(57)【要約】  本発明は、血管新生阻害効果を有する長生ドラジからの抽出物に関し、さらに詳しくは癌細胞の増殖及び転移に関与する血管新生を阻害する効果を有する長生ドラジからの抽出物に関する。本発明の長生ドラジ抽出物により、血管新生に関与する細胞移動、細胞接着、細胞浸潤及び管腔形成を抑制できる。従って、本発明の長生ドラジ抽出物を含む血管新生阻害剤は癌予防及び治療に有用であろう。 【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長生ドラジからの抽出物を有効成分として含む血管新生阻害剤。
【請求項２】
前記長生ドラジからの抽出物は熱水抽出物又は有機溶剤抽出物であること、を特徴とする請求項１に記載の血管新生阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害効果を有する長生ドラジからの抽出物に関し、より詳細には癌細胞の増殖及び転移に関与する血管新生に対する阻害効果を有する長生ドラジからの抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キキョウ科のキキョウ（学名Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ａ．ＤＣ）の根は、主根長さが約１０〜１５ｃｍ、根径が１〜３ｃｍで、茶ねずみ色から乳白色をしており、上部には不規則に分岐する部位を有し、長手方向には皺、横断方向には殻眼及び皺がある。さらに、それらは硬いが本来非繊維質で、そのため割れ易い、また若干の香り及び苦味がある（リュク、チャン‐ソオ他、「モダン・ファーマコグノシー」ハクチャングサ社、ソウル市、ｐ．４６０〜４６１、１９９３年（Ryuk, Chang-Soo, et al., Modern Pharmacognosy, Hackchangsa Co., Seoul, 460-461,1993））。  
【０００３】
キキョウ根の主な薬学的成分として、トリテルペンサポニン（プラチコジンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｄ２及びＤ３）があり、根の約２％を構成する。動物試験により、こうした薬学的成分には様々な作用、例えば鎮咳作用及び去痰作用、中枢神経系抑制作用（鎮静作用、痛みの緩和及び解熱）、急性慢性炎症に対する抗炎症作用、抗潰瘍作用、胃液分泌抑制作用、血管拡張により血圧を低下させる抗コリン作用、血糖低下作用、及びコレステロール代謝促進作用があることが確認されている（「ケミカル＆ファーマスーティカル・ブリティン」第２０号、ｐ．１９５２、１９７２年；「ケミカル＆ファーマスーティカル・ブリティン」第２３号、ｐ．２９６５、１９７５年；「ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサエティ、パーキン・トランスアクションＩ」ｐ．６６１、１９８４年；「総合医学」３、１、１９５１年；「ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・ソサエティ・オブ・コリア」第１９号、ｐ．１６４、１９７５年（Chem., Pharm. Bull., 20, 1952 (1972); Chem. Pharm. Bull., 23, 2965 (1975); J. Chem. Soc. , Perkin trans I, 661 (1984); Sogoigaku, 3,1 (1951) ; J. Pharm., Soc. Kor., 19, 164 (1975) ）。キキョウ根から分離した他の薬学的成分としては、αスピナステロール、スチグマスト‐７‐エノール、及びαスピナステロール・グルコシド等のステロイド化合物、及び、イヌリン及びベツリン等の多糖類が挙げられる。
【０００４】
本明細書では、用語「長生ドラジ」は２０年生以上のキキョウ根の名称であるが、その様々な薬学的作用にもかかわらず、キキョウを長期に亘り栽培するのは困難であった。しかしながら、２０年生以上のキキョウ根である長生ドラジの栽培を可能にする技術が最近開発され（韓国特許第０４５７３１号、リー・ソンホ（Lee, Sung-Ho）、発明の名称「メソッド・フォー・プロデューシング・ペレニアル・バルーンフラワーズ（a method for producing perennial balloonflowers）」）、その結果現在では長生ドラジの大量生産が可能になった。こうした長生ドラジは、２〜４年間栽培された通常のキキョウ根と比較すると、薬学的効果及び生理作用において優れている。     
【０００５】
現在までの長生ドラジについての研究としては、抗糖尿作用に関する試験（「ジャーナル・オブ・ザ・コリアン・ソサエティ・オブ・フードサイエンス・アンド・ニュートリション」第２５号、ｐ．９８６、１９９６年（J. Korean Soc. Food Sci. Nutri., 25, 986 (1996)）、及び抗高脂血症に関する試験（「ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・ソサエティ・オブ・ジャパン」第９３号、１９７３年、ｐ．１１８８〜１１９４(J. Pharmaceutical Society of Japan 93 (1973), 1188-1194)）が挙げられ、その肝臓障害の予防及び抑制についての研究も行なわれている。加えて、キキョウ根からの熱水及びエタノール抽出物がカビのアプラトキシンを抑制すること、イヌリン画分には食菌作用及び固形癌である肉腫に対する強力な抗腫瘍作用があること、及びキキョウ根からの４０％抽出物にはアルコール吸収抑制作用があることが知られている（「マイコパソロジア」第６６号、ｐ．１６、１９７９年、「生薬学雑誌」第４０号、ｐ．３６７、１９８６年、「生薬学雑誌」第４０号、ｐ．３７５、日本国特開昭６０−８９４２７号公報、１９８５年（Mycopathologia, 66, 16 (1979), Shoyakugaku Zasshi, 40, 367 (1986), Shoyakugaku Zasshi, 40, 375 (1986), Japanese Patent No. 60-89427 (1985)）。
【０００６】
癌が死に至る病であると認識される理由は、固形癌の場合、医学上診断可能な大きさを持つ原発性癌塊と比べ微小な大きさの潜在的転移性癌が脅威となるからである。血管伝いに転移する癌は、摘出した場合でも、別の臓器や組織に常に繁殖する可能性があり、そのため一度転移条件が整うと新たな癌を誘発してしまう。こうした理由で、癌の治療率が５０％超に過ぎなくても実際には良好とされ、外科手術又は他の抗癌治療を施せる癌の治療率は、癌の種類又は患者の状態により必然的に極めて制限されてしまう。
【０００７】
一方で、癌組織が増殖するには、酸素及び栄養分の補給が必要であり、そうした補給物用の通路を作成するために、血管新生が生じる。癌組織における血管新生過程に関しては、まず癌細胞が血管新生誘導因子を分泌し、これが順に内皮細胞に存在する受容体に結合し、それと同時に新たな血管の形成過程が開始される。刺激を受けた内皮細胞は、プロテナーゼを分泌しながら増殖し始め、プロテナーゼによる基底膜分解が発生し、それにより内皮細胞は、血管新生誘導因子を分泌する細胞に向かい移動する（細胞移動）。移動した内皮細胞は血管内に接着され（細胞接着）、浸潤する位置に移動し、次いで基底膜に浸潤する（細胞貫通）。浸潤した細胞は互いに結合して管腔を形成し（管腔形成）、最終的に２４の中空新芽の終端部が互いに結合して、血液が流れるループが形成される。こうした過程のいずれか１過程を阻止することで血管新生を減少させ、その結果抗癌作用を提供できる。
【０００８】
さらに、癌細胞は新たな血管を通り他の組織に転移するため、癌の増殖及び転移に必要な血管新生を抑制することは、新たな癌治療として認められている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、癌細胞の増殖及び転移過程で発生する血管新生を抑制するための治療剤を提供することであり、該治療剤には、安全で無毒な天然物質である長生ドラジからの抽出物を、有効成分として含む。
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明は有効成分として長生ドラジからの抽出物を含む血管新生阻害剤を提供する。
【００１１】
これ以降、本発明について詳細に記述する。
【００１２】
本発明者らは、安全で無毒な天然物質を使用して、癌細胞の増殖及び転移に関与する血管新生を抑制する製剤を開発するために、広範囲に亘る研究を行ない、その結果長生ドラジからの抽出物が細胞移動、細胞接着、細胞浸潤及び管腔形成という血管新生に関与する過程を阻止することを発見した。この発見に基づき、本発明は完成された。
【００１３】
本発明による長生ドラジ抽出物を、当技術分野で従来使用される任意の方法により製造する。長生ドラジ抽出物は熱水抽出物又は有機溶剤抽出物とするのが好ましく、該抽出物は単独で又は薬学上許容されるハーブ材料と混合して調製可能である。長生ドラジを抽出する際には、長生ドラジの粉末を使用するのが好ましいが、該粉末は長生ドラジを乾燥させて含水率を５％未満にし、この乾燥させた材料を粉末にして、粒子サイズが０．６ｍｍ未満の粉末を選別し、調製したものである。
【００１４】
熱水抽出物を好適には、約５〜１０倍容量の水を長生ドラジ粉末に対して添加し、その溶液を温度９０〜１００℃で４〜６時間に亘り２度抽出することにより調製する。その結果得た濾液を、単独で又は許容可能なハーブ材料又はハーブ抽出物から選択したものと混合して使用する。
【００１５】
有機溶剤抽出物を好適には、約３倍容量の有機溶剤を長生ドラジ粉末に対して添加し、その溶液を室温で２度抽出し、その結果得た濾液を減圧濃縮し、次に許容可能なハーブ材料又はハーブ抽出物から選択したものをこの濃縮物に添加して調製する。有機溶剤としては、アルコール、好適にはメタノール又はエタノール、を使用するのが好ましいと思われる。。
【００１６】
本発明の長生ドラジ抽出物を、食品衛生上許容される又は薬学上許容される賦形剤を使用する既知の方法により製剤して、それにより製薬製剤を調製してもよい。製薬製剤を調製する際には、有効成分としての長生ドラジ抽出物を好適には担体と混合又は希釈する、或いは容器状の担体に封入する。担体を希釈剤として用いる場合、該担体を媒介物、賦形剤又は媒質として働く固体、半固体又は液状物質としてもよい。従って、製剤を錠剤、丸剤、粉末、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エアゾル剤、軟又は硬カプセル剤、滅菌注射、滅菌粉末等の形態にしてもよい。適切な担体、賦形剤又は希釈剤の例として、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油が挙げられる。製剤には、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤等を含有してもよい。本発明の長生ドラジ抽出物を含む血管新生阻害剤を、哺乳動物に投与後に、有効成分を迅速に、継続して又は遅延して放出させる当技術分野でよく知られる如何なる方法によっても製剤可能である。    
【００１７】
本発明の長生ドラジ抽出物に有効成分として含まれる血管新生阻害剤を、その目的に応じて、様々な経路、経口、経皮、皮下、静脈内、及び筋内経路を介して投与可能である。ヒトに対しては、本発明の抽出物の１日投与量を通常、１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重としてもよく、好適には１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重とし、１回又は数回投与してもよい。しかしながら、本発明の抽出物の実際の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、健康状態、疾病重症度等を含む様々な要因に鑑みて決定すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
これ以降、本発明についてさらに詳細に実施例及び試験例により記述する。しかし、当然のことながら、これらの実施例は本発明の好適な一実施例を説明する目的で提示するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１９】
実施例１：長生ドラジからの熱水抽出物の製造
２リットルの蒸留水を０．２ｋｇの長生ドラジ粉末に添加し、その溶液を２回９０〜９５℃で５時間抽出し、濾過した。濾過液を凍結乾燥させて、１００ｇの長生ドラジ抽出物を得た。
【００２０】
以下の試験を行い、ヒトの癌細胞における血管新生に関与する、管腔形成、細胞浸潤、細胞接着、及び細胞移動に対する本発明の血管新生阻害剤の抑制効果について検討した。
【００２１】
試験例１：癌リンパ球（ＨＬ‐６０）のヒト内皮細胞（ＨＭＥＣ‐１）への接着に対する抑制効果
１．試薬
以下の試薬を購入使用した。
ＨＴ‐１０８０、ＨＭＥＣ‐１及びＨＬ‐６０細胞株、ヒトの癌細胞株を韓国細胞株バンク（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）より購入し、マトリゲル、ＲＰＭＩ‐１６４０培養液、Ｃａｌｃｅｉｎ‐ＡＭ、トリプシン、及びウシ胎仔血清をシグマ化学社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）より購入した。
【００２２】
２．試験方法
本発明の長生ドラジ抽出物の、リンパ球癌細胞ＨＬ‐６０のヒト内皮細胞ＨＭＥＣ‐１への接着抑制効果について検討するために、ＨＭＥＣ‐１細胞を４８ウエルプレートに播種し、長生ドラジ抽出物で２４時間前処理した。次に、ＨＬ‐６０を蛍光物質（Ｃａｌｃｅｉｎ‐ＡＭ）で標識化し、ＨＭＥＣ‐１細胞と６時間共培養した。その培養液を分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、その後蛍光顕微鏡で観察し、それにより接着したＨＬ‐６０細胞数を計数した。その結果を図１に示す。
【００２３】
図１は、ヒト内皮細胞に接着した癌細胞数を、長生ドラジ抽出物処理濃度別に、示すグラフ図である。図１に示すように、ヒト内皮細胞ＨＭＥＣ‐１へのＨＬ‐６０細胞の接着が、長生ドラジ抽出物で処理した群では、対照群及び血管新生促進因子（Ｖ−ＥＧＦ）で処理した群より、抑制されたことが認められた。また、細胞接着の抑制については、長生ドラジ抽出物の処理濃度により異なった（ＣＫ１００：１００μｇ／ｍｌ；ＣＫ２００：２００μｇ／ｍｌ及びＣＫ５００：５００μｇ／ｍｌ）。  
【００２４】
試験例２：ヒト癌細胞株（ＨＴ‐１０８０）の細胞及び細胞膜への浸潤に対する長生ドラジの抑制効果
１．試験方法
長生ドラジ抽出物の、細胞膜への浸潤抑制効果について検討するために、癌細胞株ＨＴ‐１０８０をマトリゲルで被覆した４８ウエルプレートで継代培養し、その後各濃度の試料をウエルプレートに入れた。１８時間後、細胞浸潤を顕微鏡下で観察し、それにより浸潤したＨＴ‐１０８０細胞数を計数した。その結果を図２及び図３に示す。  
【００２５】
図２は、対照群及び８００μｇ／ｍｌの長生ドラジ抽出物で処理後にマトリゲルに浸潤した細胞を示した写真である。図３は、細胞膜浸潤抑制効果を長生ドラジ抽出物の処理別に示したグラフ図である。図３に示すように、長生ドラジ抽出物で処理していない対照群と比べ、長生ドラジ抽出物が持つ細胞及び細胞膜浸潤抑制効果が示された。こうした抑制効果は、長生ドラジ抽出物の処理濃度が１００μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００μｇ／ｍｌと高くなるに従い増大した。
【００２６】
試験例３：ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の細胞移動に対する長生ドラジ抽出物の抑制効果
１．試験方法
ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の細胞移動に対する試料の抑制効果について検討するために、ＨＴ‐１０８０を４８ウエルプレートで継代培養し、ブルーチップで傷付けた。６時間後、移動したＨＴ‐１０８０細胞数を、顕微鏡を使い計数した。その結果を図４及び図５に示す。  
【００２７】
図４は、癌細胞株をチップで剥離した後に残った空間に移動した癌細胞株を示す写真である。図５は、ヒト癌細胞株の移動細胞数を、長生ドラジ抽出物の処理濃度別に示すグラフ図である。図５に示すように、ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の細胞移動は、長生ドラジ抽出物の処理濃度に応じて大幅に抑制された。
【００２８】
試験例４：長生ドラジ抽出物の血管新生阻害効果
１．試験方法
ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０に対する試料の血管新生阻害効果について検討するために、ＨＴ‐１０８０をマトリゲルで被覆した４８ウエルプレートで継代培養し、各濃度の試料をウエルプレートに入れた。１８時間後、血管新生（管腔形成）を顕微鏡で観察した。陽性対照として、血管新生促進因子であるＶＥＧＦを使用した。その結果を図６及び図７に示す。
【００２９】
図６は、マトリゲルにおいて管腔を形成した癌細胞株を示す写真である。図６に示すように、長生ドラジ抽出物で処理した群の管腔形成は、対照群及び血管新生促進因子で処理した群と比べ、抑制された。図７は、癌細胞株の管腔形成（％）を、長生ドラジ抽出物の処理濃度別に示すグラフ図である。図７に示すように、血管新生におけるＨＴ‐１０８０の管腔形成は、長生ドラジ抽出物の処理濃度に応じて大幅に抑制された。
【００３０】
上述したように、ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の管腔形成に対する長生ドラジ抽出物の抑制効果を検討したが、その結果ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の管腔形成（％）が長生ドラジ抽出物の処理濃度に応じて抑制されたことが示された。また、ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の細胞浸潤に対する長生ドラジの抑制効果も検討され、その結果ヒト癌細胞株Ｂ１６Ｆ１０の細胞浸潤が、長生ドラジ抽出物の処理濃度に応じて、著しく減少したことが示された。さらに、ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の移動に関する測定結果では、ヒト癌細胞株ＨＴ‐１０８０の移動が、長生ドラジ抽出物の処理濃度に応じて、減少したことが示された。一方、ＨＬ‐６０細胞のヒト内皮細胞ＨＭＥＣ‐１への接着に関する測定結果では、ＨＬ‐６０細胞のＨＭＥＣ‐１への接着は長生ドラジ抽出物の処理濃度によって異なることが示された。
【００３１】
即ち、本発明の長生ドラジ抽出物は以下の全過程を抑制する：内皮細胞が血管新生誘導因子を放出する部位に向けて移動する細胞移動；移動した細胞が血管内に接着する細胞接着；接着した内皮細胞が浸潤する位置に移動し、その後基底膜に浸潤する細胞浸潤；及び浸潤した内皮細胞が相互に結合し、それにより管腔を形成する管腔形成。従って、本発明の長生ドラジ抽出物は血管新生を抑制し、その結果長生ドラジ抽出物には抗癌作用があることが示唆されよう。
【００３２】
試験例５：急性毒性試験
１．経口投与
体重２５ｇのＩＣＲマウス５０匹を各１０匹から成る５群に分けた。本発明の長生ドラジ抽出物を経口投与にて該５動物群に其々１、５、２５、１２５及び６２５ｍｇ／ｋｇ投与した。その後２週間に亘り毒性を観察した。その結果５群全てで死亡した動物はなかったことが示された。  
【００３３】
２．腹部投与
体重２５ｇのＩＣＲマウス４０匹を各１０匹から成る４群に分けた。本発明の長生ドラジ抽出物を該４動物群の腹腔に其々０．２、２、２０及び２００ｍｇ／ｋｇ投与した。その後２４時間に亘り毒性を観察した。その結果４群全てで死亡した動物はなかったことが示された。
【００３４】
上記の結果、本発明の長生ドラジ抽出物には殆ど又は全く急性毒性がないことが確認された。
【００３５】
以下の製剤例では、本発明の長生ドラジ抽出物を有効成分として含む抗癌剤の製剤について説明する。しかし、当然ながら本発明の抗癌剤はこれらの製剤例により制限されるものではない。
【００３６】
製剤例１：錠剤調剤
長生ドラジ抽出物      ５０ｍｇ
乳糖                      ２０ｍｇ
澱粉                      ２０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  適量
本発明の長生ドラジ抽出物を有効成分として含有する上記組成物を従来の錠剤化方法により錠剤化し、錠剤を調剤した。
【００３７】
製剤例２：カプセル製剤の調剤
長生ドラジ抽出物      ５０ｍｇ
乳糖                      ２０ｍｇ
澱粉                      ２０ｍｇ
タルク                    １ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  適量
本発明の長生ドラジ抽出物を有効成分として含有する上記組成物を従来の方法によりゼラチンカプセルに充填し、カプセル製剤を調剤した。
【００３８】
上述したように、安全で無毒な天然物質である本発明の長生ドラジ抽出物を、有効成分として、含む本発明の血管新生阻害剤により、異物又はウイルス感染により発生する癌細胞の増殖及び転移に関与する血管新生を阻害できる。従って、本発明の血管新生阻害剤は、癌治療及び予防に関して臨床的に有用であろう。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
上述したように、本発明の長生ドラジ抽出物は、癌細胞の増殖及び転移に関与する、細胞移動、細胞接着、細胞浸潤及び管腔形成を抑制することにより血管新生を阻害する。従って、本長生ドラジ抽出物を有効成分とする抗癌剤は、癌予防及び治療に有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒト内皮細胞に接着した癌細胞数を、長生ドラジ抽出物の処理濃度別に示すグラフ図である。
【図２】対照群及び８００μｇ／ｍｌの長生ドラジ抽出物で其々処理した後のマトリゲルに浸潤した細胞を示す写真である。
【図３】細胞膜浸潤抑制効果を、長生ドラジ抽出物処理別に示すグラフ図である。
【図４】癌細胞株をチップで剥離した後の残りの空間に移動した癌細胞株を示す写真である。
【図５】ヒト癌細胞株の移動した細胞数を、長生ドラジ抽出物の処理濃度別に示すグラフ図である。
【図６】マトリゲル内で管腔状に形成された癌細胞株を示す写真である。
【図７】癌細胞株の管腔形成（％）を、長生ドラジ抽出物の処理濃度別に示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2006528173.tif 000011
2006528173.tif 000012