(57)【要約】脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘導するためのメガヌクレアーゼの使用およびゲノム工学および遺伝子治療についてのその適用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、遺伝子疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該遺伝子疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための使用。
【請求項２】
少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための使用。
【請求項３】
少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼをヒト以外の脊椎動物の体内に導入することによる治療以外の目的のためのヒト以外の脊椎動物の体組織のゲノム工学のための使用。
【請求項４】
前記メガヌクレアーゼが、ポリペプチドまたはプロモーター、例えば組織特異的プロモーターおよび／または誘導性プロモーターを含む適切な転写調節要素の制御下に該ポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド構築物のいずれかとして用いることができることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。
【請求項５】
前記メガヌクレアーゼが、単独でまたは適切な賦形剤もしくは担体の少なくともいずれかおよび／またはターゲティングDNAとともに投与されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載の使用。
【請求項６】
前記適切な賦形剤が、リポソーム、ポリエチレンイミンおよび膜転位ペプチドからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の使用。
【請求項７】
前記DNAのターゲティング断片が、標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を改変する配列を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載の使用。
【請求項８】
前記相同な配列が、前記標的遺伝子座と少なくとも50 bp、好ましくは100 bpより多く、より好ましくは200 bpより多くを有することを特徴とする請求項7に記載の使用。
【請求項９】
対象の部位を改変する前記配列が、遺伝子損傷を修復するための遺伝子の正しい配列であることを特徴とする請求項7または8に記載の使用。
【請求項１０】
前記メガヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびいずれの当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型であって、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示す変異型からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１１】
前記メガヌクレアーゼをエンコードする前記配列および／またはDNAの前記ターゲティング断片がベクターに挿入されていることを特徴とする請求項1〜6または10のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１２】
前記メガヌクレアーゼが、実質的に非免疫原性であることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１３】
前記メガヌクレアーゼが、単一遺伝子劣性疾患の予防、改善または治療のために対象の部位を修復可能な配列を含む請求項7で規定したDNAのターゲティング断片とともに用いられることを特徴とする請求項1および4〜12のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１４】
前記メガヌクレアーゼが、トリヌクレオチド反復疾患の予防、改善または治療のために単独であるいは少なくとも1つの適切な賦形剤および／または担体とともに用いられることを特徴とする請求項1および4〜12のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１５】
前記メガヌクレアーゼが、優性または複合の異型接合突然変異を原因とする遺伝子疾患を予防、改善または治療するために単独であるいは少なくとも1つの適切な賦形剤および／または担体とともに用いられることを特徴とする請求項1および4〜12のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１６】
前記感染性因子がウイルスであることを特徴とする請求項2および7〜12のいずれか1つに記載の使用。
【請求項１７】
前記ウイルスが、HIV、HBV、HTLV、HPVおよびHSVからなる群より選択されることを特徴とする請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
前記メガヌクレアーゼをエンコードする前記配列およびDNAの前記ターゲティング断片が同じベクターに挿入されていることを特徴とする請求項1〜17のいずれか1つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物の体組織においてエクスビボ(ex vivo)かつイントト(in toto)で相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびゲノム工学および遺伝子治療へのその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
相同的遺伝子ターゲティングは、部位特異的で正確なゲノム外科治療(surgery)を達成するため過去に広く利用されていた(ThomasおよびCapecchi, 1986, Nature, 324, 34〜8; Thomasら, 1986, Cell, 44, 419〜28; ThomasおよびCapecchi, 1986, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 51 Pt 2, 1101〜13; Doetschmanら,1988, PNAS, 85, 8583〜7)。相同的遺伝子ターゲティングは、相同的組換え機構すなわち細胞の内因性維持システムの一つに依存している。このシステムは進化を通じてよく保護されているので、遺伝子ターゲティングは、細菌、酵母、線維状真菌、哺乳動物、昆虫および植物といった異なる生物で利用できる。
【０００３】
一つの直接的な適用は、遺伝子の周囲の調節配列を改変することによる遺伝子の発現の調節である(欧州特許第419621号;米国特許第6,528,313号; 同6,528,314号; 同5,272,071号; 同5,641,670号)。突然変異した遺伝子の相同的組換えによる修正はもう一つの適用である(Fischerら, 2002, Isr Med Assoc J, 4, 51〜4)。有害な突然変異は、ゲノムのいずれの別の位置に野生型遺伝子を導入することによって相補できることが多い。しかしこのアプローチ(ランダムトランスジェネシス(transgenesis))には重大な三つの欠点がある。第一に、突然変異した遺伝子が依然として存在する。特定の突然変異は、野生型遺伝子によって相補されないかまたは野生型遺伝子を少なくとも阻害することがある機能の獲得をもたらす。第二に、遺伝子の発現が、周囲の配列の非常に長い範囲に依存することが多い。高等真核生物内で、これら配列は、数百kbにわたって延びることができ、そして細胞周期や発達の間または生理信号に対する応答における遺伝子の発現の正確な同調に必要である。トランスジェニック配列は、ほとんどの場合、数kbであるけれども、完全に野生型の表現型を回復できる方法がない。しかしこの問題は、非常に大きい配列(BAC)で形質転換することによって改善できるが、さらなる技術が必要である。第三に、ランダムトランスジェネシスは、ゲノムのどこにでも挿入を行い、有害な作用の起こる確率がゼロではない遺伝子への挿入は、その遺伝子またはその適正な調節を破壊する。このような有害作用は、SCIDの患者に対する遺伝子治療試験で最近充分に例証されており(Fischerら、上記)、恐らくウイルスが有する導入遺伝子の有害な挿入の結果として白血病様症候群の症状になった。
【０００４】
ランダムトランスジェネシスとは対照的に、相同的組換えは、染色体の遺伝子座の正確な改変を許容する。これは、ターゲティングベクターによって、遺伝子の欠失、遺伝子の挿入または遺伝子の置換となり得る。さらに、コーディング配列と調節配列の改変を含むわずかな変更を、特定の遺伝子座に導入できる(欧州特許第419621号; 米国特許第6,528,313号; 同6,528,314号; 同5,272,071号; 同5,641,670号; 同6,063,630号)。
【０００５】
これら特定の利点によって、相同的遺伝子ターゲティングはゲノム工学の普遍的な手段でかつ遺伝子治療の唯一の安全な方法になるであろう。しかし相同的組換えを使用することは、ほとんどの細胞でその効率が乏しいので制限される。相同的遺伝子ターゲティングは、酵母：サッカロミセス・セレビシエ(Sacchromyces Cerevisiae) (PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、コケ：フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens) (SchaeferおよびZryd, 1997, Plant J, 11, 1195〜206)、特定のエシェリキア・コリ(Escherichia coli) 変異株(Murphy, 1998, J. Bacteriol, 180, 2063〜71; Zhangら, 1998, Nat Genet, 20, 123〜8)、およびDT40などの鳥の細胞系(BuersteddeおよびTakeda, 1991, Cell, 67, 179〜88)では極めて効率的であるが、その効率はほとんどの細胞と生物ではきわめて低いままである。例えば、哺乳類の培養細胞では、このような組換え事象は、関連する修正(correcting)DNAまたはターゲティングDNAを取り込んだ一万個の細胞のうち一個の細胞にしか通常起こらない。
【０００６】
その結果、相同的遺伝子ターゲティングの効率を改良するため、多くの方法が用いられている。多数の例として、キメラプラスティー(chimeraplasty) (Yoonら, 1996, PNAS, 93, 2071〜6)、小断片相同的組換え(Gonczら, 2002, Gene Ther, 9, 691〜4)およびトリプレックスフォーミングオリゴヌクレオチド(Triplex Forming Oligonucleotides) (Gorman and Glazer, 2001, Curr Mol Med, 1, 391-9)がある。しかし、相同的遺伝子ターゲティングを改良する最も強力で効率的な方法は、依然として対象の遺伝子座にDNA二本鎖破壊(DNA double-strand break; DSB)を導入する方法である(米国特許第5,474,896号; 同5,792,632号; 同5,866,361号; 同5,948,678号; 同5,948,678号, 同5,962,327号; 同6,395,959号; 同6,238,924号; 同5,830,729号)。この方法は、哺乳類の細胞におけるターゲティングの効率を幾桁も改善し(Donohoら, 1998, Mol Cell Biol, 18, 4070〜8; Rouetら, 1994, Mol Cell Biol, 14, 8096〜106; Choulikaら, 1995, Mol Cell Biol, 15, 1968〜73; Cohen-Tannoudjiら, 1998, Mol Cell Biol, 18, 1444〜8; PorteusおよびBaltimore, 2003, Science, 300, 763; Porteusら, 2003, Mol Cell Biol, 23, 3558〜65; Millerら, 2003, Mol Cell Biol, 23, 3550〜7)、かつ植物(Puchtaら, 1993, Nucleic Acids Res, 21, 5034〜40)およびショウジョウバエ(Bibikovaら, 2003, Science, 300, 764)における遺伝子ターゲティングを許容する。
【０００７】
したがって、前記二本鎖の破壊を導入すると、これに伴ってその切断部位のまわりの領域に相同なDNAのターゲティングセグメントが導入され、その結果、その遺伝子座に、ターゲティング配列が効率的に導入される(遺伝子損傷の修復または特定の方法での染色体のDNAの変更のいずれかのため)。あるいは、対象の部位に二本鎖の破壊を誘発して、その遺伝子の他のコピー由来の相同の染色体DNA配列が二本鎖破壊の誘発された配列に配列を提供する遺伝子交換事象によって、遺伝子損傷が修正される。この後者のストラテジは、欠損遺伝子の1コピーが疾患の表現型を生ずる(例えば優性突然変異の場合に起こる)かまたは突然変異が遺伝子の両対立遺伝子であるが異なる位置に起こる(複合異型接合突然変異の場合のような)遺伝子疾患を修正する(WO 96/14408号; WO 00/46386号; 米国特許第5,830,729号; Choulikaら, 上記; Donohoら, 上記; Rouet ら, 上記)。
【０００８】
しかし、部位特異的DSBの送達には別の課題があることが分かった。この送達を行うには大きい配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼの使用が必要である。12塩基対より大きい配列を認識するこのような極めて稀な切断エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼと呼称されている。対象のゲノム内で一回だけ切断を行い、その切断部分が対象の遺伝子座に限定されているエンドヌクレアーゼを使用することが理想的で望ましい。
【０００９】
自然状態では、このようなエンドヌクレアーゼは、特にホーミングヌクレアーゼ(ChevalierおよびStoddard, 2001, N.A.R., 29, 3757〜74)により代表される。ホーミングヌクレアーゼは真菌類、藻類、真性細菌類および古細菌類に見られ、可動性遺伝因子にコードされていることが多い。それらの切断活性が、これら可動性因子の拡散を相同的組み換えによって開始する。HO (Haber, 1998, Annu Rev Genet, 32, 561〜99; Haber, 1995, Bioessays, 17, 609〜20)、I-Sce I (JacquierおよびDujon, 1985, Cell, 41, 383〜94; FairheadおよびDujon, 1993, Mol Gen Genet, 240, 170〜8; Colleauxおよび, 1988, PNAS, 85, 6022〜6; Perrinら, 1993, Embo J, 12, 2939〜47; Plessisら, 1992, Genetics, 130, 451〜60)およびI-Tev Iエンドヌクレアーゼ(Bell-Pedersenら, 1989, Gene, 82, 119〜26; Bell-Pedersenら, 1990, Nucleic Acids Res, 18, 3763〜70; Muellerら, 1996, Genes Dev, 10, 2158〜66)の生物学が、かようなDSB誘発組換え事象の多くの典型である。
【００１０】
HOとI-Sce Iは、相同的遺伝子ターゲティングを、酵母(Haber, 1995, 上記; Fairhead およびDujon, 1993, 上記; Plessisら, 1992, 上記; 米国特許第5,792,632号および同6,238,924号)、哺乳類の培養細胞(Donohoら; Rouetら; Choulikaら; Cohen-Tannoudjiら, 上記; 特許第5,792,632号; 同5,830,729号および6,238,924号)および植物(Puchta ら, 1996, PNAS, 93, 5055〜60; 米国特許第5,792,632号および同6,238,924号)に誘発するために使用されている。またメガヌクレアーゼは、細菌(Posfaiら, 1999, N.A.R., 27, 4409〜15)、酵母(PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、植物(SiebertおよびPuchta, 2002, Plant Cell, 14, 1121〜31; Chiurazziら, 1996, Plant Cell, 8, 2057〜66; Puchta, 1999, Genetics, 152, 1173〜81)、昆虫(Rongら, 2002, Genes Dev, 16, 1568〜81)および哺乳類の培養細胞(LinおよびWaldman, 2001, Genetics, 158,1665〜74; Liangら, 1998, PNAS, 95, 5172〜7)においてDBSが誘発する相同的組換えに基づいた各種の染色体内または染色体間の再配列をトリガーするのに使用されている。
【００１１】
グループIIのイントロンのタンパク質もメガヌクレアーゼとして使用できる。これらタンパク質の生物学は、グループIのイントロンとインテインがコードするホーミングエンドヌクレアーゼの生物学より遥かに複雑である(ChevalierおよびStoddard, 上記)。このタンパク質はイントロンのスプライシングにかかわって、スプライスされたRNA分子とともにリボ核酸粒子を形成する。この複合体は、(標的遺伝子からのDNA鎖中のRNAイントロンの)逆スプライシング、(新規遺伝子中の第二DNA鎖の)ニッキングおよび逆転写酵素(挿入されたRNAをDNA鎖にコピーする)を含む各種の活性を示す。イントロンの標的遺伝子への最終的な挿入は、すべてのこれら活性で決まる。これらタンパク質は、逆転写酵素の活性が突然変異すると、相同的組換えをDSB媒介物(intermediate)で誘発するようである(Karbergら, 2001, Nat. Biotechnol, 19, 1162〜7)。
【００１２】
天然のメガヌクレアーゼを使って、二本鎖破壊による相同的組換えを誘発するためのこのゲノム工学(genome engineering)の方法は、あいにく、組換え事象が要求される位置に前記天然メガヌクレアーゼの認識・切断部位を導入することによって制限される。
【００１３】
今日まで、新しいメガヌクレアーゼ(人工または人造のメガヌクレアーゼ)を作製する第一の方法では、いくつかのキメラ制限酵素が、DNA結合ドメイン(すなわちジンクフィンガードメイン)と触媒ドメイン（天然制限酵素Fok I由来の非特異的DNA切断ドメイン）とのハイブリッドによって製造されている(Smithら, 2000, N.A.R, 28, 3361〜9; Smithら, 1999, Nucleic Acids Res., 27, 274〜281; Kimら, 1996, PNAS, 93, 1156〜60; KimおよびChandrasegaran, 1994, PNAS, 91, 883〜7; WO 95/09233号; WO 94/18313号; 米国特許第5,436,150号)。得られるいわゆるジンクフィンガーヌクレアーゼを使って、ツメガエル(Xenopus)の卵母細胞での縦列反復組換え(Bibikovaら, 2001, Mol Cell Biol, 21, 289〜97)、ならびに哺乳類の培養細胞系(PorteusおよびBaltimore, 上記)とショウジョウバエ(Bibikovaら, 上記)での相同的遺伝子ターゲティングが誘発されている。
【００１４】
もう一つのアプローチは、II型の制限ヌクレアーゼのようにDNA結合活性と触媒活性とを単独の構造単位内に包埋することからなる。しかし認識配列の長さを長くしようとするかまたはこれら酵素の特異性を変えようとすると、触媒活性が失われるか、または酵素の構造、基質認識および触媒作用の緊密な相互依存による特異性が全面的に低下する(Lanioら, 2000, Protein Eng., 13, 275〜281)。
【００１５】
ホーミングヌクレアーゼに基づいて、Chevalierら(2002, Molecular Cell, 10, 895〜905)はホーミングヌクレアーゼI-Dmo IとI-Cre Iのドメインを融合することによって、高度に特異的な人工エンドヌクレアーゼを作製した。得られた酵素は、長いキメラDNAの標的部位に結合してそれをその天然の親と等しい速度で正確に切断する。しかし、この実験は、新しい特異性を有するあるエンドヌクレアーゼをもたらすが、いずれの望ましいポリヌクレオチド配列を認識し切断するエンドヌクレアーゼを見つけるのに利用できない。
【００１６】
核酸と化学化合物の融合体はもう一つのクラスの人工のメガヌクレアーゼであり、DNAの結合性と特異性はオリゴヌクレオチドに依存し、切断はそのオリゴヌクレオチドに連結された化学化合物に依存する。該化学化合物は、内因性切断活性を持っているかまたはトポイソメラーゼ類と複合体を形成するとき切断することができる(Arimondoら, 2001, Angew Chem Int Ed Engl, 40, 3045〜3048; ArimondoおよびHelene, 2001, Curr Med Chem Anti-Canc Agents, 1, 219〜35)。
【００１７】
したがって、メガヌクレアーゼ誘発組換えは、ゲノムに標的される改変を導入するのに極めて強力な手段になるであろう。さらに、組換え事象が必要な位置でDNAを切断できる、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ由来のまたは天然のホーミングエンドヌクレアーゼ由来の新しいメガヌクレアーゼを開発すると、意のままに妥当な効率でいずれの所定の遺伝子座にターゲティングを行うことができる。
【００１８】
それにもかかわらず、この技術を動物に使うことは、ショウジョウバエの場合(Bibikovaら、2003, 上記) (この場合この技術を使って生きている動物内の生殖細胞系と体組織に組換えを誘発できた)を除いて、これまで、この技術はほとんどの場合、培養細胞内におけるインビトロまたはエクスビボでの適用に制限されていることが、従来技術の上記分析結果から明らかである。
【００１９】
生物全体において体組織に組換えを誘発するためにこの技術を用い得ることは以下に述べるように極めて有利である。
−この技術は、動物モデルにおける組織特異的なゲノム工学または遺伝子組換え生物内の外来配列の除去(これら外来配列による形質がもはや有用でなくなったとき)に使用できる。二つの縦列反復の間のDSBが非常に高レベルの相同的組換えを誘発して一つの繰返し部分をすべての介在部分とともに欠失させるが(PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、これは適切な設計で導入遺伝子を除くのに容易に利用できる。
【００２０】
−もう一つの重要な応用は、メガヌクレアーゼが誘発する組換えの遺伝子治療における使用である。多くの場合、エクスビボのアプローチを用い得る。すなわち前駆幹細胞を患者から取り出し、エクスビボで治して欠陥組織に移植して戻す。これまでエクスビボの方法はほとんどの場合、SCIDなどの症候群の血球に対して使われてきた(相同的組換えの代わりにランダム挿入が利用されたが) (Fischerら, 上記)。幹細胞のこの操作は、他の組織に対する魅力的な方法になる。しかし、イントトメガヌクレアーゼ誘発組換えを使うと、前記エクスビボのステップをバイパスして、治療できる組織の範囲を拡大できるだろう。
【００２１】
しかし、この方法が簡単でない以下の二つの重要な理由がある。
−第一に、この方法は、メガヌクレアーゼを適当な組織内に送達する必要がある。
【００２２】
−第二に、生体内の細胞は、培養細胞または生殖細胞と同じ挙動を必ずしもしない。培養細胞および初期の(およびときには後期の)生殖細胞は分裂する細胞であり、G1、S、G2およびM期を通過する。対照的に、成熟動物の大部分の細胞は分化された細胞でありG0期に固定される。多くの試験結果が、相同的組換えが細胞周期のすべての期で同じ効率でないことを示しおよび/または示唆している(Takataら, 1998, Embo J, 17, 5497〜508; KadykおよびHartwell, 1992, Genetics, 132, 387〜402; Gasiorら, 2001, PNAS, 98, 8411〜8; Essersら,1997,Cell, 89,195〜204)。一般に、異なる組織は相同的遺伝子変換のための別個の進歩(proficiency)を有する。したがって、組換えの進歩がほとんど分かっていない特定の細胞型に依存する相同的組換えによる遺伝子ターゲティングおよびメガヌクレアーゼ誘発ゲノム工学が、生物全体でまたはエクスビボアプローチに使用できるかどうか明らかでない。
【００２３】
驚くべきことには、適当なターゲティング構築物とメガヌクレアーゼ発現ベクターを使うことによって、本発明者らは、脊椎動物の体組織内にエクスビボかつイントトで目的とする相同的組換えを実際に誘発できることを示した。
【００２４】
したがって、メガヌクレアーゼは、特定の配列を修復し、特定の配列を改変するため、対象の内因性遺伝子を減弱させるかまたは活性化させるため、対象の内因性遺伝子もしくはその一部分を不活性化するかもしくは欠失させるため、対象の部位に突然変異を導入するため、または外因性遺伝子もしくはその一部分を脊椎動物の体組織に導入するために使用できる。
【００２５】
それゆえ、これらの結果は、実験の目的のための哺乳類体組織内の効率的な部位特異的ゲノム操作の基礎を確立し、かつ遺伝子ターゲティングによる突然変異の治癒的な修正の可能性を高める。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、本発明の目的は、メガヌクレアーゼを使って、脊椎動物の体組織内にエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発することである。
【００２７】
動物モデルの作製(組織特異的ゲノム外科治療(surgery)：ノックインまたはノックアウト)を含む研究；農学的バイオテクノロジー(形質の付加または除去、マーカーの除去、タンパク質の作製)および治療(遺伝子治療：エクスビボとイントトでの遺伝子修復および抗ウイルス治療：エクスビボとイントトでのウイルスの除去)といった異なる分野に用途がある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
したがって、本発明は、遺伝子疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該遺伝子疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための少なくとも1つのメガヌクレアーゼの使用に関する。
【００２９】
また本発明は、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための少なくとも一種のメガヌクレアーゼの使用に関する。好ましくは、該感染因子はウイルスである。
【００３０】
本発明の別の目的は、メガヌクレアーゼをヒト以外の脊椎動物の体内に導入することにより、治療目的以外のためにヒト以外の脊椎動物の体組織のゲノム工学のための少なくとも一種のメガヌクレアーゼの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
−定義
本願において、用語「メガヌクレアーゼ」は、少なくとも12bp、好ましくは12bp〜60bpの大きいポリヌクレオチド認識部位を有する二本鎖エンドヌクレアーゼを意味する。該メガヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼまたは高レアカットエンドヌクレアーゼ(very rare-cutting endonuclease)とも呼ばれる。このメガヌクレアーゼはモノマーまたはダイマーである。このメガヌクレアーゼには、ホーミングエンドヌクレアーゼのような天然のメガヌクレアーゼのみならず、グループIのイントロンとインテインのホーミングエンドヌクレアーゼまたはジンクフィンガータンパク質もしくはグループIIのイントロンタンパク質のような他のタンパク質または化学化合物に融合された核酸などの化合物のいずれかに由来する高い特異性を付与された人工もしくは人造のメガヌクレアーゼが含まれる。
【００３２】
特に、人工のメガヌクレアーゼとしては、いわゆる「カスタムメイドメガヌクレアーゼ」を含み、これは、天然もしくは非天然のいずれの当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼであり、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼもカスタムメイドメガヌクレアーゼとみなすことができる。「異なる」は、カスタムメイドメガヌクレアーゼが新規の部位を、天然のメガヌクレアーゼより少なくとも10倍、好ましくは少なくとも50倍、より好ましくは少なくとも100倍の効率で切断することを意味する。「天然の」は、目的物を天然に見つけることができることを意味する。例えば、生物体内に存在し、天然の起源から単離することができかつ人間が意図的に実験室で改変していないメガヌクレアーゼは天然である。
【００３３】
用語「イントト(in toto)」は、メガヌクレアーゼが誘発する相同的組換え事象が、脊椎動物の体内のインビボで起こることを意味し、該メガヌクレアーゼは前記脊椎動物の体内に通常の手段で導入される。
【００３４】
用語「エクスビボ(ex vivo)」は、メガヌクレアーゼが誘発する相同的組換え事象が、脊椎動物の体から取り出した体細胞内で起こることを意味し、該メガヌクレアーゼは通常の手段で前記脊椎動物の細胞中に導入され(エクスビボ)、次にその改変された細胞は前記脊椎動物の体内に戻される。
【００３５】
用語「体組織」は、生殖細胞株を除く、前駆細胞(幹細胞)から充分に分化した細胞までのあらゆるタイプの細胞を含む、生物の体内のあらゆる組織を意味する。
【００３６】
「同一性(identity)」とは、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列の同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列における位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められるとき、該分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性(similarity)または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一または適合する(matching)ヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin、Madison、Wis.)の部分として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む種々の整列アルゴリズムおよび／またはプログラムを、2つの配列の間の同一性を計算するのに用いることができ、例えばデフォルト設定で用い得る。
【００３７】
「相同な(homologous)」により、別の配列と配列間の相同的組換えを導くのに充分な同一性を有し、具体的には少なくとも95％、好ましくは97％、より好ましくは99％の同一性を有する配列を意図する。
【００３８】
本明細書において用いられる「対象の部位」、「標的部位」および「特異的部位」の用語は、そこで二本鎖破壊（切断）がメガヌクレアーゼにより導入される明確な(distinct)DNAの位置、好ましくは染色体の位置をいう。
【００３９】
本明細書において用いられるように、「個体」の用語は、哺乳動物と共に他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類および爬虫類)を含む。本明細書で用いられる「哺乳動物」および「哺乳類」の用語は、その幼体に哺乳しかつ生体の幼体を出産する(真獣類または胎盤性の哺乳動物)かまたは産卵する(後獣亜網または非胎盤性の哺乳動物)かいずれかの単孔類、有袋類および胎盤性のいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳類の種の例は、ヒトおよび他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)および反芻動物(例えばウシ、ブタ、ウマ)を含む。
【００４０】
「遺伝子疾患」により、部分的または完全に、直接的または間接的に1つもしくはいくつかの遺伝子における異常を原因とするいずれの疾患を意図する。該異常は、突然変異、挿入または欠失であり得る。該突然変異は、点状の(punctual)突然変異であり得る。該異常は、遺伝子のコーディング配列またはその調節配列に影響し得る。該異常は、ゲノム配列の構造またはエンコードされたmRNAの構造もしくは安定性に影響し得る。該遺伝子疾患は、劣性または優性であり得る。
【００４１】
「ベクター」の語は、それが連結されている別の核酸を移すことができる核酸分子のことをいう。
【００４２】
−メガヌクレアーゼ
本発明による上記使用の別の実施形態では、上記のメガヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ変異型からなる群から選択される。
【００４３】
−ホーミングエンドヌクレアーゼは先に引用したChevalierとStoddardの文献に記載されているエンドヌクレアーゼである。
【００４４】
−カスタムメイドメガヌクレアーゼ
−ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガードメインに基づくメガヌクレアーゼは、先に引用したSmithらの文献に記載された構造を有する。該メガヌクレアーゼは二つの融合タンパク質のヘテロダイマーである。各融合タンパク質は、リンカーを介してヌクレアーゼドメイン(Fok Iエンドヌクレアーゼまたは他のエンドヌクレア−ゼ由来)に連結されたZif268(または他のジンクフィンガータンパク質)に由来するDNA結合ドメインを含む。DNA標的部位は、DNA結合ドメインで結合された二つの9bpの外部領域および0-15bpの中央のスペーサー領域を含む。各モノマーにおけるDNA結合ジンクフィンガードメインは、IsalanおよびChoo (2001, Methods Mol Biol, 148,417〜29)、Isalanら(2001, Nat. Biotechnol, 19, 656〜60)ならびにIsalanおよびChoo (2001, Methods Enzymol, 340,593〜609)に記載されているように9bpの外部領域の一つに結合するように選択されている。上記諸筆者が述べているように、選択はファージディスプレイで実施できるが、Youngら(2000, PNAS, 97, 7382〜7)およびBaeら(2003, Nat Biotechnol, 21,275〜80)に記載されているように、酵母中または細菌の2ハイブリッド系でのスクリーニングなどの他の方法によっても行われる。また特異性を高めるために、Klugおよび共同研究者ら(Mooreら, 2001, PNAS, 98,1432〜6 ; Papworthら, 2003, PNAS, 100,1621〜6 ; Reynoldsら, 2003, PNAS, 100,1615〜20 ; Mooreら, 2001, PNAS, 98, 1437〜41)に記載されているように、六つのフィンガーモチーフを有するDNA結合ドメインも用い得る。しかし、ヌクレオチド切断活性がFokIドメインに依存している場合は、それぞれFokIの触媒部位(各FokI触媒ドメインは一つの鎖だけ切断する)に結合する二つのモノマーを使わねばならず、二本鎖切断を達成するのにこのような二つのドメインを用いる。
【００４５】
−メガヌクレアーゼ変異型
カスタムメイドメガヌクレアーゼは、標的DNA配列を切断できるメガヌクレアーゼと定義する。この定義は、メガヌクレアーゼ変異型のライブラリを調製し、そして選択および/またはスクリーニングにより標的DNA配列を切断できる変異型を分離する工程を含む方法で製造されるいずれのメガヌクレアーゼ変異型を含む。多様性を導入することによって当初のメガヌクレアーゼから誘導された該カスタムメイドメガヌクレアーゼは、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示す。
【００４６】
多様性は、メガヌクレアーゼ中に当業者に入手可能ないずれの方法により導入することができる。好ましくは、多様性は標的突然変異導入(例えばカセット突然変異導入、オリゴヌクレオチド定方向コドン突然変異導入、標的ランダム突然変異導入)、ランダム突然変異導入(例えば突然変異誘発株、Neurospora crassa系(米国特許第6,232,112号；WO01/70946号、誤りの多い(error-prone) PCR)、DNAシャッフリング、定方向突然変異またはこれらの技術の組み合わせにより導入される(Current Protocols in Molecular Biology, 第8章 "Mutagenesis in cloned DNA", Ausubelら編, John Wiley and Sonsを参照)。メガヌクレアーゼ変異型は、当初のメガヌクレアーゼの標的突然変異誘発により製造されるのが好ましい。多様性は、DNA標的と接触するかまたはDNA標的と(直接的または間接的に)相互作用する残基の位置に導入される。多様性は、DNA標的と相互作用する領域に導入されるのが好ましく、相互作用するアミノ酸の位置に導入されるのがより好ましい。標的突然変異誘発により作製されたライブラリにおいて、20のアミノ酸を選択された可変性の位置に導入することができる。好ましくは、可変性の位置に存在するアミノ酸は、タンパク質-DNA相互作用に一般的に含まれることが知られているアミノ酸である。より具体的には、これらのアミノ酸は、一般的に親水性アミノ酸である。より好ましくは、可変性の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yを含む。任意に、可変性の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yからなる群より選択される。合成または修飾アミノ酸も用いることができる。
【００４７】
定方向ライブラリ(directed library)を作製する好ましい方法のひとつは、多様性を導入しなければならない位置での縮重コドンの使用である。いくつかの種類の縮重コドンを使用することができる。縮重コドンN N K ([ATCG] [ATCG] [TG])は、20のアミノ酸と1つの停止をエンコードする32の異なるコドンを導く。縮重コドンN V K ([ATCG] [ACG] [TG])は、15のアミノ酸と1つの停止コドンをエンコードする24の異なるコドンを導く。縮重コドンV V K ([ACG] [ACG] [TG])は、12のアミノ酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)と停止なしをエンコードする18の異なるコドンを導く。縮重コドンR V K ([AG] [ACG] [TG])は、9つのアミノ酸(A、D、E、G、K、N、R、S、T)をエンコードする12の異なるコドンを導く。好ましくは、12のアミノ酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)をエンコードする18の異なるコドンを導く縮重コドンV V K ([ACG] [ACG] [TG])をライブラリの作製に用いる。実際に、V V K縮重コドンはいずれの停止コドンも含有せずかつ全ての親水性アミノ酸を含む。
【００４８】
定方向ライブラリを作製した場合、DNA標的と相互作用するアミノ酸についての知見が有用である。この知見は、例えばX線結晶解析、アラニンスキャンまたは架橋実験により提供することができる。DNA標的と相互作用するアミノ酸は、相同性タンパク質との配列アラインメントにより導き出すこともできる。
【００４９】
カスタムメイドメガヌクレアーゼは、いずれの当初のメガヌクレアーゼに由来する。任意に、当初のメガヌクレアーゼは、その天然の認識・切断部位が標的DNA部位に最も近いように選択される。好ましくは、当初のメガヌクレアーゼは、上記の定義で示すようにホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼは、よく保存されたアミノ酸モチーフに基づいて4つの別々のファミリー、つまりLAGLIDADGファミリー、GIY-YIGファミリー、His-CysボックスファミリーおよびHNHファミリーに分けられる(Chevalierら, 2001, N.A.R, 29, 3757〜3774)。
【００５０】
いくつかのホーミングエンドヌクレアーゼ、すなわちI-Dmo I、PI-Sce I、PI-Pfu I、I-Cre I、I-Ppo IおよびE-Dre IとよばれるハイブリッドホーミングエンドヌクレアーゼI-Dmo I / I-Cre Iの詳細な3次元構造は既知である(Chevalierら, 2001, Nat Struct Biol, 8, 312〜316; Duanら, 1997, Cell, 89, 555〜564; Heathら, 1997, Nat Struct Biol, 4, 468〜476; Huら, 2000, J Biol Chem, 275, 2705〜2712; Ichiyanagiら, 2000, J Mol Biol, 300, 889〜901; Juricaら, 1998, Mol Cell, 2, 469〜476; Polandら, 2000, J Biol Chem, 275, 16408〜16413; Silvaら, 1999, J Mol Biol, 286, 1123〜1136 ; Chevalierら, 2002, Molecular Cell, 10, 895〜905)。
【００５１】
LAGLIDADGファミリーは、それらの最も一般的に保存された配列モチーフ(12残基配列の1または2コピー：ジ-ドデカペプチド、LAGLIDADGモチーフともよばれる)により集められたタンパク質の最も大きいファミリーである。1つのドデカペプチドを有するホーミングエンドヌクレアーゼ(D)は、約20 kDaの分子質量で、ホモダイマーとして作用する。2コピーを有するホーミングエンドヌクレアーゼ(DD)は、各モチーフの間に70〜150の残基を有する25 kDa (230 AA)〜50 kDa (HO, 545 AA)の範囲であり、モノマーとして作用する。切断は認識部位の中で起こり、3'OH突出を有する4 ntのジグザグのカットを残す。I-Ceu IおよびI-Cre Iは、1つのドデカペプチドモチーフを有するホモダイマーホーミングエンドヌクレアーゼを表す(モノドデカペプチド)。I-Dmo I、I-Sce I、PI-Pfu IおよびPI-Sce Iは、2つのドデカペプチドモチーフを有するモノマーホーミングエンドヌクレアーゼを表す。
【００５２】
当初のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko IおよびPI-Tsp I；好ましくはI-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Pfu I、PI-Tli I、PI-Mtu IおよびI-Ceu I；より好ましくはI-Dmo I、I-Cre I、PI-Sce IおよびPI-Pfu Iからなる群から選択され；さらに好ましくはI-Cre Iである。
【００５３】
LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの4つの構造、すなわちI-Dmo I、PI-Sce I、PI-Pfu IおよびI-Cre Iの構造は、LAGIDADGモチーフの機能的重要性およびDNA結合界面の性質を明らかにする。ホモダイマーホーミングエンドヌクレアーゼの核のαββαββα折り畳みは、モノマーホーミングエンドヌクレアーゼ中で2回繰り返され、該モノマーに擬ダイマー構造を(peudo-dimeric structure)与える。各ドメインまたはサブユニットの最初のαヘリックスは、明確なLAGLIDADGモチーフを含有する。各タンパク質の2つのLAGLIDADGヘリックスは、密に詰まったダイマーまたはドメイン界面を形成する。DNA結合界面は、逆平行βシートに折り畳まれる各ドメインまたはサブユニットの4つのβ鎖により形成される。最小のDNA結合部分は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ中にβヘアピンとして(ループまたはターンにより連結された2つのβ鎖)規定され得るが、このような2つのβヘアピンは4ストランドのβシートに連結される。
【００５４】
各ドメインまたはサブユニットは、半分の認識部位(half recognition site)と相互作用する。「外部の」四分認識部位(《external》 quarter recognition site)は、各ドメインまたはサブユニットの2つのβヘアピンの1つだけとのその相互作用により規定することができる。
【００５５】
よって、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型は、いくつかの定方向ライブラリにおいて断片化されることができる。当初のメガヌクレアーゼ進化のためのこの断片化アプローチは、より大きい多様性(ある一つの位置および／またはより多様化された位置でのより多くのアミノ酸)の導入を許容する。各ライブラリにおいて、多様性は、半分の認識部位または四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ導入され、標的DNAは、導入された多様性を含む領域と相互作用する部分についてのみ改変される。より具体的には、新規な半分の部位を探索する場合、多様性は1つのドメインまたはサブユニットの4ストランドのβシートに導入されるのが好ましく、より好ましくはこの構造中のDNAと相互作用するアミノ酸の位置である。新規な四分部位を探索する場合、多様性は対応するβヘアピン中に導入され、より好ましくはこの構造のDNAと相互作用するアミノ酸の位置である。
【００５６】
好ましくは、ライブラリの組は、標的DNA部位の全体をカバーする。よって、ライブラリが半分の部位と相互作用する領域にのみ多様性を含む場合、少なくとも2つ、好ましくは2つのライブラリが必要である。しかしながら、当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合、半分の部位のアプローチでは1つのライブラリで充分である。ライブラリが四分部位と相互作用する領域にのみ多様性を含む場合、少なくとも4つ、好ましくは4つのライブラリが必要である。当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合、四分部位のアプローチでは2つのライブラリで充分であり得る。
【００５７】
一次ライブラリ(primary library)の選択またはスクリーニングの後、一次ライブラリから選択された要素は、選択の新たなサイクルのための次のライブラリに融合されるかまたは組み合わされる。例えば2つのライブラリをシャッフリングにより融合することができる。次いで、選択の新たなサイクルは、全体の標的DNA部位について行うことができる。任意に、選択の新たなサイクルは、最初のライブラリが四分部位に基づくのであれば、半分の標的DNA部位について行うことができる。続いて、半分の部位の選択および／またはスクリーニングの結果を組み合わせて、全体の標的DNA部位についてスクリーニングすることができる最終的なライブラリを得る。
代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、標的DNA部位に結合して切断できるメガヌクレアーゼを得る。
【００５８】
他のアプローチにおいて、半分の認識部位または四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ位置する多様性を有するライブラリを製造する。次いで、このライブラリの選択またはスクリーニングの後、ライブラリから選択された要素は、認識部位との相互作用に関与する別の領域に多様性を導入するように改変され、次のライブラリを導く。ライブラリは、完全な標的DNA部位が選択されたメガヌクレアーゼにより結合されかつ切断されるまで作製される。
【００５９】
より具体的には、ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼ(I-Cre IおよびI-Ceu Iのような)について、ライブラリは、半分の部位と相互作用する領域にのみ多様性を導入することにより作製でき、該半分の部位は当初のホーミングエンドヌクレアーゼの1つのモノマーに対応する。このライブラリは、標的DNA配列の各半分の部位についての選択および／またはスクリーニングに用いることができる。ライブラリから陽性の要素が各半分の部位について選択された場合、最初の半分の部位についての変異型と他の半分の部位についての変異型は、全体の標的DNA配列に結合して切断するために一緒にされる。代わりに、陽性の変異型は、単鎖メガヌクレアーゼ(single chain meganuclease)構造に導入され得る。実施例1で説明するように、単鎖メガヌクレアーゼは、当初のダイマーホーミングメガヌクレアーゼの2つのモノマーがリンカーにより共有結合した酵素である。
【００６０】
四分部位によるアプローチを当初のダイマーホーミングエンドヌクレアーゼから選択すると、各四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ多様性を導入することにより、少なくとも2つのライブラリが作製される。一次ライブラリの選択またはスクリーニングの後、一次ライブラリから選択された変異型を、半分の部位についての新たな選択サイクルのための次のライブラリに融合させる。代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、半分の部位に結合できるモノマーを得る。そうでなければ、四分認識部位との相互作用に関与する領域内にのみ多様性を有するライブラリを製造する。次いで、このライブラリの選択またはスクリーニングの後、ライブラリから選択された要素を、他の四分部位との相互作用に関与する領域に多様性を導入するように改変して次のライブラリを導く。この第二のライブラリの選択および／またはスクリーニングは、半分の部位に結合できる変異型モノマーを導く。ライブラリから陽性の要素が各半分の部位について選択される場合、最初の半分の部位についての変異型と、他の半分の部位についての変異型を、標的DNA配列に結合して切断するために一緒にする。代わりに、陽性の変異型を単鎖メガヌクレアーゼ構造内に導入することができる。
【００６１】
好ましくは、所望のポリヌクレオチド標的を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの指向性の進化(directed evolution)に由来する。ホーミングエンドヌクレアーゼはホモダイマーであるので、この場合のアプローチは半分の認識部位または四分部位のいずれかに基づく。
指向性の進化は、I-Cre I変異型のライブラリに基づく。これらのI-Cre I変異型は、ポリヌクレオチド標的と相互作用することが予想されるいくつかの位置でアミノ酸の多様性を示す。
【００６２】
I-CreエンドヌクレアーゼとそのDNA標的とのX線構造により、次の位置が関係することが予想された：Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140。Seligmanら(上記)は、S32およびT140は、DNA認識に比較的重要ではないとみられることを示した。
【００６３】
I-Cre I変異型の組は、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。好ましい実施形態において、I-Cre I変異型の組は、位置a) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140；b) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70；c) Q26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70；またはd) Q26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70に多様性を導入することにより製造される。好ましくは、I-Cre I変異型の組は、位置Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70に多様性を導入することにより製造される。
【００６４】
任意に、I-Cre IのD75残基は、Nのような非荷電のアミノ酸に変異され得る。実際に、このアミノ酸は、ライブラリにおいて改変されることが好ましい2つの残基と相互作用する。この電荷が構造の核に存在するので、この電荷をなくすのが好ましい。
【００６５】
ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの進化アプローチが四分認識部位に基づく場合、βヘアピン(4ストランドのβシート内)により表されるDNA結合残基を置換することが実際的な解決である。これらの残基は制限された長さの要素(すなわち25残基未満)の一部分であるので、例えばカセット置換によりこれらの残基を一度に一緒に変異させることができる。構造1g9y (その標的二本鎖DNAと一緒のI-CreI)の視覚的検査は、第一のβヘアピンが、標的の最後の6つの塩基(すなわち塩基-12〜-7または塩基+7〜+12)の認識に独特なまたは主要な貢献をするものであることを示す。よって、残基S22〜残基Q44まで、より好ましくは残基I24〜残基T42までの置換は、標的部位の最後の6つの塩基についての新規な相互作用特異性を特定するのに充分であるはずである。より好ましくは、DNAと直接相互作用する残基は、改変されるはずである：I24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42。代わりに(またはさらに)、非常に末端にある24bp長のDNA標的と相互作用するβヘアピンの中間のターンは、DNA塩基の置換に耐性があるであろう短いフレキシブルなループにより置換することができる。例えば、残基30〜36は、2、3、4、5または6のグリシン残基により置換され得る。このストラテジは、類似の3D構造を示す全てのメガヌクレアーゼで試験する価値がある。第二のヘアピンは、単一の単位として同様に置換され得る(残基Y66〜I77まで)。しかしながら、このヘアピンは主に内部の四分部位(塩基-6〜-1または+1〜+6)と相互作用するが、ヘアピンから離れた他の残基(すなわちS22、Q44およびT46)は、相互作用の特異性を指向させる役割を果たすことができる。つまり、ライブラリは残基Y66、R68、R70、V73、D75およびI77を置換することによりつくることができる。並行して、S22、Q44およびT46は、さわらないままにしておくか、小さい極性アミノ酸(G、SまたはT；より好ましくはSまたはT)により置換するかまたは無作為化されるかしてライブラリに寄与することができる。別々のライブラリから選択された突然変異体(無作為化された残基がI24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42である第一のものならびに無作為化された残基がY66、R68、R70、V73、D75およびI77である第二のもの)は、相同DNA領域での組換えに基づく標準的なDNAシャッフリング法により一緒にすることができる(すなわち、残基43〜残基65の間の領域をコードするDNAは厳密に保存される)。しかしながら、第二のライブラリが残基S22、Q44およびT46の突然変異を含む場合、組換えは実現不可能になり、より古典的なDNA/タンパク質工学が必要である。
【００６６】
ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの進化アプローチが四分認識部位に基づく場合、I-Cre I変異型のライブラリは、a) I24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42；またはb) Y66、R68、R70、V73、D75およびI77からなる群より選択される位置で多様性を導入することにより製造される。選択肢b)において、多様性はS22、Q44およびT46からなる群より選択される位置においても導入することができる。
【００６７】
代わりに、所望のポリヌクレオチド標的を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼは、単鎖I-Cre Iエンドヌクレアーゼの指向性の進化により製造することもできる。単鎖I-Cre I変異型の組は、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70、Q123、K125、N127、S129、Y130、Q135、Q141、R165、R167からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。
【００６８】
メガヌクレアーゼの2つの特性、すなわち標的DNA配列に結合できる能力とそれを切断できる能力は、選択工程および／またはスクリーニング工程に用いることができる。
【００６９】
メガヌクレアーゼ変異型は、選択かつスクリーニングされるか、またはスクリーニングだけされ得る。選択および／またはスクリーニングは、メガヌクレアーゼの標的DNA配列を切断する能力について直接行うことができる。代わりに、選択および／またはスクリーニングは、標的DNA配列に対する結合能力について、次いでメガヌクレアーゼのそれを切断する能力について行うことができる。好ましくは、カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法は、次の各工程：
a) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程；
b) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程；
c) 結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程；
d) 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程；
e) 切断活性の選択工程およびスクリーニング工程；または
f) 切断活性のスクリーニング工程
を含むかまたはこれらの工程からなる。
【００７０】
より好ましくは、カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法は、次の工程：結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程を含むかまたはこれらの工程からなる。結合能力に基づく選択工程の後の結合能力についてのスクリーニングアッセイは、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型のライブラリの濃縮(enrichment)を評価するために行うことができる。
【００７１】
選択およびスクリーニングアッセイは、二本鎖切断が導入されなければならないDNA領域またはその断片について行なわれる。
好ましくは、標的配列は少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは18〜40、より好ましくは18〜30ヌクレオチドを含む。ダイマーメガヌクレアーゼの場合、標的DNAポリヌクレオチドは、結合だけのために少なくとも8ヌクレオチドに減少させることができる。好ましくは、標的DNAポリヌクレオチドの長さは、10 kb未満、好ましくは3 kb未満、より好ましくは1 kb未満である。DNA結合アッセイについて、標的DNAポリヌクレオチドの長さは、好ましくは500 bp未満、より好ましくは200 bp未満である。
【００７２】
いずれの標的配列を、それをしかるべく切断可能なカスタムメイドメガヌクレアーゼを作製するのに用いることができる。任意に、標的配列は、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識・切断部位と最大の同一性を示すように選択される。
よって、二本鎖破壊が導入されなければならないDNA領域を分析して、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識・切断部位と少なくとも25％の同一性、好ましくは50％の同一性、より好ましくは75％の同一性を有する少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは18〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜30ヌクレオチドの少なくとも1、2、3または5の配列を選択する。
【００７３】
標的DNA配列は、メガヌクレアーゼ変異型ライブラリのタイプに適合させる。ライブラリが半分の部位のアプローチに基づく場合、選択/スクリーニングに用いられる標的DNA配列は、元来の半分の部位および所望のDNA配列の半分の部位を含む。ライブラリが四分部位アプローチに基づく場合、選択/スクリーニングに用いられる標的DNA配列は、元来の部位の4分の3と所望のDNA配列の4分の1の部位とを含む。
【００７４】
選択工程および／またはスクリーニング工程から得られるメガヌクレアーゼ変異型は、多様性の導入の別のサイクルのためのインプットに任意になることができる。
選択工程および／またはスクリーニング工程により選択された陽性のメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよび／またはエクスビボの切断アッセイにより確認される。
【００７５】
結合能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件を用いて行なわれなければならない。例えば、ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの切断活性のためにマンガンまたはマグネシウムを必要とする。よって、このタイプのホーミングエンドヌクレアーゼ変異型についての結合アッセイは、マンガンまたはマグネシウムなしで、好ましくはカルシウムにより置換して行なわれる。
【００７６】
結合選択アッセイは、標的DNAポリヌクレオチドに結合できるメガヌクレアーゼの変異型の濃縮に基づく。よって、ライブラリによりエンコードされるメガヌクレアーゼ変異型は、固定化された標的DNAポリヌクレオチドと共に、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合するメガヌクレアーゼ変異型がいずれの結合能力も示さないものから差異に基づいて分配され得るように、インキュベートされる。固定化された標的DNAポリヌクレオチドと結合するメガヌクレアーゼ変異型は、次いで親和性濃縮と増幅の後続の回のために回収されて増幅される。親和性の濃縮および増幅を数回行った後に、このようにして選択されるライブラリのメンバーを単離することができる。任意に、選択されるメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列が決定され、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。
【００７７】
メガヌクレアーゼ変異型の選択は、遺伝子型と表現型とを連結する系、例えばファージディスプレイ(WO91/17271号、WO91/18980号ならびにWO91/19818号およびWO93/08278号；これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)、リボソームディスプレイ(Hanes & Pluckthun, PNAS, 1997, 第94巻, 4937〜4942；He & Taussig, Nucl. Acids Res. (1997) 第25巻, p 5132〜5143)およびmRNA-タンパク質融合(WO00/47775号；US第5,843,701号；Tabuchiら FEBS Letters 508 (2001) 309〜312；これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)を必要とする。
【００７８】
ファージディスプレイは、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質との融合としての繊維状バクテリオファージの表面上のメガヌクレアーゼ変異型の提示に関係する。メガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、ファージ染色体またはファージミドに、バクテリオファージコートタンパク質、好ましくはpIIIタンパク質とのタンパク質融合体を得るように導入される。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、メガヌクレアーゼのモノマー変異型は、ディスプレイされるように導入され、そして一定のモノマーがペリプラズムにおいて産生されるように導入することができる。バクテリオファージライブラリは、DNAに結合し得る要素を選択するために固定化標的DNA配列とインキュベートすることができる。
【００７９】
mRNA-タンパク質融合系は、1013の異なるメガヌクレアーゼ変異型から選択する可能性を開く。この系は、翻訳の最後に共有的mRNA-タンパク質融合に導くmRNAの3'末端にピューロマイシンを介してmRNAとエンコードされるタンパク質との間の連結を創造することにある。よって、メガヌクレアーゼ変異型のコーディング領域を含む二本鎖DNAライブラリは、3'ピューロマイシンを含有する翻訳のためのmRNA鋳型を再生するのに用いられる。mRNA-ピューロマイシンコンジュゲートは、インビトロで翻訳されてmRNA-メガヌクレアーゼ融合体がつくられる。cDNA合成の後、該融合体は、固定化標的DNAポリヌクレオチドに結合する能力について試験される。次いで、PCRを用いて、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型に富む二本鎖DNAを作製する。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、一定のモノマーはこのモノマーをエンコードするDNAもしくはmRNAとして、またはモノマータンパク質のいずれかとして導入することができる。この場合、単鎖メガヌクレアーゼを用いるアプローチが好ましく用いられる。
【００８０】
リボソームディスプレイは、翻訳のためのmRNA鋳型を作製するために使用されるメガヌクレアーゼ変異型のコーディング配列を含む二本鎖DNAライブラリを含む。短いインキュベーションの後、Mg2+の添加および低温でのインキュベーションまたは翻訳阻害剤の添加により翻訳を停止する。次いでリボソーム複合体を、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合する能力について試験する。選択されたmRNAは、cDNAを構築するのに用いられ、PCRは、結合能力を提示するメガヌクレアーゼ変異型に富む二本鎖DNAを作製する。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、一定のモノマーは、このモノマーをエンコードするDNAもしくはmRNAまたはモノマータンパク質のいずれかとして導入される。この場合、単鎖メガヌクレアーゼを用いるアプローチが好ましく用いられる。
【００８１】
標的DNA配列は、固体支持体上に固定化され得る。該固体支持体は、カラム、常磁性のビーズまたはマイクロプレートのウェルであり得る。例えば、標的DNA配列を含むポリヌクレオチドは一方の末端でリガンド(例えばビオチン)を提示し、該リガンドはリガンドの標的(例えばビオチンが用いられる場合はストレプトアビジン)をもつ固体支持体上への固定化を許容する。
【００８２】
メガヌクレアーゼ変異型の選択は、これらのメガヌクレアーゼの結合または切断能力に基づくスクリーニングアッセイにより、通常、モニターすることができる。しかしながら、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は、切断能力に基づく選択工程に直接導入することもできる。
【００８３】
スクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要がある。選択をファージディスプレイシステムを用いて行った場合、各メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするクローンを容易に単離することができる。選択をmRNA-タンパク質融合またはリボソームディスプレイにより行なった場合、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は発現ベクターにサブクローニングされなければならない。
【００８４】
スクリーニングアッセイは、標的DNAポリヌクレオチドが固定化されたマイクロプレート(96、384または1536ウェル)で行なわれるのが好ましい。メガヌクレアーゼ変異型の発現の後、これらの変異型を固定化標的DNAポリヌクレオチドと共にインキュベートする。メガヌクレアーゼ変異型の発現は、インビボまたはインビトロのいずれかで、好ましくはインビトロ発現系により行うことができる。好ましくは、メガヌクレアーゼ変異型は、標的ポリヌクレオチドとのインキュベーションの前に精製される。次いで、保持されたメガヌクレアーゼ変異型を検出する。検出は、当業者に公知のいくつかの手段により行うことができる。例えば、ファージを用いる場合は、検出はファージに対する抗体を用いて(ELISA)行うことができる。そうでなければ、発現を、放射活性のメガヌクレアーゼを得るために、S35アミノ酸の存在下に行うことができる。つまり、結合を放射活性測定により評価する。本発明は、メガヌクレアーゼによるDNA結合の検出の当業者に入手可能な他の手段も考慮する。
【００８５】
任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。
陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、その切断能力について試験しなければならない。よって、該メガヌクレアーゼ変異型は、切断の選択および／またはスクリーニング実験、好ましくはインビボ切断スクリーニングアッセイに組み込まれる。任意に、該メガヌクレアーゼ変異型は、インビトロ切断アッセイにより試験できる。
【００８６】
スクリーニングアッセイは、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型の濃縮を評価するためにだけ用いることもできる。この評価は、結合能力に基づく選択の新しい回が必要であるか、または選択されたライブラリを切断の選択および／またはスクリーニング、好ましくはインビボでの切断の選択および／またはスクリーニングに付すことができるかを決定する助けとなる。
【００８７】
切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件下で行なわれなければならない。切断能力に基づく選択および／またはスクリーニングにおいて用いられるメガヌクレアーゼ変異型は、メガヌクレアーゼ変異型の最初のライブラリまたは結合活性について選択および／またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型のいずれかであり得る。
【００８８】
必要であれば、選択および／またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよびインビボ切断アッセイのために適切な発現ベクターにサブクローニングされる。このようなサブクローニング工程は、バッチにおいてまたは個別に行うことができる。より具体的には、当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合。サブクローニング工程は、単鎖メガヌクレアーゼ構造内への選択されたライブラリの導入を許容する。2つのライブラリが2つの半分の認識・切断部位について選択および／またはスクリーニングされた場合、サブクローニング工程は、単鎖メガヌクレアーゼ構造内で2つの選択されたライブラリを一緒にすることを許容する。
【００８９】
メガヌクレアーゼ変異型の切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択の一般的な原理は、二本鎖破壊が正の選択マーカーの活性化または負の選択マーカーの不活性化に導くことである。
【００９０】
選択が負の選択マーカーの不活性化に基づく場合、該方法は、負の選択マーカーと所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列のコーディング配列を含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含有する細胞の使用を含む。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。好ましくは、該標的DNA配列は、負の選択遺伝子の近くまたは負の選択遺伝子内のいずれか、好ましくは負の選択遺伝子の発現を駆動するプロモーターとORFとの間に位置する。負の選択マーカーの発現は、メガヌクレアーゼ変異型が切断する機会を有するまで細胞を生存したままにするために、条件的(conditional)でなければならない。このような条件的発現は、条件的プロモーターを用いて容易に行うことができる。しかしながら、用い得る他の条件的システムもある。メガヌクレアーゼ変異型を発現カセット内に導入する。メガヌクレアーゼをエンコードする配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結する。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。メガヌクレアーゼ変異型が標的DNAを切断する能力を有する場合、負のマーカー遺伝子全体もしくはその部分(コーディング配列またはプロモーター)の欠失またはベクターの分解のいずれかにより負の選択マーカーは不活性化される。負の選択条件での培養は、標的DNA配列を切断できるメガヌクレアーゼ変異型を含む細胞の選択を許容する。
【００９１】
負の選択マーカーを含むベクターは、メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターの導入前にトランスフェクションされるのが好ましい。任意に、負の選択マーカーを含むベクターは、細胞内でエピソームの形で保存され得る。代わりに、負の選択マーカーを含むベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターは、細胞に共トランスフェクションすることができる。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。好ましくは、原核細胞はE. coliである。好ましくは、真核細胞は酵母細胞である。負の選択マーカーは細胞にとって直接または間接的に毒性のタンパク質である。例えば、負の選択マーカーは、細菌についてはトキシン、翻訳阻害剤、バーナーゼ(barnase)および抗生物質、酵母については5FOA (5-フルオロ-オロチン酸)培地と用いるURA3、α-AA培地(アルファ-アジピン酸)と用いるLYS2、および高等真核細胞についてはチミジンキナーゼからなる群から選択することができる。負のマーカー選択の例については、Gruenら, 2002, Nucleic Acids Research, 30, e29を参照。この開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００９２】
選択が正の選択マーカーの活性化に基づく場合、該方法は、不活性な正の選択マーカーと所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列とを含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含む細胞の使用を含む。任意に、不活性な正の選択マーカー、標的DNA配列およびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、同じベクター上にあることができる(WO 02/44409号を参照)。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。メガヌクレアーゼ変異型は、発現カセット中に導入される。メガヌクレアーゼエンコード配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結することができる。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。例えば、正の選択マーカーは、細菌については抗生物質耐性(例えばテトラサイクリン、リファンピシンおよびアンピシリン耐性)または栄養要求性マーカー、酵母についてはTRP1、URA3または栄養要求性マーカー、および高等真核細胞についてはネオマイシンまたはピューロマイシンであり得る。任意に、正の選択マーカーは細菌と酵母の両方に矛盾しない栄養要求性マーカーであり得る(例えばURA3、LYS2、TRP1およびLEU2)。不活性な正の選択マーカー遺伝子および標的DNA配列は、二本鎖破壊が活性な正のマーカーにおいてマーカーの転位(rearrangement)を導くように配置されなければならない。2種の修復プロセスは、活性な正の選択マーカー、すなわち一本鎖アニーリング(SSA)または遺伝子変換(GC)に導くことができる。
【００９３】
インビボ一本鎖アニーリング組換え試験(SSA)は当業者に周知であり、例えばRudinら(Genetics 1989, 122, 519〜534 ; Fishman-Lobell & Haber (Science 1992, 258, 480〜4); Linら(Mol. Cell. Biol., 1984, 4, 1020〜1034)およびRouetら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6064〜6068)に開示される。これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００９４】
メガヌクレアーゼ変異型を試験するために、細胞内、好ましくは細菌または酵母細胞でのSSAに基づくインビボアッセイが開発されている。例えば、該方法は酵母細胞を用いる。この生物は、高い頻度で相同的組換えを介してそのDNAを自然に組み換える点で有利である。
このインビボ試験は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製される二本鎖破壊により誘発される正の選択マーカーのSSAによる修復に基づく。標的は、標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択遺伝子からなる。内部重複は、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも200 bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。介在配列は、細胞が自発的組換え事象により正の選択マーカーを修復していないことを確かめることを許容する選択マーカーを任意に含み得る。正の選択マーカー遺伝子は、アッセイにおいて用いる細胞に関連する構成性プロモーターに動作可能に連結されるのが好ましい。該アッセイ方法によると、細胞は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により導入された二本鎖破壊の後にSSA事象が起こる場合にのみ選択される。
【００９５】
任意に、各ベクターは細胞内にプラスミドが存在することを確実にするために選択可能なマーカーを含み得る。この選択可能なマーカーの存在は、酵母細胞内で行われるアッセイについて好ましい。例えば、酵母について、標的遺伝子を含む第一の構築物は、形質転換された酵母がいずれのロイシンも含有しない合成培地上で増殖するのを許容するLeu2選択マーカーを含むことができ、第二の構築物は、形質転換された酵母がいずれのトリプトファンも含有しない合成培地上で増殖するのを許容するTrp1選択マーカーを含むことができる。
【００９６】
正の選択マーカーを含むベクターは、メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターの導入の前にトランスフェクションされるのが好ましい。任意に、正の選択マーカーを含むベクターは、細胞内でエピソームの形で保持され得る。代わりに、正の選択マーカーを含むベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターは、細胞内に共トランスフェクションすることができる。
【００９７】
メガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択は、遺伝子変換アッセイを用いて行うこともできる。例えば、選択ベクターは、欠失または変異と欠失の位置にメガヌクレアーゼのための標的DNA配列の挿入とを有する第一の改変された正の選択遺伝子を含む。正の選択遺伝子は、標的DNA配列を含む挿入による遺伝子の分断により不活性化されることもできる。選択構築物は、欠失の境をなす正の選択マーカー遺伝子配列で両側を挟まれる欠失された正の選択マーカー遺伝子のセグメントをさらに含む。境界配列は、両側にある正の選択マーカー遺伝子と少なくとも100 bp、好ましくは少なくとも300 pbの相同性を含む。標的DNA配列内で活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製された二本鎖破壊は、遺伝子変換事象を引き起こし、機能的な正の選択マーカー遺伝子をもたらす。この種類のアッセイは、次の文献に記載される：Rudinら(Genetics 1989, 122, 519〜534)、Fishman-Lobell & Haber (Science 1992, 258, 480〜4)、Paques & Haber (Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 6765〜6771)。これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる。
【００９８】
そうでなければ、メガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択は、染色体標的上での組換えアッセイにより行うことができる。組換えはSSAまたは遺伝子変換の機構に基づくことができる。
【００９９】
SSAに基づく第一の例は次のとおりである。所望のメガヌクレアーゼ変異型についての標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複(internal duplication)を有する改変された正の選択遺伝子を、細胞の染色体内へ導入する。内部重複は、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも200 bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。細胞内でのメガヌクレアーゼ変異型の生成を許容する発現構築物での細胞のトランスフェクションにより、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製した二本鎖破壊の相同的組換えによる修復が機能的な正の選択マーカー遺伝子を導く。
【０１００】
遺伝子変換に基づく別の例は、次のとおりである。所望のメガヌクレアーゼ変異型についての標的DNA配列を含む変異された非機能的な正の選択マーカー遺伝子を、細胞の染色体内へ導入する。該標的DNA配列は、変異の近傍、好ましくは変異から1 kb未満、より好ましくは変異の周囲500 bp、200 bpまたは100 bp未満になければならない。変異領域に対応する機能的な正の選択マーカー遺伝子の断片と細胞内でメガヌクレアーゼ変異型の産生を許容する発現構築物とで細胞をトランスフェクションすることにより、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製された二本鎖破壊の相同的組換えによる修復は、機能的な正の選択マーカー遺伝子を導く。代わりに、修復を許容する機能的な正の選択マーカーの断片を、染色体上に組み込むことができる。この種類のアッセイは、次の文献に記載される：Rouetら(Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106)；Choulikaら(Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973)；Donohoら(Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070〜4078)。これらの開示は本明細書に参照により組み込まれる。
【０１０１】
選択されたクローンは、標的DNA配列を切断する能力を示すメガヌクレアーゼ変異型を含む。スクリーニングアッセイにより選択を確認するのが好ましい。このスクリーニングアッセイは、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで行うことができる。
任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列を切断することができるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。
【０１０２】
スクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要があり、切断アッセイは各クローンについて個別に行われる必要がある。
スクリーニングについてのインビボ切断アッセイは、選択工程で用いられるものと類似である。これは、負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの不活性化あるいは正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの活性化に基づくことができる。
レポーター遺伝子により、容易にアッセイされる物質、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑蛍光タンパク質、チロシナーゼ、DsRedタンパク質をエンコードするいずれの核酸を意図する。レポーター遺伝子は、アッセイにおいて用いられる細胞に関係する構成性プロモーター(例えばCMVプロモーター)に動作可能に連結されるのが好ましい。
【０１０３】
このスクリーニングアッセイで用いられる細胞は、原核細胞、好ましくはE. coli、または真核細胞、好ましくは酵母細胞または哺乳動物細胞であり得る。より具体的には、エクスビボ切断アッセイによる陽性のメガヌクレアーゼ変異型の確認のために哺乳動物細胞を用いるのが興味深い。
【０１０４】
メガヌクレアーゼ変異型による標的DNA配列またはその一部分の認識および切断は、当業者に公知のいずれの方法によりアッセイすることができる。
メガヌクレアーゼ変異型の活性を試験するある方法は、標的DNA配列またはその一部分を含むポリヌクレオチド基質に対するインビトロ切断アッセイを用いることである。該ポリヌクレオチド基質は、
−全体の標的DNA部位；
−半分の標的DNA部位と半分の元来の部位；または
−4分の1の標的DNA部位と4分の3の元来の部位
に対応する合成標的部位であり得る。
【０１０５】
該ポリヌクレオチド基質は、直鎖状または環状であることができ、唯一の切断部位を含むのが好ましい。アッセイされたメガヌクレアーゼ変異型は、適切な条件においてポリヌクレオチド基質とインキュベートされる。得られるポリヌクレオチドは、いずれの既知の方法、例えばアガロース上での電気泳動またはクロマトグラフィーにより分析される。ポリヌクレオチド基質が直線化されたプラスミドである場合、メガヌクレアーゼ活性は2つのバンド(生成物)の出現および元来の全長の基質のバンドの消滅により検出される。好ましくは、該アッセイされたメガヌクレアーゼ変異型は、得られるポリヌクレオチドの分析の前に例えばプロテイナーゼKにより消化される。例えば、ポリヌクレオチド基質は、標的部位の配列を含むポリヌクレオチドのプラスミド内へのTAまたは制限酵素クローニングによる導入により、任意にプラスミドの直線化を続けて製造される。好ましくは、このような直線化は、標的DNA配列の周囲では行なわない。Wangら, 1997, Nucleic Acid Research, 25, 3767〜3776；Examples, Materials & Methods "in vitro activity assays"のセクションの実施例、および当初のホーミングエンドヌクレアーゼの特徴付けの文献を参照。
【０１０６】
代わりに、このようなインビトロ切断アッセイは、蛍光体に連結されたポリヌクレオチド基質を用いて行うことができ、このような基質は標的DNA配列を含む。これらのポリヌクレオチド基質は、固体支持体に固定化される。該固体支持体は、好ましくはマイクロプレート(96、384または1536ウェル)である。例えば、標的DNA配列を含むポリヌクレオチドは、一方の末端でリガンド(例えばビオチン)を提示し、該リガンドはリガンドの標的(ビオチンを用いる場合は例えばストレプトアビジン)を有する固体支持体上への固定化を許容する。固定化された末端の反対側の末端は、蛍光体と連結される。切断は、固体支持体からの蛍光色素の放出により蛍光の減少を導く。
【０１０７】
そうでなければ、いくつかのインビトロ切断アッセイは、蛍光消失に基づくことができる。蛍光体(例えばFAMまたはTAMRA)および消光物質(例えばDABCYL)は、ポリヌクレオチド基質上に、消光物質が蛍光発光を阻害するように位置する。消光は、ポリヌクレオチド基質上でメガヌクレアーゼ変異型による切断が起こるときに撤廃される。この消光アッセイのいくつかの例は、Eisenschmidtら(2002, Journal of Biotechnology, 96, 185〜191)およびWO 02/42497号に説明され、これらの文献の開示は本明細書中に参照として組み込まれる。
【０１０８】
−ターゲティングDNA
本発明の上記使用の第一実施形態において、標的の遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を改変する配列を含むDNAのターゲティング断片(またはターゲティングDNA)が、必要に応じて(下記のメガヌクレアーゼの送達の章参照)、前記脊椎動物(ヒトまたは非ヒト)の体内に導入される。少なくとも50bp、好ましくは100bpを超える、より好ましくは200bpを超える相同配列が使用されるのが好ましい。対象の部位を改変する配列は、遺伝子の損傷を修復するための遺伝子の正しい配列であり得る(遺伝子治療)。あるいは、対象の部位を改変する前記配列は、ある種の特定の方法で染色体DNAを変えるために使う他の配列でもよく、その配列としては、特定の配列を改変したり、対象の内因性遺伝子を減弱もしくは活性化させたり、対象の内因性遺伝子もしくはその一部分を不活性化もしくは欠失させたり、対象の部位に突然変異を導入したり、または外因性遺伝子もしくはその一部分を導入するために使用される配列がある。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学(動物モデル、タンパク質の製造)または抗ウイルス治療に利用される。
【０１０９】
−メガヌクレアーゼの送達
メガヌクレアーゼは、ポリペプチドまたはプロモーター例えば組織特異的プロモーターおよび/または誘導性プロモーターを含む適当な転写制御要素の制御下で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物として使用できる。誘導性プロモーターの例は、重金属の濃度増大で誘発される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)に応答して誘発される原核lacZプロモーターおよび温度上昇で誘発される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒト界面活性剤(SP) Aタンパク質とBタンパク質、β-カゼインおよび酸性ホエータンパク質の遺伝子である。このプロモーターは、当該技術分野で周知の通常の手段で、単独または少なくとも適当な賦形剤もしくは担体および/またはターゲティングDNAと組み合わせて、個体の体細胞中に導入される。
【０１１０】
本発明の使用の有利な実施形態によれば、メガヌクレアーゼ(ポリペプチド)は、
−リポソーム類、例えばポリエチレンイミン(PEI)と結合する。この場合、その結合物が投与されて体細胞の標的に導入される；または
−膜転位ペプチド(membrane translocating peptide) (Bonetta, 2002, The Sientist, 16, 38; Fordら, Gene Ther, 2001, 8, 1〜4 ; WadiaおよびDowdy, 2002, Curr Opin Biotechnol, 13, 52〜56)と結合する。この場合、該ペプチドとの融合体がある。
【０１１１】
メガヌクレアーゼは、特定のメガヌクレアーゼと細胞型に適した当該技術分野で広く知られている方法にしたがって、個体から体組織に導入することもできる。
【０１１２】
本発明の使用の別の有利な実施形態によれば、メガヌクレアーゼ(該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド)および/またはターゲティングDNAがベクターに挿入される。ターゲティングDNAおよび／またはメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入することができる(例えば注入、形質転換、トランスフェクション、直接の取り込み(direct uptake)、発射物打込み(projectile bombardment)、リポソーム)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて細胞内で安定的にまたは一過的に発現することができる。真核細胞における発現の技術は、当業者に周知である(Current Protocols in Human Genetics:第12章 "Vecto Therapy"と第13章 "Delivery Systems for Gene Therapy"を参照)。任意に、組換えタンパク質に核局在化シグナルを組み込んで、それが核内で発現されることを確実にすることが好ましい。
【０１１３】
メガヌクレアーゼをコードする配列とターゲティングDNAは、同じベクターに挿入すると有利である。
【０１１４】
本発明で使用できるベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体の、非染色体の、半合成もしくは合成のDNAからなる直線状もしくは環状のDNAもしくはRNAの分子を含む。好ましいベクターは、自立複製することができるベクター(エピソームベクター)および/またはそのベクターが連結されている核酸を発現できるベクター(発現ベクター)である。多種類の適切なベクターが、当業者に知られており、購入できる。
【０１１５】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、オルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹およびセンダイ)のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびαウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)およびポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス(hepadnavirus)、および肝炎ウイルスを含む。
レトロウイルスの例は、トリ白血病-肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLVグループ、レンチウイルス、スプマウイルス(Coffin, J. M.、Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology、第3版、B. N. Fieldsら編、Lippincott- Raven Publishers、Philadelphia、1996)を含む。その他の例は、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全性ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびレンチウイルスを含む。ベクターのその他の例は、例えばMcVeyら、米国特許第5,801,030号に記載され、この教示は本明細書に参照として組み込まれる。
【０１１６】
ベクターは、選択マーカー(selectable marker) (例えば、真核細胞培養にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、およびハイポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；エス・セレビシエにはTRP1；イー・コリではテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン耐性など)を含み得る。
【０１１７】
一旦細胞内に入ると、メガヌクレアーゼ、ならびにもし存在するならばターゲティングDNAおよび／またはメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、細胞により細胞質から核内の活動する部位に取り込まれるかまたは移動される。
【０１１８】
メガヌクレアーゼならびに切断部位の周囲の領域に相同なターゲティングDNAおよび／またはカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、当該技術において一般に知られた投与経路を用いて個体に導入することができる。投与は、局所的または内部的(internal)あるいは患者に治療剤を導入するのに適したいずれの他の経路によるものであり得る。局所的投与は、皮膚への塗布または目、耳もしくは鼻への適用によるものであり得る。内部的投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、動脈内もしくは静脈内またはいずれの他の適切な経路により行い得る。本発明の組成物を経口摂取によるかまたは呼吸、直腸もしくは膣により投与することが有利な場合もあり得る。
【０１１９】
メガヌクレアーゼおよびベクターは、医薬的に許容される担体、例えば食塩水、滅菌水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液中に投与することができる。典型的には、治療の適用のために、メガヌクレアーゼは、計画された投与経路に適切な医薬的に許容される賦形剤と組み合わせる。種々の医薬的に許容される賦形剤が周知であり、そのうちメガヌクレアーゼを感染の部位に効果的に送達するものが選択できる。American Pharmaceutical Associationにより出版されるHANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTSは、本発明の使用のための適切な賦形剤についての有用な指針である。構成物は、受容者がその投与に耐え得る場合は「医薬的に許容される賦形剤」とよばれる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、静脈内投与に適する医薬的に許容される賦形剤の一例である。投与の形態は、標的細胞の位置が好ましい。
【０１２０】
投与頻度を含む、個体に投与される本発明のメガヌクレアーゼまたはベクターの用量は、投与の形態および経路；受容者のサイズ、年齢、性別、健康、体重および食餌；治療される疾患または障害の性質および症状の程度；並行して行う治療の種類、治療の頻度および所望される効果を含む種々の因子に応じて変動する。医薬的な剤形およびそれらの使用の簡単なレビューについては、PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND THEIR USE (1985) (Hanshuber Publishers, Berne, Switzerland)を参照。
【０１２１】
治療の目的のために、カスタムメイドメガヌクレアーゼと医薬的に許容される賦形剤とは治療上有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が生理的に意義がある場合に「治療上有効量」で投与されるという。剤は、その存在が受容者の生理機能に検出できる変化をもたらす場合に、生理的に意義がある。本発明の関係において、剤は、その存在が標的疾患の1以上の症状の重篤度の減少または障害もしくは異常のゲノムの修正またはウイルス感染の阻害をもたらす場合に、生理的に意義がある。
【０１２２】
本発明のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち有害な免疫応答をほとんどまたは全く発生させない。この種類の有害な免疫反応を緩和または消去する種々の方法を、本発明の方法に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、N-ホルミルメチオニンを実質的に有さない。望ましくない免疫反応を回避するための別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール(「PEG」)またはポリプロピレングリコール(「PPG」)と結合させることである(好ましくは平均分子量(MW)が500〜20,000ダルトン)。例えばDavisら(US第4,179,337号)に記載されるようなPEGまたはPPGとの結合は、抗ウイルス活性を有する非免疫原性の生理活性な水溶性エンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供することができる。ポリエチレン−ポリプロピレン グリコールコポリマーを用いる類似の方法がSaiferら(US第5,006,333号)に記載されている。
【０１２３】
−遺伝子治療
本発明による遺伝子治療のためのメガヌクレアーゼの使用は、遺伝子疾患(単一遺伝子の劣性疾患、トリヌクレオチド反復疾患または優性および複合の異型接合突然変異により起こる疾患)のタイプによって変わる。
【０１２４】
したがって、本発明のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、単一遺伝子劣性疾患を予防、改善または治癒するために対象の部位を修復する配列を含む上記で規定したターゲティングDNAと組み合わせて使用する。
【０１２５】
この場合、メガヌクレアーゼの使用は、(a)個体の体組織において、該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に二本鎖切断を誘発する工程、および(b)個体中にターゲティングDNAを導入する工程を少なくとも有し、該ターゲティングDNAは、(1)切断部位のまわりの領域と相同性を共有するDNAおよび(2)ターゲティングDNAと染色体DNAの間の組換えによって対象の部位を修復するDNAを含む。該ターゲティングDNAは、該ターゲティングDNAを対象の部位に導入するのに適切な条件下で個体に導入される。
【０１２６】
単一遺伝子劣性疾患としては、限定されないが、対応する体組織内の下記の遺伝子に影響する疾患を含む。
−肝臓：アポリポタンパク質欠損症(apo A-I遺伝子またはapo B遺伝子)；家族性高コレステロール血症(FH;LDL受容体遺伝子)；ウイルソン病(WND遺伝子)；鎌状赤血球貧血(ヘモグロビンβ遺伝子(HBB))；α-1抗トリプシン欠損症(α-1抗トリプシン遺伝子)；遺伝性血色素症(HFE遺伝子)；血友病Aまたは血友病B(IX因子またはX遺伝子)；アミノ酸症(チロシン血症(フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子(FAH))；フェニルケトン尿症(フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)など)、
−肺：嚢胞性線維症(CFTR: 嚢胞性線維症膜貫通制御因子)、
−筋肉：肢帯筋ジストロフィー(α、β、γまたはδ-サルコグルカン遺伝子)、
−腎臓：多嚢胞性腎臓病(PKHDI)、
−網膜：色素性網膜炎(ロドプシン遺伝子)、
−中枢神経系(CNS)：ティ・サックス病；レッシュ・ナイハン症候群(HPRT遺伝子)。
【０１２７】
本発明の別の実施形態では、メガヌクレアーゼを単独でまたは少なくとも一つの適当な賦形剤および/または担体と組み合わせて、トリヌクレオチド反復病を予防、改善または治癒するために使用する。
【０１２８】
この場合、メガヌクレアーゼの認識・切断部位を挟むトリヌクレオチド反復((CGG)n、(CAG)nまたは(GAA)n)を染色体内相同的組換えで除去する。より正確には、メガヌクレアーゼの使用は、個体の体組織において、切断部位のまわりの領域に相同な染色体DNAが対象の部位で除去されて該対象の部位を修復する(染色体内相同的組換え)のに適当な条件下で、該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に二本鎖破壊を誘発することを含む。
【０１２９】
トリヌクレオチド反復疾患としては限定されないが、下記のような遺伝子に影響を与える疾患を含む。
−脆弱性X症候群：CGG反復、FMR1遺伝子、
−脆弱性XE症候群：CCG反復、FMR2遺伝子、
−フリードライヒ運動失調症：GAA反復、X25遺伝子、
−緊張筋ジストロフィー：CAG反復、DMPK遺伝子、
−ハンチントン病：CAG反復、HD遺伝子、
−骨髄小脳性運動失調：CAG反復、SCA1,2,3,6,7および8遺伝子、
−ホーリバー(Haw river)症候群：GAA反復、DRPLA遺伝子。
【０１３０】
本発明のさらに別の実施形態において、メガヌクレアーゼを単独で、または上記で規定したターゲティングDNAおよび/または少なくとも一つの適当な賦形剤および/または担体と組み合わせて、優性または複合の異種接合突然変異により起こる遺伝子疾患を予防、改善または治癒するために使用する。
【０１３１】
したがって、以下の二つの場合がある。
1. 単独で使用するメガヌクレアーゼ：突然変異の部位における二本鎖破壊を用いて、遺伝子の別のコピーからの相同染色体DNA配列が、該二本鎖破壊が誘発された配列に配列を提供する遺伝子変換事象(染色体間相同的組換え)を介して遺伝子の損傷を修正する。より詳しく述べると、このメガヌクレアーゼの使用は、個体の体組織において該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に、切断部位のまわりの領域に相同な染色体DNAを対象の部位に導入してその対象の部位を修復するのに適切な条件下で、二本鎖破壊を誘発する工程を含む。
【０１３２】
2. ターゲティングDNAと組み合わせて使用するメガヌクレアーゼ：該メガヌクレアーゼの使用は、(a) 個体の体組織において、該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に二本鎖切断を誘発し、そして(b)個体にターゲティングDNAを導入する工程を少なくとも含み、該ターゲティングDNAは、(1)切断部位のまわりの領域と相同性を共有するDNAおよび(2)ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に対象の部位を修復するDNAを含む。該ターゲティングDNAは、対象の部位にターゲティングDNAを導入するのに適切な条件下で個体中に導入される。メガヌクレアーゼをコードする配列とターゲティングDNAをコードする配列は同じベクターで運ぶことができる。
【０１３３】
本発明によれば、両方の場合で、上記の二本鎖切断は、上記のメガヌクレアーゼを個体に投与することによってイントトで誘発させるか、または該メガヌクレアーゼを個体から取り出して改変した後に個体に戻して体細胞中にエクスビボで導入することによって誘発させる。
【０１３４】
優性または複合の異型接合突然変異により引き起こされる遺伝子疾患としては、限定されないが、ハンチントン病、家族性高コレステロール血症、家族性高脂質血症、1型口指顔骨形成異常症候群、優性耳硬化症、バナヤン(Bannayan)症候群、ヘーリー-ヘーリー病、軟骨形成不全症を含む。
【０１３５】
−抗ウイルス治療
本発明によると、メガヌクレアーゼは、DNA媒介物を示すウイルスまたはレトロウイルスが起こすウイルス疾患の治療における治療剤として使用される。実際に、真核細胞に感染する多くのウイルスが、そのライフサイクルの少なくとも一部分の間に、メガヌクレアーゼにより容易に切断され得る二本鎖DNAからなるゲノムを有する。このストラテジは、ウイルス特異的、すなわちヒトゲノム中には存在しないウイルスゲノム内のDNA配列の同定を含む。一旦同定されると、かような配列に高い親和性と特異性で特異的に結合して切断するメガヌクレアーゼを、本発明にて説明したようなカスタムメイドメガヌクレアーゼの製造法を使って設計できる。次に、設計されたメガヌクレアーゼをウイルス感染症の治療のために用いる。
【０１３６】
メガヌクレアーゼまたは該メガヌクレアーゼをコードする発現ベクターは、いずれの簡便な手段で個体内に導入される。カスタムメイドメガヌクレアーゼが、感染された細胞中に導入されるかまたは発現されると、ウイルスは不活性化されおよび/または除かれる。メガヌクレアーゼ治療は、健康な細胞の機能に対する影響がない。同様に、少なくとも一つのメガヌクレアーゼの使用に基づくかような抗ウイルス治療を用いて、異種移植された動物の器官を処置できる。
【０１３７】
そのライフサイクルの間に二本鎖DNAの段階を含むいずれのウイルスも、ウイルスゲノムに特異的なDNA配列を認識するメガヌクレアーゼを創ることにより、除去または不活性化の標的となり得る。これらのウイルスは、複製型または潜伏型であり得る。これらは、エピソームとしてかまたは宿主のゲノムに組み込まれるかのいずれかでとどまることができる。
【０１３８】
二本鎖DNAゲノムウイルスは、本発明で規定されるメガヌクレアーゼを用いることにより処理されるのに非常に適する。これらのうち、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、パポバウイルスおよびポックスウイルスが見出されている。ヘルペスウイルスのうち、単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス6、7および8が見出されている。ヘパドナウイルスのうち、ヒトB型肝炎ウイルス(HBV)が見出されている。パピローマウイルスのうち、パピローマウイルス(HPV) (例えばHPV16またはHPV18)およびポリオーマウイルスが見出されている。アデノウイルスのうち、アデノウイルス11および21が見出され、これらは急性出血性膀胱炎に関連する。
【０１３９】
レトロウイルスも、本発明によるメガヌクレアーゼを用いることにより処理するのに非常に適する。これらはRNAウイルスであるが、宿主のゲノムに二本鎖DNAの形で組み込まれる。レトロウイルスのうち、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびヒトTリンパ腫ウイルス(HTLV) (例えばHTLV1)が見出されている。
【０１４０】
本発明の使用の有利な実施形態では、前記ウイルスは、HIV、HBV、HTLV、HPVおよびHSVから選択される。
【０１４１】
いくつかの上記のウイルスは、発癌性に関係することが周知である。バーキットリンパ腫、その他のリンパ組織増殖性の疾患および上咽頭癌におけるEBV；カポジ肉腫におけるヘルペスウイルス8；肝細胞癌におけるHBV；性器の癌におけるHPV；T細胞白血病におけるHTLV-1である。
【０１４２】
エピソームウイルスについて、そのゲノムに導入された二本鎖破壊は、ゲノムの直線化およびその分解に導く。エピソームウイルスの例は、HSV-1、EBVおよびHPVである。
【０１４３】
組込みウイルス(integrated viruses)について、組み込まれたウイルス配列の中またはその近くに導入された二本鎖破壊は、組み込まれたウイルス配列の部分的または完全な欠失に導く。組込みウイルスの例は、HPV、HTLV、HBVおよびHIVである。欠失にはいくつかの機構が関係し得る。染色体の二本鎖破壊は、相同な染色体との遺伝子変換を誘発し、よってウイルス配列の欠失を導く。二本鎖破壊の近くに直列反復配列(directed repeat sequence)が存在する場合、該破壊はSSA (一本鎖アニーリング)により修復することができ、部分的または完全なウイルスの欠失を導く。2つの二本鎖破壊を導入すると、二本鎖破壊の位置に応じて、染色体は末端結合(end joining)により修復されることができ、ウイルスの部分的または完全な欠失が導かれる。米国特許第5,948,678号(この開示は本明細書に参照として組み込まれる)の実施例5を参照。
標的ウイルスDNA配列が宿主のゲノムに存在しないことを確実にするために、このようなDNA標的配列は、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも18ヌクレオチド長であるべきである。ホーミングエンドヌクレアーゼは12〜40 bpにわたる認識配列を示すので、この条件は本発明により規定されるカスタムメイドメガヌクレアーゼが充足する。より具体的には、I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼは22 bpの認識配列を有する。
【０１４４】
ウイルスゲノムのいずれのDNA配列も、本発明により規定されるメガヌクレアーゼによる切断のために標的され得る。好ましい標的部位は、ウイルスの株の間で保存され、および／またはその遺伝子がウイルスの増殖および感染性に必須である配列を含む。これらの位置は、少なくとも2つの理由から好ましい。第一に、ウイルスの必須の部分は他より突然変異が少ない。第二に、ウイルスの不活性化を最大限にするためにウイルスの必須の領域を標的することが好ましい。
【０１４５】
カスタムメイドメガヌクレアーゼの良好な標的は、ウイルスの複製起点(ori)および／またはori結合タンパク質をエンコードするウイルス遺伝子であり得る。ori結合タンパク質の例は、HSV-1 UL9遺伝子産物、VZV遺伝子51産物、ヒトヘルペスウイルス6B CH6R遺伝子産物、EBV EBNA-1遺伝子産物ならびにHPV E1およびE2遺伝子産物である。HPVについての他の対象の標的は遺伝子E6およびE7であるが、これはこれらの産物が増殖および悪性の表現型の開始および維持に関係するからである。好ましい標的は、HPVのプレコア／コア領域内の高度に保存された62ヌクレオチド配列である (E6、E7)。EBVについての対象の標的の例は、遺伝子EBNAおよびLMPである。ウイルスの発癌性効力を仲介すると考えられるHTLV-1の遺伝子Taxを標的することは興味深いであろう。HBVについて、対象の標的はX遺伝子であろう。なぜなら、Xタンパク質はDNA修復システムの要素と相互作用しかつp53の変異率を増加させ得るからである。HIVについて、好ましい標的はTAT、REVまたはTAR遺伝子の中にある。ウイルスの標的は、上記の例に限定されない。任意に、標的DNAは、ウイルスの反復配列、例えばITR (逆方向末端反復)およびLTR (長末端反復)であり得る。
【０１４６】
好ましくは、少なくとも2つの異なる標的部位を用いる。実際に、ウイルスの主要な防御はそれらの変異する能力である。よって、2つの標的部位は、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを用いることによる処理からウイルスが逃れるのを回避する。さらに、異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼの継続使用により、有害な免疫応答を回避することができる。該異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、異なる当初のメガヌクレアーゼを示すことができ、よって異なる免疫原性を示す。
【０１４７】
ウイルスの増殖と感染を阻害するメガヌクレアーゼの効力は、好ましくはインビトロおよびインビボの感染検定法で評価される。かような検定は、第一に、異なるメガヌクレアーゼがウイルスの増殖に有害な作用をする方式でウイルスDNAを切断する可能性を立証するため、細胞培養で実施することができる。この種の予備試験に続いて適当な動物モデルの試験を行う。最後に、臨床試験を行う。
【０１４８】
異なるウイルスに適切な宿主および培養条件は大きく変動するので、異なるウイルスは異なるアッセイシステムを必要とする。しかしながら、このような適切な条件は多くのウイルスの培養について記載されており、これらの条件を用いてウイルスおよび／または宿主をメガヌクレアーゼに曝露する効果を試験して、エンドヌクレアーゼがウイルス感染を阻害する能力を決定することができる。特定のウイルスについての培養条件の議論についてはFieldsおよびKnipe編, FIELDS VIROLOGY, 第2版, Raven Press, N.Y. (1990)の第17章を参照。
【０１４９】
宿主および／またはウイルスは、感染の経過において、変更しうるいくつかの関係するパラメータに言及すると、種々の回数、種々の条件下で、いくつかの量で、そして種々の賦形剤で曝露して、潜在的な治療効果を達成するメガヌクレアーゼの潜在能力を評価することができる。
【０１５０】
さらに、培養細胞においてエクスビボで試験するために、潜在的な治療のメガヌクレアーゼを動物モデルにおいて試験して、単独または他の治療剤との組み合わせのいずれかでの予防、緩和、治療および／または治癒的な能力を評価することができる。ウイルスの培養が可能でなく、全ての生物学的アッセイを動物モデルにおいて行うことが必要な場合がある。異なる動物モデルが異なるウイルスに適切であることが容易に認識されるであろう。しかしながら、いずれの動物モデルも、メガヌクレアーゼの治療的能力を評価するのに用いることができる。
【０１５１】
アッセイされるメガヌクレアーゼの潜在的有効量は、動物の適切な個体群に投与することができ、ウイルス感染の経過におけるメガヌクレアーゼの効果は、適切なコントロールとの比較により評価できる。薬理学的効果を評価するためのこのような方法は、当該技術において周知であり、メガヌクレアーゼの治療的プロフィールを測定するのに容易に適応させることができる。
【０１５２】
−ゲノム工学(genome engineering)
ゲノム工学は、生細胞および／または生物の遺伝子プログラムにおける変化を誘導するのに用いられる一連の方法である。本発明により得られるメガヌクレアーゼは、細胞ゲノムの合理的な部位特異的改変を許容する。これらの技法の目的は、改変されるべき染色体を、ゲノムの残りの部分を無傷のままにして正確に上書きすることである。ゲノム工学の適用分野は多様である：動物モデルの作製(ノックインまたはノックアウト)、タンパク質産生(産生株のエンジニアリング、ミルク中のタンパク質産生のための植物および動物でのタンパク質産生)、農学的生物工学(形質の付加または除去、マーカーの切り出し)、代謝経路の改変および研究。
【０１５３】
本発明による使用の第一の実施形態において、該使用は少なくとも次の工程を含む；
1) メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座で二本鎖破壊を導入する工程、および
2) 標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入されるべき配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程。
実際に、共有されるDNA相同性は、ターゲティングDNA構築物における破壊の部位の上流および下流を挟む領域に位置し、導入されるべきDNAは、2つの腕の間に位置するべきである。該メガヌクレアーゼは、細胞に直接または該メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含みかつ用いられる細胞内のその発現に適する発現ベクターを介して提供され得る。このストラテジを用いて、DNA配列を標的部位に導入し、例えば薬剤の試験またはタンパク質の製造に用い得るノックイン動物モデルまたは細胞系が作製される。
【０１５４】
本発明の使用の別の実施形態において、該使用は少なくとも以下の工程を含む；
1) 該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程；
2) 切断部位の周囲の領域と相同な染色体DNAとの相同的組換えに適切な条件下に維持する工程。
このストラテジを用いて、標的部位におけるDNA配列を除き、例えばゲノムの機能試験のためのノックアウト動物の作製または薬剤試験のための適当な動物モデルが作製される。さらにノックアウト動物は、代謝経路の改変を含む細胞株の改良もしくは最適かまたは薬剤試験のための細胞系の作製に用いることができる。
【０１５５】
本発明による、体組織に相同的組換えを誘発するメガヌクレアーゼの使用を例示する実施例を参照するさらなる記述と図面によって、本発明をさらに詳解する。しかしこれら実施例は、本発明を例示するためにのみ提供するものであり本発明を決して限定するものではないと解すべきである。
【０１５６】
−図1は、単鎖I-Cre Iメガヌクレアーゼのアミノ酸配列および該単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするあるポリヌクレオチドを開示する。タンパク質配列において、2つの最初のN-末端残基はメチオニンとアラニン(MA)であり、3つのC-末端残基はアラニンとアラニンとアスパラギン酸(AAD)である。これらの配列は、NcoI (CCATGG)およびEagI (CGGCCG)制限部位を含むDNAコーディング配列を有することを許容し、これらは種々のベクターにクローニングするのに用いられる。
【０１５７】
−図2はポリヌクレオチド配列を開示する。図2Aは、I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「天然」とよばれるポリヌクレオチドを開示する。図2Bは、I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「非相同」とよばれるポリヌクレオチド配列を開示する。図2Cは、変異D75NJを含むI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「鋳型」とよばれるポリヌクレオチド配列を開示する。各I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼは、N-末端の端に2つのさらなるアミノ酸(MA)およびC-末端の端に3つのさらなるアミノ酸(AAD)を有する。図2Dは、ライブラリUlibIおよびUlibIIを作製するのに用いられるUlibIfor、UlibIrev、UlibIIforおよびUlibIIrevとよばれるプライマーのポリヌクレオチド配列を開示する。
【０１５８】
−図3は、D75N変異を含むI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「鋳型」とよばれるポリヌクレオチド配列の模式図である。濃い矢印は、2つのライブラリUlibIおよびUlibIIを作製するのに用いられるプライマーUlibIfor、UlibIrev、UlibIIforおよびUlibIIrevの位置を示す。D-ヘリックスはLAGLIDADGヘリックスのことである。N75は変異D75Nのことである。
【０１５９】
−図4は、ライブラリ構築のストラテジの模式図である。工程1：pET24C-Tはポリヌクレオチド「鋳型」を含むプラスミドである。2つのPCR増幅、PCR ulib1およびulib2は、UlibIforとUlibIIrevまたはUliblIforとUliblIIrevのいずれかを用いて行なわれる。PCR ulib1産物をファージミドpCes4 NHTにクローニングする。PCR ulib2産物をプラスミドpET24C-Tにクローニングする。工程2：Ulib2ベクター(pET45C-Ulib2)の断片のUlib1ファージミド(pCes4-Ulib1)へのサブクローニング。
【０１６０】
−図5：COS細胞単層を、I Sce-I (B)を発現するベクターまたはコントロールプラスミド(A)を用いてトランスフェクションする。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV-1 (30 PFU)を用いて感染させる。2日後、単層を固定して染色(X-Gal)する。感染した細胞は青色になった。
【０１６１】
−図6：図6A：細胞単層を30 PFUで感染させる。HSV-1増殖を、細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性により定量する。図6B：細胞単層を300 PFUで感染させる。細胞の生存率を細胞溶解物中のタンパク質測定により測定する。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことである。I-Sce I(-)は、I Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことである。ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。
【０１６２】
−図7：図7Aは、組換えHSV-1のゲノムDNAの模式図である。Lac遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むカセットを、主要LAT転写産物に挿入した。I-Sce I制限部位をプロモーターとレポーター遺伝子との間にクローニングした。aおよびbは、半定量的PCRに用いたプライマーを示す。COS-7単層をI-Sce Iを発現するベクターまたはコントロールプラスミドを用いて感染させた。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV-1 (30 PFU)を用いて感染させた。DNAを感染の1、2または3日後に抽出した。PCRを「実験方法」に記載のようにして行った。Stdは内部標準のことであり；LacはrHSV-1 Lac遺伝子のアンプリコンのことである。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことであり；I-Sce I(-)はI Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。図7B；ウイルスのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のPCR定量。PCRを2つのDNA濃度で行なった。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことであり；I-Sce I(-)はI Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。
【０１６３】
−図8は、トランスフェクションした細胞の感染の後に培地に放出されたウイルスの力価を示す。培地を毎日回収して新鮮な培地を加えた。ウイルスを、標準的なプラークアッセイにより測定した。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことであり；I-Sce I(-)はI Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。
【０１６４】
−図9は、I-CreI DNA標的および5つの関係する標的を示す。保存された位置は灰色の箱である。
−図10は、6つの標的を用いてLib2ライブラリをスクリーニングした後に得られる4つの結合パターンを示す。陽性のものは最初のスクリーニングで同定され、第二のスクリーニングにおいて確認されたが、その間にそれらは標的のそれぞれ(C1234、C1221、C4334、H1234、H1221およびH4334)について8回アッセイされた(8つの立方のバーに対応する)。ヒストグラムは各クラスからの1つのクローンについて示される。標的は図9に示す。
【０１６５】
−図11は、標的ベクターの模式図を示す。CpG欠失LacZ遺伝子(LagoZ)は、ヒト伸長因子1アルファプロモーターにより駆動される。LagoZ遺伝子は、I-SceI切断部位の挿入により不活性化される。挟む反復を白抜きの矢印で示す。相同配列の長さをボールドで示す。
【０１６６】
−図12は、一本鎖アニーリング(SSA)効率に対する相同性の長さの影響を示す。細胞単層を、等モル量の異なる長さの相同反復配列を有する標的プラスミドおよびISce-Iを発現するベクターを用いるかまたはコントロールプラスミドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を回収して細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性を定量した。(+)I-SceI、I-SceIを発現するベクターを用いた共トランスフェクション；(-)I-SceI、I-SceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクターを用いた共トランスフェクション。
【０１６７】
−図13：細胞単層を(+)I-SceIを発現するベクターまたはコントロールプラスミド(-)I-SceIを用いて共トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を固定して染色した(X-Gal)。図13A：遺伝子修復が起こった細胞が暗く現れた。図13B：70および220 bp重複標的ベクター上のI-SceI誘導組換えの頻度。頻度は、青色の細胞／トランスフェクションされた細胞の比により計算される。
【０１６８】
−図14A：標的LagoZ遺伝子(30μg)およびI-SceI発現ベクター(10μg)の混合物を注射されたマウスからの肝臓のX-Gal染色。図14B：標的LagoZ遺伝子(30μg)およびI-SceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクター(10μg)の混合物を注射されたマウスからの肝臓のX-Gal染色。
【０１６９】
−図15：IVにより「Ad.I-SceI」アデノウイルスを用いて感染させた2つの独立した系統の半接合体トランスジェニックマウスの肝臓のX-Gal染色。A. 感染の5日後、β-ガラクトシダーゼ活性が、1010感染性単位で感染された「58A」半接合体の肝臓全体の多数の細胞で検出される。これに比べて、「Ad.control」で感染された半接合体または感染していない「58A」同腹子の肝臓のX-Gal染色により、β-ガラクトシダーゼ活性は検出できない(データ示さず)。B.およびC. 感染の14日後、β-ガラクトシダーゼ活性が、109感染性単位で感染されたマウス(B)および1010感染性単位で感染されたマウス(C)の肝臓全体の多数の細胞で検出される。より強いシグナルはBに比べてCで検出され、これはおそらくより多数の細胞が「Ad.I-SceI」を用いて感染されたからであろう。これに比べて、感染していない「361」同腹子の肝臓のX-Gal染色により、β-ガラクトシダーゼ活性は検出できない(データ示さず)。
【０１７０】
−図16：肝臓抽出物の蛍光β-ガラクトシダーゼアッセイ。トランスジェニックマウスの2つの独立した系統(58 Aおよび361)に109または1010 PFUのI-SceIを発現するアデノウイルス(Ad.I-SceI)またはコントロールウイルス(Ad.control)を注入した。マウスを注射の5または14日後に犠牲にし、肝臓を切開し、タンパク質を抽出した。肝臓タンパク質抽出物30μlを37℃でフルオレセインジガラクトシド(FDG)の存在下にインキュベートした。バーは、アッセイの標準偏差を示す(同じ抽出物のサンプルを用いて2回の測定実験)。NI：注射されていないマウス；Ad.I-SceI：I-SceIを発現するアデノウイルスを注射したマウス；Ad.control：コントロールアデノウイルスを注射したマウス。
【０１７１】
−図17は、実施例7で用いた導入遺伝子、DNA修復マトリックスおよびプライマーの配列を示す。
−図18は、マウスにおけるI-SceI誘導遺伝子変換によるI-SceI-hApo A-I導入遺伝子修復のRT-PCR分析を説明する。3〜4週齢のトランスジェニックマウス(ライン14Aおよび21)への裸の(naked) DNA (I-SceI発現ベクターおよびDNA修復マトリックス)の流体力学的尾部静脈注射(hydrodynamic tail vein injection)。A：2 kbpのDNA修復マトリックス(RM)およびB：1.5 kbpのRM。CHO細胞におけるI-SceI-hApo A-I導入遺伝子についてのI-SceI誘導遺伝子変換を、PCRのポジティブコントロールとして用いた。
【実施例】
【０１７２】
実施例1：ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
いくつかのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、ホモダイマーとして活性である。各モノマーはそれらのドデカペプチドモチーフを介して主にダイマー化する。単鎖メガヌクレアーゼは、この酵素の2つのサブユニットの間に共有結合を導入するようにして改変された2つのモノマーを共有結合させることによりつくることができる。好ましくは、共有結合は2つのモノマーの間にペプチド結合を創ることにより導入される。しかしながら、他の簡便な共有結合も意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、単鎖I-Cre Iおよび単鎖I-Ceu Iのような同じホーミングエンドヌクレアーゼからの2つのサブユニットを含むのが好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは多数の利点を有する。例えば、単鎖メガヌクレアーゼはより操作(manipulate)しやすい。単鎖メガヌクレアーゼは、ダイマー構造に比べて例えば標的配列の認識のために熱力学的に好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは、オリゴマー化の制御を許容する。
【０１７３】
I-CreIの単鎖バージョン(scI-CreI)を手本とし作製した。scI-CreIは、その同種の(cognate) DNA基質をインビトロで切断し、酵母および哺乳動物細胞の両方において相同的組換えを誘発する。
【０１７４】
−単鎖I-CreIメガヌクレアーゼの設計
Chlamydomonas reinhardtiiからのI-CreIは、小さいLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼであり、これはより大きいモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものに類似の構造にダイマー化する。I-CreIの単鎖バージョン(scI-CreI)をつくるために、2つのI-CreIコピーを融合させた。このことは2つのドメインの間にリンカー領域を配置することを必要とし、I-CreIタンパク質のかなりの部分がリンカーに先行するドメインの末端で除去されなければならなかった。
【０１７５】
I-DmoIの三次元構造は、I-DmoIはある明確なドメインから他のドメインへ導くリンカー領域を含むことを除いてI-CreIのものに匹敵する。このリンカーの境界は、I-CreIダイマーの関係する主鎖原子に精巧に調和する。第一のドメインにおいて、I-CreIとI-DmoIの第三のα-ヘリックスからの残基93〜95 (リンカーに先行する)は、構造的に等しい。第二のLAGLIDADGα-ヘリックスの最初(第二のドメイン)では、I-DmoIの残基104〜106はI-CreIの残基7〜9に対応する。さらに、I-DmoIからのLeu95およびGlu105は、I-CreIにおいて同一性を保存しており、I-DmoIの残基Arg104はI-CreI中の別の塩基性残基(Lys7)と整列する。つまり、単鎖I-CreI (scI-CreI)は、残基94〜104 (配列MLERIRLFNMR)のI-DmoIリンカー領域を第一のI-CreIドメイン(Pro93で終結)と第二のI-CreIドメイン(Glu8から開始)との間に挿入することにより設計された。
【０１７６】
どのようにして新しいリンカーがscI-CreIタンパク質ドメイン(手本とした構造において)を連結するかの詳細な構造解析により、矛盾の可能性(potential incompatibility)は見られなかった。例えば、I-DmoIからの非極性アミノ酸の側鎖であるMet94、Ile98およびPhe109は、内部に向いてI-CreIのキャビティにフィットする。しかしながら、単一の突然変異(P93A)を作製してリンカー領域に先行するα-ヘリックスにおける主軸(backbone)の規則性を促進した(アミノ酸およびポリヌクレオチド配列について図1を参照)。
【０１７７】
−材料および方法
タンパク質の発現および精製
Hisタグをつけたタンパク質を、pET-24d (+)ベクター(Novagen)を用いてE. coli BL21 (DE3)細胞で過剰発現させた。IPTG (1mM)を用いて25℃で誘導した。細胞をプロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、Roche)および5% (v/v)グリセロールを含有する25mM HEPES (pH 8)溶液中で超音波破砕した。細胞溶解物を2回遠心分離した(15 000 g、30分間)。次いでHisタグをつけたタンパク質を、コバルトをのせた5mlのHi-Trapキレーティングカラム(Amersham)を用いて親和性精製した。イミダゾールの直線勾配(0.25Mイミダゾールまで、続いて0.5Mイミダゾールおよび0.5M NaClのプラトー)を用いる溶出の間にいくつかのフラクションを回収した。タンパク質に富むフラクション(SDS-PAGEにより測定)を、10kDaカットオフのセントリプレップAmiconシステムを用いて濃縮した。最後に得られたサンプルをSuperdex75 PG Hi-Load 26-60カラム(Amersham)での排除クロマトグラフィーにより精製した。回収したフラクションをSDS-PAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mM HEPES (pH 7.5)および20% (v/v)グリセロールの溶液に対して透析した。
【０１７８】
インビトロ切断アッセイ
単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37℃または65℃で12.5mM HEPES (pH 8)、2.5% (v/v)グリセロールおよび10mM MgCl2の中で行なった。反応を0.1容量の0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、0.25 M EDTA、5% (w/v) SDSおよび0.5 mg/mlのプロテイナーゼKの添加および37℃で20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1％アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。
【０１７９】
酵母比色アッセイ
酵母の形質転換法を、以前のプロトコルから適合させた。染色には、伝統的な定性のX-Galアガロースオーバーレイアッセイ(Agarose Overlay Assay)を用いた。各プレートを、60℃で0.1 M燐酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.2% SDS、12%ジメチルホルムアミド(DMF)、14 mM β-メルカプトエタノール、0.4% X-Gal中の1％アガロース2.5 mlで被覆した。プレートを37℃でインキュベーションした。
【０１８０】
哺乳動物細胞アッセイ
COS細胞を、Superfectトランスフェクション試薬を用いて、供給業者(Qiagen)のプロトコルに従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞をPBS1Xで2回リンスし、溶解バッファー(Tris-HCl 10mM pH7.5、NaCl 150mM、トリトンX100 0.1 %、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)中でインキュベーションした。溶解物を遠心分離し、上清をタンパク質濃度測定およびβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイに用いた。典型的に、抽出物30μlを3μlのMg 100Xバッファー(MgCl2 100mM、β-メルカプトエタノール 35%)、33μlのONPG 8 mg/mlおよび234μlのリン酸ナトリウム 0.1M pH7.5と合わせた。37℃でのインキュベーション後、反応を500μlの1M Na2CO3で停止してODを415nmで測定した。相対的なβ-ガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として測定し、反応時間およびタンパク質の全量で標準化する。
【０１８１】
−結果：単鎖I-CreIはそのDNA基質をインビトロおよび生細胞内で切断する
新規な酵素に対応する合成遺伝子をつくり、scI-CreIタンパク質をE. coliで過剰発現させた。精製scI-CreIのインビトロでDNA基質を切断する能力を、I-CreIホーミング部位のコピーを有する直線化したプラスミドを用いて試験した。親のI-CreIと同様に、新規な酵素はI-CreI標的部位を37℃で切断する。
【０１８２】
インビボでのscI-CreIの機能性を試験するために、酵母および哺乳動物細胞でのメガヌクレアーゼにより誘導された相同的組換えをモニターするためのアッセイを設計した。酵母、ツメガエル(Xenopus)の卵母細胞および哺乳動物細胞においては、2つの直列反復の間のDNA切断が、これらの反復の間の相同的組換えを非常に高レベルで誘導することが知られている。単鎖アニーリング(SSA)としばしばよばれる組換え経路は、1つの反復ユニットおよび全ての介在配列を除去する。つまり、細菌のLacZ遺伝子の2つの短縮された非機能的コピーおよび介在配列内のI-CreI切断部位を有するSSAレポーターベクターを、酵母複製プラスミド内で構築した。切断部位の切断は、X-gal染色により簡単に検出され得る機能的なユニークLacZコピーをもたらすはずである。
【０１８３】
レポーターベクターを酵母細胞を形質転換するのに用いた。細胞のわずかのフラクションが機能性LacZを発現したようであり、これはおそらく形質転換の間の組換え事象による。これに比べて、I-CreIまたはscI-CreIのいずれかを発現するプラスミドとの共形質転換(co-transformation)は、プレートに播種した全ての細胞に青色の染色をもたらした。非誘導条件(グルコース)の下でさえも、タンパク質の残存レベルはSSAを誘導するのに充分であり、このことは、scI-CreIが、I-CreIと同程度に、酵母細胞内で非常に有効であることを示唆する。さらに、SSA誘導はI-CreIタンパク質による標的切断部位の切断に完全に依存した。なぜなら、この部位を欠くベクターはバックグラウンドのレベルに比べてβ-ガラクトシダーゼ活性の増加がないからである。
【０１８４】
SSAアッセイを、哺乳動物細胞での試験のために改変した。レポーターおよびメガヌクレアーゼ発現プラスミドのプロモーター配列と終結配列を変更して、プラスミド組換えを一過性トランスフェクションアッセイにおいて評価した。scI-CreIまたはI-CreIのいずれかを用いて、同様のレベルの組換え(2〜3倍の増加)の誘導が観察された。酵母での実験のように、I-CreI切断部位がないとβ-ガラクトシダーゼの増加がないので、組換えは反復の間のI-CreI切断部位に依存する。
【０１８５】
逆方向反復の間の組換えに基づく別の組換えアッセイも、COS細胞でのメガヌクレアーゼに誘導される組換えをモニターするために用いた。直列反復がSSAにより組換え可能であるので、間接反復(indirect repeat)の間の相同的組換えは遺伝子変換事象を必要とする。遺伝子変換の同様の刺激(3〜4倍)が、scI-CreIまたはI-CreIのいずれかを用いて観察された。真の相同的組換え事象に予想されるように、相同の供与体鋳型の不在下では増強が観察されなかった。
【０１８６】
実施例2：HIV-2標的のためのI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼに由来するカスタムメイドメガヌクレアーゼ
−I-Cre I変異型のファージディスプレイライブラリの構築
特異性が変化した新規なメガヌクレアーゼを作るために、DNA結合残基を置換するI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼの突然変異誘発によりコンビナトリアルライブラリを構築した。次いで、選択およびスクリーニングの適用により、特定の選択されたDNA標的に結合し得る変異型を発見することができた。ファーディスプレイについて、I-Cre Iはホモダイマーであるので、2つの別個のI-Cre Iタンパク質をエンコードするファージミドベクターが必要であった。2つのI-Cre Iコピーのうちの1つ(ファージコートタンパク質p3に融合された)のみを突然変異させた。ファージディスプレイフォーマットで得られたタンパク質ライブラリは、I-Cre I野生型/変異体へテロダイマーを含んだ。DNA標的部位内の単一の半分の部位のほとんどの塩基との特異的相互作用可能な8残基(Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70)を選択した。我々のコンビナトリアルライブラリは、8つの対応するコドンをユニーク縮重VVKコドンで置換することにより得た。結局、タンパク質ライブラリ中の変異体は、8つの残基の位置でVVKコドンによりエンコードされる12アミノ酸(ADEGHKNPQRST)のいずれの独立した組み合わせに対応した。ゆえに、タンパク質ライブラリの最大の(理論的)多様性は、128または4.29×108であった。
【０１８７】
−ライブラリの構築
まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽されている残基D75をN (Asn)に変異させた。これは、ライブラリにおけるこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみ(energetic strain)のようなものを除くためである。変異型D75Nのホモダイマー(pET発現ベクターを用いてこれを過剰発現させたE. coli細胞から精製した)は、I-CreIホーミング部位を切断することが示された。次いで、野生型I-CreI (図2Aおよび2B：「天然」または「非相同」)をエンコードするファージミドベクターをつくり、ファージコードタンパク質p3に融合されたD75N変異体(図2C：「鋳型」)およびファージディスプレイ野生型/D75Nヘテロダイマーは、その標的DNAに結合することが示された。
【０１８８】
次に、中ぐらいのサイズの2つの媒介物(intermediate)のライブラリをつくった：Lib1 (残基26、28、30、33および38を変異；理論的多様性125または2.48×105)およびLib2 (残基44、68および70を変異；理論的多様性123または1.7×103)。所望の突然変異の組み合わせを有するDNA断片は、縮重プライマー(図 2D：Uliblfor、Uliblrev、Ulibllfor、Ulibllrev)およびDNA鋳型としてD75N遺伝子を用いるPCR (50μl中に数回の反応)により得られた。Lib1およびLib2は、特定の制限酵素を用いて消化した対応するPCR産物を、ファージミドベクター内およびpET発現ベクター内のD75N変異遺伝子中にそれぞれライゲーションすることにより構築した。ベクターおよび挿入DNAの消化は2つの工程(単一酵素消化)で行い、これらの工程の間にDNAサンプルを抽出(フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール)し、EtOH沈殿させた。消化されたベクターDNA 10μgを、挿入DNAの5：1の超過でライゲーションに用いた。E. coli TG1細胞は、得られたベクターを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。いずれのライブラリの理論的多様性を越えるいくつかの細胞クローンを製造するために、Lib1ライゲーションサンプルの35回までのエレクトロポレーションおよびLib2ライゲーションサンプルの4回のエレクトロポレーションが必要であった。4×106 (最大の多様性の16倍(times))および6×104 (多様性の35倍)のクローンをLib1およびLib2についてそれぞれ得た(これらの数は、挿入なしで行なったライゲーションを用いて得られたクローンの数により補正された)。
【０１８９】
最後に、Lib1およびLib2細菌クローンをプレートからかきとり、対応するプラスミドベクターを抽出して精製した。次いで完全なライブラリを、Lib2ベクターの断片をLib1ファージミドベクター中にサブクローニングすることにより得た(ライブラリ構築の模式図について図4を参照)。DNA 2工程消化、脱リン酸化、精製、定量、ライゲーションおよびエレクトロポレーションのサイクルを数回行なった。150エレクトロポレーションショットの4回目(これは1.4μgのベクターの0.4μgの挿入を用いる12のライゲーションに相当)の後に、5.5×107細菌クローンを得た(バックグラウンドについての修正後)。細菌をかきとり、グリセロールストックとして貯蔵した。さらに、このグリセロールストックの一定量を、200 mlの培養に植菌するために用い、ライブラリベクターを、貯蔵および可能性のあるサブクローニングのためにこの培養から抽出して精製した。
【０１９０】
−材料および方法
タンパク質の発現および精製
Hisタグをつけたタンパク質を、pET 24d (+)ベクター(Novagen)を用いてE. coli BL21 (DE3)細胞において過剰発現させた。IPTG (l mM)を用いる誘導を15℃で5晩にわたって行なった。細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、Roche)およびDNase I (80ユニット) / ヌクレアーゼ(それぞれ80および60ユニット、Roche)を含むB-Per溶液(Bacterial Protein Extraction Reagent、Pierce、200mlの培養細胞に5ml)中に1時間、4℃で破砕した。あるいは、細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、Roche)および5% (v/v)グリセロールを含む25 mM HEPES (pH 8)の溶液中で超音波破砕した。
【０１９１】
細胞溶解物を2回遠心分離した(15 000 g、30分)。次いでHisタグをつけたタンパク質を、コバルトをのせたHi-Trapキレーティングカラム(Amersham) 1 mlを用いて親和性精製した。イミダゾールの直線勾配(0.25Mイミダゾールまで、続いて0.5Mイミダゾールおよび0.5M NaClのプラトー)を用いる溶出の間にいくつかのフラクションを回収した。タンパク質に富むフラクション(SDS-PAGEにより測定)を、10kDaカットオフのセントリプレップAmiconシステムを用いて濃縮した。最後に、得られたサンプルをSuperdex75 PG Hi-Load 26-60カラム(Amersham)での排除クロマトグラフィーにより精製した。
回収したフラクションをSDS-PAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mM HEPES (pH 7.5)および20% (v/v)グリセロールの溶液に対して透析した。
【０１９２】
インビトロ切断アッセイ
単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37℃で12.5mM HEPES (pH 8)、2.5% (v/v)グリセロールおよび10mM MgCl2の中で行なった。反応を0.1容量の0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、0.25 M EDTA、5% (w/v) SDSおよび0.5 mg/mlのプロテイナーゼKの添加および37℃で20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1％アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。
【０１９３】
ファージミド構築
I-Cre I/D75Nヘテロダイマーのファージディスプレイを、プロモーターpLacの調節下で、バイシストロン(bicistron)として2つの異なるORFを有するファージミドを用いることにより得た。最初の1つは、N-末端シグナル配列に融合された可溶性タンパク質を産生し、これが生成物をE. coliのペリプラズム空間に指向させる。遺伝子1-Cre I WTを制限酵素ApaLIおよびAscIを用いてこのORFにクローニングした。D75NドメインをNco IおよびEag I制限酵素を用いて第二のORFにクローニングして、6Hisタグ、C-Mycタグおよびアンバー停止コドンを介するファージコートタンパク質p3との融合体に導く。この最終のファージミドはpCes1CreTとよばれる。TG1またはXL1blueのような抑制株において、およびヘルパーファージ(例えばM13K07)による感染の後に、D75N-p3融合体はファージコートタンパク質に組み込まれ、同じ区画で生成される可溶性I-CreIモノマーは、ダイマー化するかまたはディスプレイされたD75Nドメインと相互作用するかのいずれかにより、I-CreI WT/D75Nヘテロダイマーをディスプレイする粒子を産生する。
【０１９４】
ファージ生成
100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含む2xTYの5 mLの培養液に、ファージミドpCes1CreTを含む細菌の一晩培養物の1/100希釈物を植菌し、37℃で攪拌した。OD600が0.5のとき、ファージヘルパーM13K07 (Pharmacia)を、20：1のファージ：細菌比で加えた。攪拌せずに37℃で30分経過後、培養物を4000 rpmで10分間遠心分離し、ペレットを100μg/mLのアンピシリンおよび25μg/mLのカナマイシンを含む2xTY 25 mlに再懸濁し、30℃で一晩撹拌した。培養物を遠心分離し、上清をそのままファージELISAに用いた。
【０１９５】
ファージELISA
マイクロタイタープレートを、PBS中の2μg/mLのビオチン化BSA 100μl/ウェルを用いて37℃で1時間コートした。0.1% Tween20 (PBST)を含むPBS中での数回の洗浄の後、ウェルをPBS中の10μg/mLのストレプトアビジン100μl/ウェルを用いてインキュベートし、RTで1時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄して、PBS中に250 pMの標的部位を有するビオチン化PCR断片とインキュベートした。RTで1時間のインキュベーションの後、プレートを、3%粉ミルクおよび25 mM CaCl2を含むPBS (PMC) 200μl/ウェルと飽和させた。PMCを捨て、プレートをPMC 80μlおよびファージ粒子を含む培養上清20μl/ウェルで満たした。RTで1時間のインキュベーションの後、プレートをPBSTで広範に洗浄し、PMC中に1/5000に希釈した抗25 M13-HRPコンジュゲート抗体(Pharmacia) 100μl/ウェルとインキュベートした。プレートをRTで1時間インキュベートし、洗浄し、TMB溶液(Sigma)とインキュベートした。反応を50μl/ウェルの1M H2SO4でブロックした。プレートを450 nmで読み取った。バックグラウンド(無関係な標的)の3倍より高いシグナルを陽性とみなすことができる。
【０１９６】
PCRベースの突然変異誘発
遺伝子I-CreI D75Nを含むプラスミドpET24-T45を、PCRの鋳型として用いるために、1 ng/μlで希釈した。所望のランダム化(randomization)をエンコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて、挿入断片当たり4×50μlのPCR反応においてPCR断片Lib1およびLib2を増幅した。PCR産物をプールし、EtOH沈殿させ、50μlの10 mM Tris中に再懸濁した。
【０１９７】
DNA消化
全ての酵素および対応するバッファーはNEBiolabsからであった。10μgまでのDNAの消化を、100 Uまでの第一の制限酵素を用いて、37℃で150〜500μlの最終反応容積で行った。2〜6時間後に、消化したDNAをフェノール抽出してEtOH沈殿させた。消化基質および産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、所望の産物をゲルから抽出して精製した(Nucleospin Extract、Macherey-Nagel)。PCR挿入断片については、消化産物をNucleospinカラムで直接精製した。次いで、第二の消化を同じ条件で行なった。この第二の消化反応の最後に、0.1容量の1OX CAPバッファーおよび0.5μlのCAPを消化したベクターに加え、サンプルをさらに30分間、37℃でインキュベートした(アルカリホスファターゼを、EDTAの添加後にサンプルを70℃で10分間インキュベートすることにより不活性化した)。最後に、消化して脱リン酸化したDNAをフェノール抽出し、EtOH沈殿させて10 mM Tris pH8 30μl中に再懸濁した。最終のDNA濃度を、電気泳動の後のアガロースゲルでのバンドの強度の比較により見積もった。
【０１９８】
ライゲーション
大規模ライゲーションを16℃で、200μl反応容積中で、消化したベクター1400 ngおよび5：1モル超過の消化したものならびに4000 UのT4 DNAリガーゼ(NEBiolabs)を用いて行なった。ライゲーションの後、反応サンプルを65℃で20分間インキュベートしてリガーゼを不活性化した。ベクターDNAは、最後にEtOH沈殿させ、25 ng/μlの10 mM Tris pH8中に再懸濁した。
【０１９９】
エレクトロポレーション
自家製のエレクトロコンポーネント細胞TG1 40μlを、2 mmのキュベット中にライゲーションしたDNA (1μl) 25 ngと混合した。氷上で1分経過後、細胞をパルス(2.5 Kv、25μF、200オーム)し、2xTY + 2% グルコース1 mlに直ちに再懸濁した。細胞を37℃で1時間、攪拌下におき、次いでアンピシリン(ファージミドベクター)またはカナマイシン(pETベクター)および2%グルコースを含む2xTYの大きいプレートにおいて、30℃で一晩インキュベートした。一定量を2xTY中に希釈し、2xTYアンピシリングルコースの小さいプレートにおいて、単離されたコロニーを得たが、このコロニーはライブラリの多様性の算出および制限分析によるいくつかのクローンの特徴づけを可能にする。
【０２００】
−ファージディスプレイを用いるI-Cre I変異型のライブラリからのHIV2由来DNA標的へのメガヌクレアーゼの結合の選択およびスクリーニング
このプロジェクトの目的は、HIV2のゲノムで見出された配列(GGAAGAAGCCTTAAGACATTTTGA)を切断可能なメガヌクレアーゼを得ることであった。ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iを骨格(scaffold)として用いて、1つのI-Cre IモノマーのDNA結合界面に位置する8残基のランダム化による108の変異型のライブラリを構築した(前の節を参照)。このライブラリを、HIV2に由来する標的(H1V6335)を有するビオチン化DNA断片を用いる数回の選択／増幅により結合物について濃縮した。続いて、選択された標的をファージELISAを用いて結合についてスクリーニングした。
【０２０１】
材料および方法
ファージミドフォーマット
pCeslベースのファージミド(pCLS346)を選択した。このプラスミドは、プロモーターpLacの調節下で、バイシストロンとして2つの異なるORFを有した。最初の1つは、N-末端シグナル配列に融合された可溶性タンパク質を産生し、これが生成物をE. coliのペリプラズム空間に指向させる。我々の場合、この第一の産物がI-CreIの野生型モノマーであった。第二のORFは、6Hisタグ、C-Mycタグおよびアンバー停止コドンを介してファージコートタンパク質p3と融合したI-CreIモノマーをエンコードした。TG1またはXL1blueのような抑制株において、およびヘルパーファージ(例えばM13K07)による感染の後に、このファージミドを有する細菌はファージ粒子を産生し、それらの約1〜10％はそれらの表面上で組換えタンパク質をディスプレイする。
【０２０２】
p3に融合され、DNA結合界面についてランダム化されたモノマーをファージコート中に組込み、可溶性I-CreIモノマーが、同じ区画内で、ダイマー化するかまたはディスプレイされたモノマーと相互作用して産生され、それによりI-CreIホモダイマー(またはp3に融合されたモノマーが変異した場合はヘテロダイマー)をディスプレイする粒子を産生した。
【０２０３】
標的産生
所望の配列をエンコードするが3'に余分のアデノシンを有する2つの相補的プライマーをアニールして、pGEM-t Easy (Promega)にライゲーションした。配列決定の後、正しいクローンを、ビオチン化200 pb断片をキットKOD (Novagen)ならびにプライマーSP6 (TTTAGGTGACACTATAGAATAC)およびbiotT7 (biot-TAATACGACTCACTATAGG)を用いてPCR増幅するための鋳型として選択した。PCR産物の濃度をゲル上で見積もり、断片をそのままELISAまたは選択手順において用いた。
【０２０４】
ファージミドライブラリのレスキュー
ライブラリの標本の一定量(ライブラリのサイズより少なくとも10倍より多い細菌)を用いて、100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含む2xTY (2TYAG) 50 mlに植菌し、培養物を37℃で攪拌した。0.5のOD600で、この培養物5 mlにヘルパーファージK07を20：1のファージ：細菌の比で感染させ、攪拌せずに37℃で30分間インキュベートした。室温(RT)にて4000 rpmで10分間遠心分離した後、ペレットを100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む2xTY (2TYAK) 25 mlに再懸濁して、30℃で一晩攪拌した。培養物を4℃にて4000 rpmで20分間遠心分離し、ファージ粒子を、0.2容量の20% PEG6000 /2.5M NaClを氷上で1時間添加することにより沈殿させた。
【０２０５】
4℃にて4000 rpmで20分間遠心分離した後、ファージのペレットをPBS 1 mlに再懸濁し、10 00 rpmで5分間遠心分離した。上清に0.2容量の20% PEG6000 /2.5M NaClを加え、混合物を10 000 rpmで遠心分離してファージ粒子をペレット化した。粒子を最後にPBS 250μl中に再懸濁した。
【０２０６】
選択手順
ファージ粒子を、3%乾燥ミルクおよび25 mM CaClを含むPBS (PMC) 1 ml中に希釈し、RTで1時間インキュベートした。100 pIストレプトアビジンビーズ(Dynal、第1回目について200μl)をPMC中に3回洗浄し、同じバッファー中に1時間ブロックした。ビオチン化された標的を、示された濃度でファージに添加し、混合物をRTで1時間攪拌した。ビーズを混合物に添加し、RTで15分間インキュベートした。ビーズをバイアルの壁上で磁石を用いて回収し、0.1％Tweenを含むPMC中で10回洗浄した。PBS中での最後の洗浄の後、ビーズを100 mMのトリエタノールアミン pH 12 0.5 ml中に再懸濁し、ちょうど10分間インキュベートした。上清を回収し、1 M Tris pH8 0.5 mlで直ちに中和した。この溶出物の一定量を、タイトレーションのために2xTY 4 mlで段階的に希釈した。指数関数的に増殖するTG1細胞5 mlを加え、混合物を攪拌せずに37℃で30分間インキュベーションした。細胞を2TYAGの大きいプレート上におき、30℃で一晩インキュベーションした。コロニーを2TYAG中に再懸濁し、OD600を100に調整し、15 %グリセロールの添加後に−80℃で保存した。
【０２０７】
ファージELISAによるスクリーニング
選択アウトプットからの単離されたコロニーを楊枝でついて96ウェルプレート中の2TYAG 100μlに入れ、37℃で一晩攪拌した。次の日、2TYAG 100μlを含む新しいプレートをトランスファー装置を用いて分離した。滅菌60%グリセロール50μlを一晩インキュベートしたプレートに加え、このマスタープレートを−80℃で保存した。新しいプレートを37℃で2.5時間攪拌し、2×109 pfuのヘルパーファージM13K07を含む2TYAGの添加によりレスキューし、30℃で30分間インキュベーションし、1700 rpmで15分間スピンした。細胞のペレットを2TYAK 150μl中に再懸濁し、30℃で一晩攪拌した。遠心分離後、上清20μlを前の節で記載したようにして用いた。
【０２０８】
−結果
選択
I-Cre I変異型をディスプレイするファージ粒子を、ファージミドライブラリを有する細菌をヘルパーファージM13KO7で感染させることにより産生した。ファージ粒子をPEG沈殿により精製し、HIV6335標的を有するビオチン化PCR断片とインキュベーションした。室温で1時間のインキュベーションの後、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを溶液に添加して、ビオチン化DNAおよび結合したファージを回収した。ビーズを充分に洗浄し、結合したファージをpHショックにより溶出させた。細菌を溶出させたファージで感染させ、アンピシリンおよび2％グルコースを含む2xTYの大きいプレート上においた。溶出させたファージの一定量の段階希釈を用いて細菌に感染させ、ファージ粒子の数を算出して単離されたコロニーを得た。
【０２０９】
1日後、細菌を大きいプレートからかきとり、グリセロールストックとして保存した。一定量(多様性の標本)を用いて、選択の第2回目のためのファージ粒子の新しいバッチを作製した。
選択の強度(stringency)は、各回の後に増加させた。第一の選択を、ビオチン化標的10 nMを用いて行なった。第二を400 pMを用いて行ない、洗浄工程を延長した。第三回目は250 pMを用い、洗浄をより延長した。
【０２１０】
表1に示すように、HIV2標的に対する第1回目および第2回目の選択は、バックグラウンドの値(105〜106 pfu/ml)に特徴的なアウトプット力価 (output titer)に導く。しかしながら、第3回目では有意な濃縮が測定された。
【０２１１】
【表１】
2006518372.tif 000002
【０２１２】
ファージELISAによるスクリーニング
各アウトプットから無作為に採取した80のクローン（および選択されなかったクローン）を用いて、モノクローナルの様式でI-CreI変異型をディスプレイするファージ粒子を生成した。ファージ粒子を含む上清を、ストレプトアビジンを介してプラスチック上に固定化されたビオチン化PCR断片上でインキュベートした。結合したファージを、HRP標識抗p8 (主要なコートタンパク質)モノクローナル抗体(Pharmacia)を用いて染色した。表2に示すように、選択されなかったクローンの中からまたは選択の第1回目のアウトプットから結合物は検出されなかった。しかしながら、第2回目の後に採取されたクローンの60％は、H6335に対して陽性であるが、無関係な標的(P1234、ホーミングエンドヌクレアーゼPI-Scelの標的)に対しては陰性である。この結果は、アウトプット力価とよく一致している。実際に、この選択は温和な濃縮をもたらすだけであり、このことはクローンの多数がまだバックグラウンドから生じることを示唆する。予期されたように、選択の第3回目は強い結合物の99%を導き、このことはこの第3の選択の後のアウトプットファージが多数であることを説明する。
【０２１３】
【表２】
2006518372.tif 000003
【０２１４】
ファージディスプレイを用いて、新規なメガヌクレアーゼをI-Cre I変異型の大きい(large)ライブラリから選択する。ビオチン化DNA標的での選択は、DNA標的に結合できる分子の濃縮に特徴的なアウトプット力価の増加を導く。この濃縮は、ファージELISAにより確認された。これらの結果は、選択およびスクリーニング法の効率を証明する。
【０２１５】
新規なメガヌクレアーゼを同定するための酵母での選択／スクリーニング実験
材料および方法
細菌株および酵母株
全てのサブクローニングおよびプラスミド調製は、Stratageneにより提供されるXLI-blue ：E.coliで標準の手順に従って行う。S. cerevisiaeでの実験は、次の株を用いて行う：
- FYC2-6A：アルファ, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ 200
- FYBL2-7B：a, ura3Δ 851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202
- YASP3 (FYC2-6A由来)：アルファ, ura3::SSA-ura3-HIV2-KanR, ade2::SSA-ade2-HIV2-TRP1, trp1Δ63, leu2Δ, his3Δ 200
【０２１６】
プラスミド
- pCLS0279：ADH1プロモーター、TRP1選択マーカーおよびARS-CEN複製起点、β-ガラクトシダーゼSSA標的、HIV2 6335切断部位。
- pCLS0569：カナマイシン耐性カセット、HIV2 6335、URA3遺伝子の内部断片。
- pCLS0570：カナマイシン耐性カセット、HIV2 6335、LYS2遺伝子の内部断片。
- pCLS0576：TRP1選択マーカー、HIV2 6335、ADE2遺伝子の内部断片。
- pCLS0047：ガラクトース誘導プロモーター、LEU2選択マーカーおよび2ミクロン複製起点。
【０２１７】
結果
特定の標的に対する検出可能な活性を有する突然変異誘発したI-CreIタンパク質変異型のスクリーニングを許容する、酵母でのインビボアッセイを行った。
変異I-CreIメガヌクレアーゼのライブラリを、まずファージディスプレイ法により選択し、HIV2 6335標的に結合し得る対象の変異型について濃縮されたサブライブラリを得る。この濃縮されたサブライブラリからの挿入断片を、酵母でのさらなる選択のためにガラクトース誘導プロモーターの調節の下のpCLS0047にサブクローニングする。しかしながら、我々は適切な酵母発現ベクターにおいて直接ライブラリを製造し、ファージディスプレイの工程を除くことができる。
【０２１８】
染色体に組み込まれた2つのレポーター系を含む特定の酵母株(YASP3)を製造した。これらの2つのレポーター系は、単鎖アニーリング(SSA)による組換えに基づく。SSAは、HIV2 6335部位の特異的切断により誘導される。
すなわち、URA3 SSA標的およびADE2 SSA標的を導入した。URA3 SSA標的は、4.3 kbにより分けられた600塩基対の2つの直列反復を有する改変されたura3遺伝子(カナマイシン耐性カセットおよびHIV2 6335切断部位を含む)であった。この株は、ウラシルを欠く最少培地では増殖できないが、G418耐性であった。この標的が適切に切断されて組み換えられたとき、酵母はウラシルを含まない培地で増殖でき、G418感受性であった。
【０２１９】
ADE2 SSA標的は、3.6kbにより分けられた1.1kbの2つの直列反復を有する改変されたade2遺伝子(トリプトファン選択マーカーおよびHIV2 6335切断部位を含む)であった。この変異されたade2遺伝子により、酵母株はアデニンを欠く最少培地上で増殖できないが、アデニン含量が低い培地上で赤色を有した。トリプトファン選択マーカーにより、この株はトリプトファンを含まない最少培地上で増殖できた。この標的が適切に切断されて組み換えられたとき、酵母は白色で、アデニンを含まない培地上で増殖できかつトリプトファンを欠く最少培地上で増殖できなかった。
【０２２０】
基本的に、受容酵母株は赤色(低アデニン培地上で)で、G418耐性で、トリプトファン原栄養性でかつウラシルおよびアデニンについて栄養要求性であった。特定のメガヌクレアーゼがこの株で発現され、その標的部位を切断すると、得られる酵母クローンは白色で、G418感受性で、トリプトファンについて原栄養性でかつウラシルおよびアデニンについて栄養要求性である。
【０２２１】
YASP3株は、各標的単独の自発的組換えおよび両方の標的を一緒にした自発的組換えのレベルを測定することにより、確認した。URA3 SSA 10標的は、ウラシル原栄養性、約6 10-4の割合でG418感受性として自発的に組み換えた。ADE2 SSA標的は、約2.7 10-3の割合でアデニン原栄養性として自発的に組み換えた。両方のマーカーの組み換えは、約10-6の割合で自発的に起こった(ウラシル/アデニン原栄養性となる)。
【０２２２】
ウラシルエルアデニン(uracileladenine)原栄養体のバックグラウンドレベルを示さなかった形質転換体1.5x10を用いるパイロット実験は、約100万の独立したクローンを産生するであろうライブラリを用いた形質転換実験の後に擬陽性クローンの数が10未満であるはずであることを意味する。
【０２２３】
ライブラリをYASP3を形質転換するのに用いる。通常、DNA 1 pg当たり106の独立した形質転換体を与える伝統的な化学／熱ショックプロトコルを用いた(Gietz, R.D.およびWoods, R.A., 2002)。酢酸リチウム／一本鎖キャリアDNA／ポリエチレングリコール法(Methods Enzymol, 350, 87〜96)による酵母の形質転換。
【０２２４】
該ライブラリを用いる菌株の形質転換は、106より多い独立した酵母形質転換体を与え、これらの中からいくつかのクローンがウラシル、ロイシンを含まず、炭素源としてのガラクトースおよび少量のアデニンを含む選択培地上で増殖可能である。これらのクローンのうち、対象のものは白く、これらがHIV2 6335部位に特異的なメガヌクレアーゼの発現を許容するLEU2ベクターを含みかつ酵素がURA3レポーターおよびADE2レポーターの両方を切断できることを示す。
【０２２５】
陽性のクローンを単離し、プラスミドのSSA β-ガラクトシダーゼ標的(pCLSO279)の特異的組換えを誘導するそれらの能力についてスクリーニングした。このプラスミド性レポーターは、1.3kbにより分けられた825塩基対の2つの直列反復を有する改変されたLacZ遺伝子(URA3選択マーカーおよびHIV2 6335切断部位を含む)であった。ベクター(トリプトファンを含まない培地上で選択され得る)を用いて酵母株(FYBL2-7B)を形質転換し、クローンを、ウラシルを欠く最少培地35で維持して、未組換えのLacZ標的を維持する。
【０２２６】
選択実験から得られた酵母クローンを、SSA β-ガラクトシダーゼ標的を含む酵母株とかけ合わせる。2倍体を選択し、誘導されたβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイする。いくつかのクローンは、この工程で擬陽性としてふるまうことが予想される。これらはURA3およびADE2 SSA標的の自発的組換えのバックグラウンドのレベルに対応する。全ての残りのクローン(SSA-LacZ標的の組換えを誘発可能なウラシルおよびアデニン栄養要求体)は、インビボでHIV2 6335標的を切断するメガヌクレアーゼを発現する真の陽性である。上記の実験に基づく他の実験も、このような新規な酵素の活性をより精密に測定するのに用いることができる。
【０２２７】
実施例3：抗ウイルス治療のためのメガヌクレアーゼの使用
−実験手順
細胞
American Type Culture Collection (ATCC)からのCOS-7細胞株を、10％ウシ胎児血清を含むDMEMで培養した。ATCCからのPC-12細胞は、10％熱失活ウマ血清および5％熱失活ウシ胎児血清を補ったRPMI1640で増殖した。PC-12細胞を、以前に記載された(Suら, 1999, Journal of Virology, 4171〜4180)ようにして分化させた。簡単に、細胞を6ウェルプレートにウェル当たり5 104細胞で播種した。次の日、細胞を100 ng/ml の2,5S NGF (Invitrogen)を含むPC-12培地でインキュベートした。培地は3日毎に変えた。インキュベーションの7日後、未分化細胞を2μMのフルオロデオキシウリジン(FdUrd)の添加により除去した。
【０２２８】
組換えHSV-1の構築
HSV-1はATCCから購入した。ウイルスを低MOI (0.01PFU/細胞)でCOS-7細胞で増殖させた。組換えウイルス(rHSV-1)を、以前に記載された(Lachmann, R.H., Efstathiou, S., 1997, Journal of Virology, 3197〜3207)ようにして得た。4.6 KbのpstI-bamHIウイルスゲノムDNA断片をpUC 19にクローニングした。データベースからのHSV-1配列(ID：NC 001806)に基づくと、この領域はヌクレオチド118867〜123460を表す。Lac遺伝子の発現を駆動するCMVプロモーターからなるカセットを168 bpのHpaI欠失に導入した。この領域は、HSV-1の主要LAT遺伝子座の中に位置する。I-Sce I切断部位を、最終的に、CMVプロモーターのすぐ後にクローニングした。この構築物を組換えウイルスを作製するのに用いた。プラスミドはXmnI消化により直線化し、このプラスミドDNA 2μgを、COS-7感染細胞からCaCl2法により調製したHSV-1ゲノムDNA 15μgと共トランスフェクションさせた。3または4日後、感染した細胞を回収して超音波破砕した。溶解した細胞の一定量を用いてCOS単層を感染させた。ウイルス組換え体を、COS単層に300μg/mlのX-Gal (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を含む培地中の1％アガロースをオーバーレイすることにより選択した。青いクローンを採取し、3回のプラーク精製にさらに付した。I-Sce I部位の存在をPCRおよびインビトロI Sce-I酵素消化により確認した。
【０２２９】
ウイルス阻害
6ウェルプレートにウェル当たり2.104細胞を播種した。次の日、COS-7細胞をISce-Iを発現するかまたはISce-I ORFを逆方向に含むプラスミド0.5μgを用いて製造業者のプロトコルに従うEFFECTENE法によりトランスフェクションした。この方法を用いて、我々の実験室では、通常、60〜70％の効率を達成した。48時間後、亜集密な(subconfluent)トランスフェクションされた細胞をrHSV-1を用いて感染させた。感染には、rHSV-1を1％ウシ胎児血清を含むPBSで希釈し、5% CO2の湿性インキュベーター中に37℃で20〜40分間細胞に吸着させた。それぞれウイルス阻害実験または細胞生存実験のために、6ウェルのプレートにウェル当たり30〜300 PFUで感染させた。細胞を第1、2および3日に回収し、β-ガラクトシダーゼ活性を分析してDNAを抽出した。
【０２３０】
β-ガラクトシダーゼ活性
細胞単層を、1mM MgCl2を含む100mM PBS中の0.5%グルタルアルデヒド中に4℃で10分間固定した。洗剤溶液(100mM PBS、1mM MgCl2、0,02% Nonidet p-40)で1回洗浄後、細胞を37℃でX-Gal染色溶液(10 mM PBS、1mM MgCl2、150 mM NaCl、33 mM K4Fe(CN)6.3H2O、33 mM K3Fe(CN)6、0.1% X-Gal)中で発色するまでインキュベートした。β-ガラクトシダーゼ活性を細胞抽出液についても基質としてo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)を用いて測定した。細胞単層をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を10 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100、プロテアーゼ阻害剤を用いて溶解した。氷上で30分間のインキュベーションの後、細胞溶解物を遠心分離してβ-ガラクトシダーゼをアッセイした。典型的には、上清30μlを800μg /ml ONPG含有反応バッファー(10 mM PBS；pH 7.5、1 mM MgCl2、0.3% β-メルカプトエタノール) 270μlと合わせた。反応を37℃で行い、1M NaCO3 0.5 mlで停止した。吸光度を415 nmで測定した。β-ガラクトシダーゼ活性は、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出する。
【０２３１】
半定量(Semi-quantitative) PCR
rHSV-1のウイルス複製を測定するために、オリゴヌクレオチドを設計してLac遺伝子から217 bpの断片を増幅した。このアッセイにおいて用いた標準DNAは、この断片をBluescriptプラスミドにクローニングし、5'オリゴヌクレオチドの下流に50 bpの断片を挿入することにより作製した。標準物のPCRにより267 bpのアンプリコンを産生した。一連のPCR (示さず)を行なって標準およびDNAサンプルの量ならびにサイクル数を固定して増幅の直線的な応答を達成した。基本的な半定量的PCRを、全容量30μl中に、各プライマー20 pmolおよびDNA 180 pgとともにREADYMIX(商標) TAQ (Sigma)を用いて行なった。チューブを94℃で4分間加熱し、22サイクル：94℃で1分、62℃で50秒、72℃で2分および72℃で7分に付した。
【０２３２】
ウイルス力価
ある一連の実験において、培養液を第1、2、3および4日の毎日回収し、新しい培地を加えた。別の実験において、実験の間に培地を交換せず、一定量を毎日回収した。HSV-1の子孫の放出を監視するために、培地の一定量を標準プラークアッセイによりCOS-7細胞に対して力価測定した。
【０２３３】
−結果
ウイルス複製に対するI-Sce Iの影響を、I-Sce I制限部位を有する組換え単純ヘルペスウイルス(rHSV-1)を用いて調べた。簡単に、rHSV-1を、Lac遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むカセットを用いて構築した。I-Sce I部位をCMVプロモーターとLac遺伝子との接合部に挿入した。発現カセットを、主要LAT遺伝子座における相同的組換えによりクローニングしたが、該遺伝子座はCOS-7細胞単層における溶菌感染の間にβ-ガラクトシダーゼ (β-gal)の発現を許容した。ウイルス感染前のI-Sce I発現ベクターのストリンキング(strinkingly)トランスフェクションは、X-Galの呈色により示されるようにCOS細胞でのHSV-1プラーク形成を実質的に完全に阻害した(図5)。これに対して、いずれの機能的転写も許容しない、I-Sce Iオープンリーディングフレームを逆方向に含む発現ベクターを用いたコントロールトランスフェクションは、ウイルス複製に影響しなかった。さらに、感染の48時間後、細胞をI-Sce I発現について調べた。I-Sce I発現ベクターでトランスフェクションされた細胞単層において形成された全ての溶菌プラークは、I-Sce Iを発現しなかった細胞を表した (一過性のトランスフェクションは約70%の効率である)。しかしながら、溶菌プラークの周囲のI-Sce Iを発現する細胞は、ウイルスの増殖を阻害した。I-Sce Iの影響は、細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することにより確認された。ウェル当たり30 Pfuを用いるI-Sce Iを一過的に発現するCOS-7細胞単層の感染の後、細胞単層を感染後第1、2および3日に回収してβ-galをアッセイした。図6Aは、rHSV-1複製の阻害を反映して、β-ガラクトシダーゼ活性の大きな低下を示す。rHSV-1感染の時間経過の間にわたるI-Sce Iの防御効果を、次に評価した。感染の3日後、I-Sce I発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は細胞変性効果の徴候を示さなかったが、コントロールの培養物は、図6Bに示すように完全に溶解した。I-Sce IによるウイルスDNA複製の阻害の程度を定量するために、半定量的PCRを設定した。ゲノムDNAを、感染後第1、2および3日に細胞から抽出した。PCRを、Lac遺伝子で217 bpのアンプリコンを発生するプライマーaおよびbを用いて行なった(図7A)。内部標準をPCRの前にサンプルに添加してDNAを定量した。Lac遺伝子は、感染の3日後のI-Sce Iを発現する細胞において、実質的に検出できなかった(図7A)。これに対して、I-Sce I発現ベクターを受容していない細胞は、高いレベルのウイルスDNAを示した。この結果は、ウイルスの内因性遺伝子内のプライマーを用いるPCRにより確認された(図7B)。チミジンキナーゼ(TK)遺伝子の増幅は、I-Sce Iがウイルスの複製を阻害したことを示した。最後に、活性I-Sce Iまたは逆方向にI-Sce I ORFを発現するCOS-7細胞にrHSV-1を感染させ、異なる時間点で培地中に放出されたウイルスの濃度を、プラークアッセイにより測定した(図8)。ウイルスをI-Sce Iが産生された第1日に大ざっぱな配列(rough array)で定量した。ウイルス産生は、I-Sce Iを発現しなかった細胞と比較したときに、感染の2日後でさえかなり減少しており、このことはI-Sce Iがウイルス複製をかなり効率的に阻害したことを示した。この影響は、より少ない程度ではあるが、第3日にも確認された。おそらくウイルス複製の間に高い割合で起こる突然変異が、I-Sce I活性から逃れることができる変異HSV-1の出現を許容した。
【０２３４】
ひとまとめにして考えると、これらの結果はI-Sce I、より一般的にはメガヌクレアーゼをウイルス感染を阻害するのに用いることができることを証明する。特定のウイルスの配列を切断するように設計されたカスタムメイドメガヌクレアーゼまたはカスタムメイドメガヌクレアーゼの組み合わせの使用は、抗ウイルス療法の強力な新規のストラテジとなり得る。
【０２３５】
実施例4：I-CreIホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、変更された結合特性を有するメガヌクレアーゼ
この実験の目的は、I-CreIの天然の標的部位の近くの標的部位に結合する新規なメガヌクレアーゼを得ることであった。野生型で天然のI-CreI標的(C1234と呼ぶ)、実施例2で記載したHIV2標的(ここではH1234と呼ぶ)およびさらなる4つの標的を含む一連の6つの標的を用いた(図9)。これらのさらなる4つの標的は、12 bpの半分のI-CreIまたはHIV2標的部位の逆方向反復に対応する24 bpのパリンドロームである。C1221およびC4334は、それぞれC1234標的の第一の半分および第二の半分の逆方向反復である。H1221およびH4334は、それぞれH1234標的の第一の半分および第二の半分の逆方向反復である。
【０２３６】
実施例2と比べて、ここで用いる方法はいずれの選択工程も含まないが、Lib2ライブラリの広範囲なスクリーニングに基づいた(実施例2を参照)。DNA標的との塩基特異的相互作用が可能な3つの残基(Q44、R68およびR70)を選択した。3つの対応するコドンをユニーク縮重VVKコドンで置き換えることにより、コンビナトリアルライブラリを得た。結局、タンパク質ライブラリ中の変異体は、3つの残基の位置でVVKコドン(ADEGHKNPQRST)によりエンコードされるいずれの12アミノ酸の独立した組み合わせに対応した。結果として、タンパク質ライブラリの最大限の(理論的に)多様性は123または1728であった。
【０２３７】
材料および方法
I-CreI変異型のファージディスプレイされたライブラリの構築
まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽される残基D75を、ライブラリ中のこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみのようなものを除くために、N (Asn)に変異させた。突然変異型D75Nのホモダイマー (pET発現ベクターを用いてそれを過剰発現させたE. coli細胞から精製)は、I-CreIホーミング部位を切断することが示された。次いで、ファージコートタンパク質p3に融合したD75N突然変異型(図2C：「鋳型」)をエンコードするファージミドベクターを作製し、ファージディスプレイされたD75Nモノマーは、I-CreI天然DNA標的に結合することを示した(図9のC1234)。
【０２３８】
次いで、所望の変異の組み合わせを有するDNA断片を、縮合プライマー(図2D：UlibIIfor、UlibIIrev)と、DNA鋳型としてD75N遺伝子とを用いてPCR (50μl中に数回の反応)により得た。Lib2を、特異的制限酵素で消化した対応するPCR産物を実施例2に記載のようにしてファージミドベクター内のD75N変異遺伝子にライゲーションすることにより構築した。
【０２３９】
6つの異なる標的に結合するメガヌクレアーゼのスクリーニング
スクリーニングは、実施例2に記載のようにしてファージELISAにより行なった。
−結果
4560クローン(理論上の変異体ライブラリ多様性の2.5倍を越える)を個別に採取し、6つの異なる標的を用いてファージELISAによりスクリーニングした。28の陽性(6つの標的のうち1つに結合するクローン)を同定した。確認のために、これらの28のクローンを6つの異なる標的を用いて8回並行してファージELISAにより再アッセイした。これにより、20のクローンが真の陽性であると確認された。最後に、28全てのクローンを配列決定した。
【０２４０】
【表３】
2006518372.tif 000004
【０２４１】
4つの異なるパターン(ELISAの結果)を確認することができた。図10は、それぞれについて1つの代表的な例を取り上げる。第一のクラス(クラスI)は、C1234、C1221、C4334およびH4334の強い結合に対応する。野生型タンパク質(QRR)がこのクラスにおいて回収され、このことはクラスIのプロフィールが本来の骨格の規則的な結合プロフィールであることを示す。2つの変異型もこのような結合をディスプレイすることが示された(QRKおよび完全に同定されていない別の変異体)。
【０２４２】
第二のクラスからの変異型は、H4334を除いて全ての標的についてそれらの親和性を低下させた。なぜなら、C1234、C1221およびC4334との結合が観察されなかったからである。8つの異なるタンパク質とその配列が決定できなかった1つのタンパク質がこのクラスに属することが見出された。クラスIIの配列変異型のうち、5つが野生型配列からのQ44アミノ酸および位置68または70の2つのアルギニンのうち1つを保存する。しかしながら、1つの変異体(DSH)において、位置44、68および70からのアミノ酸のいずれも保存されていなかった。クラスIII (4つの異なるタンパク質)は、C1221およびH4334標的について明確な結合を保持しているので、より複雑なパターンを有する。最後に、1つのタンパク質(クラスIV)は、標的C1221に対してわずかな結合を保持し、いずれの他の標的も全く結合しない。
【０２４３】
クラスIVから結論を導き出すのは困難である。なぜなら、C1221との残存結合は非常に低く、ユニークなクラスIV変異体の配列決定は失敗したからである。しかしながら、クラスIIおよびIIIとクラスIの野生型プロフィールとの比較は、結合特異性が変更されたことを明確に示す。
【０２４４】
結論は、Lib2のような小さいライブラリからであってさえも (複雑度1.7 103)、変更された結合プロフィールを有する変異型は、図10に示すように単離することができることである。よって、より大きい変異体ライブラリから出発するスクリーニングに基づくストラテジは、例えば当初のタンパク質骨格が結合しなかった標的に対する結合のような、より劇的な変更の同定を許容するはずである。さらに、このアプローチは、各プロフィールについて多くの異なるタンパク質の同定を導く。この種類の広範囲の研究は、DNA/メガヌクレアーゼ相互作用のよりよい理解の基礎ももたらすはずである。
【０２４５】
実施例5 ：I-Sce I発現プラスミドを用いる染色体外レポーターのイントト(in toto)メガヌクレアーゼ誘導組換え
A-レポーター系の最適化
−実験手順
ベクター構築
標的ベクターは、ヒトEF1-アルファ遺伝子のプロモーターにより駆動されるLagoZ発現ベクターに基づく。このプロモーターは、以前に、インビボでの発現スペクトルが広いことが示されている(Kim, D.W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S, 1990, Gene, 91, 217〜223)。プロモーター領域は、スプライス供与体および受容体部位をh-EF1-アルファ遺伝子の5'非翻訳領域に含む。LagoZは、トランスジェニックマウスでサイレントになる遺伝子を破壊するように設計された、LacZ 遺伝子を欠くCpG島(island)である(Henry I, Forlani S, Vaillant S, Muschler J, Choulika A, Nicolas JF, 1999, C R Acad Sci III. 322, 1061〜70)。異なる長さの相同性を有する標的ベクターを構築するために、LagoZ遺伝子の3'断片(約2000 bp)をまず欠失させ、I-Sce I切断部位により置換した。異なる長さの3'断片を親のプラスミドの消化により作製した。これらの断片は、LagoZ遺伝子の5'断片との相同性を種々の量で有した。最後にこれらのDNA断片をI-SceI切断部位に近接して(adjacent to)それぞれクローニングして、それぞれ0、70、220、570および1200 bpの相同性を有する種々の標的ベクターを創った。
【０２４６】
細胞培養
American Type Culture Collection (ATCC)からのCOS-7およびCHO-K1細胞株をそれぞれ10% ウシ胎児血清を加えたDMEMまたはHam's F12K培地で培養した。I-Sce I誘導単鎖アニーリング(SSA)アッセイのために、細胞をトランスフェクションの1日前に12ウェルプレートにウェル当たり15.103細胞で播種した。一過性のトランスフェクションを、次の日に、500 ngのDNAを用いて、EFFECTENEトランスフェクションキット(Qiagen)を用いて行なった。等モル量の標的プラスミドとI-SceI発現ベクターとを用いた。次の日に、培地を置換して細胞をさらに72時間インキュベートした。
【０２４７】
β-ガラクトシダーゼ活性
細胞単層を、1mM MgCl2を含む100mM PBS中の0.5%グルタルアルデヒド中で4℃で10分間固定した。洗浄溶液(100mM PBS、1mM MgCl2、0.02% Nonidet p-40)を用いて1回洗浄した後、細胞を37℃でX-Gal染色溶液(10 mM PBS、1 mM MgCl2、150 mM NaCl、33 mM K4Fe(CN)6.3H2O、33 mM K3Fe(CN)6、0.1% X-Gal)中に発色するまでインキュベートした。β-ガラクトシダーゼ活性を細胞抽出物中でもo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)を基質として用いて測定した。細胞単層をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を10 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100、プロテアーゼ阻害剤を用いて溶解した。氷上で30分間インキュベーションした後、細胞溶解物を遠心分離してβ-ガラクトシダーゼを測定した。典型的には、上清30μlを、800μg /ml ONPGを含む反応バッファー(10 mM PBS、pH 7.5、1 mM MgCl2、0.3% β-メルカプトエタノール) 270μlと合わせた。反応を37℃で行い、1M NaCO3 0.5 mlで停止した。吸光度を415 nmで測定した。β-ガラクトシダーゼ活性を、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出した。
【０２４８】
−結果
DNA二本鎖破壊(DSB)が2つの反復配列の間に導入されるとき、これは相同的組換えを誘導して全ての介在配列とともに反復の欠失をもたらす。組換え経路は、しばしば、単鎖アニーリング(SSA)経路とよばれる。レポーター系は、メガヌクレアーゼ誘導SSAをイントト動物モデルにおいてモニターするように設計された。レポーター系を最適化するために、メガヌクレアーゼ誘導SSAの効率と反復の長さとの間の相関関係をまず調べた。種々のサイズの重複を含むLagoZ遺伝子を有する種々の標的ベクターを構築した(図11)。重複の存在およびI-SceI切断部位の存在が、遺伝子を不活性化する。SSAによるLagoZ遺伝子の修復は、1つの反復の損失および切断部位の損失をもたらしかつ機能的LagoZ遺伝子の回復をもたらす。LagoZは、比色分析により検出できるβ-ガラクトシダーゼ酵素をコードする。等モル量の標的ベクターとI-SceI発現ベクターまたはメガヌクレアーゼを発現しない発現ベクターを用いる一過性トランスフェクションを、CHOまたはCOS-7細胞で行なった。種々の構築物で得られた結果を図12に示す。I-SceI誘導DSBは、明らかにSSA修復機構を刺激する。さらに、70 bpの相同性は、誘導されたSSAの最大限に近い効率を達成するのに充分であったが、自発的組換えのレベル(I-SceI誘導DSBなし)は最小であった。220 bpの重複を用いると最大限の効率が達成されたが、より長い重複を用いてもSSA効率におけるさらなる向上は観察されなかった。同様の結果がCOS-7細胞で得られた(データは示さず)。70および220 bpの相同性は、活性  対  バックグラウンドの最良の比を与えた。β-ガラクトシダーゼを細胞溶解物中でアッセイしかつ1つの単一細胞が標的プラスミドのいくつかのコピーを有し得るので、この方法により絶対的なSSA効率を評価することは不可能である。よって、細胞単層の直接の着色を、トランスフェクションの72時間後に行なった(図13)。メガヌクレアーゼの不在下では、青い細胞は実質的に検出されなかった(図13A)。これに比べて、I-SceIが標的ベクターを用いて共トランスフェクションされるときに多数のβ-ガラクトシダーゼ-陽性細胞が存在し、このことはメガヌクレアーゼ誘導DSBによる相同的組換えの刺激を証明する。I-SceI誘導SSAの効率は、青い細胞(組換えが起こった細胞)を計数することおよびそれをトランスフェクションされた細胞(効率的にDNAを受容した細胞)の数と比較することにより算出した。図13Bは、I-SceIが70または220 bpの重複を有する標的ベクターとともに存在する場合に、細胞の50〜60%が相同的組換えをおこすが、自発的組換えは事象の0.1％未満を表すことを示す。つまり、導入遺伝子とともに70 bpおよび220 bpの相同性を有する構築物を動物での研究に選択した。
【０２４９】
4B. イントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導組換え
−実験手順
インビボでの流体力学ベースのトランスフェクション
マウス肝臓細胞の形質導入を、流体力学的尾部静脈注射により以前に記載されたようにして行った(Zhang, G., Budker, V., Wolff, A., 1999, Human Gene Therapy, 10, 1735〜1737; Liu, F.,Song, Y.K., Liu, D., 1999, Gene Therapy, 6, 1258〜1266)。この方法は、動物における効率的な形質導入および外因性遺伝子の発現を、尾部静脈注射によるプラスミドDNAの投与により許容する。簡単に、DNAを1.5〜2 mlのPBSに混合し、これは動物の体重の10%である。続いて、尾部静脈注射を26-ゲージ針を用い、5〜10秒にわたって、滅菌の材料および作業状況を用いて行う。このようなプロトコルを用いて、ほぼ肝臓細胞のみに形質導入し、それによりLagoZ遺伝子の修正に導くI-SceI-媒介SSA事象を肝臓において研究した。用いたI-SceI発現ベクターはpCLS 197であり、これはpUC主軸内のCMVプロモーターの制御下でのI-SceIコーディング配列(米国特許第5,474,896号)に相当しかつ5737bpの長さである。
【０２５０】
15〜20 gの体重のOF1マウスをCharles River Laboratories, Franceから得た。等量の標的ベクターとI-SceI発現ベクターまたはコントロールベクターのいずれかを含む合計20μgのDNAを、マウスの尾部静脈に注射した。標的ベクターは、相同性の70 bpを含む直列反復配列で挟まれるI-SceI切断部位により分断されたLagoZ遺伝子を含む。コントロールマウスは、標的ベクターとI-SceIを発現しないプラスミドとの混合物を注射された。
【０２５１】
β-ガラクトシダーゼ活性
注射の3日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、マウスの肝臓のX-Gal染色を行なった。肝臓を動物から冷 1×PBS中に解剖し、組織にX-Galがより接近することを許容するために、肝葉(lobes)を約1／4 cmの破片に切断した。次いで、肝臓の破片を、氷上に保持した12ウェル細胞培養プレート内の新鮮な冷PBS 1×中に入れ、4%パラホルムアルデヒド中に1時間、攪拌下に4℃で固定した。サンプルを3回、室温で30分間、洗浄バッファー(100mM リン酸ナトリウム pH=7.3、2mM MgCl2、0.01容量% デオキシコレートナトリウム 0.02容量% NP-40)で洗浄した。イントトX-Gal染色を一晩、37℃で染色溶液(洗浄バッファー中に5mM フェリシアン化カリウム、5mM フェロシアン化カリウム、1mg/ml X-gal、20mM Tris pH=7.3)中に行なった。最後に、サンプルを広範にPBSで洗浄し、顕微鏡で調べた。写真をNikon CoolpixカメラでNikon SMZ 1500 双眼顕微鏡の下で撮影した。
【０２５２】
−結果
細胞の研究は、70 bpの相同性がDSB誘導SSAのほぼ最大限の効率を達成するのに充分であるが、一方、自発的組換え(I-SceI誘導DSBなし)は最小であることを示す。よって、インビボで組換えを刺激する最初の試みにおいて、一過性の実験を行った。標的ベクター(30μg)とI-SceI発現プラスミドまたはコントロールプラスミド(10μg)のいずれかとの混合物を、流体力学的尾部静脈注入法により肝臓に導入した。図14は、注射の3日後に回収し、染色した肝臓の拡大図を示す。青色の点は、70 bpの重複に接するI-SceI部位を有する不完全なLagoZ遺伝子が修復された細胞を表す。メガヌクレアーゼ誘導DSBの後、SSA経路は1つの反復の欠失および機能的遺伝子の再構築をもたらす。LagoZ遺伝子によりエンコードされる活性なβ-ガラクトシダーゼは、次いで、X-Gal染色により検出され得る。さらに、メガヌクレアーゼ発現ベクターの不在下では遺伝子修正が検出されなかった。これらのデータは、メガヌクレアーゼ誘導組換えが肝臓において刺激され、染色体外標的のイントト修復が達成できることの最初の証拠である。
【０２５３】
実施例6： I-Sce I発現アデノウイルスを用いるイントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導組換え
種々のマウス組織におけるイントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導ゲノム外科治療を証明するために、イントトlagoZ遺伝子の修復を、いくつかの器官の形質導入化細胞により、I-SceI-発現アデノウイルスである 「Ad.I-SceI」を用いて試験した。コントロールのトランスジェニック同腹子に、I-SceI-非発現アデノウイルスである「Ad.control」を感染させた。トランスジェニックマウスでのアデノウイルス感染は、静脈内(IV)注射により行なった。イントトlagoZ遺伝子のいくつかの組織における修復を、イントトβ-ガラクトシダーゼ活性を検出する2つの方法、X-gal染色およびFDGアッセイにより試験した。
【０２５４】
−実験手順
トランスジェニックマウス
トランスジェニック創始者の発生のために用いられた導入遺伝子は、ヒト伸長因子1アルファプロモーター(human elongation factor 1 alpha promoter)の制御下にあり、70 bpまたは220bpのLagoZ重複およびI-SceI切断部位により不活性化された不完全なLagoZ遺伝子を有する5919bpのBglII/NotI断片であった(図11参照)。
【０２５５】
トランスジェニック創始者を古典的なトランスジェネシスにより、すなわち直線状の精製された上記のBglII/NotI断片を500コピー/ピコリットルを超えて、Elevage Janvierから購入したB6D2F1の雄と雌の交配に由来する単核細胞段階の受精卵の雄の前核にマイクロインジェクションすることにより作製した。マイクロインジェクションは、Nikon TE2000顕微鏡の下でNormarski DICとエッペンドルフtransferMan NK2マイクロマニピュレーターおよびエッペンドルフFemtojet 5247マイクロインジェクターを用いて行なった。注入後、発育と出産のために卵を代理の偽妊娠B6CBAF1/Jの雌(Elevage Janvier)に移した。この方法により作製したトランスジェニックマウスを、F0マウスの尾部の生検から抽出したゲノムDNAについてのPCRおよびサザンブロット解析により同定した。
【０２５６】
次いで、半接合体トランスジェニックF1動物を得るために、創始者をB6D2F1マウスに交配した。導入遺伝子の発現を、トランスジェニックF1動物の尾部生検から抽出したRNAに対するRT-PCRをQiagen RNeasyキット(カタログ番号74124)を用いて行うことにより試験した。次いで、F2半接合体トランスジェニック株を創るために、半接合体F1マウスをB6D2F1マウスに交配した。
【０２５７】
220bpまたは70bpのいずれかの長さのlagoZ遺伝子反復配列を有する2つの独立した株を用いた。これらのトランスジェニック株は、それぞれ株「361」および「58A」という。導入遺伝子組込みの分子的な特徴付けは、組込みが「361」ではBglII/NotI導入遺伝子の約5つの直列反復であり、「58A」では2つの逆方向反復と5つの直列反復であることを示す。半接合体マウスを、尾部生検、ゲノムDNA抽出およびPCR分析により同定した。次いで、「361」および「58A」半接合体マウスを、イントトI-SceI媒介-lagoZ遺伝子修復のために用い、トランスジェニック同腹子をネガティブコントロールとして用いた。
【０２５８】
アデノウイルスベースのイントト形質導入
CMVプロモーターの制御下にI-SceIメガヌクレアーゼコーディング領域を有する組換えV型アデノウイルス「Ad.I-SceI」は、Q BIOジーンカンパニーから、TCID50法により評点された1.58 1011感染性単位濃度で提供された。ネガティブアデノウイルスコントロール「Ad.control」もQ BIOジーンカンパニーから、3.76 1011感染性単位濃度で提供された。組換えV型アデノウイルス感染は、トランスジェニックマウスの尾部静脈での静脈内(IV)注射により行なった。トランスジェニックマウスを秤量し、キシラシン(100 mg/kg)とケタミン(10 mg/kg)の混合物の腹腔内注射により感染の前に麻酔をかけた。IV感染を、400μlの容量中の1010感染性単位/動物で行なった。感染は、4〜7週齢のトランスジェニックマウスに行なった。アデノウイルスに感染したマウスと未感染のコントロール同腹子とをアイソレーター中に、β-ガラクトシダーゼアッセイのために犠牲にするまで飼育した。
【０２５９】
β-ガラクトシダーゼ活性
アデノウイルスに感染したマウスを、感染後5〜14日(days-post-infention；dpi)でCO2吸入により犠牲にし、その器官をβ-ガラクトシダーゼアッセイのために加工した。肝臓の約10% (8 mm3)をタンパク質抽出のために用い、残りの90%を、β-ガラクトシダーゼのイントトX-galアッセイ(プロトコルは以前に記載)のために用いた。
【０２６０】
蛍光β-ガラクトシダーゼアッセイを、96ウェルプレート中に37℃でインキュベートした。アッセイを、タンパク質抽出物30μl、1μMのフルオレセインジガラクトシド(FDG、Sigma)、0.1% β-メルカプトエタノール、1 mM MgCl2および100 mMリン酸バッファー、pH 7.0を含む合計容量100μl中に行なった。プレートをFuoroskan Ascent (Labsystem)で5分のインターバルでスキャンした。β-ガラクトシダーゼ活性を、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出する。
【０２６１】
−結果
2匹の「58A」トランスジェニックマウスを、70bpの重複lagoZ配列の間のDSBを標的し、レポーター遺伝子の修復を誘導するために、1010感染性単位の「Ad.I-SceI」アデノウイルスでIV-注入した。注入後の種々の時間においてマウスを犠牲にし、いくつかの器官を解剖してイントトX-galアッセイにより分析した。青色の染色が、5dpiで安楽死させた感染したマウスの肝臓全体にわたって分散した細胞として検出された(図15A)。試験したほかの器官、すなわち腎臓、脾臓、心臓および肺において染色は検出できなかった。2匹の「58A」トランスジェニックマウス同腹子をコントロールとして用い、1匹は1010感染性単位のコントロールアデノウイルス「Ad.control」をIV-注入し、もう一方は感染させなかった。いずれのコントロールの肝臓でもβ-ガラクトシダーゼ活性は検出できなかった(データ示さず)。同様の結果が、Ad.I-SceIアデノウイルスの109および1010感染性単位で感染させた2匹の「361」トランスジェニックマウスで得られた(それぞれ図15Bと15C)。これらの結果は、肝臓抽出物でのβ-ガラクトシダーゼ活性の測定により確認された(図16)。I-SceIを発現するアデノウイルス(Ad.1Sce-I)を注入したマウスの肝臓において、高い活性が検出された。これに比べて、注入しなかったマウス(NI)は、コントロールアデノウイルス(Ad.control)を注入したマウスで検出される活性と類似の残存バックグラウンド活性だけを示した。
【０２６２】
「Ad.1-SceI」アデノウイルス1010感染性単位をIV-注入したマウスは、「Ad.1-SceI」アデノウイルス109感染性単位をIV-注入したマウスより染色された肝臓細胞およびより高いβ-ガラクトシダーゼ活性を示した。これらの結果は、I-SceI-誘導組換えが用量依存性であり、I-SceI誘導組換えのよりよい収率が、注入されるアデノウイルスの力価を増加させることにより得ることができることを示唆する。よって、I-SceI-誘導ゲノム外科治療は、V型アデノウイルス感染への感受性がより低いことが報告されている他の器管において検出されるはずである。
【０２６３】
まとめると、これらのデータは、レポーター遺伝子の修復がI-SceIメガヌクレアーゼの活性により誘導されたことを強く示唆する。この結果は、I-SceIおよびより一般的にはメガヌクレアーゼが、効果的な部位特異的相同的組換えを誘導するのにイントトで用いることができ、染色体遺伝子の修復に導くことの最初の証拠である。よってこの結果は、哺乳動物における遺伝子治療の分野における適用を切り開く。
【０２６４】
実施例7：イントト変異ヒトApoAI遺伝子のメガヌクレアーゼ誘導修正
遺伝子修正は、遺伝子治療の最も安全な方法であろう。実際に、相同的組換えは、染色体遺伝子座の精密な改変を許容し、かつ細胞培養において広く用いられている。残念なことに、この効率は非常に低く、そのまま治療的手段として構想することができない。しかしながら、この機構はゲノム標的内の二本鎖破壊(DSB)により向上されることが示されている。今までのところ、脊椎動物において、この技術の使用は細胞の適用に限定されている。これは、メガヌクレアーゼ発現カセットとDNA修復マトリックスとの混合物の血流中の直接の注入による、イントトの哺乳動物におけるDSB誘導遺伝子変換の使用の最初の報告である。
【０２６５】
この系は、イントトでのマウスにおけるヒトApo A-I導入遺伝子の修復に基づく。アポリポタンパク質A-I (APO A-I)は、高密度リポタンパク質(HDL)の主要なタンパク質構成成分であり、HDL代謝において重要な役割を演じる。高密度リポタンパク質は、逆コレステロール輸送(reverse cholesterol transport)の主要なメディエータとして、主要な心臓防御の役割を有する。Apo A-I遺伝子は肝臓において発現され、タンパク質は血中に分泌される。さらに、ヒトでのApo A-I欠乏は、早期の冠動脈性心疾患に導く。これらを合わせて、これらの条件により、Apo A-I遺伝子はメガヌクレアーゼが誘導する遺伝子修正の研究のための良好な候補となる。
【０２６６】
−実験手順
導入遺伝子
ヒトApo A-I遺伝子をコードするゲノム配列を用いて導入遺伝子を構築した。Apo A-I遺伝子の発現は、その独自の最小プロモーター(328bp)により駆動され、このプロモーターは肝臓における導入遺伝子の発現を促進するのに充分であることが示されている(Walshら, J. Biol. Chem., 1989, 264, 6488〜6494)。簡単に、ヒトApo A-I遺伝子をヒト肝臓ゲノムDNA (Clontech)でのPCRにより得て、プラスミドpUC19にクローニングした。2つの停止コドンを含むI-SceI部位を、エキソン4 (図17)の冒頭にPCRにより挿入した。得られる変異遺伝子(I-SceI-hApo A-I)は、本来のヒトAPO A-Iの短縮形 (野生型APO A-Iの267アミノ酸に対して80残基)をエンコードする。全ての構築物を配列決定し、ヒトApo A-I遺伝子配列に対して確認した。
【０２６７】
トランスジェニックマウスの作製
変異ヒトApo A-I遺伝子を有するEcoRI/XbaIゲノムDNA断片を、トランスジェニック創始者の作製用に用いた。マイクロインジェクションを、マウスapo a-I遺伝子についてノックアウトした雄(WT KOマウス) (The Jackson Laboratory、＃002055)とB6SJLF1 雌(Janvier)との繁殖からの受精卵母細胞において行なった。トランスジェニック創始者マウス(F0)を、尾部から抽出したゲノムDNAのPCRおよびサザンブロット分析により同定した。次いで、内因性マウスapo a-I遺伝子についてのノックアウト遺伝子バックグラウンドにおいてI-SceI-hApo A-Iトランスジェニック株を得るためにF0をWT KOマウスと交配させた。合計で7つの独立したトランスジェニック株を研究した。導入遺伝子組込みの分子的特徴づけをサザンブロット実験により行なった。
【０２６８】
それぞれのトランスジェニック株における導入遺伝子発現の分析を、肝臓から抽出した全RNAについてのRT-PCRにより行なった(Trizol Reagent, Invitrogen)。マウスの転写物との交差反応を回避するために、ヒトトランスジェニックI-SceI-hApo A-I cDNAに特異的なプライマー(オリゴヌクレオチドEおよびF、図17)を用いた。内部コントロールとしてアクチンプライマーを用いた。
【０２６９】
流体力学ベースのイントト形質導入
トランスジェニックマウスの肝臓細胞のイントトの形質導入は、以前に記載されたようにして流体力学的尾部静脈注射により行なった(Zhangら, 1999, Human Gene Therapy, 10, 1735〜1737)。10〜20 gの動物に、それらの体重の1／10の容量のPBS中の環状プラスミドDNAを10秒未満で注入した。I-SceIをCMVプロモーターの調節下にコードするプラスミドと、DNA修復マトリックス(図17に示す2 kbp or または1.5 kbp)を有する等量のプラスミドとの混合物20または50μgを用いた。同じベクター内にI-SceI発現カセットと2 kbp DNA修復マトリックスとを有するプラスミド20または50μgも用いた。
【０２７０】
遺伝子修正の分析
I-SceI発現カセットとDNA修復マトリックスの注入後のマウスにおける導入遺伝子の修復を、ランダムヘキサマーを用いる逆転写した肝臓全RNAに対するネストPCR (nested PCR)により分析した。修正されたが未修正ではない遺伝子を検出するために、修復された導入遺伝子を特異的に増幅するプライマーの組を用いた。I-SceI部位に広がるリバースオリゴヌクレオチドにより、特異性が達成され、フォワードは修復マトリックスの外側に位置していた(最初のPCRにおいてオリゴヌクレオチドGおよびH、ならびにネストPCRにおいてオリゴヌクレオチドEおよびI、図17)。アクチンプライマーを内部コントロールとして用いた。
【０２７１】
−結果
I-SceI-h apo A-I導入遺伝子のいくつかのコピーを有する7つのトランスジェニック株をこれらの実験に用いた。表4に、各トランスジェニック株における導入遺伝子の分子的特徴付けおよび発現についてまとめた。
【０２７２】
【表４】
2006518372.tif 000005
【０２７３】
系統49および50において導入遺伝子の発現が非常に低いので、5つの他の株についてさらなる分析を行なった。これらの実験においては、マウスにI-SceIを発現するベクターとDNA修復マトリックスとの混合物またはI-SceIを発現するカセットとDNA修復マトリックスとを有するベクターのいずれかを注射した。変異ヒトApo A-I遺伝子の修復を、修正されたヒトApo A-I遺伝子とだけ対となるように特異的に設計されたプライマー(図17)を用いて、肝臓全RNAについてのRT-PCRによりモニターした(図18)。コントロールとして、注射しなかったトランスジェニックマウスまたはI-SceI発現ベクター単独もしくはDNA修復マトリックス単独を注射したトランスジェニックマウスについてRT-PCRを行った。これらの実験条件で遺伝子修正は検出できなかった。さらに、I-SceI発現ベクターとDNA修復マトリックスとの混合物またはI-SceI発現カセットおよびDNA修復マトリックスの両方を有するベクターのいずれかを注射した野生型マウスは、いずれのPCR増幅DNA断片も示さなかった。これに対して、I-SceI発現カセットとDNA修復マトリックスとが注射されたトランスジェニックマウスにおいて、PCR断片が特異的に視覚化された(図18)。遺伝子修正は、導入遺伝子の1つまたはいくつかのコピー含有する試験した全てのトランスジェニック株において検出可能であった(表5)。
【０２７４】
【表５】
2006518372.tif 000006
【０２７５】
修正された導入遺伝子の検出は、トランスジェニック株に応じて、14〜100%の注射されたマウスで起こる。この不均質性は、おそらく、流体力学的尾部静脈注射法の高い変動性を反映している。I-SceI発現カセットおよびDNA修復マトリックスを有する1つのプラスミドの単純な注射または2つのベクターの同時の注射は、同じ結果を与えた。最後に、結果は、注射された20または50μgのDNAについても同様であった。これらの結果は、ヒトApo A-I遺伝子修正は、I-SceI DSB修復機構により誘導されることを示した。
【０２７６】
これらの結果は、メガヌクレアーゼ誘導遺伝子変換は、イントトゲノム外科治療を行うのに用いることができ、かつメガヌクレアーゼをこのような適用のための薬剤として用いることができることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】図1は、単鎖I-Cre Iメガヌクレアーゼのアミノ酸配列および該単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするあるポリヌクレオチドを開示する。
【図２】図2はポリヌクレオチド配列を開示する。
【図３】図3は、D75N変異を含むI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「鋳型」とよばれるポリヌクレオチド配列の模式図である。
【図４】図4は、ライブラリ構築のストラテジの模式図である。
【図５】図5：COS細胞単層を、I Sce-I (B)を発現するベクターまたはコントロールプラスミド(A)を用いてトランスフェクションする。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV-1 (30 PFU)を用いて感染させる。2日後、単層を固定して染色(X-Gal)する。
【図６】図6：図6A：細胞単層を30 PFUで感染させる。HSV-1増殖を、細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性により定量する。図6B：細胞単層を300 PFUで感染させる。細胞の生存率を細胞溶解物中のタンパク質測定により測定する。
【図７】図7Aは、組換えHSV-1のゲノムDNAの模式図である。図7B；ウイルスのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のPCR定量。
【図８】図8は、トランスフェクションした細胞の感染の後に培地に放出されたウイルスの力価を示す。
【図９】図9は、I-CreI DNA標的および5つの関係する標的を示す。
【図１０】図10は、6つの標的を用いてLib2ライブラリをスクリーニングした後に得られる4つの結合パターンを示す。
【図１１】図11は、標的ベクターの模式図を示す。
【図１２】図12は、一本鎖アニーリング(SSA)効率に対する相同性の長さの効果を示す。
【図１３】図13：細胞単層を(+)I-SceIを発現するベクターまたはコントロールプラスミド(-)I-SceIを用いて共トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を固定して染色した(X-Gal)。
【図１４】図14A：標的LagoZ遺伝子(30μg)およびI-SceI発現ベクター(10μg)の混合物を注射されたマウスからの肝臓のX-Gal染色。図14B：標的LagoZ遺伝子(30μg)およびI-SceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクター(10μg)の混合物を注射されたマウスからの肝臓のX-Gal染色。
【図１５】図15：IVにより「Ad.I-SceI」アデノウイルスを用いて感染させた2つの独立した株の半接合体トランスジェニックマウスの肝臓のX-Gal染色。
【図１６】図16：肝臓抽出物の蛍光β-ガラクトシダーゼアッセイ。
【図１７】図17は、実施例7で用いた導入遺伝子、DNA修復マトリックスおよびプライマーの配列を示す。
【図１８】図18は、マウスにおけるI-SceI誘導遺伝子変換によるI-SceI-hApo A-I導入遺伝子修復のRT-PCR分析を説明する。
【図１】
2006518372.tif 000007
【図２−１】
2006518372.tif 000008
【図２−２】
2006518372.tif 000009
【図３】
2006518372.tif 000010
【図４】
2006518372.tif 000011
【図５】
2006518372.tif 000012
【図６】
2006518372.tif 000013
【図８】
2006518372.tif 000014
【図９】
2006518372.tif 000015
【図１０】
2006518372.tif 000016
【図１１】
2006518372.tif 000017
【図１２】
2006518372.tif 000018
2006518372.tif 000019
2006518372.tif 000020
【図１５】
2006518372.tif 000021
【図１６】
2006518372.tif 000022
【図１７】
2006518372.tif 000023
【図７】
2006518372.tif 000024
【図１３】
2006518372.tif 000025
【図１８】
2006518372.tif 000026
【配列表】
2006518372000001.app
【国際調査報告】
2006518372.tif 000027
2006518372.tif 000028
2006518372.tif 000029