(57)【要約】  支持体上にミクロスフィアアレイを含む要素、ならびに、変更可能な弾性率をもつ受入れ層を形成するべくコーティング組成物を支持体にコーティングする段階；  流体懸濁液中にミクロスフィアの分散を受入れ層上にコーティングする段階；  ミクロスフィアが受入れ層内に部分的に沈埋できるようにするため受入れ層の弾性率を変更する段階；  受入れ層から流体懸濁液を除去する段階及び要素が湿式処理に耐えられるように受入れ層内でミクロスフィアを固定する段階を含む、該要素の製作方法、が記述されている。
2006528352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上にミクロスフィアアレイを含む要素を製造する方法において、
ａ）架橋により変更可能な弾性率を有する受入れ層を形成するべくコーティング組成物を支持体にコーティングする段階；
ｂ）部分的に架橋された受入れ層内へのミクロスフィアの部分的沈埋を可能にする弾性率を達成するべく受入れ層の部分的架橋を可能にする段階；
ｃ）流体懸濁液中のミクロスフィアの分散を部分的に架橋された受入れ層上にコーティングする段階であって、各ミクロスフィアが１つの位置を有している段階；
ｄ）部分的に架橋された受入れ層内にミクロスフィアが部分的に沈埋できるようにする段階；
ｅ）部分的に架橋された受入れ層から流体懸濁液を除去する段階；及び
ｆ）湿式処理中及びその後、ミクロスフィアがそのそれぞれの位置を維持するような形で、部分的に架橋された受入れ層をさらに架橋できるようにする段階；
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記ミクロスフィアが部分的に架橋された受入れ層との界面を形成し、該界面が界面表面エネルギーγ1を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミクロスフィアが流体懸濁液と界面を形成し、該界面が界面表面エネルギーγ2を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記部分的に架橋された受入れ層の弾性率が１ＭＰaという下界を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
部分的に架橋された受入れ層の弾性率が、γ1対γ2の比率の単調増加関数により定義され、ここでγ1はミクロスフィアと受入れ層の間の界面表面エネルギーであり、γ2はミクロスフィアと流体懸濁液の間の界面表面エネルギーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）支持体；
ｂ）受入れ層材料を含む、支持体上の水不溶性受入れ層；
ｃ）受入れ層内に固定され部分的に沈埋されたランダムに間隔どりされたミクロスフィアであって、受入れ層より上に露出された表面を有し、各露出表面が被分析物と相互作用するように取付けられた少なくとも１つのプローブを有しているミクロスフィア；
を含んで成り、ミクロスフィアの露出表面が受入れ層材料を含まない、要素。
【請求項７】
架橋された層がゼラチンを含有する、請求項６に記載の要素。
【請求項８】
ミクロスフィアがポリスチレン又はポリ（メチルメタクリレート）を含んで成る、請求項６に記載の要素。
【請求項９】
支持体がガラスペーパー、金属又は重合体を含んで成る、請求項６に記載の要素。
【請求項１０】
ミクロスフィアが１〜１００μの平均直径を有する、請求項６に記載の要素。
【請求項１１】
ミクロスフィアが５〜２０μの平均直径を有する、請求項６に記載の要素。
【請求項１２】
架橋層内の１cm2あたりのミクロスフィア数が１００〜１，０００，０００である、請求項６に記載の要素。
【請求項１３】
架橋層内の１cm2あたりのミクロスフィア数が１０，０００〜１００，０００である、請求項６に記載の要素。
【請求項１４】
架橋層内の１cm2あたりのミクロスフィア数が１０００〜２００，０００である、請求項６に記載の要素。
【請求項１５】
ミクロスフィアが色分けされている、請求項６に記載の要素。
【請求項１６】
各々のミクロスフィアの色コードがミクロスフィアの表面上のプローブを同定する、請求項１５に記載の要素。
【請求項１７】
プローブがタンパク質又は核酸である、請求項６に記載の要素。
【請求項１８】
ミクロスフィアアレイを含む要素において、それが、
ａ）架橋により変更可能な弾性率を有する受入れ層を形成するべくコーティング組成物を支持体にコーティングする段階；
ｂ）部分的に架橋された受入れ層内へのミクロスフィアの部分的沈埋を可能にする弾性率を達成するべく受入れ層の部分的架橋を可能にする段階；
ｃ）流体懸濁液中のミクロスフィアの分散を部分的に架橋された受入れ層上にコーティングする段階であって、各ミクロスフィアが１つの位置を有している段階；
ｄ）部分的に架橋された受入れ層内にミクロスフィアが部分的に沈埋できるようにする段階；
ｅ）部分的に架橋された受入れ層から流体懸濁液を除去する段階；及び
ｆ）湿式処理中及びその後、ミクロスフィアがそのそれぞれの位置を維持するような形で、部分的に架橋された受入れ層をさらに架橋できるようにする段階；
を含んで成る方法によって生産される要素。
【請求項１９】
部分的に架橋された受入れ層の弾性率が、流体懸濁液の除去中に、部分的に架橋された受入れ層内のミクロスフィアの側方運動を全く許容しない、請求項１８に記載の要素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的又はセンサーマイクロアレイ技術全般に関する。特にこれは、コーティングに先立ちミクロスフィアを引き付けるべく指定されたサイトを全く含まない基板上にコーティングされたマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年初頭に発見されて以来ずっと、２次元固体支持体上の生物活性プローブの空間的にアドレス可能な合成により形成された高密度アレイは、生物学的研究及び開発プロセスを大幅に増強し単純化してきた（Science, ２５１，７６７−７７３，１９９１）。現在のマイクロアレイ技術に対する鍵は、「空間的にアドレス可能な」形でのマイクロチップ上の単一のスポットにおける生物活性作用物質の被着にある。
【０００３】
現行の技術は、マイクロアレイを製造するためにさまざまなアプローチを使用してきた。例えば、米国特許第５，４１２，０８７号及び５，４８９，６７８号は、ペプチド及びＤＮＡマイクロアレイを作るためのフォトリソグラフィプロセスの使用について実証している。これらの特許は、フォトリソグラフィにより１cm×１cmのチップ上の明確なスポットを脱保護し次に活性化されたアミノ酸又はＤＮＡ塩基で表面全体をフラッディングする連続的サイクルを通してペプチド及びＤＮＡマイクロアレイを調製するための感光保護基の使用について教示している。このプロセスを反復することで、アレイ上の異なるスポットで何千もの任意に異なるペプチド又はオリゴヌクレオチド配列を用いてペプチド又はＤＮＡマイクロアレイを構築することが可能となる。この方法は高価である、空間的にアドレス可能なアレイを製造するため、インクジェットアプローチが使用されることもある（例えば、米国特許第６，０７９，２８３号；６，０８３，７６２号；及び６，０９４，９６６号）が、この技術にも又、４０〜１００μｍという比較的大きいスポットサイズに加えて製造コストが高いという欠点がある。単一のチップ上に設置されるべき生物活性プローブの数は通常１０００〜１００，０００プローブの間のどこかにあることから、空間アドレス方法は、そのチップの製造方法の如何に関わらず本質的にコストの高いものである。
【０００４】
空間的にアドレス可能な方法に対する代替的アプローチは、生物学的多重化アレイを生成するべく螢光染料が取込まれた重合体ビーズを用いるコンセプトである。米国特許第５，９８１，１８０号は、多重化生物学検定を実施するためのフローサイトメトリと色分けビーズの併用方法について開示している。ＤＮＡ又はモノクローナル抗体プローブとそれらの表面上で接合されたミクロスフィアが、さまざまな比率の２つの全く異なる螢光染料で内部染色された。何百もの「スペクトルアドレス」されたミクロスフィアが生体試料と反応させられ、「液体アレイ」は、試料の情報を復号するべくフローサイトメトリーセルの中に一度に単一のミクロスフィアを通過させることによって分析された。米国特許第６，０２３，５４０号は、染料装填されたミクロスフィアを組立てるべく遠位端部に予めエッチングしたマイクロウェルを伴う光ファイバ束を使用することを開示している。各々のスペクトルアドレスされたミクロスフィアの表面に対して独特の生物活性作用物質が付着され、異なる生物活性プローブを担持する何千ものミクロスフィアが組合わされて、光ファイバ束の予備エッチング済みマイクロフェル上にビーズアレイを形成する。
【０００５】
さらに最近では、ミクロスフィア内に取込まれた異なるサイズの硫化亜鉛キャッピングされたセレン化カドミウムナノ結晶を用いることにより、新規の光符号化ミクロスフィアアプローチが達成された（Nature Biotech,１９，６３１−６３５（２００１））。これらのナノ結晶によって実証される狭い帯域幅を考えると、このアプローチは、ミクロスフィア内のスペクトルバーコード化能力を著しく拡張する。
【０００６】
「スペクトルアドレスされたミクロスフィア」アプローチはマイクロアレイ製作における旧式の「空間的アドレス可能な」アプローチに比べたその単純さに関して１つの利点をまさに提供してはいるものの、当該技術分野においては、生物学的マイクロアレイの製造をさほどむずかしくなく、かつさほど高価でないものにする必要性がなおも存在している。
【０００７】
２００１年８月２９日付けの米国特許出願第０９／９４２，２４１号「ミクロスフィアのランダムアレイ」は、図１ａ及び１ｂに示されているようにゼラチン中に分散されたミクロスフィアを含む流体コーティング組成物で支持体をコーティングするさまざまなコーティング方法を教示し、機械コーティングを例証している。図１Ｃに示されているように、コーティングの直後に、支持体はコーティング機内の冷却−硬化チャンバ内に通され、ここでゼラチンは急速ゲル化を受け、ミクロスフィアは固定化される。図１ｄに示されているように、余剰流体は蒸発によって除去される。このプロセスは、そのとき既存の技術に比べて莫大な製造上の利点を提供するものの、当該技術分野に対するその全潜在的価値を最大限にするためには幾分かの改良が必要である。問題は、かかる機械のコーティング及び急速ゲル化の間に、ゲル化剤が図１ｅに示されているようにミクロスフィアの表面を覆い、かくして被分析物（例えばＤＮＡ）が、ゲルのオーバーコートを通して浸透しミクロスフィアの表面上でプローブとハイブリッド形成するのを防げる傾向をもつということにある。
【０００８】
２００２年１月３１日付けの米国特許出願第１０／０６２，３２６号「酵素を用いたミクロスフィアのランダムアレイの製作方法」は、ミクロスフィアの無欠性又はそれらの表面上のＤＮＡプローブを損なうことなくミクロスフィアの表面からゲル化剤を酵素的に除去することにより上述の問題を克服している。酵素処理された表面は、完全ＤＮＡハイブリダイゼーションプロセスを通してその物理的無欠性を維持し、マイクロアレイは非常に強いハイブリダイゼーションシグナルを示す。米国特許出願第１０／０６２，３２６号の利点は、ゲルオーバーコートから所要量を除去するように酵素消化を容易に制御できるということにある。さらに、酵素、プロテアーゼは、容易に利用可能であり経済的に得ることができる。しかしながら、付加的なプロセス（酵素消化）が必要とされ、これには付加的な時間とコストが関与する、という欠点がある。
【０００９】
２００２年３月７日付けの米国特許出願第１０／０９２，８０３号「ミクロスフィアのランダムアレイ」では、図２ａ及び２ｂに示されているように、ゾル−ゲル転移する能力をもつ受入れ層上に、ゲル化剤は無いもののゲル化剤用の架橋剤を含有するミクロスフィアの懸濁液をコーティングすることにより、ランダムビードマイクロアレイを調製するプロセスについて記述されている。ミクロスフィアは、図２Ｃに示されているように受入れ層内に部分的に沈埋し、このとき受入れ層は図２ｄに示されているように架橋される。図２ｅに示されているように、懸濁液からの余剰の流体は蒸発によって除去されて、マイクロアレイを形成する。このアプローチは米国特許出願第０９／９４２，２４１号に比べ１つの改良であるものの、受入れ層内のゲル化剤はミクロスフィアを被着するのに用いられる水性懸濁液中で溶解する可能性がありかつ懸濁液が受入れ層上に展延された時点でミクロスフィア上に再度被着し得ることから、図２ｆに示されているように、ミクロスフィアの表面上へのゲル化剤の被着を防止する上で全面的に成功しているものではない。さらに、懸濁液中の架橋剤の存在は、ミクロスフィアの表面上の生物学的分子を架橋しそれらをプローブとして無効にすることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ミクロスフィアの懸濁液が受入れ層上に展延され得、ミクロスフィアが輸送されつつある懸濁液又は媒体中に受入れ層の材料が溶解しない方法が必要とされている。さらに、受入れ層組成は、蒸発などによって懸濁液中の溶媒が除去されたときに側方凝集を防ぐため受入れ層内へのミクロスフィアの充分な沈埋を可能にするようなものでなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ミクロスフィアを有するマイクロアレイといった要素を作る方法において、架橋により変更可能な弾性率を有する受入れ層を形成するべくコーティング組成物を支持体にコーティングする段階；部分的に架橋された受入れ層内へのミクロスフィアの部分的沈埋を可能にする弾性率を達成するべく受入れ層の部分的架橋を可能にする段階；流体懸濁液中のミクロスフィアの分散を、部分的に架橋された受入れ層上にコーティングする段階であって、各ミクロスフィアが１つの位置を有している段階；部分的に架橋された受入れ層内にミクロスフィアが部分的に沈埋できるようにする段階；部分的に架橋された受入れ層から流体懸濁液を除去する段階；及び湿式処理中及びその後、ミクロスフィアがそのそれぞれの位置を維持するような形で、部分的に架橋された受入れ層をさらに架橋できるようにする段階を含んで成る方法を提供する。
【００１２】
本発明のもう1つの実施形態では、支持体；受入れ層材料を含む、支持体上の不水溶性受入れ層；受入れ層内に固定され部分的に沈埋されたランダムに間隔取りされたミクロスフィアであって、受入れ層より上に露出された表面を有し、各露出表面が被分析物と相互作用するように取付けられた少なくとも１つのプローブを有しているミクロスフィアを含んで成り、ミクロスフィアの露出表面が受入れ層材料を含まない要素が開示されている。
【００１３】
受入れ層及び支持体は、ミクロスフィアと特異的に物理的又は化学的に相互作用するように設計されたサイトの不在によって特徴づけされている。従って、ミクロスフィアの分布は予め定められたり又は誘導されたりすることなく、全くランダムである。
【発明の効果】
【００１４】
該発明は、当該技術分野において開示されているように、ミクロスフィアを引きつけるべくマイクロウェルで予備エッチングされる必要も又いかなる形であれサイトで予備マーキングされる必要もない基板上のマイクロアレイを調製するために独特のコーティング技術を利用している。マーキングされていない基板又はいかなる予備コーティング前処理も必要としない基板を使用することにより、本発明は、既存の技術に比べて莫大な製造上の利点を提供する。該発明は、分散中のアドレス可能な混合済みミクロスフィアを、ミクロスフィアを引付きつけるためのウェル又はサイトを全くもたない受入れ層上にランダムに分布させる方法を開示している。
【００１５】
本発明は、基板を変性する必要がなくそれでもミクロスフィアは基板上で固定化された状態にとどまることから、以前に開示されたものよりもコストが少なく調製が容易であるマイクロアレイを提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、２００１年８月２９日付けの米国特許出願第０９／９４２，２４１号とは対照的に、ミクロスフィア表面が露出されるが、２００２年６月３日付けの米国特許出願第１０／０６２，３２６号で開示されている付加的なプロセス段階（酵素消化）を利用しないマイクロアレイを提供している。露出されたミクロスフィア表面は、ミクロスフィアの表面に付着されたプローブに対する被分析物のさらに容易なアクセスを可能にする。「被分析物」というのは、本書で「プローブ」と呼んでいるミクロスフィア表面上の特定の分子と化学的又は物理的に相互作用する能力をもつ官能基をもつ分子を意味する。本発明においては、被分析物は好ましくは核酸又はタンパク質である。
【００１７】
本発明の主たる要素の１つは、受入れ層の選択である。受入れ層は、ミクロスフィアが受入れ層中に充分沈埋しかくして側方凝集を防ぐような所望の物理的特性を有していなくてはならない。受入れ層の物理的特性に関する具体的要件については、以下で詳述する通りである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本書で使用される「ゾル−ゲル転移」又は「ゲル化」という用語は、粒子の流体溶液又は懸濁液が、いかなる定常状態流も示さない連続した３次元網を形成するプロセスを意味する。これは、重合体内で多機能単量体の存在下での重合によって；反応性側鎖を有する溶解した重合体の共有結合による架橋によって；及び溶液中の重合体分子間の例えば水素結合といった二次的結合によって発生し得る。ゼラチンといったような重合体は、最後のタイプのものである熱によるゲル化を示す。ゲル化又は硬化プロセスは、粘度の不連続的上昇により特徴づけされる。P.I. Rose「写真プロセスの理論」第４版、T.H. James編、ｐ５１〜６７を参照のこと。
【００１９】
本書で使用する「ゲル化剤」というのは、上述の通りのゲル化することのできる物質を意味する。これらの例には、ゼラチン、水溶性セルロースエーテル又はポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミド）といった熱によりゲル化する材料、又はポリ（ビニルアルコール）といったようなホウ酸化合物によって化学的に架橋され得る物質が含まれる。その他のゲル化剤には、紫外線放射、電離放射又は電子ビーム放射といったような放射線により架橋され得る重合体が含まれる。ゲル化剤の例としては、アカシア、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セトステアリルアルコール、コロイド珪素ジオキシド、エチルセルロース、ゼラチン、グアールゴム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、珪酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、デンプン、トラガカント及びキサンタンガムが含まれる。Secundum Artem第４巻、第５号、Lloyd V. Allen内に記載されているものといったような当該技術分野において既知のその他のゲル化剤も同様に使用することができる。好ましいゲル化剤はアルカリで予め処理されたゼラチンである。
【００２０】
本書で使用されている「ランダム分布」という用語は、いかなる選好性も偏向も示さない要素の空間的分布を意味する。ランダム性は、ポワソン分布により予想されるものと整合性に関して測定可能である。
【００２１】
本発明は、受入れ層を内含し得る基板上の「ビーズ」とも呼ばれるミクロスフィアのランダムアレイを製作する方法を教示する。該ミクロスフィアは、各ミクロスフィアの表面の一部分が受入れ層より上に露出されるような形で受入れ層上に被着される。受入れ層又は基板上のミクロスフィアの分布又はパターンは完全にランダムであり、ミクロスフィアは、当該技術分野で以前に知られていたその他の方法の場合のように受入れ層又は基板上に予備マーキングされた又は予め定められているサイトに対し引き付けられも保持されもしない。
【００２２】
ランダムアレイは、ゲル化剤及びゲル化剤のための化学的架橋剤を含有する流体層を任意の適切な表面又は支持体１（図３ａ、４ａ、５ａ）上にまず最初にコーティングして、受入れ層９（図３ｂ、４ｂ、５ｂ）を形成することによって達成される。支持体１は、上に受入れ層を形成できる表面をそれが提供できるかぎり、例えばガラス、紙、金属、重合体材料、複合材料又はそれらの組合せであり得る。受入れ層９内のゲル化剤は、部分的に架橋して、部分的に架橋された受入れ層１０（図３ｃ、４ｃ、５ｃ）を形成することができる。次に、ミクロスフィア３の流体懸濁液１１が部分的に架橋された受入れ層１０の上に展延させられる（図３ｄ、４ｄ、５ｄ）。この部分的に架橋された受入れ層１０は流体懸濁液１１中で不溶である。ミクロスフィア３は、部分的に架橋された受入れ層１０内に少なくとも部分的に沈降する（図３ｅ、４ｅ、５ｅ）。沈降の程度は、部分的に架橋された受入れ層１０の弾性率、ミクロスフィア３の材料の界面表面エネルギー及び流体懸濁液１１の界面表面エネルギーに関連している。ミクロスフィア３は、部分的に架橋された受入れ層１０内全体にわたり又はその一部分だけに沈降することができる。単数または複数のミクロスフィアは、部分的に架橋された受入れ層１０内を同じ深さまで沈降できる。一部の実施形態に従うと、ミクロスフィア３の少なくとも一部分は、部分的に架橋された受入れ層１０の底まで沈降して支持体上に乗ることができる。
【００２３】
部分的に架橋された受入れ層１０の弾性率は、単位体積あたりの架橋材料のモル数として定義される、部分的に架橋された受入れ層１０の架橋密度によって制御される。さらに架橋密度は、化学的架橋剤の濃度；化学的架橋の持続時間；ＵＶ、電離又は電子ビーム放射といった放射線の強度と時間、及び利用される架橋タイプ、のうちの単数または複数のものに関連している。
【００２４】
代替的には、化学的架橋又は放射線誘発型架橋の代りに物理的ゲル化を使用することが可能である。物理的ゲル化は、受入れ層中の水素結合の形成に基づいている。物理的ゲル化における架橋密度は、ゲル化剤の濃度及び部分的に架橋された受入れ層の温度と部分的に架橋された受入れ層内のゲル化剤のゲル点又はゾル−ゲル転移温度の間の差に関連している。この場合、コーティング時の流体懸濁液の温度は、部分的に架橋された受入れ層内のゲル化剤の流体懸濁液内への溶解を防止するべく、部分的に架橋された受入れ層内のゲル化剤のゾル−ゲル転移温度より低く維持される。
【００２５】
流体懸濁液１１の蒸発は、流体懸濁液１１全体にわたり空気を吹きつけるか流体懸濁液１１を加熱するか又はその両方を行なって流体を蒸発させ（図３ｆ、４ｆ、５ｆ）、アレイ５を残すことによって達成される。アレイ５が完全に製造された後、架橋剤の添加によってより早期に開始される架橋済みゲル化剤を含む部分的に架橋された受入れ層１０の架橋反応は、完了してミクロスフィア３を架橋された受入れ層１２（図３ｇ、５ｇ）内の所定の位置に恒久的に固定することができる。ゼラチンがゲル化剤として用いられた場合、好ましい架橋剤は、ビス（ビニルスルホン）メタン、グルタルアルデヒド又はスクシンアルデヒドといったような化合物であり得る。代替的には、図４ｇに示されているように、付加的な架橋をもたらすべく、ＵＶ放射、電離放射線又は電子ビーム照射といったような付加的な放射線１３を使用することができる。架橋された受入れ層は不溶性であり、架橋された受入れ層の溶解又は分解無く、形成されたマイクロアレイの湿式処理を可能にする。
【００２６】
図３ｇ、４ｇ及び５ｇに示されているように、アレイ５内のミクロスフィア３は、その露出表面に付着した又はそれを被覆する受入れ層材料を全く有していない。こうして、ミクロスフィアの露出表面に対する官能化された化学又は生物学的基、プローブ及び被分析物の付着が可能となる。
【００２７】
物理的ゲル化、化学的架橋又は放射線により部分的に架橋された受入れ層を調製する上述の方法は、アレイを形成するべく部分的に架橋された受入れ層からの流体懸濁液の蒸発中にミクロスフィアの側方凝集が全く発生しなくなるようにするための適切な物理的特性を有するミクロスフィアを受入れる能力をもつ部分的に架橋された受入れ層を生成するように設計されている。ミクロスフィアの側方凝集が発生することになるか否かを見極める上で、２つの要因が重要となる。１つは、「静電気及び毛管力により制御されるパターン化されたコロイド被着」J. Aizenberg, P. Braun, 及び P. Wiltzius, Physical Review Letters, 第８４巻、No.１３，２０００の中で記述されている通りの、ミクロスフィアを互いに向かって駆動する毛細管である。もう１つは、部分的に架橋された受入れ層内へのミクロスフィアの圧入度である。ミクロスフィア上の毛管力は、流体懸濁液とミクロスフィアの間の界面表面エネルギーに正比例する。流体懸濁液と部分的に架橋された受入れ層の組合せ厚みがミクロスフィアのサイズに匹敵するものとなる流体懸濁液の蒸発段階で、毛管力は部分的に架橋された受入れ層内でミクロスフィアの側方凝集をひき起こす傾向をもつ。一方、ミクロスフィアと部分的に架橋された受入れ層の間の表面力は、「弾性固体の表面エネルギーと接触」K. Johnson et al., Proc. R. Soc. Lond., A.３２４，１９７１の中で説明されている通り、比較的軟質の部分的に架橋された受入れ層内にミクロスフィアを圧入させ、流体懸濁液が蒸発により除去された時点で側方凝集を妨げるべく部分的に架橋された受入れ層内へのミクロスフィアの充分な沈埋を可能にすることができる。
【００２８】
以上の論述から、側方凝集を防止するために、部分的に架橋された受入れ層の物理的特性は、或る種の条件を満たさなくてはならないということが容易にわかる。部分的に架橋された受入れ層が硬質である場合、部分的に架橋された受入れ層内へのミクロスフィアの沈埋はきわめてわずかであり、ミクロスフィアの側方凝集が発生する確率が高い。一方、部分的に架橋された受入れ層が過度に軟質である場合には、それは、ミクロスフィアの側方凝集を駆動する毛管力に対する抵抗をほとんど提供しなくなる。部分的に架橋された受入れ層の変形抵抗特性は、ヤング率によって表わすことができる。その内部ではミクロスフィアのいかなる側方凝集も発生しない部分的に架橋された受入れ層のヤング率の下界と上界を決定することが可能である。部分的に架橋された受入れ層のヤング率の限界を決定する方法が、本書の実施例の節で提供されている。
【００２９】
該発明は、アレイ内の各々のミクロスフィアがマイクロアレイ内のその他のミクロスフィアから該ミクロスフィアを区別する全く異なるシグネチャーを有している、重合体ミクロスフィアベースのランダムマイクロアレイである。かかるシグネチャーは、ミクロスフィアの色、形状、サイズ又はそれらの組合せに基づくものであり得る。色に基づくシグネチャーのためには、全く異なる「カラーアドレス」（一意的ＲＧＢ値、例えばＲ＝０、Ｇ＝２０４、Ｂ＝１５３）をもつ識別可能なミクロスフィアを何千も作り出すべく、原色赤、緑及び青を表わす３つの染料を混合して色を導出することができる。ミクロスフィアは、「活性」であるサイト（これはすなわち、かかるサイトにおいてはミクロスフィアとその他の分子又は化合物の間で物理的又は化学的相互作用が発生し得ることを意味する）をその表面上に伴って作ることができる。かかる化合物は、有機又は無機化合物であってよい。分子又は化合物の例としては、有機核酸、タンパク質又はそのフラグメント、又は例えば金属イオン及び塩を含む電離合物が含まれる。各々のミクロスフィアの表面に対しては、予め合成されたオリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体又はその他のあらゆる生物学的又は化学的作用物質を付着させることができる。従って、各々のミクロスフィアアドレス例えば色は特定のプローブに対応し得る。これらのミクロスフィアは、等量で混合でき、ランダムマイクロアレイは、例えば単一層内で混合されたミクロスフィアをコーティングすることにより製造され得る。
【００３０】
ミクロスフィア懸濁液をコーティングするためのコーティング方法は、Edward Cohen及びEdgar B.Gutoffにより、「近代的コーティング及び乾燥技術」の第１章、界面工学シリーズ、第１巻、ＶＣＨ Publishers Inc., NewYork, ＮＹ１９９２）中で広く記述されている。適切なコーティング方法には、ナイフコーティング、ブレードコーティング、浸漬コーティング、ロッドコーティング、エアナイフコーティング、グラビアコーティング、順方向及び逆方向ロールコーティング及びスロット及び押出しコーティングが含まれ得る。当該技術分野において既知の通りのさまざまなコーティング補助剤を添加して、基板上へのミクロスフィア懸濁液のコーティングを補助することが可能である。例えば、適切なコーティング補助剤には、界面活性剤、希釈剤又は薄め剤が含まれ得る。
【００３１】
螢光標識された、化学発光標識された又はその両方の生体試料を、ミクロスフィアベースのランダムマイクロアレイにハイブリッド形成させることができる。螢光、化学発光又はその両方により非選択的に標識された生体試料及びアドレス可能な重合体ミクロスフィアの両方からのシグナルを、光学系を通しての画像拡大の後、電荷結合素子で分析することができる。記録されたアレイ画像は、各ミクロスフィアの色コードなどの各ミクロスフィアの「アドレス」に基づいた生物活性プローブ情報を得るべく、画像処理アルゴリズムにより自動的に分析され得、この情報を螢光／化学発光画像に比較して、試料中の特定の生物学的被分析物材料を検出し定量化することができる。シグネチャーを確認するために光学的又はその他の電磁手段を適用することも可能である。
【００３２】
実質的に曲線形状をもつミクロスフィア又は粒子が、調製の容易さのために好まれるが、楕円形又は立方体の粒子といったようなその他の形状の粒子も同様に利用可能である。粒子を調製する適切な方法が当該技術分野において既知であり、これには、I.Piirmaによる「エマルジョン重合」Academic Press, New York（１９８２）などで記述されているようなエマルジョン重合、又は、J. Colloid Interface Science, 第１６９巻、ｐ４８〜５９（１９８５）中で、T.H. Whitesides 及び D.S. Dossにより記述されているような、制限された合一が含まれる。粒子又はミクロスフィアを作製するために利用される特定の重合体は、着色可能である水不混和性の合成重合体である。好ましい重合体は、あらゆる非晶質水不混和性重合体である。有用である重合体タイプの例としては、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリラート）又はポリ（ブチルアクリラート）がある。スチレン及びブチルアクリラートの共重合体といったような共重合体も同様に使用可能である。ポリスチレン重合体は、使用に便利である。形成されたミクロスフィアは、コーティング又は沈埋処理中に溶解しない顔料又は染料である不溶性着色剤を用いて着色可能である。適切な染色は、事実上油溶性であり得る。染料は、ミクロスフィア内にとり込まれた時点で非螢光性であることが好ましい。
【００３３】
ミクロスフィアは望ましくは、１〜１００μｍ、例えば１〜５０μｍ、より好ましくは３〜３０μｍそして最も好ましくは５〜２０μｍの範囲内の平均直径を有するように形成される。コーティング内のミクロスフィアの濃度は、１ｃｍ2あたり１００〜１００万、より好ましくは１ｃｍ2あたり１０００〜２００，０００、最も好ましくは１ｃｍ2あたり１０，０００〜１００，０００の範囲内にある。
【００３４】
ミクロスフィアは、所望の被分析物と相互作用するようミクロスフィアの表面に付着された化学的又は生物学的官能化基を有することができる。化学的又は生物学的官能基を添加する方法は、当該技術分野において既知である。
【００３５】
化学的に官能化されたミクロスフィアの表面に対する生物活性剤の付着は、例えばBangs Laboratories, Inc, Technote ２０５，Rev.００３，３０ＭＡＲ０２（Bangs Laboratories, Inc., Fishers IN）内で記されているように、当該技術分野において公開されている手順に従って実施され得る。いくつかの一般的に使用されている化学的官能基としては、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシ、ヒドラジド、アミド、クロロメチル、エポキシ、アルデヒドなどが含まれるが、これらに制限されるわけではない。生物活性剤の例としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＤＮＡフラグメント、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド、抗体、酵素、タンパク質及び生物活性をもつ合成分子が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００３６】
一定の与えられたミクロスフィア組成物のための受入れ層のヤング率範囲の決定方法について以下で記す。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例においては、James E. Gentle, Springer Verlag（１９９８）による「乱数発生及びモンテカルロ法（統計及び計算）」の中で記されている通りのモンテカルロシミュレーションが、ランダムに導入されたミクロスフィア間の距離を決定するために実施される。その後、ミクロスフィアの側方凝集を回避する受入れ層のヤング率を計算するための分析において、結果を利用する。
【００３８】
該発明によって達成される通りのミクロスフィアのランダム分布をシミュレートするために、１０μの直径の１０００個のミクロスフィアを、１cm2の面積をもつ基板全体の上にランダムに落下させ、図６に示されているように、どの２つのミクロスフィアも重複しないようにした。図６内のミクロスフィア間の最近傍離隔距離の分布は表１に示され、図７にプロットされている。ミクロスフィアを基板上に２０回ランダムに落下させ、２０回のシミュレーション全てについての平均を表２に示す。少なくともその離隔距離だけ離隔させられたミクロスフィアの合計数の百分率に等しい最近傍離隔距離の各々についての累積平均が表２に提供されている。
【００３９】
表２は、この例について（１０００個／cm2のミクロスフィア；直径１０μのミクロスフィア）、ミクロスフィアの９５％がその最も近傍のミクロスフィアから少なくとも３０μだけ離隔していることを表わしている。この離隔（この場合３０μ）は「Ｌ」と呼ばれ、ミクロスフィアの少なくとも９５％についてミクロスフィア間の最小測定離隔距離である。
【００４０】
複数のケースのミクロスフィア密度及びミクロスフィア直径についてシミュレーションを反復し、各々のミクロスフィア直径／密度組合せにおいて２０回の反復シミュレーション全体にわたり、上述のとおり、各ケースのＬを決定した。結果は表３に要約されている。
【００４１】
表３からの値を用いて、側方凝集無くミクロスフィアを定着させるための部分的に架橋された受入れ層に関する弾性率要件を決定することができる。各ミクロスフィア上に作用し側方凝集をもたらす垂直力Ｐ及び側方力Ｆは、図８に例示されている。垂直力Ｐは、ミクロスフィアを受入れ層内に押下げることによって所定の場所にそれを保持する。Ｐは、R.Soc., London Ａ３２４，３０１（１９７１）の中でK.L. Johnson et al.,によって教示されているように、γ1として記述されるミクロスフィアと部分的に架橋された受入れ層の間の界面表面エネルギー及びミクロスフィアの半径Ｒによって決定される：
Ｐ＝６πＲγ1        （１）
【００４２】
ミクロスフィアの側方運動により側方凝集をもたらすため各々のミクロスフィアに対して作用する水平力Ｆは、球の半径Ｒ、ミクロスフィア間の距離Ｌ及び、γ２と記されるミクロスフィアとミクロスフィアを含有する流体懸濁液の間の界面表面エネルギーにより、Aizenburg et al.,によってＰＨＹＳ．ＲＥＶ．ＬＴＲＳ．、第８４巻、第１３号（２０００）中に教示されている通りに決定される。側方力Ｆは、以下の公式により決定される。
【数１】
2006528352.tif 000003
【００４３】
等式（１）及び（２）より、一定の与えられたミクロスフィアの半径及びミクロスフィア間の距離について、表面エネルギーγ1及びγ2が各々のミクロスフィアに作用する垂直力及び側方力の量を決定するということがわかる。
【００４４】
部分的に架橋された受入れ層のヤング率及び力Ｐ及び力Ｆの相互関係は、ミクロスフィアが側方凝集に抵抗するのに充分な形で部分的に架橋された受入れ層内に定着されているか否かを決定することになる。ミクロスフィアが部分的に架橋された受入れ層上で流体懸濁液内でコーティングされる場合、ミクロスフィアは、該流体懸濁液を通して部分的に架橋された受入れ層上に沈む。ミクロスフィア上の垂直力Ｐと部分的に架橋された受入れ層のヤング率の関係に応じて、ミクロスフィアは少なくとも部分的に、部分的に架橋された受入れ層内に侵入することになる。流体懸濁液が蒸発によって除去され、流体懸濁液レベルが部分的に架橋された受入れ層の上にあるミクロスフィアの高さより低くなるにつれて、毛管力が効力を発し、側方力Ｆをひき起こすことになる。側方に移動するためには、ミクロスフィアは部分的に架橋された受入れ層を通って変形するか又はかき分けて進む必要がある。この運動は、部分的に架橋された受入れ層の変形に抵抗する能力によって抵抗され、かかる抵抗は、部分的に架橋された受入れ層のヤング率により表わされる。材料のヤング率が高くなればなるほど、その変形抵抗は高くなり、部分的に架橋された受入れ層内でミクロスフィアを所定の位置に保存する。部分的に架橋された受入れ層のヤング率が過度に低い場合、部分的に架橋された受入れ層は過度に流動性をもち、ミクロスフィアの容易な運動を許容し、こうして側方凝集を導く可能性がある。部分的に架橋された受入れ層のヤング率が過度に高い場合、ミクロスフィアは、側方運動に抵抗するのに充分なほどに部分的に架橋された受入れ層内に侵入せず、かくして、ミクロスフィアは、変形無く部分的に架橋された受入れ層の表面に沿って滑動できる。
【００４５】
側方凝集を回避することになる受入れ層のヤング率の範囲を決定するためには、有限要素解析が行なわれる。従来の有限要素解析技術に従うと、ミクロスフィア及び層を離散的要素（メッシュとも呼ばれる）に分割することによってミクロスフィア及び受入れ層の幾何学的表現が作り出される。一定の与えられた垂直力及び側方力について、有限要素解析は、ヤング率の選択された値についてミクロスフィアが静止状態にとどまるか又は側方に移動して凝集を形成するかを決定する。この解析は、ミクロスフィアが移動しなくなる最低の弾性率である下部範囲つまり下界、及びミクロスフィアが移動しなくなる最高の弾性率である上部範囲つまり上界を提供する。結果は、図９に示されているように、弾性率対γ1／γ2比の関数としてプロットすることができる。
【００４６】
図９に示されているように（ミクロスフィア数／cm2＝１０００、ミクロスフィア直径＝１０μ、Ｌ＝３０μ）、ミクロスフィアを所定の場所に保ちながらその凝集を防止する部分的に架橋された受入れ層の所望のヤング率は、該下界と該上界の間の領域である。結果は、ミクロスフィアと部分的に架橋された受入れ層間の界面表面エネルギー、γ1及びミクロスフィアと流体懸濁液間の界面表面エネルギー、γ2の絶対値により左右される。下界表面エネルギーγ1及びγ2は、ミクロスフィア、流体懸濁液及び部分的に架橋された受入れ層の材料特性から導出され、ミクロスフィアに作用する力を表わす（公式１及び２を参照）。例えば図９では、γ1対γ2の比が２に等しい場合、部分的に架橋された受入れ層の弾性率は１ＭＰａと５５ＭＰａの間にあるべきである。表３からのミクロスフィア直径及び密度のその他のケースについての結果は、図１０〜１４内に示されている。実際上は、弾性率についての下界は１ＭＰａとして選択することができる。弾性率の上界及び下界は、単位面積あたりのミクロスフィア数、ミクロスフィア半径及び離隔距離Ｌに応じて、本書に提供されている公式を用いて最適化することができる。
【００４７】
【表１】
2006528352.tif 000004
【００４８】
【表２】
2006528352.tif 000005
【００４９】
【表３】
2006528352.tif 000006
*  ミクロスフィアの９６％が、その最近傍ミクロスフィアからＬより大きい距離だけ離隔している。
**  ミクロスフィアの９５％がその最近傍ミクロスフィアからＬより大きい距離だけ離隔している。
【００５０】
該発明は、そのいくつかの実施形態を特に基準にして詳述されてきた。該発明の精神及び範囲内で、変更及び修正を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ミクロスフィアマイクロアレイを調製するために先行技術において利用されてきた１つの方法を示す概略図である。図１ａは、任意の適切な支持体１を示し、図１ｂは、図１ａの支持体全体にわたり展延されたミクロスフィア（ビーズ）３、ゲル化剤及び化学的架橋剤を含む流体層２を示す；図１Ｃは、ゲル化剤がゾル−ゲル転移を受けかくしてゲル４中にミクロスフィア３を固定化している流体層を示す；図１ｄは、ゲル層４からの余剰の流体２の蒸発によって形成されたマイクロアレイ５を示す；又図１ｅは、マイクロアレイ内でミクロスフィア３を恒久的に固定し、ミクロスフィア３の表面上にゲル剤のフィルム７を残す架橋された流体層６を示す。
【図２】ランダムミクロスフィアマイクロアレイを調製するもう１つの先行技術のプロセスの概略図であり、ここで図２ａは任意の適切な支持体１を示し；図２ｂは、架橋されていないゲル化剤８でコーティングされた支持体１を示し；図２Ｃは、図２ｂの支持体１上に配置された、ゲル化剤８のための架橋剤及びプローブ担持ミクロスフィア３を支持する流体層２を示す；図２ｄは、架橋されていないゲル化剤８の中に沈められた図２ｃのミクロスフィア３を示す。図２ｃを見ればわかるように、ゲル化剤８を伴う層は、ゲル４へのゾル−ゲル転移を受け、かくしてミクロスフィア３を固定化する。図２ｅは、流体層２からの流体の蒸発を示す：図２ｆは、流体層２内へのゲル化剤８の溶解のためミクロスフィア３がなおもその表面上にゲルコーティング４を有している最終マイクロアレイ５を示している。
【図３】本発明の１実施形態の概略図であり、ここで図３ａは任意の適切な支持体１を示し；図３ｂは、受入れ層９を形成するべく図３ａの支持体１全体にわたり展延された架橋可能な組成物及び化学的架橋剤を示す；図３ｃは、上に展延される予定の流体懸濁液中へのミクロスフィアの圧入を可能にするように調整される弾性率をもつ部分的に架橋された受入れ層１０を示す；図３ｄは、図３ｃの部分的に架橋された受入れ層全体にわたり展延されたミクロスフィア３を含有する流体懸濁液１１を示す；図３ｅは、部分的に架橋された受入れ層１０内に部分的に沈んでいるミクロスフィア３を示す；図３ｆは、ミクロスフィア３の表面を露出させるための流体懸濁液１１の蒸発を示す；図３ｇは、マイクロアレイ５を湿式処理に対し頑強なものにするさらなる化学的に架橋された受入れ層１２を示す。
【図４】本発明のもう１つの実施形態の概略図であり、ここで図４ａは、任意の適切な支持体１を示し；図４ｂは、受入れ層９を形成するべく図４ａの支持体１全体にわたり展延された架橋可能な組成物を示す；図４ｃは、上に展延される予定の流体懸濁液中へのミクロスフィアによる圧入を可能にするのに充分な弾性率まで、紫外線（ＵＶ）放射、電離放射又は電子ビーム照射といったような放射線１３により架橋される、部分的に架橋された受入れ層１０を示している；図４ｄは、図４ｃの部分的に架橋された受入れ層１０全体にわたり展延されたミクロスフィア３を含有する流体懸濁液１１を示す；図４ｅは、部分的に架橋された受入れ層１０内に部分的に沈んでいるミクロスフィア３を示す；図４ｆは、ミクロスフィア３の表面を露出させるための流体懸濁液１１の蒸発を示す；図４ｇは、マイクロアレイ５を湿式処理に対し頑強なものにするため、ＵＶ放射、電離放射又は電子ビーム照射といったような放射線１３によって架橋される、さらに架橋された受入れ層１２を示す。
【図５】本発明のプロセスのさらにもう１つの概略図であり、ここで図５ａは、任意の適切な支持体１を示し、図５ｂは、受入れ層９を形成するべく図５ａの支持体全体にわたり展延されたゲル化剤及びゲル化剤のための遅効性の化学的架橋剤を含有する流体を示す；図５ｃは、ミクロスフィア３による圧入を可能にするのに充分な弾性率を有するようにゲル化剤がゲル化されている、ゾル−ゲル転移した受入れ層１４を示す；図５ｄは、図５ｃのゲル化された受入れ層１４全体にわたって展延された受入れ層内のゲル化剤のゾル−ゲル転移より低い温度のミクロスフィア３を含有する流体懸濁液１１を示す；図５ｅは、ゲル化された受入れ層１４内に部分的に沈んでいるミクロスフィア３を示す；図５ｆは、ミクロスフィア３の表面を露出させるための流体懸濁液１１の蒸発を示す；図５ｇは、マイクロアレイ５を湿式処理に対し頑強なものにする化学的に架橋された受入れ層１２を示す。
【図６】どの２つのミクロスフィアも重複しない、１０００個のミクロスフィアを伴う１cm2の面積のダイヤグラムである。
【図７】図６のミクロスフィア間の最近傍離隔距離の分布を示す表１中のデータのプロットである。
【図８】ミクロスフィア上の力を示す概略図である。
【図９】Ｌが３０μｍである、１０μｍのミクロスフィアについての実現可能な弾性率の上界及び下界を示すプロットである。
【図１０】Ｌが３０μｍである、５μｍのミクロスフィアについての実現可能な弾性率の上界及び下界を示すプロットである。
【図１１】Ｌが２０μｍである、１５μｍのミクロスフィアについての実現可能な弾性率の上界及び下界を示すプロットである。
【図１２】Ｌが２０μｍである、２０μｍのミクロスフィアについての実現可能な弾性率の上界及び下界を示すプロットである。
【図１３】Ｌが５μｍである、１０μｍのミクロスフィアについての実現可能な弾性率の上界及び下界を示すプロットである。
【図１４】Ｌが２５μｍである、２０μｍのミクロスフィアについての実現可能な弾性率の上界及び下界を示すプロットである。
【符号の説明】
【００５２】
１    支持体
２    流体層
３    ミクロスフィア（ビーズ）
４    ゲル
５    マイクロアレイ
６    架橋された流体層
７    ゲル化剤のフィルム
８    架橋されていないゲル化剤
９    受入れ層
１０    部分的に架橋された受入れ層
１１    流体懸濁液
１２    化学的に架橋された受入れ層
１３    放射線
１４    ゾル−ゲル転移を受けた受入れ層
【図１ａ】
2006528352.tif 000007
【図１ｂ】
2006528352.tif 000008
【図１ｃ】
2006528352.tif 000009
【図１ｄ】
2006528352.tif 000010
【図１ｅ】
2006528352.tif 000011
【図２ａ】
2006528352.tif 000012
【図２ｂ】
2006528352.tif 000013
【図２ｃ】
2006528352.tif 000014
【図２ｄ】
2006528352.tif 000015
【図２ｅ】
2006528352.tif 000016
【図２ｆ】
2006528352.tif 000017
【図３ａ】
2006528352.tif 000018
【図３ｂ】
2006528352.tif 000019
【図３ｃ】
2006528352.tif 000020
【図３ｄ】
2006528352.tif 000021
【図３ｅ】
2006528352.tif 000022
【図３ｆ】
2006528352.tif 000023
【図３ｇ】
2006528352.tif 000024
【図４ａ】
2006528352.tif 000025
【図４ｂ】
2006528352.tif 000026
【図４ｃ】
2006528352.tif 000027
【図４ｄ】
2006528352.tif 000028
【図４ｅ】
2006528352.tif 000029
【図４ｆ】
2006528352.tif 000030
【図４ｇ】
2006528352.tif 000031
【図５ａ】
2006528352.tif 000032
【図５ｂ】
2006528352.tif 000033
【図５ｃ】
2006528352.tif 000034
【図５ｄ】
2006528352.tif 000035
【図５ｅ】
2006528352.tif 000036
【図５ｆ】
2006528352.tif 000037
【図５ｇ】
2006528352.tif 000038
【図６】
2006528352.tif 000039
【図７】
2006528352.tif 000040
【図８】
2006528352.tif 000041
【図９】
2006528352.tif 000042
【図１０】
2006528352.tif 000043
【図１１】
2006528352.tif 000044
【図１２】
2006528352.tif 000045
【図１３】
2006528352.tif 000046
【図１４】
2006528352.tif 000047
【国際調査報告】
2006528352.tif 000048
2006528352.tif 000049
2006528352.tif 000050