(57)【要約】Ｎｏｄ１活性を調整する方法であって、機能的Ｎｏｄ１を発現する細胞を用意し、および、該細胞をＭＴＰ関連分子を含んでなる組成物の関連分子と接触させることを含む方法、ならびに炎症および／またはアポトーシスを調整するためのＭＴＰ関連分子の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｄ１活性を調整する方法であって、
（ａ）真核細胞において機能的Ｎｏｄ１を発現させ、かつ
（ｂ）前記細胞を、ＭＴＰ関連分子と接触させる
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
Ｎｏｄ１活性を増強させる方法であって、かつ、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアゴニスト作用を有する分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＴＰ関連分子が、トリペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤａｐ、その生物学的に活性な誘導体、またはそのペプチドミメティック（peptidomimetic）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＴＰ関連分子が、ＭＴＰ、その生物学的誘導体またはそのペプチドミメティックである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｎｏｄ１活性を低下させる方法であって、かつ、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰに対してアンタゴニスト作用を有する分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物における炎症および／またはアポトーシスを調整する方法であって、ＭＴＰ関連分子を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項７】
炎症および／またはアポトーシスを増強させる方法であって、かつ、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアゴニスト作用を有する分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
炎症および／またはアポトーシスを減少させる方法であって、かつ、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアンタゴニスト作用を有する分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
生物学的に許容されうる担体と、生物学的有効量のＭＴＰ関連分子とを含んでなる、組成物。
【請求項１０】
構造Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰを有するトリペプチド、またはその生物学的誘導体もしくはペプチドミメティックである、化合物。
【請求項１１】
真核生物において炎症および／またはアポトーシスをin vivo増強させるための、アジュバントとして有用な化合物であって、
構造Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰを有するトリペプチド、またはその生物学的誘導体もしくはペプチドミメティックであり、かつ、アジュバントとして使用した場合に前記トリペプチドのアミノ酸ＡｌａがＮ−アシルムラミン酸と結合しない、化合物。
【請求項１２】
アジュバントとして使用する、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
抗原と、生物学的有効量の請求項１２に記載の分子とを含んでなる、組成物。
【請求項１４】
免疫原と、生物学的有効量の請求項１２に記載の分子とを含んでなる、組成物。
【請求項１５】
宿主の免疫応答を増強させる方法であって、宿主に、生物学的に許容されうる担体と免疫応答を増強させるのに十分な量の請求項１０に記載の化合物とを含有する組成物と関連づけられる、抗原、または、宿主において免疫応答を誘導させることが可能な目的の製品を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
宿主において免疫応答をもたらす方法であって、免疫応答を促進するのに有効な量の請求項１３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
目的の抗原と、免疫原性組成物の効果を増強するのに有効な量の請求項１２に記載の分子とを含有する、病原菌に対する免疫原性組成物。
【請求項１８】
ヒトまたは動物宿主のワクチン接種方法であって、宿主に、請求項１７に記載の免疫原性組成物のワクチン接種に有効な量を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
宿主がヒトまたは温血動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
Ｎｏｄ１が関与している炎症および／またはアポトーシス経路の分子の機能異常を検出する方法であって、
（ａ）Ｎｏｄ１が関与している炎症および／またはアポトーシス経路の分子の機能異常が疑わしい細胞を用意し、
（ｂ）前記細胞をＭＴＰまたはそのアゴニストと接触させ、
（ｃ）ＮＦ−κＢ活性化またはＩＬ−８生成を評価する
ことを含んでなり、
ここで、ＮＦ−κＢ活性化の変化またはＩＬ−８生成の変化は、Ｎｏｄ１が関与している炎症および／またはアポトーシス経路の分子の機能異常を示す、
方法。
【請求項２１】
Ｎｏｄ１とＭＴＰとの間の直接または間接相互作用の後に起こる炎症および／またはアポトーシス反応を調整することが可能な分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）機能的Ｎｏｄ１を発現する細胞を用意し、
（ｂ）前記細胞を試験しようとする分子と接触させ、
（ｃ）ＮＦ−κＢ活性化および／またはＩＬ−８生成を測定し、かつ、
（ｄ）必要に応じて、工程ｃ）の結果を試験しようとする分子の不在下で得られた結果と比較する
ことを含んでなり、
ここで、試験しようとする分子の不在下でのＮＦ−κＢ活性化および／またはＩＬ−８生成に対するＮＦ−κＢ活性化および／またはＩＬ−８生成の変化が、その試験した分子の哺乳動物グラム陰性菌感染によって起こる炎症反応を調整する能力を示す、
方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載のスクリーニング法によって同定された、分子。
【請求項２３】
哺乳動物における炎症および／またはアポトーシスを調整する方法であって、スクリーニング法によって同定された分子を哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
Ｎｏｄ１とＭＴＰまたはその誘導体もしくはペプチドミメティックを含有する、ペプチド性複合体。
【請求項２５】
グラム陰性菌感染を予防または治療するための、請求項９に記載の組成物。
【請求項２６】
サンプルにおいてグラム陰性菌由来のペプチドグリカンを検出する方法であって、
ａ）ペプチドグリカンを検出しようとするサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、
ｃ）ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用を検出する
ことを含んでなり
ここで、ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用は、そのサンプル中にグラム陰性菌由来のペプチドグリカンが存在することを示す、
方法。
【請求項２７】
ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用が、ＮＦ−κＢ活性化を測定することによって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用が、生物発光シグナルによって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物発光シグナルがＦＲＥＴ技術を用いて得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
サンプルにおいてペプチドグリカンを検出し、必要に応じて、ペプチドグリカンがグラム陰性菌起源のものであるか、グラム陽性菌起源のものであるかを判定する方法であって、
ａ）ペプチドグリカンを検出しようとするサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、Ｎｏｄ２タンパク質とも接触させ、
ｃ）ＭＴＰおよびＭＤＰと２種のＮｏｄタンパク質のうちの少なくとも一方との間の相互作用を検出し、かつ、
ｄ）必要に応じて、Ｎｏｄ１との相互作用とＮｏｄ２との相互作用とを識別する
ことを含んでなり、
ここで、ｃ）では２種のＮｏｄタンパク質のうちの少なくとも一方との相互作用がそのサンプル中にペプチドグリカンが存在することを示し、かつ、ｄ）ではＮｏｄ２とだけ相互作用することがそのサンプル中のペプチドグリカンがグラム陽性菌起源のものであることを示し、一方、Ｎｏｄ１ともＮｏｄ２とも相互作用することがそのサンプル中のペプチドグリカンがグラム陰性菌起源のものであることを示す、
方法。
【請求項３１】
ＭＴＰまたはＭＤＰとＮｏｄタンパク質との間の相互作用が、ＮＦ−κＢ活性化を測定することによって検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＭＴＰまたはＭＤＰとＮｏｄタンパク質との間の相互作用が、生物発光シグナルによって検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
生物発光シグナルが、ＦＲＥＴ技術を用いて得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
グラム陰性菌のペプチドグリカンとＮｏｄ１との間の相互作用を調整する分子をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＭＴＰを用意し、
ｂ）試験分子の存在下および不在下において、ＭＴＰをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、
ｃ）試験分子の存在下および不在下における、ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用を評価する
ことを含んでなり、
ここで、試験分子の存在下でのＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用の調整が前記分子がＮｏｄ１とグラム陰性菌のペプチドグリカンと間の前記相互作用を調整することを示す、
方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、最初に説明する、病原体認識分子Ｎｏｄ１に関するものであり、このＮｏｄ１は、具体的に言えば、ペプチドグリカンモチーフ、ムラミルトリペプチド（muramyl tripeptide）を介してグラム陰性菌を感知する。より詳細には、本発明は、ムラミルトリペプチド（ＭＴＰ）と関連する分子によるＮｏｄ１活性の調整に関する。本発明はまた、Ｎｏｄ１活性を調整することが可能な分子を同定するためのスクリーニング工程、ならびに炎症および／またはアポトーシスを調整するためのそのような分子の治療上の使用に関する。本発明はまた、炎症および／またはアポトーシスを調整するためにまたはアジュバントとして使用可能な新規化合物に関する。
【０００２】
多細胞生物では、細胞増殖速度と細胞死速度との均衡を保つことによりホメオスタシスが維持されている。細胞増殖は、多くの増殖因子および一般に細胞周期を通じて進行を促すプロトオンコジーンの発現によって影響を受ける。これに対し、腫瘍抑制遺伝子の発現をはじめとする多くの事象によって細胞増殖の停止が引き起こされる。
【０００３】
分化細胞では、内部自殺プログラムが働くとアポトーシスと呼ばれる独特のタイプの細胞死が起こる。このプログラムは、種々の外部シグナルのほか、例えば、遺伝子損傷を受けて細胞内で発生するシグナルによっても開始される。瀕死の細胞は炎症反応を起こすことなく食細胞によって迅速に取り除かれるため、長年、アポトーシス細胞死の規模は分からなかった。
【０００４】
アポトーシスを媒介する機構は集中的に研究されてきた。これらの機構は内因性プロテアーゼの活性化、ミトコンドリア機能の低下、ならびに細胞骨格の破壊、細胞収縮、膜のブレビング、およびＤＮＡ分解による核凝縮のような構造変化を伴う。アポトーシスを引き起こす種々のシグナルが、Ｃ．エレガンス(C. elegans)のような蠕虫類からヒトへと高度に保存されている遺伝子の発現によって調節される一般的な細胞死経路に集中し、これらの事象を引き起こしていると考えられている。実際に、無脊椎動物モデル系はアポトーシスを制御する遺伝子を同定し、特徴付ける貴重なツールであった。無脊椎動物およびさらに進化した動物の研究を通じて、細胞死と関係している多くの遺伝子が同定されたが、それらの産物が相互に作用してアポトーシスプログラムを実行する方法についてはほとんど分かっていない。
【０００５】
アポトーシスプログラムの中心となるタンパク質の一種であるカスパーゼは、基質切断部位のアスパラギン酸エステルに対して特異性を有するシスチンプロテアーゼである。これらのプロテアーゼは、主として、アポトーシスを受けている細胞で認められる形態変化の原因となる細胞タンパク質の分解に関与する。例えば、ヒトで確認されたカスパーゼの１つが、プロ−ＩＬ−１βの活性サイトカインへのプロセシングに関与するシステインプロテアーゼであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）変換酵素（ＩＣＥ）としてすでに知られている。
【０００６】
多くのカスパーゼおよびカスパーゼと相互に作用するタンパク質は、カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）と呼ばれる約６０個のアミノ酸からなるドメインを有している。特定のアポトーシスタンパク質がそれらのＣＡＲＤを介して互いに結合すること、そして、異なるサブタイプのＣＡＲＤが結合特異性を与え、それによって、例えば、種々のカスパーゼの活性が調節されることを主張した者もいた。
【０００７】
病原菌に対する生得免疫は、パターン認識分子（ＰＲＭ）による病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の特異的な感知によるものである。哺乳動物では、トール様受容体（ＴＬＲ）が最も広く研究されているＰＲＭ種であり、これらはリポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、リポタンパク質、二本鎖ＲＮＡおよびＣｐＧ  ＤＮＡのような種々のＰＡＭＰを感知することが分かっている(S. Akira et al., Nat. Immunol., 2, 675, 2001; R. Medzhitov, Nat. Rev. Immunol., 1, 135, 2001)。ＴＬＲは、主として原形質膜で発現されるものであるが、Ｎｏｄ１／ＣＡＲＤ４およびＮｏｄ２／ＣＡＲＤ１５をはじめとする細胞内タンパク質ファミリーであるＮｏｄ分子が細胞質コンパートメント内の細菌産物を感知することから、細胞内に侵入した細菌の存在の検出を可能にする新たなＰＲＭ群である可能性が最近提起されている(N. Inohara et al., J. Biol. Chem. 274, 14560, 1999; J. Bertin et al., J. Biol. Chem., 274, 12955, 1999; N. Inohara et al., J. Biol. Chem., 276, 2551, 2001; S. E. Girardin et al., EMBO Rep., 2, 736, 2001; Y. Ogura et al., J. Biol. Chem., 276, 4812, 2001; Y. Ogura et al., Nature, 411, 603, 2001; J. P. Hugot et al., Nature, 411, 599, 2001)。
【０００８】
カスパーゼリクルートメントドメインにちなんでＣＡＲＤ４とも呼ばれるＮｏｄ１の部分配列（ｃＤＮＡおよびタンパク質）は、１９９８年２月６日出願の特許出願番号０９／０１９，９４２で開示されており、米国特許第６，０３３，８５５号として現在認可されている。さらに、Bertin et al.(1999)では、ＣＡＲＤ４の完全アミノ酸配列と上記特許ですでに述べられているその機能の１つ：ＣＡＲＤ４がＮＦ−κＢおよびアポトーシスシグナル伝達経路を調整することが開示されている。Girardin et al.(2001)では、ＣＡＲＤ４／Ｎｏｄ１が侵入性Ｂ群赤痢菌(Shigella flexneri)によるＮＦ−κＢ活性化を媒介することが開示されている。この論文では、Ｂ群赤痢菌ＬＰＳとＣＡＲＤ４との間の相互作用を特に研究している。
【０００９】
ＣＡＲＤ−４が異常にダウンレギュレートされるという状況下、および／またはＣＡＲＤ−４活性を上昇させることに有益な効果がある可能性が高いという状況下では、Ｎｏｄ１／ＣＡＲＤ−４活性を促進することが望ましい。逆に、ＣＡＲＤ−４が異常にアップレギュレートされるという状況下、例えば、心筋梗塞、および／またはＣＡＲＤ−４活性を低下させることに有益な効果がある可能性が高いという状況下では、ＣＡＲＤ−４活性を阻害することが望ましい。ＣＡＲＤ−４がサイトカインのプロセシングに関与していることから、異常な炎症を起こしている患者においてはＣＡＲＤ−４の活性または発現を阻害することが有益であると思われる。
【００１０】
Ｎｏｄ１が上皮細胞の細胞質コンパートメント内のグラム陰性病原体、Ｂ群赤痢菌の存在を感知することが最近示され(S. E. Girardin et al., 2001)、さらに、市販のＬＰＳ調製物がＮｏｄ１を活性化することが分かっていることから、検出されたＰＡＭＰがＬＰＳであるという仮説が立てられた(N. Inohara et al., J. Biol. Chem., 276, 2551, 2001)。しかしながら、これらのＬＰＳは細菌細胞壁夾雑物を含有していることが多いため、当技術分野では、特定の分子モチーフがＮｏｄ１によって実際に検出され、そのモチーフがＮｏｄ１活性を調整するかどうかについてのより詳細な記載が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、当技術分野におけるこの必要性を満たす助けとなるものである。一つの態様では、本発明は、Ｎｏｄ１活性を調整する方法であって、
（ａ）真核細胞において機能的Ｎｏｄ１を発現させ、かつ
（ｂ）前記細胞をＭＴＰ関連分子と接触させる
ことを含んでなる方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、Ｎｏｄ１活性を増強させる方法であり、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアゴニスト作用を有する分子であるこの種の方法も提供する。一つの態様では、ＭＴＰ関連分子がトリペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤａｐ、その生物学的に活性な誘導体またはそのペプチドミメティック（ペプチド類似体（peptidomimetic））である。
【００１３】
もう一つの態様では、ＭＴＰ関連分子がＭＴＰ、その生物学的誘導体またはそのペプチドミメティックである。Ｎｏｄ１活性を低下させることが可能な方法であり、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰに対してアンタゴニスト作用を有する分子である。
【００１４】
さらに、本発明は、哺乳動物における炎症および／またはアポトーシスを調整する方法であって、ＭＴＰ関連分子をその哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。一つの態様では、炎症および／またはアポトーシスを増強させる方法であり、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアゴニスト作用を有する分子である。また、もう一つの態様では、炎症および／またはアポトーシスを減少させる方法であり、ＭＴＰ関連分子がＮｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアンタゴニスト作用を有する分子である。
【００１５】
さらに、本発明は、生物学的に許容されうる担体と生物学的有効量のＭＴＰ関連分子を含んでなる組成物を提供する。
本発明はまた、構造Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰを有するトリペプチド、またはその生物学的誘導体もしくはそのペプチドミメティックである化合物も提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、真核生物において炎症および／またはアポトーシスをin vivo増強させるための、すなわち、アジュバントとして有用な化合物であって、構造Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰを有するトリペプチド、またはその生物学的誘導体もしくはペプチドミメティックであり、かつ、アジュバントとして使用した場合に前記トリペプチドのアミノ酸ＡｌａがＮ−アシルムラミン酸と結合しない化合物を提供する。この化合物はアジュバントとしての使用に好適である。
【００１７】
本発明の組成物は、抗原と生物学的有効量の本発明の分子を含んでなる。組成物は、免疫原と生物学的有効量の分子を含んでなっていてもよい。
本発明は、宿主の免疫応答を増強させるための方法であって、宿主に、生物学的に許容されうる担体とその免疫応答を増強させるのに十分な量の本発明の化合物を含有する組成物と関連づけられる、抗原、または、宿主において免疫応答を誘導させることが可能な目的の製品を投与することを含む方法を提供する。この方法は、抗原と本発明の分子を含んでなる組成物の免疫応答を促進するのに有効な量を投与することを含んでもよい。
【００１８】
さらに、本発明は、目的の抗原と免疫原性組成物の効果を増強するのに有効な量の分子を含有する、病原菌に対する免疫原性組成物を提供する。
また、本発明は、ヒトまたは動物宿主のワクチン接種方法であって、その宿主に本発明の免疫原性組成物のワクチン接種に有効な量を投与することを含む方法も提供する。この宿主は、ヒトまたは温血動物であることが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明は、Ｎｏｄ１が関与している炎症および／またはアポトーシス経路の分子の機能異常を検出する方法であって、
（ａ）Ｎｏｄ１が関与している炎症および／またはアポトーシス経路の分子の機能異常が疑わしい細胞を用意し、
（ｂ）その細胞をＭＴＰまたはそのアゴニストと接触させ、かつ
（ｃ）ＮＦ−κＢ活性化またはＩＬ−８生成を評価する
ことを含んでなり、
ここで、ＮＦ−κＢ活性化の変化またはＩＬ−８生成の変化は、Ｎｏｄ１が関与している炎症および／またはアポトーシス経路の分子の機能異常を示す、
方法を提供する。
【００２０】
Ｎｏｄ１とＭＴＰとの間の直接または間接相互作用の後に起こる炎症および／またはアポトーシス反応を調整することが可能な分子をスクリーニングするための本発明の方法は、
（ａ）機能的Ｎｏｄ１を発現する細胞を用意し、
（ｂ）その細胞を試験しようとする分子と接触させ、
（ｃ）ＮＦ−κＢ活性化および／またはＩＬ−８生成を測定し、かつ、
（ｄ）必要に応じて、工程ｃ）の結果を試験しようとする分子の不在下で得られた結果と比較する
ことを含んでなり、
ここで、試験しようとする分子の不在下でのＮＦ−κＢ活性化および／またはＩＬ−８生成に対するＮＦ−κＢ活性化および／またはＩＬ−８生成の変化がその試験した分子の哺乳動物グラム陰性菌感染によって起こる炎症反応を調整する能力を示す。本発明は、スクリーニング工程によって同定された分子を含む。
【００２１】
また、本発明は、哺乳動物における炎症および／またはアポトーシスを調整する方法であって、スクリーニング工程によって同定された分子をその哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、Ｎｏｄ１とＭＴＰまたはその誘導体もしくはペプチドミメティックを含有するペプチド性複合体、ならびにグラム陰性菌感染を予防または治療するための本発明の組成物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、サンプルにおいてグラム陰性菌由来のペプチドグリカンを検出する方法であって、
ａ）ペプチドグリカンを検出しようとするサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、
ｃ）ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用を検出する
ことを含んでなり、
ここで、ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用がそのサンプル中にグラム陰性菌由来のペプチドグリカンが存在することを示す、
方法も提供する。
【００２４】
特定の態様では、本発明は、サンプルにおいてペプチドグリカンを検出し、必要に応じて、ペプチドグリカンがグラム陰性菌起源のものであるか、グラム陽性菌起源のものであるかを判定する方法であって、
ａ）ペプチドグリカンを検出しようとするサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、Ｎｏｄ２タンパク質とも接触させること、
ｃ）ＭＴＰおよびＭＤＰと２種のＮｏｄタンパク質のうちの少なくとも一方との間の相互作用を検出し、および、
ｄ）必要に応じて、Ｎｏｄ１との相互作用とＮｏｄ２との相互作用とを識別する
ことを含んでなり、
ここで、ｃ）では２種のＮｏｄタンパク質のうちの少なくとも一方との相互作用がそのサンプル中にペプチドグリカンが存在することを示し、かつ、ｄ）ではＮｏｄ２とだけ相互作用することがそのサンプル中のペプチドグリカンがグラム陽性菌起源のものであることを示し、Ｎｏｄ１ともＮｏｄ２とも相互作用することがそのサンプル中のペプチドグリカンがグラム陰性菌起源のものであることを示す、
方法を提供する。
【００２５】
従って、上記の方法によって、サンプルにおける細菌の存在を検出し、必要に応じて、前記細菌がグラム陰性起源のものであるかグラム陽性起源のものであるかを判断することが可能になる。
【００２６】
最後に、本発明は、グラム陰性菌のペプチドグリカンとＮｏｄ１との間の相互作用を調整する分子をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＭＴＰを用意し、
ｂ）試験分子の存在下および不在下において、ＭＴＰをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、
ｃ）試験分子の存在下および不在下における、ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用を評価する
ことを含んでなり、
ここで、試験分子の存在下でのＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用の調整が前記分子が前記相互作用を調整することを示す、
方法を提供する。
【発明の具体的説明】
【００２７】
本明細書において、ＭＴＰとは、グラム陰性菌細胞壁のペプチドグリカン由来のムラミルトリペプチド、ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰまたはメソ−ＤＡＰを含有するＧＭ−トリペプチドを意味する。
本明細書において、「ＭＴＰ関連分子」とは、Ｎｏｄ１のＭＴＰの活性に対してアゴニスト作用を有する分子もしくは化合物またはアンタゴニスト作用を有する分子もしくは化合物を意味する語である。ＭＴＰ関連分子としては、限定されるものではないが、ＭＴＰ、トリペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰ、例えば、糖部分を含まない３個のアミノ酸であるＭＴＰのペプチド部分のような生物学的に活性なＭＴＰ誘導体、ＧｌｃＮＡｃを含まないＭＴＰ、非環化糖を含まないＭＴＰ、ペプチドミメティックおよびＮｏｄ１の１つのＭＴＰに対してアンタゴニスト作用を有する分子が挙げられる。
【００２８】
ＭＴＰ関連分子の活性は、実施例で開示する試験によって評価することができる：例えば、ＮＦ−κＢ活性化の評価またはＩＬ−８生成の評価。Ｎｏｄ１のＭＴＰ活性に対してアゴニストとしての作用を有する分子は、ＮＦ−κＢ活性化またはＩＬ−８生成を増強する。Ｎｏｄ１のＭＴＰ活性に対してアンタゴニストとしての作用を有する分子は、ＮＦ−κＢ活性化またはＩＬ−８生成を低減する。
【００２９】
本明細書において、「生物学的に活性な誘導体」とは、機能保存的変異体、相同タンパク質またはペプチドおよびペプチドミメティック、ならびに、本明細書に記載するように、好ましくは、親ペプチドの結合特異性および／または生理作用を保持しているホルモン、抗体または合成化合物（すなわち、ペプチド性または非ペプチド性分子）を指す語である。
【００３０】
本明細書に記載するように、親ペプチドの結合特異性および／または生理作用を保持しており、試験を行うために開示されている作用試験で陽性結果が出る好ましいペプチドミメティックも本発明の一部である。
【００３１】
本明細書において、「ペプチドミメティック」とは、ペプチドのいくつかの特性、好ましくは、それらの結合特異性および／または生理作用がよく似ている有機分子である。好ましいペプチドミメティックは、好ましくは、Ｌ−アミノ酸の代わりに非天然アミノ酸であるＤ−アミノ酸を使用した本発明のペプチドの構造修飾、立体配座の制限、等配電子の置換、環化または他の修飾によって得られる。他の好ましい修飾としては、限定されるものではないが、１以上のアミド結合を非アミド結合に置き換えるという修飾、ならびに／または１以上のアミノ酸側鎖を異なる化学的部分に置き換えるという修飾、またはＮ末端、Ｃ末端あるいは１以上の側鎖のうちの１以上のものを保護基によって保護するという修飾、ならびに／または剛性および／もしくは結合親和性を高めるために二重結合および／もしくは環化および／もしくは立体特異性をアミノ酸鎖に導入するという修飾が挙げられる。
【００３２】
Ｎｏｄ１の１つに対してアンタゴニスト作用を有する分子を調製するために修飾を行ってもよい。
細胞外の細菌感知におけるトール様受容体の役割が集中的に研究されている一方で、Ｎｏｄ分子を通じた細胞内の細菌検出については、依然としてほとんどが確認されていない。本発明では、ＮＦ−κＢ経路の活性化をもたらすグラム陰性菌ペプチドグリカンに見られる、ジアミノピメリン酸を含有する独特のＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃトリペプチドモチーフをＮｏｄ１が特異的に検出することを示している。さらに、本発明では、侵入性病原体に対する防御の第一線である上皮細胞において、細胞内のグラム陰性菌感知にＮｏｄ１が不可欠であることを示している。これまでのところ、Ｎｏｄ１がグラム陰性菌ペプチドグリカンを特異的に感知する病原体認識分子の最初の例である。
【００３３】
さらに、本発明では、Ｎｏｄ１がＭＴＰ、より詳細には、ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃトリペプチドのペプチド部分を特異的に感知することを示している。
本発明において、本発明者らは、先の研究においてＬＰＳが夾雑物であったこと、そして、Ｎｏｄ１がグラム陰性菌のペプチドグリカンに見られる独特のモチーフ：その３番目の位置にジアミノピメリックアミノ酸を有するムラミルトリペプチドを特異的に検出することを示している。
【００３４】
多くの公開物は、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）とそのアジュバント特性を対象としている。また、ＭＴＰ（ムラミルトリペプチド）のアジュバント特性についての公開物もあり、これらは一般に、ＭＴＰ−ＰＥ、すなわち、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミンを対象としたものである。最初の特許である、１９７１年１１月１９日出願のＦＲ２１６０３２６は、マイコバクテリウム(mycobacteria)またはノカルジア菌(Nocardia)細胞壁から抽出されるアジュバント活性を有する可溶性薬剤を調製する方法に関するものである。ＦＲ２１６０３２６の他、１９７３年１０月２３日出願のＦＲ２２４８０２５は、この可溶性薬剤のアジュバント活性が細胞壁ペプチドグリカンの可溶性断片から来ているという発見を開示する、特定のムラミルペプチドに関するものである。等価の米国特許は特許番号第４，１８６，１９４号である。本発明は、以下のとおりである。
【００３５】
米国特許第４，１８６，１９４号のトリペプチドは決まって糖部分を有している。
大腸菌(Escherichia coli)ＬＰＳの市販の調製物（１０μｇ）をＮｏｄ１過剰発現ＨＥＫ２９３細胞に添加することで、Ｎｏｄ１依存性ＮＦ−κＢ活性化のレベルを５倍増強することができる（図１Ａ）。一方、高度に精製された大腸菌ＬＰＳ（１０μｇ）またはリピド（脂質）Ａ（１０μｇ）では、Ｎｏｄ１経路を刺激することができない（図１Ａ）が、それらはマクロファージを効果的に活性化することができる。これらの発見は、市販のＬＰＳ調製物中に存在する夾雑物がＮｏｄ１活性化に関与している可能性が高いことを示している。そのため、この夾雑物の性質を同定することが１つの狙いであった。リポタンパク質は、最近、市販の大腸菌ＬＰＳによる刺激を受けた後のＴＬＲ２シグナル伝達に関与する、ＬＰＳ調製物の重要な夾雑物と同定された(K. Lee et al., P. S. Tobias, J. Immunol., 168, 4012, 2002)。しかしながら、合成リポペプチドまたは大腸菌において最も豊富なリポタンパク質であるＬｐｐいずれかの添加ではＮｏｄ１経路を刺激することはできなかった（図１Ｂ）。さらに、市販のＬＰＳの煮沸またはプロテイナーゼＫ処理は、Ｎｏｄ１シグナル伝達の阻止に十分なものではなかった。
【００３６】
次の狙いは、Ｎｏｄ１シグナル伝達経路の刺激におけるＰＧＮの潜在的役割について取り組むことであった。そのため、大腸菌由来、Ｂ群赤痢菌由来、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)由来、枯草菌(Bacillus subtilis)由来および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のＰＧＮを、特に、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に対して設計された試験手順に従って精製した(B. L. de Jonge et al., J. Biol. Chem., 267, 11248, 1992; B. Glauner, Anal. Biochem., 172, 451, 1988)。これらのＰＧＮの精製に使用する厳密な精製工程によって可能性ある夾雑物を排除する（図４）。顕著にも、グラム陰性菌由来のＰＧＮ調製物はＮｏｄ１経路を刺激するが、一方、ここで試験した２種類のグラム陽性菌ＰＧＮ調製物では刺激し得ないということが観察された（図１Ｃ）。さらに、Ｃ末端のロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）を欠いた突然変異型Ｎｏｄ１を用いることにより、Ｎｏｄ１のＬＲＲがグラム陰性菌ＰＧＮの感知において重要な役割を果たすということが観察された（図１Ｄ）。よって、これらの結果は、Ｎｏｄ１がＬＲＲドメインを通じてグラム陰性菌ＰＧＮを特異的に感知する細胞内ＰＲＭであることを強く示唆した。
【００３７】
Ｎｏｄ１によって検出される最小ＰＧＮモチーフを同定するため、髄膜炎菌由来のムロペプチドを、ムラミダーゼによってＰＧＮを消化した後、逆相ＨＰＬＣにより分析した。実際には、グラム陰性菌によって自然に放出される主要なＰＧＮ断片がムロペプチドである(J.-H. Holtje, Microbiol. Mol., Biol. Rev., 62, 181, 1988; N. T. Blackburn et al., J. Mol. Evol., 52,78, 2001)。この分析により、アミノ糖に結合したペプチド鎖のアミノ酸数、ペプチド鎖の重合度またはアミノ糖のＯ−アセチル化または脱水などの自然修飾に応じたムロペプチドの分離が可能になった（図２Ａ）。
【００３８】
ムロペプチドを個々に回収し、Ｎｏｄ１経路を活性化するそれらの能力について試験した。驚くべきことに、２つの画分（３および１７）だけにＮｏｄ１を活性化し得るムロペプチドが含まれていた（図２Ｂ）。質量分析による解析では、画分３が分子量８９３ｍ／ｚのムロペプチドであり、画分１７の活性分子が分子量８７３ｍ／ｚのムロペプチドであることが分かった。８９３ｍ／ｚの分子は還元ムロペプチド、トリペプチド基置換を受けたＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃまたは「Ｍ」）にβ−１，４結合したＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたは「Ｇ」）と一致し（図２Ｃ）、一方、８７３ｍ／ｚの分子はＭｕｒＮＡｃ部分において自然脱水を受けた同じムロペプチド（アンヒドロ−ＭｕｒＮＡｃ）に該当する。そのため、ＭｕｒＮＡｃにおいて置換するトリペプチド基、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰ（ここで、Ａｌａはアラニンであり、Ｇｌｕはグルタミンであり、ＤＡＰはジアミノピメリン酸である）は画分３および１７において同じである。Ｂ群赤痢菌から単離されたムロペプチドについてＨＰＬＣ分析および生物学的アッセイを行ったところ、試験結果は同様であった。
【００３９】
Ｎｏｄ１が感知する分子パターンに関する多くの知識を得るため、ＧＭ−ジペプチド、ＧＭ−トリペプチドおよびＧＭ−テトラペプチドによるＮｏｄ１経路の活性化についての比較を行った。同量（１０ｎｇ）のＧＭ−ジペプチド、ＧＭ−トリペプチド（画分３から）およびＧＭ−テトラペプチド（画分６）をＮｏｄ１経路を活性化するそれらの能力について試験した。Ｎｏｄ１がＧＭ−ジペプチドやＧＭ−テトラペプチドではなくＧＭ−トリペプチドを特異的に検出することが観察された（図２Ｄ）。Ｎｏｄ１はＮｏｄ２と密接な関係があるため、これらのＰＧＮ産物をＮｏｄ２検出についても試験した。先の発見およびInohara et al.の発見によりＮｏｄ２がＭ−ジペプチドを認識することが示された(S. E. Girardin et al., J. Biol. Chem., 278, 8869, 2003; N. Inohara et al., J. Biol. Chem., 278, 5509, 2003)。顕著には、Ｎｏｄ２がＭ−ジペプチドに加えて、ＧＭ−トリペプチドやＧＭ−テトラペプチドではなくＧＭ−ジペプチドを検出することが判明し（図２Ｄ）、これら２種類のＮｏｄ分子はいずれもＰＧＮを感知するが、検出の実現には異なる分子モチーフが必要であることが示唆される。また、ＴＬＲ２では試験したいずれのムロペプチドも検出し得ないということも観察された（図２Ｄ）。
【００４０】
Ｎｏｄ２が感知するＰＧＮモチーフ、ＧＭ−ジペプチドはあらゆる細菌で見られることから、Ｎｏｄ２がＰＧＮ分解産物の一般センサーであることが示唆される(S. E. Girardin et al., 2003; N. Inohara et al., 2003)。これに対し、Ｎｏｄ１による感知にはメソＤＡＰがさらに必要であるということにより、Ｎｏｄ１が、試験したグラム陽性菌ＰＧＮに対し、グラム陰性菌から精製されたＰＧＮだけを検出する（図１Ｃを参照）ことへの説明がつく。実際に、黄色ブドウ球菌ＰＧＮにはメソＤＡＰの代わりにリジンが含まれており、一方、枯草菌にはアミド化ジアミノピメリン酸が含まれている（図５Ａ〜５Ｃ）。さらに、黄色ブドウ球菌ＰＧＮには検出可能な量のＧＭ−トリペプチドが存在しない(B. L. de Jonge et al., 1992)。加えて、これらの発見は、メソＤＡＰも含有しているＧＭ−テトラペプチドがＮｏｄ１によって感知されないことから、Ｎｏｄ１感知系には露出されたメソＤＡＰが必要であるということも示す。次に、ＰＧＮ検出の実現にメソＤＡＰを必要としないＮｏｄ２が枯草菌ＰＧＮも髄膜炎菌ＰＧＮも感知するということが観察された（図２Ｅ）。これに対し、たとえ枯草菌ＰＧＮがメソＤＡＰを含有するＰＧＮといくつかの構造的類似性を共有しているとしても（図５Ａ〜５Ｃ）、Ｎｏｄ１によって枯草菌ＰＧＮは検出されない（図２Ｅ、図１Ｃでも示される）。Ｎｏｄ１がＧＭ−トリペプチドを感知することによって、ＮＦ−κＢ活性化に加え、グラム陰性菌感染した上皮細胞で生成される主要なサイトカインの１つである炎症性ケモカイン、インターロイキン−８の生成も引き起こされる（図２Ｆ）ことが分かった(L. Eckmann et al., J. Biol. Chem., 275, 14084, 2000; T. Pedron et al., J. Biol. Chem., 278 (36), 33878-86,2003)。総合すれば、これらの結果は、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−８のＮｏｄ１依存性活性化に関するＰＧＮの構造条件として、トリペプチドと末端メソＤＡＰアミノ酸に結合したＧＭが挙げられ、その両方のカルボキシ基が重要な役割を果たすことを示している。
【００４１】
次に、関心あることは、上皮細胞による細胞内細菌感知においてのＮｏｄ１によるＰＧＮ検出への貢献を確認することであった。実際に、先の研究では粘膜面における病原菌に対する防御の第一線としてのこれらの細胞の極めて重要な役割を強く主張した。まず、種々のグラム陰性菌またはグラム陽性菌から抽出物を調製し、これらの抽出物の相対ＰＧＮ含量を測定した（図６Ａ）。次いで、これらの細菌抽出物を細胞外に添加したところ、それらがＨＥＫ２９３上皮細胞においてＮＦ−κＢを活性化し得ないことが分かり（図３Ａ）、これらの細胞が内因性ＴＬＲ２／４感知系を発揮しないことを確認した。唯一の例外がネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)抽出物であった。このケースでは、フラジェリン欠損ネズミチフス菌株由来の抽出物でＮＦ−κＢ経路を刺激し得なかったことから、ＮＦ−κＢ活性化にＴＬＲ５が関与していると思われる(F. Hayashi et al., Nature, 410, 1099, 2001)（図３Ａ）。次いで、ジギトニンによる透過性上昇技術を利用して細菌産物の細胞質への侵入を促し、侵入性細菌由来の細菌産物または非侵入性細菌由来の細菌産物のＮＦ−κＢ経路を活性化する能力の直接比較をした。多くのグラム陰性菌由来の抽出物ではＮＦ−κＢ経路を刺激し得、一方、４種類のグラム陽性菌由来の抽出物では刺激し得ないことが観察された。（図３Ａ）。他の２種類の上皮細胞系（ＨｅＬａおよびＣａｃｏ−２）では、Ｂ群赤痢菌由来または黄色ブドウ球菌由来の細菌産物をマイクロインジェクションし、続いて、免疫蛍光によりＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットの核移行を検出することによって、グラム陰性菌抽出物によるＮＦ−κＢの特異的活性化しか確認されなかった（図３Ｂおよび図６Ｂ）。
【００４２】
よって、これらのデータは、細胞質コンパートメントに提示された際、上皮細胞はグラム陰性菌産物を感知するがグラム陽性菌産物を感知しないということを示している。これらの発見は、ここで試験したグラム陰性菌から放出されたＰＧＮモチーフ全てに末端メソＤＡＰを有するＧＭ−トリペプチドが含まれており、放出されたグラム陽性菌ＰＧＮ産物にこの構造はないという事実と一致している。リステリア菌(L. monocytogenes)のケースでは、ＰＧＮにメソＤＡＰが含まれている；しかしながら、ＰＧＮ分解産物については今だ確認されていない。興味深いことに、リステリア菌の主要なＰＧＮヒドロラーゼがＰＧＮ糖骨格とペプチド鎖との結合を切断するＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−アミダーゼである。それゆえに、リステリア菌がかなりの量のムロペプチドを放出するという可能性は低く、むしろ、ペプチド鎖およびアミノ糖を遊離させるのではないかと思われる(A. M. McLaughlan et al., Microbiology, 144, 1359, 1998)。
【００４３】
上皮細胞によるグラム陰性菌抽出物の細胞内感知に関与しているシグナル伝達経路を同定するために、まず、ドミナントネガティブ型ＭｙＤ８８ではネズミチフス菌ΔＦ、Ｂ群赤痢菌および大腸菌をはじめとするグラム陰性菌由来の抽出物によりジギトニン透過化細胞において誘導されるＮＦ−κＢ経路の活性化を遮断し得ないことから、この経路がＴＬＲ／ＩＬ−１経路の重要なアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８とは無関係であること(T. Kawai et al., Immunity, 11, 115, 1999)が立証された（図３Ｃ、データは示していない）。一方、ドミナントネガティブ型Ｎｏｄ１（ＤＮ−Ｎｏｄ１）を用いた場合、Ｂ群赤痢菌由来の細菌産物、ネズミチフス菌由来の細菌産物および大腸菌由来の細菌産物によりジギトニン透過化細胞において誘導されるＮＦ−κＢ活性化を効果的に遮断し得た（図３Ｄ）。Ｎｏｄ１がＲｉｐ２のリクルートメントを通じてＮＦ−κＢ経路を活性化するということを示す報告もある(S. E. Girardin et al., 2001; N. Inohara et al., J.Biol. Chem., 275, 27823, 2000; A. l. Chin et al., Nature, 416, 190, 2002; K. Kobayashi, et al., Nature, 416, 194, 2002)。それに応じて、ドミナントネガティブ型Ｒｉｐ２がグラム陰性菌由来の抽出物によりジギトニン透過化細胞において誘導されるＮＦ−κＢ経路を遮断するいうことも観察された（図３Ｅ）。
【００４４】
これらの発見は、ゆえに、Ｎｏｄ１が上皮細胞における重大な細胞内細菌産物センサーであり、Ｎｏｄ１依存性炎症経路の誘導は、侵入性または細胞外の病原菌がグラム陰性菌ＰＧＮを細胞内環境へと移行させる能力に依存していることを示している。
【００４５】
さらに、ＧＭ−ジペプチドの画分に対してさらなる試験を実施したところ、驚くべきことに、Ｎｏｄ１が糖部分を含まないトリペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰを感知し得ることが分かった。ゆえに、同定する、Ｎｏｄ１が感知する最小のモチーフがトリペプチドである。
【００４６】
当然のことながら、本発明はＮｏｄ１の１以上の生物活性を阻害することができるか、または増強することができるＮｏｄ１のアンタゴニストおよびアゴニストを含む。好適なアンタゴニストとしては、有機または無機小分子（すなわち、分子量が約５００未満の分子）、大分子（すなわち、分子量が約５００より大きい分子）、抗体および核酸分子が挙げられる。Ｎｏｄ１のアゴニストとしては、小分子と大分子との組合せも含む。
【００４７】
よって、本発明は（１）機能的Ｎｏｄ１を発現している細胞をＮｏｄ１の活性を調整するのに十分な濃度のＮｏｄ１活性化化合物と接触させることにより、Ｎｏｄ１の活性を調整する（例えば、低下または増強させる）ための方法；ならびに（２）Ｎｏｄ１を試験化合物（例えば、ポリペプチド、リボ核酸、小分子、大分子、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボ核酸）と接触させ、試験化合物の存在下または不在下でＮｏｄ１の活性レベルを検出し、比較することにより、Ｎｏｄ１の活性を調整する（例えば、低下または増強させる）化合物を同定する方法を特徴とする。
【００４８】
ある細胞においてＮｏｄ１の活性を調整する化合物は、選択した化合物の存在下でのＮｏｄ１の活性を前記化合物の不在下でのＮｏｄ１の活性と比較することにより同定することができる。Ｎｏｄ１活性レベルの差が、選択した化合物がその細胞におけるＮｏｄ１発現を調整するということことを示す。
【００４９】
本発明に従ってスクリーニングすることが可能な典型化合物としては、限定されるものではないが、好適な細胞に侵入し、Ｎｏｄ１タンパク質の活性に影響を及ぼし得る有機小分子が挙げられる。
【００５０】
コンピューターモデリングや検索技術により、Ｎｏｄ１活性を調整することが可能な化合物の同定、またはすでに同定されている化合物の改良が可能になる。このような化合物または組成物を同定することにより、活性部位または領域が同定される。このような活性部位は、一般に、活性の天然モジュレーターに対する結合であると思われる。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸の核酸配列から、または関連化合物もしくは組成物とその天然リガンドとの複合体の研究からといったように、当技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。後者のケースであれば、化学的またはＸ線結晶学的方法を利用し、因子上でモジュレーター（またはリガンド）が発見される場所を見つけることによって活性部位を発見することができる。
【００５１】
次に、活性部位の三次元幾何構造を決定することが可能である。これは完全な分子構造を決定することができるＸ線結晶学をはじめとする公知の方法によって行える。他方、固相または液相ＮＭＲを利用して、特定の分子内距離を決定してもよい。構造決定についての他の試験方法を利用して、部分または完全幾何構造を得てもよい。幾何構造は天然または人工のモジュレーター複合体（リガンド）を用いて測定することができ、それによって決定する活性部位の構造の精度を高めることが可能である。
【００５２】
決定された構造が不完全であるか、または十分な正確さを欠いているならば、コンピューターによる数値モデリング法を利用して、構造を完成させるか、またはその精度を向上させることができる。タンパク質または核酸のような特定の生物高分子に特有のパラメータ化されたモデル、分子運動のコンピューティングに基づく分子動力学モデル、サーマルアンサンブルに基づく統計力学モデルまたは複合モデルを含む、認知されているあらゆるモデリング方法を利用することができる。ほとんどの種類のモデルでは、構成原子と基との間の影響力を表す標準分子力場が必要であり、物理化学において公知の力場から選択することができる。不完全であるか、またはあまり正確ではない実験構造は、これらのモデリング方法によってコンピューティングされる完全でより正確な構造に対する制約となる。
【００５３】
最後に、実験によって、モデリングによって、または組み合わせて、活性部位の構造を決定したら、それらの分子構造に関する情報とともに化合物を含むデータベースを検索することで候補調整化合物を同定することができる。このような検索では、決定された活性部位構造をマッチさせ、活性部位を定義している基と相互に作用する構造を有する化合物を探求する。このような検索は手動で行えるが、好ましくは、コンピューターを使用する。この検索で見つかったこれらの化合物は有力なＮｏｄ１調整化合物である。
【００５４】
また、これらの方法を利用して、これまで確認されている調整化合物またはリガンドから改良された調整化合物を同定することもできる。既知化合物の組成物を修飾し、新規組成物に適用される上記の実験的方法およびコンピューターモデリング法を用いて修飾の構造効果を決定する。次いで、改変された構造を化合物の活性部位構造と比較して、適合または相互作用が向上したかどうかを判断する。このように、側基の変更によるなどの組成物における体系的変化を迅速に評価して、特異性または活性が向上した修飾型調整化合物またはリガンドを得ることができる。
【００５５】
分子モデリング系の例としては、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムがある(Polygen Corporation, Waltham, Mass.)。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子動力学的機能を備えている。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を行う。ＱＵＡＮＴＡは対話式構築、修飾、画像化、および分子の相互挙動の解析が可能である。
【００５６】
特定のタンパク質と相互に作用する薬物のコンピューターモデリングを総説する、Rotivinen et al., Acta Pharmaceutical Fennica, 97: 159 [1993]; Ripka, New Scientist 54-57 [Jun. 16, 1988]; McKinaly and Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 29: 111 [1989]; Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design, pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis and Dean, Proc. R. Soc. Lond., 236: 125 [1989];および141 [1980]；ならびに、核酸成分のモデル受容体に関する、Askew et al., J Am. Chem. Soc., 111: 1082 [1989])のような多くの論文がある。化学物質をスクリーニングし、図形表示する他のコンピュータープログラムは、BioDesign, Inc.(Pasadena, Calif.)、Allelix, Inc.(Mississauga, Ontario, Canada)およびHypercube, Inc.(Cambridge, Ontario)のような企業から入手することができる。これらは、主として、特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するために設計されているが、領域が同定されているのならば、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な薬物の設計にそれらを適合させてもよい。
【００５７】
結合を改変し得る化合物の設計および作製に関して以上で記載したが、天然物または合成化学物質、およびタンパク質をはじめとする生物活性物質を含む既知化合物のライブラリーをＮｏｄ１活性の阻害剤またはアクチベーターである化合物についてスクリーニングしてもよい。
【００５８】
本明細書に記載のもののようなアッセイによって同定された化合物は、例えば、Ｎｏｄ１の生物学的機能を構成する際やＮｏｄ１活性または発現の異常に関連する疾患の治療に有用である。上記方法で同定される化合物の有効性を試験するためのアッセイを以下に論述する。
【００５９】
Ｎｏｄ１（またはＮｏｄ１のドメイン）と相互作用することが可能な化合物を同定するようにin vitro系を設計し得る。同定された化合物は、例えば、野生型および／または変異型Ｎｏｄ１の活性を調整するのに有用であり得、生物学的機能Ｎｏｄ１を構成するのに有用であり得、正常なＮｏｄ１の相互作用を遮断する化合物を同定するためのスクリーニングに利用し得、またはそれ自体でこのような相互作用を遮断し得る。
【００６０】
Ｎｏｄ１を活性化する化合物を同定するのに使用されるアッセイの原理では、Ｎｏｄ１（またはそのドメイン）と試験化合物の反応混合物を２成分が相互作用し、活性化させるのに十分な条件下および時間で調製し、それを受けて複合体が形成され、反応混合物においてこの複合体が除去および／または検出される。使用するＮｏｄ１種はスクリーニングアッセイの目的によって異なる。場合によっては、アッセイ系（例えば、標識化、生じた複合体の単離など）に有利な異種タンパク質またはポリペプチドと融合される、Ｎｏｄ１のドメインに相当するペプチドを使用することが好ましい。
【００６１】
細胞系アッセイを使用して、Ｎｏｄ１と相互に作用する化合物を同定してもよい。この目的のために、Ｎｏｄ１を発現する細胞系統またはＮｏｄ１を発現するよう遺伝子操作した細胞系統を使用することができる。
【００６２】
化合物を阻害活性について試験するために、試験化合物の存在下および不在下で反応混合物を調製する。試験化合物は最初に反応混合物に含めておいてもよいし、Ｎｏｄ１部分を導入した直後に添加してもよい。対照反応混合物は試験化合物不在かまたは非活性対照化合物とともにインキュベートする。次いで、Ｎｏｄ１部分と結合パートナーとのあらゆる複合体の形成を検出する。対照反応物では複合体が形成するが、試験化合物を含む反応混合物では形成しないことから、化合物がＮｏｄ１と相互に作用する結合パートナーとの相互作用を妨げることが示される。さらに、試験化合物と正常Ｎｏｄ１タンパク質とを含む反応混合物内での複合体形成と、試験化合物と変異型Ｎｏｄ１とを含む反応混合物内での複合体形成との比較も行える。変異型の相互作用を遮断するが、正常Ｎｏｄ１の相互作用は遮断しない化合物を同定することが望ましいというケースにおいてこの比較は重要なものとなろう。
Ｎｏｄ１を調整することが可能な化合物を同定するための他の方法は、実施例に開示している。
【００６３】
本発明は、Ｎｏｄ１の活性を調整する化合物を投与することにより、アポトーシス細胞死の異常なレベルもしくは割合（望ましくないほど高いか、望ましくないほど低い）、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１受容体複合体の異常な活性、ＴＮＦ受容体複合体の異常な活性、カスパーゼの異常な活性または感染もしくは非感染起源の炎症に関連する疾患を患っている患者を診断し、治療する方法を包含する。このような化合物の例としては、小分子および大分子が挙げられる。当然のことながら、以下のもののような種々の疾患の治療にも本発明を使用することができる。
【００６４】
アポトーシスが抑制されると、生産され、生存または増殖し続ける、生存細胞の数の増加に関連する疾患がある。これらの疾患としては、癌（特に、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の突然変異に関連する癌腫、および乳癌、前立腺癌および卵巣癌のようなホルモン依存性腫瘍）、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎など）、ならびにウイルス感染（ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスに起因するものなど）が挙げられる。
【００６５】
発達段階に生じる自己免疫細胞または免疫応答の間に体細胞突然変異の結果として産生する自己免疫細胞が排除されなかった場合に自己免疫疾患が起こる。リンパ球における細胞死の調節において重要な役割を果たす分子の１つがＦａｓに対する細胞表面受容体である。
【００６６】
ウイルス感染事象では、細胞が枯渇することが多く、恐らく、最も劇的な例がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって起こる細胞枯渇である。驚くべきことに、ＨＩＶ感染時に死滅するほとんどのＴ細胞は、ＨＩＶに感染しているように見えない。多くの解釈が提示されてきたが、ＣＤ４受容体が刺激を受けることで感染していないＴ細胞のアポトーシスを受ける感受性が高まるということが最近示された。
【００６７】
多くの種類の神経系疾患には、神経細胞の特定集団が徐々に喪失するという特徴がある。このような疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、および種々の小脳変性症が挙げられる。これらの疾患での細胞の喪失は炎症反応を誘導せず、アポトーシスが細胞死の機構であると思われる。
【００６８】
さらに、多くの血液疾患は血液細胞生成の減少と関連している。これらの疾患としては、慢性疾患に伴う貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少症および骨髄異形成症候群が挙げられる。骨髄異形成症候群およびある種の再生不良性貧血のような血液細胞生成疾患は、骨髄内でのアポトーシス細胞死の増加と関連している。これらの疾患は、アポトーシスを促す遺伝子の活性化、間質細胞もしくは造血生存因子の後天性欠乏、または毒素および免疫応答メディエーターの直接の影響によって生じ得る。
【００６９】
２つのよく見られる細胞死関連疾患が心筋梗塞および卒中である。どちらの疾患においても、血流の急性欠乏事象において生じる虚血の中心部内にある細胞が壊死の結果として急速に死滅するようである。しかしながら、中心虚血領域外では、より長い時間をかけて細胞が死滅し、アポトーシスにより形態学的に死滅すると思われる。
【００７０】
感染起源および非感染起源いずれもの特定炎症性疾患を、Ｎｏｄ１活性を調整する化合物を投与することにより治療し得る。炎症性疾患の病理は、炎症を介する組織の破壊と関連している。非感染起源の炎症性疾患としては、限定されるものではないが、アレルギー、喘息、乾癬、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎など）、および特定の癌が挙げられる。感染性炎症性疾患としては、胃腸炎（赤痢菌属(Shigella spp.)、腸炎菌(Samonella enteritidis)、カンピロバクター属(Campylobacter spp.)、下痢原性大腸菌の異種系統）、胃炎、胃潰瘍、および癌（ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)）、腟炎（クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)）ならびに呼吸器疾患（緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、マイコバクテリウムなど）を引き起こすもののような感染症が挙げられる。
【００７１】
Ｎｏｄ１活性の異常によって媒介される疾患を有する患者は、Ｎｏｄ１の活性を改変する化合物の投与によって治療することができる。よって、本発明は、Ｎｏｄ１の活性を低下または増強させる化合物（例えば、ポリペプチド、リボ核酸、小分子、大分子、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはデオキシリボ核酸）の治療上有効な量を投与することにより、Ｎｏｄ１活性異常に関連する疾患を有する患者を治療する方法を特徴とする。それゆえに、本発明は、Ｎｏｄ１をコードする遺伝子の発現または活性を調整することによりアポトーシスを調整する方法を特徴とする。
【００７２】
Ｎｏｄ１活性異常に関連する疾患の予防的または治療的処置のために、Ｎｏｄ１活性に対して促進または阻害効果を有する薬剤またはモジュレーターを個体に投与してもよい。異質の化合物または薬物に対する個体の反応により効果的な薬剤の選択が可能になり、その反応は適切な用量および治療計画の決定にさらに利用することができる。よって、Ｎｏｄ１の活性を決定し、それを利用して、個体の治療的または予防的処置に好適な薬剤を選択することが可能である。
【００７３】
本発明は、サンプルにおいてグラム陰性菌由来のペプチドグリカンを（ＭＴＰを通じて）検出する方法を包含する。これらの方法では、グラム陰性菌ＭＴＰとＮｏｄ１との間の特異的相互作用を利用して、サンプル中のグラム陰性菌由来のペプチドグリカン、次に、グラム陰性菌を検出する。
【００７４】
好ましい態様では、本発明は、サンプルにおいてグラム陰性菌由来のペプチドグリカンを検出する方法であって、
ａ）ペプチドグリカンを検出しようとするサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、
ｃ）ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用を検出する
ことを含んでなり、
ここで、ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用がそのサンプル中にグラム陰性菌由来のペプチドグリカンが存在することを示す、
方法に向けられる。
【００７５】
グラム陰性菌ＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用の検出は、例えば、実施例に開示したように、細胞におけるＮＫ−κＢ活性化を測定することによりなし得る。
他方、Ｎｏｄ１は感染後に自己オリゴマー化する(N. Inohara et al., 2001)。この特性に基づき、Ｎｏｄ１のオリゴマー化を検出することによって、Ｎｏｄ１／グラム陰性菌ＭＴＰ相互作用を検出してもよい。例えば、Ｎｏｄ１のオリゴマー化の検出は、Ｎｏｄ１とプローブとのカップリングを利用することにより行うことができる。より詳細には、本発明の方法を無細胞系で実施し、Ｎｏｄ１のオリゴマー化を生理化学反応によりモニタリングすることができる。特定の態様では、当業者に周知の、検出可能な生物発光シグナルを発生させるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用して、Ｎｏｄ１のオリゴマー化を検出する。
【００７６】
Ｎｏｄ２は、グラム陰性菌ペプチドグリカンまたはグラム陽性菌ペプチドグリカンのいずれかを検出する(S. E. Girardin et al., 2003; N. Inohara et al., 2003)。ゆえに、本発明の方法では、Ｎｏｄ１およびＮｏｄ２タンパク質を使用して、サンプル中の細菌ペプチドグリカン、次に、細菌の存在を検出し、必要に応じて、前記サンプル中の細菌がグラム陰性菌起源のものであるか、グラム陽性菌起源のものであるかを判定する。
【００７７】
好ましい態様では、本発明は、サンプルにおいてペプチドグリカンを検出し、必要に応じて、ペプチドグリカンがグラム陰性菌起源のものであるか、グラム陽性菌起源のものであるかを判定する方法であって、
ａ）ペプチドグリカンを検出しようとするサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、Ｎｏｄ２タンパク質とも接触させ、
ｃ）ＭＴＰおよびＭＤＰと２種のＮｏｄタンパク質のうちの少なくとも一方との間の相互作用を検出し、および、
ｄ）必要に応じて、Ｎｏｄ１との相互作用とＮｏｄ２との相互作用とを識別する
ことを含んでなり、
ここで、ｃ）では２種のＮｏｄタンパク質のうちの少なくとも一方との相互作用がそのサンプル中にペプチドグリカンが存在することを示し、かつ、ｄ）ではＮｏｄ２とだけ相互作用することがそのサンプル中のペプチドグリカンがグラム陽性菌起源のものであることを示し、一方、Ｎｏｄ１ともＮｏｄ２とも相互作用することがそのサンプル中のペプチドグリカンがグラム陰性菌起源のものであることを示す、
方法を包含する。
【００７８】
より詳細には、Ｎｏｄ２は、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を介する、グラム陽性菌由来またはグラム陰性菌由来のペプチドグリカンの一般的センサーであり、一方、Ｎｏｄ１は、ＭＴＰを介する、陰性菌由来のペプチドグリカンに特異的なセンサーである。細菌ペプチドグリカンとＮｏｄタンパク質との間の相互作用は上記の方法により検出することができる。ＭＤＰとＮｏｄ２との間の相互作用を検出する方法は(S. E. Girardin et al., 2003)に開示されている。特定の態様では、その方法は、ＦＲＥＴ技術を利用してＮｏｄ１とＮｏｄ２のオリゴマー化を検出することにより、細菌ペプチドグリカンのＮｏｄタンパク質との相互作用を検出する。
【００７９】
さらに、本発明は、細菌ペプチドグリカンのＮｏｄタンパク質との相互作用を調整する分子をスクリーニングする方法を包含する。特定の態様では、前記方法により、グラム陰性菌ペプチドグリカンのＮｏｄタンパク質との、特に、Ｎｏｄ１タンパク質との相互作用を特異的に調整する分子を識別することが可能である。この相互作用の調整は、上記の方法によって検出される。
【００８０】
好ましい態様では、本発明は、グラム陰性菌のペプチドグリカンとＮｏｄ１との間の相互作用を調整する分子をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＭＴＰを用意し、
ｂ）試験分子の存在下および不在下で前記ＭＴＰをＮｏｄ１タンパク質と接触させ、
ｃ）試験分子の存在下および不在下でのＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用を評価する
ことを含んでなり、
ここで、試験分子の存在下でのＭＴＰとＮｏｄ１との間の相互作用の調整が前記分子がＮｏｄ１とグラム陰性菌のペプチドグリカンと間の前記相互作用を調整することを示す、
方法に向けられる。
【実施例】
【００８１】
実施例１
材料および方法
細菌株と製品
これらの研究に使用した細菌株は、次の：ネズミチフス菌株Ｃ５２およびＣ５２−デルタフラジェリン(fliC::aphA-3(Km)fljB5001::Mud(Cm))；大腸菌Ｋ１２；Ｂ群赤痢菌５ａ  Ｍ９０Ｔ；Ｂ．１６サブチルス(B. 16 subtilis)(Agnes Fouet, Institut Pasteur製)；黄色ブドウ球菌(Olivier Chesneau, Institut Pasteur製)；カセイ菌(L. casei)(Raphaelle Bourdet-Sicard, Danone Vitapole製)；リステリア菌(株ＥＧＤ、Pascale Cossart, Institut Pasteur製)；髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３である。細菌株を一晩培養したものから細菌抽出物を調製し、それをＯＤ６００値が０．３になるまで希釈し、３分超音波処理し、濾過した（０．２ミクロン）。
【００８２】
市販のＬＰＳおよびリピドＡは、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４(Sigma)由来のものであった。市販の黄色ブドウ球菌ＰＧＮはFluka Chemicals製であった。市販のＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４−ＯＨリポペプチドは、Roche Diagnostics(Mannheim)製であり、大腸菌リポタンパク質調製物は、Emmanuelle Bouveret and Roland Lloubes(UPR 9027, Marseille)からの提供品であった。
【００８３】
純粋ＲＥ−ＬＰＳは、大腸菌Ｆ５１５由来のものであり、すでに記載されているように(P. M. Sanchez Carballo et al., Eur. J. Biochem., 261, 500, 1999)、精製した。合成ＧＭ−ジペプチドは、Sigma社から購入した。大腸菌、Ｂ群赤痢菌および髄膜炎菌のＰＧＮは、Glauner et al., 1988に記載されているように精製した。枯草菌および黄色ブドウ球菌のＰＧＮは、de Jonge et al., 1992に記載されているように精製した。実施例２も参照のこと。
【００８４】
発現プラスミドと一時的トランスフェクション
Ｆｌａｇタグ付きＮｏｄ１の発現プラスミドは、Gabriel Nunez製の発現プラスミドであり、すでに記載されている(N. Inohara et al., 1999)。ＨＡ−タグ付きＤＮ−Ｎｏｄ１（１１７−９５３ａａ）およびｍｙｃタグ付き”ＬＲＲ（１−６４４ａａ）Ｎｏｄ１は、ＰＣＲにより作製し、ｐｃＤＮＡ３(Invitrogen)およびｐＲＫ５(Alan Hall, ICRF, London製)それぞれにクローニングした。ＤＮ−ＭｙＤ８８は、Marta Muzio製のものであり、ｖｓｖタグ付きＤＮ−Ｒｉｐ２（７−４２５ａａ）の発現プラスミドは、Margot Thome and Jurg Tschopp(University of Lausanne, Switzerland)からの提供品であった。トランスフェクションは、すでに記載されているように(S. E. Girardin et al., 2001)、ＨＥＫ２９３において行った。
【００８５】
ＮＦ−κＢ活性化アッセイ
ジギトニン透過化細胞でのＮＦ−κＢ活性化アッセイでは、すでに記載されているように(S. E. Girardin et al., 2001)、ＨＥＫ２９３  １×１０５個を２４穴プレートで増殖させ、その後、７５ｎｇのＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼリポーター遺伝子（Ｉｇκルシフェラーゼ）で２４時間トランスフェクトした。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌジギトニン(Sigma)を含むまたは含まない透過化バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ  ７、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、８５ｍＭスクロース、０．２％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰおよび０．１ｍＭ  ＧＴＰ）５００μｌ中、超音波処理済細菌抽出物２５μｌとともに３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、すでに記載されているように(S. E. Girardin et al., 2001)、透過化バッファーを除去し、ルシフェラーゼ測定用に処理する前の４時間、１０％ウシ胎児血清(Gibco)を含有する培地(ＤＭＥＭ, Gibco)で置き換えた。図３に示すドミナントネガティブ研究では、漸増量のドミナントネガティブ型構築物をＮＦ−κＢリポータープラスミドで同時トランスフェクトした。その後、以上で詳述したように試験を実施した。
【００８６】
Inohara et al.(N. Inohara et al., 2001)によって記載されているように、Ｎｏｄ１を過剰発現している細胞においてＬＰＳ、リピドＡ、リポタンパク質または精製ＰＧＮによるＮＦ−κＢの活性化を調べる研究を行った。要するに、ＨＥＫ２９３細胞を１０ｎｇのＮｏｄ１で一晩トランスフェクトした。同時に、ＬＰＳ、リポタンパク質またはペプチドグリカン調製物を添加し、その後、２４時間同時インキュベートした後にＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ活性化を測定した。予めトランスフェクトし、それを洗浄してリポソーム試薬を除去した細胞に細菌産物を細胞外添加してもＮＦ−κＢの活性化は起こらない（データは示していない）ことから、添加されたＤＮＡを含むトランスフェクション試薬が細菌産物の細胞への取り込みを助けていると考えられる。
【００８７】
ＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼアッセイを繰り返し行った。データは少なくとも３回の独立した試験のものである。データは平均±ＳＥＭであり、ベクター発現細胞に対する活性化倍率またはＮｏｄ１発現細胞のＮＦ−κＢ活性化レベルに対する相乗効果倍率として表している（Ｎｏｄ１  １０ｎｇの場合、ＮＦ−κＢ活性化はベクター発現細胞に対して約５倍である）。
【００８８】
免疫蛍光研究では、すでに記載されているように(D. J. Philpott et al., J. Immunol., 165, 903, 2000)、細菌産物（ＦＩＴＣ−デキストランで１：１希釈した）をマイクロインジェクションした後、ＨｅＬａ細胞、Ｃａｃｏ−２細胞または単離腸上皮細胞におけるＮＦ−κＢ  ｐ６５の核移行により、ＮＦ−κＢ活性化を評価した。１カバースリップにつきマイクロインジェクションした細胞を少なくとも５０個調べた。少なくとも２回、独立して試験を行ったところ、同様の結果であった。
【００８９】
インターロイキン−８の生成
ムロペプチドにより上皮細胞において生成されたＮｏｄ１依存性ＩＬ−８を測定するため、５×１０５個ＨｅＬａ細胞を１２穴プレートの各穴に播種し、翌日、１０ｎｇ  Ｎｏｄ１と各ムロペプチドとでトランスフェクトし（上記のとおり）、または陽性対照としてＩＬ−１で処理した。１８時間後、上清を回収し、すでに記載されているように(D. J. Philpott et al., 2000)、ＥＬＩＳＡキット(R and D Systems)を用いてＩＬ−８についてアッセイした。
【００９０】
ウエスタンブロットおよび免疫沈降
すでに記載されているように(S. E. Girardin et al., 2001)、ウエスタンブロットと免疫沈降を行った。Ｎｏｄ１のａａ１−１５および５６７−５８２に相当する２種類のペプチドでウサギを免疫化することにより、Ｎｏｄ１ポリクローナル抗体を得た。血清を回収し、アフィニティー精製し、Ｎｏｄ１に対して特異的であることを確認した。Ｎｏｄ２ポリクローナル抗体は、Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)製であった。
【００９１】
実施例２
グラム陰性菌由来およびグラム陽性菌由来の高度に精製されたＰＧＮの調製
ＰＧＮの調製に使用する細菌株は、次の:大腸菌Ｋ１２；Ｂ群赤痢菌５ａ  Ｍ９０Ｔ（野生型）；髄膜炎菌；枯草菌１６８；黄色ブドウ球菌ＣＯＬ(Olivier Chesneau, Institut Pasteur製)である。大腸菌およびＢ群赤痢菌のＰＧＮは、Glauner et al(B. Glauner et al., 1988)によって記載されているように精製した。枯草菌および黄色ブドウ球菌のＰＧＮは、de Jonge et al(B. L. de Jonge et al., 1992)によって記載されているように精製した。要するに、細菌を指数増殖期に光学密度（６００ｎｍ）値０．４〜０．６にて回収し、氷−エタノール浴で急冷して、内因性自己溶解素によるＰＧＮ加水分解を最小限に抑えた。ペレットを氷冷水に再懸濁し、沸騰した８％ＳＤＳに少しずつ滴下した。サンプルを３０分煮沸し、自己溶解素を直ちに不活性化させた。不溶性の重合ＰＧＮを遠心分離により回収し、ＳＤＳが検出されなくなるまで数回洗浄した。ＳＤＳアッセイをHayashi(K. A. Hayashi, Anal. Biochem., 67, 503, 1975)によって記載されているように行った。ＳＤＳ処理により混入しているタンパク質、非共有結合したリポタンパク質およびＬＰＳを除去した。グラム陽性菌サンプルを酸洗浄したガラスビーズ（＜１００ｎｍ）で物理的に破壊した。ＰＧＮ画分を分画遠心分離により回収して、細胞残屑を除去した。全てのＰＧＮをさらに処理し、α−アミラーゼにより全てのグリコーゲンを除去し、トリプシン（３×結晶トリプシン、Worthington）消化により共有結合したタンパク質（グラム陽性菌のＬＰＸＴＧタンパク質）またはリポタンパク質（グラム陰性菌）を除去した。サンプルをさらに１％ＳＤＳ中で煮沸してトリプシンを不活性化し、洗浄してＳＤＳを除去した。グラム陽性菌サンプルを４９％フッ化水素酸で４℃にて４８時間処理した。この弱酸加水分解により、テイコ酸、莢膜、ポリ−（β，１−６ＧｌｃＮＡｃ）等のような、リン酸ジエステル結合によってＰＧＮと共有結合する二次的多糖類が除去される。グラム陽性菌およびグラム陰性菌ＰＧＮ両方のさらなる処理では、８Ｍ  ＬｉＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡで洗浄して全てのポリペプチド性夾雑物を除去し、アセトンで洗浄してリポタイコ酸またはＬＰＳの痕跡を除去した。サンプルを凍結乾燥してＰＧＮ量を測定した。ＨＣｌ加水分解後のＨＰＬＣアミノ酸および糖類分析によりサンプルの純度を評価した（図４も参照のこと）。
【００９２】
実施例３
逆相ＨＰＬＣおよび質量分析による髄膜炎菌ＰＧＮの解析
髄膜炎菌またはＢ群赤痢菌のペプチドグリカンをムラミダーゼムタノリジン(M1, Sigma)により消化して、両種のムロペプチドの全てのスペクトルを取得した。Glauner(B. Glauner et al., 1988)によって記載されているように、ムロペプチドを水素化ホウ素ナトリウムで還元し、逆相ＨＰＬＣにより分画した。各ムロペプチドピークを回収し、生物学的アッセイにそのまま使用した。質量分析による解析では、Garcia-Bustos et al.(J. F. Garcia-Bustos et al., Antimicrob. Agents Chemother., 31, 178, 1987によって記載されているように、髄膜炎菌ペプチドグリカンの異なるムロペプチド画分をＨＰＬＣによりさらに脱塩した。Xu et al.(N. Xu et al., Anal. Biochem., 248, 7, 1997)によって記載されているように、脱塩処理したムロペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより解析した。
【００９３】
次の解析した画分についてそれらの分子量を決定した：画分３［Ｍ＋Ｈ］＋  ８７１，６２１４ｍ／ｚ；［Ｍ＋Ｎａ］＋：８９３，３６３３ｍ／ｚ；［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋  ９１５，３５１８ｍ／ｚ、これはＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰ構造（計算質量８７０）と一致する；画分６［Ｍ＋Ｈ］＋  ９４２，４５１２ｍ／ｚ；［Ｍ＋Ｎａ］＋  ９６４，４６８９ｍ／ｚ；［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋  ９８６，４４２９ｍ／ｚ；［Ｍ＋３Ｎａ−２Ｈ］＋  １００８，４３２１ｍ／ｚ、これはＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰ−ＤＡｌａ構造（計算質量９４１）と一致する；画分１７  ２ムロペプチド種の混合物：１）［Ｍ＋Ｈ］＋  ８５１，３４６０ｍ／ｚ；［Ｍ＋Ｎａ］＋  ８７３，３４２２ｍ／ｚ；［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋  ８９５，３２１９ｍ／ｚ；［Ｍ＋３Ｎａ−２Ｈ］＋  ９１７，３１１５ｍ／ｚ、これはＧｌｃＮＡｃ−アンヒドロ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ＧｌｕメソＤＡＰ構造（計算質量８５０）と一致する、２）［Ｍ＋Ｈ］＋  １８６５，５５８８ｍ／ｚ；［Ｍ＋Ｎａ］＋  １８８７，５３３１ｍ／ｚ；［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋  １９０９，５７５３ｍ／ｚ；［Ｍ＋３Ｎａ−２Ｈ］＋  １９３１，５６２５ｍ／ｚ、これはムロペプチド二量体ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰ（ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−メソＤＡＰ−Ｄ−Ａｌａ）−Ｄ−Ａｌａ構造（計算質量１８６４）と一致する。
【００９４】
実施例４
Ｎｏｄ１経路
Ｎｏｄ１経路は、市販のＬＰＳおよびグラム陰性菌ＰＧＮによって活性化される。図１Ａは、Ｎｏｄ１経路が市販の大腸菌ＬＰＳによっては活性化されるが、タンパク質を含まない純粋なＬＰＳまたはリピドＡによっては活性化されないことを示している。図１Ｂは、リポペプチドまたは大腸菌リポタンパク質（脂質化されたものおよび脱脂質化されたもの、すなわち、「Ｌｐｐ」および「可溶性E.c Lpp」）ではＮｏｄ１経路を活性化し得ないことを示している。図１ｃは、Ｎｏｄ１はグラム陰性菌ＰＧＮ（大腸菌、Ｂ群赤痢菌、髄膜炎菌）に対するＮＦ−κＢの反応を媒介するが、グラム陽性菌ＰＧＮ（枯草菌、黄色ブドウ球菌または市販の黄色ブドウ球菌ＰＧＮ）に対する反応を媒介しないことを示している。図１ｄにて示されるように、ΔＬＲＲ−Ｎｏｄ１発現細胞では、大腸菌ＰＧＮによるＮＦ−κＢの相乗的活性化は観察されなかった。ＬＰＳ、リピドＡ、リポタンパク質調製物は、１０μｇ／ｍｌにて使用した。ＰＧＮ調製物は、１μｇ／ｍｌにて使用した。
【００９５】
実施例５
Ｎｏｄ１によって検出されたＰＧＮモチーフの特性決定
Ｎｏｄ１によって検出されたＰＧＮモチーフの特性決定を図２に示す。図２Ａでは、髄膜炎菌由来のＰＧＮムロペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分画し、続いて、質量分析により解析した（サポーティングオンラインテキスト参照）。Ｎ．Ｄ．（ａ）、このＨＰＬＣ分画では検出されなかったが、後のＨＰＬＣ分画と質量分析による解析でＯ−アセチル化二量体ＧＭ−テトラペプチドであることが判明した。この画分は追加試験でもＮｏｄ１刺激に対して陰性であった（データは示していない）。Ｎ．Ｄ．（ｂ）、不明の画分。図２Ｂでは、各ＨＰＬＣ画分の１％量を、個々に、Ｎｏｄ１経路の活性化について試験したところ、ＧＭ−トリペプチドに当たる画分３がＮｏｄ１を活性化することを示した。二量体ＧＭ−テトラペプチド（Ｎｏｄ１を活性化しない）と無水ＧＭ−トリペプチドとの混合物に当たる画分１７はＮｏｄ１を活性化する。図２Ｃは、髄膜炎菌ＰＧＮの模式図であり、質量分析によって決定された画分３（ＧＭ−トリペプチド）のＮｏｄ１活性モチーフを詳細に示している。図２Ｄでは、同量（１０ｎｇ）のＧＭ−ジペプチド（ＧＭ−ジ；合成によるもの）、ＧＭ−トリペプチド（ＧＭトリ）、またはＧＭ−テトラペプチド（ＧＭ−テトラ）をＮＦ−κＢのＮｏｄ１−、Ｎｏｄ２−またはＴＬＲ２依存性活性化の刺激について試験した。図２Ｅは、髄膜炎菌および枯草菌ＰＧＮによるＮｏｄ１またはＮｏｄ２の相乗的活性化に関するものである。図２Ｆは、Ｎｏｄ１の存在下、ＧＭ−トリペプチドで刺激したＨｅＬａ上皮細胞において炎症性ケモカイン、ＩＬ−８が生成したが、ＧＭ−ジペプチドまたはテトラペプチドで刺激した場合には生成しなかったことを示している。ＩＬ−８生成のＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）刺激を陽性対照として示している。ムロペプチドのバッファー希釈液は淡黄褐色である。
【００９６】
実施例６
グラム陰性菌の細胞内検出
ＭｙＤ８８ではなくＮｏｄ１／Ｒｉｐ２を通じ、上皮細胞においてグラム陽性菌産物ではなくグラム陰性菌産物が細胞内で検出されることを図３に示す。
グラム陰性（Ｓ．ｔ，ネズミチフス菌；Ｓ．ｔΔＦ，ネズミチフス菌−デルタフラジェリン；Ｅ．ｃ，大腸菌；Ｓ．ｆ，Ｂ群赤痢菌）およびグラム陽性（Ｂ．ｓ，枯草菌；Ｓ．ａ，黄色ブドウ球菌；Ｌ．ｃ，カセイ菌；Ｌ．ｍ，リステリア菌）菌由来の抽出物を、ジギトニン（１０μｇ／ｍｌ）によって透過性上昇処理を行ったＨＥＫ２９３細胞または処理を行わなかったＨＥＫ２９３細胞に添加し、４時間後、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼリポーターアッセイを用いてＮＦ−κＢ活性を測定した。その結果を図３Ａに示している。
【００９７】
ＨｅＬａ細胞にデキストラン−ＦＩＴＣ単独（バッファー）または細菌抽出物のいずれかをマイクロインジェクションし、ＮＦ−κＢ  ｐ６５を染色した。図３Ｂで、グラム陰性菌上清をマイクロインジェクションした細胞の１００％にＮＦ−κＢの移行が認められるが、グラム陽性菌上清の場合には活性細胞は認められなかった。ＤＡＰＩ染色では核の位置が分かる。矢印は活性化細胞の核に移行したＮＦ−κＢ  ｐ６５を示している。
【００９８】
図３ｃでは、ドミナントネガティブ型ＭｙＤ８８（ＤＮ−ＭｙＤ８８；０，２０，５０ｎｇ）がグラム陰性菌抽出物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性に及ぼす影響は示されていないが、ＩＬ−１によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化（ＩＬ−１，１０ｎｇ／ｍｌ）を阻害することが示されている。
【００９９】
図３Ｄにて示されるような、Ｎｏｄ１  １１７−９５３ａａ（ＤＮ−Ｎｏｄ１；０，２００，４００ｎｇ）でトランスフェクトしたジギトニン透過化ＨＥＫ２９３細胞におけるグラム陰性菌抽出物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性の阻害。
図３Ｅにて示されるような、ドミナントネガティブ型Ｒｉｐ２（ＤＮ−Ｒｉｐ２；０，５０，１００ｎｇ）によるグラム陰性菌抽出物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性の阻害。
【０１００】
実施例７
Ｎｏｄ１欠損マウス腸上皮細胞の反応
Ｎｏｄ１欠損マウスの腸上皮細胞は、図８にて示されるように、細菌上清に反応しない。野生型マウスの単離腸上皮細胞では、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの核移行に見られるように、グラム陽性菌上清ではなくグラム陰性菌上清をマイクロインジェクションした場合にＮＦ−κＢが活性化される（図３Ｂについて記載したとおり）。これに対し、Ｎｏｄ１欠損マウスの細胞は細菌上清によって活性化されないが、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）によってこれらの細胞におけるＮＦ−κＢ核移行が効果的に刺激される。グラム陰性菌上清をマイクロインジェクションした野生型細胞の９８％にＮＦ−κＢの核移行が認められたが、グラム陽性菌上清をマイクロインジェクションした場合には活性細胞は認められなかった。Ｎｏｄ１欠損細胞のケースでは、どちらの場合でも活性細胞は認められなかった。野生型またはＮｏｄ１欠損細胞では、グラム陰性菌上清またはグラム陽性菌上清のどちらを細胞外に添加してもＮＦ−κＢ核移行は刺激することはできない（データは示していない）。
【０１０１】
ショウジョウバエ(Drosophila)では、トール経路によりグラム陽性菌と真菌の両方を検出する一方で、グラム陰性菌感知に特有のＩｍｄ経路が存在する(B. Lemaitre et al., Cell, 86, 973, 1996)。最近、２つのペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲＰ）が、ショウジョウバエにおける細菌の示差的検出において重要な役割を果たすことが分かってきた(T. Michel et al., Nature, 414, 756, 2001; K. M. Choe et al., Science, 296, 359, 2002; M. Gottar et al., Nature, 416, 640, 2002; M. Ramet et al., Nature, 416, 644, 2002)。ＰＧＲＰ−ＳＡがトール経路におけるグラム陽性菌認識に関与する一方で、ＰＧＲＰ−ＬＣがグラム陰性菌感知においてＩｍｄの上流で作用している。しかしながら、この示差的検出が実質的にＰＧＮによるものであるという明確な立証がまだ得られていない。
【０１０２】
本発明は、哺乳動物細胞では細菌のＮｏｄ１依存性検出がグラム陰性菌ＰＧＮモチーフの感知によってなされていることを示してきた。実際に、本発明は、ＧＭ−トリペプチドとＧＭ−ジペプチドが新たな細菌ＰＡＭＰ種を形成し、この新たな種がＮｏｄ１およびＮｏｄ２それぞれによって示差的に認識されているということを立証している。これらのＰＧＮモチーフは、増殖中に細菌から放出される天然に存在する分解産物である。そのため、細菌によって放出されたか、またはリソソームコンパートメントで宿主細胞によって加工されたＰＧＮ分解産物のペプチド性組成物は、細菌感染に対する宿主の反応の定義づけにおいて極めて重要である。この点において、Ｎｏｄ１およびＮｏｄ２が感知するＰＧＮモチーフを同定することにより、これら２つの分子が生得免疫の一因となる相補的でかつ重複していない機能を有することが示唆される。さらに、本発明の結果は、Ｎｏｄ１はＰＧＮ感知を通じた細菌の細胞内検出を可能にする、上皮バリアーにおける唯一の歩哨分子である可能性が高いことを示したものであるが、そのことによって、生得免疫防御におけるその重要な役割が明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】Ｎｏｄ１経路が市販のＬＰＳおよびグラム陰性菌ＰＧＮによって活性化されることを示す。
【図２】Ｎｏｄ１によって検出されたＰＧＮモチーフの特性決定である。
【図３】ＭｙＤ８８ではなくＮｏｄ１／Ｒｉｐ２を通じ、上皮細胞においてグラム陽性菌産物ではなくグラム陰性菌産物が細胞内で検出されるという結果を示す。
【図４】高度に精製されたグラム陰性菌由来またはグラム陽性菌由来ＰＧＮを調製するための試験手順を示す。
【図５】種々の細菌のＰＧＮから誘導されるムロペプチドの模式図である。  図５Ａ：グラム陰性菌で認められた、メソＤＡＰアミノ酸を含有するムロペプチド。図５Ｂ：枯草菌のような一部のグラム陽性菌で認められたムロペプチド。メソＤＡＰの代わりに、アミド化ＤＡＰが認められる。図５Ｃ：大部分のグラム陽性菌で認められた、３番目のアミノ酸としてＬ−リジンを含有するムロペプチド。これらのムロペプチド間に存在する違いが３番目のアミノ酸の位置だけであることに留意。
【図６】調製した細菌抽出物の相対ＰＧＮ含量の調査結果を示す。マイクロインジェクションした細胞におけるＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットのサイトゾルから核への移行によりＮＦ−κＢ活性化を評価した。  図６Ａ：  本発明者らは調製した細菌抽出物の相対ＰＧＮ含量を決定することを目的とした。この目的を達するために、リポタンパク質活性に作用するプロテイナーゼＫ処理および煮沸処理したまたは未処理の細菌抽出物を細胞外添加することによりＴＬＲ２過剰発現ＨＥＫ２９３細胞を刺激した。このようにして、本発明者らは細菌リポタンパク質対ＰＧＮのＴＬＲ２刺激への相対的寄与率を解析した。本発明者らはグラム陰性菌の細菌抽出物が同じ光学密度に培養したグラム陽性菌の抽出物よりもずっと低いＰＧＮ活性を示すことを観察した（図３Ａ）。グラム陰性菌が有するＰＧＮはグラム陽性菌よりも少なく、また、グラム陰性菌は増殖中より高い程度にＰＧＮを再循環させるということは周知であるため、この発見は驚くにはあたらない。  図６Ｂ:  Ｂ群赤痢菌および黄色ブドウ球菌の細菌抽出物をＦＩＴＣ−デキストランと一緒にＣａｃｏ−２上皮細胞にマイクロインジェクションした。３０分後、細胞を固定化し、ＮＦ−κＢ活性化について免疫蛍光により解析した。マイクロインジェクションした細胞におけるＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットのサイトゾルから核への移行によりＮＦ−κＢ活性化を評価した。グラム陰性菌の細菌抽出物をマイクロインジェクションしたＣａｃｏ−２細胞にのみＮＦ−κＢの活性化が観察された。本発明者らは細菌抽出物の細胞外添加後のＣａｃｏ−２細胞におけるＮＦ−κＢ活性化が不十分であることも観察した。このことは、これらの細胞が機能的内因性ＴＬＲ感知系ではないことを示唆している。
【図７Ａ】図７は、Ｎｏｄ１とＮｏｄ２がＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３上皮細胞で発現されることを示す。Ｎｏｄ１とＮｏｄ２がＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３上皮細胞で発現されている。  図７Ａ：  ＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３細胞のタンパク質抽出物（２．１０４細胞／レーン）をヒト型Ｎｏｄ１およびＮｏｄ２それぞれに対して作製された特異的ポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット法によりＮｏｄ１およびＮｏｄ２の内因性発現について直接解析した（方法の節を参照）。この技術では依然としてＮｏｄ１およびＮｏｄ２の内因性発現が検出できなかったため、抗体の特異性を示すためにＮｏｄ１（ＨＥＫ／Ｎｏｄ１）およびＮｏｄ２（ＨＥＫ／Ｎｏｄ２）の発現ベクターで一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３のタンパク質抽出物を同時に解析したことに留意。
【図７Ｂ】図７は、Ｎｏｄ１とＮｏｄ２がＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３上皮細胞で発現されることを示す。Ｎｏｄ１とＮｏｄ２がＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３上皮細胞で発現されている。  図７Ｂ：  ウエスタンブロット法による解析に先立ち、図のように、Ｎｏｄ１、Ｎｏｄ２または対照ＩｇＧ抗体を用いてＨｅＬａおよびＨＥＫ  ２９３細胞のタンパク質抽出物（１０７細胞／レーン）を免疫沈降させた。この免疫沈降法では細胞抽出物に存在するＮｏｄ１およびＮｏｄ２を〜５００倍に濃縮可能であることから、内因性タイプのＮｏｄ１およびＮｏｄ２の存在を検出するためにはこの方法が必要であった。
【図８Ａ】図８は、Ｎｏｄ１による検出に必要なペプチドグリカン構造を示す。図８Ａは、Ｎｏｄ１によるペプチドグリカンの検出に環状糖部分を必要としないことを示す。
【図８Ｂ】図８は、Ｎｏｄ１による検出に必要なペプチドグリカン構造を示す。図８Ｂは、Ｎｏｄ１はメソ−ＤＡＰを含有するＧＭ−トリペプチドを検出するが、アミド化ＤＡＰを含有するＧＭ−トリペプチドは検出しないことを示す。
【図８Ｃ】図８は、Ｎｏｄ１による検出に必要なペプチドグリカン構造を示す。図８Ｃは、Ｎｏｄ１がＴｒｉＤＡＰを検出することを示す。
【図８Ｄ】図８は、Ｎｏｄ１による検出に必要なペプチドグリカン構造を示す。図８Ｄは、Ｎｏｄ１がＵＤＰ−ＭｕｒＴｒｉＤＡＰおよびＭｕｒＴｒｉＤＡＰを検出することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【国際調査報告】
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