(57)【要約】本発明は、免疫細胞をＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する物質に接触させることを含む免疫反応を調節するための方法を提供する。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化は、増加することで免疫反応をダウンレギュレートするか、代わりに減少することで免疫反応をアップレギュレートする。調節は活性化または阻害のいずれかで、接触はインビボまたはインビトロにおいて発生する。インビボでの該方法の実行はまた、免疫反応のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションから利益を得る個体の治療となりうる可能性がある。免疫反応をダウンレギュレートする、かかる調節は、例えば、臓器移植を受けた個体、またはアレルギーまたは自己免疫疾患などの状態を有する個体に対する治療として役立つ。また、免疫反応をアップレギュレートする調節は、例えば、免疫抑制疾患または腫瘍などの状態を有する個体に対する治療として役立つ。ＢＴＦ４シグナルまたはＢ７−Ｌ１シグナルを調節する物質を同定する方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＴＦ４分子の細胞外領域を含む、融合蛋白。
【請求項２】
配列番号：５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の融合蛋白。
【請求項３】
Ｂ７−Ｌ１分子の細胞外領域を含む、融合蛋白。
【請求項４】
配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３記載の融合蛋白。
【請求項５】
免疫細胞をＢＴＦ４媒介シグナルを増加させる物質と接触させ、それにより免疫反応をダウンモジュレートさせることを含む、免疫反応のダウンモジュレーション方法。
【請求項６】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
物質がＢＴＦ４ポリペプチドである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
物質が不溶性基質に交差結合されたＢＴＦ４ポリペプチドの細胞外部分である、請求項５記載の方法。
【請求項９】
物質が、不溶性基質に交差結合された、配列番号：５に示されるアミノ酸配列を含む、ＢＴＦ４−Ｉｇ融合蛋白である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
免疫細胞をＢＴＦ４介在シグナル化を減少させる物質と接触させ、それにより免疫反応をアップモジュレートさせることを含む、免疫反応のアップモジュレーション方法。
【請求項１１】
物質がＢＴＦ４に特異的に結合する抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
接触工程がインビボで発生する、請求項５または１０記載の方法。
【請求項１３】
接触工程がインビトロで発生する、請求項５または１０記載の方法。
【請求項１４】
さらに、Ｔ細胞を、免疫反応をアップレギュレートする追加物質と接触させることを含む、請求項１０の方法。
【請求項１５】
さらに、Ｔ細胞を、免疫反応をダウンレギュレートする追加物質と接触させることを含む、請求項５記載の方法。
【請求項１６】
免疫反応をダウンレギュレートさせることで利益を得るであろう状態の対象を治療する方法であって、ＢＴＦ４−介在シグナル化を促進する物質を対象に投与し、その結果、免疫反応をダウンレギュレートさせることで利益を得るであろう状態を治療する方法。
【請求項１７】
対象が移植、アレルギー、および自己免疫疾患からなる群より選択される状態を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
物質がＢＴＦ４ポリペプチドである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
さらに、免疫反応をダウンレギュレートする二次物質を対象に投与することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
免疫反応をアップレギュレートさせることで利益を得るであろう状態の対象を治療する方法であって、ＢＴＦ４−介在シグナル化を阻害する物質を対象に投与し、その結果、免疫反応をアップレギュレートさせることで利益を得るであろう状態を治療する方法。
【請求項２１】
対象が腫瘍および免疫抑制疾患からなる群より選択される状態を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
物質がＢＴＦ４に特異的に結合する抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
さらに、免疫反応をアップレギュレートする二次物質を対象に投与することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
ＢＴＦ４シグナル化をモジュレートする物質を同定する方法であって、
ａ）Ｔ細胞、適切な活性化シグナルおよび試験物質を準備し；および
ｂ）試験物質の存在および不存在下における活性化シグナルによるＴ細胞活性化のＢＴＦ４モジュレーションの変化を測定することでＢＴＦ４シグナル化のモジュレーションを検定すること
を含む、ここで試験物質の存在下におけるＢＴＦ４によるＴ細胞活性化のモジュレーションにおける比較可能な変化は試験物質がＢＴＦ４シグナル化のモジュレーターであることを示す、方法。
【請求項２５】
免疫細胞をＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させる物質と接触させ、それにより免疫反応をダウンモジュレートさせることを含む、免疫反応のダウンモジュレーション方法。
【請求項２６】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
物質がＢ７−Ｌ１ポリペプチドである、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
物質が不溶性基質に交差結合されたＢ７−Ｌ１ポリペプチドの細胞外部分である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
物質が、不溶性基質に交差結合された、配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含む、Ｂ７−Ｌ１−Ｉｇ融合蛋白である、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
免疫細胞をＢ７−Ｌ１介在シグナル化を減少させる物質と接触させ、それにより免疫反応をアップモジュレートさせることを含む、免疫反応のアップモジュレーション方法。
【請求項３１】
物質がＢ７−Ｌ１に特異的に結合する抗体である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
接触工程がインビボで発生する、請求項２５または３０記載の方法。
【請求項３３】
接触工程がインビトロで発生する、請求項２５または３０記載の方法。
【請求項３４】
さらに、Ｔ細胞を免疫反応をアップレギュレートさせる追加物質と接触させることを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
さらに、Ｔ細胞を免疫反応をダウンレギュレートさせる追加物質と接触させることを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３６】
免疫反応をダウンレギュレートさせることで利益を得るであろう状態の対象を治療する方法であって、Ｂ７−Ｌ１−介在シグナル化を促進する物質を対象に投与し、その結果、免疫反応をダウンレギュレートさせることで利益を得るであろう状態を治療する、方法。
【請求項３７】
対象が移植、アレルギー、および自己免疫疾患からなる群より選択される状態を有する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
物質がＢ７−Ｌ１ポリペプチドである、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
さらに、免疫反応をダウンレギュレートさせる二次物質を対象に投与することを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
免疫反応をアップレギュレートさせることで利益を得るであろう状態の対象を治療する方法であって、Ｂ７−Ｌ１−介在シグナル化を阻害する物質を対象に投与し、その結果、免疫反応をアップレギュレートさせることで利益を得るであろう状態を治療する、方法。
【請求項４１】
対象が腫瘍および免疫抑制疾患からなる群より選択される状態を有する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
物質がＢ７−Ｌ１に特異的に結合する抗体である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
さらに、免疫反応をアップレギュレートさせる二次物質を対象に投与することを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
Ｂ７−Ｌ１シグナル化をモジュレートする物質を同定する方法であって、
ａ）Ｔ細胞、適切な活性化シグナルおよび試験物質を準備し；および
ｂ）試験物質の存在および不存在下における活性化シグナルによるＴ細胞活性化のＢ７−Ｌ１モジュレーションの変化を測定することでＢ７−Ｌ１シグナル化のモジュレーションを検定する、
ことを含む、ここで試験物質の存在下におけるＢ７−Ｌ１によるＴ細胞活性化のモジュレーションにおける比較可能な変化は試験物質がＢ７−Ｌ１シグナル化のモジュレーターであることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本出願は２００２年６月１７日に出願された米国仮出願番号６０／３８９，６６０の優先を主張するもので、その内容は出典を明示することで本明細書の一部とする。
【０００２】
（背景技術）
Ｔ細胞が異種蛋白に反応するためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により２つのシグナルが休止Ｔリンパ球に提供されなければならない（Jenkins,M.およびSchwartz,R.（１９８７） J. Exp. Med. １６５, ３０２−３１９；Mueller, D.L.ら.（１９９０） J. Immunol. １４４, ３７０１−３７０９）。免疫反応を特異的なものとする第一のシグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連で提示される異種抗原ペプチドを認識した後に、Ｔ細胞受容体を通して変換される。共同刺激と呼ばれる第二のシグナルは、Ｔ細胞が増殖し、機能を有するよう誘導する（Lenschowら、１９９６.  Annu. Rev. Immunol. １４：２３３）。仮に、Ｔ細胞が、追加される共同刺激を受け取らずに、Ｔ細胞受容体を通してのみ刺激されるならば、Ｔ細胞は無反応性、アネルギーとなるか死んでしまい、免疫反応のダウンモジュレーションという結果になる。共同刺激は、抗原特異的なものでも、ＭＨＣに制限されるものでもいずれでもなく、ＡＰＣにより発現される１つまたはそれ以上の別個の細胞表面分子により提供されると考えられている（Jenkins, M.K.ら、１９８８ J. Immunol. １４０, ３３２４−３３３０；Linsley, P.S.ら、１９９１ J. Exp. Med. １７３, ７２１−７３０；Gimmi, C.D.ら、, １９９１ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ８８, ６５７５−６５７９；Young, J.W.ら、１９９２ J. Clin. Invest. ９０, ２２９−２３７；Koulova, L.ら、１９９１ J. Exp. Med. １７３, ７５９−７６２；Reiser, H.ら、１９９２ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ８９, ２７１−２７５；van−Seventer, G.A.ら、（１９９０） J. Immunol. １４４, ４５７９−４５８６；LaSalle, J.M.ら、, １９９１ J. Immunol. １４７, ７７４−８０；Dustin, M.I.ら、, １９８９ J. Exp. Med. １６９, ５０３；Armitage, R.J.ら、１９９２ Nature ３５７, ８０−８２；Liu, Y.ら、１９９２ J. Exp. Med. １７５, ４３７−４４５）。
【０００３】
ＡＰＣ上に発現される、蛋白Ｂ７ファミリーのメンバー、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）は、重要な共同刺激分子である（Freemanら、１９９１. J. Exp. Med. １７４：６２５；Freemanら、１９８９ J. Immunol. １４３：２７１４；Azumaら、１９９３ Nature ３６６：７６；Freemanら、１９９３. Science ２６２：９０９）。Ｂ７は、一次免疫反応の間、優勢的な役割をするようであり、免疫反応の過程において後でアップレギュレートされるＢ７−１は、長期にわたる一次Ｔ細胞反応または共同刺激する二次Ｔ細胞反応において重要である（Bluestone.  １９９５.  Immunity.  ２：５５５）。
Ｂ７−１およびＢ７−２などの分子のＢ７ファミリーのメンバーが、ＣＤ２８分子に結合することが知られている。ＣＤ２８は、休止Ｔ細胞上で構成的に発現され、活性化の後に発現が増加する、共同刺激受容体分子である。Ｔ細胞受容体を通してのシグナルの後で、ＣＤ２８の結合および共同刺激シグナルの変換は、Ｔ細胞が増殖し、ＩＬ−２を分泌するよう誘導する（Linsley, P.S.ら、１９９１ J. Exp. Med. １７３, ７２１−７３０；Gimmi, C.D.ら、１９９１ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ８８, ６５７５−６５７９；June, C.H.ら、１９９０ Immunol. Today. １１, ２１１−６；Harding, F.A.ら、１９９２ Nature. ３５６, ６０７−６０９）。
【０００４】
Ｂ７分子が結合する受容体（すなわち、共同刺激受容体または阻害受容体）は、免疫細胞に対する結果として生じるシグナルが共同刺激または阻害のいずれであるかを決定する。いくつかのＢ７ファミリーメンバーは、共同刺激受容体ＣＤ２８および阻害受容体ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）の両方に対して、結合親和性を示す。ＣＴＬＡ４は、休止Ｔ細胞上には発現されておらず、Ｔ細胞活性化の後でのみ出現する。（Brunet, J.F.ら、１９８７ Nature ３２８, ２６７−２７０）。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞反応の負のレギュレーションにおいて重要であるようだ（Waterhouseら、１９９５.  Science ２７０：９８５）。ＣＴＬＡ４の遮断が阻害シグナルを取り除くことが判明し、一方、ＣＴＬＡ４の凝集がＴ細胞反応をダウンレギュレートする阻害シグナルを提供することが判明した（AllisonおよびKrummel、１９９５.  Science ２７０：９３２）。Ｂ７分子はＣＤ２８よりもＣＴＬＡ４に対して高い親和性を有するため、Ｔ細胞活性化の過程を通した、２つの受容体の異なる発現パターンは、Ｔ細胞反応の適切な調節に重要であると考えられている（Linsley, P.S.ら、１９９１ J. Exp. Med. １７４, ５６１−５６９）。Ｂ７−１およびＢ７−２などのＢ７ファミリーのメンバーが、ＣＴＬＡ４分子の別個の領域に結合し、ＣＴＬＡ４に対する結合に異なる機構を有することが発見された（Linsleyら、１９９４.  Immunity.  １：７９３）。
【０００５】
数種のさらなるＢ７ファミリーメンバー、Ｂ７−Ｈ１（Dong, H.ら、（１９９９） Nat. Med. ５：１３６５−１３６９）、ＩＣＯＳ−Ｌ（ＧＬ５０、Ｂ７ｈ、ＬＩＣＯＳおよびＢ７ＲＰ−１としても知られている）（Ling, V.ら、（２０００） J. Immunol. １６４：１６５３−７；Swallow, M. M.ら、（１９９９） Immunity １１：４２３−４３２；Aicher, A.ら、（２０００） J. Immunol. １６４：４６８９−９６；Mages, H. W.ら、（２０００） Eur. J. Immunol. ３０：１０４０−７；Brodie, D.ら、（２０００） Curr. Biol. １０：３３３−６；Yoshinaga, S. K.ら、（１９９９） Nature ４０２：８２７−３２）、Ｂ７−Ｌ１（ＷＯ９８／４４１１３；ＷＯ００／５３７５３；ＷＯ００／０８０５７；ＷＯ００／０８１５８；ＷＯ００／３２６３３；ＷＯ９８／５４９６３；CN １２４２３７６）、およびＢＴＦ４（Tazi−Ahniniら、, Immunogenetics ４７： ５５−６３（１９９７）；ＷＯ９８／３３９１２；ＷＯ９９／０７８４０）が、最近、同定された。Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１としても知られている）は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、共同刺激活性よりむしろ免疫阻害性を示し、免疫阻害受容体ＰＤ−１と相互作用することが知られている（Freeman, G. J.ら、（２０００） J. Exp. Med. １９２：１０２７−３４）。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞上に発現している。ＩＣＯＳ−Ｌは、共同刺激活性を示し、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に関する細胞表面受容体である、ＩＣＯＳと相互作用することが知られている（Hutloffら、（１９９９） Nature ３９７：２６３；ＷＯ９８／３８２１６；Tamatani, T.ら、（２０００） Int. Immunol. １２：５１−５５）。ＬＤＣＡＭは、非免疫組織型において広く発現し、マクロファージおよび樹状細胞を含む、いくつかの免疫細胞型上に発現する（ＷＯ００／０８１５８）。Ｂ７−Ｌ１は、まだ同定されていない他の結合パートナーを有するかもしれない。ＢＴＦ４に対する結合パートナーは、まだ同定されていない。
【０００６】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共同刺激／阻害経路の重要性は、インビトロおよびいくつかのインビボモデル系において証明されてきた。この共同刺激経路の遮断は、ネズミおよびヒト系における抗原特異耐性の発達につながる（Harding, F.A.ら、（１９９２） Nature. ３５６, ６０７−６０９；Lenschow, D.J.ら、（１９９２） Science. ２５７, ７８９−７９２；Turka, L.A.ら、（１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ８９, １１１０２−１１１０５；Gimmi, C.D.ら、（１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci USA ９０, ６５８６−６５９０；Boussiotis, V.ら、（１９９３） J. Exp. Med. １７８, １７５３−１７６３）。対照的に、Ｂ７陰性ネズミ腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶反応に付随して起こるＴ細胞媒介特異免疫および長期間持続する腫瘍の攻撃に対しての保護作用を誘発する（Chen, L.ら、（１９９２） Cell ７１, １０９３−１１０２；Townsend, S.E. and Allison, J.P.（１９９３） Science ２５９, ３６８−３７０；Baskar, S.ら、（１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. ９０, ５６８７−５６９０）。種々のＢ７ファミリーメンバーの共同刺激および免疫阻害経路の解明および操作は、医薬的に免疫反応を操作する大きな可能性を提供する。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、とりわけ、ＢＴＦ４および／またはＢ７−Ｌ１を経由するシグナル化を調節し、それにより免疫反応を調節する方法を提供することで、従来の技術を発展させるものである。以下の実施例のセクションにおいて詳述される実験結果は、ＢＴＦ４およびＢ７−Ｌ１が共にＴ細胞受容体媒介性のＴ細胞活性化をダウンレギュレートすることを示す。したがって、免疫細胞におけるＢＴＦ４および／またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を、細胞の抗原媒介活性化を負または正いずれかの調節をするよう操作することができる。特定の免疫細胞の反応の調節は、順次、典型的には生物内で発生する全ての免疫反応の一因となる、様々な免疫細胞型により増加された免疫反応のより広い調節に至ることができる。
【０００８】
本発明の１つの態様は、ＢＴＦ４分子の細胞外領域を含む融合蛋白に関する。
１つの具体例において、融合蛋白は配列番号：５に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の他の態様は、Ｂ７−Ｌ１分子の細胞外領域を含む融合蛋白に関する。
１つの具体例において、融合蛋白は配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の他の態様は、免疫反応をダウンモジュレートする方法に関する。該方法は、免疫細胞を、ＢＴＦ４介在シグナル化を増加させ、それにより免疫反応をダウンモジュレートする物質と接触させることを含む。
【０００９】
１つの具体例において、免疫細胞はＴ細胞である。
他の具体例において、物質はＢＴＦ４ポリペプチドである。
他の具体例において、物質は、不溶性基質に交差結合されたＢＴＦ４のポリペプチドの細胞外部分である。
他の具体例において、物質は、不溶性基質に交差結合された、配列番号：５に示されるアミノ酸配列を含む、ＢＴＦ４−Ｉｇ融合蛋白である。
１つの具体例において、接触工程はインビボで発生する。
他の具体例において、接触工程はインビトロで発生する。
【００１０】
１つの具体例において、該方法はさらに、Ｔ細胞を、免疫反応をダウンレギュレートする追加物質と接触させることを含む。
本発明の他の態様は、免疫反応をアップモジュレートする方法に関する。該方法は、免疫細胞を、ＢＴＦ４介在シグナル化を減少させ、免疫反応をアップモジュレートする物質と接触させることを含む。
１つの具体例において、物質は、ＢＴＦ４に特異的に結合する抗体である。
１つの具体例において、接触工程はインビボで発生する。
他の具体例において、接触工程はインビトロで発生する。
１つの具体例において、該方法はさらに、Ｔ細胞を、免疫反応をアップレギュレートする追加物質と接触させることを含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、免疫反応をダウンレギュレートすることより利益を得るだろう状態を有する対象を治療するための方法に関する。該方法は、免疫反応のダウンレギュレーションより利益を得るだろう状態を治療するため、ＢＴＦ４−介在シグナル化を促進する物質を対象に投与することを含む。
１つの具体例において、対象は、移植、アレルギーまたは自己免疫疾患である状態を有する。
他の態様において、物質は、ＢＴＦ４ポリペプチドである。
【００１２】
１つの具体例において、該方法はさらに、免疫反応をダウンレギュレートする二次物質を対象に投与することを含む。
本発明の他の態様は、免疫反応をアップレギュレートすることより利益を得るだろう状態を有する対象を治療するための方法に関する。該方法は、状態を治療するため、ＢＴＦ４−介在シグナル化を阻害する物質を対象に投与することを含む。
１つの具体例において、状態は腫瘍または免疫抑制疾患である。
他の具体例において、物質は、ＢＴＦ４に特異的に結合する抗体である。
１つの具体例において、該方法はさらに、免疫反応をアップレギュレートする二次物質を、対象に投与することを含む。
【００１３】
本発明の他の態様は、ＢＴＦ４シグナルを調節する物質を同定する方法に関する。該方法は、Ｔ細胞、適切な活性化シグナルおよび試験物質の提供、および試験物質の存在下および非存在下における活性化シグナルによる、Ｔ細胞活性化のＢＴＦ４の調節における変化を測定することによる、ＢＴＦ４シグナルの調節に対するアッセイを含む。試験物質の存在下におけるＢＴＦ４によるＴ細胞活性化の調節において比較可能な変化は、試験物質がＢＴＦ４シグナルの調節因子であることを示す。
【００１４】
本発明の他の態様は、免疫反応をダウンモジュレートする方法に関する。該方法は、免疫細胞を、Ｂ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させ免疫反応をダウンモジュレートする物質に接触させることを含む。
１つの具体例において、免疫細胞はＴ細胞である。
他の具体例において、物質はＢ７−Ｌ１ポリペプチドである。
他の具体例において、物質は、不溶性基質に交差結合されたＢ７−Ｌ１ポリペプチドの細胞外部分である。
【００１５】
他の具体例において、物質は、不溶性基質に交差結合された、配列番号：６に示されるアミノ酸配列を含む、Ｂ７−Ｌ１−Ｉｇ融合蛋白である。
１つの具体例において、接触工程はインビボで発生する。
他の具体例において、接触工程はインビトロで発生する。
１つの具体例において、該方法はさらに、Ｔ細胞を、免疫反応をダウンレギュレートする追加物質と接触させることを含む。
【００１６】
本発明の他の態様は、免疫反応をアップモジュレートする方法に関する。該方法は、免疫細胞を、Ｂ７−Ｌ１介在シグナル化を減少させ、免疫反応をアップモジュレートする物質と接触させることを含む。
１つの具体例において、物質は、Ｂ７−Ｌ１に特異的に結合する抗体である。
１つの具体例において、接触工程はインビボで発生する。
他の具体例において、接触工程はインビトロで発生する。
１つの具体例において、該方法はさらに、Ｔ細胞を、免疫反応をアップレギュレートする追加物質と接触させることを含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、免疫反応をダウンレギュレートすることより利益を得るだろう状態を有する対象を治療するための方法に関する。該方法は、免疫反応のダウンレギュレーションより利益を得るだろう状態を治療するため、Ｂ７−Ｌ１−介在シグナル化を促進する物質を対象に投与することを含む。
１つの具体例において、状態は、移植、アレルギーまたは自己免疫疾患である。
他の態様において、物質は、Ｂ７−Ｌ１ポリペプチドである。
１つの具体例において、該方法はさらに、免疫反応をダウンレギュレートする二次物質を対象に投与することを含む。
【００１８】
本発明の他の態様は、免疫反応をアップレギュレートすることより利益を得るだろう状態を有する対象を治療するための方法に関する。該方法は、免疫反応のアップレギュレーションより利益を得るだろう状態を治療するため、Ｂ７−Ｌ１−介在シグナル化を阻害する物質を対象に投与することを含む。
１つの具体例において、状態は腫瘍または免疫抑制疾患である。
１つの具体例において、物質は、Ｂ７−Ｌ１に特異的に結合する抗体である。
他の具体例において、該方法はさらに、免疫反応をアップレギュレートする二次物質を、対象に投与することを含む。
【００１９】
本発明の他の態様は、Ｂ７−Ｌ１シグナルを調節する物質を同定する方法に関する。該方法は、Ｔ細胞、適切な活性化シグナルおよび試験物質の提供、そしておよび試験物質の存在下および非存在下における活性化シグナルによる、Ｔ細胞活性化のＢ７−Ｌ１の調節における変化を測定することによる、Ｂ７−Ｌ１シグナルの調節に対するアッセイを含む。試験物質の存在下におけるＢ７−Ｌ１によるＴ細胞活性化の調節において比較可能な変化は、試験物質がＢ７−Ｌ１シグナルの調節因子であることを示す。
【００２０】
（図面の簡単な記載）
図１は、Ｔ細胞活性化アッセイの結果を表す、４つの棒グラフを含む。Ｔ細胞を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１、または共同刺激分子ＩＣＯＳ−ＬまたはＢ７−２、あるいは既知のＴ細胞阻害剤ＰＤ−Ｌ１の存在下および非存在下において活性化した。下のグラフは、上のグラフの重複実験である。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
ＢＴＦ４およびＢ７−Ｌ１は細胞表面分子である。理論に拘束されなければ、Ｔ細胞などの免疫細胞がＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を発現する細胞に接触した場合、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子は、免疫細胞（例えばＴ細胞）上に存在する特異的結合パートナー（当該分野において受容体または対構造とも称される）に結合し、ついで免疫細胞の活性化状態を調節するシグナルを伝達する。本明細書で明らかにされるように、ＢＴＦ４およびＢ７−Ｌ１は、細胞上で免疫阻害受容体として機能する受容体に結合することで細胞の活性化をダウンレギュレートする。したがって、免疫細胞の活性化状態は、ＢＴＦ４およびＢ７−Ｌ１シグナルの操作により、調節できる。例えば、１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を減少させ、免疫反応をアップレギュレートするために、一の物質を使用する。このことは、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１とそれらの受容体の相互作用を阻害する物質（例えば、抗体または小分子）と細胞を接触させることで達成され得る。他の具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させ、免疫反応をダウンレギュレートするために、一の物質を使用する。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化は、免疫細胞上の受容体に結合するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の量を増加させ、シグナル化を活性化させることで、増加させることができる。
【００２２】
当業者は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の修飾を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体を発現する免疫細胞の操作、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を発現する細胞の操作、または両方によって達成できることを認識するだろう。
１つの具体例において、抗原提示細胞上に発現するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と、免疫細胞（例えばＴ細胞またはＢ細胞）上に発現する免疫阻害受容体との相互作用を、所望の効果を生成するために調節する。この相互作用は、例えば、抗原提示細胞または免疫細胞を、例えば遮断抗体の添加により結合を阻害し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の活性化形態の添加により結合を増強する、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体結合を増強するかまたは阻害するかのいずれかにより機能するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子と接触させることで調節される。
【００２３】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する他の方法は、免疫細胞に接触する細胞（例えば抗原提示細胞）内の蛋白の発現を調節することである。細胞内のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現を、細胞内に導入したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドをコードする外因性の核酸分子の発現により調節できる。別法として、細胞を内因性のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現を増加する物質と接触させ得る。
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書に記載の「免疫細胞」なる語は、造血器由来で、免疫反応において働く細胞を含む。免疫細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄細胞を含む。
【００２５】
本明細書に記載の、「Ｔ細胞」なる語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞なる語はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方を含む。「抗原提示細胞」なる語は、専門的抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば、角化細胞、内皮細胞、星状膠細胞、線維芽細胞、希突起神経膠細胞）を含む。
本明細書に記載の、「免疫反応」なる語は、Ｔ細胞共同刺激の調節により誘導される、Ｔ細胞媒介および／またはＢ細胞媒介免疫反応を含む。典型的な免疫反応は、Ｔ細胞反応、例えばサイトカイン生成および細胞性細胞障害性、を含む。加えて、免疫反応なる語は、例えば、抗体生成（液性免疫）および、サイトカイン反応性細胞、例えばマクロファージの活性化などの、Ｔ細胞活性化により非直接的に効果を受ける免疫反応を含む。
【００２６】
本明細書に記載の、「共同刺激受容体」なる語は、共同刺激シグナルを、免疫細胞、例えばＣＤ２８に伝達する受容体を含む。Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞への共同刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡにより阻害されないシグナル経路を含む。加えて、共同刺激シグナルは、Ｔ細胞におけるサイトカイン（例えばＩＬ−２および／またはＩＬ−１０）の分泌を誘導でき、および／または抗原に対する無反応の誘導、アネルギーの誘導、またはＴ細胞における細胞死の誘導を阻害できる。本明細書に記載の、活性化免疫細胞に関して、「共同刺激」なる語は、共同刺激分子の、増殖またはエフェクター機能を誘導する二次、非活性化受容体介在シグナル化（「共同刺激シグナル」）を提供する能力を誘導する。例えば、共同刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞−受容体介在シグナル化を受け取ったＴ細胞において、サイトカインを分泌できる。例えば活性型受容体を経由した、細胞−受容体介在シグナル化を受け取った免疫細胞を、本明細書では「活性型免疫細胞」という。
【００２７】
本明細書に記載の、「阻害受容体」または「免疫阻害受容体」なる語は、免疫細胞（例えばＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）に阻害シグナルを伝達する受容体を含む。阻害受容体が伝達した阻害シグナルは、たとえ共同刺激受容体（ＣＤ２８など）が免疫細胞上に存在せず、したがって単に、共同刺激分子の結合に対する阻害受容体および共同刺激受容体の間での競合機能ではなくとも、起こりうる（Fallarinoら、１９９８. J. Exp. Med. １８８：２０５）。免疫細胞への阻害シグナルの伝達は、無反応性またはアネルギーまたは免疫細胞におけるプログラム細胞死となりうる。
【００２８】
本明細書に記載の、「ＢＴＦ４受容体」なる語は、ＢＴＦ４分子に結合し、免疫細胞にシグナルを伝達する受容体のことをいう。１つの具体例において、細胞の表面上に発現するＢＴＦ４分子の結合は、ＢＴＦ４受容体へ結合すると、免疫細胞に負のシグナルを伝達する。「Ｂ７−Ｌ１受容体」なる語は、Ｂ７−Ｌ１分子に結合し、免疫細胞にシグナルを伝達する受容体のことをいう。１つの具体例において、細胞の表面上に発現するＢ７−Ｌ１分子の結合は、Ｂ７−Ｌ１受容体へ結合すると、免疫細胞に負のシグナルを伝達する。１つの具体例において、Ｂ７−Ｌ１受容体はＬＤＣＡＭである。
【００２９】
本明細書に記載の、「阻害シグナル」なる語は、免疫細胞上の阻害受容体（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＢＴＦ４受容体またはＢ７−Ｌ１受容体）を経由して伝達されるシグナルのことをいう。かかるシグナルは、活性化受容体を経由して伝達されるシグナル（例えば、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３、Ｂ細胞受容体またはＦｃ分子を経由したシグナル）に拮抗し、例えば：セカンドメッセンジャーの形成の阻害；例えば食細胞の減少、抗体産生の減少、細胞性細胞障害性の減弱、免疫細胞の伝達物質（サイトカイン（例えばＩＬ−２）および／またはアレルギー反応の伝達物質など）の生成不全などの、免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害；またはアネルギーの発達につながりうる。
【００３０】
本明細書に記載の、「活性化受容体」なる語は、抗原、（例えば、ＭＨＣ分子との関連で）複合化抗原に結合するか、または抗体に結合する免疫細胞受容体を含む。かかる活性化受容体は、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体およびＦｃ受容体を含む。
例えば、Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞上に存在し、ＣＤ３分子と結合する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子との関連で抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化物質により）刺激を受ける。Ｔ細胞受容体を経由したＴ細胞活性化により、多くの変化、例えば、蛋白のリン酸化、膜脂質の変化、イオンの流れ、周期性のヌクレオチドの交代、ＲＮＡの転写の変化、蛋白合成の変化、および細胞体積の変化などが起きる。
【００３１】
Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞上に存在する。Ｂ細胞抗原受容体は、膜Ｉｇ（ｍＩｇ）および他の膜貫通ポリペプチド（例えばＩｇαおよびＩｇβ）の間の複合体である。ｍＩｇのシグナル変換機能は、オリゴマーのまたは多量体抗原による受容体分子の交差結合により誘発する。Ｂ細胞はまた、抗免疫グロブリン抗体により活性化できる。Ｂ細胞受容体の活性化に引き続き、チロシンのリン酸化を含む、多くの変化が発生する。
【００３２】
Ｆｃ受容体は、免疫反応に関与する多くの細胞上に見られる。Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）は、免疫グロブリン分子（Ｉｇｓ）のＦｃ部分に対する細胞表面受容体である。現在同定されているヒトＦｃＲｓには、ＩｇＧ（ＦｃγＲを示す）、ＩｇＥ（ＦｃεＲ１）、ＩｇＡ（Ｆｃα）および重合化ＩｇＭ／Ａ（ＦｃμαＲ）を認識するものがある。ＦｃＲｓは、細胞型：ＦｃεＲＩ（肥満細胞）、ＦｃεＲＩＩ（多くの白血球）、ＦｃαＲ（好中球）およびＦｃμαＲ（腺上皮、肝細胞）で見られる（Hogg, N., １９８８, Immun. Today, ９：１８５−８６）。広く研究されたＦｃγＲｓは、細胞性免疫防御の中心であり、炎症の伝達物質の放出および自己免疫疾患の発生機序に関わる加水分解酵素を刺激する原因である（Unkeless, J. C., １９８８, Ann. Rev. Imm., ６：２５ １−８７）。マクロファージ／単球、多形核球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃγＲｓは、ＩｇＧによって媒介される特異的認識の要素を形成するため、ＦｃγＲｓは、エフェクター細胞およびＩｇを分泌するリンパ球の間で重要な結合を提供する。ヒト白血球は、少なくとも３つの異なるＩｇＧに対する受容体：ｈＦｃγＲＩ（単球／マクロファージで見られる）、ｈＦｃγＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、およびおそらくはＢ細胞およびＫ５６２細胞系上）、およびＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球およびマクロファージ上）を有する。
【００３３】
本明細書に記載の、「アネルギー」または「耐性」なる語は、受容体媒介刺激活性化に対する屈折力を含む。かかる屈折力は、一般に、抗原特異的であり、耐性抗原に対する曝露が中止された後も持続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギー（無反応性と対比される）は、サイトカインの生成、例えばＩＬ−２の欠如により特性化される。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、二次シグナル（共同刺激シグナル）の非存在下で、一次シグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３介在シグナル化）を受け取ると発生する。かかる状況下で、細胞の同じ抗原に対する再曝露は（たとえ再曝露が、共同刺激分子の存在下で発生しても）、サイトカインの生成不全、およびそれによって増殖不全に陥る。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、非関連抗原に対する反応を上昇でき、サイトカイン（例えばＩＬ−２）と培養されれば増殖しうる。例えば、Ｔ細胞アネルギーはまた、ＥＬＩＳＡ、またはインジケーター細胞系を使用した増殖アッセイにより測定されるＴリンパ球によるＩＬ−２の生成の欠如により観察できる。また、レポーター遺伝子構造物も使用できる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５´ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの調節下の異種プロモーターにより、またはエンハンサーの中に見いだすことのできるＡＰ１配列のマルチマーにより誘導される、ＩＬ−２遺伝子の転写を開始できない（Kangら、 １９９２.  Science.  ２５７：１１３４）。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を、本明細書において、例えば受容体に対するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の結合により、受容体が作動化される場合に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１に対する受容体を所有する免疫細胞において、直接的または非直接的に誘導される１つまたはそれ以上の細胞性事象として記載する。受容体の作動化は、細胞性変化となるシグナル化事象を開始する。かかる細胞性事象は、例えば、免疫細胞の活性化状態における変化、例えばセカンドメッセンジャーの発生、活性化マーカーの発現、またはエフェクター機能における変化、を測定することによって検知できる。例えば、１つの具体例において、Ｔ細胞活性化は、以下の実施例項にて詳細が記載されるものと同様の試行において、測定できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルは、例えばＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現および／または活性を調節することで、調節できる。
【００３４】
「小分子」なる語は、当該分野の語で、約１０００分子量未満であるか、または約５００分子量未満である分子を含む。１つの具体例において、小分子はペプチド結合だけを排他的に含むわけではない。他の具体例において、小分子はオリゴマーではない。典型的には、活性をスクリーニングできる小分子化合物は、制限するものではないが、ペプチド、ペプチド類似物、核酸、炭水化物、小有機分子（例えばポリケチド）（Caneら、１９９８. Science ２８２：６３）、および天然生成物抽出ライブラリーを含む。他の具体例において、化合物は、小さい有機性非ペプチド化合物である。更なる具体例として、小分子は生合成のものではない。
【００３５】
ＩＩ．ＢＴＦ４およびＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子
種々の物質を用いてＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節することができる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に結合し、受容体を経由したシグナル（例えば、受容体を交差結合することによる）を開始する物質を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させるための物質として使用できる。かかる物質のいくつかの実施例を以下に提供し、詳細を記載する。対照的に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に結合するが、受容体を活性化しない物質は、例えば、結合に対してＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と競合することによるか、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１結合を遮断することによって、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を減少させるための物質として使用できる。かかる物質のいくつかの実施例をまた以下に提供し、詳細を記載する。
【００３６】
Ａ．単離ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子
１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の活性および／または発現を調節するために有効である調節物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはその生物学的に活性のある部分をコードする、単離核酸分子を含む。好ましくは、核酸分子は真核生物のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を、より好ましくはヒトＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１をコードする。１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子は、配列番号：１（ＢＴＦ４）または配列番号：３（Ｂ７−Ｌ１）に示される配列を有する。
本明細書に記載の「核酸分子」なる語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、およびヌクレオチドアナログを使用して生成したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図している。核酸分子は、１本鎖または２本鎖でよいが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００３７】
「単離」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する、他の核酸分子より分離したものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離」なる語は、ゲノムＤＮＡが天然で関連する染色体より分離した核酸分子を含む。好ましくは、「単離」核酸分子には、核酸分子が派生する生物のゲノムＤＮＡ内で、天然において核酸分子の側面に位置する配列（すなわち、核酸の５´および３´末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な具体例において、単離ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子は、核酸が派生する細胞のゲノムＤＮＡ内で、天然において核酸分子の側面に位置する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子には、本質的に、他の細胞性物質、または組換え技術により生成された場合の培養培地を含まず、または本質的に、化学的に合成された場合の化学前駆物質または他の化学物質を含まない。しかしながら、「単離」ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子は、ゲノムＤＮＡ内では通常、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列の側面に位置していない他のヌクレオチド配列に結合されていてもよい（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ヌクレオチド配列は、ベクター配列に結合されていてもよい）。特定の好ましい具体例において、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子にも、他の細胞性物質がない。しかしながら、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子にとって、「単離」と見なされるうえで、他の細胞性物質を含まないことは必要ではない（例えば、他の哺乳類ＤＮＡより分離され、細菌細胞内に挿入されたＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ＤＮＡ分子であっても、「単離」と見なす）。
【００３８】
本発明の核酸分子、例えば配列番号：１（ＢＴＦ４）または配列番号：３（Ｂ７−Ｌ１）、またはその一部を有する核酸分子は、標準化分子生物学技術、および本明細書に記載の配列情報を使用して、単離できる。例えば、配列番号：１または３の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子を、標準化ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離できる（例えば、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning：  A Laboratory Manual. ２nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８９に記載される）。
【００３９】
さらに、配列番号：１または３の全てまたは一部を包含する核酸分子は、配列番号：１または３の各々の配列に基づいて組み立てられた合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離できる。
本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはまたゲノムＤＮＡを、テンプレートまたは適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして用い、標準化ＰＣＲ増幅技術にしたがって増幅できる。十分増幅された核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特性化できる。さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば自動化ＤＮＡシンセサイザーを使用して、標準化合成技術によって調整できる。
【００４０】
好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列を含む。
他の好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部を含む。配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、配列番号：１または３の各々に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズでき、そして安定したニ量体を形成できる程度に、配列番号：１または３の各々に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的であるものである。
【００４１】
さらに他の好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列に対して（例えば、ヌクレオチド配列の全長に対して）、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはより相同であるヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列を、最適化比較目的のために直線化する（例えば、最適化直線化のため、ギャップを一次および二次アミノ酸の１つまたは両方、または核酸配列に導入でき、比較目的のために、非相同配列を無視できる）。好ましい具体例において、比較目的のために直線化された基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、よりさらに好ましくは少なくとも６０％、およびよりさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。対応する位置の残基は、それから比較され、ある配列のある位置が、一方の配列の対応する位置と同じ残基に占められている場合、分子はその位置において同一であるとする。したがって、２つの配列間でのパーセント同一性は、２つの配列に共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同じ位置の数／全ての位置の数  ｘ１００）。２つの配列間でのパーセント同一性は、２つの配列の最適化直線化にとって導入する必要がある、ギャップの数、各ギャップの長さを考慮に入れたうえでの、配列に共有される同一の位置の数の関数である。本明細書に記載の、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である。
【００４３】
配列の比較、および２つの配列間でのパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。好ましい具体例において、２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（http：／／www.gcg.comで入手可能）を使用し、Ｂｌｏｓｕｍ６２基質またはＰＡＭ２５０基質のいずれか、およびギャップ重が１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長重が１、２、３、４、５または６を使用して決定する。さらに他の好ましい具体例において、２つのヌクレオチド配列間でのパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳギャップｄｎａ．ＣＭＰ基質およびギャップ重が４０、５０、６０、７０または８０、および長重が１、２、３、４、５または６を使用して決定する。
【００４４】
本発明の核酸および蛋白配列をさらに「問い合わせ配列」として用いて、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公共データベースに対する検索を行うことができる。かかる検索は、Altschulら、（１９９０） J. Mol. Biol. ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（２．０版）を使用して実行できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得るため、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、言語長＝１２を用いて実行できる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、言語長＝３を用いて行われ、本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白分子に相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的とするギャップ化アラインメントを得るために、Altschulら、（１９９７） Nucleic Acids Res. ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のギャップ化ＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメーター（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を利用できる。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ギャップペナルティーを：実存数１１および拡張１に設定した、デフォルトＢｌａｓｔｎ基質１ないし３を使用して、分析した。本発明のアミノ酸配列は、デフォルト設定：ギャップペナルティーを実存数１１および拡張１に設定した、Ｂｌｏｓｕｍ６２基質を使用して、分析した。例えば、ＮＩＨのウェブページを参照のこと。
【００４５】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１または３の核酸配列の単なる一部、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部分（例えば、受容体結合部分）をコードする断片を含むことができる。１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部分は、天然に生じる蛋白の細胞外領域を含む。この１つの例は、配列番号：２の約アミノ酸１ないし約アミノ酸２４９、または配列番号：４の約アミノ酸１ないし約アミノ酸３２３に対応する部分である。好ましい具体例において、細胞外領域は、配列番号：２のアミノ酸１ないしアミノ酸２４９、または配列番号：４のアミノ酸１ないしアミノ酸３２３を含む。
【００４６】
Ｂ７−Ｌ１蛋白の少なくとも２つの天然に生じる形態が当該分野で知られている。１つは長さが３９８（配列番号：４に記載される）、および１つは４３２のアミノ酸（ＷＯ００／０８０５７；ＷＯ００／０８１５８；ＷＯ００／３２６３３）のものである。これら２つの形態は、２９番目以降で異なり、この部位では長い形態は３４個のアミノ酸の挿入を含む。挿入部以降では、２つの形態は、配列が同一である。本発明の１つの具体例において、本発明の核酸分子は、長い形態のＢ７−Ｌ１の生物学的に活性のある部位（例えば、受容体結合部位）を含む。他の具体例において、本発明の核酸分子は、短い形態のＢ７−Ｌ１の生物学的に活性のある部位（例えば、受容体結合部位）を含む。１つの具体例において、Ｂ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部位は、天然に生じる蛋白の細胞外領域を含む。
【００４７】
「ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部位」をコードする核酸断片は、配列番号：１または３のヌクレオチド配列の一部、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１各々の生物学的活性（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的活性は、本明細書にて記載される）を有するポリペプチドをコードする、他のヌクレオチド配列の一部を単離することで調製でき、（例えば、インビトロでの組換え発現により）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白のコードされた部分を発現し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白のコードされた部分の活性を評価する。
【００４８】
遺伝暗号の変性のために配列番号：１または３とは異なり、このため配列番号：１または２によりコードされる同じＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする核酸分子もまた、本発明に包含される。したがって、他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるアミノ酸配列、または本明細書に記載される、その生物学的に活性のある部分を有する蛋白をコードするヌクレオチド配列を有する。他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００４９】
さらに、他のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ファミリーメンバーをコードし、このため配列番号：１または３のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ファミリー配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に含まれることを意図する。例えば、他のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ｃＤＮＡは、ヒトＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のヌクレオチド配列に基づいて同定できる。このように、（例えば、受容体結合部分および／または細胞外部分に対応する）他のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ファミリーメンバーの生物学的に活性のある部分はまた、本発明の範囲内に含まれる。さらに、異種由来のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードし、このため配列番号：１または３のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に含まれることを意図する。このように、（例えば、受容体結合部分および／または細胞外部分に対応する）他のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１種の生物学的に活性のある部分はまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００５０】
加えて、先に記載されるように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子またはｃＤＮＡの天然対立変種およびホモログの、生物学的に活性のある部位はまた、本発明の範囲内に含まれることを意図する。本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ｃＤＮＡの天然対立変種およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書で開示されるｃＤＮＡｓまたはその一部を、標準化ハイブリダイゼーション技術にしたがってハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書で開示されるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸に対する相同性に基づいて、単離できる。１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１をコードする核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３に示される配列の相補体であるヌクレオチド配列を含む核酸分子に対して、全長にわたってハイブリダイズする。他の具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１をコードする核酸分子は、Ｂ７−Ｌ１またはＢＴＦ４の細胞外領域をコードする、配列番号：１または配列番号：３の一部の相補体であるヌクレオチド配列を含む核酸分子の一部に対して、ハイブリダイズする。
【００５１】
例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ＤＮＡは、配列番号：１または３の全てまたは一部を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用し、および（例えば、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning：  A Laboratory Manual. ２nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, １９８９に記載されるように）標準化ハイブリダイゼーション技術を使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーより単離できる。さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の全てまたは一部を包含する核酸分子は、配列番号：１または３の配列に基づいて組み立てられたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単離できる。例えば、（例えば、Chirgwinら、（１９７９） Biochemistry １８：５２９４−５２９９の、グアニジン−チオシアン酸抽出操作により）ｍＲＮＡは細胞より単離でき、ｃＤＮＡは逆転写酵素（例えば、Gibco／BRL, Bethesda, MDより入手可能であるMoloney MLV 逆転写酵素；または、Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FLより入手可能であるAMV 逆転写酵素）を使用して調整できる。ＰＣＲ増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列に基づいて組み立てることができる。本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡまたは代わりにゲノムＤＮＡを、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用し、標準化ＰＣＲ増幅技術にしたがって増幅できる。十分増幅された核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特性化できる。さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば自動化ＤＮＡシンセサイザーを使用して、標準化合成技術によって、調整できる。
【００５２】
他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、長さが少なくとも４００（例えば４２９）、４５０、５００または５５０、またはそれ以上のヌクレオチドで、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１または３のヌクレオチド配列、または先に記載した生物学的に活性のあるその一部をコードするその断片を含む、核酸分子にハイブリダイズする。他の具体例において、核酸分子は、長さが少なくとも６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００（例えば９０９）または９５０、またはそれ以上のヌクレオチドである。
【００５３】
本明細書に記載の、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」なる語は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％相同であるヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよびウォッシュの条件を記載することを意図する。かかるストリンジェントな条件は、当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.（１９８９）, ６.３.１−６.３.６において見ることができる。好ましい、緊縮ハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションであり、５０ないし６５℃の０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれ以上のウォッシュが続く。好ましくは、配列番号：１または３の配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、本発明の単離核酸分子は、天然に生じる核酸分子に対応する。
本明細書に記載の、「遺伝子」および「組換え遺伝子」なる語は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、好ましくは哺乳類ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードするオープン・リーディング・フレームを含み、さらに非コード調節配列およびイントロンを含むことができる核酸分子のことをいう。
【００５４】
本明細書に記載の、「天然に生じる」核酸分子とは、天然に生じる（例えば、天然蛋白をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことをいう。配列番号：１または３に示されるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ヌクレオチド配列に加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列における微小変化につながるＤＮＡ配列の多様性は、母集団（例えば、ヒト母集団）の中に存在するだろうということは、当業者に認識されるべきである。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子におけるかかる遺伝的多様性は、天然対立変異のため母集団内の個体に存在するだろう。かかる天然対立変異は、機能性および非機能性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白を両方含み、典型的には、遺伝子のヌクレオチド配列において、１ないし５％の変異となる。かかるヌクレオチド変異、および天然対立変異の結果であり、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子におけるアミノ酸の多様性は、本発明の範囲内に含まれる。天然対立変種より生成する核酸を、遺伝子または指令の対立変異体という。かかる核酸がコードするポリペプチドを蛋白の対立変種という。
【００５５】
母集団内に存在するだろうＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列の、天然に生じる対立変種に加えて、当業者はさらに、例えば配列番号：１または３のヌクレオチド配列内への突然変異が起き、それによりＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の機能的活性を変化させることなく、コードした蛋白のアミノ酸配列における変化につながることで、微小変化が導入される可能性のあることを認識するだろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸の置換につながるヌクレオチド置換は、配列番号：１または３の配列内で起きうる。「非必須」アミン酸残基は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子の機能的活性を変化することなく、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子の野生型配列（例えば、配列番号：１または３の配列）より変化できる残基である。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の受容体への結合に必要であると分かったＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の細胞外領域における残基（例えば、アラニンスキャンニング突然変異誘発性スクリーニングまたは他の認識されたスクリーニングアッセイ技術を使用して同定される）は変化しないことが好ましい。必須でなく、そのため置換を受けやすいＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の典型的な残基は、Ｂ７ファミリーメンバーのアミノ酸直線化を実行、および保存されていない残基を決定することで、当該分野の一般的な技術の１つにより同定できる。かかる残基は、保存されていないため、置換をより受けやすい。
【００５６】
したがって、本発明の他の態様は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性には必須でないアミノ酸残基における変化を含む、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする核酸分子に関する。かかるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、配列番号：１または３とはアミノ酸配列が異なるが、固有の活性は保持する。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の非天然変種をコードする単離核酸分子は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がコード蛋白に導入されるように、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を、配列番号：１または３のヌクレオチド配列に導入することで、生成できる。突然変異は、配列番号：１または３に、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準化技術により、導入できる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基において起きる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めて、当該分野で定義されている。このように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換されている。
【００５７】
また、もう一つ別の具体例において、変異は、例えば飽和変異誘発によってＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コード化配列全体または一部に沿って無作為に導入され得、得られた変異体をＤＮＡとの結合能および／または転写の活性化能についてスクリーンし、機能的活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１変異体蛋白を、組換え的に宿主細胞内に発現でき、変異蛋白の機能的活性は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性を評価するための技術において入手可能であるアッセイを使用して決定できる。
したがって、本発明の他の態様は、活性には必須でないアミノ酸残基における変化を含む、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする核酸分子に関する。
【００５８】
本発明のさらに他の態様は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白をコードする単離核酸分子に関する。非ＢＴＦ４または非Ｂ７−Ｌ１蛋白（異種）、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に、作動可能に連結した、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を少なくとも含む、かかる核酸分子は、標準的組換えＤＮＡ技術により調製できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白は、さらに後で記載される。
【００５９】
先に記載したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする核酸分子に加えて、それのアンチセンス鎖である単離核酸分子は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節に効果を与える調節物質として使用できる。「アンチセンス」核酸は、例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、またはｍＲＮＡ配列に相補的である、蛋白をコードする「センス」核酸に相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コード鎖の全て、またはその一部だけに相補的となれる。１つの具体例において、アンチセンス核酸分子は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード化領域」に対するアンチセンス鎖である。「コード化領域」なる語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含めたヌクレオチド配列の領域をいう。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンス鎖である。「非コード化領域」なる語は、アミノ酸に翻訳されないコード化領域の側面に位置する５´および３´配列のことをいう（すなわち、５´および３´非翻訳領域ともいう）。
【００６０】
本明細書で開示されるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１をコードするコード鎖配列が与えられると、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対の法則にしたがって、組み立てることができる。アンチセンス核酸分子は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ｍＲＮＡのコード化領域の全てに相補的でありうるが、より好ましくはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ｍＲＮＡのコードまたは非コード化領域の一部だけのアンチセンス鎖であるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲にある領域に相補的でありうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチドでありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で知られている操作を使用して、化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して、組み立てることができる。例えば、アンチセンス核酸分子（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、または例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用できるのだが、分子の生物学的安定性を増加するよう、またはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成されたニ量体の物理的安定性を増加するよう組み立てられた、多様に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成できる。アンチセンス核酸を生成するために使用できる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロルウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオジン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオジン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンタニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキサミン、偽ウラシル、クエオジン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、を含む。また、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向性にサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成できる（すなわち、挿入された核酸より転写されるＲＮＡは、以下の小節でさらに記載される、該標的核酸に対してアンチセンス配向性である）。
【００６１】
アンチセンス核酸分子は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現を阻害するだろう、そしてこのためＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害するだろう。かかる阻害は、免疫細胞による免疫反応のアップレギュレーション、このためアンチセンス核酸分子が投与された個体における免疫反応のアップレギュレーションにつながる。
【００６２】
本発明のアンチセンス核酸分子を、典型的に対象に投与するか、または、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合させ、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、蛋白の発現を阻害するように、インサイチュにおいて生成する。ハイブリダイゼーションは、安定したニ量体を形成する従来のヌクレオチド相補性により、または、例えばＤＮＡニ量体に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせん構造の大きな溝における特異的相互作用を通してできる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接注入を含む。また、アンチセンス核酸分子は、選択細胞を標的とし、そして全身性に投与するよう修飾できる。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することにより、選択細胞表面上で発現する受容体または抗原に特異的に結合するように修飾できる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを使用して、細胞に投与できる。アンチセンス分子の細胞内濃度を十分にするため、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置かれるベクター構造物が好ましい。
【００６３】
さらに他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、特異的な二本鎖ハイブリッドと共に、通常のβ−ユニットに反して、鎖が互いに平行して走る相補性ＲＮＡを形成する（Gaultierら、（１９８７） Nucleic Acids. Res. １５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２´−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら、（１９８７） Nucleic Acids Res. １５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoueら、（１９８７） FEBS Lett. ２１５：３２７−３３０） を含むことができる。
【００６４】
さらに他の具体例において、アンチセンス核酸分子はリボゾームである。リボゾームは、相補的な領域を有する、ｍＲＮＡなどの１本鎖核酸分子を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。このように、リボザイム（例えば、槌状リボザイム（HaseloffおよびGerlach（１９８８） Nature ３３４：５８５−５９１に記載される））は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡ転写物を触媒性に切断し、そしてＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コード核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書で開示されるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号：１または３）に基づいて組み立てることができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コードｍＲＮＡにおいて、切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を組み立てることができる。例えば、Cechら、米国特許第４９８７０７１号；およびCechら、米国特許第５１１６７４２号を参考のこと。また、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡは、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを、ＲＮＡ分子のプールより選択する際に使用できる。例えば、Bartel, D.およびSzostak, J. W.（１９９３） Science ２６１：１４１１−１４１８を参考のこと。
【００６５】
別法として、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子発現は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の調節領域（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的であるヌクレオチド配列を標的とし、標的細胞内のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の転写を抑制する三重らせん構造を形成することで阻害できる。一般には、Helene, C.（１９９１） Anticancer Drug Des. ６（６）：５６９−８４；Helene, C.ら、（１９９２） Ann. N.Y. Acad. Sci. ６６０：２７−３６；およびMaher, L. J.（１９９２） Bioessays １４（１２）：８０７−１５を参考のこと。
【００６６】
他の具体例において、ＲＮＡｉを促進する化合物は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現を阻害するために使用できる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、ｄｓＲＮＡと同じ配列を有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を減少させるために使用する、転写後、標的化遺伝子抑制技術である（Sharp, P.A.およびZamore, P.D. ２８７, ２４３１−２４３２（２０００）；Zamore, P.D.ら、Cell １０１, ２５−３３（２０００）；Tuschl, T.ら、Genes Dev. １３, ３１９１−３１９７（１９９９））。この過程は、内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを、小干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる、より短い、２１または２２ヌクレオチドの長さのＲＮＡに切断する場合に、生じる。それから小ＲＮＡ区域は、標的ｍＲＮＡの減成を媒介する。ＲＮＡｉの合成に用いるキットは、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎより市販されている。
【００６７】
さらに他の具体例において、本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子は、塩基性部分、糖成分、またはリン酸骨格において、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するために、修飾できる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成させるために修飾できる（Hyrup, B.およびNielsen, P. E.（１９９６） Bioorg. Med. Chem. ４（１）：５−２３を参考のこと）。本明細書に記載の、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」なる語は、例えば、デオキシリボースリン酸骨格が、偽ペプチド骨格により置換され、４つのヌクレオ塩基だけが保持されている、ＤＮＡの擬態などの、核酸の擬態のことをいう。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下での、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とするために、示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、HyrupおよびNielsen（１９９６）前掲およびPerry−O'Keefeら、（１９９６） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：１４６７０−６７５に記載される標準化固相ペプチド合成プロトコルを使用して実行できる。
【００６８】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子のＰＮＡは、治療上および診断上の適用において使用できる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止を誘導することにより、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節に用いるアンチセンスまたは抗遺伝子物質として使用できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子のＰＮＡはまた；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレア−ゼ（HyrupおよびNielsen（１９９６）前掲））と組み合わせて使用する場合には「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ配列解析またはハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして（Hyrup B.およびNielsen（１９９６）前掲；Perry−O'Keefeら、（１９９６）前掲）、（例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングにより）遺伝子内の単一塩基対変異の分析において使用できる。
【００６９】
他の具体例において、（例えば、安定性または細胞性取り込みを増強させるために）脂肪親和性または他の補助群をＰＮＡに付加することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームまたは当該分野で知られている薬剤デリバリーの他の技術によって、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のＰＮＡは修飾できる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を併せ持つだろう、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、生成できる。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供することで、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能とする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基の数量、ヌクレオ核酸の間の結合の数、および配向性に鑑みて選択される、適切な長さのリンカーを使用して結合できる（Hyrup B.およびNielsen（１９９６）前掲）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup B.およびNielsen（１９９６）前掲およびFinn P. J.ら、（１９９６） Nucleic Acids Res. ２４（１７）：３３５７−６３に記載されるように実行できる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準化ホスホラミドン酸カップリング化学を使用して、固体補助により合成できる。修飾ヌクレオシドアナログ（例えば、５´−（４−メトキシトリチル）アミノ−５´−デオキシ−チミジンホスホラミドン酸）は、ＰＮＡおよびＤＮＡの５´末端の間でのリンカーとして使用できる（Mag, M.ら、（１９８９） Nucleic Acid Res. １７：５９７３−８８）。また、キメラ分子は、５´ＤＮＡ区域および３´ＰＮＡ区域と一緒に合成できる（Peterser, K. H.ら、（１９７５） Bioorganic Med. Chem. Lett. ５：１１１９−１１１２４）。
【００７０】
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、（例えば、インビボでの宿主細胞受容体の標的化に用いる）ペプチド、または細胞膜を横切る輸送を促進する物質（例えばLetsingerら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：６５５３−６５５６；Lemaitreら、（１９８７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参考のこと）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参考のこと）などの他の付加群を含んでよい。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断物質（例えば、Krolら、（１９８８） Biotechniques ６：９５８−９７６を参考のこと）または介在物質（例えば、Zon（１９８８） Pharm. Res. ５：５３９−５４９を参考のこと）と一緒に修飾できる。すなわち、オリゴヌクレオチドは他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発交差結合物質、輸送物質、またはハイブリダイゼーション誘発切断物質）に接合できる。
【００７１】
Ｂ．ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を認識する単離ポリペプチドおよび抗体
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させるために有効である典型的な物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部位である。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１は、ＢＴＦ４受容体またはＢ７−Ｌ１受容体に結合し、受容体を経由してシグナルを伝達する能力を有する。一般的に、受容体の活性化は、受容体の交差結合を必要とする。このように、好ましくは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の活性形態は多価性である。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体を発現する細胞と接触された場合、多価形態は、受容体を経由してシグナルを伝達するために受容体に結合し、交差結合する。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の活性形態は、例えば可溶性であるか、または固体または半固体基質に結合した分子の一価形態であろう。
【００７２】
本発明の１つ以上の具体例において、不溶性基質の表面上にあるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子を固定化することが望ましい。かかる固体または半固体基質の例は、排他的ではないが、ポリプロピレン、ポリスチレン、セファロース、およびアガロースなどの物質のいずれかを含み、ミクロビーズまたは細胞培養ウェルなどの形成物に成型される。（例えば、脂質二重層を含む）細胞または細胞様表面、または形成物に成型される基質様のいずれのゲルも包含される。
１つの具体例において、基質に結合される蛋白を許容する領域を加える融合蛋白を提供できる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合蛋白は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸収できる。
【００７３】
基質上に蛋白を固定するためのほかの技術もまた、本発明において使用できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１は、ビオチンおよびストレプトアビジンの接合を利用して固定できる。ビオチル化ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または標的分子は、当該分野でよく知られている技術（例えば、ビオチル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド）より調製でき、ストレプトアビジン加工９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定できる。また、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、その標的分子に対する結合に干渉しない、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に反応性の抗体または標的分子は、プレートのウェルに誘導体化でき、非結合標的またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、抗体接合によりウェル内に捕獲できる。かかる複合体を検出する方法は、ＧＳＴ固定化複合体用の先に記載のものに加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に反応性の抗体を使用した免疫検出法、ならびにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または標的分子に関連する酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイを含む。
【００７４】
１つの具体例において、天然ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、標準化蛋白精製技術を使用して、適切な精製スキームによって、細胞または組織源より単離できる。他の具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白を、組換えＤＮＡ技術により生成する。組換え発現の代わりとして、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはポリペプチドは、標準化ペプチド合成技術を使用して、化学的に合成できる
【００７５】
蛋白を基質に固定するための他の技術はまた、本発明において使用できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１は、ビオチンおよびストレプトアビジンの接合を利用して固定できる。ビオチル化ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または標的分子は、当該分野でよく知られている技術（例えば、ビオチル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド）より調製でき、ストレプトアビジン加工９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定できる。また、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、その標的分子に対する結合に干渉しない、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に反応性の抗体または標的分子は、プレートのウェルに誘導体化でき、非結合標的またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、抗体接合によりウェル内に捕獲できる。かかる複合体を検出する方法は、ＧＳＴ固定化複合体用の先に記載のものに加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に反応性の抗体を使用した免疫検出法、ならびにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または標的分子に関連する酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイを含む。
【００７６】
１つの具体例において、単離ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、各々配列番号：２または４によりコードされるアミノ酸配列、またはその生物学的活性断片を含む。他の好ましい具体例において、蛋白は、ＢＴＦ４分子の細胞外部分である、配列番号：２のアミノ酸１ないし２４９のアミノ酸配列を含むか、またはＢ７−Ｌ１分子の細胞外部分である、配列番号：４のアミノ酸１ないし３５７のアミノ酸配列を含む。他の具体例において、蛋白は、配列番号：２または配列番号：４に示されるアミノ酸配列、または配列番号：２のアミノ酸１ないし１４３、または配列番号：４のアミノ酸１ないし３５７と、少なくとも５０％、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、さらに好ましくは７０％のアミノ酸同一性、さらに好ましくは８０％、およびよりさらに好ましくは９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００７７】
先に記載のように、本発明はさらに可溶形態のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に関する。かかる形態は、例えば配列番号：２に示されるように、天然に生じることができるか、または操作して、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の細胞外領域を含むか構成することができる。１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの細胞外領域は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの成熟形態を含むが、膜貫通および細胞質領域は含まない。受容体に交差結合するのに十分である程度に多価性である、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の可溶形態、またはその受容体結合部分はまた、活性形態であると考えられる。単量でこのため活性化を起こすのに十分に受容体に交差結合できないＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の可溶形態、またはその受容体結合部分は、天然に生じるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と結合する受容体に競合するために使用され、このようにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の阻害剤として役立つ。
【００７８】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部分は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の全長より少数のアミノ酸を含み、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の少なくとも１つの活性、好ましくは中性受容体に結合する能力を示す、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白のアミノ酸配列に、十分に相同であるかまたはそこから派生するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性のある部分は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の少なくとも１つの活性を有する領域またはモチーフを含む。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部分は、例えば長さが少なくとも約１００、１５０、２００またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドでありえる。
【００７９】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを増加させるために有効な他の型の物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の作動薬である。作動薬は、例えば、天然に生じる蛋白の機能性変種、擬態物またはペプチド類似物、または小分子（例えば、１０ｋＤａ未満）であろう。好ましくは、作動薬は、調節効果に必要とされるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の活性を示す（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１がシグナルを活性化するのと類似の様式でＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１免疫抑制受容体に結合する）。例えば、可溶形態における作動薬は多価であろう。また、作動薬は、固体または半固体基質に結合するか、受容体交差結合および活性化を促進するのに十分な数で、細胞の表面上に発現していてよい。
【００８０】
作動薬として役立つＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の変種は、変異誘発（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の切断）により生成できる。作動薬として役立つＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の変種は、本質的に同じであるか、または亜群の、天然に生じる形態のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、免疫細胞の活性化を阻害する生物学的活性を保持していなければならない。制限された機能の変種で処理することにより特異的な生物学的効果を誘発するために、天然に生じる形態のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的活性の亜群のみを保持する変種を使用することは有利である。１つの具体例において、対象を、天然に生じる形態の蛋白の、生物学的活性の亜群を有する変種で処理することは、天然に生じる形態のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白で処理することと比較して、副作用がより少ない。拮抗薬として作用する変種もまた作成できる。
【００８１】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の変種は、所望の活性のためのＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、切断変異体などの、変異体のコンビナトリアルライブラリー（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の作動薬または拮抗薬）のスクリーニングにより同定できる。１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１変種の多様なライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により生成し、多様な遺伝子ライブラリーによりコードする。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１変種の多様なライブラリーは、潜在性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列の変性セットが個体のポリペプチドとして、またはまた、その中にＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列のセットを含む、（例えば、ファージ表示に用いる）より大きい融合蛋白のセットとして発現できるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列内に酵素的にライゲートすることにより、生成できる。変性オリゴヌクレオチド配列より、潜在性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１変種のライブラリーを生成するために使用できる多様な方法がある。変性遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡシンセサイザーで実行でき、合成遺伝子はそれから適切な発現ベクターにライゲートできる。遺伝子の変性セットの使用は、１つの混合物において、潜在性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列の所望のセットをコードする全ての配列を供給することを必要とする。変性オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野で知られている（例えば、Narang, S. A.（１９８３） Tetrahedron ３９：３；Itakuraら、（１９８４） Annu. Rev. Biochem. ５３：３２３；Itakuraら、（１９８４） Science １９８：１０５６；Ikeら、（１９８３） Nucleic Acid Res. １１：４７７を参考のこと）。
【００８２】
Ｂ．融合蛋白
作動薬または拮抗薬の他の形態は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１より派生する融合蛋白またはキメラ蛋白、またはその変種の断片である。本明細書に記載の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチド、断片、または非ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドに作動可能に連結したその機能性変種を含む。「ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチド」は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、しかし「非ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチド」は、本質的にＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に相同でない蛋白、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白とは異なり、同じかまたは異なる生物より派生する蛋白に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の全てまたは一部に対応することができる。好ましい具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的に活性のある部分、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の細胞外領域を少なくとも１つ含む。融合蛋白において、「作動可能に連結した」なる語は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチド、および非ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドが、互いにフレーム単位で融合されることを示すよう意図する。非ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合できる。
【００８３】
例えば、１つの具体例において、融合蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１アミノ酸配列（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子の細胞外領域）が、抗体分子のＦｃ領域に融合される融合蛋白である。他の具体例において、融合蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１アミノ酸配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ−Ｂ７−４またはＧＳＴ−ＰＤ−１融合蛋白である。他の具体例において、融合蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列がインフルエンザ赤血球凝集素エピトープタグにフレーム単位で融合されるように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ヌクレオチド配列を、ｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Herrscher, R. F.ら、（１９９５） Genes Dev. ９：３０６７−３０８２）などのベクターに挿入する、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１−ＨＡ融合蛋白である。かかる融合蛋白は、組換えＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の精製を促進できる。
【００８４】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１のペプチドの溶解度、親和性、安定性または原子価を変える部分、例えば免疫グロブリン定常部領域に対応する第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え発現により生成できる。好ましくは、第１のペプチドは、免疫反応を調節するのに十分である配列番号：２または４に示される配列の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの一部（例えば、シグナル配列の切断の後の部分）より成立する。第２のペプチドは、免疫グロブリンの定常部領域、例えば、ヒトＣγ１領域またはＣγ４領域（例えば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４の、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、例えばCaponら、米国特許第５,１１６,９６４号；第５,５８０,７５６号；第５,８４４,０９５号およびその同様を参考のこと；ただしその内容は出典を明示することで本明細書の一部とする）を含みうる。生じる融合蛋白は、変化したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１溶解度、結合親和性、安定性および／または原子価（すなわち、１分子当たりで有効な結合部分の数）を有し、蛋白精製の効率を上げるだろう。組換え技術により生成される融合蛋白およびペプチドは、細胞の混合物および蛋白またはペプチドを含む培地より、分泌または単離できる。また、蛋白またはペプチドは細胞質に保持でき、細胞は採取、溶解でき、蛋白は単離できる。細胞培養は、典型的には、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野においてよく知られている。蛋白およびペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞または両方より、蛋白およびペプチドを生成するための当該分野で知られている技術を使用して、単離できる。宿主細胞をトランスフェクションする技術および、蛋白およびペプチドを精製するための技術は、当該分野で知られている。
【００８５】
特に好ましいＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１Ｉｇ融合蛋白は、免疫グロブリンの定常部領域（例えば、Ｆｃ領域）に結合されたヒトＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の細胞外部分または可変部領域様領域を含む。ＢＴＦ４−ＦｃおよびＢ７−Ｌ１−Ｆｃ融合蛋白の典型的な具体例のアミノ酸配列は、配列番号：５および６各々に示される。かかる融合蛋白は、ニ価であり、そのため可溶形態で、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に交差結合する能力を有する。融合蛋白の他の具体例は、一価であり、このため可溶形態でＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１に交差結合する能力を欠くが、しかしながら、例えば固体または半固体基質への交差結合、または細胞の表面上での発現を通した、多価単位を形成する一価融合蛋白の結合はまた、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１各々の融合蛋白の活性形態となるだろう。免疫グロブリンの定常部領域は、免疫グロブリン構造特有のエフェクター活性を減少または除去する遺伝的修飾を含んでよい。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの細胞外部分をコードするＤＮＡは、例えば、ＷＯ９７／２８２６７に示されるように、部位特異的突然変異誘発により修飾されるヒトＩｇＧγ１および／またはＩｇＧγ４の、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合できる。
【００８６】
好ましくは、本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白は、標準的組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えばライゲーションのための鈍端の、またはねじれ端の末端の利用、適切な末端を提供する制限酵素消化、適切な粘着性末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションなどの、従来の技術に応じて一緒にフレーム単位でライゲートする。他の具体例において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術により合成できる。また、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を発生させるために後でアニーリングおよび再増幅できる２つの連続する遺伝子断片の間で、相補的突出部を発生させるアンカープライマーを使用して実行できる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubelら、John Wiley & Sons： １９９２を参考のこと）。さらに、すでに融合部分をコードする多くの発現ベクターは、市販される（例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コード核酸は、融合部分がＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白にフレーム単位で結合するように、かかる発現ベクターにクローニングできる。
【００８７】
他の具体例において、融合蛋白は、Ｎ末端において異種のシグナル配列を含むＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現および／または分泌は、異種のシグナル配列の使用を通して増加できる。
本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白を医薬組成物に配合し、インビボで対象に投与できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白の活性形態の使用は、治療上、免疫学的疾患、例えば自己免疫疾患の治療に対して、または移植の拒絶反応を阻害する場合に有効である。本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１融合蛋白の可溶形態または交差結合形態は、対象において抗ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１抗体を生成するための免疫原として、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を生成するために、およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１とその受容体の相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、使用できる。
【００８８】
好ましくは、本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１キメラまたは融合蛋白は、標準的組換えＤＮＡ技術により生成する。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えばライゲーションのための鈍端の、またはねじれ端の末端の利用、適切な末端を提供する制限酵素消化、適切な粘着性末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションなどの、従来の技術に応じて一緒にフレーム単位でライゲートする。他の具体例において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術により合成できる。また、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を発生させるために後でアニーリングおよび再増幅できる２つの連続する遺伝子断片の間で、相補的突出部を発生させるアンカープライマーを使用して実行できる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubelら、John Wiley & Sons： １９９２を参考のこと）。さらに、すでに融合部分をコードする多くの発現ベクターは、市販される（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コード核酸は、融合部分がＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白にフレーム単位で結合するように、かかる発現ベクターにクローニングできる。
【００８９】
Ｃ．抗体
特異的にＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１に結合し、受容体結合を抑制する抗体はまた、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の作動薬として役立つ。かかる抗体の生成は、一般の当業者の能力において行える。本明細書に記載の、「抗体」なる語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリンの免疫学的に活性のある部分、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ´）２断片、１本鎖の抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｄまたは他の断片などの抗体に結合する（免疫反応する）抗体結合部位を含む分子を含む。好ましくは、抗体は、特異的または本質的に特異的に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子に結合する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルである。本明細書に記載の、「モノクローナル抗体」なる語は、抗原の特有のエピトープに免疫反応できる抗原結合部位の１つの種のみ含む抗体分子の集団をいうが、しかし「ポリクローナル抗体」なる語は、特有の抗原と相互作用できる抗原結合部位の多くの種を含む抗体分子の集団をいう。
【００９０】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に結合し、交差結合し、そして受容体を活性化させる抗体はまた、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加する物質として役立つ。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に結合し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１結合を抑制するが、受容体を活性化しない抗体は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害する物質として使用できる。かかる抗体の生成は、一般の当業者の能力において行える。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の活性化は、例えば、以下の実施例項において記載される型のように、Ｔ細胞活性化アッセイにおける共同刺激の阻害によりアッセイできる。
【００９１】
標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成できる、ヒトおよび非ヒト部分を両方含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの、組換え抗ＢＴＦ４、抗Ｂ７−Ｌ１、抗ＢＴＦ４受容体および抗Ｂ７−Ｌ１受容体抗体の使用はまた、本発明の範囲内である。例えば、Robinsonら、国際特許公開ＰＣＴ／US８６／０２２６９；Akiraら、欧州特許出願１８４,１８７；Taniguchi, M.、欧州特許出願１７１,４９６；Morrisonら、欧州特許出願１７３,４９４；Neubergerら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabillyら、米国特許第４,８１６,５６７号；Cabillyら、欧州特許出願１２５,０２３；Betterら、（１９８８） Science ２４０：１０４１−１０４３；Liuら、（１９８７） PNAS ８４：３４３９−３４４３；Liuら、（１９８７） J. Immunol. １３９：３５２１−３５２６；Sunら、（１９８７） PNAS ８４：２１４−２１８；Nishimuraら、（１９８７） Canc. Res. ４７：９９９−１００５；Woodら、（１９８５） Nature ３１４：４４６−４４９；およびShawら、（１９８８） J. Natl Cancer Inst. ８０：１５５３−１５５９）；Morrison,  S. L.（１９８５） Science ２２９：１２０２−１２０７；Oiら、（１９８６） BioTechniques ４：２１４；Winter 米国特許 ５,２２５,５３９；Jonesら、（１９８６） Nature ３２１：５５２−５２５；Verhoeyanら、（１９８８） Science ２３９：１５３４；およびBeidlerら、（１９８８） J. Immunol. １４１：４０５３−４０６０に記載される方法を使用して、かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で知られている組換えＤＮＡ技術により生成できる。
【００９２】
加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１、またはこれらに反応性の受容体に結合するヒト化抗体は、米国特許第５,５６５,３３２号において開示されるような標準的プロトコールにしたがって作成できる。他の具体例において、抗体鎖または特異的に結合する対のメンバーは、（例えば米国特許第５,５６５,３３２号、第５,８７１,９０７号または第５,７３３,７４３号に記載されるような）当該分野で知られている技術を使用して、特異的に結合する対のメンバーのポリペプチド鎖、および複製可能な遺伝的開示パッケージの成分の融合体をコードする核酸分子を含むベクター、および単一の結合する対のメンバーの第２ポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間での組換えにより生成できる。細胞内で蛋白の機能を阻害する細胞内抗体の使用はまた、当該分野で知られている（例えば、Carlson, J. R.（１９８８） Mol. Cell. Biol. ８：２６３８−２６４６；Biocca, S.ら、（１９９０） EMBO J. ９：１０１−１０８；Werge, T.M.ら、（１９９０） FEBS Letters ２７４：１９３−１９８；Carlson, J.R.（１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：７４２７−７４２８；Marasco, W.A.ら、（１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：７８８９−７８９３；Biocca, S.ら、（１９９４） Bio／Technology １２：３９６−３９９；Chen, S−Y.ら、（１９９４） Human Gene Therapy ５：５９５−６０１；Duan, Lら、（１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：５０７５−５０７９；Chen, S−Y.ら、（１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：５９３２−５９３６；Beerli, R.R.ら、（１９９４） J. Biol. Chem. ２６９：２３９３１−２３９３６；Beerli, R.R.ら、（１９９４） Biochem. Biophys. Res. Commun. ２０４：６６６−６７２；Mhashilkar, A.M.ら、（１９９５） EMBO J. １４：１５４２−１５５１；Richardson, J.H.ら、（１９９５） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９２：３１３７−３１４１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６１０ Marascoらによる；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０３８３２ Duanらによる、を参考のこと）。
【００９３】
完全なヒト化抗体はまた、当該分野で知られている技術を使用して作成できる。例えば、トランスジェニックマウスは、標準方法を使用して、例えばHoganら、"Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory、ただし出典を明示することで本明細書の一部とする、にしたがって作成できるか、市販で購入できる。胚幹細胞は、公表の手順（奇形癌および胚幹細胞：実用方法, Robertson, E. J. ed., IRL Press, Washington, D.C., １９８７；Zjilstraら、（１９８９） Nature ３４２：４３５−４３８；およびSchwartzbergら、（１９８９） Science ２４６：７９９−８０３、各々は出典を明示することで本明細書の一部とする）によって操作する。トランスジェニックマウスは、精製または組換えＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の細胞外領域の少なくとも免疫原の部分を含む融合蛋白を使用して、免疫化できる。抗体反応性は、標準方法を使用して測定できる。
【００９４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりとして、抗ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１抗体（抗体の一本鎖Ｆｖ様部分）は、Ｍ１３バクテリオファージ（Winterら、１９９４ Annu. Rev. Immunol. １９９４ １２：４３３；Hoogenboomら、１９９８, Immunotechnology ４： １）で開示されるヒト免疫グロブリン配列のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、同定および単離できる。ＢＴＦ４ＦｃまたはＢ７−Ｌ１Ｆｃは、このようにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離するために、使用できる。ファージ開示ライブラリーを発生およびスクリーニングするためのキットは市販されており、標準方法は、ｓｃＦｖを発生させるため使用されるだろう（Helfrichら、J. Immunol Methods ２０００.  ２３７： １３１−４５；Cardosoら、Scand J. Immunol ２０００. ５１： ３３７−４４）。
【００９５】
他の具体例において、リボソーム開示は、開示プラットフォームとしてバクテリオファージを置換するために使用できる（例えば、Hanesら、 ２０００.  Nat. Biotechnol.  １８：１２８７；Wilsonら、 ２００１.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９８：３７５０；または Irvingら、２００１  J. Immunol. Methods  ２４８：３１）。さらに他の具体例において、細胞表面ライブラリーは、抗体をスクリーニングできる（Boderら、 ２０００.  Proc. Natl. Acad. Sci.  USA  ９７：１０７０１；Daughertyら、 ２０００ J. Immunol. Methods ２４３：２１１）。かかる手順は、モノクローナル抗体の単離およびそれに続くクローニングのための従来のハイブリドーマ技術の代わりを提供する。
【００９６】
Ｄ．ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の追加調節因子
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の追加調節因子もまた同定できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白コード配列の断片のライブラリーは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の変種のスクリーニングおよびそれに続く選択に用いる、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１断片の多様な集団を発生するために使用できる。１つの具体例において、コード配列断片のライブラリーは、ヌクレアーゼと共に、切り込みが１分子当たり約１回だけ発生する条件下でＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１コード配列の２本鎖ＰＣＲ断片で処理し、２本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを復元して、異なる切り込みの入った生成物由来のセンス／アンチセンス対を含む２本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することにより再形成したニ量体より１本鎖部分を除去し、および生じる断片ライブラリーを発現ベクター内にライゲートすることにより得ることができる。該方法により、Ｎ末端、Ｃ末端およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の様々な大きさの内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００９７】
点変異または末端切断により作成したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする多くの技術が当該分野で知られている。かかる技術は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の組み合わせ突然変異誘発により発生する遺伝子ライブラリーの急速スクリーニングに適応できる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために、ハイスループット分析の影響を受けやすい最も広く使用される技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターへクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、所望の活性を検出することで、その産物の検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリーにおいて機能性変異体の頻度を増強する新規の技術である、再帰的集団突然変異誘発（ＲＥＭ）は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１変種を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用できる（ArkinおよびYouvan（１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：７８１１−７８１５；Delagraveら、（１９９３） Protein Eng. ６（３）：３２７−３３１）。
【００９８】
１つの具体例において、細胞に基づくアッセイは、多様なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ライブラリーを分析するために利用できる。例えば、発現ベクターのライブラリーは、普通はＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を合成および分泌している細胞系にトランスフェクトできる。ついで、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１および個々の変異体ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１が分泌され、細胞上清におけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性での変異体の発現効果が、例えば、多くの機能的アッセイのいずれかにより検出できるように、トランスフェクトされた細胞を培養する。ついで、プラスミドＤＮＡは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性の阻害、あるいはまた増強作用を集計する細胞より回復し、個体のクローンはさらに特性化できる。
【００９９】
作動薬の他の形態は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白のペプチドアナログまたはペプチド類似物である。ペプチドアナログは、普通、医薬産業において、テンプレートペプチドと類似の特性を有する非ペプチド薬剤として使用される。非ペプチド化合物のこれらの型を「ペプチド類似物」といい（Fauchere, J.（１９８６） Adv. Drug Res. １５：２９；VeberおよびFreidinger（１９８５） TINS p.３９２；およびEvansら、（１９８７） J. Med. Chem. ３０：１２２９、これらは出典を明示することで本明細書の一部とする）、普通、コンピューター化された分子モデリングの補助において明らかとなる。構造的にＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１に類似のペプチド類似物またはその機能性変種を用いて等価の効果を得ることができる。一般に、ペプチド類似物は、構造的にパラダイムポリペプチド（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１）に類似するが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される連結により随意的に置換される、１つまたはそれ以上のペプチド連結を有する。このことは、さらに以下の参考文献に記載されている当該分野にて既知の方法により当業者によってなされる：Spatola, A. F.、"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins" Weinstein, B.編, Marcel Dekker, New York, p. ２６７（１９８３）；Spatola, A. F.、Vega Data（March １９８３）、第１巻、第３版、"Peptide Backbone Modifications"（一般評論）；Morley, J. S.（１９８０） Trends Pharm. Sci. ４６３−４６８頁（一般評論）；Hudson, D.ら、（１９７９） Int. J. Pept. Prot. Res. １４：１７７−１８５（−CH２NH−, CH２CH２−）；Spatola, A. F.ら、（１９８６） Life Sci. ３８：１２４３−１２４９（−CH２−S）；Hann, M. M.（１９８２） J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., ３０７−３１４（−CH−CH−, シスおよびトランス）；Almquist, R. G.ら、（１９０） J. Med. Chem. ２３：１３９２−１３９８（−COCH２−）；Jennings−White, C.ら、（１９８２） Tetrahedron Lett. ２３：２５３３（−COCH２−）；Szelke, M.ら、European Appln. EP ４５６６５（１９８２） CA： ９７：３９４０５（１９８２）（−CH（OH）CH２−）；Holladay, M. W.ら、（１９８３） Tetrahedron Lett.（１９８３） ２４：４４０１−４４０４（−C（OH）CH２−）；およびHruby, V. J.（１９８２） Life Sci.（１９８２） ３１：１８９−１９９（−CH２−S−）（これらは各々その出典を明示することで本明細書の一部とする）。特に好ましい非ペプチド連結は、−ＣＨ２ＮＨ−である。かかるペプチド類似物は、ポリペプチドに対して、例えば：さらに経済的な生産、大きな化学的安定性、増強された医薬特性（例えば、生物学的活性の幅広いスペクトル）および減弱した抗原性などの、意味のある利点を有するだろう。
【０１００】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のいずれかのアミノ酸配列、またはその機能性変種の１つまたはそれ以上のアミノ酸を、同種のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）で系統的に置換することは、増加した安定性を有するペプチド物質を発生するために使用できる。加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１アミノ酸配列、その機能性変種、または本質的に同一の配列変化を含む限定ペプチドは、当該分野で知られている方法（RizoおよびGierasch（１９９２） Annu. Rev. Biochem. ６１：３８７、出典を明示することで本明細書の一部とする）；例えば、ペプチドを環化し作動薬を精製する細胞内ジスルフィド架橋を形成できる内部システイン残基を添加することにより得ることができる。
【０１０１】
部分的な機能のみを保持するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の変種は、拮抗薬として役立つ。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の拮抗薬は、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の細胞性活性を競合的に調節することによって、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の天然に生じる形態の１つまたはそれ以上の活性を阻害できる。かかる変種は、先に記載の変種と類似の方法により生成され、機能的に同定される。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のいずれかの拮抗薬である変種は、免疫抑制性受容体に結合する能力を保持するが、抑制性シグナルのシグナル変換を誘導する能力を欠く。拮抗薬の他の形態は、各受容体への結合に競合するが、反応を誘導するよう受容体を活性化しない、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のペプチド類似物である。活性（例えば、免疫抑制性受容体への結合）を抑制するようにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１に結合するか、シグナルを抑制するように対応する免疫抑制性受容体に結合する小分子はまた、拮抗薬を供給する。
【０１０２】
ペプチドは、典型的に、直接化学合成により生成でき、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の、対応する免疫抑制性受容体との相互作用の作動薬または拮抗薬として使用できる。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に、共有結合により付加した非ペプチド部分を有する、修飾ペプチドとして生成されるだろう。特定の好ましい具体例において、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかまたは両方を、化学的に修飾する。末端のアミノおよびカルボキシ群の最も普通の修飾は、各々、アセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）などのアミノ末端修飾、およびアミド化などのカルボキシ末端修飾、ならびに環化を含む他の末端修飾は、本発明の様々な具体例に組み込まれる。特定のアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列へのペプチド拡張は、有利な物理的、科学的、生化学的および医薬的特性：増強された安定性、増加した効力および／または効果、血清プロテアーゼに対する耐性、および所望の薬物動態学的特性などを提供できる。
【０１０３】
ＩＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子をコードする核酸分子は、ベクター、好ましくは発現ベクターに含有されうる。本明細書に記載の、「ベクター」なる語は、結合した他の核酸分子を輸送する能力を有する核酸分子のことをいう。ベクターの一型が「プラスミド」であり、これは付加のＤＮＡ部分がライゲートされうる、環状２本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの他の型がウイルスベクターであり、付加のＤＮＡ部分はウイルスゲノムにライゲートできる。特定のベクターは、導入される宿主細胞内において、自律的複製ができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入により宿主細胞内のゲノム内に取り入れられ、そして宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術において実用的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も普通に使用されるベクターの形態であるため、可換的に使用できる。しかしながら、本発明は、等価の機能を供給する、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの、かかる他の形態の発現ベクターを含むことも意図する。
【０１０４】
組換え発現ベクターは、例えば、宿主細胞の核酸の指標細胞におけるＰＤ−１またはＢ７−４分子の構成または誘導発現などの発現に適切な形態の、本発明の核酸分子を含むことができ、これは組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結した、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、１つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結した」とは、目的とするヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする形で（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）、調節配列に結合されていることを意味するものである。「調節配列」なる語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。かかる調節配列は、例えば、Goeddel（１９９０） Methods Enzymol. １８５：３−７において記載される。調節配列は多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成発現を誘導する配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの組み立ては、形質転換される宿主細胞の選択、所望の蛋白の発現レベル、および同様のものなどの因子に依存できるということを、当業者は認識するだろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入でき、そして本明細書に記載の核酸によりコードされる、融合蛋白またはペプチドを含む、蛋白またはペプチド（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ファミリー蛋白、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の変異形態、融合蛋白、および同様のもの）を生成する。
【０１０５】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞における調節物質の発現のために設計することができる。例えば、調節物質は、イー・コリなどの細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）昆虫細胞、酵母菌細胞または哺乳類細胞において発現されうる。適切な宿主細胞はGoeddel（１９９０）前掲においてさらに記載される。また、組換え発現ベクターは、インビトロで、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写および翻訳できる。
【０１０６】
原核生物における蛋白の発現は、イー・コリにおいて、融合または非融合蛋白のいずれかの発現を誘導する、構成または誘導プロモーターを含むベクターと共に、最も頻繁に実行される。融合ベクターは、そこにコードされる蛋白、普通は組換え蛋白のアミノ末端に多くのアミノ酸を加える。かかる融合ベクターは、典型的に３つの目的：１）組換え蛋白の発現を増加；２）組換え蛋白の溶解度を増加；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによる、組換え蛋白の精製の補助、を供給する。しばしば、融合発現ベクターにおいて、蛋白分解的切断部位は、融合蛋白の精製の後で、組換え蛋白を融合部分より分離できるようにするため、融合部分および組換え蛋白の連結において導入される。かかる酵素、およびその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、各々標的組換え蛋白に対して、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc；Smith, D. B.およびJohnson, K. S.（１９８８） Gene ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合するｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）、マルトースＥ結合蛋白、または蛋白Ａを含む。
【０１０７】
精製蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性アッセイ（例えば、直接アッセイまたは以下に詳細に記載する競合アッセイ）において、または例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に特異的な抗体を発生させるために利用できる。
適当な誘導性非融合イー・コリ発現ベクターとして、ｐＴｒｃ（Amannら、（１９８８） Gene ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Studierら、（１９９０） Methods Enzymol. １８５：６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター由来の宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクター由来の標的遺伝子発現は、共同発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒介される、Ｔ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター由来の転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下においてＴ７ｇｎ１遺伝子を有する定住プロファージ由来の、宿主系統ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１０８】
イー・コリにおける組換え蛋白発現を最大限とする１つの方法は、組換え蛋白を蛋白分解的に切断する能力を損なっている宿主細菌において、蛋白を発現することである（Gottesman, S.（１９９０） Methods Enzymol.１８５：１１９−１２８）。他の方法は、各アミノ酸に対応する個々のコドンが、選択的にイー・コリにおいて利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変えることである（Wadaら、（１９９２） Nucleic Acids Res. ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のかかる変形は標準化ＤＮＡ合成技術により行うことができる。
他の具体例において、調節物質発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セレヴィシエにおける発現に用いるベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら、（１９８７） EMBO J. ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（KurjanおよびHerskowitz（１９８２） Cell ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら、（１９８７） Gene ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）およびｐｉｃＺ（Invitrogen Corp, San Diego, CA）を含む。
【０１０９】
また、調節物質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞において発現できる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）における蛋白の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系（Smithら、（１９８３） Mol. Cell Biol. ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系（Lucklow, V. A.およびSummers, M. D.（１９８９） Virology １７０：３１−３９）を含む。
【０１１０】
さらに他の具体例において、調節物質をコードする核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの例は、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Seed, B.（１９８７） Nature ３２９：）およびｐＭＴ２ＰＣ（８４０Kaufmanら、（１９８７） EMBOJ. ６：１８７−１９５）を含む。哺乳類細胞において使用される場合、発現ベクターの調節機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０より派生する。原核および真核細胞の両方に用いる他の適切な発現系に関しては、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning：  A Laboratory Manual. ２nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８９の１６章および１７章を参考のこと。 
【０１１１】
哺乳類発現ベクターには、特定の細胞型において選択的に挿入核酸の発現を誘導できるものがある（例えば、組織特異的調節要素は核酸を発現させるために使用される）。組織特異的調節要素は当該分野で知られている。限定するものではないが、適当な組織特異的プロモーターとして、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら、（１９８７） Genes Dev. １：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（CalameおよびEaton（１９８８） Adv. Immunol. ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（１９８９） EMBO J. ８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Banerjiら、（１９８３） Cell ３３：７２９−７４０；QueenおよびBaltimore（１９８３） Cell ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら、（１９８５） Science ２３０：９１２−９１６）および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４,８７３,３１６号および欧州出願公開番号２６４,１６６）が挙げられる。例えば、ネズミのホメオボックスプロモーター（KesselおよびGruss（１９９０） Science ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（１９８９） Genes Dev. ３：５３７−５４６）などの、発達上調節されるプロモーターもまた包含する。
【０１１２】
さらに、哺乳類細胞における使用に用いる誘導調節系、例えば遺伝子発現が、重金属イオン（例えば、Mayoら、（１９８２） Cell ２９：９９−１０８；Brinsterら、（１９８２） Nature ２９６：３９−４２；Searleら、（１９８５） Mol. Cell. Biol. ５：１４８０−１４８９を参考のこと）、熱ショック（例えば、Nouerら、（１９９１） in Heat Shock Response、Nouer, L.編、CRC, Boca Raton , FL, pp１６７−２２０を参考のこと）、ホルモン（例えば、Leeら、（１９８１） Nature ２９４：２２８−２３２；Hynesら、（１９８１） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８：２０３８−２０４２；Klockら、（１９８７） Nature ３２９：７３４−７３６；IsraelおよびKaufman（１９８９） Nucl. Acids Res. １７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２３４３１を参考のこと）、ＦＫ５０６関連分子（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１７を参考のこと）またはテトラサイクリン（Gossen, M.およびBujard, H.（１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：５５４７−５５５１；Gossen, M.ら、（１９９５） Science ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３を参考のこと）により調節される系は、当該分野で知られている。したがって、他の具体例において、本発明は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ＤＮＡが誘導性の真核生物のプロモーターに作動可能に連結した組換え発現ベクターを提供し、そして真核細胞内における調節物質の誘導性の発現を可能とする。
【０１１３】
ＤＮＡ分子はまた、アンチセンス配向性に発現ベクターにクローニングされてもよい。すなわち、ＤＮＡ分子は、天然ｍＲＮＡのアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（ＤＮＡ分子の転写により）可能にする方法で、作動可能に調節配列に連結される。例えば、ウイルス性プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、様々な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を誘導する、アンチセンス配向性にクローニングされる核酸に作動可能に連結した調節配列を選択できるか、または構成、組織特異的または細胞型特異的なアンチセンスＲＮＡの発現を誘導する調節配列を選択できる。アンチセンス発現ベクターは、活性は、ベクターが導入される細胞型により決定できる、高い有効性の調節領域の調節下において、アンチセンス核酸が精製される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態でありえる。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の調節の論考に関しては、Weintraub, H.ら、（１９８６） 鄭ntisense RNA as a molecular tool for genetic analysis  総論−Trends in Genetics、第１巻（１）を参考のこと。
【０１１４】
本発明はさらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の調節因子をコードする組換え発現ベクターが導入される宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる語は、本明細書において可換的に使用する。当然のことながら、かかる語は、単に特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的子孫のこともいう。特定の修飾は、変異または環境的影響のいずれかのために後世において生じるため、かかる子孫は、実際、親細胞とは同一でないだろうが、本明細書に用いられるかかる語の範囲内に含まれるものである。
【０１１５】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかでありえる。例えば、調節物質は、イー・コリなどの細菌細胞、昆虫細胞、酵母菌または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など）において発現されうる。他の適当な宿主細胞は当業者に知られている。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により、原核または真核細胞に導入できる。本明細書に記載の、「形質転換」および「トランスフェクション」なる語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共同促進、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、異種核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための様々な技術認識技術をいうことを意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning：  A Laboratory Manual. ２nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, １９８９）および他の実験使用マニュアルに記載されている。
【０１１６】
哺乳類細胞の適切なトランスフェクションのために、当然のことながら、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、少数の細胞のみが、異種ＤＮＡをそのゲノム内に取り入れるだろう。これらの成分を同定および選択するために、選択可能な標識（例えば、抗体への耐性）をコードする遺伝子を、一般に、目的とする遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能な標識は、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤への耐性を与えるものを含む。選択可能な標識をコードする核酸は、宿主細胞において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子をコードするものと同じベクターに導入できるか、または分離ベクターに導入できる。導入核酸で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定できる（例えば、選択可能な標識遺伝子組み込んだ細胞は生き残り、一方他の細胞は死ぬだろう）。
【０１１７】
培養中の原核または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は調節物質を生成（すなわち、発現）するために使用できる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して調節物質を生成するための方法を提供する。１つの具体例において、この方法は、調節物質蛋白が生成されるように、適切な培地において（調節物質をコードする組換え発現ベクターが導入される）発明の宿主細胞を培養することを含む。他の具体例において、この方法はさらに、調節物質を培地または宿主細胞より単離することを含む。
【０１１８】
特定の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を生成するために使用できる。例えば、１つの具体例において、宿主細胞は、配列をコードする調節物質が導入された受精卵母細胞または胚幹細胞である。かかる宿主細胞は、それから、外因性調節物質配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または外因性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列が、所望の調節効果を生成するために変えられた相同な組換え動物を生成するために使用できる。かかる動物は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの機能および／または活性を研究するのに、およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子を同定および／または評価するのに有効である。本明細書に記載の、「トランスジェニック動物」なる語は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類であり、１つまたはそれ以上の動物の細胞は、トランス遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例は、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類および同様のものを含む。トランス遺伝子は、トランスジェニック動物が成長する細胞のゲノム内に取り入れられ、成熟動物のゲノムに残っている外因性ＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１つまたはそれ以上の細胞型または組織において、コードされた遺伝子産物の発現を誘導する。本明細書に記載の、「相同性組換え動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであり、外因性調節物質遺伝子は、動物の成長に先立って、動物の細胞、例えば動物の胚細胞内に導入された、外因性遺伝子および外因性ＤＮＡ分子の間の相同的組換えにより変わっている。
【０１１９】
トランスジェニック動物は、調節物質コード核酸分子を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、受精卵母細胞の雄性前核に導入し、卵母細胞が偽妊娠した雌の養育動物内で成長できるようにすることで作成できる。先に記載の調節物質ＤＮＡ配列は、トランス遺伝子として、ヒト以外の動物のゲノム内に導入できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子またはその変種が、調節物質として使用される場合、その分子は、マウスまたはラットＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子などの、ヒトＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の非ヒトホモログより派生し、派生した遺伝子生成物は、トランス遺伝子として使用できる。また、他のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ファミリーメンバーなどのＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子ホモログは、配列番号：１または３のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ファミリーｃＤＮＡ配列（上記のサブセクションＩにおいてさらに記載）へのハイブリダイゼーションに基づいて単離でき、調節物質を派生するために使用できる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、トランス遺伝子の発現の効率を増加させるために、トランス遺伝子に含めることができる。組織特異的調節配列は、調節物質蛋白の発現を特定の細胞に誘導するため、調節物質トランス遺伝子に結合することが可能である。胚操作およびマイクロインジェクションによって、特にマウスなどの動物であるトランスジェニック動物を発生する方法は従来技術であり、例えば、その両方がLederらの米国特許第４,７３６,８６６号および第４,８７０,００９号、Wagnerらの米国特許第４,８７３,１９１号、およびHogan, B. Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８６）において記載される。類似の方法が、他のトランス遺伝子動物の生成のために使用される。トランス遺伝子創始動物は、ゲノムの中の調節物質トランス遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞の中の調節物質ｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。トランス遺伝子創始動物は、それからトランス遺伝子を持つ追加動物を受精させるために使用できる。さらに、調節物質をコードするトランス遺伝子を持つトランス遺伝子動物は、さらに他のトランス遺伝子を持つ他のトランス遺伝子動物に受精することができる。
【０１２０】
相同性組換え動物を作成するため、欠失、付加または置換が導入され、それによってＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子を変化させる、例えば機能的に破壊する調節物質遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製される。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子は、ヒト遺伝子でありえるが、より好ましくはヒトＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、配列番号：１または３のヌクレオチド配列との緊縮ハイブリダイゼーションにより単離されるｃＤＮＡ）である。例えば、マウスＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子を用いて、マウスゲノムにおいて外因性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子を変えるために適切である相同性組換えベクターを構築することができる。好ましい具体例において、ベクターを、相同性組換えに基づいて、外因性調節物質遺伝子（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１）が機能的に破壊される（すなわち、機能性蛋白をもはやコードしない；また「ノックアウト」ベクターともいう）ように設計する。また、ベクターを、相同性組換えに基づいて、外因性調節物質遺伝子が変異されるか、さもなければ改変されるが、機能性蛋白を依然としてコードする（例えば、上流の調節領域は変えることができ、それによって外因性調節物質蛋白の発現を変える）ように設計することができる。相同性組換えベクターにおいて、調節物質遺伝子の変化部分は、ベクターが持つ外因性調節物質遺伝子、および胚幹細胞の外因性調節物質遺伝子の間で、相同性組換えが生じることを可能とするために、調節物質遺伝子の追加核酸配列により５´および３´末端において側面に位置する。付加で側面に位置する調節物質核酸配列は、外因性遺伝子との相同性組換えが成功するために十分な長さである。典型的に、側面に位置するＤＮＡのいくつかのキロベース（５´および３´末端において両方）は、ベクターに含まれる（例えば、相同性組換えベクターの記載としてThomas, K. R.およびCapecchi, M. R.（１９８７） Cell ５１：５０３を参考のこと）。ベクターは、胚幹細胞系に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入され、導入調節物質遺伝子が、外因性調節物質遺伝子と相同的に組換えされた細胞が選択される（例えば、Li, E.ら、（１９９２） Cell ６９：９１５を参考のこと）。ついで、選択細胞を動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞内に注入し、凝集キメラを形成する（例えば、Bradley, A. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsにおける：A Practical Approach, Robertson, E. J.編（IRL, Oxford, １９８７）１１３−１５２頁を参考のこと）。キメラ胚は、それから適切な偽妊娠した雌の養育動物に移植でき、出産される。生殖細胞内に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は、動物の全ての細胞が、トランス遺伝子の生殖細胞系列遺伝により、相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を受精させるために使用できる。相同性組換えベクターおよび相同性組換え動物を構築する方法は、さらにBradley, A.（１９９１） Curr. Opin. Biotechnol. ２：８２３−８２９ において、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４（Le Mouellecら）；ＷＯ９１／０１１４０（Smithiesら）；ＷＯ９２／０９６８（Zijlstraら）；およびＷＯ９３／０４１６９（Bernsら）において記載される。
【０１２１】
上記に加えて、相同性組換えに用いる当該分野で知られている他の方法が、本発明に適用できることを、当業者は認識するであろう。酵素使用部位特異的総合系が、当該分野で知られており、二次標的ＤＮＡ分子において先決部位で、ＤＮＡ分子を結合するために使用できる。かかる酵素使用総合系の例は、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘターゲット系（例えば、Baubonis, W.およびSauer, B.（１９９３） Nucl. Acids Res. ２１：２０２５−２０２９；およびFukushige, S.およびSauer, B.（１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：７９０５−７９０９において記載される）およびＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴターゲット系（例えば、Dang, D. T.およびPerrimon, N.（１９９２） Dev. Genet. １３：３６７−３７５；およびFiering, S.ら、（１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：８４６９−８４７３において記載される）を含む。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３に記載されるような、テトラサイクリン調節誘導相同性組換え系もまた使用できる。
【０１２２】
例えば、他の具体例において、トランス遺伝子の調節発現を可能とする選択系を含むトランスジェニックヒト以外の動物を生成できる。かかる系の１つの具体例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載に関しては、Laksoら、（１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：６２３２−６２３６を参考のこと。リコンビナーゼ系の他の例は、サッカロマイセスセレヴィシエのＦＬＰリコンビナーゼ系（O'Gormanら、（１９９１） Science ２５１：１３５１−１３５５）である。仮にｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を、トランス遺伝子の発現のために使用するのであれば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択蛋白の両方をコードするトランス遺伝子を含む動物が要求される。かかる動物は、例えば、１つは選択蛋白をコードするトランス遺伝子を含み、一方はリコンビナーゼをコードするトランス遺伝子を含む、２つのトランスジェニック動物を結合することによる、「二重の」トランスジェニック動物を構築することを通して提供されうる。
【０１２３】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, I.ら、（１９９７） Nature ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載される方法にしたがって生成できる。要するに、トランスジェニック動物由来の細胞、例えば体細胞は単離でき、成長周期を終了しＧ０段階に入るよう誘導できる。休止細胞はそれから、例えば電気的パルスの使用を通して、休止細胞が単離されるものと同じ種の動物由来の除核卵母細胞に融合できる。再構成した卵母細胞を、それから、桑実胚または未分化胚芽細胞に成長するように培養して、ついで偽妊娠した雌の養育動物に移す。この雌の養育動物から産まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンであろう。
【０１２４】
ＩＶ．本発明の使用および方法
ＢＴＦ４および／またはＢ７−Ｌ１調節物質、例えば、本明細書に記載の核酸分子、蛋白、蛋白ホモログおよび抗体は、１つまたはそれ以上の以下の方法：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）検出アッセイ；ｃ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、監視臨床治験および薬理遺伝学）において、ならびに免疫細胞活性化の調節の方法において使用できる。本発明の単離核酸分子は、例えば、遺伝子治療の適用における宿主細胞にある組換え発現ベクターを通して、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、またはその修飾異形（例えば、変異または切断または融合蛋白として発現）を発現するために、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における遺伝子変化を検出するために、または以下にさらに記載されるように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節するために、使用できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１阻害剤の生成が不十分または過剰であることにより起きる）異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を含む疾患を治療するために使用できる。加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、天然に生じるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１調節因子をスクリーニングするために、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する薬剤または化合物をスクリーニングするために、ならびにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生成または、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１野生型蛋白と比較して活性が減少または異常である、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白形態の生成が不十分または過剰であり、両方ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化が異常に低い量となるであろうことを特色とする疾患を治療するために使用できる。さらに、本発明の抗ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１抗体は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白を（例えば、診断目的のために個体より）検出および単離し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の生物学的利用能を調節し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性を（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の各々のレセプターとの相互作用を調節することにより）調節するために使用できる。
【０１２５】
Ａ．スクリーニングアッセイ
本発明の他の態様は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを調節する物質、すなわちＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化に対して刺激または阻害効果を有する物質（例えば、ペプチド、ペプチド類似物、小分子または他の薬剤）を同定するための（本明細書において「スクリーニングアッセイ」ともいう）方法に関する。物質は、免疫反応がＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の存在によりダウンレギュレートされる、免疫反応に対する標準化インビトロアッセイを用いて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを調節する能力をアッセイされる、１つまたはそれ以上の（本明細書において、候補または試験化合物ともいう）試験物質より同定する。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１存在下での免疫細胞活性化の適切な読み取り法（例えば、細胞増殖または抗体生成、サイトカイン生成および食作用などのエフェクター機能）が当該分野に存在する。一般に使用される一のアッセイはＴ細胞活性化アッセイである。
【０１２６】
例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化をダウンモジュレートするために、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の存在下で、活性化Ｔ細胞を生成する標準方法により、操作される。試験物質の存在下における、免疫反応のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１媒介ダウンモジュレーションにおける比較変化は、試験物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルの調節因子であることを示す。免疫反応のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１媒介ダウンモジュレーションの阻害は、アッセイにより測定される免疫反応における、統計的に有意で、再現性のある増加となる。同様に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１媒介ダウンモジュレーションの増加もまた、測定できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の、対応する免疫抑制受容体との相互作用を遮断または阻害する物質、ならびにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１媒介阻害シグナルを促進する物質は、免疫細胞活性化、例えば、増殖および／またはエフェクター機能を調節する能力、またはインビトロアッセイに加えられた場合にアネルギーを誘導する能力により同定できる。
【０１２７】
１つの具体例において、本発明は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、またはポリペプチドまたはその生物学的に活性のある部分の発現および／または活性に結合または調節する、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドが、その受容体と相互作用する能力、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節に作用する相互作用分子（例えば、細胞内相互作用分子）を調節する、候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、例えば、先に記載の化合物のいずれかでありえる。かかる化合物は：生物学的ライブラリー；空間的アドレス可能並列固相または液相ライブラリー；デコンボルーションを要求する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアッフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当該分野で知られているコンビナトリアルライブラリーにおける多数の方法のうちいずれかを使用して得ることができるだろう。生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリー（Lam, K. S.（１９９７） Anticancer Drug Des. １２：１４５）に適用可能である。
【０１２８】
分子ライブラリーの合成に用いられる方法の一例が、例えば：DeWittら、（１９９３） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：６９０９；Erbら、（１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：１１４２２；Zuckermannら、（１９９４） J. Med. Chem. ３７：２６７８；Choら、（１９９３） Science ２６１：１３０３；Carrellら、（１９９４） Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ３３：２０５９；Carellら、（１９９４） Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ３３：２０６１に；およびGallopら、（１９９４） J. Med. Chem. ３７：１２３３に記載されている。
【０１２９】
化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Houghten（１９９２） Biotechniques １３：４１２−４２１）中で、またはビーズ（Lam（１９９１） Nature ３５４：８２−８４）、チップ（Fodor（１９９３） Nature ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ladner USP ５,２２３,４０９）、胞子（Ladner USP '４０９）、プラスミド（Cullら、（１９９２） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９：１８６５−１８６９）上で、またはファージ（ScottおよびSmith（１９９０） Science ２４９：３８６−３９０）；（Devlin（１９９０） Science ２４９：４０４−４０６）；（Cwirlaら、（１９９０） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：６３７８−６３８２）；（Felici（１９９１） J. Mol. Biol. ２２２：３０１−３１０）；（Ladner前掲）上で存在しうる。
【０１３０】
１つの具体例において、アッセイは細胞に基づくアッセイである。１つの具体例において、かかるアッセイは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を生じる細胞またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を発現する細胞受容体を、試験物質と接触させ、試験化合物の、調節する（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする）能力を決定することを含む。試験化合物の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する能力の決定は、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、各々の受容体と結合または相互作用する能力の決定により達成できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、その結合パートナーと結合または相互作用する能力の決定は、例えば、直接結合を測定することにより達成できる。別法として、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルの誘導を測定することもできる。これは、当該分野で知られている方法を使用して達成できる。例えば、細胞の活性化状態は、例えば、細胞表面マーカーの発現、セカンドメッセンジャーの発生または（例えば、以下の実施例のセクションに記載されるようなＴ細胞活性化アッセイにおける共同刺激を使用して）細胞性活性化のパラメーターを測定することにより検査できる。
【０１３１】
直接結合アッセイにおいて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または修飾異形またはその類似物（または各々の受容体）は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１標的分子への結合が、複合体の標識蛋白を検出することで決定できるように、放射性同位体または酵素標識を連結できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子、例えばＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、直接的にまたは非直接的にかのいずれかで１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識でき、放射性同位体は、放射放出の直接計数により、またはシンチレーション計数により検出できる。また、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで、酵素的に標識でき、酵素標識は、生成する適切な基質の変換の決定により検出できる。
【０１３２】
試験物質または化合物はまた、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１およびその受容体との相互作用を阻害することにより、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害するように機能するだろう。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１およびその受容体の間での相互作用を調節する試験物質または化合物のかかる活性は、相互作用のいずれかを標識しないで決定できる。例えば、微視的物理メーターは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のいずれかまたは受容体を標識しないで、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の、その受容体との相互作用を検出するために使用できる（McConnell, H. M.ら、（１９９２） Science ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書に記載の、「微視的物理メーター」（例えば、細胞センサー）は、光アドレス可能電位差センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞が環境を酸性化する比率を測定する分析機器である。酸性化比率における変化は、化合物および受容体の間での相互作用の指標として使用できる。
【０１３３】
好ましい具体例において、試験物質の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を誘導または阻害する能力の決定は、試験物質の、免疫細胞においてＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１がシグナルを媒介する能力に対する効果を測定することにより達成できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化は、例えば、細胞性セカンドメッセンジャーの誘導（例えば、チロシンキナーゼ活性）を検出、適切な基質の触媒／酵素活性を検出、（検出可能マーカー、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結した標的反応性調節要素を含む）レポーター遺伝子の誘導を検出、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体により調節される細胞性反応を検出することにより決定できる。
【０１３４】
他の具体例において、アッセイは細胞を含まないアッセイである。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはその生物学的に活性のある部位は、試験物質に接触でき、試験物質が、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはその生物学的に活性のある部位が、適切な受容体を経てシグナルを送る能力を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する。試験物質の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のその受容体に結合する能力に対する効果を決定することにより達成できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、その受容体に結合する能力の決定もまた、実時間Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）（Sjolander, S.およびUrbaniczky, C.（１９９１） Anal. Chem. ６３：２３３８−２３４５およびSzaboら、（１９９５） Curr. Opin. Struct. Biol. ５：６９９−７０５）などの技術を使用して達成できる。本明細書に記載の、「ＢＩＡ」は、いずれの反応体（例えば、ＢＩＡコア）も標識しないで、実時間での生物特異的相互作用の研究に用いる技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化は、生物学的分子の間での実時間反応の表示として使用できる。
【０１３５】
さらに他の具体例において、細胞を含まないアッセイは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはその生物学的に活性のある部位を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に結合して、アッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させ、アッセイ混合物を、試験化合物と接触させ、試験化合物の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白と相互作用する能力を決定することを含む。試験化合物の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白と相互作用する能力は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白が、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１標的分子、例えば受容体に選択的に結合または活性を調節する能力を測定することによって決定できる。
【０１３６】
もう一つ別の具体例において、試験化合物の、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の活性を調節する能力の決定は、試験化合物が、例えば受容体の細胞質領域と相互作用することによって、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の下流で機能する分子の活性を調節する能力を決定することによって達成できる。例えば、セカンドメッセンジャーのレベルを測定し、適切な標的上の相互作用分子の活性を決定し、または相互作用分子の、適切な標的に対する結合を上記したように決定できる。
【０１３７】
他の具体例において、（例えば、抗原提示細胞における）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現の調節因子は、細胞を試験物質と接触させ、細胞内でのＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現を決定する方法において同定する。試験物質の存在下におけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現レベルは、試験物質の非存在下におけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現レベルと比較できる。ついで、試験物質を、この比較に基づいて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現の調節因子として同定できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現が、試験物質の存在下における方が非存在下より大きい（例えば、統計的に有意に大きい）場合、試験物質を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現の刺激因子として同定する。また、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現が、試験物質の存在下における方が非存在下より小さい（例えば、統計的に有意に小さい）場合、試験物質を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現の阻害因子として同定する。細胞におけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白の発現レベルは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたは蛋白を検出するための、本明細書に記載の方法により同定できる。
【０１３８】
さらに本発明の他の態様において、好ましくは膜結合形態である、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と結合または相互作用し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性に関する他の蛋白（「ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１結合蛋白」または「ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１塩基対」）を同定するために、２本ハイブリッドアッセイまたは３本ハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５,２８３,３１７号；Zervosら、（１９９３） Cell ７２：２２３−２３２；Maduraら、（１９９３） J. Biol. Chem. ２６８：１２０４６−１２０５４；Bartelら、（１９９３） Biotechniques １４：９２０−９２４；Iwabuchiら、（１９９３） Oncogene ８：１６９３−１６９６；およびBrent ＷＯ９４／１０３００を参考のこと）において「おとり蛋白」として使用できる。かかるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１結合蛋白もまた、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化経路の上流または下流要素として、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１標的によるシグナルの調節に関するようである。
【０１３９】
２本ハイブリッド系は、分離可能ＤＮＡ結合および活性化領域から構成される転写因子の大部分のモジュラー特性に基づいている。要するに、アッセイは、２つの異なるＤＮＡ構造物を利用する。１つの構造物において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合領域をコードする遺伝子に融合されている。もう一方の構造物において、ＤＮＡ配列のライブラリー由来で、同定されていない蛋白（「犠牲」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列は、既知の転写因子の活性化領域をコードする遺伝子に融合されている。仮に、「おとり」および「犠牲」蛋白が、インビボにおいて相互作用でき、複合体を形成するなら、転写因子のＤＮＡ結合および活性化領域は、かなり近接している。近接することで、転写因子に反応性のある転写調節部位に作動可能に結合できるレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現は検出でき、機能性転写因子を含む細胞クローンは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白と相互作用する蛋白をコードするクローン化された遺伝子を得るために単離および使用できる。
【０１４０】
本発明はさらに、先に記載のスクリーニングアッセイにより同定される新規の物質に関する。さらに本発明は、先に記載のスクリーニングアッセイまたは本明細書に記載の方法により同定された新規の物質の使用に関する。
【０１４１】
Ｂ．検出アッセイ
本明細書に記載の方法で同定される、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の調節因子の部分または断片（例えば、蛋白または核酸配列）は、試薬として多数の方法において使用できる。例えば、核酸配列は：（ｉ）各遺伝子を染色体上にマッピングするために；したがって、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域を位置付けるために；（ｉｉ）微小生物学的サンプルから個体を同定するために（組織適合試験）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的同定を補助するために使用できる。これらの適用は、以下の小節に記載される。
【０１４２】
１．染色体マッピング
遺伝子の配列（または配列の一部）を単離すると、この配列は、染色体上に遺伝子の位置をマッピングするために使用できる。この過程は、染色体マッピングと呼ばれる。したがって、本明細書に記載の調節物質として機能するか、またはコードするヌクレオチド配列の一部または断片は、染色体上で対応する遺伝子の位置をマッピングするために使用できる。かかる配列の染色体へのマッピングは、かかる配列を、疾患と関連する遺伝子と相互に関連付けることにおいて、重要な第一歩である。
【０１４３】
要するに、遺伝子は、ＰＣＲプライマー（好ましくは、長さが１５ないし２５塩基対）をヌクレオチド配列より調製することにより、染色体にマッピングできる。配列をコンピューター分析に付し、ゲノムＤＮＡにおいて１つ以上のエキソンに及んでおらず、したがって増幅過程を複雑にするプライマーを予測することができる。これらのプライマーはそれから、個々のヒト染色体を含む、体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用できる。配列に対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドだけが、増幅した断片を生じるだろう。
【０１４４】
体細胞ハイブリッドは、体細胞を、異なる動物（例えば、ヒトおよびマウス細胞）から融合することにより調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが、成長および分裂するにしたがって、これらは次第にヒト染色体をランダムに失うが、マウス染色体は保持する。特有の酵素を欠如するためにマウス細胞は成長できないが、ヒト細胞は成長できる培地を使用することで、必要な酵素をコードする遺伝子を保持する１つのヒト染色体は、保持されるだろう。様々な培地を使用することで、ハイブリッド細胞系のパネルが確立できる。パネルの各細胞系は、単一ヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、およびマウス染色体のフルセットを含み、個々の遺伝子の、特異的ヒト染色体への簡易なマッピングを可能とする（D'Eustachio, P.ら、（１９８３） Science ２２０：９１９−９２４）。ヒト染色体の断片のみを含む体細胞ハイブリッドもまた、転座および欠失を用いて、ヒト染色体を使用することで生成できる。
【０１４５】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特有の配列を特有の染色体に割り当てるための急速手順である。１つの温度サイクラーを使用して、一日当たり、３つまたはそれ以上の配列を割り当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマーお組み立てるヌクレオチド配列を使用して、準局在性は、特異的染色体由来の断片のパネルを用いて達成できる。配列を染色体にマッピングするために同様に使用できる他のマッピング方法は、インサイチュハイブリダイゼーション（Fan, Y.ら、（１９９０） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８７：６２２３−２７に記載される）、標識され、流れで区別された染色体を用いたプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選択を含む。
【０１４６】
分裂中期の染色体スプレッドへの、ＤＮＡの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）はさらに、１つの工程で正確な染色体の位置を提供するために使用できる。染色体スプレッドは、分裂が、紡錘体を破壊するコルセミドなどの化学物質により、分裂中期で遮断されている細胞を使用して作成できる。染色体は、トリプシンで簡単に処理でき、それからギムザで染色できる。明暗のバンドパターンは、各染色体上で発現し、そのため染色体は個々で同定できる。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基と同じ程度に短いＤＮＡ配列を用いて使用できる。しかしながら、１０００塩基より大きいクローンは、単純検出に用いるのに十分なシグナル強度で、独自の染色体部位に結合する可能性が高い。好ましくは、１０００塩基、およびより好ましくは２０００塩基が、適度な時間で良好な結果を得るのに十分である。この方法の見直しとして、Vermaら、Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques（Pergamon Press, New York １９８８）を参考のこと。
【０１４７】
染色体マッピングに用いる試薬は、個々で、単一染色体または染色体上の単一部位を標識するために使用でき、試薬のパネルは、複合部位および／または複合染色体を表質するために使用できる。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬は、実際にはマッピング目的として好まれる。コード配列は、遺伝子ファミリーにおいてより保存されているようで、したがって染色体マッピングの間に交差ハイブリダイゼーションの可能性が増加する。
いったん配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的部位は、遺伝マップデータと相関できる。（かかるデータは、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能である、McKusick, V., Mendelian Inheritance in Manで見られる。）  ついで、同じ染色体領域にマッピングされた、遺伝子および疾患の間の関係を、例えばEgeland, J.ら、（１９８７） Nature ３２５：７８３−７８７に記載される連鎖解析（物理的隣接遺伝子の共同遺伝的形質）を通して同定できる。
【０１４８】
さらに、目的とする遺伝子と関連した疾患に罹患した個体および罹患していない個体の間でのＤＮＡ配列における違いを決定できる。仮に、変異を、罹患した個体のいくつかまたは全てに観察するが、罹患していない個体のいずれにおいても観察しない場合、変異は特有の疾患の原因物質である可能性がある。罹患および罹患していない個体の比較は一般に、染色体スプレッドから可視であり、そのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを使用して検出可能である、欠失または転座などの染色体における構造的変化を第一に探すことを含む。最終的に、いくつかの個体由来の遺伝子の完全な配列は、変異の存在を確認するために、および多型性から変異を区別するために実行できる。
【０１４９】
Ｃ．予測可能な医薬
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイおよび臨床治験のモニターが、予後の（予測の）目的で使用され、それによって個体を予防的に治療する予測医学の範囲に関する。したがって、本発明の１つの態様は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）との関連で、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白および／または核酸発現、ならびにＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性を決定し、それによって個体が、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化につながる、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性と関連した、病気または疾患に罹患しているかどうか、または疾患を発達させる危険があるかどうかを決定する診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、核酸発現または活性と関連した疾患を発達させる危険があるかどうかを決定するための予後の（予測の）アッセイを提供する。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の変異は、生物学的サンプルにおいて、野生型ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と比較して、活性をアッセイできる。かかるアッセイは、それによって、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを特色とするか、またはそれと関連する疾患が発症するより前に、予防的に個体を治療する予後または予測目的に使用できる。
【０１５０】
本発明の他の態様は、臨床治験において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現または活性における物質（例えば、薬剤、化合物）の影響のモニターに関する。
これらおよび他の物質は、以下の項でより詳細に記載される。
【０１５１】
Ｄ．診断アッセイ
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸が、生物学的サンプルに存在するか存在しないかを検出するための典型的な方法は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸の存在が、生物学的サンプルにおいて検出できるように、試験対象より生物学的サンプルを採取し、生物学的サンプルを、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または物質と接触させることを含む。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションできる標識核酸プローブである。標識核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、ストリンジェントな条件下において、とりわけＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションできるのに十分であるオリゴヌクレオチドなどの、配列番号：１または３の核酸分子またはその一部などの、ヒトＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子でありえる。本発明の診断アッセイにおいて使用できる他の適切なプローブは、本明細書に記載される。
【０１５２】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白を検出するための好ましい物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に結合可能な抗体、好ましくは、検出可能な標識が付いた抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルでありえる。無傷の抗体、またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２）が使用できる。プローブまたは抗体に関して、「標識された」なる語は、検出可能な物質を、プローブまたは抗体にカップリング（すなわち、物理的に結合）することによって、直接プローブまたは抗体を標識すること、ならびに直接標識される他の試薬との反応性によって、プローブまたは抗体を非直接的に標識することを包含することを意図している。非直接標識の実施例は、蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出できるように、蛍光的に標識された二次抗体および、ビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を使用して、一次抗体を検出することを含む。「生物学的サンプル」なる語は、対象より単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象に存在する組織、細胞および液体を含むことを意図する。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボにおいて、生物学的サンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡ、蛋白またはゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｍＲＮＡの検出に用いるインビトロ技術は、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを含む。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の検出に用いるインビトロ技術は、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光検査法を含む。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ゲノムＤＮＡの検出に用いるインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の検出に用いるインビボ技術は、対象に、標識した抗ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、標準化画像技術により、対象において存在および位置を検出できる放射性マーカーで標識できる。
【０１５３】
１つの具体例において、生物学的サンプルは、試験対象由来の蛋白分子を含む。また、生物学的サンプルは、試験対象由来のｍＲＮＡ分子、または試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物学的サンプルは、従来の方法により、対象から単離された血清サンプルである。
他の具体例において、方法はさらに、対照対象由来の対照生物学的サンプルを採取すること、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が、生物学的サンプルにおいて検出されるように、対照サンプルを、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または物質と接触させること、および対照サンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験対象におけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。
【０１５４】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは、生物学的サンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白またはｍＲＮＡを検出可能な標識された化合物または物質を含むことができる：サンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の量を決定するための方法；および、サンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の量を標準と比較するための方法。化合物または物質は、適切な容器に保存できる。キットはさらに、キットを用いてＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸を検出するための使用説明書を含みうる。
【０１５５】
異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルはまた、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の異常な発現を含まない条件から生じてもよい。かかる状況において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のシグナル化を研究し、障害の存在を同定することもできる。したがって、本発明はまた、対象におけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の検出、および健康な個体において予想される正常範囲に対する該シグナルの定量に関する。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の検出は、例えばインビトロにおいて、以下の実施例のセクションにおいて詳細に記載されるような、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の検出および定量に用いる手順によって、試験対象より単離された免疫細胞を用いて実行する。かかる検出を試験対象の細胞を用いて行い、正常範囲を定めるための、１つまたはそれ以上の健康な個体の細胞を用いて行った同一の検出より得られる結果と比較する。
【０１５６】
Ｅ．予後アッセイ
本明細書に記載の診断方法はさらに、（例えば、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性より生じる）異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化と関連した病気または疾患を有するか、発達させる危険がある対象を同定するために利用できる。例えば、先行診断アッセイまたは追従アッセイなどのような、本明細書に記載のアッセイは、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化と関連した疾患を有するか、発達させる危険がある対象を同定するために利用できる。異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性と関連した病気または疾患を同定するためのかかる方法の１つは、対象より採取される試験サンプル、およびサンプルにおけるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）の検出を含み、異常に高いか低いレベルのＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性の存在は、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性と関連した病気または疾患を有するか、発達させる危険がある対象の診断となる。本明細書に記載の、「試験サンプル」は、目的とするある対象より採取される生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的液体（例えば、血清）、細胞サンプルまたは組織でありえる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子（例えば、変異分子）の活性より生じるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の量により決定し、例えば、本明細書に記載のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を測定するよう設計されたインビトロアッセイにより決定できる。
【０１５７】
さらに、本明細書に記載の診断アッセイは、対象に、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化と関連した病気または疾患を治療するため、物質（例えば、作動薬、拮抗薬、ペプチド類似物、蛋白、ペプチド、核酸、小分子または他の薬剤候補）を投与できるかどうかを決定するために使用できる。したがって、本発明は、対象を、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性と関連した疾患に用いる物質で、効果的に治療できるかどうかを決定するための方法を提供し、ここでは試験サンプルが採取され、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸の発現、活性または誘導された発現が検出される。ある例では、多量のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸の発現または活性は、対象のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化に直接関する。この例および可能ならば他の例においても、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性を治療するための物質の投与は、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化（異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１発現または活性と関連した疾患）を治療するのに十分であろう。
【０１５８】
対象のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における遺伝的変化は、当該分野で知られている方法により検出され、それによって、変化した遺伝子を有する対象が、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルと関連した疾患の危険があるかどうかを決定する。好ましい具体例において、該方法は、対象由来の細胞のサンプルにおいて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白をコードする遺伝子の統合性に作用する少なくとも１つの変化、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の誤発現を特性とする、遺伝的変化の存在または非存在を検出することを含む。例えば、かかる遺伝的変化は、１）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子由来の、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子への、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、４）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の、染色体再配置；５）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の、メッセンジャーＲＮＡ転写物レベルでの変化、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンなどの、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の異常な修飾、７）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の、非野生型スプライシングパターンの存在、８）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の非野生型レベル、９）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子の、対立遺伝子の欠損、および１０）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白の、不適切な翻訳後修飾、が少なくとも１つ存在することを確かめることによって検出できる。本明細書に記載のように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における変化を検出するために使用できる、当該分野で知られている多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、対象より従来の方法により単離した、組織または血清サンプル、例えば心臓組織サンプルである。
【０１５９】
特定の具体例において、変化の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許Nos. ４,６８３,１９５および４,６８３,２０２を参考のこと）における、またはまた、ライゲート連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegranら、（１９８８） Science ２４１：１０７７−１０８０；およびNakazawaら、（１９９４） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：３６０−３６４を参考のこと）における、プローブ／プライマーの使用を含み、後者は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における点変異の検出に特に有効でありえる（Abravayaら、（１９９５） Nucleic Acids Res. ２３：６７５−６８２を参考のこと）。この方法は、患者由来の細胞のサンプルを採取し、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、核酸サンプルを、（仮に存在するなら）ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションする１つまたはそれ以上のプライマーと接触させ、および増幅生成物の存在または非存在を検出、または増幅生成物の大きさを検出し対照サンプルと長さを比較するという工程を含むことができる。予想されるように、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載の変異を検出するために使用されるいずれかの技術と併用して、予備的な増幅工程として使用することが望ましいであろう。
【０１６０】
代わりの増幅方法は：自律的配列複製（Guatelli, J.C.ら、（１９９０） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Kwoh, D. Y.ら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardi, P. M.ら、（１９８８） Biotechnology ６：１１９７）、または他のいずれかの核酸増幅方法を含み、続いて当業者によく知られている技術を使用して、増幅された分子を検出する。これらの検出スキームは、仮にかかる分子が非常に少ない場合に、核酸分子を検出するのに特に有効である。
【０１６１】
代わりの具体例において、サンプル細胞由来のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における変異は、制限酵素の切断パターンにおける変化により同定できる。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡを、単離し、（作動可能に）増幅し、１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、および断片長の大きさは、ゲルエレクトロポレーションにより決定し、比較する。サンプルおよび対照ＤＮＡの間での断片長の大きさにおける違いは、サンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許番号５,４９８,５３１を参考のこと）の使用は、リボザイム切断部位の発達または喪失により、特異的変異の存在を集計するために使用できる。
【０１６２】
他の具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１における遺伝的変異は、サンプルおよび対照核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、何百、何千ものオリゴヌクレオチドプローブ（Cronin, M. T.ら、（１９９６） Hum. Mutat. ７：２４４−２５５；Kozal, M. J.ら、（１９９６） Nat. Med. ２：７５３−７５９）を含むような高密度配列で、ハイブリダイゼーションすることによって同定できる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１における遺伝的変異は、Cronin, M. T.ら（１９９６）前掲に記載のような光発生ＤＮＡプローブを含む、二次元配列において同定できる。要するに、プローブの第一のハイブリダイゼーション配列は、配列の重複プローブの直線配列を作成することによって、配列の間の塩基変化を同定するための、サンプルおよび対照におけるＤＮＡの全長に渡って走査するために使用できる。この工程により点変異の同定が可能となる。この工程の後に、検出される全ての変種または変異に相補的である、小さく、特殊なプローブ配列を使用することで、特異的変異の特性化を可能とする、第２のハイブリダイゼーション配列が続く。各変異配列は、１つは野生型遺伝子に相補的であり、もう１つは変異遺伝子に相補的である、類似のプローブセットを含む。
【０１６３】
さらに他の具体例において、当該分野で知られている様々な配列決定反応のいずれかは、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子を直接に配列決定するため、およびサンプルＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の配列と、対応する野生型（対照）配列と比較することによって、変異を検出するために使用できる。配列決定反応の例は、MaxamおよびGilbert（（１９７７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：５６０）、またはSanger（（１９７７） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：５４６３）によって開発された技術に基づくものを含む。様々な自動化配列決定手順のいずれかは、質量分析法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Cohenら、（１９９６） Adv. Chromatogr. ３６：１２７−１６２；およびGriffinら、（１９９３） Appl. Biochem. Biotechnol. ３８：１４７−１５９を参考のこと）を含む、診断アッセイ（（１９９５） Biotechniques １９：４４８）を実施する場合に利用できると考えられる。
【０１６４】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における変異を検出するための他の方法として、切断物質から保護してＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロニ量体における不対合塩基を検出する方法（Myersら、（１９８５） Science ２３０：１２４２）が挙げられる。一般に、「不対合切断」の技術は、組織サンプルより得られる、変異する可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡと共に、野生型ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列を含む、ハイブリダイゼーションしている（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡにより形成されるヘテロニ量体を提供することにより開始する。２本鎖ニ量体を、対照およびサンプルの鎖の間での塩基対不対合により存在するであろう、二量体の１本鎖領域を切断する物質で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡニ量体は、ＲＮａｓｅで処理でき、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、不対合領域を酵素的に消化するまでＳ１ヌクレアーゼで処理できる。他の具体例において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡニ量体のいずれかは、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、および不対合領域を消化するためにピペリジンで処理できる。不対合領域を消化した後、ついで得られる物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で大きさにより分離し、変異の部位を決定する。例えば、Cottonら、（１９８８） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：４３９７；Saleebaら、（１９９２） Methods Enzymol. ２１７：２８６−２９５を参考のこと。好ましい具体例において、対照となるＤＮＡまたはＲＮＡが検出のために標識されうる。
【０１６５】
さらに他の具体例において、不対合切断反応は、細胞のサンプルより得られるＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１  ｃＤＮＡｓにおける点変異を検出およびマッピングするための、定義済みの系において、２本鎖ＤＮＡにおいて不対合塩基対を認識する、１つまたはそれ以上の蛋白（いわゆる、「不対合修復」酵素）を使用する。例えば、イー・コリの変異Ｙ酵素は、Ｇ／Ａ不対合においてＡを切断し、ヒーラ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／Ｔ不対合においてＴを切断する（Hsuら、（１９９４） Carcinogenesis １５：１６５７−１６６２）。典型的な具体例によると、Ｂ７−４配列に基づくプローブ、例えば野生型ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１配列は、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ生成物にハイブリダイズする。二量体を、ＤＮＡ不対合修復酵素で処理し、あるならば、切断生成物が電気泳動プロトコールなどから検出できる。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参考のこと。
【０１６６】
他の具体例において、電気泳動易動度における変化は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子における変異を同定するために使用できる。例えば、１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）は、変異体および野生型核酸の間での、電気泳動易動度における違いを検出するために使用できる（Oritaら、（１９８９） Proc Natl. Acad. Sci. USA： ８６：２７６６、Cotton（１９９３） Mutat. Res. ２８５：１２５−１４４；およびHayashi（１９９２） Genet. Anal. Tech. Appl. ９：７３−７９も参考のこと）。サンプルおよび対照のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸の、１本鎖ＤＮＡ断片は、変性および復元できる。１本鎖核酸の二次構造は、配列にしたがって変化し、電気泳動易動度において生じる変化により、単一塩基変化でさえ検出できる。ＤＮＡ断片は、標識プローブにより、標識または検出できる。アッセイの感度は、二次構造が、配列における変化により感度がいい、（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを使用することで増強するだろう。好ましい具体例において、対象方法は、電気泳動易動度における変化に基づいて、２本鎖ヘテロニ量体分子を分離するヘテロニ量体分析を利用する（Keenら、（１９９１） Trends Genet. ７：５）。
【０１６７】
さらに他の具体例において、濃度勾配のある変性剤を含むポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型断片の移動を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイする（Myersら、（１９８５） Nature ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析の方法として使用する場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによる、おおよそ４０塩基対の高融点のＧＣが豊富なＤＮＡのＧＣクランプを加えることにより、完全に変性しないよう保証するために修飾できる。さらなる具体例において、対照およびサンプルＤＮＡの易動度における違いを同定するために、変性勾配の変わりに温度勾配を使用する（RosenbaumおよびReissner（１９８７） Biophys. Chem. ２６５：１２７５３）。
【０１６８】
点変異を検出するための他の技術の例は、排他的ではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー拡張を含む。例えば、既知の変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、ついで完璧な適合と判明した場合に限り、ハイブリダイゼーションを可能とする条件下において、標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる（Saikiら、（１９８６） Nature ３２４：１６３）；Saikiら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：６２３０）。オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション膜に付加し、標識された標的ＤＮＡでハイブリダイズする場合、かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ、または多くの異なる変異にハイブリダイズする。
【０１６９】
また、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と併用して使用できる。特異的増幅に用いるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、（増幅が差動ハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中心で（Gibbsら、（１９８９） Nucleic Acids Res. １７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で、不対合がポリメラーゼ拡張を抑制または減少できる、１つのプライマーの極限の３´末端において（Prossnerら、（１９９３） Tibtech １１：２３８）、目的とする変異を運ぶことができる。加えて、切断に基づく検出を生成するために、変異領域において、新規制限部位を導入することが望ましい（Gaspariniら、（１９９２） Mol. Cell Probes ６：１）。特定の具体例においては、増幅はまた、増幅に用いるＴａｑリガーゼを使用して行うことができる（Barany（１９９１） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９）。かかる場合において、増幅の存在または非存在を探すことにより、特異的部位における既知の変異の存在を検出することを可能とする、５´配列の３´末端における完璧な適合がある場合に限り、ライゲーションは生じるだろう。
【０１７０】
本明細書に記載の方法は、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１遺伝子を含む疾患または病気の症状または家族歴を示す患者を診断するような臨床条件において便利よく使用できる、例えば、本明細書に記載のプローブ核酸または抗体試薬を少なくとも１つ含む、包装済みの診断キットを利用することにより行うことができる。
さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１が発現される、いずれかの細胞型または組織は、本明細書に記載の予後アッセイにおいて利用できる。
【０１７１】
Ｖ．治療方法：
本発明は、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化に関連する疾患の危険があるか（または感受性がある）、または疾患を有する対象を治療する、予防的および治療的の両方の方法を提供する。本発明の１つの態様は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する物質を用いて免疫反応を調節する方法に関する。１つの具体例において、物質はＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナル化を増加させ、免疫反応をダウンレギュレートさせる。所望の、免疫反応のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを得るために、Ｂ７−Ｌ１およびＢＴＦ４の両方のシグナル化を操作することは有利であろう。好ましい具体例において、アネルギーが、免疫細胞において誘導される。
【０１７２】
好ましくは、調節物質を、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）と接触させる。接触はインビボまたはインビトロで生じうる。インビトロでの接触は、例えば、治療剤（例えば、生体外治療剤）の調製における、当然の事として、またはエクスビボでの細胞の調節のために行うことができる。インビボでの接触は、例えば当然の事ながら、以下でより詳細に記載されるが、免疫反応のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションより利益を得るだろう個体の治療において行うことができる。
本明細書に記載の治療的および予防的方法は、免疫反応の調節より利益を得るだろう個体に対して使用できる。
【０１７３】
Ａ．予防的方法
１つの態様において、本発明は、対象において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する物質を対象に予防的に投与することにより、異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルと関連した疾患または状態を抑制する方法を提供する。異常なＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルが原因となるか、または助長する疾患の危険がある対象は、例えば、本明細書に記載の診断または予後アッセイのいずれか、または組み合わせにより同定できる。予防的物質は、病気または疾患が抑制または、代わりに進行を遅らされるように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナル異常の特性を示す症状が出現するより前に投与することができる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナル異常または状態の型に依存して、例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチド、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１作動薬またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１拮抗薬が、対象を治療するために使用できる。適切な物質は、臨床適応に基づいて決定でき、例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用して同定できる。
【０１７４】
Ｂ．治療的方法
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１が、活性化された免疫細胞の共同刺激および増殖を阻害し、阻害シグナルを免疫細胞に伝達することが証明されてきた。したがって、このシグナル化は免疫反応を調節するために調節できる。当然のことながら、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の阻害は免疫反応のアップレギュレーションにつながるが、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の刺激または活性化は免疫反応のダウンレギュレーションにつながる。
【０１７５】
本発明は、個体において、一次および二次免疫反応の両方を調節するために使用できる。以下の実施例のセクションにおいて詳細となる実験は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルの調節は直接、一次Ｔ細胞免疫反応を調節することを示す。個体におけるＴ細胞活性のかかる調節はさらに、二次免疫反応に作用するだろう。個体のＴ細胞免疫反応の直接的な調節に加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルの調節もまた、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体を発現する他の免疫細胞により増加する、免疫反応の類似の調節に直接つながり、個体の免疫反応に直接作用することが予想される。個体の免疫反応は、抗体生成、免疫細胞増殖、サイトカインの放出、細胞表面マーカーの発現、細胞毒性などをアッセイすることによって、決定できる。
【０１７６】
本発明の調節方法は、細胞を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の調節因子（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現または活性を調節する物質、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１を擬態するか、または阻害する物質、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と受容体との相互作用を調節する物質）と接触させることを含む。本明細書において、調節物質ともいう、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する物質はまた、上記に詳述されている。調節物質の性質および機序は、どの細胞が調節物質と接触し、免疫反応にて所望の効果を生成するかを決定するであろう。
【０１７７】
調節物質は、インビトロで（例えば、細胞を物質と接触させることによって）、またはまた、インビボで（例えば、物質を対象に投与することによって）投与できる。かかるように、本発明は、免疫反応の調節より利益を得るだろう病気または疾患、例えば免疫反応のアップまたはダウンレギュレーションより利益を得るだろう疾患、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または核酸分子の異常な発現または活性により特性化される疾患に罹患している個体を治療するための方法を提供する。１つの具体例において、該方法は、物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定する物質）、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）物質の組み合わせを投与することを含む。
【０１７８】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化のアップレギュレーションは、免疫反応が、異常に高い状況において（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルが異常に低い状況において）、および／または増加したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルによって増強された免疫反応が、有益な効果を有する可能性のある状況において望ましい。同様に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の阻害は、免疫反応が異常に弱い状況において、および／または減少したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルが有益な効果を有する可能性のある状況において望ましい。
【０１７９】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を減少することによって免疫反応をアップモジュレートする際に使用する典型的な物質（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１拮抗薬）は、排他的ではないが：アンチセンス分子、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１に結合し、各受容体への結合を阻害する抗体、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１と免疫細胞上の受容体の相互作用を遮断する化合物（例えば、可溶性で一価のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子、およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の可溶形態または対象のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物）を含む。排他的ではないが：アンチセンス分子、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に結合するが、免疫細胞に阻害シグナルを変換しない抗体（「非活性化抗体」）、およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の可溶形態を含む、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の阻害剤（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体拮抗薬）もまた含む。
【０１８０】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強することによって免疫反応をダウンモジュレートする際に使用する典型的な物質（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１作動薬）は（例えば）：ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸分子、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の多価形態、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現を増加する化合物、およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の活性形態を発現する細胞を含む。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の活性を増強する際に使用される物質（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体作動薬）として、排他的ではないが：ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に結合および活性化する抗体、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の発現を増強する化合物、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体をコードする核酸分子、およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子の活性形態もまた含む。１つの具体例において、物質は活性化受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＤ３）に拘束すると同時に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ｎ受容体を拘束する。
【０１８１】
Ｃ．ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強することによる、免疫反応のダウンレギュレーション
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化をアップレギュレートし、それによって免疫反応をダウンレギュレートするための方法の具体例が多数ある。ダウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫反応を阻害または遮断する形態でありえるか、または免疫反応の誘導を抑制することを含んでもよい。活性化された免疫細胞の機能は、免疫細胞反応をダウンレギュレートすることによって、または免疫細胞内に特異的なアネルギーを誘導することによって、またはその両方によって阻害できる。１つの具体例において、免疫反応は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１が結合する受容体によるシグナルの伝達によってダウンレギュレートし、耐性を誘導する。
【０１８２】
各受容体に結合および活性化するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の形態、例えば細胞表面上の多価のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１は、免疫反応をダウンモジュレートするために使用できる。同様に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体経路もまた、物質の使用によって刺激でき、それによって免疫反応をダウンモジュレートする。かかる物質の１つの例は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体に交差結合し、受容体が位置する免疫細胞に負のシグナルを提供する活性化抗体である。
【０１８３】
本発明の１つの具体例において、受容体活性を刺激するために使用される活性化抗体は、二重特異性抗体である。例えば、かかる抗体は、受容体結合部位、および免疫細胞上の、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、または骨髄細胞上の、表面受容体を標的とする他の結合部位を含むことができる。１つの具体例において、かかる抗体は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体結合部位を含むことに加えて、さらに特異的細胞集団に対して分子を標的とするため、受容体、例えばＢ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体またはＦｃ受容体に近接する分子に結合する結合部位を含むことができる。例えば、ＣＤ３抗原、Ｔ細胞受容体鎖、ＬＦＡ−１、ＣＤ−２、ＣＴＬＡ−４、免疫グロブリン、Ｂ細胞受容体、Ｉｇアルファ、Ｉｇベータ、ＣＤ２２、またはＦｃ受容体を使用できる。かかる抗体（または他の二重特異性物質）は、当該分野で認識され、例えば本明細書に記載のように生成できる。二重特異性抗体に対するこの二次抗原の選択は、阻害するよう標的とされる細胞集団の選択において柔軟性を提供する。
【０１８４】
他の具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体、および細胞上の他の（活性化または阻害）受容体の共同ライゲーションにより、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体による負のシグナルの発生を増強できる。かかる共同ライゲーションは、例えば二重特異性物質、例えば共同ライゲートされる両方の受容体に対する特異性を有する、本明細書に記載されるような二重特異性抗体の使用によって達成できる。他の具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体によって負のシグナルを伝達する物質の多価形態、例えばビーズ上または表面上に提示される物質の使用は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体による負のシグナルの伝達を増強するために使用できる。他の具体例において、かかる多価物質は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体および他の受容体、または受容体関連分子（例えば、抗ＣＤ３およびＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のいずれかを含むビーズ）を共同ライゲートするための特異性を二つ含むことができる。
【０１８５】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１とこれらの受容体との相互作用を遮断または阻害する物質（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の可溶形態またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１への遮断抗体）は、免疫細胞の増殖および／またはエフェクター機能を阻害する能力、またはインビトロアッセイに加えられた場合にアネルギーを誘導する能力によって同定できる。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１媒介阻害シグナルを促進する物質、または受容体を活性化するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体の作動薬（例えば、受容体活性化抗体または受容体活性化小分子）は、インビトロアッセイに加えられた場合に、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強する能力によって同定できる。例えば、標準化Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、細胞は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の存在下でＴ細胞活性化を刺激する物質の存在下で培養できる。当該分野が認識する細胞活性化の多数の読み出しは、例えば活性化物質の存在下における細胞増殖またはエフェクター機能（例えば、抗体生成、サイトカイン生成、食作用）を測定するために利用できる。試験物質の、活性化に対するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１のダウンモジュレーション効果を遮断または増強する能力は、物質が、増殖において各々増加または減少に効果を与える能力、または測定されるエフェクター機能を測定することによって、簡単に決定できる。
【０１８６】
本発明の１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強する物質と共に、抗原を共同投与することによって、耐性が特異的抗原に対して誘導される。例えば、特異的抗原によって特異的に活性化される免疫細胞において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを増加することによって、耐性を特異的抗原に対して誘導できる。これは例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを増加する物質と組み合わせて抗原（例えば、抗原および物質は物理的に結合している）を投与することにより達成できる。例えば、ＶＩＩＩ因子を頻繁に受ける患者は、この凝固因子に対する抗体を発生する。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強する物質を、組換えＶＩＩＩ因子と組み合わせて（または、例えば交差結合によってＶＩＩＩ因子に物理的に結合して）共同投与すると、ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応のダウンモジュレーションを生じることができる。このように、免疫反応が望ましくない、アレルギーまたは異種蛋白に対する免疫反応を阻害できる。
【０１８７】
１つの具体例において、２つの分離ペプチド（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強する物質、および共同刺激性Ｂリンパ球抗原（例えばＢ７−１またはＢ７−２）の活性を阻害するための二次物質（例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−１に対する遮断抗体と結合したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の作動薬））は、単一の組成物として結合できるか、または分離して（同時に、または連続して）投与でき、対象において免疫細胞媒介免疫反応をダウンレギュレートする。さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増強する１つまたはそれ以上の物質の、医薬的に活性のある量は、免疫反応に影響する、他のダウンモジュレーション試薬と併用して使用できる。他の免疫調節試薬の例は、（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳに対して）共同刺激シグナルを遮断する抗体、ＣＴＬＡ４による阻害シグナルを活性化する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する（例えば、ＣＤ４０に対する、ＣＤ４０リガンドに対する、またはサイトカインに対する）抗体、融合蛋白（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、ＰＤ−１−Ｆｃ）および免疫抑制薬剤（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）を含む。
【０１８８】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ペプチド、またはその類似物はまた、細胞を破壊することによって免疫細胞の機能を遮断する医薬物質を組み立てる場合に有効であろう。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの一部は毒素に結合でき、細胞障害性物質が、結合する細胞の破壊を誘発できるようにする。
細胞障害性物質を作成するために、当該分野で知られている技術、例えば、交差結合または組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチドを毒素に結合または作動可能に付加する。免疫毒素の調製は、一般に当該分野でよく知られている（例えば、米国特許第４,３４０,５３５号およびＥＰ４４１６７を参考のこと（これらは両方その出典を明示することで本明細書の一部とする））。毒素部分をポリペプチドと複合させるように、巧みに利用できる、リンカーを含む多数の型のジスルフィド結合が知られている。１つの具体例において、立体的に「込み合った」ジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボにおけるより大きな安定性を有し、このため作用部位における結合より前に、毒素部分の放出を抑制するため好ましいだろう。
【０１８９】
本発明のポリペプチドまたは抗体に複合されるだろう、幅広い種類の毒素が知られている。例は：一例として、様々なＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖、サポリンまたはゲロニンなどのリボゾーム不活性化蛋白、アルファ−サルシン、アルペルギリン、レストリクトシン、胎盤リボヌクレアーゼなどのリボヌクレアーゼ、アンギオジェニック、ジフテリア毒素、およびシュードモナス外毒素などを含む、多数の有効である植物、真菌または細菌由来の毒素を含む。本発明と関連して使用するのに好ましい毒素部分は、炭水化物残基を修飾または除去するよう処理された毒素Ａ鎖である、デグリコシルＡ鎖である（米国特許第５,７７６,４２７号）。
【０１９０】
かかる細胞障害性物質を単独でまたは組み合わせて（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１リシンを単独でまたはＢ７−２リシンまたはＢ７−１リシンと単独でまたは組み合わせて）患者に注入すると、特に、より多くの量のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１受容体を発現する活性化免疫細胞を鑑みれば、免疫細胞の死が生じるだろう。例えば、受容体は、活性化リンパ球の表面上に誘導されるだろうから、受容体に対する抗体は、Ｆｃ−Ｒ依存性機序によって、または細胞障害性薬剤（例えば、リシン、サポリンまたはカリケアマイシン）を抗体に複合させることによる消耗によって、これらの特異的細胞の減少を標的とするために使用できる。１つの具体例において、抗体毒素は、二重特異性抗体でありえる。かかる二重特異性抗体は、例えば特定の型の細胞においてのみ見られるマーカー、例えばＴＣＲ、ＢＣＲまたはＦｃＲ分子を使用して、特異的細胞集団を標的とするのに有効である。
【０１９１】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化のアップレギュレーションは、例えば、組織、皮膚および臓器移植の状況において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）において、免疫反応をダウンレギュレートするために有効である。不適切な、または異常な免疫反応を含むか、またはそれにより引き起こされる状態を有する個体は、免疫反応のダウンレギュレーションより利益を得るだろう。かかる状態は、排他的ではないが、臓器または組織移植、アレルギー、または自己免疫疾患を有することを含む。不適切な、または異常な免疫反応に関連した自己免疫病または疾患の例は、間接リウマチ、若年性間接リウマチ、乾癬性間接炎、アレルギー、接触皮膚炎、乾癬、ハンセン病逆転反応、アレルギー性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、急性壊死性出血性脳脊髄炎、特発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、クレーブス眼疾患、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性若年性糖尿病、シェーグレン症候群に関連する乾性眼症、後部ぶどう膜炎、および間質性肺線維症を含む。
【０１９２】
例えば、免疫細胞機能の遮断により、組織移植において、組織の破壊が減少する。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶は、免疫細胞により異種として認識されることを通して開始し、移植片を破壊する免疫反応が続く。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増加を阻害する分子（ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１ポリペプチドの可溶形態、単量形態など）を、単独で、または移植の前か、または移植と同時に他のダウンレギュレーション性物質と併用して投与することにより、共同刺激シグナルの発生を阻害できる。さらに、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルの促進はまた、免疫細胞をアネルギー化するのに十分であり、それによって対象において耐性を誘導する。増加したＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルによって免疫反応をダウンモジュレートする耐性を長期間誘導することは、これらの試薬を繰り返して投与する必要を回避するだろう。
【０１９３】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを増加させる物質による免疫反応のダウンレギュレーションを、免疫細胞を、免疫反応をダウンレギュレートする（付加的）物質とさらに接触させることによって増強する。同様に、抗原提示細胞を、免疫細胞反応のダウンレギュレーションをさらに引き起こすために（例えば、ＰＤ−Ｌ１などの、免疫細胞反応をダウンレギュレートするだろう付加的分子を発現するために）操作する。この組み合わせ治療は、対象において、十分な免疫抑制または耐性を達成するために必要で、これはまた、他の分子の共同刺激機能を遮断するために理想であろう。例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ７−４などの、他のＢ７ファミリーメンバーの機能を付加的に遮断するために理想であろう。Ｂ７共同刺激活性の遮断を、Ｂ７分子が天然のリガンドに結合する能力に干渉する物質および／またはサイトカイン生成および／または増殖により測定される、Ｂ７分子が免疫反応（例えば、Ｔ細胞反応）を調節する能力に干渉する物質を使用して達成する。典型的な物質は、遮断抗体、Ｂ７分子が天然のリガンドに結合する能力を遮断するが、天然のリガンドを通してシグナルを伝達できないペプチド、ペプチド類似物、小分子、および同様のものを含む。投与は、分離して、または単一の組成物として一緒に行われ、病気の発症または移植の前に、または同時に行われる。
【０１９４】
本発明のダウンモジュレーション方法と一緒に使用できる他のダウンモジュレーション物質は、例えば、ＣＴＬＡ４による阻害シグナルを伝達する物質、ＣＴＬＡ４の可溶形態、ＣＴＬＡ４による阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーに対する遮断抗体または他の受容体リガンド対の可溶形態（例えば、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド（例えば、抗ＣＤ４０リガンド抗体）の間での相互作用を破壊する物質、サイトカインに対する抗体、または免疫抑制剤）を含む。
【０１９５】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させることによる、免疫反応のダウンモジュレーションはまた、自己免疫性疾患を治療するのに有効である。多くの自己免疫性疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾患病理に関わる、サイトカインおよび自己抗体の生成を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を抑制することで、疾患の症状は軽減または消失するだろう。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させることによって、免疫細胞の共同刺激を遮断する物質の投与は、免疫細胞活性化を阻害し、疾患の過程に関わる自己抗体またはサイトカインの生成を抑制するのに有効である。加えて、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させる物質は、疾患からの長期間の緩和につながりえる、自己反応性免疫細胞の抗原特異的耐性を誘導するだろう。自己免疫疾患を抑制または軽減する際における試薬の有効性は、ヒト自己免疫疾患の、多くの高度に特性化される動物モデルを使用して決定できる。例として、ネズミ実験用自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、ネズミ自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、およびネズミ実験用重症筋無力症を含む（Paul編、Fundamental Immunology, Raven Press, New York, １９８９、８４０−８５６頁を参考のこと）。
【０１９６】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を通して、免疫細胞活性化を阻害するための免疫反応の阻害は、例えばＩｇＥ生成を阻害することによる、アレルギーおよびアレルギー反応の治療において、治療的に有効である。ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を増加させることによって、免疫反応をダウンモジュレートする物質は、対象において免疫細胞が媒介するアレルギー反応を阻害するために、アレルギー対象に投与できる。投与は、適切なＭＨＣ分子と共にアレルゲンへの曝露を伴う。アレルギー反応は、アレルゲンの進入ルートおよび肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥの析出パターンに依存して、天然において全身性または局所性となりえる。このように、投与は、（例えば、局所反応を阻害するために）局所性、または（例えば、全身性の反応を阻害するために）全身性となるだろう。
【０１９７】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を通して、免疫細胞活性化を阻害するための免疫反応の阻害はまた、免疫細胞のウイルス感染において治療的に重要だろう。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、免疫細胞活性化はウイルスの複製を刺激する。感染した免疫細胞機能のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１誘導シグナルを増加することは、ウイルス複製を阻害し、およびそれによってＡＩＤＳの経過を改善するだろう。
【０１９８】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を通した、免疫反応のダウンレギュレーションはまた、自己組織の自己免疫発作を治療する際に有効だろう。例えば、Ｂ−７ファミリーメンバー（例えば、Ｂ７−４）は、通常は心臓において高度に発現し、自己免疫発作より心臓を保護することが知られている。これは、Ｂａｌｂ／ｃＰＤ−１ノックアウトマウスが、血栓症を伴う心臓に対する大きな自己免疫発作を示すという事実が証拠となる。このように、自己免疫発作により引き起こされるか、または悪化する状態（例えば、この例においては、心臓疾患、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化）は、Ｂ７ファミリーメンバーの活性を増加させることによって改善または好転するだろう。したがって、自己免疫疾患などの自己免疫発作によって悪化する状態（ならびに、心臓疾患、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化などの状態）を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を刺激することによって、調節することは、本発明の範囲内である。
【０１９９】
Ｄ．免疫反応のアップレギュレーション
免疫反応をアップレギュレートする方法としてＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を阻害することはまた、治療において有効である。低活性の免疫反応を含むか、またはそれにより引き起こされる状態を有する個体は、免疫反応のアップレギュレーションより利益を得るだろう。免疫反応のアップレギュレーションは、既存免疫反応を増強するか、または開始免疫反応を誘発する形態でありえる。例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を増強することを通して免疫反応を増強することは、微生物、例えば細菌、ウイルスまたは寄生虫に感染した場合、また免疫抑制疾患または腫瘍が存在する場合に有効である。かかる個体の治療を達成するために、本明細書に記載される、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害する作動薬または他の物質を、患者に投与するか、別法として生体外治療において使用する。例えば、１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を阻害する物質の投与は、抗体および細胞媒介反応のアップレギュレーションが、より急速で徹底的にウイルスを除去するために有益であるだろう状況において、治療上有効である。これらは、かかる物質が皮膚に局所的にデリバリーされえるヘルペスまたは帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患を含む。加えて、インフルエンザ、風邪および脳炎などの全身性ウイルル疾患は、かかる試薬を全身性に投与することにより軽減するだろう。
【０２００】
特定の例において、免疫反応をさらに増加するために、共同刺激受容体によってシグナルを変換する、Ｂ７ファミリーメンバーの形態などの、免疫反応をアップレギュレートする他の物質をさらに投与することが望ましい。本発明の１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを減少する物質による（例えば、抗原提示細胞または免疫細胞に作用することによる）免疫反応のアップレギュレーションは、免疫細胞を、行動刺激分子などの、免疫反応をアップレギュレートする（付加）物質とさらに接触させることにより増強する。
【０２０１】
また、免疫反応は、免疫細胞を患者より除去し、免疫細胞を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化の増強を阻害する物質と接触させることを含む方法により、免疫細胞を活性化し、インビトロで刺激される免疫細胞を患者に再導入することにより、感染した患者において増強できる。
【０２０２】
ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害する物質は、様々なポリペプチド、例えば病原体由来のポリペプチドに対するワクチンにおいて、予防的に使用できる。病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫は、適切なアジュバント含まれる形態の物質と一緒にウイルス蛋白でワクチンを接種することで誘導できる。また、病原体抗原および物質形態の両方をコードする遺伝子を含むベクターを、ワクチン接種に利用できる。核酸ワクチンは、様々な方法、例えば、注射（例えば、筋肉内、皮内、または皮膚内に粒子を注入するために、粒子加速器または圧縮ガスを使用する遺伝子銃を用いての、ＤＮＡ被覆金粒子の、表皮内への生物学的注入（Haynesら、１９９６.  J. Biotechnol.  ４４：３７））により投与できる。また、核酸ワクチンは、非浸襲的方法により投与できる。例えば、純粋または脂質調剤ＤＮＡは、呼吸器系またはどこか他の標的、例えばＤＮＡの経口デリバリーによってパイエル板（Schubbert.  １９９７. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：９６１）にデリバリーできる。弱毒化された微生物は、粘膜表面へのデリバリーに使用できる（Sizemoreら、１９９５. Science. ２７０：２９）。
【０２０３】
１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害する物質は、共同刺激分子（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−４などのＢ７ファミリーメンバー）と共に投与でき、Ｔ細胞が活性化し、感染からの免疫を提供する。例えば、ワクチンが有効である病原体は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリアおよび住血吸虫症を含む。
【０２０４】
他の適応において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害することによる免疫反応のアップレギュレーションは、腫瘍免疫の誘導において有効である。Ｂ７共同刺激抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−４）をコードする核酸分子と共にトランスフェクションされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞種、癌）は、対象における腫瘍特異性耐性を打開するために、対象に投与できる。腫瘍細胞による、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを阻害する物質（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の発現を阻害する物質）の発現はさらに、腫瘍免疫を増強するだろう。仮に理想であるなら、腫瘍細胞は、Ｂ７ポリペプチド（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−４）の組み合わせを発現するために、トランスフェクションできる。例えば、患者より採取される腫瘍細胞は、物質およびＢ７共同刺激抗原の発現を誘導する発現ベクターと共に、生体外でトランスフェクションできる。腫瘍免疫の誘導はまた、腫瘍細胞により、物質単一の発現から生じるだろう。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻し、トランスフェクションされた細胞により、コードされたペプチドの発現が生じる。また、遺伝子治療技術は、インビボでのトランスフェクションのための腫瘍細胞を標的とするため、使用できる。
【０２０５】
他の具体例において、免疫反応は、既存の耐性を打開するように、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１が結合する受容体によるシグナル伝達を阻害することによりアップレギュレートできる。例えば、対象が、例えば腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する、重要な免疫反応を上昇できない抗原に対する免疫反応は、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１介在シグナル化を阻害する物質を投与することにより誘導できる。例えば、１つの具体例において、シグナルを遮断し、例えば腫瘍細胞に対する免疫反応を増強する可溶受容体または可溶ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１（例えば、ＢＴＦ４ＦｃまたはＢ７−Ｌ１Ｆｃ）。１つの具体例において、腫瘍特異的抗原などの自己抗原は、物質と共同で投与できる。他の具体例において、免疫反応を、抗原（例えば自己抗原）に対して刺激でき、神経疾患を治療できる。他の具体例において、物質は、能動免疫法の過程において、異種抗原に対する免疫を高めるためのアジュバントとして使用できる。
【０２０６】
さらに他の具体例において、機能性ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１（例えば、受容体に結合するＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の形態）の生成は、免疫反応をアップレギュレートするため、例えば、アンチセンスＲＮＡを使用して阻害できる。例えば、１つの具体例において、腫瘍細胞による、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１またはその機能性変種の生成を、抗腫瘍免疫を増加させるために阻害できる。
【０２０７】
１つの具体例において、免疫細胞を対象より採取し、培養し、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルを阻害する物質の存在下において、生体外で活性化することで、活性化免疫細胞の集団は拡大する。さらなる具体例において、免疫細胞をそれから、対象に投与する。免疫細胞は、例えば当該分野で知られている一次活性化および共同刺激シグナルを、免疫細胞に提供することにより、インビトロで増殖するよう刺激することができる。Ｂ７ファミリー蛋白の様々な形態はまた、免疫細胞の増殖を共同刺激するために使用できる。１つの具体例において、免疫細胞を、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６に記載される方法にしたがって、生体外で培養する。共同刺激分子は、可溶で、細胞膜に付加、またはビーズなどの固体表面に付加しえる。
【０２０８】
ＶＩ．医薬組成物
個体への投与のために、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１シグナルの調節因子（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１核酸分子、蛋白、先に記載の抗体、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１活性および／または発現の調節因子として、またはＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１の間での相互作用の調節因子として同定される化合物を含む、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１阻害性または刺激性物質）を投与に適切な医薬組成物に配合することが好ましいであろう。かかる組成物は典型的に、核酸分子、蛋白または抗体、および医薬上許容されるキャリアーを含む。本明細書に記載の、「医薬上許容されるキャリアー」なる語は、医薬投与と混合可能である、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌薬および抗真菌薬、等張性物質および吸収遅延物質、および同様のもののいずれか、または全てを含むことを意図している。医薬活性物質のための、かかる媒体および物質の使用は、当該分野においてよく知られている。いずれかの従来の媒体または物質が、活性化合物と混合できないことを除いて、組成物におけるその使用を意図する。補助的活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
【０２０９】
本発明の医薬組成物を、意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下を適用するために使用する溶液または懸濁液は、以下の成分：注入に用いる水などの消毒希釈剤、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンズなどの抗生物質；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファー、および緊張性の調節に用いる、ナトリウム塩化物またはＤ型グルコースなどの物質を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基で調節できる。非経口の調製は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスまたはプラスチックでできた複数回投与用水薬瓶に入れることができる。
【０２１０】
注入可能な使用に適切である医薬組成物は、（水溶性である）消毒水溶液または分散、および注入可能な消毒水溶液または分散を即席で調整するための消毒粉末を含む。静脈内投与のため、適切なキャリアーは、医薬生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水を含む。全ての場合において、組成物は消毒されていなくてはならず、注射器を使用する範囲では液体である。組成物は、製造および保存の条件下において安定してなくてはならず、細菌および菌類などの微生物の、汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、および同様のもの）、およびその適切な混合物を含む、溶媒または分散溶媒でありえる。適した流動性は、分散の場合には要求される粒径を維持することにより、および界面活性剤を使用することによって、例えば、レシチンなどを被覆することを使用して維持できる。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌および抗菌物質、例えば、パラベンズクロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、および同様のものにより達成できる。多くの場合において、等張物質、例えば砂糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含むことは好ましい。注入可能な組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸ナトリウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅らせる物質を組成物に含むことにより、もたらすことができる。
【０２１１】
消毒された注入可能溶液は、要求される量の活性化合物（例えば、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白または抗ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１抗体）に、上記の成分を１つ、または組み合わせて、適切な溶媒に組み込み、要求されるように続いてろ過滅菌することで調製できる。一般に、分散は、活性化合物を、上記のもの由来の塩基分散媒体および要求される他の成分を含む消毒ビヒクルに組み込むことで調製する。消毒された注入可能溶液の調整のための消毒粉末の場合において、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末に加えて、その前もって消毒ろ過した溶液由来の、いずれかの所望の追加成分を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２１２】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用キャリアーを含む。これらは、ゼラチンカプセルに入れるか、または錠剤に圧縮できる。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤に組み込むことができるか、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用できる。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のためのキャリアーを使用することで調製でき、液体キャリアー中の化合物は経口で適用され、口をゆすいで、吐くか、飲み込むかする。医薬上混合可能な結合物質および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチおよび同様のものは、以下の成分または類似の性質を持つ化合物：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；でんぷんまたはラクトースなどの賦刑剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジ香料などの香料添加剤のいずれかを含むことができる。
【０２１３】
非経口投与を代わりに利用してよい。吸入による投与において、化合物を、適切な高圧ガス、例えば二酸化炭素を含む圧縮容器またはディスペンサー、または噴霧器から、エアゾールスプレーの形態で投与する。全身投与もまた、経粘膜または経皮の方法により可能となる。経粘膜または経皮投与において、浸透に対するバリアに適切な浸透剤を、処方において使用する。かかる浸透剤は、一般に当該分野において知られており、例えば粘膜投与においては、合成洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、スプレー式点鼻薬または座薬の使用を通して達成できる。経皮投与において、一般に当該分野で知られている活性化合物を、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームの中に処方する。化合物はまた、（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの、従来の座薬基剤と共に）座薬または直腸デリバリーのための停留浣腸の形態で投与できる。
【０２１４】
１つの具体例において、調節物質を、インプラントおよびマイクロカプセルデリバリー系を含む調節放出製剤などの、体内からの急速な排出に対して化合物を保護するだろうキャリアーと共に調製する。エチレン酢酸ビニル、酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生体分解可能で、生体適合性のあるポリマーを使用することができる。かかる処方の調整に用いる方法は、当業者は理解するだろう。物質はまた、Alza Corporationより市販で入手でき、および（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で、感染細胞を標的とするリポソームを含む）Nova Pharmaceuticals, Inc.  Liposomal懸濁液はまた、医薬上許容されるキャリアーとして使用できる。これらは、例えば米国特許番号４,５２２,８１１に記載されるような、当業者に知られている方法にしたがって調製できる。
【０２１５】
投与の容易さ、および容量の均一性のために、容量単位形態に経口または非経口の組成物を処方することは特に有利である。本明細書に記載の、容量単位形態は、治療される対象への単位容量として適応した、物理的に別個の単位のことをいい；各単位は、要求の医薬的キャリアーと関連して、所望の治療効果を生成するよう予測された、所定量の活性化合物を含む。本発明の容量単位形態の規格は、活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果、および個体の治療に用いる、かかる活性化合物を混合する技術における特有の制限により変化し、直接依存する。
【０２１６】
医薬組成物を、投与のための使用説明書と一緒に、容器、包装またはディスペンサーに含むことができる。例えば、かかる診断キットは、毒素と複合した抗体を含むことができる。キットはさらに、抗体複合体、例えば１つまたはそれ以上のシリンジを投与するための方法を含むことができる。キットは、使用説明書と共に包装できる。
【０２１７】
かかる化合物の毒性および治療効果を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療効果的量）を決定するため、細胞培養における標準化医薬手順または実験動物により決定できる。毒性および治療的効果の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現できる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用できるが、非感染細胞への潜在的損害を最小限とし、それによって副作用を軽減するために、治療は、かかる化合物を罹患組織の部位に標的とするデリバリー系を組み立てるようにするべきである。
【０２１８】
細胞培養アッセイおよび動物研究より得られるデータは、ヒトにおいて使用する用量の範囲を処方する際に使用できる。かかる化合物の用量は、好ましくはほとんど、または全く毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、利用される用量形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化するだろう。本発明の方法で使用するいずれの化合物においても、治療効果的用量は、細胞培養アッセイより最初に推定できる。用量を、細胞培養において決定される、ＩＣ５０を含む循環血漿濃度の範囲（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を達成するため、動物モデルにおいて決定できる。かかる情報は、ヒトにおいて有効な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿におけるレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０２１９】
本発明の１つの具体例において、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１蛋白に結合する抗体の治療効果的量を個体に投与する。本明細書に定義される、抗体の治療効果的量（すなわち、効果的用量）は、約０．００１から３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびよりさらに好ましくは約１から１０ｍｇ／ｋｇ、２から９ｍｇ／ｋｇ、３から８ｍｇ／ｋｇ、４から７ｍｇ／ｋｇ、または５から６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。排他的ではないが、病気または疾患の重症度、それまでの治療、対象の一般健康およびまたは年齢、および他の疾患の存在を含む特定の因子は、効果的に個体を治療するのに要求される用量に影響するだろうということを、当業者は理解するだろう。さらに、個体を抗体の治療効果的量で治療することは、単一の治療を含むことができるか、または好ましくは一連の治療を含むことができる。好ましい具体例において、約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある抗体で、約１から１０週の間、好ましくは２から８週の間、より好ましくは約３から７週の間、およびさらにより好ましくは約４、５または６週、１週間につき１回、個体を治療する。治療に使用する抗体の効果的用量は、特定の治療の経過に渡って、増加または減少するだろうということもまた理解されるだろう。用量の変化は、本明細書に記載の診断アッセイの結果により生じるだろう。
【０２２０】
ＶＩＩ．本発明のＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１調節因子の投与
好ましくは、個体の適切な細胞（例えば、抗原提示細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞などの免疫細胞）を物質と接触するのに必要である方法で投与する。どの細胞に物質が接触するかは、使用される特定の物質、および治療される特定の状態に依存しており、当業者により決定できる。物質および調節因子を、所望の免疫反応の修飾を生成するために、独立して、または代わりに組み合わせて使用するだろう。これらをまた、同様に免疫反応を調節する追加物質と組み合わせて有利に使用できる。
【０２２１】
本明細書を通して引用される、全ての出典、係属特許出願および出版特許は、参考のため本明細書に明示的に添付する。本明細書で開示される各出典は、出典を明示することにより全体として本明細書の一部とする。
【０２２２】
実施例
実施例１．融合蛋白の生成
融合蛋白を、ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１分子のいずれかの細胞外領域を含むアミノ酸配列を使用して発生した。使用するＢＴＦ４配列は、米国出願番号０９／７４６,７８３におけるクローンｃｃ１３０＿１（受入番号ＡＴＣＣ９８５０１）として以前に報告された配列に対応する。融合蛋白を組み立てるために使用するＢ７−Ｌ１配列は、米国出願番号０９／０４７,６６１におけるクローンｃｒ１１６２＿２５として以前に報告された配列に対応する。Ｂ７−Ｌ１はまた、時々ＤＥ０１−８６として参照されることに留意する。ＢＴＦ４（配列番号：２に記載される１ないし２４９アミノ酸配列）またはＢ７−Ｌ１（配列番号：４に記載される１ないし３２３アミノ酸配列）の両方の融合蛋白を、ＢＴＦ４．ＦｃまたはＢ７−Ｌ１．Ｆｃを生成するため、いずれかの分子の細胞外領域を、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合することによって発生した。融合蛋白ＩＣＯＳ−Ｌ．Ｆｃ、ＰＤ−Ｌ１．Ｆｃ、Ｂ７−２．Ｆｃを、別法の標準化方法により、Freemanら（J. Exp. Med. １９２：  １０２７−１０３４（２０００）） の方法にしたがって発生した。生じる可溶構造物を、ならし培地を生成するためにＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。このならし培地をそれから、蛋白Ａアフィニティクトマトグラフィーにより精製した。
【０２２３】
発生したＢＴＦ４．Ｆｃ融合蛋白は、以下に示されるアミノ酸配列を有する。ＢＴＦ４部分を太字で示す：
【０２２４】
【表１】
2006502978.tif 000002
【０２２５】
発生したＢ７−Ｌ１．Ｆｃ融合蛋白は、以下に示されるアミノ酸配列を有する。Ｂ７−Ｌ１部分を太字で示す：
【０２２６】
【表２】
2006502978.tif 000003
【０２２７】
精製融合蛋白をそれから、Ｔ細胞に対する効果をアッセイした。
【０２２８】
実施例２．ＢＴＦ４またはＢ７−Ｌ１によるシグナル化は免疫細胞活性化をダウンモジュレートする
さらにＢ７−Ｌ１またはＢＴＦ４の機能を決定する目的で、各蛋白のＴ細胞活性化に対する効果を、標準化Ｔ細胞活性化アッセイにおいて決定した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、末梢血白血球から負の選択により精製した。前活性化Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化することにより調整し、続いてアッセイの準備の前に一晩置いた。トシル活性化磁気ミクロスフィア（Dynal, Great Neck, NY）を、製品使用説明書にしたがって、抗ＣＤ３ｍＡｂ（１μｇ／１０７ミクロスフィア）、およびＩＣＯＳ−Ｌ．Ｆｃ、ＰＤ−Ｌ１．Ｆｃ、Ｂ７−２．Ｆｃ、Ｂ７−Ｌ１．Ｆｃ、またはＢＴＦ４．Ｆｃ（４μｇ／１０７ミクロスフィア）で被覆した。ネズミＩｇＧまたは無関連融合蛋白を、ミクロスフィア（総蛋白＝５μｇ／１０７ミクロスフィア）の結合能力を飽和させるため使用した。抗ＣＤ３ビーズは、１μｇ／１０７ビーズ抗ＣＤ３および４μｇ／１０７ビーズ無関連融合蛋白を含んだ。
【０２２９】
前活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＢ７−Ｌ１．Ｆｃ融合蛋白、抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＢＴＦ４．Ｆｃ融合蛋白、抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＩＣＯＳ−Ｌ．Ｆｃ融合蛋白、抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＰＤ−Ｌ１．Ｆｃ融合蛋白、抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＢ７−２．Ｆｃ融合蛋白、または抗ＣＤ３ｍＡｂ単独のいずれかで被覆されたミクロスフィアに接触させた。蛋白で被覆されたミクロスフィアを、前活性化または静止ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）に、可溶抗ＣＤ３ｍＡｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において１：１の割合で加えた。ＩＣＯＳ−ＬおよびＢ７−２は、既知の共同刺激分子であり、一方ＰＦ−Ｌ１はＴ細胞活性化を阻害することが知られている。Ｔ細胞増殖をそれから定量化した。
【０２３０】
７２時間で増殖を、１μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジンで培養物を標識することで評価し、さらに６ないし１６時間培養した。結果を図１に提示する。抗ＣＤ３およびＩＣＯＳ−Ｌ．Ｆｃ被覆ビーズでの、または抗ＣＤ３およびＢ７−２．Ｆｃ被覆ビーズでの、予想されたＴ細胞の刺激は、実質的増殖を生成した。この増殖をさらに、可溶抗ＣＤ２８の存在下で増強した。ＰＤ−Ｌ１は、免疫抑制性受容体ＰＤ−１と相互作用することが知られている（Freeman, G. J.ら、（２０００） J. Exp. Med. １９２：１０２７−３４）。抗ＣＤ３およびＰＤ−Ｌ１．Ｆｃ被覆ビーズでのＴ細胞の刺激は、抗ＣＤ３でのみ被覆されたビーズにより誘導される増殖と比較して、増殖を減少させた。この減少した増殖は、可溶抗ＣＤ２８の存在によってほとんど増強しなかった。抗ＣＤ３およびＢ７−Ｌ１．Ｆｃ被覆ビーズ、または抗ＣＤ３およびＢＴＦ４．Ｆｃ被覆ビーズでのＴ細胞の刺激もまた、増殖を減少させ、この減少した増殖は、可溶抗ＣＤ２８の存在によってほとんど増強しなかった。これは、Ｔ細胞活性化に阻害性効果を生成するＢ７−Ｌ１およびＢＴＦ４介在シグナル化の効果と一致する。
【０２３１】
Ｂ７−Ｌ１が、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞の増殖反応を阻害するという発見は、以前の報告（例えばＷＯ００／０８１５８を参考のこと）とは対照的である。Ｂ７−Ｌ１およびＢＴＦ４の阻害性効果が、ＰＤ−Ｌ１の阻害性効果よりさらに顕著であったことを指摘することは興味深い。これらの結果は、Ｔ細胞上に発現するＢ７−Ｌ１またはＢＴＦ４受容体の関与が、これらの受容体を通した負のシグナルのデリバリーにつながり、Ｔ細胞受容体を通して活性化をダウンレギュレートすることを示す。これらの知見は、Ｂ７−Ｌ１および／またはＢＴＦ４介在シグナル化の作動薬または拮抗薬の開発は、Ｔ細胞活性化の調節に用いる治療法の開発につながるであろうことを示す。
【０２３２】
等価物
当業者であれば、単なる慣用的な実験を行うことで、本明細書に記載の具体的な例示と均等な多くの発明を認識するか、または確認することができるであろう。かかる等価物も添付した特許請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
（原文に記載なし）
【配列表】
2006502978.tif 000004
2006502978.tif 000005
2006502978.tif 000006
2006502978.tif 000007
2006502978.tif 000008
2006502978.tif 000009
2006502978.tif 000010
【図１Ａ】
2006502978.tif 000011
【図１Ｂ】
2006502978.tif 000012
【図１Ｃ】
2006502978.tif 000013
【図１Ｄ】
2006502978.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月16日(2005.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006502978000001.app
【国際調査報告】
2006502978.tif 000015
2006502978.tif 000016
2006502978.tif 000017
2006502978.tif 000018