(57)【要約】被検者にて、心筋炎、心筋症、脈管炎およびベーチェット病のような炎症関連疾患を予防または治療する方法であって、前記被検者における炎症または心臓リモデリングの調節に直接的または間接的に関係する１つ以上の発現生成物の発現を変化させるのに十分なアルドステロンブロッカーの治療学的に有効な量で前記被検者を処置することを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者にて、心筋炎、心筋症、脈管炎およびベーチェット病からなる群より選択される炎症関連疾患を予防または治療する方法であって、該方法が、前記被検者における炎症または心臓リモデリングの調節に直接的または間接的に関係する１つ以上の発現生成物の発現を変化させるのに十分なアルドステロンブロッカーの治療学的に有効な量で前記被検者を処置することを含む方法。
【請求項２】
前記炎症関連疾患が、心筋炎である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症関連疾患が、心筋症である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症関連疾患が、脈管炎である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症関連疾患が、ベーチェット病である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
被検者における炎症または心臓リモデリングの調節にて直接的または間接的に関係する１つ以上の発現生成物の前記発現が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、ANF、avβ3、Inf-γ、IL-1、TNF-アルファ、NADH/NADPH酸化酵素、スーパーオキシドフリーラジカル、TXA2、b-FGF、CD44、エンドテリン、アンギオテンシンII受容体、活性t-PA、不活性t-PA、PAI-1、CRP、IL-6、IL-10、IL-12、トロポニンT、HSP65、アミロイド、ホスホリパーゼA2、フィブリノーゲン、CD40/CD40L、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、コラーゲン結合インテグリンa1β1およびコラーゲン結合インテグリンa2β1からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記発現生成物の２つ以上が、同時的に、同時発現される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記発現生成物が、シクロオキシゲナーゼ-2を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記シクロオキシゲナーゼ-2が、オステオポンチン、MCP-1、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびVCAM-1からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現生成物が、オステオポンチンを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
前記オステオポンチンが、シクロオキシゲナーゼ-2、MCP-1、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびVCAM-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現生成物が、MCP-1を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１３】
前記MCP-1が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびVCAM-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現生成物が、ICAM-1を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１５】
前記ICAM-1が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、MCP-1、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-βおよびVCAM-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現生成物が、VCAM-1を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１７】
前記VCAM-1が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現生成物が、インターロイキン-8を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１９】
前記インターロイキン-8が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、VCAM-1、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現生成物が、NFカッパBを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項２１】
前記NFカッパBが、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、VCAM-1、インターロイキン-8、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現生成物が、形質転換成長因子-βを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換成長因子-βが、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、VCAM-1、インターロイキン-8、NFカッパB、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
３つ以上の発現生成物が、同時的に、同時発現される、請求項6に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルドステロンブロッカーが、アルドステロン受容体アンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、スピロラクトン-タイプの化合物である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記スピロラクトン-タイプの化合物が、
7α-アセチルチオ-3-オキソ-4,15-アンドロスタジエン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
3-オキソ-7α-プロピオニルチオ-4,15-アンドロスタジエン-〔17((β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
6β,7β-メチレン-3-オキソ-4,15-アンドロスタジエン-〔17((β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
15α,16α-メチレン-3-オキソ-4,7α-プロピオニルチオ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
6β,7β,15α,16α-ジメチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
7α-アセチルチオ-15β,16β-メチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
15β,16β-メチレン-3-オキソ-7β-プロピオニルチオ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；および、
6β,7β,15β,16β-ジメチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、スピロノラクトンである、請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシ-ステロイド系アルドステロンアンタゴニストである、請求項25に記載の方法。
【請求項３０】
前記エポキシ-ステロイド系化合物が、20-スピロキサン化合物のステロイド核の“C”環に縮合したエポキシ部分を有する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記20-スピロキサン化合物が、9-アルファ,11-ベータ-置換されたエポキシ部分の存在を特徴とする、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記エポキシ-ステロイド系化合物が、
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ，(γ-ラクトン，メチルエステル，(7α，11α，17β)-；
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-ジメチルエステル，(7α，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-,γ-ラクトン(6β，7β，11α，17β)-；
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-１７-ヒドロキシ-3-オキソ，7-(１−メチルエチル)エステル，一カリウム塩，(7α，11α，17β)-；
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，7-メチルエステル，一カリウム塩，(７α，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-1,4,6-トリエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，メチルエステル，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，一カリウム塩，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α，17β)-；
プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ，γ-ラクトン，エチルエステル，(7α，11α，17β)-；および、
プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，1-メチルエチルエステル，(7α，11α，17β)-；
からなる群より選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシメクセレノンである、請求項25に記載の方法。
【請求項３４】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-ジメチルエステル，(7α，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-,γ-ラクトン(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ，7-(1-メチルエチル)エステル，一カリウム塩，(７α，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項３７】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，7-メチルエステル，一カリウム塩，(７α，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項３８】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-1,4,6-トリエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項３９】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，メチルエステル，(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項４０】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，一カリウム塩，(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項４１】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項４２】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，エチルエステル，(7α，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項４３】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，エチルエステル，(7α，11α，17β)-である、請求項25に記載の方法。
【請求項４４】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、ドロスピレノンである、請求項25に記載の方法。
【請求項４５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシメクセレノンである、請求項25に記載の方法。
【請求項４６】
投与されるエポキシメクセレノンの量が、約0.5mg〜約500mg/日の間である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約0.5mg〜約100mg/日の間である、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約10mg〜約100mg/日の間である、請求項45に記載の方法。
【請求項４９】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約0.5mg〜約25mg/日の間である、請求項45に記載の方法。
【請求項５０】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約0.5mg〜約10mg/日の間である、請求項45に記載の方法。
【請求項５１】
前記アルドステロンブロッカーが、11β-ヒドロキシアンドロステ-4-エン-3-オン17-スピロラクトンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項1に記載の方法。
【請求項５２】
前記アルドステロンブロッカーが、アルドステロン阻害剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項５３】
前記アルドステロン阻害剤が、アロマターゼ阻害剤；12-リポキシゲナーゼ阻害剤；P45011β阻害剤；心房ナトリウム排泄増加性因子；20溶解酵素阻害剤；PKC阻害剤；ベンゾジアゼピン類；カルシウムブロッカー；ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤；カリウムイオノホア；電子伝達ブロッカー；または、それらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記アルドステロン阻害剤が、ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤である、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
前記ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤が、1,6-ビス-シクロヘキシルオキシミノカルボニルアミノ)-ヘキサンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記アルドステロン阻害剤が、ベンゾジアゼピン化合物である、請求項52に記載の方法。
【請求項５７】
前記ジアゼピン化合物が、ジアゼパムまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記アルドステロン阻害剤が、アロマターゼ阻害剤である、請求項52に記載の方法。
【請求項５９】
前記アロマターゼ阻害剤が、ファドロゾールまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
前記アルドステロン阻害剤が、リポキシゲナーゼ阻害剤である、請求項52に記載の方法。
【請求項６１】
前記リポキシゲナーゼ阻害剤が、フェニドンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
前記アルドステロン阻害剤が、P45011β阻害剤である、請求項52に記載の方法。
【請求項６３】
前記P45011β阻害剤が、18-ビニルプロゲステロンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記アルドステロンブロッカーが、アルドステロンシンターゼ阻害剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項６５】
被検者にて炎症関連疾患を予防または治療する方法であって、該方法が、インターロイキン-8、NFカッパBおよび形質転換成長因子-βからなる群より選択される１つ以上の発現生成物の発現を変化させるのに十分なアルドステロンブロッカーの治療学的に有効な量で
前記被検者を処置することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炎症関連疾患、さらに詳しくは、炎症関連心臓血管疾患を予防または治療する分野である。さらに詳しくは、本発明は、アテローム硬化症を含め心臓血管疾患の予防または治療におけるアルドステロンブロッカー療法の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
プロスタグランジン類は、炎症プロセスにて重要な役割を演じ、プロスタグランジンの生成、特に、PGG2、PGH2およびPGE2の生成の阻害は、抗炎症性薬剤発見の一般的な標的となっている。しかし、プロスタグランジン誘発苦痛および炎症プロセスに付随する腫張を軽減するのに活性な一般的非ステロイド系抗炎症剤(NSAID’s)もまた炎症プロセスに付随しないその他のプロスタグランジン調節プロセスに作用するのに活性である。かくして、最も一般的なNSAID’sの高投薬量の使用は、生死にかかわる潰瘍を含め、それらの治療学的な潜在性を制限する重大な副作用を生じかねない。NSAID’sとは別に、コルチコステロイド類の使用も存在するが、コルチコステロイド類も、また、特に長期治療に関わる時、重大な副作用を生ずる。
【０００３】
NSAIDsは、酵素シクロオキシゲナーゼ(COX)を含め、ヒトアラキドン酸/プロスタグランジン経路にて酵素を阻害することによってプロスタグランジン類の生成を予防することが見出されている。炎症に付随する誘発性酵素(“シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)”または“プロスタグランジンG/HシンターゼII”と称される)の最近における発見は、炎症をさらに効果的に軽減し、ドラスチックな副作用が少なくかつ副作用度の低い阻害の実用可能な標的を提供する。
【０００４】
最近、心臓疾患における炎症の役割は、さらに理解されつつある。Ridker et al.(New Eng. J. Med.，336，973-9(1997))は、心臓血管病における炎症の潜在的な役割について記載している。J．Boyle(J．Path. 181，93-9(1997))は、血小板破裂とアテローム硬化性炎症との関係を記載している。
【０００５】
シクロオキシゲナーゼ-2を選択的に阻害する化合物は、U.S.特許5,380,738；5,344,991；5,393,790；5,434,178；5,474,995；5,510,368；および、WOパンフレットWO96/06840；WO96/03388；WO96/03387；WO96/19469；WO96/25405；WO95/15316；WO94/15932；WO94/27980；WO95/00501；WO94/13635；WO94/20480およびWO94/26731に記載されている。
【０００６】
〔ピラゾール-1-イル〕ベンゼンスルホンアミド類は、シクロオキシゲナーゼ-2の阻害剤として記載されており、炎症、関節炎および痛みの処置にて、臨床前および臨床試験にて最も副作用の少ない徴候を示している。心臓血管病における炎症を治療するためのそれらの使用は、U.S.特許No. 5,466,823に記載されている。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症関連疾患の予防または治療のためのアルドステロンブロッカーの使用に係る。さらに詳しくは、本発明は、炎症関連心臓血管病の予防におけるアルドステロンブロッカーの使用に関わる。
【０００８】
本発明は、心臓血管疾患をその必要のある被検者にて予防または治療するための方法を提供する。この方法は、被検者をアルドステロンブロッカーまたはその誘導体もしくは薬学的に許容可能な塩の治療学的に有効な量で処置することを含む。
【０００９】
上記方法は、被検者にて、心臓、腎臓および脳の炎症関連疾患を含め(これらに限定されるものではないが)炎症関連疾患、特に血管炎症関連疾患を予防または治療するのに有用であるが、これに限定されるものではないだろう。本方法は、冠状動脈病；動脈瘤；動脈硬化；心臓移植アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、塞栓症、発作、心筋炎、心筋症を含めアテローム性動脈硬化症；静脈血栓症を含め血栓症；不安定なアンギナを含めアンギナ；カルシウム沈着(例えば、血管カルシウム沈着および心臓弁膜カルシウム沈着)；川崎病および炎症(例えば、冠状血小板炎症；Chlamydia-誘発炎症、寄生生物誘発炎症およびウイルス誘発炎症を含め細菌誘発炎症)の予防または治療のために有用であろう。本方法は、直接的または間接的に炎症を調節する１つ以上の発現生成物の発現を変化させることによって状態を治療または予防するために有用である。炎症関連心臓血管障害は、発現の増減を受けることのできる１つ以上の発現生成物によって、全体または一部媒介されうる。前記発現生成物としては、協働するかまたは単独で作用して、効果を直接的または間接的に生ずる有機分子、蛋白質、DNA-基体またはRNA-基体の分子およびこのような生成物の網状構造体または凝集体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。前記発現生成物の発現パターンの変化は、２つ以上の発現生成物に関連し、逐次的または同時的に生じうる。これら発現生成物は、被検者の組織または器官に直接または間接の効果を有することができ、その他の分子または発現生成物によって誘発される病理学的効果を誘発または増幅する。これら発現生成物は、それぞれ、前炎症または抗炎症発現生成物としてのそれらの機能に依存して、発現の増減により前炎症効果を生じかねない。
【００１０】
本方法は、シクロオキシゲナーゼ-2およびオステオポンチンを含め、冒された組織にてみられる前炎症成分の調節を加減することによって状態を治療または予防するのに特に有用である。
【００１１】
上記方法にて、心臓血管疾患としては、炎症成分を有することが公知である疾患およびアルドステロンによって媒介されうる疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記方法としては、また、シクロオキシゲナーゼ-2またはオステオポンチンの調節された発現を加減する必要のあるアルドステロンブロッカーによる患者の治療が挙げられる。腎臓、心臓、膵臓および脳(これらに限定されるわけではないが)を含め組織にて、アイソフォームシクロオキシゲナーゼ-2が誘発され、前炎症酵素の調節を上回る発現(upregulated expression)を生じかねず、これにより、軽度ないし重度の組織および器官損傷を生じかねない。上記方法にて、アルドステロンブロッカーの投与は、シクロオキシゲナーゼ-2の調節を上回る発現を加減するために使用される。もう１つの実施態様にて、本方法のサイトカイン発現は、前炎症サイトカインの転写に関係する核因子の阻害またはブロック、例えば、NF-カッパBの阻害またはブロックを通して加減される。上記方法は、また、腎臓、心臓および脳(これらに限定されるわけではないが)を含め組織にて生じうる状態を予防または治療するためにも有用であり、前炎症蛋白質オステオポンチンの調節を上回る発現が誘発され、軽度ないし重度の組織および器官損傷を生じかねない。上記方法にて、アルドステロンブロッカーの投与は、オステオポンチンの調節を上回る発現を加減するために使用される。
【００１２】
もう１つの実施態様にて、本発明は、腎臓、心臓および脳(これらに限定されるわけではないが)を含め組織および器官にて状態を予防または治療するのに有用であり、前炎症発現生成物MCP-1、IL-1、IL-6、IL-8、VCAM-1およびICAM-1のいずれか１つの調節を上回る発現が生じ、軽度ないし重度の組織および器官損傷を生じかねない。上記方法にて、アルドステロンブロッカーの投与は、MCP-1、IL-1、IL-6、IL-8、VCAM-1およびICAM-1のいずれか１つの調節を上回る発現を加減するために使用される。
【００１３】
その発現がアルドステロンブロッカーによる治療によって炎症関連心臓血管病を軽減す
るために加減されうる発現生成物の例を図34に示すが、これらに限定されるものではなく、以下の１つ以上の上方調節(upregulation)が挙げられる：
(a)  アンギオテンシンIIおよびエンドテリンに対する受容体；
(b)  単核細胞活性化分子、例えば、av3β(癒着、増殖、転移)およびCD44(転移)；
(c)  血管炎症のメディエイタ、例えば、インターロイキン-γ(Inf-γ)、インターロイキン-1(IL-1)、腫瘍壊死因子-a(TNF-a)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-8(IL-8)およびフラクタルカイン；
(d)  組織損傷スーパーオキシドラジカルを生ずるためのNADH/NADPH酸化酵素；および；
(e)  活性組織プラスミノーゲン活性剤(ｔ-PA)にて減少を生ずるプロトロンビンプラスミノーゲン活性剤阻害剤-1(PAI-1)。
【００１４】
本発明のもう１つの実施態様にて、その発現がアルドステロンブロッカーによる処置によって炎症関連心臓血管病を軽減するために加減することのできる発現生成物の例としては、以下の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない：
急性相反応物質、例えば、C-反応性蛋白質(CRP)、
多面発現作用性サイトカイン類、例えば、インターロイキン-6(IL-6)、
IL-12、溶解性細胞内癒合分子-1(sICAM-1)、
トロポニンTまたはI、熱ショック蛋白質65(HSP65)、
アミロイド、ホスホリパーゼA2、フィブリノーゲン、CD40/CD40L信号系経路、
および、癒着メディエイタ、例えば、コラーゲン結合インテグリン類a1β1(間葉細胞)およびa2β1(上皮細胞)。
【００１５】
投薬量および治療処方
投与されるアルドステロンブロッカーの量と本発明の方法についての投薬処方は、例えば、被検者の年齢、体重、性別および医学的状態、病原性効果の重度、投与ルートおよび頻度、使用される個々のアルドステロンブロッカーを含め多様な因子に依存し、かくして、広範に変化させることができる。被検者に対する日用量約0.001〜30mg/kg体重、好ましくは、約0.005〜約20mg/kg体重の間、さらに好ましくは、約0.01〜約15mg/kg体重の間、なおさらに好ましくは、約0.05〜約10mg/kg体重の間、最も好ましくは、約0.01〜5mg/kg体重の間が適当であるかもしれない。ヒト被検者に投与されるアルドステロンアンタゴニストの量は、典型的には、約0.1〜約2000mgの範囲であろう。本発明の１つの実施態様にて、投薬範囲は、約0.5〜約500mgである。本発明のもう１つの実施態様にて、投薬範囲は、約0.75〜約250mgである。本発明のさらなる実施態様にて、投薬範囲は、約1〜約100mgの範囲である。本発明のもう１つの実施態様にて、投薬範囲は、約10〜100mgである。本発明のさらなる実施態様にて、投薬範囲は、約25〜約100mgである。本発明のもう１つの実施態様にて、投薬範囲は、約25〜約75mgである。被検者にて実質的な利尿および/または抗昇圧効果を生じないアルドステロンブロッカーの日用量は、本方法によって特に包含される。日用量は、１日当り1〜4回投与で投与される。
【００１６】
アルドステロンブロッカーの用量は、血圧または適当な代理標識(例えば、ナトリウム排泄増加性ペプチド、エンドテリンおよびその他の以下に考察する代理標識)の測定に基づき決定および調節することができる。アルドステロンブロッカーの投与後の血圧および/または代理標識レベルは、アルドステロンブロッカーの投与前の対応するベースラインレベルに対して比較することができ、本方法の効力を測定し必要に応じて滴定することができる。本方法で有用な代理標識の例は、腎臓病および心臓血管病についての代理標識であるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
予防投与
前記炎症関連心臓血管疾患の診断前に、予防的に、アルドステロンブロッカーを投与し
、被検者が炎症関連疾患の疑いがある期間、アルドステロンブロッカーの投与を継続することが有益である。したがって、顕著な臨床的発現はないが、にもかかわらず、病原性効果の疑いのある個体は、アルドステロンブロック化合物の予防投与に賦すことができる。アルドステロンブロッカーのこのような予防投与は、重度の特異的病原性効果を治療するために使用される用量よりも低くてもよいが、必ずしも必要ではない。
【００１８】
心臓血管病理学投与
心臓血管機能の病理学を治療するための投与は、ナトリウム排泄増加性ペプチドの血液濃度の測定に基づき決定および調節することができる。ナトリウム排泄増加性ペプチドは、構造的に類似の１つの群であるが、概して、心臓血管、腎臓および内分泌恒常性にて異なった作用を有するペプチドを識別する。心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド(“ANP”)および脳ナトリウム排泄増加性ペプチド(“BNP”)は、心筋細胞起源を有し、C-タイプのナトリウム排泄増加ペプチド(“CNP”)は、内皮起源を有する。ANPおよびBNPは、ナトリウム排泄増加性ペプチド-A受容体(“NPR-A”)に結合し、これは、3’,5’-環式グアノシンモノホスフェート(ｃGMP)を介して、ナトリウム増加排泄、血管拡張、レニン阻害、抗有糸分裂誘発およびラシトロピー特性(lusitropic puroperties)を媒介する。血液中の高ナトリウム排泄増加性ペプチドレベル、特に、血液BNPレベルは、概して、血液容量膨張条件下および血管損傷、例えば、急性心筋梗塞後に被検者にて観測され、梗塞後長い時間高いままである。(Uusimaa et al.: Int. J. Cardiol 1999；６９：5-14)。
【００１９】
アルドステロンブロッカーの投与前に測定したベースラインに関してナトリウム排泄増加性ペプチドレベルの低下は、アルドステロンの病理学的効果における低下を示し、したがって、病理学的効果の阻害との相関を生ずることを示す。
【００２０】
したがって、所望されるナトリウム排泄増加性ペプチドレベルの血液レベルは、病理学的効果を治療する本方法の効力を決定するために、アルドステロンブロッカーの投与前の対応するベースラインレベルに対して比較することができる。このようなナトリウム排泄増加性ペプチドレベル測定に基づき、アルドステロンブロッカーの投与は、心臓血管病理学的効果を軽減するために調節することができる。
【００２１】
同様に、心臓病の病理学もまた同定することができ、適当な投与は、循環および尿のcGMPレベルに基づき決定される。cGMPの増加血漿レベルは、平均動脈圧の降下と平行する。cGMPの尿排泄の増加は、ナトリウム排泄増加と相関する。
【００２２】
心臓病の病理学もまた駆出率の低下または心筋梗塞もしくは心不全の存在または左心室肥大によって同定することができる。左心室肥大は、心エコー図または核磁気共鳴イメージングによって同定することができ、治療の進行および投与の適切性をモニターするために使用することができる。
【００２３】
本発明のもう１つの実施態様にて、したがって、本発明の方法は、ナトリウム排泄増加性ペプチドレベル、特に、BNPレベルを低下させるために使用して、それによって、また、関連心臓血管病理学を治療することができる。
【００２４】
腎臓病理学投与
腎臓機能の病理学を治療するための投与は、蛋白尿、ミクロアルブミン尿、糸球体濾過率(GFR)の減少またはクレアチニンクリアランスの減少の測定に基づき測定および調節することができる。蛋白尿は、24時間の尿収集にて0.3gより多い尿蛋白質の存在によって同定される。ミクロアルブミン尿は、免疫検定可能な尿アルブミンの増加によって同定される。このような測定に基づき、アルドステロンブロッカーの投与は、腎臓病理学効果を軽減するために調節することができる。
【００２５】
神経疾患病理学投与
神経疾患、特に、末梢神経疾患は、感覚欠損または感覚運動能力の神経学的試験に基づき同定され、投与調節することができる。
【００２６】
網膜症病理学投与
網膜症は、眼科学的試験に基づき同定し、投与調節することができる。
【００２７】
炎症標識
ある種の標識は、炎症または前炎症状態の指標となるかまたは原因となりうる。これら標識の測定は、投与されるアルドステロンブロッカーの適した投薬量を決定、または、投与後のアルドステロンブロッカーの有効な投与の決定に有用でありうる。このような標識としては、オステオポンチン；急性相反応物質、例えば、C-反応性蛋白質(CRP)、フィブリノーゲン、因子VIII、血清銅(キャリヤー蛋白質セルロプラスミン)、血清鉄(キャリヤー蛋白質フェリチン)、プラスミノーゲン活性剤阻害剤-1(PAI-1)およびリポ蛋白質(a)；ナトリウム排泄増加性ペプチド；エンドテリン；VCAM-1；ICAZM-1；IL-1β；TNF-α；IL-6；IL-8、COX-2；フラクタルカイン；MCP-1；および、トリグリセリドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
組み合わせ療法
本発明の方法は、さらに、アルドステロンブロッカーの投与と組み合わせたその他の活性成分の投与または療法を含みうる。
【００２９】
例えば、本方法で使用されるアルドステロンブロッカーは、高血圧と心臓血管および腎臓の状態および疾患との治療にて使用されるその他の活性剤と組み合わせて被検者に投与することができる。アルドステロンブロッカーと投与される活性な薬剤としては、例えば、レニン阻害剤；アンギオテンシンIIアンタゴニスト；ACE阻害剤；実質的にアルドステロンブロック効果を有しない利尿剤；および、レチノール酸からなる群より選択される薬剤が挙げられる。“組み合わせ療法(または“同時療法”)という語句は、薬剤の組み合わせについて使用する時、薬剤組み合わせの有益な効果を提供するであろう処方にて各剤の逐次投与を包含することを意図し、また、これら薬剤を、実質的に同時、例えば、これら活性剤の一定比を有するカプセルもしくは注射液で１回または各薬剤について別個のカプセルまたは注射液で多数回投与することを包含することも意図する。
【００３０】
“アンギオテンシンIIアンタゴニスト”という語句は、例えば、WO96/40257に記載されているアンギオテンシンIIアンタゴニストを包含する。
“アンギオテンシン転化酵素阻害剤(“ACE阻害剤”)という語句は、アンギオテンシンのデカペプチド形(“アンギオテンシンI”)のアンギオテンシンの血管収縮オクタペプチド形(“アンギオテンシンII”)への酵素による変換を一部または完全にブロックする能力を有する薬剤または化合物あるいは２つ以上の薬剤または化合物の組み合わせを包含する。アンギオテンシンIIの形成をブロックすると、アンギオテンシンIIの原発作用をなくすことによって、体液および電解質平衡の調節、血圧および血液量に影響を及ぼしかねない。アンギオテンシンIIの原発作用には、副腎皮質によるアルドステロン受容体の合成および分泌の刺激；および、細動脈の平滑筋の直接収縮による血圧の上昇が含まれる。
【００３１】
組み合わせ療法に使用することのできるACE阻害剤の例としては、以下の化合物が挙げられるがこれらに限定されるものではない：AB-103、アンコベニン、ベナゼプリラート、BRL-36378、BW-A575C、CGS-13928C、CL-242817、CV-5975、エクアテン、EU-4865、EU-4867、EU-5476、フォロキシミチン、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、15B2、インドラプリル、ケトメチル尿素、KRI-1177、KRI-1230、L-681176、リベンザプリル、MCD、MDL-27088
、MDL-27467A、モベルチプリル、MS-41、ニコチアンアミン、ペントプリル、フェナセイン、ピボプリル、レンチアプリル、RG-5975、RG-6134、RG-6027、RGH-0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、RU-44403、S-8308、SA-291、スピラプリラート、SQ-26900、SQ-28084、SQ-28370、SQ-28940、SQ-31440、シネコール、ウチバプリル、WF-10129、Wy-44221、Wy-44655、Y-23785、Yissum P-0154、ザビシプリル、アサヒビールAB-47、アラトリオプリル、BMS 182657、Asahi Chemical C-111、Asahi Chemical C-112、Dianippon DU-1777、ミキサンプリル、プレンチル、ゾフェノプリラート、1-(-(1-カルボキシ-6-(4-ピペリジニル)ヘキシル)アミノ)-1-オキソプロピルオクタヒドロ-1H-インドール-2-カルボン酸、バイオプロジェクトBP1.137、Chiesi CHF  1514、フィゾンFPL-66564、イドラプリル、マリオンメレルダウMDL-100240、ペリンドプリラートおよびセルビールS-5590、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォジノプリル、フォジノプリラート、イミダプリル、リシノプリル、パーインドプリル、キナプリル、ラミプリル、サララシンアセテート、テンポカプリル、トランドラプリル、セラナプリル、メオキシプリル、キナプリラートおよびスピラプリル。
【００３２】
特に興味深い１群のACE阻害剤は、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、フォシノプリラート、イミダプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、サララシンアセテート、テモカプリル、トランドラプリル、セラナプリル、モエキシプリル、キナプリラートおよびスピラプリルからなる。
【００３３】
これらACE阻害剤の多くは、市販入手可能である。例えば、非常に好ましいACE阻害剤カプトプリルは、E. R. Squibb & Sons，Inc.，Princeton N. J. で、現在、Bristol-Meyers-Squibb，により、商標“CAPOTEN”の下に、１錠当り12.5mg、50mgおよび200mg用量で錠剤剤形で販売されている。エナラプリルまたはエナラプリルマレエートおよびリシノプリルは、Merck and Co.，West Point，Paにより販売されているさらに２倍非常に好ましいACE阻害剤である。エナラプリルは、１錠当り2.5mg、5mg、10mgおよび20mgの用量の錠剤剤形で商標“VASOTEC”の下に販売されている。リシノプリルは、１錠当り5mg、10mg、20mgおよび40mgの用量の錠剤剤形で商標“PRINIVIL”の下に販売されている。
【００３４】
利尿剤は、数種の公知の類、例えば、チアジドおよび関連スルホンアミド、カリウムスペアリング利尿剤、ループ利尿剤(loop diuretics)および有機水銀利尿剤から選択することができる。チアジドの例は、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、シクロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ポリチアジドおよびトリクロロメチアジドであるが、これらに限定されるものではない。チアジドに関連するスルホンアミドの例は、クロルタリドン、キネタゾンおよびメトラゾンであるが、これらに限定されるものではない。カリウムスペアリング利尿剤の例は、トリアメテレンおよびアミロリドであるが、これらに限定されるものではない。ループ利尿剤、すなわち、腎臓のヘンレのループの上行肢(ascending limb)に作用する利尿剤の例は、フロセミドおよびエチンアクリル酸であるが、これらに限定されるものではない。有機水銀利尿剤の例は、メルカプトメリンナトリウム；メレトキシリン；プロカイン；および、テオフィリンを有するメルサリルであるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
１つの実施態様にて、組み合わせ療法は、ACE阻害剤；アルドステロン受容体アンタゴニストであるエポキシ-ステロイド系化合物；および、ヒト被検者に対して実質的なアルドステロンアンタゴニスト活性を有しないループ利尿剤を投与することを含む。
【００３６】
このような組み合わせ療法は、例えば、哺乳動物被検体にて炎症関連心臓血管疾患を予防または治療するために有用であろう。実質的なアルドステロンアンタゴニスト活性を有
しない利尿剤もまたACE阻害剤およびエポキシステロイド系化合物と協働して使用することができる。
【００３７】
あるいは、組み合わせ療法は、炎症関連心臓血管疾患を治療または予防するために、ヒト被検者に対して、ACE阻害剤の治療学的に有効な量；エポキシ-ステロイド系化合物の治療学的に有効な量；実質的なアルドステロンアンタゴニスト活性を有しないループ利尿剤の治療学的に有効な量；および、ジゴキシンの治療学的に有効な量を投与することを含む。
【００３８】
心臓血管疾患の予防に使用されるアラキドン酸の代謝におけるシクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤は、種々の機構を通して酵素活性を阻害することができる。例として、本明細書に記載する方法で使用される阻害剤は、酵素活性の発現を阻害しうる。アルドステロンブロッカーを使用して、炎症損傷部位にて、シクロオキシゲナーゼ-2の発現をブロックすることは、特に長期の予防処置が予想される場合に、それにより、非選択的NSAID’sで生じかねない胃の副作用を最小とする点で非常に有益である。
【００３９】
本発明の方法にて使用されるアルドステロン受容体アンタゴニストは、概して、スピロラクトン-タイプのステロイド化合物である。“スピロラクトン-タイプ”という用語は、スピロ結合配置を通して、典型的には、ステロイドの“D”環で、ステロイド核に結合したラクトン部分を含む構造を特徴とすることを意図する。スピロラクトン-タイプアルドステロンアンタゴニスト化合物の亜類は、エポキシ-ステロイド系アルドステロンアンタゴニスト化合物、例えば、エプレレノンからなる。スピロラクトン-タイプのアンタゴニスト化合物のもう１つの亜類は、非エポキシ-ステロイド系アルドステロンアンタゴニスト化合物、例えば、スピロノラクトンからなる。
【００４０】
本発明の方法にて使用されるエポキシ-ステロイド系アルドステロンアンタゴニスト化合物は、概して、エポキシ-タイプの部分で置換されたステロイド核を有する。“エポキシ-タイプ”部分という用語は、2つの炭素原子間にブリッジとして酸素原子を有することを特徴とするいずれかの部分を包含することを意図し、その例としては、以下の部分が挙げられる：
【００４１】
【化１】
2006508174.tif 000002
【００４２】
“エポキシ-ステロイド系”という語句で使用される“ステロイド系”という語句は、慣用的な“A”、“B”、“C”および“D”環を有するシクロペンテノ-フェナンスレン部分によって提供される核を表す。エポキシ-タイプ部分は、いずれかの結合可能または置換可能な部位にてシクロペンテノフェナンスレン核に結合していてもよく、すなわち、ステロイド核の環の１つに縮合していてもよく、あるいは、その部分が環系の環員上で置換されていてもよい。“エポキシ-ステロイド系”という語句は、それに結合した１つまたは複数のエポキシ-タイプ部分を有するステロイド核を包含することを意図する。
【００４３】
本方法で使用するのに適したエポキシ-ステロイド系のアルドステロンアンタゴニストとしては、ステロイド核の“C” 環に縮合したエポキシ部分を有する化合物の系統群が挙げられる。9”,11”-置換されたエポキシ部分の存在を特徴とする20-スピロキサン化合物が特に好ましい。以下の表1の化合物1〜11が、本方法で使用することのできる9”,11”-
エポキシ-ステロイド系化合物の例である。これらエポキシステロイドは、Grob et al.，U.S.特許No. 4,559,332に記載されている方法によって製造することができる。9,11-エポキシステロイド系化合物およびそれらの塩類の製造のためのさらなる方法は、Ng et al.，WO97/21720およびNg. et al.，WO98/25948に開示されている。
【００４４】
【表１】
2006508174.tif 000003
【００４５】
【表２】
2006508174.tif 000004
【００４６】
【表３】
2006508174.tif 000005
【００４７】
【表４】
2006508174.tif 000006
【００４８】
上記示したように、化合物1である化合物エプレレノン(エポキシメクセレノンとしても公知)が特に興味深い。エプレレノンは、アルドステロン受容体アンタゴニストであり、かつ、例えば、スピロノラクトンが有するよりもアルドステロン受容体に対してより高い特異性を有する。本方法にてアルドステロンアンタゴニストとしてエプレレノンを選択すると、特異性の低いアルドステロンアンタゴニストの使用で生ずるある種の副作用、例え
ば、女性化乳房を軽減するために有益であろう。
【００４９】
本方法にて使用するのに適した非エポキシステロイド系アルドステロンアンタゴニストとしては、式III：
【００５０】
【化２】
2006508174.tif 000007
【００５１】
によって定義されるスピロラクトン-タイプ化合物の系統群が挙げられる：
低級アルキル残基としては、分岐および未分岐の基、好ましくは、メチル、エチルおよびn-プロピルが挙げられる。
【００５２】
式IIIに入る興味深い特異な化合物は、以下の：
7α-アセチルチオ-3-オキソ-4,15-アンドロスタジエン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
3-オキソ-7α-プロピオニルチオ-4,15-アンドロスタジエン-〔17((β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
6β,7β-メチレン-3-オキソ-4,15-アンドロスタジエン-〔17((β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
15α,16α-メチレン-3-オキソ-4,7α-プロピオニルチオ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
6β,7β,15α,16α-ジメチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
7α-アセチルチオ-15β,16β-メチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
15β,16β-メチレン-3-オキソ-7β-プロピオニルチオ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；および、
6β,7β,15β,16β-ジメチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
である。
【００５３】
式Iで表される化合物を製造するための方法は、Wiechart et al.に対して1978年12月12日に発行されたU.S.特許No. 4,129,564に記載されている。
興味深い非エポキシ-ステロイド系化合物のもう１つの系統群は、式III：
【００５４】
【化３】
2006508174.tif 000008
【００５５】
〔式中、R1は、C1-3アルキルまたはC1-3アシルであり、R2は、HまたはC1-3アルキルである。〕
によって定義される。
【００５６】
式IIに入る興味深い特異な化合物は、以下の：
1α-アセチルチオ-15β,16β-メチレン-7α-メチルチオ-3-オキソ-17α-プレグネ-4-エン-21,17-カルボラクトン；および、
15β,16β-メチレン-1α,7α-ジメチルチオ-3-オキソ-17α-プレグネ-4-エン-21,17-カルボラクトン；
である。
【００５７】
式IIIで表される化合物を製造するための方法は、Nickisch et al．に対するU.S.特許No. 4,789,668に記載されており、この特許は、1988年12月6日に発行された。
興味深い非エポキシ-ステロイド系化合物のなおもう１つの系統群は、式IV：
【００５８】
【化４】
2006508174.tif 000009
【００５９】
〔式中、Rは、低級アルキルであり、好ましい低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルである。〕
の構造によって定義される。興味深い特異な化合物としては：
3β,21-ジヒドロキシ-17”-プレグナ-5,15-ジエン-17-カルボン酸(-ラクトン；
3β,21-ジヒドロキシ-17”-プレグナ-5,15-ジエン-17-カルボン酸(-ラクトン3-アセテート；
3β,21-ジヒドロキシ-17”-プレグネ-5-エン-17-カルボン酸(-ラクトン；
3β,21-ジヒドロキシ-17”-プレグネ-5-エン-17-カルボン酸(-ラクトン3-アセテート；
21-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグネ-4-エン-17-カルボン酸(-ラクトン；
21-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグネ-4,6-ジエン-17-カルボン酸(-ラクトン；
21-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグネ-1,4-ジエン-17-カルボン酸(-ラクトン；
7”-アシルチオ-21-ヒドロキシ-3-オキソ-17”−プレグネ-4-エン-17-カルボン酸(ラクトン；
および、
7”-アセチルチオ-21-ヒドロキシ-3-オキソ-17”−プレグネ-4-エン-17-カルボン酸(ラクトン；
が挙げられる。
【００６０】
式IVで表される化合物を製造するための方法は、Patchettに対するU.S.特許No. 3,257,390に記載されており、この特許は、1966年6月21日に発行された。
興味深い非エポキシ-ステロイド系化合物のなおもう１つの系統群は、式V：
【００６１】
【化５】
2006508174.tif 000010
【００６２】
〔式中、E’は、エチレン、ビニレンおよび(低級アルカノイル)チオエチレン基からなる群より選択され；E”は、エチレン、ビニレン、(低級アルカノイル)チオエチレンおよび(低級アルカノイル)チオプロピレン基からなる群より選択され；Rは、E’およびE”が、それぞれ、エチレンおよび(低級アルカノイル)チオエチレン基である時以外メチル基であり、その場合、Rは、水素およびメチル基からなる群より選択され；E’およびE”の選択は、少なくとも１つの(低級アルカノイル)チオ基が存在するようにする。〕
によって表される。
【００６３】
式IVに入る非エポキシ-ステロイド系化合物の好ましい系統群は、式VI：
【００６４】
【化６】
2006508174.tif 000011
【００６５】
によって表される。
式VIで表されるさらに好ましい化合物は、
1-アセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-アンドロステ-4-エン-3-オンラクトンである。
【００６６】
式IVに入る非エポキシ-ステロイド系化合物のもう1つの系統群は、式VII：
【００６７】
【化７】
2006508174.tif 000012
【００６８】
によって表される。
式VIIに入るさらに好ましい化合物としては、以下の：
7”-アセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-アンドロステ-4-エン-3-オンラクトン；
7β-アセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-アンドロステ-4-エン-3-オンラクトン；
1”,7”-ジアセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-アンドロスタ-4,6-ジエン-3-オンラクトン；
7”-アセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-アンドロスタ-1,4-ジエン-3-オンラクトン；
7”-アセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-19-ノルアンドロステ-4-エン-3-オンラクトン；および、
7”-アセチルチオ-17”-(2-カルボキシエチル)-17β-ヒドロキシ-6”-メチルアンドロステ-4-エン-3-オンラクトン；
が挙げられる。
【００６９】
式IV〜VIにて、“アルキル”という用語は、１〜約8個の炭素を含有する直鎖または分岐アルキル基を包含することを意図する。“(低級アルカノイル)チオ”という用語は、式：
【００７０】
【化８】
2006508174.tif 000013
【００７１】
で表される基を包含する。
以下の構造式および公称を有する化合物スピロノラクトンが特に興味深い：
【００７２】
【化９】
2006508174.tif 000014
【００７３】
“スピロノラクトン”：17-ヒドロキシ-7”-メルカプト-3-オキソ-17”-プレグネ-4-エン-21-カルボン酸γ-ラクトンアセテート。
式V〜VIIの化合物を製造するための方法は、Cella et al.に対するU.S.特許No. 3,013,012に記載されており、この特許は、1961年12月12日に発行された。スピロノラクトンは、１錠当り25mg、50mgおよび100mgの用量の錠剤剤形で、G. D. Searle & Co.，Skokie，Illinoisにより商標“ALDACTONE”の下に販売されている。
【００７４】
本発明で考えるステロイド系アルドステロンアンタゴニストのもう１つの系統群としては、ドロスピレノン、〔6R-(6アルファ，7アルファ，8ベータ，9アルファ，10ベータ，13ベータ，14アルファ，15アルファ，16アルファ，17ベータ)〕-1,3’,4’,6,10,11,12,9,10,11,12,13,14,15,16,20,21-ヘキサデカヒドロ-10,13-ジメチルスピロ〔17H-ジシクロプロパ〔6,7：15,16〕シクロペンタ〔a〕フェナンスレン-17,2’(5’H)-フラン〕-3,5’(2H)-ジオン，CAS登録番号67392-87-4が挙げられる。ドロスピレノンを製造し使用するための方法は、DE 2652761 1976を優先権主張する特許GB 1550568 1979に記載されている。
【００７５】
定義
“治療”または“治療すること”という用語は、病理学的心臓血管状態の発現を阻害または逆転するだろうアルドステロンブロッカーのある量をその必要のあるヒトに投与することを含む。
【００７６】
“予防”または“予防すること”という用語は、臨床的に明らかな心臓血管疾患の発症を完全に予防するか、または、個体における心臓血管疾患の前臨床的に明らかな段階の発症を予防することを含む。
【００７７】
“治療学的に有効な”という語句は、副作用を回避しつつ、疾患の重度および発症の頻度にて改善目的を達成するであろう組み合わせにて示される２つの薬剤の量を称することを意図する。
【００７８】
治療のための“被検者”という用語は、炎症疾患にかかりやすいかまたはかかっているヒトまたは動物のいずれかの被検体を含み、好ましくは、ヒト被検者である。被検者は、例えば、食物により危険にさらされるか、細菌またはウイルス感染にさらされ、共通の徴候が存在し、心臓血管疾患に遺伝的にかかりやすい等である。
【００７９】
“アルドステロン”という用語は、アルドステロンと、アルドステロンエステル、例えば、アルドステロン-18-アセテート、アルドステロン-20-アセテートおよびアルドステロン-21-アセテートとの両方を含むことを意図する。
【００８０】
“アルドステロンブロッカー”という用語は、アルドステロンの生理学的効果を低下または阻害することのできる化合物を表す。アルドステロンブロッカーは、アルドステロン阻害剤またはアルドステロン受容体アンタゴニストであってもよい。
【００８１】
本発明のアルドステロンブロッカーは、広範には、２つのカテゴリー；アルドステロン阻害剤およびアルドステロン受容体アンタゴニストに入る。
“アルドステロン阻害剤”という用語は、アルドステロンの合成または活性を直接的または間接的に低下または停止させる化合物を表す。
【００８２】
“アルドステロンアンタゴニスト”および“アルドステロン受容体アンタゴニスト”という用語は、アルドステロンの受容体媒介活性を変調するために、受容体部位でアルドステロンそれ自体の作用の拮抗阻害剤として、アルドステロン受容体に結合することのできる化合物を表す。
【００８３】
本発明のアルドステロン阻害剤の例としては：アロマターゼ阻害剤、例えば、R-76713、R-83842、CGS-16949A(ファドロゾール)、CGS-20267(レトロゾール)、CGS-20267、アミノグルテタアミド、CGS-47645、ICI-1033、クロモンアンドキサントン誘導体およびYM-511；12-リポキシゲナーゼ阻害剤、例えば、PDGF、TNF、IL-1、IL-1ベータ、BW755c、フェニドン、バイカレイン、アミノグアニジン、ノルジヒドログアイアレクレットアシッド(nordihidoroguaiaretic acid)(NDGA)、シンナミル-3,4-ジヒドロキシ-アルファ-シアノシンナメート(CDC)、パナキシノール、ピオグリタゾンおよびmRNA開裂リボゾイム；P45011β阻害剤、例えば、18-ビニルプロゲステロンおよび18-エチニルプロゲステロン；脂肪酸、例えば、オレイン酸；18-ビニルデオキシコルチコステロン、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、エトミデート、スピロノラクトンおよび23-0586；心房性ナトリウム排泄増加因子、例えば、ANP、ANFおよびANFフラグメント；17,20リサーゼ阻害剤、例えば、YM-55208およびYM-53789；プロスタグランジン合成阻害剤、例えば、インドメタシン、メクロフェナメート、アミノグルテタアミドおよびアスピリン；PKC阻害剤、例えば、スフィンゴシン、レチナール、H-7、スタウロスポリンおよびトリフルオペラジン；ベンゾジアゼピン類、例えば、ジアゼパムおよびミダゾラム；カルシウムブロッカー、例えば、アムロジピンおよびミベフラジル；ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤、例えば、RHC-80267〔1,6-ビス-(シクロヘキシルオキシミノカルボニルアミノ)-ヘキサン〕；カリウムイオノフォア、例えば、バリノマイシンおよびクロマカリム；電子伝達ブロッカー(代謝阻害剤)、例えば、アンチマイシンA、シアニド、ロテノンおよびアミタール；ドーパミン(プロラクチン阻害ホルモン)、クロルブトール、18-エチニル-11-デオキシコルチコステロン(18-EtDOC)；および、エタノールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
ある種の化合物、例えば、11β-ヒドロキシアンドステ-4-エン-3-オン17-スピロラクトンは、アルドステロンシンターゼ阻害剤およびアルドステロン受容体アンタゴニストの両方として作用する。このような化合物も、また、本発明にて考え、“アルドステロンブロッカー”の定義内に入る。
【００８５】
また、アンギオテンシンII阻害剤およびアンギオテンシン転化酵素(ACE)阻害剤がアルドステロンの合成を低下させることが公知である。アンギオテンシンII阻害剤としては、アンギオテンシンII類縁体、例えば、Des-asp1-thr8-アンギオテンシンII（L-Ary-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Thr）、Des-asp1-Ile8-アンギオテンシンII（L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Ile）およびDes-asp1-ala8-アンギオテンシンII(L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Ala）；および、アンギオテンシンII受容体アンタゴニスト、例えば、カンダーサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ローサルタン、テルミサルタンおよびバルサルタンが挙げられる。
【００８６】
“前炎症（pro-inflammatory）”という用語は、組織または器官にて炎症応答を誘発、活性化または高めるために、体内にて生ずる分子を特徴とする。
“ヒドリド”という用語は、単一の水素原子(H)を表す。このヒドリド基は、例えば、酸素原子に結合されてヒドロキシル基を形成してもよく、または、２つのヒドリド基は、炭素原子に結合されてメチレン(-CH2-)基を形成してもよい。単独またはその他の用語、例えば、“ハロアルキル”、“アルキルスルホニル”、“アルコキシアルキル”および“ヒドロキシアルキル”内で使用される場合、“アルキル”という用語は、1〜約20個の炭素原子、または、好ましくは、1〜約12個の炭素原子を有する直鎖または分岐基を包含する。さらに好ましいアルキル基は、1〜約10個の炭素原子を有する“低級アルキル”である。1〜約6個の炭素原子を有する低級アルキル基が最も好ましい。このような基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等が挙げられる。“アルケニル”という用語は、2〜約20個の炭素原子、または、好ましくは、2〜約12個の炭素原子を有する少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する直鎖または分岐基を包含する。さらに好ましいアルケニル基は、2〜約6個の炭素原子を有する“低級アルケニル”基である。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、アリル、プロペニル、ブテニルおよび4-メチルブテニルが挙げられる。“アルキニル”という用語は、2〜約20個の炭素原子、または、好ましくは、2〜約12個の炭素原子を有する直鎖または分岐基を表す。さらに好ましいアルキニル基は、2〜約10個の炭素原子を有する“低級アルキニル”基である。2〜約6個の炭素原子を有する低級アルキニル基が最も好ましい。このような基の例としては、プロパルギル、ブチニル等が挙げられる。“アルケニル”、“低級アルケニル”という用語は、“cis”および“trans”配置、あるいは、“E”および“Z”配置を有する基を包含する。“シクロアルキル”という用語は、3〜12個の炭素原子を有する飽和炭素環式基を包含する。さらに好ましいシクロアルキル基は、3〜約8個の炭素原子を有する“低級シクロアルキル”基である。このような基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。“シクロアルケニル”という用語は、3〜12個の炭素原子を有する一部不飽和な炭素環式基を包含する。さらに好ましいシクロアルケニル基は、4〜約8個の炭素原子を有する“低級シクロアルケニル”基である。このような基の例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。“ハロ”という用語は、ハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。“ハロアルキル”という用語は、アルキル炭素原子のいずれか１つ以上が上記定義したハロで置換されている基を包含する。モノハロアルキル、ジハロアルキルおよびポリハロアルキル基が特に包含される。モノハロアルキル基は、１つの例として、基内にヨウ素、臭素、塩素またはフッ素原子のいずれかを有してもよい。ジハロおよびポリハロアルキル基は、同一のハロ原子または異なるハロ基の組み合わせの２つ以上を有してもよい。“低級ハロアルキル”は、1〜6個の炭素原子を有する基を包含する。ハロアルキル基の例としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルが挙げられる。“ヒドロキシアルキル”という用語は、そのいずれか１つが１つ以上のヒドロキシル基で置換されていてもよい1〜約10個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基を包含する。さらに好ましいヒドロキシアルキル基は、1〜6個の炭素原子と１つ以上のヒドロキシル基とを有する“低級ヒドロキシアルキル”である。このような基の例としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチルおよびヒドロキシヘキシルが挙げられる。“アルコキシ”および“アルキルオキシ”という用語は、各々が1〜約10個の炭素原子のアルキル部分を有する直鎖または分岐オキシ-含有基を包含する。さらに好ましいアルコキシ基は、1〜6個の炭素原子を有する“低級アルコキシ”基である。このような基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびt-ブトキシが挙げられる。“アルコキシアルキル”という用語は、アルキル基に結合した１つ以上のアルコキシ基を有するアルキル基を包含し、すなわち、モノアルコキシアルキルおよびジアルコキシアルキル基を形成する。“アルコキシ”基は、さらに、１
つ以上のハロ原子、フルオロ、クロロまたはブロモで置換されて、ハロアルコキシ基を生じてもよい。さらに好ましいハロアルキル基は、1〜6個の炭素原子と１つ以上のハロ基とを有する“低級ハロアルコキシ”基である。このような基の例としては、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシおよびフルオロプロピキシが挙げられる。“アリール”という用語は、単独または組み合わせにて、１つ、２つまたは３つの環を含有する炭素環式芳香族系を意味し、このような環は、ともに、側鎖として結合していてもよく、または、縮合していてもよい。“アリール”という用語は、芳香族基、例えば、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンおよびビフェニルを包含する。アリール部分は、また、アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルコキシ、アラルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ハロ、ニトロ、アルキルアミノ、アシル、シアノ、カルボキシ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニルおよびアラルコキシカルボニルから独立に選択される１つ以上の置換基により置換可能な部位にて置換されていてもよい。“ヘテロサイクリル”という用語は、飽和、一部不飽和および不飽和ヘテロ原子含有環状基を包含し、ヘテロ原子は、窒素、硫黄および酸素から選択することができる。飽和ヘテロサイクリル基の例としては、1〜4個の窒素原子を含有する飽和3〜6員ヘテロ単環式基(例えば、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル等)；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する飽和3〜6員単環式基(例えば、モルホリニル等)；1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含有する飽和3〜6員ヘテロ単環式基(例えば、チアゾリジニル等)が挙げられる。一部不飽和なヘテロ環式基としては、ジヒドロチオフェン、ジヒドロピラン、ジヒドロフランおよびジヒドロチアゾールが挙げられる。“ヘテロアリール”という用語は、一部飽和されたヘテロ環式基を包含する。不飽和ヘテロ環式基は、“ヘテロアリール”基とも称され、その例としては、1〜4個の窒素原子を含有する不飽和3〜6員ヘテロ単環式基、例えば、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル(例えば、4H-1,2,4--トリアゾリル、1H-1,2,3-トリアゾリル、2H-1,2,3-トリアゾリル等)、テトラゾリル(例えば、1H-テトラゾリル、2H-テトラゾリル等)等；1〜5個の窒素原子を含有する不飽和縮合ヘテロ環式基、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル(例えば、テトラゾロ〔1,5-b〕ピリダジニル等)等；1個の酸素原子を含有する不飽和3〜6員ヘテロ単環式基、例えば、ピラニル、フリル等；1個の硫黄原子を含有する不飽和3〜6員ヘテロ単環式基、例えば、チエニル等；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和3〜6員ヘテロ単環式基、例えば、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル(例えば、1,2,4-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オ��サジアゾリル等)等；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和縮合ヘテロ環式基(例えば、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル等)；1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和3〜6員ヘテロ単環式基、例えば、チアゾリル、チアジアゾリル(例えば、1,2,4-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル等)等；1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和縮合ヘテロ環式基(例えば、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル等)等が挙げられる。この用語は、また、ヘテロサイクリル基がアリール基に縮合している基を包含する。このような縮合した２環式基の例としては、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン等が挙げられる。前記“ヘテロサイクリル基”は、１つ〜３つの置換基、例えば、アルキル、ヒドロキシル、ハロ、アルコキシ、オキソ、アミノおよびアルキルアミノを有してもよい。“アルキルチオ”という用語は、2価の硫黄原子に結合した1〜10個の炭素原子を有する直鎖または分岐のアルキル基を含有する基を包含する。さらに好ましいアルキルチオ基は、1〜6個の炭素原子を有する“低級アルキルチオ”基である。このような低級アルキルチオ基の例は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオおよびヘキシルチオである。“アルキルチオアルキル”基という用語は、2価の硫黄原子を介して1〜約10個の炭素原子を有するアルキル基に結合したアルキ
ルチオ基を含有する基を包含する。さらに好ましいアルキルチオアルキル基は、1〜6個の炭素原子のアルキル基を有する“低級アルキルチオアルキル”基である。このような低級アルキルチオアルキル基の例としては、メチルチオメチルが挙げられる。“アルキルスルフィニイル”という用語は、2価の-S(＝O)-基に結合した1〜10個の炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基を含有する基を包含する。さらに好ましいアルキルスルフィニル基は、1〜6個の炭素原子のアルキル基を有する“低級アルキルスルフィニル”基である。このような低級アルキルスルフィニル基の例としては、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ブチルスルフィニルおよびヘキシルスルフィニルが挙げられる。“スルホニル”という用語は、単独またはアルキルスルホニルのようにその他の用語と結合させて使用することができ、それぞれ、2価の基-SO2-を表す。“アルキルスルホニル”は、スルホニル基に結合したアルキル基を包含し、ここで、アルキルは、上記のように定義される。さらに好ましいアルキルスルホニル基は、1〜6個の炭素原子を有する“低級アルキルスルホニル”基である。このような低級アルキルスルホニル基の例としては、メチルスルホニル、エチルスルホニルおよびプロピルスルホニルが挙げられる。“アルキルスルホニル”基は、さらに、1つ以上のハロ原子、例えば、フルオロ、クロロまたはブロモで置換されて、ハロアルキルスルホニル基を生ずることができる。“スルファミル”、“アミノスルホニル”および“スルホンアミジル”という用語は、NH2O2S-を表す。“アシル”という用語は、ヒドロキシルの有機酸からの除去後の残基によって生ずる基を表す。このようなアシル基の例としては、アルカノイルおよびアロイル基が挙げられる。このような低級アルカノイル基の例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、トリフルオロアセチルが挙げられる。“カルボニル”という用語は、単独または“アルコキシカルボニル”のようなその他の用語とともに使用され、-(C=O)-を表す。“アロイル”という用語は、上記定義したようなカルボニル基を有するアリール基を包含する。アロイルの例としては、ベンゾイル、ナフトイル等が挙げられ、前記アロイル中のアリールは、さらに、置換されていてもよい。“カルボキシ”または“カルボキシル”という用語は、単独または“カルボキシアルキル”のようなその他の用語とともに、-CO2Hを表す。“カルボキシアルキル”という用語は、カルボキシ基で置換されたアルキル基を包含する。上記定義したような低級アルキル基を包含する“低級カルボキシアルキル”がさらに好ましく、さらに、アルキル基上をハロで置換されていてもよい。このような低級カルボキシアルキル基の例としては、カルボキシメチル、カルボキシエチルおよびカルボキシプロピルがあげられる。“アルコキシカルボニル”とい用語は、酸素原子を介して、カルボニル基に結合した、上記定義したような、アルコキシ基を含有する基を意味する。1〜6個の炭素を有するアルキル部分を有する“低級アルコキシカルボニル”がさらに好ましい。このような低級アルコキシカルボニル(エステル)基の例としては、置��または未置換メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニルおよびヘキシルオキシカルボニルが挙げられる。“アルキルカルボニル”、“アリールカルボニル”および“アラルキルカルボニル”という用語としては、カルボニル基に結合する、上記定義したような、アルキル、アリールおよびアラルキル基を有する基が挙げられる。このような基の例としては、置換または未置換メチルカルボニル、エチルカルボニル、フェニルカルボニルおよびベンジルカルボニルが挙げられる。“アラルキル”という用語は、アリール置換されたアルキル基、例えば、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチルおよびジフェニルエチルを包含する。前記アラルキル中のアリールは、さらに、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキルおよびハロアルコキシで置換されていてもよい。ベンジルおよびフェニルメチルという用語は、互換的である。“ヘテロサイクリルアルキル”という用語は、飽和/一部不飽和ヘテロサイクリル置換されたアルキル基、例えば、ピロリジニルメチル；および、ヘテロアリール置換されたアルキル基、例えば、ピリジルメチル、キノリルメチル、チエニルメチル、フリルエチルおよびキノリルエチルを包含する。前記ヘテロアラルキル中のヘテロアリールは、さらに、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキルおよびハロアルコキシで置換されていてもよい。“アラルコキシ”という用語は、酸素原子
を介してその他の基に結合したアラルキルを包含する。“アラルコキシアルキル”という用語は、酸素原子を介してアルキル基に結合したアラルコキシを包含する。“アラルキルチオ”という用語は、硫黄に結合したアラルキル基を包含する。“アラルキルチオアルキル”という用語は、硫黄原子を介してアルキル基に結合したアラルキルチオ基を包含する。“アミノアルキル”という用語は、1つ以上のアミノ基で置換されたアルキルを包含する。“低級アミノアルキル”基がさらに好ましい。このような基の例としては、アミノメチル、アミノエチル等が挙げられる。“アルキルアミノ”という用語は、1つまたは2つのアルキルで置換されているアミノ基を表す。1〜6個の炭素原子のアルキル部分を有する“
低級アルキルアミノ”が好ましい。適した低級アルキルアミノは、モノまたはジアルキルアミノ、例えば、N-メチルアミノ、N-エチルアミノ、N,N-ジメチルアミノ、N,N-ジエチルアミノ等であるのがよい。“アリールアミノ”という用語は、1つまたは2つのアリール基で置換されているアミノ、例えば、N-フェニルアミノを表す。“アリールアミノ”基は、さらに、その基のアリール環部分で置換されていてもよい。“アラルキルアミノ”という用語は、アミノ窒素原子を介して他の基に結合したアラルキル基を包含する。“N-アリールアミノアルキル”および“N-アリール-N-アルキル-アミノアルキル”という用語は、1つのアリール基または1つのアリールと1つのアルキル基で、それぞれ、置換されていてもよく、アルキル基に結合されたアミノ基を有するアミノ基を表す。このような基の例としては、N-フェニルアミノメチルおよびN-フェニル-N-メチルアミノメチルが挙げられる。“アミノカルボニル”という用語は、式-C(＝O)NH2のアミド基を表す。“アルキルアミノカルボニル“とう用語は、1つまたは2つのアルキル基でアミノ窒素原子上を置換されているアミノカルボニル基を表す。“N-アルキルアミノカルボニル”“N,N-ジアルキルアミノカルボニル”が好ましい。上記定義したような低級アルキル部分を有する“低級N-アルキルアミノカルボニオル”“低級N,N-ジアルキルアミノカルボニル”基がさらに好ましい。“アルキルアミノアルキル”という用語は、アミノアルキル基に結合した1つ以上のアルキル基を有する基を包含する。“アリールオキシアルキル”という用語は、2価の酸素原子を介してアルキル基に結合したアリール基を有する基を包含する。“アリールチオアルキル”とう用語は、2価の硫黄原子を介してアルキル基に結合したアリール基を有する基を包含する。
【００８７】
本発明の方法にて使用する化合物は、遊離塩基またはその薬学的に許容可能な酸付加塩の形で存在するのがよい。“薬学的に許容可能な塩”という用語は、一般的に、アルカリ金属塩を形成したり、遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成する塩を包含する。塩の性質は、それが薬学的に許容可能である限り、重要ではない。式Iで表される化合物の適した薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から製造することができる。このような無機酸の例は、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸およびリン酸である。適当な有機酸は、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、芳香族脂肪族、ヘテロ環式、炭素環式、カルボキシルおよびスルホン類から選択することができ、その例は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマール酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、4-ヒドロキシ-安息香酸、フェニル乳酸、マンデル酸、エンボエ(パーモエ)酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸(algenic)、b-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクト酸(galactaric)およびガラクチュロン酸である。適した薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛からなる金属塩；または、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N-メチルグルカミン)およびプロカインからなる有機塩類が挙げられる。これらの塩類は、全て、例えば、適当な酸または塩基と化合物とを反応させることによって対応する化合物から慣用的な手段によって製造する
ことができる。
【００８８】
本発明は、心臓血管疾患の予防のための薬学的組成物であって、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは希釈剤（本明細書では、集合的に“担体”材料と称す）および、所望される場合の、その他の活性成分とともにアルドステロンブロッカーの治療学的に有効な量を含む。本発明の活性化合物は、当業者公知のいずれかの適当なルートによって、好ましくは、このようなルートに適合した医薬組成物の形で、かつ、意図する治療に有効な用量で投与することができる。活性化合物および組成物は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、気管支内、皮下、筋肉内または局所(例えば、エアロゾル)投与することができる。
【００８９】
アルドステロンブロッカーの投与は、経口ルートにより、または、静脈、筋肉内または皮下注射により達成することができる。配合物は、丸薬の形で、または、水性または非水性アイソトニック滅菌注射溶液または懸濁液の形であってもよい。これらの溶液および懸濁液は、1つ以上の薬学的に許容可能な担体または希釈液；または、結合剤、例えば、ゼラチンもしくはヒドロキシプロピル-メチルセルロースを、1つ以上の滑剤、保存剤、界面活性剤または分散剤とともに有する滅菌粉末または顆粒から製造することができる。
【００９０】
経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形であってもよい。医薬組成物は、好ましくは、個々の量の活性成分を含有する投薬単位の形で製造される。このような投薬単位の例は、錠剤またはカプセルである。これらは、約0.5〜250mg、好ましくは、約25〜150mgの各活性成分量を含有するのが有益であるかもしれない。哺乳動物のための適した日用量は、患者の状態およびその他の因子に依存して広範に変化させることができる。しかし、約0.01〜30mg/kg体重の用量、特に、約1〜15mg/kg体重の用量が適切であるかもしれない。
【００９１】
活性成分は、また、組成物として注射により投与することもでき、例えば、食塩水、デキストロースまたは水を適当な担体として使用することができる。各活性成分の適した日用量は、治療される病気に応じて多数回1日当り約0.01mg〜15mg/kg体重多数回投与される。好ましい日用量は、約1〜10mg/kg体重であろう。予防治療を示す化合物は、好ましくは、日用量概して1日当り約0.1mgから約15mg/kg体重の範囲内で投与されるであろう。さらに好ましい投薬量は、約1mg〜約15mg/kg体重の範囲であろう。1日当り約1〜約10mg/kg体重の範囲の投薬量が最も好ましい。1日あたり多数回の亜投与で適した用量を投与することができる。これら亜投与は、単位剤形で投与してもよい。典型的には、投与または亜投与は、単位剤形当り活性化合物約1mg〜約100mgを含有するのがよい。さらに好ましい投薬量は、単位剤形当り活性化合物約2mg〜約50mgを含有するであろう。単位用量当り活性剤約3mg〜約25mgを含有する剤形が最も好ましい。
【００９２】
好ましい組み合わせ療法にて、アルドステロン受容体アンタゴニストは、約10mg〜約200mgの範囲の量存在するのがよい。
本方法で病気の状態を治療するための投薬処方は、患者のタイプ、年齢、体重、性別および医学的状態、病気の重度、投与ルートおよび使用する個々の化合物を含め、多様な因子に従い選択され、かくして、広範に変化させることができる。
【００９３】
治療目的のためには、本方法の活性成分は、通常、指示された投与ルートに適切な1つ以上のアジュバントと組み合わせられる。経口投与の場合、成分は、ラクトース、シュクロース、澱粉粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、マグネシウムステアレート、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、ナトリウムアルギネート、ポリビニルピロリドン、および/または、ポリビニルアルコールを添加するのがよく、つ
いで、投与に便利なように錠剤化または封入するのがよい。このようなカプセルまたは錠剤は、活性化合物のヒドロキシプロピルメチルセルロース分散液で提供されるように、放出調節配合物を含有してもよい。非経口投与用の配合物は、水性または非水性アイソトニック滅菌注射溶液または懸濁液の形であってもよい。これら溶液および懸濁液は、経口投与用の配合物に使用される上記した1つ以上の担体または希釈剤を有する滅菌粉末または顆粒から調製することができる。成分は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および/または、種々の緩衝液に溶解させることができる。その他のアジュバントおよび投与モードも薬学分野で十分かつ広範に知られている。
【００９４】
エポキシ-ステロイド系アルドステロンアンタゴニストの固体状態形
本発明の方法は、1つ以上のそれ自体の固体形またはエプレレノンの1つ以上の固体形を含む医薬組成物形のいずれかのその固体状態形にてのエプレレノンの治療学的に有効な量の投与を包含する。これら新規の固体状態形としては、溶媒和された結晶質エプレレノン、非溶媒和結晶質エプレレノンおよび非晶質エポレレノンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
１つの実施態様にて、本発明の方法に従い投与されるエプレレノンは、以下の表1に記載するX線粉末回折パターン(本明細書で“高融点多形体”または“フォームH”と称す)を有するエプレレノンの非溶媒和結晶形である。フォームHエプレレノンは、国際出願公開パンフレットNo. WO01/42272に開示されており、この開示は、参考とすることにより本明細書に組み込む。
【００９６】
もう１つの実施態様にて、エプレレノンは、組成物に含有されるエプレレノンの全量が相純粋なフォームHとして存在する医薬組成物の形で投与される。もう１つの実施態様にて、エプレレノンは、組成物に含有されるエプレレノンの全量が相純粋なフォームLとして存在する医薬組成物の形で投与される。フォームLエプレレノンは、国際特許出願公開パンフレットNo. WO01/41535にて開示され、この開示は、参考とすることによって本明細書に組み込む。
【００９７】
もう１つの実施態様にて、エプレレノンは、組成物に含有されるエプレレノンの全量が相純粋な溶媒和された結晶質エプレレノンとして存在する医薬組成物の形で投与される。
もう１つの実施態様にて、エプレレノンは、組成物に含有されるエプレレノンの全量が非晶質エプレレノンとして存在する医薬組成物の形で投与される。
【００９８】
もう１つの実施態様にて、エプレレノンは、組成物がエプレレノンの第1の固体状態形とエプレレノンの第2の固体状態形とを含み、エプレレノンの第1および第2の固体状態形がフォームH、フォームL、溶媒和されたエプレレノンおよび非晶質エプレレノンから選択される医薬組成物の形で投与される。概して、前記第1の固体状態形対前記第2の固体状態形の重量比は、好ましくは、少なくとも約1：9、好ましくは、約1：1、さらに好ましくは、少なくとも約2：1、さらに好ましくは、少なくとも約5：1、なおさらに好ましくは、少なくとも約9：1である。エプレレノンの配合物は、また、国際特許出願公開パンフレットNo. WO00/33847およびWO01/41770に開示されており、これらの開示は、参考とすることによって本明細書に組み込む。
【００９９】
もう１つの実施態様にて、エプレレノンは、組成物がフォームHとフォームLとの両方を含む医薬組成物の形で投与される。組成物中のフォームL対フォームHの量の比は、約1：20〜約20：1の間である。その他の実施態様にて、例えば、この比は、約10：1〜約1：10；約5：1〜約1：5；約2：1〜約1：2；または、約1：1である。
【０１００】
上記実施態様の各々は、広範囲のエプレレノン粒子サイズにわたるエプレレノンの固体状態形の投与を包含してもよいが、エプレレノンの固体状態形を選択するとともに、エプレレノンの粒子サイズを低下させると、未配合のエプレレノンおよびその固体状態形のエプレレノンを含む医薬組成物の生物学的利用能を改善しうることが発見された。
【０１０１】
1つのこのような実施態様にて、未配合のエプレレノンまたは医薬組成物にて出発材料として使用されるエプレレノンのD90粒子サイズは、概して、約400ミクロン未満、好ましくは、約200ミクロン未満、さらに好ましくは、約150ミクロン未満、なおさらに好ましくは、約100ミクロン未満、なおさらに好ましくは、約90ミクロン未満である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約40ミクロンと約100ミクロンとの間である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約30ミクロンと約50ミクロンとの間である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約50ミクロロンと約150ミクロンとの間である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約75ミクロンと約125ミクロンとの間である。
【０１０２】
もう1つのこのような実施態様にて、未配合エプレレノンまたは医薬組成物にて出発材料として使用されるエプレレノンのD90粒子サイズは、概して、約15ミクロン未満、好ましくは、約1ミクロン未満、さらに好ましくは、約800nm、なおさらに好ましくは、約600nm、なおさらに好ましくは、約400nm未満である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約10nm〜約1ミクロンの間である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約100nm〜約800nmの間である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約200nm〜約600nmの間である。もう１つの実施態様にて、D90粒子サイズは、約400nm〜約800nmの間である。
【０１０３】
粒子サイズ約15ミクロン未満を有するエプレレノンの固体状態形は、当分野公知の適用可能な粒子サイズ低下技術に従い製造することができる。このような技術としては、U.S.特許 5,145,684；5,318,767；5,384,124および5,747,001が挙げられるが、これらに限定されるものではない。U.S.特許 5,145,684；5,318,767；5,384,124および5,747,001は、全く詳細に記載されている通り参考とすることによって特に組み込む。U.S.特許 5,145,684の方法に従えば、例えば、適当なサイズの粒子は、エプレレノンを液体分散媒に分散させ、粉砕媒体の存在でその混合物を湿式粉砕して、その粒子を所望されるサイズに小さくすることにより製造される。必要とされる場合によっては、粒子は、表面改質剤の存在で、サイズを低下させることができ、また、有益である。
【０１０４】
エプレレノンに適用する“非晶質”という用語は、エプレレノン分子が無秩序な配置で存在し、識別可能な結晶格子または単位格子を形成しない固体状態を称す。X線粉末回折に賦した時、非晶質エプレレノンは、いずれの特徴的な結晶質ピークも生じない。
【０１０５】
本出願で物質または溶液の“ 沸点”という場合、“沸点”という用語は、適用可能なプロセス条件下での物質または溶液の沸点を意味する。
エプレレノンに適用する“結晶形”という用語は、エプレレノン分子が配列され、(i)
識別可能な単位格子を含み；かつ、(ii)  X線照射に賦した時、回折ピークを生成する識別可能な結晶格子を形成する固体状態をいう。
【０１０６】
本出願を通して使用する“晶析”という用語は、エプレレノン出発材料の製造に関して適用可能な環境に応じた晶析および/または再結晶を称する。
“熟成(digestion)”という用語は、溶剤または溶剤混合物中の固体エプレレノンのスラリーを適用可能なプロセス条件下で溶剤または溶剤混合物の沸点に加熱するプロセスを意味する。
【０１０７】
本明細書で使用する“直接晶析”という用語は、エプレレノンの中間溶媒和された結晶
質固体状態形を形成および脱溶媒和することなく適当な溶剤から直接エプレレノンを晶析することをいう。
【０１０８】
本明細書で使用する“粒子サイズ”という用語は、当分野周知の慣用的な粒子サイズ測定技術、例えば、レーザー光散乱、沈降場流動分割(sedimentation field flow fractionation)、光子相関スペクトロスコピー(photon correlation spectoroscopy)またはディスク遠心分離によって測定される粒子サイズをいう。“D90粒子サイズ”という用語は、このような慣用的な粒子サイズ測定技術によって測定した粒子の少なくとも90%の粒子サイズを意味する。
【０１０９】
“純度”という用語は、慣用的なHPLC検定に従うエプレレノンの化学的純度を意味する。本明細書で使用する場合、“低純度エプレレノン”は、概して、フォームH成長促進剤および/またはフォームL成長阻害剤の有効な量を含有するエプレレノンを意味する。本明細書で使用する場合、“高純度エプレレノン”は、概して、フォームH成長促進剤および/またはフォームL成長阻害剤の有効な量を含有しないか、または、その有効量未満を含有するエプレレノンを意味する。
【０１１０】
“相純度(phase purity)”という用語は、本明細書に記載する赤外分光分析法によって測定したエプレレノンの個々の結晶質または非晶質形に関するエプレレノンの固体状態純度を意味する。
【０１１１】
“XPRD”という用語は、X線粉末回折を意味する。
“Tm”という用語は、融点を意味する。
【０１１２】
固体状態形の特性決定
1.  分子配座
単結晶X線分析は、特に、エプレレノン分子配座がステロイド環の7-位のエステル基の向きに関して、フォームHとフォームLとの間で異なることを示す。エステル基の向きは、C8-C-7-C23-02捩り角(torsion angle)によって定義することができる。
【０１１３】
フォームH結晶格子にて、エプレレノン分子は、エステルのメトキシ基がC-H結合と7-位でほぼ整列し、カルボニル基がBステロイド環の中心にわたってほぼ位置する配座を採る。C8-C7-C23-02捩り角は、この配座にてほぼ-73.0°である。この向きにて、エステル基(01)のカルボニル酸素原子は、9,11-エポキシド環(04)の酸素原子に密着している。01-04の距離は、約2.97オングストロームであり、これは、(酸素についてのファンデルワールス半径1.5オングストロームを仮定して)ファンデルワールス接触距離3.0オングストロームより直下である。
【０１１４】
フォームL結晶格子にて、エプレレノン分子は、そのエステル基がフォームHのそれに関してほぼ150°回転し、ほぼ+76.9°のC8-C7-C23-02の捩り角を有する配座を採る。この向きにて、エステルのメトキシ基は、Aステロイド環の4,5-アルケンセグメントを向く。この向きにて、エステル基のいずれかの酸素原子(01，02)と9,11-エポキシド環の酸素原子との間の距離は、フォームHについて,測定される距離に比較して長くなる。02-04距離は、ほぼ3.04オングストロームであり、ファンデルワールス接触距離の直上に入る。01-04距離は、約3.45オングストロームである。
【０１１５】
エプレレノン分子は、今日まで単結晶X線回折により分析されている溶媒和されている結晶形にてフォームLの配座特性を採るようである。
【０１１６】
2.  X線粉末回折
エプレレノンの種々の結晶形をSiemens D5000粉末回折計またはInel 多目的回折計のいずれかで分析した。Siemens D500粉末回折計については、素データは、2q値2〜50について測定し、ステップ0.020およびステップ期間2秒であった。Inel多目的回折計については、試料をアルミニウム試料ホルダー内に置き、素データは、同時に、全ての2θ値で30分間収集した。
【０１１７】
表1A、1Bおよび1Cは、(低純度エプレレノンの熟成によって得られるエタノール溶媒和物の脱溶媒によって製造される)フォームH、 (高純度エプレレノンの再結晶によって得られるメチルエチルケトン溶媒和物の脱溶媒和によって製造される)フォームLおよび(メチルエチルケトン中の高純度エプレレノンの室温スラリー変換によって製造される)メチルエチルケトン溶媒和物結晶形のエプレレノンについて、それぞれ、2q値および強度条件での主ピークの有意なパラメータを示す(波長1.54056オングストロームでのX線照射)。
【０１１８】
ピーク位の小さなシフトは、フォームHおよびフォームLの製造ルート(すなわち、溶媒和物の脱溶媒和)による結晶回折面の間隔の不完全性の結果としてフォームHおよびフォームLの回折パターンにて存在してもよい。また、フォームHは、粗製のエプレレノンの熟成によって製造される溶媒和物から単離される。本方法は、フォームHの低い全体としての化学的純度(ほぼ90%)を生ずる。最後に、エプレレノンの溶媒和された形は、結晶格子にて溶剤チャネル内での溶剤分子の移動度の増大により回折ピークの位置にて幾分かのシフトを示すことが予想される。
【０１１９】
【表５】
2006508174.tif 000015
【０１２０】
【表６】
2006508174.tif 000016
【０１２１】
【表７】
2006508174.tif 000017
【０１２２】
【表８】
2006508174.tif 000018
【０１２３】
【表９】
2006508174.tif 000019
【０１２４】
【表１０】
2006508174.tif 000020
【０１２５】
【表１１】
2006508174.tif 000021
【０１２６】
エプレレノンのフォームH、フォームLおよびメチルエチルケトン溶媒和物結晶形についてのX線回折パターンのグラフの例を、それぞれ、図1-A、1-Bおよび1-Cにて示す。フォームHは、7.0±0.2、8.3±0.2および12.0±0.2°2θで識別ピークを示す。フォームLは、8.0±0.2、12.4±0.2、12.8±0.2および13.3±0.2°2θで識別ピークを示す。メチルエチルケトン溶媒和された結晶形は、7.6±0.2、7.8±0.2および13.6±0.2°2θで識別ピークを示す。
【０１２７】
3.  溶融/分解温度
非溶媒和エプレレノン結晶形の溶融/分解温度は、TA Instrument 2920示差走査熱量計を使用して測定した。シールするまたはかシールしないアルミニウム皿内に各試料(1〜2mg)を置き、10℃/分で加熱した。溶融/分解範囲は、溶融/分解吸熱の推定開始から最高値までと定義した。
【０１２８】
非溶媒和エプレレノン結晶形(フォームHおよびフォームL)の溶融は、化学的分解およびトラップされた溶剤の結晶格子からの喪失を伴った。溶融/分解温度は、また、分析前の固体の温度調節によって影響を受けた。例えば、適当な溶剤からの；または、適当な溶剤または溶剤混合物中での高純度エプレレノンの晶析より得られる溶媒和物の脱溶媒和からの直接晶析によって製造される(D90粒子サイズ近似値約180〜450ミクロンの)非粉砕フォームLは、概して、溶融範囲約237〜242℃を有した。(D90粒子サイズの近似値約80〜100ミクロンの)粉砕したフォームL(適当な溶剤または溶剤混合物中の高純度エプレレノン溶液から溶媒和物を晶析し、その溶媒和物を脱溶媒和してフォームLを生成させ、生ずるフォームLを粉砕することによって製造されるフォームL）は、概して、より低くかつより広い溶融/分解範囲約223〜234℃を有した。低純度エプレレノンの熟成によって得られる溶媒和物の脱溶媒和によって製造される(D90粒子サイズの近似値約180〜450ミクロンの)非粉砕フォームHは、概して、より高い溶融/分解範囲約247〜251℃を有した。(a)  メチルエチルケトンから直接晶析させた非粉砕フォームL、(b)  メチルエチルケトンからの高純度エプレレノンの晶析によって得られる溶媒和物の脱溶媒和によって製造される非粉砕フォームL、(c)  メチルエチルケトンからの高純度エプレレノンの晶析によって得られる脱溶媒和された溶媒和物を粉砕することによって製造されるフォームLおよび(d)  メチルエチルケトンからの低純度エプレレノンの熟成により得られる溶媒和物の脱溶媒和によって製造される非粉砕フォームHのDSCサーモグラムの例を、それぞれ、図2-A、2-B、2-Cおよび2-Dにて示す。
【０１２９】
エプレレノンの溶媒和された形のDSCサーモグラムは、Perkin Elmer Pyris 1示差走査熱量計を使用して測定した。シールしていないアルミニウム皿に各試料(1〜10mg)を置き、10℃/分で加熱した。低温にての１つ以上の吸熱事象は、溶剤が溶媒和結晶格子から失われるにつれて生ずるエンタルピー変化を伴う。最も高い１つまたは複数の温度吸熱は、フォームLまたはフォームHエプレレノンの溶融/分解を伴った。エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和された結晶形についてのDSCサーモグラムの例を図2-Eにて示す。
【０１３０】
4.  赤外吸収分光法
エプレレノン(フォームHおよびフォームL)の非溶媒和された形の赤外吸収スペクトルは、Nicolet DRIFT(拡散反射赤外フーリエ変換)Magna System 550 分光光度計により得られた。スペクトル-テックコレクタ系およびマイクロサンプルカップを使用した。試料(5％)を臭化カリウム中で分析し、400〜4000cm-1で走査させた。希釈されたクロロホルム溶液(3％)中または溶媒和された結晶形中でのエプレレノンの赤外吸収スペクトルは、Bio-rad FTS-45分光光度計で得られた。クロロホルム溶液試料は、塩化ナトリウム塩板で0.2mm経路長さの溶液セルを使用して分析した。溶媒和物FTIRスペクトルは、IBMミクロ-MIR(多重内部反射)アクセサリーを使用して収集した。試料は、400〜4000cm-1で走査させた。(a)
フォームH、(b)  フォームL、(c)  メチルエチルケトン溶媒和物および(d)  クロロホルム溶液中のエプレレノンの赤外吸収スペクトルの例を、それぞれ、図3-A、3-B、3-Cおよび3Dにて示す。
【０１３１】
表2は、フォームH、フォームLおよびメチルエチルケトン溶媒和物結晶形のエプレレノンについての吸収帯の例を開示する。クロロホルム溶液中のエプレレノンについての吸収帯の例もまた比較のために開示する。フォームHとフォームLまたはメチルエチルケトン溶媒和物との間の差は、例えば、スペクトルのカルボニル領域にて観測された。フォームHがほぼ1739cm-1のエステルカルボニルストレッチングを有するのに対し、フォームLおよびメチルエチルケトン溶媒和物の両方は、それぞれ、ほぼ1724および1722cm-1に対応するストレッチングを有する。エステルカルボニルストレッチングは、クロロホルム溶液中のエプレレノンにてほぼ1727cm-1に生ずる。フォームHとフォームLとの間のエステルカルボニルのストレッチング周波数の変化は、その2つの結晶形の間のエステル基の向きの変化
を反映する。また、A-ステロイド環の共役ケトンのエステルストレッチングは、フォームHまたはメチルエチルケトン溶媒和物のいずれにてもほぼ1664〜1667cm-1からフォームLのほぼ1655cm-1にシフトする。対応するカルボニルストレッチングは、希釈溶液にてほぼ1665cm-1で生ずる。
【０１３２】
フォームHとフォームLとの間のもう１つの差は、C-Hベンディング領域にて見られた。フォームHは、フォームL、メチルエチルケトン溶媒和物またはクロロホルム溶液中のエプレレノンにて観測されないほぼ1399cm-1に吸収を有する。1399cm-1のストレッチングは、カルボニル基に隣接するC2およびC21メチレン基についてのCH2シソーシング領域にて生ずる。
【０１３３】
【表１２】
2006508174.tif 000022
【０１３４】
5.  核磁気共鳴
13C NMRスペクトルは、31.94MHzの磁場にて得られた。フォームHおよびフォームLエプレレノンの13C NMRスペクトルを、それぞれ、図4および5にて示す。フォームHエプレレノンを分析すると、図4にて反映されるデータが得られ、相純粋ではなく、少量のフォームLエプレレノンを含有した。フォームHは、64.8ppm周辺、24.7ppm周辺および19.2ppm周辺での炭素共鳴によって最も明瞭に識別される。フォームLは、67.1ppm周辺および16.0ppm周辺での炭素共鳴によって最も明瞭に識別される。
【０１３５】
6.  熱重量測定法
溶媒和物の熱重量測定分析は、TA Instrument TGA熱重量測定分析計を使用して行った。シールしないアルミニウム皿に窒素パージ下で試料を置いた。出発温度は、25℃であり、約10℃/分の速度で温度を上昇させた。メチルエチルケトン溶媒和物についての熱重量測定分析プロフィールの例を図6-Aにて示す。
【０１３６】
7.  単位格子パラメータ
以下の表3A、3Bおよび3Cは、フォームH、フォームLおよび幾つかの溶媒和された結晶形について測定した単位格子をまとめて示す。
【０１３７】
【表１３】
2006508174.tif 000023
【０１３８】
【表１４】
2006508174.tif 000024
【０１３９】
1溶媒和物分子は、チャネルにて溶剤分子の無秩序により完全には精製されなかった。
【０１４０】
【表１５】
2006508174.tif 000025
【０１４１】
1溶媒和物分子は、チャネルにて溶剤分子の無秩序により完全には精製されなかった。
エプレレノンの選択された溶媒和結晶形についてのさらなる情報は、以下の表4にて報告する。メチルエチルケトン溶媒和物について上記表3Aに報告した単位格子データは、また、これらさらなるエプレレノン結晶溶媒和物の多くについての単位格子パラメータの典型例である。試験したエプレレノン結晶溶媒和物の大部分は、実質的に、相互に等構造(isostructural)である。取り込まれた溶剤分子のサイズにより１つの溶媒和された結晶形から次の結晶形へのX線粉末回折ピークにおける若干の小さなシフトが存在してもよいものの、全体としての回折パターンは、実質的に同等であり、単位格子パラメータおよび分子配置は、試験した大部分の溶媒和物について、実質的に同一である。
【０１４２】
【表１６】
2006508174.tif 000026
【０１４３】
1窒素下加熱速度10℃/分で熱重量測定分析により決定した最終溶剤重量損失工程からの推定される脱溶媒和温度として定義した。しかし、脱溶媒和温度は、溶媒和物の製造方法によって影響を受けやすい。種々の方法により、低温にて溶媒和物の脱溶媒和を開始しうる種々の数の核形成部位を生じさせうる。
【０１４４】
溶媒和物の単位格子は、4つのエプレレノン分子によって構成される。単位格子中のエプレレノン分子と溶剤分子との化学量論もまた多数の溶媒和物について上記表4に報告する。フォームHの単位格子は、4つのエプレレノン分子によって構成される。フォームLの単位格子は、2つのエプレレノン分子によって構成される。溶媒和物単位格子は、エプレレノン分子が溶剤分子によって残された空間を満たすために転移および回転を受ける時、脱溶媒和の間に、フォームHおよび/またはフォームL単位格子へと変換される。表4は、また、多数の異なる溶媒和物についての脱溶媒和温度を報告する。
【０１４５】
8.  不純物分子の結晶特性
エプレレノンの不純物を選択すると、溶媒和物の脱溶媒和の間にフォームHの形成を誘発することができる。特に、以下の2つの不純物分子：7-メチル水素4α,5α：9”,11α-ジエポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-17α-プレグネ-7α,21-ジカルボキシレート,(γ-ラクトン3(“ジエポキシド”)；および、7-メチル水素11α,12α-エポキシ-17-ヒドロキシ-
3-オキソ-17α-プレグネ−４−エン-７”，21-ジカルボキシレート,(γ-ラクトン4(11,12-エポキシド“)の効果を評価した。
【０１４６】
【化１０】
2006508174.tif 000027
【０１４７】
脱溶媒和によって生ずるエプレレノン結晶形に及ぼすこれら不純物の影響は、本出願の実施例にてはるかに詳細に記載する。
7-メチル水素17-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグナ-4,9(11)-ジエン-7α,21-ジカルボキシレート,(γ-ラクトン5(“9,11-オレフィン”)とフォームHの単結晶構造にて類似性が示される場合、9,11-オレフィンもまた溶媒和物の脱溶媒和の間にフォームHの形成を誘発することができると仮定される。
【０１４８】
【化１１】
2006508174.tif 000028
【０１４９】
ジエポキシド,11,12-オレフィンおよび9,11-オレフィンは、それぞれ、例えば、Ng et al.，WO98/25948の実施例47C、47Bおよび37Hに記載されているようにして製造することができる。各不純物化合物について単結晶形が単離された。ジエポキシド、11,12-エポキシドおよび9,11-オレフィンについて単離された結晶形についての典型的なX線粉末回折パターンを、それぞれ、図9、10および11に示す。各不純物分子のX線粉末回折パターンは、フォームHのX線粉末回折パターンに類似し、フォームHと3つの不純物化合物とが類似した単結晶構造を有することを示唆する。
【０１５０】
各不純物化合物の単結晶もまた単離され、X線構造決定に賦して、これら3つの化合物がフォームHのそれと類似した単結晶構造を採ることが立証された。ジエポキシドの単結晶は、メチルエチルケトンから単離された。11,12-エポキシドの単結晶は、イソプロパノールから単離された。9,11-オレフィンの単結晶は、n-ブタノールから単離された。各不純物化合物の結晶形について測定された結晶構造データを表5に示す。生ずる結晶系と格子パラメータとは、フォームH、ジエポキシド、11,12-エポキシドおよび9,11-オレフィン結
晶形について、実質的に、同一であった。
【０１５１】
【表１７】
2006508174.tif 000029
【０１５２】
表5に報告した4つの化合物は、同一の空間群に晶析し、類似の格子パラメータを有する(すなわち、それらは、等構造である)。ジエポキシド、11,12-エポキシドおよび9,11-オレフィンは、フォームH配座を採ると仮定される。各不純物化合物について(溶液から直接)パッキングする(packing)フォームHの単離が比較的容易であることは、フォームH格子が構造的に類似した化合物のこの系列について安定なパッキングモードであることを示す。
【０１５３】
エプレレノンの製造
本発明の新規な結晶形を製造するために使用するエプレレノン出発材料は、Ng et al.，WO97/21720；および、Ng et al.，WO98/25948に記載の方法、特に、WO97/21720およびWO98/25948に記載のスキーム1を使用して製造することができる。
【０１５４】
結晶形の製造
1.  溶媒和された結晶形の製造
エプレレノンの溶媒和された結晶形は、適当な溶剤または適当な溶剤混合物からエプレレノンを晶析させることによって製造することができる。適当な溶剤または適当な溶剤混合物としては、概して、高温でいずれかの不純物とともにエプレレノンを可溶化するが、冷却すると溶媒和物を優先的に晶析する有機溶剤または有機溶剤混合物が挙げられる。このような溶剤または溶剤混合物におけるエプレレノンの溶解度は、概して、室温で約5〜約200mg/mLである。溶剤または溶剤混合物は、好ましくは、エプレレノン出発材料を製造するためのプロセスにて先に使用した溶剤；特に、エプレレノン結晶形を含む最終的な医
薬組成物にて含有される場合に薬学的に許容可能であろう溶剤から選択される。例えば、塩化メチレンを含み、塩化メチレンを含む溶媒和物を生成する溶剤系は、概して、望ましくない。
【０１５５】
使用される各溶剤は、好ましくは、薬学的に許容可能な溶剤；特に、“Impurities: Guideline For Residual Solvents”，International Conference On Harmmonization Of Technical Requirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use(Recommended for Adoption at Step 4 of the ICH Process on July 17，1997 by the ICH Steering Committee)に定義されているようにクラス2またはクラス3溶剤である。なおさらに好ましくは、溶剤または溶剤混合物は、メチルエチルケトン、1-プロパノール、2-プロパノール、酢酸、アセトン、ブチルアセテート、クロロホルム、エタノール、イソブタノール、イソブチルアセテート、メチルアセテート、エチルプロピオネート、n-ブタノール、n-オクタノール、イソプロパノール、プロピルアセテート、プロピレングリコール、t-ブタノール、テトラヒドロフラン、トルエン、メタノールおよびt-ブチルアセテートからなる群より選択される。なおさらに好ましくは、溶剤は、メチルエチルケトンおよびエタノールからなる群より選択される。
【０１５６】
エプレレノンの溶媒和された結晶形を製造するためには、エプレレノン出発材料のある量をある量の溶剤に可溶化させ、結晶が形成されるまで冷却する。エプレレノンを溶剤に添加する溶剤温度は、概して、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に基づいて選択されるであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤については、例えば、この溶剤温度は、典型的には、少なくとも約25℃、好ましくは、約30℃〜溶剤の沸点、さらに好ましくは、溶剤の沸点下約25℃〜溶剤の沸点である。
【０１５７】
あるいは、高温溶剤をエプレレノンに添加してもよく、結晶が形成されるまで混合物を冷却するのがよい。溶剤がエプレレノンに添加される時点での溶剤温度は、概して、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に基づき選択されるであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、溶剤温度は、典型的には、少なくとも25℃、好ましくは、約50℃〜溶剤の沸点、さらに好ましくは、溶剤の沸点下約15℃〜溶剤の沸点までである。
【０１５８】
所定の量の溶剤と混合されるエプレレノン出発材料の量は、同様に、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に依存する。典型的には、溶剤に加えるエプレレノンの量は、室温での溶剤のその量に完全に可溶化しないであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、所定の量の溶剤と混合されるエプレレノン出発材料の量は、通常、室温にて溶剤のその量に可溶化するであろうエプレレノンの量の少なくとも約1.5〜約4.0倍、好ましくは、約2.0〜約3.5倍、さらに好ましくは、約2.5倍である。
【０１５９】
エプレレノン出発材料が溶剤に完全に可溶化した後、溶液を典型的には緩やかに冷却すると、エプレレノンの溶媒和された結晶を晶出する。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、溶液は、約20℃/分より遅い速度、好ましくは、約10℃/分以下の速度、さらに好ましくは、約5℃/分以下の速度、なおさらに好ましくは、約1℃/分以下で冷却する。
【０１６０】
溶媒和された結晶形が収集される最終温度は、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に依存する。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、終点温度は、典型的には、約25℃未満、好ましくは、約5℃未満、さらに好ましくは、約-5℃未満である。最終温度が低いほど、概して、溶媒和された結晶形の形成に好ましい。
【０１６１】
あるいは、溶媒和物を製造するために、その他の技術も使用することができる。このような技術の例としては、(i)  １つの溶剤にエプレレノン出発材料を溶解し、溶媒和され
た結晶形の晶析を補助するために補助溶剤を加える、(ii)  溶媒和物の蒸気拡散成長、(iii)  蒸発、例えば、ロータリーエバポレータによる溶媒和物の単離、および、(iv)  スラリー変換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６２】
上記のようにして製造した溶媒和された結晶形の結晶は、いずれかの適当な慣用的な手段、例えば、濾過または遠心分離により溶剤から分離することができる。結晶の間の溶剤系の攪拌を速くすると、概して、より小さな結晶粒子サイズを生成する。
【０１６３】
2.  溶媒和物からのフォームLの製造
フォームLエプレレノンは、溶媒和された結晶形から脱溶媒和によって直接製造することができる。脱溶媒和は、いずれかの適当な脱溶媒和手段、例えば、溶媒和物を加熱すること、溶媒和物を取り囲む周囲温度を低下させることまたはそれらの組み合わせによって達成することができるが、これらに限定されるものではない。溶媒和物が溶剤を除去するために、例えば、オーブン内で加熱される場合、このプロセスの間の溶媒和物の温度は、典型的には、フォームHおよびフォームLについてのエナンチオトロピック転移温度(enantiotropic transition temperature)を上回ることがない。この温度は、好ましくは、約150℃を超えない。
【０１６４】
脱溶媒和圧力および脱溶媒和時間は、さほど、重要ではない。脱溶媒和圧力は、好ましくは、約1気圧以下である。しかし、脱溶媒和圧力が低いと、脱溶媒和が実施されうる温度および/または脱溶媒和時間が、同様に、低下または短縮される。特に、高い脱溶媒和温度を有する溶媒和物について、減圧下での乾燥は、低い乾燥温度の使用を許容とするであろう。脱溶媒和時間は、完了に到達するために、脱溶媒和、かくして、フォームLの形成を可能とするのに十分なだけ必要とされる。
【０１６５】
実質的に全てのフォームLを含む生成物の製造を確実にするために、エプレレノン出発材料は、典型的には、高純度エプレレノン、好ましくは、実質的に純粋なエプレレノンである。フォームLエプレレノンを製造するために使用されるエプレレノン出発材料は、概して、少なくとも90%純粋、好ましくは、少なくとも95%純粋、さらに好ましくは、少なくとも99%純粋である。本出願の他の箇所ではるかに詳しく考察するように、エプレレノン出発材料中のある種の不純物は、本プロセスから得られる生成物の収率およびフォームL含量に悪影響を及ぼす可能性がある。
【０１６６】
高純度エプレレノン出発材料からこのようにして製造される晶析されたエプレレノン生成物は、概して、少なくとも10%フォームL、好ましくは、少なくとも50%フォームL、さらに好ましくは、少なくとも75%フォームL、なおさらに好ましくは、少なくとも90%フォームL、なおさらに好ましくは、少なくとも約95%フォームL、なおさらに好ましくは、実質的に相純粋なフォームLを含む。
【０１６７】
3.  溶媒和物からのフォームHの製造
フォームHを含む生成物は、(i)  高純度エプレレノン出発材料の代わりに低純度エプレレノン出発材料を使用すること；(ii)  溶剤系に相純粋なフォームH結晶を接種すること；または、(iii)  (i)および(ii)の組み合わせによりフォームLの製造について上記したと実質的に同様に製造することができる。
【０１６８】
A.  成長促進剤および阻害剤としての不純物の使用
エプレレノン出発材料中の全ての不純物の合計量よりもむしろエプレレノン出発材料中の選択される不純物の存在および量が、溶媒和物の脱溶媒和間のフォームH結晶形成についての可能性により影響を及ぼす。選択される不純物は、概して、フォームH成長促進剤またはフォームL成長阻害剤である。それは、エプレレノン出発材料に含有されていても
よく、エプレレン出発材料を加える前に溶剤または溶剤混合物に含有されていてもよく、および/または、エプレレノン出発材料を加えた後に溶剤または溶剤混合物に加えてもよい。Bonafede et al.，“Selective Nucleation and Growth of an Organic Polymorph by Ledge-Directed Epitaxy on a Molecular Crystal Substrate”，J. Amer Chem Soc．，Vol. 117,No.30(Augast 2,1995)は、多形体システムにおける成長促進剤および成長阻害剤の使用を考察しており、参考とすることによって本明細書に組み込む。本発明については、不純物は、概して、フォームHの単結晶構造と実質的に同一の単結晶構造を有する化合物を含む。不純物は、好ましくは、フォームHのX線粉末回折パターンと実質的に同等なX線粉末回折パターンを有する化合物であり、さらに好ましくは、ジエポキシド、11,12-エポキシド、9,11-オレフィンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１６９】
フォームHを製造するために必要とされる不純物の量は、典型的には、一部、溶剤または溶剤混合物およびエプレレノンに関する不純物の溶解度に依存する。メチルエチルケトン溶剤からのフォームHの晶析にて、例えば、ジエポキシド対低純度出発材料の重量比は、典型的には、少なくとも約1：100、好ましくは、少なくとも約3：100、さらに好ましくは、約3：100〜約1：5の間、なおさらに好ましくは、約3：100〜約1：10の間である。11,12-エポキシドは、ジエポキシドよりもメチルエチルケトンにより高い溶解度を有し、概して、フォームH結晶を製造するのに概して必要とされるよりも大量の11,12-エポキシドを必要とする。不純物が11,12-エポキシドを含む場合、ジエポキシド対低純度エプレレノン出発材料の重量比は、典型的には、少なくとも約1：5、さらに好ましくは、少なくとも約3：25、なおさらに好ましくは、約3：25〜約1：5の間である。ジエポキシドおよび11,12-エポキシド不純物がともにフォームH結晶の製造にて使用される場合、各不純物対エプレレノン出発材料の重量比は、それら不純物の一方のみをフォームH結晶の製造に使用する時の対応する比よりも低いのがよい。
【０１７０】
選択された不純物を含む溶媒和物が脱溶媒和される時、フォームHおよびフォームLの混合物が、概して、得られる。溶媒和物の初期脱溶媒和から生ずる生成物中のフォームHの重量分率は、典型的には、約50%未満である。以下に考察するように、晶析または熟成によりこの生成物をさらに処理すると、概して、生成物中のフォームLの重量分率を増大させるであろう。
【０１７１】
B.  接種
フォームH結晶は、また、溶剤系に相純粋なフォームH結晶(または上記考察したようなフォームH成長促進剤および/またはフォームL成長阻害剤)をエプレレノンの晶析前に接種することによっても製造することができる。エプレレノン出発材料は、低純度エプレレノンまたは高純度エプレレノンのいずれであってもよい。いずれかの出発材料から製造される生成溶媒和物が溶解される時、生成物中のフォームHの重量分率は、典型的には、少なくとも約70%であり、約100%ほどの大きい値であってもよい。
【０１７２】
溶剤系に加えるフォームH種結晶対溶剤系に加えるエプレレノン出発材料の重量比は、概して、少なくとも約0.75：100、好ましくは、約0.75：100〜約1：20の間、さらに好ましくは、約1：100〜約1：50の間である。フォームH種結晶は、フォームH結晶の製造について本出願にて考察するいずれかの方法、特に、以下に考察する熟成によるフォームH結晶の製造方法によって製造することができる。
【０１７３】
フォームH種結晶は、一度に、多数回に分けて、あるいは経時的に実質的に連続して加えてもよい。しかし、フォームH種結晶の添加は、概して、エプレレノンが溶液から晶析を始める前に完了し、すなわち、接種は、曇り点(メタステーブル域の低い端)に到達する前に完了させる。接種は、溶液温度範囲が曇り点より約0.5℃高いから曇り点より約10℃高い範囲であり、好ましくは、曇り点より約2℃〜約3℃高い範囲である時実施される。種
が加えられる曇り点より高い温度が上昇するので、フォームH結晶の晶析に必要とされる接種の量は、概して、多くなる。
【０１７４】
接種は、好ましくは、曇り点より高いばかりではなく、メタステーブル域内でも行うことができる。曇り点およびメタステーブル域の両方とも、溶剤または溶剤混合物中のエプレレノンの溶解度および濃度に依存する。12体積希釈のメチルエチルケトンについて、例えば、メタステーブル域の高い端は、概して、約70℃〜約73℃の間であり、メタステーブル域の低い端(すなわち、曇り点)は、約57℃〜63℃の間である。8体積のメチルエチルケトン濃度については、メタステーブル域は、溶液が超飽和であるので、なお狭い。この濃度にて、溶液の曇り点は、約75℃〜約76℃で生ずる。メチルエチルケトンの沸点が、周囲条件下で約80℃であるので、この溶液についての接種は、典型的には、約76.5℃〜沸点の間で行う。
【０１７５】
フォームHでの接種の例を以降の実施例7に記載するが、これは、例を示すもので、限定するものではない。
フォームH成長促進剤またはフォームL成長阻害剤および/またはフォームH接種を使用して得られる晶析したエプレレノンは、概して、少なくとも2%のフォームH、好ましくは、少なくとも5%のフォームH、さらに好ましくは、少なくとも7％のフォームH、なおさらに好ましくは、少なくとも約10%のフォームHを含む。残りの晶析されたエプレレノン生成物は、概して、フォームLである。
【０１７６】
C.  エプレレノンを粉砕することによって製造されるフォームH
なおもう１つ別に、エプレレノンを適当に粉砕することによって少量のフォームHを製造することができることが発見された。粉砕したエプレレノンのフォームHの濃度約3%程度の高さが観測された。
【０１７７】
4.  低純度のエプレレノンから製造される溶媒和物からのフォームLの製造
上記考察したように、低純度のエプレレノンを晶析して溶媒和物を形成し、続いて、溶媒和物を脱溶媒和すると、フォームHとフォームLとの両方を含む生成物を生ずる。より多くのフォームL含量を有する生成物は、溶剤系に相純粋なフォームL結晶を接種するか、または、フォームL成長促進剤および/またはフォームH成長抑制剤を使用することによって、フォームHの製造について上記したのと実質的に同様にして低純度エプレレノンから製造することができる。接種プロトコルおよび溶剤系に加えるフォームL種結晶の量対溶剤系に加えるエプレレノン出発材料の重量比は、概して、相純粋なフォームH結晶を接種することによるフォームHエプレレノンの製造について先に上記考察したそれらの比と同等である。
【０１７８】
このようにして製造される晶析したエプレレノン生成物は、概して、少なくとも10%フォームL、好ましくは、少なくとも50%フォームL、さらに好ましくは、少なくとも75%フォームL、さらに好ましくは、少なくとも90%フォームL、なおさらに好ましくは、少なくとも約95%フォームL、なおさらに好ましくは、実質的に相純粋なフォームLを含む。
【０１７９】
フォームHエプレレノンの製造に関して本節および前節にて記載する接種プロトコルは、また、晶析されるエプレレノンの粒子サイズの調節を改善可能とする。
【０１８０】
5.溶液から直接のフォームLの晶析
フォームLエプレレノンは、また、脱溶媒和の必要のある中間体溶媒和物および関連物質を形成することなく適当な溶剤または溶剤混合物からのエプレレノンの直接晶析によっても製造することができる。典型的には、(i)  溶剤は、溶媒和物結晶格子の利用可能なチャネル空間に不適合な分子サイズを有し、(ii)  エプレレノンといずれかの不純物とは
、高温で溶剤に溶解性であり、(iii)  冷却すると、非溶媒和フォームLエプレレノンの晶析を生ずる。エプレレノンの溶剤または溶剤混合物への溶解度は、概して、室温で、約5〜約200mg/mLである。溶剤または溶剤混合物は、好ましくは、メタノール、エチルアセテート、イソプロピルアセテート、アセトニトリル、ニトロベンゼン、水およびエチルベンゼンからなる群より選択される１つ以上の溶剤を含む。
【０１８１】
フォームLエプレレノンを溶液から直接晶析するためには、ある量のエプレレノン出発材料を、溶剤のある量に可溶化し、結晶が形成されるまで冷却する。エプレレノンを溶剤に加える溶剤温度は、概して、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に基づき選択されるであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、この溶剤温度は、典型的には、少なくとも約25℃、好ましくは、約30℃〜溶剤の沸点まで、さらに好ましくは、溶剤の沸点下約25℃〜溶剤の沸点までである。
【０１８２】
あるいは、高温溶剤をエプレレノンに加えてもよく、その混合物は、結晶が形成されるまで冷却するのがよい。溶剤がエプレレノンに加えられる時点までの溶剤温度は、概して、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に基づき選択されるであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、溶剤温度は、典型的には、少なくとも25℃、好ましくは、約50℃〜溶剤の沸点まで、さらに好ましくは、溶剤の沸点下約15℃〜溶剤の沸点までである。
【０１８３】
所定量の溶剤と混合されるエプレレノン出発材料の量は、同様に、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に依存するであろう。典型的には、溶剤に加えられるエプレレノンの量は、室温でその溶剤を完全に可溶化しないであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、所定の溶剤量と混合されるエプレレノン出発材料の量は、室温で溶剤のその量に可溶化されるであろうエプレレノンの量の、通常、少なくとも約1.5〜約4.0倍、好ましくは、約2.0〜約3.5倍、さらに好ましくは、約2.5倍である。
【０１８４】
実質的に相純粋なフォームLを含む生成物を確実に製造するためには、エプレレノン出発材料は、概して、高純度のエプレレノンである。エプレレノン出発材料は、好ましくは、少なくとも65%純粋、さらに好ましくは、少なくとも90%純粋、なおさらに好ましくは、少なくとも98%純粋、なおさらに好ましくは、少なくとも99%純粋である。
【０１８５】
エプレレノン出発材料が溶剤に完全に可溶化した後、溶液は、典型的には、緩やかに冷却されて、エプレレノンの溶媒和された結晶形を晶析する。本明細書にて記載する大部分の溶剤について、例えば、溶液は、約1.0℃/分より緩やかな速度で、好ましくは、約0.2℃/分以下の速度で、さらに好ましくは、約5℃/分〜約0.1℃/分間の速度で冷却される。
【０１８６】
フォームL結晶が収集される終点温度は、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に依存する。本明細書にて記載する大部分の溶剤については、例えば、終点温度は、典型的には、約25℃未満、好ましくは、約5℃未満、さらに好ましくは、約-5℃未満である。
【０１８７】
あるいは、フォームL結晶を製造するためには、その他の技術を使用してもよい。このような技術の例としては、(i)  エプレレノン出発材料を１つの溶剤に溶解させてフォームLエプレレノンの晶析を補助する補助溶剤を加える、(ii)  フォームLエプレレノンの蒸気拡散成長、(iii)  蒸発、例えば、ロータリーエバポレータによるフォームLエプレレノンの単離、および、(iv)  スラリー変換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８８】
上記したようにして製造した溶媒和された結晶形の結晶は、いずれかの慣用的な手段、例えば、濾過または遠心分離によって溶剤から分離することができる。
また、フォームLエプレレノンは、また、高純度のエプレレノンのメチルエチルケトンスラリーを(以下に記載するように)熟成し、熟成したエプレレノンをスラリーの沸点で濾過することによって製造することもできる。
【０１８９】
6.  溶液からフォームHの直接製造
晶析がフォームHおよびフォームLのエナンチオトロピック転移温度(T1)より高い温度で行われる場合、特に、フォームH成長促進剤またはフォームL成長阻害剤が存在するかまたは溶剤に相純粋なフォームH結晶を接種する場合、フォームHがこれらのより高い温度でより安定であるので、フォームHは、溶液から直接晶析されるはずである。使用する溶剤系は、好ましくは、高沸点溶剤、例えば、ニトロベンゼンを含む。適したフォームH成長促進剤としては、ジエポキシドおよび11,12-オレフィンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
7.  エプレレノンの溶剤による熟成
エプレレノンの溶媒和された結晶形、フォームHおよびフォームLは、また、適当な溶剤または溶剤混合物中でエプレレノン出発材料の熟成によって製造することができる。熟成プロセスにて、エプレレノンのスラリーは、溶剤または溶剤混合物の沸点に加熱される。例えば、ある量のエプレレノン出発材料をある量の溶剤または溶剤混合物と組み合わせ、加熱還流し、留去物の除去と同時にさらなる量の溶剤を加えつつ留去物を除去する。あるいは、留去物は、熟成プロセスの間にさらなる溶剤を添加することなく、凝縮およびリサイクルされる。典型的には、元々の量の溶剤が一度除去されるかまたは凝縮およびリサイクリルされると、スラリーは、冷却され、溶媒和された結晶が形成される。溶媒和された結晶は、いずれかの適当な慣用的手段、例えば、濾過または遠心分離により溶剤から分離することができる。先に記載したような溶媒和物の脱溶媒和は、溶媒和された結晶における選択された不純物の存在または不在に依存し、フォームHまたはフォームLエプレレノンのいずれかを生成する。
【０１９１】
適当な溶剤または溶剤混合物は、概して、本明細書にて先に開示した１つ以上の溶剤を含む。溶剤は、例えば、メチルエチルケトンおよびエタノールからなる群より選択することができる。
【０１９２】
熟成プロセスに使用される溶剤に添加されるエプレレノン出発材料の量は、概して、スラリー(溶剤または溶剤混合物中のエプレレノンは、完全には可溶化されない)を溶剤または溶剤混合物の沸点に維持するのに十分である。値の例としては、4mLのメチルエチルケトン当り約1グラムのエプレレノン、8mLのエタノール当り約1グラムのエプレレノンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９３】
一度溶剤転換が完了してエプレレノンの溶媒和された結晶形を晶析すると、溶液は、概して、緩やかに冷却される。試験された溶剤について、例えば、溶液は、約20℃/分より遅い速度、好ましくは、約10℃/分以下の速度、さらに好ましくは、5℃/分以下の速度、なおさらに好ましくは、約1℃/分以下の速度で冷却される。
【０１９４】
溶媒和された結晶形を収集する終点温度は、溶剤または溶剤混合物の溶解度曲線に依存するであろう。本明細書に記載する大部分の溶剤について、例えば、終点温度は、典型的には、約25℃未満であり、好ましくは、約5℃未満であり、さらに好ましくは、約-5℃未満である。
【０１９５】
主としてまたは専らフォームLを含む生成物が所望される場合、高純度のエプレレノン出発材料が、典型的には、熟成される。高純度エプレレノン出発材料は、好ましくは、少なくとも98%純粋、さらに好ましくは、少なくとも99%純粋、なおさらに好ましくは、少な
くとも99.5%純粋である。このようにして製造される熟成されたエプレレノン生成物は、概して、少なくとも10%フォームL、好ましくは、少なくとも50%フォームL、さらに好ましくは、少なくとも75%フォームL、さらに好ましくは、少なくとも90%フォームL、なおさらに好ましくは、少なくとも約95%フォームL、なおさらに好ましくは、実質的に相純粋なフォームLを含む。
【０１９６】
主としてまたは専らフォームHを含む生成物が所望される場合、低純度エプレレノン出発材料が、典型的には、熟成される。低純度エプレレノン出発材料は、概して、フォームHを生成するために必要とされるほどのみのフォームH成長促進剤および/またはフォームL成長阻害剤を含有する。好ましくは、低純度エプレレノン出発材料は、少なくとも65%純粋、さらに好ましくは、少なくとも75%純粋、なおさらに好ましくは、少なくとも80%純粋である。このようにして製造される熟成されたエプレレノン生成物は、概して、少なくとも10%フォームH、好ましくは、少なくとも50%フォームH、さらに好ましくは、少なくとも75%フォームH、さらに好ましくは、少なくとも90%フォームH、なおさらに好ましくは、少なくとも約95%フォームH、なおさらに好ましくは、実質的に相純粋なフォームHを含む。
【０１９７】
8.  非晶質エプレレノンの製造
非晶質エプレレノンは、固体エプレレノンの適当な微粉砕、例えば、圧潰、粉砕および/または超微粉砕によって少量製造することができる。相純粋な非晶質エプレレノンは、例えば、エプレレノン溶液、特に、エプレレノン水溶液を凍結乾燥することによって製造することができる。これらの方法は、以降の実施例13および14にて示す。
【０１９８】
作業実施例
以下の実施例は、本出願にて記載するエプレレノンの種々の固体状態形を製造する方法の詳細な説明を含む。これらの詳細な説明は、本発明の範囲に入り、本発明を例示する役割を果たす。これらの詳細な説明は、例示する目的を表し、本発明の範囲について限定的な意図はない。特に断らない限り、部は、全て、重量部であり、温度は、摂氏温度である。以下の実施例の各々にて使用するエプレレノン出発材料は、Ng. et al,，WO98/25948に記載のスキーム1に従い製造した。
【０１９９】
実施例1：(a)  高純度エプレレノン出発材料からのメチルエチルケトン溶媒和物および(b)  生ずる溶媒和物からのフォームL結晶エプレレノンの製造
A.  メチルエチルケトン溶媒和物の製造：
マグネチックスターラーを900rpmで回転しつつホットプレート上で加熱沸騰することによって、高純度エプレレノン(437mg；0.2%未満のジエポキシドおよび11,12-エポキシドが存在し99%純度より高い)をメチルエチルケトン10mLに溶解させた。生ずる溶液をマクネチックスターラーで連続的に攪拌しつつ室温まで冷却させた。一度室温となったら、溶液を1℃浴に移し、攪拌を1時間維持した。1時間後、減圧濾過によって、固体のメチルエチルケトン溶媒和物を収集した。
【０２００】
B.  フォームL結晶エプレレノンの製造：
上記工程Aにて製造した固体のメチルエチルケトン溶媒和物を周囲圧力にてオーブン内100℃で乾燥させた。DSCおよびXPRD分析により乾燥させた固体を測定すると、純粋なフォームLであった。
【０２０１】
実施例2：高純度エプレレノン出発材料からのさらなる溶媒和物の製造
メチルエチルケトンを以下の溶剤：n-プロパノール、2-ペンタノン、酢酸、アセトン、ブチルアセテート、クロロホルム、エタノール、イソブタノール、イソブチルアセテート、イソプロパノール、メチルアセテート、エチルプロピオネート、n-ブタノール、n-オクタノール、プロピルアセテート、プロピレングリコール、t-ブタノール、テトラヒドロフ
ランおよびトルエンで置換し、実質的に実施例1の工程Aにて上記したようにして晶析を行うことによりさらなる溶媒和された結晶形を製造した。実質的に実施例1の工程Bにて記載したようにして、各溶媒和物からフォームLエプレレノンを形成した。
【０２０２】
実施例3：蒸気拡散成長によるメチルエチルケトン溶媒和物の製造
原液を形成するために、ホットプレート上で温めることによって、エプレレノン(400mg；99.9%純度より高い)をメチルエチルケトン20mLに溶解させた。原液8mL量を第1の20mLシンチレーションバイアルに移し、メチルエチルケトンで10mLに希釈した(80％)。その原液10mL量を第2の20mLシンチレーションバイアルに移し、メチルエチルケトンで10mLに希釈した(40％)。その原液の最終2mLをメチルエチルケトンで10mLに希釈した(20％)。希釈液を入れた４つのバイアルをアンチソルベントとして少量のヘキサンを入れたデシケータに移した。デシケータをシールし、ヘキサン蒸気をメチルエチルケトン溶液に拡散させた。翌日、80%希釈試料にて、メチルエチルケトン溶媒和物結晶が成長していた。
【０２０３】
実施例4：ロータリーエバポレータを使用する蒸発によるメチルエチルケトン溶媒和物の製造
エプレレノン(99.9％純度より高い)約400mgを250mL丸底フラスコに秤取する。溶剤(150ｍL)をフラスコに加え、必要とされる場合は、固体が溶解するまで緩やかに、その溶液を加熱する。生ずる透明な溶液をBuchiのロータリーエバポレータに入れ、浴温を約85℃とし、減圧下、溶剤を除去する。丸底フラスコにほぼ10mLの溶剤が残る時、溶剤除去を停止する。生ずる固体は、適当な方法(XPRD、DSC、TGA、鏡検法等)によって分析し、フォームを測定する。
【０２０４】
実施例5：スラリー変換
フォームLエプレレノンほぼ150mgとフォームHエプレレノン150mgとを酢酸エチル5mLに加えた。生ずるスラリーを300rpm(磁気攪拌)で一晩攪拌した。次の日、濾過により固体試料を収集した。試料をXPRDにより分析すると、試料がフォームLエプレレノンによって完全に構成されることが示された。
【０２０５】
実施例6：(a)  低純度エプレレノン出発材料からの溶媒和および(b)  生ずる溶媒和物からのフォームH結晶エプレレノンの製造
不純物7-メチル水素4α,5α,9α,11α-ジエポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-17α-プレグネ-7α21-ジカルボキシレート，(γ-ラクトン)(“ジエポキシド”)または不純物7-メチル水素11α,12α-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-17α-プレグネ-4-エン-7α,21-ジカルボキシレート，(γ-ラクトン(11,12-エポキシド)の種々の量を含有する試料は、前記不純物の所望される量を、7mLのシンチレーションバイアルに、合計試料質量100mgを与えるのに十分なエプレレノンの量とともに加えることによって製造した。各試料中のジエポキシドまたは11,12-エポキシドの重量パーセントを、それぞれ、表X-6Aおよび表X-6Bに示す。微小な(micro-flea)マグネチックスターラーを、メチルエチルケトン1mLとともに、各シンチレーションバイアルに入れた。バイアルを緩くキャップし、磁気攪拌(magnetic stirring)しつつ、ホットプレート上で加熱攪拌することによって固体を溶解させた。一度固体が溶解したら、ホットプレート上で、溶液を室温まで冷却した。冷却期間中、磁気攪拌を維持した。溶液が室温に到達した後、減圧濾過により固体を収集し、直ちに、X線粉末回折(XPRD)によって分析した。ついで、固体を100℃オーブンに入れ、周囲圧力で1時間乾燥させた。約12.1°2θにおけるフォームＨ回折ピーク面積をモニターすることにより、乾燥した固体をフォームH含量についてXPRDによって分析した。Inel Multipurpose Diffractometerを使用して、全てのXPRD回折パターンを記録した。
【０２０６】
【表１８】
2006508174.tif 000030
【０２０７】
【表１９】
2006508174.tif 000031
【０２０８】
A.  ジエポキシドの結果
図13は、(a)  0%、(b)  1%、(c)  3%および(d)  5％ジエポキシドドープトメチルエチルケトン晶析により得られる湿潤ケーキ(メチルエチルケトン溶媒和物)についてのX線粉末回折パターンを示す。ピーク強度は、比較が容易なように正規化されている。フォームHまたはジエポキシドのピーク特性は、回折パターンには存在しない。パターンは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物の特性である。
【０２０９】
図14は、(a)  0%、(b)  1%、(c)  3%および(d)5％ジエポキシドドープトメチルエチルケトン晶析により得られる乾燥した固体についてのX線粉末解析パターンを示す。ピーク強度は、比較が容易なように正規化されている。フォームHは、0および1%ドーピングレベ
ルで行ったメチルエチルケトン晶析に対応する乾燥した試料については検出されなかった。フォームHは、3および5%ドーピングレベルで行ったメチルエチルケトン晶析に対応する乾燥した試料にて検出された。各試料についての約12.1°2θでのフォームH回折ピークについての面積および評価されるフォームH含量は、以下の表X-6Cにて示される。
【０２１０】
【表２０】
2006508174.tif 000032
【０２１１】
表X-6Cにて報告した結果は、ジエポキシドの存在が脱溶媒和の間のフォームHに影響を及ぼすことを裏付ける。これらの結果は、ジエポキシドがメチルエチルケトン溶媒和物結晶に組み込まれるかおよび/または吸収される時、フォームHエプレレノンの形成を誘発するのに有効であることを示す。
【０２１２】
脱溶媒和の間に形成されるフォームHの量に及ぼす製造ルートのインパクトを分析するために、3%ジエポキシドドーピング実験を繰り返した。この実験にて、ドープト晶析により得られるメチルエチルケトン溶媒和物を２つの部分に分割した。第1の部分は、未処理のまま残し、他方、第2の部分は、乳鉢および乳棒で軽く粉砕して、高レベルの結晶欠損を誘発させた。2つの部分は、ともに、周囲圧力下100℃で1時間乾燥した。乾燥した固体は、XPRDにより分析した。(a)  乾燥に先立ち溶媒和物を粉砕しないかまたは(b)  乾燥に先立ち溶媒和物を粉砕したジエポキシドの3%ドーピングでメチルエチルケトン晶析からの乾燥した固体について、図15にて、XPRDパターンを示す。XPRDパターンは、未粉砕の試料と比較して粉砕した試料にてフォームHの量が多いことを示した。これらの結果は、メチルエチルケトン溶媒和物が単離されかつ処理される条件が脱溶媒和により生ずる結晶に影響を及ぼしうることを示唆する。
【０２１３】
B.  11,12-エポキシドの結果
図16は、(a)  0%、(b)  1%、(c)  5%および(d)  10%11,12-エポキシドドープトメチルエチルケトン晶析により得られる湿潤ケーキ(メチルエチルケトン溶媒和物)についてのX線粉末回折パターンを示す。ピーク強度は、比較が容易なように正規化されている。フォームHまたは11,12-エポキシドのピーク特性は、回折パターンには存在しない。パターンは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物の特性である。
【０２１４】
図17は、(a)  0%、(b)  1%、(c)  5%および(d)  10%11,12-エポキシドドープトメチルエチルケトン晶析により得られる乾燥させた固体についてのX線粉末回折パターンを示す。ピーク強度は、比較容易なように正規化されている。フォームHは、0、1%および5%ドーピングレベルで行ったメチルエチルケトン晶析に対応する乾燥した試料については検出されなかった。フォームHは、10%ドーピングレベルで行ったメチルエチルケトン晶析に対応する乾燥した試料にて検出された。各試料についての約12.1°2θでのフォームH回折ピークについての面積および評価されるフォームH含量は、表X-6Dにて示される。
【０２１５】
【表２１】
2006508174.tif 000033
【０２１６】
表X-6Dで報告した結果は、11,12-エポキシドの存在が脱溶媒和の間にフォームHの形成をインパクトすることを裏付ける。フォームHエプレレノンの形成を誘発するのに必要とされるメチルエチルケトン晶析における不純物のパーセンテージは、ジエポキシドについてよりも11,12-エポキシドについてより大きいようである。
【０２１７】
実施例7：晶析および乾燥の最終結晶形に及ぼす効果
晶析および乾燥の最終結晶形に及ぼす効果を分析する以下の4つの実験を行った：(i)  エプレレノンのメチルエチルケトン晶析(実験の23+3統計学的実験デザイン)、(ii)  少量の母液残渣の晶析、(iii)  フォームH接種での高純度エプレレノンの晶析および(iv)  フォームL接種での低純度エプレレノンの晶析。実験デザインでの変数としては、冷却速度、出発材料純度レベルおよび晶析の最終温度が挙げられる。本実施例の目的に対して、高純度エプレレノンは、超純粋な微粉砕したエプレレノン(HPLC分析は、この材料が100.8%純粋であることを示した)と定義し、低純度エプレレノンは、89%純粋なエプレレノンと定義した。低純度エプレレノンを製造するためには、エプレレノン製造についてのプロセスからのストリップトダウン母液を分析し、ブレンドさせて、61.1%エプレレノン、12.8%ジエポキシドおよび7.6％11,12-エポキシドである材料を生成させた。ついで、この材料を十分な量の高純度エプレレノンとブレンドさせて、89%エプレレノンを生成させた。
【０２１８】
A.  メチルエチルケトン晶析
メチルエチルケトン晶析実験にて、全ての実験は、高純度エプレレノン60gを使用して行った。高い終点は、45℃と定義し、低い終点は、5℃と定義した。速い冷却速度は、3℃/分冷却と定義し、遅い冷却速度は、0.1℃/分冷却と定義した。中心点は、1.5℃/分冷却、94.5%純粋なエプレレノンおよび25℃終点であった。
【０２１９】
バックグランド読みをFTIRで測定した後、メチルエチルケトン250mLを1リットルのMettler RC-1，MP10反応器に充填し、100rpmで攪拌した。数スキャン後、エプレレノンを反応器に充填し、続いて、メチルエチルケトンさらなる470mLを充填した。固体を懸濁するために、攪拌を500rpmまで速くし、バッチ温度を80℃まで上昇させた。エプレレノンが確実に溶解するように、バッチ温度を80℃に維持した。生ずる透明な溶液にて黒または白い斑点(specks)が概して目視された。ついで、バッチ温度を所望される終点まで所望される速度で傾斜冷却(ramp cooled)し、終点に1時間維持してから移しかえフラスコ(transfer flask)に入れ、濾過した。反応器、移しかえフラスコを減圧にし、ついで、ケーキをメチルエチルケトン120mLで洗浄した。ケーキを一度洗浄した後、停止した。各湿潤ケーキ約10グラムを軽い窒素ブリードで75℃の公称条件下にて減圧オーブン内で乾燥させた。以降に記載する“高、高、高”および“低、低、低”実験について、流動床乾燥は、高および低条件下で操作した。高流動床乾燥は、ブロワー設定“4”で100℃と定義し、他方、流動床
乾燥は、ブロワー設定“1”で40℃と定義した。
【０２２０】
B.  少量の母液残渣の晶析
少量の母液残渣の晶析実験にて、61.1%純粋な材料60gとメチルエチルケトン720mLとを直接1リットルのMettler RC-1，MP10反応器に充填した。反応器に充填する前に、61.1%純粋な材料を高純度のエプレレノンとブレンドしなかった。生ずる混合物は、80℃まで加熱し、その温度で不透明のスラリーであった。晶析を継続し、混合物を迅速な冷却条件下45℃で濾過した。
【０２２１】
C.  フォームH接種
フォームH接種実験にて、純粋な(100.8％)エプレレノン60gとメチルエチルケトン720mLとを1リットルのMettler RC-1，MP反応器に充填した。混合物を80℃まで加熱し、ついで、1.5℃/分の速度で25℃まで冷却した。溶液が62℃まで冷却された時、溶液に相純粋なフォームH結晶3gを接種して晶析を開始した。フォームH種結晶は、以降の実施例9に記載する熟成法によって製造した。
【０２２２】
D.  フォームL接種
フォームL接種実験にて、(100％エプレレノン48.3gと61.1%エプレレノン18.3gとを混合することによって製造した)89.3％のエプレレノン66.6gとメチルエチルケトン720mLとを1リットルのMettler RC-1，MP10反応器に充填した。混合物を80℃まで加熱し、ついで、1.5℃/分の速度で25℃まで冷却した。溶液が63℃まで冷却された時、溶液に相純粋なフォームL結晶を接種して晶析を開始した。フォームL種結晶は、上記実施例1に記載した晶析および脱溶媒和法によって製造した。
【０２２３】
実験よりの結果を表X-7Aに報告する。(n+1)回の晶析実験にて、フォームHは、生成物がジエポキシドを含有する低純度エプレレノンを使用する実験においてのみ検出された。最終生成物中の高レベルのジエポキシドは、また、速い冷却速度でも観測された。
【０２２４】
少量の母液残渣の晶析実験は、X線粉末回折によって分析した時、ジエポキシドとフォームHとの混合物であると思われる少量の材料を生成した。
フォームH接種実験(高純度のエプレレノンにフォームHを接種した場合)は、X線粉末回折分析に基づき77%のフォームHであるが、DSCに基づき完全にフォームHである生成物を生成した。しかし、X線粉末回折モデルは、約15%フォームHを越える直線性については試験しなかった。この実験は、ジエポキシドなしでフォームHを生成させる本実施例の4つの実験の1つのみであった。
【０２２５】
(低純度エプレレノンにフォームLを接種する)フォームL接種実験は、完全にフォームLである生成物を生成した。
エプレレノンの高流動床乾燥について得られるデータは、減圧オーブン乾燥について得られるデータに対応するようである。低流動床乾燥は、減圧オーブン乾燥の結果とは異なる結果を生ずる。
【０２２６】
【表２２】
2006508174.tif 000034
【０２２７】
1冷却速度：(+)＝3℃/分；(0)=1.5℃/分；および、(-)=0.1℃/分。
2冷却終点：(+)＝45℃；(0)=25℃；および、(-)=5℃。
3不純物レベル：(+)＝89.3%純度エプレレノン出発材料；(++)＝61.1%純度エプレレノン出発材料；(0)=100.8％純度エプレレノン出発材料；および、(-)=94.5％純度エプレレノン出発材料。
4溶媒和物を減圧オーブン内で75℃にて乾燥後の重量%。
5XPRDにより分析した時、フォームHおよびジエポキシドの混合物であるようである。
6XPRDにより分析した時、77%フォームH、DSCにより分析した時、100%フォームHであるようである。
【０２２８】
A.  材料純度
表X-7Aに報告したデータに基づく生成物純度、出発材料純度、冷却速度および終点温度の立方体プロット(cube plot)を図18にて示す。立方体プロットは、晶析の開始時にてより高純度の材料を使用すると、より高純度の生成物が生成するであろうことを示唆する。晶析の終点温度は、生成物の純度に大きな影響を及ぼさないようである。しかし、冷却速度は、より迅速な冷却速度により生ずる幾分低い純度の生成物にて影響を有するようである。事実、ジエポキシドのレベルは、概して、より迅速な冷却速度でより高かったようである。
【０２２９】
図19は、可変数がもしあれば生成物純度に統計学的に有意な影響を有するかどうかを決定するために、立方体プロットの結果を使用して作成した半正規化プロット(half normal
plot)を示す。出発材料純度は、生成物純度に最も統計学的に有意な効果を有するが、冷却速度および冷却速度と出発材料純度との間の相互作用も、また、統計学的に有意な効果と見られた。
【０２３０】
図20は、これらの結果に基づき、生成物の純度に及ぼす出発材料純度と冷却速度との間の相互作用を示す相互作用グラフである。高純度のエプレレノン(100.8％エプレレノン出発材料)では、冷却速度は、最終純度にほとんどまたは全く影響を有しないようである。しかし、低純度のエプレレノン(89.3％エプレレノン出発材料)では、冷却速度が速くなると、生成物純度が低下する。この結果は、より迅速な冷却速度で行われるエプレレノン晶析にては、より多量の不純物が晶析することを示唆する。
【０２３１】
B.  フォームH含量
表X-7Aにて報告したデータに基づくフォームH重量分率、出発材料生成物純度、冷却速度および終点温度の立方体プロットを図21に示す。立方体プロットは、晶析の開始時により高純度の材料を使用すると、フォームHのより少ない量を生成するであろうことを示唆する。晶析の終点温度もまた最終生成物のフォームに影響を有するようである。冷却速度は、フォームHの形成に大きく影響を及ぼさないようであるが、幾分かのフォームHは、不純物の存在にて、低い終点温度でより迅速な冷却により生ずるかもしれない。
【０２３２】
図22は、可変数がもしあれば最終材料にてフォームHの量に統計学的に有意な影響を有するかどうかを決定するために、立方体プロットの結果を使用して作成した半正規化プロット(half normal plot)を示す。出発材料純度、晶析の終点温度およびこれらの2つの変数間の相互作用は、統計学的に有意な効果を有すると見られた。
【０２３３】
高純度のエプレレノン(100.8％エプレレノン出発材料)では、終点温度は、フォームHの含量にほとんど影響を有しないようである。純粋なエプレレノンのいずれの場合にても、フォームHは、生成しなかった。しかし、低純度のエプレレノン(89.3％エプレレノン出発材料)では、フォームHは、いずれの場合にても存在し、より高い終点温度で有意により多量のフォームHを生じた。
【０２３４】
表X-7Bは、流動床(LAB-LINE/P. R. L. Hi-Speed Fluid Bed Dryer，Lab-Line Instruments，Inc.)または減圧オーブン(Baxter Scientific Products Vacuum Drying Oven, Model DP-32)のいずれかを使用して乾燥した材料にて測定したフォームHの重量分率を報告する。高流動床または減圧オーブンのいずれにて乾燥した匹敵しうる材料について同等のフォームH含量が観測された。しかし、乾燥オーブンと比較して低い流動床で乾燥させた匹敵しうる材料については、差が観測された。
【０２３５】
【表２３】
2006508174.tif 000035
【０２３６】
実施例8：溶媒和物を製造するためのメチルエチルケトンからのフォームHおよびフォームLの混合物の晶析および(b)  フォームLを製造するための溶媒和物の脱溶媒和
フォームHエプレレノン(10ｇ)をメチルエチルケトン80mLと合わせた。混合物を(79℃で)加熱還流し、この温度にて約30分間攪拌した。ついで、生ずるスラリーを65℃、50℃、35℃および25℃の各温度に約90分間維持することによって、スラリーを段階的な保持点プロトコル(holdpoint protocol)で冷却した。スラリーを濾過し、約20mLメチルエチルケトンで濯いだ。単離される固体を最初にフィルター上で乾燥させ、ついで、減圧オーブン内にて40〜50℃で乾燥させた。減圧オーブン内90〜100℃で乾燥を完了させた。脱溶媒和された固体は、82%回収で得られた。XPRD、MIRおよびDSCは、固体がフォームL結晶構造を有することを裏付けた。
【０２３７】
実施例9：フォームHを製造するための溶剤による低純度エプレレノン出発材料の熟成
A.  エタノール溶剤による熟成：
低純度エプレレノン(24.6g：HPLCにより64重量%検定)を126ｍLのエタノール3Aと合わせた。スラリーを加熱還流し、留去物を除去した。大気圧蒸留により126mLの溶剤を除去すると同時に、さらなる126mLのエタノール3Aを加えた。溶剤転換が完了したら、混合物を25℃まで冷却し、1時間攪拌した。固体を濾過し、エタノール3Aで濯いだ。固体を風乾すると、エタノール溶媒和物を与えた。溶媒和物をさらに減圧オーブン内で90〜100℃にて6時間乾燥させると、フォームHエプレレノン14.9gが得られた。
【０２３８】
B.  メチルエチルケトン溶剤による熟成
別の熟成プロセスにて、低純度エプレレノン(約65%純粋)1グラムをメチルエチルケトン4mLで2時間熟成した。2時間後、混合物を室温まで冷却した。冷却が済んだら、減圧濾過により、固体を収集し、XPRD分析によりメチルエチルケトン溶媒和物であることが決定された。固体を100℃にて30〜60分間乾燥させた。乾燥した固体は、XPRDにより純粋なフォームHであることが決定された。
【０２３９】
実施例10：フォームLを製造するための溶剤による高純度エプレレノン出発材料の熟成
A.  エタノール溶剤による熟成：
高純度エプレレノン(1グラム)をエタノール8mL中でほぼ2時間熟成した。ついで、溶液を室温まで冷却し、減圧濾過により、固体を収集した。濾過後直ちにXPRDにより固体を分析すると、固体が溶媒和物(恐らくは、エタノール溶媒和物)であることが示された。続いて、固体を大気圧下100℃で30分間乾燥させた。乾燥させた固体は、XPRDにより分析し、主としてフォームLである(フォームHは検出されなかった)ことが決定された。
【０２４０】
B.  メチルエチルケトン溶剤による熟成
高純度エプレレノン(1グラム)をメチルエチルケトン4mL中で2時間熟成した。2時間後、
溶液を室温まで冷却し、減圧濾過により、固体を収集した。固体は、直ちに、XPRDにより分析し、エプレレノンの溶媒和物(恐らくは、メチルエチルケトン溶媒和物)であることが決定された。続いて、溶媒和物を周囲圧下100℃で30〜60分間乾燥させた。乾燥させた固体は、XPRDにより分析し、主としてフォームLであり、フォームHについては回折ピークが存在しないことが決定された。
【０２４１】
実施例11：フォームLの溶液から直接晶析
処理法A：  75℃に加熱することによって、エプレレノン(2.5g)を酢酸エチルに溶解させた。エプレレノンが溶解したら、溶液を75℃に30分間保持して完全に溶解させた。ついで、溶液を1℃/分で13℃まで冷却した。13℃になったら、スラリーを、オーバーヘッドスターラーにより750rpmで2時間攪拌した。減圧濾過により、結晶を収集し、減圧オーブン内で40℃にて1時間乾燥させた。固体のXPRDパターンおよびDSCサーモグラムは、フォームLエプレレノンの特性であった。固体の熱重量分析(TGA)は、200℃までその固体から重量損失を示さなかった。
【０２４２】
処理法B:  別の処理法にて、2gのエプレレノンを、磁気攪拌しつつホットプレート上で加熱することによって、15/85%アセトニトリル/水350mLに溶解させた。エプレレノンが溶解したら、溶液を、磁気攪拌しつつ、室温まで一晩冷却した。生ずる固体を減圧濾過により収集した。結晶を複屈折すると、三角プレート様の晶相を有した。固体は、フォームLエプレレノンのXPRDおよびDSC特性を有した。TGAは、200℃まで重量損失を示さなかった。
【０２４３】
処理法C:  別の処理法にて、エプレレノン640mgをエチルベンゼン20mLとともに50mLフラスコに入れた。生ずるスラリーを116℃まで加熱すると透明な溶液となった。透明な溶液を30分かけて25℃まで冷却した。核形成は、冷却期間の間84℃で始まった。生ずる固体を溶液から濾過し、風乾すると固体530mg(83％回収)を与えた。高段階鏡検法およびXPRDは、固体が結晶であることを裏付けた。
【０２４４】
処理法D：  別の処理法にて、エプレレノン1.55gをニトロベンゼン2.0mLに加え、200℃まで加熱した。生ずるスラリーを200℃で一晩攪拌した。溶液を(自然空気対流で)室温まで次の日まで冷却し、固体を単離した。XPRDおよび偏光鏡検法により、固体は、フォームLエプレレノンであると決定した。
【０２４５】
処理法E：  別の処理法にて、エプレレノン(純度99%より高)5.0gをメタノール82g(104mL)に加えた。攪拌作業下(200rpm)、溶液を60℃まで加熱し、その温度に20分間保持して、完全に溶解させた。ついで、溶液を、攪拌下、0.16℃/分の速度で-5℃まで冷却した。濾過により、結晶を収集し、減圧オーブン内で40℃にて20時間乾燥させた。乾燥させた固体は、DSCおよびXPRD分析により純粋なフォームLであると決定された。
【０２４６】
処理法F：  別の処理法にて、エプレレノン(9％エタノールを含有し、かつ、補正純度95.2%を有するエタノール溶媒和物)6.0gをメタノール82g(104mL)に加えた。攪拌作業下(210rpm)、溶液を60℃まで加熱し、その温度に20分間保持して、完全に溶解させた。ついで、溶液を、0.14℃/分の速度で50℃まで冷却し、ついで、その温度に約2.5時間保持した。ついで、溶液を、攪拌下、0.13℃の速度で-50℃まで冷却した。濾過により、結晶を収集し、減圧オーブン内で40℃にて16時間乾燥させた。乾燥させた固体は、DSCおよびXPRD分析により純粋なフォームLエプレレノンであると決定された。
【０２４７】
実施例12：  フォームHの溶液からの直接晶析
ジエポキシド150.5mgとエプレレノン2.85gとをニトロベンゼン1.5mLに加えた。混合物を200℃で数時間磁気的に攪拌した。ついで、スラリーを、自然対流により、室温まで冷
却した。試料を乾燥させ、偏光鏡検法およびXPRDにより分析した。XPRDは、試料がフォームHとフォームLとの混合物であることを示した。鏡検法により、結晶は、半透明であり、脱溶媒和(およびフォームHまたはフォームLのいずれかへの変換)が生じなかったことを示す。
【０２４８】
実施例13：  微粉砕(Comminution)による非晶質エプレレノンの製造
スチール製のWig-L-Bug容器のほぼ半分にエプレレノン(99.9％純度より高)約60gを充填した。スチールボールおよびキャップを試料容器上に置き、Wig-L-Bug装置によって30秒間攪拌した。Wig-L-Bug容器の表面からエプレレノンをこすりとり、容器をさらに30秒間攪拌した。生ずる固体をXPRDおよびDSCにより分析し、非晶質エプレレノンとフォームL結晶エプレレノンとの混合物であることが決定された。
【０２４９】
実施例14：凍結乾燥による非晶質の製造
水400mLを入れたビーカーに粗製のエプレレノンほぼ100mgを秤取した。溶液を5分間幾分加熱し、ついで、超音波処理し、攪拌しつつ、さらに5分間加熱した。HPLC水50mLを入れた1000mL丸底フラスコに、ほぼ350mLのエプレレノン溶液を濾過した。1〜2分間かけて、ドライアイス/アセトン浴で溶液をフラッシュ凍結した(flushed frozen)。フラスコをLabconco Freezone 4.5凍結乾燥機に取り付け一晩攪拌した。フラスコ内の固体を褐色小瓶に移した。カーギル油(1.404)中、偏光顕微鏡下、10X、1.25Xオプチバー(optivar)で少量のアリコートが観測され、少なくとも95%非晶質エプレレノンであることが観測された。図24および25は、非晶質エプレレノンについて得られるXPRDパターンおよびDSCサーモグラムを示す。図24の39°2θで観測されるピークは、アルミニウム試料容器に起因する。
【０２５０】
実施例15：  エプレレノン多形体組成物
フォームLエプレレノンの25mg、50mg、100mgおよび200mg用量を含有する錠剤を製造し、錠剤は、以下の組成を有する：
【０２５１】
【表２４】
2006508174.tif 000036
【０２５２】
実施例16：  エプレレノン多形体組成物
エプレレノン100mg用量を含有するカプセル(硬質ゼラチンカプセル，#0)を製造し、このカプセルは、以下の組成を有する：
【０２５３】
【表２５】
2006508174.tif 000037
【０２５４】
実施例17：エプレレノン多形体組成物
エプレレノン200mg用量を含有するカプセル(硬質ゼラチンカプセル，#0)を製造し、このカプセルは、以下の組成を有する：
【０２５５】
【表２６】
2006508174.tif 000038
【０２５６】
実施例18：  粉砕したエプレレノンの製造
乾燥させたメチルエチルケトン溶媒和物は、最初にその溶媒和物をフィッツミル(Fitzmill)上で20メッシュの篩を通過させることによって脱塊する(delumped)。脱塊した固体は、ついで、Alpine Hosakawaスタッドディスクピン粉砕機を使用し、液体窒素下で操作し、ほぼ250kg/時の供給速度で冷却してピン粉砕(pin milled)する。ピン粉砕により、D90サイズほぼ65〜100ミクロンを有する微粉砕されたエプレレノンを生成する。
【０２５７】
被検者の個体群
ある種の群は、アルドステロンの変調効果を乱すことがさらに立証されている。アルドステロンに影響されやすいこれらの群の員は、また、典型的には、塩に鋭敏であり、個体の血圧は、概して、ナトリウム消費の増減に従い、それぞれ、上昇および降下する。本発明は、実施にて、これらの群に限定されると考えるべきものではなく、これらの被検者群は、本発明のアルドステロンブロッカーの抗炎症投与による治療に特に適していると考えるべきである。
【０２５８】
本発明の実施態様にて、被検者は、好ましくは、全部または一部にて、日本民族または黒色人種の員である。日本国における高血圧症は、重大な問題である。１つの最近の評価によると、約30,000,000人もの日本の成人が高血圧症にかかっていると示唆されている。(Saruta T，J. Clin. Ther Med 1997；13；4024-9)。血圧を調節する情勢は、日本国にて最近改善されているものの、高血圧の処置は、なお、不十分であると考えられる。(Shimamoto；K. Japanese  Cases. Nihon Rinsyo(Clinical Medicine in Japan)，2000；58(Suppl)：593-6)。Trends in blood pressure and urinary sodium and potassium excretion
in Japan：reinvestigation in the 8th year after the Intersalt Study. Nakagawa H，et al. Hum. Hypertens 1999 Nov；13(11)：735-41は、日本国民が摂取カリウムを増加させ、摂取ナトリウムを低下させることを勧めている。
【０２５９】
しかし、日本国におけるナトリウム制限処方は、混同され、遵守されないでいる。Kobayashi et al.による日本国の研究によれば、5〜8グラム/日に制限された摂取が処方されるが、なお良く遵守されないでいる。(Kobayashi，Y et al.：Jpn Citr J 1983；47：268-75)。日本国の厚生省は、10グラム/日未満にナトリウムを制限することを推奨している(Guidelines on treatment of hypertension in the elderly, 1995--a tentative plan for comprehensive research projects on aging and health--Members of the Research Group for“Guidelines on Treatment of Hypertension in the Elderly”，Comprehensive Research Projects on Aging and Health, the Minstry of Health and Welfare of Japan). Ogihara T，et al．Nippon Ronen Igakkai Zasshi. 1996；33(12)：945-75).公衆に普及させるべく発案されて10年になるにもかかわらず、日本国の正常な個体と高血圧症の個体との間の尿ナトリウムレベルによって測定すると、なお遵守されていない比率が高い(約50%より高いと見積もられる)。（Kobayashi Y，et al. Jpn Circ J；47(2)：268-75）．
さらに、日本では、２つの広い群、塩鋭敏性および塩非鋭敏性の2つの群が示されている(Preventive nutritional factors in epidemiology：interaction between sodium and calcium. Mizushima S. Clin Exp Pharmacol Physical 1999；26：573)。多くの日本人の高血圧症は、塩鋭敏性であると考えられる。したがって、塩鋭敏性、高ナトリウム摂取および自発的なナトリウム消費制限欠如の組み合わせを示す日本民族の員は、本発明の療法によることが特に有益である。
【０２６０】
したがって、本発明のもう１つの実施態様にて、治療の必要のある被検者は、全体または一部にて、日本民族群の員であり、とりわけ、高血圧症；および/または、心臓血管疾患、特に、心不全、左心室拡張機能不全、肥大性心筋症および拡張性心不全からなる群の1つ以上の員から選択される心臓血管疾患にかかるかまたはかかりやすい塩鋭敏性の個体である。
【０２６１】
黒色人種における高血圧症も同様に重大な問題である。多くの高血圧症の黒人および正常な血圧の黒人は、塩鋭敏性である(Svetkey, LP et al.：Hypertension 1996；28：854-8)。免疫学の収集されたデータによれば、黒人の間での高血圧症の罹患率は、ほとんど全ての年齢および性別に符合する群にて白人より高い。高血圧症の黒人は、概して、高血圧症の白人よりも、左心室機能不全、発作および腎臓損傷の発生率が高い(が、虚血性心臓病の発生率が低い)。(Eisner, GM. Am. J. Kidney Dis 1990；16(4 Sppl 1)：35-40).  アメリカ系の黒人間の免疫学的な高血圧症についての原因は、大きくは、環境的な要因により；高ナトリウムおよびアルコール摂取、肥満、物理的不活性および心理社会的ストレスが全て原因とされている。(Flack, JM, et al.：J Assoc And Acad Minor Phys 1991；2：143-50).
黒色人種および白色人種両個体間の問題の原因は、不明瞭であるが、ナトリウムハンドリングの差が、黒人の高血圧症の特定の血流力学およびホルモン特性に寄与するようであ
る。ナトリウム排泄増加性容量を制限する内因性または高血圧誘発性腎異常、低いNa+, K(+)-ATPアーゼポンプ輸送活性、その他の膜イオン輸送外乱、心理的ストレッサーに対する暴露較差、より大きなインスリン抵抗性および摂取性因子(少ないカルシウムおよびカリウム摂取)が、恐らくは、役割を演ずると考えられる。(Flack, JM et al.；Hypertension；1991；17(1 Suppl)：I115-21)．一般的な差は、黒人にての塩鋭敏性を根拠とするかもしれないという研究もある。(Svetkey LP et al.：Hypertension 1996；28：854-8)
黒人の高血圧は、概して、最初に、食事にてナトリウム摂取を制限することによって処置される。食事による制御が不十分な場合、24時間効力を有し、血管抹消抵抗を低下させ、ナトリウム排泄を促進し、腎血流力学を強力に改善する抗高血圧症剤の投与が推奨されている。(Eisner, GM. Am. J. Kidney Dis 1990；16(4 Suppl 1)：35-40)．しかし、黒人は、概して、白人と比較して抗高血圧剤に対して異なって応答する。概して、β-アドレナリン作動性受容体アンタゴニストまたはACE阻害剤を使用する単一療法は、白人におけるほど黒人においては効果的ではない。黒人男性は、黒人女性よりもなおさらにACE阻害剤に対して応答性ではないようである(Eisner GM. Am. J. Kidney Dis 1990；16(4 Suppl
1)：35-40)．したがって、塩鋭敏性、高ナトリウム摂取および自発的なナトリウム消費制限欠如の組み合わせを示す黒色人種の員は、本発明の療法によることが特に有益である。
【０２６２】
したがって、本発明のもう1つの実施態様にて、治療の必要のある被検者は、全体または一部にて、黒色人種群の員であり、とりわけ、高血圧症；および/または、心臓血管疾患、特に、心不全、左心室拡張機能不全、肥大性心筋症および拡張性心不全からなる群の1つ以上の員から選択される心臓血管疾患にかかるかまたはかかりやすい塩鋭敏性の個体である。
【０２６３】
非変調個体
非変調個体は、腎臓血液流速およびアルドステロンの副腎生成にて高ナトリウム摂取またはアンギオテンシンII投与に対して鈍い陽性応答を示す。このような非変調個体は、また、迅速なインスリンレベルの増加およびグルコース刺激インスリンレベルにおける増分の増加を示すかもしれない。(Ferri et al.：Diabetes 1999；48；1623-30)．インスリン抵抗もまた心筋梗塞の危険性の増加を伴う。
【０２６４】
したがって、本発明のもう1つの実施態様にて、治療の必要のある被検者は、とりわけ、(i)  インスリン抵抗、特に、タイプIまたはタイプII真性糖尿病、および/または、グルコース抵抗にかかるかまたはかかりやすいか；および/または、(ii)  心臓血管疾患にかかるかまたはかかりやすい塩鋭敏性かつ非変調の個体である。
【０２６５】
老齢な個体
塩鋭敏性の個体にて、ナトリウムの食事にての摂取の増加を示すことへの血圧応答の増分は、年齢とともに高くなる。同様に、塩鋭敏性は、高年齢の個体にてより多い頻度で観測される。さらに、インスリン抵抗は、年齢とともに同様な増加を示す。
【０２６６】
したがって、本発明のもう1つの実施態様にて、治療の必要のある被検者は、とりわけ、インスリン抵抗、特に、タイプIまたはタイプII真性糖尿病；および/または、グルコース抵抗にかかるかまたはかかりやすい少なくとも55歳、好ましくは、少なくとも約60歳の塩鋭敏性の個体である。
【０２６７】
解毒および覚醒すべきアルコール依存症
解毒および覚醒すべきアルコール依存症もまた一般的に塩鋭敏性である(Genaro C et al.：Hypertension 2000：869-874)。したがって、本発明のもう1つの実施態様にて、治療の必要のある個体は、塩鋭敏性個体であり、とりわけ、解毒または覚醒すべきアルコール
依存症である。
【０２６８】
肥満症
肥満症の個体は、一般的に塩鋭敏性である。Bonnerによる研究(MMW Fortschr Med 1999；14：34-6)は、全高血圧症患者の44%が体重が重すぎ、さらに、塩鋭敏性、高い細胞内カルシウム、ナトリウム保持および高い心臓の心拍出量を伴うと評価している。さらに、Dimsdale et al．(Am J Hypertens 1990；3：429-35)は、肥満患者が塩負荷に応答して自らの収縮圧を多分に増加させるようであると報告している。また、塩鋭敏性の子供もまた肥満症および心臓血管病の高い可能性を有する。(Falkner B et al．：Am. J．Clin. Nutr 1997；65：618S-621S)。正常血圧の個体においてさえ、ナトリウム鋭敏性の被検者は、ナトリウム抵抗被検者よりも体重が重い傾向にある。(Rocchini AP et al，：Am. J. Med Sci 1994；307 Suppl 1：575-80)．したがって、本発明のもう1つの実施態様にて、治療の必要のある被検者は、塩鋭敏性の個体、とりわけ、肥りすぎである。
【０２６９】
生物学的評価
ヒト心臓血管疾患は、複合状態であり、血管の高緊張または心筋梗塞(MI)によって始まることが多い。心臓血管疾患について治療の有望な効き目を決定するためには、数種の検定にて成分の効力を決定することが重要である。したがって、検定“A”にて、アルドステロンアンタゴニストエプレレノン(エポキシメクスレノン)の効力を、アンギオテンシンII輸液を使用して血管の炎症を有する高血圧症のラットモデルにて測定した。検定“B”にて、血管炎症を伴う高血圧症を発症させるために、アルドステロン輸液を使用して、ラットモデルにおけるアルドステロンアンタゴニストエプレレノン(エポキシメクセレノン)の効力を評価する研究を記載する。検定“C”にては、血管炎症を伴う高血圧症を発症させるために、アルドステロン輸液を使用して、ラットモデルにおけるアルドステロンアンタゴニストエプレレノン(エポキシメクスレノン)の効力を評価するさらなる研究を記載する。
【０２７０】
また、臨床試行を使用して、ヒトにて、アルドステロンアンタゴニスト療法を評価することができる。このような治療試験の数多くの例、例えば、American Journal of Cardiology 78，902-907(1996)に記載されたRALES 003研究またはNew England Journal of Medicine 341，709-717(1999)に記載されたR-ALES004研究が公開されている。
【０２７１】
検定  A：  インビボアンギオテンシンII輸液モデル
プロトコル：
方法：
・雄ウイスターラット(n＝50，10/群；BW＝200g)
・飲むための1%NaCl
・実験群
1対照
2アンギオテンシンII(25ng/分，アルゼットミニポンプを介してのsc)
3アンギオテンシンII(25ng/分，sc)+エプレレノン100mpk
4アンギオテンシンII(25ng/分，sc)+副腎摘出＋デキサメタゾン(12μg/kg/d，sc)
5アンギオテンシンII(25ng/分，sc)+副腎摘出＋デキサメタゾン(12μg/kg/d，sc)＋アルドステロン(40mg/kg/d，アルゼットミニポンプを介してのsc)
・毎週テイル-カフ(tail-cuff)によって測定したSBP
・24時間食事および液体摂取および毎日測定した尿排出量
・尿電解質の測定のために毎日収集した尿試料
・4週間後血液採取(exanguination)によって殺害。血清電解質の測定のために乾燥試験管内に、および、アルドステロンおよびコルチコステロイドレベルの測定のためにEDTAを入れた試験管内に血液を収集した。
【０２７２】
心臓をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、形態学的異常(すなわち、壊死、血管損傷)の測定について分析した。
【０２７３】
結果
血圧  アンギオテンシンII輸液を受容する全ての動物にて収縮血圧が上昇した。ビヒクルを受容する動物と比較する時、エプレレノンも副腎摘出もともに血圧を低下させなかった。アルドステロン注入は、アンギオテンシンII/塩、副腎摘出したラットにて血圧を上昇させた。図23は、収縮血圧のこの上昇を示す。
【０２７４】
電解質排出  毎日の尿Na＋排出および尿K+排出の間の比(U Na＋/K+比)をナトリウム排泄増加指数として使用した。尿Na＋/K+比は、処置前の全ての群にて同等であり、高塩食餌を開始すると、全ての動物にて同様に上昇した。尿Na+/K+比は、17日目までアンギオテンシンII輸液を受容する動物にて変化がなかったが、この時、それは、ビヒクル注入ラットに関してこれらの動物にて有意に上昇した。同様の効果は、エプレレノンを受容するアンギオテンシンII注入動物にても生じ、このことは、注入14日目からの尿Na+/K+比における上昇を立証する。しかし、エプレレノン処置したラットは、いずれの時点でもビヒクルで処置したアンギオテンシンII注入ラットよりもより高い尿Na+/K＋比を示す。事実、アンギオテンシンII注入ビヒクル処置したラットがエプレレノン処置した動物よりもより高い尿Na+/K+比を示す時、21日目でようやく有意な差が観測され、これらの実験条件下では、エプレレノンは、有意な利尿またはナトリウム排泄増加性効果を生じなかったことを示す。アルドステロン注入の有無に関せず、副腎摘出された動物は、必ず、副腎摘出を受けない動物よりもより高い尿Na+/K+比を示した。
【０２７５】
心筋損傷  十中七つのアンギオテンシンII/塩処置した動物が、冠状動脈にて血管炎症変化を発現した。これらの変化は、脈間周囲の白血球浸潤、主として、マクロファージを特徴とした。動脈によっては、その媒体の線維素様壊死もまた観測された。場合によっては、外傷が甚だしい時、周囲の心筋にて付随する心筋細胞壊死(cardiomyocyte necrosis)も存在した。心筋壊死の発見と結びつき、これらの場合には、実質出血(Parenchymal Hemorrhages)も観測された。これらの血管炎症外傷は、エプレレノンを受容するアンギオテンシンII注入動物の十中一のみにて観測されるが、にもかかわらず、これらの動物は、ビヒクル処置したアンギオテンシンII注入ラットと同程度に高血圧であった。(図24参照)。同様に、副腎摘出は、心臓にての血管炎症外傷を予防した。しかし、アルドステロン置換は、アンギオテンシンII注入した副腎摘出を受けないビヒクル処置したラットにて観測される重度の冠状および心筋炎症ならびに損傷を回復させた。
【０２７６】
アンギオテンシンII注入したラットからの心臓をシクロオキシゲナーゼ-2特異性抗体で免疫染色(Immunostaining)すると、動脈の周囲の炎症領域、主として、単核細胞/マクロファージにて、この酵素の存在が同定された。シクロオキシゲナーゼ-2染色(staining)は、また、脈管周囲に凝集する多形変化または炎症の証拠が存在しない時でさえ、冠状動脈の媒体の血管平滑筋細胞にて観測された(図26)。エプレレノン処置および副腎摘出は、アンギオテンシンII注入したラットからの心臓にてシクロオキシゲナーゼ-2の発現を著しく低下させ、大部分の場合、完全に予防した(図25および27)。アンギオテンシンII、副腎摘出したラットにてアルドステロン置換すると、冠状動脈におけるシクロオキシゲナーゼ-2の存在が回復された。
【０２７７】
オステオポンチン(早期T-細胞活性-1，Eta-1としても公知)は、単核細胞の化学走性誘引、活性化および転移を媒介する前炎症特性を有する分泌グリコ蛋白質である。アンギオテンシンII注入し食塩水を飲ませたラットからの心臓をオステオポンチン-特異性抗体で免疫染色(Immunostaining)すると、冠状動脈のその媒体中にてオステオポンチンの存在が
同定された。エプレレノン処置および副腎摘出の両方とも、アンギオテンシンII注入し食塩水を飲ませたラットからの心臓におけるオステオポンチン発現を予防した(図28および29)。アルドステロン置換は、副腎摘出した動物にてオステオポンチン発現を回復した。
【０２７８】
検定B：  インビボアルドステロン注入モデル
プロトコル2：
方法：
・雄SD-ラット(n＝39；BW＝250g)
・飲むための1%NaCl
・ミニポンプ移植の間に行われる単腎切除
・実験群：
1.対照
2.アルドステロン(0.75mg/時，アルゼットミニポンプによるsc)
2.アルドステロン(0.75mg/時，アルゼットミニポンプによるsc)＋エプレレノン100mpk，po
1.アルドステロン(0.75mg/時，アルゼットミニポンプによるsc)＋飲料中0.6%KCl
・飲料中0.3%KClのみを受容する群1、2および3
・腹大動脈に挿入した放射線遠隔測定プローブ(radio-telemetry probes)により測定したSBP
・4週間後殺害
心臓を採りだし、心室中心断面に沿って半分に分割した：上半分をホルマリン中に貯蔵した。生物化学的分析のために、底部部分を液体窒素中でスナップ凍結した(snap-frozen)。
・心臓をヘマトキシリンおよびエオシンとコラーゲン特異性染料ピクロ-シリアスレッド(picro-sirius red)で染色し、間質性コラーゲン体積分率および多形異常(すなわち、壊死、血管損傷)の測定のために分析した。
・凍結した心臓にて、ヒドロキシプロリン濃度を測定した。
・定量RT-PCR(Taqman)により、オステオポンチンおよびCOX-2の測定を行った。免疫組織化学により、オステオポンチンもまた心臓にて同定された。
【０２７９】
結果
血圧  収縮血圧は、アルドステロン輸液を受容する全ての動物にて上昇した。エプレレノン処置は、有意に低下させたが、血圧を正常とさせなかった。図43は、これらの結果をグラフで示す。
【０２８０】
心筋損傷
食塩水を飲ませ、単一腎切除したラットは、心筋損傷を有しなかった。間質性コラーゲン体積分率の組織学的測定によるかまたはヒドロキシプロリン濃度の生物化学的測定による間質性コラーゲンの測定は、アルドステロン/塩処置を受容する動物にて心筋線維症が存在しないことを立証した。しかし、ヘマトキシリン-エオシン染色したアルドステロン/塩処置をしたラットからの心臓を調べると、重度の血管炎症外傷が立証された。これらの外傷は、プロトコル1にて記載した外傷と同等であった。エプレレノンを投与すると、アルドステロン注入し食塩水を飲ませ単一腎切除したラットにおける血管炎症変化を完全に予防するが(図32)、なおそれでも、血圧を正常とすることができなかった。摂取カリウムの増加は、これらの動物がビヒクルを受容するアルドステロン/塩処置ラットと同等レベルの損傷を示すほど、アルドステロン誘発された損傷の発現にて有意な効果を有しなかった。
【０２８１】
血清オステオポンチンレベルを28日目に測定し、各群(NaCl  1%を飲ませるラット，アルドステロンとともにNaCl  1％を飲ませるラット，アルドステロンおよびエプレレノン
とともにNaCl  1%を飲ませるラット)について測定した。図48は、エプレレノン処置したラットにおける循環オステオポンチンの著しい低下を示す。
【０２８２】
オステオポンチン免疫染色(immunostaining)は、また、これらの動物からの心臓にても行った。食塩水を飲ませ、単一腎切除したアルドステロンを受容しない動物にても、オステオポンチンは検出されなかった。しかし、アルドステロン輸液を受容する動物の冠状動脈の媒体にて、オステオポンチンは、明瞭に同定された。エプレレノン処置は、アルドステロン注入したラットからの心臓におけるオステオポンチンの発現を予防した(図30および40)。摂取カリウムの増加は、オステオポンチンの発現を低下させなかった。定量RT-PCRによりオステオポンチンmRNAを測定すると、ビヒクルを受容するアルドステロン/塩処置したラットの心臓におけるこのサイトカインの顕著な(7倍の)上方調節を示した(相対的なmRNA発現：1.7±.2対12.25±1.7，P<.0001)。この効果は、エプレレノンにより予防された(相対的なmRNA発現：2.5±.6，P<.0001対アルドステロン/塩＋ビヒクル群)。心臓における発現アルドステロン誘発血管炎症におけるシクロオキシゲナーゼ-2についての役割と符合して、COX-2  mRNA発現は、アルドステロン/塩＋ビヒクル処置を伴うラットにて3倍増加した(相対的なmRNA発現：1.2±.12対3.7±.46，P<.0001)。オステオポンチン発現に及ぼす効果と同様に、エプレレノンは、アルドステロン/塩処置したラットにてCOX-2発現の増加を予防した(相対的なmRNA発現：1.8±.36，P<.01対アルドステロン/塩＋ビヒクル群，図31および39参照)。
【０２８３】
上記データは、アルドステロンが高血圧のラットの心臓にて血管炎症表現型を媒介することを示唆する。この表現型は、動脈媒体における血管平滑筋細胞にてサイトカインオステオポンチンおよび酵素シクロオキシゲナーゼ-2の調節に関係し、これは、観測される脈管炎症、したがって、冠状動脈および心筋の虚血/壊死性炎損傷を媒介するかもしれない。いずれかの理論と結び付けようとするつもりはないが、これは、病気、例えば、心不全、冠状動脈疾患、自己免疫またはウイルス性心筋炎、結節性動脈周囲炎、発作および腎硬化症にて観測される血管変性を媒介する機構であると考えられる。図33は、オステオポンチンとシクロオキシゲナーゼ-2とが冠状動脈壁の同一領域で発現されることを現す。理論は、本発明にて一部役割を演じないものの、図34は、このモデルについて提案されている機構を示す。これらの例にて、エプレレノン処置は、プロトコル#1で示したように、副腎摘出のそれと同等な程度まで心臓における血管炎症を予防した。エプレレノンの効果は、プロトコル#1にて示されるように、収縮血圧における大きな低下に大部分依存した。アンギオテンシンII/塩高血圧ラットにおけるエプレレノンの利尿またはナトリウム排泄増加効果の欠如は、選択的なアルドステロンアンタゴニストの保護効果もまた上皮組織に及ぼすその強力な効果に依存したことを示唆する。また、高摂取カリウムが、エプレレノンの効果を最小にすることに失敗したという事実は、エプレレノンがそのカリウムスパーリング特性を介して利点を生ずる可能性に対して反する。かくして、本発明者らは、アルドステロンが上皮組織にて電解質恒常性におけるこのホルモンの効果または血圧に及ぼすその効果とは無関係に冠状血管系に直接悪影響を有するかもしれないことを提案する。エプレレノンのヒトへの投与は、本実験によって示唆されるように、(限定するつもりはないが)心臓、腎臓および脳を含め血管の通る器官にてその抗炎症効果によって利点を提供する。
【０２８４】
検定C：さらなるインビボアルドステロン注入研究
検定Bの処理法をさらなる研究に際し拡張した。単一腎切除したSDラットに飲むための1%NaCl-0.3%KClを与え、以下の処置の1つを施した：ビヒクル；アルドステロン注入；または、エプレレノン(100mg/kg/日)と組み合わせたアルドステロン注入。アルドステロン/塩処置は、30日後ラットにて重度の高血圧症を誘発したが、これは、エプレレノンによって有意に低下させられた。各処置群にて動物からの心筋組織を7、14または30日目の処置後調べた。組織病理学的分析によれば、14日目に始めて血管炎症外傷が現れ、心筋を取り囲むように拡がり、限局性虚血/壊死変化を生じた。前炎症性分子の発現および進行性上方
調節(progressive upregulation)によって、外傷が進行した。前炎症性分子および関連する血管および心筋損傷の上方調節は、エプレレノン処置によって著しく弱毒化された。これらのデータは、エプレレノンが血圧を低下させ、心臓におけるアルドステロン誘発血管炎症損傷に対して終末器保護を提供するのに効果的であることを示す。
【０２８５】
動物
体重230〜250gの雄SD-ラット(Harlan Sprague-Dawley Indutries，Indianapolis，IN)を周囲温度22±1℃で12時間点灯/12時間暗室の日周期の室に収容した(n=96)。実験開始までに、動物を到着後1週間調整させ、TEKLAD 22/5ネズミの餌(Harlan TEKLAD，Madison，WI)と水道水とを自由に与えた。
【０２８６】
実験プロトコル
手術前に、動物は、個々に、体重を量り、以下の群の1つに入れた：(I)  高塩対照(ビヒクル/通常の食餌/1％NaCl & 0.3％KCl飲料水，3時点群についてn=31)，(II)  アルドステロン対照(アルドステロン/通常の食餌/1％NaCl &  0.3%KCl飲料水、3時点群についてn=28)，(III)  100mg/kg/日エプレレノン(アルドステロン/エプレレノン食餌/1％NaCl & 0.3％KCl飲料水，3時点についてn＝30)。アルドステロン過剰に伴う強力な低カリウム血症を予防するために、塩化カリウム補充液を食塩水に加えた。
【０２８７】
処置
手術の時点で、ビヒクル(9％エタノール/87％プロピレングリコール/4％dH2O)または1.0mg/mL d-アルドステロン(Sigma Chemical，St. Lois、MO)のいずれかを収容するAlzet 2002浸透圧ミニポンプ(Alza Corp.，Palo Alto，CA)をその首の項部で皮下に挿入した。アルドステロンを0.75  g/時の用量で投与した。TEKLAD 22/5ネズミの餌(Harlan TEKLAD、Madison，WI)に1mg/g食餌濃度(100mg/kg/日供給計算値)でエプレレノンを配合した。先の分析作業は、この食餌中のエプレレノンの安定性および調製後に得られる均質性を示している。処置7日、14日または30日後に、各群(ｎ=8~13)より動物を殺害した。
【０２８８】
手術処置
処置7日または14日後に殺害される動物を単一腎切除し、Alzetミニポンプを移植した。以下の処方に従い、30日間処置した動物を単一腎切除し、Alzetミニポンプを装備させ、放射線遠隔測定ユニット(model＃TA11PA-C-40，Data Science Inc.，St. Paul，MN)を移植した。動物を5%イソフルラン(SOLVAY Animal Health Inc.，Mendota Heights MN)で麻酔にかけ、VMS麻酔装置(Matrix Medical，Inc.，Orchard Park，NY)を使用して、これは、O2に供給した。手術処置の間を通して1~2%イソフルランで麻酔を保った。手術部位をクリップし、ノルバサンで手洗いし、ベタジンを噴霧した。#11メスを使用して、肋骨ケージ底部から恥骨領域まで皮膚を通して、吻-尾(rostal-caudal)切開を行った。腹腔を露出させるために、腹壁の筋肉を通して第2の切開を行った。尿道、左方腎の腎動脈および静脈を単離し、4-0シルクで縛り、腎臓を切除し、廃棄した。腹大動脈を露出させるために、組織レトラクタで、器官を注意深く置換した。腹大動脈の回腸動脈への分岐にちょうど額角の(rostal)1.5cmセグメントから過剰の結合組織を取り除き、4-0シルクを使用して、その大動脈に隣接して係留した。ついで、過剰の血流を止めるために、洗浄した領域の両端に、微細血管クリップを位置させた。曲がった21ゲージのニードルを使用して、腹大動脈に貫入させた。放射線遠隔測定ユニットのカニューレを挿入し、4-0シルクアンカーを使用して大動脈内に安定化させた。器官を再配列させ、遠隔測定ユニットをその器官の上に置いた。4-0シルクによる非結節縫合パターンを使用し、腹壁を閉じ、続いて、結節縫合パターンにて4-0シルクを使用して、皮膚を閉じた。動物は、100μLの麻酔剤Marcaine HCl(Sanofi Winthrop Pharmaceutical，New York，NY)を縫合の周りに注射し、抗生物質Mandol(Eli Lilly & Co.，Indianapolis，IN)を注射(i.m.)した。術後のケアは、胸骨横臥(sternal recumbency)が回復するまで麻酔よりの回復の間加熱パッド上で動物をモニター
することを含んだ。動物は、手術部位で窮迫および感染の徴候について毎日モニターした。術後の継続した不快感を示す動物は、0.1~0.5mg/kg，s.c. Buphrenorphine(Rickett & Colman Pharmaceuticals，Inc. Richmond、VA)で処置した。ついで、動物を水道水およびTEKLAD 22/5ネズミの餌(Harlan TEKLAD，Madison，WI)上に置いた。
【０２８９】
血圧の分析
放射線遠隔測定大動脈血圧は、DATAQUEST A. R. T. Version 1.1−Gold software(Data
Sciences International．St. Paul，MN)で計算した。データ点は、各動物について5秒ごとに10秒間読みを設定した収集速度で24時間にわたって収集した。使用する24時間は、午前6時〜午前6時であった。
【０２９０】
殺害
各実験時点の中断にて、動物は、ペンタバルビトール(65mg/kg i. p.，Sigma Chemical，St. Louis MO)で麻酔され、Melller PM6000天秤(Mettler-Toledo，Inc.，Hightstown，NJ)で秤量した。腹大動脈を露出させるために、腹腔を開いた。腹大動脈に16ゲージの針を挿入し、動物は、12ccのシリンジに血液を採取した。血液試料は、薬剤レベル分析のために、直ちに、ガラス製の血清収集管(Terumo Medical Corp.，Elkton，MD)に移した。試料収集が完了するまで、湿潤氷(wet ice)上に置き、4℃にて3000回転/分で15分間遠心分離した。
【０２９１】
採血に続き、心臓および腎臓を単離し、取り出し、冷ホスフェート緩衝食塩水で濯ぎ、ふき取って乾燥させた。腎臓は、直ちに、レーザメスで長軸に沿って分岐し、10%中性緩衝ホルマリン(NBF，Richard-Allen Scientific，Kalamazoo，MI)中に入れた。心臓については、右心室(RV)を左心室(LV)から切り取り、Mettler AE 163天秤(Mettler-Toledo，Inc.，Hightstown，NJ)を使用して秤量し、RVを10%NBF中に入れた。LV頂端の2mm冠状スラブ(slab)を取り出し、遺伝子発現の分析用にドライアイス/イソペンタンで凍結させ、LVの残る部分を固定のために10%NBF中に入れた。3〜4日固定後、ウエットトリミング(wet trimming)を完了し、ここで、第2の2mm冠状スラブをヒドロキシプロリン分析用に取り出し、第3の2mmスラブを組織学研究用にエカトリアル(equatorial)領域から取り出した。
【０２９２】
組織の処理および染色
心臓のエカトリアル領域をパラフィン中自動化された組織処理装置(Hypercenter XP，Shandon/Lipshaw Inc.，Pittsburgh，PA)でルーチン処理し、新しいパラフィンアピカル(paraffin apical side down)(Shandon Embedding Center，Shandon/Lipshaw Inc.)に包埋した(embedded side down)。Leica RM2035ロータリーマイクロトーム(Leica Inc.，Houston，Texas)を使用して組織の各ブロックから5および10μm断片を切り取り、Superfrost/Plus顕微鏡スライド(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)に載せた。(0.1％(w/v)Sirius Red F3BA(C. I. #35780，Pfaltz & Bauer，Inc. Waterbury，CN)を含むコラーゲン特異性染料Picrosirius Red F3BA(飽和ピクリン酸(Sigma Chemical，St. Louis，MO)により、10μm断片を染色した。載せた組織を水で水和させた。続いて、スライドを蒸留水中、0.2%(w/v)ホスホモリブデン酸(Phosphomolybdic Acid)(Sigma Chemical，St. Louis，MO)と15分間インキュベートし、0.1%Picrosirius Red F3BA染色に110分間移し、95%エタノールw/1％酢酸(v/v)中に1分間入れ、続いて、100%エタノール中で1分間のインキュベーションを2回続け、キシレン中で1分間清澄とした。Permount Histological Mounting Media(Fisher Scientific)を使用して、#1カバーグラスでスライドをカバースリップした。5μm断片を載せた2つのスライドを各動物について切り取った。1つのスライドをH & E染色用に処理し、1つを過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色用とした。H & EおよびPASは、心臓の病理学的スコア用に使用した。
【０２９３】
組織病理学的分析
先の記載を少し改良(7)して、心筋損傷の半定量を行った。つまり、0〜4のスケールを使用して心筋損傷のレベルをスコアで表した。スコア0は、損傷がないことを表した。スコア1は、心筋細胞損傷のない血管および脈間周囲の炎症外傷の存在を表した。スコア2は、心筋壊死の1つの明らかな領域が観測される時に与えた。心筋壊死は、心筋細胞の壊死変化、例えば、核凝縮または核崩壊；非収縮性周辺波形繊維；および、細胞質の過好酸球増加症の存在；または、心筋細胞膜破壊の明瞭な証拠と定義した。2つ以上の別個の壊死領域が見られる(2つの異なる冒された領域の存在を包含する。)時、心臓は、スコア3とした。スコア4は、左心室の50%より多くが危険にさらされる壊死の広い面積を示す心臓に付与した。
【０２９４】
画像分析
Picrosirius Red F3BA染色したスライドを使用して、Videometric 150画像分析システム(Oncor Inc.，Gaitherburg，MD)で間質コラーゲンを定量した。つまり、Nikon Optiphot顕微鏡(Nikon Inc.)に取り付けたNikon E Plan 10/0.25；160/-Objective(Nikon Inc. Garden City，NY)を使用して、画像を捕えた。Toshiba 3 CCD Color Video Camera(Model＃IK-T30T，Toshiba Corp. Japan)により、顕微鏡からV 150ビデオボードを備えた386コンピュータまでのRGBフォーマットにて画像をリレーした。V 150ビデオボード/V 150ソフトウエアーアプリケーション(Oncor Inc.)により、Sony Trinitron Color Video Monitor(Model＃PVM-1342Q，Sony Corp. Tokyo，Japan)上305xの拡大率で表示および分析のために、RGB画像をHIS(Hue，Intensity、Saturation)フォーマットへと変換した。画像モニター上に画像が表示されたら、測定すべき画素の色相、強度および飽和度をスレッショルディング(thresholding)と称されるプロセスにより定義した。ついで、しきい値に入る画素のみをV 150アプリケーションで測定した。システムは、マイクロメートルスケールで検量し(EM Sciences，FT. Washington，PA 19034)、これにより、データをmm2または  m2で表した。各測定後、データは、ASC IIファイルフォーマットに自動的にセーブし、最終的な合計のためにMicrosoft Excel version 7.0に移した。
【０２９５】
免疫組織化学
5μm断片をキシレン中で脱パラフィンし(2回，5〜10分間インキュベーション)、以下のように、3分インキュベートすることによって再度水和した：100%エタノール中で2回インキュベートし、続いて、95%アルコール中で2回インキュベートし、70%アルコール中で1回インキュベートする。一度、水和したら、断片を水道水で1分間、蒸留水で1分間濯いだ。スライドを3.0%H2O2中に15分間入れ、続いて、蒸留水で5分間濯ぐことにより、内因性のパーオキシド活性をブロックした。クエン酸，pH6.0を使用し、抗体の取り出しのために、スライドを処理した。スライドを加熱沸騰させ、25℃に20分間冷却し、蒸留水で濯いだ。DAKO自動染色器(DAKO Corporation，CA)を使用して、スライドを染色した。染色に先立ち、スライドを濯ぎ、ブロック緩衝液で20分間インキュベートした。ブロック緩衝液は、Vectastain ABCキット(Vector Labs，Burlingame，CA)に記載されており、10ml TNB(NEN TSA Biotin System kit，Cat＃NEL 700A，NEN Life Science Products，Boston，MA)と3滴の標準(2次抗体に対応する)血清とを含有する。
【０２９６】
染色に使用される原発抗体(Primary antibodies)としては、1：100に希釈したオステオポンチン(Mouse monoclonal，Cat＃MP IIIb 10，Developmental Studies Hybridoma Bank，The University of Iowa，Iowa City，IA)；1：500に希釈されたED-1(anti-macrophage
glycoprotein，mouse monoclonal，MAB 1435，Chemicon International Inc.，Temecula，CA)；1：300に希釈されたCD-3(anti-T-cell，rabbit polyclonal-affinity purified antibody，A0452，DAKO Corporation，Carpineria，CA)；1：100に希釈されたICAM-1(goat
polyclonal-affinity purified，M-19：sc-1511，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；1：100に希釈されたVCAM-1(goat polyclonal−affinity purified，C-19：sc-1504，Santa Cruz Biotechnology)が挙げられる。スライドを、原発抗体で60分間、続いて
、最終濃度5μL/mLで30分間25℃にてビオチニル化した。Vectastain ABC-APキット(Vector Laboratories)とジアミノベンチジン染色(DAKO Corporation，Carpinteria，CA)とにより染色を目視した。スライドを水で濯ぎ、ヘマトキシリンでほぼ30秒間対比染色した。同位体符号IgG(Sigma Chemical，St. Louis MO)を原発抗体のための陰性対照として使用した。
【０２９７】
オステオポンチンmRNAについてのin situハイブリダイゼーション
ラットオステオポンチン(GenBank accession # NM 008608-1)についての配列に基づき、RNAプローブを発生させた。つまり、以下のプライマーを使用して、ラットオステオポンチンのcDNAフラグメントをRT-PCRにより発生させた：フォワードプライマー，5’-TGG CAC ATT TGT CTT；リバースプライマ-3’-AGC CCA TCC AGTC。TAクローニングキット(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)を使用して、PCR IIプラスミドにcDNAフラグメントを挿入した。ｒRNasin(2U)，DNase(0.5U)，TE緩衝液(1X)，rGTP(10mM)，rCTP(10ｍM)，rATP(10mM)，ｒUTP(10mM)，(PROMEGA，Madison，WI)，5  L(50  Ci)33P-UTP(Elkin Pelmer，Boston，MA)および適当なRNAポリメラーゼ(Sp6 RNAポリメラーゼ(20U  L)；T7 RNAポリメラーゼ(15U  L)(PROMEGA)を含有させて37℃で60分間、100  Lインビトロ転写反応にてプローブを標識した。Microcon YM-50 Microconcentrator(Amicon，Bedford，MA)を使用して、反応物から遊離の標識を除去した。断片をキシレン中で脱パラフィンし、上記した等級のエタノールで再度水和させ、4%パラホルムアルデヒド(EMS，Ft. Washington，PA)中、40℃で10分間固定させた。ついで、プロテナーゼK(5mg/mL；10分，37℃，Roche，Indianapolis，IN)で組織を温浸し、0.5 X SSC緩衝液(食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液)で洗浄した(10分)。一連の等級のエタノールで逐次脱水後、再水和について記載した逆のプロセス、続いて、ハイブリダイゼーション緩衝液(50％ホルムアミド，2 X SSC，10%デキストランサルフェート，v/v)中、42℃で2時間のインキュベーションによって、プリハイブリダイゼーションを行った。tRNA(50μg/mL，Sigma，St. Lois，MO)と55℃で適当に標識したプローブとを含有するハイブリダイゼーション緩衝液を使用して、ハイブリダイゼーションを一晩行った。ついで、ハイブリッドした組織を、2X SSC緩衝液、0.1X SSC-EDTA緩衝液(0.1X SSC，1mM EDTA)および2X SSC緩衝液で1時間40分、逐次、洗浄した。スライドは、NH4OAcを含有する上記したような一連の等級のエタノールで(各2分)最終的に脱水し、室温で1.5時間減圧デシケータ内で乾燥させた。組織を一晩リンスクリーンにさらした。スライドを写真乳剤(Kodak，Rochester，NY)で被覆し、現像前に3〜5週間4℃で暴露した。現像したスライドは、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。
【０２９８】
TaqMan分析の原理
Applied Biosystems’7700Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)を使用する蛍光5’-ヌクレアーゼ検定(TaqMan PCR)は、遺伝子特異性染色標識したオリゴヌクレオチドプローブの蛍光の増加をモニターすることによって特異な遺伝子のリアルタイム検出/測定を可能とした。標的および参照遺伝子についてのプローブは、5’-末端を6-カルボキシフルオレッセン(6FAM)レポータ染料で、3’-末端を6-カルボキシ-N,N,N’,N’-テトラメチルローダミン(TAMRA)クエンチャー染料で標識した。プローブを標的遺伝子にアニールする時、6FAMの蛍光は、極近位TAMRAによって妨害された。Taqポリメラーゼのエキソヌクリアーゼ活性は、存在する標的メッセージの量に正比例して蛍光励起を生ずる標的配列よりプローブを置換することによってオリゴヌクレオチドプローブから染料を放出した。Applied BiosystemからのSequence Detection Systemソフトウエアを使用してデータ解析を行った。
【０２９９】
TaqManプライマーおよびプローブ：TGFβ1，ANP，コラーゲンI，コラーゲンIII
Oligo Primer Analysis Software，Version5.0(National Biosciences Inc.（NBI）-Wojciech Rychilik，Cascade，CO)を使用して、プライマーとプローブとを設計した。プライマーは、Life Technologies(Grand Island，NY)によって合成され、プローブは、Appli
ed Biosystemsによって合成された。プライマー/プローブセットは、分析されるべきラット遺伝子の公知の配列から設計した。標的遺伝子値は、全て、参照遺伝子，構成発現されたシクロフィリンに対して正規化した。プライマー/プローブセット配列は、表8に示す。
【０３００】
【表２７】
2006508174.tif 000039
【０３０１】
全てのオリゴヌクレオチドは、5’-3’と書く。プライマーは、標識せず、プローブは、全て、5’-末端を6-カルボキシフルオレッセン(6FAM)レポータ染料で、3’−末端を6-カルボキシ-N,N,N’,N’-テトラメチルローダミン(TAMRA)クエンチャー染料で標識した。
【０３０２】
RNA単離：TGFβ1、ANP、コラーゲンI、コラーゲンIII
製造者の指針(Leedo Medical Laboratories，Inc.，Houston，Texas)に従い、1.5mL RN
A-STAT 60を使用して、凍結した(-70℃)左心室(LV)組織(ほぼ10〜20mg)からRNAを抽出した。つまり、5mmプローブを備えた組織ホモジナイザー(Ultra-−Turrax T8 Homogenizer，IKA Works，Inc.，Wilmington，NC)を使用して、組織を均質化した。均質化に続き、等量の分子等級クロロホルム(Sigma Chemical Co.，St. Louis MO)を、周期的に10分間室温で混合しつつ、インキュベートした。試料を12,000gで10分間遠心分離し、等量の分子等級イソプロパノール(Sigma Chemical Co.)を加え、続いて、-80℃で一晩インキュベートすることによって、頂部層からRNAを沈殿させた。12,000gでの遠心分離により、RNAを沈殿させ、75%エタノールで洗浄し、ヌクレアーゼを含まない水(Promega，Madison，WI)に可溶化させた。RNAを希釈し、濃度および純度について分光光度測定により分析した(A260/A280＝1.9〜2.0，平均収率2〜5μg RNA)。
【０３０３】
逆転写：TGFβ1，ANP、コラーゲンI、コラーゲンIII
15%のヌクレアーゼを含まない水(Promega，Madison，WI)、1X RT緩衝液(Life Technologies，Grand Island，NY)、10mM DTT(Life Technologies)、各0.5mMのdATP，dTTP，dGTP，dCTP，(PE Biosystems，Foster City，CA)2.5μM Oligo d（T）15(Oligo Therapeutics，Inc.，Wilsonvile，OR)、40ユニットRNAsin（Promega）および200ユニットSuperScript
II逆転写酵素(Life Technologies)を含有する20μL最終量に400ng RNA(4μL)を加えることによって、二重鎖cDNAを合成した。反応温度を正確にするために、反応は、キャップ付きの薄壁反応チューブ(Applied Biosystems)中で行った。以下のプロトコルに従い、Gene
Amp 9600熱循環器(Applied Biosystems)を使用して、反応を行った：37℃で1時間、95℃で5分および4℃で10分。
【０３０４】
TaqMan分析：TGFβ1、ANP、コラーゲンI、コラーゲンIII
各PCR反応は、以下を含んだ：38.5%のヌクレアーゼを含まない水(Promega)、1X PCR緩衝液II、2mM MgCl2、0.05U/μL Ampli Taq Gold(PCR Core Reagent Kit，N808-0228，Applied Biosystems)、300nMの各フォワードおよびリバースプライマー(Life Technologies)、200nMプローブ(Applied Biosystems)および200μMの各dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP(Applied Biosystems)を含有するPCR混合物の22.5μLに2.5μL(50ng)の各cDNAを加えた。MicroAmp光学キャップを備えたMicroAmp光学チューブに単一反応を設定し、7700 Sequence Detectorに負荷した。全ての反応に以下のプロトコルを適用した：95℃で10分(ポリメラーゼ活性化)、95℃で10秒を40サイクリル(変性)および57℃で1分(アニーリング)。
【０３０５】
TaqManプライマーおよびプローブ：COX-2、オステオポンチン、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1
7700 Sequence Detection Systemにより供給されているPrimer Expressソフトウエアを使用して、全てのプライマーおよびプローブを設計し、Applied Biosystemsにより合成した。実験試料の分析前にTaqMan反応にて各プライマー/プローブセットの効率を測定するために、合計RNA(200ng〜320pg)の5倍希釈液を使用する標準曲線を作成した。プライマー/プローブセットは、分析するラット遺伝子の公知の配列より設計した。全ての標的遺伝子の値を参照遺伝子、構成発現シクロフィリンに対して正規化した。プライマー/プローブセット配列は、表8に見ることができる。
【０３０６】
RNA単離：COX-2、オステオポンチン、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1
全RNA単離キット(Ambion，Inc.，Austin，TX)を使用して、凍結(-80℃)ラット心臓組織からRNAを抽出した。-80℃に冷却し、3〜10mLの冷変性緩衝液を含有するダウンスホミジナイザー(Kontes，Vineland，NJ)に移しておいた組織をステンレススチール性の乳鉢および乳棒を使用して粉砕した。組織を均質化し、滅菌15mLポリプロピレン遠心分離チューブに移した。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25：24：1)を加え、試料を激しく1分間振盪し、氷上で少なくとも15分間インキュベートした。試料を10,000gで30分間遠心分離した。水相を取り出し、1/10体積の酢酸ナトリウム溶液(3.0M NaOAc pH4.5)を加え、試料を10秒間振盪または倒置し、酸-フェノール(イソアミルアルコールと
予め混合した)：クロロホルム(5:1，Ambion，Inc.)を出発試料体積に等価な量加えた。試料を1分間激しく振盪し、続いて、氷上で15分インキュベートし、10,000gで30分間遠心分離した。水相を取り出し、清浄なポリプロピレンチューブに入れた。等量のイソプロパノール(Sigma，St. Louis，MO)を加え、試料を混合し、-20℃で一晩インキュベートした。試料を10,000gで30分間遠心分離し、上澄み液を取り出し、RNAペレットとDNAse/RNAseを含まない水に再懸濁させた。試料を-80℃で少なくとも2時間凍結し、湿潤氷上で解凍し、測定のために希釈した。
【０３０７】
ゲノムDNAを取り出すためのDNase消化と炭水化物を取り出すためのLiCl沈殿により、全てのRNAをさらに精製した。40ｍM Tris ｐH7.8，6mM MgCl2，10mM CaCl2を含有する緩衝液中、1ユニットのDNAse(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)と10ユニットのRNAse阻害剤(Applied Biosystems，Foster City，CA)と、37℃で45分間、各RNA(100μg)をインキュベートした。RNAクリーンアップのためのRNeasy Miniプロトコル(Qiagen，Valencia，CA)を使用して、DNAseと緩衝液とを除去した。ついで、試料量の半分に等しい量の7.5M LiCl/50 mM EDTA(Ambion，Inc.，Austin，TX)でRNAを沈殿させ、-20℃で一晩インキュベートし、4℃、13〜16,000gで30分間遠心分離した。全てのRNAを-80℃で少なくとも2時間凍結し、解凍し、希釈し、濃度および純度について分光光度計で分析した。
【０３０８】
TaqMan分析：COX-2、オステオポンチン、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1
TaqMan反応を以下のように行った。ウラシル-N-グリコシラーゼを含まない12.5μLの2X
1工程PCR Master Mix(AmpliTaq  Gold DNAポリメラーゼ、dUTPを含むdNTPs、受動参照(passive reference)および最適化した緩衝液成分を含有する)、0.625μLの40X MultiScibeおよびRNAse阻害剤混合物、0.625μLの20μMフォワードプライマー、0.625μLの20μMリバースプライマー、0.5μLの5μM TaqManプローブおよび0.125μのDNAse/RNAseを含まない水を含有する15μLのRT-PCR反応混合物に、10μL(200ng)の合計RNA(DNAsedしたのとLiCl沈殿したの)を加えた。MicroAmp光学キャップまたは接着カバー(Applied Biosystems)を備えたMicroAmp光学96穴反応プレート内で、反応を重複してセットし、7700 Sequence Detectorに負荷した。全ての反応に以下のプロトコルを適用した：48℃で30分(逆転写)、95℃で10分(逆転写酵素およびポリメラーゼの不活性化)、95℃で15秒の40サイクル(変性)および60℃で1分(アニーリング)。
【０３０９】
ヒドロキシプロリン検定
心筋ヒドロキシプロリン濃度は、先に記載したように(4)、酸化されたヒドロキシプロリンとp-ジメチルアミノベンズアルデヒドとの間の反応を定量する比色検定によって測定した。つまり、Reacti-Therm加熱ブロック(Pierce，Rockford，IL)を使用して、組織(180〜250mg)を60℃で18時間乾燥し、秤量した。乾燥した組織と陽性のコラーゲン対照(Bovine Collaben Type1，Sigma，St. Louis，MO)をReacti-Therm加熱ブロック中、150℃で2mLの6N HClにより3時間加水分解した。窒素ガス下で酸を蒸発させ、試料を1mLのクエン酸塩-酢酸塩緩衝液(0.7M NaOAc，0.2Mクエン酸塩、45mMクエン酸，ｐH6.0)中、4mLイソプロパノールの存在で再度水和し、0.45μm Millex LCRフィルター(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)を介して濾過した。
【０３１０】
ヒドロキシプロリン含量は、60μLの加水分解した試料またはコラーゲン標準を350μLのクエン酸塩-酢酸塩-イソプロパノール緩衝液(40％のイソプロパノールを含むクエン酸塩-酢酸塩緩衝液，v/v)および100μLの300mMクロラミンT(J. T. Baker，Philipsburg，NJ)とともに25℃で5分間インキュベートすることによって測定した。Erlichの試薬(1.25ｍL，80%のイソプロパノールを含む70%過塩素酸中3.5Mの p-ジメチルアミノベンズアルデヒド，v/v)をヒドロキシプロリンの視覚化および測定のために加えた。試料を60℃で30分間インキュベートし、室温まで冷却し、吸光度を558nmでモニターした。Trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン(Sigma，St. Louis，MO)の新しく調製した標準曲線からヒドロキシプロリ
ン含量を測定した。全ての試料および標準は、重複して行った。
【０３１１】
統計学的解析
分散の一方向解析(ANOVA)を使用して、データを解析した。群内の正規性の仮定と群を横切る分散の相等性とは一致させることができないので、解析は、素データの順位変換値について行った(非パラメータ解析)。平均間の想定比較のためには、有意性のα=0.05レベルを使用した。群間の想定した比較のためには、最小有意差(LSD)法を使用した。SAS統計学ソフトウエアパッケージ(SAS PC，version 6.12，SAS Institute，Cary，NC)のPROC TTESTを使用して、データを解析した。データは、全て、平均±平均の標準誤差(SEM)として報告する。
【０３１２】
動物の排除
実験期間中、3匹の動物が死亡した：ラット#17（アルドステロン＋塩群，注入24日後に死んでいることが見出された）、ラット#64(アルドステロン+塩群、手術により死亡した)およびラット5(ビヒクル群，手術により死亡した)。多数のパラメータがそれらが特定されている処理群を表せないことが見出されいる場合(例えば、その処理群についての平均から3匹より大の標準偏差)、さらなる動物は、排除した。3匹のこのような動物は、研究から排除した：ラット#57(7日プロトコルから，アルドステロン+塩群)、ラット#97(14日プロトコルから，アルドステロン＋塩群)およびラット24(30日プロトコルから，100mg/kg/日エプレレノン群)。これら3匹の動物は、処理群についての平均値から3より大の標準偏差である炎症マーカー遺伝子(COX-2，オステオポンチン，MCP-1，ICAM-1およびVCAM-1)の発現を示した。ラット#24も、また、遠隔測定ユニット機能不全の結果、排除した。これら動物について生ずる値は、データ表のその他の動物についてのデータとは別個に、表9.10〜表9.19に示す。
【０３１３】
【表２８】
2006508174.tif 000040
【０３１４】
--=技術的困難によりデータを収集しなかった。
【０３１５】
【表２９】
2006508174.tif 000041
【０３１６】
--=技術的困難によりデータを収集しなかった。
【０３１７】
【表３０】
2006508174.tif 000042
【０３１８】
--=技術的困難によりデータを収集しなかった。
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３１９】
【表３１】
2006508174.tif 000043
【０３２０】
【表３２】
2006508174.tif 000044
【０３２１】
--=技術的困難によりデータを収集しなかった。
【０３２２】
【表３３】
2006508174.tif 000045
【０３２３】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３２４】
【表３４】
2006508174.tif 000046
【０３２５】
--=技術的困難によりデータを収集しなかった。
【０３２６】
【表３５】
2006508174.tif 000047
【０３２７】
--=技術的困難によりデータを収集しなかった。
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３２８】
【表３６】
2006508174.tif 000048
【０３２９】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３３０】
【表３７】
2006508174.tif 000049
【０３３１】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３３２】
【表３８】
2006508174.tif 000050
【０３３３】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３３４】
【表３９】
2006508174.tif 000051
【０３３５】
【表４０】
2006508174.tif 000052
【０３３６】
【表４１】
2006508174.tif 000053
【０３３７】
【表４２】
2006508174.tif 000054
【０３３８】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３３９】
【表４３】
2006508174.tif 000055
【０３４０】
【表４４】
2006508174.tif 000056
【０３４１】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３４２】
【表４５】
2006508174.tif 000057
【０３４３】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３４４】
【表４６】
2006508174.tif 000058
【０３４５】
【表４７】
2006508174.tif 000059
【０３４６】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３４７】
【表４８】
2006508174.tif 000060
【０３４８】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３４９】
【表４９】
2006508174.tif 000061
【０３５０】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３５１】
【表５０】
2006508174.tif 000062
【０３５２】
【表５１】
2006508174.tif 000063
【０３５３】
【表５２】
2006508174.tif 000064
【０３５４】
【表５３】
2006508174.tif 000065
【０３５５】
【表５４】
2006508174.tif 000066
【０３５６】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３５７】
【表５５】
2006508174.tif 000067
【０３５８】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３５９】
【表５６】
2006508174.tif 000068
【０３６０】
【表５７】
2006508174.tif 000069
【０３６１】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３６２】
【表５８】
2006508174.tif 000070
【０３６３】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３６４】
【表５９】
2006508174.tif 000071
【０３６５】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３６６】
【表６０】
2006508174.tif 000072
【０３６７】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３６８】
【表６１】
2006508174.tif 000073
【０３６９】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
【０３７０】
【表６２】
2006508174.tif 000074
【０３７１】
【表６３】
2006508174.tif 000075
【０３７２】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３７３】
【表６４】
2006508174.tif 000076
【０３７４】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３７５】
【表６５】
2006508174.tif 000077
【０３７６】
Nd=不十分なmRNA試料によりデータを報告しなかった。
【０３７７】
【表６６】
2006508174.tif 000078
【０３７８】
*この動物からのデータは、統計学的解析について考察せず、最終結果に含めなかった。
結果
血圧
血圧は、実験を通してビヒクル+塩対照で正常なままだった。アルドステロン+塩は、時間とともに血圧の漸進的増加を誘発した。エプレレノン+アルドステロン+塩を受容する動物にて、収縮血圧は、8〜30日で有意に低下した。しかし、血圧は、ビヒクル+塩対照と比較して高いままであった。
【０３７９】
【表６７】
2006508174.tif 000079
【０３８０】
これらのデータは、図1にグラフで表す。
値は、5分ごとに24時間にわたって得られる平均±SEMである。
＊ビヒクル+塩とは有意に異なった，p<0.05。
#アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
【０３８１】
体重、心筋の肥大およびANP
体重は、ビヒクル+塩正常圧対照と比較して7日目、14日目および30日目にアルドステロン+塩処置を受容する動物にて有意に低下した(表11〜13)。アルドステロン+塩処置によって誘発される体重の減少は、30日目のエプレレノンの投与によって有意に弱毒化された(表11；図45)。アルドステロン+塩処置に応答して、有意な左および右心室肥大が生じた。左心室肥大は、アルドステロン+塩処置の7日後に明らかとなったが(表11)、右心室肥大は、アルドステロン+塩処置の30日後にやっと明らかになった(表13)。エプレレノンは、アルドステロン+塩処置によって誘発される絶対心室重量または心室重量対脛骨比にインパクトを与えなかった(表11〜13)。心房ナトリウム排泄増加性(natiuretic)ペプチド(ANP)mRNAレベルにおける有意な上昇も、また、アルドステロン+塩で処理した動物にて観測された(表11〜13)。ANP mRNA上方調節は、処置の30日後エプレレノンによって有意に低下した
が、14日後にはそうでなかった(表13)。
【０３８２】
【表６８】
2006508174.tif 000080
【０３８３】
値は、処置7日後に測定した平均±SEMである。
＊ビヒクル+塩対照とは有意に異なった，p<0.05。
＃アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
ANU=心房ナトリウム排泄増加性ペプチド。
AU=任意の単位，シクロフィリン発現と比較して測定した。
【０３８４】
【表６９】
2006508174.tif 000081
【０３８５】
値は、処置14日後に測定した平均±SEMである。
＊ビヒクル+塩対照とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
ANU=心房ナトリウム排泄増加性ペプチド。
AU=任意の単位，シクロフィリン発現と比較して測定した。
【０３８６】
【表７０】
2006508174.tif 000082
【０３８７】
値は、処置30日後に測定した平均±SEMである。
＊ビヒクル+塩対照とは有意に異なった，p<0.05。
＃アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
ANU=心房ナトリウム排泄増加性ペプチド。
AU=任意の単位，シクロフィリン発現と比較して測定した。
【０３８８】
心筋結合組織炎
組織間腔のコラーゲン体積分率およびヒドロキシプロリンレベルは、実験群のうちのいずれの時点でも統計学的に異なった(表14〜16)。コラーゲンタイプ-Iメッセージにおける非常に少ない増加は、アルドステロン+塩およびアルドステロン+エプレレノン+塩処置の30日目に検出され、ビヒクル+塩対照と比較した(表16)。コラーゲンタイプIII mRNAレベルは、いずれの時点でも有意に増加しなかった(表14〜16)。
【０３８９】
【表７１】
2006508174.tif 000083
【０３９０】
値は、処置7日後に測定した平均±SEMである。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
ICVF=組織間腔コラーゲン体積分率。
コラーゲン-I＝コラーゲンタイプI mRNA。
コラーゲン-III＝コラーゲンタイプIII mRNA。
AU=任意の単位，シクロフィリン発現と比較して測定した。
【０３９１】
【表７２】
2006508174.tif 000084
【０３９２】
値は、処置14日後に測定した平均±SEMである。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
ICVF=組織間腔コラーゲン体積分率。
コラーゲン-I＝コラーゲンタイプI mRNA。
コラーゲン-III＝コラーゲンタイプIII mRNA。
AU=任意の単位，シクロフィリン発現と比較して測定した。
【０３９３】
【表７３】
2006508174.tif 000085
【０３９４】
データは、処置30日後に測定した平均±SEMである。
＊ビヒクル+塩対照とは有意に異なった，p<0.05。
＃アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
ICVF=組織間腔コラーゲン体積分率。
コラーゲン-I＝コラーゲンタイプI mRNA。
コラーゲン-III＝コラーゲンタイプIII mRNA。
AU=任意の単位，シクロフィリン発現と比較して測定した。
【０３９５】
心筋組織病理学
心筋組織損傷は、半定量的スコアシステムを使用して、処置7日、14日および30日後に評価した。ビヒクル+塩対照からの心臓は、あらゆる時点で組織学的に正常であった。血管または心筋外傷は、アルドステロン＋塩を受容するラトからの心臓にて処置7日後同定されなかった(表14)。対照的に、限局性動脈および心筋変性は、処置の14日目に始まって観測された(表15および16)。動脈および心筋における定性的変化は、アルドステロン+塩処置の14日および30日後で同等であったが、頻度および重度は、時間とともに増大した。図44に示したように、エプレレノンの投与は、あらゆる時点で心筋損傷を顕著に弱毒化した(表14〜16)。
【０３９６】
炎症メディエイタの遺伝子発現
多数の前炎症性分子の発現レベルは、定量的TaqmanPCR分析を使用して査定した(表17〜19)。シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)と単核細胞化学走性誘因蛋白質-1(MCP-1)との発現レベルは、アルドステロン+塩処置によってあらゆる時点で同様および有意に増大した。オステオポンチン発現も、また、アルドステロン+塩処置14日(（〜6倍）および30日(〜13倍)後、著しく上方調節された(表18〜19)。形質転換成長因子ベータ1(TGF-β)mRNAレベルは、調べたいずれの時点でも上方調節されなかった。細胞内癒着分子-1(ICAM-1)mRNA発現は、アルドステロン+塩処置の14日目および30日目に上方調節されたが、増加は非常に少なかった(表9〜10)。血管細胞癒着分子-1(VCAM-1)についての遺伝子発現は、アルドステロン+塩処置30日目に2倍に増加したが、しかし、この増加は、統計学的な有意性には達しなかった(表19)。全てのマーカー遺伝子の発現は、アルドステロン+塩で処置した動物での遺伝子発現と比較して、エプレレノンにより、有意に低下した(図46)。
【０３９７】
【表７４】
2006508174.tif 000086
【０３９８】
値は、(シクロフィリン発現と比較した)処置7日後の任意の単位のmRNA発現平均値±SEMである。
＊ビヒクル+塩とは有意に異なった，p<0.05。
＃アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
COX-2＝シクロオキシゲナーゼ-2。
MCP-1＝単核細胞化学走性誘因蛋白質-1。
TGF-β1=形質転換成長因子ベータ1。
ICAM=細胞内癒着分子-1。
VCAM＝血管細胞癒着分子-1。
【０３９９】
【表７５】
2006508174.tif 000087
【０４００】
値は、(シクロフィリン発現と比較した)処置14日後の任意の単位のmRNA発現平均値±SEMである。
＊ビヒクル+塩とは有意に異なった，p<0.05。
＃アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
COX-2＝シクロオキシゲナーゼ-2。
MCP-1＝単核細胞化学走性誘因蛋白質-1。
TGF-β1=形質転換成長因子ベータ1。
ICAM=細胞内癒着分子-1。
VCAM＝血管細胞癒着分子-1。
【０４０１】
【表７６】
2006508174.tif 000088
【０４０２】
値は、(シクロフィリン発現と比較した)処置30日後mRNA発現平均値±SEMである。
＊ビヒクル+塩とは有意に異なった，p<0.05。
＃アルドステロン+塩とは有意に異なった，p<0.05。
エプレレノン用量は、100mg/kg/日であった。
COX-2＝シクロオキシゲナーゼ-2。
MCP-1＝単核細胞化学走性誘因蛋白質-1。
TGF-β1=形質転換成長因子ベータ1。
ICAM=細胞内癒着分子-1。
VCAM＝血管細胞癒着分子-1。
【０４０３】
免疫組織化学
アルドステロン+塩誘発された前炎症応答の分子解析は、さらに、免疫組織化学分析を使用することを特徴とした。内皮に癒着し、血管周辺空間を浸潤する大部分の細胞は、単核細胞/マクロファージ抗体(ED-1)について陽性、T-細胞抗体(CD-3)について陰性に染色した。オステオポンチンの有意な発現は、ビヒクル+塩対照からの心臓にて染色するオステオポンチンが存在しないことと比較して、アルドステロン+塩処置したラットからの心臓にて明瞭であった。オステオポンチン発現は、冒されるか幾分冒されていない冠状動脈の内側細胞に主として局在するが、血管周辺空間および心筋壊死領域にて若干のマクロファージにも存在した。有意なオステオポンチン発現の証拠は、心筋細胞には見られなかった。ICAM-1染色は、内皮細胞および血管周辺空間にては同定されたが、しかし、VCAM-1は、内皮細胞にて主として発現された。エプレレノンの投与は、評価される全てのマーカー蛋白質について、心筋組織にてアルドステロン+塩処置誘発された染色を著しく鈍らせた
。
【０４０４】
オステオポンチンmRNAについてのin situハイブリダイゼーション
心筋組織にてオステオポンチン発現を局在化させるために、in situハイブリダイゼーションを行った。大部分のオステオポンチンmRNAは、冠状動脈の心筋細胞にて見られたが；しかし、オステオポンチンメッセージも、また、血管周辺細胞および虚血壊死領域を浸潤する細胞にても同定された。オステオポンチンmRNAは、心筋細胞または冒されていない間質領域にては明瞭でなかった。
【０４０５】
結論
塩の存在にてのアルドステロンによるラットの処置は、血管炎症および心臓組織損傷を誘発した。アルドステロン+塩処置によって誘発されるこの損傷は、前炎症分子の上方調節を特徴とする炎症応答の後に起こった。エプレレノンは、この早期血管炎症応答を、続いて、心筋損傷を、著しく弱毒化した。
【０４０６】
アテローム硬化症の予防を含め心臓血管状態の予防の評価のために適した数種のその他の動物モデルも利用可能である。Stehbens，Prog. Card．Dis．XXIX，1007-28(1986)およびZhang et al.，Science，258，468-71(1992)参照。
【０４０７】
本発明のもう1つの実施態様にて、脈管炎を治療または予防する方法を開示する。ベーチェット病(BD)は、脈管炎を特徴とするマルチシステム疾患である。BDおよび結腸の憩室病が関連するかもしれないことが提案されている。Sahan C et al. Behcet’s Disease and Diverticulosis Dig Surg 2001；18(5)：421-2.本発明の方法にて使用されるアルドステロンブロッカーは、心臓血管炎症の治療および予防に有用である。したがって、本発明の方法は、ベーチェット病；および、憩室病、例えば、結腸の憩室病を治療および予防するのに有用であろう。
【０４０８】
本発明のもう１つの実施態様にて、心筋炎を治療または予防する方法を開示する。本発明のもう１つの実施態様にて、心筋症を治療または予防する方法を開示する。
【０４０９】
ラット実験自己免疫心筋炎(EAM)
強心剤ミオシン誘発自己免疫心筋炎後のラット拡大心筋症は、慢性心不全の動物モデルとして使用することができる。実験自己免疫心筋炎は、ブタの強心剤ミオシンによる免疫化によってルイスラットにて誘発される。外傷における多核巨細胞の外見を特徴とする急性重度の心筋炎は、免疫化後15日目に惹起される。約28日目まで、劇症心筋炎は継続し、ついで、炎症細胞浸潤が心筋から治まる。自己免疫巨細胞心筋炎が治された後、ヒト拡大心筋症に類似する慢性心不全が明瞭となる。治療期間は、例えば、約29日間から6週間であってもよい。1つの例にて、治療の効力を測定するために、群を構成する。例えば、4つの群を構成してもよい。1つの群は、例えば、食塩水のようなビヒクルで処置した対照群であってもよい。その他の群は、アルドステロンブロッカーの低投与、中投与および高投与するであろうラットによって構成することができる。特に好ましい例にて、第1の群は、約20mgエポキシメクセレノン/kg体重/日の低投薬量を投与される。第2の群は、約100mgエポキシメクセレノン/kg体重/日の中投薬量を投与される。第3の群は、500mgエポキシメクセレノン/kg体重/日の高投薬量を投与される。効力は、心臓リモデリングの種々のインジケータを測定することによって示すことができる。インジケータとしては、血流動力学パラメータ、例えば、左心室収縮圧、左心室弛緩圧；異常発見、例えば、心臓の重さ、心臓の重さ対体重の比、心筋線維症の面積およびコラーゲン繊維の成分の測定；および、リモデリングに影響を及ぼすことが公知のmRNA翻訳の種々の蛋白質の発現は、例えば、形質転換成長因子-β(TGF-β)が挙げられる。本発明の方法は、心筋炎および心筋症を治療および予防するのに効果的であろうと考えられる。
【０４１０】
成長および分化因子の形質転換成長因子-β(TGF-β)上科は、成人にて非常に広範な範囲の生物学的機能を調節し、胚発育の間のパターン付けおよび細胞死測定にて中心的な重要性を有する。TGF-βは、広範な生物学的効果を有する。特に、それは、細胞外マトリックス成分の生成を刺激し、それは、プロテアーゼの発現を阻害し、プロテアーゼ阻害剤の発現を増加することによって細胞外マトリックスの分解を抑制する。成長および細胞外マトリックスに及ぼすこれらの効果は、心筋症の進行性にて重要である。
【０４１１】
アテローム硬化症についてのAPOeマウスモデルは、Roselear et al.によって記載されている(Arterioscle Thromb. Biol.，16、013-18(1996))。アルドステロンブロッカーは、アテローム硬化性外傷を予防するのに活性であるはずである。
【０４１２】
本発明を具体的な実施態様について記載したが、これら実施態様の詳細は、本発明をなんら限定するべきものではない。
本明細書中で参考とした全ての特許文献は、参考とすることによって組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０４１３】
【図１Ａ】図1-Aは、フォームHエプレレノンのX線粉末回折パターンを示す。
【図１Ｂ】図1-Bは、フォームLエプレレノンのX線粉末回折パターンを示す。
【図１Ｃ】図1-Cは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物のX線粉末回折パターンを示す。
【図２Ａ】図2-Aは、メチルエチルケトンから直接晶析した非粉砕フォームLの示差走査熱量(DSC)サーモグラムを示す。
【図２Ｂ】図2-Bは、メチルエチルケトンからの高純度エプレレノンの晶析によって得られる溶媒和物の脱溶媒和によって調製される非粉砕フォームLの示差走査熱量(DSC)サーモグラムを示す。
【図２Ｃ】図2-Cは、メチルエチルケトン中の高純度エプレレノンの溶液から溶媒和物を晶析し、その溶媒和物を脱溶媒和してフォームLを生成させ、生ずるフォームLを粉砕することによって調製されるフォームLの示差走査熱量(DSC)サーモグラムを示す。
【図２Ｄ】図2-Dは、適当な溶剤からの低純度エプレレノンの熟成によって得られる溶媒和物の脱溶媒和によって調製される非粉砕フォームHの示差走査熱量(DSC)サーモグラムを示す。
【図２Ｅ】図2-Eは、メチルエチルケトン溶媒和物についてのDSCサーモグラムを示す。
【図３Ａ】図3-Aは、フォームHエプレレノンの赤外スペクトル(拡散反射，DRIFTS)を示す。
【図３Ｂ】図3-Bは、フォームLエプレレノンの赤外スペクトル(拡散反射，DRIFTS)を示す。
【図３Ｃ】図3Cは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物の赤外スペクトル(拡散反射，DRIFTS)を示す。
【図３Ｄ】図3-Dは、クロロホルム溶液中のエプレレノンの赤外スペクトル(拡散反射，DRIFTS)を示す。
【図４】図4は、エプレレノンのフォームHについての13C NMRスペクトルを示す。
【図５】図5は、エプレレノンのフォームLについての13C NMRスペクトルを示す。
【図６Ａ】図6-Aは、メチルエチルケトン溶媒和物についての熱重量分析特性を示す。
【図７】図7は、7-メチル水素4”,5”,9”,11”-ジエポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグネ-7”,21-ジカルボキシレート(メチルエチルケトンから単離された-ラクトン)の結晶形のX線粉末回折パターンを示す。
【図８】図8は、7-メチル水素11”、2”-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグネ-4-エン-7”,21-ジカルボキシレート(イソプロパノールから単離された-ラクトン)の結晶形のX線粉末回折パターンを示す。
【図９】図9は、7-メチル水素-17-ヒドロキシ-3-オキソ-17”-プレグナ-4，9(11)-ジエン-7”,21-ジカルボキシレート(n-ブタノールから単離された-ラクトン)の結晶形のX線粉末回折パターンを示す。
【図１０】図10は、(a)0%、(b)1%、(c)3%および(d)5%ジエピキシドドープトメチルエチルケトン晶析から得られる湿潤ケーキ(メチルエチルケトン溶媒和物)についてのX線粉末回折パターンを示す。
【図１１】図11は、(a)0%、(b)1%、(c)3%および(d)5%ジエポキシドドープトメチルエチルケトン晶析から得られる乾燥固体についてのX線粉末回折パターンを示す。
【図１２】図12は、(a)乾燥の前に溶媒和物を粉砕することなくおよび(b)乾燥前に溶媒和物を粉砕して、ジエポキシドの3%ドーピングでメチルエチルケトン晶析からの乾燥した固体についてのX線粉末回折パターンを示す。
【図１３】図13は、(a)0%、(b)1%、(c)5%および(d)10%11,12-エポキシドドープトメチルエチルケトン晶析から得られる湿潤ケーキ(メチルエチルケトン溶媒和物)についてのX線粉末回折パターンを示す。
【図１４】図14は、(a)0%、(b)1%、(c)5%および(d)10%11,12-エポキシドドープトメチルエチルケトン晶析から得られる乾燥固体についてのX線粉末回折パターンを示す。
【図１５】図15は、表X-7Aにて報告したデータに基づく生成物純度、出発材料純度、冷却速度および終点温度の立方体プロットを示す。
【図１６】図16は、最終物質の純度に及ぼす統計学的に有意な効果を有する可変数を測定するために、図18の立方体プロットを使用して作成した半正規化プロットを示す。
【図１７】図17は、最終物質純度に及ぼす出発材料純度と冷却速度との間の相互作用を示す表X-7Aにて報告した結果に基づく相互作用グラフである。
【図１８】図18は、表X-7Aにて報告したデータに基づくフォームH重量分率、出発物質純度、冷却速度および終点温度の立方体プロットを示す。
【図１９】図19は、最終物質の純度に統計学的に有意な効果を有する可変数を測定するために、図21の立方体プロットを使用して作成した半正規化プロットを示す。
【図２０】図20は、最終物質純度に及ぼす出発材料と終点温度との間の相互作用を示す表X-7Aにて報告した結果に基づく相互作用グラフである。
【図２１】図21は、非晶質エプレレノンのX線回折パターンを示す。
【図２２】図22は、非晶質エプレレノンのDSCサーモグラムを示す。
【図２３】図23は、アンギオテンシンII注入したラットの研究における収縮血圧の変化を示す。
【図２４】図24は、アンギオテンシンII注入したラットの心臓にての血管炎症のエプレレノン(エポキシメクセレノン)による予防を示す。
【図２５】図25は、ビヒクル注入したラットの心臓にてシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)の欠如を示す。
【図２６】図26は、Ang II注入したラットの心臓におけるCOX-2発現の誘発を示す。
【図２７】図27は、Ang II注入したラットの心臓におけるCOX-2発現の誘発のエプレレノンによる予防を示す。
【図２８】図28は、ビヒクル注入したラットの心臓におけるオステオポンチン発現の欠如を示す。
【図２９】図29は、アルドステロン注入したラットの心臓におけるオステオポンチンの誘発のエプレレノンによる予防を示す。
【図３０】図30は、アルドステロン注入したラットの心筋におけるオステオポンチン上方調節による予防を示す。
【図３１】図31は、アルドステロン注入したラットの心筋におけるCOX-2上方調節のエプレレノンによる予防を示す。
【図３２】図32は、アルドステロン注入したラットにおける心筋損傷のエプレレノンによる予防を示す。
【図３３】図33は、アルドステロン注入したラットの冠状動脈媒体におけるCOX-2とオステオポンチンとの上方調節された同時発現を示す。
【図３４】図34は、アルドステロン誘発された血管炎症および損傷についての幾つかの機構を示す。
【図３５】図35は、アンギオテンシンII注入され、カプトプリル処置された発作腹臥(stroke prone)自発高血圧ラットにてエプレレノン処置による尿蛋白質分泌の増加の阻害を示す。
【図３６】図36は、アンギオテンシンII注入され、カプトプリル処置された発作腹臥自発高血圧ラットにてエプレレノン処置による腎損傷についての組織病理学的スコアにおける低下を示す。
【図３７】図37は、発作腹臥自発高血圧ラットにてエプレレノン処置により増加した生存および低下した大脳損傷を示す。
【図３８】図38は、発作腹臥自発高血圧ラットにてエプレレノンによる大脳損傷の低下を示す。
【図３９】図39は、アルドステロン注入し、エプレレノンで処置した高血圧ラットにおける心筋COX-2の早期時間コース発現の阻害を示す。
【図４０】図40は、アルドステロン注入し、エプレレノンで処置した高血圧ラットにおける心筋オステオポンチンの早期時間コース発現の阻害を示す。
【図４１】図41は、アルドステロン注入し、エプレレノンで処置した高血圧ラットにおける心筋MCP-1の早期時間コース発現の阻害を示す。
【図４２】図42は、アルドステロン注入し、エプレレノンで処置した高血圧ラットにおける心筋ICAM-1およびVCAM-1の早期時間コース発現の阻害を示す。
【図４３】図43は、アルドステロン注入による収縮血圧上昇およびアルドステロン注入かつエプレレノン処置によるこの上昇の低下を示す。
【図４４】図44は、対照ラットについて、アルドステロンを注入したラットについておよびアルドステロンを注入しかつエプレレノンで処置したラットについて、28日目の心筋病理学的スコア；および、アルドステロンを注入したラットについておよびアルドステロンを注入しかつエプレレノンで処置したラットについて、心臓の重量対体重の比を示す。
【図４５】図45は、対照ラットについて、アルドステロンを注入したラットについておよびアルドステロンを注入しかつエプレレノンで処置したラットについて、28日循環オステオポンチンレベルを示す。
【図４６】図46は、対照ラットにて、アルドステロンを注入したラットにておよびアルドステロンを注入しかつエプレレノンで処置したラットにて、炎症サイトカインについて、28日目の相対的なmRNA発現を示す。
【図１Ａ】
2006508174.tif 000089
【図１Ｂ】
2006508174.tif 000090
【図１Ｃ】
2006508174.tif 000091
【図２Ａ】
2006508174.tif 000092
【図２Ｂ】
2006508174.tif 000093
【図２Ｃ】
2006508174.tif 000094
【図２Ｄ】
2006508174.tif 000095
【図２Ｅ】
2006508174.tif 000096
【図３Ａ】
2006508174.tif 000097
【図３Ｂ】
2006508174.tif 000098
【図３Ｃ】
2006508174.tif 000099
【図３Ｄ】
2006508174.tif 000100
【図４】
2006508174.tif 000101
【図５】
2006508174.tif 000102
【図６Ａ】
2006508174.tif 000103
【図７】
2006508174.tif 000104
【図８】
2006508174.tif 000105
【図９】
2006508174.tif 000106
【図１０】
2006508174.tif 000107
【図１１】
2006508174.tif 000108
【図１２】
2006508174.tif 000109
【図１３】
2006508174.tif 000110
【図１４】
2006508174.tif 000111
【図１５】
2006508174.tif 000112
【図１６】
2006508174.tif 000113
【図１７】
2006508174.tif 000114
【図１８】
2006508174.tif 000115
【図１９】
2006508174.tif 000116
【図２０】
2006508174.tif 000117
【図２１】
2006508174.tif 000118
【図２２】
2006508174.tif 000119
【図２３】
2006508174.tif 000120
【図３０】
2006508174.tif 000121
【図３１】
2006508174.tif 000122
【図３２】
2006508174.tif 000123
【図３４】
2006508174.tif 000124
【図３５】
2006508174.tif 000125
【図３６】
2006508174.tif 000126
【図３７】
2006508174.tif 000127
【図３９】
2006508174.tif 000128
【図４０】
2006508174.tif 000129
【図４１】
2006508174.tif 000130
【図４２】
2006508174.tif 000131
【図４３】
2006508174.tif 000132
【図４４】
2006508174.tif 000133
【図４５】
2006508174.tif 000134
【図４６】
2006508174.tif 000135
【図２４】
2006508174.tif 000136
【図２５】
2006508174.tif 000137
【図２６】
2006508174.tif 000138
【図２７】
2006508174.tif 000139
【図２８】
2006508174.tif 000140
【図２９】
2006508174.tif 000141
【図３３】
2006508174.tif 000142
【図３８】
2006508174.tif 000143
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月21日(2005.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者にて、前記被検者における炎症または心臓リモデリングの調節に直接的または間接的に関係する１つ以上の発現生成物の発現を変化させることにより、心筋炎、心筋症、脈管炎およびベーチェット病からなる群より選択される炎症関連疾患を予防または治療するための、アルドステロンブロッカーを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記炎症関連疾患が、心筋炎である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炎症関連疾患が、心筋症である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記炎症関連疾患が、脈管炎である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炎症関連疾患が、ベーチェット病である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６】
被検者における炎症または心臓リモデリングの調節にて直接的または間接的に関係する１つ以上の発現生成物が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、ANF、avβ3、Inf-γ、IL-1、TNF-アルファ、NADH/NADPH酸化酵素、スーパーオキシドフリーラジカル、TXA2、b-FGF、CD44、エンドテリン、アンギオテンシンII受容体、活性t-PA、不活性t-PA、PAI-1、CRP、IL-6、IL-10、IL-12、トロポニンT、HSP65、アミロイド、ホスホリパーゼA2、フィブリノーゲン、CD40/CD40L、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、コラーゲン結合インテグリンa1β1およびコラーゲン結合インテグリンa2β1からなる群より選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記発現生成物の２つ以上が、同時的に、同時発現される、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記発現生成物が、シクロオキシゲナーゼ-2を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記シクロオキシゲナーゼ-2が、オステオポンチン、MCP-1、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびVCAM-1からなる群より選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記発現生成物が、オステオポンチンを含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記オステオポンチンが、シクロオキシゲナーゼ-2、MCP-1、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびVCAM-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記発現生成物が、MCP-1を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記MCP-1が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびVCAM-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記発現生成物が、ICAM-1を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ICAM-1が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、MCP-1、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-βおよびVCAM-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記発現生成物が、VCAM-1を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記VCAM-1が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、インターロイキン-8、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記発現生成物が、インターロイキン-8を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記インターロイキン-8が、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、VCAM-1、NFカッパB、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記発現生成物が、NFカッパBを含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記NFカッパBが、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、VCAM-1、インターロイキン-8、形質転換成長因子-β、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記発現生成物が、形質転換成長因子-βを含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記形質転換成長因子-βが、シクロオキシゲナーゼ-2、オステオポンチン、VCAM-1、インターロイキン-8、NFカッパB、ICAM-1およびMCP-1からなる群より選択される１つ以上の発現生成物と同時発現される、請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
３つ以上の発現生成物が、同時的に、同時発現される、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記アルドステロンブロッカーが、アルドステロン受容体アンタゴニストである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、スピロラクトン-タイプの化合物である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記スピロラクトン-タイプの化合物が、
7α-アセチルチオ-3-オキソ-4,15-アンドロスタジエン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
3-オキソ-7α-プロピオニルチオ-4,15-アンドロスタジエン-〔17((β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
6β,7β-メチレン-3-オキソ-4,15-アンドロスタジエン-〔17((β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
15α,16α-メチレン-3-オキソ-4,7α-プロピオニルチオ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
6β,7β,15α,16α-ジメチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
7α-アセチルチオ-15β,16β-メチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
15β,16β-メチレン-3-オキソ-7β-プロピオニルチオ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；および、
6β,7β,15β,16β-ジメチレン-3-オキソ-4-アンドロステン-〔17(β-1’)-スピロ-5’〕パーヒドロフラン-2’-オン；
からなる群より選択される、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、スピロノラクトンである、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシ-ステロイド系アルドステロンアンタゴニストである、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記エポキシ-ステロイド系化合物が、20-スピロキサン化合物のステロイド核の“C”環に縮合したエポキシ部分を有する、請求項29に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記20-スピロキサン化合物が、9-アルファ,11-ベータ-置換されたエポキシ部分の存在を特徴とする、請求項29に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記エポキシ-ステロイド系化合物が、
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ，(γ-ラクトン，メチルエステル，(7α，11α，17β)-；
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-ジメチルエステル，(7α，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-,γ-ラクトン(6β，7β，11α，17β)-；
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-１７-ヒドロキシ-3-オキソ，7-(１−メチルエチル)エステル，一カリウム塩，(7α，11α，17β)-；
プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，7-メチルエステル，一カリウム塩，(７α，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-1,4,6-トリエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，メチルエステル，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，一カリウム塩，(6β，7β，11α，17β)-；
3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α，17β)-；
プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ，γ-ラクトン，エチルエステル，(7α，11α，17β)-；および、
プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，1-メチルエチルエステル，(7α，11α，17β)-；
からなる群より選択される、請求項29に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシメクセレノンである、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-ジメチルエステル，(7α，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-,γ-ラクトン(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ，7-(1-メチルエチル)エステル，一カリウム塩，(７α，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-4-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，7-メチルエステル，一カリウム塩，(７α，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-1,4,6-トリエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，メチルエステル，(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，一カリウム塩，(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、3’H-シクロプロパ〔6，7〕プレグナ-4,6-ジエン-21-カルボン酸，9,11-エポキシ-6,7-ジヒドロ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，(6β，7β，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，エチルエステル，(7α，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、プレグネ-４-エン-7,21-ジカルボン酸，9,11-エポキシ-17-ヒドロキシ-3-オキソ-，γ-ラクトン，エチルエステル，(7α，11α，17β)-である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、ドロスピレノンである、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記アルドステロン受容体アンタゴニストが、エポキシメクセレノンである、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
投与されるエポキシメクセレノンの量が、約0.5mg〜約500mg/日の間である、請求項45に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約0.5mg〜約100mg/日の間である、請求項45に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約10mg〜約100mg/日の間である、請求項45に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約0.5mg〜約25mg/日の間である、請求項45に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
投与されるエポキシメクセレノンの治療学的に有効な量が、約0.5mg〜約10mg/日の間である、請求項45に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記アルドステロンブロッカーが、11β-ヒドロキシアンドロステ-4-エン-3-オン17-スピロラクトンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記アルドステロンブロッカーが、アルドステロン阻害剤である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記アルドステロン阻害剤が、アロマターゼ阻害剤；12-リポキシゲナーゼ阻害剤；P45011β阻害剤；心房ナトリウム排泄増加性因子；20溶解酵素阻害剤；PKC阻害剤；ベンゾジアゼピン類；カルシウムブロッカー；ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤；カリウムイオノホア；電子伝達ブロッカー；または、それらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記アルドステロン阻害剤が、ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤である、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤が、1,6-ビス-シクロヘキシルオキシミノカルボニルアミノ)-ヘキサンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項54に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記アルドステロン阻害剤が、ベンゾジアゼピン化合物である、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記ジアゼピン化合物が、ジアゼパムまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項56に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記アルドステロン阻害剤が、アロマターゼ阻害剤である、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記アロマターゼ阻害剤が、ファドロゾールまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項58に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記アルドステロン阻害剤が、リポキシゲナーゼ阻害剤である、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記リポキシゲナーゼ阻害剤が、フェニドンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項60に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記アルドステロン阻害剤が、P45011β阻害剤である、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記P45011β阻害剤が、18-ビニルプロゲステロンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項62に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記アルドステロンブロッカーが、アルドステロンシンターゼ阻害剤である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
被検者にて、インターロイキン-8、NFカッパBおよび形質転換成長因子-βからなる群より選択される１つ以上の発現生成物の発現を変化させることにより、炎症関連疾患を予防または治療するための、アルドステロンブロッカーを含む医薬組成物。
【国際調査報告】
2006508174.tif 000144
2006508174.tif 000145
2006508174.tif 000146
2006508174.tif 000147