(57)【要約】  本発明は、細菌懸濁液又はウイルス懸濁液、特に濃縮したもの及び未精製若しくは少し精製したものの存在下で安定性の高い新規な水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを提供する。本発明のエマルジョンは、少なくも１種の免疫原、具体的には、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット、組換え発現ベクター、及びプラスミド、又はその組合せを含む群から選択される免疫原を含む薬剤組成物を送達するための媒体の役割を果たすことができる。一実施形態では、本発明は、（１）不活性化したマイコプラズマハイオニューモニエ細菌、不活性化したブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）ウイルス、又はその組合せを含む群から選択される免疫原を含有する水溶液と、（２）鉱油と、（３）非イオン性親油性界面活性剤と、（４）エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤（通常、１１〜１３のＨＬＢ値を有する）とを含む、注射可能な水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１種の免疫原を含有する水溶液と、
（ｉｉ）鉱油と、
（ｉｉｉ）非イオン性親油性界面活性剤と、
（ｉｖ）１３〜４０の高い親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する非イオン性親水性界面活性剤と、
（ｖ）９〜１３の低い親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する非イオン性親水性界面活性剤とを含む、
注射可能な水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
高ＨＬＢ非イオン性親水性界面活性剤が、エマルジョンの単位体積当たりの重量として表して、０．１％〜１．５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
界面活性剤の割合が、重量体積比（ｗ／ｖ）約４％〜約６％である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
低ＨＬＢ非イオン性親水性界面活性剤が、エマルジョンの単位体積当たりの重量として表して、１％〜８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非イオン性親油性界面活性剤が、エマルジョンの単位体積当たりの重量として表して、０．１％〜２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
鉱油が、２０％〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
エマルジョンが、３３〜６６℃の転相温度（ＰＩＴ）を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
低ＨＬＢ非イオン性親水性界面活性剤が、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル、エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステル、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪酸エトキシ化ヒマシ油、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
エトキシ化脂肪酸エステルのエステルが、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれら組合からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
非イオン性親油性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、マンニド脂肪酸エステル、ジエトキシ化マンニド脂肪酸エステル、トリエトキシ化マンニド脂肪酸エステル、テトラエトキシ化マンニド脂肪酸エステル、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
脂肪酸エステルのエステルが、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
高ＨＬＢ非イオン性親水性界面活性剤が、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪酸、非イオン性ブロックコポリマー、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
エトキシ化ソルビタンモノエステルが、エトキシ化ソルビタンモノラウレート、エトキシ化ソルビタンモノパルミテート、エトキシ化ソルビタンモノステアレート、エトキシ化ソルビタンモノオレエート、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
鉱油が、パラフィン油、スクアラン、プリスタン、ポリイソブテン油、水素添加ポリイソブテン油、ポリデセン油、ポリイソプレン油、ポリイソプロペン油、及びそれら組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
パラフィン油、非イオン性親油性界面活性剤としてのソルビタン脂肪酸モノエステル、低ＨＬＢ非イオン性親水性界面活性剤としてのエトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル、及び高ＨＬＢ非イオン性親水性界面活性剤としての非イオン性ブロックコポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
ソルビタン脂肪酸モノエステルがソルビタンモノオレエートであり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルがエトキシ化ソルビタントリオレエートであり、非イオン性ブロックコポリマーがポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンポリマー（ＰＯＥ−ＰＯＰ）である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
パラフィン油が、濃度１０％〜４０％（ｖ／ｖ）で存在し、ソルビタンモノオレエートが濃度０．２％〜１．５％（ｗ／ｖ）で存在し、エトキシ化ソルビタントリオレエートが濃度２％〜５％（ｗ／ｖ）で存在し、ＰＯＥ−ＰＯＰが濃度０．１％〜０．５％（ｗ／ｖ）で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
パラフィン油が、濃度２９．３％（ｖ／ｖ）で存在し、ソルビタンモノオレエートが濃度０．６％（ｗ／ｖ）で存在し、エトキシ化ソルビタントリオレエートが濃度３．４％（ｗ／ｖ）で存在し、ＰＯＥ−ＰＯＰが濃度０．２５％（ｗ／ｖ）で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫原が、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット、組換え発現ベクター、及びプラスミド、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
病原体が、ウイルス、細菌、真菌、寄生性原虫、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫原が、不活性化ウイルスである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
免疫原が、不活性化ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）ウイルスである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
免疫原が、不活性化した不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１９に記載のワクチン組成物を動物に投与するステップを含む、動物中で病原体に対する免疫応答を誘導するための方法。
【請求項２５】
免疫原が、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット、組換え発現ベクター、及びプラスミド、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫原が、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌、不活性化ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）ウイルス、又はそれら組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１回療法としてワクチン組成物が投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
動物が、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ、カモ、及びシチメンチョウからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
投与が筋肉内注射（ＩＭ）、皮内注射（ＩＤ）、又は皮下注射（ＳＣ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
投与が、針なし注射器によって行われる、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容の全体を参照により組み込む、２００３年７月２４日出願の米国特許仮出願第６０／４９０３４５号に対して優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、水中油型エマルジョン、アジュバントとしてのその使用、及びそれを含む薬剤組成物、免疫組成物、又はワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンにおけるアジュバントの使用は公知である。アジュバントとは、ワクチン抗原と併用されると、ワクチン抗原のみによって誘導される応答と比べて、ワクチン抗原に対する免疫応答を高める化合物である。抗原免疫原性を促進する戦略の中には、ワクチン抗原を粒子状にするもの、ワクチン抗原を重合させ又は乳化するもの、ワクチン抗原を封入する方法、宿主の生得的サイトカイン応答を高める方法、及び抗原提示細胞をワクチン抗原の標的にする方法がある（Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.）, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.）, Plenum Press, NY, N.Y. p. 141）。アジュバントがワクチン抗原の免疫原性を改善するうえで果たす役割は極めて重要であるため、ワクチンを調合する際のアジュバントの使用は、ほぼいたるところで行われている（上述のNossal, 1999;上述のVogel and Powell, 1995;国際公開第９７／１８８３７号も参照のこと。これらの教示は、参照により本明細書に組み込む）。当技術分野で公知の従来のアジュバントは、性質が多様である。例えば、これらは、水不溶性の無機塩、リポソーム、ミセル又はエマルジョンからなるもの、即ちフロイントのアジュバントでよい。上述のVogel and Powell, 1995で、他のアジュバントを見つけることができる。アジュバントの作用に単一の機序はないが、本質的な特質は、ワクチン抗原のみによって誘導される応答と比べて、ワクチン抗原に対する免疫応答を有意に高める能力である（上述のNossal, 1999;上述のVogel and Powell, 1995）。この点に関して、体液性免疫応答を高めるのにより有効なアジュバントもあれば、細胞性免疫応答を高めるのにより有効なアジュバントもあり（上述のVogel and Powell, 1995）、さらに別のグループのアジュバントは、ワクチン抗原に対する体液性免疫応答も細胞性免疫応答も高める（上述のVogel and Powell, 1995）。
【０００４】
一般に、ワクチン製剤で使用されるエマルジョンは、油、水溶液、及び界面活性剤の混合物を含む。一部のエマルジョンは、「Span 80(登録商標）」などの親油性界面活性剤、及び「Tween 80(登録商標）」などの親水性界面活性剤を組み込む。これらのエマルジョンは、イオン性界面活性剤の特性を有することが知られているレシチンやサポニンなどの化合物を含んでもよい。
【０００５】
しかし、ワクチンアジュバントとして使用されるエマルジョンに関して、特に保管又は輸送中の安定性の問題が認められている。この問題は、これらの組成物が、濃縮した免疫原、特に未精製の濃縮した免疫原を含有しているとき、特に当てはまる。一般に、これは、不活性化ワクチン（死菌ワクチン）で使用されるアジュバントで起こることである。この問題は、多価ワクチン組成物では、同体積の希釈液における免疫原の濃度がより高いため、さらに著しい。
【０００６】
アジュバント使用に関する別の問題は、毒性や注射部位の局所的炎症などの有害事象の危険性に関係している。例えば、局所的な炎症反応及び／又は肉芽腫が、注射後に生じることがある。このような有害反応を制限するために、エマルジョン中の界面活性剤及び他の成分を減らしてよいが、その場合、減量により、ワクチン組成物の安定性が低下することがある。したがって、新規なアジュバント、並びに安全性及び安定性の高いこのようなアジュバントを含有するワクチン組成物が必要とされている。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／４９０３４５号
【特許文献２】国際公開第９７／１８８３７号
【非特許文献１】Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.）, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.
【非特許文献２】Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.）, Plenum Press, NY, N.Y. p. 141
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の実施形態では、本発明は、細菌懸濁液又はウイルス懸濁液、特に濃縮したもの及び未精製若しくは少し精製したものの存在下で安定性の高い新規な水中油（Ｏ／Ｗ）（oil in water）型エマルジョンを提供する。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、より具体的には免疫原でよい少なくとも１種の有効成分を含む薬剤組成物を送達するための媒体の役割を果たす、安定で、安全で、且つ容易に投与可能な、具体的には注射可能な、Ｏ／Ｗ型エマルジョンを提供する。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態は、免疫原によって誘導される免疫応答を高めるためのアジュバントの役割を果たす、安定で、安全で、且つ注射可能なＯ／Ｗ型エマルジョンを提供する。具体的には、本発明は、免疫原を含有するワクチン組成物中で使用すると、免疫原に対するワクチン接種者の細胞性免疫応答、体液性免疫応答、又は好ましくはその双方を高める、新規なアジュバントを提供する。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態では、Ｏ／Ｗ型エマルジョンを含む、安定で、安全で、且つ免疫原性の組成物又はワクチンを提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、本発明のアジュバントを用いてワクチン組成物を作製する方法、そうして得られたワクチン組成物、及びそれを使用する方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態では、第１のバイアル中の免疫原又は他の医薬品と、第２のバイアル中の本発明に従って作製したアジュバントとを備える、使用前にこのアジュバントを免疫原又は他のワクチン製品と混合するように設計したキットを提供する。
【００１３】
好ましい一実施形態では、本発明は、
（１）免疫原を含有する水溶液と、
（２）鉱油と、
（３）非イオン性親油性界面活性剤と、
（４）エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤（通常、１１〜１３のＨＬＢ値を有する）とを含む、
注射可能な水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを提供する。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、本発明は、
（１）免疫原を含有する水溶液と、
（２）親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）（hydrophilic-lipophilic balance)値が高く、ＨＬＢ値が１３より大きく４０より小さく、特にＨＬＢ≧１３．５、好ましくはＨＬＢ≧１４である、非イオン性親水性界面活性剤と、
（３）鉱油と、
（４）非イオン性親油性界面活性剤と、
（５）ＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤（約９〜１３のＨＬＢ値）とを含む、注射可能な水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを提供する。
【００１５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ワクチン接種者中で免疫応答を引き出すのに適した少なくとも１種の免疫原を含有する新規なエマルジョンを含むワクチン組成物を提供する。本発明は、そのエマルジョンが、免疫原によって誘導される免疫応答を高めるための、具体的には細胞性応答、体液性応答、又は好ましくはその双方を高めるためのアジュバントの役割を果たす、このような組成物をさらに提供する。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、免疫原、特に、凍結乾燥した形態の又は水溶液に溶かした免疫原が本発明によるアジュバントと混合されたワクチン組成物を作製する方法を提供する。この免疫原は、プラスミドなどを含めて、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、サブユニット抗原、組換え発現ベクターからなる群から選択してよい。この病原体は、起源が細菌でも、ウイルスでも、原生動物でも、真菌でもよく、又は、免疫原は、抗毒素であってもよい。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のワクチン組成物をワクチン接種者に投与するステップを含む、ワクチン接種者中で病原体に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも２つのバイアルと、第１のバイアル中の免疫原、特に凍結乾燥した形態の又は水性媒体の溶液に溶かした免疫原と、第２のバイアル中の本発明によるアジュバント又はエマルジョンとを含む、キットを提供する。
【００１９】
本開示内容及び特に特許請求の範囲では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの用語は、米国特許法においてこれらの用語に帰されている意味を有することができ、例えば、これらは、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などを意味することができること、また、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」や「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」などの用語は、米国特許法によりこれらの用語に認められている意味を有し、例えば、これらは、明示的に列挙されていない要素を考慮しているが、従来技術中に存在する要素又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を及ぼす要素は除外することに留意されたい。
【００２０】
これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、又はそれらから明らかになり、また、それらに包含される。
【００２１】
その最良の形態を含めて、当業者に対する本発明の完全な開示及び実施可能な程度の開示を、本明細書の残りの部分で、添付の図面の参照を含めてより具体的に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の他の目的、特徴、及び態様は、以下の詳細な説明において開示され、又はそれから明らかになる。本考察は、例示的な実施形態の説明に過ぎず、本発明の広範な態様を限定するためのものではなく、その広範な態様は例示的な構成の中に包含されていることを、当業者は理解すべきである。実際に、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な変更及び改変を本発明で行えることが、当業者には明らかであろう。例えば、一実施形態の一環として例示又は説明した特徴を別の実施形態で使用して、さらに別の実施形態を生じることができる。本発明は、添付の特許請求の範囲内で生じるこのような変更例及び改変例並びにその均等物を包含するものとして意図されている。本出願全体を通じて引用したすべての参考文献、公開特許、及び特許の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２３】
便宜上、明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲中で使用するいくつかの用語を以下にまとめる。
【００２４】
本明細書では、「動物」という用語は、ヒトを含めてすべての脊椎動物を含む。また、この用語は、胚段階及び胎児段階を含めて、発生の全段階における動物個体も含む。具体的には、「脊椎動物」という用語には、それだけには限らないが、ヒト、イヌ科の動物（例えばイヌ）、ネコ科の動物（例えばネコ）、ウマ科の動物（例えばウマ）、ウシ亜科の動物（例えばウシ）、ブタ系の動物（例えばブタ）、並びにトリが含まれる。本明細書では「トリ」という用語には、それだけには限らないが、中でも、ニワトリ（種畜、食肉用若鶏、及び産卵鶏）、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、並びにダチョウ、エミュー、及びヒクイドリを含めた平胸類など分類階級の任意の種又は亜種を意味する。
【００２５】
本明細書では、「ブタ」又は「子ブタ」という用語は、ブタに由来する動物を意味し、「雌ブタ」とは、生殖可能年齢であり生殖能力のある雌を意味する。
【００２６】
本明細書では、「毒性の」という用語は、動物宿主に感染する能力を保持した単離物を意味する。
【００２７】
本明細書では、「不活性化ワクチン」という用語は、もはや複製も増殖もできない感染性の生物又は病原体を含有するワクチン組成物を意味する。この病原体は、起源が細菌でも、ウイルスでも、原生動物でも、真菌でもよい。凍結融解、化学処理（例えば、チメロサール又はホルマリンによる処理）、音波処理、放射線、熱、又は、生物の免疫原性を維持しつつ、その複製若しくは増殖を防止することができる従来手段を含めて、様々な方法によって不活性化を行うことができる。
【００２８】
本明細書では、「免疫原性」という用語は、宿主動物中で１種又は複数の抗原に対する免疫応答を起こすことができる能力を意味する。この免疫応答は、ワクチンによって誘発される、特定の感染性生物に対する防御免疫の基礎を形成するものである。
【００２９】
本明細書では、「免疫応答」という用語は、動物で誘発される応答を意味する。免疫応答とは、細胞性免疫（ＣＭＩ）（cellular immunity）を指しても、体液性免疫を指してもよく、或いは、その双方を含んでもよい。本発明は、免疫系の一部分に限定された応答も企図する。例えば、本発明のワクチン組成物は、特異的に、高いγインターフェロン応答を誘導することができる。
【００３０】
本明細書では、「抗原」又は「免疫原」という用語は、宿主動物中で特異的な免疫応答を誘導する物質を意味する。この抗原は、殺した、弱毒化した、又は生きた生物の全体、ある生物のサブユニット又は一部分、免疫原性の特質を有する挿入物を含む組換えベクター、宿主に与えると免疫応答を誘導できるＤＮＡの一片又は断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、或いは任意のそれらの組合せを含んでよい。或いは、この免疫原又は抗原は、毒素又は抗毒素を含んでもよい。
【００３１】
本明細書では、「多価」という用語は、同一種（即ち、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumonia）の異なる分離株）又は異なる種（即ち、パスツレラヘモリティカ（Pasteurella hemolytica）及びパスツレラマルトシダ（Pasteurella multocida）の双方から得た分離株）から得た複数の抗原を含有しているワクチン、或いは、異なる属から得た抗原の組合せを含有しているワクチン（例えば、パスツレラマルトシダ、サルモネラ、大腸菌、ヘモフィルスソムナス（Haemophilus somnus）、及びクロストリジウムから得た抗原を含むワクチン）を意味する。
【００３２】
本明細書では、「アジュバント」という用語は、ワクチンの免疫原性を高めるためにワクチンに加えられる物質を意味する。アジュバントがどのように機能するかという機序は、完全には分かっていない。一部のアジュバントは、ゆっくりと抗原を放出することによって免疫応答を高めていると考えられているのに対し、他のアジュバントは、それ自体に強い免疫原性があり、相乗的に機能すると考えられている。既知のワクチンアジュバントには、それだけには限らないが、油及び水のエマルジョン（例えば、フロイントの完全アジュバント及びフロイントの不完全アジュバント）、コリネバクテリウムパルブム（Corynebacterium parvum）、カルメットゲラン菌（Bacillus Calmette Guerin）、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント（Bacto-Adjuvant）、ポリアミノ酸やアミノ酸のコポリマーなどいくつかの合成ポリマー、サポニン、「REGRESSIN」（Vetrepharm社製、アセンス（Athens）、ジョージア州）、「AVRIDINE」（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、パラフィン油、ムラミルジペプチドなどが含まれる。
【００３３】
本明細書では、「製薬上許容される担体」及び「製薬上許容される媒体」という用語は交換可能であり、有害事象を起こさずに宿主中に注入することができる、ワクチン抗原を含有するための液体媒体を指す。当技術分野で既知の適切な製薬上許容される担体には、それだけには限らないが、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、又は緩衝液が含まれる。担体は、それだけには限らないが、希釈剤、安定化剤（即ち、糖及びアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘添加剤、着色剤などを含めて、補助剤を含んでよい。
【００３４】
本明細書では、「ワクチン組成物」という用語は、宿主中で免疫応答を誘導するのに有用な製薬上許容される媒体中の少なくとも１種の抗原又は免疫原を含む。ワクチン組成物は、医薬分野又は獣医学分野の当業者には公知の用量及び技法により、レシピエント動物の齢、性別、体重、種、及び状態などの因子並びに投与経路を考慮して、投与することができる。投与経路は、粘膜投与（例えば、口、鼻、肛門、膣）、又は非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、静脈内、又は腹腔内）による経皮的なものでよい。ワクチン組成物は、単独で投与することができ、或いは、他の治療又は療法と合わせて同時投与又は順次投与することもできる。投与形態には、懸濁剤、シロップ又はエリキシル剤、及び滅菌した懸濁液やエマルジョンなど非経口投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、又は静脈内投与（例えば、注射投与）用の調製物が含まれてよい。ワクチン組成物は、スプレーとして又は食品及び／若しくは水に混合して投与しても、滅菌水、生理食塩水、グルコースなど適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合して送達してもよい。この組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化剤又は増粘添加剤、保存剤、矯味剤、着色剤などの補助物質を含有してよい。過度に実験をすることなく、適切な調製物を調製するために、"Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990など標準的な製薬の教科書を参考にすることができる。
【００３５】
本発明は、
（１）宿主中で免疫応答を誘導することができるワクチン抗原又は免疫原を含有する水溶液、
（２）親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値が１３より大きく４０より小さい（ＨＬＢ＞１３、特にＨＬＢ≧１３．５、好ましくはＨＬＢ≧１４）非イオン性親水性界面活性剤、
（３）鉱油、
（４）非イオン性親油性界面活性剤、及び
（５）ＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤（９〜１３のＨＬＢ値）を含む、
新規な水中油（Ｏ／Ｗ）型アジュバント又はエマルジョンを提供する。
【００３６】
本発明に従って作製するエマルジョンは、界面活性剤の３種の異なるグループのメンバーから選択される少なくとも３種の界面活性剤の組合せをベースとしており、各グループに付属する１種又は複数の界面活性剤を使用することが可能である。
【００３７】
好ましい実施形態では、エマルジョン（本明細書では、これは、別段の定めがない限り、全成分を含む最終のエマルジョンを意味する）中の非イオン性親水性界面活性剤（５）の濃度は、エマルジョンの単位体積当たりの重量百分率（（ｗ／ｖ））として表して、１％〜８％、特に１．５％〜６％、好ましくは２％〜５％、より好ましくは２．５％〜４％である。
【００３８】
このグループの界面活性剤は、ＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤（９〜１３のＨＬＢ値）を含む。このグループには、それだけには限らないが、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル（特に５個のエトキシル基）（例えば「Tween 81（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタンモノオレエート）、エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステル、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル（特に２０個のエトキシル基）（例えば、「Tween 85（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタントリオレエート）、「Tween 65（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタントリステアレート、エトキシ化脂肪アルコール（特に５〜１０個のエトキシル基）（例えば、「Brij 76（登録商標）」、「Brij 56（登録商標）」、「Brij 96（登録商標）」）、エトキシ化脂肪酸（特に５〜１０個のエトキシル基）（例えば、「Simulsol 2599（登録商標）」、「Myrj 45（登録商標）」）、エトキシ化ヒマシ油（特に２５〜３５個のエトキシル基）（例えば、「Arlatone 650（登録商標）」、「Arlatone G（登録商標）」）、及びそれらの組合せが含まれる。
【００３９】
エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステル及びエトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルが好ましく、これら両方の種類の組合せも同様に好ましい。脂肪酸は、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。好ましいエトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルは、「Tween85（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタントリオレエート、又は「Tween65（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタントリステアレートを含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、非イオン性親水性界面活性剤（２）の濃度は、エマルジョンの単位体積当たりの重量百分率（（ｗ／ｖ））として表して、一般に、０．１％〜１．５％、特に０．２％〜１．４％、好ましくは０．３％〜１．３％、より好ましくは０．４％〜１．２％である。
【００４１】
この第２の界面活性剤のグループは、親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値の高い（ＨＬＢ＞１３、特にＨＬＢ≧１３．５、好ましくはＨＬＢ≧１４）非イオン性親水性界面活性剤を含む。このグループは、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル（特に２０個のエトキシル基）（例えば、「Tween 20（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタンモノラウレート、「Tween 40（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタンモノパルミテート、「Tween 60（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタンモノステアレート、「Tween 80（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタンモノオレエート）、エトキシ化脂肪アルコール（特に１５〜３０個のエトキシル基）（例えば、「Brij 78（登録商標）」、「Brij 98（登録商標）」、「Brij 721（登録商標）」）、エトキシ化脂肪酸（特に１５〜３０個のエトキシル基）（例えば、「Myrj 49（登録商標）」、「Myrj 51（登録商標）」、「Myrj 52（登録商標）」、「Myrj 53（登録商標）」）、非イオン性ブロックコポリマー（例えば、「Lutrol F127（登録商標）」や「Lutrol F68（登録商標）」）などのポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマー（ＰＯＥ−ＰＯＰ）（polyoxyehylene/polyoxypropylene copolymer）、及びそれらの組合せを含む。
【００４２】
非イオン性ブロックコポリマーの場合、比率はより低くてよく、具体的には０．１％〜０．５％、より具体的には０．２％〜０．４％（エマルジョンの単位体積当たりの重量（（ｗ／ｖ）））でよい。
【００４３】
好ましい界面活性剤（２）は、前述したもののような、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステルを含む。
【００４４】
好ましい実施形態では、非イオン性親油性界面活性剤（４）の濃度は、エマルジョンの単位体積当たりの重量百分率（（ｗ／ｖ））として表して、０．１％〜２．５％、特に０．２％〜２％、好ましくは０．２％〜１．５％、より好ましくは０．２％〜１．２％である。
【００４５】
このグループの界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、「Span 20（登録商標）」のようなソルビタンモノラウレート、「Span 40（登録商標）」などのソルビタンモノパルミテート、「Span 60（登録商標）」などのソルビタンモノステアレート、「Span 65（登録商標）」などのソルビタントリステアレート、「Span 80（登録商標）」のようなソルビタンモノオレエート、「Span 85（登録商標）」のようなソルビタントリオレエート、「Arlacel 987（登録商標）」などのソルビタンモノイソステアレート、「Crill 6（登録商標）」などのソルビタンイソステアレート）、マンニドの脂肪酸エステル（例えば、「Montanide 80（登録商標）」、モノオレイン酸マンニド（「Arlacel A（登録商標）」など）、ジオレイン酸マンニド、トリオレイン酸マンニド、テトラオレイン酸マンニド）、マンニドのエトキシ化脂肪酸エステル（２、３又は４個のエトキシル基）（例えば、「Montanide 888（登録商標）」、「Montanide 103（登録商標）」、エトキシ化モノオレイン酸マンニド、エトキシ化ジオレイン酸マンニド、エトキシ化トリオレイン酸マンニド、エトキシ化テトラオレイン酸マンニド）、及びそれらの組合せを含む。
【００４６】
脂肪酸は、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート及びそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。
【００４７】
好ましい界面活性剤（４）は、ソルビタン脂肪酸エステル、特に前述したもの、及びそれらの組合せを含む。
【００４８】
本発明の界面活性剤は、動物由来又は植物由来の脂肪酸を含んでよい。エマルジョンを調合する際にごくわずかに調整するだけで、ある由来元を別のものへ変更（例えば動物由来「Tween 80（登録商標）」を植物由来「Tween 80（登録商標）」に変更）できるはずである。
【００４９】
本発明によるエマルジョンは、エマルジョンの単位体積当たりの重量で、総濃度が１．２％〜１０％、特に２％〜８％、好ましくは３％〜７％、より好ましくは４％〜６％の界面活性剤を含んでよい。
【００５０】
一般に、本発明によるエマルジョンは、３３℃以上、具体的には３３℃〜６５℃の範囲、より具体的には３６℃〜６０℃、好ましくは３７℃〜５５℃、より好ましくは３８℃〜５０℃の転相温度（ＰＩＴ）（phase inversion temperature)を有していてよい。
【００５１】
ＰＩＴは、油中水型エマルジョンが水中油型エマルジョンに変化し、又は、相が変化する（エマルジョンの破壊及び２相の分離）温度である。ＰＩＴ値は、例えば、視覚的外観によって（例えば、実施例２を参照のこと）又は導電率によってなど、様々な手段で測定することができる。エマルジョンのＰＩＴより低い温度、例えば約２５℃で水浴中にエマルジョンを入れる。温度を徐々に上げる。エマルジョンの視覚的外観の変化、特に、流動性、粘性、２相の分離、表面に油相が移動することにより起こる表面の外観の変化を対照のエマルジョンと比べて観察する。視覚的外観の変化が観察された温度が、エマルジョンのＰＩＴ値である。或いは、エマルジョンの表面近くに装着したプローブによる測定した導電率の値が、約５〜８ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）（水中油型エマルジョン）から約０ｍＳ／ｃｍの値（油中水型エマルジョン）に急速に推移することから、ＰＩＴを決定する。転移が観察された温度が、エマルジョンのＰＩＴ値である。当業者なら、本発明によるエマルジョン、具体的には上記に定義した範囲内のＰＩＴ値を有するエマルジョンを過度の実験をせずに調製するために、個々の濃度を含めて、界面活性剤及び油の組合せを決定することができるであろう。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、本明細書で説明するエマルジョンは、イオン性界面活性剤、又はレシチンやサポニンなどイオン性界面活性剤の性質を有することが分かっている化合物をまったく含まない。一般に、本発明によるエマルジョンは、エマルジョンの単位体積当たりの体積で、３％〜５５％の油、特に５％〜５０％の油、好ましくは１０％〜４０％の油、より好ましくは２０％〜４０％の油を含んでよい。別段の定めがない限り、本明細書の値の範囲は、常に範囲の境界を含むものと定義する。
【００５３】
使用する油は、それだけには限らないが、イソパラフィン油などのパラフィン油、及び／又はナフテン油、スクアラン、プリスタン、ポリイソブテン油、水素添加ポリイソブテン油、ポリデセン油、ポリイソプレン油、ポリイソプロペン油などを含めて、鉱油でよい。本発明で有用な１種の有利な鉱油には、１５より多い、好ましくは１５〜３２個のいくつかの炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の炭素鎖を含み、芳香族化合物を含まない油が含まれ得る。このような油は、例えば、「MARCOL 52（登録商標）」若しくは「MARCOL 82（登録商標）」（Esso社製、フランス）又は「DRAKEOL 6VR（登録商標）」（Penreco社製、米国）の名称で市販されているものでよい。
【００５４】
油は、本明細書で記述する油の中から選択される少なくとも２種の油を任意の比率で含む、油の混合物でもよい。この油の混合物は、前述の油の中から選択される少なくとも１種の油及び少なくとも１種の植物油を含んでよく、また、この植物油は、油相の約０．１％〜約３３％、好ましくは約１０％〜約２５％（ｖ／ｖ）を占める。これらの植物油は、生分解性であり、好ましくは保管温度（約＋４℃）で液体であり、又は、少なくともこの温度で液状のエマルジョンを生じることを可能にする、オレイン酸に富む不飽和油である。例えば、この植物油は、ラッカセイ油、ナッツ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ダイズ油、オナガー（onager）油などでよい。
【００５５】
好ましい実施形態では、親水性界面活性剤（２）及び（５）は、分子中に同じ親水性部分を有する界面活性剤を含むことが好ましい。例えば、親水性界面活性剤（２）及び（５）のそれぞれに対してエトキシ化ソルビタン脂肪酸エステルを使用する。例えば、「Tween 85（登録商標）」をＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤として選択する場合、ＨＬＢ値の高い非イオン性親水性界面活性剤は、「Tween 80（登録商標）」などのエトキシ化ソルビタンで構成された親水性部分を有すると、有利である。
【００５６】
一般に、本発明は、それだけには限らないが、滅菌水、生理食塩水、グルコース、緩衝液などを含めて、獣医学的に又は製薬上許容される適切な媒体、賦形剤、又は希釈剤を含む水溶液の使用を企図する。媒体、賦形剤又は希釈剤は、ポリオール、糖質、又はｐＨ緩衝剤を含んでもよい。媒体、賦形剤、又は希釈剤は、例えば、アミノ酸、ペプチド、抗酸化薬、殺菌薬、静菌性化合物を含んでもよい。この水溶液を油及び界面活性剤に十分量加えて、本発明によるエマルジョンの１００％の体積を得る。
【００５７】
エマルジョンの親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）から、界面活性剤の親水力又は親油力を概算することが可能である。両親媒性分子のＨＬＢは、一般に以下のように算出される。
ＨＬＢ＝（２０×親水性部分の重量）／（両親媒性分子の重量）
【００５８】
ＨＬＢは、０（大半の親油性分子の場合）〜２０（大半の親水性分子の場合）の範囲の値をとり得る。界面活性剤の化学組成（特に、例えばエトキシル基又はアルケンオキシドの添加）によって、この概算が変わることがあり、また、ＨＬＢ値の範囲が大きくなることがある（例えば、「Lutrol F68（登録商標）」のＨＬＢは２９である）。界面活性剤の混合物に関しては、混合物のＨＬＢは、重量比によって重み付けした、各界面活性剤のＨＬＢの加算値である。
ＨＬＢ＝｛（界面活性剤ＸのＨＬＢ×界面活性剤Ｘの重量）＋（界面活性剤ＹのＨＬＢ×界面活性剤Ｙの重量）｝／（界面活性剤Ｘの重量＋界面活性剤Ｙの重量）
【００５９】
本発明に従って作製するエマルジョンの一実施形態では、エマルジョンの最終ＨＬＢは、約９〜約１２、好ましくは約９．５〜約１１．５、より好ましくは約１０〜約１１．５である。
【００６０】
本発明は、パラフィン油（具体的には、エマルジョンの単位体積当たりの体積（ｖ／ｖ）で表して、約１０％〜約４０％、好ましくは約２０％〜約４０％の濃度）、ソルビタン脂肪酸モノエステル（非イオン性親油性界面活性剤として）、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル（ＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤として）、及びエトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステル（ＨＬＢ値の高い非イオン性親水性界面活性剤として）を含むエマルジョンを企図する。具体的には、このソルビタン脂肪酸モノエステルは、ソルビタンモノオレエート（具体的には、エマルジョンの単位体積当たりの重量（（ｗ／ｖ））で表して、０．２〜１．５％、好ましくは０．２％〜１．２％の濃度）であり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルは、エトキシ化ソルビタントリオレエート（具体的には、２％〜５％、好ましくは２．５％〜４％の濃度（ｗ／ｖ））であり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸モノエステルは、エトキシ化ソルビタンモノオレエート（具体的には、０．３％〜１．３％、好ましくは０．４％〜１．２％（ｗ／ｖ）の濃度）である。例えば、このエマルジョンは、エマルジョンの単位体積当たりの体積で約２９．３％のパラフィン油と、エマルジョンの単位体積当たりの重量で０．６％のソルビタンモノオレエートと、エマルジョンの単位体積当たりの重量で３．４％のエトキシ化ソルビタントリオレエートと、エマルジョンの単位体積当たりの重量で０．７５％のエトキシ化ソルビタンモノオレエートとを含む。
【００６１】
本発明による第２の実施形態では、エマルジョンは、パラフィン油（具体的には、１０％〜４０％、好ましくは２０％〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度）、ソルビタン脂肪酸モノエステル（非イオン性親油性界面活性剤として）、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステル（ＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤として）、及び非イオン性ブロックコポリマー（ＨＬＢ値の高い非イオン性親水性界面活性剤として）を含む。具体的には、このソルビタン脂肪酸モノエステルは、ソルビタンモノオレエート（具体的には、０．２％〜１．５％、好ましくは０．２％〜１．２％（ｗ／ｖ）の濃度）であり、エトキシ化ソルビタン脂肪酸トリエステルは、エトキシ化ソルビタントリオレエート（具体的には、２％〜５％、好ましくは２．５％〜４％（ｗ／ｖ）の濃度）であり、非イオン性ブロックコポリマーは、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンポリマー（ＰＯＥ−ＰＯＰ）（具体的には、０．１％〜０．５％、好ましくは０．２％〜０．４％（ｗ／ｖ）の濃度）である。例えば、このエマルジョンは、約２９．３％（ｖ／ｖ）のパラフィン油と、０．６％（ｗ／ｖ）のソルビタンモノオレエートと、３．４％（ｗ／ｖ）のエトキシ化ソルビタントリオレエートと、０．２５％（ｗ／ｖ）のエトキシ化ソルビタンモノオレエートとを含む。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明は、
（１）薬物や免疫原などの活性成分、好ましくは免疫原を含有する水溶液と、
（２）鉱油と、
（３）非イオン性親油性界面活性剤と、
（４）エトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルからなるＨＬＢ値の低い非イオン性親水性界面活性剤（１１〜１３のＨＬＢ値を有することができる）とを含む、
注射可能な水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを企図する。
【００６３】
この実施形態によるエマルジョンは、最大２０個のエトキシ基を含み得るエトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含む。脂肪酸は、動物由来でも植物由来でもよく、オレエート、パルミテート、ステアレート、イソステアレート、ラウレート、及びそれらの組合せからなる群から選択され得る。一実施形態では、エトキシ化脂肪酸はオレエートであることが好ましい。他の成分、並びにＰＩＴなどエマルジョンの一般的特性は、前述のものと同じ特徴を有していてよい。
【００６４】
界面活性剤（４）は、エトキシ化ソルビタンジオレエート、エトキシ化ソルビタンジステアレート、又はエトキシ化ソルビタンジイソステアレート、エトキシ化ソルビタンジパルミテート、エトキシ化ソルビタンジラウレート、及びそれらの組合せなどのエトキシ化ソルビタン脂肪酸ジエステルを含むことが好ましい。
【００６５】
場合によっては、それだけには限らないが、ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（oligonucleotide）、具体的にはODN2006、2007、2059、又は2135 (Pontarollo R.A. et al, Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103)；ポリＡ−ポリＵ ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03)；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡ）（dimethyldioctadecylammonium bromide）("Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157)、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（「Avridine（登録商標）」など）（同書、p.148)、カーボマー、キトサン（例えば、米国特許出願第５９８０９１２号を参照のこと）を含めて、コアジュバントとして他の化合物をエマルジョンに加えてよい。
【００６６】
本発明は、少なくとも１種の抗原又は免疫原と、本発明に従って作製したアジュバント又はエマルジョンとを含むワクチン組成物又は免疫組成物を作製する方法も提供する。免疫原は、エマルジョンを形成する間に組み込んでもよく、又は、代替の実施形態では、後で、例えば使用の直前に免疫原をエマルジョンに加えてもよい。
【００６７】
最初に生成されるエマルジョン中に、使用する水溶液の全量が存在してもよい。或いは、この水溶液の一部分だけをエマルジョン形成のために使用し、免疫原の組込み後に残りの量の水溶液を加えてもよい。免疫原又は抗原は、凍結乾燥した形態で、又は他の何らかの適切な固形で存在していて、次にエマルジョンと混合してもよく、或いは、抗原を溶液、特に水溶液に溶かし、この溶液をエマルジョンと混合してもよい。
【００６８】
界面活性剤は、その溶解性に応じて、油又は水溶液に加えることが好ましい。例えば、本発明によれば非イオン性親油性界面活性剤は、油に加えられるが、一方、ＨＬＢ値の高い非イオン性親水性界面活性剤は水溶液に加えられる。
【００６９】
乳化は、当業者には既知の従来の方法によって行うことができる。例えば、本発明の一実施形態では、エマルジョンのＰＩＴより低い温度、具体的には室温、例えば約２５℃でエマルジョンを調製することができる。機械攪拌によって、例えば、高せん断力を生じることができるローター／ステーターを装備したタービンを用いて、水性相及び油相を一緒に混ぜる。攪拌は、低い回転速度で開始して、通常は油中に水溶液を徐々に添加するのとともにゆっくりと速めることが好ましい。水溶液を、油に徐々に加えることが好ましい。油／水溶液の比は、油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルジョンを得るために適合させることができ、例えば、油の約４０％〜約５５％（ｖ／ｖ）の濃度である。攪拌を止めると、エマルジョンは、徐々にＯ／Ｗ型エマルジョンに変化する（転相）。転相後、必要なら、水溶液を加えることによりエマルジョンを希釈して、最終のエマルジョン中に入る油を所望の濃度にする。このエマルジョンは、約５℃で保管することができる。
【００７０】
別の実施形態では、エマルジョンのＰＩＴより高い温度で、エマルジョンを調製することができる。第１の工程では、エマルジョンのＰＩＴより高い温度で、水性相及び油相を一緒に混ぜる。水溶液を、油に徐々に加えることが好ましい。油／水溶液の比は、油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルジョンを得るために適合させることができ、例えば、油の約４０％〜約５５％（ｖ／ｖ）の濃度である。低いせん断力で、又はせん断力を加えずに攪拌することによって、例えば、静止型混合機若しくはマリンヘリックス（marine helix)を用いて、又はタービンを極めて低い回転速度で用いて、乳化を行うことができる。得られるエマルジョンは、油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルジョンである。第２の工程では、エマルジョンを徐々にＰＩＴより低い温度に冷やす。この工程の間に、エマルジョンは、Ｏ／Ｗ型エマルジョンに変化する（転相）。転相後、必要なら、水溶液を加えることによりエマルジョンを希釈して、最終のエマルジョン中に入る油を所望の濃度にする。このエマルジョンは、約５℃で保管することができる。
【００７１】
エマルジョン中の液体粒子のサイズは、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍになり得る。このエマルジョンは、例えば、ワクチン組成物又は薬剤組成物を調合するためのアジュバントとして使用してよい。このエマルジョンは、例えば、弱毒化した微生物又は生きた組換ベクターを含有している乾燥製品、特に凍結乾燥した製品を溶解させるための溶媒として使用してもよい。
【００７２】
特定の実施形態では、水溶液の一部分だけを用いてプレエマルジョンを作製する。薬物又は免疫原などの活性成分、好ましくは免疫原の懸濁液を加えることによりこのプレエマルジョンを希釈して、最終組成物を得ることができる。或いは、水溶液でプレエマルジョンを希釈し、凍結乾燥製品などの乾燥製品を溶解させるのに使用してもよい。
【００７３】
本発明で使用するのに適した免疫原又は抗原は、免疫原性挿入物を有するプラスミドを含めて、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、免疫原性のサブユニット（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン）、又は組換え発現ベクターからなる群から選択してよい。本発明の一実施形態では、この免疫原は、不活性化した、又は殺した微生物である。本発明の別の実施形態では、ワクチン組成物は、それだけには限らないが、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ゲルトネル菌（Salmonella enteritidis）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（Infectious Bronchitis virus）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（Newcastle Disease virus）、産卵低下症候群ウイルス（ＥＤＳ）（egg drop syndrome virus）、又は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（Infectious Bursal Disease virus）、トリインフルエンザウイルスなど、及びそれらの組合せを含めて、トリ病原体の群から選択される免疫原を含む。
【００７４】
或いは、このワクチン組成物は、それだけには限らないが、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）（feline herpesvirus）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）（feline calicivirus）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）（feline leukemia virus）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）（feline immunodeficiency virus）、狂犬病ウイルスなど、及びそれらの組合せなどネコの病原体から選択される免疫原を含む。
【００７５】
さらに別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、それだけには限らないが、狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）（canine herpesvirus）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）（canine parvovirus）、イヌコロナウイルス、犬型レプトスピラ（Leptospira canicola）、黄疸出血性レプトスピラ（Leptospira icterohaemorragiae）、レプトスピラグリッポチフォーサ（Leptospira grippotyphosa）、ボレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）など、及びそれらの組合せを含めて、イヌの病原体から選択される免疫原を含む。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、ウマヘルペスウイルス（１型又は４型）、ウマインフルエンザウイルス、テタヌス、西ナイルウイルスなど、又はそれらの組合せなどウマの病原体から選択される免疫原を含む。
【００７７】
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、狂犬病ウイルス、ウシロタウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ｂＰＩＶ−３）（bovine parainfluenza virus type 3）、ウシコロナウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）（bovine viral diarrhea virus）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（foot and mouth disease virus）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）（bovine respiratory syncytial virus）、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus）、大腸菌、パスツレラマルトシダ、パスツレラヘモリティカなど、及びそれらの組合せなどウシの病原体から選択される免疫原を含む。
【００７８】
本発明のさらに別の実施形態では、組成物は、それだけには限らないが、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）（swine influenza virus）、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）（porcine circovirus type 2）、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）（porcine reproductive respiratory syndrome virus）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）（pseudorabies virus）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）（porcine parvovirus）、ＦＭＤＶ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、豚丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、パスツレラマルトシダ、気管支敗血症菌、大腸菌など、及びそれらの組合せなどブタの病原体から選択される免疫原を含む。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態は、製薬上許容される媒体中に少なくとも１種の免疫原及びエマルジョンを含むワクチン組成物を提供する。ウイルス、細菌、真菌などを含む免疫原は、適切な培養培地又は宿主細胞系統を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養方法、及び当業者には公知の従来の方法によって作製することができる。例えば、ＰＲＲＳは、ＭＡ−１０４細胞系統など適切な細胞系統で培養することができる（特に、米国特許出願第５５８７１６４号、第５８６６４０１号、第５８４０５６３号、第６２５１４０４号を参照のこと）。同様の方法で、ＰＫ−１５細胞系統を用いて、ＰＣＶ−２を培養することができ（米国特許出願第６３９１３１４号を参照のこと）、卵上でSIV を培養することができ（米国特許出願第６０４８５３７号）、適切な培養培地中で、マイコプラズマ・ハイオニューモニエを培養することができる（米国特許出願第５９６８５２５号、米国特許第５３３８５４３号、Ross R. F. et al., Am. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905）。
【００８０】
不活性化した免疫組成物又はワクチン組成物を得るために、回収後に病原体を不活性化することが好ましく、場合によっては、例えば、ホルマリン若しくはホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）（binary ethyleneimine）、チメロサールなどを用いる化学的処理、及び／又は物理的処理（例えば熱処理又は音波処理）により清浄化する。不活性化の方法は、当業者には公知である。例えば、ＰＲＲＳウイルスは、β−プロピオラクトン処理により(Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370)、又はＢＥＩ処理により（米国特許出願第５５８７１６４号）、不活性化することができ、ＰＣＶ−２ウイルスの不活性化は、エチレンイミン処理により、又はβ−プロピオラクトン処理により（米国特許出願第６３９１３１４号）行うことができ、ブタインフルエンザウイルスは、Tritonのような洗浄剤を用いて、又はホルムアルデヒド処理によって（米国特許出願第６０４８５３７号）不活性化することができ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌は、ホルムアルデヒド処理により（Ross R. F.、前掲書）、エチレンイミン処理若しくはＢＥＩ処理により（国際公開第９１／１８６２７号を参照のこと）、又はチメロサール処理（米国特許出願第５９６８５２５号及び第５３３８５４３号）により、不活性化することができる。
【００８１】
不活性化した病原体は、従来の濃縮技術、具体的には限外ろ過によって濃縮することができ、且つ／又は従来の精製手段、具体的には、それだけには限らないが、ゲルろ過を含めたクロマトグラフィー技術、ショ糖密度勾配超遠心法、又は、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（polyethylene glycol）の存在下での選択的沈殿を用いて、従来の精製技術によって精製することができる。
【００８２】
本発明によるワクチン組成物で有用な免疫原には、発現ベクターも含まれる。このようなベクターには、それだけには限らないが、ポリヌクレオチドベクターやプラスミドなどのｉｎ  ｖｉｖｏ組換え発現ベクター（欧州特許出願公開第１００１０２５号；Chaudhuri P, Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-6）、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、鶏痘ベクター（米国特許出願第５１７４９９３号、第５５０５９４１号、及び第５７６６５９９号）やカナリア痘ベクター（米国特許出願第５７５６１０３号）などのポックスウイルスベクターなどのウイルスベクター、又は細菌ベクター（大腸菌又はサルモネラ菌種）が含まれる。
【００８３】
本発明は、多価の免疫組成物又は混合ワクチン組成物の製剤も包含する。例えば、本発明に従って作製した本発明の混合ウシ細菌ワクチンで有用な抗原には、それだけには限らないが、ウシ・マイコプラズマ（Mycoplasma bovis）、パスツレラ菌種、特にＰ．マルトシダ及びＰ．ヘモリティカ（haemolytica）、ヘモフィルス菌種、特にＨ．ソムナス、クロストリジウム菌種、サルモネラ、コリネバクテリウム、ストレプトコッカス（Streptococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、モラクセラ（Moraxella）、大腸菌などが含まれる。
【００８４】
本発明は、本発明による免疫組成物又はワクチン組成物を宿主に投与するステップを含む、宿主、例えば動物中で免疫応答を誘導するための方法もさらに提供する。この方法で誘発される免疫応答は、具体的には抗体反応及び／又は細胞性免疫応答、特にγ−インターフェロン応答である。
【００８５】
具体的には、本発明は、動物の病原生物への感染（例えば、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生性原虫による感染）に対して免疫性を与え、又はその感染によって引き起こされる症状を予防若しくは軽減するための方法を提供する。本発明の方法は、それだけには限らないが、ヒト、イヌ科の動物（例えば、イヌ）、ネコ科の動物（例えば、ネコ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ウシ亜科の動物（例えばウシ）、及びブタ系の動物（例えば、ブタ）を含めた脊椎動物、並びに、それだけには限らないが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、及び平胸類（ダチョウ、エミュー、ヒクイドリなど）を含めたトリにおいて有用である。
【００８６】
本発明の特定の態様では、これらの方法は、本発明に従って作製したワクチン組成物を投与することにより、分娩前に妊娠中のメスにワクチン接種することからなる。これらの方法は、ワクチン接種プロトコールにより誘発される防御抗体の誘導、及びワクチン接種された妊娠中のメスからその子孫へのこれら防御抗体の移行もさらに含む。このような母性抗体が移行されると、続いてその子孫が疾患から保護される。
【００８７】
本発明に従って作製したワクチン組成物の用量は、ワクチンを接種される動物の種、品種、齢、大きさ、ワクチン接種歴、及び健康状態に応じて変わる。抗原濃度、追加のワクチン成分、及び投与経路（即ち、皮下、皮内、経口、筋肉内、又は静脈内投与）のような他の因子も、有効用量に影響を及ぼす。投与するワクチン用量は、ワクチンの抗原濃度、投与経路、並びにワクチンを接種される動物の齢及び状態に基づき、容易に決定できる。抗原の各回分量は、個別に調整することができる。或いは、様々な用量の系統的な免疫原性試験、並びにＬＤ５０試験及び他のスクリーニング手順を使用して、過度の実験をすることなく、本発明によるワクチン組成物の有効用量を決定することができる。以下に示す実施例から、およそどれくらいの用量及びおよそどれくらいの体積が、本明細書で記述するワクチン組成物を使用するのに適切であるかが用意に明らかになるであろう。その用量が、自然感染に関連する死亡率及び罹患率の低下により証明されるような、自然感染に対する少なくとも部分的な防御効果を与えているということが、重要な要素である。同様に、適切な体積は、当業者によって容易に確認される。例えば、トリの種では、用量の体積は、約０．１ｍｌ〜約０．５ｍｌ、有利には、約０．３ｍｌ〜約０．５ｍｌである。ネコ、イヌ及びウマの種では、用量の体積は、約０．２ｍｌ〜約３．０ｍｌ、有利には約０．３ｍｌ〜約２．０ｍｌ、より有利には、約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌでよい。ウシ及びブタの種では、用量の体積は、約０．２ｍｌ〜約５．０ｍｌ、有利には約０．３ｍｌ〜約３．０ｍｌ、より有利には０．５ｍｌ〜約２．０ｍｌでよい。
【００８８】
最初に、又は最後の投与から長時間が経過しているときに免疫応答を高めるためには、定期的な時間間隔でワクチンを反復接種することが好ましいことがある。 本発明の一実施形態では、非経口的な注射剤として（即ち、皮下、皮内、又は筋肉内に）、ワクチン組成物を投与する。組成物は、１回量で投与してもよく、或いは、代替の実施形態では、約２〜約６週間、好ましくは約２〜約５週間の間隔で約２〜約５回投与する反復投与で投与してもよい。しかし、投与回数及びワクチン接種の間の時間間隔は、それだけには限らないが、ワクチン接種される動物の齢、動物の状態、免疫感作の経路、用量当たりの利用可能な抗原量などを含めて、いくつかの因子に応じて変わることが、当業者には認識されよう。初回のワクチン接種である場合は、期間は、通常、１週間より長く、好ましくは、約２〜約５週間となる。ワクチン接種歴のある動物の場合は、妊娠前又は妊娠中に、追加免疫用のワクチン接種を約１年間隔で実施してよい。
【００８９】
本発明は、「Pigjet（登録商標）」、「Avijet（登録商標）」、「Dermojet（登録商標）」又は「Biojector（登録商標）」（Bioject社製、オレゴン州、米国）などの針なし注射器を用いて、ワクチン組成物を投与することも企図する。当業者なら、過度に実験をすることなく、ワクチンを接種される動物の種、その動物の齢及び体重などの因子に対して必要に応じて、注射器の仕様を調整することができる。
【００９０】
本発明の一実施形態では、この方法は、本発明によるエマルジョンと調合したワクチン組成物の単回投与を含む。例えば、一実施形態では、このワクチン組成物は不活性化したマイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチンであり、一方、代替実施形態では、不活性化したＰＣＶ２ウイルス組成物を含むワクチンが提供される。それだけには限らないが、不活性化したＰＲＲＳ及びＳＩＶを含めて、他の免疫組成物又はワクチンが、単回投与療法で使用するのに適している。具体的には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチン組成物の場合、ブタが生まれてから屠殺されるまでの間、特に約３〜約５６日齢、好ましくは約１０〜約３５日齢、より好ましくは約１５〜約３０日齢の間に、単回投与を行うことができる。ワクチンは、既存の抗体の存在下でも、投与してよい。
【００９１】
本発明はさらに、本発明に従って作製し、また、タンパク質若しくはペプチド、抗体、アレルゲン、ＣｐＧ  ＯＤＮ、成長因子、サイトカイン、又は抗生物質、特にＣｐＧ  ＯＤＮ又はサイトカインからなる群から選択される少なくとも１種の免疫原を含む薬剤組成物を宿主に投与するステップを含む、宿主、例えば、動物を治療するための方法にも関する。これらの薬剤組成物を使用して、ニワトリ、ブタ、又は乳牛などの動物の発育能力を改善することができる。
【００９２】
本発明はさらに、免疫原や薬剤組成物などの成分を含む第１のバイアルと、第２のバイアル中に入れた、本発明に従って作製したエマルジョンとを備える、キットに関する。免疫原は、本明細書で記述するように、凍結乾燥した形態でも、乾燥形態でも、水溶液に溶かしたものでもよい。
【００９３】
次に、以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００９４】
エマルジョン製造法
以下に記述する２つの工程でエマルジョンを作製した。
【００９５】
第１工程：Silverson社製のハイシアーローター／ステーター式乳化機（直径１０ｍｍの粉砕用ヘッドが付いたＬ４ＲＴタイプ）を用いて、調合物を作製した。エマルジョンを得るために、２５℃で、１体積の油相を１体積の水性相＃１で乳化した。１分間、５０００ｒｐｍ（１分当たり回転数）で攪拌しながら、水性相を油相に加えた。体積の増加に伴ない、１分間の間に、回転速度を徐々に８３００ｒｐｍまで高めた。この工程の間、エマルジョンは油中水型エマルジョンであった。ＴＳ６エマルジョンの場合、相の組成は以下のとおりであった。
油相（１２０ｍｌ）：
−  ソルビタンモノオレエート（「Span 80（登録商標）」）            ：１．８％（ｗ／ｖ）
−  ソルビタントリオレエート（２０  ＯＥ）（「Tween 85（登録商標）」）：１０．２％（ｗ／ｖ）
−  パラフィン油（「Marcol 82（登録商標）」）                        ：８８％（ｖ／ｖ）、
水性相＃１（１２０ｍｌ）：
−  ２０％（ｗ／ｖ）ソルビタンモノオレエート溶液（２０  ＯＥ）（「（Tween 80（登録商標）」）                                                              ：１１．２５％（ｗ／ｖ）
−  リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）：８５．７５％（ｖ／ｖ）
−  ナトリウムメルクロチオレート（「Thiomersal（登録商標）」）の１％水溶液：１．５％（ｖ／ｖ）
【００９６】
ソルビタンモノオレエート（「Span 80（登録商標）」）及びソルビタントリオレエート（２０  ＯＥ）（「Tween 85（登録商標）」）を油相に添加した。ソルビタンモノオレエート（２０  ＯＥ）（「Tween 80（登録商標）」）は、パラフィン油に混和性がなかった。ワクチンと同じ緩衝液、例えば、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）中に溶かして、「Tween 80（登録商標）」の２０％（（ｗ／ｖ））溶液を調製した。ナトリウムメルクロチオレートは、保存剤の役割を果たし、エマルジョンに不可欠なものではない。
【００９７】
攪拌を止めると、エマルジョンは、水中油型エマルジョンに変化した。このエマルジョンを少なくとも４時間、５℃の冷室に置いた。この段階では、エマルジョンは、油相を５０％含有するプレエマルジョンであった。
【００９８】
第２工程：免疫原（後述するような、不活性化したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原、又はＰＣＶ−２免疫原）を含むｐＨ７．８のリン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液１２０ｍｌを用いて、水性相＃２を調製した。第１の工程で調製したプレエマルジョンを約５℃まで冷却し、同じ温度で２分の１体積の水性相＃２を加えて希釈し、１分間マグネチックバーを回転させて混合した。ＴＳ６エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、４．７５％（（ｗ／ｖ））であった。
【００９９】
本明細書で調製したＴＳ６ワクチンは、５℃で少なくとも１年間安定である。
【０１００】
同じ調整法を用いて、後述するように、他のエマルジョンを得ることができる。
【０１０１】
ＴＳ７エマルジョン：
ＴＳ７エマルジョンは、油相を３３％含有するＯ／Ｗ型エマルジョンである。油相（１２０ｍｌ）は、「Marcol 82（登録商標）」を８８％（ｖ／ｖ）、「Span 80（登録商標）」を１．８％（ｗ／ｖ）、及び「Tween 85（登録商標）」を１０．２％（ｗ／ｖ）含む。水性相＃１（１２０ｍｌ）は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）を９７．７５％（ｖ／ｖ）、「Thiomersal（登録商標）」１％水溶液を１．５％（ｖ／ｖ）、及び「Lutrol F127（登録商標）」を０．７５％（ｗ／ｖ）含む。水性相＃２（１２０ｍｌ）は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）で構成され、場合によっては免疫原を含有する。ＴＳ７エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、４．２５％（ｗ／ｖ）である。
【０１０２】
ＴＳ８エマルジョン：
ＴＳ８エマルジョンは、油相を５０％含有するＯ／Ｗ型エマルジョンである。油相（１６０ｍｌ）は、「Marcol 82（登録商標）」を９２％（ｖ／ｖ）、「Span 85（登録商標）」を１．８％（ｗ／ｖ）、及び「Brij 96（登録商標）」を６．２％（ｗ／ｖ）含む。水性相＃１（１６０ｍｌ）は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）を９８．５％（ｖ／ｖ）、「Thiomersal（登録商標）」１％水溶液を１．０％（ｖ／ｖ）、及び「Lutrol F127（登録商標）」を０．５％（ｗ／ｖ）含み、場合によっては免疫原を含有する。ＴＳ８エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、４．２５％（ｗ／ｖ）である。
【０１０３】
ＴＳ９エマルジョン：
ＴＳ９エマルジョンは、油相を１０％含有するＯ／Ｗ型エマルジョンである。油相（１２０ｍｌ）は、「Marcol 82（登録商標）」を６０％（ｖ／ｖ）、「Span 40（登録商標）」を１７．２％（ｗ／ｖ）、及び「Arlatone 650（登録商標）」を２２．８％（ｗ／ｖ）含む。水性相＃１（１２０ｍｌ）は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）を９７．５％（ｖ／ｖ）、及び「Tween 20（登録商標）」を２．５％（ｗ／ｖ）含む。水性相＃２は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）４００ｍｌで調製され、場合によっては免疫原を含有する。１００ｍｌのプレエマルジョンを、４００ｍｌの水性相＃２で希釈して、ＴＳ９エマルジョンを得た。ＴＳ９エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、４．２５％（ｗ／ｖ）である。
【実施例２】
【０１０４】
エマルジョンの転相温度（ＰＩＴ）の測定
温度約２５℃の水浴中のガラス管中に、１０ｍｌのＴＳ６エマルジョンを入れた。ＴＳ６エマルジョンは、白色の均一なエマルジョンであった。水浴の温度を徐々に高くした。エマルジョンの変化が視覚的に観察された（エマルジョンは、黄褐色の油相が表面へ移動したことにより、２つの分離した相になった）。この変化は、エマルジョン破壊の特徴である。この変化が観察される温度が、エマルジョンのＰＩＴ値である。ＴＳ６エマルジョンのＰＩＴは４０〜４５℃であり、ＴＳ７エマルジョンのＰＩＴは４４〜４９℃であった。
【実施例３】
【０１０５】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチン組成物及びヘテロロガス攻撃
材料及び方法：実施例１で記述したようにして調製したＴＳ６エマルジョン、及びワクチン１ｍｌ当たり８．７ｌｏｇ１０  ＣＣＵ（色調変化単位（color changing unit））の濃度の不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、ＢＱ１４系統（Kobisch M. et al., Ann. Inst. Pasteur Immunol., 1987, 138:693-705）を含有するワクチン組成物を調合した。母性抗体を有する（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ血清陽性の雌ブタから生まれた）３週齢の２２匹の子ブタを、無作為に２つの群に割り当てた。１０匹の子ブタからなる１つの群には、第０日に、２ｍｌのワクチン組成物を筋肉内注射によってワクチン接種し、一方、１２匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。
【０１０６】
実験期間中に選択した間隔（第０、２７、４２、及び５６日）で、双方の群の子ブタから鼻スワブを採取し、ＥＬＩＳＡによって抗ＢＱ１４分泌型抗体を測定した。２７日目に、子ブタから血を採り、末梢血中のＩＦＮγレベルを測定するために末梢血単核球（ＰＢＭＮ）を得た。２８日目に、約６．６ｌｏｇ１０  ＣＣＵ／ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエＭｐ８８ｃ系統（デンマークの病気のブタから単離し、Kobisch and Friis in Rev. Sci. Tech. Off.Int. Epiz. 1996, 15: 1569-1605に記載されているように培養した系統）を含有する溶液で、各外鼻孔に約５ｍＬを塗布してすべての子ブタを経鼻的に攻撃した。この攻撃を２４時間後に繰り返し行った。ブタを屠殺し、死体解剖をして肺を集めた。７つの肺葉のそれぞれについて病変の表面積を概算することにより（葉全体の表面に対する百分率として表して）、肺のスコアを決定した。スコアは、以下のように割り当てられた。
【０１０７】
【表１】
2006528647.tif 000003
各肺の個々の葉について得られたスコアを加えて合計スコアを計算したところ、動物１匹当たりの最大スコアは２８となった。
【０１０８】
結果：ＴＳ６ワクチン製剤をワクチン接種したブタは、強い細胞性応答を示し、この応答は、５×１０５個の末梢血単核球（ＰＢＭＮ）からＩＦＮγを分泌しているスポットの数によって実証されているように、対照群より有意に高いものであった。ワクチン接種群のブタのスポット数の平均は、ワクチン接種されていない対照群で１１（標準偏差５）であったのに対し、１３９（標準偏差２５）であった。
【０１０９】
【表２】
2006528647.tif 000004
【０１１０】
ワクチン接種群及び対照群における抗ＢＱ１４分泌型抗体のレベルを以下の表にまとめて示す。この結果は、ワクチン接種されたブタの方が、未処置の対照群と比べて、攻撃の２〜３週間後に有意に高いレベルの分泌型抗体を有することを示している。
【０１１１】
【表３】
2006528647.tif 000005
【０１１２】
ここで図１を参照すると、ＴＳ６ワクチン組成物をワクチン接種した動物は、未処置の対照群の平均肺スコアが７．８±４．１であるのに対し、２．１±１．９（平均値±標準偏差）の平均肺スコアを示している。これらの結果は、ワクチン接種されていない対照群と比べて、ワクチン組成物をワクチン接種したブタにおいて肺病変が有意に低下したことを示している。
【実施例４】
【０１１３】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエのヘテロロガス攻撃に対する防御の持続
材料及び方法：母性抗体を有する（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ血清陽性の雌ブタから生まれた）３週齢の３８匹の子ブタを、以下のように、無作為に３つの群に割り当てた。
第１群（１２匹のコブタ）には、第０日に、実施例３で記述したワクチン組成物２ｍｌを筋肉内経路によりワクチン接種した。
第２群（１２匹のコブタ）には、第０日に、市販のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの不活性化ワクチン２ｍｌを筋肉内注射によりワクチンを接種した。
第３群（１４匹の子ブタ）は、ワクチンを接種されていない対照群の役割を果たした。
【０１１４】
ワクチン接種の２０週後に、前述したマイコプラズマ・ハイオニューモニエＭｐ８８ｃの攻撃用系統（６．６ｌｏｇ１０  ＣＣＵ／ｍｌ）を外鼻孔当たり約５ｍｌ用いて、すべての子ブタを経鼻的に攻撃した。この攻撃を２４時間後に繰り返し行った。前述したように、すべての群から血液を採取し、ＩＦＮγレベルを測定するために末梢血単核球（ＰＢＭＮ）（peripheral blood mononuclear cells）を得た。各群について、第１３８日に抗ＢＱ１４  ＩｇＡ及びＩｇＧ１血清抗体を測定した。死体解剖後、上記の実施例３で記述したようにして、肺スコア（平均値+標準偏差）を計算した。
【０１１５】
結果：ここで図２を参照すると、ＴＳ６ワクチン組成物をワクチン接種した第１群は、０．４±０．９の平均肺スコアを示し、市販のワクチンを接種した子ブタ群の肺スコア（４．０±５．１）又はワクチンを接種されていない対照群の肺スコア（６．１±５．８）からの統計学的に有意な低下を実証した。
【０１１６】
第１３８日に各群から採取した血清中の抗ＢＱ１４  ＩｇＡ及びＩｇＧ１循環抗体の平均結果（±標準偏差）を以下にまとめて示す。
【０１１７】
【表４】
2006528647.tif 000006
【０１１８】
以下の表は、５×１０５個の末梢血単核球（ＰＢＭＮ）について、末梢血中でγ−インターフェロン（ＩＦＮγ）を分泌しているスポットの数の平均結果（±標準偏差）をまとめたものである。
【０１１９】
【表５】
2006528647.tif 000007
【０１２０】
不活性化ワクチンを用いたときに予想されたように、ワクチン接種後１３８日の時点で検出可能な抗ＢＱ１４  ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の出現率は、２８日時点よりはるかに低かった。興味深いことに、ＴＳ６をワクチン接種したブタの大半は１３８日時点でもなお陽性であり、この群では細胞性応答が維持されていることが示唆された。１５２日時点（攻撃の１３日後）で循環している抗ＢＱ１４  ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の出現率は、これら３つの群の間で大きく異なっていた。ＴＳ６をワクチン接種した群は、他の群とは対照的に、極めて高い細胞性応答を示した。この結果は、攻撃が、ＴＳ６ワクチンにより誘導された免疫記憶を効率的に呼び戻すことを示唆している。
【実施例５】
【０１２１】
ＴＳ６エマルジョンによるＰＣＶ−２アジュバントワクチンの１回量を投与した後の血清分析の結果
材料及び方法：２〜３ヶ月齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）（specific pathogen-free）子ブタ１０匹を無作為に２群に割り当てた。５匹の子ブタからなる１つの群には、１回量当たり６．８ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０の不活性化ＰＣＶ−２（imp1010系統）を含有するワクチン２ｍｌを（第０日に）筋肉内経路によりワクチン接種した（ワクチン接種群）。５匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。ＥＬＩＳＡによってＰＣＶ−２  ＯＲＦ２抗体の力価測定をするために、ワクチン接種後０日、７日、１４日、２１日、及び２８日に血液サンプルを採取した。
【０１２２】
結果：以下の表で示すように、すべてのワクチン接種ブタが、ワクチン接種の７〜４０日後に有意な抗ＰＣＶ−２  ＯＲＦ２抗体応答を示した。
【０１２３】
【表６】
2006528647.tif 000008
【実施例６】
【０１２４】
ＴＳ６エマルジョンによるＰＣＶ−２アジュバントワクチンにより誘発される、攻撃に対する防御
材料及び方法：４〜５日齢のＳＰＦ子ブタ１６匹を以下のように無作為に２群に割り当てた。８匹の子ブタからなる１つの群には、１回量当たり７．５５ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０の不活性化ＰＣＶ−２（imp1010系統）を含有するワクチン２ｍｌを、第０日及び２１日に、筋肉内注射によって２回ワクチン接種した（ワクチン接種群）のに対し、８匹の子ブタからなる対照群にはワクチンを接種しなかった。３５日目に、１ｍｌ当たり約５．５ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０を含有するＰＣＶ−２  Imp1011-48285系統（アクセッション番号Ｖ９８０１１６０８でＥＣＡＣＣに寄託されているもの）を用いて、各外鼻孔に約５ｍＬを塗布してすべての子ブタを経鼻的に攻撃した。ＥＬＩＳＡ試験と血清中和（ＳＮ）試験の双方を実施し、以下のように各子ブタの臨床スコアを決定した。
【０１２５】
【表７】
2006528647.tif 000009
【０１２６】
死体解剖後に、以下のとおり、病変スコアを計算した。
【０１２７】
【表８】
2006528647.tif 000010
2006528647.tif 000011
【０１２８】
結果：３０日及び６３日後の時点でＥＬＩＳＡ及び血清中和抗体価試験によって行った血清分析の結果は、ワクチン接種された子ブタの方が、未処置の対照群で得られたレベルより高いレベルを有することを示している。以下の表は、糞便スワブ及び神経節組織からＰＣＶ−２ウイルスを単離した結果を要約し、且つ、ワクチン接種群及び対照群の平均の臨床スコア及び病変スコアを示したものである。結果は、対照群と比べて、ワクチン接種群の方が、循環抗体とＳＮ力価の双方がより高レベルであることを示している。同様に、臨床スコア及び肺病変も、ワクチン接種された子ブタで有意に低減されている。攻撃後の臨床スコアの変化を図３に示す。
【０１２９】
【表９】
2006528647.tif 000012
【実施例７】
【０１３０】
ＴＳ６によるＰＣＶ−２不活性化アジュバントワクチンの１回量をワクチン接種した後の現場での有効性の結果
ワクチン組成物：実施例１で記述したようにして、ＴＳ６アジュバントを調製した。米国特許出願第６５１７８４３号（Ellis et al;その内容は、これによりその全体を本明細書に組み込む）で記載されているようにして、ＰＣＶ−２ウイルスをＰＫ／１５細胞上で培養し、ウイルスを増殖させた。簡単に言うと、ウイルス培養の最後に、感染した細胞を収集し、溶解させ、ウイルス収集物を従来の方法で不活性化した。例えば、＋３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンを用いて、又は＋２８℃で２４時間、０．５％β−プロピオラクトンを用いて、又は、＋４℃で２４時間、０．２％及び０．１％β−プロピオラクトンを用いて、不活性化を行うことができる。不活性化前のウイルス力価が不十分である場合は、ウイルス懸濁液を、限外ろ過により、カットオフ値が１５０〜３００ｋＤａの膜を用いて濃縮した。ワクチンを調製する前に、不活性化したウイルス懸濁液を＋５℃で保管した。ワクチンの抗原含有量は、１回量当たり２．１ｌｏｇ１０抗原単位に設定した。この含有量に基づき、ＥＬＩＳＡ法により最終製品中の活性成分を定量することによって決定されるワクチン活性を、自由裁量で、最小値が１回量当たり１００ＥＬＩＳＡ単位となるように設定した。
【０１３１】
ワクチン接種プロトコール：現場条件下でのワクチン組成物の有効性を試験するために、子ブタのＰＣＶ−２感染によって引き起こされる離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）（postweaning multisytemic wasting syndrome）の地方病的発生を典型的に示している農場を選択した。雌ブタを２群に分け、ワクチン接種群には、分娩の２〜３週間前にＴＳ６によるＰＣＶ−２不活性化アジュバントワクチンを１回（用量２ｍｌ）筋肉内注射した。第２の群にはワクチンを接種せず、対照群とした。雌ブタに出産させて、ワクチン接種された雌ブタ（ｎ＝８８９）及び対照群の雌ブタ（ｎ＝７１３）から生まれた子ブタの死亡率を、屠殺する時点まで観察した。
【０１３２】
結果：図４は、虐殺する時点までの子ブタのＰＭＷＳ症例の百分率を示すグラフである。グラフから分かるように、ワクチンを接種されていない対照群から生まれた子ブタの症例数と比べて、ワクチン接種された雌ブタに生まれた子ブタのＰＭＷＳの症例数は７５％低減していた。これらの結果は、ＰＣＶ−２感染に関連した臨床疾患の有意な減少を示しており、子ブタのＰＣＶ２感染に伴なう死亡及び罹患を防ぐために、ＴＳ６によるＰＣＶ２不活性化アジュバントワクチンを分娩の直前に雌ブタにワクチン接種することの可能性を実証するものである。これらの結果はさらに、本発明によるワクチン組成物を１回量用いるだけで、実際の現場条件にある子ブタのＰＭＷＳの有意な減少が実現できることも実証している。
【実施例８】
【０１３３】
ＬＦ２エマルジョン
実施例１の前述の方法を用いて、１０％の油相エマルジョンを含有し、ＬＦ２と名づけた水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを作製した。油相（１００ｍｌ）は、「Marcol 82（登録商標）」を８８％（ｖ／ｖ）、「Span 80（登録商標）」を１．８％（ｗ／ｖ）、「Tween 85（登録商標）」を１０．２％（ｗ／ｖ）を含んだ。水性相＃１（１００ｍｌ）は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）を８８．５％（ｖ／ｖ）、及び「Tween 80（登録商標）」の２０％（ｗ／ｖ）溶液を１１．５％（ｗ／ｖ）含んだ。水性相＃２（４００ｍｌ）は、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムの０．０２Ｍ等張緩衝液（ｐＨ７．８）で構成し、場合によっては免疫原を含有した。１００ｍｌのプレエマルジョンを、４００ｍｌの水性相＃２で希釈して、ＬＦ２エマルジョンを得た。ＬＦ２エマルジョン中の界面活性剤の最終濃度は、１．４３％（ｗ／ｖ）であった。導電率によって決定したＬＦ２エマルジョンのＰＩＴは４５℃より高かった。
【実施例９】
【０１３４】
ＬＦ２エマルジョンによるブタインフルエンザアジュバントワクチンの投与後の血清分析
材料及び方法：約１０週齢の子ブタ１５匹を無作為に３群に割り当てた。１つの群（ワクチン接種群）では、５匹の子ブタに、１回量当たり７．７ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０の組換型ブタインフルエンザワクチン２ｍｌを２回（第０日及び２８日）、筋肉内注射によりワクチン接種した。この組換え発現ベクターワクチンは、Ｈ１Ｎ１ブタインフルエンザウイルスの核プロテイン（ＮＰ）（nucleoprotein）及び赤血球凝集素（ＨＡ）（haemagglutinin）をコード及び発現しているカナリア痘ベクターを含んだ。５匹の子ブタからなる第２の群には、（１回量当たり７．７ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０で）ＬＦ２エマルジョンによる組換型ブタインフルエンザのアジュバントワクチン２ｍｌを（第０日及び２８日に筋肉内注射によって）２回ワクチンを接種した（ＬＦ２ワクチン接種群）。５匹の子ブタはワクチン接種をせずに残した（対照群）。赤血球凝集抑制（ＨＩ）（haemagglutination inhibition）力価を測定するために、ワクチン接種後０日、１４日、２８日、４２日、５６日に血液サンプルを採取した。
【０１３５】
結果：以下の表で要約するように、すべてのワクチン接種ブタが、未処置の対照のブタと比べて、ワクチン接種の４２〜５６日後に有意な抗ブタインフルエンザ抗体応答を示した（分散分析、ｐ＜０．０００１）。しかし、ＬＦ２によるアジュバントワクチンをワクチン接種したブタは、アジュバントを使用していない組換型ワクチンを与えられたブタと比べて、ワクチン接種の４２〜５６日後に、抗体応答の有意な上昇を示した（分散分析、ｐ＜０．０００１）。
【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
これらの結果から実証されるように、ＬＦ２エマルジョンのアジュバント効果により、ワクチンが、非アジュバントワクチンと比べて、ブタインフルエンザウイルスに対するより高い抗体応答を誘導することが可能となる。
【実施例１０】
【０１３８】
ＬＦ２エマルジョンによるマンヘミアヘモリティカ（Mannheimia haemolytica）アジュバントワクチンによって誘導される防御
材料及び方法：陰性又はマンヘミアヘモリティカロイコトキシン抗体力価の低い５ヶ月齢の２０匹の子ウシを、それぞれ子ウシ１０匹からなる２つの群に無作為に割り当てた。上記の実施例８で記述したようにして、ＬＦ２エマルジョンを作製し、ワクチン１回量当たり約６０〜７０ＥＬＩＳＡ単位（未加工の非濃縮細菌培養物の約０．３４ｍＬ〜１．１ｍＬに相当）の不活性化マンヘミアヘモリティカ（Ａ１系統）を含み、ＬＦ２エマルジョンをアジュバントとして用いたワクチンを調製した。１０匹の子ウシからなる１つの群には、第０日に、ＬＦ２ワクチン組成物２ｍｌを皮下注射によってワクチン接種し、一方、１０匹の子ウシからなる対照群には、ワクチン接種しなかった。ワクチン接種の日（Ｄ０）から攻撃の日（Ｄ２０）まで、すべてのワクチン接種した子ウシのワクチン接種に対する全身反応及び局所反応を定期的に検査した。臨床検査には、（感情鈍麻、食欲不振、多呼吸、唾液過多、震えなどの）全身性反応の評価、直腸温度の記録、及び注射部位での局所反応の測定を含んだ。ワクチン接種に対して全身性反応を示した子ウシは１匹もいなかった。以下の表に要約した直腸温度（単位；℃、平均±標準偏差）は、ワクチン接種後２４時間以内をピークとする、一時的且つ軽度の体温上昇がワクチン接種群で観察されることを示した。
【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
ワクチン接種された子ウシにおける局所反応（表面積として測定（単位；ｃｍ２）、平均±標準偏差）では、すべてのワクチン接種された動物においてワクチン接種の約２４〜４８時間後に現れ、その後、１４日目までに約３ｃｍ２の大きさに急速に減少する強力な局所反応を示した。これらの反応は、２０日目までにほとんどなくなった。この反応を以下にまとめて示す。
【０１４１】
【表１２】
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【０１４２】
様々な間隔（第０日、７日、１４日、２０日、及び２８日）ですべての動物から血液サンプルを採取し、マンヘミアヘモリティカＡ１のロイコトキシンに対する抗体レベルをＥＬＩＳＡによって測定した（ｌｏｇ１０  ＯＤ５０で示した力価）。結果は、ワクチン接種の前はすべての子ウシが陰性であることを示した。１回のワクチン接種後、２０日目までに、ワクチン接種ウシ１０匹中８匹で抗体陽転が起こったが、対照のすべての子ウシは、０日目から２０日目まで陰性のままであった。ＥＬＩＳＡの結果を以下にまとめて示す。
【０１４３】
【表１３】
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【０１４４】
攻撃試験プロトコール：約９．２ｌｏｇ１０  ＣＦＵ（colony forming unit）／ｍｌ（１ミリリットル当たりのコロニー形成単位）のマンヘミアヘモリティカＡ１系統を含有している３０ｍｌの攻撃用溶液を気管内投与することによって、すべての子ウシを２０日目に攻撃した。この攻撃を２４時間後に繰り返し行った。攻撃した日から試験の最終日まで、呼吸困難を含めて、すべての子ウシの全般的臨床徴候を毎日検査した。観察した徴候には、全身状態、食欲不振、直腸温度、鼻汁、咳、呼吸数、及び呼吸困難が含まれた。
【０１４５】
以下の式及び表に示した部分スコアに従って、総合臨床スコアを計算した。
総合臨床スコア＝Σ（部分スコア×係数）／１４
【０１４６】
【表１４】
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【０１４７】
死亡した動物の場合は、個々の１日の臨床スコアの最大値２を適用した。
【０１４８】
以下の式を用いて、各子ウシの肺病変スコア（百分率で表示）も決定した。
肺病変スコア＝Σ（葉の病変の表面積／葉全体の表面積×１００×ＬＲＭ）
上式で、ＬＲＭは肺の相対論的質量であり、各値は、
右上葉及び右中上葉の場合は０．１１、
右中下葉の場合は０．０７、
右下葉の場合は０．３５、
左上葉の場合は０．０５、
左中葉の場合は０．０６、
左下葉の場合は０．３２、
奇静脈葉の場合は０．０４
である。
【０１４９】
攻撃試験の結果：以下の表に示した各群の総合臨床スコアは、未処置の対照群と比べて、ワクチン接種された群の総合臨床スコアが有意な低下を示していることを示した（ｐ＝０．０４６、分散分析）。
【０１５０】
【表１５】
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【０１５１】
攻撃に屈した動物はすべて、肺の６０％以上が感染していた。対照群の病変よりも、ワクチン接種された動物の肺病変が少ないという統計的傾向（ｐ＝０．０８）があった。肺の３分の１超が感染していた、群当たりの動物数はワクチン接種群では２／１０（２０％）であり、対照動物群では７／１０（７０％）であった。肺の３分の１超が感染していた動物の数は、ワクチン接種群で有意に低かった（ｐ＝０．０３、フィッシャーの正確確率検定、片側検定）。肺病変スコアの結果を以下の表にまとめて示す。
【０１５２】
【表１６】
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【０１５３】
総合臨床スコアと肺病変率との間には極めて有意で（ｐ＜０．００１）強い相関関係（Ｒ２＝０．８６）があった。ワクチン接種された動物はすべて、ワクチン接種後にわずかな高体温を示したが、ワクチン接種に対する他の全身反応は観察されなかった。ワクチン接種後に強い局所反応が観察されたが、急速に減少して十分に許容される大きさになり、有意な病変は死体解剖で観察された。これらの結果は、ＬＦ２エマルジョンによるアジュバントワクチンの安全性を実証している。
【０１５４】
対照群と比べて、平均臨床スコアと肺病変スコアの双方がワクチン接種群で有意に低下したことを示すこの実験結果は、ＬＦ２エマルジョンによるマンヘミアヘモリティカのアジュバントワクチンを１回注射するだけで、生まれたばかりの子ウシをマンヘミアヘモリティカの攻撃から保護することを実証している。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態をこのように詳細に述べたが、上記の節で定義した本発明は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多数のその外見上の改変例が実施可能であるため、上記の記載で説明した特定の詳細な内容に限定されるべきではないことを、理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】実施例３に従ってワクチン接種の２８日後に攻撃した子ブタの肺病変スコアを示すグラフである。十字形は平均値を示し、箱は、下位４分位点及び上位４分位点を示し、箱中の横線は統計的な中央値を示し、最小値から最大値を縦線で示している。
【図２】実施例４に従ってワクチン接種の２０週後に攻撃した子ブタの肺病変スコアを示すグラフである。十字形は平均値を示し、箱は、下位４分位点及び上位４分位点を示し、箱中の横線は統計的な中央値を示し、最小値から最大値を縦線で示している。
【図３】実施例６に従って攻撃した後の、臨床スコアによって示した臨床疾患の進行を示すグラフである。
【図４】現場での有効性の試験結果を示すグラフである。分娩前に、本発明に従って作製したＰＣＶ−２ワクチン組成物を１回ワクチン接種された雌ブタに生まれた子ブタ（ｎ＝８８９匹の子ブタ）が、ワクチン接種をされていない雌ブタに生まれた対照の子ブタ（ｎ＝７１３）と比べて、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）による死亡率の有意な低下（７５％低下）を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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