(57)【要約】【課題】調節性ジンクフィンガータンパク質の提供。【解決手段】内因性遺伝子を調節できるキメラジンクフィンガータンパク質が開示されている。そのようなタンパク質の例は、VEGF-A発現を調節できるタンパク質を含む。前記タンパク質とそれをコードする核酸は血管生成を調節するために使用され得る。
2006508675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドであって、
前記ＤＮＡ結合ドメインがＶＥＧＦ遺伝子内の特定部位に結合でき、
少なくとも２つのジンクフィンガードメインが各々表１、表２、表３、または表４、あるいは表５の第２列に記載された個別ジンクフィンガードメインモチーフから選ばれることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
前記ジンクフィンガードメインが各々表１または表３の第２列に記載された個別ジンクフィンガードメインモチーフを含むことを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ジンクフィンガードメインが表１または表３の第３列に記載されたジンクフィンガードメインからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合ドメインがＮ−末端でＣ−末端方向に第１、第２および第３のジンクフィンガードメインを含み、ここで
（１）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＸ１Ｒであり、ここでＸ１はＨまたはＮであるか；  
（２）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＸ２、第２のジンクフィンガードメインではＲＸ３ＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴであり、ここでＸ２はＴまたはＶであり、Ｘ３はＳまたはＤであるか；  
（３）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＶＳＮＶであるか；  
（４）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＤＥＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲ、第３のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴであるか；    
（５）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＮＲであるか；
（６）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＮＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴであるか；  
（７）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＮＲであるか；    
（８）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲであるか；  
（９）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第２のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＤＥＲであるか；
（１０）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＮＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲであるか；    
（１１）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲであるか；    
（１２）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第２のジンクフィンガードメインではＷＳＮＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲであるか；  
（１３）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＷＳＮＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＷＳＮＲであることを特徴とする請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ジンクフィンガードメインが表２、表４または表５の第３列に記載されたジンクフィンガードメインからなる群から選ばれることを特徴とする請求項２記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦ遺伝子がヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインまたはタンパク質伝達ドメイン（protein transduction domain）をさらに含むことを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記転写活性化ドメインがｐ６５またはＶＰ１６活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記転写抑制ドメインがＫｉｄまたはＫＯＸ抑制ドメインを含むことを特徴とする請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記タンパク質伝達ドメインがＴＡＴタンパク質、ＶＰ２２タンパク質、またはアンテナペディアホメオドメイン（Antennapedia homeodomain）の一部であることを特徴とする請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１３】
請求項８記載のポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１２記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１記載のポリペプチドを含む変形された哺乳動物細胞。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが細胞内で請求項１４記載の核酸から産生されることを特徴とする請求項１４記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１記載のポリペプチド、請求項１２記載の核酸または請求項１４記載の変形された哺乳動物細胞、および薬剤学的に許容可能な担体を含む、新生物疾患、炎症性疾患または血管生成−基盤疾患の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１７】
前記新生物疾患が癌であることを特徴とする請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドに含まれたジンクフィンガードメインが表１または表３の第３列に記載されたジンクフィンガードメインからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがＮ−末端でＣ−末端方向に第１、第２および第３のジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合ドメインを含み、ここで、
（１）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＸ１Ｒであり、ここでＸ１はＨまたはＮであるか；  
（２）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＸ２、第２のジンクフィンガードメインではＲＸ３ＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴであり、ここでＸ２はＴまたはＶであり、Ｘ３はＳまたはＤであるか；  
（３）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＶＳＮＶであるか；
（４）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＤＥＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲ、第３のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴであるか；    
（５）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＮＲであるか；    
（６）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＮＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴであるか；    
（７）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＤＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＮＲであるか；    
（８）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲであるか；
（９）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第２のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＤＥＲであるか；
（１０）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＮＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲであるか；
（１１）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第２のジンクフィンガードメインではＱＳＳＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲであるか；    
（１２）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＱＳＨＴ、第２のジンクフィンガードメインではＷＳＮＲ、第３のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲであるか；
（１３）−１、２、３および６位置のＤＮＡ接触残基が、第１のジンクフィンガードメインではＷＳＮＲ、第２のジンクフィンガードメインではＲＳＨＲ、第３のジンクフィンガードメインではＷＳＮＲであることを特徴とする請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
１０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質に対して透過性である生体適合性物質からなるカプセル化層（encapsulation layer）、および分泌因子の産生を調節するキメラジンクフィンガータンパク質をコードする配列を含む核酸を含有する組換え哺乳動物細胞を含む、カプセル化された組成物。
【請求項２１】
前記分泌因子がインシュリン、インシュリン−類似成長因子、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、インターフェロン、インターロイキン、または繊維芽細胞成長因子であることを特徴とするカプセル化された請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１記載のポリペプチドまたは請求項１２記載の核酸を細胞に導入することを含む、ＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが転写活性化ドメインを含み、細胞においてＶＥＧＦ遺伝子の発現が増加することを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが転写抑制ドメインを含み、細胞においてＶＥＧＦ遺伝子の発現が減少することを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記ＶＥＧＦ遺伝子がヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。  
【請求項２６】
前記細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１６記載の組成物を、血管生成を減少させるのに効果的な量で対象（subject）に投与することを含む、対象の血管生成を調節する方法。
【請求項２９】
前記対象が癌を患っているか、患うと推測されるヒトであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子のようなＤＮＡ結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの遺伝子は、通常プロモーターまたはエンハンサー領域内にある該遺伝子内の特定のＤＮＡ部位に結合するポリペプチド転写因子による転写水準で調節される。これらのタンパク質は、プロモーター部位でＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を活性化または抑制することによって標的遺伝子の発現を調節する。活性化因子（activator）または抑制因子（repressor）であるかにかかわらず多くの転写因子は、構造的な特性を有するモジュール（module）を有する。そのようなモジュールは、構造的に独特なドメインとしてフォールディングが可能であり、ＤＮＡ結合、二量化（dimerization）または転写機構（transcriptional machinery）との相互作用のような特定の機能を有する。活性化ドメインまたは抑制ドメインのようなエフェクター（effector）ドメインは、異種転写因子のＤＮＡ−結合ドメインに連結されてもその機能を維持する（BrentおよびPtashne, (1985) Cell 43:729-36; Dawson et al., (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31）。このようなジンクフィンガードメイン（zinc finger domain）、ホメオドメイン（homeodomain）およびヘリックス・ターン・ヘリックス（helix-turn-helix）ドメインを含む多くのＤＮＡ−結合ドメインの３次構造はＮＭＲおよびＸ−線結晶データを用いて決定し得る。
【０００３】
ジンクフィンガードメインはモジュール機能を有する構造ドメインの一つのタイプである。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰｓ）は転写を調節するために使用され得る。たとえば、キム（Kim）とパボ（Pabo）は、Ｚｉｆ２６８タンパク質が標的遺伝子の転写開始部位近くに結合してＶＰ１６によって活性化された標的遺伝子の転写を効果的に抑制すると報告している（Kim and Pabo (1997) J Biol Chem 272:29795-29800）。リュ（Liu）らは、部位−特異的突然変異によって製造された加工ジンクフィンガータンパク質を用いたＶＥＧＦ−Ａの活性化について報告している（Liu et al. (2001). J. Biol. Chem. 276, 11323-11334）。
【非特許文献１】BrentおよびPtashne著、１９８５年発行、Cell 43:729-36
【非特許文献２】Dawsonら著、１９９５年発行、Mol. Cell Biol. 15:6923-31
【非特許文献３】KimおよびPabo著、１９９７年発行、J Biol Chem 272:29795-29800
【非特許文献４】Liuら著、２００１年発行、J. Biol. Chem. 276, 11323-11334
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
関連する出願の相互参照
本出願は、２００２年１２月９日に出願された米国出願第６０／４３１，８９２号を優先権として主張し、その内容は本明細書に参照として含まれる。
【０００５】
一つの態様において、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインを含み、真核生物細胞のような細胞内で遺伝子の発現を調節できるポリペプチドを提供する。一つの実施形態において、ポリペプチドは遺伝子内の標的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡ結合ドメインは典型的に少なくとも３つのジンクフィンガードメインを含む。
【０００６】
一つの実施形態において、少なくとも１つ、２つ、または３つのジンクフィンガードメインは天然型ジンクフィンガードメインである。たとえば、該ドメインは他の天然型タンパク質のジンクフィンガードメインと同一であるか、天然型タンパク質に由来する隣接しないジンクフィンガードメインと同一であり得る。すべてのジンクフィンガードメインは天然型であり得る。
【０００７】
他の実施形態において、少なくとも１つ、２つ、または３つのジンクフィンガードメインは天然型ジンクフィンガードメインの変異体、たとえば、一つ〜４つ、或いは２つ〜５つのアミノ酸残基が異なるドメインであり得る。前記ポリペプチドは天然型ジンクフィンガードメインおよび変異ドメインの組合せを含み得る。
【０００８】
前記ポリペプチドは任意の遺伝子を調節できる。このような調節はポリペプチドが標的遺伝子内の標的部位と相互作用する場合のように直接的である。たとえば、遺伝子は細胞内の内因性遺伝子（例：天然型遺伝体内の遺伝子）、異種遺伝子（例：転移遺伝子）またはウイルス性遺伝子であり得る。一つの実施形態において、内因性遺伝子は分泌されるポリペプチド、または分泌性ポリペプチドの産生に関与するか、産生を調節するポリペプチドなどを分泌する因子をコードする。一つの実施形態において、前記内因性遺伝子は細胞増殖、細胞移動、または組織形態形成（たとえば、血管形成）を調節する。
【０００９】
一つの実施形態において、前記内因性遺伝子はホルモン産生、ホルモンまたは成長因子を調節するポリペプチドをコードし、例示的な成長因子は成長因子のＶＥＧＦファミリー（family）である。
【００１０】
ＶＥＧＦ−Ａは前記ファミリーの一員である。一つの実施形態において、ポリペプチドはＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の調節部位内の標的部位、たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の−９５０〜＋４５０の間に位置する部位を認識する。たとえば、ポリペプチドはヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターの−６８０，−６７７，−６７１，−６６８，−６６５，−６３３Ｒ，−６３２Ｒ，−６３１，−６３０，−６０６，−６０３，−５５４，−５３６，−４９５，−４７５，−４６８，−４６５，−４６２，−４５５，−３９５Ｒ，−３９４Ｒ，−３９３Ｒ，−３９２，−３９１Ｒ，−３８５Ｒ，−３８２Ｒ，−３５８Ｒ，−３１４Ｒ，−２８２，−２０６，−２０３，−１８４，−１８１，−１３７，−１２４，−９０Ｒ，−８５，−３０，７７，２４４Ｒ，２８３Ｒ，３４２，３５７，３６６，４３４，４３５，或いは４７４Ｒ付近、または前記部位において６０，５０，２０，１０，５，または３ヌクレオチド内の部位を認識できる。前記ヌクレオチド位置は文字「Ｒ」が添付されていない場合、プロモーターの順方向ストランド上の転写開始部位から５’末端のヌクレオチドの位置を示す。一方、「Ｒ」で標識された場合、位置の番号は逆方向ストランド上で５’末端のヌクレオチドの位置を表示する。たとえば、Ｆ４３５（−９０Ｒ）の標的配列は逆方向ストランド上で５’：−９０〜３’：−９８である（順方向ストランドの転写開始部位からは５’：−９８〜３’：−９０位置である）。一つの実施形態において、前記ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の標的部位に結合するために、本明細書内に記載された配列を有するポリペプチドと競争する。  
また、一つの実施形態において、内因性遺伝子の調節領域にある標的部位はＤＮａｓｅ敏感部位と重なるか、内因性転写因子の結合部位と重なる。他の実施形態においては、標的部位はこのような部位または領域から７００，５００，３００，２００，５０，２０，１０，５，または３塩基対の距離内にある。更に他の一つの実施形態においては、前記ポリペプチドは標的部位に２０，７，５，３，２，１，０．５，または０．０５ｎＭ以下の解離定数で結合する。
【００１１】
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは細胞内にあるとき、前記内因性遺伝子の転写を１．２５，１．５，１．７，１．９，２．０，２．５，５，１０，２０，５０，または１００倍以上変化（たとえば、抑制または活性化）させ得る。
【００１２】
一つの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは表１、表２、表３、表４、または表５の単一列に列挙される少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含むか、表１、表２、表３、表４、または表５の単一列に列挙される２つのジンクフィンガードメインと同じＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む。
【００１３】
ポリペプチドは転写活性化または抑制ドメインをさらに含み得る。ポリペプチドはさらに細胞伝達（transduction）ドメイン、たとえば、ＨＩＶ  ｔａｔ伝達ドメインを含み得る。
【００１４】
また別の実施形態において、前記ポリペプチドは、哺乳動物細胞において低酸素条件によって誘導されたＶＥＧＦ−Ａ産生を抑制する。前記抑制は、たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ水準がポリペプチドを含まないという相違点のみを有する同一細胞において低酸素条件によって誘導されたタンパク質水準の８０，７０，６０，５０，４０，３０，２０，１０，５，３，２，１、または０．１％以下になるようにする。
【００１５】
本発明はまた、本明細書内に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸およびその核酸を含む細胞（たとえば、原核細胞、真核細胞、たとえば、哺乳動物細胞）を提供する。該細胞は前記核酸を発現し、目標ポリペプチドを産生する。また一つの実施形態において、前記細胞はインビトロ（in vitro）で培養される。この細胞は免疫−分離されるか、カプセル化され得る。本発明は、また、前記ポリペプチドを産生し、そのポリペプチドによって内因性遺伝子が調節される細胞を含む生物体を提供する。
【００１６】
更に他の態様において、本発明は、少なくとも３つのジンクフィンガードメインを含む人工ポリペプチドをコードするコーディング核酸を含む細胞を提供する方法において：前記ポリペプチドが内因性遺伝子の標的ＤＮＡ部位に結合する段階；および人工ポリペプチドが産生され、標的ＤＮＡ部位に結合し、内因性遺伝子を調節する条件下で細胞内でコーディング核酸を発現させる段階を含むものを提供する。一つの実施形態において、前記ジンクフィンガードメインの少なくとも２つは天然型ジンクフィンガードメインである。たとえば、２つのジンクフィンガードメインは異なる天然型タンパク質のジンクフィンガードメインと同じであり得るか、同じ天然型タンパク質と隣り合わせにならないジンクフィンガードメインであり得る。一つの実施形態において、前記人工ポリペプチドは転写活性化ドメイン、或いは転写抑制ドメインを含み、前記内因性遺伝子は抑制または活性化され得る。一つの実施形態において、前記細胞はこれを核酸伝達運搬体（vehicle）、たとえば、リポソーム、ウイルス、またはウイルス性粒子と接触させることによって利用できる。一つの実施形態において、前記細胞は生物体、たとえば、哺乳動物細胞である。前記方法は、発現前に対象生物体に細胞を導入するか、細胞をカプセル化し、対象生物体にカプセル化した細胞を導入することをさらに含み得る。
【００１７】
前記ポリペプチドの例は、少なくとも２つのジンクフィンガードメイン、下記表の特定列中の２つ、３つ、または４つのジンクフィンガードメインを含み得る。  
【表１】
2006508675.tif 000003
【表２】
2006508675.tif 000004
【表３】
2006508675.tif 000005
【表４】
2006508675.tif 000006
【表５】
2006508675.tif 000007
【００１８】
本発明の一つの態様においては、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドを提供する。このＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガードメインを有する。前記ポリペプチドは、細胞内でＶＥＧＦ−Ａの発現または産生を変化させ得る。たとえば、前記ポリペプチドは、細胞の正常な反応をＶＥＧＦ−Ａの産生または発現を増加または減少させる信号に変化させる。また一つの実施形態において、前記ポリペプチドはＶＥＧＦ−Ａの産生または発現が誘導される条件下で細胞内ＶＥＧＦ−Ａの産生または発現の誘導を抑制する。たとえば、前記抑制は、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質またはｍＲＮＡの量がポリペプチドを含まない同じ細胞で誘導される量に比べて８０，７０，６０，５０，４０，３０，２０，１０，５，３，２，１，または０．５％以下になり、更に一つの実施形態においては、前記条件に低酸素条件を含む。この条件は、たとえば、下記実施例に記載するように、特にヒト胚性腎細胞２９３Ｆにおいて決定される。
【００１９】
前記ポリペプチドは、たとえば、培養中であるヒト細胞でまたはヒトまたは非−ヒト哺乳動物のような生体内で非常に多様な用途に使用される。
【００２０】
一つの実施形態において、前記ポリペプチドはヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の部位に結合する。他の実施形態において、前記ポリペプチドは間接的に作用し、たとえば、他の遺伝子の部位に結合する。
【００２１】
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは抑制ドメインを含み、本明細書内に記載された他の特徴を含み得る。本発明はまた、前記ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
前記組成物は対象（subject）に投与され得る。たとえば、対象において血管生成を減少させるのに効果的な量で、たとえば、対象の患部（すなわち、新生組織）の付近に、または対象の全身に投与され得る。一つの実施形態において、対象は転移性癌を患っているか、患うと予測されるヒトである。
【００２３】
任意の提供された特定ポリペプチドに関連して、このポリペプチドは異種配列、核位置シグナル（nuclear localization signal）、小分子結合ドメイン（例：ステロイド結合ドメイン）、エピトープタグ（tag）または精製道具、触媒ドメイン（例：核酸修飾ドメイン、核酸切断ドメイン、またはＤＮＡ復旧触媒ドメイン）、転写機能ドメイン（例：活性化ドメイン、抑制ドメインなど）、タンパク質伝達（transduction）ドメイン（例：HIV tat由来）および／または調節部位（例：リン酸化部位、ユビキチネーション部位またはタンパク質分解酵素切断部位）などをさらに含み得る。
【００２４】
前記ポリペプチドは、一つ以上の追加的成分とともに医薬組成物に製剤化し得る。この組成物は前記ポリペプチドの他の物質を治療用使用法に基づいて含み得る。
【００２５】
前記ポリペプチドはビーズ、マトリックスまたは平面アレイなどの固体支持体に（共有または非共有結合で）結合され得、また、放射性化合物、蛍光化合物、他の感知可能な物質、または感知システムの成分（例：化学発光試薬）のような標識に結合され得る。
【００２６】
本発明は、前述したポリペプチドの一つをコードする配列を含む分離された核酸をまた含む。この核酸は作動可能に連結された調節配列、たとえば、プロモーター、転写エンハンサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ウイルスパッケージング配列、および／または選択マーカーなどをさらに含む。該核酸はレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスまたはアデノウイルスなど哺乳動物細胞を感染させ得るウイルスなどのウイルス内に包装され得る。
【００２７】
本発明は、前記ポリペプチドまたはそれをコードする配列を含む核酸を含有する細胞をさらに提供する。細胞は対象生物体の組織にあるか、培養体であり得る。細胞は動物細胞（例：哺乳動物細胞（例：ヒトまたは非−ヒト細胞））、植物細胞、または微生物細胞（例：菌類または細菌細胞）であり得る。細胞はポリペプチドを細胞或いは親細胞に導入するか、核酸を細胞や親細胞に導入して製造し得る。前記核酸は細胞内でポリペプチドを産生するために使用され得る。
【００２８】
本発明はまた、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、ウシ、ヤギまたはヒツジのようなヒトではない遺伝子導入（transgenic）哺乳動物をさらに含み得る。遺伝子導入哺乳動物の遺伝的補充物は、前述したか本明細書の他の個所で説明したキメラジンクフィンガーポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本発明はまた、たとえば、核酸を発現してポリペプチドを産生する方法および、たとえば、細胞内の内因性遺伝子またはウイルス遺伝子を調節するためにポリペプチドを用いる方法を含む。
【００２９】
本明細書においてＶＥＧＦ−Ａを調節する任意のポリペプチドに関連して、ポリペプチドは細胞内でＶＥＧＦ−Ａ発現を調節する方法に使用され得る。前記方法はポリペプチド或いはポリペプチドをコードする配列を含む核酸を細胞内に導入する方法を含む。たとえば、ポリペプチドはリポソームを用いてまたはタンパク質伝達ドメインと融合させることによって導入され得る。核酸はトランスフェクション（transfection）或いはウイルス性伝達によって導入され得る。
【００３０】
本発明は、組成物、たとえば、本明細書に記載されたようなＶＥＧＦ−Ａを調節するポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。一つの実施形態において、該ポリペプチドはＶＥＧＦ−Ａ発現を抑制でき、組成物は、たとえば、対象において血管生成を減少させるのに効果的な量で、たとえば、対象の患部（すなわち、新生組織）の付近に、または対象の全身に投与され得る。一つの実施形態において、対象は転移性癌を患っているか、患うと予測されるヒトである。
【００３１】
他の実施形態において、前記ポリペプチドはＶＥＧＦ−Ａの発現を増加させ、その組成物は対象において血管生成を増加させるのに効果的な量で対象に投与される。たとえば、増加された血管生成は血管形成、胚発生、体細胞成長、神経系の分化、妊娠の保持、傷の治癒などに必要であることがある。血管生成因子（ＶＥＧＦ−Ａ）は内皮細胞に特異的に作用する成長因子中の一つであり、内皮細胞の成長と分化を調節する主要因子である。
【００３２】
ＶＥＧＦ或いはその異形体（isoform）であるＶＥＧＦ１６４とＶＥＧＦ１８８が十分ではない場合、生後血管形成、貧血性心臓疾患が誘発される。ＶＥＧＦ−Ａの活性化は末梢動脈および冠状動脈疾患の治療または予防に使用され得る。たとえば、対象は傷（内部、外部）、妊娠、神経性異常、胚分化異常、心血管疾患（たとえば、虚血性心臓疾患、末梢動脈疾患、冠状動脈疾患）などの症状を有するヒトであり得る。
【００３３】
少なくとも５種のＶＥＧＦ−Ａタンパク質の異形体が、異なるスプライス変異体（splice variants）から産生される。これらの異形体は血管生成において異なる効能を有する。本明細書に記載されたタンパク質のようなジンクフィンガータンパク質によるＶＥＧＦ−Ａの活性化は、実施するにおいて好ましい臨床結果を得るために重要なスプライス変異体（全体または特定の）の上昇調節を可能にする。たとえば、前記ジンクフィンガータンパク質はすべてのスプライス変異体の発現を調節するか、またはスプライス変異体の一つのサブセット、たとえば、少なくとも一つのスプライス変異体の発現を調節し得る。
【００３４】
他の態様において、本発明は、生体適合性物質からなるカプセル化層を含むカプセル化された組成物と、細胞因子、たとえば、分泌性因子、または細胞質タンパク質のような非分泌性因子の産生を調節するキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を含む組換え哺乳動物細胞を提供する。一つの実施形態において、生体適合性物質は１０、２０、３０、または４０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質を透過させるものである。生体適合性物質は５０、１００、１２０、または２００ｋＤａ以上の大きいタンパク質を保持できる。
【００３５】
本発明は、キメラタンパク質（たとえば、転写因子）を確認し、製造できる迅速かつ調節可能な細胞に基づく方法を提供する。このような転写因子は、たとえば、生医学的および生物工学的応用において内因性遺伝子の発現を変化させるために使用され得る。転写因子の活性はインビボで培養細胞、すなわち、生きている培養細胞で測定され得る。
【００３６】
他の態様において、本発明は、本明細書で説明するジンクフィンガータンパク質のようなキメラジンクフィンガータンパク質の特徴を究明する（characterizing）方法を特徴とする。この方法は次を含む：タンパク質をコードする核酸を細胞内に導入する段階；核酸の発現段階；および標的遺伝子の発現を評価する段階。たとえば、該測定は細胞内で内因性遺伝子の発現プロファイルを分析することを含み得る。このような発現プロファイルは複数の値を含むが、各値は異なる遺伝子、または一つの遺伝子のスプライス変異体または対立遺伝子（allelic）変異体の発現（すなわち、ｍＲＮＡ水準）や翻訳産物の量（すなわち、タンパク質水準）に対応する。その値は遺伝子の発現水準または遺伝子の翻訳産物の定性的または定量的尺度になり得、すなわち、１）遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、または２）遺伝子からコードされたポリペプチドの量の尺度であり得る。
【００３７】
また他の態様において、本発明は、特定の標的部位に結合できるキメラジンクフィンガータンパク質を確認する方法を提供する。この方法は次の段階を含む：天然型ヒトジンクフィンガードメイン（例：ヒトジンクフィンガードメイン）に対する識別子（identifier）を、その識別子によって対照されるジンクフィンガードメインによって認識される３−または４−塩基対の下位部位（subsite）と連結させる各記録を含む資料記録の提供段階；標的部位を少なくとも２つの３−または４−塩基対の下位部位に分解する段階；各下位部位に対してそれを認識するジンクフィンガードメインに対する識別子を含む一つのセットの識別子を資料記録から検索する段階；および、各下位部位に対するセットから識別子によって対照される、各下位部位に対するジンクフィンガードメインを含むポリペプチドの考案段階。
【００３８】
資料記録は標的ジンクフィンガードメインを確認する記録を含み得る。前記方法はインビトロ（in vitro）でポリペプチドをコードする核酸の合成および／またはポリペプチドの合成段階をさらに含み得る。この方法はまた、たとえば、インビトロ結合分析またはレポーター遺伝子発現に対する分析のようなインビボ（in vivo）分析を用いて標的部位に対するポリペプチドの結合を評価する段階を含み得る。合成されたポリペプチドは抑制または活性化ドメインをさらに含み得る。
【００３９】
一つの実施形態において、前記方法は一つ以上の内因性遺伝子の発現を変更させるポリペプチドの能力を評価することをさらに含む。前記評価は、たとえば、核酸マイクロアレイを用いて複数の内因性遺伝子、または単一または限定された数の遺伝子の発現を調査することを含み得る。この方法はまた、たとえば、インビトロでポリペプチドを標的部位を含むＤＮＡと接触させることをさらに含み得る。
【００４０】
他の態様において、この方法は第１および第２のジンクフィンガードメインをコードする配列を含む各核酸を含むアドレス（address）指定された核酸ライブラリーからポリペプチドをコードする核酸を検索することをさらに含む。
【００４１】
他の態様において、本発明は、特定のポリペプチドと単離された核酸とを提供する。本発明のポリペプチドは、たとえば、１個、２個、３個、あるいは４個のジンクフィンガードメインを含み得、本明細書に提示された特定のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと関わりがある。たとえば、前記ポリペプチドは、１個、２個、３個、あるいは４個以上のジンクフィンガードメインにおいて参照ポリペプチドの各々のジンクフィンガードメイン内のＤＮＡ−接触残基と同じＤＮＡ−接触残基を有し得る。他の例として、ポリペプチドの３つのジンクフィンガードメインにおいて、ＤＮＡ接触残基（３ｘ４）の少なくとも９個、１０個、あるいは１１個は参照ポリペプチド内の各ジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基と同じである。他の例として、ポリペプチドの４個のジンクフィンガードメインにおいて、ＤＮＡ接触残基（４ｘ４）の少なくとも１２個、１３個、１４個、あるいは１５個は参照ポリペプチド内の各ジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基と同じである。ポリペプチドは参照ポリペプチドと同じ位置に結合して同じ内因性遺伝子を、たとえば、参照ポリペプチドに比べて０．１〜１０倍または０．５〜１．５倍の活性で調節し得る。
【００４２】
一つの実施形態において、一つ以上（または全部）のジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は天然型配列である。一つの実施形態において、ポリペプチドは標的遺伝子、たとえば、細胞の内因性遺伝子、たとえば、参照ポリペプチドと同じ標的遺伝子、たとえば、ＶＥＧＦ−Ａを調節し得る。
【００４３】
さらに、本発明の精製されたポリペプチドは本明細書に記載されたジンクフィンガードメインと５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９３％，９５％，９６％，９８％，９９％以上、または１００％同一なアミノ酸配列を有し得る。前記ポリペプチドはポリペプチドのＤＮＡ接触残基に該当するアミノ酸位置が本明細書内に記載されたジンクフィンガードメインと同一であり得る。これとは異なり、ポリペプチドはポリペプチドのＤＮＡ接触残基に該当する少なくとも一つの残基が本明細書に記載されたジンクフィンガードメインと異なる。たとえば、ポリペプチド内の一つ以上のジンクフィンガードメインはＤＮＡ接触残基上の保存的な置換を含む。
【００４４】
ポリペプチドは少なくとも１個、２個、または３個の残基、たとえば、ＤＮＡ接触残基以外の残基において異なり得る。たとえば、与えられたジンクフィンガードメイン内で、ポリペプチドは前記で参照された配列と一個、２個、３個または４個のアミノ酸が異なり得る。相違点は、本明細書で定義した保存的置換に起因し得る。一つの実施形態において、前述の参照配列と関連するアミノ酸の差異は、亜鉛と配位結合する二番目のシステイン（cystein）と−１位置のＤＮＡ接触部位（後述するＤＮＡ接触部位のナンバリングシステムを参照）との間に位置する。
【００４５】
配列の比較および２つの配列間の同一性の百分率の決定は数学的アルゴリズムを用いて求め得る。特に、２つのアミノ酸配列の間の同一性の百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに含まれているニードルマン（Needleman）とヴンシュ（Wunsch）（(1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453）のアルゴリズムを用いて、１２ギャップペナルティ（gap penalty）、４ギャップ延長ペナルティ（gap extend penalty）および、５フレームシフトギャップペナルティ（frame shift gap penalty）を適用するブロッサム６２スコアリングマトリックス（Blossum 62 scoring matrix）を用いて計算され得る。
【００４６】
前記精製されたポリペプチドは次から選ばれる一つ以上を含み得る：異種ＤＮＡ結合ドメイン、核位置信号、小分子結合ドメイン（例：ステロイド結合ドメイン）、エピトープタグ（epitope tag）または精製道具、触媒ドメイン（たとえば、核酸修飾ドメイン（nucleic acid modifying domain）、核酸切断ドメイン（nucleic acid cleavage domain）、および／またはＤＮＡ復旧触媒ドメイン（DNA repair catalytic domain)）、転写機能ドメイン（たとえば、活性化ドメイン、抑制ドメインなど）。一つの実施形態において、ポリペプチドは第２のジンクフィンガードメイン、たとえば、本明細書に記載された配列を有するドメインをさらに含む。たとえば、ポリペプチドは少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガーのアレイを含み得る。一つの実施形態において、一つ以上のドメイン（例：各ドメイン）は本明細書に記載されたモチーフ、たとえば、ｍＣＳＮＲ，ｍＤＳＡＲ，ｍＤＳＣＲ，ｍＩＳＮＲ，ｍＱＦＮＲ，ｍＱＳＨＶ，ｍＱＳＮＩ，ｍＱＳＮＫ，ｍＱＳＮＲ，ｍＱＳＮＶ，ｍＱＳＳＲ，ｍＱＴＨＱ，ｍＱＴＨＲ，ｍＲＤＥＲ，ｍＲＤＨＴ，ｍＲＤＫＲ，ｍＲＳＨＲ，ｍＲＳＮＲ，ｍＶＳＮＶ，ｍＶＳＳＲ，ｍＶＳＴＲ，ｍＷＳＮＲ，ｍＤＧＮＶ，ｍＤＳＮＲ，およびｍＲＤＮＱによる配列を有し得る。さらに、各ドメインは本明細書に提供された配列を有し得る。以下に記載するように、小文字「ｍ」は、前記に並べられている４つのアミノ酸がＤＮＡ接触残基のモチーフを表示するということを意味する。
【００４７】
本発明の核酸は前述のポリペプチドをコードする核酸を含む。本発明の核酸は異種核酸配列、たとえば、誘導性プロモーター（ステロイドホルモン誘導性プロモーター、小分子調節プロモーター、テトラサイクリンＴｅｔ−ＯｎまたはＴｅｔ−Ｏｆｆシステムのような工学処理された誘導システム）によって作動可能に調節され得る。一つの実施形態において、プロモーターは哺乳動物細胞で誘導され得る。
【００４８】
本明細書に記載されているように、ポリペプチドは細胞内で産生され得、細胞内で各ジンクフィンガードメインが認識する下位部位を含む標的部位に結合して遺伝子、たとえば、内因性遺伝子を調節し得る。前記細胞は哺乳動物細胞であり得る。
【００４９】
本発明は、異種核酸結合ドメインと融合された、本明細書に記載されたポリペプチドを発現する方法をさらに含む。前記方法は細胞に前記融合タンパク質をコードする核酸を導入することを含む。
【００５０】
他の態様において、本発明は、カプセル化された組成物を提供する。前記組成物は生体適合性物質からなるカプセル化層と組換え哺乳動物細胞を含む。前記細胞は細胞内で他の核酸、たとえば、異種核酸または内因性核酸の産生を調節する異種ジンクフィンガータンパク質をコードする配列を含む核酸を含む。たとえば、細胞は分泌性ポリペプチドをコードするか、分泌性因子、たとえば、分泌性ポリペプチドの産生を調節するか、産生に関与する遺伝子を調節し得る。一つの実施形態において、分泌性ポリペプチドはインシュリン、インシュリン−類似成長因子、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦ、インターフェロン、インターロイキン、または繊維芽細胞成長因子である。
【００５１】
カプセル化層は典型的に少なくとも分子量１０ｋＤａを有するタンパク質、たとえば、分子量が約１０，２０，３０，４０，５０，または７０ｋＤａのタンパク質を透過させる。前記カプセル化層は前記分子量よりも大きい、たとえば、１００ｋＤａ以上のタンパク質に対して非透過性であり得る。追加のカプセル化層が存在し得る。キメラジンクフィンガータンパク質は本明細書に記載された一つ以上の特徴を含み得る。  
「ジンクフィンガータンパク質」という用語は、ジンクフィンガードメインを含むすべてのタンパク質を指す。タンパク質は一つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。例示的なジンクフィンガータンパク質は２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含む。典型的に前記タンパク質は単一鎖である。しかし、いくつかの例において、タンパク質は複数のポリペプチド鎖を含み得る。たとえば、前記タンパク質は異種二量体（heterodimeric）または同種二量体（homodimeric）タンパク質であり得る。
【００５２】
「塩基接触位置」、「ＤＮＡ接触位置」、または「核酸接触位置」という用語は、Ｚｉｆ２６８のアルギニン７３、アスパラギン酸７５、グルタミン酸７６、およびアルギニン７９の位置に構造的に対応するジンクフィンガードメインの四つのアミノ酸位置を指す。
【００５３】
Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser
1               5                  10                  15
Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys
20                  25                  30
Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His
35                  40                  45
Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys
50                  55                  60
Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His
65                  70                  75                  80
Thr Lys Ile His Leu Arg Gln Lys Asp   (配列番号：129)
85
【００５４】
これらの位置はまた、−１，２，３，および６番位置として称されることもある。検索配列内で塩基接触位置に相応する位置を同定するためには、検索配列のシステインおよびヒスチジン残基がＺｉｆ２６８のフィンガー３のシステインおよびヒスチジン残基と整列されるように検索配列を関心ジンクフィンガードメインと整列させる。ヨーロッパ生物情報研究所（European Bioinformatics Institute）のClustalW WWWサービス（http://www2.ebi.ac.uk/clustalw; Thompson et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680）は簡便な配列整列方法を提供する。
【００５５】
保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）とは類似する側鎖を有する残基の相互交換可能性を言う。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループはセリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖を有するアミノ酸グループはアスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトパン；塩基性側鎖を有するアミノ酸グループはリジン、アルギニンおよびヒスチジン；酸性側鎖を有するアミノ酸グループはアスパラギン酸およびグルタミン酸；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸グループはシステインおよびメチオニンである。状況によって、同じグループ内のアミノ酸を相互交換できる。いくつかの追加の保存的アミノ酸置換グループは次の通りである：バリン−ロイシン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジン−アルギニン；アラニン−バリン；アスパラギン酸−グルタミン酸；およびアスパラギン−グルタミン。
【００５６】
「異種（heterologous）ポリペプチド」という用語は非−天然型配列を有するポリペプチド（例：ハイブリッドポリペプチド）、または天然型ポリペプチドと同一であるが、自然的には存在しない方式で存在する配列を有するポリペプチドを指す。たとえば、自然的には互いに融合していない２つの天然型ポリペプチドの融合は一つのポリペプチドが相手に対して異種であるポリペプチドを作るようになる。
【００５７】
「ハイブリッド」という用語は、（ｉ）２つ以上の異なる天然型配列；（ii）一つ以上の人工配列（すなわち、非−天然型配列）および一つ以上の天然型配列；または（iii）２つ以上の人工配列（同一または相異）のいずれかから由来するアミノ酸配列を含有する非−天然型ポリペプチドを指す。人工配列の例としては、天然型配列の突然変異および新たに設計された配列がある。
【００５８】
本明細書で用いられる「厳しい条件下のハイブリッド化」という用語は、４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリッド化し、次いで６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２回洗浄する条件を指す。本発明は、厳しい条件下で核酸を本明細書に記載された核酸、または本明細書に記載されたポリペプチドをコードする核酸とハイブリッド化することをまた提供する。
【００５９】
「結合選好度（binding preference）」という用語は、ポリペプチドが他の結合部位に比べて一つの核酸結合部位を選択する識別力を指す。たとえば、２つの異なる核酸結合部位に対してポリペプチド量が制限的である場合、本明細書に記述されたインビボまたはインビトロ分析法において他の部位に比べて選好される部位により多量のポリペプチドが結合することになる。
【００６０】
本明細書に用いられる「解離定数（dissociation constant）」という用語は、関心対象の標的部位に結合するタンパク質（例：ジンクフィンガータンパク質）の平衡（equilibrium）解離定数を指す。９〜１８塩基対の標的部位を認識するジンクフィンガータンパク質の場合において、結合は２８塩基対の二本鎖ＤＮＡと関連して評価される。解離定数は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、１０％グリセロール、０．１％ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（bovine serum albumin）、室温の条件下で結合する精製されたタンパク質を用いたゲル移動分析（gel shift analysis）によって決定される。詳細は、実施例１およびレバーとパボの論文（Rebar and Pabo(1994) Science 263:671-673）に提供されている。解離定数は１０−６、１０−７、１０−８または１０−９Ｍ以下であり得る。
【００６１】
一つのポリペプチド（「競争ポリペプチド」）は他の（「関心ポリペプチド」）と結合部位に結合するために「競争」をする。標的部位を有するプローブ分子を用いたインビトロ実験において競争ポリペプチドが関心ポリペプチドの濃度の１０倍以内であれば、関心ポリペプチドによって結合したプローブ分子の数は２５％以上減少する。これはプローブ分子に対する関心ポリペプチドのＫｄ値の約５０倍で行われた実験の結果である。
【００６２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２とある与えられたジンクフィンガードメインを含むキメラタンパク質がＺｉｆ２６８のフィンガー１および２が認識する５’−ＧＧＧＣＧ−３’の５−塩基対配列と与えられた３−塩基対のＤＮＡ部位をいずれも含む標的部位に５ｎＭ以下の親和度を有する場合、与えられたジンクフィンガードメインは与えられた３−塩基対のＤＮＡ部位に「特異的に結合する」と言える。「認識する」と「特異的に結合する」という用語は相互交換的に用いられ、前記Ｚｉｆ２６８融合分析においてジンクフィンガードメインによる結合部位（binding site）の区別を意味する。
【００６３】
本明細書で用いられる「縮退オリゴヌクレオチド」とは、（ａ）各々特定のアミノ酸配列をコードする異なるオリゴヌクレオチドの集団、および（ｂ）一つ以上の配列に結合し得る単一種のオリゴヌクレオチド、たとえば、イノシンのような非天然型ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの両方を意味する。
【００６４】
「分離された組成物」とは、細胞試料または反応混合物の少なくとも一つの成分を少なくとも９０％除去して得られた組成物を意味する。人工的にまたは自然的に生産された組成物は関心種（species）の種または集団が重量基準で少なくとも５，１０，２５，５０，７５，８０，９０，９２，９５，９８または９９％純粋すれば特定の純度「以上の組成物」であり得る。本明細書に記載されたあるタンパク質または核酸組成物も分離された形態で提供され得る。
【００６５】
ジンクフィンガードメインを用いることは特に有利である。第一に、ジンクフィンガー構築物は非常に多種のＤＮＡ配列を認識できるが、任意の特定のジンクフィンガーは特定の配列に高度の特異性を有し得る。第二に、天然型ジンクフィンガータンパク質の構造はモジュール的である。たとえば、「Ｅｇｒ−１」とも呼ばれるＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質は３つのジンクフィンガードメインが並んで整列されて構成される。パブレティチとパボは、ジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８の断片のＸ線結晶構造を発表した（Pavletich and Pabo (1991) Science 252: 809-817）。この構造において３つのＺｉｆ２６８フィンガーはＤＮＡと結合している。各フィンガーは独立してＤＮＡ認識部位の３−４塩基対と接触する。同じポリペプチド鎖中で多数個のジンクフィンガーモジュールが協同効果を発揮することによって高親和度の結合が達成される。
【００６６】
本発明は、ヒトゲノムをはじめとする他のすべてのゲノムに存在するすべてのジンクフィンガードメインに対して規定している。ジンクフィンガーは永い間にわたって進化してきたため、ゲノム上に存在するジンクフィンガーを確保することが非常に有利である。さらに、宿主種に由来するドメインを使用する場合、本明細書に記述されている遺伝子治療用ジンクフィンガータンパク質を製造したとき、ホストによる免疫作用の可能性を低めることができる。もちろんヒトまたは哺乳動物のジンクフィンガードメインの変種や完全に人工的なジンクフィンガードメインのような非−天然型ジンクフィンガードメインを使用することも可能である。
【００６７】
特定の配列を認知するＤＮＡ結合ドメインを選択できれば、細胞内の内因性遺伝子のような標的遺伝子を特異的に調節する新規タンパク質を考案できる。多くの例において、このようなタンパク質は治療用または産業用に活用できる。また、他の応用も可能である。
【００６８】
本発明はまた、特定例を用いてジンクフィンガータンパク質が癌に対する治療剤として使用され得ることを立証する複数の実施形態を含む。一つの実施形態においては、ジンクフィンガータンパク質がＶＥＧＦ−Ａ発現の強力な抑制因子として作用する。ＶＥＧＦ−Ａは腫瘍組織の血管生成に主な役割を果すため、ＶＥＧＦ−Ａを調節（例：抑制）するジンクフィンガータンパク質は、たとえば、腫瘍の周りや腫瘍内部の血管生成を減少させるために使用され得る。
【００６９】
本明細書に言及されたすべての特許、特許出願、および参考文献はその全体が参照されて含まれる。次の特許出願、すなわち、ＷＯ０１／６０９７０（Kimら）；米国出願公開第２００２−００６１５１２号、第２００３−１６５９９７号、および第２００３−１９４７２７号と米国出願第１０／６６９，８６１号、第６０／４３１，８９２号、および第６０／４７７，４５９号はすべての目的で全体として含まれる。本発明の一つ以上の実施形態の具体的な内容は添付の図面および下記説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点はこの説明および図面、および前記請求項から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。少なくとも一つのジンクフィンガードメインを含むキメラジンクフィンガータンパク質は細胞内で遺伝子の発現を調節するために使用され得る。ジンクフィンガータンパク質は少なくとも２つの天然型ジンクフィンガードメインを含み得る。一組の例において、キメラジンクフィンガータンパク質は哺乳動物細胞においてＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節するために用いられる。  
キメラジンクフィンガータンパク質は様々な方法によって得られる。
【００７１】
一つの実施形態において、このタンパク質は標的ＤＮＡ部位を認識するように考案される。有用な標的部位は標的遺伝子の調節領域、または標的遺伝子の調節領域の１ｋｂまたは５００ｂｐ以内の部位を含む。たとえば、標的部位はＴＡＴＡボックスまたは遺伝子の転写開始部位から１ｋｂまたは５００ｂｐ以内に存在し得る。ジンクフィンガータンパク質を考案する一つの方法は標的部位を各ジンクフィンガードメインによって認識され得る３または４塩基対の配列に分けるものである。その後、分けられた要素に該当する連続的なジンクフィンガードメインを有するタンパク質をコードする配列を含む核酸構造体を製造する。候補タンパク質をコードする異なる複数の核酸構造体が作られ、宿主細胞で発現される。標的遺伝子の発現は標的遺伝子の発現を調節できる一つ以上の候補タンパク質を識別するために評価される。
【００７２】
他の実施形態において、キメラジンクフィンガータンパク質はジンクフィンガードメインのライブラリーから細胞内での表現形質に対する効果に基づいて選択される。たとえば、無作為キメラジンクフィンガードメインをコードする核酸のライブラリーを、培養された哺乳動物細胞に導入する。ライブラリーの核酸を細胞内で発現させる。細胞を関心のある表現形質に対して評価し、対照群と比較して表現形質が変化した細胞を分離する。このような細胞内のライブラリー核酸を回収し、このように回収された核酸によってコードされるジンクフィンガータンパク質をその特性を確認するか、使用するか、または変形する。
【００７３】
＜ジンクフィンガードメイン＞
ジンクフィンガードメインは約３０個のアミノ酸残基からなる小さいポリペプチドドメインであって、そのうち、システインまたはヒスチジンである４個のアミノ酸残基が適切に配置されて亜鉛イオンと配位結合ができる（たとえば、文献[Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12: 464-469 (1987); Evans and Hollenberg, (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett. 234: 245-250; Miller et al., (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:99-102;およびRosenfeld and Margalit, (1993) J. Biomol. Struct. Dyn. 11: 557-570]を参照）。したがって、ジンクフィンガードメインは亜鉛イオンと配位結合する残基の種類によって、たとえば、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２類、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ２類、Ｃｙｓ２−ＣｙｓＨｉｓ類などに分類できる。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーにおいて亜鉛と配位結合する残基は典型的に次のように配置されている：
C-X2-5-C-X3-Xa-X5-ψ-X2-H-X3-5-H, (配列番号：１２３）
ここで、Ψ（プサイ）は疎水性残基であり（Wolfe et al., (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 3:183-212）、「Ｘ」は任意のアミノ酸を示し、下付きはアミノ酸の個数を示し、ハイフンでつないだ２つの下付きは介入アミノ酸の典型的な範囲を示す。多くのジンクフィンガードメインにおいて、最初のシステインの前はフェニルアラニンまたはチロシンが位置し、その次にシステインではないアミノ酸が位置する。通常、介入するアミノ酸はフォールディングされてα−へリックスに対して充填される逆平行（anti-parallel）β−シートを形成するが、逆平行（anti-parallel）β−シートは短く、非理想的、または存在しない場合もある。フォールディングによって、亜鉛と配位結合する側鎖は亜鉛イオンと配位結合するのに適合な四面体構造を有するように配置される。塩基接触残基は一対の金属−キレート残基の間のループ（loop）領域内にある。
【００７４】
便宜のために、ジンクフィンガードメインの主なＤＮＡ接触残基は次の例に基づいて−１、２、３および６として番号付けた。
【００７５】
-1 1 2 3 4 5 6
C-X2-5-C-X3-Xa-X-R-X-D-E-Xb-X-R-H-X3-5-H （配列番号：１２４）
【００７６】
前記例に示したように、ＤＮＡ接触残基はアルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびアルギニン（Ｒ）である。前記モチーフはＲＤＥＲに略記できる。本明細書に使用されたそのような略記は一番目のシステインの２つ前の残基（配列番号：１２４の開始残基）から最後の金属−キレートヒスチジン（配列番号：１２４の最後の残基）までの特定のポリペプチド配列の圧縮型である。前記または他のモチーフにおいて、Ｘａは通常芳香族であり、Ｘｂは通常疎水性である。２つの異なる配列が同じモチーフを有する場合、各配列を区別するために数字を使用し得る（例：ＲＤＥＲ１またはＲＤＥＲ２）。
【００７７】
文脈から明らかに分かる場合、４文字の圧縮型は一般的にモチーフを指す。言い換えれば、モチーフは−１、２、３および６番位置のアミノ酸を特定化する反面、他の位置は任意のアミノ酸であり得、典型的に、非−システインアミノ酸であるが、必ずしもそうとは限らない。モチーフ前の小文字「ｍ」は前記略語がモチーフ（motif）を指すことを明白にするために使用され得る。たとえば、ｍＲＤＥＲは−１位置にＲ、２位置にＤ、３位置にＥ、６位置にＲが現れるモチーフを指す。
【００７８】
ジンクフィンガーＤＮＡ−結合タンパク質は通常直列に配置された３つ以上のジンクフィンガードメインから構成できる。
【００７９】
ジンクフィンガードメイン（「ＺＦＤ」）は最もありふれた真核生物ＤＮＡ−結合モチーフ中の一つであって、酵母から高等植物およびヒトに至る様々な種から発見される。ヒトゲノムにも数千個以上、たぶん４，５００個以上のジンクフィンガードメインが存在すると推測される。ジンクフィンガードメインはジンクフィンガータンパク質から同定されるか、それから単離できる。ジンクフィンガータンパク質の非制限的な例としては、ＣＦ２−ＩＩ；クルッペル（Kruppel）；ＷＴ１；バソヌクリン（basonuclin）；ＢＣＬ−６／ＬＡＺ−３、赤血球クルッペル−類似転写因子；転写因子Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４；転写抑制剤ＹＹ１；ＥＧＲ１／Ｋｒｏｘ２４；ＥＧＲ２／Ｋｒｏｘ２０；ＥＧＲ３／Ｐｉｌｏｔ；ＥＧＲ４／ＡＴ１３３；Ｅｖｉ−１；ＧＬＩ１；ＧＬＩ２；ＧＬＩ３；ＨＩＶ−ＥＰ１／ＺＮＦ４０；ＨＩＶ−ＥＰ２；ＫＲ１；ＺｆＸ；ＺｆＹ；およびＺＮＦ７などがある。
【００８０】
一つの人工転写因子は利用可能なジンクフィンガードメインのキメラを含み得る。一つの実施形態において、一つ以上のジンクフィンガードメインは天然型である。多くのヒトジンクフィンガードメインの例が米国出願公開第２００２−００６１５１２号、第２００３−１６５９９７号、および米国出願第６０／４３１，８９２号に明示されている。また、下記の表６を参照できる。各ドメインの結合特異性は特定の特異性を有する転写因子を考案するのに使用され得る。
【表６】
2006508675.tif 000008
【００８１】
ジンクフィンガードメインの追加的な例には次のモチーフが含まれる：ｍＣＳＮＲ，ｍＤＳＡＲ，ｍＤＳＣＲ，ｍＩＳＮＲ，ｍＱＦＮＲ，ｍＱＳＨＶ，ｍＱＳＮＩ，ｍＱＳＮＫ，ｍＱＳＮＲ，ｍＱＳＮＶ，ｍＱＳＳＲ，ｍＱＴＨＱ，ｍＱＴＨＲ，ｍＲＤＥＲ，ｍＲＤＨＴ，ｍＲＤＫＲ，ｍＲＳＨＲ，ｍＲＳＮＲ，ｍＶＳＮＶ，ｍＶＳＳＲ，ｍＶＳＴＲ，ｍＷＳＮＲ，ｍＤＧＮＶ，ｍＤＳＮＲ，およびｍＲＤＮＱ。
【００８２】
ジンクフィンガーではなく他のタイプのＤＮＡ結合ドメインを少なくとも一つのドメインとして使用し得る。本発明は、異なる結合特異性を有する核酸結合ドメインの集合体を用いる。様々なタンパク質構造が高い親和性と高い特異性をもって核酸と反応すると知られている。二本鎖ＤＮＡを認識する構造モチーフの概観を理解するために、たとえば、文献［PaboおよびSauer (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:1053-95; PatikoglouおよびBurley (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:289-325; Nelson (1995) Curr Opin Genet Dev. 5:180-9］を参照されたい。ジンクフィンガードメイン以外の核酸結合ドメインの非限定的な例には、ホメオドメイン（homeodomains）、ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン（helix-turn-helix domains）、ウィングドへリックスドメイン（winged helix domains）、そして、へリックス−ループ−へリックスドメイン（helix-loop-helix domains）が含まれる。
【００８３】
＜転写因子の特徴＞
ＤＮＡ結合ドメインに加えて、転写因子は調節ドメイン、核位置信号、または本明細書に説明する他の特徴をさらに含み得る。
【００８４】
活性化ドメイン
本発明に用いられる転写活性化ドメインは、酵母のＧａｌ４活性化ドメインおよびヘルペスシンプレックスウイルスのＶＰ１６ドメインを含むが、これに限定されない。転写を活性化するドメインの効能は前記ドメインを周知のＤＮＡ結合ドメインと融合させ、前記周知のＤＮＡ結合ドメインが認識する部位に作動可能なように連結されたレポーター遺伝子が前記融合タンパク質によって活性化されるかを測定して確認できる。
【００８５】
一つの例示的活性化ドメインは次のｐ６５ドメインである：
ＹＬＰＤＴＤＤＲＨＲＩＥＥＫＲＫＲＴＹＥＴＦＫＳＩＭＫＫＳＰＦＳＧＰＴＤＰＲＰＰＰＲＲＩＡＶＰＳＲＳＳＡＳＶＰＫＰＡＰＱＰＹＰＦＴＳＳＬＳＴＩＮＹＤＥＦＰＴＭＶＦＰＳＧＱＩＳＱＡＳＡＬＡＰＡＰＰＱＶＬＰＱＡＰＡＰＡＰＡＰＡＭＶＳＡＬＡＱＡＰＡＰＶＰＶＬＡＰＧＰＰＱＡＶＡＰＰＡＰＫＰＴＱＡＧＥＧＴＬＳＥＡＬＬＱＬＱＦＤＤＥＤＬＧＡＬＬＧＮＳＴＤＰＡＶＦＴＤＬＡＳＶＤＮＳＥＦＱＱＬＬＮＱＧＩＰＶＡＰＨＴＴＥＰＭＬＭＥＹＰＥＡＩＴＲＬＶＴＡＱＲＰＰＤＰＡＰＡＰＬＧＡＰＧＬＰＮＧＬＬＳＧＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱ（配列番号：７３）
【００８６】
例示的Ｇａｌ４活性化ドメインの配列は次の通りである：
ＮＦＮＱＳＧＮＩＡＤＳＳＬＳＦＴＦＴＮＳＳＮＧＰＮＬＩＴＴＱＴＮＳＱＡＬＳＱＰＩＡＳＳＮＶＨＤＮＦＭＮＮＥＩＴＡＳＫＩＤＤＧＮＮＳＫＰＬＳＰＧＷＴＤＱＴＡＹＮＡＦＧＩＴＴＧＭＦＮＴＴＴＭＤＤＶＹＮＹＬＦＤＤＥＤＴＰＰＮＰＫＫＥＩＳＭＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ（配列番号：７４）
【００８７】
バクテリアにおいての活性化ドメインの機能は、野生型ＲＮＡ重合酵素アルファサブユニットＣ−末端ドメインまたは突然変異アルファサブユニットＣ−末端ドメイン、たとえば、タンパク質相互作用ドメインに融合されたＣ−末端ドメインを召集するドメインを融合させることによって模倣できる。
【００８８】
抑制ドメイン
必要な場合、活性化ドメインの代わりに、抑制ドメインをＤＮＡ結合ドメインに融合できる。真核細胞抑制ドメインの例としては、Ｋｉｄ、ＵＭＥ６、オレンジ（ORANGE）、グローチョ（groucho）、およびＷＲＰＷ［Dawson et al (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31］由来の抑制ドメインが含まれる。転写を抑制するドメインの効能は前記ドメインを周知のＤＮＡ結合ドメインと融合させ、前記周知のＤＮＡ結合ドメインが認識する部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が前記融合タンパク質によって抑制されるかを測定して確認できる。
【００８９】
一番目の例示的抑制ドメインはＫｉｄタンパク質（Witzgall R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91(10): 4514-8）由来の「ＫＲＡＢ」ドメインである：  
ＶＳＶＴＦＥＤＶＡＶＬＦＴＲＤＥＷＫＫＬＤＬＳＱＲＳＬＹＲＥＶＭＬＥＮＹＳＮＬＡＳＭＡＧＦＬＦＴＫＰＫＶＩＳＬＬＱＱＧＥＤＰＷ（配列番号：７５）
【００９０】
二番目の例示的抑制ドメインはＫＯＸ抑制ドメインである。このドメインはヒトＫｏｘ１タンパク質（ジンクフィンガータンパク質１０；ＮＣＢＩタンパク質データベースＡＡＨ２４１８２；ＧＩ：１８８４８３２９）由来の「ＫＲＡＢ」ドメイン、すなわち、Ｋｏｘ１の２−９７番アミノ酸を含む：
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬＤＴＡＱＱＩＶＹＲＮＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦＥＩＫＳＳＶ（配列番号：７２）
【００９１】
三番目の例示的抑制ドメインはＵＭＥ６タンパク質由来の次のドメインである：
ＮＳＡＳＳＳＴＫＬＤＤＤＬＧＴＡＡＡＶＬＳＮＭＲＳＳＰＹＲＴＨＤＫＰＩＳＮＶＮＤＭＮＮＴＮＡＬＧＶＰＡＳＲＰＨＳＳＳＦＰＳＫＧＶＬＲＰＩＬＬＲＩＨＮＳＥＱＱＰＩＦＥＳＮＮＳＴＡＣＩ（配列番号：１１９）
【００９２】
ＷＲＰＷドメインは抑制ドメインのまた一つの例である。  
また、他のキメラ転写因子は活性化ドメインまたは抑制ドメインを有さない。その代わりに、このような転写因子は、結合した内因性転写因子（たとえば、活性化因子または抑制因子）を代替するか、それと競争して転写を変化させる。
【００９３】
他の機能性ドメイン
他の機能性ドメインの例には、ヒストン修飾酵素（たとえば、ヒストンアセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素）、ＤＮＡ修飾酵素（たとえば、メチル化酵素）などが含まれる。
【００９４】
タンパク質伝達ドメインはジンクフィンガータンパク質と融合され得る。タンパク質伝達ドメインは伝達ドメインとそれに付着したポリペプチドを細胞内に導入できるようにする。「タンパク質伝達ドメイン」または「ＰＴＤ」は生物学的膜、特に細胞膜を通過できるアミノ酸配列である。異種ポリペプチドに付着した場合、ＰＴＤは生物学的膜を通じた異種ポリペプチドの転位を促進する。ＰＴＤは典型的に異種ＤＮＡ結合ドメインに（たとえば、ペプチド結合によって）共有結合している。たとえば、ＰＴＤと異種ＤＮＡ結合ドメインは単一核酸によってコードされ得る。たとえば、共通のオープン・リーディング・フレーム（open reading frame）または共通遺伝子の一つ以上のエクソンによってコードされ得る。例示的なＰＴＤは１０〜３０個のアミノ酸を含み、両親媒性螺旋を形成し得る。多くのＰＴＤは塩基性特性を有し、少なくとも４、５、６、または８個の塩基性残基（アルギニンまたはリジン）を有する。ＰＴＤは細胞壁のない細胞或いは真核細胞、脊椎動物細胞、ヒト、類人猿、ネズミ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジのような哺乳動物細胞内にポリペプチドの転位（translocation）を促進し得る。
【００９５】
典型的に、ＰＴＤは、ジンクフィンガータンパク質のＤＮＡ結合ドメインとＰＴＤを一つのポリペプチド鎖にする形態でジンクフィンガータンパク質と連結されるが、ＰＴＤを結合させる他の方法も使用され得る。たとえば、ＰＴＤはビオチン−アビジン、コイルド−コイル（coiled-coil）のような非共有結合反応によって結合され得る。さらに具体的な例において、ＰＴＤはフレキシブルリンカー（flexible linker）を用いてジンクフィンガータンパク質と連結され得る。フレキシブルリンカーは自由回転を与えるために一つまたはそれ以上のグリシン（glycine）残基を含み得る。たとえば、ＰＴＤは転写因子のＤＮＡ結合ドメインから１０，２０，または５０アミノ酸以上離れていてもよい。ＰＴＤはＤＮＡ結合ドメインに基づいてＮ−またはＣ−末端に位置し得る。
【００９６】
ジンクフィンガータンパク質は複数のＰＴＤ（たとえば、異なる複数のＰＴＤまたは少なくとも２つのコピーの同じＰＴＤ）を含み得る。  
例示的なＰＴＤはアンテナペディア（antennapedia）タンパク質、ペスシンプレックスウイルスＶＰ２２タンパク質とＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質由来の切片である。
【００９７】
Ｔａｔ
ヒト免疫欠乏ウイルスタイプＩ（HIV-I）に由来するＴａｔタンパク質は外部から加えられるときに細胞内に侵入する能力が非常に高い（Frankel A.D. and Pabo C.O. (1988) Cell 55:11891193, Mann D.A and Frankel A.D. (1991) EMBO J. 10:17331739, Fawell et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:664668）。Ｔａｔ  ＰＴＤの最小要素はヒト免疫欠乏ウイルスＴａｔタンパク質の４７−５７番残基を含む。このペプチド配列は本明細書において「ＴＡＴ」と言及される。
【００９８】
アンテナペディア（Antennapedia）
アンテナペディアホメオドメインもＰＴＤペプチドを含む（Derossi et al. (1994) J. Bio. Chem. 269:10444-10450）。このペプチドは「ペネトラチン（penetratin）」とも呼ばれる。
【００９９】
ＶＰ２２
ＨＳＶ  ＶＰ２２タンパク質もＰＴＤを含む。このＰＴＤはＶＰ２２  Ｃ−末端３４アミノ酸残基に位置する。エリオットおよびオヘア（Elliott and O’Hare, 1997, Cell 88:223-234）および米国特許第６，１８４，０３８号を参照されたい。
【０１００】
他の例示的ＰＴＤはポリ−アルギニン（poly-arginine）配列、たとえば、少なくとも４，５，６，または８個のアルギニン残基、たとえば、５〜１０アルギニン残基を含む配列である。
【０１０１】
細胞−特異的ＰＴＤ
いくつかのＰＴＤは特定タイプの細胞或いは状態において特異性を有する。細胞−特異的ＰＴＤの一つの例示として、米国出願公開第２００２−０１０２２号に明示されたＨｎ１合成ペプチドがある。Ｈｎ１はヒト頭頸部扁平細胞癌（head and neck squamous carcinoma）細胞によって内部に取り入れられ、人工転写因子が頭頸部腫瘍のような腫瘍或いは密接に関連する配列を標的とするのに使用され得る。米国出願公開第２００２−０１０２２６５号は、ファージディスプレイを用いて細胞−特異的ＰＴＤを確認する一般的方法を詳述している。ＰＴＤに対する追加的情報については米国出願公開第２００３−００８２５６１号、第２００２−０１０２２６５号および第２００３−００４００３８号、Schwarze et al. (1999) Science 285:1569-1572 Derossi et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:18188; Hancock et al. (1991) EMBO J. 10:4033-4039; Buss et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8:3960-3963; Derossi et al. (1998) Trends in Cell Biology 8:84-87; Lindgren et al. (2000) Trends in Pharmacological Sciences 21:99-103; Kilic et al. (2003) Stroke  34:1304-10; Asoh et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(26):17107-12; Tanaka et al. (2003) J Immunol. 170(3):1291-8をまた参照されたい。
【０１０２】
＜新規なＤＮＡ結合タンパク質の考案＞
一つの実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は各ドメインが標的部位の切片を認識するように、特性化されたジンクフィンガードメインの混合−適合（mixing and matching）法によって推論的に考案された。ジンクフィンガードメインは米国出願公開第２００２−００６１５１２号および第２００３−１６５９９７号に明示された方法を用いて単離され、特性化された。ジンクフィンガードメインの組立構造は新規なＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのこれらの再整列を容易にする。天然型Ｚｉｆ２６８タンパク質内のジンクフィンガードメインはＤＮＡ二重螺旋に沿って直列に位置している。各ドメインは独立して３−４塩基対のＤＮＡ断片を認識する。
【０１０３】
ジンクフィンガードメインのデータベース
前述のワン−ハイブリッド選別システムは、可能な３または４−塩基対結合部位の各々に対して、または代表的な数の前記結合部位に対して、一つ以上のジンクフィンガードメインを同定するのに使用できる。この過程の結果は、ジンクフィンガードメインとそれが選好する３または４−塩基対の結合部位間の一連の連関性として蓄積され得る。そのような連関性の例は、米国出願公開第２００２−００６１５１２号および第２００３−１６５９９７号に示されている。
【０１０４】
その結果は、たとえば、相関的なデータベース、スプレッドシート、またはテキストファイルなどのようなデータベースとして機械に格納できる。そのようなデータベースの各記録は、ジンクフィンガードメインの表示をそのドメインの一つ以上の選好結合部位の配列を表示するストリング（string）と連関させる。データベースの記録は各部位に結合するジンクフィンガードメインの相対的な親和性の表示を含み得る。ある実施形態において、データベースの記録は特定のジンクフィンガードメインをコードする核酸の実際位置を示す情報を含み得る。そのような実際位置は、たとえば、冷凍庫に貯蔵されたマイクロプレートの特定のウェル（well）であってもよい。
【０１０５】
データベースは、ＳＱＬ作動環境、（ＰＥＲＬまたはMicrosoft Excel（登録商標）macroのような）スクリプティング言語、またはプログラミング言語を用いて質問するか、フィルターできるように配置できる。そのようなデータベースは、使用者が特定の３または４−塩基対の結合部位を認識する一つ以上のジンクフィンガードメインを同定できるようにする。データベース、およびデータベースサーバーに格納可能な他の情報は、ある装置によって翻訳できる命令または他のシグナルを用いて各装置と意思疎通されるように配置できる。このシステムのコンピュータに基づく態様では、デジタル電子回路、或いは、コンピュータハードウエア、ファームウエア、ソフトウエア、またはこれらの組合せで行われる。本発明のデータベースサーバーなどの装置は、プログラム可能なプロセッサーによって実行するための機械読み取り可能な貯蔵装置に明白に具体化されたコンピュータプログラム産物によって実現させることができ；方法動作は、入力データに作動して出力することによって、本発明の機能を果たすための指示プログラムを実行するプログラム可能なプロセッサーによって行い得る。実行環境の非制限的例の一つはウィンドウＸＰ（登録商標）またはウィンドウＮＴ４．０（登録商標）（Microsoft, Redmond WA）、ＬＩＮＵＸ（商標）、または他のオペレーティングシステムによって作動されるコンピュータを含む。
【０１０６】
また、前記ジンクフィンガードメインの特異性を立証するために、これらを複数の異なる融合タンパク質内に融合された状況で試験できる。さらに、少量のドメインが利用可能な特定の結合部位は追加的な選別スクリーニングの標的となり得る。そのような選別のためのライブラリーは、類似するが明らかに区別できる部位に結合するジンクフィンガードメインを突然変異させることによって製造できる。利用可能なドメインを最大限活用するために標的結合部位に対してドメインをずらすようにできるので、各々の可能な結合部位に対するジンクフィンガードメインの完全なマトリックスは必須的なものでない。このようなずれは、最も有用な３または４塩基対の結合部位において結合部位を分解し、また、ジンクフィンガードメインの間のリンカーの長さを変化させることによって達成できる。考案されたポリペプチドが選択性および高い親和度をすべて有するようにするためには、目的とする部位に対して高い特異性を有するジンクフィンガードメインの両側に、さらに高い親和度を有するが特異性に劣る他のドメインを連結できる。米国出願公開第２００２−００６１５１２号および第２００３−１６５９９７号に記述されたインビボスクリーニング法は人為的に組み立てられたジンクフィンガータンパク質およびこれらの誘導体の生体内機能、親和度、および特異性を試験するのに利用され得る。同じように、本方法は、たとえば、多様化されたリンカー組成、ジンクフィンガードメインモジュール、ジンクフィンガードメイン組成などのライブラリーを製造することによって、そのような組み立てられたタンパク質を最適化するのに使用され得る。
【０１０７】
標的部位の分解
標的９−ｂｐまたはより長いＤＮＡ配列は３−または４−ｂｐ断片に分解される。各々の分解された３−または４−ｂｐ断片を認識するジンクフィンガードメインを（たとえば、前述のデータベースから）同定する。さらに長い標的配列、たとえば、２０ｂｐ〜５００ｂｐ配列も、内在する９ｂｐ、１２ｂｐ、および１５ｂｐ下位配列を同定できるので、標的配列として適する。特に、データベースに明示されている部位に分解され得る下位配列は最初のデザイン標的として機能することができる。
【０１０８】
考案された特定のキメラジンクフィンガータンパク質が細胞内で標的部位を認識する可能性を推定できるようにするために点数制を利用できる。この点数は、前記考案されたタンパク質において各構成フィンガーの選好下位部位に対する親和性、特異性およびその成功度の関数であり得る。
【０１０９】
コンピュータプログラム
前述の機械で読み取り可能なデータベースを用いるため、標的部位を分解するため、そして一つ以上のキメラジンクフィンガータンパク質の考案を出力するためにコンピュータシステムとソフトウエアが使用できる。
【０１１０】
前記技術は、移動または固定コンピュータのようなプログラム可能な機械と、プロセッサー、そのプロセッサーによって読み取れる貯蔵媒体および一つ以上の出力装置を含む同様な装置上で実行されるプログラムで実現できる。各プログラムは、機械システムと意思疎通するために高度の過程または目的志向的プログラミング言語によって実行できる。コンピュータ言語のいくつかの非制限的例はＣ、Ｃ＋＋、ジャバ（登録商標）、フォートラン、およびビジュアルベーシック（Visual Basic）（商標）である。
【０１１１】
このような各プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ（compact disc read only memory）、ハードディスク、磁気ディスケット、またはそれと類似する媒体または装置などの貯蔵媒体または装置に貯蔵できるが、これらは本明細書に記述された過程を行うためにコンピュータが貯蔵媒体または装置を読み取るとき、機械を配置し、作動させるために一般的または特定の目的のプログラム可能な機械によって読み取ることができる。このシステムは、プログラムとともに配置された、機械で読み取り可能な貯蔵媒体で実行できるが、このように配置された貯蔵媒体が機械を特定的で予定された方式で作動するようにする。
【０１１２】
コンピュータシステムは内部または外部のネットワークに連結できる。たとえば、コンピュータシステムは、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、またはＸＭＬプロトコールを用いて遠く離れた顧客システムから要求を受け取ることができる。このような要求は、公知の標的遺伝子、または標的核酸の配列を代表するストリングに対する識別子（identifier）であってもよい。前者の場合は、コンピュータシステムがＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）のような配列データベースに入って標的遺伝子の調節領域の核酸配列を検索できる。次いで、調節領域の配列または直接受取った標的核酸配列は下位部位に分解され、前述のようにキメラジンクフィンガータンパク質を考案する。
【０１１３】
システムは遠く離れた顧客に結果を通報できる。一方、システムは、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を実際に検索するようにロボットを調整することもできる。この実施形態において、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸のライブラリーを製造して冷凍精製ＤＮＡ、または核酸を含む冷凍細菌菌株として貯蔵する。ロボットはライブラリーの特定のアドレスを見つけることによって、コンピュータシステムのシグナルに反応する。次いで、検索された核酸はプロセスされ、包装されて顧客に配達され得る。一方、検索された核酸を細胞に挿入して分析できる。コンピュータシステムはネットワークを通じて顧客に分析結果を通報できる。
【０１１４】
選択されたモジュールからのタンパク質の製造
複数のジンクフィンガードメインを含むキメラポリペプチド配列を一旦デザインすると、デザインされたポリペプチド配列をコードする核酸配列を合成できる。合成遺伝子を製造する方法はこの技術分野においては周知のものである。前記方法は注文合成されたオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ媒介されたクローニング、およびメガ−プライマーＰＣＲからの遺伝子製造を含む。一つの例として、選択されたジンクフィンガードメインをコードする核酸は連続的に連結されてキメラポリペプチドをコードする核酸を形成する。追加の配列を、考案されたポリペプチド配列をコードする核酸に付け加えることができる。追加の配列は自体として調節機能を提供でき、目的とする機能のアミノ酸配列をコードできる。
【０１１５】
＜キメラジンクフィンガータンパク質の調節プロファイル＞
キメラジンクフィンガータンパク質の特性を確認し、このタンパク質が哺乳動物細胞のような細胞において一つ以上の内因性遺伝子を調節できるかを決定できる。キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸をまず抑制または活性化ドメインに連結した後、対象細胞内に導入できる。適当な培養およびコーディング核酸の発現誘導後、細胞からｍＲＮＡを抽出し、核酸マイクロアレイを通じて分析する。
【０１１６】
核酸マイクロアレイは、たとえば、フォトリソグラフィック法（例：米国特許第５，５１０，２７０号参照）、機械的方法（例：米国特許第５，３８４，２６１号に記載された直接流れ［directed flow］法）またはピン基盤（pin based）法（米国特許第５，２８８，５１４号に記載）などの様々な方法によって製作できる。このアレイは、発現された特定の遺伝子に対する核酸を検出するのに適した特別な捕獲プローブ（capture probe）を各アドレスに有するように製作される。
【０１１７】
ｍＲＮＡは、たとえば、文献［Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, N.Y］等に記述されたように、ＤＮａｓｅを処理し、ゲノムＤＮＡを除去し、オリゴ−ｄＴを結合した固体基質にハイブリッド化することを含む一般の方法で分離できる。基質を洗浄した後、ｍＲＮＡを溶出させる。分離されたｍＲＮＡを米国特許第４，６８３，２０２号に記載されたように、ｒｔＰＣＲなどによって逆転写させ、任意に増殖させる。増殖または逆転写過程中に標識されたヌクレオチドの挿入によって核酸を認識させ得る。好ましい標識の例は赤色蛍光染料Ｃｙ５（Amersham）または緑色蛍光染料Ｃｙ３（Amersham）のような蛍光標識を含む。一方、核酸をバイオチンで標識し、ストレプトアビジン−ピコエリトリン（Molecular Probes）などの標識されたストレプトアビジンとのハイブリダイゼーションで検出できる。
【０１１８】
次いで、標識された核酸をアレイに接触させ得る。さらに、対照核酸または参考核酸を同じアレイに接触させ得る。対照核酸または参考核酸を標本核酸の標識とは異なる標識、たとえば、異なる最大放出（emission）波長を有する標識で認識できる。標識された核酸をハイブリダイゼーションの条件でアレイと接触させる。アレイを洗浄した後、アレイの各アドレスで蛍光を検出するために映像化する。
【０１１９】
プロファイルを作って評価する一般的な方法はアレイの各アドレスでハイブリッド化を検出する段階を含む。各アドレスのハイブリダイゼーションの程度は数字で表示してベクター、一次元マトリックス、または一次元アレイで貯蔵する。ベクターｘはアレイの各アドレスに対する値を有する。たとえば、特定のアドレスでハイブリダイゼーションの程度に対する数値はｘａという変数で貯蔵される。この数値は、各地域の背景水準、標本量および他の変異条件に合わせて調節できる。また、対照標本から核酸を準備し、同一または異なるアレイにハイブリッド化できる。ベクターｙはベクターｘと等しく製作する。たとえば、２つのベクターの関数である数学式を用いて標本発現プロファイルを対照プロファイルと比較できる。この比較は、２つのプロファイルの類似性を示す点数などのスカラー（scalar）値として評価できる。アレイによって検出される異なる遺伝子に加重値を与えるために前記ベクターのいずれかまたはすべてはマトリックスによって変換し得る。
【０１２０】
発現データはデータベース、たとえば、ＳＱＬデータベース（例：オラクル（Oracle）またはサイベース（Sybase）データベース環境）のような関連データベースに貯蔵できる。データベースは数個の表を有する。たとえば、処理されていない（raw）発現データを、各縦列は分析される遺伝子（例：アドレスまたはアレイ）に該当し、各横列は標本に該当する一つの表に貯蔵できる。別途の表は、識別子、および使用したアレイのバッチ（batch）数字、日付および他の品質管理情報などの標本情報を貯蔵できる。
【０１２１】
同様に調節される遺伝子は共に調節される遺伝子を同定するために発現データをクラスタリング（clustering）することによって同定できる。このようなクラスターは、キメラジンクフィンガータンパク質によって同等に調節される遺伝子セットを表示する。遺伝子は階層的クラスタリング（hierarchical clustering)[例:Sokal and Michener (1958) Univ. Kans. Sci. Bull. 38:1409参照]、ベイジアンクラスタリング（Bayesian clustering）、カッパー平均クラスタリング（k-means clustering）、および自体組織地図（self-organizing maps)［Tamayo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2907参照］を用いてクラスタリングできる。
【０１２２】
標本発現プロファイルの対照発現プロファイル（例：対照細胞）との類似性は、たとえば、標本発現水準のログをプレディクター（predictor）または対照発現値のログと比較し、この比較結果をプロファイル内の例示値のすべての遺伝子に対する重要度によって調整することによって決定できる。
【０１２３】
＜考案された転写因子の追加的な特徴＞
ペプチドリンカー
ＤＮＡ結合ドメインは様々なリンカーによって連結できる。リンカーの有用性とデザインはこの技術分野でよく知られている。特に有用なリンカーは核酸によってコードされるペプチドリンカーである。したがって、第１のＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、および第２のＤＮＡ結合ドメインをコードする合成遺伝子を製造できる。このようなデザインは大規模な合成多数−ドメインＤＮＡ結合タンパク質を製造するために繰り返すことができる。国際特許出願第ＷＯ９９／４５１３２号およびキムおよびパボ（Kim and Pabo, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7）は、ジンクフィンガードメインを連結するのに適したペプチドリンカーのデザインを記述している。
【０１２４】
無作為コイル、α−螺旋またはβ−ひだ状の３次構造を形成する追加的なペプチドリンカーを使用できる。適した柔軟性のあるリンカーを形成するポリペプチドはこの技術分野でよく知られている（Robinson and Sauer (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34参照）。柔軟性のあるリンカーは典型的にグリシンを含むが、これはグリシンが側鎖を欠いているため回転自由度を有する唯一のアミノ酸であるためである。親水性を増加させるためにセリンまたはトレオニンをリンカーに挿入できる。また、結合親和度を増加させるためにＤＮＡのリン酸骨格と相互作用できるアミノ酸を使用できる。このようなアミノ酸の適切な使用によって親和度の増加と配列特異性の減少との間のバランスを取ることができる。もし、リンカーが厳格な伸張性を要求する場合、文献［Pantoliano et al. (1991) Biochem. 30:10117-10125］に記述された螺旋状リンカーのようなα−螺旋リンカーを使用できる。また、リンカーはコンピュータモデリングによってデザインできる（米国特許第４，９４６，７７８号参照）。分子モデリングのためのソフトウエアは市販のものを使用できる（たとえば、Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA）。このようなリンカーは、タンパク質工学分野で実施される標準的な突然変異誘導技術および適切な生物理学的テスト、および本明細書に記述された機能的分析法を用いて、たとえば、抗原性を減少させ／減少させるか、安定性を増加させるための目的などに任意に最適化する。
【０１２５】
ジンクフィンガードメインを活用した実施のために、ジンクフィンガーの間で自然的に発見されるペプチドをフィンガーと共に連結するためのリンカーとして使用できる。そのような自然的に発見されるリンカーとして典型的なものはＴｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）（配列番号：１２５）である。
【０１２６】
二量化ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインを連結するまた他の方法は二量化ドメイン、特に異種二量化ドメイン（Pomerantz et al. (1998) Biochemistry 37:965-970を参照）を用いることである。このような例においては、ＤＮＡ結合ドメインが別個のポリペプチド鎖で存在する。たとえば、一番目のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインＡ、リンカーおよびドメインＢをコードする反面、二番目のポリペプチドはドメインＣ、リンカーおよびドメインＤをコードする。当業者は特性が明らかになった多くの二量化ドメインから一つの二量化ドメインを選別できる。同種二量体が好ましくない場合、異種二量化を選好するドメインを使用できる。特に、適用可能な二量化ドメインはコイル化されたコイルモチーフ、たとえば、二量体平衡または逆平衡コイル化されたコイルである。優先的に異種二量体を形成するコイル化されたコイル配列をまた利用できる（Lumb and Kim, (1995) Biochemistry 34:8642-8648）。二量化ドメインのまた他の種類として二量化が小分子によってまたは信号伝達経路を通じて誘発されるものがある。たとえば、ＦＫ５０６の二量体形態は２つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを二量化するのに使用できる。このような二量化ドメインは追加的な調節段階を提供するために利用できる。
【０１２７】
＜機能性分析（Functional Assays）および用途＞
ジンクフィンガータンパク質は細胞を使用しない試験や細胞試験を用いて評価できる。細胞を使用しない試験の例としては、少なくとも部分的に精製されたタンパク質の生化学的特性を試験すること、たとえば、インビトロＤＮＡ結合試験が含まれる。有用なインビトロ試験の例としては、電気泳動移動検定法（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡフットプリンティング（DNA footprinting）、ＤＮＡメチル化保護法、表面プラスモン共鳴分析、蛍光偏光分析、そして蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）がある。結合と他の機能的特性は細胞内試験でまたはインビボで（たとえば、生物体で）試験され得る。
【０１２８】
たとえば、ドメインは細胞増殖を調節する遺伝子のプロモーター部位などのような標的部位に結合するように選択できる。単位体組立てによって、（１）標的プロモーター部位にわたっての下位部位に各々結合するように選択されたドメインおよび（２）活性化ドメインまたは抑制ドメインのような転写調節ドメインを含むタンパク質を考案できる。細胞増殖を調節する遺伝子を調節するタンパク質と細胞増殖と拮抗するタンパク質の例において、適した転写調節ドメインは前記遺伝子が細胞増殖を促進するか（たとえば、抑制ドメインが用いられる）、または抑制するか（たとえば、活性化ドメインが用いられる）に従って選択され得る。他の例において、ジンクフィンガードメインの無作為組合せをコードするライブラリーは表現形質を変化させるキメラジンクフィンガータンパク質を確認するためにスクリーンされる。
【０１２９】
キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列は、たとえば、カンおよびキム（Kang and Kim, (2000) J Biol Chem, 275:8742）に記載の誘導性発現ベクターなどの発現ベクター内にクローニングされ得る。誘導性発現ベクターは誘導可能なプロモーターまたは調節配列を含み得る。誘導可能なプロモーターの非制限的例はステロイド−ホルモン反応性プロモーター（例：エクジソン−反応性、エストロゲン−反応性およびグルタコルチコイド−反応性プロモーター）、テトラサイクリン「テト−オン（Tet-On）」および「テト−オフ（Tet-Off）」システム、および金属−反応性プロモーターを含む。このような構造物を組織培養細胞または胚芽幹細胞にトランスフェクトすることによって、対象モデルとしての遺伝子移植生物体を生成できる。遺伝子移植動物モデルにおいてタンパク質の発現を誘導し、組織培養細胞の細胞増殖を調査するか、発生学的変化および／または腫瘍の成長を分析することによって、キメラジンクフィンガータンパク質の効率を決定できる。さらに、標的遺伝子の発現程度は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット等のようなｍＲＮＡを検出する一般的な方法によって分析できる。さらに完璧な測定のためには、キメラジンクフィンガータンパク質を発現する細胞と発現しない細胞でｍＲＮＡを精製する。このようなｍＲＮＡの２つのプールを用いて大規模の遺伝子集合物、たとえば、関心ある疾患（たとえば、癌）に関連する遺伝子の集合物または生物体のゲノムで同定された遺伝子の集合物に対するプローブを含有するマイクロアレイを探知する。このような分析は、キメラジンクフィンガータンパク質の特異性を決定するのに特に有用である。もしタンパク質が高い親和度を有するが、低い特異性をもって結合する場合は、予想される標的遺伝子以外の遺伝子の発現にも影響を与え、色々な面で好ましくない効果をもたらす。このような効果は転写物の全体的な分析によって明らかにされる。
【０１３０】
さらに、考案されたタンパク質は内因性遺伝子を調節するために対象細胞または対象生物体で生産され得る。考案されたタンパク質は前述の通りに内因性遺伝子の一領域に結合して転写活性化または抑制をもたらすように配列される。カンおよびキムの前記文献に記述されたように、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸の発現は調節可能なプロモーター（例：誘導性または抑制性プロモーター）に作動可能に連結され得る。プロモーターを調節できる物質、たとえば、プロモーターに対する誘導対の濃度を変化させることによって内因性遺伝子の発現を濃度依存的方式で調節できる。
【０１３１】
ジンクフィンガータンパク質の結合部位選好度はＥＭＳＡ、ＤＮａｓｅフットプリンティング（footprinting）、表面プラスモン共鳴法、セレックス（SELEX）、またはカラム結合のような生化学的分析法によって確認できる。結合のための基質としては標的部位または制限切片を含む合成オリゴヌクレオチドを使用し得る。前記分析は非特定ＤＮＡを競争体としてまたは特定のＤＮＡ配列を競争体として含み得る。特定の競争体ＤＮＡは１つ、２つ、または３つのヌクレオチド突然変異を有するＤＮＡ結合のための認識部位を含み得る。したがって、生化学的分析によって所定部位に対するドメインの親和度だけでなく、他の部位に対する所定部位の相対的親和度も測定できる。レバーおよびパボ（Rebar and Pabo, 1994, Science 263:671-673）は、ＥＭＳＡからジンクフィンガードメインに対するＫｄ常数を得る方法を記述している。例示的なジンクフィンガータンパク質は、特定の認識部位に対して１つ、２つ、または３つのヌクレオチドに突然変異を有する関連部位に比べて少なくとも２、５、１０、５０、１００、または５００倍の選好度を有する。
【０１３２】
本発明の明細書に記載されたタンパク質または核酸は内皮細胞または血管生成を調節する能力のような生物学的活性を試験するためにインビトロまたはインビボで評価され得る。
【０１３３】
内皮細胞増殖
ウシ毛細内皮細胞増殖試験、ヒナカム（ＣＡＭ）試験、マウス角膜試験、そして移植された腫瘍に対するタンパク質または核酸の効能判定などのような生物活性試験を用いてタンパク質または核酸の内皮細胞増殖抑制力を試験し得る。ヒナカム試験は、オライリーら（“Angiogenic Regulation of Metastatic Growth” Cell, vol. 79 (2), Oct. 21, 1994, pp. 315-328）などに記載されている。要するに、完全な卵黄を有する３日齢のヒナ胚芽を卵から分離してシャーレに移す。３日間培養した後、各胚芽のＣＡＭを試験されるタンパク質を含有するメチルセルロースディスクで処理する。４８時間培養後、胚芽とＣＡＭを内皮細胞の成長が阻害されたかどうかを判定するために観察する。マウス角膜試験は成長因子を含有するペレットをまた他の内皮細胞増殖を阻害すると推定される物質を含有するペレットとともにマウスの角膜に移植し、毛細血管のパターンを観察することを伴う。
【０１３４】
血管生成
血管生成は臍帯静脈、冠状動脈、または皮膚細胞などのような様々なヒト内皮細胞システムを用いて試験し得る。適した試験としては増殖を測定するためのアラマーブルー−基板試験（Alamar blue based assay）（Biosource Internationalから購入可能である。）；蛍光分子を用いる転移試験、たとえば、血管生成増強剤または抑制剤の存在或いは不在時、細胞が膜を経て移動することを測定するためにベクトン・ディッキンソン・ファルコン（Becton Dickinson Falcon）社のＨＴＳフルオロブロック細胞培養挿入機（HTS FluoroBlock cell cultrue inserts）を使用すること；マトリゲル（Matrigel, Becton Dickinson）上で内皮細胞による管形成に基づく細管形成試験法などが含まれる。
【０１３５】
細胞付着
細胞付着試験は試験しようとするタンパク質または核酸が存在または不在時、精製された付着タンパク質に細胞が付着するかどうか、または細胞同士が付着するかどうかを測定する。細胞−タンパク質付着試験は精製されたタンパク質に細胞が付着することを調節する試料の能力を測定する。たとえば、生成した組換えタンパク質を２．５ｇ／ｍｌでＰＢＳに希釈して、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。対照群に用いられたウェルはコーティングしない。コーティングされたウェルを洗浄し、１％ＢＳＡでブロッキングした後、さらに洗浄する。試料は最終試験濃度の２倍に希釈し、ブロッキングおよびコーティングされたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、付着していない細胞を洗い出す。プレート上に残っている細胞にカルセイン−ＡＭのような膜透過性蛍光染色を加えて直接標識し、信号を蛍光マイクロプレートリーダーで定量化する。
【０１３６】
細胞−細胞間の付着試験は試験対象であるタンパク質または核酸が細胞相互間の結合を調節する能力を有するかどうかを測定するために用いられる。これらの試験には自然的または組換え的に選別された付着タンパク質（adhesion protein）を発現する細胞を使用し得る。例示的試験において、細胞付着タンパク質を発現する細胞は他の細胞（同じ細胞タイプ、または細胞が付着する他のタイプの細胞）とともに多重ウェルプレートのウェル上に塗布される。付着し得る細胞はＢＣＥＣＦのような膜透過性蛍光染色で標識され、試験対象タンパク質または核酸が存在する単一層上に付着するようにする。付着していない細胞を洗い出し、付着している細胞を蛍光プレートリーダーを用いて検出する。また、高効率の細胞付着試験も文献［Falsey J R et al., Bioconjug Chem. May-June 2001, 12(3): 346-53]などに記載されている。
【０１３７】
細管形成
細管形成試験は培養された細胞、一般的に内皮細胞が細胞基質（matrix）上で細管構造を形成する能力を観察するために使用され得、これは一般的に細胞外基質の環境と同様である。基質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩＶおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む基底膜タンパク質の抽出物であるマトリゲル（Matrigel（商標）、Becton Dickinson）があり、これは４℃では液体であり、３７℃では固形ゲルを形成する。他の適した基質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、および／またはフィブリンのような細胞外成分が含まれる。親血管生成刺激剤で刺激された細胞の細管を形成する能力が検出される。細管は一般的に刺激剤と一晩培養後検出されるが、さらに長いか短い時間でも検出可能である。細管形成試験は公知である（例：文献［Jones M K et al., 1999, Nature Medicine 5:1418-1423］参照）。これらの試験は伝統的に血漿または成長因子ＦＧＦまたはＶＥＧＦによる刺激と関連している。一つの実施形態において、前記試験は血漿を含有していない培地で培養された細胞を用いて行われる。また一つの実施形態においては、前記試験を一つ以上の親血管生成因子、たとえば、ＴＮＦ−αのような炎症性血管生成因子、またはＦＧＦ、ＶＥＧＦ、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、ＴＮＦ−アルファ、エプリン（ephrin）などの存在下で行う。
【０１３８】
細胞移動
内皮細胞の移動に対する例示的試験にはヒト微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）移動試験がある（文献［Tolsma et al. (1993) J. Cell Biol 122, 497-511］参照）。細胞移動試験は公知である（例：文献［Paik J H et al., 2001, J Biol Chem 276:11830-11837］参照）。一例として、培養された内皮細胞を基質でコーティングされた、典型的な細胞のサイズよりも小さい孔径を有する多孔質層上に加える。層は一般的に、トランスウェルポリカーボネート膜（Corning Costar Corporation, Cambridge, Mass.）のような膜であり、普通親血管生成刺激剤を含有する下層チャンバーの液体と接触する上層チャンバーの部分である。細胞移動は一般的に刺激剤とともに一晩培養後試験されるが、より長いか短い培養時間も可能である。細胞移動は層を通過した細胞の数字として測定され、細胞をヘモトキシリン溶液（VWR Scientific.）で染色するか、細胞の数を算定できる他の方法で測定され得る。他の例として、細胞は蛍光標識され、細胞移動は、たとえば、ファルコンＨＴＳフルオロブロック（Becton Dickinson）を用いた蛍光判読器を用いて検出される。刺激の不在下でもわずかな細胞移動が観察されるが、細胞移動は親血管生成因子に反応して大きく増加する。前記試験は内皮細胞の移動に対して試験中のタンパク質または核酸の効果を試験するために使用され得る。
【０１３９】
発芽試験（sprouting assay）
例示的な発芽試験は、コラーゲンゲルを基礎とする基質（matrix）に埋められた定められた数の細胞によって形成されるスフェロイド（spheroid）集合体を用いて行う３次元インビトロ血管生成試験である。前記スフェロイドは細胞外基質内侵入による毛細管類似構造の発芽（細胞発芽（cell sprouting）と称する）の開始点となり、これに伴う複雑な血管接合網（anastomosing network）を形成する役割をする（Korff and Augustin, 1999, J Cell Sci 112:3249-58）。一つの実験設計の例において、スフェロイドは４００個のヒト臍帯静脈内皮細胞を非接着性９６−ウェルプレートの各ウェルに分株し、一晩培養してスフェロイド体を形成することによって製造される（Korff and Augustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998）。得られたスフェロイドを回収してメトセル−コラーゲン溶液９００μｌに塗布し、コラーゲンゲルポリマー化が起こるように２４ウェルプレートの各ウェルに分株する。３０分後に試験試料の使用濃度の１０倍濃縮物１００μｌをゲルの上部に分株して加える。プレートは２４時間３７℃で培養される。実験培養時間の最後にパラホルムアルデヒドを添加することによって培養板は固定する。内皮細胞の発芽程度はスフェロイド体個々に累積された発芽長さを測定するための自動映像分析システムによって定量化され得る。
【０１４０】
他の例示的試験としては、[Ferrara and Henzel(1989) Nature 380:439-443]；[Gospodarowicz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7311-7315]；[Claffey et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1246:1-9]；[Leung et al. (1989) Science 246:1306-1309]; [Rastinejad et al. (1989) Cell 56:345-355]；および［米国特許第５，８４０，６９３号］に記載されている方法がある。虚血症（ischemia）を調節する組成物の効能は、たとえば、ラット後足虚血症モデル（rat hindlimb ischemia model）を用いて評価し得る（Takeshita, S. et al., Circulation (1998) 98: 1261-63）。
【０１４１】
＜遺伝子調節の標的＞
標的遺伝子は任意の遺伝子、たとえば、染色体の遺伝子または異種遺伝子（例：形質転換遺伝子）であり得る。標的遺伝子は、たとえば、標的遺伝子の活性を調節（例：増加または減少）することにおける有用性の有無によって選択され得る。たとえば、病原体に有利な遺伝子、腫瘍の増殖に必要な遺伝子を抑制し、また反対に発現されないか、不安定なタンパク質をコードする遺伝子、ストレスに対する抵抗性を与える遺伝子を活性化する。
【０１４２】
特定の標的遺伝子の例は次のタンパク質をコードする遺伝子を含む：細胞表面タンパク質（例：糖鎖化した表面タンパク質）、腫瘍−関連タンパク質、サイトカイン（cytokines)、ケモカイン(chemokines)、ペプチドホルモン(peptide hormones)、神経伝達物質 (neurotransmitters)、細胞表面レセプター (cell surface receptors)(例:細胞表面レセプターキナーゼ(cell surface receptor kinases)、7膜貫通レセプター(seven transmembrane receptors)、ウイルスレセプターと補助レセプター（virus receptors and co-receptors))、細胞外結合タンパク質（extracellular matrix binding proteins）、細胞結合タンパク質（cell-binding proteins）、病原体の抗原（たとえば、バクテリア抗原、マラリア抗原など）。その他の標的タンパク質はエノラーゼ（enolases）、シトクロムＰ４５０ｓ、アシルトランスフェラーゼ（acyltransferase）、メチラーゼ（methylase）、ＴＩＭ障壁（barrel）酵素、イソメラーゼ（isomerase）などがある。
【０１４３】
さらに具体的な例は次を含む：インテグリン（integrins）、細胞付着分子（cell attachment molecules）または「ＣＡＭｓ」（例：カドヘリン（cadherins）、セレクション（selections）、Ｎ−ＣＡＭ、Ｅ−ＣＡＭ、Ｕ−ＣＡＭ、Ｉ−ＣＡＭなど）；プロテアーゼ（例：サブチリシン、トリプシン、キモトリプシン；プラスミノゲン活性剤（plasminogen activator）（例：ウロキナーゼ（urokinase）、ヒト組織型プラスミノゲン活性剤など）；ボンベシン（bombesin）；因子ＩＸ、トロンビン；ＣＤ−４；血小板−由来成長因子；インシュリン−類似成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；神経成長因子；繊維芽細胞成長因子（例：ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；ＶＥＧＦａ；形質転換成長因子（ＴＧＦ、例：ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インシュリン−類似成長因子結合タンパク質；エリスロポイエチン；トロンボポイエチン；ムチン（mucins）；ヒト血清アルブミン；成長ホルモン（例：ヒト成長ホルモン）；プロインシュリン、インシュリンＡ−鎖およびインシュリンＢ−鎖；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン（thyroxine）；卵胞促進ホルモン（follicle stimulating hormone）；カルシトニン；ＡＮＰ（atrial natriuretic peptides）Ａ、ＢまたはＣ；黄体ホルモン（leutinizing hormone）；グルカゴン；因子ＶＩＩＩ；造血成長因子；腫瘍壊死因子（例：ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；エンケファリナーゼ（enkephalinase）；ミューラー管抑制物質（MIS;Mullerian-inhibiting substance）；ゴナドトロピン−関連ペプチド；組織因子タンパク質；インヒビン（inhibin）；アクチビン（activin）；血管内皮細胞成長因子（VEGF）；ホルモンまたは成長因子レセプター；リウマチ因子（rheumatoid factor）；骨誘導因子（osteoinductive factors）；インターフェロン（例：インターフェロン−α，β，γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）（例：Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）（例：ＩＬ−
１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４など）；ＤＡＦ（decay accelerating factor）；および免疫グロブリン。いくつかの例において、標的遺伝子は、たとえば、癌、感染性疾患、炎症、または心血管系疾患のような疾病に関わるタンパク質や他の因子（例、ＲＮＡ）をコードする。
【０１４４】
一つの実施形態において、前記遺伝子はヒト疾病遺伝子である。たとえば、この遺伝子は欠陥や障害のある酵素をコードする突然変異を含んでいるか、調節配列（例、転写、翻訳または接合調節配列）内に欠陥を有し発現される。かつこのような遺伝子の発現を促進するジンクフィンガータンパク質が得られる。
【０１４５】
たとえば、ＦＧＦ遺伝子と反応できる、たとえば、図２Ａ乃至２Ｆに示されている配列内結合部位に結合するジンクフィンガータンパク質、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）遺伝子と反応できる、たとえば、図３Ａ乃至３Ｅに示されている配列内結合部位に結合するジンクフィンガータンパク質を考案すると前記タンパク質はこれらの遺伝子のプロモーター領域として作用し得る。
【０１４６】
任意の遺伝子を調節するためのキメラジンクフィンガータンパク質は一つまたはそれ以上の標的部位に作用できるように考案され得る。たとえば、標的部位は遺伝子のコーディング領域または非コーディング領域に位置し得る。一つの実施形態において、標的部位は調節領域、たとえば、プロモーターのような転写調節領域にある。一つの実施形態において、標的部位は転写開始部位、ＤＮａｓｅ敏感部位、または転写因子結合部位の７００，５００，３００，２００，５０，２０，１０，５，または３塩基対内に位置する。標的遺伝子がＶＥＧＦ−Ａである実施形態において、結合部位は国際特許公開第ＷＯ０２／４６４１２号の表２または３の部位と異なり得る（たとえば、重ならない）。他の実施形態においても結合部位はこのような部位と重ならない。
【０１４７】
＜遺伝子および細胞治療＞
キメラジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ分子は遺伝子治療を目的で様々なＤＮＡ構造体およびベクター内に挿入され得る。本発明の明細書に記載されたように、「ベクター」はそれが共有的に連結された異なる核酸分子を運搬できる核酸分子である。ベクターはプラスミド、コスミド、人工染色体（artificial chromosome）、ウイルス性要素、およびＲＮＡベクター（たとえば、ＲＮＡウイルス誘電体に基づく）を含む。このようなベクターは宿主細胞内で複製されるか、宿主のＤＮＡ内に編入され得る。ウイルス性ベクターは複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−連関ウイルスなどを含む。
【０１４８】
遺伝子治療用ベクターは、たとえば、哺乳動物のような対象に投与することを目的として考案され、対象の細胞がベクターに含まれている治療用遺伝子を発現できるベクターである。遺伝子治療用ベクターは、たとえば、５’調節要素、エンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域（5’untranslated region）、信号配列（signal sequence）、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位（polyadenylation site）、および３’調節領域のような調節要素を含み得る。たとえば、５’調節要素、エンハンサー、またはプロモーターは治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を調節できる。前記調節は組織特異的であり得る。たとえば、前記調節は、脳細胞に好ましい遺伝子の転写、たとえば、脳皮質ニューロンまたは神経膠細胞；造血細胞（hematopoietic cells）；または内皮細胞などに制限し得る。これとは異なり、調節要素は外来薬物、たとえば、ステロイド、テトラサイクリンまたはそれらと類似するものに反応するものに含まれ得る。したがって、治療用ジンクフィンガータンパク質（たとえば、ＶＥＧＦを調節するポリペプチド）の発現の水準および時期は統制できる。
【０１４９】
遺伝子治療用ベクターは露出型核酸として伝達するために、ウイルスまたは非活性ウイルス性要素、またはリポソーム或いは他の運搬体の構成要素として製造され得る（米国出願公開第２００３−０１４３２６６号および第２００２−０１５０６２６号参照）。一つの実施形態において、核酸は微細粒子、たとえば、５０〜１０マイクロメーターの直径を有する粒子を形成するために脂質−タンパク質−糖基質（matrix）で剤形化され得る。前記粒子は公知の任意の脂質（ジパルミトイルホスファチジルコリン；ＤＰＰＣなど）、タンパク質（アルブミンなど）、または糖（ラクトースなど）を用いて製剤化され得る。
【０１５０】
遺伝子治療用ベクターは、ウイルス性システムを用いて伝達され得る。例示的なウイルス性ベクターは、モロニーレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−連関ウイルスおよびレンチウイルス、たとえば、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex viruses；ＨＳＶ）などのレトロウイルスに由来するベクターを含み、ＨＳＶは神経系細胞を感染させるなどの用途として潜在的に有用である（米国出願公開第２００３−０１４７８５４号、第２００２−００９０７１６号、第２００３−００３９６３６号、第２００２−００６８３６２号および第２００３−０１０４６２６号参照）。遺伝子伝達物質、たとえば、ウイルス性ベクターは、遺伝子伝達システムを産生する組換え細胞から産生され得る。
【０１５１】
遺伝子治療用ベクターは、対象に、たとえば、静脈内注射、局部投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位注射（stereotactic injection；文献［Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057］参照）によって投与され得る。遺伝子治療物質は、徐放性基質（slow release matrix）などを用いて放出を遅延または延長するように剤形化され得る。組換えジンクフィンガータンパク質を提供する一つの方法としては対象から回収した骨髄細胞に遺伝子治療用ベクターを挿入する方法がある。該細胞はレトロウイルス遺伝子治療ベクターなどで感染させて培養する。
【０１５２】
一方、対象は骨髄細胞を除去するために放射能に照射される。対象の骨髄は感染した培養細胞で再充填される。対象は回復および治療用ポリペプチドの産生を調べるためにモニターされる。
【０１５３】
細胞基盤−治療方法は、培養条件での細胞に作動可能なプロモーターに連結されたキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を導入することを含む。キメラジンクフィンガータンパク質は培養された細胞内の内因性遺伝子を調節するか、培養された細胞において好ましい表現形質を作るように選択され得る。さらに、形質転換遺伝子、たとえば、内因性遺伝子を調節するキメラジンクフィンガータンパク質をコードする形質転換遺伝子を挿入するために核酸組換えを通じて細胞、たとえば、幹細胞を改造することも可能である。改造された幹細胞は対象に投与され得る。幹細胞をインビトロで培養する方法は、たとえば、米国出願公開第２００２−００８１７２４号に記載されている。いくつかの例において、幹細胞は対象内で分化し、形質転換遺伝子を発現するように誘導され得る。たとえば、幹細胞は肝、脂肪細胞、または骨格筋細胞に分化され得る。幹細胞は所望の組織タイプ、たとえば、肝、脂肪細胞、骨格筋細胞を産生する細胞種から誘導され得る。
【０１５４】
他の実施形態において、キメラジンクフィンガータンパク質を発現するか、発現できる組換え細胞は、たとえば、本明細書に記述されたように、対象内で代替治療（replacement therapy）のために使用され得る。たとえば、作動可能にプロモーター（たとえば、誘導性プロモーター、ステロイドホルモンレセプターによって調節されるプロモーター）に連結されたキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸はヒトまたは非ヒト、たとえば、ブタ組換え細胞のような哺乳動物に導入され得る。このような細胞は培養され、ポリ-リジンアルギン酸塩(poly-lysine alginate)のような生体適合性物質内にカプセル化され、次いで対象に移植される(文献 [Lanza (1996) Nat. Biotechnol. 14:1107]; [Joki et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:35];および米国特許第5,876,742号参照)。細胞をカプセル化するための生体適合性ポリマーの他の例としては、アルギン酸ナトリウム(sodium alginate)、アルギン酸バリウム(barium alginate)または硫酸ナトリウムセルロース(sodium cellulose sulfate)がある。有用なポリマーはタンパク質（たとえば、７０，２０，１０ｋＤａ以下のタンパク質）がこれらを通過して拡散できるようにする。超純粋物質はカプセル化した細胞の生存力を改善し、免疫反応を減少させる。カプセル化した細胞、たとえば、人工転写因子を含み、拡散性因子を産生する細胞は対象内で拡散性因子を対象に提供する治療法として使用され得る。
【０１５５】
細胞と組織をカプセル化する一つの例示的な方法は非繊維誘導性アルギン酸塩（non-fibrogenic alginate）、特定の種類の褐藻類から得られるゼラチン性物質で形成されたコーティングを使用することを含む。たとえば、細胞を粘液質の液体アルギン酸塩に懸濁し、細胞をカプセル化するに適したサイズの滴中に任意の様々な方法で噴霧する。滴が塩化カルシウム（calcium chloride）または塩化バリウム（barium chloride）のようなゲル化溶液（gelling solution）と接触すると、細胞を取り囲む単一層アルギン酸塩コーティングが作られる。
【０１５６】
静電気的コーティング過程を用いた単一層アルギン酸塩コーティングの生成のための接近法の例は、米国特許第４，７８９，５５０号、第４，９５６，１２８号、第５，６３９，４６７号、第５，６５６，４６８号、および第５，６９３，５１４号に紹介されている。エアーナイフ（air knife）工法を用いて単一層アルギン酸塩コーティングを生成する例は米国特許第５，５２１，０７９号に紹介されている。滴をコーティングするための加圧工法（pressurized process）は米国特許第５，２６０，００２号および第５，４６２，８６６号に記述されている。回転板装置を用いて単一層アルギン酸塩コーティングを作るための他の例は米国特許第５，６４３，５９４号および第６，００１，３８７号に記述されている。圧電ノズルを用いて単一層アルギン酸塩コーティングを作るための例は、米国特許第５，２８６，４９６号、第５，６４８，０９９号および第６，０３３，８８８号に記述されている。
【０１５７】
米国特許第５，４７０，７３１号および第５，５３１，９９７号はゲル化が可能な有機ポリマーおよびカチオン性ポリマーの一次層および一次層と化学的に結合した水溶性および半透過性二次層を記載している。米国特許第６，０２０，２００号は交差結合基質（cross-linked matrix）からなる安定化した外皮層を有する二重層を記載している。米国特許第５，２２７，２９８号（Weberら）は二重層アルギン酸塩コーティングを記載している。
【０１５８】
カプセル化した細胞は手術（たとえば、腹腔鏡または従来の外科術）または注射を通じて移植され得る。細胞は肝、脾臓、胸腺、睾丸、脳、膵臓、肺、腎臓、腹腔、皮下組織、脂肪層および他の位置を含む任意の適切な身体部位に導入され得る（文献[J. Rozga et al., Intraabdominal Organ Transplantation 2000)；および[Landes Co., USA, 1994: 129]参照）。
【０１５９】
キメラジンクフィンガータンパク質が分泌性タンパク質をコードする内因性遺伝子を調節するにおいて、分泌されるポリペプチドの産生は対象に薬物（たとえば、ステロイドホルモン）を投与することによって対象内で調節され得る。他の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質の産生は内因性信号、たとえば、分泌されたタンパク質の減少を指示する信号によって統制され得る。したがって、人工的なフィードバックループが使用され得る。たとえば、信号は分泌されたタンパク質自体の水準によって調節される転写因子によって媒介され得る。
【０１６０】
細胞をカプセル化する追加的方法は、文献［米国特許第４，３９１，９０９号；米国出願公開第２００２−００２２０１６号；Lohr et al., (2002) Cancer Chemother Pharmacol, 49: S21-S24; Hobbs et al., (2001) Journal of Investigative Medicine, vol.49, no.6, 49(6):572-5; Zimmermann et al. (2001) Ann N Y Acad Sci. 2001; Moashebi et al; Tissue Engineering, 2001, vol.7, 5, 525-534; Orive et al., (2002) Trends in Biotechnology, vol.20, 382-7; Lim and Sun (1980) Science 210: 908-910; Reed et al. 2001. Nature Biotech. 19:29-34; Dornish et al., (2001) "Standards and guidelines for Biopolymers in Tissue-Engineered Medical Products:およびASTM Alginate and Chitosan Standard Guides." Ann N Y Acad Sci. 2001; 944: 388-97]に記述されている。
【０１６１】
また他の実施形態において、キメラジンクフィンガータンパク質を発現するか発現できる組換え細胞はインビトロで培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は細胞または細胞周囲の培養液から回収（たとえば、精製）され得る。他の例において、組換え細胞はフィーダー細胞（feeder cells）として使用され得る。
【０１６２】
＜医薬組成物＞
他の実施形態において、本発明は、薬剤学的に許容可能な担体とともに製剤化されたジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸、たとえば、本明細書に記載された分子を含む組成物を提供する。
【０１６３】
本明細書に使用されたように、「薬剤学的に許容可能な担体」は任意またはすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗バクテリアおよび抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、および生理的に交換され得る類似のものを含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊椎、上皮の投薬（たとえば、注射または注入）に適したものである。投薬の経路によって、活性物質はその物質を不活性化できる酸或いは他の自然的環境の作用からその物質を保護するための材料中でコーティングされ得る。
【０１６４】
「薬剤学的に許容可能な塩」とは、原物質の好ましい生物学的活性を保持し、何らの好ましくない毒性効果（Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 参照）を与えない塩を指す。このような塩の例には酸付加塩（acid addition salt）と塩基付加塩（base addition salt）を含む。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、３価リン酸などから誘導された無毒性無機酸だけでなく、脂肪族モノ−およびジカルボン酸、フェニルで置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような無毒性有機酸に由来する塩を含む。塩基付加塩はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から誘導されたものだけでなく、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性アミンから誘導されたものを含む。
【０１６５】
本発明の組成物は様々な形態になり得る。これらは、たとえば、液体溶液（たとえば、注射または注入可能な溶液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソームおよび座薬のような液体、半固体および固体剤形を含む。前記剤形は目的とする投与の方法と治療的適用によって異なる。組成物の例として注射または注入可能な溶液形態がある。一つの投与方法として非経口（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）投与がある。一つの実施形態において、ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を含む組成物は静脈内注入または注射によって投与される。他の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を含む組成物は筋肉内または皮下に注射される。
【０１６６】
本明細書に使用された「非経口投与」および「非経口で投与される」という文章は、腸内（enteral）および局部の投与を除く、一般的に注射による方法および静脈内、筋肉内、動脈内、包膜（脳、脊椎）内、包皮内、眼窩内（intraorbital）、心臓内（intracardiac）、皮膚内、腹腔内、呼吸管内、皮下内、上皮下、関節内、皮膜下、くも膜下、脊椎内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。
【０１６７】
医薬組成物は、典型的に産生と保管の条件下で無菌および安定でなければならない。試料準備過程でのエンドトキシンの水準はＵＳＰ２４／ＮＦ１９法によってリミュラスアメボサイトライセート試験（たとえば、Bio Whittaker lot # 7L3790のキットを用いて検出限界０．１２５ＥＵ／ｍｌ）でテストされ得る。医薬組成物の無菌性はＵＳＰ２４／ＮＦ１９法によってチオグリコレート培養液を用いて特定され得る。たとえば、準備された試料はチオグリコレート培養液に接種するのに使用され、３５℃で１４日またはそれ以上培養する。前記培養液は微生物の増殖を検出するために周期的に検査される。
【０１６８】
前記組成物は溶液、微細懸濁液、分散、リポソーム、または他の高濃度の薬に適した整頓された構造を有するように剤形化され得る。無菌の注射可能な溶液は活性合成物（すなわち、ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸）を必要な量で一つの成分または上で列挙した成分の組合せで適切な溶媒内に混合して製造され得、必要に応じて、フィルターを用いて殺菌できる。一般的に、分散液（dispersion）は活性合成物を基本的に分散媒質を含む無菌の運搬体および上に列挙した他の必要な成分に混合して準備される。無菌注射可能な溶液を準備するために無菌粉末を使用する場合、活性成分と予め無菌フィルターされた溶液から付加的に好ましい成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥法が好ましい。溶液の適切な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングを用い、分散の場合、好ましい粒子サイズを保持し、界面活性剤を用いることによって保持され得る。注射可能な組成物の長期間吸収は、たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチンのような吸収を遅延させる薬品を成分に含ませて可能にすることができる。
【０１６９】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を含む組成物は公知の様々な方法で投与され得る。色んな適用のための投与の経路／方法は静脈注射または注入である。たとえば、治療用適用のために、ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を含む組成物は３０，２０，１０，５または１ｍｇ／分以下の速度の静脈注入によって投与されて１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の量を投与し得る。投与の経路／方法は期待する結果によって変化し得る。ある実施形態においては、活性成分は迅速な放出から成分を保護できる、たとえば、調節性放出剤形、すなわち、移植、微細カプセル伝達システムのような担体とともに製造され得る。エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような剤形の準備のための多くの方法が特許されているか、一般的に知られている。たとえば、持続および調節放出薬物伝達システム（J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978）がある。
【０１７０】
特定の実施形態において、前記組成物は、たとえば、不活性希釈剤または同化し得る食用担体とともに経口投与され得る。前記化合物（および好ましい場合、他の成分）はまた硬質または軟質ゼラチンカプセルの外皮内に封入するか、錠剤形に圧縮するか、または対象者の飲食内に直接混合し得る。治療用経口投与のために、化合物は賦形剤とともに混合されて消化可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ剤、カプセル、エリクシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態に使用され得る。本明細書に記載された化合物を非経口投与以外の方法で投与するために、化合物を不活性化防止物質とともにコーティングするか、または共に投与することが必要であり得る。
【０１７１】
医薬組成物は公知の医療器具で投与され得る。たとえば、前記の実施形態において、本明細書に記載された医薬組成物は米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に公開された器具のような針のない皮下注射器具で投与され得る。本発明においてよく知られた有用な移植装置とモジュールは徐放性速度で薬物を分散させるための、移植可能な微細−注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）；皮膚を通過して薬を投与する治療器具（米国特許第４，４８６，１９４号）；正確な注入速度で薬を伝達するための薬物注入ポンプ（第４，４４７，２３３号）；継続的な薬物の伝達のための可変流速移植可能な注入装置（第４，４４７，２２４号）；多重チャンバー分画を有する浸透性薬物伝達システム（第４，４３９，１９６号）；および浸透性薬物伝達システム（第４，４７５，１９６号）を含み、他の公知の移植、伝達システム、そしてモジュールも含まれる。
【０１７２】
ある実施形態において、本明細書に記載された化合物は生体内での適切な分布のために剤形化され得る。たとえば、血液−脳障壁（ＢＢＢ）は多い強親水性化合物を排除させる。化合物のＢＢＢ通過を保障するために（好ましい場合）、たとえば、化合物はリポソーム内に剤形化され得る。リポソーム産生方法は、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号および第５，３９９，３３１号に記載されている。リポソームは特定の細胞或いは器官に選別的に運搬される一つまたはそれ以上の部分を含み得、標的化された薬物伝達を増進できる(たとえば、V.V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。
【０１７３】
投与処方計画は最適の好ましい反応（たとえば、治療反応）を提供するために調整され得る。たとえば、一回の錠剤が投与され得、数回にわたって長期間投与されるか、投与量は治療状況における必要性によって一定の比率で減少または増加させ得る。非経口用組成物を投与単位の形態で調製することは投与の容易性と投与量の一貫性のために特に利点がある。本明細書に使用された投与単位形態は治療対象者に単一投与量で適した物理的に分離された単位であって；各単位は目的とする治療効果を得るために計算された、定量の活性混合物と必要な薬剤学的担体を含む。投与単位形態の設計は、（ａ）活性成分の固有な特性と成就しようとする特殊な治療効果および（ｂ）このような活性成分を個人別敏感性の処置を目的とする成分化上の固有な制限点による。
【０１７４】
本明細書に記載された治療的または予防的に効果的な組成物の量は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましい量は１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１７５】
組成物は静脈内注入法によって３０，２０，１０，５，または１ｍｇ／分の速度で１〜１００ｍｇ／ｍ２または約５〜３０ｍｇ／ｍ２の投与量になるように投与され得る。投与量の値は緩和の値は緩和されなければならない疾患の種類と深刻性によって変化し得ることを念頭に置く必要がある。任意の特定対象に対して特異的投与計画は個人の必要と投与するヒトまたは組成物の投与を監督する者の専門的判断によって十分な時間を置いて調整しなければならず、本明細書で説明する投与量の範囲はただ例であり、これに制限されない。
【０１７６】
医薬組成物はジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸、たとえば、本明細書に記載されたタンパク質または核酸の「治療的に効果的な量」または「予防的に効果的な量」を含み得る。「治療的に効果的な量」とは、投与量および必要な時間周期で目的とする治療結果が得られる有効量を指す。組成物の治療的に効果的な量は、個人の疾病の段階、年齢、性別、および体重によって、そして前記タンパク質が個人において好ましい反応を導き出す能力によって変化し得る。治療的に効果的な量はまた組成物の任意の毒性または有害な効果も治療的に有益な効果より超えない量である。「治療的に効果的な投与量」は、測定可能な変数、たとえば、炎症または腫瘍の増殖速度を治療されていない対象に比べて少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも約８０％を抑制する。測定可能な変数、たとえば、腫瘍を抑制する成分の能力は、ヒト腫瘍における薬効を予測可能な動物モデルシステムで評価され得る。組成物のこの特性は当業界の熟練者に知られている試験法で抑制する成分の能力をインビトロで試験することによって評価され得る。
【０１７７】
「予防的に効果的な量」とは、投与量および必要な時間周期の間、目的とする予防的結果を達成するために効果的な量を指す。典型的に、予防的投与は疾病の初期段階以前または初期段階で用いられるため、予防的に効果的な量は治療的に効果的な量よりも少ないであろう。
【０１７８】
本発明の範囲にはジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を含むキットと使用法、たとえば、処理、予防または診断の用途の使用法もある。ジンクフィンガータンパク質がＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節する一つの実施形態において、治療的適用の使用法は腫瘍または腫瘍性疾患、または血管生成に関連する疾患（たとえば、特定の炎症疾患）を有する患者に提案される投与量および／または投与方法を含む。前記キットは診断用または治療用試薬のような一つ以上の追加的試薬を含み得るが、たとえば、本明細書に記載された診断用または治療用試薬および／または一つまたはそれ以上の区別された薬剤学的調製で適切に剤形化された一つ以上の追加的ジンクフィンガータンパク質または核酸である。
【０１７９】
＜治療（Treatments）＞
内因性遺伝子を調節できるジンクフィンガータンパク質、特に、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節できるタンパク質は治療および予防の用途に使用され得る。たとえば、該タンパク質と該タンパク質をコードする核酸はインビトロまたはインビボで培養細胞に投与するか、インビボでのように対象に投与することによって癌、特に転移性癌、炎症性疾患と血管生成に関連する疾病を治療、予防または診断するのに使用され得る。
【０１８０】
本明細書に使用されたように、「治療する」または「治療」は疾病、疾病の症状または兆しを治療するか傷を治療、弱化、減少、変化、治癒、除去、改善または影響を与えるためにジンクフィンガータンパク質が細胞内に入って遺伝子発現を調節できるようにする薬物を患者のような対象に加えるか、投与すること、または患者のような対象から分離した組織や細胞株のような細胞に薬物を加えるか投与するものと定義されるが、この際、患者とは、疾病（例：本文に使用された疾病）を有しているか、疾病の症状や兆しを示す対象を言う。
【０１８１】
一つの実施形態において、「細胞を治療すること」または「組織を処置すること」とは、ＶＥＧＦ−Ａ産生、血管生成の促進、細胞増殖のように細胞の活性が少なくとも一つ以上減少すること、または過多増殖する細胞または腫瘍のような組織内や周辺細胞のような細胞の活性を減少させることを意味する。このような減少には細胞や組織（例：転移組織）の活性や細胞の個数や組織のサイズ、および組織に供給される血の量の減少、たとえば、統計的に意味ある減少を含み得る。活性減少の例としては、細胞の移動（例：細胞外基質を通じた移動）、血管形成の減少、または細胞分化の減少がある。他の例としては、直接または間接的に炎症や炎症の標識を減少させるものがある。
【０１８２】
本明細書に使用されたように、ジンクフィンガータンパク質やそれをコードする核酸の治療に効果的な量または「治療効果量」とは、細胞治療において対象に単一投与や反復投与を通じて効果を示すタンパク質や核酸の量を意味する。
【０１８３】
本明細書に使用されたように、疾病の予防に効果的なジンクフィンガータンパク質やそれをコードする核酸の量またはタンパク質や核酸の「予防効果量」とは、単一投与や反復投与を通じて疾病（例：癌、血管生成関連疾病、または炎症疾患）の発病の開始を防ぐか、遅延させる効果を示すタンパク質やそれをコードする核酸の量を意味する。
【０１８４】
本明細書に使用されたように、「対象」はヒトやヒト以外の動物を含む。例示的対象は非正常な細胞増殖や分化として特徴付けられる疾病を有するヒト患者を含む。「ヒト以外の動物」はヒト以外のすべての脊椎動物、たとえば、非哺乳動物（例：ニワトリ、両棲類、爬虫類）およびヒツジ、イヌ、ウシ、ブタなどのようなヒト以外の霊長類のような哺乳動物を含む。
【０１８５】
一つの実施形態において、対象はヒトである。一つの実施形態において、ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸の組成物は獣医学的な目的やヒトの疾病に対する動物モデルとして使用するためにヒト以外の動物（例：霊長類、ブタまたはマウス）に投与され得る。動物モデルのような後者の場合は組成物の治療効果（例：投与量や投与時間の推移）を評価するのに有用であり得る。
【０１８６】
一つの実施形態において、本発明は、新生物性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、たとえば、新生物性疾患を治療するか、予防するほど十分な量で、ＶＥＧＦ−Ａまたはそれをコードする遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質のようなジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸で対象の細胞と接触する段階を含む。たとえば、この疾病は発癌性細胞、腫瘍細胞または転移性細胞によって誘発され得る。この方法は、インビトロやインビボ培養細胞に使用され得る。たとえば、発癌性細胞や転移性細胞（例：腎臓、膀胱、大腸、直腸、肺、乳房、子宮内膜、卵巣、前立腺、または肝の癌または転移性細胞）は細胞培養液中でインビトロで培養され得、接触段階はジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を培養液に入れることによって影響を受け得る。この方法はインビボ（例：治療用または予防用）プロトコールの一部であって、対象（例：ヒト）に存在する細胞（例：発癌性または転移性細胞）に適用され得る。インビボでの実施形態の場合、接触段階は対象内で影響を与え、対象の細胞にあるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節する効果を示す条件下でジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を対象に投与することを含む。
【０１８７】
前記方法は癌を治療するのに使用され得る。本明細書に使用されたように、「癌」、「過多増殖」、「悪性」および「新生物性」は互いに同じ意味で用いられ、速い増殖または新生物によって特徴付けられる非正常な状態や条件を意味する。この用語は、組織病理学的な形態と進行程度に関係なく、すべての形態の発癌性成長、発癌過程、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織または器官を含む。「病理学的な過多増殖」細胞は悪性腫瘍成長として特徴付けられる疾病状態で現れる。
【０１８８】
「組織新生」という用語の一般の医学的意味は新生物性細胞のような細胞に対する正常な成長調節に対する反応を欠く結果を示す「新しい細胞の成長」である。「増生」とは、非正常に成長速度が速くなった細胞を意味する。しかし、本明細書に使用するように、新生物と増生は互いに混用され得るが、内容が示すように、一般的に非正常な細胞の増殖速度を有する細胞を言う。新生物と増生は腫瘍を含み、これは陽性であるか、若しくは悪性転移または悪性であり得る。
【０１８９】
癌の例としては、固形癌、軟組織癌（soft tissue tumors）、転移性損傷（lesion）などを含むが、これに制限されない。固形癌の例としては、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例；大腸）および泌尿器官（例：腎臓、尿道細胞）、咽頭、前立腺、卵巣などの種々の器官に発生する肉腫（sarcoma)、腺癌（adenocarcinomas）と癌腫（carcinomas）などの悪性腫瘍（malignancy）だけでなく、大部分の大腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝癌、非細胞性肺癌、小腸癌などを含む腺癌（adenocarcinoma）が含まれる。前述した癌の転移性損傷は本明細書に記述されている方法または組成物によって治療または予防され得る。
【０１９０】
前記方法は、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例：大腸）、そして泌尿生殖器官（例：腎臓、尿道）、前立腺、卵巣、咽頭などの種々の器官に発生する悪性腫瘍および、大部分の大腸癌、腎臓細胞癌、前立腺癌、睾丸癌、非細胞性肺癌、小腸癌および食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌（adenocarcinoma）を治療するのに有用である。「癌または癌腫」は当業界の熟練者によって発見され得、呼吸系腫瘍、胃腸系腫瘍、泌尿器系腫瘍、睾丸腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、内分泌系腫瘍と黒色腫を含む上皮または内分泌系組織の悪性腫瘍を言う。癌腫の例としては絨毛癌と子宮頸部、肺、前立腺、乳房、子宮内膜、頭および首、大腸および卵巣などの組織から生成する癌を含む。この用語はまた、癌腫性および肉腫性組織から構成された悪性腫瘍などの癌肉腫を含む。「腺癌」は腺組織に由来する癌であるか、特徴的な腺構造を有している癌を言う。「肉腫」は当業界の熟練者によって発見され得、間葉細胞由来組織の悪性腫瘍を言う。
【０１９１】
前記方法はＶＥＧＦ−Ａを発現する造血幹細胞由来細胞の過多増殖／新生細胞の増殖を抑制するためにも使用され得る。
【０１９２】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸を投与する方法は「医薬組成物」部分に記述されている。用いられる物質の適正投与量は対象の年齢と体重、用いられる特定薬物によって異なる。
【０１９３】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸は対象に導入された後に対象内イメージングのために標識物質と連結され得る。適当な標識物質としてはＭＲＩで検出可能なものまたは放射線標識を含む。
【０１９４】
本明細書に記述されているジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸は単独で投与されるか、既存に存在する治療法と並行して投与され得、既存の方法は手術をはじめ放射線療法、化学療法などを含む。
【０１９５】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸、特にＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節（例：発現抑制）することは炎症性疾患や疾病を治療するために単独で投与するか、一つ以上の既存の治療方法と並行して投与し得る。代表的な炎症性疾患や疾病はリウマチ性関節炎、青少年慢性関節炎、乾癬、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、皮膚硬化症、糖尿病、アレルギーのような急性および慢性免疫疾患および自家免疫性疾患；喘息、同種異系移植（例、腎臓移植、心臓移植、脊椎移植、肝移植、膵臓移植、小腸移植、肺移植と皮膚移植など）に関連する急性または慢性免疫疾患；類肉腫症、慢性炎症性腸疾病、潰瘍性大腸炎、クローン病変や疾病のような慢性炎症性病変；播種性血管内凝固、動脈硬化、カワサキ病変および血管炎症候群（たとえば、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、巨大細胞関節炎および腎臓微細血管炎など）の血管炎症性病変；慢性活性肝炎; シェグレン症候群;乾癬性関節炎；腸疾患性関節炎；反応性関節炎と炎症性腸疾病に関連する関節炎；ブドウ膜炎などを含む。
【０１９６】
炎症性腸疾病（ＩＢＤ）は一般的な慢性、再発性胃腸炎を含む。ＩＢＤとは、クローン疾病と潰瘍性大腸炎の二つの特徴的な疾病を言う。ＩＢＤの臨床的な症状は間歇的な直腸出血、痙攣性腹痛、体重減少および下痢を含む。潰瘍性大腸炎の臨床活性指数（Clinical Activity Index）のような臨床的指標がＩＢＤをモニターするために使用され得る（文献［Walmsley et al. Gut. 1998 Jul;43(1):29-32］および［Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2):164-71］参照）。
【０１９７】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸は前述した疾病の一つを治療または予防するのに使用され得る。たとえば、このタンパク質は、各々の疾病の少なくとも一つの症状を緩和させるのに効果的な量が（局部的または全身的に）投与され得る。このタンパク質はまた局部体温、浮腫（例：測定されるもの）、赤み、局部または全身の白血球の数、好中球の存在有無、サイトカイン水準などのような炎症の標識のような炎症を緩和できる。タンパク質の投与前、投与中、投与後に上述した対象の炎症標識のうちの一つまたはそれ以上を評価できる。
【０１９８】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸、特にＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節（例：ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子発現活性化）することは傷の治癒を向上させることのように傷を治療するために単独で投与するか、既存の治療方法のうちの一つまたはそれ以上と並行投与できる。たとえば、一般的にＶＥＧＦ−Ａ活性化は新しい血管や毛細血管形成を増加させる。そのタンパク質や核酸は手術、火傷、外傷、潰瘍、骨折、および血管生成を増加させることが必要な他の疾病を緩和させるのに使用され得る。
【０１９９】
ジンクフィンガータンパク質またはそれをコードする核酸、特にＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を調節（たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の発現増加）できるタンパク質または核酸は虚血性心臓疾患、四肢動脈疾患または心臓動脈疾患のような心血管疾患の治療のために単独で投与されるか、既存の治療方法のうち一つまたはそれ以上と並行して投与できる。
【実施例】
【０２００】
本発明は、下記実際的な実施例を通じてさらに具体的に記述されるであろう。しかし、これらの実施例は本発明の範囲を制限しようとする意図で提供されたものではないことを留意しなければならない。
【０２０１】
実施例１：ゲル移動分析
本実施例はインビボ（in vivo）でジンクフィンガータンパク質のＤＮＡ結合特性を評価するための方法を提供する。ジンクフィンガータンパク質を大腸菌で発現させ、精製した後、ゲル移動分析実験に用いた。ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片をpGEX-4T2（Pharmacia Biotech）に挿入した。ＧＳＴ（glutathione-S-transferase）に融合したジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質を生産するために前記構造物を大腸菌ＢＬ２１で発現させた。前記融合タンパク質をグルタチオン親和クロマトグラフィー（glutathione affinity chromatography, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて精製した後トロンビンで切断した。トロンビンはＧＳＴ残基とジンクフィンガータンパク質との間のリンカー（linker）配列を切断する。
【０２０２】
様々な量のジンクフィンガータンパク質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．７）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４、１０％グリセロール、０．１％ノニデットＰ−４０（Nonidet P-40）、５ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（bovine serum albumin）含有緩衝溶液中で放射性同位元素で標識されたＤＮＡプローブと室温で１時間反応させた後、前記反応混合物をゲル電気泳動で分析した。ゲル上のプローブの分布をPHOSPHORIMAGER（商標）分析（Molecular Dynamics）によって定量した。解離定数（dissociation constant, Kd）は文献に記述された通りに決定した（RebarおよびPabo(1994) Science 263:671-673）。
【０２０３】
本発明者らは、インビボ酵母分析で機能をするジンクフィンガータンパク質が生化学的活性もまた有していることを既に発見したことがある。一般的に、たとえば、３つのジンクフィンガードメインを有するジンクフィンガータンパク質が１ｎＭ以下の解離定数でＤＮＡ配列に結合するならば、前記ジンクフィンガータンパク質は米国出願公開第２００２−００６１５１２号に記述された単一−ハイブリッド化酵母分析法（one-hybrid yeast assay）で細胞成長を可能にする反面、ジンクフィンガータンパク質が１ｎＭ以上の解離定数でＤＮＡ配列に結合するならば、前記分析において細胞成長は可能でない。１ｎＭ以上５０ｎＭ未満の解離定数で結合するジンクフィンガータンパク質もまた有用できる。たとえば、より硬いか特異的な結合剤（binder）を生産するために付加的なフィンガーが前記ジンクフィンガーに添加され得る。
【０２０４】
インビボ分析は特定の３−ｂｐまたは４−ｂｐ部位に対する個別ジンクフィンガードメインの結合を評価するために適用され得る。一つの実施形態において、個別ジンクフィンガードメインはＺｉｆ２６８のフィンガー１および２と、ｉ）フィンガー１および２によって認識される塩基対と、ｉｉ）特定の３−ｂｐまたは４−ｂｐ部位を含む標的部位の関係において評価される。
【０２０５】
実施例２：個別３−フィンガータンパク質の製造
本実施例は、キメラ３−フィンガータンパク質をコードする核酸の製造方法を提供する。哺乳類細胞においてキメラジンクフィンガータンパク質を発現させるためにベクターＰ３（Toolgen, Inc.）を用いた。Ｐ３はベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, San Diego CA）の変形を通じて製作された。連結可能な突出末端（overhangs）を有する合成オリゴヌクレオチド二本鎖をHindIIIおよびXhoIで切断されたｐｃＤＮＡ３ベクターに連結した。前記二本鎖はヘマグルチニン（hemagglutinin, HA）タグ（tag）と核位置信号（nuclear localization signal, NLS）をコードする核酸を含む。前記二本鎖はまたＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩおよびＢｇｌII切断部位および停止コドンを含む。さらに、前記で生成したベクターをＸｍａＩで切断し、切断部位の突出末端を埋めた後、両末端を再連結することによって、このベクターのＳＶ４０複製起源内のＸｍａＩ切断部位を除去した。
【０２０６】
下記は多重ジンクフィンガードメインを有するキメラジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミドを製作する一つの例示的な方法である。まず、単一ジンクフィンガードメインをコードする挿入体（insert）を一つのジンクフィンガードメインをコードする配列を有するベクター（Ｐ３ベクター）に挿入した。前記クローニングの結果として２つのジンクフィンガードメインを有するジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミドが得られた。２つのジンクフィンガードメインからなるジンクフィンガードメイン挿入体を前記方法によって製造した後、一つまたは二つのジンクフィンガードメインを有するAgeI／NotI切断によって線形化されたベクターＰ３にクローニングして３つまたは４つのジンクフィンガードメインから構成されたジンクフィンガータンパク質遺伝子を含むプラスミドを得た。
【０２０７】
キメラジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子をｐ６５転写活性ドメイン、Ｋｉｄ転写抑制ドメインまたはＫｏｘ転写抑制ドメインのような機能性ドメインをコードする予め準備されたプラスミドにクローニングした。キメラジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子を含む前記プラスミドをEcoRI／NotIで切断した後、同じ制限酵素によって線形化されたプラスミド内に挿入した。レセプタープラスミド（ｐＬＦＤ−ｐ６５，ｐＬＦＤ−ＫＲＡＢ，ｐＬＦＤ−ＫＯＸ）のクローニング部位は機能性ドメインに対してＤＮＡ結合部位がＮ−末端になり得る位置にジンクフィンガードメインをコードする配列を位置させた。これから得た構造物はＮ−末端からＣ−末端にＨＡ−タグ、核位置信号、ジンクフィンガータンパク質および機能性ドメインを含むタンパク質をコードする。
【０２０８】
実施例３：ヒトジンクフィンガードメインを有する３−フィンガータンパク質のインビボ分析
新しい３−フィンガータンパク質がインビボで機能的であるかどうかを決定するためにインビボ抑制分析法が用いられた。たとえば、文献キムおよびパボ（KimおよびPabo, (1997)J. Biol. Chem. 272:29795-29800）を参照されたい。前記分析法はキムおよびパボの構造物（前記文献参照）でＺｉｆ２６８部位の位置に相応する位置に標的部位が存在するルシフェラーゼレポーター構造物を用いた。
【０２０９】
前記ルシフェラーゼレポータープラスミドはｐＧＬ３−ＴＡＴＡ／Ｉｎｒ（KimおよびPabo、前記文献参照）の変異体であるp△S-modiから製作された。前記レポーターはレポータータンパク質としてホタルルシフェラーゼを用いた。TATAボックスの上流SacI 切断部位をp△S-modiから除去した。新しいSacI 切断部位を転写開始部位の次に挿入した。互いに異なるレポータープラスミドが互いに異なるジンクフィンガータンパク質の各々に対して製作された。各々のプラスミドを製作するために、特定のジンクフィンガータンパク質と相互作用すると予想される特異的９−ｂｐ結合部位を含むオリゴマーを前記プラスミドに挿入した。プラスミドp△S-modiをSacIおよびHindIIIで切断した後、前記オリゴマーを挿入した。この操作は転写開始部位から１２−ｂｐ下流に位置する１４−ｂｐを取り替えた。これから得られたレポータープラスミドをｐ１Ｇ−ＺＦＰ  ＩＤとして命名したが、本明細書においてＩＤは相応するジンクフィンガータンパク質の名前である。
【０２１０】
特定の３−フィンガータンパク質のインビボ活性を以下のように分析した。ＨＥＫ２９３細胞を４つのプラスミドでトランスフェクト（transfection）した：特定の３−フィンガータンパク質を発現するプラスミド１４ｎｇ；前記に記述されたレポータープラスミド１４ｎｇ；ＧＡＬ４−ＶＰ１６を発現するプラスミド７０ｎｇ；およびレニラー（Renillar）ルシフェラーゼを発現するプラスミド１．４ｎｇ。ＧＡＬ４−ＶＰ１６は特定の３−フィンガータンパク質によるレポーター抑制不在時の最小合成プロモーターの転写を活性化させる。他のジンクフィンガータンパク質の能力をまた他の３−フィンガータンパク質と比較した。レニラールシフェラーゼを発現するプラスミドはトランスフェクト効率の対照群を提供した。
【０２１１】
リポフェクタミン（LIPOFECTAMINE（商標）、Gibco-BRL）がトランスフェクトのために用いられた。細胞は９６−ウェルプレートのウェルで３０〜５０％の懸濁度（confluency）でトランスフェクトされた。前記細胞を２日間培養した後ルシフェラーゼの分析のために収穫した。その後、二重−ルシフェラーゼレポーター分析システム（DUAL-LUCIFERASE（商標） Reporter Assay System, Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。前記で観察されたホタルルシフェラーゼの活性を、観察されたレニラールシフェラーゼの活性を用いて補正した。抑制または「抑制−倍数（fold-repression)」の程度をジンクフィンガータンパク質の不在時の補正されたレポーター発現値をジンクフィンガータンパク質存在時の補正されたレポーター発現値で割って計算した。
【０２１２】
ジンクフィンガータンパク質はトランスフェクト分析において少なくとも２倍以上の転写抑制を示す場合には高い厳格性（stringency）のカット−オフ（cut-off）値を満たすものとして、またはトランスフェクト分析において１．５〜２倍の転写抑制を示す場合には低い厳格性のカット−オフ値を満たすものとして分類された。
【０２１３】
実施例４：ＺＦＰｓとこれらの特異的レポーターの結合分析結果
インビボ分析で観察された活性を結合親和度と連関させるためにゲル移動分析（gel shift assay）を用いた。互いに異なる標的配列に対するＺｉｆ２６８の結合をゲル移動分析および前記実施例３に記載されたトランスフェクト分析を用いて評価した。ゲル移動分析によって測定された解離定数と上述したトランスフェクト分析における転写抑制水準との間に良好な相互連関性が確認された。一般的に、トランスフェクト分析において２倍以上の抑制（すなわち、５０％の抑制）を示すジンクフィンガータンパク質はゲル移動分析によって測定されたように１ｎＭ以下の解離定数を示した。
【０２１４】
実施例５：３−フィンガータンパク質の特性分析
二つの形態の「３−フィンガー」キメラジンクフィンガータンパク質を製造した。一つは、天然型ヒトジンクフィンガードメインのみから構成されたキメラタンパク質を含むが、前記ドメインは天然型（naturally-occurring）ヒトジンクフィンガードメインと同じである。もう一つは天然型ジンクフィンガードメインと同一でないジンクフィンガードメインを含むキメラタンパク質を含む。後者のジンクフィンガードメインは典型的に天然型ジンクフィンガードメインのインビボ突然変異とファージディスプレイ選択（phage display selection）によって同定された。このような突然変異ドメインは自然的進化の厳格性を避けたものである。
【０２１５】
総３６個のジンクフィンガードメイン、すなわち、１８個のヒトジンクフィンガードメインおよび１８個の突然変異ジンクフィンガードメインが検定３−フィンガータンパク質の一セットを組み立てるのに用いられた。突然変異されたジンクフィンガードメインは文献（ChooおよびKlug(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11168-11172; DesjarlaisおよびBerg(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:11099-11103;Dreierら(2001) J. Biol. Chem. 276:29466-29478;Dreierら(2000) J. Mol. Biol. 303:489-502; Fairallら(1993) Nature 366:483-487; GreismanおよびPabo (1997) Science 275:657-661; KimおよびPabo (1997) J. Biol. Chem. 272:29795-29800; Segalら(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-2763）などに記述されている。米国出願公開第２００３−１６５９９７号の表９もまた参照されたい。３６個のドメインをコードする核酸をEcoRIおよびNotIで切断されたＰ３ベクターに個別的にサブクローニングした後、生成したプラスミドをキメラジンクフィンガータンパク質の製作のための出発物質として用いた。
【０２１６】
キメラ３−フィンガータンパク質をコードする核酸を二つの異なる方法によって製造した。一番目の方法では、全てのジンクフィンガードメインをコードする核酸を無作為に混合し、３−フィンガー構造物を以降の分析のために無作為に選別した。各構造物の塩基配列を分析し、それがコードするポリペプチド内の構成ジンクフィンガードメインを決定した。次いで、無作為に分類された各々の３−フィンガータンパク質に対して標的ＤＮＡ配列を合成した。前記標的ＤＮＡ配列は予想される選好標的部位を基にした。前記標的を前述のルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングした。このような接近方式を「ジンクフィンガータンパク質−優先」接近方式という。
【０２１７】
二番目の方法では、キメラ３−フィンガータンパク質をコードする核酸を特定の標的ＤＮＡ配列に基づいて組み立てた。ジンクフィンガードメインの認識部位と標的ＤＮＡ配列を連結するためにコンピュータアルゴリズムが用いられた。公知の遺伝子のプロモーター配列が入力標的ＤＮＡ配列として用いられた。前記プロモーター配列をスキャンして９個のヌクレオチドの長さでジンクフィンガードメインの利用可能な集合が提供されたキメラ３−フィンガータンパク質によって認識される許容可能な標的部位である断片を同定した。一旦同定されると、キメラ３−フィンガータンパク質をコードする核酸を製作した。この接近方式を「標的部位−優先」接近方式という。
【０２１８】
塩基接触残基の２番位置にアスパラギン酸残基を含むジンクフィンガードメインを特に考慮して分析した。前記ジンクフィンガードメインはＲＤＥＲ１，ＲＤＨＴ，ＲＤＮＲ，ＲＤＫＲ，ＲＤＴＮ，ＴＤＫＲおよびＮＤＴＲを含む。ＤＮＡに結合したＺｉｆ２６８のＸ線共同結晶構造（X-ray co-crystal structure）は２番位置のアスパラギン酸がジンクフィンガーによって認識される３−ｂｐ下位部位外の一つの塩基と水素結合を形成できることを示す。その結果、２番位置にアスパラギン酸残基を含むＲＤＥＲフィンガーは４−ｂｐ部位を選好する：５’−ＧＣＧ（Ｇ／Ｔ）−３’。前記コンピュータアルゴリズムはこのような付加的な特異性を考慮した。２番位置にアスパラギン酸残基を有するフィンガーを含み、４−ｂｐ部位に対する前記規則を従わない無作為に組み立てられた３−フィンガータンパク質は本明細書に記述された他の分析で除外された。
【０２１９】
総１５３個の３−フィンガータンパク質が「ジンクフィンガータンパク質−優先」および「標的部位−優先」接近方式によって製造された。これらのタンパク質を実施例３に記載された一時的共同−トランスフェクト分析法で検証した。
【０２２０】
１５３個のキメラジンクフィンガータンパク質のうち３１個が高い厳格性基準である２倍抑制（ＲＦ２；ＲＦ＝抑制倍数）以上を示した。全般的に天然型ヒトジンクフィンガードメインのみから製作されたタンパク質の場合、２８．１％（９６個のうち２７個）が高い厳格性基準を通過し、５９．４％は低い厳格性基準（ＲＦ１．５）を通過した。２つの天然型ヒトジンクフィンガードメインと１つの突然変異ドメインで製作されたタンパク質のうちでは、３３．３％が高い厳格性基準を通過し、２０％のみが低い厳格性基準を通過した。
【０２２１】
これに対し、１つのヒトドメインと２つの突然変異ドメインで製作された１７個のタンパク質の場合は１つのタンパク質（５．９％）のみが高い厳格性基準を通過し、２つのタンパク質（１１．８％）のみが低い厳格性基準を通過した。驚いたことに、全般的に突然変異ドメインのみから構成されたジンクフィンガータンパク質のうちのいずれも抑制分析法で高い厳格性基準を満たしていない。このようなタンパク質のうち一つ（４％）のみが低い厳格性基準を満たした。この結果は、天然型ヒトジンクフィンガードメインが突然変異ドメインよりも新しいＤＮＡ−結合タンパク質の製造に遥かに優れたビルディングブロックであることを示すものである。
【０２２２】
実施例６：ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に結合するキメラジンクフィンガータンパク質の考案
本実施例において、本発明者らはヒト血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）遺伝子内のＤＮＡ構成要素に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を考案した。ＶＥＧＦ−Ａプロモーターの−９５０から＋４５０地域をスキャンして３−フィンガーの形態でジンクフィンガードメインの利用可能な組合せによって認識され得る９個のヌクレオチド部位を同定した。
【０２２３】
本発明者らはこのような９個のヌクレオチド部位を認識するように考案されたドメインを含むジンクフィンガータンパク質をコードする数個のＤＮＡ構造物を製作した。前記タンパク質を大腸菌で発現させた後精製した。本発明者らはＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）実験を通じてこれらのＤＮＡ結合特異性を調査した。ＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的に考案された多くのジンクフィンガータンパク質は予想されるＤＮＡ結合特異性を示した。ＳＥＬＥＸ分析によって得られたほとんどすべての保存的な配列はＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の意図された標的配列と同じであった。１つの例示的なジンクフィンガータンパク質としてＦ１２１はこれに相応するジンクフィンガーが塩基認識において縮退（degeneracy）を示す位置における一つの塩基が意図された標的配列と異なる保存的な配列を示した。
【０２２４】
このような人工的なジンクフィンガーから構成されたＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子は３つのジンクフィンガードメインをコードする核酸をｐ６５またはＶＰ１６活性ドメインをコードする核酸に融合させて製造した。その結果として生成した核酸を発現プラスミドに挿入した。
【０２２５】
図４は、このようなキメラジンクフィンガータンパク質によって認識されるＶＥＧＦ−Ａプロモーター内のＤＮＡ結合部位の位置を示す。ヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターは少なくとも２つのDNase I−過敏性地域（hypersensitive regions）を含む。これらの部位に対する操作されたジンクフィンガータンパク質転写因子の結合はＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の発現を活性化させ得る。Ｆ４８０は、約−６３３Ｒ（「Ｒ」は逆方向ストランドを意味する）で結合部位を認識するように考案された。Ｆ４７５は、約−４５５で結合部位を認識するように考案された。Ｆ４３５は、約−３９１Ｒと−９０Ｒで結合部位を認識するように考案された。Ｆ８３は、約＋３５９で結合部位を認識するように考案された。Ｆ１２１は、約＋４３４で結合部位を認識するように考案された。
【０２２６】
本発明者らは、結合部位の位置に関わらず、調査された４つのジンクフィンガータンパク質（Ｆ４８０，Ｆ４７５，Ｆ１２１およびＦ４３５）がＶＥＧＦプロモーターの調節下でルシフェラーゼレポーター遺伝子だけでなく、内因性ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子自体も活性化させることを発見した。一時的にトランスフェクトされた細胞の培地を用いたＥＬＩＳＡはこれらのキメラジンクフィンガータンパク質がまたＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生を上向きに調節（up-regulation）して１３〜２１倍増加させることを示した。
【０２２７】
２つのキメラジンクフィンガータンパク質、Ｆ４３５とＦ１２１を各々ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合させると、これらは各々ＨＥＫ２９３細胞でＶＥＧＦ−Ａ発現を活発に抑制した。いずれのジンクフィンガータンパク質暗号化配列も含まない親発現ベクターでトランスフェクトされた対照群細胞はＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡまたはタンパク質水準で何らかの増減も示さなかった。
【０２２８】
タンパク質Ｆ８３は前記分析でＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の水準に何らかの効果も示さなかった。これは、標的部位または局所的染色質構造にある他のタンパク質の結合に基づくものとみられ、このような結合は標的ＤＮＡがジンクフィンガータンパク質に接近できないようにする。これらのジンクフィンガータンパク質によるVEGF-Aの発現水準とこれらのDNA-結合親和力またはこれらの細胞内発現水準との間には何らの顕著な相関関係もなかった。
【０２２９】
ゲノム全体（genome-whole scale）に対するジンクフィンガータンパク質の特異性を調査するために、本発明者らは下記３つの種類のジンクフィンガー転写因子のいずれか一つをコードするＤＮＡ構造物で安定的にトランスフェクトされた２９３細胞を対象にＤＮＡマイクロアレイ（microarray）実験を行った：Ｆ１２１−ｐ６５，Ｆ４３５−ｐ６５およびＦ４７５−ＶＰ１。７４５８個の遺伝子のうち５１個が３種のジンクフィンガー転写活性タンパク質のすべてによって調節された。４９個が２倍以上上向きに調節され、２個は２倍以上下向きに調節された。このような同時に調節された遺伝子の大部分がＶＥＧＦ−Ａ機能と密接に関連しているとみられる。これらのう中の多数がＶＥＧＦ−Ａによって調節され、血管生成（angiogenesis）または低酸素症（hypoxia）に関与するか、血管内皮細胞で発現される。したがって、これらの遺伝子はＶＥＧＦ−Ａ発現の下流標的であるとみられる。また、数多くの他の遺伝子が検証された３つのタンパク質のすべてによってではなく、１つまたは２つのジンクフィンガータンパク質活性剤（activators）によって調節された。これらのジンクフィンガータンパク質は９−ｂｐ部位を認識するので、これらのジンクフィンガータンパク質が、たとえば、他の遺伝子内の同一または関連する標的部位に結合することによってＶＥＧＦ−Ａ以外の他の遺伝子を直接調節することが可能である。４，５または６−フィンガータンパク質の製作は特異性を向上させるであろう。総合すれば、前記結果は天然型ジンクフィンガードメインのシャフリング（shuffling）によって組み立てられた前記に記載されたジンクフィンガータンパク質が細胞内で特異的な内因性遺伝子の転写調節子として作用することを示す。
【０２３０】
たとえば、本明細書に記載されたタンパク質は下記の遺伝子の一つ以上を調節するであろう：ｊｕｎ  Ｂ原癌遺伝子（proto-oncogene）（N94468）、ＥｐｈＡ２（H84481）、ＥｐｈＢ４（AI261660）、繊維芽細胞成長因子レセプター３（fibroblast growth factor receptor 3）（軟骨無形成症［achondroplasia］、致死性骨格異形成症［thanatophoric dwarfism］）（AA419620）、ＦＫ５０６−結合タンパク質８（３８ｋＤ）（N95418）、タンパク質キナーゼＣ、ゼータ（zeta）（AA458993）、ｖ−ｅｒｂ−ｂ２鳥類赤血球性貧血ウイルス発癌遺伝子同族体３（avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3）（AA664212）、レクチン（lectin）、ガラクトシド−結合（galactoside-binding）、水溶性、１（ガレクチン［galectin］１）（AI927284）、タンパク質ホスファターゼ２（protein phosphatase 2）、調節性サブユニットＢ（regulatory subunit B）（Ｂ５６）、アルファイソ型（alpha isoform）（R59165）、インシュリン−類似成長因子２（insulin-like growth factor 2）（ソマトメジンＡ［somatomedin A］）（N54596）、プレクチン１（plectin 1）、中間微細繊維結合タンパク質（intermediate filament binding protein）、５００ｋＤ（ＡＡ４４８４００）、ペリプラキン（Periplakin）（ＡＩ７０３４８７）、コリンキナーゼ（choline kinase）（Ｈ０９９５９）、コラーゲン、タイプＶＩ、アルファ１（Ｈ９９６７６）、アダプタ−関連タンパク質複合体１（adaptor-related protein complex 1）、シグマ１サブユニット（sigma 1 subunit）（Ｗ４４５５８）、アレスチン（arrestin）、ベータ２（ＡＷ００９５９４）、ＧＡＴＡ−結合タンパク質２（Ｈ００６２５）、サイクリン−依存性キナーゼ抑制剤１Ａ（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A）（ｐ２１、Ｃｉｐ１）（ＡＩ９５２６１５）、ミトゲン−活性タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ１１（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11）（Ｒ８０７７９）、アセチルコリンエステラーゼ（acetylcholinesterase）（ＹＴ血液群）（ＡＩ３６０１４１）、脳−特異的Ｎａ−依存性無機リン酸塩同時伝達子（brain-specific Na-dependent inorganic phosphate cotransporter）（ＡＡ７０２６２７）、細胞性レチノイン酸−結合タンパク質１（cellular retinoic acid-binding protein 1）（ＡＡ４５４７０２）、細胞性レチノイン酸−結合タンパク質２（ＡＡ５９８５０８）、カドヘリン１３（cadherin 13）、Ｈ−カドヘリン（心臓）（Ｒ４１７８７）、カルシウムチャンネル、電圧−依存性、ベータ３サブユニット（calcium channel, voltage-dependent, beta 3 subunit）（Ｒ３６９４７）、炭酸脱水酵素ＸＩ（carbonic anhydrase XI）（Ｎ５２０８９）、トロポニンＴ１（troponin T1）、骨格、低速（slow）（ＡＡ８６８９２９）、ガンマ−アミノ酪酸（gamma-aminobutyric acid、GABA）Ｂレセプター、１（Ｎ７０８４１）、アデニレートシクラーゼ活性ポリペプチド１（adenylate cyclase activating polypeptide 1）（脳下垂体）レセプタータイプＩ（Ｈ０９０７８）、溶質輸送体ファミリー４（solute carrier family 4）、アニオン交換体（anion exchanger）、メンバー２（赤血球膜タンパク質バンド−３類似１［erythrocyte membrane protein band 3-like 1］）（Ｗ４５５１８）、グリピカン１（glypican 1）（ＡＡ４５５８９６）、タンパク質Ｃ抑制剤（プラスミノゲン活性剤抑制剤III［plasminogen activator inhibitor III］）（Ｗ８６４３１）、サイクリン−依存性キナーゼ抑制剤１Ｃ（ｐ５７，Ｋｉｐ２）（ＡＩ８２８０８８）、ジンクフィンガータンパク質４３（ＨＴＦ６）（ＡＡ７７３８９４）、マウスにおいてＺｆｐ−３６のジンクフィンガータンパク質同族体（Ｒ３８３８３）、メイス（Meis）（マウス）同族体３（ＡＡ７０３４４９）、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連、基質連合（matrix associated）、クロマチン（chromatin）のアクチン依存性調節子、サブファミリーｄ、メンバー３（ＡＡ０５３８１０）、未詳（Ｒ１１５２６）、未詳（ＡＡ０４５７３１）、未詳（Ｔ５１８４９）、未詳（Ｔ５０４９８）、暫定的遺伝子産物（putative gene product）（Ｈ０９１１１）、Ｂ／Ｋタンパク質（Ｈ２３２６５）、損傷−特異的ＤＮＡ結合タンパク質２（４８ｋＤ）（ＡＡ４１０４０４）、ジヒドロピリミジナーゼ−類似４（dihydropyrimidinase-like 4）（ＡＡ７５７７５４）、Ｎ−メチルプリン−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（N-methylpurine-DNA glycosylase）（Ｎ２６７６９）、タンパク質チロシンホスファターゼ、レセプタータイプ、Ｎ（Ｒ４５９４１）、線維束性収縮および延長タンパク質ゼータ１（fasciculation and elongation protein zeta 1）（zygin I）（Ｈ２０７５９）、ラノステロール合成剤（lanosterol synthase）（２，３−オキシドスクアレン−ラノステロールシクラーゼ［2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase］）（ＡＡ４３７３８９）、スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチル転移酵素（spermidine/spermine N1-acetyltransferase）（ＡＡ０１１２１５）、およびトロンボスポンジンタイプ１モチーフ（thrombospondin type 1 motif）を有するジスインテグリン−類似および金属タンパク分解酵素（disintegrin-like and metalloprotease）（レプロライシンタイプ［reprolysin type］）、１（Ｔ４１１７３）。前記タンパク質またはこれらをコードする遺伝子の発現は少なくとも０．５，１．０，２，５，１０または５０倍、たとえば、２〜８０倍程度調節され得る。
【０２３１】
ＶＥＧＦ−Ａプロモーター内の例示的部位およびこれらを認識できるタンパク質は下記を含む：
【表７】
2006508675.tif 000009
【表８】
2006508675.tif 000010
【表９】
2006508675.tif 000011
【表１０】
2006508675.tif 000012
【表１１】
2006508675.tif 000013
【０２３２】
ジンクフィンガーライブラリーのための酵母発現プラスミドの製作
本発明者らはｐＰＣ８６（Chevray and Nathans(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793）の変形によってジンクフィンガー転写因子をコードする発現プラスミドを製作した。Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子をｐＰＣ８６のSalIおよびEcoRI切断部位の間に挿入してＧａｌ４活性ドメインがＺｉｆ２６８ドメインに融合しているｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆを製造した。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆをジンクフィンガーライブラリーを製造するためのベクターとして用いた。ヒトジンクフィンガーライブラリーを製造するために、ジンクフィンガーをコードするＤＮＡ断片を重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）（Promega, Madison, WI）と天然型ジンクフィンガータンパク質内のジンクフィンガーの間の連接部（junction）において頻繁に発見される配列Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ／Ｇｌｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅを有する変性（degenerate）ＰＣＲプライマーの混合物を用いてヒトゲノムＤＮＡから増幅した。ジンクフィンガーをコードする１００−ｂｐ  ＰＣＲ産物をＳａｃIIおよびＡｖａＩで切断した後、ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆに挿入したが、前記ＰＣＲ産物はＺｉｆ２６８のフィンガー１および２とヒトゲノムに由来するジンクフィンガードメイン（共に３−フィンガータンパク質を構成する）から構成されたハイブリッド（hybrid）化転写因子を暗号化する。前記プラスミドライブラリーは総１．２×１０６大腸菌形質転換体から製造された。
【０２３３】
レポータープラスミドは３つのコピー（copy）の９−ｂｐ標的配列を含む６４対の相補的なオリゴヌクレオチドのいずれか一つをｐＲＳ３１５（His）およびｐＬａｃＺｉ（Clontech, Palo Alto, CA）に挿入して製造された。
【０２３４】
ヒトゲノムから選択されたヒトジンクフィンガードメインのギャップ復旧クローニング
個別的ジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡ配列のギャップ復旧クローニング（gap repair cloning）を文献に記述された通りに行った（Hudsonら(1997)Genome Res. 7:1169-1173）。ジンクフィンガードメインをコードする一つのＤＮＡ断片をクローニングするために、２つの重なり合う（overlapping）オリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドは個別的ジンクフィンガードメインをコードする核酸配列にアニーリングできる特定の配列だけでなく、ＰＣＲの２番目の反応のためにその３’−末端に２１−ｂｐ共通尻尾（common tail）を含む。ジンクフィンガーをコードするＤＮＡ配列は同じモル濃度で混合された２つの相応するオリゴヌクレオチドの混合物を用いてヒトゲノムＤＮＡから増幅された。
【０２３５】
ＰＣＲ初期反応から増幅された産物を二番目のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。２番目のＰＣＲ反応のためのプライマーは２つの地域を有するが、一つはｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆの断片と同じであり、もう一つは２１−ｂｐ共通尻尾と同じである。２番目のＰＣＲ反応産物の混合物とＭｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで切断されて線形化されたｐＰＣＦＭ−ＺｉｆをｙＷ１（MATα △gal4 △gal80 lys2801 his3-△200 trp1-△63 leu2 ade2-101CYH2）酵母菌株に形質転換させた。この方法によって総８２３個のヒトジンクフィンガーがクローニングされた。多くのクローンが本明細書に記載されたインビボでの選別方法に用いられた。
【０２３６】
ジンクフィンガードメインのインビボでの選別
３−ｂｐ標的部位の各々に結合するジンクフィンガーの同定を容易にするために酵母交雑法（yeast mating）を用いた。ジンクフィンガーライブラリーをｙＷ１（ＭＡＴα）菌株に導入し、これから〜１．４７×１０６個の個別的形質転換酵母クローンを得た。これらの形質転換細胞の分液（aliquot）を一倍体酵母菌株ｙＷ１（ＭＡＴα）と３０℃で５時間交雑させたが、前記形質転換細胞は２つのセットの各々に６４個のレポータープラスミドを含んでいる（レポーター遺伝子の各々に対して一つずつ）。前記レポータープラスミドはＬａｃＺまたはＨＩＳ３遺伝子のコーディング地域に隣接する３つのコピー数の標的ＤＮＡ配列を含んでいる。これから得られた一倍体をＸ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）および３−アミノトリアゾール（3-amino triazole, 3-AT）（１ｍＭ）を含むが、ヒスチジン（histidin）を欠く選択培地に塗抹した。青色（陽性）コロニーから分離されたプラスミドを前記結果を確認するために再度形質転換させ、塩基配列を分析してこれらのコーディングジンクフィンガードメインを同定した。Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２に融合した各々のジンクフィンガーの結合親和力および特異性を酵母内でＥＭＳＡを用いて決定した。これらの方法を下記に説明する。
【０２３７】
モジュールビルディングブロック（modular building block）として選別されたジンクフィンガーを用いた３−フィンガータンパク質の製造
ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, Carlsbad, CA）ベクターの変異体ベクター（Ｐ３）を哺乳類細胞でジンクフィンガータンパク質を発現させるための親ベクターとして用いた。Ｐ３はＨＡタグおよび核位置信号を含むが、これらはいずれも開始コドンの３’−末端に挿入した。個別ジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡ断片をＰ３ベクターのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位の間にサブクローニングし、これから得られたプラスミドをキメラジンクフィンガータンパク質の製造のための出発物質として用いた。新しい３−フィンガータンパク質は２つの異なる方法によって製造された。一番目の方法では、すべてのジンクフィンガーを混合し、組み立てられた３−フィンガー構造物を以降の分析のために無作為に選抜した。２番目の方法では、新しい３−フィンガータンパク質を特異的なＤＮＡ配列を標的として考案した。このため、本発明者らはジンクフィンガーの認識部位と標的DNA配列との間の組合せ(match)を発見する簡単なコンピュータアルゴリズムを用いた。本発明者らは入力ＤＮＡ配列として公知の遺伝子のプロモーター配列を用い、前記入力配列内で９−ｂｐＤＮＡ断片に結合する３−フィンガータンパク質を同定した。
【０２３８】
ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を標的とするジンクフィンガータンパク質がこの方法によって製造された。このように製造されたジンクフィンガータンパク質を以前に記述された方法に従って哺乳類細胞においてこれらのＤＮＡ結合力および親和力を調査した（KimおよびPabo (1997) J. Biol. Chem. 272: 29795-29800; KimおよびPabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2812-2817；およびKangおよびKim (2000) J. Biol. Chem. 275: 8742-8748）。前記分析のためのレポータープラスミドはレポーターとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＧＬ３−ＴＡＴＡ／Ｉｎｒを用いて製作した。
【０２３９】
ジンクフィンガータンパク質に機能的ドメインを連結するために、ｐ６５（アミノ酸２８８−５４８）およびＶＰ１６（アミノ酸４１３−４９０）の転写活性ドメインを特定のオリゴマー対を用いたＰＣＲを通じて増幅し、ｐ６５およびＶＰ１６のＰＣＲ産物を各々Ｐ３にクローニングしてｐＬＦＤ−ｐ６５およびｐＬＦＤ−ＶＰ１６を製造した。ＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的とするジンクフィンガータンパク質をコードする核酸をｐＬＦＤ−ｐ６５またはＶＰ１６に挿入してジンクフィンガータンパク質−活性ドメイン（ＡＤ）融合タンパク質（ＺＦＤ−ＡＤ）を発現させた。実時間ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびマイクロアレイ分析法を用いてこれらのＺＦＰ−ＡＤがＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を活性化させるかどうかを決定した。また、前記タンパク質が適切な標的ＤＮＡ配列を認識するかどうかを調査するためにＳＥＬＥＸを行った。下記を参照されたい。
【０２４０】
ヒトジンクフィンガードメインの結合親和力および特異性
青色酵母コロニーから分離されたプラスミド（「ジンクフィンガードメインのインビボでの選別」項目を参照）を個別的にｙＷ１細胞内に再形質転換させた。各々の分離されたプラスミドに対して、再形質転換されたｙＷ１細胞を６４個のＬａｃＺレポータープラスミド各々を含むｙＷ１ａ細胞と交雑させた。これから得られた細胞をＸ−ｇａｌとヒスチジンは含むが、トリプトパンとウラシルを欠く最小培地上に塗抹した。ＧＥＬ−ＤＯＣ（商標）システム（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて、コロニーの各々に対する青色の強度を測定してＺｉｆ２６８のフィンガー１および２に融合されたジンクフィンガードメインの各々のＤＮＡ結合親和力および特異性を決定した。Ｚｉｆ２６８タンパク質を用いた対照群実験はジンクフィンガードメインとＬａｃＺレポーターのプロモーター内の標的結合部位の間の陽性相互作用が濃青色から薄青色のコロニーを産生し、これらの間の陰性相互作用が白色のコロニーを産生することを示した。
【０２４１】
電気泳動移動検定法（electrophoretic mobility shift assay;EMSA）
ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＮｏｔＩ処理によって分離した後、ｐＧＥＸ−４Ｔ２（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）に挿入した。ジンクフィンガータンパク質を、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（glutathione-S-transferase, GST）が連結された融合タンパク質の形態で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株で発現させた。前記融合タンパク質をグルタチオン親和クロマトグラフィー（glutathione affinity chromatography, Amersham Pharmacia）を用いて精製した後、トロンビンで切断した。このような切断過程はＧＳＴ残基とジンクフィンガータンパク質との間の連結を提供する。この場合、精製されたジンクフィンガータンパク質はＣ−末端の位置３で選別されたジンクフィンガーに融合されたＺｉｆ２６８のフィンガー１および２を含む。ＤＮＡプローブを合成し、アニーリングし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）を用いて３２Ｐで標識した後、文献に記載された通りにＥＭＳＡを行った（KimおよびPabo (1997) J. Biol. Chem. 272:29795-29800、およびKimおよびPabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-2817）。前記と同様な過程が他のジンクフィンガータンパク質を検証するために使用され得る。
【０２４２】
内因性ＶＥＧＦの転写的調節
ヒト胚芽腎臓２９３細胞を１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle medium）で保持した。ルシフェラーゼ分析のために、前記細胞を１０４細胞／ウェルの濃度で９６−ウェルプレートで予め培養した。リポフェクタミントランスフェクションキット（LIPOFECTAMINE（商標） transfection kit, Life Technologies, Rockville, MD）を用いて、２９３細胞を天然型のＶＥＧＦプロモーターがpGL3-basic（Promega）内のルシフェラーゼ遺伝子に融合されたレポータープラスミド２５ｎｇとジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミド２５ｎｇでトランスフェクトした。４８時間培養した後、ルシフェラーゼ活性をＴＤ−２０／２０照度計（luminometer, Turner Designs Inc., Sunnyvale, CA）を用いて二重ルシフェラーゼ分析キット（DUAL LUCIFERASE（商標）assay kit, Promega）で測定した。
【０２４３】
逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡ分析のために、前記細胞を１０５細胞／ウェルの濃度で１２−ウェル培養プレートで１ｍｌの培養培地（抗生剤のない１０％ＦＢＳ含有培地）に接種した後、３７℃、５％ＣＯ２を含む湿った空気下で２４時間予め培養した。その後、前記細胞をリポフェクタミントランスフェクションキット（Life Technologies）を用いてＤＮＡでトランスフェクトした。簡単に説明すると、ジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミド１μｇを５μｌプラス試薬（plus reagent）を含有する５０μｌのＤＭＥＭに添加した後、前記溶液を２μｌのリポフェクタミン試薬を含む５０μｌのＤＭＥＭと混合した。１５分間培養した後、総１００μｌの混合物を培養プレート内の細胞に添加し、前記細胞を４８時間さらに培養して成長させた。細胞と培養上澄液をＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ分析のために収穫した。
【０２４４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
総細胞性ＲＮＡを製造社の指針に従ってトリゾール−溶解質（TRIZOL（商標）M-lysates, Life Technologies）を用いて抽出した。ｍＲＮＡに対する第１−ストランド合成プライマーとしてオリゴ−ｄＴとスーパースクリプト第１−ストランド合成システム（SUPERSCRIPT（商標）first-strand synthesis system, Life Technologies）で提供されるＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて４μｇの総ＲＮＡに対して逆転写反応を行った。ｍＲＮＡ定量分析のために、ＲＴ反応から形成された１μｌの第１−ストランドｃＤＮＡｓをＶＥＧＦ−Ａ特異的プライマーを用いて増幅させた。ＲＮＡの初期量をＧＡＰＤＨ特異的プライマーを用いた特異的増幅によって計算されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）ｍＲＮＡ濃度で補正した。ＶＥＧＦ−ＡおよびＧＡＰＤＨ−特異的なｃＤＮＡｓの増幅をＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ  ＳＹＢＲ（商標）キット（QIAGEN, Valencia, CA）およびROTORGENE（商標）2000実時間増幅機（Corbett, Sydney, Australia）を用いて実時間で分析し、前記反応に含まれた標準試料の連続希釈法（serial dilution）を用いて定量した。
【０２４５】
ＥＬＩＳＡ
腎臓２９３細胞培養上澄液を５分間簡単に遠心分離して細胞と細胞屑を除去した。培養培地に蓄積されたＶＥＧＦタンパク質（各々１００μｌ）と組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質標準試料の希釈液をサンドイッチＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）を用いて分析したが、前記ＥＬＩＳＡで培養上澄液を抗−ヒトＶＥＧＦ抗体（R & D systems；ＡＦ−２９３−ＮＡ）、ビオチン化（biotinylated）抗−ヒトＶＥＧＦ抗体（R & D systems; BAF293）およびストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（streptavidin alkaline phosphatase）と反応させた。抗原−抗体複合体をｐＮＰＰ緩衝溶液（Chemicon; ES011）に溶解したｐＮＰＰ（p-Nitrophenyl phosphate）と反応させた。試料中のＶＥＧＦ−Ａ濃度をＰＯＷＥＲＷＡＶＥ（商標）Ｘ３４０（Bio-TEK Instrument Inc., Winooski VT）を用いて４０５ｎｍで測定した。
【０２４６】
安定的にジンクフィンガータンパク質を発現するＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞株のＤＮＡマイクロアレイ分析
ＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的として考案されたＺＰＦｓをコードするプラスミドを製造社の指針に従ってＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞株（Invitrogen）に安定的に導入した。簡略に説明すると、ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を含むｐＬＦＤ−ｐ６５またはｐＬＦＤ−ＶＰ１６ベクターから得られたHindIII−XhoI断片をｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Invitrogen）にサブクローニングした。これから生成したプラスミドをｐＯＧ４４（Invitrogen）と共にＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞内に同時−トランスフェクトした後、安定的挿入体（integrant）をスクリーニングした。これから生成した細胞株はドキシサイクリン（doxycycline）誘導によってＺＦＰ−ｐ６５またはＺＦＰ−ＶＰ１６を発現する。
【０２４７】
７４５８個のヒト発現された配列タグ（expressed sequence tag, EST）クローンを含むＤＮＡマイクロアレイはGenomic Tree, Inc.(Taejon, Korea）から提供された。ＺＦＰ−ｐ６５またはＺＦＰ−ＶＰ１６を安定的に発現するＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞を４８時間１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘ）或いは非処理（−Ｄｏｘ）状態で培養した。総ＲＮＡを各々の試料から分離した。−Ｄｏｘ試料から分離したＲＮＡを対照群（Ｃｙ３）として用いた。マイクロアレイ実験は製造社の指針に従って行った。
【０２４８】
組み合わせられたジンクフィンガータンパク質のＳＥＬＥＸ
鋳型オリゴヌクレオチドはその両末端で不変配列（invariant sequences）に隣接する無作為２０−ヌクレオチド地域を含むように考案された。また、前記鋳型オリゴヌクレオチドの不変地域に相補的な２つのプライマーをＰＣＲ増幅のために考案した。前記鋳型オリゴヌクレオチドはプライマーのうちの一つからのクレノー断片拡張（Klenow fragment extension）によって二本鎖ＤＮＡに転換された。ジンクフィンガータンパク質によって結合された標的配列の増幅のために、１００μｇのＧＳＴ−融合タンパク質を１００μｌ結合緩衝溶液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．９、４０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）上で１０ｐｍｏｌの二本鎖鋳型ＤＮＡと混合して室温で１時間反応させた。ＧＳＴ−樹脂（１０μｌ）を前記混合物に添加した。室温で３０分間反応させた後、前記樹脂を２．５％脱脂油を含む結合緩衝溶液で３回洗浄した。
【０２４９】
前記樹脂を室温で１０分間１Ｍ  ＫＣｌ  １００μｌと反応させて結合された二本鎖鋳型オリゴマーを樹脂から分離した。回収した二本鎖鋳型オリゴマーのＰＣＲ増幅後、ＳＥＬＥＸの新しい反応を繰り返した。この過程を８回繰り返した。最終ＰＣＲ産物をXbaIおよびBamHIで切断した後、同じ制限酵素で処理されたｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ＫＳに挿入した。ジンクフィンガータンパク質当たり少なくとも８個の個別的挿入体（insert）のＤＮＡ配列を決定した。
【０２５０】
実施例７：代表的なタンパク質の配列
下記はＶＥＧＦ−Ａを調節できる代表的なタンパク質のＤＮＡ結合地域のアミノ酸配列である。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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ポリペプチド、たとえば、前記に記載された配列を含むポリペプチドはまたタグ（たとえば、ＨＡタグ）、ＮＬＳ、リンカーおよび調節ドメイン（たとえば、活性または抑制ドメイン）を含む。これらの構成要素はＮ−末端からＣ−末端へと如何なる順によっても整列され得る。一つの実施形態において、前記ポリペプチドは下記のように整列される：ＨＡタグ−ＮＬＳ−ＰＧＥＫＰ−ＤＮＡ結合ドメイン（たとえば、前記記載の配列）−ＡＡＡ−ｐ６５。またはさらに具体的には次の通りである：  
ＭＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＥＬＰＰＫＫＫＲＫＶＧＩＲＩＰＧＥＫＰ−ＤＮＡ＿ＢＩＮＤＩＮＧ＿ＤＯＭＡＩＮ−ＡＡＡ−ｐ６５；（ＤＮＡ結合ドメインに対する先導Ｎ−末端（leader N-terminal）は配列番号：１２６である）
・  ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：１２６の３〜１２）は例示的なタグである（ここではＨＡ−タグ）
・  ＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１２６の１５〜２１）は例示的なＮＬＳである（核位置信号）
・「ＺＦＰ」はジンクフィンガードメインの整列である。
【０２５１】
他の実施形態においては、前記ポリペプチドがＤＮＡ結合ドメインおよび抑制ドメイン、たとえば、ＫＲＡＢまたはＫＯＸドメインを含む。  
本実施例に記述されたポリペプチドをコードする核酸は、たとえば、原核生物での発現に有用な（たとえば、最適化された）コドン、真核生物での発現に有用な（たとえば、最適化された）コドン、または相応する天然型ドメインをコードするコドンのようなコドンの如何なる選択によっても産生され得る。
【０２５２】
下記の結果は複数のジンクフィンガーがＶＥＧＦ−Ａ産生を活性化させ得ることを示すものである。
【表１３】
2006508675.tif 000019
【０２５３】
実施例８：封入された細胞によるＶＥＧＦ−Ａ産生
ドキシサイクリン−誘導性プロモーターに作動的に連結されたＦ４３５−ｐ６５ジンクフィンガータンパク質をコードするコーディング地域を含む核酸構造物をＦｌｐ−Ｔ−Ｒｅｘ細胞内に安定的にトランスフェクトした。
【０２５４】
ＺＦＰ−ＴＦｓを安定的に発現するヒト胚芽腎臓（ＨＥＫ）細胞株を下記に従って製造した：ＺＦＰ−ＴＦｓをコードするプラスミドを製造社の指針に従ってＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞株に安定的に導入した。簡単に説明すると、ＺＦＰ−ＴＦｓをコードするＤＮＡ断片を含むｐＬＦＤ−ｐ６５ベクターから得られたHindIII／XhoI切片をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Invitrogen）にサブクローニングした。これから生成したプラスミドをｐＯＧ４４（Invitrogen）とともにＦｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔｒｅｘ（商標）−２９３細胞内に同時−トランスフェクトして部位−特異的な統合（site-specific integration）を誘導した。その後、安定的挿入体または統合体（integrant）をスクリーニングした。これから生成した細胞株は培養培地にドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を添加した状態で条件付きでジンクフィンガータンパク質を発現した。Ｆ４３５−ｐ６５を安定的に発現する細胞を固定するために、アルギン酸ナトリウム（Sigma）を最終濃度が１％（ｗｔ／ｖ）になるようにＰＢＳに溶解し、１０６細胞／ｍｌの最終密度で細胞と注意深く混合した。前記細胞懸濁液をＣａＣｌ２（１００ｍＭ）溶液に滴加して１５分間細胞皮膜（capsules）を凝固させた後ＰＢＳで洗浄した。封入された細胞を培養用培地に添加した。１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを添加して発現を誘導し、封入された細胞から産生されたＶＥＧＦ−Ａの量を測定した。Ｆ４３５−ｐ６５を用いた一つの実施形態において、ドキシサイクリンの存在下で成長した細胞（細胞株＃１５１）は、２日経過後は少なくとも６００ｐｇ／ｍｌ、３日経過後は少なくとも４０００ｐｇ／ｍｌ、４日経過後は少なくとも５０００ｐｇ／ｍｌ、５日経過後は少なくとも５３００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ａを産生した。ＶＥＧＦ−Ａ産生はＦ４３５−ｐ６５ジンクフィンガータンパク質を含んでいない対照群またはドキシサイクリンを添加していない状態で成長した細胞に比べて少なくとも５、１０、５０または１００倍以上高く示された。
【０２５５】
実施例９：ヒトＶＥＧＦ−Ａ発現のための細胞−基盤分析
３×１０４ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をポリ−Ｌ−リジン（Biocoat）で予備コーティングされた９６−培養プレートで１００μｇのｐＬＦＤ−４Ｆ−ｐ６５プラスミドの各々でトランスフェクトした。トランスフェクトし、４８時間経過後に培養上澄液を収穫して使用する前まで直ちに−８０℃に保管した。トランスフェクトの効率はＸ−ｇａｌ染色によって１００ｎｇのＬａｃＺでトランスフェクトされた各プレートのウェルで測定した。各実験で計算されたトランスフェクトの効率は７０〜８０％範囲で多様であった。
【０２５６】
ＶＥＧＦ−Ａの産生はサンドイッチＥＬＩＳＡによって分泌されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質を測定して分析した。捕獲抗体（capture antibody, AF-293-NA）とビオチン化検出抗体（detection antibody, BAF293）はＲ＆Ｄシステムズ（Systems）社から、ストレプトアビジン−ＡＰ（ＳＡ１１０）と基質緩衝溶液（ＥＳ０１１）はケミコン（Chemicon）社から、基質ｐＮＰＰ（Ｎ９３８９）はシグマアルドリッチ（Sigma Aldrich）社から購入した。ＥＬＩＳＡ分析過程は自動化されたワークステーション（workstation）（GENESIS RSP 150, TECA）で行われた。４０５ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定し（ＰＯＷＥＲＷＡＶＥ（商標）Ｘ３４０、BioTek Instrument Inc.）、ＶＥＧＦ−Ａの量は連続的に希釈された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（R&D Systems）のＯＤ値から得られた標準曲線から計算した。相対的なＶＥＧＦ−Ａ産生はｐＬＦＤ−４Ｆ−ｐ６５の個別的なトランスフェクト培養液から得られたＶＥＧＦ−Ａ濃度を親ベクターｐ３でトランスフェクトされた培養液から得られたＶＥＧＦ−Ａ濃度に補正して計算した。
【０２５７】
実施例１０：ヒトＶＥＧＦ−Ａ発現のための細胞−基盤分析
ジンクフィンガータンパク質Ｆ１２１はヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の転写開始部位から約＋４３４ヌクレオチド位置にヒトＶＥＧＦプロモーターの９−ｂｐ配列が結合するように考案された３つのヒトジンクフィンガードメインから構成されている；Ｆ１０９はヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の転写開始部位から約−５３６ヌクレオチド位置にヒトＶＥＧＦプロモーターからの１２−ｂｐ配列が結合するように考案された４つのヒトジンクフィンガードメインから構成されている；そして、Ｆ４３５はヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の転写開始部位から約−９０Ｒおよび−３９１Ｒヌクレオチド位置（ここで、Ｒは逆方向ストランドを意味する）にヒトＶＥＧＦプロモーターからの９−ｂｐ配列が結合するように考案された３つのヒトジンクフィンガードメインから構成されている。
【０２５８】
ヒトＶＥＧＦプロモーターを含むルシフェラーゼレポータープラスミドの製造
天然型ヒトＶＥＧＦプロモーターＤＮＡ（−９５０から＋４５０位置で、図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す転写開始配列に比例して番号付けられる）を配列特異的なプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した後プラスミドｐＧＬ３（Promega, E1751）のKpnI／XhoI切断部位にクローニングし、これから生成したプラスミドをpGL3-VEGFprom（図５Ｂ）として命名した。
【０２５９】
ジンクフィンガータンパク質による天然型ヒトＶＥＧＦプロモーターを含むルシフェラーゼレポーターの抑制
２９３細胞を天然型ヒトＶＥＧＦプロモーター（転写開始部位から−９５０〜＋４５０）を含むルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−ＶＥＧＦｐｒｏｍと３０ｎｇのｐＬＦＤ−Ｆ１２１−ＫＲＡＢまたはｐＬＦＤ−Ｆ１０９−ＫＲＡＢでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は前述のように測定した。抑制倍数値はレニラールシフェラーゼ活性に対してホタルルシフェラーゼ活性を補正して計算し、前記結果を対照群ベクターｐＬＦＤおよびレポータープラスミドで２９３細胞をトランスフェクトして得られた対照群の値と比較した。
【０２６０】
Ｆ１２１−ＫＲＡＢ（３０ｎｇ）およびＦ１０９−ＫＲＡＢ（３０ｎｇ）をコードする前記プラスミドは各々８．７倍および６．１倍減少したレポーター活性を示した。
【０２６１】
ＺＦＰ−ＫＲＡＢによる内因性ＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡの抑制
ＺＦＰ発現プラスミドをヒト胚芽腎臓２９３Ｆ細胞（Gibco Life Technologies）にトランスフェクトした。２９３Ｆ細胞は高いトランスフェクション率を示す。  
２９３Ｆ細胞を２４−ウェル培養プレートで１０％ＦＢＳを含有する１ｍｌのＤＭＥＭに１０５細胞／ウェルの密度で接種し、３７℃、５％ＣＯ２を含む湿った空気下で２４時間培養した。前記細胞をＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（商標）（Life Technologies）を用いて０、２００または４００ｎｇの目的とするキメラジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。もし約４００ｎｇ以下のジンクフィンガータンパク質発現ベクターが用いられた場合は、親ベクターを添加して総ＤＮＡの量を４００ｎｇに調節した。前記細胞を４８時間さらに培養した。総ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Gibco Life Technologies）を用いて前記細胞から抽出した。
【０２６２】
ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの定量は下記の実時間ＲＴ−ＰＣＲによって行われた。
【０２６３】
第１−ストランドｃＤＮＡを得るために、４μｇの総ＲＮＡとスーパースクリプト第１−ストランド合成システム（Gibco Life Technologies）から提供されるｍＲＮＡに対する第１−ストランド合成プライマーであるオリゴ−ｄＴ、ｄＮＴＰおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写反応を行った。ｍＲＮＡの量を分析するために、これから得られた第１−ストランドｃＤＮＡ  １μｌをＶＥＧＦ−Ａ  ｃＤＮＡ特異的なプライマー（正方向プライマー５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＡＣ−３’、配列番号：１２７および逆方向プライマー５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧ−３’、配列番号：１２８）を用いて実時間ＰＣＲで増幅した。この方法は初期ＲＮＡ量に敏感であるため、初期ＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ−特異的なプライマーを用いた特異的増幅によって計算されたＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに補正した。ＶＥＧＦ−およびＧＡＰＤＨ−特異的なｃＤＮＡｓの増幅はＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ（商標）ＳＹＢＲキット（QIAGEN, Valencia, CA）とROTORGENE（商標）２０００実時間増幅機（Corbett, Sydney, Australia）を用いて実時間で追跡および分析し、増幅されたｃＤＮＡｓは前記反応に含まれた標準試料の連続希釈法によって定量した。
【０２６４】
ジンクフィンガータンパク質によるＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡ合成の抑制
内因性ＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡの発現は非処理対照群細胞に比べて２．２倍（５４．５％抑制、２００ｎｇ  ｐＬＦＤ−Ｆ４３５−ＫＲＡＢ）および４．１倍（７５．６％抑制、４００ｎｇ  ｐＬＦＤ−Ｆ４３５−ＫＲＡＢ）減少した。このような結果は容量依存的効果を示した。
【０２６５】
ＺＦＰ（Ｆ４３５−ＫＲＡＢ）によるＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の抑制
ＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡ発現の抑制がＶＥＧＦ−Ａタンパク質分泌の減少によるものであるかどうかを検証するために、２９３Ｆ細胞（１０４／９６ウェルプレート）を０〜２００ｎｇのＺＦＰ発現プラスミド（ｐＬＦＤ−Ｆ４３５−ＫＲＡＢ）でトランスフェクトした後７２時間培養した。培養培地（各１００μｌ）内に蓄積されたＶＥＧＦタンパク質と組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質標準試料の希釈液をサンドイッチＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）で分析したが、前記ＥＬＩＳＡで培養上澄液を抗−ヒトＶＥＧＦ抗体（R&D systems; AF-293-NA）、ビオチン化抗−ヒトＶＥＧＦ抗体（R&D systems;BAF293）およびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼと反応させた。抗原−抗体複合体をｐＮＰＰ緩衝溶液（Chemicon, ES011）に溶解したｐＮＰＰ（p-Nitrophenyl phosphate）と反応させた。試料中のＶＥＧＦ−Ａ濃度はＰＯＷＥＲＷＡＶＥ（商標）Ｘ３４０（Bio-TEK Instrument Inc., Winooski VT）を用いて４０５ｎｍで測定された吸光度から決定した。
【０２６６】
Ｆ４３５−ＫＲＡＢは容量依存的方式でＶＥＧＦ−Ａ産生を減少させた。２００ｎｇのプラスミドが用いられた場合、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質濃度は対照群プラスミドでトランスフェクトされた対照群細胞に比べて３．９倍（１３８ｐｇ／ｍｌ）抑制された。表１４を参考されたい。
【表１４】
2006508675.tif 000020
【０２６７】
低酸素条件によるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子誘導の抑制
ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は血管生成を誘導するのに重要な因子であると知られている。ＶＥＧＦ−Ａ活性は多くの腫瘍の発生と成長のために必須的である。ＶＥＧＦ−Ａ活性は癌組織で低酸素条件によって刺激されると明らかにされた。ＶＥＧＦ−Ａの高発現は腫瘍細胞から頻繁に観察される。
【０２６８】
２９３Ｆ細胞を培養するための培地を１００〜８００μＭのＣｏＣｌ２で約７時間処理すると、低酸素条件が誘導されて細胞によるＶＥＧＦ産生が急激に増加する。ジンクフィンガータンパク質が低酸素条件でＶＥＧＦ発現を抑制できるかどうかを調査するために下記実験を行った。
【０２６９】
２９３Ｆ細胞（１０４細胞／ウェル、９６−ウェルプレート）を５０ｎｇのｐＬＦＤ−Ｆ４３５−ＫＲＡＢでトランスフェクトした後４８時間培養した。低酸素条件を誘導するために、８００μＭのＣｏＣｌ２を培養段階で少なくとも７時間培地に処理した。培養培地内に分泌されるＶＥＧＦ−Ａの量をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２７０】
模擬（mock）−トランスフェクトされた細胞の低酸素ＣｏＣｌ２処理培養から産生されたＶＥＧＦの量は約１，０３９ｐｇ／ｍｌと増加した反面、非処理対照群細胞においては約２７３ｐｇ／ｍｌであった。前記結果は低酸素条件がＶＥＧＦ−Ａの産生を強く誘導することを立証するものである。しかし、ｐＬＦＤ−Ｆ４３５−ＫＲＡＢでトランスフェクトされた細胞は低酸素条件でＶＥＧＦ−Ａの産生を誘導しなかった。前記細胞は非−低酸素条件でと同様な濃度である約２７２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ａのみを産生した。この結果は、Ｆ４３５−ＫＲＡＢの発現が低酸素条件下でＶＥＧＦ−Ａの産生を抑制することを証明するものである。トランスフェクション率が約８５〜９０％に過ぎないため、このようなＶＥＧＦ−Ａ産生の残余水準は培養時、トランスフェクトされていない細胞に起因するとみられる。本発明者らは、Ｆ４３５−ＫＲＡＢおよびその機能的に類似するキメラジンクフィンガータンパク質がＶＥＧＦ−Ａ発現の強力な抑制剤であると結論付けた。
【０２７１】
選択されたジンクフィンガータンパク質または同じ残基を含む関連タンパク質は、たとえば、治療剤として使用され得るであろう。このような製剤は、たとえば、ＶＥＧＦ−Ａの発現を抑制して腫瘍細胞の成長を遅延させ得るであろう。
【０２７２】
本発明に関する多くの実施形態を記述した。それにもかかわらず、本発明の真意および範囲を外れない様々な変形が可能であることを理解できるであろう。したがって、他の実施形態も後述する請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１Ａ】ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の例示的領域の核酸配列（配列番号：１２０）を示す。前記領域はプロモーターを含む。前記配列はＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登載番号ＡＦ０９５７８５．１から得られた。転写開始部位はヌクレオチド２３６３番付近にある。翻訳開始コドンはヌクレオチド３４０１番付近にある。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図２Ａ】ヒト形質転換タンパク質（human transforming protein；ＦＧＦ４）遺伝子の例示的領域の核酸配列（配列番号：１２１）を示す。前記領域はプロモーターを含む。前記配列はＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登載番号Ｊ０２９８６．１とＡＰ００６３４５．２（ヒトゲノムＤＮＡ、染色体１１番クローン：ＲＰ１１−１８６Ｄ１９、完成された配列）から得られた。転写開始部位は３７３１番ヌクレオチド付近にある。翻訳開始コドンは３９５９番ヌクレオチド付近にある。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図２Ｄ】図２Ｃの続きである。
【図２Ｅ】図２Ｄの続きである。
【図２Ｆ】図２Ｅの続きである。
【図３Ａ】ヒト肝細胞成長因子（hepatocyte growth factor；ＨＧＦ）遺伝子の例示的領域の核酸配列（配列番号：１２２）を示す。前記領域はプロモーターを含む。前記配列はＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登載番号ＡＣ００４９６０．１（ヒトＰＡＣクローンＲＰ５−１０９８Ｂ１、７ｑ１１．２３−ｑ由来）から得られた。転写開始位置は４３８９番ヌクレオチド付近にある。翻訳開始コドンは４４５４番ヌクレオチド付近にある。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】図３Ｃの続きである。
【図３Ｅ】図３Ｄの続きである。
【図４】ＶＥＧＦ−Ａプロモーターの模式図である。
【図５Ａ】ＫＲＡＢドメインを有するジンクフィンガータンパク質の発現のための例示的核酸構造体の模式図である。
【図５Ｂ】ＶＥＧＦ−Ａプロモーターを含む例示的ルシフェラーゼレポーターの模式図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2006508675.tif 000024
【図２Ｂ】
2006508675.tif 000025
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2006508675.tif 000027
【図２Ｅ】
2006508675.tif 000028
【図２Ｆ】
2006508675.tif 000029
【図３Ａ】
2006508675.tif 000030
【図３Ｂ】
2006508675.tif 000031
【図３Ｃ】
2006508675.tif 000032
【図３Ｄ】
2006508675.tif 000033
【図３Ｅ】
2006508675.tif 000034
【図４】
2006508675.tif 000035
【図５Ａ】
2006508675.tif 000036
【図５Ｂ】
2006508675.tif 000037
【配列表】
2006508675000001.app
【国際調査報告】
2006508675.tif 000038
2006508675.tif 000039
2006508675.tif 000040