(57)【要約】本発明は、一般的には、アプタマーを用いて免疫系を調節する方法に関し、とりわけ、ＣＴＬＡ−４機能を阻害する方法及びかかる方法に使用するのに適したアプタマーに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０又はＴＧＦβ受容体に結合するアプタマーの免疫機能調節に充分な量を哺乳動物に投与することからなる、前記哺乳動物における免疫機能を調節する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物が癌罹患者である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記罹患者がヒトである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記罹患者が抗原特異的免疫療法を受けているものである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アプタマーの投与が前記免疫療法を増強する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アプタマーがＣＴＬＡ−４に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アプタマーがＣＤ２８に結合しない請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アプタマーがＣＴＬＡ−４の種間同族体の保存されたエピトープに特異的である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アプタマーがＤｅｌ  ６０である請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記アプタマーがヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アプタマーが、２'−アミノ、２'−フルオロ又は２'−Ｏ−アルキルヌクレオチドからなる群から選ばれた修飾ヌクレオチドを含んでいる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アプタマーが３'キャップを有している請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アプタマーがポリエチレングリコール部分を含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アプタマーがリポソームに結合されている請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アプタマーがマルチマーとして存在している請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ｉ）核酸の候補混合物を調製し、
ii）前記混合物をＣＴＬＡ−４と接触させ、その場合に、前記混合物中に存在し、前記候補混合物に比してＣＴＬＡ−４に対する親和性の高い核酸を前記候補混合物の残余から分割分離できるものであり、そして、
iii）ＣＴＬＡ−４に対する親和性の高い前記核酸を前記候補混合物の残余から分割分離することからなる、ＣＴＬＡ−４アプタマーの同定確認方法。
【請求項１７】
さらに、工程（ｉ）と（ii）との間に、前記候補混合物をＣＤ２８と接触させ、前記候補混合物に比してＣＤ２８に対し高い親和性をもつ核酸を前記候補混合物から分割分離することを包含する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＴＬＡ−４機能を阻害するアプタマーを同定確認する方法であって、前記アプタマーの存在下及び不存在下にＴ細胞増殖を評価し、前記アプタマーの存在下でのＴ細胞増殖の増強をもってＣＴＬＡ−４機能の阻害の指標とする方法。
【請求項１９】
ＣＴＬＡ−４に結合するアプタマー。
【請求項２０】
前記アプタマーがＤｅｌ  ６０又はＭ９−１４Ｄｅｌ  ５５である請求項１９に記載のアプタマー。
【請求項２１】
請求項１９のアプタマーと担体とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００３年３月１２日に提出された国内出願第６０／４５３，８３１号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を引用によってここに挿入する。
【０００２】
本発明は、一般的には、アプタマーを用いて免疫系を調節する方法に関し、特に、ＣＴＬＡ−４の機能を阻害する方法及び係る方法に使用するのに適したアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞活性化における重要な事象は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣ−ペプチド複合体との間の相互作用である。完全な活性化には、第二の共刺激シグナルが必要なことが、１９８０年代半ばに明らかになった。ＣＤ２８は、静止細胞ならびに活性Ｔ細胞の表面で発現される主要な共刺激分子であり、Ｂ７−１及びＢ７−２は、樹状細胞、活性化された単球／マクロファージなどのプロＡＰＣ表面で発現されるＣＤ２８の主な対抗（カウンター）受容体である（非特許文献１〜３）。
【０００４】
Ｔ細胞活性化過程では、ＩＬ−２ｍＲＮＡの転写及び安定性の調節によるＩＬ−２の産生に、ＣＤ２８を介してのシグナル伝達（共刺激）が必要である。Ｔ細胞活性化の強力な共刺激因子ではあるが、ＣＤ２８機能は、とくに強い又は持続性の抗原（Ａｇ）特異的シグナルが得られる状況下では、必ずしも要求されない（非特許文献４及び５）。
【０００５】
ＣＴＬＡ−４は、共通のリガンドＢ７−１及びＢ７−２への結合に関与するモチーフ及びＭＹＰＰＹを含めて、ＣＤ２８とかなりの相同性を共有する第二の共刺激分子である（非特許文献６）。ＣＤ２８とは異なり、ＣＴＬＡ−４の発現は、Ｔ細胞が活性化されるときに誘発され、ＣＴＬＡ−４が、ＣＤ２８よりも５０−２０００倍高い親和性をもつＢ７リガンドに結合する（非特許文献７）。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の負の調節因子である（非特許文献８〜１１に総説されている）。最初の証拠は、一価抗ＣＴＬＡ−４抗体（Ａｂ）とのＣＴＬＡ−４を介してのシグナル伝達がＡｇ依存性（及びＣＤ２８依存性）のＴ細胞増殖を増強することを示したインビトロの研究から得られた（非特許文献１２及び１３）。ＣＴＬＡ−４の阻害機能の説得力ある証拠は、ＣＴＬＡ−４欠損マウスが致命的なリンパ増殖性疾患にかかるという観察から得られた（非特許文献１４及び１５）。
【０００６】
ＣＴＬＡ−４はＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞表面で活性化されるが、インビボでは、ＣＤ４Ｔ細胞媒介阻害については、ＣＤ４＋Ｔ細胞が一次標的であると思われる（非特許文献１６及び１７）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、構成的にＣＴＬＡ−４を発現する（非特許文献１８及び１９）。しかし、Ｔｒｅｇ上のＣＴＬＡ−４の機能上の役割は、現在のところ、論議の的となっている（非特許文献２０〜２３）。ノックアウトマウスにはＣＴＬＡ−４が遺伝的に存在しない（非特許文献２４及び２５）ことから、又は、正常マウスでのＣＴＬＡ−４機能のＡｂ介在性遮断（非特許文献２６）が大量のリンパ球増殖と関連していることから、ＣＴＬＡ−４の生理学的機能は、末梢性トレランスを維持すること、すなわち自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻止し、及び／又はそれら細胞の増大を減弱させることであると考えられる。これが、自己反応性Ｔ細胞又はＴｒｅｇ細胞の表面で発現されたＣＴＬＡ−４によって媒介されるのか、両者の組合せによるのかは、明瞭ではない。
【０００７】
インビトロにおいて、ＣＴＬＡ−４遮断がＴ細胞の応答を増強する能力によって発現されるＴ細胞活性化に対するＣＴＬＡ−４の阻害的役割ならびにＣＴＬＡ−４欠損マウスで見られる強度のＴ細胞増殖を考慮すれば、インビボでのＣＴＬＡ−４機能の一過性阻害が腫瘍免疫を増強できるかどうかを調べることは、もっともなことであった。マウス腫瘍モデルを用いたいくつかの研究が、実際に、インビボでのＣＴＬＡ−４の遮断が抗腫瘍Ｔ細胞依存性免疫を増強することを示し、Ａｇ特異性ポリクローナルＴ細胞応答を減弱させる上でのＣＴＬＡ−４の一役割を支持するさらなる証拠を提供している。これらの研究においては、一過性のＣＴＬ４遮断が、マウスを抗ＣＴＬ４モノクローナル抗体で処置することによって達成された。
【０００８】
マウスを抗ＣＴＬＡ−４Ａｂで処置すると、免疫原性の移植腫瘍が拒絶されるに至るが、免疫原性の弱い又はそれをもたない腫瘍に対しては効果がない、又はほとんどないことが、まず示された（非特許文献２７及び２８）。前もって株化された腫瘍を含めての非免疫原性腫瘍の拒絶は、ＣＴＬＡ−４遮断をワクチン接種（非特許文献２９〜３１）又は低用量化学療法（非特許文献３２）と、いずれの処置も単独では有効でないような条件下で組合せれば、達成できた。これらの観察は、インビボでのＣＴＬＡ−４遮断が、ＣＴＬＡ−４により送達される阻害シグナルの遮断によって、Ｔ細胞のＡｇ依存性活性化及び／又は増大を容易ならしめるという見解を補強する。
【０００９】
興味あることに、最近の一研究が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の両者の同時除去（抗ＣＤ２５Ａｂを用いての）とＣＴＬＡ−４遮断（抗ＣＴＬＡ−４Ａｂを用いての）とが、相乗的抗腫瘍作用をもつことを示し、ＣＴＬＡ−４介在性免疫抑制が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞とは異なる細胞及び経路によって媒介されることを示唆している（非特許文献３３）。いくつかの場合には、ワクチン接種と組合せての抗ＣＴＬＡ−４Ａｂによるマウスの処置が、局部的皮膚色素脱失の形の弱い自己免疫発現と関連した（非特許文献３４〜３７）。このことは、ＣＴＬＡ−４欠損マウスで見られるところと異なることなく、腫瘍ワクチンで発現される組織特異性抗原に向けられる自己反応性Ｔ細胞の活性化を表しているのかもしれない（非特許文献３８及び３９）。
【００１０】
アプタマーは、高親和性の一本鎖核酸リガンドであり、各々が所与の標的分子に特異的であり、反復的インビトロ選択手法を用いたコンビナトリアルケミストリーのプロセスによって単離することができる。かかるインビトロ選択へのアプローチの概観を図１に示す（ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）と呼ばれる）（非特許文献４０及び４１）。ＳＥＬＥＸは、強力な精製法であり、きわめて稀な結合活性（１０１１中の１ないし１０１３中の１の頻度の）を大きなコンビナトリアルライブラリーからアフィニティー精製によって単離することができる。
【００１１】
このインビトロ選択プロセスの出発点は、通常は２０−４０のランダム化された位置を含んだ一本鎖核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ）からなるコンビナトリアルライブラリーである。ランダム化によって、きわめて多様の可能な配列が創り出される（たとえば、４０のランダム化された位置での４種のヌクレオチドは、理論上の可能性として４４０又は１０２４の異なる配列を与える）。短い一本鎖核酸はそれらの配列によって規定される柔軟性のあまりない構造をとるので、かかるライブラリーは、莫大な数の分子形状又は立体配座を含んでいる。ある所与の標的タンパク質に対する高親和性核酸リガンドを単離するためには、出発核酸ライブラリー（実際面では、１０１４〜１０１５の異なる配列）を、関心の対象であるタンパク質とともにインキュベートする。特定のタンパク質への結合を可能ならしめる立体配座をとる核酸分子を、次に、採用した条件下で前記タンパク質に結合できないライブラリー中の他の配列から分割分離する。
【００１２】
次に、結合した配列を前記タンパク質から取り外し、逆転写及びＰＣＲ（ＲＮＡを基礎としたライブラリーの場合）又はＰＣＲのみ（ＤＮＡを基礎としたライブラリーの場合）によって増幅して、標的タンパク質に結合する配列が濃縮され、複雑度の減じたライブラリーを生じさせる。このライブラリーを、次に、インビトロで転写させ（ＲＮＡを基礎としたライブラリーの場合）、又はそれの鎖を分離し（ＤＮＡライブラリーの場合）、次回の選択に用いるための分子を生成させる。典型的には厳密性を増しながら行われる数回（普通８−１２回）の選択ののち、選択されたリガンドを配列決定し、標的タンパク質に対する親和性及びインビトロで標的タンパク質の活性を阻害する能力について評価する。
【００１３】
ＳＥＬＥＸで単離されたアプタマーは、顕著な親和性及び特異性を示すことができる。成功裏に行われたならば、選択されたリガンドは強固に結合し、典型的な解離定数は低ピコモル（１×１０−１２Ｍ）から低ナノモル（１×１０−９Ｍ）までの範囲内にある。インビトロ選択手法が改良されるのに伴い、標的に対してナノモル未満の親和性をもつアプタマーの生成が益々ありふれたこととなってきている。これらの親和性は、モノクローナル抗体と抗原との間の相互作用について測定されるものと類似している。しかし、アプタマー−標的タンパク質について測定される解離定数は真の親和性であるので、それらは、より正確には、Ｆａｂ断片のそれらが標的とする抗原に対する親和性に比されるものである。概して、標的タンパク質に対するアプタマーの親和性は、Ｆａｂ断片とそれらの標的抗原との間の相互作用に典型的なものよりも強い（非特許文献４２）。
【００１４】
高親和性の核酸−タンパク質間相互作用には、前記核酸と前記タンパク質の両者がもつ官能基の間の特異的相補的接触が必要である。タンパク質−アプタマー相互作用を媒介する相補的接触部位の特異的な三次元配列は、他のタンパク質では反復されそうにはないので、アプタマーは、それらの標的に対して一般的に特異的である。２種の関連標的（ヒト及びブタトロンビン（非特許文献４３）など）の間での選択ラウンドの「トグリング（切替え）」によって、それらの関連標的の共通のモチーフに結合する交差反応性アプタマーを単離することができる。
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，４７５，０９６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２７０，１６３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７０７，７９６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７６３，１７７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５８０，７３７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，５６７，５８８号明細書
【特許文献７】米国特許第６，１７１，７９５号明細書
【特許文献８】ＷＯ０２／０９６９２６
【００１６】
【非特許文献１】Chambers et al, Immunity 7(6):885-895(1997)
【非特許文献２】Alegre et al, Nature Reviews Immunology 1:220-228(2001)
【非特許文献３】Salomon and Bluestone, Annu. Rev. Immunol.19:225-252(2001)
【非特許文献４】Teh and Teh, Cell. Immunol.179(1):74-83(1997)
【非特許文献５】Kundig et al, Immunity 5(1):41-52(1996)
【非特許文献６】Linsley et al, Immunity 1(9):793-801(1994)
【非特許文献７】Brunet et al, Nature 328(6127):267-270(1987)
【非特許文献８】Alegre et al, Nature Reviews Immunology 1:220-228(2001)
【非特許文献９】Salomon and Bluestone, Ann. Rev. Immunol. 19:225-252(2001)
【非特許文献１０】Chambers et al, Immunity, 7(6):885-895(1997)
【非特許文献１１】Egen and Nat. Immunol. 3(7):611-618(2002)
【非特許文献１２】Krummel and Allison,J. Exp. Med. 182(2):459-465(1995)
【非特許文献１３】Walnus et al, Immunity 1(5):405-413(1994)
【非特許文献１４】Waterhouse et al, Science 270(5238):985-988(1995)
【非特許文献１５】Tivol et al, Immunity 3(5):541-547(1995)
【非特許文献１６】Chambers et al, Immunity 7(6):885-895(1997)
【非特許文献１７】Bachmann et al, J. Immunol. 160(1):95-100(1998)
【非特許文献１８】Read et al, J. Exp. Med. 192〔2〕:295-302(2000)
【非特許文献１９】Takahashi et al, J. Exp. Med. 192(2):303-310(2000)
【非特許文献２０】Read et al, J. Exp. Med. 192(2):295-302(2000)
【非特許文献２１】Takahashi et al, J. Exp. Med. 192(2):303-310(2000)
【非特許文献２２】Levings et al, J. Exp. Med. 193(11):1295-1302(2001)
【非特許文献２３】Jonuleit et al, J. Exp. Med. 193(11):1285-1294(2001)
【非特許文献２４】Waterhouse et al, Science 270(5238):985-988(1995)
【非特許文献２５】Tivol et al, Immunity 3(5):541-547(1995)
【００１７】
【非特許文献２６】Takahashi et al, J. Exp. Med. 192(2):303-310(2000)
【非特許文献２７】Yang et al, Cancer Res. 57(18):4036-4041(1997)
【非特許文献２８】Leach et al, Science 271(5256):1734-1736(1996)
【非特許文献２９】Hurwitz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071(1998)
【非特許文献３０】Hurwitz et al, Cancer Res. 60(9):2444-2448(2000)
【非特許文献３１】van Elsas et al, J. Exp. Med. 190(3):355-366(1999)
【非特許文献３２】Mokyr et al, Cancer Res. 58(23):5301-5304(1998)
【非特許文献３３】Sutmuller et al, J. Exp. Med. 194(6):823-832(2001)
【非特許文献３４】Hurwitz et al, Cancer Res. 60(9):2444-2448(2000)
【非特許文献３５】van Elsas et al, J. Exp. Med. 190(3):355-366(1999)
【非特許文献３６】Sutmuller et al, J. Exp. Med. 194(6):823-832(2001)
【非特許文献３７】van Elsas et al, J. Exp. Med. 194(4):481-489(2001)
【非特許文献３８】Waterhouse et al, Science 270(5238):985-988(1995)
【非特許文献３９】Tivol et al, Immunity 3(5):541-547(1995)
【非特許文献４０】Ellington and Szostak, Nature 346(6287):818-822(1990)
【非特許文献４１】Tuerk and Gold,Science 249(4968):505-510(1990)
【非特許文献４２】Gold et al, Annu. Rev. Biochem. 64:763-797(1995)
【非特許文献４３】White et al, Mol. Ther. 4(6):567-573(2001)
【非特許文献４４】Beigelman et al, J. Biol. Chem. 270(43):25702-25708(1995)
【非特許文献４５】Pieken et al, Science 253(5017):314-317(1991)
【非特許文献４６】Aurup et al, Biochemistry 31(40):9636-9641(1992)
【非特許文献４７】Jellinek et al, Biochemistry 34(36):11363-11372(1995)
【非特許文献４８】Beigelman et al, J. Biol. Chem. 270(43):25702-25708(1995)
【非特許文献４９】Tucker et al, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 732(1):203-212(1999)
【非特許文献５０】Willis et al, Bioconjug. Chem. 9(5):573-582(1998)
【００１８】
【非特許文献５１】Lee and Sullenger, Nat. Biotechnol. 15(1):41-45(1997)
【非特許文献５２】Lee and Sullenger, J. Exp. Med. 194(2):315-324(1996)
【非特許文献５３】Gold, J. Biol. Chem. 270(23):13581-13584(1995)
【非特許文献５４】Altman et al, Science 274:94-96(1996)
【非特許文献５５】Rusconi et al, Thromb. Haemost. 84(5):841-848(2000)
【非特許文献５６】Doudna et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(6):2355-2359(1995)
【非特許文献５７】Rusconi et al, Thromb.Haemost.84(5):841-848(2000)
【非特許文献５８】Conrad et al, J. Biol. Chem. 269(51):32051-32054(1994)
【非特許文献５９】Rusconi et al, Thromb. Haemost. 84(5):841-848(2000)
【非特許文献６０】White et al, Mol. Ther. 5(6):567-573(2001)
【非特許文献６１】Davis et al, Methods Enzymol. 267:302-314(1996)
【非特許文献６２】Mathews et al, J. Mol. Biol. 288(5):911-940(1999)
【非特許文献６３】White et al, Mol. Ther. 4(6):567-573(2001)
【非特許文献６４】Rusconi et al, Thromb. Haemost. 84(5):841-848(2000)
【非特許文献６５】Krummel and Allison, J. Exp. Med. 182(2):459-465(1995)
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【非特許文献６７】Linsley et al, J. Exp. Med. 176(6):1595-1604(1992)
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【非特許文献７１】Lee et al, New Biol. 4(1):66-74(1992)
【非特許文献７２】Ellington and Szostak, Nature 346〔6287〕:818-822(1990)
【非特許文献７３】Chambers et al, Immunity 7(6):885-895(1997)
【非特許文献７４】Alegre et al, Nature Reviews Immunology 1:220-228(2001)
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【００１９】
【非特許文献７６】Hulwitz et al, Proc. Natul. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071(1998)
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【非特許文献８０】Nair et al, Nat. Med. 6(9):1011-1017(2000)
【非特許文献８１】Kim et al, Science 266(5193):2011-2015(1994)
【非特許文献８２】Shay and Bacchetti, Eur. J. Cancer 33(5):787-791(1997)
【非特許文献８３】Hicke et al, J. Clin. Invest. 106:923(2000)
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【非特許文献８５】Watson et al, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10:63(2000)
【非特許文献８６】Altman et al, Science 274:94-96(1996)
【非特許文献８７】Shchepinov et al, Nulceic Acids Res. 25:4447(1997)
【非特許文献８８】Beier and Hoheisel, Nucleic Acids Res. 27:1970(1999)）
【非特許文献８９】Ringquist et al, Cytometry 33:394(1998)
【非特許文献９０】Davis et al, Nucleic Acids Res.26:3915(1998)
【非特許文献９１】Crothers et al, Immunochemistry 9:341(1972)
【非特許文献９２】Kaufman et al, Cancer Res.52:4157(1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、アプタマーを用いて免疫機能を調節する方法及びかかる方法に用いるのに適したアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、たとえばＡｇ特異的免疫療法のための有用な補助手段となりうる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、一般的には、アプタマーを用いて免疫系を調節する方法に関する。より詳しくは、本発明は、ＣＴＬＡ−４機能を阻害する方法及びかかる方法に適したアプタマーに関する。
【００２２】
本発明の諸々の目的及び利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
図１はＳＥＬＥＸプロトコールの概念的図である。
【００２４】
図２はＣＴＬＡ−４の場合の正及び負のＳＥＬＥＸの概念的図である。ＲＮＡライブラリーをまずＣＤ２８とともにインキュベートし、このタンパク質に結合するＲＮＡ類を捨てる。この予備処理を通過したライブラリーをつぎにＣＴＬＡ−４とともにインキュベートし、それに結合するＲＮＡ類を選択し、増幅する。各回の選択ごとにこのプロセスを反復し、最終的にＣＴＬＡ−４とＣＤ２８とを区別する高親和性アプタマー類を単離する。
【００２５】
図３はヒト及びマウスＣＴＬＡ−４に対するＴＯＧＧＬＥ  ＳＥＬＥＸの概念的図である。＃１回では、ＲＮＡライブラリーをマウス及びヒトＣＴＬＡ−４双方とともにインキュベートし、いずれかのタンパク質に結合しうるＲＮＡリガンド類を単離し、増幅する。以後の「偶数」回の選択では、ライブラリーをヒトＣＴＬＡ−４とともにインキュベートし、「奇数」回では、マウスＣＴＬＡ−４とともにインキュベートして、両タンパク質に存在する保存領域に結合しうるアプタマー類を単離する。
【００２６】
図４及び図５はＣＴＬＡ−４結合性アプタマーのインビトロ機能分析結果を示す図である。図４は個々のＣＴＬＡ−４結合性アプタマーによるＣＴＬＡ−４機能の阻害結果を示す。９回目の選択後に残ったアプタマープールからの個々のアプタマーをクローン化し、配列決定した（Ｍ９−１、Ｍ９−２など）。選択されたプールのうちのいくつかの構成員は、括弧内に示したとおり、１回よりも多く提示された。クローン化されたアプタマーを、インビトロで、ＣＴＬＡ−４機能阻害について試験した。それらのアプタマーは、陽性対照として用いた抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ結合部位の推定モル濃度に相当する２００ｎＭ及び４００ｎＭの２つの濃度で使用した。ＣＴＬＡ−４機能の阻害は、イソタイプ対照Ａｂに比しての抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂの存在下でのＴ細胞増殖の増大として反映される。アプタマーＭ９−８、Ｍ９−９及びＭ９−１４は、用量応答的にＣＴＬＡ−４機能を阻害したが、Ｍ９−１５はしなかった。
【００２７】
図５はＭ９−９アプタマー及び３'末端からの除去欠失によって導かれた３５ｎｔ長の裁端短小化体Ｄｅｌ６０によるＣＴＬＡ−４機能の阻害効果（右図）及び提案されるＣＴＬＡ−４結合部位を示すＤｅｌ６０アプタマーのコンピュータシミュレーションによる二次構造を示す（左図）。
【００２８】
図６はＤｅｌ６０アプタマーによるインビトロでのＣＴＬＡ−４機能の阻害結果を示す図である。ＣＴＬＡ−４阻害についてのインビトロ機能検定は、図４に示したようにして行われた。未結合Ｄｅｌ６０アプタマー及びＤｅｌ６０／ｓｃｒａｍ対照アプタマー（Ｄｅｌ６０のスクランブル配列）。さらなる特異性試験では、Ｄｅｌ６０アプタマーを、表示どおり、ｍＣＴＬＡ−４／Ｆｃ又はヒトＩｇＧとともにプレインキュベートし、次に、プロテインＧを用いて、磁気ビーズに結合させて、Ｔ細胞増殖反応に用いた。
【００２９】
図７はＣＴＬＡ−４結合性Ｄｅｌ６０アプタマー処置マウスにおける腫瘍増殖阻害結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹に、ＰＢＳを注射するか、又はＢ１６／Ｆ１０．９黒色腫細胞を移植し、移植から１、３及び６日後に右側腹から、照射したＧＭ−ＣＳＦ発現性Ｂ１６／Ｆ１０．９腫瘍細胞によって免疫化した。腫瘍移植から３及び６日後に、表示どおりに抗体又はアプタマーを腹腔内投与した。各処置群で５匹のマウスを使用した。個々の（ドット）及び平均の（柱）腫瘍サイズが示されている。使用アプタマーは上記Ｄｅｌ６０であり、やはりインビトロでＣＴＬＡ−４機能を阻害したＭ９−１４（図４）から導かれた裁端アプタマーＤｅｌ５５及び他の選択実験で得られたインビトロアッセイでＣＴＬＡ−４を阻害しなかったＭ８Ｇ−２８アプタマーを使用した。
【００３０】
図８はＣＴＬＡ−４アプタマーによるＴＥＲＴ免疫療法の結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹に、ＰＢＳを注射するか、又はＢ１６／Ｆ１０．９黒色腫細胞を移植し、腫瘍細胞移植から２、９及び１６日後に、アクチン又はＴＥＲＴｍＲＮＡ導入ＤＣにより免疫化した。表示したとおりに、Ｄｅｌ６０  ＣＴＬＡ−４結合性アプタマー又は対照Ｄｅｌ６０／ＳＣＲＡＭを、各免疫化に続く３及び６日後に、ＴＥＲＴ免疫化マウスに投与した。各処置群に５匹のマウスを使用した。腫瘍移植から２１日後の個々の（ドット）及び平均の（柱）腫瘍サイズが示されている。
【００３１】
本発明は、一般的には、核酸リガンド、又はアプタマー、を用いて、免疫機能を調節する方法に関する。本発明に従えば、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＴＧＦβ受容体を包含する（ただし、これらに限定されるものではない）標的特異的アプタマーを使用して、免疫系を操作することができる。
【００３２】
好ましい一具体化態様にあっては、本発明は、癌免疫療法の一方法に関する。この方法に従えば、負のレギュレーター、たとえばＣＴＬＡ−４の作用を阻害するアプタマーを用いて、ワクチン誘発抗腫瘍免疫応答を増強することができる。前記アプタマーはＣＴＬＡ−４に結合するが、ＣＤ２８には結合しないことが有利である。
【００３３】
本発明で使用するのに適したアプタマーは、たとえば、ＳＥＬＥＸ法（たとえば、特許文献１〜８で引用されている他の同様の特許参照）を用いて単離することができる。正負の選択体系を用いることによって、非標的分子、たとえばＣＴＬＡ−４が意図する標的である場合のＣＤ２８、に対するアプタマーの結合の可能性を減じることができる。「Ｔｏｇｇｌｅ  ＳＥＬＥＸ」（非特許文献４３）を用いて、同一標的の種間同族体（たとえばヒトＣＴＬＡ−４とそれのマウスでの同族体）と交差反応するアプタマーを単離することができる。かかる交差反応性アプタマーは、たとえば、インビボ動物モデルにおけるアプタマーの機能及び毒性を評価するのに使用できる。
【００３４】
たとえばヒトＣＴＬＡ−４を標的とするアプタマーの単離に当っては、修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡライブラリーを用いて、たとえばヌクレアーゼ分解に抵抗性のアプタマーを得ることができる。アプタマーの血漿安定性は、リボヌクレオチドを、たとえば２'−アミノ、２'−フルオロ又は２'−Ｏ−アルキルヌクレオチドで置換することによって増大させることができる（非特許文献４４及び４５）。これらの置換基を含有する修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５〜１５時間の範囲内のインビトロ半減期をもち得る。
【００３５】
さらに、２'−アミノ又は２'−フルオロＣＴＰ及びＵＴＰはインビトロ転写によって容易にＲＮＡ中へ組入れることができるので、選択プロセスの最初に、これらのバックボーン修飾をコンビナトリアルライブラリーに導入することができる（非特許文献４６及び４７）。アプタマーの３'末端のキャッピングによって、それをエキソヌクレアーゼ分解から保護することができる（非特許文献４８）。エンドヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、リボース及びデオキシリボースヌクレオチドを、Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド又は種々の非ヌクレオチドリンカーなどの修飾ヌクレオチドでさらに置換することによって、さらに増大させることができる。アプタマーのクリアランス速度は、それの有効分子サイズを増大させることによって、たとえば種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分又はコレステロールなどの疎水性基の部位特異的付加あるいはリポソーム表面へのアプタマーの付着によって、合理的に変えることができる（非特許文献４９及び５０）。このように、本発明のアプタマーは、数分間ないし数日間のインビボ半減期をもつように調製することができる。（非特許文献５１〜５３及び特許文献８に記載されている修飾法も参照されたい）。
【００３６】
アビディティ（結合活性）及び生物活性も、アプタマーの多量体誘導体を生成させることによって増強できる（非特許文献５４）。
【００３７】
以下は、例示のために示すものである。固定された配列が隣接する約２０−４０ヌクレオチドのランダム配列領域を含むＲＮＡライブラリーは、たとえば、合成ＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって生成させることができる（非特許文献５５及び５６）。たとえばヒトＣＴＬＡ−４を認識するが、非標的分子、たとえばヒトＣＤ２８には結合しないＲＮＡアプタマーを同定、単離するためには、図２に記載されているもののごとき正負ＳＥＬＥＸプロセスを用いることができる。ランダム化ＲＮＡライブラリー（〜１０１５の異なる分子）をスクリーニングして、たとえばＣＴＬＡ−４／Ｆｃ融合タンパク質の形のヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に結合するＲＮＡを得ることができる。たとえばＣＤ２８にも結合するＲＮＡを削除するために、そのＲＮＡライブラリーを、たとえばヒトＣＤ２８／Ｆｃ融合タンパク質とともにプレインキュベートすることができる。ＣＤ２８タンパク質に結合するＲＮＡは、たとえば、ＣＤ２８／Ｆｃ融合タンパク質−ＲＮＡ複合体を、たとえばプロテインＧ被覆セファロースビーズによって沈殿させることによって、除去できる。
【００３８】
かかるプロセスは、たとえばプロテインＧ被覆ビーズ、Ｆｃ及びＣＤ２８に結合するプールからＲＮＡをあらかじめ除去するのにも役立ちうる。この予備処理を通過したＲＮＡプールは、次に、たとえばヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃ融合タンパク質とともにインキュベートし、このタンパク質に結合するＲＮＡを、たとえばプロテインＧビーズによる沈殿及びたとえばフェノール抽出による溶出によって回収できる。溶出されたＲＮＡは、つぎに逆転写することができ、生じたｃＤＮＡはＰＣＲ増幅してＤＮＡ鋳型を生成させることができ、これらの鋳型は、インビトロ転写によって、次回の選択のためのＲＮＡを産生することができる。
【００３９】
かかる選択を約８−１４回用いて、高い親和性及び特異性でヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃ融合タンパク質に結合するＲＮＡ分子を生じさせることができる。これらのＲＮＡ分子の配列及びそれらのヒトＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８及びヒトＦｃに対する親和性は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ又はニトロセルロースフィルター結合法（非特許文献５７）によって求めることができる。
【００４０】
ＲＮＡアプタマー−タンパク質平衡解離定数（Ｋｄ）は、たとえば二重フィルター、ニトロセルロースフィルター結合法（非特許文献５８及び５９）を用いて求めることができる。簡潔に、かつ例示のためのみに言えば、３２Ｐ−末端標識ＲＮＡアプタマー（<０．１ｎＭ）をある濃度範囲の個々のタンパク質とともにインキュベートすることができる。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、たとえば混合物をニトロセルロースフィルターに通すことによって、遊離ＲＮＡから分離できる。結合及び遊離ＲＮＡは、たとえばりん光発光分析によって定量でき、それらのデータは、ＲＮＡアプタマー−タンパク質相互作用についてのＫｄを求めるのに適している。高ピコモル〜低ナノモルの範囲内のＫｄで標的（たとえばヒトＣＴＬＡ−４）に結合するが、非標的分子（たとえばヒトＣＤ２８又はＦｃ）には、もとのＲＮＡライブラリーがそれらの分子に結合するよりも強固には結合しないアプタマーを単離するのが有利である。
【００４１】
上で示したように、「toggle  ＳＥＬＥＸ」は、標的、たとえばＣＴＬＡ−４の種間同族体（たとえばヒトとマウス）上の保存エピトープを認識するアプタマーを同定するのに利用できる（非特許文献６０）。かかる交差反応性アプタマーを単離するためには、たとえば、図３に示したように、ヒト及びマウスＣＴＬＡ−４／Ｆｃタンパク質を用いて交互に選択を行うことができる。１回目のインビトロ選択では、出発ＲＮＡライブラリーを、たとえば、ヒト及びマウスの両ＣＴＬＡ−４／Ｆｃとともにインキュベートすることができる。
【００４２】
いずれかのタンパク質に結合するＲＮＡを、たとえば、プロテインＧビーズによる沈殿によって回収し、次回の選択のために増幅することができる。２回目の選択では、濃縮されたライブラリーを、たとえば、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃのみとともにインキュベートし、結合したＲＮＡを回収して、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃの表面に結合する構成員がさらに濃縮されたＲＮＡライブラリーを製出することができる。３回目の選択では、このヒトＣＴＬＡ−４富化ライブラリーをマウスＣＴＬＡ−４／Ｆｃとともにインキュベートして、前記マウスタンパク質に結合するＲＮＡのサブセット（亜集団）を回収することができる。前記マウスタンパク質に結合しないＲＮＡは廃棄することができる。
【００４３】
この例では、生じたＲＮＡライブラリーでは、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質とマウスのそれとの間に保存されている構造モチーフに結合するＲＮＡが濃縮されている。およそ８−１４回のtoggle  ＳＥＬＥＸによって、ヒト及びマウスの両ＣＬＴＡ−４タンパク質に結合するＲＮＡアプタマーが得られると期待できる。toggle  ＳＥＬＥＸの過程の間に、正負の選択を上述のようにして実施できる。このアプローチを用いて、低ナノモル〜高ピコモルの範囲内のＫｄでヒト及びマウスＣＴＬＡ−４の双方に結合するが、もとのＲＮＡライブラリーよりも緊密にヒト及びマウスＣＤ２８と結合することはないアプタマーを単離することができる。上記のアプローチを他の標的タンパク質にも適用可能なことは了解されるであろう。
【００４４】
その後の栽端研究は、標的、たとえばＣＴＬＡ−４に結合する、長さがたとえば約５０ヌクレオチド未満のアプタマーを同定するのに利用できる。変異誘発研究を利用して、標的（たとえばＣＴＬＡ−４）に結合しないが、野生型アプタマーに配列がきわめて近似している対照アプタマーを生じさせることができる。かかる変異アプタマーは、インビトロ及びインビボ研究における陰性対照として役立ちうる。
【００４５】
裁端及び変異誘発研究は、標準的手法を用いて実施できる。しかしながら、例示目的のために、以下を記述する。裁端及び変異体アプタマーを生じさせるには、上記のもののようなアプローチを用いて単離したアプタマーを、たとえば、以前に記載されているように（非特許文献６１）、ＲＮＡ配列アラインメント（非特許文献６２）及び先に述べたＲＮＡフォールディングアルゴリズム（非特許文献５９）を利用して、ファミリーに分類することができる。分類ができると、共変動分析を採用して、各ファミリーにおいてアプタマーがどのように折りたたまれるかの最初の二次構造モデルを創り出すことができる。
【００４６】
このモデルを、アプタマーの折りたたみを妨害すると予想できる特異的突然変異ならびにその構造を回復させると期待できる補償突然変異を生じさせることによって、検定することができる。さらに、その作業モデルにおいて折りたたみに重要ではないアプタマー領域を欠失させて、これらのアプタマー変異体のすべての標的（たとえばＣＴＬＡ−４）との結合能力を上記のようにして評価することができる。さらに、あるアプタマーファミリー内で高度に保存されている配列中での１つ又はごく少数のみの変異を含むアプタマー誘導体を生成させ、試験して、標的へのアプタマーの結合にとって重要なヌクレオチドを同定することができる。
【００４７】
上記のものなどのアプローチを用いて選択したアプタマーを、標的との結合についてのそれらの既知リガンドとの競合能力に基づいてさらに選択することができる。ＣＴＬＡ−４の場合には、たとえばＢ７との競合能力に基づいてアプタマーを選抜することができる（非特許文献６３及び６４）。簡単に、ただし単に例として、説明すると、痕跡量の３２Ｐ標識アプタマーを、ＣＴＬＡ−４と、アプタマーの約半分が前記タンパク質と結合するのを可能ならしめる条件下で、インキュベートすることができる。
【００４８】
さらに、Ｂ７−１タンパク質を増量しながら添加して、ＣＴＬＡ−４との結合についてＢ７が当前記アプタマーと競合するかどうかを明らかにすることができる。結合反応混合物は、次に、ニトロセルロース／ナイロンの２フィルター系を通過させて、ＣＴＬＡ−４に結合したアプタマーを未結合アプタマーから分離することができる。フィルター上の放射能は、たとえばりん光発光分析を用いて定量することができ、データは、Ｂ７との競合についてのｋｉを求めるのに使用できる。
【００４９】
上記のものなどのアプローチを用いて選択したアプタマーは、インビトロアッセイ法を用いて活性を試験することができる。たとえば、マウス及び／又はヒトＣＴＬＡ−４との結合のために選択したアプタマーは、インビトロでＣＴＬＡ−４の機能を阻害するそれらの能力について試験できる。ＣＴＬＡ−４機能の阻害は、たとえば、インビトロ増殖アッセイで測定できる。読み出された情報は、たとえば、α−ＣＴＬＡ−４（非特許文献６５及び６６）やＣＴＬＡ−４結合性アプタマー（図４及び５）などのＣＴＬＡ−４阻害剤の存在下のα−ＣＤ３及びα−ＣＤ２８による最適以下の多クローン性活性化の条件下でのＴ細胞増殖の増強であり得る。
【００５０】
ＣＴＬＡ−４の阻害によるＴ細胞増殖増強は、最適以下の条件下で検出できるので、ヒトＴ細胞の増強された増殖を検出するのに必要なヒトα−ＣＤ３及びα−ＣＤ２８ならびにα−ＣＴＬＡ−４の濃度は、実験的に求めることができる。インキュベーション時間を求めるには、当前記細胞を、たとえば、採集に先立ち１４〜１８時間の間３Ｈ−チミジンで短時間標識して、ある時間経過の間に採集することができる。マウスＴ細胞と同様に、ｈＣＴＬＡ−４発現は２〜３日後にピークに達するが、ヒトＴ細胞上では、少なくとも５日間は発現が高度のままであり、延長されたインキュベーション時間が有利になる可能性がある（非特許文献６７及び６８）。
【００５１】
マウスでは、α−ＣＴＬＡ−４介在性増殖増強は、休止Ｔ細胞上では検出できないＣＴＬＡ−４発現の上方制御（アップレギュレーション）によって生起する。しかし、ヒトＴ細胞は検出可能なＣＴＬＡ−４発現を有しており、これは活性化されるとき上方制御される（非特許文献６８及び６９）。これを説明するためには、培養中のさまざまな時点でα−ＣＴＬＡ−４を添加すればよい。各条件についての反復実験を用いて、分裂細胞の割合の培養ごとの変動を推定し、極小化することができる。
【００５２】
ヒトＣＴＬＡ−４発現を上方制御する他の方法は、ヒトＴ細胞に対して用量依存的に機能するＩＬ−２とともにインキュベートすることである（非特許文献６８）。ＩＬ−２の濃度及びインキュベーション時間は、実験的に検定して、α−ＣＴＬＡ−４抗体による増殖増強の条件を求めることができる。ＩＬ−２の存在がＴ細胞増殖に対するα−ＣＴＬＡ−４の影響を減少させるならば、α−ＣＴＬＡ−４の添加に先立って、培養を洗って、このサイトカインを除去することができる。
【００５３】
アプタマー（たとえばＣＴＬＡ−４を標的とするアプタマー）の段階希釈液を、ＣＴＬＡ−４の場合にはα−ＣＴＬＡ−４抗体（たとえば）の最適濃度の場合と同等数の結合部位を与える濃度より上及び下の濃度範囲にわたって試験することができる。Ｔ細胞増殖の増強がＣＴＬＡ−４機能の阻害によるものであることを確認するために、２種類の対照を使用することができる：
ａ）対照オリゴヌクレオチド（ＯＤＤ）であって、ＣＴＬＡ−４に結合しない類似の塩基組成をもつもの（スクランブルＯＤＮ）を陰性対照として使用でき、
ｂ）アプタマー候補を、たとえばｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃ又は対照Ｉｇとともにプレインキュベートして、Ｔ細胞培養への添加に先立って前記アプタマーを除去することができる。これは図６に示したとおりである。
【００５４】
増強がＦｃ：アプタマー相互作用よりもＣＴＬＡ−４：アプタマー相互作用によるものであれば、ＣＴＬＡ−４介在性増殖増強は、マウスアプタマーの場合に見られたように、ｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃで予備除去するとなくなるが、対照Ｉｇではそうならない（図６）。たとえばα−ＣＴＬＡ−４と同等以下の濃度で同等レベルまで増殖を一貫して増強するアプタマーが、さらに試験するための好ましい候補である。最低濃度でＣＴＬＡ−４を阻害するアプタマーは、さらに裁端して、ＣＴＬＡ−４結合及びＣＴＬＡ−４機能阻害について再試験することができる。
【００５５】
Ｂ１６／Ｆ１０．９黒色腫モデルを用いて、アプタマー及びそれらの誘導体の毒性を評価し、雌性Ｃ５７ＢＬ／マウスでの腫瘍増殖を阻止又は遅延させるアプタマーの能力を試験することができる（非特許文献７０）（図６及び７参照）。マウスは、ＴＥＲＴｍＲＮＡ導入ＤＣにより免疫化して、アプタマーの抗腫瘍免疫性増強能を、たとえば図８に記載したようにして、求めることができる。この治療モデルのストリンジェンシーは、移植腫瘍細胞の用量あるいは腫瘍細胞移植と免疫療法／アプタマー投与開始との間隔によって調節することができる。これにより、ますます有効なアプタマー及びそれらの誘導体を評価することが可能になる。
【００５６】
強力な抗腫瘍応答を示す選択されたアプタマーによって処置されたマウスは、自己免疫徴候について調べることができる。制御不全となったリンパ球増殖についてスクリーニングを行うために、免疫化マウスを定期的に屠殺して、詳細な病理学的検討及び血液免疫組織化学的検討に付すことができる。
【００５７】
本発明のアプタマーを含有する医薬として有用な組成物は、医薬として許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤を用いて、当業界で認められている手法により処方することができる。かかる担体及び処方の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences"（レミントンの薬学）中に見出すことができる。アプタマーは、たとえば液剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤又はスプレー剤として処方できる。アプタマーは、丸剤、カプセル剤、錠剤又は坐剤などの投与単位剤形中に存在することができる。それが適当な場合には、それらの組成物を滅菌することができる。それらの組成物は、本発明のアプタマーを１種より多く含有していてもよい。
【００５８】
本発明のアプタマー又はそれを含有する組成物の投与方法は、当前記アプタマー、患者及び求める効果に応じて異なりうる。かかる投与法の例としては、非経口的、静脈内、皮内、脊髄内、筋肉内、皮下、局所、経皮パッチ、直腸、膣又は尿道座剤による、腹腔内、経皮、鼻内噴霧、外科的埋入、外科的体内塗布、注入ポンプ又はカテーテル経由が挙げられる。前記アプタマー又はそれを含有する組成物は、植込剤、大型丸剤、微粒子、小球体、ナノ粒子又はナノ球体などの徐放性処方で投与することができる。製剤処方の標準的情報については、Ansel et al, "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System"（医薬品剤形と薬物送達システム）、第６版、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（１９９５）を参照されたい。
【００５９】
本発明のアプタマーは、剤形に適合した方法で、治療上の有効量を投与することができる。投与すべき量は、前記アプタマー、処置すべき対象、前記対象の身体の有効成分利用能力及び所望する治療効果の度合いに応じて異なりうる。投与を要するアプタマーの最適量は、当業者ならば容易に決定することができる。一般に、当前記組成物は、体重に合わせた用量で、たとえば体重１ｋｇ当り約１μｇから体重１ｋｇ当り約１００ｍｇまで、好ましくは体重１ｋｇ当り１ｍｇから体重１ｋｇ当り５０ｍｇまでの用量で、投与することができる。
【００６０】
本発明のアプタマー、とりわけＣＴＬＡ−４を標的とするアプタマーは、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の双方においてワクチンにより惹起された抗腫瘍反応を増強するためのＡｇ特異的免疫療法への有用な補助手段となる。
【００６１】
本発明のいくつかの側面を、以下の非限定的な実施例において、より詳細に記述することができる。
【実施例１】
【００６２】
ＣＴＬＡ−４の機能を阻害するヌクレアーゼ抵抗性ＲＮＡアプタマーの単離を、ＣＬＴＡ−４結合アプタマー単離のためのＳＥＬＥＸプロトコール（非特許文献７１及び７２）を用いて実行した。簡単に言えば、>１０１４のユニークＲＮＡ分子からなるライブラリーを生ぜしめた。このとき、各分子は、選択したＲＮＡ種をその後の諸ラウンドでの選択のための増幅のために使用する定常配列に隣接する４０ｎｔ長のランダム領域からなる。ＲＮアーゼ抵抗性を増すために、２'−フルオロ修飾ピリミジン類を、転写の間に分子内へ組み込んだ。そのＲＮＡライブラリーをマウスＣＴＬＡ−４／ヒトＦｃ融合タンパク質（ｍＣＴＬＡ−４／Ｆｃ）とともにインキュベートし、結合したＲＮＡをニトロセルロースフィルター結合によって未結合ＲＮＡから分割し、次回の選択に付した。
【００６３】
２回ごとの選択ののち、フィルター結合アッセイを用いてＲＮＡのｍＣＴＬＡ−４／Ｆｃに対する親和性をチェックして、選択の進行をモニターした。親和性の増大は選択が進行していることを示す。ＣＤ２８及びヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）結合親和性を時々測定して、特異性を追跡した。選択を９ラウンド実施した。その時点でそれ以上の親和性増大は認められなかった。そのＣＴＬＡ−４結合性アプタマープールは、それら２種の分子の間のかなりの相同性（非特許文献７３〜７５）にもかかわらず、ＣＤ２８への結合を示さなかった。
【００６４】
第９ラウンドからの増幅生成物のクローニング及び配列決定により、配列の多様性が限られていることが明らかとなり、８種のユニーク配列が複数回再提示され（図４）、選択がほぼ終点にあることが示された。各配列を代表する構成員を、インビトロアッセイでＣＴＬＡ−４阻害について試験した。このアッセイでは、以前に記載されているとおりに（非特許文献６５及び６６）、精製Ｔ細胞を、前述の条件で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８Ａｂとともにインキュベートして、刺激し、増殖させる。Ｔ細胞増殖を抑制するＣＴＬＡ−４の機能に一致して、抗ＣＴＬＡ−４Ａｂとのインキュベーションは、Ｔ細胞増殖増強をきたしたが、イソタイプ対照Ａｂとのそれではそうはならなかった。数種のＲＮＡ種が、抗ＣＴＬＡ−４抗体と同等以上にＣＴＬＡ−４機能を阻害した（図４：Ｍ９−８、Ｍ９−９及びＭ９−１４）。その一方、他のＲＮＡ種は、それらがＣＴＬＡ−４に結合したという事実にもかかわらず、ＣＴＬＡ−４を阻害しなかった。
【００６５】
アプタマーＭ９−９を、それが図４に示されているように一貫してもっとも強力なＣＴＬＡ−４阻害剤であることに基づいて、さらなる研究のために選択した。ＣＴＬＡ−４結合性アプタマーのインビボ検討を容易にするために、Ｍ９−９アプタマーの欠失誘導体を生成させ、ＣＴＬＡ−４結合性及びインビトロでのＣＴＬＡ−４−４機能阻害能について試験した。ｍＣＴＬＡ−４／Ｆｃに結合し、ＣＴＬＡ−４機能を阻害した最小の機能性Ｍ９−９アプタマーは、Ｄｅｌ  ６０と名付けた３５ｎｔ長の裁端体であった（図５）。Ｄｅｌ  ６０のコンピュータシミュレーションによって得られた二次構造は、ステムループ構造がＣＴＬＡ−４に対する結合部位を構成していることを示唆している（図５）。
【００６６】
Ｄｅｌ  ６０アプタマーによるＣＴＬＡ−４機能の阻害の特異性を、図６に示す。まず、Ｄｅｌ  ６０は、制限条件下でＴ細胞増殖を増強するが、対照アプタマーはそれをしない。第二に、Ｔ細胞培養への添加に先立って、Ｄｅｌ  ６０アプタマーをｍＣＴＬＡ−４／Ｆｃとプレインキュベートすると、アプタマーの増強作用がなくなったが、ｈｕＩｇＧとではなくならず、Ｄｅｌ  ６０は、ｍＣＴＬＡ−４／ＦｃのＦｃ部分にではなく、ＣＴＬＡ−４に結合することによって、その作用を伝達することが示された。
【００６７】
マウスでの研究によって、抗体介在性ＣＴＬＡ−４阻害を、いずれの処置も単独では有効ではないような条件下で、ワクチン接種と併用すれば、腫瘍の拒絶を達成できることが示されている（非特許文献７６〜７８）。腫瘍増殖に対するＣＴＬＡ−４結合性アプタマーの影響能は、最初、以前の研究（非特許文献７６〜７８）で用いられた免疫原性の弱いＢ１６／Ｆ１０．９黒色腫モデル（非特許文献７９）で試験した。
【００６８】
図７に示した実験では、マウスにＢ１６／Ｆ１０．９腫瘍細胞を移植し、移植から１、３及び６日後に、模擬としてＰＢＳにより免疫化し、あるいは、照射したＧＭ−ＣＳＦ分泌性Ｂ１６／Ｆ１０．９（Ｆ１０．９−ＧＭ）腫瘍細胞により免疫化した。腫瘍移植から３及び６日後に、Ｆ１０．９−ＧＭ免疫化群には抗体又はアプタマーをｉ．ｐ．注射した。模擬免疫化ＰＢＳ群にはその注射は行わなかった。この実験では、照射Ｆ１０．９−ＧＭ細胞による免疫化は腫瘍細胞に対して認めうるほどの作用を示さなかった（Ｆ１０．９−ＧＭ細胞ワクチンを与えなかったＰＢＳ群を、イソタイプ対照Ａｂで処置した免疫化群と比較されたい）。照射ＧＭ−ＣＳＦ分泌性Ｂ１６／Ｆ１０．９でマウスを免疫化することにより誘発される弱い免疫反応は、測定できるほどに腫瘍増殖に影響するには充分でなかったと考えられる。
【００６９】
先に報告されているように、抗ＣＴＬＡ−４Ａｂで処置した免疫化マウスは、腫瘍増殖の有意な遅延を示したが、イソタイプ対照Ａｂではそうではなかった（van Elsas,1999 #23;Hurwitz,1998 #21;Hurwitz,2000 #22）。インビトロでＣＴＬＡ−４機能を阻害した２種のアプタマー、Ｄｅｌ  ６０及びやはりインビトロでＣＴＬＡ−４機能を阻害するＭ９−１４の裁端体であるＭ９−１４Ｄｅｌ  ５５は、抗ＣＴＬＡ−４Ａｂ処置マウスで見られるのに匹敵する程度まで腫瘍増殖を阻害したが、インビトロでＣＴＬＡ−４に結合するがＣＬＴＡ−４機能を阻害しないＭ８Ｇ−２８は阻害しなかった。それゆえ、この実験は、ＣＴＬＡ−４結合性アプタマーはインビボで生物活性をもつということを証明するものである。
【００７０】
先に、マウステロメラーゼのタンパク質サブユニット、テロメラーゼ逆トランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ）に対して、ＴＥＲＴｍＲＮＡ導入同系骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を用いて、マウスを免疫化すると、予防的抗腫瘍免疫が生じることが示されている（非特許文献８０）。ＴＥＲＴに対する免疫療法の魅力ある特徴は、それがほとんど（>８０％）の腫瘍で過剰発現されること（非特許文献８１及び８２）であり、それゆえ、免疫療法の共通の標的の実例となることである。さらに、驚くほどのことではないが、ＴＥＲＴは正常な遺伝子産物であるから、それは弱い抗原であり、すなわちＴＥＲＴに対する免疫化により刺激された抗腫瘍反応は弱かった（非特許文献８０）。
【００７１】
免疫化の治療効果を増強するためには、腫瘍により発現される追加の抗原を標的にすること及び／又は抗ＴＥＲＴ免疫化を他の処置と組合せることが有用であろうと推測された。ここで、ＣＴＬＡ−４結合性アプタマーによるマウスの処置がＴＥＲＴに対する免疫化の治療上の有用性を増強するかどうかを試験した。図８に示したように、ＴＥＲＴｍＲＮＡ導入ＤＣによる担がん動物の処置は、きわめて弱い腫瘍抑制効果を示し、以前の観察（非特許文献８０と一致していた。しかし、インビトロでやはりＣＴＬＡ−４機能を阻害することが示された（図６及び７）ＣＴＬＡ−４結合性アプタマー（Ｄｅｌ  ６０）によってもマウスを処置するときには、腫瘍抑制が有意に増強された。しかし、非機能性非ＣＴＬＡ−４結合性対照アプタマー（Ｄｅｌ  ６０／ＳＣＲＡＭ）で処置した場合には、増強はなかった。この観察は、ＳＥＬＥＸ法によって単離されたＣＴＬＡ−４結合性アプタマーが生物活性を示すという結論を支持する追加の証拠を提供するものである。
【実施例２】
【００７２】
ヒトＣＴＬＡ−４に結合し、これに拮抗するアプタマーを、それらをインビボ安定性、循環血中半減期及びヒトＣＴＬＡ−４に対するアビディティが増大するように修飾することによって、阻害剤としての活性を最適化することができる。いずれの場合にも、アプタマーは、合成後の化学的方法によって修飾できて、所望の性質をもつ誘導体を生じることのできる合成化合物であるという事実を利用できる。
【００７３】
安定性の増強。  ２'−フルオロピリミジン含有ＣＴＬＡ−４アプタマーをインビボでのヌクレアーゼ分解に対してより抵抗性を与えるために、それらをできるだけ多くの２'−ヒドロキシ（２'ＯＨ）プリンを（機能分析によるＣＴＬＡ−４結合親和性確保における有意の損失なしに）糖部分に２'−Ｏ−メチル（２'Ｏｍｅ）を含む修飾プリンヌクレオチドによって置換することにより、さらに修飾することができる。かかる置換基は、先に、インビボでのアプタマーのヌクレアーゼに対する安定性を一層増強することが示されている（総説については、非特許文献８３参照）。
【００７４】
残念ながら、２'Ｏｍｅプリン類は、インビトロ転写の間にＴ７ＲＮＡポリメラーゼがそれらをあまりよく利用しないため、ＳＥＬＥＸの間にＲＮＡ中に組み込むことが困難である。すなわち、かかる修飾は、同定、裁端及び有効性確認ののち、ＣＴＬＡ−４アプタマーに組み込むことができる。２'−Ｏｍｅ含有オリゴヌクレオチドの合成は、現在では標準的実務であり、かかる化合物が商業的に入手可能である。２'ＯＨプリンの多数を２'Ｏｍｅで置換して、インビボでのヌクレアーゼ分解に対して高度に抵抗性の修飾されたＣＴＬＡ−４特異性アプタマーを生成させうると思われる（非特許文献８３）。
【００７５】
ＣＴＬＡ−４結合性を失うことなくどのプリンを置換できるかを知るために、アプタマーの二次構造の作業モデルを利用できる。まず、アプタマーを構造ドメイン（たとえば種々のステム及びループ）に分割することができる。次に、各ドメインについて２'Ｏｍｅを含むように修飾された所与のドメインに各プリン残基を含むアプタマー誘導体を合成することができる。次に、これらの修飾アプタマーを結合性研究で試験して、かかる置換がアプタマー−ＣＴＬＡ−４結合に影響するかどうかを知ることができる。ある特定のドメイン（単数又は複数）が全２'Ｏｍｅ置換を許容しない（結合の大きい低下に至る）ならば、そのドメイン内のどのヌクレオチド（単数又は複数）を２'Ｏｍｅ置換できないかを、単一２'Ｏｍｅ置換誘導体類の生成及び検討によって知ることができる。このようにして、２'Ｏｍｅで修飾可能なプリン及びそれができないものを容易に同定できる。最後に、許容される極大数の２'Ｏｍｅを含むＣＴＬＡ−４アプタマーを生成させて、生化学的、細胞及びインビボでの研究で試験することができる。
【００７６】
生体利用率の増強。アプタマーのインビボでの生体利用率を増強するために、アプタマーの末端へのコレステロール部分又は４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加が、動物試験においてこれらの分子の循環血中半減期を有意に向上させうることが示されている（非特許文献８４及び８５）。かかる合成後修飾なしのアプタマーは、腎臓によって速やかに取り除かれるために、それらの循環血中半減期は１０分間の範囲内である（非特許文献８４及び８５）。これに対し、コレステロール又はＰＥＧを含有するアプタマーは、ＩＶ投与後４−１２時間の範囲内の半減期で循環する（非特許文献８４及び８５）。
【００７７】
これらの化合物の循環血中半減期の増大は、アプタマーがＣＴＬＡ−４に結合する機会を拡げることによりインビボでの改善されたアプタマー効率をもたらすことができる。ＣＴＬＡ−４アプタマーのインビボ循環半減期を増大させるために、コレステロール又は４０ｋＤａのＰＥＧ部分をアプタマーに付加することができる。これらの部分は、６炭素原子のリンカーを介してアプタマーの５'末端に付加させることができる。生じたアプタマー誘導体は、ＣＴＬＡ−４に結合し、その機能を阻害するそれらの能力を検定することができる。このようにして凝固因子ＩＸａに特異的なアプタマーにコレステロール及びＰＥＧ部分を付加しても、ＩＸａ因子に結合して、その活性を阻害するアプタマーの能力に有意の影響を与えないことが証明されている。
【００７８】
このアプタマー（Ｒｅｇ１）へのコレステロールの付加は、ブタへの静脈内投与後に前記アプタマーの循環血中半減期を有意に増大させた。未修飾アプタマーの循環血中半減期はおよそ１０分間であるが、コレステロール修飾アプタマーは３時間より長い半減期で循環する。ＰＥＧ修飾アプタマーはＩＶ投与後に１２時間の範囲内の半減期で循環しうることが証明されている（非特許文献８４及び８５）。コレステロール又は４０ｋＤａＰＥＧの付加がアプタマーのＣＴＬＡ−４への結合を有意に減少させるならば、アプタマーの３'末端へのコレステロール及びＰＥＧの付加と同様にして、他の長さのリンカーをアプタマーへの付加について検討することができる。かかる３'末端付加のための化学は、５'末端付加ほどには発展しておらず、したがって、５'末端の修飾が好ましい。最後に、コレステロール又はＰＥＧの付加を許容するＣＴＬＡ−４アプタマー誘導体を、細胞を基礎とした活性アッセイ及びインビボの活性アッセイでスクリーニングすることができる。
【００７９】
四量体の多量体を生成させて、それらのＣＴＬＡ−４に対するアビディティ及びインビボ生物活性を増強することができる（非特許文献８６）。例として、以下に３つのカテゴリーを記述する：
【００８０】
ｉ）二価アプタマー合成。
RingquistとParma（Cytochemistry 33:394(1998)）は、分岐３'−３'結合ＣＰＧ支持体（Glen Research,Sterling,バージニア州）から開始する固相ホスホロアミダイトカップリング化学を用いたＬ−セレクチンに対する二価版のアプタマーの合成を記載している。この方法を用いて、アプタマー単位の３'末端が対称性リンカーによって連結された二価版のアプタマーを生成させることができる。この方法によって、さまざまの原子長のスペーサー（たとえば、３、６、９又は１８原子スペーサー）をＣＰＧとアプタマーの３'残基との間に標準的ホスホロアミダイトリンカー及びカップリング化学を用いて組み込むことにより前記スペーサーを含ませることによって、アプタマーユニット間の距離を容易に変えることができる。この方法は有効性が確認されており、二価アプタマーの制御された生成を可能ならしめることができる。この方法の限界は、３'連結二価アプタマーのみを合成できるだけであり、全収率がカップリング工程の数のゆえに低いかもしれないということである。
【００８１】
ii）三価及び四価アプタマー合成。
デンドリマーホスホロアミダイト（非特許文献８７）（Glen Research,Sterling,ＶＡ）を用いて、三価及び四価形態を生成させることができる。デンドリマーホスホロアミダイトシントンは、本質的には、このシントンのオリゴヌクレオチドへの付加が、使用したシントンに応じて、追加的オリゴヌクレオチド合成又は付加のための２−３部位を製出するから、単量体オリゴヌクレオチドの結合価を増大させるのに使用できるビルディングブロックである。この合成戦略は、多価ＰＣＲプライマー、ハイブリダイゼーションプローブなどの作成に使用されており（非特許文献８７）及びその中の参照）、容易に多価アプタマーの合成に転用できる。簡単に述べれば、現在行われているように逆向きデオキシチミジンＣＰＧから合成したアプタマーを、対称性の二倍性又は三倍性デンドリマーホスホロアミダイトの５'残基に結合させて、アプタマー付加のためのそれぞれ２又は３箇所の追加の部位を製出させることができる。次に、デンドリマーからのアプタマーの段階的合成によって追加のユニットを付加させて、使用したデンドリマーに応じてそれぞれ三価又は四価のアプタマーを製出させる。
【００８２】
別法として、ｄＡ−５'−ＣＥホスホロアミダイトを前記デンドリマーに結合させ、次に、この部位への先に合成したアプタマーユニット（それの５'ＤＭＴをなお含有している）の５'末端の５'−５'結合を介してのカップリングによって前記デンドリマーに追加のユニットを付加させて、それぞれの５'末端で結合された三価又は四価アプタマーを製出することができる。この後者の戦略には、完全合成アプタマーをデンドリマーに付加させるという利点があり、それゆえ、より純度の高い製品をより高い収率で得ることができる。上述のとおり、個々のアプタマーユニットの間の間隔は、アプタマーユニットとデンドリマーの付加部位との間に種々原子数のスペーサーを介在させることによって調整できる。これらのスキームのうちでは、後者がより純粋な製品をより高い収率で生じるように思われる。精製した全長アプタマーを用いて、最終の多価生成物を組み立てるからである。
【００８３】
iii）二ないし五価アプタマー合成。
非特許文献８８は、多価核酸プローブの生成のための屈曲可能なポリアミンリンカーの合成を記載している。本質的には、この化学を用い、制御されたやり方で、オリゴヌクレオチド用の２ないしＮ箇所の付加部位（所定のリンカー間隔で隔てられた）を含む屈曲可能なリンカー系を、単純な連結化学によって製出することができる。このアプローチを用いて、二ないし五価形態を生成させることができる。簡単に述べれば、２、３、４又は５つの第一級アミン付加部位をもつリンカーを、記述されているようにして（非特許文献８８）合成できる。次に、このリンカーに、先に合成したアプタマーの５'ヒドロキシルをリンカーのアミノ基にジスクシンイミジルカーボネート又はジスクシンイミジルオキサレートを活性化剤として用いて結合させることによって、アプタマーユニットを付加することができる。上記の方法によるのと同様に、この場合にはリンカー上のアミノ基間の間隔を増すか、又は、合成の間にアプタマーの５'末端にさまざまな長さのスペーサーを付加させることによって、アプタマーユニット間の間隔を変えることができる。生じたアプタマーは、それらの５'末端で連結させることができる。ここでも、最終の多価生成物の組立てに全長アプタマーを使用するので、この方法は、純度の高い最終製品を生じることができる。
【００８４】
多価アプタマーの特性決定。
多価アプタマー誘導体の合成に用いた方法とは関係なく、アプタマーユニットの数及びこれらのユニットによって生じた親和性の変化を決定することが、予備的研究で見られたように、多価アプタマーの増強された能力の原因となる基礎機構の理解にとって重要な意味をもち得る。アプタマー形態の価数は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析法によりそのアプタマー形態の分子量を測定することによって容易に確認でき、これは、トランスジェノミック（Transgenomic）での標準的品質管理工程である。多価形態の親和性は、フローサイトメトリーによって決定することができ、蛍光標識版のアプタマー及びビーズ固定ＣＴＬＡ−４を用いることができる（非特許文献８９及び９０）。
【００８５】
このアッセイフォーマットは、滴定及び競合による解離定数の測定ならびに種々のアプタマー形態の会合速度及び解離速度の測定を可能にする。価数の増加は、ビーズ固定化（及び細胞表面）ＣＴＬＡ−４へのアプタマーの親和性の増大ならびに滞留時間の延長に導くことができる。多価アプタマー形態の各アプタマーユニットの活性は、直接には求められないが、リガンド親和性の期待される増大をリガンド価数の関数として予測できる強力な理論的基礎がある（非特許文献９１及び９２）。ビーズ固定化ＣＴＬＡ−４に対するこれらの形態の測定された親和性をリガンド価数に基づく親和性の予期される増大と比較すると、アプタマーユニットのいくつが実質的なＣＴＬＡ−４結合活性を維持しているかを推定することが可能となり、それを用いて、どの形態をインビトロ及びインビボの活性アッセイでさらに試験すべきかを決定することができる。
【００８６】
上で引用したすべての文献の全体を引用によりここに挿入するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＳＥＬＥＸプロトコールの概念図である。
【図２】ＣＴＬＡ−４の場合の正及び負のＳＥＬＥＸの概念図である。
【図３】ヒト及びマウスＣＴＬＡ−４に対するＴＯＧＧＬＥ  ＳＥＬＥＸの概念的図である。
【図４】個々のＣＴＬＡ−４結合性アプタマーによるＣＴＬＡ−４機能の阻害結果を示す図である。
【図５】Ｍ９−９アプタマー及び３'末端からの除去欠失によって導かれた３５ｎｔ長の裁端短小化体Ｄｅｌ６０によるＣＴＬＡ−４機能の阻害結果（右図）及び提案されるＣＴＬＡ−４結合部位を示すＤｅｌ６０アプタマーのコンピュータシミュレーションによる二次構造を示す（左図）図である。
【図６】Ｄｅｌ６０アプタマーによるインビトロでのＣＴＬＡ−４機能の阻害を示す図である。
【図７】ＣＴＬＡ−４結合性Ｄｅｌ６０アプタマー処置マウスにおける腫瘍増殖阻害を示す図である。
【図８】ＣＴＬＡ−４アプタマーによるＴＥＲＴ免疫療法の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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