(57)【要約】本発明は、炎症性腸疾患の予防または処置に使用するための組成物(医薬および栄養製品を含む)に関する。このような組成物はバショウ属(Musa spp.)の果実由来の可溶性繊維の治療的有効量を含む、該可溶性繊維は特にプランテンまたはバナナ由来であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バショウ属(Musa spp.)の果実由来の可溶性繊維の治療的有効量を含む、炎症性腸疾患の予防または処置において使用するための組成物。
【請求項２】
該可溶性繊維が均一化した果実を傾潟して得られる水溶液由来である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該可溶性繊維が果実を沸騰させることに由来する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
該可溶性繊維が澱粉を除去するために処理されている、請求項１、２または３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
該澱粉が澱粉の酵素消化により除去されている、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
該可溶性繊維がエタノールで処理された水溶液の沈殿に由来する、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
該水溶液が８０％エタノールでの沈殿工程に付される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
(１)新鮮な果実を切ってすべての果皮を除き、水溶液中に加えるか；または全果実(果皮を除く)を凍結乾燥し、それを製粉して水溶液中に加えるか；または乾燥させた果実を製粉し、水溶液中に加えるか；または果実から調製した粉末を取って水溶液中に加え；
(２)(１)からの溶液を取り、澱粉がゼラチン状になるまで加熱し、すべての澱粉粒子を分散させ；
(３)熱溶液(２)を冷却し、すべてまたはほとんどの澱粉の消失を確認するまで澱粉消化酵素で加水分解し、；
所望により溶液(３)を次いで８０％エタノールで沈殿させ、洗浄し、遠心分離分離し、アルコール性上清を除去し、残留物を凍結乾燥または噴霧乾燥する
ことにより可溶性繊維を得る、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
(ａ)果皮を剥いた全果実を凍結乾燥し、製粉し；
(ｂ)製粉した物質を沸騰させてすべての澱粉をゼラチン状にし、すべての澱粉粒子を分散させ；
(ｃ)該物質中の澱粉をアミラーゼで加水分解し；
(ｄ)該物質をエタノールで沈殿させ、洗浄して、凍結乾燥または噴霧乾燥をして残留物を取得し；そして
(ｅ)凍結乾燥または噴霧乾燥した残留物を再構成し、沸騰させ、遠心分離分離し；
ここで、遠心分離分離(ｅ)で得られる上清が可溶性繊維を含むものである
ことにより該可溶性繊維が得られている、請求項９記載の組成物。
【請求項１０】
粉末形である、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
該粉末が請求項９(ｄ)の乾燥残留物、または、噴霧乾燥もしくは凍結乾燥した請求項９(ｅ)の上清を含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
さらに香味剤、糖、甘味剤、抗酸化剤、ミネラルまたはビタミンの少なくとも１種を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
クローン病の予防または処置のための、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
該可溶性繊維がバショウ属の果実由来である、請求項１から１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
炎症性腸疾患の予防または処置に使用するための医薬の製造のための、バショウ属の果実由来の可溶性繊維の使用。
【請求項１６】
該医薬が、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物と薬学的に許容される担体を含む、請求項１０記載の使用。
【請求項１７】
該医薬が経口摂取のための液体、カプセルまたは錠剤である、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
炎症性腸疾患の処置法であり、このような処置を必要とする対象にバショウ属の果実由来の可溶性繊維の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
バショウ属由来の可溶性繊維の治療的有効量を含む、炎症性腸疾患の予防または処置において使用するための、栄養製品。
【請求項２０】
飲み物または飲料の形である、請求項１９記載の栄養製品。
【請求項２１】
１ｇ／１００mlから３０ｇ／１００mlの間の可溶性繊維を含む、請求項２０記載の栄養製品。
【請求項２２】
粉末または粉末混合物の形の、請求項１９記載の栄養製品。
【請求項２３】
棒状食品または他の固形食料品の形である、請求項１９記載の栄養製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)の処置、および、特に、食用植物由来の可溶性抽出物でのＩＢＤの処置に関する。
【０００２】
ＩＢＤは、胃腸管の特発性、慢性炎症を述べるために使用される用語であり、２種の主要な表現型を含む：クローン病(ＣＤ)および潰瘍性大腸炎(ＵＣ)。クローン病は、胃腸管のすべての部位に影響するが、特に回盲部に影響する、肉芽腫性炎症により類型化される。潰瘍性大腸炎は結腸特異的であり、広範囲の上皮傷害、腺窩膿瘍および増加した粘膜好中球が関連する。広範囲のＵＣまたは結腸性クローン病の患者は、ＩＢＤ−関連致死の主要な原因を代表する結腸直腸癌を発症する危険性が約１０倍高い。
【０００３】
ＩＢＤの病因はまだ十分に理解されていない。しかしながら、患者での試験および大腸炎のトランスジェニックモデルの両方の研究に基づいて、腸の炎症が非病原性腸内細菌の異常な反応に由来するとの意見の一致が増えてきている。ＩＢＤ病因に細菌が関与するという最も著しい証拠のいくつかは、クローン病患者から採取した回腸粘膜生検における大腸菌(E. coli)の存在を証明する試験に由来する。これらの生物は、細菌病原性の慣用のマーカーがないにもかかわらず、腸の細胞系に侵入でき、アポトーシスを誘導することなくマクロファージ内で生存できる。すべての種の細菌を検出するためのインサイチュ・ハイブリダイゼーションのための広い特異性の１６Ｓリボソームプローブを使用した他の試験により、ＵＣおよびＣＤの両方における粘液層内の未確認細菌の増加が発見された。
【０００４】
ＩＢＤの衰弱性病状およびＩＢＤ−関連死亡率を考慮すると、これらの状態の新規で改善された処置を提供する必要がある。したがって、ＩＢＤの予防または処置に有用な組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０００５】
本発明の第一の局面により、バショウ属(Musa spp.)の果実由来の可溶性繊維の治療的有効量を含む、炎症性腸疾患の予防または処置に使用するための組成物を提供する。
【０００６】
本発明の第二の局面により、バショウ属の果実由来の可溶性繊維の、炎症性腸疾患の予防または処置用医薬の製造のための使用を提供する。
【０００７】
本発明の第三の局面により、炎症性腸疾患の処置法であり、このような処置を必要とする対象にバショウ属の果実由来の可溶性繊維の治療的有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【０００８】
“可溶性繊維”なる用語により、我々は、非澱粉源の可溶性ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む、水性媒体(およびまた所望により血流)に溶解できる繊維を意味する。このような繊維は実質的に消化されることなく、胃および小腸を通って大腸まで行くことができる。該繊維は、次いで、大腸の細菌の発酵可能な基質として作用し得る。異なるタイプの可溶性繊維が果実、とりわけリンゴおよびオレンジ；野菜；オーツ麦のふすま(oat bran)；大麦；およびマメ科植物のような一般的な食料源からもたらされ得る。異なる供給源からの可溶性繊維は異なる量のヘミセルロースまたはペクチンのようなポリサッカライドを含み、かつ異なる量のオリゴサッカライドおよびモノサッカライド誘導体を含む。可溶性繊維は植物源の特性を示すが、品種、熟成度、および地理的原因の因子に反応して変化するであろう。対照的に、不溶性繊維は植物の細胞壁に見られ、植物構造を与える。不溶性繊維の一般的な食料源は、ふすま(wheat bran)およびイチゴのような可食性の果皮および種子を有する果実である。不溶性繊維は消化を助ける。それらは主に膨張性薬剤として働き(短い滞在時間と糞便量の増加をもたらす)；そしてまたそれらが胃腸管を動くにつれ、水を保持する(便を柔らかくし、それにより便秘の防止を助ける)。
【０００９】
本発明の可溶性繊維が純粋形で存在してよく、または、他の化合物(本発明の繊維の抗炎症性特性を阻害しない化合物である限り)と混合してもよいことは認められるであろう。したがって、本発明は、有効量の可溶性繊維および不溶性繊維を含む、組成物も包含する。
本発明により使用する可溶性繊維は非ゼリー状（non-gelling）であることが好ましい。
【００１０】
我々はいかなる仮説にも縛られることを望まないが、本発明者は、可溶性繊維が、その科学分野での理解および実施例１に提示する試験に基づいて、ＩＢＤの処置および予防に有用であると信じる。
【００１１】
彼はＩＢＤ(例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病)が、通常の腸内微生物叢に対する変化した反応を表し得ることを認識している。特に、彼は明白な非病原性“無害”細菌が、それらが腸を覆う粘膜の層を通過し、それら自体が腸の上皮細胞(lining cell)と密接に結びついたとき、炎症の原因となることがあるという可能性を信じている。腸の細菌定着における重要な段階は、粘膜への線毛タンパク質および／または付着因子として既知のタンパク質を介した付着である。これらのタンパク質は、宿主細胞表面糖脂質または糖タンパク質により発現されるグリコシルモチーフを認識するレクチンとして働き、細菌病原性において重要な役割を演じる。粘膜糖タンパク質の異常グリコシル化が、結腸の疾患で証明されており、潰瘍性大腸炎、クローン病および結腸癌において類似の異常が発見されている。本発明者らは、炎症性腸疾患粘膜において発現される炭水化物構造に特異的な付着因子を有する細菌のサブグループが存在し得ると信じている。故に、ＩＢＤで見られる結腸の粘膜糖タンパク質の変化したグリコシル化は、初期の炎症性腸病巣と関係する大腸菌の特異的付着因子に対するレセプターを示し得る。
【００１２】
本発明者は、したがって、炎症性腸疾患関連細菌の付着を、炭水化物構造に対して特徴付けした(実施例１参照)。彼はこのような細菌の細胞表面への付着が、すべてのではないがいくつかの複合炭水化物により遮断できることを発見した。特に彼は、本発明の可溶性繊維が細菌付着の予防に有効であり、したがって、ＩＢＤの予防または処置に効果を有することを発見した。したがって、該可溶性繊維は、細菌レセプターを模倣するかそれと競合でき、それにより細菌の集合と続く炎症を防止すると考えられる。
【００１３】
本発明の可溶性繊維は、低分子量の部分的に加水分解されたガム(例えばグアールガム、イナゴマメ・ガム、コロハ・ガムまたはオクラ・ガムおよび他の適当な低粘性食用ガム)、ウシ顎下腺ムチン(ＢＳＭ)、アルギネートまたは部分的に加水分解されたカアラゲナンに由来し得る。
【００１４】
本発明の可溶性繊維はまた果実、野菜または穀物抽出物またはそれらの活性フラクションに由来し得る。該活性フラクションは、ナス科(Solanaceae)、ミカン科(Rutaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、バラ科(Rosaceae)、バショウ科(Musaceae)、ウルシ科(Anacardiaceae)、ブドウ科(Vitacease)、ヤシ科(Arecaceae)、ツツジ科(Ericaceae)、クスノキ科(Lauraceae)およびイネ科(Poaceae)の果実または植物から選択される果実または穀粒由来であり得る。
【００１５】
本発明により使用できる果実の例は、ナス科、ミカン科、ウリ科、バラ科、バショウ科、ウルシ科、パイナップル科(Bromeliaceae)、ブドウ科(Vitaceae)、ヤシ科、ツツジ科およびクスノキ科から選択されるものである。
【００１６】
ナス科の例は、トマト、例えばイングリッシュ・トマト品種を含む。ミカン科の例は、Citrus paradisii(グレープフルーツ)、Citrus sinensis(オレンジ)、Citrus limon(レモン)およびCitrus aurantifolia(ライム)を含む。ウリ科の例は、Cucumis melo(メロン)、例えばハニーデュー・メロンを含む。ウルシ科の例は、Masagifera indica(マンゴー)を含む。バラ科の例は、Pyrus sylvestris(リンゴ)、Pyrus communis(ナシ)、Anygdalus periscaまたはPrunus persica Var. nectarina(ネクタリン)、Prunus armeniaca(アプリコット)、Prunus domestica(プラム)、Prunus avium(サクランボ)、Prunus persica(モモ)、イチゴおよびブラックベリーを含む。バショウ科の例は、Musa paradisiaca(バナナ)を含む。パイナップル科の例は、Ananas sativus(パイナップル)を含む。クスノキ科の例は、Persea gratisssimaまたはPersea americana(アボカド)を含む。ブドウ科の例は、Vitis vinifera(ブドウ)を含む。ヤシ科の例は、Phoenix dactylifera(ナツメヤシ)を含む。ツツジ科の例は、ブルーベリーを含む。
【００１７】
その抽出物または活性フラクションが、本発明で有用であることが判明した果実の具体的な例は、トマト、グレープフルーツ、メロン、マンゴー、ネクタリン、イチゴ、プラム、ブドウ、ナシ、リンゴおよびアボカドである。野菜の具体例は、ジャガイモ、ニンジン、パースニップ、カブラ、カボチャ、ズッキーニおよびピーマンである。穀類の具体例は、小麦穀粒、大麦穀粒、トウモロコシ粒および米粒である。
【００１８】
しかしながら、本発明者らは、バショウ科(すなわちバショウ属(Musa genera)およびエンセーテ属(Ensete genera))由来の可溶性繊維が特に有用であることを発見した。バショウ属(すなわちバナナまたはプランテン)由来の可溶性繊維がＩＢＤの処置または予防に最も有用である。１１種のバショウ属が知られているが、可溶性繊維は好ましくは栽培品種Musa acuminata、Musa balbisiana、Musa paradisiacaまたはMusa sapientum由来である。
【００１９】
ＩＢＤの処置または予防のための使用に好ましい可溶性繊維は、プランテンまたは緑色(すなわち未成熟)食用バナナ由来である。
【００２０】
本発明の可溶性繊維は、水溶液中の繊維供給源(例えば生プランテン)を均質化し、次いで水性上清を傾潟することによる、その最も単純な形で製造できる。この上清を次いで本発明に使用できる。あるいは、混合物を遠心分離して固形物を、可溶性繊維を含む水溶液から分離できる。この水溶液は、本質的に果汁と、所望により均質化段階中に添加した余分の水から成ってよい。このような水性抽出物を、例えば、標準技術で、例えば、減圧下の蒸発により濃縮し、富化し、または凝縮する。濃縮物の例は、少なくとも２倍濃縮された、より通常は、少なくとも４倍、例えば少なくとも８倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも１０００倍濃縮されたものである。
【００２１】
該水溶液は、その中に可溶性繊維を含む１個またはそれ以上の活性フラクションに、例えば、分子量濾過、または、セファロースゲルのような適当な支持体上のクロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー)または、適当な処置シリカまたはアルミナ、例えばＯＤＳ被覆シリカ上のＨＰＬＣを使用したイオン交換カラムにより；または溶媒抽出により、分画または単離してよい。
【００２２】
本発明の可溶性繊維は、下記の工程の１個またはそれ以上によって製造できる：
(Ａ)該可溶性繊維を、果実(例えばプランテンまたはバナナ)をすりつぶすか薄く切り、次いで果実を水(好ましくは滅菌水)中で２から６０分の間、好ましくは約３０分沸騰させることにより、製造することが好ましい。あるいは、乾燥果実を粉砕し、次いで上記のように水中で沸騰させてもよい。このような程度の沸騰時間は、澱粉を破壊するのを助ける(本発明者らは、可溶性繊維の高澱粉含量が望ましくないことを発見している)。沸騰後、本溶液を遠心分離(例えば１０,０００ｇで１０分)し、不溶性物質を上清から分離すべきである。次いで、本ペレットを廃棄し、上清を本発明の可溶性繊維として使用できる。本上清が有用であるという事実は、果肉(すなわちペレット化した物質)が医学的に有用である可能性があることを示唆した先行文献に鑑みて特に驚くべきことである。例えば、Rabbini et al. (2001) Gastroenterology 121 p554-560)は、バナナ果肉を下痢の処置に使用し得ることを示唆する。
【００２３】
しかしながら、本発明は、１００℃での沸騰が、本発明の可溶性繊維の製造に必須ではないことを発見していることは認識すべきである。実施例は、上記のように均質化した果実が、必ずしもサンプルを沸騰させることなく、使用可能な可溶性繊維を製造できる(特に、下記のような澱粉を除去するための工程を行うとき)ことを説明している。
【００２４】
(Ｂ)好ましい可溶性繊維は、澱粉を加水分解できる酵素の処理工程に付し、それにより、可溶性繊維から澱粉を除去できる。動物、細菌または真菌供給源からのα−アミラーゼ、アミログリコシダーゼまたはプルラナーゼのような澱粉分解酵素を、このような目的で、個々にまたは組み合わせて使用できる。したがって、可溶性繊維を製造するための好ましいプロトコールは、可溶性繊維を沸騰させたプランテンから抽出し、それを澱粉消化酵素(複数もある)で処理し、澱粉を除去し、非澱粉ポリサッカライド(ＮＳＰ)フラクションを製造することを含む。
【００２５】
(Ｃ)本発明の可溶性繊維の製造および富化に用い得るさらなる工程は、沈殿工程である。このような工程を用いて、他の水溶性不純物から可溶性繊維を分離できるように、可溶性繊維を沈殿させることができる。沈殿させた該可溶性繊維を次いで粉末形(下記参照)に保つか、別法として、定義された組成および容量の液体に再懸濁してよい(それにより、可溶性繊維の濃度を調節する)。
【００２６】
本発明者は、可溶性繊維を沈殿させる理想的な方法は、８０％エタノールを該可溶性繊維の粗抽出物に添加することであることを発見した。沈殿のための別法として、透析を用い得ることは認められよう。
【００２７】
本発明の可溶性繊維を単離するための上記工程(Ａ)−(Ｃ)を組み合わせて、可溶性繊維を製造するための有用なプロトコールを提供できることは認められよう。このようなプロトコールは：
(１)新鮮な果実を切ってすべての果皮を除き、水溶液中に加えるか；または全果実(果皮を除く)を凍結乾燥し、それを製粉して水溶液中に加えるか；または乾燥させた果実を製粉し、水溶液中に加えるか；または果実から調製した粉(例えばプランテン粉)を得て、水溶液中に加える。
(２)次いで、(１)からの溶液を澱粉がゼラチンになるまで加熱(例えば１００℃で沸騰)して、すべての澱粉顆粒を消散させる。
(３)該物質をまた澱粉消化酵素で加水分解してすべて／ほとんどの澱粉の除去を確実にする。
(４)残った液体フラクションは、本発明の可溶性繊維として使用し得る非澱粉ポリサッカライド(ＮＳＰ)を含む。
(５)該液体フラクションを次いで８０％エタノールで沈殿させ、洗浄し、遠心分離する(約１０,０００ｇ−低遠心分離力を用い得ることは認められよう)。該アルコール性上清を次いで廃棄し、残留物(可溶性および不溶性ＮＳＰの両方を含む)を凍結乾燥または噴霧乾燥する。該乾燥産物(本発明の可溶性繊維にまた相当する)を次いで貯蔵し、必要時に再構成する。
(６)可溶性繊維が溶液である必要があるとき、該乾燥残留物を水中で沸騰させ；遠心分離し(例えば１０,０００ｇで１０分)、そして上清を必要に応じて使用してよい。
【００２８】
該上清(６)は所望により凍結または噴霧乾燥し、再び、本発明の好ましい(粉末)可溶性繊維を作り得る。
【００２９】
澱粉の除去が関与し、可溶性繊維を製造するための好ましい方法を示す好ましいプロトコールは下記を含む：
(ｉ)プランテン果皮をプランテンから除去し、全果実(果皮を除く)を凍結乾燥し、次いで製粉する。
(ii)該製粉した物質を、約３０分水中で沸騰させ(１００℃)、澱粉をゼラチン状にし、すべての澱粉粒子を消散させる。
(iii)該物質を次いでブタ膵臓アミラーゼで加水分解し(４０℃で)、すべての／ほとんどの澱粉が除去されたことを確実にする。ヒト消費のための可溶性繊維を、細菌または真菌α−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびプルラニナーゼで処理することがより好ましい。
(iv)残った液体フラクションは非澱粉ポリサッカライド(ＮＳＰ)を含む。次いで、これを８０％エタノールで沈殿させ、洗浄し、遠心分離する(約１０,０００ｇ−低遠心力を用いうることは認められよう)。該アルコール性上清を次いで廃棄し、残留物(可溶性および不溶性ＮＳＰの両方を含む)を凍結乾燥または噴霧乾燥する。該乾燥産物(本発明の可溶性繊維にまた相当する)を次いで貯蔵し、必要時に再構成する。
(ｖ)可溶性繊維が溶液である必要があるとき、該噴霧乾燥または凍結乾燥残留物を水中で約３０分沸騰させ；１０,０００ｇで１０分遠心分離し、そして上清を必要に応じて使用してよい。
【００３０】
該上清(ｖ)は所望により凍結または噴霧乾燥し、再び、本発明の好ましい(粉末)可溶性繊維を作り得る。
【００３１】
本発明者は、プランテン由来の可食物質(すなわち果皮以外のすべて)がプランテンの約５０％を構成し、乾燥物質が約３１％を構成することを発見した。本発明者は、(上記のプロトコールにしたがった)ＮＳＰの収率は約３−４％であり、該ＮＳＰの約４０％が本発明の可溶性繊維に相当することを発見した。
【００３２】
本発明者は、可溶性繊維溶液の有効なｐＨはｐＨ７付近であることも発見した。ｐＨの上昇は溶解度を上昇させるが、過剰なアルカリ性は、可溶性繊維中のポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを分解し、効果を減少させることが判明した。
【００３３】
表１は、上記プロトコールの工程(ｉ)−(ｖ)にしたがい得られた典型的な可溶性繊維の糖含量を説明する。可溶性繊維の糖含量の分析は、特定の供給源由来の可溶性繊維の“フィンガープリント”を提供する。プランテンと他の植物(例えばエンドウの殻または小麦)由来の可溶性繊維を区別できる。これ故、好ましいバショウ属由来の可溶性繊維は、表１に示すものと類似の糖含量を有することは認められよう。
【００３４】
【表１】
2006517219.tif 000002
【００３５】
該糖含量が表２に示すものと類似であることがより好ましい：
【表２】
2006517219.tif 000003
【００３６】
本発明で使用するための最も好ましい可溶性繊維は、実施例に記載する。
【００３７】
ＩＢＤは、天然源由来の可溶性繊維(例えばバナナまたはプランテンから製造)を使用して処理できる。あるいは、合成糖を、天然源から製造した可溶性繊維と同じまたは類似の組成で使用できる。
【００３８】
粗調製物が、水溶液中の、沸騰させたまたは均質化しただけの果実由来であることは認められよう。果実固形物を遠心分離することによりペレット化でき、上清(可溶性繊維を含む)を本発明にしたがい使用できる。
【００３９】
臨床上の要請は、このような粗調製物(上記の上清)を実質的に“そのまま”または希釈してでも使用する必要がある場合があることを示す。このときには、上清(希釈していてもいなくても)を、栄養学的理由、医学的理由または処置すべき対象に関する可溶性繊維の嗜好性を調節する目的ででも添加し得る多くの他の薬剤と、混合してよい。
【００４０】
例えば、該可溶性繊維を乳製品(diary product)(例えば牛乳、ミルクセーキまたはヨーグルト)または果汁(例えばオレンジジュースまたは同様のもの)と処方して、付加的利点、すなわち可溶性繊維を含み、したがって、ＩＢＤの患者への軽食として非常に適した、味のよい飲料(drink)／飲み物(beverage)を製造できる。
【００４１】
別法として、粗調製物を経腸栄養法のための栄養液に包含させてよい。例えば、上清を対象への経腸栄養法のための食塩水または水溶液(他のビタミン、ミネラルおよび栄養素を含み得る)と混合し得る。
【００４２】
最初のプロトコール由来の調製物の濃縮が必要である可能性があるか、または、粉末組成が必要であることは認められよう。このときには、粗抽出物／上清を濃縮／脱水する必要がある。
【００４３】
可溶性繊維を含む組成物は、カプセルに封入させるための粉末、顆粒または半固体として製剤できる。半固体の形での提示のために、ポリエチレングリコールのような粘性液体または半固体媒体、またはグリコール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロールのような液体担体、または、植物油または魚油、例えばオリーブ油、ヒマワリ油、紅花油、月見草油、大豆油、冷肝油、ニシン油などに可溶性繊維を溶解または懸濁できる。これを次いで硬ゼラチンタイプまたは軟ゼラチンタイプのいずれか、または、硬もしくは軟ゼラチン等価物から成るカプセルに充填でき、軟ゼラチンまたはゼラチン等価物カプセルが粘性液体または半固体充填剤のために好ましい。
【００４４】
本発明の可溶性繊維を含む粉末は、ＩＢＤの予防または処置に使用できる薬学的または栄養学的製品の製造に特に有用である。
【００４５】
凍結乾燥または噴霧乾燥が、本発明の可溶性繊維を含む粉末の製造のための好ましい方法に相当する。噴霧乾燥は良好な流動特性と速い溶解特性を有する、自由流動性顆粒粉末をもたらす。
【００４６】
上記のプロトコールにより製造した噴霧乾燥または凍結乾燥粉末が、本発明の好ましい粉末可溶性繊維に相当することは認識されよう。好ましい粉末は、工程(ｉ)−(ｖ)(上記参照)により製造した、再構成し、続いて凍結乾燥または噴霧乾燥した可溶性繊維に由来する。
【００４７】
粉末の可溶性繊維を、透明／半透明低粘性飲料／飲み物として再構成できる。再構成は、上記のような水、乳製品または果汁中でよい。粉末を小袋に包装し、対象が、必要なときまたは望むときに飲料として再構成してよいことは認識されよう。
【００４８】
粉末混合物は本発明の好ましい態様に相当する。このような混合物は、さらなる成分と混合された可溶性繊維(上記のような)を含む。このような成分は栄養学的または医学的利用からまたは嗜好性を改善するために添加し得る。該粉末可溶性繊維を種々のサイズのグラニュー糖と混合し、種々の甘さの自由流動性粉末混合物を得ることができる。
【００４９】
あるいは、天然甘味剤または人工甘味剤(例えばアスパルテーム、サッカリンなど)を、低カロリー／減少させたカロリーの甘い飲料として再構成させるために、可溶性繊維と混合できる。粉末混合物はミネラル・サプリメントを含んでいてよい。該ミネラルはカルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛、ナトリウム、鉄およびそれらの種々の組み合わせのいずれか１つであってよい。
【００５０】
粉末混合物はまたクエン酸およびリン酸緩衝剤のような緩衝剤、および、炭酸塩、例えば、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸アンモニウムのような重炭酸塩、および固形酸、例えばクエン酸または酸シトレート塩から形成された発泡性剤も含み得る。
【００５１】
該可溶性繊維は、食品強化剤または添加剤として提示でき、または、食品、例えば、機能性食品または栄養補助食品に包含できる。このような製品は、主食としておよびそれらが臨床的に必要であり得る事情下で使用できる。
【００５２】
該粉末は、棒状スナック食品、例えばフルーツ・バー、ナッツ・バーおよびシリアル・バーに包含されてよい。棒状スナック食品の形への提示に関して、該粉末を乾燥トマト、干しブドウおよび種なし干しぶどう(sultana)のような乾燥果実、ピーナッツまたは、オート麦および小麦のような穀物から選択される任意の１種またはそれ以上の成分と混合できる。
【００５３】
可溶性繊維を医薬として使用するための薬剤(処方箋または他のものが必要である)として有利に製剤することが認識されよう。
【００５４】
粉末可溶性繊維または濃縮液体可溶性繊維をまた錠剤、ロゼンジ、甘いものまたは経口摂取のための他の食料品に包含できる。このような粉末可溶性繊維または濃縮液体可溶性繊維を、消化され、長期間にわたり可溶性繊維を腸に放出できる、遅延放出カプセルまたはデバイスに包含できる。
【００５５】
可溶性繊維をまたマイクロカプセルに入れてよい。例えばカプセル封入は、カルシウム−アルギネートゲルカプセル形成によるものであり得る。カッパ−カラゲナン、ゲランガム、ゼラチンおよび澱粉を、マイクロカプセル化の賦形剤として使用してよい。
【００５６】
粗調製物、液体濃縮物、粉末などは、ＩＢＤを処置するための既知の治療剤と組み合わせ得る。本発明の可溶性繊維それ自体、非常に有効な組み合わせ治療に使用できる。溶液中の可溶性繊維が、ＩＢＤを処置するための他の治療剤の理想的な媒体として働き得ることは認識されよう。
【００５７】
該可溶性繊維は、プロバイオティック部分を含む、組み合わせ／共生的治療(synbiotic theparies)に包含されていてよい。多くのプロバイオティック混合物に含まれる細菌は粘着性特性を有さず、したがって、プランテン可溶性繊維の包含により影響されない。
【００５８】
本発明の組成物は、規定された濃度の可溶性繊維を含む、単位投与形の形で提示できる。このような単位投与形は、所望のレベルの生物学的活性を達成できるように選択できる。
【００５９】
対象が必要とする可溶性繊維の量は、製剤、投与形態、可溶性繊維の物理化学的特性および可溶性繊維を単剤治療としてまたは組み合わせ治療において使用するかに同様に依存する、生物学的活性および生物学的利用能により、決定する。一般に、成人への一日量は、０.１ｇから１００ｇの凍結乾燥または噴霧乾燥粉末(いかに製剤されていても)の間であるべきであり、より好ましくは一日量は１ｇから３０ｇの間(例えば必要に応じて約５ｇ、１０ｇまたは１５ｇ)である。
【００６０】
本発明の固体または半固体投与形は、約１０００mgまでの、例えば約８００mgまでの可溶性繊維含有乾燥抽出物を含んでいてよい。
【００６１】
投与の頻度は、上記因子および特に処置すべき対象内での可溶性繊維の半減期により影響を受けるであろう。例えば、該半減期は対象の健康状態、腸運動性および他の因子により影響を受けるであろう。
【００６２】
該可溶性繊維は、錠剤またはカプセルのような医薬製剤に包含されたとき、特に有用である。このような製剤は、生物学的利用能からそれが示されるとき、腸溶性コーティングされている必要があることがある。製薬産業で通常用いられているような(例えばインビボ実験、臨床試験など)既知の方法を使用して、医薬組成物の具体的な製剤および厳密な治療レジメン(例えば該化合物の一日量および投与頻度)を確立できる。
【００６３】
慣用の“栄養補助食品”法を用いて、該可溶性繊維を含む液体飲料、粉末および食料品を作ることができる。
【００６４】
一日投与量は１回投与として与えてよい(例えば経口接種のための毎日の錠剤または一回の液体飲料として)。あるいは、使用する該可溶性繊維を１日２回またはそれ以上投与する必要があることがある。例として、０.１−２０ｇの噴霧乾燥可溶性繊維(好ましくは０.３−１０ｇの噴霧乾燥可溶性繊維およびより好ましくは０.５−３.０ｇ)を含む１００mlオレンジ飲料を一日を通して喉の渇きを癒すために使用し、それにより必要量を送達してよい。
【００６５】
可溶性繊維を添加した栄養製品は、本発明の可溶性繊維を、ＩＢＤを有するまたは発症のリスクを有する対象に提供する理想的手段に相当することは認識されよう。したがって、本発明の第４の局面において、バショウ属の果実由来の可溶性繊維の治療的有効量を含む、炎症性腸疾患の予防または処置に使用するための栄養製品を提供する。
【００６６】
該栄養製品は：
(ａ)透明で、低粘性で、水様で、安定で、直ぐ使用できる、瓶入り、炭酸または非炭酸飲料であるか；またはバショウ属の果実由来の非ゼリー状可溶性繊維を含む、再構成のための濃縮透明溶液である；
(ｂ)バショウ属の果実由来の非ゼリー状可溶性繊維を含む、飲用液として、水または他の任意の経口摂取可能液体で再構成すべき粉末／顆粒混合物であるか；または
(ｃ)食料品(例えばチョコレート・バー、ロゼンジなど)に混合された粉末／顆粒混合物
を含んでいてよい。
【００６７】
該栄養製品は上記の通りであってよく、水溶性ビタミン、付加的ミネラル・サプリメント、栄養学的化合物、抗酸化剤または香味剤を含んでいてよく、また含んでいなくてもよい。
【００６８】
本発明は、さらに、下記のような添付の図面を参照して例示の方法でさらに説明する：
図１は、粘膜に付着している大腸菌による、線毛発現(fimbrial expression)を、実施例１の電子顕微鏡(いくつかは矢印で示す)を使用して説明する；
図２は、実施例１のクローン病の患者における粘膜に付着している細菌の増加を示すグラフである；
図３は、実施例１のコントロール患者から単離された大腸菌と比較して、凝集活性を有するクローン病組織から、有意に多い大腸菌が単離されることを示す；
図４は、大腸菌の凝集株が、大腸菌の非凝集株よりも有意に高いレベルで、Ｉ−４０７と付着し、侵入できることを示す(これは、細菌付着の阻害の評価のための、血球凝集アッセイの使用を確認する)；
図５は、実施例１において、プランテン可溶性繊維が細胞への細菌付着を有意に減少させることを説明するグラフである；そして
図６は、実施例１において、プランテン可溶性繊維が細胞への細菌侵入を有意に減少させることを説明するグラフである。
【００６９】
実施例１
本発明者は、本実験を粘膜層内；粘膜と密接に結合している；または粘膜層に侵入しているいずれかの細菌集団の存在に関するＩＢＤ生検の検査の目的で本研究を行った。培養細菌を十分に特徴付けし、大腸菌と同定されたものをそれがヒト赤血球に付着する能力に関して試験した。付着性大腸菌をさらに病原性遺伝子および既知の付着因子の存在、それらの付着特性およびヒト腸細胞系に侵入するそれらの能力に関してさらに特徴付けした。
【００７０】
１.１  材料および方法
１.１.１  患者
６０名の患者を試験した。１８名が潰瘍性大腸炎、１４名がクローン病を有し、２８名が正常コントロールであった。生検標本を結腸鏡検査またはＳ状結腸鏡検査中に大多数の患者から取り、一組の生検標本を慢性無力症の正常患者の切除サンプルから取った。
【００７１】
１.１.２  細菌培養
４つの生検標本を、切除組織サンプル(１名の患者)または結腸鏡検査(５９名の患者)のいずれかから採取した。生検標本を１０mlの生理食塩水に入れ、研究室に氷冷して運んだ。該生検標本を、５００μlの０.０１６％ジチオスレイトール(ＤＴＴ)溶液を含む１.５mlエッペンドルフに１５分入れ、粘液層を除去した。５０μlのＤＴＴ上清をMacConkey寒天上に播き、３７℃で２４時間インキュベートした。該生検標本を次いで５００μl滅菌食塩水または５００μlゲンタマイシン(５０ml／Ｌ)のいずれかを含む２個の１.５mlエッペンドルフに分けた。３０分後、該生検標本を、それらを５００μl食塩水を含む１.５mlエッペンドルフに連続的に移すことにより４回洗浄した。４回目の洗浄後、各エッペンドルフからの１個の生検標本(すなわちゲンタマイシン処置生検標本から１個および非ゲンタマイシン処置生検標本から１個)を滅菌蒸留しかつ脱イオン化した水に入れ、各エッペンドルフ由来の他方を５００μl食塩水に入れた。さらに３０分後、最終エッペンドルフの各々由来の５０μl溶液をMacConkey寒天プレートに播いた。２４時間、３７℃でインキュベーション後、コロニー計数を行った。
【００７２】
１.１.３  細菌同定
コロニー計数を行った後、細菌コロニーを特徴付けし、各々のコロニータイプの５つを栄養寒天で継代培養した。グラム染色を行い、グラム陰性桿菌と同定されたすべての細菌を、さらにＡＰＩ２０Ｅ細菌同定キット(BioMerieux, Fr)を使用して同定した。各継代培養したコロニー由来の細菌サンプルを、Protectビーズ上で−８０℃で貯蔵した。
【００７３】
１.１.４  抗生物質耐性アッセイ
１個の十分に単離された細菌コロニーを、栄養寒天プレートから取った細菌コロニーを使用して、５mlの滅菌食塩水に懸濁した。１００μlの該細菌懸濁液を、感受性寒天プレート上に播いた。抗生物質ディスクを次いで該プレート上に分配した。下記の抗生物質を使用した：ゲンタマイシン、トリメトプリム、スルホノミド、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、ナラジキシン酸(Naladixic acid)、クロラムフェニコール。該細菌を３７℃で一晩インキュベートした。ディスクの周りの細菌生育の直径を測定し、抗生物質に対する細菌の耐性を計算した。
【００７４】
１.１.５  最大線毛発現のための細菌増殖条件
最大線毛発現は、細菌コロニーを一晩栄養寒天上で増殖させ、滅菌食塩水に懸濁し、次いで室温に４８時間置いた後に見られた。線毛発現はＥＭを使用して確認し、図１に見ることができる。
【００７５】
１.１.６  血球凝集アッセイ
血液をヒト健康ボランティアから採り、ヘパリン添加容器中に入れた。血液を、ＰＢＳで、１０００rpmで５分遠心分離し、ペレットを新たなＰＢＳに再懸濁することにより３回洗浄した。３回目の洗浄後、該ペレットをＰＢＳに再懸濁し、１％赤血球細胞溶液を得た。大腸菌として同定された細菌、およびＣＤ−回腸関連大腸菌の５株を増殖させ、最大線毛発現を得た(上記参照)。細菌を食塩水に懸濁し、MacFarland標準５と同じＯＤを得た。細菌懸濁液の２倍希釈を、９６ウェルＵ底血球凝集プレート(Dynex technologies)中で行い、最終容量１００μl／ウェルとした。５０μlの１％赤血球細胞を各ウェルに添加した。該プレートを優しく軽くたたいてウェルの内容物を混合させ、室温で約２時間放置した。
【００７６】
１.１.７  ヒト赤血球パネルを使用した血球凝集アッセイ
全大腸菌を、一団の既知の抗原型の赤血球に対して試験した。これらはＩＤパネル１(Lewis、Lutheran、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｋ、Kidd、Rhesusおよびその他を含む２６抗原)、A1rr細胞、Brr細胞(ＡＢＯ血液型)(ＮＢＳ試薬、Liverpool, UK)および成人ii細胞(Diagnostics Scotland, Edinburgh, UK)を含んだ。
【００７７】
１.１.８  異なるオリゴサッカライド／繊維での血球凝集アッセイ
細菌性血球凝集を、一団のオリゴサッカライド／繊維を使用して行った。試験した構造は：マンノース(０.４Ｍ)、フコース(０.４Ｍ)、ガラクトース(０.４Ｍ)、フェチュイン(５０μg／ml)、アシアロフェチュイン(５０μg／ml)、ウシ顎下腺ムチン(ＢＳＭ)、加水分解ＢＳＭ、ヒツジ顎下腺ムチン(ＯＳＭ)、ラクトース、ラクツロース、シアリルＴｎ(siayl Tn)、ＧａｌＧａｌＮＡｃ、Ｎ−グリコリノイラミン酸(N-glycolyneuraminic acid)、Ｎ−アセチルノイラミン酸、３'−ｎ−アセチルノイラミニル−ラクトース、６'−ｎ−アセチルノイラミニル−ラクトース、メリビオース、プランテン、スタキオース、牛乳由来ガラクト−オリゴサッカライド、ラフィノース、ペクチン、ポリガラクツロン酸およびパララクト−ｎ−ヘキサオースであった。
【００７８】
１.１.９  ＰＣＲ
凝集性大腸菌として同定された細菌を、大腸菌の毒性株に関連する病原性および既知の付着因子遺伝子の両方に関してスクリーニングした。これらは：ＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｅ、ＳＴＩ、ＳＴII、ＬＴＩ、Ｅｉｎｖ、Ｅａｇｇ、ＣＮＦ１、ＣＮＦ１１、ＥａｅＡ、ＥａｅＢ、ＥＡＦ、Ｂｆｐ、ＣＤＴ、ＥＡＳＴ、Ｈｌｙ、ＨｌｙＡ、ｐａｐ、ｓｆａ、ａｆａ、Ｍ−凝集素、ｆｉｍＨであった。
【００７９】
１.１.１０  パルス・フィールド・ゲル電気泳動
大腸菌の凝集性株を、クロナリティー(clonality)に関してパルス・フィールド・ゲル電気泳動を使用して試験した。
【００８０】
１.１.１１  付着および侵入アッセイ
凝集性細菌を、腸細胞系Ｉ−４０７およびＨＴ−２９に付着し、侵入するそれらの能力に関して試験した。シゲラ・ソニ(Shigella sonni)を侵入に関する陽性コントロールとして使用し、付着性であるが非侵入性大腸菌である大腸菌Ｋ１２を侵入の陰性コントロールとして使用した。細胞を、１０％(vol／vol)熱不活性化ウシ胎児血清(Sigma, UK)、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ(ダルベッコ改変イーグル培地−Sigma, UK)に、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。単層を２４−ウェル組織培養プレート(Costar, UK)に４×１０５細胞／ウェルで播いた。細胞を２０時間インキュベートした。該単層をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄した。細菌を線毛発現を最大にするために増殖させた(食塩水中４８時間)。各単層を、抗生物質なしの培養培地中、約７×１０６細菌／ウェルで感染させた。３時間、３７℃でインキュベーション後、該単層を３回ＰＢＳで洗浄した。細菌侵入を測定するために、ウェルをゲンタマイシン(１００μg／ml)を含む新鮮培養培地で処理した。この目的はゲンタマイシンがヒト細胞を浸透できないため、すべての細胞外細菌を殺すことである。１時間、３７℃の後、該単層を３回滅菌ＰＢＳで洗浄した。単層を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有脱イオン水を５分添加することにより融解させた。該細胞融解物の１０倍希釈を行い、５０μlを栄養寒天プレート上に播いた。プレートを３７℃でインキュベートし、コロニー形成単位(ＣＦＵ)を２４時間後に計数した。細菌付着を、ＣＦＵ計数を希釈因子で掛けて計算し、これはまたウェルの接種に使用した細菌の総数のパーセントとしても示した。細菌侵入を、ゲンタマイシン処置で生存した付着細菌のパーセントとして定義した。細菌付着および侵入の経時的変化を、５時間の期間にわたり、Ｉ−４０７細胞でのみ測定した。
【００８１】
１.１.１２  細菌の付着および侵入におけるプランテン可溶性繊維の影響
大腸菌の付着および侵入における、プランテンと細菌のプレインキュベーションの影響を調べた。
【００８２】
１.１.１２.１  凍結乾燥プランテン可溶性繊維の調製：果皮をプランテンから除去し、全果実(果皮を除く)を凍結乾燥し、次いで製粉した。次いでこれを約３０分、水中で沸騰(１００℃)させ、澱粉をゼラチン状にし、すべての澱粉顆粒を消散させた。次いでこれをブタ膵臓アミラーゼで(４０℃で)加水分解し、すべての澱粉の除去を確実にした。該非澱粉ポリサッカライド(ＮＳＰ)フラクションを８０％エタノールで沈殿させ、洗浄し、遠心分離した(約１０,０００ｇ)。該アルコール性上清を次いで廃棄し、残留物(可溶性および不溶性ＮＳＰの両方を含む)を凍結乾燥した。該凍結乾燥サンプルは、本発明の粉末可溶性繊維に相当する。
【００８３】
１.１.１２.２  プランテン可溶性繊維溶液の調製：可溶性繊維のサンプルが必要なとき、凍結乾燥残留物(１.１.１２.１)を水中で３０分沸騰させ、１０,０００ｇで１０分遠心分離し、上清をプランテンの可溶性繊維として取った。
【００８４】
１.１.１２.３  精製凍結乾燥プランテン可溶性繊維の調製：該上清(１.１.１２.２)を凍結乾燥し(上記のように)、本発明の好ましい粉末可溶性繊維を形成した。
【００８５】
１.１.１３  付着および侵入アッセイに使用するための細菌の調製。
最大線毛発現を達成するために滅菌食塩水で増殖させている１mlの細菌培養を、２個のエッペンドルフにピペットで取った。該試験管を１００００ｇで５分遠心分離した。上清を廃棄し、１本の試験管からのペレットを１mlの可溶性プランテン溶液に再懸濁した。他方のペレットを１ml滅菌食塩水に再懸濁した。両方のエッペンドルフを細胞スピナー(cell spinner)で３０分回転させた。該細菌懸濁液を前記のように遠心分離し、ペレットを２回滅菌食塩水で洗浄した。該ペレットを最後に１mlの滅菌食塩水に溶解し、前記のような付着および侵入アッセイに使用した。
【００８６】
１.２  結果
１.２.１  クローン病における増加した粘膜に付着している細菌
細菌を「方法」の欄に記載のような微生物学的技術を使用して同定した。
【００８７】
継代培養した合計７０７細菌コロニーのうち、４０６がグラム陰性であり、これらの２９２が大腸菌として同定された。ゲンタマイシン、トリメトプリム、スルホノミド、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、ナラジキシン酸およびクロラムフェニコールのような抗生物質に対する感受性を試験し、該細菌をさらに特徴付けした(データは示していない)。
【００８８】
粘液−付着細菌(mucus-associated bacteria)を、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)−処置生検サンプルの上清から培養した(ＤＴＴは生検サンプルから粘液層を除き、粘膜を暴露する)。粘液−付着細菌の数の有意な差は患者グループ間で見られなかった(データは示していない)。しかしながら図２は、コントロール患者と比較してクローン病の患者で粘膜に付着している細菌が有意に増加することを示し、ＣＤ患者の７９％(１１／１４)が粘膜付着細菌が陽性であり、比較してコントロール患者では３９％(１１／２８)であった(Ｐ＝０.０３８；カイ二乗)。粘膜付着細菌は、表面粘液をＤＴＴ処理および徹底的な洗浄により除去した後に、粘膜表面から回収できるものである。
【００８９】
このデータは、発明者の推測通りに、ＩＢＤにおいて粘膜に付着している細菌が増加していることを示す。
【００９０】
１.２.２  ヘマグルチニンを発現する粘膜付着大腸菌
図３は、クローン病組織から単離された大腸菌が、コントロール患者から単離された大腸菌と比較して、有意に高い血球凝集活性を有することを説明する。血球凝集性大腸菌は、ＣＤ患者の３９％(５／１４)で同定され、比較してコントロール患者は４％(１／２８)であった(Ｐ＝０.０１)。ＵＣ患者からの、凝集することができる細菌の数もまた増加していた。
【００９１】
健常ヒトボランティアからの赤血球(ｒｂｃ)を凝集できる細菌がまた輸血センターから供給された既知の抗原型の一団の赤血球を凝集できることも判明した。大腸菌のクローン病関連株はまた赤血球パネルに選択的結合することが示された。この大腸菌の結合パターンは、それが血液型‘Ｍ’特異的付着因子を有することを示唆した。この細菌は、ＰＣＲを使用してさらに特徴付けした。
【００９２】
これらのデータは、粘膜付着大腸菌が、腸細胞と、細胞表面上のグリコシル化タンパク質との相互作用の手段により相互作用することを示唆する。これは、細菌がＩＢＤにおける腸に侵入する機構に関する発明者の仮説をさらに確認する。
【００９３】
１.２.３.  培養している腸細胞に付着および侵入する粘膜付着大腸菌
凝集性大腸菌の１６の異なる株を、１.１.４、１.１.９および１.１.１０の方法にしたがい特徴付けし、方法１.１.１１にしたがう付着および侵入アッセイに付した。ヒト結腸細胞系、ＨＴ２９およびヒト腸細胞系、Ｉ−４０７を本実験に使用した。
【００９４】
すべての凝集性大腸菌は、ＨＴ２９およびＩ４０７細胞系の両方に付着したが、侵入は、概ね、Ｉ４０７細胞にのみ見られた(表２参照)。侵入および付着は、非ゲンタマイシン処置およびゲンタマイシン処置細胞(ｎ＝４)から回収したコロニー形成単位(ＣＦＵ)の平均数により計算した。(ゲンタマイシンは非侵入大腸菌をすべて殺すが、腸細胞内に浸透できないため、侵入している大腸菌は無傷のままである)。ＬＦ８２は回腸のクローン病病巣から単離された付着性および侵入性大腸菌(ＡＩＥＣ)である。シゲラ・ソニを侵入に関する陽性コントロールとして使用し、大腸菌Ｋ１２を侵入の陰性コントロールとして使用した。それは細胞にマンノース−結合性付着因子を介して付着するが、非侵入性であることが既知である。
【００９５】
さらなる実験を行い、凝集性大腸菌(例えば、ＩＢＤの対象由来のもの)と非凝集性大腸菌を、Ｉ−４０７細胞と付着し侵入する能力に関して比較した。図４は、細菌が凝集する能力と、腸細胞への付着の間の相関を示す。これは、したがって、ＩＢＤにおける細菌が、糖タンパク質が関与する機構を標的とすることにより、粘膜を侵すことをさらに示唆する。
【００９６】
【表３】
2006517219.tif 000004
【００９７】
１.２.４  ＩＢＤの対象から単離された細菌における可溶性繊維の効果
可溶性繊維(１.１.１２.２にしたがい調製)および他の炭水化物を、ＩＢＤの対象由来の細胞の凝集、付着および侵入を調節するそれらの能力に関して試験した。
【００９８】
１.２.４.１  凝集：すべての例で、可溶性プランテン繊維およびウシ顎下腺ムチン(ＢＳＭ)により凝集は阻害されたが、シアル酸およびフコースを除去するためのＢＳＭの穏やかな酸加水分解後には阻害されなかった。
【００９９】
マンノース、フコース、ガラクトース、ラクトース、ラクツロース、シアリロシル−Tn(syaylosyl-Tn)、Ｇａｌベータ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−グリコリノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、３'−ｎ−アセチルノイラミニル−ラクトース、６'−ｎ−アセチルノイラミニル−ラクトース、メリビオース、スタキオース、牛乳由来ガラクトオリゴサッカライド、ラフィノース、ポリガラクツロン酸およびパララクト−ｎ−ヘキサオース、フェチュイン、アシアロフェチュイン、ヒツジ顎下腺ムチンおよびペクチンを含む他の炭水化物および複合糖質は非阻害性であった。
【０１００】
１.２.４.２  プランテン可溶性繊維により細菌付着の阻害：細菌株９、１２および１４(表３に示す通り)が、図４は、プランテン可溶性繊維が細菌株９および１２のＩ−４０７細胞への細菌付着を有意に減少させることを説明する。株１４では有意な差は見られなかったが、可溶性繊維の存在下または非存在下で、この株の限定した付着が見られた。
【０１０１】
１.２.４.３  プランテンによる細菌侵入の阻害：図５は、３種の細菌株(表２の株９、１２および１４)の各々とプランテン可溶性繊維のプレインキュベーションにより細菌侵入が減少することを説明する。
【０１０２】
１.３  考察
これらのデータは、クローン病のようなＩＢＤが、増加した粘膜に付着している大腸菌の普及と関係することを証明する。これらの大腸菌は既知の病原性遺伝子を欠くが、高い割合でヘマグルチニンを発現するものを含み、これがそれらを腸上皮細胞系に付着させ、侵入させる。本発明者は、該細菌の付着性および侵入性性質が炎症性状態をもたらし、それによりＩＢＤの特性を表すものであると信じる。
【０１０３】
本発明者は、ＩＢＤと、ＩＢＤの対象由来の細菌の凝集する能力の間の関連を確立した。したがって、ＩＢＤにおける細菌が炭水化物により制御されるはずであると推論し、多くのオリゴサッカライドを試験して、それらがＩＢＤにおける大腸菌の負の効果を阻害できるか否かを評価した。ほとんどの試験した糖／オリゴサッカライドは該細菌の調節ができなかった。しかしながら、驚くべきことに、プランテン由来の可溶性繊維が大腸菌を阻害した。これにより、発明者は、本発明の可溶性繊維が、クローン病のようなＩＢＤの処置のための細菌調節オリゴサッカライドを含むことを理解した。
【０１０４】
これらのデータが、本発明の可溶性繊維がまた細菌付着および侵入により特徴付けられ得る他の胃腸状態(例えば結腸癌、下痢性疾患／状態、胃腸炎または１型糖原貯蔵症)の処置または予防にまた有用であることを示唆することは認識されよう。
【０１０５】
実施例２：本発明で使用するためのプランテン可溶性繊維の粉末の製造
２５０ｇの切断したプランテン果肉を１,０００mlの沸騰中に入れ、次いで、１.１.１２.１に記載のように処置する。可溶性繊維の凍結乾燥収率(１.１.１２.２)は約４.０ｇである。
【０１０６】
実施例３：本発明で使用するためのプランテン可溶性繊維の粉末混合物の製造
３.０ｇの凍結乾燥した可溶性繊維粉末(実施例２)を０.５ｇ粉末クエン酸、２６.３ｇのグラニュー糖および０.２ｇの香味剤の標準噴霧乾燥混合物と混合した。
この混合物は、小袋に包装するのに適した自由流動性粉末製剤(３.０ｇの可溶性繊維を含む)に相当する。該粉末混合物は、味のために希釈されてもよく、ＩＢＤを有する対象が必要とするときに、飲用されてよい。
【０１０７】
実施例４：本発明で使用するためのプランテン可溶性繊維の別の粉末混合物の製造
３.０ｇの噴霧乾燥した可溶性繊維粉末(実施例１.１.１２.１)を、０.５ｇ粉末クエン酸、２６.３ｇのグラニュー糖および０.２ｇの香味剤の標準噴霧乾燥混合物と混合した。
この混合物は、小袋に包装するのに適した自由流動性粉末製剤(３.０ｇの可溶性繊維を含む)に相当する。該粉末混合物は、味のために希釈されてもよく、ＩＢＤを有する対象が必要とするときに、飲用されてよい。
【０１０８】
実施例５：本発明で使用するためのオレンジ飲料の製造
(ａ)１００mlの粗調製物(方法１.１.１２.２にしたがい調製)を、１００mlの２倍濃縮オレンジジュース(水で２倍の濃度に希釈するオレンジジュース濃縮物)と混合した。
(ｂ)３.５ｇの凍結乾燥粉末(方法１.１.１２.１にしたがい調製)を１００mlのオレンジジュース(または別法として、オレンジジュース濃縮物と水)に溶解した。
(ｃ)２.５ｇの凍結乾燥粉末(方法１.１.１２.３にしたがい調製)を１００mlのオレンジジュース(または別法として、オレンジジュース濃縮物と水)に溶解した。
【０１０９】
該オレンジ飲料調製物(ａ、ｂまたはｃ)は、直ぐに対象により消費されるか、後の消費のために冷蔵されるか、または、長い貯蔵寿命のために瓶または紙パック(carton)に密封されてよい。
オレンジジュースは別の味がよいものと容易に置き換えられることは認識されよう。
【０１１０】
実施例６：経腸栄養法に使用するためのプランテン可溶性繊維含有栄養液の製造
液体栄養混合物は、ＮＳＰの総含量(実施例１.１.１２.１に記載の方法)が該食事混合物の総乾燥物質含量の０.１から１０％のである、経腸栄養法に使用するために製造できる。該ＮＳＰを食塩水または水溶液と混合してよく、他のビタミン、ミネラルおよび栄養素を対象の経腸栄養法に必要であれば包含してよい。このような経腸液体製剤は、点滴に使用するためのまたはポンプ・フィードに挿入するための小袋に包装できる(例えば１００ml−２,０００mlを含む)。
【０１１１】
実施例７
さらなる実験(実施例１に記載のプロトコールにしたがう)を行い、ｐＨ７で繊維を均質化／抽出することにより調製した(表４の第３列)；該溶液を４０℃または１００℃のいずれかに加熱し(表４の第４列)；加熱した溶液を、澱粉を除去するために処理し(表４の第５列)；該可溶性繊維を単離することにより調製した(表４の第３列)本発明の可溶性繊維の効果を試験した。
【０１１２】
【表４】
2006517219.tif 000005
【表５】
2006517219.tif 000006
最終容量は約１０mlであり、２００mg生プランテン／mlに対応する。
【０１１３】
表４に説明するデータは、プランテンに由来し、本明細書に記載のように調製した(すなわち、試験管１−７)可溶性繊維が、細菌凝集の減少に有効であることを証明する。この効果は、可溶性繊維が炎症性腸疾患の予防または処置に有用であることを当業者に示す。試験管８および９は陽性コントロールであり、一方試験管Ａおよび５Ｂ−８Ｄは陰性コントロールに相当する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】粘膜に付着している大腸菌による、線毛発現を、実施例１の電子顕微鏡(いくつかは矢印で示す)を使用して説明する。
【図２】実施例１のクローン病の患者における粘膜に付着している細菌の増加を示すグラフである。
【図３】実施例１のコントロール患者から単離された大腸菌と比較して、凝集活性を有するクローン病組織から、有意に多い大腸菌が単離されることを示す。
【図４】大腸菌の凝集株が、大腸菌の非凝集株よりも有意に高いレベルで、Ｉ−４０７と付着し、侵入できることを示す(これは、細菌付着の阻害の評価のための、血球凝集アッセイの使用を確認する)。
【図５】実施例１において、プランテン可溶性繊維が細胞への細菌付着を有意に減少させることを説明するグラフである。
【図６】実施例１において、プランテン可溶性繊維が細胞への細菌侵入を有意に減少させることを説明するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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