(57)【要約】本発明は、溶解度を高め、血漿タンパク質結合を調整するか、又は薬剤のバイオアベイラビリティを高めるための、新規プロドラッグ技術及び新規プロドラッグを提供する。本発明では、プロドラッグは、治療用化合物とペプチド（例えば、テトラペプチド又はヘキサペプチド）の接合体であり、ここで、この接合体は、ジペプチジル−ペプチダーゼ、さらに好ましくはＣＤ２６によって開裂可能であり、ＤＰＰＩＶ（ジペプチジルアミノジペプチダーゼＩＶ）として知られている。本発明はさらに、薬剤の脳送達及びリンパ送達を高め、及び／又は血漿中の薬剤の半減期をある程度まで高めるための上記プロドラッグを製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用化合物Ｄのプロドラッグを含む薬学的組成物であって、前記治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を包含するか、又は該治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、前記プロドラッグが、オリゴペプチドに接続する前記治療用化合物Ｄを含み、前記オリゴペプチドが一般構造
Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n
からなり、
ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２】
ｎ＝２〜５である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドが、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドである、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
Ｙが、プロリン、ジヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリン又はアラニンである、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
該オリゴペプチドが、治療用化合物の芳香族基上、治療用化合物の炭水化物基上、又は治療用化合物のプリン又はピリミジンヌクレオチド基上、又は治療用化合物のアルキル基上、又は治療用化合物の無機の基上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
該リンカーがオリゴペプチドＡmの一般構造を有し、Ａが任意のアミノ酸であり、ｍが１〜１５であり、Ａmが、Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nのカルボキシ末端に対してそのアミノ末端で結合し、Ａmが、アミド結合又はエステル結合を介して該治療用化合物Ｄに対してそのカルボキシ末端で結合する、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
ｍ＝１である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
該治療用化合物Ｄが、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための薬物である、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
該抗ウイルス剤がＴＳＡＯ又はＮＡＰ−ＴＳＡＯである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
該抗ウイルス剤がＡｒａ−Ｃ又はアシクロビルである、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
治療用化合物Ｄのプロドラッグ構築物であって、前記治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は該治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、前記プロドラッグが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nを有するオリゴペプチドに接続する前記治療用化合物Ｄからなり、ここで、ｎ＝２〜５であり、ＸがＬ−アミノ酸であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じることを特徴とする、プロドラッグ構築物。
【請求項１５】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項１４に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項１６】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項１４に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項１７】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項１４に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項１８】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドが、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドである、請求項１４〜１７のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項１９】
Ｙが、プロリン、ジヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリン又はアラニンである、請求項１４〜１８のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項２０】
該オリゴペプチドが、治療用化合物の芳香族基上、治療用化合物の炭水化物基上、又は治療用化合物のプリン又はピリミジンヌクレオチド基上、又は治療用化合物のアルキル基上、又は治療用化合物の無機の基上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする、請求項１４〜１９のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項２１】
該リンカーがオリゴペプチドＡmの一般構造を有し、Ａが任意のアミノ酸であり、ｍが１〜１５であり、Ａmが、Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nのカルボキシ末端に対してそのアミノ末端で結合し、Ａmが、アミド結合又はエステル結合を介して治療用化合物Ｄに対してそのカルボ
キシ末端で結合する、請求項１４〜２０のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ構築物。
【請求項２２】
ｍ＝１である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
該治療用化合物Ｄが、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための薬物である、請求項１４〜２２のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２４】
該抗ウイルス剤がＴＳＡＯ、ＮＡＰ−ＴＳＡＯ、ＡｒａＣ及びアシクロビルから選択される、請求項２３に記載のプロドラッグ。
【請求項２５】
ペプチドを治療用化合物Ｄにカップリングさせることによって得られた接合体がジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能である、血漿タンパク質の結合及び／又は治療用化合物Ｄのバイオアベイラビリティを調節する、水溶解度を調節するための方法。
【請求項２６】
該ジペプチジルペプチダーゼがＣＤ２６であり、該治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は該治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、該オリゴペプチドが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｎ＝２〜５である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３０】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３１】
治療用化合物Ｄのプロドラッグを製造する方法であって、該プロドラッグがジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能であり、当該方法が、治療的に活性な薬剤及びペプチドを接続させ、得られた接合体がＣＤ２６によって開裂可能である工程を含む、方法。
【請求項３２】
該ジペプチジルペプチダーゼがＣＤ２６であり、該治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は該治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、
該オリゴペプチドが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸
であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｎ＝２〜５である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３６】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３７】
潜在的なプロドラッグを選択する方法であって、当該方法が、アミノ酸プロドラッグとジペプチジル−ペプチダーゼ又は組織又は細胞が産生するジペプチジル−ペプチダーゼとを、及び平行実験においてジペプチジル−ペプチダーゼを含まない培地とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項３８】
該ジペプチジルペプチダーゼがＣＤ２６であり、該治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は該治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、該オリゴペプチドが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｎ＝２〜５である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４２】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
治療用化合物Ｄのプロドラッグを調製するための一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nを有するペプチドの使用であって、前記治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は該治療用化合
物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、前記プロドラッグがオリゴペプチドに接続する前記治療用化合物Ｄを含み、前記オリゴペプチドが一般構造
Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n
からなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じることを特徴とする、使用。
【請求項４４】
前記治療用化合物Ｄが、抗新生物性薬剤以外、又はＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ酵素活性に対する阻害活性を有する薬剤以外の細胞毒性の癌薬剤ではない、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
ｎ＝２〜５である、請求項４３又は４４に記載の使用。
【請求項４６】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項４３〜４５のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項４３〜４５のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項４３〜４５のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドが、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドである、請求項４３〜４８のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
Ｙが、プロリン、ジヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリン又はアラニンである、請求項４３〜４９のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
該オリゴペプチドが、治療用化合物の芳香族基上、治療用化合物の炭水化物基上、又は治療用化合物のプリン又はピリミジンヌクレオチド基上、又は治療用化合物のアルキル基上、又は治療用化合物の無機の基上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする、請求項４３〜５０のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
該リンカーがオリゴペプチドＡｍ1の一般構造を有し、Ａが任意のアミノ酸であり、ｍが１〜１５であり、Ａmが、Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nのカルボキシ末端に対してそのアミノ末端で結合し、Ａmが、アミド結合又はエステル結合を介して治療用化合物Ｄに対してそのカルボキシ末端で結合する、請求項４３〜５１のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
ｍ＝１である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
該治療用化合物Ｄが、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓
血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための薬物である、請求項４３〜５３のうちいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
該抗ウイルス剤がＴＳＡＯ又はＮＡＰ−ＴＳＡＯである、請求項５４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド部分のタンパク質分解によって放出又は活性化される治療用化合物のプロドラッグに関する。本発明はさらに、血清タンパク質結合、治療用化合物の血液−脳障壁浸透、又は溶解度及びバイオアベイラビリティを改良する、経口吸収を高めるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の薬剤開発技術（例えば、組み合わせ化学、ハイスループット薬理学的スクリーニング、構造に基づく薬剤設計）は、非常に特異的で強力な薬剤分子を提供している。しかし、これらの新規な化学構造は好ましくない物理化学的性質及び生物薬剤学的性質を有することがむしろ一般的である。それに加えて、新規治療用薬剤の開発の間、研究者は典型的には薬理学的性質及び／又は生物学的性質に焦点を当て、物理化学的性質にはほとんど関心を持たない。しかし、薬剤分子の物理化学的性質（分離定数、溶解度、分配係数、安定性）は、その薬学的挙動及び生物薬剤学的挙動に顕著な影響をもつ。従って、必要な場合には、薬剤開発中に、物理化学的性質を決定し改良する必要がある。さらに、すでに上市されている多くの既存の薬剤分子の物理化学的性質は最適なものではない。
【０００３】
今日、候補薬剤は、数え切れないいまだ認識されていない医学的利点をもちつつ、しばしば、水溶解度が低いこと、又は吸収が不十分であることの課題のために中断される。なお他の製品は上市されるが、安全性又は有効性への懸念のためにその完全な市場でのポテンシャルは認識されない。プロドラッグは、この両方の課題を克服する可能性を有する。この技術は、プロドラッグを薬剤の活性形態に選択的に生体変換するための内因性酵素を開拓する。この技術は、開発中に新規候補薬剤の有望性を保持し、既存の薬剤製品の安全性及び有効性を高める能力を有する。
【０００４】
プロドラッグは、体内で活性な親薬物を放出する目的で化学変換又は酵素による生体変換を必要とする薬剤分子のほとんど不活性な誘導体である。プロドラッグは、薬剤の所望でない性質を克服するために設計される。そのようなものとして、この技術は、種々の薬剤の物理化学的性質、生物薬剤学的性質及び／又は薬動力学的性質を改良するために適用することができる。通常は、プロドラッグ自体は生物学的に不活性である。それ故に、プロドラッグは、薬剤標的に到達するとすぐに、顕著な有効性を届けるために、親薬物に効果的に変換される必要がある。
【０００５】
概して、改良された薬剤吸収を得る目的で、プロドラッグは、生体膜を介した薬剤の浸透を改良し、薬剤の作用時間を延長し（プロドラッグからの親薬物の遅延性放出、薬剤の一次経路代謝の減少）、薬剤作用を標的化し（例えば、脳又は腫瘍を標的とする）、薬剤の水溶解度及び安定性を改良し（静脈内調製物、点眼薬等）、局所的な薬剤送達（例えば皮膚送達及び眼球送達）を改良し、薬剤（例えばペプチド）の化学／酵素安定性を改良し、又は薬剤の副作用を減らすために設計される。
【０００６】
多くのプロドラッグ技術は、変換される薬剤の種類によってすでに開発されている。これらのプロドラッグ技術は、ペプチド及びペプチド模倣物のための環状プロドラッグ化学、三級アミン、フェノール及びヒンダードアルコールの可溶化のためのホスホノオキシメチル（ＰＯＭ）化学、及び概してエステル化を含む。さらに、標的化ストラテジーは、特定の酵素、例えば、ペプチド又は前立腺癌を標的化するために使用されるＰＳＡ（前立腺特異的な抗原）のＮ−末端ホルミル基を開裂するバクテリアのペプチドデフォルミラーゼによって開裂可能な基をカップリングすることによって追究される。
【０００７】
治療剤に対するペプチド又はアミノ酸のカップリングは、いくつかの理由について過去にすでに追究されている。アンチセンス−抗原の分野では、オリゴヌクレオチド又は挿入剤は、治療用薬剤の細胞吸収を高める目的でペプチドに接合される。しかし、これらのオリゴヌクレオチド及び挿入剤は、細胞浸透後に放出される必要はなく、プロドラッグとみなすことができない。治療用化合物に対するアミノ酸カップリングの例は、バルガンシクロビル、ガンシクロビルのＬ−バリルエステルプロドラッグであり、これらは、サイトメガロウイルス感染の予防及び治療のために使用される。経口投与後、プロドラッグは、腸管及び肝臓のエステラーゼによって迅速にガンシクロビルへと変換される。近年、新規な抗腫瘍ベンゾチアゾールのアラニン及びリシンプロドラッグが観察されている［Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，７４４−４７４］。
【０００８】
ヌクレオチドアナログのアミノ酸エステルプロドラッグのペプチドキャリアで媒介される膜輸送は、すでに示されている［Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９８）１５：１１５４−１１５９；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９８）１５：１３８２−１３８６］。薬剤の経口バイオアベイラビリティは、アミノ酸、好ましくはＬ−配置のアミノ酸を含有するアミノ酸プロドラッグ誘導体によって媒介可能であることが実際に示されている。Ｌ−バリンは、腸管吸収のために、鎖長及びアミノ酸のβ−炭素での分枝の最適な組み合わせを有すると考えられる。ｈＰＥＰＴ−１は、Ｌ−バリンエステルプロドラッグの増加する全身送達の一次吸収経路として関与していることがわかっている。近年、ｈＰＥＰＴ−１トランスポーターが遊離ＮＨ2、カルボニル基及び脂溶性の全体と最適に相互作用する必要があることが示され、その標的分子とさらなるいくつかのＨ−架橋を形成し得ることが示された。Ｌ−バリン−に接続したヌクレオシドアナログエステルは、有効なｈＰＥＰＴ−１基質活性のためのこれらの要求を満たし得る［Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２００２）１６：１−１３］。しかし、溶解度及びバイオアベイラビリティを改善するための従来技術は、有機低分子のアミノ酸プロドラッグ（１つのアミノ酸のみにカップリング）のみであり、エステラーゼによって遊離の治療用薬剤に容易に変換されるため、アミノ酸はほとんどエステル結合を介してカップリングされる。
【０００９】
従来技術文献は、多くのプロテアーゼ、例えばアミノペプチダーゼ（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／６８１４５）及びアミノトリペプチダーゼ（ＰＣＴ出願ＷＯ０２／００２６３）によるプロドラッグの加工を記載する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、新規の代替の、より良好なプロドラッグ技術がなお必要とされており、高分子量の高いｌｏｇＰ［分配係数］、又は水溶解度が低い多量の新規化合物を製造するために組み合わせ化学及びハイスループットスクリーニングが続けられるため、この必要性は増してきている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、治療用薬剤の溶解度及び／又はバイオアベイラビリティを改善するために適用可能な新規プロドラッグ技術を提供する。本発明は、それらの溶解度及び／又はバイオアベイラビリティを改善するための（治療用又は診断用）薬剤の誘導体化を含む。本発明は、治療用薬剤とペプチド部分との接合体を提供し、ここで、この接合体は、ジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって開裂可能である。この技術はさらに、治療用化合物Ｄのタンパク質結合を調節し、哺乳動物における特異的な部位を標的化するために
使用することができる。
【００１２】
本発明は、薬剤の溶解度、タンパク質結合及び／又はバイオアベイラビリティを調節するための新規プロドラッグ技術及び新規プロドラッグを提供する。本発明において、プロドラッグは治療用化合物Ｄとペプチドとの接合体であり、この接合体は、ジペプチジル−ペプチダーゼ、さらに好ましくはジペプチジル−ペプチダーゼＩＶによって開裂可能である。本発明はさらに、上記プロドラッグを製造する方法を提供する。本発明はまた、さらに選択的な標的薬剤のため、及び薬剤の脳及びリンパ送達を改良し、特に高め、及び／又は血漿中の薬剤半減期を延ばすための、プロドラッグ技術を提供する。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、治療用化合物Ｄのプロドラッグを含む薬学的組成物に関する。治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、治療用化合物Ｄがアミノ基、特に末端一級または二級アミノ基を含み、これらはアミノ酸のカルボキシル基と結合可能である。又は代替的に、治療用化合物Ｄは、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基、特にアミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級または二級アミノ基を含むリンカーに結合する。特定の実施形態では、治療用化合物Ｄはさらに、オリゴヌクレオチド又は核酸インターカレーティング薬剤ではない。プロドラッグは、オリゴペプチドに接続する治療用化合物Ｄを含み、上記オリゴペプチドが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じることを特徴とする。Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nペプチドは遊離アミノ末端、すなわち、修飾されていないＮＨ2基を有する。明確にするために、各繰り返し単位［Ｘ−Ｙ］中の各Ｘ及びＹは、他と独立して、及び各繰り返し単位について互いに独立して選択される。１つの実施形態では、ペプチドは、２〜５個のＣＤ２６開裂可能な繰り返しを有する。別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なオリゴペプチドとＤとの間のリンカーＡm中のアミノ酸の数ｍは１〜１５である。さらに特定的には、ｍは１である。さらに特定的には、ｍは１であり、Ａはバリンである。別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なオリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、テトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。特定の実施形態では、［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドは、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、さらに特定的には、良好な腸管吸収を有し、Ｘ及びＹの選択によって、溶解度の改変と組み合わせて治療用化合物を遅延または迅速に放出するためのＶａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2である。１つの実施形態では、テトラ又はヘキサペプチドは、一般構造Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］又はＶａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］2を有する。１つの実施形態によれば、Ｙはプロリン又はヒドロキシプロリン又はジヒドロキシプロリン又はアラニンである。別の実施形態によれば、Ｘは、バリン、アスパラギン酸、セリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、イソロイシン又はロイシンから選択される。別の実施形態によれば、Ｘは、開裂を遅らせるためには酸性アミノ酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸から選択され、治療用化合物Ｄの迅速な放出のためには、陽電荷を持つアミノ酸であるアルギ���ン、ヒスチジン又はリシンから選択される。
【００１４】
オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、芳香族基のような有機分子／原子上、炭水化物基上、又は治療用化合物のヌクレオチド基上、又はジアルキル基上、又はヘテロ環基上、またはアルキル、アルケニル又はアルキニル上、または有機分子／原子上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングしてもよい。１つの実施形態では、オリゴペプチド［Ｘ
−Ｙ］nは、治療用化合物の芳香族基上、治療用化合物の炭水化物基上、又は治療用化合物のプリン又はピリミジンヌクレオチド基上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする。又は、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、アミノ基を含むリンカーを介して治療用化合物Ｄに間接的にカップリングする。このようなリンカーは、オリゴペプチドＡmの一般構造を有し、ｍが１〜１５であり、さらに特定的には１〜３であるか、又はｍ＝１である。構造Ａm中のＡは任意のアミノ酸であることができる。１つの実施形態によれば、ｍ＝１であり、Ａはバリンである。このようなリンカーが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n−Ａm−Ｄを有するプロドラッグ。オリゴペプチドＡm又はアミノ酸Ａは、オリゴペプチドＨ−［Ｘ−Ｙ］nに結合するアミド結合を介してそのアミノ末端で接続する。オリゴペプチドＡm又はアミノ酸Ａは、治療用化合物Ｄに結合するアミド又はエステルを介してそのカルボキシ末端で接続する。薬学的組成物は、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための治療用化合物のプロドラッグを含むことができる。１つの実施形態では、薬学的組成物は、肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する癌及び／又は障害以外の、上述の群から選択される障害を予防又は治療するための化合物のプロドラッグを含む。抗ウイルス剤の特定の例はＴＳＡＯＡである。抗ウイルス剤の別の特定の例は上に記載されるようなＨＩＶプロテアーゼインヒビターである。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、Ｘ又はＹについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。特定の実施形態では、プロドラッグのペプチドは、Ｂp−［Ｘ−Ｙ］n−Ａmを含み、ここで、Ｂは、ペプチダーゼ／アミノペプチダーゼによって開裂される任意のアミノ酸又はペプチドであることができ、ｐは１〜１０個のアミノ酸の範囲である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、治療用化合物Ｄのプロドラッグ構築物であって、上記治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、上記プロドラッグが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nを有するオリゴペプチドに接続する上記治療用化合物Ｄからなり、ここで、ｎ＝２〜５であり、Ｘがアミノ酸であり（１つの実施形態ではＸはＬ−アミノ酸であり）、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり（１つの実施形態ではＹはＬ−アミノ酸であり）、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、又はＸ及びＹはＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。１つの実施形態によれば、このプロドラッグは、活性化の際に、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ酵素に対して阻害効果を有さない。１つの実施形態では、ｎは、２、３、４又は５から選択され、なお特に、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、テトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。特定の実施形態では、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ａｒｇ−Ａｌａ、Ｈｉｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｌａ
、Ｉｌｅ−Ａｌａ及びＬｅｕ−Ａｌａの群から選択される。１つの実施形態によれば、Ｙは、プロリン又はヒドロキシプロリン又はジヒドロキシプロリン又はアラニンである。１つの実施形態によれば、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、治療用化合物の芳香族基上、炭水化物上、又はヌクレオシド上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする。又は、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、アミノ基を含むリンカーを介して治療用化合物Ｄに間接的にカップリングする。このリンカーは、有機分子（すなわち、アルキルアミノ、ペプチド、又は両方の組み合わせ）を含む。１つの実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なオリゴペプチドとＤとの間のリンカーＡm中のアミノ酸の数ｍは１〜１５である。特定の実施形態では、このようなリンカーは、オリゴペプチドＡmの一般構造を有することができ、ｍが１〜１５であり、より特定的には１〜３であり、又はｍ＝１である。構造Ａm中のＡは任意のアミノ酸であることができる。１つの実施形態によれば、ｍ＝１であり、Ａはバリンである。このようなリンカーが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n−Ａm−Ｄを有するプロドラッグ。１つの実施形態によれば、プロドラッグは、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための治療用化合物のプロドラッグである。１つの実施形態では、プロドラッグは、ＴＳＡＯ又はＮＡＰ−ＴＳＡＯのような抗ウイルス剤である。別の実施形態によれば、プロドラッグは、式（Ｉ）の一般構造をもつＨＩＶプロテアーゼインヒビタープロドラッグである。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ペプチドを治療用化合物Ｄにカップリングさせることによって得られた接合体がジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能である、血漿タンパク質の結合及び／又は治療用化合物Ｄのバイオアベイラビリティを調節する、水溶解度を調節する（増加又は減少する）ための方法に関する。１つの実施形態によれば、ジペプチジルペプチダーゼはＣＤ２６であり、治療用化合物Ｄはペプチド又はタンパク質ではなく、治療用化合物Ｄは上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、上記オリゴペプチドが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる。１つの実施形態によれば、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、テトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。１つの実施形態によれば、溶解度、血漿タンパク質結合又はバイオアベイラビリティが改良される治療用化合物は、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための治療用化合物である。特定の実施形態では、上記障害は、肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の癌又は障害である。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、Ｘ又はＹについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。
【００１７】
本発明の別の態様は、治療用化合物Ｄのプロドラッグを製造する方法であって、上記プ
ロドラッグがジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能であり、当該方法は、治療的に活性な薬剤及び構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nを有するペプチドを接続させ、得られた接合体がＣＤ２６によって開裂可能である工程を含む、方法に関する。１つの実施形態によれば、ジペプチジルペプチダーゼはＣＤ２６であり、治療用化合物Ｄはペプチド又はタンパク質ではなく、治療用化合物Ｄは、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、上記オリゴペプチドが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる。１つの実施形態によれば、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、テトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、Ｘ又はＹについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。
【００１８】
本発明の別の態様は、潜在的なプロドラッグを選択する方法であって、当該方法が、アミノ酸プロドラッグとジペプチジル−ペプチダーゼ又は組織又は細胞が産生するジペプチジル−ペプチダーゼとを、及び平行実験においてジペプチジル−ペプチダーゼを含まない培地とを接触させる工程を含む、方法に関する。１つの実施形態によれば、ジペプチジルペプチダーゼはＣＤ２６であり、治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、上記オリゴペプチドが、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる。１つの実施形態によれば、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nはテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、Ｘ又はＹについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、疾患を治療又は予防するための医薬を製造するための治療用化合物Ｄのプロドラッグの使用に関する。特定の実施形態では、本発明は、癌以外の障害又は増加したＤＰＰＩＶレベルに関連する非感染性の障害以外のもの又は血中の長期間の増加したグルコース濃度の結果である障害以外のものを治療又は予防するための医薬の製造のための治療用化合物Ｄのプロドラッグの使用に関する。治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシ
ル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、上記プロドラッグがオリゴペプチドに接続する上記治療用化合物Ｄを含み、上記オリゴペプチドが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、ＸがＬ−アミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる。１つの実施形態によれば、癌以外の障害又は増加したＤＰＰＩＶレベルに関連する非感染性の障害以外のもの又は血中の長期間の増加したグルコース濃度の結果である障害以外のものは、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、痛みの減少、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＭＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病以外の代謝疾患の群から選択される。医薬を製造するためのＣＤ２６開裂可能なプロドラッグの使用は、ＣＤ２６インヒビターのプロドラッグによって治療可能なＤＰＰＩＶの所望でないレベルの増加に起因するこれらの障害を否定する。これらの障害、例えば、ＣＤ２６のレベルが増加し、ＣＤ２６開裂可能な細胞毒性癌プロドラッグ又は新生物性プロドラッグによって治療可能な種類の腫瘍のための使用を否定する。別の実施形態によれば、ｎは２〜５の範囲であり、さらに特定的にはｎは２又は３である。別の実施形態によれば、オリゴペプチドはテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である。別の実施形態によれば、オリゴペプチドはテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である。別の実施形態によれば、オリゴペプチドはテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。別の実施形態によれば、オリゴペプチドは、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、さらに特定的には、良好な腸管吸収を有し、Ｘの選択によって、溶解度の改変と組み合わせて治療用化合物を遅延または迅速に放出するためのＶａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2である。別の実施形態によれば、Ｙはプロリン又はヒドロキシプロリン又はジヒドロキシプロリン又はアラニンであり、さらに特定的な実施形態では、Ｙはプロリンである。別の実施形態によれば、オリゴペプチドは、芳香族基のような有機分子／原子上、炭水化物基上、又は治療用化合物のヌクレオチド基上、又はジアルキル基上、又はヘテロ環基上、またはアルキル、アルケニル又はアルキニル上、または有機分子／原子上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする。別の実施形態によれば、オリゴペプチドはリンカーを介して治療用化合物Ｄに間接的にカップリングし、上記リンカーはＮＨ2又は置換ＮＨアミノ基を含む。別の実施形態によれば、治療用化合物Ｄは、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための薬物である。特定の実施形態では、治療用化合物はＴＳＡＯ又はＮＡＰ−ＴＳＡＯのようなそれらの誘導体である。別の実施形態では、抗ウイルス剤はＨＩＶプロテアーゼのインヒビターである。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、Ｘ又はＹについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。
【００２０】
本発明のなお別の態様は、治療用化合物ＤのＣＤ２６開裂可能なプロドラッグを調製するための一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nを有するペプチドを用いてプロドラッグを製造するための製造プロセスに関する。治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は上記治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級
アミノ基を含むリンカーに結合する。プロドラッグは、上記プロドラッグがオリゴペプチドに接続する上記治療用化合物Ｄを含み、前記オリゴペプチドが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じることを特徴とする。特定の実施形態では、Ｘについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。別の実施形態では、Ｙについて選択されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるか、又はＸ及びＹはＬ−アミノ酸である。別の実施形態は特に、Ｘ及びＹについてＤ−アミノ酸の使用を排除する。１つの実施形態では、ペプチドは２〜５個のＣＤ２６開裂可能な繰り返しを有する。別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なオリゴペプチドとＤとの間のリンカーＡm中のアミノ酸の数ｍは１であり、Ａはバリンである。別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なオリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、テトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である。特定の実施形態では、特定の実施形態では、［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドは、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、さらに特定的には、良好な腸管吸収を有し、Ｘの選択によって、溶解度の改変と組み合わせて治療用化合物を遅延または迅速に放出するためのＶａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2である。プロドラッグ構築物Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n−Ｄの中で、治療用化合物Ｄは、［Ｘ−Ｙ］nペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のＣＯＯＨ基に結合する一級（ＮＨ2）又は二級（ＮＨ）アミノ基である。治療用化合物ＤがＮＨ2もＮＨ基も有さない場合、又はＮＨ又はＮＨ2基が反応可能でない場合（例えば、立体障害に起因して）、治療用化合物Ｄはリンカーと反応することができ、反応後にＮＨ2又はＮＨ基を有し、これらが［Ｘ−Ｙ］nペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のＣＯＯＨ基と反応することができる。１つの実施形態によれば、Ｙは、プロリン又はヒドロキシプロリン又はジヒドロキシプロリン又はアラニンである。１つの実施形態では、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、芳香族基のような有機分子／原子上、炭水化物基上、又は治療用化合物のヌクレオチド基上、又はジアルキル基上、又はヘテロ環基上、またはアルキル、アルケニル又はアルキニル上、または有機分子／原子上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする。又は、オリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、アミノ基を含むリンカーを介して治療用化合物Ｄに間接的にカップリングする。このようなリンカーは、限定されないが、オリゴペプチドＡｍの構造を含み、ｍが１〜１５の範囲、より特定���には１〜３の範囲、又はｍ＝１である任意の構造を有することができる。構造Ａm中のＡは任意のアミノ酸であることができる。１つの実施形態によれば、ｍ＝１であり、Ａはバリンである。このようなリンカーが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n−Ａm−Ｄを有するプロドラッグ。オリゴペプチドＡm又はアミノ酸Ａは、治療用化合物Ｄに結合するアミド又はエステルを介してそのカルボキシ末端で接続する。薬学的組成物は、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための治療用化合物のプロドラッグを含むことができる。抗ウイルス剤の特定の例はＴＳＡＯである。抗ウイルス剤の別の特定の例は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビター又はインテグラーゼインヒビターである。特定の実施形態では、本発明は、治療用化合物の異なる部位で２つ以上のオリゴペプチドにカップリングする治療用化合物Ｄに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
定義
用語「プロドラッグ」は、本明細書中で使用される場合、活性な親薬物を放出する目的で化学変換又は酵素による変換を必要とする、治療用化合物のほとんど不活性な誘導体（又は強力に活性が低下した誘導体、すなわち、誘導体化されていない薬剤分子の活性が２０％未満、１０％未満、５％未満又はさらに１％未満残っている誘導体）を指す。本発明のプロドラッグは、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n−Ｄを有する。このプロドラッグの化学的性質は、以下に詳細に説明される。プロドラッグは、薬剤の所望でない性質を克服するために設計される。そのようなものとして、この技術は、種々の薬剤の物理化学的性質、生物薬剤学的性質及び／又は薬動力学的性質を改良するために適用することができる。通常は、プロドラッグ自体は生物学的に不活性である。それ故に、プロドラッグは、薬剤標的に到達するとすぐに、顕著な有効性を届けるために、親薬物に効果的に変換される必要がある。この活性化は、体内に存在する酵素によってなすことができるか、又は酵素はプロドラッグとともに投与される。
【００２２】
概して、プロドラッグは、生体膜を介した薬剤の浸透を改良し、薬剤の作用時間を延長し（プロドラッグからの親薬物の遅延性放出、薬剤の一次経路代謝の減少）、薬剤作用を標的化し（例えば、脳又は腫瘍を標的とする）、薬剤の水溶解度及び安定性を改良し（静脈内調製物、点眼薬等）、局所的な薬剤送達（例えば皮膚送達及び眼球送達）を改良し、薬剤（例えばペプチド）の化学／酵素安定性を改良し、又は薬剤の副作用を減らすために、より一般的には、治療用化合物Ｄの効力を高める目的で設計される。
【００２３】
用語「治療用化合物Ｄ」は、本明細書中で使用される場合、疾患に対して有益な効果を有する任意の薬剤、特定の疾患又は障害のための治療として将来使用されるか又は使用され得る任意の薬剤を指す。このことはさらに、まだ開発段階又は研究段階にあり、まだそれらの有効性及び安全性がわかっていない全ての分子を指す。これらとしては、有機低分子、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂肪族炭素鎖、芳香族化合物及びアナログ及び誘導体が挙げられる。
【００２４】
（末端）アミノ基を有する治療用化合物Ｄ、より詳しくは、一級又は二級アミノ基は、遊離アミノ基（一級又は二級）、すなわちＮＨＲ（−Ｒは水素又は当該技術分野で公知の任意の他の化学基であることができる）基を有する治療用化合物を指す。アミノ基は、飽和又は不飽和炭素を介して治療用化合物Ｄに、カルボニルにカップリングすることができるか、又は、アミノ基が含まれる他のさらに広い官能基（アミド、カルバメート等）の一部分であり得るが、それぞれの環境におけるアミノ基は、安定なアミド結合を形成するために、アミノ酸と反応可能である必要がある。特定の実施形態では、治療用化合物のアミノ基ＮＨＲは、アミン官能を有する官能基に属し、アミド又はカルバメートのようなさらに広い一般的な官能基に属さない。
【００２５】
治療薬物はさらに、リンカーを介してオリゴペプチドに対するリンカーであることができる。このリンカーは、アミノ基を含み、上に記載されるようなＮＨＲ基を含有する任意の有機構造であることができる。
【００２６】
「ＣＤ２６」は、本明細書中で使用される場合、膜結合及び遊離形態におけるジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＥＣ３．４．１４．５）を指す。ＣＤ２６の同義語は、ＤＰＰＩＶ、ＤＰＰ４、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ又はＡＤＣＰ２（アデノシンデアミナーゼ複合体化タンパク質２）である。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、ジペプチジル−ペプチダーゼは、ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性、すなわち基質中の第２のＣＯ−ＮＨアミド結合を開裂することによって基質側のアミノ末端側からジペプチドを除去する活性を有する酵素を指す。ＣＤ２６と匹
敵する活性及びタンパク分解特異性を有するＣＤ２６以外の他の酵素（すなわち、プロリルオリゴペプチダーゼ）は、「ジペプチジル−ペプチダーゼ」と称される。「ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ」はＣＤ２６を指す。
【００２８】
本明細書中で記載されるように、アミノ酸配列は標準的な規則に従って表され、すなわち、ペプチドのアミノ末端は左側に、カルボキシ末端は右側に現される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」又は「オリゴペプチド」は、アミド結合によって接続される２つ以上のアミノ酸に関する。治療用化合物Ｄと組み合わせて述べられる場合、ペプチド又はオリゴペプチドは、ペプチドのＣＯＯＨ基及び治療用化合物Ｄ又は治療用薬剤に接続するリンカー上のＮＨ2又はＮＨ基を起源とするアミド結合によって接続される２つ以上のアミノ酸を指す。ペプチドの長さは、−ペプチドの前のギリシャ文字の数によって示される（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド等）。［Ｘ−Ｙ］nと称される場合、それぞれの繰り返し単位［Ｘ−Ｙ］中の各Ｘ及びＹは、互いに独立して選択され、各繰り返し単位について独立して選択される。
【００３０】
本発明では、新規プロドラッグ技術は、治療用薬剤に対するペプチドのカップリングに基づいて提供され、この接合体のアミド結合はジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって開裂可能である。そのようなものとして、治療用化合物Ｄの溶解度、バイオアベイラビリティ及び効力は、概して、さらに広範囲に調整することができる。リンパ球表面の糖タンパク質ＣＤ２６は、膜に関連するペプチダーゼの固有の種類に属する。多様な機能性をもつアレイによって特徴付けられ、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ、ＥＣ３．４．１４．５）と同一である。ＤＰＰＩＶは、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ；ＥＣ３．４．２１．２６）ファミリーのメンバーであり、典型的なセリンプロテアーゼの群は、プロリル結合を加水分解することができる。７６６アミノ酸長のＣＤ２６は、単一の疎水性セグメントによって細胞の脂質二層膜に固定され、６個のアミノ酸の短い細胞質テールを有する［Ａｂｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）４０：３３１−３３８］。膜アンカーは、大きな細胞外グリコシル化領域、システイン豊富な領域及びＣ−末端触媒ドメインに結合する（Ａｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．上に引用）。ＣＤ２６は上皮細胞上（すなわち、腎臓の近位の細管、腸）で、及びいくつかの種類の内皮細胞及び線維芽細胞上で、及び白血球サブセット上で強力に発現される［Ｈｅｇｅｎ，Ｍ．Ｉｎ：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ．Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９７），ｐｐ．４７８−４８１］。ＣＤ２６はさらに、精液、血漿及び脳脊髄液中に存在する可溶化形態として生じる。これは細胞内テール及び膜間領域を有していない［Ｄｅ  Ｍｅｅｓｔｅｒ  ｅｔ
ａｌ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９９９）２０：３６７−３７５］。そのエキソペプチダーゼ活性に加えて、ＣＤ２６は、いくつかのタンパク質のその基質結合部位の外側［Ｔｒｕｇｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：細胞ｕｒｆａｃｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｅｎｎｙ，＆  Ｂｏｕｓｔｅａｄ，，ｅｄｓ．ＢＩＯＳ，（１９９７），ｐｐ．２０３−２１７］、フィブロネクチン［Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ（１９９６），１０（Ｓｕｐｐｌ．３）：３２］、コラーゲン［Ｌｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９５），２１７：３４１−３４８］に特異的に結合する。ＣＤ２６は、目的の（ジペプチジル）ペプチダーゼ触媒活性を有しており、種々の天然ペプチドのＮ−末端の末端から２番目の位置にプロリン又はアラニンをもつペプチドに対して高い選択性を有する。
【００３１】
いくつかのサイトカイン、造血増殖因子、神経ペプチド及びホルモンは、Ｎ−末端でＸ−Ｐｒｏ又はＸ−Ａｌａモチーフを共通で有し、酵素について効果的な基質として作用す
ることが示された［Ｄｅ  Ｍｅｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９９９）２０：３６７−３７５及びＭｅｎｔｌｅｉｎ  Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．（１９９９）８５：９−２４にまとめられている］。サブスタンスＰは、そのＨ−末端でＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］を含有する１１アミノ酸の天然ペプチドの例でさえあり、ＣＤ２６によってＡｒｇ−Ｐｒｏ及びＬｙｓ−Ｐｒｏの段階的な放出によって活性なヘプタペプチドに開裂される［Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９９２），２６０：１２５７−１２６１］。ＣＤ２６は、非常に小さな天然ペプチド［すなわち、ペンタペプチドエンテロスタチン（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］［Ｂｏｕｒａｓ
ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（１９９５），１６：３９９−４０５］からそれぞれそのアミノ末端にＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ及びＶａｌ−Ｐｒｏ配列を含有するさらに大きなペプチド［ケモカインランテス（ＲＡＮＴＥＳ）及びＳＤＦ−１α及びＩＰ−１０（６８〜７７アミノ酸）を含む］からジペプチドを切断することができる［Ｏｒａｖｅｃｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７），１８６：１８６５−１８７２；Ｐｒｏｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），２７３：７２２２−７２２７；Ｏｈｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９８），４３１：２３６−２４０；Ｐｒｏｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９８），４３２：７３−７６］。
【００３２】
比較的制限された基質特異性（末端から２番目がＰｒｏ又はＡｌａ）がＣＤ２６について観察されるが、末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏ又はＡｌａの代わりにＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＬｅｕの場合にさらに低い開裂速度がさらにいくつか観察された（Ｄｅ  Ｍｅｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．上に引用）。さらに、末端アミノ酸の性質は、ＣＤ２６の最終的な触媒効率において役割を果たす。ＣＤ２６によるペプチドの有効な切断のための網の末端での好ましい最初のアミノ酸について、疎水性（すなわち、脂肪族：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ及び芳香族Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）から塩基性（すなわち、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）から中性（すなわち、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ）から酸性（すなわち、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）のアミノ酸の順に好ましさが減少する（Ｄｅ  Ｍｅｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．上に引用）。さらに非天然アミノ酸が認識されＣＤ２６によるマクロファージから誘導されるケモカイン（ＭＤＣ）の２重切断が生じ、Ｇｌｙ1−Ｐｒｏ2の後にＴｙｒ3−Ｇｌｙ4が連続的に離れるという観察結果は、ＣＤ２６の基質活性が、一般的に受け入れられているよりも末端から２番目のＰｒｏ又はＡｌａに制限されていないことを示唆する［Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９），２７４：３９８８−３９９３］。
【００３３】
多くの他のヒドロラーゼ（ＥＣ３）、さらに特定的にはペプチダーゼ（ＥＣ３．４）、及びなおさらに特定的にはアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）、例えば、プロリルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．５）及びＸ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．９）は、すでに同定されている。さらに他のジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５）及びジペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４、このＥＣ−グループはさらにトリペプチジル−ペプチダーゼも含む）は、ＣＤ２６に隣接して存在する。ジペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．１）は、リソソーム中に生じ、コンセンサス配列Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3をもつペプチドからジペプチドを開裂するが、但し、Ｘ1がＡｒｇ又はＬｙｓであるか、又はＸ2又はＸ3がＰｒｏである場合、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１４．２）は、酸性ｐＨで最大活性をもち、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3をもつオリゴペプチド（好ましくはトリペプチド）からジペプチドを放出するリソソームペプチダーゼであり、ここで、Ｘ2は好ましくはＡｌａ又はＰｒｏである。ＤＰＰ  ＩＩＩ（ＥＣ３．４．１４．４）はサイトゾルペプチダーゼであり、４個以上の残基を含むペプチドからジペプチドを開裂するジペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．６）である。Ｘ−Ｐｒｏジペプチジル−ペプチダ
ーゼ（ＥＣ３．４．１４．１１）は、ＣＤ２６と同様の活性を有する微生物ペプチダーゼである。それらのいくつかは、ヒト及び他の哺乳動物中に見いだされ、一方、他のものは酵母及び真菌のような微生物によって産生される。それらは第１にアミノ酸配列が異なるだけではなく、認識するアミノ酸配列についての特異性が異なる。それに加えて、ＤＰＰＩＶを用いたデータベーススクリーニングは、新規なプロリン特異的なジペプチダーゼを明らかにした（ＤＰＰ８、ＤＰＰ９、ＤＰＰ１０）［Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｊ．（２００３）３７３，１７９−１８９］。これらのプロリン特異的なジペプチダーゼのほとんどは、リソソーム中で細胞内に生じ、酸性ｐＨで作用する。ＤＰＰＩＶのみが、細胞の外側で膜結合タンパク質として、又は分泌されるタンパク質として生じる。それ故に１つの実施形態によれば、本発明の化合物は、中性ｐＨで細胞外又は膜結合ジペプチジルペプチダーゼによって開裂される。
【００３４】
本発明は、ＣＤ２６のエキソジペプジル−ペプチダーゼ活性によってペプチジルプロドラッグ誘導体が効果的に親化合物に変換されることを示す。本発明はさらに、ペプチジルプロドラッグ誘導体が細胞外で親治療用化合物に加工されることを示す。
【００３５】
Ｌ−バリン部分がジペプチジルプロドラッグアプローチに関与し得るため、この技術は、顕著に水溶性が高くタンパク質結合の少ない親油性化合物を製造するためだけではなく、親分子の経口アベイラビリティ及び血漿送達を高めるために強力なツールを表し得る。この技術はさらに、親薬物をＣＤ２６を発現する細胞にさらに確実に選択的に送達するための強力なツールを表し得る。本発明は、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６）がポストプロリン又はポストアラニンジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有し、ポリペプチド又はタンパク質のＮ−末端からＸ−プロリン又はＸ−アラニンジペプチドを優先的に開裂させるという知識から誘導される。この観察の観点において、本発明は、薬剤の溶解度、血漿タンパク質結合及び／又はバイオアベイラビリティを調節するための新規なプロドラッグ技術を提供する。本発明の他の実施形態では、プロドラッグは、さらに選択的な標的薬剤のため、及び薬剤の脳及びリンパ送達を高めし、特に高め、及び／又は血漿中の薬剤半減期を延ばすために、送達される。本発明は、プロドラッグがジペプチジル−ペプチダーゼＣＤ２６又は同じ活性及びＣＤ２６と同じタンパク分解特異性を有する他の酵素によって開裂されることを特徴とする、新規プロドラッグを提供する。好ましい実施形態では、本発明のプロドラッグは、ジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６についての開裂部位を含有するアミノ酸を含むペプチド−治療用化合物接合体及びそれらの誘導体である。そのようにして、本発明はさらに、アミド結合を介してペプチドに接続する治療用化合物を含み、ジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって特異的に開裂される、治療用プロドラッグ組成物を提供する。
【００３６】
治療用化合物Ｄは、直接又はリンカー基を介してのいずれかでアミノ酸のカルボキシ基に接続することができる。好ましい実施形態では、治療用化合物Ｄ及びペプチドは、アミド結合を介して直接的にカップリングする。治療用化合物Ｄは、アミノ酸のカルボキシル基、さらに好ましくはα−カルボキシル基とカップリング可能な遊離アミノ基（一級又は二級）を有することができる。別の好ましい実施形態では、治療用化合物Ｄ及びペプチドはリンカーを介してカップリングし、このリンカーは非ペプチド性又はペプチド性を有することができる。治療用化合物Ｄとペプチドとの間の接続がリンカーを介してなされる場合、リンカーと第１のアミノ酸との接続は好ましくはアミド結合である。リンカーは、当業者に公知の任意の種類の結合及び化学基を介して、より好ましくは共有結合によって治療用化合物Ｄに接続してもよい。リンカーは、開裂後にも治療用化合物Ｄ上に残っていてもよいか、又は哺乳動物中に存在する薬物とのさらなる反応又は自己開裂工程のいずれかによって開裂後に除去されてもよい。リンカーの開裂に影響を与え得る外部薬剤としては、酵素、タンパク質、有機試薬又は無機試薬、プロトン及び他の薬剤が挙げられる。リンカーが薬剤に接続したままである実施形態では、リンカーは、ペプチドの開裂後に薬剤の
活性を実質的に阻害しない任意の基であることができる。他の実施形態では、リンカーは自己開裂する。自己開裂するリンカーは、ジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によるペプチドの開裂後に薬剤から開裂するように配置されるものである。リンカーの自己開裂に関与する機構は、例えば、分子内環化又は自然ＳN１加溶媒分解及びペプチド開裂の際の薬物の放出である。リンカーのいくつかの例は、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７：３７１−３８０）に提供される。リンカーは、一般的に、ペプチドのカルボキシ末端に結合してアミドを形成する一級アミンを含有する。リンカーはさらに、薬剤上に見いだされる一級アミンに結合してアミドを形成するカルボン酸を含有する。リンカーは、当業者に利用可能な反応から選択される１つ以上の反応によって薬剤にカップリングすることができる。
【００３７】
１つの実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なペプチド（ＣＤ２６によって開裂可能な構造［Ｘ−Ｙ］nを有する１つ以上の反復性のＸ−Ｙジペプチドからなる）と本発明の治療用化合物との間のリンカーは、１つ以上のアミノ酸を含み、さらに特定の実施形態では、一般構造［Ｘ−Ｙ］n−Ａmである。ここで、Ａは任意のアミノ酸である。［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドと連続したＡアミノ酸との間の結合は、ＣＤ２６タンパク質分解を可能にするアミド結合である。Ａアミノ酸間の結合は、アミド結合又はエステル結合のいずれかであることができ、Ａアミノ酸とプロドラッグとの結合は、アミド結合又はエステル結合又は当該技術分野で公知の任意の他の結合のいずれかであることができる。ｍは１〜１５の長さで変動することができる。１つの実施形態では、ｍは１であり、Ａはエステラーゼ又はアミノペプチダーゼによってプロドラッグから加水分解することができる。
【００３８】
１つの実施形態では、プロドラッグのタンパク質分解のために使用可能なプロテアーゼはＣＤ２６である。得られた実験データは、ＣＤ２６がジペプチド構造上で開裂することがわかる。その活性は、プロリンと薬剤部分とのアミド結合のすぐ後に治療用化合物Ｄの存在によって妨害されない。同じ内容で、ジペプチド又はポリペプチドと薬剤との間にさらなるペプチド又は他のリンカー分子を有することは必要ではない。さらに、異なる臓器上でのその組織（癌組織及び正常組織の両方）、腎臓、肺、副腎、空腸、肝臓、耳下腺、脾臓、睾丸及び皮膚、心臓、膵臓、脳、脊髄、血清）、及び異なる細胞種（例えば、胸腺細胞、内皮細胞、リンパ細胞、小グリア細胞）での発現（高いレベルから低いレベルまで）に起因して、いくつかの適用及びいくつかの治療提供を予想することができる。ペプチドのタンパク質分解の速度は、アミノ末端のアミノ酸及び／又は２番目のアミノ酸によって調整することができる。加水分解の調整とともに又は独立して、ペプチドプロドラッグの物理化学的特徴を調整することができる。
【００３９】
特に、プロドラッグ中のペプチドのアミノ末端は、Ｘ−Ｐｒｏ、Ｘ−Ａｌａ、Ｘ−Ｇｌｙ、Ｘ−Ｓｅｒ、Ｘ−Ｖａｌ、又はＸ−Ｌｅｕを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸又はそれらの異性体をあらわす（すなわち、Ｌ−又はＤ−配置）である。２番目の位置にヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、及びアジリジンカルボン酸を有する他のジペプチドもさらにＣＤ２６によって開裂可能である。好ましい実施形態では、ペプチドは、アミノ末端にＸ−プロリン又はＸ−アラニンを含む。そのようにして、アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン及びそれらの誘導体から選択することができる。さらに、改変された（すなわち、ヒドロキシルプロリン）又は非天然アミノ酸を含むことができる。別の好ましい実施形態では、ペプチドの長さは２〜１０アミノ酸であり、それ故に、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長を有することができる。別の好ましい実施形態では、ペプチドは［Ｘ−Ｙ］n繰り返し単位を含み、ここでＸは任意のアミノ酸を表
し、Ｙは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＬｅｕから選択され、ｎは、１、２、３、４又は５から選択される。別のさらに好ましい実施形態では、上記ペプチドはジペプチドである。なおさらに好ましい実施形態では、ジペプチドはＬｙｓ−Ｐｒｏである。別のなおさらに好ましい実施形態では、アミノ酸はＬ−配置を有する。本実験は、従来のキャッピング基または保護基を含有するプロドラッグのペプチドのアミノ末端が開裂しないか、又は非常に弱く開裂し、それによってＣＤ２６の基質であるとされないことを示すように見える。このようなキャッピング基としては、アセチル、スクシニル、ベンジルオキシカルボニル、グルタリル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、モルホリノカルボニル、メチル及び当該技術分野で公知の多くの他のものが挙げられる。１つの実施形態では、プロドラッグのペプチドの末端アミノ酸の末端アミノ基は、キャッピング基又は保護基を含有しない。本発明の特定の実施形態は、遊離末端アミノ基を有さないプロドラッグの使用を排除する。当業者は、接合体の溶解度、バイオアベイラビリティ及び標的化に関する良好なプロフィールを有するペプチドを達成するための置換をなすことができる。それ故に、本発明は、接合体がジペプチジル−ぺプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって開裂可能なままである限り、上述のようなペプチド配列、及びそれらのアナログ又は誘導体を含む。
【００４０】
別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なオリゴペプチド［Ｘ−Ｙ］nは、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸であるか、又は少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸であるペプチドである。さらに長いペプチド（ｎが３、４、５）の疎水性及び／又はタンパク質分解を調整するために、２つ以上のＸが所望の効果を達成するための特殊な種類の側鎖を有する。さらに、Ｙの選択は、プロドラッグのタンパク質分解速度、疎水性、溶解度、バイオアベイラビリティ及び効力に影響を与える。
【００４１】
なお別の実施形態では、一般構造［Ｘ−Ｙ］nを有するペプチドは、ＸＦ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ、ＸＦ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ、ＸＳ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ、ＸＳ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ、ＸＢ−Ｙ−Ｘ−Ｙ、Ｘ−Ｙ−ＸＢ−Ｙ及びＸＢ−Ｙ−ＸＢ−Ｙの群から選択される構造を有するテトラペプチド又はヘキサペプチド、又はＸＦ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ、ＸＳ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ、ＸＦ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ、ＸＦ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ、ＸＦ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ、ＸＳ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ、ＸＳ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ−ＸＦ−Ｙ及びＸＳ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ−ＸＳ−Ｙ、ＸＢ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｙ、ＸＢ−Ｙ−ＸＢ−Ｙ−Ｘ−Ｙ、Ｘ−Ｙ−ＸＢ−Ｙ−ＸＢ−Ｙ、ＸＢ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−ＸＢ−Ｙ及びＸＢ−Ｙ−ＸＢ−Ｙ−ＸＢの群から選択される構造を有するヘキサペプチドである。ここで、Ｆは速いことを表し、ＸＦはＣＤ２６によって迅速にジペプチドの放出を生じるアミノ酸（例えば芳香族アミノ酸及び疎水性アミノ酸）である。ここで、Ｓは遅いことを表し、ＸＳはＣＤ２６によるジペプチドの放出が遅いアミノ酸（例えば酸性アミノ酸及び中性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）である。ここで、Ｂは塩基性を表し、ＸＢは、電荷を有し疎水性のジペプチドの放出を調整する塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ）である。このような組み合わせは、プロドラッグに規定された疎水性とともに十分に規定された分解速度を与えるペプチドのテイラーメイドの組み合わせを可能にする。例えば、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ−Ｐｒｏジペプチドを有する疎水性プロドラッグの分解は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｐ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ：ＮＯ３］、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］テトラペプチドプロドラッグを生じるさらなる末端Ｇｌｙ−Ｐｒｏジペプチドの存在によって遅くすることができる。疎水性は、ヘキサペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］を導くさらなるＴｙｒ／Ｐｈｅ−Ｐｒｏジペプチドを添加することによってさらに増加させることができる。遅延放出性の電荷をもつペプチドプロドラッグが所望であり、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］はＧｌｙ−Ｐｒｏよりも好ましくあり得る。他の組み合わせは、当業者によって開発可能であり、テトラペプチド又はヘキサペプ
チドは、ＣＤ２６によるペプチドプロドラッグの溶解度及び分解速度の調整を可能にする。他の目的のために、プロリンはアラニンと交換することができる。消化されていないプロドラッグ、部分的に消化されたプロドラッグ、及び完全に消化されたプロドラッグの物理化学的性質及び分解速度は、逆相クロマトグラフィー上での保持時間を決定することによって評価することができる。
【００４２】
本発明のプロドラッグにおいて使用され得る治療用化合物としては、ペプチドに直接的又は間接的に接続可能で、接合体がジペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって開裂可能な任意の薬剤（タンパク質又はペプチド薬剤、例えば、ペプチドホルモンを除く）が挙げられる。公知の治療用化合物に加えて、本発明はさらに、現在薬剤開発中の新規な薬剤分子又はすでに臨床的に使用されている薬剤分子に適用することができる。別の好ましい実施形態では、治療用化合物Ｄは有機低分子であり、ペプチド、タンパク質、挿入剤又はオリゴヌクレオチド又はそれらのアナログ（例えば、ＨＮＡ、ＰＮＡ等）ではない。治療用分子は、心臓血管学、神経学、呼吸学、腫瘍学、代謝疾患、免疫学、泌尿器学、抗炎症、炎症及び全ての他の治療分野において活性を有することができる。なお別のさらに好ましい実施形態では、治療用化合物Ｄは、抗ウイルス活性を有する。なおさらに好ましい実施形態では、治療用化合物Ｄは抗−ＨＩＶ活性を有する。
【００４３】
好ましい薬剤／治療用化合物は、一級アミンを含有するもの、さらに特定的にはアミン官能基に属するものである。一級アミンの存在は、薬剤とペプチドとの間にアミド結合を形成することを可能にする。一級アミンは、一般的に提供されるように薬剤中に見出されてもよいか、又は化学合成によって薬剤に付加されてもよい。特定の治療用化合物は一級アミンを含有し、例えば、アミノ糖を含有するアントラサイクリン抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシ等である。アミン又はアミドを含有する抗ウイルス剤は、例えば、抗ヘルペス活性を有するグアニン誘導体、例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル及びロブカビル、シトシン誘導体、ゲムシタビン、ｄｄＣ、ａｒａＣ、ＨＰＭＰＣ（シドフォビル）及びラミブジン（３ＴＣ）、プロテアーゼインヒビター、アンプレナビル及びＤＭＰ８５０及び８５１である。他のものは、リバビリン、ＮＮＲＴＩ、ＴＭＣ１２５（チボテック−ヴィルコ（Ｔｉｂｏｔｅｃ−Ｖｉｒｃｏ）から）及びＡＧ１５４９（アグロン（Ａｇｏｕｒｏｎ）から）、ＰＭＰＡ（テノフォビル）、ＰＭＥＡ（アデフォビル）及びオセルタミビルである。本発明のプロドラッグに変換可能な他の治療用化合物は、例えば以下のものである：ＤＮＡ挿入剤、例えば、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アミノアクリジン（プロフラビン）；ＤＮＡバインダー、例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミノ白金ジクロリド）；ＤＮＡ鎖切断薬剤、例えば、ブレオマイシン；ホルモン、例えば、ノルアドレナリン；アルカノイド、例えば、プロカイン（ノボカイン）；抗うつ剤、たとえば、フェニルジン；神経伝達物質、例えば、ドーパミン及びＧＡＢＡ（γ−アミノブタン酸）；抗癌薬剤、例えば、ホスホラミドマスタード及びメトトレキサート；抗生物質、例えば、スルホンアミド（ベンゼンスルホンアミド、プロントシル、スルホニルアミド、スルファジアジン、スルファメトキシン等）及びアミノグリコシド、例えば、ストレプトマイシン；ビタミン、例えば、葉酸、テトラヒドロ葉酸等；抗マラリア薬剤、例えば、トリメトプリム；抗ハンセン病薬剤、例えば、スルホン。
【００４４】
ＦＤＡのＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＣＳ）によれば、薬剤基質は以下のように分類される：クラスＩ−高い浸透性、高い溶解度；クラスＩＩ−高い浸透性、低い溶解度；クラスＩＩＩ−低い浸透性、高い溶解度及びクラスＩＶ−低い浸透性、ｊ低い溶解度。この分類システムにおいてどのように薬剤が分類されるかは、ＢＣＳのガイドラインに記載されている。好ましい実施形態では、本発明において使用可能な治療用化合物ＤはクラスＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶから選択される。
【００４５】
本発明は、ジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能なプロドラッグを提供する。ジペプチジル−ペプチダーゼは、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４）、なおさらに特定的には、アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）、例えば、プロリルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．５）及びＸ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．９）の群から選択され、ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．５）及びジペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ．３．４．１４、このＥＣ−グループはさらにトリペプチジル−ペプチダーゼを含む）、例えば、ジペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．１）、ＩＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、ＩＩＩ（ＥＣ３．４．１４．４）、ＩＶ（ＥＣ３．４．１４．５）、ジペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．６）及びＸ−Ｐｒｏジペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．１１）の群から選択される。好ましい実施形態では、プロドラッグは、哺乳動物、又はさらに好ましくはヒト中に存在するジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能である。さらに好ましい実施形態では、プロドラッグは、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６）によって開裂可能であり、及び精液、血漿及び脳脊髄液中に存在する可溶性形態によるような細胞表面結合によって開裂可能である。２つの異なる種類のＣＤ２６の発生は、細胞膜での活性化のため、及び体液中での活性化のためのプロドラッグの適用を可能にする。
【００４６】
本発明はさらに、治療用化合物にペプチドをカップリングさせ、得られた接合体がジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって開裂可能な、治療用化合物Ｄの（水）溶解度、タンパク質結合及び／又はバイオアベイラビリティを調節（すなわち、増加、減少）するための方法を提供する。治療用化合物Ｄの任意の電荷は、アミノ酸の接合も含み、上記薬剤の溶解度及びバイオアベイラビリティプロフィールに明らかな影響を有する。しかし、本発明は、治療用化合物Ｄの活性プロフィールを変化させることなく、薬剤の溶解度及び／又はバイオアベイラビリティを改善する方法を提供する。他の化学基は、本発明のプロドラッグにカップリングしてもよく、プロドラッグを水にさらに可溶性にするものを含む。これらの基としては、多糖類又は他のポリヒドロキシル化部分が挙げられる。例えば、デキストラン、シクロデキストリン及びデンプンは、本発明のプロドラッグに含まれてもよい。
【００４７】
本発明はさらに、ジペプチジル−ペプチダーゼを発現する細胞、組織又は臓器に分子を標的するための方法を提供し、ただし、ジペプチジル−ペプチダーゼは、細胞表面で発現されるか、又は細胞外培地中に分泌される。ＣＤ２６は、種々の臓器中で発現される。主に上皮及び腺房細胞の先端表面上、及びリンパ球上及び毛細管内皮細胞上ではさらに低いレベルで発現される。ＣＤ２６は、胃腸管、胆汁管、外分泌膵臓、腎臓、子宮、胎盤、前立腺表皮、筋肉、副腎、耳下腺、汗腺、唾液腺、乳房腺中で、及び肝臓、脾臓、肺及び脳を含む試験される全ての臓器の上皮上で示された。１つの実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なプロドラッグは、非癌性障害又は機能不全の治療のために使用することができ、ここで、例えば、肝臓再生、肝臓機能不全、腎臓移植拒絶反応、脳炎又は骨粗しょう症のように、ＤＰＰＩＶレベルは増加する。
【００４８】
別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なプロドラッグは、過体重、糖尿、高脂血症のような代謝異常を治療又は予防するために使用することができ、さらに、血中のグルコース濃度が継続して高い結果の重篤な代謝アシドーシス及び真性糖尿病を治療又は予防するために使用することも可能である。
【００４９】
別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なプロドラッグは、ＣＤ２６が正常なレベルで生じる上述の組織のうちの１つの機能不全の任意の障害を治療又は予防するために使用することができる。
【００５０】
別の実施形態では、ＣＤ２６開裂可能なプロドラッグは、ＣＤ２６レベルが低いが、例えば、主要なうつ病、ｎｏｒｅｘａｉ及び神経性大食症、真性糖尿病、高血圧、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、妊娠、免疫抑制、ウイルス感染、例えばＨＩＶ、又は特定の癌、例えば、非肝臓性胃腸癌及び口腔扁平上皮癌がなお存在する条件下でさえ、上述の臓器又は組織のうちの１つの機能不全の任意の障害を治療又は予防するために使用することができる。
【００５１】
本発明はさらに、プロドラッグがジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６によって開裂可能なプロドラッグを製造する方法を提供する。プロドラッグを製造するこの方法は、治療的に活性な薬剤及びペプチドを接続させる工程を含む。さらに好ましい実施形態では、治療的に活性な薬剤又はペプチドは、その後の段階でアミド結合を介して治療用化合物Ｄとペプチドとを接続可能にするために、第１の段階で誘導体化される。特定の実施形態では、ペプチドは、薬剤に直接接続する。他の実施形態では、ペプチドは、薬剤に間接的に接続し、その接続はリンカーを介して生じる。それぞれの場合において、ペプチドのカルボキシ末端は接続のために使用される。カルボキシル基及びアミノ基をカップリングさせてアミド結合を形成する多くの受容可能な方法は、当業者に公知である。
【００５２】
本発明はさらに、ＴＳＡＯのプロドラッグを提供する。［１−［２’，５’―ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−３−（３−アミノ−プロピル）−チミン］−（Ｒ）（リボ）−３’−スピロ−５−（４−アミノ−１，２−オキサチオール−２，２−ジオキシド）（＝ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）のペプチドプロドラッグは、本発明によって提供される。バリン−、バリン−プロリン−及びバリン−プロリン−バリン−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ誘導体は、本発明によって提供される。
【００５３】
本発明はさらに、ＡｒａＣ、ドコソルビシン及びアシクロビルのプロドラッグを提供する。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）
【００５５】
【化１】
2006525235.tif 000002
【００５６】
のプロドラッグ化合物、それらの立体異性体形態及び塩に関し、
式中、
ｎは１、２、３、４又は５であり；
Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンであり；
Ｘは、Ｄ−配置又はＬ−配置における任意のアミノ酸から選択され；
各繰り返し単位［Ｘ−Ｙ］中の各Ｘ及びＹは、他と独立して、及び各繰り返し単位について互いに独立して選択され；
Ｚは、直接結合、又は１〜４個の炭素原子を有する二価の直鎖又は分枝の飽和炭化水素
基であり；
Ｒ1は、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールオキシＣ1〜4アルキル、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロシクロアルキルＣ1〜4アルキルオキシ、ヘテロアリールオキシＣ1〜4アルキル、ヘテロアリールＣ1〜4アルキルオキシであり；
Ｒ2はアリールＣ1〜4アルキルであり；
Ｒ3は、Ｃ1〜10アルキル、Ｃ2〜6アルケニル又はＣ3〜7シクロアルキルＣ1〜4アルキルであり；
Ｒ4は水素又はＣ1〜4アルキルであり；
アリールは、単独又は別の基と組み合わせて使用される場合、Ｃ1〜4アルキル、ヒドロキシ、Ｃ1〜4アルキルオキシ、ニトロ、シアノ、ハロ、アミノ、モノ−又はジ（Ｃ1〜4アルキル）アミノ及びアミドからなる群からそれぞれ個々に選択される１つ以上の置換基で場合により置換されたフェニルを意味し；
ヘテロアリールは、単独又は別の基と組み合わせて使用される場合、１つ以上の酸素、硫黄又は窒素ヘテロ原子を有する単環式又は二環式の芳香族ヘテロ環を意味し、これらの芳香族ヘテロ環は、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキルオキシ、アミノ、ヒドロキシ、アリール、アミド、モノ−又はジ（Ｃ1〜4アルキル）アミノ、ハロ、ニトロ、ヘテロシクロアルキル及びＣ1〜4アルキルオキシカルボニルからなる群から選択される置換基を有する１つ以上の炭素原子で場合により置換されてもよく、芳香族ヘテロ環はさらに、Ｃ1〜4アルキル又はアリールＣ1〜4アルキルによって二級窒素原子上で場合により置換されてもよく；
ヘテロシクロアルキルは、単独又は別の基と組み合わせて使用される場合、１つ以上の酸素、硫黄又は窒素ヘテロ原子を有する飽和又は部分的に不飽和の単環式又は二環式ヘテロ環を意味し、Ｃ1〜4アルキル、Ｃ1〜4アルキルオキシ、ヒドロキシ、ハロ及びオキソからなる群から選択される置換基を有する１つ以上炭素原子上で場合により置換されてもよく、芳香族ヘテロ環はさらに、Ｃ1〜4アルキル又はアリールＣ1〜4アルキルによって二級窒素原子上で場合により置換されてもよい。
【００５７】
基又は基の一部分としての用語Ｃ1〜4アルキルは、１〜４個の炭素原子を含有する直鎖及び分枝鎖の飽和一価炭化水素基を意味する。このようなＣ1〜4アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、第２級（ｓｅｃ）−ブチル、第３級（ｔｅｒｔ）−ブチル等が挙げられる。
【００５８】
基又は基の一部分としての用語Ｃ1〜6アルキルは、１〜６個の炭素原子を含有する直鎖及び分枝鎖の飽和一価炭化水素基を意味する。このようなＣ1〜6アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、第２級（ｓｅｃ）−ブチル、第３級（ｔｅｒｔ）−ブチル、２−メチルブチル、ペンチル、イソ（ｉｓｏ）−アミル、ヘキシル、３−メチルペンチル等が挙げられる。
【００５９】
基又は基の一部分としての用語Ｃ1〜10アルキルは、１〜１０個の炭素原子を含有する直鎖及び分枝鎖の飽和一価炭化水素基を意味する。このようなＣ1〜10アルキル基の例としては、Ｃ1〜6アルキル基の例及びヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、３−エチル−ヘプチル等が挙げられる。
【００６０】
基又は基の一部分としてのＣ2〜6アルケニルは、少なくとも１つの二重結合を有し、２〜６個の炭素原子を含有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を意味する。このようなＣ2〜6アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、２−メチル−１−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、３−メチル−２−ペンテニル等が挙げられる。
【００６１】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、単独又は別の基と組み合わせて使用される場合、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードに対する一般的な用語である。
【００６２】
用語Ｃ3〜7シクロアルキルは、単独又は別の基と組み合わせて使用される場合、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルに対する一般的な用語である。
【００６３】
治療用途のために、本発明のプロドラッグ化合物の塩は、対イオンが薬学的又は生理学的に受容可能なものである。しかし、薬学的に受容可能でない対イオンを有する塩もさらに、例えば、本発明の薬学的に受容可能な化合物の調製又は精製において、用途を見出し得る。全ての塩は、薬学的に受容可能であるかそうでないかに関わらず、本発明の範囲内に含まれる。
【００６４】
本発明のプロドラッグ化合物が形成可能な薬学的に受容可能又は生理学的に耐え得る酸付加塩の形態は、適切な酸、例えば、無機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸又は臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等；又は有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピリビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノ−サリチル酸、パモン酸を用いて簡便に調製することができる。
【００６５】
逆に、上記酸付加塩の形態は、適切な塩基を用いて処理することによって遊離塩基形態に変換することができる。
【００６６】
酸性プロトンを含有する本発明のプロドラッグ化合物はさらに、適切な有機塩基及び無機塩基を用いた処理によって非毒性金属付加塩又はアミン付加塩に変化されてもよい。適切な塩基の塩形態は、例えば、アンモニウム塩、四級アンモニウム塩、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等、有機塩基との塩、例えば、ベンザチン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩、ヒドラバミン塩、アミノ酸との塩、例えば、アルギニン塩、リシン塩等を含む。
【００６７】
逆に、上記延期付加塩の形態は、適切な酸を用いて処理することによって遊離酸形態に変換することができる。
【００６８】
用語「塩」はさらに、本発明のプロドラッグ化合物が形成可能な水和物及び溶媒付加形態を含む。このような形態の例は、例えば、水和物、アルコレート等である。用語「塩」はさらに、本発明の化合物の窒素原子の四級化を含む。塩基性窒素は、例えば、低級ハロゲン化アルキル、ジアルキルサルフェート、長鎖ハロゲン化物及びアリールアルキルハロゲン化物を含む、当業者に公知の任意の薬剤で四級化することができる。
【００６９】
本発明のプロドラッグ化合物はさらに、それらの互変異性体形態で存在してもよい。このような形態は、上述の式中に明確に示されてはいないが、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００７０】
１つの実施形態では、−（Ｙ−Ｘ）nのペプチド結合の末端アミノ酸の末端アミノ基は、場合により、アセチル、スクシニル、ベンジルオキシカルボニル、グルタリル、モルホリノカルボニル及びＣ1〜4アルキルから選択される１つ又は２つのキャッピング基を含有してもよい。
【００７１】
１つの実施形態では、それぞれのＸは独立して、天然に生じるアミノ酸から選択される。
【００７２】
１つの実施形態では、それぞれのＸは独立して、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸である。
【００７３】
１つの実施形態では、それぞれのＹは独立して、プロリン、アラニン、グリシン、バリン又はロイシンであり；好ましくはそれぞれのＹは独立して、プロリン又はアラニンである。
【００７４】
１つの実施形態では、ｎは１、２又は３である。
【００７５】
１つの実施形態では、Ｒ1は、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ1〜4アルキルオキシ、アリール又はアリールオキシＣ1〜4アルキルである。
【００７６】
１つの実施形態では、Ｒ1は、ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラニル−オキシテトラヒドロフラニル−オキシ、キノリニル、チアゾリルメチルオキシ、アリール、アリールオキシメチルである。
【００７７】
１つの実施形態では、Ｒ1は、ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−イル−オキシ、テトラヒドロフラン−３−イル−オキシ、キノリン−２−イル、チアゾール−５−イルメチルオキシ、３−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル、２，６−ジメチルフェノキシメチルである。
【００７８】
１つの実施形態では、Ｒ1は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−イル−オキシ、（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イル−オキシ、キノリン−２−イル、チアゾール−５−イルメチルオキシ、３−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル、２，６−ジメチルフェノキシメチルである。
【００７９】
化合物の目的の基は、以下の制限を適用するそれらの式（Ｉ）の化合物のそれらの基である：
・ｎは１、２又は３であり；
・Ｙはプロリンであり；
・それぞれのＸは独立して、バリン、アスパラギン酸、リシン又はプロリンから選択され；
・Ｚはメチレンであり；
・Ｒ1はヘテロシクロアルキルオキシであり；
・Ｒ2はフェニルメチルであり；
・Ｒ3はＣ1〜10アルキルであり；
・Ｒ4は水素である。
【００８０】
目的の化合物は、Ｒ2がフェニルメチルである、式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８１】
目的の化合物は、Ｒ3がＣ1〜4アルキル、特にＲ3がイソブチルである、式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８２】
目的の化合物は、Ｒ4が水素である、式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８３】
目的の化合物は、Ｒ2がフェニルメチルであり；Ｒ3がイソブチルであり、Ｒ4が水素である、式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８４】
目的の化合物は、Ｚ4がメチレンである、式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８５】
目的の化合物は、Ｒ1が、ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラニル−オキシ、テトラヒドロフラニル−オキシ、キノリニル、チアゾリルメチルオキシ、アリール、アリールオキシメチルであり；Ｒ2がフェニルメチルであり；Ｒ3がイソブチルであり、Ｒ4が水素である、式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８６】
化合物の特定の群は、
ｎは１、２又は３であり；
Ｙはプロリン又はアラニンであり；
それぞれのＸは独立して、天然に生じるアミノ酸から選択され；
Ｚは直接結合又はメチレンであり；
Ｒ1は、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ1〜4アルキルオキシ、アリール又はアリールオキシＣ1〜4アルキルであり；
Ｒ2はフェニルメチルであり；
Ｒ3はイソブチルであり；
Ｒ4は水素である、
式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８７】
さらに、化合物の特定の群は、
ｎは１、２又は３であり；
Ｙはプロリンであり；
それぞれのＸは独立して天然に生じるアミノ酸から選択され；
Ｚはメチレンであり；
Ｒ1は、ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラニル−オキシ、テトラヒドロフラニル−オキシ、キノリニル、チアゾリルメチルオキシ、アリール、アリールオキシメチルであり；
Ｒ2はフェニルメチルであり；
Ｒ3はイソブチルであり；
Ｒ4は水素である、
式（Ｉ）の化合物又は任意の規定されたそれらのサブグループである。
【００８８】
式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）の治療用化合物のためのプロドラッグであり、
【００８９】
【化２】
2006525235.tif 000003
【００９０】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＺは式（Ｉ）の化合物及び異なる実施形態において定義されるとおりである。
【００９１】
式（Ｉａ）のこれらの治療用化合物は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害活性を有することが知られており、ＥＰ６５６８８７、ＥＰ７１５６１８、ＥＰ８１０２０９、ＵＳ５７４４４８１、ＵＳ５７８６４８３、ＵＳ５８３０８９７、ＵＳ５８４３９４６、ＵＳ５９６８９４２、ＵＳ６０４６１９０、ＵＳ６０６０４７６、ＵＳ６２４８７７５、ＷＯ９９／６７４１７に記載され、これらすべては本明細書中に参照として組み込まれる。
【００９２】
いくつかの治療用化合物がＨＩＶの複製のインヒビターであることに起因して、上記治療用化合物のプロドラッグ化合物は、ＨＩＶに感染した温血動物、特に、ヒトの治療において有用である。本発明の化合物で予防又は治療され得るＨＩＶに関連する状態としては、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連合併症（ＡＲＣ）、持続性全身性リンパ節腫脹（ＰＧＬ）、及びレトロウイルスによって生じる慢性ＣＮＳ疾患、例えば、ＨＩＶによって媒介される痴呆及び多発性硬化症が挙げられる。
【００９３】
それ故に、本発明の抗ＨＩＶ治療用化合物のプロドラッグ化合物は、上述の状態を治療する方法に対して、又はそれらの方法における医薬として使用されてもよい。医薬としての上記使用又は治療方法は、治療的に有効量の抗ＨＩＶ治療用下等物をＨＩＶに感染した温血動物、特にＨＩＶに感染したヒトに対して全身投与することを含む。結果として、本発明の化合物のプロドラッグは、ＨＩＶ感染に関連する状態を治療するのに有用な医薬の製造において使用することができる。
【００９４】
本発明の化合物の立体化学的な異性体形態との用語は、本明細書中で使用される場合、本発明の化合物が有し得る、同じ結合順序で結合した同じ原子で作られるが、互変可能ではない異なる三次元立体構造を有する全ての可能な化合物を定義する。他に言及又は指示されない限り、化合物の化学的な記号は、上記化合物が有し得る、全ての可能な立体化学的な異性体形態の全ての混合物を包含する。上記混合物は、上記化合物の基本的な分子構造の全てのジアステレオマー及び／又はエナンチオマーを含有してもよい。純粋形態または互いの混合物における本発明の化合物の全ての立体化学的な異性体形態は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００９５】
上記化合物及び中間体の純粋な立体異性体形態は、上記化合物又は中間体の同じ基本的な分子構造の他のエナンチオマー形態又はジアステレオマー形態を実質的に含まない異性体として定義される。特に、用語「立体異性体的に純粋な」は、少なくとも８０％の立体異性体過剰（すなわち、１つの異性体が最少で８０％であり、他の可能な異性体が最大で２０％である）から１００％の立体異性体過剰（すなわち、１つの異性体が１００％であり、他の異性体が存在しない）までの化合物又は中間体、さらに特定的には、９０％〜１００％の立体異性体過剰を有する化合物又は中間体、なおさらに特定的には、９４％〜１００％の立体異性体過剰を有する化合物又は中間体、最も特定的には９７％〜１００％の立体異性体過剰を有する化合物又は中間体に関する。用語「エナンチオマー的に純粋な」及び「ジアステレオマー的に純粋な」は同様の様式で理解されるべきであるが、問題の混合物についてそれぞれエナンチオマー過剰及びジアステレオマー過剰に関するものである。
【００９６】
本発明の化合物及び中間体の純粋な立体異性体形態は、当該技術分野で公知の手順を適用することによって得てもよい。例えば、エナンチオマーは、光学的に活性な酸とのそれらのジアステレオマー塩の選択的な再結晶化によって、互いに分離されてもよい。あるいは、エナンチオマーは、キラル固定相を用いるクロマトグラフィー技術によって分離されてもよい。上記の純粋な立体化学的な異性体形態はさらに、適切な出発物質の対応する純
粋な立体化学的な異性体形態から誘導されてもよいが、但し、反応は立体特異的に行う。好ましくは、特定の立体異性体が望ましい場合、上記化合物は立体特異的な調製方法によって合成される。これらの方法は、エナンチオマー的に純粋な出発物質を有利に使用する。
【００９７】
本発明の化合物のジアステレオマーのラセミ体は、従来の方法によって別個に得ることができる。有利に使用され得る適切な物理的分離方法は、例えば、選択的結晶化及びクロマトグラフィー、例えば、カラムクロマトグラフィーである。
【００９８】
上記化合物は、１つ以上の不斉中心を含有してもよく、異なる立体異性体形態として存在してもよい。上記化合物中に存在し得るそれぞれの不斉中心の絶対配置は、Ｒ及びＳの立体化学記述子によって示されてもよく、このＲ及びＳの記号は、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９７６，４５，１１−３０に記載される規則に対応する。
【００９９】
本発明はさらに、本発明の化合物上に存在する原子の全ての同位体を含むことが意図される。同位体としては、原子数が同じであるが、異なる質量数を有する原子が挙げられる。一般的で限定されない例を用いて、水素の同位体としては、トリチウム及び重水素が挙げられる。炭素の同位体としては、Ｃ−１３及びＣ−１４が挙げられる。
【０１００】
概して、式（Ｉａ）の治療用化合物は、ＥＰ６５６８８７、ＥＰ７１５６１８、ＥＰ８１０２０９、ＵＳ５７４４４８１、ＵＳ５７８６４８３、ＵＳ５８３０８９７、ＵＳ５８４３９４６、ＵＳ５９６８９４２、ＵＳ６０４６１９０、ＵＳ６０６０４７６、ＵＳ６２４８７７５、ＷＯ９９／６７４１７に記載されるように調製することができる。
【０１０１】
式（Ｉ）のプロドラッグ化合物は、当該技術分野で公知のペプチド化学を用いて式（Ｉａ）の治療用化合物から出発して調製することができる。
【０１０２】
【化３】
2006525235.tif 000004
【０１０３】
たとえば、アミノ酸は、治療用化合物Ｄにカップリングして、スキーム１に示されるようなペプチド結合を形成してもよい。このカップリング反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン又は試薬を可溶化する任意の他の溶媒のような適切な反応不活性溶媒中で、式ＰＧ−Ｙ−ＯＨ（ここで、ＰＧ（保護基）は、例えば、Ｂｏｃ（第３級（ｔｅｒｔ）−ブチルオキシカルボニル）、Ｃｂｚ（
ベンジルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃである）のアミノ保護されたアミノ酸を用いて、カップリング剤、例えば、ＤＣＣ（ジクロロヘキシルカルボジイミド）又はＥＤＣＩ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）及びＨＯＡｔ（１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）又はそれらの機能等価体の存在下で行われてもよい。次いで、このように形成されたペプチドは、従来の脱保護技術、例えば、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を用いた脱保護を用いて脱保護されてもよい。
【０１０４】
このカップリング反応工程及び後に続く脱保護反応工程は、所望のペプチド結合を形成するための試薬としてＰＧ−Ｘ−ＯＨを用いて繰り返すことができる。
【０１０５】
アミノ酸のいくつか、例えばリシン及びアスパラギン酸は、第２の保護基を必要とする場合があり、式ＰＧ−（ＸＰＧ）−ＯＨ又はＰＧ−（ＹＰＧ）−ＯＨであらわすことができる。
【０１０６】
または、式ＰＧ−Ｘ−Ｙ−ＯＨ、又はＰＧ−（Ｘ）n−ＯＨ、又はＰＧ−（Ｘ）n−Ｙ−ＯＨ、又はＰＧ−（Ｘ−Ｙ）tの試薬は、上述の反応手順において使用することができる。
【０１０７】
上に表される調製において、反応生成物は、反応媒体から単離されてもよく、必要な場合、当該技術分野で一般的に知られている方法論、例えば、抽出、結晶化、蒸留、磨砕及びクロマトグラフィーに従ってさらに精製されてもよい。本明細書中上で記載されるプロセスにおいて調製されるような本発明の化合物は、立体異性体形態の混合物として合成されてもよく、特に、別個の以下に示す当該技術分野で公知の解決手順から分離可能なエナンチオマーのラセミ体混合物の形態で合成されてもよい。本発明のラセミ体化合物は、好適なキラル酸との反応によって対応するジアステレオマー塩形態に変換されてもよい。上記ジアステレオマー塩形態は、その後、例えば、選択的結晶化又はフラクションの結晶化によって分離され、エナンチオマーはアルカリによってそれらから遊離する。本発明の化合物のエナンチオマー形態を分離する代替の様式は、キラル固定相を用いる液体クロマトグラフィーを含む。上記純粋な立体化学的な異性体形態はさらに、適切な出発物質の対応する純粋な立体化学的な異性体形態から誘導されてもよいが、但し、反応は立体特異的に行う。好ましくは、特定の立体異性体が望ましい場合、上記化合物は立体特異的な調製方法によって合成される。これらの方法は、エナンチオマー的に純粋な出発物質を有利に使用する。
【０１０８】
本発明の化合物は、医薬、とりわけ、互いの混合物において、又は薬学的調製物の形態において、動物、特に哺乳動物、特にヒトにおいて使用することができる。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、上に記載されるように、本発明のプロドラッグ技術を用いることによって、組織又は細胞を産生するジペプチジル−ペプチダーゼを検出する方法を提供する。この方法は、検出可能に標識された本発明のペプチドと、標的組織とを、ジペプチジル−ペプチダーゼ、例えばＣＤ２６がペプチドを開裂し、検出可能な標識を放出可能なように十分な時間、接触させることによって行われる。次いで、検出可能な標識が検出される。次いで、検出のレベルを、標的組織と接触していないコントロールサンプルのレベルと比較する。光学的に基づく標識、色素体、化学発光、蛍光又はリン光標識、及び放射能標識、例えば、α、β又はγ発光標識を含む、例えば、検出可能な標識の多くの改変体が利用可能である。蛍光標識の例としては、アミン含有クマリン、例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチル、及び他のアミン含有蛍光体、例えば、６−アミノキノリン、２−アミノプリン、及びローダミン（ローダミン１１０を含む）が挙げられる。放射能標識の例としては、3Ｈ、14Ｃ及び125Ｉのようなβ発光体が挙げられる。色素標識（特徴的な吸収スペクトルを有するもの）の例としては、ニト
ロ芳香族化合物、例えばｐ−ニトロアニリンが挙げられる。化学発光標識の例としては、リシフェリン、例えば、６−アミノ−６−デオキシルシフェリンが挙げられる。
【０１１０】
好ましくは、検出可能な標識の選択は、迅速な検出及び容易に解釈可能な決定を可能にする。本発明において使用するための検出可能な標識は、好ましくは、開裂状態と未開裂状態とからの検出値間で明確に検出可能な差異を示す。
【０１１１】
本発明は、ジペプチジル−ペプチダーゼ、さらに好ましくはＣＤ２６の過剰発現又は低い発現にかかわる障害を検出するための方法を提供し、この方法は、ジペプチジル−ペプチダーゼ産生に関連する障害を有することが疑われる細胞とプロドラッグとを接触させる工程と、ペプチドの開裂を検出する工程とを含む。ジペプチジル−ペプチダーゼと反応性のペプチドは、ジペプチジル−ペプチダーゼによる開裂を検出することができる化合物で標識される。本発明の目的のために、プロドラッグは、生体液及び組織、例えば、唾液、血液又は尿における酵素的に活性なジペプチジル−ペプチダーゼのレベルを検出するために使用されてもよい。疑いのある細胞中のジペプチジル−ペプチダーゼのレベルを、正常細胞中のレベルと比較して、その被検体が、ジペプチジル−ペプチダーゼ産生に関連する細胞障害を有しているか否かを決定することができる。
【０１１２】
本発明はさらに、本発明において使用するための潜在的なプロドラッグを選択する方法を提供する。この方法は、一般的に、本発明のプロドラッグとジペプチジル−ペプチダーゼ又は組織又は細胞が産生するジペプチジル−ペプチダーゼとを、及び平行実験においてジペプチジル−ペプチダーゼを含まない培地とを接触させる工程からなる。
【０１１３】
本発明の特定の実施形態では、上に記載されるプロドラッグは、医薬として使用することができる。別の実施形態では、上に記載されるプロドラッグは、特定の疾患を予防又は治療するための医薬を製造するために使用することができる。治療される疾患は、プロドラッグ技術において使用される治療用薬剤に依存する。
【０１１４】
本発明はさらに、本発明によって記載されるようなプロドラッグを投与することによって特定の疾患を治療する方法を提供する。本発明のプロドラッグ及び／又はそれらのアナログ又は誘導体は、ヒト、非ヒト動物及び哺乳動物を含む任意の宿主に、障害を治療するのに有効量で投与することができる。
【０１１５】
本発明のプロドラッグの薬動力学的プロフィールをさらに最適化するために、それらは、疾患部位で、必要な濃度のプロドラッグ又は治療用化合物Ｄを維持するのに有用な、好適な送達ビヒクル（例えば、マイクロカプセル、微小球、生分解性ポリマーフィルム、脂質ベースの送達系、例えば、リポソーム及び脂質フォーム、粘稠性の点滴及び被吸収性の機械的障壁）と組み合わせて投与することができる。
【０１１６】
プロドラッグ又は「医薬」は、当業者内で任意の好適な方法によって投与されてもよい。治療用薬剤のための当該技術分野で公知の投与モードとしては、非経口、例えば、静脈内（例えば、抗体インヒビターのための）、腹腔内、皮内、及び皮下及び皮内を含む表皮、経口、又は、例えば、エアロゾス懸濁物の吸入を用いた鼻腔内投与による、及び被検体における筋肉又は他の組織に移植することによる、粘膜表面に対する適用が挙げられる。
【０１１７】
座剤及び局所的に適用される調製物はさらに考慮に入れられる。投与の経路及び場所によって、プロドラッグの疎水性又は親水性ペプチド部分も考慮に入れることができる。
【０１１８】
本発明では、プロドラッグは、投与経路によって、特定の疾患を予防、低減又は治療するのに十分な量で導入される。
【０１１９】
本発明の方法においてプロドラッグ又は「医薬」のための最も有効な投与モード及び投薬法は、治療される疾患の重篤度、被検体の健康、以前の病歴、年齢、体重、身長、性別及び治療に対する応答及び治療する外科医の判断に依存する。それ故に、投与されるプロドラッグの量、及び後に続く投与の数及びタイミングは、個々の被検体の応答に基づく医学的な専門家が行う治療によって決定される。最初に、このようなパラメーターは、安全性及び有効性についての動物モデルにおける適切な試験、及びプロドラッグ配合物の臨床トライアル中のヒト被検体における適切な試験を用いて熟練者によって容易に決定される。投与後、プロドラッグを用いた治療の有効性は、臨床的な写真の評価を含む種々の方法によって評価される。
【０１２０】
上記組成物及びそれらの配合物において使用するための好適な薬学的キャリアは当業者に周知であり、本発明内の選択に対して特に制限はない。当業者に公知の好適なキャリア又は賦形剤は、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、Ｈａｎｋ溶液、固定化油、オレイン酸エチル、５％デキストロース食塩水、等張性及び化学安定性を高める基質（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）、バッファー及び保存剤である。他の好適なキャリアとしては、組成物、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸及びアミノ酸コポリマーを受ける個々に対して有害な抗体をそれ自身が誘発しない任意のキャリアが挙げられる。それらのキャリアとしてはさらに、添加物、例えば、湿潤剤、分散剤、粘着剤、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング、抗バクテリア剤及び抗カビ剤（例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）等が挙げられてもよいが、但し、これらは、薬学的手法が一致していること、すなわち、哺乳動物に対して永久的な障害を与えないキャリア及び添加物であることが必要である。本発明の薬学的組成物は、例えば、選択されたキャリア物質を用いて均一に混合し、一段階又は複数段階の手順において活性成分をコーティング及び／又は顆粒化することによって、任意の公知の様式で調製されてもよく、適切な場合、他の添加物、例えば、表面活性剤はさらに、例えば、通常は約１〜１０μｍの直径を有する微小球の形態で得るために、すなわち、活性成分の放出制御又は遅延放出のためのマイクロカプセルを製造するために、イニクロニゼーション（ｉｎｉｃｒｏｎｉｓａｔｉｏｎ）によって調製されてもよい。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物において使用される好適な表面活性剤は、良好な乳化性、分散性、及び／又は湿潤性を有する非イオン性、カチオン性及び／又はアニオン性物質である。好適なアニオン性界面活性剤としては、水溶性石鹸及び水溶性合成表面活性剤が挙げられる。好適な石鹸は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）の置換されていないか又は置換されたアンモニウム塩であり、例えば、オレイン酸又はステアリン酸のナトリウム塩又はカリウム塩であるか、又はココナッツ油又はタロー油から得られる天然脂肪酸混合物のナトリウム塩又はカリウム塩である。合成界面活性剤としては、ポリアクリル酸のナトリウム塩又はカルシウム塩；脂肪酸スルホネート及びサルフェート；スルホネート化ベンズイミダゾール誘導体及びアルキルアリールスルホネートが挙げられる。脂肪酸スルホネート又はサルフェートは、通常は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の形態であり、置換されていないアンモニウム塩、又は８〜２２個の炭素原子を有するアルキル又はアシル基で置換されたアンモニウム塩であり、例えば、リグノスルホン酸又はドデシルスルホン酸のナトリウム塩又はカルシウム塩、又は天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールサルフェートの混合物、硫酸エステル又はスルホン酸エステルのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウムラウリルサルフェート）及び脂肪族アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸である。好適なスルホネート化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは、８〜２２個の炭素原子を含有する。アルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸又はジブチル−ナフタレンスルホン酸又はナフタレン−スルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウム又はアルカノールアミン塩である。さらに好適なのは、対応するホ
スフェート、例えば、リン酸エステル塩、及びｐ−ノニルフェノールとエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシドとの付加物、又はリン脂質である。個の目的のための好適なリン脂質は、天然（動物細胞又は植物細胞起源）又はセファリンまたはレシチン型の合成リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リゾレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジル−コリン、ジパルミトイルホスガチジル−コリン及びそれらの混合物である。
【０１２２】
好適な非イオン性界面活性剤としては、分子中に少なくとも１２個の炭素原子を含有する、アルキルフェノール、脂肪族アルコール、脂肪酸、脂肪族アミン又はアミドのポリエトキシレート化及びポリプロポキシレート化誘導体、アルキルアレンスルホネート及びジアルキルスルホスクシネート、例えば、脂肪族及び環状脂肪族アルコールのポリグリコールエーテル、飽和及び不飽和の脂肪酸及びアルキルフェノールが挙げられ、上記誘導体は、好ましくは、３〜１０個のグリコールエステル基及び（脂肪族）炭化水素部分に８〜２０個の炭素原子、及びアルキルフェノールのアルキル部分に６〜１８個の炭素原子を含有する。さらに好適な非イオン性界面活性剤は、１〜１０個の炭素原子をアルキル鎖中に含有するポリエチレンオキシドとポリプロピレングリコール、エチレンジアミノポリプロピレングリコールとの水溶性付加物であり、この付加物は、２０〜２５０個のエチレングリコールエーテル基及び／又は１０〜１００プロピレングリコールエーテル基を含有する。このような化合物は、通常は、プロピレングリコール単位あたり、１〜５個のエチレングリコール単位を含有する。非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール及びオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート）、グリセロール、ソルビタン、スクロース及びペンタエリスリトールはさらに、好適な非イオン性界面活性剤である。
【０１２３】
好適なカチオン性界面活性剤としては、場合によりハロ、フェニル、置換フェニル又はヒドロキシで置換された、炭化水素基を有する四級アンモニウム塩、好ましくはハロゲン化物であり；例えば、少なくとも１つのＣ８Ｃ２２アルキル基（例えば、セチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイル等）をＮ−置換基として含有し、さらなる置換基として、置換されていないか又はハロゲン化された低級アルキル、ベンジル及び／又はヒドロキシ低級アルキル基を含有する四級アンモニウム塩が挙げられる。
【０１２４】
本目的のために好適な表面活性剤のさらに詳細な記載は、例えば、「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｆｆｉｅｒｓ  Ａｎｎｕａｌ」（ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｒｏｐ．，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ−Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９８１）、「Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ」、２ｄ  ｅｄ．（Ｍａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｉｅｎｎａ，１９８１）及び「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ
Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）に見出され得る。
【０１２５】
さらなる成分は、組成物中の活性成分の作用の持続時間を制御するために含まれてもよい。制御放出組成物は、適切なポリマーキャリア、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセテートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プロタミンサルフェート等を選択することによって達成されてもよい。薬剤放出の速度及び作用の持続時間はさらに、活性成分を粒子、例えば、ポリマー性基質、例えば、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリニエチルメタクリレート及び他の上述のポリマーのマイクロカプセルに組み込むことによって制御されてもよい。
【０１２６】
このような方法としては、リポソーム、微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル等のようなコロイド薬剤送達システムが挙げられる。投与経路によって、薬学的組成物としては、保護コーティングを必要とする場合がある。注射可能な使用のために好適な薬学的形態としては、滅菌水溶液又は非水溶液又は分散液（分散物、エマルション）及びそれらを即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。それ故に、この目的のための典型的なキャリアとしては、生体適合性の水性バッファー、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル等及びそれらの混合物が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー、又は固定化油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体及び栄養補充液、電解液補充液（例えば、リンガー、デキストロースに基づくもの）等が挙げられる。保存剤及び他の添加物はさらに、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、及び不活性ガス等が存在することができる。
【０１２７】
本発明は、好ましい実施形態において、細胞表面上又は血漿中に存在するジペプチジル−ペプチダーゼのための有効な基質として作用する薬剤のジ−及びオリゴペプチジル誘導体を提供する。たとえば、水溶性の、親油性薬剤を（極性の）ジ−及びオリゴペプチドに接続することによって、これらの薬剤は、生体液及び生理学的媒体中でさらに水溶性になるが、腸管のｈＰＥＰＴ−１及び関連するペプチドトランスポーターによる特異的な認識に起因して（経口）バイオアベイラビリティーを得る場合もある。ヌクレオシドアナログのバリン誘導体、例えば、バルアシクロビル及びバルガンシクロビルは、ｈＰＥＰＴ−１のための基質であるヌクレオシドプロドラッグの例であり、腸管の上皮刷子縁膜ペプチド−キャリアが媒介する輸送に起因して、それらの溶解度、吸収及び全身アベイラビリティは、親化合物と比較して顕著に向上する。従って、本発明の１つの実施形態によれば、本発明のプロドラッグは、アミノ末端にバリンを有するジペプチド又はテトラペプチドを有するＣＤ２６開裂可能なプロドラッグであるか、又は第１及び／又は第３のアミノ酸がバリンであるテトラペプチドを有するＣＤ２６開裂可能なプロドラッグである。（オリゴ）ペプチド部分におけるアミノ酸の数及び性質を調整することは、プロドラッグ分子のジペプチジル−ペプチダーゼ（例えばＣＤ２６）感受性に影響を与えるが、水溶解度、血漿タンパク質結合及びバイオアベイラビリティ、及び血漿での半減期の程度にも影響を与える。アミノ酸組成物は、特定の薬剤の性質及び生物学的適用において最適化することができる。
【０１２８】
ジペプチジルペプチダーゼは、ペプチドのアミノ末端に遊離アミノ基を必要とし、開裂されるペプチドのアミノ酸がＬ−配置であることを必要とする。Ｌ−アミノ酸を有する改変されていないジペプチドは、プロドラッグの作成のための分野において使用される他のグループと比較して毒性が低い。従って、ある実施形態によれば、本発明のプロドラッグは、保護するジペプチジル基を放出した際に副作用の低いプロドラッグの作成を可能にする。
【０１２９】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲において記載される発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３０】
ＴＳＡＯプロドラッグ
実施例１：精製ＣＤ２６によって、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯを、親化合物ＮＡＰ−ＴＳＡＯ及びＶａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯに変換
脂溶性のＮ3−アミノプロピル置換されたＴＳＡＯ−ｍ3Ｔヌクレオシド誘導体ＮＡＰ−
ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−２１２）を、ジ／トリペプチドの遊離カルボン酸末端を介して、ジペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ及びトリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｒに化学的に接続し、ＣＡＭ−４０５（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）及びＣＡＭ−４３１（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）を得た（図１）。ＣＤ２６がこのような脂溶性ヌクレオチドアナログ合成ジ／トリペプチド誘導体を基質として認識するか否かを明らかにするために、５０μＭ  ＣＡＭ−４０５又はＣＡＭ−４３１を精製ＣＤ２６の５．７ｍＵｎｉｔにさらし、ＣＡＭ−４０５又はＣＡＭ−４３１のそれぞれＣＡＭ−２１２又はＣＡＭ−４０３（Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）への変換をＨＰＬＣ分析によってインキュベーション時間の関数で記録した。形成されたＣＡＭ−２１２生成物の同定は、コントロールとして参照親化合物と用いたＨＰＬＣ分析によって、及びマススペクトロメトリーによって明らかになった。本願発明者らは、ＣＤ２６が効果的にＣＡＭ−４０５からジペプチドＶａｌ−Ｐｒｏを除去し、親化合物ＣＡＭ−２１２が時間によって現れてくることを見出した（図２）。反応の最初の１０分以内に、少なくとも２０％のＣＡＭ−４０５がＣＡＭ−２１２に変換され、５０％のＴＳＡＯジペプチド誘導体が反応３０分以内にＣＡＭ−２１２に変換され、６７％までのＣＡＭ−４０５が６０分後には加水分解されていた。このように、開始時の反応速度は、薬剤暴露の最初の１０分間の後には遅くなっていた（図２）。おそらく、反応生成物Ｖａｌ−Ｐｒｏの放出は、用量依存的にＣＤ２６触媒によるジペプチジル−ペプチダーゼ反応をフィードバック阻害している。トリペプチド誘導体Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−４３１）からＶａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ生成物（ＣＡＭ−４０３）の変換についても同様のデータが得られた（データは示されていない）。ジペプチドＶａｌ−ＰｒｏがＣＤ２６に対する阻害効果について評価される場合、それぞれ、４ｍＭで完全に反応が阻害され；４００μＭでＶａｌ−Ｐｒｏはその反応が９０％を超えて阻害され、一方、４０μＭ及び４μＭではＣＤ２６触媒によるＧＰ−ＰＮＡからのｐ−ニトロアニリン放出が７０〜１５％阻害された（図３）。従って、５０μＭのＣＡＭ−４０５の存在下で、ＣＡＭ−４０５の５０％がＣＡＭ−２１２へと加水分解し、２５μＭ  Ｖａｌ−Ｐｒｏが表れ、すなわち、この濃度は、ＣＤ２６反応が５０％まで阻害される（フィードバックする）濃度である。これらの発見は、ＣＤ２６触媒による反応のレベルダウンは、ＣＤ２６に対する薬剤の暴露の開始後すぐに始まることを説明する。対照的に、ジペプチドＬｙｓ−Ｐｒｏは、ＣＤ２６によってＬｙｓ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯから完全に除去され、このことにより、遊離Ｌｙｓ−ＰｒｏによるＣＤ２６のフィードバック阻害は起こらないことを指摘する。従って、プロドラッグ放出速度のさらなるレベル調整は、ジペプチドがＣＤ２６が存在する組織から拡散するまで、ＣＤ２６の活性部位に競合するジペプチド部分を選択することによって導入することができる。任意のジペプチドの阻害活性は、上述のアッセイによって評価することができる。
【０１３１】
時間の関数における変換速度は、以下のジペプチドからなるＮＡＰ−ＴＳＡＯ−ジペプチドについて表１に与えられる：Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−４−ヒドロキシＰｒｏ、Ｇｌｙ−３，４−ジヒドロキシＰｒｏだけではなく、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ及びＶａｌ−Ｐｈｅ。親ＮＡＰ−ＴＳＡＯに対する変換速度は、ジペプチドの性質によって異なることは明らかである。さらに、ジペプチドの末端アミンは、脂溶性基によってブロックされている（すなわち、メチル、Ｚ又はＦｍｏｃ）場合には、プロドラッグはＣＤ２６について測定可能な基質活性を失う。
【０１３２】
【表１】
2006525235.tif 000005
【０１３３】
実施例２：精製ヒトＣＤ２６によって、テトラペプチド−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ化合物を、親化合物ＮＡＰ−ＴＳＡＯに変換
時間の関数における変換速度は、以下のテトラペプチドからなるテトラペプチドＮＡＰ−ＴＳＡＯ化合物について表２に与えられる：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ
ＩＤ  ｎｏ：６］（ＣＡＭ４６７）、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ
ｎｏ：７］（ＣＡＭ４７３）又はＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ［ＳＥＱ  ＩＤ  ｎｏ：８］（ＣＡＭ４７７）。ＣＡＭ４７３の親ＮＡＰ−ＴＳＡＯに対する変換速度は、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ４２４）と用いた場合よりも速くなることは明らかである。テトラペプチドＣＡＭ４７３からＮＡＰ−ＴＳＡＯへの変換において、ジペプチドプロドラッグ（ＣＡＭ４０５）は、中間体として痕跡量のみ見られる。さらに、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］は、迅速にＮＡＰ−ＴＳＡＯに変換される。対照的に、ＣＡＭ４７７のＮＡＰ−ＴＳＡＯの変換は、明らかに２段階で起こり、ＣＡＭ４３５（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）を形成
する最初の初期段階の後、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯから最終的にＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ２１２）を形成する遅い第２段階が起こる。
【０１３４】
【表２】
2006525235.tif 000006
【０１３５】
実施例３：ヒト血清及びウシ血清によって、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯを親化合物ＮＡＰ−ＴＳＡＯ及びＶａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯに変換
ヒト及びウシの血清を、５０μＭのＣＡＭ−４０５存在下、３７℃で３時間、６時間、及び／又は２４時間インキュベートした。最終濃度が０．５、１、２．５又は５％になるように血清をＰＢＳで希釈した。ヒト血清（ＨＳ）及びウシ血清（ＢＳ）の両方が、効果的にＣＡＭ−４０５をＣＡＭ−２１２に変換した。インキュベーション時間を長くするにつれて、及び使用される血清濃度を高くするにつれて、ＣＡＭ−４０５からＣＡＭ−２１２への変換が速く起こった（図４）。ＣＤ２６について注記されたように、ＨＳ−及びＢＳ−による触媒反応は、時間の関数で遅くなり、血清濃度と直線的には比例しなかった（図４）。これらの発見は、再度、ヒト及びウシ血清において、放出されたＶａｌ−Ｐｒｏジペプチドによってジペプチジル−ペプチダーゼ反応を顕著にフィードバック阻害しているという証拠を提供する。ＨＳは、ＢＳよりも、ＣＡＭ−４０５からＣＡＭ−２１２への変換において有効であった（図４）。１％のＨＳが２０％までの５０μＭ  ＣＡＭ−４０５をインキュベーション３０分以内に加水分解することができ、このことにより、フィードバック阻害が起こらない場合（無傷な有機体において、臓器吸収、腎臓排出等を含むいくつかの機構に起因して放出されたＰｒｏ−Ｖａｌが血漿から迅速に消失することが予想されるため）には、希釈していない血清だと、この１００倍速いスピード、すなわち１．８分以内でこのプロドラッグ量をその親化合物に変換可能であると計算される。このことは、１０μＭのＣＡＭ−４０５は、血漿中で１．８分未満の半減期を有し、実際には血漿中に現れるとすぐにその親化合物に変換されることを意味する。
【０１３６】
実施例４：ＣＥＭ細胞懸濁物によって、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯを化合物ＮＡＰ−ＴＳＡＯに変換
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−４０５）からＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−２１２）への変換はさらに、ＰＢＳ中の注意深く洗浄したＴ−リンパ球ＣＥＭ細胞懸濁物によって効果的に起こった。２００μｌのＰＢＳに懸濁させた１０００万個のＣＥＭ細胞は、３７℃でのインキュベーション３時間以内に、ＣＡＭ−４０５からＶａｌ−Ｐｒｏ部分を６５％加水分解した。この量の加水分解は、ＰＢＳ上清及びそのＣＥＭ細胞抽出物の両方で見出された。おそらく、ＣＥＭ細胞の細胞膜中に存在するＣＤ２６は、ＣＡＭ−４０５からＶａｌ−Ｐｒｏを開裂させ、その後に、切断され、無傷なプロドラッグは、リンパ球によって等しい程度で吸収される。
【０１３７】
実施例５：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯからＮＡＰ−ＴＳＡＯへの変換における、特異的なＣＤ２６阻害の効果
ＣＤ２６触媒によるＣＡＭ−４０５のＣＡＭ−２１２への変換を、ＣＤ２６インヒビタージプロチンＡの非存在下又は存在下で記録した（図５）。興味深いことに、最も高いインヒビター濃度（１０００μＭ）で、ＨＳ又はＢＳ又は精製ＣＤ２６によるＣＡＭ−４０５のＣＡＭ−２１２への変換がほぼ完全に阻害された。１０分の１の阻害濃度（すなわち、１００μＭ）のジプロチンＡは、ＨＳ又はＢＳ又は精製ＣＤ２６によるＣＡＭ−４０５のＣＡＭ−２１２への変換をなお効果的に抑制した（５０％を超える）（図５）。これらの観察は、脂溶性ＮＡＰ−ＴＳＡＯジペプチドヌクレオシドアナログからジペプチド部分を除去するためのＨＳ及びＢＳにおける主要かつ優位な酵素としてＣＤ２６を指摘する。
【０１３８】
実施例６：精製ＣＤ２６及びヒト血清の存在下でのジペプチドプロドラッグの加水分解
種々の異なるＮＡＰ−ＴＳＡＯジペプチド及びトリペプチド誘導体を合成し、それらがＣＤ２６について効果的な基質として作用する能力について評価した。ＣＡＭ−４３１（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）は、ＮＡＰ−ＴＳＡＯに接続したトリペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）部分を含有し、これはＣＤ２６によって加水分解され、ジペプチドＶａｌ−Ｐｒｏを放出し、バリン置換されたＶａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯが残る。興味深いことに、ＣＡＭ−４１２中のＶａｌの遊離アミノ基にメチル基を含有するＣＡＭ−４０７（ＣＨ３−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＴＳＡＯ）は、ＣＤ２６に対する基質活性を完全に失っていた。さらにインキュベーション２４時間後、形成された切断ＣＨ3−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ誘導体は痕跡量も観察されなかった。同様の観察結果が、脂溶性部分がバリンの遊離アミノ基で接続しているＶａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ又はＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ誘導体でなされた。従って、最終的なアミノ酸の遊離アミノ基は、ＣＤ２６による基質活性が必須条件である。Ｖａｌ−Ｐｒｏに加えて、本願発明者らは、Ｌｙｓ−ＰｒｏがＣＤ２６によって開裂される非常に効果的なジペプチドであることを見出した。Ａｓｐ−Ｐｒｏは、それほど効果的には開裂されなかった。
【０１３９】
ＮＡＰ−ＴＳＡＯ上のジペプチドＶａｌ−Ｐｒｏが、他のジペプチド、例えば、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ又はＶａｌ−Ｐｈｅで交換されている場合、ＣＤ２６触媒による親化合物への変換は、インキュベーション２４時間後でさえ観察されなかった。さらに、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ中のＬ−ＰｒｏがＤ−Ｐｒｏによって交換されている場合、この化合物は精製ＣＤ２６のための良好な基質としてはもはや作用せず、Ｖａｌ−（Ｄ）Ｐｒｏは実際に切り離されなかった。しかし、ＮＡＰ−ＴＳＡＯに接続したＶａｌ−Ａｌａは、Ｖａｌ−Ｐｒｏとともに、代替のジペプチドとして、ＣＤ２６分子によって親ＮＡＰ−ＴＳＡＯ分子から効果的に放出されることがわかった。従って、ＮＨ2末端で末端から２番目にＰｒｏ又はＡｌａを含有する天然ペプチドを用いる場合、ＣＤ２６はさらに、ペプチドとは異なる分子（すなわち、ＴＳＡＯ）にアミド結合を介して接続する場合にも、ジペプチド配列を認識することができる。
【０１４０】
興味深いことに、ジペプチド−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ化合物が２０％ヒト血清（ＰＢＳで希釈）にさらされる場合、化合物は、ジペプチドの性質によって１個又は２個の誘導体に変換された（図６）。例えば、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯは、効果的に（しかし単に）Ｇｌｙ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯへと変換された。Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ及びＶａｌ−Ｐｈｅ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯは、それぞれＬｅｕ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ及びＰｈｅ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯだけでなく、ＮＡＰ−ＴＳＡＯに限定された程度までしか変換されなかった。興味深いことに、末端から２番目にＤ−配置でプロリン残基を含有するＶａｌ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＴＳＡＯ−ＮＡＰ誘導体は、ヒト血清中で非常に安定である。非常に限定された量のＮＡＰ−ＴＳＡＯ（Ｄ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯではない）のみが検出された（図６）。トリペプチド誘導体Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯは、精製ＣＤ２６の存在下で起こるように、ヒト血清によって非常に効果的にＶａｌ−ＴＳＡＯに優先して変換された（データは示されない）。
【０１４１】
実施例７：溶解度
薬剤の脂溶性は、その溶解度、血漿タンパク質結合だけではなく、血液−脳障壁を通る能力を強力に決定する場合がある。ＮＡＰ−ＴＳＡＯに接続した異なるジペプチド又はテトラペプチドは、分子の計算されたｌｏｇＰ値に顕著に影響を与える（表３）。
【０１４２】
ＮＡＰ−ＴＳＡＯ上に存在するジペプチド部分の性質が、水中のプロドラッグ溶解度に顕著に影響を与えることも明らかである。例えば、Ｖａｌ−ＡｌａがＮＡＰ−ＴＳＡＯに接続している場合にはほんの少量のプロドラッグが水相に現れ、一方、ＮＡＰ−ＴＳＡＯに接続するＶａｌ−Ｇｌｙ、特にＮＡＰ−ＴＳＡＯに接続するＶａｌ−Ｐｒｏは、水溶解度が顕著に高まっていた（表４）。
【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
結果として、脂溶性ＴＳＡＯヌクレオシドアナログのジペプチジル又はトリペプチジル誘導体は、精製ＣＤ２６のための、及びヒト及びウシの血清中に存在する可溶性ＣＤ２６のための有効な基質であることが示された。高度に水不溶性の薬剤のオリゴペプチド誘導体は、これらの薬剤をさらに顕著に水溶製にし、血漿タンパク質結合性を下げることができ、さらに、それらの経口バイオアベイラビリティ及び血液−脳障壁の浸透を増加させることができる。それに加えて、この技術は、ＣＤ２６を発現する細胞に対する薬剤のさらに特異的な標的化を可能にする。
【０１４５】
抗癌剤ドキソルビシンのプロドラッグ及び６−アミノキノリンのプロドラッグ
実施例８：時間の関数における、精製ＣＤ２６によって、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ドキソルビシンをドキソルビシンに変換、及びＶａｌ−Ｐｒｏ−６−アミノキノリンを６−アミノキノリンに変換
ジペプチドＶａｌ−Ｐｒｏを含有し、ドキソルビシンのアミノ糖に接続したＶａｌ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン（ＣＡＭ４６９）は、ＣＤ２６によって非常に有効にドキソルビシンに変換された。Ｆｍｏｃによってアミノ末端でブロックされている場合（ＣＡＭ４６８
）、親薬物への変換は見出されなかった（表５）。
【０１４６】
Ｖａｌ−Ｐｒｏが親化合物の芳香族環で６−アミノ基に接続している蛍光６−アミノキノリンジペプチド（ＣＡＭ４７５）の変換は、非常に効率的に行われ、実際に、１時間以内に親６−アミノキノリン誘導体に完全に変換された。
【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
実施例９：ＮＡＰ−ＴＳＡＯ、ドキソルビシン及び６−アミノキノリンのジペプチドプロドラッグの分離
ドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）、ＣＡＭ４６９（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｄｏｘｏ）及びＣＡＭ４６８（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｄｏｘｏ）：それぞれ１６．２、１６．４及び３１．５８分；６−アミノキノリン（ＣＡＭ４８３）及びＶａｌ−Ｐｒｏ−６−アミノキノリン（ＣＡＭ４７５）：それぞれ１２．２及び１４．２６分。Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］（ＣＡＭ４７７）、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ４３５）、ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ２１２）：それぞれ２２．８、２５．４及び２９．７分。
【０１４９】
実施例１０：精製ＣＤ２６、ヒト血清及びウシ血清によって、ＰＩ−１ジペプチド（ＰＩ−２）をＰＩ−１に変換
ＰＩ−１のジペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ）誘導体（ＰＩ−２）を、精製ＣＤ２６（図１０）、及びＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）で希釈した１０％又は２％のヒト血清又はウシ血清にさらした（図１０及び１１）。ＰＩ−２は、試験された全ての条件でＰＩ−１に効果的に変換された。６０分以内に、精製ＣＤ２６によってＰＩ−２は完全にＰＩ−１に変換された。１０％ＢＳ又はＨＳは１時間でＰＩ−２の４０〜７０％をＰＩ−１に変換した（図１０）。２％ＢＳ及びＨＳは、それぞれＰＩ−２の８％及び２５％をＰＩ−１に変換した。４時間後に、３５％及び９５％の化合物がＢＳ及びＨＳによってそれぞれ加水分解された（図１）。
【０１５０】
５０μＭのＧＰ−ｐＮＡ（グリコプロリル−パラ−ニトロアニリン）の存在下で、１００μＭのＰＩ−２は、ＣＤ２６のための基質と効果的に競合した（図１２）。さらに、２０μＭのＰＩ−２は、ＧＰ−ｐＮＡからｐＮＡの放出を阻害し、これは、ＣＤ２６による触媒反応の競争的な阻害によるものと考えられる。ＰＢＳ中の２％のＢＳによるＧＰ−ｐＮＡからｐＮＡへの変換は、精製ＣＤ２６よりもＰＩ−２によってさらに効果的に阻害された（図１３）。さらに、ＨＳ（ＰＢＳ中２％）触媒によるＧＰ−ｐＮＡからｐＮＡへの変換は、ＰＩ−２によって競争的に阻害された（図１４）。
【０１５１】
実施例１１：ＰＩ−２及びＰＩ−１化合物の分離
化合物を、バッファーＡ（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4  ＋  ５ｍＭ  ヘプタンスルホン酸
ｐＨ３．２）及びバッファーＢ（アセトニトリル）の勾配を用いてＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  ＲＰ−８（メルク（Ｍｅｒｃｋ））で分離した。
【０１５２】
０→２分：２％バッファーＢ；２→８分：２０％バッファーＢ；８→１０分：２５％バッファーＢ；１０→１２分：３５％バッファーＢ；１２→３０分：５０％バッファーＢ；３０→３５分：５０％バッファーＢ；３５→４０分：２％バッファーＢ；４０→４５分：２％バッファーＢ。流速：１ｍｌ／分。ＰＩ−２及びＰＩ−１のＲｔ値はそれぞれ１８．７分及び１７．７分であった。
【０１５３】
一般的な方法論
実施例１２：化合物、酵素及び細胞
図１に示されるＴＳＡＯ誘導体を、以下に記載されるように合成することができる。ＧｌｙＰｒｏ−ｐＮＡ（ＧＰ−ｐＮＡ）、ジプロチンＡ及びＶａｌ−Ｐｒｏをシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ボーネン，ベルギー）から購入した。ＣＤ２６を以前に記載されるように精製した［Ｄｅ  Ｍｅｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９６），１８９：９９−１０５］。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）をインテグラ（Ｉｎｔｅｇｒａ）（ディーレン，オランダ）から得た。ヒト血清は、健康な志願者（血液ドナー）から誘導されるプールされた血清を表す。ヒトリンパ球ＣＥＭ細胞は、ＡＴＣＣ（ロックビル，ＭＤ）から誘導した。
【０１５４】
実施例１３：プロドラッグの調製
ＴＳＡＯ−ペプチド−Ｚ保護（４）の合成のための一般的な手順
対応するペプチド（１．５当量）（ペプチド合成において通常のカップリング方法に従って調製した）のジクロロメタン（２ｍｌ）溶液を、室温で、（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ）−トリス（ｔｒｉｓ）−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）（１．５当量）、アミノ−プロピルＴＳＡＯ誘導体（ＮＡＰ−ＴＳＡＯ）３（１当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）で続けて処理した。反応混合物を出発化合物（３）が完全に消失するまで攪拌した（１０〜１２時間）。次いで、溶媒を乾燥するまで蒸発させ、残渣を乾燥ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、クエン酸１０％水溶液（１０ｍＬ）、１０％ＮａＨＣＯ3水溶液（１０ｍＬ）及び食塩水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、乾燥するまで蒸発させた。残渣をジクロロメタン：メタノール（７０：１）を溶離液として用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、ジペプチド−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ化合物（４）（５０〜５５％収率）を得た。
【０１５５】
脱保護されたペプチド−ＴＳＡＯ化合物（５）を合成するための一般的な手順
対応するＴＳＡＯ−ＮＡＰ−ペプチド−Ｚ保護（４）（１当量）のメタノール溶液（４０％ｗｔ／ｗｔ）（Ｐｄ／Ｃ（１０％）を含有）を、室温で２時間、２５ｐｓｉで水素化した。反応混合物をろ過し、ろ液を乾燥するまで減圧下で蒸発させ、５（９０％収率）を泡状物として得た。
【０１５６】
一般的なペプチド化学
ペプチドを形成するための天然アミノ酸のカップリングは、当業者にとって直接的である。いくつかの化学ストラテジーが利用可能であり、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃ化学は、最も広範囲に使用されている。分野Ｇ．Ｂ．は、アミノ酸を互いにカップリングするため、又は治療化合物Ｄのために適用可能であるペプチド化学の広範囲な記載を与える［Ｆｉｅｌｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．：Ｔｏｔａｗａ，（１９９４），ｐｐ．１７−２７］。固体相及び溶液相の化学が適用可能である［Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ＆  Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａ
ｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｔｏｋｙｏ，（１９８９）］。保護基のカップリングを介してブロックされる、プロドラッグ調製手順中に反応可能ではない治療化合物の保護ストラテジー官能基は、使用される必要がある。
【０１５７】
Ｎ−ベンゾイルオキシカルボニル−３−ブロモ−プロピルアミン（１）
乾燥ジクロロメタン中の３−ブロモプロピルアミン臭化水和物（０．９ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．３ｍｌ、９．０５ｍｍｏｌ）の氷冷した懸濁物に、ベンジルクロロホルミエート（０．６ｍＬ、４．１１ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（１ｍＬ）溶液をゆっくりと添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、飽和ＮａＣｌ水溶液（２×１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（無水Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、乾燥するまで蒸発させた。残渣をヘキサン、酢酸エチル（４：１）を用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、０．８ｇ（７２％）の（１）を白色泡状物として得た。
【０１５８】
［１−［２’，５’−ビス−Ｏ−（第３級（ｔｅｒｔ）−ブチルジメチルシリル）−ｐ−Ｄ−リボフラノシル］−３−Ｎ−（３−（ベンジルオキシカルボニルメチル）アミノプロピル）チミン］−３’−スピロ−５”−（４”−アミノ−１”，２”−オキサチオール
２”，２”−ジオキシド）（２）
ＴＳＡＯ−Ｔ（１当量）の乾燥アセトン（２０ｍＬ）溶液に、乾燥Ｋ2ＣＯ3（１．１当量）及び化合物１（２当量）を添加した。反応混合物を６時間還流させ、ついで、乾燥するまで濃縮した。残渣を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、食塩水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、乾燥するまで蒸発させた。このようにして得られた残渣を、ジクロロメタン：メタノール（７０：１）を溶離液として用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、２（８５％）を白色泡状物として得た。
【０１５９】
［１−［２’，５’−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ｐ−Ｄ−リボフラノシル］−３−Ｎ−（３−アミノプロピル）チミン］−３’−スピロ−５”−（４”−アミノ−１”，２”−オキサチオール−２”，２”−ジオキシド）（３）
化合物２（１当量）のメタノール溶液（３０％ｗｔ）（Ｐｄ／Ｃ（１０％）を含有）を、室温で２時間、２５ｐｓｉで水素化した。反応混合物をろ過し、ろ液を乾燥するまで減圧下で蒸発させ、化合物３（９０％収率）を得た。
【０１６０】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒａ−Ｃ（Ａ）
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（９４．５ｍｇ、０．３０ｍｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）溶液を、室温で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４０．５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（４６．７μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）及びＡｒａ−Ｃ（６０．９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）で続けて処理した。出発化合物が完全に消失するまで攪拌した（一晩攪拌）。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、クエン酸１０％水溶液、ＮａＨＣＯ3（１０％）及び食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させ、残渣を得て、これをジクロロメタン：メタノール（２０：１）を用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、Ａｒａ−Ｃ−ジペプチド（Ａ）（２１％収率）を得た。
【０１６１】
ＨＣＩ・Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒａ−Ｃ（Ｂ）
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＡｒａＣ（２４．８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、酢酸エチル（５３０μＬ）中のＨＣｌ３．２Ｍ溶液で処理し、出発化合物が完全に消失するまで反応物を室温で攪拌した（３０分）。次いで、溶媒を乾燥するまで減圧下で蒸発させ、Ｂ（８０％収率）を得た。
【０１６２】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒａ−Ｃ（Ｄ）
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１３４．４ｍｇ、０，２４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）溶液を、室温で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３３．３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（３８．４μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）及びＡｒａ−Ｃ（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）で続けて処理した。出発化合物が完全に消失するまで攪拌を続けた（一晩攪拌）。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、クエン酸１０％水溶液、ＮａＨＣＯ3（１０％）及び食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、乾燥するまで蒸発させると残渣が残り、これをジクロロメタン：メタノール（２０：１）を用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、Ｄ（２２％収率）を得た。
【０１６３】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒａ−Ｃ（Ｅ）
対応するＡｒａ−Ｃ−テトラペプチド−Ｚ保護（Ｄ）（２４．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（Ｐｄ／Ｃ（１０％ｗｔ／ｗｔ）を含有）（１１．５ｍｇ）を室温で２時間、２５ｐｓｉで水素化した。反応混合物をろ過し、ろ液を乾燥するまで減圧下で蒸発させ、Ｄ（９０％収率）を得た。
【０１６４】
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン（Ｆ）
ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ及びドキソルビシン・ＨＣｌ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）溶液を、室温で、Ｎ−［（ジメチルアミノ）１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジノ−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアンモニウムヘキサフルオロホスフェート  Ｎ−オキシド（ＨＡＴＵ）（３６．０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（２９，５μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）で続けて処理した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、溶媒を凍結乾燥し、残渣を酢酸エチルに溶解し、クエン酸（１０％）、ＮａＨＣＯ3（１０％）及び食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、乾燥するまで蒸発させ、Ｆ（４５％収率）を得た。
【０１６５】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン（Ｇ）
ジメチルホルムアミド中のピペリジン５０％（１．９２ｍＬ）溶液を、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン（Ｆ）（２９．７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）に添加し、反応混合物を室温で１分攪拌した（反応物の色は赤から紫に変化する）。次いで、反応混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、このようにして得られた残渣を、水／アセトニトリル（７０：１）を用いた逆相クロマトグラフィーで精製し、脱保護された化合物Ｇ（５０％収率）を得た。
【０１６６】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−６−アミノキノリン（Ｈ）
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２１７．４ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．５ｍＬ）溶液を、室温で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８４．３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（９７．２μＬ、０．６２ｍｍｏｌ）及び６−アミノキノリン（７５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）で続けて処理した。出発化合物が完全に消失するまで攪拌を続けた（一晩）。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、クエン酸（１０％）、ＮａＨＣＯ3（１０％）及び食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、乾燥するまで蒸発させると残渣が残り、これをヘキサン：酢酸エチル（１：４）を用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、Ｈ（２０％収率）を得た。
【０１６７】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−６−アミノキノリン（Ｉ）
対応するＺ保護された−ジペプチド−６−アミノキノリン（Ｈ）（２５．８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍＬ）溶液（Ｐｄ／Ｃ（１０％ｗｔ／ｗｔ）を含有）（１０．５ｍｇ）を室温で２時間、２５ｐｓｉで水素化した。反応混合物をろ過し、ろ液を
乾燥するまで減圧下で蒸発させ、Ｉ（９０％収率）を得た。
【０１６８】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ（Ｘ）［ＳＥＱ  ＩＤ  ｎｏ：９］
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（６８１．２ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６ｍＬ）溶液を、室温で、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロファール（ＢＯＰ）（８６５．１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ・ＨＣｌ（５００ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（５００μＬ、３．５８ｍｍｏｌ）で続けて処理した。混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、クエン酸（１０％）、ＮａＨＣＯ3（１０％）及び食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、乾燥するまで蒸発させると残渣がのこり、これをヘキサン：酢酸エチル（２：１）を用いたクロマトグラフィーで精製し、Ｘ（６８％収率）を得た。
【０１６９】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｙ）［ＳＥＱ  ＩＤ  ｎｏ：９］
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯtＢｕ［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９］（１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、ジクロロメタン（４．８５ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（２．７６ｍｌ、３．５８ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を室温で３時間攪拌した。次いで、溶液を乾燥するまで蒸発させ、残渣を凍結乾燥してＹ（８４％収率）を得た。
【０１７０】
実施例１４：精製ＣＤ２６、ヒト血清及びウシ血清によるＰｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯからＮＡＰ−ＴＳＡＯへの変換に対するＣＤ２６インヒビターの阻害効果の評価
全ての酵素活性アッセイを、３７℃の加熱ブロック上でエッペンドルフ管中で行った。それぞれの管に、３２μｌのＣＤ２６（最終濃度が１．５ｍＵｎｉｔ）又は１０μｌの胎児ウシ血清（ＢＳ）（最終濃度が１．５ｍＵｎｉｔ）又は１０μｌの胎児ウシ血清（ＢＳ）（最終濃度：ＰＢＳ中で２．５％ＢＳ；５６℃で３０分間あらかじめ加熱）又は１０μｌのヒト血清（ＨＳ）（最終濃度：ＰＢＳ中で２．５％ＨＳ）、４０μｌの適切な濃度のインヒビター（ジプロチンＡ）のＰＢＳ溶液（実際の濃度については、図５の凡例を参照）、ＣＡＭ−４０５（反応基質反応）を５０μＭ（最終濃度）及びＰＢＳを添加して、全体積を４００μｌにした。反応混合物のｐＨを、血漿の生理学的ｐＨと実際に同一の７．５にした。酵素又は血清を添加することによって反応を開始し、反応を３７℃で行った。５時間後、１００μｌの反応混合物をエッペンドルフ管から採取し、２００μｌの冷メタノールに添加し、タンパク質を沈殿させた。１０分後、氷の上に置き、管の内容物を遠心分離し、上清を逆相カラム（ＲＰ−８，メルク  ラボラトリーズ（Ｍｅｒｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でＨＰＬＣで分析した。５０ｍＭナトリウムホスフェート  ＋  ５ｍＭヘプタンスルホン酸  ｐＨ３．２（バッファーＡ）及びアセトニトリル（バッファーＢ）の以下のような勾配によって、ＣＡＭ−４０５をＣＡＭ−２１２（反応生成物）から分離した：バッファーＡ：９８％＋２％バッファーＢ、２分；２０％バッファーＢまで直線勾配、２〜８分；２５％バッファーＢまで直線勾配、８〜１０分；３５％バッファーＢまで直線勾配、１０〜１２分；５０％バッファーＢまで直線勾配、１２〜３０分；５０％バッファーＢ、３０〜３５分；９８％バッファーＡ＋２％バッファーＢまで直線勾配、３５〜４０分；９８％バッファーＡ、４０〜４５分。ＣＡＭ−４０５及びＣＡＭ−２１２の保持時間は、それぞれ２９．３及び３０．０分であった。
【０１７１】
実施例１５：プロドラッグの溶解度及びバイオアベイラビリティの測定
第１に、本方法は、化合物の溶解度を予想するために存在する。例えば、Ｊ  Ｃｈｅｍ
Ｉｎｆ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｓｃｉ  １９９８  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３８（３）：４５０−６において、分子トポロジー及び神経ネットワークモデリングに基づく薬物の水溶性予測が記載されている。
【０１７２】
実際に、溶解度及びバイオアベイラビリティに関連する全てのパラメーター（ｐＫａ、
分配係数等）を決定することができる。「Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ：Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ」は、これらのパラメーター及びそれらの決定又は予測の総括的な概要を与える（ＩＳＢＮ  ３５２７３０４３８Ｘ）。
【０１７３】
分配係数は、脂溶性の測定値である。「ｌｏｇＰ」値として数値的に表され、２つの不混和性の相、例えば、水／オクタノール又は水／リポソームにおける基質の濃度間の比であり、容易に計算することができる。高いｌｏｇＰ値を有する基質は、水よりも脂質及び油によく溶解する。このことは、受動的な拡散による身体中の脂質（脂肪に基づく）膜に入り込む能力を高め、吸収の潜在能力を高める。
【０１７４】
多くの薬剤は、１〜４の間のｌｏｇＰ値を有し、経口による送達方法が好適である。高いｌｏｇＰ値を有する薬剤は、通常は水への溶解性が低い。それらは脂質溶解性であり得るが、ＧＩ管中で溶解することができず、消化壁に拡散することができない。それらが膜に入り込む場合、結果的に毒性の影響を持ちつつ、トラップされる場合がある。
【０１７５】
分配係数はさらに計算することができる。モルインスピレーション（Ｍｏｌｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ）（ｍｉＬｏｇＰ１．２）で開発されたｌｏｇＰ予測のための方法は、グループ寄与率に基づく。グループ寄与率は、数千の薬剤用分子のトレーニングセットについて、計算されたｌｏｇＰと実験的なｌｏｇＰとをあわせることによって得られる。この方法は、ｗｗｗ．ｍｏｌｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ｌｏｇｐ．ｈｔｍｌ（ＱＳＡＲ１５，４０３（１９９６））で使用されることによって使用することができる。多くの他のＬｏｇＰ決定プログラムが利用可能である。
【０１７６】
実施例１６〜２０  式（Ｉ）の化合物を調製するための実験パート
式（Ｉ）のプロドラッグ化合物の調製を記載する実施例は、下式
【０１７７】
【化４】
2006525235.tif 000009
【０１７８】
（本明細書中以下でＰＩ  １と称される）
を有するＨＩＶプロテアーゼインヒビターに基づく。
【０１７９】
実施例１６：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １
工程１
【０１８０】
【化５】
2006525235.tif 000010
【０１８１】
化合物１．１（０．９５ｇ；１．６９ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０．５３ｇ；１．７ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。ＥＤＣＩ（０．３６ｇ；１．９ｍｍｏｌ）及びＨＯＡｔ（０．０２３ｇ；０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０時間攪拌した。反応混合物をＨ2Ｏに注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。あわせた有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を除去し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した（溶離液：酢酸エチル）。化合物１．２を白色固体として得た（収率５５％、純度９５％  ＬＣ−ＭＳ）。
【０１８２】
工程２
【０１８３】
【化６】
2006525235.tif 000011
【０１８４】
化合物１．２（０．７７ｇ；０９ｍｍｏｌ）の１０ｍＬ  ＣＨ2Ｃｌ2溶液に、トリフルオロ酢酸１０ｍＬを添加した。反応混合物を室温で３時間攪拌した後、溶媒を除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１．３  ０．４２ｇを得た（収率６１％、純度９５％  ＬＣ−ＭＳ）。
【０１８５】
実施例１７：Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １
工程１
【０１８６】
【化７】
2006525235.tif 000012
【０１８７】
化合物２．１（３．１６ｇ；５．６３ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１．３３ｇ；６．１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解した。ＥＤＣｌ（１．１８ｇ；６．１８ｍｍｏｌ）及びＨＯＡｔ（０．０７７ｇ；０．５ｍｍｏｌ）を添加し、３６時間攪拌した。酢酸エチル及び０．１Ｎ  ＨＣｌを添加し、得られた反応混合物を酢酸エチルで３回抽出した。あわせた有機層を０．１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ2Ｏ、飽和Ｎａ
ＨＣＯ3、水及び食塩水で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた後、溶媒を蒸発させ、白色泡状物（４．３９ｇ、１０３％）を得た。ジイソプロピルエーテル中で磨砕した後、化合物２．２  ３．９ｇを得た（収率９３％、純度９７％  ＬＣ−ＭＳ）。
【０１８８】
工程２
【０１８９】
【化８】
2006525235.tif 000013
【０１９０】
４０ｍＬＣＨ2Ｃｌ2中の化合物２．３（３．７ｇ；４．８ｍｍｏｌ）及び１５ｍＬトリフルオロ酢酸の混合物を室温で２時間攪拌した。溶媒を蒸発させた後、粗混合物を酢酸エチルと飽和ＮａＨＣＯ3との間で分配した。有機層を分離し、食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。粗固体をジイソプロピルエーテル中で再懸濁させ、ろ過し、化合物２．３  ２．７３ｇを得た（収率８５％、純度＞９０％  ＮＭＲ）。
【０１９１】
工程３
【０１９２】
【化９】
2006525235.tif 000014
【０１９３】
化合物２．３（１．０ｇ；１．５ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｏ（０．４８ｇ；１．７ｍｍｏｌ）の３０ｍｌ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液に、ＥＤＣｌ（０．３２ｇ；１．７ｍｍｏｌ）及びＨＯＡｔ（０．０２ｇ；０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩攪拌した後、粗混合物を酢酸エチルと０．１Ｎ  ＨＣｌとの間で分配した。Ｈ2Ｏ層を３回抽出し、あわせた有機層を０．１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ2Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ3及びＨ2Ｏで洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた後、溶媒を除去し、残渣をジイソプロピルエーテル中で磨砕した。化合物２．４  １．１２ｇを得た（収率７９％、純度９４％
ＬＣ−ＭＳ）。
【０１９４】
工程４
【０１９５】
【化１０】
2006525235.tif 000015
【０１９６】
化合物２．４から２．５への脱保護は、化合物２．２から化合物２．３への脱保護と似た手順で行った。
【０１９７】
実施例１８：Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］
【０１９８】
【化１１】
2006525235.tif 000016
【０１９９】
実施例１及び２に記載されるような類似の反応手順を用いて、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを化合物３．１にカップリングさせ（実施例２において調製されるように）、化合物３．２を得た。Ｂｏｃ−脱保護後、化合物３．３を得た。次いで、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを化合物３．３にカップリングさせ、化合物３．４を得て、これを次いでＢｏｃ−脱保護し、化合物３．５を得た。化合物３．５をＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯtＢｕ）−ＯＨとカップリングさせ、化合物３．６を得て、これを最初にＢｏｃ−脱保護し、次いで、テトラヒドロフラン中のジメチルアミンを用いてＦｍｏｃ−脱保護し、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］に対応する化合物３．８を得た。
【０２００】
実施例１９：精製ＣＤ２６、ヒト血清及びウシ血清による、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １からＰＩ  １への変換
ＰＩ  １のジペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ）誘導体（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １）を、精製ＣＤ２６（図１０）、及びＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）で希釈した１０％又は２％のヒト又はウシ血清（図１０及び１１）にさらした。Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １は、試験された全ての条件で効果的にＰＩ  １に変換された。６０分以内に、ＣＤ２６によってＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １は、ＰＩ  １に完全に変換された。１０％ＢＳ又はＨＳは、１時間で４０〜７０％のＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １をＰＩ  １に変換した（図１０）。２％ＢＳ及びＨＳは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １をＰＩ  １にそれぞれ８％及び２５％変換した。４時間後に、３５％及び９５％の化合物がそれぞれＢＳ及びＨＳによって加水分解された（図１１）。５０μＭのＧＰ−ｐＮＡ（グリコプロリル−パラ−ニトロアニリド）の存在下で、１００μＭのＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １は、ＣＤ２６のための基質と効果的に競合した（図１２）。さらに、２０μＭのＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １は、ＧＰ−ｐＮＡからｐＮＡの放出を阻害し、これは、ＣＤ２６による触媒反応の競争的な阻害によるものと考えられる。ＰＢＳ中の２％のＢＳによるＧＰ−ｐＮＡからｐＮＡへの変換は、精製ＣＤ２６よりもＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １によってさらに効果的に阻害された（図１３）。さらに、ＨＳ（ＰＢＳ中２％）触媒によるＧＰ−ｐＮＡからｐＮＡへの変換は、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １によって競争的に阻害された（図１４）。
【０２０１】
実施例２０：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐ１  １及びＰＩ  １化合物の分離
化合物を、バッファーＡ（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4  ＋  ５ｍＭ  ヘプタンスルホン酸
ｐＨ３．２）及びバッファーＢ（アセトニトリル）の勾配を用いてＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  ＲＰ−８（メルク（Ｍｅｒｃｋ））で分離した。
【０２０２】
０→２分：２％バッファーＢ；２→８分：２０％バッファーＢ；８→１０分：２５％バッファーＢ；１０→１２分：３５％バッファーＢ；１２→３０分：５０％バッファーＢ；３０→３５分：５０％バッファーＢ；３５→４０分：２％バッファーＢ；４０→４５分：２％バッファーＢ。Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐ１  １及びＰＩ  １のＲｔ値はそれぞれ１８．７分及び１７．７分であった。
【０２０３】
実施例２１：
アセチル−ＡＣＶ［９−（２−アセトキシエトキシメチル）グアニン］（１）
アシクロビル（９６．８ｍｇ、０．４３ｍｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）溶液を、無水酢酸（１２２．７μＬ、１．２９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（５．３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で１８時間攪拌した。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、１（９１％収率）を得た。
【０２０４】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＩ（２）
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２２８ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４．５ｍｌ）溶液を、塩化チオニル（９５μＬ、１．３０ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を室温で２時間攪拌した。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、純粋な化合物２（定量的な収率）を得た。
【０２０５】
Ｚ−Ｖａｌ−ＰｒＯ−ＡＣＶ−ＯＡｃ（３）
１（５０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）のピリジン（１．０ｍｌ）溶液を、Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｌ（２）のジメチルホルムアミド溶液で処理した。出発物質が完全に消失するまで反応物を攪拌した（２〜３日）。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、残渣を酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解し、クエン酸（１０％）、ＮａＨＣＯ3（１０％）及び食塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させて残渣を得て、ジクロロメタン：メタノール（２０：１）を用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、３（３９％収率）を得た。
【０２０６】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＡＣＶ−ＯＡｃ（４）
Ｚ−保護された化合物（３）（１５．８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液（Ｐｄ／Ｃ（１０％ｗｔ／ｗｔ）を含有）（１０．２ｍｇ）を室温で４時間、３５ｐｓｉで水素化した。反応混合物をろ過し、ろ液を乾燥するまで減圧下で蒸発させ、４（９０％収率）を得た。
【０２０７】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＡＣＶ（５）
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＡＣＶ−ＯＡｃ（４）（１当量）及び４０％メチルアミン水溶液（５ｍＬ）の混合物を室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン：メタノール（２０：１）を用いたクロマトグラフィーでＣＣＴＬＣで精製し、５（２２％収率）を得た。
【０２０８】
アシクロビルプロドラッグの合成を表す反応スキーム：
【０２０９】
【化１２】
2006525235.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】多くの代表的な試験化合物の構造式をあらわす。
【図２】本発明の１つの実施形態にかかる、インキュベーション時間の関数において精製されたＣＤ２６（５．７ｍＵｎｉｔ）による、５０μＭ  Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−４０５）からＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−２１２）への変換を示す。
【図３】色素産生基質ＧＰ−ｐＮＡ（２５μＭ）からＧＰ＋ｐＮＡへのＣＤ２６触媒による変換に対する、反応時間５分（左側の棒）、１０分（中央の棒）、又は１５分（右側の棒）での、ジペプチドＶａｌ−Ｐｒｏの異なる濃度の阻害効果を示す。ＣＤ２６触媒反応は、ＰＮＡ放出によって生じる吸収の増加を４００ｎｍで記録することによって測定した。
【図４】本発明の１つの実施形態にかかる、ＰＢＳ中のヒト血清（ＨＳ）（上側パネル）及びウシ血清（ＢＳ）（下側パネル）のいくつかの希釈における、５０μＭ  Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−４０５）からＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−２１２）への変換を示す。変換は、インキュベーション３、６又は２４時間後に記録した。
【図５】精製されたＣＤ２６（１．５ｍＵｎｉｔ）による、ＰＢＳ中の２．５％ウシ血清（ＢＳ）又はＰＢＳ中の２．５％ヒト血清（ＨＳ）における、５０μＭ  Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−４０５）からＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−２１２）への変換についてのジプロチンＡの阻害効果を示す。（左側の棒：０μＭ；中央の棒：１００μＭ；右側の棒：１０００μＭ）。
【図６】インキュベーション時間の関数における、ＰＢＳ中の２０％ヒト血清によるＮＡＰ−ＴＳＡＯ（５０μＭ）の種々のジペプチド誘導体の変換を示す。黒色の棒（底部）はＮＡＰ−ＴＳＡＯの親ジペプチド誘導体をあらわす。灰色の棒（中央部）は、最後のアミノ酸（バリン）が除去されたＮＡＰ−ＴＳＡＯ−アミノアシル誘導体をあらわす。白色の棒（上部）は、ジペプチジル−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ誘導体から放出されるＮＡＰ−ＴＳＡＯ（ＣＡＭ−２１２）をあらわす。
【図７】テトラペプチドＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＮＡＰ−ＴＳＡＯからＮＡＰ−ＴＳＡＯへの変換を示す。ジペプチド（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）−ＮＡＰ−ＴＳＡＯ中間体の形成は明らかに形成され、その後に、親薬物にさらに変換される。これは、２段階反応であることを示す。
【図８】ＴＳＡＯ誘導体の合成のために使用される合成スキームの概要をあらわす。
【図９】テトラペプチドプロドラッグを調製するための前駆体構造、及び異なる薬剤のブロックされたジペプチド及びテトラペプチド誘導体及び遊離ジペプチド及びテトラペプチド誘導体の構造を示す。
【図１０】時間の関数におけるＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １プロドラッグからＰＩ  １（プロテアーゼインヒビター）への変換を示す。Ａ：ＣＤ２６；Ｂ：ウシ血清；Ｃ：ヒト血清（両方ともＰＢＳ中１０％）。
【図１１】時間の関数におけるＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １プロドラッグからＰＩ  １（プロテアーゼインヒビター）への変換を示す。上側パネル：ウシ血清（ＰＢＳ中２％）、下側パネル：ヒト血清（ＰＢＳ中２％）。
【図１２】ＧＰ−ｐＮａからＧＰ＋ＰＮＡへのＣＤ２６触媒による変換に対するＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １の阻害（競争）効果を示す（黄色）。
【図１３】２％ヒト血清（ＰＢＳ中）におけるＧＰ−ｐＮａからＧＰ＋ＰＮＡへのＣＤ２６触媒による変換に対するＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １の阻害（競争）効果（黄色）。
【図１４】２％ウシ血清（ＰＢＳ中）におけるＧＰ−ｐＮａからＧＰ＋ＰＮＡへのＣＤ２６触媒による変換に対するＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰＩ  １の阻害（競争）効果（黄色）。
【図１】
2006525235.tif 000018
【図２】
2006525235.tif 000019
【図３】
2006525235.tif 000020
【図４】
2006525235.tif 000021
【図５】
2006525235.tif 000022
【図６】
2006525235.tif 000023
【図８】
2006525235.tif 000024
【図９−１】
2006525235.tif 000025
【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
2006525235.tif 000028
【図１２】
2006525235.tif 000029
【図１３】
2006525235.tif 000030
【図１４】
2006525235.tif 000031
【図７】
2006525235.tif 000032
【配列表】
2006525235000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月11日(2006.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌ではない障害、又はＤＤＰＩＶの増加したレベルに関連する別の障害を治療又は予防するためのプロドラッグであって、オリゴペプチドに接続する治療用化合物Ｄを含み、オリゴペプチドが一般構造
Ｈ−［Ｘ−Ｙ］n
からなり、
ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じ、該化合物Ｄが、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ酵素活性に対する阻害活性を有する薬剤以外の薬剤である、プロドラッグ。
【請求項２】
ｎ＝２〜５である、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項５】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドが、Ｖａｌ−Ｙ−［Ｘ−Ｙ］1-2の群から選択されるテトラペプチド又はヘキサペプチドである、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
Ｙが、プロリン、ジヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリン又はアラニンである、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
該オリゴペプチドが、治療用化合物の芳香族基上、治療用化合物の炭水化物基上、又は治療用化合物のプリン又はピリミジンヌクレオチド基上、又は治療用化合物のアルキル基上、又は治療用化合物の無機の基上に残るアミノ基に結合するアミドを介してカップリングする、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
該リンカーがオリゴペプチドＡmの一般構造を有し、Ａが任意のアミノ酸であり、ｍが１〜１５であり、Ａmが、Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nのカルボキシ末端に対してそのアミノ末端で結合し、Ａmが、アミド結合又はエステル結合を介して該治療用化合物Ｄに対してそのカルボキシ末端で結合する、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
ｍ＝１である、請求項９に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
該治療用化合物Ｄが、ウイルス、バクテリア、原生動物、カビ、酵母及びウイルス感染、炎症、アレルギー、うつ病、疼痛、神経障害、代謝障害、呼吸障害、泌尿器障害、心臓血管障害、ＣＮＳの障害、免疫障害、及び肥満及び糖尿病のようなグルコースレベルの増加に起因する障害以外の代謝疾患の群から選択される障害の予防又は治療のための薬物である、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
水溶解度を調節し、治療用化合物Ｄの血漿タンパク質結合及び／又はバイオアベイラビリティを調節調整するための方法であって、ペプチドを上記治療用化合物にカップリングさせ、得られた接合体がジペプチジル−ペプチダーゼによって開裂可能であり、ここで、前記治療化合物は、癌ではない障害、又はＤＤＰＩＶの増加したレベルに関連する別の障害を治療又は予防するためのものであり、前記化合物Ｄは、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ酵素活性に対する阻害活性を有する薬剤以外の薬剤である、方法。
【請求項１３】
該ジペプチジルペプチダーゼがＣＤ２６であり、該治療用化合物Ｄがペプチド又はタンパク質ではなく、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な末端一級又は二級アミノ基を含むか、又は該治療用化合物Ｄが、アミノ酸のカルボキシル基と結合可能な一級又は二級アミノ基を含むリンカーに結合し、該オリゴペプチドが一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなり、ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは、１、２、３、４及び５から選択され、Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｎ＝２〜５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが疎水性アミノ酸又は芳香族アミノ酸である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
該［Ｘ−Ｙ］nペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが中性アミノ酸又は酸性アミノ酸である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
該［Ｘ−Ｙ］nオリゴペプチドがテトラペプチド又はヘキサペプチドであり、少なくとも１つのＸが塩基性アミノ酸である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１８】
一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなるオリゴペプチドに接続する化合物Ｄを含むプロドラッグの使用であって、−Ｘがアミノ酸であり、ｎ＝１〜５であり、−Ｙが、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、−Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じ、−前記化合物Ｄが、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ酵素活性に対する阻害活性を有する薬剤以外の薬剤であり、癌ではない障害、又はＤＤＰＩＶの増加したレベルに関連する別の障害を治療又は予防するための医薬の製造における、使用。
【請求項１９】
癌ではない障害、又はＤＤＰＩＶの増加したレベルに関連する別の障害を有する動物の治療又は予防の方法であって、前記化合物ＤがＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ酵素活性に対する阻害活性を有する薬剤以外の薬剤であり、前記患者に、一般構造Ｈ−［Ｘ−Ｙ］nからなるオリゴペプチドに接続する化合物Ｄを含むプロドラッグを投与する工程を含み、−ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは、１、２、３、４及び５から選択され、−Ｙは、プロリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、ジヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸（チオプロリン）、デヒドロプロリン、ピペコリン酸（Ｌ−ホモプロリン）、アゼチジンカルボン酸、アジリジンカルボン酸、グリシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、−Ｈ−［ＸＹ］nのカルボキシ末端とＤ又はそのリンカーのアミノ基との間の結合がアミドを介して生じる、方法。
【国際調査報告】
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