(57)【要約】ＲＮａｓｅの分解からＲＮＡを保護し、溶液中のＲＮａｓｅを失活するための方法が開示される。本発明は、保存中にＲＮＡを保護し、定量ＰＣＲ反応を実行し、又はｃＤＮＡを調製するための方法を含む。本方法は、還元剤を含むか、又は含まない溶液中のＲＮａｓｅ阻害剤と、ＲＮａｓｅを失活させる高熱との組合せを含む。
2006524504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボヌクレアーゼによる酵素分解からＲＮＡを保護するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＲＮＡを含有するか、又は後にＲＮＡが添加される第一溶液に対して、混合液を生じるように、還元剤を含むか、又は含まないバッファー中に分配されたリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含む第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するように十分な時間において約５０℃ほどの温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱し、それによって、前記混合液に存在するか、又は後に該混合液に添加されるＲＮＡをリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護するステップと、
を含み、前記第二溶液中のリボヌクレアーゼ阻害タンパク質の含有量は、リボヌクレアーゼによる酵素分解からＲＮＡを保護するために十分であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）で、混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｂ）で、前記混合液はＲＮＡを含まず、さらに前記混合液は約９０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ及びリボヌクレアーゼＩによる酵素分解からＲＮＡを保護するための方法であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡを含有し、リボヌクレアーゼを含有していると疑われる第一溶液でリボヌクレアーゼを失活する方法であって、該方法は、
（ａ）前記第一溶液に対して、混合液を生じるために、還元剤を含むか、又は含まないバッファー中に含まれるリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するように十分な時間において少なくとも約５０℃の温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱し、それによって、前記第一溶液に存在するリボヌクレアーゼが失活されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するように十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）で、混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一溶液に存在するリボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ及びリボヌクレアーゼＩの失活方法であることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リボヌクレアーゼによる酵素分解からＲＮＡを保護する状況下でＲＮＡを保存する方法であって、該方法は、
（ａ）分離したＲＮＡを含有するか、又は分離したＲＮＡを後に添加される第一溶液に対して、混合液を生じるように、還元剤を含むか、又は含まないバッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するために十分な時間において少なくとも約５０℃の温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱するステップと、
（ｃ）前記混合液を冷却するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ｂ）で、前記混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｂ）で、前記混合液はＲＮＡを含まず、さらに前記混合液は約９０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＲＴ−ＰＣＲを実行する方法であって、該方法は、
（ａ）サーマルサイクル反応を受ける前に、ＲＮＡを含有するか、又は後にＲＮＡを添加されるＲＴ−ＰＣＲ反応液に対して、混合液を生じるように、還元剤を含むか、又は含まないバッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含む溶液量を添加するステップと、
（ｂ）ＲＮＡが存在しない場合に前記ステップ（ａ）の混合液に対してＲＮＡテンプレートを添加するステップと、
を含み、
前記添加される溶液量は、第一のサーマルサイクル反応段階で酵素分解から前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液に存在するＲＮＡを保護するために十分量であり、
前記混合液のＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に存在するリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護され、さらにリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ａ）で、前記バッファーは、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ａ）の後であり、かつステップ（ｂ）に先立って、混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ａ）で、前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＲＮＡを含有せず、前記ステップ（ａ）の後であり、かつステップ（ｂ）に先立って、前記混合液は少なくとも約９０℃の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＲＴ−ＰＣＲを実行する方法であって、該方法は、
（ａ）ＲＴ−ＰＣＲ試薬の混合液に対して、第二溶液を生じるように、還元剤を含むか、又は含まないバッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含む第一溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記第二溶液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するように十分な時間において少なくとも約５５℃の温度まで前記第二溶液混合液を加熱するステップと、
（ｃ）ＲＮＡの混合液を生じるように前記第二溶液に対してＲＮＡを添加するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）の前記ＲＮＡ混合液においてＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、それによって、前記ＲＮＡ混合液中のＲＮＡは前記第二溶液に存在するリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護され、かつ、さらに前記混合液中のＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ反応中にリボヌクレアーゼから保護されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ａ）で、前記バッファーは、少なくとも５０μＭＤＴＴの前記第二溶液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｂ）で、前記第二溶液は、約７０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｂ）で、前記第二溶液は、約９０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項２６乃至２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項２６乃至２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼを失活する方法であって、該方法は、
（ａ）原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼの含有が疑われる第一溶液に対して、混合液を生じるように、還元剤を含むか、又は含まないバッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在する原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼ活性を阻害するために十分な時間において少なくとも約５５℃の温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱し、それによって、前記第一溶液に存在する原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼが失活されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項３２又は３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ａ）で、第一溶液はＥ．ｃｏｌｉのリボヌクレアーゼの含有が疑われ、前記ステップ（ｂ）で、前記混合液に存在するＥ．ｃｏｌｉのリボヌクレアーゼ活性を阻害するために十分な時間で加熱されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）による分解からリボ核酸（ＲＮＡ）を保護する方法を導く。より詳細には、本発明は、ＲＮＡを活用する研究プロトコール（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＴ−ＰＣＲなど）で使用する試薬に存在するＲＮａｓｅｓからＲＮＡを保護するための方法と同様に、ＲＮＡの保存中にＲＮａｓｅｓからＲＮＡを保護するための方法を含む。さらに、本発明はＲＴ−ＰＣＲの感度を高める方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸（ＲＮＡ）は、ほとんどの生物のシステムにおいて非常に重要な要素である。その生物学的な役割は、核からの遺伝コードを運ぶメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、核酸のメッセージをポリペプチドに翻訳するように支援するリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、及びメッセンジャーＲＮＡの解読を支援ように機能するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む。さらに、ＲＮＡは、酵素的機能を有する、干渉ＲＮＡ及び調節的なリボザイムなどの他の調節機能の宿主において、認識させるように開始する。数多のウィルスにおいて、ＲＮＡはウィルス自身の核となる遺伝的なメッセージを運ぶ。
【０００３】
生物学的な作用におけるＲＮＡの重要性のため、ＲＮＡ生成及び分解はｉｎ  ｖｉｖｏで厳しく制御されなければならない。一方で、ＤＮＡは全く安定しており、それは二重鎖分子の影響によるものであり、ＲＮＡ（一本鎖分子）は酵素的な分解に対して非常に弱い。酵素的な分解は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）と呼ばれるユビキタスクラスの酵素によって実行される。
【０００４】
ＲＮａｓｅｓは非常にロバストな酵素である。ほとんどのタンパク質と違って、ＲＮａｓｅｓは、極度のｐＨまたは高温のいずれによっても分解するのが非常に困難である。ＲＮａｓｅｓが非常にロバストとなるように進化したいくつかの理論がある。それらは、縮重ＲＮＡからタンパク質に翻訳する結果の保護と、細胞内ＲＮＡの調節とを含む。加えて、ＲＮａｓｅｓは一時的に高温によって変性できるが、高温だけによるＲＮａｓｅｓの変性が、つまり室温でのＲＮａｓｅｓからＲＮＡを保護するための効果的な方法でないように、いくつかのＲＮａｓｅｓは冷却で元に戻る（この現象を可逆的熱変性と呼ぶ）。
【０００５】
ＲＮＡは分子生物学において非常に重要なツールである。真核生物ゲノムＤＮＡのイントロンの存在により、ゲノムＤＮＡに存在する遺伝的なメッセージは、直接的にタンパク質に翻訳できない。したがって、ゲノムＤＮＡは、ライブラリーの作成、クローニング、プラスミドまたはベクターの細胞に遺伝子を導入する場合の第二の選択である。ライブラリーに最適なソースは、相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡからＤＮＡに逆転写して直接的に作成される。このプロセスは、一般的に“スプライシング”と呼ばれる、イントロンの除去を経る、ｍＲＮＡの分離を必要とする。スプライシングの過程で、非翻訳のイントロンは、ＲＮＡがタンパク質に翻訳される以前に除去される。デオキシヌクレチド基（ＲＮＡに見られるウラシルに代わって、チミンも含む）の存在下で逆転写酵素を使用することによって、ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡが合成される。
【０００６】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼを使用する一本鎖ＤＮＡの転写の複製は、ｍＲＮＡテンプレートの配列を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。さらに、ゲノムＤＮＡと同様にｃＤＮＡは非常に安定であり、分子生物学的な操作におけるｃＤＮＡの活用性は多大である。ｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用する増幅、クローニングで使用するためのｃＤＮＡライブラリーの作製を含む、様々な目的で使用できる。ｃＤＮＡを合成することによって、研究者は、生物に導入する場合に、機能的なタンパク質に直接的に翻訳できる、合成遺伝子を作製できる。イントロンが存在する理由で、この能力は真核生物のゲノムＤＮＡを使用して不可能である。適切なタンパク質を生じるために、イントロンは、ゲノムシークエンスから適切にスプライスされなければならない。
【０００７】
ｃＤＮＡの合成は、ＲＮＡのための単に試験的な使用ではない。また、ＲＮＡベクター（例えば、非特許文献１参照）及びＲＮＡプローブなど他の使用は、ＲＮａｓｅｓによって悪影響を受ける。したがって、ここ数年の重要な研究努力は、ＲＮａｓｅｓからＲＮＡを保護する方法を開発することである。概略すると、分析のためにＲＮＡを保存する必要性があったので、多くの異なる方法がＲＮａｓｅ活性を阻害するために用いられてきた。サンプルから除去されるＲＮａｓｅ活性は、ＲＮＡとのＲＮａｓｅの共同精製によるか、またはサンプルを処理する際に使用する試薬からサンプルに導入されてよい。
【０００８】
ＲＮａｓｅ活性を阻害するための幾つかの方法が開発されている。それらの方法は、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）の使用、ＲＮａｓｅ阻害タンパク質の使用、ＲＮａｓｅに優先的に結合するリボース化合物の使用を含む。
【０００９】
ＲＮａｓｅ活性を阻害する一つの方法は、化学剤ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）の使用を含む。ＤＥＰＣは、酵素を失活するようにＲＮａｓｅと反応する。しかしながら、このタイプの化学的な存在の使用は、常に便利ではなく、可能でもない。（例えば、可逆的な化学反応により、ＴｒｉｓとＭＯＰＳの溶液は、ＤＥＰＣと共に処理できない。）ＤＥＰＣは、ＲＮａｓｅの多数の異なる残基と反応し、ＲＮａｓｅ酵素の失活を導く。例えば、ＲＮａｓｅＡ（ＥＣ３．２．２７．５）において、２つのヒスチジン残基（Ｈｉｓ−１２及びＨｉｓ−１１９）は、酵素の触媒活性において重要である。ＤＥＰＣはＲＮａｓｅＡのＨｉｓ−１２残基と反応して、カルバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）タイプの結合を生じ、これによって、この残基がＲＮＡとの反応において利用できなくさせる。（例えば、非特許文献２及び３参照。）他のタイプのＲＮａｓｅｓにおいて、ＤＥＰＣは、リジンのε−アミノ基と、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基と、分子内及び分子間で妨害し、ＲＮａｓｅｓを失活する。ＤＥＰＣとの処理が効果的である一方、その使用は非常に煩雑である。ＤＥＰＣはまた、疑わしい発癌物質である。
【００１０】
ＲＮａｓｅｓに対する保護としてＤＥＰＣを使用する場合、ＲＮＡと接触する試薬、メガネ、電気泳動装置及び他の実験器具はＤＥＰＣで処理した水で洗浄し、ＲＮａｓｅｓの分解を促進するように３７℃で数時間インキュベーションする。次いで、ＤＥＰＣを破壊するために、処理された器具は約３０分間オートクレーブする。加えて、保存中にＲＮＡを保護するように、ＲＮＡ溶液はＤＥＰＣで処理した水で保存される。ＲＮＡを保存するこの方法が使用される場合、ＤＥＰＣは、ＲＮＡを使用する前に溶液から除去される必要がある。
【００１１】
ＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、膵臓のＲＮａｓｅを阻害したタンパク質として最初に認識された。このＲＮａｓｅ阻害タンパク質の系は識別され、胎盤エキスから精製された。（例えば、特許文献４参照。）結果として、ＲＮａｓｅ阻害剤の遺伝子は、胎盤からクローニングされ、組換え体ＲＮａｓｅ阻害タンパク質が開発された。（例えば、特許文献１参照。）それらの阻害タンパク質は、阻害剤とＲＮａｓｅとの間で非常に強固な１：１の複合体を形成することによって力学的に機能する。
【００１２】
ブタ及びラットと同様に、ヒトの胎盤の阻害剤をコード化する遺伝子がクローニングされ、配列の解読が行なわれた。この系の数多の要素における三次元構造が決定された。（例えば、非特許文献５参照。）この系のＲＮａｓｅ阻害タンパク質の特徴の比較が発行された。（例えば、非特許文献６、７参照。）分子生物学の応用におけるそれら阻害タンパク質の有用性は、ある程度それらの特徴に帰する。特に、阻害タンパク質のヒトの胎盤の形態は、（１）酵素のＲＮａｓｅＡ、Ｂ及びＣ系のＲＮａｓｅを阻害し、（２）約５５℃の水溶液で熱的に失活されるように、（３）Ｅ．ｃｏｌｉからの主要なＲＮａｓｅ（通常、ＲＮａｓｅＩという）または植物に由来するＲＮａｓｅを阻害することができないことが報告されている。（例えば、非特許文献８、９参照。）ＲＮａｓｅが阻害剤と複合体となる場合、複合体はＲＮａｓｅ活性を全く有しない。しかしながら、特許文献９で報告されているように、ＲＮａｓｅは阻害剤によって永久的に失活されない。ある条件下で阻害剤が阻害剤とＲＮａｓｅとの複合体から開放される場合、自由になったＲＮａｓｅはＲＮＡを分解する能力を回復する。
【００１３】
天然源からの分離または組換手段によってなされた、ヒトの胎盤からのＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、長年にわたって市販されて入手可能である。この間、ＲＴ−ＰＣＲなどの特定の分子生物学の応用においてＲＮＡの分解を防ぐ際に阻害剤が効果的でない報告がされている。これは、ＲＴ−ＰＣＲ反応で使用される温度における阻害タンパク質の脆弱な熱安定性によると報告している。実際、ＲＮａｓｅ阻害剤を添加することを提案する上記の文献は、ＲＴ−ＰＣＲ実験の成功的な完遂に悪影響を及ぼし得る。要するに、供給されたＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、ＲＮａｓｅに対して複合される阻害タンパク質の重要な分画をすでに有することを非特許文献９は提案している。さらに、このＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ阻害剤を含有する溶液の加熱における活性な形態から放出され得る。非特許文献９は、放出される潜在的に活性なＲＮａｓｅが実験におけるＲＮＡテンプレートを破壊し得ると推測し、したがって、実験の失敗に至る。
【特許文献１】米国特許第５，５５２，３０２号
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３３：３２７−３３８）
【非特許文献２】Ｆｉｎｄｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６１）  Ｎａｔｕｒｅ  １９０：７８１−７８４
【非特許文献３】Ｒａｉｎｅｓ  （１９９８）  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  ９８：１０４５−１０６６．
【非特許文献４】Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：５９０４−５９１０．
【非特許文献５】Ｋｏｂｅ  ＆  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ  （１９９６）  “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ，”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６４（５）：１０２８−１０４３．
【非特許文献６】Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：５９０４−５９１０
【非特許文献７】Ｂｕｒｔｏｎ  ＆  Ｆｕｃｃｉ  （１９８２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  １９：３７２−３７９
【非特許文献８】“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ９．３，”  ａ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），
【非特許文献９】Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．’ｓ  （Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘａｓ）  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ａｍｂｉｏｎ’ｓ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＲＮａｓｅからＲＮＡを防ぐことの難しさにより、ＲＮＡの保存及びＲＮＡの操作中において、ＲＮａｓｅの分解からＲＮＡを保護する良好な手法を必要としているが、満足したものではなかった。実施が簡素で、有害な試薬を使用するべきでない手法を必要とする。介在して追加的な精製ステップがなく、ＲＮＡの酵素的な分解を気にすることなく、（プロトコールから別のプロトコールへと移る際に）直接的に使用できる、ＲＮａｓｅから保護されたＲＮＡを生じる手法を必要とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは驚いたことに、哺乳類（ヒトの胎盤、ラットなど、天然または組換え体）からのＲＮａｓｅ阻害タンパク質が、特定の化学的な条件で組み合わせできることを発見し、組み合わせがＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＲＴ−ＰＣＲなどの特に高温度の応用で阻害剤を効果的にさせることを発見した（Ｊｏｅ：それらの特定の化学的な試薬、つまりＤＴＴはもはや必要ではなく、熱だけが作用する）。特に、ＲＮａｓｅの含有が疑わしいサンプルを含むＲＮＡ阻害剤の溶液を加熱する場合、反応におけるＲＮａｓｅの阻害となるだけでなく、ＲＮａｓｅ阻害剤を失活する状況下の溶液処理後の活性ＲＮａｓｅの放出がない。ＲＮａｓｅ阻害剤の溶液は如何なる状況（ＲＮＡ阻害剤を失活し、潜在的に活性なＲＮａｓｅを実験溶液に放出する）でも加熱されるべきでないことを上述の文献が示す限り、本発明は胎盤由来のＲＮＡ阻害剤が用いられる従来の手法と対立する。
【００１６】
本発明の別の特異的な態様は、本発明のＲＮａｓｅ阻害剤溶液が加熱される場合、溶液は、通常、ＲＮａｓｅ阻害剤単独、又は添加した試薬単独では阻害されないＲＮａｓｅを失活可能であることである。作用の特定方法に限定されないが、明らかにＲＮａｓｅを失活されることができる範囲のこの増加は、ＲＮａｓｅ阻害剤と添加試薬または熱との間の相乗の結果である。組み合わせがその部分の合計よりも大きいと、その組み合わせは、阻害剤又は添加試薬によっては失活されない、ＲＮａｓｅを失活する。最終結果は、本願明細書に記載されて、請求される本発明が、溶液の加熱の前後で哺乳類のＲＮａｓｅに対するＲＮＡの保護となり、さらに穏やかに溶液を加熱した後に細菌及び植物源に由来するＲＮａｓｅに対する保護を提供することである。
【００１７】
本発明の別の特異的な態様は、反応混合物が還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が欠けている時でさえ、本発明のＲＮａｓｅ阻害剤の溶液がＲＮａｓｅを失活可能にすることである。従来技術において、ジチオスレイトール又は同様の機能の還元剤は、必須の試薬とみなされる。しかしながら、本発明者らは、この種の還元剤は、本願明細書において記載されている阻害剤を使用してＲＮａｓｅを失活するために、絶対に必要でないと決定した。
【００１８】
したがって、本発明の主な目的は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ分解から保護する方法を提供することである。本発明の第一の実施態様は、ＲＮＡをＲＮａｓｅによる酵素分解から保護するための方法を導く。この方法は、ＲＮＡを含有する、又は後にＲＮＡが添加される第一溶液に、ＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質と、ＤＴＴなどの還元剤（例えば、少なくとも約５０μＭ）を含むか又は含まないバッファー量を含有する第二溶液を添加することからなる。第二溶液のＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質の容量は、混合液に存在するＲＮａｓｅによる酵素分解からＲＮＡを保護するために十分である。次いで、混合液に存在するＲＮａｓｅ活性を阻害するために十分な時間において約５０℃程度の温度まで加熱する。代替となる実施態様において、混合液は６５℃より高い温度まで加熱される。
【００１９】
この手法において、混合液に存在するか、または後に混合液に加えられるＲＮＡは、一般的に、ＲＮａｓｅ、特に哺乳類のＲＮａｓｅによる酵素分解から保護される。ＲＮＡが後に混合液に添加される場合、混合液は、少なくとも約９０℃まで加熱できる。
【００２０】
好ましい方法は、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＢ、ＲＮａｓｅＣ及びＲＮａｓｅＩによる酵素分解からＲＮＡを保護する。
【００２１】
ＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含有するバッファーは、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴなどの還元剤を含むことができるし、含まないこともできる。ＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含有するバッファーが還元剤を含む場合、好ましい還元剤はＤＴＴである。ＤＴＴを含有するバッファーにおいて、好ましくは、混合液のＤＴＴの終濃度が少なくとも約５０μＭＤＴＴであるように、バッファーは十分なＤＴＴを含む。同様に、バッファーは追加的なＤＴＴを含むことができる。例えば、混合液のＤＴＴの終濃度が少なくとも約１００μＭＤＴＴであるか、または少なくとも１．０ｍＭＤＴＴであるように、バッファーは十分なＤＴＴを含むことができる。
【００２２】
好ましくは、ＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤または組換え体のヒトの胎盤の供給源に由来する。そのようなＲＮａｓｅ阻害剤は、米国、ウィスコンシン州、マジソンのプロメガコーポレーションなどから市販されており入手可能である。
【００２３】
本発明の利点を得るために、混合液は長期間加熱される必要はない。一般的に、５０℃かそれより高い温度で、約２０秒間が十分である。（６５℃よりも高い温度で使用してもよい。）当然のこととして、混合液は、分単位（ＲＮＡが存在する場合）から時間単位（ＲＮＡが後に添加される場合）まで、長時間において加熱できる。例えば、約７０℃かそれより高い温度で約１分間加熱することは、多くタイプの実験において十分である。
【００２４】
本発明の第二の実施態様は、ＲＮＡを含むことが知られているか、ＲＮａｓｅを含むことが疑われる第一溶液のＲＮａｓｅを失活する方法を導く。この第二の実施態様は、混合液を生じるために、第一溶液に還元剤（既に記載のような）を含むか又は含まないバッファーに存在するＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含む第二溶液を添加して、次いで、混合液に存在するＲＮａｓｅの活性を阻害するように、混合液を少なくとも約５０℃（または、少なくとも約７０℃）で十分な時間加熱することを含む。これは、第一溶液に存在するＲＮａｓｅが失活される結果となる。溶液が２０秒間から５分間において加熱されることが好ましい。
【００２５】
本発明の第三の実施態様は、ＲＮａｓｅによる酵素分解からＲＮＡを保護する状況下でＲＮＡを保存する方法を導く。第三の実施態様は、混合液を生じるために、分離したＲＮＡを含有するか、又は分離したＲＮＡを後に加える第一溶液に、還元剤を含むか又は含まないバッファー中のＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含む第二溶液を添加することを含む。次いで、混合液は、混合液に存在するＲＮａｓｅの活性を阻害するために約７０℃程度で十分な時間において加熱され、次いで、混合液は冷却されて適切な容器に保存される。
【００２６】
本発明のさらに別の実施態様は、ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを実行する方法を導く。本発明における、この第四の実施態様は、混合液を生じるために、第一に、サーマルサイクルを受けるに先立って、ＲＮＡを含有するＲＴ−ＰＣＲ反応溶液に対して、還元剤を含むか又は含まないバッファー中のＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含有する溶液量を添加することを含む。添加される溶液量は、第一のサーマルサイクル反応中の酵素分解からＲＴ−ＰＣＲ反応液に存在するＲＮＡを防ぐために十分な量である。次いで、ＲＮＡが混合液に存在しない場合、ＲＮＡテンプレートを混合液に添加する。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ反応は混合液に導かれ、ここで混合液中のＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液に存在するＲＮａｓｅによる酵素的な分解から保護され、さらに、第一のサーマルサイクル反応中、及びＲＴ−ＰＣＲ反応を通して、ＲＮａｓｅによる酵素分解から保護される。
【００２７】
この実施態様の変化は、第二溶液を生じるために、ＲＴ−ＰＣＲ試薬の混合液に対して、バッファー中のＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含有する第一溶液を添加することを含む。次いで、第二溶液は、第二溶液に存在するＲＮａｓｅ活性を阻害するように十分な時間において少なくとも約５０℃（または、少なくとも約７０℃）まで加熱される。次いで、ＲＮＡは、ＲＮＡ混合液を生じるように第二溶液に添加される。最後に、ＲＴ−ＰＣＲ反応はＲＮＡ混合液でなされ、ここでＲＮＡ混合液中のＲＮＡは、第二溶液に存在するＲＮａｓｅによる酵素分解から保護され、かつ、混合液中のＲＮＡはさらに、ＲＴ−ＰＣＲ反応中のＲＮａｓｅから保護される。
【００２８】
本発明のさらなる実施態様は、ＲＮａｓｅＩを失活する方法を導く。本発明のこの実施態様は、混合液を生じるために、ＲＮａｓｅＩを含有することが疑われる第一溶液に対して、還元剤を含むか又は含まないバッファー中にＲＮａｓｅ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加し、次いで、混合液に存在するＲＮａｓｅＩ活性を阻害するために十分な時間において少なくとも約７０℃の温度で混合液を加熱することを含み、それによって、第一溶液に存在するＲＮａｓｅＩは失活される。
【００２９】
ここに開示した実施態様において、本方法で使用されるＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤又は組換え体のヒトの胎盤の供給源に由来する。
【００３０】
本発明の目的及び利点は、添付図と共になる本発明の好ましい実施態様の下記の詳細な記載から、より明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、ＲＮａｓｅによる分解からＲＮＡを保護するための方法を導く。本発明はさらに、ＲＮａｓｅ活性がない保存溶液でＲＮＡを保存する方法を導く。
【００３２】
略語及び定義
ここで使用されるように、限定されるものではないが、用語「還元剤」は、ジチオスレイトールおよびメルカプトエタノールを含む、いかなる還元剤も意味する。
【００３３】
ここで使用されるように、用語「ＲＮＡ」は限定されるものではないが、いかなる供給願からのＲＮＡを意味し、原核細胞ＲＮＡ、真核生物ＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡおよび転写反応からのＲＮＡを含む。
【００３４】
ここで使用されるように、条件のない用語「ＲＮａｓｅ」は限定されるものではないがいかなる供給源からのＲＮａｓｅを意味し、原核細胞および真核生物ＲＮａｓｅを含む。ＲＮａｓｅは、ほとんどの生物にあり、かつ、多くの器官及び体液に存在する。下記に限定するものではないが、ＲＮａｓｅの例は、特に、細菌のＲＮａｓｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｐ、ＰＨ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、ＢＮ、Ｅ及びＭと同様に、ＲＮａｓｅＡ、Ｂ及びＣ（哺乳類、例えば、ウシ膵臓）、ＲＮａｓｅ１（例えば、ヒトの膵臓）、ＲＮａｓｅ２（好酸球由来の神経毒）、ＲＮａｓｅ３（好酸球陽イオン・タンパク質）、ＲＮａｓｅ４及びＲＮａｓｅ５である。これらはすべて、ＲＮＡを分解する主要な活性を共有する。ＲＮａｓｅに関するより広範囲な議論のために、例えば、Ｄ’Ａｌｌｅｓｉｏ  ＆  Ｒｉｏｒｄａｎ  “Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９７）；  Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ  ＆  Ｌｉｂｏｎａｔｉ  （１９９７）  “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ：  Ｍａｉｎ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  ＲＮａｓｅｓ，”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０４：１−５；及びＮｉｃｈｏｌｓｏｎ  （１９９９）  “Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２３：３７１−３９０を参照のこと。
【００３５】
ここで使用されるように、用語「ＲＮａｓｅ阻害タンパク質」または「ＲＮａｓｅ阻害剤」は、ＲＮａｓｅの活性を阻害する哺乳類の由来のタンパク質を意味する。本発明において使用するための好ましいＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、米国ウィスコンシン州、マジソンのプロメガコーポレーションによって製造される。連邦政府によって登録された商標「ＲＮａｓｉｎ」登録のブランドＲＮａｓｅ阻害剤（米国商標登録番号Ｎｏ．１，２３７，８８４）の下で、天然のタンパク質及び組換えタンパク質として、ヒトの胎盤に由来するＲＮａｓｅ阻害タンパク質をプロメガは販売している。ＲＮａｓｉｎブランドのＲＮａｓｅ阻害剤での追加的な情報において、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＆  Ｍｏｏｒｅ  （１９８２）  Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  Ｖｏｌ．  ＸＶ，  Ｐａｒｔ  Ｂ；  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  Ｗｉｌｓｏｎ，  ＆  Ｍｏｏｒｅ，  （１９７７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：５９０４；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：２１９；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，  ２２５を参照のこと。また、米国特許第４，９６６，９６４号、５，０１９，５５６号及び５，２６６，６８７号を参照のこと。
【００３６】
本発明において使用するための別の好ましいＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」登録商標のＲＮａｓｅ阻害剤として本明細書に示される。このＲＮａｓｅ阻害タンパク質は、ラットの肺に由来して、大腸菌において合成される組換えタンパク質である。このタンパク質のクローニングの記載において、ラットの肺のｃＤＮＡライブラリーから分離される、ラットのリボヌクレアーゼ阻害剤のｃＤＮＡクローニング及びシークエンスを議論する、Ｋａｗａｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１２９：  ３３５−３３８を参照のこと。このタンパク質は、市販されており、米国ウィスコンシン州、マジソンのプロメガコーポレーションから購入できる。また、このラット由来のＲＮａｓｅ阻害剤をコードするクローニングされたＲＮＡは、市販されており、オリジーンテクノロジーズインク（米国メリーランド州ロックビル）から入手できる。
【００３７】
本明細書において記載されている本発明は、ＲＮＡを使用するかまたは必要とする、種々の分子生物学的プロトコールの使用において適切である。このようなプロトコールの宿主の概要において、“ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，”  Ｅ．  Ｆａｒｒｅｌｌ，  Ｊｒ．，  ｅｄｉｔｏｒ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９８を参照すること。
【００３８】
以下のプライマーが実施例で使用される。
【００３９】
Ｆ−ＣＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＡＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  １）：  ルシフェラーゼＲＴ−ＰＣＲリバースプライマー
Ｆ−ＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ２）：  フォワードｌｕｃ  ＲＴ−ＰＣＲ
Ｆ−ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＣＣＡ  （ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ３）：  ダウンストリームＫａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ
Ｆ−ＴＴＧＧＧＣＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ４）：  アップストリームＫａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  ２
ＨＯ−ＣＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＡＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ５）：  ルシフェラーゼＲＴ−ＰＣＲ  リバースプライマー
ＨＯ−ＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ．  ＮＯ：  ６）：  フォワードプライマーｌｕｃ  ＲＴ−ＰＣＲ
本発明の典型的なバージョンにおいて、ＲＮＡを含有する第一溶液は、バッファー中にＲＮａｓｅ阻害剤（例えば、「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」登録商標のＲＮａｓｅ阻害剤（プロメガ））を含有する第二溶液に第一溶液を加えることによって、ＲＮａｓｅによる分解から保護される。一般的に、バッファーは、還元剤を含むかまたは含まない。還元剤がバッファーに存在する場合、ＤＴＴが好ましく、濃度は少なくとも約５０μＭ（好ましくは）である。高濃度のＤＴＴ、例えば、少なくとも約１００μＭや少なくとも約１．０ｍＭＤＴＴが使用されてよい。特に好ましい実施態様において、バッファーは、ＤＴＴを含んでもまた含まなくとも、プロメガバッファーＢ又はプロメガ保存バッファーを含む。このように、一つの好ましいバッファーは、６  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５），  ６  ｍＭ  ＭｇＣｌ;２，及び５０  ｍＭ  ＮａＣｌを含むが、還元剤は含まない。別の好ましいバッファーは、２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．６），  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ，及び５０％  （ｖ／ｖ）  ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むが、還元剤は含まない。
【００４０】
ＲＮａｓｅ阻害剤及びバッファーを添加した後、溶液は少なくとも約５０℃、好ましくは少なくとも約７０℃までＲＮａｓｅを失活するために十分な時間、一般的には約２０秒から５分以上加熱される。溶液が高温である時間は、ある程度は、保証されているプロトコールに依存する。ＲＮａｓｅの失活は哺乳類のＲＮａｓｅにおいて基本的に直ちに起こり、加熱はより丈夫なＲＮａｓｅを停止させるのに役立つ。ＲＮＡが混合液に未だに存在しない場合、少なくとも９０℃ほど高い温度で１０分間以上加熱されてよい。この処理によって、加熱ステップの前後で、混合液はＲＮａｓｅを含まない。この方法の明白な利点は、溶液のＲＮＡが可逆的な変性の恐れなしに、長期間においてＲＮａｓｅから保護されることである。
【００４１】
本発明で用いられることができるＲＮａｓｅ阻害剤としては、ブタのＲＮａｓｅ阻害剤、ラットのＲＮａｓｅ阻害剤、ヒトの胎盤のＲＮａｓｅ阻害剤及び組換えＲＮａｓｅ阻害剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。ここに列記したものは典型的なものである。プロメガコーポレーションを含み、ＲＮａｓｅ阻害剤の供給元は幾つかある。
【００４２】
本発明の別の実施態様は、保存中にＲＮａｓｅからＲＮＡを保護する方法である。この実施態様において、ＲＮＡを含有する溶液は、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を気にすることなく、長期間（例えば、９０日間以上）にわたって保存できる。ＲＮＡを保護するために、「ＲＮａｓｉｎ」ブランドの阻害剤などのＲＮａｓｅ阻害剤は、還元剤の存在に関係なく、ＲＮＡを含有する溶液に添加される。次いで、溶液は、少なくとも約２０秒間にわたって少なくとも約５０℃まで加熱される。次いで、混合液は適切な容器に置かれ、冷却される。そのように処理された後、ＲＮＡ溶液は、未だＲＮａｓｅから保護されている長期間（つまり、少なくとも１時間、頻繁には長時間、例えば、９０日以上）にわたって室温で保存できる。この実施態様の明白な利点は、処理されたＲＮＡ溶液がＲＮａｓｅから保護するために冷却して保存する必要がないことである。冷却温度（例えば、４℃又は−２０℃）が温度に依存するＲＮＡ分解を軽減するのを支援することを当業者は理解するであろう。
【００４３】
本発明はまた、一般的な化学反応かつ酵素反応中、特に、ＲＴ−ＰＣＲに基づくプロトコールにおいて、ＲＮＡを保護する方法を含む。本発明のこの実施態様において、ＲＮＡは予め分離されて、開示された本発明によってＲＮａｓｅからすでに保護されている。しかしながら、当業者は、ＲＮＡを含有する溶液にいかなる試薬を添加することが阻害されていないＲＮａｓｅの導入の危険性を冒すことを認識する。このような例において、第一の反応ステップが実行される以前に、ＲＮａｓｅ阻害剤が反応混合液に添加できる。ＲＴ−ＰＣＲに基づく反応の場合、第一のサーマルサイクルのステップに先立って、ＲＮａｓｅ阻害剤が添加される。それによって、サーマルサイクルステップ中、かつ、すべての後続するサーマルサイクルにおいて、驚くべきことに、ＲＮＡはＲＮａｓｅによる分解から保護される。特に好ましい実施態様において、ＲＮＡの添加に先立って、ＲＮａｓｅ阻害剤とバッファーが反応混合液に添加される。さらに、反応混合液は、ＲＮＡの添加に先立って加熱され、逆転写酵素反応における最も高いＲＮＡの保護及び最も高い感度を保証する。
【００４４】
本発明はまた、天然の哺乳類又は組換えＲＮａｓｅ阻害剤によって通常は阻害されないＲＮａｓｅを阻害するために効果的である。相乗効果は、ＲＮａｓｅ阻害タンパク質と熱との組合せにおいて発見され、この組合せが単独で個々のステップの合計より多大な結果を生じる。本発明の実施態様において、一般的に原核生物、特に、Ｅ．ｃｏｌｉによって生成されるＲＮａｓｅＩが阻害される。この実施態様において、最初に述べた実施態様のように、ＲＮａｓｅ阻害剤と適切なバッファーは、第二溶液を産生するためにＲＮａｓｅＩを含むと考えられる溶液に加えられる。したがって、原核生物のＲＮａｓｅは、この処理によって失活され、ＲＮＡは分解を心配することなく添加できる。
【００４５】
ＲＮａｓｅを失活し、ＲＮＡを分解から保護するための上記方法が７０℃でＲＮＡ溶液または混合液を加熱することによって遂行されることができると共に、ＲＮＡが後で添加される溶液または混合液が少なくとも９０℃以上（基本的に沸点まで）の温度で長期間において加熱できることが本発明の特徴である。一旦、反応が冷却されると、ＲＮＡはＲＮａｓｅによる分解を心配することなく添加できる。ＲＮａｓｅ阻害タンパク質のＲＮＡ溶液への追加に応じて、ＲＮａｓｅが溶液中のＲＮＡを分解させるのを妨害されることは、本発明のさらなる態様である。さらに、少なくとも約７０℃の温度で混合液を加熱した後、ＲＮａｓｅは失活され、ＲＮＡは室温で長期間（つまり、少なくとも１時間以上）においてＲＮａｓｅの分解から安全である。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は、単に、本明細書で開示され、請求される本発明のより完全な理解を提供するために含まれる。実施例は、いかなる方法もの本発明を制限しない。
【００４７】
実施例１：プロメガの「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」ブランドのＲＮａｓｅ阻害剤によるラットの肝臓のライゼートのＲＮａｓｅの不活性化
この実施例の目的は、ラットの肝臓のライゼート（ＲＮａｓｅの供給源）が意図的に反応液に添加された、ＲＴ−ＰＣＲ実験で「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」のＲＮａｓｅ阻害剤でｍＲＮＡの保護を実証することである。
【００４８】
材料：
ラットの肝臓のライゼート：超純水に０．５  ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｔ  ＃  Ｌ−１３８０  Ｌｔ  ＃  １０８Ｆ８１８５）
ルシフェラーゼｍＲＮＡ：超純水に０．１  ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４５６Ａ  Ｌｔ  ＃  １４９３７４０３）
ルシフェラーゼｍＲＮＡ：超純水に０．０１  ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４５６Ａ  Ｌｔ  ＃  １４９３７４０３）
「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」ブランドのＲＮａｓｅ阻害剤＊：４０  ｕｎｉｔｓ／μｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ  ＃  Ｎ２６１  Ｌｔ  ＃  １６５６８２）
ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ  ＃  Ａ１７０３  Ｌｔ  ＃  １５８３０４）
＊「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」ブランドのラット由来のＲＮａｓｅ阻害剤は、プロメガから市販されており購入できる。
【００４９】
実験：
「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」ブランドのＲＮａｓｅ阻害剤とラットの肝臓のライゼートの両者の２００μｌは、７０℃で１５分間において個別の試験管で加熱された。
【００５０】
下記の反応は、ｍＲＮＡを添加せずに、複製して調製された。
【００５１】
【表１】
2006524504.tif 000003
【００５２】
【表２】
2006524504.tif 000004
反応番号４、５及び６において、ＲＮａｓｅ阻害剤とラットの肝臓のライゼートは個別に加熱され、次いで共にされる。反応番号７において、ＲＮａｓｅ阻害剤とラットの肝臓のライゼートは共にされて、加熱される。
【００５３】
反応番号７は、非加熱処理されたライゼートと非加熱処理されたＲＮａｓｅ阻害剤を用いて調製され、７０℃で１５分間インキュベーションされた。
【００５４】
０．１ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼｍＲＮＡ（１００ｎｇ）の１μｌが反応液の第一セットに添加された。
【００５５】
０．０１ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼｍＲＮＡ（１０ｎｇ）の１μｌが反応液の第二セットに添加された。すなわち、反応液の第二セットは、反応液の第一セットに比較して、ｍＲＮＡテンプレート量が１０分の１を含む。
【００５６】
次いで、反応液は３７℃で１時間インキュベーションされた。
【００５７】
インキュベーションの間、ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、下記のように、プロメガコーポレーションから入手可能な組成物を使用して氷上で調製された。
【００５８】
２５０  mｌ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｑｕｉｃｋ  ２ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
２２０  mｌ  ヌクレアーゼ−フリーの水
１０  mｌ  ルシフェラーゼアップストリームプライマー、  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０２４７  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ルシフェラーゼダウンストリームプライマー、  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０８１８  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ＡＭＶ−ＲＴ  （５  ｕｎｉｔｓ／mｌ）
３７℃で１時間インキュベーションした後（反応に挑戦ように設計された温度；ＲＮａｓｅ活性に最適の温度である３７℃）、反応液は氷上に移した。４５μｌのＲＴ−ＰＣＲマスターミックスが、氷上で「ＭｉｃｒｏＡｍｐ」ブランドのストリップウェル試験管に分配された。次いで、５μｌの各反応液がマスターミックスに添加された。反応液は、ＰＥ９６００サーモサイクラー（パーキンエルマーコーポレーション、シェルトン、米国コネチカット州）に置かれ、下記のようにサイクル反応が行なわれた。
【００５９】
４８°Ｃ  ４５分  １サイクル
９６°Ｃ  ２分  １サイクル
９４°Ｃ  １５秒
６５°Ｃ  →  ５５°Ｃ  １分                ２０サイクル
７２°Ｃ  １．５分
７２°Ｃ  ５分  １サイクル
４°Ｃ  浸漬
次いで、１５μｌの各ＲＴ−ＰＣＲ反応液が、臭化エチジウム染色の１％のＴＢＥアガロースゲルにローディングされて、８０Ｖで１時間のランを行なった。
【００６０】
結果は図１に示す。下記がレーンの詳細である。
【００６１】
レーン番号１から８は、１００ｎｇのｍＲＮＡを含む。
【００６２】
レーン番号１１から１８は、１０ｎｇのｍＲＮＡを含む。
【００６３】
レーン番号９及び１０は、ブランクである。
【００６４】
レーン番号
１．２００ｂ．ｐ．のＤＮＡステップラダー
２．ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓのみ（−）
３．ライゼートのみ（−）
４．ＲＮａｓｉｎ（−）＋ライゼート（−）
５．ＲＮａｓｉｎ（＋）＋ライゼート（−）
６．ＲＮａｓｉｎ（−）＋ライゼート（＋）
７．個別に加熱されたＲＮａｓｉｎ（＋）＋ライゼート（＋）
８．共に加熱されたＲＮａｓｉｎ（＋）＋ライゼート（＋）
１１．２００ｂ．ｐ．のＤＮＡステップラダー
１２．ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓのみ（−）
１３．ライゼートのみ（−）
１４．ＲＮａｓｉｎ（−）＋ライゼート（−）
１５．ＲＮａｓｉｎ（＋）＋ライゼート（−）
１６．ＲＮａｓｉｎ（−）＋ライゼート（＋）
１７．個別に加熱されたＲＮａｓｉｎ（＋）＋ライゼート（＋）
１８．共に加熱されたＲＮａｓｉｎ（＋）＋ライゼート（＋）
（−）＝非加熱サンプル
（＋）＝加熱サンプル
図１に示されるゲルの結果は顕著である。各レーン３、５、７、１３、１５及び１７において、ＲＴ−ＰＣＲ産物は完全に不足している。対照的に、各レーン２、４、６、８、１２、１４、１６及び１８において、検出される非常に明確な産物がある。これらの結果は、阻害剤と、ＲＮａｓｅと、加熱との間の明確な相乗を示す。特に、レーン７及び１７に示されるように、阻害剤とライゼートが個別に加熱され、次いで、一緒にされる場合、ＲＴ−ＰＣＲの完全な失敗である。しかし、レーン８及び１８によって証明されるように、阻害剤とライゼートが一緒にされ、次いで加熱される場合、ＲＴ−ＰＣＲ実験は成功である。レーン５及び１５（阻害剤は加熱されるが、ライゼートは加熱されない）だけでなく、レーン７及び１７（阻害剤とライゼートは個別に加熱される）においても、ＲＴ−ＰＣＲ実験は失敗する（ライゼートがなく阻害剤を加熱することは阻害剤を“殺す”ことを示す）。しかしながら、驚くべきことに、阻害剤とライゼートが一緒にされ、次いで加熱される場合、レーン８及び１８のように、ＲＴ−ＰＣＲは成功し、阻害剤と、バッファー溶液と、熱との個別の効果の合計よりも相乗効果の方が多大であることを示す。
【００６５】
実施例２：定量ＰＣＲでのｍＲＮＡの保護
この実施例の目的は、ラット由来の胎盤のＲＮａｓｅ阻害剤、ヒト由来の胎盤のＲＮａｓｅ阻害剤が定量ＲＴ−ＰＣＲで使用され、ラットの肝臓のＲＮａｓｅが反応液に意図的に添加される、本発明がｍＲＮＡを保護することを実証することである。
【００６６】
材料：
ラットの肝臓のライゼート：超純水に０．５  ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｔ  ＃  Ｌ−１３８０  Ｌｔ  ＃  １０８Ｆ８１８５）
ルシフェラーゼｍＲＮＡ：超純水に０．１  ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４５６Ａ  Ｌｔ  ＃  １４９３７４０３）
カナマイシンｍＲＮＡ：超純水に０．００５  ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｃ１３８Ａ  Ｌｔ  ＃  １５４２３６０２）
「ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓ」ブランドの阻害剤：４０  ｕｎｉｔｓ／μｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ  ＃  Ｎ２６１  Ｌｔ  ＃  １６５６８２）
組換え「ＲＮａｓｉｎ」ブランドの阻害剤：４０  ｕｎｉｔｓ／μｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ  ＃  Ｎ２５１  Ｌｔ  ＃  １５２７３４）
ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ  ＃  Ａ１７０３  Ｌｔ  ＃  １５８３０４）
実験：
下記の反応液がｍＲＮＡを添加せずに調製された。
【００６７】
【表３】
2006524504.tif 000005
【００６８】
【表４】
2006524504.tif 000006
反応液は室温で５分間インキュベーションされた。
【００６９】
次いで、２．５μｌの０．１ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼｍＲＮＡ（総量２５０ｎｇ）と２μｌの０．００５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンｍＲＮＡ（１０ｎｇ）が各反応液に添加された。
【００７０】
反応液は、３７℃で５分間インキュベーションされた。
【００７１】
ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、プロメガコーポレーションから入手可能な組成物を用いて、下記のように氷上で調製された。
【００７２】
２５０  mｌ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｑｕｉｃｋ  ２ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
２００  mｌ  ヌクレアーゼ−フリーの水
１０  mｌ  ルシフェラーゼアップストリームプライマー，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０２４７  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ルシフェラーゼダウンストリームプライマー，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０８１８  （１５  mＭ）
１０  mｌ  カナマイシンアップストリームプライマー，  ＃  ２０９３６  （１５  mＭ）
１０  mｌ  カナマイシンダウンストリームプライマー，  ＃  ２０９３７  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ＡＭＶ−ＲＴ  （５  ｕｎｉｔｓ／mｌ）
４５μｌのＲＴ−ＰＣＲマスターミックスが、氷上で「ＭｉｃｒｏＡｍｐ」ブランドのストリップウェル試験管に分配された。次いで、５μｌの各反応液がマスターミックスに添加された。反応液は、ＰＥ９６００サーモサイクラーに置かれ、下記のようにサイクル反応が行なわれた。
【００７３】
４８°Ｃ  ４５分  １サイクル
９６°Ｃ  ２分  １サイクル
９４°Ｃ  １５秒
６５°Ｃ  →  ５５°Ｃ  １分  １２サイクル
７２°Ｃ  １．５分
７２°Ｃ  ５分  １サイクル
４°Ｃ  浸漬
次いで、２０μｌの各ＲＴ−ＰＣＲ反応液が、臭化エチジウム染色の１％のＴＢＥアガロースゲルにローディングされて、８０Ｖで１時間のランを行なった。
【００７４】
結果：
結果は図２、３及び４に示す。
【００７５】
図２（ラット）及び図３（ヒト）のレーン番号：
１．２００ｂ．ｐ．のＤＮＡステップラダー
２．コントロール（テンプレートなし）
３．ライゼートなし／ＲＮａｓｉｎなし−全産物
４．ライゼートなし−全産物
５．ライゼートなし−全産物
６．ライゼートなし−全産物
７．＋ライゼート／ＲＮａｓｉｎなし
８．＋ライゼート／ＲＮａｓｉｎなし
９．＋ライゼート／ＲＮａｓｉｎなし
１０．＋ライゼート＋ＲＮａｓｉｎ
１１．＋ライゼート＋ＲＮａｓｉｎ
１２．＋ライゼート＋ＲＮａｓｉｎ
図２及び３のバンド強度の定量がデンシトメーターを使用して実行された。ルシフェラーゼ産物（上部のバンド１．６Ｋｂ）のカナマイシン産物（下部のバンド１．２Ｋｂ）に対する比が決定された。比率は、ｎ＝３において平均値とした：
【００７６】
【表５】
2006524504.tif 000007
【００７７】
【表６】
2006524504.tif 000008
次いで、２標本ｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）が実行され、等分散でないと仮定する。結果は、以下の通りだった：
【００７８】
【表７】
2006524504.tif 000009
【００７９】
【表８】
2006524504.tif 000010
【００８０】
【表９】
2006524504.tif 000011
ライゼート処理及び全産物のコントロールにおいて、ｐ＜０．０５、有意な差。
【００８１】
ライゼート処理及びＲＮａｓｉｎ保護において、ｐ＜０．０５、有意な差。
【００８２】
コントロールの全産物及びＲＮａｓｉｎ保護において、ｐ＞０．０５、有意な差なし。
【００８３】
それらの結果は、図４で図式的に表される。
【００８４】
この実施例は、ライゼート処理サンプルとコントロールサンプルとの間、及びライゼート処理サンプルとＲＮａｓｉｎ処理サンプルとの間に有意な差があることを示している。コントロールサンプルとＲＮａｓｉｎ処理サンプルとの間には有意な差はない。要約すると、阻害剤がライゼートに添加された場合に得られるＲＴ−ＰＣＲ産物の収量に差はないが、阻害剤がライゼートに添加されない場合の産物の収量は有意な差がある。
【００８５】
実施例３：ＲＮａｓｅ阻害剤の存在におけるＲＮａｓｅを加熱する効果
本実施例は、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在におけるＲＮａｓｅを加熱する効果を実証する。実施例は、下記のように行なわれた。寒天は、ＲＮＡと、ｐＨインジケータと、Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ−Ｏとで混合された。具体的には、０．２％のイーストＲＮＡ（ｐＨ  ７．０）を有する１．５％のＬＢ寒天は、０．００５％のＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ−Ｏと混ぜ合わせられた。イーストＲＮＡは、ベーリンガーマンハイム社（カタログ番号１０９−２２３）から購入された。Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ−Ｏは、シグマ社（カタログ番号Ｔ３２６０）から購入された。寒天は、ペトリディッシュに注入されて、凝固された。ＲＮＡのＲＮａｓｅ分解はヌクレオチドを放出し、それによって、局所ｐＨを減少させる。これは、ｐＨインジケータをピンクにする。
【００８６】
３溶液は、０．５ｍｌのマイクロフュージチューブで複製されて調製された。下記が組成物である。
【００８７】
【表１０】
2006524504.tif 000012
＊ＤＴＴを有さないＲＮａｓｅＡは、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  （Ｓｉｇｍａ  Ｒ４８７５），  ２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．６），  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ａｎｄ  ５０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを含有するバッファーで調製された。
【００８８】
複製した溶液の一つは７０℃で５分間加熱され、次いで、室温まで冷却される。複製した溶液のもう一方は、最後まで室温で維持された。
【００８９】
ディッシュはグリッドされ、ウェルは異なるサンプルをローディングするためのゲルに中心が抜かれた。次いで、それら溶液のサンプルは、寒天プレートに中心が抜かれたウェルに配置された。次いで、プレートは３７℃で３０分間インキュベーションされた。図５に示されるように、プレートの上半分は、加熱されたサンプルを含み、下半分は非加熱サンプルを含む。加熱されたサンプルは、上から下に向かって、ＲＮａｓｅ単独、ＲＮａｓｅにヒトのＲＮａｓｅ阻害剤を加えたもの、ＲＮａｓｅに組換えＲＮａｓｅ阻害剤（ラット由来）を加えたものであった。非加熱サンプルも同様の順番である。左から右に、サンプルがそれぞれ２μｌ、２μｌ、５μｌ、５μｌ、１０μｌ及び１０μｌ添加されたレーンを示す。
【００９０】
実験の結果は、ＲＮａｓｅ単独を含有する加熱及び非加熱の両列において、ＲＮＡの分解を示し暗い光輪があることを示す。ＲＮａｓｅと、ヒトのＲＮａｓｅ阻害剤と、ラット由来のＲＮａｓｅ阻害剤を含有する列において、暗い光輪はなく、ＲＮＡの分解がないことを示している。加熱処理されなかったＲＮａｓｅと、ヒトのＲＮａｓｅ阻害剤、又はラット由来のＲＮａｓｅ阻害剤を含有する列において、すべての中心のまわりに弱い暗い光輪があり、これは、非加熱処理されたサンプルにおいても、ＲＮａｓｅ阻害剤によるＲＮＡの保護が完全ではないことを示す。対照的に、大量にＲＮａｓｅを添加した加熱処理サンプルにおいては、完全な阻害があった。
【００９１】
実施例４：加熱及び非加熱における阻害剤の存在下でのＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解
この実施例は、加熱処理に係わらず、ＲＮａｓｅ阻害剤及びバッファーの存在下でのＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解を試験するために行なわれた。この実験は、ＲＮＡとｐＨインジケータとが寒天に混合された、２つの同一の寒天プレートを調製することによって行なわれた。
【００９２】
０．５ｍｌのマイクロフュージチューブに５つの溶液が複製されて調製された。組成は、下記の表１１であった。
【００９３】
【表１１】
2006524504.tif 000013
＊ＲＮａｓｅ  Ａ  ＝  ＲＮａｓｅ  Ａ  （Ｓｉｇｍａ  Ｒ４８７５）はＤＴＴを含有しない保存バッファーで調製された。
＊＊  保存バッファー  ＝  ２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．６  ａｔ  ４°Ｃ），  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ８  ｍＭ  ＤＴＴ，  ５０％  （ｖ／ｖ）  グリセロール
＊＊＊  バッファーＢ  ＝  ６０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，  ｐＨ  ７．５  （ａｔ  ３７°Ｃ），  ６０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０  ｍＭ  ＤＴＴ
複製のうちの一つは、７０℃で５分間加熱され、４℃まで冷却されて、室温になるようにした。複製のもう一方は、このまま室温で維持された。それぞれ１０μｌのそれら溶液のサンプルは、寒天プレートのウェルに置かれた。この実験の結果は、図６に概略して例示される。
【００９４】
左上のプレートが室温で、インキュベーションされたサンプルをローディングし、一方で、右上のプレートが７０℃まで加熱されたサンプルをローディングされたこと以外は、プレートは同じくローディングされた。プレートはローディングされ、上から下に向かって、ＲＮａｓｅ単独、プロメガ保存バッファー中のＲＮａｓｅ＋「ＲＮａｓｉｎ」のＲＮａｓｅ阻害剤、ＲＮａｓｅ＋保存バッファー、ＲＮａｓｅ＋プロメガバッファーＢであった。次いで、プレートは３７℃で３０分間インキュベーションされた。図６に示されるこの実験の結果は、非加熱サンプルにおいて、単に阻害剤だけが存在する際に、ＲＮａｓｅの阻害が生じることを示す。加熱処理サンプルにおいて、単に阻害剤と保存バッファーが存在する際にだけ阻害が生じる。それらの結果は、室温及び高温下のＲＮＡの保護において、阻害剤とバッファーが添加されなけらばならず、一方で、混合物は室温で調製される。
【００９５】
実施例５：ラットＲＮａｓｉｎでの小麦胚ＲＮａｓｅの阻害
この実施例の目的は、予め加熱されたラットＲＮａｓｉｎが、小麦胚の抽出物に存在するＲＮａｓｅの効果的な阻害剤であるかを決定することである。
【００９６】
材料：
小麦胚の抽出物  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４８１Ａ，  Ｌｔ＃  １２２０４１０４）
ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ：  ４０  ｕｎｉｔｓ／mｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｎ２６１，  Ｌｔ＃  １６５６８２）
ルシフェラーゼｍＲＮＡ：  １  ｍｇ／ｍｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４５６Ａ，  Ｌｔ  ＃  １４９３７４０３）
ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ａ１７０３，  Ｌｔ＃  １５８３０４）
実験：
ルシフェラーゼｍＲＮＡの添加なしに、下記の反応液が調製された。
【００９７】
【表１２】
2006524504.tif 000014
反応番号１乃至４は室温で維持された。反応番号５乃至７は、７０℃で１５分間加熱され、次いで、室温まで冷却された。
【００９８】
次いで、１μｌ（１μｇ）のルシフェラーゼｍＲＮＡは、表１２に示されるように反応液に添加された。
【００９９】
次いで、反応液は３７℃で６０分間インキュベーションされた。
【０１００】
ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、プロメガコーポレーションから入手可能な組成物を用いて、下記のように氷上で調製された。
【０１０１】
２５０  mｌ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｑｕｉｃｋ  ２ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
２２０  mｌ  ヌクレアーゼ−フリーの水
１０  mｌ  ルシフェラーゼアップストリームプライマー，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０２４７  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ルシフェラーゼダウンストリームプライマー，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０８１８  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ＡＭＶ−ＲＴ  （５  ｕｎｉｔｓ／mｌ）
４５μｌのＲＴ−ＰＣＲマスターミックスが、氷上で「ＭｉｃｒｏＡｍｐ」ブランドのストリップウェル試験管に分配された。次いで、５μｌの各反応液がマスターミックスに添加された。反応液は、ＰＥ９６００サーモサイクラーに置かれ、下記のようにサイクル反応が行なわれた。
【０１０２】
４８°Ｃ  ４５分  １サイクル
９６°Ｃ  ２分  １サイクル
９４°Ｃ  １５秒
６５°Ｃ  →  ５５°Ｃ  １分  ２０サイクル
７２°Ｃ  １．５分
７２°Ｃ  ５分  １サイクル
４°Ｃ  浸漬
次いで、１５μｌの各ＲＴ−ＰＣＲ反応液が、臭化エチジウム染色の１％のＴＢＥアガロースゲルにローディングされて、８０Ｖで１時間のランを行なった。
【０１０３】
結果は図７に示される。（ＷＧＥは小麦胚抽出物である。）
レーン番号１−２００ｂ．ｐ．のＤＮＡステップラダー
レーン番号２−テンプレートなし
レーン番号３−完全な産物
レーン番号４−ＲＮａｓｉｎのみ／ＷＧＥなし
レーン番号５−室温でＷＧＥ＋ＲＮａｓｉｎ
レーン番号６−７０℃でＷＧＥ＋ＲＮａｓｉｎ（２０μｌ）
レーン番号７−７０℃でＷＧＥ＋ＲＮａｓｉｎ（１０μｌ）
レーン番号８−７０℃でＷＧＥ＋ＲＮａｓｉｎ（５μｌ）
この実施例は、加熱処理したラットＲＮａｓｉｎが小麦胚抽出物に存在する幾らかのＲＮａｓｅを阻害するが、その阻害が完全ではないことを実証する。図７のレーン６、７及び８と比較して、レーン５を参照のこと。
【０１０４】
実施例６：ラットＲＮａｓｉｎでの小麦胚ＲＮａｓｅのさらなる阻害
実施例４と同様に、この実施例の目的は、予め加熱されたラットＲＮａｓｉｎが、小麦胚の抽出物に存在するＲＮａｓｅの効果的な阻害剤であるかを決定することである。この実施例では、添加したＤＴＴの有無に関係ないバッファーを含み（反応上のＤＴＴの効果を評価するため）、わずかに異なるバッファーが使用された。
【０１０５】
材料：
小麦胚の抽出物  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４８１Ａ    Ｌｔ＃  １２２０４１０４）
ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ：  ４０  ｕｎｉｔｓ／μｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｎ２６１  Ｌｔ＃  １６５６８２）
ルシフェラーゼｍＲＮＡ：  １  ｍｇ／ｍｌ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ｌ４５６Ａ  Ｌｔ  ＃  １４９３７４０３）
ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ＃  Ａ１７０３  Ｌｔ＃  １５８３０４）
ＲＮａｓｉｎ  保存バッファー  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｔ  ＃  ＢＮ２５１  Ｌｔ＃  １４７６８１）
ＤＴＴを含むＲＮａｓｉｎ保存バッファー；
２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，  ｐＨ  ７．６
５０  ｍＭ  ＫＣｌ
８  ｍＭ  ＤＴＴ
５０％グリセロール
実験：
下記の反応液がルシフェラーゼｍＲＮＡの添加なしに調製された。
【０１０６】
【表１３】
2006524504.tif 000015
反応番号１乃至４、６、１０及び１２は室温で維持された。反応番号５、７、８、９、１１、１３及び１５は、７０℃で１５分間加熱され、次いで、室温まで冷却された。
【０１０７】
次いで、１μｌ（１μｇ）のルシフェラーゼｍＲＮＡは、表１３に示されるように反応液に添加された。
【０１０８】
次いで、反応液は３７℃で６０分間インキュベーションされた。
【０１０９】
ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、下記のように氷上で調製された：
２５０  mｌ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｑｕｉｃｋ  ２ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
２２０  mｌ  ヌクレアーゼ−フリーの水
１０  mｌ  ルシフェラーゼアップストリームプライマー，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０２４７  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ルシフェラーゼダウンストリームプライマー，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ２０８１８  （１５  mＭ）
１０  mｌ  ＡＭＶ−ＲＴ  （５  ｕｎｉｔｓ／mｌ）
４５μｌのＲＴ−ＰＣＲマスターミックスが、氷上で「ＭｉｃｒｏＡｍｐ」ブランドのストリップウェル試験管に分配された。次いで、５μｌの各反応液がマスターミックスに添加された。反応液は、ＰＥ９６００サーモサイクラーに置かれ、下記のようにサイクル反応が行なわれた。
【０１１０】
４８°Ｃ  ４５分  １サイクル
９６°Ｃ  ２分  １サイクル
９４°Ｃ  １５秒
６５°Ｃ  →  ５５°Ｃ  １分  ２０サイクル
７２°Ｃ  １．５分
７２°Ｃ  ５分  １サイクル
４°Ｃ  浸漬
次いで、１５μｌの各ＲＴ−ＰＣＲ反応液が、臭化エチジウム染色の１％のＴＢＥアガロースゲルにローディングされて、８０Ｖで１時間のランを行なった。
【０１１１】
結果は図８に示される。
【０１１２】
レーン番号１−２００ｂ．ｐ．のＤＮＡステップラダー
レーン番号２−テンプレートなし
レーン番号３−完全な産物
レーン番号４−ＲＮａｓｉｎのみ／ＷＧＥなし
レーン番号５−室温でＷＧＥのみ／ＲＮａｓｉｎなし
レーン番号６−７０℃でＷＧＥのみ／ＲＮａｓｉｎなし
レーン番号７−室温でＷＧＥ＋室温でＲＮａｓｉｎ
レーン番号８−７０℃でＷＧＥ＋７０℃でＲＮａｓｉｎ（２０μｌ）
レーン番号９−７０℃でＷＧＥ＋７０℃でＲＮａｓｉｎ（１０μｌ）
レーン番号１０−７０℃でＷＧＥ＋７０℃でＲＮａｓｉｎ（５μｌ）
レーン番号１１−室温でＷＧＥ＋室温でＤＴＴを含む保存バッファー
レーン番号１２−７０℃でＷＧＥ＋７０℃でＤＴＴを含む保存バッファー
レーン番号１３−７０℃でＷＧＥ＋７０℃でＤＴＴを含まない保存バッファー
レーン番号１４−室温でＷＧＥ＋室温でＤＴＴを含む保存バッファー
ＮＢ：反応番号１２及び１３は、レーン１３及び１４において、ゲルをローディングすると、即座に、偶然に逆になった。
【０１１３】
実施例５にように、この実施例は、本発明が小麦胚抽出物のＲＮａｓｅを阻害することができるが、しかし、完全ではないことを示す。詳細には、レーン７で得られた産物量と、レーン８乃至１０で得られた産物量とを比較すること。さらに、レーン１１乃至１４からの興味深く観察されることは、ＤＴＴの有無に関係ない保存バッファーは、加熱される限り、幾らかの保護を提供できる。あたかも全ての要因が、ラットＲＮａｓｉｎ、保存バッファー、ＤＴＴ及び熱の組合せによって見られる相乗作用の阻害効果に何らかの方法で貢献するかのように現れる。
【０１１４】
実施例７：ＤＴＴを含有しないＲＮａｓｅ阻害剤
この実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．  ＃Ｍ４２６１）、ＲＮａｓｅＩの阻害は、（１）ＲＮａｓｉｎ−ＰｌｕｓブランドのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．  ＃Ｎ２６１，  ８  ｍＭ  ＤＴＴを含有する保存バッファー）；（２）高温度でインキュベーションした後のＤＴＴを含有しない保存バッファーＲＮａｓｉｎ−ＰｌｕｓブランドのＲＮａｓｅ阻害剤によって阻害された。ＤＴＴを含有しない保存バッファーＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓブランドの阻害剤は精製されて、特にＤＴＴである還元剤を決して含まないバッファーに保存された。この阻害剤は、ＤＴＴ及び他の還元剤が存在しない状態でＲＮａｓｅＩとインキュベーションされた。驚くべきことに、ＲＮａｓｅＩは、ＤＴＴ及び他の還元剤が存在しない溶液によって阻害された。ＲＮａｓｅＩがこのような状況の下でＲＮａｓｉｎ−ＰｌｕｓブランドのＲＮａｓｅ阻害剤によって阻害されることが可能だったという事実は、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅを阻害するために、ＲＮａｓｉｎタイプの阻害剤において、ＤＴＴが絶対に必要とはしないことを証明する。
【０１１５】
加えて、ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓブランドの阻害剤を含有するＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．  ＃Ｒ４８７５）及びＲＮａｓｅＢ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｃａｔ．  ＃１０１０８４）の溶液が調製され、様々な温度で加熱されて、ＲＮａｓｅ活性において試験された。それらの反応液において、ＲＮａｓｅ活性は、ＲＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ阻害剤溶液の加熱に応じて見られなかった。要約すると、ＲＮａｓｅの失活は、温度に依存しないことが示された（試験した温度において）。これらの結果は、定まった状況の下で、ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓタイプの阻害剤が、ＤＴＴの有無に係わらず、これらのＲＮａｓｅｓ（ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＢ）を完全に阻害することができることを証明する。さらに、これらの結果は、阻害剤がＤＴＴの存在に依存しないことを示す。ＲＮａｓｅＩの溶液は、プロメガコーポレーション（Ｃａｔ．  ＃Ｍ４２６１）から得られた。また、ＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓブランドの阻害剤は、保存バッファーに含んで、プロメガコーポレーション（Ｃａｔ．  ＃Ｎ２６１、８ｍｍＤＴＴ）から得られた。ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．  ＃Ｒ４８７５）及びＲＮａｓｅＢ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｃａｔ．  ＃１０１０８４）の溶液は購入されて、ＤＴＴを含有しない１００ｎｇ／μｌの保存バッファーで調製された。ＤＴＴを含有しないＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓブランドの阻害剤は、精製処理中に使用される如何なる溶液にＤＴＴを含有しないか、又は他の還元剤を含有しないこと以外に、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  （１９７９）  Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２５４（２４）：１２４８４−１２４８７に記載の方法にしたがって、ＲＮａｓｅＡ親和性樹脂により精製された。
【０１１６】
表１４にしたがって、７つの複製溶液が生成された（水を１００μｌまで加える）。
【０１１７】
【表１４】
2006524504.tif 000016
それら試験管の各一セットは、５０℃、６０℃、６５℃、７０℃、８０℃、９０℃及び９９．９℃の加熱温度によって１分間加熱された。次いで、溶液は４℃まで冷却されて、各サンプルの８μｌが、前述した実施例に記載のようにＲＮａｓｅ検出プレートのウェルに移された。次いで、プレートは前述の記載のように３７℃でインキュベーションされ、ＲＮａｓｅ活性を判断した。下記の表１５において、ＲＮａｓｅ活性は、その温度でインキュベーションしたが、ＲＮａｓｅ阻害剤がない溶液でみられるように０％の阻害値のＲＮａｓｅ検出プレートで検出されるＲＮａｓｅ活性の領域のサイズから推定された。
【０１１８】
【表１５】
2006524504.tif 000017
同様の実験において、ＤＴＴを含有しないＲＮａｓｉｎ−Ｐｌｕｓブランドの阻害剤の量は、１０倍（１０Ｘ）に高められた。これらの状況下において、ＲＮａｓｅＩは５８℃において１００％阻害された。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】実施例１のＲＴ−ＰＣＲプロトコールにおいてラット由来のＲＮａｓｅ阻害タンパク質を使用してウシ膵臓ＲＮａｓｅの阻害を例証するゲルの写真である。
【図２】実施例２において、ラット由来のＲＮａｓｅ阻害タンパク質を使用して、定量ＲＴ−ＰＣＲにおけるｍＲＮＡの保護を例証するゲルの写真である。
【図３】実施例２において、ヒト由来のＲＮａｓｅ阻害タンパク質を使用して、定量ＲＴ−ＰＣＲにおけるｍＲＮＡの保護を例証するゲルの写真である。
【図４】実施例２に記載されて、図２及び３のゲルに示されるＲＴ−ＰＣＲ反応の産物におけるバンド密度の統計的な分析の結果を示すヒストグラムである。
【図５】実施例３において、アッセイはＲＮＡとｐＨインジケータを混合した寒天でローディングした寒天プレートを含み、そのプレートは中心が抜かれ、そのウェルに加熱処理又は非加熱処理を施したＲＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ阻害剤をローディングして、ＲＮＡの消化はウェルの周囲の視覚可能な消化領域となる、ＲＮａｓｅによりＲＮＡの消化を示すプレートアッセイの結果を概略して示す図である。
【図６】実施例４において、ＲＮａｓｅ阻害剤が存在し、異なるタイプのバッファーでＲＮＡの分解におけるＲＮａｓｅの加熱の効果を検査するプレートアッセイの結果を示す図である。
【図７】実施例５のＲＴ−ＰＣＲ実験において小麦麦芽に由来するＲＮａｓｅによる分解からｍＲＮＡの保護を例証するゲルの写真である。
【図８】実施例６のＲＴ−ＰＣＲ実験において小麦麦芽に由来するＲＮａｓｅによる分解からｍＲＮＡの保護を例証するゲルの写真である。
【配列表】
2006524504.tif 000018
2006524504.tif 000019
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月31日(2005.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボヌクレアーゼによる酵素分解からＲＮＡを保護するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＲＮＡを含有するか、又は後にＲＮＡが添加される第一溶液に対して、混合液を生じるように、バッファー中に分配されたリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含む第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するように十分な時間において約５０℃ほどの温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱し、それによって、前記混合液に存在するか、又は後に該混合液に添加されるＲＮＡをリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護するステップと、
を含み、前記第二溶液中のリボヌクレアーゼ阻害タンパク質の含有量は、リボヌクレアーゼによる酵素分解からＲＮＡを保護するために十分であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）で、混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｂ）で、前記混合液はＲＮＡを含まず、さらに前記混合液は約９０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ及びリボヌクレアーゼＩによる酵素分解からＲＮＡを保護するための方法であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡを含有し、リボヌクレアーゼを含有していると疑われる第一溶液でリボヌクレアーゼを失活する方法であって、該方法は、
（ａ）前記第一溶液に対して、混合液を生じるために、バッファー中に含まれるリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するように十分な時間において少なくとも約５０℃の温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱し、それによって、前記第一溶液に存在するリボヌクレアーゼが失活されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するように十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）で、混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一溶液に存在するリボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＢ、リボヌクレアーゼＣ及びリボヌクレアーゼＩの失活方法であることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リボヌクレアーゼによる酵素分解からＲＮＡを保護する状況下でＲＮＡを保存する方法であって、該方法は、
（ａ）分離したＲＮＡを含有するか、又は分離したＲＮＡを後に添加される第一溶液に対して、混合液を生じるように、バッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するために十分な時間において少なくとも約５０℃の温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱するステップと、
（ｃ）前記混合液を冷却するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ａ）の第一溶液がＲＮＡを含有しない場合に前記ステップ（ｃ）の前記混合液にＲＮＡを添加し、次いで、前記混合液を密閉した容器に配置するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ｂ）で、前記混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｂ）で、前記混合液はＲＮＡを含まず、さらに前記混合液は約９０℃程度の温度まで加熱され、前記（ｄ）は前記ステップ（ｃ）の前記混合液にＤＮＡを添加することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＲＴ−ＰＣＲを実行する方法であって、該方法は、
（ａ）サーマルサイクル反応を受ける前に、ＲＮＡを含有するか、又は後にＲＮＡを添加されるＲＴ−ＰＣＲ反応液に対して、混合液を生じるように、バッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含む溶液量を添加するステップと、
（ｂ）ＲＮＡが存在しない場合に前記ステップ（ａ）の混合液に対してＲＮＡテンプレートを添加するステップと、
を含み、
前記添加される溶液量は、第一のサーマルサイクル反応段階で酵素分解から前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液に存在するＲＮＡを保護するために十分量であり、
前記混合液のＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に存在するリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ａ）で、前記バッファーは、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ａ）の後であり、かつステップ（ｂ）に先立って、混合液は、約５５℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ａ）で、前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＲＮＡを含有せず、前記ステップ（ａ）の後であり、かつステップ（ｂ）に先立って、前記混合液は少なくとも約９０℃の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＲＴ−ＰＣＲを実行する方法であって、該方法は、
（ａ）ＲＴ−ＰＣＲ試薬の混合液に対して、第二溶液を生じるように、バッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含む第一溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記第二溶液に存在するリボヌクレアーゼ活性を阻害するように十分な時間において少なくとも約５５℃の温度まで前記第二溶液混合液を加熱するステップと、
（ｃ）ＲＮＡの混合液を生じるように前記第二溶液に対してＲＮＡを添加するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）の前記ＲＮＡ混合液においてＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、それによって、前記ＲＮＡ混合液中のＲＮＡは前記第二溶液に存在するリボヌクレアーゼによる酵素分解から保護され、かつ、さらに前記混合液中のＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ反応中にリボヌクレアーゼから保護されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ａ）で、前記バッファーは、少なくとも５０μＭＤＴＴの前記第二溶液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｂ）で、前記第二溶液は、約７０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｂ）で、前記第二溶液は、約９０℃程度の温度まで加熱されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項２６乃至２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項２６乃至２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼを失活する方法であって、該方法は、
（ａ）原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼの含有が疑われる第一溶液に対して、混合液を生じるように、バッファー中にリボヌクレアーゼ阻害タンパク質を含有する第二溶液を添加するステップと、
（ｂ）前記混合液に存在する原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼ活性を阻害するために十分な時間において少なくとも約５５℃の温度まで前記ステップ（ａ）の混合液を加熱し、それによって、前記第一溶液に存在する原核細胞又は植物のリボヌクレアーゼが失活されるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ａ）で、前記第二溶液は、少なくとも５０μＭＤＴＴの混合液を調製するために十分量のＤＴＴを含有することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、哺乳類に由来することを特徴とする請求項３２又は３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ａ）で、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質は、ブタ、ラット、ヒトの胎盤、又は組換え体のヒトの胎盤に由来することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ａ）で、第一溶液はＥ．ｃｏｌｉのリボヌクレアーゼの含有が疑われ、前記ステップ（ｂ）で、前記混合液に存在するＥ．ｃｏｌｉのリボヌクレアーゼ活性を阻害するために十分な時間で加熱されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【国際調査報告】
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