(57)【要約】線維化組織の生成を遅延させるまたは抑制する薬物を放出させることによって、癒着および線維症を治療するための薬剤および方法。ポリマーから線維化組織抑制剤を放出させるための方法を提供する。ポリマー／薬物の組合せは、液体、ゲルまたはペーストとしてそのまま患部に用いることができる。あるいは、ポリマー／薬物の組合せを好適なビヒクルによって（静脈内、腹腔内または皮下）注入してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式:
【化１】
2006522140.tif 000017
（式中、
Pは水溶性ポリマーセグメントであり、
Mは水溶性ポリマーセグメントPをコポリマー主鎖と連結させ、かつ-L-D基をその主鎖と結合させる多官能性部分であり、
Lはリンカーまたは化学結合であり、
Dは線維化組織抑制化合物であり、
Qは多価カプラーであり、
nは3以上の整数であり、
kは2〜1000の整数であり、
PPは-L-D基を結合するための１以上の官能基を有するポリマーであり、
mは整数である）
の薬物／ポリマー複合体を含んでなる、線維化組織抑制剤。
【請求項２】
Dが抗線維化剤である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
Dが抗増殖剤である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
Dが線維化組織抑制プロリン類似体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
Dがシス-4-ヒドロキシ-L-プロリン(cHyp)、シス-4-ヒドロキシ-Dプロリン、シス-3-ヒドロキシ-DL-プロリン、3,4-デヒドロ-L-プロリン(DHP)、シス-4-フルオロ-L-プロリン、シス-4-クロロ-L-プロリン、シス-4-ブロモ-L-プロリン、L-アゼチジン-2-カルボン酸(AZA)またはL-チアゾリジン-4-カルボン酸(THP)である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
Dがパーフェニドン、トラニラスト、ハロフジノン、ペントキシフィリン、レラキシン、エストラジオール、インターロイキン10、ピリジン-2または4-ジカルボン酸-ジ（2-メトキシエチル）アミドである、請求項２に記載の薬剤。
【請求項７】
Dが5-フルオロウラシル、マイトマイシン-Cまたはパクリタキセルである、請求項３に記載の薬剤。
【請求項８】
Dがレチノイン酸、レチノイン酸類似体、レチノイン酸アンタゴニスト、プラスミノゲンアクチベーター、バスタチンまたは抗ステロイド系抗炎症性化合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
DがリンカーLの酵素作用または代謝活性によって放出される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１０】
Pがヒドロキシル、アミノ、チオール、二硫化アルキル、二硫化アリール、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、スクシンイミジル炭酸アルキル、スクシンイミジル炭酸アリール、クロロ炭酸アルキル、クロロ炭酸アリール、スクシンイミジルチオ炭酸アルキル、スクシンイミジルチオ炭酸アリール、クロロチオ炭酸アルキル、クロロチオ炭酸アリール、ハロゲン化物およびチオエステルからなる群から選択される、Mと共有結合するための少なくとも2つの官能基を有する化合物から誘導される重量平均分子量400〜25,000Daの水溶性セグメントである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１１】
Pがポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（マレイン酸）、ポリリジン、またはその混合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１２】
Pがポリ（カルボン酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、プルロニックポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリレート）、ポリアミド、ポリホスファジン、ポリ（アミノ酸）、ポリペプチド、擬似ポリ（アミノ酸）、PEGを含有する線状もしくは分岐ポリマー、PEGのコポリマー、デンドリマーまたはPEG-デンドリマーである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１３】
PPがポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（マレイン酸）、ポリリジンまたはその混合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１４】
PPがポリ（カルボン酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、プルロニックポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリレート）、ポリアミド、ポリホスファジン、ポリ（アミノ酸）、ポリペプチド、擬似ポリ（アミノ酸）、PEGを含有する線状もしくは分岐ポリマー、PEGのコポリマー、デンドリマー、PEG-デンドリマー、コラーゲン、ヒアルロン酸、脂肪酸脂質、ポリヒドロキシアルカン酸、コンドロチン硫酸、グリコサミノグリカン、キトサン、アルギン酸塩、デンプン、デキストラン、炭水化物系ポリマー、セルロースまたはセルロース誘導体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１５】
nが3〜100である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１６】
kが2〜100である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１７】
mが1〜100である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１８】
組織の癒着を処置するための方法であって、
手術に起因する癒着または線維症の治療を必要とする組織に、式:
【化２】
2006522140.tif 000018
（式中、
Pは水溶性ポリマーセグメントであり、
Mは水溶性ポリマーセグメントPをコポリマー主鎖と連結させ、かつ-L-D基をその主鎖と結合させる部分であり、
Lはリンカーまたは化学結合であり、
Dは線維化組織抑制化合物であり、
Qは多価カプラーであり、
nは3以上の整数であり、
kは2〜1000の整数であり、
PPは-L-D基を結合するための１以上の官能基を有するポリマーであり、および
mは整数である）
の薬物／ポリマー複合体を含んでなる線維化組織抑制剤の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
薬剤が吸入によるかまたは注射により局所的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が腐食性ポリマーにカプセル封入されているか、またはポリマーマトリックスに捕捉されている、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、線維症を処置および／または予防するための薬剤および方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリマーマトリックス内部から薬物を放出させることにより線維性疾患を治療するための薬剤および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
瘢痕化としても知られている線維症は、多くの臨床的疾患、症状および障害（本明細書ではこれらの用語を同義的に使用した）において現れる。例えば、肝線維症は、通常、慢性肝疾患が原因となって起こり、多くの場合、重篤な変形（硬変）を伴う。心血管線維症は、心室−動脈系の柔軟性を失わせ、収縮期高血圧および鬱血性心不全を伴うことが多い。
【０００３】
また、外科的介入では、望ましくない副作用として臓器切開部位間に線維性癒着の形成が起こり、その後に矯正外科手術が必要となることが多い。一例として、開腹事例全体の60%に起こる腸閉塞を矯正するための外科的介入では、死亡率が5%〜30%となっている(Ellis, 1997)。婦人科手術後の卵巣または卵管を含む骨盤内癒着によって患者集団の最大45%が不妊症となる(Stangel ら, 1984)。このように、線維症を治療する方法が極めて必要である。
【０００４】
線維性癒着をなす多くの細胞外基質タンパク質のうち、コラーゲンが臨床的線維化に大きく貢献していると思われる。それらは線維性癒着部位において相対的に多く存在する上、コラーゲンのタンパク質分解が細胞外基質での除去に関する律速段階であるように思われる。そのため、細胞外基質タンパク質、特に、コラーゲンの蓄積を遅延させようと、および／または防止しようと多くのアプローチが試みられた。
【０００５】
外科手術による外傷を最小限にとどめるために、例えば、種々の吸収性バリアー材料および非吸収性バリアー材料が調査された(Sawhney, ら, 1994; Edward, ら, 1997; Urman, ら, 1991)。この分野で開発がなされたが、臨床的に使用可能である少数の製品（主として、酸化再生セルロースまたはヒアルロン酸のようなバリアー材料）でも、まだその効果はごくわずかである。
【０００６】
代替的分子アプローチとして、トランス−ヒドロキシル化プロリンおよびリジン残基を高い割合で含有する、機能的に必要なコラーゲンの三次元構造を変化させた。実際には、ヒドロキシル化がコラーゲン線維形成の必要条件であり、プロコラーゲンの未完成鎖に直接組み込まれる、シス-4-ヒドロキシ-(cHyp)、フルオロ−もしくはブロモ−プロリンまたは3,4-L-デヒドロプロリン(DHP)のようなプロリン類似体が効果的であった(UittoおよびProckop, 1974; UittoおよびProckop, 1977; KaoおよびProckop, 1976; Liotta ら, 1978)。単量体cHypを限定された期間投与することにより、腹部癒着、硬変および肺線維症をはじめとする種々の実験モデル動物においてコラーゲンの蓄積を防止することが分かった(Giri, 1990; Tan ら, 1983)。
【０００７】
短期研究では、数種類の抗線維化薬物の有効性が示されたが、このような薬物の予測される長期使用に対しては少なくとも2つの制限がある：(1)一般タンパク質合成への介入によって起こる全身毒性(Eldridge, ら, 1988)、および(2)薬物の迅速な吸収、拡散および／または排泄。従って、抗線維化剤を線維化組織に向け、かつ／または治療剤の局所保持を強化する処理が必要である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
上述の必要性は、本発明によってある程度満たされる。本発明の1つの態様において、式:
【化１】
2006522140.tif 000002
【０００９】
（式中、
Pは水溶性ポリマーセグメントであり、
Mは水溶性ポリマーセグメントPをコポリマー主鎖と連結させ、かつL-D基をその主鎖と結合させる多官能性部分であり、
Lはリンカーまたは化学結合であり、
Dは線維化組織抑制化合物であり、
Qは多価カプラーであり、
nは3以上の整数であり、
kは2〜1000の整数であり、
PPは-L-D基を結合するための１以上の官能基を有するポリマーであり、
mは整数である）
の薬物／ポリマー複合体を含んでなる線維化組織抑制剤が提供される。Dは抗線維化剤、抗増殖剤および／または線維化組織抑制プロリン類似体:シス-4-ヒドロキシ-L-プロリン(cHyp)、シス-4-ヒドロキシ-Dプロリン、シス-3-ヒドロキシ-DL-プロリン、3,4-デヒドロ-L-プロリン(DHP)、シス-4-フルオロ-L-プロリン、シス-4-クロロ-L-プロリン、シス-4-ブロモ-L-プロリン、L-アゼチジン-2-カルボン酸(AZA)もしくはL-チアゾリジン-4-カルボン酸(THP)であってよい。Dが抗線維化剤である場合には、Dはパーフェニドン、トラニラスト、ハロフジノン、ペントキシフィリン、レラキシン、エストラジオール、インターロイキン10、ピリジン-2または4-ジカルボン酸-ジ（2-メトキシエチル）アミドであってよい。Dが抗増殖剤である場合には、Dは5-フルオロウラシル、マイトマイシン-Cまたはパクリタキセルであってよい。また、Dがレチノイン酸、レチノイン酸類似体、レチノイン酸アンタゴニスト、プラスミノゲンアクチベーター、バスタチンまたは抗ステロイド系抗炎症性化合物であってもよい。DはリンカーLの酵素作用または代謝活性によって放出され得る。ポリマーセグメントPは、ヒドロキシル、アミノ、チオール、二硫化アルキル、二硫化アリール、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、スクシンイミジル炭酸アルキル、スクシンイミジル炭酸アリール、クロロ炭酸アルキル、クロロ炭酸アリール、スクシンイミジルチオ炭酸アルキル、スクシンイミジルチオ炭酸アリール、クロロチオ炭酸アルキル、クロロチオ炭酸アリール、ハロゲン化物およびチオエステルからなる群から選択される、Mと共有結合するための少なくとも2つの官能基を有する化合物から誘導される平均分子量400〜25,000Daのセグメントであってよい。いくつかの実施形態では、Pがポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（マレイン酸）、ポリリジン、またはその混合物であってよい。他の実施形態では、Pがポリ（カルボン酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、プルロニックポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリレート）、ポリアミド、ポリホスファジン、ポリ（アミノ酸）、ポリペプチド、擬似ポリ（アミノ酸）、PEGを含有する線状もしくは分岐ポリマー、PEGのコポリマー、デンドリマーまたはPEG-デンドリマーである。PPは、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（マレイン酸）、ポリリジンまたはその混合物であってもよいし、あるいはポリ（カルボン酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、プルロニックポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリレート）、ポリアミド、ポリホスファジン、ポリ（アミノ酸）、ポリペプチド、擬似ポリ（アミノ酸）、PEGを含有する線状もしくは分岐ポリマー、PEGのコポリマー、デンドリマー、PEG-デンドリマー、コラーゲン、ヒアルロン酸、脂肪酸脂質、ポリヒドロキシアルカン酸、コンドロチン硫酸、グリコサミノグリカン、キトサン、アルギン酸塩、デンプン、デキストラン、炭水化物系ポリマー、セルロースまたはセルロース誘導体であってもよい。nは3〜100（両値を含む）の整数であってよく、kは2〜100（両値を含む）の整数であってよく、およびmは1〜100（両値を含む）の整数であってよい。
【００１０】
本発明のもう１つの実施形態では、組織の癒着を治療するための方法であって、
手術に起因する癒着または線維症の治療を必要とする組織に、式:
【化２】
2006522140.tif 000003
【００１１】
（式中、
Pは水溶性ポリマーセグメントであり、
Mは水溶性ポリマーセグメントPをコポリマー主鎖と連結させ、かつ-L-D基をその主鎖と結合させる多官能性部分であり、
Lはリンカーまたは化学結合であり、
Dは線維化組織抑制化合物であり、
Qは多価カプラーであり、
nは3以上の整数であり、
kは2〜1000の整数であり、
PPは-L-D基を結合するための１以上の官能基を有するポリマーであり、および
mは整数である）
の薬物／ポリマー複合体を含んでなる線維化組織抑制剤の有効量を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、mが2以上の整数であり、他の実施形態では、mが1〜1000の整数である。薬剤は吸入によるかまたは注射によって局所的に投与し得、その薬剤は腐食性(eroding)ポリマーにカプセル封入(encapsulate)されていてもよいし、またはポリマーマトリックスに捕捉(entrap)されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書において記載する組成物および方法は、線維化組織抑制(fibrotic tissue inhibiting)（「抗線維化(anti-fibrotic)」とも呼ばれる）薬物の送達を増進することができるものであり、薬物の半減期を延長し、その放出を持続させ、代謝活性によって薬物を放出し、および／または炎症部位にてそれを放出することによってそれを行う。このような線維化組織抑制薬物送達の増進は、薬物をポリマーと組み合わせることにより実現できる。いかなる抗線維化剤でも線維化組織および／または癒着を予防および治療するための本発明の組成物および方法に組み込むことができる。
【００１３】
一例として、線維化組織抑制薬物としては、限定されるものではないが、例えば、シス-4-ヒドロキシ-L-プロリン、シス-4-ヒドロキシ-D-プロリン、シス-3-ヒドロキシ-DL-プロリン、3,4-デヒドロ-L-プロリン、シス-4-フルオロ-L-プロリン、シス-4-クロロ-L-プロリン、シス-4-ブロモ-L-プロリン、L-アゼチジン-2-カルボン酸(AZA)およびL-チアゾリジン-4-カルボン酸(THP)のようなプロリン類似体が挙げられる。パーフェニドン、トラニラスト、ハロフジノン、ペントキシフィリン、レラキシン、エストラジオール、インターロイキン10、ピリジン-2,4-ジカルボン酸-ジ（2-メトキシエチル）アミドをはじめとする抗線維化薬物も本明細書にて開示する送達形式に組み込む薬物として有用である。加えて、5-フルオロウラシル、マイトマイシン-Cおよびパクリタキセルのような抗増殖薬物を使用してもよい。レチノイン酸、レチノイン酸類似体、レチノイン酸アンタゴニスト、プラスミノゲンアクチベーター、バスタチンおよび／または抗ステロイド系抗炎症性薬のような抗線維化作用を示す薬物もまた使用できる。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、線維化組織抑制薬物が合成ポリマーまたは天然に存在するポリマーと共有結合されている。薬物をポリマーと結合させることにより、薬物／ポリマー複合体に、炎症部位における蓄積の増大、いわゆる、「透過性および滞留性の亢進」(Maeda, H, 2001)；高疎水性薬物の可溶化の向上（ポリマー自体が可溶性である場合）；薬物の半減期の延長および／または持続的送達をはじめとする多くの特性が与えられる。高分子サイズの薬物／ポリマー複合体が薬物の半減期および生体内分布に影響を与える可能性がある。
【００１５】
薬物をポリマーへと結び付けるリンカーは、酵素によって切断され得る（あるいは、薬物とリンカーとの間に、pH、イオンもしくは酸化還元条件の変化のような局所的代謝活性および／または化学的活性により薬物が放出される化学結合を使用してもよい）か、または加水分解、還元反応、酸化反応、pH変動、光分解もしくはその組合せのようなin situ環境に対する反応により解離され、その結果として活性薬物が放出され得る、１以上の化学結合を含んでいる。薬物／ポリマー複合体の薬物は、酵素活性と非酵素活性の組合せにより放出させることができる。好ましい実施形態では、癒着の形成に関連する条件により抗線維化薬物がポリマーから放出される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態では、薬物／ポリマー複合体がポリ[D-L-M-P]（式中、Mは規則的な繰返しの線状コポリマー主鎖を形成するために水溶性ポリマーセグメントPを連結し、さらにリンカーLを介して線維化組織抑制薬物Dを結合させるための化学置換基を提供するのに使用される多官能性化学的部分であり、およびnはD-L-M-Pの繰り返し数である）タイプのポリマーを含んでなる。線維化組織抑制薬物Dは、リンカーLと共有結合してもよいし、またはMと直接結合して、そのポリマーがポリ[D-M-P]となってもよい。水溶性ポリマーセグメントPは、多官能性化学的部分Mと共有結合するために使用される少なくとも2つの同種化学官能基（例えば、限定されるものではないが、ヒドロキシル、アミノ、チオール、二硫化アルキルもしくは二硫化アリール、イソチオシアネート、チオカルボニルイミダゾール、塩化チオカルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、塩化スルホニル、リン酸、スクシンイミジル炭酸アルキルもしくはスクシンイミジル炭酸アリール、クロロ炭酸アルキルもしくはクロロ炭酸アリール、スクシンイミジルチオ炭酸アルキルもしくはスクシンイミジルチオ炭酸アリール、クロロチオ炭酸アルキルもしくはクロロチオ炭酸アリール、ハロゲン化物またはチオエステルを含む）を有する比較的短い水溶性ポリマー系（例えば、平均分子量400〜25,000Da）からなる。
【００１７】
Pは、限定されるものではないが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（リジン）等、またはこれらの混合物で構成されているコポリマー、あるいは、場合によって有機官能基で置換されている他のポリマー存在物であり得る。同様に、Q-(P-L-D)k（式中、Qはk個の短い水溶性ポリマーセグメント、Pと結合するように設計されている）タイプのポリマーも本発明に使用することができる。このポリマーの場合、線維化組織抑制薬物Dは、リンカーLと共有結合してもよいし、またはPと直接結合して、そのポリマーがQ-(P-D)kとなってもよい。
【化３】
2006522140.tif 000004
【００１８】
本発明の線維化組織抑制薬物の共有結合に好適な他のポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリ（カルボン酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルアルコール）、プルロニックポリオール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（アミド）、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）、分枝鎖ポリペプチド、擬似ポリ（アミノ酸）、ポリ（エチレングリコール）、PEGを含有する分岐ポリマー、PEGのコポリマーおよび他の記述したポリマー、PEG-デンドリマー、ならびに他のデンドリマーのような合成ポリマー；コラーゲン、ヒアルロン酸、脂肪酸、脂質、ポリヒドロキシアルカン酸、コンドロチン硫酸、グリコサミノグリカン、キトサン、アルギン酸塩、デンプン、デキストラン、セルロースおよびその誘導体、ならびに他の炭水化物系ポリマーのような天然ポリマーが挙げられる。
【００１９】
薬物／ポリマー複合体は、注射によって用いてもよいし、または局所的に投与してもよい。薬物／ポリマー複合体を腐食性ポリマーにカプセル封入して、注射によって用いてもよいし、または局所的に投与してもよい。薬物／ポリマー複合体を合成ポリマーまたは天然に存在するポリマーを用いたポリマーマトリックスに捕捉させて、注射によるか、または移植によって局所的に投与してもよい。
【００２０】
抗線維化薬物Dまたは架橋基／薬物D-Lは、これまでに記載されている方法により上述のポリマーの多くと共有結合され、PP-(D-L)nのような系を形成する（この際、PPは分子量1,000〜1,000,000ダルトンの上述のポリマーのうちの1つであり、架橋基／薬物複合体D-Lのn個のコピーを結合するのに使用される化学基である）。
【００２１】
線維化組織抑制薬物を共有結合するために使用されるポリマーは、癒着の形成または線維症を伴う組織または細胞種をターゲッティングすることが可能な部分も有し得る。好ましい実施形態では、ポリマーがT-R-P-L-Dタイプ、(T-R)q-ポリ[D-L-M-P]タイプ、(T-R)q-ポリ[D-M-P]タイプ、(T-R)q-Q-(P-L-D)kタイプ、(T-R)q-Q-(P-D)kタイプ、ポリ[D-L-M]-ポリ[T-R-M]（ペンダント鎖はランダムに繰り返されるか、または連続的に繰り返される）タイプおよびポリ[D-M]-ポリ[T-R-M]（ペンダント鎖はランダムに繰り返されるか、または連続的に繰り返される）タイプ（式中、Tは標的化薬剤であり（例えば、抗体、受容体結合剤または酵素結合剤）、RはTをポリマーと連結させる化学基であり、およびqはT-Rの繰り返し数である）タイプのものである。
【化４】
2006522140.tif 000005
【００２２】
いくつかの実施形態では、線維化組織抑制薬物を合成ポリマーまたは天然に存在するポリマーを用いてカプセル封入することができる。ポリマー複合体は、薬物コアを取り囲む、注射、移植または局所的送達に使用できるミクロスフェアのような粒子形態であってよい。カプセル封入用ポリマーが酵素により分解されるか、pH、イオンもしくは酸化還元条件の変化のような局所的代謝活性により、または薬物が加水分解、還元反応、酸化反応、pH変動、光分解もしくはその組合せのようなin situ環境に対する反応により放出される。好ましい実施形態では、癒着の形成に関連する条件により薬物がポリマーから放出される。
【００２３】
他の実施形態では、線維化組織抑制薬物を合成ポリマーまたは天然に存在するポリマーを用いてポリマーマトリックスに捕捉させることができる。薬物はポリマー全体にわたって均等に分布する。線維化組織抑制薬物は、マトリックス内のポリマーと架橋結合する（結果として、薬物とポリマーとの間に共有結合を生じる）か、または非共有結合力により所定の位置に保持される。ポリマー／薬物複合体は、粒子（例えば、ミクロスフェア、注射によって用いられるか、または局所的に投与される）、ゲル（インプラントとして使用されるか、または局所的に用いられる）またはフィルム（インプラントとして使用されるか、または局所的に用いられる）形態であってよい。特に、捕捉用ポリマーが酵素により分解されるか、pH、イオンもしくは酸化還元条件の変化のような局所的代謝活性により放出されるか、または薬物が加水分解、還元反応、酸化反応、pH変動、光分解もしくはその組合せのようなin situ環境に対する反応により放出される。好ましい実施形態では、癒着の形成に関連する条件により薬物がポリマーから放出される。
【実施例】
【００２４】
A. ポリマーの合成
ポリ[D-M-P]nタイプの種々のポリマー構造を合成し、抗線維化剤の制御放出について調べた。これらのものには、種々のサブユニット長を有するPEG(PEG1000、PEG2000、PEG4000およびPEG8000)、ならびにデス−アミノチロシル−チロシンとコポリマー化したPEG2000(PEG2000-TT)を用いた代替ポリエチレングリコール(PEG)およびリジン（PEG-リジン）コポリマーが含まれていた。
【００２５】
一例を挙げれば、ポリ[ポリ(PEG-Lys-cHyp)]複合体を合成し、in vitro試験および制限in vivo試験により調べ、効果のあることが分かった。この場合のPは平均分子量2000ダルトンを有するポリ（エチレングリコール）(PEG-2000)のセグメントであり、L-リジン(Lys)がMであり、およびシス-4-ヒドロキシ-L-プロリン(cHyp)がDである。出発物質をLys-CHYPジペプチドとし、鎖伸長はビス（スクシンイミジル）ポリ（エチレングリコール）(BSC-PEG)のcHyp-Lysジペプチドのα-およびε-アミンとのコポリマー化により実施した。鎖伸長をより効率的に行うため、ビス（スクシンイミジル）ポリ（エチレングリコール）(BSC-PEG)を用いるCHYP構築物が99.99%を超える二官能性であることが好ましい；PEGの単官能性混入物質は連鎖停止剤として作用し得る。ビス（スクシンイミジル）ポリ（エチレングリコール）(BSC-PEG) MW=1000のいくつかの商業的供給源には単官能性混入物質が0.1%より多く含有されていることが分かった。ビス（スクシンイミジル）ポリ（エチレングリコール）(BSC-PEG) MW=2000の供給源にはこのような問題はないように思われた。より長いPEGビルディングブロック(MW=4000Daおよび8000Da)では、CHYP収容能力がより制限され、薬物の効果に認め得るほどの改善は示されなかった。
【化５】
2006522140.tif 000006
【００２６】
プロリン類似体は、それらのイミノ基を介して結合され、リジンのカルボキシル基とペプチド結合を形成する。異なる長さのPEGについて換算し、屈折率により検出するカラムでのゲル透過クロマトグラフィーによる測定に基づき、最終構築物は分子量20〜35kDa間であった。しかしながら、分子量は約10〜約200kDaの範囲である。アミノ酸含量およびLys対プロリン類似体の比率をアミノ酸解析により決定した。平均複合体分子量およびPEGサブユニットの既知サイズからの評価に基づき、コポリマーは、一般に、構築物につき8〜12個のペンダントアミノ酸を含有していた。例えば、PEG（分子量2000「PEG2000」）を含有するポリ(PEG-Lys-cHyp)の平均分子量は25,000Daであり、それ故、それは平均11個のPEGユニットと11個のペンダントCHYPを含有している。ポリ(PEG-Lys-cHyp)についての平均多分散性は1.6である。
【００２７】
in vitro研究では、種々のPEG鎖長(MW=1000、2000および4000Da)のポリ(PEG-Lys-cHyp)製剤がコラーゲン生成の阻害に効果的であり得ることが示された。図1は、種々の形態のポリ(PEG-Lys-cHyp)についてのラット肺線維芽細胞増殖の阻害を示している。この設計により、PEG1000ポリマー複合体ではPEG4000薬剤よりも4倍多いcHypの送達がなされ、PEG2000ポリマー複合体ではPEG4000薬剤よりも2倍多いcHypの送達がなされる。
【００２８】
B. ポリマーの安定性
ヒト血漿および37℃の生理的リン酸バッファー中でインキュベートし、続いて、所定の時間間隔でポリマーの分子量についてのGPC分析を行って、48時間にわたるポリ(PEG-[14C]-Lys)の安定性を測定した。48時間にわたり分子量および分子量あたりの放射能（比放射能）に目立った変化はなかった。ヒト血漿、37℃の生理的リン酸バッファー、トリプシン、トロンビン、プラスミンまたはコラーゲナーゼ中でインキュベートした後のポリ(PEG-Lys-cHyp)のHPLC分析により、ポリマーからCHYPが放出されていないことが分かった。
【００２９】
C. 細胞増殖の阻害およびin vitroにおける細胞毒性
種々のプロリン類似体を単独にて、ペプチド性プロドラッグとして、およびポリマー結合プロドラッグ構築物として、マイクロタイタープレートで単層として増殖させたラット線維芽細胞 RFL-6細胞において試験した。培養開始時から試験化合物を連続希釈物に添加した。4日時点に、テトラゾリウム生存力指示染料(Dojindo)を用いて生存力を評価した。
【００３０】
典型的なIC50試験を図2に示している。この試験では、PEGと結合しているシス−ヒドロキシプロリン(CHYP)の異なる2合成バッチを遊離CHYPとともに調べた。示すように、ポリマー構築物（1および2）と遊離アミノ酸は同程度にラット線維芽細胞の増殖を阻害する。ポリ(PEG-Lys-cHyp)2バッチ間の差は有意ではなかった。さらに重要なことには、遊離CHYPの活性と複合体化したCHYPの活性との間に差がないことから、RFL-6細胞がポリマー主鎖からCHYPを容易に加水分解することが分かる。他のPro類似体を用いた同様の試験を以下の表1に要約している。
【００３１】
表1：遊離プロリン類似体、リシルジペプチドおよびPEG構築物についてのIC50結果のまとめ
【表１】
2006522140.tif 000007
【００３２】
遊離アミノ酸CHYPは、RFL-6培養物で試験した細胞毒性の最も低いプロリン類似体であるが、リシル-ジペプチドおよびPEG複合体形態でのその効果は他のプロリン類似体のものと同程度である。このことからCHYP-Lys結合を容易に切断する細胞の能力が示される。この能力は他の類似体と異なっており、AZC、DHPおよびTHPは、遊離薬物としてのCHYP、ならびにリシル-ジペプチド形態のCHYPよりも細胞毒性がはるかに強いが、PEG構築物としてのそれらの細胞毒性は、遊離アミノ酸と比べて、それぞれ、4倍、8倍および12倍低下している。
【００３３】
細胞増殖には足場依存性線維芽細胞によるコラーゲン合成が必要である。細胞増殖の阻害と細胞毒性とを区別するため、プレーンウェルまたはコラーゲンでプレコーティングしたウェルで増殖させたRFL-6細胞に及ぼすプロリン類似体の効果を調べた。培養物を阻害性の認められる濃度のプロリン類似体の存在下または不在下でインキュベートした（表1を参照）。CHYPおよびDHPは、プレーンウェルでの細胞増殖を阻害したが、コラーゲンでコーティングしたウェルでの増殖は阻害しなかった。このことは、コラーゲンでウェルをプレコーティングすることでこれらのプロリン類似体の効果を無効にしているという事実を立証している（図3）。THPは、あらゆる効果を観察するために試験した濃度では、両面に対する細胞毒性があまりにも高かった。
【００３４】
D. ポリ(PEG-Lys-cHyp)イムノアッセイ
キーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)と結合したポリ(PEG-Lys-cHyp)で免疫化したウサギにてポリクローナル抗血清を作製した。免疫前、免疫および追加免疫した血漿サンプルを固相ポリ(PEG-Lys-cHyp)（1μgポリ(PEG-Lys-cHyp)／ウェルをImmulon マイクロタイタープレートに吸着させた）と結合する能力について試験した。競合するハプテンとともにプレインキュベートした後、固定されている複合体と結合する抗体の能力によって特異性を決定した。競合するハプテンとしては、ポリ(PEG-Lys-cHyp)自体、遊離CHYP、PEG-Lys（ポリ(PEG-Lys-cHyp)の実際のコポリマー主鎖）、CHYP-Lys、ならびにヒドロキシプロリンの構造類似体（デヒドロプロリン、すなわちDHP、およびアゼチジンカルボン酸、すなわちACA）が含まれた。これらの競合-結合研究から、抗血清が無傷のポリ(PEG-Lys-cHyp)分子だけを認識することが分かった（2〜5μg/mlにて50%阻害）。他の分子は効果的に競合しなかった（>50μg/mlにて50%阻害）。
【００３５】
E. 送達ビヒクルの開発
ヒアルロン酸(HA)は、種々の医薬品の一成分となる天然に存在するバイオポリマーである。一般に、HAは、線維芽細胞および関連細胞種の移動および増殖を遅延させることが分かっている生体適合性材料である。組織平面間のバリアーを本質的に形成しているヒアルロン酸ゲルおよびフィルムのin vivo研究では、手術による癒着の形成を無効にすることが証明されている。
【００３６】
ポリ(PEG-Lys-cHyp)活性剤のような抗線維化剤を含有するHAビーズを作製することができる。HAビーズは、噴霧乾燥またはHAを沈降させるための非水性溶媒（例えば、アルコール）の使用のような多くの標準的な技術により製造することができる。HAビーズは、ビーズの安定性を高め、生体吸収速度を調節するために、続いて、多くの標準的な化学的方法を利用して架橋結合する場合がある。ビーズの最終形態は、自由に流動する凍結乾燥粉末であってよい。
【００３７】
ヒアルロン酸ビーズからのポリ(PEG-Lys-cHyp)の最適な放出特性を決定するために、多くの形成変数を調べた。表2は種々のHA/ポリ(PEG-Lys-cHyp)ビーズ製剤とそれらの放出速度論を示している：
表2：種々のポリマー製剤の放出速度論
【表２】
2006522140.tif 000008
【００３８】
続いて、表2に挙げたHA/ポリ(PEG-Lys-cHyp)ビーズを別々に、各変数につき3動物で試験し、14日時点を過ぎた後観察した。いずれの材料からも目立った有害反応はなかった。よって、HA/ポリ(PEG-Lys-cHyp)ビーズを種々のin vivoモデルにて調査した。
【００３９】
F. in vivo結果
癒着剥離モデル
成熟雌ウサギの右腹壁（約2×5cmの領域から周囲部および第1筋層を切除）、右腹壁に隣接した盲腸（漿膜の切除）および右子宮角擦過傷に損傷を作製した。意図しない癒着を最小限に抑えるため、手術の間膀胱を保護した。側壁損傷を電気焼灼し；耳静脈から約2〜3ccの血液を採取し、創傷にかけた。動物を回復させ；3週間後に第2開腹術を実施し、各動物について、各癒着の発生率、重症度および範囲に評点をつけた（癒着評点方式については表3を参照）。癒着が生じていない動物はこの研究から外した。癒着を分離し、動物を処置し、回復させた。癒着剥離術および処置から3週後、最終開腹観察を実施し、その観察によって各癒着の発生率、重症度および範囲に再度評点をつけ、初回観察時と比較した。対照群では、分離した全癒着の88%が再形成した（表4）。
【００４０】
表3：手術による癒着の評価尺度
【表３】
2006522140.tif 000009
【００４１】
この一連の研究では、粘性ポリマー溶液を持続放出性ポリマー、ポリ(PEG-Lys-cHyp)の担体ゲルとして使用した。粘性ポリマー溶液は、α-ヒドロキシ酸PLAおよびPGAにグラフトされたPEGからなり、いったん水和させて半固体ゲルに分相した。ゲルによりポリ(PEG-Lys-cHyp)の制御放出が提供された。4種類の製剤を開発して癒着剥離モデルで試験した：A. ゲル；B. ゲルおよび2mg/mlポリ(PEG-Lys-cHyp)；C. ゲルおよび8mg/mlポリ(PEG-Lys-cHyp)；ならびにD. ゲルおよび2mg/ml遊離cHyp。外科医を「ブラインドする」ために、全ての処置チューブをコード化した。
【００４２】
表4は、この試験でのデータの概要を示している。各処置群には6箇所以上の癒着が存在しており、それらが処置された。処置した群での1動物あたりの平均発生率は1.75であった（例えば、平均して、1動物あたり約2箇所の癒着があった）。初回観察では、癒着の65%を超えるものが評点2以上であった（癒着剥離術および処置）。表4では、3週後に行った処置後の観察を示している（図4および5にて図示した）。群A〜Dを合わせた1動物あたりの平均処置後癒着発生率は1未満であった。この値は初回観察時の平均発生率に対し統計的に有意な差がある(p<0.05)。群BおよびC（持続放出性製剤）の場合の癒着数は処置後実質的に少なくなった。この値は初回観察時の癒着数に対し統計的に有意な差(p<0.05)がある。
【００４３】
表4：最終観察（癒着剥離術から3週間後）
【表４】
2006522140.tif 000010
【００４４】
群BおよびCでは、癒着再発率も対照よりまたは群AまたはDよりも有意に低かった（図9Aを参照）。群C（8mg/ml持続放出性ポリマー）と群B（2mg/ml持続放出性ポリマー）との間にも統計的に有意な差があり、このことにより持続放出性ポリマーが用量依存的に作用することが示唆される。各癒着を重症度と範囲について評価し；初回観察での評点を最終観察での評点と比較して、各群の組合せ平均点を図9Bに示している。癒着再発率と同様に、群BおよびCでは、癒着の範囲および重症度が対照または群AもしくはDと比べて有意に低下している。
【００４５】
平行研究では、この場合も癒着剥離および処置モデルを使用して、癒着防止用の現在の主要製品、SEPRAFILM（商標）(Genzyme)を対照（癒着剥離術、処置せず）と比較した。SEPRAFILM（商標）は架橋ヒアルロン酸フィルムである。表8は、この試験でのデータの概要を示している。各処置群には6箇所以上の癒着が存在しており、それらが処置された（表5-A）。処置した群での平均発生率は1.2であり、対照群での平均発生率は2.25であった。初回観察では、癒着の65%を超えるものが評点2以上であり（癒着剥離術および処置）、この点については上述の試験の場合と同じである。
【００４６】
表5-Bでは、3週後に行った処置後の観察を示している。Seprafilm群の場合の1動物あたりの平均処置後癒着発生率は0.8であった。この値は初回観察時の平均発生率に対し統計的に有意な差はない(p<0.05)。対照群の場合の平均処置後癒着発生率は1.75であった。この値は初回観察時の平均発生率に対し統計的に有意な差はない(p<0.05)。Seprafilm群の場合の再発癒着数は66.7%であった。この値は対照群に対し統計的に差はない(p<0.05)。対照群の場合のこの試験における再形成率は77.8%であった。Seprafilm群では癒着再形成のなかった動物が1個体存在した。Seprafilm群の残る動物のうち3個体において癒着の重症度が1評点分低下した。
【００４７】
表5-A：癒着剥離術および処置時の癒着観察
【表５−Ａ】
2006522140.tif 000011
表5-B：癒着剥離術および処置から3週後の癒着観察
【表５−Ｂ】
2006522140.tif 000012
表4および5に記載のように、HA/ポリ(PEG-Lys-cHyp)ビーズを使用して同様の癒着剥離術研究を実施した。この研究では、製剤HA/中濃度X（活性剤を含まない）とHA/活性剤/低濃度X、HA/活性剤/中濃度X（表2を参照）を使用した。ビーズ材料を各創傷の上に置いて、完全に常に被覆した（1創傷当たり約100mg）。各ビーズ製剤は組織に比較的強く付着し、その後すぐに水和し始めた。ビーズは約15分後にペースト状のフィルムを形成した。
【００４８】
処置から3週間後に観察を行った。これまでに観察されたように、送達部位において材料による目に見える副作用はなかった。HA/活性剤/中濃度Xで処理した2動物にカプセル封入したポリマー（恐らく、HA）が残留していた。ポリマーが残留する部位には軽い炎症があった。
【００４９】
表6は、この試験でのデータの概要を示している。各処置群には6箇所以上の癒着が存在しており、それらが処置された。処置した群での1動物あたりの平均発生率は1.85であり、対照群での平均発生率は2.1であった。初回観察では、最初の癒着の65%を超えるものが評点2以上であり（癒着剥離術および処置）、この点については上述の試験の場合と同じである3週後に行った処置後の観察では、対照群において癒着剥離術後の再発癒着発生率が高い(91.54%)ことが確認された。平均癒着発生率と癒着再発率は、各適用群に効果があったということを示していた。平均発生率または癒着再発率において、HA/活性剤/中濃度XとHA/活性剤/低濃度Xとの間には統計的に差はなかった(p<0.05)。しかしながら、群HA/中濃度X（HAビーズにポリ(PEG-Lys-cHyp)を含まない）は、ポリ(PEG-Lys-cHyp)を含む2群ほどの効果はないように思われた。
【００５０】
表6：癒着剥離術および処置から3週後の癒着観察
【表６】
2006522140.tif 000013
【００５１】
小腸モデル
ヒト小腸閉塞の少なくともいくつかの臨床症状によく似た症状を呈する小腸癒着モデルをウサギにて開発した。小腸の4〜5cm切片を摘出し、その表面をガーゼで薄く削った。削った部分の中線で小腸ループを作製し、その腸ループを2本の5/0プロレン結節縫合糸により、約0.5cmの間隔をあけて固定した。ループを作製した小腸に影響を及ぼす腸間膜動脈の分枝を5/0プロレン縫合糸で結紮し、ループを周囲条件に2分間晒すことによりその領域を乾燥させた。動物を2週間回復させた後、癒着の範囲および重症度を調査した。
【００５２】
この方法で処置した全ての動物(n=17)で、小腸ループ間に癒着が起こり、動物の90%が評点3の癒着（鋭的な切除を要する血管新生化した癒着）を有しており、残る動物は評点2の癒着（鋭的な切除を要する血管新生化していない癒着）を有していた。動物の30%が腸閉塞の徴候を示していた。
【００５３】
表7は、この試験でのデータの概要を示している。癒着形態は3つのカテゴリーに分類された：ループ内癒着、縫合部癒着および小腸と他の器官との癒着。注目すべきは、最も重症な癒着がループ内癒着であり、対照群においては評点3の癒着が壊死および閉塞の原因となることが多いということである。V0426Aで処置した動物には評点3の癒着は認められなかった。全ての処置群で、対照群に対し統計的に有意な癒着発生率の低下を示した。しかしながら、群V0425B（HAビーズにポリ(PEG-Lys-cHyp)を含まない）は、ポリ(PEG-Lys-cHyp)を含む2群と比べて実質的に効果が低かった。V0425A（50mM EDCにより架橋結合）とV0426A（25mM EDCにより架橋結合）では統計的に差はなかった。
【００５４】
表7：小腸癒着研究でのデータの概要
【表７】
2006522140.tif 000014
【００５５】
子宮摘出モデル
ヒトにおける術後の周囲組織との癒着についてのいくつかの臨床問題によく似た症状を呈するウサギ子宮摘出モデルを開発した。このモデルは、左または右茎を5/0プロレン縫合糸で結紮して、子宮の一部4〜5cmを摘出することにより作製した。次いで、子宮の約4cmを手術により切除し、電気焼灼によって止血を行った。切除面を処置し、その創傷を標準的な手法を用いて縫合閉鎖した。14日後にこの部位を観察した。
【００５６】
表8は、この試験でのデータの概要を示している。この研究では、材料V0714Aが30%ポリ(PEG-Lys-cHyp)を含有するものであり、材料V0714Bが何も含有しないものであった。全ての処置群で、対照群に対し統計的に有意な癒着発生率の低下を示した。しかしながら、群V0714B（HAビーズにポリ(PEG-Lys-cHyp)を含まない）は、活性剤であるポリ(PEG-Lys-cHyp)を含むV0714Aと比べて効果が低かった。V0714Aで処置した5動物のうち2動物に、そしてV0714Bで処置した6動物のうち6動物にポリマー（恐らく、HA）が残留していることが分かった。ポリマーが残留する部位には軽い炎症が認められ、1つの事例では残留ポリマーから膀胱にかけて癒着が起こっていた。
【００５７】
表8：HAビーズを用いた子宮摘出モデル
【表８】
2006522140.tif 000015
【００５８】
同じ子宮摘出モデルを使用して、送達ゲルを使用しないポリ(PEG-Lys-cHyp)薬剤の送達を調査した。ポリ(PEG-Lys-cHyp)の投与を、7日間にわたって薬剤の直線的な持続放出を提供するAlzet 7日間用ミニ浸透圧ポンプを使用して行った。100μl中20mgのポリ(PEG-Lys-cHyp)を各ポンプに充填し、子宮摘出を行った後、縫合閉鎖する前に、3つのポンプを各動物の腹膜腔に埋め込んだ。表9は、この試験でのデータの概要を示している。この研究により、活性剤であるポリ(PEG-Lys-cHyp)単独でも癒着の形成を十分に阻害できるということが分かる。
【００５９】
表9：Alzet ミニポンプを用いた子宮摘出モデル
【表９】
2006522140.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】コーティングしていないプレートでのラット肺線維芽細胞の増殖を示す。0日時点、2.0mg/mlにて全ての処置を開始した。
【図２】RFL-6 ラット線維芽細胞に対する遊離CHYPとポリ(PEG-Lys-cHyp)構築物（2合成バッチ）の細胞毒性を示す。
【図３】プレーンウェルまたはコラーゲンでプレコーティングしたウェルでのRFL-6 細胞増殖に対する0.1mg/ml遊離プロリン類似体の効果を示す（4日時点）。CHYP(0.76mM)、THP(0.75mM)、DHP(0.90mM)。
【図４】癒着剥離術および処置後の癒着の再発に対する4種類の抗線維化製剤の効果を示す。癒着再発率（存在する癒着数／初回観察時の癒着数）。
【図５】初回観察時と癒着剥離術および処置の3週間後の癒着度（表4に従って評価した）の比較を示す。
【図１】
2006522140.tif 000019
【図２】
2006522140.tif 000020
【図３】
2006522140.tif 000021
【図４】
2006522140.tif 000022
【図５】
2006522140.tif 000023
【国際調査報告】
2006522140.tif 000024