(57)【要約】本発明は、内皮細胞のインテグリンαｖβ３と相互作用するペプチドの新規の用途に関するものであり、より詳細にはチロシン−ヒスチジン（ＹＨ）またはアスパラギン−ヒスチジン（ＮＨ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなるペプチドまたはこの機能的同等物を用いて内皮細胞の付着、内皮細胞の移動及び／又は血管新生を抑制する方法に関するものである。また、本発明は上記ペプチドを用いて血管新生と関連した疾患を治療または予防する方法を提供する。
2006522111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなる分離されたペプチド；または
（ｂ）上記（ａ）ペプチドでチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）がセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）、チロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）及びアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、分離されたペプチドの有効量を個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む内皮細胞の付着、内皮細胞の移動及び／又は血管新生を抑制する方法。
【請求項２】
上記バルキーな側鎖を有する疎水性アミノ酸はイソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ペプチドは（Ｉ，  Ｄ，  ＥまたはＫ）−（Ｅ，  ＡまたはＱ）−Ｌ−（Ｌ，  ＲまたはＡ）−（Ｎ，  ＤまたはＳ）−（Ａ，  Ｌ，  ＫまたはＩ）−（ＬまたはＹ）−（Ｒ，  Ｎ，  ＬまたはＫ）−（ＹまたはＮ）−Ｈ−（Ｍ，  ＩまたはＧ）−（Ｖ，  Ｌ，  ＱまたはＧ）−（Ｇ，  Ｋ，  ＴまたはＤ）−（Ｒ，  Ｓ，  ＬまたはＥ）−（Ｒ，  Ａ，  ＥまたはＩ）−（Ｖ，  Ｍ，  ＴまたはＬ）−（Ｌ，  ＣまたはＶ）−（Ｔ，  Ａ，  ＧまたはＳ）アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記ペプチドは配列番号２３〜配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記ペプチドは配列番号１７〜配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ペプチドは配列番号１１〜配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなる分離されたペプチド；または
（ｂ）上記（ａ）ペプチドでチロシン−ヒスチジンまたはアスパラギン−ヒスチジンがセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）、チロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）及びアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、分離されたペプチドの有効量を個体に投与することを含む血管新生と関係した疾患を治療または予防する方法。
【請求項８】
上記血管新生と関係した疾患は癌、血管奇形、動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症、角膜性血管新生、血管新生性緑内障、糖尿病性網膜症、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎、リューマチ性関節炎、全身性紅斑性ループス、甲状腺炎、乾癬、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎及びにきびからなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなる分離されたペプチド；または
（ｂ）上記（ａ）ペプチドでチロシン−ヒスチジンまたはアスパラギン−ヒスチジンがセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）、チロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）及びアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、分離されたペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制用薬学的組成物。
【請求項１０】
（ａ）チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなる分離されたペプチド；または
（ｂ）上記（ａ）ペプチドでチロシン−ヒスチジンまたはアスパラギン−ヒスチジンがセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）、チロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）及びアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、分離されたペプチドを有効成分として含有する血管新生と関連した疾患の治療または予防用薬学的組成物。
【請求項１１】
内皮細胞の付着、内皮細胞の移動及び／又は血管新生を抑制する薬剤の製造のための、
（ａ）チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなる分離されたペプチド；または
（ｂ）上記（ａ）ペプチドでチロシン−ヒスチジンまたはアスパラギン−ヒスチジンがセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）、チロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）及びアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、分離されたペプチドの用途。
【請求項１２】
血管新生に関連した疾患の治療剤または予防剤の製造のための、
（ａ）チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖（ｂｕｌｋｙ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなる分離されたペプチド；または
（ｂ）上記（ａ）ペプチドでチロシン−ヒスチジンまたはアスパラギン−ヒスチジンがセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）、チロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）及びアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、分離されペプチドの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制効果を有するペプチドに関し、より詳細には内皮細胞のインテグリンαｖβ３と相互作用するペプチドの抗−血管新生学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、既存の微細血管から新たな毛細血管が形成される過程をいう。血管新生が正常に起きる場合は胚芽の発生、組織の再生、器官の成長、傷の治癒、女性の生殖器系統の周期的な変化である黄体が発達する時であり、このような場合にも血管新生は厳格に調節されて進行される（Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｔｒａｎ，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｅｘｐ．  Ｐａｔｈｏ．，  １６：２０７−２４８，１９７６）。血管新生は、一般にタンパク質分解酵素による血管基底膜の分解、血管内皮細胞の移動、増殖及び血管内皮細胞の分化による管腔の形成、これによる血管の再構成を伴う。
【０００３】
血管新生が自律的に調節されずに、非正常的に発生するようになれば、諸疾患を誘発する。病理学的状態で現れる血管新生と関連した疾患としては、各種癌（腫よう）をはじめとして血管奇形、動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症などのような血管疾患、角膜移植性血管新生、血管新生性緑内障、糖尿病性網膜症、新生血管による角膜疾患、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎などのような眼科疾患、リューマチ性関節炎、全身性紅斑性ループス、甲状腺炎などのような炎症性疾患、乾癬、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、にきびなどのような皮膚科疾患などがある（米国特許第５，９９４，２９２号；大韓民国公開特許特２００１−６６９６７；Ｄ’Ａｍａｔｏ  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｈｔａｈｌｍｏｌ．，  １０２：１２６１−１２６２，１９９５；Ａｒｂｉｓｅｒ  Ｊ．  Ｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ａｃａｄ．  Ｄｅｒｍ．，  ３４（３）：４８６−４９７，１９９６；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｋ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９３（４）：６７２−６８２，１９９６；Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ８６：３５３−３６４，１９９６）。
【０００４】
従って、血管新生の機構に対する研究及びこれを抑制することができる物質の発見は癌を含む諸疾患の予防及び治療において重要な関心の焦点になっている。現在血管新生抑制に関する研究は、血管新生の過程において強力な誘導因子として知られているＶＥＧＦとｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）などの作用を抑制するために競争物質を投与する方法と癌細胞の転移を抑制するために血管内皮細胞におけるインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）の発現を調節する方法など多様な方法で様々なターゲット遺伝子を対象にして進行している。癌との関連性については血管の吸収と癌細胞により誘導される血管新生との相関関係及びこの時に作用する血管新生誘導タンパク質などについて研究がなされているが、今のところは非常に不備な状態である。血管新生の抑制に対する研究は血管新生と関係がある各種疾患の診断、治療及び／又は予防に応用されることができ、これに対する研究及び開発が引き続き要求されている実情である。
【０００５】
一方、βｉｇ−ｈ３は細胞外基質タンパク質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、ＴＧＦ−β１を処理したヒト肺腺癌細胞（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）Ａ５４９から製造されたｃＤＮＡライブラリスクリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を通じてスコニア（Ｓｋｏｎｉｅｒ）などにより最初に分離された（Ｓｋｏｎｉｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １１：５１１−５２２，  １９９２）。βｉｇ−ｈ３は、６８３個のアミノ酸で構成されており、そのカルボキシル末端には様々なインテグリン受容体に対するリガンド認識部位（ｌｉｇａｎｄ  ｒＥｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）に作用するＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフが存在し、アミノ末端には分泌配列（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が存在する（Ｓｋｏｎｉｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １１：５１１，  １９９２）。また、βｉｇ−ｈ３タンパク質は、ショウジョウバエのファシクリン（ｆａｓｃｉｃｌｉｎ）−Ｉに存在する類似したモチーフ（ｍｏｔｉｆ）と同質性を有する‘ｆａｓ−１ドメイン’という４個の同質的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）な内部反復ドメインを含む。ｆａｓ−１ドメインは哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母及び細菌を含む数種の分泌タンパク質または膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質において非常に保存的な配列として発見される（Ｋａｗａｍｏｔｏ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ２８８−２９２，１９９８）。ｆａｓ−１ドメインは、約１１０〜１４０個のアミノ酸で構成され、特に相同性が高い約１０個のアミノ酸で構成された二つの鎖（Ｈ１及びＨ２）を含んでいる。
【０００６】
βｉｇ−ｈ３タンパク質は、繊維状構造（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有し、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）及びコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）のような数種の細胞外マトリックスタンパク質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｌｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と相互作用することで知られている（Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．，  ４３：６５６−６６１，２００２）。また、βｉｇ−ｈ３が細胞の成長及び分化、傷の治癒及び形態の形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与すると報告されている（Ｓｋｏｎｉｅｒ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １３：５７１−５８４，１９９４；Ｄｉｅｕｄｏｎｎｅ  Ｓ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７６：２３１−２４３，１９９９；Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７７：１６９−１７８，２０００；Ｒａｗｅ  Ｉ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．，  ３８：８９３−９００，１９９７；ＬｅＢａｒｏｎ  Ｒ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １０４：８４４−８４９，１９９５）。併せて、βｉｇ−ｈ３は角膜上皮細胞、軟骨細胞及び線維芽細胞のような多様な類型の細胞の付着を媒介するものとして知られている（ＬｅＢａｒｏｎ  Ｒ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １０４：８４４−８４９，１９９５；Ｏｈｎｏ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４５１：１９６−２０５，１９９９；Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３０９０７−３０９１５，２０００）。しかし、いままでβｉｇ−ｈ３が血管新生と関連しているという報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これに対し、本発明者らはβig-h3が血管新生と関連があるかどうかについて引き続き研究した中、βig-h3のfas-1ドメインに存在する保存的なYHモチーフが内皮細胞のインテグリンαvβ3を通じて抗-血管新生効果を示すことを究明することにより本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用するペプチドの新規用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記のような目的を達成するために、本発明は内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用するペプチドの有効量を個体(subject)に投与することを含む内皮細胞の付着、内皮細胞の移動及び/又は血管新生を抑制する方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用するペプチドの有効量を個体に投与することを含む血管新生と関連した疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用するペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制用薬学的組成物及び血管新生と関連した疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
【００１２】
併せて、本発明は内皮細胞の付着、内皮細胞の移動及び/又は血管新生を抑制する薬剤の製造のための内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用するペプチドの用途を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は血管新生と関連した疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用するペプチドの用途を提供する。
本発明において、‘YHモチーフ‘とは、βig-h3のfas-1ドメインに高く保存されたチロシン-ヒスチジン(Y-H)またはアスパラギン-ヒスチジン(N-H)残基及びこれに隣接する複数のロイシン、イソロイシンなどの疎水性アミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列をいい(Kim,  J.-E.  et al.  J.  Biol.  Chem.,  277:46159-46465,2002)、βig-h3以外に他のタンパク質由来のfas-1ドメインに非常に高く保存されている(図1を参照)。
【００１４】
本発明において、‘有効量‘とは、内皮細胞の移動、付着及び/又は血管新生を抑制する効果を示す量を言う。
本発明において、‘個体(subject)’とは、ほ乳動物、特にヒトを含む動物を意味する。上記個体は治療が必要な患者(patient)でありうる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によるペプチドは内皮細胞のインテグリンαvβ3と相互作用して内皮細胞の付着と移動を抑制するだけでなく、優れた血管新生抑制効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明によるペプチドはチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸で構成され得る。上記においてバルキーな側鎖を有する疎水性アミノ酸はロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ；Ｌ）またはイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ；Ｉ）でありうる。また、本発明のペプチドは上記疎水性アミノ酸を少なくとも３個以上、望ましくは４個〜６個を含む。上記疎水性アミノ酸はチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）に隣接するように存在することが望ましい。具体的には、上記疎水性アミノ酸は上記チロシン−ヒスチジンまたはアスパラギン−ヒスチジンの一方の末端（Ｎ−末端またはＣ−末端）部位に存在したり、または両末端にともに存在することができる。
【００１７】
具体的に、本発明のペプチドはｆａｓ−１ドメイン内に保存的に存在するＹＨモチーフを含むアミノ酸配列を有することができる。望ましくは、βｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインから由来したＹＨモチーフを含む少なくとも１８個のアミノ酸で構成され得る。より望ましくは、（Ｉ，  Ｄ，  ＥまたはＫ）−（Ｅ，  ＡまたはＱ）−Ｌ−（Ｌ，  ＲまたはＡ）−（Ｎ，  ＤまたはＳ）−（Ａ，  Ｌ，  ＫまたはＩ）−（ＬまたはＹ）−（Ｒ，  Ｎ，  ＬまたはＫ）−（ＹまたはＮ）−Ｈ−（Ｍ，  ＩまたはＧ）−（Ｖ，  Ｌ，  ＱまたはＧ）−（Ｇ，  Ｋ，  ＴまたはＤ）−（Ｒ，  Ｓ，  ＬまたはＥ）−（Ｒ，  Ａ，  ＥまたはＩ）−（Ｖ，  Ｍ，  ＴまたはＬ）−（Ｌ，  ＣまたはＶ）−（Ｔ，  Ａ，  ＧまたはＳ）アミノ酸配列を含むことができる。上記のアミノ酸の略字の定義は次の通りである：Ｉ、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）；Ｄ、アスパルテート（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）；Ｅ、グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）；Ｋ、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）；Ａ、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）；Ｑ、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）；Ｌ、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）；Ｒ、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）；Ｎ、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）；Ｓ、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）；Ｙ、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）；Ｈ、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）；Ｍ、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）；Ｇ、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）；Ｖ、バリン（ｖａｌｉｎｅ）；Ｔ、スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）；及びＣ、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）。最も望ましくは、配列番号２３〜配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。配列番号２３のアミノ酸配列はβｉｇ−ｈ３の第一のｆａｓ−１ドメインから、配列番号２４のアミノ酸配列はβｉｇ−ｈ３の第二のｆａｓ−１ドメインから、配列番号２５のアミノ酸配列はβｉｇ−ｈ３の第三のｆａｓ−１ドメインから、そして配列番号２６のアミノ酸配列はβｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインからそれぞれ由来したものである。
【００１８】
また、本発明のペプチドの範囲にはチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とバルキーな側鎖を有する少なくとも３個以上の疎水性アミノ酸を含む、少なくとも１８個以上のアミノ酸からなるペプチドの機能的同等物及びこれらの塩が含まれる。上記において‘機能的同等物’とは、本発明のペプチドにおいて一部のアミノ酸がペプチドの生理活性に影響を及ぼさない程度に変異されたペプチドを言う。即ち、本発明のペプチドと同一または類似した生理活性を示す限り、アミノ酸配列のみならず、構造学的に同一または類似したペプチドも本発明の範囲に含まれる。上記において‘生理活性’とは、内皮細胞のインテグリンαｖβ３と相互作用して内皮細胞の付着、内皮細胞の移動及び／又は血管新生を抑制することを言う。
【００１９】
上記において、‘変異’とはアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含み、望ましくは置換でありうる。例えば、ＹＨモチーフ上においてチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）に隣接するバルキーな側鎖を有する疎水性アミノ酸が他のアミノ酸、望ましくは‘セリン’で置換された場合である。より望ましくは、本発明のペプチドは配列番号１２〜配列番号１４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有してもよく、また、上記選択されたアミノ酸配列を含む配列番号１８〜配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２０】
また、上記変異はＹＨモチーフ上においてチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）が他の２個のアミノ酸で置換された場合であってもよい。望ましくは、チロシン（Ｙ）またはアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択されるいずれか一つで置換されても及び／又はヒスチジン（Ｈ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されてもよい。より望ましくは上記チロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）が従来知られたタンパク質のｆａｓ−１ドメインに保存されているセリン−ヒスチジン（Ｓ−Ｈ）、ヒスチジン−ヒスチジン（Ｈ−Ｈ）、フェニルアラニン−ヒスチジン（Ｆ−Ｈ）、スレオニン−ヒスチジン（Ｔ−Ｈ）及びチロシン−アスパラギン（Ｙ−Ｎ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されてもよい（図１を参照）。
【００２１】
この他にもチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）が疎水性アミノ酸、望ましくはアラニン−アラニン（Ａ−Ａ）で置換されてもよい。この場合には望ましくは配列番号１１のアミノ酸配列を有してもよく、また、上記アミノ酸配列を含む配列番号１７のアミノ酸配列を有してもよい。
【００２２】
併せて、上記変異はチロシン−ヒスチジン（Ｙ−Ｈ）またはアスパラギン−ヒスチジン（Ｎ−Ｈ）とこれに隣接するバルキーな側鎖を有する疎水性アミノ酸が上記のように両方とも置換された場合も含む。ただし、この場合、ペプチド内にバルキーな側鎖を有する疎水性アミノ酸が少なくとも３個以上存在することが望ましい。望ましくは配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を有してもよく、また、上記選択されたアミノ酸配列を含む配列番号２１または配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２３】
また、本発明の機能的同等物の範囲には本発明によるペプチドの基本骨格及びこの生理活性を維持しながらペプチドの一部の化学構造が変形されたペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性または溶解度などを変更させるための構造変更がこれに含まれる。
【００２４】
本発明のペプチドは当業界に公知となった化学的合成（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  ＮＹ，  １９８３）により容易に製造され得る。代表的な方法としてこれらに限定されるものではないが、液体または固体状合成、断片凝縮、Ｆ−ＭＯＣまたはＴ−ＢＯＣ化学法が含まれる（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌｏｒｉｄａ，  １９９７；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ａｔｈｅｒｔ  ｏｎ＆Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｅｄｓ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ，  １９８９）。
【００２５】
また、本発明のペプチドは遺伝工学的方法により製造されることができる。まず、常法により上記ペプチドをコードするＤＮＡ配列を作製する。ＤＮＡ配列は適切なプライマーを用いてＰＣＲで増幅することにより作製することができる。他の方法で当業界に公知となった標準方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（ＢｉｏｓｅａｒｃｈまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社で販売するもの）を用いてＤＮＡ配列を合成することができる。作製されたＤＮＡ配列は、このＤＮＡ配列に作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）、そのＤＮＡ配列の発現を調節する一つまたはそれ以上の発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例：プロモーター、エンハンサー等）を含むベクターに挿入させ、これより形成された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる。生成された形質転換体を上記ＤＮＡ配列が発現されるのに適切な培地及び条件下で培養し、培養物から上記ＤＮＡ配列によりコードされた実質的に純粋なペプチドを回収する。上記回収は当業界に公知となった方法（例えば、クロマトグラフィー）を用いて行うことができる。上記において‘実質的に純粋なペプチド’とは、本発明によるペプチドが宿主から由来した如何なる他のタンパク質も実質的に含まないことを意味する。本発明のペプチド合成のための遺伝工学的方法は次の文献を参考にすることができる：Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｇｕｔｈｒｉｅ＆Ｆｉｎｋ（ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ，  １９９１；及びＨｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５：１２０７３−１２０８０，１９９０．
【００２６】
本発明者らはβｉｇ−ｈ３が上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の付着を誘導するα３β１インテグリン−作用モチーフを有しており（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３０９０７−３０９１５，２０００）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の付着を媒介するαｖβ５インテグリン−作用モチーフも有していたということを以前に究明している（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：４６１５９−４６１６５，２００２）。これに対し、本発明ではβｉｇ−ｈ３と、このｆａｓ−１ドメインが内皮細胞に対する付着活性があるかどうかを調査し、βｉｇ−ｈ３による内皮細胞の付着に関与するインテグリン受容体を同定した。また、上記インテグリン受容体と相互作用するβｉｇ−ｈ３内のモチーフを究明するためにβｉｇ−ｈ３に対する欠失変異体を製造して細胞付着に関与する切片を調査した（実施例１〜実施例４−１を参照）。
【００２７】
その結果、βｉｇ−ｈ３及びこの各ｆａｓ−１ドメインはほぼ同一な活性で内皮細胞の付着を媒介し（図２を参照）、αｖβ３インテグリンがβｉｇ−ｈ３と相互作用して内皮細胞の付着に関与することを確認した（図３ａ〜図３ｄを参照）。また、ｆａｓ−１ドメインの一部に該当する、配列番号１の５４８−６１４のアミノ酸切片（ΔＨ１Ｈ２（６））が細胞付着と関連した活性を示すことを確認した（図４ｂを参照）。
【００２８】
一方、本発明者らはβｉｇ−ｈ３の５４８−６１４のアミノ酸切片内にαｖβ５インテグリンと結合するＹＨモチーフが存在することを以前に究明している（Ｋｉｍ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：４６１５９−４６１６５，２００２）。従って、本発明者らはＹＨモチーフがαｖβ３インテグリンと相互作用して内皮細胞の付着を媒介するかどうかを確認するために、ＹＨモチーフを含む２９個のアミノ酸からなる断片（配列番号１の５６０−５８８）及びチロシン−ヒスチジンとこれに隣接した複数個のイソロイシン／ロイシンをアラニン−アラニンとセリンでそれぞれ置換した変異体を製作し、これらの細胞付着活性を調査した（実施例４−２を参照）。
【００２９】
その結果、ＹＨモチーフに対する数個の変異体はその活性において多少差はあるものの、いずれも細胞付着を媒介する活性を保有していることを確認した（図４ｂを参照）。
【００３０】
以後、本発明者らはβｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインの配列に基づいてＹＨモチーフを含むようにデザインした１８個のアミノ酸からなる４個のペプチド（ＹＨ１８合成ペプチド；配列番号２３〜配列番号２６）を合成し、上記ペプチドが内皮細胞の付着に及ぼす影響を調査した（実施例５を参照）。
【００３１】
その結果、βｉｇ−ｈ３により媒介される内皮細胞の付着がＹＨモチーフを含むＹＨ１８合成ペプチドにより濃度依存的に抑制されることを確認した（図５を参照）。これは、αｖβ３インテグリンを通じたβｉｇ−ｈ３の内皮細胞の付着がｆａｓ−１ドメイン内の保存的配列であるＹＨモチーフによるものであることを示すものである。
【００３２】
また、本発明ではＹＨモチーフが内皮細胞の付着のみならず、内皮細胞の移動にも関与するかどうかを調査した（実施例７を参照）。その結果、ＹＨ１８合成ペプチドがβｉｇ−ｈ３により促進される内皮細胞の移動を濃度依存的に抑制することを確認した（図７ａ及び図７ｂを参照）。
【００３３】
併せて、本発明では内皮細胞の付着及び移動を抑制するＹＨモチーフが抗−血管新生効果を示すかどうかを調査した（実施例８を参照）。その結果、試験管内条件（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）だけでなく生体内条件（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でもＹＨ１８合成ペプチドにより血管新生が効果的に抑制されることを確認した（図８ａ及び図８ｂを参照）。
【００３４】
本発明によるペプチドは次のような生理活性を有している。
第一に、本発明のペプチドは内皮細胞のインテグリンαｖβ３と相互作用する。
第二に、内皮細胞の付着と移動を抑制する。
第三に、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で血管新生を抑制する。
【００３５】
したがって、本発明は本発明によるペプチドを有効成分として含有する内皮細胞の付着、移動及び／又は血管新生抑制用薬学的組成物を提供する。また、上記ペプチドを有効成分として含有する血管新生と関連した疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
【００３６】
本発明において血管新生と関連した疾患は各種癌（腫よう）をはじめとして血管腫、血管繊維腫、血管奇形、動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症などのような血管疾患；角膜移植性血管新生、血管新生性緑内障、糖尿病性網膜症、新生血管による角膜疾患、斑点の変性、翼状片、網膜変性、後水晶体繊維増殖症、顆粒性結膜炎などのような眼科疾患；リューマチ性関節炎、全身性紅斑性ループス、甲状腺炎などのような炎症性疾患；及び乾癬、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、にきびなどのような皮膚科疾患を含む（米国特許第５，９９４，２９２号；大韓民国公開特許特２００１−６６９６７；Ｄ’Ａｍａｔｏ  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｈｔａｈｌｍｏｌ．，  １０２：１２６１−１２６２，１９９５；Ａｒｂｉｓｅｒ  Ｊ．  Ｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ａｃａｄ．  Ｄｅｒｍ．，  ３４（３）：４８６−４９７，１９９６；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｋ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９３（４）：６７２−６８２，１９９６；Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ８６：３５３−３６４，１９９６）。より望ましくは癌、関節炎、乾癬、糖尿病癌疾患、動脈硬化または炎症でありうる。
【００３７】
本発明によるペプチドを有効成分として含有する薬学的組成物は薬学的に許容される担体、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含む。経口投与用の場合、本発明によるペプチドは賦形剤と混合されて摂取型錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウエハなどの形態で使われる。また、非経口投与用担体は、水、好適なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含み、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。好適な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。好適な保存剤としては、ベンズアルコニウムクロリド、メチル−またはプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考とすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １９ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９５）。
【００３８】
本発明による薬学的組成物は、多様な非経口または経口投与形態で剤形化することができる。非経口投与用剤形の代表的なものは注射用剤形であり、等張性水溶液または懸濁液が望ましい。注射用剤形は好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当業界に公知となった技術により製造することができる。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化することができる。また、経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤などがあるが、これら剤形は有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン）と滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウムまたはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含むことができる。上記錠剤はマグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドンのような結合剤を含むことができ、場合に応じて澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤及び／又は甘味剤をさらに含むことができる。上記剤形は通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造されることができる。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、防腐剤、水和剤、乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤のような補助剤とその他治療的に有用な物質をさらに含むことができ、常法により製剤化することができる。
【００４０】
本発明の薬学的組成物において、本発明のペプチドの総有効量は単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で患者に投与することができ、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）が長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与することができる。本発明のペプチドを含む薬学的組成物は、疾患の程度により有効成分の含量を異にすることができるが、通常、１回投与時１０μｇ〜１０ｍｇの有効容量で一日に数回反復投与することができる。しかし、上記ペプチドの濃度は薬の投与経路及び治療回数のみならず、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食物及び排泄率等、多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮する時、当分野における通常の知識を有する者であれば、上記ペプチドの血管新生抑制剤または血管新生関連疾患の治療または予防剤としての特定の用途による適切な有効投与量を決定することができる。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特別に制限されない。
【実施例】
【００４１】
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容がこれに限定されるものではない。
【００４２】
＜実施例１＞
βｉｇ−ｈ３タンパク質及び各ｆａｓ−１ドメインの発現及び精製
＜１−１＞発現ベクターの製造
本発明者らは、以前にβｉｇ−ｈ３及びこの各ｆａｓ−１ドメインを含む組換えタンパク質について報告している（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３０９０７−３０９１５，２０００；大韓民国登録特許第１０−０３８２０４２号）。したがって、これと同様な方法でβｉｇ−ｈ３及び各ｆａｓ−１ドメインを製造した。
【００４３】
具体的には、４個のｆａｓ−１ドメインを全て発現する組換えβｉｇ−ｈ３タンパク質（以下、‘βｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂ’という）は、ｐＨｉｓ−β−ｂベクターを用いて製造した。上記ｐＨｉｓ−β−ｂベクターは、βｉｇ−ｈ３  ｃＤＮＡでアミノ末端部分の一部が欠失されたＡｓｐ７１８−ＢｇｌＩＩ断片をｐＥＴ−２９βのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して製造されたものである。また、βｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインを含む組換えタンパク質を発現させるために、第一のｆａｓ−１ドメイン（βｉｇ−ｈ３  Ｄ−Ｉ）、第二のｆａｓ−１ドメイン（βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩ）、第三のｆａｓ−１ドメイン（βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩＩ）及び第四のｆａｓ−１ドメイン（βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ）を含むβｉｇ−ｈ３  ｃＤＮＡ各切片をＰＣＲで増幅した（図２のＡを参照）。
【００４４】
以後、各ＰＣＲの産物をｐＥＴ−２９ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。製造された各発現ベクターをｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−Ｉ、ｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩ、ｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩＩ及びｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶと命名した。βｉｇ−ｈ３の４個のｆａｓ−１ドメインのアミノ酸配列を配列番号２〜配列番号５とそれぞれ記載した。
【００４５】
＜１−２＞大腸菌形質転換及び組換えタンパク質の精製
上記実施例＜１−１＞で製造した各発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を形質転換した。形質転換された各大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ培地で培養した。各組換えタンパク質の発現を誘導するために、培養液の吸光度が５９５  ｎｍで０．５−０．６となった時、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して３７℃で３時間さらに培養した。以後、発現されたタンパク質の精製はキムらの方法により行った（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７７：１６９−１８７，２０００）。まず、培養液を遠心分離して細胞を得た後、溶解緩衝溶液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  ０．５  ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞懸濁液を超音波により粉砕した。封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）形態で発現されたタンパク質は８Ｍ尿酸変性緩衝液で溶解させ、変性されたタンパク質はＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ｒｅｓｉｎ，  Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。組換えタンパク質を２００  ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）溶液で溶離した後に、５０  ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０  ｍＭトリス−塩酸緩衝液内で高濃度から低濃度尿酸へ順に透析して精製した。上記発現精製された組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（結果は図示せず）。各ｆａｓ−１ドメインを発現する組換えタンパク質は４個のドメインを全て含んでいる組換えβｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂタンパク質とは異なり、全て水溶性で合成され、変性段階を経なくてもよく、多量を容易に得ることができた。
【００４６】
一方、上記発現ベクターｐＨｉｓ−β−ｂ，  ｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩ及びｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶにより形質転換された大腸菌はそれぞれＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／Ｈｉｓ−β−ｂ，  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｇ及びＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｅと命名し、２０００年４月２５日付で生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ  １８００８Ｐ，  ＫＣＴＣ  １８０１０Ｐ及びＫＣＴＣ  １８００９Ｐ）。
【００４７】
＜実施例２＞
βｉｇ−ｈ３及び各ｆａｓ−１ドメインに対する内皮細胞の付着活性調査   
細胞付着の分析は、キムらの方法（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：４６１５９−４６１６５，２００２）により行った。上記実施例１で製造した各組換えタンパク質（βｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂ，  βｉｇ−ｈ３  Ｄ−Ｉ、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩ、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩＩ及びβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ）を底が平らかな９６−ウェルＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）プレート（Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  ＮＹ）に１０μｇ／ｍｌの量でそれぞれ添加した後、４℃で一晩中培養してプレートの表面をコーティングした。対照群は２％ＢＳＡでプレートをコーティングさせた。以後、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）バッファを処理して室温で１時間ブロックさせた。
【００４８】
一方、ＨＵＶＥＣｓ（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を２％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を含有するＥＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。培養された細胞を３×１０５細胞／ｍｌの濃度で培地に懸濁した後、０．１  ｍｌの細胞懸濁液を上記プレートの各ウェルに添加した。以後、３７℃で３０分間培養した後、ＰＢＳバッファで１回洗浄してプレートに付着されない細胞を除去した。付着された細胞に３．７５  ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グリコサミニド（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）及び０．２５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ  ５．０）を添加して３７℃で１時間培養した。以後、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５０  ｍＭのグリシンバッファ（ｐＨ  １０．４）を添加して酵素の活性を遮断させた。吸光も測定機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  ５５０  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて４０５  ｎｍで吸光度を測定した。この時、プレートに細胞が多くついているほど、即ち、細胞の数が多いほど吸光度の数値が高い。
【００４９】
その結果、図２のＢから見られるように、βｉｇ−ｈ３が内皮細胞の付着を媒介することとβｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインも、ほぼ類似した活性で内皮細胞の付着を媒介することを確認することができた。
【００５０】
＜実施例３＞
βｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の付着に関与するインテグリンの同定
＜３−１＞インテグリン受容体の同定のための実験１
本発明者らは、βｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の付着に関与するインテグリンを同定するためにインテグリンの機能を特異的に阻害する様々な抗体を用いて細胞付着抑制の分析を行った。
【００５１】
数種のインテグリン−特異的単一クローン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）５μｇ／ｍｌを０．１  ｍｌの培養溶液で３×１０５細胞／ｍｌ濃度のＨＵＶＥＣ細胞と３７℃で３０分間それぞれ前培養させた。本実験に使われた抗体は次の通りである：Ｐ１Ｂ５（α３に対する抗体）、Ｐ１Ｄ６（α５に対する抗体）、Ｐ３Ｇ８（αｖに対する抗体）、６Ｓ６（β１に対する抗体）、Ｂ３Ａ（β３に対する抗体）、ＬＭ６０９（αｖβ３に対する抗体）及びＰ１Ｆ６（αｖβ５に対する抗体）。抗体と共に前配向しないものを対照群とした。以後、培養された細胞を組換えβｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂタンパク質で予めコーティングされたプレートに移した後、３７℃で３０分間追加培養した。付着された細胞は上記実施例２と同様な方法で定量した。
【００５２】
その結果、図３ａで見られるように、βｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の付着はαｖβ３インテグリン及びβ３インテグリンに対する抗体により特異的に抑制された反面、α３、α５等、他のインテグリンに対する抗体によっては抑制されなかった。
【００５３】
＜３−２＞インテグリン受容体の同定のための実験２
上記実施例２において、βｉｇ−ｈ３のみならず、この各ｆａｓ−１ドメインも内皮細胞の付着を媒介することを確認した。したがって、本発明者らはβｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインに対するインテグリン受容体を同定するために、上記実施例＜３−１＞と同様な方法でβｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインでプレートの表面をコーティングさせて細胞付着抑制の分析を行った。
【００５４】
その結果、図３ｂで見られるように、各ｆａｓ−１ドメインに対する内皮細胞の付着はαｖβ３に対する抗体により特異的に抑制された反面、αｖβ５に対する抗体により抑制されていないことを確認した。
【００５５】
＜３−３＞内皮細胞の表面で発現されるインテグリンの究明
本発明者らは、内皮細胞の表面でαｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンが両方とも発現されるかどうかを確認するために上記両インテグリンに特異的な単一クローン抗体を用いてＦＡＣＳ分析を行った。
【００５６】
ＨＵＶＥＣが完全に成長した（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）プレートに０．２５％トリプシン及び０．０５％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファを処理してプレート表面から細胞を外した。細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄した後、再びＰＢＳバッファに再懸濁した。細胞懸濁液に抗−αｖβ３インテグリン抗体（ＬＭ６０９；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）または抗−αｖβ５インテグリン抗体（ＰＩＦ６；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）を添加して４℃で１時間培養した。１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  ＣＡ）と結合した二次塩素−抗マウスＩｇＧ抗体を添加して４℃で１時間細胞をさらに培養させた後、５−ｗａｔｔレーザ付き柔細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を用いて４８８  ｎｍで分析した。対照群には２次抗体のみを添加した。
【００５７】
その結果、図３ｃで見られるように、ＨＵＶＥＣはαｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンを両方とも発現した。しかし、αｖβ５インテグリンの発現水準はαｖβ３インテグリンに比べて低かった。
【００５８】
＜３−４＞インテグリン受容体の同定のための実験３
本発明者らは、βｉｇ−ｈ３により媒介されるＨＵＶＥＣの付着がαｖβ３インテグリンに依存するかどうかをさらに究明するために、インテグリンの機能を特異的に阻害する抗体の存在下でβｉｇ−ｈ３の結合親和力を調査した。結合分析（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）はマイレらの方法（Ｍａｉｌｅ，  Ｌ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：２３７４５−２３７５０，２００２）により行った。
【００５９】
まず、ＨＵＶＥＣを１×１０５細胞／ｍｌの濃度で培地に懸濁した。細胞懸濁液１  ｍｌを抗−αｖβ３抗体（ＬＭ６０９）または抗−αｖβ５抗体（Ｐ１Ｆ６）と３７℃で３０分間前配向した。以後、前培養された細胞をビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）で標識させたβｉｇ−ｈ３（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  βｉｇ−ｈ３，以下‘ビオチン−βｉｇ−ｈ３’という）と共に０．１％ＢＳＡ−含有無血清培地で５時間４℃培養した。この時、ビオチン−βｉｇ−ｈ３を１×１０−１０、１×１０−９及び５×１０−９  μＭの濃度でそれぞれ添加した。以後、ＰＢＳバッファ（ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した後、アイス−コールドバッファＡ（ｉｃｅ−ｃｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ  ７．４，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，  ０．５％ＳＤＳ，  ０．０２％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １  ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で４℃で溶解させた。４℃で３０分間１３，０００  ｒｐｍで遠心分離して細胞溶解物を浄化した。以後、同じ量のタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタン免疫ブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行ってビオチン−βｉｇ−ｈ３の量を定量した。
【００６０】
ビオチン−βｉｇ−ｈ３を可視化するために、膜をＨＲＰ（ｈｏｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合したストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と共に培養した。以後、ＥＬＣ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行ってパーオキシダーゼ−標識された抗体の結合を可視化した。内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）でβ−チューブリンタンパク質をウェスタンブロッティングして同じ量のタンパク質を検査したことを確認した。
【００６１】
その結果、βｉｇ−ｈ３は濃度依存的にＨＵＶＥＣの表面に結合し（図３ｄのＡを参照）、その結合は、αｖβ３インテグリンに対する抗体によってのみ特異的に抑制された（図３ｄのＢを参照）。
【００６２】
上記結果は、βｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインがαｖβ５インテグリンでない‘αｖβ３インテグリン’を通じて内皮細胞の付着を媒介するモチーフを含有していることを提示する。
【００６３】
＜実施例４＞
内皮細胞の付着においてαｖβ３インテグリンと相互作用するβｉｇ−ｈ３内モチーフの同定
＜４−１＞ｆａｓ−１ドメインの欠失変異体を用いたαｖβ３インテグリン−作用モチーフ同定
本発明者らは、βｉｇ−ｈ３またはｆａｓ−１ドメインがαｖβ３インテグリンと相互作用して内皮細胞の付着を誘導する時、αｖβ３インテグリンと相互作用するモチーフを同定するために、ｆａｓ−１ドメインの欠失変異体を製造し、これらの細胞付着活性を調査した。
【００６４】
ｆａｓ−１ドメインの欠失変異体は、キムらの方法（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３０９０７−３０９１５，２０００）により製造した。具体的に本発明者らはｆａｓ−１ドメインで非常に保存的なＨ１、Ｈ２ペプチド及び／又はα３β１インテグリンと相互作用して角膜上皮細胞との付着に関与するＥＰＤＩＭモチーフが欠失された断片を製造した（図４ａを参照）。各欠失変異体に対する情報を下記表１に記載した。下記表１において各欠失変異体断片のアミノ酸領域は配列番号１と記載されるβｉｇ−ｈ３のアミノ酸配列を基準としたものである。
【００６５】
【表１】
2006522111.tif 000003
【００６６】
各欠失変異体は、第四のｆａｓ−１ドメイン（配列番号５）を暗号化するｃＤＮＡを主型としてＰＣＲを行って製造した（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３０９０７−３０９１５，２０００）。ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片をｐＥＴ−２９ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。突然変異如何は配列分析を通じて確認し、従来の方法により組換えタンパク質を誘導及び精製した（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７７：１６９−１７８，２０００）。以後、各欠失変異体の細胞付着活性を実施例２と同様な方法で行って調査した。
【００６７】
その結果、最も小さい欠失変異体であるΔＨ１Ｈ２（６）が内皮細胞の付着活性を依然として保有していることを確認した（結果は図示せず）。これによりαｖβ３インテグリンと相互作用するモチーフが配列番号１の５４８−６１４に該当する断片内に存在することが分かった。
【００６８】
＜４−２＞ＹＨモチーフの変異体を用いたαｖβ３インテグリン−作用モチーフの同定
本発明者らは、配列番号１の５４８−６１４に該当する断片内に高く保存されたチロシン−ヒスチジン残基及びこれに隣接する複数のロイシン、イソロイシン残基で構成されるＹＨモチーフがαｖβ５インテグリンに結合することを以前に究明している（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：４６１５９−４６１６５，２００２）。したがって、本発明者らはＹＨモチーフがαｖβ３インテグリンとも相互作用して内皮細胞の付着を媒介するものと予想した。これに対し、本発明者らはｆａｓ−１ドメインの保存的配列であるチロシン−ヒスチジン残基及び／又は上記チロシン−ヒスチジン残基に隣接する保存されたロイシンとイソロイシン残基をアラニンとセリンでそれぞれ置換して多様な組合わせで変異させた（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４６１５９−４６１６５，２００２）（図４ｂを参照）。製造された多様なＹＨモチーフ変異体のアミノ酸配列を配列番号１７〜配列番号２２と記載した。突然変異如何は、配列分析を通じて確認した。以後、各欠失変異体を従来の方法（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７７：１６９−１７８，２０００）により発現及び精製した。各欠失変異体の細胞付着活性を実施例２と同様な方法で行って調査した。
【００６９】
その結果、図４ｂで見られるように、ｆａｓ−１ドメイン内に高く保存されたチロシン−ヒスチジン残基を疎水性アミノ酸である‘アラニン−アラニン’で置換させた場合（Ｄ−ＩＶ−ＡＡ）とチロシン−ヒスチジン残基の一方の末端（Ｎ−末端またはＣ−末端）に隣接するロイシンとイソロイシン残基を親水性アミノ酸である‘セリン’で置換させた場合（Ｄ−ＩＶ−Ｌ及びＤ−ＩＶ−Ｒ）の細胞付着活性は、ｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−ＩＶ）及びこの断片（Ｈ１Ｈ２（６））と同等な水準であった。一方、チロシン−ヒスチジンの両末端部位に存在するイソロイシンとロイシンを全て‘セリン’で置換させた場合（Ｄ−ＩＶ−ＬＹＨＲ）には細胞付着活性が半分に減少し、チロシン−ヒスチジン及びこれに隣接するイソロイシンとロイシンをそれぞれ‘アラニン−アラニン’及び‘セリン’で両方とも置換させた場合（Ｄ−ＩＶ−ＬＡＡ及びＤ−ＩＶ−ＡＡＲ）には細胞付着活性が少し減少した。しかし、いずれも対照群に比べては高い水準であった。これによりチロシン−ヒスチジンのみならず、上記アミノ酸の両末端に隣接するバルキーな残基を有する疎水性アミノ酸が内皮細胞の付着に必要であるということを確認することができた。
【００７０】
＜実施例５＞
ＹＨ１８合成ペプチドによる内皮細胞の付着抑制の分析
本発明者らはβｉｇ−ｈ３のＹＨモチーフが内皮細胞の付着に関与するかどうかをさらに確認するために、ＹＨ１８合成ペプチド（Ｋｉｍ，  Ｊ．−Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：４６１５９−４６１６５，２００２）を用いて細胞付着分析を行った。上記ＹＨ１８合成ペプチドはβｉｇ−ｈ３の全てのｆａｓ−１ドメインに保存的なＹＨモチーフで由来した配列であり、チロシン（またはアスパラギン）−ヒスチジン残基とこれに隣接する保存された数個のロイシン及びイソロイシン残基を含む１８個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００７１】
具体的に、本実施例ではβｉｇ−ｈ３の第一のｆａｓ−１ドメインから由来した配列番号２３と記載されるＹＨ１８合成ペプチド（以下、‘Ｄ−ＩＹＨ１８’という）、第二のｆａｓ−１ドメインから由来した配列番号２４と記載されるＹＨ１８合成ペプチド（以下、‘Ｄ−ＩＩＹＨ１８’という）、第三のｆａｓ−１ドメインから由来した配列番号２５と記載されるＹＨ１８合成ペプチド（以下、‘Ｄ−ＩＩＩＹＨ１８’という）及び第四のｆａｓ−１ドメインから由来した配列番号２６と記載されるＹＨ１８合成ペプチド（以下‘Ｄ−ＩＶＹＨ１８’という）を用いた（図５を参照）。また、配列番号２７と記載されるＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチドをＹＨ１８合成ペプチドに対する対照群として用いた。上記ペプチドはいずれもエニジン（ＡｎｙＧｅｎ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．、光州、大韓民国）社に依頼して合成した。以後、上記ＹＨ１８合成ペプチドがβｉｇ−ｈ３がコーティングされたウェルで内皮細胞が付着することを抑制する能力があるかどうかを調査した。
【００７２】
このため、３×１０５細胞／ｍｌの濃度でＨＵＶＥＣを懸濁させた後、細胞懸濁液０．１  ｍｌに各ＹＨ１８合成ペプチドまたはＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチドを１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ及び１０００μＭの濃度でそれぞれ添加し、３７℃で３０分間前培養させた。前培養された細胞を組換えβｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂタンパク質で予めコーティングされた９６−ウェルプレートの各ウェルに入れた。以後、上記実施例２と同様な方法でテストした。
【００７３】
その結果、図５で見られるように、βｉｇ−ｈ３により媒介される内皮細胞の付着がβｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインから由来したＹＨ１８合成ペプチドにより濃度依存的に抑制されることを確認した。これによりＹＨモチーフがαｖβ３インテグリンを通じてβｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の付着に関与することが分かった。
【００７４】
＜実施例６＞
βｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の機能的受容体αｖβ３の再確認
αｖβ３インテグリンがβｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の付着を媒介するかどうかを再確認するために、本発明者らはヒトβ３インテグリン発現ベクターで安定的に形質転換させたＨＥＫ２９３細胞を用いて分析した。
【００７５】
＜６−１＞細胞付着分析
ヒトβ３インテグリン発現ベクターを製造するために、ヒト胎盤ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを主型としてＲＴ−ＰＣＲを行って２．４  ｋｂのβ３  ｃＤＮＡを製造した（Ｃｈａｎｄｒｉｋａ，  Ｓ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：１６３９０−１６３９７，１９９７）。増幅されたβ３  ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切断した後、上記切断された断片をｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。製造されたベクターを‘β３／ｐｃＤＮＡ３’と命名した。以後、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ；Ｇｉｂｃｏ）を用いて上記β３／ｐｃＤＮＡ３ベクター（１μｇ）をＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ，  ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  ＣＲＬ  １５７３）に導入させた。対照群には、ヒトβ３  ｃＤＮＡが挿入されないｐｃＤＮＡ３ベクターを導入させた。上記ベクターはいずれもＧ４１８選択標識を含んでいるため、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を用いて安定な形質転換体を選別した。β３／ｐｃＤＮＡ３ベクターが導入された細胞を‘β３／２９３’と命名し、ｐｃＤＮＡ３ベクターが導入された細胞（対照群）を‘ｐｃ／２９３’と命名した。選別された各形質転換体を１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）及びペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地で培養した。以後、上記実施例２と同様な方法で細胞付着分析を行った。
【００７６】
その結果、図６ａで見られるように、β３／２９３細胞はβｉｇ−ｈ３に強く付着した反面、ｐｃ／２９３細胞はＢＳＡをコーティングした場合と類似にβｉｇ−ｈ３に付着できていないことを確認した。このような結果は、ｐｃ／２９３細胞はαｖのみを独自に生成するだけであり、β３を合成することができないため、βｉｇ−ｈ３に付着できないが、β３／２９３細胞はβ３を発現させることができ、αｖβ３インテグリンを生成することができるためである。
【００７７】
＜６−２＞インテグリン機能阻害抗体を用いた内皮細胞の付着抑制分析
本発明者らは、インテグリンの機能を阻害する抗体を用いてβｉｇ−ｈ３がαｖβ３インテグリンを通じて内皮細胞の付着を媒介するかどうかを再度調査した。実験は上記実施例＜３−１＞と同様な方法で行った。
【００７８】
その結果、図６ｂで見られるように、βｉｇ−ｈ３に対するβ３／２９３細胞の付着はαｖβ３インテグリンに対する機能阻害抗体により特異的に抑制された反面、αｖβ５に対する抗体によっては抑制されなかった。
【００７９】
＜６−３＞ＹＨ１８合成ペプチドを用いた内皮細胞の付着抑制分析
本発明者らは、上記実施例５においてＹＨ１８合成ペプチドがαｖβ３インテグリンを通じてβｉｇ−ｈ３に対する内皮細胞の付着を抑制することを確認した。これに対し、本発明者らは上記ＹＨ１８合成ペプチドがβｉｇ−ｈ３に対するβ３／２９３細胞の付着も抑制するかどうかを調査した。実験は上記実施例５と同様な方法で行った。
【００８０】
その結果、図６ｃで見られるように、それぞれのｆａｓ−１ドメインから由来したＹＨ１８合成ペプチドがβｉｇ−ｈ３に対するβ３／２９３細胞の付着を濃度依存的に抑制することを確認した。
【００８１】
上記結果からβｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインにあるＹＨモチーフがαｖβ３インテグリンを通じて内皮細胞の付着を媒介し、上記ＹＨモチーフを含むペプチドを添加する場合、上記ペプチドがαｖβ３インテグリンと相互作用して内皮細胞の付着を抑制することを再確認することができた。
【００８２】
＜実施例７＞
ＹＨ１８合成ペプチドの内皮細胞の移動抑制分析
＜７−１＞インテグリン機能阻害抗体を用いた内皮細胞の移動抑制分析
まず、本発明者らはβｉｇ−ｈ３が内皮細胞の移動に関与するかどうかを調べるために、細胞移動実験を行った。細胞移動実験はトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレート（ポアサイズ８μｍ，  Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）を用いて実施した。膜の底の表面を上記実施例１で製造した組換えβｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）で４℃でコーティングさせた後、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファを添加して室温で１時間ブロックさせた。一方、ＨＵＶＥＣは抗−αｖβ３抗体（ＬＭ６０９）または抗−αｖβ５抗体（Ｐ１Ｆ６）を添加して３７℃で３０分間前培養させた。対照群にはマウスＩｇＧを添加した。以後、抗体と共に前培養されたＨＵＶＥＣを３×１０５細胞／ｍｌの濃度で培地に懸濁した後、細胞懸濁液０．１  ｍｌをフィルタの上の部分に添加した。細胞を３７℃で６−８時間移動するように置いた。
【００８３】
以後、綿棒でフィルタの上の部分から細胞を除去して細胞移動を終結した。フィルタを８％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させ、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）で染色した。細胞移動は光学顕微鏡で観察した。ＨＰＦ（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｈｉｇｈ  ｐｏｗｅｒ  ｆｉｅｌｄｓ，×２００）の下で任意に選択された９ヶ所で細胞数を数えた。
【００８４】
その結果、ＨＵＶＥＣの移動は底面にβｉｇ−ｈ３がコーティングされたトランスウェルで強化され（結果を図示せず）、上記効果はαｖβ３インテグリンに対する抗体により特異的に抑制された反面、αｖβ５インテグリンに対する抗体によっては抑制されていないことを確認した（図７ａを参照）。
【００８５】
＜７−２＞ＹＨ１８合成ペプチドによる内皮細胞の移動抑制分析
次に、本発明者らはＹＨ１８合成ペプチドにより内皮細胞の移動が抑制されるかどうかを調べた。ＨＵＶＥＣ懸濁液を膜の上の部分に添加する時、インテグリン機能阻害抗体の代わりに配列番号２６と記載されるＹＨ１８合成ペプチド５００  μＭまたは１  ｍＭを共に添加した以外は上記実施例＜７−１＞と同様な方法で実験を行った。ペプチド処理に対する対照群には５％ＤＭＳＯ（溶媒）を処理し、上記ＹＨ１８合成ペプチドに対する対照群には配列番号２７と記載されるＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチドを添加した。
【００８６】
その結果、図７ｂで見られるように、ＹＨ１８合成ペプチドがβｉｇ−ｈ３に向かった内皮細胞の移動を抑制することを確認した。上記結果からβｉｇ−ｈ３のＹＨモチーフがαｖβ３インテグリンを通じた内皮細胞の移動を媒介し、ＹＨモチーフを含むペプチドを添加した場合、上記ペプチドがαｖβ３インテグリンと相互作用して内皮細胞の移動を抑制することが分かった。
【００８７】
＜実施例８＞
ＹＨ１８合成ペプチドによる血管新生抑制分析
＜８−１＞内皮チューブ形成分析（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
本発明者らは、ｆａｓ−１ドメインのＹＨモチーフが血管新生を抑制するかどうかを調べるために、上記ペプチドが内皮チューブの形成に及ぼす影響を分析した。まず、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）を９６−ウェルプレートの各ウェルに１００μｇづつ添加して重合させた。ＨＵＶＥＣを３×１０５細胞／ｍｌの濃度で培地で懸濁した後、細胞懸濁液０．１  ｍｌを上記マトリゲルがコーティングされた各ウェルに添加した。この時、配列番号２６と記載されるＹＨ１８合成ペプチド５００  μＭまたは１  ｍＭを共に添加した。ペプチド処理に対する対照群には５％ＤＭＳＯ（溶媒）を処理し、上記ＹＨ１８合成ペプチドに対する対照群には配列番号２７と記載されるＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチドを処理した。以後、細胞を３７℃で１６−１８時間培養した後、細胞の写真を撮ってチューブを計数して平均値を求めた。
【００８８】
その結果、図８ａで見られるように、ＹＨ１８合成ペプチドは濃度依存した方法によりマトリゲルで内皮チューブ形成を選択的に抑制することを確認した。ＹＨ１８合成ペプチドのＩＣ５０は５００  μＭであった。
【００８９】
＜８−２＞マトリゲルプラグ分析（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ）
本発明者らは、上記実施例＜８−１＞の試験管内条件（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で確認したＹＨ１８合成ペプチドの血管新生抑制効果を生体内条件（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で分析した。生体内マトリゲルプラグ分析はマエシマらの方法（Ｍａｅｓｈｉｍａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：２３７４５−２３７５０，２０００）で行った。Ｃ５７／ＢＬ６マウスは５〜６週齢の雄をヒョチャン科学から購入して用いた。
【００９０】
まず、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＭＡ）を２０  ｕｎｉｔｓ／ｍｌヘパリン、１５０  ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）と配列番号２６と記載されるＹＨ１８合成ペプチドと混合した。ＹＨ１８合成ペプチドに対する対照群としては、ＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチドを用い、ペプチド処理に対する対照群には５％ＤＭＳＯ（溶媒）を処理した。マトリゲル混合物をＣ５７／ＢＬ６マウスに皮下注射した。７日後にマウスを犠牲にしてマトリゲルを除去した後、４％パラホルムアルデヒドで固定した。プラグをパラフィンに埋め込み、切断してＨ＆Ｅ染色を行った。切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）を光学顕微鏡で観察し、血管の数を４−６  ＨＰＦ（ｈｉｇｈ  ｐｏｗｅｒ  ｆｉｅｌｄｓ；  ×２００）で計数して平均値を求めた。それぞれのグループは３または４マトリゲルプラグで構成される。
【００９１】
その結果、５００  μＭ濃度のＹＨ１８合成ペプチドを添加した場合には血管の数が急激に減少し、１  ｍＭ濃度のＹＨ１８合成ペプチドを添加した場合には血管新生が完全に抑制されることを確認した（図８ｂのＡを参照）。また、切片を観察した場合にも上記のような結果を得た（図８ｂのＢ及びＣを参照）。
【００９２】
上記結果からＹＨモチーフを含むペプチドが試験管内及び生体内条件で血管新生を抑制することを確認することができた。
【００９３】
＜適用例１＞癌
血管新生は癌細胞の成長と転移において必須の段階である（（Ｗｅｉｄｎｅｒ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２４：１−８，１９９１）。腫ようは新生血管を通じて成長と増殖に必要な栄養と酸素の供給を受け、また、腫ようまで浸透した新生血管は癌細胞が血液循環系に入る機会を提供して癌細胞が転移されるようにする（Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｙｌｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｓ．  Ｂ．  Ｄａｙ  ｅｄ．）Ｒａｖｅｎ  ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ９４−１０３，１９７７；Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  Ｐ．  Ｊ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ６（３）：２３０−２４７，１９９５）。血管新生が起こらないと腫ようは一定期間休止状態で生存し、これ以上成長することができなくなる（Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｙｌｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｓ．  Ｂ．  Ｄａｙ  ｅｄ．）Ｒａｖｅｎ  ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ９４−１０３，１９７７）。しかし、癌組織の血管新生が発達すればするほど他の組織への転移が起きるようになる（Ｗｅｉｄｎｅｒ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２４：１−８，１９９１）。血流を通じた癌細胞の転移は既に生成されている血管を通じて発生する場合は非常にまれであり、血管新生が旺盛に発生する部位で主に発生する。即ち、不完全な血管壁の間に癌細胞が抜け出たり、タンパク質分解酵素の作用により血管壁の基底膜が分解される時、この間に癌細胞が抜け出て、一部では増殖している内皮細胞が直接癌細胞を新生血管内に移動させて全身的転移が発生するようになる。したがって、本発明のＹＨモチーフを含むペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制用組成物は血管新生の抑制効能に優れるため、多様な癌細胞の転移予防及び治療に非常に効果的である。
【００９４】
＜適用例２＞関節炎
関節炎は、自己免疫異常が原因であるが、病気が進行されるにつれて関節間の滑液腔に生じた慢性炎症が血管新生を誘導して軟骨が破壊される。関節炎には感染性関節炎、退行性関節炎、リューマチ性関節炎、股骨頭無菌壊死、強直性脊椎炎、先天性奇形による関節炎など数種があるが、原因を問わず、病気が進行する過程で滑液腔に生じた慢性炎症が血管新生を誘導すると知られており、新たな毛細血管が関節に侵入して軟骨が損傷することが特徴である（Ｋｏｃｂ  Ａ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈ．  Ｒｈｅｕｍ．，  ２９：４７１−４７９，１９８６；Ｓｔｕｐａｃｋ  Ｄ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｃｓ．，  ３２：５７８−２８１，１９９９；Ｋｏｃｈ  Ａ．  Ｅ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，  ４１：９５１−９６２，１９９８）。この時、種類により炎症反応が一次的、二次的に生じて軟骨を破壊して病気の進行に重要な役割をし、関節内への新生血管の形成が重要な病理機構として作用すると報告されている（Ｃｏｌｖｉｌｌｅ−Ｎａｓｈ，  Ｐ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．，  ５１，９１９−９２５，１９９２；Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｒ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ４９：１−１９，１９９１）。関節炎の治療は原因による治療よりは痛みを抑制することと炎症現象を抑制して関節や筋肉などの破壊速度を最大限遅らせて機能消失を最小化することを優先とする。したがって、本発明の血管新生抑制用組成物は関節炎の進行防止と治療に非常に効果的である。
【００９５】
＜適用例３＞乾癬
乾癬は、丘疹及び銀白色の鱗屑を伴う皮膚疾患である。概して悪化と好転が繰り返される慢性の増殖性疾患であり、原因はまだ明らかでないが、病理学的所見上、病変部や非病変部で観察される新生血管の形成とこれによる血管透過性の増加により好中球などの免疫細胞の浸潤が病気の悪化に重要であると知られている（Ｂｈｕｓｈａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １４１：１０５４−１０６０，１９９９）。正常人の場合、角質細胞が１ケ月に一度増殖するのに比べて乾癬患者は少なくとも一週間に一度増殖する。このような速い増殖をするためには多くの血液が供給されなければならないため、血管新生が速く生じざるを得ない（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ５９：４０−４８，１９７２）。したがって、本発明の血管新生抑制用組成物が乾癬の治療に効果的である。
【００９６】
＜適用例４＞糖尿性眼疾患
毎年全世界的に数百万名が失明するようになる多くの眼科疾患も血管新生が原因である（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｍ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １０３：１２３１−１２３６，１９９９；Ｓｔｕｐａｃｋ  Ｄ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｃｓ．，  ３２：５７８−２８１，１９９９）。その代表的な例として老人に生じる退化斑（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症、新生血管性緑内障、新生血管による角膜疾患などがある（Ａｄａｍｉｓ  Ａ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ３：９−１４，１９９９）。その中でも糖尿性癌疾患は失明をもたらす糖尿病の主要合併症の一つであり、血糖調節程度とは関係なく有病期間が長くなれば発生する。最近糖尿病の治療法が向上することにより糖尿病患者の寿命が延長されながら糖尿網膜病症も並行して増加する趨勢にある。従って、糖尿網膜病症は西欧ではもちろん韓国でも成人失明の最も大きな原因となっている。糖尿性網膜症は網膜の微細循環の障害により発生し、血管新生が網膜の内面と後部硝子体に沿って広がりながら硝子体内に血管が侵入したり出血が起こったりしながら失明をもたらす。特に、糖尿性網膜症のような糖尿性癌疾患は急速な血管新生の進行によりもたらされる疾患であると報告されている（Ｆａｖａｒｄ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  Ｍｅｔａｂ．，  ２２：２６８−２７３，１９９６）。したがって、本発明の血管新生抑制用組成物が糖尿性癌疾患の予防及び治療に非常に効果的である。
【００９７】
＜適用例５＞動脈硬化
動脈硬化症は動脈壁が厚くなって壁の弾力性が消失する疾患を意味する。三つの形態学的種類があるが、中サイズ以上の動脈にアテロームが形成されて生じるアテローム様動脈硬化が最も一般的で重要な疾患である。コレステロールとコレステロールエステルで構成され、繊維性被膜に積まれたアテロームが動脈の内面を覆いながら動脈壁の内腔が狭くなって遠位部臓器の血流を遮断して臓器の虚血性損傷を引き起こす。大動脈に生じた場合、侵犯された動脈壁を弱化させて動脈瘤と血管破裂、血栓を引き起こす。この時、アテローム内への血管新生が血管壁を弱化させるのに重要な役割をすると報告されている（Ｈｏｓｈｉｇａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，  ７７：１１２９−１１３５，１９９５；Ｋａｈｌｏｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ８：６０−６４，１９９２；Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  ９：４１３−４２３，１９９８）。したがって、本発明の血管新生抑制用組成物が動脈硬化により引き起こされる深刻な合併症予防に非常に効果的である。
【００９８】
＜適用例６＞炎症
炎症とは、局所的な損傷に対する血管がある生きている組織の反応であり、感染、外傷など様々な要因により生じ得るが、原因と反応組織の差に関係なくほぼ類似した変化を示す。この変化には血流の増加、血管壁の透過性の増加、白血球の浸潤があるが、これら全ての変化に血管新生が原因と結果として生じると報告されている（Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ，  Ｊ．，  １１：４５７−４６５，１９９７）。炎症とは、損傷に対する修復機構であるため、害になる反応ではないが、過多に生じたり、自己免疫の場合のように不適切に生じる場合、炎症の変化自体により組織の損傷と変形をもたらすことができる。このような過度であったり不適切な炎症反応を調節するにあたり、本発明の血管新生抑制用組成物が効果的である。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
以上詳察した通り、本発明によるペプチドは内皮細胞のインテグリンαｖβ３と相互作用して内皮細胞の付着と移動を抑制するだけでなく、優れた血管新生抑制効果を示す。従って、本発明のペプチドは内皮細胞の付着、移動及び／又は血管新生を抑制するのに有用である。また、血管新生と関連した多様な疾患の治療または予防にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】多様なタンパク質由来のｆａｓ−１ドメインに高く保存されたチロシン−ヒスチジン及びこれに隣接する保存されたロイシン／イソロイシン残基を含む配列を比較した図である。
【図２】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインのそれぞれを含む組換えタンパク質の模式図（Ａ）及びＨＵＶＥＣがβｉｇ−ｈ３またはそれぞれのｆａｓ−１ドメインでコーティングしたプレートに付着した程度を吸光度で示したグラフ（Ｂ）である。
【０１０１】
ＢＳＡ：対照群である牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）
野生型：４個のｆａｓ−１ドメインを全て含む組換えβｉｇ−ｈ３  Ｈｉｓ−β−ｂタンパク質
Ｄ−Ｉ：第一のｆａｓ−１ドメイン
Ｄ−ＩＩ：第二のｆａｓ−１ドメイン
Ｄ−ＩＩＩ：第三のｆａｓ−１ドメイン
Ｄ−ＩＶ：第四のｆａｓ−１ドメイン
【図３ａ】様々なインテグリンに対する機能阻害抗体がプレートにコーティングされたβｉｇ−ｈ３に対するＨＵＶＥＣの付着を阻害する程度を示したグラフである。
【０１０２】
ＢＳＡ：プレートにＢＳＡをコーティングした場合
Ｎｏｎｅ：無処理
α３：Ｐ１Ｂ５（α３に対する抗体）処理
α５：Ｐ１Ｄ６（α５に対する抗体）処理
αｖ：Ｐ３Ｇ８（αｖに対する抗体）処理
β１：６Ｓ６（β１に対する抗体）処理
β３：Ｂ３Ａ（β３に対する抗体）処理
αｖβ３：ＬＭ６０９（αｖβ３に対する抗体）処理
αｖβ５：Ｐ１Ｆ６（αｖβ５に対する抗体）処理
【図３ｂ】αｖβ３またはαｖβ５インテグリンに対する機能阻害抗体がプレートにコーティングされた各ｆａｓ−１ドメインに対するＨＵＶＥＣの付着を阻害する程度を示したグラフである。
【０１０３】
ＢＳＡ：プレートにＢＳＡをコーティングした場合
Ｄ−Ｉ：βｉｇ−ｈ３の第一のｆａｓ−１ドメイン
Ｄ−ＩＩ：βｉｇ−ｈ３の第二のｆａｓ−１ドメイン
Ｄ−ＩＩＩ：βｉｇ−ｈ３の第三のｆａｓ−１ドメイン
Ｄ−ＩＶ：βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメイン
【図３ｃ】αｖβ３またはαｖβ５インテグリンに対する機能阻害抗体を用いてＨＵＶＥＣ表面で発現するインテグリンをＦＡＣＳで分析した結果である。
【図３ｄ】βｉｇ−ｈ３の内皮細胞の付着に関与する受容体を同定するために、ＨＵＶＥＣ細胞膜に対するビオチン−βｉｇ−ｈ３の結合能（Ａ）及びαｖβ３またはαｖβ５インテグリン機能阻害抗体がＨＵＶＥＣ細胞膜に対するビオチン−βｉｇ−ｈ３の結合を阻害する程度（Ｂ）を濃度別に調査したウェスタン−免疫ブロッティング分析結果である。この時、β−チューブリンは測定に用いたタンパク質量が同一であることを示す内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）である。
【図４ａ】βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−ＩＶ）の多様な欠失変異体に対する概略図を示した図である。
【図４ｂ】第四のｆａｓ−１ドメイン内に保存されたＹＨモチーフに対するいくつかの置換変異体の概略図及び上記変異体のＨＵＶＥＣ付着活性を調査した結果を示すグラフである。検定ブロック：置換されたアミノ酸
【図５】βｉｇ−ｈ３の各ｆａｓ−１ドメインから由来したＹＨ１８合成ペプチドの配列及び上記ペプチドがβｉｇ−ｈ３に対するＨＵＶＥＣの付着を濃度依存的に阻害する程度を示すグラフである。
【図６ａ】β３インテグリン発現ベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３細胞がβｉｇ−ｈ３に付着する程度を示したグラフである。
【０１０４】
ｐｃ／２９３：ｐｃＤＮＡ３ベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３細胞
β３／２９３：β３インテグリン発現ベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３細胞
【図６ｂ】αｖβ３またはαｖβ５インテグリンに対する機能阻害抗体がプレートにコーティングされたβｉｇ−ｈ３に対するβ３／２９３細胞の付着を阻害する程度を示したグラフである。
【０１０５】
ＢＳＡ：プレートにＢＳＡをコーティングした場合
ＩｇＧ：マウスＩｇＧ処理
αｖβ３：ＬＭ６０９（αｖβ３に対する抗体）処理
αｖβ５：Ｐ１Ｆ６（αｖβ５に対する抗体）処理
【図６ｃ】ＹＨ１８合成ペプチドがプレートにコーティングされたβｉｇ−ｈ３に対するβ３／２９３細胞の付着を濃度−依存的に阻害する程度を示したグラフである。
【図７ａ】αｖβ３及びαｖβ５インテグリンに対する機能阻害抗体がプレートにコーティングされたβｉｇ−ｈ３に対するＨＵＶＥＣの移動を阻害することを示した写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【０１０６】
ＢＳＡ：プレートにＢＳＡをコーティングした場合
ＩｇＧ：マウスＩｇＧ処理
αｖβ３：ＬＭ６０９（αｖβ３に対する抗体）処理
αｖβ５：Ｐ１Ｆ６（αｖβ５に対する抗体）処理
【図７ｂ】ＹＨ１８合成ペプチドがプレートにコーティングされたβｉｇ−ｈ３に対するＨＵＶＥＣの移動を阻害することを示した写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【０１０７】
ＢＳＡ：プレートにＢＳＡをコーティングした場合
対照群：５％ＤＭＳＯ処理
ＹＨ１８−ｃｏｎ．：ＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチド（対照群ペプチド）処理
ＹＨ１８−５００μＭ：ＹＨ１８合成ペプチドを５００μＭの濃度で処理
ＹＨ１８−１ｍＭ：ＹＨ１８合成ペプチドを１ｍＭの濃度で処理
【図８ａ】ＹＨ１８合成ペプチドによりＨＵＶＥＣのチューブ形成が阻害される程度を示した写真（Ａ）及び形成されたチューブの分枝数を測定して示したグラフ（Ｂ）である。
【０１０８】
対照群：５％ＤＭＳＯ処理
ＹＨ１８−ｃｏｎ．：ＹＨ１８−ｃｏｎ．ペプチド（対照群ペプチド）処理
ＹＨ１８−５００μＭ：ＹＨ１８合成ペプチドを５００μＭの濃度で処理
ＹＨ１８−１ｍＭ：ＹＨ１８合成ペプチドを１ｍＭの濃度で処理
【図８ｂ】ＹＨ１８合成ペプチドにより血管新生が阻害される程度を示した写真（Ａ）、Ｈ＆Ｅ染色した切断面の写真（Ｂ）及び血管数を測定して示したグラフ（Ｃ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
2006522111.tif 000013
【図３ｃ】
2006522111.tif 000014
【図３ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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