(57)【要約】本発明はＴ細胞非結合性ペプチド及びその類似物の慢性関節リウマチの治療ヘの用途を提供する。このペプチド治療剤は慢性関節リウマチの異常な免疫反応を特異的に抑制することができ、疾患の前期段階で病気の進行を根本的に制御する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通配列QK/RRAA （即ちGln-Lys / Arg-Arg-Ala-Ala ）を有するターゲット配列に結合するＴ細胞非結合性ペプチド及びその類似物。
【請求項２】
以下の配列のいずれかを有するＴ細胞非結合性ペプチド。
F K G E A G P K G E   （配列番号１）
F K G E Q A P K G E   （配列番号２）
F K G E Q G A K G E   （配列番号３）
F K G E Q G P A G E   （配列番号４）
F K  G E Q G A A G E   （配列番号５）
F K G E Q A G A G E   （配列番号６）
F K G E G A G A G E   （配列番号７）
【請求項３】
請求項１に記載のＴ細胞非結合性ペプチド及びその類似物、並びに薬学的に使用可能な担体および補助剤を含む医薬組成物。
【請求項４】
慢性関節リウマチの治療のための医薬の製造における請求項１に記載のＴ細胞非結合性ペプチド及びその類似物の使用。
【請求項５】
慢性関節リウマチの治療における請求項１に記載のＴ細胞非結合性ペプチド及びその類似物の用途。
【請求項６】
請求項１に記載のＴ細胞非結合性ペプチド及びその類似物を慢性関節リウマチの患者に投与すること。
【請求項７】
請求項２に記載のＴ細胞非結合性ペプチド、並びに薬学的に使用可能な担体または補助剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
慢性関節リウマチの治療のための医薬の製造における請求項２に記載のＴ細胞非結合性ペプチドの使用。
【請求項９】
慢性関節リウマチの治療における請求項２に記載のＴ細胞非結合性ペプチドの用途。
【請求項１０】
請求項２に記載のＴ細胞非結合性ペプチドを慢性関節リウマチの患者に投与すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴ細胞非結合性ペプチドの製造、ならびに慢性関節リウマチ及びその他自己免疫疾患を治療する医薬としての同ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ（Rheumatoid Arthritis, RA）は主に関節の病変を引き起すとしてよく知られている身体に障害を及ぼしうる慢性自己免疫疾患である。中国での罹患率は0.34% で、全国において約５００万の患者があり、身体障害の割合はほぼ９３％にのぼる。この疾患の発病の過程は一種の抗原に駆動される「激発−連鎖免疫反応」の過程である。感染要因及び自己免疫反応を介した免疫損傷は慢性関節リウマチの発病と病状変化の基礎となる。抗原ポリペプチドは体内の抗原提示細胞（APC ）によって提示され、Ｔリンパ細胞を活性化させて、サイトカインの放出、免疫グロブリン、ケモカイン、フリーラジカルなどの炎症因子の産生増大を招き、ひいては血管炎、滑膜増殖、軟骨および骨の損傷などの慢性関節リウマチの特異的な臨床徴候を引き起こす。
【０００３】
現在、慢性関節リウマチを根本的に制御できる薬剤はまだない。臨床では、主に例えば非ステロイド系抗炎症剤であるブルフェン（Brufen, 登録商標）、ジクロフェナクなどを使用して一時的に症状を緩和させる。また、メトトレキサート、レフルノミドなどの疾患修飾性抗リウマチ薬は、DNA 合成抑制により免疫反応を幅広く抑制することによって関節の炎症を抑制するために用いられる。しかしながら、これらの薬剤は、慢性関節リウマチの治療において発病の初期イベントに奏功するものではなく、同薬剤により疾患を特異的に制御することは非常に困難である。そのため、全身及び関節の疾患は進行し続け、最後には患者に身体障害をもたらすことになる。さらに、これらの薬剤の幅広い免疫抑制作用は骨髄抑制、肝機能異常などの副作用を引き起こす場合が多いため、多くの患者はこれらの薬剤による治療を受けることができなくなる。
【０００４】
現在、慢性関節リウマチの発病の原因に対して免疫反応の初期段階で抑制することで当該疾患を治療する薬剤が、差し迫って必要である。そのために、本発明者は長年の研究を通じて、慢性関節リウマチに用いることのできる治療薬剤としてＴ細胞非結合性ペプチドを見つけた。この研究は、本発明のペプチドがHLA-DRβ１分子とＴ細胞の抗原に対する識別及びこれによる自己免疫反応を抑制でき、慢性関節リウマチ発症の中心となる過程において本疾患の発生と進行を阻止および制御できることを証明した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的のひとつは、慢性関節リウマチを効果的に治療するために使用可能なＴ細胞非結合性ペプチドを提供することである。
本発明の他の目的は、当該Ｔ細胞非結合性ペプチドの慢性関節リウマチの治療における用途を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、当該Ｔ細胞非結合性ペプチドを含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書において使用する用語「Ｔ細胞非結合性ペプチド」とは、配列番号１−７ポリペプチドの中の任意の一つ、或いは複数のアミノ酸を改変することにより作製され、かつ改変後も依然としてHLA-DRβ１と結合できるポリペプチドをいう。アミノ酸配列を改変す
る方法は当業者にとっては既知の方法である。  
【０００８】
本発明は、主にアラニン（alanine, A）或いはグリシン（glycin, G ）を用いて、天然に存在するCII ペプチド中の、Ｔ細胞受容体と結合可能でＴ細胞の増殖を刺激する作用を有する一つ又は複数のアミノ酸を置換し、且つHLA-DRβ１と結合可能なアミノ酸を残しておくことによって、HLA-DRβ１とは結合可能であるが、Ｔ細胞受容体に認識されない新規CII ポリペプチド分子を形成することを含む。同分子はすなわち、添付されている七つのＴ細胞非結合性ペプチド（267A、268A、269A、270A、Mut269-270、Mut268-270、Mut267-270）である（その配列と名称は配列表を参照）。
【０００９】
HLA-DRβ1 と抗原ペプチドとＴ細胞受容体との三つの分子の間での相互認識と結合は慢性関節リウマチの異常免疫反応の中心となる部分である。従って、本発明は慢性関節リウマチを引き起こすキーポイント、即ちＴ細胞と抗原との結合を阻止することから着手して、Ｔ細胞の抗原に対する認識と、Ｔ細胞非結合性ペプチドの病原性抗原に対する競合的な抑制作用とを利用することにより慢性関節リウマチ患者体内の異常免疫反応を制止し、疾病の発病及び病変の進行を抑え、慢性関節リウマチを根本的に治療する目的を達成する。
【００１０】
すでに報告されているように、HLA-DRβ1 配列の第７０−７４アミノ酸は共通配列QK/RRAA(すなわちGln-Lys/Arg-Arg-Ala-Ala,  グルタミン‐リジン‐アルギニン‐アルギニン‐アラニン‐アラニン) を有する（１）。当該共通配列はHLA-DRβ1 の抗原結合溝の形成に関連し、同配列内のアミノ酸が機能して抗原に結合する。本発明者とWucherfennigらの多くの研究を経て当該共通配列の中の陽性に荷電した第７１アミノ酸（ＬｙｓまたはＡｒｇ）が抗原結合のかなめとなる部位であることが明らかとなった（２‐８）。
【００１１】
Ｘ線回折技法を用いたHLA-DRβ1 ‐抗原ダイマーの結晶構造に対する研究から、慢性関節リウマチに関係するHLA-DRβ1 （DR4/DR1 ）分子に結合する種々の抗原ペプチドの折り畳み構造はいずれも類似していることが見出された。該抗原ペプチドは変性したII型コラーゲン（CII ）および熱ショックたんぱく質（HSP70 ）などを含む（９−１２）。これらの抗原ペプチドの立体構造（図１）から分るように、Phe263(P1)、Glu266(P4)、Gly271(P9)の側鎖は左側のHLA-DRβ1 分子へと伸び、全部または部分的に抗原結合溝に埋め込まれている。他のアミノ酸側鎖は別の側またはHLA-DRβ１の反対側（Ｔ細胞受容体側）に伸び、Ｔ細胞活性化を刺激する。図２が示したようにCII ポリペプチドのP1、P4、P9側鎖はHLA-DRβ1 分子の抗原結合“ポケット”に埋め込まれ、陰性に荷電したP4(GluとHLA-DRβ１分子の陽性に荷電した第７１アミノ酸(Lys71) は接近して、より親和力の高い極性結合を形成する。従って、おそらくGlu266が、CII ポリペプチドがHLA-DRβ１と結合するための要となるアミノ酸であるかもしれない（１３，１４）。さらに、あとの研究で実証されたように、CII ペプチドは主にPhe263、Gly265、Glu266、Gly271、Glu272によってＴ細胞受容体に結合して、Ｔ細胞を活性化させる（１２−１４）。従って、CII ポリペプチド配列のなかで主にHLA-DRβ１に結合するアミノ酸はPhe263、Gly265、Glu266、Gly271、Glu272で、主にＴ細胞受容体に結合するアミノ酸はGln267、Gly268、Pro269およびLys270である（表１）。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
以上の研究に基づき、本発明者は、CII ペプチド配列中の、Ｔ細胞受容体に結合し、かつＴ細胞の増殖を刺激するアミノ酸をアラニン（Ａ）とグリシン（Ｇ）を用いて置換し、HLA-DRβ１に結合するアミノ酸を残すことにより、HLA-DRβ１分子のみと結合し、Ｔ細胞受容体に認識されないＴ細胞非結合性ペプチドを作製した。このＴ細胞非結合性ペプチドはHLA-DRβ１と特異的に結合可能であり、自己抗原とHLA-DRβ１の結合を競合的に抑制できる。そして、HLA-DRβ1 が仲介した自己免疫反応及びそれに伴う炎症因子放出等の疾病過程を抑制できる。
【００１４】
そのため、本発明の実施例に、Ｔ細胞非結合性ペプチド及びその類似物を提供する。以下のペプチド、すなわちFKGEAGPKGE（配列番号１) 、FKGEQAPKGE（配列番号２) 、 FKGEQGAKGE ( 配列番号３) 、 FKGEQGPAGE （配列番号４) 、 FKGEQGAAGE （配列番号５) 、FKGEQAGAGE（配列番号６) 、FKGEGAGAGE（配列番号７）が好ましい。これらのペプチドは、慢性関節リウマチの発症に関係するHLA-DRβ1 の特異配列QK/RRAA(すなわちGln-Lys/Arg-Arg-Ala-Ala)と結合可能であり、それによってＴ細胞の活性化は抑制を受け、慢性関節リウマチ及びその他Ｔ細胞関与を仲介とする自己免疫疾患を治療する目的が達成される。
【００１５】
また、本発明の実施例に上記のＴ細胞非結合性ペプチドまたはその類似物及び薬学的に使用可能な担体または補助剤を含む医薬組成物を提供する。
これらの薬学的に使用可能な担体または補助剤は、ラクトース、サッカロース、ソルビンアルコール、マンニトール、馬鈴薯澱粉、コーン澱粉あるいはアミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなどを含む。上記の医薬組成物は錠剤、ピル、カプセル、シロップ、粉末剤、顆粒剤、液剤などの形態に調製できる。例えば、上記の医薬組成物を経口投与する際、当該ペプチドを上記の担体または補助剤と混合し、それからプレスにかけて錠剤とすることができる。必要な場合はさらにコーティングを施しても良い。
【００１６】
液剤に、当技術分野で周知の他の賦形剤を含めてもよい。当該医薬組成物は薬学的に使用可能な担体、例えば、水、混懸剤、乳化剤および他の成分を含みうる。
本発明の医薬組成物におけるＴ細胞非結合性ペプチド或いはその類似物の含有量は、通常錠剤あたり50-200μｇ、最適な含有量は錠剤あたり 100μｇである。当業者は、患者の
病状、体重、年齢など基づき、本発明のＴ細胞非結合性ペプチドの用量を具体的に確定することができる。
【００１７】
本発明のＴ細胞非結合性ペプチドとその類似物は、様々な投与経路（例えば経口、注射など）で慢性関節リウマチ患者に投与可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００１９】
［ペプチドの設計と合成］
前記の研究で既に証明されたように（４，５，９−１１）、CII ペプチド配列中の２６７−２７０アミノ酸は主にＴ細胞受容体に結合し、かつＴ細胞の活性化を刺激する。本発明はFlechsler 等（１４）により報告された固相法をまず利用して、単一あるいは数個の置換アミノ酸（CII 267-270 ）を含む七種のＴ細胞非結合性ペプチド群を合成した（表２）。これらのＴ細胞非結合性ペプチドの吸収率、生体利用度及び治療の効果を向上させるために、合成する際に一つ一つのペプチドのN-末端にミリスチン酸の遺伝子を連結させ、ペプチドが細胞内へ輸送されやすいようにした。本発明で用いる１０アミノ酸のペプチドはすべて四つ以上の親水性残基例えばリジン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）を含むので、溶解および吸収されやすい。また、このＴ細胞非結合性ペプチドは、劣化しやすいメチオニン（Ｍ）やトリプトファン（Ｗ）、及びアミノ基やカルボキシル基が脱落しやすいアスパラギン酸（Ｎ）などは含まない。よって、ペプチドの安定性は良く、細胞内に入りやすいので、Ｔ細胞認識の妨害作用を発揮することができる。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
研究より、Ｔ細胞に結合するアミノ酸（267-270 ）をそれぞれアラニン（A ）及び/ 或いはグリシン（G ）と置換した後も、上記七つのＴ細胞非結合性ペプチドはいずれもＴ細胞の活性化を抑制する作用を有することが示されている。その内267AとMut267-270ペプチドの著しい抑制効果は、すでに下記の細胞実験と関節炎動物モデルによって証明された（
下記参照）。
【実施例２】
【００２２】
［本発明のＴ細胞非結合性ペプチドのＴ細胞活性化に対する抑制作用］
抗原ペプチドは抗原提示細胞（APC ）によって提示され、Ｔリンパ細胞を活性化させ、体内の炎症因子の産生を引き起こす。こうして、慢性関節リウマチの特異的な臨床徴候を引き起こす。試験する際、Ｔ細胞の増殖とインターロイキン‐２（IL- ２）のレベルを調べることによって、Ｔ細胞非結合性ペプチドのＴ細胞活性化に対する抑制作用を調べることができる。本研究では国際的に認められた以下の二種類の抗原提示とＴ細胞活性化システムを使用する。
【００２３】
抗原提示細胞（APC ）：
L57.23細胞: HLA-DR1 抗原を認識（DR1 遺伝子のトランスジェニック）
Priess細胞: HLA-DR1/4 を認識（EBV 形質転換）
Ｔ細胞：
3.19細胞: HLA-DR1 特異的なＴ細胞クローン
3838細胞: HLA-DR4 特異的なＴ細胞クローン
そのうちL57.23細胞と3.19細胞は抗原提示とＴ細胞活性化システムの一つで、Priess細胞と3838細胞はほかの抗原提示とＴ細胞活性化システムである。上記七つのＴ細胞非結合性ペプチドの、抗原提示とＴ細胞活性化に対する影響の違いを比べることを通じて、Ｔ細胞活性化を著しく抑制するＴ細胞非結合性ペプチドを選別する。
【００２４】
反応系の中へまず抗原提示細胞と種々のＴ細胞非結合性ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）およびそれに相応するＴ細胞を入れ、３７℃で４８時間インキュベートしてから、上澄み液を取り、増殖期のIL- ２依存性細胞（CTLL）に添加してテトラゾリウム塩法(MTT) を用いてCTLL細胞の増殖を調べた。こうしてＴ細胞非結合性ペプチドのＴ細胞活性化への抑制効果を測定した。
【００２５】
本実験の結果が示したように、天然に存在するDRβ１結合ペプチドは400 、200 、80、40、20μg/mlの濃度下ではいずれもＴ細胞の増殖を刺激することができ、上澄み液中に高濃度のIL- ２が検出できた。しかしながら、七つのＴ細胞非結合性ペプチドのＴ細胞活性化に対する刺激作用は著しく弱くなり、上澄み液中のIL- ２の濃度は天然に存在するペプチドの場合より有意に低くなった。(p<0.01)( 図３) 。また、Ｔ細胞非結合性ペプチドと天然に存在するペプチド及びＴ細胞活性化システムを一緒にインキュベートした際、Ｔ細胞非結合性ペプチドにより、天然に存在するDRβ１結合ペプチドのＴ細胞活性化が著しく抑制され、しかも、この抑制作用はＴ細胞非結合性ペプチド濃度の増加に伴って強くなった（図４）。更なる実験で実証されたように、第２６７アミノ酸を置換したＴ細胞非結合性ペプチド(267A)を用いてコラーゲン関節炎ラットを治療すると、関節腫脹と炎症反応を著しく軽減することができた。以上の結果から示されるように、天然に存在するCII263-272ペプチドにはII型コラーゲンの抗原エピトープが含まれており、当該ペプチドのなかでＴ細胞に結合するアミノ酸を置換することにより形成されたＴ細胞非結合性ペプチドは、Ｔ細胞受容体による当該ペプチドに対する識別を阻止し、 またＴ細胞活性化を抑制する
ことができる。これらの一連の研究結果は、いずれもＴ細胞非結合性ペプチドがHLA-DR1/DR4 に仲介される自己免疫反応を抑制する新規な方法をもたらす可能性があることを示している。
【実施例３】
【００２６】
［本発明のＴ細胞非結合性ペプチドの実験関節炎に対する抑制作用］
関節炎を誘発する免疫反応において、抗原提示細胞は抗原によってＴ細胞活性化を誘発し、Ｔ細胞の増殖を刺激し、動物体内のサイトカイン（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１）のレ
ベルを上昇させ、それにより慢性関節リウマチの特異的な臨床徴候をもたらす。従って、実験動物体内のサイトカインのレベルを調べることを通じてＴ細胞非結合性ペプチドの関節炎に対する抑制作用を知ることができる。同時に、病理切片によって組織学の角度から薬剤の治療効力について評価することもできる。
【００２７】
本発明の動物試験プロトコールでは、ウシII型コラーゲンを用いてWistarラットのコラーゲン誘発関節炎（CIA 関節炎）を誘発させた。本発明のＴ細胞非結合性ペプチドを用いて関節炎ラットを治療した結果、267Aペプチドはこのラットの関節炎を著しく抑制可能であり、関節腫脹の程度を低減させ、疾患の経過を短縮できることが見出された（試験結果を参照）。
【００２８】
（１）実験関節炎の動物モデルの確立
本発明に使用した実験関節炎のモデルは、国際的に公認されているコラーゲン誘発関節炎（CIA 関節炎）モデルである（１３，１４）。実験動物はクローズドコロニーに属する米国のWistarラットである。本系統ラットは１９０７年に米国Wistar研究所で育成され、中国で最も早く導入され、且つ幅広く使用されている系統である。本実験用ラットはすべて北京大学人民医院動物試験センター（ＳＰＦ２級）で飼育した。ラットを下に木のフレークを敷いたポリステロールのケージに入れ、１２時間の明／暗循環を維持し、自由に水と飼料を摂取できるようにした。実験に用いるラットは全て８−１０週齢で体重が１８０±１０ｇの雄ラットとした。実験において動物にかかわる全てのプロトコールは中国実験動物管理条例に基づいて行った。
【００２９】
Sigma 社（USA, st. Louis）からウシII型コラーゲン（カタログ番号：Ｃ１１８８）入手した。このコラーゲンを酢酸に溶かして8mg/mlの溶液を作成し、次に等体積の完全フロイントアジュバント（Difco, Detroid, USA ）で乳化して、各Wistarラットの右足蹠に100 μl 乳化物を接種注射した。注射用量は４00μl/匹である。このようにしてWistarラットの関節炎モデルの確立に成功した。
【００３０】
（２）関節炎の評価
CII を用いてWistarラットの関節炎を誘発した約１５日後、全てのラットについて中足指節関節と指骨間関節に腫脹が見られた。０−１６点のスコア等級で関節炎の重篤度を具体的に評価した。０−４点で各肢を採点し、そのうち、０＝関節腫脹なし、１＝一つの関節腫脹、２＝二つの関節腫脹、３＝三つの関節腫脹、４＝四つ全部、肢全体の腫脹とした。四本の肢それぞれのスコアを得て、累計してスコアの総和を得た。免疫後２日目より開始し実験の終了まで、毎日ラットを採点した。
【００３１】
（３）Ｔ細胞非結合性ペプチドを用いたWistarラット関節炎に対する治療
Wistarラットの関節炎発症から第４−７日目に、関節炎を誘発されたラットをランダムに４群に分け、三つを治療群、一つを対照群とした。各群１０匹とし、三日目ごとにラットの尾基部にＴ細胞非結合性ペプチド267Aまたは滅菌蒸留水を皮下注射した。Ｔ細胞非結合性ペプチド267Aは注射する前に滅菌蒸留水に溶かした。三つの治療群に用いる濃度をそれぞれ100μg/ml 、500μg/ml 、1000μg/mlとし、ラット毎に100μlとした。対照群には滅菌蒸留水のみを注射した。排水法で毎日右肢体積の変化を測定した。上記の関節炎評価方法を用いて、関節炎を患う関節の数に基づいて毎日関節炎スコアを得た。治療してから１８日目に動物を屠殺し、末梢血液を採取した。ＴＮＦαおよびＩＬ−２のELISA キット（中華人民共和国深せん所在の晶美生物技術公司）で血清中の各サイトカイン濃度を検出すると同時に、右肢関節を切り離して固定し、脱灰し、切片を作製してHE染色を行った。
【００３２】
（４）SPSSソフトウエアで統計分析した。
（５）結果：本発明のＴ細胞非結合性ペプチドの実験関節炎に対する抑制作用
ウシII型コラーゲンで４０匹の雄のWistarラットに関節炎の誘発を行った結果、すべてのラットにおいて第１４−１７日に重篤度の異なる中足指節関節と指骨間関節の腫脹が表れた。ラットの関節炎が発症してから第４−７日目に、ラットをランダムに４群に分け、三つを治療群、一つを対照群とし、各群を１０匹とした。三つの治療群に用いたペプチド267Aの濃度はそれぞれ100μg/ml 、500μg/ml 、1000μg/mlとした。上記の関節炎評価方法を用いて、関節炎を患う関節の数に基づいて関節炎スコアを得た。
【００３３】
結果のデータにみられるように、治療前には、右肢腫脹率に関する関節炎スコア及び末梢血中のIL-2濃度はいずれも各群間で著しい違いがなかった。腫脹が見られる踝関節と中足指節関節をすべてHE染色したところ、様々な程度の滑膜増殖とリンパ細胞浸潤が認められ、一部の関節にはパンヌスが見られた（図５）。病理変化と関節腫脹は正相関を表した。三つの治療群では治療後２週間以内にラット右肢の腫脹が緩和されたが、対照群では右肢の腫脹に著しい変化は認められなかった。
【００３４】
本発明のＴ細胞非結合性ペプチド(267A)を用いて関節炎ラットを治療した後は、投与後第４日目に三つの治療群の全てのラットの関節炎は著しく緩和された（図６、下記の表３参照）。三つの治療群の関節炎の緩解率は対照群より有意に高い(P<0.05)。三つの治療群の第８，１０，１２，１４日目の右肢腫脹率および関節炎スコアは対照群より有意に低く(P<0.01)、三つの治療群の間に有意差はなかった。100μg/ml 用量群の末梢血中ＴＮＦα濃度は対照群より有意に低かった(P<0.05 、図７) 。これらの結果から、Ｔ細胞非結合性ペプチドが関節炎ラットの自己免疫性炎症を低減し、コラーゲン誘発関節炎の重篤度と病気の経過を抑制しうることが立証され、さらに、当該Ｔ細胞非結合性ペプチドが慢性関節リウマチに対する治療作用を有するかもしれないことが示唆される。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
本発明者は本願の他のＴ細胞非結合性ペプチド268A、269A、270A、Mut267-270、Mut267
-270についても上記のＴ細胞活性化アッセイ及び/ 或いはCIA モデルの実験研究を行い、いずれも２６７A と類似する結果を得た。
【００３７】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】すでに報告されたHLA-DRβ１に結合する五つのペプチド（CII 、HSP70 、Clip、HA、HB）の立体構造の類似性を示す図。五つのペプチドは重なり合い、それぞれ異なる色で示されている。左右の図は異なる角度からこれらのペプチドの構造を示したものである。この図から、これらのペプチドの構造は非常に類似していることが分る。左側の１位(P1)、４位(P2)、９位(P9)のアミノ酸側鎖はHLA-DRβ１分子と結合し、全部または一部が抗原結合溝に埋め込まれる。他のアミノ酸側鎖は、別の側またはHLA-DRβ１の反対のＴ細胞受容体の方向に向き、Ｔ細胞活性化を刺激する（immunity 7: 473-81,1997 ）。
【図２】CII ペプチドに結合しているHLA-DRβ１の結晶構造を示す図。CII ペプチドのP1、P4、P9側鎖はHLA-DRβ１分子の抗原結合「ポケット」に埋め込まれ、陰性に荷電したP4(Glu) とHLA-DRβ１分子の陽性に荷電した第７１アミノ酸(Lys71) とが接近して、親和性の高い極性結合が形成される（immunity 7: 473-81,1997 ）。
【図３】Ｔ細胞非結合性ペプチドと天然に存在するCII ペプチドのＴ細胞活性化への刺激作用の比較を示す図。天然に存在するCII ペプチドと比較すると、269A、270A、Mut269-270、Mut268-270、Mut267-270はいずれもＴ細胞活性化に有意な作用を示さない。
【図４】Ｔ細胞非結合性ペプチドのＴ細胞活性化への抑制効果を示す図。Ｔ細胞非結合性ペプチドと天然に存在するCII ペプチドおよびＴ細胞活性化システムを一緒にインキュベートすると、Ｔ細胞非結合性ペプチドによりDRβ１結合ペプチドのＴ細胞活性化作用が著しく抑制される。また、この抑制作用はＴ細胞非結合性ペプチドの濃度の増加に伴って強くなる。
【図５】CIA 関節炎モデルの滑膜の病理特徴を示す図。HE染色により、滑膜増殖とリンパ細胞浸潤、一部の関節にはパンヌスの形成も認められた。病理的変化と関節腫脹率は正相関した。
【図６】コラーゲン誘発関節炎（CIA 関節炎）に対するＴ細胞非結合性ペプチド(267A)の治療作用を示す図。三つの治療群の第８、１０、１２、１４日における右肢の腫脹率と関節炎スコアは対照群より有意に低く(P<0.05 あるいは P<0.01)、治療後第８日目と第１６日目の対照群のCIA 緩解率は三つの治療群より有意に低い(P<0.05)。
【図７】コラーゲン誘発関節炎（CIA 関節炎）におけるＴＮＦα発生に対するＴ細胞非結合性ペプチド(267A)の抑制作用を示す図。100μg/ml 用量群の末梢血中のＴＮＦα濃度は対照群より有意に低い(P<0.05)が、ほかの二つの治療群と対照群とを比較すると有意差はない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月24日(2005.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥの第５〜８位のアミノ酸のうち一つまたは複数をアラニンおよびグリシンのうち少なくともいずれかで置換することによって得られるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
（ａ）請求項１に記載のペプチド、および
（ｂ）薬学的に使用可能な担体および補助剤および賦形剤のうち少なくともいずれか
を含む医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
慢性関節リウマチの治療のための医薬の製造における請求項１に記載のペプチドの用途。
【請求項６】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される、請求項５に記載の用途。
【国際調査報告】
2006508901.tif 000014
2006508901.tif 000015
2006508901.tif 000016
2006508901.tif 000017
2006508901.tif 000018
2006508901.tif 000019