(57)【要約】β-カロテンケトラーゼ遺伝子を発現し、且つキサントフィロミセス（Xanthophyllomyces）属（ファフィア（Phaffia）属）に属する組換え微生物を、水性栄養培地中にて好気性条件下で培養する工程、および生じたカロテノイドを前記組換え微生物の細胞から、または培養液から単離する工程を含む、カンタキサンチンおよびエキネノンを製造する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-カロテンケトラーゼ遺伝子を発現し、且つキサントフィロミセス（Xanthophyllomyces）属（ファフィア（Phaffia）属）に属する組換え微生物を、水性栄養培地中にて好気性条件下で培養する工程、および生じたカロテノイドを該組換え微生物の細胞から、または培養液から単離する工程を含む、カンタキサンチンおよびエキネノンを製造する方法。
【請求項２】
組換え微生物が、キサントフィロミセス・デンドロラス（Xanthophyllomyces dendrorhous）（ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma））ATCC96815またはその変異体に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
β-カロテンケトラーゼ遺伝子が、β-カロテンケトラーゼ遺伝子を有するアグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、パラコッカス属およびヘマトコッカス属の微生物からなる群より選択される微生物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
β-カロテンケトラーゼ遺伝子が、β-カロテンケトラーゼ遺伝子を有するアグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）、アルカリゲネス（Alcaligenes）PC-1、パラコッカス・マーキュシー（Paracoccus marcusii）MH1、グラム陰性細菌E-396（FERM BP-4283）およびヘマトコッカス・プルバリス（Haematococcus pluvialis）からなる群より選択される微生物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
β-カロテンケトラーゼ遺伝子がアルカリゲネスPC-1に由来するか、またはβ-カロテンケトラーゼ遺伝子のDNA配列がそれと実質的に相同である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
制御配列を用いて、β-カロテンケトラーゼ遺伝子を組換え微生物において発現させる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
培養工程が、pH 4〜8の範囲、温度15〜26℃の範囲で24〜500時間にわたって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
培養工程が、pH 5〜7の範囲、温度18〜22℃の範囲で48〜350時間にわたって行われる、請求項7記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファフィア属（Phaffia）に属する微生物による、キサントフィルカロテノイド、特にカンタキサンチンおよびエキネノンの製造方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、ファフィア属に属する遺伝子操作が行われた組換え微生物により、キサントフィルカロテノイド、特にカンタキサンチンおよびエキネノンを産生させるための方法を提供する。
【０００３】
本発明の方法を用いることにより、アスタキサンチン以外の有用なキサントフィルカロテノイド、例えばカンタキサンチンおよびエキネノンを、ファフィア属に属する組換え微生物における主要なキサントフィルカロテノイドとして産生させることが可能になる。
【発明の開示】
【０００４】
β-カロテンを産生しうる任意の菌株が、適した宿主株でありうる。選択した宿主株がβ-カロテンからアスタキサンチンを産生しうる通常のファフィア株である場合には、β-カロテンケトラーゼをコードする遺伝子の導入および発現の後に、アスタキサンチンと他のキサントフィルカロテノイドとの混合物の産生が得られる。一方、アスタキサンチンを産生できず、β-カロテンを蓄積する菌株を前記宿主株として選択した場合には、アスタキサンチンの蓄積を生じずに、カンタキサンチンおよびエキネノンなどのキサントフィルカロテノイドが最大レベルで産生されると考えられる。β-カロテンを蓄積するこのような宿主株は、アスタキサンチンを蓄積するファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma）の菌株の変異誘発によって入手可能である。または、β-カロテンを蓄積するこのような宿主株を、β-カロテンからのアスタキサンチンの生合成に関与する酵素であって米国特許第6,365,386号に開示されているアスタキサンチンシンターゼを失活させることによって入手することもできる。アスタキサンチンシンターゼの遺伝子の破壊は、この酵素を失活させるための最も簡便な方法の一つである。
【０００５】
さらに、β-カロテンを蓄積するこのような宿主株を、公開された培養物コレクションから入手することもできる。例えば、β-カロテン蓄積性のP.ロドジマ（P. rhodozyma）ATCC96815を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, USA）から購入することができる。自然界由来のP.ロドジマの新たなβ-カロテン蓄積株（これはアスタキサンチン産生株の派生物または自然変異体でもよい）は、本発明の宿主株を作製するためのもう1つのアプローチである。
【０００６】
本発明の1つの局面は、β-カロテンケトラーゼを発現している組換えファフィア株を培養することを含む、カンタキサンチンおよびエキネノンを製造する方法である。
【０００７】
前記β-カロテンケトラーゼは、β-カロテンのβ-イオノン環の4位および4'位にあるメチレンのケト基への変換を触媒し、エキネノンを経て、キサントフィルの一種であるカンタキサンチンを生成する。この酵素をコードする遺伝子はいくつかの種から単離されており、これには例えば、海洋細菌（アグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）およびアルカリゲネス属（Alcaligenes sp.））由来のcrtW、パラコッカス・マーキュシー（Paracoccus marcusii）由来のcrtW（GenBankアクセッション番号Y15112）、パラコッカス・カロチニファシエンス新種（Paracoccus carotinifaciens sp.nov.）由来のcrtW、およびヘマトコッカス・プルバリス（Haematococcus pluvialis）のbkt遺伝子（GenBankアクセッション番号D45881）がある。
【０００８】
本発明には、β-カロテンケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子を用いることができる。
【０００９】
好ましくは、前記β-カロテンケトラーゼ遺伝子は、β-カロテンケトラーゼ遺伝子を有する、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、パラコッカス属およびヘマトコッカス属の微生物からなる群より選択される微生物から入手可能である。
【００１０】
より好ましくは、前記β-カロテンケトラーゼ遺伝子は、β-カロテンケトラーゼ遺伝子を有する、アグロバクテリウム・オーランティアカム（GenBankアクセッション番号D58420）、アルカリゲネスPC-1（GenBankアクセッション番号D58422）、パラコッカス・マーキュシーMH1（GenBankアクセッション番号Y15112）、グラム陰性細菌E-396（FERM BP-4283）（この微生物から得られたβ-カロテンケトラーゼ遺伝子のDNA配列はJP-A Hei 10-155497号の記載に見いだすことができる）およびヘマトコッカス・プルバリス（GenBankアクセッション番号D45881）からなる群より選択される微生物から入手可能であり、GenBankアクセッション番号はそれぞれの微生物から得られたβ-カロテンケトラーゼ遺伝子のDNA配列を示している。
【００１１】
さらにより好ましくは、前記β-カロテンケトラーゼ遺伝子は、アルカリゲネスPC1から入手可能である、またはそれをそれと実質的に相同なDNA配列から入手することもできる。
【００１２】
「実質的に相同なDNA配列」という用語は、β-カロテンケトラーゼをコードするDNA配列に関して、アルカリゲネスPC-1のcrtWのアミノ酸配列と比較した場合の同一性が60％を上回る、好ましくは70％を上回る、より好ましくは80％を上回る、最も好ましくは90％を上回り、かつアルカリゲネスPC-1のcrtWによってコードされる酵素と同じ型の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列である、アミノ酸配列をコードするDNA配列のことを指す。
【００１３】
β-カロテンケトラーゼ遺伝子を用いることにより、ファフィア属に属する微生物に対して、カンタキサンチンおよびエキネノンを産生する能力を付与することが可能である。β-カロテンケトラーゼ遺伝子を発現するファフィア属の組換え微生物は、公知の組換え技術によって作製することができる。
【００１４】
本発明のβ-カロテンケトラーゼをコードするDNAの単離またはクローニングのために用いられる技法は当技術分野で知られており、これにはゲノムDNAからの単離が含まれる。このようなゲノムDNAからの本発明のDNA配列のクローニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書では以下、PCRと称する）を用いて行うことができる。
【００１５】
β-カロテンケトラーゼをコードする、単離またはクローニングがなされたDNAは、好ましくは、ファフィア属の宿主微生物における本酵素の発現のために適した発現ベクター上へのクローニング後に用いることができる。
【００１６】
「発現ベクター」には、内部に含まれるDNA配列を、そのような配列がファフィア属に属する微生物における前記DNA配列の発現を生じさせうる制御配列などの他の配列と機能的に結合している場合に、発現させることが可能なベクターが含まれる。「機能的に結合している」という用語は、そのように記載された複数の構成要素が、それらが意図した様式で機能することを許容するような位置関係にあることを指す。「制御配列」という用語は、少なくとも、目的の遺伝子の発現のために必要な構成要素を含むことを意図しており、さらにそのほかの有益な構成要素も含まれうる。一般に、制御配列にはプロモーター、ターミネーターが含まれ、場合によってはエンハンサー、トランス活性化因子または転写因子が含まれる。P.ロドジマ由来のグリセルアルデヒド-3-デヒドロゲナーゼ（GAP）遺伝子プロモーター（国際公開公報第97／23,633号）などの構成性プロモーターを、構成的発現を得るために用いることもできる。厳密に制御された発現を実現するために誘導性プロモーターを用いることもできる。誘導性プロモーターの例の一つは、熱ショックタンパク質またはアミラーゼ遺伝子などをコードする遺伝子のプロモーターである。
【００１７】
当業者に周知の方法を、前記発現ベクターの構築に用いることもできる。
【００１８】
明示的には述べられていないが、発現ベクターは、エピソームとして、または染色体DNAに組み込まれた部分として、宿主生物内で複製可能でなければならないと考えられている。一般に、後者の場合の方が遺伝子の安定性が高いと予想される。相同組換えによって宿主微生物の染色体に発現ベクターを組み込むためには、宿主ゲノムDNAと配列が相同なDNA断片の少なくとも一部分を含むようにベクターを調製する。この目的のために、rDNA遺伝子断片を、ファフィア属に属する微生物において有効に用いることができる。rDNAは、ゲノム上に多コピーが存在する一種のサテライトDNAである。rDNA断片を発現ベクター上の標的指向性DNAとして用いることにより、前記ベクター上で発現させようとする目的DNAを宿主ゲノム中に組み込むことができ、さらにそれを多コピーとして存在させることもできる。これにより、目的の酵素の過剰発現をもたらすと考えられる遺伝子用量効果が得られる可能性がある。本発明の実施例においては、このようなrDNA断片をこの目的に首尾良く用いた。本発明は、既知である、または後に知られるようになる、等価な機能を果たす他の型の発現ベクターも含む。
【００１９】
β-カロテンケトラーゼをコードする単離されたDNA配列を、そのポリペプチドの発現を得るためにさまざまな方法で操作することができる。発現ベクターに応じて、前記β-カロテンケトラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターへの挿入の前に操作することが望ましいまたは必要であると考えられる。クローニング法を利用してヌクレオチド配列を改変するための技法は当技術分野で周知である。
【００２０】
発現ベクター中にクローニングされた前記β-カロテンケトラーゼの遺伝子からなる組換えDNAは、宿主微生物に導入されると考えられる。ファフィア属に属する微生物を含む真菌細胞への外来性DNAの導入のための方法は当技術分野で周知である。これらには例えば、LiCl法による形質転換、プロトプラスト融合、電気穿孔、DNAをコーティングした粒子による微粒子銃法、および当技術分野で知られた他の方法が含まれる。本発明の実施例では、P.ロドジマに対する形質転換方法として微粒子銃法を用いた。微粒子銃法の手順は当業者に周知である。
【００２１】
このようにして得られた組換え生物は、β-カロテンケトラーゼをコードするDNA配列を過剰発現することができる。このため、本発明の組換え生物は、キサントフィルカロテノイド、特にカンタキサンチンおよびエキネノンの製造方法において有用である。
【００２２】
本発明のさらにもう1つの局面は、カンタキサンチンおよびエキネノンを製造するための生物的方法であって、ファフィア属の組換え微生物を、カロテノイドを産生するための基質の存在下で水性栄養培地中にて好気性条件下で培養する工程、および生じたカロテノイドを前記組換え微生物の細胞から、または培養液から単離する工程を含む方法である。
【００２３】
キサントフィルを含むカロテノイドは、通常、細胞に適した多量栄養素および微量栄養素、例えば、細胞増殖のための糖質源としてと同時にカロテノイドを産生するための基質としての糖蜜、サッカロースまたはグルコース、ならびにコーンスチーブリカー、酵母エキス、硫酸二アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウムまたは尿素などの窒素源、リン酸アンモニウムおよびリン酸などのリン源、ならびに、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛およびビオチンまたはデスチオビオチンなどの補足的な微量栄養素または無機塩を含む培地中で、ファフィア属の菌株を培養することによって産生される。
【００２４】
培養に関して好ましい条件は、pHが4〜8の範囲にあり、温度が15〜26℃の範囲で、24〜500時間にわたることである。より好ましい培養条件は、pHが5〜7の範囲にあり、温度が18〜22℃の範囲で、48〜350時間にわたることである。
【００２５】
培養においては、換気および攪拌によって通常はカロテノイドの産生に関して良好な成績が得られる。
【００２６】
本発明の方法を用いてファフィア属の組換え株を培養することによってカロテノイドがひとたび産生されれば、培地（それらが培地中に分泌される場合）または微生物の細胞からカロテノイドを単離することができ、必要に応じて、ある特定のカロテノイドが所望の場合には、当技術分野で知られた方法により、存在する可能性のある他のカロテノイドから単離することもできる。
【００２７】
本発明に従って製造されたカロテノイドは、食品または飼料の調製のための方法に用いることができる。当業者はこのような方法に精通している。このような複合的な食品または飼料がさらに、このような目的のために一般に用いられ、当技術分野で知られている添加物または成分を含むこともできる。
【００２８】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、これらはそれによって本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
下記の実施例には以下の材料および方法を用いた。
【００３０】
菌株
P.ロドジマ ATCC96594（ブダペスト条約に準拠して1998年4月8日にアクセッション番号ATCC 74438として再寄託）
P.ロドジマ ATCC96815（ブダペスト条約に準拠して1999年2月18日にアクセッション番号ATCC 74486として再寄託）
大腸菌TOP10：F−、mcrA、delta（mrr-hsdRMS-mcrBC）、phi80、delta（lacZ M15）、delta（lacX74）、recA1、deoR、araD139（ara-leu）7697、galU、galK、rpsL（Strｒ）、endA1、nupG（Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA）
【００３１】
ベクター
pCR2.1-TOPO（Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA）
pGEM-T（Promega Corporation, USA）
【００３２】
方法
制限酵素およびT4 DNAリガーゼはTakara Shuzo（Ohtsu, JP）から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、Perkin Elmer model 2400によるサーマルサイクラーを用いて行った。各々のPCR条件は実施例の項に記載している。PCRプライマーは販売供給元から購入した。DNAシークエンシングのための蛍光DNAプライマーはPharmacia社から購入した。DNAシークエンシングは自動蛍光DNAシークエンサー（ALFred, Pharmacia）を用いて行った。
【００３３】
β-カロテンの基準試料はWAKO（Osaka, Japan）から購入した。カンタキサンチンおよびエキネノンはRoche Vitamines AG（Basle, Switzerland）から入手した。
【００３４】
実施例1：発現ベクターの構成要素の調製
発現ベクターの構成要素である、G418耐性遺伝子、P.ロドジマのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（本明細書では以下、GAPと称する）のプロモーターおよびターミネーター領域、ならびにP.ロドジマのrDNA断片を調製した。G418耐性遺伝子カセットは以下の通りに調製した。
【００３５】
Sac I-リンカーを、G418耐性遺伝子カセットを保有するベクターpUC-G418（米国特許第6,365,386 B1号）の一意的なHind III部位に連結し、その結果得られたベクターをpG418Sa512と命名した。pG418Sa512から切り出した1.7kbのKpn I／Sac I断片をG418耐性遺伝子カセットとして用いた。
【００３６】
GAP遺伝子のプロモーターおよびターミネーターならびにrDNA断片はそれぞれ、P.ロドジマ ATCC 96594のゲノムDNAをテンプレートとして用いるPCRによって入手した。ゲノムDNAを入手するためには、QIAGEN Blood & Cell Culture DNA Midi キット（QIAGEN, Germany）を、YPD（Difco Laboratories）培地中での一晩培養によって得たP.ロドジマ ATCC 96594の細胞とともに用いた。
【００３７】
調製したゲノムDNAをテンプレートとして用いて、PCRをAdvantage-HF PCR Kit（CLONTECH Laboratories, Inc., USA）およびサーマルサイクラー（Perkin Elmer 2400, USA）を用いて行った。
【００３８】
GAPのプロモーター配列を増幅するために用いた合成プライマーは以下の通りとした：GAP#1（配列番号：1）（Not I部位 GCGGCCGCを有する）およびGAP#5（配列番号：2）（Sma I部位 CCCGGGGを有する）。
【００３９】
最初のテンプレート変性段階は94℃ 5分からなる。94℃ 30秒間、55℃ 30秒間および72℃ 1分の増幅サイクルを25回繰り返した。さらに72℃ 10分の反応の後に、反応混合物を4℃に保った。この反応により、GAPプロモーターを含むDNA断片（398bp）が増幅された。この増幅されたGAPプロモーターを、TOPO TA Cloningキット（Invitrogen Corporation, USA）を用いることにより、pCR2.1-TOPOベクターと連結して大腸菌TOP 10細胞に導入した。いくつかのクローンを配列解析のために選択した。各候補クローンのクローニングされたGAPプロモーターの配列を調べた。P.ロドジマのGAPプロモーター（GenBankアクセッション番号Y08366）と完全に同じ配列を示した、DNAクローンの1つをpTOPO-pGAP2#1と命名した。pTOPO-pGAP2#1から切り出した398bpのNot I／Sma I断片をGAPプロモーターカセットとして用いた。
【００４０】
GAPのターミネーター配列の増幅には以下の2つの合成プライマーを用いた：GAP#33（配列番号：3）（BamH I-SalI部位 GGATCCGTCGACを有する）およびGAP#4（配列番号：4）（Kpn I部位 GGTACCを有する）。
【００４１】
PCR条件は上記のGAPプロモーターに関するものと同じとした。この反応により、GAPターミネーターを含むDNA断片（302bp）が増幅された。この増幅されたGAPターミネーターを、TOPO TA Cloningキットを用いることにより、pCR2.1-TOPOベクターと連結して大腸菌TOP 10細胞に導入した。いくつかのクローンを配列解析のために選択した。各候補クローンのクローニングされたGAPターミネーターの配列を調べた。P.ロドジマのGAPターミネーター（GenBankアクセッション番号Y08366）と完全に同じ配列を示した、DNAクローンの1つをpTOPO-tGAP#1と命名した。pTOPO-tGAP#1から切り出した302bpのBamH I／Kpn I断片をGAPターミネーターカセットとして用いた。
【００４２】
rDNA断片の増幅には以下の2つの合成プライマーを用いた：R#1（配列番号：5）（Sac I部位 GAGCTCを有する）およびR#2（配列番号：6）（Not I-Sac I部位 GCGGCCGCGAGCTCを有する）。
【００４３】
PCR条件は上記のGAPプロモーターに関するものと同じとした。この反応により、rDNAを含むDNA断片（3126bp）が増幅された。この増幅されたrDNAを、TOPO TA Cloningキットを用いることにより、pCR2.1-TOPOベクターと連結して大腸菌TOP 10細胞に導入した。いくつかのクローンを配列解析のために選択した。各候補クローンのクローニングされたrDNAの配列を調べた。P.ロドジマのrDNA（GenBankアクセッション番号D31656、AF139632）と完全に同じ配列を示した、DNAクローンの1つをpTOPO-rDNA#1と命名した。pTOPO-rDNA#1から切り出した1960bpのSac II／Not I断片をrDNAカセットとして用いた。
【００４４】
実施例2：β-カロテンケトラーゼ遺伝子（crtW）を保有する発現ベクターの構築、ならびにカンタキサンチンおよびエキネノンの生産のための使用
アミノ酸配列（GenBankアクセッション番号D58422）の逆翻訳によって、アルカリゲネスPC-1株のβ-カロテンケトラーゼをコードする人工的crtW遺伝子のヌクレオチド配列を入手するために、PCRを用いた遺伝子合成を利用した。詳細な方法は米国特許第6,124,113号の実施例に記載されている。この場合には、2つの末端プライマーのそれぞれを、crtW遺伝子のそれぞれ5'末端および3'末端にSma IおよびBamH Iの制限部位が導入されるように設計した。
【００４５】
crtW遺伝子を保有する発現ベクターは、pGEM-Tを骨格として用いて、rDNAカセットおよびGAPプロモーターカセット（実施例1で入手）、上記の通りに構築したcrtW遺伝子、ならびにGAPターミネーターカセットおよびG418耐性遺伝子カセット（実施例1で入手）を連結して、この順に配置することによって構築した。
【００４６】
この結果得られた発現ベクターを、欧州特許第1,158051号に記載された微粒子銃法を用いることによってP.ロドジマ ATCC 96815に導入した。
【００４７】
このようにして得たP.ロドジマ ATCC 96815のcrtW組換え株を、試験管（直径21mm）に入れた7mlの播種培地中にて20℃で3日間振盪下で培養することによって調製した種培養物を接種した後に、500mlエーレンマイヤーフラスコに入れた50mlの生産培地中にて20℃で7日間振盪下で培養する。適当な量の培養液を採取し、細胞の増殖およびカロテノイドの生産性に関する分析のために用いた。
【００４８】
培地組成は以下の通りとした。
【００４９】
播種培地：グルコース30.0g／l、NH４C1 4.83g／l、KH２PO４ 1.0g／l、MgSO４-7H２O 0.88g／l、NaCl 0.06g／l、CaCl２-2H２O 0.2g／l、フタル酸KH 20.0g／l、FeSO4-7H２O 28mg／l、微量元素溶液0.3ml、ビタミンストック溶液1.5ml（pH 5.4〜5.6に調整）
【００５０】
微量元素溶液：4N H２SO４ 100ml／l、クエン酸-H２O 50.0g／l、ZnSO４-7H２O 16.7g／l、CuSO４-5H２O 2.5g／l、MnSO４-4,5H２O 2.0g／l、H３BO３ 2.0g／l、Na２MoO４ 2.0g／l、KI 0.5g／l
【００５１】
播種培地用のビタミンストック溶液：4N-H２SO４ 17.5ml／l、ミオイノシトール40.0g／l、ニコチン酸2.0g／l、Ca-D-パントテン酸2.0g／l、ビタミンB１（チアミンHCl）2.0g／l、p-アミノ安息香酸1.2g／l、ビタミンB６（ピリドキシンHCl）0.2g／l、ビオチンストック溶液8.0ml
【００５２】
ビオチンストック溶液は、4N-H２SO４をエタノール50mlに添加して合計100mlとすることによって調製した。続いてD-ビオチン400mgを添加した。
【００５３】
生産培地：グルコース22.0g／l、KH２PO４ 14.25g／l、MgSO４-7H２O 2.1g／l、CaC1２-2H２O 0.865g／l、(NH４)２SO４ 3.7g／l、FeSO４-7H２O 0.28g／l、微量元素溶液4.2ml、ビタミンストック溶液9.35ml（pH 5.5に調整）
【００５４】
生産培地用のビタミンストック溶液：4N H２SO４ 17.5ml／l、ニコチン酸2.0g／l、Ca-D-パントテン酸3.0g／l、ビタミンB１（チアミンHCl）2.0g／l、p-アミノ安息香酸1.2g／l、ビタミンB６（ピリドキシンHC1）0.2g／l、ビオチンストック溶液30.0ml
【００５５】
播種培養液の一部（2.5ml）を、500mlエーレンマイヤーフラスコに入れた47.5mlの生産培地に移した。続いて、200rpmで回転振盪しながら20℃で培養を開始した。発酵2日目に50％グルコース溶液5mlを培地に添加し、発酵を続けた。発酵4日目に培養液2mlを採取し、50％グルコース溶液5mlを再び培地に添加して、培養をさらに3日間続けた。7日目に培養物のアリコートを採取し、カロテノイド生産および細胞増殖に関する分析のために用いた。
【００５６】
細胞増殖の分析に関しては、UV-1200光度計（Shimadzu Corp., Kyoto, Japan）を用いて660nmの光学密度を測定した。
【００５７】
β-カロテン、カンタキサンチンおよびエキネノンの含有量の分析に関しては、採取した培養液を溶媒混合物（エチルアルコール、ヘキサンおよび酢酸エチル）と混合し、ガラスビーズとともに激しく振盪することにより、培養液およびP.ロドジマ細胞からカロテノイドを抽出した。抽出の後に、破壊された細胞およびガラスビーズを遠心分離によって除去し、その結果得られた上清をHPLCによりカロテノイド含有量に関して分析した。用いたHPLC条件は以下の通りである：HPLCカラム：Chrompack Lichrosorb si-60（4.6mm、250mm）；温度：室温；溶出液：アセトン／ヘキサン（18／82）、溶出液に水1ml／1を添加；注入量：10μl；流速：2.0ml／分；検出：UV、450nmにて。
【配列表】
2006500046.tif 000002
2006500046.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月2日(2005.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006500046000001.app
【国際調査報告】
2006500046.tif 000004
2006500046.tif 000005
2006500046.tif 000006