(57)【要約】本発明は、a)適切な癌細胞系を選択するステップと、b)前記癌細胞系の表面上の抗原発現を検出するステップとを含み、発現される抗原は多価ワクチンに使用される、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法も提供する。本発明は、a)適切な癌細胞系を選択するステップと、b)免疫原性の検出は多価ワクチンに使用されるステップとを含む、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法も提供する。本発明は、特定された多価ワクチンの様々な使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法であって、
a) 適切な癌細胞系を選択するステップと、
b) 前記細胞系の表面上の抗原発現を検出するステップと、
を含み、発現された前記抗原は前記多価ワクチンに使用される方法。
【請求項２】
前記抗原の発現を特異抗体によって検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記発現を蛍光活性化細胞選別装置によって検出する、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法であって、
a) 適切な癌細胞系を選択するステップと、
b) 前記細胞系の表面上の抗原の免疫原性を検出するステップと、
を含み、前記免疫原性を示す前記抗原は前記多価ワクチンに使用される方法。
【請求項６】
前記抗原の免疫原性を補体依存性細胞傷害アッセイによって決定する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が小細胞肺癌である、請求項1、2、3、4、5または6に記載の方法。
【請求項８】
請求項1、2、3、4、5、6または7に記載の方法によって特定される最適な組合せ。
【請求項９】
GM2、フコシルGM1、Globo Hおよびポリシアル酸を含むが、GD2もGD3も含まない小細胞肺癌用多価ワクチン。
【請求項１０】
シアリルルイスaをさらに含む、請求項9に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記抗原がコンジュゲートされている、請求項9に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記抗原がコンジュゲートされている、請求項10に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記抗原がキーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートしている、請求項11に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記抗原がキーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートしている、請求項12に記載のワクチン。
【請求項１５】
適切なアジュバントを含む、請求項9、10、11、12、13または14に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適な癌用多価ワクチンに関する。
【０００２】
本願は、その内容を参照により本願に援用する、2003年4月9日に出願された米国出願第60/461,622号の利益を主張するものである。
【０００３】
本願は、NIH Grant No. PO1CA33049による一部補助を受けた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有することができる。
【０００４】
本発明を通して、様々な参考文献が引用される。これらの出版物の全体の開示は、本発明が関係する現況技術をより十分に記述するために参照により本願に援用される。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
小細胞肺癌(SCLC)生検材料は、これまで、30種類の標的抗原候補に対するモノクローナル抗体(mAb)を用いてスクリーニングされ、最も広範に、すなわち、生検材料の>60%において癌細胞の>50%に発現される標的抗原が特定されてきた(1-3)。糖脂質GM2、フコシルGM1、sLeaおよびglobo H、ならびに胎児性NCAM上のポリシアル酸(polySA)がこれらの判定基準を満たした。さらに2種類の糖脂質GD2およびGD3もSCLC上に一般的に存在していることが別の研究者によって記述されており(4、5)、抗イディオタイプワクチンターゲティングGD3を用いた多施設無作為化第三相試験が現在進行中である。これらはすべて、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)にコンジュゲートさせ、免疫アジュバントQS-21と混合したときに、患者において一貫して免疫原性となることが実証された細胞表面抗原である(6、7、8、9、10)(試験されていないシアリルルイス(sialyl Lewis)a(sLea)を除く)。これらはすべて、SCLCに対する抗体誘導多価ワクチンに混合するための優れた候補である。
【０００６】
GM2、フコシルGM1、Globo HおよびpolySAは、生検材料を用いた免疫組織化学による本発明者らの初期スクリーニングにおいては、SCLC細胞表面抗原のうち最も広範囲に認められた。これら4種類の抗原は、SCLC細胞表面に対する多価ワクチンに混合される第一選択であった。この4価コンジュゲートワクチンを調製する前に、これらの抗原に対する抗体の混合物が個々の抗体よりも細胞表面反応性が高いことを確認し、追加の抗原を混合することによってSCLCに対する細胞表面反応性がより高くなるかどうかを明らかにすることが望まれた。2つの関連する関心事があった。第1に、SCLC細胞系は、補体活性化および補体依存性細胞傷害(CDC)に対して耐性があることが示され、患者のSCLCが補体ターゲティングおよび細胞傷害性に対して耐性があることが示唆された。第2に、細胞表面からの距離が遠いためにCDCに対して低質の標的であることを本発明者らが知っているpolySAに対する抗体は(17)、他の抗原に対するmAbによって媒介されるCDCを妨害するであろう。このため、これら7種類の標的抗原に対するモノクローナル抗体を個々に、または異なる組合せでプールして用いて、10種類のSCLC細胞系をフローサイトメトリーおよび補体依存性細胞傷害(CDC)によって試験した。これらの同じ抗原をワクチン接種された患者からの血清で見られる反応性レベルに匹敵する蛍光活性化細胞選別装置アッセイ(FACS)による反応性レベルを示す、最適よりわずかに低いmAb濃度を使用した。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本明細書に開示される発明は、様々な癌に対する単一の多価ワクチンの最適な組合せを決定する一般的方法を提供する。本発明は、最適な組合せを特定するシステムを提供する。
【０００８】
本発明は、a)癌細胞系を選択するステップと、b)前記癌細胞系の表面上の抗原発現を検出するステップとを含み、発現される抗原を多価ワクチンに使用する、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法も提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、a)適切な癌細胞系を選択するステップと、b)前記細胞系の表面上の抗原の免疫原性を検出するステップとを含み、前記免疫原性を示す抗原は多価ワクチンに使用される、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法も提供する。
【００１０】
最後に、本発明は、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを提供する。一実施形態においては、本発明は、GM2、フコシルGM1、Globo Hおよびポリシアル酸を含む小細胞肺癌用4価ワクチンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書に開示される発明は、様々な癌に対する多価ワクチン用の抗原の最適な組合せを決定する一般的方法を提供する。文献においては、多数の抗原が癌細胞表面で発現されると記載されている。ワクチンに使用すべき抗原の設計において、本発明は、最適な組合せを特定するシステムを提供する。
【００１２】
本発明は、a)適切な癌細胞系を選択するステップと、b)前記癌細胞系の表面上の抗原発現を検出するステップとを含み、発現される抗原は多価ワクチンに使用される、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法も提供する。
【００１３】
国際特許出願第PCT/US02/21348号(国際公開第WO 03/003985号A2、2003年1月16日)は、糖脂質抗原、多糖抗原、ムチン抗原、グリコシル化ムチン抗原および適切なアジュバントを含む群から選択される少なくとも2種類のコンジュゲート抗原を含む多価ワクチンを開示する。PCT/US02/21348は、以下、すなわち、グリコシル化MUC-1-32mer、Globo H、GM2、Ley、Tn(c)、sTN(c)およびTF(c)の少なくとも2種類を含む多価ワクチンも提供する。
【００１４】
本発明は、前記ワクチンの組合せを予測し最適化するin vitroのシステムを提供する。
【００１５】
一実施形態においては、多価ワクチンの最適な確認の前記特定に2種類以上の癌細胞系が使用される。別の実施形態においては、抗原の発現は、特異抗体によって検出する。さらに別の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態においては、発現は、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)によって検出される。
【００１６】
本発明は、さらに、a)適切な癌細胞系を選択するステップと、b)前記細胞系の表面上の抗原の免疫原性を検出するステップとを含み、前記免疫原性を示す抗原は多価ワクチンに使用される、癌に対する多価ワクチンの最適な組合せを特定する方法も提供する。
【００１７】
本明細書において使用される免疫原性とは、ある物質に対して免疫応答を惹起することができるその物質の特性を意味し、その物質がその物質に対する免疫応答をどのくらい惹起できるかの指標である。この応答は、細胞性応答および液性応答を含む。
【００１８】
一実施形態においては、抗原の免疫原性は、補体依存性細胞傷害アッセイによって決定される。別の実施形態においては、癌は小細胞肺癌である。
【００１９】
本発明は、さらに、上記方法による最適な組合せの特定を提供する。
【００２０】
本発明は、GM2、フコシルGM1、Globo Hおよびポリシアル酸およびGD2またはGD3を含む小細胞肺癌用多価ワクチンも提供する。一実施形態においては、ワクチンはさらにシアリルルイスaも含む。
【００２１】
一実施形態においては、抗原はコンジュゲートされている。さらに別の実施形態においては、抗原は、キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートしている。
【００２２】
さらに別の実施形態においては、上記ワクチンは適切なアジュバントを含む。適切なアジュバントは、ワクチンの免疫原性を増大させることができるべきである。さらに別の実施形態においては、アジュバントは、サポニン系アジュバントである。
【００２３】
サポニン系アジュバントとしては、QS21、GPI-0100などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００２４】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってより良く理解されるはずであるが、当業者には、詳述された具体的実験が説明のためのものであって、以下の特許請求の範囲によって定義されている本明細書に記載の発明を限定するものではないことが容易に理解されるはずである。
【００２５】
実験の詳細
小細胞肺癌(SCLC)生検材料は、これまで、30種類の標的抗原候補に対するモノクローナル抗体を用いてスクリーニングされ、最も広範に、すなわち、生検材料の>60%において癌細胞の>50%に発現される標的抗原が特定されてきた。糖脂質GM2、フコシルGM1、sLea、globo Hおよび胎児性NCAM上のポリシアル酸がこれらの判定基準を満たした。先行研究は、GM2(4、12)、フコシルGM1(4、11、12)およびpolySA(13、14)を用いて実施された。さらに2種類の糖脂質GD2およびGD3もSCLC上に一般的に存在していることが別の研究者によって記述されており(4、5)、抗イディオタイプワクチンターゲティングGD3を用いた多施設無作為化第三相試験(16)が現在進行中である。これらはすべて、KLHにコンジュゲートさせ免疫アジュバントQS-21と混合したときに、患者において一貫して免疫原性となることが示された細胞表面抗原である。これらはすべて、SCLCに対する抗体誘導多価ワクチンに混合するための優れた候補である。
【００２６】
GM2、フコシルGM1、Globo HおよびpolySAは、生検材料を用いた免疫組織化学による本発明者らの初期スクリーニングにおいて、SCLC細胞表面抗原のうち最も広範囲に認められた。これら4種類の抗原は、SCLCに対する多価ワクチンに混合される第一選択であった。これら4種類のコンジュゲートを混合して単一の多価ワクチンにする前に、これらの抗原に対する抗体の混合物が個々の抗体よりも細胞表面反応性が高いことを確認し、追加の抗原を混合することによってSCLCに対する細胞表面反応性が高くなるかどうかを確認し、最適な組合せを特定することが望まれた。2つの関連する関心事があった。第1に、SCLC細胞系は、補体活性化および補体依存性細胞傷害(CDC)に対して耐性があることが示され、患者のSCLCが補体ターゲティングおよび細胞傷害性に対して耐性があることが示唆された。第2に、細胞表面からの距離が遠いためにCDCに対して低質の標的であり、それによって他の抗原に対するmAbによって媒介されるCDCを妨害することが知られているpolySAに対する抗体である。このため、これら7種類の標的抗原に対するモノクローナル抗体を個々に、また異なる組合せでプールして用いて、10種類のSCLC細胞系をフローサイトメトリーによって試験した。これらの同じ抗原をワクチン接種された患者からの血清で見られる反応性レベルに匹敵するFACSによる反応性レベルを示す、最適よりわずかに低いmAb濃度を使用した。
【００２７】
細胞系:  すべての細胞系をAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Manassas、VA)から購入した。これらの細胞系を表1および表2に示す。各々の起源は、胸水から生ずるH82、H187およびH196ならびに骨髄生検から生ずるH211およびH345を除いて、ATCCによって、肺小結節の生検から得られたSCLCとして記載されている。SHP77は、大きい細胞変異体SCLCとして記載されている。
【００２８】
モノクローナル抗体(mAb):  7種類のmAbに対する標的抗原、これらのmAbの出所およびFACS試験に使用された濃度を以下に記載する。
【００２９】
GM2、mAb PGNX. Progenics Pharmaceuticals Inc.(Tarrytown、NY)、腹水  0.5μl/ml。フコシルGM1、mAb F12、Dr. Thomas Brezicka(Goteborg、Sweden)、 0.1μg/ml。Globo H、mAb VK9、Kenneth Lloyd(MSKCC)、20μg/ml。ポリシアル酸、mAb 5A5、Urs Rutishauser(MSKCC)、腹水  0.1μg/ml。GD2、mAb 3F8、Dr. Nai-Kong Cheung(MSKCC)、0.4μg/ml。GD3、mAb R24、Dr. Paul Chapman(MSKCC)、0.4μg/ml。sLea、mAb 19.9、Signet(Dedham、MA)から購入された、上清  0.05μl/ml。これらのmAb、濃度およびmAbサブクラスを表1に記載する。これらのmAbによって認識される抗原を図1に示す。
【００３０】
蛍光活性化細胞選別装置(FACS)アッセイ:  10種類のSCLC細胞系を標的として使用した。2×105細胞/管の単細胞懸濁液を3%ウシ胎児血清のPBS溶液で洗浄し、1:20希釈mAb 20μlと一緒に氷上で30分間インキュベートした。細胞を3%FCSのPBS溶液で2回洗浄した後に、20μlの1:15ウサギ抗ヒトIgGまたはFITC標識IgMを添加した。この懸濁液を混合し、30分間インキュベートし、洗浄した。陽性集団パーセントおよび染色細胞の平均蛍光強度をFACS Scan(Becton-Dickinson、CA)を用いて分析した(8、9)。二次抗体のみに陽性の細胞のパーセントは1%に設定した。
【００３１】
補体依存性細胞傷害(CDC)および抗体依存性細胞傷害(ADCC):  補体依存性細胞傷害は、以前に記述された2時間の51クロム放出アッセイ(10)によって、10μg/mlのMoAbとヒト補体を用いて10種類の細胞系について評価した。約107個の細胞を100μCiのNa251CrO4(New England Nuclear、Boston、MA)を含む3%HSAで37℃で2時間標識し、15分ごとに振とうした。この細胞を4回洗浄し、106生細胞/mlの濃度にした。標識細胞50μlを、ワクチン接種前もしくはワクチン接種後の未希釈血清50μlまたは媒体のみと96ウェルの丸底プレート(Corning、New York、NY)中で混合し、振とう機上で4℃で45分間インキュベートした。3%HSAで1:5希釈されたヒト補体(Sigma Diagnostics、St. Louis、MO)を100μ1/ウェルで添加し、37℃で2時間インキュベートした。プレートを100gで3分間回転させ、各ウェルから得られた100μl一定分量の上清をγ線計数器によって読み取り、放出された51Crの量を測定した。すべての試料はトリプリケートで実施し、最大放出および補体の非存在下における自然放出の対照ウェルを含んだ。
【００３２】
自然放出(補体のみと一緒にインキュベートされた標的細胞によって放出された量)は、実験放出値と最大放出値の両方から差し引いた。最大放出は、1%Triton X-100と一緒に2時間インキュベーションした後に標的細胞によって放出された放射能量であった。比放出(specific release)パーセントは、補正実験放出/補正最大放出として計算された。CD55およびCD59によって媒介される阻害に対抗するために、25〜150μg/mlの濃度の抗CD55および抗CD59を、mAbまたはmAbプールを含むCDCアッセイウェルに添加した。CD55に対するMabクローンBRIC 216およびCD59に対するmAb MEM-43は、Serotec Inc.(Raleigh、N.C.)から購入した。
【００３３】
FACSによって示される細胞表面反応性
表1に要約した濃度で使用した7種類のモノクローナル抗体に対する細胞表面反応性は、10種類のSCLC細胞系において1%から90%を超える範囲となった。mAbのうち2種類は(GM2を認識するPGNXおよびpolySAを認識する5A5)は、10種類のSCLC細胞系のうち6種類において50%以上の陽性細胞を生じた。それ以外のmAbは、5種類以下の細胞系と同等の反応性を示した。一方、抗体が、同じ濃度の抗体を用いて異なる組合せでプールされたときには、10種類の細胞系のうち9種類が50%以上の陽性細胞を示した。
【００３４】
フコシルGM1、GM2、globoHおよびポリシアル酸に対するmAbを含む組合せ(4種類のmAbプール)が最適であった。GD2、GD3およびシアリルルイスAに対する抗体を添加してもさらに影響を及ぼすことはほとんどなかった。DMS79、H187などの一部の細胞系は、7種類のmAbのうち6種類と強い陽性を示したが、SHP77、H211およびH82またはH196などの他の細胞系は、わずか0、1または2種類のmAbに対して陽性であった。しかし、抗体を異なる組合せでプールすると、SHP77のみが50%未満の陽性細胞を発現し続けた。4種類のmAbのプールを用いた10種類の細胞系に対するFACSによる細胞表面反応性を図2にさらに詳細に示す。細胞系SHP77を除いて、強い細胞表面反応性がすべての細胞系に対して示された。
【表１】
2006522828.tif 000002
【００３５】
CDCによって示される細胞表面反応性
ヒト補体を用いた補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイによれば、GM2に対するPGNXでは10種類の細胞系のうち5種類において、フコシル化GM1、GD2およびGD3に対するmAbでは10種類の細胞系のうち3〜4種類において溶解性が30%以上であり、ポリシアル酸、globoHおよびシアリルLeAに対するmAbではどの細胞系も溶解性が30%以上ではなかったことが実証された(表2)。フコシル化GM1、GM2、globoHおよびポリシアル酸を含む4種類の抗体のプールは、10種類の細胞系のうち9種類に対して細胞傷害性が30%を超えた。これは、GD2およびGD3に対する抗体の添加によってわずかに増加したが、それでも1種類の細胞系H345は、同じプールを用いてH345細胞の99%がFACSによる強い反応性を有するにもかかわらず細胞傷害性が30%未満であった。H345は別として、FACSとCDCはかなり密接に相関し、HSP77、H211などの一部は予想よりも強いCDCを示した。
【表２】
2006522828.tif 000003
【００３６】
CD55およびCD59の細胞表面発現
CD55は10種類のうち3種類の細胞系(SHP77、H524およびH196)上で強く発現され、CD59はH211およびH82以外のすべての細胞系上で強く発現された。これら2種類の補体の抵抗因子の発現と補体依存性細胞傷害レベルとの間には明確な相関はなかった(表3)。H345は、多数の強いCD59陽性細胞系の1つであったが、CD55に対しては適度に陽性であるに過ぎなかった。H345は、細胞表面においてこれらのmAbによって認識される優勢な抗原がポリシアル酸であるので、CDCによって陰性であったのかもしれない。それでも、補体溶解におけるこの明白な補体耐性細胞系に対するCD55およびCD59の役割を探究するために、抗CD55または抗CD59mAbの存在下でCDCアッセイが実施された(表3参照)。抗CD55と抗CD59の両方とも(この2つの組合せも)、H345に対して検出可能な補体細胞傷害性をそれ自体で媒介することができなかった。しかし、4種類のmAbのプールによって媒介されたCDCは、100μg/mlの抗CD55の存在下で5%から15%に増加し、100μg/mlの抗CD59の存在下で70%に増加した(図3)。
【表３】
2006522828.tif 000004
【００３７】
結論
SCLCの生検によって、多種多様な細胞炭水化物表面抗原が示される。フコシルGM1、GM2、ポリシアル酸、globo H、シアリルLea、GD2およびGD3は、このうち最も広範に発現される。これらは各々、活性抗体または受動抗体(passive antibody)が介在するSCLCの免疫療法の優れた標的であるが、これらの抗原のうちどれもSCLC生検材料の70%または80%を超えて発現されることはこれまで示されていない。これは、これらの抗原のいくつかに対する多価ワクチンを構築することに焦点を絞る根拠となっている。しかし、どの抗原か、すべてが必要か、これらの抗原の一部に対して誘導された抗体は、他の抗原に対して誘導された抗体の影響を損なうだろうか、抗体のプールは、すべてのSCLCを標的にすることができるか。これらの疑問には、これらの7種類の異なる細胞表面抗原に対するmAbの反応性を、10種類のSCLC細胞系のパネル上でフローサイトメトリーを用いて試験することによって対処した。使用したmAbの濃度は、これらの抗原に対するKLHコンジュゲートワクチンを接種された患者において得られる反応性の力価(6〜10、17、26)に匹敵する、ELISAおよびFACSによる反応性の力価が得られるように選択した。生検材料、すなわち今回はこれら10種類の細胞系上でこれらのmAbによって最も広範に認識された4種類の抗原は、フコシル化GM1、GM2、globoHおよびポリシアル酸であった。FACSによって50%以上の陽性細胞を示す細胞系の数は、この抗体プールを利用すると10種類のうち9種類に増加した。残りの細胞系も陽性であり、30%の陽性細胞を示した。GD2、GD3およびシアリルLeaに対する抗体を添加してもさらに影響を及ぼすことはほとんどなかった。これらの結果に基づいて、本発明者らは、本発明者らがSCLCに対して構築中である多価ワクチンに混合するために、フコシル化GM1、GM2、globoHおよびポリシアル酸を選択した。しかし、polySA-KLHコンジュゲートワクチンを用いた以前の臨床試験において、ポリシアル酸に対する抗体は、CDCを媒介することができなかった。したがって、本発明者らは、これら4種類の標的抗原の選択について、polySAに対する抗体がそれ以外の3種類の抗原に対する抗体によって媒介されるCDCを妨害しないことを、補体依存性細胞傷害アッセイによって確認したいと考えた。
【００３８】
癌細胞が補体依存性細胞傷害を逃れる機序は、いくつか記述されている(20〜22)。C3コンバターゼのレベルで干渉するCD55および膜侵襲複合体の構築を妨害するCD59は、補体活性化抵抗因子のうち最も広範に研究されている。腫瘍細胞は、抗原がムチンなどの長い分子上にあるときには、細胞表面における強力なFACS反応性にもかかわらずCDCを回避できることが報告された。これは、モノクローナル抗体およびワクチンによって誘導されたMUC1に対する抗体を用いて最初に検出されたが(23)、最近、ポリシアル酸に対する抗体を用いても検出された(17)。CDC耐性は、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)、サルモネラ・モンテビデオ(Salmonella monte video)、スダミナ・エルジノーサ(sudamina aeruginosa)および長いリポ多糖鎖を有する他の「滑面」菌種に対して記述されたCDC耐性(18、19)と同様に、補体活性化が起こる細胞表面からの距離が遠いためと考えられた。補体活性化は、一連の酵素活性を惹起し、その結果、C3bの結合をもたらし、最終的にC5b-9タンパク質補体膜侵襲複合体(MAC)を細胞膜に挿入して細孔を形成する。MACの寸法は、100×150オングストロームである(25)。NCAM C末端細胞外サブユニットおよびフランキング配列の分子量は100KDを超えているため(24)、ポリシアル酸部分が細胞膜から100オングストローム以上離れて始まる可能性が高くなっている。補体活性化が細胞膜から100オングストロームよりも遠い部位において起こる場合には、膜侵襲複合体は形成されず、形成されたとしても細胞膜に達せず、いくつかの血清タンパク質が、形成しつつある膜侵襲複合体を素早く不活性化することになる(25)。この場合でも、C3によって媒介される炎症およびオプソニン作用は所定の位置に残る。
【００３９】
本明細書に示す研究においては、mAb5A5はやはり高反応性IgM抗体であり、10種類のSCLC細胞系のうち6種類に対してFACSによる強力な細胞表面反応性を生じることが判明したが、細胞系に対する補体細胞傷害性を媒介することはできなかった。これは、ワクチン接種後のSCLC患者から得られた血清を用いた本発明者らの以前の知見と一致した(17)。しかし、mAb5A5を他のモノクローナル抗体のプールに添加すると、CDCの減少は検出されず、細胞表面脂質二重層とより密接に会合している抗原に結合している抗体によって媒介されるCDCに対して立体障害または他の障害のないことが示された。まとめると、CDCアッセイによって、FACSによって得られたものと極めて類似した結果が得られた。いずれか1種類のmAbを用いて30%を超える細胞傷害性を示す細胞系の数は、単一のmAbを用いた0〜5種類の細胞系から、抗体プールを用いた10種類の細胞系のうちの9種類にまで増加した。
【００４０】
結腸および胃のほとんどの癌はCD55を発現することが知られているが、CD55は、今まで記述された2種類のSCLC検体のどちらでも見出されておらず(27、28)、SCLC細胞系の0/4(29)または29%(30)において見られ、10種類のSCLC細胞系のうち3種類における強いCD55発現の本発明者らの知見と一致した。CD55は、CDCに耐性がある1種類のSCLCにおいては、最小限でしか発現されなかった。したがって、CD55によって媒介されるCDC抵抗が、本発明者らが免疫しようとするSCLC患者における主要な問題である可能性はありそうにないが、原発性および転移性SCLC生検材料を用いたさらなる研究によってこれを確認する必要がある。CD59は10種類の細胞系のうち8種類で強く発現されたが、この発現とCDCとの間には明確な相関はなかった。(CD55を弱く発現し、CD59を強く発現した)細胞系H345はピークCDCが12%であったが、FACSによって99%の陽性細胞を示した。しかし、CD59に対するmAbが阻害レベルで存在する場合には、CDCは12%から72%に増加した。これは、CD59によって膜侵襲複合体レベルにおいてのみ阻害されている4種類のmAbのプールによる補体活性化を示している。これは、4種類の抗体のプールを用いて、H345までも含めて、試験された全10種類のSCLC細胞系が、補体活性化によって媒介されるもの(炎症およびオプソニン作用)などの、抗体によって媒介されるエフェクター機構の良好な標的になることを強く示唆する。これらの結果は、4種類の細胞表面抗原フコシル化GM1、GM2、globo Hおよびポリシアル酸を含有するワクチンは、SCLCの大多数に対する抗体を誘導するのに十分なはずであり、これらの抗体は、腫瘍細胞の破壊を媒介することができるはずであることを示す。
【００４１】
参考文献
2006522828.tif 000005
2006522828.tif 000006
2006522828.tif 000007
2006522828.tif 000008
2006522828.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、SCLC細胞表面において発現される糖脂質および糖タンパク質抗原を示す図である。
【図２】図２は、PGNX(GM2)、F12(フコシルGM1)、VK9(globo H)および5A5(ポリシアル酸)を含む4種類のmAbのプールとの混合後の10種類のSCLC細胞系に対するIgM FACS結果を示すグラフである。
【図３】図３は、抗CD59 mAbが、H345のプール2によって媒介されるCDCを大きく増加させることを示すグラフである。
【図１】
2006522828.tif 000010
【図２】
2006522828.tif 000011
【図３】
2006522828.tif 000012
【国際調査報告】
2006522828.tif 000013
2006522828.tif 000014