(57)【要約】造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞を拡大するエクスビボ方法、それにより得られた造血幹細胞の拡大された集団及びそれらの用途が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項３】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項５】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項４記載の方法。
【請求項６】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項８】
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＣＤ３８の発現および／または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
【請求項９】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項１、２、４および７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項１、２、４および７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性の減少のためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１、２、４および７のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤がＣＤ３８発現を下方制御する薬剤である請求項８記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、およびビタミンＤ受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項１５および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤が、前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を減少させるためのアンタゴニストである請求項１５および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤がポリヌクレオチドである請求項１５および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが、抗ＣＤ３８抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドＸ受容体抗体、または抗ビタミンＤ受容体細胞内抗体をコードする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、抗ＣＤ３８抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドＸ受容体抗体、または抗ビタミンＤ受容体抗体をコードする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、細胞内ＣＤ３８、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、またはビタミンＤ受容体のｍＲＮＡ分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびＤＮＡｚｙｍｅ分子からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤である請求項１５および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する前記薬剤がポリヌクレオチドである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤が細胞内抗体である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが細胞内ＰＩ３−キナーゼｍＲＮＡまたは遺伝子分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびＤＮＡｚｙｍｅ分子からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項１５および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＣＤ３８活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１、２、４および７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤がＣＤ３８活性を阻害する薬剤である請求項８記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項３３】
ＣＤ３８活性を阻害する前記薬剤が、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物である請求項３１および３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ニコチンアミドアナログは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸からなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１、２、４および７のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項８記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項３７】
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される請求項３５および３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項３９】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項４０】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項４２】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項４５】
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
【請求項４６】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項３８、３９、４１、４４および４５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項４７】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項３８、３９および４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに対する前記応答能力の減少が可逆的である請求項３８、３９、４１、４４および４５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項５３】
前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに対する前記応答能力の減少が、有効量の少なくとも１つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも１つのレチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／または少なくとも１つのビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下での前記造血単核細胞のエクスビボ培養による請求項３８、３９、４１、４４および４５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項５４】
前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに対する前記応答能力の減少が、前記造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の０．１〜５０％の期間、有効量の少なくとも１つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも１つのレチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／または少なくとも１つのビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下で前記造血単核細胞をエクスビボ培養することによる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／またはビタミンＤ受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項４５記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項５６】
前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項５３、５４および５５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物：
ＡＧＮ１９４３１０；ＡＧＮ１９３１０９；３−（４−メトキシ−フェニルスルファニル）−３−メチル−酪酸；６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オン，２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イルトリフルオロメタン−スルホネート；エチル４−（（２，２ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート；エチル４−（（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート（４１）；チオクロメン−６−イル］−エチニル−ベンゾエート（イル）；（ｐ−［（Ｅ）−２−［３’４’−ジヒドロ−４，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’イル］プロペニル］安息香酸１’１’−ジオキシド；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ブトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ペントキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘキソキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘプトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−オクトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−（３−ｔ−ブチル−５−（１−フェニル−ビニル）−フェニル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−｛［４，５−３Ｈ２］−ｎ−ペントキシ｝フェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸エチルエステル；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−カルボキシアミド）安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−シクロプロピル］−ペンタ−２，４−ジエン酸；ｐ−［（Ｅ）−２−［３’，４’−ジヒドロ−４’，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’−イル］プロペニル］安息香酸；１’，１’−ジオキシド，４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト［２，３−ｇ］インドール−３−イル）−安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ヘキシルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−オクチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；および（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−（５Ｈ−２，３（２，５ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル｝安息香酸；４−［４−２メチル−１，２−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−１−イル−フェニルカルバモイル］安息香酸；４−［４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−７，７，１０，１０−テトラメチル−１−（３−ピリジルメチル）−アントラ［１，２−ｂ］ピロール−３−イル］安息香酸；（３−ピリジルメチル）−］５−チアアントラ［２，１−ｂ］ピロール−３−イル）安息香酸；および（３−ピリジルメチル）−アントラ［２ｍｌ−ｄ］ピラゾール−３−イル］安息香酸。
【請求項５７】
前記レチノイドＸ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項５３、５４および５５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物：
ＬＧＮ１００５７２；ＬＧＮ１００５７４；１−（３−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エネニトリル；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−［３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；４−［１（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ベンゼネート（ｂｅｎｚｅｎｅｔｅ）トラゾール；２−［１−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エチル］ピリジン−５−カルボン酸；エチル−２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボキシレート；５−［１−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−２−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；メチル２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボキシレート；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸ブチルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸プロピルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸シアノイミン；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸アリルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸４−（３−メチルブト−２−エン酸）オキシム；および４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸１−アミノエチルオキシム；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；および４−（５Ｈ−２，３（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；および４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸。
【請求項５８】
前記ビタミンＤ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項５３、５４および５５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物：１α，２５−（ＯＨ）−Ｄ３−２６，２３ラクトン；１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（３）；２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２；（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；（２３Ｒ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；１β，２５（ＯＨ）２Ｄ３；１β，２５（ＯＨ）２−３−エピ−Ｄ３；（２３Ｓ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；（２３Ｒ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；およびブチル−（５Ｚ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，３Ｒ，２４Ｒ）−１，３，２４−トリヒドロキシ−２６，２７−シクロ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９），２２−テトラエン−２５−カルボキシレート）。
【請求項５９】
造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項６０】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項６１】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項６３】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項６６】
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
【請求項６７】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項５９、６０、６２、６５および６６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項６８】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項５９、６０および６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力の減少が可逆的である請求項５９、６０、６２、６５および６６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項７４】
前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力の減少が、有効量の少なくとも１つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも１つのレチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／または少なくとも１つのビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下での前記造血単核細胞画分のエクスビボ培養による請求項５９、６０、６２、６５および６６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項７５】
前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力の減少が、前記造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の０．１〜５０％の期間、有効量の少なくとも１つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも１つのレチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／または少なくとも１つのビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下で前記造血単核細胞をエクスビボ培養することによる請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／またはビタミンＤ受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項６６記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項７７】
前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項７４、７５および７６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物：
ＡＧＮ１９４３１０；ＡＧＮ１９３１０９；３−（４−メトキシ−フェニルスルファニル）−３−メチル−酪酸；６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オン，２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イルトリフルオロメタン−スルホネート；エチル４−（（２，２ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート；エチル４−（（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート（４１）；チオクロメン−６−イル］−エチニル−ベンゾエート（イル）；（ｐ−［（Ｅ）−２−［３’４’−ジヒドロ−４，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’イル］プロペニル］安息香酸１’１’−ジオキシド；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ブトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ペントキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘキソキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘプトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−オクトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−（３−ｔ−ブチル−５−（１−フェニル−ビニル）−フェニル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−｛［４，５−３Ｈ２］−ｎ−ペントキシ｝フェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸エチルエステル；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−カルボキシアミド）安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−シクロプロピル］−ペンタ−２，４−ジエン酸；ｐ−［（Ｅ）−２−［３’，４’−ジヒドロ−４’，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’−イル］プロペニル］安息香酸；１’，１’−ジオキシド，４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト［２，３−ｇ］インドール−３−イル）−安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ヘキシルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−オクチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；および（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−（５Ｈ−２，３（２，５ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル｝安息香酸；４−［４−２メチル−１，２−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−１−イル−フェニルカルバモイル］安息香酸；４−［４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−７，７，１０，１０−テトラメチル−１−（３−ピリジルメチル）−アントラ［１，２−ｂ］ピロール−３−イル］安息香酸；（３−ピリジルメチル）−］５−チアアントラ［２，１−ｂ］ピロール−３−イル）安息香酸；および（３−ピリジルメチル）−アントラ［２ｍｌ−ｄ］ピラゾール−３−イル］安息香酸。
【請求項７８】
前記レチノイドＸ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項７４、７５および７６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物：
ＬＧＮ１００５７２；ＬＧＮ１００５７４；１−（３−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エネニトリル；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−［３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；４−［１（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ベンゼネート（ｂｅｎｚｅｎｅｔｅ）トラゾール；２−［１−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エチル］ピリジン−５−カルボン酸；エチル−２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボキシレート；５−［１−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−２−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；メチル２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボキシレート；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸ブチルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸プロピルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸シアノイミン；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸アリルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸４−（３−メチルブト−２−エン酸）オキシム；および４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸１−アミノエチルオキシム；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；および４−（５Ｈ−２，３（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；および４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸。
【請求項７９】
前記ビタミンＤ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項７４、７５および７６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物：１α，２５−（ＯＨ）−Ｄ３−２６，２３ラクトン；１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（３）；２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２；（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；（２３Ｒ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；１β，２５（ＯＨ）２Ｄ３；１β，２５（ＯＨ）２−３−エピ−Ｄ３；（２３Ｓ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；（２３Ｒ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；およびブチル−（５Ｚ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，３Ｒ，２４Ｒ）−１，３，２４−トリヒドロキシ−２６，２７−シクロ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９），２２−テトラエン−２５−カルボキシレート）。
【請求項８０】
造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項８１】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項８２】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項８４】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件およびニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項８７】
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物からなる群から選択され、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
【請求項８８】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項８０、８１、８３、８６および８７のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項８９】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項８０、８１および８６のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項８９記載の方法。
【請求項９３】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
前記ニコチンアミドアナログは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸からなる群から選択される請求項８０、８１、８３、８６および８７のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項９５】
造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時にＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項９６】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項９７】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項９９】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項１０２】
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１０３】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項９５、９６、９８および１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項９５、９６、９８および１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項１０４記載の方法。
【請求項１０８】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
ＰＩ３−キナーゼの前記発現および／または前記活性の減少のためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項９５、９６、９８および１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤である請求項１０２記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１１１】
ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する前記薬剤がポリヌクレオチドである請求項１０９および１１０のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１１２】
ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤が細胞内抗体である請求項１０９および１１０のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１１３】
前記ポリヌクレオチドが細胞内ＰＩ３−キナーゼｍＲＮＡまたは遺伝子分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびＤＮＡｚｙｍｅ分子からなる群から選択される請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１０９および１１０のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１１６】
前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項１０２記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１１７】
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される請求項１１５および１１６のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１１８】
造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項１１９】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項１２０】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項１２２】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項１２１記載の方法。
【請求項１２３】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項１２２記載の方法。
【請求項１２４】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得る工程、
（ｂ）前記造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件、および同時に少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターを提供し、それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程、および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項１２５】
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターの効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１２６】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項１１８、１１９、１２１、１２４および１２５のいずれかに記載の方法および／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１２７】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項１１８、１１９および１２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２８】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項１２７記載の方法。
【請求項１２９】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項１２８記載の方法。
【請求項１３０】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項１２７記載の方法。
【請求項１３１】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項１３０記載の方法。
【請求項１３２】
少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターを前記造血単核細胞に与えることは、少なくとも１つの銅キレーターを前記造血単核細胞に与えることによる請求項１１８、１１９、１２１および１２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
前記造血単核細胞画分に亜鉛を与えることをさらに含む請求項１３２記載の方法。
【請求項１３４】
前記造血幹細胞画分の前記拡大された集団が、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞から、少なくとも１つの銅キレーターの効果的な量の存在下でエクスビボ増殖される請求項１２５記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１３５】
前記造血幹細胞画分の前記拡大された集団が、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞から、亜鉛の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖される請求項１３４記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１３６】
遷移金属キレートまたはキレーターが造血幹細胞の分化を実質的に阻害および誘導するかどうかを明らかにするアッセイであって、
造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、遷移金属キレートまたはキレーターの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の分化をモニターすることを含み、分化が処理されていない造血単核細胞と比較して増大する場合、遷移金属キレートまたはキレーターは分化を誘導し、分化が処理されていない造血単核細胞と比較して低下する場合、遷移金属キレートまたはキレーターは分化を阻害すること、
を含むアッセイ。
【請求項１３７】
前記少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターがポリアミンキレーターを含む請求項１１８、１１９、１２１、１２４、１２５、１３６および１３８〜１４１のいずれかに記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１３８】
前記ポリアミンキレーターが、銅以外の遷移金属との有機金属錯体を形成することができる請求項１３７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１３９】
前記遷移金属は、亜鉛、コバルト、ニッケル、鉄、パラジウム、白金、ロジウムおよびルテニウムからなる群から選択される請求項１３８記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１４０】
前記ポリアミンキレーターが線状ポリアミンである請求項１３７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１４１】
前記線状ポリアミンが下記の一般式Ｉを有する請求項１４０記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000022
式中、
ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；
ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、
ただし、前記Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される。
【請求項１４２】
前記Ａが下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１４１記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000023
式中、
ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１４３】
前記Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１４２記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000024
式中、
ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；
ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；および
Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１４４】
前記線状ポリアミンがテトラエチレンペンタミンである請求項１４１記載の方法、アッセイ、医薬組成物、キット、拡大された集団および／またはアッセイ。
【請求項１４５】
前記Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１４２記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１４６】
前記Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１４３記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１４７】
前記ポリアミンキレーターが環状ポリアミンである請求項１３７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１４８】
前記環状ポリアミンがシクラムである請求項１４７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１４９】
前記環状ポリアミンが下記の一般式ＩＶを有する請求項１４７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000025
式中、
ｍは１〜１０の整数である；
ｎは０〜２０の整数である；
ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｄは、下記の一般式Ｖを有する架橋基である：
2006508692.tif 000026
式中、
ＵおよびＶはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される；
Ｗは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
ただし、Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される。
【請求項１５０】
前記Ａが下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１４９記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000027
式中、
ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１５１】
前記Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１５０記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000028
式中、
ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；
ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；および
Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１５２】
前記Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１５０記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１５３】
前記Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１５１記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１５４】
前記環状ポリアミンが下記の式ＶＩ〜式Ｘからなる群から選択される一般式を有する請求項１４７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000029
式中、
ｍは１〜１０の整数である；
ｎは０〜２０の整数である；
ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｄは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Ｖを有する架橋基であり、
2006508692.tif 000030
式中、
ＵおよびＶはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される；および
Ｗは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
さらに、前記Ｄが一方の端部でＡ（式ＶＩ、式ＶＩＩおよび式Ｘ）に結合している場合、前記Ｕまたは前記Ｖは前記アルキレン鎖における１つの炭素原子に結合しており、また、前記Ｄが一方の端部でＢ１またはＢｎ（式ＶＩＩＩ、式ＩＸおよび式Ｘ）に結合している場合、前記Ｕまたは前記Ｖは前記アルキレン鎖における１つの炭素原子に結合している；
ただし、前記Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される。
【請求項１５５】
前記Ａが下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１５４記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000031
式中、
ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１５６】
前記Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１５５記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000032
式中、
ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；
ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；および
Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１５７】
前記Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１５５記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１５８】
前記Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１５６記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１５９】
前記ポリアミンキレーターが少なくとも１つの線状ポリアミンおよび少なくとも１つの環状ポリアミンを含む請求項１３７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１６０】
前記ポリアミンキレーターが下記の一般式ＸＩを有する請求項１５９記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000033
式中、
ｎは１よりも大きい整数である；
ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｏおよびｔのそれぞれは独立して、０〜１０の整数である；
Ｅ１、Ｅ２およびＥｎのそれぞれは独立して線状ポリアミンである；
Ｇ１、Ｇ２およびＧｎのそれぞれは独立して環状ポリアミンである；
Ｑ１、Ｑ２およびＱｎのそれぞれは独立して、これらのポリアミンの２つの間を連結するリンカーである；
ただし、Ｑ１、Ｑ２およびＱｎの少なくとも１つがアミン基であり、かつ／または、前記線状ポリアミンおよび前記環状ポリアミンの少なくとも１つが少なくとも１つのフリーのアミン基を有する。
【請求項１６１】
前記Ｑ１、Ｑ２およびＱｎのそれぞれは独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、アミン、アゾ、アミド、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、ケトエステル、カルボニル、チオカルボニル、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバマート、チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシおよびシラザからなる群から選択される請求項１６０記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１６２】
前記Ｅ１，Ｅ２およびＥｎのそれぞれが独立して下記の一般式Ｉを有するで線状ポリアミンである請求項１５９記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000034
式中、
ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；
ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、
ただし、前記Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される。
【請求項１６３】
前記Ａが下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１６２記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000035
式中、
ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１６４】
前記Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１６３記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000036
式中、
ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；
ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；および
Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１６５】
前記Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１６３記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１６６】
前記Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１６４記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１６７】
前記Ｇ１、Ｇ２およびＧ２がそれぞれ独立して下記の一般式ＩＶを有する環状ポリアミンである請求項１６０記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000037
式中、
ｍは１〜１０の整数である；
ｎは０〜２０の整数である；
ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｄは、下記の一般式Ｖを有する架橋基である：
2006508692.tif 000038
式中、
ＵおよびＶはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される；
Ｗは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
ただし、Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される。
【請求項１６８】
前記Ａが下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１６７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000039
式中、
ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１６９】
前記Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１６８記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000040
式中、
ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；
ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；および
Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１７０】
前記Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１６８記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７１】
前記Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１６９記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７２】
前記環状ポリアミンが下記の式ＶＩ〜式Ｘからなる群から選択される一般式を有する請求項１６０記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000041
式中、
ｍは１〜１０の整数である；
ｎは０〜２０の整数である；
ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；
Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；
Ｄは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Ｖを有する架橋基であり、
2006508692.tif 000042
式中、
ＵおよびＶはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される；および
Ｗは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される、
さらに、前記Ｄが一方の端部でＡ（式ＶＩ、式ＶＩＩおよび式Ｘ）に結合している場合、前記Ｕまたは前記Ｖは前記アルキレン鎖における１つの炭素原子に結合しており、また、前記Ｄが一方の端部でＢ１またはＢｎ（式ＶＩＩＩ、式ＩＸおよび式Ｘ）に結合している場合、前記Ｕまたは前記Ｖは前記アルキレン鎖における１つの炭素原子に結合している；
ただし、前記Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される。
【請求項１７３】
前記Ａが下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１７２記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000043
式中、
ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１７４】
前記Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である請求項１７３記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物：
2006508692.tif 000044
式中、
ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；
ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；および
Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される。
【請求項１７５】
前記Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１７３記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７６】
前記Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルな炭素原子である請求項１７４記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７７】
前記ポリアミンキレーターは、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、カプトプリル、ペニシラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’，ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、１，７−ジオキサ−４，１０−ジアザシクロドデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン、１，４，７−トリアザシクロノナン、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンからなる群から選択される請求項１３７記載の方法、アッセイおよび／または移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７８】
レチノイン酸受容体アンタゴニストが効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、レチノイン酸受容体アンタゴニストの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、レチノイン酸受容体アンタゴニストは効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
【請求項１７９】
前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項１７８記載のアッセイ：
ＡＧＮ１９４３１０；ＡＧＮ１９３１０９；３−（４−メトキシ−フェニルスルファニル）−３−メチル−酪酸；６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オン，２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イルトリフルオロメタン−スルホネート；エチル４−（（２，２ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート；エチル４−（（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート（４１）；チオクロメン−６−イル］−エチニル−ベンゾエート（イル）；（ｐ−［（Ｅ）−２−［３’４’−ジヒドロ−４，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’イル］プロペニル］安息香酸１’１’−ジオキシド；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ブトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ペントキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘキソキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘプトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−オクトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−（３−ｔ−ブチル−５−（１−フェニル−ビニル）−フェニル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−｛［４，５−３Ｈ２］−ｎ−ペントキシ｝フェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸エチルエステル；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−カルボキシアミド）安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−シクロプロピル］−ペンタ−２，４−ジエン酸；ｐ−［（Ｅ）−２−［３’，４’−ジヒドロ−４’，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’−イル］プロペニル］安息香酸；１’，１’−ジオキシド，４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト［２，３−ｇ］インドール−３−イル）−安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ヘキシルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−オクチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；および（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−（５Ｈ−２，３（２，５ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル｝安息香酸；４−［４−２メチル−１，２−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−１−イル−フェニルカルバモイル］安息香酸；４−［４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−７，７，１０，１０−テトラメチル−１−（３−ピリジルメチル）−アントラ［１，２−ｂ］ピロール−３−イル］安息香酸；（３−ピリジルメチル）−］５−チアアントラ［２，１−ｂ］ピロール−３−イル）安息香酸；および（３−ピリジルメチル）−アントラ［２ｍｌ−ｄ］ピラゾール−３−イル］安息香酸。
【請求項１８０】
レチノイドＸ受容体アンタゴニストが効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、レチノイドＸ受容体アンタゴニストの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、レチノイドＸ受容体アンタゴニストは効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
【請求項１８１】
前記レチノイドＸ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項１８０記載のアッセイ：
ＬＧＮ１００５７２；ＬＧＮ１００５７４；１−（３−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エネニトリル；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−［３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；４−［１（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ベンゼネート（ｂｅｎｚｅｎｅｔｅ）トラゾール；２−［１−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エチル］ピリジン−５−カルボン酸；エチル−２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボキシレート；５−［１−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−２−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；メチル２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボキシレート；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸ブチルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸プロピルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸シアノイミン；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸アリルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸４−（３−メチルブト−２−エン酸）オキシム；および４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸１−アミノエチルオキシム；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；および４−（５Ｈ−２，３（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；および４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸。
【請求項１８２】
ビタミンＤ受容体アンタゴニストが効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、ビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、ビタミンＤ受容体アンタゴニストは効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
【請求項１８３】
前記ビタミンＤ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項１８２記載のアッセイ：１α，２５−（ＯＨ）−Ｄ３−２６，２３ラクトン；１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（３）；２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２；（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；（２３Ｒ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；１β，２５（ＯＨ）２Ｄ３；１β，２５（ＯＨ）２−３−エピ−Ｄ３；（２３Ｓ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；（２３Ｒ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；およびブチル−（５Ｚ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，３Ｒ，２４Ｒ）−１，３，２４−トリヒドロキシ−２６，２７−シクロ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９），２２−テトラエン−２５−カルボキシレート）。
【請求項１８４】
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤が効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤の存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤は効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
【請求項１８５】
ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物が効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物の存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、前記造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物は効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
【請求項１８６】
前記造血単核細胞の培養がサイトカインの効果的な量の存在下で行われる請求項１７８、１８０、１８２、１８４および１８５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８７】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項１８６記載のアッセイ。
【請求項１８８】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項１８７記載のアッセイ。
【請求項１８９】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項１８６記載のアッセイ。
【請求項１９０】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項１８９記載のアッセイ。
【請求項１９１】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項１７８、１８０、１８２、１８４および１８５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１９２】
低下した分化を前記モニターすることがＣＤ３４の造血細胞表面発現を決定することによる請求項１７８、１８０、１８２、１８４および１８５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１９３】
低下した分化を前記モニターすることは、造血細胞表面ＣＤ３８、ＣＤ３、ＣＤ６１、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、またはＣＤ４を発現しないか、発現が実質的に消滅していることを決定することによる請求項１７８、１８０、１８２、１８４および１８５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１９４】
効果的な量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニストおよび／またはビタミンＤ受容体アンタゴニストが補充された造血幹細胞回収／培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収／培養バッグ。
【請求項１９５】
前記レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項１９４記載の造血幹細胞回収／培養バッグ：
ＡＧＮ１９４３１０；ＡＧＮ１９３１０９；３−（４−メトキシ−フェニルスルファニル）−３−メチル−酪酸；６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オン，２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イルトリフルオロメタン−スルホネート；エチル４−（（２，２ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート；エチル４−（（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート（４１）；チオクロメン−６−イル］−エチニル−ベンゾエート（イル）；（ｐ−［（Ｅ）−２−［３’４’−ジヒドロ−４，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’イル］プロペニル］安息香酸１’１’−ジオキシド；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ブトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ペントキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘキソキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘプトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−オクトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−（３−ｔ−ブチル−５−（１−フェニル−ビニル）−フェニル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸；２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−｛［４，５−３Ｈ２］−ｎ−ペントキシ｝フェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸エチルエステル；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−カルボキシアミド）安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−シクロプロピル］−ペンタ−２，４−ジエン酸；ｐ−［（Ｅ）−２−［３’，４’−ジヒドロ−４’，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’−イル］プロペニル］安息香酸；１’，１’−ジオキシド，４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト［２，３−ｇ］インドール−３−イル）−安息香酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ヘキシルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−オクチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；および（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−（５Ｈ−２，３（２，５ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル｝安息香酸；４−［４−２メチル−１，２−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−１−イル−フェニルカルバモイル］安息香酸；４−［４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−７，７，１０，１０−テトラメチル−１−（３−ピリジルメチル）−アントラ［１，２−ｂ］ピロール−３−イル］安息香酸；（３−ピリジルメチル）−］５−チアアントラ［２，１−ｂ］ピロール−３−イル）安息香酸；および（３−ピリジルメチル）−アントラ［２ｍｌ−ｄ］ピラゾール−３−イル］安息香酸。
【請求項１９６】
前記レチノイドＸ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項１９４記載の造血幹細胞回収／培養バッグ：
ＬＧＮ１００５７２；ＬＧＮ１００５７４；１−（３−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エネニトリル；３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；４−［３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；４−［１（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］安息香酸；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ベンゼネート（ｂｅｎｚｅｎｅｔｅ）トラゾール；２−［１−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エチル］ピリジン−５−カルボン酸；エチル−２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボキシレート；５−［１−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−２−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；メチル２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボキシレート；４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸ブチルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸プロピルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸シアノイミン；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸アリルオキシム；４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸４−（３−メチルブト−２−エン酸）オキシム；および４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸１−アミノエチルオキシム；（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；および４−（５Ｈ−２，３（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；および４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸。
【請求項１９７】
前記ビタミンＤ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される請求項１９４記載の造血幹細胞回収／培養バッグ：１α，２５−（ＯＨ）−Ｄ３−２６，２３ラクトン；１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（３）；２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２；（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；（２３Ｒ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；１β，２５（ＯＨ）２Ｄ３；１β，２５（ＯＨ）２−３−エピ−Ｄ３；（２３Ｓ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；（２３Ｒ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；およびブチル−（５Ｚ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，３Ｒ，２４Ｒ）−１，３，２４−トリヒドロキシ−２６，２７−シクロ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９），２２−テトラエン−２５−カルボキシレート）。
【請求項１９８】
効果的な量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物が補充された造血幹細胞回収／培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収／培養バッグ。
【請求項１９９】
効果的な量のＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤が補充された造血幹細胞回収／培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収／培養バッグ。
【請求項２００】
請求項１、３８、５９、８０、９５および１１８のいずれかに記載の方法によって得られる造血幹細胞のエクスビボ拡大集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液サンプルの造血単核細胞画分に存在する造血幹細胞のエクスビボ拡大（自己再生）方法、および、それにより得られる造血幹細胞の拡大（自己再生）された集団に関する。本発明は、さらに、これらの方法および／または上記方法によって得られた拡大造血幹細胞集団を使用する治療的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特に幹細胞拡大およびレトロウイルス媒介遺伝子形質導入などの目的のための造血幹細胞のエクスビボ培養物の必要性が高まっている。しかし、幹細胞のエクスビボ培養物の作製方法では通常、幹細胞集団の活性が急激に低下し、さらに、自己再生能力が著しく損なわれ、培養された細胞集団の移植可能性が減少する。このような方法を改良する必要性は幅広く認められている。さらに、レトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療の適用には、増殖している造血幹細胞を使用する必要があり、さらに、これらの細胞は、形質導入された遺伝子の発現を長期間維持するために、培養物中で未分化の状態で維持する必要がある。したがって、長期自己再生能力を有する造血幹細胞集団のエクスビボ培養物を維持する能力は、広範な一連の治療用途に非常に重要である。
【０００３】
現在、再生可能な幹細胞は、線維芽細胞の支持層上で幹細胞を増殖させるか、初期作用性サイトカイントロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で細胞を増殖させることによって、拡大されている（Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１０：４８１，Ｐｕｎｚｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３：９２，ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：９４３）。支持細胞層上での幹細胞の拡大により巨大で実質的に終わりなく細胞が拡大される一方で、上記の初期作用性サイトカインの存在下での支持細胞層を使用しない幹細胞の拡大により分化度が上昇する（実施例およびＬｅｓｌｉｅ  ＮＲ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９２：４７９８）、Ｐｅｔｚｅｒ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎ  １８３：２５５１、Ｋａｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．８：７３に記載のコントロールを参照のこと）。
【０００４】
従って、インビボおよびインビトロの両方での造血幹細胞および先祖細胞（ＨＰＣ）の自己再生（拡大）は、細胞分化によって制限される。造血系の分化には、他の変化もあるが、表面抗原発現の変化が含まれる（Ｓｉｅｆｆ  Ｃ，Ｂｉｃｋｎｅｌｌ  Ｄ，Ｃａｉｎｅ  Ｇ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｊ，Ｌａｍ  Ｇ，Ｇｒｅａｖｅｓ  ＭＦ（１９８２）  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ６０：７０３）。正常なヒトでは、多能性造血幹細胞およびその系統が約束されている先祖細胞のほとんどがＣＤ３４＋である。細胞の大部分はＣＤ３４＋ＣＤ３８＋であり、少数の細胞（１０％未満）はＣＤ３４＋ＣＤ３８−である。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−表現型は、自己再生が可能であり多系統への分化を行うことができるほとんど未成熟の造血細胞とみなすことができるようである。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞画分は、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）前ＣＦＵを含み、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞と比較してその表現型をより長く維持し、サイトカインに対する増殖反応を遅延させる。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−は、インビトロでリンパ系細胞および骨髄性細胞を生じ、ＳＣＩＤマウスを再生させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）高い能力を有する（Ｂｈａｔｉａ  Ｍ，Ｗａｎｇ  ＪＣＹ，Ｋａｐｐ  Ｕ，Ｂｏｎｎｅｔ  Ｄ，Ｄｉｃｋ  ＪＥ（１９９７）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５３２０）。さらに、自己血球移植を受けた患者では、注入されたＣＤ３４＋ＣＤ３８−の細胞数は造血回復速度に正に相関する。これらの機能的特徴と一致して、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、検出可能なレベルのテロメラーゼを有することが示されている。
【０００５】
造血幹細胞および造血前駆細胞のエクスビボ拡大に関する現在発表されている研究では、ＣＤ３４抗原またはさらにより初期のＡＣ１３３抗原を発現する始原細胞が高度に濃縮されている細胞を開始のために接種することが伴う［Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．、Ｔ．Ｄ．ＡｌｌｅｎおよびＬ．Ｇ．Ｌａｊｔｈａ、造血幹細胞の集団をインビトロで制御する条件、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７７、９１（３）：ｐ．３３５〜４４；Ｍｕｅｎｃｈ，Ｍ．Ｏ．、Ｊ．Ｇ．ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＭ．Ａ．Ｍｏｏｒｅ、原始的なネズミ造血細胞の調節におけるコロニー刺激因子（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびｋｉｔリガンド）の間での相互作用、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１９９２、２０（３）：ｐ．３３９〜４９；Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ｃ．Ｍ．、ヒトの原始的な造血前駆細胞と骨髄間質との直接的な接触は長期のインビトロ血液生成のために要求されない、Ｂｌｏｏｄ、１９９２、７９（１１）：ｐ．２８２１〜２６；Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，Ｇ．、Ａ．Ｒ．Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ、Ｍ．Ｌ．Ｄｒｕｚｉｎ、Ｐ．Ｊ．Ｇｉａｒｄｉｎａ、Ｋ．Ｍ．ＺｓｅｂｏおよびＪ．Ｗ．Ａｄａｍｓｏｎ、組換えヒト幹細胞因子の存在下でのＣＤ３４＋臍帯血細胞の液体培養におけるコロニー形成細胞の長期にわたる生成、Ｂｌｏｏｄ、１９９２、７９（１０）：ｐ．２６２０〜２７；Ｐｕｒｄｙ，Ｍ．Ｈ．、Ｃ．Ｊ．Ｈｏｇａｎ、Ｌ．Ｈａｍｉ、Ｉ．ＭｃＮｉｅｃｅ、Ｗ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｒ．Ｂ．Ｊｏｎｅｓ、Ｓ．Ｉ．Ｂｅａｒｍａｎ、Ｒ．Ｊ．Ｂｅｒｅｎｓｏｎ、Ｐ．Ｊ．ＣａｇｎｏｎｉおよびＳ．Ｈｅｉｍｆｅｌｄ、移植のためのＣＤ３４陽性造血前駆細胞の大容量エクスビボ拡大、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．、１９９５、４（６）：ｐ．５１５〜２５；ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．、Ｒ．Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｓ．Ｃｌａｒｋ、Ｔ．ＢｏｏｎｅおよびＰ．Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙ、高度に濃縮（富化）されたヒト造血前駆細胞に対するインターロイキン−３、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの作用：ＧＭ−ＣＳＦ＋Ｇ−ＣＳＦの相乗的相互作用、Ｂｌｏｏｄ、１９８９、７４（１）：ｐ．１１０〜１４；Ｃｏｌｔｅｒ，Ｍ．、Ｍ．ＪｏｎｅｓおよびＳ．Ｈｅｉｍｆｅｌｄ、ＣＤ３４＋始原細胞の選択：臨床的移植、腫瘍細胞パージング、遺伝子治療、エクスビボ拡大および臍帯血処理、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ、１９９６、５（２）：ｐ．１７９〜８４；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｔ．、Ｒ．Ｐｌｅｔｔｉｇ、Ｗ．Ｗｅｔｚｓｔｅｉｎ、Ｂ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｒ．Ｏｒｄｅｍａｎｎ、Ｈ．Ｏ．Ｎａｇｅｌｓ、Ｇ．ＥｈｎｉｎｇｅｒおよびＭ．Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ、ヒト臍帯血細胞のエクスビボ拡大のための最適な条件の明確化。始原細胞濃縮、フィーダー層による妨害、早期作用サイトカインおよび培養槽の撹拌の影響、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１９９９、１７（１）：ｐ．１９〜２４］。
【０００６】
単核細胞（ＭＮＣ）画分全体をサイトカインの存在下で用いたエクスビボ培養の開始は培養の最初の数週間の間にＣＦＵｃの拡大をもたらし、その後、培養物の急速な衰退をもたらすことが示されていたので、ＣＤ３４＋（またはＡＣ１３３）細胞の精製が、長期培養のコロニー形成細胞（ＬＴＣ−ＣＦＵｃ）だけでなく、造血幹細胞の成功したエクスビボ拡大を達成するための必須条件であるとこれまで広く受け入れられている［Ｂｒｉｄｄｅｌｌ，Ｒ．、Ｋｅｒｅｎ，Ｂ．Ｐ．、Ｚｉｌｍ，Ｋ．Ｌ．他、ＣＤ３４＋細胞の精製は臍帯血細胞の最適なエクスビボ拡大のために不可欠である、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．、６：１４５、１９９７；Ｉａｎ  Ｋ  ＭｃＮｉｅｃｅ、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｂ．Ｓｔｏｎｅｙ、Ｂｒｅｎｔ  Ｐ．ＫｅｒｅｎおよびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｂｒｉｄｄｅｌｌ、Ｉｓｏｌｅｘ３００ｉおよびｃｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）選択装置を使用した凍結臍帯血産物からのＣＤ３４＋細胞の選択、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ、７：４５７〜４６１（１９９８）］。
【０００７】
国際特許出願公開ＷＯ９９／４０７８３、同ＷＯ００／１８８８５、およびＰｅｌｅｄ他、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１１６：６５５、２００２（これらはすべて、本明細書中に詳しく示されるかのように参照により組み込まれる）には、造血前駆細胞の自己再生と分化との間でのバランスの調節に対する、細胞中に存在する遊離銅の影響が教示される。これらの参考文献では、細胞の銅含有量を減少させることができる薬剤を早期作用サイトカインと一緒にＣＤ３４＋細胞の培養物に加えることにより、長期にわたるＣＤ３４＋細胞の拡大が培養でのエクスビボでもたらされることが教示される。これらの参考文献の教示によれば、そのような薬剤には、好ましくは、銅と結合することができる遷移金属キレーター、例えば、線状ポリアミン（例えば、テトラエチレンペンタミン、ＴＥＰＡ）などが含まれる。従って、５μＭ〜１０μＭのＴＥＰＡをＣＤ３４＋細胞培養物に早期作用サイトカインの存在下で加えることにより、細胞の銅含有量が（原子吸光によって測定されたとき）３０％減少し、そして、長期にわたるＣＦＵ細胞およびＣＤ３４＋細胞の拡大に関して長期培養の持続期間が延びたことがこれらの参考文献では示されている。
【０００８】
しかしながら、これらの参考文献に開示された方法ではまた、幹細胞または始原細胞の精製が培養におけるそれらの拡大の前に伴う。
【０００９】
このように、今日の技術を使用した場合、均一にまで最初に実質的に濃縮（富化）または単離されない限り、幹細胞を拡大することができない。従って、幹細胞集団をエクスビボ拡大する現在知られている方法は、培養の開始に先立つ、手間および費用のかかる幹細胞濃縮プロセスによって制限されている。
【００１０】
このように、事前の幹細胞濃縮を伴うことなく造血幹細胞をエクスビボ拡大する方法が必要であることが広く認められており、また、そのような方法を得ることは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、事前の幹細胞濃縮手法の使用を伴うことなく、血液サンプルの造血単核細胞画分に存在する造血幹細胞を拡大する際の様々な薬剤の使用、それにより得られる造血幹細胞の拡大（自己再生）された集団、およびその使用を開示する。
【００１２】
本発明の１つの局面によれば、造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法が提供される。
【００１３】
１つの実施形態において、この方法は、造血系の方向づけられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００１４】
別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００１５】
さらに別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００１６】
なお別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、ＰＩ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００１７】
さらに別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００１８】
なお別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時にＰＩ３−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、この方法は、造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む。
【００２０】
さらに、本発明によれば、本明細書中上記に記載される方法によって得られる、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団が提供される。
【００２１】
本発明の別の局面によれば、造血細胞を移植または埋込みする方法が提供される。
【００２２】
１つの実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２３】
別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２４】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２５】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、ＰＩ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２６】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２７】
さらになお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２８】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００２９】
さらになお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることを含む。
【００３０】
上記方法におけるドナーおよびレシピエントは、単一の個体または異なる個体、例えば、同種の個体または異種の個体であり得る。
【００３１】
本発明のさらに別の局面によれば、移植可能な造血細胞調製物が提供される。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＣＤ３８の発現および／または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害するための効果的な量の薬剤の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を減少させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害するための効果的な量の薬剤の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３５】
なお別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体のシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３６】
さらに別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＰＩ３−キナーゼのシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３７】
なお別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、および、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物からなる群から選択され、同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤の、同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００３９】
なお別の実施形態において、本発明の移植可能な造血細胞調製物は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートの、同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む。
【００４０】
本発明のさらなる局面によれば、養子免疫療法の方法が提供される。
【００４１】
１つの実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４２】
別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４３】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体および／またはレチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４４】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、ＰＩ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４５】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４６】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４７】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００４８】
さらに、本発明の１つの局面によれば、幹細胞を外因遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｅ）で遺伝子改変する方法が提供される。
【００４９】
１つの実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５０】
別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５１】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５２】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体および／またはレチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５３】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、ＰＩ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５４】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５５】
さらに別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤とを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５６】
なお別の実施形態において、この方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、および（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することを含む。
【００５７】
好ましい実施形態において、細胞を遺伝子改変することは、外因遺伝子を含むベクターによって達成され、この場合、そのようなベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは核酸ベクターである。
【００５８】
本発明のさらにさらなる局面によれば、効果的な量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニストおよび／またはビタミンＤ受容体アンタゴニスト、効果的な量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、およびニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物、効果的な量のＰＩ３−キナーゼ阻害剤、あるいは、効果的な量の銅キレーターまたは銅キレートが補充された造血幹細胞回収／培養バッグが提供され、この場合、それらのそれぞれにより、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される。
【００５９】
本発明のさらなる局面によれば、薬剤／分子が効果的な造血幹細胞拡大剤であるかどうかを明らかにするアッセイが提供される。このアッセイは、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、試験されている薬剤／分子の存在下で培養すること、および、造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、この場合、造血幹細胞の増大した拡大および低下した分化が、処理されていない造血単核細胞と比較して生じる場合、試験された薬剤／分子は効果的な造血幹細胞拡大剤である。
【００６０】
薬剤／分子は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、ビタミンＤ受容体アンタゴニスト、ニコチンアミドならびにそのアナログ、誘導体および代謝産物、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤、銅キレーターおよび銅キレートであり得る。
【００６１】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ３８発現を下方制御（ダウンレギュレート）する薬剤によってＣＤ３８の発現および／または活性を減少させる。
【００６２】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、およびビタミンＤ受容体アンタゴニストからなる群から選択される。あるいは、この薬剤は、幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を減少させるためのアンタゴニストである。またあるいは、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤である。
【００６３】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤は、ポリヌクレオチドである。
【００６４】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤は、抗ＣＤ３８抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドＸ受容体抗体、または抗ビタミンＤ受容体抗体、または抗ＰＩ３−キナーゼ抗体、または細胞内抗体をコードするポリヌクレオチドである。
【００６５】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ポリヌクレオチドは、細胞内ＣＤ３８、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体またはＰＩ３−キナーゼのｍＲＮＡ分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である。
【００６６】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびＤＮＡｚｙｍｅ分子からなる群から選択される干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である。
【００６７】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ３８の発現および／または活性を、ＣＤ３８活性を阻害する薬剤によって減少させる。薬剤は、例えば、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物であり得る。ニコチンアミドアナログは、好ましくは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸からなる群から選択される。
【００６８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させることは、ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤によって達成される。
【００６９】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、エクスビボ細胞増殖のための条件を使用した幹細胞の獲得は、前記細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む。
【００７０】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、サイトカインは初期活動サイトカインであり、例えば、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンなどであるが、これらに限定されない。
【００７１】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、サイトカインは、後期活動サイトカイン（後期作動性サイトカイン）であり、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子などであるが、これらに限定されない。
【００７２】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、造血単核細胞は、骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する。
【００７３】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、造血単核細胞のシグナル伝達経路に対する応答能力の減少は可逆的である（例えば、本質的に可逆的である）。
【００７４】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、造血単核細胞の上記のアンタゴニストおよび／または上記の受容体のシグナル伝達経路に対する応答能力の減少は、好ましくは造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の０．１〜５０％、より好ましくは０．１〜２５％、さらに好ましくは０．１〜１５％の期間、有効量の少なくとも１つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも１つのレチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／または少なくとも１つのビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下で造血単核細胞をエクスビボ培養することによる。
【００７５】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される：
ＡＧＮ１９４３１０；ＡＧＮ１９３１０９；３−（４−メトキシ−フェニルスルファニル）−３−メチル−酪酸；
６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オン，２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イルトリフルオロメタン−スルホネート；
エチル４−（（２，２ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート；
エチル４−（（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート（４１）；
チオクロメン−６−イル］−エチニル−ベンゾエート（イル）；
（ｐ−［（Ｅ）−２−［３’４’−ジヒドロ−４，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’イル］プロペニル］安息香酸１’１’−ジオキシド；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ブトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ペントキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘキソキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘプトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−オクトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−（３−ｔ−ブチル−５−（１−フェニル−ビニル）−フェニル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−｛［４，５−３Ｈ２］−ｎ−ペントキシ｝フェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸エチルエステル；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−カルボキシアミド）安息香酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−シクロプロピル］−ペンタ−２，４−ジエン酸；
ｐ−［（Ｅ）−２−［３’，４’−ジヒドロ−４’，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’−イル］プロペニル］安息香酸；
１’，１’−ジオキシド，４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト［２，３−ｇ］インドール−３−イル）−安息香酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−エトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ヘキシルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−オクチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；および
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；
４−（５Ｈ−２，３（２，５ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；
４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；
４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル｝安息香酸；
４−［４−２メチル−１，２−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−１−イル−フェニルカルバモイル］安息香酸；
４−［４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−７，７，１０，１０−テトラメチル−１−（３−ピリジルメチル）−アントラ［１，２−ｂ］ピロール−３−イル］安息香酸；
（３−ピリジルメチル）−］５−チアアントラ［２，１−ｂ］ピロール−３−イル）安息香酸；および
（３−ピリジルメチル）−アントラ［２ｍｌ−ｄ］ピラゾール−３−イル］安息香酸。
【００７６】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、レチノイドＸ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される：
ＬＧＮ１００５７２；ＬＧＮ１００５７４；
１−（３−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；
１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；
３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エネニトリル；
３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；
４−［３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸；
４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；
４−［１（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］安息香酸；
４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ベンゼネート（ｂｅｎｚｅｎｅｔｅ）トラゾール；
２−［１−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エチル］ピリジン−５−カルボン酸；
エチル−２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボキシレート；
５−［１−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−２−カルボン酸；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；
メチル２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボキシレート；
４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸ブチルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸プロピルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸シアノイミン；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸アリルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸４−（３−メチルブト−２−エン酸）オキシム；および
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸１−アミノエチルオキシム；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；および
４−（５Ｈ−２，３（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；および
４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸。
【００７７】
記載の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ビタミンＤ受容体アンタゴニストは、以下からなる群から選択される：１α，２５−（ＯＨ）−Ｄ３−２６，２３ラクトン；１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（３）；２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２；（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；（２３Ｒ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；１β，２５（ＯＨ）２Ｄ３；１β，２５（ＯＨ）２−３−エピ−Ｄ３；（２３Ｓ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；（２３Ｒ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；およびブチル−（５Ｚ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，３Ｒ，２４Ｒ）−１，３，２４−トリヒドロキシ−２６，２７−シクロ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９），２２−テトラエン−２５−カルボキシレート）。
【００７８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される。
【００７９】
本明細書中上記に記載される本発明の様々な局面において使用される銅キレートまたは銅キレーターは、好ましくは、ポリアミンキレーターを含む。
【００８０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは、銅以外の遷移金属と有機金属錯体を形成することができる。そのような遷移金属は、例えば、亜鉛、コバルト、ニッケル、鉄、パラジウム、白金、ロジウムおよびルテニウムであり得る。
【００８１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは線状ポリアミンである。
好ましくは、線状ポリアミンは下記の一般式Ｉを有する：
2006508692.tif 000002
（式中、ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、ただし、Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される）。
【００８２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、Ａは、下記の一般式ＩＩを有するアルキレン鎖である：
2006508692.tif 000003
（式中、ｇは、０または３〜１０に等しい整数である；Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラートからなる群から選択される）。
【００８３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、Ｂ１およびＢｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である：
2006508692.tif 000004
（式中、ｐは、０またはｇ＋１に等しい整数である；ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である；Ｒｐ、Ｒｐ＋１およびＲｑのそれぞれは独立して、Ｒ１、Ｒ２およびＲｇに関して本明細書中上記に記載された置換基からなる群から選択される）。
【００８４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、Ｃ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つ、ならびに／または、Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つはキラルな炭素原子である。
【００８５】
本発明による好ましい線状ポリアミンはテトラエチレンペンタミンである。
【００８６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは、シクラムなどの環状ポリアミンである。
【００８７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、環状ポリアミンは下記の一般式ＩＶを有する：
2006508692.tif 000005
（式中、ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｄは、下記の一般式Ｖを有する架橋基である：
2006508692.tif 000006
［式中、ＵおよびＶはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される；Ｗは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される］、
ただし、Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される）。
【００８８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、式ＩＶにおけるＡ、ならびに、Ｂ１およびＢｎのそれぞれは、本明細書中上記に記載されるように、一般式ＩＩおよび一般式ＩＩＩを有するアルキレン鎖である。
【００８９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、環状ポリアミンは、下記の式ＶＩ〜式Ｘからなる群から選択される一般式を有する：
2006508692.tif 000007
（式中、ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｄは、本明細書中上記に記載されるように、一般式Ｖを有する架橋基であり、さらに、Ｄが一方の端部でＡ（式ＶＩ、式ＶＩＩおよび式Ｘ）に結合している場合、ＵまたはＶはアルキレン鎖における１つの炭素原子に結合しており、また、Ｄが一方の端部でＢ１またはＢｎ（式ＶＩＩＩ、式ＩＸおよび式Ｘ）に結合している場合、ＵまたはＶはアルキレン鎖における１つの炭素原子に結合している；
ただし、Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される）。
【００９０】
アルキレン鎖のＡ、Ｂ１およびＢｎは、好ましくは、本明細書中上記に記載される通りである。
【００９１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ポリアミンキレーターは少なくとも１つの線状ポリアミンおよび少なくとも１つの環状ポリアミンを含む。
【００９２】
そのようなポリアミンキレーターは、好ましくは、下記の一般式ＸＩを有する：
2006508692.tif 000008
（式中、ｎは１よりも大きい整数である；ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｏおよびｔのそれぞれは独立して、０〜１０の整数である；Ｅ１、Ｅ２およびＥｎのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような線状ポリアミンである；Ｇ１、Ｇ２およびＧｎのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような環状ポリアミンである；Ｑ１、Ｑ２およびＱｎのそれぞれは独立して、これらのポリアミンの２つの間を連結するリンカーである；
ただし、Ｑ１、Ｑ２およびＱｎの少なくとも１つがアミン基であり、かつ／または、線状ポリアミンおよび環状ポリアミンの少なくとも１つが少なくとも１つのフリーのアミン基を有する）。
【００９３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、Ｑ１、Ｑ２およびＱｎのそれぞれは独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、アミン、アゾ、アミド、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、ケトエステル、カルボニル、チオカルボニル、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバマート、チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシおよびシラザからなる群から選択される）。
【００９４】
記載された好ましい実施形態におけるより一層強い特徴によれば、ポリアミンキレーターは、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、カプトプリル、ペニシラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、１，７−ジオキサ−４，１０−ジアザシクロドデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン、１，４，７−トリアザシクロノナン三塩酸塩、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンからなる群から選択される。
【００９５】
本発明は、幹細胞について造血単核細胞を事前に濃縮することなく造血幹細胞を拡大する方法を提供することによって、現在知られている形態の様々な欠点に対処することに成功している。
【００９６】
別途に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記に記載される。矛盾する場合には、本特許明細書（定義を含む）が優先する。さらに、材料、方法および例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００９７】
図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図面において：
図１ａ〜ｂは造血単核細胞の培養におけるＣＤ３４＋造血幹細胞の拡大に対するＴＥＰＡキレーターの影響を例示する。臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）がサイトカインの存在下で培養バッグに接種され、ＴＥＰＡキレーターが補充され（ＭＮＣ−ＴＥＰＡ）、または、ＴＥＰＡキレーターが補充されなかった（ＭＮＣコントロール）。比較のために、精製されたＣＤ３４＋細胞が、ＴＥＰＡキレーターを補充することなく、同様に、サイトカインの存在下で培養バッグに接種された（ＣＤ３４＋培養）。すべての培養物は１２週間インキュベーションされ、１週間間隔で、ＣＤ３４＋細胞が、ｍｉｎｉＭａｃｓカラムを使用して培養物から精製され、計数される。
図２は上記に記載された未処理ＭＮＣ培養物、ＴＥＰＡ処理ＭＮＣ培養物およびＣＤ３４＋細胞培養物におけるＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞密度のＦＡＣＳ分析を例示する。
図３は上記に記載された未処理ＭＮＣ培養物、ＴＥＰＡ処理ＭＮＣ培養物およびＣＤ３４＋細胞培養物から１週間間隔で測定されたコロニー形成細胞（ＣＦＵ）の比較可能な数を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
本発明は、造血単核細胞に微量画分として存在する造血幹細胞の集団を、幹細胞を最初に濃縮することなく、その一方で同時に、造血幹細胞の分化を実質的に阻害しながらエクスビボ拡大する方法に関する。本発明は、幹細胞について造血単核細胞を事前に濃縮することなく、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、幹細胞の供給源としての造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を使用して、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団を効率的に提供するために使用することができる。本発明の造血幹細胞の拡大された集団は、例えば、造血細胞の移植において、細胞遺伝子治療のための遺伝子操作に好適な幹細胞を作製することにおいて、ならびに、さらなる適用、例えば、限定されないが、養子免疫療法、インビボでのシス分化状況およびトランス分化状況における幹細胞の埋込み、ならびに、シス分化状況およびトランス分化状況におけるエクスビボ組織工学などにおいて使用することができる。
【００９９】
本発明の方法では、上記で記載された造血幹細胞集団のエクスビボ拡大を誘導し、それにより、造血幹細胞のエクスビボ拡大のための効率的で、簡略化され、かつ、それにもかかわらず、万能的な技術を提供するために、ＣＤ３８の発現および／または活性を妨げ、かつ／ならびに細胞内の銅含有量を妨げる様々な分子（これはまた本明細書中では薬剤として示される）が利用される。
【０１００】
本発明の原理および操作は、図面ならびに付随する説明および実施例を参照してさらに良く理解することができる。
【０１０１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載に示されるか、または実施例の節において例示される構成要素の組み立ておよび構成の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明目的のためであり、限定であるとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【０１０２】
本明細書中上記で議論されたように、国際特許出願公開ＷＯ９９／４０７８３、同ＷＯ００／１８８８５、および、Ｐｅｌｅｄ他、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１１６：６５５、２００２では、細胞の銅が、造血前駆細胞の自己再生と分化との間のバランスを調節することに関与していることが教示される。これらの参考文献の教示によれば、銅と結合することができる遷移金属キレーター（例えば、線状ポリアミンのテトラエチレンペンタミンなど）を早期作用サイトカインの存在下でＣＤ３４＋細胞培養物に添加することにより、銅含有量が３０％減少し、長期にわたるＣＦＵおよびＣＤ３４＋細胞の拡大に関して長期培養物の継続期間が長くなった。従って、これらの参考文献では、遷移金属キレーター（特に銅キレーター）の存在下でのエクスビボで幹細胞集団を拡大する方法が教示され、さらには、得られた拡大された幹細胞集団の様々な適用における使用が教示される。
【０１０３】
国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２には、銅キレート、すなわち、銅イオンとの複合体を形成し、そしてまた、そのような細胞の培養培地に加えられたときには、幹細胞および始原細胞の増殖を促進させ、かつ分化を阻害する銅キレーターが開示される。国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２の教示によれば、これらの知見は、幹細胞および始原細胞の増殖および分化に対する銅キレートのこの作用が、細胞の銅含有量だけに関連せず、むしろ、さらなる調節経路に関連することを示唆している。
【０１０４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６４および米国仮特許出願第６０／４５２５４５号（これらは、本明細書中に十分に示されているかのように参照により組み込まれる）には、ＣＤ３８の発現および／または活性を妨げることができる一連の分子により、幹細胞の分化プロセスが抑制され、また、１６週間〜１８週間までの期間ではあるが、活発な細胞増殖および細胞拡大（再生）の段階がエクスビボで可逆的な様式で刺激され、かつ長くなることが開示される。従って、これらの参考文献は、幹細胞集団をエクスビボで拡大する方法であって、ＣＤ３８の発現をダウンレギュレーションする薬剤、またはＣＤ３８の活性を阻害する薬剤のいずれかを幹細胞の培養培地に加えることを伴う方法を教示している。従って、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６４および米国仮特許出願第６０／４５２５４５号に開示された方法では、様々な分子が用いられており、例えば、ＲＡＲスーパーファミリーおよびＲＸＲスーパーファミリーのレチノイン酸受容体アンタゴニスト；ビタミンＤ受容体アンタゴニスト；抗ＣＤ３８、抗レチノイン酸受容体、抗レチノイドＸ受容体、抗ビタミンＤ受容体などの抗体をコードするポリヌクレオチド；これらの受容体をコードする内因性ポリヌクレオチドの分解を生じさせるために向けられたポリヌクレオチド；ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を妨げることができる分子；ならびに、ニコチンアミドおよびその関連化合物などのＣＤ３８阻害剤などが用いられている。
【０１０５】
従って、国際特許出願公開ＷＯ９９／４０７８３、同ＷＯ００／１８８８５、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６４および米国仮特許出願第６０／４５２５４５号はすべて、幹細胞集団のエクスビボ拡大のための方法における、幹細胞（特に造血幹細胞）の自己再生と分化との間のバランスを、異なった経路および／または機構を介して調節する様々な分子の使用を教示している。しかしながら、別途示されない限り、これらの分子による幹細胞の自己再生および分化の調節は、これらの参考文献の教示によれば、培養された細胞が幹細胞および／または前駆細胞について最初に濃縮されたときに得られ、従って、当該分野における現在の他の技術と一致して、予備的な幹細胞濃縮を必要とする。
【０１０６】
本発明を実施に移しているとき、驚くべきことに、そして予想外にも、細胞の供給源が単核血液細胞の完全な画分（すなわち、濃縮されてない幹細胞）を含むとき、銅キレーター、銅キレートおよびレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストなどの分子が造血幹細胞の分化を抑制し、かつ、造血幹細胞の増殖を刺激し、その増殖が長くなることが発見された。
【０１０７】
本明細書中上記の背景の節で記載されたように、非常に好都合ではあるが、現時点では、濃縮されていない幹細胞を拡大するための技術は開示されていない。従って、事前の幹細胞濃縮を要しない、造血幹細胞集団をエクスビボ拡大する方法を伴う本明細書中に示され、かつ例示される技術は、エクスビボ拡大された造血幹細胞集団を得る効率的で、簡略された費用効果的な方法を規定する。本明細書中に示された技術によって得られる拡大された造血幹細胞集団は、様々な適用において使用することができ、いくつかが下記に列挙される。
【０１０８】
造血細胞の移植：造血細胞の移植は、種々の遺伝病または悪性疾患に最適な治療となりつつある。初期の移植手順は骨髄（ＢＭ）集団全体を使用していたが、最近では、幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）を富化させたより顕著な特性を有する集団が使用されている（Ｖａｎ  Ｅｐｐｓ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ，  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ，ａｎｄ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：４１１，１９９４）。骨髄に加えて、このような細胞は、末梢血（ＰＢ）および新生児臍帯血（ＣＢ）などの他の供給源から得ることもできる（Ｅｍｅｒｓｏｎ  ＳＧ．Ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：３０８２，１９９６）。ＢＭと比較して、ＰＢ細胞の移植により、汎血球減少の期間が短くなり、感染および出血のリスクが低くなる（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｃｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２８３，１９９５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：１６８７，１９９６；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｈｅａｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ５：２４７，１９９６）。
【０１０９】
移植にＰＢを使用するさらなる利点は、その利用しやすさである。ＰＢの移植を制限する要因は、循環している多能性幹細胞／先祖細胞数が少ないことである。
【０１１０】
移植に十分なＰＢ由来の幹細胞を得るためには、これらの細胞を、化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環へのその動員後に、ロイコフォレシスを繰り返すことによって「採取」する（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｃｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２８３，１９９５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：１６８７，１９９６）。このような処置は、正常なドナーには明らかに適切ではない。
【０１１１】
移植へのエクスビボで拡大した幹細胞の使用は以下の利点を有している（Ｋｏｌｌｅｒ  ＭＲ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  ＳＧ，Ｐａｌｓｓｏｎ  ＢＯ．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８２：３７８，１９９３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：４０４，１９９４）。
【０１１２】
成体造血系の再構成に必要な血液量を減少させ、動員およびロイコフォレシスの必要性を回避することができる（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２８３，１９９５）。
【０１１３】
将来使用する可能性のために少数のＰＢまたはＣＢ幹細胞を保存することができる。
【０１１４】
悪性疾患のレシピエントの自己移植の場合には、自己輸液への腫瘍細胞の混入が、多くの場合、疾患の再発の一因となる（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２８３，１９９５）。ＣＤ３４＋幹細胞を選択し拡大させることにより、最終的な移植片中の腫瘍細胞の負荷量が減少する。
【０１１５】
培養によりＴリンパ球が有意に減少し、これは移植片対宿主病の軽減のための同種異系移植の状況に有用であり得る。
【０１１６】
臨床試験は、少数のＰＢ ＣＤ３４＋細胞に由来するエクスビボで拡大させた細胞の移植により、高用量の化学療法で処置したレシピエントの造血を回復させることができることが示されるにもかかわらず、結果は依然としてこれらの培養細胞の長期間にわたるインビボ造血能力について結論を得ていない（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２８３，１９９５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：１６８７，１９９６）。
【０１１７】
移植の成功のためには、血球減少期間の短縮ならびに長期間の植え付けが重大である。移植片に中期および後期先祖（前駆）細胞を含めることにより、ドナー由来の成熟細胞の産生が促進され、それにより血球減少期間を短縮することができる。したがって、エクスビボで拡大させた細胞には、幹細胞に加えて、短期間での回復および造血の長期間にわたる修復を最適にするためのより分化した先祖細胞が含まれることが重要である。幹細胞の拡大を同時に生じる、中期および後期先祖細胞（特に、好中球および巨核球系統に方向付けられたもの）の拡大はこの目的に役立つはずである（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８６：９５８，１９９５）。
【０１１８】
このような培養物は、骨髄が完全に取り除かれたレシピエントの造血の回復、さらには従来の放射線治療および化学療法後のレシピエントの骨髄回復を早めるための支援手段の獲得に有用であり得る。
【０１１９】
稀な細胞における遺伝的欠損の出生前診断：出生前診断は、妊婦由来の子宮内の胚細胞の採取および遺伝的欠損の分析を含む。好ましい非侵襲性の胚細胞採取手段としては、末梢母体循環系に浸潤した胚性有核赤血球前駆体の分離が挙げられる。しかし、これらの細胞の量は非常に少ないので、さらに本発明を適用して、分析の前に、本明細書中に記載の方法によりこのような細胞を拡大させる。したがって、本発明は、出生前診断に適用するための胚細胞の拡大手段を提供する。
【０１２０】
遺伝子治療：長期間にわたる遺伝子治療の成功のためには、そのゲノム内に安定に組み込まれた導入遺伝子で遺伝子が改変された幹細胞が高頻度で存在することが絶対に必要である。ＢＭ組織では、大部分の細胞は、循環している先祖細胞および前駆細胞であり、幹細胞は細胞集団の小さい割合を構成するにすぎず、そのほとんどが休止した循環していない状態にある。ウイルスベースの（例えば、レトロウイルス）ベクターは、宿主ゲノム中に導入遺伝子を組み込むために活発な細胞分裂を必要とする。したがって、新鮮なＢＭ幹細胞への遺伝子導入はあまり効果がない。精製された幹細胞集団を拡大させ、その細胞分裂をエクスビボで調節する能力により、その遺伝子を改変する可能性が増大する（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ＲＤ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｈｅａｖｙ  ｍｅｔａｌｓ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｚｉｎｃ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ＭＴＦ−１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（４）：１２１９−１２２３，１９９４）。
【０１２１】
養子免疫療法：エクスビボで拡大させ、顕著な特性を有するリンパ系小集団が研究されており、種々の悪性疾患、免疫不全疾患、ウイルス性疾患、および遺伝性疾患の養子免疫療法に使用されてきた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：４６，１９９６；Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：５５１，１９９６；Ｐｒｏｔｔｉ  ＭＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｉｍｅ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：１２１０，１９９６）。
【０１２２】
この処置により、必要な免疫応答が増強されるか、または欠損機能が置き換えられる。このアプローチは、非常に多数の自己のエクスビボで拡大させられた非特異的キラーＴ細胞を、続いて、エクスビボで拡大させられた特異的腫瘍浸潤性リンパ球を使用して、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８５：６２２，１９９３）によって最初に行われた。
【０１２３】
同様に、機能的に活性な抗原提示細胞を、サイトカインを維持させた培養物中のＣＤ３４＋ＰＢ細胞の出発集団から成長させることができた。これらの細胞は、インビトロで、自己Ｔ細胞に対する可溶性タンパク質抗原を提示することができるので、高用量の免疫治療の投与後に残っている極小さい病変の免疫療法に新しい見通しを与える。同様に、抗原を提示する樹状細胞のエクスビボでの拡大も研究されており、これは現在提案されている技術のさらなる有望な適用である（Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：９９，１９９５；Ｆｉｓｃｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：５９５，１９９６；Ｓｉｅｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｓｓｉｖｅ  ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＣＤ３４＋  ｂｌｏｏｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｔ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２３：１４６３，１９９６）。
【０１２４】
本明細書中上記で簡単に議論され、さらには国際特許出願公開ＷＯ９９／４０７８３、同ＷＯ００／１８８８５、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６４および米国仮特許出願第６０／４５２５４５号に詳しく記載されるように、銅キレーター、銅キレートおよびレチノイド受容体アンタゴニストはそれぞれが、幹細胞の自己再生を、異なる経路を介して調節し、これにより、幹細胞の低下した分化および延長された増殖を生じさせる種々の細胞事象をもたらす。従って、これらの分子は、混合造血細胞集団に存在する造血幹細胞集団を拡大する作用を誘導することができる広範囲の様々な分子を表している。
【０１２５】
従って、本発明の１つの局面によれば、造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のための、そして同時に、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することによって達成される。
【０１２６】
本明細書中で使用される表現「造血単核細胞」は、血液サンプルに存在する白血球の全レパートリーを示す。健康なヒトにおいて、白血球は、造血系の方向づけられた細胞および分化した細胞の混合物（典型的には、９９％を越える単核細胞が方向づけられた細胞である）を含み、これには、例えば、方向づけられた始原細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３３＋（骨髄系の方向づけられた細胞）、ＣＤ３４＋ＣＤ３＋（リンパ系の方向づけられた細胞）、ＣＤ３４＋ＣＤ４１＋（巨核球系の方向づけられた細胞）、および分化した細胞、すなわち、ＣＤ３４−ＣＤ３３＋（骨髄系細胞、例えば、顆粒球および単球など）、ＣＤ３４−ＣＤ３＋、ＣＤ３４−ＣＤ１９＋（それぞれ、Ｔ細胞およびＢ細胞）、ＣＤ３４−ＣＤ４１＋（巨核球）、ならびに造血幹細胞および初期始原細胞、例えば、ＣＤ３４＋Ｌｉｎｅａｇｅ陰性（Ｌｉｎ−）、ＣＤ３４−Ｌｉｎｅａｇｅ陰性ＣＤ３４＋ＣＤ３８−（典型的には１％未満）が含まれる。
【０１２７】
表現「造血系の方向づけられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞」は、白血球画分の任意の部分を記述するために本明細書中では使用され、この場合、細胞の大部分は造血系の方向づけられた細胞であり、その一方で、細胞の少数部分は造血幹細胞および造血前駆細胞である。これらの用語は本明細書中下記においてさらに定義される。
【０１２８】
造血単核細胞は、典型的には、血液サンプルをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ層に載せ、密度勾配遠心分離後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅと血清との間に存在する境界層を集めることによって血液サンプルから得られ、この場合、そのような境界層は、本質的にはすべてが、血液サンプルに存在する白血球からなる。
【０１２９】
本明細書中で使用される表現「造血系の方向づけられた細胞」は、特定の造血細胞に方向づけられ、従って、生理学的条件のもとで、実質的にはこの特定の造血系譜にだけ発達することができる分化した造血細胞を示す。
【０１３０】
本明細書中で使用される表現「造血幹細胞」は、正しい増殖条件が与えられた場合、血液に存在する任意の細胞系譜に発達することができる多能性の造血細胞を示す。本明細書中で使用されるこの表現は、血液における細胞集団を生じさせる元となる最も初期の再生可能な造血細胞集団（例えば、ＣＤ３４−／ＡＣ１３３＋細胞、ＣＤ３４−／ＡＣ１３３−／Ｌｉｎｅａｇｅ−細胞、ＣＤ３４＋／ＡＣ１３３＋細胞）、および、幾分より分化しているが、未だ拘束されておらず、容易に逆戻りして、最も初期の再生可能な造血細胞集団の一部になることができる非常に初期の造血前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、特に、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）の両方を示す。
【０１３１】
通常のヒトでは、造血系の多能性幹細胞および方向づけられた始原細胞のほとんどがＣＤ３４＋である。大部分の細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８＋であり、少数の細胞（１０％未満）がＣＤ３４＋ＣＤ３８−である。
【０１３２】
ＣＤ３４＋ＣＤ３８−幹細胞画分は、自己再生および多系譜分化が可能である最も未熟な造血細胞であることが確認されている。この画分は、より長期にわたる培養を開始させる細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）のプレＣＦＵを含有し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞画分と比較して、幹細胞のより長い維持と、サイトカインに対する遅れた増殖応答とを示す。
【０１３３】
現在、造血幹細胞は、上記で記載されたように密度差遠心分離により得られる造血単核細胞をさらに濃縮することによって得られている。このさらなる濃縮プロセスは、典型的には、免疫磁石分離またはＦＡＣＳなどの免疫分離によって行われ、造血幹細胞について濃縮された細胞画分をもたらしている。
【０１３４】
従って、造血単核細胞を、造血幹細胞の拡大された集団を得るための直接の供給源として使用することにより、拡大前の幹細胞濃縮が必要であることが回避され、それにより、プロセスが効率および費用の両方に関して実質的に簡略化される。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合は、用語「阻害」は、減速、減少、遅延、防止、または廃止をいう。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合は、用語「分化」は、発達の間の比較的一般化または特殊化した変化をいう。種々の系統の細胞分化は、十分に報告されたプロセスであり、本明細書中でさらに説明する必要はない。本明細書中で使用される場合は、用語「分化」は、多くの場合に細胞分裂に関与しているが、機能するための特定の細胞型へと成熟し、次いで例えばプログラムされた細胞死によって死滅するプロセスである、成熟とは異なる。
【０１３７】
句「細胞の拡大」は、実質的に細胞分化を欠く細胞増殖プロセスを説明するために本明細書中で使用する。したがって、拡大される細胞は、その細胞再生特性を維持し、多くの場合は、本明細書中で再生可能な細胞（例えば、再生可能な幹細胞）をいう。
【０１３８】
従って、造血幹細胞のための供給源として造血単核細胞を使用する造血幹細胞の拡大は、本発明によって教示されるように、単核細胞に存在する造血幹細胞および造血前駆細胞からなる（１％未満の）微量画分を、拡大後に、造血細胞集団だけではないが、少なくとも主画分に変換することをもたらし、それにより、幹細胞拡大の経過途中において、方向づけられた細胞が実質的に希釈され、かつ／または死滅する。
【０１３９】
本明細書中で使用される場合は、用語「エクスビボ」は、生きた生物から細胞を取り出し、生物外（例えば、試験管内）で増殖させるプロセスをいう。しかし、本明細書中で使用される場合は、用語「エクスビボ」は、種々の細胞株（例えば、ＨＬ−６０、ＭＥＬ、ＨｅＬａなど）などのインビボでのみ増殖することが公知の細胞を培養するプロセスについては言わない。言い換えれば、本発明によってエクスビボで拡大された細胞は、これらが最終的に分化するという点で、細胞株に転換していない。
【０１４０】
エクスビボでの細胞増殖のための条件をエクスビボで増殖させた細胞に与えることは、栄養素、好ましくは１つ以上のサイトカイン（以下にさらに詳述する）を細胞にあてがうことを含む。
【０１４１】
上記のように、造血単核細胞をエクスビボで増殖させる条件での造血単核細胞の処理と同時に、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるために細胞を短期間または長期間処理する。
【０１４２】
本発明の１つの実施形態では、ＣＤ３８活性を阻害する薬剤（すなわち、ＣＤ３８インヒビター）を細胞に与えることによって、ＣＤ３８活性を低下させる。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合は、「ＣＤ３８インヒビター」は、幹細胞中でＣＤ３８活性をダウンレギュレート（下方制御）または抑制することができる薬剤をいう。
【０１４４】
本発明のこの態様のＣＤ３８インヒビターは、ＣＤ３８内因性活性を阻害する「直接的インヒビター」またはＣＤ３８シグナル伝達成分（例えば、ｃＡＤＰＲおよびリアノジンシグナル伝達経路）またはＣＤ３８活性に影響を受ける他のシグナル伝達経路の活性または発現を阻害する「間接的インヒビター」であり得る。
【０１４５】
本発明のこの態様の現在公知の実施形態によれば、ニコチンアミドは好ましいＣＤ３８インヒビターである。
【０１４６】
したがって、１つの実施形態では、本発明のこの態様による方法を、ニコチンアミド自体、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物のいずれかを造血単核細胞に与えることによって行う。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合は、句「ニコチンアミドアナログ」は、ニコチンアミドと同様に作用することが公知の任意の分子をいう。ニコチンアミドアナログの代表例には、ベンズアミド、ニコチンチオアミド（ニコチンアミドのチオールアナログ）、ニコチン酸、およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
句「ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体」は、ニコチンアミド自体の、またはニコチンアミドのアナログの任意の構造誘導体をいう。このような誘導体の例には、置換ベンズアミド、置換ニコチンアミド、およびニコチンチオアミド、およびＮ置換ニコチンアミドおよびニコチンチオアミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
句「ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物」は、ニコチンアミドまたはそのアナログ由来の生成物（例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、およびＮＡＤＰＨなど）をいう。
【０１５０】
あるいは、本発明のこの態様のＣＤ３８インヒビターは、例えばＣＤ３８触媒ドメインに結合することによってＣＤ３８触媒活性を阻害する活性な中和抗体であり得る。それにもかかわらず、ＣＤ３８が細胞内タンパク質であるので、原形質膜を介して送達することができるインヒビターの使用手段がとられることが認識される。これに関して、Ｆａｂフラグメント（以下に記載）などの断片化抗体を使用することが好ましい。
【０１５１】
本発明で使用される、用語「抗体」には、完全な分子ならびにマクロファージに結合することができるその機能的フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）が含まれる。これらの機能的抗体フラグメントを以下のように定義する：
Ｆａｂ：抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含み、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を得るために酵素パパインでの完全な抗体の消化によって産生される、フラグメント；
Ｆａｂ’：完全な軽鎖および重鎖の一部を得るためにペプシンでの完全な抗体の処理およびその後の還元によって得ることができる抗体分子のフラグメント；抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；
（Ｆａｂ’）２：その後に還元することなく酵素ペプシンでの完全な抗体の処理によって得ることができる抗体のフラグメント；（Ｆａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合により互いに結合した２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；
Ｆｖ：２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；および
単鎖抗体（「ＳＣＡ」）：適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子融合された１本鎖分子としての遺伝子操作された分子。
【０１５２】
これらのフラグメントの作製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【０１５３】
本発明の抗体フラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）でフラグメントをコードするＤＮＡを発現させることによって調製することができる。
【０１５４】
従来の方法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化によって、抗体フラグメントを得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを得るためのペプシンでの抗体の酵素分解によって抗体フラグメントを産生することができる。チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基をブロックする基を使用してこのフラグメントをさらに切断して、１価の３．５ＳＦａｂ’フラグメント産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、２つの１価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４０３６９４５号、および同第４３３１６４７号ならびにこれらに記載の参考文献（これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用されている）によって記載されている。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９−１２６，１９５９もまた参照のこと。フラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りは、１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素技術、化学的技術、または遺伝子技術などの抗体を切断するための他の方法を使用することもできる。
【０１５５】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の結合を含む。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２，１９７２に記載のように、この結合は非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合によって結合するか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチド結合によって連結したＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）を、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ｓＦｖの産生方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：９７−１０５，１９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９９８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７，１９９３；ａｎｄ  Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４９４６７７８号（その全体が本明細書中で参考として援用されている）によって記載されている。
【０１５６】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子の構築によって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製する。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。
【０１５７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体、取り込まれたＣＤＲ、またはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、実質的に全て、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１５８】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源由来のアミノ酸残基に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。典型的には導入可変ドメインから採取されるこれらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基といわれる。本質的に、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の対応するヒト抗体配列との置換によるＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））にしたがってヒト化を行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインがヒト以外の種由来の対応配列に置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際には、ヒト化抗体は一般に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１５９】
当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を使用してヒト抗体を産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ヒトモノクローナル抗体の調製のためのＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術も利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、トランスジェニック動物（例えば、外因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によってヒトを作製することができる。チャレンジにより、ヒト抗体産生が認められる。これは、遺伝子の再配置、構築、および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトで認められる非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１６０】
あるいは、本発明のこの態様による方法を、エクスビボで培養した造血単核細胞にＣＤ３８発現をダウンレギュレートする薬剤を与えることによって行うことができる。
【０１６１】
ＣＤ３８発現をダウンレギュレートする薬剤とは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでＣＤ３８合成（遅延）または分解（加速）に影響を与える任意の薬剤をいう。例えば、本発明のこの態様にしたがって、ＣＤ３８発現をダウンレギュレートするようにデザインした干渉性低分子ポリヌクレオチドを使用することができる。
【０１６２】
ＣＤ３８発現をダウンレギュレートすることができる干渉性低分子ヌクレオチドの例は、干渉性低分子ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ（例えば、Ｍｕｎｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｕｎｓｈｉ  ＣＢ，Ｇｒａｅｆｆ  Ｒ，Ｌｅｅ  ＨＣ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２  Ｄｅｃ  ２０；２７７（５１）：４９４５３−８）によって記載された、以前に記載されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２）によってｍＲＮＡの配列特異的分解を指示する、二重鎖オリゴヌクレオチドを含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド）である。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合は、句「二重鎖オリゴヌクレオチド」は、１つの自己相補性核酸鎖または少なくとも２つの相補性核酸鎖のいずれかによって形成されたオリゴヌクレオチド構造またはその模倣物をいう。本発明の「二重鎖オリゴヌクレオチド」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、単離ＲＮＡ（すなわち、部分精製されたＲＮＡ（本質的に純粋なＲＮＡ））、合成ＲＮＡ、および組換えＲＮＡから構成され得る。
【０１６４】
好ましくは、本発明の特異的干渉性低分子二重鎖オリゴヌクレオチドは、主にリボ核酸から構成されるオリゴリボヌクレオチドである。
【０１６５】
ＲＮＡ干渉を媒介することができる二重鎖オリゴヌクレオチドの作製説明書は、ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍに記載されている。
【０１６６】
したがって、本発明の干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子（干渉性ＲＮＡ分子）であり得る。
【０１６７】
あるいは、干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、以下にさらに記載されているＣＤ３８特異的アンチセンス分子またはリボザイム分子などのオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１６８】
本発明の教示にしたがってデザインしたオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成方法（酵素合成または固相合成など）にしたがって作製することができる。固相合成を実施するための装置および試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。このような合成のための任意の他の手段も使用することができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６９】
本発明のこの実施形態で使用したオリゴヌクレオチドは、１０〜約２００塩基、好ましくは１５〜１５０塩基、より好ましくは２０〜１００塩基、最も好ましくは２０〜５０塩基の範囲から選択される長さを有するものである。
【０１７０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、３’〜５’ホスホジエステル結合で結合したプリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含み得る。
【０１７１】
好ましくは、使用するオリゴヌクレオチドは、以下で広く説明するように、骨格、ヌクレオシド間結合、または塩基のいずれかで修飾されたものである。このような修飾は、しばしばオリゴヌクレオチド取り込みおよび細胞内条件に対する抵抗性を促進させることができる。
【０１７２】
本発明のこの態様で有用な好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド内結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとして、米国特許第４６８７８０８号、同第４４６９８６３号、同第４４７６３０１号、同第５０２３２４３号、同第５１７７１９６号、同第５１８８８９７号、同第５２６４４２３号、同第５２７６０１９号、同第５２７８３０２号、同第５２８６７１７号、同第５３２１１３１号、同第５３９９６７６号、同第５４０５９３９号、同第５４５３４９６号、同第５４５５２３３号、同第５４６６６７７号、同第５４７６９２５号、同第５５１９１２６号、同第５５３６８２１号、同第５５４１３０６号、同第５５５０１１１号、同第５５６３２５３号、同第５５７１７９９号、同第５５８７３６１号、および同第５６２５０５０号に開示の骨格中にリン原子を保持するものが挙げられる。
【０１７３】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、通常の３’−５’結合を有するホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルのホスホネート（３’アルキルホスホネートおよびキラルなホスホネートを含む）、ホスフィナート、ホスホラミデート（３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネートを含む）、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’で結合している逆の極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も使用することができる。
【０１７４】
あるいは、その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、混合へテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、または１つ以上の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド内結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルフォキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分を有する他の骨格を有するものが含まれ、これらは、米国特許第５０３４５０６号、同第５１６６３１５号、同第５１８５４４４号、同第５２１４１３４号、同第５２１６１４１号、同第５２３５０３３号、同第５２６４５６２号、同第５２６４５６４号、同第５４０５９３８号、同第５４３４２５７号、同第５４６６６７７号、同第５４７０９６７号、同第５４８９６７７号、同第５５４１３０７号、同第５５６１２２５号、同第５５９６０８６号、同第５６０２２４０号、同第５６１０２８９号、同第５６０２２４０号、同第５６０８０４６語、同第５６１０２８９号、同第５６１８７０４号、同第５６２３０７０号、同第５６６３３１２号、同第５６３３３６０号、同第５６７７４３７号、同第５６７７４３９号に開示されている。
【０１７５】
本発明で使用することができる他のオリゴヌクレオチドは、糖およびヌクレオシド内結合の両方が修飾されたものである（すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規の基に置換されている）。適切なポリヌクレオチド標的との相補性のために塩基単位は維持される。このようなオリゴヌクレオチド模倣物の例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）に置換されたオリゴヌクレオチドをいう。塩基が保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号（それぞれ本明細書中で参考として援用されている）が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用することができる他の骨格修飾は、米国特許第６３０３３７４号に開示されている。
【０１７６】
本発明のオリゴヌクレオチドには、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用される場合は、「非修飾」または「天然の」塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の塩基が含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基としては、米国特許第３６８７８０８号に開示の塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｉｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示の塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示の塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されている塩基を挙げることができる。このような塩基は、特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増大に有用である。これらには、５置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５−メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２７６−２７８）、これが現在好ましい塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるとさらに好ましい。
【０１７７】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増大させる１つ以上の部分もしくは抱合体へのオリゴヌクレオチドの化学結合を含む。このような部分には、米国特許第６３０３３７４号に開示のコレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール）またはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
所与のオリゴヌクレオチド分子中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、１つの化合物または１つのオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドに１つ以上の上記修飾を組み込むことができる。
【０１７９】
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはキメラ分子であるアンチセンス分子である。「キメラアンチセンス分子」は、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドから構成される２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解耐性の増大、細胞取り込みの増大、および／または標的ポリヌクレオチドに対する結合親和性の増大を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として作用することができる。このような酵素の例には、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるＲＮアーゼＨが含まれる。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化により、ＲＮＡ標的が切断され、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が非常に増大する。したがって、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合、同一の標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して短いオリゴヌクレオチドを使用して類似の結果をしばしば得ることができる。必要に応じて、当該分野で公知の核酸ハイブリッド形成技術と組み合わせたゲル電気泳動によってＲＮＡ標的の切断を日常的に検出することができる。
【０１８０】
上記のように２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの複合構造（修飾オリゴヌクレオチド）として本発明のキメラアンチセンス分子を形成することができる。このようなハイブリッド酵素の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５０１３８３０号、同第５１４９７９７号、同第５２２０００７号、同第５２５６７７５号、同第５３６６８７８号、同第５４０３７１１号、同第５４９１１３３号、同第５５６５３５０号、同第５６２３０６５号、同第５６５２３５５号、同第５６５２３５６号、および同第５７００９２２号（それぞれ全体が本明細書中で参考として援用されている）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、リボザイム配列をさらに含み得る。リボザイムは、ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のために使用されつつある。いくつかのリボザイム配列を、本発明のオリゴヌクレオチドに融合することができる。これらの配列には、ＶＥＧＦ−Ｒ（血管内皮成長因子受容体）の形成を特異的に阻害するＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（血管形成経路における重要成分）、およびＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するようにデザインされたリボザイム）（Ｒｙｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
あるいは、本発明の干渉性低分子ポリヌクレオチドは、ＤＮＡｚｙｍｅであり得る。
【０１８３】
ＤＮＡｚｙｍｅは、一本鎖の触媒性核酸分子である。ＤＮＡｚｙｍｅの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡｚｙｍｅは、それぞれ７から９個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインに隣接した１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このＤＮＡｚｙｍｅ型は、プリン：ピリミジン連結点でその基質ＲＮＡを有効に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９；ＤＮＡｚｙｍｅの概説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００２，４：１１９−２１を参照のこと）。
【０１８４】
一本鎖および二本鎖標的切断部位を認識する合成された操作ＤＮＡｚｙｍｅの構築および増幅の例は、Ｊｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第６３２６１７４号に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向する類似のデザインのＤＮＡｚｙｍｅは、最近、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、インビボで結腸癌細胞転移を首尾よく阻害することが認められた（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４０９，Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用では、ｂｃｒ−ａｂ１癌遺伝子に相補的なＤＮＡｚｙｍｅは、白血病細胞中での癌遺伝子の発現を首尾よく阻害し、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合には、自己骨髄移植における再発率を低下させた。
【０１８５】
あるいは、上記のように、およびＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６４および米国仮特許出願第６０／４５２５４５号にさらに詳しく記載されるように、レチノイド受容体の活性および／または発現をダウンレギュレートまたは抑制するレチノイド受容体スーパーファミリーインヒビター（例えば、アンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、抗体など）を使用して、ＣＤ３８発現をダウンレギュレートすることができる。
【０１８６】
簡単に述べれば、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、およびビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）などのレチノイド受容体は、細胞の増殖および分化ならびに特にＣＤ３８発現の調節に関連する遺伝子発現経路の調節に関与していることが報告されている（Ｋａｐｉｌ  Ｍ．，Ｔｅｒｅｓａ  Ｍ．，Ｔａｇｈｉ  Ｍ．，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｃ．，Ｍａｈｅｒ  Ａ．．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３８  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３６０７−３６１４；Ｕｅｎｏ  Ｈ，Ｋｉｚａｋｉ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｈ，Ｍｕｔｏ  Ａ，Ｙａｍａｔｏ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｔ，Ｈｉｄａ  Ｔ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｈ，Ｋｏｅｆｆｌｅｒ  ＨＰ，Ｉｋｅｄａ  Ｙ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＲＡＲ）−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ＨＬ−６０  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＡＲ  ａｌｐｈａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．１９９８；２２：５１７−２５）。したがって、本発明のＣＤ３８発現をダウンレギュレートする好ましい薬剤には、ＲＡＲアンタゴニスト、ＲＸＲアンタゴニスト、およびＶＤＲアンタゴニスト、あるいは、造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を低下させるためのアンタゴニストが含まれる。
【０１８７】
本明細書中で使用される場合は、用語「アンタゴニスト」は、受容体のアゴニストまたは天然のリガンドの効果を反作用または消滅させる薬剤をいう。このようなアンタゴニストに関するさらなる特徴を以下に詳述する。
【０１８８】
さらにあるいは、米国仮特許出願第６０／４５２５４５号に詳しく記載されるように、ＣＤ３８発現のダウンレギュレーションを、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（これはまた、ＰＩ３−キナーゼとして本明細書中を通して示される）の発現および／または活性をダウンレギュレーションすることによって得ることができる。簡単に記載すると、ＰＩ３−キナーゼは、適正な受容体シグナル伝達経路に対する必須因子として、レチノイド受容体スーパーファミリーおよびビタミンＤ受容体などの様々な核受容体の活性化において非常に重要な機能を果たしており、従って、細胞分化に関与することが報告されている。
【０１８９】
従って、ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を妨げる薬剤はまた、本発明によれば、ＣＤ３８をダウンレギュレーションするための好ましい薬剤である。ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤の代表的な例には、既知のＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２、ならびにそれらのアナログ、誘導体および代謝産物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のさらなる例が米国特許第５３７８７２５号（これは、本明細書中に詳しく示されるかのように参照により組み込まれる）に記載される。本発明に従ってＰＩ３−キナーゼの発現をダウンレギュレーションする薬剤の代表的な例には、ＣＤ３８の発現をダウンレギュレーションすることに関して本明細書中上記で記載された方法論を使用するポリヌクレオチド（例えば、小さい干渉性のＲＮＡ分子、アンチセンスリボザイムおよびＤＮＡザイムなど）、ならびに細胞内抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
上記の各薬剤は、ＣＤ３８の発現または活性をそれぞれ低下させることができる。しかし、本発明はまた、これらの薬剤の任意の組み合わせの使用を含むことを目的とする。
【０１９１】
以下にさらに記載するように、本発明のタンパク質薬（例えば、抗体）を、これをコードするポリヌクレオチドから発現させ、適切な遺伝子送達媒介物／方法および核酸構築物を使用してエクスビボした培養造血単核細胞に提供することができることが明らかである。
【０１９２】
適切な構築物の例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（それぞれ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）から市販されている）が含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびパッケージング系の例は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から販売されているもの（多クローニング部位にクローニングすることができ、導入遺伝子がＣＭＶプロモーターから転写される、Ｒｅｔｒｏ−ＸベクターｐＬＮＣＸおよびｐＬＸＳＮが含まれる）である。導入遺伝子が５’ＬＴＲプロモーターから転写されるＭｏ−ＭｕＬＶ由来のベクター（ｐＢａｂｅなど）もまた含まれる。
【０１９３】
本発明のこの態様にしたがって、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、上で詳述するように、ＲＡＲ、ＲＸＲ、またはＶＤＲアンタゴニスト、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤またはニコチンアミドおよびそのアナログなどのＣＤ３８インヒビターを使用してタンパク質レベルまたは遺伝子操作技術による発現レベルのいずれかでＣＤ３８発現および／または活性を調節し、本発明にしたがって、いくつかの好ましい造血単核細胞の造血幹細胞集団のエクスビボでの拡大方法をさらに提供する。
【０１９４】
１つの特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であり、同時に造血幹細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血幹細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
【０１９５】
細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤまたはレチノイン酸、レチノイドＸ、および／またはビタミンＤ受容体のシグナル伝達に対する応答能力を、例えば、受容体アンタゴニストを含む化学的インヒビターの投与によって低下させることができる。
【０１９６】
別の特定の実施形態では、幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、同時に造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタミンＤ受容体を含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血細胞集団を拡大させると同時に造血細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
【０１９７】
細胞のレチノイン酸、レチノイドＸ、および／またはビタミンＤ受容体のシグナル伝達事象に対する応答能力を低下させることには、細胞の連続的または短いパルス期間で供給するアンタゴニストでの処理を含み、これは、そのそれぞれの同族受容体による細胞シグナル伝達経路の縮小または破壊によって行われる。
【０１９８】
ＰＣＴ／ＩＬ０１／０００６４に記載され、例示されるように、開示されたシグナル伝達経路に対する造血細胞の応答能力の低下は可逆的（例えば、本質的の可逆的）である。言い換えれば、本発明のプロトコールを使用して拡大させた細胞は、細胞株とはならない。したがって、このような細胞を十分な拡大後に、分化が誘導される成長条件に供することによって、細胞に対して、エクスビボおよびインビボでのシスおよびトランス分化を含む所望の方向へのエクスビボでの分化を指示することができる。
【０１９９】
本明細書中で使用される場合は、「シス分化」は、成体幹細胞が得られた組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、ＣＤ３４＋造血細胞の異なる方向性／成熟血球への分化はシス分化に含まれる。
【０２００】
本明細書中で使用される場合は、「トランス分化」は、成体幹細胞が得られたものとは異なる組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、ＣＤ３４＋造血細胞の異なる組織起源の細胞（例えば、筋細胞）への分化はトランス分化に含まれる。
【０２０１】
上記アンタゴニストおよび／または上記受容体およびキナーゼのシグナル伝達経路に対する造血単核細胞の応答能力の低下は、有効量の少なくとも１つのレチノイン酸受容体アンタゴニスト、少なくとも１つのレチノイドＸ受容体アンタゴニスト、および／または少なくとも１つのビタミンＤ受容体アンタゴニストの存在下で、好ましくは造血単核細胞の全エクスビボ培養期間の０．１〜５０％、好ましくは０．１〜２５％、より好ましくは０．１〜１５％の期間、または全期間の間、造血単核細胞をエクスビボ培養することによって行われる。これに関して、驚いたことに、アンタゴニストへの最初のパルス曝露が、培養環境からアンタゴニストを除去したずっと後で細胞の拡大を生じるのに十分であることが明らかとなった。
【０２０２】
アンタゴニストの最終濃度は、特定の適用に依存してμＭまたはｍＭの範囲であり得る。例えば、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲内または約４μＭ〜約５０ｍＭの範囲内、より好ましくは約５μＭ〜約４０ｍＭの範囲内である。
【０２０３】
本発明のこのおよび他の局面および実施形態で使用することができるＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＶＤＲの多数のアンタゴニストが現在公知である。
【０２０４】
かかるレチノイン酸受容体アンタゴニストの代表例は以下のものを含むがこれらに限定されない：ＡＧＮ１９４３１０；ＡＧＮ１０９；３−（４−メトキシ−フェニルスルファニル）−３−メチル−酪酸；
６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オン，２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イルトリフルオロメタン−スルホネート；
エチル４−（（２，２ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート；
エチル４−（（２，２ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル）−ベンゾエート（４１）；
チオクロメン−６−イル］−エチニル］−ベンゾエート（イル）；
（ｐ−［（Ｅ）−２−［３’４’−ジヒドロ−４，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’イル］プロペニル］安息香酸１’１’−ジオキシド；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ブトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ペントキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘキソキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−ヘプトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ｎ−オクトキシフェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−（３−ｔ−ブチル−５（１−フェニル−ビニル）−フェニル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ−［７−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−｛［４，５−３Ｈ２］−ｎ−ペントキシ｝フェニル）−３−メチル］−オクタ−２，４，６−トリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸エチルエステル；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−エトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−エトキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−ブチルオキシフェニル］３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−カルボキシアミド）安息香酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−シクロプロピル］−ペンタ−２，４−ジエン酸；
ｐ−［（Ｅ）−２−［３’，４’−ジヒドロ−４’，４’−ジメチル−７’−（ヘプチルオキシ）−２’Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６’−イル］プロペニル］安息香酸；
１’，１’−ジオキシド，４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト［２，３−ｇ］インドール−３−イル）−安息香酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−メトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−エトキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−ヘキシルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３，５−ジ−ｔｅｒｔ．ブチル−２−オクチルオキシフェニル］−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ）−（１ＲＳ，２ＲＳ）−５−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ブトキシ−フェニル）−シクロプロピル］−３−メチル−ペンタ−２，４−ジエン酸；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；
４−（５Ｈ−２，３（２，５ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；
４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；
４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル｝安息香酸；
４−［４−２−メチル−１，２−ジカルバ−クロソ−ドデカボラン−１−イル−フェニルカルバモイル］安息香酸；
４−［４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−７，７，１０，１０−テトラメチル−１−（３−ピリジルメチル）−アントラ［１，２−ｂ］ピロール−３−イル］安息香酸；
（３−ピリジルメチル）−］５−チアアントラ［２，１−ｂ］ピロール−３−イル）安息香酸；および
（３−ピリジルメチル）−アントラ［２ｍｌ−ｄ］ピラゾール−３−イル］安息香酸。
【０２０５】
かかるレチノイドＸ受容体アンタゴニストの代表例は以下のものを含むがこれらに限定されない：ＬＧＮ１００５７２；
１−（３−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；
１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノン；
３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エネニトリル；
３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；
４−［３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸；
４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；
４−［１（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］安息香酸；
４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ベンゼネートトラゾール；
２−［１−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エチル］ピリジン−５−カルボン酸；
エチル−２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボキシレート；
５−［１−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−２−カルボン酸；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；
メチル２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボキシレート；
４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ベンズアミド；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］ピリジン−５−カルボン酸；
２−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸ブチルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸プロピルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸シアノイミン；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸アリルオキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸４−（３−メチルブト−２−エン酸）オキシム；
４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）カルボニル］安息香酸１−アミノエチルオキシム；
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−（３−ｎ−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸；  
４−（５Ｈ−２，３（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−ｎ−プロピルジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸；および
４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５ｍ。
【０２０６】
かかるビタミンＤ受容体アンタゴニストの代表例は以下のものを含むがこれらに限定されない：１α，２５−（ＯＨ）−Ｄ３−２６，２３ラクトン；１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（３）；２５−カルボン酸エステルＺＫ１５９２２２；（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；（２３Ｒ）−２５−デヒドロ−１α−ＯＨ−Ｄ（３）；１β，２５（ＯＨ）２Ｄ３；１β，２５（ＯＨ）２−３−エピ−Ｄ３；（２３Ｓ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；（２３Ｒ）２５−デヒドロ−１α（ＯＨ）Ｄ３−２６，２３−ラクトン；およびブチル−（５Ｚ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，７Ｅ，２２Ｅ−（１Ｓ，３Ｒ，２４Ｒ）−１，３，２４−トリヒドロキシ−２６，２７−シクロ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９），２２−テトラエン−２５−カルボキシレート）。
【０２０７】
上記に列挙したアンタゴニストは、その各同族受容体に対して高親和性を有することが知られている。しかし、これらの分子を他の受容体に対して活性にすることができる場合もある。
【０２０８】
従って別の特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、同時に造血単核細胞のＰＩ３−キナーゼを含むシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
【０２０９】
別の特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物を含むエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血幹細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
【０２１０】
さらに別の特定の実施形態では、造血幹細胞集団をエクスビボで拡大すると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法を、エクスビボでの細胞増殖のための条件であって、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤を含むエクスビボ培養条件を方向づけられた造血細胞からなる主画分と、造血幹および前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に与える工程と、それにより造血幹細胞集団を拡大させると同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程によって行う。
【０２１１】
ニコチンアミドまたはそのアナログ、誘導体、または代謝産物およびＰＩ３−キナーゼ阻害剤の最終濃度は、好ましくは、特定の適用に依存して、ｍＭ範囲である。例えば、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲内、好ましくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲内、より好ましくは約５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲内である。
【０２１２】
本明細書中上記に記載されるように、また、下記の実施例の節においてさらに例示されるように、造血単核細胞に存在する造血幹細胞集団の拡大はまた、銅キレーターまたは銅キレートの存在下で達成され得る。国際特許出願公開ＷＯ００／１８８８５および国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２において詳しく議論されているように、銅キレーターまたは銅キレートを細胞培養培地に加えることにより、細胞の銅濃度が影響を受け、これにより、次に、細胞分化に関連するシグナル伝達経路が影響を受ける。国際特許出願公開ＷＯ００／１８８８５および国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２の教示によれば、銅キレートを細胞培養培地に加えることにより、細胞の遊離銅の濃度が、細胞拡大時には実質的に変化しないで維持され、その一方で、銅キレーターを細胞培養培地に加えることにより、銅を利用する際の細胞の能力が低下する。
【０２１３】
本明細書中で使用される表現「銅キレーター」は、環を形成するように銅または銅イオンと配位結合することができる少なくとも２つの原子を有するリガンドを示す。銅キレーターは銅イオンを含有せず、すなわち、銅イオンとの錯体を形成していない。キレート化作用に関連するさらなる特徴が、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２に記載される。
【０２１４】
本明細書中を通して使用される表現「銅キレート」は、銅イオンとの錯体を形成している、本明細書中上記で定義されるような銅キレーターを示す。
【０２１５】
従って、本発明によれば、造血幹細胞の集団をエクスビボ拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する別の方法が提供される。本発明のこの局面によるこの方法は、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞に、エクスビボ細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供し、それにより、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することによって達成される。
【０２１６】
本発明の銅キレートまたは銅キレーターは、多くの場合、銅以外の遷移金属との有機金属錯体を形成することができる。銅以外の金属が、典型的には、細胞に存在し（例えば、亜鉛）、または、治療時に細胞に投与され得る（例えば、白金）ので、他の金属とも相互作用することができる銅キレートまたは銅キレーターは非常に効果的であることが見出された。そのような遷移金属の代表的な例には、限定されないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、鉄、パラジウム、白金、ロジウムおよびルテニウムが含まれる。
【０２１７】
本発明の銅キレートは、銅イオン（例えば、Ｃｕ＋１、Ｃｕ＋２）と、１つまたは複数の銅キレーターとを含む。本発明による好ましい銅キレーターには、ポリアミン分子が含まれ、この場合、ポリアミン分子は、ポリアミンに存在する２つ以上のアミン基を介して銅イオンとの環状錯体を形成することができる。
【０２１８】
従って、本発明の種々の局面および実施形態に関連して使用される銅キレートまたは銅キレーターには、好ましくは、ポリアミンキレーター、すなわち、１個〜１０個のアミン成分（好ましくは２個〜８個のアミン成分、より好ましくは４個〜６個のアミン成分、最も好ましくは４個のアミン成分）によって置換および／または中断されるポリマー鎖が含まれる。
【０２１９】
表現「アミン成分」、表現「アミン基」および単に表現「アミン」は、分子内のその位置に依存して、−ＮＲ’Ｒ”基または−ＮＲ’−基（式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり、これらの用語は本明細書中下記において定義される）を記載するために本明細書中では使用される。
【０２２０】
ポリアミンキレーターは、線状ポリアミン、環状ポリアミンまたはそれらの組合わせであり得る。
【０２２１】
線状ポリアミンは、本発明によれば、下記の一般式Ｉを有するポリアミンであり得る：
2006508692.tif 000009
（式中、ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖であり、ただし、Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、アルキレン鎖における炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される）。
【０２２２】
従って、線状ポリアミンは、本発明によれば、好ましくは、１つまたは複数のアルキレン鎖（式Ｉにおいて、Ａｍ、Ｂ１・・・Ｂｎ）から構成され、Ｓ、ＯおよびＮ（式Ｉにおいて、Ｙ１・・・Ｙｎ）などの１つまたは複数のヘテロ原子によって中断され、２つのそのようなヘテロ原子（式Ｉにおいて、ＸおよびＺ）で終わる。
【０２２３】
アルキレン鎖Ａは、本明細書中上記に記載されるように、１個〜１０個の置換炭素原子または非置換炭素原子を有し、少なくともその一方の端部においてヘテロ原子（例えば、式ＩにおけるＸ）に連結する。２つ以上のアルキレン鎖Ａが存在する場合（ｍが２以上である場合）には常に、最初のアルキレン鎖ＡのみがＸに連結する。しかしながら、ｍは好ましくは１であり、従って、式Ｉに示される線状ポリアミンは、好ましくは、アルキレン鎖Ａを１つだけ含む。
【０２２４】
アルキレン鎖Ｂは、本明細書中上記に記載されるように、１個〜２０個の置換炭素原子または非置換炭素原子を含む。アルキレン鎖Ｂは、その２つの端部において、ヘテロ原子（式Ｉにおいて、Ｙ１・・・ＹｎおよびＺ）に連結する。
【０２２５】
式Ｉに示される好ましい線状ポリアミンは、１個〜２０個のアルキレン鎖Ｂ（Ｂ１・・・Ｂｎとして表される）を含み、この場合、「Ｂ１・・・Ｂｎ」は、複数のアルキレン鎖Ｂ（すなわち、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、・・・、Ｂｎ−１およびＢｎ、ただし、ｎは０〜２０に等しい）を記載するために本明細書中では使用される。これらのアルキレン鎖は同じまたは異なり得る。Ｂ１・・・Ｂｎのそれぞれがそれぞれのヘテロ原子Ｙ１・・・Ｙｎに連結し、構造における最後のアルキレン鎖Ｂｎもまたヘテロ原子Ｚに連結する。
【０２２６】
本明細書中を通して、整数が０に等しいときには常に、すなわち、式の構成要素が数字０を伴っているときには常に、この構成要素は構造中に存在しないことに留意しなければならない。例えば、式Ｉにおけるｎが０に等しい場合、アルキレン鎖Ｂは存在せず、かつ、ヘテロ原子Ｙが構造中には存在しないことが意味される。
【０２２７】
好ましくは、ｎは２〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、最も好ましくは３〜５である。従って、式Ｉに示される線状ポリアミンは、好ましくは、３個〜５個のアルキレン鎖Ｂを含む、それぞれが３個〜５個のヘテロ原子Ｙに連結する。
【０２２８】
式Ｉに示される線状ポリアミンは、少なくとも１つのアミン基（この用語は本明細書中上記に定義されている）、好ましくは少なくとも２つのアミン基、より好ましくは少なくとも４つのアミン基を含まなければならない。アミン基は、Ｘ、ＺおよびＹ１・・・Ｙｎの少なくとも１つが−ＮＨ−基であるように、ヘテロ原子Ｘ、ＺまたはＹ１・・・Ｙｎとして、あるいは、アルキレン鎖Ａおよびアルキレン鎖Ｂ１・・・Ｂｎにおける置換された炭素原子の１つまたは複数の置換基として構造中に存在させることができる。これらのアミン基の存在は、本明細書中上記で議論されたように、銅イオンとの安定なキレートを形成させるために必要である。
【０２２９】
アルキレン鎖Ａは、好ましくは、下記の一般式ＩＩを有する：
2006508692.tif 000010
（式中、ｇは、０または３〜１０に等しい整数である）。
【０２３０】
従って、アルキレン鎖Ａは、Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基、・・・、Ｒｇ−１基およびＲｇ基によってそれぞれ置換された複数の炭素原子Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、・・・、Ｃｇ−１およびＣｇから構成される。好ましくは、アルキレン鎖Ａは、２個〜１０個の炭素原子、より好ましくは２個〜６個の炭素原子、最も好ましくは２個〜４個の炭素原子を含む。
【０２３１】
本明細書中上記で定義されたように、ｇが０に等しい場合、構成要素ＣｇＨ（Ｒｇ）は構造中に存在せず、従って、アルキレン鎖Ａは２個の炭素原子のみを含む。
【０２３２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲｇはそれぞれが、Ａにおける炭素原子に結合する置換基である。Ｒ１、Ｒ２およびＲｇのそれぞれは独立して、限定されないが、下記のような置換基であり得る：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、複素脂環、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、シクロアルキルアミノ、複素脂環アミノ、ヘテロアリールアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アゾ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、アンモニウム、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、スルホニル、スルフィニル、Ｎ−スルホンアミド、Ｓ−スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｃ−チオカルボキシ、Ｏ−チオカルボキシ、Ｎ−カルバマート、Ｏ−カルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｏ−チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシ、シラザ、アクオ、アルコール、ペルオキソ、アミンオキシド、ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アリールヒドラジン、一酸化窒素、シアナート、チオシアナート、イソシアナート、イソチオシアナート、シアノ、アルキルニトリル、アリールニトリル、アルキルイソニトリル、アリールイソニトリル、ニトラート、ニトリト、アジド、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルアリールスルホキシド、アルキルスルフェン酸、アリールスルフェン酸、アルキルスルフィン酸、アリールスルフィン酸、アルキルチオールカルボン酸、アリールチオールカルボン酸、アルキルチオールチオカルボン酸、アリールチオールチオカルボン酸、カルボン酸、アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、スルファート、スルフィト、ビスルフィト、チオスルファート、チオスルフィト、アルキルホスフィン、アリールホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アリールホスフィンオキシド、アルキルアリールホスフィンオキシド、アルキルホスフィンスルフィド、アリールホスフィンスルフィド、アルキルアリールホスフィンスルフィド、アルキルホスホン酸、アリールホスホン酸、アルキルホスフィン酸、アリールホスフィン酸、ホスファート、チオホスファート、ホスフィト、ピロホスフィト、トリホスファート、ハイドロジェンホスファート、ジハイドロジェンホスファート、グアニジノ、Ｓ−ジチオカルバマート、Ｎ−ジチオカルバマート、ビカルボナート、カルボナート、ペルクロラート、クロラート、クロリト、ハイポクロリト、ペルブロマート、ブロマート、ブロミト、ハイポブロミト、テトラハロマンガナート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロアンチモナート、ハイポホスフィト、ヨーダート、ペルヨーダート、メタボラート、テトラアリールボラート、テトラアルキルボラート、タルタラート、サリチラート、スクシナート、シトラート、アスコルバート、サッカリラート、アミノ酸、ヒドロキサム酸およびチオトシラート。
【０２３３】
Ｒ１、Ｒ２またはＲｇが水素であるときには常に、そのそれぞれの炭素原子は非置換炭素原子である。
【０２３４】
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、直鎖基および分枝鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素である。好ましくは、アルキル基は１個〜２０個の炭素原子を有する。より好ましくは、アルキル基は、１個〜１０個の炭素原子を有する中サイズのアルキルである。最も好ましくは、アルキル基は、１個〜４個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は置換または非置換であり得る。置換される場合、置換基は、例えば、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバマート、Ｎ−カルバマート、Ｏ−チオカルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロ、スルホンアミド、シリル、グアニジン、ウレアまたはアミノ（これらの用語は本明細書中下記で定義される）であり得る。
【０２３５】
用語「アルケニル」により、少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合からなるアルキル基が記載される。
【０２３６】
用語「アルキニル」により、少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素の三重結合からなるアルキル基が記載される。
【０２３７】
用語「シクロアルキル」により、環の１つまたは複数が完全に共役したπ電子系を有しない、すべてが炭素の単環式環基または縮合環基（すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環）が記載される。シクロアルキル基の非限定的な例には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンが含まれる。シクロアルキル基は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｏ−カルバマート、Ｎ−カルバマート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロまたはアミノ（これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される）であり得る。
【０２３８】
用語「アリール」により、完全に共役したπ電子系を有する、すべてが炭素の単環状基または縮合環多環基（すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環）が記載される。アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルが含まれる。アリール基は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、ハロ、トリハロメチル、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｏ−カルバマート、Ｎ−カルバマート、Ｏ−チオカルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、スルフィニル、スルホニルまたはアミノ（これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される）であり得る。
【０２３９】
用語「ヘテロアリール」により、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの１つまたは複数の原子を環（１つまたは複数）に有し、かつ、さらには、完全に共役したπ電子系を有する単環式環基または縮合環基（すなわち、隣接原子対を共有する環）が記載される。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。ヘテロアリール基は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、アルキル、シクロアルキル、ハロ、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオカルボニル、スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、Ｏ−カルバマート、Ｎ−カルバマート、Ｏ−チオカルバマート、Ｎ−チオカルバマート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミドまたはアミノ（これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される）であり得る。
【０２４０】
用語「複素脂環」により、窒素、酸素およびイオウなどの１つまたは複数の原子を環（１つまたは複数）に有する単環式環基または縮合環基が記載される。環にはまた、１つまたは複数の二重結合が存在し得る。しかしながら、環は、完全に共役したπ電子系を有しない。複素脂環は置換または非置換であり得る。置換されるとき、置換基は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、Ｏ−カルバマート、Ｎ−カルバマート、Ｏ−チオカルバマート、Ｎ−チオカルバマート、スルフィニル、スルホニル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミドまたはアミノ（これらの用語は本明細書中上記または本明細書中下記で定義される）であり得る。
【０２４１】
用語「ハロ」により、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子が記載される。
【０２４２】
用語「アミノ」により、本明細書中上記で「アミン」または「アミノ基」に関して定義されるように、−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれが独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり、これらの用語は本明細書中上記で定義されている）を記載するために本明細書中では使用される。
【０２４３】
従って、用語「アルキルアミノ」、用語「アリールアミノ」、用語「シクロアルキルアミノ」、用語「複素脂環アミノ」および用語「ヘテロアリールアミノ」により、そのＲ’およびＲ”の少なくとも１つが、それぞれ、アルキル、アリール、シクロアルキル、複素環およびヘテロアリールである、上記で定義されるようなアミノ基が記載される。
【０２４４】
用語「ヒドロキシ」により、−ＯＨ基が記載される。
【０２４５】
「アルコキシ」により、本明細書中で定義されるような−Ｏ−アルキル基および−Ｏ−シクロアルキル基の両方が記載される。
【０２４６】
「アリールオキシ」により、本明細書中で定義されるような−Ｏ−アリール基および−Ｏ−ヘテロアリール基の両方が記載される。
【０２４７】
用語「アゾ」により、−Ｎ＝Ｎ基が記載される。
【０２４８】
「Ｃ−アミド」により、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２４９】
「Ｎ−アミド」により、Ｒ’Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２５０】
「アンモニウム」により、−Ｎ＋ＨＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２５１】
用語「チオヒドロキシ」により、−ＳＨ基が記載される。
【０２５２】
用語「チオアルコキシ」により、本明細書中上記で定義されるような−Ｓ−アルキル基および−Ｓ−シクロアルキル基の両方が記載される。
【０２５３】
用語「チオアリールオキシ」により、本明細書中上記で定義されるような−Ｓ−アリール基および−Ｓ−ヘテロアリール基の両方が記載される。
【０２５４】
「スルフィニル」により、−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ基（式中、Ｒは、限定されないが、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールであり、これらは本明細書中上記で定義される）が記載される。
【０２５５】
「スルホニル」により、−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ基（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２５６】
「Ｓ−スルホンアミド」は、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０２５７】
「Ｎ−スルホンアミド」はＲ’（Ｓ＝Ｏ）２−ＮＲ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０２５８】
「ホスホニル」は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）−Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０２５９】
「ホスフィニル」は−ＰＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０２６０】
「ホスホニウム」は−Ｐ＋Ｒ’Ｒ”Ｒ’’’基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りであり、Ｒ’’’はＲ’またはＲ”のいずれかとして定義される）である。
【０２６１】
用語「カルボニル」により、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ基（式中、Ｒは、本明細書中上記で定義されるように、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合する）または複素脂環（環炭素を介して結合する）である）が記載される。
【０２６２】
「チオカルボニル」により、−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ基（式中、Ｒは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２６３】
「Ｃ−カルボキシ」により、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ基（式中、Ｒは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２６４】
「Ｏ−カルボキシ」基により、ＲＣ（＝Ｏ）−Ｏ−基（式中、Ｒは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである）を示す。
【０２６５】
「カルボン酸」は、Ｒが水素であるＣ−カルボキシ基である。
【０２６６】
「Ｃ−チオカルボキシ」は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｒ基（式中、Ｒは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０２６７】
「Ｏ−チオカルボキシ」基はＲ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−基（式中、Ｒは、用語「カルボニル」に関して本明細書中上記で定義される通りである）を示す。
【０２６８】
用語「Ｏ−カルバマート」により、−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２６９】
「Ｎ−カルバマート」により、Ｒ’−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７０】
「Ｏ−チオカルバマート」により、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７１】
「Ｎ−チオカルバマート」により、Ｒ’ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７２】
用語「ウレア」により、−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７３】
用語「チオウレア」により、−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７４】
用語「ボラート」により、−Ｏ−Ｂ−（ＯＲ）２基（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７５】
用語「ボラン」により、−Ｂ−Ｒ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７６】
用語「ボラザ」により、−Ｂ（Ｒ’）（ＮＲ”Ｒ’’’）基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２７７】
用語「シリル」により、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’’’基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中で定義される通りである）が記載される。
【０２７８】
用語「シロキシ」は−Ｓｉ−（ＯＲ）３（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０２７９】
用語「シラザ」により、−Ｓｉ−（ＮＲ’Ｒ”）３（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中で定義される通りである）が記載される。
【０２８０】
用語「アクア（ａｑｕｏ）」により、Ｈ２Ｏ基が記載される。
【０２８１】
用語「アルコール」により、ＲＯＨ基（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２８２】
用語「ペルオキソ」により、−ＯＯＲ基（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０２８３】
本明細書中で使用される「アミンオキシド」は−Ｎ（＝Ｏ）Ｒ’Ｒ”Ｒ’’’基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中で定義される通りである）である。
【０２８４】
「ヒドラジン」は−ＮＲ’−ＮＲ”Ｒ’’’基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中で定義される通りである）が記載される。
【０２８５】
従って、「アルキルヒドラジン」および「アリールヒドラジン」により、Ｒ’がそれぞれアルキルまたはアリールであり、Ｒ”およびＲ’’’が本明細書中上記で定義される通りであるヒドラジンが記載される。
【０２８６】
用語「一酸化窒素」は−Ｎ＝Ｏ基である。
【０２８７】
用語「シアノ」は−Ｃ≡Ｎ基である。
【０２８８】
「シアナート」は−Ｏ−Ｃ≡Ｎ基である。
【０２８９】
「チオシアナート」は−Ｓ−Ｃ≡Ｎ基である。
【０２９０】
「イソシアナート」は−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基である。
【０２９１】
「イソチオシアナート」は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基である。
【０２９２】
用語「アルキルニトリル」および用語「アリールニトリル」により、−Ｒ−Ｃ≡Ｎ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０２９３】
用語「アルキルイソニトリル」および用語「アリールイソニトリル」により、Ｒ−Ｎ≡Ｃ−基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０２９４】
「ニトラート」または「ニトロ」は−ＮＯ２基である。
【０２９５】
「ニトリト」は−Ｏ−Ｎ＝Ｏ基である。
【０２９６】
「アジド」はＮ３＋基である。
【０２９７】
「アルキルスルホン酸」および「アリールスルホン酸」により、−Ｒ−ＳＯ２−ＯＨ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０２９８】
「アルキルスルホキシド」、「アリールスルホキシド」および「アルキルアリールスルホキシド」により、−Ｒ’Ｓ（＝Ｏ）Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれがアルキルであり、Ｒ’およびＲ”はそれぞれがアリールであり、ここで、それぞれ、Ｒ’はアルキルであり、かつＲ”はアリールである）が記載される。
【０２９９】
「アルキルスルフェン酸」および「アリールスルフェン酸」により、−Ｒ−Ｓ−ＯＨ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３００】
「アルキルスルフィン酸」および「アリールスルフィン酸」により、−Ｒ−Ｓ（＝Ｏ）−ＯＨ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３０１】
本明細書中で使用される用語「アルキルカルボン酸」および用語「アリールカルボン酸」により、−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３０２】
「アルキルチオールカルボン酸」および「アリールチオールカルボン酸」により、−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＨ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３０３】
「アルキルチオールチオカルボン酸」および「アリールチオールチオカルボン酸」により、−Ｒ−Ｃ（＝Ｓ）−ＳＨ基（式中、Ｒはそれぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３０４】
「スルファート」は−Ｏ−ＳＯ２−ＯＲ’基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３０５】
「スルフィト」基は−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）−ＯＲ’基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３０６】
「ビスルフィト」は、Ｒ’が水素であるスルフィト基である。
【０３０７】
「チオスルファート」は−Ｏ−ＳＯ２−ＳＲ’基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３０８】
「チオスルフィト」は−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）−ＳＲ’基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３０９】
用語「アルキル／アリールホスフィン」により、−Ｒ−ＰＨ２基（式中、Ｒは、上記で定義されるように、それぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３１０】
用語「アルキルホスフィンオキシドおよび／またはアリールホスフィンオキシド」により、−Ｒ’−ＰＲ”２（＝Ｏ）基（式中、Ｒ’およびＲ”は、本明細書中上記で定義されるように、アルキルおよび／またはアリールである）が記載される。
【０３１１】
用語「アルキルホスフィンスルフィドおよび／またはアリールホスフィンスルフィド」により、−Ｒ’−ＰＲ”２（＝Ｓ）基（式中、Ｒ’およびＲ”は、本明細書中上記で定義されるように、アルキルおよび／またはアリールである）が記載される。
【０３１２】
用語「アルキル／アリールホスホン酸」により、−Ｒ’−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２基（式中、Ｒ’は、上記で定義されるようなアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３１３】
用語「アルキル／アリールホスフィン酸」により、−Ｒ’−Ｐ（ＯＨ）２基（式中、Ｒ’は、上記で定義されるようなアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３１４】
「ホスファート」は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）（ＯＲ”）基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３１５】
「ハイドロジェンホスファート」は、Ｒ’が水素であるホスファート基である。
【０３１６】
「ジハイドロジェンホスファート」は、Ｒ’およびＲ”がともに水素であるホスファート基である。
【０３１７】
「チオホスファート」は−Ｓ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３１８】
「ホスフィト」は−Ｏ−Ｐ（ＯＲ’）２基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３１９】
「ピロホスフィト」は−Ｏ−Ｐ（ＯＲ’）−Ｏ−Ｐ（ＯＲ”）２基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０３２０】
「トリホスファート」により、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ”）−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’’’）２（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３２１】
本明細書中で使用される用語「グアニジン」により、−Ｒ’ＮＣ（＝Ｎ）−ＮＲ”Ｒ’’’基（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３２２】
用語「Ｓ−ジチオカルバマート」により、−ＳＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’Ｒ”基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３２３】
用語「Ｎ−ジチオカルバマート」により、Ｒ’ＳＣ（＝Ｓ）−ＮＲ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３２４】
「ビカルボナート」は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基である。
【０３２５】
「カルボナート」は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ基である。
【０３２６】
「ペルクロラート」は−Ｏ−Ｃｌ（＝Ｏ）３基である。
【０３２７】
「クロラート」は−Ｏ−Ｃｌ（＝Ｏ）２基である。
【０３２８】
「クロリト」は−Ｏ−Ｃｌ（＝Ｏ）基である。
【０３２９】
「ハイポクロリト」は−ＯＣｌ基である。
【０３３０】
「ペルブロマート」は−Ｏ−Ｂｒ（＝Ｏ）３基である。
【０３３１】
「ブロマート」は−Ｏ−Ｂｒ（＝Ｏ）２基である。
【０３３２】
「ブロミト」は−Ｏ−Ｂｒ（＝Ｏ）基である。
【０３３３】
「ハイポブロミト」は−ＯＢｒ基である。
【０３３４】
「ペルヨーダート」は−Ｏ−Ｉ（＝Ｏ）３基である。
【０３３５】
「ヨーダート」は−Ｏ−Ｉ（＝Ｏ）２基である。
【０３３６】
用語「テトラハロマンガナート」により、ＭｎＣｌ４、ＭｎＢｒ４およびＭｎＩ４が記載される。
【０３３７】
用語「テトラフルオロボラート」により、−ＢＦ４基が記載される。
【０３３８】
「テトラフルオロアンチモナート」は、ＳｂＦ６基である。
【０３３９】
「ハイポホスフィト」は−Ｐ（ＯＨ）２基である。
【０３４０】
用語「メタボラート」により、下記の基が記載される：
2006508692.tif 000011
（式中、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は本明細書中上記で定義される通りである）。
【０３４１】
用語「テトラアルキル／テトラアリールボラート」により、Ｒ’Ｂ−基（式中、Ｒ’は、上記で定義されるように、それぞれアルキルまたはアリールである）が記載される。
【０３４２】
「タルタラート」は−ＯＣ（＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基である。
【０３４３】
「サリチラート」は下記の基である：
2006508692.tif 000012
【０３４４】
「スクシナート」は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ基である。
【０３４５】
「シトラート」は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基である。
【０３４６】
「アスコルバート」は下記の基である：
2006508692.tif 000013
【０３４７】
「サッカリラート」は、２つのカルボン酸基を有する酸化型サッカリドである。
【０３４８】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸」には、天然アミノ酸および修飾アミノ酸が含まれ、従って、２１個の天然に存在するアミノ酸；多くの場合にはインビボで翻訳後に修飾されたそのようなアミノ酸（これには、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンが含まれる）；および、他の非通常的なアミノ酸（これには、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように、少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０３４９】
「ヒドロキサム酸」は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＯＨ基である。
【０３５０】
「チオトシラート」は下記の基である：
2006508692.tif 000014
【０３５１】
同様に、アルキレン鎖Ｂ１・・・Ｂｎのそれぞれは独立して、下記の一般式ＩＩＩを有する：
2006508692.tif 000015
（式中、ｐは０またはｇ＋１に等しい整数であり、ｑはｇ＋２からｇ＋２０までの整数である）。
【０３５２】
従って、アルキレン鎖Ｂ１・・・Ｂｎのそれぞれは、Ｒｐ基、Ｒｐ＋１基、Ｒｐ＋２基、・・・、Ｒｑ−１基およびＲｑ基によってそれぞれ置換される複数の炭素原子Ｃｐ、Ｃｐ＋１、Ｃｐ＋２、・・・、Ｃｑ−１およびＣｑから構成される。好ましくは、アルキレン鎖Ｂ１・・・Ｂｎのそれぞれは、２個〜２０個の炭素原子を含み、より好ましくは２個〜１０個の炭素原子を含み、最も好ましくは２個〜６個の炭素原子を含む。
【０３５３】
本明細書中上記で定義されるように、ｐが０に等しい場合、構成要素−ＣｐＨ（Ｒｐ）−は構造中に存在しない。ｐがｇ＋１に等しい場合、ｐは１または４〜１１のいずれかであり得る。整数ｑは２または５〜２０のいずれかであり得る。
【０３５４】
置換基Ｒｐ、Ｒｐ＋１、・・・、Ｒｎのそれぞれは、Ｒ１、Ｒ２およびＲｇに関して本明細書中上記に記載される置換基のいずれかであり得る。
【０３５５】
従って、本発明による好ましい線状ポリアミンは２つ以上のアルキレン鎖を含む。アルキレン鎖はヘテロ原子によってその間が中断され、それぞれがその一方の端部でヘテロ原子に連結する。好ましくは、アルキレン鎖のそれぞれが、ヘテロ原子と銅イオンとの間で安定なキレートを形成することができるように少なくとも２つの炭素原子を含む。
【０３５６】
式Ｉに示される線状ポリアミンは、好ましくは、少なくとも１つのキラルな炭素原子を含む。従って、アルキレン鎖ＡにおけるＣ１、Ｃ２およびＣｇの少なくとも１つ、ならびに／あるいは、アルキレン鎖ＢにおけるＣｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑの少なくとも１つがキラルである。
【０３５７】
本発明による好ましい線状ポリアミンはテトラエチレンペンタミンである。本発明に関連して使用可能な好ましい線状ポリアミンの他の代表的な例には、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、アミノエチルエタノールアミン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、およびＮ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミンが含まれるが、これらに限定されない。
【０３５８】
ポリアミンキレーターが環状ポリアミンである場合、ポリアミンは下記の一般式ＩＶを有することができる：
2006508692.tif 000016
（式中、ｍは１〜１０の整数である；ｎは０〜２０の整数である；ＸおよびＺはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ｙ１およびＹｎはそれぞれが独立して、酸素原子、イオウ原子および−ＮＨ基からなる群から選択される；Ａは、１個〜１０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｂ１およびＢｎはそれぞれが独立して、１個〜２０個の置換炭素原子および／または非置換炭素原子を有するアルキレン鎖である；Ｄは、下記の一般式Ｖを有する架橋基である：
2006508692.tif 000017
［式中、ＵおよびＶはそれぞれが独立して、置換炭化水素鎖および非置換炭化水素鎖からなる群から選択される；Ｗは、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンからなる群から選択される］、
ただし、前記Ｘ、Ｚ、Ｙ１およびＹｎの少なくとも１つが−ＮＨ基であり、かつ／または、前記アルキレン鎖における前記炭素原子の少なくとも１つがアミン基により置換される）。
【０３５９】
場合により、環状ポリアミンは、下記の一般式ＶＩ〜一般式Ｘのいずれかを有する：
2006508692.tif 000018
（式中、ｍ、ｎ、Ｘ、Ｙ１、Ｙｎ、Ｚ、Ａ、ＢおよびＤは上記で定義される通りであり、さらには、架橋基Ｄが一方の端部でＡ（式ＶＩ、式ＶＩＩおよび式Ｘ）に結合している場合、ＵまたはＶはアルキレン鎖における１つの炭素原子に結合しており、また、Ｄが一方の端部でＢ１またはＢｎ（式ＶＩＩＩ、式ＩＸおよび式Ｘ）に結合している場合、ＵまたはＶはアルキレン鎖における１つの炭素原子に結合している）。
【０３６０】
従って、本発明による好ましい環状ポリアミンは、線状ポリアミンに関して本明細書中上記に詳しく記載されるように、２つ以上のアルキレン鎖Ａ、Ｂ１・・・Ｂｎを含む。アルキレン鎖は、架橋基Ｄを介して、その両端の間で、すなわち、ヘテロ原子のＸおよびＺの間で連結されることによって環状構造を形成することができる（式ＩＶ）。場合により、アルキレン鎖は、架橋基Ｄを介してその間で連結されることによって立体配座が制限された環状構造を形成することができる（式Ｘ）。さらに場合により、立体配座が制限された環状構造を、１つのアルキレン鎖を１つの末端ヘテロ原子（ＸまたはＺ、式ＶＩ〜式ＩＸ）に連結することによって形成することができる。
【０３６１】
本明細書中上記で記載されたように、環状構造が、式ＶＩ〜式ＩＸに示されるように、１つのアルキレン鎖を１つの末端ヘテロ原子に連結することによって形成される場合、架橋基Ｄは、末端ヘテロ原子（すなわち、ＸまたはＺ）と、アルキレン鎖ＡおよびＢ１・・・Ｂｎにおける１つの炭素原子とを連結する。この炭素原子は、本明細書中上記で記載されるＣ１、Ｃ２、Ｃｇ、Ｃｐ、Ｃｐ＋１およびＣｑのいずれか１つであり得る。
【０３６２】
さらに本明細書中上記で記載されたように、環状構造は、構造において２つの構成要素をつなぐ架橋基Ｄによって形成される。架橋基Ｄは一般式Ｕ−Ｗ−Ｖ（式中、ＵおよびＶはそれぞれが置換炭化水素鎖または非置換炭化水素鎖である）を有する。
【０３６３】
本明細書中で使用される表現「炭化水素鎖」により、共有結合により互いに結合し、とりわけ、水素原子によって置換される複数の炭素原子が記載される。炭化水素鎖は、飽和、不飽和、分枝状または非分枝状であり得るし、従って、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基およびアリール基ならびにそれらの組合せを含むことができる。
【０３６４】
炭化水素鎖の長さ（すなわち、鎖における炭素原子の数）は、好ましくは、一方では、形成された環状構造の環の緊張が最小限になり、他方では、銅イオンとの効率的なキレート形成が達成されるように、環状ポリアミンの構造によって決定される。
【０３６５】
炭化水素鎖が置換されるとき、置換基は、線状ポリアミンにおけるＲ１、Ｒ２およびＲｇに関して本明細書中上記で記載される置換基のいずれか１つまたはその組合せであり得る。
【０３６６】
２つの炭化水素鎖は、アミド、エーテル、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、イミンおよびアルケンであり得る基Ｗによってその間が連結される。
【０３６７】
本明細書中で使用される用語「エーテル」は−Ｏ−基である。
【０３６８】
用語「エステル」は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基である。
【０３６９】
「ジスルフィド」は−Ｓ−Ｓ−基である。
【０３７０】
「チオエーテル」は−Ｓ−基である。
【０３７１】
「チオエステル」は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−基である。
【０３７２】
「イミン」は−Ｃ（＝ＮＨ）−基である。
【０３７３】
「アルケン」は−ＣＨ＝ＣＨ−基である。
【０３７４】
架橋基Ｄは、典型的には、例えば、米国特許第５８１１３９２号に記載されるように、広く知られている技術によってその間（Ｗ）の結合が生じるように炭化水素鎖のＵおよびＶの反応性誘導体を連結することによって形成される。
【０３７５】
線状ポリアミンに関して上記で記載されたように、環状ポリアミンは、安定な銅キレートを形成するように、少なくとも１つのアミン基（好ましくは少なくとも２つのアミン基、より好ましくは少なくとも４つのアミン基）を含まなければならない。
【０３７６】
本発明による好ましい環状ポリアミンはシクラム（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン）である。
【０３７７】
本明細書中上記で記載されたように、本発明のポリアミンキレーターにはさらに、１つまたは複数の線状ポリアミンと、１つまたは複数の環状ポリアミンとの多量体組合せが含まれ得る。従って、そのようなポリアミンキレーターは、本明細書中上記で記載された線状ポリアミンおよび環状ポリアミンの任意の組合せから構成され得る。
【０３７８】
好ましくは、そのようなポリアミンキレーターは下記の一般式ＸＩを有する：
2006508692.tif 000019
（式中、ｎは１よりも大きい整数である；ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｏおよびｔのそれぞれは独立して、０〜１０の整数である；Ｅ１、Ｅ２およびＥｎのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような線状ポリアミンである；Ｇ１、Ｇ２およびＧｎのそれぞれは独立して、本明細書中上記に記載されるような環状ポリアミンである；Ｑ１、Ｑ２およびＱｎのそれぞれは独立して、前記ポリアミンの２つの間を連結するリンカーであり、ただし、前記Ｑ１、Ｑ２およびＱｎの少なくとも１つがアミン基であり、かつ／または、前記線状ポリアミンおよび前記環状ポリアミンの少なくとも１つが少なくとも１つのフリーのアミン基を有する）。
【０３７９】
式ＸＩにおけるＥ１、Ｅ２およびＥｎのそれぞれは、本明細書中上記で詳しく記載されたような線状ポリアミンを表し、一方、Ｇ１、Ｇ２およびＧｎのそれぞれは、本明細書中上記で詳しく記載されたような環状ポリアミンを表す。
【０３８０】
式ＸＩに記載されるポリアミンは、別の線状ポリアミンまたは環状ポリアミンにそれぞれがつながれる１つまたは複数の線状ポリアミンを含むことができる。
【０３８１】
式ＸＩにおける線状ポリアミンまたは環状ポリアミンはそれぞれが、式ＸＩにおけるＱ１、Ｑ２およびＱｎによって表される１つまたは複数のリンカーを介して別のポリアミンにつながれる。
【０３８２】
リンカー（Ｑ１、Ｑ２およびＱｎ）のそれぞれは、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、アミン、アゾ、アミド、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホニウム、ケトエステル、カルボニル、チオカルボニル、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバマート、チオカルバマート、ウレア、チオウレア、ボラート、ボラン、ボロアザ、シリル、シロキシおよびシラザであり得る。
【０３８３】
本明細書中で使用される用語「アルケニレン」により、少なくとも２つの炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合とからなるアルキル基が記載される。
【０３８４】
用語「アルキニレン」により、少なくとも２つの炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素の三重結合とからなるアルキル基が記載される。
【０３８５】
用語「シクロアルキレン」により、環の１つまたは複数が完全に共役したπ電子系を有しない、すべてが炭素の単環式環基または縮合環基（すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環）が記載される。シクロアルキル基の非限定的な例には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンが含まれる。
【０３８６】
用語「アリーレン」により、完全に共役したπ電子系を有する、すべてが炭素の単環状基または縮合環多環基（すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環）が記載される。アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルが含まれる。アリール基は置換または非置換であり得る。
【０３８７】
用語「ヘテロアリーレン」により、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの１つまたは複数の原子を環（１つまたは複数）に有し、かつ、さらには、完全に共役したπ電子系を有する単環式環基または縮合環基（すなわち、隣接原子対を共有する環）が記載される。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。ヘテロアリール基は置換または非置換であり得る。
【０３８８】
本発明のリンカーに関連して使用される用語「アミン」により、−ＮＲ’−（式中、Ｒ’は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環であり得、これらの用語は本明細書中上記で定義される）が記載される。
【０３８９】
本発明のリンカーに関連してさらに使用される用語「アゾ」により、−Ｎ＝Ｎ−基が記載される。
【０３９０】
用語「アミド」により、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３９１】
用語「アンモニウム」により、−Ｎ＋ＨＲ’−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３９２】
用語「スルフィニル」により、−Ｓ（＝Ｏ）−基が記載される。
【０３９３】
用語「スルホニル」により、−Ｓ（＝Ｏ）２−基が記載される。
【０３９４】
用語「スルホンアミド」により、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ’−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３９５】
用語「ホスホニル」により、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３９６】
用語「ホスフィニル」により、−ＰＲ’−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３９７】
用語「ホスホニウム」により、−Ｐ＋Ｒ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０３９８】
用語「ケトエステル」により、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基が記載される。
【０３９９】
用語「カルボニル」により、−Ｃ（＝Ｏ）−基が記載される。
【０４００】
用語「チオカルボニル」により、−Ｃ（＝Ｓ）−基が記載される。
【０４０１】
用語「カルバマート」により、−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０２】
用語「チオカルバマート」により、−ＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’−基（式中、Ｒ’は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０３】
用語「ウレア」により、−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０４】
用語「チオウレア」により、−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ’−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０５】
用語「ボラート」により、−Ｏ−Ｂ−（ＯＲ）−基（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０６】
用語「ボラン」により、−Ｂ−Ｒ−’−基（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０７】
用語「ボラザ」により、−Ｂ（ＮＲ’Ｒ”）−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中上記で定義される通りである）が記載される。
【０４０８】
用語「シリル」により、−ＳｉＲ’Ｒ”−基（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中で定義される通りである）が記載される。
【０４０９】
用語「シロキシ」は−Ｓｉ−（ＯＲ）２−（式中、Ｒは本明細書中上記で定義される通りである）である。
【０４１０】
用語「シラザ」により、−Ｓｉ−（ＮＲ’Ｒ”）２−（式中、Ｒ’およびＲ”は本明細書中で定義される通りである）が記載される。
【０４１１】
本発明のリンカーに関連して本明細書中上記で記載された用語はすべて、置換基に関して上記で記載されたのと同じであることに留意しなければならない。しかしながら、その一方の端部において構成要素に結合している置換基とは対照的に、リンカー基は、その２つの部位において２つの構成要素に結合しており、従って、これらの用語は、リンカーに関して再定義されている。
【０４１２】
本明細書中上記で述べられているように、本発明の現時点で最も好ましい実施形態によれば、ポリアミンキレーターはテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）である。しかしながら、他の好ましいポリアミンキレーターには、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミン、カプトプリル、ペニシラミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、１，７−ジオキサ−４，１０−ジアザシクロドデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン、１，４，７−トリアザシクロノナン、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、および１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンが含まれるが、これらに限定されない。
【０４１３】
上記に列挙された好ましいキレーターは、銅イオンに対するその大きい親和性において知られている。しかしながら、これらのキレーターはさらに、ＲｏｓｓおよびＦｒａｎｔ［Ｒｏｓｓ  ＪＷおよびＦｒａｎｔ  ＭＳ、「Ｃｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ，  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｃｕｐｒｉｃ  ｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：１９００、１９６９］（これは、本明細書中に詳しく示されるかのように参照により組み込まれる）によって記載されるように、他の遷移金属に対してもまたその実質的な親和性によって有益に特徴づけられている。
【０４１４】
本明細書中上記で記載されたポリアミンキレーターはすべて、市販品を入手することができるか、あるいは、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ（編）、１９９９（“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７７９頁）、または、Ｒ．Ｃ．ＬａｒｏｃｋおよびＶ．Ｃ．Ｈ．Ｗｉｏｌｅｙ、“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”（１９９２）、第２版）に記載されるなどの知られている手法を使用して合成することができる。
【０４１５】
テトラエチレンペンタミン−銅キレート（ＴＥＰＡ−Ｃｕ）を調製するための好ましい手法が国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２に記載される。
【０４１６】
銅キレートまたは銅キレーターを細胞培養培地に与えることができる。銅キレートの最終濃度は、特定の適用に依存して、マイクロモル濃度〜ミリモル濃度の範囲、例えば、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲、好ましくは約４μＭ〜約５０ｍＭの範囲、より好ましくは約５μＭ〜約４０ｍＭの範囲であり得る。
【０４１７】
造血幹細胞集団をエクスビボ拡大するための本明細書中上記に記載される方法は、とりわけ、造血幹細胞の拡大された集団をもたらす。
【０４１８】
従って、さらに、本発明の１つの局面によれば、本明細書中上記に記載された方法のいずれかによって得られる、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団が提供される。本発明による造血幹細胞の拡大された集団は、３％〜２０％の細胞が再選択可能なＣＤ３４＋細胞であり、そのうちの少なくとも４０％の細胞がＣＤ３４＋ｄｉｍであること、すなわち、ＦＡＣＳ分析において中央値強度に達しないこと、また、再選択可能なＣＤ３４＋細胞において、Ｌｉｎ−である細胞の大部分もまたＣＤ３４＋ｄｉｍ細胞であることによって特徴づけられる複数の細胞を含む。
【０４１９】
１つの実施形態において、造血幹細胞の集団は単一の遺伝的背景を有する。
【０４２０】
別の実施形態において、造血幹細胞のエクスビボ拡大された集団は、単一のドナーに由来する少なくともＮ個の細胞を含む（この場合、Ｎは、造血単核細胞の１つのサンプルに由来するＣＤ３４＋細胞の平均数を１０００倍した数に等しい）。
【０４２１】
ＣＤ３４マーカーおよび／またはＬｉｎマーカーの細胞表面での発現は、例えば、ＦＡＣＳ分析または免疫組織化学的染色技術によって明らかにすることができる。造血幹細胞の自己再生能は、下記の実施例の節においてさらに例示されるように、長期コロニー形成（ＬＴＣ−ＣＦＵｃ）によってインビトロで明らかにすることができる。
【０４２２】
本明細書中上記で詳しく議論されたように、造血幹細胞のエクスビボ拡大は、例えば、造血細胞の移植または埋込み、養子免疫療法、および遺伝子治療などの様々な適用において好都合に利用することができる。造血単核細胞を細胞供給源として用いて造血幹細胞のエクスビボ拡大を実施できることにより、これらの適用における本明細書中上記で記載された方法の利用が実質的に容易になる。
【０４２３】
従って、本発明の別の局面によれば、造血細胞の移植または埋込みを行う方法が提供される。本発明のこの局面によるこの方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をドナーから得ること、（ｂ）造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時にＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供し、その結果、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）そのようにして得られた造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みすることによって達成される。
【０４２４】
本明細書中上記で記載されたように、様々な薬剤を、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるために本発明の種々の局面に関連して使用することができる。
【０４２５】
従って、本発明のこの局面の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供することによって達成される。
【０４２６】
別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供することによって達成される。
【０４２７】
本発明のこの局面の別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のための、そして同時に、ＰＩ３−キナーゼを伴うシグナル伝達経路に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させるためのエクスビボ培養条件を提供することによって達成される。
【０４２８】
本発明のこの局面のさらに別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物とを提供することによって達成される。
【０４２９】
本発明のこの局面の別の特定の実施形態において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤とを提供することによって達成される。
【０４３０】
本発明の別の局面において、上記で記載された、造血細胞の移植または埋込みを行う方法は、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、本明細書中上記で記載された１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートとを提供することによって達成される。
【０４３１】
本発明のこの局面の方法のいずれかにおいて、ドナーおよびレシピエントは、単一の個体または異なる個体、例えば、同種の個体または異種の個体であり得る。同種移植が実施されるとき、当該分野では広く知られているように、インプラント拒絶および／または対宿主性移植片病を減少させるための治療法を講じなければならない。そのような治療法は、現在、ヒトの治療では実施されている。最も進んだ様々な治療法が、Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．他による刊行物（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）、２２：６４、および、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２００２）、１１：２６５）、Ｇｕｒ  Ｈ．他による刊行物（Ｂｌｏｏｄ（２００２）、９９：４１７４）、および、Ｍａｒｔｅｌｌｉ  ＭＦ他による刊行物（Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２００２）、３９：４８）に開示される（これらは参照により本明細書中に組み込まれる）。
【０４３２】
本明細書中上記に記載された方法は、移植可能な造血細胞調製物を作製するために利用することができ、その結果、本発明のなお別の局面によれば、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させ、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害するための効果的な量の薬剤の存在下でエクスビボ増殖された造血幹細胞の拡大された集団、および医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物が提供されるようになる。
【０４３３】
本明細書中上記で記載されたように、様々な薬剤が、これらの条件のもとで、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させ、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害するために見出されていた。
【０４３４】
従って、本発明のこの局面の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、レチノイン酸、レチノイドおよび／またはビタミンＤに応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤である。
【０４３５】
本発明のこの局面の別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体および／またはビタミンＤ受容体のシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤である。
【０４３６】
本発明のこの局面のなお別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、ＰＩ３−キナーゼのシグナル伝達に応答することにおける造血単核細胞の能力を低下させ、その一方で同時に幹細胞の分化を実質的に阻害する薬剤である。
【０４３７】
本発明のこの局面のさらに別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、および、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物からなる群から選択される薬剤の効果的な量を含む。
【０４３８】
本発明のこの局面のさらに別の特定の実施形態において、上記で記載された薬剤は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤の効果的な量を含む。
【０４３９】
本発明のさらに別の局面によれば、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを拡大前に含む造血単核細胞から、本明細書中上記で定義されるような少なくとも１つの銅キレートまたは銅キレーターの存在下、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害しながらエクスビボ増殖された造血幹細胞の拡大された集団、および医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物が提供される。
【０４４０】
本明細書中上記でさらに議論されているように、本発明の造血幹細胞のエクスビボ拡大は養子免疫療法において利用することができる。
【０４４１】
本発明の造血移植法または造血埋込み法と同様に、本発明による養子療法の方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞をレシピエントから得ること、（ｂ）本明細書中上記に詳しく記載されるように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、本明細書中上記に記載される銅キレーターまたは銅キレートのそれぞれ、ならびに／あるいは、本明細書中上記に記載される、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるための薬剤のそれぞれとを提供し、その結果、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）そのようにして得られた造血幹細胞をレシピエントに移植することによって達成される。
【０４４２】
下記においてさらに詳述されるように、一般には幹細胞、具体的には造血幹細胞は、細胞遺伝子治療を行うために役立ち得る。
【０４４３】
本明細書中で使用される遺伝子治療は、遺伝的または後天的な疾患または状態または表現型を処置または防止するための、宿主への目的とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の移入を示す。目的とする遺伝物質により、インビボでのその産生が所望される産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）がコードされる。例えば、目的とする遺伝物質により、治療的に有益なホルモン、受容体、酵素、ポリペプチドまたはペプチドがコードされ得る。総説については、一般には、テキスト“Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ”（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照のこと。
【０４４４】
遺伝子治療に対する２つの基本的な方法が発展してきている：（ｉ）エクスビボ遺伝子治療または細胞遺伝子治療、および（ｉｉ）インビボ遺伝子治療。エクスビボ遺伝子治療では、細胞が患者から取り出され、そして、培養されながら、細胞がインビトロで処置される。一般には、機能的な置換遺伝子が、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および必要に応じて発現システムによって細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、宿主／患者に戻される。これらの遺伝子的に再埋込みされた細胞は、トランスフェクションされた遺伝物質をインサイチュで発現することが示されている。
【０４４５】
従って、さらに、本発明の局面によれば、細胞を外因遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｅ）で遺伝子改変する方法が提供される。本発明のこの局面によるこの方法は、（ａ）造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を得ること、（ｂ）本明細書中上記に詳しく記載されるように、造血単核細胞に、細胞増殖のためのエクスビボ培養条件と、そして同時に、本明細書中上記に記載される銅キレーターまたは銅キレートのそれぞれ、ならびに／あるいは、本明細書中上記に記載される、ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させるための薬剤のそれぞれとを提供し、その結果、造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に造血幹細胞の分化を実質的に阻害すること、ならびに（ｃ）造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変することによって達成される。
【０４４６】
好ましい実施形態において、細胞を遺伝子改変することは、外因遺伝子または導入遺伝子を含むベクターによって達成され、この場合、そのようなベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは核酸ベクターである。細胞遺伝子治療において使用される好適な多くのウイルスベクタ−が知られており、様々な例が本明細書中下記に示される。同様に、様々な核酸ベクターを、下記においてさらに記載されるように、本発明の拡大された細胞を遺伝的に形質転換するために使用することができる。
【０４４７】
それによれば、本明細書中の拡大された細胞は、遺伝子産物を発現させるために改変することができる。本発明で使用される表現「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチドおよび機能的ＲＮＡ分子を示す。一般には、核酸分子によりコードされる遺伝子産物が、対象に提供されることになる所望の遺伝子産物である。そのような遺伝子産物の例には、レシピエント対象の器官によって通常的に産生されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質が含まれる。例えば、膵臓における不完全な器官に対する遺伝子置換として供給され得る遺伝子産物には、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼおよびアミラーゼが含まれる；肝臓により通常的に産生される遺伝子産物には、血液凝固因子（例えば、血液凝固の第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子など）、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、および種々のチトクロームＰ４５０酵素、ならびに、血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスの場合にはアデノシンデアミナーゼが含まれる；胸腺により産生される遺伝子産物には、血清胸腺因子、胸腺ホルモン因子、チモポイエチンおよびチモシンα１が含まれる；消化管細胞により産生される遺伝子産物には、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロチニンおよびサブスタンスＰが含まれる。
【０４４８】
あるいは、コードされる遺伝子産物は、所望される遺伝子産物の細胞による発現を誘導するものである（例えば、導入された遺伝物質により、対象に提供される遺伝子産物の転写を誘導する転写因子がコードされる）。
【０４４９】
さらに別の実施形態において、組換え遺伝子により、異種タンパク質（例えば、それが発現される細胞に対して生来的でない異種タンパク質）を提供することができる。例えば、様々なヒトＭＨＣ成分を、ヒトレシピエントにおける生着を支援するために、非ヒト細胞に提供することができる。あるいは、導入遺伝子は、ドナーのＭＨＣ遺伝子産物の発現または作用を阻害するものである。
【０４５０】
細胞に導入される核酸分子は、核酸によりコードされる遺伝子産物の細胞における発現のために好適な形態である。従って、核酸分子は、コード配列、および、遺伝子の転写のために要求され、また、遺伝子産物がタンパク質またはペプチドであるときには、遺伝子の翻訳のために要求される調節配列（またはその一部）を含み、そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナル、ならびに、コードされるタンパク質またはペプチドの輸送のために必要な配列（例えば、タンパク質またはペプチドを細胞の表面に輸送するためのＮ末端シグナル配列、または分泌のためのＮ末端シグナル配列）が含まれる。
【０４５１】
遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列）が、遺伝子産物が発現させられる細胞のタイプ、および遺伝子産物の所望される発現レベルに基づいて選択される。例えば、プロモーターに連結された遺伝子の細胞タイプ特異的な発現をもたらすことが知られているプロモーターを使用することができる。筋芽細胞遺伝子の発現のために特異的なプロモーターを、その遺伝子産物の筋肉特異的な発現をもたらすために目的の遺伝子に連結することができる。当該分野で知られている筋肉特異的な調節エレメントには、ジストロフィン遺伝子に由来する上流領域（Ｋｌａｍｕｔ他（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９：２３９６）、クレアチンキナーゼ遺伝子に由来する上流領域（ＢｕｓｋｉｎおよびＨａｕｓｃｈｋａ（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９：２６２７）、およびトロポニン遺伝子に由来する上流領域（ＭａｒおよびＯｒｄａｈｌ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：６４０４）が含まれる。他の細胞タイプについて特異的な調節エレメントが当該分野では知られている（例えば、肝臓特異的な発現のためのアルブミンエンハンサー；膵島細胞特異的な発現のためのインスリン調節エレメント；様々な神経細胞特異的な調節エレメント、これには、神経ジストロフィン、神経エノラーゼおよびＡ４アミロイドのプロモーターが含まれる）。
【０４５２】
あるいは、様々な異なる細胞タイプにおいて遺伝子の構成的な発現を行わせることができる調節エレメント（例えば、ウイルスの調節エレメントなど）を使用することができる。遺伝子発現を行わせるために一般に使用されているウイルスプロモーターの例には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来するプロモーター、ならびにレトロウイルスのＬＴＲが含まれる。
【０４５３】
あるいは、連結された遺伝子の誘導可能な発現をもたらす調節エレメントを使用することができる。誘導可能な調節エレメント（例えば、誘導可能なプロモーター）の使用は、細胞における遺伝子産物の産生の調節を可能にする。真核生物細胞において使用される潜在的に有用な誘導可能な調節システムの例には、ホルモンにより調節されるエレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３〜５６０７を参照のこと）、合成リガンドにより調節されるエレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．他（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１０１９〜１０２４を参照のこと）、およびイオン化放射線により調節されるエレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．他（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：１０６０７〜１０６１３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０１４〜１０１５３を参照のこと）が含まれる。開発され得るさらなる組織特異的または誘導可能な調節システムもまた、本発明に従って使用することができる。
【０４５４】
本発明の細胞を改変するために適用され得る数多くの技術が、遺伝物質を細胞に導入するために当該分野では知られている。
【０４５５】
１つの実施形態において、核酸はネイクド核酸分子の形態である。この状況では、改変される細胞に導入される核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸と、必要な調節エレメントとのみからなる。
【０４５６】
あるいは、（必要な調節エレメントを含めて）遺伝子産物をコードする核酸はプラスミドベクターに含有される。プラスミド発現ベクターの例には、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ他（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１８７〜１９５）が含まれる。
【０４５７】
別の実施形態において、細胞に導入されるための核酸分子はウイルスベクターに含有される。この状況では、遺伝子産物をコードする核酸はウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）に挿入される。遺伝子産物の発現を行わせる調節エレメントを、ウイルスゲノムに挿入された核酸とともに含ませることができる（すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結することができる）か、または、そのような調節エレメントをウイルスゲノム自身によって提供され得る。
【０４５８】
ネイクド核酸は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接的な注入、および受容体媒介による取り込みを使用して細胞に導入することができる。
【０４５９】
ネイクド核酸（例えば、ＤＮＡ）は、核酸およびリン酸カルシウムを含有する沈殿物を形成させることによって細胞に導入することができる。例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理的食塩水溶液を、塩化カルシウムおよび核酸を含有する溶液と混合して、沈殿物を形成させることができ、その後、沈殿物は細胞とインキュベーションされる。グリセロールまたはジメチルスルホキシドによるショック工程を、特定の細胞により取り込まれる核酸の量を増大させるために加えることができる。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションは、安定（または一過性）に細胞をトランスフェクションするために使用することができ、また、細胞のインビトロ操作に対して適用可能であるにすぎない。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションのための様々なプロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１節）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、第１６．３２節〜第１６．４０節）、または他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
【０４６０】
ネイクド核酸は、核酸およびＤＥＡＥ−デキストランの混合物を形成させ、混合物を細胞とインキュベーションすることによって細胞に導入することができる。ジメチルスルホキシドまたはクロロキンによるショック工程を、核酸取込みの量を増大させるために加えることができる。ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションは、細胞のインビトロ操作に対して適用可能であるにすぎず、ＤＮＡを一過性に細胞に導入するために使用することができ、しかし、安定にトランスフェクションされた細胞を作製するためには好ましくない。従って、この方法は、遺伝子産物の短期間の産生のために使用することができ、しかし、遺伝子産物を長期間にわたって産生させるための優れた方法ではない。ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションのための様々なプロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．２節）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、第１６．４１節〜第１６．４６節）、または他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
【０４６１】
ネイクド核酸はまた、適切な緩衝液において細胞および核酸を一緒にインキュベーションし、細胞に高電圧の電気パルスを与えることによって細胞に導入することができる。核酸がエレクトロポレーションによって細胞に導入される効率は、加えられた電場の強さ、電気パルスの長さ、温度、ＤＮＡの立体配座および濃度、ならびに媒体のイオン組成によって影響を受ける。エレクトロポレーションは、広範囲の様々な細胞タイプを安定（または一過性）にトランスフェクションするために使用することができ、また、細胞のインビトロ操作に対して適用可能であるにすぎない。細胞のエレクトロポレーションのための様々なプロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．３節）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、第１６．５４節〜第１６．５５節）、または他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
【０４６２】
ネイクド核酸が細胞に導入され得る別の方法には、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）が含まれる。核酸は、カチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁物と混合される。その後、ＤＮＡ／リポソームの複合体が細胞とインキュベーションされる。リポソーム媒介トランスフェクションは、インビトロで培養中の細胞を安定（または一過性）にトランスフェクションするために使用することができる。様々なプロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．４節）、および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。また、インビボでの遺伝子送達が、リポソームを使用して達成されている。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ他（１９８７）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１４９：１５７〜１７６；ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７８５１〜７８５５；Ｂｒｉｇｈａｍ他（１９８９）、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２９８：２７８；Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ他（１９８９）、Ｇｅｎｅ、８４：４２９〜４３８を参照のこと。
【０４６３】
ネイクド核酸はまた、核酸を細胞に直接注入することによって細胞に導入することができる。細胞のインビトロ培養物の場合、ＤＮＡをマイクロインジェクションによって導入することができる。それぞれの細胞が個々にマイクロインジェクションされるので、この方法は、非常に多数の細胞を改変するときには非常に労働集約的である。しかしながら、マイクロインジェクションが優れた方法である状況が、（下記においてより詳しく議論される）遺伝子組換え動物の作製においてである。この状況では、ＤＮＡは、受精した卵母細胞に安定に導入され、その後、卵母細胞は動物に発達させることができる。得られる動物は、卵母細胞に導入されたＤＮＡを有する細胞を含有する。直接的な注入もまた、ネイクドＤＮＡを細胞にインビボで導入するために使用されている（例えば、Ａｃｓａｄｉ他（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：８１５〜８１８；Ｗｏｌｆｆ他（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５〜１４６８を参照のこと）。ＤＮＡを細胞にインビボで注入するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を使用することができる。そのような装置が（例えば、ＢｉｏＲａｄから）市販されている。
【０４６４】
ネイクド核酸は、受容体媒介のエンドサイトーシスにより取り込まれるために細胞表面受容体に対するリガンドに結合されるポリリシンなどのカチオンに対して複合体を形成させることができる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎ他（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：９６３〜９６７；米国特許第５１６６３２０号を参照のこと）。核酸−リガンド複合体が受容体に結合することにより、ＤＮＡの取込みが受容体媒介のエンドサイトーシスによって促進される。ＤＮＡ−リガンド複合体が標的とする受容体には、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体が含まれる。エンドソームを本来的に破壊し、それにより物質を細胞質内に放出するアデノウイルスカプシドに連結されたＤＮＡ−リガンド複合体を、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために使用することができる（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ他（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２１２２〜２１２６を参照のこと）。受容体媒介によるＤＮＡ取込みを、ＤＮＡをインビトロまたはインビボのいずれかで細胞に導入するために使用することができ、また、受容体媒介によるＤＮＡ取込みは、目的とする標的細胞において選択的に発現する受容体に結合するリガンドの使用により、ＤＮＡが特定の細胞タイプに対して選択的に標的化され得るという別の特徴を有する。
【０４６５】
一般に、ネイクドＤＮＡが、（例えば、上記で記載されたトランスフェクション技術の１つによって）培養中の細胞に導入されるとき、小さい割合の細胞（１０５個のうちの約１個）のみが、典型的には、トランスフェクションされたＤＮＡをそのゲノムに組込むにすぎない（すなわち、ＤＮＡは細胞においてエピソームに維持される）。従って、外因性ＤＮＡを取り込んでいる細胞を同定するために、選択マーカーをコードする核酸を目的とする核酸と一緒に細胞にトランスフェクションすることが好都合である。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与するマーカーが含まれる。選択マーカーは、目的とする遺伝子と同じプラスミドで導入することができ、または、別個のプラスミドで導入することができる。
【０４６６】
遺伝子産物をコードする核酸を細胞に導入するための好ましい方法は、遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含有するウイルスベクターの使用による方法である。ウイルスベクターによる細胞の感染は、大きな割合の細胞が核酸を受け取るという利点を有しており、これにより、核酸を受け取っている細胞を選択しなければならないことが回避され得る。また、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクターに含有されるｃＤＮＡ）が、ウイルスベクターの核酸を取り込んでいる細胞において効率的に発現される。ウイルスベクターシステムはインビトロまたはインビボのいずれでも使用することができる。
【０４６７】
欠陥レトロウイルスが、遺伝子治療目的のための遺伝子移入における使用のために詳しく特徴づけられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）、Ｂｌｏｏｄ、７６：２７１を参照のこと）。目的とする遺伝子産物をコードする核酸がレトロウイルスのゲノムに挿入された組換えレトロウイルスを構築することができる。また、レトロウイルスのゲノムの一部を除いて、レトロウイルスを複製欠陥にすることができる。その後、複製欠陥レトロウイルスはビリオンにパッケージングされ、これを使用して、標準的な技術によってヘルパーウイルスの使用により標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスを作製し、そのようなウイルスを用いてインビトロまたはインビボで細胞に感染させるための様々なプロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１０節〜第９．１４節）、および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。好適なレトロウイルスの例には、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが含まれ、これらは当業者には広く知られている。好適なパッケージングウイルス株の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｉｐ、Ψ２およびΨＡｍが含まれる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞タイプにインビトロおよび／またはインビボで導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ他（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３９５〜１３９８；Ｄａｎｏｓａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：６４６０〜６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ他（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ他（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６１４１〜６１４５；Ｈｕｂｅｒ他（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８０３９〜８０４３；Ｆｅｒｉ他（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３７７〜８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ他（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１８０２〜１８０５：ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７６４０〜７６４４；Ｋａｙ他（１９９２）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３：６４１〜６４７；Ｄａｉ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０８９２〜１０８９５；Ｈｗｕ他（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０：４１０４〜４１１５；米国特許第４８６８１１６号；米国特許第４９８０２８６号；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９／０５３４５；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。レトロウイルスベクターでは、レトロウイルスのゲノム（およびそれに挿入される外来核酸）が宿主のゲノムに組み込まれ��、核酸を細胞に安定に導入するためには、標的細胞の分裂が必要である。従って、標的細胞の複製を刺激することが必要となる場合がある。
【０４６８】
アデノウイルスのゲノムを、目的とする遺伝子産物をコードし、かつ発現し、しかし、正常な溶解性ウイルス生活環において複製するその能力に関して不活性化されているように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ他（１９８８）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９２）、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する好適なアデノウイルスベクターが当業者には広く知られている。組換えアデノウイルスは、効果的な遺伝子送達ビヒクルであるために分裂中の細胞を要求せず、また、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９２）、上掲）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６４８２〜６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２８１２〜２８１６）および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１〜２５８４）を含む広範囲の様々な細胞タイプに感染させるために使用することができるという点で好都合である。また、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含有される外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、エピソームにとどまり、それにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）における挿入変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題が回避される。そのうえ、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの運搬能が、他の遺伝子送達ベクターに対して大きい（８キロベースまでである）（Ｂｅｒｋｎｅｒ他、上掲；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されているほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスのＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子のすべてまたは一部について欠失されているが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％ほどが保持されている。
【０４６９】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および繁殖的な生活環のためのヘルパーウイルスとして別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど）を要求する天然に存在する欠陥ウイルスである（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ他、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）、１５８：９７〜１２９を参照のこと）。アデノ関連ウイルスはまた、ＤＮＡを非分裂の細胞に組み込むことができ、かつ、高頻度の安定な組み込みを示す数少ないウイルスの１つである（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ他（１９９２）、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ他（１９８９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ他（１９８９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３〜１９７３を参照のこと）。ＡＡＶの３００塩基対もの少数を含有するベクターをパッケージングすることができ、かつ組み込むことができる。外因性ＤＮＡのための余地は約４．５ｋｂに制限される。ＡＡＶベクター、例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３２５１〜３２６０に記載されるベクターなどを使用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して種々の細胞タイプに導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ他（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ他（１９８８）、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２：３２〜３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８４）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１：６１１〜６１９；Ｆｌｏｔｔｅ他（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：３７８１〜３７９０を参照のこと）。
【０４７０】
核酸を細胞に導入する特定の発現ベクターシステムの効率および方法の効率は、当該分野で日常的に使用されている標準的な方法をによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡをフィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって検出することができ、また、導入されたＤＮＡの転写により産生されたＲＮＡを、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護または逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。遺伝子産物を、適切なアッセイによって、例えば、特異的な抗体などを用いた、産生されたタンパク質の免疫学的検出によって、または、遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能的アッセイ（例えば、酵素アッセイなど）によって検出することができる。細胞により発現されることが注目される目的とする遺伝子産物が容易にアッセイできない場合、発現システムは、使用される調節エレメントおよびベクターに連結されたレポーター遺伝子を使用して最初に最適化され得る。レポーター遺伝子は、容易に検出することができる遺伝子産物をコードし、従って、システムの効率を評価するために使用することができる。当該分野で使用されている標準的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が含まれる。
【０４７１】
核酸を細胞の集団に導入するために使用される方法により、細胞の大きな割合の改変、および、細胞による遺伝子産物の効率的な発現がもたらされる場合（例えば、ウイルス発現ベクターを使用した場合には多いが）、改変された細胞集団は、集団内の個々の細胞をさらに単離またはサブクローニングすることなく使用することができる。すなわち、さらなる細胞単離が必要とされないように、その細胞集団による遺伝子産物の十分な産生がもたらされ得る。あるいは、１個の改変された細胞から同一的に改変された細胞の均一な集団を成長させて、遺伝子産物を効率的に発現する細胞を単離することが望ましい場合がある。一様な細胞のそのような集団は、１個の改変された細胞を限界希釈クローニングにより単離し、その後、標準的な技術によって１個の細胞を培養で拡大して細胞のクローン集団にすることによって調製することができる。
【０４７２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書中上記で記載された方法のそれぞれにおいて、造血単核細胞にエクスビボ細胞増殖のための条件を提供することは、細胞に、栄養分と、サイトカインとを提供することによって達成される。好ましくは、サイトカインは早期作用サイトカインであり、例えば、限定されないが、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−αおよびトロンンボポイエチンなどである。これに関連して、新規なサイトカインが継続して発見され、そのいくつかが本発明の細胞拡大方法において有用であり得ることが理解される。
【０４７３】
後期作用サイトカインもまた使用することができる。これらには、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞増殖因子およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【０４７４】
造血単核細胞に存在する造血幹細胞の分化を阻害する本発明の薬剤の能力は、細胞回収および細胞培養などの技術的適用においてさらに使用することができる。
【０４７５】
本発明のさらなる局面によれば、造血幹細胞回収／培養バッグが提供される。本発明の細胞回収／培養バッグには、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化を実質的に阻害する効果的な量のレチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニストおよび／またはビタミンＤ受容体アンタゴニストが補充される。あるいは、本発明の造血幹細胞回収／培養バッグには、効果的な量のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの誘導体、または、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログの代謝産物が補充される。さらにあるいは、本発明の造血幹細胞回収／培養バッグには、効果的な量のＰＩ３−キナーゼ阻害剤が補充される。さらにあるいは、本発明の造血幹細胞回収／培養バッグには、効果的な量の１つまたは複数の銅キレーターまたは銅キレートが補充される。
【０４７６】
本発明のさらなる局面によれば、特定の分子／薬剤（例えば、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、ビタミンＤ受容体アンタゴニスト、ＣＤ３８阻害剤、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤、銅キレーターまたは銅キレートなど）が、造血単核細胞画分に存在する造血幹細胞の集団を拡大するための効果的な薬剤であるかどうかを明かにするアッセイが提供される。
【０４７７】
本発明のこの局面によるこのアッセイは、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞を、試験されている薬剤／分子の存在下で培養し、造血幹細胞の拡大を経時的に（例えば、数週間〜数ヶ月）モニターすることによって行われる。増大した拡大および低下した分化が、非処理の細胞と比較して生じる場合、試験された薬剤／分子は効果的な造血幹細胞拡大剤である。
【０４７８】
好ましくは、造血単核細胞を培養することは、効果的な量のサイトカインの存在下で、好ましくは、早期作用サイトカインまたはそのようなサイトカインの組合せの存在下で、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンドおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で行われる。このアッセイは、例えば、上記で列挙されたアンタゴニスト、阻害剤、または銅キレーターおよび銅キレートのどれが、本明細書中上記で記載された本発明の様々な方法および調製物を実行するために最も効率的であるかを明らかにするために、当業者によって使用することができる。このアッセイはさらに、異なる起源の造血単核細胞を用いて最適な結果を達成するために最も効果的な濃度および暴露時間を決定するために使用することができる。
【０４７９】
本明細書中上記で記載された本発明の局面のそれぞれにおいて、造血単核細胞は、動物および植物の両方を含む任意の多細胞生物から得ることができる。好ましくは、造血単核細胞は、骨髄（Ｒｏｗｌｅｙ  ＳＤ他（１９９８）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２１：１２５３）、末梢血（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｋ（２０００）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２６：７８７）、肝臓（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＢＥ他（１９９８）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２７：４３３）および新生児臍帯血から得られる。
【０４８０】
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実施例により支持される。
【実施例】
【０４８１】
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。
【０４８２】
実施例１
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対する銅キレーターの影響
実験手法
サンプル収集および処理：サンプルを、正常な満期出産の後の臍帯血から得て、分娩後２４時間以内に凍結した。血液細胞をＤｅｘｔｒａｎ緩衝液中で解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）が補充されたＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）において１５時間インキュベーションした。その後、細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７グラム／ｍｌの密度；Ｓｉｇｍａ）に重層して、４００ｇで３０分間、室温で遠心分離した。その後、境界層における単核細胞を集め、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で３回洗浄し、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳに再懸濁した。その後、細胞を２つに分け、１つを単核細胞（ＭＮＣ）画分とし、もう一方の画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４＋始原（前駆）細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｍ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用する免疫磁石分離によってＣＤ３４＋細胞を精製するために使用した。得られたＣＤ３４＋細胞の純度は、フローサイトメトリーによる評価に基づいて９５％〜９８％の範囲であった。
【０４８３】
造血幹細胞のエクスビボ拡大：本明細書中上記に記載されるようにして得られた単核細胞（ＭＮＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）が補充されたアルファ最少必須培地（α−ＭＥＭ）とともに、約１０６細胞／ｍｌの濃度で、２４ウエルのＣｏｓｔａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に置床し、または培養バッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐ．）に接種した。精製されたＣＤ３４＋細胞を、約１０４細胞／ｍｌの濃度で、同様に置床し、または培養バッグに接種した。培地には、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）キレーター（Ｓｉｇｍａから得られる）および／または下記のヒト組換えサイトカイン（すべてがＰｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から得られる）を補充した：トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌ；インターロイキン６（ＩＬ−６）、５０ｎｇ／ｍｌ；ＦＬＴ−３リガンド、５０ｎｇ／ｍｌ；幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍｌ；時々、ＳＣＦをＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）により置き換えた。すべての培養物を、５％ＣＯ２／空気の雰囲気で加湿下、３７℃でインキュベーションした。１週間間隔で、細胞培養物を半分除き、サイトカインを含有する新しい培地を補充した。種々のインキュベーション期間の後、細胞を集め、トリパンブルーで染色して、計数した。
【０４８４】
形態学的評価：
サイトスピン（Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）によりスライドガラス上に堆積した細胞のアリコートついて、得られた培養集団の形態学的特徴づけを行った。細胞を固定し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａ染色液で染色し、顕微鏡で試験した。
【０４８５】
表面抗原分析：
細胞を採取し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリン結合抗体（全てＩｍｍｕｎｏｑｕａｌｉｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて４℃で６０分間染色した。次いで、細胞を同じ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳキャリバまたはＦａｃｓｔａｒｐｌｕｓフローサイトメーターによって分析した。シース液として生理食塩水を使用して、細胞を１０００細胞／秒の速度で通過させた。４８８ｎｍのアルゴンレーザビームを励起光源として使用した。対数増幅を使用して１０，０００個の細胞の発光を測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【０４８６】
ＣＤ３４＋細胞およびサブセットの決定：
精製したＣＤ３４＋細胞または全ＭＮＣ画分のいずれかを用いて開始した短期および長期培養物について、ＣＤ３４＋表面発現を、以下のように決定した：ＣＤ３４＋細胞を再度ポジティブ選択し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉキット）、計数した。その後、ＦＡＣＳおよび細胞形態分析によって、純度を確認した。
【０４８７】
再選択したＣＤ３４＋細胞サブセットを、以下の抗原の組み合わせで染色した：ＣＤ３４ＰＥ／ＣＤ３８ＦＩＴＣおよびＣＤ３４ＰＥ／３８，３３，１４，１５，３，４，６１，１９（Ｌｉｎ）ＦＩＴＣ。
【０４８８】
細胞集団の計算：
ＦＡＣＳ分析の結果を、細胞の比率で示す。サブセットの絶対数を、ＣＤ３４＋細胞の絶対数から計算する。
【０４８９】
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞のベースラインの決定を、以下のように行った：ＣＤ３４＋細胞を３つの解凍臍帯血単位から精製し、上記マーカーについて染色した。これらの実験の平均を、ベースライン値と見なした。
【０４９０】
総細胞数、ＣＤ３４＋細胞およびサブセットの数、ならびにＣＦＵ数を、培養物が継代されていないということを前提として、累積数（すなわち、ｍｌあたりの細胞数×実施した継代の数）として示す。
【０４９１】
コロニー形成単位（ＣＦＵ）能力のアッセイ：
２ＩＵ／ｍｌエリスロポイエチン（Ｅｐｒｅｘ，Ｃｉｌａｇ  ＡＧ  Ｉｎｔ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、幹細胞因子、およびＩＬ−３（共に２０ｎｇ／ｍｌ）、ならびにＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（共に１０ｎｇ／ｍｌ）（全てＰｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した半固体メチルセルロース含有培地中で細胞をクローニングした。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿空気中で１４日間インキュベートした。
【０４９２】
ＬＴＣ−ＣＦＵｃ値の決定：
培養物の自己再生を維持する能力を、上記引例に記載されているように、長期および延長した長期培養物におけるコロニー形成単位（ＬＴＣ−ＣＦＵｃ）の含有量の決定によって測定した。
【０４９３】
実験結果
単核細胞（ＭＮＣ）を、上記に記載されるように培養バッグに接種し、栄養分およびサイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌのＦＬｔ３、ＩＬ−６、ＴＰＯおよびＳＣＦ）を与えた。ＭＮＣ培養物を様々な濃度（５〜１０μＭ）のＴＥＰＡキレーターで処理（処置）し、または非処理（非処置）であった（非処理コントロール）。処理されたＭＮＣ培養物には、最初の３週間だけＴＥＰＡを補充し、３週目以降、キレーター非含有培地を重層した。事前に精製されたＣＤ３４＋培養物には、ＴＥＰＡを補充せず、これを陽性コントロールとして使用した。培養物を、細胞数（ＣＦＵｃ細胞、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）について１２週間の期間中、毎週分析した。ＣＤ３４＋細胞の含有量を正確に求めるために、ＣＤ３４＋細胞を毎週、実験群（処置ＭＮＣ培養物および非処置ＭＮＣ培養物）および陽性コントロール（ＣＤ３４＋培養物）のそれぞれから再選択し、計数した。
【０４９４】
結果が、下記の図１ａ〜ｂ、図２および図３に示される。結果は、非精製ＭＮＣ培養物へのＴＥＰＡキレーターの添加は、１２週間の期間にわたって、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋コロニー形成細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の数を実質的かつ徐々に増大させたことを示している。従って、ＴＥＰＡで処理されたＭＮＣ培養物では、ＣＤ３４＋細胞の累積数が、２週間後の検出不能レベルから１２週間後の８ｘ１０７細胞／ｍｌ以上に増大した（図１ａ〜ｂ）；ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の累積数が、２週間後の検出不能レベルから１２週間後の２．５ｘ１０７細胞／ｍｌに増大した（図２）；ＣＤ３４＋ＣＦＵｓの数が、２週間後の検出不能レベルから１０週間後の３．２ｘ１０７細胞／ｍｌに増大した（図３）。他方で、ＴＥＰＡがＭＮＣ培養物に添加されなかった場合（非処置コントロール）、幹細胞または始原細胞の著しい拡大は１２週間の期間を通して測定されなかった。さらに、ＴＥＰＡで処置されたＭＮＣ培養物における幹細胞および始原細胞の密度は、事前に精製されたＣＤ３４＋細胞培養物（これはＴＥＰＡで処置されていない；陽性コントロール）における幹細胞および始原細胞の密度に等しいか、またはそれを超えていた。長期間にわたるＴＥＰＡ処置ＭＮＣ培養物に由来する細胞の形態学的分析により、非分化細胞の割合が大きく、一方、ＴＥＰＡで処置されていない長期のＭＮＣ培養物に由来する細胞のほとんどは完全に分化していることが明らかにされた。
【０４９５】
本実施例において記載される結果は、造血幹細胞および造血前駆細胞が、ＣＤ３４＋細胞の事前の精製を伴うことなく、混合（単核細胞画分）血液細胞の培養において、少なくとも１２週間の期間にわたって継続してエクスビボで実質的に拡大され得ることを明瞭に示している。データはまた、この作用が、最初の３週間の培養時にだけＴＥＰＡキレーターを細胞培養培地に補充することから生じたことを示している。
【０４９６】
これらの結果は、サイトカインに加えてＴＥＰＡが補充された短期間のＭＮＣ細胞培養物は、サイトカインだけで処置されたＭＮＣ培養物で得られるこれらの細胞の最小限の拡大と比較して、ＣＤ３４＋細胞および幹細胞／早期始原細胞（ＣＤ３４＋３８−）の非常に大きい拡大を可能にしたことを示している。比較実験により、ＣＤ３４＋細胞およびその希なＣＤ３４＋３８−細胞サブセットの拡大が、延長された長期の培養において引き続き生じ、また、高度に精製されたＣＤ３４＋細胞で開始された培養物から得られる拡大と比較してはるかに大きくなっていることが明らかにされた。従って、これらの結果から、ＴＥＰＡによるＭＮＣの短期間の処置は、長期にわたる自己再生能を伴って細胞のより大きい拡大を可能にする方法でＭＮＣ培養物を高めることが示唆され得る。
【０４９７】
これらの結果からはまた、ＣＤ３４＋細胞およびその早期サブセットに対する調節作用に加えて、キレーターはまた、ＣＤ３４＋細胞画分に関して同時に精製されていない小さい細胞サブセットのエクスビボ拡大を可能にし得ることが示唆され得る。この細胞サブセットは、事実上ＣＤ３４−であるとおそらくは考えられるが、延長された長期の培養の時におけるＣＤ３４＋細胞およびそのサブセットの優れた拡大を支援し得る。
【０４９８】
従って、本実施例では、混合単核細胞培養物における幹細胞および始原細胞の実質的なエクスビボ拡大が例示される。この新規な手法では、当該分野で現在使用されている、培養の開始に先立つ、手間および費用のかかる幹細胞濃縮の必要性が回避される。従って、ＴＥＰＡなどの銅キレーターの使用により、幹細胞および／または始原細胞のエクスビボ拡大の手法が実質的に簡略化され、その費用が削減され、また、その効率が改善され得る。
【０４９９】
実施例２
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対する銅キレートの影響
銅−ＴＥＰＡキレートを、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６２に記載されるように調製した。
【０５００】
単核細胞（ＭＮＣ）を、上記の実施例１に記載されるように培養バッグに接種し、これに栄養分およびサイトカインを与えた。単核細胞培養物は非処置（コントロール）であるか、または、Ｃｕ−ＴＥＰＡキレートで処置された。処置されたＭＮＣ培養物には、銅−ＴＥＰＡキレートが最初の３週間にわたって補充され、３週目以降はキレーター非含有培地が重層された。すべての培養物は、８週間の期間の後、８週間分析された。
【０５０１】
結果が下記の表１に示される。結果は、ＭＮＣ培養物への銅−ＴＥＰＡキレートの添加により、８週間のインキュベーション期間の後、ＣＤ３４＋細胞の数、ＣＤ３４＋細胞の割合、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の数が著しく増大したことを示している。従って、インキュベーション後の培養バッグあたりのＣＤ３４＋細胞の累積数は、非処置培養物（サイトカインのみ）、５０μＭの銅−ＴＥＰＡで処置された培養物、および１００μＭの銅−ＴＥＰＡで処置された培養物において、それぞれ、２．５６ｘ１０６、１２．３７ｘ１０６または３２．８５ｘ１０６であった。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の累積数は、非処置のコントロール培養物（サイトカインのみ）における２．１ｘ１０５から、銅−ＴＥＰＡ（１００μＭ）で処置された培養物における６．１ｘ１０５にまで増大した。
2006508692.tif 000020
【０５０２】
本実施例において記載される結果から、造血幹細胞が、銅−ＴＥＰＡなどの銅キレートの存在下、ＣＤ３４＋細胞の事前の精製を行うことなく、単核血液細胞の培養物において、少なくとも８週間の期間にわたってエクスビボで実質的に拡大され得ることが明らかにされる。
【０５０３】
実施例３
単核細胞培養物の造血幹細胞のエクスビボ拡大に対するＲＡＲアンタゴニストの影響
材料および実験方法
高親和性レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストの４−［［４−（４−エチルフェニル）−２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオコメン−６−イル］］安息香酸（ＡＧＮ１９４３１０）を、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００６４に記載される手法に従って合成した。
【０５０４】
単核細胞画分を、上記の実施例１に記載されるように集め、精製した。ＭＮＣ培養物を、上記に記載されるように調製し、維持した。ＡＧＮ１９４３１０のＲＡＲアンタゴニストを１ｘ１０−３Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ［すなわち、４１０μｇ／ｌ〜４．１ｘ１０−５μｇ／ｌ］の範囲の濃度で試験培養物に加えた。このアンタゴニストは、所定の限られた期間、３週間までの間、または全培養期間中連続して加えられた。
【０５０５】
表２に表わされる結果は以下のことを示す：ＲＡＲアンタゴニストおよびサイトカインの存在下で培養した単核細胞画分は、最初の播種から２週間後および５週間後（それぞれ）に再選択した高度に精製したＣＤ３４＋細胞画分からＦＡＣＳ分析で定量したところ、コントロールの未処理ＭＮＣ画分と比較して、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞数の有意な増加を示した（７８％、２４％）。ＭＮＣ細胞は、ＣＤ３４＋集団の精製を先に行わなくても、ＲＡＲアンタゴニストに応答し、未分化の集団を拡大させた。ＲＡＲアンタゴニストでの処理は、播種から５週間後で幹細胞／先祖細胞画分の特異的拡大を刺激するのに十分である一方で、コントロールの未処理ＭＮＣでは検出可能なＣＤ３４＋集団は得られず、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物では有意な数のＣＤ３４＋細胞が得られ、これらは系統マーカーを欠いていた。したがって、コントロールサンプル中でのＣＤ３４＋細胞の生存を抑制するＭＮＣ培養細胞によって詳しく調べられた全ての因子では、この画分を詳しく調べるためにＲＡＲアンタゴニストによって得られたシグナルを超えるには不十分である。
2006508692.tif 000021
【０５０６】
明確にするために異なる実施形態の状況について記載してきた本発明の一定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて得ることもできることが認識される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の状況について記載した本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切な組み合わせで得ることもできる。
【０５０７】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。本発明および添付の特許請求の範囲の範囲は、ここに示されたいかなる明示のまたは特定の理論によって制限されるとみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０５０８】
【図１】造血単核細胞の培養におけるＣＤ３４＋造血幹細胞の拡大に対するＴＥＰＡキレーターの影響を例示する（図１ａ〜図１ｂ）。臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）がサイトカインの存在下で培養バッグに接種され、ＴＥＰＡキレーターが補充され（ＭＮＣ−ＴＥＰＡ）、または、ＴＥＰＡキレーターが補充されなかった（ＭＮＣコントロール）。比較のために、精製されたＣＤ３４＋細胞が、ＴＥＰＡキレーターを補充することなく、同様に、サイトカインの存在下で培養バッグに接種された（ＣＤ３４＋培養）。すべての培養物は１２週間インキュベーションされ、１週間間隔で、ＣＤ３４＋細胞が、ｍｉｎｉＭａｃｓカラムを使用して培養物から精製され、計数される。
【図２】上記に記載された未処理ＮＭＣ培養物、ＴＥＰＡ処理ＭＮＣ培養物およびＣＤ３４＋細胞培養物におけるＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞密度のＦＡＣＳ分析を例示する。
【図３】上記に記載された未処理ＭＮＣ培養物、ＴＥＰＡ処理ＭＮＣ培養物およびＣＤ３４＋細胞培養物から１週間間隔で測定されたコロニー形成細胞（ＣＦＵ）の比較可能な数を表す。
【図１】
2006508692.tif 000045
【図２】
2006508692.tif 000046
【図３】
2006508692.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月22日(2005.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞のエクスビボ集団を拡大し、その一方で同時に、造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する方法であって、
造血単核細胞を提供し；
前記単核細胞を、細胞増殖を可能にする条件下でエクスビボで培養し、そして同時に前記細胞を以下のものからなる群から選択される条件下で培養し；
前記単核細胞中のＣＤ３８の発現および／または活性を低下させる条件；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビ
タミンＤに対する応答能力を低下させる条件；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、お
よび／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させる
条件；
前記単核細胞を、前記単核細胞中のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコ
チンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニ
コチンアミドアナログ代謝産物の存在下で培養する条件；
前記単核細胞中のＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させる条件；お
よび
前記単核細胞を少なくとも１つの銅キレーターまたはキレートの存在下で培養する条
件；
それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害することを含む方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、造血細胞を移植または埋込みする方法：
（ａ）造血単核細胞を得る工程；
（ｂ）  前記単核細胞を、細胞増殖のためにエクスビボで培養し、ここで、前記培養は以下のものからなる群から選択される条件下で行われ；
ＣＤ３８の発現および／または活性を低下させる条件；
前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する
応答能力を低下させる条件；
前記造血単核細胞のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および／またはビタ
ミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させる条件；
前記単核細胞をニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくは
ニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナロ
グ代謝産物の存在下で培養する条件；
ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させる条件；および
前記単核細胞を少なくとも１つの銅キレーターまたはキレートの存在下で培養する条
件；
それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程；および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植または埋込みする工程。
【請求項３】
前記ドナーおよび前記レシピエントが単一の個体である請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する方法：
（ａ）造血単核細胞を得る工程；
（ｂ）前記単核細胞を、細胞増殖のためにエクスビボで培養し、ここで、前記培養は以下のものからなる群から選択される条件下で行われ；
前記単核細胞中のＣＤ３８の発現および／または活性を低下させる条件；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビ
タミンＤに対する応答能力を低下させる条件；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、お
よび／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させる
条件；
前記単核細胞を、前記単核細胞中のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコ
チンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニ
コチンアミドアナログ代謝産物の存在下で培養する条件；
前記単核細胞中のＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させる条件；お
よび
前記単核細胞を少なくとも１つの銅キレーターまたはキレートの存在下で培養する条
件；
それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化をエクスビボで実質的に阻害する工程；および
（ｃ）前記造血幹細胞を外因遺伝子で遺伝子改変する工程。
【請求項５】
遺伝子改変することが外因遺伝子を含むベクターによって達成される請求項４記載の方法。
【請求項６】
ベクターがウイルスベクターまたは核酸ベクターである請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、養子免疫療法の方法：
（ａ）造血単核細胞をレシピエントから得る工程；
（ｂ）前記単核細胞を、細胞増殖のためにエクスビボで培養し、ここで、前記培養は以下のものからなる群から選択される条件下で行われ；
前記単核細胞中のＣＤ３８の発現および／または活性を低下させる条件；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビ
タミンＤに対する応答能力を低下させる条件；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、お
よび／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させる
条件；
前記単核細胞を、前記単核細胞中のニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコ
チンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニ
コチンアミドアナログ代謝産物の存在下で培養する条件；
前記単核細胞中のＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させる条件；お
よび
前記単核細胞を少なくとも１つの銅キレーターまたはキレートの存在下で培養する条
件；
それにより、前記造血幹細胞の集団を拡大し、その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する工程；および
（ｃ）前記造血幹細胞をレシピエントに移植する工程。
【請求項８】
造血単核細胞から薬剤の効果的な量の存在下でエクスビボ増殖させられた造血幹細胞の拡大された集団、および、医薬的に許容され得るキャリアを含む移植可能な造血細胞調製物であって、前記薬剤が以下のものからなる群から選択される活性を有し：
前記単核細胞中のＣＤ３８の発現および／または活性を低下させる活性；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビ
タミンＤに対する応答能力を低下させる活性；
前記造血単核細胞の前記単核細胞中のレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、お
よび／またはビタミンＤ受容体を伴うシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させる
活性；
前記単核細胞中のＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させる活性；ま
たは
前記薬剤は銅キレーターまたはキレートであるか、または
ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミド
アナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物であ
り；
その一方で同時に前記造血幹細胞の分化を実質的に阻害する移植可能な造血細胞調製物。
【請求項９】
前記造血単核細胞が骨髄、末梢血、新生児臍帯血からなる群から選択される供給源に由来する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
エクスビボ細胞増殖のための前記条件を前記造血単核細胞に与えることは、前記造血単核細胞に栄養素およびサイトカインを与える工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインが初期活動サイトカインである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記初期活動サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンからなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記サイトカインが後期活動サイトカインである請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記後期活動サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子からなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性の減少のためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤がＣＤ３８発現を下方制御する薬剤である請求項８記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項１７】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト、およびビタミンＤ受容体アンタゴニストからなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤が、前記造血単核細胞のレチノイン酸、レチノイド、および／またはビタミンＤに対する応答能力を減少させるためのアンタゴニストである請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ３８発現を下方制御する薬剤がポリヌクレオチドである請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが、抗ＣＤ３８抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドＸ受容体抗体、または抗ビタミンＤ受容体細胞内抗体をコードする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、抗ＣＤ３８抗体、抗レチノイン酸受容体抗体、抗レチノイドＸ受容体抗体、または抗ビタミンＤ受容体抗体をコードする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、細胞内ＣＤ３８、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、またはビタミンＤ受容体のｍＲＮＡ分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびＤＮＡｚｙｍｅ分子からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤である請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する前記薬剤がポリヌクレオチドである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＰＩ３−キナーゼ発現を下方制御する薬剤が細胞内抗体である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが細胞内ＰＩ３−キナーゼｍＲＮＡまたは遺伝子分解を指示する干渉性低分子ポリヌクレオチド分子である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記干渉性低分子ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子、およびＤＮＡｚｙｍｅ分子からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤ３８発現を下方制御する前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＣＤ３８活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤がＣＤ３８活性を阻害する薬剤である請求項８記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項３３】
ＣＤ３８活性を阻害する前記薬剤が、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物である請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
前記ニコチンアミドアナログは、ベンズアミド、ニコチンチオアミド、ニコチン酸、およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸からなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ３８の前記発現および／または前記活性を減少させるためのエクスビボ培養条件を前記造血単核細胞に与えることは、ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤を前記造血単核細胞に与えることによる請求項１記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤がＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤である請求項８記載の移植可能な造血細胞調製物。
【請求項３７】
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する前記薬剤は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２からなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記造血幹細胞が、細胞増殖を可能とする条件下でのエクスビボ培養に先立って濃縮されていない請求項１記載の方法。
【請求項３９】
前記造血細胞が、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む請求項１記載の方法。
【請求項４０】
遷移金属キレートまたはキレーターが造血幹細胞の分化を実質的に阻害および誘導するかどうかを明らかにするアッセイであって、
造血単核細胞を、遷移金属キレートまたはキレーターの存在下で培養すること、および、前記造血幹細胞の分化をモニターすることを含み、分化が処理されていない造血単核細胞と比較して増大する場合、遷移金属キレートまたはキレーターは分化を誘導し、分化が処理されていない造血単核細胞と比較して低下する場合、遷移金属キレートまたはキレーターは分化を阻害すること、
を含むアッセイ。
【請求項４１】
効果的な造血幹細胞増殖剤を同定するアッセイであって、
以下のものからなる群から選択される化合物の存在下で造血単核細胞を培養すること：
レチノイン酸受容体アンタゴニスト；
レチノイドＸ受容体アンタゴニスト；
ビタミンＤ受容体アンタゴニスト；
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤；および
ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミド
アナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物；
および前記造血幹細胞の拡大をモニターすることを含み、非処理の造血単核細胞と比較して前記造血幹細胞の増大した拡大および減少した分化が起こる場合、前記化合物は効果的な造血幹細胞拡大剤であるアッセイ。
【請求項４２】
効果的な量の以下のものからなる群から選択される化合物：
レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイドＸ受容体アンタゴニストおよび／ま
たはビタミンＤ受容体アンタゴニスト、
ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミドもしくはニコチンアミド
アナログ誘導体、またはニコチンアミドもしくはニコチンアミドアナログ代謝産物；ま
たは
ＰＩ３−キナーゼ活性を阻害する薬剤
が補充された造血幹細胞回収／培養バッグであって、造血系の方向づけられた細胞からなる主画分と、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる微量画分とを含む造血単核細胞の造血幹細胞画分の細胞分化が実質的に阻害される造血幹細胞回収／培養バッグ。
【請求項４３】
請求項１記載の方法によって得られる造血幹細胞のエクスビボ拡大集団。
【国際調査報告】
2006508692.tif 000048
2006508692.tif 000049