(57)【要約】試料中の標的核酸の存在を検出するための方法において、−  非メチル化シトシンを修飾する作用物質で核酸を含有する試料を処理するステップ；−  核酸の標的領域に結合する能力を有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）の形態をとる検出リガンドを処理済み試料に供給し、検出リガンドが標的核酸に結合するのに充分な時間をおくステップ；及び−  標的核酸の存在を示すために試料中の核酸分子に対する検出リガンドの結合を検出するステップ、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
非メチル化シトシンを修飾する作用物質で核酸を含有する試料を処理するステップ；
核酸の標的領域に結合する能力を有するインターカレーティング核酸（intercalating  nucleic acid;ＩＮＡ）の形態をとる検出リガンドを、前記処理済み試料に供給し、前記検出リガンドが前記標的核酸に結合するのに充分な時間をおくステップ；及び
前記標的核酸の存在を示すために、前記試料中における核酸分子に対する前記検出リガンドの結合を検出するステップ、を含む方法。
【請求項２】
前記核酸が、真核生物、原核生物、ウイルスのゲノム、ミトコンドリア核酸、その他の細胞小器官内に見られる核酸、細胞外核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡ形態、並びにＤＮＡ及びＲＮＡの天然又は人工誘導体から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ及びＲＮＡの天然又は人工誘導体が、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣＮＡ及びそのキメラの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がゲノムＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物質が、重亜硫酸塩、酢酸塩又はクエン酸塩から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物質が、水の存在下でシトシンをウラシルへと修飾する試薬である重亜硫酸ナトリウムである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＮＡが、（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的領域が、前記未処理核酸内に少なくとも１つの５’−メチルシトシンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｎが可能性のある４つの塩基Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧのいずれか１つを表わすとき、前記検出リガンドが、ＤＮＡのＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有領域を標的とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡの前記ＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有領域が、
遺伝子の調節領域中にある、又は
化学物質、毒素、薬物、放射線、合成又は天然化合物、並びにウイルス、細菌、真菌及びプリオンなどの微生物又はその他の感染性物質を含む環境因子により活性が改変される、プロモータ、エンハンサ、腫瘍遺伝子、レトロエレメント、可動又は可動化可能な配列、を含む任意の調節因子または調節領域、あるいはその他の調節因子のエンハンサ中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料の処理に先立ち、前記核酸が、濃縮又は選択ステップに供される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃縮又は選択ステップが、音波処理及びせん断を含む物理的方法、及び、酵素消化、酵素処理、制限消化、ヌクレアーゼ処理、ＤＮａｓｅ処理、濃縮、抗体捕捉、酸性又は塩基性消化を含む化学的方法、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記濃縮又は選択ステップが、メチル化された核酸試料を得るための５’−メチルシトシンを標的とする抗体を用いる処理である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
核酸のメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有するつインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）の形態をとる検出リガンドを前記処理済み試料に供給することによって標的核酸のメチル化を検出する方法であって、
前記試料中の前記核酸に対する前記検出リガンドの結合の検出が、前記標的核酸のメチル化の程度を示す、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸配列の第１の部分を認識する能力を有する捕捉リガンドが固体支持体に結合され、前記処理済み核酸が第１の捕捉リガンドを介して支持体に結合するようにされており、
次に、前記結合した核酸が、前記標的核酸配列の第２の部分を認識する能力を有する検出リガンドに暴露され、前記検出リガンドが、支持体に結合された標的核酸に結合するのに充分な時間をおき、
前記支持体に結合した核酸に対する前記検出リガンドの結合が、前記試料中の前記標的核酸の存在を判定するために測定され、
前記捕捉リガンド又は前記検出リガンドのうちの少なくとも１つがＩＮＡリガンドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リガンドが、ＩＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ＬＮＡプローブ、ＨＮＡプローブ、ＡＮＡプローブ、ＭＮＡプローブ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、抗体、タンパク質、ペプチド、それらの組合せ、及びそれらのキメラ体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記捕捉リガンドが、ＩＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドプローブからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉リガンド及び前記検出リガンドの両方がＩＮＡリガンドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出リガンドが、ＤＮＡのメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有するＩＮＡリガンドであり、
前記検出リガンドの結合度又は結合量が、前記標的核酸のメチル化の程度を示す、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記支持体が、プラスチック材料、蛍光ビーズ、磁気ビーズ、造形粒子、プレート、マイクロタイタープレート、合成又は天然メンブラン、ラテックスビーズ、ポリスチレン、カラムサポート、ガラスビーズ又はスライド、ナノチューブ、アレイ、ファイバ、有機及び無機支持体からなる群から選択される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記支持体が、磁気ビーズ、蛍光ビーズ、造形粒子、ビーズアレイ、又は１つ以上のウェルを備えたマイクロタイタープレートである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複数の捕捉リガンドが前記固体支持体上に整列されている、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＮＡ検出リガンドには、検出可能な標識が固定されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能な標識が、化学ルミネセンス、蛍光、放射能、酵素、ハプテン及びデンドリマーからなる群から選択されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＮＡ検出リガンドに結合された前記核酸がさらにプロセス又は処理される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、核酸の領域を標的とするプライマを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマがＩＮＡリガンドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡのメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有する少なくとも１つのＩＮＡリガンドを含む、非メチル化シトシンを修飾する作用物質で処理された核酸を分析するためのキット。
【請求項２９】
１つ以上のＩＮＡリガンドが固体支持体に固定化されている、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記固体支持体が、プラスチック材料、蛍光ビーズ、磁気ビーズ、造形粒子、プレート、マイクロタイタープレート、合成又は天然メンブラン、ラテックスビーズ、ポリスチレン、カラムサポート、ガラスビーズ又はスライド、ナノチューブ、アレイ、ファイバ、有機及び無機支持体からなる群から選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
処理済みＤＮＡを増幅するためのプライマをさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
前記プライマがＩＮＡプライマである、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、及び改良されたオリゴヌクレオチド又はインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）アッセイに関する。本発明は、特に、これらのアッセイを用いたＤＮＡ内の５−メチルシトシン塩基を含む特定の塩基配列を識別するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸分子を検出するためには、数多くの方法が利用可能であった。これらの方法は、概して、短いオリゴヌクレオチド（２０塩基以下）から数千塩基の配列に至る範囲の長さを有し得る標的ＤＮＡと核酸プローブの間の配列依存性ハイブリダイゼーションに依存している。
【０００３】
直接的検出のために、最も一般的には標的ＤＮＡがゲル電気泳動によりサイズに基づいて分離され、固体支持体に移されてから、標的配列に相補的なプローブによるハイブリダイゼーションに供される（サザン及びノーザンブロット法）。該プローブは、ＩＮＡといったような天然の核酸又はその類似体、又はlocked nucleic acid（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ及びＭＮＡであり得る。プローブは、直接標識されていてよく（例えば３２Ｐで）、そうでなければ間接的検出方法を使用することもできる。間接的方法は通常ビオチン又はジゴキシゲニンといったような「タグ」のプローブ内への取込みに依存しており、プローブはこのとき、酵素関連性基質転換又は化学発光（chemiluminescence）といった手段によって検出される。
【０００４】
広く使用されてきた核酸の直接的検出のためのもう１つの方法は、「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕捉プローブが固体支持体にカップリングされ、溶液中の標的ＤＮＡは結合済みプローブとハイブリッド形成させられる。結合しない標的ＤＮＡは、洗浄され、結合したＤＮＡは、標的配列に対しハイブリッド形成する第２のプローブを用いて検出される。検出は、上述のように直接又は間接的方法を使用することができる。「分岐型ＤＮＡ」シグナル検出システムは、サンドイッチハイブリダイゼーション原理を用いる一つの例である（Urdea Ms Branched DNA signal amplification, Biotechnology, 12 : 926-928）。
【０００５】
核酸配列の直接的検出のために核酸ハイブリダイゼーションを使用する急速な拡大を続ける分野は、ＤＮＡマイクロアレイの分野である。（Young RA, Biomedical discovery with DNA arrays, Cell, 102:9-15 (2000); Watson, New tools. A new breed of high tech detectives., Science, 289:850-854(2000)）。このプロセスにおいては、オリゴヌクレオチドからｃＤＮＡクローンといったようなさらに長い配列までの範囲にあり得る個々の核酸種が、格子パターンで固体支持体に固定された。次に、タグを付けられた又は標識された核酸集団がアレイとハイブリッド形成させられ、アレイ内の各スポットとのハイブリダイゼーションレベルは定量化される。最も一般的には、ハイブリダイゼーションのためには、放射能又は蛍光標識された核酸（例えばｃＤＮＡ）が使用されたが、その他の検出システムも利用された。
【０００６】
核酸配列の集団内から特定の配列を増幅するために最も広く用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（Dieffenbach C and Dveksler G eds., PCR Primer: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）。この増幅方法においては、変性一本鎖ＤＮＡ上でのＤＮＡ合成をプライミングするために、相補的ＤＮＡ鎖上及び増幅すべきＤＮＡ領域のいずれかの末端において長さが一般に１５〜３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドが使用された。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた変性プライマハイブリダイゼーション及びＤＮＡ鎖合成の連続的サイクルは、プライマ間の配列の指数関数的増幅を可能にする。最初にｃＤＮＡコピーを作製するべく逆転写酵素を用いてコピーすることにより、ＲＮＡ配列を増幅することができる。ゲル電気泳動、標識されたプローブでのハイブリダイゼーション、（例えば酵素結合アッセイによる）その後の同定を可能にするタグを付けられたプライマの使用、標的ＤＮＡでのハイブリダイゼーションの時点でシグナルを発生する蛍光によりタグ付けされたプライマの使用（例えばＢｅａｃｏｎ及びＴａｑＭａｎシステム）を含めたさまざまな手段によって、増幅されたＤＮＡフラグメントを検出することができる。
【０００７】
ＰＣＲと同様に、さまざまなその他の技術が、特定の配列の検出及び増幅のために開発されてきた。一例としては、リガーゼ連鎖反応がある（Barany F, Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193(1991)）。
【０００８】
現在、例えば前立腺癌においてＧＳＴＰ１遺伝子プロモータの中に見出されたような、ＤＮＡ内のメチル化の変化を検出するために選ばれる方法は、ＤＮＡの重亜硫酸塩による修飾の後、このような配列をＰＣＲで増幅する方法に依存していた。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ中では、シトシンはウラシルに変換されるが（ひいては、ＰＣＲ中にチミンとして増幅され）、メチル化シトシンは反応せずシトシンとしてとどまる。（Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL and Paul CL, A genomic sequencing protocol which yeilds a positive display of 5-methyl cytosine residues in individual DNA strands, PNAS, 89:1827-1831 (1992); Clark SJ, Harrison J, Paul CL and Frommer M, High sensitivity mapping of methylated cytosines, Nucleic Acids Res., 22:2990-2997(1994)）。かくして（重亜硫酸塩処理の後）５−メチルシトシン塩基を含有するＤＮＡは、対応するメチル化されていないＤＮＡと配列的に異なっていることになる。Ｆｒｏｍｍｅｒらによる１９９２年の結果は、ＤＮＡ中の５−メチルシトシン残基を配列決定するために重亜硫酸塩を使用する方法の基盤となっている。数年後、このアッセイは、米国特許第５７８６１４６号明細書中のＣｐＧ島のメチル化状態についてのＰＣＲアッセイの基礎として使用された。プライマは、そのメチル化状態を判定するために問題のゲノムの領域を非選択的に増幅するように選択されてもよいし、又は、中で特定のシトシンがメチル化された配列を選択的に増幅するように設計されてもよい（Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD and Baylin SB, Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands, PNAS, 93:9821-9826 (1996)）。
【０００９】
シトシンメチル化の検出のための代替的方法には、部位特異的ＤＮＡメチル化によりその切断が阻止される制限酵素を用いた消化と、それに続くサザンブロット法及び問題の領域についてのハイブリダイゼーションプローブ探査が含まれる。このアプローチは、ＤＮＡの有意な割合（一般に１０％を超える）がその部位でメチル化され、検出を可能にするのに充分な通常１０μｇのＤＮＡが存在するような状況に制限される。部位特異的ＤＮＡメチル化によりその切断が防止されている制限酵素での消化の後に、制限酵素部位にフランキングするプライマを用いたＰＣＲ増幅が行われる。この方法では、より少量のＤＮＡを使用するが、ＤＮＡメチル化以外の理由で完全な酵素消化が行われなかった場合には、ことごとく偽陽性シグナルを導く可能性がある。
【００１０】
数年前、デオキシリボース−ホスフェート主鎖全体が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる構造的に同形性の非荷電ポリアミド主鎖で交換されたペプチド核酸（ＰＮＡ）が開発された（Ray A and Norden B, Peptide nucleic acid, (PNA):its medical and biotechnical applications and for the future, FASEB J, 14:1041-1060(2000)）。
【００１１】
ＰＣＲ増幅を必要としない高感度で特異的なＤＮＡ検出のために、ＰＮＡリガンドを利用する方法が開発されてきている（国際公開第０２／３８８０１号パンフレット）。最近では、固有の有用な特性を有する新しいＤＮＡリガンドであるインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）が開発されてきている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
当該発明人らは、ＩＮＡプローブを用いて問題の核酸を検出するための新しいアッセイを開発した。
【００１３】
発明の開示
第１の態様において、本発明は、試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
（ａ）  非メチル化シトシンを修飾する作用物質で核酸を含有する試料を処理するステップ；
（ｂ）  核酸の標的領域に結合する能力を有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）の形態をとる検出リガンドを、前記処理済み試料に供給し、前記検出リガンドが前記標的核酸に結合するのに充分な時間をおくステップ；及び
（ｃ）  試料中の標的核酸の存在を示すために、試料中の核酸分子に対する検出リガンドの結合を測定するステップ、を含む方法を提供する。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、試料中の標的核酸のメチル化を検出するための方法であって、
（ａ）  非メチル化シトシンを修飾する作用物質で核酸を含有する試料を処理するステップ；
（ｂ）  核酸のメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有するインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）の形態をとる検出リガンドを処理済み試料に提供し、標的核酸に対し検出リガンドが結合するのに充分な時間をおくステップ；及び
（ｃ）  標的核酸のメチル化の程度を示す、試料中の核酸に対する検出リガンドの結合を検出するステップ；を含む方法、を提供する。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
（ａ）  非メチル化シトシンを修飾する作用物質で核酸を含有する試料を処理するステップ；
（ｂ）  標的核酸配列の第１の部分を認識する能力を有する捕捉リガンドが結合された支持体を提供するステップ；
（ｃ）  処理済みの試料と支持体を接触させ、核酸が捕捉リガンドに結合するのに十分な時間おいて、試料中の標的核酸が捕捉リガンドを介して支持体に結合できるようにするステップ；
（ｄ）  標的核酸配列の第２の部分を認識する能力を有する検出リガンドと支持体を接触させ、支持体に結合した標的核酸に検出リガンドが結合するのに充分な時間をおくステップ；
（ｅ）  試料中の標的核酸の存在を判定するために支持体に結合した核酸に対する検出リガンドの結合を測定するステップ；を含み、
ここで捕捉リガンド又は検出リガンドのうちの少なくとも１つがインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）の形態をとる方法を提供する。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、試料中の標的核酸のメチル化の程度を評価するための方法であって、
（ａ）  非メチル化シトシンを修飾する作用物質で核酸を含有する試料を処理するステップ；
（ｂ）  標的核酸配列の第１の部分を認識する能力を有する捕捉リガンドが結合された支持体を提供するステップ；
（ｃ）  処理済みの試料と支持体を接触させ、ＤＮＡが捕捉リガンドに結合するのに十分な時間おいて、試料中の標的核酸が捕捉リガンドを介して支持体に結合できるようにするステップ；
（ｄ）  支持体と、ＤＮＡのメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別する能力を有する検出リガンドとを接触させ、支持体上で検出リガンドが任意の標的核酸に結合できるようにするステップ；及び
（ｅ）  結合度又は結合量が標的核酸のメチル化の程度を示すような形で支持体に対する検出リガンドの結合を検出するステップ、を含み、該捕捉リガンド又は検出リガンドのうちの少なくとも１つがインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）の形態をとる方法を提供する。
【００１７】
第５の態様では、本発明は、メチル化されたＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有ＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）  ＤＮＡ内で非メチル化シトシンをウラシルへと修飾するために重亜硫酸塩でＤＮＡを含有する試料を処理するステップ；
（ｂ）  ＤＮＡのメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有する検出ＩＮＡリガンドを、処理済み試料に供給するステップ；及び
（ｃ）  検出ＩＮＡリガンドの結合の存在又は非存在に基づいてメチル化されたＤＮＡを検出するステップ；を含む方法を提供する。
【００１８】
第６の態様では、本発明は、試料中の標的ＤＮＡのメチル化の程度を評価するための方法であって、
（ａ）  非メチル化シトシンをウラシルへと修飾するために重亜硫酸塩でＤＮＡを含有する試料を処理するステップ；
（ｂ）  標的ＤＮＡ配列の第１の部分を認識する能力を有するＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴヌクレオチドリガンドの形態を有する捕捉リガンドが結合させた、磁気ビーズ、多重ウェルマイクロタイタープレート又は造形粒子の形態の固体支持体を供給するステップ；
（ｃ）  支持体と標的ＤＮＡを含有する疑いのある処理済み試料とを接触させ、試料中の標的ＤＮＡが捕捉リガンドを介して固体支持体に結合できるようにするステップ；
（ｄ）  ＤＮＡのメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有するＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴヌクレオチドリガンドの形態をとる検出リガンドと、支持体を接触させるステップ；及び
（ｅ）  結合した検出リガンドの量を測定することにより支持体に結合したＤＮＡのメチル化の程度を判定するステップ、を含み、捕捉リガンド又は検出リガンドのうちの少なくとも１つがＩＮＡである方法を提供している。
【００１９】
１つの好ましい形態では、捕捉リガンドはＩＮＡである。もう１つの好ましい形態では、検出リガンドはＩＮＡである。
【００２０】
第７の態様では、本発明は、標的核酸のメチル化をアッセイする方法において、非メチル化シトシンを修飾して、メチル化シトシンを修飾しない作用物質、及び
核酸のメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有するＩＮＡプローブの形態をとる１つ以上のリガンド、の使用に関する。
【００２１】
第８の態様では、本発明は、非メチル化シトシンを修飾する作用物質で処理された核酸を分析するためのキットであって、ＤＮＡのメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別能を有する少なくとも１つのＩＮＡリガンドを含むキットを提供する。
【００２２】
好ましくは、キットは、固体支持体に固定化された１つ以上のＩＮＡリガンドを含んでいる。該キットは同様に、処理済みＤＮＡを増幅するためのプライマを含んでいてもよい。
【００２３】
核酸は、真核生物、原核生物及びウイルスのゲノム、ならびにミトコンドリア核酸、その他の細胞小器官内に見られる核酸及び細胞外のものである核酸を含んでもよく、これらからコピーされたものであってもよい。本書で定義されている通りの核酸は同様に、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、マンニトール核酸（ＭＮＡ）及びこれらのキメラの組合せといったような、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方の形態及びその天然又は人工的誘導体をも含み得る。
【００２４】
核酸は、細菌、ウイルス、ウイロイド又は真核生物又はプリオンに感染した病気の生物又は正常な生物から誘導され得る。該核酸は同様に、異なる種から又は人工的に合成された供給源からの核酸を取込んだ修飾された（遺伝子導入型）生物にも（修飾された生物が、生殖細胞系、過渡的又は体細胞トランスフェクションプロセスのいずれから作られているかとは無関係に）由来し得る。該核酸は、（ステント、パッチ、ペースメーカーなどといった）機械的、電子的又は化学的放出型である、移植又は固定されたデバイスを伴う生物の細胞、組織又は器官に由来していてよい。該核酸は、接合、人工受精、胚幹細胞方法又は核移入、（体細胞又は生殖細胞系核からの）又は細胞質、核又は膜抽出物による細胞又は核の修飾によるクローニングという標準的でない方法；又は（決定転換及び分化転換プロセスが関与する）外来性作用物質による細胞の修飾、又は同じ又は異なる種からのミトコンドリア又はその他の細胞小器官の投入又は修飾、又はその組合せから発生する生体に由来し得る。該核酸は、自己移植片、同種移植片又は異種移植片、組織又は器官移植片又は（例えばモデル生物インターベンショナルカーディオロジーの場合のような）他の生物内にヒト細胞が移植された組織に由来してもよい。核酸は（ｉｎ  ｖｉｖｏかエクスビボのいずれかでの）ノック−アウト、ノック−イン又はノック−ダウン方法、又は例えばＲＮＡｉ、リボザイム、アプタマー、トランスポゾン活性化、薬物又は（Ｔｒｏｊａｎペプチドを含むもののこれに制限されるわけではない）ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣＮＡ分子又はその他の核酸ベースの接合体に起因する擾乱といったような小分子方法によって、過渡的又は永久的にゲノム又はトランスクリプトームが改変されるようなあらゆる方法によって、産生又は修飾された生物に由来してもよい。該核酸は、受精から死後４８時間までの人間の全てのライフステージ由来、又はあらゆる（正常又は子宮外）妊娠段階及び、胚材料又は胎児材料由来、ならびに染色体不均衡の又は間性固体といった異なる自己細胞集団のキメラ又は２倍体、異数性又は分節的異数性細胞集団のキメラである個体又は生物由来であってよい。核酸は、上述の供給源のいずれか又は全てに由来する一次又は培養細胞系統に由来するか又は；組織学的標本、組織及び器官といった貯蔵された材料；ならびにヒト組織から単離された細胞（及び細胞系統）及びその誘導体、同種移植片、異種移植片ならびに、凍結された又は（その他の形で貯蔵された；天然又は人工的に保存された又はミイラにされた）切開された又は切除された供給源、顕微鏡スライドといった供給源に由来し得る試料、ブロック又は液体培地内に包埋された試料又は合成又は天然の表面又は液体から抽出された試料に由来する可能性がある。
【００２５】
好ましくは、核酸はＤＮＡ、より好ましくは動物又はヒトからのゲノムＤＮＡである。
【００２６】
修飾性作用物質は好ましくは、重亜硫酸塩、酢酸塩又はクエン酸塩から選択される。より好ましくは、この作用物質は、水の存在下でシトシンをウラシルへと修飾する試薬である重亜硫酸ナトリウムである。
【００２７】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、脱アミノ化を起こす可能性がありかつ水の存在下で亜硫酸ウラシルを発生させるスルホン化シトシン反応中間体を形成するべくシトシンの５，６二重結合と容易に反応する。必要であれば、亜硫酸塩基を弱アルカリ性条件下で除去してウラシルを形成させることができる。かくして、潜在的に全てのシトシンはウラシルに転換されることになる。しかしながら、メチル化による保護によって、いかなるメチル化シトシンも修飾用試薬により転換され得ない。
【００２８】
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、配列特異性をもつ核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）に対しハイブリッド形成できる、天然に発生するものでないポリヌクレオチドである。ＩＮＡは、複数の望ましい特性を示すことから、プローブベースのハイブリダイゼーションアッセイ内で核酸プローブに対する代替案／代用品候補である。ＩＮＡは、核酸に対しハイブリッド形成して、対応する天然に発生する核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定したハイブリッドを形成する重合体である。これらは、ペプチド又は核酸を消化させるものとして知られている酵素のための基質ではない。従って、ＩＮＡは、天然に発生する核酸フラグメントに比べ生体試料中でより安定しかつより長い保存寿命を有するはずである。イオン強度に高く依存している核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、核酸とＩＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度からかなり独立しており、イオン強度の低い、天然に発生する核酸と核酸のハイブリダイゼーションには著しく不利に作用する条件下でも有利である。ＩＮＡの結合強度は、分子内に挿入された挿入基（intercalating groups）の数、ならびに二本鎖構造内で特異的に積重ねられた塩基間の水素結合からの通常の相互作用に左右される。配列の識別は、ＤＮＡを認識するＤＮＡよりも、ＤＮＡを認識するＩＮＡの方が、効率が良い。
【００２９】
好ましくは、ＩＮＡは（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトである。
【００３０】
ＩＮＡは、市販のフォーマットに標準的オリゴヌクレオチド合成方法を応用することによって合成される。ＩＮＡ及びその合成の完全な定義は、本発明に参照により援用されている国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレット及び国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（Ｕｎｅｓｔ  Ａ／Ｓ）の中に見出すことができる。
【００３１】
ＩＮＡプローブと標準的核酸プローブの間には、実際数多くの差異が存在する。これらの差異は、生物学的、構造的及び物理化学差異に内訳すると便利である。以上及び以下で論述するように、これらの生物学的、構造的及び物理化学的差異は、核酸が標準的に利用されてきた応用分野でＩＮＡプローブを使用することを試みた場合に、予測できない結果を導く可能性がある。この異なる組成物の非等価性は、化学技術では往々にして見られることである。
【００３２】
生物学的差異に関しては、核酸は、遺伝子伝達及び発現の作用物質として生きた種の生において中心的役割を果たす生物学的材料である。そのｉｎ  ｖｉｖｏ特性は、かなり良く理解されている。しかしながらＩＮＡは、化学者の頭の中で設計され合成有機化学を用いて作られた、近年開発された完全に人工的な分子である。それには、既知の生物学的機能は全く無い。
【００３３】
構造的にも、ＩＮＡは核酸とは格段に異なっている。両方に共通の核塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵ）を利用し得るものの、これらの分子の組成は構造的に多様である。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＩＮＡの主鎖は、反復ホスホジエステルリボース及び２−デオキシリボース単位からなる。ＩＮＡは、重合体に対しリンカー分子を介して固定した１つ以上の大型で平坦な分子を有するという点でＤＮＡ又はＲＮＡとは異なっている。平坦な分子は、二本鎖構造内でＩＮＡとは反対側の相補的ＤＮＡ鎖内の塩基の間に介在する。
【００３４】
ＩＮＡと、ＤＮＡ又はＲＮＡとの物理／化学的差異も同様に実質的なものである。ＩＮＡは、核酸プローブが同じ標的配列に結合する以上に急速に相補的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントとは異なり、ＩＮＡは、挿入基か末端位置にあるのでないかぎり、ＲＮＡに対しほとんど結合しない。挿入基と相補的ＤＮＡ鎖上の塩基の間の強い相互作用のため、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類似のＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のものよりも高い。
【００３５】
ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメント又はＰＮＡといったその他のＤＮＡとは異なり、ＩＮＡは、自己凝集又は結合特性を示さない。
【００３６】
要するに、ＩＮＡは配列特異性をもつ核酸にハイブリッド形成することから、これは、プローブベースのアッセイを開発するための有用な候補であり、キット及びスクリーニングアッセイのために特に適している。しかしながら、ＩＮＡプローブは核酸プローブの等価物ではない。従って、プローブベースのアッセイの特異性、感度及び信頼性を改善し得るあらゆる方法、キット又は組成物が、ＤＮＡ含有試料の検出、分析及び定量において有用となるだろう。ＩＮＡは、この目的に必要な特性を有している。
【００３７】
ステップ（ｂ）では、一方のリガンドが１つ以上のメチル化シトシンを含有する核酸領域に結合する能力をもち、もう一方のリガンドが、処理（ステップ（ａ））前にいかなるメチル化シトシンも含有していなかった核酸の対応する領域に結合する能力を有する、２つの検出リガンドを使用することができる。試料は標的核酸コピーを数多く含有しうることから、往々にしてコピーは異なるメチル化量を有する。従って、２つのリガンドの結合比は、試料中のその核酸標的のメチル化度に正比例することになる。２つのリガンドを、一緒に１つの試験において添加することも、又別々のデュプリケート試験において添加することもできる。各々のリガンドは、１つの試験内で同時に又は別々に検出され得る独自のマーカーを含むこともできるし、又同じマーカーを有し別々の試験内で個別に検出することもできる。
【００３８】
好ましくは、捕捉リガンドは、ＩＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、ＬＮＡプローブ、ＨＮＡプローブ、ＡＮＡプローブ、ＭＮＡプローブ、ＣＮＡプローブ、オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、抗体、タンパク質、ペプチド、その組合せ又はそのキメラ体から選択される。
【００３９】
より好ましくは、捕捉リガンドは、ＩＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ又はオリゴヌクレオチドプローブである。さらに一層好ましくは、捕捉リガンドはＩＮＡプローブである。
【００４０】
支持体は、プラスチック材料、蛍光ビーズ、磁気ビーズ、造形粒子、プレート、マイクロタイタープレート、合成又は天然のメンブラン、ラテックスビーズ、ポリスチレン、カラムサポート、ガラスビーズ又はスライド、ナノチューブ、ファイバ、又はその他の有機及び無機支持体といったようなあらゆる適切な支持体であり得る。好ましくは、支持体は、磁気ビーズ、蛍光ビーズ、造形粒子、又は１つ以上のウェルを伴うマイクロタイタープレートである。
【００４１】
固体基質は、標準的にはガラス又は重合体であり、最も一般的に用いられる重合体は、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク又はマイクロプレート或いはアッセイを実施するのに適したその他のあらゆる表面の形をしていてよい。結合プロセスは、当該技術分野において周知であり、一般的には不溶性担体に対し分子を架橋共有結合させること又は物理的に吸着させることからなる。
【００４２】
好ましい形態では、ステップ（ｂ）は固体支持体上に整列した複数の捕捉リガンドを含む。該アレイは、その上に同じ標的核酸を捕捉するべく同じリガンドの多数のコピーを含むことができ、そうでなければアレイ上に複数の標的核酸分子を捕捉するべく異なる核酸のターゲットとなる複数の異なるリガンドを含むこともできる。標準的には、アレイは約１０〜２００，０００の捕捉リガンドを含む。しかしながら、アレイは任意の数の捕捉リガンドを有することができるということがわかるだろう。
【００４３】
１つの形態においては、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、ＩＮＡプローブ又は捕捉ＰＮＡプローブを１つのアレイ上に配置し、核酸のメチル化された状態を測定するために、重亜硫酸塩で処理された核酸の捕捉に使用することができる。アレイ技術は周知であり、未処理試料内の遺伝子又はヌクレオチド配列の存在を検出するために使用されてきた。しかしながら、本発明は、沢山の異なる核酸供給源のメチル化状態についての貴重な情報を提供するためにアレイ技術の有用性を拡張することができる。
【００４４】
好ましい形態では、試料は、幹細胞、血液、尿、糞、精液、脳脊髄液；脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎、造血器、乳房、胸腺、精巣、卵巣又は子宮といった細胞又は組織；環境試料；細菌、ウイルス、真菌、原生動物、ウイロイドなどを含めた微生物といったあらゆる生体試料であり得る。幹細胞には、始原細胞を含む細胞集団が含まれる。これは又、胚細胞集団にもあてはまり、同じく体細胞と融合して特定の表現型を採用する能力を有するハイブリッド細胞を形成する幹細胞をも内含する。
【００４５】
好ましくは、修飾性作用物質は、非メチル化シトシンを修飾するもののメチル化シトシンを修飾しないという能力を有する。該作用物質は好ましくは、重亜硫酸塩、酢酸塩及びクエン酸塩から選択される。好ましくは、該作用物質は、重亜硫酸ナトリウムであり、シトシンはウラシルへと修飾される。
【００４６】
本書で使用する「修飾する」という語は、非メチル化シトシンとメチル化シトシンを区別することになる１つの非メチル化シトシンからもう１つのヌクレオチドへの転換を意味する。好ましくは、該作用物質は、非メチル化シトシンをウラシルへと修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために用いられる作用物質は、重亜硫酸ナトリウムである。非メチル化シトシンを類似の要領で修飾するもののメチル化シトシンを修飾しないその他の作用物質も同様に、本発明の方法において使用可能である。例としては重亜硫酸塩、酢酸塩又はクエン酸塩が含まれるが、これらに制限されるわけではない。好ましくは、該作用物質は、水の存在下でシトシンをウラシルに修飾する試薬である重亜硫酸ナトリウムである。
【００４７】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、５，６−シトシン二重結合と容易に反応するがメチル化シトシンとはほとんど反応しない。シトシンは重亜硫酸塩イオンと反応して、脱アミノ化を受ける可能性のあるスルホン化シトシン反応中間体を形成し、スルホン化ウラシルを発生させる。スルホン酸塩基は、アルカリ性条件下で除去され、ウラシルを結果として形成することができる。かくして、シトシンを含有する配列又はウラシルを含有する対応する配列を認識することになるリガンドを調製できるような形でメチル化シトシンが転換から保護されている一方で、全ての非メチル化シトシンがウラシルに転換されることになる。２つのプローブの結合比は、一定の与えられた核酸内のメチル化度の精確な尺度を提供することができる。
【００４８】
重要なことに、数多くの状況において、必要な情報を得るために核酸を増幅させる必要は全くなくなり、かくして潜在的誤差を克服し、自動化に従順な、より高速でかつより単純なアッセイが結果としてもたらされる。処理に先立つ捕捉又は核酸選択の後の増幅も、本発明には同じく可能である。
【００４９】
好ましい形態では、検出リガンドは、ＮがＡ、Ｔ、Ｃ又はＧという考えられる４つの塩基のうちのいずれか１つを表わす場合に、ＤＮＡのＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有領域に向けられている。好ましくは、ＤＮＡのＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有領域は、化学物質、毒素、薬物、放射線、合成又は天然化合物及び微生物又はその他の感染性物質例えばウイルス、細菌、真菌及びプリオンなどを含めた環境因子により活性が改変されている、プロモータ、エンハンサ、腫瘍遺伝子、レトロエレメント、可動（ｍｏｂｉｌｅ）又は可動化可能（ｍｏｂｉｌｉｓａｂｌｅ）な配列又はその他の調節要素を含む任意の調節要素又は領域のエンハンサ又は遺伝子の調節領域の中にある。例えば、プロモータ又は調節要素は、腫瘍抑制遺伝子プロモータ、腫瘍遺伝子又は、加齢といったような変化する正常状態又は病的状態に関与する１つ以上の遺伝子を抑制するか又はこれに影響を及ぼす可能性のあるその他のあらゆる要素又は領域であり得る。
【００５０】
標本中にＤＮＡのメチル化されたＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有領域が存在することは、特に細胞プログラミングに関しての細胞の機能的変化を表わす可能性がある。該変化は、増殖障害でもありうる。これには、低悪性度星状細胞腫、未分化悪性星状細胞腫、グリア芽腫、髄芽細胞腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、白血病、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌及び神経芽細胞腫、又は幹細胞集団の正常な細胞分裂、分化又は代謝／異化の障害が含まれる可能性がある。
【００５１】
核酸修飾性作用物質の反応を補助するために、尿素、メトキシアミン及びそらの混合物といった任意の添加物を加えてもよい。
【００５２】
ステップ（ｂ）は標準的に、該方法のその後のステップ内でメチル化について分析されることになる問題の核酸を捕捉するために使用される。かくして、ステップ（ｂ）は、問題の核酸の捕捉及び濃縮を可能にする。好ましくは、１つ以上のＩＮＡプローブがステップ（ｂ）で使用される。
【００５３】
１つの好ましい形態においては、ステップ（ｂ）は、固体支持体上に整列された複数の捕捉リガンドを含む。該アレイは、その後の試験のためアレイ上の同じ標的核酸を捕捉するべく同じリガンドの多数のコピーを含有し得る。代替的には、該アレイは、その後の試験のためアレイ上の数多くの異なる標的ＤＮＡ試料を捕捉するべく異なるＤＮＡ分子をターゲットとする複数の異なる捕捉リガンドを含有し得る。好ましい形態では、捕捉リガンドは、多数のアッセイを実施し得るようにマイクロタイタープレートのウェルに結合させられている。
【００５４】
ステップ（ｄ）では、１つのリガンドが、１つ以上のメチル化シトシンを含む核酸領域に結合する能力をもち、第２のリガンドが、メチル化シトシンを全く含まない対応する核酸領域に結合する能力を有する、２つの検出リガンドを使用することができる。試料は、異なるメチル化量を有する、１つの標的核酸の数多くのコピーを含有し得る。従って、２つのリガンドの結合比は、該試料内のその核酸標的のメチル化度に正比例することになる。２つのリガンドは１つの試験で一緒に添加することもできるし、そうでなければ別々のデュプリケート試験で添加することもできる。各々のリガンドは、１つの試験内で同時に又は別々に検出され得る独自のマーカーを有することもできるし、又同じマーカーを有し別々の試験内で個別に検出することもできる。
【００５５】
標的核酸に対する検出リガンドの結合を検出するためには、好ましくは、リガンドはそれに付された検出可能な標識を有する。結合した標識の存在は、リガンドの結合の程度を表わす。適切な標識としては、化学ルミネセンス、蛍光、放射能、酵素、ハプテン及びデンドリマーが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００５６】
重亜硫酸塩修飾の後、試料のＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ含有ＤＮＡを検出するために本発明で使用される検出リガンドは、未処理ＤＮＡ、メチル化されたＤＮＡ、及びメチル化されていないＤＮＡを特異的に区別することができる。メチル化されていないＤＮＡのためのオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ又はＩＮＡプローブの形態の検出リガンドは、好ましくは、メチル化されたＤＮＡ内に保持されたＣとそれを区別するべく３’ＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ対内にＴ又はＡを有する。
【００５７】
本発明のプローブは、テスト対象のゲノム遺伝子座の一本の鎖に対し「実質的に」相補的であり適切なＧ又はＣヌクレオチドを含むように設計することができる。このことはすなわち、結合を可能にする条件下で、プライマが、それぞれの問題の領域とハイブリッド形成するのに充分な相補性を有するべきである、ということを意味している。換言すると、プローブは、好ましくは、５’及び３’フランキング配列とハイブリッド形成するのに充分な相補性を有するべきである。
【００５８】
本発明のＩＮＡプローブは、当該技術分野において既知の任意の適切な方法を用いて調製可能である。好ましくは、プローブは、本発明に参照により援用されている国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレット及び国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（Ｕｎｅｓｔ  Ａ／Ｓ）の教示に従って調製される。
【００５９】
標的核酸のメチル化状態に関係する本発明に従った方法は、それが標的領域（通常はＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ）を含む特定の核酸配列を含んでいる又は含んでいるとされることを条件として、出発材料として、精製済み又は未精製形態での任意の核酸試料を使用することができる。１つの好ましい形態では、未増幅試料が、本発明に従った方法において使用される。
【００６０】
検出リガンドによる捕捉に先立ち増幅濃縮ステップにおいて、ＩＮＡ混合物又は特異的ＩＮＡ分子を使用することができる。重亜硫酸塩で処理された核酸の特異的又は無作為増幅のために、単一の又は多数のＩＮＡを使用することができるだろう。
【００６１】
問題の核酸分子は、本発明に従った方法のステップ（ａ）に先立って選択又は濃縮可能である。濃縮又は選択ステップには、音波処理及びせん断、酵素消化、酵素処理、制限消化、ヌクレアーゼ処理、ＤＮａｓｅ処理、濃縮、抗体捕捉を含めた物理的方法、酸性又は塩基性消化を含めた化学的方法及びそれらの組合せが含まれるが、これらに制限されるわけではない。例えば、５−メチルシトシンを濃縮する又はメチル化度の高いゲノムＤＮＡといった核酸を捕捉するために、５−メチルシトシンに向けられた抗体を使用することができる。より管理しやすいサイズの核酸へと分割するべく任意の適切な物理的又は酵素的手段による分割を受けたゲノムＤＮＡから核酸を誘導することができる。
【００６２】
メチル化ＣｐＧ又はＣｐＮｐＧの検出に用いられる核酸含有標本は、任意の供給源に由来するものであってよく、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp280, 281, 1982）によって記述されているものなど、さまざまな技術によって抽出され得る。
【００６３】
試料中の核酸が二本鎖を含有する場合には、修飾されないうちに核酸の鎖を分離する必要がある。鎖の分離は、別々のステップとしてか又は化学的処理と同時に実施できる。この鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含むさまざまな適切な変性条件を用いて達成され得、「変性」という語はこのような手段全てを内含する。核酸鎖を分離する１つの物理的方法には、変性されるまで核酸を加熱することが含まれる。標準的な熱変性には、ＤＮＡについて約１〜１０分の範囲の時間、約８０℃〜１０５℃の範囲内の温度が関与する。鎖分離は、同様に、ヘリカーゼとして知られる酵素クラスからの酵素によって、又はヘリカーゼ活性を有しリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性するものとして知られている酵素ＲｅｃＡによっても誘発され得る。ヘリカーゼでのＤＮＡの鎖分離に適した反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978）によって記述されており、ＲｅｃＡを用いるための技術は、C. Radding (Ann.Rev.Genetics, 16:405-437, 1982）の中で再考された。
【００６４】
検出可能な標識は、化学発光、蛍光又は放射性標識であってよく、そうでなければ、ミクロスフェア又はナノ結晶の形の第２の標識又はマーカーを含有してもよい。蛍光又は放射性ミクロスフェア又はナノ結晶は、捕捉リガンド又は検出リガンドに共有結合され得る。
【００６５】
好ましくは、標的核酸に対するハイブリダイゼーションの特異性を用いて、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを識別する。
【００６６】
一部は一本鎖ＤＮＡに選択的である、核酸に結合し、かつその励起及び発光波長が異なる適切な数多くの蛍光色素が知られていた。検出システムは同様に、ＤＮＡに選択的に結合することになりかつ酵素アッセイを用いて検出し得る正荷電領域を担持する酵素、又は捕捉されたＤＮＡに対し選択的に結合する正荷電放射性分子でもあり得る。適切な物質は、同様に、コア／シェルＣｄＳｅ／ＺｒＳ半導体ナノ結晶でもあり得る（Gerion et al 2002 J Am Chem Soc: 24:7070-7074）。
【００６７】
この方法におけるリガンドの１つとしてＩＮＡプローブを使用することには、オリゴヌクレオチド又はＰＮＡプローブの使用に比べて非常に有意な利点がある。ＩＮＡ結合は、オリゴヌクレオチド又はＰＮＡといったその他のリガンドに比べて速く平衡に達し、より大きい配列特異性を示し、かつＩＮＡが１つ以上の挿入基を担持することから。これらはより高い結合係数で標的ＤＮＡ分子を結合させる。結合特性は、ＩＮＡに付加するべく挿入基の異なる数を選択することによって修飾可能である。
【００６８】
本発明は、直接検出方法を使用できることから、該方法は、試料内での標的核酸の量の真正かつ正確な尺度を提供できる。該方法は、その方法において一般に使用される酵素が異なる配列の増幅速度差を通して系統的偏向を導入する可能性のある場合に、シグナル増幅用としてＰＣＲといったようなプロセスに依存している先行技術の方法に固有の潜在的偏向によって混乱させられることはない。
【００６９】
蛍光又は放射能を検出又は測定するのに利用可能な数多くの検出システム及び計器が存在する。計装における改良及び進歩が数多くのメーカーにより行なわれている。本発明のためには、数多くの異なる測定計器を使用できることがわかるだろう。例えば、多光子検出（Ｍｕｌｔｉ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）は、超微量の選択された放射性同位元素を検出するための独自仕様のシステムである。これは既存の方法より１０００倍高い感度をもつ。これは、ゼプトモル量の生体材料の定量で、ヨウ素１２５原子１０００個の感度を有する。これには、１ピコキュリー未満の同位元素しか必要ではなく、この値は、コップ１杯の水中の１００分の１の放射能である。ＭＰＤ計器ファミリーは、すでに、１つの試料中の放射能を測定するために存在している。これらは、９６ウェル、３８４ウェル及びそれ以上用に構成されている計器からなる。ＭＰＤは、オペレータが選択した放射性同位元素と相容性ある光子のみを選択的に計数するためのコンピュータ制御式電子部品と接続された同時多重チャンネル光子検出を使用する。数多くの異なる同位元素を使用できることから、これは多色システムである。ＭＰＤイメージャシステムは、ホスホイメージャに比べ少なくとも１００倍高い感度をもつ。かかる計装は、リガンド又は支持体が放射性となっている本発明の検出部において特に適したものとなる。
【００７０】
結合された捕捉リガンド又は検出リガンドを含むビーズは、蛍光を測定するセルソーターで処理又は測定することができる。実施例又は適切な計器には、フローサイトメータ及びその改良型が含まれる。
【００７１】
本発明に従った方法は、特に数多くの試料を処理するためのスケールアップ及び自動化に非常に適している。
【００７２】
上述のことに関わらず、記述された方法は、検出用として充分な材料を提供するために制限的な量のＤＮＡを増幅する必要がある場合に、かかる増幅方法と併用することができる。さらに、メチル化された又はメチル化されていない核酸に対し導かれたＩＮＡリガンドで捕捉されたＤＮＡを選択的に増幅するために、ＰＣＲを使用することができる。
【００７３】
メチル化されたＤＮＡ：
本発明で詳述されている通りの特定の適合において、重亜硫酸ナトリウムで処理されたＤＮＡ中のメチル化シトシンの存在を区別するために該方法を用いることができる。シトシンは、メチルシトシンが未反応状態にとどまっている間にウラシルへと転換されていることから、メチル化された分子及びメチル化されていない分子に由来する重亜硫酸塩処理済みＤＮＡの配列は異なっている。選択された標的領域に対し特異的ＩＮＡリガンド（長さ４〜１００残基、好ましくは長さ２０±１０残基）を選択することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を用いて、ＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ部位内になかったシトシンが完全に反応しウラシルに転換されている分子のみが査定されることを確実にしながら、（シトシンとしてとどまっている）ＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ部位にあるメチル化シトシンと、シトシンがウラシルに転換されているメチル化されていないＣｐＧ又はＣｐＮｐＧ部位を区別することができる。
【００７４】
その他の部位にあるメチル化シトシンも同様にして検出可能である。重亜硫酸塩と完全に反応しなかった（１つ以上のシトシンがウラシルに転換されていない）分子の存在を同定するための対照として、適切なＩＮＡプローブを用いることができる。しかしながら、ＤＮＡのメチル化状態を識別できるその他のリガンドを類似の要領で使用できることがわかるだろう。
【００７５】
該方法は、多重ウェルプレート、マイクロアレイ、光ファイバアレイ及び懸濁粒子を含めたさまざまなフォーマットでの使用に適している。アレイフォーマットでの使用のための特異的リガンドの適切な選択により、多数の標的領域内での個々のシトシンのメチル化状態を同時に判定することができる。
【００７６】
多型現象／突然変異及び後成的突然変異の検出：
本発明に従った方法は捕捉リガンド及び／又は検出リガンドの配列が１つの対立遺伝子と整合するがもう１つの対立遺伝子とは不整合となる、１つの遺伝子の異なる対立遺伝子の識別に対し適用可能である。
【００７７】
ＤＮＡ定量化：
本発明に従った方法を使用することにより、特定の領域において１つの配列をもつ分子に対してもう１つの配列をもつ分子の割合をＤＮＡ集合内部で直接決定することが可能である。これは、異なる色の蛍光色素が装てんされたミクロスフェア、ナノ結晶又は放射性分子、粒子及びマイクロタイタープレートといった支持体に対し、配列の代替形態を表わすリガンドをカップリングすることによって行なうことができる。かかる配列差は、遺伝子のもとの塩基配列の差、又はもとのＤＮＡ内のメチル化の差に起因していた重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの塩基配列の差であり得る。
【００７８】
細胞定量化：
該方法は、ゲノム内の特定の部位において塩基配列が異なっている（癌細胞及び正常な細胞内といった）１つの集団内の細胞比を決定するために応用できる。
【００７９】
変動：
該方法は、多重ウェルプレート、マイクロアレイ、光ファイバアレイ及び懸濁粒子を含むさまざまなフォーマットにおける使用に適している。アレイフォーマットで使用するための特異的ＩＮＡプローブの適切な選択により、例えば多重標的領域内の個々のシトシンのメチル化状態の決定など、異なるＤＮＡ配列の存在の同時決定を可能にすることができる。
【００８０】
本明細書全体を通して、前後関係から相反する必要性が生じた場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」といった活用形は、言及された要素、整数又はステップ、又は要素、整数又はステップ群の内含を意味するもののその他のあらゆる要素、整数又はステップ、又は要素、整数又はステップ群の除外を意味しないものと理解される。
【００８１】
本明細書中に含まれた文書、行為、材料、装置、物品などについての論述は全て、単に本発明の前後関係を提供するためのものにすぎない。これは、これらのもののいずれか又は全てが先行技術の基礎の一部を成す又は本出願の各請求の範囲の優先年月日以前にオーストラリアに存在した通りの本発明に関連する分野における一般的な共通の知識であったということを認知するものとしてとらえられるべきではない。
【００８２】
本発明をより明確に理解するため、以下、図面及び実施例を参考にしながら、好ましい形態について記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
発明を実施する方法
定義
エピジェネティクス／エピゲノミクス／メチロミクス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｓ）
受精から死後４８時間に至るまでの全ての細胞、組織及び器官内及びヒト組織自己移植片ならびに非自己移植片、異種移植片から単離された細胞（及び細胞系統）及びその誘導体内の、全てのライフサイクル段階でのヒト、動物、細菌（ナノ細菌及び細胞外ならびに細胞内細菌を含む）及びウイルス起源の試料、ならびに凍結させられた又はその他の形で貯蔵された、切開又は切除された供給源、顕微鏡スライドといった組織学的供給源から誘導され得る試料、ブロック又は液体培地内に包埋された試料又は合成又は天然の表面又は液体から抽出された試料からの核酸内の５−メチルシトシン残基の分析。
【００８４】
エピジェネティクス／エピゲノミクス／メチロミクス
主要な死因すなわち、悪性新生物、（癌）、虚血性心臓疾患、脳血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎及びインフルエンザ、動脈疾患（アテローム性動脈硬化症及び大動脈瘤）、真性糖尿病及び中枢神経疾患、ならびに不安症、ストレス関連神経精神病及び肥満症などの社会的消耗性疾患、及び異常染色体数又は染色体再配列から発生したすべての状態、（常染色体ならびに性染色体が関与する異数性、身体的状態又は生殖細胞系内の挿入、転位、欠損症、複製）、ならびにミトコンドリアゲノムの類似の異常、に重点をおいた、病気の個体（なおここで言う「病気の」という語は、Jean D Wilson et al., McGraw Hill Inc.編, Harrison’s Principles of Internal Medicine、第１２版及びそれ以降の版に記述されている又は言及されている全てのヒトの疾患、病気、不快及び逸脱状態、ならびにOMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.gov内に記述された全ての疾患、病気、不快及び逸脱状態を含む）からの細胞、組織及び器官、ならびに健康な個体（ＷＨＯにより定義されている通りの健康）の細胞、組織及び器官の間に自然に発生する変動の５−メチルシトシン分析を含む。
【００８５】
正常な又は病気の個体は、（ａ）さまざまな民族性及び進化系統の集団、（ｂ）種族及び地理的隔離集団、（ｃ）亜種、（ｄ）同性又は異性の双生児又はさらに高次の多生児、（ｅ）正常な接合方法、人工受精、胚幹細胞方法によるクローニングから発生した又は（体細胞又は生殖細胞系核からの）核移植によって又は細胞質抽出物又は外来性作用物質による細胞又は核の修飾（決定転換及び分化転換）によって発生した、又はミトコンドリア又はその他の細胞小器官の投入又は修飾から発生した個体、（ｆ）遺伝子導入ノック−アウト、ノック−イン又はノック−ダウン方法（ｉｎ  ｖｉｖｏ、エクスビボ又は遺伝子活性が例えばＲＮＡｉ、リボザイム、トランスボゾン活性、薬物又は小分子方法、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＭＡ、ＡＨＡなど又は核酸ベースの接合体（Ｔｒｏｊａｎペプチドを含むがこれに制限されるわけではない）などによって過渡的に又は常時改変されているあらゆる方法によるかのいずれか）に由来する個体、又は、（正常な又は子宮外）妊娠の任意の段階にある個体、に由来し得る。
【００８６】
エピジェネティクス／エピゲノミクス／メチロミクス
エピジェネティクス／エピゲノミクス／メチロミクスは、以下のような、変化したパラメータ及び基礎を成すメカニズムを、正常に変動する系及び病気の系の両方において決定し、治療的に改変させることを目的とした、細胞外又は細胞内様式でのヒトの疾患に結びつけられる、原核又は真核生物及びウイルス（又はそれらの組合せ）からの核酸内の５−メチルシトシン残基の分析を意味する。
（ｉ）  遺伝的疾患；
（ｉｉ）  生物学的又は非生物学的起源のいずれであれ、環境的に誘発された因子（ここで言う環境的という語は、あらゆる妊娠段階中の又は排卵及び不妊治療条件下にある生物自体の体内の環境をも含むものとしてとらえられる）によりひき起こされた非遺伝的又は後成的遺伝疾患；
（ｉｉｉ）  「プリオン」クラスの因子、気圧変化及び無重力に対する暴露又は放射線効果によってもたらされる効果を含む、遺伝的又は非遺伝的疾患に対する素因；
（ｉｖ）  加齢に関連するうつ病、苦痛、神経精神病及び神経変性病及び更年期前及び更年期後の身体状態（排卵減少を含む；両方の性別で）を含む、全ての細胞型組織、器官系および生命ネットワークにおける加齢プロセスでの５−メチルシトシン変化；
（ｖ）  癌（又は核酸増幅、欠失、再配列、転位及び挿入事象から生じる核型異常を伴う細胞内の変化を含めた、核酸供与量の変化により実証される疾病）における５−メチルシトシン変化、及び（日周期、光周期、睡眠、記憶及び「時差ぼけ」に対する細胞周期効果を含む）異なる細胞周期現象におけるその変動又は改変
（ｖｉ）  （（イオン化するものであれイオン化しないものであれ、又は化学療法治療又は高高度暴露から生じたものであれ）あらゆるタイプの低酸素症、酸素欠乏症、放射線、ストレスによって又はミトコンドリア、核又は細胞小器官ゲノム間の不均衡によってもたらされた代謝効果を含めた）受精卵から胚形成、胎児発達、出生、青年期、成人期及び老年期までの、最も広義で定義された代謝ネットワーク内の５−メチルシトシン変化；
（ｖｉｉ）  （翻訳後付加、翻訳後分割産物、翻訳後修飾（例えばインテイン、エクステイン、汎存化及び分解産物など）を伴うあらゆるもの；学習、脳成長及び細胞死に関与するＤ−セリンといったような単一の希少アミノ酸ならびに希少天然アミノ酸を含むタンパク質、ポリペプチド及びペプチド；薬物、生物医薬品、化学物質（ここで化学物質及び生物医薬品の定義は、G.Ashton, 2001, Nature Biotechnology, 19, 307-3111のものである）を含めた）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及びＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＭＡ、ＡＨＡなど又はペプチドアプタマー、代謝産物、新規塩、プロドラッグ、既存の化合物のエステル、ワクチン、抗原、ポリケチド、非リボソームペプチド、ビタミン、及び（植物由来のシクロパミンといったような）あらゆる天然供給源由来の分子に対する、分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する５−メチルシトシンの改変；
（ｖｉｉｉ）  それが一本鎖であれ二本鎖であれ、外部供給源からの内因性トランスポゾン又はレトロトランスポゾン（ＳＩＮＥＳ及びＬＩＮＥＳ）などの中で内部的に活性化されたＲＮＡ及びＤＮＡウイルスに対する、分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する５−メチルシトシンの改変；
（ｉｘ）  遺伝子由来又は非遺伝子由来のいずれであれ（又はイントロンを含有しているか又はしていない）、ＲＮＡ写しの逆転写されたコピーに対する分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する５−メチルシトシンの改変；
（ｘ）  （ａ）妊娠前、妊娠中及び妊娠後の母体流体ならびに血液及び脳脊髄液を含む全ての流体中を循環するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＭＡ、ＡＨＡなどの分子を含めた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＭＡ、ＡＨＡなど（又はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＭＡ、ＡＨＡ、そのいずれかのもののアプタマーのあらゆる組合せ）、
（ｂ）ペプチド及び核酸のキメラであるか又はコレステロール部分、ホルモン及び核酸といったような天然分子のキメラである接合生体分子の組合せに対する、分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する５−メチルシトシンの改変；及び
（ｘｉ）  （ｉｎ  ｖｉｖｏ又はエクスビボで、又は新規の環境又は天然の及び合成の基質と結びつけられた形で又はその組合せの形で実施される）その他の任意の既存の又は新規の細胞型への軌道に沿って、好ましくは幹細胞へ又は幹細胞からの軌道に沿っての、（両生類卵母細胞、植物、動物、細菌又はウイルス供給源といったような非ヒト供給源からの擾乱原、薬物、抗体又はそれらのあらゆる混合物を含めた）、最も広義での擾乱原を用いて決定転換又は分化転換された（又はされつつある）細胞又は幹細胞の応答に起因する５−メチルシトシンの改変。
【００８７】
核酸
「核酸」という語は、天然に発生する核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡを網羅する。「核酸類似体」という語は、天然に発生する核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡの誘導体ならびに天然に発生する核酸の合成類似体を網羅する。合成類似体は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。ヌクレオチド類似体という語には、基本的に天然に発生するヌクレオチドのように、核酸主鎖内に取込まれる能力をもちかつ特異的塩基対合（以下参照）の能力を有する全てのヌクレオチド類似体が含まれる。
【００８８】
従って、「核酸」又は「核酸類似体」という語は、基本的に複数のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体及び／又はインタカレータ擬ヌクレオチドからなるあらゆる分子を表わしている。本発明にとって有用な核酸又は核酸類似体は、異なる主鎖モノマー単位を伴う一定数の異なるヌクレオチドを含み得る。
【００８９】
好ましくは、核酸又は核酸類似体の一本鎖は、実質的に相補的な一本鎖核酸及び／又は核酸類似体とハイブリッド形成して二本鎖核酸又は核酸類似体を形成する能力を有する。より好ましくは、かかる二本鎖類似体は、二重らせんを形成する能力を有する。好ましくは、該二重らせんは、水素結合に起因して形成され、より好ましくは、二重らせんは、Ａ形態、Ｂ形態、Ｚ形態及びそれらの中間体の二重らせんからなる群から選択された二重らせんである。
【００９０】
従って、本発明に有用な核酸及び核酸類似体としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＩＮＡ及びその混合物及びそのハイブリッド、ならびにそのリン原子修飾、例えば制限的意味なくホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステル及びホスホボラノエート、が含まれるが、これらに制限されるわけではない。さらに、制限的な意味なくメチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテート及びアミドを含む連結基といったような、リンを含有しない化合物をヌクレオチドに対する連結のために使用することができる。特に、核酸及び核酸類似体は、１つ以上のインタカレータ擬ヌクレオチドを含むことができる。
【００９１】
この状況下で、「混合物」は、異なる種類のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む核酸又は核酸類似体鎖を網羅するものと考えられている。さらに、この状況下では、「ハイブリッド」は、１つ以上の種類の主鎖を伴うヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む１つの鎖及び異なる種類の主鎖を伴うヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むもう一方の鎖を含む核酸又は核酸類似体を網羅すると考えられている。
【００９２】
ＩＮＡというのは、本発明に参照により援用されている国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレット及び国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（Ｕｎｅｓｔ  Ａ／Ｓ）の教示に従ったインターカレーティング核酸を意味する。ＨＮＡというのは、例えばＶａｎ  Ａｅｔｓｃｈｏｔら、１９９５により記述されている通りの核酸を意味する。ＭＮＡというのは、Ｈｏｓｓａｉｎら、１９９８によって記述されている通りの核酸を意味する。ＡＮＡは、Ａｌｌｅｒｔら、１９９９により記述されている核酸を意味する。ＬＮＡは、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット（Ｅｘｉｑｏｎ）中で記述されている通りのあらゆるＬＮＡ分子であり得、好ましくは、ＬＮＡは国際公開第９９／１４２２６号パンフレットの要約で描かれている分子から選択される。より好ましくは、ＬＮＡは、Ｓｉｎｇｈら、１９９８、Ｋｏｓｈｋｉｎら、１９９８又はＯｂｉｋａら、１９９７に記述されている通りの核酸である。ＰＮＡは、例えばＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１により記述されている通りのペプチド核酸を意味する。
【００９３】
ヌクレオチドという語は、核酸又は核酸類似体の構築ブロックを表わし、ヌクレオチドという語は、天然に発生するヌクレオチド及びその誘導体ならびに基本的に天然に発生するヌクレオチド及びその誘導体と同じ機能を果たす能力を有するヌクレオチドを網羅している。天然に発生するヌクレオチドには、４つの主たる核塩基アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）のうちの１つを含むデオキシリボヌクレオチド、及び４つの核塩基アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）を含むリボヌクレオチドが含まれる。上述の主たる又は一般的な塩基に加えて、一部の核酸分子内に存在しうるその他のさほど一般的でない天然に発生する塩基としては、５−メチルシトシン（ｍｅｔ−Ｃ）及び６−メチルアデニン（ｍｅｔ−Ａ）が含まれる。
【００９４】
ヌクレオチド類似体は、核酸主鎖内に取込まれる能力をもちかつ特異的塩基対合の能力も有する任意のヌクレオチド様分子であり得る。天然に発生するものでないヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ−［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ−［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ又はα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれたヌクレオチドが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００９５】
ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の機能は、相補的ヌクレオチドの核塩基の水素結合を介して相補的ヌクレオチドと特異的に相互作用できるようになることならびに核酸又は核酸類似体の中に取込まれ得るようになることにある。天然に発生するヌクレオチドならびに一部のヌクレオチド類似体は、例えばＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼにより核酸又は核酸類似体内に酵素的に取込まれる能力を有する。しかしながら、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、核酸又は核酸類似体内に化学的に取込まれてもよい。
【００９６】
さらに核酸又は核酸類似体は、２つの比較的小さい核酸又は核酸類似体をもう１つのものにカップリングすることによって調製されることができ、例えば、これはリガーゼによって酵素的に行なわれてもよいし、又、化学的に行なわれてもよい。
【００９７】
ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、主鎖モノマー単位及び核塩基を含む。核塩基は、天然に発生する核塩基か又は基本的に同じ機能を果たす能力を有するその誘導体又はその類似体であり得る。核塩基の機能は、水素結合を介して１つ以上のその他の核塩基と特異的に会合する能力を有することにある。かくして、１つ又はわずかなその他の核塩基と安定した水素結合を形成することだけができ、通常それ自体を含めた大部分のその他の核塩基と安定した水素結合を形成できないということが、核塩基の重要な特長である。もう１つの核塩基との１つの核塩基の特異的相互反応は一般に「塩基対合」と呼ばれる。
【００９８】
塩基対合は、予め定められたヌクレオチドと相補的ヌクレオチドの間の特異的ハイブリダイゼーションを結果としてもたらす。相補的ヌクレオチドは、塩基対合の能力を有する核塩基を含むヌクレオチドである。
【００９９】
一般的な天然に発生する核塩基のうち、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）と対合し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対合する。従って、Ａを含むヌクレオチドは、Ｔ又はＵのいずれかを含むヌクレオチドと相補的であり、Ｇを含むヌクレオチドは、Ｃを含むヌクレオチドと相補的である。
【０１００】
ヌクレオチドは、追加の分子物質を含むようにさらに誘導体化され得る。ヌクレオチドは、核塩基又は主鎖モノマー単位上で誘導体化され得る。塩基上の好ましい誘導体化部位としては、アデニンの８位、ウラシルの５位、シトシンの５又は６位及びグアニンの７位が含まれる。複素環修飾は、強化された塩基スタッキング、付加的な水素結合、及びこれらのクラスの組合わせといった３つの構造クラスへとグループ分けすることができる。平面系のπ−電子雲を拡張させることによって塩基スタッキングを増強する修飾か、ピリミジンの５位及び７−デアザ−プリンの７位における接合型親油性修飾により代表される。ピリミジン修飾の５位での置換にはプロピン、ヘキシン、チアゾール及び単にメチル基が含まれ、７−デアザプリンの７位における置換には、ヨード、プロピニル及びシアノ基が含まれる。プロピルから５員複素環へそして４及び５位（シトシンクランプ）から生じる３環融合系へとシトシンの５位を修飾することも同様に可能である。複素環修飾の第２のタイプは、付加的なアミノ基が、Ｇ−Ｃ塩基対内の３水素結合に類似するＡ−Ｔ塩基対内のもう１つの水素結合を提供している２−アミノ−アデニンにより代表される。効果の組合せを提供する複素環修飾は、２−アミノ−７−デアザ−７−修飾済みアデニン及びヘテロ二重鎖のエトキシアミノ官能基を有する３環シトシン類似体により代表される。さらに、Ｎ２−修飾済み２−アミノアデニン修飾済みオリゴヌクレオチドが、一般的な修飾の中に含まれる。リボース又はデオキシリボース部分上の好ましい誘導体化部位は、非連結性炭素位置Ｃ−２’及びＣ−４’の修飾、連結性炭素Ｃ−１’、Ｃ−３’及びＣ−５’の修飾、糖酸素Ｏ−４’の置換、無水糖修飾（立体配座制限あるもの）、環糖修飾（立体配座制限あるもの）、リボフラノシル環サイズ変更、連結部位−糖対糖、（Ｃ−３’対Ｃ−５’／Ｃ−２’対Ｃ−５’）、ヘテロ原子環−修飾済み糖及び上述の修飾の組合せである。しかしながら、核酸又は核酸類似体の全体的塩基対合特異性が分断されないかぎり、その他の部位を誘導体化させることもできる。最終的に、主鎖モノマー単位がリン酸塩基を含む場合、一部の主鎖モノマー単位のリン酸塩を誘導体化させることができる。
【０１０１】
本書で使用されている通りのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、基本的にヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体及び／又はインタカレータ擬ヌクレオチドの配列からなる分子である。好ましくは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は５〜１００個の個々のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ＰＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ及びその混合物ならびにあらゆるその他のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体及び／又はインタカレータ擬ヌクレオチドを含み得る。
【０１０２】
対応する核酸
核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、それらがハイブリッド形成する能力を有する場合に対応しているとみなされる。好ましくは、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、低ストリンジェンシー条件でハイブリッド形成する能力をもち、より好ましくは、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、中ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する能力をもち、より好ましくは、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する能力を有する。
【０１０３】
本書で使用する高ストリンジェンシー条件は、例えばSouthern E.M., 1975, J. Mol. Biol., 98:503-517によって記述されている通りのサザンブロット法及びハイブリダイゼーションに関連して通常利用される通りのストリンジェンシーを表わすものとする。このような目的のためには、予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションのステップを内含することが日常的実践方法である。かかるステップは通常本発明に参照により援用されている「Molecular Cloning/A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbar）中でＳａｍｂｒｏｏｋらにより記述されているように、６×ＳＳＰＥ、５％のＤｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精巣ＤＮＡを含有する溶液を使用し（４２℃で１８時間のインキュベーション）、それに続いて２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで洗浄し（室温及び３７℃で）、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで洗浄する（３０分間６８℃でのインキュベーション）ことによって実施される。
【０１０４】
本書で使用されている中ストリンジェンシー条件は、ｐＨ７．０で１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４Ｈ２Ｏ、１４０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中でのハイブリダイゼーションを意味するものとする。好ましくは、各々の核酸又は核酸類似体が約１．５μＭずつ提供される。代替的には、中ストリンジェンシーは、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のトリトンＸ−１００、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中でのハイブリダイゼーションを意味する可能性がある。
【０１０５】
低ストリンジェンシー条件は、ｐＨ７．０で１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４を構成する緩衝液中でのハイブリダイゼーションを意味する。
【０１０６】
代替的には、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、７０％を上回る相補性、例えば７５％を上回る、例えば８０％を上回る、例えば８５％を上回る、例えば９０％を上回る、例えば９２％を上回る、例えば９４％を上回る、例えば９５％を上回る、例えば９６％を上回る、例えば９７％を上回る相補性といったような実質的な相補性を一定の与えられた配列上で互いに有する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド類似体である。
【０１０７】
好ましくは、該一定の与えられた配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば少なくとも１５ヌクレオチド、例えば少なくとも２０ヌクレオチド、例えば少なくとも２５ヌクレオチド、例えば少なくとも３０ヌクレオチド、例えば１０〜５００ヌクレオチドの間、例えば１０〜１００ヌクレオチド長の間、例えば１０〜５０ヌクレオチド長の間である。より好ましくは、対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は実質的にその全長にわたり相補性をもつ。
【０１０８】
クロスハイブリダイゼーション
クロスハイブリダイゼーションという語は、少なくとも２つの核酸又は核酸類似体の間の意図的でないハイブリダイゼーションを網羅している。クロスハイブリダイゼーションという語は、その意図された標的配列以外の核酸配列又は核酸類似体配列に対する核酸プローブ又は核酸類似体プローブ配列のハイブリダイゼーションを表わすために用いることができる。
【０１０９】
往々にして、クロスハイブリダイゼーションは、たとえそのプローブ及びその対応する標的配列よりも低い相補性度しか有していなくても、１つ以上の対応する非標的配列とプローブの間で起こる。この望まれない効果は、標的に比べてプローブがはるかに余剰であること及び／又はアニーリング反応速度が速いことに起因している可能性がある。クロスハイブリダイゼーションは同様に、わずかな核塩基対の間、例えばＰＣＲ反応内のプライマの間の水素結合によっても発生し、プライマ２量体を形成する及び／又は非特異的ＰＣＲ産物を形成する結果となる。
【０１１０】
同じタイプのヌクレオチド類似体に対する高い親和力をもつ１つ以上のヌクレオチド類似体を含む核酸は、塩基対合に基づいた２量体又はそれより高次の複合体を形成する傾向をもつ。ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びＰＮＡといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）ヌクレオチド類似体を含むプローブは一般に、同じタイプの主鎖モノマー単位を含むその他のオリゴヌクレオチド類似体に対しハイブリッド形成するための高い親和力を有する。従って、個々のプローブ分子が低い相補性度しか有していない場合でも、それらはハイブリッド形成する傾向をもつ。
【０１１１】
自己ハイブリダイゼーション
自己ハイブリダイゼーションという語は、自らの上に戻るように折畳むことによって核酸又は核酸類似体分子が自らにアニールして例えばヘアピン構造などといった二次構造を生成するプロセス、又は１つの分子がもう１つの同一の分子に結合して分子の凝集を導くことを網羅している。大部分の利用分野において、自己ハイブリダイゼーションを回避することが重要である。さらに、自己ハイブリダイゼーションは同様にバックグラウンドシグナルを増大させ、分子生物学的方法又はアッセイの感度を大幅に低下させる可能性がある。二次構造の生成は、望ましい核酸標的配列とのハイブリダイゼーションを阻害し得る。これは、例えば核酸又は核酸類似体がＰＣＲ反応内のプライマとして又はエクソヌクレアーゼアッセイ用のフルオロフォア／消光剤標識済みプローブとして使用される場合などの大部分のアッセイにおいて望ましくない。両方のアッセイにおいて、自己ハイブリダイゼーションは、標的核酸に対するハイブリダイゼーションを阻害することになり、さらにエクソヌクレアーゼアッセイにおけるフルオロフォア消光度は低下させられる。
【０１１２】
同じタイプのヌクレオチド類似体に対する高い親和力を伴う１つ以上のヌクレオチド類似体を含む核酸は、自己ハイブリッド形成する傾向をもつ。ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びＰＮＡといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）ヌクレオチド類似体を含むプローブは一般に、自己ハイブリッド形成するための高い親和力を有する。従って、個々のプローブ分子が低い自己相補性度しかもたない場合でも、これらは自己ハイブリッド形成する傾向をもつ。
【０１１３】
融解温度
核酸の融解というのは、二本鎖核酸分子の二本鎖の分離を意味する。融解温度（Ｔｍ）は、５０％のらせん（ハイブリッド形成されたもの）対コイル（ハイブリッド形成されていないもの）形態が存在する摂氏温度を表わす。
【０１１４】
高い融解温度は、安定した複合体、ひいては個々の鎖間の高い親和力を表わす。同様にして、低い融解温度は、個々の鎖間の比較的低い親和力を表わす。従って、通常は、２つの鎖の間の強い水素結合は、結果として高い融解温度をもたらす。
【０１１５】
さらに、二本鎖核酸の核塩基間のインタカレータの挿入も同様に、二本鎖核酸を安定化し、従ってより高い融解温度を結果としてもたらす。
【０１１６】
さらに、融解温度は、周囲の物理的／化学的状態に左右される。例えば融解温度は塩濃度及びｐＨによって左右される。
【０１１７】
融解温度は、数多くのアッセイにより決定され得る。例えば、それは、ハイブリダイゼーションの形成及び崩壊（融解）を判定するべくＵＶスペクトルを用いることにより決定され得る。
【０１１８】
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）又はインタカレータ擬ヌクレオチド
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、本明細書においてインタカレータ擬ヌクレオチドとも呼ばれている。
【０１１９】
インタカレータを含み以下の望ましい特徴のうちのうちの１つ以上のものを有する擬ヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体：
予め定められた位置で二重らせん内に挿入する；
Ｉ．  ＤＮＡに対する親和力を実質的に増大させる；
ＩＩ．  自己及びクロスハイブリダイゼーションを阻害又は減少させる；
ＩＩＩ．  ＲＮＡ及びＤＮＡといったような異なる核酸を識別する；
ＩＶ．  ハイブリダイゼーションの特異性を実質的に増大させる；
Ｖ．  ヌクレアーゼ安定性を増大させる；
ＶＩ．  鎖侵入を有意に増強させる；
ＶＩＩ．  ハイブリダイゼーションの時点で蛍光強度の変化を示す。
【０１２０】
インタカレータ擬ヌクレオチドは、一般構造：
Ｘ−Ｙ−Ｑ、
を有し、式中、
Ｘは、核酸又は核酸類似体の主鎖内に取込まれる能力を有する主鎖モノマー単位であり；
Ｑは、ＤＮＡの核塩基とコ・スタッキング（ｃｏ−ｓｔａｃｋｉｎｇ）する能力を有する、少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むインタカレータであり；
Ｙは、主鎖モノマー単位とインタカレータを連結するリンカー部分である。
【０１２１】
より好ましくは、インタカレータ擬ヌクレオチドは、一般構造：
Ｘ−Ｙ−Ｑ、
を有し、式中
−  Ｘは、
【化１】
2006517402.tif 000002
という一般構造式の核酸又は核酸類似体の主鎖内に取込まれる能力を有する主鎖モノマー単位であり、
［ここで、ｎ＝１〜６であり、
Ｒ１は三価又は五価の置換基を有するリン原子であり；
Ｒ２は少なくとも２つの結合を形成する能力を有する原子から個別に選択され、Ｒ２は任意には個別に置換されており、
Ｒ６は保護基である］、
−  Ｑは、ＤＮＡの核塩基とコ・スタッキングする能力を有する、少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むインタカレータであり；
−  Ｙは、主鎖モノマー単位のＲ２のいずれかとインタカレータを連結するリンカー部分であり；
Ｑ及びＹの合計長は、約７Å〜２０Åの範囲内にある。
【０１２２】
インタカレータがピレンである場合、例えば、Ｑ及びＹの合計長は約９Å〜１３Å、好ましくは９Å〜１１Åの範囲内にある。
【０１２３】
「核酸又は核酸類似体の主鎖内に取込まれた」という語は、該インタカレータ擬似ヌクレオチドを核酸及び／又は核酸類似体の配列内に挿入できることを意味している。
【０１２４】
「平坦な接合系」という語は、その接合系内に含まれた実質的に全ての原子が１つの平面内にあることを意味する。
【０１２５】
「基本的に平坦な接合系」という語は、接合系内に含まれる全ての原子のうち常時１つの平面内に無いのは最大でも２０％であることを意味する。
【０１２６】
「接合系」という語は、３つ以上の隣接する原子の原子ｐ軌道の重複を伴う化学的結合を含有する構造単位を意味する（Gold et al., 1987, Compendium of Chemical Terminology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK）。
【０１２７】
コ・スタッキングは、コアキシャル・スタッキング（ｃｏａｘｉａｌ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）を略したものとして用いられている。コアキシャル・スタッキングは、スタック様の構造内の共通軸に沿って互いの上に（平坦な側面に対し平坦な側面）平坦な分子が整列している１つのエネルギー的に有利な構造である。コ・スタッキングには、個々の分子の２つのパイ電子雲の間の相互作用が必要である。二重鎖内で核塩基とコ・スタッキングするインタカレータ擬似ヌクレオチドの場合、好ましくは、反対側の鎖上にパイ電子系との相互作用が存在し、より好ましくは、両鎖上にパイ電子系との相互作用が存在する。コ・スタッキング相互作用は分子間及び分子内の両方で見られる。例えば、核酸は、核塩基コ・スタッキングを可能にするべく二重鎖構造を採用している。
【０１２８】
主鎖モノマー単位
適切なあらゆる主鎖モノマー単位を利用することができる。主鎖モノマー単位は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の主鎖内に取込まれ得るインタカレータ擬似ヌクレオチドの部分を含む。さらに、主鎖モノマー単位は、その主鎖モノマー単位を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の合成中又は合成の後、いかなる形であれ除去又は変化されうる１つ以上の離脱基、保護基及び／又は反応基を含み得る。
【０１２９】
「主鎖モノマー単位」という語には、主鎖モノマー単位自体しか含まれず、例えばインタカレータに主鎖モノマー単位を連結させるリンカーは含まれない。従って、インタカレータならびにリンカーは主鎖モノマー単位の一部ではない。
【０１３０】
従って、主鎖モノマー単位はモノマーが１つの配列内に取込まれている原子のみを含有し、次のものからなる群から選択される。
−  近隣ヌクレオチドの主鎖モノマー単位に対する連結を形成する能力を有する原子；又は
−  少なくとも２つの部位で主鎖モノマー単位のその他の原子に連結されている原子；又は
−  １つの部位で主鎖モノマー単位に連結され、そうでなければその他の原子と連結されていない原子。
【０１３１】
かくして、主鎖モノマー単位原子は、モノマーが１つの配列内に取込まれた時点で近隣ヌクレオチドの主鎖リン原子の間の直接的連結（最短経路）に関与し、該近隣ヌクレオチドが天然に発生するヌクレオチドである原子として定義づけされる。
【０１３２】
主鎖モノマー単位は、適切な任意の主鎖モノマー単位であり得る。主鎖モノマー単位は例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ又はα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡの主鎖モノマー単位からなる群から選択され得る。
【０１３３】
ＬＮＡ（ロック核酸）の主鎖モノマー単位は、ＤＮＡ主鎖モノマー単位の通常の立体配座の自由を制限する分子内ブリッジを含む、立体的に制限されたＤＮＡ主鎖モノマー単位である。ＬＮＡは、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット（Ｅｘｉｑｏｎ）内で記述されているようなあらゆるＬＮＡ分子であり得る。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ位を４’−Ｃ位に連結するメチルリンカーを含むが、２’オキシ原子が窒素又は硫黄のいずれかで置換されているＬＮＡといったようなその他のＬＮＡも同様に、本発明の中に含まれている。
【０１３４】
インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、好ましくは、オリゴヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体の中に取込まれる前に、一般構造：
【化２】
2006517402.tif 000003
を有し、式中、
ｎ＝１〜６、好ましくはｎ＝２〜６、より好ましくはｎ＝３〜６、より好ましくはｎ＝２〜５、より好ましくはｎ＝３〜５、より好ましくはｎ＝３〜４であり；
Ｒ１は、三価又は五価の置換リン原子であり、好ましくはＲ１は、
【化３】
2006517402.tif 000004
であり、
Ｒ２は、少なくとも２つの結合を形成する能力を有する原子から個別に選択され得、該原子は任意には個別に置換され、好ましくはＲ２は、任意には個別に置換されたＯ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、Ｐから個別に選択される。「個別に」という語は、Ｒ２が同じ分子内の１つ、２つ又はそれ以上の異なる基を表わし得ることを意味している。２つのＲ２の間の結合は、飽和又は不飽和又は環系の一部、又はその組合せであり得る。各々のＲ２は、Ｈ、低級アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、Ｃ７−Ｃ１１アリールメチル、Ｃ２−Ｃ７アシルオキシメチル、Ｃ３−Ｃ８アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｃ７−Ｃ１１アリーロイルオキシメチル、Ｃ３−Ｃ８Ｓ−アシル−２−チオエチルから選択された置換基といった任意の適切な置換基と個別に置換され得る。
【０１３５】
「アルキル」基というのは、直鎖、分枝鎖、及び環状アルキル基を含めた、任意には置換された脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は１〜２５個の炭素を有し、２０個以下のヘテロ原子を含む。より好ましくは、１〜１２個の炭素、より好ましくは１〜６個の炭素、より好ましくは１〜４個の炭素の低級アルキルである。ヘテロ原子は好ましくは、窒素、硫黄、リン及び酸素からなる群から選択されている。
【０１３６】
「アルケニル」基は、全て任意に置換され得る直鎖、分枝鎖及び環状アルケニル基を内含する少なくとも１つの二重結合を含有する、任意に置換された炭化水素を意味する。好ましくは、アルケニル基は２〜２５個の炭素を有し、２０個以下のヘテロ原子を含有する。より好ましくは、２〜１２個、より好ましくは２〜４個の炭素の低級アルケニルである。ヘテロ原子は好ましくは、窒素、硫黄、リン及び酸素からなる群から選択される。
【０１３７】
「アルキニル」基は、全て任意に置換され得る直鎖、分枝鎖及び環状アルキニル基を内含する少なくとも１つの３重結合を含有する、任意に置換された不飽和炭化水素を意味する。好ましくは、アルキニル基は２〜２５個の炭素を有し、２０個以下のヘテロ原子を含有する。より好ましくは、２〜１２個、より好ましくは２〜４個の炭素の低級アルキニルである。ヘテロ原子は好ましくは、窒素、硫黄、リン及び酸素からなる群から選択される。
【０１３８】
「アリール」は、接合パイ電子系を伴う少なくとも１つの環を有する任意には置換された芳香族基を意味し、炭素環アリール、複素環アリール、ビ−アリール及びトリ−アリール基を含む。アリール置換の置換基例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、基本的に相補的なアミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルフォニル、ハロゲン、チオール及びアリールオキシが含まれる。
【０１３９】
「炭素環アリール」は、芳香族環上の全ての原子が炭素原子であるアリールを意味する。炭素原子は、任意にはアリールについて以上で記述されている通りに置換される。好ましくは、炭素環アリールは、任意に置換されたフェニルである。
【０１４０】
「複素環アリール」というのは、芳香族環の中の環原子として１〜３個のヘテロ原子を有するアリールを意味し、該環原子の残りの部分は炭素原子である。適切なヘテロ原子には酸素、硫黄及び窒素が含まれる。複素環アリールの例としては、フラニル、チェリル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル及びイミダゾリルが含まれる。複素環アリールは、アリールについて上述されたとおり、任意には置換される。
【０１４１】
２つ以上のＲ２上の置換基は、代替的には合わさって、上述のとおりの環系のいずれかのような１つの環系を形成する。好ましくはＲ２は、Ｈ、メチル、Ｒ４、ヒドロキシ、ハロゲン、及びアミノから選択された１つの原子又は基で置換され、より好ましくはＲ２は、Ｈ、メチル、Ｒ４から選択された１つの原子又は基で置換される。より好ましくは、Ｒ２はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（Ｍｅ）、Ｎ（Ｒ４）、Ｃ（Ｒ４）２、ＣＨ（Ｒ４）又はＣＨ２から個別に選択され、ここでＲ４は以下で定義される通りである。
【０１４２】
Ｒ３は、メチル、ベータ−シアノエチル、ｐ−ニトロフェネチル、ｏ−クロロフェニル、又はｐ−クロロフェニルである。
【０１４３】
Ｒ４は、低級アルキル、好ましくはメチル、エチル、又はイソプロピルといったような低級アルキル、又はモルフォリノ、ピロリジノ又は２，２，６，６−テトラメチルピロリジノといったような複素環であり、ここで低級アルキルはＣ１−Ｃ４といったようなＣ１−Ｃ６として定義される。
【０１４４】
Ｒ５は、Ｘ２＝Ｏ−である場合にＨであることを条件としてアルキル、アルコキシ、アリール又はＨであり、好ましくはＲ５は低級アルキル、低級アルコキシ、アリールオキシから選択されている。好ましい実施形態においては、アリールオキシはフェニル、ナフチル又はピリジンから選択されている。
【０１４５】
Ｒ６は、任意の適切な保護基から選択された保護基である。好ましくは、Ｒ６は、トリチル、モノメトキシトリチル、２−クロロトリチル、１，１，１，２−テトラクロロ−２，２−ビス（ｐ−メトキシフェニル）−エタン（ＤＡＴＥ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（ピキシル）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）又は、「Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry」volume 1, Beaucage et al. Wileyの中で言及されているその他の保護基からなる群から選択される。より好ましくは、保護基は、モノメトキシトリチル及びジメトキシトリチルからなる群から選択され得る。最も好ましくは、保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）であり得る。
【０１４６】
Ｒ９は、任意に置換されたＯ、Ｓ、Ｎから選択され、好ましくはＲ９はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（Ｍｅ）から選択される。
【０１４７】
Ｒ１０は、任意に置換されたＯ、Ｓ、Ｎ、Ｃから選択される。
【０１４８】
Ｘ１は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又はＮ（Ｒ４）２から選択される。
【０１４９】
Ｘ２は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ４）２又はＯ−から選択される。
【０１５０】
置換基に関して上述されているように、主鎖モノマー単位は、非環式又は環系の一部分であり得る。
【０１５１】
好ましくは、インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、非環式主鎖モノマー単位からなる群から選択されている。非環式というのは、環構造を含まないあらゆる主鎖モノマー単位を網羅するものとされており、例えば、該主鎖モノマー単位は好ましくはリボース又はデオキシリボース系を含まない。
【０１５２】
特に、インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位が、バルジ挿入（以下で定義されている）を安定化させる能力を有する非環式主鎖モノマー単位であることのが好ましい。
【０１５３】
インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、五価のリン原子といったような三価及び五価のリン原子から選択された少なくとも１つの化学基を含む主鎖モノマー単位からなる群から選択され得る。より好ましくは、インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位のリン原子は、ホスホエステル、ホスホジエステル、ホスホラミデート及びホスホラミダイト基からなる群から選択された少なくとも１つの化学基を含む主鎖モノマー単位からなる群から選択され得る。
【０１５４】
リン酸塩、ホスホエステル、ホスホジエステル、ホスホラミデート及びホスホラミダイト基からなる群から選択された少なくとも１つの化学基を含む好ましい主鎖モノマー単位は、それが核酸主鎖内に取込まれた場合、リン原子を含まずに少なくとも１つのリン原子から近隣ヌクレオチドの少なくとも１つのリン原子までの距離が、長くても６原子、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６原子の長さである、主鎖モノマー単位である。
【０１５５】
好ましくは、主鎖モノマー単位は、いずれの場合でもリン原子自体を含めずに、多くとも５個の原子（より好ましくは多くとも４個）がインタカレータ擬似ヌクレオチド主鎖モノマー単位のリン原子と最も近い近隣リン原子を隔離しており、より好ましくは５個の原子が、インタカレータ擬似ヌクレオチド主鎖モノマー単位のリン原子と最も近い近隣リン原子を隔離しているような形で、核酸又は核酸類似体のリン酸塩主鎖内に取込まれる能力を有している。
【０１５６】
特に好ましい形態では、インタカレータ擬似ヌクレオチドは、ホスホラミダイトを含む主鎖モノマー単位を含み、より好ましくは、該主鎖モノマー単位は三価のホスホラミダイトを含む。適切な三価のホスホラミダイトは、核酸及び／又は核酸類似体の主鎖内に取込まれ得る三価のホスホラミダイトである。通常は、アミダイト基は、核酸の主鎖内に取込まれ得ず、むしろアミジット基又はその一部は、離脱基及び／又は保護基として役立ち得る。しかしながら、ホスホラミダイト基は、核酸主鎖内への主鎖モノマー単位の取込みを容易にし得ることから、主鎖モノマー単位がホスホラミダイト基を含むことが好ましい。
【０１５７】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内に挿入されるインタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、ホスホジエステル結合を含み得る。さらに、インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は五価のホスホラミダイトを含み得る。好ましくは、インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、五価のホスホラミデートを含み得る非環式主鎖モノマー単位である。
【０１５８】
離脱基
主鎖モノマー単位は、１つ以上の離脱基を含み得る。離脱基は、インタカレータ擬似ヌクレオチド又はヌクレオチドがモノマーである場合に主鎖モノマー単位の一部であるが、ひとたびインタカレータ擬似ヌクレオチド又はヌクレオチドがオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内に取込まれた時点で分子内にもはや存在しない化学基である。
【０１５９】
離脱基の性質は、主鎖モノマー単位により異なる。例えば、主鎖モノマー単位がリンアミジットである場合、離脱基は例えばジイソプロピルアミン基であり得る。一般に、主鎖モノマー単位がリンアミジットである場合、離脱基は例えばジイソプロピルアミンの形でリン原子に固定され、離脱基は求核基に対するリン原子のカップリング時点で除去され、一方リン酸塩基の残りの部分又は残りの部分の１部分が核酸又は核酸類似体主鎖の一部となり得る。
【０１６０】
反応基
主鎖モノマー単位はさらに、反応前よりも長い１つのヌクレオチドである核酸又は核酸類似体を形成するべくもう１つのヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド又は核酸又は核酸類似体との化学反応を実施する能力を有する反応基を含むことができる。従って、ヌクレオチドは、その遊離形態にある場合、すなわち核酸内に取込まれていない場合、もう１つのヌクレオチド又は核酸又は核酸類似体と反応する能力を有する反応基を含み得る。
【０１６１】
反応基は、保護基によって保護され得る。化学反応に先立って、保護基を除去することができる。保護基はかくして、新たに形成された核酸又は核酸類似体の一部とはならない。反応基の例としては、ＤＮＡ又はＲＮＡ主鎖モノマー単位の５’−ヒドロキシ基といったような求核物質がある。
【０１６２】
保護基
主鎖モノマー単位は、合成中に除去できる保護基をも含むことができる。保護基の除去は、インタカレータ擬似ヌクレオチドとヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はもう１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドの間の化学反応を可能にする。
【０１６３】
特にヌクレオチドモノマー又はヌクレオチド類似体モノマー又はインタカレータ擬似ヌクレオチドモノマーは、ひとたびヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はインタカレータ擬似ヌクレオチドが核酸又は核酸類似体内に取込まれた時点で、分子内にもはや存在しなくなる１つの保護基を含み得る。さらに、主鎖モノマー単位は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はインタカレータ擬似ヌクレオチドの取込みの後にオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内に存在しうるものの該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体への付加的なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の導入後にはもはや存在し得ないか又はオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体全体の合成後除去され得る保護基を含むことができる。
【０１６４】
保護基は、当業者にとって既知の一定数の適切な技術によって除去され得る。好ましくは、保護基は、酸処理、チオフェノール処理及びアルカリ処理からなる群から選択された処理によって除去され得る。
【０１６５】
主鎖モノマー単位の５’末端及び５’末端類似体を保護するために用いることのできる好ましい保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、２−クロロトリチル、１，１，１，２−テトラクロロ−２，２−ビス（ｐ−メトキシフェニル）−エタン（ＤＡＴＥ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（ピキシル）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）又は「Current Protocols In Nucleic Acid Chemistry」volume 1, Beaucage et al. Wiley中で言及されているその他の保護基からなる群から選択され得る。より好ましくは、保護基は、モノメトキシトリチル及びジメトキシトリチルからなる群から選択され得る。最も好ましくは、保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）であり得る。４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基は、酸処理例えば、ＣＨ２Ｃｌ２中の３％ジクロロ酢酸中での又は３％のトリクロロ酢酸中での短時間のインキュベーション（３０〜６０秒で充分である）によって除去可能である。
【０１６６】
主鎖モノマー単位のリン酸塩又はホスホラミダイト基を保護し得る好ましい保護基は、例えばメチル及び２−シアノエチルからなる群から選択され得る。メチル保護基は、例えば、チオフェノール又は二ナトリウム２−カルバモイル２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートでの処理によって除去され得る。２−シアノエチル基は、アルカリ処理例えば、濃縮アンモニア水、メチルアミン水と濃縮アンモニア水の１：１混合物又はアンモニアガスでの処理により除去され得る。
【０１６７】
インタカレータ
インタカレータという語は、核酸の核塩基とコ・スタッキングする能力を有する少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むあらゆる分子部分を網羅する。好ましくは、インタカレータは、核酸又は核酸類似体の核塩基とコ・スタッキングする能力を有する少なくとも１つの基本的に平坦な接合系からなる。
【０１６８】
好ましくは、インタカレータは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートからなる群から選択された化学基を含み、さらに一層好ましくは、インタカレータは基本的にポリアロメート又はヘテロポリアロメートからなる。最も好ましくは、インタカレータはポリアロメート及びヘテロポリアロメートからなる群から選択される。
【０１６９】
ポリアロメート又はヘテロポリアロメートは、例えば１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば６個、例えば７個、例えば８個、例えば８個を超える数といった適切な任意の数の環で構成され得る。さらに、ポリアロメート又はヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシ及びアミドからなる群から選択された１つ以上のもので置換することができる。
【０１７０】
１つの好ましい形態においては、インタカレータは、蛍光発光能力を有するポリアロメート及びヘテロポリアロメートからなる群から選択され得る。
【０１７１】
もう１つのより好ましい形態においては、インタカレータは、エキサイマー、エキシプレックス、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）又は電荷移動複合体を形成する能力を有するポリアロメート及びヘテロポリアロメートからなる群から選択され得る。
【０１７２】
従って、インタカレータは好ましくは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナプテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン、ベンズアントラセン、スチルベン、オキサロ−ピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリン、プソラレン、及びヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシ及び／又はアミドからなる群から選択された１つ以上のものと置換された上述のインタカレータのうちのいずれかからなる群から選択され得る。
【０１７３】
好ましくは、インタカレータはフェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナプテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン、ベンズアントラセン、スチルベン、オキサロ−ピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリン及びプソラレンからなる群から選択される。
【０１７４】
インタカレータの例は、いかなる形であれ制限的意味があるものとして理解されるべきではなく、インタカレータとして使用するための考えられる構造の一例を提供するためのものである。さらに、修飾された構造を得るための各インタカレータ上の１つ以上の化学基の置換も同様に内含されている。
【０１７５】
インタカレータ擬似ヌクレオチドのインタカレータ部分は、リンカーにより主鎖単位に連結される。主鎖からリンカーに沿って挿入部分まで進んだ時点で、リンカー及びインタカレータの連結は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体かインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド類似体に対しハイブリッド形成された時点でオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の一本の鎖の核塩基とコ・スタッキングすることのできる接合系の一部分である第１の原子とリンカー原子の間の結合として定義される。
【０１７６】
リンカーは、接合系を含むことができ、インタカレータはもう１つの接合系を含むことができる。この場合、リンカー結合系は、反対側のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体鎖の核塩基とコ・スタッキングする能力をもたない。
【０１７７】
リンカー
インタカレータ擬似ヌクレオチドのリンカーは、インタカレータ擬似ヌクレオチドの主鎖モノマーとインタカレータを連結する部分である。リンカーは、１つ以上の原子又は原子間に結合を含み得る。
【０１７８】
本書で定義されている挿入部分と主鎖の定義によると、リンカーは、主鎖とインタカレータを連結する最短経路である。インタカレータが主鎖に直接連結されている場合、リンカーは１つの結合である。リンカーは通常、原子の連鎖又は原子の分枝鎖からなる。連鎖は、飽和ならびに不飽和であり得る。リンカーは、接合された結合を伴う又は伴わない環構造でもあり得る。例えば、リンカーは、連鎖の片端がインタカレータに連結され、連鎖のもう一方の末端が主鎖モノマー単位に連結された、Ｃ、Ｏ、Ｓ、Ｎ．Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからなる群から選択されたｍ個の原子の連鎖を含み得る。
【０１７９】
インタカレータ擬似ヌクレオチドのインタカレータ及びリンカーの全長は好ましくは８Å〜１３Åの間である。従って、ｍは、特定のインタカレータ擬似ヌクレオチドのインタカレータのサイズに応じて選択されるべきである。すなわち、ｍは、インタカレータが小さい場合に比較的大きく、インタカレータが大きい場合に比較的小さいものであるべきである。ただし、大部分の目的について、ｍは、１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４の整数となる。上述の通り、リンカーは、不飽和連鎖又は接合した結合が関与するもう１つの系であり得る。例えば、リンカーは環式接合構造を含み得る。好ましくは、リンカーが飽和連鎖であるときｍは１〜４である。
【０１８０】
インタカレータがピレンである場合、ｍは好ましくは１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４、より好ましくは１〜４、さらに一層好ましくは１〜３の整数であり、最も好ましくはｍは２又は３である。
【０１８１】
インタカレータが、構造：
【化４】
2006517402.tif 000005
を有する場合、
ｍは、２〜６、より好ましくは２である。
【０１８２】
リンカーの連鎖は、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからなる群から選択された１つ以上の原子で置換され得る。
【０１８３】
１つの形態においては、リンカーはアザアルキル、オキサアルキル、チアアルキル又はアルキル鎖である。例えば、リンカーは、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからからなる群から選択された１つ以上のもので置換されたアルキル鎖であり得る。好ましい実施形態においては、リンカーは、非分枝アルキル鎖から成り、ここで連鎖の片端はインタカレータに連結され、連鎖のもう一方の末端は主鎖モノマー単位に連結され、各々のＣは２Ｈで置換されている。より好ましくは、非分枝アルキル鎖の長さは、原子長１〜５個、例えば原子長１〜４個、例えば原子長１〜３個、例えば原子長２〜３個である。
【０１８４】
もう１つの形態においては、リンカーはＣ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからなる群から選択された原子を含む環構造である。例えば、連結は、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからなる群から選択された１つ以上のものと置換されたこのような環構造であり得る。
【０１８５】
もう１つの形態においては、リンカーは、１〜６個のＣ原子、Ｏ、Ｓ、Ｎの各々の原子０〜３個からなる。より好ましくは、リンカーは、１〜６個のＣ原子及びＯ、Ｓ、Ｎの各々の原子０〜１個からなる。好ましい形態においては、リンカーは、任意に置換されたＣ、Ｏ、Ｓ及びＮ個の原子の鎖からなる。好ましくは、連鎖は、多くても３個の原子から成り、かくして、任意に置換されたＣ、Ｏ、Ｓ、Ｎから個別に選択された０〜３個の原子を含むべきである。
【０１８６】
好ましい形態においては、リンカーは、Ｃ、Ｎ、Ｓ及びＯ原子の連鎖から成り、ここで連鎖の片端はインタカレータに連結され、連鎖のもう一方の末端は、主鎖モノマー単位に連結される。
【０１８７】
リンカーは、上述の通りのインタカレータ擬似ヌクレオチドについての構造式Ｘ−Ｙ−Ｑ中のＹを構成し、従って、Ｘ及びＱはリンカーの一部ではない。
【０１８８】
インタカレータ擬似ヌクレオチド
インタカレータ擬似ヌクレオチド又はＩＮＡ分子は、好ましくは一般構造：
Ｘ−Ｙ−Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、核酸又は核酸類似体の主鎖内に取込まれる能力を有する主鎖モノマー単位であり；
Ｑは、核酸の核塩基とコ・スタッキングする能力を有する、少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むインタカレータであり；
Ｙは、主鎖モノマー単位とインタカレータを連結するリンカー部分であり；
Ｑ及びＹの合計長は、約７Å〜２０Åの範囲内にある。
【０１８９】
さらに、本発明の好ましい実施形態においては、インタカレータ擬似ヌクレオチドは、主鎖モノマー単位を含み、ここで主鎖モノマー単位は、多くとも４個の原子がインタカレータに最も近い主鎖の２つのリン原子を隔離しているような形で核酸又は核酸類似体のリン酸塩主鎖内に取込まれる能力を有する。
【０１９０】
インタカレータ擬似ヌクレオチドは好ましくは、ワトソン・クリック水素結合を形成する能力を有する核塩基を含まない。従って、インタカレータ擬似ヌクレオチドは好ましくは、ワトソン・クリック塩基対合の能力をもたない。
【０１９１】
好ましくは、Ｑ及びＹの全長は、約７Å〜２０Å、より好ましくは約８Å〜１５Å、さらに一層好ましくは約８Å〜１３Å、さらに一層好ましくは約８．４Å〜１２Å、最も好ましくは約８．５９Å〜１０Å又は約８．４Å〜１０．５Åの範囲内にある。
【０１９２】
インタカレータが例えばピレンである場合、Ｑ及びＹの全長は好ましくは約８Å〜１３Å、例えば約９Å〜１３Å、より好ましくは約９．０５Å〜１１Å、例えば約９．０Å〜１１Å、さらに一層好ましくは約９．０５〜１０Å、例えば約９．０〜１０Åの範囲内にあり、最も好ましくは約９．８Åである。
【０１９３】
リンカー（Ｙ）及びインタカレータ（Ｑ）の全長は、インタカレータから最も遠くにあるリンカーの非水素原子の中心から、主鎖モノマー単位から最も遠くにあるインタカレータの基本的に平坦な接合系の非水素原子の中心までの距離を決定することによって、決定されるべきである。好ましくは該距離は、結合角及び標準化学法則がいかなる形であれ破られない又はゆがめられない最大距離でなくてはならない。
【０１９４】
該距離は好ましくは、最低の立体配座エネルギーレベルをもつ遊離挿入擬ヌクレオチドの構造を計算し、次に、自由に回転する結合（例えば環構造に参与する結合又は二重結合でない）の単純回転以上に構造を湾曲、伸長又はその他の形でゆがませることなく、インタカレータから最も遠くにあるリンカーの非水素原子の中心から、主鎖モノマー単位から最も遠くにあるインタカレータの基本的に平坦な接合系の非水素原子の中心までの最大距離を決定することによって決定されるべきである。好ましくは、エネルギー的に有利な構造は、非経験又は力場計算により見出される。
【０１９５】
該距離は、以下のステップからなる方法により決定可能である。
−  問題のインタカレータ擬似ヌクレオチドの構造は、プログラムＣｈｅｍＷｉｎｄｏｗ（登録商標）６．０（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））を用いてコンピュータにより引き出される；
−  該構造は、コンピュータプログラムＳｙｍＡｐｐｓＴＭ（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））へと転送される；
−  インタカレータ擬似ヌクレオチドの計算された結合長及び結合角を含む３次元構造は、コンピュータプログラムＳｙｍＡｐｐｓＴＭ（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて計算される；
−  該３次元構造は、コンピュータプログラムRasWin Molecular Graphics Ver. 2.6-ucbへと転送される；
−  該結合は、最大距離（以上で定義づけした通りの距離）を得るべくRasWin Molecular Graphics Ver. 2.6-ucbを用いて回転される；そして
−  該距離が決定される。
【０１９６】
インタカレータ擬似ヌクレオチドは、上述の主鎖モノマー単位、リンカー及びインタカレータのあらゆる組合せであり得る。
【０１９７】
もう１つの好ましい形態においては、インタカレータ擬似ヌクレオチドは、１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトからなる群から選択される。さらに一層好ましくは、インタカレータ擬似ヌクレオチドは、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイト及び（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトからなる群から選択される。
【０１９８】
インタカレータ擬似ヌクレオチドの調製
インタカレータ擬似ヌクレオチド又はＩＮＡ分子は、適切なあらゆる方法により合成可能である。１つの適切な方法は、以下のステップを含む。
ａ１）  任意には反応基にカップリングされたリンカー部分及び核酸の核塩基とコ・スタッキングする能力を有する少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むインタカレータを含有する化合物を提供するステップ；
ｂ１）  少なくとも２つの反応基を含むリンカー前駆体分子を提供するステップ（なお該２つの反応基は任意には個々に保護されていてよい）；
ｃ１）  インタカレータをリンカー前駆体と反応させ、かくしてインタカレータ−リンカーを得るステップ；
ｄ１）  少なくとも２つの反応基を含み（なお該２つの反応基は任意には個別に保護及び／又はマスキングされていてよい）、かつ任意にはリンカー部分を含む、主鎖モノマー前駆体単位を提供するステップ；及び
ｅ１）  インタカレータ−リンカーを主鎖モノマー前駆体と反応させ、インタカレータ−リンカー−主鎖モノマー前駆体を得るステップ；
又は、
ａ２）  少なくとも２つの反応基を含み（なお、該２つの反応基は、任意には個別に保護及び／又はマスキングされていてよい）かつ任意にはリンカー部分を含む主鎖モノマー前駆体単位を提供するステップ；
ｂ２）  少なくとも２つの反応基を含むリンカー前駆体分子を提供するステップ（なお該２つの反応基は任意には個別に保護されていてよい）；
ｃ２）  リンカー前駆体とモノマー前駆体単位を反応させ、かくして主鎖−リンカーを得るステップ；
ｄ２）  任意には反応基にカップリングされたリンカー部分及び核酸の核塩基とコ・スタッキングする能力を有する少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むインタカレータを含有する化合物を提供するステップ；及び
ｅ２）  主鎖−リンカーとインタカレータを反応させ、インタカレータ−リンカー−主鎖モノマー前駆体を得るステップ；
又は、
ａ３）  反応基にカップリングされたリンカー部分及び核酸の核塩基とコ・スタッキングする能力を有する少なくとも１つの基本的に平坦な接合系を含むインタカレータを含有する化合物を提供するステップ；
ｂ３）  少なくとも２つの反応基（なお該２つの反応基は任意には個別に保護及び／又はマスキングされていてよい）；及びリンカー部分を含む、主鎖モノマー前駆体単位を提供するステップ；及び
ｃ３）  インタカレータ−リンカー部分を主鎖モノマー前駆体のリンカーと反応させ、インタカレータ−リンカー−主鎖モノマー前駆体を得るステップ；
ｆ）  任意には、インタカレータ−リンカー−主鎖モノマー前駆体を保護しかつ／又は脱保護するステップ；
ｇ）  ２つの擬ヌクレオチド、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を合わせて連結する能力を有するリン含有化合物を提供するステップ；
ｈ）  インタカレータ−リンカー−主鎖モノマー前駆体とリン含有化合物を反応させるステップ、及び
ｉ）  インタカレータ擬似ヌクレオチドを得るステップ。
【０１９９】
好ましくは、インタカレータ反応基は、それがリンカー反応基と反応し得るような形で選択される。従って、リンカー反応基が求核物質である場合には、好ましくは、インタカレータ反応基は求電子物質であり、より好ましくは、ハロアルキル、メシルオキシアルキル及びトシルオキシアルキルからなる群から選択された求電子物質である。より好ましくは、インタカレータ反応基は、クロロメチルである。代替的には、インタカレータ反応基は、例えばヒドロキシ、チオール、セラム、アミン又はそれらの混合物を含む求核物質基といった求核物質基であり得る。
【０２００】
好ましくは、環式又は非環状アルカンは、少なくとも３つのリンカー反応基を含む多置換アルカン又はアルコキシであり得る。より好ましくは、多置換アルカンは、アルカントリオール、アミノアルカンジオール又はメルカプトアルカンジオールといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）３つの求核基を含み得る。好ましくは、多置換アルカンは、その他のものよりもさらに反応性の高い１つの求核基を含有し、代替的には、求核基のうちの２つは保護基により保護されていてよい。より好ましくは、環式又は非環状アルカンは、２，２−ジメチル−４−メチルヒドロキシ−１，３−ジオキサランであり、さらに一層好ましくは、アルカンはＤ−α，β−イソプロピリデングリセロールである。
【０２０１】
好ましくは、リンカー反応基はインタカレータ反応基と反応できなくてはならず、例えば、リンカー反応基は、例えばヒドロキシ、チオール、セラム及びアミンからなる群から選択された求核物質基であり得、好ましくはヒドロキシ基である。代替的には、リンカー反応基は、例えばハロゲン、トリフレート、メシレート及びトシレートからなる群から選択された求電子物質基であり得る。好ましい形態では、少なくとも２つのリンカー反応基は保護基により保護され得る。
【０２０２】
該方法は、さらに、インタカレータ−前駆体モノマーの１つ以上の反応基に対し保護基を固定させるステップを含むことができる。例えば、ＤＭＴ基は、ＣｌといったハロゲンにカップリングされたＤＭＴを提供し、少なくとも１つのリンカー反応基とＤＭＴ−Ｃｌを反応させることによって添加可能である。従って好ましくは、少なくとも１つのリンカー反応基が利用可能となり、１つが保護されている。このステップがリン含有作用物質との反応に先立って行なわれた場合には、該リン含有作用物質は、単に１つのリンカー反応基とのみ相互作用し得る。
【０２０３】
リン含有作用物質は、例えば、ホスホラミダイト、例えばＮＣ（ＣＨ２）２ＯＰ（Ｎｐｒｉ２）２又はＮＣ（ＣＨ２）２ＯＰ（Ｎｐｒｉ２）Ｃｌであり得る。好ましくは、リン含有作用物質は、Ｎ（ｅｔ）３、Ｎ（‘ｐｒ）２Ｅｔ及び及びＣＨ２Ｃｌ２といったような塩基の存在下でインタカレータ−前駆体と反応し得る。
【０２０４】
インタカレータ擬似ヌクレオチドを合成する方法の１つの特定の例が、実施例１及び図７で概略的に説明されている。
【０２０５】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の適切な配列がひとたび決定された時点で、これらは好ましくは市販の方法及び機器を用いて化学的に合成される。例えば、インタカレータ擬似ヌクレオチドを含む短かいオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を産生するために、固相ホスホラミダイト方法を使用することができる。
【０２０６】
例えば、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、「Current Protocols in Nucleic acid Chemistry」Volume 1, Beaucage et al., Wileｙに記述されている方法のいずれかにより合成可能である。
【０２０７】
インタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
標的核酸に対する合成核酸の高い親和力は、検出アッセイを著しく容易にすることができ、その上、標的核酸に対する高い親和力をもつ合成核酸は、核酸の遺伝子ターゲティング及び精製といったような数多くのその他の目的のために有用であり得る。インタカレータを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、相同な相補的核酸に対する親和力を増大させることが示されてきた。
【０２０８】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体及び相同な相補的ＤＮＡからなるハイブリッド（ＤＮＡハイブリッド）の融解温度が該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体と同じヌクレオチド配列からなるインタカレータ擬似ヌクレオチドが欠如したオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体と相同な相補的ＤＮＡの間のハイブリッド（対応するＤＮＡハイブリッド）の融解温度よりも著しく高い、少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を作ることができる。
【０２０９】
好ましくは、ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、対応するＤＮＡハイブリッドの融解温度よりも１〜８０℃、より好ましくは少なくとも２℃、さらに一層好ましくは少なくとも５℃、さらに一層好ましくは少なくとも１０℃高い。
【０２１０】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、少なくとも１つの内部インタカレータ擬似ヌクレオチドを有することができる。内部的にインタカレータ単位を位置づけすることで、設計上の柔軟性をさらに大きくすることができる。内部的に位置づけされたインタカレータ擬似ヌクレオチドを含む核酸類似体はかくして、内部的に位置づけされたインタカレータ擬似ヌクレオチドをもたない核酸類似体に比べ、相同的相補性核酸に対するさらに高い親和力を有し得る。少なくとも１つの内部インタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、ＲＮＡ（ＲＮＡ様の核酸類似体を含む）とＤＮＡ（ＤＮＡ様の核酸類似体を含む）を識別することもできる。さらに、内部的に位置づけされた蛍光インタカレータモノマーは、診断手段内で使用可能である。
【０２１１】
インタカレータ擬似ヌクレオチドは、一定の与えられたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の内部の任意の望ましい位置に配置され得る。例えば、インタカレータ擬似ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の末端に置くことができ、そうでなければインタカレータ擬似ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内の内部的位置に置くこともできる。
【０２１２】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体が２個以上のインタカレータ擬似ヌクレオチドを含んでいる場合、インタカレータ擬似ヌクレオチドを互いとの関係において任意の位置に置くことができる。例えば、これらを互いに隣り合って置くことができ、そうでなければ、１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば５個を超えるヌクレオチドがインタカレータ擬似ヌクレオチドを隔離しているような形で位置づけすることもできる。１つの好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内部の２つのインタカレータ擬似ヌクレオチドが次の最近隣体として配置される。すなわち、これらは、２つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを離隔する１つのヌクレオチドを有し、該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内部で任意の位置に設置され得る。もう１つの好ましい形態では、２つのインタカレータが、それぞれオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の各々の末端に又はそれに近いところに配置される。
【０２１３】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、上述のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体といったような任意の種類のヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＡＮＡ、ＩＮＡ及びＨＮＡ内に含まれるヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含み得る。従ってオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体はＰＮＡ、ホモ−ＤＮＡ、ｂ−Ｄ−アルトロピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−グルコピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−アロピラヌシル−ＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、□−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、□−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、□−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、□−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、□−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、□−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、□−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、□−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡのサブユニットからなる群から選択された１つ以上のものを含むことができる。すなわちオリゴヌクレオチド類似体はＰＮＡ、ホモ−ＤＮＡ、ｂ−Ｄ−アルトロピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−グルコピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−アロピラヌシル−ＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、□−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、□−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、□−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、□−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、□−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、□−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、□−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、□−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ及びその混合物からなる群から選択され得る。
【０２１４】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の１つの利点は、少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチド及び基本的に相補的なＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体からなるハイブリッド（ＤＮＡハイブリッド）の融解温度が、基本的に相補的なＤＮＡ及びそれに相補的なＤＮＡからなる二重鎖の融解温度よりも著しく高いという点にある。
【０２１５】
従って、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、天然に発生する核酸よりも高い親和力をもつＤＮＡとハイブリッドを形成し得る。融解温度は、例えば５から２０℃へ、例えば１０℃から１５℃へ、例えば２℃から５℃へ、例えば５℃から１０℃へ、例えば１５℃から２０℃へ、例えば２０℃から２５℃へ、例えば２５℃から３０℃へ、例えば３０℃から３５℃へ、例えば３５℃から４０℃へ、例えば４０℃から４５℃へ、例えば４５℃から５０℃以上へ、好ましくは２〜３０℃上昇させられる。
【０２１６】
特に、融解温度の上昇は、挿入がＤＮＡ二重鎖を安定させ得ることから、インタカレータの挿入に起因して達成される可能性がある。従って、インタカレータがＤＮＡの核塩基間に挿入する能力を有することが好ましい。好ましくは、インタカレータ擬似ヌクレオチドは、二重鎖内にバルジ挿入又は末端挿入として配置され（以下参照）、これが一部の核酸又は核酸類似体内で挿入を可能にし得る。
【０２１７】
少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチド及び基本的に相補的なＲＮＡ（ＲＮＡハイブリッド）又はＲＮＡ様核酸類似体（ＲＮＡ様ハイブリッド）を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の融解温度は、いかなるインタカレータ擬似ヌクレオチドも含まないオリゴヌクレオチド類似体と基本的に相補的なＲＮＡ又はＲＮＡ様の標的からなる二重鎖の融解温度よりも著しく高いものであり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体のインタカレータ擬似ヌクレオチドの大部分又は全ては、いずれか又は両方の末端に位置づけされている。
【０２１８】
従って、オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド類似体は、天然に発生する核酸よりも高い親和力をもつＲＮＡ又はＲＮＡ様の核酸類似体又はＲＮＡ様オリゴヌクレオチド類似体とハイブリッドを形成し得る。融解温度は、例えば５から１５℃へ、例えば１０℃から１５℃へ、例えば２℃から５℃へ、例えば５℃から１５℃へ、例えば１５℃から２０℃以上へ、好ましくは２〜２０℃上昇される。
【０２１９】
インタカレータ擬似ヌクレオチドは好ましくは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の末端に位置づけされた時点で、ＲＮＡ及びＲＮＡ様標的に向かってのみ安定することになる。しかし、そのために、インタカレータ擬似ヌクレオチドが形成済みハイブリッドの内部の領域に配置されるようにＲＮＡ又はＲＮＡ様核酸類似体とハイブリッド形成されるべきオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体内へのインタカレータ擬似ヌクレオチドの位置づけが除外されるわけではない。これは、或る種のハイブリッド不安定性を得るため又はハイブリッド形成の後に形成されるべき分子内及び分子間複合体の全体的２Ｄ又は３Ｄ構造に影響を及ぼすために行なわれ得る。
【０２２０】
１つ以上のインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド類似体が、相同な相補的核酸又は核酸類似体又はオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体に対するフーグステン型塩基対合により結合されたオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド類似体からなる３本鎖構造（３重鎖構造）を形成し得る。該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、３重鎖構造内のフーグステン型塩基対合の融解温度を上昇させ得る。
【０２２１】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、プリン富有／ピリミジン富有核酸又は核酸類似体二重鎖標的配列のような特定の配列制約の存在に左右されない形で３重鎖構造内のフーグステン型塩基対合の融解温度を上昇させ得る。従って、３重鎖構造内のフーグステン型塩基対合は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体がインタカレータ擬似ヌクレオチドを全くもたなかった場合の二重鎖領域に対するフーグステン型塩基対合の融解温度に比べて著しく高い融解温度を有する。
【０２２２】
従って、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、天然に発生する核酸よりも高い親和力をもつ相同な相補的核酸又は核酸類似体又はオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を伴う３重鎖構造を形成し得る。融解温度は、例えば２から４０℃へ、例えば２から３０℃へ、例えば５から２０℃へ、例えば１０℃から１５℃へ、例えば２℃から５℃へ、例えば５℃から１０℃へ、例えば１０℃から１５℃へ、例えば１５℃から２０℃へ、例えば２０℃から２５℃へ、例えば２５℃から３０℃へ、例えば３０℃から３５℃へ、例えば３５℃から４０℃へ、例えば４０℃から４５℃へ、例えば４５℃から５０℃へ、好ましくは２〜５０℃上昇させられる。
【０２２３】
特に、融解温度の上昇は、挿入がＤＮＡ３重鎖を安定させ得ることから、インタカレータの挿入に起因して達成される可能性がある。従って、インタカレータが３重鎖構造の核塩基間に挿入する能力を有することが好ましい。好ましくは、インタカレータ擬似ヌクレオチドは、二重鎖内にバルジ挿入として配置され（以下参照）、これが一部の核酸又は核酸類似体内で挿入を可能にし得る。
【０２２４】
３重鎖形成は、フーグステン型塩基対合された第３の鎖が標的二重鎖に侵入し同一の鎖の一部分又は全てを変位させて相補的鎖とワトソン・クリック塩基対を形成するプロセスであり、鎖反転の中で進行してもよいし、しなくてもよい。これは、複数の目的で開発利用可能である。オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、二本鎖核酸又は核酸類似体標的のみが存在する場合に適切に使用され、３重鎖形成及び／又は鎖反転のための二本鎖核酸又は核酸類似体領域を予め融解させることの無い相補的領域の二本鎖侵入又は領域の一本鎖侵入による検出である標的鎖の分離は、不可能、実施不能であるか又は望まれない。従って、核酸又は核酸類似体分子の二本鎖領域に侵入することのできる少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体が提供される。
【０２２５】
配列特異的な領域で二本鎖核酸又は核酸類似体に侵入することのできる少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を提供することができる。少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含む侵入性のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド類似体は、変位された鎖よりも高い親和力をもつ配列特異的な領域で相補的鎖に結合することになる。
【０２２６】
少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチド及び相同な相補的ＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド類似体からなるハイブリッド（ＤＮＡハイブリッド）の融解温度は、通常、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体及び相同な相補的ＲＮＡ（ＲＮＡハイブリッド）又はＲＮＡ様の核酸類似体標的又はＲＮＡ様のオリゴヌクレオチド類似体標的からなるハイブリッドの融解温度よりも著しく高い。オリゴヌクレオチドは、上述のオリゴヌクレオチド類似体のいずれかであり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチド（類似体）又は少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むホモ−ＤＮＡ、ｂ−Ｄ−アルトロピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−グルコピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−アロピラヌシル−ＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、□−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、□−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、□−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、□−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、□−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、□−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、□−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、□−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡオリゴヌクレオチド又はその混合物である。
【０２２７】
従って、ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の親和力は、ＲＮＡ又はＲＮＡ様標的についてのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の親和力よりも著しく高い。従って、制限的な数のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体及び相同な相補的ＤＮＡ及び相同な相補的ＲＮＡ又は相同な相補的ＲＮＡ様標的を含む混合物内では、該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は好ましくは相同な相補的ＤＮＡにハイブリッド形成する。
【０２２８】
好ましくは、ＤＮＡハイブリッドの融解温度は少なくとも２℃、例えば少なくとも５℃、例えば少なくとも１０℃、例えば少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃、例えば少なくとも３０℃、例えば少なくとも３５℃、例えば少なくとも４０℃、例えば２〜３０℃、例えば５℃〜２０℃、例えば１０℃〜１５℃、例えば２℃〜５℃、例えば５℃〜１０℃、例えば１０℃〜１５℃、例えば１５℃〜２０℃、例えば２０℃〜２５℃、例えば２５℃〜３０℃、例えば３０℃〜３５℃、例えば３５℃〜４０℃、例えば４０℃〜４５℃、例えば４５℃〜５０℃、例えば５０℃〜５５℃、例えば５５℃〜６０℃だけ、相同な相補的ＲＮＡ又はＲＮＡ様ハイブリッドの融解温度よりも高い。
【０２２９】
少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を、核酸又は核酸類似体の二次構造に対しハイブリッド形成させることができる。該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、二次構造に対するかかるハイブリダイゼーションを安定化させる能力を有する。二次構造は、ステム−ループ構造、ファラデ−接合部、折り畳み、Ｈ−ノット及びバルジであり得るが、これらに制限されるわけではない。二次構造は、少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体が、該インタカレータ擬似ヌクレオチドが二次構造とオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の間の３方接合部の中に形成された３つの二重鎖のうちの１つの二重鎖の末端でハイブリッド形成しているような形で設計されているＲＮＡのステム−ループ構造であり得る。
【０２３０】
インタカレータ擬似ヌクレオチドの位置
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、相同な相補的核酸又は核酸類似体（標的核酸）に対しハイブリッド形成し得るような形で設計可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、標的核酸に対し実質的に相補的である。より好ましくは、オリゴヌクレオチド類似体が標的核酸とハイブリッド形成された時点でインタカレータ擬似ヌクレオチドがバルジ挿入として位置づけされるような形で少なくとも１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドが位置づけされる。すなわち、インタカレータ擬似ヌクレオチドの上流側近隣ヌクレオチド及びインタカレータ擬似ヌクレオチドの下流側近隣ヌクレオチドは、標的核酸内の近隣ヌクレオチドに対してハイブリッド形成される。
【０２３１】
１つのインタカレータ擬似ヌクレオチドを、該インタカレータ擬似ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド類似体とその標的ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の間に形成された二重鎖のいずれか又は両方の末端の隣りに位置づけすることが可能であり、例えば、インタカレータ擬似ヌクレオチドを、懸垂コ・スタッキング末端として位置づけすることもできる。
【０２３２】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の全てのインタカレータ擬似ヌクレオチド又はＩＮＡは、オリゴヌクレオチド類似体が標的核酸とハイブリッド形成された時点で全てのインタカレータ擬似ヌクレオチドがバルジ挿入及び／又は懸垂コ・スタッキング末端として位置付けされるような形で位置づけされ得る。
【０２３３】
インタカレータ擬似ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドの例を以下に記す。
Ｎ１−（Ｐ）ｑ−Ｎ２、
Ｎ１−（Ｐ−Ｎ３）ｑ−Ｎ２、
（Ｐ）ｑ−Ｎ２、
Ｎ１−（Ｐ）ｑ、
（Ｐ）ｑ−Ｎ２−（Ｐ）ｒ、
Ｎ１−（Ｐ）ｑ−Ｎ２、
Ｎ１（Ｐ−Ｎ３）ｑ−Ｎ２−（Ｐ−Ｎ３）ｒ−Ｎ４、
式中、
−  Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４は個別に、１つのヌクレオチド配列及び／又は少なくとも１つのヌクレオチドのヌクレオチド類似体を表わし、
−  Ｐは、インタカレータ擬似ヌクレオチドを表わし、
−  ｑ及びｒは、１〜１０の整数から個別に選択される。
【０２３４】
メチル化
ゲノムＤＮＡのメチル化の量又は度合は、加齢、幹細胞分化、遺伝子異常、癌及びその他の疾病状態といった数多くの身体条件において潜在的重要性をもつ。メチル化状態の数多くの潜在的重要性が、以下に記されている。
【０２３５】
融合が行なわれた後ＤＮＡメチル化のレベルで発生する再プログラミングを検討するための、成人の胸腺細胞と胚幹細胞の融合。全染色体検査により視覚化されるように、不活性体細胞Ｘは活性状態となる（Tada et al., 2001; Current Biology, 11, 1553-1558）。
【０２３６】
かかる腫瘍を同定する廉価で正確な方法としての、散発性結腸直腸癌の臨床病理学的特長における特異的ＤＮＡ領域内のメチル化パターン（Ward et al., 2001; Gut, 48, 821-829）、及びヒト結腸腺窩内の幹細胞中のメチル化パターン（Ro et al., 2001, Proc Natl Acad Sci, USA, 98, 10519-10521; Yatabe et al., 2001, Proc. Natl. Acad Sci USA, on line edition）の検討。
【０２３７】
前立腺癌及び特定の遺伝子を再活性化するために５−アザシチジンで処理された細胞系統におけるメチル化パターン（Chetcuti et al., 2001, Cancer Research, 61, 6331-6334）。
【０２３８】
メチル化を介しての遺伝子不活性化が数多くの癌において発生するものの正常な個体では高頻度ではない、子宮内膜癌内のさまざまなエストロゲンレセプタ中のメチル化パターン（Sasaki et al., 2001, Cancer Research, 61, 3262-3266）。
【０２３９】
膀胱癌におけるメチル化パターン（Markl et al., 2001, Cancer Research, 61, 5875-5884）。
【０２４０】
乳癌におけるメチル化パターン（Nielsen et al., 2001, Cancer Letters, 163, 59-69）。
【０２４１】
肺癌及び乳癌に関与する特異的プロモータ内のメチル化パターン（Burbee et al., 2001, J Natl Cancer Institute, 93, 691-699）。
【０２４２】
食道腺癌患者の血漿中の遊離ＤＮＡ内のメチル化パターン（Kawakami et al., 2000, J Natl Cancer Institute, 92, 1805-1811）。
【０２４３】
遺伝性びまん性胃癌内のＣＤＨ１プロモータのメチル化（Grady et al., 2000, Nature Genetics, 26, 16-17）。
【０２４４】
例えば、遺伝子の父系対立遺伝子が活性であり母系対立遺伝子が不活性であるか又はその逆である、ゲノムインプリンティング。この不活性化は、関与する遺伝子又はそれらに近い配列内のメチル化変化を介して達成される。基本的に、ＤＮＡ領域は１つの性別の生殖細胞系の中でメチル化された状態となるが、もう１つの性別のものの中ではメチル化された状態とならない（Mann, 2001, Stem Cells, 19, 287-294）。
【０２４５】
核移植又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を介したさまざまな種（ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ及びマウス）のクローニングの研究における全ゲノムメチル化パターン。かくして、卵母細胞内に挿入された供与体核のメチル化パターンは大幅に変動し、これが、現行のクローニング実験においてあれほどまでに失敗率が高い理由であると考えられている。これらの分化された核は恐らくは、胚幹細胞内といったような分化度の低いものに比べさらに再プログラミングを必要とする（Kang et al., 2001;Nature Genetics, 28, 173-177; Humphreyset al., 2001, Science, 293, 95-97）。
【０２４６】
２４の癌細胞系統対正常な組織内の過剰な超メチル化パターン（Smiraglia et al., 2001, Human Molecular Genetics, 10, 1413-1419）。
【０２４７】
遺伝子発現及びインプリンティングに対する効果を検討するための非メチル化ミニ遺伝子構成体内へのメチル化ＤＮＡの挿入（Holmgren et al., 2001, Current Biology, 11, 1128-1130）。
【０２４８】
特定の遺伝子がメチル化により活性化された、成熟Ｂ細胞リンパ腫内のメチル化パターン（Malone et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA, 98, 10404-10409）。
【０２４９】
急性骨髄性白血病における特定の遺伝子のメチル化パターン（Melki et al., 1999, Leukemia, 13, 877-883）。
【０２５０】
ノック−アウトマウスにおけるＭｅｃｐ２遺伝子の分析。このタンパク質は、ＤＮＡ中のメチル化された部位に対する結合に関与し、遺伝性神経障害であるレット症候群に関与すると思われる（Guy et al., Nature Genetics, 27, 322-326）。
【０２５１】
正常な加齢プロセス中の及び潰瘍性大腸炎における５個の特異的遺伝子のメチル化パターン（Issa et al., 2001, Cancer Research, 61, 3573-3577）。
【０２５２】
シグナル変換経路上に衝突するアポトーシスプロセス、細胞周期制御、ゲノム内での可動要素の運動におけるメチル化の喪失（Jackson-Grusbyet al., 2001, Nature Genetics, 27, 31-39）。
【０２５３】
遺伝子調節に関与するＣｐＧ島の進化的保存性又はその喪失を判定するための、ヒト及びマウスといった異なる種におけるプロモータ及び遺伝子領域のメチル化パターンの比較（Cuadrado et al., 2001, EMBO Reports, 21, 586-592）。
【０２５４】
異なる発達段階におけるこう丸精子内のＤＮＡメチル化パターン（Manning et al., 2001, Urol Int, 67, 151-155）。
【０２５５】
ＤＮＡメチル化パターンを分析するためのモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色（Piyathilake et al., 2000, Biotechnic and Histochem, 75, 251-258）。
【０２５６】
遺伝子と偽遺伝子のメチル化パターンの差（Grunau et al., 2000, Human Mol Genet, 9, 2651-2663）。
【０２５７】
キイロショウジョウバエといったような無脊椎動物モデルの５−メチルシトシン含有量（Gowher et al., 2000, EMBO J, 19, 6918-6923）。
【０２５８】
ＣｐＧ島のメチル化パターンを用いたヒトプロモータの大規模マッピング（Ioshikhes et al., 2000, Nature Genetics, 26, 61-63）。
【０２５９】
知的障害、顔面形成異常、泌尿生殖器異常及びアルファサラセミアを発生させるＡＴＲＸ遺伝子の発現の変化に起因する哺乳動物の発達中の遺伝子発現、ＤＮＡメチル化、クロマチンリモデリングプロセスにおいて誘発された変化（Gibbons et al., 2000, Nature Genetics, 24, 368-371）。
【０２６０】
前立腺癌に関与するＧＳＴＰ１遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化されたドメインとメチル化されていないドメインの間の境界（Millar et al., 2000, J Biological Chemistry, 275, 24893-24899;Millar et al., 1999, Oncogene, 18, 1313-1324）。
【０２６１】
正常な加齢プロセス中のメチル化の変化（Toyota et al., 1999, Seminars in Cancer Biology, 9, 349-357）。
【０２６２】
心臓血管系内のアテローム性動脈硬化症及び加齢（Post et al., 1999, Cardiovascular Research, 43, 985-991）における、及び結腸直腸粘膜内の癌及び加齢の間のメチル化の変化（Ahuja et al., 1998, Cancer Research, 58, 5489-5494）。
【０２６３】
精巣内のセルトリ細胞及び生殖細胞内のメチル化パターン（Coffigny et al., 1999, Cytogenet Cell Genets, 87, 175-181）。
【０２６４】
ゼブラフィッシュといったような脊椎動物モデルの発達中のＤＮＡメチル化の変化（Macleod et al., 1999, Nature Genetics, 23, 139-140）。
【０２６５】
ヒト組織−血液ABO遺伝子のプロモータ領域内のメチル化パターン（Kominato et al., 1999, J Biol Chem, 274, 37240-37250）。
【０２６６】
モノクローナル抗体を用いた哺乳動物着床前発達中のメチル化パターン（Rougier et al., 1999, Genes and Development, 12, 2108-2113）。
【０２６７】
さまざまな癌化学療法薬物により誘発されるメチル化パターン（Nyce, 1997, Mutation Research, 386, 153-161;Nyce, 1989, Cancer Research, 49, 5829-5836）及びフェノバルビタールで誘発された及び自然発生肝癌におけるＤＮＡメチル化の変化（Ray et al., 1994, Molecular Carcinogenesis, 9, 155-166）。
【０２６８】
重亜硫酸塩配列決定方法によるＤＮＡ中の５−メチシトシン（methycytosine）残基の分析（Grigg, 1996, DNA Sequence, 6, 189-198）。
【０２６９】
メチル化されたＤＮＡ結合カラムを用いたＣｐＧ島の単離（Cross et al., 1994, Nature Genetics, 6, 236-244）。
【０２７０】
カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）溶菌成長はメチル化感応性スイッチにより誘発されるか？（Laman and Boshoff, Trends Microbiol, 2001, Oct, 9(10): 464-6）。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ又はＨＨＶ−８）の潜在的成長及び溶菌成長は共にその病因に寄与している。
【０２７１】
以上に記した異なるメチル化状態及び潜在的重要性の多数の例からわかるように、本発明は、メチル化研究のための強力な手段を提供しており、かくして数多くの疾病及び健康の様相にとって有用なものである。
【０２７２】
材料と方法
固体支持体
表１は、本発明の捕捉リガンドを固定するために有用な固体支持体のいくつかの例を示す。
【０２７３】
【表１】
2006517402.tif 000006
【０２７４】
【表２】
2006517402.tif 000007
【０２７５】
挿入用核酸（ＩＮＡ）
挿入用核酸（ＩＮＡ）は、配列特異性を伴って核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）にハイブリッド形成し得る天然に発生しないポリヌクレオチドである。ＩＮＡは、複数の望ましい特性を示すことから、プローブベースのハイブリダイゼーションアッセイにおいて核酸プローブに対する代替物／代用品の候補である。ＩＮＡは、対応する核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定しているハイブリッドを形成するべく核酸に対しハイブリッド形成する重合体である。これらは、ペプチド又は核酸を分解させるものとして知られている酵素のための基質ではない。従って、ＩＮＡは、天然に発生する核酸フラグメントに比べて生体試料内でより安定しており、かつより長い保管寿命をもつ。イオン強度に大きく左右される核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、核酸とのＩＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度からかなり独立しており、核酸に対する核酸のハイブリダイゼーションに極めて不利な条件下で低いイオン強度で有利な作用を受ける。ＩＮＡの結合強度は、分子へと工学処理された挿入基の数ならびに二本鎖構造内で特異的にスタッキングされた塩基間の水素結合からの通常の相互作用によって左右される。配列の識別は、ＤＮＡ認識ＤＮＡについてよりもＩＮＡ認識ＤＮＡについてさらに効率が良い。
【０２７６】
ＩＮＡは、市販のフォーマットの標準的オリゴヌクレオチド合成方法を適合させることによって合成される。
【０２７７】
ＩＮＡプローブと標準的核酸プローブの間には、実に数多くの差異が存在する。これらの差異は、生物学的、構造的及び物理化学的差異へと都合良く分類することができる。以上及び以下で論述されるように、これらの生物学的、構造的、及び物理化学的差異は、核酸がこれまで標準的に利用されてきた利用分野でＩＮＡプローブを使用しようとした場合に、予測できない結果を導く可能性がある。この異なる組成物の非等価性は、化学技術において往々にして見られる。
【０２７８】
生物学的差異に関しては、核酸は、遺伝的伝達及び発現の作用物質として生きた種の生命において中心的役割を果たす生体物質である。そのｉｎ  ｖｉｖｏ特性は、かなり充分に理解されている。しかしながら、ＩＮＡは、化学者の頭の中で考案され、合成有機化学を用いて作られた、最近開発された完全に人工的な分子である。これには既知の生物学的機能は全く無い。
【０２７９】
構造的には、ＩＮＡは同様に核酸とも劇的な違いをもつ。両方共共通の核塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵ）を利用し得るものの、これらの分子の組成は、構造的に多様である。ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＩＮＡの主鎖は、反復するホスホジエステルリボースと２−デオキシリボース単位で構成されている。ＩＮＡは、リンカー分子を介して重合体に固定される１つ以上の大きく平坦な分子を有するという点でＤＮＡ又はＲＮＡと異なっている。平坦な分子は、二本鎖構造内のＩＮＡと反対側の相補的ＤＮＡ鎖内の塩基間に挿入する。
【０２８０】
ＩＮＡとＤＮＡ又はＲＮＡの間の物理化学的差異も同様に実質的なものである。ＩＮＡは、核酸プローブが同じ標的配列に結合するよりも急速に、相補的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントとは異なるＩＮＡは、挿入基が末端位置にあるのでないかぎりＲＮＡにほとんど結合しない。相補的ＤＮＡ鎖上の塩基と挿入基の間の強い相互作用のため、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類似のＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のものよりも高い。
【０２８１】
ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメント又はＰＮＡといったその他のＤＮＡと異なり、ＩＮＡは、自己凝集又は結合特性を示さない。
【０２８２】
要約すると、ＩＮＡは、配列特異性をもつ核酸に対してハイブリッド形成することから、プローブベースのアッセイを開発するための有用な候補であり、キット及びスクリーニングアッセイに特に適合されている。しかしながらＩＮＡプローブは、核酸プローブの等価物ではない。従って、ＤＮＡ含有試料の検出、分析及び定量において、プローブベースのアッセイの特異性、感度及び信頼性を改善できるあらゆる方法、キット又は組成物が有用となる。ＩＮＡはこの目的で必要な特性を有する。
【０２８３】
本発明中で実施例のために使用されるＩＮＡの一例としては、（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトであった。しかしながら、ＩＮＡのその他の化学的形態も同様に使用され得ることがわかるだろう。
【０２８４】
重亜硫酸ナトリウム−特異的脱アミノ方法
重亜硫酸ナトリウムで核酸を処理するための標準的な方法は、Frommer et al., 1992, Proc Natl Acad Sci, 89:1827-1831; Grigg and Clark, 1994, BioAssays, 16:431-436; Shapiro et al., 1970, J Amer Chem Soc, 92:422 to 423;Wataya and Hayatsu, 1972, Biochemistry, 11:3583-3588を含めた数多くの参考文献に見出すことができる。これらのプロトコルに対するいくつかの改良も、本発明により開発されてきた。
【０２８５】
検出システム
磁気ビーズのコーティング
磁気ビーズに固定させるために用いられるＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡは、数多くの要領で修飾可能である。この例では、ＩＮＡはＥＤＣで使用されているようなヘテロ−２官能性リンカーを用いたビーズへのＩＮＡの共有結合による固定のための５’又は３’のいずれかのアミノ基を含有していた。しかしながら、同様にビオチンといった５’基でＩＮＡを修飾することもでき、この５’基を次に、アビジン又はストレプトアビジン基で修飾された磁気ビーズに受動的に固定させることができる。
【０２８６】
清浄な１．５ｍｌ入りの試験管に、１０μｌのカルボキシレート修飾済みＭａｇｎａｂｉｎｄＴＭビーズ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））又は１００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ  （ダイナル））を移し、９０μｌのＰＢＳ溶液を磁気ビーズに添加した。
【０２８７】
次にビーズを混合し、次に磁化して、上清を廃棄した。ビーズを、１回あたり１００μｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、最後にｐＨ４．５の５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液又はメーカーの仕様により規定されているもう１つの緩衝液９０μｌの中で再懸濁させた。
【０２８８】
試料に対し１μｌの２５０μＭのＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ（濃度はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション実験により判定される通り、選択されたＩＮＡの比活性によって左右される）を添加し、試験管をボルテックスに付し、１０〜２０分間室温で放置した。
【０２８９】
その後１０μｌの新たに調製した２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  ／Ｓｉｇｍａ）を添加し、試料をボルテックスに付し、室温か又は４℃で最高６０分間インキュベートした。
【０２９０】
その後試料を磁化し、上清を廃棄し、ビーズは必要とあらば１００μｌの０．２５ＭＮａＯＨか又は０．５ＭトリスｐＨ８．０を１０分間添加することによって遮断した。
【０２９１】
その後ビーズをＰＢＳ溶液で２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ溶液中で最終的に再懸濁させた。
【０２９２】
磁気ビーズを用いたハイブリダイゼーション
１０μｌのＩＮＡコーティング済みＭａｇｎａｂｉｎｄＴＭを清浄な試験管に移し、ストレート又は蒸留水中で１：１に希釈した４０μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ  緩衝液（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、或いはその他のあらゆる市販の又は自家製ハイブリダイゼーション緩衝液を加えた。緩衝液は、既知の濃度のカチオン／アニオン又は両性洗浄剤のいずれか、又はヘパリン及びポリアミノ酸といったようなその他の添加剤をも含有し得る。
【０２９３】
その後上述の溶液にＤＮＡ１〜５μｌの熱変性された試料を添加し、試験管をボルテックスに付し次に２０〜６０分、選ばれたＩＮＡの融解温度に応じて５５℃又はもう１つの温度でインキュベートする。
【０２９４】
試料を磁化し、上清を廃棄し、１回あたり５分間、以前のステップからのハイブリダイゼーション温度で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回ビーズを洗浄し、２回洗浄の間に試料を磁化させた。
【０２９５】
二重ＩＮＡ捕捉
ＩＮＡ＃１を、ＩＮＡのＮ又はＣ末端アミンを介してカルボキシレート修飾された磁気ビーズにカップリングさせ、洗浄して未結合ＩＮＡを除去した。
【０２９６】
その後、ＩＮＡ／ビーズ複合体を、適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて溶液中の標的ＤＮＡに対しハイブリッド形成させた。
【０２９７】
その後、適切な方法を用いて磁気ビーズから標的ＤＮＡを放出し、ＤＮＡ分子の反対側末端にターゲティングされた第２のＩＮＡ／磁気ビーズ複合体の入った試験管にこれを移した。
【０２９８】
適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて溶液中の標的ＤＮＡに対し、第２のＩＮＡ／ビーズ複合体又はオリゴ／ビーズ複合体をハイブリッド形成させた。
【０２９９】
検出分子として、標的ＤＮＡの中央領域に相補的な第３のＩＮＡ又はオリゴヌクレオチドを使用することができる。この検出分子は、数多くの方法で標識することができる。すなわち、
（ｉ）  Ｐ３２又はＩ１２５といったような放射性同位元素でＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を直接標識し、その後標的ＤＮＡでハイブリッド形成させることができる。
（ｉｉ）  Ｃｙ−３又はＣｙ−５といった蛍光分子でＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を標識し、次に標的ＤＮＡでハイブリッド形成させることができる。
（ｉｉｉ）  アミン修飾されたＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を上述の方法のうちのいずれかで標識し次に既知のサイズのカルボキシレート修飾されたミクロスフェアにカップリングさせ、次にスフェアを洗浄して未結合の標識されたＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴを除去することができる。このビーズ複合体を次に、特異的ＤＮＡ分子の検出用のシグナル増幅系を産生するために用いることができる。
（ｉｖ）  ＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を、蛍光又は放射性基のいずれかで標識されたデンドリマー分子に固定させ、この複合体を用いてシグナル増幅を生成させることができる。
（ｖ）  上述のいずれかの方法で標識され固体支持体上で標的ＤＮＡにハイブリッド形成されたＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を、大豆ヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼといったような一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いて溶液中に放出することができる。
【０３００】
放射性標識された検出スフェアの調製
ＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を、アミノ基、チオール基又はビオチンといったような分子で３’又は５’標識することができる。
【０３０１】
標識された分子は又、第１の標識に対し分子の反対側末端で取込まれたＰ３２又はＩ１２５といったような第２のラベルを有することもできる。
【０３０２】
この二重標識された検出分子は、例えばＥＤＣといったヘテロ−２官能性リンカーを用いて、既知のサイズのカルボキシレート又は修飾されたラテックスビーズに共有結合でカップリングされ得る。アッセイに応じて、その他の適切な基質も使用することができる。
【０３０３】
このとき、未結合分子を洗浄により除去して、多数の特異的検出／シグナル増幅分子でコーティングされたビーズを残すことができる。
【０３０４】
これらのビーズは、このとき、シグナル増幅を生成するべく問題のＤＮＡ試料でハイブリッド形成することができる。
【０３０５】
蛍光標識された検出スフェアの調製
ＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を、アミノ基、チオール基又はビオチンといったような分子で３’又は５’標識することができる。
【０３０６】
標識された分子は又、第１の標識に対し分子の反対側末端で取込まれたＣｙ−３又はＣｙ−５といったような第２のラベルを有することもできる。
【０３０７】
ここで、この二重標識された検出分子は、ＥＤＣといったヘテロ−２官能性リンカーを用いて、既知のサイズのカルボキシレート又は修飾されたラテックスビーズに共有結合でカップリングされ得る。
【０３０８】
このとき、未結合分子を洗浄により除去して、多数の特異的検出／シグナル増幅分子でコーティングされたビーズを残すことができる。
【０３０９】
これらのビーズは、このとき、シグナル増幅を生成するべく問題のＤＮＡ試料でハイブリッド形成することができる。
【０３１０】
酵素で標識された検出スフェアの調製
ＩＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＡＮＡ、ＭＮＡ、ＣＮＡ、を、アミノ基又はチオール基といったような分子で３’又は５’標識することができる。
【０３１１】
標識された分子は又、ビオチン又は第１の標識に対し分子の反対側の末端で、へテロ２官能性リンカーを介して接合させたホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼといったその他の分子といったような第２のラベルを有することもできる。
【０３１２】
この二重標識された検出分子は、ＥＤＣといったヘテロ−２官能性リンカーを用いて、既知のサイズのカルボキシレート又は修飾されたラテックスビーズに共有結合でカップリングされ得る。
【０３１３】
このとき、未結合分子を洗浄により除去して、多数の特異的検出／シグナル増幅分子でコーティングされたビーズを残すことができる。
【０３１４】
これらのビーズは、このとき、シグナル増幅を生成するべく問題のＤＮＡ試料でハイブリッド形成することができる。
【０３１５】
シグナル増幅はこのとき、ストレプトアビジンといったような分子の結合又は比色分析基質が関与する酵素反応により達成可能である。
【０３１６】
ＩＮＡオリゴマー組合せ
上述のケース全てにおいて、初期ハイブリダイゼーション事象には、問題の核酸に対して相補的なＩＮＡでコーティングされた磁気ビーズの使用が関与していた。
【０３１７】
第２のハイブリダイゼーション事象には、上述の方法のいずれかが関与し得る。
【０３１８】
このハイブリダイゼーション反応は、問題のＤＮＡに相補的な第２のＩＮＡ、ＰＮＡ又は問題の核酸に対し相補的なオリゴヌクレオチド又は修飾済みオリゴヌクレオチドのいずれかを用いて行なうことができる。これらのアッセイにおける適切なサイズの蛍光ビーズは１０６を超える蛍光色素分子を担持し単一の蛍光ビーズは容易に検出可能であることから、該方法は、１つ又は数個の細胞からの１つ又は数個のＤＮＡをアッセイするための潜在的感度を有する。
【０３１９】
デンドリマー及びアプタマー
デンドリマーは、特異的分子で標識された多重層を生成し得るように制御された形で化学的に合成可能な分枝樹状分子である。これらは、中心から周囲に又はその逆に段階的に合成された。
【０３２０】
デンドリマー構造及びその生成を支配する最も重要なパラメータの１つは、各ステップ内で生成される分枝の数である。これは、所望の分子を構築するために必要とされる反復的ステップの数を決定する。
【０３２１】
シグナル増幅を増強するべく、Ｃｙ−３又はＣｙ−５といったような蛍光標識又はＩ１２５又はＰ３２といったような放射性標識を含むデンドリマーを合成することができる。
【０３２２】
代替的には、修飾されたＩＮＡ、ＰＮＡ又はＤＮＡ分子を固定させるために用いることのできるカルボキシレート基又はその他のあらゆる反応基を含むようにデンドリマーを合成することが可能である。
【０３２３】
方法
固体支持体及び磁気ビーズを用いたメチル化されたＤＮＡの検出
図１及び図２は、それぞれ固体支持体及び磁気ビーズを用いたサンドイッチＩＮＡシグナル増幅を使用する本発明の方法の実施例を示している。ＩＮＡが図１及び図２で検出リガンドとして例示されているものの、オリゴヌクレオチドといったようなその他の検出リガンドもこれらの方法において使用できるということがわかるだろう。
【０３２４】
マイクロタイターウェルの形態の固体支持体を提供し、ウェルに対するＩＮＡ又はその他のリガンドの固定を補助するべくＮ−オキシスクシニミドでこれをコーティングした。
【０３２５】
標的ヌクレオチド配列の第１の部分に対し相補的であった第１のＩＮＡをウェルに添加し、この固体支持体に固定させる。
【０３２６】
その後ウェルに重亜硫酸塩で処理したＤＮＡを添加し、ＩＮＡにハイブリッド形成しその後ウェルに結合した標的ＤＮＡを捕捉するべくＩＮＡとこれをハイブリッド形成させた。
【０３２７】
その後、ハイブリダイゼーション溶液及びハイブリッド形成しなかった全てのＤＮＡを除去してウェル上に捕捉されたハイブリッド形成済みＤＮＡのみを残すように、ウェルを洗浄した。
【０３２８】
次に、標的ヌクレオチド配列の第２の部分に相補的であった第２のＩＮＡを、蛍光標識をもつミクロスフェアビーズに連結させた。その後、第２の連結されたＩＮＡを、すでにウェルに結合した標的ＤＮＡでハイブリッド形成させた。その後、ハイブリッド形成しなかった第２のＩＮＡ／ミクロスフェア複合体を除去して、標的ＤＮＡ配列と関連した蛍光標識及びＩＮＡ／ミクロスフェア複合体のみを残すように、ウェルを洗浄した。
【０３２９】
その後、蛍光を測定して、標的ＤＮＡのレベルを決定した。
【０３３０】
ミクロスフェアを用いたメチル化されたＤＮＡの検出
方法論
図３及び図４を参照すると、ミクロスフェアを用いたメチル化されたＤＮＡの検出が示されている。
【０３３１】
捕捉ＩＮＡでのマイクロタイターウェルのコーティング
（ｉ）  ５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．５（１００μｌ）中の捕捉ＩＮＡ（ウェルあたり０．０１〜１００ｐＭ）を用いて、Ｎ−オキシスクシニミドでコーティングされたマイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ（コスター）Ｃａｔ＃２４９８）を１６〜２４時間４℃でコーティングした。
（ｉｉ）  プレートを１００μｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．５で洗浄した。
（ｉｉｉ）  各ウェルに対し、３％のＢＳＡ、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．５を１５０μｌ添加し、必要になるまで４℃でプレートを放置した。
【０３３２】
検出ＩＮＡでのフルオロスフェアのコーティング
（ｉ）  フルオロスフェア（分子プローブ）を５秒間５回音波処理して、凝集した材料を全て壊した。
（ｉｉ）  ｐＨ６．０の音波処理された５０ｍＭの２［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）２５０μｌ及び音波処理されたフルオロスフェア２５０μｌ中３００ｐＭ〜０．３ｐＭの範囲内で検出プローブＩＮＡを希釈し、３０分間室温で溶液を放置した。
（ｉｉｉ）  試料に対し０．５ｍｇの１−エチル−３［３ジメチルアミンプロピル］カルボジイミド［ＥＤＡＣ］、Ｓｉｇｍａ  （シグマ）  Ｃａｔ＃Ｅ１７６９を添加し、試料を暗所で室温に４〜６時間放置し、次に４℃で１６時間インキュベートした。
（ｉｖ）  ビーズに対し１Ｍのグリシン５５μｌで添加し、２時間室温にビーズを放置した。
（ｖ）  ５〜２０分間（ビーズのサイズによる；一般に０．５μＭのビーズは５分を要し、一方０．１μＭのビーズは２０分を要した）、ベンチトップ遠心分離機内で１４，０００ｒｐｍでビーズを遠心分離に付し、上清を廃棄した。
（ｖｉ）  前述のように洗浄ステップ間で遠心分離に付しながら、５００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回ビーズを洗浄した。
（ｖｉｉ）  次にビーズを２００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で再懸濁し、必要となるまで暗所で４℃で貯蔵した。
（ｖｉｉｉ）  感度を最適化しバックグラウンドレベルを最小限にするため、ビーズに結合されたＩＮＡリガンドの数の変動を使用することができる。
【０３３３】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション
（ｉ）  Ｃｌａｒｋら、（Clark SJ, Harrison J, Paul CL and Frommer M, High sensitivity mapping of methylated cytosines, Nucleic Acids Res., 22:2990-2997(1994)）内にある通りに処理された重亜硫酸塩であったＤＮＡか対照サケ精子ＤＮＡのいずれかを、マイクロタイターウェルにカップリングされたＩＮＡリガンドとハイブリッド形成させ、次に各ウェルに添加した。
（ｉｉ）  １００μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ  緩衝液（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））とＤＮＡ試料を混合させ、さらに長時間のインキュベーションのためプレートをラップでカバーするか又はウェルを鉱油（シグマ（Ｓｉｇｍａ））により被覆し、試料を１〜１６時間４５〜６０℃の間でインキュベートさせた。
（ｉｉｉ）  その後ウェルを、１回あたり５〜１０分間、１５０μｌの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ＠４５〜６０℃で２回洗浄した。
（ｉｖ）  ウェルをさらに１５０μｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにより４５〜６０℃で５〜１０分間洗浄し、洗浄溶液を廃棄した。
（ｖ）  ＩＮＡ／フルオロフェアをＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ  緩衝液（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））中で１／１００に希釈し、１００μｌの試料をウェルに添加した。さらに長時間のインキュベートのため、プレートをラップでカバーするか又はウェルを鉱油（シグマ（Ｓｉｇｍａ））により被覆し；試料を１〜１６時間、４５〜６０℃でインキュベートさせた。
（ｖｉ）  次にウェルを、１回あたり５〜１０分間、４５〜６０℃で１５０μｌの２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにより２回洗浄した。
（ｖｉｉ）  ウェルをさらに５〜１０分間４５〜６０℃で１５０μｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにより洗浄し、洗浄溶液を廃棄した。
（ｖｉｉｉ）  最後に、各ウェルの蛍光強度を、Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ蛍光プレート読取り装置内で特定のビーズ（黄色ビーズについては５００／５２０）について適切な励起／発光波長で測定した。
（ｉｘ）  いかなるＩＮＡも固定しなかったウェル内で測定したバックグラウンド値を全ての測定値から差引いた。
【０３３４】
コーティングされた放射性標識済みビーズの生産方法
（ｉ）  標的ＤＮＡ又は問題の核酸領域に対して特異的オリゴヌクレオチド（ＩＮＡ又はＰＮＡ）を合成した。このオリゴヌクレオチド、ＩＮＡ又はＰＮＡは、標準化学（シグマジェノシス（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ））を用いて合成された３’アミン基を含有していた。
（ｉｉ）  次に、以下の通りのガンマＰ３２ｄＡＴＰを用いて、オリゴヌクレオチド（ＩＮＡ又はＰＮＡ）を５’キナーゼ処理した。
・オリゴヌクレオチド（２０ｎｇ／μｌ）    １μｌ
・Ｘ１０ＰＮＫ緩衝液      １μｌ
・Ｔ４ＰＮＫ      １μｌ
・ガンマＰ３２ｄＡＴＰ      ２μｌ
・無菌水      ５μｌ
（ｉｉｉ）  その後、１時間３７℃で試料をインキュベートさせ、次に、酵素を不活性化するべく９５℃まで５分間加熱した。
（ｉｖ）  ０．１μＭのカルボキシレートで修飾済みの蛍光ビーズ（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）  Ｃａｔ＃Ｆ−８８０３）を、無菌水中で１／１０，０００、１／１００，０００及び１／１，０００，０００に希釈し、次にキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドを以下の通りビーズにカップリングした。
・ビーズ  １μｌ
・標識されたオリゴ（ＩＮＡ又はＰＮＡ）  ３μｌ
・５０ｍＭのＭＥＳｐＨ８．０  ５μｌ
・１０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））  ２μｌ
（ｖ）  その後、ビーズを１時間室温でインキュベートして、キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドを３’アミンを介してビーズに固定させた。
（ｖｉ）  その後、ビーズを１５分間最高速度で微小遠心分離機内で回転させて、コーティング済みビーズを沈降させた。
（ｖｉｉ）  上清を除去し、ビーズを１００μｌのＰＢＳ溶液で洗浄し、上述の通り旋回させた。
（ｖｉｉｉ）  上清を除去し、ビーズを５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。
（ｉｘ）  その後チェレンコフ計数プロトコルを用いて標準シンチレーション計数管内で、コーティングされたビーズのＣＰＭを測定した。最高の活性をもつビーズを次に、アッセイ中の検出システムとして使用した。
【０３３５】
このプロトコルの背後にある考え方は、最高の比活性をもつビーズを最少数生成する、というものであり、かくして検出可能なシグナルを生成するために標的配列にわずかなビーズを結合させる必要しかなかった。
【０３３６】
ＤＮＡの重亜硫酸塩処理
２μｇのＤＮＡに対して、２μｌ（１／１０体積）の３ＭのＮａＯＨ（５０ｍｌの水中に６ｇ、直前に調製）を、最終体積２０μｌで添加した。１５分間３７℃で混合物をインキュベートした。室温より高い温度でのインキュベーションを用いて、変性効率を改善することができる。
【０３３７】
インキュベーションの後、２０８μｌの２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（４１６ｍｌの１０Ｎ  ＮａＯＨを伴う２０ｍｌの水又はトリス／ＥＤＴＡ中７．６ｇ；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ  ＃１０３５６．４Ｄ；直前に調製）を添加した。２００μｌの鉱油で試料を被覆した。次に試料を一晩５５℃でインキュベートした。代替的には、以下の通りに試料をサーマルサイクラーで循環させることができる。すなわち、以下の通りに約４時間又は一晩インキュベートさせる。ステップ１、ＰＣＲ機内で循環して２時間、５５℃；ステップ２、２分間９５℃。ステップ１は、約３７℃から約９０℃までの任意の適切な温度で実施可能であり、５分〜１６時間の間で長さを変動できる。ステップ２は、約７０℃から約９９℃まで任意の温度で実施可能であり、約１秒から６０分又はそれ以上と長さが変動し得る。
【０３３８】
メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理の後、油を除去し、ＤＮＡ濃度が低い場合、１μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）又は２μｌのグリコーゲンを添加した。これらの添加物は任意であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合に標的ＤＮＡと共沈させることによって得られるＤＮＡの収量を改善させるために用いることができる。
【０３３９】
イソプロパノール浄化処理は、以下の通りに実施された。すなわち、試料に対し８００μｌの水を加え、混合させ次に１ｍｌのイソプロパノールを添加した。試料を再度混合し、最低５分間−２０℃で放置した。１０〜１５分間微小遠心分離機内で試料を回転させ、ペレットを８０％のＥＴＯＨで２回洗浄し、毎回ボルテックスに付した。この洗浄処理は、核酸と共に沈殿したあらゆる残留塩を除去する。
【０３４０】
ペレットを乾燥させ、その後５０μｌといった適切な量のＴ／Ｅ（１０ｍＭのトリス／０．１ｍＭＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５中に再懸濁させた。ｐＨ１０．５の緩衝液が特に有効であることがわかった。核酸を懸濁させるのに必要とされるように、１分−９６時間３７℃〜９５℃で試料をインキュベートさせた。
【０３４１】
抗体アプローチ
ゲノム内のメチル化されたＤＮＡ配列のための抗体選択
該アプローチは図３の中に記され、以下で要約されている。
Ｉ．  ５−メチルシトシンに対し向けられた抗体を、磁気ビーズ上にコーティングする。（Ａ）。
ＩＩ．  未結合抗体を除去するべく洗浄した後、ビーズをゲノムＤＮＡに添加する。（Ｂ）。
ＩＩＩ．  ５−メチルシトシンを含有するあらゆるＤＮＡはことごとく抗体でコーティングされたビーズに結合し、溶液中に遊離した大部分のメチル化されていないＤＮＡを放置する。
ＩＶ．  抗体／ビーズを洗浄して、メチル化されたＤＮＡ配列の純粋な集合を生成させ、これを次に重亜硫酸塩処理に付す。（Ｃ）
【０３４２】
多重リガンドアプローチ
挿入用核酸リガンド（ＩＮＡ）を用いた多重リガンド
図４に１つの好ましいアプローチが記されている。この方法を用いて、問題の配列を次のように検出する。
Ｉ．  問題の配列の５’領域に対し設計されたＩＮＡを磁気ビーズ又は検出可能な粒子にカップリングする。（Ａ）
ＩＩ．  ＩＮＡ／ビード複合体を重亜硫酸塩処理されたＤＮＡと混合し、洗浄して非標的ＤＮＡを除去する。（Ｂ）
ＩＩＩ．  第２のＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴを次に添加する（これは問題の配列の３’領域に対し設計されている）。第２のＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴは、その後検出のために使用されるゲノム内に発見されないユニーク配列タグを含む。（ｃ）
ＩＶ．  その後、試料を洗浄し、ここでも同じタグを含む第２のＩＮＡ種を添加し、ビーズを洗浄する。（Ｄ）
Ｖ．  第３及び第４のＩＮＡ等々を添加し、ハイブリッド形成させ、洗浄する。（Ｅ）
ＶＩ．  ＩＮＡ１〜４のタグ配列に結合する標識された（蛍光／放射性）ＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴを用いて、タグ配列をここで検出する。（Ｆ）
【０３４３】
図５に１つの好ましいアプローチが記されている。この方法を用いて、問題の配列を次のように検出する。
Ｉ．  問題の配列の５’領域に対し設計されたＩＮＡを磁気ビーズ又は検出可能な粒子にカップリングする。（Ａ、Ｂ）
ＩＩ．  ＩＮＡ／ビード複合体を重亜硫酸塩処理されたＤＮＡと混合し、洗浄して非標的ＤＮＡを除去する。（Ｃ）
ＩＩＩ．  問題の配列の３’領域に対し設計されている第２のＩＮＡ／ビーズを次に添加する。第２のＩＮＡ／ビーズ複合体を、検出のために使用されるように蛍光又は放射能のいずれかにより標識する。（Ｄ）
ＩＶ．  その後、試料を洗浄し、ここでも蛍光又は放射能で標識された第３のＩＮＡ／ビーズ複合体を添加する。（Ｄ）
Ｖ．  第３及び第４のＩＮＡ等々を添加し、ハイブリッド形成させ、洗浄する。
ＶＩ．  次に、全ての検出ビーズ複合体の合計を用いてシグナル増幅を達成する。（Ｅ）
【０３４４】
抗体捕捉多重リガンドアッセイ
本発明者らは、（通常染色体を染色するために使用される）５−メチルシトシンに向けられた抗体を、高いメチル化の部域をもつ核酸を捕捉又は濃縮するために使用できる、ということを発見した。ひとたび捕捉した時点で、核酸を本発明に従った方法に従ってアッセイすることができる。
【０３４５】
アッセイについて、以下で記述する。
【０３４６】
Ａ．  磁気ビーズに対する５−メチルシトシン抗体のカップリング
Ｉ．  メーカーの指示に従って洗浄した状態で、１２５μｌのダイナル・パン・マウスＤ（Ｄｙｎａｌ  Ｐａｎ  Ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ（Ｃａｔ＃１１０．２２）に対して、０．１μｌ（０．５μｇ）のモノクローナル５−メチルシトシン抗体（オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）Ｃａｔ＃ＮＡ８１）を添加した。
ＩＩ．  試料を４５分間室温で揺動させた。
ＩＩＩ．  ビーズをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで４回洗浄した。
ＩＶ．  次にビーズをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ１２５μｌ中に最懸濁させた。
【０３４７】
Ｂ．  ゲノムＤＮＡの予備濃縮
Ｉ．  メーカーの指示に従ってＥｃｏＲ１及びＨｉｎｄＩＩＩで予め消化した６．５μｇのゲノムＬＮＣａＰＤＮＡを、洗浄済みビーズに添加した。
ＩＩ．  試料を４５分間室温で揺動させた。
ＩＩＩ．  ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで４回ビーズを洗浄した。
ＩＶ．  次に４０μｌの水でビーズを再懸濁させた。
【０３４８】
Ｃ．  捕捉されたＤＮＡの重亜硫酸塩処理
Ｉ．  ２０μｌの捕捉されたＤＮＡを以下の通りに重亜硫酸塩で処理した。
ＩＩ．  ２μｌ（１／１０体積）の３ＭのＮａＯＨ。１５分間、３７℃で混合物をインキュベートした。
ＩＩＩ．  インキュベーションの後、２０８μｌの２Ｍのメタ重亜硫酸ナトリウムを添加した。試料を２００μｌの鉱油により被覆した。
ＩＶ．  次に５５℃で一晩試料をインキュベートした。
Ｖ．  メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理後、油を除去し、１μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）。
ＶＩ．  ８００μｌの水を試料に添加し、混合し、次に１ｍｌのイソプロパノールを添加した。試料を再度混合し、３０分間４℃で放置した。
ＶＩＩ．  １０〜１５分間、微小遠心分離機内で試料を回転させ、ペレットを８０％のＥＴＯＨで２回洗浄し、毎回ボルテックスに付した。
ＶＩＩＩ．  ペレットを乾燥させ、次にｐＨ１０．５の５０μｌのＴ／Ｅ（１０ｍＭのトリス／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁させた。
ＩＸ．  試料を１時間７２℃でインキュベートさせた。
【０３４９】
Ｄ．  ＰＮＡ捕捉ビーズの調製
ＧＳＴＰ！遺伝子（受入れ番号Ｍ２４４８５）のメチル化された配列を認識するため、以下のＰＮＡを合成した。
ＰＮＡ  ５’アミン−ＣＴＡ  ＡＣＧ  ＣＧＣ  ＣＧＡ  ＡＡＣ
Ｉ．  １０μｌのカルボキシレート修飾済みＭａｇｎｅｂｉｎｄＴＭビーズ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）  Ｃａｔ＃２１３５３）を清潔な１．５ｍｌ入り試験管に移し、９０μｌのＰＢＳ溶液を磁気ビーズに添加した。
ＩＩ．  ビーズを混合し、次に磁化させ、上清を廃棄した。ビーズを、一回につき１００μｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、最終的にｐＨ４．５の９０μｌの５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液５０ｍＭの中に再懸濁させた。
ＩＩＩ．  試料に１μｌの２５０μＭＰＮＡを添加し、試験管をボルテックスに付し、１０〜２０分間室温で放置した。
ＩＶ．  １０μｌの調製されたばかりの２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ溶液（ピアース／シグマ  （Ｐｉｅｒｃｅ  ／  Ｓｉｇｍａ））を次に添加し、試料をボルテックスに付し、最高６０分間室温又は４℃のいずれかでインキュベートした。
Ｖ．  次に試料を磁化させ、上清を廃棄した。
ＶＩ．  １０分間、０．２５ＭのＮａＯＨ又は０．５ＭのトリスｐＨ８．０のいずれか１００μｌを添加することにより、ビーズを遮断した。
ＶＩＩ．  その後、ＰＢＳ溶液で２回ビーズを洗浄し、最後に１００μｌのＰＢＳ溶液中で再懸濁させた。
【０３５０】
Ｅ．  抗体濃縮した重亜硫酸塩処理されたＤＮＡに対するＰＮＡコーティングした捕捉ビーズのハイブリダイゼーション
Ｉ．  １０μｌのＰＮＡコーティングされたビーズを、５μｌの抗体濃縮した重亜硫酸塩処理済みＤＮＡ及び蒸留水で１：１に希釈した３５μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  （クローンテック））と共に、新鮮な１．５ｍｌ入り遠心分離管に添加した。
ＩＩ．  試料を混合し、１時間５５℃で放置した。
ＩＩＩ．  ５５℃で×２ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回、試料を洗浄した。磁化し、上清を廃棄した。
ＩＶ．  さらに５５℃で×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回、試料を洗浄した。磁化し、上清を廃棄した。
Ｖ．  最後に、２０μｌの×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ内で試料を再懸濁させた。
【０３５１】
Ｆ．  検出オリゴヌクレオチドのキナーゼ処理
初期ＰＮＡ捕捉内で用いられる領域の下流側のメチル化された領域に対して、４つの特異的検出オリゴヌクレオチドを設計した。これらのプライマの配列が以下に示されている。
ＤＥＴＥＣＴ−１  ５’−TAAATCACGACGCCGACCGCTCTT−アミン３’  （配列番号１）
ＤＥＴＥＣＴ−２  ５’−AAAACGCGAACCGCGCGTACTCA−アミン３’（配列番号２）
ＤＥＴＥＣＴ−３  ５’−CCTAAAAACCGCTAACGACACTA−アミン３’（配列番号３）
ＤＥＴＥＣＴ−４  ５’−TAAACCACGATATAAAACGACACTC−アミン３’  （配列番号４）
【０３５２】
合成オリゴヌクレオチドを以下の通りにキナーゼ処理した。
オリゴ          ４０ｎｇ
×１０緩衝液    ２μｌ
Ｔ４キナーゼ    ２μｌ
ガンマＰ３２    ４μｌ
水              ２０μｌまで
【０３５３】
反応物を６０分間３７℃で加熱し、次に酵素を５分間９５℃で熱変性させた。
【０３５４】
Ｇ．  蛍光ビーズに対するキナーゼ処理済みオリゴヌクレオチドの固定
Ｉ．  ５μｌのキナーゼ処理済みの検出オリゴを、以下の通り、１０−７希釈Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （モレキュラー・プローブ）  カルボキシレートフルオロスフェア０．５μＭ（Ｃａｔ＃Ｆ−８８１２−ｐｉｎｋ）１μｌにカップリングさせた。
１０−７のフルオロスフェア０．５μＭ        １μｌ
キナーゼ処理済み検出オリゴ                ５μｌ
５０ｍＭのＭＥＳｐＨ８．０                １２μｌ
１０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））  ２μｌ
ＩＩ．  ビーズを室温で１時間放置した。
ＩＩＩ．  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回ビーズを洗浄し、以下の通り再懸濁させた。
ＩＶ．    Ｄｅｔｅｃｔ  １．  ２０μｌの×０．１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
Ｖ．      Ｄｅｔｅｃｔ  ２．  １０μｌの×０．１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ＶＩ．    Ｄｅｔｅｃｔ  ３．  １０μｌの×０．１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ＶＩＩ．  Ｄｅｔｅｃｔ  ４．  １０μｌの×０．１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
【０３５５】
Ｈ．  ＰＮＡ捕捉された抗体濃縮済みの重亜硫酸塩処理されたＤＮＡに対する検出オリゴのハイブリダイゼーション
Ｉ．  セクションＦからのビーズを磁化し、上清を除去した。
ＩＩ．  蒸留水で１：１に希釈した４７μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液（クローンテック  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を試料に添加した。
ＩＩＩ．  試料に対して、検出ビーズ１−４各々３μｌずつ（合計容積１２μｌ）を添加した。
ＩＶ．  １時間５５℃で試料をインキュベートした。
Ｖ．  ５５℃で×２ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回試料を洗浄した。磁化し、上清を廃棄した。
ＶＩ．  ５５℃で×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳさらに１回試料を洗浄した。磁化し、上清を廃棄した。
ＶＩＩ．  最後に、５ｍｌのＩｎｓｔａＧｅｌシンチラントの中にビーズを再懸濁させ、放射能を、チェレンコクプロトコルを用いたシンチレーション計数により決定した。
【０３５６】
結果
図６は、抗体を受けなかったゲノムＤＮＡ試料と抗体捕捉試料を比較した場合に提供される濃縮係数を示す。
【０３５７】
図７は、抗体捕捉多重リガンドアッセイを用いた非ＰＣＲシグナル増幅を示す。結果は、１．ＬＮＣａＰＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ）について抗体濃縮無し、２．抗体濃縮されたＤｕ１４５ＤＮＡ（メチル化されていないＤＮＡ）及び３．抗体濃縮されたＬＮＣａＰＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ）を用いて得られたシグナルを示す。
【０３５８】
ゲノムＤＮＡ配列を捕捉するためのＩＮＡプローブ及びＰＣＲを用いた検出
アッセイは、図８に要約されている。この方法を用いて、問題の配列は以下のように検出される。
Ｉ．  重亜硫酸塩転換済みのメチル化された領域又は重亜硫酸塩転換済みのメチル化されていない領域に対して導かれたＩＮＡを、問題の配列の５’領域に対し設計し、次に磁気ビーズ又は任意の固相にカップリングする。
ＩＩ．  ＩＮＡ／ビーズ複合体を、重亜硫酸塩処理したＤＮＡと混合し、洗浄して非標的ＤＮＡを除去する。
ＩＩＩ．  その後、捕捉された材料は、所望の配列が捕捉されたことを正のＰＣＲが示した場合に捕捉部位から下流側の配列を検出するべくＰＣＲのための入力材料として使用される。
ＩＶ．  ＩＮＡリガンドは同様に、形状で認識できるあらゆる粒子に結合され得、従って、何千もの反応が唯一の反応試験管の中で発生し得る。
Ｖ．  ＩＮＡ１が形状１の粒子に固定され、ＩＮＡ２が形状２の粒子に固定され、ＩＮＡ３が形状３の粒子に固定されるといったような形で、ＩＮＡ、ＰＮＡ又はオリゴなどがかかる粒子に固定され、次に粒子はその後の反応のため全て一本の試験管内に入れられる。
ＶＩ．  ＩＮＡは同様に、ＰＣＲプレートのウェルに物理的に結合され得、反応全体は単一のウェル内で実施され得る。こうして、生成された正のシグナルがプレート内の位置により（メチル化／メチル化無しについて）解読され得る「キット」フォーマットが可能となる（アガロースゲル実験結果については以下の図９を参照のこと）。
【０３５９】
磁気ビーズに対するアミン修飾された核酸のカップリング
Ｉ．  清浄な１．５ｍｌ入り試験管に対し、１０μｌのカルボキシレート修飾済みＭａｇｎａｂｉｎｄＴＭビーズ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を移し、９０μｌのＰＢＳ溶液を磁気ビーズに添加した。
ＩＩ．  次にビーズを混合し、次に磁化し、上清を廃棄した。ビーズを一回につき１００μｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、最終的に９０μｌの５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．５又は、メーカーの仕様書に規定されている通りのもう１つの緩衝液中で再懸濁させた。
ＩＩＩ．  １μｌの２５０μＭＩＮＡ（濃度は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション実験により決定される通りの選択されたＩＮＡの比活性に応じて異なる）を、試料に加え、試験管をボルテックスに付し、１０〜２０分間室温で放置した。
ＩＶ．  その後、１０μｌの新たに調製された２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ溶液（ピアース／シグマ  （Ｐｉｅｒｃｅ  ／  Ｓｉｇｍａ））を次に添加し、試料をボルテックスに付し、室温か又は４℃で最高６０分インキュベートした。
Ｖ．  その後試料を磁化し、上清を廃棄し、必要とあらば、１０分間、０．２５ＭのＮａＯＨ又は０．５ＭのトリスｐＨ８．０のいずれかを１００μｌ添加することによってビーズを遮断した。
ＶＩ．  次にビーズをＰＢＳ溶液で２回洗浄し、最終的に１００μｌのＰＢＳ溶液中で再懸濁させた。
【０３６０】
ゲノムＤＮＡに対するＩＮＡでコーティングされた磁気ビーズを用いたハイブリダイゼーション
１０μｌのＩＮＡコーティング済みＭａｇｎａｂｉｎｄＴＭビーズを清浄な試験管に移し、ストレート又は蒸留水中で１：１に希釈した４０μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  ＨｙｂＴＭ  緩衝液（クローンテック  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、或いはその他のあらゆる市販の又は自家製ハイブリダイゼーション緩衝液を加えた。緩衝液は、既知の濃度のカチオン／アニオン又は両性洗浄剤のいずれか、又はヘパリン及びポリアミノ酸といったようなその他の添加剤をも含有し得る。
【０３６１】
その後上述の溶液にＤＮＡ１〜５μｌの熱変性された試料を添加し、試験管をボルテックスに付し次に２０〜６０分、選ばれたＩＮＡの融解温度に応じて５５℃又はもう１つの温度でインキュベートする。
【０３６２】
試料を磁化し、上清を廃棄し、１回あたり５分間、以前のステップからのハイブリダイゼーション温度で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回ビーズを洗浄し、２回洗浄の間に試料を磁化させた。
【０３６３】
ＩＮＡ捕捉されたＤＮＡのＰＣＲ増幅
以下の通り、最終的な再懸濁された試料体積の１／５である、１μｌの処理済みＤＮＡに対し、ＰＣＲ増幅を実施した。各プライマ１μｌあたり６ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ  （プロメガ）  ＰＣＲマスターミックスを用いて、１μｌの重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを含有する２５μｌの反応混合物内でＰＣＲ増幅を実施した。重亜硫酸塩処理済みＤＮＡからのＧＳＴＰ１の増幅のために用いられる鎖特異的なネスティングされたプライマは、ＧＳＴ−９（９６７−９９３）
TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT（Ｆ）ＧＳＴ−１０（１３０７−１３３２）（配列番号５）
AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT第１ラウンドの増幅条件（配列番号６）である。
【０３６４】
第１ラウンドの増幅の１μｌを、
プライマ（Ｒ）ＧＳＴ−１１（９９９−１０２７）
GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT（Ｆ）ＧＳＴ−１２（１２８１−１３０６）（配列番号７）
ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCC（Ｒ）（配列番号８）
を含有する第２ラウンドの増幅反応混合物に移した。プライマの場所は、ＧＳＴＰ１配列（受入れ番号Ｍ２４４８５）に従って示されている。ＰＣＲ産物の試料を標準的な条件の下でＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  ＰＸ２サーマルサイクラーの中で増幅させた。
【０３６５】
５０ｍｌのアガロースあたり１滴の臭化エチジウム（ＣＬＰ＃５４５０）を含有する１％のＴＡＥ内で、アガロースゲル（２％）を調製した。５μｌのＰＣＲ由来の産物を、１μｌの５×アガロースローディングバッファーと混合し、潜水水平電気泳動タンクを用いて×１ＴＡＥ中で１２５ｍＡで電気泳動させた。マーカーは、低１００〜１０００ｂｐタイプであった。Ｋｏｄａｋ  （コダック）  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ２９０システムを用いて、ＵＶ照射の下でゲルを視覚化した。
【０３６６】
図９は、ＩＮＡ捕捉及びＰＣＲ方法のアガロースゲル表現を示している。メチル化されていないゲノムＤＮＡ配列に特異的なＩＮＡリガンドが、磁気ビーズにカップリングされ、ゲノム重亜硫酸塩処理済みＤＮＡと混合された。ビーズ／ＤＮＡ複合体を洗浄し、結合した分子を、下流側領域についてのＰＣＲにおける鋳型として使用した。レーン：マーカー、１、２、３、ここで
レーン１：ＨｅｐＧ２ＤＮＡ（標的部位においてメチル化されているものとして知られている）、
レーン２：Ｄｕ１４５ＤＮＡ（標的部位においてメチル化されていないものとして知られている）、
レーン３：ＢＬ１３ＤＮＡ（標的部位においてメチル化されていないものとして知られている）。
【０３６７】
結果は、磁気ビーズにカップリングされたメチル化されていない標的核酸に向けられたＩＮＡリガンドを用いて、ＩＮＡが、メチル化されていない重亜硫酸塩処理された合計ゲノムＤＮＡを特異的に捕捉することができる、ということを示している。レーン１で用いられているゲノムＤＮＡ（ＨｅｐＧ２）は、ＩＮＡが導かれたゲノム遺伝子座でメチル化されている。レーン２（Ｄｕ１４５）及び３（ＢＬ１３）で用いられているゲノムＤＮＡは、ＩＮＡが導かれたゲノム遺伝子座でメチル化されておらず、その結果両方のレーンで正のＰＣＲシグナルがもたらされている。その上、この例は、メチル化された／メチル化されていない標的核酸の存在を迅速に決定するためＰＣＲ検出と共に該アプローチを使用し得るということを示している。
【０３６８】
メチル化された混合物を用いたＩＮＡリガンドの特異性
ＩＮＡ捕捉ビーズの調製
以下のＩＮＡは、ＧＳＴＰ１遺伝子のメチル化された配列及び同じ領域のメチル化されていないバージョンを認識するように合成された（受入れ番号；Ｍ２４４８５）。（Ｙは偽挿入ヌクレオチドを表わす）。
【０３６９】
メチル化されたＩＮＡ−１  ５’アミン−YA TCY GGC YGC GCY AAC YTA Y（配列番号９）
メチル化されていないＩＮＡ−２  ５’アミン−CTA ACG CGC CGA AAC（配列番号１０）
【０３７０】
Ｉ．  清浄な１．５ｍｌ入り試験管に対し、１０μｌのカルボキシレート修飾済みＭａｇｎａｂｉｎｄＴＭビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ（ピアース）ｃａｔ  ＃  ２１３５３）を移し、９０μｌのＰＢＳ溶液を磁気ビーズに添加した。
ＩＩ．  次にビーズを混合し、次に磁化し、上清を廃棄した。ビーズを一回につき１００μｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、最終的に９０μｌの５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．５中で再懸濁させた。
ＩＩＩ．  １μｌの２５０μＭＰＮＡ）を、試料に加え、試験管をボルテックスに付し、１０〜２０分間室温で放置した。
ＩＶ．  その後、１０μｌの新たに調製された２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  ／  Ｓｉｇｍａ  （ピアース／シグマ））を次に添加し、試料をボルテックスに付し、室温か又は４℃で最高６０分インキュベートさせる。
Ｖ．  その後試料を磁化し、上清を廃棄した。
ＶＩ．  １０分間、０．２５ＭのＮａＯＨ又は０．５ＭのトリスｐＨ８．０のいずれかを１００μｌ添加することによってビーズを遮断した。
【０３７１】
次にビーズをＰＢＳ溶液で２回洗浄し、最終的に１００μｌのＰＢＳ溶液中で再懸濁させた。
【０３７２】
メチル化された及びメチル化されていない合成ＧＳＴＰ１配列に対するＩＮＡリガンドのハイブリダイゼーション
２つの合成１００ｂｐオリゴヌクレオチドを、ＧＳＴＰ１遺伝子のメチル化された及びメチル化されていない領域を示すように設計した。
【０３７３】
メチル化されていない配列
５’AGGGAATTTTTTTTTGTGATGTTTTGGTGTGTTAGTTTGTTGTGTATATTTTGTTGTGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTTGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGATTTTAG−３’（配列番号１１）
メチル化された配列
５’AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG−３’（配列番号１２）
【０３７４】
メチル化された及びメチル化されていない配列を次に以下のメチル化されたもの対メチル化されていないものの比で混合した。
１００：０％    ２５：７５％
９９：１％      １０：９０％
９５：５％        ５：９５％
９０：１０％      １：９９％
７５：２５％      ０：１００％
５０：５０％
【０３７５】
ハイブリダイゼーション反応
Ｉ．  蒸留水で１：１に希釈した４０μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を５μｌのカップリングされたビーズに添加した。
ＩＩ．  ５μｌのオリゴ混合物を添加し、溶液を積極的なピペッティングにより混合して粒子を再懸濁させた。
ＩＩＩ．  次に試料を３０分間５０℃でインキュベートして、標的配列の結合を可能にした。
ＩＶ．  ビーズを磁化し、上清を除去した。
Ｖ．  次にビーズを、５分間５０℃で×２ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。
ＶＩ．  ビーズを磁化させ、上清を除去した。
ＶＩＩ．  ビーズを洗浄し、さらにもう１回、５分間５０℃で×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。
【０３７６】
検出オリゴヌクレオチドのキナーゼ処理
メチル化された又はメチル化されていないのいずれかの合成オリゴ配列の３’領域に対して結合した２つの検出オリゴヌクレオチドを合成した。
メチル化された検出オリゴヌクレオチド
５’−AAA CTA ACA CAC CAA AAC ATC ACA AA−アミン−３’（配列番号１３）
メチル化されていない検出オリゴヌクレオチド
５’−GAA CTA ACG CGC CGA AAC ATC GCG AA−アミン−３’（配列番号１４）
【０３７７】
オリゴを、以下の通りにキナーゼ処理した。
オリゴ            １００ｎｇ
×１０緩衝液      ２μｌ
Ｔ４キナーゼ      ２μｌ
ガンマＰ３２      ４μｌ
水                ２０μｌまで
【０３７８】
反応物を６０分間３７℃で加熱し、次に酵素を５分間９５℃で熱変性させた。反応体積を次に、ＰＣＲグレードの水で５５μｌに調整した。
【０３７９】
ＩＮＡ捕捉磁気ビーズに対するキナーゼ処理済みオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
Ｉ．  蒸留水で１：１に希釈した４５μｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に洗浄済みのＩＮＡ捕捉ビーズを再懸濁した。
ＩＩ．  ５μｌのキナーゼ処理済みオリゴを添加し、溶液を積極的なピペッティングにより混合して粒子を再懸濁させた。
ＩＩＩ．  次に試料を３０分間５０℃でインキュベートして、標的配列の結合を可能にした。
ＩＶ．  ビーズを磁化し、上清を除去した。
Ｖ．  次にビーズを、５分間５０℃で×２ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。
ＶＩ．  ビーズを磁化させ、上清を除去した。
ＶＩＩ．  ビーズをさらにもう１回、５分間５０℃で×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。
ＶＩＩＩ．  ビーズを磁化し、上清を除去した。
ＩＸ．  最終的に、ビーズを５ｍｌのＩｎｓｔａ  Ｇｅｌシンチラント中に再懸濁させ、チェレンコフプロトコルを用いたシンチレーション計数により放射能を決定した。
【０３８０】
結果は、それぞれに、メチル化されていない及びメチル化されたＤＮＡに対して導かれたＩＮＡの特異性を実証する図１０及び図１１に示されている。
【０３８１】
ＩＮＡ対ＰＮＡ対オリゴヌクレオチドの特異性
捕捉ビーズの調製
ＩＮＡ対ＰＮＡ対オリゴヌクレオチドの特異性を判定するため、以下のプローブを合成した。
ＩＮＡプローブ  ５’アミン−YA TCY GGC YGC GCY AAC YTA Y（配列番号１５）
ＰＮＡプローブ  ５’アミン−ATC GCC GCG CAA CTA Å（配列番号１６）
オリゴプローブ  ５’アミン−AAT CCC CGA AAT CGC CGC GCA ACT AA（配列番号１７）
【０３８２】
プローブは、ＧＳＴＰ１遺伝子（受入れ番号Ｍ２４４８５）のメチル化された配列を認識するように合成された。
Ｉ．  清浄な１．５ｍｌ入り試験管に対し、１０μｌのカルボキシレート修飾済みＭａｇｎａｂｉｎｄＴＭビーズ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ｃａｔ  ＃  ２１３５３）を移し、９０μｌのＰＢＳ溶液を磁気ビーズに添加した。
ＩＩ．  次にビーズを混合し、次に磁化し、上清を廃棄した。ビーズを一回につき１００μｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、最終的に９０μｌの５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．５中で再懸濁させた。
ＩＩＩ．  １μｌの２５０μＭＰＮＡを、試料に加え、試験管をボルテックスに付し、１０〜２０分間室温で放置した。
ＩＶ．  その後、１０μｌの新たに調製された２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ溶液（ピアース／シグマ（Ｐｉｅｒｃｅ  ／  Ｓｉｇｍａ））を次に添加し、試料をボルテックスに付し、室温か又は４℃で最高６０分インキュベートさせる。
Ｖ．  その後試料を磁化し、上清を廃棄した。
ＶＩ．  １０分間、０．２５ＭのＮａＯＨ又は０．５ＭのトリスｐＨ８．０のいずれかを１００μｌ添加することによってビーズを遮断した。
ＶＩＩ．  次にビーズをＰＢＳ溶液で２回洗浄し、最終的に１００μｌのＰＢＳ溶液中で再懸濁させた。
【０３８３】
合成ＧＳＴＰ１配列に対するビーズ／プローブ複合体のハイブリダイゼーション
複合体１１０ｂｐオリゴヌクレオチドを、ＧＳＴＰ１遺伝子のメチル化された領域を示すように設計した。
５’AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG−３’（配列番号１８）
【０３８４】
合成オリゴを以下の通りに、１／１０、１／１００及び１／１０００でキナーゼ処理した。
オリゴ          ２μｌ
×１０緩衝液    ２μｌ
Ｔ４キナーゼ    ２μｌ
ガンマＰ３２      ４μｌ
水              ２０μｌまで
【０３８５】
６０分間３７℃で反応物を加熱し、次に酵素を５分間９５℃で熱変性させた。
【０３８６】
ハイブリダイゼーション反応
Ｉ．  １．５ｍｌ入り遠心分離管の中の５μｌの磁気ビーズコーティングされたプローブに対して、蒸留水で１：１に希釈された４０μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  （クローンテック））を添加した。
ＩＩ．  ５μｌのキナーゼ処理済みオリゴを添加し溶液を積極的なピペッティングにより混合して粒子を再懸濁させた。
ＩＩＩ．  次に試料を３０分間５５℃でインキュベートして、標的配列の結合を可能にした。
ＩＶ．  ビーズを磁化し、上清を除去した。
Ｖ．  次に粒子を、１回につき５分間５５℃で×２ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。
ＶＩ．  ビーズをさらにもう１回、５分間５５℃で×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。
ＶＩＩ．  上清を除去し、最後にＩｎｓｔａ  Ｇｅｌシンチラント５ｍｌ中でビーズを再懸濁させ、チェレンコフプロトコルを用いたシンチレーション計数により放射能を決定した。
【０３８７】
図１２は、ＧＳＴＰ１遺伝子のメチル化された領域に対して設計された合成１１０ｂｐオリゴとのＰＮＡ、ＩＮＡ及びオリゴ試料のハイブリダイゼーション時点で生成されたシグナルを示している。オリゴは、記述されている通りに希釈され、次に標識され、試料に対してハイブリッド形成された。ここでわかるように、ＩＮＡは、ＰＮＡプローブよりも高くないものの類似のシグナル強度を示した。
【０３８８】
図１２は、ＰＮＡ、ＩＮＡ及びオリゴヌクレオチドが同一のゲノム遺伝子座を検出するために設計された場合に生成される結果を示している。ＰＮＡ、ＩＮＡ及びオリゴヌクレオチドリガンドは、系列希釈された合成重亜硫酸塩転換された配列とハイブリッド形成された。ハイブリダイゼーションの後、試料を洗浄して、未結合分子を除去し、次に残りの特異的結合済み分子を定量化した。ここでわかるように、ＩＮＡは、ＰＮＡに比べ高い特異性、及び従来のオリゴヌクレオチドのものに比べ１５倍以上の検出シグナル強度の増加を示した。
【０３８９】
固体支持体上のアレイタイプのハイブリダイゼーションを用いたＩＮＡリガンド対オリゴヌクレオチドの比較
ＩＮＡリガンド対オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション試験を行なうため、以下のＩＮＡプローブを、次に記した記号のさまざまな遺伝子座に対して合成した。Ｍ＝メチル化された配列検出、Ｕ＝メチル化されていない配列検出。
【０３９０】
【表３】
2006517402.tif 000008
【０３９１】
ＩＮＡリガンドをオリゴと比較するため、同じオリゴヌクレオチド配列を合成した。
【０３９２】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｐ／Ｎ２０６１４３）を用い、標準的条件の下で１０×多重反応を用いて各々の選択されたゲノム領域からＰＣＲ産物を生成した。
【０３９３】
固体支持体に対するＩＮＡリガンド及びオリゴヌクレオチドのカップリング
Ｉ．  Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｃトランスファメンブラン（Ｐａｌｌ  Ｐ／７０１５５Ａ）の８ｃｍ×１２ｃｍの切片をカットし、０．１ＮのＨＣｌで簡単に洗い流した。
ＩＩ．  メンブランを１５分間、調製されたばかりのＥＤＣ水溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の中に浸漬した。
ＩＩＩ．  水中でメンブランを洗い流し、９６ウェルのドットブロット装置内に入れた。
ＩＶ．  ５００ｍｇのＩＮＡ及びオリゴを、２０μｌのＰＢＳ中に希釈し、適切なウェル内へとピペット取りした。
Ｖ．  １０分間メンブランを室温に放置し、その後真空を加え、ウェルを乾燥させた。
ＶＩ．  その後２００μｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０でウェル２回洗浄し、２回の洗浄間に真空を加えた。
ＶＩＩ．  メンブランをブロッティング装置から除去し、メンブラン上の残りの活性部位を室温で１０分間０．１ＮのＮａＯＨでクエンチングさせた。
ＶＩＩＩ．  蒸留水でメンブランを洗浄し、最終的に使用に先立ち３０分間空気乾燥させた。
【０３９４】
Ｐ３２で標識された多重プローブの調製
Ｐｒｉｍｅ−ａ−ｇｅｎｅ  標識系（プロメガ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  Ｃａｔ＃Ｕ１１００）を用いて、放射性プローブを調製した。
ＰＣＲ産物          ２μｌ
ＰＣＲグレードの水  ２１μｌ
【０３９５】
５分間９５℃で試料を加熱し、次に氷上で急冷した。
ｄＮＴＰミックス    ６μｌ
プライマミックス  １５μｌ
Ｐ３２ｄＡＴＰ        ５μｌ
クレノウ            １μｌ
【０３９６】
プローブを室温で１時間放置し、次に、メーカーの指示に従って、ウイザードＤＮＡクリーンナップシステムを用いて精製した。
【０３９７】
コーティングしたメンブランの予備ハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション
Ｉ．  １時間、１分あたり７ｒｐｍで回転する５５℃のローラーボトル内で１００μｇ／ｍｌのせん断されたサケ精巣ＤＮＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む１０ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中で、メンブランを予備ハイブリッド形成させた。
ＩＩ．  ５分間プローブを煮沸し、５分間氷上で急冷させ、次にメンブランに添加させた。
ＩＩＩ．  一分あたり７ｒｐｍで回転するボトルの中で５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。
【０３９８】
メンブランの洗浄
Ｉ．  その後メンブランを、１回あたり２０分間５５℃で、×２ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。
ＩＩ．  メンブランを２０分間５０℃で、×１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでさらに１回洗浄した。
ＩＩＩ．  最後に、メンブランを２０分間５５℃で、×０．１ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでさらに１回洗浄した。
ＩＶ．  メンブランを、グラッドラップ（ｇｌａｄ  ｗｒａｐ）で包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  （モレキュラー・ダイナミクス）リン画像形成機に暴露した。
【０３９９】
ＩＮＡ対従来のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション結果は、図１３に記されている。上部２列のシグナルは、ＩＮＡを用いて生成された。下部２列のシグナルは、従来のオリゴヌクレオチドを用いて生成された。図１３から、ＩＮＡを用いて生成されたハイブリダイゼーションシグナルの質の高さが明らかにわかる。
【０４００】
ＰＮＡに対するＩＮＡの利点
ＩＮＡリガンドは、標準オリゴヌクレオチドプラットフォーム上で合成され得、一方ＰＮＡリガンドは、専門化されたペプチド合成機上で合成されなくてはならない。
【０４０１】
ＰＮＡリガンドは、ＰＣＲ、逆転写、実時間ＰＣＲ、等温増幅反応、拡張反応といったような標準的分子技術ではプライマとして使用することができない。これとは対照的に、ＩＮＡリガンドは、以上の全てにおいて使用可能であり、そのため分子生物学にとってはるかに有用な手段となっている。
【０４０２】
ＩＮＡリガンドをエクソヌクレアーゼ耐性のものにすることも可能である。
【０４０３】
ＩＮＡリガンドは、ＤＮＡに選択的に結合するように設計でき、一方ＰＮＡリガンドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に結合する。
【０４０４】
ＩＮＡリガンドは、同様に内因性蛍光を示しそのため実時間ＰＣＲといったような応用分野において有用な分子となっており、一方ＰＮＡリガンドはそうではない。
【０４０５】
ＩＮＡリガンドは同時に、ＰＮＡリガンドに比べた場合、自己親和性が減少している。
【０４０６】
本発明者らは、ＰＮＡリガンドが表面に非特異的に粘着するという意味でむしろ「粘着性」でもあるということを発見した。このことは、２つのＩＮＡリガンドを同じ系内で使用した場合に、特に明白である。ＩＮＡリガンドが、この問題で不利益をこうむっているとは思われない。
【０４０７】
要約
本発明の方法は、固体支持体に結合された１つのリガンド（好ましくはオリゴヌクレオチド又はＩＮＡ）及びミクロスフェアにカップリングされた１つのリガンドを用いたあらゆるＤＮＡの検出に応用することができる。天然のオリゴヌクレオチド又はＩＮＡを使用することができるが、その特異性、安定性及びハイブリダイゼーション速度のためＩＮＡが好まれた。
【０４０８】
１つの特定の適合においては、本発明の方法は、重亜硫酸塩ナトリウムで処理されたＤＮＡ中のメチル化シトシンの存在を区別するために使用することができる。ハイブリダイゼーションの特異性は、重亜硫酸塩と完全に反応しなかった分子（ウラシルに転換されなかった１つ以上のシトシン）を識別し、かつ（シトシンとしてとどまっている）ＣｐＧ部位におけるメチル化シトシンとシトシンがウラシルに転換されているメチル化されていないＣｐＧ部位を区別するために使用することができる。
【０４０９】
もう１つの適合においては、本発明の方法は、ウラシルへと転換させるために、そのシトシンが完全に重亜硫酸塩試薬と反応しなかったＤＮＡを識別するために使用することができる。
【０４１０】
重亜硫酸塩での処理は、全てのシトシンをウラシルに転換させること（ただし５−メチルシトシンは転換させない）によってＤＮＡの配列を変更させることから、５メチルシトシンを含有する領域を認識するものの偶然５メチルシトシンを全く有していない同じ配列は認識しないことになる特異的ＩＮＡを作ることが可能である。
【０４１１】
本発明の方法は同様に、オリゴヌクレオチド又はＩＮＡの一方又は両方の配列が１つの対立遺伝子と完全に整合するもののもう１方の対立遺伝子とは整合しない１つの遺伝子の異なる対立遺伝子の識別にも応用することができる。
【０４１２】
本発明の方法は、バルクＤＮＡ試料のメチル化状態の迅速な検出のための多重アレイチップを考案する上での特殊な用途を含め、以前に記述した通りの数多くの利用分野を有する。検出可能な粒子は同様に、検出及びスクリーニングプロセスをスケールアップし自動化するためにも使用可能である。
【０４１３】
該方法は、異なるメチル化状態が細胞の病的又は改変された状態において１つの役割を果たすことが発見されてきたその他の数多くの状態及び条件のために利用可能であることがわかるだろう。ＣｐＧメチル化による影響を受けたほんのいくつかの遺伝子の例が表３に示されている。本発明は、明らかにこのようなメチル化状態及び数多くのその他の状態の検出又は測定に利用可能である。
【０４１４】
当業者であれば、広範に記述された通りの本発明の精神又は範囲から逸脱することなく特定の実施形態において示された通りの該発明に対し数多くの変形形態及び／又は修正を加えることができるということを認識することだろう。従って本実施形態は、全ての点で例示的かつ非制限的なものとしてみなされるべきである。
【０４１５】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０４１６】
【図１】サンドイッチＩＮＡシグナル増幅を示す。
【図２】磁気ビーズ又は検出可能な粒子を用いたサンドイッチＩＮＡシグナル増幅技術を示す。
【図３】抗体を用いたメチル化されたＤＮＡの捕捉の概略を示す。
【図４】ミクロスフェアを用いたメチル化されたＤＮＡの検出の概略を示す。
【図５】ミクロスフェアを用いたメチル化されたＤＮＡの検出の概略を示す。
【図６】抗体を受けつけなかったゲノムＤＮＡ試料と抗体捕捉試料を比較した場合に提供される濃縮係数の結果を示す。
【図７】抗体捕捉多重リガンドアッセイを用いた非ＰＣＲシグナル増幅の結果を示す。結果は、１．ＬＮＣａＰ  ＤＮＡ（メチル化されていないＤＮＡ）での抗体濃縮無し、２．抗体濃縮されたＤｕ１４５  ＤＮＡ（メチル化されていないＤＮＡ）及び３．抗体濃縮されたＬＮＣａＰ  ＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ）を用いて得られたシグナルの結果を示す。
【図８】メチル化されたＤＮＡの検出及びその後の増幅の概略図を示す。
【図９】ＩＮＡ捕捉及びＰＣＲ方法のアガロースゲル表現を示す。メチル化されていないゲノムＤＮＡ配列に特異的なＩＮＡリガンドが、磁気ビーズにカップリングされ、ゲノム重亜硫酸塩処理済みＤＮＡと混合された。ビーズ／ＤＮＡ複合体を洗浄し、結合した分子を、下流側領域についてのＰＣＲ内の鋳型として使用した。レーン；マーカー、１、２、３。レーン１：ＨｅｐＧ２ＤＮＡ（標的部位においてメチル化されているものとして知られている）レーン２：Ｄｕ１４５ＤＮＡ（標的部位においてメチル化されていないものとして知られている）レーン３：ＢＬ１３ＤＮＡ（標的部位においてメチル化されていないものとして知られている）。
【図１０】メチル化されていないＤＮＡに対して導かれたＩＮＡの特異性を示す。グラフは、ＤＮＡのメチル化百分率を示す。
【図１１】メチル化されたＤＮＡに対して導かれたＩＮＡの特異性を示す。グラフは、ＤＮＡのメチル化百分率を示す。
【図１２】ＧＳＴＰ１遺伝子のメチル化された領域に対し設計された合成１１０ｂｐオリゴとのＰＮＡ、ＩＮＡ及びオリゴ試料のハイブリダイゼーションの時点で生成されたシグナルを示す。オリゴは、記述された通りに希釈されており、次に標識され、試料に対しハイブリッド形成された。ここでわかるように、ＩＮＡは、ＰＮＡリガンドより高くないものの類似のシグナル強度を示した。
【図１３】ＩＮＡ対従来のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションの結果を示す。上部２列は、ＩＮＡを用いて生成されたシグナルである。下部２列は、従来のオリゴヌクレオチドを用いて生成されたシグナルである。結果から、ＩＮＡリガンドを用いて生成されたハイブリダイゼーションシグナルの質がより優れたものであることが明確にわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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