(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのプロテアーゼを有する飼料添加剤または試料組成物を提供することにより反芻動物において繊維消化を増大する方法を提供する。特に、本発明は次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用し；該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成るフォレージまたは穀類の消化率を増大する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォレージまたは粒餌の消化率を増大する方法において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し、
ｄ）該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用する
から成ることを特徴とする、フォレージまたは粒餌の消化率を増大する方法。
【請求項２】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌は、バチルス属の種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１６から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
反芻動物に餌付けする方法において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）フォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し
ｄ）該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用する
から成ることを特徴とする、反芻動物に餌付けする方法。
【請求項２１】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
細菌は、バチルス属の種である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項３５から３７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
フォレージまたは粒餌を処理して消化率を増大する方法において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し、
ｄ）該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用する
から成ることを特徴とする、フォレージまたは粒餌を処理して消化率を増大する方法。
【請求項４０】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
細菌は、バチルス属の種である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項５４から５６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
飼料添加剤を製造する方法において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）プロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合して飼料添加剤を形成し、
ｃ）飼料添加剤を反芻動物に餌付けするか、または飼料添加剤を動物用のフォレージまたは粒餌に添加し、それにより消化率の増大が影響する
から成ることを特徴とする、飼料添加剤を製造する方法。
【請求項５９】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
細菌は、バチルス属の種である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項７３から７５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
反芻動物に餌付けするための飼料組成物を製造する方法において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）フォレージまたは粒餌を用意し、および
ｃ）プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用し、組成物を形成し、それにより消化率の増大が影響する
から成ることを特徴とする、反芻動物に餌付けするための飼料組成物を製造する方法。
【請求項７８】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
細菌は、バチルス属の種である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９５】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項９２から９４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
少なくとも１つの飼料グレードのプロテアーゼを、１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて有する飼料添加剤において、フォレージまたは粒餌に利用し、かつ動物に与えた場合に、フォレージまたは粒餌の消化率を増大する量でプロテアーゼを含有することを特徴とする、少なくとも１つの飼料グレードのプロテアーゼを、１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて有する飼料添加剤。
【請求項９７】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来し、その際、プロテアーゼの量は、１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて、１ｍＬまたは１グラム当たりプロテアーゼ１００〜５０００００単位の範囲内である、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項９８】
細菌は、バチルス属の種である、請求項９７に記載の添加剤。
【請求項９９】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項９７に記載の添加剤。
【請求項１００】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項９７に記載の添加剤。
【請求項１０１】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１００に記載の添加剤。
【請求項１０２】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項９７に記載の添加剤。
【請求項１０３】
１つ以上の不活性または活性成分は、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される、請求項９７に記載の添加剤。
【請求項１０４】
プロテアーゼは、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中に存在し、その際、乾物はフォレージまたは粒餌である、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項１０５】
プロテアーゼは、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中に存在し、その際、乾物はフォレージまたは粒餌である、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項１０６】
プロテアーゼは、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中に存在し、その際、乾物はフォレージまたは粒餌である、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項１０７】
プロテアーは、フォレージまたは粒餌に利用される場合に、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項１０８】
プロテアーは、フォレージまたは粒餌に利用される場合に、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項１０９】
プロテアーは、フォレージまたは粒餌に利用される場合に、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項９６に記載の添加剤。
【請求項１１０】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１０７から１０９までのいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項１１１】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１０４から１０９までのいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項１１２】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１０４から１０９までのいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項１１３】
フォレージまたは粒餌を少なくとも１つのプロテアーゼと組合せて有する、反芻動物に餌付けするための飼料組成物であって、それによって消化率の増大が作用することを特徴とする、飼料組成物。
【請求項１１４】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１６】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１７】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１９】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１２０】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１１９に記載の組成物。
【請求項１２１】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１２２】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１２３】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２５】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２６】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２７】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２８】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２９】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１３０】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１３１】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１２８から１３０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３２】
反芻動物に餌付けするためのプロテアーゼの使用において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）フォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し、
ｄ）該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用する
から成ることを特徴とする、反芻動物に餌付けするためのプロテアーゼの使用。
【請求項１３３】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１３２に記載の使用。
【請求項１３４】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１３２に記載の使用。
【請求項１３５】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項１３２に記載の使用。
【請求項１３６】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１３７】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１３８】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１３９】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１３８に記載の使用。
【請求項１４０】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１４１】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１４２】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４３】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４４】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４５】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４６】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４７】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４８】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１４９】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１４１に記載の使用。
【請求項１５０】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１４７から１４９までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５１】
飼料添加剤を製造するためのプロテアーゼの使用において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）プロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合し、飼料添加剤を形成する
から成ることを特徴とする、飼料添加剤を製造するためのプロテアーゼの使用。
【請求項１５２】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項１５１に記載の使用。
【請求項１５３】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５４】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５５】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５６】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１５５に記載の使用。
【請求項１５７】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５８】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５９】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６０】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６１】
プロテアーゼは、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中で存在する、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６２】
プロテアーゼは、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中で存在する、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６３】
プロテアーゼは、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中で存在する、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６４】
プロテアーゼは、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６５】
プロテアーゼは、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６６】
プロテアーゼは、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６７】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１６４から１６６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６８】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１６１から１６６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６９】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１６１から１６６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７０】
飼料組成物を製造するためのプロテアーゼの使用において、次の工程：
ａ）少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、
ｂ）フォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し、それによって消化率の増大が作用する
から成ることを特徴とする、飼料組成物を製造するためのプロテアーゼの使用。
【請求項１７１】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１７０に記載の使用。
【請求項１７２】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１７０に記載の使用。
【請求項１７３】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項１７０に記載の使用。
【請求項１７４】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１７３に記載の使用。
【請求項１７５】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１７３に記載の使用。
【請求項１７６】
プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される、請求項１７３に記載の使用。
【請求項１７７】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１７６に記載の使用。
【請求項１７８】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１７３に記載の使用。
【請求項１７９】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項１７３に記載の使用。
【請求項１８０】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１７９に記載の使用。
【請求項１８１】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１７９に記載の使用。
【請求項１８２】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８３】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８４】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８５】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８６】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８７】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８８】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１８５から１８８までのいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼを有する飼料添加剤または試料組成物を提供することにより反芻動物において繊維消化を増大する方法に関する。
【０００２】
本発明の背景
反芻動物は、特殊な消化器であるルーメンを有する哺乳類であり、このルーメン内では嫌気性微生物（細菌、真菌類、原生動物）の活動により効果的な植物繊維の消化が行われている。反芻動物は、主に草およびマメ科植物から由来する植物繊維で生存しており、この植物繊維は不溶性多糖類、特にセルロースとヘミセルロースから成る。大抵の哺乳類は、このような多糖類を消化するのに必要な酵素が欠損しており、反芻動物は消化剤としての微生物に依存している。ルーメン内に食べ物が残っている間に、セルロース分解細菌はセルロースを加水分解し、二糖類セルビオースと遊離グルコース単位にする。放出されたグルコースは、次に細菌発酵を受け、揮発性脂肪酸（すなわち、酢酸、プロピオン酸および酪酸）とガス（二酸化炭素とメタン）を生産する。揮発性脂肪酸は、ルーメン壁を介して血管に移動し、その主要エネルギー源として反芻動物により酸化される。二酸化炭素とメタンは、おくびにより大気中に除去される。さらに、微生物はアミノ酸とビタミンを合成する。
【０００３】
ルーメンが消化に十分なメカニズムであるにもかかわらず、このプロセスは遅く、特に多い繊維飼料ではしばしば不十分である。この効率の悪さは、家畜生産のコストを上げ、飼料源の使用を増やし、反芻動物生産の環境的影響力を増す。物理学的処理（例えば、粉砕、水蒸気処理、ペレッティングなど）または化学的処理（例えば、アルカリ、アンモニア、尿素、オゾンなど）を用いることによって反芻動物による繊維の利用能の範囲を増すアプローチは、経費やヒトと環境にもたらす危険性ゆえに望ましくない。
【０００４】
ルーメン内の飼料消化を促進する生物学的触媒または酵素のような二者択一的な処理が望ましい。飼料消化の増大は、動物の生産性を促進し、生産コストを下げることができる。さらに、動物から排泄される堆肥の量を減らし、かつ特定の生産レベルを得るのに必要な飼料の品質を下げることにより、環境における家畜生産の影響力を下げることもできる。
【０００５】
酵素は、生物学的反応を促進または触媒するタンパク質であり、微生物（主に真菌または細菌）から分泌される。植物細胞壁または“繊維”を分解する酵素は、分解する繊維部分（セルロースまたはヘミセルロース）に応じて、一括してセルラーゼおよびヘミセルラーゼと呼ばれる。セルラーゼとヘミセルラーゼは、織物、食べ物、醸造、洗剤ならびに飼料工業で広く使用されている。動物栄養学的に、それらは単胃産業（家禽および豚）で使用されているが、しかし反芻動物での使用はなお発展途上のままである。
【０００６】
反芻動物の食餌で酵素を使用する初期の研究は、使用される酵素の不十分な特徴付けゆえに決定的ではなかった。さらに、保護されていない酵素が高いタンパク質分解活性によりルーメン内で素早く不活性化されるであろうと考えられていたので、この使用は懐疑的であった。さらに、反芻動物の微生物自体が添加された同じタイプの酵素を分泌することにより飼料を分解するので、補足的酵素がプラスの効果を有さないであろうと考えられていた。しかし、より新しく、かつ良好に特徴付けられた酵素混合物を使用する研究では、これらの酵素が消化を変えるほど十分に長い時間ルーメン環境に耐えることができるだけではなく、特定の酵素混合物の添加が飼料消化と動物の性能（すなわち、肥育場のウシおよび乳牛）を上げることを証明した。米国特許第5720971号明細書、Beaucheminらは、一定の有利な割合とレベルでセルラーゼとキシラナーゼの混合物を含有する繊維消化酵素サプリメントならびに反芻動物用のマメ科植物フォレージと粒餌の消化率を高めるための、その使用を教示している。
【０００７】
従来の反芻動物の研究は、セルラーゼとヘミセルラーゼ、場合によりペクチナーゼとアミラーゼに注目していた。これとは対照的に、反芻動物の食餌におけるプロテアーゼの使用は無視されていた。可能性として有り得る理由は、ルーメン内での過剰のタンパク質分解が栄養学的に非効率であり、動物からのより高い窒素損失と汚染の増大を導くと考えられていたからである。しかし、本発明は意外にも反芻動物の食餌におけるプロテアーゼの使用が有効であり、飼料消化率の増大に有益であることを証明した。
【０００８】
本発明の要約
本発明は、少なくとも１つのプロテアーゼを有する飼料添加剤または試料組成物を提供することにより反芻動物において繊維消化を増大する方法を広く提供する。特に、本発明は次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し；反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；かつ該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成るフォレージまたは粒餌の消化率を増大する方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；かつ該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成る反芻動物に餌付けする方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；かつ該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成る消化率を増大するためのフォレージまたは粒餌の処理方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、プロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合して飼料添加剤を形成し；該飼料添加剤を反芻動物に餌付けするか、または該飼料添加剤を動物用のフォレージまたは粒餌に添加し、それによって消化率の増大が作用することから成る飼料添加剤を製造する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して組成物を形成し、それによって消化率の増大が作用することから成る反芻動物に餌付けするための飼料組成物を製造する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、少なくとも１つの飼料グレードのプロテアーゼを、少なくとも１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて有する飼料添加剤であって、その際に、フォレージまたは粒餌に利用し、かつ動物に与えた場合に、フォレージまたは粒餌の消化率を増大する量でプロテアーゼを含有する飼料添加剤を提供する。さらに、本発明は、フォレージまたは粒餌を少なくとも１つのプロテアーゼと組合せて有する反芻動物に付けするための飼料組成物であって、これによって消化率の増大が作用する飼料組成物を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成る反芻動物に餌付けするためのプロテアーゼの使用を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、プロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合し、飼料添加剤を形成し；該飼料添加剤を反芻動物に餌付けするか、または該飼料添加剤を動物用のフォレージまたは粒餌に添加し、それにより消化率の増大が影響することから成る、飼料添加剤を製造するためのプロテアーゼの使用を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して組成物を形成し、それによって消化率の増大が作用することから成る飼料組成物を製造するためのプロテアーゼの使用を提供する。
【００１７】
本明細書および請求項に記載されているように、以下に記載されている用語や語句は次の定義を有する。
【００１８】
“ルーメン”は、反芻動物の胃の最も大きなコンパートメントである。
【００１９】
“反芻動物”または“反芻動物類”は、複雑な、複数に仕切られた胃を持つウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、バッファロー、シカ、トナカイ、カリブーおよびヘラジカを含む。
【００２０】
“飼料材料”とは、フォレージまたは粒餌またはこれらの組合せを意味する。
【００２１】
“粒餌”とは、一般的に反芻動物に与えられる植物の種を意味し、種の外殻、さやまたは包被を含めても含めなくてもよい。粒餌の例には、次のものに限定されるわけではないが、オオムギ、小麦、トウモロコシ、オート、モロコシ、ライコムギ、ライ麦、油料種子が含まれる。
【００２２】
“フォレージ”とは、分離した穀粒以外の植物の食用部分を意味し、これは放牧動物用の飼料を提供できるか、または反芻動物を餌付けするために刈入れることができる。
【００２３】
“マメ科植物フォレージ”とは、動物の飼料原料として使用される植物の部分を意味する。これは、マメ科植物族のメンバーである双子葉植物種である。例には、次のものに限定されるわけではないが、ムラサキウマゴヤシ、イガマメ、チョウジおよびベッチが含まれる。この用語は、マメ科植物族からの植物材料５０％以上と、残りのその他の種からの植物材料とから成るフォレージを意味する。
【００２４】
“混合乾草”とは、イネ科−マメ科混合乾草を意味する。
【００２５】
“TMR”と略記する“混合飼料（Total mixed ration）”とは、２種以上の飼料材料の組合せを意味する。
【００２６】
“乾燥した”とは、１５％（w/w）未満の湿分を有する飼料材料を意味する。
【００２７】
“湿った”とは、１５％（w/w）以上の湿分を有する飼料材料を意味する。
【００２８】
“ＤＭ”と略記する“乾物”とは、オーブン乾燥の後に一定の重さで残る植物中の物質を意味する。
【００２９】
“ＯＭ”と略記する“有機物”とは、元の飼料組成物とその灰分との差を意味し、少なくとも３時間５００℃以上で燃焼することにより測定する。
【００３０】
“ＣＰ”と略記する“粗タンパク質”とは、全体の窒素（Ｎ）含有量の測定値×６．２５に対する概算のタンパク質含量を意味する。
【００３１】
“ＮＤＦ”と略記する“中性デタージェント繊維”は、中性デタージェント中に不溶である飼料の部分を意味し、ペクチンを除く細胞壁成分と同義語である。
【００３２】
“ＡＤＦ”と略記する“酸性デタージェント繊維”は、飼料材料を酸性デタージェントで抽出した後に残る不溶性残査を意味するか、またはヘミセルロースを引いた細胞壁成分である。
【００３３】
“ＡＤＬ”と略記する“酸性デタージェントリグニン”は、濃硫酸でＡＤＦを抽出した後に測定するリグニンまたは残査を意味する。
【００３４】
“ヘミセルロース”とは、植物の細胞壁中のセルロースおよびリグニンと関連する多糖類を意味し、グルカン（デンプンとは別）、マンナン、キシラン、アラビナンまたはポリグルクロン酸またはポリガラクツロン酸が含まれる。ＮＤＦとＡＤＦの差として決定される。
【００３５】
“セルロース”とは、β−１，４結合により連結したグルコース単位から成る炭水化物である。
【００３６】
“見かけの消化率”とは、動物飼育実験により測定される消化率を意味し、飼料消費から排泄物を引いて計算した飼料組成物のパーセンテージとして表現されるが、しかし、糞中の内因性排泄物を占めていない。
【００３７】
“真の消化率”とは、糞中の内因性排泄を含めた、同じ摂取材料の摂取と糞便減量の間のバランスにより示される飼料、フォレージまたは栄養素の実際の消化率または利用能を意味する。この用語は、in vitroでの消化率も表す。
【００３８】
“ＶＦＡ”と略記する“揮発性脂肪酸”は、ルーメン内の微生物発酵の最終生成物であり、宿主動物にエネルギーを提供する。ＶＦＡは、次のものに限定されるわけではないが、酢酸、プロピオン酸および酪酸を含む。分枝鎖の揮発性脂肪酸は、“ＢＣＶＦＡ”と略記される。
【００３９】
“酵素混合物”は、少なくとも１つのプロテアーゼを含有する酵素の組合せを意味する。
【００４０】
“セルラーゼ”は、セルロースを消化してヘキソース単位にする酵素を意味する。
【００４１】
“プロテアーゼ”または“プロテアーゼ類”は、ペプチド結合を切断することができる酵素を意味する。
【００４２】
限定されるわけではないが、この用語には、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼが含まれる。
【００４３】
“プロテアーゼ活性”とは、プロテアーゼの活性を意味する。すなわち、ペプチド結合を切断する能力、または０．４％アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０、３９℃でアッセイするプロテアーゼ活性を意味する。
【００４４】
“主成分としてのプロテアーゼ”とは、プロテアーゼを主成分として用い、別の活性が存在しているかもしれないが、その他の酵素活性が必要でないことを意味する。
【００４５】
“セリンプロテアーゼ”とは、ペプチド結合の加水分解の触媒に重要である酵素を意味し、これは、活性部位に活性なセリン残基を有する。この用語は、触媒的ヒスチジン、アスパラギンおよびセリンと同じ空間配置を有するトリプシン様タイプおよびサブチリシン様タイプを意味するが、しかし触媒的骨組みは極めて異なる。
【００４６】
“サブチリシン様セリンプロテアーゼ”とは、その触媒活性がセリンプロテアーゼのトリプシンファミリーの触媒活性と類似しているチャージ・リレー・システム（charge relay system）によりもたらされるセリンプロテアーゼを意味するが、このリレーシステムは独立の展開により発生する。触媒トライアッドに関係する残基の周辺の配列は、トリプシンセリンプロテアーゼ内の同じ残基の配置とは全く異なっており、かつプロテアーゼのカテゴリーのそれに特異的な信号として使用することができる。
【００４７】
“トリプシン様セリンプロテアーゼ”とは、約２３０残基を有するトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレンおよびトロンビンのような哺乳類の酵素と、約１９０残基を有する細菌性酵素との両方を含む。
【００４８】
“濃度”とは、プロテアーゼで処理した飼料材料を有する飼料組成物の乾物１ｋｇ当たりのプロテアーゼの活性レベルを意味する。
【００４９】
“安定”とは、プロテアーゼが活性のままであり、飼料材料がカビたり腐敗しないか、または処理後少なくとも１年間は劣化しないことを意味する。
【００５０】
“飼料組成物”とは、飼料材料に酵素を添加することにより形成される複合体を意味する。
【００５１】
“飼料グレード”とは、動物に与えた場合に非毒性であることを意味する。
【００５２】
図面の簡単な説明
図１は、餌付け後の時間を関数として発酵槽のｐＨをプロットし、飼料添加後（0900時）に連続培養発酵槽中の日ごとのｐＨ変化が酵素混合物により影響されていること記載したグラフである。値は最小二乗平均であり、垂直線はSEMを表す。
【００５３】
本発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも１つのプロテアーゼを有する飼料添加剤または試料組成物を提供することにより反芻動物において繊維消化を増大する方法を広く提供する。特に、本発明は次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し；反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；かつ該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成るフォレージまたは粒餌の消化率を増大する方法を提供する。
【００５４】
さらに、本発明は次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；かつ該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成る反芻動物に餌付けする方法を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し；かつ該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成る消化率を増大するためのフォレージまたは粒餌の処理方法を提供する。
【００５６】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、プロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合して飼料添加剤を形成し；該飼料添加剤を反芻動物に餌付けするか、または該飼料添加剤を動物用のフォレージまたは粒餌に添加し、それによって消化率の増大が作用することから成る、飼料添加剤を製造する方法を提供する。
【００５７】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して組成物を形成し、それによって消化率の増大が作用することから成る反芻動物に餌付けするための飼料組成物を製造する方法を提供する。
【００５８】
さらに、本発明は、少なくとも１つのプロテアーゼを、少なくとも１つ以上の不活性または活性成分と組合せて有する飼料添加剤を提供する。さらに、本発明は、フォレージまたは粒餌を少なくとも１つのプロテアーゼと組合せて有する反芻動物に付けするための飼料組成物であって、これによって消化率の増大が作用する飼料組成物を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して組成物を形成し；該組成物を動物に投与し、それによって消化率の増大が作用することから成る反芻動物に餌付けするためのプロテアーゼの使用を提供する。
【００６０】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、プロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合して、飼料添加剤を形成し；該飼料添加剤を反芻動物に餌付けするか、または該飼料添加剤を動物用のフォレージまたは粒餌に添加し、それにより消化率の増大が影響することから成る、飼料添加剤を製造するためのプロテアーゼの使用を提供する。
【００６１】
さらに、本発明は、次の工程：少なくとも１つのプロテアーゼを用意し、フォレージまたは粒餌を用意し、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して組成物を形成し、それによって消化率の増大が作用することから成る飼料組成物を製造するためのプロテアーゼの使用を提供する。
【００６２】
反芻動物には、次のものに限定されるわけではないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、バッファロー、シカ、トナカイ、カリブーおよびヘラジカが含まれる。フォレージまたは粒餌には、次のものに限定されるわけではないが、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せが含まれる。有利なフォレージには、次のものに限定されるわけではないが、ムラサキウマゴヤシならびにムラサキウマゴヤシ−グラス混合フォレージを含むムラサキウマゴヤシ混合物およびムラサキウマゴヤシを含有している食餌が含まれる。フォレージまたは粒餌は乾燥している（１５％以上の湿分）か、または湿っている（１５％未満の湿分）ことができる。
【００６３】
飼料添加剤または試料組成物には、別の活性が存在しているかもしれないが、その他の酵素活性が必要でないようにプロテアーゼが主成分として含まれる。プロテアーゼには、次のものに限定されるわけではないが、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼが含まれ、これはトリプシン様タイプまたはサブチリシン様タイプであってよい。プロテアーゼが多くの種々の方法により製造できることが当業者には容易に理解できる。例えば、プロテアーゼは宿主生物を標準的な技法により作成し、所望のプロテアーゼを特定の量で生産させることにより得ることができる。二者択一的に、プロテアーゼは、微生物から由来するか、またはこのようなプロテアーゼを含有しているか、生産できる微生物の発酵から誘導することができる。例えば、プロテアーゼはバチルス属からの種のような細菌またはトリコデルマ属からの種のような真菌類から由来することができる。二者択一的に、次のものに限定されるわけではないが、以下：Protex 6L（Genencor International, Rochester, NY）を含む市販のプロテアーゼを使用することもできる。適切なセリンプロテアーゼには、次のものに限定されるわけではないが、以下：サブチリシンのような特性（E.C.3.4.21.62）を有するアルカリ性セリンエンドペプチターゼを含む。適切なサブチリシンには、次のものに限定されるわけではないが、以下：Sigma Chemicals, St. Louis, MOから入手可能なSubtilisn Carlsberg（Type VIII, Cat.No.P5380）が含まれる。
【００６４】
プロテアーゼは、特定の濃度と活性を提供するのに十分な量で用意され、飼料の消化率と動物の性能を最大にする。プロテアーゼは、０．１〜２０．０mL／kg消費食餌乾物の範囲内、より有利には０．５〜２．５mL／kg消費食餌乾物の範囲内、最も有利には０．７５〜１．５mL／kg消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用される。
【００６５】
フォレージまたは粒餌に添加されるプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内、より有利には２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内、最も有利には３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内で、得られるフォレージまたは粒餌組成物が十分なプロテアーゼ活性を有するような量である。プロテアーゼ活性とは、ペプチド結合を切断するプロテアーゼの能力を意味するか、または０．４％アゾカゼインを基質として用いてｐＨ６．０、３９℃でアッセイされるプロテアーゼ活性を意味する。
【００６６】
サブスチリン様プロテアーゼは、アルカリ性（すなわち、ｐＨ７を最適に上回る活性）であり、適切なプロテアーゼはルーメンに特徴的なｐＨ範囲に相当する５〜７の範囲のｐＨで活性を示す。
【００６７】
本発明は、特に反芻動物の飼料添加剤と試料組成物にまで及ぶ。種々のプロテアーゼ調製物は、繊維消化を促進するために反芻動物に投与することが望ましい。プロテアーゼは、次のような固体、液体、懸濁液、飼料添加剤、混合物、または飼料組成物として調製できる。
ｉ）固体−プロテアーゼは固体として、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製することができる。粉末の形では、プロテアーゼを飼槽に撒くか、または飼料と混合してもよい。
ｉｉ）液体および懸濁液−プロテアーゼを液体に挿入し、凍結乾燥または粉末化したプロテアーゼを適切な液体に添加することにより溶液または懸濁液として調製することができる。摂取のために、プロテアーゼは動物の飲料水と混合するか、または他の液体の形で提供することができる。
ｉｉｉ）飼料添加剤−プロテアーゼは、プロテアーゼが添加されている凍結乾燥した微生物の調製物を有する飼料添加剤の形で投与できる。飼料添加剤は、動物の通常の飼料と一緒に含有していてもよい。飼料添加剤は、１ｍＬまたは１グラム当たり、プロテアーゼ１００〜５０００００単位を１つ以上の不活性または活性成分と一緒に含有している少なくとも１つの飼料グレードのプロテアーゼを有していてもよい。
ｉｖ）混合剤−飼料材料への活性成分の挿入は、一般に活性成分のプレミックスを製造し、このプレミックスをビタミンおよびミネラルと混合し、次にこのプレミックスまたは飼料添加剤を飼料に添加することにより達成される。プロテアーゼは、当業者に公知の他の活性剤、例えば、他の酵素（セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ；抗生物質；プレビオティックスおよびプロビオティックスを含むが、これに限定されない）と混合することもできる。プロテアーゼだけまたは他の活性成分と組合せて含まれている活性成分は、栄養素と組合せて、プレミックスサプリメントを提供することができる。栄養素には、ビタミン、ミネラルのような微量栄養素と多量栄養素の両方が含まれる。次にプレミックスが飼料材料に添加される。
ｖ）飼料組成物−  プロテアーゼは、プロテアーゼで処理したフォレージまたは粒餌を有する飼料組成物の形で提供することができる。プロテアーゼは、乾燥した形、例えば、粉末として、または飲み薬やスプレーとして使用すべき液体としてフォレージまたは粒餌と混合してもよい。
【００６８】
調製物は、他のタンパク質または化学薬剤を添加することにより安定化してもよい。製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈剤および付形剤を調製物に挿入してもよい。動物が十分な量を消費することを確実にするために、着香剤を添加して動物の口に合うような形でプロテアーゼを提供してもよい。
【００６９】
プロテアーゼは、幾つかの方法で投与できるが、動物の飼料中への経口投与が有利である。プロテアーゼの投与量は、当業者に周知の多くの要因、例えば、動物の種類、年齢および体重による。プロテアーゼは日用量で動物に投与することができる。
【００７０】
飼料材料の消化率の改善を達成するために、一定の方法とパラメーターに従って、プロテアーゼをフォレージまたは粒餌に使用すべきである。フォレージまたは粒餌の量に関連して、十分に粉末化または液体化したプロテアーゼを水中で希釈して、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内、有利には２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内、最も有利には３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内という所望の活性レベルが提供される。
【００７１】
液体の形のようなプロテアーゼは、フォレージまたは粒餌に利用されて、フォレージまたは粒餌上に水溶液の均一な分布を提供する。一般的に、フォレージまたは粒餌が同時に混合されて均一なプロテアーゼの分布を促進させながら、プロテアーゼはフォレージまたは粒餌上にスプレーされる。
【００７２】
フォレージまたは粒餌の処理は、種々の一般的な飼料の加工工程と組合せてもよく、この工程はプロテアーゼ処理の前または後にあってもよい。このような加工程には、次のものに限定されるわけではないが、飼料のドライローリング、スチームローリング、スチームフレーキング、キュービング、テンパリング、ポッピング、ロースティング、蒸煮または分解が含まれる。加工工程に高温が含まれる場合には、プロテアーゼは加工工程の後に利用するのが好ましい。
【００７３】
発明者は、実施例に記載されているように、反芻動物においてフォレージまたは粒餌の消化率を増大するプロテアーゼの驚くべき効果を決定した。例１に示されているように、はじめに２２個の市販の酵素混合物をスクリーンし、それらのタンパク質濃度、酵素活性および天然基質における加水分解能（すなわち、還元糖の放出）を検定した。
【００７４】
例２には、反芻動物の食餌で通常使用されるフォレージのin vitroでのルーメンの分解を含む３つの実験を記載されている。重要なことは、酵素混合物がルーメン液の存在で調査されたことである。実験１では代表の酵素混合物を同定し、さらに実験２ではムラサキウマゴヤシとトウモロコシサイレージに及ぼすそれらの分解作用を評価した。次に、これらのファクター間の関係を確立するために、相間を行った。そのために、２つの酵素混合物を選択し、さらに実験３ではin vitroでのフォレージ分解の速度と程度における影響を決定した。
【００７５】
実験３に示されているように、選択したプロテアーゼ酵素混合物が混合飼料（オーブン乾燥または凍結乾燥した物の代わりに新鮮な物を使用）に及ぼす影響を、連続培養を用いて試験した。ルーメンの代謝応答は、二系統流れ連続培養発酵槽を用いて、in vitroで刺激することができる。この系は、ルーメンをフィステル形成したウシから得られるルーメン液を接種し；コントロールまたは試験飼料材料と一緒に連続的に供給し；かつ人工唾液を連続的に注入した発酵槽のシリーズから成っている。発酵槽は、温度、ｐＨ、嫌気条件ならびに類似の食餌を消費する反芻動物において見られる速度に合う速さで消化の連続的流れを保持した。更に、ｐＨを２つの異なるｐＨ範囲（５．４〜６．０および６．０〜６．７）を生じるように調整して、ウシに高濃度の食餌を与える場合に通常生じる唾液分泌の減少をシュミレーションした（Van Soest, 1994）。プロテアーゼ酵素混合物が食餌の消化率を改善するかどうかを調べ、かつこの改善の範囲が高ｐＨよりも低ｐＨで低くなるかどうかを調べた。細菌計数、酵素活性および化学試験を含めた分析を行った。種々のｐＨ条件下でのプロテアーゼ酵素混合物の添加は、タンパク質分解において数値増大だけを伴って繊維分解を促進した。総じて、これらの調査結果は、反芻動物におけるプロテアーゼ酵素混合物の作用様式が、直接および間接的作用の組合せであり、ルーメン内の飼料と微生物個体群の両方に及んでいることを更に示唆している。
【００７６】
例４の選択したプロテアーゼ酵素混合物の分析では、プロテアーゼのタイプがサブチリシン様タイプであると思われることが示唆されているが、しかし、繊維消化の有益な作用は、このタイプのプロテアーゼだけに限定されているわけではない。
【００７７】
特に、発明者らは、特定のプロテアーゼ酵素混合物を、反芻動物の食餌で通常使用されている飼料に添加することがルーメン内の繊維（NDF）消化を６０％（期待幅：１０〜４５％）まで高めることを発見した。さらに、繊維消化のこの増大は、ルーメンのタンパク質消化において望ましくない大幅な増大、またはメタン生産の増大を伴わない。添加プロテアーゼによる繊維消化の増大は、ムラサキウマゴヤシフォレージと幾つかのムラサキウマゴヤシフォレージ含有の食餌に関して最大であったが、しかし、改善はムラサキウマゴヤシをベースとする食餌に限定されているわけではない。
【００７８】
繊維消化におけるこの大きさの増大は、動物にとって利用可能なエネルギー量の増大につながり、その結果、成長速度または乳生産を改善すると考えられる。これらのプロテアーゼが繊維消化を増大するメカニズムは、線維性微生物とそれらの酵素に構造的バリアとして働いているタンパク様の実体の除去と関連すると考えられている。ムラサキウマゴヤシでは、消化部分の微生物のコロニー化を遅らせる構造的バリアを取り除くことにより、分解速度を上げて効果的に酵素が働いていると考えられる。トウモロコシサイレージでは、効果的な酵素は、ルーメンの酵素と相互作用してフォレージの分解をより早めているようである。繊維消化での増大の大きさを観察してみると、反芻動物の食餌へプロテアーゼを添加することが、この食餌を与えられた動物の成長率または乳生産を改善すると予測される。
【００７９】
例５は、乳牛の食餌にプロテアーゼ酵素を添加することが食餌の消化率を増大させたことを示している。ＤＭ、ＯＭ、Ｎ、ＡＤＦおよびＮＤＦの消化率は、プロテアーゼ酵素によって一貫して増大した。消化率の改善は、一般に高フォレージ食餌よりも、低フォレージ食餌（すなわち、高生産乳牛に商業的に与えられる典型的な食餌）に関して優れていたが、しかし消化率の改善は両方の食餌に関して相当なものであった。
【００８０】
例６には、例５の餌付け研究で使用した各フォレージの消化率における増大が示されている。食餌の各フォレージ成分を別々に処理した場合に、プロテアーゼ酵素はムラサキウマゴヤシ乾草の消化を改善したが、オオムギサイレージでは改善しなかった。しかし、これらの同じフォレージが例６のウシに与えた食餌を含んだ場合には、全体の食餌の消化率は増大した。ムラサキウマゴヤシ乾草は、この食餌を１６％だけを含んでいたので、消化率の増大はムラサキウマゴヤシ乾草成分の消化率の改善だけにより説明できるものよりも大きかった。例５で示されるルーメン液の増大した酵素活性は、プロテアーゼ酵素の餌付けがルーメンの全体的な繊維分解能を増大させ、外因性酵素作用とルーメン微生物の間の相乗作用を示している。従って、食餌にプロテアーゼを添加することにより、繊維を消化するルーメンのキャパシティーが増大した。例５で観察された消化の増大は、例６でフォレージを別々にインキュベートした場合のように、食餌のムラサキウマゴヤシ乾草成分だけに限定されなかった。
【００８１】
通常の当業者には、本発明を実施するために本明細書に明確に列挙されている以外の二者択一的な方法、試薬、手法および技術を使用するか、または容易に適合できることが明らかであろう。本発明は、さらに以下に限定されることのない例を説明する。本明細書中で使用される全ての略語は、この分野で使用されている標準的な略語である。実施例には詳細に記載されていない特殊な方法は、この分野では周知である。
例１−酵素混合物の初期スクリーニング
２２個の市販の酵素混合物を使用した。実験コード（RT1180からRT1201）を各酵素混合物に割り当てた（Genecor Int., Rochester, NYのRT1180からRT1194；Quest Int., Naarden, the NetherlandsのRT1195からRT1198；DSM, Delft, the NetherlandsのRT1199からRT1201）。さらに、公知の効能を有する３種の市販の酵素混合物は、プラスのコントロールとして利用した；実験コードP, PD,PB（Cargill Inc., St Louis, MO）。
ａ．タンパク質濃度
ウシ血清アルブミンを標準物として用い、Bio-Rad DCタンパク質測定キット（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を用いてタンパク質の量を測定した。各希釈酵素混合物５μｌをマイクロタイタープレートに添加し、続いてBio-Rad試薬Ａ２５μＬと試薬Ｂ２００μＬを添加した。反応を室温で１５分間行い、MRX-HDプレートリーダー（Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA）を用いて吸光度を６３０nmで読んだ。
ｂ．酵素活性
（i）ポリサッカリダーゼ活性
ポリサッカリダーゼ活性を蒸留水中の基質溶液または懸濁液（１％w/v）を用いてトリプリケートで測定した。キシラン（樺の木またはオートスペルト小麦からの）、カルボキシメチルセルロース（CMC, 中粘度）、シグマセル５０、リケナン、ラミナリンおよび可溶性デンプン（全てSigma Chemicals, St Louis, MOから得られた物）を、キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）、エキソグルカナーゼ（EC 3.2.1.91）、α−１，３−α−１，４−グルカナーゼ（EC 3.2.1.73）、α−１，３−グルカナーゼ（EC 3.2.1.6）およびα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）の測定にそれぞれ使用した。さらに、オオムギのα−グルカン、キシログルカン（タマリンド種からの）および小麦アラビノキシランは、Megazyme International Ltd.（Wicklow, Ireland）から得られたものである。
【００８２】
適切に希釈した酵素（５０μＬ）と基質溶液（４５０μＬ）を活性に応じて５〜６０分間インキュベーションし、かつWood and Bhat（1988）に従ってアッセイした。簡潔には、２容量のソモギー−ネルソン試薬（Somogyi, 1952）を添加することにより反応を中止し、１０分間沸騰させた。還元糖を６３０nmで比色により測定した。活性の１単位は、これらのアッセイ条件下で、１μmol当量のキシロースまたはグルコースmin−１g−１酵素生成物を放出するのに必要な酵素量として定義した。
（ii）グルコシダーゼ活性
Wood and Bhat（1988）に記載されているようなｐ−ニトロフェニル誘導体（Sigma Chemicals, St. Louis, MO）の１mM溶液を使用して、測定したグルコシダーゼ活性は、β−Ｄ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）、β−Ｄ−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（EC 3.2.1.55）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.23）およびアセチルエステラーゼ（EC 3.1.1.6）であった。各基質１００μＬを希釈酵素混合物（１２．５μＬ）および緩衝液（３７．５μＬ）と３９℃で３０分間インキュベート（ｎ＝６）した（アセチルエステラーゼ活性を除く）。インキュベーションに際して、０．４Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH 10.8）１５０μＬの添加により反応を中断し、吸光度を４２０nmで測定した。アセチルエステラーゼ測定に関しては、インキュベーションの０分、５分、１０分および１５分で連続的に読み取り、３４０nmでの吸光度の増大に基づいて活性を計算した。活性の１単位は、１μmolのニトロフェノールmin−１g−１酵素混合物を放出するのに必要な酵素量として定義した。
（iii）プロテアーゼ活性
プロテアーゼ活性は、放射拡散アッセイ法（Brown, et al., 2001）を用いて測定した。クエン酸塩−リン酸塩緩衝液（0.1M、pH6.0）中で製造し、基質として０．５％（w/v）ゼラチン（Fischer Scientific, Fair Lawa, NJ）を含有している１％（w/v）モルター寒天（Fermtech Agar, EM Science, Gibbstown, NJ）１０ｍＬをペトリ皿（直径９０mm）に注いだ。０．０１％アジ化ナトリウム（w/v）を微生物の成長を抑制するために含めた。寒天凝固に関しては、コルク穴あけ機を用いて、６mmウェルを各プレート中に作り、かつ未希釈酵素混合物５μＬ＋蒸留水２０μＬを添加した。プレートを３９℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、飽和硫酸アンモニウム溶液を添加することにより未加水分解のゼラチンを析出させた。ウェル周辺のクリヤーな放射状の部分（酵素により分解された部分を示している）を二人の独立観察者により電子デジタルキャリパー（Traceable, Model No 62379-531, Control Company, Friendswood, TX）を用いて測定した。次に、ウェルの直径により補正した後に、分解したゼラチンのｍｍに関してプロテアーゼ活性を表した。
ｃ．天然基質からの還元糖の放出
酵素混合物（５０μＬ）と３９℃およびｐＨ６．０（０．１Ｍクエン酸塩−リン酸塩緩衝液４５０μＬ）で１５分間インキュベートした後に、ムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージ（凍結乾燥し、かつ破砕して１mmのスクリーンを通るようにする）２５ｍｇから放出された還元糖を測定することにより、加水分解能をトリプリケートで測定した。粉末化した酵素混合物を蒸留水で２５０倍に希釈したのに対して、液体酵素混合物は２５倍に希釈した。凍結乾燥の前に基質を室温で２時間、蒸留水で洗浄し、可溶性成分を抽出した。基質だけを含有する空試験値を補正に含めた。放出された還元糖は、μｇグルコース当量／ｍｇ添加酵素生成物と表記した。
【００８３】
表１は、タンパク質含有量、酵素活性ならびに全ての酵素混合物をムラサキウマゴヤシ乾草およびトウモロコシサイレージとインキュベーションして放出された還元糖を示している。微生物源、製造法および調製物中で一般に使用される防腐剤またはキャリヤーの多様性ゆえに、タンパク質含有量は、おおむね全ての酵素混合物の間で変化した。酵素活性に関しては、試験された中でRT1197が最も集中しており、測定した１７個の活性のうち、１４個は上位５個の調製物の範囲内に格付けされた。RT1191、RT1192、RT1196およびRT1200は、一般に高い活性を示した。RT1191、RT1192およびRT1197は、セルロースに対して最も活性であった。RT1190、RT1191およびRT1192は、両方の基質から還元糖を放出することに最も成功していた。
【００８４】
酵素活性と、ムラサキウマゴヤシ乾草とトウモロコシサイレージからの還元糖の放出との関係を測定した（表２）。還元糖の放出におけるタンパク質含有量と酵素活性の段階的な回帰は、タンパク質の含有量だけが、ムラサキウマゴヤシ乾草とトウモロコシサイレージの全体の変動のそれぞれ６０％と５９％（Ｐ＜０．００１）を説明していることを示した。α−グルカンに対する活性は、ムラサキウマゴヤシ乾草での変動の２４％（Ｐ＜０．００１）を説明するが、しかし、還元糖の放出との関係はマイナスであった。これとは異なり、トウモロコシサイレージからの還元糖の放出は、オートスペルト小麦キシラン（Ｐ＜０．０３）、ＣＭＣ（Ｐ＜０．０７）および結晶セルロース（Ｐ＜０．０５）に対する活性にプラスに相間したが、樺の木のキシラン（Ｐ＜０．０１）、デンプン（Ｐ＜０．００１）およびｐＮＰ−グルコピラノシド（Ｐ＜０．００３）に対する活性にはマイナスに相間した。全てまとめると、全ての変数（variable）は、トウモロコシサイレージからの還元糖の放出に関して全体の変動の９６％を説明した。タンパク質含有量と、両方の基質からの還元糖の放出との間の強力なプラスの関係は、希釈試料よりも濃縮酵素が良く働くか、または少なくとも速く働き、十分な酵素活性を供給して割り当てられた短い時間で多糖類をより簡単な分子に分解したことを示唆できる。
例２−プロテアーゼ活性を有する酵素混合物に関するin vitroでのルーメン分解アセスメント
幾つかの実験を実施し、ルーメン液の存在で、優れたプロテアーゼ活性を有する酵素混合物を同定し、ムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージに及ぼすそれらの影響を調べた。飼料材料の同じバッチを全ての実験に使用した。ムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージの１ｇＤＭ（±２０ｍｇ、乾燥かつ粉砕して２mmスクリーンを通るようにしたもの）を１２５ｍＬ発酵ボトル（Wheaton Scientific, Millville, NJ）に計量供給した。ムラサキウマゴヤシ乾草は、ＮＤＦとＡＤＦをそれぞれ３８２．０ｇ／ｋｇＤＭ、２５２．４ｇ／ｋｇＤＭを含有したのに対して、トウモロコシサイレージは、ＮＤＦとＡＤＦをそれぞれ４６７．４ｇ／ｋｇＤＭ、２５４．１ｇ／ｋｇＤＭを含有した。
【００８５】
統計分析に関しては、実験１は完全にランダム化した計画であり、固定効果として酵素処理と基質を含んだモデルを用いた。有意な酵素基質相互作用が見つかったので、各フォレージ源について別々に分析を行った（ムラサキウマゴヤシ乾草とトウモロコシサイレージ）。平均の差は、SASのミックス法（SAS Inst. Inc., Cary, NC, 1996）を用いて分析し、PDIFFコマンドを呼び出した。タンパク質含有量、全体の活性および放出された還元糖を、SASの段階的回帰法を用いて各飼料源についての乾物消化率（DMD）値に相間させた。実験２と３からの結果は、酵素を固定効果として、かつ実験実施変動効率として含めたモデルを用い、処理の要因配列で完全にランダム化したデザインとして分析した。特記されない限り、有意差はＰ＜０．０５で定義し、傾向はＰ＜０．１０で議論した。
（ｉ）実験１−酵素混合物添加がムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージの分解に及ぼす影響
ルーメン液とインキュベートする２０時間前に２２個の酵素混合物を１．５ｍｇ／ｇＤＭフォレージの割合で利用した。３種の市販の酵素混合物をプラスのコントロールとして使用した：Ｐ、ＰＤおよびＰＢ。各酵素混合物１２５ｍｇを蒸留水５０ｍＬに溶かし、０．６ｍＬを各ボトルに添加した。処理物をトリプリケートで計量した。３時間後に、１Ｍトランスアコニット酸（Sigma Chemicals, St Louis, MO）を用いてｐＨ６．０に調節した嫌気的緩衝培地（Goering and Van Soest, 1970）４０ｍＬを添加し、ボトルを２５℃で一晩貯蔵した。
【００８６】
トウモロコシサイレージをベースとした混合飼料が与えられ、ルーメンをフィステル形成してある乳牛３頭からルーメン液を回収した。液を回収する４時間前に飼料を供給機から引き出した。連続的なＣＯ２流の元で、ルーメン内容物を４層のチーズクロスを通して濾過し、実験室の予備加熱した魔法瓶フラスコに移した。ルーメン液１０ｍＬを、既に３０℃まで予備加熱しておいた各ボトルに接種した。基質のみ含有、またはルーメン液のみ含有のコントロールをトリプリケートで含めた。ボトルを３９℃で１８時間インキュベートし、分解されていない残査は、予め計量した焼結ガラスるつぼ（多孔率１１００〜１６０μｍ粒度）を通して直ちに濾過した。残査を１１０℃で２４時間乾燥させ、見かけの乾物分解（ＤＭＤ）を測定し、ｇ／ｋｇとして表現した。酵素混合物の格付けは、コントロールに対するＤＭＤの相対的増加に基づいて決定した。
【００８７】
表３は、酵素混合物がムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージに及ぼす影響を示している。ムラサキウマゴヤシ乾草に関しては、ルーメン液と１８時間インキュベートした後に、未処理のコントロールに対して５個の酵素混合物がＤＭＤを増大した（Ｐ＜０．０５）。トウモロコシサイレージに関しては、１１個の酵素混合物がＤＭＤを増大した（Ｐ＜０．０５）。興味深いことに、ムラサキウマゴヤシ乾草に対して最も効果的な酵素混合物は、トウモロコシサイレージに対しては効果的ではなく、酵素−飼料の強い特異性を示唆した。
【００８８】
ルーメン液と１８時間インキュベートした後のムラサキウマゴヤシ乾草とトウモロコシサイレージの酵素活性と、見かけのＤＭＤとの関係を試験した（表４）。タンパク質濃度の段階的な多重回帰、全体の酵素活性、およびin vitroでのルーメンの分解値を有して放出される場合には、プラスの相間（Ｐ＝０．０１）がキシラナーゼ（オートスペルト小麦）とムラサキウマゴヤシＤＭＤの間で観察された。プロテアーゼ活性もムラサキウマゴヤシＤＭＤ（Ｐ＜０．１０）とプラスに関係した。しかし、このモデルにより説明された分散の割合は、４０％未満であった。オートスペルト小麦キシランに対する活性は、トウモロコシサイレージに関しては有意であった（Ｐ＝０．０４）が、相間の特徴はマイナスであった（表４）。しかし、このマイナスの相間が、トウモロコシサイレージにおいて低いキシラナーゼ活性と高ＤＭＤの間の因果関係を示しているのかどうかは不明である。
ｉｉ．実験２−選択したプロテアーゼ酵素混合物で処理または処理していないムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージの乾物分解動力学
実験１の結果に基づいて、ムラサキウマゴヤシの更なる評価にRT1184とRT1197を選択し、トウモロコシサイレージの研究にRT1181とRT1183を選択した。In vitroでのDaisy II発酵系（ANKOM Corp., Fairport, NY）を使用して、これらの酵素混合物で処理した飼料のＤＭと繊維分解の速度と程度を試験した。ムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージ５００ｍｇ（±２０ｍｇ）を人工繊維バッグ（♯Ｆ57,ANKOM Corp.）に計量供給し、次にこれを熱密封した。６個の空の補正用バッグを含む３０個のバッグのグループを緩衝液（ｐＨ６．０）１５０ｍＬと一緒にプラスチック容器中に直立に置いた。予備処理に使用した緩衝液は、還元溶液を添加していないGoering and Van Soest（1970）によるものである。ルーメン液を添加する２０時間前に、蒸留水１ｍＬ中に溶かした酵素を適切な速度（１．５ｍＬ／ｇフォレージＤＭ）で容器に添加した。混合物をゆっくり振盪し、適切に混合し、室温（２４℃）で貯蔵した。実験１に記載したようにルーメン液を３頭のウシから回収した。
【００８９】
次にルーメン液４００ｍＬを嫌気緩衝液（ｐＨ６．０に調節）１６００ｍＬと一緒に各ANKOM発酵壺に添加した。バッグ、プラスチック容器中の全液体内容物を発酵壺に添加し、３９℃で９６時間発酵が続くようにした。バッグをインキュベーションの０、６、１８、３０、４８および９６時間において４重に（時点ごとに１個の空のバッグをプラス）除き、冷たい水道水で過剰の流水が澄むまで洗浄した。バッグを５５℃で４８時間乾燥させ、ＤＭＤを測定した。Van Soest  et al.（1991）によるANKOM２００繊維分析系（ANKOM Corp., Fairport, NY）を用いて、繊維（NDFとADF）分解を同じバッグで連続的に測定した。ＮＤＦ分析には、α−アミラーゼを含めたが、しかし亜硫酸ナトリウムは除いた。各分析の後、バッグをＤＭＤ測定で記載したように乾燥させた。実験を２回繰り返した。
【００９０】
表５には、酵素混合物で処理または処理していないムラサキウマゴヤシ乾草またはトウモロコシサイレージの乾物の分解動力学が示されている。RT1184は、６時間後（＋９．０％）にムラサキウマゴヤシ乾草の分解を増大し（Ｐ＜０．０５）、０時間（＋８．８％）での分解を改善する傾向があった（Ｐ＜０．１０）。ムラサキウマゴヤシのどの処理についてもインキュベーションの６時間後に差が検出されなかった。トウモロコシサイレージでは、RT1181がインキュベーションの６時間後にＤＭＤを増大し（Ｐ＜０．０５）、３０時間でＤＭＤを増大する傾向があった（Ｐ＜０．１０）。さらに、RT1181とRT1183は４８時間でＤＭＤを増大した（Ｐ＜０．０５）。意外にも、後者では酵素は分解の速度を高めるが、程度は高めないという一般的な一致を生じた（Colombatto, 2000; Beauchemin et al., 2001）。しかし、４８時間の時点以降でも相当な分解がなお行われていたので、４８時間でのＤＭＤはトウモロコシサイレージにとって終点ではなかった。（１０〜１４パーセント単位）。ムラサキウマゴヤシ乾草で観察されたものとは異なって、活発な分解は３０〜４８時間のインキュベーションの間でも、なお続いているようであった。
【００９１】
表６には、ムラサキウマゴヤシ乾草の繊維（NDF、ADFおよびヘミセルロース）分解動力学が示されている。RT1184は６時間のインキュベーションでムラサキウマゴヤシ乾草のヘミセルロース分解を殆ど１００％増大した（Ｐ＜０．０５）のに対して、同じ酵素処理でのインキュベーションの６時間後と１８時間後に、NDFで相当な大きさの増大（有意ではない）が観察された。これとは異なり、RT1197はコントロールに関して差を示さなかった。殆どの入手可能な繊維が４８時間までに分解され、酵素が単に分解速度を高めたことが明確である。６時間後のヘミセルロース分解の増大と組合わさって、繊維フラクションが０時間で殆ど分解されていないことは、分解への物理的バリアを提供していた成分をRT1184が除去したことを強く示唆している。RT1184が主にプロテアーゼ活性を有することは、タンパク質が除去された成分であることを示唆しているのであろう。
【００９２】
表７には、トウモロコシサイレージの繊維（NDF、ADFおよびヘミセルロース）分解動力学が示されている。RT1181は、４８時間のインキュベーションの時点までNDFとADF分解を増大し、１８時間と４８時間での有意性（Ｐ＜０．０５）を達成した。ヘミセルロース分解は同じ酵素により６時間のインキュベーションで増大し（Ｐ＜０．０５）、１８時間（±１７％）と４８時間（１１％）でのコントロールよりも高い傾向（Ｐ＜０．１０）があった。ムラサキウマゴヤシ乾草とは異なり、コントロールといずれかの酵素処理との間で“予備摂取（pre-ingestive）”効果（すなわち、０時間の差）の兆候はなかった。この結果は、トウモロコシサイレージでは、酵素混合物がルーメンレベルでのみ働いていることを示唆している。ムラサキウマゴヤシは、おそらく細胞壁への小さな構造的変化により、予備処理期間によって得をしているように見える（Nsereko et al., 2000）。一方で、トウモロコシサイレージでの状況は不明確である。よって、餌付け前の酵素−飼料相互作用の最適な時間の長さは、飼料の種類によるのであろう。
【００９３】
表８には、繊維フラクションに起因するＤＭＤにおける増大の割合を測定するために、非繊維フラクションの分解プロフィールが示されている。RT1184をムラサキウマゴヤシに添加した時に、初めの１８時間のインキュベーションの際に繊維分解は約三分の一のＤＭＤを示した。RT1181をトウモロコシサイレージに添加した時には、繊維分解は分解における全体の増大の少なくとも５０％に寄与し、４８時間で見られたＤＭＤの著しい増大は、繊維分解の増大により十分（８６．４％）に説明される。この結果は、RT1181とRT1184が異なる作用様式を有していることを裏付けている。RT1181（トリコデルマ属longibrachiatum由来）は、in vitroでのルーメン系で、その作用を繊維に集中しているようである。バチルス属由来のRT1184は、主に非繊維フラクション（おそらくタンパク質）に作用しており、０時間でのインキュベーションにおいて効果的な証拠があり、微生物のコロニー化とムラサキウマゴヤシの分解を遅らせる構造的バリアの除去を示唆している。
（iii）実験３−選択したプロテアーゼ酵素混合物が、組み合わせた形、またはミックスフォレージに及ぼす影響
実験２は、RT1181とRT1184が、それぞれトウモロコシサイレージとムラサキウマゴヤシ乾草を効果的に分解したことを示したので、発明者らはこれらの酵素混合物がミックスフォレージ（ムラサキウマゴヤシ乾草とトウモロコシサイレージ１：１、w/w）の場合、または酵素混合物が組合わさった場合（“8184”）において効果的であるかどうかを試験した。方法は実験２で記載されているものと同じであった。処理グループは次の通りである：
１．コントロール（酵素無し）
２．ＲＴ１１８１のみ
３．ＲＴ１１８４のみ
４．２個の最終的なレベルで、RT1181とRT1184の組合せ（１：１, v/v）、０．５（低8184）または１．５（高8184）ｍＬ／ｇフォレージＤＭ
表９に記載されているように、６時間と１８時間のインキュベーションで、RT1184はムラサキウマゴヤシ−トウモロコシサイレージの組合せのＤＭＤを増大した（Ｐ＜０．０５）。０時間でのＤＭＤも増大させ（Ｐ＜０．０５）、“予備摂取”効果の存在を示している。さらに、コントロールに関する改善の度合いは、０時間と１８時間の間で全く一定に保たれ、これは、０時間での改善は最も簡単に消化可能なフラクションを犠牲にしても達成されなかったことを示唆している（すなわち、初めの１２時間のインキュベーション以内で分解された）。これは、６時間または１８時間での分解能がコントロールの分解能と等しくなった場合であると考えられる。得られた証拠は、インキュベーション１８時間と３０時間の間に分解速度がゆっくりなり始めたことを示唆し、繊維フラクションがin vitroでインキュベートした時にルーメン微生物により攻撃された時間と一致している。
【００９４】
RT1184処理における繊維分解の分析は、ＤＭＤの増加が６時間でＮＤＦ分解の増加（Ｐ＜０．０５）、１８時間でＮＤＦ分解の増大に対する傾向（Ｐ＜０．１０）、そして６時間と１８時間でヘミセルロース分解の増大を伴ったことを示している（表１０）。
【００９５】
RT1181とRT1184の組合せは、コントロールとRT1184の間の中間値を示している（表９）。高8184での処理は、６時間のインキュベーションでＤＭＤを増大する傾向（Ｐ＜０．１０）を示し、ＮＤＦとヘミセルロース分解において増大（Ｐ＜０．０５）を伴った。RT1181がＤＭＤまたは繊維分解を著しく増大できなかったので、ムラサキウマゴヤシ−トウモロコシの組合せで見られた全ての増大は、RT1184の作用だけによるものと推測するのが妥当である。さらに、RT1184の投与速度が繊維分解の効果を失うことなく半分になったと思われる。
【００９６】
特に興味深いことは、RT1184およびRT1181とRT1184の２つの組合せが、ＤＭＤとＮＤＦ両方の終点（９６時間）の分解を増大したことである（Ｐ＜０．０５）。このことは、一般に酵素をフォレージに添加した場合に観察されたものとは異なる（Yang et al., 1999; Colombatto, 2000）。ＤＭＤの増大が生物学的に重要ではないように見えるが、ＮＤＦ分解で達成された改善の程度（それぞれRT1184、低8184、高8184について、＋2.0、＋3.5および＋3.5%）は促進し、特にRT1184と高RT8184を含めた処理の場合に、殆ど全てのインキュベーション時間でより高いＮＤＦ分解値を示した。
【００９７】
非繊維フラクションの分解プロフィールを考えた時に、初めの１８時間のインキュベーションの間にRT1184で観察された増大は、繊維フラクションでの増大だけに寄与しただけではない。なぜなら、後者のフラクションはＤＭＤでの増大の２５〜５０％を示したからである。これらの結果は、実験２のものと一致し、RT1184が主に非繊維フラクションに作用し、ミックスフォレージならびに単なるムラサキウマゴヤシ乾草のみに効果的であったことを示している。
実験３−選択したプロテアーゼ酵素混合物が酵素活性、微生物数および混合飼料の繊維分解に及ぼす影響
選択したプロテアーゼ酵素混合物が混合飼料に及ぼす影響を試験した。さらに、２つの発酵ｐＨ領域（５．４〜６．０と６．０〜６．７）を人工唾液の濃度を調節することにより維持した。酵素混合物が食餌の消化率を改善するかどうか、かつ改善の程度が高ｐＨよりも低ｐＨで低くなるかを調査した。
ａ．飼料材料の製造
混合飼料（ＴＭＲ）は、ムラサキウマゴヤシ乾草３０％、トウモロコシサイレージ３０％およびロール処理したトウモロコシ穀粒（ＤＭベース）４０％からなっており、これは中期から後期の授乳期に乳牛に与えられる通常の市販の食餌である。
【００９８】
フォレージ：濃厚飼料の比は６０：４０であった。ムラサキウマゴヤシ乾草をロール処理して、４．５mmのスクリーンを通るようにした（Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA）。一方で、ロール処理したトウモロコシはKnifetec 1095試料ミル（Fross Tecator, Hoeganaes, Sweden）中で２秒間粉砕して、穀粒を部分的に砕いた。両方の基質を使用するまで室温で貯蔵した。レスブリッジ研究センター（Lethbridge, AB）にあるバンカーサイロ内の色々な部位からトウモロコシサイレージの見本を取り、使用するまで−４０℃で貯蔵した。必要な場合には、サイレージの試料（飼育３日間分に十分な量）を解凍し、Knifetec 1095試料ミル（Fross Tecator, Hoeganaes, Sweden）を用いて新たに１０秒間粉砕した。粉砕試料を４℃で最大３日間貯蔵した。各飼料成分を計量することにより、１Ｌプラスチック容器中でＴＭＲを３日ごとに製造した。含有物を完全に混合し、４℃で貯蔵した。表１１には、各飼料材料とＴＭＲの化学組成がまとめられている。
ｂ．酵素混合物とプロテアーゼ活性の測定
市販の酵素混合物RT1184をこの研究に使用した。酵素混合物はバチルス属licheniformisから由来し、無視できる程に微量のセルロース、ヘミセルロースおよびα−アミラーゼ活性を有する（Colombatto et al., 2003）。
【００９９】
基質として０．４％（wt/vol）アゾカゼインを用いて、ｐＨ６．０、３９℃でプロテアーゼ活性を測定した（Bhat and Wood, 1989）。簡単に説明すると、０．５ｍＬアゾカゼイン、０．５ｍＬクエン酸塩−リン酸塩緩衝液および２５μＬ酵素（蒸留水中１：１００に希釈）含有の反応混合物を３９℃で１５分間インキュベートした。未加水分解のアゾカゼインを、２５％（wt/vol）トリクロロ酢酸８０μＬの添加により沈殿させ、次に２０４０×ｇで室温で１０分間遠心分離することにより除去した。０．５ｍＬの上澄液試料を０．５ＭＮａＯＨ０．５ｍＬと混合し、４２０nmでの吸光度を空試験値の試薬に対して読んだ。酵素（基質なし）と基質（酵素なし）の空試験値も補正に含んだ。プロテアーゼ活性の１単位は、同じ条件下でアッセイされた標準のプロテアーゼ１０μｇの作用により、４２０nmで測定した吸光度として定義した（Streptomyces griseus, Type XIV, Sigma Chemicals, St Louis, MO）。酵素混合物のプロテアーゼ活性は、次のように計算して４５０７単位／ｍＬ（ＳＤ＝１６１．０，ｎ＝５）であると決定された：
標準物１０μｇは０．２７８の吸光度を生じ、酵素混合物の１：１００希釈水溶液２５μＬは０．３１３の吸光度を生じる。
【０１００】
従って、１プロテアーゼ単位が０．２７８である場合は、溶液は（０．３１３／０．２７８）単位＝１．１２６単位を含有する。これを１ｍＬ当たりの単位に変換するために、希釈倍率（１００）と添加量（２５μＬ）を使用した：１．１２６×４０×１００＝４．５０７単位／ｍＬ未希釈酵素混合物。
【０１０１】
ｃ．In vitroでのルーメン分解アセスメント
３頭の授乳期の乳牛を実験で使用した。カナダ動物管理協会（Canadian Council on Animal Care）(1993)により確立されたガイドラインに従ってウシを飼い、ルーメンをフィステル形成した。ウシには発酵槽に用意した食餌と同類のものを与えた。
【０１０２】
４単位の二系統流れ連続培養系（Hoover et al., 1989に記載されているのと同等）を４つの連続的期間で使用した。餌付けの２時間後にルーメン液接種物を動物から回収した。ルーメンの内容物を酸素不含のＣＯ２流のもとでワーリングブレンダー（Waring Product Division, New Hartford, CT）中で１分間ホモジナイズした。次にホモジネートを４層のチーズクロスを通して濾過し、実験室の予熱した魔法瓶フラスコに移した。１５ｍＬ／分の速度でＣＯ２を注入して嫌気条件を保持した。人工唾液を発酵槽に連続的に注入した（McDougall, 1948）。各期間の間に、２つの発酵槽では通常の濃度で唾液を用いたのに対して、他の２つの発酵槽には蒸留水中で希釈して通常の濃度の６０％に等しい濃度にした唾液を用いた。人工唾液は、循環窒素をシミュレートするための尿素０．２ｇ／Ｌ、およびアンモニア１５Ｎ０．０１５ｇ（（１５ＮＨ４）２ＳＯ４、１０．６％原子パーセント１５Ｎ；Isotec, Miamisburg, OH）を含有した。各発酵槽に添加した１５Ｎの１日の量は、約１．５ｍｇであった。液体と固体の希釈速度は、それぞれ１０％と４．５％／時間に一定に保持した。全部で１日当たりＤＭ８０ｇを０９００時と２１００時で２つの等しい餌に与えた。４つの処理グループは以下の通りであった：
【０１０３】
【表１】
2006519597.tif 000002
【０１０４】
酵素混合物を利用するために、酵素混合物６０μＬを蒸留水４４０μＬに溶かし、２５０ｍＬプラスチック容器中のＴＭＲ（ＤＭベース）４０ｇに加え、反転により混合した。コントロールの処理には、蒸留水５００μＬを与えた。酵素混合物と飼料材料の相互作用の期間は、４℃で１２〜２４時間に及んだ。
【０１０５】
実験のデザインは、４つの９日間の期間（それぞれ６日間の適用と３日間の試料抽出から成る）を有する４×４ラテン方陣であった。試料抽出の日に、回収容器を４℃に保ち、微生物の活動を妨げた。固体および液体の流出液を混合した。２５０ｍＬの試料を４℃、１６０００×ｇで４０分間遠心分離し、流出液ＤＭを測定した（すなわち、未消化部分）。２番目の５００ｍＬ試料を４℃、１６０００×ｇで４０分間遠心分離し、沈殿物が得られ、これを５５℃で乾燥し、灰、窒素、ＮＤＦ、ＡＤＦ、酸性デタージェントリグニン（ＡＤＬ）およびデンプンについて分析した。
【０１０６】
各試料抽出期間の１日と２日目に、発酵槽に挿入したｐＨプローブを用いて発酵槽のｐＨを０８００〜２１００時まで毎時間測定した。朝の給餌の直前に濾液から液体試料が得られ、次に給餌の２時間、５時間、８時間および１２時間後にアンモニアと揮発性脂肪酸（VFA）を測定した。アンモニア測定に関しては、濾過した液体の５ｍＬのサブ試料を１％硫酸（v/v）１ｍＬで酸性化した。他の５ｍＬサブ試料は、VFA分析用に２５％メタリン酸（w/v）１ｍＬで酸性化した。試料を凍結して分析するまで−４０℃で貯蔵した。朝の給餌の６時間後（すなわち、１５００時）に、ガス試料をガス組成物（ＣＯ２およびＣＨ４）の分析用に取った。同時に、発酵槽からのルーメン液の２．０ｍＬ試料を除去し、全体およびセルロース分解細菌を定量化した。付加的な試料１．５ｍＬを酵素活性の測定用に得た。
【０１０７】
各期間の最終日に細菌を発酵槽から単離した。発酵槽の内容物をワーリングブレンダー（Waring Product Division, New Hatford, CT）を用いて遅い速度で１分間ホモジナイズし、固相細菌を取り除いた。次に４層のチーズクロスを通して濾過した。濾液を４℃、１１９６×ｇで１５分間遠心分離して飼料粒子と原生動物を除去し、次に４℃、１６０００×ｇで４０分間遠心分離して、細菌ペレットを単離した。ペレットを凍結乾燥し、乳鉢と乳棒を用いて更に粉砕し、次に１５Ｎ富化について分析した。ＤＭ、ＯＭ、  Ｎの見かけの消化と真の消化（すなわち、微生物部分により補正）を計算した。ＮＤＦ、ＡＤＦ、ＡＤＬおよびデンプンの消化を測定した。
ｉ．統計学的分析
ｐＨ、酵素およびそれらの相互作用を固定効果として含むモデルを使用し、SASのミックス法（SAS Inst. Inc., Cary, NC）を用いてデータを分析した。発酵槽と期限を変動効率として考えた。特記されない限り、平均間の差は、ｐ＜０．０５での有意性を定義付けたのに対して、傾向はＰ＜０．１５で論じた。
ｉｉ．細菌計数
全体の生存可能な微生物を定量化するために、０．１％ペプトン、０．１％リザズリン、０．０５％システインおよび０．３５％Ｎａ２ＣＯ３含有培地（Brynt and Burkey, 1953）を用いて、濾過した発酵槽内容物の嫌気的連続希釈液（１０−６〜１０−９）を作った。各希釈液をトリプリケートで接種し、セルビオース、キシラン、デンプンおよびグルコース（０．５ｍｇ／ｍＬずつ）含有の別々の回転培養管に入れた。生存可能なコロニーを３９℃でのインキュベーションの４８時間後に数えた。３９℃でのインキュベーションの１４日後に、唯一の炭水化物源として、ワットマンNo.1濾紙を用いて、各希釈液（１０−１〜１０−４） を有するトリプリケートチューブ中でセルロース分解細菌を数えた。最も起こりそうな数の方法を使用した（Garthright, 1998）。統計分析の前に、微生物データにログ変換を行いエラーの分布を正規化した（Dehority et al., 1989）。
ｉｉｉ．酵素活性のアッセイ
Colombatto, et al.,2003に従って、液相の酵素活性を測定した。エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）、エキソグルカナーゼ（EC3.2.1.91）、β−Ｄ−グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）、キシラナーゼ（EC3.2.1.8）、β−Ｄ−キシロシダーゼ（EC3.2.1.37）、プロテアーゼおよびα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（EC3.2.1.55）活性を測定した。
キシラナーゼとエンドグルカナーゼ
１０ｍｇ／ｍＬの濃度でオートスペルト小麦キシランと、中粘度のカルボキシメチルセルロース（Sigma Chemicals, St Louis, MO）をそれぞれキシラナーゼとエンドグルカナーゼ用の基質として使用した。酵素４０μＬを基質１ｍＬ、緩衝液０．９０ｍＬ（０．１Ｍクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０）および蒸留水０．０６ｍＬとインキュベートした。インキュベーションを３９℃で６０分（キシラナーゼ）または１２０分（エンドグルカナーゼ）トリプリケートで行った。ジニトロサリチル酸試薬を添加することにより酵素反応を中断し、MRX-HDプレートリーダーを用いて吸光度を５３０nmで読んだ（Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA）。同じ条件下で生じた標準のキシロースまたはグルコース曲線を用いて吸光度の値を還元糖に変換した。空試験値である基質だけ（すなわち、酵素なし）および酵素だけ（すなわち、基質なし）を含めて、それぞれ基質自己分解と酵素試料中に存在する糖を補正した。活性の１単位は、これらのアッセイ条件下で、１分当たりに１nmolのキシロースまたはグルコース当量を放出するのに必要な酵素量として定義した。
プロテアーゼ活性
インキュベーションが１２０分であったことを除いて、上記のようなアゾカゼインの０．４％（w/v）溶液を用いてプロテアーゼ活性をｐＨ６．８でアッセイし、試料４０μＬをインキュベートした。プロテアーゼ活性の１単位は、同じ条件下であると同時に各インキュベーションシリーズも同じ条件でアッセイした標準のプロテアーゼ（Streptomyces griseus, Type XIV, Sigma Chemicals, St Louis, MO）１μｇの作用により、４２０nmで測定した吸光度として定義した。種々のアッセイの長さゆえに１μｇを標準として使用した。１０μｇを使用すると、吸光度が高すぎて光学濃度の直線範囲内に入ることになっていたと考えられる。
アリール−グリコシダーゼ活性
ｐ−ニトロフェニル（p-ＮＰ）誘導体の原液（１mM）を使用した。基質は、ｐ−ＮＰ−β−Ｄ−セロビオシド、ｐ−ＮＰ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ＮＰ−β−Ｄ−キシロピラノシドおよびｐ−ＮＰ−α−Ｌ−アラビノフラノシド（Sigma Chemicals, St Louis, MO）であった。未希釈の酵素試料（２０μＬ）を相応の基質（緩衝液ｐＨ６．０中で製造）８０μＬと３９℃で１８０分インキュベートした。反応は、グリシン−NaOH緩衝液（０．４Ｍ、ｐＨ１０．８）の１体積の添加により中断した。ｐ−ニトロフェノールの放出は、４２０nmで比色により測定した。酵素活性の１単位は、これらのアッセイ条件下で１分あたり、１nmolのｐ−ニトロフェノールを放出するのに必要な酵素量として定義した。
ｉｖ．化学分析
次の化学分析を実施した：
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
【表３】
2006519597.tif 000004
【０１１０】
図１は、唾液濃度を変えることにより２つの異なるｐＨプロフィールを得たｐＨ範囲を示している。表１２は、ｐＨと酵素混合物が全体の生存可能な細菌とセルロース分解細菌に及ぼす影響を示している。全体の生存可能な細菌の数は、低ｐＨで増大し（Ｐ＜０．０３）、酵素混合物の添加に伴って増大した（Ｐ＜０．１３）。セルロース分解細菌は、低ｐＨで減少したが（Ｐ＜０．０２）、酵素混合物により作用を受けないままであった（Ｐ＞０．８８）。
【０１１１】
表１３は、餌付け６時間後でのｐＨと酵素混合物の影響を示している。エンドグルカナーゼとβ−Ｄ−キシロシダーゼ活性は、低ｐＨでは低かった（Ｐ＜０．０５）のに対して、エキソグルカナーゼ活性は減少した（Ｐ＜０．１１）。これとは異なり、主としてＬＴグループにより示される活性が増大した理由で、プロテアーゼ活性は低ｐＨでより高かった（Ｐ＜０．００１）。酵素混合物はキシラナーゼ、エンドグルカナーゼおよびプロテアーゼ活性（Ｐ＜０．０２）を増大させ、β−Ｄ−グルコシダーゼ（Ｐ＜０．０７）とエキソグルカナーゼ（Ｐ＜０．１２）を増大させた。酵素混合物が、この活性を高ｐＨで増大させたが、低ｐＨで低下させたようであったので、有意のｐＨ×酵素相互作用（Ｐ＜０．０５）がβ−Ｄ−キシロシダーゼで検出された。プロテアーゼ活性に関して、有意なｐＨ×酵素混合物の相互作用は、上記のようなＬＴグループにより示される活性の大きな増大によるものであった。α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼだけがｐＨまたは酵素混合物により影響されなかった。
【０１１２】
表１４には、ｐＨと酵素混合物がＤＭ、ＯＭ、ＮＤＦ、ＡＤＦおよびデンプンに及ぼす影響が示されている。真のＯＭ消化率は、低ｐＨで低かった（Ｐ＜０．０５）；しかし、真のＤＭ消化率は僅かに低い傾向があるだけであった（Ｐ＜０．０７）。酵素混合物は真のＤＭ（Ｐ＞０．３６）またはＯＭ（Ｐ＞０．２７）消化率に影響を与えなかった。ＮＤＦとＡＤＦ消化は、低ｐＨ（Ｐ＜０．００１）では大幅に減少したのに対して、酵素混合物はＮＤＦ消化率を上げた（Ｐ＜０．００５）。酵素混合物はヘミセルロース消化率を上げたが（Ｐ＜０．００１）、セルロース消化率に影響を与えなかった。真の粗タンパク質（ＣＰ）とデンプン消化は処理によって影響されなかった（Ｐ＞０．１５）。
【０１１３】
表１５には、ｐＨと酵素混合物がＶＦＡ生産、乳酸およびガス濃度に及ぼす影響が示されている。全体のＶＦＡ生産は低ｐＨで低かった（Ｐ＜０．００６）。分枝鎖の揮発性脂肪酸（ＢＣＶＦＡ）の生産も低ｐＨで減少を示した（Ｐ＜０．００１）。高ｐＨは、アセテート、ブチレート、イソブチレートおよびイソバレレートの割合を増大し（Ｐ＜０．０１）、カプロエートは増大の傾向を示した（Ｐ＜０．１４）。しかし、高ｐＨはプロピオネートとバレエートの割合を減少した（Ｐ＜０．０１）。アセテート：プロピオネートの割合は、高ｐＨよりも低ｐＨで低かった（Ｐ＜０．００１）。酵素混合物は、ＶＦＡに何の影響も与えなかった（Ｐ＞０．２０）。乳酸のレベルは低く、おそらく生物学的に意味は無いが、高ｐＨでは高いレベルになる傾向が観察された（Ｐ＜０．１０）。全体のガス組成物に関しては、メタンの割合が低ｐＨにより大幅に減少したのに対して（Ｐ＜０．００１）、ＣＯ２の割合は、高ｐＨでは高かった（Ｐ＜０．０４）。
【０１１４】
表１６には、ｐＨと酵素混合物がルーメン微生物の窒素代謝に及ぼす影響が示されている。全体のＮ流は、高ｐＨで高（Ｐ＜０．１５）かったが、酵素混合物により減少した（Ｐ＜０．０８）。細菌のＮ流も食餌のＮ流も処理により影響されなかった（Ｐ＞０．１５）。アンモニアレベルは、著しく低く、高ｐＨでは高かった（Ｐ＜０．００３）。結果として、微生物タンパク質合成の効率は、低ｐＨよりも高ｐＨで高くなる傾向があった（Ｐ＜０．１０）。
【０１１５】
プロテアーゼ酵素混合物の添加は繊維（殆どがヘミセルロース）分解を著しく増大させ（未処理のコントロールと比較して４３％まで）、乾物およびタンパク質分解の数値的増大を伴った（それぞれ、４．５％と５．５％）。これらの増大は、全体の微生物数の増大およびそれらの分泌酵素活性の増大と同時に起こっていた。全体として、このプロテアーゼの添加がフォレージ中に存在する構造的バリアを除去し、ルーメン微生物によって基質への迅速なアクセスを可能にするので、このことが結果として速い微生物増殖と基質分解を生じるという仮定とこれらの結果は一致する。メタン生産は、低ｐＨで減少したが、プロテアーゼ酵素混合物の添加によっては影響されなかった。このような結果は、反芻動物により環境に有害なメタン生産を増大することなく、プロテアーゼ酵素混合物が繊維消化率の増大に有益であることを示している。さらに、プロテアーゼ酵素混合物の効果は、ルーメン内の特徴であるより高いｐＨ条件で大きい。
例４−プロテアーゼ酵素混合物のプロテアーゼの種類の決定
例３のプロテアーゼ酵素混合物（RT1184）をさらに評価して、混合物内のプロテアーゼの種類を決定した。プロテアーゼ活性のアッセイは、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF, セリンプロテアーゼの阻害剤）、ＥＤＴＡ（金属プロテアーゼの阻害剤）およびｐ−クロロメルクリベンゾエート（CMB, システインプロテアーゼの阻害剤）のような特異的なプロテアーゼ阻害剤を添加するか、または添加せずに実施した。混合物中に存在するタンパク質の分子サイズを、SDS−PAGE法を用いて解決した。作用に重要であるフラクションが非耐熱性であるかどうかを決定するために、天然の形（すなわち、そのままの形）またはオートクレーブした後の（すなわち、酵素を１２１℃で高圧に少なくとも３０分間さらした）酵素両方を用いてin vitroでの分解の研究を行った。同様に、用量−反応研究を実施し、分解パラメーターに対する添加する増分の酵素レベルの影響を試験した。最後に、ルーメン液とのインキュベーション０時間（すなわち、ルーメン液を添加する前の前処理）とインキュベーション１８時間からの試料を電子顕微鏡法を用いて定量的に分析した。
【０１１６】
阻害剤研究は、プロテアーゼの１つのタイプだけであるセリンプロテアーゼが存在することを示した。１ｍＭジソジウムＥＤＴＡまたは０．１ｍＭ  ＣＭＢの添加がタンパク質分解作用を阻害しなかったのに対して、３ｍＭのＰＭＳＦはプロテアーゼを３６％阻害したので、酵素混合物中にセリンプロテアーゼは存在しているが、金属プロテアーゼが不在であることを示している。SDS-PAGEにより判断して、酵素混合物は３２kDaの主要バンドを他の約２２kDaと１０kDaというより小さなバンドと一緒に含んでいた。
【０１１７】
In vitroでのルーメン分解アセスメントは、ルーメン液の添加２時間前に１．５μＬ／ｇＤＭで添加した場合に、酵素混合物はムラサキウマゴヤシ乾草のＤＭ分解（２２時間のインキュベーション）を１１．８％まで増大して効果的であることを立証した。さらに、分解は、投与速度の増大（１０μＬ／ｇまで）に伴って２１％まで増大したが、しかし相互関係は二次であった（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．８５）。オートクレーブ処理は、この可能性を壊し、以前に天然の酵素（すなわち、オートクレーブしていない物）で観察された繊維分解における全てのプラスの効果を取り去った。このことは、活性成分が非耐熱性であることを示している。
【０１１８】
顕微鏡試験は、酵素混合物がムラサキウマゴヤシ乾草の分解エリアを、ルーメン液とのインキュベーションの１８時間後に増し、幾つかの効果は０時間でも観察された（すなわち、前処理効果）。プロテアーゼ混合物がフォレージ中に存在する構造的バリアを除去し、ルーメン微生物によってより迅速なコロニー化と繊維分解を可能にしたと推測される。
【０１１９】
これらの結果は、有効成分が非耐熱性であり、ほぼプロテアーゼ活性であることを示唆している。付加的なin vitroでの研究は、市販の精製したセリンプロテアーゼ源（サブチリシン、Sigma Chemicals社製, St. Louis, MO）をこの酵素混合物に対する比較として使用して実施した。投与速度を調節して、この酵素混合物による活性と似たプロテアーゼ活性を提供できるようにした。精製したサブチリシンが極めて似た方法でこの酵素混合物に働くことが示された。さらに、繊維消化の増大で観察されたこの特異的なタイプのプロテアーゼの役割を示唆している。
【０１２０】
よって、発明者らは、サブチリシンの様な特徴を有する特異的なプロテアーゼを一連の反芻動物の飼料に添加する場合に、繊維消化が増大することを見いだした。この効果は、タンパク質消化の増大と同時に生じるので、飼料中に存在する構造的バリア（おそらくタンパク質を起源）の除去から由来し、このようにルーメン微生物により基質への迅速なアクセスを可能にしていると考えられている。観察された繊維消化の増大の大きさから、反芻動物の食餌へのプロテアーゼの添加が、この食餌を与えられた動物の成長速度または乳生産を改善することが予測される。
例５−混合飼料への選択したプロテアーゼ酵素混合物の添加が、栄養素の消化率に及ぼす影響
乳牛に与えた混合飼料（ＴＭＲ）へ選択したプロテアーゼ酵素混合物を添加する影響を試験した。さらに、全消化管中の栄養素の消化率における影響を査定した。
ａ．動物と実験計画
８頭の多重産の授乳期ホルスタイン牛を使用し、４頭のウシに外科的にルーメンカニューレを装着した。ウシは、実験の開始時に平均して６３±３２（平均±ＳＤ）日間乳が出る状態であった。平均体重は実験の開始時に６９０±４４（平均±ＳＤ）ｋｇであり、実験の終了時に６８５±４０（平均±ＳＤ）ｋｇであった。
【０１２１】
実験計画は、二重の４×４ラテン方陣であり、各期間は２１日間続いた（処理の適合に１０日間、データ収集に１１日間）。ウシがカニューレ装着をされているかどうかにより、ウシを方陣に割り当て、２つの方陣を同時に行った。各期間の間に、ウシは４種の食餌のうち１つを与えられた。処理を２×２の階乗として整えた（酵素補足が有りと無しで、食餌において２つのレベルのフォレージ）。
ｂ．食餌と餌付け材料の調製
高いレベルのフォレージまたは低いレベルのフォレージを含有している２種類の食餌を使用した。高いフォレージ食餌は、６０％フォレージを含有したのに対して、低フォレージ食餌は、３４％フォレージを含有した（ＤＭベース）。各食餌を外因性プロテアーゼ酵素が有り又は無しで与え、以下のような４つの処理グループを形成した。
【０１２２】
【表４】
2006519597.tif 000005
【０１２３】
食餌のフォレージ成分は、ムラサキウマゴヤシ乾草とオオムギサイレージの混合物から成っていた。濃厚飼料は、スチーム−ロール処理したオオムギ、ドライ−ロール処理したトウモロコシおよびペレット化したサプリメントを含有していた。Cornell-Penn-Miner System（CPM Dairy, Version 2.0）を使用して食餌を調製し、かつバランスをとって十分に代謝可能なエネルギーならびにタンパク質、ビタミンおよびミネラルを供給し、脂質３．５％とタンパク質３．３％を有する乳４０ｋｇ／日を生産した。表１７には、食餌の化学組成が示されている。
ｃ．選択したプロテアーゼ酵素混合物
この研究で使用した酵素生成物は、市販のプロテアーゼ（Protex 6Lσ, Genencor International, Rochester, NY）であった。これを１．２５ｍｌ／食餌ＤＭｋｇの速度で加えた。この市販の酵素生成物は、食品グループの酵素に関する最近の規格に適合し、一般に安全であると認識されているバチルス属licheniformisの系統から由来するプロテアーゼ活性により特徴付けられている。この酵素生成物を製造時に濃厚飼料に噴霧した。次に、濃厚飼料をフォレージと毎日混合してＴＭＲを製造した。
ｄ．動物の飼育と管理
少なくとも１０％の日常の飼料の拒否を含めて、無制限に摂取させる食餌をＴＭＲとして与えた。全てのウシに別個に１日３回与え、水飲み場に自由に接近させた。カナダ動物管理協会の指導方針（Ottawa, ON, Canada）に従ってウシを世話した。ゴムマットレスを設置したタイストールの中で、かんな屑を敷いてウシ飼い、一日に２回搾乳した。日中の運動のためにウシを家畜の囲い地に出した。
ｅ．飼料の試料抽出
与えた飼料と拒否された飼料を毎日測定し、記録した。オオムギサイレージ、細断したムラサキウマゴヤシ乾草、濃厚飼料を毎週試料抽出して、ＤＭ含有量を決定した。ＤＭ含有量の変化を占めるように食餌を調節した。与えたＴＭＲと拒否されたＴＭＲの試料を毎日収集し、５５℃で乾燥させ、１mmのスクリーン（標準モデル４； Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA）を通るように粉砕し、引き続く分析用に貯蔵した。
ｆ．消化率
２ｇＹｂ／日／ウシの摂取を達成するために、ペレット化した濃厚飼料の部分に、８．７ｇＹｂＣｌ３／日／ウシの速度で直接に置いたＹｂＣｌ３（Rhone-Poulenc, Inc., Shelton, CT）を用いて、栄養素の見かけの全消化管の消化を測定した。６〜１２日目の日中の様々な時間で全てのウシから糞便試料（直腸からの）を回収した。試料を、各ウシの試料抽出時間にわたり混合し、５５℃で乾燥させ、１mmスクリーン（標準モデル４）を通るように粉砕し、化学分析用に貯蔵した。見かけの全消化管の栄養素消化率を、以下の方程式を用いて、与えた食餌、食べ残しおよび糞便中のＹｂと栄養素の濃度から計算した。
（１）見かけの消化率＝１００−（１００×（Ｙｂｄ／Ｙｂｆ）×（Ｎｆ／Ｎｄ）
式中、Ｙｂｄ＝消費した食餌中のＹｂの濃度（すなわち、与えた物の食べ残し）
Ｙｂｆ＝糞便中のＹｂの濃度、
Ｎｆ＝糞便中の栄養素の濃度、
Ｎｄ＝消費した食餌中の栄養素の濃度（すなわち、与えた物の食べ残し）。
ｇ．ルーメンの試料抽出
酵素活性を決定するにあたり、１９日と２０日目の午後の餌付け後０時間と４時間において、ルーメンの内容物をカニューレ装着したウシから試料抽出した。ウシにより合成されたルーメン内容物の約１Ｌがルーメン内の前方背面、前方腹面、内側腹面、後部背面および後部腹面の部位から得られ、PeCAP（Ｒ）ポリエステルスクリーン（孔径３５５μｍ；B＆SH Thompson, Ville Mont-Royal, QC, Canada）を通して濾過した。全体のルーメン内容物から濾過された残りの固体を０．９％ＮａＯＨと合わせ（１：１, wt/vol）、ブレンダー（Waring Products Division, New Hartford, CT）中で２分間ホモジナイズし、ＰｅＣＡＰ（Ｒ）ポリエステルスクリーン（孔径３５５μｍ）を通して再び濾過し、濾過したルーメン液と混合した。２工程の濾過プロセスから生じたルーメン液５０ミリリットルを試料抽出した。酵素活性を分析するまで、全ての試料を−２０℃で貯蔵した。
ｈ．実験室の分析
次の分析を行った：
【０１２４】
【表５】
2006519597.tif 000006
【０１２５】
【表６】
2006519597.tif 000007
ｈ．統計分析
ＳＡＳＴＭ（SAS Institute, 1999, Cary, NC）の混合モデル法を用いて、全てのデータを統計的に分析した。消化率のデータは、方陣の固定効果（すなわち、カニューレ装着無しのウシvsカニューレ装着したウシ）、食餌中のフォレージレベルの固定効果（すなわち、高フォレージvs低フォレージ）、酵素の固定効果（すなわち、ノン−プロテアーゼvsプロテアーゼ）、フォレージと酵素の間の相互作用の固定効果、方陣内のウシの変動効果、方陣内の範囲の変動効率および残差を説明するモデルを用いて分析した。ルーメン酵素活性のデータを同じモデルを用いて分析したが、反復測定を説明することによっても分析した。差は、Ｐ＜０．０５で有意であったと考えられる。
【０１２６】
表１８には、食餌へのプロテアーゼ酵素の添加が、食餌の消化率を高めたことが示されている。ＤＭ、ＯＭ、Ｎ、ＡＤＦおよびＮＤＦの消化率は、プロテアーゼ酵素により一貫して増大した。消化率の改善の大きさは、一般に、高フォレージ食餌よりも低フォレージ食餌に関して大きかったが、しかし両方の食餌について消化率の改善が相当であった。
【０１２７】
表１９には、食餌にプロテアーゼ酵素を添加することにより、ルーメン液中の酵素活性が増大したことが示されている。特に、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼおよびプロテアーゼの活性が増大した。酵素生成物が測定できる程のキシラナーゼ活性またはエンドグルカナーゼ活性を含まなかったので、ルーメン液中のより高い活性が微生物活性を増大する結果を招いた。これらのデータは、プロテアーゼ酵素を乳牛の食餌に添加することが、ルーメン内の全体的な繊維分解活性を増大したことを明らかに示している。従って、プロテアーゼの添加は、微生物の数と共に相乗作用を引き起こした。ルーメンの繊維消費能は、表１８に示される飼料消化の増大を説明するものであろう。
例６−プロテアーゼ酵素がin vitroでのフォレージの消化率に及ぼす影響
この研究は、例５のin vivo研究からのフォレージを用いて行った。研究を行って、プロテアーゼ酵素生成物の添加がin vitroで測定したフォレージ消化率に及ぼす影響を調べた。
【０１２８】
In vitroでのフォレージのルーメンのガス生成は、Mauricio et al,(1999)により記載されたシステムに似たシステムを用いて測定した。例５に記載のin vivo実験で使用したムラサキウマゴヤシ乾草とオオムギサイレージの新鮮な試料を、KnifetecＴＭ 1095試料ミル（Foss Tecator, Hoeganaes, Sweden）を用いて１０秒間微粉砕した。次に、ＤＭ約１ｇに等しい微粉砕したフォレージの試料を気密な血清培地バイアル（１２５ｍｌ容量）に計量供給し、８回くり返した。例５で使用したのと同じ市販のプロテアーゼ製品（Protex 6LＲ Genencor International, Rochester, NY）を用いた。ルーメン液を接種する２０時間前に、酵素を１．２５μｌ／ｇＤＭフォレージの速度で投与した。これは例５で使用した投与速度と同じであった。チューブに酵素を添加した３時間後に、Goering and Van Soest(1970)に記載されているように作成し、１Ｍトランス−アコニット酸（Sigma Chemicals）を用いてｐＨを６．０に調整した嫌気緩衝培地４０ｍｌを添加し、バイアルを２０℃で一晩貯蔵した。
【０１２９】
オオムギサイレージ、細断したムラサキウマゴヤシ乾草、ロール処理したトウモロコシ粒穀ならびに濃厚飼料から成る食餌を与えた授乳期の乳牛からのルーメン液が、餌付けの４時間後（１１００時）に得られた。例５に記載されているように回収した濾過ルーメン液を実験室の予備加熱した密封容器に移し、水浴中で３９℃に保った。インキュベーター内で３９℃まで温めておき、酸素不含のＣＯ２でフラッシュした培養バイアルに、接種物を計量分配（１バイアル当たり１０ｍｌ）した。次にバイアルをローディング直後に１４mmのブチルゴムストッパーと、アルミニウムクリンプキャップで密封し、４８時間インキュベートした。ネガティブコントロール（ルーメン液＋緩衝液のみ、およびルーメン液＋緩衝液と酵素生成物）もインキュベートし、８回くり返した。接種物から直接に生じるガス放出と発酵残留物の補正用に、これらのコントロールを使用した。表示装置（Data Track, Christchurch, UK）に接続した圧力トランスデューサー（type T443A, Baily and Mackey, Birmingham, UK）に設置した２３ゲージ（０．６mm）針を挿入することにより、基質発酵から生産されたヘッドスペースガスを接種後２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３０、３６、４２および４８時間で測定した。次に、トランスデューサーを取り除き、針を所定の位置に置きガス抜きをした。インキュベートした基質有機物の量とネガティブコントロールからのガス放出に関して補正した圧力値を使用して、
Mauricio et al.(1999)により報告された方程式（ガス体積＝０．１８＋３．６９７×ガス圧＋０．０８２４×ガス圧２）を用いて概算の値を出した。除去の際に、バイアルを４℃の冷蔵庫に２時間置き、発酵を中止し、濾過した。
【０１３０】
表２０には、プロテアーゼをムラサキウマゴヤシに添加することが、インキュベーションの開始から２時間でガス生成を増大させ、この増大がインキュベーションの間ずっと保持されたことが示されている。増大したガス生成は、微生物消化の改善を示している。これとは異なり、プロテアーゼの添加は、オオムギサイレージのガス生成では何の効果も無かった。
【０１３１】
【表７】
2006519597.tif 000008
【０１３２】
【表８】
2006519597.tif 000009
【０１３３】
本明細書で挙げられた全ての刊行物は、本発明に関わる当業者のレベルであることを示している。全ての刊行物は、各刊行物が明確かつ個々に参照して組み込まれて示されているのと同程度の範囲で、本明細書に組み込まれているものとする。
【０１３４】
明瞭さと理解を目的に、上記の発明を図表と実施例により詳細に記載してきたが、以下の請求項に定義されるような本発明の範囲と意図から離れることなく、ある程度の変化と改修を行うことができることも分かると思われる。
【０１３５】
【表９】
2006519597.tif 000010
【０１３６】
【表１０】
2006519597.tif 000011
【０１３７】
【表１１】
2006519597.tif 000012
【０１３８】
【表１２】
2006519597.tif 000013
【０１３９】
【表１３】
2006519597.tif 000014
【０１４０】
【表１４】
2006519597.tif 000015
【０１４１】
【表１５】
2006519597.tif 000016
【０１４２】
【表１６】
2006519597.tif 000017
【０１４３】
【表１７】
2006519597.tif 000018
【０１４４】
【表１８】
2006519597.tif 000019
【０１４５】
【表１９】
2006519597.tif 000020
【０１４６】
【表２０】
2006519597.tif 000021
【０１４７】
【表２１】
2006519597.tif 000022
【０１４８】
【表２２】
2006519597.tif 000023
【０１４９】
【表２３】
2006519597.tif 000024
【０１５０】
【表２４】
2006519597.tif 000025
【０１５１】
【表２５】
2006519597.tif 000026
【０１５２】
【表２６】
2006519597.tif 000027
【０１５３】
【表２７】
2006519597.tif 000028
【０１５４】
【表２８】
2006519597.tif 000029
【０１５５】
【表２９】
2006519597.tif 000030
【０１５６】
【表３０】
2006519597.tif 000031
【０１５７】
【表３１】
2006519597.tif 000032
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、餌付け後の時間を関数として発酵槽のｐＨをプロットした図である。
【図１】
2006519597.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月10日(2005.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物のルーメンにおける繊維分解を増大する方法において、次の工程：
ａ）システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される１つ以上のプロテアーゼを用意し、
ｂ）フォレージまたは粒餌を１つ以上のプロテアーゼで処理し、
ｃ）処理されたフォレージまたは粒餌を反芻動物に与え、それによってルーメンの繊維分解能の増大が作用する
から成ることを特徴とする、反芻動物のルーメンにおける繊維分解を増大する方法。
【請求項２】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌は、バチルス属の種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
真菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上のプロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のプロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上のプロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
１つ以上のプロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上のプロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上のプロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上のプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のプロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上のプロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１８から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
反芻動物に餌付けする方法において、次の工程：
ａ）システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される１つ以上のプロテアーゼを用意し、
ｂ）フォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）１つ以上のプロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し
ｄ）該組成物を動物に投与し、それによってルーメンの繊維分解能の増大が作用する
から成ることを特徴とする、反芻動物に餌付けする方法。
【請求項２３】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
細菌は、バチルス属の種である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
細菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上のプロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
１つ以上のプロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上のプロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上のプロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
１つ以上のプロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
１つ以上のプロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
１つ以上のプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
１つ以上のプロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
１つ以上のプロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項３９から４１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
フォレージまたは粒餌を処理して反芻動物のルーメンにおける繊維分解を増大する方法において、次の工程：
ａ）システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される１つ以上のプロテアーゼを用意し、
ｂ）反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、
ｃ）１つ以上のプロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用して飼料組成物を形成し、
ｄ）該組成物を動物に投与し、それによってルーメンの繊維分解能の増大が作用する
から成ることを特徴とする、フォレージまたは粒餌を処理して反芻動物のルーメンにおける繊維分解を増大する方法。
【請求項４４】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
細菌は、バチルス属の種である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
真菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
１つ以上のプロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
１つ以上のプロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
１つ以上のプロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
１つ以上のプロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
１つ以上のプロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
１つ以上のプロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
１つ以上のプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
１つ以上のプロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
１つ以上のプロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項６０から６２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
反芻動物用の飼料添加剤を製造する方法において、次の工程：
ａ）システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される１つ以上のプロテアーゼを用意し、
ｂ）１つ以上のプロテアーゼを１つ以上の不活性または活性成分と混合して飼料添加剤を形成し、
ｃ）飼料添加剤を反芻動物に餌付けするか、または飼料添加剤を動物用のフォレージまたは粒餌に添加し、それによりルーメンの繊維分解能の増大が影響する
から成ることを特徴とする、反芻動物用の飼料添加剤を製造する方法。
【請求項６５】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
細菌は、バチルス属の種である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
細菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
１つ以上のプロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
１つ以上のプロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
１つ以上のプロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
１つ以上のプロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
１つ以上のプロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
１つ以上のプロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
１つ以上のプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
１つ以上のプロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
１つ以上のプロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項８１から８３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
反芻動物に餌付けするための飼料組成物を製造する方法において、次の工程：
ａ）システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される１つ以上のプロテアーゼを用意し、
ｂ）反芻動物に適切なフォレージまたは粒餌を用意し、および
ｃ）１つ以上のプロテアーゼをフォレージまたは粒餌に利用し、組成物を形成し、それにより該組成物を反芻動物に与えた場合に、ルーメンの繊維分解能の増大が影響する
から成ることを特徴とする、反芻動物に餌付けするための飼料組成物を製造する方法。
【請求項８６】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
細菌は、バチルス属の種である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
真菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
１つ以上のプロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
１つ以上のプロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
１つ以上のプロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
１つ以上のプロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
１つ以上のプロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
１つ以上のプロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
１つ以上のプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
１つ以上のプロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
１つ以上のプロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１０２から１０４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
１つ以上の飼料グレードのプロテアーゼを、１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて有する飼料添加剤において、１つ以上のプロテアーゼを、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択し、かつフォレージまたは粒餌に利用して、動物に与えた場合に、繊維分解を増大する量で含有することを特徴とする、１つ以上の飼料グレードのプロテアーゼを、１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて有する飼料添加剤。
【請求項１０７】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来し、その際、１つ以上のプロテアーゼの量は、１つ以上の飼料グレードの不活性または活性成分と組合せて、１ｍＬまたは１グラム当たりプロテアーゼ１００〜５０００００単位の範囲内である、請求項１０６に記載の添加剤。
【請求項１０８】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１０７に記載の添加剤。
【請求項１０９】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項１０８に記載の添加剤。
【請求項１１０】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１０７に記載の添加剤。
【請求項１１１】
真菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項１１０に記載の添加剤。
【請求項１１２】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項１０７に記載の添加剤。
【請求項１１３】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１０７に記載の添加剤。
【請求項１１４】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１０７に記載の添加剤。
【請求項１１５】
１つ以上の不活性または活性成分は、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される、請求項１０７に記載の添加剤。
【請求項１１６】
１つ以上のプロテアーゼは、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中に存在し、その際、乾物はフォレージまたは粒餌である、請求項１１５に記載の添加剤。
【請求項１１７】
１つ以上のプロテアーゼは、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中に存在し、その際、乾物はフォレージまたは粒餌である、請求項１１５に記載の添加剤。
【請求項１１８】
１つ以上のプロテアーゼは、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費食餌乾物の範囲内の量を生じるように添加剤中に存在し、その際、乾物はフォレージまたは粒餌である、請求項１１５に記載の添加剤。
【請求項１１９】
１つ以上のプロテアーは、フォレージまたは粒餌に利用される場合に、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項１１５に記載の添加剤。
【請求項１２０】
１つ以上のプロテアーは、フォレージまたは粒餌に利用される場合に、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項１１５に記載の添加剤。
【請求項１２１】
１つ以上のプロテアーは、フォレージまたは粒餌に利用される場合に、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を生じる量で存在する、請求項１１５に記載の添加剤。
【請求項１２２】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１１９から１２１までのいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項１２３】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１１９から１２１までのいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項１２４】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１１９から１２１までのいずれか１項に記載の添加剤。
【請求項１２５】
フォレージまたは粒餌を、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択される１つ以上のプロテアーゼと組合せて有する、反芻動物に餌付けするための飼料組成物であって、それによって該組成物を反芻動物に与えた場合に、繊維分解の増大が作用することを特徴とする、飼料組成物。
【請求項１２６】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２８】
プロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２９】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３０】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３２】
真菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３３】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１３４】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３５】
プロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３６】
プロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３７】
プロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
プロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１３９】
プロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４０】
プロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４１】
プロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４２】
プロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４３】
プロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４４】
プロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４５】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１４２から１４４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４６】
反芻動物のルーメンにおける繊維分解の増大のための１つ以上のプロテアーゼの使用において、１つ以上のプロテアーゼを、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼから成るグループから選択し、かつ１つ以上のプロテアーゼを反芻動物に与えた場合に、ルーメンの繊維分解能の増大が影響することを特徴とする、反芻動物のルーメンにおける繊維分解の増大のための１つ以上のプロテアーゼの使用。
【請求項１４７】
フォレージまたは粒餌は、ムラサキウマゴヤシ乾草とサイレージ、牧乾草とサイレージ、混合乾草とサイレージ、藁、トウモロコシサイレージ、トウモロコシ穀粒、オオムギサイレージ、オオムギ穀粒、脂肪種子またはこれらの組合せから成るグループから選択される、請求項１４６に記載の使用。
【請求項１４８】
フォレージは、ムラサキウマゴヤシフォレージまたはムラサキウマゴヤシ−グラスフォレージ混合物である、請求項１４６に記載の使用。
【請求項１４９】
１つ以上のプロテアーゼは、細菌または真菌から由来する、請求項１４６に記載の使用。
【請求項１５０】
細菌は、バチルス属の種である、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５１】
細菌は、Bacillus licheniformisである、請求項１５０に記載の使用。
【請求項１５２】
真菌は、トリコデルマ属の種である、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５３】
真菌は、Trichoderma longibrachiatumである、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５４】
繊維は、ヘミセルロースまたはセルロースである、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５５】
１つ以上のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５６】
１つ以上のプロテアーゼは、サブチリシン様である、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５７】
１つ以上のプロテアーゼは、固体、液体または懸濁液として調製される、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５８】
１つ以上のプロテアーゼは、ミネラルブロック、塩、顆粒、丸剤、ペレットまたは粉末として調製される、請求項１５７に記載の使用。
【請求項１５９】
１つ以上のプロテアーゼを、キャリヤー；希釈剤；着香剤；付形剤；セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびエステラーゼから成るグループから選択される酵素；抗生物質；プレビオティックス；プロビオティックス；微量養素；ビタミン；ミネラルおよび多量養素から成るグループから選択される１つ以上の不活性または活性成分と組合せる、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６０】
１つ以上のプロテアーゼを、０．１〜２０ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１５９に記載の使用。
【請求項１６１】
１つ以上のプロテアーゼを、０．５〜２．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１５９に記載の使用。
【請求項１６２】
１つ以上のプロテアーゼを、０．７５〜１．５ｍＬ／ｋｇ消費乾物の範囲内の量でフォレージまたは粒餌に利用する、請求項１５９に記載の使用。
【請求項１６３】
１つ以上のプロテアーゼの量は、１０００〜２３０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１５９に記載の使用。
【請求項１６４】
１つ以上のプロテアーゼの量は、２３００〜１１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１５９に記載の使用。
【請求項１６５】
１つ以上のプロテアーゼの量は、３３００〜６８００プロテアーゼ単位／ｋｇ乾物の範囲内のプロテアーゼ活性を有する、請求項１５９に記載の使用。
【請求項１６６】
アゾカゼインを基質として用いて、ｐＨ６．０および３９℃でプロテアーゼ活性をアッセイする、請求項１６３から１６５までのいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
2006519597.tif 000034
2006519597.tif 000035
2006519597.tif 000036