインキュベートし、次いで受精能を獲得したマウス精子と授精した。全ての場合で、血清または組換えタンパク質は、配偶子相互作用の間存在していた。卵細胞を処理し、精子結合について分析した。データは、３つの異なる実験からの平均±ＳＥを示す。（＊）Ｐ＜０.０５、（＊＊）Ｐ＜０.０１(スチューデントＴ検定）。コントロール：前免疫血清または非タンパク質またはreceＰＡＤ(細胞質性卵細胞タンパク質)。
【０１２２】
【図６】図６は、ヒト組換えＳＬＬＰ１のマウス精子-卵細胞結合に対する効果を試験する実験から得たデータを示す棒グラフである(実施例４を参照されたい)。帯不含マウスの卵細胞を、recmＳＬＬＰ１タンパク質の提示された濃度とプレインキュベートし、次いで受精能を獲得したマウス精子と授精された。全ての場合で、血清または組換えタンパク質は、配偶子相互作用の間存在していた。卵細胞を処理し、精子融合について分析した。データは、３つの異なる実験からの平均±ＳＥを示す。（＊）Ｐ＜０.０５、（＊＊）Ｐ＜０.０１(スチューデントＴ検定）。コントロール：前免疫血清または非タンパク質またはreceＰＡＤ(細胞質性卵細胞タンパク質)。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月15日(2005.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006518193000001.app
【国際調査報告】
2006518193.tif 000025