(57)【要約】一本鎖核酸のキャピラリー電気泳動用分離マトリックスが開示される。該マトリックスは、変性剤および(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースを含有する水性緩衝液を含んで成る。
2006518452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーティングなしのキャピラリーを用いた一本鎖核酸のキャピラリー電気泳動用分離マトリックスであって、該マトリックスが：
(ヒドロキシプロピル)メチルセルロース；
水性緩衝溶液；および
変性剤；
を含む、上記分離マトリックス。
【請求項２】
前記変性剤が尿素である、請求項１に記載の分離マトリックス。
【請求項３】
前記尿素がマトリックス中に1M〜11Mの濃度で溶解されている、請求項２に記載の分離マトリックス。
【請求項４】
前記尿素がマトリックス中に8Mの濃度で溶解されている、請求項３に記載の分離マトリックス。
【請求項５】
前記水性緩衝溶液が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン20mM、N-[2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]グリシン20mMおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物0.1mMを含む、請求項１に記載の分離マトリックス。
【請求項６】
前記(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースがマトリックスの1%〜6%(重量/体積)を構成している、請求項１に記載の分離マトリックス。
【請求項７】
前記マトリックスの2%(重量/体積)が低分子量(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースから成り、前記マトリックスの1.2%(重量/体積)が高分子量(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースから成る、請求項１に記載の分離マトリックス。
【請求項８】
コーティングなしのキャピラリーチューブ少なくとも１本；
前記コーティングなしのキャピラリーチューブ少なくとも１本内に収容された分離マトリックスであって、変性剤含有水性緩衝溶液中に溶解された(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースを含んでいる分離マトリックス；
を含んで成る、一本鎖核酸のキャピラリー電気泳動用システム。
【請求項９】
水性緩衝溶液を準備すること；
(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースを準備すること；
変性剤を準備すること；および
前記水性緩衝溶液、変性剤および前記(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースを混合すること；
を含んで成る、キャピラリー電気泳動用分離マトリックスの製造方法。
【請求項１０】
前記変性剤が尿素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記尿素がマトリックス中に1M〜11Mの濃度で溶解されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記尿素がマトリックス中に8Mの濃度で溶解されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水性緩衝溶液が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン20mM、N-[2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]グリシン20mMおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物0.1mMを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースがマトリックスの1%〜6%(重量/体積)を構成している、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリックスの2%(重量/体積)が低分子量(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースから成り、前記マトリックスの1.2%(重量/体積)が高分子量(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースから成る、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖核酸分離用キャピラリー電気泳動マトリックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸特に一本鎖核酸はキャピラリー電気泳動により分離することができる。分離を行うにはキャピラリーチューブをマトリックスで満たす。マトリックスは通常緩衝溶液に溶解されたポリマーおよび時に変性剤を含む。サンプル容量をキャピラリーチューブの一方の端部の中に注入する。キャピラリーチューブの両端部を緩衝溶液中に沈め、キャピラリーチューブの端部と端部の間に大きな電圧をかける。サンプルの成分がキャピラリーチューブの中を移動していくと、サンプルの成分が電気泳動的に分離される。マトリックス内のサンプル成分の分離は注入された化学種の分子サイズおよび電荷に基づくものである。大きい分子はポリマーマトリックスの中を小さい分子よりもゆっくりと移動する。マトリックス中のポリマー濃度および／またはもしあればマトリックス中のポリマー架橋度を変えて、広範囲の分子量および電荷の化学種の分離を行うことができる。
【０００３】
ポリアクリルアミドベースのマトリックスは、核酸フラグメントを分離するのには高い分解能を示すが、典型的にはキャピラリーチューブの中に迅速に入れるまたはそこから迅速に取り出すのには粘稠すぎる。さらに、ポリアクリルアミドマトリックスは典型的には、核酸フラグメントの移動を妨害する電気浸透流(EOF；electroosmotic flow)を最小限に抑えるまたはなくするために、内壁部がコーティングされたキャピラリーチューブを必要とする。EOFが小さくされていない場合は、移動時間が過度に長くなるかあるいは場合によってはキャピラリーの入口側からのサンプルのロスが起こり得る。コーティングされたキャピラリーチューブの使用は煩わしい準備プロトコルを必要とし、またコーティングの劣化によりキャピラリーの寿命が短くなる。ポリエチレンオキシドおよびヒドロキシエチルセルロースは、マトリックスの中に組み込まれる他のポリマーの例である。ヒドロキシエチルセルロースは好ましくは内側表面がコーティングされたキャピラリーチューブで用いられる（米国特許第5,534,123号[Bashkin et al.]を参照されたい）。(ヒドロキシプロピル)メチルセルロース（HPMC）ベースのマトリックスはコーティングされたキャピラリーでの二本鎖DNA分離に用いられてきた（Cheng et al., Anal. Chem., 66 (1994) 4210を参照されたい）。さらに、HPMCベースのマトリックスはコーティングなしのキャピラリーでの二本鎖DNAのキャピラリー電気泳動にも用いられてきた（Shihabi, J. of Chromatography A, 853 (1999) 349-354を参照されたい）。しかしながら、二本鎖DNAの効率的な分離に必要とされる分離マトリックスは一本鎖DNAに対して必要とされるそれとは大きく異なる。
【発明の開示】
【０００４】
調製が容易であり、キャピラリーチューブの中に入れるのが容易であり、一本鎖核酸フラグメントの高分解能分離を提供し、キャピラリーチューブから取り出すのが容易であり、254nmの紫外線を透過させる分離マトリックスに対するニーズがある。さらに、理想的には分離マトリックスは内部壁がコーティングされていない溶融石英キャピラリーチューブで機能すべきである。コーティングされたキャピラリーチューブは長ったらしい準備を必要とするし、またコーティングの劣化のため寿命も短い。
【０００５】
本発明の主な課題は、上述したニーズのそれぞれを満たすことである。この課題およびその他の課題（すなわち方法と組成物の双方における課題）を達成する方法は以下の詳細な説明から明らかである。
【０００６】
発明の概要
本発明は、一本鎖核酸のキャピラリー電気泳動による分離を行う新規なマトリックスとその新規なマトリックスを用いての新規な分離方法の両方である。本マトリックスは、調製するのが容易で、キャピラリーチューブに入れるまたはそこから取り出すのが容易で、また、コーティングなしのキャピラリーチューブの内部で使用するためのものである。最も広い意味では、本マトリックスは３つの構成成分すなわち水性緩衝液、変性剤およびHPMCから成っている。一本鎖核酸の分離は、このゲルマトリックスを使用することでよくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本マトリックスの第１の構成成分は、変性剤を含有している水性緩衝液である。好ましい緩衝液（pH = 8.1）は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン20mM、N-[2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]グリシン20mMおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物0.1mMの水溶液である。しかしながら、本発明に対しては、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン89mM、ホウ酸89mMおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物2mMの緩衝液（TBE緩衝液、pH = 8.2）やトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン50mM、[(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ]-1-プロパンスルホン酸50mMおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物2mMの緩衝液（TTE緩衝液、pH = 8.2）のような他の緩衝液も機能すると思われる。
【０００８】
変性剤は二本鎖核酸を個々の鎖に分離させる。マトリックスの一部として変性剤を用いると、核酸はキャピラリーの中を一本鎖の形態で移動する。一本鎖核酸を分離する場合、サンプル構成成分間のランダムなハイブリダイゼーションを防ぐために、変性剤がマトリックスの一部としてあるのが好ましい。尿素、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドが変性剤の例である。尿素が本発明の好ましい変性剤であり、マトリックス溶液中1〜11 Mの濃度、好ましくは8 Mの濃度で存在させる。ホルムアミドを尿素と共に、あるいは単独で用いてもよい。ホルムアミドの好ましい濃度はマトリックス中5〜30 %(体積/体積)である。ジメチルスルホキシドは254 nmの光を吸収し、一本鎖核酸の検出と干渉するので、本発明にとっては好ましいものではない。
【０００９】
本マトリックスの第３の成分はポリマーである。好ましいポリマーはHPMCである。低分子量（11,500）HPMCのみを使用する場合は、粘度は許容できるほどに低いが、一本鎖核酸の移動を妨害するEOFが高く、分離に理想よりも長い時間がかかる。高分子量(86,000)HPMCのみを使用する場合は、EOFは許容できるほどに低いが、マトリックスが粘稠すぎてキャピラリーチューブの中に容易に入れることができない。低分子量HPMCと高分子量HPMCの組み合せが十分に低いEOFと十分に低い粘度を与えることができることが見出された。例えば、好ましいマトリックスの処方として0.5 %〜4.6 %(重量/体積)の低分子量HPMCと0.1 %〜3 %(重量/体積)の高分子量HPMCが挙げられる。より好ましいマトリックスの処方としては2 %(重量/体積)の低分子量HPMCと1.2 %(重量/体積)の高分子量HPMCが挙げられる。HPMCは市販されており（St. Louis, MOにあるSigma-Aldrich社）、さらなる精製なしに使用することができる。
【００１０】
本発明のマトリックスは加圧下で素早くキャピラリーチューブの中に入れるまたはそこから取り出すことができる。例えば、実施例1のマトリックス組成に対して、内径75ミクロンで全長80 cmのキャピラリーチューブは、500 psiにて1分で空にすることができる。キャピラリーチューブはこの後次のラン(実験)のためリンスしてさらなるマトリックスで再充填することができる。マルチプレックスキャピラリー電気泳動装置では、多数のキャピラリーチューブを同時に充填、リンス、乾燥、あるいは再充填することができる。
【００１１】
本マトリックスはコーティングなしのキャピラリーチューブで使用することができる。このことは、コーティングなしのキャピラリーチューブは最小限の準備しか必要としないので、また寿命も長く（劣化するコーティングがない）廉価であるので、大きな利点となる。
【００１２】
本マトリックスは254 nmの紫外線を透過させる。それゆえ、本発明のマトリックスは一本鎖核酸フラグメントの検出と干渉しない。
【実施例】
【００１３】
以下の実施例は本発明を説明するために提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【００１４】
実施例 1（マトリックスの調製）
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 2ミリモル、N-[2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]グリシン 2ミリモルおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 0.01ミリモルを水に溶解させた。この溶液に尿素0.8モルを加え、溶解させた。この溶液を100 mLに希釈した。この溶液にHPMC（分子量 11,500）2 gおよびHPMC（分子量 86,000）1.2 gを加え、溶解させた。
【００１５】
実施例 2（一本鎖DNA 79merおよび80merの分離）
標記分離をMCE 2000(登録商標)［96キャピラリー、マルチプレックス型キャピラリー電気泳動装置（CombiSep, Inc., Ames, Iowa）］で行った。この装置には、有効長さ55 cm全長80 cmの内径75ミクロン外径150ミクロンの溶融石英キャピラリーが装着されていた。データの処理および装置の制御はCombiSep's MCE Manager(登録商標)ソフトウェアパッケージで行った。使用した試薬全てはACS等級以上であった。使用したゲルマトリックスは上記実施例1のものである。合成の一本鎖オリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologies, Inc.（Coralville, Iowa）から得た。このオリゴヌクレオチドを水に10-7Mの濃度に溶解させた。このサンプルを50ボルト/cmで15秒間注入した。分離は180ボルト/cmで行った。オリゴヌクレオチドは254 nmにおける吸収で検出した。結果を図1に示す。本発明のマトリックスの分解能はポリアクリルアミドマトリックスのそれと比べても遜色ないもので、コーティングされたキャピラリーの使用に依存するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図 1は、記載したHPMCベースのマトリックスを用いた、80merから79merの分離を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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