(57)【要約】本発明は、zsig33ペプチドを抗体に結合させてこれに拮抗させることにより、体重、ボディマス、脂肪沈着、および循環グルコースレベルを制御する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド−抗体複合体を形成する方法であって、
配列番号2の残基24〜37を含むペプチドに抗体を接触させ；
こうして当該ペプチドを当該抗体に結合させることを含む方法。
【請求項２】
前記抗体が前記ペプチドに特異的に結合する、請求項1の方法。
【請求項３】
前記抗体が配列番号2に示すポリペプチドに特異的に結合する、請求項2の方法。
【請求項４】
前記抗体が細胞膜上に固定化されている、請求項2の方法。
【請求項５】
ペプチドを精製する方法であって、
配列番号2の残基24〜37を含むペプチドに特異的に結合する抗体を固定化させ；
当該抗体に前記ペプチドを接触させ、こうして当該ペプチドを当該抗体に特異的に結合させ；
こうして当該ペプチドを精製することを含む方法。
【請求項６】
GHS-Rを発現する細胞のシグナル伝達を阻害する方法であって、
GHS-Rを発現する細胞を用意し；
配列番号2の残基24〜37を含むペプチドを用意し；
当該ペプチドに特異的に結合する抗体を当該ペプチドに接触させ、こうして当該ペプチドを当該抗体に結合させ；
かつここで当該抗体への当該ペプチドの結合は前記細胞のシグナル伝達を阻害することを含む方法。
【請求項７】
それが必要な哺乳動物の体重を低下させる方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の体重を低下させることを含む方法。
【請求項８】
それが必要な哺乳動物の脂肪沈着を低下させる方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の脂肪沈着を低下させることを含む方法。
【請求項９】
それが必要な哺乳動物の食欲を抑制する方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体はポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の食欲を抑制させることを含む方法。
【請求項１０】
それが必要な哺乳動物の下垂体細胞中の成長ホルモン分泌を阻害する方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の下垂体細胞中の成長ホルモン分泌を阻害することを含む方法。
【請求項１１】
それが必要な哺乳動物の代謝障害を治療する方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体はポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして代謝障害を改善させることを含む方法。
【請求項１２】
神経フィードバックが必要な代謝障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、ここで代謝障害は、
a)満腹調節；
b)グルコース代謝；および
c)神経障害関連消化管障害、からなる群から選択され、
そしてこの方法は、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
当該ペプチドを当該抗体に特異的に結合させることを含む方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが配列番号16に示すアミノ酸配列からなる、請求項5、7、8、9、10、11、または12の方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである、請求項7、8、9、10、11、または12の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
体重と食欲の調節は、代謝系、神経系および内分泌系を含む系の相互作用が関与し、これがエネルギー摂取とエネルギー消費を正しくバランスさせている。これらの系の間の相互作用は、満腹のシグナル伝達、体重とボディマス、および視床下部と消化管とのフィードバックを必要とする他の生理学的プロセスの調節にとって重要である。このプロセスには長期および短期のシグナルが関与することがよく知られているが、現在の知見は、ダイエットをしている患者の95％以上が体重の維持に失敗していることを示唆している。
【０００２】
ヒトの肥満と代謝障害の現在の流行を考慮すると、当該分野において体重低下と体重維持の改良された方法についてのニーズがある。本明細書に記載のユニークな方法と技術はこのニーズを満足させるものである。
発明の要約
ある態様において本発明は、ペプチド−抗体複合体を形成する方法であって、ペプチド（このペプチドは配列番号2の残基24〜37を含む）に抗体を接触させ、こうしてペプチドが抗体に結合することを含む方法を提供する。ある実施態様において、抗体はペプチドに特異的に結合する。別の実施態様において、抗体は配列番号2に示すポリペプチドに特異的に結合する。別の実施態様において、抗体は細胞膜上に固定化される。
【０００３】
別の態様において本発明は、ペプチドを精製する方法であって、配列番号2の残基24〜37を含むペプチドに特異的に結合する抗体を固定化させ；抗体にペプチドを接触させ、こうしてペプチドが抗体に特異的に結合し；こうしてペプチドが精製されることを含む方法を提供する。ある実施態様において、ペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。
【０００４】
別の態様において本発明は、GHS-Rを発現する細胞のシグナル伝達を阻害する方法であって、GHS-Rを発現する細胞を提供し；ペプチド（このペプチドは配列番号2の残基24〜37を含む）を提供し；ペプチドに特異的に結合する抗体をペプチドに接触させ、こうしてペプチドが抗体に結合し；かつここで抗体へのペプチドの結合は細胞のシグナル伝達を阻害することを含む方法を提供する。
【０００５】
別の態様において本発明は、それが必要な哺乳動物の体重を低下させる方法であって、抗体を哺乳動物に投与し；抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；ここで抗体はポリペプチドに特異的に結合する；こうして哺乳動物の体重が低下することを含む方法を提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。別の実施態様において哺乳動物はヒトである。
【０００６】
別の態様において本発明は、それが必要な哺乳動物の脂肪沈着を低下させる方法であって、抗体を哺乳動物に投与し；抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；ここで抗体はポリペプチドに特異的に結合する；こうして哺乳動物の脂肪沈着が低下することを含む方法を提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。別の実施態様において哺乳動物はヒトである。
【０００７】
別の態様において本発明は、それが必要な哺乳動物の食欲を抑制する方法であって、抗体を哺乳動物に投与し；抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；ここで抗体はポリペプチドに特異的に結合する；こうして哺乳動物の食欲が抑制されることを含む方法を提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。別の実施態様において哺乳動物はヒトである。
【０００８】
別の態様において本発明は、それが必要な哺乳動物の下垂体細胞中の成長ホルモン分泌を阻害する方法であって、抗体を哺乳動物に投与し；抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；ここで抗体はポリペプチドに特異的に結合する；こうして哺乳動物の下垂体細胞中の成長ホルモン分泌が阻害されることを含む方法を提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。別の実施態様において哺乳動物はヒトである。
【０００９】
別の態様において本発明は、それが必要な哺乳動物の代謝障害を治療する方法であって、抗体を哺乳動物に投与し；抗体に配列番号2の残基24〜37を含むペプチドを接触させ；ここで抗体はポリペプチドに特異的に結合する；こうして代謝障害が改善されることを含む方法を提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。別の実施態様において哺乳動物はヒトである。
【００１０】
別の態様において本発明は、神経フィードバックが必要な代謝障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、ここで代謝障害は、満腹調節、グルコース代謝、および神経障害関連消化管障害よりなる群から選択され、該方法は、抗体を哺乳動物に投与し；抗体に配列番号2の残基24〜37を含むペプチドを接触させ；ここで抗体はポリペプチドに特異的に結合する；およびここでペプチドは抗体に特異的に結合することを含む方法を提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号16に示すアミノ酸配列からなる。別の実施態様において哺乳動物はヒトである。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明を参照することにより明らかであろう。
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、以下の用語を定義することが有用であろう。
【００１２】
本明細書において用語「親和性タグ」は、第2のポリペプチドの精製を提供するか、または基質への第2のポリペプチドの結合のための部位を提供するために、第2のポリペプチドに結合することができるポリペプチドセグメントを意味するために使用される。原理的には、抗体もしくは他の特異的結合物質が利用できる任意のペプチドもしくはタンパク質を、親和性タグとして使用することができる。親和性タグには、ポリヒスチジン束、プロテインＡ（Nilssonら、EMBO J. 4:1075, 1985；Nilssonら、Methods Enzymol. 198:3, 1991）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（SmithとJohnson、Gene 67:31, 1988）、Glu-GLu 親和性タグ（Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985）（配列番号x）、サブスタンスP、Flag（登録商標）ペプチド（Hoppら、Biotechnology 6:1204-1210, 1988）、ストレプトアビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質（Guanら、Gene 67:21-30, 1987）、セルロース結合タンパク質、チオレドキシン、ユビキノン、T7ポリメラーゼ、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインがある。一般的には、Fordら、Protein Expression and Purifiction 2:95-107, 1991を参照されたい。親和性タグをコードするDNAおよび他の試薬は、販売業者から入手できる（例えば、ファルマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州；ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州；イーストマンコダック（Eastman Kodak）、ニューヘーブン（New Haven）、コネチカット州）。
【００１３】
本明細書において用語「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は、ポリペプチド内の位置を示すのに使用される。文脈が許せばこれらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分を参照して、近傍もしくは相対位置を示すのに使用される。例えばポリペプチド内の参照配列のカルボキシ末端に位置するある配列は、参照配列のカルボキシ末端に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシ末端ではない。
【００１４】
用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、参照配列と比較して相補的塩基配列および逆の配向を有するポリヌクレオチド分子である。例えば配列5'ATGCACGGG3'は5'CCCGTGCAT3'に相補的である。
【００１５】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1つ以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して）。縮重コドンは異なるヌクレオチドのトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUとGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
【００１６】
用語「発現ベクター」は、その転写を与える追加のセグメントに機能できる形で結合した目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む線形または環状のDNA分子を示すのに使用される。このような追加のセグメントには、プロモーターおよびターミネーター配列があり、また1つ以上の複製開始点、1つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどもある。発現ベクターは一般に、プラスミドもしくはウイルスDNAから得られるか、またはこの両方を成分を含有してもよい。
【００１７】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用される時、その天然の遺伝的環境からポリヌクレオチドが切り離されており、従って外因性のもしくは好ましくないコード配列を含まず、遺伝子操作されたタンパク質産生系内での使用に適した形である。このような単離された分子は、その天然の環境から分離された分子であり、cDNAおよびゲノムクローンを含む。本発明の単離された分子は、通常結合している他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'非翻訳領域を含む（例えば、プロモーターおよびターミネーター）。結合した領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、DynanとTijan、Nature 316:774-78, 1985を参照）。
【００１８】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境以外の条件で（例えば、血液や動物組織から離れて）存在するポリペプチドまたはタンパク質である。好適な形では単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド（特に動物起源の他のポリペプチド）を実質的に含まない。ポリペプチドを、高度に精製された形、すなわち95％を超える純度、さらに好ましくは99％を超える純度で与えることが好ましい。本明細書の文脈において用語「単離された」は、別の物理的形（例えば、ダイマーまたは代替グリコシル化もしくは誘導体化された型）の同じポリペプチドの存在を否定しない。
【００１９】
「機能できる形で結合した」は、2つ以上の物質が、その目的のために協調して機能するように結合していることを意味する。DNAセグメントについて言及する時この用語は、例えばコード配列が正しい読みとり枠内で結合され、プロモーター内で転写が開始され、コード配列を経由してターミネーターまで進行することを示す。ポリペプチドについて言及する時、「機能できる形で結合した」は、共有的（例えばジスルフィド結合）および非共有的（例えば、水素結合、疎水性相互作用、または塩−ブリッジ相互作用）に結合した配列を含む（ここで、配列の所望の機能は保持される）。
【００２０】
用語「オーソログ（ortholog）」または「種相同体」は、異なる種からのポリペプチドもしくはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドもしくはタンパク質を意味する。オーソログ中の配列の差は、種分化の結果である。
【００２１】
「パラログ（paralog）」は、生物が作る異なっているが構造が関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子複製により発生すると考えられる。例えばα−グロブリン、β−グロブリン、およびミオグロビンは互いのパラログである。
【００２２】
「ペプチド−受容体複合体」は、ペプチドまたはリガンドが受容体に結合すると形成されて、受容体の性質に変化が起きる。この変化は、反応カスケードを開始させて細胞機能を変化させるか、または受容体が追加のペプチドに結合できなくする。ペプチド−受容体複合体の形成は、可逆的である。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」は、5'末端から3'末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの1本鎖もしくは2本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドにはRNAとDNAがあり、天然の起源から単離されるか、in vitroで合成されるか、または天然および合成分子の組合せから調製される。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（「bp」と略記される）、ヌクレオチド（「nt」）、またはキロ塩基（「kb」）として表される。文脈が許せば後者の2つの用語は、1本鎖または2本鎖であるポリヌクレオチドを意味することがある。この用語が2本鎖分子に適用される時、これは全体の長さを示すのに使用され、用語「塩基対」と同等であることが理解されるであろう。2本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は長さが若干異なり、その末端は酵素切断の結果としてねじれても良く、従って2本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対合していなくてもよいことを、当業者は理解するであろう。
【００２４】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基のポリマーであり、天然にまたは合成により産生される。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【００２５】
本明細書において用語「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合と転写開始とを与えるDNA配列を含有する遺伝子の一部を意味するのに使用される。プロモーター配列は、絶えずではないが一般に、遺伝子の5'非コード領域中に存在する。
【００２６】
「タンパク質」は、1つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質はまた、炭水化物のような非ペプチド成分を含んでもよい。タンパク質が産生される細胞により、タンパク質に炭水化物や他の非ペプチド置換基を付加されてもよく、細胞のタイプにより変化してもよい。本明細書においてタンパク質は、そのアミノ酸骨格構造により定義される。炭水化物基のような置換基は一般的には特定されないが、それでも存在してもよい。
【００２７】
用語「受容体」は、生物活性分子（すなわちリガンド）に結合し、細胞に対するリガンドの作用を仲介する細胞結合タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと、一般的にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインとを含むマルチドメインまたはマルチペプチド構造が特徴である。受容体へのリガンドの結合により受容体のコンフォメーション変化が起き、これがエフェクタードメインと細胞中の他の分子との相互作用を引き起こす。この相互作用が次に、細胞の代謝を変化させる。受容体−リガンド相互作用に関連する代謝イベントには、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生の上昇、細胞カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解とリン脂質の加水分解がある。一般に受容体は、膜結合性、サイトゾル性または核性；モノマー性（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ−アドレナリン作用性受容体）またはマルチマー（例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体およびIL-6受容体）でもよい。
【００２８】
用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA配列を意味し、これは、より大きなポリペプチドの成分として、ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を、より大きなポリペプチドが通るように指令する。より大きなポリペプチドは一般に、分泌経路を通過中に切断されて分泌ペプチドを除去する。
【００２９】
「セグメント」は、特定の性質を有するより大きな分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、より長いDNA分子の一部（例えば、プラスミドまたはプラスミド断片）であり、これは5'から3'方向に読まれると、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【００３０】
本明細書において用語「スプライス変種」は、遺伝子から転写される別の型のRNAを示すのに使用される。スプライス変種は、転写されたRNA分子内の代替スプライス部位の使用により自然に起きるか、またはまれであるが別々に転写されたRNA分子の間で起き、同じ遺伝子からいくつかのmRNAが転写されることになる。スプライス変種は、改変アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。本明細書において用語スプライス変種はまた、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変種によりコードされるタンパク質を示すのに使用される。
【００３１】
不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により測定されるポリマーの分子量や長さは、近似値であることは理解されるであろう。このような値が「約」Xまたは「ほぼ」Xとして表される時、Xの表示値は±10％の正確さであることは理解されるであろう。
【００３２】
本明細書で引用されるすべての文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本発明は、既に記載された分泌タンパク質zsig33（Sheppard, P.O., WO98/42840:1998）と受容体GHS-R（Howard, A.D.ら、Science 273:974-977, 1996）とのペプチド−抗体複合体を形成するための新規方法に関する。本発明はまた、限定された数の該ペプチドの変種と抗体に関する。ペプチド−抗体複合体を形成するためのこの新規方法の発見は、体がいかに栄養ホメオスタシスを維持するかを解明するために、およびこれらのプロセスを妨害する治療薬の開発のために、ならびに本明細書の教示から明らかな他の用途にとって、重要である。
【００３４】
本発明は一部は、zsig33として知られている既に開示されている分泌ポリペプチドの同定に基づく（米国特許第6,380,158号、米国特許第6,291,653号、および米国特許第6,627,729号、これらはすべて参照することにより本明細書に組み込まれる）。zsig33ポリペプチドは、GHS-Rとして知られているGタンパク質結合受容体のペプチドリガンドであることが証明されている（Feighner, S.D.ら、Science  284:2184-2188, 1999）。zsig33リガンドはモチリンと相同性があり、消化管系で転写されることがわかっている。オーファン受容体は、モチリン受容体GPR38と相同性を有する。zsig33のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列は、それぞれ配列番号1と2に示す。配列番号3は、配列番号2の縮重ポリヌクレオチド配列である。GHS-Rオーファン受容体のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列は、それぞれ配列番号4と5に示す。配列番号6は配列番号5の縮重ポリヌクレオチド配列である。モチリンのポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列は、それぞれ配列番号7と8に示す。モチリン受容体GPR38は、別のスプライシングイベントにより生じる2つのアイソフォームを有する。Feighner, F.D.（前述）を参照されたい。長い型であるGPR-38Aのポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列は、それぞれ配列番号9と10に示す。短い型であるGPR-38Bのポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列は、それぞれ配列番号11と12に示す。zsig33の末端切断型のポリペプチド配列は、配列番号16と配列番号17に示す。この受容体クラスのメンバーは、ホスホリパーゼCシグナル伝達経路を活性化するようである。
【００３５】
本発明はまた一部は、zsig33ポリペプチドのアンタゴニストの同定に基づく。すのようなアンタゴニストは、既に米国特許第6,291,653号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００３６】
本発明の態様は、例えば抗zsig33抗体のようなアンタゴニストを使用して、GHS-Rに結合するポリペプチドの能力を低下、制限、または改変するか、またはGHS-Rによる細胞内シグナル伝達イベントを誘導するのに充分な方法で、zsig33ポリペプチドに結合する機構により、代謝障害を引き起こす。
【００３７】
zsig33ポリペプチドまたはその変種のGHS-Rへの結合は、Gタンパク質にその結合GDPを放出させてGTPに結合させ、こうしてGタンパク質を活性化する。次に一般に活性化Gタンパク質は、第2のメッセンジャーの形成を触媒するアフェクター酵素に結合する。GHS-Rへのzsig33リガンド結合の場合、このような第2のメッセンジャーの結果は、例えば胃収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモン分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモン分泌の調節、ならびに本明細書に記載の他の測定法により測定することができる。アンタゴニストとzsig33ポリペプチドとのとの結合イベントの結果は、栄養物質取り込みの低下、胃収縮性の低下、分泌される消化酵素およびホルモンの減少、膵臓の分泌酵素およびホルモンの減少、カロリー摂取の減少、体重およびボディマスの低下、体脂肪重量と体脂肪マス、および非脂肪と比較して体脂肪の割合の低下である。
【００３８】
成長ホルモンの放出は多くの組織で増殖を刺激し、代謝過程（例えば、タンパク質合成と遊離の脂肪酸動員の刺激、ならびに炭水化物からの種々のエネルギー源から脂肪酸への代謝の刺激）に影響を与える。成長ホルモンの欠損は、こびと症のような医学的障害を引き起こすことがある。
【００３９】
成長ホルモン放出の制御は、ホルモンや神経伝達物質により直接または間接に厳密に制御されている。例えば成長ホルモン放出は、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）により刺激され、ソマトスタチンにより阻害され、両方とも視床下部から放出され、主に下垂体で作用する。成長ホルモン放出はまた、他の化合物により刺激され、例えばL-3,4-ジヒドロフェニルアラニン、グルカゴン、バソプレシン、下垂体アドレニルシクラーゼ活性化ペプチド（PACAP）、ムスカリン受容体アゴニスト、および合成ペプチド（すなわち、成長ホルモン放出ペプチド）がある。
【００４０】
成長ホルモン分泌促進物質は、小ペプチドおよび／または小分子の群であり、GHRHの機構以外の機構（すなわち、下垂体および視床下部中の異なる受容体（GHS-R）に結合すること）により下垂体細胞からの成長ホルモンの放出を刺激する。こうしてこの受容体の結合は、神経内分泌外の作用（例えば、睡眠および食物摂取）で成長ホルモン分泌を制御する役割を果たすことができる。従って成長ホルモンの分泌は、zsig33とGHS-Rとのペプチド−抗体複合体の形成により制御される。
【００４１】
本発明がリガンド（zsig33）と抗体の両方の変種ポリヌクレオチド配列を含むことを、当業者は認識するであろう。これらの変種は、保存的アミノ酸置換、対立遺伝子変種、および縮重ポリヌクレオチド配列により産生される変種に包含される。
【００４２】
本発明は、本明細書に開示したzsig33とGHS-Rポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子（DNA分子とRNA分子とを含む）を提供する。遺伝子コードの縮重を考慮すると、これらのポリヌクレオチド分子内で多様な配列の変化が可能であることを、当業者は容易に認識するであろう。配列番号3は、配列番号2のzsig33ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号6は、配列番号5のGHS-RポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号3と6の縮重配列はまた、Tの代わりにUを使用することにより、配列番号2と5をコードするすべてのRNA配列を与えることも、当業者は容易に認識するであろう。すなわち配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド351を含むポリヌクレオチド、および配列番号6のヌクレオチド1からヌクレオチド1098を含むポリヌクレオチド、およびこれらのRNA同等物をコードするzsig33ポリペプチドは、本発明に包含される。表1は、縮重ヌクレオチド位置を示すための配列番号3と6内で使用される一文字コードを記載する。「分解（Resolution）」は、コード文字により示されるヌクレオチドである。「相補体（Complement）」は、相補的ヌクレオチドのコードを示す。例えばYはCまたはTを示し、その相補体RはAまたはGを示し、AはTに相補的であり、GはCに相補的である。
【００４３】
【表１】
2006502227.tif 000002
【００４４】
あるアミノ酸のすべての可能なコドンを包含する配列番号3と6で使用される縮重コドンを表2に示す。
【００４５】
【表２】
2006502227.tif 000003
【００４６】
各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンの示す縮重コドンの決定において、ある程度のあいまいさが導入されることを当業者は理解するであろう。例えば、セリンの縮重コドン（WSN）は、ある場合にはアルギニン（AGR）をコードし、アルギニンの縮重コドン（MGN）は、ある場合にはセリン（AGY）をコードする。フェニルアラニンとロイシンをコードするコドンの間に同様の関係が存在する。すなわち縮重配列に包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変種のアミノ酸配列をコードすることがあるが、当業者は、配列番号2と5のアミノ酸配列に関してこのような変種配列は容易に同定できるであろう。変種配列は、本明細書に記載の機能について容易に試験することができる。
【００４７】
当業者はまた、異なる種が「優先的コドン使用」を示すことができることを理解するであろう。特定の種の優先的コドンは、当該分野で公知の種々の方法により本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。例えば組換えDNAへの優先的コドン配列の導入は、特定の細胞タイプまたは種内でのタンパク質翻訳をより効率的にすることにより、タンパク質の産生を増強することができる。従って配列番号3と6に開示した縮重コドン配列は、当該分野で一般的に使用され本明細書に開示した種々の細胞タイプおよび種でのポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として機能する。優先的コドンを含有する配列は、種々の種での発現のために試験し最適化することができ、本明細書に開示した機能について試験することができる。
【００４８】
本発明の好適な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件下で配列番号1と3、または配列番号4と6の同様のサイズの領域、またはこれに相補的な配列にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは当該分野で公知であり、多くの応用で広く使用されており、例えばSambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州、1989；Ausubelら編、「分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons Inc.）、ニューヨーク州、1987；BergerとKimmel編、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology、第152巻、1987、およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-59, 1990を参照されたい。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、1本鎖相補的配列が2本鎖ハイブリッドを形成できる能力を利用する。このようなハイブリッドには、DNA-DNA、RNA-RNAおよびDNA-RNAがある。
【００４９】
例として、変種GHS-Rポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号4または6（またはこれらの相補体）のヌクレオチド配列を有する核酸分子と、42℃で一晩、50％ホルムアミド、5×SSC（1×SSC；0.15Ｍ塩化ナトリウム、および15mMクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルツ溶液（100×デンハルツ溶液；2％(w/v) フィコール400、2％(w/v) ポリビニルピロリドン、および2％(w/v) ウシ血清アルブミン）、10％デキストラン硫酸、および20μg/ml変性した切断したサケ精子DNAを含む溶液中でハイブリダイズすることができる。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件の変化を工夫することができる。例えばハイブリダイゼーション混合物は、より高い温度（例えば約65℃）で、ホルムアミドを含まない溶液中でインキュベートすることができる。さらに、プレミクスしたハイブリダイゼーション溶液を、製造業者の説明書に従って利用できる（例えば、クロンテクラボラトリーズインク（CLONTECH Laboratories, Inc.）（パロアルト、カリホルニア州）からのエクスプレスハイブ（ExpressHyb）（登録商標）ハイブリダイゼーション溶液）。
【００５０】
ハイブリダイゼーション後、ストリンジェント条件下で、または高ストリンジェント条件下で核酸分子を洗浄して、非ハイブリダイズ核酸分子を除去することができる。典型的なストリンジェント洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を有する0.5×〜2×SSCの溶液で55〜65℃での洗浄を含む。すなわち、変種GHS-Rポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号4または6のヌクレオチド配列（またはこれらの相補体）を有する核酸分子と、ストリンジェント洗浄条件下でハイブリダイズし、ここで洗浄のストリンジェンシーは、55〜65℃の0.1％ SDSを有する0.5×〜2×SSCと同等であり、55℃の0.1％ SDSを有する0.5×SSC、または65℃の0.1％ SDSを有する2×SSCを含む。当業者は、例えば洗浄溶液中のSSCをSSPEで置換することにより、同等の条件を容易に作り出すことができる。
【００５１】
本発明はまた、2つの基準を使用して同定することができるGHS-R変種核酸分子を包含する：コードされたポリペプチドと配列番号5のアミノ酸配列との類似性の測定（後述）、およびハイブリダイゼーションアッセイ（前述）。そのようなGHS-R変種には、(1)配列番号4または6のヌクレオチド配列（またはこれらの相補体）を有する核酸分子とストリンジェント洗浄条件下でハイブリダイズする核酸分子（ここで、ストリンジェント洗浄条件は55〜65℃の0.1％ SDSを有する0.5×〜2×SSCに等しい）、および(2)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは90％、さらに好ましくは95％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。あるいはGHS-R変種は、(1)配列番号4または6のヌクレオチド配列（またはこれらの相補体）を有する核酸分子とストリンジェント洗浄条件下でハイブリダイズする核酸分子（ここで、ストリンジェント洗浄条件は50〜65℃の0.1％ SDSを有する0.1×〜0.2×SSCに等しい）、および(2)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは90％、さらに好ましくは95％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として、特徴付けることができる。
【００５２】
GHS-Rの保存されたアミノ酸の領域を、新しいファミリーメンバーを同定するための手段として使用することができる。これらの領域は、配列番号5の残基275〜280；配列番号5の残基319〜324；配列番号5の残基139〜144；配列番号5の残基124〜129；および配列番号5の残基302〜307である。当業者は、これらの目的のために縮重ヌクレオチドおよび縮重ヌクレオチド配列の相補体を決定することができる。例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用して、種々の組織源または細胞株から得られるRNAから、保存された領域をコードする配列を増幅することができる。特に、GHS-R配列から設計される高度の縮重プライマーはこの目的に有用である。
【００５３】
既に記載されているように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAとRNAを含む。DNAとRNAを調製する方法は、当該分野で公知である。一般にRNAは、大量のzsig33またはGHS-R RNAを産生する組織もしくは細胞から単離される。このような組織および細胞はノーザンブロッティング（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980）により同定され、zsig33ペプチドについて胃、小腸、および膵臓、そしてGHS-Rについて下垂体、視床下部、海馬、および中枢神経系がある。
【００５４】
総RNAは、グアニジンイソチオシアネート抽出と、次にCsCl勾配中の遠心分離で単離して調製することができる（Chirgwinら、Biochemistry 18:52-94, 1979）。ポリ(A)+RNAは、総RNAからAvivとLederの方法を使用して調製される（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972）。相補的DNA（cDNA）はポリ(A) +RNAから公知の方法を使用して調製される。別の方法では、ゲノムDNAを単離することができる。次にGHS-Rポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、例えばハイブリダイゼーションもしくはPCRにより単離される。
【００５５】
相補的DNA（cDNA）クローンが調製されるが、ある応用（例えば、トランスジェニック動物中の発現）では、ゲノムクローンを使用するかまたはcDNAクローンを修飾して、少なくとも1つのゲノムイントロンを含めることが好ましいかも知れない。cDNAおよびゲノムクローンの調製法は公知で当業者の技術の範囲内であり、ライブラリーをプローブ検索またはプライミングするための本明細書に開示された配列もしくはその一部の使用がある。発現ライブラリーを、GHS-Rに対する抗体または他の特異的結合パートナーとプローブ結合させることができる。
【００５６】
本明細書に開示のGHS-Rポリヌクレオチドまたはzsig33ポリヌクレオチド配列はまた、それぞれGHS-Rもしくはzsig33遺伝子の5'非コード領域をクローン化するためのプローブもしくはプライマーとして使用することもできる。従ってGHS-Rまたはzsig33遺伝子のプロモーター成分は、例えばトランスジェニック動物または遺伝子治療を受けた患者で異種遺伝子の組織特異的発現を指令するのに使用することができるであろう。5'フランキング配列のクローニングはまた、米国特許第5,641,670号に記載のように「遺伝子活性化」によりGHS-Rまたはzsig33タンパク質の産生を促進する。簡単に説明すると、細胞中の内因性GHS-Rまたはzsig33遺伝子の発現は、少なくとも1つのターゲティング配列、制御配列、エキソン、および対合していないスプライスドナー部位を含むDNA構築体を、GHS-Rまたはzsig33遺伝子座に導入することにより改変される。ターゲティング配列は、構築体と内因性GHS-Rまたはzsig33遺伝子座との相同的組換えを可能にするGHS-R 5'またはzsig33非コード配列であり、こうして構築体内の配列が内因性GHS-Rまたはzsig33コード配列と機能できる形で結合する。こうして内因性GHS-Rまたはzsig33プロモーターは、他の制御配列で置換または補足されて、増強された、組織特異的、または他の制御された発現を与える。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、DNA合成機を使用して合成することができる。例えばホスホラミダイト法を使用することができる。遺伝子または遺伝子断片の合成のような応用のために化学合成した2本鎖DNAが必要なら、各相補鎖が別々に作成される。短い遺伝子（60〜80bp）の産生は技術的に簡単であり、相補鎖を合成し次にアニーリングすることにより行うことができる。しかし化学的DNA合成中の各サイクルの結合効率はめったに100％にならないため、より長い遺伝子（＞300bp）の産生には、特別の方法が必要である。この問題を克服するために、20〜100ヌクレオチドの長さの1本鎖断片から、合成遺伝子（2本鎖）がモジュールで組み立てられる。GlickとPasternak, 「分子バイオテクノロジー、組換えDNAの原理と応用（Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA）」（エーエスエムプレス（ASM Press）、ワシントンDC、1994）；Itakuraら、Annu. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984) およびClimieら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-7, 1990を参照されたい。
【００５８】
本発明はさらに、他の種からの対応するポリペプチドおよびポリヌクレオチド（オーソログ）を与える。これらの種には、特に限定されないが、哺乳動物、鳥類、両生類、は虫類、魚、昆虫および他の脊椎動物と非脊椎動物種がある。特に関係するのは、他の哺乳動物種からのGHS-Rポリペプチド（ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマおよび他の霊長類ポリペプチドを含む）である。ヒトGHS-Rのオーソログは、本発明が与える情報と組成物を従来のクローニング法と組合せて使用することによりクローン化することができる。例えば、本明細書に記載のGHS-Rを発現する組織または細胞タイプから得られるmRNAを使用して、cDNAをクローン化することができる。mRNAの適当な供給源は、ノーザンブロットを、本明細書に開示の配列から設計されるプローブとプローブ結合することにより同定することができる。次に、陽性組織または細胞株のmRNAから、ライブラリーが調製される。次に、GHS-RをコードするcDNAを、種々の方法（例えば、完全なまたは物理的ヒトcDNAとの、または開示された配列に基づく1つ以上のセットの縮重プローブとのプローブ結合）により単離することができる。cDNAはまた、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちPCR（Mullis, 米国特許第4,683,202号）を使用して、本明細書に開示の代表的ヒトGHS-R配列から設計されるプライマーを使用して、クローン化することができる。ある追加の方法では、cDNAライブラリーを使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトして、GHS-Rポリペプチドに対する抗体を用いて目的のcDNAの発現を検出することができる。ゲノムクローンの単離に、同様の技術を応用することができる。
【００５９】
当業者は、配列番号4と6に開示された配列が、ヒトGHS-Rの単一の対立遺伝子であり、対立遺伝子の変化および代替スプライシングが起きると予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変種は、標準的方法により異なる個体からのcDNAまたはゲノムライブラリーをプローブ結合することによりクローン化することができる。配列番号4と6に示すDNA配列の対立遺伝子変種（サイレント変異を含むもの、およびアミノ酸配列の変化を引き起こす変異を含むものを含む）は、配列番号5の対立遺伝子変種であるタンパク質と同様に、本発明の範囲内である。GHS-Rポリペプチドの性質を保持する代替スプライシングされたmRNAから生成するcDNAは、このようなcDNAやmRNAによりコードされるポリペプチドと同様に、本発明の範囲に含まれる。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当業者に公知の標準的方法に従って異なる個体または組織からのcDNAまたはゲノムライブラリーとプローブ結合することにより、クローン化することができる。
【００６０】
本発明はまた、配列番号5のポリペプチドおよびそのオーソログと実質的に類似の単離されたGHS-Rポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは配列番号およびそのオーソログと、好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは95％またはそれ以上同一である。配列同一性パーセントは、従来法により決定される。例えばAltschulら、Bull. Math. Bio. 48:603-16, 1986、およびHenikoffとHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9, 1992を参照されたい。簡単に説明すると、gap opening penaltyが10とgap extension penaltyが1、そして表3に示すようにHenikoffとHenikoff（同上）の「blosum 62」スコアリングマトリックスを使用して、整列スコアを最適化するために2つのアミノ酸配列が整列される（アミノ酸は標準的な一文字コードにより示される）。同一性パーセントは以下のように計算される：
同一一致の総数×100／［より長い配列の長さ＋2つの配列を整列するためにより長い配列中に導入されるギャップの数］
【００６１】
【表３】
2006502227.tif 000004
【００６２】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記の比を使用して同様の方法により決定される。
【００６３】
当業者は、2つのアミノ酸配列を整列するための多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解するであろう。PearsonとLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示のアミノ酸配列と推定変種GHS-Rのアミノ酸配列が共有する同一性レベルを調べるための適切なタンパク質整列法である。FASTAアルゴリズムは、PearsonとLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)により記載されている。
【００６４】
簡単に説明するとFASTAはまず、アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく、最も高い同一性密度（ktup変数が1なら）または同一性対（ktup＝2なら）を有する問題の配列（例えば配列番号5）と試験配列とが共有する領域を同定することにより、配列類似性を解析する。次に最も高い同一性密度を有する10個の領域を、アミノ酸置換マトリックスを使用してすべての対のアミノ酸の類似性を比較して再スコア化し、領域の末端を「トリム」して最も高いスコアに寄与する残基のみを含める。「カットオフ」値（配列の長さとktup値に基づいて、あらかじめ決定された式により計算される）より大きなスコアを有する領域がいくつかあるなら、トリムした最初の領域を調べて、領域を結合させてgapsを有する適切な整列を形成できるかどうかを決定する。最後に2つのアミノ酸配列の最も高いスコアの領域を、Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム（NeedlemanとWunsch、J. Mol. Biol. 48:444 (1970)；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)）を変更したものを使用して整列させると、アミノ酸挿入と欠失が可能になる。FASTA分析の好適なパラメータは：ktup＝1、gap opening penalty＝10、gap extension penalty＝1、および置換マトリックス＝BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のAppendix 2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「SMATRIX」）を修飾することによりFASTAプログラム中に導入することができる。
【００６５】
FASTAはまた、上記の比を使用して核酸分子の配列同一性を決定するのに使用することもできる。ヌクレオチド配列比較のために、他のすべてのパラメータをデフォールト値に設定して、ktup値は1〜6、好ましくは3〜6の範囲、最も好ましくは3でもよい。
【００６６】
本発明は、配列番号5のアミノ酸配列と比較して1つ以上の保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。BLOSUM62の表は、タンパク質セグメントの約2,000の局所的複数整列から得られるアミノ酸置換マトリックスであり、500を超える群の関連タンパク質の高度に保存された領域を示す（HenikoffとHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, (1992)）。従ってBLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入される保存的アミノ酸置換を規定するのに使用することができる。本明細書において用語「保存的アミノ酸置換」は、-1より大きいBLOSUM62値により示される置換を意味する。例えば置換がBLOSUM62値0、1、2、または3により特徴付けられるなら、アミノ酸置換は保存的である。好適な保存的アミノ酸置換は、BLOSUM62値が少なくとも1（例えば、1、2または3）により特徴付けられ、より好適な保存的アミノ酸置換はBLOSUM62値が少なくとも2（例えば、2または3）により特徴付けられる。
【００６７】
配列番号4のヌクレオチドの代わりにヌクレオチドを使用することにより、GHS-R遺伝子中の保存的アミノ酸変化を導入することができる。このような「保存的アミノ酸」変種は、例えばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する突然変異誘発などにより得られる（アウスベル（Ausubel）(1995) 8-10頁〜8-22頁；およびMcPherson（編）、「特異的突然変異誘発：実際的アプローチ（Directed Mutagenesis: A Practical Approach）」 （アイアールエルプレス（IRL Press）、1991）を参照）。このような変種が細胞−細胞相互作用を促進する能力は、例えば本明細書に記載の測定法のような標準的方法を使用して測定することができる。あるいは変種GHS-Rポリペプチドを、抗GHS-R抗体に特異的に結合する能力により同定することができる。
【００６８】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発のような当該分野で公知の方法に従って同定することができる（CunninghamとWells, Science 244:1081-5, 1989；Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-502, 1991）。後者の方法では、分子のすべての残基に単一のアラニン変異が導入され、分子の活性に決定的に重要なアミノ酸残基を同定するために、生じる変異分子が後述のように生物活性について試験される。またHiltonら、J. Biol. Chem. 271:4699-708, 1996を参照されたい。zsig33-GHS-R結合の部位は、物理的構造解析（例えば核磁気共鳴、結晶構造解析、電子回折、または光親和性標識）を、推定接触部位アミノ酸の変異と組合せることにより決定することもできる。例えばde Vosら、Science 255:306-12, 1992；Smithら、J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaverら、FEBS Lett. 309:59-64, 1992も参照されたい。必須アミノ酸の本体はまた、関連するGタンパク質結合受容体との相同性の分析から推定することもできる。
【００６９】
複数のアミノ酸置換を作成し、突然変異誘発とスクリーニングの公知の方法を使用して試験することができ、例えばReidhaar-OlsonとSauer（Science 241:53-7, 1988）またはBowieとSauer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989）により開示されている。簡単に説明すると、これらの著者は、ポリペプチド中の2つ以上の位置を同時にランダム化する方法、機能性ポリペプチドを選択する方法、そして次に突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して各位置の可能な置換の範囲を決定する方法を開示する。使用可能な他の方法にはファージ表示（例えば、Lowmanら、Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladnerら、米国特許第5,223,409；Huse, WIPO公報 WO92/06204）および領域−指令突然変異誘発（Derbyshireら、Gene 46:145, 1986；Nerら、DNA 7:127, 1988）がある。
【００７０】
開示されたGHS-R DNAとポリペプチド配列の変種は、Stemmer, Nature 370:389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994、およWIPO公報 WO92/20078に開示されたDNAシャフリングにより作成することができる。簡単に説明すると、親DNAのランダム断片化によるin vitro相同的組換えを行い、次にPCRを使用して再組み立てを行い、ランダムに導入された点突然変異を行うことにより、変種DNAが作成される。この方法は、親DNAのファミリー（例えば、異なる種からの対立遺伝子変種またはDNA）を使用して、プロセス中に追加の変化を導入することにより変更することができる。所望の活性の選択またはスクリーニング、そして次に突然変異誘発と測定の追加的繰り返しは、有害な変化に対して同時に選択しながら所望の変異について選択することにより、配列の急速な「進化」を与える。
【００７１】
本明細書に開示の突然変異誘発法を高処理能力の自動スクリーニング法と組合せて、宿主細胞中のクローン化された突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる。活性ポリペプチド（例えば、胃収縮性の低下、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモンの分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモンの分泌の調節）をコードする突然変異誘発したDNA分子は、宿主細胞から回収し、近代的な装置を使用して迅速に配列決定することができる。これらの方法は、目的のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にし、未知構造のポリペプチドに応用することができる。
【００７２】
変種GHS-R遺伝子の特定のヌクレオチド配列に無関係に、遺伝子は、zsig33リガンドまたは抗GHS-R抗体に特異的に結合する能力を特徴とするポリペプチドをコードする。さらに詳しくは変種GHS-R遺伝子は、本明細書に記載のヒトGHS-R遺伝子にコードされるポリペプチドの活性の少なくとも50％、好ましくは70％、80％もしくは90％以上を示すポリペプチドをコードする。
【００７３】
変種GHS-Rポリペプチドまたは実質的に相同的なGHS-Rポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有することが特徴である。これらの変化は好ましくは小さいものであり、すなわち保存的アミノ酸置換およびポリペプチドの折り畳みもしくは活性に大きく影響しない他の置換；典型的には1〜約30アミノ酸の小さな欠失；およびアミノ−もしくはカルボキシル末端伸長（例えば、アミノ末端メチオニン残基、約20〜25残基までの小さなリンカーペプチド、または親和性タグ）である。すなわち本発明は、配列番号5の対応する領域と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは95％またはそれ以上同一である配列を含む366〜1800アミノ酸残基のポリペプチドを含む。親和性タグを含むポリペプチドはさらに、GHS-Rポリペプチドと親和性タグとの間にタンパク質分解切断部位を含むことができる。好適なそのような部位は、トロンビン切断部位とXa因子切断部位がある。
【００７４】
任意のGHS-Rポリペプチド（変種および融合タンパク質を含む）について、当業者は、上記表1と2に記載の情報を使用して、変種をコードする完全に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に作成することができる。さらに当業者は、標準的ソフトウェアを使用して、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に基づいてGHS-R変種を作成することができる。すなわち本発明は、以下の配列の少なくとも1つを提供するデータ構造でコードされるコンピューターで読める媒体を含む：配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、および配列番号15。コンピューターで読める媒体の適当な型には、磁気媒体、および光学的に読める媒体がある。磁気媒体の例には、ハードディスクまたは固定ディスク、ランダムアクセスメモリー（RAM）チップ、フロッピー（登録商標）ディスク、デジタルリニアテープ（DLT）、ディスクキャッシュ、およびZIPディスクがある。光学的に読める媒体の例には、コンパクトディスク（例えば、CD-リードオンリーメモリー（ROM）、CD-リライタブル（RW）、およびCD-レコーダブル）、およびデジタルバーサタイル／ビデオディスク（DVD）（例えば、DVD-ROM、DVD-RAMおよびDVD+RW）がある。
【００７５】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体、および1つ以上のポリペプチド融合体を含む関連するマルチマータンパク質を提供する。例えばGタンパク質結合受容体は、ダイマー化タンパク質への融合体として調製することができる（米国特許第5,155,027号および5,567,584号に開示されている）。この点で好適なダイマー化タンパク質には、他のGタンパク質結合受容体、Gタンパク質結合受容体断片、またはタンパク質のGタンパク質結合受容体ファミリーの他のメンバーを含むポリペプチド、例えばGPR38（すなわちGPR38AまたはGPR38B、モチリン受容体）ならびにIg-Heptaがある。またAbe, J.ら、J. Biol. Chem. Vol.274:19957-19964, 1999も参照されたい。これらのドメイン融合体またはドメイン断片融合体、またはGタンパク質結合受容体ペプチドとの融合体は、遺伝子操作された細胞中で発現して、種々のマルチマーGタンパク質結合受容体様類似体を産生することができる。
【００７６】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製し、これらを化学的に結合させることにより、当業者に公知の方法により調製することができる。あるいは融合タンパク質の両方の成分を正しい読みとり枠でコードするポリヌクレオチドを公知の方法により作成し、本明細書に記載の方法により発現することができる。例えば生物学的機能を与えるドメインの一部またはすべてを、本発明のGHS-Rと、他のファミリーベクター（例えばGPR38）の機能的に同等のドメインとで交換してもよい。このようなドメインには、特に限定されないが、分泌シグナル配列、膜貫通スパニングドメイン、およびシグナリングドメインのような保存されたモチーフがある。そのような融合タンパク質は、構築される融合体に依存して、本発明のポリペプチドまたは他の公知のGタンパク質結合受容体様ファミリータンパク質（例えばGPR38）と同じかまたは同様の生物学的機能性プロフィールを有すると予測される。さらにそのような融合タンパク質は、本明細書に記載の他の性質を示してもよい。
【００７７】
さらに当該分野で記載された方法を使用して、ポリペプチド融合体すなわちハイブリッドGHS-Rタンパク質を、本発明のGHS-Rの領域もしくはドメインを他のGタンパク質結合受容体（例えばGPR38）のもの、他の受容体ファミリーのメンバー（例えば、b-アドレナリン作用性受容体ファミリー）、または他の異種タンパク質と組合せて使用して構築することができる（サムブルーク（Sambrook）ら、前述、Altschulら、前述、Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994、およびその中の文献）。これらの方法は、目的のポリペプチド中のより大きなドメインまたは領域の生物学的重要性の測定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応動力学、結合を変化させ、基質特異性を縮小または拡大し、またはポリペプチドの組織および細胞局在化を変化させ、そして未知構造のポリペプチドに応用することができる。
【００７８】
付属ドメインをzsig33ポリペプチドに融合させて、本明細書の実施例9で同定される具体的な細胞、組織、または巨大分子にこれらをターゲティングすることができる。例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼ断片を、標的細胞の表面上のGHS-Rポリペプチドに特異的に結合するzsig33ポリペプチドドメインまたは断片に融合することにより、あらかじめ決められた細胞タイプにターゲティングすることができる。こうして、ポリペプチド、ポリペプチド断片およびタンパク質は、治療または診断目的にターゲティングすることができる。そのようなzsig33ポリペプチドドメインまたは断片は、2つ以上の残基（例えば精製のために親和性タグ、およびターゲティング−GHS-R）に融合することができる。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間に1つ以上の切断部位を含有してもよい。Tuanら、Connective Tissue Research 34:1-9, 1996を参照されたい。
【００７９】
本発明のポリペプチド融合体は一般に、約1,500以下のアミノ酸残基、好ましくは約1,200残基以下、さらに好ましくは約1,000残基以下を含有し、多くの場合かなり小さい。例えばzsig33またはGHS-Rポリペプチドの残基を、大腸菌（E. coli ）b-ガラクトシダーゼ（1,021残基；Casadabanら、J. Bacteriol. 143:971-980, 1980を参照）、10残基スペーサー、および4残基Xa因子切断部位に融合することができる。第2の例においてzsig33またはGHS-Rポリペプチドの残基は、マルトース結合タンパク質（約370残基）、4残基切断部位、および6-残基ポリヒスチジンタグに融合することができる。
【００８０】
宿主細胞からのzsig33またはGHS-Rポリペプチドの移出を指令するために、zsig33 DNAは、分泌ペプチド（例えばt-PA分泌ペプチド、またはzsig33由来の分泌ペプチド、またはGHS-R分泌ペプチド）をコードする第2のDNAセグメントに連結される。分泌ポリペプチドの精製を促進するために、C末端伸長、例えばポリヒスチジンタグ、物質P、Flagペプチド（Hoppら、Bio/Technology 6:1204-1210, 1988；イーストマンコダック（Eastman Kodak）、ニューヘーブン（New Haven）、コネチカット州、から入手できる）、マルトース結合タンパク質、または抗体もしくは他の特異的生物活性物質が入手できる他のポリペプチドもしくはタンパク質を、zsig33またはGHS-Rポリペプチドに融合することができる。
【００８１】
本発明はまた、zsig33とGHS-Rポリペプチドの「機能性断片」およびそのような機能性断片をコードする核酸分子を包含する。核酸分子の日常的検出分析を行って、zsig33またはGHS-Rポリペプチドをコードする核酸分子の機能性断片を得ることができる。例として配列番号1もしくは3、または配列番号4もしくは6のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連のネステッド（nested）欠失を得ることができる。次に断片は正しい読みとり枠で発現ベクター中に挿入され、発現されたポリペプチドは単離され、細胞−細胞相互作用、または抗zsig33または抗GHS-R抗体に結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化の1つの代替法は、オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発を使用して欠失または停止コドンを導入して、所望の断片の産生を特定することである。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してzsig33またはGHS-R遺伝子の特定の断片を合成することができる。
【００８２】
機能性ドメインを同定するための標準的方法は当業者に公知である。例えば、インターフェロンの片方または両方の末端での末端切断に関する研究は、HorisbergerとDi Marco、Pharmac. Ther. 66:507 (1995)に要約されている。さらにタンパク質の機能的分析の標準的方法は、例えばTreuterら、Molec. Gen. Genect. 240:113 (1993)、Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell（編）、65-72頁（Nijhoff 1987）中のContentら、「ヒトインターフェロンにより誘導される42kDa 2-5A シンターゼの発現と予備的欠失分析」、「動物細胞増殖の制御（Control of Animal Cell Proliferation）」、Vol. 1, Boyntonら（編）、169-199頁（アカデミックプレス（Academic Press）、1985）中のHerschman、「EGF受容体」、Coumailleauら、J. Biol. Chem. 270:29270 (1995)；Fukunagaら、J. Biol. Chem.270:25291 (1995)；Yamaguchiら、Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)、およびMeiselら、Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)に記載されている。
【００８３】
本発明はまた、それぞれ配列番号2または5のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するzsig33またはGHS-R遺伝子の機能性断片を包含する。変種zsig33遺伝子は、上記したように配列番号1または2のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを測定することにより、ならびに本明細書の表Aと比較することにより、構造に基づき同定することができる。変種GHS-R遺伝子は、上記したように配列番号4または5のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを測定することにより、構造に基づき同定することができる。構造に基づき変種遺伝子を同定する方法の代替法は、変種zsig33またはGHS-R遺伝子候補をコードする核酸分子が、上記したように配列番号1と3、または配列番号4と6のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを測定することである。
【００８４】
本明細書に記載の方法を使用して当業者は、配列番号5の種々のポリペプチド断片または変種もしくは野生型GHS-Rタンパク質の活性を保持するものを同定および／または調製することができる。そのようなポリペプチドは、例えば分泌ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの一部もしくはすべてからの追加のアミノ酸（細胞内シグナル伝達に関与するアミノ酸；融合ドメイン；親和性タグ；などを含む）を含んでよい。
【００８５】
本発明はまた、本明細書に記載のzsig33ポリペプチドのエピトープ担持部分を有する部分を含むポリペプチド断片またはペプチドを提供する。そのような断片またはペプチドは、「免疫原性エピトープ」を含み、これは、免疫原として全タンパク質が使用される時、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である。免疫原性エピトープ担持ペプチドは、標準的方法を使用して同定することができる（例えば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)を参照）。
【００８６】
これに対して、ポリペプチド断片またはペプチドは、「抗原性エピトープ」を含んでよく、これは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である。あるエピトープは、アミノ酸の線状のまたは連続的ストレッチからなり、そのようなエピトープの抗原性は変性物質によっては破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣できる比較的短い合成ペプチドは、タンパク質に対する抗体の産生を刺激するのに使用することができることは、当該分野で公知である（例えばSutcliffeら、Science 219:660 (1983)を参照）。従って本発明の抗原性エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドと結合する抗体を作成するのに有用である。
【００８７】
抗原性エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号2または5の少なくとも4〜10個のアミノ酸、好ましくは少なくとも10〜15個のアミノ酸、さらに好ましくは15〜30個のアミノ酸を含有する。そのようなエピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、zsig33またはGHS-Rポリペプチドを断片化するか、または本明細書に記載のように化学ペプチド合成により産生することができる。さらにランダムペプチドライブラリーのファージ表示によりエピトープを選択することができる(例えば、LaneとStrephen, Cuur. Opin. Immunol. 5:268 (1993)、およびCorteseら、Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)を参照）。エピトープを含む小ペプチドからエピトープを同定し抗体を産生する標準的方法は、例えば「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）」、Vol. 10, Manson（編）、105-116頁（ザ・ヒュマーナプレスインク（The Humana Press, Inc）、1992）中のMole, 「エピトープマッピング」、「モノクローナル抗体：産生、操作、および臨床的応用（Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application）」、RitterとLadyman（編）、60-84頁（ケンブリッジ大学プレス（Cambridge University Press）、1995）中のPrice、「合成ペプチド由来抗体の産生と性状解析」、およびColiganら（編）、Current Protocols in Immunology, 9.3.1-9.3.5頁および9.4.1-9.4.11頁（ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、1997）に記載されている。
【００８８】
例として、レーザージーン（LASERGENE）（ディーエヌエースター（DNASTAR）；マジソン、ウィスコンシン州）のプロテアン（PROTEAN）プログラム（バージョン3.14）により実行されるように、Jameson-Wolf法、JamesonとWolf、CABIOS 4:181 (1988)を使用して、zsig33中の抗原性部位候補が同定された。この解析ではデフォールトパラメータが使用された。
【００８９】
この解析の結果は、配列番号2のアミノ酸残基30〜50；配列番号2の残基57〜73；および配列番号2の残基109〜117からなるペプチドが、抗原性ペプチドであることを示した。
【００９０】
zsig33ポリペプチドはまた、zsig33エピトープ、ペプチドまたはポリペプチドに結合する抗体を調製するのに使用することができる。zsig33ポリペプチドまたはその断片は、動物を免疫し免疫応答を誘発するための抗原（免疫原）として機能する。当業者は、抗原性エピトープ担持ポリペプチドは、zsig33ポリペプチド（例えば配列番号2）の少なくとも6、好ましくは少なくとも9、さらに好ましくは少なくとも14〜約30個の連続的アミノ酸残基を含有することを認識するであろう。zsig33ポリペプチドのより大きな部分（すなわち10〜30残基、アミノ酸配列の全長さまで）を含むポリペプチドが含まれる。抗原または免疫原性エピトープはまた、本明細書に記載のように、結合したタグ、アジュバントおよび担体を含有することができる。適当な抗原には、アミノ酸番号24〜アミノ酸番号117、またはその連続的9〜94アミノ酸断片の、配列番号2にコードされるzsig33ポリペプチドがある。他の適当な抗原には、配列番号2の残基1〜残基23；配列番号2の残基24〜残基37；配列番号2の残基24〜41；配列番号2の残基24〜117；および配列番号2の残基42〜117がある。抗原として使用するための好適なペプチドは、疎水性プロットから当業者により予測されるような親水性ペプチドである。zsig33親水性ペプチドは、配列番号2の残基28〜49；配列番号2の残基57〜75；配列番号2の残基89〜97；配列番号2の残基107〜117；またはこれらのペプチドの任意の1つの部分を含有する連続的9〜94アミノ酸断片よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに折り畳まれたタンパク質の表面上に提示されるアミノ酸の配列は抗原性であろう。zsig33ペプチドについて、適当な表面提示ペプチドには、配列番号2の残基27〜52；配列番号2の残基56〜79；配列番号2の残基87〜98；配列番号2の残基105〜117よりなる群から選択されるアミノ酸を含むペプチドがある。これらの抗原を接種した動物により生成する免疫応答からの抗体は、本明細書に記載のように単離し精製することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製し単離する方法は、当該分野で公知である。例えば、「免疫学の現代のプロトコール（Current Protocols in Immunology）」、Cooliganら（編）、国立衛生研究所（National Institutes of Health）、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons Inc.）、1995；サムブルーク（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第2版、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州、1989；およびHurrell, J.G.R.編、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術と応用（Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications）」、シーアールシー・プレスインク（CRC Press Inc.）、ボカラートン（Boca Raton）、フロリダ州、1982を参照されたい。
【００９１】
当業者には明らかなようにポリクローナル抗体は、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラット）にzsig33ポリペプチドまたはその断片を接種して作成することができる。zsig33ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントの使用により増強することができる。免疫に有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばzsig33またはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合体を含む。ポリペプチド免疫原は、完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」なら、そのような部分は免疫のために巨大分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、または破傷風毒素）に結合または連結することが有利である。
【００９２】
本明細書において用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、親和性精製したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合断片、例えばF(ab')2およびＦabタンパク質分解断片を含む。遺伝子操作した完全な抗体または断片、例えばキメラ抗体、Fv断片、1本鎖抗体など、ならびに合成抗原結合ペプチドおよびポリペプチドもまた含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトフレームワークおよび定常領域上に移植することにより、または全非ヒト可変ドメインを取り込む（露出した残基の置換によりヒト様表面でこれらを随時「おおう（cloaking）」、この結果は「化粧張りをした（veneered）」抗体である）ことによりヒト化される。ある場合には、正しい結合特性を増強するために、ヒト化抗体はヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持してもよい。抗体をヒト化することにより、生物学的半減期が延長され、ヒトへの投与時の有害な免疫反応の可能性が低下する。さらにヒト抗体は、WIPO公報WO98/24893に開示されているように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するように操作されたトランスジェニック非ヒト動物中で産生することができる。これらの動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるように不活性化または排除することが好ましい。
【００９３】
本明細書で有用な抗体を作成または選択するための代替法には、zsig33タンパク質またはペプチドへのリンパ球のin vitro暴露、およびファージベクターまたは同様のベクター中の抗体表示ライブラリーの選択がある（例えば、固定化または標識zsig33タンパク質またはペプチドの使用による）。zsig33ポリペプチド結合ドメイン候補を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）または細菌（例えば大腸菌（E. coli ））上に表示されるランダムペプチドライブラリーを選択することにより得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの方法、例えばランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成により得ることができる。これらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質またはポリペプチドでもよい既知の標的（例えば、リガンドもしくは受容体、生物学的もしくは合成巨大分子、または有機もしくは無機物質）に相互作用するペプチドについてスクリーニングするのに使用ことができる。そのようなランダムペプチド表示ライブラリーを作成しスクリーニングする技術は、当該分野で公知（Ladnerら、米国特許第5,223,409号；Ladnerら、米国特許第4,946,778号；Ladnerら、米国特許第5,403,484号およびLadnerら、米国特許第5,571,698号）であり、ランダムペプチド表示ライブラリーおよびそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばクロンテクラボラトリーズインク（Clontech Laboratories, Inc.）（パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）、インビトロゲン（Invitrogen）（サンジエゴ、カリホルニア州）、ニューイングランドバイオラボズインク（New England Biolabs Inc.）（ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）およびファルマシアエルケービーバイオテクノロジーインク（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）（ピスカタウェイ（Piscataway, ニュージャージー州）から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、本明細書に記載のGHS-R配列を使用してスクリーニングして、GHS-Rに結合するタンパク質を同定することができる。これらの「結合タンパク質」（zsig33を含む）はGHS-Rポリペプチドと相互作用し、親和性精製により細胞をターゲティングし同族体ポリペプチドを単離するのに使用することができる。これらは直接または間接に、薬物、毒素、放射性核種などに結合することができる。これらの結合タンパク質はまた、発現ライブラリーや中和活性のスクリーニングのような分析法で使用することもできる。結合タンパク質はまた、ポリペプチドの循環レベルを測定するための；基礎的病理または疾患のマーカーとしての可溶性ポリペプチドを検出または定量するための、診断測定法として使用することもできる。これらの結合タンパク質はまた、in vitroおよびin vivoでのzsig33結合およびシグナル伝達を阻止するzsig33「アンタゴニスト」としても作用する。これらの抗zsig33結合タンパク質は、例えば一般に血小板凝集、アポトーシス、神経形成、筋肉形成、免疫認識、腫瘍形成、および細胞−細胞相互作用を追跡するのに有用であろう。
【００９４】
抗体は、対照（非zsig33）ポリペプチドへの結合親和性より少なくとも10倍大きい結合活性（zsig33ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに対して）の閾値レベルを示すなら、特異的に結合すると決定される。抗体の結合親和性は、当業者が、スキャチャード解析（Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949）により容易に測定することができる。
【００９５】
当業者に公知の種々の測定法を使用して、zsig33タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出することができる。測定法の例は、「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、HarlowとLane（編）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1988に詳述されている。そのような測定法の例には以下がある：同時免疫電気泳動、放射免疫定量法、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、ドットブロットもしくはウェスタンブロット測定法、阻害もしくは競合測定法、およびサンドイッチ測定法。抗体はまた、野生型対変異体zsig33タンパク質またはポリペプチドへの結合についてスクリーニングすることができる。さらにzsig33/GHS-R複合体に対する抗体も同定することができる。
【００９６】
zsig33を発現する細胞のタグ付け；親和性精製によるzsig33の単離；zsig33ポリペプチドの循環レベルを測定するための測定法；基礎病理または疾患のマーカーとしての可溶性zsig33の検出または定量；FACSを用いる分析法；発現ライブラリーのスクリーニング；抗イディオタイプ抗体の作成；in vitroおよびin vivoでのGHS-Rへのzsig33の結合を阻止する中和抗体もしくはアンタゴニストとして；およびGHS-Rへのzsig33の結合により形成されるzsig33/GHS-R複合体の検出のためのに、zsig33に対する抗体が使用される。適当な直接タグまたは標識物には、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などがあり；間接タグまたは標識物には、ビオチン−アビジンまたは中間体としての他の相補体／抗相補体対の使用がある。本明細書の抗体はまた直接または間接に、薬物、毒素、放射性核種などに結合され、これらの結合体はin vivoで診断または治療用途に使用される。さらにzsig33またはその断片に対する抗体は、測定法、例えばウェスタンブロットまたは当該分野で公知の他の測定法で、変性zsig33もしくはその断片を検出するためにin vitroで使用してもよい。
【００９７】
本明細書に記載の抗体またはポリペプチドはまた、薬物、毒素、放射性核種などに結合され、これらの結合体はin vivoで診断または治療用途に使用される。例えば本発明のポリペプチドまたは抗体を使用して、対応する抗相補的分子（例えばGHS-R）を発現する組織または臓器が同定または治療される。さらに詳しくはzsig33ポリペプチドまたは抗zsig33抗体、またはその生物活性断片もしくは部分を、検出可能なもしくは細胞障害性分子に結合させて、抗相補的分子を発現する細胞、組織または臓器を有する哺乳動物に与えることができる。
【００９８】
適当な検出可能な分子は、ポリペプチドまたは抗体に直接または間接に結合され、これらは、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などがある。適当な細胞障害性分子は、ポリペプチドまたは抗体に直接または間接に結合され、これらには、細菌もしくは植物毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素、リシン、アブリンなど）、ならびに治療用放射性核種、例えばヨード-131、レニウム-188またはイットリウム-90がある（ポリペプチドまたは抗体に直接結合されるか、または例えばキレート分子を介して間接に結合される）。ポリペプチドまたは抗体はまた、細胞障害性薬物（例えばアドリアマイシン）に結合してもよい。検出可能なまたは細胞障害性分子の間接的結合のために、検出可能なまたは細胞障害性分子は、多くの相補的／抗相補的対に結合することができ、ここで他のメンバーはポリペプチドまたは抗体部分に結合する。これらの目的のためにビオチン／ストレプトアビジンは、相補的／抗相補的対の例である。
【００９９】
別の実施態様においてポリペプチド−毒素融合タンパク質または抗体−毒素融合タンパク質は、ターゲティング細胞または組織阻害もしくは除去のために使用することができる（例えば、癌細胞または組織を治療するために）。あるいは配列番号2の残基24〜41を含むペプチドのみを含む融合タンパク質は、検出可能な分子、細胞障害性分子または相補的分子を、目的細胞または組織タイプ、例えば一般に下垂体、視床下部、海馬、および中枢神経系に向けるのに適している。
【０１００】
別の実施態様において、zsig33−サイトカイン融合タンパク質または抗体−サイトカイン融合タンパク質は、zsig33ポリペプチドまたは抗zsig33抗体が標的臓器（例えば、胃、腎臓、空腸、十二指腸、膵臓、小腸、および肺）からの過剰増殖組織を標的とするなら、これらの臓器のin vivo死滅を増強するのに使用することができる（一般的には、Hornickら、Blood 89:4437-47, 1997を参照されたい）。Hornickらは、所望の作用部位へのサイトカインのターゲティングを可能にし、こうしてサイトカインの局所的濃度上昇を与える融合タンパク質を記載した。適当なzsig33ポリペプチドまたは抗zsig33抗体は、好ましくない細胞または組織（すなわち、腫瘍または白血病）を標的とし、融合したサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。この目的に適したサイトカインには、例えばインターロイキン−2および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）がある。
【０１０１】
さらに別の実施態様において、zsig33ポリペプチドまたは抗zsig33抗体が血管細胞または組織を標的とするなら、そのようなポリペプチドまたは抗体を放射性核種（特にベータ放射性核種）に結合させて、再狭窄を減少させることができる。そのような治療的アプローチは、放射線療法を行う臨床家に対する危険が小さくなる。
【０１０２】
本明細書に記載の生物活性ポリペプチドまたは抗体結合体は、静脈内、動脈内または管内に投与できるか、または目的の作用部位に局所的に導入してもよい。
【０１０３】
本発明のzsig33ポリペプチド（完全長ポリペプチド、その生物活性断片および融合ポリペプチドを含む）は、従来法に従って遺伝子操作された宿主細胞中で産生することができる。適当な宿主細胞は、外因性DNAで形質転換またはトランスフェクトされ、培養して増殖することができるものであり、細菌、真菌細胞、および培養した高等真核細胞がある。真核細胞（特に多細胞生物の培養細胞）が好ましい。クローン化DNA分子を操作し外因性DNAを種々の宿主細胞中に導入する方法は、Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州、1989；Ausubelら編、「分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons Inc.）、ニューヨーク州、1987に開示されている。
【０１０４】
一般にzsig33またはGHS-RポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内のその発現のための他の遺伝子要素（一般的には転写プロモーターとターミネーターを含む）に機能できる形で結合している。このベクターはまた一般に、1つ以上の選択マーカーおよび1つ以上の複製開始点を含むが、ある系において選択マーカーは別のベクター上で提供され、外因性DNAの複製は宿主細胞ゲノムへの組み込みにより行われることを当業者は認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他の要素の選択は、当業者の日常的技術レベル内である。そのような要素の多くは文献に記載され、販売業者から入手できる。
【０１０５】
zsig33またはGHS-Rポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、発現ベクター中に分泌シグナル配列（またリーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている）が提供される。分泌シグナル配列はzsig33、GHS-Rのものでもよく、または他の分泌タンパク質（例えば、t-PA）から得られるか、新規合成されてもよい。分泌シグナル配列はzsig33またはGHS-R DNA配列に機能できる形で結合し、すなわち分泌シグナル配列とzsig33（またはγGHS-R）配列は正しい読みとり枠で結合し配置されて、新たに合成したポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向ける。分泌シグナル配列は一般に、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の5'に位置するが、いくつかの分泌シグナル配列は、目的のDNA配列の別の場所に配置される（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照）。
【０１０６】
本発明のポリペプチドの未変性の分泌シグナル配列は、他のポリペプチドを分泌経路に向けるのに使用される。本発明はそのような融合ポリペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが作成され、ここでzsig33ポリペプチド（すなわち、配列番号2の残基1〜23）から得られる分泌シグナル配列は、当該分野で公知の本明細書に開示の方法を使用して、他のポリペプチドに機能できる形で結合される。本発明の融合ポリペプチドに含有される分泌シグナル配列は好ましくは、追加のペプチドを分泌経路へ導くために、追加のペプチドのアミノ末端に融合される。そのような構築体は、当該分野で公知の多くの用途がある。例えばこれらの新規分泌シグナル配列融合構築体は、正常の非分泌タンパク質の活性成分の分泌を指令することができる。そのような融合体は、分泌経路にペプチドを導くためにin vivoまたはin vitroで使用される。
【０１０７】
同様にGHS-Rのa-らせん膜貫通スパニングドメインは、異種配列により置換することができ、他のGタンパク質結合受容体からの、または例えばbアドレナリン作用性受容体ファミリーのメンバーからの異なるa-らせん膜貫通ドメインを提供する。
【０１０８】
培養哺乳動物細胞は本発明に適した宿主である。哺乳動物細胞に外因性DNAを導入する方法には、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（Wiglerら、Cell 14:725, 1978；CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981；GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973）、電気穿孔法（Neumannら、EMBO. J. 1:841-5, 1982）、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション（Ausubelら、同上）、およびリポソーム介在トランスフェクション（Hawley-Nelsonら、Focus 15:73, 1993；Ciccaronら、Focus 15:80, 1993）、およびウイルスベクター（MillerとRosman, Bio/Techniques 7:980-90, 1989；WangとFiner, Nature Med. 2:714-6, 1996）がある。培養哺乳動物細胞中の組換えポリペプチドの産生は、例えばLevinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；およびRingold, 米国特許第4,656,134号に開示されている。適当な培養哺乳動物細胞にはCOS-1（ATCC No. CRL 1650）、COS-7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 1632）、BHK570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATCC No. CRL 1573；Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）、およびチャイニーズハムスター卵巣（例えばCHO-K1；ATCC No. CRL 61）細胞株がある。追加の適当な細胞株は当該分野で公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ロックビル、メリーランド州）のような公的菌株保存機関から入手できる。一般に強い転写プロモーター（例えばSV-40またはサイトメガロウイルスからのプロモーター）が好適である。例えば米国特許第4,956,288号を参照されたい。他の適当なプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第4,579,821号および4,601,978号）からのプロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーターがある。
【０１０９】
薬剤選択は一般に、外来DNAが挿入されている培養哺乳動物細胞を選択するのに使用される。そのような細胞は一般に「トランスフェクション体」と呼ばれる。選択物質の存在下で培養して目的の遺伝子をその子孫に渡すことができる細胞は、「安定なトランスフェクション体」と呼ばれる。好適な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型の薬剤（例えばG-418など）の存在下で行われる。選択系はまた、目的の遺伝子の発現レベルの上昇させる（「増幅」と呼ぶプロセス）ために使用することができる。増幅は、低レベルの選択物質の存在下でトランスフェクション体を培養し、次に選択物質の量を増加させて、導入した遺伝子の高レベルの生成物を産生する細胞について選択することにより行われる。好適な増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素であり、これはメソトレキセートに対する耐性を与える。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる。改変表現型を導入する代替マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）または細胞表面タンパク質（例えばCD4、CD8、クラスI MHC、または胎盤アルカリホスファターゼ）を使用して、FACS分類または磁性ビーズ分離技術のような手段により、トランスフェクト細胞を非トランスフェクト細胞から分類してもよい。
【０１１０】
他の高等真核細胞もまた宿主として使用でき、植物細胞、昆虫細胞および鳥類細胞がある。植物細胞中で遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarら、J. Biosci. （Bangalore）11:47-58, 1987、による総説がある。昆虫細胞の形質転換とそこでの外来ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号およびWIPO公報 WO94/06463により開示されている。昆虫細胞は、一般的にはオートグラファ・カリホルニカ核ポリヘドロシスウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）（AcNPV）から得られる組換えバキュロウイルスで感染させることができる。King, L.A.とPossee, R.D., 「バキュロウイルス発現系：実験室ガイド（The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide）」、ロンドン、チャップマン・アンド・ホール（Chapman & Hall）；O'Reilly, D.R.ら、「芽球発現ベクター：実験室マニュアル（Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク、オックスフォード大学プレス、1994；およびRichardson, C.D.編、「バキュロウイルス発現プロトコール、分子生物学の方法（Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology）」、トトワ（Totowa）、ニュージャージー州、ヒュマーナプレス（Humana Press）、1995を参照されたい。組換えzsig33バキュロウイルスを作成する第2の方法は、Luckowにより記載されたトランスポゾンベースのシステムを利用する（Luckow, V.A.ら、J. Virol. 67:4566-79, 1993）。移動ベクターを利用するこのシステムは、Bac-to-Bac（登録商標）キット（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ロックビル、メリーランド州）で販売されている。このシステムは、Tn7トランスポゾンを含有する移動ベクターpFastBac1（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を利用して、zsig33ポリペプチドをコードするDNAを、「バクミド（bacmid）」と呼ぶ大きなプラスミドとして大腸菌（E. coli）中で維持されるバキュロウイルスゲノム中に移動させる。pFastBac1（登録商標）移動ベクターは、AcNPVポリヘドリンプロモーターを利用して、目的の遺伝子（この場合zsig33またはGHS-R）の発現を指令する。しかしpFastBac1（登録商標）は、かなりの程度まで修飾することができる。ポリヘドリンプロモーターは除去でき、バキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター（Pcor、p6.9またはMPプロモーターとしても知られている）（これは先にバキュロウイルス感染で発現される）で置換でき、分泌タンパク質を発現するのに有用であることが証明されている。Hill-Perkins, M.S.およびPossee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990；Bonning, B.C.ら、J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994；およびChazenbalk, G.D., およびRapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995を参照されたい。そのような移動ベクター構築体において、塩基性タンパク質プロモーターの短いかまたは長いものを使用することができる。さらに、未変性のzsig33分泌シグナル配列を、昆虫タンパク質由来の分泌シグナル配列で置換した移動ベクターを構築することができる。例えば、未変性のzsig33分泌シグナル配列を置換するために、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（TGT）、ミツバチメリチン（インビトロゲン（Invitrogen）、カールスバド（Carlsbad）、カリホルニア州）、またはバキュロウイルスgp67（ファーミンゲン（PharMingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）からの分泌シグナ��配列を、構築体中で使用することができる。さらに移動ベクターは、発現されたzsig33ポリペプチドのC末端またはN末端にエピトープタグ（例えばGlu-Gluエピトープタグ）をコードするDNAとのフレーム内融合を含有することができる（Grussenmeyer, T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985）。当該分野で公知の鋳型を使用して、zsig33を含有する移動ベクターは大腸菌（E. coli）中に形質転換され、組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドDNAは、一般的方法を使用して単離され、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（例えばSf9細胞）をトランスフェクトするのに使用される。次にzsig33を発現する組換えウイルスが産生される。当該分野で公知の方法により、組換えウイルスストックが作成される。
【０１１１】
組換えウイルスは、宿主細胞、典型的にはヤガの一種であるスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から得られる細胞株を感染するのに使用される。一般的には、GlickとPasternak, 「分子バイオテクノロジー：組換えDNAの原理と応用（Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA）」（エーエスエムプレス（ASM Press）、ワシントンDC、1994）を参照されたい。他の適当な細胞株は、トリコプルシア・ニー（Trichoplusia ni）から得られるハイファイブオー（HighFiveO）（登録商標）細胞株（インビトロゲン（Invitrogen））である（米国特許第5,300,435号）。細胞を増殖させ維持するのに、市販の無血清培地が使用される。適当な培地は、Sf9細胞用にSf900II（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））またはESF921（登録商標）（エクプレションシステムズ（Expression Systems））、およびティー・ニー（T. ni）細胞用にEx-cellO405（登録商標）（ジェイアールエィチバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）、レネクサ（Lenexa）、カンザス州）またはExpressFive（登録商標）（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））である。細胞を接種密度約2〜5×105細胞から密度1〜2×106細胞まで増殖させ、ここで組換えウイルスストックを感染多重度（MOI）0.1〜10、典型的にはほぼ3で加える。操作法は一般的には実験室マニュアルに記載されている（King, L.A.とPossee, R.D., 同上；O'Reilly, D.R.ら、同上；Richardson, C.D., 同上）。上清からのzsig33ポリペプチドの以後の精製は、本明細書に記載の方法を使用して行われる。
【０１１２】
真菌細胞（酵母細胞を含む）もまた本発明で使用することができる。この点で関係する酵母種には、サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）がある。エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）細胞を外因性DNAで形質転換させ、そこから組換えポリペプチドを産生する方法は、例えばKawasakiら、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；およびMurrayら、米国特許第4,845,075号に開示されている。形質転換された細胞は、選択マーカー、一般的には薬剤耐性または特定の栄養物質（例えばロイシン）の非存在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）で使用するための好適なベクター系は、Kawasakiら（米国特許第4,931,373号）により開示されたPOT1ベクター系であり、これは形質転換された細胞をグルコース含有培地中での増殖により選択することを可能にする。酵母で使用するための適当なプロモーターとターミネーターには、解糖系酵素遺伝子(例えば、Kawasakiら、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照）、およびアルコール脱水素酵素遺伝子がある。米国特許第4,990,446号；5,063,154号；5,139,936号、および4,661,454号も参照されたい。他の酵母、ハンゼヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・ギリエルモンディイ（Pichia guillermondii）およびカンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）を含む他の酵母の形質転換系も、当該分野で公知である。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986、およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス（Aspergillus）細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従って使用される。アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号に開示されている。ノイロスポラ（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。組換えタンパク質産生のための宿主としてのピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）の使用は、米国特許第5,716,808号、5,736,383号、5,854,039号、および5,888,768号に開示されている。
【０１１３】
細菌である大腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）、および他の属の株を含む原核宿主細胞もまた、本発明において有用である。これらの宿主を形質転換し、そこでクローン化された外来DNA配列を発現する方法は、当該分野で公知である（例えば、Sambrookら、同上を参照）。大腸菌（E. coli ）のような細菌中でzsig33またはGHS-Rポリペプチドを発現する時、ポリペプチドは細胞質（典型的には不溶性顆粒として）中に保持されるか、または細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収され、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を使用して変性される。次に変性ポリペプチドは、変性剤を希釈、例えば尿素と還元および酸化グルタミン酸の組合せとの溶液に対して透析し、次に緩衝化食塩水で透析して、再折り畳みしダイマー化させる。後者の場合、細胞を破砕（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）して細胞周辺腔の内容物を放出させ、タンパク質を回収して、変性と再折り畳みの必要性を無くすことで、ポリペプチドを細胞周辺腔から可溶性の機能性型で回収することができる。
【０１１４】
形質転換またはトランスフェクトした細胞は、選択された宿主細胞の増殖に必要な栄養物質や他の成分を含有する培地中で、従来法に従って培養される。当該分野で種々の適当な培地（規定培地および複合培地を含む）が公知であり、一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地はまた、必要に応じて増殖因子または血清のような他の成分を含有してもよい。増殖培地は一般に、例えば発現ベクター上にあるかまたは宿主細胞中に同時トランスフェクトされる選択マーカーにより補足される薬剤選択または必須栄養物質の欠損により、外因性に加えたDNAを含有する細胞について選択する。ピー・メタノリカ（P. methanolica）細胞は、充分な炭素源、窒素源および微量栄養物質を含む培地中で、約25℃〜35℃の温度で培養される。液体培養物は、例えば小フラスコの振盪または発酵槽のスパージングのような従来法により、充分通気される。ピー・メタノリカ（P. methanolica）の好適な培地はYEPD［2％D-グルコース、2％バクト（登録商標）ペプトン（ディフコラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロイト、ミシガン州）、1％バクト（登録商標）酵母エキス（ディフコラボラトリーズ（Difco Laboratories））、0.04％アデニンおよび0.006％L-ロイシン］である。
【０１１５】
本発明のある態様においてGHS-R受容体（膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含む）は培養細胞により産生され、この細胞を使用して、zsig33リガンドの変種（天然のリガンド、および天然のリガンドのアゴニストやアンタゴニストを含む）がスクリーニングされる。このアプローチを要約すると、受容体をコードするcDNAまたは遺伝子は、その発現に必要な他の遺伝的要素（例えば、転写プロモーター）と組合わされ、生じる発現ベクターが宿主細胞に挿入される。DNAを発現し機能性受容体を産生する細胞が選択され、種々のスクリーニング系で使用される。
【０１１６】
一般に同じ種からの宿主細胞と受容体が使用される。しかし細胞株は、任意の種から複数の受容体サブユニットを発現するように操作され、こうして種特異性から来る制限の可能性を克服している。別の方法では、ヒト受容体cDNAの種同族体がクローン化され、同じ種からの細胞株（例えばBaF3細胞株中のマウスcDNA）で使用される。こうして1つの造血増殖因子（例えばIL-3）に依存する細胞株は操作されて、zsig33リガンドに依存するようになる。
【０１１７】
機能性GHS-Rを発現する細胞は、スクリーニング測定法で使用される。種々の適当な測定法が当該分野で公知である。これらの測定法は、標的細胞中の生物学的応答の検出に基づく。そのような測定法の1つは、細胞増殖アッセイである。細胞は試験化合物の存在下または非存在下で培養され、細胞増殖は、例えばトリチウム化チミジンの取り込みを測定することにより、またはアリマーブルー（Alymar Blue）（登録商標）（アクメド（AccuMed）、シカゴ、イリノイ州）または3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）（Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983）の代謝的分解に基づく比色法により検出される。代替測定法もまた本明細書に列挙される。
【０１１８】
他の測定法はホスホリパーゼCシグナル伝達を利用して、受容体結合を測定する。この種類の測定法の例は、エクオリン（aequorin）（生物発光Ca2+感受性レポータータンパク質）を用いるCa2+の放出を測定する。この測定法はさらに、Feighner, S.D.ら（前述）により記載されている。従ってzsig33ペプチドは、ホスホリパーゼCシグナル伝達を測定する測定法を使用して試験することができる。
【０１１９】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。天然に存在しないアミノ酸には、特に限定されないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンがある。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に取り込むためのいくつかの方法が当該分野で公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス変異が抑制されているin vitro系を使用することができる、アミノ酸およびアミノアシル化tRNAを合成する方法は、当該分野で公知である。ナンセンス変異を含有するプラスミドの転写と翻訳は、大腸菌（E. coli）S30抽出物、市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。例えばRobertsonら、J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellmanら、Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chungら、Science 259:806-9, 1993；およびChungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993 を参照されたい。第2の方法では翻訳は、変異mRNAと化学アミノアシル化サプレッサーtRNAの微量注入法によりアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中で行われる（Turcattiら、J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996）。第3の方法では大腸菌（E. coli）細胞は、置換すべき天然のアミノ酸（例えばフェニルアラニン）の非存在下で、かつ所望の天然に存在しないアミノ酸（例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。天然に存在しないアミノ酸は、天然のものの代わりにタンパク質中に取り込まれる。Koideら、Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、in vitro化学修飾により天然に存在しないものに変換される。化学修飾を部位特異的突然変異誘発と組合せて、置換の範囲をさらに拡張することができる（WynnとRichards, Protein Sci. 2:395-403, 1993）。
【０１２０】
限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、および非天然のアミノ酸を、zsig33またはGHS-Rアミノ酸残基の代わりに使用してもよい。
【０１２１】
本発明のポリペプチドを、≧80％の純度、さらに好ましくは≧90％の純度、さらに好ましくは≧95％の純度まで精製することが好ましく、特に汚染巨大分子（特に他のタンパク質および核酸）に関してかつ他の感染性物質および発熱物質の無い、薬剤学的に純粋な状態（すなわち99.9％の純度）であることが好ましい。好ましくは精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１２２】
発現された組換えzsig33およびGHS-Rタンパク質（キメラポリペプチドおよびマルチマータンパク質を含む）は、従来のタンパク質精製法（典型的にはクロマトグラフィー法の組合せ）により精製される。一般的には、「親和性クロマトグラフィー：原理と方法（Affinity Chromatography: Principles & Methods）」、ファルマシアエルケービーバイオテクノロジー（Pharmacia LKB Biotechnology）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン、1988；およびScopes, 「タンパク質精製：原理と実際（Protein Purification: Principles and Practice）」、スプリンガー−フェアラーク（Springer-Verlag）、ニューヨーク、1994を参照されたい。ポリヒスチジン親和性タグ（典型的には約6ヒスチジン残基）を含むタンパク質は、ニッケルキレート樹脂上で親和性クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Houchuliら、Bio/Technol. 6:1321-1325, 1988を参照されたい。glu-gluタグを含むタンパク質は、従来法に従って免疫親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、Grussenmeyerら（同上）を参照されたい。マルトース結合タンパク質融合体は、当該分野で公知の方法に従ってアミロースカラム上で精製される。
【０１２３】
本発明のポリペプチドは、特に限定されないが、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを含む方法の組合せにより単離することができる。例えば固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーを使用して、ヒスチジンリッチなタンパク質（ポリヒスチジンタグを有するものを含む）を精製することができる。簡単に説明すると、まずゲルに2価金属イオンを加えてキレートを形成させる（Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985）。ヒスチジンリッチなタンパク質を、使用される金属イオンにより異なる親和性でこのマトリックスに吸着させ、競合的溶出によりpHを低下させるか、または強いキレート剤を使用して溶出させる。他の精製法には、レクチン親和性クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製がある（Methods in Enzymol., Vol.182、「タンパク質精製のガイド（Guide to Protein Purification）」、M. Deutscher（編）、アカデミックプレス（Acad. Press）、サンジエゴ、1990, 529-39頁）。本発明のさらなる実施態様において、目的のポリペプチドと親和性タグの融合体（例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）を構築して精製を促進してもよい。
【０１２４】
zsig33およびGHS-Rポリペプチドはまた、当該分野で公知の方法に従う化学合成（専用の固相合成、部分固相法、断片縮合を含む）または古典的液相合成により調製することができる。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963；Stewartら、「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）」（第2版）、ピアスケミカル社（Pierce Chemical Co.）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ州、1984；BayerとRapp、Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986；およびAthertonら、「固相ペプチド合成：実際的アプローチ（Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach）」、アイアールエルプレス（IRL Press）、オックスフォード、1989を参照されたい。in vitro合成は、より小さいポリペプチドの調製に特に有効である。
【０１２５】
当該分野で公知の方法を使用して、zsig33およびGHS-Rタンパク質はモノマーまたはマルチマー；グリコシル化または非グリコシル化；ペギル化または非ペギル化物として調製することができ、初期のメチオニンアミノ酸残基を含有しなくてもよい。
【０１２６】
zsig33ポリペプチドへのGHS-Rポリペプチドの結合は、例えば細胞−細胞相互作用、リガンド−受容体結合、および消化管-ホルモンファミリーメンバーに関連する他の生物学的機能を測定する種々の測定法を使用して測定することができる。特に関係するのは、胃収縮性、成長ホルモンの調節、体重維持、およびグルコース吸収の変化である。リガンド結合と胃収縮性を測定する測定法は当該分野で公知であり、さらに本明細書の例で説明される。成長ホルモン分泌、受容体結合、および体重を測定するさらなる測定法は、Hansen, B.S.ら、Eur. J. Endocrinol. 141:180-189, 1999に記載されている。
【０１２７】
本発明のタンパク質（代替スプライシングから生じるペプチドを含む）は、単独で作用しているか、または一般に胃、十二指腸、空腸、腎臓、小腸、骨格筋、肺、下垂体、視床下部、海馬、および中枢神経系のような組織中の他の分子（増殖因子、サイトカインなど）と一緒に作用して、胃収縮性の調節、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモン分泌の調節、消化酵素およびホルモンの分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモンの分泌の調節、および胃逆流に有用である。zsig33 mRNAの代替スプライシングは、細胞タイプ特異的でもよく、特異的組織に活性を与える。
【０１２８】
関係する他の測定法は、筋肉細胞の増殖、分化、成長および／または電気的結合の変化を測定または検出する。さらに、繊維芽細胞、筋芽細胞、神経細胞、白血球、免疫細胞、および腫瘍細胞の細胞−細胞相互作用に対するzsig33ポリペプチドの作用の測定が関係するであろう。さらに他の測定法は、収縮性、およびホルモンや酵素の分泌の変化を調べる。
【０１２９】
組織の収縮性に対するzsig33ポリペプチド、そのアンタゴニストおよびアゴニストの作用は、張力計を使用して電界刺激有りまたは無しでin vitroで測定することができる。そのような測定法は当該分野で公知であり、組織試料（例えば、消化管および他の収縮性組織試料）に応用することができ、zsig33ポリペプチド、そのアゴニストおよびアンタゴニストが収縮性を増強するかまたは抑制するかを測定するのに使用することができる。従って本発明の分子は、収縮性組織に関連する機能不全を治療するのに有用であるか、またはin vivoで収縮性を抑制または増強するのに使用することができる。従って本発明の分子は、消化管および増殖関連疾患を治療するのに有用である。
【０１３０】
消化管組織を含む組織の収縮性に対する本発明のzsig33ポリペプチド、アンタゴニストおよびアゴニストの作用は、例えば組織中の収縮性および緩和を測定する張力計で測定することができる。Daintyら、J. Pharmacol. 100:767, 1990；Rheeら、Neurotox. 16:179, 1995；Anderson, M.B., Endocrinol. 114:364-368, 1984；およびDowning, S.J.とSherwood, O.D. Endocrinol. 116:1206-1214, 1985を参照されたい。例えば大動脈輪の血管拡張の測定は当該分野で公知である。簡単に説明すると、4ヶ月齢のスプラーグドーレイ（Sprague Dawley）ラットから大動脈輪を取り、改変クレブス液（118.5mM NaCl、4.6mM KCl、1.2mM MgSO4.7H2O、1.2mM KH2PO4、2.5mM CaCl2.2H2O、24.8mM NaHCO3および10mM グルコース）のような緩衝液中に入れる。この方法は他の動物（例えばウサギ、他のラット株、モルモットなど）でも使用できることを、当業者は認識するであろう。次にこの輪をイソメトリックフォーストランスデューサ（isometric force transducer）（ラドノチインク（Radnoti Inc.）、モンロビア（Monrovia）、カリホルニア州）に取り付け、ポネマフィジオロジープラットフォーム（Ponemah physiology platform）（ゴールドインストルメントシステムズインク（Gould Instrument systems, Inc.）、バレービュー（Valley View）、オハイオ州）でデータを記録し、緩衝液を含有する酸素添加（95％ O2、5％ CO2）組織浴に入れる。組織を1ｇの休止張力に調整し、約1時間安定化させた後試験する。輪の完全性をノルエピネフリン（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）とカルバコール（Carbachol）（ムスカリン性アセチルコリン受容体）（シグマ社（Sigma Co.））を用いて試験する。完全性をチェック後、輪を新鮮な緩衝液で3回洗浄し、約1時間休止させる。大動脈輪組織の血管拡張または緩和について試料を試験するために、輪を2グラムの張力に収縮させ、15分間安定させる。次にzsig33ポリペプチドを、あふれさせないように4つの浴の1、2または3に加え、輪の張力を記録し、緩衝液のみを含有する対照輪と比較する。zsig33ポリペプチド添加の前または後に、抗体を加え、zsig33ポリペプチド、そのアゴニストおよびアンタゴニストによる収縮性の増強または緩和を直接測定する。この方法は、消化管組織のような他の収縮性組織に応用することができる。
【０１３１】
本発明の分子の活性は、例えば胃収縮性の刺激、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモンの分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモンの分泌の調節を測定する種々の測定法を使用して測定することができる。特に関係するのは、平滑筋細胞の収縮性の変化である。例えば哺乳動物の十二指腸または他の消化管の平滑筋組織のセグメントの収縮性応答（Depoortereら、J. Gastrointestinal Motility 1:150-159, 1989）。in vivo測定法の例は、超音波測微計を使用して交連間を放射状に、および弁ベースの平面に対して縦に測定する（Hansenら、Society of Thoracic Surgeons 60:S384-390, 1995）。
【０１３２】
胃運動性は一般に、胃内容排出に必要な時間、次に消化管中の移動時間に応じて臨床の場で測定される。胃内容排出スキャンは当業者に公知であり、簡単に説明すると、経口造影剤（例えばバリウム、または放射能標識食）を使用する。固体と液体が別に測定される。試験食物または液体はアイソトープ（例えば99mTc）で標識され、摂取または投与後、消化管中および胃内容排出の経過時間がガンマカメラを使用して視覚的に測定される（Meyerら、Am. J. Dig. Dis. 21:296, 1976；Collinsら、Gut 24:1117, 1983；Maughanら、Diabet. Med. 13 9 Supp. 5:S6-10, 1996、およびHorowitzら、Arch. Intern. Med. 145:1467-1472, 1985）。これらの試験は、薬剤の効力を定量するための運動性促進物質の投与前および後に行ってもよい。
【０１３３】
増殖は、培養細胞を使用して、または本発明の分子を適当な動物モデルに投与してin vivoで測定することができる。一般に増殖作用は、細胞数の増加として観察され、従ってアポトーシスの阻害ならびに有糸分裂誘発を含む。培養細胞には、下垂体、視床下部、海馬、ならびに消化管、腎臓、胃、十二指腸および空腸から得られる細胞がある。当業者は、例えばzsig33へのGHS-Rの結合の効果を研究するのに有用なATCC（マナサス（Manasas）、ヴァージニア州）からの細胞株を同定することができるであろう。細胞増殖の測定法は当該分野で公知である。例えば増殖を測定する測定法には、ニュートラルレッド色素に対する化学感受性（Cavanaughら、Investigational New Drugs 8:347-354, 1990）、放射能標識ヌクレオチドの取り込み（Cookら、Analytical Biochem. 179:1-7, 1989）、増殖細胞のDNA中の5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込み（Porstmannら、J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985）、およびテトラゾリウム塩の使用（Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983；Alleyら、Cancer Res. 48:589-601, 1988；Marshallら、Growth Reg. 5:69-84, 1995；およびScudieroら、Cancer Res. 48:4827-4833, 1988）のような測定法がある。
【０１３４】
zsig33が化学誘引物質かどうかを決定するために、zsig33を皮内または腹腔内注入により投与することができる。注入部位に蓄積する白血球の性状解析は、系統特異的細胞表面マーカー、および蛍光免疫サイトメトリーまたは免疫組織化学により測定することができる（Jose, J. Exp. Med. 179:881-87, 1994）。骨髄から末梢血への特異的白血球細胞集団の放出は、zsig33注入後に測定することができる。
【０１３５】
終末分化または脱分化への経路に沿って特異的な細胞タイプを刺激する因子が、共通の前駆体または幹細胞に由来する全細胞集団に影響を与えることを示唆する証拠がある。すなわちzsig33ポリペプチドは、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋および膵臓の内分泌および外分泌細胞の阻害または増殖を刺激することがある。
【０１３６】
本発明の分子は、消化管／上皮細胞の増殖または分化を刺激しながら、共通の前駆体／幹細胞へのその作用により、神経細胞の増殖または分化を阻害する。本発明の新規ポリペプチドは、神経および上皮幹細胞、および胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓前駆細胞を、in vivoとex vivoの両方で研究するのに有用である。
【０１３７】
分化を測定する方法は、例えば組織、酵素活性、機能活性または形態変化の段階特異的発現に関連する細胞表面マーカーを測定する（Watt, FASEB, 5:281-284, 1991；Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994；Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989）。
【０１３８】
本発明のzsig33ポリペプチドは、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓の増殖または分化を研究するのに使用することができる。本発明のかかる方法は一般に、これらの組織からの細胞をzsig33ポリペプチド、そのモノクローナル抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの存在下および非存在下でインキュベートし、細胞増殖または分化の変化を観察する。これらの組織からの細胞株は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（マナサス（Manasas）、ヴァージニア州）から市販されている。
【０１３９】
本発明のタンパク質（代替スプライシングから生じるペプチドを含む）および断片は、胃収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモンの分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモンの分泌の調節を研究するのに有用である。zsig33分子、変種、および断片は、単独で、または胃、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓中の他の分子（増殖因子、サイトカインなど）と一緒に適用することができる。
【０１４０】
成長ホルモンの用途可能性は広範であり、骨形成に関連する疾患と症状（例えば、骨粗鬆症の治療、骨形成と修復の加速、骨芽細胞、骨リモデリングと軟骨増殖の刺激、および骨格形成異常）；免疫（例えば、免疫系の刺激、免疫抑制患者の治療）；肥満、および代謝障害（例えば、糖質コルチコイドの異化性副作用の予防、肥満および肥満が引き起こす発育遅延の治療、術後のタンパク質異化性応答の緩和、癌またはAIDSのような慢性疾患による悪液質とタンパク質喪失）；小人症（例えば、成長ホルモン欠損と慢性疾患を含む発育遅延と生理学的短伸長、および子宮内発育遅延の治療）；創傷治癒（例えば、創傷治癒の加速；火傷患者の快復の加速、および創傷治癒遅延患者の治療）；生殖（例えば、排卵誘発のアジュバント治療）；ならびにストレスが引き起こす症状；腎臓および肺機能不全が引き起こす症状；加齢と高齢が引き起こす症状（筋力、骨脆弱性および皮膚の厚さを含む）；および神経内分泌活性（例えば睡眠）の治療がある。すなわち成長ホルモン分泌促進物質（zsig33ポリペプチドと抗体アンタゴニストを含む）は、これらの障害が引き起こす症状を治療するのに有用であろう。成長ホルモンの放出を測定する測定法は、当該分野で公知である。
【０１４１】
消化管機能と脳機能との関連が、このクラスの他のホルモンについて観察されている。例えば自閉症児へのセクレチン注入は、消化管症状の緩和ならびに行動の劇的な改善を引き起こした（アイコンタクトの改善、注意力、および感情表現用語の拡大）。Hovrath, K.ら、J. Assoc. Acad. Minor Phys 9(1):9-15, 1998を参照されたい。同様に消化管症状を有する自閉症児の上部消化管の研究は、非自閉症児と比較して、多くが逆流性食道炎、慢性胃炎、および慢性十二指腸炎、ならびに十二指腸陰窩中のパネート細胞数の増加を有することを証明した。Horvath, K.ら、J. Pediatr. 135(5):559-563, 1999を参照されたい。これらの自閉症児へのセクレチン投与により、膵胆管液産生と液体産生の増加を引き起こした。胃腸障害、特に逆流性食道炎と二糖吸収不全は、非言語的自閉症患者の行動の問題に寄与する。セクレチン注入後に観察された膵胆管液分泌の増加は、セクレチン受容体のアップレギュレーションを示唆する。消化管-ホルモンファミリーのタンパク質のメンバーとして、zsig33はその抗体または受容体に結合することにより、神経成長および／または利用に影響を与えるかも知れない。
【０１４２】
本発明のタンパク質は、特に限定されないが、プロテアーゼ、放射性核種、化学療法剤、および小分子のような治療薬の投与に適している。これらの治療薬の作用は、培養細胞を使用してin vitroで、組織切片を用いてex vivoで、または本発明の分子を適切な動物モデルに投与することによりin vivoで測定することができる。本発明のタンパク質を測定するための別のin vivoアプローチは、ウイルス供給系がある。この目的のウイルスの例には、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）がある。アデノウイルス（2本鎖DNAウイルス）は、異種核酸の供給のための現在最もよく研究されている遺伝子移動ベクターである（総説については、T.C. Beckerら、Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994；およびJ.T. DouglasとD.T. Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997を参照されたい）。アデノウイルス系は、いくつかの利点を有する：アデノウイルスは、(1)比較的多量のDNA挿入体を収容する；(ii)高力価まで増殖する；(iii)広範囲のタイプの哺乳動物細胞に感染する；および(iv)異なるプロモーターを含む多くの入手できるベクターで用いることができる。またアデノウイルスは血流中で安定なため、静脈内注射により投与することができる。
【０１４３】
アデノウイルスゲノムの部分を欠失させることにより、異種DNAのより大きな挿入体(7kbまで）を収容することができる。これらの挿入体は、直接結合または同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同的組換えによりウイルスDNA中に取り込むことができる。ある系の例では、ウイルスベクターから必須のE1遺伝子が欠失され、E1遺伝子が宿主細胞により提供されないならウイルスは複製しない（ヒト293細胞株は一例である）。無傷の動物に静脈内投与されると、アデノウイルスは主に肝臓を標的とする。アデノウイルス供給系がE1遺伝子欠失を有するなら、ウイルスは宿主細胞中で複製できない。しかし宿主の組織（例えば肝臓）は異種タンパク質を発現し処理（および、もし分泌シグナル配列が存在するなら、分泌）する。分泌されたタンパク質は、高度に血管化した肝臓中で循環流中に入り、感染された動物への作用を測定することができる。
【０１４４】
さらに、ベクターに対する免疫応答を低下させるかまたは排除するために、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルスベクターを使用することができる。そのようなアデノウイルスはE1が欠失し、さらにE2AまたはE4の欠失を含有する（Lusky, M.ら、J. Virol. 72:2022-2032, 1998；Raper, S.E.ら、Human Gene Therapy 9:671-679, 1998）。さらに、E2bの欠失は免疫応答を低下させると報告されている（Amalfitano, A.ら、J. Virol. 72:926-933, 1998）。さらに全アデノウイルスゲノムを欠失させることにより、異種DNAの非常に大きな挿入体が収容される。すべてのウイルス遺伝子が欠失したいわゆる「やる気のない（gutless）」アデノウイルスの作成は、異種DNAの大きな挿入体の挿入に特に有効である。総説については、Yeh, P.とPerricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997を参照されたい。
【０１４５】
アデノウイルス系はまた、in vitroでのタンパク質産生のために使用することができる。細胞が急速に分裂しない条件下でアデノウイルス感染非293細胞を培養することにより、細胞は長期間タンパク質を産生することができる。例えばBHK細胞は細胞ファクトリー中でコンフルエンスまで増殖され、次に目的の分泌タンパク質をコードするアデノウイルスベクターに暴露される。次に細胞を無血清条件下で増殖させると、これは、感染細胞が顕著な細胞分裂無しで数週間生存することを可能にする。あるいは、アデノウイルスベクター感染293細胞は、接着細胞としてまたは比較的高密度で懸濁培養で増殖して、多量のタンパク質を産生することができる（Garnierら、Cytotechnol. 15:145-55, 1994）。いずれかのプロトコールにより、発現され分泌された異種タンパク質は、細胞中の発現されたタンパク質の性質に依存して、細胞培養物上清、溶解物、または膜画分から繰り返し単離することができる。感染した293細胞産生プロトコールにおいて、非分泌タンパク質もまた有効に得られる。
【０１４６】
可溶性または細胞表面タンパク質として、zsig33およびGHS-Rポリペプチドの活性は、シリコンベースのバイオセンサーマイクロ生理機能計（これは、細胞表面タンパク質相互作用と以後の生理学的細胞応答に関連する細胞外酸性化速度またはプロトン排出を測定する）により測定することができる。装置の例は、モレキュラーデバイシーズ（Molecular Devices）（サニーデール、カリホルニア州）製のサイトセンサー（Cytosensor）（登録商標）マイクロ生理機能計である。細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症性応答、制御性および受容体活性化などの種々の細胞応答が、この方法で測定できる。例えばMcConnell, H.M.ら、Science 257:1906-1912, 1992；Pitchford, S.ら、Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997；Arimilli, S.ら、J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998；Van Liefde, I.ら、Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998を参照されたい。マイクロ生理機能計は、接着性または非接着性真核細胞または原核細胞を測定するのに使用することができる。細胞培地中の細胞外酸性化の変化を経時的に測定することにより、マイクロ生理機能計は、種々の刺激（zsig33タンパク質、そのアゴニストおよびアンタゴニストを含む）に対する細胞応答を直接測定する。好ましくはマイクロ生理機能計は、GHS-Rを発現しない対照真核細胞と比較して、その細胞表面にGHS-Rを発現する真核細胞の応答を測定するのに使用される。そのようなGHS-R発現細胞には、内因性GHS-Rポリヌクレオチドを発現する細胞、およびポリヌクレオチド配列またはGHS-Rポリヌクレオチド配列の一部を含有する断片もしくはキメラ(すなわち配列番号4または6）がトランスフェクトされている細胞がある。zsig33に暴露されない対照に対して、zsig33ポリペプチドに暴露された細胞の応答の変化により測定される差は、zsig33調節細胞応答の直接測定値である。さらに、そのようなzsig33調節応答は種々の刺激下で測定することができる。本発明は、zsig33タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法であって、zsig33ポリペプチドに応答性の細胞を提供し、試験化合物の非存在下で細胞の第1の部分を培養し、試験化合物の存在下で細胞の第2の部分を培養し、そして細胞の第1の部分と比較した細胞の第2の部分の細胞応答の変化を検出することを含む方法を提供する。細胞応答の変化は、細胞外酸性化速度の測定可能な変化として示される。さらにzsig33ポリペプチドの存在下でかつ試験化合物の非存在下で細胞の第3の部分を培養すると、zsig33刺激細胞の陽性対照と、試験化合物のアゴニスト活性をzsig33ポリペプチドの活性と比較するための対照とを提供する。zsig33のアンタゴニストは、試験化合物の存在下および非存在下で細胞をzsig33タンパク質に暴露することにより同定することができ、ここでzsig33刺激活性の低下は試験化合物中のアゴニスト活性を示す。
【０１４７】
さらにzsig33は、GHS-Rを発現する追加の細胞、組織もしくは細胞株、またはzsig33刺激経路に応答する他の細胞を同定するのに使用することができる。上記のマイクロ生理機能計は、本発明のzsig33に応答性の細胞を迅速に同定するのに使用することができる。細胞はzsig33ポリペプチドの存在下または非存在下で培養することができる。zsig33の存在下で細胞外酸性化の測定可能な変化を誘発する細胞は、zsig33に応答性である。そのような細胞株は、上記のzsig33の追加のアイソフォーム、zsig33ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを同定するのに使用することができる。同様にマイクロ生理機能計は、zsig33による活性化を維持するGHS-Rの変種を同定するのに本方法で使用することができる。
【０１４８】
本発明により提供される追加の測定法には、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用がある。これらのハイブリッドポリペプチドは2つの大きなクラスに分かれる。第1のクラスでは、配列番号5のほぼ残基327〜366を含むGHS-Rの細胞内ドメインが、第2の受容体のリガンド結合ドメインに結合される。第2の受容体がGタンパク質結合受容体（例えばモチリン受容体GPR38）であることが好ましい。ハイブリッド受容体はさらに、いずれかの受容体から得られる膜貫通ドメインを含む。次にハイブリッド受容体をコードするDNA構築体は宿主細胞に挿入される。ハイブリッド受容体を発現する細胞はモチリンの存在下で培養され、応答が測定される。この系は、容易に利用可能なリガンドを使用して、GHS-Rにより仲介されるシグナル伝達を分析する手段を提供する。この系はまた、特定の細胞株がGHS-Rにより伝達されるシグナルに応答できるかどうかを測定するのに使用することもできる。第2のクラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、GHS-Rの細胞外（リガンド結合）ドメイン（配列番号5のほぼ残基1〜326）を、第2の受容体（好ましくはGタンパク質結合受容体）の細胞質ドメイン、および膜貫通ドメインとともに含む。膜貫通ドメインはいずれかの受容体から得られる。この第2のクラスのハイブリッド受容体は、第2の受容体により伝達されるシグナルに応答可能であることが知られている細胞中で発現される。まとめてこれらの2つのクラスのハイブリッド受容体は、受容体ベースの測定系で広範囲の細胞タイプの使用を可能にする。
【０１４９】
測定法は、化学走化性、接着、イオンチャネル流入の変化、第2のメッセンジャーレベルの制御、および神経伝達物質放出を含む他の細胞応答を測定するのに使用することができる。そのような測定法は当該分野で公知である。例えば「基礎的臨床的内分泌学シリーズ（Basic & Clinica Endocrinology Ser.）」、第3巻、Cytochemical Bioassays: Techniques & Applications, Chayen; Chayen, Bitensky編、デッカー（Dekker）、ニューヨーク、1983を参照されたい。
【０１５０】
zsig33とGHS-R発現について観察された組織分泌（すなわち、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓）を考慮すると、zsig33のアゴニスト（未変性または合成ペプチドを含む）とアンタゴニストは、in vitroとin vivo応用の両方で大きな可能性を有する。zsig33アゴニストおよびアンタゴニストとして同定される化合物は、胃収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモン分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモン分泌の調節を、in vivoおよびin vivoで研究するのに有用である。例えばzsig33とアゴニスト化合物は規定細胞培地の化合物として有用であり、単独でまたは他のサイトカインやホルモンと一緒に使用されて、細胞培養で一般的に使用される血清を置換する。すなわちアゴニストは、培養物中のG細胞、腸クロム親和性細胞のような胃腸細胞、および胃、十二指腸、空腸の上皮粘膜、ならびに腎臓、肺、および膵臓細胞の増殖および／または成長を促進するのに特に有用である。さらにzsig33ポリペプチドおよびzsig33アゴニスト（小分子を含む）は、例えば胃、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓の拡張、分化、および／または細胞−細胞相互作用の研究試薬として有用である。zsig33ポリペプチドは、これらの細胞タイプの組織培養培地に加えられる。
【０１５１】
消化管-脳ペプチドのファミリーは、神経機能およびCNS機能に関連している。例えばNPY（脳と消化管の両方に受容体を有するペプチド）は、中枢神経系に投与すると食欲を刺激することが証明されている（Gehlert, Life Sciences 55(6):551-562, 1994）。脳の異なる領域、特に小脳および下垂体中で、モチリン免疫活性が同定されている（Gaspariniら、Hum. Genetics 94(6):671-674, 1994）。モチリンは、小脳中で神経伝達物質γ-アミノ酪酸と共存することがわかっている（Chan-Patay, Pro Sym. 50th Anniv. Meet. Br. Pharmalog. Soc.:1-24, 1982）。生理学的研究は、モチリンが摂食行動（Rosenfieldら、Phys. Behav. 39(6):735-736, 1987）、膀胱の制御、下垂体成長ホルモン放出に影響を与えるという証拠を示した。他の消化管-脳ペプチド（例えば、CCK、エンケファリン、VIPおよびセクレチン）は、消化器系で活性がある以外に、血圧、心拍、行動、および疼痛調節の制御に関与することが証明されている。従ってGHS-Rまたはその部分へのzsig33の結合は、何らかの神経的関連があると予測される。
【０１５２】
さらに消化管-脳ペプチドの他のメンバー（例えば、CCK、ガストリンなど）は、膵臓酵素およびホルモンの分泌を調節することが証明されている。膵臓中のGHS-Rの位置（Guan, X.M.ら、Mol. Brain Res. 48:23-29, 1997）は、GHS-Rへのzsig33ペプチドの結合が、膵臓酵素およびホルモンの分泌を調節するのに使用できることを示唆する。
【０１５３】
同様に消化管-脳ペプチドの他のメンバーは、内因性タンパク質の分泌を調節する（例えば、グルカゴンがインスリンの分泌を調節するように）ことが知られている。成長ホルモン分泌促進物質の1つの利点は一般に、正常のフィードバック機構を維持しながら、内因性拍動性の成長ホルモン分泌を増幅する能力である。他の重要な作用は、高齢者の血清インスリン様増殖因子-I（IGF-I）レベルを青年に近いレベルまで回復する能力である。Hansen（同上）を参照されたい。すなわちGHS-Rのリガンドとしてzsig33は、成長ホルモンとインスリン様増殖因子-Iの分泌を調節するのに有用となり得る。さらにzsig33ペプチドは、非zsig33タンパク質（例えば、GLP-1、ソマトスタチンなど）の分泌を調節するのに使用することができる。zsig33抗体特異的結合はまた、成長ホルモンの分泌を調節または阻害するのに使用することができる。
【０１５４】
本発明のアミノ酸とDNA配列の部位特異的変化を使用して、アンタゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストである類似体を作成することができる（Macielayら、Peptides: Chem. Struct. Biol. pp 659, 1996）。アンタゴニストは、胃腸運動亢進に関連する臨床症状（例えば、下痢およびクローン病）に有用である。アンタゴニストもまた、リガンド−受容体相互作用の部位を解析するための研究試薬として有用である。
【０１５５】
アンタゴニストはまた、相補体／抗相補体対のメンバー間の相互作用部位、ならびに細胞−細胞相互作用の部位を解析するための研究試薬として有用である。zsig33活性のインヒビター（zsig33アンタゴニスト）には、抗zsig33抗体、および可溶性zsig33ポリペプチド（例えば配列番号2）ならびに他のペプチド性および非ペプチド性物質（リボザイムを含む）がある。
【０１５６】
治療用途には、一般に中和抗体を使用することが好ましい。本明細書において用語「中和抗体」は、抗体を1000倍モル過剰で加えた時、同種の抗原の生物活性を少なくとも50％阻害する抗体を意味する。より大きな中和活性が好ましいことがあり、100倍または10倍モル過剰で50％阻害を与える抗体が有利に使用できることを、当業者は認識するであろう。
【０１５７】
抗体は好ましくは、非経口的に、治療の過程で例えばボーラス注射または注入（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）により投与される。抗体は一般に、治療期間中、約20μg〜1mg/kg体重の抗体の最少循環レベルを与えるのに充分な量で投与される。この点で、半減期が少なくとも12時間、好ましくは少なくとも4日、さらに好ましくは14〜21日である抗体を使用することが好ましい。キメラおよびヒト化抗体は、それぞれ4日および14〜21日の循環半減期を有することが予測される。多くの場合、入院中は毎日の用量を投与し、通院治療中は頻度を減らしてボーラス注射をすることが好ましい。抗体はまた、除放性送達系、ポンプ、および連続的注入のための他の公知の送達系により投与することができる。投与処方は、その薬物動態に基づいて特定の抗体の所望の循環レベルを与えるように変化される。用量は、所望の循環レベルの治療薬が維持されるように計算される。投与期間を平均すると上記の用量が与えられるように、より大きな低頻度のボーラス投与として毎日の用量が投与される。
【０１５８】
モノクローナル抗体の投与は、静脈内投与（毎日、毎週、2週間毎、および毎月投与）、皮下投与（毎日、週に3回、毎週、2週間毎、および毎月投与）により投与され、1〜100mg/kg体重の範囲でもよい（例えば、1、3、5、10、20、50、75および100mg/kg体重）。抗体の投与はまた、ペプチドとその誘導体に対する中和抗体を誘発するためにペプチド−結合体ワクチンとして行われる。
【０１５９】
zsig33に対するアンタゴニスト（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む）の投与は、補助的治療（食事制限とカウンセリングを伴う）が有りまたは無しで、体重減少治療法の補助；直接および／または間接に脂肪沈着を低下させて、体重を低下させ、除脂肪体重の比率の増大；除脂肪体重の比率の増大（例えば、筋肉を増やして体型を整える）；ならびに、特に限定されないが、遺伝的異常に起因する過食症（例えばPrader-Willi症候群）に伴う食欲抑制、に有用であろう。さらにzsig33に対するアンタゴニストは、非ヒト哺乳動物（例えば、家畜やペット）を治療するのに有用である。
【０１６０】
同じ原理により他のzsig33アンタゴニストが使用できることを当業者は認識するであろう。あるアンタゴニストの投与処方は、アンタゴニストの力価、薬物動態、および物理化学的性質を含む多くの要因により決定されるであろう。例えば非ペプチド性zsig33アンタゴニストは、非経口的に投与される。
【０１６１】
zsig33はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するのに使用することもできる。試験化合物を本明細書に開示の測定法に加えて、zsig33の活性を阻害する化合物を同定する。本明細書に開示の測定法以外に、zsig33依存性細胞応答のリガンド／受容体、またはリガンド／抗体結合、または刺激／阻害を測定するように設計された種々の測定法により、zsig33活性の阻害について試料を試験することができる。例えばzsig33応答性細胞株を、zsig33刺激細胞経路に応答性のレポーター遺伝子構築体でトランスフェクトすることができる。この種のレポーター遺伝子構築体は当該分野で公知であり、一般には測定可能なタンパク質（例えばルシフェラーゼ）または代謝物（例えばサイクリックAMP）をコードする遺伝子に機能できる形で結合したDNA応答要素を含む。DNA応答要素には、特に限定されないが、サイクリックAMP応答要素（CRE）、ホルモン応答要素（HRE）、インスリン応答要素（IRE）（Nasrinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990）、および血清応答要素（SRE）（Shawら、Cell 56:563-72, 1989）がある。サイクリックAMP応答要素は、Roestlerら、J. Biol. Chem. 263(19):9063-6；1988、およびHabener, Molec. Endocrinol. 4(8):1087-94；1990の総説がある。ホルモン応答要素は、Beato, Cell 56:335-44:1989の総説がある。1つの可能なレポーター遺伝子構築体はGタンパク質結合受容体を含有し、これはリガンドに結合すると、例えばサイクリックAMP応答要素を介して細胞内でシグナル伝達をする。1つの可能なレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である（de Wetら、Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当該分野で公知の方法を使用して発光により検出される（例えば、Baumgartnerら、J. Biol. Chem. 269:19094-29101, 1994；SchenbornとGoiffin, Promega Notes 41:11, 1993）。ルシフェラーゼ測定キットは、例えばプロメガ社（Promega Corp.）（マジソン、ウィスコンシン州）から市販されている。この種の標的細胞株は、化学物質、細胞調整培地、真菌ブロス、土壌試料、水試料などのライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。候補化合物、溶液、混合物または抽出物は、レポーター遺伝子発現のzsig33刺激の低下により証明されるように、標的細胞へのzsig33の活性を阻害する能力について試験される。この種の測定法は、GHS-Rへのzsig33の結合を直接阻止する化合物、ならびに結合後の細胞経路のプロセスを阻止する化合物を検出する。あるいは、化合物または他の試料は、検出可能な標識物（例えば、125I、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、FITCなど）で標識したzsig33を使用して、GHS-Rへのzsig33の結合の直接阻止について試験することができる。この種の測定法では、GHS-Rへの標識zsig33の結合を阻害する試験試料の能力は阻害活性を示し、これは2次的測定法により確認することができる。結合測定法で使用される受容体は、細胞性受容体、例えばGHS-R、可溶性受容体、または単離された、固定化された受容体でもよい。さらにこの種の測定法は、zsig33ペプチドの機能性変種ならびにGHS-R変種を同定するのに使用することができる。
【０１６２】
他の測定法は、アゴニスト活性のスクリーニング系で、Gα16を発現する細胞株およびカルシウム感受性光タンパク質（エクオリン）使用する。このシステム（Stables, J.ら、Anal. Biochem. 126, 1997により記載されている）は、Gタンパク質結合受容体と結合するGα16を使用する。受容体に結合すると、細胞内カルシウム濃度が上昇する。細胞はシーレンテラジン(coelenterazine)中でプレインキュベートされ、細胞内カルシウムはエクオリン(これは細胞にトランスフェクトされている）およびシーレンテラジンと反応し、発光応答を与える。下垂体、視床下部、および膵臓からの細胞株は、この測定法でGHS-Rに有用であろう。
【０１６３】
またzsig33ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓組織の創傷治癒を促進するのに、治療的に有効である。本発明のzsig33ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストにおいてこの可能性の有無を証明するために、かかるzsig33ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、当該分野で公知の方法に従って創傷治癒を促進する能力について評価される。所望であればこの点のzsig33ポリペプチドの性能が、増殖因子、例えばEGF、NGF、TGF-α、TGF-β、インスリン、IGF-I、IGF-II、繊維芽細胞増殖因子（FGF）などと比較することができる。さらにzsig33ポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、相乗作用を同定するために、1つ以上の増殖因子と一緒に評価される。
【０１６４】
GHS-Rもまた、zsig33の精製のために使用することができる。このポリペプチド（すなわち配列番号5）は、固体支持体（例えば、アガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカベースの樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミドなど、または使用条件下で安定な同様の物質）上に固定化される。ポリペプチドを固体支持体に結合させる方法は当該分野で公知であり、アミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、およびヒドラジン活性化がある。生じる媒体は一般にカラムの形であり、zsig33ポリペプチドを含有する液体は、1回以上カラムを通過して、zsig33ポリペプチドをGHS-Rポリペプチドに結合させる。次にzsig33ポリペプチドは、塩濃度、カオトロピック物質（グアニジン塩酸）、またはpHの変化を使用して受容体結合を破壊して溶出される。
【０１６５】
リガンド結合受容体（または抗体、相補的／抗相補的対の1つのメンバー、または他の細胞表面結合タンパク質）またはその結合断片、および市販のバイオセンサー装置（BIAcore、ファルマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）を使用する測定系が有利に使用される。そのような受容体（すなわちGHS-R）、抗体、相補体／抗相補体対のメンバーまたは断片は、受容体チップの表面に固定化される。この装置の使用は、Karlsson, J. Immunol. Meth. 145:229-40, 1991およびCunninghamとWells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993に開示されている。受容体、抗体、メンバー、リガンドまたは断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して、フローセル中の金箔に結合したデキストランファイバーに共有結合される。試験試料を細胞中を通過させる。試料中にもしリガンド、エピトープ、または相補的／抗相補的対の反対のメンバーが存在するなら、それは固定化された受容体、抗体またはメンバーに結合し、媒体の屈折率を変化させ、これは、金箔の表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系は、オンレートとオフレートの測定を可能にし、そこから結合親和性が計算され、結合の化学量論が評価される。
【０１６６】
GHS-Rポリペプチドと、リガンドポリペプチドに結合する他の受容体ポリペプチドはまた、当該分野で公知の他の測定系で使用できる。そのような系には、結合親和性の測定のためのスキャチャード解析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949）、および熱量測定（Cunninghamら、Science 253:545-48, 1991:Cunninghamら、Science 245:821-25, 1991）がある。
【０１６７】
「可溶性タンパク質」は、細胞膜に結合していないタンパク質である。可溶性タンパク質は一般的には、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが欠如したリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性タンパク質は、追加のアミノ酸残基（例えば、ポリペプチドの精製を提供するか、または基質へのポリペプチドの結合部位を提供する親和性タグ、または免疫グロブリン定常領域配列）を含有することができる。多くの細胞表面タンパク質は、タンパク質分解により産生されるかまたは代替スプライスされたmRNAから翻訳された、天然に存在する可溶性物を有する。タンパク質は、膜アンカリングまたはシグナル伝達を提供するこれらのセグメントの充分な部分が無い時、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない。
【０１６８】
本発明の分子は、他のアイソフォームのGHS-R、または他のGタンパク質結合受容体、細胞表面結合タンパク質、または消化管-ホルモン相互作用に関与する相補体／抗相補体対のメンバーを同定し単離するのに使用することができる。例えば、zsig33のタンパク質およびペプチドはカラム上に固定化され、膜調製物はカラムに流される（「固定化親和性リガンド技術（Immobilized Affinity Ligand Techniques）」、Hermansonら（編）、アカデミックプレス（Academic Press）、サンジエゴ、カリホルニア州、1992、195-202頁）。タンパク質とペプチドはまた放射能標識（Methods in Enzymol., vol.182, 「タンパク質精製のガイド（Guide to Protein Purification）」、M. Deutscher（編）、アカデミックプレス（Acad. Press）、サンジエゴ、1990, 721-37）、または光親和性標識(Grunnerら、Annu. Rev. Biochem. 62:483-514, 1983およびFedanら、Biochem. Pharmacol. 33:1167-80, 1984）することもでき、特異的細胞表面タンパク質を同定することができる。
【０１６９】
本発明の分子は、胃収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモン分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモン分泌の調節に有用であろう。本発明の分子は、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓のような多様な組織の、リガンド−受容体結合を調節するのに、またはこれらの病状の進行を治療または予防するのに使用することができる。特に、いくつかの疾患は、そのような診断、治療または予防を受けやすい。本発明の分子は、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓のニューロンおよび筋細胞の阻害と増殖を調節するのに使用することができる。本発明のポリペプチド、核酸および／または抗体は、例えば逆流性食道炎、胃不全麻痺、下垂体ホルモン（成長ホルモンおよび／または成長ホルモン刺激ホルモンを含む）の分泌の調節、クローン病、代謝性消耗、胃潰瘍、体重管理、出生率、発育中の生殖系の疾患、および変性疾患が引き起こす障害の診断、治療または予防に使用することができる。
【０１７０】
zsig33および／またはGHS-Rポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zsig33／GHS-R結合活性を上昇させるかまたはインヒビターすることが好ましい遺伝子治療への応用で有用である。もし哺乳動物が変異したzsig33またはGHS-R遺伝子を有するかまたはこれが欠失しているなら、その遺伝子を哺乳動物の細胞中に導入することができる。ある実施態様においてzsig33またはGHS-Rポリペプチドをコードする遺伝子は、ウイルスベクターによりin vivoで導入される。そのようなベクターには、特に限定されないが、単純ヘルペスウイルス（HSV）、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）などの弱毒化または欠陥DNAウイルスがある。ウイルス遺伝子が完全にまたはほとんど欠如した欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞に導入した後に感染性ではない。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染することを心配することなく、特異的な局在化領域に細胞を投与することを可能にする。具体的なベクターの例には、特に限定されないが、欠陥単純ヘルペスウイルス1（HSV1）ベクター（Kaplittら、Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991）；弱毒化アデノウイルスベクター、例えばStratford-Perricaudetら、J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992が記載したベクター；および欠陥アデノ関連ウイルスベクター（Samulskiら、J. Virol. 61:3096-101, 1987；Samulskiら、J. Virol. 63:3822-8, 1989）がある。
【０１７１】
さらに、細胞表面分子としてGHS-Rポリペプチドは、細胞に遺伝子治療を導入するための標的として使用することができる。この応用は、GHS-Rが正常に発現される細胞（例えば、下垂体、視床下部、および海馬細胞）中に治療用遺伝子を導入するのに特に適しているであろう。例えば上記したようなウイルス遺伝子治療は、ウイルスベクターよりGHS-Rポリペプチドのような細胞受容体を発現する特異的細胞タイプを標的とすることができる。標的細胞表面のGHS-R分子を認識する抗体または他の分子（例えばzsig33ペプチド）は、ウイルスが標的細胞に感染するように向け、遺伝子治療用物質を標的細胞に投与するのに使用することができる。Woo, S.L.C, Nature Biotech. 14:1538, 1996；Wickham, T.J.ら、Nature Biotech. 14:1570-1573, 1996；Douglas, J.T.ら、Nature Biotech. 14:1574-1578, 1996；Rihova, B., Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169, 1997；およびVile, R.LG.ら、Mol. Med. Today 4:84-92, 1998を参照されたい。例えば、GHS-R特異的抗体に結合したウイルス中和性Fab断片を含有する二重特異的抗体は、GHS-Rを発現する細胞にウイルスを向け、細胞への遺伝子要素を含有するウイルスの効率的侵入を可能にするために使用することができる。例えば、Wickham, T.J.ら、J. Virol. 71:7663-7669, 1997；およびWickham, T.J.ら、J. Virol. 70:68331-6838, 1996を参照されたい。
【０１７２】
別の実施態様において、zsig33またはGHS-R遺伝子はレトロウイルスベクター中に導入することができ、例えば米国特許第5,399,346号；Mannら Cell 33:153, 1983；Teminら、米国特許第4,650,764号；Teminら、米国特許第4,980,289号；Markowitzら、J. Virol. 62:1120, 1988；Teminら、米国特許第5,124,263号；国際特許公報 WO95/07358、Doughertyらにより1995年3月16日に公開；Kuoら、Blood 82:845, 1993に記載されている。あるいはベクターは、リポソームを使用してin vivoでリポフェクションにより導入することができる。合成陽イオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Flgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7, 1987；Mackeyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988）。in vivoで特異的な特異的臓器に外因性遺伝子を導入するリポフェクションの使用は、いくつかの実際的利点を有する。特異的細胞へのリポソームの分子ターゲティングは、1つの有利な領域である。例えばトランスフェクションを特定の細胞タイプへ向けることは、細胞の不均一性（例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳）を有する組織で特に有利であろう。脂質は、ターゲティングの目的で他の分子に化学結合してもよい。ターゲティングされたペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、タンパク質（例えば抗体）、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合することができる。
【０１７３】
同様にzsig33ポリヌクレオチド（配列番号1または配列番号3）を使用して、特定の組織（例えば胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓）をターゲティングすることができる。体から標的細胞を除去すること；裸のDNAプラスミドとしてベクターを導入すること；そして次に形質転換された細胞を体内に再移植すること、が可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターは、当該分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはDNAベクタートランスポーターの使用）により所望の宿主細胞に導入することができる。例えば、Wuら、J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992；Wuら、J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988を参照されたい。
【０１７４】
zsig33遺伝子転写と翻訳を阻害するために（例えばin vivoで細胞増殖を阻害するために）種々の方法（アンチセンスおよびリボザイム法を含む）が使用できる。zsig33をコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号1または3に記載のポリヌクレオチド）のセグメントに相補的なポリヌクレオチドは、zsig33をコードするmRNAに結合して、そのようなmRNAの翻訳を阻害するように設計される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物または被験体のzsig33ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するように使用される。
【０１７５】
zsig33またはGHS-R遺伝子を発現するように操作されたマウス（「トランスジェニックマウス」と呼ぶ）およびzsig33またはGHS-R遺伝子機能の完全な欠如を示すマウス（「ノックアウトマウス」と呼ぶ）もまた、作成される（Snouwaertら、Science 257:1083, 1992；Lowellら、Nature 366:740-42, 1993；Capecchi, M.R., Science 244:1288-1292, 1989；Palmiter, R.D.,ら、Annu Rev Genet. 20:465-499, 1986）。例えば、遍在的にまたは組織特異的もしくは組織制限プロモーター下でzsig33またはGHS-Rを過剰発現するトランスジェニックマウスは、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを調べるのに使用することができる。例えば野生型zsig33またはGHS-Rポリペプチド、そのポリペプチド断片もしくは変異体の過剰発現は、正常な細胞プロセスを変化させ、zsig33またはGHS-R発現が機能的に関連している組織を特定する表現型を生じさせ、zsig33、そのアゴニストまたはアンタゴニストの治療標的を示すことがある。例えば、操作するための好適なトランスジェニックマウスは、GHS-Rポリペプチド（配列番号5のほぼアミノ酸1〜366）またはzsig33ポリペプチド（配列番号2のアミノ酸1〜117）を過剰発現するものである。さらにそのような温度ベクターは、ヒト疾患との類似性を示す表現型を与えることがある。同様にノックアウトzsig33およびGHS-Rマウスは、zsig33がin vivoで絶対的に必要かどうかを調べるのに使用することができる。ノックアウトマウスの表現型は、zsig33アンタゴニスト（例えば本明細書に記載のもの）が有するin vivo効果を予測させる。ヒトzsig33 cDNAは、マウスzsig33 mRNA、cDNAおよびゲノムDNAを単離するのに使用することができ、次にこれらはノックアウトマウスを作成するのに使用される。これらのマウスは、zsig33とGHS-R遺伝子、およびこれらのコードされるタンパク質をin vivo系で研究するのに使用され、対応するヒト疾患のin vivoモデルとして使用することができる。さらに本明細書に記載のzsig33またはGHS-Rアンチセンスポリヌクレオチド、またはzsig33に対するリボザイムは、同様に上記トランスジェニックマウスに使用することができる。
【０１７６】
zsig33ポリペプチド、その変種および断片は、細胞−細胞相互作用が引き起こす障害（例えば、胃収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素およびホルモン分泌の調節、および／または膵臓中の酵素および／またはホルモン分泌の調節）の置換療法として有用となり得る。
【０１７７】
組織形態形成のあまり広くは認識されていない決定要因は、細胞再整列プロセスである。細胞運動性および細胞−細胞接着は、形態形成的細胞再整列で中心的役割を果たしている可能性がある。細胞は、隣接細胞との接触を急速に破壊し、おそらく同時に再作成できることが必要である。Gumbiner, B.M., Cell 69:385-387, 1992を参照されたい。胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓中の分泌タンパク質として、zsig33とGHS-Rは、これらおよび他の組織で細胞内再整列において役割を果たす。
【０１７８】
zsig33遺伝子は、欠陥zsig33遺伝子を有するヒトを特定するためのプローブとして有用である。胃、腎臓、小腸、および膵臓中のzsig33の強い発現は、zsig33ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがこれらの組織中の異常増殖の指標として使用できることを示唆する。すなわちzsig33のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびこれらの変異は、これらの組織における癌の診断指標として使用することができる。
【０１７９】
zsig33結合タンパク質（例えば、抗zsig33抗体またはGHS-R）はまた、循環レベルのzsig33の検出のための診断系で使用される。関連する実施態様において、GHS-Rに特異的に結合する抗体または他の物質は、循環受容体ポリペプチドを検出するために使用することができる。リガンドまたは受容体ポリペプチドレベルの上昇または低下は、病的状態（癌を含む）を示し得る。
【０１８０】
本発明のポリペプチドは、細胞接着と転移におけるその役割を研究するのに有用であり、転移、特に胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓の転移を予防するのに有用である。同様にzsig33のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍または悪性腫瘍組織におけるその欠陥物を置換するのに使用される。
【０１８１】
zsig33およびGHS-Rポリペプチドは、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓で発現される。すなわち本発明のzsig33ポリペプチド医薬組成物は、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、平滑筋、および膵臓の病的制御または発現が引き起こす障害の予防または治療に有用である。
【０１８２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、制御可能なプロモーターとともに使用され、こうして投与されるタンパク質の用量を制御することを可能にする。
【０１８３】
配列番号2のzsig33ポリヌクレオチドは、染色体3p26.1にマッピングされている。すなわち本発明はまた、診断応用で有用となるであろう試薬を提供する。例えばzsig33遺伝子、zsig33 DNAもしくはRNAを含むプローブ、またはそのサブ配列は、zsig33遺伝子が染色体3p26.1上に存在するかどうか、または変異が起きているかどうかを調べるのに使用することができる。zsig33遺伝子座の検出可能な染色体異常には、特に限定されないが、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化および再整列がある。そのような異常は、本発明のポリヌクレオチドを使用して、分子遺伝学的方法、例えば制限断片長多型（RFLP）解析、PCR法を使用するショートタンデム繰り返し（STR）解析、および当該分野で公知の他の遺伝子連鎖解析を使用して、検出することができる（サムブルーク（Sambrook）ら、同上；アウスベル（Ausubel）ら、同上；Marian, Chest 108:255-65, 1995）。
【０１８４】
本発明のペプチド、変種、核酸および／または抗体は、胃収縮性、成長ホルモン分泌の調節、消化酵素、ホルモンおよび酸の分泌、消化管運動性、消化酵素の動員が引き起こす障害；炎症、特に消化管系に影響を与えるもの；逆流疾患および栄養物質吸収の制御の治療に使用される。本発明の分子による治療の利益を受ける具体的な症状には、特に限定されないが、糖尿病性胃不全麻痺、術後胃不全麻痺、迷走神経切断術、慢性突発性小腸偽性閉塞、および胃食道逆流疾患がある。さらなる用途には、放射線による研究のための胃内容排出、胆嚢収縮と鼓室洞摘出術の刺激がある。
【０１８５】
本発明の分子の運動および神経作用は、肥満と、神経のフィードバックが栄養物質吸収を調節する他の代謝性障害の治療に有用である。本発明の分子は、満腹調節、グルコース吸収と代謝、および神経障害関連消化管障害を制御するのに有用である。
【０１８６】
本発明のペプチドは、zsig33ペプチド（変種を含む）で消化管系を抗原刺激し、胃運動性と収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素とホルモンの分泌の調節、または膵臓中の酵素および／またはホルモンの分泌の調節を測定することにより、視床下部−下垂体−副腎軸の機能を評価するのに有用である。
【０１８７】
さらにzsig33ペプチドの分子およびこれに特異的に結合する抗体は、GHS-Rペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖および／または分子を検出または調節するのに使用される。zsig33ペプチドは、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などで標識することができ；間接タグまたは標識物は、中間体としてビオチン−アビジンまたは他の相補体／抗相補体対の使用を特徴とする。これらの標識されたポリペプチドはin vitroまたはin vivoで適用され、例えば脳、膵臓、腎臓、十二指腸、空腸および肺のような組織中の腫瘍上に局在化したGHS-R受容体を同定するのに特に有用である。
【０１８８】
本発明の分子はまた、グルコースを含有する抗低血糖調製物への添加剤として、および急速な栄養物質作用が必要な経口薬剤の吸収エンハンサーとして有用である。さらに本発明の分子は、グルコース誘導性のインスリン放出を刺激するのに使用することができる。
【０１８９】
医薬用途において本発明のタンパク質は、経口、直腸、非経口（特に静脈内または皮下）、槽内、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏剤、点滴剤、または経皮分割として）、頬内、または肺もしくは鼻内吸入剤として投与することができる。静脈内投与は、大型丸薬投与によりまたは1〜数時間の典型的な時間注入される。一般に医薬製剤は、zsig33タンパク質を単独、またはダイマーパートナーとともに、薬剤学的に許容されるビヒクル（例えば、食塩水、緩衝化食塩水、5％グルコース水溶液など）とともに含む。製剤はさらに、1つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝化剤、バイアル表面上のタンパク質の喪失を防ぐためのアルブミンなどを含有してもよい。製剤化の方法は当該分野で公知であり、例えば「レミントン：薬剤の科学と実践（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）」、Gennaro編、マックパブリッシング社（Mack Publishing Co.）（イーストン、ペンシルバニア州）、第19版、1995に開示されている。治療用量は一般に、0.1〜100μg/kg患者体重/日、好ましくは0.5〜20mg/kg/日の範囲であり、正確な用量は、受容されている基準に従って、治療される症状の性質と重症度、患者の特徴などを考慮して臨床医師により決定される。用量の測定は、当業者の技術レベルの範囲内である。タンパク質は、急性治療のために、1週間またはそれ以下、しばしば1〜3日の期間で投与されるか、または慢性治療（数ヶ月または数年）で使用される。一般にzsig33の治療的有効量は、消化管収縮性、栄養物質取り込みの調節、成長ホルモンの調節、消化酵素とホルモンの分泌の調節、および膵臓、胃、肺、腎臓、十二指腸、空腸、平滑筋、および膵臓組織中の酵素および／またはホルモンの分泌の調節の、臨床的に有意な変化を生じるのに充分な量である。
【０１９０】
本発明はさらに以下の非限定例により例示される。
実施例
実施例1
zsig33の組織分布
zsig33の組織分布の解析は、クロンテク（Clontech）（パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）のヒト多組織ブロット（Human Multiple Tissue Blots）とヒトRNAマスタードットブロット（Human RNA Master dot blot）を使用して行った。プローブは約40bpのオリゴヌクレオチドZC12,494（配列番号13）である。プローブは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）とT4ポリヌクレオチドキナーゼフォワード緩衝液（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.））を使用して末端標識した。プローブは、ヌクトラップ（NUCTRAP）プッシュカラム（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州）を使用して精製した。プレハイブリダイゼーション用に、およびノーザンブロットのハイブリダイズ溶液として、エクスプレスヒブ（EXPRESSHYB）（クロンテク（Clontech））溶液を使用した。ハイブリダイゼーションは42℃で行い、ブロットを2×SSC、0.05％ SDSで室温で洗浄、次に1×SSC、0.1％ SDSで71℃で洗浄した。胃に約600bpの転写体を強いシグナルとして観察し、膵臓と小腸に弱いシグナルが見られた。
実施例2
A. gutノーザン組織ブロット
以下の供給源からのmRNAを使用してノーザンブロットを調製した：
1. ヒト結腸直腸腺癌細胞株SW480からのRNA（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州）
2. ヒト小腸組織からのRNA（クロンテク（Clontech））
3. ヒト胃組織からのRNA（クロンテク（Clontech））
4. ヒト小腸平滑筋細胞株（Hism：ATCC No. CRL-1692；アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、12301, パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド州）
5. 正常ヒト結腸細胞株（FHC；ATCC No. CRL-1831；アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection））
6. ヒト正常胎児小腸細胞株（FHs74Int.；ATCC No. CCL241；アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection））
Hism、FHCおよびFHs74Int.から酸性グアニジン法により総RNAを単離した（Chomczynskiら、Anal. Biochem. 162:156-159, 1987）。ポリA+RNAを保持するカラムで総RNAを溶出して、ポリA+RNAを選択した（Avivら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972）。各試料から2mgのポリA+RNAを、2.2M ホルムアルデヒドとリン酸緩衝液中の1.5％アガロースゲルで分離した。RNAを、20×SSC中で一晩ニトラン（Nytran）膜（シュレイチャー・アンド・シュエル（Schleicher & Schuell）、キーン（Keene）、ニューハンプシャー州）に移した。ブロットを0.12ジュールのUVストラタリンカー（Strantalinker）2400（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州）で処理した。次にブロットを80℃で1時間ベーキングした。
【０１９１】
PCRで増幅した完全長cDNA（配列番号1に示す）を使用して、約50ngのzsig33 DNAと42.5mlの水を、レジプライムペレットキット（Rediprime pellet kit）（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を使用して製造業者の規格に従って32P dCTPで放射能標識した。ブロットを55℃で一晩エクスプレスヒブ（EXPRESSHYB）（クロンテク（Clontech））でハイブリダイズさせた。ブロットを室温で2×SSC、0.1％ SDSで洗浄し、次に2×SSC、0.1％ SDSで65℃で、最後に0.1×SSC、0.1％ SDSで65℃で洗浄した。結果は、zsig33が胃RNAにハイブリダイズし、他の組織起源の他のRNAにはハイブリダイズしないことを示した。
B. 腫瘍ノーザンブロット
ノーザンテリトリー（Northern Territory）（登録商標）−ヒト腫瘍パネルブロットII（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州）とノーザンテリトリー（Northern Territory）（登録商標）−ヒト胃腫瘍パネルブロットII（インビトロゲン（Invitrogen））を、zsig33 RNAの発現パターンについて解析した。
【０１９２】
ヒト腫瘍パネルブロットはレーン当たり20mgの総RNAを含有し、1％変性ホルムアルデヒドゲルに流した。ブロットは、食道腫瘍、正常食道、胃腫瘍、正常胃、結腸腫瘍、正常結腸、直腸腫瘍および正常直腸からのRNAを含有した。胃腫瘍パネルブロットは、4つの異なるドナーからのヒトおよび正常組織から単離された総RNAを含有した。各レーンで20mgのRNAを使用し、レーンは各ドナーからの正常と腫瘍セットを交互に含有した。
【０１９３】
約40bpのオリゴヌクレオチドZC12,494（配列番号11）であるプローブを調製した。プローブは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）とT4ポリヌクレオチドキナーゼフォワード緩衝液（ライフテクノロジーズインク（Life Technologies Inc.））を使用して末端標識した。プローブは、ヌクトラップ（NUCTRAP）プッシュカラム（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla）、カリホルニア州）を使用して精製した。腫瘍ブロットと胃ブロットを同じ方法で処理した。プレハイブリダイゼーション用に、およびノーザンブロットのハイブリダイズ溶液として、エクスプレスヒブ（EXPRESSHYB）（クロンテク（Clontech））溶液を使用した。ハイブリダイゼーションは42℃で行い、ブロットを0.1×SSC、0.01％ SDSで60℃で洗浄、次に0.1×SSC、0.1％ SDSで70℃で洗浄した。結果は、ヒト腫瘍パネルとヒト胃腫瘍パネルの両方の正常胃組織にのみzsig33が発現されることを明瞭に示す。
実施例3
タンパク質精製
N末端およびC末端EEタグを有するzsig33の精製条件：
Glu-GLuタグ（配列番号12）をコードするポリヌクレオチドに機能できる形で結合した配列番号1のDNAまたはその一部を含有する発現ベクターで、大腸菌（E. coli）、ピキア（Pichia）、CHOおよびBHK細胞をトランスフェクトする。zsig33タンパク質は、大腸菌（E. coli）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、および／またはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の調整培地中で発現される。大腸菌（E. coli）とピキア（Pichia）中で発現されたzsig33について、精製前に培地を濃縮しない。特に明記しない場合は、すべての操作は4℃で行う。全部で25リットルのBHK細胞由来の調整培地を、4インチの0.2mM ミリポア（Millipore）（ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）オプティキャップ（OptiCap）カプセルフィルターと0.2mM ゲルマン（Gelman）（アンアーバー（Ann Arbor）、ミシガン州）スーパーキャップ（Supercap）50で連続無菌ろ過を行う。次に3000 kDaカットオフアミコン（Amicon）（ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）S10Y3膜を取り付けたミリポアプロフラックス（Millipore ProFlux）A30タンジェンシャルフロー濃縮器を使用して、材料を約1.3リットルに濃縮する。濃縮した物質を再度、上記したようにゲルマン（Gelman）フィルターで滅菌ろ過する。濃縮した調整培地にプロテアーゼインヒビターの混合物を、最終濃度2.5mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）、0.001mM ロイペプチン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、インディアポリス、インディアナ州）、0.001mM ペプスタチン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））、および0.4mM ペファブロック（Pefabloc）（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））になるように加える。上記したように調製される50.0mlの抗EEセファロース試料を加え、混合物をウィートン（Wheaton）（ミルビル（Millville）、ニュージャージー州）ローラー培養装置で4℃で18時間静かに攪拌する。
【０１９４】
次に混合物を5.0×20.0cm エコノカラム（Econo-Column）（バイオラッド（BioRad）、ラボラトリーズ、ハーキュレス（Hercules）、カリホルニア州）に注ぎ、ゲルを30カラム容量のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄する。保持されないフロースルー画分を捨てる。280nMの溶出液の吸光度が0.05未満の場合、カラムのフロースルーをゼロにし、抗EEセファロースゲルを、0.2mg/mlのEEペプチド（アナスペック（AnaSpec）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州）を含有する2.0カラム容量のPBSで洗浄する。使用されるペプチドは、配列GluTyrMetProValAspを有する。4℃で1.0時間後、流れを再開し、溶出したタンパク質を集める。この画分をペプチド画分と呼ぶ。次に抗EEセファロースゲルを2.0カラム容量の0.1M グリシン（pH2.5）で洗浄し、グリシン洗浄物を別々に集める。少量の10×PBSを加えてグリシン溶出液画分のpHを7.0に調整し、必要であれば将来の分析のために保存する。
【０１９５】
15,000分子量カットオフの膜濃縮器（ミリポア（Millipore）、ベッドフォード（Bedoford）、カリホルニア州）を使用して製造業者の説明書に従って、ペプチド溶出液を5.0mlに濃縮する。次に濃縮ペプチド溶出液を、バイオカドスプリント（BioCad Sprint）HPLC（パーセプティブバイオシステムズ（PerSeptive BioSystems）、フラミンガム、マサチューセッツ州）を使用して1.0mg/mlの流速でPBSで平衡化した1.5×50cm セファデックスG-50（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）のクロマトグラフィーにより、遊離のペプチドから分離する。2ml画分を集め、280nMの吸光度を追跡する。280nMで吸収のあるカラムのボイド容積近辺で溶出液する物質の最初のピークを集める。この画分は純粋なzsig33 NEEまたはzsig33 CEEである。純粋な物質を上記のように濃縮し、SDS-PAGEと抗EE抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分析し、アリコートを取り、標準的方法に従って-80℃で保存する。
抗EEセファロースの調製：
100mlベッド容量のタンパク質G-セファロース（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）を、0.02％アジ化ナトリウムを含有する100mlのPBSを用いて、500mlのナルゲン（Nalgene）0.45ミクロンフィルター装置を使用して3回洗浄する。ゲルを6.0容量の200mMトリエタノールアミン（pH8.2）（TEA、シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）で洗浄し、900mgの抗体を含有する等量のEE抗体溶液を加える。4℃で一晩インキュベート後、上記したように5容量の200mM TEAで樹脂を洗浄して結合しなかった抗体を除去する。樹脂を2容量のTEAに再懸濁し、適当な容器に移し、TEAに溶解したジメチルピミリミデート-2HCl（ピアス（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）を36mg/mlゲルの最終濃度に加える。ゲルを室温で45分間振盪し、上記したようにフィルター装置を使用して液体を除去する。次にゲル上の非特異部位を、200mM TEA中の5容量の20mMエタノールアミンで室温で10分間インキュベートしてブロックする。次にゲルを、0.02％アジ化ナトリウムを含有する5容量のPBSで洗浄し、この溶液中で4℃で保存する。
非標識zsig33の精製：
大腸菌（E. coli）、ピキア（Pichia）、CHOおよびBHK細胞を、配列番号1のDNA配列またはその一部を含有する発現ベクターでトランスフェクトする。大腸菌（E. coli）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）およびベビーハムスター腎（BHK）細胞の調整培地で発現されるタンパク質について、後述の方法を使用する。しかし大腸菌（E. coli）とピキア（Pichia）で発現されたzsig33について、精製前に培地を濃縮しない。特に明記しない場合は、すべての操作は4℃で行う。全部で25リットルのBHK細胞由来の調整培地を、4インチの0.2mM ミリポア（Millipore）（ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）オプティキャップ（OptiCap）カプセルフィルターと0.2mM ゲルマン（Gelman）（アンアーバー（Ann Arbor）、ミシガン州）スーパーキャップ（Supercap）50で連続無菌ろ過を行う。次に3000 kDaカットオフのアミコン（Amicon）（ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）S10Y3膜と取り付けたミリポアプロフラックス（Millipore ProFlux）A30タンジェンシャルフロー濃縮器を使用して、材料を約1.3リットルに濃縮する。濃縮した物質を再度、上記したようにゲルマン（Gelman）フィルターで滅菌ろ過する。濃縮した調整培地にプロテアーゼインヒビターの混合物を最終濃度2.5mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）、0.001mM ロイペプチン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、インディアポリス、インディアナ州）、0.001mM ペプスタチン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））、および0.4mM ペファブロック（Pefabloc）（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））になるように加える。
実施例4
ペプチドの合成
配列番号2のアミノ酸残基24（Gly）〜アミノ酸残基37（Gln）に対応するペプチドであるzsig33-1を、モデル431Aペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ／パーキン・エルマー（Applied Biosystems/Perkin Elmer）、フォスターシティ（Foster City）、カリホルニア州）を使用して固相ペプチド合成により合成した。初期の支持体樹脂としてFmoc-グルタミン樹脂（0.63mmol/g；アドバンストケムテク（Advanced Chemtech）、ルイスビル、ケンタッキー州）を使用した。1mmolのアミノ酸カートリッジ（アナスペック（AnaSpec）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州）を合成のために使用した。2(1-Hベンゾトリアゾール-y-イル 1,1,3,3-テトラメチルヒルロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、2m N,N-ジイソルプロピルエチルアミン、N-メチルピロリドン、ジクロロメタン（すべてアプライド・バイオシステムズ／パーキン・エルマー（Applied Biosystems/Perkin-Elmer）から）およびピペリジン（アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）の混合物を、合成試薬として使用する。
【０１９６】
ペプチド比較ソフトウェア（ペプチドインターナショナル（Peptides International）、ルイスビル（Louisville）、ケンタッキー州）を使用して、凝集可能性とzsig33-1ペプチド合成の困難さレベルを予測した。単一のカプリングプログラムを使用して製造業者の規格に従って合成を行った。
【０１９７】
標準的TFA切断法（アプライド・バイオシステムズ／パーキン・エルマー（Applied Biosystems/Perkin Elmer）のペプチド切断マニュアルに従う）により、固相からペプチドを切断した。ペプチドの精製は、C18、10μm半調製カラム（バイダック（Vydac）、ヘスペリアル（Hesperial）、カリホルニア州）を使用してRP-HPLCにより行った。カラムから溶出された画分を集め、正しい質量と純度を電子噴霧質量スペクトル法により分析した。溶出した物質の2つのプールを集めた。質量スペクトル分析は、両方のプルが質量1600ダルトンのzsig33の精製型を含有することを示した。これは予測された質量であり、従ってプールを一緒にし凍結し、凍結乾燥した。
実施例5
完全長GHS-Rを発現する発現ベクターの構築
GHS-R cDNAを含有するプラスミドからPCRによりBamHIとEcoRI部位とを含有するプライマーを使用して、全GHS-Rを単離する。反応条件は以下の通りである：95℃で1分；95℃で1分、55℃で1分、72℃で2分間を35サイクル；次に72℃で10分；次に10℃に浸漬。PCR産物を1％低融点アガロース（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））に流し、キアクイック（Qiaquick）（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen））を使用して製造業者の説明書に従って、約1.05kbのGHS-R cDNAを単離する。
【０１９８】
精製したGHS-R cDNAをBamHI（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））とEcoRI（ビーアールエル（BRL））を用いて製造業者の説明書に従って消化する。全消化物を1％低融点アガロース（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））に流し、断片をキアクイック（Qiaquick）（登録商標）ゲル抽出キットを使用して製造業者の説明書に従って、精製する。生じる切断されたGHS-Rを、後述のように発現ベクターに挿入する。
【０１９９】
受容体発現ベクターpZP-5NをBamHI（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））とEcoRI（ビーアールエル（BRL））を用いて製造業者の説明書に従って消化し、上記したようにゲル精製する。このベクター断片を、上記で単離したBamHIとEcoRI切断GHS-R断片と結合反応で一緒にする。結合物をT4リガーゼ（ビーアールエル（BRL））を使用して15℃で一晩流す。結合試料をDH10Bエレクトロマックス（electroMAX）（登録商標）電気コンピタントな大腸菌（E. coli）細胞に電気穿孔する（25μF、200Ω、2.3V）。形質転換体をLB+アンピシリンプレートに広げ、PCRで単一のコロニーをスクリーニングして、新プライマーと上記したようにPCR条件を使用してGHS-R配列についてチェックする。
【０２００】
GHS-R配列の確認は、配列分析により行う。挿入体は約1.1kbであり、完全長である。
実施例6
GHS-Rを発現するBaF3細胞の構築
マウス骨髄由来のインターロイキン-3（IL-3）依存性前リンパ細胞株であるBaF3（パラシオス（Palacios）とステインメッツ（Steinmetz）、Cell 41：727-734, 1985；マセイ−プレボット（Mathey-Prevot）ら、Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986）を、10％熱不活性化胎児牛血清、2mg/ml マウスIL-3（mIL-3）（アールアンドディー（R & D）、ミネアポリス、ミネソタ州）、2mM L-グルタマックス-1（登録商標）（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））、1mM ピルビン酸ナトリウム（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））、およびPSN抗体（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））を補足した完全培地（RPMI培地（ジェイアールエィチバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）、レネクサ（Lenexa）、カンザス州））で維持する。電気穿孔法の前に、pZP-5N/GHS-R cDNA（実施例5）を調製し、キアゲンマキシプレップキット（Qiagen Maxi Prep kit）（キアゲン（Quiagen））を使用して製造業者の説明書に従って精製する。電気穿孔法のためのBaF3細胞をRPMI培地で1回洗浄し、次にRPMI培地に107細胞/mlの細胞密度で再懸濁する。再懸濁したBaF3細胞の1mlを、30μgのpZP-5N/GHS-R プラスミドDNAと混合し、別のディスポーザブル電気穿孔チャンバー（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））に移す。室温で15分インキュベート後、電気穿孔法装置（セルーポレーター（CELL-PORATOR）（登録商標）；ギブコビーアールエル（Gibco BRL））により細胞に2回の連続ショック（800 IFad/300V；1180 IFad/300V）を与える。5分の回復時間後、電気穿孔した細胞を50mlの完全培地に移し、15〜24時間インキュベーターに入れる（37℃、5％CO2）。次に細胞を遠心分離し、T-162フラスコ中にゲネチシン（Geneticin）（登録商標）（ギブコ（Gibco））選択（500μg/ml G418）を含有する50mlの完全培地に懸濁し、G418耐性プールを単離する。トランスフェクトしたBaF3細胞（以後BaF3/GHS-Rと呼ぶ）のプールを、後述するようにzsig33結合能力について測定する。
実施例7
BaF3/GHS-R細胞を使用するアラマーブルー増殖アッセイを使用するGHS-R活性のスクリーニング
BaF3/GHS-R細胞を遠心分離し、mIL-3不含培地で3回洗浄して、mIL-3の除去を確実にする。次に細胞を血球計算器で計測し、5000細胞/ウェルで100μl/ウェルの容量でmIL-3不含培地を使用して96ウェルフォーマットで広げる。
【０２０１】
BaF3/GHS-R細胞の増殖を、mIL-3不含培地で50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、および0.375％（zsig33の）濃度に希釈した合成zsig33を含有する培地を使用して評価する。100μlの希釈した合成zsig33をBaF3/GHS-R細胞に加える。総測定容量は200μlである。mIL-3不含培地のみを使用して、zsig33を加えることなく、陰性対照を平行して流す。測定プレートを37℃、5％ CO2で3日間インキュベートし、この時アラマーブルー（Alamar Blue）（アクメッド（Accumed）、シカゴ、イリノイ州）を20μl/ウェルで加える。アラマーブルーは、生きた細胞の数に基づいて蛍光測定読み値を与え、従って陰性対照と比較して細胞増殖の直接測定値を与える。再度プレートを37℃、5％ CO2で24時間インキュベートする。プレートをエフマックス（Fmax）（登録商標）プレートリーダー（モレキュラーデバイシーズ（Molecular Devices）、サニーデール、カリホルニア州）でソフトマックス（SoftMax）（登録商標）プロ（Pro）プログラムを使用して、波長544（励起）と590（発光）で読む。
【０２０２】
陽性結果は、BaF3野生型細胞が同じ濃度で増殖しない時、バックグランドに対して約4倍として測定される。合成法でまたは組換え法で産生した追加の変種もまた、こうしてスクリーニングされる。同様にzsig33またはGHS-Rに対する抗体は、zsig33リガンドの阻害／アンタゴニストについて、この方法で試験される。
実施例8
zsig33抗ペプチド抗体
2羽のメスニュージーランド白色ウサギをペプチドhuzsig33-2（配列番号16）で免疫して、ポリクローナル抗ペプチド抗体を調製した。アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）モデル431Aペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ（Foster City）、カリホルニア州）を使用して製造業者の説明書に従って、ペプチドを合成した。次にペプチドを、担体タンパク質であるマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にシステイン残基を介して結合させた（ピアス（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）。各ウサギに完全フロイントアジュバント（ピアス（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）中の結合ペプチド200mgを初期腹腔内（IP）注射により投与し、次に不完全フロイントアジュバント中の100mgの結合ペプチドの追加免疫IP注射を3週間毎に行う。第3の追加免疫注射投与の3〜10日後に、動物を採血し、血清を採取する。次にウサギに追加免疫し、3週間毎に採血する。
【０２０３】
zsig33ペプチド特異抗体を、1gのCNBr-セファロース当たり10mgのzsig33ペプチドを使用して調製したCNBr-セファロース4Bペプチドカラム（ファルマシアエルケービー（Pharmacia LKB））を使用して、ウサギ血清から親和性精製し、次にPBSで一晩透析した。ペプチド特異的zsig33抗体を、ELISA力価測定チェックにより抗体標的として1μg/mlの適切なペプチドを使用して性状解析した。
実施例9
zsig33のin situ結合研究
10週齢のオスのBalb/cマウスを筋肉内注射により麻酔し、zsig33ペプチドの結合をin vivoで試験した。
【０２０４】
2つのペプチドを試験した：第1のペプチドzsig33-1（実施例4を参照）は配列番号2の残基24〜37からなり、第2のペプチドzsig33-2は配列番号2の残基24〜41からなった。単一のグリシンを陰性対照として使用した。さらに、再整列（配列番号15）してあった第1のペプチドの残基からなる「スクランブルした」陰性対照も試験した。ペプチドと対照を以下の方法でフルオレセインイソチオシアネート（FITC、モレキュラープローブズ（Molecular Probes）（ユージーン、オレゴン州、アメリカ合衆国））に結合させた：ペプチド、グリシン対照およびFITCをpH9.0の0.1M重炭酸ナトリウムに、ペプチドとグリシン対照については2.0mg/mlの濃度に、FITCについてはFITCが強い光に露光されるのを避けながら5mg/mlの濃度に溶解した。FITC／重炭酸ナトリウム溶液をペプチドに、1mg FITC対1mgペプチドまたはグリシン対照の比で加え、暗所で周囲の室温で1時間反応させた。FITC結合ペプチドとグリシン対照を1K透析膜で0.1M 重炭酸ナトリウム緩衝液で4℃で透析した。緩衝液を毎日交換し、透析後緩衝液中の非結合FITCをHPLCにより測定した。6日後、緩衝液をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）に交換し、2日間透析し、次にPBSでもう一回交換しさらに2日間透析した。透析したFITC結合物質の吸光度を498nmで測定し、フルオレセインの吸光係数0.083μMで割って、ペプチド−またはグリシン−結合FITCを定量した。次に、フルオレセイン対ペプチドのモル比（モルFITC／モルペプチド）を決定した。
【０２０５】
各マウスが0.5ml（0.5mg）の標識ペプチドを与えられるように、標識ペプチドを尾静脈注射により投与し、これをマウス中で注射後15分間循環させた。
【０２０６】
麻酔下で各マウスの右心房を切って出口経路を作り、20mlのPBSを左心室に注入し、循環系をフラッシュするのに使用した。次にマウスに、中性緩衝液中のホルマリン約10ml（10％中性緩衝化ホルマリン（NBF）、サージパス（Surgipath）、リッチモンド、イリノイ州）を潅流させた。
【０２０７】
肝臓、腎臓、心臓、肺、胸腺、脾臓、十二指腸、回腸、空腸結腸および胃の組織を切開して採取し、10％NBFで一晩固定した後、組織学的評価のために処理した。組織はV.I.P.2000（マイルスインク（Miles, Inc.）、エルクハート（Elkhart）、インディアナ州）で処理して、組織にパラフィン（登録商標）を浸潤させた。組織／パラフィン（登録商標）ブロックをユングビオカット（Jung Biocut）（ライカ（Leica）、ヌスロッチ（Nussloch）、ドイツ）で5μmの切片にし、ガラススライド上に置き、60℃で1時間インキュベートして、組織がスライドに接着するのを助けた。スライドを100％キシレン中で5分間3回洗浄してパラフィン（登録商標）を除去した。次にスライドを100％エタノールで3分間2回洗浄し；次に95％エタノールで1回洗浄して、再水和させた。スライドを乾燥させ、次に55〜70℃で溶解した2％ DABCO（1,4-ジアゾビシクロ-(2,2,2)-オクタン、シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を含有する9部のグリセロールを、0.2M トリス塩酸（pH7.5） DAPI（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）またはヨウ化プロピジウム（0.5μg/ml）を含有する1部のグリセロールに加えて調製した5〜10μlのフェージング防止媒体でマウントした。フェージング防止媒体については、Kievits, T.ら、Cytogenet Cell Genet 53:134-136 (1990)も参照されたい。スライドをカバーガラスで覆い、直ちに蛍光顕微鏡で495nmで観察した。
【０２０８】
結果は、標識zsig33ペプチド、zsig33-1およびzsig33-2が、グリシンと「スクランブルした」対照と比較して、十二指腸、空腸、および腎臓の集合管と曲尿細管で蛍光の増強を示すことを示した。他の組織は、陰性対照と同様の蛍光を示した。
実施例10
消化管収縮性に対するzsig33の効果
約12週齢の2匹のオスのスプラーグ−ドーレイラット（ハーラン（Harlan）、インディアナポリス、インディアナ州）をウレタンで麻酔し、その胃を小さな腹部切開により露出させた。2つの水晶振動子の間の距離の変化として環状収縮性が追跡できるように、2つの2.4mmの変換水晶振動子（transducing crystals）（ソノメトリクス（Sonometrics）、オンタリオ、カナダ）を胃の洞部分に置いた。水晶振動子はウェットボンド組織接着剤（WETBOND TISSU ADHESIVE）（スリーエム（3M）、セントポール（St. Paul）、ミネソタ州）で結合させた。
【０２０９】
10mlの1mM アセチルコリンを2つの水晶振動子の間の胃に局所的に適用すると、2つの水晶振動子の間の距離の迅速であるが一過性の上昇を引き起こした。1mMのノルエピネフリン（NE）10mlは、2つの水晶振動子の間の距離の低下を引き起こした。NE誘導性低下の強度は、アセチルコリン誘導性の距離の上昇の約50％であった。両方の応答とも一過性であった。
【０２１０】
水晶振動子の間に局所適用した陰性対照の10mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）は、何の効果もなかった。
【０２１１】
14アミノ酸のzsig33ペプチド（zsig33-1、実施例4に示す）をPBSに溶解し、10mlを最終濃度1μg、10μgまたは100μgになるように適用した。1μgのzsig33ペプチドは、水晶振動子距離の持続的な律動性の上昇と低下を誘導した。この作用は用量依存性のようであり、10μgと100μgを試験した時、収縮の速度と強度の両方で応答が増強された。
実施例11
グルコース吸収に対するzsig33の効果
約6週齢の8匹のメスのob/obマウス（ジャクソンラボズ（Jackson Labs）、バーハーバー（Bar Harbor）、 メイン州）を、毎日4時間の摂食スケジュールに2週間馴化させた。摂食スケジュールで2週間後、摂食期間の後（食後）に、100μlの無菌の0.1％ BSA中の100μgのzsig33ペプチド（zsig33-1、実施例4に示す）を胃管栄養法により、マウスに投与した（食後）。30分後、マウスに0.5ml容量の25％グルコースを経口的に刺激投与した。眼窩後方採血を行って、血清グルコースレベルを測定した。zsig33投与の前、経口グルコース刺激投与の前、およびグルコース刺激投与の1、2、4および20時間後に、血液を採取した。
【０２１２】
経口グルコース刺激投与の30分前に、zsig33ペプチド 100μgを経口投与すると、食後グルコース吸収の上昇が見られた。
実施例12
胃内容排出に対するzsig33の効果
絶食状態のオススプラーグ−ドーレイラット（ハーラン（Harlan）、インディアナポリス、インディアナ州）の胃を介するフェノールレッドの移送に対する、局所適用したzsig33ペプチド（配列番号2のアミノ酸24〜37）の効果を評価した。ラット（6匹、8週齢）を24時間絶食した後、ウレタン（0.5ml/100ｇの25％溶液）で麻酔した。麻酔後、動物に1mlのフェノールレッド溶液（2％メチルセルロース溶液中50μg/ml）を経口胃管栄養法により投与した。
【０２１３】
各動物の胃を小さな腹部切開により露出させ、胃管栄養法後5分に、胃に1μgのzsig33ペプチドまたはスクランブル配列ペプチドの14アミノ酸対照を局所適用した。胃に残存するフェノールレッドの量を、胃管栄養法後30分に抽出胃内容物の光学密度を測定することにより、測定した。
【０２１４】
zsig33ペプチドはスクランブルペプチドと比較して、胃に残存するフェノールレッドの量を約25％低下させ、zsig33ペプチドがこれらのラットで胃内容排出を増強させることを示している。
実施例13
体重、食物摂取、およびグルコースクリアランスに対するzsig33の効果
8週齢の16匹のメスob/obマウス（ジャクソンラボズ（Jackson Labs）、バーハーバー（Bar Harbor）、 メイン州）を、毎日4時間の特別摂食スケジュールに2週間馴化させた。動物に毎日午前7:30〜11:30に食事を自由に与えた。摂食スケジュールで2週間後、マウスを8匹の2群に分けた。1つの群に100mlの無菌0.1％ BSQA中の1.0μg/マウスのzsig33-1（14アミノ酸ペプチド）と他のビヒクル（14アミノ酸スクランブルド配列ペプチド）を経口胃管栄養法により、食事の直前と4時間の摂食期間の最後に与えた。マウスに1日2回14日間注射し、この間、食物摂取と体重を毎日測定した。14日目に、zsig33-1ペプチドの2回目の経口胃管栄養法直後に、マウスに0.5ml容量の25％グルコースを経口的に刺激投与した。眼窩後方出血を行って、zsig33-1ペプチドまたはビヒクル投与の直前（t=30分）、および経口グルコース刺激投与の0、1、2、4時間後に血清グルコースレベルを測定した。
【０２１５】
結果は、1μg/マウスで経口投与したzsig33-1は、毎日の体重または食物摂取測定値に、または14日目に測定するとグルコースクリアランスに全く影響がなかった。
実施例14
食物摂取と体重に対するアンタゴニストの効果
zsig33ウサギポリクローナル抗体（実施例8を参照）または適切な対照タンパク質を、マウスまたはラットに末梢的に注入する。記載の時点で、食物摂取活性、体重、脂肪体サイズ、および循環グルコース、インスリン、レプチンおよびzsig33レベルの変化について動物を追跡する。任意の行動変化も記録する。
【０２１６】
自由に食物を与えられた食事誘導性肥満（DIO）マウス、またはカロリー制限によりある程度の体重低下のあったマウスを抗体で処理し、4週間の間自由に食物を与える。食物摂取、体重および血液化学物質を、治療前、治療後2および4週間に追跡する。
【０２１７】
これらの動物からのマウス組織を将来の組織学的分析のために保存する（n=10／群）。
【０２１８】
遺伝的に肥満に罹りやすいマウスの1つの系統（ob、db、他）を選択し、上記したものと同じ処理と評価を行う（各群 n=10）。
【０２１９】
8時間の絶食を受けたマウスまたはラットを2時間の再給餌に付す。絶食状態の最後の2または4時間前に、ビヒクル（対照タンパク質）後または抗zsig33注入後に、動物を追跡する。2時間の再給餌期間中に消費された食物量を測定し、ビヒクル処理動物と比較する。まず、zsig33に対する親和性精製したウサギのポリクローナル抗体が使用される。抗zsig33と平行して、適当な陰性対照抗体を試験する。
【０２２０】
マウス抗zsig33モノクローナル抗体による効果を同じ方法で測定する。
実施例15
アシル化ペプチド合成
配列番号16に示すペプチドの1つ以上のセリン残基を、n-オクタン酸側鎖を含むように修飾する。配列番号16の3位のセリンのヒドロキシル基以外のすべてのアミノ酸を保護して、Fmoc化学によりペプチドを合成する。樹脂に結合したまま、このセリンのヒドロキシル基は、4-(ジメチルアミノ）ピリジン（フルカ（Fluka）、ブクス（Buchs）、スイス）の存在下1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ピアスケミカル（Pierce Chemical）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ州）の作用によりn-オクタン酸（ティーシーアイアメリカ（TCI America）、ポートランド、オレゴン州）でアシル化される。アシル化後、樹脂からペプチドを切断し、保護基を除去する。次にペプチドを逆相HPLCにより精製する。
実施例16
Zsig33とモノクローナル抗体
4匹のメスのスプラーグ−ドーレイラット（チャールズリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories）、ウィルミントン（Wilmington）、マサチューセッツ州）を精製組換えタンパク質で免疫して、ラットモノクローナル抗体を調製する。各ラットに、完全フロイントアジュバント（ピアス（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）中の精製組換えタンパク質25μgの初期腹腔内（IP）注射により投与し、次に不完全フロイントアジュバント中の10μgの精製組換えタンパク質の追加免疫IP注射を2週間毎に行う。第2の追加免疫注射投与の7日後に、動物から採血し、血清を採取する。
【０２２１】
Zsig33特異的ラット血清試料を、特異抗体標的として1μg/mlの精製組換えタンパク質Zsig33を使用してELISAにより解析する。
【０２２２】
1匹の高力価ラットから脾細胞を採取して、単一融合法でPEG1500を使用してSP2/0（マウス）ミエローマ細胞と融合させる（4:1 融合比、脾細胞対ミエローマ細胞、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、E. HarlowとD. Lane, コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press））。融合後の9日間の増殖後、特異抗体産生ハイブリドーマを、特異抗体標的としてヨウ素125標識組換えタンパク質Zsig33を使用して放射免疫沈降法（RIP）により、および特異抗体標的として500ng/mlの組換えタンパク質Zsig33を使用してELISAにより同定する。いずれかの測定プロトコールで陽性のハイブリドーマプールを、GHS-Rの受容体配列を発現するBaF3細胞に対する精製組換えタンパク質Zsig33の細胞増殖活性を阻止する能力（「中和測定法」）について、さらに分析する。
【０２２３】
RIPのみにより、またはRIPと「中和測定法」により陽性結果を与えるハイブリドーマプールを、限界希釈により少なくとも2回クローン化する。
【０２２４】
組織培養培地から精製したモノクローナル抗体を、受容体配列を発現するBaF3細胞に対する精製組換えタンパク質Zsig33の細胞増殖活性（「中和測定法」）を阻止する能力について性状解析する。こうして「中和」モノクローナル抗体を同定する。
【０２２５】
以上より、本発明の具体例を例示目的に説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であることが理解される。従って本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【配列表】
2006502227000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月20日(2004.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GHS-Rを発現する細胞のシグナル伝達を阻害する方法であって、
GHS-Rを発現する細胞を用意し；
配列番号2の残基24〜37を含むペプチドを用意し；
当該ペプチドに特異的に結合する抗体を当該ペプチドに接触させ、こうして当該ペプチドは当該抗体に結合させ；
かつここで当該抗体への当該ペプチドの結合は前記細胞のシグナル伝達を阻害することを含む方法。
【請求項２】
それが必要な哺乳動物の体重を低下させる方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の体重を低下させることを含む方法。
【請求項３】
それが必要な哺乳動物の脂肪沈着を低下させる方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の脂肪沈着を低下させることを含む方法。
【請求項４】
それが必要な哺乳動物の食欲を抑制する方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の食欲を抑制させることを含む方法。
【請求項５】
それが必要な哺乳動物の下垂体細胞中の成長ホルモン分泌を阻害する方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして哺乳動物の下垂体細胞中の成長ホルモン分泌を阻害することを含む方法。
【請求項６】
それが必要な哺乳動物の代謝障害を治療する方法であって、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
こうして代謝障害を改善させることを含む方法。
【請求項７】
神経フィードバックが必要な代謝障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、ここで代謝障害は、
満腹調節；
グルコース代謝；および
神経障害関連消化管障害、からなる群から選択され、
そしてこの方法は、
抗体を哺乳動物に投与し；
当該抗体に配列番号2の残基24〜37を含むポリペプチドを接触させ；
ここで当該抗体は当該ポリペプチドに特異的に結合し；そして
当該ペプチドを当該抗体に特異的に結合させることを含む方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号16に示すアミノ酸配列からなる、請求項2、3、4、5、6、または7の方法。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである、請求項2、3、4、5、6、または7の方法。
【国際調査報告】
2006502227.tif 000005