(57)【要約】エリスロポイエチンレセプター(EPO-R)の調節ドメインと複合化し、EPO-Rと共に使用されて、EPO-Rの存在、競合アッセイにおいて調節ドメインに結合し、かつ生理学的環境において主題化合物が結合した場合に、細胞中にEPO-rによるシグナルを誘発する他の分子の能力を決定する化合物が提供される。該化合物は、少なくとも一の窒素原子を有する６員の複素環を有することを特徴とし、置換トリアゾロピリミジン、ピリダジノン、ピリジン及びピペリジンを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポイエチンレセプターの調節配列を含んでなるポリペプチドと、水素以外の１２〜３６の原子、９〜２０の炭素原子、４〜１２のヘテロ原子であるカルコゲン、窒素、ハロゲン及び周期表のＩ及びＩＩ族の金属イオンの非ペプチド有機分子であって、式：
(１)
【化１】
2006508041.tif 000020
[上式中：
Ｘは、１〜７の水素以外の原子のもので、酸素、０〜２の酸素原子に結合した硫黄、アミノ及びアルキル置換アミノであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ１は水素、又は１〜１２の炭素原子と、０〜６のカルコゲン、窒素及びハロゲンであるヘテロ原子を有する有機基であり、０〜２の不飽和部位を有する１〜６の炭素原子の脂肪族、非オキソカルボニル及びその窒素及び硫黄誘導体、０〜２の不飽和部位を有する脂環式のもの、アリール、複素環、及びそれらの組合せであって、環状構造は１〜２の環を有していてもよいものからなり；
Ｒ２は、水素、環炭素に結合した窒素及び／又はカルコゲンを有するヘテロ官能基、１〜１０の炭素原子の有機基で置換された環炭素に結合した窒素及び／又はカルコゲンを有するヘテロ官能基、５〜１０の炭素原子のアリール、アルカリル、アラルキル、及びアラルケニル、６〜１０の炭素原子のアロイル、又はＲ１に対して記載したように、は環状炭素に結合した窒素及び／又はカルコゲンを有しており、ここでＲ１において上述したように１〜４のヘテロ原子を有する１〜１２の炭素原子を介して結合した有機基であり；
Ｒ３は、水素、又は１〜１０の炭素原子と０〜４のカルコゲン及び窒素のヘテロ原子の有機基であり；
Ｒ４は、水素又はアルキル又は置換アルキルで１〜６の炭素原子のものであり、ここで置換基はオキシ、アミノ及びハロであり；
但しＲ３及びＲ４は共同して、それらが結合している環原子と共に４〜１０の環原子を有する環を形成することができ、また１〜２の環を形成し、ここで環原子は、ハロ、１〜３の炭素原子のアルキル、０〜３の炭素原子のオキシ、０〜３の炭素原子のチオ、及び０〜４の炭素原子のアミノで置換されるか未置換である]
のもの、
(２)
【化２】
2006508041.tif 000021
[上式中：
ｐは０、１又は２であり；
Ｒ５は、水素以外に１〜３の原子を有する基で、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、及びアルキルである]
のもの、
(３)
【化３】
2006508041.tif 000022
[上式中：
ＹはＯ、ｍが０、１又は２であるＳ(Ｏ)ｍ、アミノ又はＣＨ２であり；
Ｒ６はＨ又は１〜３の炭素原子のアルキルであり；
Ｒ７は水素、又は水素以外の０〜３の原子の基であり、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ及びアルキルであり；
Ｖは０〜２の窒素原子を含み、残りが炭素原子である６環員のアリール基であり；
Ｕは水素以外が０〜５の原子の置換基で、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、及びアルキルであり；
ｕは０〜３である]
のもの、
(４)
【化４】
2006508041.tif 000023
[上式中：
Ｙは酸素、硫黄、ＮＨ、(１〜３の炭素原子のアルキル、Ｈ)又はＨ２であり；
Ｒ７は水素、又は１〜１２の炭素原子と０〜４のヘテロ原子の有機基であり；
Ｒ８は水素、１〜６の炭素原子の脂肪族基、又は５〜６の環員と、酸素、窒素又は硫黄である１〜２のヘテロ環員の複素環であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は同一又は異なっており、水素、又は１〜１２の炭素原子の有機基、又は１〜３のヘテロ原子のヘテロ置換基であり；
Ｒ１１及びＲ１２は同一又は異なっており、水素、又は１〜１２の炭素原子の有機基である]
のジアゾロヘキサヒドロキノリン、
である非ペプチド有機分子を含有する組合せ物。
【請求項２】
前記ポリペプチド及び前記非ペプチド有機分子が、EPO-Rの調節ドメインにおいて複合化している、請求項１に記載の組合せ物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが細胞膜に結合したEPO-Rである、請求項２に記載の組合せ物。
【請求項４】
エリスロポイエチンレセプターの調節ドメイン配列を含んでなるポリペプチドと、水素以外の１２〜３６の原子、９〜２０の炭素原子、及び４〜１２のヘテロ原子であるカルコゲン、窒素、ハロゲン、及び周期表のＩ及びＩＩ族の金属イオンの非ペプチド有機分子であって、式：
(１)
【化５】
2006508041.tif 000024
[上式中：
Ｘは、水素以外の１〜３の原子のもので、酸素、０〜２の酸素原子に結合した硫黄、アミノ及びアルキル置換アミノであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ１は、１〜３の炭素原子の低級アルキル基、又は０〜３の置換基を有する６環員芳香族基を有する有機基であり、ここで置換基はハロ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、ニトロ、トリハロメチルであり、Ｘに直接結合しているか、又は鎖内部において、１〜４の炭素、窒素、又はカルコゲン原子、特に炭素及び窒素、の連結基を介して結合し、鎖内部に０〜２のヘテロ原子があり、ここでヘテロ原子は、０〜１のＮ-ＯＨを有するアルファ-アセタミジニル、又は炭素及び水素にのみ結合しており；
Ｒ２は、水素、０〜３の炭素原子のアミノ、０〜３の炭素原子のオキシ、１〜１０の炭素原子と０〜３のヘテロ原子の有機基が置換された環炭素に結合した窒素又はカルコゲンを有するヘテロ官能基であり；
Ｒ３は、水素、又は１〜１０の炭素原子と０〜４のカルコゲン及び窒素のヘテロ原子の有機基であり；
Ｒ４は、水素、アルキル又は置換アルキルで１〜６の炭素原子のものであり、ここで置換基はオキシ、アミノ及びハロであり；
但しＲ３及びＲ４は共同して、それらが結合している環原子と共に、４〜１０の環原子の環を形成することができ、また１〜２の環を形成し、ここで環原子は、ハロ、１〜３の炭素原子のアルキル、０〜３の炭素原子のオキシ、０〜３の炭素原子のチオ、及び０〜４の炭素原子のアミノで置換されるか未置換である]
の非ペプチド有機分子を含有する組合せ物。
【請求項５】
Ｒ３が、水素、又は１〜８の炭素原子と０〜４のカルコゲン、窒素及びハロのヘテロ原子の有機基である、請求項４に記載の組合せ物。
【請求項６】
Ｒ３がシクロプロピルメチルアミノである、請求項５に記載の組合せ物。
【請求項７】
Ｒ３がＨである、請求項５に記載の組合せ物。
【請求項８】
Ｒ１が、０〜３の置換基を有する６環員芳香族基であり、ここで置換基がハロ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、ニトロ、トリハロメチルで、Ｘに直接結合しているか、又は鎖内部に１〜４の炭素、窒素、又はカルコゲン原子の連結基を介して結合している、請求項４に記載の組合せ物。
【請求項９】
Ｒ４がメチルである、請求項４に記載の組合せ物。
【請求項１０】
Ｒ４がＨである、請求項４に記載の組合せ物。
【請求項１１】
エリスロポイエチンレセプターの調節配列を含んでなるポリペプチドと、水素以外の１２〜３６の原子、９〜２０の炭素原子、及び４〜１２のヘテロ原子であるカルコゲン、窒素、ハロゲン、及び周期表のＩ及びＩＩ族の金属イオンの非ペプチド有機分子であって、式：
(３)
【化６】
2006508041.tif 000025
[上式中：
ＹはＯ、ｍが０、１又は２であるＳ(Ｏ)ｍ、アミノ又はＣＨ２であり；
Ｒ６はＨ又は１〜３の炭素原子のアルキルであり；
Ｒ７は水素、又は０〜３の水素以外の原子の基で、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ及びアルキルであり；
Ｖはフェニル基であり；
Ｕはオキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、及びアルキル及び０〜３の水素以外の原子であり；ｕは０〜３である]
の非ペプチド有機分子を含有する組合せ物。
【請求項１２】
ＹがＳＯ２であり、Ｖがフェニルであり、Ｒ７がＣｌであり、ｕが０である、請求項１１に記載の組合せ物。
【請求項１３】
エリスロポイエチンレセプターの調節ドメイン配列を含んでなるポリペプチドと、水素以外の１２〜３６の原子、９〜２０の炭素原子、及び４〜１２のヘテロ原子であるカルコゲン、窒素、ハロゲン、及び周期表のＩ及びＩＩ族の金属イオンの非ペプチド有機分子であって、式：
(１)
【化７】
2006508041.tif 000026
[上式中：
Ｘは、１〜３の水素以外の原子のもので、酸素、０〜２の酸素原子に結合した硫黄、アミノ及びアルキル置換アミノであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ１は、１〜３の炭素原子のアルキル、ＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３であり、環状炭素原子に直接結合するか、又は鎖内部に１〜３の炭素及び窒素原子の連結基を介して結合した０〜３の置換基を有する置換フェニル、又はＮ-ヒドロキシアミジニルであり；
Ｒ２は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、並びに、ＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３である０〜２の置換基を有する７〜８の炭素原子のアロイルアミドであり；
Ｒ３は、カルボキシ、Ｈ、又は３〜４の環原子を有する４〜８の炭素原子のシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、又は２〜４の炭素原子のアルコキシメチルであり；
但しＲ３及びＲ４は互いに共同して、ハロがＦ又はＣｌである、１,２-ジメチレン-アルファ-ハロ、アルファ-ＣＨ３-ハロベンゼンを形成する]
の非ペプチド有機分子を含有する組合せ物。
【請求項１４】
細胞膜成分として存在するEPO-Rの活性を調節する方法において、請求項１３に記載の組合せ物の構成成分を複合体形成条件下で混合することにより複合体を形成させることを含んでなり、前記ポリペプチドがEPO-Rである方法。
【請求項１５】
細胞膜成分として存在するEPO-Rの活性を調節する方法において、請求項１１に記載の組合せ物の構成成分を複合体形成条件下で混合することにより複合体を形成させることを含んでなり、前記ポリペプチドがEPO-Rである方法。
【請求項１６】
請求項１３の化合物と、製薬的に許容可能なビヒクル。
【請求項１７】
請求項１１の化合物と、製薬的に許容可能なビヒクル。
【請求項１８】
EPO-Rの調節ドメインに対する被験化合物の結合親和性を測定する方法において、請求項１に記載の組合せ物に前記被験化合物を添加し、前記被験化合物の存在下における前記組合せ物の複合体の量を、前記被験化合物が存在しない場合と比較して、測定することを含んでなる方法。
【請求項１９】
宿主にEPO-Rの生理反応を誘発させる方法において、１２〜３６の水素以外の原子、９〜２０の炭素原子、及び４〜１２のカルコゲン、窒素、ハロゲンであるヘテロ原子及び周期表のＩ及びＩＩ族の金属イオンの非ペプチド有機分子であって、次の式：
(１)
【化８】
2006508041.tif 000027
[上式中：
Ｘは、１〜３の水素以外の原子のもので、酸素、０〜２の酸素原子に結合した硫黄、アミノ及びアルキル置換アミノであり；
ｎは０又は１であり；
Ｒ１は、１〜３の炭素原子のアルキル、ＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３であり、環炭素原子に直接結合するか、鎖内部で１〜３の炭素及び窒素原子の連結基を介して結合した０〜３の置換基を有する置換フェニル、Ｎ-ヒドロキシアミジニルであり；
Ｒ２は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、並びにＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３である０〜２の置換基を有する７〜８の炭素原子のアロイルアミドであり；
Ｒ３は、カルボキシ、Ｈ、又は３〜４の環原子を有する４〜８の炭素原子のシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、又は２〜４の炭素原子のアルコキシメチルであり；
但しＲ３及びＲ４は互いに共同して、ハロがＦ又はＣｌである、１,２-ジメチレン-アルファ-ハロ、アルファ-ＣＨ３-ハロベンゼンを形成する]
のもの、又は
(３)
【化９】
2006508041.tif 000028
[上式中：
Ｘは、１〜３の水素以外の原子のものであり、酸素、０〜２の酸素原子に結合した硫黄、アミノ及びアルキル置換アミノであり；
ｎは０又は１であり；
ＹはＯ、ｍが０、１又は２であるＳ(Ｏ)ｍ、アミノ又はＣＨ２であり；
Ｒ６はＨ又は１〜３の炭素原子のアルキルであり；
Ｒ７は水素、又は水素以外の０〜３の原子の基であり、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ及びアルキルであり；
Ｖはフェニル基であり；
Ｕはオキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、及びアルキル及び０〜３の水素以外の原子であり；
ｕは０〜３である]
の非ペプチド有機分子の生理学的有効量を、前記宿主に投与することを含んでなる方法。
【請求項２０】
前記非ペプチド有機分子が式１のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｘがアミノであり、Ｒ２がｏ-メチル、ｐ-クロロフェニル-１であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がシクロプロピルメチルアミノであり、Ｒ４がメチルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
EPO-RにEPOが結合することにより影響を受ける造血又は神経細胞の刺激に対する応答を調節する方法において、１２〜３６の水素以外の原子、９〜２０の炭素原子、及び４〜１２のカルコゲン、窒素、ハロゲンであるヘテロ原子及び周期表のＩ及びＩＩ族の金属イオンの非ペプチド有機分子であって、式：
(１)
【化１０】
2006508041.tif 000029
[上式中：
Ｒ１は、１〜３の炭素原子のアルキル、ＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３であり、環炭素原子に直接結合するか、又は鎖内部で１〜３の炭素及び窒素原子の連結基を介して結合した０〜３の置換基を有する置換フェニルであり、Ｎ-ヒドロキシアミジニルであり；
Ｒ２は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、及びＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３である０〜２の置換基を有する７〜８の炭素原子のアロイルアミドであり；
Ｒ３は、カルボキシ、Ｈ、又は３〜４の環原子を有する４〜８の炭素原子のシクロアルキルアルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、又は２〜４の炭素原子のアルコキシメチルであり；
但しＲ３及びＲ４は互いに共同して、ハロがＦ又はＣｌである１,２-ジメチレン-アルファ-ハロ、アルファ-ＣＨ３-ハロベンゼンを形成する]
のもの、又は
(３)
【化１１】
2006508041.tif 000030
[上式中：
ＹはＯ、ｍが０、１又は２であるＳ(Ｏ)ｍ、アミノ又はＣＨ２であり；
Ｒ６はＨ又は１〜３の炭素原子のアルキルであり；
Ｒ７は水素、又は水素以外の０〜３の原子の基であり、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ及びアルキルであり；
Ｖはフェニル基であり；
Ｕはオキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、及びアルキル及び０〜３の水素以外の原子であり；
ｕは０〜３である]
の非ペプチド有機分子を、前記応答を調節するのに有効な量、前記細胞と接触させることを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(コンピュータディスクと配列表の記述)
本出願は、米国特許商標庁から提供されたＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．０ソフトによって作成されたＰａｔｅｎｔＩｎプロジェクトファイルである９９０バイトの「７／２／２００３」付けのファイル「REC105-SEQLIST.prj」及びＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．０ソフトを用いてＰａｔｅｎｔＩｎプロジェクトファイルREC105-SEQLIST.prjから作成された配列表である２１キロバイトの「７／２／２００３」付けの「REC105-SEQLIST.doc」を含むLennart Olsson及びTatjana Narandaによる「Affinity Small Molecules for the EPO Receptor」と題された出願用配列表と標識したコンピュータディスクと２配列の配列表を含む。ファイル「REC105-SEQLIST.prj」及び「REC105-SEQLIST.doc」を含む「配列表」と標識した取り込んだコンピュータディスク上のコンピュータ読み取り可能フォマットで記録された情報は取り込まれた文書の配列表と同一である。
【０００２】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、一般に、エリスロポイエチン結合部位以外の調節部位においてエリスロポイエチンレセプターに対する親和性を有する非ペプチド分子、及びこのような分子の用途に関する。
【０００３】
(背景情報)
細胞経路が発見されているため、宿主細胞ゲノムの遺伝子の転写及び発現のための、細胞膜レセプターへのリガンドの結合に起因するシグナル伝達に関与している種々の分子の識見が増加している。エリスロポイエチン(「EPO」)の開発により、貧血治療を大幅に改善することができた。貧血は遺伝的欠陥に起因する自然現象であったり、又は感染もしくは放射線治療又は化学療法の結果であったりする。これらの事例のそれぞれにおいて、宿主の生存に対しては、赤球数又はヘマトクリット値が実質的に正常に保持されていることが必要である。多くの状況では、治療レベルは、所望する処置が施せない程の、赤血球数に対する悪影響によって妥協せしめられており、所望される治療薬を投与できない。EPOが利用可能となったことで、上記妥協された患者の赤血球数を回復する手段が提供された。
【０００４】
EPOは、高価で、製造、精製及び製剤化が困難な大きなグリコシル化タンパク質である。また血液中においてはプロテアーゼで分解されるので、投与されたEPOの大部分が失われる。これらの問題にもかかわらず、EPOにより達成される劇的な効果は、１０億ドルを超える年間売上げをもたらしている。
【０００５】
米国特許第6,333,031号及びActivation of Erythropoietin Receptor Through a Novel Extracellular Binding Site, Narandaら, Endocrinology 19XX 143(6)：2293-2302；Activation of Erythropoietin Receptor in the Absence of Hormone by a Peptide That Binds to a Domain Different from the Hormone Binding Site, Narandaら, Proc, Natl. Acad. Sci. 1999, 96(13)：7569-74には、「調節ドメイン(modulation domain)」と称されるEPOレセプター(「EPO-R」)の細胞外結合部位の存在が報告されている。ヒトEPO-Rにおいて、調節ドメインは約アミノ酸194-216に相当し、アミノ酸配列QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRY(配列番号：１)を有する。配列番号：１の配列を有する２３のアミノ酸ペプチドがEPO-R調節ドメインへ結合することにより、リガンドの存在下又は不存在下においてEPO-R活性が調節される。よって、そのペプチドは、EPOの活性を高め、類似の活性を達成するためのEPOの必要性を低減させるために、EPOと共に使用される補助化合物を提供する。ペプチドは効率的かつ経済的に容易に合成することができる。しかしながら、ペプチドは小さく、血中で容易に分解される。また、注射の必要があるといった不便さもある。
【０００６】
よって、貧血の治療においてEPOと組み合わせて役立ち、並びにEPO-Rのアッセイ、EPO及びEPO-R機能の研究、EPO-Rの精製、及び類似の用途に関連した他の機能によって役立ちうる小さな非ペプチド分子の開発には関心がある。
【０００７】
関連文献
米国特許第6,333,031号、及びActivation of Erythropoietin Receptor Through a Novel Extracellular Binding Site, Narandaら, Endocrinology 19XX 143(6)：2293-2302；Activation of Erythropoietin Receptor in the Absence of Hormone by a Peptide That Binds to a Domain Different from the Hormone Binding Site, Narandaら, Proc, Natl. Acad. Sci. 1999, 96(13)：7569-74には、調節ドメイン及び配列番号：１が記載されている。PCT/US02/064211には、トロンビンインヒビターとして使用されるトリアゾロピリミジン類が記載されている。
【０００８】
(発明の概要)
EPO-R調節化合物としての用途があり、調節ドメイン部位に対して配列番号：１と競合する、アザアリール(azaaryl)複素環コアと少なくとも二の置換基を有する有機化合物が提供される。前記化合物は、EPO-Rに結合してEPO-Rの活性を調節し、EPO-Rを単離し、EPO-Rの発現又はそのエンドサイトーシスをアップレギュレーション可能な化合物の活性を評価するために使用することができ、また親和結合に関連した他の用途に使用することができる。前記化合物の調製方法が提供される。前記化合物は、EPO-Rの調節ドメインを含むポリペプチドと組合せて、又はEPO-Rと結合してアッセイ、EPO-R調節及びEPO-R精製に使用するという使用説明書と組み合わせて提供される。
【０００９】
(発明の詳細な記載)
環中に１〜２の窒素原子を有する６環員の置換アザ複素環を有し、コアとして、アザアリールを含む少なくとも一の不飽和部位を通常有する有機化合物が、「調節ドメイン」と称されるところでのEPO-Rへの結合のために提供される。本化合物は、縮合していても縮合していなくてもよく、又はその双方であってよい少なくとも二の環と少なくとも二の置換基とを有する。少なくとも一の複素環と４までの環が存在し、ここで芳香環置換基は５〜６環員の炭素環又は複素環でありうる。置換基は炭素原子又はヘテロ原子を介して環の炭素原子に結合していてもよい。本化合物は水素原子以外の少なくとも１２の原子を有しており、またコアは、脂肪族、芳香族、脂環式、複素環及びヘテロ置換基を含有していてもよい。
【００１０】
主題の有機化合物のコアを形成するアザ複素環は、種々の置換基で置換され、その置換基には、炭素環式基を含む脂肪族基、芳香族基及び複素環基、芳香族と非芳香族の双方が含まれる。さらに、これらは、種々の基で置換されてもよい。一価の基には、ハロ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＯ２、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＦ３、アルキル、例えばＣＨ３で、アルキル以外の示した一価の置換基でさらに置換されていてもよいものが含まれる。二価の置換基は通常は環に結合して、一般的に４の炭素原子を有する縮合環を形成し、また二価の置換基が結合した隣接する環原子と共同して６員の炭素環を形成し、ここでこのような環は、二価の置換基を含む上述した任意の置換基でさらに置換されていてもよい。
【００１１】
主題化合物は、調節ドメインを含むポリペプチド、EPO-Rの細胞外部分の一部、精製された形態又は他の化合物と組み合わせたEPO-R、ミクロソーム、溶菌液、ポリペプチド及び／又はポリペプチド以外の有機分子との混合物として提供することができる。主題化合物は、調節ドメインから分離した状態で提供することもできるし、調節ドメインと結合して複合体を形成することもできる。本化合物はEPO-Rの調節ドメインを含むポリペプチドと組合せて、又はEPO-Rと結合してアッセイ、EPO-R調節及びEPO-R精製に使用するという使用説明書と組み合わせて提供される。
【００１２】
調節ドメインは、ヒトEPO-R(「hEPO-R」)に対して配列番号：１として、マウスEPO-R(「mEPO-R」)に対して類似配列QRVEVLEGRTECVLSNLRGGTRY(配列番号：２)として文献に記載されており、これらペプチドは調節ドメインに結合して、EPO-Rに結合したEPOの存在下でEPO-Rの活性に影響を及ぼす。(以下、そのペプチドを「ERP」と称する)。前記配列は、それぞれ当該分野で、SwissProt受託番号P19235及びP14753で報告されている。多くの部分で、異なる種由来の調節ドメインは高度に保存されており、一般的に約５アミノ酸以下しか異ならない。ペプチド間には交差反応が観察され、一つの種由来の調節ドメインペプチドは異なる種のEPO-Rレセプターに結合しよう。
【００１３】
EPO-Rレセプターに言及する場合、任意の哺乳動物EPO-R、特に霊長類、中でもヒト、齧歯動物、マウス(murine)、ハムスター及びラット、又は家畜、例えばウシ、ウマ、ブタ等のものを意図している。
【００１４】
主題化合物は、６環原子の複素環コアを有し、少なくとも一の窒素環ヘテロ原子及び少なくとも二の置換基及び／又は縮合環を有するという共有の特徴を共有している。複素環コアには、トリアゾロピリミジン、特に[１,２,４]トリアゾロ[１,５-ａ]ピリミジン、ピリジン、ピリダジン及び[４Ｈ,８Ｈ]-１,２,８-トリアザインデンが含まれる。前記化合物は、水素以外が少なくとも１２の原子、通常は水素以外が少なくとも１５で４０を超えず、さらには水素以外で３６を超えない原子を有し、ここで該原子には、炭素、カルコゲン(Ｏ及びＳ)、ハロ、窒素、及び生理学的に許容可能な金属イオン、一般的に周期表のＩ及びＩＩ族のものが含まれる。ヘテロ原子含有置換基には、オキシ(ヒドロキシル及びエーテルで、ここで酸素は水素又は有機基に結合している)、チオ(チオール、チオエーテル、スルフィン酸エステル、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルフェンアミド、スルホンアミド等、ここで硫黄は水素、酸素、窒素又は有機基に結合している)、非オキソカルボニル(カルボン酸、カルボン酸塩、エステル、及びアミド及び窒素、例えばアミジン、アミド酸エステル、Ｎ-オキシ置換されたもの等、及びチオ、例えばチオノカルボン酸、チオカルボン酸エステル等、それらの類似体)、オキソ-カルボニル(アルデヒド及びケト)、アミノ(それらのＩ°、ＩＩ°、ＩＩＩ°及びＩＶ°誘導体、例えばジアルキルアミノ、カルバミル、アミジニル、Ｎ-オキシアミジニル、ウレイド、テトラアルキルアミノ等)、ハロ(フッ素、塩素、臭素、ヨウ素及びそれらのアニオン)等が含まれる。炭素原子を介してコアの複素環上に置換される基には、脂肪族、脂肪族的に飽和した及び不飽和で、一般に３以下の不飽和部位、通常は２以下の部位、脂環式(別に定義しない限りは脂肪族の範囲に含まれる)、６〜１２、通常は６〜１０の環員からの炭素環芳香族、及び５〜１２、通常は５〜１０の環員と１〜４、通常は１〜３のヘテロ環員、一般的にカルコゲン及び窒素を有する複素環のものが含まれ、ここでこれら環のそれぞれが０〜４、通常は０〜２のヘテロ原子含有置換基を有してもよい。炭素原子の全数は約９〜２０、通常は９〜１８の範囲の炭素原子である一方、ヘテロ原子の数は、一般的に約３〜１２、通常は４〜１０の範囲である。
【００１５】
４種の主たるコア構造は、以下の式のものである：
【００１６】
(１)トリアゾロピリミジン類
【化１】
2006508041.tif 000002
【００１７】
ここで、含まれている基は以下のように定義される：
【００１８】
Ｘは、１〜７、通常は１〜３の水素以外の原子のヘテロ原子結合基であり、アミノ及び１〜６、通常は１〜２の炭素原子のアルキル基を有する置換アミノ、及び通常は未置換の、チオ、スルホキシド及びスルホン(０〜２の酸素原子を有する硫黄)、又はオキシを含む；
【００１９】
ｎは０又は１である；
【００２０】
Ｒ１は水素、又は１〜１２、通常は１〜１０の炭素原子と、０〜６、通常は０〜４のカルコゲン、窒素及びハロゲンであるヘテロ原子を有する有機基であり、ここで有機基は０〜４、通常は０〜２の不飽和部位を有する脂肪族、例えばアルキル、アルケニル及びアルキニルであってよく、０〜２の不飽和部位を有する脂環式のものを含み、１〜６の炭素原子、通常は１〜３、特に１〜２の炭素原子を有するアルキル、非オキソカルボニル、及びその窒素及び硫黄誘導体、特にその窒素誘導体で、水素以外が３〜１２の原子、特に１〜１０の炭素原子、２〜６、通常は２〜４のヘテロ原子のもの、アリール、特にフェニル、３〜６環員の複素環、及びそれらの組合せ物、例えばアラルキル及びアルカリルを含み、ここで環状構造は、縮合していても縮合していなくてもよい１〜３、一般に１〜２の環を有していてもよく、例としてはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、フェニル、トリル、フルオロフェニル、アニソール、フェネトール、ナフチル、インドリル、キノリニル、カルボキシ、エトキシカルボニル、アミジニル、ヒドロキシアミジニルメチル、エトキシカルバミルエチル、フェニルチオエチル、フェニルアミノプロピル、ニトロフェネチル、ｐ-ニトロフェニル、メシチルエチル、２-フルオロ-５-エチルフェニル、２,６-ジフルオロフェニルで、部分的又は完全に還元された形態の芳香族基、例えばピリジン及びピペリジン等、特に６員の芳香族基で、特に１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、ハロ、特にＣｌ及びＦ、０〜３の炭素原子のオキシ、トリハロメチル、シアノ及びニトロを含む、０〜４、通常は０〜３の置換基を有するもの、特にフェニルである。Ｒ１は、Ｘが窒素でｎが１である場合に、６〜１０の炭素原子のアリール基、特にフェニルを有していてもよい。
【００２１】
Ｒ２は、水素、窒素及び／又はカルコゲンを有するヘテロ官能基であり、そのヘテロ官能基は環炭素原子に結合し、ここでヘテロ原子は、Ｒ１に対して上述したように、１〜１０、通常は１〜８の炭素原子と、０〜４、通常は０〜３のヘテロ原子の有機基、特に１〜６、通常は１〜２の炭素原子のアルキル、５〜１０の炭素原子のアルカリル、アラルキル及びアラルケニルを含むアリール、６〜１０の炭素原子のアロイルのもの、又は環原子に炭素原子を介して結合し、１〜１２、通常は１〜８の炭素原子の有機基で、０〜４、通常は１〜２のヘテロ原子を有する脂肪族、脂環式、芳香族及び複素環基を含むもので置換されていてもよい；
【００２２】
Ｒ３は、水素、又は１〜１０、通常は１〜８の炭素原子と、通常はカルコゲン及び窒素、特に酸素の０〜４、通常は０〜２のヘテロ原子の有機基で、アルキル、オキシカルボニル、特にアルコキシカルボニル、及びアリール、アルカリル及びアラルキル、特に炭素環アリールで、特に６〜８の炭素原子のものを含むものである；
【００２３】
Ｒ４は、水素又はアルキル及び置換アルキルで、１〜６、通常は１〜３の炭素原子のものであり、ここで置換基はオキシ、アミノ及びハロ、特にフルオロである；
【００２４】
Ｒ３及びＲ４は共同してそれらが結合している原子と共に、４〜１０、通常は４〜８の環原子を有する環を形成するものであってよく、それは置換又は未置換で、０〜１の不飽和部位を持つ１,４-ブタンジイル基を特に含んで縮合環を形成し、１〜２の環を付加し、ここでブタンジイルは更なる環と縮合してビシクロ置換基であってもよく、ここで環原子はカルコゲン、窒素、ハロ及び１〜３の炭素原子のアルキル、特に０〜３の炭素原子のオキシ、０〜３の炭素原子のチオ、及び０から４の炭素原子のアミノで置換されていてもよい；
【００２５】
(２)ジ(アリールチオ)ピリジン類
【化２】
2006508041.tif 000003
【００２６】
ここで、ｐは０、１又は２で、通常は２である；
【００２７】
Ｒ５は、水素以外が１〜３の原子を有する基であり、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、及びアルキルを含み、ここでＲ５は３又は４位、通常は３位にある；
【００２８】
(３)アリール置換ピリダジノン(ジヒドロピリダジンを含む)：
【化３】
2006508041.tif 000004
【００２９】
ここで、ＹはＯ、Ｓ(Ｏ)ｍであり、ここでｍは０、１又は２、アミノ又はＣＨ２である；
【００３０】
Ｒ６はＨ又は１〜３の炭素原子のアルキルである；
【００３１】
Ｒ７は水素、又は水素以外が０〜３の原子の基であり、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ及びアルキルを含む；
【００３２】
Ｖは０〜２の窒素原子を含み、残りは炭素原子である、６環員のアリール基である。
【００３３】
Ｕは水素以外が０〜５の原子の置換基であり、オキシ、チオ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、及び通常は１〜３の炭素原子のアルキルを含む一方、ｕは０〜３、通常は０〜１である；
【００３４】
(４)ジアゾロヘキサヒドロキノリン
【化４】
2006508041.tif 000005
【００３５】
ここで、Ｙは酸素、硫黄、ＮＨ、(１〜３の炭素原子のアルキル、Ｈ)又はＨ２である；
【００３６】
Ｒ７は水素、上述したような１〜３のヘテロ原子のヘテロ置換基、又は１〜１２、通常は１〜１０、さらには１〜６の炭素原子と、０〜６、通常は０〜４のカルコゲン、窒素及びハロゲンであるヘテロ原子の有機基であり、ここで有機基は０〜４、通常は０〜２の不飽和部位を有する脂肪族、例えばアルキル、アルケニル及びアルキニルであってよく、０〜２の不飽和部位を有する脂環式のものを含み、また１〜６の炭素原子、通常は１〜３、特に１〜２の炭素原子を有するアルキル、非オキソカルボニル、及びその窒素及び硫黄誘導体、特にその窒素誘導体で、水素以外が３〜１２の原子、特に１〜１０の炭素原子、２〜６、通常は２〜４のヘテロ原子のもの、ここで脂肪族基は１〜４、通常は１〜２の上述したヘテロ置換基で置換されていてもよいもの、アリール、特にフェニル、３〜６環員の複素環、及びそれらを組合せたもの、例えばアラルキル及びアルカリルを含み、ここで環状構造は縮合していても又は縮合していなくてもよい１〜３、一般に１〜２の環を有していてもよく、例としてはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、フェニル、トリル、フルオロフェニル、アニソール、フェネトール、ナフチル、フラニル、チエニル、インドリル、キノリニル、カルボキシ、エトキシカルボニル、アミジニル、ヒドロキシアミジニルメチル、エトキシカルバミルエチル、フェニルチオエチル、フェニルアミノプロピル、ニトロフェネチル、ｐ-ニトロフェニル、メシチルエチル、２-フルオロ-５-エチルフェニル、２,６-ジフルオロフェニルで、部分的又は完全に還元された形態の芳香族基、例えばピリジン及びピペリジン等、特に６員の芳香族基で、特に１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、ハロ、特にＣｌ及びＦ、０〜３の炭素原子のオキシ、トリハロメチル、シアノ及びニトロを含む、０〜４、通常は０〜３の置換基を有するもの、特にフェニルである。
【００３７】
Ｒ８は水素、上述したような１〜３のヘテロ原子のヘテロ置換基、又は１〜１２、通常は１〜１０、さらには１〜６の炭素原子と、０〜６、通常は０〜４のカルコゲン、窒素及びハロゲンであるヘテロ原子の有機基であり、ここで有機基は０〜４、通常は０〜２の不飽和部位を有する脂肪族、例えばアルキル、アルケニル及びアルキニルであってよく、０〜２の不飽和部位を有する脂環式のものを含み、また１〜６の炭素原子、通常は１〜３、特に１〜２の炭素原子を有するアルキル、非オキソカルボニル、及びその窒素及び硫黄誘導体、特にその窒素誘導体で、水素以外が３〜１２の原子、特に１〜１０の炭素原子、２〜６、通常は２〜４のヘテロ原子のもの、アリール、特にフェニル、３〜６環員を有する複素環、及びそれらを組合せたもの、例えばアラルキル及びアルカリルを含み、ここで環状構造は縮合していても又は縮合していなくてもよい１〜３、一般的に１〜２の環を有していてよく、あるいは上述したような１〜３のヘテロ原子のヘテロ置換基であり、例としては、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、フェニル、トリル、フルオロフェニル、アニソール、フェネトール、ナフチル、インドリル、キノリニル、カルボキシ、エトキシカルボニル、アミジニル、ヒドロキシアミジニルメチル、エトキシカルバミルエチル、フェニルチオエチル、フェニルアミノプロピル、ニトロフェネチル、ｐ-ニトロフェニル、メシチルエチル、２-フルオロ-５-エチルフェニル、２,６-ジフルオロフェニルで、部分的又は完全に還元された形態の芳香族基、例えばピリジン及びピペリジン等、特に６員の芳香族基で、特に１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、ハロ、特にＣｌ及びＦ、０〜３の炭素原子のオキシ、トリハロメチル、シアノ及びニトロを含む、０〜４、通常は０〜３の置換基を有するもの、特にフェニルである。より詳細には、Ｒ８は水素、１〜６、通常は１〜３の炭素原子のアルキル、又は置換アルキルで、ここで、置換基は、水素以外の原子の全数が、５〜１０、通常は５〜８の範囲にある、酸素、窒素又は硫黄である１〜２のヘテロ環員と、５〜６環員の複素環に関して記載されたものである；
【００３８】
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は同一又は異なっており、通常は２以下、さらには１以下がＨ以外であり；Ｈでない場合、基はＲ８の定義の範囲内であり、一般的に、１〜６、通常は１〜３の炭素原子のアルキル又は置換アルキルで、０〜２、通常は０〜１の上述した置換基を有するもの、０〜８、通常は０〜６の炭素原子のアミノ、チオ、オキシ、カルコゲン、窒素又はハロである１〜３のヘテロ原子のヘテロ置換基であり、ここで脂肪族、芳香族及び複素環置換基は今度は上述したような０〜２の置換基、特に１〜４、通常は１〜３の炭素原子のアルキル又は置換アルキルを有していてもよい。
【００３９】
Ｒ１１及びＲ１２は同一又は異なっており、Ｈ、又は１〜１２、通常は１〜８、さらには１〜６の炭素原子と、０〜６、通常は０〜４のカルコゲン、窒素及びハロであるヘテロ原子の有機基、特に１〜８、通常は１〜３の炭素原子で、置換又は未置換であり、０〜３、通常は０〜２の上述した置換基を有する脂肪族(脂環式を含む)、６〜１２、通常は６〜１０の炭素原子で、置換又は未置換であり、０〜３、通常は０〜２の上述した置換基を有する芳香族、及び３〜６環員と１〜３のカルコゲン及び窒素であるヘテロ原子を有する複素環；特に水素又は１〜３の炭素原子のアルキルである。
【００４０】
４つの式のうち、トリアゾロピリミジンのコア構造が特に興味あるものである。このファミリーの化合物は、２位に((Ｘ)ｎ-Ｒ１)を有していることが認められ、ここでＸはアミノ、チオ又はスルホンで、ｎは０又は１であり、アミノは未置換であるか、又は１〜３の炭素原子の低級アルキルで置換されていてもよく、Ｒ１は１〜３の炭素原子の低級アルキル基、特にメチルであるか、又は６環員芳香族基、特にフェニル又はピリジニル基を有する有機基、好ましくは０〜３の置換基を有するフェニルであり、ここで置換基はハロ、特にクロロ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、特にメチル、ニトロ、トリハロメチル、特にトリフルオロメチルであり、ここでフェニル基は末端にあり、アミノ又はチオ原子に直接結合しているか、又は鎖内部で１〜４、通常は１〜３の原子の連結基を介して結合しており、該原子は炭素、窒素、又はカルコゲン、特に炭素及び窒素であり、ここでヘテロ原子は炭素及び水素にのみ結合しており、鎖内部に０〜２のヘテロ原子が存在しており、連結基は、一般に全体で１〜８の水素以外の原子、通常は１〜６の原子であり、０〜２のヘテロ置換基、例えばオキソを持つか、又は０〜１のＮ-ＯＨを有するアルファ-アセタミジニル、すなわちＮ-ヒドロキシアルファ-アセタミジニルを有する。
【００４１】
Ｒ２は、特にアミノ(-ＮＨ-)等、カルコゲン又は窒素である０〜１のヘテロ原子を有する１〜３の原子の連結基により環炭素原子に結合した炭素環であり、該環は３〜６、特に３〜４の環原子、０〜３の炭素原子の基で、１〜３の炭素原子の低級アルキル、特にメチル、オキシ又はアミノ、フェニル又は、環原子に直接又はカルバミル又はビニル基を介して結合した置換フェニルを有し、ここで置換基は０〜３の炭素原子のオキシ、特にアルコキシ、より詳細にはメトキシ、又は１〜３の炭素原子の低級アルキル、特にメチル、又は１〜２、通常は１の環ヘテロ原子を有する５〜６環員の複素環であり、環ヘテロ原子はカルコゲン及び窒素で、０〜３の炭素原子の０〜１の置換基を有する。例示的な基には、アミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ヒドロキシ、プロピルオキシ、エトキシ、メトキシ、フェニル、トリル、メシチル、フェネトール、アニソール、クロロフェニル、ブロモトリル、スチリル、ｐ-エトキシスチリル、フェネチルアミン、ベンジルアミン、Ｎ-フェニルアミノカルボニル(-ＮＨＣＯ-)、Ｎ-２,４-ジクロロフェニルアミノカルボニル、Ｎ-アニソリルアミノカルボニル、ピリジニルメチル、チオフェニル、チアゾリニル及びピペリジニル、並びにＲ３に対して記載した基が含まれる。
【００４２】
Ｒ３は、水素又は１〜８の炭素原子と０〜４、通常は０〜３のカルコゲン、窒素及びハロであるヘテロ原子の有機基で、１〜６の炭素原子のアルキルと、０〜２、通常は０〜１の脂肪族不飽和部位を有する不飽和又は飽和、特に飽和の脂肪族、１〜４の炭素原子の非オキソカルボニル、カルコゲン又は窒素である０〜１のヘテロ原子を有する１〜３の原子の連結基、特にアミノ（-ＮＨ-）によって環炭素原子に結合したカルボン酸基で、ここで環は３〜６の環原子、特に３〜４の環原子を有するもの、及びアルコキシカルボニルで、アルコキシ基が１〜３の炭素原子のものである。例示的な基には、メチル、プロピル、アリル、プロパギル、３-ブテニル-１、シクロプロピルエチル、シクロブチルメチル、シクロプロピルプロピルアミノ、シクロプロピルメトキシ、シクロペンチル、アリルアミノ、ヘキソキシ、ブトキシホルミル、フェニルオキシホルミル及びメトキシエチルホルミルがある。
【００４３】
Ｒ４は、水素、１〜３の炭素原子の低級アルキル、特にメチル、２〜５、通常は２〜４の炭素原子のアルコキシアルキル、又は１〜３の炭素原子と１〜４のハロ原子のハロアルキル、通常はフルオロ、特にトリフルオロメチルであり、ここでＲ４は好ましくは水素又は１〜３の炭素原子の低級アルキル、特にメチルである。例示的な基には、メチル、プロピル、イソブチル、４-メチルペンチル、３-クロロプロピル、４,４,４-トリフルオロブチル、２-フルオロエチル、トリフルオロメチル、及び２,３-ジフルオロプロピルが含まれる。
【００４４】
脂肪族基については、脂肪族基には、分枝状又は直鎖状鎖であり、一般に１〜６、通常は１〜３の炭素原子を有し、カルコゲン、窒素及びハロゲンである０〜３のヘテロ原子を有し、通常は０〜３の炭素原子のオキシ、０〜４の炭素原子のアミノ、及び０〜２の酸素原子と０〜３の炭素原子を有するチオであり、飽和しているか、又は０〜３の不飽和部位、すなわち二重及び三重結合を有する不飽和であるアルキルが含まれる。
【００４５】
アリール基については、炭素環及び複素環基の双方は、特に窒素複素環を意図しており、ここで５〜１２、通常は５〜１０の環原子、特に５又は６の環原子が存在しており、０〜８、通常は０〜６、特に０〜３のヘテロ原子、例えばカルコゲン、窒素及びハロを有しており、飽和又は不飽和であり、ここで置換基は、１〜８、通常は１〜６の水素以外の原子が存在し、一般に０〜６、通常は０〜３の炭素原子を有し、オキシ、チオ、アミノ、その窒素及び硫黄類似体を含む非オキソカルボニル、オキソカルボニル、ハロ、シアノ、ニトロ等を含む。
【００４６】
複素環基については、これらの基は一般に非芳香族であり、５〜１０、通常は５又は６の環員を有し、環当たり１〜３、通常は１〜２のカルコゲン及び窒素であるヘテロ原子を有し、飽和又は不飽和であり、一般に０〜３、通常は０〜２のエチレン性不飽和部位を有し、未置換であるか又は置換され、０〜３の置換基を有する。
【００４７】
置換基には、一般的に１〜６、通常は１〜３の炭素原子、１〜３の炭素原子と、１〜７、通常は１〜５のハロ原子、特にフルオロ、ハロ、さらにはＣｌを有するハロアルキル、０〜３の炭素原子のオキシ、硫黄に結合した０〜２の酸素原子を有する０〜８、特に６〜８の炭素原子のチオ、０〜８の炭素原子のアミノが含まれ、通常、１〜４の炭素原子のアルキルアミノ、６〜８の炭素原子のアリールアミノ、及び７〜８の炭素原子のアロリルアミノの場合、ニトロ、シアノ、ハロ、特にフッ素及び塩素、及び１〜６、通常は１〜３の炭素原子の非オキソカルボニル、主として酸及びエステルが含まれる。
【００４８】
特に興味があるものはトリアゾロピリミジン類である。より詳細には、EPO-Rの活性を調節する化合物であり、ここで調節とは、タンパク質の発現等、検出可能なシグナルが、化合物の結合の際に細胞中に伝達されることを意味している。この範疇に入る化合物は、上述した式の表示を用いて示される。これらの化合物は、通常、ＸがＮＨ又はＳである。Ｒ１は通常１〜３の炭素原子のアルキル、特にＣＨ３、環炭素原子に直接、又は０〜３、通常は１〜２の原子を有する鎖において１〜３の原子の結合基を介して結合した置換フェニルで、該原子が炭素及び窒素であるもの、特にメチレン及びアミノエチレンであり、フェニル基は未置換であるか、又はＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３である置換基を有しているものである。Ｒ２は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、及びＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＣＦ３である０〜２の置換基を有する７〜８の炭素原子のアロイルアミド、特にトルオイルアミドである。Ｒ３は、カルボキシ、Ｈ、３〜４の環原子を有する４〜８、通常は４〜６の炭素原子のシクロアルキルアルキルである。Ｒ４はＨ、１〜３の炭素原子の低級アルキル、特にＣＨ３、又は２〜４の炭素原子のアルコキシメチル、特にメトキシメチルである。Ｒ３及びＲ４は互いに共同して、フェニル-１,２-ジメチレン-アルファ-ハロ、アルファ-ＣＨ３を形成し、ここで環は、ハロ、例えばＦ及びＣｌ、ＮＯ２、ＣＨ３及びＣＦ３である１〜２の置換基でさらに置換されていてもよい。
【００４９】
Ｒ３が脂肪族基(脂肪族とは、脂肪族的に飽和していても飽和していなくても、アルキル、シクロアルキル、及びそれらを組合せたものを意味する)、又は２〜６、通常は３〜５の炭素原子の脂肪族基置換であり、シクロアルキルが一般に飽和していて、３〜４の炭素原子のものである場合、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は以下の定義を有する。ＸはＮＨ又はＳであり、ｎは１である。Ｒ１は１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、又はＸに直接、又はＣ及びＮからなる鎖において２〜４の原子の結合鎖を介して結合したＣＨ３、ＣＦ３、ＮＯ２及びＣｌを含む、０〜３の置換基、特に２〜３の置換基を有するフェニルであり、ここでＮは炭素にのみ結合しており、０〜１の非オキソカルボニル基を有し；Ｒ２はＨ、１〜３の炭素原子のアルキル、特にＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、及びＮＨ２であり；Ｒ４はＨ及びＣＨ３である。Ｒ２が脂肪族基を有する場合、Ｒ３の定義はＲ２の定義に置き換えられ、他の定義は同じままである。
【００５０】
Ｒ３がＨである場合、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は以下の定義を有する。ＸはＮＨ又はＳであり、ｎは１である。Ｒ１は１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、又はＸに直接、又はＣ及びＮからなる鎖において１〜４の原子の結合鎖を介して結合したフェニルで、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＯ２及びＣｌを含む、０〜３の置換基、特に２〜３の置換基を有するフェニルであり、ここでＮは炭素にのみ結合しており、０〜１の非オキソカルボニル基を有し、又は０〜１のＮ-ヒドロキシル基を有するアミジニルメチルであり；Ｒ２はＨ、１〜３の炭素原子のアルキル、特にＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、及びＮＨ２、５〜６、特に５の環員を有する複素環であり、ここでヘテロ原子はカルコゲン及び窒素、特にカルコゲンであり、０〜２、通常は１〜２の不飽和部位を有し、又はＣＨ３、Ｃｌ、ＯＣＨ３、及びＮＯ２である、０〜２、通常は１〜２の置換基を有するフェニルであり、ここでフェニルは０〜１のエチレン性不飽和部位を有し、１〜３、通常は１〜２の炭素原子の脂肪族複素環鎖を介して、又は直接環状炭素原子に結合しており；Ｒ４はＨ及びＣＨ３である。
【００５１】
Ｒ３が非オキソカルボニル基(特に１〜５、通常は１〜４、特に１又は３の酸、エステル又はアミド)を含み、オキソ基が環原子に直接結合している場合、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は以下の定義を有する。ＸはＮＨ又はＳであり、ｎは１である。Ｒ１は１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、又はＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２又はＯＣＨ３、特にメチルである０〜２の置換基を有するフェニルであり、フェニルは、特にＣ及びＮの鎖、通常はＣＨ２において１〜３の原子の結合鎖を介して、又は直接環状原子に結合しており；Ｒ２はＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３又はＮＨ２、特にＯＨ又はＮＨ２であり；Ｒ４はＨ又はＣＨ３、特にＨである。
【００５２】
Ｒ３が０〜２の置換基を有し、ＣＨ２等、炭素と窒素である鎖において、１〜３の原子の連結基を介して、又は直接環原子に結合しているフェニルであり、置換基がＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＯＣＨ３である場合、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は以下の定義を有する。ＸはＮＨ又はＳであり、ｎは１である。Ｒ１はＣＨ３、Ｃｌ、ＮＯ２及びＯＣＨ３である０〜３の置換基、通常は０〜２の置換基を有し、直接又はＣＨ２を介して環状原子に結合したフェニルである。Ｒ２はＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３及びＮＨ２、特にＯＨ及びＯＣＨ３である。Ｒ４はＨ又はＣＨ３である。
【００５３】
EPOに対するEPO-R反応の調節に活性を示す例示的化合物を以下に示す：
【００５４】
次の化合物をE5と表示する。
【化５】
2006508041.tif 000006
【００５５】
次の化合物をEM5と表示する。
【化６】
2006508041.tif 000007
【００５６】
主題となる本発明のトリアゾロピリミジン類は、便宜的にE5(EM5を含む)ファミリーと呼ぶ。次表に、調製し、調節ドメインに対する結合性を試験した化合物をまとめる。全ての化合物は、細胞中へのシグナルの伝達においてEPO-R活性の調節をもたらす基のメンバーによって、調節ドメインに対して特異的親和性を有している。
【００５７】
表１
【表１】
2006508041.tif 000008
2006508041.tif 000009
【００５８】
表２
【表２】
2006508041.tif 000010
2006508041.tif 000011
2006508041.tif 000012
【００５９】
アリール置換ピリダジノン類については、次のものが好ましい：
【００６０】
Ｘはチオ、好ましくはスルホンであり、ｙは０〜１である。
【００６１】
Ｒ７はＨ、ハロ、特にＣｌ、１〜３の炭素原子のアルキル、特にメチル、ＯＨ又はＯＣＨ３である。
【００６２】
次の化合物をE6と表示する。
【化７】
2006508041.tif 000013
【００６３】
次の化合物をE4と表示する。
【化８】
2006508041.tif 000014
【００６４】
ジアゾロヘキサヒドロキノリン類については、次のものが好ましい：
【００６５】
Ｒ７、Ｒ８−１０及びＲ１３−１６は同一又は異なっており、少なくとも２で４を超えないものがＨ以外であり、その他は、アルキル、又は１〜６、通常は１〜３の炭素原子と０〜１の置換基、特にカルコゲン及びアミンの置換アルキルであり、ここでヘテロ原子は環原子に結合していてもよく、さらにカルコゲン又は窒素である１〜２の環ヘテロ原子を有する３〜６の環原子の複素環、及びアルキル、オキシ及びハロを含む０〜２の置換基を有する６〜８の炭素原子の芳香環である。
【００６６】
Ｒ８は、Ｈ、上述したような１〜３のヘテロ原子のヘテロ置換基、又は１〜１２、通常は１〜６の炭素原子の有機基であり、ここで有機基は、カルコゲン又は窒素であるヘテロ原子を介して又は直接環炭素原子に結合していてもよく、有機基は、上述した置換基で置換されていてもよい、１〜１２、通常は１〜６、さらに１〜３の炭素原子脂肪族(脂環式を含む)、６〜１０、通常は６〜８の炭素原子の芳香族、又はカルコゲン及び窒素である１〜３、通常は１〜２のヘテロ原子を有する３〜６の環員、特に５又は６の環員の複素環で、飽和又は不飽和であってもよいもの、及びそれらを組合せたのもでもよい。例示的な基には、メチル、メトキシエチル、シアノエチル、アセチル、Ｎ-メチルカルバミル、トリフルオロメチル、シクロプロピルメチル、クロロフェニル、フェネトール、ピラニル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピペリジニル、ピリジニル、メチルピリジニル等が含まれる。
【００６７】
Ｒ１１及びＲ１２は同一又は異なっており、Ｈ、１〜１２、通常は１〜６の炭素原子の有機基、特に脂肪族(脂環式を含む)、特にアルキル又はアシルで、上述した置換基で置換されていてもよいもの、６〜１０、通常は６〜８の炭素原子の芳香族、又はカルコゲン及び窒素である１〜３、通常は１〜２のヘテロ原子を有する３〜６の環員、特に５〜６の環員の複素環で、飽和又は不飽和であってもよいもの、及びそれらを組合せたものを含む。例示的な置換基には、メチル、エチル、ヒドロキシエチル、グリコリル、アセチル、ブチリル、シクロブチルメチル、クロロフェニル、トリル、ピラニル、フラニル、ピロリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピリジニル、ピラジニル等が含まれる。
【００６８】
次の化合物が特に興味あるものであり、E5A29と表示する。
【化９】
2006508041.tif 000015
【００６９】
主題化合物は、種々の方法、特に主題化合物の意図する目的にとって活性な又は不活性な他の物質と組合せて、提供されうる。主題化合物は唯一の活性成分として提供されてもよく、又はEPO-Rの少なくとも調節ドメインとの複合体として提供されてもよい。先の場合では、主題化合物は種々の希釈液と共に提供されてよく、薬物製剤又はアッセイ試薬等、低濃度で使用することができる。あるいは、主題化合物は、競合結合アッセイに使用されるように、EPO-Rの少なくとも調節ドメインとの複合体として提供されてもよく、ここで主題化合物の放出性が決定されることになる。主題化合物は、複合化又は非複合化又はその双方の、乾燥した又は液状製剤として、単一の容器に又は別々の容器に、EPO-Rの少なくとも調節ドメインと共に提供されうる。
【００７０】
主題化合物は、EPO-R及びEPOに関連した多くの用途が見出されている。主題化合物はアフィニティーカラムに使用することができ、一又は複数の主題化合物は官能化され、アフィニティーカラムの充填物に接着させてもよい。アフィニティーカラムの充填物には、アガロース、セファロース、セファデックス、ラテックス等が含まれる。多数の参考文献に、化合物を官能化させ、活性又は不活性粒子にそれらを結合させる方法が記載されている。また、電気泳動用のゲルを官能化させてもよく、ここでEPO-Rは、その移動速度を低減させつつ、主題化合物と複合化する。例えば、米国特許第5,445,958号；同6,033,574号；同6,258,275号；同6,281,006号、及びそこに引用された参考文献を参照。
【００７１】
また、主題化合物は、存在するEPO-Rの数を計測するために使用されてもよい。特に、細胞膜におけるEPO-R集団密度によって観察されるように、EPO-Rのアップ又はダウンレギュレーションに対する細胞環境変化の効果を評価することができる。放射性同位元素、蛍光剤等の検出可能な標識で主題化合物を標識することにより、主題化合物の標識された誘導体に細胞を接触させた後に、非特異的に結合した標識された誘導体を洗い流し、尚も細胞に結合している標識された誘導体の量を測定する。予め決められた環境中でのEPO-R集団密度が既知の標準体を使用することで、環境変化が表面のEPO-R集団に影響を及ぼすかどうかを決定することができる。環境変化は、EPO-Rの発現を調節するか、又はリガンド部位に結合させることにより、EPO-R集団密度を調節する被験化合物の能力についてなされうる。また主題化合物はEPO-Rレセプターを発現する細胞を単離するために使用されうる。容器の壁、ビーズ、特に磁性ビーズ、キャピラリー壁等の表面に、主題化合物を結合させることにより、適切な培地中に細胞を分散させ、分散した細胞を結合した主題化合物と接触させることができる。非特異的に結合した細胞を洗い流した後、EPO-Rを発現し、細胞膜にEPO-Rを輸送する細胞を単離することができる。
【００７２】
主題化合物は、他の化合物が調節ドメインに結合するかどうかを測定するための競合アッセイに使用することができる。被験化合物と競合させるために、主題化合物の標識された誘導体を使用することにより、被験化合物の結合親和性を評価することができる。複合体形成条件下で、標識された主題化合物と被験化合物をEPO-Rと組合せることにより、EPO-Rに結合した標識された主題化合物の量を、被験化合物の親和性と関連させる。競合アッセイのための種々のアッセイプロトコルが知られており、例えばEPO-Rを固定し、被験化合物の存在下又は不在下で、固定されたEPO-Rに結合する標識誘導体の量を測定する。蛍光剤で標識された主題化合物では、全内部反射が使用され、容器の壁に隣接する蛍光剤が検出される。別法として、ビオチン化された主題化合物を用いてもよい。複合体形成条件下で、ビオチン化された主題化合物、被験化合物及びEPO-Rを混合した後、固定されたストレプト／アビジンを使用し、ビオチン化された主題化合物とEPO-Rの複合体を分離することができる。洗浄して、非特異的に結合したEPO-Rを除去した後、酵素標識抗(EPO-R)を添加し、酵素の基質のターンオーバー速度を測定することができる。ターンオーバー速度は調節ドメインに対する被験化合物の親和性に関連している。他の方法は、EPO-Rの少なくとも調節ドメインとの複合体として標識された主題化合物を使用し、複合体を固定するものである。ついで、被験化合物の存在下及び不存在下で、標識された主題化合物が複合体から放出される速度を測定することができ、これが被験化合物の親和性を示す。
【００７３】
種々の標識、例えば放射性同位元素、例えばトリチウム、蛍光剤、化学発光剤、酵素、量子ドット等がアッセイで使用される。また、珍しい同位体を使用し、質量分析により化合物を検出してもよい。これら種々の標識を主題化合物中に導入する方法は、十分類推される。例えばメチル基はチオール基を用いて官能化されてもよく、それによりマレイミド官能化蛍光剤をチオエーテル基を介して結合させることができる。エステル又はアミドの酸基は、化学発光剤の酸基で置き換えられてよい。酵素官能化抗体を使用することができ、ここで抗体が主題化合物とのEPO-R複合体に結合する。
【００７４】
主題化合物は、EPO-Rの細胞外部分と複合体を形成する。複合体は、生理学的条件を含む、通常約５〜１０、さらには６〜９の範囲のｐＨを有するように緩衝された条件下で、EPO-Rの少なくとも調節ドメイン部分と、主題化合物とを一緒にすることにより、容易に形成される。種々のバッファー、例えばトリス、ホスファート、ボラート、カルボナート、MOPS等が、一般に約１０〜２００ｍＭの範囲の濃度で使用され得る。２つの成分の濃度は、それらが混合される環境、例えば水性緩衝媒体中の合成混合物、EPO-Rを発現する培養培地の細胞、宿主への投与等に依存するであろう。濃度は０．１ｎＭ〜飽和状態までの範囲、又はそれ以上であってよい。EPO-Rは精製された分子、可溶化液のメンバー、ミクロソーム中に存在するか又は細胞膜に存在するタンパク質の混合物のメンバーであってよく、ここで細胞は赤血球又は他の細胞であってよく、誘導又は構成性条件下等で、EPO-R発現のためのEPO-R発現コンストラクトで形質転換した細胞であってもよい。複合体は精製複合体であってよく、又は上述したような混合物に存在するものであってもよい。EPO-Rは、リガンド、例えば複合体のリガンド結合部位に存在するEPO又は模倣物を有していても、有していなくてもよい。
【００７５】
生理学的効果を有する化合物は、エリスロポイエチン等のEPO-Rに対するリガンドと組み合わせて使用することができる。EPOの存在下、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、EPOと共に、EPO-Rを活性化させ、細胞中へシグナルを伝達する効果を有しており、少ないEPOを主題化合物の存在下で同様の細胞反応を得るために使用することができる。例えば個々に添加した場合、非常に低濃度のEPO及び非ペプチドEPO-Rモジュレータにより、骨髄からはCFU-eが得られないか、非常に少数しか得られないが；これに対し、一緒に添加した場合は、最大の反応が得られる。
【００７６】
非ペプチドEPO-Rモジュレータは、インビボで被験者(例えば哺乳動物)に、又はエクスビボ又はインビトロで哺乳動物細胞に投与することができる。
【００７７】
非ペプチドEPO-Rモジュレータにより、EPOに対する細胞反応性を増大させることは、EPOの作用に対して部分的に無反応、例えば耐性があるか、又は低い天然のEPOレベルを有する、被験者の反応性を改善する手段を提供することである。いくつかの状況において、このことは、EPOの投与が所望しない副作用を有するか、又はEPOの量が低減した宿主における所定の場合に特に望ましい。
【００７８】
一使用方法では、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、自然に生じるEPOレベルに対する反応性を高める必要のある被験者に投与されうる。他の方法では、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、EPOと組合せて被験者に投与されうる。さらなる他の方法では、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、EPOの量が低減した患者に投与されうる。
【００７９】
非ペプチドEPO-Rモジュレータは、単独で、又は外因性EPOと共に投与することができ、その場合、当業者には分かるように、投与は同時又は逐次とできる。EPOは、通常は注射により投与されるが、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、以下に示すような種々の経路で投与されうる。
【００８０】
非ペプチドEPO-Rモジュレータは、哺乳動物においてEPOエンハンサーとなりうる。さらに、非ペプチドEPO-RモジュレータとEPOとの間の効果により、非ペプチドEPO-Rモジュレータを、非ペプチドEPO-Rモジュレータの投与によりEPO-Rに結合するEPOの生理学的効果を高めるために使用することもできる。非ペプチドEPO-Rモジュレータを、不十分な又は不適切なEPO-Rの反応性に関与している病気の診断及び治療のための方法に使用することができる。
【００８１】
非ペプチドEPO-RモジュレータはEPOの効果を高めるか又は置き換えるために使用されるため、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、EPOの量が不十分であること、又は再生不良性貧血を含む、EPOに対する十分な反応性を欠くことに原因がある病気を治療するために使用することができる。
【００８２】
貧血は赤血球数が不足する場合に生じる。それは、種々の原因、例えば鎌状赤血球化疾患、ホモベータサラセミア、遺伝性球状赤血球症、赤血球酵素異常症、鉄、ビタミンＢ１２、葉酸欠乏症、再生不良性貧血、ファンコーニ貧血、ブラックファンダイアモンド(Blackfan Diamond)貧血、又は白血病に応答して生じる。患者が急性腎不全に罹った場合、又は慢性腎不全が進行した場合、エリスロポイエチンの腎臓での生成が不十分となる結果、再生不良性貧血になる。同様に、早産児の貧血は、ヘモグロビン濃度が漸次低下し、網状赤血球の絶対数が比較的低い場合に生じ、血清エリスロポイエチンが低濃度になって、骨髄赤芽球低形成が発生する。腎臓透析を受けている患者には、頻繁に貧血が生じている。
【００８３】
慢性腎不全の間の貧血の発生に対する還元エリスロポイエチンの作用は既知であり、さらにLancet, 1175(1986)及びN. Engl. J. Med, 316：731(1987)に記載された知見により立証されており、これには、血液透析を受けている患者の貧血が、組換えヒトエリスロポイエチンで完全に逆転されることが報告されている。これらの知見により、貧血は、少なくとも部分的にはエリスロポイエチン欠乏症が原因であることが示唆される。
【００８４】
ここで使用される場合、「治療」とは、好ましくは臨床的結果を含む、恩恵があるか又は所望される結果を得るためのアプローチである。治療は、場合によっては病気又は病状の徴候の回復、病気又は病状の徴候の予防、又は病気又は病状の進行の遅延化に関与している。この出願において記載された非ペプチドEPO-Rモジュレータを使用して治療され得る病気及び病状には、限定されるものではないが、この出願に記載された病気及び病状が含まれる(例えば、赤血球細胞レベルにおける増加により改善され、又は部分的に改善される任意の病気又は病状が含まれる)。
【００８５】
主題化合物は、経口的又は非経口的投与の際には、迅速には分解されないため、多様な製剤を使用することができる。非ペプチドEPO-Rモジュレータと製薬的に許容可能な担体、希釈液、又は賦形剤を含有する製薬用組成物が提供される。製薬用組成物は、場合によっては一又は複数の付加的な成分を含有していてもよいことは理解されるであろう。この出願において、特に明記しない限り、我々は担体、希釈液、及び賦形剤を、集合的に「賦形剤」と称する。
【００８６】
一般に、製薬用組成物は、治療的有効量の非ペプチドEPO-Rモジュレータと製薬的に許容可能な賦形剤を含有しているであろう。非ペプチドEPO-Rモジュレータを含有する製薬用組成物は、単位用量形態で提供されてもよい。
【００８７】
この出願において、「製薬的に許容可能な」とは、担体、希釈液又は賦形剤が製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害なものではないことを意味している。製薬的に許容可能な賦形剤は当該分野でよく知られており、製薬に使用される滅菌水、等張液、例えば生理食塩水及びリン酸緩衝液、生理食塩水、及びデキストロース溶液が含まれる。さらに、製薬用組成物又は製剤は他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤、賦形剤等を含有することができる。また組成物は、生理的条件に近似させるための付加的な物質、例えばｐＨ調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤、湿潤剤及び洗浄剤を含有することもできる。ヒト患者への投与に適した他の賦形剤は、当該分野において知られている。例えばRemington：The Science and Practice of Pharmacy(20th edition, 2000, Gennavo, ed)を参照。賦形剤は、薬剤又は組合わせ物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。
【００８８】
非ペプチドEPO-Rモジュレータの投与方法に応じて、非ペプチドEPO-Rモジュレータを送達せしめるための製薬用組成物は、多様な方法で製剤化され得る。
【００８９】
製薬用組成物は、種々の形態、例えば顆粒、錠剤、丸薬、坐薬、カプセル、懸濁液、膏薬、ローション等として提供することができる。治療的に活性な化合物を含有する組成物を作製するために、医薬グレードの有機又は無機担体及び／又は経口及び局所使用に適した希釈液を使用することができる。当該分野において公知の希釈剤には、水性媒体、植物性及び動物性油、及び油脂(脂肪)が含まれる。安定剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、又は適切なｐＨ値を確保するためのバッファー、及び皮膚浸透エンハンサーを、補助剤として使用することができる。
【００９０】
製薬用組成物の調製に使用される成分は高純度のものであり、実質的に潜在的な有害汚染物質を含有していない(例えば、少なくとも米国食品(ＮＦ)グレード、一般的に少なくとも分析用グレード、典型的には少なくとも製薬的グレードのもの)。ヒトの消費用にするためには、組成物はGMP規格下で製造又は製剤化される。例えば、適切な製剤は、滅菌されており、及び／又は実質的に等張であり、及び／又は米国食品医薬品局(U.S.Food and Drug Administration)の適正製造基準(GMP)の規定に完全に合致させることができる。
【００９１】
一変形例では、製薬用組成物は、非ペプチドEPO-Rモジュレータと製薬的に許容可能な担体を含有しており、ここで非ペプチドEPO-Rモジュレータは、この出願に記載されている非ペプチドEPO-Rモジュレータから選択される。主題化合物は、通常、製薬用組成物に均質に分配されており、宿主に対して生理学的に利用可能な形態をしており、治療される部位(群)に輸送され、投与方法及び適用又は摂取頻度に基づいて効果的な用量が提供される濃度とされる。
【００９２】
治療のためには、非ペプチドEPO-Rモジュレータは、有効量の非ペプチドEPO-Rモジュレータを送達可能な任意の手段により投与され得る。非ペプチドEPO-Rモジュレータの投与の非限定的例には、経口、局所、又は非経口投与、例えば皮下、腹腔内、血管内、鼻腔内、経皮等、特定の部位への注射が含まれる。注射用の製剤は、生理学的に許容可能な媒体、例えば水、生理食塩水、ＰＢＳ、水性エタノール、水性エチレングリコール等を含有するであろう。使用され得る水溶性防腐剤(保存料)には、重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルバート、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、ホウ酸フェニル水銀、パラベン類、ベンジルアルコール及びフェニルエタノールが含まれる。使用され得る適切な水溶性緩衝剤は、アルカリ又はアルカリ土類金属の炭酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩等、例えばナトリウムのリン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩である。担体として、添加剤、例えばカルボキシメチルセルロースが使用され得る。製剤は、製剤の目的、特にレセプター活性を調節するための使用方式、意図する治療等に応じて変化するであろう。製剤には、パッチ、カプセル、リポソーム、遅延性コーティング、丸薬が含まれてよく、又は連続投与のためのポンプ中に処方されてもよい。特定の用量は、既知の方法に従い、経験的に決定することができる。例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine 11版, Braunwaldら編, McGraw Hill Book Co., New York, 1987を参照。
【００９３】
一般に、物質の「有効量」又は「治療的有効量」とは、所望の生物学的効果、例えば臨床的結果を含む有益な結果を得るのに十分な量であり、例えば「有効量」はそれが適用される状況に依存する。脊椎動物、ヒト又は他の動物へ非ペプチドEPO-Rモジュレータを投与する場合、治療的有効量は、動物(例えばヒト又は他の動物の貧血症患者)においてヘマトクリットレベルを増加させることができ、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、さらには約１００％、またさらにはそれ以上増加可能な量であってよい。あるいは、有効量は、ヒト又は非ヒト動物においてEPOの作用を高めるのに十分な、非ペプチドEPO-Rモジュレータの量であってよい。例えば、外因性EPOを投与する必要のある患者(例えば貧血の患者)に、有効量の非ペプチドEPO-Rモジュレータを投与すると、与えられた評価項目(例えば、正常な又は健康レベルの動物における、指定されたレベルの赤血球)を達成するのに必要な外因性EPOの量を低減することができる。主題化合物が不在の場合と比較して、使用される外因性EPOの量の低減度合いは、少なくとも約１０％、多くの場合は少なくとも約２０％、時折は少なくとも約５０％、又はそれ以上であってよい。有効量は、予め決められた療法に従い、一又は複数回の投与で投与することができる。
【００９４】
それぞれの被験者に与えられる非ペプチドEPO-Rモジュレータの量は、製薬的特性、例えば生物学的利用能、クリアランス率及び投与経路に依存する。また用量は、主題化合物の生物学的活性度、投与されるEPO及び／又は他の薬剤の量、宿主の生理学的状態等にも依存するであろう。有用な用量範囲は、０．０１〜２００μｇ／ｋｇ、通常は０．０５〜１００μｇ／ｋｇである。投与は、投与される薬剤のレベルに応じて、週に一度、隔週、又は毎日、毎日二度、毎日二度以上、二日毎、又は多かれ少なかれ頻繁になされ得る。
【００９５】
宿主は、家畜、ペット、実験動物、及び霊長類、特にヒトを含む任意の哺乳動物であってよい。量は、一般的に非ペプチドEPO-Rモジュレータの半減期に応じて調節され、範囲のより低い部分の用量が使用され、ここで非ペプチドEPO-Rモジュレータは高められた半減期を有するか、又は持続性薬剤、例えば粒子を含有する徐放性組成物として提供され、これは延長された期間を超えて非ペプチドEPO-Rモジュレータを維持しているマトリックス、例えばコラーゲンマトリックスに導入され、実質的に一定速度を超えて、延長された期間を超えてペプチドを絶えず注入するポンプ、又はそれと同様のものが使用される。Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery：CRC Critical Reviews in Therapeutic Drua Carrier Systems, Vol.1, CRC Press, Boca Raton, FL, 1987, pp39-90には、制御された薬剤送達のためのカプセル化について記載されており、Di Colo(1992)Biomaterials 13：850-856には、疎水性ポリマーからの制御された薬剤放出について記載されている。
【００９６】
主題化合物は商業的に入手可能であり、又は一般的な合成法により容易に合成され得る。
【００９７】
上述したE5及びE5類似分子は、Maybridge, Plc(Cornwall, UK)及びKey Organics Ltd(Cornwall, UK)から入手できる。
【００９８】
E5は以下のように合成することができる。上述した文献(J. Het. Chem.,(1999), 36, 183-188)にあり、スキーム１に要約されて、コアが提供される。
【化１０】
2006508041.tif 000016
【００９９】
ついで、以下の経路(スキーム２)を使用し、E5標的分子を合成することができる。
【化１１】
2006508041.tif 000017
【０１００】
上述したE4分子はMaybridge, Plc(Cornwall, UK)及びKey Organics Ltd(Cornwall, UK)から入手できる。化合物は報告されており(Londonら, J. Chem. Soc.,(1939)902-906、及びMillerら, Synth. Comm.,(1978)371-376)、経路の選択には前例があり(Hamedら, J. Chem. Soc., Perkin 1,(1997)2415-2422)；出発物質は商業的に入手可能であり、合成法は以下のスキーム２に示す。
【化１２】
2006508041.tif 000018
【０１０１】
上述したE6分子はMaybridge, Plc(Cornwall, UK)及びKey Organics Ltd(Cornwall, UK)から入手できる。
【０１０２】
E6は以下のようにして合成することができる：
【０１０３】
前駆化合物は報告されており(Kajiら, Chem. Pharm. Bull., (1970), 18, 147-156)、スキーム３に示すように、合成法では商業的に入手可能な出発物質が使用される。
【化１３】
2006508041.tif 000019
文献５．Kajiら, 1970 Chem Pharm Bull18, 147-56
文献６．Lattiら, 1998 J Labelled Compounds Radiopharm 41, 191-200
【０１０４】
一般に、E4、E5及びE6類似体の合成は、当業者に知られた合成有機化学の技術を使用して達成され得る。
【０１０５】
主題発明の化合物は、EPO-Rに結合する活性を示し、ある例では、培養中及びインビボにおいてEPO-Rを活性化させる。最初の競合的ERPスクリーニングアッセイは、固体プレート結合アッセイとして設計された。このアッセイの詳細なプロトコルは、以下のERPスクリーニングプロトコルのセクションに記載する。
【０１０６】
簡単に説明すれば、競合的ERPスクリーニングアッセイでは、EPO-Rの細胞外部分をR&D(Minneapolis, MN)から購入し；ビオチン化された標準的なペプチドをAmerican Peptide Companyにより合成し；レセプター及びビオチン化ペプチド(bio-ERP)を室温でインキュベートし；溶液をニュートラビジン(neutravidin)(ストレプトアビジン)で被覆されたプレートと接触させ、レセプターとペプチドとの間に任意の複合体を結合させ；プレートに結合した複合体をEPO-Rに特異的な抗体で検出し、検出をHRP-結合した第２の抗体を用いて実施し；レセプターとペプチド間の複合体の存在を、４９０ｎｍの吸光度により検出するもので；シグナルがないか又は低シグナルであることは、ビオチン化ペプチドが競合しており、EPO-Rの調節ドメインに対する被験化合物が親和性を有していることを示している。
【０１０７】
スクリーニングされた化合物のライブラリは、２つのライブラリを組合せたものとして作製され：化合物はMaybridge, Plc(Cornwall, UK)及びKey Organics Ltd(Cornwall, UK)から購入した。ライブラリはマイクロタイタープレートとして受け入れた。プレートからの化合物を最終濃度１０_Ｍに希釈し、スクリーニングに使用した。ポジティブヒットを、EPO-Rの標的部位に対する結合についてビオチン化ERPペプチドと競合してこれに優る化合物として同定した。競合度８０％をポジティブなバインダーのカットオフ基準として使用した。ヒットを結合アッセイにおいて再試験して、用量反応曲線を決定した。
【０１０８】
最初のスクリーニングで同定した化合物を、２つのアッセイ：TF-1及びUT-7細胞における細胞シグナル伝達アッセイ及び細胞増殖アッセイにおいてさらに生物学的活性度を試験した。細胞増殖におけるヒット率は０．１６％；細胞シグナル伝達におけるヒット率は０．２５％であった。
【０１０９】
株化細胞TF-1及びUT-7における生物学的試験の終わりに、E4、E5、E5類似体及びE6分子は、最も高い活性を示すものとして同定された化合物のいくつかであった。活性をEPO天然ホルモンと比較し、E4、E5、E5類似物、及びE6分子が、低レベルのEPOの存在下でEPOの最大活性のものに匹敵する最大活性を有していることが観察された。
【０１１０】
上述したアッセイに加えて、カルボプラチン誘発性の貧血モデルを含む、さらなるインビボでの研究に着手した(以下にさらに詳細に記載)。ここでE4、E5、E5類似体、及びE6分子は、カルボプラチンで処置された動物におけるヘマトクリットレベルを回復させることが見出され；赤血球コロニー形成(CFU-e)をマウス及びヒトの骨髄を用いて実験し、ここでE4、E5、E5類似体、及びE6分子は、EPOがCFU-e形成を刺激するのと同程度に、CFU-e形成を刺激することが見出された。
【０１１１】
これらのアッセイのいくつかの結果は、この出願の図に含まれる。
【０１１２】
主題化合物は、少なくとも主題化合物とその使用説明書を含む、特に市販のためのキットとして提供することができる。使用説明書は、種々の電子媒体、例えばCD、フロッピー、テープ等を使用し、電子的に又は書き込まれたものであってよい。使用説明書は用量、副作用、許容可能な又は許容できない組合せ等を示す、治療製剤と共に提供されるラベルであってよい。アッセイにおいて、キットには、少なくとも一のEPO-Rの調節ドメイン、標識された主題化合物、EPO-Rを含む細胞又はEPO-Rの発現をアップレギュレート可能な細胞、及び上述したような適切な使用説明書が含まれうる。
【０１１３】
次の実施例は、本発明を限定するものではなく、例証することを意図している。
【実施例】
【０１１４】
最初の競合的ERPスクリーニングアッセイを、固体プレート結合アッセイとして設計した。このアッセイの詳細なプロトコルは、以下のERPスクリーニングプロトコルのセクションに記載する。
【０１１５】
簡単に言えば、競合的ERPスクリーニングアッセイにおいては、EPO-Rの細胞外部分をR&D(Minneapolis, MN)から購入し；ビオチン化された標準的なペプチドをAmerican Peptide Companyにより合成し；レセプター及びビオチン化ペプチド(bio-ERP)を室温でインキュベートし；溶液をニュートラビジン(ストレプトアビジン)で被覆されたプレートと接触させ、レセプターとペプチドとの間に任意の複合体を結合させ；プレートに結合した複合体をEPO-Rに特異的な抗体で検出し、検出をHRP-結合した第２の抗体を用いて実施し；レセプターとペプチドとの間の複合体の存在性を、４９０ｎｍの吸光度により検出するもので；シグナルがないか又は低シグナルであることは、ビオチン化ペプチドが競合しており、EPO-Rの調節ドメインに対して被験化合物が親和性を有していることを示している。
【０１１６】
スクリーニングされた化合物のライブラリは、２つのライブラリを組合せたものとして作製され：化合物はMaybridge, Plc(Cornwall, UK)及びKey Organics Ltd(Cornwall, UK)から購入した。ライブラリはマイクロタイタープレートとして受け入れた。プレートからの化合物を最終濃度１０μＭに希釈し、スクリーニングに使用した。ポジティブヒットを、EPO-Rの標的部位に対する結合についてビオチン化-ERPペプチドと競合可能な化合物として同定した。８０％の競合度を、ポジティブバインダーのカットオフ基準として使用した。ヒットを結合アッセイにおいて再試験し、それらの用量反応曲線を決定した。
【０１１７】
最初のスクリーニングで同定された化合物を、２つのアッセイ：TF-1細胞における細胞シグナル伝達アッセイ及び細胞増殖アッセイにおいてさらに生物学的活性度を試験した。細胞増殖におけるヒット率は０．１６％；細胞シグナル伝達におけるヒット率は０．２５％であった。
【０１１８】
株化細胞Tにおける生物学的試験の終わりに、E4、E5、E5類似体及びE6分子は、最も高い活性を示すものとして同定された化合物のいくつかであった。活性はEPO天然ホルモンと比較され、E4、E5、E5類似物、及びE6分子が、EPOの最大活性のものに匹敵する最大活性を有することが観察された。
【０１１９】
上述したアッセイに加えて、貧血モデルで誘発されたカルボプラチンを含む、さらなるインビボでの研究に着手した(以下にさらなる詳細を記載)。ここでE4、E5、E5類似体、及びE6分子は、カルボプラチンで処置された動物におけるヘマトクリットレベルを回復させることが見出され；赤血球コロニー形成(CFU-e)をマウス及びヒトの骨髄を用いて実験し、ここでE4、E5、E5類似体、及びE6分子は、EPOがCFU-e形成を刺激するのと同程度に、CFU-e形成を刺激することが見出された。
【０１２０】
これらのアッセイのいくつかの結果は、この出願の図に含まれる。
【０１２１】
ERPスクリーンングプロトコル
候補分子をEPO-R結合についてスクリーニングした。化合物をミニソーブ(minosorb)プレートで１：２０に希釈した。１０μｌの化合物溶液を、プレートの各ウェルに、マトリックス衝撃電子マルチ分注器を用いて添加した。ついで、１０μｌの冷ペプチド(5%のDMSOと共に)を添加した(又は対照ウェルに5%のDMSOを含むHBS)。ERPを１：４に希釈し(25μｌ 1mM＋75μＬ HBS、250μM)、氷上に置いた。２６μｌの２μＭEPOレセプター溶液を、２０５４μｌのHBSを収容しているレセプターチューブに添加し、少し攪拌した。この溶液２０μlを、ウェル毎に繰り返し分注器を用いて各ウェルに添加し(競合において10μM)；８．８μlの２５０μＭERP-ビオチン溶液を、２．２ｍｌのHBSと共に各チューブに添加し、少し攪拌した。この溶液２０μlを、繰り返し分注器を用いてウェルに分注した(競合において400μM)。ついで、水平振盪器において、プレートを室温(RT)で９０分間インキュベートした。０．２％のBSAと共に１５０μlのHBS、及び２％のTween-20をウェルに添加した。ついで、プレートを室温で６０分間インキュベートした。５０μl／ウェルをニュートラビジンプレートに移し、振盪器において、室温で３０分間インキュベートした。ウェルを３ｘHBS０．０５％Tween-20で洗浄し、最後の洗浄後にタオルでたたいた。HBS＋０．３％のドライミルク＋０．０５％のTween-20繰り返し分注器プラスで希釈した抗-EPO-Rab(m.c. R&D)を添加した。水平振盪器において、ウェルを室温で１時間インキュベートした。ウェルをHBS０．０５％Tween-20で３回洗浄し、最後の洗浄後にタオルでたたいた。抗マウスAb-HRP(Santa Cruz)を、HBS＋０．３％のドライミルク＋０．０５％のTween-20において１：１０００に希釈し、ウェルに添加した。次に室温で３０分間インキュベートし、ウェルをHBS０．０５％Tween-20で３回洗浄した。１００μｌのTMB(N,N,N',N'-テトラメチルベンジジン)を添加し、室温で１５分間インキュベートした後、５０μｌの２Ｍ硫酸を添加した。ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０１２２】
保存溶液アリコート：
２μＭのEPO-R(50μg/ml PBS)３００μｌ／シリコーン処理チューブ、６０チューブ；１ｍＭの６０チューブでのERP-ビオチン５０μｌ；ERP１２０μｌのアリコート６０チューブ１ｍＭの水：１０xHBSを調製。
【０１２３】
毎日必要な溶液：
２％のTween20と０．２％のBSAを伴うHBS(500ml)：１０ｇのTween-20；１ｇのBSA(SIGMA)；HBSで５００ｍｌまで満たす；洗浄用バッファー(0.05%のTween20を伴うHBS)１．２ｌ １０ｘHBS；プラス１０．８ｌの水；プラス６ｇのTween-20(まず小さなビーカーにTweenを入れ、いくらかの水に溶解させ、10xHBSを添加して水の容量に一緒にした)。
【０１２４】
アッセイ用バッファー：
５００ｍｌの洗浄用バッファープラス０．３％(１．５ｇ)のSafewayドライミルク；
【０１２５】
細胞増殖：
【０１２６】
TF-1細胞を種々の非ペプチドEPO-Rモジュレータで９６時間刺激したところ、非ペプチドEPO結合分子が、用量に応答する形で、天然ホルモンの程度まで細胞増殖を刺激することが観察された。その結果は、EPO-Rを介しての作用により、非ペプチドEPO-Rモジュレータが細胞に対して抗アポトーシス活性を示すことを証明している(図３を参照)。
【０１２７】
UT-7細胞の成長と飢餓
【０１２８】
UT-7細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて、T150フラスコ(60ml/フラスコ)中に２０％のFBS、１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、５ｎｇ／ｍｌのGM-CSF、及び１００Ｕのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンスルファート(「P/S」)を含む最小必須培地アルファ(MEM-α)中で、５x１０５細胞／ｍｌの密度を超えないように成長させた。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて、T150フラスコ(60ml/フラスコ)中に５x１０５細胞／ｍｌの密度で１０％のFBS、１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、及びP/Sを含有するMEM-α中で一晩飢餓させた。ついで、細胞を、室温で５分間、２００ｘｇにて、振盪バケットローターにおいて遠心分離した。上清を除去し、細胞を５０ｍｌの円錐管にためた。細胞を無血清培地(1.5g/LのNaHCO３及びP/Sを含有するMEM-アルファ)で２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を無血清培地に、１ｘ１０７細胞／ｍｌの密度に再懸濁させた。ついで、細胞を１ｍｌのアリコートにおいて１５ｍｌの円錐管に配し、３７℃、５％ＣＯ２において、１時間、キャップをゆるめてインキュベートした。１０分毎に、各管の下部を数回軽くたたき(はじき)、細胞が沈降するのを防止した(この工程は非常に重要である点に留意されたい)。
【０１２９】
インビトロでのシグナル伝達
TF-1又はUT-7細胞を３０分まで刺激し、EPO-レセプターの下流シグナル伝達経路の活性化、すなわちJAK2、STAT1、STAT3及びSTAT5のホスホリル化を評価した。非ペプチドEPO-RモジュレータはEPO-Rのシグナル変換を活性化させるという結果が示された(図４を参照)。また、EPO-Rは、非ペプチドEPO-Rモジュレータで刺激された場合にホスホリル化されることも観察された(図４を参照)。
【０１３０】
EPO及び成分への反応におけるTF-1細胞でのシグナル伝達
細胞の成長と飢餓
TF-1細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて、T150フラスコ(60ml/フラスコ)中に１０％のFBS、２ｎｇ／ｍｌのヒトGM-CSF、及び１００Ｕのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンスルファート(「P/S」)を含むRPMI1640培地中で成長させた。細胞を８x１０５細胞／ｍｌの密度を超えないように成長させた。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて、T150フラスコ(60ml/フラスコ)中に８x１０５細胞／ｍｌの密度で３．５％のFBS及びP/Sを含有するRPMI1640培地中で一晩飢餓させた。アッセイ当日、細胞をプロセシングする前に、試験される非ペプチドEPO-Rモジュレータを以下に記載するようにして希釈した。細胞に添加する前に、希釈された化合物を９０分間、室温に置いた。細胞を、室温で５分間、２００ｘｇにて、振盪バケットローターにおいて遠心分離した。上清を除去し、細胞を５０ｍｌの円錐管にためた。細胞を無血清培地(P/Sを含有するRPMI1640)で２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を無血清培地に、１．５ｘ１０７細胞／ｍｌの密度に再懸濁させた。細胞を１ｍｌのアリコートにおいて１５ｍｌの円錐管に配し、３７℃、５％ＣＯ２において、１時間、キャップをゆるめてインキュベートした。１０分毎に、各管の下部を数回軽くたたき、細胞が沈降するのを防止した。
【０１３１】
細胞の活性化及び免疫沈降
細胞を飢餓させる一方、GammaBind Gセファロースビーズを抗体で被覆した。このため、GammaBind GビーズをPBSで３回洗浄した(ビーズは50%のビーズを含有するスラリーとして提供されており；このスラリー３０μｌをサンプル毎に使用した)。まず、スラリーを１５〜２０秒間回転させ、上清をデカントした。各洗浄において、１ｍｌの氷冷されたPBSをビーズに添加し、チューブを数回反転させた。チューブを１５〜２０秒間回転させ、上清をデカントした。最後の洗浄後、上清をデカントし、サンプル毎に２μｇ(10μl)の抗-ホスホチロシン抗体(PY99)をビーズに添加した。次に、チューブが５０％のビーズと５０％の液体を収容するように、十分なPBSを添加した(例えば、10サンプルでは、300μlのスラリーが使用され；これにより約150μlのビーズが付与される)。ビーズを洗浄し、１００μｌの抗体プラス５０μlのPBSを添加した。転倒回転(end-over-end rotation)により、ビーズを室温で２時間インキュベートした。
【０１３２】
細胞の１時間のインキュベートが終了した時、それらを次のようにして刺激した：非ペプチドEPO-Rモジュレータを受容した細胞は、０．３％のDMSO最終濃度を有している。全ての細胞において等しい条件を維持するために、化合物を受容しないよう、全ての細胞にDMSOを添加した。DMSOの最終濃度を０．３％とするために、１０μlの３０％DMSOを１ｍｌの細胞に添加し、よく混合した。０．３％のDMSOを含有する１ｍｌの細胞を負の対照として使用し、３００ｍＵ／ｍｌのEPO及び０．３％のDMSOを含有する１ｍｌの細胞を、正の対照として使用した。
【０１３３】
希釈：
サンプルをそれらの１００ｘの最終濃度まで希釈し、各希釈液１０μｌを、１ｍｌの細胞に添加し、最終濃度を得た。３０μＭのERPの最終濃度を得るために、３０μｌの１ｍＭ保存溶液を、１ｍｌの細胞に直接添加した。希釈液については、以下の表を参照のこと：
最終濃度         100x       希釈液
300mU/ml EPO    30U/ml     6μl 500U/ml の保存EPO＋94μlの氷冷PBS
30μM化合物     3mM        9μl 10mMの保存化合物＋21μlのH2O
3μM化合物      0.3mM      3μl 3mMの化合物＋27μl  27%のDMSO
0.3μM化合物    0.03mM     4μl 0.3mMの化合物＋36μl  27%のDMSO
30μM EPO-R                1mlの細胞に直接、30μl  1mMの保存EPO-Rを添加
3μM EPO-R      0.3mM      6μl 1mMの保存EPO-R＋14μlの氷冷H2O
0.3μM EPO-R    0.03mM     3μl 0.3mMのEPO-R(上述)＋17μlの氷冷H2O
【０１３４】
サンプルを、３７℃、５％のＣＯ２にて３０分インキュベートし、１０分毎に各チューブの下部を数回軽くたたく(はじく)ことによりサンプルを混合した。各サンプルに、１４ｍｌの氷冷されたPBSを添加することにより、アッセイを停止させた。サンプルを、４℃で５分間、４００ｘｇにて、振盪バケットローターにおいて遠心分離した。サンプルを氷上に置き、上清を吸引した。細胞を溶解させるため、８００μｌの２ｘ溶菌用バッファー(２ｘプロテアーセインヒビターを含有、使用直前に添加)を各細胞ペレットに添加し、数回、ピペットで吸い上げたり、下ろしたりした。ついで、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。サンプルを１．５ｍｌのマイクロ遠心分離用管に移し、１０分間、１００００ｘｇ、４℃で回転させた。サンプルを回転させつつ、抗体で被覆されたGammaBind Gビーズを、適切な数の１．５ｍｌのマイクロ遠心分離用管において、同量のアリコートに分けた。上清を各サンプルから取り出し、抗-ホスホチロシン被覆されたGammaBind Gビーズに添加し、ビーズと上清の混合物を、転倒回転により、４℃で一晩インキュベートした。サンプルを１５〜２０秒間回転させ、上清をデカントした。ビーズを８００μｌの１ｘ溶菌用バッファーで２回(1xのプロテアーゼインヒビターを含有、使用直前に添加)、８００μｌの１：１溶菌用バッファー：１２５ｍＭのトリスｐＨ６．８の混合物で一度洗浄した(各洗浄において、バッファーを添加し、チューブを数回反転させ、１５〜２０秒回転させ、上清をデカント)。４５μｌの１ｘサンプル用バッファーを各サンプルに添加した。サンプルを５分間、９５℃で加熱し、簡単に遠心分離して(約２０秒)、SDS-PAGEにより検査した。
【０１３５】
ウエスタン分析
還元条件下で、サンプルを２つの８％SDS-ポリアクリルアミドゲルにかけた。手順は、イモビロン-Ｐ膜にタンパク質を移動させ(10%のMeOHを含有し、pH11で、10mMのCAPS移動用バッファーにおいて、60分300mAで移動)；室温で１時間、ブロットにおいて膜をブロックし；一方ではアルファ-STAT5b抗体、他方ではアルファ-EPO-R抗体を有する膜(双方ともブロットにおいて１：１０００に抗体を希釈)を４℃で一晩インキュベートし；室温で、ブロットにおいて膜を３回、洗浄当たり４分間洗浄し；双方の膜に、ブロットにおいて１：２０００に希釈されたアルファ-ウサギ-AP第２抗体を添加し；室温で２時間インキュベートし；洗浄当たり４分間、ブロットで３回膜を洗浄し；洗浄当たり４分間、１ｘTSTで膜を２回洗浄し；洗浄当たり４分間、１ｘTSMで膜を１回洗浄し；検出用に、各膜に１０ｍｌのBCIP/NBT基質を添加するというものである。
【０１３６】
溶液
２ｘの溶菌用バッファー：
１００ｍＭのHEPES, ｐＨ７．６       ５０ｍｌの１Ｍ HEPES, ｐＨ７．６
３００ｍＭのNaCl                    ８．８ｇのNaCl
２％のTritonX-100                 １０ｍｌのTriton X-100
１０ｍＭのEDTA                    １０ｍｌの０．５Ｍ EDTA, ｐＨ８
Ｈ２Ｏを５００ｍｌまで添加
【０１３７】
１００ｘのプロテアーゼインヒビター：
１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン          ２０ｍｇのアプロチニン
１００μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ*   ２ｍｇのペプスタチンＡ*
１００μｇ／ｍｌのロイペプチン      ２ｍｇのロイペプチン
１００μｇ／ｍｌのキモスタチン*     ２ｍｇのキモスタチン*
２３．８ｍｇ／ｍｌのAEBSF           ４７６ｍｇのAEBSF
*他のインヒビターと組合せる前に、１００μｌのDMSOに、キモスタチンとペプスタチン-Ａを溶解。Ｈ２Ｏで容量を２０ｍｌにする。使用直前に溶菌用バッファーに添加。
【０１３８】
サンプル用バッファー：
１００μlの５０％グリセロール
０．０５％のブロムフェノールブルー
２０μｌのｕ−メルカプトエタノール
４０μｌの１０％SDS
１６０μｌの１ｘゲルランニング用バッファー(電気泳動用バッファー)
【０１３９】
１０ｘTST：
０．１Ｍのトリス  ｐＨ７．４             １２．１ｇのトリス塩基
１．５ＭのNaCl                     ８７．７ｇのNaCl
０．７５％のTween-20                 ７．５ｍｌのTween-20
０．２％のNaN３                    ３ｇのNaN３
ｐＨを７．４にする
１リットルになるまでＨ２Ｏを添加
【０１４０】
ブロット：
１ｘTST                                  １００ｍｌの１０ｘTST
５ｇのドライミルク                       ０．５％のドライミルク
１リットルになるまでＨ２Ｏを添加
【０１４１】
１０ｘTSM：
１Ｍのトリス  ｐＨ９．０           １２１．１ｇのトリス塩基
１ＭのNaCl                         ５８．４ｇのNaCl
５０ｍＭのMaCl２                   １０．２ｇのMaCl２x6H2O
ｐＨを９．０にする
【０１４２】
主題化合物を抗アポトーシス効果を評価するために試験した場合に、これらの抗体が使用された：抗Bcl-XＬ／Ｓ抗体(Santa Cruz Biotechnology, SC-1041)、抗Bcl-XL抗体(Santa Cruz Biotechnology, SC8392)。
【０１４３】
BCIP/NBT基質：
NBT原液：７０％のジメチルホルムアミドに５０ｍｇ／ｍｌ。−２０℃で保管；BCIP保管：１００％のジメチルホルムアミドに５０ｍｇ／ｍｌ。−２０℃で保管；使用直前に１０ｍｌの１ｘTSMと６６μｌの５０ｍｇ／ｍｌのNBT、及び３３μｌの５０ｍｇ／ｍｌのBCIPを組合せ；よく混合し、フィルターに適用する。
【０１４４】
材料：
抗EPO-R抗体(c-20)：Santa Cruz Biotech, cat. #sc-695；抗STAT 5b抗体(c-17)：Santa Cruz Biotech, cat. #sc-835；抗-ホスホチロシン抗体(PY99)：Santa Cruz Biotech, cat. #sc-7020；抗-ウサギIgG-AP：Santa Cruz Biotech, cat. #sc-2007；BCIP(5-ブロモ-4-クロロ-3-イノロイルホスファート)：Sigma, cat. #B-8503；CAPSバッファー(3-[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスルホン酸)：Sigma, cat. #C-2632；ウシ胎児血清：American Type Culture Collection(ATCC), cat. #30-2020；GammaBind(登録商標)G セファロース：Pharmacia Biotech, cat. #17-0885-02；ヒトGM-CSF：Pepro Tech, cat. #300-03；イモビロンＰ：Millipore, cat. #IPVH00010；NBT(ニトロ・ブルー・テトラゾリウム)：Sigma, cat. #Ｎ-6876；PBS(ホスファート緩衝液)：Sigma, cat. #P-3813；ペニシリン／ストレプトマイシンスルファート：Applied Scientific, cat. #9366；RPMI 1640：American Type Culture Collection(ATCC), cat. #30-2001；
【０１４５】
骨髄からの赤血球コロニー(CFU-e、BFU-e)の形成
マウス又はヒト骨髄細胞を、非ペプチドEPO-Rモジュレータを用い、７日(マウス)又は１４日(ヒト)、メチルセルロースにおいて刺激した。赤血球コロニーの形成が観察された(図６ないし８を参照)。
【０１４６】
ヒト骨髄の単離プロトコル
(１)滅菌PBSを用いてヒト骨髄を１：１に希釈。(２)２０ｍｌのLSMリンパ球分離媒体(ICN/Cappel-cat#50494)を収容した５０ｍｌのチューブにおいて、骨髄がゆっくりと層になる。５０ｍｌの骨髄が２本のチューブに得られる。(３)ブレーキをオフにして、３０分間２０００ｒｐｍでチューブを回転。(４)１０ｍｌのピペットを使用し、中間層をゆっくりと取り出し、新しい５０ｍｌのチューブに移す。(５)洗浄用のチューブにPBS＋０．５％のBSA＋５ｍＭのEDTAを添加。(６)ブレーキをオンにし、速度４で５分間、チューブを回転。(７)２回以上、洗浄工程を繰り返す。(８)第３回目の洗浄後、SF Iscoves' MDM培地にペレットを再懸濁。(９)３％の酢酸において、希釈された細胞を計測。(１０)所望の濃度に細胞を希釈し(5x105細胞/ml)、メチルセルロースに蒔く。
【０１４７】
半固体状のメチルセルロース培地に蒔かれたヒト骨髄のプロトコル
(１)５０ｎｇ／ｍｌのhSCFが補填された３．０ｍｌのメチルセルロース培地(Stemcell Technology, cat#H4230)を収容したチューブを調製する(別法として、50ng/mlのhSCF、20ng/mlのhIL-3及びhIL-6でメチルセルロースを補填することができる)。(２)所望の濃度の化合物又はEPOをチューブに添加する。「対照」チューブ又はEPOを受容するであろうチューブは、最終濃度が０．１６％になるまで、DMSOを補填する。同様のDMSO濃度を、全ての他の実験条件において一定に保持する。(３)５ｘ１０５細胞／ｍｌである３００μlのヒト骨髄細胞を各チューブに添加し、簡単に攪拌し、チューブをテスト用チューブのラックに５分間放置する。１．１ｍｌの細胞混合物を１６ｇの平滑断端針(Stemcell Technology)を使用し、２つの３５ｍｍ皿に等分する。３ｍｌの滅菌水を収容した第３の３５ｍｍ皿を、１２５ｍｍの組織培養皿に、２つの皿と共に配する。(４)皿を３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートし、コロニー形成を定期的に観察する。コロニーについて１日１２回記録する。
【０１４８】
コロニー形成アッセイ
骨髄細胞をマウスの大腿骨から単離した。細胞をPBSで２回洗浄し、６．５ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で培地に再懸濁させた。３００μｌ(６．５ｘ１０６細胞／ｍｌ)の細胞を、１．５ｍｌのメチルセルロース培地(Stemcell Technology)と混合し、所望の濃度の化合物又はEPOを添加した。混合物を３５ｍｍ皿に注ぎ；全ての条件を複製においても実施した。３７℃、５％のＣＯ２にて８日間インキュベートした。コロニーについて１日７回記録した。
【０１４９】
材料：
Stemcell Technology：１．cat#M3234のネズミ細胞用のメチルセルロース塩基培地 ８０ｍｌ／ボトル；２．３５ｍｍ皿  cat#27150 500/パック cat#27100 10/パック；３．cat#07700の、２％FBSを有するイスコブズ(Iscove's)変性ダルベッコ培地(MDM) １００ｍｌ／ボトル；４．１６口径の平滑断端針cat#28110パックを100；５．3ccシリンジcat#28240パックを1000；６．グリッドスコアリング皿(Gridded scoring dishes)cat#27500 5/パック；
【０１５０】
応用化学：１．ミニソープチューブ(minosorp tube)100x15 cat#468608；２．ミニソープチューブ100x15ストッパーcat#343036；３．10ccシリンジcat#9604；
【０１５１】
コーニング：１．滅菌100mm組織培養皿cat#25020；
【０１５２】
付加的な物質：１．滅菌水；２．計測器
【０１５３】
メチルセルロースを一晩解凍した後、翌朝、２０ｍｌのイスコブズMDM＋２％FBSをボトルに添加し、全体で１００ｍｌにする。ボトルを少なくとも３０秒混合し、約１０分間静置させる。10ccシリンジを使用し、ミニソープチューブ当たり３ｍｌに等分する。
【０１５４】
胎児肝臓細胞からのCFU-eの形成
マウス胎児の肝臓細胞を単離し、非ペプチドEPO-Rモジュレータを用いて、３日間、メチルセルロースにおいて刺激した。赤血球コロニーの形成を観察した(図５を参照)。
【０１５５】
マウス胎児肝臓CFU-eアッセイ
手順は以下の通りである。１．１０ｃｍ皿で、氷冷されたIMDM(StemCell Tech)において１ないし2E12の妊娠するように調節されたCD-1マウス(10-12胎児；Charles River)から胎児を取り除く；２．切開範囲下、IMDMにおいて胎児から胎児肝臓(FL)を切開；３．IMDMを用い、FLを２回洗浄；４．１-２ｍＬのIMDMを添加；P1000/ブルーチップを用いて、１０〜１５回、ピペットで吸い上げたり、下ろしたりして、細胞懸濁液においてFLを構成要素に分ける；５．細胞ストレーナ(70μ、Falcon352350)に細胞懸濁液を通す；６．IMDMで細胞を３回洗浄；１ｍＬのIMDM／２％のFBS(StemCell)に細胞を再懸濁させ、３％の酢酸において有核細胞1/20を計測；１２FLは約４ｘ１０７の有核細胞を産出すべき；７．IMDM／２％のFBSにおいて、０．５〜１ｘ１０６／ｍＬでFL細胞を希釈；８．組換えヒトエリスロポイエチンアルファ及び／又は他のサイトカイン類／化合物を含有する３ｍＬの１ｘM3231(StemCell Technologies)に、３ｍＬの細胞を添加；９．激しく攪拌し、５分間放置；１０．１６口径の平滑断端針／３ｍＬのシリンジを使用し、３５ｍｍ皿(StemCell#27100)に２ｘ１．１ｍＬを分配；１１．３ｍＬの滅菌水を収容する第３の被覆されてない３５ｍｍ皿と共に、１０ｃｍの培養皿に２３５ｍｍの皿を配する；１２．３７℃／５％のＣＯ２で２〜３日インキュベートし、CFU-eについて記録する。
【０１５６】
任意：CFU-e／BFU-eのベンジジン染色
１．ベンジジン染色液の作製(新鮮なものを作製)--０．２％のベンジジンＨＣｌ(Sigma B-3383)、０．５％の氷酢酸、０．１２％のＨ２Ｏ２(0.2mL/50mL 30%H2O2、SigmaH-1009)；２．細胞で覆われたMethocult皿に十分な量(0.75ｍL/35mm皿)のベンジジン染色液をゆっくりと添加；数分待つ；ヘモグロビンを発現している細胞は青く変色する。
【０１５７】
貧血症の動物を用いたインビボ実験
マウスをカルボプラチン剤(化学治療で通常使用されており、Sigmaから入手可能)で処置したとこころ、ヘマトクリットの低下が誘発された。非ペプチドEPO-Rモジュレータの腹腔内(ip)又は経口投与により、カルボプラチン処置された動物のヘマトクリットレベルの低下が保護された；すなわち貧血の発現が少なくとも部分的に防止された(図９-１１)。
【０１５８】
８週のC57BI雄マウスにおけるカルボプラチン誘発された貧血症でのヘマトクリットにおける非ペプチドEPO-R結合小分子の効果の測定
注射プロトコル
注射溶液の調製：
ビヒクル-０．１ｍｇ／ｍＬBSAを含有する生理食塩水；３００ｍＬの生理食塩水に３０ｍｇのBSAを添加；層流フードに滅菌条件下で真空濾過；ミニソープチューブに生理食塩水(0.1mg/mLのBSA)を等分。少なくとも４１ｘ７ｍＬのアリコートを調製すべきである。チューブにキャップをかぶせ、４℃で冷蔵保管；
【０１５９】
カルボプラチン-１２０ｍｇ／ｋｇの用量：３６の雄マウス(８週〜２５ｇ)に付与された単一注射の算定：１２０ｍｇ／マウスｘ０．０２５ｋｇｘ３６マウス＝１０８ｍｇ；注射は０．５ｃｃ／マウス＝０．５ｃｃ／マウスx３６マウス＝１８ｃｃの容量で腹腔内に分配され；３６のマウスに６ｍｇ／ｍＬでカルボプラチン：１０８ｍｇ／１８ｃｃ；１２０ｍｇ／２０ｃｃ；注射当日、攪拌バーを収容する１００ｃｃのビーカーにおいて、２０ｃｃの生理食塩水に１２０ｍｇのカルボプラチン(Sigma #C2538)を添加。パラフィンでビーカーを被覆。カルボプラチンが完全に溶解するまで混合。
【０１６０】
非ペプチドEPO-R結合小分子-１１ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の用量
１０日間の期間を超えて、１２の雄マウス(８週〜２５ｇ)に付与された毎日の注射を算定：
【０１６１】
１１ｎｍｏｌ／ｋｇ／マウス／日ｘ０．０２５ｋｇ／１２マウス＝３．３ｎｍｏｌ／日；注射は０．５ｃｃ／マウス／日＝０．５ｃｃ／マウス／日x１２マウス＝６ｃｃ／日の容量で腹腔内に分配され；２０のマウスに非ペプチドEPO-R結合小分子：３．３ｎｍｏｌ／６ｃｃを毎日：３．８５ｎｍｏｌ／７ｃｃを毎日；非ペプチドEPO-R結合小分子２ｍＭ＝２ｎｍｏｌ／μＬで等分；７ｃｃで１日当たり３．８５ｎｍｏｌ(0.55nmol/mL)；よって：３．８５ｎｍｏｌｅを２ｎｍｏｌ／μＬ保管で分割＝２ｍＭの１．９２５μＬ；それぞれ２μＬの容量を有する小さなマイクロ遠心分離管において、２ｍＭの非ペプチドEPO-R結合小分子を少なくとも１０のアリコートに前もって調製。各アリコートを凍結；それぞれの注射の当日、７ｃｃの滅菌生理食塩水(0.1mg/mLのBSA)を収容したチューブに、２μＬの容量を有する２ｍＭの非ペプチドEPO-R結合小分子の１解凍アリコートを添加。これにより、０．５５ｎｍｏｌｅ／ｍＬ濃度を有する非ペプチドEPO-R結合小分子の注射溶液になる。
【０１６２】
１．５μｇ／ｋｇ／日のエリスロポイエチン用量：
１０日間の期間を超えて、１２の雄マウス(８週〜２５ｇ)に付与された毎日の注射を算定：１．５μｇ／ｋｇ／マウス／日ｘ０．０２５ｋｇ／１２マウス＝０．４５μｇ／日；注射は０．５ｃｃ／マウス／日＝０．５ｃｃ／マウス／日x１２マウス＝６ｃｃ／日の容量で腹腔内に分配され；１２のマウスにEPO：０．４５μｇ／６ｃｃを毎日：０．５２５μｇ／７ｃｃを毎日；１ｍＬのPBSを有するEPO(#287-TC-500, R&DSystems)の５００単位(５μｇ)を再構成させると、５μｇ／ｍＬの保存濃度が提供される；７ｃｃで１日当たり０．５２５μｇ(75ng/mL)使用；よって：０．５２５μｇを５μｇ／ｍＬ保管で分割＝５μｇ／ｍＬで０．１０５ｍＬ〜５μｇ／ｍＬで１００μＬ；それぞれ１００μＬの容量を有する小さなマイクロ遠心分離管において、５μｇ／ｍＬのEPOを少なくとも１０のアリコートに前もって調製。これらのアリコートを凍結；それぞれの注射の当日、７ｃｃの滅菌生理食塩水(0.1mg/mLのBSA)を収容したチューブに、１００μＬの容量を有する５μｇ／ｍＬのEPOの１解凍アリコートを添加。これにより、０．７５ｎｇ／ｍＬ濃度を有するエリスロポイエチンの注射溶液になる。
【０１６３】
注射処方
カルボプラチンのみの負の対照群：
各動物に、０日目に６ｍｇ／ｍＬのカルボプラチンの注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。各動物に１〜１０日、生理食塩水(0.1mg/mLのBSA)の注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。
【０１６４】
注射処方
カルボプラチン＋非ペプチドEPO-R結合小分子(１１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日)のテスト群：
各動物に、０日目に６ｍｇ／ｍＬのカルボプラチンの注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。各動物に１〜１０日、非ペプチドEPO-R結合小分子(0.55nmole/mL)の注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。
【０１６５】
カルボプラチン＋エリスロポイエチン(１．５μｇ／ｋｇ／日)の正の対照群：
各動物に、０日目に６ｍｇ／ｍＬのカルボプラチンの注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。各動物に１〜１０日、７５ｎｇ／ｍＬのエリスロポイエチンの注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。
【０１６６】
生理食塩水の対照群：
各動物に、０日目に生理食塩水(0.1mg/mLのBSA)の注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。各動物に１〜１０日、生理食塩水(0.1mg/mLのBSA)の注射を、０．５ｃｃ腹腔内に与える。
【０１６７】
正常なマウスにおける網状赤血球の測定
正常なマウスの腹腔内に、０日目に非ペプチドEPO-Rモジュレータを注射した。網状赤血球のレベルを注射５、８及び１１日目に測定した。非ペプチドEPO-Rモジュレータは、天然ホルモンと同程度まで、網状赤血球レベルを増加させた(図１２)。
【０１６８】
EPOと共同して、また置き換えて作用する小分子を、CNSにおけるそれらの可能性のある適用について評価した。得られた結果には、実際には、主題となる小分子がニューロン性のアポトーシスにおいて保護的役割を有していることが示された。テストされた主題となる小分子は、細胞生存率を６０％まで増加させることにより、グルタマート神経毒性から培養ニューロンを保護した。よって、主題となる小分子は、脳虚血、脊髄損傷又は代謝性侵襲の防止に使用されることが見出された。
【０１６９】
主題となる発明の分子の数を、脳虚血及び代謝性侵襲の病状を表す、インビトロ系で評価した。まず、EPOがニューロン性アポトーシスを防止するメカニズムの一つは、抗-アポトーシスタンパク質であることが十分に定義されている、Bcl-X1タンパク質の発現レベルをアップレギュレーションすることによるものであることが知られている。よって、EPO反応性であることが知られている株化細胞(以前の研究で使用されているUT-7及びTF-1)を、EPO-Rを介して小分子の抗-アポトーシス活性を調査するために細胞システムとして使用した。
【０１７０】
CNS系における主題となる小分子の適用
図１３-１４に表したように、双方の株化細胞において、小分子(E5A24及びEM5)は、用量反応方式においてBcl-XLタンパク質のアップレギュレーションを誘発した。Bcl-XLタンパク質のアップレギュレーションが達成されると、EPOで達成されたレベルまでになった。評価を、細胞の飢餓、適切な濃度で化合物を用いた細胞の刺激(又は対照サンプルに対して刺激なし)、及び両方の形態(短及び長)のBcl-XLタンパク質に対して特異的な抗体を用いた細胞溶解物の免疫沈降により実施した。Bcl-XL(抗-アポトーシス活性を有していることが知られている長タンパク質形態)タンパク質の量をウエスタンブロット分析により評価した。
【０１７１】
記載したプロトコルに従い、実験を実施した。主題となる小分子の抗-アポトーシス効果を、血清吸引時にアポトーシスを被ったＰ-１９細胞(神経系の胎生期癌株化細胞)において評価した。簡単に言えば、血清吸引の２４時間前に小分子で処置した。血清を主題となる小分子(EM5及びE5A24)の存在下又は不在下で４８時間吸引した。期間の終わりに、細胞生存率を評価した。図１５に提示したように、用量に応答する形で小分子は、アポトーシスから細胞を保護する。この図は主題となる小分子と実験の典型例でありる。実験は文献の手順に従い実施した(Sirenら, Proc. Nat. Acad. Sci. 98, 4044, 2001)。細胞生存率は、細胞増殖について記載されたプロトコルに従い測定した。
【０１７２】
一次培養細胞をモデルとして使用し、CNSに対する主題小分子の効果を評価した。グルタマート神経毒性は、最も多くの場合、後期胚形成期における脳から得られたニューロンを使用し、直接研究することが可能で、続いて成熟のために培養される。グルタマート誘発性ニューロン死における、主題となる小分子(E5A24及びE5A29)の効果を調査するために、胎生１８日のラットから皮質ニューロンを単離し、１０日間培養した。続いて、主題となる小分子のあるなしで、ニューロンを２４時間処置し、さらに３００μＭのグルタマートに２４時間暴露した。グルタマートを洗浄した後、細胞をさらに２４時間培養した。グルタマートチャレンジ及び二次培養の間、主題となる小分子はなかった。最後に、細胞生存性を調査した。図１６には、主題となる小分子が６０％まで細胞生存率を増加させることが示されている。よって、小分子は、用量に応答する形でグルタマート誘発性ニューロン死を防止した。実験は文献に従って実施された(Morishitaら, Neuroscience 76, 105, 1997)。
【０１７３】
上述した結果には、高い親和性でEPO-Rの調節ドメインに特異的に結合する、主題化合物のファミリーの驚くべき能力が示されている。生理学的細胞条件を含む種々の条件下でかなりの安定性を有する非ペプチド化合物を使用することにより、リガンドの結合に干渉されることなく、被験化合物等、環境の変化に応じて、特に細胞表面に存在するEPO-Rの量の変化をアッセイし、EPO-Rを精製することができる。また、試験リガンドと主題化合物とが共に作用して、飽和度以下のEPO-Rリガンドの濃度において、EPO-Rシグナル変換の活性度が高められるかどうかを測定することができる。
【０１７４】
さらに、主題化合物は、EPO-Rの調節ドメインへの結合時において、細胞内にシグナルを誘発させるEPO-Rを発現する多様な細胞で有効であることが見出されている。主題化合物は、シグナル誘発に、個々に、又は互いに又はEPOと組合せて使用されてもよい。
【０１７５】
個々に、又はEPOと組合せられる主題化合物は、ヘマトクリットを高めるために使用することができ、EPOのレベルを低減させて、ヘマトクリットを同程度に高めることができる。化合物は、典型的な実験動物において安全であることが見出されており、有毒な事象は観察されず、同時に誘発された貧血を是正することができる。
【０１７６】
主題化合物はアポトーシスを調節する神経細胞と共に使用するこことができる。それらは小さく脂質親和性であるため、血液脳関門を横断する能力が高められる。内因性EPOが不足している場合に、神経細胞を保護するために主題化合物が供給されるであろう。承認されているテストにおいて、主題化合物は神経毒環境において細胞の生存率を高めることが見出された。EPO-Rが異なる状況において他の細胞で見出される場合、主題化合物は、EPOが存在する又は不在であることにより影響を受ける状況に関連し、細胞の反応性を調節するのに使用されることが見出される。
【０１７７】
主題化合物は、腸管又は血液中で直ぐには分解されないために、主題化合物は経口的、並びに非経口的に投与することができる。さらに、主題化合物は、他の化合物、例えばバイオステレス(biosteres)で、EPO-Rと類似効果を有するが、生物学的利用能、副作用の可能性、特異体質反応性及びより高い親和性における改善をもたらし、低用量となるものを調査するために使用することができる。
【０１７８】
主題化合物は、以下に公知の合成手順により、高収率で容易に調製することができる。それらは、生理学的活性を有する公知の薬剤との類似点を共有しており、公知の方法に従い、容易に調製することができる。それらは、EPO-R活性を調節することを望む場合及び場所に適用されることが見出される。
【０１７９】
本文において称される全ての参照は、ここで十分に説明されるならば、参照としてここに取り込まれる。これらの文献に係る関連部分は、当業者には明白であろう。この出願とこのような参照との間の任意の矛盾は、この出願で説明されている観点を支持することで解決される。
【０１８０】
本発明は上述した実施例を参照して記載されているが、修正点及び変形例は本発明の趣意及び範囲を含むと理解されるであろう。従って、本発明は請求項によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】非ペプチドEPO-R結合分子を同定するために使用され得る競合結合アッセイを図示したものである。
【図２】非ペプチドEPO-Rモジュレータの生物学的活性を評価するために使用される方法の要約を示すものである。
【図３】TF-1細胞における非ペプチドEPO-RモジュレータE5の増殖効果のグラフを示す。
【図４】UT-7細胞におけるEPO-Rの非ペプチドEPO-RモジュレータE5での活性化を示す。
【図５】メチルセルロース中での赤血球コロニー形成に対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5A24の効果を示す。胎児肝臓細胞を単離し、化合物の存在下で蒔いた。コロニーを３日目に計数した。
【図６】メチルセルロース中での赤血球コロニー形成に対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5の効果を示す。ヒト骨髄細胞を単離し、化合物の存在下で蒔いた。コロニーを１４日目に計数した。
【図７】メチルセルロース中での赤血球コロニー形成に対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5とEPOとの間の協働性を示す。CD34＋細胞を単離し、化合物の存在下で蒔いた。コロニーを１４日目に計数した。
【図８】メチルセルロース中での赤血球コロニー形成に対する非ペプチドEPO-RモジュレータEM5A24とEPOとの間の協働性を示す。ヒト骨髄細胞を単離し、化合物の存在下で蒔いた。コロニーを１４日目に計数した。
【図９】カルボプラチン処置された８週のC57BLマウスでの、ヘマトクリットレベルに対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5の効果を示す。化合物を腹腔内に与えた。
【図１０】カルボプラチン処置された８週のC57BLマウスでの、ヘマトクリットレベルに対する非ペプチドEPO-RモジュレータE6とEPOとの間の協働効果を示す。化合物を腹腔内に与えた。
【図１１】カルボプラチン処置された８週のC57BLマウスでの、ヘマトクリットレベルに対する非ペプチドEPO-RモジュレータE6の効果を示す。化合物を経口的に与えた。
【図１２】正常なマウスでの網状赤血球レベルに対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5の効果を示す。化合物を腹腔内に与えた。
【図１３】TF-1細胞におけるBcl-XL発現のアップレギュレーションに対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5A24及びEM5の効果を示す。
【図１４】UT-7細胞におけるBcl-XL発現のアップレギュレーションに対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5A24及びEM5の効果を示す。
【図１５】血清吸引後のP19細胞の細胞生存性の増加に対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5A24及びEM5の効果を示す。
【図１６】グルタマートチャレンジ後の皮質ニューロンの細胞生存性の増加に対する非ペプチドEPO-RモジュレータE5A24及びE5A29の効果を示す。
【図１７】非ペプチドEPO-Rモジュレータの活性の要約を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2006508041.tif 000045
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2006508041000001.app
【国際調査報告】
2006508041.tif 000048