(57)【要約】ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒの調節により寛容を促進および維持する方法が提供される。抗体を含むそのアンタゴニストが提供される。本発明は、１つの実施形態では、炎症もしくは免疫の状態もしくは障害を有する被験体において、抗原に対する寛容を調節する方法であって、該方法が、ＣＤ２００のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて処置する工程を包含する。好ましい実施形態では、この調節は、寛容を上昇させるか、もしくは維持し、かつ前記処置が、以下：ａ）ＣＤ２００のアンタゴニストを投与する工程を包含するか；もしくはｂ）ＴＨ２型の応答を上昇させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症もしくは免疫の状態もしくは障害を有する被験体において、抗原に対する寛容を調節する方法であって、該方法が、ＣＤ２００のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて処置する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記調節が、寛容を上昇させるか、もしくは維持し、かつ前記処置が、以下：
ａ）ＣＤ２００のアンタゴニストを投与する工程を包含するか；もしくは
ｂ）ＴＨ２型の応答を上昇させる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アゴニストもしくはアンタゴニストが、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒに特異的に結合する抗体の抗原結合部位由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストが：
ａ）ＣＤ２００；もしくは
ｂ）ＣＤ２００Ｒ
に特異的に結合する抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アゴニストもしくはアンタゴニストが：
ａ）ポリクローナル抗体；
ｂ）モノクローナル抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）Ｆｖ、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント；または
ｅ）抗体のペプチド模倣物
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アゴニストもしくはアンタゴニストが、核酸を含み、該核酸が：
ａ）ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒをコードするか；または
ｂ）ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が：
ａ）アンチセンス核酸；
ｂ）ＲＮＡ干渉核酸；もしくは
ｃ）前記被験体のゲノムにおける、生物活性なＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒの発現を減少させる遺伝的変異
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記状態もしくは障害が、自己免疫状態もしくは自己免疫障害を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記状態もしくは障害が：
ａ）ブドウ膜網膜炎；
ｂ）移植片拒絶もしくは移植組織拒絶；
ｃ）糖尿病；
ｄ）多発性硬化症；
ｅ）炎症性腸障害（ＩＢＤ）；
ｆ）慢性関節リウマチ；または
ｇ）喘息もしくはアレルギー
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
寛容が：
ａ）鼻腔内で；
ｂ）腸内で；
ｃ）経口で；
ｄ）非経口で；
ｅ）静脈内で；もしくは
ｆ）粘膜で
誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記上昇もしくは維持が、組織学的スコアの改善を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記改善が：
ａ）炎症細胞の湿潤；もしくは
ｂ）構造組織の損傷
の減少を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）前記細胞の湿潤が、網膜において起こるか；もしくは
ｂ）前記組織の損傷が、光受容細胞の損傷である、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記障害もしくは状態が、免疫の結果として生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＨ２型の応答が：
ａ）ＩＬ−４；
ｂ）ＩＬ−５；
ｃ）ＩＬ−１０；もしくは
ｄ）ＩＬ−１３
であるサイトカインの発現もしくはレベルの検出可能な上昇を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＨ２サイトカインの発現もしくはレベルが、ＣＤ２００アンタゴニスト処置をしない場合よりもＣＤ２００アンタゴニスト処置をする場合に、少なくとも２倍大きい、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、ＣＤ２００アンタゴニストにより処置されない寛容化被験体に比べて、ＣＤ２００アンタゴニストにより処置された寛容化被験体において、免疫細胞の増殖が検出可能に減少もしくは阻害される、方法。
【請求項１８】
ＣＤ２００アンタゴニスト処置のある免疫細胞の増殖が、ＣＤ２００アンタゴニスト処置のない増殖の：
ａ）７５％以下；もしくは
ｂ）５０％以下
である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫細胞が、脾臓細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＣＤ２００アンタゴニストのない処置に比べて、該ＣＤ２００アンタゴニスト処置が、結果として、該ＣＤ２００アンタゴニストによる処置においてＳＴＡＴ６の発現もしくは活性化の検出可能な上昇をもたらす、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＣＤ２００アンタゴニストのない処置に比べて、該ＣＤ２００アンタゴニストによる処置において：
ａ）Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）；もしくは
ｂ）ＩＬ−１０発現細胞；
の活性もしくはレベルの検出可能な上昇が存在する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで：
ａ）前記Ｔｒｅｇが、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋のＴ細胞を含むか；または
ｂ）前記ＩＬ−１０発現細胞が：
ｉ）ＣＤ１１ｂ−；
ｉｉ）ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−／ｌｏｗ、ＣＤ３−、Ｂ２２０−、ＣＤ４５ＲＢｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ；もしくは
ｉｉｉ）形質細胞の樹状細胞
である、
方法。
【請求項２３】
前記調節が減少であり、かつ前記処置が、ＣＤ２００のアゴニストを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫の状態もしくは障害が：
ａ）持続性の感染；もしくは
ｂ）癌
である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記調節が：
ａ）ＴＨ２応答を減少させるか；または
ｂ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性もしくはレベルを減少させるかもしくは阻害する、
請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫系機能を含む哺乳動物の生理機能を調節するための方法に関する。特に、本発明は、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒの調節物質を用いた、免疫寛容を誘導および維持するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
感染もしくは損傷に対する免疫応答の調節は、免疫学的なホメオスタシスを回復および維持する開始シグナルおよび終結シグナルを含む。これらの制御プロセスは、抗原の攻撃に対する免疫応答の微調整を可能にする反対の機能を有する、関連レセプターをコードする遺伝子ファミリーを含み得る。マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のような脊髄系列の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、これらの調節プロセスの中心である。この調節の重要性は、阻害レセプターの破壊が標的とされたマウスにおいて観察される、時に致命的な自己免疫障害およびリンパ増殖障害により証明される。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するリガンドＢ７．１およびＢ７．２は、Ｔ細胞についての重大な制御点を代表し、そして骨髄細胞において、シグナル調節タンパク質ＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰβは、骨髄細胞の機能において相反する役割を果たすことが同定されている。ＣＤ２００は、ＯＸ−２としてもまた公知であり、骨髄抗原提示細胞および活性化Ｔリンパ球の両方の、負の制御因子であり得るとして同定されている。あるいは、ＣＤ２００は、Ｂ７．１分子およびＢ７．２分子に対する配列相同性を有し、サイトカイン分泌パターンを変化させてＴ細胞増殖を誘導する、補助刺激分子として機能することが報告されている。そこで、他の近年報告されている負のコレセプターと同様に、関与するメカニズムは現在のところ公知ではないものの、ＣＤ２００は、免疫応答において異なる時点で異なる効果を発揮し得る。
【０００３】
【表１】
2006512396.tif 000002
ＣＤ２００は、再循環Ｂ細胞、ならびに静止状態ではなく活性化された、Ｔ細胞、ニューロン細胞、内皮細胞、および樹状細胞を含むリンパ球で生じる、広く分布する膜結合タンパク質である。ヒトＣＤ２００は同様に発現され、例えば、正常な脳内でおよびＢ細胞により発現される。この膜結合リガンドは、その短い細胞質ドメイン（１９アミノ酸）により識別される。ある細胞のＣＤ２００は、別の細胞のＣＤ２００レセプター（ＣＤ２００Ｒ；ＯＸ２Ｒ）に結合し得る。ヒトでは、ＣＤ２００Ｒの二つのサブタイプ（ｈＣＤ２００ＲａおよびｈＣＤ２００Ｒｂ）が同定されており、マウスのホモログは四つのレセプターサブタイプ（ＣＤ２００Ｒａ、ＣＤ２００Ｒｂ、ＣＤ２００ＲｃおよびＣＤ２００Ｒｄ）から構成される。ＣＤ２００Ｒａは、主に、マクロファージ、小グリア細胞（脳のマクロファージ）、単球、および顆粒球において発現される。
【０００４】
【表２】
2006512396.tif 000003
ＣＤ２００欠損マウス（ＣＤ２００−／−：ＣＤ２００ノックアウト；ＣＤ２００ＫＯとしてもまた公知）は、種々の骨髄欠陥を示す。これらの欠陥は、正常にＣＤ２００を発現する組織内のマクロファージ数の上昇、および特に二次リンパ組織の周辺領域におけるＤＡＰ−１２発現の上昇が挙げられ、このことは、骨髄細胞の活性化を示す。この表現型の結果として、ＣＤ２００欠損マウスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が媒介する自己免疫疾患に対する感受性が上昇したようである。特に、小グリア細胞活性化のＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ調節は、ニューロン組織に顕著な効果を有し、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および実験的自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＥＡＵ）を含む中枢神経系に作用する自己免疫性実験モデルの出現を促進する（例えば、Ｈｏｅｋら、前出；Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋら（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：１６６９−１６７７を参照のこと）。
【０００５】
ＥＡＵは、網膜の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介され、そして鼻粘膜を介した抗原特異的寛容の誘導を含む、ヘルパーＴ細胞の機能を標的とした種々の治療アプローチを用いて調節され得る。活性化マクロファージは、疾患の完全な発現のために必要とされるが、同時に、マクロファージは、炎症の消散のためにも必要とされる。例えば、マクロファージは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のようなシグナルに応答し、かつ抗炎症プロセスに活発に関与し、このことは、代替的に活性化されたマクロファージが治癒および組織の再構築において役割を果たすという概念を支持する。このような代替的に活性化されたマクロファージは、近年、ＥＡＵのラットモデルにおいて、出願人らにより述べられている。骨髄のＡＰＣはまた、ＥＡＥおよびＥＡＵにおける鼻腔の寛容の誘導において、二重の役割を有し得、ここでは、ニューロンで発現されるＣＤ２００によるシグナリングは、炎症プロセスの間に生じているはずである。これらのモデルにおいて、効果的な防御は、頚のリンパ節における初期のＩＦＮγによって導かれる初回刺激事象と関連し、このＩＦＮγは、その後のＴ細胞アポトーシスおよび抗原特異的Ｔ細胞が再刺激に応答して増殖する能力のダウンレギュレーションと関連する。
【０００６】
【表３】
2006512396.tif 000004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
寛容の誘導および維持の根本的メカニズムは、あまり理解されていない。本発明は、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒの調節を介して寛容を誘導および維持するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、抗原に対する寛容がＣＤ２００のアンタゴニストにより上昇され得るという知見に基づく。
【０００９】
本発明は、炎症もしくは免疫の状態もしくは障害を有する被験体において、抗原に対する寛容を調節する方法を提供し、この方法は、ＣＤ２００のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置する工程を包含する。上記の方法であって、ここで、調節することが寛容を上昇させるかもしくは維持し、かつこの処置がＣＤ２００のアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法；またはＴＨ２型の応答を上昇させる、方法；ならびに上記の方法であって、ここで、アゴニストもしくはアンタゴニストが、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒに特異的に結合する抗体の抗原結合部位由来である、方法；ならびに上記の方法であって、ここで、アンタゴニストが、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒに特異的に結合する抗体である、方法もまた、提供される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、アゴニストもしくはアンタゴニストが、ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；ヒト化抗体；Ｆｖ、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント；遮断抗体；もしくは抗体のペプチド模倣物を含む、上記の方法；ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストが、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒをコードする核酸；またはＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸を含む、上記の方法；ならびに核酸が、アンチセンス核酸；ＲＮＡ干渉核酸；もしくは生物活性なＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒの発現を減少させる、被験体のゲノムにおける遺伝的変異を含む、上記の方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、炎症もしくは免疫の状態もしくは障害を有する被験体における、抗原に対する寛容を調節する方法であって、この方法は、ＣＤ２００のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置する工程を包含し；ここで、この状態もしくは障害は、自己免疫状態もしくは自己免疫障害を含む、方法；この状態もしくは障害が、ブドウ膜網膜炎；移植片拒絶もしくは移植組織拒絶；糖尿病；多発性硬化症；炎症性腸障害（ＩＢＤ）；慢性関節リウマチ；または喘息もしくはアレルギーを含む、上記の方法；ならびに寛容が、鼻腔内；腸内；経口；非経口；静脈内；もしくは粘膜で誘導される、上記の方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、この上昇もしくは維持が、組織学的スコアの改善を含む、上記の方法；ならびにこの改善が、炎症細胞の湿潤の減少；もしくは構造組織の損傷の減少を含む、上記の方法；ならびに細胞の湿潤が、網膜においてあるか；もしくは組織の損傷が、光受容細胞の損傷である、上記の方法；ならびにこの障害もしくは状態が、免疫の結果として生じる、上記の方法を提供する。
【００１３】
本発明のなお別の局面は、ＴＨ２型の応答が、ＩＬ−４；ＩＬ−５；ＩＬ−１０；もしくはＩＬ−１３であるサイトカインの発現もしくはレベルの検出可能な上昇を含む、上記の方法；ならびにＴＨ２サイトカインの発現もしくはレベルが、ＣＤ２００アンタゴニスト処置がないよりも、ＣＤ２００アンタゴニスト処置によって、少なくとも２倍大きい、上記の方法；ならびにこの状態もしくは障害が、免疫の結果として生じ、かつ少なくとも２倍大きい発現もしくはレベルが、免疫の２１日後以前に生じる、上記の方法を提供する。
【００１４】
さらに、ＣＤ２００アンタゴニストにより処置されていない寛容化被験体に比べて、ＣＤ２００アンタゴニストにより処置されている寛容化被験体において、免疫細胞の増殖が、検出可能に減少もしくは阻害される、上記の方法；ならびにＣＤ２００アンタゴニスト処置による免疫細胞の増殖が、ＣＤ２００アンタゴニスト処置のない増殖の７５％以下であるか；もしくは５０％以下である、上記の方法、ならびに；さらに；免疫細胞が、脾臓細胞である、上記の方法が提供される。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、ＣＤ２００アンタゴニストのない処置と比べて、ＣＤ２００アンタゴニストによる処置により、ＣＤ２００アンタゴニスト処置が、結果としてＳＴＡＴ６の発現；もしくはＳＴＡＴ６の活性化の検出可能な上昇をもたらす、上記の方法；ＣＤ２００アンタゴニストのない処置と比べて、ＣＤ２００アンタゴニストによる処置により、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）；もしくはＩＬ−１０発現細胞の活性もしくはレベルの検出可能な上昇のある、上記の方法；ならびにＴｒｅｇが、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含むか；もしくはＩＬ−１０発現細胞が、ＣＤ１１ｂ−であるか；ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−／ｌｏｗ、ＣＤ３−、Ｂ２２０−、ＣＤ４５ＲＢｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅであるか；もしくは形質細胞の樹状細胞である、上記の方法を含む。
【００１６】
本発明は、炎症もしくは免疫の状態もしくは障害を有する被験体において抗原に対する寛容を調節する方法であって、ＣＤ２００のアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置する工程を包含し；ここで、この調節は、減少であり、かつこの処置は、ＣＤ２００のアゴニストを含む、方法；免疫の状態もしくは障害が、持続性の感染；もしくは癌である、上記の方法；ならびに調節が、ＴＨ２応答を減少させるか；または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性もしくはレベルを減少させるかもしくは阻害する、上記の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（詳細な説明）
添付の特許請求の範囲を含む本明細書中で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」のような単数形の用語は、文脈が明らかにそうでないことを示すのでなければ、それらの対応する複数形を含む。
【００１８】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、個々の刊行物、特許、もしくは公開された特許出願の各々を参考として援用することが具体的におよび個々に示されるようなことと同程度まで、参考として本明細書中で援用される。
【００１９】
（Ｉ．定義）
「アンタゴニスト」もしくは「阻害因子」、または「アゴニスト」もしくは「活性化因子」は、これが、例えば、リガンド、レセプター、補因子、遺伝子、細胞、組織、もしくは器官の活性の調節に関与するので、それぞれ阻害分子もしくは活性化分子をいう。例えば、遺伝子、レセプター、リガンド、もしくは細胞の調節因子は、遺伝子、レセプター、リガンド、もしくは細胞の活性を変化させる分子であり、ここで、活性は、活性化されるか、阻害されるかもしくは変化させられ得る。この調節因子は、単独で作用し得るか、またはこの調節因子は、補因子（例えば、タンパク質、金属イオン、もしくは低分子）を使用し得る。阻害因子は、活性化を減少させるか、阻止するか、防御するか、遅延させるか、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、レセプター、もしくは細胞を不活性化するか、脱感作するかまたはダウンレギュレートする化合物である。活性化因子は、活性化を増加させるか、活性化するか、容易にするか、促進するか、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、レセプター、もしくは細胞を感作するかまたはアップレギュレートする化合物である。阻害因子はまた、構成性の活性を減少させるか、阻止するか、もしくは不活性化する組成物としても定義され得る。「アゴニスト」は、標的と相互作用して、標的の活性化の上昇を引き起こすかもしくは促進する化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防御するか、減少させるか、阻害するか、もしくは中和する。アンタゴニストはまた、同定されたアゴニストが存在しない場合でさえも、標的（例えば、標的レセプター）の構成性の活性も、防御するか、阻害するか、もしくは減少させ得る。
【００２０】
阻害の程度を調べるために、例えば、所与の、例えば、タンパク質、遺伝子、細胞、もしくは生物体を含むサンプルもしくはアッセイが、潜在的な活性化因子もしくは阻害因子を用いて処理され、かつ阻害因子のないコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（すなわち、アンタゴニストにより処置されない）を１００％の相対活性値とする。コントロールに対する活性値が約９０％以下、代表的には８５％以下、より代表的には８０％以下、最も代表的には７５％以下、一般的には７０％以下、より一般的には６５％以下、最も一般的には６０％以下、代表的には５５％以下、通常は５０％以下、より通常は４５％以下、最も通常には４０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下、なおより好ましくは２５％以下、そして最も好ましくは２５％以下である場合、阻害が達成される。コントロールに対する活性値が約１１０％、一般的には少なくとも１２０％、より一般的には少なくとも１４０％、より一般的には少なくとも１６０％、多くの場合は少なくとも１８０％、より多くの場合は少なくとも２倍、最も多くの場合は少なくとも２．５倍、通常は少なくとも５倍、より通常は少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも４０倍、そして最も好ましくはコントロールの４０倍を越えて高い場合、活性化が達成される。
【００２１】
活性化もしくは阻害の終点は、以下のようにモニターされ得る。例えば、細胞、生理学的流体、組織、器官、および動物もしくはヒトの被験体の処置に対する活性化、阻害もしくは応答は、終点によりモニターされ得る。この終点は、例えば、炎症、腫瘍形成、もしくは細胞の脱顆粒もしくは分泌（例えば、サイトカイン、有毒な酸素、もしくはプロテアーゼの放出）の指標の所定の量もしくは百分率を含み得る。この終点は、例えば、所定のイオン流量もしくは輸送量；細胞移動；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化（例えば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期、もしくは転移に関する遺伝子の発現の変化）を含み得る。
【００２２】
【表４】
2006512396.tif 000005
阻害の終点は、一般的にはコントロールの８０％以下、より一般的にはコントロールの７０％以下、最も一般的にはコントロールの６０％以下、好ましくはコントロールの５０％以下、より好ましくはコントロールの４０％以下、そして最も好ましくはコントロールの３０％以下、通常はコントロールの２０％以下、より通常はコントロールの１０％以下、そして最も通常はコントロールの５％以下である。一般的に、活性化の終点は、コントロールの少なくとも１５０％、好ましくはコントロールの少なくとも２倍、より好ましくはコントロールの少なくとも４倍、そして最も好ましくはコントロールの少なくとも１０倍である。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「生物活性」は、細胞、組織、器官または動物、培養された細胞もしくは組織、灌流されている組織もしくは器官、または生命維持されている動物の代謝活性、シグナリング活性、ホルモン活性、発育活性、胎生学的活性、増殖活性、アポトーシス活性、分泌活性、移動活性、接着活性、神経学的活性、病理学的活性、炎症活性、および癌活性の記載のために、限定することなく使用される。「生物活性」はまた、インビボでの酵素および精製された状態の酵素の触媒活性ならびに酵素および他のタンパク質のコンホメーションの変化を含む。
【００２４】
「生体区画」は、組織、器官、細胞、細胞小器官、もしくは例えば、リンパ節、内皮層もしくは上皮層、または脾臓の領域（例えば、赤脾髄もしくは白脾髄）のような細胞の構成要素をいう。「生体区画」はまた、細胞質ゾル、ヌクレオゾル、脳脊髄液、血漿、血清、全血、尿、胆汁、もしくはリンパのような所与の区画の中に含まれるか、もしくはそれらの区画から誘導される流体、コロイド、ゲル、もしくはスラリーをもいい得る。
【００２５】
「免疫状態」もしくは「免疫障害」は、例えば、病理学的炎症、炎症性障害、および自己免疫障害もしくは自己免疫疾患を含む。「免疫状態」はまた、感染、持続性の感染、ならびに癌、腫瘍、および血管新生のような、免疫系による感染、腫瘍、および根絶に抵抗する癌を含む増殖状態もいう。「増殖状態」は、例えば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生、形成異常のような前癌の状態、ならびに例えば、細菌、寄生生物、多細胞外来生物、およびウイルスの増殖による状態を含む。
【００２６】
「特異的に」もしくは「選択的に」結合する、とは、リガンド／レセプター、抗体／抗原、もしくは他の結合ペアについていう場合、タンパク質および他の生物学的物質の不均質集団中での、タンパク質の存在の決定的な結合反応を示す。したがって、指定される条件下で、特定されたリガンドは特定のレセプターに結合し、かつサンプル中に存在する他のタンパク質へ有意な量で結合することはない。抗体、もしくは抗体の抗原結合部位由来の結合組成物は、企図された方法で、その抗原またはその改変体もしくはムテインに、いずれの他の抗体もしくはそれ由来の結合組成物との親和性よりも、少なくとも２倍大きい、好ましくは少なくとも１０倍大きい、より好ましくは少なくとも２０倍大きい、そして最も好ましくは少なくとも１００倍大きい親和性で結合する。好ましい実施形態において、抗体は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定した場合、約１０９ｌ／モルより大きな親和性を有する（Ｍｕｎｓｅｎら（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。
【００２７】
「脾臓細胞」は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、および／もしくは他の細胞を含む脾臓から収集される細胞である（例えば、Ｍｅｔｗａｌｉら（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８３：Ｇ１１５−Ｇ１２１；Ｓｃｈａｅｆｅｒら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５８５９−５８６３；Ｈａｍｅｇら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７０６７−７０７４を参照）。脾臓細胞の増殖の研究において、一般的に、Ｔ細胞は増殖において最も活性な細胞である。本発明は、ＣＤ２００アンタゴニストにより処置する方法を企図し、ここで、脾臓細胞、Ｔ細胞、免疫細胞、もしくは血流由来の免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の増殖は、一般的には１０％以上、より一般的には２０％以上、最も一般的には３０％以上、代表的には４０％以上、より代表的には５０％以上、最も代表的には６０％以上、通常は７０％以上、より通常は８０％以上、そして最も通常には９０％以上減少される。
【００２８】
「リガンド」は、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはレセプターの結合物質として作用する、低分子、ペプチド、ポリペプチドもしくは膜会合分子および膜結合分子をいう。リガンドはまた、上記膜会合リガンドもしくは膜会合リガンドの可溶型も含む。リガンドが第一の細胞において膜結合している場合、レセプターは、通常、第二の細胞に生じる。この第二の細胞は、第一の細胞と同じ独自性を有しても異なる独自性を有していてもよい。リガンドおよびレセプターは、完全に細胞内であり得、すなわち、それらは、細胞質ゾル、核、もしくは何らかの他の細胞内区画に存在し得る。リガンドとレセプターとの複合体は、「リガンド  レセプター複合体」と呼ばれる。リガンドおよびレセプターがシグナリング経路に関与する場合、リガンドはシグナリング経路の上流の位置で生じ、そしてレセプターはシグナリング経路の下流の位置で生じる。リガンドのレセプターへの結合定数および反応速度特性を決定するための方法が、利用可能である。
【００２９】
【表５】
2006512396.tif 000006
「核酸」は、一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｄｓＤＮＡ）、および複数鎖のポリヌクレオチドならびにプローブおよびプライマーを含む。本発明はまた、修飾された核酸（例えば、ビオチン化された核酸、分子ビーコン、アンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉のための組成物、およびペプチド核酸も提供する。
【００３０】
【表６】
2006512396.tif 000007
治療剤の「治療有効量」は、有意義な患者の利益を示す（すなわち、処置される状態の症状の減少もしくは改善を引き起こす）ために十分な薬学的処方物の活性成分の各々の量として定義される。薬学的処方物が、診断剤を含む場合、「治療有効量」は、用いられる診断系における画像もしくは他の診断パラメーターを生成するために十分な薬学的処方物の活性成分の各々の量として定義される。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、この用語はその成分のみをいう。活性成分の組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせて投与されるか連続的に投与されるか同時に投与されるかに関わらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わされた量をいう。薬学的処方物の有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体の特異体質応答のような因子に従って変化する（例えば、米国特許第５，８８８，５３０号を参照のこと）。
【００３１】
「寛容」は、例えば、癌もしくは腫瘍、または移植同種抗原のような同種抗原、外来抗原性分子、外来分子複合体、または外来の生物もしくはウイルス由来の抗原に対する免疫非応答性を含む。寛容はまた、例えば、その自己抗原が自己免疫障害に関係する自己抗原に対する免疫非応答性または免疫非応答性の上昇も含む。さらに、「寛容」は、自然に生じる寛容および人工的にもしくは薬理学的に誘導される寛容も含む。さらに、寛容はまた、分子類似性により認識される自己抗原に対する免疫非応答性にも関する。
【００３２】
【表７】
2006512396.tif 000008
例えば、ＣＤ２００のアゴニスト、すなわち、ＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒシグナリング経路のアゴニストを投与することによる寛容の減少は、例えば、マラリアのような持続性の感染の処置において、例えば、ＴＨ２応答を減少するために、ならびに腫瘍、癌、新生物、およびウイルス（持続性の腫瘍、癌、新生物、およびウイルスを含む）の処置のために有用である。持続性のカンジダ症の感染は、ＴＨ２応答と関連している。
【００３３】
【表８】
2006512396.tif 000009
本発明は、寛容が媒介されるメカニズムによって限定されない。例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、Ｔｒ１細胞；Ｔｈ３細胞、ＣＤ８＋サプレッサーＴ細胞、もしくはγδＴ細胞のような調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性もしくは特性の調節によるか；樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるか；またはＴ細胞アネルギーにより寛容を調節する方法が含まれる。
【００３４】
【表９】
2006512396.tif 000010
本発明は、ＴＨ１応答、ＴＨ２応答、もしくはＴＨ１およびＴＨ２応答の両方を調節することによる寛容の調節を企図する。ＴＨ１応答の調節は、例えば、インターフェロンγの発現を変化させることを含む。ＴＨ２応答の調節は、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３のうちの任意の組み合わせの発現を変化させることを含む。代表的には、ＴＨ２応答の上昇（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、もしくはＩＬ−１３のうちの少なくとも一つの発現の上昇（減少）を含み；より代表的には、ＴＨ２応答の上昇（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、もしくはＩＬ−１３のうちの少なくとも二つの発現の上昇（減少）を含み、最も代表的には、ＴＨ２応答の上昇（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、もしくはＩＬ−１３のうちの少なくとも三つの発現の上昇（減少）を含むが、理想的には、ＴＨ２応答の上昇（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５，ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の全ての発現の上昇（減少）を含む。
【００３５】
一つの被験体から別の被験体へのＴ細胞の転移が寛容を転移する、「感染性の寛容」の調節もまた、企図される（例えば、Ｕｎｇｅｒら（２００３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７３１−７３９；Ｉｗａｓｈｉｒｏら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９２２６−９２３０を参照）。
【００３６】
ヒト被験体、獣医学的被験体もしくは調査的な被験体に対して適用される場合、「処置」は、治療的処置、予防的もしくは防御的な手段、調査および診断の適用をいう。「処置」は、ヒト被験体、獣医学的被験体もしくは調査的な被験体、または細胞、組織、または器官に対して適用される場合、ヒトもしくは動物の被験体、細胞、組織、生理学的区分、または生理学的流体へのＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒのアゴニストもしくはアンタゴニストの接触も含む。「細胞の処置」はまた、例えば、流体相もしくはコロイド相において、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００ＲのアゴニストもしくはアンタゴニストがＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒに接触する状況も含むが、また、投与されたアゴニストもしくはアンタゴニストが細胞、ＣＤ２００、もしくはＣＤ２００Ｒに接触することが証明されていない状況も含む。
【００３７】
（ＩＩ．一般論）
寛容において生じるような免疫応答の阻害は、骨髄細胞（例えば、ＤＣおよびマクロファージ）およびリンパ系細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＴｒ１細胞のような調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））により媒介される。代替的なマクロファージの活性化およびスカベンジャーレセプターの発現は、免疫応答阻害のメカニズムのうちの一つである。ＩＬ−１０のようなサイトカインは、免疫応答の阻害を調節し得、そしてこの応答の重要性は、阻害的レセプターもしくはＩＬ−１０シグナリングの阻害が標的とされたマウスにおいて観察される、時に致命的となる自己免疫障害およびリンパ増殖障害により証明されている。
【００３８】
【表１０】
2006512396.tif 000011
免疫機能の負の調節因子であるＣＤ２００は、ニューロン、微小血管内皮、再循環Ｂ細胞および静止状態ではなく活性化されているＴ細胞を含む種々の細胞により発現され、その構造的に関連する阻害的レセプター（ＣＤ２００Ｒ）は、単球／マクロファージ、ＤＣならびに小グリア細胞およびいくつかのＴリンパ球を含む骨髄系列の細胞に限られる。ＣＤ２００Ｒファミリーの二つのさらなるメンバーである、ｍＣＤ２００ＲＬａおよびｍＣＤ２００Ｌｂは、マウスにおいて生じる。ｍＣＤ２００ＲＬａおよびｍＣＤ２００Ｌｂは、ＣＤ２００に結合しないが、ＤＡＰ−１２アダプタータンパク質の結合を介する潜在的な活性化機能を有する。したがって、他の近年記載されている負のコレセプターと同様に、ＣＤ２００は、免疫応答において異なる時点で異なる効果を発揮し得る。
【００３９】
【表１１】
2006512396.tif 000012
ＣＤ２００ＫＯマウスは、例えば、ＣＤ２００を正常に発現している組織内のマクロファージ数の上昇、および特に二次リンパ組織の周辺領域におけるＤＡＰ−１２発現の上昇のような種々の骨髄欠陥を示し、このことは、骨髄細胞の活性化を示す。ＣＤ２００ＫＯマウスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が媒介する自己免疫疾患に対する感受性が上昇しているようである。特に、小グリア細胞活性化のＣＤ２００およびＣＤ２００Ｒが媒介する制御は、ニューロン組織への顕著な効果を示し、中枢神経系に作用する自己免疫性実験モデル（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および実験的自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＥＡＵ））の出現を促進する（例えば、Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋら（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：１６６９−１６７７を参照のこと）。
【００４０】
ＥＡＵは、網膜の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介され、ここで、ＥＡＵは、ヘルパーＴ細胞の機能を標的とした治療アプローチ（例えば、鼻粘膜を介した抗原特異的寛容の誘導）を用いて調節され得る。活性化マクロファージは、疾患の完全な発現のために必要とされるが、同時に、マクロファージは、炎症の消散のためにも必要とされる。炎症の消散において、マクロファージはＩＬ−４およびＩＬ−１０のようなシグナルに応答する。骨髄のＡＰＣはまた、ＥＡＥおよびＥＡＵにおける鼻腔の寛容の誘導において、二重の役割を有し得る。これらのモデルにおいて、防御は、頚のリンパ節における初期ＩＦＮγによって導かれる初回免疫現象、その後の、Ｔ細胞アポトーシスおよび抗原特異的Ｔ細胞が再刺激に応答して増殖する能力のダウンレギュレーションに関連する。
【００４１】
本発明の研究は、寛容のモデルを使用し、ここで、寛容は抗原への呼吸性曝露により誘導され、かつＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒが媒介するシグナリングは炎症および寛容を調節するものとして示される。ブドウ膜炎形成Ｔ細胞のみでは、標的器官の損傷を引き起こすためには不十分であることから、適度に感受性なＣ５７Ｂ１／６マウスＥＡＵモデルを使用した。単球マクロファージはまた、網膜における初期炎症性湿潤に必要かつ顕著であり、そしてさらに、ＮＯＳ２の単球発現は疾患の完全な発現に必要である。気道樹状細胞（ＲＴＤＣ）および肺胞マクロファージは、抗原への呼吸性曝露により誘導される寛容を媒介する。
【００４２】
本発明の研究において、排出頚部リンパにおけるＴ細胞の活性化および増殖の後に、続いて、脾臓の調節細胞の組織的な生成が起こった。
【００４３】
【表１２】
2006512396.tif 000013
本発明の研究において、疾患の発生は促進されるにも関わらず、全体の疾患の発病率および重症度は、ＣＤ２００ＫＯマウスにおいて時間とともに減少し、疾患症状の減少は、調節性Ｔ細胞の上昇数および疾患プロセスの後期のＩＬ−１０高分泌脾臓骨髄細胞の存在と関連していた。ＣＤ２００ＫＯは、網膜の抗原に対する寛容を促進した。このＣＤ２００ＫＯの結果は、野生型と比較した気道のＡＰＣの表現型の変化および寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスにおけるＴｈ２切り換えの促進に関連し得る。ＣＤ２００ＫＯマウスにおける寛容の誘導は、効率的であり、免疫後２８日で、眼の５０％がなお疾患から保護されていた。
【００４４】
【表１３】
2006512396.tif 000014
本発明の研究において、２８日目の偽寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスおよび寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスの両方の脾臓の細胞において、ＣＤ１１ｂ−ＩＬ１０ｈｉｇｈ細胞が明らかに上昇していた。これらの細胞は、２１日目由来の全ての実験群に存在するより多いＣＤ１１ｂ＋ＩＬ１０ｌｏｗ集団とは区別された。細胞は、いかなる付加的な活性化刺激もブレフェルディンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）もしくは他のゴルジ阻害因子によるサイトカインの人工的隔離もなく直接エキソビボで分析されたので、この検出されたＩＬ−１０の高レベルは内因性であった。これらの細胞のさらなる分析は、それらが、ＣＤ１１ｃ−／ｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＢｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅおよびＢ２２０−であり、かつ形質細胞ＤＣの形態を有することを示していた。ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ以外は同様の表現型を有する寛容を生じる形質細胞ＤＣは、ＩＬ−１０を用いたインビトロ培養により生成され得、正常なＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓から単離され得、かつＩＬ１０トランスジェニックマウスにおいて上昇され得る。この細胞は、インビトロにおいて、分化に３週間かかり、そして本発明の研究において、疾患の発病後３〜４週間でＣＤ２００ＫＯの脾臓に出現し、このことは、細胞分裂の長期の刺激および／もしくは数回の細胞分裂が関与していることを示唆する。骨髄由来の形質細胞はまた、寛容を生じ、かつインビボで、抗原特異的ＩＬ−１０分泌Ｔｒｅｇを生成し得る。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＬ−１０＋細胞の有意な数は、本研究においては見出せなかったが、ＣＤ２００ＫＯマウスにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋数の上昇傾向が見られ、そしてこのことは、全ての時点での寛容化群において有意であった。Ｔｒｅｇは、例えば、ＩＬ−２もしくはＩＬ−１０の発現を阻害することにより免疫抑制効果を有し得る。本発明の研究の２８日目の全ての群におけるＩＬ−１０の誘導およびＩＬ−２の抑制は、この疾患プロセスの間の調節性Ｔ細胞誘導と矛盾がなく、そしてＴｒ１の誘導と抗原の鼻腔内投与とを結びつける知見と矛盾がない。
【００４５】
【表１４】
2006512396.tif 000015
肺のＤＣは、吸入された抗原に対する免疫応答を媒介し、無害な抗原もしくはＴｈ２に偏った応答の優先的活性化および拡大に対するＴ細胞低応答性を誘導する。このことは、粘膜微環境およびこれらの細胞の未成熟な表現型に起因する。ＩＬ−１０は、粘膜の寛容を誘導する役割を有し、かつ疾患の後期における炎症の制限において役割を有する。ＩＬ−１０への単一の曝露はＤＣを寛容化表現型に変化させ得るので、Ｔｈ２由来のＩＬ−１０は、抗原特異的な様式で寛容を増強する効力を有する。
【００４６】
【表１５】
2006512396.tif 000016
（ＩＩＩ．ポリペプチドおよび核酸の精製および改変）
本発明のポリペプチドおよび核酸の診断薬および治療薬は、当該分野において確立されている方法により調製され得る。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、免疫沈降、エピトープタグ、アフィニティークロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、および安定化剤、界面活性剤もしくは乳化剤の使用を含み得る。
【００４７】
【表１６】
2006512396.tif 000017
タンパク質、ペプチド、および核酸の改変は、エピトープタグ、融合タンパク質、蛍光生もしくは放射性の基、単糖類もしくはオリゴ糖類、スルフェート基もしくはホスフェート基、Ｃ末端アミド、改変Ｎ末端アミノ基（例えば、アセチル化もしくは脂肪酸アシル化による、鎖内切断ペプチド結合、および脱アミド化生成物）を含む。
【００４８】
【表１７】
2006512396.tif 000018
（ＩＶ．結合組成物、アゴニスト、アンタゴニスト、およびムテイン）
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびヒト化抗体が調製され得る。
【００４９】
【表１８】
2006512396.tif 000019
ヒト化抗体は、親マウスの抗体の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸配列を含み、これは、ヒト抗体のフレームワークに移植される。ヒト化の代替的なものとしては、完全ヒト抗体ならびにファージで提示されるヒト抗体ライブラリーもしくはトランスジェニックマウスに含まれるヒト抗体ライブラリーの使用が挙げられる。
【００５０】
【表１９】
2006512396.tif 000020
ヒト化された抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異的抗体、および抗体のペプチド模倣物が以下に記載されている。
【００５１】
【表２０】
2006512396.tif 000021
抗原の精製は、抗体の生成のためには必ずしも必要ではない。免疫は、ＤＮＡベクター免疫により実施され得る（例えば、Ｗａｎｇら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：２７８−２８４を参照のこと）。あるいは、動物は、目的の抗原を有する細胞により免疫され得、続いてハイブリドーマの生成が起こり得る。例えば、Ｍｅｙａａｒｄら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２８３−２９０；Ｗｒｉｇｈｔら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：２３３−２４２；Ｐｒｅｓｔｏｎら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１−１９１８；Ｋａｉｔｈａｍａｎａら（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１６３：５１５７−５１６４を参照のこと。二重特異的抗体もまた、企図される（例えば、Ｔｓｏらに発行された米国特許第５，９３２，４４８号、Ｐａｕｌｕｓらに発行された同第５，５３２，２１０号、およびＷｅｉｎｅｒらに発行された同第６，１２９，９１４号を参照のこと）。
【００５２】
抗体／抗原結合特性は、例えば、表面プラズモン共鳴もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定され得る。
【００５３】
【表２１】
2006512396.tif 000022
本発明の抗体は、抗体の標的抗原および関連する結合したタンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る（Ｗｉｌｃｈｅｋら（１９８４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：３−５５）。
【００５４】
可溶性レセプターは、標準の方法に従って調製および使用され得る。
【００５５】
【表２２】
2006512396.tif 000023
抗体、可溶性レセプター、および他の結合組成物のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への結合は、循環時間の延長および抗原性の減少をもたらし得る（Ｓｏｌｏｒｚａｎｏら（１９９８）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：１１１９−１１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（２００１）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：２２１３−２２２３；Ｂｅｎｄｅｌｅら（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４３：２６４８−２６５９；ＴｒａｋａｓおよびＴｚａｒｔｏｓ（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２０：４２−４９）。ＰＥＧとの結合は、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および短鎖Ｆｖのような、インビボで比較的短い寿命を有する傾向にある、治療用の抗体フラグメントのために有用であり得る（Ｃｈａｐｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７８０−７８３）。
【００５６】
（Ｖ．治療および診断の使用）
本発明は、種々の免疫もしくは炎症の障害において寛容を誘導もしくは維持するための、ＣＤ２００もしくはＣＤ２００Ｒのアゴニストもしくはアンタゴニストの使用を企図する。寛容の促進もしくは維持は、例えば、移植片もしくは移植組織拒絶；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）；敗血症性ショック；喘息；アレルギー；および多発性硬化症、炎症性腸障害（ＩＢＤ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、慢性関節リウマチ、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）、多発性硬化症、自己免疫性心筋炎、腎炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症、糖尿病、および甲状腺炎のような器官特異的自己免疫障害の処置において有用である。ＩＢＤとしては、クローン病、潰瘍性大腸炎、およびセリアック病が挙げられる。寛容の促進はまた、薬物（例えば、ペニシリン、組換え抗体、および欠損タンパク質の遺伝子治療）への反応の防御において；ならびに胚もしくは胎児への母体の寛容の促進においても有用である。
【００５７】
【表２３】
2006512396.tif 000024
本発明のアゴニストもしくはアンタゴニストは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、好酸球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、単球／マクロファージ）、内皮細胞、上皮細胞、パイエル斑もしくは腸の粘膜、中枢神経系に関連する免疫障害を処置するために使用され得る。
【００５８】
抗体、抗体フラグメント、およびサイトカインは、連続的な注入によるか、または例えば、一日、一週間、もしくは一週間あたり１〜７回のような間隔での投与により提供され得る。投与は、静脈内に、皮下に、局所的に、経口で、鼻腔内で、直腸に、筋肉内に、大脳内に、もしくは吸入により提供され得る。好ましい投与プロトコルは、重篤な所望されない副作用を回避する最大用量もしくは投与頻度を含む投与プロトコルである。週間総用量は、一般的には少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、最も一般的には少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、代表的には少なくとも１μｇ／ｋｇ、より代表的には少なくとも１０μｇ／ｋｇ、最も代表的には少なくとも１００μｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、最適には少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、より最適には少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、そして最も最適には少なくとも５０ｍｇ／ｋｇである。
【００５９】
【表２４】
2006512396.tif 000025
低分子治療剤（例えば、ペプチド模倣物、天然物、もしくは有機化合物）の所望される用量は、モル／ｋｇ体重に基づいて、抗体もしくはポリペプチドとほぼ同じである。
【００６０】
治療剤もしくは診断剤の処方物は、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤もしくは安定剤と混合することにより、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、もしくは懸濁液の形態で保存のために調製され得る。
【００６１】
【表２５】
2006512396.tif 000026
適切な用量の決定は、例えば、当該分野で処置に作用すると知られているか、もしくはその疑いがあるか、または処置に作用すると予測されるパラメーターもしくはファクターを用いて、医師によりなされる。一般的に、この用量は、最適用量よりもいくらか少ない量で開始され、そしてこれは、任意の負の副作用に対して所望されるもしくは最適の効果が達成されるまで、少しの増分によって上昇させられる。重要な診断の尺度は、例えば、炎症の状態の尺度もしくは産生された炎症性サイトカインのレベルを含む。好ましくは、使用される生物は、処置のために標的とされた動物と同じ種に由来し、そのため、試薬に対する体液性応答は最小限に抑えられる。
【００６２】
特定の患者のための有効量は、処置される状態、患者の総合的な健康、投与の経路および用量、ならびに副作用の重症度のような因子に依存して変化し得る。処置および診断の方法のガイダンスが入手可能である。
【００６３】
【表２６】
2006512396.tif 000027
本発明はまた、細胞および区画を備えるキット、細胞および試薬を備えるキット、試薬を備えるキット、細胞および使用もしくは処分のための説明書を備えるキット、ならびに細胞、区画、および試薬を備えるキットも提供する。さらに、本発明はまた、細胞および区画および説明書を備えるキット、細胞および試薬および説明書を備えるキット、試薬および説明書を備えるキット、細胞および説明書を備えるキット、ならびに細胞、区画、試薬、および説明書を備えるキットも提供する。この説明書は、使用のための、試薬の処分のための、もしくは使用および処分のための説明を含み得る。
【００６４】
本発明の広い範囲が、以下の実施例の参照により最も良く理解され、これらの実施例は、本発明を特定の実施形態に限定するものとしては意図されない。
【実施例】
【００６５】
（Ｉ．一般的方法）
いくつかの標準的な方法は、以下に記載されるか、もしくは参照される。
【００６６】
【表２７】
2006512396.tif 000028
例えば、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心沈殿法、免疫沈降法、ならびにベクターおよび細胞によるクローニングおよび発現を含むタンパク質の精製のための方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯを参照する。
【００６７】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が入手可能である。
【００６８】
【表２８】
2006512396.tif 000029
細胞の計数は、例えば、Ｃａｌｔａｇ（登録商標）計数ビーズ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）およびＰｅｒｆｅｃｔｃｏｕｎｔ（登録商標）（Ｅｘａｌｐｈａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）のようなビーズもしくはミクロスフェアの補助により達成され得る。例えば、診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよび核酸プローブを含め、核酸、ポリペプチド、および抗体を改変するために適切な蛍光試薬が、入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【００６９】
免疫系組織学の標準的方法は、以下に記載されている。
【００７０】
【表２９】
2006512396.tif 000030
診断剤、治療剤、および薬学的物質の試験、評価、およびスクリーンニングのために、動物モデル（例えば、ノックアウトマウス）および細胞に基づくアッセイを使用するための方法が、入手可能である。
【００７１】
【表３０】
2006512396.tif 000031
動物およびヒトにおける炎症の状態の診断および処置のための方法が、以下に記載されている。
【００７２】
【表３１】
2006512396.tif 000032
例えば、抗原フラグメント、シグナル配列、およびリーダー配列、タンパク質折りたたみ、および機能性ドメインを決定するためのソフトウェアパッケージが入手可能である。
【００７３】
【表３２】
2006512396.tif 000033
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ由来などの公の配列データベースがまた、使用され得る。
【００７４】
（ＩＩ．動物および実験的自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＥＡＵ）の誘導）
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＣＤ２００欠損マウス（ＣＤ２００−／−）を作製し、そして生物学的サービスであるＵｎｉｔ  ｏｆ  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫにおいて確立された特定の病原体のない（ＳＰＦ）交配群で隔離体を飼育した（Ｈｏｅｋら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１７６８−１７７１）。ＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＣＤ２００＋／＋）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｏｌａｃ、ＵＫから購入した。３〜６匹のマウス群を、各実験についての文章に詳細を記載したとおりに使用した。
【００７５】
免疫のために、性別および年齢を合わせたマウスの群を、６〜８週齢で使用した。マウスを、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、２．５ｍｇ／ｍｌ  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中の０．５ｍｇのＩＲＢＰ（Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）のペプチド１〜２０の皮下注射により免疫し、そしてさらなるアジュバントとしてのＢｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴＸ）の注射（腹腔内）を与えた（Ａｖｉｃｈｅｚｅｒら（２０００）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｃｉ．４１：１２７−１３１）。特定の時点で、ＣＯ２窒息により動物を犠牲にし、そして樹脂組織学（組織学的スコア付け系のためのヘマトキシリンおよびエオシン染色）もしくは免疫細胞化学のために眼を摘出した。ペプチド特異的な増殖およびサイトカイン応答を決定するために、リンパ系組織もまたサンプルとした。ラットＥＡＵについて組織学的階級付けシステムの改変型を用いて、疾患の重症度を評価した。後眼房の炎症性湿潤および組織損傷の程度を組み合わせた半定量的スコア付け系を用いて、マスクされた様式において、各眼由来の少なくとも三つの切片をスコア付けした（Ｄｉｃｋら（１９９４）Ｅｙｅ  ８（ｐｔ．１）：５２−５９）。
【００７６】
（ＩＩＩ．鼻の寛容の誘導）
５μｌのＰＢＳ中の５０μｇのペプチドもしくは５μｌのＰＢＳのみを、鼻腔内投与した。免疫１０日前に投与されるこのレジメンは、ＥＡＵの調節において有効である（Ｊｉａｎｇら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８５：７３９−７４４）。いくつかの実験において、排出頚部リンパ節および脾臓の細胞、もしくはコントロールとして下顎下および腸間膜のリンパ節の細胞への鼻腔内（ｉ．ｎ．）ペプチドの効果を調べるために、続いての４８時間にわたる間隔でマウスを犠牲にした。他の実験において、ＰＴＸを有するＦＣＡ中のペプチドもしくはＰＢＳにより、１０日後に動物を免疫した。
【００７７】
（ＩＶ．増殖アッセイおよびサイトカインプロファイルアッセイ）
リコール抗原に対するリンパ球増殖応答を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒＤＵ）フローキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を用いて測定した。この試験は、全体としての細胞集団のＤＮＡ総含量の測定と一緒に、Ｓ期の細胞のＢｒＤＵ標識を検出させる。
【００７８】
単一の細胞の懸濁液を、組織を０．２５ｍｍ金属ふるいに通して押出すことによって個々の脾臓から得、そして単核細胞をＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）密度勾配遠心分離法により精製した。低張溶液により、赤血球を除去した。１０μｇ／ｍｌのペプチド１〜２０とともに、９６時間、１×１０６細胞／ｍｌの密度に培養物を設定した。この時点を、４８〜１２０時間のインキュベーションからのデータの編集により、最適時点として確立した。次に、各ウェルを１０μｌの１ｍＭブロモデオキシウリジン（ＢｒＤＵ）で４５分間パルスし、収集し、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により透過性にし、そして染色および分析の前に、１０％ＤＭＳＯを有するＦＣＳ中で、−８０℃で凍結した。ＢｒＤＵ取り込みの程度を同定するためにＦＩＴＣ標識された抗ＢｒＤＵ抗体を使用し、そしてＤＮＡ総含量を定量するためにＤＮＡ染料７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を使用した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）もしくはＢＤ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲ（登録商標）を用いて２色フローサイトメトリーにより測定を行った。各時点での少なくとも三匹の個々の動物からデータを得た。対応する培養物のサイトカインプロファイル分析のために、並行して１ｍｌの培養物を、４×１０６細胞および１０μｇ／ｍｌのペプチドで設定した。７２時間後、上清を収集し、遠心分離法により清浄化し、そしてアッセイまで−３０℃で凍結した。陰性コントロール培養物は、ペプチドの代わりにＰＢＳを含有した。アッセイの間の最適な増殖状態および細胞の生存率を証明するために、ポジティブコントロール培養物には２．５μｇ／ｍｌのコンカバリンＡを添加した。
【００７９】
（Ｖ．サイトカイン測定）
ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ製のｏｐｔＥＬＩＳＡ（登録商標）キットを用いて、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２を測定した。他のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの測定のためには、マウスサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡキット、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。簡単にいうと、Ｔｈ１／Ｔｈ２  ＣＢＡアッセイは、異なる蛍光強度を有し、そしてマウスのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮγもしくはＴＮＦαに特異的な捕捉抗体でコーティングされている、五つのビーズ集団を利用する。この捕捉ビーズを、ＰＥ結合検出抗体と混合し、そして組換え標準もしくは試験サンプルとともにインキュベートして、サンドイッチ複合体を形成した。この五つのビーズ集団を一緒に混合し、そしてＢＤ  ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターのＦＬ３チャネルに溶解した。
【００８０】
（ＶＩ．血清抗体アイソタイプ決定）
尾のティッピングもしくは心臓穿刺により血清を得、そしてアッセイまで−３０℃で凍結保存した。抗ＩＲＢＰ反応および抗ペプチド１〜２０応答をＥＬＩＳＡにより力価測定した。９６ウェルプレートを、Ｃａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌペプチド１〜２０で一晩コーティングした。次に、ウェルを０．５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄し、そして１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ／０．５％Ｔｗｅｅｎ中で血清を連続希釈し、そして２時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、結合した抗体を検出し、Ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ；０．１Ｍのクエン酸／酢酸緩衝液  ｐＨ６．０中の０．４ｍｇ／ｍｌ）をペルオキシダーゼ反応の基質として使用した。マイクロタイタープレート分析器で、４９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定した。免疫前の血清のＯＤよりも大きい最後の希釈の逆数として、力価を表わした。
【００８１】
（ＶＩＩ．免疫細胞化学）
免疫細胞化学のために、アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）技術を用いて、免疫されたマウス由来の眼もしくはリンパ組織を切開し、ＯＣＴ中で急速凍結し、そして７μｍの連続切片に切断し、風乾し、そして１００％冷アセトンにおいて固定した。ＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中での再水和に続いて、適切なコントロールおよび陰性コントロールとしてのブロックキングペプチドを用いて、ＴＢＳ（１％正常ウサギ血清）、そして次にポリクローナルウサギ抗ＳＴＡＴ４（Ｃ２０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）染色およびポリクローナルウサギ抗ＳＴＡＴ６（Ｍ２０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）染色のためのアビジンＤブロック溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、切片をブロッキングした。Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）由来のＣＤ３ならびに骨髄細胞マーカーであるＦ４／８０抗原（ＣＩ：Ａ３−１）、ＭＯＭＡ−１およびＭＯＭＡ−２に対するマウスモノクローナル抗体を用いて、他の切片を染色した。活性化マーカーは、ＮＯＳ２（クローン６；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＫＹ、ＵＳＡ）、ならびにＣＤ８６（ＧＬ−１）およびＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）（Ｐ７．７）（どちらも、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｃｏｌｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）製）を含んだ。陽性染色を、マウスが吸収したビオチン化抗ウサギＩｇ−ＡＰ結合体もしくはビオチン化抗マウスＩｇ−ＡＰ結合体、続いてストレプトアビジン：ＡＢＣ  ＡＰ複合体およびｆａｓｔ  ｒｅｄ基質（Ｄａｋｏ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ヘマトキシリンによる軽い対比染色により検出した。各抗体についての均一な標識化条件を確実にするために、画像分析のための切片をバッチ染色した。次に、ＡＤＣＩＳ（ＡＤＣＩＳ  ＳＡ、Ｈｅｒｏｕｖｉｌｌｅ−Ｓａｉｎｔ−Ｃｌａｉｒ、Ｆｒａｎｃｅ）製のＡｐｈｅｌｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｘ（登録商標）画像分析プログラムを用いて、切片を分析した。このプログラムは、使用者が規定の画像領域において免疫染色分析を可能にするために、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を用いて適応された。各切片についての平均値（２０倍視野あたりの陽性染色された組織パーセント）を、４〜６視野から得た。
【００８２】
（ＶＩＩＩ．フローサイトメトリー）
データ収集のためにＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）を、そしてデータ分析のためにＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ）を使用した。リンパ節および脾臓から単離された抗原提示細胞およびリンパ球を、以下の細胞表面マーカーについてのｍＡｂを用いた二重もしくは三重の免疫蛍光染色により評価した：ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＣＤ４（ＲＭ４−４）、ＣＤ４５ＲＢ（１６Ａ）、ＣＤ４５Ｒ（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ４０（３／２３）、ＣＤ８６（ＧＬ−１）、ＣＤ１５２（ＢＮ１３）、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）（ＡＦ６−１２０．１）、ＣＤ２５（ＰＣ６１）、ＣＤ３８（９２）、ＣＤ８ａ（５３−６Ｂ２）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）およびＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）は全てＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｃｏｌｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）製である。
【００８３】
ＣＴＬＡ−４およびＩＬ−１０の細胞内検出のために、四重染色を実施した。製造者の使用説明書（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ−ｃｙｔｏｐｅｒｍで処理し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）結合ＣＤ１５２（ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１）、およびＰＥもしくはＦＩＴＣ結合抗ＩＬ−１０抗体（ＪＥＳ５−１６Ｅ３）で染色した。抗ＣＤ２０４（２Ｆ８）、Ｆ４／８０（ＣＩ：Ａ３−１）、金属親和性マクロファージ（ＭＯＭＡ−１）およびＣＤ８０（ＲＭＭＰ−１）は、Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）製であった。これらは、必要とされるとおりに、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、ＰｅｒＣＰもしくはビオチンに結合されていた。ＳＡ−ＡＰＣ（１：４００）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の添加により、ビオチン標識された抗体を検出した。正確な破過点補償をするために、ネガティブアイソタイプコントロール、および単一ポジティブコントロールを実施した。
【００８４】
形態学的に調べるために、ＩＬ−１０高発現、ＣＤ１１ｃｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ−に対する蛍光抗体染色により規定されたゲートに従って、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡを用いて細胞集団を選別した。
【００８５】
（ＩＸ．ＳＴＡＴ６の発現および活性化）
ＳＴＡＴ６の発現および活性化を、細胞質ゾル抽出物および核抽出物から調製された免疫沈降物の免疫ブロット法により決定した（Ｄｉｃｋら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８５：１００１−１００６）。抗ＳＴＡＴ６抗体（Ｍ２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを用いてＳＴＡＴ６タンパク質を集め、続いてＨｙｂｏｎｄ  ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥブロッティングにより分離し、そして抗ＳＴＡＴ６抗体を用いて調べることによりブロットを分析してＳＴＡＴ６を検出した。抗ホスホチロシン抗体（ｍＡｂ  ４Ｇ１１０、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）を用いて、リン酸化ＳＴＡＴ６を検出した。
【００８６】
（Ｘ．組織学的スコアおよび脾臓細胞増殖により決定されたように、ＣＤ２００ノックアウトは寛容化を促進する）
０．５ｍｇのＩＲＢＰペプチド１〜２０の注射（皮下）により、マウスを免疫し、鼻腔内ペプチド（寛容化群）もしくはコントロールＰＢＳ（偽寛容化）で免疫の１０日前に処置した。自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を、免疫後１６日目、２１日目、および２８日目にモニターした。眼を樹脂組織学もしくは免疫化学により試験し、ここで、組織学的スコアは二つの指標（すなわち、炎症細胞湿潤および構造組織損傷）の複合的なものとした。疾患の発病は、偽寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスにおいて促進され、毛様体、網膜血管内皮、および網膜の内網状層の細胞における２型酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２）が発現し、疾患の初期の徴候は１０日目に生じた。しかし、後期には、組織損傷は、ＣＤ２００ＫＯマウスにおいてよりも野生型マウスにおいて、より重症であった（Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋら（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：１６６９−１６７７を参照のこと）。
【００８７】
寛容化プロトコルは、結果として、１６日目、２１日目、および２８日目の野生型マウスおよびＣＤ２００ＫＯマウスの両方における組織学的スコアの改善をもたらし、この改善は、２８日目において、野生型マウス（スコア２．９）よりもＣＤ２００ＫＯマウス（スコア１．７）において大きかった。全ての時点で、寛容化は野生型マウスおよびＣＤ２００ＫＯのマウスの両方を保護し、もっとも高度に保護されたマウスは、２８日目の寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスに見られた（表１）。
【００８８】
【表３３】
2006512396.tif 000034
野生型群およびＣＤ２００ＫＯ群における寛容の誘導は、結果として、非寛容化マウスと比較して、ＩｇＧ１抗体の力価の上昇をもたらした。２８日目、ＩｇＧ１抗体の力価は、野生型寛容化マウスにおいて約６８００、そしてＣＤ２００ＫＯ寛容化マウスにおいて約７２００であり、全ての非寛容化マウスにおけるＩｇＧ１の力価は、約１８００〜２０００であった。寛容が誘導したＩｇＧ１の上昇は、ＴＨ１応答からＴＨ２応答への切り替えを示した。
【００８９】
ペプチド１〜２０に対する脾臓細胞の増殖応答は、野生型マウスとＣＤ２００ＫＯのマウスとで同等の応答を示した（Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋら、前出）。本寛容化研究において、脾臓細胞の増殖を四つの群のマウスにおいて評価し、評価は、全体としての集団のＤＮＡ総含量の測定とともにＳ期の細胞のブロモデオキシウリジレート標識を測定することによって行った（表２）。本寛容化研究において、抗原への鼻腔内曝露は、１６日目もしくは２１日目の脾臓細胞のピークの増殖になんら阻害効果を有さなかったが、これら二つの日の寛容化動物における疾患は減少した。２８日目までに、寛容化野生型マウスおよび寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスの両方において、Ｓ期の細胞数は減少し、この減少は、野生型マウス（９．５）よりもＣＤ２００ＫＯマウス（１．０）において大きかった（表２）。言い換えれば、２８日目までに両方の寛容化群でＳ期の細胞数は減少したが、ＣＤ２００ＫＯ寛容化群ではより減少した。したがって、ＣＤ２００ＫＯは寛容を促進する。
【００９０】
【表３４】
2006512396.tif 000035
（ＸＩ．ＣＤ２００ノックアウトはＴＨ１応答ではなくＴＨ２型応答を促進する）
サイトカイン発現の評価のための増殖アッセイと並行して脾臓細胞培養物を設定し、ペプチドによる再刺激後にサイトカイン発現を測定した（表３〜５）。２１日目、および２８日目に、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の発現は、偽寛容化野生型マウス、偽寛容化ＣＤ２００ＫＯマウス、および寛容化野生型マウスと比較した場合、寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスにおいて最も高かった。このことは、ＣＤ２００ＫＯがＴＨ２応答を促進することを証明する（表３〜５）。
【００９１】
インターロイキン−２およびＴＮＦαは、他の三つの群のマウスにおけるレベルと比較して、１６日目の偽寛容化野生型マウスにおいて上昇した。ＩＬ−２およびＴＮＦαはまた、他の三つのマウスの群におけるレベルと比較して、２１日目の偽寛容化野生型マウスにおいて上昇した。２８日目のＩＬ−２のレベルは四つ全ての群において同様であり、一方、２８日目のＴＮＦαのレベルもまた、四つ全ての群において同様であった。ＩＬ−１２は全ての培養試験物において低く、すなわち、約５０ｐｇ／ｍｌ以下であった。多量のＩＦＮγ（５〜１５ｎｇ／ｍｌ）もまた、全ての培養試験物において発現されたが、群間での有意な差異は観察されなかった。
【００９２】
【表３５】
2006512396.tif 000036
ＳＴＡＴ６は、Ｔｈ２分化経路を制御している。対照的に、ＳＴＡＴ４は、ＩＬ−１２シグナリング後に活性化され、ＴＨ１型の応答を誘導する（例えば、Ｔａｋａｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６２７−６３０；Ｋａｐｌａｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：３１３−３１９；Ｋａｐｌａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：１７４−１７７；Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：１７１−１７４を参照のこと）。鼻腔内の寛容化後、種々の時間間隔（０時間、１２時間、２４時間および４８時間）で、鼻腔粘膜を脾臓のリンパ領域（白脾髄）、および脾臓のマクロファージ領域（赤脾髄）へと排出する頚部リンパ節を、ＳＴＡＴ６の発現および活性化について試験した。下顎下リンパ節を並行して分析することでコントロール組織として役立てた（表６）。ＴＨ２型の細胞シグナリングは、寛容化およびＣＤ２００ノックアウトの両方によって促進され、これは、ｔ＝２４時間か４８時間かのどちらかに示されるように、脾臓の白脾髄および頚部リンパ節におけるＳＴＡＴ６発現の上昇によって証明された（表６）。この効果は、頚部リンパ節においては一時的なものであったが、脾臓のリンパ領域およびマクロファージ領域においては持続していた。
【００９３】
ＳＴＡＴ４は、処置後２４時間のＣＤ２００ＫＯマウスの排出リンパ節および脾臓において一時的に上昇した。このことは、ラット寛容モデルにおいて観察される初期のＴＨ１の初回免疫と一致し、そして頚部リンパ節におけるＣＤ８６発現の上昇と関連する。ＳＴＡＴ４の発現の上昇は、サンプリング期間の間、野生型マウスにおいては見られなかった（表６）（Ｄｉｃｋら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８５：１００１−１００６）。
【００９４】
【表３６】
2006512396.tif 000037
組織学的切片の免疫染色は、ＣＤ２００ＫＯマウスにおけるＳＴＡＴ６発現の上昇を示した。このことは、ＣＤ２００ＫＯ依存性のＳＴＡＴ６発現の現象を証明する（表７）。頚部リンパ節の関連する研究は、ＳＴＡＴ６が、ＣＤ２００ＫＯマウスにおいて細胞質ゾルから核へとトランスロケーションすることが、野生型マウスではそうではないこと、およびＳＴＡＴ６のリン酸化は、野生型マウスよりもＣＤ２００ＫＯマウスにおいて多いことを証明した。
【００９５】
【表３７】
2006512396.tif 000038
ＳＴＡＴ６の少しの上昇は、ＣＤ２００ＫＯマウスの下顎下リンパ節における寛容化を用いて見られた。これらの少しの上昇は、鼻腔内投与の間の少量の抗原の摂取により生成され、脾臓における変化の全身性効果、もしくは播種された抗原の効果をもたらし得る（Ｄｉｃｋら、前出）。
【００９６】
（ＸＩＩ．ＣＤ２００ＫＯは、Ｔｒｅｇの上昇および気道樹状細胞のＩＬ−１０陽性細胞の上昇を誘導する）
気道樹状細胞（ＤＣ）は、鼻腔内投与された抗原に対する寛容、および優先的に刺激されたＴＨ２型の応答に関する（Ａｋｂａｒｉら（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７２５−７３１；Ｓｔｕｍｂｌｅｓら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０１９−２０３１）。天然型マウスおよびＣＤ２００ＫＯマウスの気道由来のＣＤ４５＋細胞を単離した。野生型マウスにおいて、主な集団はＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（８０％より多い）であり、少数のＣＤ１１ｂ＋細胞（１０〜１５％）を有していた。ＣＤ２００ＫＯマウスにおいて、主な集団はＣＤ１１ｂ＋細胞（４０％より多い）であり、より少数のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（３５〜４０％）を有していた。野生型マウスおよびＣＤ２００ＫＯマウスの両方由来の細胞は、気道のＡＰＣについて予測されたように、低い活性化マーカーレベルを示した。ＣＤ２００ＫＯの気道由来のＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ１１ｃ＋の両方の細胞は、野生型マウス由来の対応する細胞よりも低いＭＨＣクラスＩＩ抗原レベルを表した。野生型マウスおよびＣＤ２００ＫＯマウスの両方において、ＣＤ４５＋細胞の約２５〜２８％でＦ４／８０が見られ、一方、野生型マウス由来のＣＤ４５＋細胞の約１５％およびＣＤ２００ＫＯマウス由来のＣＤ４５＋細胞の約５％でＣＤ２０４が見られた。
【００９７】
ＴＨ２型応答は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の上昇を引き起こし得、一方、寛容化はＩＬ−１０およびＴｒｅｇに依存し得る。
【００９８】
【表３８】
2006512396.tif 000039
コントロールマウスおよびＣＤ２００ＫＯマウスの非透過化脾臓細胞の蛍光測定は、ＣＤ３＋Ｔ細胞集団において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの穏やかな上昇を証明し、これらの上昇は、ＣＤ２００ＫＯノックアウトにより引き起こされた（表８）。三つ全ての時点で、寛容化ＣＤ２００ＫＯマウスは、寛容化野生型マウスよりも高いＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの百分率を有した。このことは、調節性Ｔ細胞応答についてのＣＤ２００への依存性を証明する（表８）。
【００９９】
正常な野生型マウス（免疫されない；寛容化されない）におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞であるＣＤ３＋細胞の百分率は約８．７％であり、そしてＣＤ２００ＫＯマウス（免疫されない；寛容化されない）においては約９．２％であった（データは示されていない）。
【０１００】
【表３９】
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インターロイキン−１０産生細胞は、脾臓骨髄細胞集団において見られた。２１日目以前から二つの主な集団（すなわち、ＩＬ−１０ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋およびＩＬ−１０ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ−細胞）が見られた。ＩＬ−１０ｌｏｗＣＤ１１ｂ＋細胞の百分率は、２〜８％にわたり、２８日目により高い百分率となる傾向があり、一方で、ＩＬ−１０ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ−細胞集団は、より小さく、２１日目で約２％、そして２８日目で約４％であった。幾何学的な蛍光指数による分析は、偽寛容化ＣＤ２００ＫＯマウス由来の細胞および寛容化ＣＤ２００ＫＯマウス由来の細胞の両方が、野生型偽寛容化マウスおよび野生型寛容化マウスよりも高いＩＬ−１０レベルを生成することを証明した。２８日目のＩＬ−１０ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ−細胞の分析は、これらの細胞のほとんどが、ＣＤ１１ｃ−／ｌｏｗ、ＣＤ３−、Ｂ２２０−およびＣＤ４５Ｒｂｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅであり、かつ典型的な形質細胞ＤＣ形態を示すことを証明した。この表現型は、インビトロで生成される形質細胞ＤＣのＣＤ１１ｃｌｏｗＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ部分集合と同様であり、これは、インビボでのＴｒ１細胞の寛容および分化を誘導し得る（Ｗａｋｋａｃｈら（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：６０５−６１７）。
【０１０１】
（ＸＩＩＩ．リアルタイムＰＣＲにより決定されたＣＤ２００Ｒ発現）
ＣＤ２００Ｒ発現を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によるリアルタイムＰＣＲ分析により決定した。ここで、結果はユビキチン発現との比較である（表９）。ＴＨ２細胞において見られたＣＤ２００Ｒ発現の上昇は、これらの細胞がＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒシグナリング経路のアゴニストもしくはアンタゴニストでの処理により調節され得ることを示す。抗ＣＤ２００抗体もしくはＣＤ２００ＲノックアウトのようなＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ経路のアンタゴニストは、ＴＨ２応答の上昇を引き起こす。
【０１０２】
【表４０】
2006512396.tif 000041
本発明の多くの改変および変化が、当業者に明らかなように、特定の状態、材料、組成物、プロセス、プロセス工程に適応するため、本発明の目的、意図、および範囲を保存するためになされ得る。すべてのこのような改変は、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本明細書に添付される特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例としてのみ提供され、そして本発明は、このような特許請求の範囲によって権利が与えられているのと同等の全範囲に沿って、添付される特許請求の範囲の用語によって限定され；そして本発明は、例として本明細書中に示されている特定の実施形態によって限定されるべきではない。
【国際調査報告】
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