(57)【要約】イオンチャネルまたはその機能的サブユニットをその活性な構造へと折りたたむ方法が記述されている。この目的のために、１番目の界面活性剤で溶解し、変性する最初のイオンチャネルの発現サブユニットが供給され、続いて１番目の界面活性剤は、イオンチャネルのサブユニットをその活性な構造へと折りたたませる２番目の界面活性剤で置換される。次いで、イオンチャネルのサブユニットは、その活性な構造へと組み立てられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）  １番目の界面活性剤に溶解し、変性したイオンチャネルの発現サブユニットを供給する、
（ｂ）  １番目の界面活性剤を、イオンチャネルのサブユニットがその本来の構造へと折りたたまれることを誘因する２番目の界面活性剤と置き換える、および
（ｃ）  イオンチャネルのサブユニットをその活性な構造に組み立てる、
ことからなる、活性な構造へと折りたたまれるイオンチャネルまたはその機能的サブユニットを製造する方法。
【請求項２】
イオンチャネルが電位依存性イオンチャネルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオンチャネルがリガンド依存性イオンチャネルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サブユニットがホモマーであることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サブユニットがヘテロマーであることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
サブユニットの供給が、融合タンパク質、好ましくはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質としてのサブユニットの発現により起きることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）の後に続く工程が、サブユニットをクロマトグラフィーのカラム材料に結合させる工程（ａ１）、および工程（ｂ）の後に続く工程が、サブユニットをクロマトグラフィーのカラム材料から溶出させる工程（ｂ１）であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
１番目の界面活性剤が、Ｎ−ラウリルサルコシン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、グアニジニウム、および／またはＮ−テトラデシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１４）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
２番目の界面活性剤が穏やかな界面活性剤、好ましくはＮ−テトラデシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１４）であることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
同じ界面活性剤が１番目および２番目の界面活性剤としてそれぞれの場合で用いられ、２番目の界面活性剤が１番目の界面活性剤よりも低濃度であることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤が、Ｎ−テトラデシルホスホコリンであり、１番目の界面活性剤として０．１〜１％濃度、好ましくは０．５％の濃度で、２番目の界面活性剤として０．０１〜０．５％濃度、好ましくは０．０５％の濃度で用いられることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
２番目の界面活性剤が、脂質／界面活性剤の混合ミセルの形態で折りたたみ用緩衝液中に存在することを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、イオンチャネルまたはその機能的サブユニットのリガンドを含む折りたたみ用緩衝液中で行われることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
イオンチャネルのサブユニットが、その活性な構造に組み立てられることが、溶液中で起こることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
イオンチャネルのサブユニットが、その活性な構造に組み立てられることが、プロテオリポソーム中で起こることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
以下の工程： 
（ａ）  適当な緩衝液中で、活性な構造で存在するイオンチャネルを供給すること、
（ｂ）  イオンチャネルのリガンドを加えること、および
（ｃ）  イオン流束を測定すること、
からなり、イオンチャネルが請求項３から１５のいずれかに記載の方法で製造されることを特徴とする、リガンド依存性イオンチャネルまたはその機能的サブユニットの活性を測定する方法。
【請求項１７】
イオンチャネルがプロテオリポソーム中に存在することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）の代わりに、イオンチャネルまたはその機能的サブユニットのリガンドとの特異的な相互作用を、平衡定数ＫＤの測定により測定する工程（ｃ１）を実施することを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）の代わりに、イオンチャネルまたはその機能的サブユニットのリガンドとの特異的な相互作用を、イオンチャネルまたはその機能的サブユニットへの結合に対する標識リガンドと非標識リガンドとの競合反応を測定することにより測定する工程（ｃ２）を実施することを特徴とする、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程：
（ａ）  プロテオリポソーム中に存在する活性な構造のイオンチャネルを供給し、該プロテオリポソ−ムは適当な緩衝液中にあり、そして色素がプロテオリポソ−ム中に捕捉されていること、
（ｂ）  イオンチャネルのリガンドを加えること、および
（ｃ）  色の変化を測定すること、
からなり、該イオンチャネルが請求項３から１５のいずれかに記載の方法で製造されることを特徴とする、リガンド依存性イオンチャネルまたはその機能的サブユニットの活性を測定する方法。
【請求項２１】
本来の構造へと折りたたまれるイオンチャネルまたはその機能的サブユニットを製造するための、Ｎ−テトラデシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１４）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その活性構造もしくはその機能的サブユニットへと折りたたまれるイオンチャネルを製造する方法、イオンチャネルやその機能的サブユニットを製造するための界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）の使用、およびイオンチャネルの活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変性したタンパク質をその本来の構造へと再度折りたたむ方法は、当該分野で一般的に公知である。
【０００３】
生体細胞は脂質二重膜で囲まれており、その親油性のために水分子やイオンは透過できない。細胞がその周囲とイオン交換できるようにするために、いわゆるチャネルタンパク質（イオンチャネルとも言われる）が細胞膜中に存在する。これらイオンチャネルは、細胞膜を貫通する環状のチャネル細孔を形成し、それは一時的に開口される。
【０００４】
それぞれのイオンチャネルを通過するイオンの選択性に関する要素としては、細孔内壁の荷電アミノ酸残基、原子半径、水和鞘（ｗａｔｅｒ  ｓｈｅａｔｈ）およびイオン電荷であることが多い。
【０００５】
イオンチャネルは、通常、複数のサブユニットから構成される。これらのサブユニットは、例えば、グリシンチャネルのように同じ構造を持っていてもよく（ホモマー）、あるいは、例えば、アセチルコリン受容体のように、そのチャネルは異なったサブユニットから構成されている（ヘテロマー）。
【０００６】
イオンチャネルは、例えば記述的に分類される、すなわち、透過できるイオン種にしたがって分類される。別の重要な分類は、そのチャネルの制御機構に基づく、すなわち、どのシグナルが率先して細孔を開いたり、閉じたりしているかということである。これに関連して、電位依存性チャネルとリガンド依存性チャネルに区別される。電位依存性チャネルは、例えば、電位依存性ナトリウムチャネル、カリウムチャネルおよびカルシウムチャネルがあり、生理学上非常に重要である。それらは、チャネルを開かせる細胞膜の電場の変化に特徴がある。リガンド依存性イオンチャネルには、例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体チャネル、グルタミン酸受容体チャネル、セロトニン受容体チャネル、グリシン受容体チャネル、ＧＡＢＡ受容体チャネルがある。これらのイオンチャネルは、特に素早いシナプス伝達にとって重要である。リガンド依存性イオンチャネルは、チャネルを開口させる、特定のリガンドの結合あるいはその類縁体の結合に特徴がある。
【０００７】
イオンチャネルの機能不全は、多くの疾病に関与していることが知られている。このように、以前は知られていなかった２つの脳特異的カリウムチャネルの中に、突然変異が最近になって見出された。突然変異のためにカリウムの流れが減少することで、ある神経細胞の過剰興奮を引き起こし、臨床的にてんかん性発作をきたす可能性がある。さらに、カルシウムチャネルの遺伝的欠損は、家族性片麻痺性偏頭痛を誘発することが見出された。イオンチャネルにおける変化、あるいは個々のサブユニットにおける変化は、先天性の全身もしくは局所の筋無力症、ある種の心室細動、あるいは難聴の進行においてもまた、重要な役割を果たしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
こうした背景を踏まえて、イオンチャネルタンパク質の研究は、特に新規な薬理活性成分の発見においてもまた大変重要である。イオンチャネルのイン・ビトロにおける研究の基礎は、単離・精製した、特に機能的に活性なイオンチャネルタンパク質を、できるだけ多くの量を供給することによって形成される。それゆえ、天然のイオンチャネルタンパク質を製造するのに適した方法は、必要不可欠である。
【０００９】
幅広く多様性に富んだ型のタンパク質を製造するための様々な方法が、当該分野において公知である。天然に存在する生体物質からのタンパク質の精製の他に、タンパク質を、細菌、哺乳類、昆虫、植物または酵母の細胞中で発現させ、続いて精製する遺伝子操作手法もまた公知である。
【００１０】
このように、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）らは、「ブタ脊髄のグリシン受容体の精製と特性」（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８５），２４，９９０−９９４）において、国産ブタの脊髄膜からグリシン受容体を精製することについて、記述している。しかしながら、そこに記述されている方法は、大変複雑であり、とりわけたくさんの量の組織が必要となる。さらにその方法は、他のイオンチャネルタンパク質に直接適用できない。本来の形に折りたたまれた受容体の収率もまた、大変低い。それゆえ、記述されたその方法は、大規模な使用には適していない。
【００１１】
カスキオ（Ｃａｓｃｉｏ）らが、「バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）に感染した昆虫細胞中の、同じサブユニットから成る（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）ヒトａ１グリシン受容体の機能的発現と精製」（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９９３年），第２６８巻，２２１３５−２２１４２頁）において、真核細胞の発現系に基づいた方法を記述している。ヒトのａ１グリシン受容体チャネルは、バキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞において発現する。続いて、その発現したチャネルは、昆虫細胞の細胞膜の中へと取り込まれるようになり、そして細胞膜から精密に単離しなければならない。さらに、そこに記載された方法は、本来の形に折りたたまれたチャネルタンパク質の収率が非常に低いという不利な点を持っている。この理由は、特に膜中のチャネル濃度が高いことで、昆虫細胞が死ぬことになり、その結果、発現が起こらなくなるからである。それゆえ、ここで記述されている方法もまた、大規模な使用には適していない。
【００１２】
タレブ（Ｔａｌｅｂ）とベッツ（Ｂｅｔｚ）は、「アフリカツメガエルの卵母細胞中のヒトグリシン受容体のａ１サブユニットの発現：高い受容体密度における明らかな作動薬親和性の増加」（ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）（１９９４年），第１３巻，１３１８−１３２４頁）において、同様に真核細胞の発現系に基づいた方法を述べており、その方法によって、ヒトグリシン受容体チャネルのサブユニットが製造されることを記述している。この目的のために、該サブユニットをコードするｃＤＮＡ構築物が、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入される。それから、チャネルタンパク質サブユニットが、卵母細胞中で発現し、卵母細胞膜へと取り込まれる。この文献は、膜からタンパク質のさらに必要な精製については記述していない。この公知の方法もまた非常に複雑で、本来の形に折りたたまれたタンパク質の収率は非常に低いという結果になっている。そのため、この方法では、同様に大規模への適用が不適当である。
【００１３】
ＷＯ  ０１／１４４０７は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を製造する方法を開示している。ここで、ＧＰＣＲは細菌細胞中で発現し、最初はいわゆる不溶な封入体の形態である。それから、ＧＰＣＲは界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）の交換により、それら本来の形へと折りたたまれる。しかしながら、ＧＰＣＲは生化学的には、イオンチャネルタンパク質に匹敵しない。
【００１４】
したがって、ＧＰＣＲはその３次元構造において、チャネル形成をするタンパク質とはかなり異なる。大方のＧＰＣＲは、細胞外のＮ末端ループ領域を有する、７回膜貫通型へリックスからなる保存されている２次構造を持つ。ＧＰＣＲはシグナル伝達カスケードの中で、シグナルを中継する役目を果たすが、イオンを貫通させる役目は持たない。イオンチャネルタンパク質の構造は、ＧＰＣＲとは異なり、既述の通り通常は複数のサブユニットを持つが、その構造によって、結果としてアミノ酸鎖が完全に異なった折りたたみの挙動を示すことにもなる。すなわち、本来のイオンチャネルタンパク質の構造の推定は、ＧＰＣＲとは異なった方法で行われる。これに対する理由として非常に重要なのは、組み立てられたチャネルの細孔の内部において、荷電したアミノ酸残基の確定した配置が頻繁に起きているということである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
こうした背景に対し、本発明の目的は、その活性な構造に折りたたまれるイオンチャネル、またはその機能的サブユニットを製造する方法を提供することであって、それにより従来技術の不利な点が回避されている。
【００１６】
本発明の目的は、次の工程：
（ａ）  １番目の界面活性剤において溶解し、変性したイオンチャネルの発現したサブユニットを供給する、
（ｂ）  その本来の構造へとイオンチャネルのサブユニットを折りたたむことを誘因する２番目の界面活性剤へ、１番目の界面活性剤から置き換える、および
（ｃ）  イオンチャネルのサブユニットをその活性な構造に組み立てる、
からなる方法にしたがって達成される。
本発明の目的は、このようにして完全に達成される。
【００１７】
その理由は、本発明者らが、細菌を使用して発現された出発原料、または無細胞系における出発原料もまた、本来の形に折りたたまれたイオンチャネルタンパク質を製造するのに用いることができることを実現したからである。このことは、従来技術でイオンチャネルに対して用いられた真核発現系と比べて、非常に大量のタンパク質材料がそれにより利用可能で、したがって、本来の形に折りたたまれている大量のイオンチャネルもまた得ることができるという特別な利点を持っている。出発原料は、大抵、例えば大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉのような生体細胞の細胞質ゾルの中に封入体として沈殿しており、それゆえ、生体細胞に対しては無毒である。さらに、その封入体は、例えば遠心分離のような当業者に公知の単純な方法で、生体タンパク質から分離できる。
【００１８】
これに関連して、「発現」とは細菌を使用した発現および無細胞系におけるイン・ビトロ発現の両方を意味する。細菌を使用した発現系は、従来技術で十分に公知であり、当該分野で試験されている。無細胞系の発現に対しては、例えば「急速翻訳システム（ＲＴＳ）」（ロッシュ・ダイアグノスティクス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、マンハイム、ドイツ）を用いることができる。
【００１９】
ここでの「機能的サブユニット」は、イオンチャネルの機能を持つが、「完全な」イオンチャネルを形成しないサブユニットもまた含まれることを意味する。
【００２０】
これまで、例えば細菌を使用して、または無細胞系でヒトのイオンチャネルタンパク質を発現するという当該技術に関する記述または試みは全く無かった。なぜなら、しばしばそれに伴う溶解性の問題が、封入体としてのタンパク質の沈殿のために、これまで解決されてこなかったからである。特に、細菌を使用して発現させ、機能的に不活性な封入体の形状のイオンチャネルタンパク質を、その本来の構造に折りたたむことができる方法については、当業者が利用できる方法は依然として全くない。
【００２１】
本発明によれば、この機能的に不活性なイオンチャネルタンパク質をその本来の構造へと折りたたむことが初めて可能となる。それゆえ、本発明者らが実現したように、不活性なタンパク質が１番目の界面活性剤により変性・溶解し、続いてこの１番目の界面活性剤を、タンパク質の折りたたみを誘因するさらなる界面活性剤に置換することが非常に重要である。したがって、折りたたみを誘因する界面活性剤によって可溶化剤を置換することは、この方法にとって非常に重要である。サブユニットは組み立てられ、イオンチャネルはその活性な構造を獲得する。
【００２２】
再び折りたたまれたチャネルタンパク質の使用目的に応じて、本発明方法は、２番目の界面活性剤を除去する工程、例えば透析工程が後に続いてもよい。さらに、例えばグルタチオンによる、チャネルタンパク質のジスルフィド架橋の形成が必要かもしれない。
【００２３】
さらに、本発明に関する方法のさらなる実施態様では、イオンチャネルが電位依存性イオンチャネルであることが好ましい。
【００２４】
別の実施態様では、イオンチャネルがリガンド依存性イオンチャネルであることが好ましい。その理由は、本発明者らがそのような本来の構造のイオンチャネルを新規な方法で調整できることを実現したからである。
【００２５】
それゆえ、本発明方法を用いて、特に薬理学的に興味のあるチャネルタンパク質、例えばアセチルコリン受容体チャネルを製造することができる。ここで、アセチルコリン受容体チャネルは、特定の筋無力症に関して重要な役割を果たしているように思われる。
【００２６】
さらには、サブユニットとしては、ホモマーが好ましい。
【００２７】
ホモマーで構成されるイオンチャネルは、このようにして容易に製造される、なぜなら、本発明方法によれば、サブユニットが容易に供給され、組み立てられるからである。
【００２８】
さらなる実施態様としては、サブユニットはヘテロマーが好ましい。
【００２９】
同様に、本発明方法を用いて、異なったサブユニットから成るイオンチャネルを製造することができる。
【００３０】
本発明方法のさらなる展開として、サブユニットの供給が、融合タンパク質としてのサブユニットの発現を経由するものであり、その融合タンパク質は好ましくはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質である。
【００３１】
ＧＳＴとの融合は、結果として融合タンパク質をもたらし、細菌で発現させた場合、細菌細胞膜に“非融合”的に取り込まれ、その細胞の細胞質ゾルに蓄積する。
【００３２】
ＧＳＴとの融合は、製造されるタンパク質の取り扱いを特に容易にする。したがって、Ｎ末端もしくはＣ末端に融合されたセグメントは、適当なカラム材料に結合させることにより、細菌タンパク質からタンパク質を分離するために用いられる。したがって、緩衝液を変更すること、あるいはタンパク質を精製することもまた容易にできる。一方、より大きな収率が、ＧＳＴセグメントにより達成される。なぜならば、既に述べたように、細菌を使用して発現されたイオンチャネルは細菌の細胞膜に取り込まれず、逆に封入体として、細胞質ゾル中に沈殿するからである。融合されたセグメントは、場合により切断されて  再び折りたたまれたタンパク質とすることができる。
【００３３】
さらに、融合タンパク質は、融合タンパク質がそれにより単離されるような標識を持っていてもよい。これは、例えば、ある一定の数のヒスチジンからなるヒスチジン標識であってもよい。しかしながら、標識の付いたタンパク質の単離を可能とする、いかなる他の標識もまたこの目的のために用いることができる。
【００３４】
さらに、本発明方法を用いて、工程（ａ）の後にサブユニットをクロマトグラフィーのカラム材料に結合させる工程（ａ１）が続き、また、工程（ｂ）の後に結合したサブユニットを、クロマトグラフィーのカラム材料から溶出させる工程（ｂ１）が続くのが好ましい。
【００３５】
このことは、該界面活性剤の交換が特に簡単に、単一の反応混合液中で起こるという特別な利点を持っている。さらに、例えば、ヒスチジンの融合部が、すなわち、それ自身変性条件下で機能的に活性である性質が利用される。１番目の可溶な界面活性剤の存在下で、変性したサブユニットが工程（ａ１）で例えばニッケルカラムに結合し、それから緩衝液を交換し、このようにして、緩衝液中に溶解している１番目の界面活性剤が、折りたたみを誘因する界面活性剤を含む緩衝液と置換され、その後、カラムに結合しているサブユニットがその本来の構造を取ると思われる。それから、次に続く工程（ｂ１）において、本来の形に折りたたまれているサブユニットが、例えばイミダゾールを加えることで、カラムから溶出される。既述の通り、特に折りたたまれたタンパク質から遊離イミダゾールを除くために、透析が次に続くことも、場合によっては、可能である。
【００３６】
さらに、１番目の界面活性剤は、Ｎ−ラウリルサルコシン、尿素、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、グアニジニウム、および／または、ＦＯＳ−コリン−１４（Ｎ−テトラデシルホスホコリン）からなる群より選択されるのが好ましい。
【００３７】
このことは、そのような高い活性を持った界面活性剤が、発現したタンパク質を確実に完全に溶解させ、変性させるという特別な利点を持っている。したがって、イオンチャネルタンパク質が実質的に定量的に、その本来の構造に折りたたむための前提条件が、設定される。
【００３８】
さらに、２番目の界面活性剤は１番目よりも穏やかな界面活性剤が好ましく、好ましくは、Ｎ−テトラデシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１４）である。
【００３９】
本発明者らが実現したように、このことは特別な利点を持ち、それはイオンチャネルタンパク質がその本来の構造へと所望通りに再び折りたたまれるのが、実質的に定量的に起こるという利点であり、したがって、より穏やかな界面活性剤を用いることで、特に効率的に行われる。すなわち、１番目の界面活性剤を穏やかな界面活性剤、例えばＦＯＳ−コリン−１４に置換することにより、その結果、本来は機能的に不活性な大部分のイオンチャネルタンパク質が、機能的に活性な、本来の形に折りたたまれているイオンチャネルタンパク質に転化する。
【００４０】
別の実施態様では、１番目と２番目の界面活性剤は同じものが使われ、２番目の界面活性剤はより低い濃度であるのが好ましい。
【００４１】
界面活性剤としては、Ｎ−テトラデシルホスホコリンが特に好ましく、０．１〜１％の濃度、好ましくは０．５％の濃度で用いられるのが好ましく、２番目の界面活性剤は０．０１〜０．５％の濃度、好ましくは０．０５％の濃度で用いられるのが好ましい。
【００４２】
本発明方法をさらに発展させると、２番目の界面活性剤は、脂質／界面活性剤混合ミセルの形で、折りたたみ緩衝液中に存在する。
【００４３】
このことは特別な利点を持っていて、それはイオンチャネルタンパク質の安定化が、それら混合ミセルによって、すなわち、界面活性剤に脂質を加えた後により良くなるという利点である。このことが、今度は脂質／界面活性剤ミセルの使用により、その本来の構造へと折りたたまれるイオンチャネルタンパク質の収率をさらに向上させるという結果をもたらすのである。
【００４４】
さらに、本発明の工程（ｂ）は、イオンチャネルのリガンドまたはその機能的サブユニットのリガンドを含む折りたたみ用緩衝液中で行われるのが好ましい。
【００４５】
このことは、特別な利点を持っており、それはこの手段が本来の形に折りたたまれるイオンチャネルタンパク質の収率をさらに増大させるという利点である。この場合、加えられたリガンド、例えばグリシン受容体チャネルの場合はグリシンが、「折りたたみ助剤」として働き、チャネルタンパク質が本来の構造へと折りたたまれ、いったん折りたたまれた構造の安定化をもたらす。
【００４６】
本発明による方法のある実施態様においては、イオンチャネルサブユニットの活性な構造への組み立てが、溶液中で起きることが好ましい。
【００４７】
これは、例えば２番目の界面活性剤が１番目の界面活性剤と置換した後ただちに、２番目の界面活性剤中で起こり得る。
【００４８】
別の好ましい実施態様では、イオンチャネルサブユニットの活性な構造への組み立てが、プロテオリポソーム中で起きる。
【００４９】
これらは、脂質の２分子層により区分された水溶性の区画を含む。この手段は特別な利点を持っており、それはプロテオリポソーム中への折りたたまれたタンパク質の取り込みが、結果として、チャネルタンパク質に関する確たるプロセスについて目標とする研究を可能にする機能的ユニットをもたらしている。  さらに、プロテオリポソーム中の様々なチャネルサブユニットが、完全なイオンチャネルへと再構成されるか、あるいは組み立てられることが可能であり、そして、例えば、イオンチャネルを用いて活性の測定をすることができる。
【００５０】
したがって、本発明は、リガンド依存性イオンチャネルの活性を測定する方法にも関し、それは、次の工程：
（ａ）  適当な緩衝液中、活性な構造で存在するイオンチャネルを供給する、
（ｂ）  測定される物質を加える、および
（ｃ）  イオン流束を測定する、
からなり、ここで、イオンチャネルは、最初に記載した本発明方法に従って製造される。
【００５１】
この場合、測定すべき物質は、例えばイオンチャネルのリガンドであってよい。
【００５２】
新規な該方法を用いて、例えば折りたたまれたイオンチャネルの特定のリガンドへの結合能により、イオンチャネルの活性をこのようにして測定することが可能である。もし、測定される物質がイオンチャネルに結合すると、イオンチャネルが開口し、イオン流束は公知の技術で測定することができる（例  パッチクランプ）。
【００５３】
さらに、新規な該方法を用いて、イオンチャネルを阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【００５４】
前記新規な方法のさらなる利点は、精製された本来のおよび機能的に活性なイオンチャネルの使用により、膜中に存在するイオンチャネルまたは膜から精製されたイオンチャネルに比較して、より大量の、より均一なタンパク質を用いることができるという利点である。
【００５５】
このことに関連して、イオンチャネルは、プロテオリポソーム中に組み立てられて存在するのが好ましい。
【００５６】
このように、イオン流束は容易に測定することができ、これにより、薬理学的に関心のある大部分のイオンチャネルの機能性能もまた今や試験することができる。
【００５７】
リガンド依存性イオンチャネルまたはその機能的サブユニットの活性を測定する方法の別の実施態様においては、工程（ｃ）の代わりに、平衡定数ＫＤの測定により、リガンドとイオンチャネルまたはその機能的サブユニットとの特有の相互作用を測定する工程（ｃ１）を実施するのが好ましい。
【００５８】
この定数は、リガンドとイオンチャネル間の結合を示すものである。これが持っている特別な利点とは、この手段によりイオンチャネルの活性またはその結合能が明確に定量される量を決定するという利点である。
【００５９】
さらに、リガンド依存性イオンチャネルまたはその機能的サブユニットを測定する別の実施態様においては、工程（ｃ）の代わりに、イオンチャネルもしくはそれの機能的サブユニットの特有の相互作用を測定する工程（ｃ２）を実施することが好ましく、工程（ｃ２）においては、イオンチャネルまたはその機能的サブユニットに結合するための、標識リガンドと非標識リガンドとの競合反応の測定により、リガンドとイオンチャネルまたはその機能性サブユニットとの特異的な相互作用が測定される。
【００６０】
このように、簡単で正確な方法でイオンチャネルの活性や結合能を測定することができる。この手順において、決められた濃度の標識リガンドが、緩衝液に加えられる。イオンチャネルタンパク質と標識リガンドとの複合体は、標識によって容易に検出される。続いて、非標識リガンドが、この混合物に様々な濃度で加えられる。それから、標識リガンドが、イオンチャネルの結合サイトから、非標識リガンドの濃度に応じて、取って変わられる。続いて、イオンチャネル上の残存標識リガンドが測定される。それから、２つのリガンドの既知の濃度に基づいて、多くの測定法によって平衡定数ＫDを容易に決定することができる。
【００６１】
これに関連して、放射性標識リガンドが好ましい。なぜなら、放射性標識は、従来の実験室の検出方法、例えば、オートラジオグラフィーやシンチレーションカウンターを用いて、容易に検出できるからである。
【００６２】
さらなる実施態様においては、リガンド依存性イオンチャネルの活性を、次の工程：
（ａ）  プロテオリポソームに存在する、活性な構造のイオンチャネルを供給する、ここで、プロテオリポソ−ムは適切な緩衝液中にあり、色素はプロテオリポソ−ム中に捕捉されている、
（ｂ）  測定する物質を加える、および
（ｃ）  色の変化を測定する、
により測定する。ここで、イオンチャネルは、本発明方法に従った方法で製造される。
【００６３】
この場合、測定物質は例えばイオンチャネルのリガンドであってよい。
【００６４】
この方法が持っている利点とは、イオンチャネルの活性を視覚的に測定できることである。測定すべきイオンチャネルは、プロテオリポソーム中で再構成される。もし、イオンチャネルに結合して該チャネルを開口させるリガンドを加えたら、例えば、物質は緩衝液中にあるプロテオリポソームへと流れ込むことができる。それゆえ、チャネルが開かれる前にプロテオリポソーム中のこれら物質から保護されている色素は、例えば、その蛍光性の変化や色の変化をもたらす。
【００６５】
この場合、色素として、例えば、６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ）、Ｎ−（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウムブロマイド（ＭＱＡＥ）またはルシゲニンなどのようなアニオン感受性色素を用いることができる。これらの３つの色素は、励起／発光波長が異なる。このようにして、本発明の方法を用いて、例えば、リガンドの作動薬および拮抗薬を測定することができる。
【００６６】
本発明は、イオンチャネルの系列からその本来の構造へと折りたたまれた、細菌を使用して発現させたタンパク質を製造するための界面活性剤の使用にも関し、ここで、界面活性剤は、好ましくはＮ−テトラデシルホスホコリン（ＦＯＳ−コリン−１４）である。
【００６７】
上記したように、発明者らは、機能的に不活性な、または変性し、溶解している、例えば、強い界面活性剤中で、イオンチャネルタンパク質を機能的に活性なまたは本来の構造へと折りたたむことを、該界面活性剤が誘因することを初めて実現した。この実現によって、機能的に活性なイオンチャネルタンパク質を製造するために、容易に取り扱うことができる細菌を使用した発現系を用いることが可能となる。なぜなら、不活性な封入体が今やＦＯＳ−コリン−１４を用いて活性なタンパク質に再び折りたたむことができるからである。この課題は、これまでの従来技術では解決されていなかった。特に、当業者はどのタイプのどの界面活性剤が、変性したイオンチャネルタンパク質の再折りたたみを誘因するのに適しているかという情報を欠いていた。
【００６８】
本発明者の成果によって、大規模なアプローチでイオンチャネルまたはそのサブユニットの活性を測定することも今や可能となった。なぜなら、このタンパク質は今や大量にその本来の形で供給されるからである。
【００６９】
さらなる利点は以下の典型的な実施態様および図から明らかである。
【００７０】
前述した、および以下で説明される特徴は、それぞれの場合で示された組み合わせだけではなく、他の組み合わせもしくは単独で用いられてもよく、それは本発明の範囲を逸脱するものではないことが当然、理解されるであろう。
【実施例１】
【００７１】
イオンチャネルタンパク質の細菌による発現
ハイデルベルク大学  神経生物学研究所から得られたｐＢＳ−Ｇｌｙα１およびｐＲＣ／ＣＭＶ−Ｇｌｙα１プラスミドを出発原料として用いた。
【００７２】
ヒト（ホモメリック）グリシンａ１チャネルに対する遺伝子は、標準条件下におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、プラスミドｐＲＣ／Ｇｌｙα１から、付加した制限切断部位を有するプライマーおよびＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社、米国）を用いて増幅し、制限切断部位を介して、発現ベクターｐＧＥＸ２ａＨｉｓ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社、スウェーデン、修飾されたｐＧＥＸ２ａベクター）に結合させた。リガンドとの連結反応混合物は、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスルーヘ、ドイツ）に形質転換した。陽性コロニーは、標準的な配列プライマーｐＧＥＸ５’ｆｏｒ／ｐＢＡＤｒｅｖ．を用いて同定し、配列を決めた。国際塩基配列データベース（ＥＭＢＬ  Ｇｅｎｂａｎｋ、ＡＣＣナンバーＸ５２００９）からの配列と比較して陽性のクローンを同定することが可能となった。発現のために、ｐＧＥＸ２ａＨｉｓ−Ｇｌｙα１プラスミドはＢＬ２１細胞（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社、米国）に形質転換した。
【００７３】
アンピシリン含有ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ）２００〜４００ｍｌに、これらの形質転換された細菌を植菌し、３７℃で終夜振とうしながら培養した。続いて、この前培地２０ｍｌを１リットルのアンピシリン含有培地に移し、最適な密度（ＯＤ）が０．８になるまで、３７℃で振とうしながら培養した。
【００７４】
１００mＭのＩＰＴＧ（イソプロピル  ｂ−チオガラクトシド）を培地に加えることにより、融合タンパク質の発現を誘導させた。その培養液はさらに３時間培養される。それから、培養液を遠心分離し、１リットル培養液からのペレットを、溶菌用緩衝液１００ｍｌ（１０ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％スクロース、１ｍＭＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニル）、１ｍｇ／ｌ  リゾチーム、１ｍＭ  ＤＴＴ）に取り込んだ。
【実施例２】
【００７５】
ラウリルサルコシン／ＦＯＳ−Ｃ−１４を用いた方法
ａ）ラウリルサルコシンを用いたイオンチャネルタンパク質の溶解
【００７６】
実施例１で得た細菌を、標準条件下でマイクロフルイダイザーを用いて、破壊した。この結果、細菌タンパク質および封入体の形のイオンチャネルタンパク質の混合物が得られる。並行して、ニッケル・ＮＴＡ・スーパーフロー・カラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社）に８〜１５ｍｌのカラム材料を充填し、５カラム体積の洗浄用緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％  ラウリルサルコシン（１番目の界面活性剤）、１０ｍＭ  ｂ−メラノサイト刺激ホルモン（ｂ−ＭＳＨ））を用いて、約２〜１０ｍｌ／ｍｉｎの移動速度で、平衡にした。
【００７７】
タンパク質を含む溶液は、約２ｍｌ／ｍｉｎの一定の移動速度で、２００〜５００ｍｌの体積で、注意深く負荷した。フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）は、２回、そのカラムに通して実施する。
【００７８】
タンパク質の材料を負荷した後、カラムは８〜１５カラム体積の洗浄用緩衝液を用いて、洗浄する。移動速度は高めることが出来、１０〜２０ｍｌ／ｍｉｎである。細菌発現のイオンチャネルタンパク質は、今やヒスチジン融合部位を介して、カラム材料に結合する。細菌タンパク質はカラム材料に結合することはできないので、洗浄工程で除去される。
【００７９】
結合したイオンチャネルタンパク質は、１段の勾配で溶出される。溶出用緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％  ラウリルサルコシン、１０ｍＭ  β−メラノサイト刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）、３００ｍＭ  イミダゾール）は、１〜２ｍｌ／ｍｉｎの移動速度で連続的に、もしくは１ｍｌの体積で非連続的のいずれかで、負荷をかける。１ｍｌの画分を採取する。個々の画分は、光度計で、３２０ｎｍ〜２４０ｎｍの波長における吸光度を調べた。２８０ｎｍで０．６を超える吸光度を持つ画分を採取し、続いて一緒に透析した。溶出したイオンチャネルタンパク質は、これらの画分に存在する。
【００８０】
プールされた画分は、タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるように調整する。全体の体積は洗浄用緩衝液の１００倍体積に対して、しかし少なくとも１リットルに対して、終夜測定し、透析する。これに続いて、別の透析が洗浄用緩衝液の同体積に対して、４時間行われる。
【００８１】
透析した画分の体積が測定され、タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定する。
【００８２】
この透析した画分は、１番目の界面活性剤（ラウリルサルコシン）で溶解し、変性した、精製イオンチャネルタンパク質を含んでいる。
【００８３】
２ｂ）変性し、溶解したイオンチャネルタンパク質の本来の構造への再折りたたみ
変性したイオンチャネルタンパク質の再折りたたみは、好ましくはさらにニッケル・ＮＴＡ・スーパーフロー・カラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社）で実施される。これを行うために、例えばミニカラム（モビテック（ＭＯＢＩＴＥＣ）社、ゲッチンゲン、ドイツ）に、約３〜４ｍｌのカラム材料を充填し、５カラム体積の洗浄用緩衝液（ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％  ラウリルサルコシン、１０ｍＭ  ｂ−メラノサイト刺激ホルモン（ｂ−ＭＳＨ））を１〜２ｍｌの移動速度で平衡にする。
【００８４】
カラムは出口にて閉じる。それから、カラムを実施例２で得られたタンパク質溶液（約１０〜１２ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌタンパク質）で満たす。続いて、カラムを完全に閉じ、コールドルームで１時間、回転ミキサーで平衡にする。
【００８５】
そして、カラム材料は、カラム体積の洗浄用緩衝液で２回洗浄する。次いで、カラムを通す移動速度を、著しく遅くなるようにし、１秒間に約１滴とする。その後、カラムは、５カラム体積の再折りたたみ用緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭ  リン酸２水素カリウム、１２０ｍＭ  グルコン酸カリウム、１ｍＭ  ＧＳＨ（グルタチオン）、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ（２硫化グルタチオン）、０．１％  ＦＯＳ−コリン−１４（２番目の界面活性剤）、０．０１％  デオキシコール酸塩、０．０１％  サメ脂質（シャークリピッド））にリガンド（それぞれの場合、受容体にもよるが、例えば２００ｍＭのグリシン、グルタミン酸塩もしくはＧＡＢＡ）を加えて洗浄する。それから、カラム出口は再び閉じられ、カラムを再折りたたみ用緩衝液で満たす。続いて、そのカラムは４℃で、少なくとも２時間もしくは終夜、回転機の中でインキュベートする。それにより、本来の構造から再び折りたたまれたイオンチャネルタンパク質を今度はカラム材料に結合させる。
【００８６】
再折りたたみ用緩衝液がカラムから溶出し、そのカラムは１０カラム体積の再折りたたみ緩衝液（リガンドは伴わない）で再び洗浄される。続いて、再折りたたみ溶出用緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭ  リン酸２水素カリウム、１２０ｍＭ  グルコン酸カリウム、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ、０．１％  ＦＯＳ−コリン−１４（２番目の界面活性剤）、０．０１％  デオキシコール酸塩、０．０１％  サメ脂質（シャークリピッド）、０．５Ｍ  アルギニン、０．５Ｍ  イミダゾール）をリガンド（それぞれの場合、受容体にもよるが、例えば２００ｍＭのグリシン、グルタミン酸塩もしくはＧＡＢＡ）とともにカラムに入れ、少なくとも各１ｍｌの１２画分採取する。３２０〜２４０ｎｍの吸収スペクトルを、個々の画分に対して記録する。２８０ｎｍで０．５を超えた吸光度画分を集め、１５ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）容器に移す。合わせた溶液に対して、再び吸光度を測定し、タンパク質濃度を、再折りたたみ溶出用緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００８７】
このようにして得られた溶液は、今やその本来の構造に折りたたまれたイオンチャネルタンパク質を含む。タンパク質の使用目的に応じて、この方法は、引き続き、緩衝液を変えたり、透析することができる。
【実施例３】
【００８８】
ＦＯＳ−Ｃ−１４を用いた方法／異なる濃度
実施例１で製造した、封入体（ＩＢ）中に存在するイオンチャネルタンパク質α１Ｇｌｙ−Ｒに対して、この場合に用いた可溶化緩衝液は、次の緩衝液である：ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ｐＨ７．４；０．５％  ＦＯＳ−Ｃ−１４；１０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）。それぞれの場合、約５０ｍｌの緩衝液を１０ｍｌのＩＢに対して用いた。可溶化緩衝液を加える前に、ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）の中で、ＩＢをもう一度均質化した。それから、ＩＢを緩衝液にゆっくりと滴下した。できるだけ多くのＩＢを可溶化するために、随意、濁った溶液のまま放置してもよく、４℃の冷所で１〜２時間攪拌し、この間１度または２度、超音波チップを用いて、３分間、５／５０％サイクルで、超音波破砕した。
【００８９】
続いて、この懸濁液を４℃、４０，０００ｒｐｍで２０分間、超遠心分離機Ｔｉ−４５（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社）中で遠心分離した。その上清は、ＤＴＴの濃度を１ｍＭ、ＦＯＳ−Ｃ−１４の濃度を０．０５％に下げるために、ＰＢＳと１対１０の割合で希釈した。
【００９０】
ＩＢの１ｍｌ当たり、１００単位のトロンビン（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社、ドイツ）を加え、その溶液は室温で４〜５時間、インキュベートし、随意、４℃で終夜インキュベートしてもよい。さらに、Ｎｉ−ＮＴＡを加える直前に、１ｍｌ当たり３０単位のトロンビンを加えた。
【００９１】
ＰＢＳに対して平衡になった１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡを、最初のＩＢの１ｍｌ当たり加えた。タンパク質は、バッチ法で少なくとも２時間、４℃でＮｉ−ＮＴＡとともにインキュベートするか、もしくは、その溶液を前もって準備したＮｉ−ＮＴＡカラムに負荷速度２５ｍｌ／ｈで、ポンプ注入した。溶出後、タンパク質が特異的にカラムに結合し、精製できたと明らかになるまで、カラムへの負荷を一時中断した。
【００９２】
非特異的に結合したタンパク質は、再折りたたみ用洗浄緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４；０．１％  ＦＯＳ−Ｃ−１４；２０ｍＭ  イミダゾール；０．０１％  デオキシコール酸塩；０．０１％  サメ脂質（シャークリピッド）；２０ｍＭ  グリシン；試験ｐＨは再び滴定して７．４にする）を用いて、少なくともカラム体積の１０〜２０倍で、洗浄した。
【００９３】
Ｈｉｓタンパク質の溶出
溶出用緩衝液が、随意、用いられる：
【００９４】
溶出用緩衝液１：ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ｐＨ７．４；０．１％  ＦＯＳ−Ｃ−１４；３００ｍＭ  イミダゾール；０．０１％  デオキシコール酸塩；０．０１％  サメ脂質（シャークリピッド）；ｐＨを再び調べ、７．４に調整する。
【００９５】
溶出用緩衝液２：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４；０．１％  ＦＯＳ−Ｃ−１４；３００ｍＭ  イミダゾール；０．０１％  デオキシコール酸塩；０．０１％  サメ脂質（シャークリピッド）；５００ｍＭ  アルギニン塩酸塩；ｐＨを再び調べ、７．４に調整する。
【００９６】
溶出用緩衝液３および４は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の代わりに、Ｔｒｉｓ／Ｃｌ／３００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）を用いて製造した。
【００９７】
溶出された個々の画分は、Ａ280０（３２０〜２４０ｎｍのスペクトル）において測定した。０．８を超える吸光度をもつ試料（希釈なし）を集め、一緒にした。それから、一緒にした画分の吸光度を再び測定し、タンパク質濃度１．３ｍｇ／ｍｌに調整した。試料は、この目的のために適当な溶出用緩衝液により希釈された。
【００９８】
溶出したタンパク質画分を安定化するために、１００ｍＭ  グリシン、３００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＧＳＨ／０．２  ＧＳＳＧ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）／５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０％  スクロース、１５％  グリセロール、５０ｍＭソルビン酸、１００μＭ  ストリキニーネを、随意、加えた。溶出用緩衝液３および４に関してのみ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を随意、加えた。スクリーニングのため、約１００μｌのタンパク質溶液を、適当な安定化剤と混合し、４℃で終夜インキュベートした。
【実施例４】
【００９９】
プロテオリポソーム中における本来のイオンチャネルの再構成
ａ）リポソ−ムの製造
３つの脂質、すなわち、コレステロール、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）および１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）のクロロホルム溶液である各１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を準備した。これら溶液を、−８０℃で保存する。使用に際しては、ストック溶液を乾燥器内で解凍し、それ以降は常に氷上で保存しなければならない。
【０１００】
ストック溶液から、２８０μｌのコレステロール、３２０μｌのＰＯＰＥおよび４００
μｌのＰＯＰＣをピペットで取り、一緒にすることによって、脂質の混合物を製造する。この溶液は全部で１００ｍｇの脂質を含み、最大１０ｍｇのタンパク質を再構成するのに十分である。
【０１０１】
その脂質混合液を、ロータリーエバポレーター用のナス型フラスコに入れ、脂質混合物１ｍｌ当たり、４ｍｌのクロロホルムを加える。その混合液を、ロータリーエバポレーターに導入し、１０分間混合する。この後、７５ミリバールで３０分間、そしてさらに、２０ミリバールで再び３０分間インキュベートする。それから、乾燥した脂質を、２回蒸留した水１０ｍｌ中に取り、これは最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに相当する。続いて、アヴェスティン（Ａｖｅｓｔｉｎ）社の押し出し機で１００ｎｍのフィルターから押し出す。リポソームは、数週間、４℃で保存できる。
【０１０２】
４ｂ）イオンチャネルの再構成
完全なイオンチャネルは、ピペットで再構成用混合液を１５ｍｌ容量、採取することにより再構成される：実施例２ｂまたは実施例３（１ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質溶液０．５〜１．０ｍｌ、予め製造したリポソーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１．５ｍｌおよび再構成用緩衝液（２５ｍＭリン酸２水素カリウム、ｐＨ７．５、１２０ｍＭグルコン酸カリウム）１２ｍｌ。混合液は、２０℃で約２４時間、回転機の中でインキュベートする。この間、タンパク質または個々のイオンチャネルサブユニットはリポソームに取り込まれ、そこで組み立てられて完全なイオンチャネルとなる。
【０１０３】
タンパク質の製造に由来し、存在する任意の界面活性剤を混合物から除去するために、２〜３ｍｌのカルビオソーブ（Ｃａｌｂｉｏｓｏｒｂ）材料（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社、ダルムシュタット、ドイツ）を再構成混合液に加え、２０℃で４〜２４時間インキュベートした。
【０１０４】
それから、５ｍｌのモビテック（Ｍｏｂｉｔｅｃ）カラム上で、カルビオソーブ（Ｃａｌｂｉｏｓｏｒｂ）材料を除去し、フロースルー液を、超遠心分離の遠沈管（例えば、Ｔｉ−７０ローター用遠沈管、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社）に採取する。
【０１０５】
混合液を５５，０００ｒｐｍで３０分間、超遠心分離器で遠心分離した。上清は捨て、ペレットを１ｍｌの再構成用緩衝液に完全に再懸濁させ、次いでその混合液を再構成用緩衝液で２５ｍｌにする。
【０１０６】
この後、さらに６０，０００ｒｐｍで３０分間、超遠心分離を行う。上清は捨て、ペレットを１ｍｌの分析用緩衝液（グリシン受容体チャネルに対しては：２５ｍＭ  リン酸２水素カリウム、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  塩化カリウム（ＫＣｌ）；グルタミン酸塩受容体チャネルに対しては、１００ｍＭ  リン酸２水素カリウム、ｐＨ７．５、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、８０ｍＭ  スクロース）に完全に再懸濁させ、混合液をアッセイ用緩衝液で２５ｍｌにする。
【０１０７】
これに続いて、さらに、６０，０００ｒｐｍで３０分間、超遠心分離をする。
【０１０８】
再構成されたイオンチャネルは、今度はペレットのプロテオリポソーム中に存在する。そのペレットを、５００μｌのアッセイ用緩衝液中に採取して完全に再懸濁させる。
【実施例５】
【０１０９】
置換分析を用いた再構成イオンチャネルの活性の測定
イオンチャネル活性の測定は、再構成されたグリシン受容体チャネルの実施例で例示される。この場合の活性の測定手段は、そのイオンチャネルのリガンドに対する親和性である。
【０１１０】
放射性置換分析を、ａ１グリシン受容体に対して用いた。グリシンの受容体チャネルに対して用いられるリガンドは、一定濃度の［3Ｈ］−ストリキニーネおよび様々な濃度の非標識ストリキニーネの２種のストリキニーネである。競合的拮抗剤としてのストリキニーネの性質がこの場合に利用される。
【０１１１】
５００ｎＭの放射性［3Ｈ］−ストリキニーネおよび５ｍＭの「コールド」ストリキニーネのストック溶液を、それぞれエタノール中で調整した。活性の分析は、９６ウェルＭＡＦＢ  ＮＯＢ  ５０プレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社、エッシュボーン、ドイツ）上で実施する。そのプレートは、０．３％ポリエチレンイミド２００μｌで被覆し、室温で１時間、インキュベ−トした。そのプレートを吸引し、アッセイ用緩衝液（実施例４参照）を用いて２回洗浄した。
【０１１２】
１２ｍｌのアッセイ用緩衝液および６４２μｌの［3Ｈ］−ストリキニーネのストック溶液からなる１番目の混合液を準備した。この混合液を適切に等しくなるように８〜１２の少量の混合液に分けた。それから、「コールド」ストリキニーネを常に同容量であるが異なる濃度で、ピペットで採取して、これら混合液に加えた。この場合の濃度は、予想される結合定数および平衡定数ＫDの１０の２乗未満から、１０の２乗を超える範囲までをカバーする。
【０１１３】
イオンチャネルは、実施例４で述べたように、脂質小胞中で再構成される。２０μｌのこれらプロテオリポソームを、それぞれのデータを取るときに用いる。結合している混合液を、９６ウェルのガラス繊維プレート上に、最終的に１５０μｌの容量をピペットで取り、２０℃で１時間、インキュベートした。［3Ｈ］−ストリキニーネの濃度は、一定の２０ｎＭに設定した。「コールド」［3Ｈ］−ストリキニーネは、それぞれの結合混合液で、１０-12モル濃度および１０-7モル濃度の間で、変化させた。イオンチャネルタンパク質に結合するリガンド；それぞれ、より多くのストリキニーネが、「コールド」ストリキニーネに対する放射能で標識されたストリキニーネの比に応じて結合する。
【０１１４】
タンパク質が結合したリガンドから遊離しているリガンドを分離するために、結合混合液を、９６ウェルガラス繊維のプレートを通して吸引濾過し、結合用緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４；２００ｍＭ  塩化カリウム）を用いて４℃で洗浄した。プロテオリポソームおよびそれに結合しているリガンドをガラス繊維膜に保持した。９６ウェルプレート中の膜を乾燥し、個々のウェルは５０μｌのシンチレーションカクテルで満たした。フィルターに残っている放射能活性（ＣＰＭ）は、結合しているピコモル濃度の［3Ｈ］−ストリキニーネに換算した。
【０１１５】
対照の測定用として、脂質小胞を、放射能標識した「コールド」リガンドとともにインキュベートし、同じ方法で処理した。
【０１１６】
続いて、放射能活性のあるストリキニーネの結合能の最大値の半分になる、「コールド」ストリキニーネの濃度を測定した。
【０１１７】
α１Ｇｌｙ受容体プロテオリポソームの［3Ｈ］−ストリキニーネ／非標識ストリキニーネに対する置換曲線を図１に示す。結合［3Ｈ］−ストリキニーネの濃度を、α１Ｇｌｙ受容体プロテオリポソーム（黒四角）および空の脂質小胞（黒丸）に対する「コールド」ストリキニーネそれぞれの濃度の関数として、プロットした。図１中のそれぞれのデータ採取点は、３つの独立した測定法により平均化した。置換曲線は、ワンサイト（Ｏｎｅ−ｓｉｔｅ）競合モデルとしてＯｒｉｇｉｎ  ６．０バージョンのソフトを用いて作成した。ｐＩ50値は、置換曲線の曲線プロファイルにおける転換点を表し、それぞれの場合で、Ｋｄに対応する。
【実施例６】
【０１１８】
イオン電流を測定することによる再構成イオンチャネルの活性の測定
実施例４においてリポソーム中で再構成されたイオンチャネルについて、イオン電流の測定を行った。この目的のために、プロテオリポソームは次に示す細胞外の溶液と混合した：２ピペットの緩衝液：１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、２８μＭグリシン。
【０１１９】
イオン電流をパッチクランプの技術を用いて測定し、対照としてグリシンなしの試験混合液も測定した。
【実施例７】
【０１２０】
捕捉された色素と再構成イオンチャネルを含むプロテオリポソームの製造
使用できる色素は、例えばアニオン感受性色素であり、例えば、６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ）、Ｎ−（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウムブロマイド（ＭＱＡＥ）またはルシゲニンなどである。これら３つの色素は、励起／発光の波長が異なる。
プロテオリポソームは、実施例４に記載のように製造する。
【０１２１】
この場合、特に４０％大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）、３２％ヒツジ脳ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および２８％コレステロールの混合液を脂質混合液として用いることもできる。その脂質は、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、１２０ｍＭ  グルコン酸カリウム、ｐＨ７．４の２５ｍＭ  リン酸水素カリウムの中に採取される。その脂質は、２００ｎｍのフィルターを通して、適切に１９回押し出される。
【０１２２】
アニオン感受性色素の捕捉は、様々な方法で行うことができ、例えば、自然に、あるいは凍結と解凍を繰り返したり、あるいは押し出したり、あるいは超音波破砕によって、アニオン感受性色素の捕捉を行うことが出来る。
【０１２３】
ＳＰＱ、ＭＱＡＥおよびルシゲニンの蛍光性は、ヨウ化物によって強く消光される。色素を負荷したプロテオリポソームを、消光用緩衝液（４０ｍＭ  ヨウ化カリウム、８０ｍＭ  グルコン酸カリウム、２５ｍＭ  リン酸水素カリウム、ｐＨ７．４）に加える。蛍光光度計における励起によって、蛍光性のシグナルが示される。リガンド（例えば、ストリキニーネ）を加えることでイオンチャネルが開き、ヨウ化物はプロテオリポソームに流れることができる。これによって、蛍光が減少するのである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、再構成されたα１−グリシン受容体のストリキニーネ結合能を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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