(57)【要約】本発明は、抗腫瘍医薬品の使用を伴う肺癌治療の技術分野に関し、より詳細には、ＸＰＤ遺伝子について示される遺伝子多型に応じて各患者を最も有効な医薬品で治療するために使用することができる診断装置の開発に関する。本発明の検定装置は、ＸＰＤ遺伝子のエキソン２３（Ａ−Ｃ、Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ）及びエキソン１０（Ｇ−Ａ、Ａｓｐ３１２Ａｓｎ）中の多型性変異体、及びＰＣＲ又は自動ＤＮＡ配列決定を使用して前記遺伝子多型を検出するのに使用できる特異的なプライマーの開発に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子多型及び／又はジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列Ｘ５２２２１及びＸ５２２２２により遺伝子座が定義されているＥＲＣＣ２／ＸＰＤ修復遺伝子のヘテロ接合性消失の検出に基づいて、肺癌に有用な抗腫瘍薬物の治療反応に対する遺伝的素因を検出するための検定装置であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６から選択されるオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする検定装置。
【請求項２】
前記プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術でヒトＤＮＡ試料マッピングプライマーとして使用されることを特徴とする、検定装置。
【請求項３】
前記プローブが、自動配列決定技術でヒトＤＮＡ試料マッピングプライマーとして使用されることを特徴とする、検定装置。
【請求項４】
Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ又はＡｓｐ３１２Ａｓｎ遺伝子多型を、それぞれ各プライマー対を用いて検出することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか一項に記載の検定装置。
【請求項５】
前記抗腫瘍薬物が、シスプラチンと、ゲムシタビン、ビノレルビン、又はドセタキセルから選択される第２の抗腫瘍化合物との組み合わせであることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか一項に記載の検定装置。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６によって示される配列を特徴とする、抗腫瘍薬物への反応に対する遺伝的素因を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
前記抗腫瘍薬物が、シスプラチンと、ゲムシタビン、ビノレルビン、又はドセタキセルから選択される第２の抗腫瘍化合物との組み合わせであることを特徴とする、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、又はＱ  ＩＤ  ＮＯ．８によって示されるオリゴヌクレオチドの、抗腫瘍薬物への反応に対する遺伝的素因を検出するためのプライマーとしての使用。
【請求項９】
前記抗腫瘍薬物が、シスプラチンと、ゲムシタビン、ビノレルビン、又はドセタキセルから選択される第２の抗腫瘍化合物との組み合わせであることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍薬物を用いた肺癌治療の技術分野の範囲に含まれており、詳細には、ＸＰＤ遺伝子について示す多型に応じて最も有効な薬物で各患者を治療することを可能にする診断装置を開発する。
【背景技術】
【０００２】
様々な抗腫瘍薬物が、発癌物質が行うのと同様の方式でＤＮＡに損傷を与える。発癌物質又は細胞傷害性の抗腫瘍薬物を共有結合させると、化学的に改変された、付加体という用語（Ｐｈｉｌｉｐｓ、２００２年）で知られているＤＮＡ塩基が形成される。シスプラチンは、ＤＮＡ鎖間の結合を引き起こし、このような付加体が、シスプラチンの細胞傷害作用をもたらす（Ｓｉｄｄｉｋ、２００２年）。ＤＮＡ修復系は、シスプラチン付加体を除去するために必須である。ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、宿主を肺癌の発症から保護するための主要な経路であり、同時に、シスプラチンに対する耐性の生じる原理でもある。実際、ベンゾピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加体及びシスプラチン付加体の双方とも、効果的にＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害し、したがって転写を無効にする（Ｈａｎａｗａｌｔ、２００１年）。これらのＤＮＡ損傷はＮＥＲ系によって除去される。ＮＥＲ系は、２つの代謝経路、すなわち転写共役修復（ＴＣＲ）とゲノム全体の修復（ＧＧＲ）（ダイアグラム１）に細分される。ＴＣＲ（又はＴＣ−ＮＥＲ）は、活性遺伝子のＤＮＡを転写する鎖中の、転写を阻害している損傷を顕著に修復するが、ＧＧＲ（又はＧＧ−ＮＥＲ）は、活性遺伝子中の転写されない鎖中の損傷を修復し、転写機能の無いゲノム中の損傷も修復する（Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ他、１９９９年；Ｍａｙ他、１９９３年；ＭｃＫａｙ他、１９９８年）。
（ダイアグラム１）
2006514825.tif 000002
【０００３】
ヒトでは、ＮＥＲは太陽光の発癌作用に対する基本的な防御機序であり、修復経路中にある種の遺伝的欠陥があると、色素性乾皮症（ＸＰ）などの常染色体劣性遺伝性疾患に深刻な影響が生じる。実際、この疾患の患者は、日光過敏性であり、皮膚癌に対する感受性が異常に高く、罹患する頻度が高い。ＸＰでは、ＮＥＲ経路で欠損し得る７種類の相補群がある。これらの遺伝子は、ＸＰＡからＸＰＧまである。ＸＰ疾患では、これらの遺伝子が両方のＮＥＲ経路で欠損している（Ｃｏｎｆｏｒｔｉ他、２０００年）。卵巣癌で、またより少ない頻度で結腸癌及び肺癌で、ヘテロ接合性の消失が種々のＸＰ遺伝子で観察されている（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ他、２００１年）。ヘテロ接合性の消失は転写が起こらないことに関係しており、これらの遺伝子の欠損は、卵巣癌で観察されたように、シスプラチンに対する感受性の増大を引き起こす。コケーン症候群（ＣＳ）は、ＮＥＲ系中の欠損に関連づけられている他の光過敏性疾患である。２種の遺伝子が同定されており、ＣＳＡ及びＣＳＢである。前記の遺伝子が改変されると、ＴＣＲ経路においてそれらが関係する機能が乱される（Ｃｏｎｆｏｒｔｉ他、２０００年）。
【０００４】
ダイアグラム１（Ｒａｊｅｗｓｋｙ及びＭｕｌｌｅｒ、２００２年のものを改変）の左部分は、シスプラチンによって引き起こされた損傷を検出するための必須の経路であるＴＣＲ経路を示す（Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ他、１９９９年）。転写の際、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが損傷を検出すると、特異的なＣＳＡ及びＣＳＢ転写因子が分子的ＮＥＲ経路中で活性化される（Ｆｕｒｕｔａ他、２００２年；ＭｃＫａｙ他、２００１年）。ＸＰ遺伝子はまた、ダイアグラム１の囲み部分で示されるように、ＴＣＲ経路に関与している。本質的には、線維芽細胞中のどちらの経路（ＧＧＲ及びＴＣＲ）においても様々な分子的欠損によって、正常な線維芽細胞中で生じる感受性に比べて、シスプラチンの細胞傷害性作用に対する感受性が増大する。ＸＰＡ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、又はＸＰＧ遺伝子のうちのどの遺伝子のどんな欠損によっても、シスプラチンの活性がかなり増大することが重要である（Ｆｕｒｕｔａ他、２００２年）。
【０００５】
一般的原則としては、癌治療、特に肺癌の治療で使用される細胞毒素の全体は、シスプラチン又はカルボプラチンを、最も重要なものを挙げれば標準的に臨床使用されるゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル、又はビノレルビンなど他の薬物と併用することを中心としている。しかし、転移性肺癌における化学療法の成果は非常に限られており、増殖抑制期間の中央値は５カ月を超えず、生存期間の中央値は８カ月及び１０カ月を超えない。これらの生存予測期間の改善において、優れた組み合わせのタイプは無い。しかし、個体レベルで臨床的検証として、個々の事例では生存期間が有意に長いことが注目されている。単純なヌクレオチドの変化である遺伝子多型によって、個人差が生じ、それによって遺伝子の発現又は機能に違いが生じる。ゲノム中に極めて高率で存在するこのような遺伝子多型は、いまだ研究中である。将来的には３，０００種以上の遺伝子多型が特徴づけられ、それが癌感受性、疾患の予後評価、及び治療反応の予測評価を判定するのに役立つ可能性がある。メッセンジャーＲＮＡ発現の段階では、ＧＧＲ経路で作用するＥＲＣＣ１遺伝子の過剰発現により、胃癌、卵巣癌、及び肺癌においてシスプラスチンに対する耐性が生じることが確認されている（Ｌｏｒｄ他、２００２年；Ｍｅｔｚｇｅｒ他、１９９８年；Ｓｈｉｒｏｔａ他、２００１年）。
【０００６】
ＸＰＤ遺伝子多型は、様々な研究でＤＮＡ修復能の減退と関連づけられている（Ｓｐｉｔｚ他、２００１年）。実際、この集団の約半分は、Ｌｙｓ７５１Ｌｙｓ遺伝子型を有し、また、正常なホモ接合体のＡｓｐ３１２Ａｓｐ遺伝子型も有している。正常なホモ接合体遺伝子型を有するこのような患者又は人間は、極めて良い修復能を有し、したがって、シスプラチンに耐性となることができる（Ｂｏｓｋｅｎ他、２００２年）。修復能の増大は、機能分析によって測定することができ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるシスプラチンに対する耐性と関連づけられている（Ｚｅｎｇ−Ｒｏｎｇ他、１９９５年）。修復能は、ＢＰＤＥへの暴露によって損傷された遺伝子の再活性化を測定することによっても試験されており、肺癌患者の修復能レベルは、対照患者と比べて有意に低い（Ｗｅｉ他、１９９６年、２０００年）。多くの研究により、修復能の減退及びＤＮＡ付加体レベルの増大が、肺癌の危険性を増大させることが示されている。したがって、ＮＥＲ経路中の重要遺伝子の基底発現は、肺癌の危険性と関係がある。肺癌患者７５名及び対照患者９５名のリンパ球中のＥＲＣＣ１、ＸＰＢ、ＸＰＧ、ＣＳＢ、及びＸＰＣの転写レベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。その結果によれば、ＸＰＧ及びＣＳＢの発現レベルが、肺癌の場合に対照と比較して有意に低下することが示された（Ｃｈｅｎｇ他、２０００年）。ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、及びＣＳＢ遺伝子のリンパ球中メッセンジャーＲＮＡレベルが、ＥＲＣＣ１又はＸＰＤのメッセンジャーＲＮＡレベルと非常に有意な相関を示したこと、また、両方の遺伝子の発現がＤＮＡ修復能と相関関係があることが重要である（Ｖｏｇｅｌ他、２０００年）。
【０００７】
本明細書に記載したものとは異なる他の遺伝子多型の検出に基づく、肺癌の診断方法に関する特許（国際公開第９７／２５４４２号）、及び他のタイプの腫瘍の診断方法に関する特許（国際公開第９７／３８１２５号、国際公開第９５／１６７３９号）がある。他の薬物（スタチン）に対するある種の患者の反応を知るために、やはり他の遺伝子における遺伝子多型の検出を使用する他の特許もまた見出されているが、本出願人は、どの肺癌患者がある種の又は別の抗腫瘍治療の影響をより受けやすいかを判定する特許を承知していない。
（参考文献）
2006514825.tif 000003
2006514825.tif 000004
2006514825.tif 000005
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
実施した研究において、遺伝薬理学的予測価値があるＸＰ遺伝子の遺伝子多型性変異体を発見した。ＸＰＤ遺伝子のエキソン２３（Ａ−Ｃ、Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ）及びエキソン１０（Ｇ−Ａ、Ａｓｐ３１２Ａｎｓ）での遺伝子多型を試験した。図１及び図２は、それぞれ、自動配列決定により実施した、コドン３１２及び７５１でのＸＰＤ遺伝子多型の２例の同定例を示す。ダイアグラム２は、様々なＤＮＡ修復代謝経路、及び前記経路中でＸＰＤ遺伝子が占める位置を示す。米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の様々な腫瘍の細胞系パネルのスクリーニングにより、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、及びＥＲＣＣ１のうちでＸＰＤの過剰発現だけがアルキル化剤に対する耐性と相関していることが明らかにされている（Ａｌｏｙｚ他、２００２年）ことから、ＸＰＤ遺伝子多型の調査に対する臨床的関心は強まっている。
（ダイアグラム２）
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【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ヒトＸＰＤ／ＥＲＣＣ２遺伝子のＬｙｓ７５１Ｇｌｎ及びＡｓｐ３１２Ａｓｎ遺伝子多型の分類
【００１０】
１．ＥＲＣＣ２／ＸＰＤ遺伝子座の遺伝子情報
この遺伝子に対応するＤＮＡ、ＲＮＡ、及び蛋白質の配列情報は、ウェブページｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ／ｒｅｆｓｅｑ．ｈｔｍｌ、にＬｏｃｕｓ  ＩＤ  ２０６８として詳述されており、以下に要約する。
ＥＲＣＣ２／ＸＰＤ−除去修復補完交配げっ歯類修復欠損相補群２（色素性乾皮症Ｄ）
ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）：
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０００４００
蛋白質：  ＮＰ＿０００３９１
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）  供給：Ｘ５２２２１、Ｘ５２２２２
ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０００４００
蛋白質：ＮＰ＿０００３９１
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ヌクレオチド配列：
ヌクレオチド：Ｌ４７２３４（タイプｇ）、ＢＣ００８３４６（タイプｍ）、Ｘ５２２２１（タイプｍ）、Ｘ５２２２２（タイプｍ）
他のリンク：
ＯＭＩＭ：１２６３４０
ユニジーン（ＵｎｉＧｅｎｅ）：Ｈｓ  ９９９８７
【００１１】
２．ＤＮＡを得るための生物試料
２種の遺伝子多型Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ及びＡｓｐ３１２Ａｓｎを分類するのに使用するＤＮＡは、末梢血液由来の有核細胞から得た。
【００１２】
このＤＮＡを得、続いて分類するために、ヒト生体の他のどんな有核細胞のタイプも使用できることは指摘しておきたい。
【００１３】
３．血液抽出
末梢血液を、Ｋ３／ＥＤＴＡ入りバキュティナ型チューブ（ベクトン・ディッキンソンシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；参照番号３６７５２又は３６８４５７）中に集める。続いてそれを、室温、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血漿分画を捨てる。２倍体積量の赤血球溶解用溶液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ＝７．４）を細胞分画に加え、それを回転台にのせて３０分間室温でインキュベートする。次にその試料を、室温、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿物を１ｍｌの赤血球溶解用溶液に再懸濁させる。室温で１０分間、３，０００ｒｐｍの遠心分離を再度行い、上清を捨てる。得られた沈殿物が、赤血球を含まない細胞分画となる。
【００１４】
４．ＤＮＡ抽出
ＤＮＡを、末梢血液の有核細胞から抽出し、市販のキットＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ血液Ｍｉｎｉ−ｋｉｔ（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ−ｋｉｔ）（キアゲン；参照番号５１１０４又は５１１０６）を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従い精製する。
【００１５】
５．Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ及びＡｓｐ３１２Ａｓｎ遺伝子多型の分類
エキソン１０のＡｓｐ３１２Ａｓｎ遺伝子多型を分類するのに、以下のＰＣＲ反応条件を使用した（最終反応体積２５μｌ）：９００ｎＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１：ＡＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡ、９００ｎＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２：ＧＧＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧ、３００ｎＭのＴａｑＭａｎ  ＭＧＢ（商標）  ＶＩＣプローブ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３：ＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＧＡＡＧＴ  ＴＡＭＲＡ、３００ｎＭのＴａｑＭａｎ  ＭＧＢ（商標）  ６−ＦＡＭ  プローブ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４  ＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＡＡＧ  ＴＡＭＲＡ、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  ユニバーサル  ＰＣＲ  マスターミックス（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（アプライドバイオシステムズ；参照番号４３０４４３７）、及び２００ｎｇのＤＮＡ。ＰＣＲサイクル（５０℃で２分間、９５℃で１０分間、［９２℃で１５秒間、６０℃で１分間］を４０サイクル）及び遺伝子多型分析は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  配列検出システム装置（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）（アプライドバイオシステムズ）で対立遺伝子識別プログラム（Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）（アプライドバイオシステムズ）を用いて行った。
【００１６】
エキソン２３のＬｙｓ７５１Ｇｌｎ遺伝子多型を分類するのに、以下のＰＣＲ反応条件を使用した（最終反応体積２５μｌ）：９００ｎＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５：ＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡ、９００ｎＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６：ＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣ、３００ｎＭのＴａｑＭａｎ  ＭＧＢ（商標）  ＶＩＣ  プローブ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７：ＴＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣ  ＴＡＭＲＡ、３００ｎＭのＴａｑＭａｎ  ＭＧＢ（商標）  ６−ＦＡＭ  プローブ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８：ＣＴＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＴＣ  ＴＡＭＲＡ、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  ユニバーサル  ＰＣＲ  マスターミックス（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（アプライドバイオシステムズ；参照番号４３０４４３７）、及び２００ｎｇのＤＮＡ。ＰＣＲサイクル（５０℃で２分間、９５℃で１０分間、［９２℃で１５秒間、６０℃で１分間］を４０サイクル）及び遺伝子多型分析は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  配列検出システム装置（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）（アプライドバイオシステムズ）で対立遺伝子識別プログラム（Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）（アプライドバイオシステムズ）を用いて行った。
【００１７】
どちらの場合も、プライマー及びプローブのデザインは、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（商標）コンピュータプログラム（アプライドバイオシステムズ）を用いて、販売元の取り扱い説明書に従い前述した参照ＤＮＡ配列を使用して行った。プライマー及びプローブの特異性は、前もって、ＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によって試験した。全ての場合で、プライマーとプローブの双方が、ＥＲＣＣ２／ＸＰＤ遺伝子の試験対象である領域２箇所のそれぞれ１箇所に独自の特異性を示した。
【００１８】
６．自動ＤＮＡ配列決定による分析の確認
得られた結果の確認として、あらかじめ分析した（前項を参照）ＤＮＡ１００サンプル中のＬｙｓ７５１Ｇｌｎ及びＡｓｐ３１２Ａｓｎ遺伝子多型に相当するＤＮＡ断片を、配列決定した。
【００１９】
第１に、Ａｓｐ３１２Ａｓｎ遺伝子多型がマップされているＸＰＤ／ＥＲＣＣ２遺伝子のエキソン１０断片を、ＰＣＲ技術によって増幅した。ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった（最終体積５０μｌ）：０．２５μＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、０．２５μＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、５μｌのＰＣＲバッファー（６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１６．６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）（エコジェン（Ｅｃｏｇｅｎ）；参照番号ＥＴＡＱ−５００）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（エコジェン（Ｅｃｏｇｅｎ）；参照番号ＥＴＡＱ−５００）、０．１２ｍＭのＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘ）（ロシュ；参照番号１５８１２９５）、１ユニットのＥｃｏＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＥｃｏＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（エコジェン（Ｅｃｏｇｅｎ）；参照番号ＥＴＡＱ−５００）、及び２００ｎｇのＤＮＡ。使用したＰＣＲサイクルは、９５℃で５分間、［９４℃で３０秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で１分間］を３５サイクル、７４℃を７分間であった。
【００２０】
第２に、Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ遺伝子多型がマップされているＸＰＤ／ＥＲＣＣ２遺伝子のエキソン２３断片を、ＰＣＲ技術によって増幅した。ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった（最終体積５０μｌ）：０．２５μＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、０．２５μＭのプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、５μｌのＰＣＲバッファー（６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１６．６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）（エコジェン（Ｅｃｏｇｅｎ）；参照番号ＥＴＡＱ−５００）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（エコジェン（Ｅｃｏｇｅｎ）；参照番号ＥＴＡＱ−５００）、０．１２ｍＭのＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘ）（ロシュ；参照番号１５８１２９５）、１ユニットのＥｃｏＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＥｃｏＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（エコジェン（Ｅｃｏｇｅｎ）；参照番号ＥＴＡＱ−５００）及び２００ｎｇのＤＮＡ。使用したＰＣＲサイクルは、９５℃で５分間、［９４℃で３０秒間、６４℃で４５秒間、７２℃で１分間］を３５サイクル、７４℃を７分間であった。
【００２１】
ＰＣＲ生成物の完全性を、１．５％−ＴＢＥアガロースゲル中での電気泳動とそれに続く１％臭化エチジウムによる染色の後に、ＵＶトランスイルミネーターで分析した。
【００２２】
得られたＰＣＲ生成物を、以下に詳しく記載する配列決定反応に使用した。第１に、この生成物を、４μｌのＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（ＵＳＢ；参照番号７８２０）を１０μｌの対応するＰＣＲ生成物に加えることによって精製し、続いて、３７℃で４５分間、８０℃で１５分間インキュベートした。４μｌのＢｉｇＤｙｅターミネーター溶液、バージョン３．０（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０）（アプライドバイオシステムズ；参照番号４３９０２４８０１０２４）及び３．２ｐｍｏｌの対応するプライマー（この場合、ＰＣＲ増幅で使用したのと同じプライマー、フォワード型とリバース型の双方を、別々の反応で使用した）を、５００〜６００ｎｇの精製したＰＣＲ生成物に加えた。この配列決定反応のためのＰＣＲサイクルは、９４℃で５分間、［９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間］を３２サイクルであった。
【００２３】
配列決定反応を終えた後、６２．５μｌの９６％エタノール、３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムバッファー  ｐＨ４．６、及び２４．５μｌの二回蒸留水を加えて生成物を沈殿させた。室温で３０分間インキュベーションした後、それらを室温、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を捨て、２５０μｌの７０％エタノールで洗浄を行った。次いで、その試料を室温、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、エタノール残留物を捨て（沈殿物を放置して完全に乾燥させ）、１５μｌのＴＳＲ添加バッファー（アプライドバイオシステムズ；参照番号４０１６７４）を加える。それらを最後に９５℃で３分間インキュベートしてから、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０配列検出システム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）自動キャピラリ型装置（アプライドバイオシステムズ）中に注入する。自動配列決定の結果を、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．３．１プログラム（アプライドバイオシステムズ）を用いて分析した。
【００２４】
分析した全ての事例で、各試料の２種の遺伝子多型をフォワードプライマー及びリバースプライマーの双方を用いて配列決定した。全ての事例の結果は互いに一致しており、リアルタイムＰＣＲ定量分析によって得られた結果とも一致していた。
【００２５】
結果
ＸＰＤの対立遺伝子変異体が転移性肺癌の化学療法処置後の生存に影響し得ることを確認するために、転移性肺癌患者における３種の試験を２００１年８月に開始した。これら３種の異なる試験は、ゲムシタビン及びシスプラチンを用いる第１の試験、ビノレルビン及びシスプラチンを用いる第２の試験、並びにドセタキセル及びシスプラチンを用いる第３の試験である。ネオアジュバント化学療法の後に手術を受けた局所進行型肺癌の患者１００名も、レトロスペクティブ解析を行った。手術のみによる治療又は術前若しくは術後化学療法による治療を受けた、初期段階の患者約１５０名も分析し、その概要は付表に含まれる。
【００２６】
これまでで最も有意なデータは、ゲムシタビン及びシスプラチンを用いた治療を受けたステージＩＶの肺癌患者の試験から得られたデータである。２００１年８月から２００２年７月までの間に、２５０名の患者を対象とし、その内の１０９名に関する最終データが得られた。添付した表１は、年齢、全身状態、組織型、及び転移に関する通常の特徴である、これらの患者の臨床的特徴を示す。表ＩＩは、様々な遺伝子多型の頻度を示す。ＥＲＣＣ１遺伝子の１１８位の多型も、分析した。エキソン２３及び１０におけるＸＰＤ遺伝子多型の頻度から、正常なホモ接合体遺伝子型が５０％を占め、ヘテロ接合体変異体が４０％であることが分かる（表ＩＩ）。以下の図に、生存期間中央値が１０．７カ月、範囲が８．９〜１２．５カ月である患者１０９名（図３）の全生存期間を順に示す。ＥＲＣＣ１遺伝子の遺伝子多型による差は、有意ではない（図４）。しかし、コドン７５１のＸＰＤ遺伝子多型について生存期間を分析すると、Ｌｙｓ／Ｌｙｓ遺伝子型の患者５９名の生存期間中央値は１０．７カ月であるのに対し、Ｌｙｓ／Ｇｌｎヘテロ接合体の患者４０名では、生存期間はより長く中央値に未到達である（図５）。少数患者群（１０名）はホモ接合体のＧｌｎ／Ｇｌｎ変異体であり、生存期間中央値は２．１カ月である（ｐ＝０．０００９）ことも発見されている（図５）。同様の有意な差がコドン３１２についても認められている。対応する図を参照されたい（ｐ＝０．００３）（図６）。同様にして増殖抑制期間を分析すると、全体では、増殖抑制期間は中央値が４カ月、範囲が３．２〜４．８カ月である（図７）。ＥＲＣＣ１遺伝子型による差は無い（図８）。しかし、遺伝子型に基づくと、コドン７５１で大きな差が観察されており、Ｌｙｓ／Ｌｙｓの患者５９名では中央値が２．９カ月であるのに対し、Ｌｙｓ／Ｇｌｎの患者４０名では中央値が７．４カ月に上昇する。この差は非常に有意である（ｐ＝０．０３）（図９）。コドン３１２におけるＸＰＤ遺伝子多型の増殖抑制期間も示すが、この場合生存期間の差は有意ではない（図１０）。この試験の結論は、２種の患者グループを区別しているので明瞭である。一部の患者は全体の反応及び生存期間をはるかに上回る反応及び生存期間を示し、ゲムシタビン及びシスプラチンでは非常に良い結果が得られたが、他方の患者群では、通常許容される生存期間中央値をはるかに下回る不十分な結果に照らすと、前記の治療は明らかに禁忌とされるはずである。
【表１】
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【表２】
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【００２７】
やはり２００１年８月に開始した、第２のステージＩＶの肺癌試験では、シスプラチン及びビノレルビンを用いて治療した約１００名の患者を分析し、これらの患者の予備的結果が得られる。ＸＰＤ遺伝子型に基づくビノレルビンの効果から見て、予後不良のＬｙｓ／Ｌｙｓ患者をゲムシタビン及びシスプラチンで治療するとき、この場合にビノレルビンを使用すると、反対の現象が起こり、Ｌｙｓ／Ｌｙｓ患者群で１０カ月の増殖抑制期間が得られるが、この患者群をゲムシタビン及びシスプラチンを用いた試験で治療すると前記の増殖抑制期間中央値はわずか２．９カ月であることが示されている。対応する図１１及び１２を参照のこと。
【００２８】
最後に、局所進行型ステージＩＩＩ肺癌患者におけるＸＰＤ遺伝子多型の結果もまた示されており、同様に生存期間が遺伝子型によって変動している。ドセタキセルをゲムシタビン及びシスプラチンの組み合わせに加えることによって、増殖抑制期間は、Ｌｙｓ／Ｌｙｓ及びＡｓｐ／Ａｓｐの患者又はＬｙｓ／Ｌｙｓホモ接合体の患者において有意に長くなる。対応する図１３及び１４を参照のこと。
【００２９】
臨床応用
これらの結果は、肺癌の個別の遺伝薬理学的予測を初めて明確に示す。第１に、Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ  ＸＰＤ遺伝子型から、ゲムシタビン及びシスプラチンを用いて治療すると標準よりかなり大きな効果及びかなり長い生存期間が予測される。第２に、前記の組み合わせは、他の遺伝子型Ｌｙｓ７５１Ｌｙｓ及びＧｌｎ７５１Ｇｌｎでは、明らかに禁忌とされる。臨床的結果はまた、Ｌｙｓ７５１Ｌｙｓ患者がビノレルビン及びシスプラチン又はドセタキセル及びシスプラチンの組み合わせに非常に有利に反応することを示す。最後として第３に、Ｇｌｎ７５１Ｇｌｎ遺伝子型の少数患者群は、シスプラチンを用いたどんな組み合わせの化学療法によっても生存期間が非常に短く、したがって、シスプラチン無しの組み合わせによって治療すべきであることが確認されている。
【００３０】
ＸＰＤ遺伝子多型の遺伝的試験は、癌患者、特に肺癌患者で化学療法を実施する前に、薬物を適切に選択するために絶対に必要である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】アミノ酸変化Ａｓｐ→Ａｓｎを引き起こすＧ→Ａ置換による、コドン３１２におけるＸＰＤ３１２遺伝子多型を示す図である。
【図２】アミノ酸変化Ｌｙｓ→Ｇｌｎを引き起こすＡ→Ｃ置換による、コドン７５１におけるＸＰＤ７５１遺伝子多型を示す図である。
【図３】ゲムシタビン／シスプラチン使用時の全生存期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図４】ＥＲＣＣ１遺伝子型による生存期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図５】ＸＰＤ７５１遺伝子型による生存期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図６】ＸＰＤ３１２遺伝子型による生存期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図７】増殖抑制期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図８】ＥＲＣＣ１遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図９】ＸＰＤ７５１遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図１０】ＸＰＤ３１２遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図１１】ビノレルビン／シスプラチン使用時のＸＰＤ７５１遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図１２】ゲムシタビン／シスプラチン使用時のＸＰＤ７５１遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：月；縦座標：確率）。
【図１３】ゲムシタビン／シスプラチン／ドセタキセル使用時のＸＰＤ７５１遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：週；縦座標：確率）。
【図１４】ＸＰＤ７５１及び３１２遺伝子型による増殖抑制期間を示す図である（横座標：週；縦座標：確率）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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