(57)【要約】本発明は、短い一本鎖ＲＮＡおよび直鎖状ＰＥＩのようなカチオンポリマーを用いたＲＮＡ干渉メカニズムによる標的遺伝子の下方制御の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびＰＥＩに細胞を曝すことを含み、該一本鎖オリゴリボヌクレオチドが該標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと相補的な５０未満のリボヌクレオチド領域を含み、該標的遺伝子がＲＮＡ干渉により下方制御されるものである、方法。
【請求項２】
該領域が２５未満のリボヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該領域が１９〜２１のリボヌクレオチドである記載の方法。
【請求項４】
該一本鎖オリゴリボヌクレオチドが標的遺伝子と相補的な領域からなる、請求項１、２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該細胞が真核細胞である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該細胞が哺乳類細胞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ＰＥＩが直鎖状ＰＥＩである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｎ／Ｐ比が２〜１０である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｎ／Ｐ比が３〜８である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該一本鎖オリゴリボヌクレオチドが１、２、３、または４個のミスマッチを含んでおり、かつ、所望により２〜４のミスマッチが互いに隣り合う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該一本鎖オリゴリボヌクレオチドが１〜１０個の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該化学的な修飾が２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該化学的修飾が修飾されたヌクレオシド内結合である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該化学的修飾がホスホロチオエート結合である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
該標的遺伝子がヒト遺伝子である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
該標的遺伝子が病理学的条件で過剰発現している遺伝子である請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該標的遺伝子が以下の群：発がん遺伝子、サイトカイン遺伝子、ウイルス性遺伝子、細菌性遺伝子、発現遺伝子、プリオン遺伝子から選択される請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉のための直鎖状ＰＥＩおよびｓｓＲＮＡの使用。
【請求項１９】
標的遺伝子の発現を阻害するのに有効量のｓｓＲＮＡおよびＰＥＩを含んでなるキットであって、該ｓｓＲＮＡが標的遺伝子と相補的な領域を含んでなりそしてＲＮＡ干渉メカニズムを介して該標的遺伝子を下方制御することができる、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、カチオンポリマーおよび一本鎖リボヌクレオチドオリゴマーを用いて標的遺伝子の発現を減少させるための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ｍＲＮＡノックダウン剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としても既知の二本鎖の短いＲＮＡは、遺伝子発現の調節における強力な道具となっており、従って、それらの機能の解明および疾患のプロセスにおける役割の推定に貢献する。
【０００３】
はじめに、遺伝子特異的阻害を達成するための最も一般的なアプローチは、目的の遺伝子のｍＲＮＡと相補的な一本鎖核酸（オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド）を細胞中に導入するものである、アンチセンス技術であった（Thompson，２００２）。より最近では、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としても既知の二本鎖の短いＲＮＡは、哺乳類細胞においてＲＮＡ干渉（Fire  et  al．，１９９８）と呼ばれるメカニズムにより適切なトランスフェクション剤で細胞送達されると、効果的に遺伝子発現を阻害することが示されている（Elbashir  et  al．，２００１）。ｓｉＲＮＡは、１９〜２１ヌクレオチド二本鎖領域を形成する２本の相補的なＲＮＡ鎖により形成され、そして鎖のそれぞれが１〜３ヌクレオチドのオーバーハングを有する。ＲＮＡ干渉はウイルス性ｄｓＲＮＡに対する自然発生防御メカニズムとして記載されている。活性の提案されたメカニズムは、二本鎖ｓｉＲＮＡをほどき、次いで、遺伝子サイレンシングプロセスにおける中間物としてｓｓＲＮＡ−酵素複合体を形成し、従って、ＲＮＡｉとアンチセンス効果の差異をぼやかせると提唱されている（Martinez  et  al．２００２，Schwarz  et  al．２００２）。
【０００４】
しかし、オリゴヌクレオチドに基づくアプローチには送達、安定および投与要求に関する多くの制限がある。無修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、そしていっそうとりわけオリゴリボヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に高い感受性であり、そして一般的に、核酸の自発的な取り込みは極めて非効率的である。その結果、オリゴヌクレオチド技術の発達における努力の多くは、細胞の取り込みを増進するトランスフェクション剤の製造、およびヌクレアーゼ消化に安定でかつ細胞中にすぐに拡散し得る、修飾された核酸の合成に集中した。過去１０年間、ホスホジエステル結合のアナログおよび２’−Ｏ−ＭＯＥ（メトキシエチル）誘導体（Martin  et  al，１９９５）のような新しい化学的に修飾されたヌクレオシド基礎単位が、有意に改善された安定性、効果並びに伝統的なホスホジエステルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴマーの選択性を有するよう設計された。
【０００５】
ＲＮＡｉメカニズムを介した無修飾ｓｓＲＮＡを用いた哺乳類細胞における遺伝子サイレンシングは近年ＨｅＬａ細胞で示された（Martinez  et  al．，２００２，  Schwarz  et  al．２００２）。しかし、ｓｓＲＮＡの効果はｄｓＲＮＡと比較して低かった。さらに、ＨｅＬａ細胞はヌクレアーゼが少ないことが知られている。従って、ＭａｒｔｉｎｅｚおよびＳｃｈｗａｒｚのアプローチは、例えばより大きなヌクレアーゼ活性を有する他の細胞株に適用され得ないので、一概に受け入れられるものではない。例えば、他の哺乳細胞株で使用されたｓｓＲＮＡ、例えばＨ−９、ＭＯＬＴ−３またはＴ−２４細胞、およびアンチセンスメカニズムを介して活動すると予期されるｓｓＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解を誘導するのに十分修飾されるべきであった（Agrawal  et  al．，１９９２，Wu  et  al．，１９９８）。ｓｓＲＮＡを安定化するために使用される化学修飾は、関連する制御メカニズムに依存して負の効果を有し得る。さらにとりわけ、修飾されたｓｓＲＮＡはアンチセンスメカニズムを通じたｍＲＮＡの分解を可能するが、しかしおそらく他の下方制御経路、例えば、ＲＮＡ干渉経路において誘導されるＲＩＳＣ−複合体形成に関与する酵素複合体とのより低い親和性を有するはずである。逆に、ＲＮＡ二本鎖の３’末端で適用される化学修飾は、サイレンシング活性に対して最小の影響を有するかまたは影響がない（Schwarz  et  al．２００２）。しかし、ＲＮＡｉのために無修飾ｓｓＲＮＡを用いる一般的に適用可能な方法の明確な必要性が存在する。なぜならかかるアプローチは試薬の費用としては明らかに有利であるかもしれないが、ｄｓＲＮＡと比較してｓｓＲＮＡの安定性が低いためその効果が制限されるからである。ｓｉＲＮＡの二本鎖に含まれる３’修飾されたオーバーハングを有する一本鎖ＲＮＡとの類似性のため、最小に３’修飾されたホスホジエステル一本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路において活動でき、また、アンチセンスノックダウン剤として作用できるはずである。従って、特定標的遺伝子の下方制御のために３’最小修飾された一本鎖ＲＮＡを使用できる方法が明らかに望まれていた。
【０００６】
本発明は、ここで、カチオンポリマーと組合せた最小修飾されたｓｓＲＮＡの適用による、哺乳類細胞における特定標的遺伝子の下方制御を可能にする方法を提供する。本発明は従って、遺伝子インヒビターとしてのＲＮＡ干渉のためのｓｓＲＮＡの最初の有効な使用を提供し、およびとりわけ高スループットスクリーニングに有用である。
【０００７】
発明の要約
本発明はｓｓＲＮＡおよびＰＥＩのようなカチオンポリマーを用いた標的遺伝子のノックダウンに関する。
【０００８】
第一の局面において、本発明は一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびＰＥＩに細胞を曝すことを含む、標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、該一本鎖オリゴリボヌクレオチドが該標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと相補的な５０未満、好ましくは２５未満のヌクレオチドの領域を含んでなる方法を提供する。他の好ましい態様において、相補的な領域が１０から３０、さらに好ましくは１５から２５、とりわけ好ましい態様において１９から２１ヌクレオチドである。他の好ましい態様において、該標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに対して相補的な領域が１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドである。
【０００９】
本発明の好ましい態様において、該細胞は、真核細胞、より好ましくは哺乳類の細胞、最も好ましくはヒトの細胞である。該ＰＥＩは好ましくは直鎖状ＰＥＩであり、そしてＮ／Ｐ比は、好ましくは２から１０、さらに好ましくは３から８である。
本発明の他の態様において、該ｓｓＲＮＡは１、２、３または４個のミスマッチを含む。ある態様において、ミスマッチは近接する。
【００１０】
本発明の他の態様において、該一本鎖オリゴリボヌクレオチドは、１から１０、好ましくは１から８、さらに好ましくは１から６個の化学的に修飾されたリボヌクレオチド残基を含んでなる。１、２、３、４、または５個の化学的に修飾された残基を有するオリゴリボヌクレオチドがとりわけ好ましい。好ましい化学的な修飾は２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾またはヌクレオシド内主鎖の修飾、例えばホスホロチオエートである。
【００１１】
該標的遺伝子は、発明の好ましい態様において、ヒト遺伝子である。好ましくは、該遺伝子は病理学的条件で過剰発現し、さらに好ましくは、該遺伝子は発がん遺伝子、サイトカイン遺伝子、ウイルス性遺伝子、細菌性遺伝子、発生遺伝子またはプリオン遺伝子である。
【００１２】
本発明の関連する局面において、ＲＮＡ干渉により該標的遺伝子が下方制御される方法が提供される。
他の関連する局面において、本発明はＲＮＡ干渉のためのｓｓＲＮＡおよびＰＥＩを提供する。
【００１３】
他の局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するのに有効量のｓｓＲＮＡおよびＰＥＩを含んでなるキットであって、該ｓｓＲＮＡが標的遺伝子と相補的な領域を含むキットを提供する。
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は４００ｎＭでのＰ２Ｘ３一本鎖の直鎖状ＰＥＩ介在トランスフェクションによるＰ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害を示す。
図２は２００ｎＭでのＰ２Ｘ３一本鎖の直鎖状ＰＥＩ介在トランスフェクションによるＰ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害を示す。
【００１５】
発明の詳細な説明
【表１】
2006517793.tif 000002
【００１６】
本明細書中に記載の発明は、記載されている特定の方法論、プロトコル、および記載された試薬に、これらが変化し得るため、限定されないと考えられる。本明細書中で使用される用語法は、特定の態様のみを記載する目的のためであり、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図するものではないということも理解されるべきである。
【００１７】
別の定義がなされていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は本発明の属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味である。本明細書中の記載と類似または等しい任意の方法および物質が本発明の実施または試験に使用され得るとしても、好ましい方法、装置および物質は本明細書に記載されている。本明細書で言及されたすべての刊行物は、本発明と組合せて使用すべきである、刊行物中で報告された物質および方法論を記載および開示する目的で、参照により本明細書の一部とする。
【００１８】
本発明の実施において、分子生物学の多くの常套の技術が使われる。これらの技術はよく知られており、例えば、Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory);およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (各々Wu and Grossman, and Wu, eds.)で説明されている。
【００１９】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明確にそうではないことを示していない限り、単数形は複数形の意味を含む。
【００２０】
本発明の目的のために、“ｓｓＲＮＡ”または“オリゴリボヌクレオチド”は、本発明の分野において一般的に定義されかつ理解されるように、一本鎖リボヌクレオチドオリゴマーと同義である。
【００２１】
“化学的な修飾”または“修飾”は、本発明において、化学的な方法、例えば化学的な部分の付加あるいは除去、またはある化学的な部分の他の化学的な部分での置換による、リボヌクレオシドオリゴマーのすべての変更を含む。とりわけ、ヌクレオシド内結合における硫黄原子による非結合性酸素原子の置換および糖ユニットの２’−ＯＨ基への置換基の付加が、化学的な修飾との用語に含まれる。
【００２２】
“ＲＮＡ干渉”との用語は、本発明の技術分野で一般的な用語である。ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の下方制御の測定またはＲＮＡ干渉メカニズムを介した標的遺伝子の下方制御が起こるか否かの決定が可能なアッセイは、本発明の技術分野において既知であり、かかるアッセイは例えばCaplen  et  al，２００１;  Elbashir  et  al．，２００１，  D．  Huesken  et  al，２００３に記載されている。
【００２３】
本発明者らは、ｓｓＲＮＡおよび直鎖状カチオンポリマーを用いて標的遺伝子の発現を下方制御することに成功した。これまでは、無修飾ｓｓＲＮＡはその高いヌクレアーゼ感受性のためにｍＲＮＡノックダウン剤として制限されていた。ｓｓＲＮＡ安定化は通常化学的な修飾、例えば、ホスホロチオエート結合による全ホスホジエステル結合の置換（Agrawal  et  al．，１９９２，  Wu  et  al．，１９９８）により、またはｍＲＮＡの分解を誘導するための２’−ＯＭｅウイング（wing）（８〜１２の２’−修飾リボヌクレオチド）および５〜９ホスホロチオエート修飾最小ギャップ（Wu  et  al．，１９９８）を担持するキメラ化合物を用いることにより達成される。本発明者らは本発明においてカチオンポリマー、とりわけ直鎖状ＰＥＩを用いることにより、ｍＲＮＡノックダウン剤としてホスホジエステルｓｓＲＮＡの使用が実行可能となるように、最小に修飾されたｓｓＲＮＡが効果的にトランスフェクトされ安定化され得ることを発見した。従って、かかるカチオントランスフェクション剤の使用が標的遺伝子の下方制御のためのｓｓＲＮＡの大規模な化学的修飾の必要を克服し、そして初めてホスホジエステルｓｓＲＮＡをこの目的のために適用可能とした。
【００２４】
第１の局面として、本発明はｓｓＲＮＡおよびカチオンポリマーへ細胞を曝すことによる標的遺伝子の下方制御の方法を提供する。該カチオンポリペプチドは、これらに限られないが、ポリ−リシン、ポリ−アルギニン、ポリ−ヒスチジン、ポリラクチド並びに乳酸およびグリコール酸（Ｐ（ＬＡ−ＧＡ））のコ−ポリマー、ポリサッカライド（ＤＥＡＥ−デキストラン）が含まれる。とりわけ好ましい態様では該カチオンポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、さらに好ましくは直鎖状ＰＥＩである。
本発明において使用されるＰＥＩは好ましくは分子量１００〜１，０００，０００ダルトン、さらに好ましくは５００〜２００，０００ダルトンまたは１，０００〜１００，０００の直鎖状ＰＥＩである。該ＰＥＩは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性ポリマーによりさらに修飾され得る。様々なタイプのＰＥＩが、例えばＡｌｄｒｉｃｈまたはＢａｙｅｒから市販されている。例えばFischer  et  al．１９９９に記載の、公知の好適なＰＥＩ剤の製造のための方法も存在する。
【００２５】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、水性溶液中で十分にプロトン化されている場合には最も高い陽電子密度を示すエチレンイミンのカチオンポリマーである。３原子毎にプロトン化が可能なアミノ窒素である（Boussif，O．et  al．，１９９５，  Behr，J．P．，１９９７）。分枝ＰＥＩは異なった程度の分枝を有する一級、二級および三級アミノ基を含み、それにより、様々なｐＨでプロトン化ができ、それに対して直鎖状ＰＥＩは主に、またはもっぱら二級アミノ基を含む。直鎖状ＰＥＩは低分子量ポリマーであり、一般的に２００００〜２５０００ダルトン近辺である。市販のＰＥＩであるＪｅｔＰＥＩの構造は:ＨＯ（ＣＨ２）２−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−（ＣＨ２）２−ＯＨである。
【００２６】
従って、１つの態様において、本発明はＰＥＩ、とりわけ直鎖状ＰＥＩ、および好ましくは無修飾、または最小限修飾されたｓｓＲＮＡの、標的遺伝子の下方制御のための使用を提供する。
【００２７】
標的遺伝子の下方制御のために必要なｓｓＲＮＡの量は、経験的に決定され得、そして当業者の技術の範囲内である。カチオンポリマーの量は使用されるｓｓＲＮＡの量に依存する。ＰＥＩについて、例えば、ＰＥＩの全窒素原子の数とｓｓＲＮＡのリン酸基の数との比（Ｎ／Ｐ比）は、ｓｓＲＮＡの所定の量を効果的に送達するためのＰＥＩの量を決定するための好適なパラメーターである。好ましい態様において、該Ｎ／Ｐ比は２〜１０、さらに好ましくは３〜８である。とりわけ好ましい比は５である。好ましい比は、取り込み後のエンドソームから複合体の取り込みおよび放出を可能にするために、オリゴヌクレオチドを効果的に複合体化させるのに必要な直鎖状ＰＥＩの量（すなわち窒素原子の量）である。ｓｓＲＮＡのある濃度では、エンドソームからの効果的な放出を誘導しないが、効果的な取り込みを誘導するのに十分なＰＥＩが存在し得る（とりわけ低いｓｓＲＮＡ濃度において）。
【００２８】
アンチセンス技術に有用なリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学的な修飾の種類は、既知である（例えば：Freier  S．M．  and  Altmann  K．H．，１９９７参照）。とりわけ好ましい態様において、ｓｓＲＮＡは主に修飾されていないリボヌクレオチドからなるのに対し、本発明はまた、いくつかの化学的な修飾を含むｓｓＲＮＡの使用を提示する。本発明において、好ましい化学的に修飾されたｓｓＲＮＡは、２’−ＯＨ基、とりわけ２’−Ｏ−アルキル基の修飾を含む１〜１０個、好ましくは１〜５個の合成リボヌクレオチドアナログ、または１〜１０個、好ましくは１〜５個の合成デオキシリボヌクレオチド、または３’末端ヒドロキシル基における任意の修飾を含んでなる。より好ましい態様において、該修飾は２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ＭＯＥである。ホスホジエステルヌクレオシド内結合を含むｓｓＲＮＡが好ましいのに対し、限られた数のヌクレオシド内結合が化学的に修飾され得る。従って、他の本発明の好ましい態様において、該ｓｓＲＮＡは１〜１０個、好ましくは１〜５個のホスホジエステル主鎖の修飾、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスホエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ペプチド等の結合を含んでなる。他の好ましい態様において、該修飾はｓｓＲＮＡ分子の５’および／または３’末端に位置する。さらに他の好ましい本発明の態様において、該ｓｓＲＮＡは５’リン酸を含む。しかし、該ｓｓＲＮＡはさらなる、またはそれ以外の当業者に既知（Freier  S．M．  and  Altmann  K．H．，１９９７）の他の多くの修飾を含み得、修飾された残基の数はさらに好ましくは１〜５である。
【００２９】
他の好ましい態様において、該ｓｓＲＮＡは１以上のデオキシリボヌクレオチドを含んでなる。１〜１０個、好ましくは１〜５個のデオキシリボヌクレオチドの伸長が好ましく、おそらく、リボヌクレオチドの伸長により片側または両側の、好ましくは３’末端の側面に位置する。
【００３０】
該ｓｓＲＮＡは、下方制御される所与の標的遺伝子に相補的な５０未満のヌクレオチドおよび好ましくは１５より多いヌクレオチドの領域を含んでなる。１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長がより好ましい。とりわけ好ましい態様において、該ｓｓＲＮＡは所与の標的遺伝子と相補的な領域からなる。本発明の他の態様において、相補領域は１、２、３または４個のミスマッチを含む。
【００３１】
カチオンポリマーにより、とりわけＰＥＩによりトランスフェクトされ得るいずれの細胞も、本発明に使用できる。好ましい細胞は真核細胞、哺乳類の細胞、より好ましくはげっ歯類、およびとりわけ好ましくはヒトの細胞である。該細胞は様々な組織に由来し得、それらは内細胞塊、胚外外胚葉あるいは胚肝細胞、全能性もしくは多能性、分裂もしくは非分裂、柔もしくは上皮または不死化もしくは形質転換などを含むが、これらに限定するものではない。該細胞は幹細胞または分化した細胞であり得る。分化した細胞型は、限定するものではないが、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、樹状細胞、神経細胞、グリア細胞、マスト細胞、血球および白血球（例えば、赤血球、巨核細胞、Ｂ、Ｔ、およびナチュラルキラー細胞のようなリンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、顆粒球）、上皮細胞、ケラチン細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌腺または外分泌腺細胞、並びに感覚細胞を含む。
【００３２】
該ｓｓＲＮＡは、本発明の技術分野で十分に確立された化学的な方法により、または生物学的な方法、例えば細胞性ＲＮＡポリメラーゼあるいはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）を用いたインビトロ転写により合成され得る。
【００３３】
本明細書に開示の通り、本発明は標的遺伝子またはヌクレオチド配列のいずれの型にも制限されない。例えば、該標的遺伝子は細胞性遺伝子、内在性遺伝子、発がん遺伝子、導入遺伝子、または転写または非転写ＲＮＡを含むウイルス性遺伝子であり得る。可能性のある標的遺伝子の以下のクラスは、説明のみを目的として列記しており制限する意図はない：転写因子および発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、Winged helixファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそのレセプター、増殖／分化因子およびそのレセプター、神経伝達物質およびそのレセプター）；発がん遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭＩ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＫＰ２、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、およびＹＥＳ）；腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＡＩ、ＢＲＣＡ２、ＣＴＭＰ、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢＩ、ＴＰ５３、およびＷＴＩ）；並びに酵素（例えば、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デクストリナーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、インシュリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リソザイム、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ並びにトポイソメラーゼ（ＲＮＡおよび／またはタンパク質成分を含む））。
【００３４】
該ｓｓＲＮＡは好ましくは１つのシグナル遺伝子と相補的な領域を含んでなるが、１より多い遺伝子と相補的な１より多い領域も含み得る。異なる遺伝子と相補的な領域を含んでなる数種のｓｓＲＮＡに該細胞を曝す方法も考えられる。
【００３５】
代謝経路の１以上の部分の酵素または病因に関連する遺伝子を阻害することで、効果は上昇し得る：各活性が影響し、そして該作用が多くの異なる標的成分により強まり得る。代謝はまた、経路におけるフィードバック制御阻害または望まない代謝副産物の生産阻害により操作され得る。
【００３６】
該細胞をｓｓＲＮＡおよびＰＥＩにインビトロまたはエクスビボで曝し、次いで動物に治療を行うために移植するかまたは、該ｓｓＲＮＡおよびＰＥＩをインビボで直接投与できる。従って、遺伝子治療の方法は、典型的には標的遺伝子に特異的なｓｓＲＮＡをＰＥＩの存在で細胞に導入することが考えられる。処置を必要とする任意の疾患または症状を引き起こすことが知られている標的遺伝子が使用され得る。例えば、腫瘍細胞はホーミングウイルス性ベクター、腫瘍特異的プロモーターを用いて、または腫瘍特異遺伝子（例えばテロメラーゼ）および発がん遺伝子を阻害するのに有効なｓｓＲＮＡ分子をデザインすることにより標的化され得る。処置は疾患と関連する任意の症状または病理学と関連した臨床徴候の改善または回避を含み、そしてこれは予防治療を含み得る。さらに好ましい態様は所望の標的遺伝子を阻害するためにｓｓＲＮＡおよびＰＥＩで処置したＥＳ細胞を対象に投与することに関する。
【００３７】
任意の病原体に由来する遺伝子は阻害のために標的化され得る。例えば、該遺伝子は直接宿主の免疫抑制を引き起こし得、または病原体の複製、病原体の伝達または感染の維持に必須である。病原体に感染するおそれのある細胞またはすでに感染された細胞、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、インフルエンザ感染症、マラリア、肝炎、マラリア、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、並びに手足口病ウイルスに感染した細胞が本発明のＲＮＡ導入による処置のために標的化され得る。該標的遺伝子は、病原体またはその宿主への病原体の侵入、病原体または宿主による薬剤代謝、病原遺伝子の複製または組み込み、宿主における感染の確立または拡散、もしくは次世代病原体の集合をもたらす宿主遺伝子であり得る。予防法（すなわち感染の予防またはリスクの減少）、並びに感染に関連した症状の頻度または重篤度の減少法は、想定できる。
【００３８】
本発明はまた、以前は知られていなかった機能の標的遺伝子の活性を阻害するためのｓｓＲＮＡおよびＰＥＩの使用を含む、生体内の遺伝子機能の同定方法を提供する。伝統的遺伝子スクリーニングによる時間と労力がかかる変異体の単離に代わって、標的遺伝子活性の量を減少しおよび／またはタイミングを変えるための本発明の使用により、機能的ゲノムが未特定遺伝子の機能を決定することを考えられるだろう。本発明は、医薬の潜在的な標的を決定すること、発生に関連した正常および病理学上の事象を理解すること、生後の発育／加齢に関連したシグナル経路を決定することなどに使用することができる。ヒトゲノムを含むゲノムおよび発現された遺伝子源からのヌクレオチド配列情報獲得の増加している速度は、例えば哺乳類系、とりわけヒト細胞培養系における、遺伝子機能を決定するために、本発明と組み合わせ得る。推定されるオープンリーディングフレームは、当業者に自明なコンピューターを用いた調査技術を用いるデータベースを利用してヌクレオチド配列から決定し得る。
【００３９】
従って、本発明の他の局面において、機能が割り当てられていない所望のＤＮＡ配列と相補的な、そして遺伝子発現を阻害するのに有効量であるＰＥＩおよびｓｓＲＮＡに細胞を曝し、野生型と比較して哺乳類細胞の表現型を同定し、そして所望の核酸に表現型を割り当てる、ＤＮＡ配列に機能を割り当てるための方法を提供する。
【００４０】
単純なアッセイは、発現配列タグ（ＥＳＴ）から利用可能な部分配列にしたがった遺伝子発現の阻害である。成長、発生、代謝、疾患耐性または他の生物学的プロセスにおける機能的変異はＥＳＴ遺伝子産物の正常な役割の指標である。データベーススクリーニングが既知の機能のタンパク質と相同の領域を発見したとき、その機能に基づいたより特異的な生化学的な試験を使用し、ＥＳＴ配列の機能（またはその阻害）について試験できる。
【００４１】
ｓｓＲＮＡをＰＥＩを用いて処置していない哺乳細胞に導入し得る容易さにより本発明は高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に使用できる。例えば、ｓｓＲＮＡは化学的に合成され、またはインビトロ転写により製造し得る。
【００４２】
標的遺伝子、例えば特異な発現遺伝子を阻害するのに十分量のＰＥＩおよびｓｓＲＮＡを含む溶液を、規則正しい配列としてマイクロタイタープレート上に位置する個々のウェル中に入れ、そして各ウェルの未処理細胞は標的遺伝子活性の阻害に関して、またはプロテオミクス、ゲノミクスおよび標準的な分子生物技術により、挙動または発生における任意の変化または修飾に関してアッセイをし得る。かかるスクリーニングは哺乳類由来の組織培養にとりわけ影響を受けやすい。
【００４３】
制御されたプロモーター（例えばレポーター遺伝子構成物でトランスフェクトした）に応答して比色分析的、蛍光発生性、または発光性シグナルを製造する細胞は、プロモーターを制御するＤＮＡ−結合タンパク質を同定するために高スループット形式でアッセイし得る。最も簡単なアッセイ形式において、負の制御の阻害によりシグナルが増加し、正の制御の阻害によりシグナルが減少する。
【００４４】
本発明は本質的な遺伝子の阻害に有用であり得る。かかる遺伝子は特定の発生段階または細胞区画においてのみ細胞または組織の生存度のために要求され得る。条件変異株の機能的等価性は、それが生存度にとって必要でない時にまたは必要でない場所で標的遺伝子の活性を阻害することにより製造され得る。本発明は、標的遺伝子に永久変異を誘導することなく発生の特定の時および組織の場所でｓｓＲＮＡを加え得る。
【００４５】
本発明はまた、カチオンポリマー、とりわけＰＥＩをトランスフェクション試薬として用いて試験サンプルまたは対象に、ｓｓＲＮＡのインビトロ、エクスビボまたはインビボ導入を行うために必要な試薬の少なくとも１つ、または哺乳細胞における標的遺伝子の発現を阻害するためにそれを発現させるための構築物を含んでなるキットを提供する。該キットはｓｓＲＮＡおよびＰＥＩを標的遺伝子を阻害するための有効量を含み、そのｓｓＲＮＡは標的遺伝子と相補的な領域を含む。かかるキットはまた、キットの使用者が本発明を実施できるように指示書を含み得る。
【００４６】
本発明について説明の目的のみのために以下の実施例にさらに説明する。参照されているが本明細書および実施例には明確に記載されていない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド生化学並びに免疫学的方法は科学文献で報告されておりそして当業者によく知られている。
【実施例】
【００４７】
材料
ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）をＰｏｌｙｐｌｕｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎから購入した（カタログ番号１０１−１０）。それは、７．５ｍＭ（窒素雰囲気下で輸送）の濃度にて送達される直鎖状ポリマーからなる。
【００４８】
細胞株
組み換えラットＰ２Ｘ３を発現する安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、先に記載の通りに製造した（Dorn  et  al．２００１）。細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１００００ＩＵ／５００ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補った最小必須培地（ＭＥＭ−α）で５％ＣＯ２加湿チャンバー内で培養した。
【００４９】
オリゴヌクレオチド合成
ｓｉＲＮＡ実験のためにオリゴリボヌクレオチドをＴＯＭ−ホスホラミダイト化学を用いた上記工程（Xeragon）で合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。純度はキャピラリーゲル電気泳動により評価した。２６０ｎＭでの吸光係数によってＵＶによる定量を行った。
ｄｓＲＮＡのアニーリングは他に記載のように行った（Elbashir  et．  al．，２００１）。
オリゴヌクレオチド配列を以下に列記する：
【表２】
2006517793.tif 000003
略号：Ｎ＝２’−Ｈ、ｎ＝２’−Ｏ−メトキシエチル、Ｎ＝２’−ＯＨ、ｓ＝ホスホロチオエート。
【００５０】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクション
ポリプレックスをトランスフェクションの直前に調製した。トランスフェクションの１８時間前に、４×１０４細胞を１ウェルあたり０．５ｍｌのＭＥＭ−α（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１００００ＩＵ／５００ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補った）の２４ウェルプレートにまいた。トランスフェクションの前に、成長培地を細胞から取り除き、５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭおよび１００μｌのＰＥＩ／オリゴヌクレオチド混合物と置き換えた。プレートを加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。続いて、６０μｌのＦＢＳを各ウェルに加え、さらに２０時間インキュベートした。
【００５１】
ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）でのトランスフェクション
ＰＥＩ濃度は窒素原子モル濃度で表され、１μｇのオリゴヌクレオチドは３ｎｍｏｌのリン酸アニオンを含む。オリゴヌクレオチド（ＯＮ）濃度に関する所望のＮ／Ｐ（ＰＥＩの全窒素原子とオリゴマーのリン酸基）比を得るための、ポリ核酸と混合する直鎖状ＰＥＩの容量は以下の式を用いて計算した：
【数１】
2006517793.tif 000004
【００５２】
ｓｉＲＮＡ二本鎖についても、これらの試薬を２本の別々の鎖とみなして、同じ式を使うことができる。
【００５３】
２４−ウェルプレート実験をトリプリケートで行うために（各ウェルの最終体積６００μｌ）、所望の量の直鎖状ＰＥＩを１５０ｍＭ滅菌ＮａＣｌ溶液で希釈して１５０μｌとし、次いでゆっくりと撹拌した。分離エッペンドルフ管で、所望の量のオリゴヌクレオチドをＮａＣｌ溶液で希釈して１５０μｌとし、次いでゆっくりと撹拌した。次いで１５０μｌのＰＥＩ溶液を１５０μｌの核酸溶液に一度に加え、すぐに１５秒撹拌した。該ＰＥＩ／オリゴヌクレオチド溶液を１５〜３０分室温にて放置し、次いで１００μｌの複合溶液を５００μｌの所望の培地を含む各ウェルに加えた。
【００５４】
ＲＮＡ回収および実時間定量ＰＣＲｍＲＮＡ分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）での製造業者のプロトコルに従ったオリゴヌクレオチドのトランスフェクションの２４時間後に単離した。該ＲＮＡサンプルは純粋な鋳型ｍＲＮＡの希釈から標準を行う場合には１０ｎｇ／μｌに、そしてｍＲＮＡの下方制御を未処置細胞に対する割合として示す場合には５０ｎｇ／１２μｌにそれぞれ希釈する。次いでＲＮＡ（いずれの場合にも各サンプル５０ｎｇ負荷）実時間定量的ＰＣＲ反応キットのＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの試薬と、またはＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｑ−ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘキット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）からの試薬のいずれかと混合し、付属のプロトコルに従って行う。
【００５５】
結果
下記実験は哺乳類細胞へのオリゴリボヌクレオチドの送達の担体としての直鎖状ＰＥＩの適用のための単純で普遍的なプロトコルを確立することを狙った。組み換えラットＰ２Ｘ３purinoreceptor ｃＤＮＡ配列、並びに特徴付けられたＰ２Ｘ３アンチセンスインヒビター配列を安定にトランスフェクトされたにチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）をｓｉＲＮＡトランスフェクションのモデル系として選択した（Dorn  et  al．，２００１）。
【００５６】
直鎖状ＰＥＩ介在摂取後の一本鎖ＲＮＡ活性
ｍＲＮＡのノックダウンに使用されるほとんどのアンチセンスはオリゴデオキシヌクレオチドであるか、またはＲＮＡアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈ活性を誘導するための２’−デオキシ窓（window）（キメラＡＳＯ）を含むにもかかわらず、オリゴリボヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡ調節の効果的な引き金であることが示された。内在性のアンチセンスＲＮＡ転写は、様々な組織において遺伝子発現を制御するために存在し、二本鎖エンドリボヌクレアーゼを活性化し、それが次いで標的ｍＲＮＡを分解することが示された。細胞内で発現したアンチセンスＲＮＡ構築物は広く使われており、系に依存して、異なるレベルのＲＮＡプロセッシング、例えば一次転写物のスプライシング、成熟ｍＲＮＡの輸送または転写での遺伝子発現阻害を誘導することが示された（Pestka  et  al．，１９９２）。ヌクレアーゼに対するそれらの感受性のために、細胞外に適用された短い無修飾ＲＮＡは一般的に一貫してｍＲＮＡまたはタンパク質調節を誘導しない。ホスホロチオエートおよびウイングの２’−修飾（キメラＲＮＡ）のような化学修飾を通じた（Agrawal  et  al．，１９９２，  Wu  et  al．，１９９８）、または相補的なセンス鎖とのハイブリダイゼーション（Martinez  et  al．２００２，Schwarz  et  al．２００２）のいずれかによる一本鎖ＲＮＡの安定化は、次いで活性なｍＲＮＡノックダウン剤をもたらした。
【００５７】
直鎖状ＰＥＩが様々な種類の修飾ＡＳＯ（およびとりわけ全ホスホジエステルＭＯＥギャップマー、様々な脂質とトランスフェクトした場合には活性でない）並びに二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をトランスフェクトできることを示すため、我々はさらにヌクレアーゼに対するその保護特性を評価した。Ｐ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害が、直鎖状ＰＥＩが適切に２つのＭＯＥ  ＤＮＡ修飾および１つの３’−末端におけるホスホロチオエート結合をトランスフェクトし、保護しそして送達し得ることが分かった。４００ｎＭ（表１）または２００ｎＭ（表２）のいずれであっても、アンチセンス一本鎖ＲＮＡは約５０％の標的ｍＲＮＡの阻害を示したが、一方センス一本鎖ＲＮＡは不活性であった。
【００５８】
【表３】
2006517793.tif 000005
表１：Ｐ２Ｘ３一本鎖（ｓｓ）アンチセンスＲＮＡ（８６４７）の直鎖状ＰＥＩ介在トランスフェクションによるＣＨＯ−Ｋ１におけるＰ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害（８６４６：一本鎖センスＲＮＡ；８５４８／８５４９：ｓｉＲＮＡ無関係対照）。
【表４】
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表２：Ｐ２Ｘ３一本鎖（ｓｓ）アンチセンスＲＮＡ（８６４７）の直鎖状ＰＥＩ介在トランスフェクションによるＣＨＯ−Ｋ１におけるＰ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害（８６４６：一本鎖センスＲＮＡ）。
【００５９】
文献
Agrawal S., Tang J.Y., Sun D., Sarin P.S. and Zamecnik P.C. (1992) Synthesis and anti-HIV activity of oligoribonucleotides and their phosphorothioate analogs. Annals of the New York academy of sciences 660, 2-10
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は４００ｎＭでのＰ２Ｘ３一本鎖の直鎖状ＰＥＩ介在トランスフェクションによるＰ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害を示す。
【図２】図２は２００ｎＭでのＰ２Ｘ３一本鎖の直鎖状ＰＥＩ介在トランスフェクションによるＰ２Ｘ３ｍＲＮＡの阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2006517793.tif 000011
2006517793.tif 000012
2006517793.tif 000013
2006517793.tif 000014
2006517793.tif 000015