(57)【要約】細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスが、本出願において提供される。このプロセスは、  少なくとも１種の二価カチオンを含む溶液から形成される細胞抽出物を加熱して、その抽出物におけるＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程を包含する。本出願はまた、オオムギ細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、その細胞から、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液中へとＰＤＥ−１を放出させて、抽出物を形成する工程；ならびにその抽出物を加熱して、その抽出物中のＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスであって、該プロセスは、
少なくとも１種の二価カチオンを含む溶液から形成される細胞抽出物を加熱して、該抽出物におけるＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；
を包含する、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、前記二価カチオンは、マグネシウムカチオンまたはカルシウムカチオンである、プロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスであって、前記二価カチオンは、マグネシウムカチオンおよびカルシウムカチオンである、プロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスであって、前記二価カチオンの濃度は、１００ｍＭ未満である、プロセス。
【請求項５】
請求項４に記載のプロセスであって、前記二価カチオンの濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、プロセス。
【請求項６】
請求項５に記載のプロセスであって、前記二価カチオンの濃度は、約５０ｍＭである、プロセス。
【請求項７】
請求項１に記載のプロセスであって、前記抽出物を、該抽出物からホスホモノエステラーゼ活性を除去することを可能にする温度まで加熱する、プロセス。
【請求項８】
請求項７に記載のプロセスであって、前記抽出物を、８０℃未満まで加熱する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスであって、前記抽出物を、約４５℃と約７５℃との間まで加熱する、プロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスであって、前記抽出物を、約６０℃まで加熱する、プロセス。
【請求項１１】
オオムギ細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスであって、該プロセスは、
該細胞から、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液中へとＰＤＥ−１を放出させて、抽出物を形成する工程；ならびに
該抽出物を加熱して、該抽出物中のＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；
を包含する、プロセス。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプロセスであって、前記抽出物を、該抽出物を加熱する前に、該抽出物中のホスホジエステラーゼの可溶化を促進するための条件において維持する、プロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記抽出物を、１０℃未満にて維持する、プロセス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプロセスであって、前記抽出物を、０℃〜約４℃にて維持する、プロセス。
【請求項１５】
請求項１１に記載のプロセスであって、
クロマトグラフィーを使用して、前記加熱した抽出物からＰＤＥ−１を精製する工程；
というさらなる工程を包含する、プロセス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセスであって、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記加熱した抽出物からＰＤＥ−１を精製する、プロセス。
【請求項１７】
請求項１〜１６のうちのいずれか１項に記載のプロセスによって精製される、ＰＤＥ−１。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＰＤＥ−１を含む、細胞。
【請求項１９】
リボヌクレオチドを生成するためのプロセスであって、該プロセスは、
ポリリボヌクレオチドを、請求項１７に記載のＰＤＥ−１と接触させて、リボヌクレオチドを生成する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプロセスによって生成される、リボヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞から酵素を抽出して精製することに関し、特に、オオムギ細胞から５’ホスホジエステラーゼを抽出して精製することに関するが、これに限定はされない。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ホスホジエステラーゼ１（オルトリン酸ジエステルホスホヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．１．４．１；本明細書中で「ＰＤＥ−１」）は、リボヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端にあるホスホジエステル結合の加水分解を触媒して５’リボヌクレオチドを生じる、酵素である。
【０００３】
ＰＤＥ−１は、食品産業および薬剤産業にとって特に重要である。なぜなら、酵母ＲＮＡのＰＤＥ−１媒介性切断により生成される５’リボヌクレオチドは、風味相乗剤として有用であるからである。
【０００４】
オオムギ細胞またはオオムギ細根が、ＰＤＥ−１供給源として、食品産業において使用される。
【０００５】
オオムギ細根からＰＤＥ−１を精製するためのプロセスは、高度な抽出技術および分離技術、複数の工程、ならびに高価な試薬および装置を必要とする点で、商業規模で操作することが困難である傾向がある。いくつかのプロセスは、容認できないＰＤＥ−１損失またはＰＤＥ−１消耗によって、特徴付けられる。他のプロセスは、最適に満たない比活性しか有さない最終産物を生じる傾向がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記を考慮すると、ＰＤＥ−１の精製のための改善されたプロセスについての必要性が、存在する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、上記の問題もしくは制限のうちの１つ以上を少なくとも最小限にし、かつ／またはＰＤＥ−１の精製のための改善されたプロセスを提供するように努める。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一局面において、本発明は、細胞からＰＤＥ−１を精製するためのプロセスを提供する。そのプロセスは、少なくとも１種の二価カチオンを含む溶液から形成される細胞抽出物を加熱して、その抽出物におけるＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程、を包含する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、オオムギ細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、
（ａ）その細胞から、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液中へとＰＤＥ−１を放出させて、抽出物を形成する工程；ならびに
（ｂ）その抽出物を加熱して、その抽出物中のＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；
を包含する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、オオムギ細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、
（ａ）その細胞から、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液中へとＰＤＥ−１を放出させて、抽出物を形成する工程；
（ｂ）その抽出物を加熱して、その抽出物中のＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；ならびに
（ｃ）アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、上記の加熱した抽出物からＰＤＥ−１を精製する工程
を包含する。
【００１１】
代表的には、上記細胞は、オオムギ細胞（例えば、オオムギ細根由来の細胞）である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、本発明のプロセスにより生成されるＰＤＥ−１を提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、本発明のプロセスにより生成されるＰＤＥ−１を含む細胞を、提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、リボヌクレオチドを生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、ポリリボヌクレオチドを、本発明のプロセスにより生成されるＰＤＥ−１と接触させて、５’リボヌクレオチドを生成する工程、を包含する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、上記のプロセスにより生成されるリボヌクレオチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（実施形態の詳細な説明）
本明細書中に記載されるように、本発明者は、少なくとも１種の二価カチオンを含む溶液中にあるオオムギ細胞抽出物もしくはオオムギ細根抽出物を加熱処理すると、その抽出物の比活性が増加させられることが可能になることを、見出した。例えば、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液から形成される加熱処理済みオオムギ細根抽出物の比活性は、非加熱処理サンプルより２．６倍増加する（３１２．６×１０−３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ  対  １２２×１０−３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ）ことが、観察された。さらに、カルシウムとマグネシウムとを含む加熱処理済み抽出物は、カルシウムおよびマグネシウムを含まない加熱処理済み抽出物（４６×１０−３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ）と比較して改善された比活性（７８×１０−３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ）を有することが、観察された。
【００１７】
これは、重要な知見である。なぜなら、これは、加熱処理、商業規模で操作することが比較的簡単な精製工程を、ＰＤＥ−１の活性損失を最小限にして実施することを、可能にするからである。
【００１８】
上記抽出物の比活性は、増加することが、考えられる。なぜなら、上記二価カチオンは、ＰＤＥ−１を、その抽出物中の他のタンパク質（ホスホモノエステラーゼを含む）が分解される温度において分解されることから保護するからである。
【００１９】
代表的には、上記溶液中の少なくとも１種の二価カチオンは、マグネシウムカチオンおよび／またはカルシウムカチオンであり得る。例えば、上記溶液は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２を含み得る。
【００２０】
上記マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンは、その抽出物が加熱された場合にＰＤＥ−１の変性の制御を可能にする量で、その抽出物中に含まれ得る。代表的には、マグネシウムおよびカルシウムは、その抽出物が加熱された場合にＰＤＥ−１の変性を少なくとも制限する量で、その抽出物中に含まれる。例えば、カルシウム濃度は、１００ｍＭ未満であり得、マグネシウム濃度は、１００ｍＭ未満であり得る。
【００２１】
約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲にあるカルシウムおよびマグネシウムの濃度は、特に有用である。なぜなら、さらなる精製（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー）のために上記抽出物をさらに下流で処理するには、カルシウムおよびマグネシウムの除去が必要とされ得るからである。従って、カルシウムイオン濃度約５０ｍＭおよびマグネシウムイオン濃度約５０ｍＭが、特に有用である。
【００２２】
ホスホモノエステラーゼは、オオムギ細根抽出物の主要成分であると、考えられる。従って、上記抽出物は、代表的には、その抽出物中のホスホモノエステラーゼの変性またはホスホモノエステラーゼ活性の破壊を可能にする温度まで、加熱される。本明細書中に記載されるように、８０℃未満の温度が、この目的のために適切である。
【００２３】
約４５℃と約７５℃との間まで上記抽出物を加熱することは、特に有利である。なぜなら、７０℃付近およびそれ以上の温度では、ＰＤＥ−１活性が、喪失され得るからである。従って、温度約６０℃が、特に有用である。
【００２４】
本発明者はまた、オオムギ細胞抽出物からのＰＤＥ−１精製は、マグネシウムとカルシウムとを含む溶液中において４℃でオオムギ細胞ホモジネートを抽出することによって、改善され得ることを見出した。具体的には、本明細書中に記載されるように、４℃で維持した後の、カルシウムとマグネシウムとを含む抽出物の比活性は、カルシウムおよびマグネシウムの非存在下で４℃にて維持した抽出物の活性（７５×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ）と比較して、９２×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬであることを見出した。
【００２５】
４℃においてそのような抽出物を維持することは、重要であると、考えられる。なぜなら、これは、ＰＤＥ−１が、その抽出物中の固体から解離することを可能にし、従って、ＰＤＥ−１が、その抽出物のさらなる処理（例えば、加熱処理工程またはクロマトグラフィー分離工程）の前に、その抽出物の液相中に可溶化することを可能にするからである。上記のカルシウムおよびマグネシウムは、４℃において上記抽出物を維持する間の上記酵素の加水分解を制限するために、重要であると考えられる。
【００２６】
従って、本発明に従って、オオムギ細胞からホスホジエステラーゼ１（ＰＤＥ−１）を精製するためのプロセスは、
（ａ）その細胞から、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液中へとＰＤＥ−１を放出させて、抽出物を形成する工程；ならびに
（ｂ）その抽出物を加熱して、その抽出物中のＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；
を包含する。
【００２７】
代表的には、上記抽出物は、その抽出物を加熱する工程の前に、その抽出物中のホスホジエステラーゼの可溶化を促進するための条件下で維持される。
【００２８】
上記抽出物は、１０℃未満にて５日間未満維持され得る。例えば、上記抽出物は、０℃〜約４℃にて、約１時間〜約４８時間維持され得る。
【００２９】
上記抽出物を４℃にて２４時間維持することは、特に有利である。なぜなら、このことは、さらなる精製工程を含む精製プロトコルの速度を改善するからである。
【００３０】
本発明者は、ＰＤＥ−１が、
（ａ）細胞から、カルシウムとマグネシウムとを含む溶液中へとＰＤＥ−１を放出させて、抽出物を形成する工程；
（ｂ）その抽出物を加熱して、その抽出物中のＰＤＥ−１の比活性を増加させる工程；ならびに
（ｃ）クロマトグラフィーを使用して、上記の加熱した抽出物からＰＤＥ−１を精製する工程；
を包含するプロセスによって、オオムギ細胞抽出物から事実上均質な状態まで精製され得ることを、さらに見出した。
【００３１】
本明細書中に記載されるように、ＰＤＥ−１は、アニオン交換クロマトグラフィーによって、加熱処理済みオオムギ細胞抽出物からさらに精製され得る。従って、代表的には、工程（ｃ）において、アニオン交換クロマトグラフィーが使用されて、その加熱された抽出物からＰＤＥ−１が精製される。
【００３２】
本発明者は、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが、アニオン交換クロマトグラフィーの間でのＰＤＥ−１の結合を制限する傾向があることを、見出した。従って、代表的には、上記抽出物は、アニオン交換クロマトグラフィーの前に脱塩される。マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンを除去するためのある脱塩方法は、限外濾過による。あるいは、分取脱塩カラム（例えば、Ｈｉトラップ２６／１０脱塩カラム）が、使用され得る。アニオン交換クロマトグラフィーの前に、そのアニオン交換カラムから精製されるＰＤＥ−１収量を最大にするために、上記抽出物からカルシウムおよびマグネシウムを実質的にすべて除去することは、特に有利である。
【００３３】
代表的には、上記抽出物は、その抽出物を加熱する前に、その抽出物中のホスホジエステラーゼの可溶化を促進するための条件中で維持される。
【００３４】
上記の本発明のプロセスにおいて、上記オオムギ細胞抽出物は、代表的には、適切な緩衝液中にてオオムギ細根を粉砕することによって、生成され得る。細根をホモジナイズする一方法は、ブレンダー（例えば、ワーリングブレンダー）の使用による。あるいは、上記抽出物は、適切な緩衝液中でオオムギ細根を粉砕することによって、生成され得る。
【００３５】
上記細胞由来のＰＤＥ−１が放出されて抽出物を形成する溶液は、代表的には、ｐＨを制御する緩衝液である。Ｔｒｉｓｍａベースから調製された溶液が、そのような溶液の例である。約１００ｍＭ以下のＴｒｉｓ濃度を有する溶液が、適切である。しかし、約２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ〜約５０ｍＭ  Ｔｒｉｓの濃度（例えば、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ）を有する溶液が、特に有利である。なぜなら、本明細書中に記載されるように、このＴｒｉｓ濃度は、アニオン交換カラムに適合し、かつアニオン交換カラムにおけるＰＤＥ−１分離を可能にするからである。
【００３６】
本発明のプロセスは、オオムギ細胞以外の細胞からＰＤＥ−１を精製するために有用であることが理解される。さらに、本発明のプロセスは、オオムギＰＤＥ−１をコードする組換え核酸分子を含む細胞からオオムギＰＤＥ−１を単離するために有用であることが理解される。このような細胞の例としては、細菌細胞および酵母細胞が挙げられる。
【００３７】
別の局面において、本発明は、リボヌクレオチドを生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、ポリリボヌクレオチドを、本発明のプロセスにより生成されたＰＤＥ−１と接触させて、リボヌクレオチドを生成する工程を包含する。好ましくは、このポリリボヌクレオチドは、酵母ＲＮＡ（例えば、酵母リボソームＲＮＡ）由来である。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：材料および機器）
発芽オオムギの種子（Ｓｃｈｏｏｎｅｒ品種）を、Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｂｕｒｓｔｏｎ  Ｍａｌｔｉｎｇ（Ｔｈｏｒｎｌｅｉｇｈ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。チミジン５’モノホスフェートｐ−ニトロフェニルエステル、Ｔｒｉｓｍａベース、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート、Ｂａｋｅｒの酵母ＲＮＡ、ウシ血清アルブミン、グアノシン５’−モノホスフェート、オルトリン酸二水素カリウムを全て、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から調達した。
【００３９】
酵母ｒＲＮＡを、清潔な室内環境においてＲＮＡｓｅを含まないＭｉｌｌｉ  Ｑ水（ｐＨ  ７．０）中の３ｍｇ／ｍＬ標準溶液として調製し、直ちに−８０℃まで凍結し、必要になるまで保存した。
【００４０】
グアノシン５’−モノホスフェートを、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水中に溶解し、−２０℃にて保存することによって、１％（ｗ／ｖ）ストックとして調製した。このストック溶液を、０．０１％（ｗ／ｖ）まで希釈することによって、作業溶液を調製した。
【００４１】
ＦＰＬＣのために使用した緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ８．９）であった。溶離緩衝液は、１Ｍ  ＮａＣｌを含んだ。
【００４２】
ＨＰＬＣ分析について、溶媒（Ａ）は、０．０２Ｍ  オルトリン酸二水素カリウム（ｐＨ  ６．５）溶液であり、一方で、溶媒（Ｂ）は、４０％メタノール（ＨＰＬＣ等級）および６０％  Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水の混合物（ｐＨ  ６．５）であった。
【００４３】
全ての溶媒および緩衝液を、脱気し、使用前に、各溶液を真空下で５分間Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅメンブレンフィルター（孔径０．４５μｍ）に通すことによって濾過した。
【００４４】
Ｕｎｉｃｏｒｎ分析ソフトウェアを支援するＣｏｍｐａｑ  Ｄｅｓｋｐｒｏ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩＩコンピュータと接続された９００モデルのモニタ、ランプおよび検出器（２８０ｎｍに設定）、９２０モデルのポンプおよびＦｒａｃ  ９５０分画コレクターを完備した、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＫＡＴ勾配処理のＦＰＬＣシステムを、全てのタンパク質精製に使用した。使用したカラムは、Ｓｕｐｅｒループ５０に接続されたＨｉ  Ｔｒａｐ  ２６／１０脱塩カラム（より大きい注入容積を容易にするため）、１６／１０  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  Ｑ陰イオン交換カラム、そして、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５カラム上で行なう最終精製を含んだ。
【００４５】
５’ヌクレオチドの分析のために使用したＨＰＬＣシステムは、オンライン脱気ユニットを備えるＳｈｉｍａｄｚｕポンプ（モデルＬＣ−１０Ａｉ）、ＳＣＬ−１０Ａシステムコントローラ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａダイオードアレイ検出器およびカラムオーブン（３０℃に設定）から構成される、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙユニットであり、このシステムを、ＳｈｉｍａｄｚｕクラスＶＰ（バージョン５．０３）分析用ソフトウェアプログラムを動作する、Ｄｅｌｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩＩコンピュータにより制御した。５’リボヌクレオチドの分析に使用したカラムは、Ａｃｔｉｖｏｎ  Ｇｏｌｄｐａｋ  ＨＰＬＣカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５ｍｍ粒子サイズおよび１０ｎｍ孔径）。ピークの高さを、２４５ｎｍおよび２８０ｎｍの両方で記録したクロマトグラムから決定した。
【００４６】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  ＵＶ−可視分光光度計をまた使用して、整列された温度制御セルを用いて、酵素活性を測定し、４１０ｎｍに設定した。これらのセルは、全て、Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ  ４０６０酵素反応速度論ソフトウェアプログラムを動作する、ＨＰ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩコンピュータにより制御した。
【００４７】
（実施例２：ＰＤＥ−１活性を決定するためのｐ−ニトロフェノールについての標準曲線の準備）
１０ｍｇ／１００ｍＬのｐ−ニトロフェノールの溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ８．９）において調製し、０．７１９μモル／ｍｌの濃度のｐ−ニトロフェノールを得た。５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中で希釈物を調製し、４１０ｎｍにおいて４．１ｍＬのサンプルサイズとして読み取り、各希釈段階における酵素活性の吸光度と直接相関させた。
【００４８】
９００モデルモニター、ランプおよび検出器（２８０ｎｍに設定）、９２０モデルポンプおよびＵｎｉｃｏｒｎ分析用ソウフトウェアをサポートするＣｏｍｐａｑ  Ｄｅｓｋｐｒｏ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩＩコンピューターに接続されたＦｒａｃ  ９５０フラクションコレクターを備える、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＫＡＴ勾配プロセシングＦＰＬＣシステムを、すべてのタンパク質精製のために使用した。使用したカラムは、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５カラム上で行われる最終精製に関して、Ｓｕｐｅｒループ５０（より多くの注入量を容易にするため）に接続されたＨｉ  Ｔｒａｐ  ２６／１０脱塩カラム、１６／１０  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  Ｑアニオン交換カラムを備えた。
【００４９】
５’ヌクレオチドの分析のために使用したＨＰＬＣシステムは、オンライン脱ガスユニットを有するＳｈｉｍａｄｚｕポンプ（モデルＬＣ−１０Ａｉ）、ＳＣＬ−１０Ａシステムコントローラ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａダイオードアレイ検出器およびカラムオーブン（３０℃に設定）からなる、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙユニットであり、このシステムを、ＳｈｉｍａｄｚｕクラスＶＰ（バージョン５．０３）分析用ソフトウェアプログラムを操作するＤｅｌｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩＩコンピューターにより制御した。５’リボヌクレオチドの分析用に使用したカラムは、Ａｃｔｉｖｏｎ  Ｇｏｌｄｐａｋ  ＨＰＬＣカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５ｍｍ粒径および１０ｎｍ細孔径）であった、ピーク高さを、２４５ｎｍと２８０ｎｍとの両方で記録したクロマトグラムから決定した。
【００５０】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  紫外可視分光計もまた、酵素活性を測定するために使用し、Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ  ４０６０酵素反応速度ソフトウェアプログラムを操作するＨＰ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＩＩコンピューターによりすべて制御される整列した温度制御セルを用いて４１０ｎｍに設定した。
【００５１】
（実施例２：ＰＤＥ−１活性を決定するためのｐ−ニトロフェノール用の検量線の調製）
ｐ−ニトロフェノールの１０ｍｇ／１００ｍＬ溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中に調製して、ｐ−ニトロフェノールに関して０．０７１９μモル／ｍｌの濃度を得た。希釈液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中に調製し、４１０ｎｍでの４．１ｍＬサンプルサイズとして読み取り、各精製工程において酵素活性吸光度と直接相関付けた。
【００５２】
（実施例３：ＰＤＥ−１比活性を決定するためのタンパク質用の検量線の調製）
タンパク質を、ウシ血清アルブミンについて作られた検量線を利用するＢｒａｄｆｏｒｄの原法に由来するＢｉｏＲａｄマイクロアッセイ手順を使用して決定した。各分析を、５９５ｎｍで測定される吸光度に関して室温で１０分間のインキュベーションを必要とする二連で行った。標準物質は、０．２〜１．４ｍｇ／ｍＬのタンパク質の範囲で調製した。
【００５３】
（実施例４：酵素反応速度アッセイ）
アッセイ溶液は、０．１ｍＬの精製したＰＤＥ−１、２．０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中の１ｍＭチミジン５’一リン酸ｐ−ニトロフェニルエステル（１ｍＬ）および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中の１ｍＭの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（１ｍＬ）からなった。この反応混合物を、毎分４１０ｎｍで酵素的に生成されたｐ−ニトロフェノールの光学濃度を測定しながら３７℃で３０分間インキュベートして、ＰＤＥ−１反応速度を決定した。
【００５４】
その活性を、１ｍＬの精製したＰＤＥ−１当たりの１分当たりのｐ−ニトロフェノールエステルから生成されたｐ−ニトロフェノールのマイクロモルとして規定される１ユニットの活性に関して、検量線に対する推定により決定した。比活性を、精製したＰＤＥ−１のミリグラム当たりの活性として規定した。
【００５５】
（実施例５：ＰＤＥ−１活性の確認）
酵素活性の確認を、精製した酵素と３ｍｇ／ｍＬ  パン酵母ＲＮＡとの反応および逆相ＨＰＬＣにより５’リボヌクレオチド産物を測定することによって行った。
【００５６】
ＨＰＬＣカラムを、１８０Ｋｐａ以下の圧力に確実に維持して、１ｍｌ／分の流速で３０分間、１００％緩衝液Ａで平衡化した。溶出系における溶媒Ｂの速度を、１８分間にわたって４０％まで直線的に増加させ、次いで、次の２分間にわたって１００％まで増加させ、そしてさらに２分間保持して任意の残存する強力に結合した化合物をフラッシュした。この系を、その後の８分間にわたって自動的にその開始条件に戻し、次の注入前にさらに３０分間緩衝液Ａで安定化した。総分析時間は、３０℃のオーブン温度で行われる溶出を含めて６０分間であった。
【００５７】
（実施例６：粗製ＰＤＥ−１抽出物の調製）
５日間（酵素抽出を容易にするための５ｍｇ／ｋｇジベレリン酸中の２日間の含浸を含む）発芽した種から、１０ｇの新鮮なオオムギ細根を得た。この細根を、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１００ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に分散させた。この混合物を、Ｗａｒｉｎｇブレンダーで、高速で１分間ホモジナイズし、４℃で２４時間維持して、ＰＤＥ−１の可溶化を容易にした。
【００５８】
不溶性物質を、ニ重のチーズクロスを通して濾過することによって抽出物から除去した。次いで、濾液を、１５，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離して固体を除去し、そして上清を０．４５μＭフィルターを通過させ、４℃で０．０１％アジ化ナトリウムを含む滅菌容器で保存した。このプロセスにより粗製ＰＤＥ−１抽出物が形成した。
【００５９】
次いで、この粗製ＰＤＥ−１抽出物の活性および比活性を、上記の実施例２〜４に従って決定した。
【００６０】
（実施例７：粗製ＰＤＥ−１抽出物からのＰＤＥ−１の精製）
精製プロセス第１段階は、ＰＤＥ−１の任意の活性の損失またはＰＤＥ−１の構造に対する損傷を低減する目的で、熱不安定性酵素（主として、酸ホスファターゼ［ホスホモノエステラーゼ（ＰＭＥ）］ＥＣ  ３．１．３．２）および阻害性タンパク質の、粗製ＰＤＥ−１抽出物からの除去に関する。ＰＭＥを不活化するために、この粗製抽出物を、水浴中で６０℃まで加熱し、その温度で１時間維持した。次いで、この抽出物を、室温まで冷却し、そしてｐＨを８．９に調整した。次いで、この抽出物を、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。
【００６１】
次いで、加熱処理したＰＤＥ−１抽出物の活性および比活性を、上記の実施例２〜４に従って決定した。
【００６２】
次いで、イオン交換クロマトグラフィーを行った。抽出物の１００ｍＬのサンプルを、Ｓｕｐｅｒループ５０カラムに注入し、そしてＨｉトラップ２６／１０脱塩カラム上で１分当たり７．０ｍＬの流速でＦＰＬＣにより脱塩して、マグネシウムおよびカルシウムを除去した。次いで、脱塩した画分をプールし、Ｓｕｐｅｒループカラムに再充填し、Ｈｉロード１６／１０アニオン交換カラムを１分当たり３．０ｍＬで通過させて、ＰＤＥ−１を初期分画した。単離した画分を、再度脱塩して、１Ｍ  ＮａＣｌ溶出緩衝液を除去し、次いで、その画分をＭｏｎｏ  ＱＨＲ  ５／５カラムを１分当たり１．５ｍＬで通過させることによって精製した。単一ピークを得、上記実施例２〜４に従って、活性および比活性を分析した。
【００６３】
（実施例８：ＰＤＥ−１についての精製プロフィール）
ＰＤＥ−１の精製についての結果を、表１に示す。
【００６４】
【表１】
2006525788.tif 000002
活性：        ×１０−３μモル／分／ｍＬ
比活性：  ×１０−３μモル／分／ｍＬ／ｍｇ。
【００６５】
（実施例９．４℃における可溶化の間の粗抽出物のＰＤＥ−１活性に対する、カルシウムおよびマグネシウムの影響）
本発明者は、カルシウムおよびマグネシウムが、４℃においてＰＤＥ−１を可溶化する工程と、その後の実施例６に記載されるホモジナイゼーション工程の間に、上記の粗抽出物中のＰＤＥ−１の安定化に対して、またはその粗抽出物のＰＤＥ−１活性を保存もしくは増強することに対して、影響を有するか否かを決定する努力を行った。
【００６６】
この目的のために、本発明者は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中で４℃において、上記のホモジネートした抽出物を、（ｉ）カルシウムおよびマグネシウムの非存在下で；（ｉｉ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＣａＣｌ２とともに；および（ｉｉｉ）５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２とともに、維持した。
【００６７】
本発明者は、カルシウムおよびマグネシウムが、ＰＤＥ−１を増強して実際に安定化したことを、見出した。５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２において、ＰＤＥ−１活性は、マグネシウムもカルシウムも含まないサンプル中よりも２２％高かった（７５×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬと比較して、９２×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ）。
【００６８】
（実施例１０．加熱処理の間の粗抽出物のＰＤＥ−１活性に対する、カルシウムおよびマグネシウムの影響）
本発明者は、カルシウムおよびマグネシウムが、実施例７に記載されるＰＤＥ−１を加熱する工程の間に、上記の粗抽出物中のＰＤＥ−１の安定化に対して、またはその粗抽出物のＰＤＥ−１活性を保存もしくは増強することに対して、影響を有するか否かを決定する努力を行った。
【００６９】
この目的のために、本発明者は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．９）中で６０℃において１時間、上記の粗抽出物を、（ｉ）カルシウムおよびマグネシウムの非存在下で；（ｉｉ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＣａＣｌ２とともに；および（ｉｉｉ）５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２とともに、インキュベートした。
【００７０】
本発明者は、加熱工程の後に、上記活性が、マグネシウムおよびカルシウムを含まないサンプルと、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むサンプルとにおいては、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２とを含むサンプルと比較して、４０％を超える分、有意に低下した（７８×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬと比較して、４６×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬおよび４８×１０３μｍｏｌｅ／分／ｍＬ）ことを見出した。
【国際調査報告】
2006525788.tif 000003
2006525788.tif 000004