(57)【要約】本発明はアルツハイマー病や他アミロイ症を治療するための化合物と方法に、BACE1活性を調節するポリペプチド類に関し、またアルツハイマー病や他アミロイド症の治療用の薬物を識別する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のものからなる群より選択される単離ポリペプチド:
(a)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の85〜97個程度の連続アミノ酸からなる第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の70〜85個程度の連続アミノ酸からなる第2ポリペプチド配列、および(iii)0〜55個のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
(b)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の97個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の85個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第2ポリペプチド配列、および(iii)0〜55個のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
(c)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の85〜97個程度の連続アミノ酸からなる第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の70〜85個程度の連続アミノ酸からなる第2ポリペプチド配列、および(iii)70〜200個のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
(d)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の97個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の85個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第2ポリペプチド配列、および(iii)70〜200個程度のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド; および
(e)  (a)〜(d)のポリペプチドの変異体であって、(a)〜(d)のポリペプチドの第1ポリペプチド配列または第2ポリペプチド配列または両ポリペプチド配列に、1つ又は複数のアミノ酸たとえば1〜15個の、1〜10個の、1〜5個の、1〜3個の、または１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を、任意の組合せで含む変異体。
【請求項２】
次のものからなる群より選択される単離ポリヌクレオチド:
(a)  (i)SEQ ID NO.1の5’末端の255〜291個程度の連続塩基からなる第1ポリヌクレオチド配列、(ii) SEQ ID NO.1の3’末端の210〜255個程度の連続塩基からなる第2ポリヌクレオチド配列、および(iii)0〜165個の連続塩基からなる第3ポリヌクレオチド配列を含み、第1ポリヌクレオチド配列がその5’末端で第2ポリヌクレオチド配列の3’末端と第3ポリヌクレオチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリヌクレオチド;
(b)  (i)SEQ ID NO.1の5’末端の255〜291個程度の連続塩基に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第1ポリヌクレオチド配列、(ii) SEQ ID NO.1の3’末端の210〜255個程度の連続塩基に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第2ポリヌクレオチド配列、および(iii)0〜165個の連続塩基または210〜600個の連続塩基からなる第3ポリヌクレオチド配列を含み、第1ポリヌクレオチド配列がその5’末端で第2ポリヌクレオチド配列の3’末端と第3ポリヌクレオチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリヌクレオチド;
(c)  本発明のポリペプチドに対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する単離ポリヌクレオチド; および
(d)  本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
1つまたは複数の発現調節配列に作用可能に連結された、請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含むように形質転換した宿主細胞。
【請求項６】
請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項2に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項2または3に記載のポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、該核酸分子によってコードされるタンパク質が発現されるような条件下で培養するステップを含む前記方法。
【請求項８】
請求項1に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項９】
細胞中のRTN3の発現を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  試験薬物を、RTN3ポリペプチドを発現するまたは発現しうる細胞と接触させるステップ、および
(c)  試験薬物の存在下および不存在下でのRTN3の発現レベルを比較し、差でRTN3の発現を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項１０】
細胞を細胞株または初代培養細胞から選択する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が細胞株である、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
細胞株がCOS-7、HEK-293T、HeLa、CHO、IMR32、SK-N-MC、SH-N-AS、SK-N-SH、SK-N-DZ、SK-N-FI、F98、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、LN-18、WERI-Rb-1、HepG2、MCP7、KB、A172、SH-SY5Yからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
動物細胞中のRTN3発現を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  RTN3ポリペプチドを発現するまたは発現する能力をもつ該動物に試験薬物を投与するステップ
(b)  該動物から組織をサンプリングするステップ、および
(c)  試験薬物の投与を受けた動物および投与を受けなかった動物の組織中のRTN3発現レベルを比較し、差でRTN3の発現を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項１４】
動物が哺乳動物である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
細胞中のRTN3タンパク質活性を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  試験薬物を、RTN3タンパク質を含む細胞と接触させるステップ、および
(c)  試験薬物の存在下および不存在下でのRTN3タンパク質の活性レベルを比較し、差でRTN3タンパク質活性を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項１６】
細胞を細胞株または初代培養細胞から選択する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が細胞株である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
細胞株がCOS-7、HEK-293T、HeLa、CHO、IMR32、SK-N-MC、SH-N-AS、SK-N-SH、SK-N-DZ、SK-N-FI、F98、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、LN-18、WERI-Rb-1、HepG2、MCP7、KB、A172、SH-SY5Yからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
動物細胞中のRTN3タンパク質活性を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  細胞にRTN3タンパク質を含む動物に試験薬物を投与するステップ
(b)  該動物から組織をサンプリングするステップ、および
(c)  試験薬物の投与を受けた動物および投与を受けなかった動物の組織中のRTN3タンパク質活性を比較し、差でRTN3タンパク質の活性を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項２０】
動物が哺乳動物である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
レチキュロン(RTN)タンパク質のBACE1との結合を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  BACE1をRTNタンパク質、RTNタンパク質誘導体、またはRTNタンパク質を含む細胞抽出物と試験薬物の存在下または不存在下に接触させるステップ、および
(b)  試験薬物の存在下および不存在下でのBACE1とRTNタンパク質との結合を比較し、差で該結合を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項２２】
RTNタンパク質がRTN3タンパク質である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
BACE1活性を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  RTN3タンパク質を発現する細胞を用意するステップ
(b)  該細胞を試験薬物と接触させるステップ、および
(c)  RTN3タンパク質の発現または活性レベルを、試験薬物の存在下および不存在下に検出し、差でBACE1活性を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項２４】
ベータアミロイドペプチドの産生を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  RTN3タンパク質を発現する細胞を用意するステップ
(b)  該細胞を試験薬物と接触させるステップ、および
(c)  RTN3タンパク質の発現または活性レベルを、試験薬物の存在下および不存在下に検出し、差でベータアミロイドペプチドの産生を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項２５】
人間または人間以外の動物の細胞におけるBACE1活性を低下させる方法であって、次の薬物群より選択される1つまたは複数の薬物を有効量、該動物に投与するステップを含む前記方法:
(a)  RTN3ポリペプチド
(b)  RTN4ポリペプチド
(c)  請求項1に記載のポリペプチド
(d)  RTN3類似物
(e)  RTN4類似物
(f)  RTN3ポリペプチドの発現を増進する薬物
(g)  RTN4ポリペプチドの発現を増進する薬物
(h)  RTN3ポリペプチドの活性を増進する薬物
(i)  RTN4ポリペプチドの活性を増進する薬物。
【請求項２６】
哺乳動物のベータアミロイドペプチド沈着に関連する疾患を治療するまたは発症を遅延させる方法であって、次の薬物群より選択される1つまたは複数の薬物を有効量、該哺乳動物に投与するステップを含む前記方法:
(a)  RTN3ポリペプチド
(b)  RTN4ポリペプチド
(c)  本発明のポリペプチド
(d)  RTN3ポリペプチド類似物
(e)  RTN4ポリペプチド類似物
(f)  RTN3ポリペプチドの発現を増進する薬物
(g)  RTN4ポリペプチドの発現を増進する薬物
(h)  RTN3ポリペプチドの活性を増進する薬物
(i)  RTN4ポリペプチドの活性を増進する薬物。
【請求項２７】
哺乳動物が人間である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
疾患がアルツハイマー病、脳アミロイド血管症および突発性封入体筋炎からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
疾患がアルツハイマー病である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
細胞中のRTN4の発現を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  試験薬物を、RTN4ポリペプチドを発現するまたは発現しうる細胞と接触させるステップ、および
(b)  試験薬物の存在下および不存在下でのRTN4の発現レベルを比較し、差でRTN4の発現を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項３１】
細胞を細胞株または初代培養細胞から選択する、請求項9に記載の方法。
【請求項３２】
細胞が細胞株である、請求項9に記載の方法。
【請求項３３】
細胞株がCOS-7、HEK-293T、HeLa、CHO、IMR32、SK-N-MC、SH-N-AS、SK-N-SH、SK-N-DZ、SK-N-FI、F98、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、LN-18、WERI-Rb-1、HepG2、MCP7、KB、A172、SH-SY5Yからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項３４】
動物細胞中のRTN4発現を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  RTN4ポリペプチドを発現するまたは発現する能力をもつ該動物に試験薬物を投与するステップ
(b)  該動物から組織をサンプリングするステップ、および
(c)  試験薬物の投与を受けた動物および投与を受けなかった動物の組織中のRTN4発現レベルを比較し、差でRTN4の発現を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項３５】
動物が哺乳動物である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
細胞中のRTN4タンパク質活性を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  試験薬物を、RTN4タンパク質を含む細胞と接触させるステップ、および
(b)  試験薬物の存在下および不存在下でのRTN4タンパク質の活性レベルを比較し、差でRTN4タンパク質活性を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項３７】
細胞を細胞株または初代培養細胞から選択する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が細胞株である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
細胞株がCOS-7、HEK-293T、HeLa、CHO、IMR32、SK-N-MC、SH-N-AS、SK-N-SH、SK-N-DZ、SK-N-FI、F98、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、LN-18、WERI-Rb-1、HepG2、MCP7、KB、A172、SH-SY5Yからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
動物細胞中のRTN4タンパク質活性を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)   RTN4タンパク質を含む細胞をもつ動物に試験薬物を投与するステップ
(b)  該動物から組織をサンプリングするステップ、および
(c)  試験薬物の投与を受けた動物および投与を受けなかった動物の組織中のRTN4タンパク質活性を比較し、差でRTN4タンパク質の活性を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項４１】
動物が哺乳動物である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
BACE1活性を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  RTN4タンパク質を発現する細胞を用意するステップ
(b)  該細胞を試験薬物と接触させるステップ、および
(c)  RTN4タンパク質の発現または活性レベルを、試験薬物の存在下および不存在下に検出し、差でBACE1活性を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項４３】
ベータアミロイドペプチドの産生を調節する薬物を識別する方法であって、
(a)  RTN4タンパク質を発現する細胞を用意するステップ
(b)  該細胞を試験薬物と接触させるステップ、および
(c)  RTN4タンパク質の発現または活性レベルを、試験薬物の存在下および不存在下に検出し、差でベータアミロイドペプチドの産生を調節する試験薬物を示すようにするステップ
を含む前記方法。
【請求項４４】
細胞が細胞株である、請求項23、24、42および42のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
細胞株がCOS-7、HEK-293T、HeLa、CHO、IMR32、SK-N-MC、SH-N-AS、SK-N-SH、SK-N-DZ、SK-N-FI、F98、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、LN-18、WERI-Rb-1、HepG2、MCP7、KB、A172、SH-SY5Yからなる群より選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
人間または人間以外の動物の患者のアミロイド症を治療する方法であって、次の薬物群より選択される1つまたは複数の薬物を有効量、該患者に投与するステップを含む前記方法:
(a)  RTN3ポリペプチド
(b)  RTN4ポリペプチド
(c)  請求項1に記載のポリペプチド
(d)  RTN3ポリペプチド類似物
(e)  RTN4ポリペプチド類似物
(f)  RTN3ポリペプチドの発現を増進する薬物
(g)  RTN4ポリペプチドの発現を増進する薬物
(h)  RTN3ポリペプチドの活性を増進する薬物
(i)  RTN4ポリペプチドの活性を増進する薬物。
【請求項４７】
RTN3ポリペプチドがSEQ ID NO.2のポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
RTN3ポリペプチドがSEQ ID NO.2のポリペプチドの変異体または断片である、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４９】
RTN3ポリペプチドがSEQ ID NO.2のポリペプチドと少なくとも85%の相同性を有するポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５０】
RTN3ポリペプチドがSEQ ID NO.2のポリペプチドと少なくとも95%の相同性を有するポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
RTN4ポリペプチドがRTN4-Aポリペプチド、RTN4-BポリペプチドまたはRTN4-Cポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
RTN4ポリペプチドがSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8またはSEQ ID NO.9のポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
RTN4ポリペプチドがSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8またはSEQ ID NO.9のポリペプチドの変異体または断片である、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
RTN4ポリペプチドがSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8またはSEQ ID NO.9のポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
RTN4ポリペプチドがSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8またはSEQ ID NO.9のポリペプチドと少なくとも85%の相同性を有するポリペプチドである、請求項25、26および46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５６】
RTN4ポリペプチドがSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8またはSEQ ID NO.9のポリペプチドと少なくとも95%の相同性を有するポリペプチドである、請求項55に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にアルツハイマー病や他アミロイ症を治療するための化合物と方法に、特にBACE1活性を調節するポリペプチド類に関し、またアルツハイマー病や他アミロイド症の治療用の薬物を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(AD)は主に加齢に関連する進行性脳変性疾患である。ADの臨床像は記憶、認知、推理、判断、見当識などの障害を特徴とする。病気の進行に伴い、運動、感覚、言語の各機能にも影響が及び、ついには種々の認知機能の全般的な障害が生じる。こうした認知機能の喪失は徐々に進行するが、4〜12年以内に重度の機能障害を経て死に至るのが普通である。
【０００３】
ADは患者脳内の細胞外老人斑と細胞内神経線維変化を特徴とする[Masters, C.L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:4245-4249 (1985)]。老人斑は脳の特定部分(海馬など)に主に形成されるが、脳血管および硬膜血管の壁にも見つかる場合がある[Delacourt, A. et al., Virchows Archiv.--A, Pathological Anatomy & Histopathology, 411:199-204(1987); Masters, C.L. et al., EMBO Journal, 4:2757-2763 (1985)]。
【０００４】
ADの老人斑は主にAベータ(専門的には他に、アミロイドβペプチド、βアミロイドペプチド、βアミロイドタンパク質、Aβペプチド、Aβタンパク質、A4タンパク質などとも呼ばれる)という異種ペプチド断片集合体からなることが判明した。Aβペプチドはアミノ酸39〜43個のタンパク質であるが、これはそれよりもずっと大きなアミロイド前駆体タンパク質(APP)という前駆体タンパク質の分解産物である。
【０００５】
いくつかの証拠によれば、脳へのβアミロイドペプチド沈着の進行はアルツハイマー病(AD)の発病機序で種子的な役割を果たすし、また認知的症状に何年もまたは何十年も先行する可能性がある(たとえばSelkoe, 1991, Neuron 6:487を参照)。Aβは培養神経細胞から放出されること、およびAβは正常人とAD患者のどちらの脳脊髄液(CSF)にも存在することがすでに立証されている(たとえばSeubert et al., 1992, Nature 359:325-327を参照)。
【０００６】
アミロイドβタンパク質の沈着はADの発症で決定的な役割を果たすという強力な証拠が、ＡＤの表現型がアミロイド前駆体タンパク質(APP)遺伝子の突然変異体と同時分離する家族性AD類縁種の識別から挙がった[Younkin, S.G., Tohoku J. of Exper.Med., 174:217-223 (1993); Matsumura, Y. et al., Neurology, 46:1721-1723 (1996)]。
【０００７】
アミロイド沈着斑および/または血管アミロイド症は他の疾患たとえば21トリソミー(ダウン症)、遺伝性脳出血、脳アミロイド血管症および突発性封入体筋炎(老人の最も一般的な進行性筋疾患)、その他の神経変性疾患とも関連すると判明している。
【０００８】
アミロイドβペプチドはβアミロイドペプチド、Aβペプチド、βアミロイド、Aベータ、Aβなどいろいろに表記されるが、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解に由来する。APPのプロセシングには数種のタンパク質分解酵素(セクレターゼという)が関与している。APPのN末端でのAβペプチドのβセクレターゼによる切断とC末端での1つまたは複数のγセクレターゼによる切断とはβアミロイド生成経路すなわちAベータが形成される経路を構成する。αセクレターゼによるAPPの分解はα-sAPPを、すなわちβアミロイド斑を形成することのない分泌型APPを生成する。この代替経路はAβペプチドの形成を不可能にする。APPのタンパク質分解性プロセシング断片は米国特許第5,441,870号、第5,721,130号および第5,942,400号の各明細書で開示されている。
【０００９】
BACE1、Asp2またはメマスピン2という膜結合アスパルチルプロテアーゼが、APPをβセクレターゼ切断部位でプロセシングしてAベータを形成する働きをする酵素であるβセクレターゼとして同定された(Yan et al., 1999; Vassar et al., 1999; Hussain et al., 1999; Lin et al., 2000; Sinha et al., 1999)。BACE1欠損マウスはAベータの産生をほぼ完全に阻止するが、これはBACE1が主要な細胞性βセクレターゼであることを示唆している(Cai et al., 2001; Lou et al., 2001; Roberds et al., 2001)。内在性のBACE1は主に後期ゴルジおよびTGN区画に局在し、そこでAPPを切断してAPPb断片や膜結合C末端断片CTF99を生成することが判明した(Yan et al., 2001)。CTF99はγセクレターゼによるさらなるプロセシングを受けてアミロイドペプチド(Aベータ)を放出する可能性がある。
【００１０】
Aベータ産生でBACE1が果たす決定的な役割のために、ADや他のAベータ沈着に関連する疾患の治療または発症遅延にはこの酵素の活性を阻害するのが望ましいと考えられている。
【００１１】
レチキュロン(RTN)ファミリーのタンパク質は神経内分泌特異的タンパク質(NSPs)ともいい、神経内分泌組織で特異的に発現する。これらのタンパク質は小胞体に関連することが知られている。今日までに4つのレチキュロン遺伝子(RTN1、RTN2、RTN3およびRTN4)がクローン化されている。MoreiraらはヒトRTN3アミノ酸配列SEQ ID NO.2とRTN3コード化領域ヌクレオチド配列SEQ ID NO.1を開示している[E.F. Moreira, C.J. Jaworski, and I.R. Rodriguez, “Cloning of a novel member of the reticulon gene family (RTN3): gene structure and chromosomal localization to 11q13.” (レチキュロン遺伝子ファミリーの新メンバーRTN3のクローニング: 遺伝子の構造と染色体上の位置11q13の同定) Genomics 58, 73-81 (1999)]。レチキュロン4 (RTN4)はRTN3の同族体であり、foocenまたはNogoともいう。RTN4遺伝子産物のアイソフォーム3種が同定されており、RTN4-A、RTN4-BおよびRTN4-Cというが、それぞれNogo A、Nogo BおよびNogo Cともいう。RTN4-BとRTN4-CはRTN4-Aの代替スプライシングバリアントである。国際公開第WO 00/31235号明細書はRTN4の3アイソフォームのアミノ酸配列、およびラットとヒトのRTN4アイソフォームをコードする核酸配列を開示している。また国際公開第WO 00/05364号および第WO 01/3631号の各明細書は、ヒトRTN4-Aアミノ酸配列SEQ ID NO.7、ヒトRTN4-Bアミノ酸配列SEQ ID NO.8、ヒトRTN4-Cアミノ酸配列SEQ ID NO.9を開示している。本願では特に断らない限り用語RTN4はRTN4ポリペプチドの3アイソフォームをみな包含する。
【００１２】
これらタンパク質は傑出した免疫反応性が数多くの脳部位(小脳、上丘、海馬、黒質、尾状核-被殻など)で認められた。これらのレチキュロンの正確な機能は不明であるが、小胞形成、分泌物のパッケージングまたは細胞内Ca2+レベルの調節に関与しているのではないかと指摘されている。
【００１３】
配列表の簡単な説明
SEQ ID NO.1: ヒトRTN3のポリヌクレオチド配列
SEQ ID NO.2: RTN3のアミノ酸配列
SEQ ID NO.3: ポリヌクレオチド配列(プライマー)
SEQ ID NO.4: ポリヌクレオチド配列(プライマー)
SEQ ID NO.5: ポリヌクレオチド配列(プライマー)
SEQ ID NO.6: ポリヌクレオチド配列(プライマー)
SEQ ID NO.7: RTN4-Aのアミノ酸配列
SEQ ID NO.8: RTN4-Bのアミノ酸配列
SEQ ID NO.9: RTN4-Cのアミノ酸配列
【発明の開示】
【００１４】
本発明は1つには、RTN3またはRTN4はBACE1活性を調節するという新発見に依拠する。従って本発明は一実施態様で、人間および人間以外の動物への外来性RTN3または外来性RTN4ポリペプチドの投与または外来性RTN3またはRTN4の発現または活性に影響を及ぼす1つまたは複数の薬物の投与によりそのBACE1活性を調節する方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、RTN3配列に由来しかつRTN3の1つまたは複数の機能または生物活性を有する組換えポリペプチド、該組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および該組換えポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、(1)RTN3またはRTN4の発現または活性、または(2)BACE1活性、を調節する薬物を識別するin vitroまたはin vivo方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、BACE1活性調節用の薬物であって、外来性RTN3、外来性RTN4ポリペプチド、本発明の組換えポリペプチド、および外来性RTN3またはRTN4の発現または活性に影響を及ぼす薬物を包含する薬物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、人間または人間以外の動物のβアミロイド沈着に関連する疾患を治療する、または発症を遅延させる方法であって、外来性RTN3、外来性RTN4ポリペプチド、本発明の組換えポリペプチド、外来性RTN3またはRTN4の発現または活性に影響を及ぼす薬物、または以上のうち任意の薬物の組み合わせを投与するステップを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
従来BACEに結合するとは判明していなかったある種のタンパク質類が実はBACE活性の重要な調節物質であることを発見した。これらはRTNファミリーのタンパク質特にRTN3、RTN4およびrab5cである。これらのBACE1活性調節タンパク質の同定は、抗HA抗体を使用してHA標識BACE1を導入したHEK-293細胞の免疫沈降実験で行った。免疫沈降複合体は4〜12% NuPageゲルで分離し、コロイダルブルーで染色した。除洗後、ゲルを配列分析にかけた。この免疫沈降実験ではBACE1と結合して免疫複合体を形成するタンパク質が少なくとも3つ存在することが判明した(図1)。RTN3タンパク質とRTN4タンパク質は別々にまたは協調して、BACE1と相互作用し、その活性を調節することが判明した。またRTN3とRTN4の発現の、一緒の、または別々の増大はBACE1活性の低下または阻害をもたらしうることも判明した。本発明は、RTN3に由来しかつ RTN3の1つまたは複数の機能または生物活性を有する組換えポリペプチド、該組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および該組換えポリペプチドを製造する方法に関する。本発明はまた、RTN3タンパク質またはRTN4タンパク質はBACE1活性を調節するという新発見に基づいて開発される検査法に関する。
【００２０】
A.  本発明のポリペプチド
本発明は一態様で、ヒトRTN3のアミノ酸配列に由来しかつ機能的に活性である(すなわち天然に存在するRTN3に関連する1つまたは複数の周知の機能的活性を示すことができる)新規のポリペプチド(本発明のポリペプチド)を提供する。そうした機能的活性の非限定的な例は、BACE1と相互作用するまたはBACE1活性を調節する能力、抗RTN3抗体と結合する(またはRTN3と競合的に結合する)能力(抗原性)、およびRTN3タンパク質に結合する抗体を生成する能力(免疫原性)などである。ヒトRTN3タンパク質のアミノ酸配列はSEQ ID NO.2のアミノ酸配列であり236個のアミノ酸をもつ。RTN3のアミノ酸配列はE.F., C.J. Jaworski, and I.R. Rodreiguez, “Cloning of a novel member of the reticulon gene family (RTN3): gene structure and chromosomal localization to 11q13.” (レチキュロン遺伝子ファミリーの新メンバーRTN3のクローニング: 遺伝子の構造と染色体上の位置11q13の同定) Genomics 58, 73-81 (1999)で開示されている。
【００２１】
本発明のポリペプチドは特に次のものを包含する:
(a)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の85〜97個程度の連続アミノ酸からなる第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の70〜85個程度の連続アミノ酸からなる第2ポリペプチド配列、および(iii)0〜55個のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
【００２２】
(b)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の97個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の85個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第2ポリペプチド配列、および(iii)0〜55個のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
【００２３】
(c)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の85〜97個程度の連続アミノ酸からなる第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の70〜85個程度の連続アミノ酸からなる第2ポリペプチド配列、および(iii)70〜200個のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
【００２４】
(d)  (i)SEQ ID NO.2のN末端の97個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第1ポリペプチド配列、(ii) SEQ ID NO.2のC末端の85個程度の連続アミノ酸に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第2ポリペプチド配列、および(iii)70〜200個程度のアミノ酸からなる第3ポリペプチド配列を含み、第1ポリペプチド配列がそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端と第3ポリペプチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリペプチド;
【００２５】
(e)  (a)〜(d)のポリペプチドの変異体であって、(a)〜(d)のポリペプチドの第1ポリペプチド配列または第2ポリペプチド配列または両ポリペプチド配列に、1つ又は複数のアミノ酸たとえば1〜15個の、1〜10個の、1〜5個の、1〜3個の、または１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を、任意の組合せで含む変異体。
【００２６】
理論に縛られるつもりはないが、本発明のポリペプチドの第1および第2ポリペプチド配列の主な機能はBACE1との結合および/または相互作用であると考えられ、また第3ポリペプチド配列の機能は本発明のポリペプチドの適正な構造形態を維持してBACE1との結合や相互作用が可能になるようにすることであると考えられる。第3ポリペプチド配列の長さは、60個以下のアミノ酸を有するか、または70〜200個程度のアミノ酸を有する限り、決定的ではない。しかし第3ポリペプチド配列の長さは1〜60個のアミノ酸たとえば10、20、30、40、50、60個のアミノ酸であるのが好ましい。一実施態様では、本発明の単離ポリペプチドは第1および第2ポリペプチド配列の間に介在配列を置かずに、第1ポリペプチド配列をそのC末端で第2ポリペプチド配列のN末端に直接連結してなる。
【００２７】
第3ポリペプチドのアミノ酸配列もまた決定的ではないが、SEQ ID NO.2の97個のアミノ酸に対し少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%の相同性を有するのが好ましい。
【００２８】
本発明のポリペプチドの変異体は、前記ポリペプチドの第1ポリペプチド配列、第2ポリペプチド配列、または両ポリペプチド配列のいずれに1つまたは複数のアミノ酸残基を追加した挿入変異体を包含する。挿入位置はポリペプチド配列のいずれかの末端または両末端でも、ポリペプチド配列の内部領域でもよい。追加の残基をもつ挿入変異体はたとえば融合タンパク質およびアミノ酸標識を含むタンパク質を包含することができる。挿入変異体は、本発明のポリペプチド配列に、またはその生物活性断片に、1つまたは複数のアミノ酸残基を追加した本発明のポリペプチドを包含する。
【００２９】
種々の標識ポリペプチドと対応する抗体は技術上周知である。その例はポリ-ヒスチジン(poly-his)またはポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ; インフルエンザHAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-mycタグおよびその8F9、3C7、G4、B7および9E10抗体[Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D (gD)タグとその抗体[Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]などである。タグポリペプチドには他に、Flagペプチド[Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194(1992)]; αチューブリンエピトープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; およびT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:6393-6397 (1990)]などもある。加えて、本発明のポリペプチドはペルオキシダーゼ、GSTおよびアルカリホスファターゼなどのような酵素性タンパク質で標識することもできる。
【００３０】
本発明はまた、前記ポリペプチドの第1ポリペプチド配列、第2ポリペプチド配列、または両ポリペプチド配列のいずれかから1つまたは複数のアミノ酸残基を除去した欠失変異体を包含する。生成する欠失変異体は天然に存在するRTN3タンパク質の活性を少なくとも1つ保持する。欠失位置はポリペプチド配列のいずれかの末端または両末端でも、ポリペプチド配列の内部領域でもよい。
【００３１】
本発明はまた、前記ポリペプチドの、その機能に実質的な影響を及ぼすことなくある残基を性質の類似した他残基で置換した同類アミノ酸置換による変異体を包含する。これは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組換えによって同類置換を導入した変異体ポリペプチドも包含する。
【００３２】
RTN3またはRTN4ポリペプチドを生産する方法は技術上周知である。たとえば組換え手段によるRTN4タンパク質の生産方法は国際公開第WO 00/31235号、WO 01/36631号の各明細書、およびTadzia GrandPre et al. Nature, Vol. 403:439-444 (2000)に開示されている。本発明のポリヌクレオチドは任意好適の方法で、たとえばRTN3ポリペプチドの限定分解、発現系を含む遺伝子組換え細胞の使用、たとえば自動ペプチド合成装置の使用による化学合成、または以上の方法の組合せで、生産することができる。そうしたポリペプチドを生産するための手段は技術上周知である。
【００３３】
B.  本発明のポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド(たとえばDNA配列とRNA転写物、センス鎖とその相補アンチセンス鎖の両方、一本鎖と二本鎖の両方、それにそのスプライシングバリアントなど)を提供する。本発明のDNAポリヌクレオチドはゲノムDNA、sDNA、および全部または一部を化学的に合成したDNAを包含する。本発明のポリヌクレオチドはRTN3タンパク質をコードするコード領域の派生物である。SEQ ID NO.1はRTN3タンパク質をコードするコード領域のcDNA配列であり、E.F. Moreira, C.J. Jaworski, and I.R. Rodreiguez, “Cloning of a novel member of the reticulon gene family (RTN3): gene structure and chromosomal localization to 11q13.” (レチキュロン遺伝子ファミリーの新メンバーRTN3のクローニング: 遺伝子の構造と染色体上の位置11q13の同定) Genomics 58, 73-81 (1999)で開示されている。
【００３４】
本発明は特に下記を包含するポリヌクレオチドを提供する:
(a)  (i)SEQ ID NO.1の5’末端の255〜291個程度の連続塩基からなる第1ポリヌクレオチド配列、(ii) SEQ ID NO.1の3’末端の210〜255個程度の連続塩基からなる第2ポリヌクレオチド配列、および(iii)0〜165個の連続塩基からなる第3ポリヌクレオチド配列を含み、第1ポリヌクレオチド配列がその5’末端で第2ポリヌクレオチド配列の3’末端と第3ポリヌクレオチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリヌクレオチド;
(b)  (i)SEQ ID NO.1の5’末端の255〜291個程度の連続塩基に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第1ポリヌクレオチド配列、(ii) SEQ ID NO.1の3’末端の210〜255個程度の連続塩基に対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有する第2ポリヌクレオチド配列、および(iii)0〜165個の連続塩基または210〜600個の連続塩基からなる第3ポリヌクレオチド配列を含み、第1ポリヌクレオチド配列がその5’末端で第2ポリヌクレオチド配列の3’末端と第3ポリヌクレオチド配列によって作用可能に連結されている単離ポリヌクレオチド;
【００３５】
(c)  本発明のポリペプチドに対して少なくとも75%の、好ましくは95%の相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する単離ポリヌクレオチド;
(d)  本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドはゲノムDNAライブラリーなどの天然ソースから獲得してもよいし、また周知の市販手法を使用して合成してもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、通常のクローニングおよびスクリーニング手法により、脳および脊髄などのヒト組織の細胞中のmRNAに由来するcDNAライブラリーから調製することもできる。ヒト脳などに由来する市販cDNAライブラリーもまた使用可能である。
【００３７】
cDNAは好適なプライマーを使用して増幅することができる。PCR増幅への使用に適したプライマー対の例は5’-ATA TAT GGA TCC CTC GCT CGC GTA GCC ATG GC-3’(SEQ ID NO.3)および5’-ATA TAT GCG GCC GCG TTT CCA TGT ACT TAT TC-3’(SEQ ID NO.4)などである。
【００３８】
His-Mycタグなどのようなタグに融合した本発明のポリペプチドを調製するには、別のPCRプライマー対たとえば5’-AAA AAG GCA GAA GTA CAT GGA AAC GCG GCC GC-3’(SEQ ID NO.5)および5’-TTC CAT GTA CTT TCT GCC TTT TTT TTG GCG ATT CC-3’ (SEQ ID NO.6)を使用して、発現コンストラクトから終止コドンを除去し、本発明のポリペプチドをC末端でタグとインフレームで融合するようにしてもよい。
【００３９】
C.  本発明のベクター、宿主細胞および発現
本発明のポリペプチドは技術上周知の方法で、発現ベクターを収めた遺伝子組換え宿主細胞から調製してもよい。従って別の態様では、本発明は(1)単数または複数の本発明のポリヌクレオチドを含む発現系、(2)そうした発現系を収めた宿主細胞、および(3)組換え手法による本発明のポリペプチドの産生を提供する。
【００４０】
非常に多様な発現系が、たとえばプラスミドおよびウイルスDNAベクターなどが使用できる。本発明に好適な哺乳動物発現系の例はpCDNA3.1シリーズ(Invitrogen)、pSVL(Pharmacia Biotech)、pSVK(Pharmacia Biotech)、およびpLPシリーズ(Clontech)などである。本発明のポリペプチドの発現に好適な発現ベクターの選択はもちろん使用する個別宿主細胞にも規定されるが、当業者の通常の技術的熟練の範囲内である。発現系は内在性または外来性の発現調節DNA配列を含んでもよい。発現調節DNA配列はプロモーター、エンハンサーおよびオペレーターなどであり、一般的には、発現コンストラクトを組み込むことになる発現系を基に選択する。本発明にも使用してよい常用プロモーター配列およびモディファイアー配列の非限定的な例は、ヒト・サイトメガロウィルス(CMV)、アデノウイルス2、パピロマウイルスおよびシミアンウイルス40(SV40)に由来する配列である。哺乳動物発現ベクターの構築方法はたとえばOkayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280(1983)); Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935 (1986)); Cosman et al. (Nature 312:768(1984)); 欧州特許出願EP-A-0367566号明細書および国際公開第WO 91/18982号明細書で開示されている。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え生産に使用するときは、該ポリヌクレオチドは成熟ポリペプチドに対応するコード配列を単独で含んでもよいし、また成熟ポリペプチドに対応するコード配列をリーディングフレーム内に他の(リーダーまたは分泌配列、プレ-、プロ-またはプレプロ-タンパク質配列または他の融合ペプチド部分などのような)コード配列と共に含んでもよい。たとえば融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードしてもよい。本発明のこの態様の好ましい実施態様では、マーカー配列はpQEベクター(Qiagen, Inc.)に収められ、またGentz et al. Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824で開示されているようなヘキサヒスチジンペプチドであるか、またはHAタグである。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物発現pCDNA3/HisMycベクターを使用する。ポリヌクレオチドはまた、転写・非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化配列などのような非コード5’および3’配列を含んでもよい。1つまたは複数の表現型選択マーカー遺伝子を含む原核宿主用の市販発現ベクターの例としては他に、pSPORTベクター、pGEMベクター(Promega)、pPROEXベクター(LTI, Bethesda, MD)およびBluescriptベクター(Stratagene)がある。
【００４２】
発現系には適切なポリヌクレオチド配列を、任意周知の技術によって挿入してよい。発現系はコード化タンパク質の産生に使用するのが好ましいが、本発明のポリヌクレオチド配列の単なる増幅に使用してもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドを発現させるための好適な宿主細胞は原核細胞、酵母細胞、およびより高等な真核細胞などである。好適な原核宿主の非限定的な例はEscherichia、BacillusおよびSalmonella属ならびにPseudomonas、StreptomycesおよびStaphylococcus属の細菌などである。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは原核細胞中での発現を意図したベクターではなく真核細胞中での発現を意図したベクターにクローニングするのが好ましい。より高等な真核生物に由来する遺伝子の発現には真核細胞のほうが好ましい場合もある。これらのタンパク質の合成、プロセシングおよび分泌の各シグナルは真核細胞では認識されるのが普通であるが、原核宿主ではしばしば認識されないからである(Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd edition, John Wiley & Sons, publishers, pp. 16-42, 1992)。好適な真核宿主の非限定的な例は昆虫細胞、CHO、HEK-293、COS7、HeLa、IMR-32、SK-N-MCおよびSK-N-SHである。
【００４５】
好適な酵母宿主細胞の例はS. cerevisiaeおよびP. pastorisなどである。酵母ベクターはしばしば、2ミクロン酵母プラスミドに由来する複製起点配列、自己複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化部位、転写終了部位、および選択マーカー遺伝子を含もう。酵母とE. coliの両方で複製可能なベクター(シャトルベクターという)を使用してもよい。シャトルベクターは酵母ベクターの上記の機構に加えてE. coli中での複製および選択部位も含もう。
【００４６】
組換え生産では、遺伝子組換えにより宿主細胞に本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部分を組み込むことができる。宿主細胞への本発明のポリヌクレオチドの導入は数多くの標準ラボラトリーマニュアルに記載の方法で行うことができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞に環状プラスミドの一部として導入しても、または単離タンパク質コード領域またはウイルスベクターを含む線状DNAとして導入してもよい。周知慣用の宿主細胞へのDNA導入法には形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞核注入、またはリポソーム、ミセル、ゴーストセルおよびプロトプラストなどの担体との融合などがある。
【００４８】
D.  本発明の化合物、薬物および方法
本発明はさらに(1)RTN3またはRTN4の発現を調節する薬物または化合物を識別する方法、(2)RTN3タンパク質、RTN4タンパク質またはBACE1の発現または活性を調節する薬物または化合物を識別する方法、(3) RTN3タンパク質またはRTN4タンパク質の発現または活性を調節する化合物からなる薬物、(4)BACE1活性を調節する方法、および(5)CNS(中枢神経系)疾患の治療方法を提供する。「調節する」はRTN3タンパク質、RTN4タンパク質またはBACE1の活性レベルを上昇させ、刺激し、低下させ、高め、倣わせ、乱し、模擬し、または他の形で変化させる、あるいはRTN3またはRTN4の発現レベルを変化させることを意味し、所与の薬物がその効果を発揮する具体的な基本機序には関知しない。「RTN3タンパク質」または「RTNポリペプチド」は人間または人間以外の哺乳動物たとえばマウスや牛のRTN3遺伝子の遺伝子産物たとえばSEQ ID NO.2のポリペプチドをいい、また天然に存在するRTN3タンパク質のBACE1調節機能を実質的に保持するようなSEQ ID NO.2のポリペプチドの変異体や断片をも、またはSEQ ID NO.2のポリペプチドに対して少なくとも85%の、好ましくは95%の相同性を示すポリペプチドをも、いう。「RTN4タンパク質」または「RTN4ポリペプチド」はRTN4遺伝子産物の3つのアイソフォームのうち任意のものを、すなわちRTN4-Aタンパク質、RTN4-Bタンパク質およびRTN4-Cタンパク質をいうが、それらは人間および人間以外の哺乳動物たとえばマウスや牛の、それぞれNogo Aタンパク質、Nogo Bタンパク質およびNogo Cタンパク質ともいう。ヒトRTN4-A、RTN4-BおよびRTN4-Cのアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8およびSEQ ID NO.9に示す。「RTN4タンパク質」はまた、天然に存在するRTN4タンパク質のBACE1調節機能を実質的に保持するような任意のRTN4タンパク質の変異体および断片をも、またSEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8およびSEQ ID NO.9のポリペプチドに対して少なくとも85%の、好ましくは95%の同一性を示すポリペプチドをも、いう。
【００４９】
1.  RTN3またはRTN4の発現もしくはRTN3タンパク質またはRTN4タンパク質の活性を調節する薬物を確認する方法
本発明はRTN3タンパク質またはRTN4タンパク質の発現または活性を調節する薬物を識別する方法を提供する。本発明の方法はin  vitro試験法とin vivo試験法の両方を包含する。
【００５０】
本発明のin vitro試験法は(1)試験薬物を、RTN3またはRTN4を発現しうる細胞と接触させるステップおよび(2)試験薬物の存在下または不存在下でのRTN3またはRTN4の活性または発現レベルを測定するステップを含む。一般にこの試験を行うには、細胞を培地に、該細胞に好適な条件下に維持し、試験薬物を培地に加える。試験薬物に曝露する細胞は本明細書では「処理細胞」という。通常、対照細胞培地も調製するが、これは試験細胞培地と同じ培地であり、細胞を試験薬物に曝露しない点を除けば同様の条件下に維持される。試験薬物添加または無添加の培地で細胞を所定時間培養した後、RTN3またはRTN4の活性または発現レベルを測定する。処理細胞中のRTN3またはRTN4の活性または発現レベルを対照細胞中のそれと比較する。RTN3またはRTN4の活性または発現を調節する薬物は、処理細胞中のRTN3またはRTN4の活性または発現に、対照細胞との比較で見た相対的な変化、増加または減少を引き起こすものとして識別する。
【００５１】
「細胞」は本明細書では、RTN3またはRTN4の遺伝子を発現するまたは収めた任意の哺乳動物細胞株、初代培養細胞、組織および器官をいう。「細胞株」は適切な新鮮培地とスペースが与えられれば無限に増殖していける永久樹立細胞株をいう。好適な細胞株の例はCOS-7、HEK-293T、HeLa、CHO、IMR32、SK-N-MC、SH-N-AS、SK-N-SH、SK-N-DZ、SK-N-FI、F98、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、LN-18、WERI-Rb-1、HepG2、MCP7、KB、A172、SH-SY5Yなどである。上記の細胞株はどれも市販されている。これらの細胞株の培養法と培地は技術上周知である。本発明の試験法は初代培養細胞を使用してもよい。「初代培養細胞」は組織から採取した動物細胞および再分割・継代前の培地増殖細胞をいう。初代培養細胞の例は動物の肝臓由来の肝細胞および神経系由来の神経細胞などである。動物から採取した組織または器官もまた試験に使用することができる。組織、器官および細胞の培養技術は技術上周知であり、本発明の試験法に容易に適合させることができる(Paul, J. Cell and Tissue Culture, Fifth edition, Churchill Livingston Inc., NY, 1975; Kruse, P.E. and M.M. Patterson, eds. Tissue Culture Methods and Applications, Academic Press, NY, 1973を参照)。
【００５２】
本発明の試験薬物はペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片、低分子、ビタミン誘導体、または糖質とすることができる。
細胞と接触させる試験薬物の量は様々であり、また薬物の効果、細胞密度、および細胞を維持する培地の容積など、様々な因子を基に調整してもよい。試験薬物は原末の形で培地に直接添加してもよいし、好適な担体と混合してから培地に添加してもよい。同じ細胞に1つまたは複数の試験薬物を連続的または同時的に、または他のやり方で、接触させてもよい。
【００５３】
RTN3またはRTN4の発現は技術上周知の遺伝子発現標準測定法たとえばノーザン法、ウェスタン法、ELISA法、Tagman PCR法、競合RT-PCR法、競合定量RT-PCR法(Ambion, Inc.提供のプロトコールを参照)、およびRNA保護法[Lee, J.J. and Costlow, N.A., A molecular titration assay to measure transcript prevalence levels. Method Enzymol. 152, 633-648, 1987]で測定することができる。一般的な遺伝子発現指標は標的遺伝子から転写されるmRNAまたは標的遺伝子のタンパク質産物である。
【００５４】
ノーザン法によるRTN3の測定はMoreira, et al. Genomics, 58, 73-81 (1999)が開示している。これは、STORM 860装置を用いて3’非翻訳RTN3特異的cDNAプローブでブロットをプローブし、SYBグリーン染色28SリボソームRNAバンドをプローブ生成シグナルで標準化して相対発現レベルを決定するというものである。RT-PCR法の例もまたMoreira, et al. Genomics, 58, 73-81 (1999)が開示している。
【００５５】
RTN3またはRTN4タンパク質の発現レベルの測定にはウェスタン法またはELISA法を用いることもできる。RTN3およびRTN4に対するペプチド抗体を技術上周知の標準方法で生成させ、内在性の発現レベルのRTN3/RTN4を発現する細胞中の、またはRTN3/RTN4発現コンストラクトを導入した細胞中の、RTN3またはRTN4タンパク質レベルの測定に使用することができる。あるいは、RTN3またはRTN4をC末端またはN末端でmyc、His、HA、Xpressなどの標識に融合し、標識RTN3またはRTN4のタンパク質レベルを特異的抗標識抗体によってモニターしてもよい。
【００５６】
競合RT-PCR法はmRNAの定量法である。この方法ではRT反応の前にRNAサンプルに内部標準RNAsを規定量加える。得られる標準cDNAを内在性の標的配列の場合と同じプライマーで同時増幅する。そのPCR産物は約50ヌクレオチド分だけ小さくなる。この方法ではRNAサンプル中のmRNA量の、ファクター2程度の小さな差まで測定することができる。
【００５７】
本発明の試験法で測定されるRTN3またはRTN4の標的活性の1つはRTN3またはRTN4のBACE1活性(BACE1のAPPプロセシング活性など)調節機能である。RTN3またはRTN4のこうしたBACE1調節機能はAPPプロセシング活性の測定によって間接的に測定してもよい。APPプロセシング活性は技術上周知の方法で、たとえばBACE1とRTN3の両方またはBACE1とRTN4の両方を産生する細胞中のAベータ産生量の変化を測定することによって、測定することができる。たとえば好ましい実施態様では、RTN3またはRTN4の活性を、BACE1とRTN3の両方を発現する細胞中のAベータ産生量を測定することにより測定する。RTN3またはRTN4の活性レベルが上昇する場合、内在性の発現レベルのBACE1を発現させる細胞では培地中の分泌Aベータのレベルは低下すると見込まれる。逆に、RTN3またはRTN4の活性レベルが低下する場合、培地中の分泌Aベータのレベルは上昇すると見込まれる。AベータのレベルはELISA法で、抗体6E10を捕捉抗体として、またRb162をAベータ40の検出に、Rb165をAベータ165の検出に、それぞれ用いて測定することができる。Aベータ産生量の測定方法は、参照により本明細書に組み込まれるYan, et al, Nature, 402:533-537 (1999)で開示されている。あるいは、Aベータペプチドは種々のELISAプロトコールにより、数多くの文献で開示されている要領に従って、またはBiosource International (Camarillo, CA)の商品などの市販ELISAキットを使用して、測定することもできる。
【００５８】
本発明はまた、RTN3またはRTN4の発現または活性を調節する薬物を識別するためのin vivo試験法を提供する。そうした試験法では動物モデルを使用し、適切な用量、頻度および期間を決めて動物に試験薬物を投与する。試験では、1つまたは複数の対照動物群すなわち試験薬物の投与を受けない動物群も使用するのが普通である。試験薬物の投与後、RTN3またはRTN4の発現または活性レベルを動物の1つまたは複数の組織で測定する。組織は技術上周知の方法でサンプリングし処理する。試験化合物の投与を受けた動物のRTN3またはRTN4の発現または活性レベルを、対照動物すなわち試験化合物の投与を受けなかった動物のそれと比較する。試験に使用する動物の種は決定的ではない。RTN3またはRTN4を発現するまたはRTN3またはRTN4の遺伝子を内部にもつ動物ならどれでも試験に使用できる。好適な動物種の例はげっ歯類(ラット、マウス、ハムスターなど)、ウサギ、犬、猿、豚、猫、鳥類および人間などである。トランスジェニック動物も使用できる。RTN3またはRTN4の発現または活性レベルは、上文で述べた方法または技術上周知の他の任意好適な方法を使用して測定することができる。
【００５９】
2.  RTN3またはRTN4とBACE1との相互作用を調節する薬物を識別する方法
本発明は別の実施態様で、RTNのBACE1との結合を調節(弱化、阻止、強化または促進)する薬物を識別するための方法を提供する。具体的には、BACE1をＲＴＮタンパク質と、またはRTNを含有する細胞抽出物と、試験薬物の存在または不存在下に混合する。BACE1とRTNとの結合を許容する条件下での混合の後、2つの混合物を分析、比較して、該薬物がBACE1とRTNの結合に影響を及ぼすかどうかを判定する。BACE1とRTNとの結合を阻止または弱化する薬物は試験薬物を含有するサンプル中の結合量を減少させるものとして識別されよう。BACE1とRTNとの結合を強化または促進する薬物は試験薬物を含有するサンプル中の結合量を増加させるものとして識別されよう。上記の試験法に使用するRTNポリペプチドは単離され特性が完全に解析されているタンパク質たとえばRTN3またはRTN4または本発明のRTN3誘導体でもよいし、細胞抽出物中に存在することがすでに確認されていて、BACE1に結合し特性が部分的に解析されているタンパク質であってもよい。当業者には自明であろうが、RTNは識別可能な特性たとえば分子量を特徴とする限り、本試験法に使用することができる。
【００６０】
3.  BACE1活性を調節する薬物を識別する方法
本発明はまた、BACE1活性を調節する薬物を識別するための方法を提供する。本発明の方法はRTN3またはRTN4の発現レベルまたは活性レベルを、BACE1活性に対する試験薬物の効果の指標として利用する。従って、RTN3またはRTN4の発現または活性を調節する薬物を識別するための方法と同じものを、BACE1活性を調節する薬物の識別にも使用することができる。本願では、ある薬物がRTN3またはRTN4の発現または活性を調節することができるとき、該薬物はBACE1活性を調節するという。特にある薬物がRTN3またはRTN4の発現または活性を増大、強化または増進させることができるとき、該薬物はBACE1阻害剤またはアンタゴニストであるという。逆に、ある薬物がRTN3またはRTN4の発現または活性を低下または減少させることができるとき、該薬物はBACE1促進剤またはアゴニストであるという。
【００６１】
4.  RTN3またはRTN4の発現を調節する、またはRTN3、RTN4またはBACE1の活性を調節する薬物
本発明はさらに、RTN3またはRTN4ペプチドの、またはBACE1の、活性を調節する薬物を提供する。そうした薬物は、本願で開示した方法、手順を使用して当業者が識別しうるような化合物を包含する。本発明の薬物または化合物はたとえばペプチド、抗体、抗体断片、低分子、ビタミン誘導体、糖質などである。特定の実施態様では、BACE1活性を調節する本発明の化合物は本発明のRTN3誘導体(ポリペプチド)である。
【００６２】
本発明のペプチド薬物は技術上周知の標準固相(または液相)ペプチド合成法を用いて調製することができる。加えて、これらのペプチドをコードするDNAを、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成し、また標準組換え生産システムを用いて組み換えによって生産してもよい。非遺伝子コード化アミノ酸を含める場合には固相ペプチド合成法で生産しなければならない。
【００６３】
本発明のもう1つの薬物種はRTN3またはRTN4ポリペプチドに結合する抗体又は抗体断片である。抗体薬物は、抗体の標的となるタンパク質部分を抗原認識部位として含むペプチドで好適な対象哺乳動物を免疫して産生させることができる。本発明はさらに、RTN3タンパク質、RTN4タンパク質または本発明のポリペプチドのペプチドミメティクスを提供する。「ペプチドミメティクス」は本願では(1) RTN3、RTN4または本発明のポリペプチドのタンパク質二次構造の要素に類似するかまたはRTN3またはRTN4の生物化学的特性または薬理学的特性に類似するタンパク質含有分子、または(2)テンプレートペプチドに類似した特性をもつ非ペプチド化合物をいう。ペプチドミメティクスは天然ペプチドに比して、たとえば次のような著しい強みをもつかもしれない: 生産がより経済的、化学的安定性が大、薬理学的特性(半減期、吸収、効能、有効性など)の改善、特異性の改善(広範囲の生物活性など)、抗原性の緩和、その他。RTN3、RTN4および本発明のペプチドのペプチドミメティクスは、技術上周知の構造に基づく医薬品設計によって構築することができる。ペプチドミメティクスの概説はたとえばJones, (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley; Bodanszky et al.,(1993) Peptide Chemistry -- A Practical Textbook, Springer Verlag.を参照 。
【００６４】
5.  BACE1活性を調節し疾患を治療する方法
前述のように、本出願人はRTN3タンパク質またはRTN4タンパク質がBACE1活性を調節することを、特にRTN3またはRTN4の発現または活性の増進がBACE1活性を低下させることを、発見した。従って本発明はさらなる態様で、哺乳動物の細胞におけるBACE1活性を低下させる方法であって、次の薬物群より選択される1つまたは複数の薬物を、BACE1活性を低下させるに足る有効量、該哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する:
(a)  RTN3ポリペプチド
(b)  RTN4ポリペプチド
(c)  本発明のポリペプチド
(d)  RTN3類似物
(e)  RTN4類似物
(f)  RTN3の発現を増進する薬物
(g)  RTN4の発現を増進する薬物
(h)  RTN3タンパク質の活性および/またはBACE1に対するアフィニティーを増進する薬物
(i)  RTN4タンパク質の活性および/またはBACE1に対するアフィニティーを増進する薬物。
【００６５】
前述のように、BACE1活性はAベータペプチドの形成と密接に関連することが判明している。Aベータペプチドの産生量の増加は1)海馬と前頭皮質、2)血管領域、および3)空胞型筋線維にアミロイド沈着を引き起こすが、それらはそれぞれアルツハイマー病の発病機序、脳アミロイド血管症(CAA)の発病機序、および突発性封入体筋炎(IBM)(老人の最も一般的な進行性筋疾患)に関与する。従って、BACE1活性を低下させる薬物はAベータ産生を減少させることになり、Aベータの沈着に関連する疾患の治療に有効であるかもしれない。そこで本発明はさらに、哺乳動物のAベータ沈着に関連する疾患を治療しまたは発症を遅延させる方法であって、次の薬物群より選択される1つまたは複数の薬物を有効量投与するステップを含む方法を提供する:
(a)  RTN3ポリペプチド
(b)  RTN4ポリペプチド
(c)  本発明のポリペプチド
(d)  RTN3類似物
(e)  RTN4類似物
(f)  RTN3の発現を増進する薬物
(g)  RTN4の発現を増進する薬物
(h)  RTN3タンパク質の活性および/またはBACE1に対するアフィニティーを増進する薬物
(i)  RTN4タンパク質の活性および/またはBACE1に対するアフィニティーを増進する薬物。
【００６６】
本発明で見込まれる疾患の例はアルツハイマー病、脳アミロイド血管症(CAA)、および突発性封入体筋炎(IBM)である。
BACE1活性を調節するための、または本発明の疾患を治療するための薬物は、単独で提供しても、他の治療診断薬と組み合せて提供してもよい。好ましい実施態様では、本発明の化合物は、一般にこれらの疾患に対して一般医療基準に従って処方される他化合物たとえばPfizer/EisaのARICEPT(登録商標; 塩酸ドネペジル)、JanssenのReminyl(登録商標; 臭化水素酸ガランタミン)、Liptor、Vioxxおよびセレブラックス(cerebrax)などと共に、投与してよい。
【００６７】
本発明の薬物は腸管外、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮または舌下など任意好適な経路で投与することができる。
投与量は患者の年齢、全身状態、体重、もしあれば併用療法の種類、所期効果の性格などに依存しよう。
【００６８】
定義
以下は明細書と特許請求の範囲を含む本願で使用している用語の意味と説明である。
「ポリヌクレオチド」は一般に任のポリリボヌクレオチド(RNA)またはポリデオキシリボヌクレオチド(DNA)をいい、非修飾RNAまたはDNAでも修飾RNAまたはDNAでもよい。「ポリヌクレオチド」は1本鎖および2本鎖DNA、1本鎖領域と2本鎖領域の混合DNA、1本鎖および2本鎖RNA、1本鎖領域と2本鎖領域の混合RNA、RNAとDNAとを含み1本鎖でもより一般的には2本鎖でも1本鎖と2本鎖の混合でもよい混成分子を非限定的に包含する。また「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRNA+DNAを含む3本鎖領域をもいう。「ポリヌクレオチド」はまた1つまたは複数の修飾塩基を含むDNAsまたはRNAs、および主鎖を修飾して安定性を高めるなどしたDNAsまたはRNAsを包含する。「修飾」塩基はたとえばトリチル化塩基や異常塩基(イノシンなど)を包含する。DNAおよびRNAに対しては多様な修飾が可能であり、従って「ポリヌクレオチド」は、一般に自然に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的および代謝的修飾形態、それにウイルスや細胞に特徴的な化学的形態のDNAやRNAを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた比較的短い、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれるポリヌクレオチドを包含する。
【００６９】
「ポリペプチド」はペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結び付いた複数のアミノ酸を含む任意のポリペプチドをいう。「ポリペプチド」は一般にペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーと呼ばれる短い分子鎖とタンパク質と呼ばれる比較的長い分子鎖の両方をいう。ポリペプチドは遺伝子でコードされている20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は天然プロセスたとえば翻訳後プロセシングかまたは技術上周知の化学修飾手法によって修飾されたアミノ酸を包含する。そうした修飾は基礎的な教科書、もっと詳しい単行書、それに大部の研究書で十分に説明されている。修飾部位はペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびC末端またはN末端などポリペプチド中のどこでもよい。同じタイプの修飾が任意のポリペプチドのいくつかの部位に出現する度合いは同じでも異なってもよいものとする。また、任意のポリペプチドは数多くのタイプの修飾を含んでもよい。
【００７０】
「単離(された)」はその自然状態から「人手によって」変えられたことを、すなわち天然に存在するものであれば、その本来の環境から変えられたまたは移動されたことを意味する。たとえば生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」体ではないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然状態の共存物質から分離されれば「単離」体となる。また、形質転換、遺伝子操作、または他の何らかの組換え手法により生物中に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえ該生物(生きていても生きていなくてもよい)中になお存在する場合でも「単離」体である。一例として、本発明のポリヌクレオチドを使用して作り出したトランスジェニック動物または組換え細胞株は「単離」核酸を利用している。
【００７１】
「同一性」は複数のポリペプチド配列間の、または複数のポリヌクレオチド配列間の、配列比較によって決定される関係をいう。一般に同一性は両ポリヌクレオチド配列または両ポリペプチド配列の、比較対象の長さにわたるヌクレオチド対ヌクレオチド、アミノ酸体アミノ酸の厳密な対応をいう。厳密な対応を欠く配列では、「%同一性」を求めてよい。一般に比較対象の両配列について配列間の相関が最大になるようにアラインメントをとる。この場合、一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入してアライメントの度合いを高めることがある。%同一性は比較対象の各配列の全長にわたって求めてよいし(いわゆる大域アラインメント;同じまたはほぼ同じ長さの配列に特に好適)、もっと短い、限定された長さにわたって求めてもよい(いわゆる局所アラインメント; 不等の長さの配列に特に好適)。
【００７２】
「融合タンパク質」は2つの、しばしば無関係の融合遺伝子またはその断片によってコードされるタンパク質をいう。
「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列による形質転換またはトランスフェクションを受けた細胞、またはそうした形質転換またはトランスフェクションを受けうる細胞をいう。
「アミロイド」はタンパク質凝集体をいう。
「アミロイド症」は体の様々な器官および組織における細胞外アミロイド集積を特徴とする任意の疾患をいう。
【実施例】
【００７３】
実施例1  RTN3とBACE1の結合の立証
RTN3とBACE1の結合を立証するために、HA標識BACE1導入細胞からの、抗HA抗体の使用による免疫沈降実験を行った。HEK293細胞を入手し、10% FBS、50IU/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンおよびグルタミンを添加したダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中、37℃、加湿CO2制御雰囲気下に増殖させ、維持した。この細胞株を使用してヒグロマイシンBの選択圧下にHA標識BACE1を発現する安定細胞株を生成させた。試薬Lipofectamine 2000(登録商標)を使用してトランスフェクションを行った。Lipofectamine 2000(登録商標) 80μlを使用して合計20μgのDNAを10cmディッシュにトランスフェクトした。全量2mlのOpti-MEM培地中でDNA+リポフェクトアミン溶液を15分間混合し、次いでこの混合物を、8ml無抗生物質DMEMを含む各ディッシュに加えた。免疫沈降複合体をコロイダルブルー染色SDS-PAGEで調べると65kD付近に成熟BACE1に対応する大きなバンドが1つ現れた(図1)。質量分析による配列解析でそれをBASE1と確認した。他の小さなバンド群は配列解析で大多数のバンドがBASE1断片に対応すると判明した。17〜38kD範囲のいくつかのバンドはちいさなGTP結合タンパク質rab5c、RTN3およびRTN4と同定された。
【００７４】
RTN3がBACE1と結合することを立証するために、完全長RTN3をヒト脳ライブラリーからPCR増幅法でクローニングした。RTN3の全コード領域をヒト脳cDNAライブラリーから増幅するために塩基対(-5’-ATA TAT GGA TCC CTC GCT CGC GTA GCC ATG GC-3’と5’-ATA TAT GCG GCC GCG TTT CCA TGT ACT TAT TC-3’)を使用した。PCR断片はまず制限酵素BamHIおよびNotIで消化し、次いで予め処理しておいたベクター(pCDNA3.1/hismyc)に挿入した。両ストランドで発現コンストラクトの配列を解析してフィデリティーを確保するようにした。別のPCRプライマー対(5’-AAA AAG GCA GAA GTA CAT GGA AAC GCG GCC GC-3’と5’-TTC CAT GTA CTT TCT GCC TTT TTT TTG GCG ATT CC-3’)を使用して前記発現コンストラクトから終止コドンを除去して、RTN3がC末端でHis-Myc標識にインフレームで融合されるようにした。RTN3のコード領域を哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1/HisMyc中に挿入した。HA-標識BACE1を発現する細胞中へのRTN3のトランスフェクションにより大きなバンド25kDが生成する。BACE1へのRTN3の結合を再現するために、トランスフェクト細胞を抗HA抗体により免疫沈降し、次いで免疫沈降複合体をウェスタン法で抗myc抗体により分析した。RTN3はRTN3を発現する細胞では観測されたが、ベクター発現細胞では観測されなかった。この結果は図1に示すような抗HA標識BACE1による免疫複合体中の内在性RTN3の同定とも合致した。この結合をさらに確認するために、交互に細胞抽出物を抗myc抗体で免疫沈降し、BACE1がmyc標識RTN3で沈めた複合体中に存在することを確認した。従って、RTN3は細胞中でBACE1と堅固な複合体を形成するとの結論に達した。
【００７５】
実施例2  RTN3によるBACE1活性の調節の立証
細胞中のAβペプチド放出に対するBACE1活性へのRTN3タンパク質の影響を、ベクター対照またはRTN3をトランスフェクトした細胞からの、ならし培地中での分泌AβペプチドレベルのELISA法による測定で評価した。Aβペプチド放出レベルはRTN3の発現レベルによる影響を受けることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図1  BACE1の免疫複合体。BACE1は、抗HA抗体を使用してHA標識BACE1を導入したHEK-293細胞から免疫沈降させた。溶出した免疫複合体を4〜12%NUPAGEゲルで分離し、次いでコロイダルブルーで染色した。ウェスタンブロット法により、矢印で示したバンドをBACE1およびその分離断片として確認した。
【図１】
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【配列表】
2006500006000001.app