(57)【要約】本発明は、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させることができ並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止することができる栄養サプリメント及び経口的に投薬可能な薬物製剤の製造に於ける、食用油及び／又は食用脂肪、特にオリーブ油、カノラ油及び魚油中に溶解又は分散させた、ジアシルグリセロール（群）（ＤＡＧ）、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）（ＰＳＥ）の組合せを含有する組成物の使用に関する。更に、本発明の組成物及びその薬物製剤は、アテローム硬化症、例えば、心血管疾患（ＣＶＤ）、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）及び真性糖尿病の病状の治療及び予防のために適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、ジアシルグリセロール（群）（ＤＡＧ）、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）（ＰＳＥ）の組合せを含有する、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための食用組成物を含有する、食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項２】
前記油が、天然油及び／又は食用油、好ましくは、オリーブ油、大豆油、ひまわり油、サフラワー油、カノラ油、パーム油、アボカド油、ゴマ油及び魚油、更に好ましくは、オリーブ油、カノラ油又は魚油である、請求項１記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項３】
前記脂肪が、全ての天然脂肪、好ましくは、バター脂肪、無水乳脂肪、カカオバター及びラードである、請求項１記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項４】
ＤＡＧの脂肪酸残基が、それが誘導される油の脂肪酸残基、例えば、オレイン酸残基、パルミチン酸残基、パルミトレイン酸残基、ステアリン酸残基、リノール酸残基、リノレン酸残基及びエイコサン酸残基に対応する、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項５】
前記フィトステロールエステル（群）が、スチグマステロール、シトステロール、β−シトステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、５−アベナステロール並びにこれらの異性体及び誘導体の脂肪酸エステルである、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項６】
前記組成物に、更に、従来の栄養組成物の成分が含有されている、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項７】
前記組成物中のジアシルグリセロール（群）とフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）との間のモル比が、１：５〜５：１である、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項８】
前記組成物中のジアシルグリセロール（群）の量が、少なくとも１重量％である、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項９】
前記組成物中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、少なくとも１重量％である、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項１０】
前記組成物中のジアシルグリセロール（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは７〜４８重量％であり、そして前記組成物中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％である、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項１１】
前記組成物が、オリーブ油、カノラ油及び魚油の何れか一種中に溶解又は分散された、１５重量％のＤＡＧ、主として１，３−ＤＡＧ（群）及び２５重量％の全ＰＳＥ（群）からなる、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項１２】
心血管異常症及びこれに関連する疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム硬化症及び真性糖尿病、特にＩＩ型糖尿病のような他の疾患によって誘発される又は顕示される心血管異常症を治療及び／又は予防するための、前記請求項の何れか１項記載の食物栄養剤又は食品サプリメント。
【請求項１３】
食用油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、ジアシルグリセロール（群）（ＤＡＧ）、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）及びフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）（ＰＳＥ）の組合せを含有し、そして任意に、更に、薬物的に許容される添加物、希釈剤、賦形剤及び／又は担体を含有する、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための、経口的に投薬可能な薬物組成物。
【請求項１４】
心血管異常症及びこれに関連する疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム硬化症及び真性糖尿病、特にＩＩ型糖尿病のような他の疾患によって誘発される又は顕示される心血管異常症の治療及び／又は予防のための、請求項１３記載の薬物組成物。
【請求項１５】
前記油が、天然油及び／又は食用油、好ましくは、オリーブ油、大豆油、ひまわり油、サフラワー油、カノラ油、パーム油、ゴマ油、アボカド油及び魚油、好ましくは、オリーブ油、カノラ油又は魚油である、請求項１３及び１４の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項１６】
前記脂肪が、全ての天然脂肪、好ましくは、バター脂肪、カカオバター、無水乳脂肪及びラードである、請求項１３記載の薬物組成物。
【請求項１７】
前記ＤＡＧの脂肪酸残基が、それが誘導される油の脂肪酸残基、例えば、オレイン酸残基、パルミチン酸残基、パルミトレイン酸残基、ステアリン酸残基、リノール酸残基、リノレン酸残基及びエイコサン酸残基に対応する、請求項１３〜１６の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項１８】
前記フィトステロールエステル（群）が、スチグマステロール、シトステロール、β−シトステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、５−アベナステロール並びにこれらの異性体及び誘導体の脂肪酸エステルである、請求項１３〜１７の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項１９】
前記組合せ中の、ジアシルグリセロール（群）とフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）との間のモル比が、１：５〜５：１である、請求項１３〜１８の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項２０】
前記組合せ中のジアシルグリセロール（群）の量が、少なくとも１重量％である、請求項１３〜１９の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項２１】
前記組合せ中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、少なくとも１重量％である、請求項１３〜２０の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項２２】
前記組合せ中のジアシルグリセロール（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは７〜４８重量％であり、そして前記組合せ中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％である、請求項１３〜２１の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項２３】
コレステロール及びトリグリセリドの血液レベルを低下させ及び／又はＬＤＬ酸化を低下させるための、オリーブ油中に溶解又は分散された、１５重量％のＤＡＧ（群）、主として１，３−ＤＡＧ（群）及び２５重量％の全ＰＳＥ（群）から実質的になる薬物組成物であって、前記組成物が、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための効果を有することによって特徴付けられる薬物組成物。
【請求項２４】
心血管異常症及びこれに関連する疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム硬化症及び真性糖尿病、特にＩＩ型糖尿病のような他の疾患によって誘発される又は顕示される心血管異常症の治療及び／又は予防のための、請求項１３〜２３の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項２５】
コレステロール及びトリグリセリド血液レベル、血清酸化ストレス、マクロファージによる酸化ＬＤＬ摂取、マクロファージ酸化状態、泡沫細胞生成及び脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響の何れか一個の低下及び／又は予防のための、請求項１３〜２４の何れか１項記載の薬物組成物。
【請求項２６】
コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための、経口的に投薬可能な薬物組成物の製造に於ける、食用油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、ＤＡＧ（群）、主として１，３−ＤＡＧ（群）及びＰＳＥ（群）の組合せ、そして任意に、更に、薬物的に許容される添加物、希釈剤、賦形剤及び／又は担体を含有する組成物の使用。
【請求項２７】
前記組合せ中の、ジアシルグリセロール（群）とフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）との間のモル比が、１：５〜５：１である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記組合せ中のジアシルグリセロール（群）の量が、少なくとも１重量％である、請求項２６及び２７の何れか１項記載の使用。
【請求項２９】
前記組合せ中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、少なくとも１重量％である、請求項２６〜２８の何れか１項記載の使用。
【請求項３０】
前記組合せ中のジアシルグリセロール（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは７〜４８重量％であり、そして前記組合せ中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％である、請求項２６〜２９の何れか１項記載の使用。
【請求項３１】
コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための、経口的に投薬可能な薬物組成物の製造に於ける、オリーブ油中に溶解又は分散された、１５重量％のＤＡＧ（群）、主として１，３−ＤＡＧ（群）及び２５重量％の全ＰＳＥ（群）から実質的になる組合せの使用。
【請求項３２】
機能性食品、機能性飲料及び食物サプリメントの何れか一種の製造に於いて使用するための、請求項１〜１２の何れか１項記載の食品サプリメント。
【請求項３３】
高いコレステロール及びトリグリセリド血液レベル、血清酸化ストレス、マクロファージによるｏｘ−ＬＤＬ摂取、マクロファージ酸化状態、泡沫細胞生成及び脂質誘導酸化ストレスの何れか一個に関する状態の治療及び／又は予防方法であって、必要な被検者に、治療的に有効量の請求項１〜１２記載の食品サプリメント又は請求項１３〜２５記載の組成物を投薬することからなる方法。
【請求項３４】
心血管異常症及びこれに関連する疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム硬化症及び真性糖尿病、特にＩＩ型糖尿病のような他の疾患によって誘発される又は顕示される心血管異常症の治療及び／又は予防のための、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
必要な被検者に、治療的に有効量の請求項１〜１２記載の食物栄養剤又は請求項１３〜２５記載の薬物組成物を投薬することからなる、健康の改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血清レベルを低下させることができ、またＬＤＬ抗酸化特性を示し、そして心血管疾患（ＣＶＤ）及び冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）の治療及び予防のために適している、栄養サプリメント及び経口的に投薬可能な薬物製剤の製造に於ける、食用油及び／又は食用脂肪中に溶解又は分散させた、ジアシルグリセロール（群）（ＤＡＧ）、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノール（ｐｈｙｔｏｓｔａｎｏｌ）エステル（群）（ＰＳＥ）の組合せを含有する組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本件特許出願を通して記載した全ての刊行物は、それらの中に引用されている全ての引用文献を含めて、ここに参照して完全に取り込まれる。
【０００３】
（アテローム硬化症のような）冠状動脈疾患は、西洋世界に於ける罹患率及び死亡率の主要原因であり、そしてその病因論には、動脈壁の細胞、血球及び血漿リポタンパク質の間の合併した相互作用が含まれる［Ｒｏｓｓ  Ｒ．、（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ  第３６２巻、第８０１−８０９頁；Ｇｌａｓｓ  Ｃ．Ｋ．及びＷｉｔｚｔｕｍ  Ｊ．Ｌ．、（２００１年）、Ｃｅｌｌ、第１０４巻、第５０３−５１６頁］。今日、コレステロールレベルを低下させることによって、心臓発作、卒中及びアテローム硬化症血管疾患の他の形態の危険性が減少することは常識である。更に、多くの最近の研究によって、酸化ストレスが、アテローム硬化症、癌及びその他の慢性疾患の病因論に於いて中心的役割を有する機構であることが示された。このシナリオに於いて、重要な役割は、酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）によって活性化される、内皮下腔内のマクロファージによって果たされる。最近、酸化ストレスに起因する内皮機能不全が、アテローム硬化症プラークの発達の過程に於けるプライミング因子（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）として同定された。
【０００４】
初期のアテローム硬化症病変は、コレステロール含有マクロファージから誘導される泡沫細胞によって特徴付けられる［Ｇｅｒｒｉｔｙ  Ｒ．Ｇ．、（１９８１年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、第１０３巻、第１８１−１９０頁；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  Ｔ．ら、（１９８０年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、第１００巻、第５７−８０頁］。マクロファージコレステロール蓄積及び泡沫細胞生成は、初期のじゅく腫形成の特徴であり、そしてこれらの細胞中のコレステロールの大部分は、血漿低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）から誘導される。しかしながら、天然のＬＤＬは、多量のマクロファージコレステロール蓄積を起こすために、幾らかの変性を受けなくてはならない［Ｂｒｏｗｎ  Ｍ．Ｓ．及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｌ．、（１９８３年）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５２巻、第２２３−２６１頁；Ｋａｐｌａｎ  Ｍ．及びＡｖｉｒａｍ  Ｍ．、（１９９９年）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、第３７巻、第７７７−７８７頁；Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．、（１９９３年）、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、第９８巻、第１−９頁；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ．ら、（１９８９年）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３２０巻、第９１５−９２４頁］。潜在的病理学的重要性を有する最も研究された変性は、ＬＤＬ酸化である［Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．、（１９９６年）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第３４巻、第５９９−６０８頁；Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．、（１９９５年）、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、第３１巻、第４１−２４９頁；Ｃｈｉｓｏｌｍ  Ｇ．Ｍ．及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ．、（２０００年）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第２８巻、第１８１５−１８２６頁］。この変性は、変性されたリポタンパク質の増加したマクロファージ摂取、続く脂質含有泡沫細胞の生成になる細胞コレステロール蓄積に至る［Ａｖｉｒａｍ、（１９９６年）、同書；Ａｖｉｒａｍ、（１９９５年）、同書；Ｃｈｉｓｏｌｍ、（２０００年）、同書、Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．、（１９９９年）、Ａｎｔｉｏｘ．Ｒｅｄｏｘ．Ｓｉｇｎａｌ、第１巻、第５８５−５９４頁］。
【０００５】
幾つかの報告が、酸化ストレスを、アテローム硬化症を引き起こす主要な因子として関係づけている［Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｗ．、（２００３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、第９１巻、第１２Ａ−１６Ａ頁；Ｃｅｃｏｎｉ，Ｃ．ら、（２００３年）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｏｉｐｈｙｓ．、第４２０巻、第２１７−２２１頁；Ｄｈａｌｌａ，Ｎ．Ｓ．ら、（２０００年）、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、第１８巻、第６５５−６７３頁］。酸化ストレスは、細胞膜との接触でもたらされ、そして生物学的分子、例えば、脂質、炭水化物、タンパク質及び核酸中で酸化的損傷に至り得る、フリーラジカル（ＦＲ）の過剰の結果として定義される［Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．Ｅ．及びＡｕｓｔ，Ｓ．Ｄ．、（１９８６年）、Ａｎｎ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．、第１５（９）巻、第１０７５−８３頁］。ＦＲによって攻撃され得る分子の一種は、ｏｘ−ＬＤＬを形成するＬＤＬであり、その高いレベルはアテローム硬化症に至る。
【０００６】
実験的及び臨床的研究に於ける増加しつつある証拠によって、酸化ストレスが、真性糖尿病の両タイプの病因論に於いて主要な役割を果たすことが示唆されている。反応性酸素種の過剰産生のための可能性のある原因は広範囲であり、これには、酵素経路、グルコースの自動酸化及びミトコンドリアが含まれる。これらのフリーラジカルの異常に高いレベル及び自動酸化防御機構の同時低下は、増加した脂質過酸化、細胞小器官及び酵素の損傷並びにＣＶＤの発達に至り得る。従って、糖尿病に於ける酸化ストレスの予防は、多数の研究者によって、糖尿病性血管疾患の発達に対する主要な防御であると考えられている。更に、幾つかの最近の研究は、酸化ストレスに於いて、ソルビタール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）経路の活性化、改良されたグリケーション（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）最終生成物（ＡＧＥ）及びＡＧＥ前駆体を、これらの患者に於いて、高血糖症ではなくて、ＣＶＤに至る基本的異常として指摘している［Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  Ｗ．Ｃ．、（２００１年）、Ｃｕｒｒ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｒｅｐ．、第３巻、第３８３−９１頁；Ｙｏｒｅｋ  Ｍ．Ａ．、（２００３年）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．、第３７巻、第４７１−８０頁；Ｍａｒｉｔｉｍ  Ａ．Ｃ．、（２００３年）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第１７巻、第２４−３８頁］。
【０００７】
パラオキソナーゼ（ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ）（ＰＯＮ１）は、ＨＤＬの成分として、血漿中に移送された糖タンパク質である。インビトロで、ＰＯＮ１がＬＤＬの酸化変性を阻害することが示された。従って、ＨＤＬ中のＰＯＮ１の存在は、これらのリポタンパク質の抗酸化特性の一定の比率を占めるであろう［Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｍ．Ｉ．ら、（１９９１年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第２８６巻、第１５２−１５４頁］。
【０００８】
アテローム硬化症のＬＤＬ酸化仮説は、おびただしい研究を、アテローム硬化症の可能な予防的治療としてのＬＤＬ酸化に対する抗酸化剤の役割に向けた。ＬＤＬの酸化に対する増加した耐性が、種々の合成薬剤による治療の後で観察されたけれども、ＬＤＬ酸化に対する抗酸化性防御を提供する、自然食品製品を同定するための努力がなされてきた。
【０００９】
オリーブ油がＬＤＬ酸化を阻害することが示され、この効果は、それの高いオレイン酸含有量並びに幾つかのフェノール系物質（ヒドロキシトルエン、オレオロペイン（ｏｌｅｏｒｏｐｅｉｎ））及びフィトステロール、例えばシトステロールに関連付けることができた［Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．及びＫａｓｅｍ  Ｅ．、（１９９３年）、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂｏｌ．、第３７巻、第７５−８４頁；Ｖｉｓｉｏｌｉ  Ｆ．ら、（１９９５年）、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、第１１７巻、第２５−３２頁］。
【００１０】
ＬＤＬ酸化に加えて、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）−環状動脈内のアテローム硬化症の結果−のための公知の危険因子には、高い血清ＬＤＬコレステロール濃度が含まれる。血清全コレステロール及びＬＤＬコレステロール濃度と、ＣＨＤの危険又はＣＨＤからの死亡率との間に、正の直線関係が存在する［Ｊｏｕｓｉｌａｈｔｕら、（１９９８年）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第９７巻、第１０８４−１０９４頁］。
【００１１】
血清トリアシルグリセロールの高い濃度は、また、ＣＨＤに寄与するであろう［Ａｕｓｔｉｎ，Ｍ．Ａ．、（１９８９年）、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、第１２９巻、第２４９−２５９頁］が、証拠はあまり明らかではない。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、健康なヒトに於いて、トリアシルグリセロールと比較して、血清トリアシルグリセロールレベルの食後上昇を下げることが示された［Ｔａｇｕｃｈｉら、（２０００年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．、第１９巻、第７８９−７９６頁］。４４ｇのＤＡＧ油の摂取後の血清トリグリセリド（ＴＧ）濃度は、４４ｇのＴＧ油の摂取後のものと比較して、食後六時間で著しく低かった。この差は、低い脂肪用量（１０ｇ及び２０ｇ）でも再現可能であった［Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｏｒｅａｕら、（２００２年）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４１巻、第４５７−５００頁］。
【００１２】
フィトステロールとＣＨＤ
用語「フィトステロール」は、植物ステロール及び植物スタノール（ｓｔａｎｏｌ）をカバーする。植物ステロールは、植物油の少量成分として食物中に存在する天然に生じる物質である。植物ステロールは、哺乳動物に於けるコレステロールのものと同様の、植物中に於ける役割、例えば、細胞膜構造を形成する役割を有する。ヒト栄養学に於いて、植物ステロール及び植物スタノールの両方は、全血漿コレステロールレベル及びＬＤＬ−コレステロールを下げる際に有効である。
【００１３】
植物ステロール及び植物スタノールの消費は、小腸からの、食事の及び内因的に産生されたコレステロールの吸収を阻害することによって、血液コレステロールレベルを低下させる。植物ステロール／スタノールは、非常に劣った吸収性の化合物である。この阻害は、植物ステロール及びスタノールの物理化学的特性に於ける、コレステロールに対する類似性に関連している。
【００１４】
植物ステロールの血液コレステロール低下効果は、３年もの長い期間、一日当たり２５グラムのように高い用量を使用する、２，４００を越える検体を含む大量の臨床的試行に於いて研究されてきた。数十年間の医学的に管理された臨床的効能試験又は植物ステロールの一般的臨床的使用を通して、顕著な悪影響は観察されなかった。更に、薬物シテリン（主としてβ−シトステロール）は、２０年間以上も処方され、そして優れた安全記録を有していた。
【００１５】
更に、植物ステロール及び植物スタノールの両方は、厳格な毒物学的評価に付されてきた。吸収、分布、代謝及び排泄での研究は、植物ステロールが腸から殆ど吸収されない（１〜１０％）ことを示した。
【００１６】
４週間の、８．６グラム以下の植物ステロール／日の摂取量での、スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）中の植物油植物ステロールエステルでの一連のヒト研究を実施した。臨床化学、血液学、腸微生物叢の細菌プロフィール及び一般的物理的条件を評価した。全ての他の研究に於けるように、悪影響は検出されなかった。
【００１７】
米国に於いて、独立専門家のパネルは、適切な食品グレード規格に適合し、そして現在の良好な製造実施（２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１８２．１（ｂ））によって製造された、植物油ステロールエステルは、２０％の植物ステロールエステルを超えない量で、植物油スプレッド中の成分として使用するために安全であると結論した。植物油ステロールエステルを、使用するために安全であるとして認定したこと、即ち、植物油ステロールエステルがＧＲＡＳ状態（安全であるとして一般的に認定された）として認可されたことが、有資格専門家と一緒のパネルの意見である。ＧＲＡＳ認可に基づいて、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０％以下の植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを含有する他のものを含有するスプレッドを使用することを許可した。同様の承認が、異なったヨーロッパ諸国並びにアジア及びオーストラリアで与えられた。
【００１８】
心疾患の促進又は予防に於ける食事の役割は、多数の研究の主題である。しかしながら、ＬＤＬ−コレステロール及びトリグリセリドレベルを下げ、そしてＬＤＬ酸化を阻害することができる、天然に生じる物質を使用することは、合成薬物の使用を超えて有利であろう。
【００１９】
最近の概説は、近年、機能性食品に於ける増大している関心と共に、血清コレステロールレベルを低下させるためにフィトステロールを使用することが、顕著な勢いを得てきたことを教示している［Ｓｔａｒｋ，Ａ．Ｈ．ら、（２００２年）、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第６０（６）巻、第１７０−１７６頁］。これは、とりわけ、フィトステロール含有食品、例えばマーガリンの商業的規模の生産をもたらす、脂肪酸によるフィトスタノールのエステル化（スタニルエステル（ｓｔａｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ））に起因すると考えるべきである。スタニルエステルと同様に、フィトステリルエステル（ステリルエステル）は、臨床研究に於いて、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）値に於いて変化が見られることなく、血清ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを着実に低下させる（約１０％以下又はそれ以上低下させる）ことが示された。この概説は、適切に配合された遊離フィトステロール及びスタノールが、ヒトに於いてＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる際に、スタニルエステル及びステリルエステルと同様に有効であろうことを示唆している。
【００２０】
国際特許出願公開第０１／３２０３５号明細書には、植物スタノールエステル及び／又は植物ステロールエステルを含有する、特別に高品質のオリーブ油（例えば、バージンオリーブ油）をベースにする、オリーブ油ベース製品が教示されている。
【００２１】
米国特許第５，８４３，４９９号明細書には、フェルラ酸エステル（フェルラ酸にエステル化されているフィトステロールエステル）、特にシトスタニルエステルを含有する、トウモロコシ繊維から抽出可能な油が開示されており、これは、コレステロール低下活性を有することが示された。トウモロコシ繊維油（約７３％の脂肪（トリアシルグリセロール）、８％のステロール（脂肪アシル）エステル、４％の遊離ステロール、６％のジアシルグリセロール及び６％のフェルラ酸エステル（ステロールエステル）を含有する）が、コレステロールレベルを低下させるための補助食品への添加物として使用されることが記載されている。
【００２２】
米国特許第６，３２６，０５０号明細書には、油又は脂肪、油又は脂肪中に溶解又は分散された、ジアシルグリセロール、遊離フィトステロール及びトコフェノロールからなる組成物が開示されている。この組成物は、コレステロール過剰血症個体の血液コレステロールを低下させる際に役割を果たす。上述の刊行物の何れにも、コレステロール血清レベル及びトリグリセリド血清レベルの両方の低下は記載されていない。
【００２３】
他の記載した植物油（例えば、トウモロコシ繊維油、食卓油、大豆油、菜種油、米ぬか油及びパーム油）とは対照的に、オリーブ油は、とりわけ、５５〜８５％のモノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、特にオレイン酸（これは、この油の高い栄養価に寄与する）からなっている。オリーブ油を使用することの、他の植物油を超えた幾つかの明確な利点が存在する。オリーブ油に富んだ食事は、高レベルのＭＵＦＡを含有しない従来の食事療法よりも、全コレステロール及びＬＤＬ−コレステロールを低下させる際に一層有効であることが示された［Ｂｒｏｗｎ  Ｍ．Ｓ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｌ．、（１９８３年）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５２巻、第２２３−２６１頁］。
【００２４】
更に、オリーブ油は、地中海性食の不可欠成分であり、蓄積データは、これが、冠状動脈性心疾患の危険因子の減少、数種の癌の予防並びに免疫性及び炎症性応答の変性を含む、健康利点を有するであろうことを示唆している［Ｂｒｏｗｎ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（１９８３年）、同書］。
【００２５】
本件特許出願人の、出願係属中のイスラエル特許出願第１４７９４２号明細書には、油及び／又は脂肪中に分散された、ジアシルグリセロール（群）、主として１，３−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）（ＰＳＥ）を含有する物質組成物が記載されている。
【００２６】
組み合わせ効果栄養サプリメント及び／又は薬物についての調査に於いて、本発明者らは、ＩＬ第１４７９４２号明細書の該混合物、即ち、油及び／又は脂肪中のジアシルグリセロール（群）、主としてＤＡＧ及びＰＳＥの組合せが相乗効果を有し、そして血液中のＬＤＬ−コレステロール及びトリグリセリドレベルの両方を低下させることを見出した。この組成物は、更に、ＣＨＤ及び動脈疾患のための危険性の低下になる、増加した血清及びマクロファージ抗酸化特性、特にＬＤＬ抗酸化特性を示すことができる。これらの新規な治療的使用は、本発明の主な目的である。
【００２７】
本発明の更なる目的は、油中に該二種の成分（ＤＡＧ及びＰＳＥ）のそれぞれを別々に使用することによって得られる、コレステロール及びトリグリセリドレベルの組み合わせた低下と比較して、より大きい程度まで血液コレステロールレベルを低下させることが見出された該組成物の投薬によって、血液コレステロール及びトリグリセリドのレベルを低下させ、その結果、哺乳動物に於けるＣＨＤについての危険性を低下させることである。このような相乗効果は、先行技術には記載もされず、示されてもいなかった。前記のように、米国特許第６，３２６，０５０号明細書は、ジアシルグリセロール及び遊離フィトステロールの組合せに言及している。この特許には、ジアシルグリセロールの量が８０重量％を超えるとき、脂質代謝への相乗効果が期待できることが記載されているけれども、このような効果は、この特許には示されてもおらず、検討もされていない。
【００２８】
これに関して、本発明に従って、増加した抗酸化特性と一緒に、コレステロール血清レベル及びトリグリセリド血清レベルの両方を低下させる効果が、僅かに２０重量％のＤＡＧ及び１１重量％のフィトステロールエステルを含有する組成物を適用するときでも観察されることを強調することができる。
【００２９】
本発明の更なる目的は、食物／栄養サプリメント（食品添加物）として又は薬物剤形で、該組成物を使用することである。
【００３０】
本発明のこれらの及びその他の目的は、説明の進行と共に明らかになるであろう。
【特許文献１】国際特許出願公開第０１／３２０３５号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、食用油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、ＤＡＧ、主として１，３−ＤＡＧ（群）及びＰＳＥの組合せを含有する、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための食用組成物を含有する、食物栄養剤又は食品サプリメントに関する。この組合せは、該食用油及び／又は脂肪中にそのように溶解又は分散させたとき、また、本明細書に於いてマルトオイル（ＭｕｌｔＯｉｌ）として参照される。
【００３２】
該組成物中に含有される油は、どのような天然油、例えば、オリーブ油、大豆油、ひまわり油、サフラワー油、カノラ油、ゴマ油、パーム油、アボカド油又は魚油であってもよい。好ましくは、この油はオリーブ油、カノラ油又は魚油である。
【００３３】
該組成物中に含有される脂肪は、どのような適切な脂肪、例えば、バター脂肪、カカオバター、無水乳脂肪又はラードであってもよい。
【００３４】
該組成物中のＤＡＧの脂肪酸残基は、使用した油の脂肪酸残基に対応することができる。代表的残基は、オレイン酸残基、パルミチン酸残基、パルミトレイン酸残基、ステアリン酸残基、リノール酸残基、リノレン酸残基、ドコサヘキサエン酸残基、エイコサペンタエン酸残基及びエイコサン酸残基である。
【００３５】
該組成物中のフィトステロールエステル（群）は、どのような脂肪酸エステル、例えば、これらに限定されないが、スチグマステロール、シトステロール、β−シトステロール、ブラシカステロール（ｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌ）、カンペステロール、５−アベナステロール並びにこれらの異性体及び誘導体の、オレイン酸及びパルミチン酸エステルであってもよい。
【００３６】
本発明に従った食物栄養剤又は食品サプリメントに於いて、該組成物には、更に、従来の栄養組成物の成分が含有されていてよい。
【００３７】
好ましい態様に於いて、本発明の食物栄養剤又は食品サプリメントに含まれる組成物に於いて、ジアシルグリセロール（群）とフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）との間のモル比は、約１：５〜約５：１である。
【００３８】
該組成物中のジアシルグリセロール（群）の量は、好ましくは少なくとも１重量％であり、そしてフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量は、好ましくは少なくとも１重量％である。
【００３９】
特別の態様に於いて、本発明は、該組成物中のジアシルグリセロール（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは７〜４８重量％であり、そして該組成物中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量が、１〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％である、該食物栄養剤又は食品サプリメントに関する。
【００４０】
他の好ましい態様に於いて、本発明は、該組成物が、オリーブ油中に溶解又は分散された、１５重量％のＤＡＧ、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）及び２５重量％の全ＰＳＥからなる、該食物栄養剤又は食品サプリメントに関する。代表的組成物に於いて、フィトステロールエステルは、約０．４重量％のブラシカステロールエステル、３．１重量％のカンペステロールエステル、２．０重量％のスチグマステロールエステル、５．３重量％のβ−シトステロールエステル、０．２重量％のアベナステロールエステルからなり、そしてＤＡＧには、下記の脂肪酸残基、即ち、オレイン酸（６５重量％）、パルミチン酸（１５重量％）、リノール酸（１０重量％）並びに１０重量％の、パルミトレイン酸、ステアリン酸、リノレン酸及びアラキジン酸を含む脂肪酸残基が含有されている。特別の態様に於いて、該組成物は、オリーブ油中に溶解又は分散された、１５重量％のＤＡＧ、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）及び２５重量％の全フィトステロールエステル（群）（ＰＳＥ）からなる。
【００４１】
本明細書に於いて参照するとき、用語「食物栄養剤」は、また、食品物品又は食品製品に関する。
【００４２】
第二の面に於いて、本発明は、食用油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、ＤＡＧ、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）及びＰＳＥの組合せを含有し、そして任意に、更に、薬物的に許容される添加物、希釈剤、賦形剤及び／又は担体を含有する、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための、経口的に投薬可能な薬物組成物に関する。
【００４３】
本発明の薬物組成物に於いて、該組合せ中のジアシルグリセロール（群）とフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）との間のモル比は、好ましくは、約１：５〜約５：１である。
【００４４】
本発明の薬物組成物に於いて、該組合せ中のジアシルグリセロール（群）の量は、少なくとも１重量％である。
【００４５】
更に、本発明の薬物組成物に於いて、該組合せ中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量は、好ましくは少なくとも１重量％である。
【００４６】
特別の態様に於いて、本発明の薬物組成物中に含まれる組合せは、１〜９９重量％、好ましくは７〜４８重量％の量のジアシルグリセロール（群）からなり、そして該組合せ中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量は、１〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％である。
【００４７】
他の特別の態様に於いて、本発明の薬物組成物は、オリーブ油中に溶解又は分散された、１５重量％のＤＡＧ、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）及び２５重量％の全ＰＳＥから実質的になる。この組成物は、血液コレステロールレベル及びトリグリセリドレベルの低下への効果を示す。代表的組成物に於いて、フィトステロールエステルは、０．４重量％のブラシカステロールエステル、３．１重量％のカンペステロールエステル、２．０重量％のスチグマステロールエステル、５．３重量％のβ−シトステロールエステル及び０．２重量％のアベナステロールエステルからなる。ＤＡＧ（群）には、オレイン酸残基（６５重量％）、パルミチン酸残基（１５重量％）、リノール酸残基（１０重量％）並びに１０重量％の、主としてパルミトレイン酸残基、ステアリン酸残基、リノレン酸残基及びアラキジン酸残基である他の脂肪酸残基が含有されている。
【００４８】
本発明の薬物組成物は、心血管異常症及びこれに関連する疾患、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム硬化症及び真性糖尿病、特にＩＩ型糖尿病のような他の疾患によって誘発される又は顕示される心血管異常症並びに脂質関連酸化ストレス又はリポタンパク質及びマクロファージじゅく腫形成性に付随する全ての異常症の治療及び／又は予防のために特に適している。
【００４９】
別の面に於いて、本発明は、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための、経口的に投薬可能な薬物組成物の製造に於ける、食用油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、ＤＡＧ、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）及びＰＳＥの該組合せ、そして任意に、更に、薬物的に許容される添加物、希釈剤、賦形剤及び／又は担体を含有する組成物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
下記の略語を明細書中で使用する。
【００５１】
カノラマルトオイル（マルトオイル−ｃ）：ベースがカノラ油であるマルトオイル。
【００５２】
ＣＨＤ：冠状動脈性心疾患
ＣＶＤ：心血管疾患
ＤＡＧ：ジアシルグリセロール（群）、主として１，３−ジアシルグリセロール
ＤＨＡ：ドコサヘキサン酸
魚マルトオイル（マルトオイル−ｆ）：ベースが魚油であるマルトオイル
ＨＢＳＳ：ハンクスの平衡塩類溶液
ＨＤＬ：高密度リポタンパク質
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質
ＭＰＭ：マウス腹膜マクロファージ
マルトオイル： 油及び／又は脂肪ベース中の、ジアシルグリセロール（群）、主として１，３−ジアシルグリセロール（群）とフィトステロール及び／又はフィトステロールエステルの組合せ
オリーブマルトオイル（マルトオイル−ｏ）：ベースがオリーブ油であるマルトオイル
ｏｘ−ＬＤＬ：酸化されたＬＤＬ
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩水
ＰＳＥ：フィトステロール又はフィトスタノールエステル（群）。
【００５３】
本発明は、動物モデル系アポＥ０マウスを使用し、この場合、重いコレステロール過剰血症及びアテローム硬化症プラークが、プラシーボ及び／又はカノラ油と比較して、本明細書に於いてマルトオイル−ｏ、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆとして参照される新規な食物組成物の抗アテローム硬化症特性を評価するために、初期齢で発生される。
【００５４】
前記のように、本発明者らは、油及び／又は脂肪中のＤＡＧ、主として１，３−ＤＡＧ及びＰＳＥの組合せ（マルトオイルとも言う）が、血液中のＬＤＬ−コレステロール及びトリグリセリドレベルの両方を低下させることによって、増強された効果をもたらすことを見出した。この組合せ及びこれを含有する組成物は、更に、増加した、血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ抗酸化特性を示し、並びに、泡沫細胞の生成を阻害し及び／又は脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止し、ＣＨＤ及び動脈関連疾患、例えば糖尿病についての危険性の低下になる。
【００５５】
該組合せのためのベースとして使用される油に依存して、それが、オリーブ、カノラ又は海洋起源のものである場合、本発明の組合せは、本明細書を通して、それぞれマルトオイル−ｏ（オリーブマルトオイル）、マルトオイル−ｃ（カノラマルトオイル）又はマルトオイル−ｆ（魚マルトオイル）として参照される。
【００５６】
従って、本発明は、主として、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させることができる並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止することができる、薬剤としてジアシルグリセロール並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）を含有する組合せの新規な使用に関する。
【００５７】
実施例及び図面に示すように、種々のマルトオイルは、動物モデル系に於いて、プラシーボ治療と比較して、血液トリグリセリド及びコレステロールのレベルを実質的に低下させることができた。
【００５８】
本発明によって使用された組合せは、食用油及び／又は脂肪中に分散された、フィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）並びにジアシルグリセロール（群）、主として１，３−ジアシルグリセロールから本質的になる。更に特に、この組合せには、該油及び／又は脂肪中に溶解又は分散された、少なくとも１重量％のジアシルグリセロール（群）並びに少なくとも１重量％のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）が含有されている。
【００５９】
油及び／又は脂肪中に含有されているジアシルグリセロール（群）の量は、１重量％〜約９９重量％、好ましくは約７重量％〜約４８重量％、最も好ましくは約１０重量％〜約２２重量％の範囲内であってよい。
【００６０】
油中に含有されているフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）の量は、１重量％〜約９９重量％、好ましくは約５重量％〜約５０重量％、最も好ましくは約２０重量％〜約３５重量％の範囲内であってよい。
【００６１】
ジアシルグリセロール（群）は、主として不飽和脂肪酸残基を含有する１，３−ジアシルグリセロール（群）から実質的になる。ジアシルグリセロール（群）の構造は、フィトステロールエステル（群）を溶解又は分散させるために使用される特別の油及び／又は脂肪に依存する。例えば、オリーブ油を使用するとき、ジアシルグリセロールは、主として、１，３−ジオレイルグリセロールからなる。一般的に言って、ＤＡＧの脂肪酸成分には、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸及びエイコサン脂肪酸が含まれる（ＤＡＧは、１，２−ジオレイル、１，３−ジオレイル、１，２−オレイルパルミトイル及び１，３−オレイルパルミトイルグリセロールである）。
【００６２】
フィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）は、どのようなフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステルであってもよい。このようなエステルの例は、スチグマステリルオレエート、スチグマステリルパルミテート、シトステリルオレエート、シトステリルパルミテート、ベータシトステリルオレエート及びベータシトステリルパルミテートである。
【００６３】
油中のフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）のジアシルグリセロール（群）に対するモル比は、約５：１〜約１：５、好ましくは約２：１である。
【００６４】
本発明の組成中に含有される油は、これらに限定されないが、オリーブ油、大豆油、ひまわり油、サフラワー油、カノラ油、ゴマ油、パーム油、アボカド油又は魚油を含む、どのような食用油であってもよい。好ましくは、この油はオリーブ油、カノラ油又は魚油の少なくとも一種である。本発明の組成物中に含有される脂肪は、どのような適切な脂肪、例えば、バター脂肪、無水乳脂肪、カカオバター及びラードのような動物脂肪又は魚油濃縮物であってもよい。
【００６５】
ジアシルグリセロール（群）は、全ての従来式の酵素的又は非酵素的方法によって得ることができる。好ましくは、これらは、油及び／又は脂肪中に存在するフィトステロール（群）とトリグリセリド（群）との間のエステル交換反応によって得られる。フィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）は、全ての従来式の酵素的又は非酵素的方法によって得ることができる。好ましくは、これは、食用油又は脂肪中に存在するフィトステロール（群）及び／又はフィトスタノールとトリグリセリド（群）との間のエステル交換反応によって得られる。本発明によって使用される組合せを得るための方法は、該ＩＬ第１４７９４２号明細書（参照してここに全部取り込まれる）に詳細に記載されている。ＩＬ第１４７９４２号明細書に記載されているように、本発明の組成物は、また、所望量のジアシルグリセロール（群）並びにフィトステロール及び／又はフィトスタノールエステル（群）を、油及び／又は脂肪と混合（又はブレンド）することによって製造することができる。
【００６６】
下記の実施例に示されているように、血清ｏｘ−ＬＤＬ及びマクロファージ酸化を防止及び／又は減少する際に、試験した組成物の顕著な効果が得られた。従って、血液ＬＤＬ−コレステロール及びトリグリセリドレベルの低下への効果を有することに加えて、該組合せ及びこれを含有する組成物は、血清ＬＤＬ及びマクロファージ抗酸化特性を示す。実施例は、更に、オリーブ油、カノラ油及び／又は魚油マルトオイル製剤が、泡沫細胞の生成を阻害し及び／又は脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止する、顕著な抗酸化特性を示したことを示す。
【００６７】
特に、図５、７、８及び９は、異なったマルトオイル製剤が、下記の酸化ストレスパラメーター、即ち、血清酸化ストレス、腹膜マクロファージによるｏｘ−ＬＤＬ摂取、マクロファージ酸化状態並びにマクロファージからのＰＭＡ誘発スーパーオキシドアニオン放出をどのように下げることができるかを示す結果を表している。
【００６８】
本発明者らは、また、血清中のＰＯＮ１活性を測定した。ＰＯＮ１は、ｏｘ−ＬＤＬを除くことができるＨＤＬ会合エステラーゼである。興味深いことに、図６の結果は、カノラ油はＰＯＮ１活性を低下させるけれども、本発明のマルトオイル組合せは、ＰＯＮ１をより高いレベルに維持できたことを示し、本発明が、アテローム硬化症環境に於いてＰＯＮ１活性を保護できることを示唆している。
【００６９】
マルトオイル組合せは、それ自体食品物品として使用することができる。その代わりに、これは、更に任意に、食品工業で使用されている一般的な添加物、例えば、保存剤、着色剤、矯味矯臭剤、香料、酸化防止剤及び硬化剤、ビタミン、カルシウム、他のミネラル微量元素、プロバイオティック剤（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、イソフラボン、カロリー剤などを含有してよい、食品物品又はサプリメントの成分であってよい。
【００７０】
更に、本発明の食品サプリメントは、機能性食品、機能性飲料又は食物サプリメントの何れか一種の製造に於いて使用することができる。該食品サプリメントは、該食品、飲料又は食物サプリメントの中に、それらの製造の間にそれを混合、添加又は含有させることによって導入することができる。
【００７１】
その代わりに、この組合せは、コレステロール及びトリグリセリドの両方の血液レベルを低下させるための並びに／又は血清、血清ＬＤＬ及びマクロファージ酸化レベルを低下させ、泡沫細胞の生成を阻害し及び／若しくは脂質誘導酸化ストレスにより生じる有害な影響を防止するための、薬物組成物の活性成分として含有させることができる。薬物組成物には、薬物的に許容される添加物、希釈剤、賦形剤及び担体が含有されていてよい。
【００７２】
薬物組成物の製剤は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，７３６，５１９号明細書、米国特許第５，７３３，８７７号明細書、米国特許第５，５５４，３７８号明細書、米国特許第５，４３９，６８８号明細書、米国特許第５，４１８，２１９号明細書、米国特許第５，３５４，９００号明細書、米国特許第５，２９８，２４６号明細書、米国特許第５，１６４，３７２号明細書、米国特許第４，９００，５４９号明細書、米国特許第４，７５５，３８３号明細書、米国特許第４，６３９，４３５号明細書、米国特許第４，４５７，９１７号明細書及び米国特許第４，０６４，２３６号明細書参照。本発明によって使用される組合せは、好ましくは、当該技術分野で公知であるような、賦形剤、担体及び／又は希釈剤並びに任意に保存剤又は類似の薬物的に許容されるビヒクルと混合することができる。例えば、前記の米国特許を参照。賦形剤の例には、グルコース、マンニトール、イノシトール、スクロース、ラクトース、フルクトース、デンプン、トウモロコシデンプン、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。任意に、増粘剤、例えば天然ゴム、セルロース誘導体、アクリル又はビニルポリマーなどを添加することができる。
【００７３】
この薬物組成物は、好ましくは、液体形、固体形又は半固体形で提供される。液体剤形は、好ましくは、水性懸濁液、油懸濁液又はマイクロカプセル組成物として提供される。半固体組成物は、好ましくは水性又は油性のゲル又はクリームとして提供される。
【００７４】
本発明の組合せを含有する、錠剤、硬質錠剤、カプセル剤及び特に軟質ゼラチンカプセル剤が、食物サプリメントとして又は薬物調剤形として好ましいであろう。本質的に、経口投薬のために適しているどのような薬物調剤形も、本発明の組合せを付与するために使用することができる。
【００７５】
本発明のマルトオイル組合せの用量は、治療すべき状態、患者の年齢、性別及び体重に依存し、担当医師又は栄養士によって決定されるであろう。成人のための好ましい用量は、一日当たり約４〜約６ｇのマルトオイル、好ましくは５ｇ（これは、約１３００ｍｇのＰＳＥ及び８００ｍｇのＤＡＧを含有するであろう）であろう。
【００７６】
本発明は、また、高いコレステロール及びトリグリセリド血液レベル、血清酸化ストレス、マクロファージによるｏｘ−ＬＤＬ摂取、マクロファージ酸化状態、泡沫細胞生成及び脂質誘導酸化ストレスの何れか一個に関する状態の治療及び／又は予防方法であって、必要な被検者に、治療的に有効用量の食品サプリメント又はそれらの組成物を経口的に投薬することからなる方法に関する。従って、この方法は、また、心血管異常症、冠状動脈性心疾患、アテローム硬化症及び真性糖尿病、特にＩＩ型糖尿病のような他の疾患によって誘発される又は顕示される心血管異常症の治療のために有効である。
【００７７】
その代わりに、このような状態は、本発明に従った食物製品の消費によって治療されるべきである。
【００７８】
最後に、本発明は、必要な被検者に、治療的に有効用量の本発明の食物栄養剤又はそれらの薬物組成物を投薬することからなる、健康の改善方法を提供する。
【００７９】
本発明は、特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の内容は、明細書の開示の範囲内に含まれるとして読まれるべきである。
【００８０】
開示され、記載されたことから、プロセス工程及び材料は幾らか変化し得るので、本発明は、本明細書に開示されている、特別の実施例、プロセス工程及び材料に限定されないことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は、付属する特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるので、本明細書中に使用された専門用語は、特別の態様のみを記載する目的のために使用され、限定されることを意図しないことも理解されるべきである。
【００８１】
本明細書及び付属する特許請求の範囲中に使用されるとき、内容が他の様式で明示していない限り、単数形には複数の指示物が含まれることが、注目されるべきである。
【００８２】
本明細書及び付属する特許請求の範囲を通して、文脈が他の様式を要求していない限り、語「を含有する」及びその変形は、全ての他の完全体若しくは工程又は完全体若しくは工程のグループを排除しないで、記載された完全体若しくは工程又は完全体若しくは工程のグループの包含を意味すると理解されるであろう。
【００８３】
下記の実施例は、本発明の一面を実施する際に本発明者らによって使用された技術の代表である。これらの技術は本発明の実施のための好ましい態様の代表であるけれども、当業者は、本明細書の開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく多数の修正を行うことができることを認識するであろうことが認められるべきである。
【実施例１】
【００８４】
材料
オリーブ油：メシェク・エゲー社（Ｍｅｓｈｅｋ  Ｅｇｅｒ）（Ｙｏｋｅｎｅａｍ  ＨａＭｏｓｈａｖａ、イスラエル国）によって製造された、市販の特性バージンオリーブ油。
【００８５】
カノラ油：シェメン・ターシオト社（Ｓｈｅｍｅｎ  Ｔａａｓｉｏｔ）（Ｈａｉｆａ、イスラエル国）によって製造された、市販のカノラ油。
【００８６】
魚油：プロノバ社（Ｐｒｏｎｏｖａ）（Ｌｙｓａｋｅｒ、ノルウェー国）によって製造された、市販の魚油。
【表１】
2006517222.tif 000002
【００８７】
全ての材料は、２５℃を超えない温度で、光及び臭いを出す製品から保護した。
【００８８】
方法
フリーラジカル捕獲能力
オリーブ油、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブマルトオイルのフリーラジカル捕獲能力を、ＤＰＰＨアッセイによって分析した。ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル）は、種々の酸化防止剤のフリーラジカル捕獲能力（電子を供与するための化合物の能力）をモニターするために広く使用されている、ラジカル発生物質である［Ｂｅｌｉｎｋｙ，Ｐ．Ａ．ら、（１９９８年）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第２４巻、第１４１９−２９頁］。ＤＰＰＨラジカルは、それの壊れた電子のために深紫色を有し、ラジカル捕獲は、薄黄色非ラジカル形が生成されるので、５１７ｎｍでの吸光度の損失によって分光光度法的に追跡することができる。それぞれのサンプルの貯蔵溶液からの１５μＬを、１ｍＬの、エタノール中の０．１ミリモルＤＰＰＨ／Ｌと混合し、５１７ｎｍでの光学濃度に於ける変化を連続的にモニターした。
【００８９】
マウス腹膜マクロファージの単離
マウス腹膜マクロファージ（ＭＰＭ）を、食塩水（３ｍＬ）中のチオグリコレート（２４ｇ／Ｌ）の腹腔内注射の四日後に、Ｅ０マウス（１５〜２５ｇ）の腹膜液から採取した。細胞（１０〜２０×１０６／マウス）を、ＰＢＳで三回洗浄し、そして５％のウシ胎仔血清（５６℃で三十分間、熱不活性化）、１００Ｕのペニシリン／ｍＬ、１００μｇのストレプトマイシン／ｍＬ及び２ｍＭのグルタミンを含有するＤＭＥＭ中で、１０６／ｍＬにまで再懸濁させた。この細胞懸濁液を培養皿の中に平板培養し、加湿したインキュベーター（５％ＣＯ２、９５％空気）内で二時間インキュベーションした。この皿をＤＭＥＭで一回洗浄して、付着していない細胞を除去し、そして単層を同様の条件下で十八時間インキュベーションした。マウス腹膜マクロファージを、それぞれのグループからの六匹のマウスから単離し、プールし、そしてそれぞれのアッセイについて、二重に又は三重に分析した。
【００９０】
マクロファージスーパーオキシド放出
マウス腹膜マクロファージによるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の産生を、シトクロムＣのスーパーオキシドジスムターゼ抑制性還元として測定した［Ｙａｎａｇｉｔａｎｉ  Ｙ．ら、（１９９９年）、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、第３３巻、第３３５−９頁］。細胞（１×１０６／ウエル）を、アセチルシトクロムＣ（８０μモル／Ｌ）を含有するＨＢＳＳ１ｍＬ中でインキュベーションした。細胞によるスーパーオキシド産生を、ホルボールミリステートアセテート（０．５μｇ／ｍＬ）の添加によって一時間賦活させた。幾つかの対照サンプルに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、３０ｍｇ／Ｌ）を添加した。スーパーオキシド放出の量を媒体中で決定し、そしてＥ５５０＝２１ミリモル／Ｌ−１ｃｍ−１の消衰係数を使用して、ｎモルのスーパーオキシド／ｍｇ細胞タンパク質として表した。
【００９１】
マクロファージ過酸化物含有量
細胞過酸化物レベルを、ジクロロフルオロレシン−ジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を使用するフローサイトメトリーによって決定した［Ｇｏｕｐｙ，Ｐ．ら、（２００３年）、Ｆｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５１（３）巻、第６１５−６２２頁］。ＤＣＦＨ−ＤＡは、細胞の中に拡散する非極性染料である。細胞内で、これは非蛍光誘導体２’，７’−ＤＣＦＨに加水分解され、この誘導体は極性であって、細胞内に捕捉される。酸化ストレス下で、ＤＣＦＨはＤＣＦ（２’，７’−ジクロロフルオレセイン）に酸化され、これは蛍光化合物である。腹膜マクロファージ（２×１０６）を２．５×１０−５モル／ＬのＤＣＦＨ−ＤＡと共に、３７℃で三十分間インキュベーションした。ＰＢＳで４℃で洗浄することによって、反応を停止させた。細胞蛍光を、フローサイトメトリー装置（ＦＡＣＳ−ＳＣＡＮ、ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、米国カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ））で決定した。測定は、アルゴンイオンレーザーによって４８８ｎｍで細胞を励起した後、５１０〜５４０ｎｍで行った。
【００９２】
血清脂質プロフィール
血清サンプルを、それらの全コレステロール及びトリグリセリドを含む脂質プロフィールについて、市販のキット（ロッシュ・ダイアグノスチックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ドイツ国ベンツベルク（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ））を使用することによって分析した［Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ，Ｍ．ら、（２００２年）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、第４０巻、第９−１４頁］。
【００９３】
血清脂質過酸化
血清を、ＰＢＳ中で１：４に希釈した。酸化に対する血清感受性は、血清サンプルを、１００ｍＭの、フリーラジカル発生化合物である２’，２’−アゾビス−２’−アミジノプロパン塩酸塩（ＡＡＰＨ）（これは、熱分解して、一定速度でペルオキシル（ｐｅｒｏｘｙｌ）ラジカルを生成する水溶性アゾ化合物である）と共にインキュベーションすることによって決定した。チオバルビツル反応性物質（ＴＢＡＲＳ）及び脂質過酸化物の生成を測定し、ＡＡＰＨ無し以外は同様の条件下でインキュベーションした血清と比較した。
【００９４】
ＰＯＮ１活性測定
血清中のＰＯＮ１活性は、基質として酢酸フェニルを使用して、アリールエステラーゼ活性を測定することによって決定した。加水分解の初期速度は、２７０ｎｍで分光光度法的に決定した。このアッセイ混合物には、２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、１．０ｍＭの酢酸フェニル及び０．９ｍＭのＣａＣｌ２が含有されていた。酢酸フェニルの非酵素的加水分解は、加水分解の全速度から差し引いた。この反応についてのＥ２７０は、１，３１０Ｍ−１ｃｍ−１であった。アリールエステラーゼ活性の一単位は、１μモルの加水分解された酢酸フェニル／分／ｍＬに等しい。精製した酵素は、ほぼ２０００単位のアリールエステラーゼ活性／ｍｇタンパク質を有していた。
【００９５】
マクロファージ酸化状態
細胞酸化ストレスを、ＤＣＦ含有マクロファージ中で、フローサイトメトリーによって、インデックスとして、非蛍光ＤＣＦＨ−ＤＡの、それの蛍光片割れＤＣＦへの転化を使用して検査した。
【００９６】
ＬＤＬのマクロファージ媒介酸化
ＭＰＭを、ＬＤＬ（１００μｇのタンパク質／ｍＬ）と共に、十八時間、酸化ストレス下で（２μモル／ＬのＣｕＳＯ４の存在下）インキュベーションし、その後、ＬＤＬ酸化の程度を、ＴＢＡＲＳアッセイによって決定した。
【００９７】
酸化されたＬＤＬのマクロファージ摂取
ＭＰＭを１２５Ｉ−標識化酸化ＬＤＬ（１０μｇのタンパク質／ｍＬ）と共にインキュベーションし、そしてこれらの細胞によるリポタンパク質細胞会合及び分解を決定した。リポタンパク質細胞分解は、集めた媒体中で、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）可溶性、非脂質放射能（これは遊離ヨウ化物に起因しなかった）として測定した。無細胞系中のリポタンパク質分解は、同一条件下で測定し、そして全分解から差し引いた。残留する細胞を、冷ＰＢＳで三回洗浄し、そしてタンパク質及び細胞会合リポタンパク質決定のために、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中に溶解させた。
【００９８】
統計的解析
結果の統計的解析のために、スチューデントｔ−試験を使用した。
【実施例２】
【００９９】
Ｅ０マウス内のマクロファージ脂質過酸化に対するオリーブ油、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブマルトオイルの抗酸化効果
前述のように、酸化ストレスは、アテローム硬化症の病因論に含まれる。アテローム硬化症は、血漿ＬＤＬ及びマクロファージを含む動脈細胞内の脂質過酸化に付随する［Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．、（２０００年）、Ｆｒｅｅ．Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．、第３３巻、第Ｓ８５−９７頁；Ａｖｉｒａｍ  Ｍ．及びＦｕｈｒｍａｎ  Ｂ．、（１９９８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１８８巻、第１４９−１５９頁］。酸化ストレス下で、マクロファージ過酸化物レベルは上昇するようになり、そしてマクロファージは反応性酸素種を発生し、それらの上昇したじゅく腫形成性に至る［Ｐｌｕｍｐ  Ａ．Ｓ．ら、（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、第７１巻、第３４３−３５３頁］。
【０１００】
アポリポタンパク質Ｅ欠損（Ｅ０）マウスは、それらが、食事（ｃｈｏｗ  ｄｉｅｔ）で重い高コレステロール血症及びアテローム硬化症病変を発症するので、アテローム硬化症のための動物モデルとして広く使用されている。更に、Ｅ０マウスに於いて、加速されたアテローム硬化症は、血漿リポタンパク質及び動脈細胞の増加する脂質過酸化に付随する［Ｈａｙｅｋ  Ｔ．ら、（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２０１巻、第１５６７−１５７４頁；Ｋｅｉｄａｒ  Ｓ．、（１９９８年）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、第６３巻、第１−１１頁］。
【０１０１】
レニン−アンギオテンシン系によって生成される血管収縮薬であるアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ−ＩＩ）が、アテローム硬化症に結び付けられた。Ａｎｇ−ＩＩは、マクロファージＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−オキシダーゼを活性化し、増加したマクロファージ脂質過酸化に至る［Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｓ．ら、（１９９６年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第９７巻、第１９１６−１９２３頁；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｒ．Ｂ．Ｊｒ．、（１９８４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１０５巻、第３６５−９頁］。
【０１０２】
この実施例に於いて、オリーブ油＋フィトステロール、オリーブマルトオイル及びオリーブ油と指定した、三種のオリーブ油の製剤の抗酸化効果を、マクロファージ酸化ストレスに対して分析した。
【０１０３】
下記の油サンプルをチェックした（全て水中に１／２体積／体積で希釈した、貯蔵溶液）。
【０１０４】
１：オリーブ油＋フィトステロール
２：オリーブマルトオイル
３：オリーブ油
オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブ油と比較した、オリーブマルトオイルのマクロファージ酸化ストレスに対する抗酸化効果を、二個のパラメーター、即ち、（ｉ）マクロファージ過酸化物含有量を減少させるための能力及び（ｉｉ）スーパーオキシドイオンを放出するためのマクロファージ能力によって分析した。
【０１０５】
マウス腹膜マクロファージを、オリーブ油＋フィトステロール、オリーブマルトオイル及びオリーブ油の何れかの貯蔵溶液５０μＬ／ｍＬと共に十五分間インキュベーションし、続いて、酸化ストレスを誘発するためにアンギオテンシンＩＩ（１０−７Ｍ）と共に更に一時間インキュベーションした。対照細胞を、アンギオテンシンＩＩ単独と共にインキュベーションした。次いで、ＤＣＦＨアッセイを使用してそれらの過酸化物含有量について及びスーパーオキシドイオンを放出するためのそれらの能力について、マクロファージを分析した（図２Ａ、Ｂ）。
【０１０６】
１）マクロファージ過酸化物含有量への、オリーブ油＋フィトステロール、オリーブマルトオイル及びオリーブ油の影響
オリーブ油単独と一緒のものを除いて、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブマルトオイルと一緒のマクロファージのプリインキュベーションは、アンギオテンシンＩＩ単独でインキュベーションした対照マクロファージと比較して、マクロファージ過酸化物含有量を減少させた。ＤＣＦＨアッセイを使用する、マクロファージ脂質過酸化物含有量は、二個のパラメーター、即ち、第一に、ＤＣＦによって発光される平均蛍光強度及び第二に、蛍光発光のために正である細胞のパーセンテージによって評価する。
【０１０７】
５０μＬ／ｍＬのオリーブ油＋フィトステロール又はオリーブマルトオイルと一緒のマクロファージのプリインキュベーションは、対照細胞と比較して、マクロファージ平均蛍光強度に於ける８３％及び６４％の減少に至り、一方、同じ濃度でのオリーブ油は、対照細胞と比較して、マクロファージ平均蛍光強度への影響を有しなかった（図２Ａ）。同様に、５０μＬ／ｍＬのオリーブ油＋フィトステロール又はオリーブマルトオイルと一緒のマクロファージのプリインキュベーションは、対照細胞と比較して、蛍光のための正細胞のパーセンテージに於ける７４％及び５５％の減少に至り、一方、同じ濃度でのオリーブ油は、対照細胞と比較して、蛍光のための正細胞のパーセンテージへの影響を有しなかった（図２Ｂ）。
【０１０８】
２）マクロファージスーパーオキシドイオン放出への、オリーブ油＋フィトステロール、オリーブマルトオイル及びオリーブ油の影響
Ｅ０マウスから単離したマウス腹膜マクロファージを、オリーブマルトオイル、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブ油単独の何れかの５０μＬ／ｍＬと共に十五分間プリインキュベーションし、続いて、酸化ストレスを誘発するためにアンギオテンシンＩＩ（１０−７Ｍ）と共に更に一時間インキュベーションした。対照細胞を、アンギオテンシンＩＩ単独と共にインキュベーションした。
【０１０９】
本研究に於いて分析した全ての三種のオリーブ油製剤は、ある程度まで、アンギオテンシンＩＩによって誘発されたマクロファージスーパーオキシド放出を抑制した。しかしながら、オリーブマルトオイル及びオリーブ油＋フィトステロールは、オリーブ油単独よりも顕著に一層強力であった。オリーブマルトオイル、オリーブ油＋フィトステロール又はオリーブ油単独の５０μＬ／ｍＬと共のマクロファージのプリインキュベーションは、アンギオテンシンＩＩ単独でインキュベーションした対照細胞と比較して、マクロファージスーパーオキシドアニオン放出に於ける、それぞれ２９％、２３％及び僅か９％の減少に至った（図３）。
【０１１０】
フィトステロール、特にオリーブマルトオイルを富化したオリーブ油製剤は、マクロファージ脂質過酸化に対する顕著な抗酸化特性を示した。反対に、オリーブ油単独は、如何なる影響も示さなかった。最も重要なことに、オリーブマルトオイルは、マクロファージ過酸化物含有量及びマクロファージスーパーオキシド放出を減少させるそれの能力に於いて、オリーブ油＋フィトステロール製剤よりも一層強力であった。
【０１１１】
これらの結果は、オリーブ油及び追加の成分（フィトステロール及びジグリセリド）が、結合し、そしてマクロファージの中に内在化できることを示唆している。更に、フィトステロールでのオリーブ油富化によって、本発明の製剤が、細胞酸化系（例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ及び／又はリポキシゲナーゼ）を抑制すること又は細胞抗酸化系（例えば、グルタチオン又はスーパーオキシドジスムターゼ系）を活性化することが可能になる。更に、オリーブ油＋フィトステロール製剤へのＤＡＧの添加（オリーブマルトオイルになる）は、マクロファージ脂質過酸化に向けた追加の抗酸化効果に至る。従って、本発明者らは、多数の細胞内シグナルトランスダクション経路に関与するＤＡＧが、マクロファージ脂質過酸化及びスーパーオキシド放出として表される、アンギオテンシンＩＩ媒介細胞酸化ストレスに含まれる、前記の細胞酸化／抗酸化系に更に影響を与えることができたと推測する。
【実施例３】
【０１１２】
リポタンパク質及びマクロファージのじゅく腫形成性への及びアテローム硬化症アポリポタンパク質Ｅ欠損（Ｅ０）マウスモデルへのマルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆの影響を研究した。八週齢のアポリポタンパク質Ｅ欠損（アポＥ０）マウスを、以下に説明するような下記のグループ（それぞれ五匹のマウス）にランダムに指定した。マウスに通常の食事を与え、そして更に、これらに、下記のものを三日毎に一度（ガバージュを経て）供給した。
【０１１３】
グループＩ：
１．プラシーボグループ：如何なる油の添加も受け取らなかった。
【０１１４】
２．カノラ油グループ（対照）：６０μＬのカノラ油を供給された。
【０１１５】
３．マルトオイル−ｃグループ：６０μＬのマルトオイル−ｃを供給された。
【０１１６】
グループＩＩ：
１．プラシーボグループ：如何なる油の添加も受け取らなかった。
【０１１７】
２．マルトオイル−ｆ：６０μＬのマルトオイル−ｆを供給された。
【０１１８】
各マウスは、約５ｍＬの水／日及び５ｇの食事／日を消費した。
【０１１９】
供給のための油製剤
マウスに供給したマルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆの量は、下記のことを基準にした。
【０１２０】
ヒト用の推奨されるフィトステロール用量は、１．５ｇのフィトステロール／日である。従って、それぞれのサンプル中の１８．１％のフィトステロール基準で、ヒト用のマルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆについての用量は、１．５／０．１８＝８．３３ｇ／日／人である。マウスのために、体重を考慮に入れるべきであり（６０，０００ｇヒト体重／２０ｇマウス体重＝３０００）、従ってマウス用の毎日用量は、８．３３ｇ／３０００＝２．７８ｍｇ／日／マウスであり、これは２．７８／０．９３＝２．９９ｍＬ／日／マウスに等しい。実験は限定された期間行ったので、使用した用量は、五倍多かった。従って、それぞれのマウスには、１５ｍＬの油／日（６０ｍＬ／四日／マウス）を投与した。
【０１２１】
実験期間の終わりに、全てのマウスから、血清分離及び分析のための血液サンプルを集めた。それぞれの実験グループ内で、それぞれのマウスの血液サンプルを個々に分析した。血清中の下記のパラメーターを分析した。
【０１２２】
１．全コレステロール及びトリグリセリドレベルを含む、脂質の決定。
【０１２３】
２．血清酸化状態の決定。
【０１２４】
３．アリールエステラーゼ活性として測定した、パラオキソナーゼの決定。
【０１２５】
心臓及び大動脈の除去の前に、ＭＰＭを採取した。マウスに、局所鼻容器内のエチルエーテルで麻酔をかけた。大動脈アテローム硬化症病変の組織病理学的分析のために、心臓及び全大動脈を全てのマウスから迅速に除去した。
【０１２６】
実験プロトコル（第ＩＬ−０６６−１０−２００１号）は、テクニオンイスラエル工科大学の動物保護及び使用委員会(the Animal Care and Use Committee of the Technion Israel Institute of Technology)（イスラエル国Ｈａｉｆａ）によって承認された。
【０１２７】
図３は、プラシーボと比較した、マルトオイル−ｃの消費が、血清中のトリグリセリドのレベルに於ける顕著で有意の低下（３６％）を示したことを示す（ｐ＜０．００１）。
【０１２８】
同様に、図４は、特にマルトオイル−ｃであるが、マルトオイル−ｆも、血清中の全コレステロールレベルを低下させる傾向を示したことを示す（ｐ＜０．１）。
【０１２９】
図５は、マルトオイル−ｃ治療が、（プラシーボと比較して）６３％ほどの、ＡＡＰＨ誘導酸化に対する血清感受性の、猛烈で高度に有意の（ｐ＜０．００１）低下になったことを示す。マルトオイル−ｆは、同様の傾向を示し、プラシーボと比較して１６％ほど脂質過酸化物を減少した。
【０１３０】
図６は興味ある結果を示す。カノラ油消費は、アテローム硬化症のために有害であり得る血清ＰＯＮ１活性［Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｂ．ら、（２００３年）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第１０７巻、第２７７５−９頁］のレベルに於ける顕著な低下を誘発したのに対して、マルトオイル−ｃ又は−ｆの消費は、ＰＯＮ１活性を、未治療（プラシーボグループ）マウスのものに匹敵するレベルまで回復させた。従って、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆの消費は、ＰＯＮ１活性の有効なレベルを維持するために有利である。
【０１３１】
図７は、マルトオイル−ｃの消費が、ｏｘ−ＬＤＬ会合（１６％）及び分解（１４％）の減少を起こし（ｐ＜０．０５）、ｏｘ−ＬＤＬに耐えるための増加したＭＰＭ能力になったこと（これは、低下した酸化状態に関連付けることができる）及びより大きい程度まで、マルトオイル−ｆが、同様の効果を示し、また、ｏｘ−ＬＤＬ会合（３４％）及び分解（３０％）の減少を起こしたこと（ｐ＜０．００１）を示す。反対に、カノラ油消費は、ｏｘ−ＬＤＬ会合及び分解の両方の僅かな増加（ｐ値＜０．０５）（プラシーボと比較して、それぞれ４％及び１１％）になった。
【０１３２】
図８は、マルトオイル−ｃ又はマルトオイル−ｆの消費が、Ｅ０マウスマクロファージの酸化状態を著しく低下させた（ｐ＜０．０００１）ことを示す。マルトオイル−ｆは、マクロファージ酸化状態をプラシーボと比較して３４％ほど低下させ、一方、マルトオイル−ｃは、それをプラシーボと比較して２９％ほど低下させた。従って、マルトオイル−ｆ及びマルトオイル−ｃの両方は、マクロファージの酸化状態を低下させる際に有効である。これらの結果と一致して、図９に、本発明者らは、同様に、マルトオイル−ｆ又はマルトオイル−ｃの消費が、マクロファージ中のスーパーオキシドアニオンのＰＭＡ誘発放出を顕著に減少させたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】マクロファージ細胞過酸化物含有量への、オリーブ油、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブマルトオイルの影響。細胞平均蛍光（ＤＣＦにより発光）強度によって決定されたマクロファージ過酸化物レベル。
【図１Ｂ】マクロファージ細胞過酸化物含有量への、オリーブ油、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブマルトオイルの影響。蛍光ポジティブ細胞のパーセンテージによって決定されたマクロファージ過酸化物レベル。
【０１３４】
略語：ＰＴ、フィトステロール；ｃｏｎｔ．、対照；Ｏｌ．Ｏ．、オリーブ油；Ｍ．Ｆ．Ｉ．、平均蛍光強度；Ｐｅｒｃ．Ｐｏｓ．Ｃｅ．、ポジティブ細胞のパーセンテージ。
【図２】マクロファージスーパーオキシドアニオン放出への、オリーブ油、オリーブ油＋フィトステロール及びオリーブマルトオイルの影響。
【０１３５】
マクロファージスーパーオキシドイオン放出は、シトクロムＣのスーパーオキシドジスムターゼ抑制性還元によって決定した。
【０１３６】
略語：ＰＴ、フィトステロール；ｃｏｎｔ．、対照；Ｏｌ．Ｏ．、オリーブ油；Ｓ．Ｏ．ｒｅｌ．、スーパーオキシド放出；ｐｒｏｔ．、タンパク質。
【図３】血清トリグリセリドプロフィールへの、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１３７】
略語：Ｔｒｉｇｌｙｃ．、トリグリセリド；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ。
【図４】血清全コレステロールプロフィールへの、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１３８】
略語：Ｃｈｏｌ．、コレステロール；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ。
【図５】血清酸化ストレスへの、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１３９】
略語：Ｓｅｒ．ｌｉｐ．Ｐｅｒ．、血清脂質過酸化物；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ。
【図６】血清ＰＯＮ１活性への、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１４０】
略語：Ｓｅｒ．ＰＯＮ１  ａｃｔ．、血清ＰＯＮ１活性；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ。
【図７】腹膜マクロファージによるｏｘ−ＬＤＬ摂取への、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１４１】
略語：ｐｒｏｔ．、タンパク質；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ；ｄｅｇ．、分解；ａｓｓ．、会合。
【図８】マクロファージ酸化状態への、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１４２】
略語：Ｒｅｌ．Ｆｌｕｏｒ．Ｕ．、相対蛍光単位；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ。
【図９】マクロファージ内のＰＭＡ誘発スーパーオキシドアニオン放出への、マルトオイル−ｃ及びマルトオイル−ｆ消費の影響。
【０１４３】
略語：Ｓ．Ｏ．ｒｅｌ．、スーパーオキシド放出；ｐｒｏｔ．、タンパク質；Ｐｌａｃ．、プラシーボ；Ｃａｎ．、カノラ。
【図１Ａ】
2006517222.tif 000003
【図１Ｂ】
2006517222.tif 000004
【図２】
2006517222.tif 000005
【図３】
2006517222.tif 000006
【図４】
2006517222.tif 000007
【図５】
2006517222.tif 000008
【図６】
2006517222.tif 000009
【図７】
2006517222.tif 000010
【図８】
2006517222.tif 000011
【図９】
2006517222.tif 000012
【国際調査報告】
2006517222.tif 000013
2006517222.tif 000014
2006517222.tif 000015
2006517222.tif 000016
2006517222.tif 000017