(57)【要約】本発明は、抗原の免疫原性を増強するためワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油形エマルジョンを提供する。本発明は、内因的に又は外因的にかかるエマルジョンと組合された抗原を含有するワクチン組成物をも提供する。エマルジョン及びワクチンを調製する方法も本発明によって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽質炭化水素非代謝性油、界面活性剤、及び水性成分を含むワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油形エマルジョンであって、前記油が前記水性成分中に分散され、かつ、平均油滴サイズが１μｍ未満である、前記エマルジョン。
【請求項２】
前記油が軽質鉱油であり、１％〜５０％ｖ／ｖの量で存在し、前記界面活性剤がレシチンを含み、０．０１％〜１０％ｖ／ｖの量で存在し、そして前記油が前記水性成分中に分散され、かつ、平均油滴サイズが０．１μｍ〜０．５μｍである、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項３】
約４０％ｖ/ｖの鉱油、約１０％ｗ/ｖのレシチン、約０．１８％ｖ/ｖのＴＷＥＥＮ−８０、約０．０８％ｖ/ｖのＳＰＡＮ−８０、及び水相を含むワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油形エマルジョンであって、前記油が前記水相中に分散され、かつ、平均油滴サイズが０．１μｍ〜０．５μｍである、前記エマルジョン。
【請求項４】
サブミクロン水中油形エマルジョンの製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）軽質炭化水素非代謝性油、界面活性剤及び水性成分を組合せることにより混合物を調製し；
（ｂ）１．０μｍ〜１．１μｍの平均油滴サイズを有する水中油形エマルジョンを生成するべく前記混合物を一次乳化プロセスに付し；及び
（ｃ）  平均油滴サイズが１μｍ未満である前記サブミクロン水中油形エマルジョンを生成するべく（ｂ）で調製した水中油形エマルジョンをマイクロ流動化に付す、
を含む前記方法。
【請求項５】
前記油が軽質鉱油であり、１％〜５０％ｖ／ｖの量で存在し、前記界面活性剤がレシチンを含み、０．０１％〜１０％ｖ／ｖの量で存在し、そして前記サブミクロンエマルジョンの前記平均油滴サイズが０．１μｍ〜０．５μｍである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
水中油形エマルジョン及び抗原を含むワクチン組成物であって、当該抗原が前記エマルジョン中に分散され、当該エマルジョンが軽質炭化水素非代謝性油、界面活性剤、及び水性成分を含み、そして当該エマルジョンの平均油滴サイズが１μｍ未満である、前記組成物。
【請求項７】
前記油が軽質鉱油であり、前記ワクチン組成物中に１％〜２０％ｖ/ｖの量で存在し、前記界面活性剤がレシチンを含み、０．０１％〜１０％ｖ/ｖの量で前記ワクチン組成物中に存在し、そして前記平均油滴サイズが０．１〜０．５μｍの間にある、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原がウイルス抗原又は細菌抗原である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記ウイルス抗原が、死菌ウシウイルス性下痢症ウイルス１型又は２型を含み、前記細菌抗原が不活性化Leptospiraバクテリン、組換え型Streptococcus uberis Pau Ａタンパク質又はE.coli細胞調製物のうちの少なくとも１つを含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ワクチン組成物の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）  軽質炭化水素非代謝性油、界面活性剤及び水性成分を組合せることにより混合物を調製し；
（ｂ）  （ａ）で形成された混合物に抗原を添加し；
（ｃ）  １．０μｍ〜１．１μｍの平均油滴サイズを有する水中油形エマルジョンを生成するべく（ｂ）で形成された前記抗原を含有する混合物を一次乳化プロセスに付し；及び
（ｄ）  平均油滴サイズが１μｍ未満である前記ワクチン組成物を生成するべく（ｃ）で形成されたエマルジョンをマイクロ流動化に付す、
を含む前記方法。
【請求項１１】
前記油が軽質鉱油であり、ワクチン組成物中に１％〜２０％ｖ/ｖの量で存在し、前記界面活性剤がレシチンを含み、０．０１％〜１０％ｖ/ｖの量で前記ワクチン組成物中に存在し、そして前記平均油滴サイズが０．１〜０．５μｍの間にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原がウイルス抗原又は細菌抗原である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス抗原が、死菌ウシウイルス性下痢症ウイルス１型又は２型を含み、前記細菌抗原が不活性化Leptospiraバクテリン、組換え型Streptococcus uberis Pau Ａタンパク質又はE.coli細胞調製物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
マイクロカプセル封入された抗原及び水中油形エマルジョンを含むワクチン組成物であって、当該マイクロカプセル封入された抗原が当該エマルジョン中に分散され、当該エマルジョンが軽質炭化水素非代謝性油、界面活性剤、及び水性成分を含み、そして当該エマルジョンの平均油滴サイズが１μｍ未満である、前記ワクチン組成物。
【請求項１５】
前記油が軽質鉱油であり、前記ワクチン組成物中に１％〜２０％ｖ/ｖの量で存在し、前記界面活性剤がレシチンを含み、０．０１％〜１０％ｖ/ｖの量で前記ワクチン組成物中に存在し、前記抗原がウイルス抗原又は細菌抗原であり、粒子状担体内にカプセル封入され、そして前記担体がポリラクチドグリコール酸を含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、ワクチンの分野、特に獣医動物における免疫応答を増強するためのアジュバント製剤に関する。特に、本発明は、抗原の免疫原性を増強するためのワクチンアジュバントとしてのサブミクロン水中油形エマルジョンの使用に関する。サブミクロン水中油形エマルジョン製剤、かかるエマルジョン内に取込まれた抗原を含有するワクチン組成物、ならびにエマルジョン及びワクチンを調製する方法が、本発明によって提供されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細菌、ウイルス、寄生虫及びマイコプラズマ感染は、畜牛、ブタ及びコンパニオンアニマルといったような獣医動物において広まっている。これらの感染性因子によりひき起こされる疾病は往々にして、抗菌薬剤療法に対する耐性をもち、効果的な治療手段が全く無くなっている。その結果、獣医動物における感染性疾患を制御するために、ワクチン学的アプローチが増々使用されている。化学的不活性化又は適切な遺伝子操作の後、感染性病原体全体をワクチン製剤中での使用に適合させることが可能である。代替的には、病原体のタンパク質サブユニットを組換え型発現系内で発現させ、ワクチン製剤内で使用するために精製することができる。
【０００３】
アジュバントは、一般に、抗原に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を増大させるあらゆる材料を意味する。従来のワクチンは、死菌病原性微生物の粗製調製物から成り、病原性微生物の培養に付随する不純物は、免疫応答を増強させるためのアジュバントとして作用することができた。しかしながら、病理学的微生物又は精製されたタンパク質サブユニットの均質な調製物がワクチン接種用の抗原として使用される場合、かかる抗原によって呼び起こされる免疫性は低く、従ってアジュバントとして或る種の外因性材料の添加が必要となる。さらに、合成及びサブユニットワクチンは生産が高くつく。従って、アジュバントの助けを得ると、免疫応答を刺激するためにさらに少ない用量の抗原しか必要とならない可能性があり、かくしてワクチンの生産コストが節約できる。
【０００４】
アジュバントは、免疫反応を増強するべく数多くの異なるやり方で作用することがわかっている。数多くのアジュバントは、免疫応答と結びつけられたサイトカインネットワークを修飾する。これらの免疫調整アジュバントは、それらが抗原と一緒でない場合でも、その効果を及ぼすことができる。一般に免疫調整アジュバントは、或る種のサイトカインの全体的アップレギュレーション及びその他のサイトカインの同時ダウンレギュレーションをひき起こし、細胞性Ｔｈ１及び／又は体液性Ｔｈ２応答を導く。
【０００５】
一部のアジュバントは、抗原が適切な免疫エフェクタ細胞に効率良く提示され得るような形で、抗原の立体配座的無欠性を保つ能力を有する。アジュバント製剤によりこのように抗原立体配座が保たれることの結果として、ワクチンは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）について示されたものといったような増大した保管寿命を有することになる。Ozel M. et al；免疫刺激複合体（iscom）の四次構造；J. of Ultra struc. And Molec・Struc. Res.１０２，２４０−２４８（１９８９）。
【０００６】
一部のアジュバントは、注入部位におけるデポー剤として抗原を保持する特性を有する。このデポー効果の結果として、抗原は肝臓浄化によって迅速に失なわれることはない。アルミニウム塩及び油中水形エマルジョンは、より短かい持続時間このデポー効果を通して作用する。例えば、油中水形エマルジョンであるフロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）を使用することにより長期デポー剤を得ることができる。ＦＣＡは標準的に、生分解が抗原提示細胞による抗原の除去を可能にするまで、注入部位にとどまる。
【０００７】
この物理的性質に基づいて、アジュバントは、２つの非常に広いカテゴリ、すなわち粒子状アジュバント及び非粒子状アジュバントの下にグループ分けすることができる。粒子状アジュバントは、微粒子として存在する。免疫原は、微粒子を取込むか又はそれと会合することができる。アルミニウム塩、油中水形エマルジョン、水中油形エマルジョン、免疫刺激複合体、リポソーム及びナノ及び微粒子が、粒子状アジュバントの例である。非粒子状アジュバントは一般に免疫調整剤であり、一般に粒子状アジュバントと併用して使用される。ムラミルジペプチド（マイコバクテリアから抽出されたペプチドグリカンのアジュバント活性成分）、非イオン性ブロック共重合体、サポニン（Quillaja saponariaの木の樹皮から抽出されたトリテルペノイドの複合混合物）、脂質Ａ（長さが一般にＣ１２〜Ｃ１６の５個又は６個の脂肪酸連鎖及び２つのリン酸塩基を伴うグリコサミンの２糖類）、サイトカイン、炭水化物重合体、誘導体化された多糖類及び細菌毒素例えばコレラ毒素及びE.coli不安定毒素（ＬＴ）が、非粒子状アジュバントの例である。
【０００８】
最もよく知られたアジュバントのいくつかは、アジュバント製剤に対しデポー効果を付与することのできる粒子材料及び非粒子状免疫調整剤の組合せである。例えば、ＦＣＡは、油エマルジョンの短時間デポー効果と共にMycobacterium tuberculosis成分の免疫調整特性を組合せている。
【０００９】
長い間、ワクチンアジュバントとして油エマルジョンが使用されてきた。Le moignic及びPinoyは１９１６年に、鉱油中の死滅したSalmonella typhimurimの懸濁液が免疫応答を増大させることを発見した。その後１９２５年に、Ramonは、ジフテリアトキソイドに対する抗毒素応答を増大させる物質の１つとしてのでんぷん油について記述した。しかしながら、油エマルジョンは、１９３７年にフロインドが現在フロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）として知られている自作のアジュバント製剤を発表するまで、広く出回っていなかった。ＦＣＡは、死菌マイコバクテリア及びアラセルＡと混合された鉱（パラフィン）油から成る油中水形エマルジョンである。アラセルＡは、主としてマンニドモノオレエートであり、乳化剤として使用される。ＦＣＡは、抗体応答を誘発する上で優れているが、重症疼痛、膿瘻形成、発熱及び肉芽腫性炎症をひき起こす。これらの望ましくない副反応を回避するため、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）が開発された。ＩＦＡは、マイコバクテリア成分が欠如しているという点を除き、その組成はＦＣＡと類似している。ＩＦＡは、全ての注入部位におけるデポー製剤及び抗体産生細胞の刺激に伴う抗原の緩慢放出を通して作用する。
【００１０】
ＦＣＡを改善するためのもう１つのアプローチは、鉱油を生体適合性油で置換することが注入部位におけるＦＣＡと結びつけられた反応を削除する一助となるという概念に基づいていた。同様に、エマルジョンは、油中水形が注入部位において長時間持続するデポーを生成することから、油中水形ではなく水中油形であるべきであると考えられていた。Hilleman et al.は、８６％の落花生油、乳化剤としての１０％のアラセルＡ及び安定化剤としての４％のモノステアリン酸アルミニウムから成る油ベースのアジュバント「アジュバント６５」について記述した。Hilleman, １９６６，Prog, Med Viol.８：１３１−１８２；Hilleman及びBeale,１９８３，New Approaches to Vaccine Development（Eds. Bell, R, 及びTorrigiani, G.），Schwabe, Basel中。ヒトにおいては、アジュバント６５は、安全かつ効能の高いものであったが、ＩＦＡに比べ低いアジュバント性しか示さなかった。それでも、アジュバント６５の使用は、いくつかのワクチンロットでのヒトに対する反応原性及びアラセルＡの代りに精製済み又は合成乳化剤を使用した場合のアジュバント性の低下のために中断された。米国特許第５，７１８，９０４号明細書及び５，６９０，９４２号明細書は、水中油形エマルジョン中の鉱油が、安全性プロフィールを改善させる目的で代謝性の油と置換され得ることを教示している。
【００１１】
アジュバント性及び安全性以外に、エマルジョンの物理的外見も又重要な商業的考慮事項である。物理的外見はエマルジョンの安定性によって左右される。クリーミング、沈降及び合一がエマルジョンの不安定性の指標である。クリーミングは、エマルジョンの油相と水相が異なる比重を有するときに発生する。クリーミングは同様に、エマルジョンの初期液滴サイズが大きく、エマルジョン液滴がいかなるブラウン運動も有していない場合にも発生する。液滴サイズが大きい場合、界面破断の傾向が存在し、液滴は大きな粒子へと合一する。エマルジョンの安定性は、使用されるエマルジョンの性質及び量、エマルジョン中の液滴直径サイズ及び油相と水相の間の密度差といったような数多くの因子により決定される。
【００１２】
乳化剤は、界面自由エネルギーを低減させ液滴合一に対する物理的又は静電気障壁を作り上げることにより、分散した液滴の安定化を促進する。非イオンならびにイオン性洗浄剤が乳化剤として使用されてきた。非イオン乳化剤は、界面において方向づけを行ない比較的かさ高い構造を生成し、かくして分散した液滴の立体回避が導かれる。アニオン性又はカチオン性乳化剤は、対イオンを引きつけることによって電気的２重層の形成を誘発する。２重層斤力により、液滴は、互いに近づいた時点で反発することになる。
【００１３】
乳化剤の使用以外に、エマルジョンの安定性は、同じく、機械的手段によりエマルジョンの液滴サイズを低減させることを通しても達成可能である。エマルジョンを製造するためには、標準的には、プロペラミキサー、タービン回転子、コロイドミル、ホモジナイザ及び音波処理機が使用されてきた。エマルジョン中の液滴サイズの均質性を増大させるもう１つの方法はマイクロ流動化である。マイクロ流動化は、サブミクロン範囲の一貫性ある粒子サイズで物理的にきわめて安定したエマルジョンを生成することができる。エマルジョンの安定性を増大させること以外に、マイクロ流動化プロセスは、最終生成物の無菌性を確保する１つの好ましい方法である末端ろ過を可能にする。その上、サブミクロンの油粒子は、注入部位からリンパ管内へ、そしてその後排液連鎖のリンパ節、血液及び脾臓の中へと通過し得る。こうして、局所的炎症及び有意な注入部位反応を生成しうる注入部位における油質のデポーを樹立する確率が低くなる。
【００１４】
マイクロ流動化装置は、現在市販されている。エマルジョン形成は、マイクロ流動化装置内で、相互作用チャンバ内部で２つの流動化された流れが高速で相互作用するにつれて発生する。マイクロ流動化装置は、空気又は窒素により駆動され、２０，０００psiを超過した内部圧で作動し得る。米国特許第４，９０８，１５４号明細書は、いかなる乳化剤も基本的に含まないエマルジョンを得るためのマイクロ流動化装置の使用を教示している。
【００１５】
文献中では、数多くのサブミクロン水中油形アジュバント製剤が記述されてきた。米国特許第５，３７６，３６９号明細書は、シンタックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）として知られているサブミクロン水中油形エマルジョンアジュバント製剤について教示している。ＳＡＦは、油成分としてのスクアレン又はスクアラン、エマルジョン形成量のPluronic Ｌ１２１（ポリオキシ−プロピレン−ポリオキシエチレン）ブロック重合体及び免疫増強量のムラミルジペプチドを含有している。スクアレンは、数多くの組織内、特にサメ又はその他の魚の肝臓の中に見い出されるコレステロールの線形炭化水素前駆体である。スクアランは、スクアレンの水素化により調製され、完全に飽和されている。スクアレン及びスクアランは両方共、代謝性であり、毒物学的研究上の優れた記録を有している。スクアレン又はスクアランエマルジョンは、穏やかな副作用と所望の効能を伴ってヒトの癌ワクチン内で使用されてきた。Anthony C. Allison, １９９９，「アジュバントとしてのスクアレン及びスクアランエマルジョン」、Methods １９；８７−９３を参照のこと。
【００１６】
米国特許第６，２９９，８８４号明細書及び国際特許公開ＷＯ９０／１４８３７号パンフレットは、ポリオキシ−プロピレンブロック共重合体がサブミクロン水中油形エマルジョンの形成にとって不可欠でないということを教示している。その上、こられの参考文献は、非毒性の代謝性油の使用を教示し、そのエマルジョン製剤の中での鉱油及び毒性石油留出物油の使用を明示的に排除している。
【００１７】
米国特許第５，９６１，９７０号明細書は、ワクチンアジュバントとして使用されるべきもう１つのサブミクロン水中油形エマルジョンを教示している。この特許に記述されているエマルジョンにおいては、疎水性成分は、中鎖脂肪酸トリグリセリド、植物油及びそれらの混合物から成るグループの中から選択される。このエマルジョンの中に含まれている界面活性剤は、リン脂質（例えばレシチン）といったような天然の生物学的に相容性ある界面活性剤又はＴＷＥＥＮ−８０といったような薬学的に受容可能な非天然界面活性剤であり得る。この特許は同様に、エマルジョンが独立してかつ外因的に形成された後にエマルジョンと抗原を混合することは対照的に、エマルジョンが形成された時点でエマルジョン内に抗原を取込むことをも教示している。
【００１８】
米国特許第５，０８４，２６９号明細書は、鉱油と組合せた形でレシチンを含有するアジュバント製剤が、宿主動物の体内での炎症を軽減し、同時に全身性免疫の増大を誘発するということを教示している。米国特許第５，０８４，２６９号明細書の結果としてもたらされたアジュバント製剤は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）という商標名で獣医ワクチンの中で商業的に使用されている。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤は、レシチンでとり囲まれたミセル油液滴で作られている。これらのミセルは、従来の油ベースのアジュバントよりもさらに全細胞の抗原を付着可能にする。その上、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）ベースのワクチン製剤は、１０％〜２０％の油を標準的に含有する油アジュバントを含むその他のワクチン製剤と比べて２．５〜５％の鉱油という低い油分を含んでいる。その低油分のため、このアジュバントベースのワクチン製剤は、注入部位における組織にとって刺激が少なくなっており、その結果、病巣はさらに抑えられて食肉解体時のトリミングも少なくなる。それに加えて、油滴をとり囲むレシチンコーティングはさらに注入部位反応を低減させ、安全でかつ効果的なワクチンを結果としてもたらす。
【００１９】
数多くの獣医ワクチンにおけるアジュバントとしてＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤が使用されており、短期及び長期貯蔵期間中のならびＮ再構成時のワクチン製剤の物理的外見を維持する必要性が存在する。さらに、凍結乾燥された抗原が、注入の直前に予め作られたアジュバント製剤と混合物される。この実践方法は、水中油形エマルジョン中に抗原の均等な分布が存在することをつねに保証するわけではなく、エマルジョンの外見が望ましいものでない可能性がある。その上、放置した場合には、均質化されたエマルジョンが、相分離を起こす可能性がある。従って、貯蔵期間が長い場合でも相分離を起こさない安定したアジュバント製剤に対する必要性が存在する。相分離を防止する１つの方法は、液滴直径を低減させ、エマルジョンの粒子均質性を増大させることにある。代謝性油ベースのエマルジョン製剤のマイクロ流動化プロセスは実証されてきたものの、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤といったような水中油形エマルジョンのマイクロ流動化はまだ実施されていない。
【００２０】
本発明においては、レシチンにとり囲まれた鉱油滴のサイズをサブミクロンサイズにするためにマイクロ流動化が用いられてきた。予想外にも、レシチンと油の混合物から成る水中油形エマルジョンのアジュバントが付加されたワクチン製剤のマイクロ流動化が、製剤の物理的外見を改善するばかりでなく製剤の免疫効果を増強するということが、当該発明人らによって発見された。マイクロ流動化された製剤は、改善された安全性プロフィルによっても特徴づけされる。
【発明の開示】
【００２１】
発明の要約
当該発明人は、マイクロ流動化により、非代謝性油ベースの水中油形エマルジョンの安全性プロフィール及びアジュバント活性を改善することができるということを予想外にも発見した。マイクロ流動化されたエマルジョンの中に取込まれた抗原は、抗原がマイクロ流動化に先立ってエマルジョン内に内因的に取込まれた場合でも安定している。
【００２２】
従って、１つの実施形態においては、本発明は、ワクチンアジュバントとして有用であるサブミクロン水中油形エマルジョン製剤を提供している。本発明のサブミクロン水中油形エマルジョンは、非代謝性油、少なくとも１つの界面活性剤及び水性成分から成り、ここで油は、サブミクロン範囲内の平均油滴サイズで水性成分中に分散されている。好ましい非代謝性油は、軽質鉱油である。好ましい界面活性剤にはレシチン、Tween−８０及びＳＰＡＮ−８０が含まれる。
【００２３】
本発明により提供される好ましい水中油形エマルジョンは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤で構成されている。
【００２４】
本発明の水中油形エマルジョンは、防腐剤、浸透圧性薬剤、生体接着性分子及び免疫刺激性分子を含めた適切かつ望ましい付加的な成分の中に含まれ得る。好ましい免疫刺激性分子としては、例えばＱｕｉｌ−Ａ、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡ）が含まれる。
【００２５】
もう１つの実施形態においては、本発明はサブミクロン水中油形エマルジョンの調製方法を提供する。本発明に従うと、油、単数又は複数の界面活性剤、水性成分及びエマルジョン内で使用するのに適したその他のあらゆる成分を含めた、エマルジョンのさまざまな成分は、一緒に混合される。該混合物は、一次乳化プロセスに付されて水中油形エマルジョンを形成し、このエマルジョンは次にマイクロ流動化装置の中を通過させられて、直径１ミクロン未満、好ましくは平均液滴サイズが０．５ミクロン未満である液滴をもつ水中油形エマルジョンを提供する。
【００２６】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、上述のサブミクロン水中油形エマルジョン及び抗原を含有するワクチン組成物を提供している。抗原は、外因的又は内因的に、好ましくは内因的にエマルジョン内に取込まれる。
【００２７】
本発明のワクチン組成物中に内含可能な抗原は、細菌、真菌又はウイルス抗原又はそれらの組合せであり得る。抗原は、不活性化された全細胞又は部分細胞又はウイルス調製物の形、又は従来のタンパク質精製、遺伝子工学技術又は化学合成によって得られる抗原分子の形をとることができる。
【００２８】
さらなる実施形態においては、本発明はサブミクロン水中油形エマルジョンと組合わされた単数又は複数の抗原を含有するワクチン組成物を調製する方法を提供する。
【００２９】
本発明のワクチン組成物を調製するにあたっては、該抗原（単複）を、水中油形エマルジョンの成分と内因的に（例えばマイクロ流動化に先立って）か又は外因的に（例えばマイクロ流動化の後）組合わせることができる。好ましくは、抗原は、内因的に水中油形エマルジョンの成分と組合わされる。
【００３０】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、マイクロカプセル封入された抗原が外因的にエマルジョンと組合わされている、上述のサブミクロン水中油形エマルジョンとマイクロカプセル封入された抗原を含むワクチン組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
予想外にも、当該発明人らによってレシチンと鉱油の混合物から成る水中油形エマルジョンのアジュバントが付加されたワクチン製剤のマイクロ流動化が、ワクチン製剤の物理的外見を改善するばかりでなくワクチン製剤の免疫効果を増強するということが発見された。マイクロ流動化された製剤は、改善された安全性プロフィールによっても特徴づけされる。
【００３２】
これらの発見に基づいて、本発明は、ワクチン組成物内のアジュバントとして有用なサブミクロン水中油形エマルジョンを提供する。マイクロ流動化装置を用いることによりこれらのサブミクロン水中油形エマルジョンを作る方法も提供されている。さらに、本発明は、抗原がサブミクロン水中油形エマルジョンと組合されるサブミクロンワクチン組成物を提供している。かかるワクチン組成物を作る方法も同様に提供される。本発明はさらに、サブミクロン水中油形エマルジョンと組合されたマイクロカプセル封入された抗原を含有するワクチン組成物及びかかるワクチンを作る方法も提供している。
【００３３】
開示を明確にするため、又制限的意味無く、本発明の詳細な説明は、本発明のいくつかの特長、実施形態又は応用を記述又は例示する以下の小項目に分割される。
【００３４】
サブミクロン水中油形エマルジョン
１実施形態において、本発明は、ワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油形エマルジョン製剤を提供する。本発明のサブミクロン水中油形エマルジョンは、ワクチン組成物内の抗原の免疫原性を増強し、動物に対する投与にとって安全であり、貯蔵中安定している。
【００３５】
本発明のサブミクロン水中油形エマルジョンは、非代謝性油、少なくとも１つの界面活性剤及び水性成分で構成され、ここで油は、サブミクロン範囲の平均油滴サイズで水性成分中に分散されている。
【００３６】
「サブミクロン」というのは、液滴が１μｍ（ミクロン）未満のサイズのもであり、平均油滴サイズが１μｍ未満であることを意味している。好ましくは、エマルジョンの平均液滴サイズは、０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満；そしてさらに一層好ましくは０．４μｍ未満又は約０．１〜０．３μｍである。
【００３７】
「平均液滴サイズ」というのは、粒子サイズの体積分布内の体積平均直径（ＶＭＤ）粒子サイズとして定義づけされる。ＶＭＤは、各粒子直径をそのサイズの全ての粒子の体積で乗じ、合計することによって計算される。これは次に、全ての粒子の合計体積によって除される。
【００３８】
本書で使用している「非代謝性油」というのは、エマルジョンが投与される動物対象の身体によって代謝され得ない油を意味する。
【００３９】
本書で使用する通りの「動物」及び「動物対象」という語は、畜牛、羊、豚などを含めた全ての非ヒト動物を意味する。
【００４０】
本発明のエマルジョン内で使用するのに適した非代謝性油には、アルカン、アルケン、アルキン、及びその対応する酸及びアルコール、エーテル及びそれらのエステル及びそれらの混合物が含まれる。好ましくは、油の個々の化合物は軽質化合物である。すなわち、かかる成分は６〜３０個の炭素原子を有する。油は、石油製品から合成的に調製又は精製可能である。本発明のエマルジョンにおいて使用するための好ましい非代謝性油としては、鉱油、パラフィン油、及びシクロパラフィンなどが含まれる。
【００４１】
「鉱油」という語は、蒸留技術を介して石油から得た液体炭化水素の混合物を意味する。この語は、「液化パラフィン」、「流動ワセリン」及び「白色鉱油」と同義語である。この語は同様に、「軽質鉱油」すなわちワセリンの蒸留によって同様に得られるものの白色鉱油よりわずかに低い比重を有する油を内含することも意図されている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, 第１８版（Easton, Pa.；Mack Publishing Company, １９９０，７８８及び１３２３ページ）。鉱油は、例えばさまざまな商業的供給源、例えば、J. T. Baker（Phillipsburg, ＰＡ），ＵＳＢ Corporation（Cleveland, ＯＨ）から得ることができる。好ましい鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）という名前で市販されている軽質鉱油である。
【００４２】
標準的には、本発明のサブミクロンエマルジョンの油成分は、１〜５体積％好ましくは１〜４５％、より好ましくは２０〜４０％の量で存在する。
【００４３】
本発明の水中油形エマルジョンは少なくとも１つ（すなわち単数又は複数）の界面活性剤を標準的に内含している。本書では互換的に使用されている語である界面活性剤及び乳化剤というのは、油滴の表面を安定化させ所望のサイズ内に油滴を維持する作用物質である。
【００４４】
当該エマルジョン内で使用するのに適した界面活性剤は、天然の生物学的に相容性ある界面活性剤及び非天然の合成界面活性剤を内含する。生物学的に相容性ある界面活性剤には、リン脂質化合物又はリン脂質混合物が含まれる。好ましいリン脂質は、大豆又は卵レシチンといったようなホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗製植物油を水洗浄し、結果として得た水和ゴムを分離し乾燥させることにより、ホスファチド及びトリグリセリドの混合物として得ることができる。アセトン洗浄によるトリグリセリド及び植物油の除去の後に残ったアセトン不溶性リン脂質及び糖脂質について混合物を分画することにより、精製品を得ることができる。代替的には、さまざまな商業的供給源からレシチンを得ることができる。その他の適切なリン脂質には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン及びホスファチジルエタノールアミンが含まれる。リン脂質は、天然供給源から単離することもできるし又、従来通り合成することもできる。
【００４５】
本発明のサブミクロンエマルジョン内で使用するのに適した非天然合成界面活性剤としては、ソルビタンベースの非イオン界面活性剤、例えば脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（登録商標）又はＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名で市販されている）、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ヒマシ油といった供給源からの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ）；ポリエトキシル化脂肪酸（例えばＳＩＭＵＬＳＯＬ  Ｍ−５３という名前で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒド重合体（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ）、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ）が含まれる。好ましい合成界面活性剤は、ＳＰＡＮ（登録商標）及びＴＷＥＥＮ（登録商標）の名で入手可能な界面活性剤である。
【００４６】
本発明の水中油形エマルジョン内で使用するための好ましい界面活性剤にはレシチン、Tween８０及びＳＰＡＮ−８０が含まれる。
【００４７】
一般的には、界面活性剤又２つ以上の界面活性剤が用いられる場合には界面活性剤の組合せは、エマルジョン中に、０．０１〜１０体積％、好ましくは０．１％〜６．０％、より好ましくは０．２％〜５．０％の量で存在する。
【００４８】
水性成分は、エマルジョンの連続相を構成し、水、緩衝生理食塩水又はその他の適切なあらゆる水溶液であり得る。
【００４９】
本発明の水中油形エマルジョンは、防腐剤、浸透圧性薬剤、生体接着性分子及び免疫刺激性分子を含め、適切かつ望ましい付加的成分を内含し得る。
【００５０】
生体接着性分子が標的粘膜表面上で又はこれを通しての抗原の送達及び付着を増強し、粘膜免疫を付与することができると考えられている。適切な生体接着性分子の例としては、ポリアクリル酸及びポリメタクリル酸（例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、ＣＡＲＢＯＭＥＲ）といったような酸性の天然に発生しない重合体；カルボキシメチルセルロースといったような酸性で合成的に修飾された天然重合体；（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースといったような中性の合成的に修飾された天然重合体；キトサンといったような塩基性アミン担持重合体；アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン、トラガカント及びカラヤゴムといったような天然供給源から得ることのできる酸性重合体；及びポリビニルアルコールといったような中性の天然に発生しない重合体；又はそれらの組合せが含まれる。
【００５１】
本書で使用されている「免疫刺激性分子」という語句は、ワクチン組成物中で抗原成分によって誘発される防御免疫応答を増強させるような分子を意味する。適切な免疫刺激性材料としては、細菌細胞壁成分、例えばムラブチド、トレオニル−ＭＤＰ及びムラミルトリペプチドといったようなＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンなどのＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンの誘導体；サポニングリコシド及びその誘導体、例えばＱｕｉｌ−Ａ、ＱＳ２１、及びＧＰＩ−０１００；コレステロール；及び第４級アンモニウム化合物、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）及びＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「アブリジン」）が含まれる。
【００５２】
サポニンは、多様な植物種の中で二次代謝物として産生されるグリコシド化合物である。サポニンの化学構造は、一部の強力かつ効果的な免疫学的活性を含む広範囲の薬理活性及び生物活性を付与する。
【００５３】
構造的には、サポニンは、単数又は複数の糖鎖に付着されたあらゆるアグリコンから成る。サポニンはそのアグリコン組成に応じて、トリテルペングリコシド、ステロイドグリコシド及びステロイドアルカロイドグリコシドに分類することができる。
【００５４】
サポニンは、Quillaja saponariaの樹脂から単離可能である。サポニンは、長い間免疫刺激剤として知られてきた。Dalsgaard, K.,「口蹄疫に対する畜牛のワクチン接種における応用を特に参考にしたそのアジュバント活性の評価」、Acta. Vet. Scand.６９：１〜４０、１９７８。サポニンを含有する植物の粗製抽出物は、口蹄疫ワクチンの効能を増強した。しかしながら該粗製抽出物には、ワクチン内に使用された時点で不利な副作用が付随した。その後、Dalsgaardは、透析、イオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィによりサポニンからアジュバント活性成分を部分的に精製した。Dalsgaard, K et al,「サポニンアジュバントＩＩＩ．口蹄疫ワクチン中のアジュバント活性をもつQuillaja saponaria Morinaからの物質の単離」、Arch. Gesamte. Virusforsch. ４４；２４３−２５４，１９７４。この要領で精製したアジュバント活性成分は「Ｑｕｉｌ−Ａ．」として知られている。重量ベースで、Ｑｕｉｌ−Ａは、効能の増大を示し、サポニンと比べた場合、局所的反応の減少を示した。Ｑｕｉｌ−Ａは、獣医ワクチン中で広く用いられている。
【００５５】
高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によるＱｕｉｌ−Ａのさらなる分析は、密に関連するサポニンの異種混合物を顕示し、毒性が減少した又は最小限である強力なアジュバントであったＱＳ２１の発見を導いた：Kensil C. R. et al.,「Quillaja saponaria Molina樹皮からのアジュバント活性をもつサポニンの分離と特徴づけ」J. Immunol. １４６；４３１−４３７，１９９１。大部分のその他の免疫刺激剤とは異なり、ＱＳ２１は水溶性であり、エマルジョンタイプの製剤を伴って、又は伴わずにワクチン内で使用可能である。ＱＳ２１は、マウス体内のＴｈ１型応答を惹起してＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体の産生を刺激することが示されてきており、サブユニット抗原に応答して抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ）を誘発した。ヒトにおける臨床研究は、受容可能な毒物学的プロフィールと共にそのアジュバント性を証明した。Kensil, C.R et al.,「Vaccine designe」中、ワクチンアジュバントＱＳ−２１の構造的及び免疫学的特徴づけ：サブユニット及びアジュバントアプローチ」、Eds. Powell, Ｍ．Ｆ．及びNewman, M. J. Plenum Publishing Corporation, New York, １９９５，ｐ５２５〜５４１。
【００５６】
米国特許第６，０８０，７２５号明細書は、サポニン−脂肪親和性接合体を作り使用する方法を教示している。このサポニン−脂肪親和性接合体の中で、脂質、脂肪酸、ポリエチレングリコール又はテルペンといった脂肪親和性分子は、トリテルペンサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸上に存在するカルボキシ基を介してアシル化されていない又はデスアシル化されたトリテルペンサポニンに共有結合により付着されている。Quillaja デスアシルサポニン、ルシオシドＰ又はGypsophila, saponaria 及び Acanthophyllumからのサポニンといったようなサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸に対する脂肪親和性分子の付着は、体液性及び細胞媒介免疫に対するそのアジュバント効果を増強させる。さらに、ノン又はデスアシルサポニンの３−Ｏ−グルクロン酸残基に対する脂肪親和性分子の付着は、もとのサポニンに比べ精製が容易で、毒性が低く、化学的により安定しておりかつ同等以上のアジュバント特性を有するサポニン類似体を生成する。
【００５７】
ＧＰＩ−０１００は、米国特許第６，０８０，７２５号明細書内に記述されているサポニン−脂肪親和性接合体である。ＧＰＩ−０１００は、グルクロン酸のカルボキシ基を介してデスアシルサポニンに対し脂肪族アミンを付加することにより産生される。
【００５８】
第４級アンモニウム化合物−アミン、第４級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン及びチオウロニウムを含む免疫学的アジュバントとして使用するために数多くの脂肪族窒素含有塩基が提案されてきた。特定のかかる化合物としてはジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロミド（ＤＤＡ）及びＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「アブリジン」）が含まれる。
【００５９】
米国特許第５，９５１，９８８号明細書は、油成分と合わせてＤＤＡといった第４級アンモニウムを含有するアジュバント製剤について教示している。この製剤は、免疫原性応答を増強するため、ワクチン組成物内で例えばウイルス又は細菌抗原といった既知の免疫学的物質との併用の形で有用である。該組成物は、非特異的免疫刺激物質としての取込まれた抗原が無くても有用である。
【００６０】
米国特許第４，３１０，５５０号明細書は、ワクチンアジュバントとしての脂肪又は脂質エマルジョンと共に処方されたＮ，Ｎ−高級アルキル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン及びＮ，Ｎ−高級アルキル−キシリレンジアミンの使用について記述している。アジュバント製剤の非経口投与を通したヒト又は動物の体内の抗原の免疫原性応答を誘発又は増強する方法が、米国特許第４，３１０，５５０号明細書内で記述されている。
【００６１】
好ましい実施形態においては、本発明は、１μｍ未満のサイズ及び約０．２５μｍの平均液滴サイズの液滴で、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤から成るワクチンアジュバントとして有用なサブミクロン水中油形エマルジョンを提供する。
【００６２】
本書において使用されている通りの「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤」という語は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０の存在下で食塩溶液とＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）レシチン油溶液（Hydronics, Lincoln, ＮＥ）を混合することにより形成された溶液を意味する。標準的なＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤は、４０体積％（v／v）の軽質鉱油、約２５％ｗ/vのレシチン、約０．１８体積％（v／v）のＴＷＥＥＮ８０及び約０．０８体積％（v／v）のＳpan８０を含有する。
【００６３】
サブミクロン水中油形エマルジョンの調製方法
もう１つの実施形態においては、本発明は、以上で記述されたサブミクロン水中油形エマルジョンの調製方法を提供する。
【００６４】
本発明に従うと、油、単数又は複数の界面活性剤、水性成分及びエマルジョン内で使用するのに適したその他のあらゆる成分を内含するエマルジョンのさまざまな成分は、組合され混合される。
【００６５】
形成された混合物は、標準的には、均質な外見及び約０．５μｍの平均液滴サイズをもつ水中油形エマルジョンを形成するべく単数又は複数のホモジナイザ又は乳化装置を単数又は複数回通過させることにより、乳化プロセスに付される。この目的で、Ross乳化装置（Hauppauge, NY），Gaulinホモジナイザ（Eeratt, MA）などの市販のあらゆるホモジナイザ又は乳化装置を使用することが可能である。
【００６６】
このように形成されたエマルジョンは、液滴サイズをサブミクロン範囲内にするため、次にマイクロ流動化に付される。マイクロ流動化は、Microfluidics, Newton, Massから入手可能な型式番号１１０Ｙ；Gaulin ３０ＣＤ型（Gaulin, Inc., Everett, Mass.）：及びRainnie Minilab ８.３０Ｈ型（Miro Atomizer Food and Dairy, Inc. Hudson, Wis）といった市販のマイクロ流動化装置を使用することによって達成可能である。これらのマイクロ流動化装置は、高圧下で小さなアパーチャを通して流体を強制することによって作動し、かくして２つの流体流は、サブミクロンサイズの液滴を伴うエマルジョンを形成するべく、相互作用チャンバ内で高速にて相互作用するようになっている。
【００６７】
液滴サイズは、市販の定寸装置を用いて、例えばレーザー回折といった当該技術分野において既知のさまざまな方法によって決定可能である。該サイズは、使用される界面活性剤のタイプ、界面活性剤と油の割合、作用圧、温度などに応じて変動し得る。当業者であれば、過度の実験無く、所望の液滴サイズをもつエマルジョンを得るべくこれらのパラメータの所望の組合せを決定することができる。本発明のエマルジョンの液滴は、直径が１μｍ未満で、好ましくはその平均液滴サイズは０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満、さらに一層好ましくは、０．３μｍ未満であり、直径１μｍ未満である。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態においては、Hydronics（Lincoln, NE）から市販されており軽質鉱油中に２５％のレシチンを含有するＤＲＡＫＥＯＬレシチン油溶液を、食塩水ならびに界面活性剤 ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０と組み合わせて混合して「ＡＭＰＨＧＥＮ（登録商標）溶液」又は「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤」を形成させる。このときＡＭＰＨＧＥＮ（登録商標）溶液は、水中油形エマルジョンを形成するべく約３４００rpmでＲoss（登録商標）（Hauppage, NY１１７８８）乳化装置を用いて乳化される。その後、該エマルジョンは、約４５００±５００psiで作動するマイクロ流動化装置に一回通される。マイクロ流動化された水中油形エマルジョンは、約０．２５μｍの平均液滴サイズで、１μｍ未満のサイズの液滴を有する。
【００６９】
サブミクロン水中油形エマルジョン中に取込まれた抗原を含有するワクチン組成物
もう１つの実施形態においては、本発明は、以上で記されたサブミクロン水中油形エマルジョン及び抗原（単複）を含有するワクチン組成物を提供している。これらのワクチン組成物は、増強された免疫原性効果と改善された物理的外見（例えば長期貯蔵後にいかなる相分離も観察されない）を有することを特徴とする。さらに、本発明のワクチン組成物は、動物に投与するのに安全である。
【００７０】
本発明に従うと、抗原は、外因的又好ましくは内因的に、エマルジョンと組み合わせることができる。「内因的に」という語は、マイクロ流動化段階の前にエマルジョン成分と抗原を組み合わせるプロセスを意味する。「外因的に」という語は、エマルジョンがマイクロ流動化された後にこのエマルジョンに抗原を付加するプロセスを意味する。外因的に付加される抗原は、遊離抗原であり得、そうでなければ、以下でさらに記述されている通り、微粒子の中にカプセル封入され得る。
【００７１】
本書で使用されている通りの「抗原」という語は、動物の体内で免疫原性であり、該ワクチン組成物が投与される動物の体内で防御免疫応答を惹起するあらゆる分子、化合物又は組成物を意味する。
【００７２】
抗原に関連して用いられる「免疫原性」という語は、抗原に対し動物の体内で免疫応答を誘発する抗原の能力を意味する。免疫応答は、主として細胞毒性Ｔ細胞により媒介される細胞性免疫応答又は、それ自体Ｂ細胞を活性化して抗体産生に導くヘルパーＴ細胞により主として媒介される体液性免疫応答であり得る。
【００７３】
「防御免疫応答」は、抗原又は抗原を含有する病原体によってひき起こされる障害又は疾病の発生を妨げるか又は検出可能な形で低減させる、又はその重症度を排除するか又は検出可能な形で低減させるか、又はその進行速度を検出可能な形で低下させる、動物の体内で発生する抗体媒介又は細胞媒介又はその両方の免疫応答であるあらゆる免疫応答として定義づけされる。
【００７４】
本発明のワクチン組成物中に内含しうる抗原としては、不活性化された全又は部分細胞調製物の形でか又は従来のタンパク質精製、遺伝子工学技術又は化学合成によって得られる抗原性分子の形で、Mycoplasma hyopneumoniae、Haemophilus somnus、Haemophilus parasuis、Bordetella bronchiseptica、Actinobacillus pleuropneumonie、Pasteurella multocida、Manheimia hemolytica、Mycoplasma bovis、Mycoplasma galanacieum、Mycobacterium bovis、Mycobacterium paratuberculosis、Clostridial spp.、Streptococcus uberis、Streptococcus suis、Staphylococcus aureus、Erysipelothrix rhusopathiae、 Campylobacter spp.、Fusobacterium necrophorum、Escherichia coli、Salmonella enterica serovars、Leptospira spp.といった病原菌；Candidaといった病原性真菌； Cryptosporidium parvum、Neospora canium、Toxoplasma gondii、Eimeria spp.といった原生動物）；Ostertagia、Cooperia、Haemonchus、Fasciolaといった蠕虫から調製された抗原が含まれる。付加的な抗原には、不活性化された全又は部分ウイルス調製物の形でか、又は従来のタンパク質精製、遺伝子工学技術又は化学合成によって得られる抗原性分子の形での、ウシヘルペスウイルス−１、３、６、１型及び２型ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病、豚コレラウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、ブタパルボウイルス、ＰＲＲＳウイルス、ブタサーコウイルス、インフルエンザウイルス、豚水疱病ウイルス、テッシェン熱ウイルス、仮性狂犬病ウイルスが含まれる。
【００７５】
抗原の量は、抗原が水中油形エマルジョンと組合わせた形で、動物の体内で防御免疫応答を誘発するのに有効であるようなものである。抗原が有効となる精確な量は、抗原の性質、活性及び純度によって左右され、当業者により決定され得る。
【００７６】
ワクチン組成物中に存在する水中油形エマルジョンの量は、ワクチン組成物中の抗原（単複）の免疫原性を増強するのに充分でなくてはならない。望ましくかつ該当する場合、付加的な量の界面活性剤（単複）又は付加的な界面活性剤（単複）を、水中油形エマルジョンにより提供される界面活性剤に加えてワクチン組成物中に添加することができる。一般的には、油成分は、１．０〜２０体積％、好ましくは１．０％〜１０％、さらに好ましくは２．０％〜５．０％の量でワクチン組成物の最終体積内に存在する。界面活性剤又は、２つ以上の界面活性剤が存在する場合には界面活性剤の組合せは、ワクチン組成物の最終体積中に、０．１〜２０体積％、好ましくは０．１５％〜１０％、より好ましくは０．２％〜６．０％の量で存在する。
【００７７】
抗原（単複）及び水中油形エマルジョンに加えて、ワクチン組成物は、水中油形エマルジョンに関連して以上で記述した通り、防腐剤、浸透圧性薬剤、生体接着性分子及び免疫刺激性分子（例えばＱｕｉｌ A、コレステロール、ＧＰＩ−０１００、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド（ＤＤＡ））といった適切かつ望ましいその他の成分を内含することができる。
【００７８】
本発明のワクチン組成物は、同様に、獣医学的に受容可能な担体を内含することもできる。「獣医学的に受容可能な担体」という語は、任意のかつ全ての溶剤、分散媒質、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを内含する。希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、なかでも塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。安定化剤としては、なかでもアルブミンがある。
【００７９】
好ましい実施形態においては、本発明は、好ましくは平均液滴サイズが０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満、さらに一層好ましくは約０．５μｍである、１μｍ未満のサイズの液滴を有する水中油形エマルジョンの中に内因的に取込まれたＢＶＤＶＩ型又はＢＶＤＶＩＩ型抗原のうちの少なくとも１つを内含するワクチン組成物を提供している。ＢＶＤＶＩ型及び／又はＩＩ型抗原は、好ましくは不活性化されたウイルス調製物の形をしている。サブミクロン水中油形エマルジョンは、好ましくはＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤（すなわち軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０を含有する製剤）で構成されている。ワクチン組成物は好ましくはＱｕｉｌ A、コレステロール、及びチメロゾルをも内含している。
【００８０】
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、水中油形エマルジョン内のＢＶＤＶＩ型又はＢＶＤＶＩＩ型抗原のうちの少なくとも１つ及びレプトスピラ抗原を含むワクチン組成物を提供する。好ましくは細胞又はウイルス調製物の形をしている抗原は、好ましくは平均液滴サイズが０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満、さらに一層好ましくは約０．５μｍである、１μｍ未満のサイズの液滴を有する水中油形エマルジョンの中に内因的に取込まれている。サブミクロン水中油形エマルジョンは好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ製剤（すなわち軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０を含有する製剤）から成る。ワクチン組成物は好ましくは同様に、Ｑｕｉｌ-A、コレステロール、ＤＤＡ、ＧＰＩ−１００及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）の中から選択された単数又は複数の免疫刺激性分子をも内含する。
【００８１】
さらにもう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、水中油形エマルジョン内に少なくとも１つの細菌抗原例えば組換え型Streptococcus uberis PauAタンパク質又はE. coliの細胞調製物又はその両方の組合せを内含するワクチン組成物を提供する。抗原（単複）は、好ましくは平均液滴サイズが０．８μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満、さらに一層好ましくは約０．２５μｍ未満である、１μｍ未満のサイズの液滴を有する水中油形エマルジョンと内因的に組合わされる。該サブミクロン水中油形エマルジョンは好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤（すなわち軽質鉱油、レシチン、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０を含有する製剤）から成る。ワクチン組成物は好ましくは同様に、Ｑｕｉｌ−Ａ、ＤＤＡ及びＧＰＩ−１００の中から選択された単数又は複数の免疫刺激性分子をも内含する。
【００８２】
本発明のワクチン組成物は、経口、鼻腔内、粘膜、局所、経皮及び非経口（例えば静脈内、腹腔内、皮内、皮下又は筋内）経路を含めた既知の経路により動物に投与することができる。投与は、例えば非経口経路を用いた第１回投与及び粘膜経路を用いた後続投与といったような経路の組合せを用いて達成可能である。
【００８３】
ワクチン組成物の調製方法
さらなる実施形態においては、本発明は、単数又は複数の抗原及びサブミクロン水中油形エマルジョンを含有するワクチン組成物を調製する方法を提供している。
【００８４】
本発明のワクチン組成物を調製するにあたっては、抗原（単複）は、水中油形エマルジョンの成分と内因的に又は外因的に組合せることができる。好ましくは、抗原は、水中油形エマルジョンの成分と内因的に組合わされる。
【００８５】
抗原は、混合物を形成するべく、油、単数又は複数の界面活性剤、水性成分及びその他のあらゆる適切な成分を含め、エマルジョンのさまざまな成分と組合せることができる。混合物は、標準的には、抗原を含有する水中油形エマルジョンを形成するべく、単数又は複数のホモジナイザ又は乳化装置を単数又は複数回通過させることにより、一次配合プロセスに付される。この目的で、Ross乳化装置（Hauppauge, NY）、Gaulinホモジナイザ（Everett, MA）又はMicrofluidics（Newton, MA）などの市販のあらゆるホモジナイザ又は乳化装置を使用することが可能である。代替的には、油、単数又は複数の界面活性剤、及び水性成分を含むエマルジョンアジュバントのさまざまな成分をまず組合わせて、ホモジナイザ又は乳化装置を使用することにより水中油形エマルジョンを形成することができ、このエマルジョンに対し次に抗原が添加される。一次配合後の水中油形エマルジョンの平均液滴サイズは約１．０〜１．２ミクロンである。
【００８６】
抗原を含有するエマルジョンは、液滴サイズをサブミクロン範囲内にするため、次にマイクロ流動化に付される。マイクロ流動化は、Microfluidics、Newton、Massから入手可能な型式番号１１０Ｙ；Gaulin ３０ＣＤ型（Gaulin, Inc., Evrett, Mass. ）；及びRainnie Minilab ８，３０Ｈ型（Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis）といった市販のマイクロ流動化装置を使用することによって達成可能である。
【００８７】
液滴サイズは、市販の足付装置を用いて、例えばレーザー回析とといった当該技術分野において既知のさまざまな方法によって決定可能である。該サイズは、使用される界面活性剤のタイプ、界面活性剤と油の割合、作用圧、温度などに応じて変動し得る。所望の液滴サイズをもったエマルジョンを得るべくこれらのパラメータの所望の組合せを決定することができる。本発明のエマルジョンの油滴は、直径１μｍ未満である。好ましくは平均液滴サイズは、０．８μｍ未満である。より好ましくは平均液滴サイズ０．５μｍ未満である。さらに一層好ましくは、平均液滴サイズは、０．３μｍ未満である。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態においては、軽質鉱油中に２５％のレシチンを含有するＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）レシチン油溶液は、４０％の軽質鉱油、レシチン、０．１８％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び０．０８％のＳＰＡＮ（登録商標）８０を含有する混合物を形成するべく、界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０及び食塩溶液と組合わされ混合される。次に、混合物は、約３４００ｒｐｍでRoss（登録商標）（Hauppauge, NY１１７８８）乳化装置で乳化されて、「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤」又は「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）溶液」とも呼ばれるエマルジョン生成物を形成する。その後、抗原（単複）を含有する水中油形エマルジョンを形成するべく、例えばRossホモジナイザといった乳化装置を用いて、所望の抗原（単複）をＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）溶液及びその他のあらゆる適切な成分（例えば免疫刺激性分子）と組合わせる。かかるエマルジョンは、約１００００±５００ｐｓｉで作動するマイクロ流動化装置の中に一回通過させられる。マイクロ流動化された水中油形エマルジョンは、約０．２５μｍの平均液滴サイズで、１μｍ未満のサイズの液滴を有する。
【００８９】
サブミクロン水中油形エマルジョン中にマイクロカプセル封入された抗原を含有するワクチン組成物及び調製方法
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、微粒子（又は「マイクロカプセル封入された抗原」）内にカプセル封入された抗原を含有し、該マイクロカプセル封入された抗原が以上で記述されたサブミクロン水中油形エマルジョン内に外因的に取込まれている、ワクチン組成物を提供している。
【００９０】
粒子状担体内に抗原を吸収又は閉じ込めるための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、「薬学的粒子状担体；治療上の応用」（Justin Hanes, Masatoshi Chiba及びRobert Langer. ワクチン送達用の重合体ミクロスフェア。Vaccine designe中。サブユニット及びアジュバントアプローチ。Michael F. Powell及びMark J. Newman編、１９９５Plenum Press, New York及びLondon）。粒子状担体は、動物対象の体内で免疫系に対し選択された抗原の多数のコピーを提示し、局所リンパ節内での抗原の捕捉及び保持を促進することができる。粒子は、マクロファージによる食作用に付される可能性があり、サイトカインの放出を通して抗原提示を増強することができる。粒子状担体は、同様に、当該技術分野において記述されており、例えばメタクリル酸ポリメチルから誘導されたものならびにＰＬＧとして知られているポリ（ラクチド）及びポリ（ラクチド−コグリコリド）から誘導されたものを内含する。メタクリル酸ポリメチル重合体は、生物分解性が無く、一方ＰＬＧ粒子は、正常な代謝経路に沿って排泄されるグリコール酸及び乳酸に対するエステル結合の無作為な非酵素的加水分解により生物分解可能であり得る。
【００９１】
生物分解性ミクロスフェアは同様に、ワクチンの制御放出を達成するためにも使用される。例えば、長時間にわたる抗原の連続的放出を達成することができる。重合体の分子量及び重合体内の酪酸対グリコール酸の比に応じて、ＰＬＧＡ重合体は、数日又は数週から数カ月又は一年までの加水分解速度を有することができる。低速制御放出の結果として、多数回の注入の後に見られるものと類似した高レベルの抗体が形成される可能性がある。代替的には、異なる加水分解速度をもつ重合体を選択することにより、ワクチン抗原のパルス放出を達成することができる。重合体の加水分解速度は、標準的に、重合体の分子量及び重合体内の乳酸対グリコール酸の比によって左右される。変動する抗原放出速度をもつ２つ以上の異なる重合体から作られた微粒子が、抗原のパルス放出を提供し、ワクチン接種の複数回投与計画を模倣する。
【００９２】
本発明に従うと、マイクロカプセル封入された抗原調製物を形成するため、（実施例１７で例示されているように）当該技術分野において既知のあらゆる手順を用いて、粒子状重合体担体、好ましくはＰＬＧ重合体に対し、以上で記述したもののいずれかを含む１つの抗原を吸収することができる。このとき、ワクチン組成物を形成するべく、マイクロカプセル封入された抗原調製物を、以上で記述されたサブミクロン水中油形エマルジョンと混合し、その中に分散させる。
【００９３】
好ましい実施形態においては、本発明は、ＰＬＧ重合体内にカプセル封入された抗原を含有するワクチン組成物において、マイクロカプセル封入された抗原が、軽質油、レシチン、ＴＷＥＥＮ８０、ＳＰＡＮ８０及び食塩水から成るマイクロ流動化された水中油形エマルジョン中に外因的に分散され、１．０μｍ未満の平均液滴サイズを有するワクチン組成物を提供する。
【００９４】
以下に記すのは、本発明を実施するための特定的な実施形態の例である。実施例は、例示のみを目的として提供されており、いかなる形であれ本発明の範囲を制限することを意図されたものではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製の調製
ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤は２段階プロセスで調製された。第１の段階では、８０リットルのDrakeol Lecithin油溶液、１１６リットルの破傷風トキソイド食塩水、１．２リットルのＳＰＡＮ８０及び２．８リットルのTween８０を一緒に混合し、Ross乳化装置を用いて乳化した。Drakeol Lecithin油溶液は、２５％のダイズレシチン及び７５％の鉱油を含有していた。乳化した生成物を、最低５体積又は最低１０分、Ross乳化装置を通して再循環させた。さらに処理するべく、最大２４時間、２〜７℃で乳化済み生成物を貯蔵した。Ross乳化装置タンクからのエマルジョンをGaulinホモジナイザに移し、４５００ｐｓｉの圧力下で２０分間均質化した。その後、結果としての４０％のDrakeol Lecithin油溶液（以下「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤」又は「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）溶液」と呼ぶ）を無菌のポリプロピレンカルボキシコンテナ中に送り出した。送り出し作業は、クラス１０、０００の制御された環境内に置かれたクラス１００の送り出しフードの内部で実施された。コンテナを、２〜７℃で保管した。他の箇所で相反する指示のないかぎり、このＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤を以下で記述する実験の中で使用した。
【００９６】
実施例２
ＢＶＤワクチンのフラッシュブレンド均質化による一次配合
この均質化プロセスに用いる器具は、図１に示されている。無菌技術又はスチームクロスバルブを用いて、ＢＶＤＩ型抗原（不活性化されたＢＶＤＩ型ウイルス調製物）の入ったボトルを配合容器上の底面側ポートに取付けた。所要体積のＢＶＤＩ型抗原の移送が完了した後、ＢＶＤＩ型ボトルを、不活性化されたＢＶＤＩＩ型ウイルス調製物（不活性化されたＢＶＤＩＩ型ウイルス調製物）の入ったボトルと交換した。所要体積のＢＶＤＩＩ型抗原の移送が完了した後、Rossホモジナイザをポータブル式容器に取付け、再循環を最大のＲＰＭ（３３００ｒｐｍ）で開始した。容器の攪拌を中速に維持した。
【００９７】
無菌技術又はスチームクロスバルブを用いて、配合容器上のホモジナイザインラインポートに、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＱｕｉｌ−Ａが入ったボトルを取付けた。所要量のＱｕｉｌ−Ａ溶液を、ライン吸込みを通して容器内に移向させた。Ｑｕｉｌ−Ａ溶液の移送が完了した後、ボトルを取外した。同じ要領で、エタノール溶液中の所要量のコレステロール（１８ｍｇ／ｍｌ）を配合容器に移送した。その後、配合容器に対して、所要量のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤、１０％のチメロゾル溶液及び改質イーグル基礎培地（「ＢＭＥ」）増量剤溶液を添加した。
【００９８】
全ての添加がひとたび完了した時点で、混合をさらに１５分間続行した。結果としての製剤を２ｍｌの用量にアリコート分割し、これは、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのＢＶＤワクチンを表わしていた。ワクチンの各用量は、５００μｇのＱｕｉｌ−Ａ、５００μｇのコレステロール、２．５％のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤及び０．００９％のチメロゾルを含有していた。２つの異なるＢＶＤ菌株のための抗原濃度は、ｇｐ５３についてＥＬＩＳＡ力価の形で決定された。
【００９９】
実施例３
マイクロ流動化による二次配合
図２は、マイクロ流動化を通した二次配合のために用いられるプロセスを例示している。マイクロ流動化装置は、蒸気滅菌した。まず最初に補助処理モジュールチャンバをユニット内に設置し、ブランクチャンバを第２のチャンバ位置に設置した。例２に記述されている通りに調製された完全アジュバントが付加されたＢＶＤワクチンの入った容器を、供給容器ドレンバルブからマイクロ流動化装置の入口まで移送ラインを取付けることによって、マイクロ流動化装置に連結した。窒素ガスを、供給容器空気フィルタ入口に連結し、容器圧力設定を２０＋／−５ＰＳＩに調整した。収集容器ドレンバルブをマイクロ流動化出口から移送ラインまで連結した。必要な連結を全て行なった後、バルブを開放し、マイクロ流動化を１０，０００＋／−５００ＰＳＩの作業圧力で開始した。ワクチンの全内容物を１度にマイクロ流動化装置に通し、マイクロ流動化後チャンバ内にこれを収集した。この調製を２ｍＬの用量にアリコート分割し、これはマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのＢＶＤワクチンに相当している。
【０１００】
実施例４
ベンチブレンドを通したワクチン組成物の調製
実施例１に記述されている通りに調製されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤は、ＢＶＤ抗原及び増量剤の添加によって２．５％まで希釈させた。結果としての溶液を、ホモジナイザを使用する代りに攪拌棒を用いて、ベンチにて配合した。最終調製物は、以下の組成を含んでいた：ＢＶＤ１型及び２型抗原、２．５％のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤（これは実施例１に記述されている通り、油、レシチン、ＳＰＡＮ（登録商標）及びＴＷＥＥＮ（登録商標）を含有する）及び食塩水。ＴＷＥＥＮ８０及びＳＰＡＮ８０は、それぞれ０．１８及び０．０８体積％で最終ワクチン調製物に存在している。
【０１０１】
実施例５
マイクロ流動化されていない及びマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物の間の液滴サイズ分布の比較
実施例２に記述されている通りに調製されたマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン、実施例３に記述されている通りに調製されたマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチンそして実施例４に記述されている通りにベンチブレンドを通して作られた調製物を用いて、ワクチン調製物の液滴サイズを比較した。各調製物由来の標本２ミリリットルをMalvern２０００レーザー回析計に添加し、液滴サイズ分布を決定した。図３に示されているように、結果は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物が、０．１ミクロン前後の最大粒子体積を有している一方で、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物が１ミクロン前後の最大粒子分布体積を有していたことを示している。
【０１０２】
実施例６
ワクチン相分離の減少
３つの異なるワクチン調製物、すなわち実施例２に記述されている通りに調製されたマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン、実施例３に記述されている通りに調製されたマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチンそして実施例４に記述されている通りにベンチブレンドを通して調製されたワクチンを並置して比較し、長期貯蔵時点での相分離特性を見極めた。全ての調製物を約１ヵ月間４℃で放置し、ワクチン調製物の上面におけるクリーム状の層の出現に関して相分離を監視した。図４に示されているように、その他の２つの調製物と比較したとき、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースの調製物の中には相分離は全く存在しなかった。
【０１０３】
実施例７
牛ウイルス性下痢症ウイルスに対するマイクロ流動化された及びマイクロ流動化されていない畜牛ワクチンの調製
牛ウイルス性下痢症抗原を、マイクロ流動化を通してＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤内に内因的に取込んだ。「内因的に取込まれた」という語は、マイクロ流動化に先立ちＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤に対し抗原を添加させたプロセスを意味する。抗原は、アジュバント製剤の成分と共にマイクロ流動化プロセスの物理的力に付された。対照のマイクロ流動化されていないグループにおいては、配合を通してＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤内に抗原調製物を分散させた。
【０１０４】
対照及びマイクロ流動化された調製物の両方の最終的組成は、以下の通りであった：
ｇｐ５３について２５３５ＲＵ／用量の不活性化後のＥＬＩＳＡ力価のＢＶＤＩ型、ｇｐ５３について３２９０ＲＵ／用量の不活性化後のＥＬＩＳＡ力価のＢＶＤＩＩ型、１．２５ｍｇ／用量の濃度のＱｕｉｌ−Ａ、１．２５ｍｇ／用量の濃度のコレステロール、２．５％の最終濃度のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤、及び０．００９％の最終濃度のチメロゾル。ワクチン用量は５ｍｌであった。
【０１０５】
実施例８
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物中の内因的に取込まれたＢＶＤウイルス抗原の長期安定性
この実験は、長期貯蔵中の内因的に取込まれた抗原の安定性を見極めるために行なわれた。マイクロ流動化されたワクチン調製物（Ａ９０７５０５）を得るべくマイクロ流動化プロセス中にＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤内に死菌ＢＶＤＩＩ型ウイルス抗原を取込んだ。マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤中に同じ抗原を含有する３つの他のワクチン調製物（Ａ９０４３６９、Ａ９０４３７０、及びＡ９０４３７１）を対照として用いた。マイクロ流動化されていない調製物内では、抗原をＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤と混合し、Rossホモジナイザを用いた配合を通して混合した。４つのワクチン調製物を全て４℃で２年間貯蔵した。貯蔵中の異なる時点（０、６、１２又は２４ヵ月）で、４つの製剤全てを用いて生後３ヵ月の乳牛にワクチン接種した。
【０１０６】
０日目と２１日目に、生後３ヵ月の乳牛を２ｍｌのワクチン製剤を用いて皮下経路でワクチン接種した。ワクチン接種を受けた動物由来の血清を３５日目に収集し、ワクチンに対する血清学的応答をＢＶＤＶ−Ｅ２  ＥＬＩＳＡを通して抗体力価の形で測定した。図５に示されているように、マイクロ流動化されたワクチン調製物は、テストされた全ての時点（０、６、１２及び２４ヵ月）においてより高い抗体力価を示し、抗原調製物の安定性がマイクロ流動化プロセス中の抗原の内因的取込みの間に失なわれないということを示唆していた。その上、驚くべきことに、マイクロ流動化されたワクチン調製物が全ての時点で増強された免疫応答を誘発するということも発見された。
【０１０７】
実施例９
マイクロ流動化後の直腸温のワクチン誘発された上昇の減少
実施例７に記述された通りに作られたマイクロ流動化された及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を、０日目に、畜牛へのワクチン接種に使用し、ワクチン接種の１日前からワクチン接種後４日目までの期間にわたり、直腸温を監視した。ワクチン用量は２ｍｌであった。グループを、単回投与又は倍量投与のいずれかでワクチン接種した。直腸温は、−１日目以降４日目まで（４日目を含む）毎日測定し記録した。０日目の直腸温は、テスト品の投与に先立って測定した。
【０１０８】
図６に示されているように、結果は、マイクロ流動化されていないワクチン製剤の単回投与又は倍量投与のいずれかをワクチン接種した動物の体内で、ワクチン接種から約２４時間以内に直腸温が急上昇したことを示している。しかしながら、マイクロ流動化された形態のワクチンを接種した動物においては、ワクチン接種後の直腸温の上昇は最小限にすぎず、マイクロ流動化されていない製剤でワクチン接種を受けた動物の場合よりも有意に低いものであった（図６）。
【０１０９】
実施例１０
注入部位反応体積は、マイクロ流動化されたワクチン製剤でのワクチン接種の時点で、より急速に消散した
実施例７で記述されている通りに作られたマイクロ流動化された及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、０日目に、畜牛へワクチン接種した。この研究に内含された動物は、交雑育種された肉牛であった。各々のプラシーボ処理グループ（Ｔ０１及びＴ０２）内に３頭の動物が存在した。グループＴ０３〜Ｔ０６の各々の中に６頭の動物が存在した。ワクチン用量は２ｍｌであり、グループは０日目に１用量又は２用量のワクチンのいずれかを用いてワクチン接種された。０日目で、テスト品を右頸部に投与した。テスト品を倍量（４ｍｌ）受けた動物（Ｔ０２、Ｔ０４及びＴ０６）は、一方の例で単回注入として倍量全てを受けた。注入部位での反応サイズの推定を含めた注入部位の観察を、０日目以降４日目まで（４日目を含む）及び６、９及び１４日目に頸部の右側で行なった。０日目に、テスト品の投与に先立ち注入部位を観察した。１用量又は２用量のプラシーボのワクチン接種を受けたグループは、注入部位の反応体積の有意な増大を全く示しておらず、従って、これらのデータは図７に示されていない。マイクロ流動化されていないワクチン製剤の場合には、１用量及び２用量のワクチン接種の間に注入部位反応体積の比例増加が見られた。一方、マイクロ流動化されたワクチン製剤の場合、単回投与がより大きい注入部位反応体積を誘発したものの、第２の用量での注入はそれ以上の増加を全くひき起こさなかった。その上、マイクロ流動化されたワクチン製剤が注入された動物の場合、注入部位反応部位体積は、マイクロ流動化されていないワクチン製剤での注入を受けた動物の場合に比べより急速に消散した。これらの結果は、図７に示されている。
【０１１０】
実施例１１
内因的に取込まれたＢＶＤウイルス及びレプトスピラ抗原ならびにＱｕｉｌ−Ａ及びＤＤＡといった免疫刺激性分子を伴うマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物の調製
約１．４×１０9個の生体／５ｍｌ用量という直接的計数で適切なアジュバント中にホルマリン不活性化されたLeptospira hardjo-bovis菌株ＣＳＬを処方した。ホルマリンで不活性化したLeptospira Pomona菌株Ｔ２６２を、約２４００比濁単位／５ｍｌ用量で処方した。比濁単位は、予め処理された発酵流体の比濁測定に基づいて計算された。ＢＶＤウイルス１型を、約３０００相対単位／５ｍｌ用量のＥ２  Elisa力価で処方した。ＢＶＤウイルス２型を、約３５００相対単位／５ｍｌ用量のＥ２  Elisa力価で処方した。相対単位は、集合前、不活性化後のバルク流体のＥ２  ＥＬＩＳＡ力価に基づいて計算された。Ｑｕｉｌ-A及びコレステロールは両方共、用量あたり０．５ｍｇの濃度で使用された。チメロゾル及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤はそれぞれ０．００９％及び２．５％の最終濃度で使用された。水酸化アルミニウム（Rchydragel ＬＶ）は、２．０％の最終濃度で使用された。ＤＤＡが免疫調整剤として使用された場合、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤内にＤＤＡを内含させた。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤（すなわち４０％のDrakeol−レシチン原液）は１．６ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含有し、適切に希釈された時点で、最終的ワクチン調製物は、２．５％のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤及び０．１ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含有していた。
【０１１１】
異なるワクチン製剤の調製においては、Silversonホモジナイザに、ＢＶＤ画分、Leptos、Ｑｕｉｌ−Ａ、コレステロール、チメロゾル、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤及び増量剤としての食塩水を付加し、１５分間１０，０００±５００ＲＰＭでこれを混合した。その後、１０，０００ｐｓｉで２００ミクロンのスクリーンを通して成分をマイクロ流動化させた。
【０１１２】
ワクチン製剤が水酸化アルミニウムを含有していた場合、マイクロ流動化は水酸化アルミニウム無しで実施された。マイクロ流動化が完了した後、水酸化アルミニウムを添加し、これを４℃で一晩攪拌棒を用いて混合した。
【０１１３】
実施例１２
攻撃研究用のＢＶＤウイルスワクチンの調製
この実験で使用されるワクチン調製物は、ＢＶＤウイルス１型及びＢＶＤウイルス２型の両方に由来する抗原を含有していた。ＢＶＤ１−５９６０抗原を、ｇｐ５３について２５３５ＲＵ／用量の不活性比後ＥＬＩＳＡ力価で使用した。ＢＶＤ２−８９０抗原は、ｇｐ５３の３２９０ＲＵ／用量の不活性化後ＥＬＩＳＡ力価で使用した。Ｑｕｉｌ A及びコレステロールは、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。チメルゾル及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤は、それぞれ０．００９％及び２．５％の最終濃度で使用した。ＤＤＡが免疫調整剤として使用された場合、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤内にＤＤＡを内含させた。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）原液（４０％のDrakeol−レシチン溶液）は、変動する量のＤＤＡを含有し、適切に希釈された場合、最終的ワクチン調製物は２．５％のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤及び０．５ｍｇ／用量〜２．０ｍｇ／用量の範囲のＤＤＡ濃度を含有していた。２％の最終濃度で、アルミニウムゲル（Rehydragel−ＬＶ）を使用した。２、３及び５ｍｇ／用量の範囲内でＧＰＩ−０１００を使用した。
【０１１４】
全ての成分をSilversonホモジナイザに添加し、１５分間、１０，５００ｒｐｍで配合し、次に１０，０００ｐｓｉで２００ミクロンのチャンバを通過させることによりマイクロ流動化させた。ワクチン調製物が水酸化アルミニウムを含有していた場合、マイクロ流動化は水酸化アルミニウム無しで実施された。マイクロ流動化が完了した後、水酸化アルミニウムを添加し、４℃で一晩攪拌棒を用いて混合した。
【０１１５】
実施例１３
レプトスピラ抗原を伴うマイクロ流動化されたアンフィゲンワクチン製剤を用いたワクチン接種後のレプトスピラ攻撃に対する防御
【０１１６】
【表１】
2006522090.tif 000002
【０１１７】
表１は、本研究でテストされたワクチン調製物内のアジュバント製剤の組成を示す。該ワクチン調製物は、実施例１１に記述されている通りに調製された。この研究においては、生後約７ヵ月の交雑育種雌肉牛が使用された。ワクチン接種は、５ｍｌのワクチン体積で、皮下経路を通って０日目と２１日目に行なわれた。攻撃は、ＮＡＤＣ（国立農業疾病センター）からのL hardjo-bovts菌株２０３で行なわれた。攻撃は１ｍｌの接種材料で５７〜５９日目の間で行なわれた。攻撃は、眼内で結膜経由で及び経膣的に投与された。攻撃材料は５．０×１０6個のレプトスピラを含有していた。レプト培養、ＦＡ及びＰＣＲのため一週間に一回尿を収集した。腎臓収集は、１１２日目及び１１３日目の間に行なわれた。
【０１１８】
【表２】
2006522090.tif 000003
【０１１９】
表２は、レプトスピラ攻撃研究からのデータを示す。攻撃を受けた動物におけるレプトスピラ感染の百分率を決定する上で、以下の基準が使用された。腎臓培養が１つの標本のみについて陽性であった場合、その動物は、レプトスピラについて陽性とみなされる。動物がＦＡ又はＰＣＲのいずれかについて１つの標本のみにおいて陽性である場合、その動物は陰性とみなされる。１つの標本のみにおいてＦＡ及びＰＣＲの両方について標本が陽性である場合、それは、レプトスピラについて陽性とみなされた。
【０１２０】
表２に示された結果は、３つの検定全てに基づいて、全てのワクチングループ内で尿中排泄持続時間が有意に短縮されたことを示している。尿及び腎臓コロニー形成に関しては、ＡＩＯＨを含まないＱＡＣ及びＤＤＡ含有製剤の効能は匹敵するものであった。ＡＩＯＨは、この攻撃発研究において、ＱＡＣ又はＤＤＣ含有ワクチンの効能を改善せず、減少させさえした。
【０１２１】
【表３】
2006522090.tif 000004
【０１２２】
ワクチン製剤中のレプトスピラ抗原の両方に対する血清応答が、ワクチン接種を受けた動物において検出され、ピーク応答は、３５日目に認められた。血清応答と攻撃に対する防御の間にはいかなる相関関係も存在しなかった。ワクチン製剤の中のアルミニウムゲルの存在は、防御レベルを低減させたが、血清応答は、ワクチン中のアルミニウムゲルの存在によって増強された。
【０１２３】
実施例１４
ＢＶＤウイルス抗原に対する免疫応答の惹起及びＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤及びＤＤＡを含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物での免疫化の後のＢＶＤ２型ウイルス攻撃に対する防御
この実験においては、生後４〜７ヵ月の血清反応陰性の子牛を使用した。異なるグループが３つあり、各グループに１０頭の動物がいた（表４）。０日目と２１日目に、各動物は、側頚部でおよそ肩甲骨と頸背の間に１回２ｍｌの皮下用量のワクチン又はプラシーボを受けた。
【０１２４】
【表４】
2006522090.tif 000005
【０１２５】
研究の４４日目に鼻腔内に５ｍｌ用量の攻撃ウイルス調製物（鼻孔１つにつき約２．５ｍｌ）を投与した。非細胞変性のＢＶＤウイルス２型、分離株＃２４５１５（Ｅｌｌｉｓ菌株）、ロット＃４６３２５−７０をこの研究において攻撃菌株として使用した。攻撃材料の保持された標本を、攻撃が開始された時点及びその完了直後に滴定した（一回の滴定につき２つの複製）。５ｍｌ用量あたりの平均生ウイルス力価は、攻撃誘発の前では５．３ｌｏｇ10ＦＡＴＤ50／５ｍｌであり、攻撃後は、５．４ｌｏｇ10ＦＡＩＤ50／５ｍｌであった（ＦＡＩＤはＴＣＩＤ50と等価である）。
【０１２６】
３日目から５８日目まで毎日動物を監視した。ＢＶＤ感染に起因する臨床的徴候に基づく０、１、２又は３という臨床疾病評点が、４２日目から５８日目まで各動物について作成された。４４日目の評点は攻撃に先立ち記録された。ＢＶＤ１型及びＢＶＤ２型ウイルス中性化抗体の血清力価の決定のため、０、２１、３５、４４及び５８日目に各動物から血液標本（２本の１３ｍｌ入り血清分離管、ＳＳＴ）を収集した。
【０１２７】
血液標本を４２日目以降５８日目まで（５８日目を含む）各動物から収集し、軟膜細胞内のＢＶＤウイルスの存在を見極めた。４４日目に、攻撃に先立って標本を得た。
【０１２８】
白血球計数を決定するため、４２日目以降５８日目まで（５８日目を含む）、各動物について血液標本（１本の４ｍｌ入りＥＤＴＡ管）を収集した。４４日目に、攻撃誘発に先立ち標本を得た。
【０１２９】
白血球減少症は、基線（攻撃誘発の日の２日前からその日までの攻撃誘発前ＷＢＣ計数の平均）からのＷＢＣ計数の４０％以上の減少として定義づけされた。
【０１３０】
疾病の状態を定義づけするために以下の通りの臨床疾病評点が使用された。評点が１以下である場合には、疾病＝無；評点が２を上回る場合には、疾病＝有。
【０１３１】
表５及び６に示されているように、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤、Ｑｕｉｌ A又はＤＤＡと共にＢＶＤウイルス抗原を含みマイクロ流動化されたワクチンの接種を受けたグループは、ＢＶＤ１型及びＢＶＤ２型ウイルスの両方について有意な血清ウイルス中性化力価を伴って血清転換した。これらのグループ内では、対照グループで１００％の動物がウイルス血病であった一方で、ウイルス血症を示す動物の百分率の有意な減少も存在した（表７）。さらに、これらのワクチン接種を受けたグループでは、疾病の頻度も有意に減少した（表８）。同様にして、白血球減少症を示す動物の百分率は、同じくワクチングループでは減少し、白血球減少症の低下は、Ｑｕｉｌ Aを含むグループよりもＤＤＡを含むグループにおいてより有意であった（表９）。対照グループでは、ワクチン接種を受けたグループと比べ、体重増加の有意な降下がみられた（表１０）。
【０１３２】
血清学
０日目のワクチン接種に先立ち、研究中の全ての動物は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体について血清反応陰性（ＳＶＮ＜１：２）であった（データ示さず）。２回目のワクチン接種（３５日目）から１４日後に、プラシーボの投与を受けた全ての動物（ＴＯ１）がＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体について血清反応陰性にとどまった。又、ＩＴＡ（治験用テスト抗原）のワクチン接種を受けた動物（ＴＯ２、ＴＯ３、ＴＯ４、ＴＯ５及びＴＯ６）の全てがＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体について血清反応陽性（ＳＶＮ≧１：８）であった。２ｍｇ／用量のＤＤＡでＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤のアジュバントが付加されたワクチンの投与を受けた１頭の動物は、３５日目にＢＶＤウイルス２型に対する抗体について３というＳＶＮ力価を有していた（表１１及び１２）。
【０１３３】
４４日目の攻撃に先立ち、１つを除く全ての対照（ＴＯ１）が、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体について血清反応陰性（ＳＶＮ＜１：２）であった（データはここでは示されている）。１つの対照（＃２４９７）は、ＢＶＤウイルス１型に対する抗体については血清反応陽性であり（ＳＶＮ＝１０）、ＢＶＤウイルス２型に対する抗体については血清反応陰性であった。攻撃から１４日後に、研究内の全ての動物は、ＢＶＤウイルス１型及び２型に対する抗体について血清反応陽性であった。
【０１３４】
【表５】
2006522090.tif 000006
【０１３５】
【表６】
2006522090.tif 000007
【０１３６】
【表７】
2006522090.tif 000008
【０１３７】
【表８】
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【０１３８】
【表９】
2006522090.tif 000010
【０１３９】
【表１０】
2006522090.tif 000011
【０１４０】
ウイルス単離
表１３に示されているデータの通り、攻撃期間（４４日目〜５８日目）の間、対照（ＴＯ１）中の１０頭の動物の全てがウイルス血症であった（ＢＶＤウイルスは１日又は複数の日に単離された）。ＩＴＡが投与されたグループでは、ウイルス血症の動物の頻度は、１０頭の各グループ（それぞれＴＯ２、ＴＯ３、ＴＯ４、ＴＯ５及びＴＯ６）内で１、０、３、２及び２件であった。対照とＩＴＡの投与を受けたグループの間の差は、統計上有意であった（Ｐ≦０．０５）。ウイルス血症の最小２乗平均日数も同様に、ＩＴＡの投与を受けたグループ（０．０〜０．５日）に比べ対照について有意に大きいもの（１０．４日）であった。
【０１４１】
臨床疾患
２又は３という臨床的徴候評点をもつ動物は、ＢＶＤ病の徴候を示すものとみなされた。表１４に示されているように、ＢＶＤウイルス疾患の臨床的徴候をもつ動物の頻度は、対照（Ｔ０１）では１０中９であり、ＩＴＡが投与されたグループ（それぞれＴ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）の各々において１０中１、２、０、０及び０であった。対照とＩＴＡの投与を受けたグループの間の差は、統計上有意であった（Ｐ≦０．０５）。
【０１４２】
白血球減少症
表１５に示されているように、攻撃期間（４４日目〜５８日目）の間、対照（Ｔ０１）中の１０頭の動物は全て白血症であった（４２〜４４日目で攻撃前基線からの４０％の白血球計数の減少）。白血病をもつ動物の頻度は、ＩＴＡの投与を受けたグループ（それぞれＴ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）の各々において１０中６、２、４、３及び２頭の動物であった。対照と０．５ｍｇ／用量のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤及び水酸化アルミニウム（Ｔ０３）のアジュバントが付加されたワクチンの投与を受けたグループの間の差は、統計的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。白血症の最小２乗平均日数は、ＩＴＡの投与を受けたグループ（０．２〜１．２日）に比べ対照について有意に（７．８日）であった。
【０１４３】
実施例１５
ＢＶＤウイルス抗原に対する免疫応答の惹起及びＧＰＩ−０１００を含有するマイクロ流動化されたワクチン製剤での免疫化の後のＢＶＤ２型ウイルス攻撃に対する防御
実施例１４に記述された通りの１組の実験条件に従い、Ｑｕｉｌ−AとＧＰＩ−０１００の間の直接的比較を行なった。表１１及び１２に示されているように、Ｑｕｉｌ−A又はＧＰＩ−０１００のいずれかを含有するマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースの調製物の中のＢＶＤ抗原でワクチン接種された動物は、ＢＶＤ１型及びＢＶＤ２型ウイルスの両方について有意な抗体力価を有していた。ＢＶＤ１型ウイルスについての抗体力価は、ＢＶＤ２型ウイルスについてのものよりもはるかに高いものであった。しかしながら、ＢＶＤ２型ウイルスでの後続する攻撃は強い保護を示し、ＧＰＩ−１００を含有するマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物でワクチン接種された子牛において疾病罹患率は有意に減少した。
【０１４４】
【表１１】
2006522090.tif 000012
【０１４５】
【表１２】
2006522090.tif 000013
【０１４６】
【表１３】
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【０１４７】
【表１４】
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【０１４８】
【表１５】
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【０１４９】
結論としては、各ワクチンの安全性は、ワクチン接種を受けた動物における不利な反応又は死亡数の不在によって実証された。各ワクチンの効能は、ワクチン接種を受けた動物の１００％において血清転換（ＢＶＤ−１及びＢＶＤ−２に対するＳＶＡ抗体力価＞１：８）によって実証された。攻撃に対する満足のいく抵抗力は、２ｍｇのＧＰＩ−０１００のみのアジュバントが付加されたワクチンによって実証された。
【０１５０】
実施例１６
マイクロ流動化された水中油形エマルジョン中にマイクロカプセル封入された抗原を含有するワクチン調製物
３３３ｍｇ／ｍｌのトレハロース溶液原液を得るため水に対し３グラムのトレハロース（Fluka）を添加した。０．８％のＳＤＳ溶液（ＳＤＳ／ｒPauA）中に可溶化させた組換え型PauA抗原をトレハロース溶液に添加して、４９４μｇのｒPauA／ｍｌという最終濃度を得た。次の段階では、２００ｍｌの塩化メチレン（ＭｅＣｌ2）内に１０グラムのポリラクチドグリコール酸（ＰＬＧ−Resomer  ＲＥ５０３Ｈ、Boeringher Ingelheim）を溶解させた。結果として得られたＰＬＧ／ＭｅＣｌ2溶液を第１段階で調製したＳＤＳ−ｒPauA／トレハロース溶液と組合わせた。組合わせた溶液を（Microfluidics社からのマイクロ流動化装置Ｍ１１０ＥＨ型）を用いてマイクロ流動化に付し、マイクロ流動化された調製物を（Temco Spray Dryer ＳＤ−０５型）を用いて噴霧乾燥させた。５００ミクロンのスクリーンを用いて、噴霧乾燥済み材料を収集した。
【０１５１】
この噴霧乾燥した材料中のｒPauAの濃度をウエスタンブロット分析を用いて定量化した。５０μｌのアセトン中で１．０４ｍｇの噴霧乾燥済み材料を溶解させ、１０分間室温で１３，２００ｒｐｍで遠心分離させた。上清を除去した。生物学的安全フード内で２．５時間、上清及びペレット画分を乾燥させた。４７．４３μＬの標本溶液（２５μｌの標本緩衝液＋１０μｌの還元剤及び６５μｌの水）中にペレットを再懸濁させた。乾燥した上清画分を２０μｌの標本溶液で再懸濁させた。ウエスタン分析においては、噴霧乾燥済み材料のｒPauA含有量を定量化するための標準として、精製済みPauAを使用した。
【０１５２】
注射用蒸留水（ＷＦＩ）５００ｍｌ中に１００グラムのマンニトール（Sigma）を溶解させることによって、２０％のマンニトール原液を調製した。ホットプレート／攪拌機で４０℃まで溶液を加熱し、３０℃まで冷却した。０．２２ミクロンの無菌フィルタ（Millipore）を通して溶液を無菌ろ過した。５００ｍｌのＷＦＩ中に１２．５グラムのカルボキシメチルセルロース（Sigma）を溶解させることにより、２．５％のカルボキシメチルセルロースを調製した。溶液を１２１℃でオートクレーブ処理した。
【０１５３】
噴霧乾燥の結果得られた粉末を、５％のマンニトール、０．３％のカルボキシメチルセルロース及び１：５０００のチメロゾルを含有する溶液中で再構成した。最終溶液を、３ｍｌのガラスビンにアリコート分割し、凍結乾燥機（ＵＳＩＦＲＯＩＤ）を用いて凍結乾燥させた。凍結乾燥済み粉末は、マイクロカプセル封入されたｒPauAを表わす。マイクロカプセル封入されたサブユニットタンパク質抗原を、（実施例２０に記述されているマイクロ流動化されたエマルジョンといったような）ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤を含有する２ｍｌのマイクロ流動化された水中油形エマルジョンの中で再懸濁させ、ワクチンとしてこれを使用した。
【０１５４】
実施例１７
水中油形エマルジョン中に細菌全細胞抗原及び組換え型タンパク質抗原の両方を含有するマイクロ流動化されたワクチン製剤の調製
実施例２及び３で記述された通りに水中油形エマルジョンに内因的添加された、組換え型Streptococcus uberis PauAタンパク質及びEscherichia coli細菌細胞の両方を含有した２つのワクチン調製物を作製した。組換え型PauA抗原は、一用量あたり１００μｇの濃度にあり、E coli 細胞は１用量あたり４×１０9の最終計数にあった。２つのワクチン製剤のエマルジョンアジュバント組成物は、表１６に示されている。
【０１５５】
【表１６】
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【０１５６】
実施例１８
水中油形エマルジョン中にｒPauA及び全細胞細菌作用物質を含有するマイクロ流動化されたワクチンに対する免疫応答
この実験においては、成熟した乳牛を使用した。登録時点で、動物はその第１又は第２の授乳の終りにあった。皮下で２ｍｌずつの各々のワクチン製剤を３回、すなわち乾乳時点で一回（Ｄ＝０）、２８日後（Ｄ＝２８）そして出産から４〜１０日後に再度（Ｃ＋４〜Ｃ＋１０）、投与した。１回目及び３回目の用量は、頸部の左側で投与され、２回目の用量は頸部の右側で投与された。各ワクチン接種に先立ちそして３回目のワクチン接種から約１４日目及び３２日目に、血液を収集した。E coli及びｒPauA抗原についての抗体力価をＥＬＩＳＡを通して決定した。図８に示されているように、結果は、ｒPauAに対する抗体力価が、免疫刺激剤としてＧＰＩ−０１００を含有するワクチン製剤でのワクチン接種を受けたグループにおいてさらに高いものであり、最初のワクチン接種後７０日目にピークになったことを表わしている。E coli抗原についての抗体力価は、図９に示されている。E coli抗原についての抗体力価は、両方のワクチン製剤において匹敵するものであったが、免疫刺激剤としてのＧＰＩ−０１００の存在は、免疫刺激剤としてＤＤＡを伴う製剤に比べて比較的高い抗体力価を誘発した。
【０１５７】
実施例１９
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物の殺ウイルス作用の分析
マイクロ流動化がウイルスを不活性化するか否かを見極めるために、３つのマイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物の殺ウイルス作用を決定した。３つの調製物は３つの異なるウシ感染性ウイルス、すなわちウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）及びウシ呼吸器性シンシチアルウイルス（ＢＲＳＶ）を含有していた。
【０１５８】
３つのワクチン調製物中の殺ウイルス作用の検出は、ＵＳＤＡ９ＣＦＲ，１１３，３５規定要件に従って行なわれた。
【０１５９】
表１７に示された結果は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物のマイクロ流動化がワクチン調製物の有意な不活性化を全くひき起こさないことを表わしている。
【０１６０】
【表１７】
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【０１６１】
０．７を上回る値は、殺ウイルス効果の表われである。
【０１６２】
実施例２０
マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤の調製
３６±１℃で８〜２２時間混合しながら、ＤＲＡＫＥＯＬレシチン油溶液（２５％のレシチンを伴う軽質鉱油）及びＴＷＥＥＮ８０（最終濃度０．１８％）及びSpan８０（最終濃度０．０８％）を組合わせることにより、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤を調製した。その後、約３４００ｒｐｍでRoss（登録商標）（Hauppauge, NY１１７８８）乳化装置を用いて、食塩水に油混合物を添加した。その後、４５００±５００ｐｓｉで２００μｍ入り相互作用チャンバを伴うマイクロ流動化装置に混合物を一度通過させた。図１０Ａ及び１０Ｂは、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤の安定性を示している。出発の初期時点においてレーザー回析によって測定される通りの粒子サイズ分布（図１０Ａ）は、４℃で２２ヵ月間の貯蔵後の粒子サイズ分布（図１０Ｂ）とほぼ同一であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、マイクロ流動化されていないワクチン組成物のバッチ調製用プロセスを描いている。このプロセスにおいては、さまざまなワクチン成分が、左側の付加容器に添加され、単純な機械的手段を通して成分が一緒に混合される配合容器内へと最終的に圧送される。
【図２】図２は、内因的に取込まれた抗原を含有するマイクロ流動化されたワクチン組成物の調製のためのプロセスを描いている。付加容器に対しさまざまなワクチン成分が添加され、単純な機械的手段を通して混合するためプリエマルジョン配合ユニットまで移送される。その後、エマルジョンは、マイクロ流動化装置内に通され、マイクロ流動化後チャンバ内に収集される。
【図３】図３は、マイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン及びベンチ配合ワクチン調製物の液滴サイズ分布を描いている。
【図４】図４は、マイクロ流動化されたワクチン調製物内の相分離の不在を示している。
【図５】図５は、マイクロ流動化されたＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物（Ａ９０７５０５）及び３つの対照、つまりマイクロ流動化されていないＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤ベースのワクチン調製物（Ａ９０４３６９、Ａ９０４３７０及びＡ９０４３７１）の中に内因的に取込まれた抗原の安定性の比較を描いている。４つのワクチン調製物は全て２年間４℃で貯蔵された。貯蔵中異なる時点（０、６、１２又は２４ヵ月目）で、生後３ヵ月の乳牛にワクチン接種するために、４つの製剤全てを使用した。ワクチン接種は、２mlのワクチン用量で０日目及び２１日目に行ない、２回目のワクチン接種から２週間後に血清を収集した。血清標本の各々の中でＢＶＤＩＩ型ウイルスについての中性化抗体力価を決定した。データは、５頭の動物について幾何平均として提示されている。
【図６】図６は、マイクロ流動化された及びマイクロ流動化されていないワクチンの投与前及び投与後の畜牛の最小２乗平均直腸温を示す。Ｔ０１：プラシーボグループ−単回投与；Ｔ０２：プラシーボグループ−倍量投与；Ｔ０３：マイクロ流動化されていない製剤−単回投与；Ｔ０４：マイクロ流動化されていない製剤−倍量投与；Ｔ０５：マイクロ流動化されていない製剤−単回投与；Ｔ０６：マイクロ流動化された製剤倍量投与。
【図７】図７は、マイクロ流動化されていない及びマイクロ流動化されたワクチン製剤の投与の後に畜牛の体内で観察された最小２乗注入部位反応体積を描いている。Ｔ０３：マイクロ流動化されていない製剤−単回投与；Ｔ０４：マイクロ流動化されていない製剤−倍量投与；Ｔ０５：マイクロ流動化された製剤−単回投与；Ｔ０６：マイクロ流動化された製剤−倍量投与。
【図８】図８は、組換え型PauＡ抗原及びE.coli全細胞抗原の両方を含有するさまざまなワクチン製剤を用いてワクチン接種した後の、Streptococcus uberisからの組換え型PauＡ抗原についての幾何平均ＩｇＧ力価を描いている。
【図９】図９は、組換え型PauＡ抗原及びE.coli全細胞抗原の両方を含有するさまざまなワクチン製剤を用いたワクチン接種後の、Streptococcus uberisからのE.coli全細胞抗原についての幾何平均ＩｇＧ力価を描いている。
【図１０Ａ】図１０及び１０Ｂは、最初の産生時（図１０Ａ）及び生産後２２ヵ月目（図１０Ｂ）のマイクロ流動化されたAmphigen 製剤の粒子サイズ分布を描いている。
【図１０Ｂ】図１０及び１０Ｂは、最初の産生時（図１０Ａ）及び生産後２２ヵ月目（図１０Ｂ）のマイクロ流動化されたAmphigen 製剤の粒子サイズ分布を描いている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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2006522090.tif 000031
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