(57)【要約】  ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を検出する方法であって、i)ＡＬＫタンパク質又はそれらの機能性誘導体を配列番号１又は２から選択されるペプチド基質とともに、該ペプチドのリン酸化反応に適した条件下でインキュベートし、ii)リン酸化されたペプチドを検出する工程を含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を検出する方法であって、以下の工程、
i)ＡＬＫタンパク又はそれらの機能性誘導体を配列番号１又は２から選択されるペプチド基質とともに、該ペプチドのリン酸化反応に適した条件下でインキュベートし、
ii)リン酸化されたペプチドを検出する工程を含む方法。
【請求項２】
ペプチドが配列番号１の配列を有する請求項１の方法。
【請求項３】
精製ＡＬＫタンパク又はＡＬＫ含有製剤を用いる請求項１の方法。
【請求項４】
製剤が細胞溶解物である請求項３の方法。
【請求項５】
機能性誘導体が、ＡＬＫ配列のＡＬＫ全長残基１１１６−１３９２の全触媒ドメインを含む請求項１の方法。
【請求項６】
機能性誘導体が、残基Ｌｅｕ1073からＡｌａ1459に伸張したＡＬＫプロテインのフラグメントである請求項５の方法。
【請求項７】
ａ）配列番号１又は２のペプチドを固相に接着させ、
ｂ）ＡＬＫフラグメントとともに固相を、チロシンリン酸化に適当な条件下でインキュベートし、
ｃ）固相を洗浄し、
ｄ）抗リン酸化チロシン抗体（第１抗体）とともに固相を、抗原−抗体結合に適当な条件下でインキュベートし、
ｅ）固相を洗浄し、
ｆ）第１抗体を認識する酵素結合抗体（第２抗体）とともに固相を、第１抗体及び第２抗体の結合に適当な条件下でインキュベートし、それによって三成分免疫複合体を形成し、
ｇ）固相を洗浄し、
ｈ）免疫複合体の酵素活性を測定し、測定された活性は、チロシン−リン酸化の量に比例する工程を含む請求項６の方法。
【請求項８】
抗体に結合した酵素が、ホースラディッシュパーオキシターゼである請求項７の方法。
【請求項９】
酵素活性を比色分析反応によって検出する請求項７の方法。
【請求項１０】
ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を調節する化合物を同定する請求項１から９のいずれかの方法。
【請求項１１】
i)ＡＬＫタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号１又は２から選択されるペプチドと、ペプチドのリン酸化に適した条件下で、候補化合物の存在のもとにインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを検出する工程を含む請求項１０の方法。
【請求項１２】
候補化合物のＡＬＫ調節活性を、候補化合物と同じ条件下でアッセイされた参照化合物のそれと比較する請求項１０又は１１の方法。
【請求項１３】
参照化合物はスタウロスポリンである請求項１２の方法。
【請求項１４】
参照化合物は一般式（Ｉ）
【化１】
2006519800.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ハロゲン（好ましくは塩素）、フェニル又は任意に１以上のハロゲンで置換されていてもよいＣ１からＣ３アルキルから選択され、Ｒ３はヒドロキシ、Ｒ４はヒドロキシ又はヒドロキシメチル、Ｒ５は、任意にハロ置換されていてもよいＣ１からＣ３アルキル又はベンジルである。）
のスタウロスポリン誘導体である請求項１２の方法。
【請求項１５】
配列番号１又は２から選択されるＡＬＫ基質として有用なペプチド。
【請求項１６】
配列番号１である請求項１５のペプチド。
【請求項１７】
ＡＬＫチロシンキナーゼ活性の測定のための請求項１５又は１６のペプチドの使用。
【請求項１８】
ＡＬＫ関連腫瘍、特に未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の治療用医薬の製造のための請求項１４の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１９】
配列番号１又は２のペプチド及び抗リン酸化チロシン抗体を含む請求項１から１４のＡＬＫチロシンキナーゼ活性を検出するためのキット。
【請求項２０】
比色分析反応用試薬、バッファ、希釈剤、洗浄剤、安定剤、請求項１４のスタウロスポリン又はそれらの誘導体から選択されるさらなる成分を含む請求項１９のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のキナーゼ活性を測定するためのアッセイを提供する。より詳細には、本発明は、ＡＬＫのチロシン−リン酸化活性を検出するための方法、試薬及び組成物に指向する。アッセイは、特に、潜在的ＡＬＫ阻害剤のインビトロでのスクリーニング及び同定に有用である。
【背景技術】
【０００２】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、受容体チロシンキナーゼであり、神経系の発達及び機能における重要な役割を果たすと考えられている。ＡＬＫは、通常、新生児期でピークの発現を伴って、中枢神経系で発現される。しかし、染色体転座によって、ＡＬＫは、異常に発現され、腫瘍融合タンパクの形態でいずれかの癌を活性化する。ＡＬＫ融合タンパクは、全非ホジキンリンパ腫の約５〜１０％に関与する。ＡＬＫ陽性リンパ腫の１年の発生率は、ＥＵ国で発生する２０００から３０００の新たな症例を含んで、全世界で約１０００００である。ＡＬＫは、発癌において必須の役割を果たし、その正常な発現は、ほとんど中枢神経系に限定されているため、治療行為に対する良好な候補である。よって、特定のＡＬＫ阻害剤は、臨床的な副作用をほとんど伴わないＡＬＫ陽性リンパ腫の有効な治療薬となり得る。潜在的なＡＬＫ阻害剤の同定のために、酵素活性に対して直接、阻害作用を示す化合物を評価するのに適するアッセイを開発することが強く望まれている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明によれば、ＡＬＫに特異で、かつＡＬＫ活性を調節する化合物のスクリーニングに有用なインビトロでのキナーゼアッセイが提供される。
このアッセイは、ＡＬＫによって容易にリン酸化されるペプチド基質の使用及びそのようにして得られたリン酸化生成物のその後の検出を基にしている。本発明の好ましい実施形態では、アッセイは、リン酸化された生成物が免疫学的反応によって検出されるＥＬＩＳＡ法である。
【０００４】
選択的なＡＬＫ基質を生成するために、ＡＬＫ活性化ループの配列を複製するペプチド（aa 1274-1294：ALK HUMAN、Q9UM73、swiss-PROT)）を合成し、試験した。そのペプチド  ＡＲＤＩＹＲＡＳＦＦＲＫＧＧＣＡＭＬＰＶＫ（配番号１)及びＡＲＤＩＹＲＡＳＹＹＲＫＧＧＣＡＭＬＰＶＫ（配列番号２）は、ほとんどのチロシンキナーゼに対して良好な基質となることが知られているランダムポリマーであるポリＧｌｕ／Ｔｙｒよりも高いリン酸化の程度を示すＡＬＫ基質として、特に有効であった。従って、本発明の第１の目的は、配列番号１及び配列番号２から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を検出する方法であり、それは、本質的に、
i) ＡＫＬタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号１及び２から選択されたペプチドとともに、そのペプチドのリン酸化反応に適する条件下でインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを検出する工程を含む。
【０００６】
ここで用いられる「ＡＬＫ機能的誘導体」は、ＡＬＫタンパクのいずれかの修飾型、例えば、未修飾ＡＬＫの触媒活性を維持している、欠失又は複合型あるいはそれらのフラグメントを意味する。機能的誘導体は、ＡＬＫ配列の1116から1392のＡＬＫ全長(spanning)残基の全触媒ドメイン(Q9UM73)を含むことが好ましい。残基Ｌｅｕ1073からＡｌａ1459に伸長したＡＬＫタンパクの一部が好ましく使用される。
【０００７】
バキュロウイルス型発現システムを用いた組換え遺伝子技術によって生成された場合、このＡＬＫフラグメントは、正しいホールディング（ＣＤスペクトルによって確認）及び有効な触媒活性を示す。
【０００８】
さらに、ＡＬＫの構成的に活性な形態を含む製剤を、精製たんぱく質又はその機能的誘導体のかわりに用いてもよい。そのような製剤は、細胞溶解物であることが好ましく、それは、ＡＬＫ発現細胞を異なる化合物で処理し、次いで、ＡＬＫキナーゼ活性に対する細胞溶解物をアッセイすることによって、ａ）ＡＫＬ又はＡＬＫ融合プロテインを発現する全細胞において、ＡＬＫ活性を確かめ、及びｂ）細胞中でＡＬＫに対する潜在的な阻害剤の効果を確かめるために使用することができる。
【０００９】
工程ii）においてリン酸化ペプチドを検出するために、工程i)のリン酸化反応を、[γ32Ｐ]ＡＴＰ又は[γ33Ｐ]ＡＴＰのような放射性試薬の存在下で行うことができ、それにより、放射技術によって容易に検出される放射性生成物を形成することができる。あるいは、免疫反応を行うことができ、それは、リン酸化ペプチドと抗リン酸化チロシン抗体との免疫複合体の形成を含む。この抗リン酸化チロシン抗体は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスホターゼ又はグルコースオキシダーゼのような、受容体酵素に放射性標識又は結合することができ、よって、特定の放射活性又は酵素活性を測定することによって、抗体及びリン酸化ペプチドの直接的な検出を可能にする。さらなる代替として、抗リン酸化チロシン抗体は、抗リン酸化チロシン抗体を認識し、かつ放射性標識又は受容体酵素を有する第２の抗体によって、あるいは、抗リン酸化チロシン抗体におけるビオチン標識を認識するストレプロアビジンに結合した酵素によって、間接的に検出することができる。
【００１０】
好ましい実施形態では、本発明は、ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を検出する方法を提供し、それは、
ａ）配列番号１又は２のペプチドを固相に接着させ、
ｂ）Ｌｅｕ1073からＡｌａ1459に伸張するＡＬＫフラグメントとともに固相を、チロシンリン酸化反応に適する条件下でインキュベートし、
ｃ）固相を洗浄し、
ｄ）抗リン酸化チロシン抗体（第１抗体）とともに固相を、抗原−抗体結合に適する条件下でインキュベートし、
ｅ）固相を洗浄し、
ｆ）抗リン酸化チロシン第１抗体を認識する酵素結合抗体（第２の抗体）とともに固相を、第１抗体の第２抗体への結合に適する条件下でインキュベートし、それによって三成分免疫複合体を形成し、
ｇ）固相を洗浄し、
ｈ）免疫複合体の酵素活性を測定する（測定された活性は、チロシン−リン酸化の量に比例する）工程を含む。
【００１１】
このアッセイ、正確にはＥＬＩＳＡベースのキナーゼアッセイは、酵素−抗体結合体に利用される。結合酵素は、基質を開裂し、着色した溶液（それは、リン酸化チロシンの量に比例する）の吸収を測定することによって、分光光度的に検出することができる着色反応生成物を生じさせる。
【００１２】
本発明で使用することができる固相又は支持体は、プラスチック材料（反応プレート、ウェル、バイアル）、ポリスチレン、ラテックス及び磁性物質ビーズ、コロイダル金属粒子、ガラス及び／又はシリカ表面ならびにその他を含む。
【００１３】
ＥＬＩＳＡベースのＡＬＫアッセイは、ＡＬＫのチロシン−リン酸化活性を調節する化合物のスクリーニング、特に、ＡＬＫ阻害剤のスクリーニングに好ましく使用される。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ＡＬＫのチロシン−キナーゼ活性を調節する化合物の同定方法に指向し、上述したＡＬＫアッセイは、候補化合物あるいはＡＬＫチロシンキナーゼ活性を刺激又は阻害するとして知られた化合物（対照）の存在下に行われる。特に、ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を調節する化合物を同定する方法は、
i)ＡＬＫタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号１又は２から選択される（好ましくは配列番号１）ペプチドとともに、そのペプチドのリン酸化に適した条件下で、候補化合物の存在のもとにインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを定量する工程を含む。
【００１４】
ＡＬＫ活性を阻害する化合物は、未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫のようなＡＬＫ関連腫瘍の治療用の潜在的な治療剤として選択される。候補化合物のＡＬＫ調節活性は、候補化合物と同じ条件下でアッセイされた参照化合物（対照）のそれと比較することができる。スタウロスポリン（Staurosporine）(Meggio F.ら、Eyr. J. Biochem. (1995) 234、317-322)は、０．２から０．３μＭ濃度でＡＬＫ阻害剤として有効であることが証明されており、ＡＬＫ阻害活性の他の化合物をスクリーニングする場合、陽性の対照として用いることができる。
【００１５】
分子モデルの研究は、スタウロスポリン親和性及びＡＬＫタンパクに対する特異性を改善することが要求されている置換基のパターンに関して、重要な指標を与えた。最も有効な構造は、以下の一般式（Ｉ）で示される。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ハロゲン（好ましくは塩素）、フェニル又は任意に１以上のハロゲンで置換されていてもよいＣ１からＣ３アルキルから選択され、Ｒ３はヒドロキシ、Ｒ４はヒドロキシ又はヒドロキシメチル、Ｒ５は、任意にハロ置換されていてもよいＣ１からＣ３アルキル又はベンジルである。）
式（Ｉ）の化合物は、ＮＰＭ−ＡＬＫ、ＡＴＩＣ−ＡＬＫ、ＣＴＬＣ−ＡＬＫ、ＴＦＧ−ＡＬＫ又はその他のトロポミオシンとの散発性融合のような発癌性の融合タンパク内で、ＡＴＰのＡＬＫのチロシンキナーゼドメインへの結合を拮抗する。したがって、それらはＡＬＫ関連腫瘍、特に、未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の治療用医薬製剤に用いることができる。
【００１８】
本発明の異なる実施形態では、化合物（Ｉ）を、ここで開示されたように、ＡＬＫ阻害剤のスクリーニング用ＡＬＫアッセイに用いる。ハイスループットのスクリーニングもまた、本発明のＡＬＫアッセイを用いて実行することができる。
【００１９】
さらなる観点によれば、本発明は、上述したＡＬＫアッセイを行うためのキットに指向する。そのキットは、所定の割合で試薬を組み合わせて包装したものからなる。通常、キットは、配列番号１又は２のペプチド（任意に固相に固定されていてもよい）、抗リン酸化チロシン抗体及び、必要に応じて、酵素的又は放射性標識された標識抗体を含むであろう。さらに、キットは、比色又は放射性反応のための試薬、バッファ、スタウロスポリン又はその誘導体のような対照、希釈剤、洗浄剤、安定剤及びアッセイを組み立てるか、アッセイを行うために有用ないずれかの他の成分を含んでいてもよい。種々の試薬の相対的な量は、アッセイの感度を最適化するために変化させることができる。特に、試薬は、溶液、懸濁剤、分散剤、乾燥粉末、凍結乾燥製剤のような固体又は液体製剤で提供してもよい。キット成分は、１つの又は別個の容器で供給される。またそのキットは、アッセイを行うための指示書を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】組換えＨｉｓ標識ＡＬＫの精製及び活性。  Ａ）マーカー（Ｍ）、ＨｉＴｒａｐカラムにロードされた透析及びプールされたＤＥＡＥカラムフラクション（load）、ＨｉＴｒａｐカラムフラクション（数字はフラクション番号を示す）を示す銀染色１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｂ）精製ｒＡＬＫの放射活性自動リン酸化反応アッセイ。レーン１：32Ｐ標識ｒＡＬＫのオトラジオグラフィー。レーン２：レーン１と同様のサンプルの銀染色。
【００２１】
【図２】ＡＬＫキナーゼとペプチドとの反応速度。
【図３】ＥＬＩＳＡベースのキナーゼアッセイを用いたＡＬＫ活性の検出。  Ａ）精製ｒＡＬＫによる配列番号２のペプチドのリン酸化反応。ＥＬＩＳＡキナーゼ反応を０．５μｇ精製ｒＡＬＫの有又は無で、配列番号２のペプチド又はペプチド無しで、３０℃にて３０分間行った。グラフは、４５０ｎｍでの吸収を示す。Ｂ）ＡＬＫペプチド基質リン酸化の反応速度。ＥＬＩＳＡキナーゼ反応を、２０６μＭの配列番号２のペプチド又は４２μＭの配列番号１のペプチドを用いて、０．１μｇの精製ｒＡＬＫとともに行った。反応は０、０．５、２、５、１０分後、ＥＤＴＡを添加することによって中止させた。
【００２２】
【図４】リン酸化反応のレベルに対するペプチド基質濃度の効果。ＥＬＩＳＡアッセイを、０．２μｇの精製ｒＡＬＫ及び０〜１０５μＭの配列番号１のペプチド（Ａ）又は０〜３１５μＭの配列番号２のペプチド（Ｂ）の存在下で、３０℃にて１５分間行った。
【図５】基質リン酸化反応に対するｒＡＬＫ濃度の効果。ＥＬＩＳＡアッセイを、２０６μＭの配列番号２のペプチド又は４２μＭの配列番号１のペプチド及び０〜２２５ｎｇの範囲のｒＡＬＫを用いて、３０℃にて１５分間行った。
【図６】スタウロスポリンによるＡＬＫ活性の阻害。ＥＬＩＳＡアッセイを、４２μＭの配列番号１のペプチド、２０ｎｇのｒＡＬＫを用いて、３０℃で１５分間、０〜５μＭのスタウロスポリン又は溶媒、ＤＭＳＯの当量の存在下にて行った。グラフは未処理対照で標準化したＡ４５０を示す。
【００２３】
実験結果
ペプチド合成
アプライド・バイオシステム・モデル４３１Ａ・シンセサイザー（４−ヒドロキシメチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂（０．９５ｍｍｏｌ／ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）)で、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を利用する自動固相合成法によって、ペプチドを合成した。
【００２４】
Ｆｍｏｃアミノ酸(０．５ｍｍｏｌ)を、２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１−１，１，３，３−トリメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート(ＨＢＴＵ)(１当量)及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ)(１当量)を、ＤＩＰＥＡ（２当量)の存在下で、活性化した。
【００２５】
ペプチジル樹脂(１００ｍｇ)を開裂させ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．３７５ｇのフェノール、０．１２５μｌの１，２−エタンエジチオール、０．２５０μｌのチオアニソール及び０．２５μｌの水中で、２時間、脱保護した。その反応混合物を、０℃に冷却したエチルエーテルを含む試験管にろ過した。析出したペプチドを遠心により分離し、新鮮なエーテルで洗浄した。
【００２６】
粗ペプチド(１０ｍｌの水中、５０から１００ｍｇ)を分離用ＲＰ−カラム(prepNova-Pak HR C18、６μｍ、２５×１０ｍｍ、Waters)にポンピングし、１２ｍｌ／分で、１０％から４５％アセトニトリルの線形勾配で溶出した。
【００２７】
ペプチドの純度は、１ｍｌ／分で、０．１％フルオロ酢酸中のアセトニトリルの線形勾配を用いた分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（５μｍ、Ｃ１８Symmetry300カラム、４．６×２５０ｍｍ (Waters)）による判定で＞９０％であった。ペプチドの分子量は、マトリクス−援助レーザー吸収イオン化飛行時間型(ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ)質量分析計(Maldi-1；Kratos-Schimadzu、Mancester、UK）を用いた質量分析法によって確認した。
【００２８】
組換えＡＬＫの生成及び精製
ＡＫＬの一部（Ｌｅｕ1073からＡｌａ1459から伸張）をバキュロウイルス転移ベクター（pBlueBacHis2C (インビトロゲン)）にクローン化した。
このベクターとＭａｘＢａｃ（登録商標）２．０バキュロウイルス発現システム（インビトロゲン）を用いて、我々は、Ｓｆ９(Spodoptera ftugiperda)昆虫細胞内で、組換えバキュロウイルス及び発現組換えＡＬＫ（ｒＡＬＫ）プロテインを生成した。このタンパクは、理論分子量が４９ｋＤａであり、６−ヒスチジン標識（Ｈｉｓ−ｔａｇ）に融合したＡＬＫ(Ｉｌｅ1116からＶａｌ1392)の予測触媒ドメインを含む。Ｈｉｓ標識ｒＡＬＫの自動リン酸化活性は、正しいホールディングを表示し、全細胞溶解物の抗リン酸化チロシン免疫ブロット及びインビトロの放射性キナーゼアッセイによって検証された。
【００２９】
精製のためのタンパクを生成するために、感染多重度（ＭＯＩ）５で、Ｓｆ９細胞を組み換えウイルスに感染させた。 ２７℃にて３日間、インキュベートすることにより培養し、次いで、４℃にて１０分間４００ｇで遠心することにより回収した。細胞ペレットを使用まで−８０℃で保存した。細胞を溶解するために、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤(ペプスタチン、ベンズアミジン、ロイペプチン及びアプロチニン)を含む低張のバッファ（バッファＡ）中で、細胞ペレットを再懸濁した。氷上でのインキュベーションの３０分後、細胞再懸濁液を１５００ｇで１５分間、４℃にて遠心し、上清を０．４５μｍフィルターによってろ過した。次いで、ろ液を、バッファＡの存在下、８０ｍｌアニオン交換高速ＤＥＡＥセファロース（シグマ）カラムに、１．５ｍｌ／分の流量で、ＡＫＴＡＦＰＬＣシステム（アマーシャム−ファルマシアバイオテック）を用いてロードした。結合したタンパクを、２０から２００ｍＭの範囲のＮａＣｌの勾配中で溶出した。フラクションを、免疫ブロットによって、ＡＬＫタンパクが存在するかどうか分析した。陽性フラクションをプールし、１リットルの陰性結合バッファ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）、５００ｍＭのＮａＣｌ及びＰＩ）中で、毎時間バッファを交換しながら、４℃にて３時間透析した。次いで、透析フラクションを、５０ｍＭイミダゾール及び２０ｍＭβメルカプトエタノールを添加した陰性結合バッファで予め平衡させて、ＨｉＴｒａｐ（商標）−ニッケル親和性クロマトクラフィーカラム（アマーシャム−ファルマシアバイオテック）にロードした。０．５から１ｍｌ／分の流量をカラムに適用した。カラムを陰性結合バッファで洗浄した後、結合タンパクを、５０から２００ｍＭの範囲のイミダゾールの線形勾配を用いて溶出した。次いで、フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって、ｒＡＬＫの存在及び純度について分析した。図１ＡはｒＡＬＫの精製の実施例を示す。
【００３０】
最後に、陽性フラクションを、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、２０ｍＭのβ−メルカプロエタノール及びプロテアーゼ阻害剤中で透析し、使用まで−８０℃で保存した。精製ｒＡＬＫが活性であることを検証するために、我々は、放射性自動リン酸化アッセイを行った。２５μｌのｒＡＬＫ陽性フラクション、６μＭの冷ＡＴＰ、１．２ｍＭのＤＴＴ、１０μＣｉ[γ−32Ｐ]ＡＴＰ、２５ｍＭのヘペス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2及び１０ｍＭのＭｎＣｌ2を含む反応混合物を３０℃にて３０分間インキュベートした。反応を、Ｌａｅｍｍｌｉバッファを加えることによって中止させ、９５℃にて５分間加熱した。サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに解像し、Immobilon（商標）−Ｐメンブレンに転写した。放射性標識タンパクを図１Ｂに示したように、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【００３１】
ペプチドリン酸化反応（放射性アッセイ）
ペプチド及びランダムポリマーポリＧｌｕ／Ｔｙｒ（１：４）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭのＭｎＣｌ2、１０μＭのＮａ−バンデート、３０μＭ［γ32Ｐ］ＡＴＰ又は[γ33Ｐ]ＡＴＰ (特異活性１０００ｃｐｍ／ｐｍｏl）及び１０単位のｒＡＬＫ [１ユニットは、ポリＧｌｕＴｙｒ (０．１ ｍｇ／ｍｌ)に対して、１分当り１ｐｍｏｌのリン酸を転移する酵素の量として定義されている]を含む媒体の３０μｌ中でリン酸化した。その反応を、３０℃で１０分間のインキュベーションの後、２５μｌの混合物をＰ８１ホスホセルロース紙にスポットすること（それは、他の箇所（１）で説明されたように進めた）により終了させた。非線形回帰を用いたミハエリス‐メンテンの式に直接データを代入するGraphPad Prism softwareによって、反応速度定数を測定した。
【００３２】
結果
Ｔｙｒ−１２７８を含む、ＡＬＫ参照配列から誘導されたペプチドは、ｒＡＬＫの良好な基質となったが、Ｔｙｒ−１２８２又はＴｙｒ−１２８３のいずれかを含むペプチドは、酵素によってわずかに影響された（図２参照）。Ｔｙｒ−１２７８誘導体は３つのＴｙｒ残基を有するペプチドによって表されたものよりももっと高い効率でリン酸化された（表Ｉ）。Ｔｙｒ−１２７８誘導体がＡＬＫ触媒ドメインに最適なペプチド基質であることを確認するために、我々は、ポリＧｌｕ／Ｔｙｒ（１：４）、つまり、ほとんどのチロシンキナーゼに非常に良好な基質であるランダムポリマーによって表されたものとそのリン酸化の程度を比較した。
表IIは、Ｔｙｒ−１２７８誘導体がポリＧｌｕ／Ｔｙｒよりも良好なＡＬＫ基質となることを示す。
【００３３】
表Ｉ
ｒＡＬＫと合成ペプチドとの反応速度定数
ペプチド：Vmax(pmol/分)：Km(μM)：効率(Vmax/Km) 
ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK：99.5：90.5：1.1
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK：186.3：109.4：1.7
【００３４】
表II
ＡＬＫ触媒ドメインによるモデル基質のリン酸化速度
ポリ(Ｇｌｕ／Ｔｙｒ)及びペプチド濃度を、それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ及び４００μＭとした。酵素濃度は１０単位であった。報告された値は、３回の別個の実験の平均を示す。Ｓ． Ｅ． Ｍ．値は常に１４％未満であった。
基質：リン酸化の程度(ｐｍｏｌ／分) 
ポリ(Ｇｌｕ／Ｔｙｒ)：１０．０
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK：３０．３
【００３５】
ＥＬＩＳＡベースのインビトロでのキナーゼアッセイ
ナンクイムノ９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中の種々の濃度でＡＬＫペプチド基質（配列番号１又は２）を含む被覆溶液（１２５μ１／ウェル）とともに、３７℃にて一晩インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ−トウーン０．０５％）の２００μ1で洗浄し、３７℃にて２時間放置して乾燥した。キナーゼ反応をキナーゼバッファ(２５ ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭのＭｎＣｌ2、５ｍＭのＭｇＣｌ2）、０．３ｍＭのＡＴＰ及び精製ｒＡＬＫを３０℃にて１５分間、１００μｌ／ウェルの総容量中、種々の濃度でインキュベートすることによって行った。次いで、反応混合物を取り出し、ウェルを洗浄バッファ２００μｌで５回洗浄した。リン酸化ペプチドをＰＢＳ＋４％ＢＳＡ中で１：５００に希釈されたマウスモノクローナル抗リン酸化チロシン抗体（クローン４Ｇ１０ UpstateBiotech Ltd）１００μｌ／ウェルを用いて検出した。室温でのインキュベートの３０分後、抗体を取り出し、上述したようにウェルを洗浄した。ＰＢＳ＋４％ＢＳＡ中で１：５００に希釈された第２抗体（抗マウスＩｇＧ、ホースラディッシュパーオキシターゼ結合全抗体、羊から、Amersham Pharmacia Biotech）の１００μｌを各ウェルに加え、上述したような洗浄の前に、プレートを再度室温にて３０分間インキュベートした。プレートを１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液(エンドゲン)を用いて製造し、反応を０． １８ Ｍの硫酸の同量を添加することによって中止させた。最後に、Ultrospec（登録商標）３００スペクトロメータ(Amersham- Pharmacia Biotech)を用いて、４５０又は４９０ｎｍで吸収を読み取った。
【００３６】
結果
我々は、ＥＬＩＳＡベースキナーゼアッセイがリン酸化ＡＬＫペプチド基質（配列番号１及び２）を、よって精製ｒＡＬＫ活性を検出するために使用することができることを示した。最初の実験で、我々は、４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸収における特別な増加が観察できるかどうかを測定するために、精製ｒＡＬＫ及び配列番号２のペプチド基質の双方の存在、非存在下でアッセイを行った（図３Ａ）。当然、精製ｒＡＬＫ及び基質の双方の存在下で、Ａ４５０ｎｍにおける劇的な増加が観察された。それに対して、ペプチド又はｒＡＬＫのいずれか及び双方の非存在下では、Ａ４５０ｎｍは低く、つまりバックグラウンド吸収の低いレベルを示した。基質リン酸化の反応速度を測定するために、我々は、種々のインキュベーション時間後のＡ４５０を測定した（図３Ｂ）。双方のペプチドについて、反応速度は、１０分後に最大リン酸化に達したというように、同様であった。
【００３７】
ＥＬＩＳＡキナーゼアッセイにおける２種のペプチドの効率を比較し、使用のためのペプチドの最適濃度を測定するために、我々は、双方のペプチドについて検量線測定を行った。結果は、ペプチド基質の量の増加がＡ４５０を、よってｒＡＬＫキナーゼ活性を増加させることを示す。配列番号２のペプチド基質について、最大Ａ４５０及びリン酸化反応は、約２００μMで観察され、それに対して、配列番号１のペプチド基質はわずか２５μMであった（図４Ａ及びＢ）。これは、配列番号１のペプチド基質がｒＡＬＫ用の基質としてより有効であることを示す。
【００３８】
キナーゼ活性の阻害を観察するために、酵素の適当な濃度、つまり、検量線の線形範囲を用いることが必須である。ＥＬＩＳＡを、２０６μＭの配列番号２又は４２μＭの配列番号１及びｒＡＬＫの０〜２２０ｎｇの範囲を用いて行った。双方の基質の曲線の線形範囲は、ｒＡＬＫの約０〜１５ｎｇの間であり、その後、曲線はプラトーに達した（図５）。
【００３９】
ｒＡＬＫ活性に対する阻害剤スタウロスポリンの効果を４２μＭの配列番号２のペプチド基質を用いて評価した。また、対応濃度でＤＭＳＯを含有する溶媒対照を行った。スタウロスポリンは、１μＭで、見積もりＩＣ50＝３００ｎＭの最大阻害に達し、著しくｒＡＬＫ活性を阻害した（図６）。溶媒（ＤＭＳＯ）単独ではｒＡＬＫ活性に実質的な効果はなかった。
【００４０】
参照
[1] Glass, D.B.、Masaracchia, R.A.、Feramisco, J.R.及びKemp, D.E.、(1978) Anal. Biochem. 87、566-575。
[2] Till, J. H.、Ablooglu, A. J.、Frankel, M.、Bishop, S. M.、Kohanski, R. A.及びHubbard S. R.、(2001) J. Biol. Chem. 276、10049-10055。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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