(57)【要約】アポトーシスを刺激する働きをする治療薬の、哺乳類の身体における有効性を評価するための方法は、該アポトーシスを刺激する働きをする治療薬で処置する哺乳類から、腫瘍細胞が存在する身体組織または体液のサンプルを得ること、ここで、該組織または体液はカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片を含む可能性があり、この断片はin vivoにおけるカスパーゼ３の特異的切断によって生じたものである；該切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該サンプルをアッセイすること；該治療薬を該哺乳類に投与すること；該哺乳類から、該身体組織または該体液の第二のサンプルを得ること；および該切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該第二のサンプルをアッセイすることを含み、該第一のサンプルで測定された量に対する、該第二のサンプルで測定された該１７ｋＤａ断片の量の増加が、アポトーシス刺激および該治療薬の有効性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の身体において治療薬の有効性を評価するための方法であって、該薬剤はアポトーシスを刺激する働きをし、
該治療薬で処置する哺乳類から、腫瘍細胞が存在する身体組織または体液のサンプルを得ること、ここで、該組織または体液はカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片を含み得、この断片はin vivoにおけるカスパーゼ３の特異的切断によって生じたものである；
該切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該サンプルをアッセイすること；
該治療薬を該哺乳類に投与すること；
該哺乳類から、該身体組織または該体液の第二のサンプルを得ること；および
該切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該第二のサンプルをアッセイすること
を含み、該第一のサンプルで測定された量に対する、該第二のサンプルで測定された該１７ｋＤａ断片の量の増加が、アポトーシス刺激および該治療薬の有効性に相関する、方法。
【請求項２】
前記体液が血液または血液成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液成分が血漿、血清または血液細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記体液が唾液である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療薬が化学療法薬、放射性治療薬、腫瘍抑制核酸、オリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療薬が核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、野生型ｐ５３分子、ＲＢ分子、ＲＢ９４分子、アポプチン分子またはアンチセンスＨＥＲ−２をコードするＤＮＡ分子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記治療薬がリガンド−カチオンリポソームとの複合体として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドがトランスフェリン、葉酸または抗トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドが抗体または抗体フラグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体または抗体フラグメントがトランスフェリン受容体またはＨＥＲ−２と結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖフラグメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記リポソームがジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）もしくはコレステロールまたはそれらの組合せとの混合物、あるいはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）とＤＯＰＥもしくはコレステロールまたはそれらの組合せとの混合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療薬が化学療法薬または放射性治療薬をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二のサンプル中の切断１７ｋＤａサブユニットの量が、前記第一のサンプル中の切断サブユニットの量の少なくとも１．５〜約２倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類の身体において治療薬の有効性を評価するための方法であって、該薬剤はアポトーシスを刺激する働きをし、
該治療薬で処置する哺乳類から、血液または血液成分のサンプルを得ること；
該サンプル中に存在するカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の量を測定すべく該サンプルをアッセイすること、ここで、該フラグメントはin vivoにおけるカスパーゼ３の特異的切断によって生じたものである；
該治療薬を該哺乳類に投与すること；
該哺乳類から、血液または血液成分の第二のサンプルを得ること；および
該サンプル中に存在する切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の量を測定すべく該第二のサンプルをアッセイすること
を含み、該第一のサンプルで測定された量に対する、該第二のサンプルで測定された該１７ｋＤａ断片の量の増加が、アポトーシス刺激および該治療薬の有効性に相関する、方法。
【請求項１７】
前記血液成分が血漿、血清または血液細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療薬が化学療法薬、放射性治療薬、腫瘍抑制核酸、オリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は２００３年１月２８日出願の米国仮出願番号６０／４４２，９０２の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アポトーシスの誘導を通じて作用する、またはアポトーシス誘導をもたらす癌治療の有効性を評価するための方法に関する。より詳しくは、本発明はアポトーシスマーカーとしての、切断カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットを検出することを含む、かかる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
全身性遺伝子療法送達系の開発における近年の研究の生産性の高い焦点の一つが、in vivoヒト治療用の遺伝子の非ウイルス系医薬製剤の開発、特にカチオンリポソーム介在遺伝子導入系に注がれてきた(Massing U, et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 35:87-90 (1997))。それらをＤＮＡ送達にとって融通が利き、かつ、魅力的なものとするカチオンリポソームは、調製が簡単なこと；大量のＤＮＡを複合化できること；どんな種類および大きさのＤＮＡまたはＲＮＡとともに用いる場合でも融通が利くこと；非分裂細胞細胞を含む、多くの異なる細胞種をトランスフェクトできること；および免疫原性または生物に有害な活性がないことを備えている(Felgner PL, et al., Ann. NY Acad. Sci. (1995) 772:126-139; Lewis JG, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:3176-3181)。ヒト癌治療の展望からより重要なこととしては、カチオンリポソームがin vivo遺伝子送達にとって安全かつ効率的であるということが分かっていることである(Aoki, K. et al., Cancer Res. 55:3810-3816 (1997); Thierry, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9742-9746 (1997))。
【０００４】
カチオンリポソームのトランスフェクション効率は、それらが細胞表面受容体によって認識されるリガンドを有する場合に劇的に上昇し得る。受容体介在エンドサイトーシスは、真核細胞に存在する効率の高い内在化経路である(Cristiano, R.J., et al., Cancer Gene Ther. 3:49-57 (1996), Cheng, P.W., Hum. Gene Ther. 7:275-282 (1996))。リポソーム上のリガンドの存在は、細胞表面にあるその受容体がまずリガンドと結合し、その後、結合複合体の内在化によって細胞へのＤＮＡ導入を助ける。トランスフェリンおよび葉酸(folate)をはじめとする種々のリガンドが、そのリポソーム標的化能に関して研究されている(Lee, R.J., et al., J. Biol. Chem. 271:8481-8487 (1996))。葉酸受容体（ＦＲ）およびトランスフェリン受容体（ＴＦＲ）レベルは、限定されるものではないが、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、頭頸部癌、膀胱癌、脳癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、および肝臓癌をはじめとする種々の癌細胞種で上昇している。また、ＴＦＲおよびＦＲの上昇レベルは腫瘍細胞の攻撃能または増殖能とも相関がある(Elliot, R.L., et al., Ann. NY Acad. Sci. 698:159-166 (1993))。よって、ＴＦＲおよびＦＲのレベルは予後の腫瘍マーカーとして有用であると考えられ、悪性細胞の治療における薬物送達のための可能性のある標的である(Miyamoto, T., et al., Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 23:430-433 (1994); Thorstensen, K., et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 215:113-120 (1993))。
【０００５】
腫瘍細胞上の受容体によって認識されるリガンドの他、特異的抗体もリポソーム表面へ結合でき、それらを特異的腫瘍細胞表面抗原（受容体を含むが、これに限定されるものではない）(Allen, T.M., et al., Stealth iposomes, pp. 233-244 (1995))に向けることができる(Allen, T.M., Biochim. Biophys. Acta 1237:99-108 (1995))。これらの「イムノリポソーム」、特に立体的に安定化したイムノリポソームは、特定の標的細胞群に治療薬物を送達することができる(Allen, T.M., et al., Stealth Liposomes, pp. 233-244 (1995))。Parkら(Park, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995))は、リポソームに結合させた抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｆａｂフラグメントが、乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を過剰発現するＨＥＲ−２に特異的に結合し得ることを明かにした。イムノリポソームは、被覆ピット経路を介する受容体介在エンドサイトーシスによって、また可能性として膜融合によっても効率的に内在化を受けることが見出された。さらに、抗ＨＥＲ−２Ｆａｂフラグメントのアンカリングによって、その阻害作用は増強した。また、ドキソルビシンを付加した抗ＨＥＲ−２イムノリポソームは、in vivoおよびin vitroにおいて標的細胞に対して有意かつ特異的な細胞傷害性を示した(Park, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995))。さらに、Suzuki et al., Br. J. Cancer 76:83-89 (1997)は、in vitroにおいてヒト白血病細胞において、より効率的にドキソルビシンを送達するために抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体結合イムノリポソームを用いた。Huwyler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14164-14169 (1996)は、in vivoにおいてラット神経膠腫（ＲＴ２）細胞に、ダウノマイシンを送達するために抗ＴｆＲモノクローナル抗体イムノリポソームを用いた。このペグ化(PEGlated)イムノリポソームによれば、正常な組織および臓器における薬物濃度がより低くなる。これらの研究は、腫瘍標的化薬物送達のためのイムノリポソームの有用性を示すものである。
【０００６】
生物工学における発展は、Ｍａｂからの特異的認識ドメインの誘導を可能にした(Poon, R.Y., Biotechnology International: International Developments in the Biotechnology Industry, pp. 113-128 (1997))。重鎖および軽鎖の可変領域の組換えと、その単一ポリペプチドへの組込みは、標的化の目的のために単鎖抗体誘導体（ｓｃＦｖと呼ばれる）を使用する可能性を提供する。癌胚抗原に向けられたｓｃＦｖ、ＨＥＲ−２、ＣＤ３４、黒色腫関連抗原およびトランスフェリン受容体を提示するよう操作したレトロウイルスベクターが開発された(Jiang, A., et al., J. Virol. 72:10148-10156, (1998); Konishi, H., et al., Hum. Gene Ther. 9:235-248 (1994); Martin, F., et al., Hum. Gene Ther. 9:737-746 (1998))。ウイルスに向けたこれらのｓｃＦｖは、特定の抗原を発現する細胞種を特異的に標的とし、結合し、感染することが示されている。さらに、少なくとも癌胚抗原の場合、ｓｃＦｖは、親抗体と同じ細胞特異性を持つことが示されている(Nicholson, I.C., Mol. Immunol. 34:1157-1165 (1997))。
【０００７】
種々のイムノリポソームが、ヒト遺伝子療法で使用するための、腫瘍を標的とする核酸の全身性送達が可能である。抗体または抗体フラグメントを標的とするイムノリポソーム複合体は、抗体または抗体フラグメントとリポソーム複合体の化学的結合によって、または簡単かつ効率的な非化学的結合法によって製造することができる。ＴｆＲｓｃＦｖは種々の方法（出典明示により本明細書の一部とするＰＣＴ出願公開番号ＷＯ００／５０００８）を用いてリポプレックスと化学的に結合させることができ、in vitroおよびin vivoでヒト前立腺腫瘍細胞をトランスフェクトすることができる。あるいは、抗体または単鎖タンパク質をリポソームと結合させ、そして、抗体またはｓｃＦｖ、リポソームおよびリガンドを所定の比率および順序で単に混合することにより、この抗体−またはｓｃＦｖ−リポソーム−治療薬または診断薬複合体が形成される。
【０００８】
この標的化リポソームは種々の治療分子を標的細胞へ運搬することができる。治療薬はリポソーム表面に付着する。このような薬剤としては、化学療法薬、高分子量ＤＮＡ分子（遺伝子）、プラスミドＤＮＡ分子、および小型のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０００９】
世界中でこれまでに６００を超える遺伝子療法臨床試験が認可されており、この数は増加の一途をたどっている。しかしながら現在、特定の遺伝子療法がその意図した標的に到達し、作用しているかどうかを判定する信頼できる、最小限の侵襲的手段はない。この問題は転移性疾患に作用可能な全身性遺伝子療法送達系の開発に向けた研究活動として特に重要である。腫瘍生検を繰り返し行うことはできないので、侵襲性の少ない方法論を用いる新しいアプローチを開発することが急がれる。
【００１０】
限定されるものではないが、化学療法薬、放射線療法、ならびにＲＢおよびｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子をはじめとする多くの抗癌薬はアポトーシスを誘導することによって働く。アポトーシス（プログラム細胞死とも呼ばれる）は、発育中の組織のパターン化に、および成熟細胞／組織のホメオスタシスの維持に中枢的役割を果たす高度に調節された生理学的プロセスである(Horvitz, H.R., Cancer Res. 59:1701-1706 (1999); Jacobsen, M.D. and Weil, M., Cancer, 88:407-454 (1997))。このアポトーシス機構の欠陥は癌の顕著な特徴である(Hanahan, D., and Weinberg, R., Cell, 100:57-70 (2000))。
【００１１】
本発明の一つの目的は、哺乳類の身体において治療薬の有効性を評価するための、簡単かつ信頼できる侵襲性の少ない方法を提供することである。より詳しくは、本発明の一つの目的は、治療薬がアポトーシスを刺激する働きをする場合の、かかる方法を提供することである。
【発明の開示】
【００１２】
本発明によれば、アポトーシスを刺激する働きをする治療薬の有効性を評価するための方法が提供される。この方法は、
腫瘍細胞が見られる身体組織、または該治療薬で処置する哺乳類からの体液のサンプルを得ること、ここで、該組織または体液はカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片を含み得、この断片はin vivoにおけるカスパーゼ３の特異的切断によって得られたものである；
該カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該サンプルをアッセイすること；
該治療薬を該哺乳類に投与すること；
該哺乳類から、該身体組織または体液の第二のサンプルを得ること；および
該切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該第二のサンプルをアッセイすること
を含み、該第一のサンプルで測定された量に対する、該第二のサンプルで測定された該１７ｋＤａ断片の量の増加が、該治療薬によるアポトーシス刺激および該治療薬の有効性に相関する。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１はＰ３０およびＰ６カラムで精製したマウス血漿由来の１７ｋＤａ切断カスパーゼ３サブユニットを示す。
図２はＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３の静注後のＰａｎｃ−１異種移植片における外因性ｗｔｐ５３の発現および１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。
図３はＰａｎｃ−１異種移植片における、葉酸−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体静注後の経時的な１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。図中、ＵＴ＝対照として用いた非処置動物；Ｆｐｐ５３＝葉酸−リポソームＡ−ｐ５３複合体；およびＦｐＶｅｃ＝エンプティーベクターを有する葉酸−リポソームＡ複合体。
図４はトランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３複合体およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で処置した後のＤＵ１４５担癌マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示す。
図５はトランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３を含む複合体とシスプラチンの組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を持つ、または持たないマウス由来の血清における、カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
図６はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体で処置した後のＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体で処置した、かかる細胞と比較して示す。
図７はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体とジェムザール(Gemzar)（登録商標）の組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置細胞と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体単独、またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
図８はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せの静脈投与後のＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍担持マウス由来の血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置動物と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体単独またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
図９Ａおよび９Ｂは、各々、ＰＡＮＣ−１およびＣＯＬＯ３５７細胞のトランスフェクション８時間後の、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはジェムザール（登録商標）との組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。両細胞種ともカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在の明瞭な結果を示した。これらの結果は、非処置細胞の結果およびジェムザール（登録商標）単独またはジェムザール（登録商標）とＴＦＲｓｖＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の組合せで処置した細胞の結果と対照的である。
図１０はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはＰＡＮＣ−１細胞のジェムザール（登録商標）６時間後トランスフェクションの組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。対照は図９Ａおよび９Ｂと同じである。
図１１は皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を担持するヌードマウスへの、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体単独またはジェムザール（登録商標）と組み合わせた静脈送達後の腫瘍細胞におけるアンチセンスＨＥＲ−２作用の局在を示す。１７ｋＤａサブユニットの存在を示す矢印は、肝細胞または肺細胞サンプルのいずれにも存在しない腫瘍における中央のバンドを指している。
図１２はＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍におけるＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せ処置のin vivo作用を、非処置腫瘍、またはジェムザール（登録商標）単独、複合体単独もしくはジェムザール（登録商標）とＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム  Ａ−スクランブルＨＥＲ−２ａ複合体の組合せで処置した腫瘍と比較して示すグラフである。
図１３はＲＢ９４腫瘍抑制遺伝子で全身処置した後のマウス血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
図１４は化学療法後のヒト乳癌患者の血清におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【００１４】
発明の詳細な説明
アポトーシスのメカニズムは進化を通じて顕著に保存され、システインプロテアーゼファミリーによって制御されている。これらの酵素はそれらの特異的基質であるアスパラギン酸残基の後ろで切断することで、アポトーシス細胞を特徴付ける多くの典型的な生化学的・形態学的変化を媒介する。当業者ならば、アポトーシスの指標または生化学的マーカーとして活性化カスパーゼの同定が使用できることを知っているが、それらの使用はこれまでのところ、in vitro細胞培養物もしくは細胞溶解物、または無傷の生細胞の場合に限られていた。
【００１５】
カスパーゼファミリーには、少なくとも１４の異なる哺乳類メンバーが存在する。これらの酵素は、プロアポトーシスシグナルに応答してタンパク質分解性の活性化を受ける不活性な前駆体（チモーゲン）としてほとんどの細胞種で構成的に発現する(Kohler et al., J. Immuno Methods 265:97-110 (2002)参照)。大きなプロ酵素は、特異的な内部配列で切断され、後にヘテロダイマーを形成する大サブユニットと小サブユニットとに分割される(Jacobsen, M.D. and Weill, M; Cell 88:307-354 (1997); Cryns, V. and Yuan, M. J., Gene Dev. 12:1551-1570 (1998);およびNunez, G., et al., Oncogene 17:3237-3245 (1998))。活性型のカスパーゼはこのような２つのヘテロダイマーからなっている(Nicholson, D.W. and Thornberry, N., trands biochem. Sci. 22:299-306 (1997))。
【００１６】
アポトーシスに関与するカスパーゼは一般に、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ２、８、９および１０）およびエフェクターカスパーゼ（カスパーゼ３、６および７）の２つのカテゴリーに分けられる。前者のグループは自己活性化型で、その後、エフェクターカスパーゼの活性化へと進行する。ある領域の細胞標的を切断して、最終的に細胞死をもたらすのはこれらの活性化されたエフェクターカスパーゼである。このイニシエーターからエフェクターカスパーゼへの一連の活性化が、カスパーゼカスケードという概念を導いた。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはｆａｓリガンドとその受容体との結合は、その活性化をもたらすイニシエータープロカスパーゼ８を補充する「細胞死誘導シグナル伝達複合体」の構築をもたらす。活性型カスパーゼ８はプロカスパーゼ３を切断および活性化してタンパク質分解カスケードを起動させる。
【００１７】
健康な細胞では、カスパーゼはミトコンドリアおよびサイトゾルに不活性型のプロ酵素として存在する(Mancini, M., et al., J. Cell Biol. 140: 1485-1495 (1998))。アポトーシスシグナルは２つの腫瘍経路：ミトコンドリアに付随する内因的経路と腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの細胞死受容体が介在する外因的経路に沿って伝達される。このカスケードはいくつかの異なる種類の刺激によって誘発される(Mathiasen and Jaeaettelae, Trends in Molecular Medicine 8:212-20 (2002))。放射線照射および化学療法薬など、ＤＮＡに傷害を起こす因子はｐ５３を活性化し、これは両アポトーシス経路を刺激し得る。重要なこととしては、両経路の遂行にはカスパーゼ３の活性化が必要であるということである。従って、カスパーゼ３により誘導されるタンパク質分解は実質上、全ての細胞アポトーシス経路において重要な事象であることが示されている。現在のデータは全て、アポトーシスの欠陥が癌の前提条件であることを示唆している(Jaeaettelae, M., Exp. Cell Research 248:30-43 (1999); Evans, G. and Vousden,K., Nature 411:342-348 (2001))。ＨＥＲ−２のような癌タンパク質の調節されない活性化、またはｐ５３のような腫瘍抑制タンパク質の不活性化によって誘導される細胞増殖シグナルはカスパーゼの活性化を誘導し、アポトーシスを誘導するはずである。しかし、ヒト腫瘍はアポトーシス遺伝子遺伝子（例えば、ｐ５３）の突然変異（それらの不活性化を招く）を含み、かつ／または抗アポトーシスタンパク質(例えば、ＨＥＲ−２)の発現／活性化(Mathiason and Jaeaettelae TRENDS in Mol. Med. 8:212-220 (2002))が増強されており、その結果、腫瘍細胞の治療モダリティーに対する応答能の低下または不活性化に至っている。
【００１８】
腫瘍細胞および／または体液におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの検出は、アポトーシスを刺激する働きをする治療薬を投与した後にアポトーシス経路が機能することを示すことにより、治療の有効性を確認する手段を提供する。よって、治療薬などによる処置を開始する前の患者からの体液または腫瘍細胞含有身体組織のサンプルにおける１７ｋＤａサブユニットのレベルを測定し、治療薬で処置した後の患者からの体液または腫瘍細胞含有身体組織の第二のサンプルにおける１７ｋＤａサブユニットのレベルと比較することにより、その治療薬がアポトーシスを刺激したかどうかを判定することができる。
【００１９】
本発明の方法はアポトーシスの存在を質的に評価すること、およびアポトーシスの程度を評価することの双方に使用できる。よって、この方法は種々の治療の相対的有効性を比較および評価するための用量応答試験で使用できる。特定の治療の有効性が高いほどアポトーシスのレベルが高く、従って、産生される１７ｋＤａサブユニットの量が多くなる。本発明によれば、腫瘍細胞または体液中のカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの量が任意のバックグラウンドレベル（すなわち、治療薬の投与前の同じ宿主からの腫瘍細胞または体液サンプルで測定されたサブユニットの量）の少なくとも約１．５〜２倍であることが判明した場合に、治療薬または治療薬の組合せによる作用の結果としてのアポトーシスが起こったことが分かる。有効性の高い治療レジメンならば、任意のバックグラウンドレベルの少なくとも約３〜４倍の１７ｋＤａレベルを生じ得る。治療薬の投与前に得られた組織または体液サンプルが１７ｋＤａサブユニットの不在を示す場合には、治療薬の投与後に得られた第二のサンプルでどんな量のサブユニットが検出されても、アポトーシスを誘導する薬剤の作用の結果であると考えられる。
【００２０】
典型的には、腫瘍サンプルまたは体液サンプル中の１７ｋＤａサブユニットの量の測定は、薬剤の性質にもよるが、投与から約３０分〜５日後、好ましくは投与から約８時間〜７２時間後に行うことができる。例えば、ＨＥＲ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療薬の投与の結果、比較的迅速にアポトーシスが起こるが、ｗｔｐ５３遺伝子を含む治療薬では効果が出るまでにもっと時間がかかる。処置が数日または数週間にわたる多数回処置である場合には、最初の処置から３０分〜５日後、各処置後、または最後の処置の後のサブユニットの量を測定することができる。処置が有効であれば、アポトーシスの量、従って、産生した１７Ｄａサブユニットの量が経時的に上昇を続ける。
【００２１】
上記で述べたように、１７ｋＤａサブユニットの量は腫瘍細胞または体液のいずれかで測定することができる。体液は血液、または血清もしくは血漿などのその成分、または唾液を含み得る。好ましい体液は血液またはその成分である。
【００２２】
特定の治療の有効性を評価するこの方法は、アポトーシスを刺激する働きをするいずれの治療薬または治療法でも有効である。このような治療薬としては放射線照射または放射性治療薬、化学療法薬、ならびにｐ５３、ＲＢ９４およびＲＢなどの腫瘍抑制遺伝子、またはアンチセンスＨＥＲ−２などのオリゴヌクレオチド、あるいは腫瘍抑制遺伝子の投与と放射線または化学療法との組合せといったそれらの組合せが挙げられる。好ましい薬剤としては、野生型ｐ５３分子、ＲＢまたはＲＢ９４分子、アポプチン分子、またはＨＥＲ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡ分子が挙げられる。
【００２３】
一実施形態では、治療薬は遺伝子療法を含み、ウイルスベクターを介して、または上記のように、より好ましくは、カチオンリポソーム−リガンド複合体の一部として投与する。このような複合体は、出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／６０１，４４４；０９／９１４，０４６および１０／１１３，９２７に詳しく記載されている。これらの複合体は目的部位、典型的にはトランスフェリン受容体を発現する癌細胞などの癌細胞に標的化される。標的化薬剤は、標的細胞上の目的の受容体と結合する、トランスフェリンまたは葉酸などのリガンド、または抗体もしくは抗体フラグメントである。好ましい抗体フラグメントは単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。このようなフラグメントは、完全な抗体によって認識される目的のエピトープに対する完全な抗体結合部位を含み、それぞれ重鎖および軽鎖に由来する成分ＶＨとＶＬ可変ドメインとを、一方の可変領域のＣ末端と他方のＮ末端を架橋する好適に設計されたリンカーペプチドで、ＶＨ−リンカー−ＶＬかＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかの順序で連結することにより形成される。これらの治療組成物は腫瘍内、腹腔内、筋肉内、経口、または全身投与することができ、静脈投与が好ましい。
【００２４】
今般、ｗｔｐ５３、ＲＢ９４またはアンチセンスＨＥＲ−２などのある種の治療薬の外因的発現とin vivoにおける脈管形成因子およびアポトーシス因子における変化との間には関係があることが見出された。この腫瘍の応答は治療薬の投与と相関し、これらの変化は、これらの因子が癌を処置する上での治療の有効性の有用な分子マーカーとして働き得ることを示している。腫瘍および組織サンプルが得られる場合、アポトーシスの程度は、ウエスタンブロットアッセイ、ＴＵＮＮＥＬアッセイまたはアネキシンＶ染色（TREVIGEN TAC（登録商標）)アポトーシス検出キットといった種々の既知の分析法を用いて測定することができる。１７ｋＤａの切断カスパーゼ３サブユニットの存在は、組織および血液サンプルにおけるウエスタン分析によって評価することができる。腫瘍における、外因的ｗｔｐ５３発現などの治療薬の存在に伴う変化と腫瘍応答との相関は、カスパーゼ３サブユニットの、腫瘍応答マーカーとしての使用を支持するものである。
【００２５】
特定の好ましい治療薬処置において、治療組成物はｐ５３、ＲＢもしくはＲＢ９４、またはアンチセンス（ＡＳ）ＨＥＲ−２オリゴヌクレオチドのいずれかをコードする核酸を含む。アポトーシス経路はｐ５３ＲＢまたはＲＢ９４によって誘導されることが知られており、また、今般、これはＡＳ  ＨＥＲ−２処置によっても誘導されることが分かった。そのＰ１３Ｋ／Ａｋｔ経路との相互作用を通じ、ＨＥＲ−２はアポトーシスに作用することができ、かつ、アンチセンスＨＥＲ−２オリゴの投与後のＨＥＲ−２の抑制的調節は、カスパーゼ３の切断を誘導することが示された。リガンド−リポソーム−アンチセンスＨＥＲ−２複合体の一例としてＴｆＲｓｃＦｖ−ｌｉｐＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体があり、ここで、ＴｆＲｓｃＦｖは、トランスフェリン受容体と結合するモノクローナル抗体の単鎖Ｆｖフラグメントを表し、ＬｉｐＡは、１：１比のジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオンリポソームを表す。この複合体および類似の複合体が、出典明示により本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／９１４，０４６に詳しく記載されている。リガンド−カチオンリポソーム−ｐ５３複合体の例は、出典明示により本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／６０１，４４４に詳しく記載されており、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：コレステロール、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）：ＤＯＰＥ、ＤＤＡＢ：コレステロールまたはＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ：コレステロールが挙げられる。以下の実施例で示すように、ｗｔｐ５３、ＲＢ９４またはＡＳＨＥＲ−２による処置とアポトーシスマーカーとしての１７ｋＤａサブユニットの存在との間には明らかな相関がある。
【００２６】
カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットのレベルは、選択された治療組成物での処置の前と後双方の腫瘍または患者の血液のサンプルを得ることにより測定することができる。このサブユニットは非処置担癌患者もしくは担癌患者の正常細胞からの血液細胞ペレット、または腫瘍細胞では検出できないが、アポトーシスを誘導する治療薬で処置した後では、血液および腫瘍細胞の双方で検出できることが分かっている。上記で述べたように、１７ｋＤａサブユニットの測定値がバックグラウンド量の少なくとも約１．５〜２倍であるというのが、投与した治療薬の作用によるアポトーシスの指標となる。
【００２７】
カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの発現は、Cell Signaling Technology, Beverly, MAからのものなど、その断片に対する市販の抗体を用い、ウエスタン分析によって判定することができる。
【００２８】
１７ｋＤａ断片のレベルを測定することで、目的の治療の有効性を評価および確認することができる。例えば、以下の実施例に詳しく記載するように、アンチセンスＨＥＲ−２またはスクランブルＨＥＲ−２オリゴヌクレオチドのいずれかを有する抗体フラグメント−リポソーム複合体の多回静脈処置とジェムザール登録商標）の多回処置を施した、ヒト膵臓癌異種移植片腫瘍担持マウスにおける１７ｋＤａ断片の誘導に及ぼす、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム−ＡＳ  ＨＥＲ−２と化学療法薬ジェムザール（登録商標）（ゲムシタビン）の組合せによる処置の作用を判定した。対照としては、ジェムザール（登録商標）単独か抗体フラグメント−リポソーム−アンチセンスＨＥＲ−２オリゴヌクレオチド複合体単独のいずれかを施した動物を用いた。血清サンプルのウエスタン分析は、アンチセンス含有リポソーム複合体とジェムザール（登録商標）で処置した動物では、いずれかの療法単独で処置した場合に比べ、１７ｋＤａサブユニットが相乗作用的に誘導されたことを明らかに示した。この強力な誘導はスクランブルオリゴ含有リポソーム複合体とジェムザール（登録商標）を施したマウスでは明らかでなかった。この試験および実施例で詳しく記載する他の試験は、１７ｋＤａサブユニットが治療効力の非侵襲的薬力学的マーカーとして使用できることを示している。
【実施例】
【００２９】
実施例１
細胞培養物およびからタンパク質を単離する方法
Ａ．細胞培養物において１７ｋＤａ活性型カスパーゼ３断片の存在を検出するため、次の実施例で下記の手順を用いて、生細胞および浮遊している死細胞の双方から全タンパク質を単離した。細胞培養容器からの培地を除去し、保存した。
【００３０】
手順：
冷ＰＢＳ  １０ｍｌの入った容器（例えば、７５ｃｍ２フラスコ）で細胞を洗浄する。このＰＢＳと保存していた培地を合わせる。各フラスコにＰＢＳ  ５ｍｌを加え、ラバーポリスマンで細胞を掻き取る。この細胞を培地／ＰＢＳ溶液に加える。各フラスコにＰＢＳ５ｍｌを加え、洗浄する。顕微鏡下で確認して、残存している細胞の量を調べる。必要に応じて、再びＰＢＳ  ５ｍｌを加え、掻き取る。前記の溶液に加える。
【００３１】
４℃で７分間、２００〜３００ｘｇで遠心分離を行う。
【００３２】
細胞ペレットをそのまま残して遠沈管から上清を除去する。
【００３３】
この細胞ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、１．５ｍｌ容のマイクロ遠沈管へ移す。
【００３４】
再び上記と同様に遠心分離を行う。
【００３５】
細胞ペレットをそのまま残してＰＢＳを除去する。
【００３６】
細胞を溶解させるため、細胞ペレットを３×１０６細胞当たり１５０μｌ〜２００μｌのＲＩＰＡバッファー（新しく調製した阻害剤を含む）に再懸濁させる。ＲＩＰＡバッファーは１×ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ（これは大容量で作製してもよい）である。使用時に以下の保存溶液から阻害剤を加える。
ａ）イソプロパノール中１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ（１０μｌ／ｍｌで使用）
ｂ）アプロチニン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ６２７９、３０μｌ／ｍｌで使用）
ｃ）冷凍アリコートとして１００ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム（１０μｌ／ｍｌで使用）
【００３７】
氷上で２０分間細胞懸濁液をインキュベートし、５〜７分おきにボルテックスにかける（溶液に気泡が生じないようにする）。
【００３８】
２１１／２ゲージのニードルに５〜１０回通す。新しく調製したＰＭＳＦを加え、氷上でさらに２０分間インキュベートする。
【００３９】
４℃で１０分間、１３，０００ｘｇで遠心分離を行う。
【００４０】
上清（細胞溶解物）を１．５ｍｌ容のマイクロ遠沈管に移した後、ペレットをほぐす。
【００４１】
１遠沈管当たり細胞溶解物３０〜５０μｌずつ小分けし、−７０℃〜−８０℃で冷凍する。製造業者のプロトコールに従い、標品としてのＢＳＡとともにＰｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定するのに用いるには、１つを５〜１０μｌとする。
【００４２】
Ｂ．次の実施例の実験では、腫瘍または他のいずれかの動物器官／組織から全タンパク質を単離するために以下の手順を用いた。安楽死の後、組織を速やかに動物から切り出し、過剰量ＰＢＳで１〜３回すすぎ、清潔な無菌器具を用いて氷上に維持しながら、組織を刻んだ。刻んだ組織を１以上の、予め秤量した無菌のポリプロピレンチューブに入れ、すぐに液体窒素中に浸漬することで急速凍結させた。凍結組織は、タンパク質を単離するまで、−７０℃〜−８０℃に維持した。
【００４３】
手順：
ドライアイス上に組織を置き、使用前、数分間、無菌Ｂｅｓｓｍａｎ組織粉砕器を液体窒素中に入れる。
【００４４】
冷却した粉砕器に組織を入れ、微粉末となるまでハンマーにより砕く。
【００４５】
粉砕した組織（粉末）を乾燥および冷却した清潔なスパチュラを用いて手早く回収し、ドライアイス上のマイクロ遠沈管に入れる。すぐに遠沈管および組織を秤量し、およその組織重を求める。
【００４６】
組織を溶解させるため、１００μｇの腫瘍組織当たり６００μｌのＲＩＰＡバッファー（新しく調製した阻害剤を含む）、または１００μｇの正常組織当たり１ｍｌのＲＩＰＡバッファーを加える。ボルテックスにかけて混合し、上記の細胞培養手順に従う。
【００４７】
実施例２
血中のカスパーゼ３  １７ｋＤａ断片の分析のための血漿の調製
以下の実施例で示される手順では、２つの方法のいずれかを用いてカスパーゼ３  １７ｋＤａ断片の評価のために用いる血漿の調製のための血液を採取した。
【００４８】
１つの好ましい実施形態では、動物またはヒトから全血を、４５ＵＳＰユニットのヘパリンナトリウムの入った標準的なヘパリン処理３ｍｌ容試験管（Vacutainer（登録商標）、カタログ番号３６６３８７、Becton Dickson VACUTAINER（登録商標）Systems, Franklin Lakes, NJ）中に採取し、よく混合し、氷上に置いた。血液量が少ない場合には、３ｍｌ容のVACUTAINER（登録商標）チューブに３０μｌの１×ＰＢＳを加えてヘパリンを溶解させ、１／２５〜１／５０の望ましい比率のヘパリン／血液量を無菌マイクロ遠沈管に入れた。この遠沈管に５０〜１００μｌの新鮮な血液を加え、よく混合し、氷上に置いた。この血液／ヘパリン混合物を４℃で１０分間、１０００×ｇで遠心分離を行った（大容量の場合は、遠心分離の前にVACUTAINER（登録商標）チューブから無菌遠沈管に移した）。遠心分離後、血漿を取り出し、別の無菌遠沈管に入れた。この血漿は小分けして−７０℃〜−８０℃で冷凍することができた。
【００４９】
もう１つの好ましい実施形態では、全血をヘパリン処理試験管に採取し、上記のように血漿を得た。１７ｋＤａ画分の検出を妨害する可能性のある他の血液成分を除去するためには、市販の“Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ”（登録商標）クロマトグラフィーカラム(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)を用いて血漿を精製すればよかった。Ｐ６カラム（Ｔｒｉｓ）またはＰ３０カラム（Ｔｒｉｓ）のいずれかを使用できた。しかしながら、好ましい実施形態では、Ｐ６（Ｔｒｉｓ）を使用した。血漿は、ある実施形態でステップ２（残留している充填バッファーを除去するためにカラムを遠心分離する）の前にカラムを、アジ化ナトリウムを含まない１ｍｌ〜１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ＝７．４〜８．０で一度、重力による洗浄をしたこと以外は製造業者のプロトコールに従って精製した。１７ｋＤａタンパク質は透過物中にあった。図１は、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片がこの方法でＰ３０およびＰ６カラムから精製されたことを示す。陽性対照は、アポトーシスを誘導するゲムシタビンでin vitro処置したＰＡＮＣ−１細胞由来のタンパク質溶解物を添加した非精製マウス血漿であった。陰性対照は、遠心分離ではなく重力流を用いてＰ３０カラムから得られた空隙容量タンパク質、主としてアルブミンであった。
【００５０】
血漿の代わりに血清を血液から単離することもできた。この場合にはヘパリンは用いなかった。その代わりに、室温で３０分〜１時間、全血を非ヘパリン処理試験管内で凝固させた後、そのサンプルを０．１×ｇで１０分間遠心分離し、血清を取り出した。血清もまた−７０℃〜−８０℃で保存し、上記のようにＰ６またはＰ３０  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎカラムにより精製することができる。
【００５１】
実施例３
カスパーゼ３  １７ｋＤａの発現に関するタンパク質のウエスタン分析
血液または組織からのタンパク質のウエスタン分析は次のように行った。
【００５２】
電気泳動
全タンパク質細胞溶解物（全タンパク質２０〜６０μｇ）を４℃の同量のＲＩＰＡバッファーで希釈する。よく混合する。
【００５３】
この溶解物溶液と１／６容量の６×電気泳動サンプルバッファー［６×電気泳動サンプルバッファー（不連続系の場合）：７ｍｌの４×Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３．０ｍｌグリセロール、１ｇ  ＳＤＳ、０．９３ｇ  ＤＴＴ、１．２ｍｇブロモフェノールブルーとを混合し、Ｈ２Ｏを加えて１０ｍｌとする（必要に応じて）。０．５ｍｌに小分けしたものを−７０℃で保存する。
【００５４】
５分間煮沸した後、室温で５秒間、１３，０００×ｇでパルスをかける。
【００５５】
すぐにBio-Rad Laboratories (Hercules, CA)製のクリテリオン・プレキャスト４〜２０％ゲル、または１３％ポリアクリルアミドゲル、４〜２０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルなどのいずれかの適当なゲルに載せる。１００Ｖで、ただし、３０ＭＡより高くならないように、ゲルの底部に色素の前線が来るまでゲルの泳動を行う。
【００５６】
あるいは、Ｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ−３０またはＰ−６カラムでのカラムクロマトグラフィーの後、１０μｌまでのヒト血清を、４〜１２％または１０〜２０％プレキャストゲルおよびＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファー(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)を製造業者のプロトコールに従って用い、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動システムにて分離する。
【００５７】
サンプルの調製：
１０μｌのヒト血清（Ｐ−３０またはＰ−６精製後のもの）を４×サンプルバッファー(Invitrogen)および同溶液で１×サンプルバッファーとなるように希釈し、このカラム後サンプルを全量２４μｌ（１ｍｍコームの場合）および３６μｌ（１．５ｍｍコームの場合）とする。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤（安定化した液体形態中で０．５Ｍ  ＤＴＴ）を加えて最終サンプル量の１０％ととした後すぐにこの溶液を６５〜７５℃（好ましくは、７０℃）で加熱し、このサンプルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上に載せる。ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファーを用い、ゲル当たり１００〜２００の一定のボルト数および７０〜１２５ｍＡでゲルの泳動を行う。
【００５８】
転写、免疫ブロット法および検出は上記のように行う。
サンプルバッファー
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー
（４×）１０ｍｌ
グリセロール                    ４．００ｇ
Ｔｒｉｓ塩基                    ０．６８２ｇ
ＴｒｉｓＨＣｌ                  ０．６６６ｇ
ＬＤＳ                          ０．８００ｇ
ＥＤＴＡ                        ０．００６ｇ
Ｓｅｒｖａ  Ｂｌｕｅ  Ｇ２５０  ０．７５ｍｌ（１％溶液）
フェノールレッド                ０．２５ｍｌ（１％溶液）
超純水                          １０ｍｌまで
１×バッファーはｐＨ８．５としなければならない。
ｐＨ調整には酸も塩基も用いてはならない。
ＬＤＳ＝ドデシル硫酸リチウム
還元条件：
以下のように、２０×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー（ＭＥＳ）を希釈し、１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファーを調製する。
十分混合する。
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー（ＭＥＳ）（２０×）  ５０ｍｌ
超純水                                                          ９５０ｍｌ
下層（外部）バッファーチャンバーで用いるための１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー８００ｍｌをとっておく。約６００ｍｌの１×泳動バッファー下層に満たす。泳動直前に、２００ｍｌの１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー当たり５００μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤を加えることで、上層（内部）バッファーチャンバー用の残りの２００ｍｌを調製する。十分混合する。
ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファー：
（２０×）５００ｍｌ
ＭＥＳ                                                ９７．６ｇ（１．００Ｍ）
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸Ｔｒｉｓ塩基    ６０．６ｇ（１．００Ｍ）
ＳＤＳ                                                １０．０ｇ（６９．３ｍＭ）
ＥＤＴＡ                                                ３．０ｇ（２０．５ｍＭ）
超純水                                                ５００ｍｌまで
１×バッファーはｐＨ７．３でなければならない。ｐＨ調整には酸も塩基も用いてはならない。
【００５９】
実施例４
血液または組織からのカスパーゼ３  １７ｋＤａタンパク質の検出のための免疫ブロット法
免疫ブロット法
膜をＢｌｏｔｔｏ  Ａ［Ｂｌｏｔｔｏ  Ａ（一般用）：５％（ｗ／ｖ）粉乳、ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０］中に１時間浸漬することにより、非特異的タンパク質結合を遮断する。全ウエスタンが１日で完了できない場合には、膜を４℃にてＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０を含まない）で覆い、一晩浸漬しなければならない。
【００６０】
この膜を一次抗体中でインキュベートする。使用する一次抗体はCell Signaling Technology (Beverly, MA)（カタログ番号９６６１１５）製の切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）に対するウサギポリクローナル抗体を、好ましくは４℃で一晩、穏やかに揺動させた５〜５０ｍｌ溶液／５０ｃｍ２膜、好ましくは１０〜３０ｍｌ／５０ｃｍ２量のＴＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）の粉乳にて１：５００〜１：２０００、好ましくは１：１０００希釈したものである。あるいは、同じ希釈率のこの一次抗体を穏やかに揺動させながら室温（２７℃）で２〜３時間インキュベートしてもよい。
【００６１】
膜を、各洗浄とも穏やかに揺動させながら１０分間３回、ＴＢＳＴで洗浄する。
【００６２】
穏やかに揺動させながら３０分間、Ｂｌｏｔｔｏ  Ａで１：１０００〜１：１０，０００、好ましくは１：２０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ、抗マウス、または抗ラットＩｇＧ（二次抗体）とともにインキュベートする。
【００６３】
各洗浄とも穏やかに揺動させながら１５分間３回、ＴＢＳＴで洗浄した後、１５分間ＴＢＳ中で洗浄する。
【００６４】
検出はＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ試薬を製造業者の仕様に従って用いて行う。
【００６５】
実施例５
膵臓腫瘍および肝臓における切断カスパーゼ３  １７ｋＤａタンパク質の検出
１つの治療薬として、出典明示により本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／９１４，０４６に詳細に記載されているＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体を用いた。ヒト膵臓癌（ＰＡＮＣ−１）皮下異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスにＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３を２４時間で３回静注した。各注射で複合体は全量８００μｌ／マウス注に４０μｇのｐ５３プラスミドＤＮＡを含んだ。最後の注射から６時間後、動物を安楽死させ、腫瘍および肝臓を摘出し、実施例１、３および４と同様にウエスタン分析用にタンパク質を単離した。非処置動物の腫瘍および肝臓からのタンパク質も対照として含めた。次に、この膜を負荷量が等しいかどうかを調べるため、アクチンに特異的な市販の抗体でプローブした。
【００６６】
図２はＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体を静注したマウスのＰＡＮＣ−１腫瘍に主要な外因性ｗｔｐ５３の発現を示す。また、同じウエスタンブロットを、１７ｋＤａ断片の存在に関してプローブする目的でも用いた。図３の一番下のレーンに示されているように、腫瘍ではこの１７ｋＤａマーカータンパク質の存在下で実質的増強が見られるが、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体で処置した後の肝臓では低レベルの痕跡しか見られず、このことはｗｔｐ５３機能の回復が特に腫瘍においてアポトーシスの誘導をもたらすことを示している。外因性の野生型（ｗｔ）ｐ５３の発現と１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現との間には明らかな相関があった。このパネルのこのパネルの上のバンドは１７ｋＤａサブユニットの１９ｋＤａ前駆体を示している。
【００６７】
他の標的化部分によって指向されるｗｔｐ３を有するリガンド−リポソームも同じ作用を示した。ＰＡＮＣ−１腫瘍においてリポソーム−ｐ５３複合体の標的化リガンドとして葉酸を用いて別の研究を行った。ヒトＰＡＮＣ−１皮下異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスに、葉酸リガンドによって標的化されるＬｉｐＡ−ｐ５３を２４時間で３回静注した。各注射とも、複合体にはｗｔｐ５３ＤＮＡを有するか、またはエンプティーベクターとしての２０μｇのプラスミドＤＮＡ／マウスを含んだ（全量３００μｇ／マウス／注射）。４２時間および６６時間後に動物を安楽死させ、腫瘍を摘出し、実施例１、３および４と同様にウエスタン分析用にタンパク質を単離した。非処置動物の腫瘍からのタンパク質も対照として含めた。次に、この膜をカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットに特異的な市販の抗体で、また負荷量が等しいかどうかを調べるためにアクチンでプローブした。ｐ５３の代わりにエンプティーベクターを有する複合体を注射した動物の腫瘍では、１７ｋＤａ断片の発現は明らかではなく、このことはこれがｐ５３に向けられた現象であることを示している（図３）。
【００６８】
実施例６
血液細胞における切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の検出
血中で１７ｋＤａ断片が検出できれば、ｗｔｐ５３遺伝子療法の有効性を確認する非侵襲的手段として使用できるものと考えられる。このことを評価するため、標的化リガンドとしてＴｆを有するＴｆ−ＬｉｐＡ−ｐ５３を全身処置したマウスから血液を採取した。１００ｍｍ３を超えるＤｕｌ４５異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスにＴｆ−ＬｉｐＡ−ｐ５３（１００μｇ  ｐ５３）を１回静脈投与した。また、このマウスには化学療法薬シスプラチン（ＣＤＤＰ）５ｍｇ／ｋｇの１回注射（腹腔内）も施した。６０時間後、マウスを安楽死させ、約１ｍｌの血液をヘパリン処理試験管に採取した。遠心分離により細胞を分離し、実施例１のように細胞ペレットからタンパク質を単離し、実施例３のように１３％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。カスパーゼ３の１７ｋＤａの切断型活性サブユニットを、実施例４に記載したように抗１７ｋＤａ特異的抗体(Cell Signaling)を用いてウエスタン分析により同定した。
【００６９】
図４の結果は、Ｔｆ−ＬｉｐＡ−ｐ５３の全身処置から６０時間後のＤＵ１４５腫瘍担持マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示している。しかしながら、このサブユニットは処置しなかった腫瘍担持動物からの血液細胞ペレットでは検出できなかった。従って、このことは、外因性ｗｔｐ５３の存在と比較的非侵襲的な手段によって血中で検出可能なこのアポトーシスマーカーの存在との間に明らかな相関があることを示している。
【００７０】
実施例７
切断カスパーゼ３の７ｋＤａ断片の発現が治療に対する腫瘍応答に関連していることの証明
実施例６の結果は、Ｔｆ−ＬｉｐＡ−ｐ５３およびＣＤＤＰでの全身処置から６０時間後のＤＵ１４５腫瘍担持マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示す。正常なリンパ球はｐ５３により誘導されるアポトーシスに感受性がある。従って、血中における１７ｋＤａ断片の出現が本当に腫瘍と関連しているかどうかを調べるために評価を行った。実施例６で記載したＤＵ１４５腫瘍担持マウスに施したものと同じ処置を、ＰＡＮＣ−１皮下異種移植片腫瘍存在を有する、または有さないマウスに繰り返した。さらに、この試験では、血液細胞の存在による複雑化を避けるために血清の使用を試してみた。血清を用いるので、負荷量が等しいかどうかを評価するためにハウスキーピング遺伝子を用いることはできないが、各レーンに等量を負荷した。実施例２に記載したようにヘパリンを用いずに全血１ｍｌから血清を単離し、実施例３および４に記載したようにウエスタン分析を行った。図５に示すように、１７ｋＤａ断片は担癌動物で、さらには担癌動物のみに強く発現した。よって、このバンドの存在はｗｔｐ５３／ＣＤＤＰ治療に対する腫瘍応答と明らかに関連している。
【００７１】
実施例８
アポトーシス指標としてのカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の検出：in vitroでのＡＳ−ＨＥＲ−２  ＯＤＮ処置後
本発明のさらなる特定の実施形態では、切断１７ｋＤａサブユニットがアンチセンス（ＡＳ）ＨＥＲ−２による治療の有効性を証明する手段として腫瘍および／または血液で検出できること、すなわち、アポトーシス経路がＡＳＨＥＲ−２処置によって誘導されることが証明された。（用いたアンチセンスＨＥＲ−２オリゴヌクレオチドは、出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第６，０２７，８９号および米国出願出願番号０９，７１６，３２０に記載されているものである）。そのＰ１３Ｋ／Ａｋｔ経路ＨＥＲ−２との相互作用によりアポトーシスに影響を及ぼし得ることが示されている。従って、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体を介したＨＥＲ−２の抑制的調節はカスパーゼ３の切断を誘導するものと思われた。１７ｋＤａ断片に対する市販(Cell Signaling Technology)の抗体を用い、実施例３および４のようにウエスタン分析によりその発現を検出した。タンパク質溶解物は実施例で記載した手順を用いて得た。トランスフェクション２４時間後、ＡＳＨＥＲ−２またはスクランブル（ＳＣ）ＨＥＲ−２  ＯＤＮのいずれかを有するＴｆＲｓｃＦｖ−ｌｉｐＡ複合体で処置した細胞からのタンパク質は実施例１で記載したように単離した。スクランブルＨＥＲ−２  ＯＤＮは、順序は無作為であるが、アンチセンス分子と同様のヌクレオチド組成を有する。ある実施形態では、ＡＳ−ＨＥＲ−２  ＯＤＮは、ヒトＨＥＲ−２遺伝子をコードする遺伝子センス鎖と開始コドンが相同な、ヌクレオチド１５個のＤＮＡ片である。Ｔ７５フラスコに１．２×１０６のＰＡＮＣ−１細胞を播種し、２４時間後、０．５μＭのＡＳ  ＨＥＲ−２またはスクランブル（ＳＣ）ＯＤＮを含有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ複合体でトランスフェクトした。実施例１で記載したようにウエスタン分析用にタンパク質を単離した。４〜２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルの各レーン当たりの負荷量は４０μｇであった。ニトロセルロース膜に転写した後、ブロットを、実施例３および４のように、カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片に特異的な市販のＡｂおよび負荷量が等しいかどうかを調べるためのアクチンでプローブした。１７ｋＤａより上のバンドは１７ｋＤａサブユニットの１９ｋＤａ前駆体を示す。図６に示すように、カスパーゼ３  １７ｋＤａ断片の誘導は明白であり、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２処置後にアポトーシス経路が刺激されることを示している。非処置またはＳＣ  ＨＥＲ−２  ＯＤＮ処置細胞ではいずれもこのバンドは明でなく、このことは明らかなＡＳ  ＨＥＲ−２特異的作用であることを示している。
【００７２】
また、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳＨＥＲ−２と化学療法薬ジェムザール（登録商標）（ゲムシタビン）の組合せによる１７ｋＤａ断片の誘導もin vitroで評価した。図７で示すように、０．８μＭジェムザール（登録商標）での９時間のＰＡＮＣ−１細胞の処置（上記の通り）はこの断片のバックグラウンドレベルを超える発現をもたらさなかった。これに対し、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２（１μＭ  ＯＤＮ）およびジェムザール（登録商標）（０．８μＭ）での処置は強い１７ｋＤａバンドを誘導したが、このバンドは、同量のジェムザール（登録商標）と組み合わせた同量のＳＣ  ＯＤＮを有する複合体で処置した細胞には存在しなかった。このことは、これが非特異的なＯＤＮまたはジェムザール（登録商標）の作用ではなかったことを示している。アクチンレベルは各レーンとも等量のタンパク質が負荷されていることを示した。
【００７３】
実施例９
ＡＳ  ＨＥＲ−２で処置した後のin vivoにおける切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の検出：in vivo薬力学マーカー
この１７ｋＤａタンパク質はまた、ＡＳ  ＨＥＲ−２治療の有効性を確認するための非侵襲的in vivo薬力学マーカーとしても使用できる。ＡＳ  ＨＥＲ−２またはＳＣ  ＯＤＮ（９ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡの多回静脈処置（全部で１９回）および１１回のジェムザール（登録商標）（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を施したＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍担持マウスにおける１７ｋＤａ断片の誘導に対する組合せ処置（ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２およびジェムザール（登録商標））の作用を調べた。ジェムザール（登録商標）またはＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ  ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体いずれか単独を施す動物を対照として用いた。
【００７４】
実施例２で上記したように、各動物の血液１ｍｌから血漿を単離した。各血漿サンプル３０μｌを４〜２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上泳動させた。カスパーゼ３の１７ｋＤａ切断型活性サブユニットは、実施例３および４で記載したようにウエスタン分析により同定した。血漿サンプルのウエスタン分析は、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ  ＡＳ  ＨＥＲ−２およびジェムザール（登録商標）で処置した動物では、いずれかの治療それ自体で処置した場合に比べ、１７ｋＤａ断片の相乗的誘導を明らかに示した（図８）。この強い誘導はＳＣ  ＯＤＮ（ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＳＣ  ＯＤＮ）およびジェムザール（登録商標）を施したマウスでは明らかでなかった。従って、ｗｔｐ５３またはＡＳ  ＨＥＲ−２いずれかの処置および作用とこのアポトーシスマーカーの存在との間には明らかな相関がある。これらの研究は、このタンパク質が治療効力の非侵襲的薬力学マーカーとして使用できることを示している。
【００７５】
実施例１０
シグナル変換経路のin vitro抑制的調節におけるＡＳ  ＨＥＲ−２に関する切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の発現
腫瘍を標的とするＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体での膵臓癌（ＰａｎＣａ）の処置はＨＥＲ−２の発現（過剰発現でない場合でも）をダウンレギュレーションすることができ、従って、細胞の増殖／生存に負の作用をし、腫瘍細胞の死滅の増強に導くアポトーシス経路を積極的に促進する。ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム複合体を介したＨＥＲ−２のダウンレギュレーションが下流のシグナル伝達経路に影響を及ぼし得ることを証明するため、ＰａｎＣａ細胞系統ＰＡＮＣ−１およびＣＯＬＯ３５７においてこの複合体の、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路およびアポトーシスの成分に作用する能力をウエスタン分析により評価した。これら２つの細胞系統はＨＥＲ−２発現のレベルが異なり、ＣＯＬＯ３５７はＰＡＮＣ−１より有意に高いＨＥＲ−２レベルを発現することから選択した。開始コドン領域（５’−ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＡＣＴ−３’）に相補的なホスホロチオエート配列特異的ＡＳ  ＨＥＲ−２と、対照としての非配列特異的ＳＣ（５’−ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ−３’）ＯＤＮを合成し、Ransom Hill Biosciences (Ramona, CA)による逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対してＡＳおよびＳＣ配列をスクリーニングしたところ、ＡＳ  ＯＤＮはＨＥＲ−２に対してのみ相同性を有していたが、ＳＣ  ＯＤＮとデータベース中の配列には相同性はなかったことが示された。ＰＡＮＣ−１またはＣＯＬＯ  ３５７細胞を６穴プレートに播種し、２４時間後に、１μＭ（ＰＡＮＣ−１の場合）または０．５μＭ（ＣＯＬＯ  ３５７の場合）のＡＳ  ＨＥＲ−２またはＳＣＨＥＲ−２ＯＤＮ（陰性対照）を有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ複合体でトランスフェクトした。オリゴ単独、または相乗作用を見出すためにはするゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））との組合せで細胞をトランスフェクトした。示された時間に細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファー中で溶解させ、タンパク質を測定し、４〜２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で泳動させ（全タンパク質６０μｇ／レーン）、実施例１、３および４で記載したようにウエスタン分析のためにするニトロセルロースに転写した。ＨＥＲ−タンパク質の発現を検出するため、膜を抗ヒトＨＥＲ−２／Ｎｅｕ（Ｃ−１８）ウサギポリクローナルＡｂ(Santa Cruz Biotechnolog)でプローブし、ＥＣＬ(Amersham)によりシグナルを検出した。非処置細胞に比べた場合のタンパク質発現の変化を、全および／またはリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）、ＰＩ３Ｋ経路における中枢的成分（抗ヒトポリクローナルＡｂ， Cell Signaling Technologyを使用）、リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ  １３６）、アポトーシスの調節に重要な因子（抗ヒトウサギポリクローナル抗体，Cell Signaling Technologyを使用）、ならびに切断カスパーゼ３（Ａｓｐ  １７５）（１７ｋＤａサブユニットに特異的なウサギポリクローナル抗体，Cell Signaling Technologyを使用）およびＰＡＲＰ／切断ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボポリメラーゼ、アポトーシスのもう１つのマーカー）（抗ヒトウサギポリクローナル抗体，Cell Signaling Technology使用）（両者ともアポトーシスの下流指標）に関しても確認した。
【００７６】
図９Ａおよび９ＢはＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２単独またはジェムザール（登録商標）との組合せのトランスフェクションの、トランスフェクション８時間後の作用を示す。ＨＥＲ−２タンパク質の半減時間が１０〜２５時間の間で報告されている(Bae et.al Experimental and Molwcular Medicine 33:15-19 (2001))。よって、予測されたように、この初期時間では．ウエスタン分析でＨＥＲ−２タンパク質レベルの変化は検出されなかった。しかしながら、この時点を、初期のアンチセンス特異的作用またはＡＳ  ＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せの何らかの相乗作用を検出する努力目標として選んだ。ＰＡＮＣ−１細胞では（図１０Ａ）、ＡＳ  ＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せによるリン酸化された活性型のＡＫＴに対していくらかの作用が見られた。しかしながら、この初期時間であってもｐＢＡの発現に対してＡＳ  ＨＥＲ−２およびジェムザール（登録商標）による明らかな相乗作用的抑制的調節が明瞭であった。より重要なことでは、カスパーゼ３の切断型（１７ｋＤａタンパク質の出現）およびＰＡＲＰはともにアポトーシス誘導の指標であるが、基本的に併用療法において（しかし、わずかながら単独療法でも同様に）ＡＳ  ＨＥＲ−２  ＯＤＮで処置した細胞においてのみ現れ、ジェムザール（登録商標）単独またはＳＣ  ＯＤＮおよびジェムザール（登録商標）で処置した細胞では現れなかったが、このことはこれらの作用がＡＳ  ＨＥＲ−２特異的なものであることを示している。また、ＣＯＬＯ３５７細胞をトランスフェクション８時間後のタンパク質発現の変化に関して調べた。ＰＡＮＣ−１の場合に見られたように、この時点はちょうどＨＥＲ−２発現の変化も事実上なく、ｐＡＫＴの抑制的調節も最小でしかなかった。しかしながら、ここでもまた、ＡＳ  ＨＥＲ−２単独、およびジェムザール（登録商標）との組合せで処置した細胞は双方とも切断カスパーゼ３（１７ｋＤａサブユニット）と切断ＰＡＲＰが明らかに明瞭であった。このことは、ジェムザール（登録商標）単独またはＳＣ  ＯＤＮとジェムザール（登録商標）の組合せで処置した細胞においてこれらのバンドの痕跡がほとんど、または全くない事実と考え合わせると、やはり、これがＡＳ特異的な作用であることを示す。
【００７７】
８時間の時点で、ＡＫＴのリン酸化活性型（ｐＡＫＴ）はＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２処置の最小の作用しか示さないので、トランスフェクション１６時間後についてもＰＡＮＣ−１細胞を調べた（図１０）。この時点は報告されているＨＥＲ−２タンパク質の半減期よりもまだ短かったので、予測されたようにＨＥＲ−２抑制的調節の証拠はなかった。しかしながら、ＡＳ  ＨＥＲ−２単独、およびジェムザール（登録商標）との組合せで処置した両細胞とも、ｐＡＫＴの有意な抑制的調節が見られ、これは対照では明らかでなかった。ｐＢＡＤは８時間目に比べて１６時間目でもさらに抑制的調節され、そのタンパク質発現はほとんど完全に消失した。ここでもジェムザール（登録商標）の作用が認められた。カスパーゼ３の切断型（１７ｋＤａ断片）およびＰＡＲＰはアンチセンス処置細胞だけでなく、ジェムザール（登録商標）単独またはＳＣ  ＯＤＮおよび薬物で処置した細胞でも明らかであった。しかしながら、ＰＡＲＰに関しては、ＡＳ  ＨＥＲ−２  ＯＤＮで処置した細胞と対照との間でなお有意差があった。ＡＳ  ＨＥＲ−２単独および組合せ処置のいずれでも、ＰＡＲＰの全レベル（切断型および非切断型）はジェムザール（登録商標）またはＳＣ  ＯＤＮおよびジェムザール（登録商標）で見られたものよりも遙かに低かったが、これはおそらく、誘導のより早期であったこととＡＳ  ＨＥＲ−２処置の結果としての継続的な分解のためである。ＡＫＴおよびＢＡＤの双方に関して、これらタンパク質のリン酸化されていない不活性型はＡＳ  ＨＥＲ−２処置によって影響を受けなかったことも述べなければならないが、これは見られた抑制的調節が経路特異的なものであって、処置の全般的な非特異的細胞傷害性の結果ではないという考えを支持するものである。
【００７８】
実施例１１
ＡＳ  ＨＥＲ−２によるＰａｎＣａ腫瘍の全身処置後のin vivoにおける切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の腫瘍特異的局在の検出
そのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路との相互作用により、ＨＥＲ−２がアポトーシスを阻害し得ることが示された。従って、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体を介したＨＥＲ−２の抑制的調節はカスパーゼ３の切断を誘導するはずである。
【００７９】
ＰＡＮＣ−１腫瘍は、４〜６週齢の雌ヌードマウスに一連の継代培養を経たＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍に由来する１ｍｍ３未満の腫瘍片を移植することにより誘導した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達した時、尾の静脈に６日間毎日、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体を静注した。マウス一個体当たりに投与するＯＤＮ（ＡＳまたはＳＣ）の用量は１０ｍｇ／ｋｇ／注射とした。標準的な治療と比較するため、別の動物に化学療法薬ジェムザール（登録商標）（腹腔内）単独（６０ｍｇ／ｋｇ／注射）を一日おきに全部で３回施した。さらに、あるマウスには、上記の用量および投与計画でＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せを施し、また、対照として、あるものには上記の用量および投与計画でＳＣ  ＯＤＮとジェムザール（登録商標）を有する複合体の組合せを施した。最後の注射から２４時間後に全てのマウスを殺し、実施例１のように腫瘍、肝臓および肺を取った。このモデルにおける腫瘍特異的標的化を評価するため、組織におけるＨＥＲ−２および１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現を実施例３および４のようにウエスタンブロット分析により調べた。ＨＥＲ−２レベルに関してもスクリーニングした腫瘍および組織サンプルにおける１７ｋＤａ断片の誘導に及ぼすＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２の作用を調べた。実施例３および４で記載したようなウエスタン分析では、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ  ＡＳ  ＨＥＲ−２単独またはジェムザール（登録商標）との組合せで処置した動物からの腫瘍において１７ｋＤａ断片の誘導が示される（図１１）。この強い誘導はＳＣ  ＯＤＮ（ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＳＣ  ＯＤＮ）およびジェムザール（登録商標）またはジェムザール（登録商標）単独を施したマウスでは明らかでなかった。より重要なこととしては、この１７ｋＤａ切断カスパーゼ３のバンドは肝臓または肺のサンプルのいずれにおいても明らかではなかった。これらの研究は、静脈投与後、この複合体はＡＳ  ＨＥＲ−２  ＯＤＮを優先的に腫瘍に標的化し、送達することができたことを示している。さらに、１７ｋＤａの発現は治療分子が発現された場合にのみ明らかであった。
【００８０】
実施例１２
ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ−ＨＥＲ−２によるＰａｎＣａ異種移植片腫瘍のin vivo化学増感
上記のin vitro研究では、ＰａｎＣａ細胞のＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体での処置はそれらのジェムザール（登録商標）応答を高めることが示されている。この遺伝子療法送達系がヒト癌、例えばＰａｎＣａにとって臨床上信頼できるものとなるためには、in vitroで見られた増感の上昇をn  vivoモデルへと翻訳しなければならない。in vivoＰａｎＣａの処置におけるＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２の有効性は、皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片マウスモデルを用いて評価した。約５０ｍｍ３の皮下異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウス（５〜９個体／１個体当たり２つの腫瘍を有する群）を、ＯＤＮを含有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体９ｍｇ／ｋｇ／注射で１週間に３回処置した。対照としてある動物群には、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２単独、またはジェムザール（登録商標）と、ＳＣ  ＯＤＮを有する複合体との組合せを施した。ジェムザール（登録商標）は、６０ｍｇ／ｋｇを１週間に２回腹腔内投与した。動物には全部で、複合体の静注１８回とジェムザール（登録商標）１２回を施した。図１２に示されるように、ジェムザール（登録商標）単独は腫瘍の増殖に最小の作用だけを示したが、ＡＳ  ＨＥＲ−２単独では効果はなかった。ジェムザール（登録商標）単独または対照ＳＣ  ＯＤＮおよびジェムザール（登録商標）を施した群は統計学的に差がなく、このことはＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＳＣ  ＯＤＮおよびジェムザール（登録商標）による増殖阻害が厳密に薬物の作用であることを示している。しかしながら、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せを施したマウスにおいて腫瘍増殖は実質的に阻害された。併用療法およびジェムザール（登録商標）単独またはＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２単独を施した群の間の差は統計学的に極めて有意である（スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１）。よって、ＡＳ  ＨＥＲ−２を有する複合体の、ジェムザール（登録商標）と組み合わせた静脈投与はＰａｎＣａに対して有効である。
【００８１】
また、動物の体重も毒性の指標としてモニタリングした。体重の低下は見られず、いずれの処置群の間にも有意差はなかった。よって、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２は著しい非特異的細胞傷害性を持たないことが明らかである。従って、この研究は、全身送達された、腫瘍を標的とするリポソームＡＳ  ＨＥＲ−２複合体は、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現によって実証されるようなアポトーシスの誘導により、ＰａｎＣａ腫瘍を化学療法薬に対して増感させ得ることを明らかに示す。
【００８２】
実施例１３
マウス血漿における腫瘍抑制ＲＢ９４検出による１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の誘導
異なる腫瘍抑制遺伝子ＲＢ９４でのin vivo処置も、アポトーシスの指標である切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の発現を誘導することが示されている。網膜芽細胞腫遺伝子ＲＢは、９２８のアミノ酸の核リンタンパク質をコードする腫瘍抑制因子である。この１１０ｋＤａのタンパク質の通常の機能は、ＤＮＡの転写を抑制し、細胞分裂を妨げ、従って、細胞増殖を阻害することである。(Li et.al., Cancer Research 62:4637-44, 2002; Xu et.al., PNAS 91:9837-41, 1994.)
【００８３】
多種のヒト癌において野生型ＲＢを用いた遺伝子置換療法がin vitroおよびin vivoでそれらの腫瘍形成性を抑制または軽減することができた。ＲＢ９４は末端切断型のＲＢであり、全長タンパク質のＮＨ２末端において１１２のアミノ酸残基を欠いており、腫瘍増殖の抑制において全長ＲＢよりもいっそう高い効力がある。ＲＢ９４タンパク質は全長ＲＢよりも長期低リン酸化状態に留まることが分かっている。それは細胞増殖の抑制を担う非リン酸化型または低リン酸化型であることから、これによりＰＢ９８の高い効力を見込める可能性がある。また、このＮ末端切断型ＲＢタンパク質はまた、アポトーシス／生存の細胞制御にも寄与することができることも示唆されている(Tomei, L.D. in Apoptosis: the Molcular Basis of Cell Death, pp 279-316, 1991)。よって、in vivoにおけるＲＢ９４の腫瘍細胞への送達および発現の結果、アポトーシスが誘導できる。ＲＢ９４で処置した担癌マウスの血漿における切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の検出は進行中のアポトーシスの指標となる。
【００８４】
ヒト膀胱癌細胞系統ＨＴＢ−９の皮下異種移植片腫瘍を担持する雌ヌードマウスに、ＲＢ９４遺伝子（４０μｇ／マウス／注射）を有する複合体（８００μｌ／注射）を２４時間内に３回静注した。また、この複合体は、リポソームＤ（１：１ＤＯＴＡＰ：コレステロール）とリガンドとして、Ｔｆ自体またはＴｆＲｓｃＦｖ分子のいずれかからもなった。対照としては、他のマウスに、標的化リガンドを含まない複合体か、またはリガンドとして非腫瘍特異的分子（ＣＤ２）を含む複合体を静注した。これらの中には、腫瘍に向かったり腫瘍に影響を及ぼしたりすると予測されるものはなかった。最後の注射から１６時間後に動物を殺し、採血し、実施例２で記載したように血漿を単離した。切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の発現のウエスタン分析は実施例３および４で記載したように行った。４〜２０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルのレーン当たり４０μｇのタンパク質を泳動させた。図１３に示されるように、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３タンパク質は、腫瘍を標的化でき、腫瘍に作用できるＲＢ９４複合体を施したマウスからの血漿においてのみ明らかであった。よって、アポトーシスの指標である１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の血漿のおける非侵襲的検出は遺伝子療法の全般的な薬力学マーカーとして役立ち得る。この方法は、ｐ５３に関しては簡単ではないが、広く適用できる。
【００８５】
実施例１４
治療後のヒト乳癌患者からの血清における１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の検出
動物モデルで得られた結果がヒトに適用できること、および１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現が治療効果を非侵襲的に評価するために使用できることを確認するため、通常の化学療法を用いて乳癌の処置を受けた２名の患者から相当する血清サンプルセットを得た。これらの血清サンプルは処置前と処置後に得た。血清はＰ６（Ｔｒｉｓ）Ｍｉｃｒｏ−Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ（登録商標）クロマトグラフィーカラム(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて精製した（実施例２）。カラム透過物を血清：ＲＩＰＡバッファーが０．１：１〜１０：１、好ましくは１：１の比率で希釈した。等量（１〜１００μｌ）を、実施例３および４に記載のように、４〜２０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で泳動させ、転写し、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現に関してプローブした。図１４に示されているように、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片は対照（非担癌）ヒト被験者または処置前の患者のいずれからの血清においても明らかでない。しかしながら、このバンドは標準的化学療法後では明らかに存在している。よって、動物モデルで示されたように、アポトーシスの指標である１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現はヒト患者における癌治療（遺伝子、アンチセンス、および化学療法）とも相関がある。従って、放射線療法をはじめ、アポトーシスを誘導するいずれの治療についても、本願に含まれている実施例に記載されているような、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片に関する血液（血清または血漿）の分析が、治療の有効性を監視するための比較的非侵襲的な方法となり得る。ヒト癌患者では、血液（１ｍｌ〜３ｍｌ）をヘパリン処理試験管に採り、４〜２７℃で３〜１０分間、３００〜１０００ｘｇで遠心分離を行って血漿を得ればよいと考えられる。この血漿は（実施例３および４で記載したように）そのまま泳動させることもできるし、あるいは、サンプルの一部２０〜７５μｌを、４〜２７℃（好ましくは１８〜２４℃、最も好ましくは２０℃）で１〜１０分間（好ましくは４分間）、Ｐ６またはＰ３０  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（好ましくはＰ６）により３００〜２０００ｘｇ（好ましくは１０００ｘｇ）での遠心分離によってさらに精製してもよい。透過物を血漿：ＲＩＰＡが０．１：１〜１０：１、好ましくは１：１の比率で希釈した後、４〜２０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で電気泳動を行い、孔径０．１か０．４５μｍ、好ましくは０．２２μｍのいずれかのナイロンまたはニトロセルロース固相支持体膜、好ましくはＰｒｏｔｒａｎ（登録商標）（Ｓ＋Ｓ）に転写する。検出は、１７ｋＤａ断片を、好ましくは１７ｋＤａ断片のみを検出するポリクローナルまたはモノクローナル抗カスパーゼ３抗体を用い、放射性または非放射性手段、好ましくは非放射性、好ましくは非比色定量的、好ましくは化学発光を介する、好ましくはＥＣＬウエスタンブロット検出試薬および分析システム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)（３０秒〜２４時間、好ましくは１分〜１８時間の範囲の時間、限定されるものではないが、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬをはじめとするオートラジオグラフィーフィルムに露光する）で見られるような増強された化学発光によって行��。
【００８６】
もう１つの実施形態では、非ヘパリン処理試験管に採取し、１８〜２４℃で５〜９０分間好ましくは３０〜６０分間凝固させることにより、１〜３ｍｌの全血から単離した血清を用いて１７ｋＤａ断片の存在を検出することができる。次に、この血餅状サンプルを０．０１〜１０００ｘｇ、好ましくは、０．０５〜０．１ｘｇ、最も好ましくは０．１ｘｇで、０．５〜３０分間、好ましくは５〜１５分間、最も好ましくは１０分間遠心分離し、血清を取り出す。この血清は実施例３および４で記載したようにそのまま分析することもできるし、あるいは血漿に関して上記したものと同じかラムで精製し、同じ方法でウエスタンブロット分析により分析することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】Ｐ３０およびＰ６カラムで精製したマウス血漿由来の１７ｋＤａ切断カスパーゼ３サブユニットを示す。
【図２】ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３の静注後のＰａｎｃ−１異種移植片における外因性ｗｔｐ５３の発現および１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。
【図３】Ｐａｎｃ−１異種移植片における、葉酸−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体静注後の経時的な１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。図中、ＵＴ＝対照として用いた非処置動物；Ｆｐｐ５３＝葉酸−リポソームＡ−ｐ５３複合体；およびＦｐＶｅｃ＝エンプティーベクターを有する葉酸−リポソームＡ複合体。
【図４】トランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３複合体およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で処置した後のＤＵ１４５担癌マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示す。
【図５】トランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３を含む複合体とシスプラチンの組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を持つ、または持たないマウス由来の血清における、カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【図６】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体で処置した後のＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体で処置した、かかる細胞と比較して示す。
【図７】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体とジェムザール(Gemzar)（登録商標）の組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置細胞と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体単独、またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
【図８】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せの静脈投与後のＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍担持マウス由来の血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置動物と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体単独またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
【図９】各々、ＰＡＮＣ−１およびＣＯＬＯ３５７細胞のトランスフェクション８時間後の、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはジェムザール（登録商標）との組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。両細胞種ともカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在の明瞭な結果を示した。これらの結果は、非処置細胞の結果およびジェムザール（登録商標）単独またはジェムザール（登録商標）とＴＦＲｓｖＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の組合せで処置した細胞の結果と対照的である。
【図１０】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはＰＡＮＣ−１細胞のジェムザール（登録商標）６時間後トランスフェクションの組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。対照は図９Ａおよび９Ｂと同じである。
【図１１】皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を担持するヌードマウスへの、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体単独またはジェムザール（登録商標）と組み合わせた静脈送達後の腫瘍細胞におけるアンチセンスＨＥＲ−２作用の局在を示す。１７ｋＤａサブユニットの存在を示す矢印は、肝細胞または肺細胞サンプルのいずれにも存在しない腫瘍における中央のバンドを指している。
【図１２】ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍におけるＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せ処置のin vivo作用を、非処置腫瘍、またはジェムザール（登録商標）単独、複合体単独もしくはジェムザール（登録商標）とＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム  Ａ−スクランブルＨＥＲ−２ａ複合体の組合せで処置した腫瘍と比較して示すグラフである。
【図１３】ＲＢ９４腫瘍抑制遺伝子で全身処置した後のマウス血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【図１４】化学療法後のヒト乳癌患者の血清におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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