(57)【要約】本発明は、構造XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXQXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX, 構造XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXTXXCXXXXXX および構造XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXXXXXCXXXXXX, を有するシステイン含有ペプチド類に関するものであり、ここで、Xは、互いに独立であり、天然に存在するあらゆるアミノ酸を意味し、並びに上記ペプチドをコードする核酸配列、上記配列を組み込んだベクター、さらに上記ペプチドを含有する医薬組成物とその医薬品としての使用、特に癌の治療を含む。
2006524985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXQXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX
または、
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXTXXCXXXXXX
または、
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXXXXXCXXXXXX,
の構造を有するシステインを含有するペプチド類であって、Xは互いに独立であって、天然に存在するあらゆるアミノ酸をあらわす、前記ペプチド類
【請求項２】
１５位にアミノ酸Ｇ、および／又は１９位にアミノ酸Ｔ、および／又は２３位にアミノ酸Ｑ、および／又は２７位にアミノ酸Ｑ、および／又は２８位にアミノ酸Ｒ、および／又は３１位にアミノ酸Ｄ、および／又は３３位にアミノ酸Ｉ、および／又は３４位にアミノ酸Ｈ、および／又は３５位にアミノ酸Ｖ、および／又は３６位にアミノ酸Ｔ、および／又は３７位にアミノ酸Ｔ、および／又は３８位にアミノ酸Ｔ、および／又は４３位にアミノ酸Ｓ、および／又は４４位にアミノ酸Ｈ、および／又は４６位にアミノ酸Ｓが配列される、請求項１に記載のシステイン含有ペプチド類
【請求項３】
前記請求項のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類であって、
KSCCRNTLGRNCYNGCRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS 
(ヘレチオニン-A), 
KSCCRNTLGRNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS 
(ヘレチオニン-B1), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS
(ヘレチオニン-B2), 
KSCCRNTLGRNCYNACRLPGTPQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR 
(ヘレチオニン-B3), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGTSQPYCARLCDCIHVTTPTCPSSHPR
(ヘレチオニン-B4), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR 
(ヘレチオニン-B5), 
KSCCRNTLARNCYNVCRFGGGSQAYCARFCDCIHVTTSTCPSSHPS
(ヘレチオニン-B6), 
KSCCRNTLGRNCYNACRLTGTSQATCATLCDCIHVTATTCRPPYPS 
(ヘレチオニン-C), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGILCDCIHVTTTTCPSSHPS
(ヘレチオニン-D), 
KSCCRNTLGRNCYAACRLTGLFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS
(ヘレチオニン-E1), 
KSCCRNTLGRNCYAACRLTGTFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS
(ヘレチオニン-E2),
の構造を有する前記ペプチド類
【請求項４】
前記請求項のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド化合物をコードする核酸配列
【請求項５】
請求項４に記載のRNA配列およびアンチセンスRNA
【請求項６】
請求項４に記載のDNA配列およびアンチセンスDNA
【請求項７】
請求項１乃至３のいずれかに記載のエステル誘導体、アミド誘導体、ハロゲン誘導体、メチル誘導体、塩誘導体、環状誘導体、およびペプチド類の改良された主鎖を有する誘導体
【請求項８】
請求項６に記載のDNA配列を含むDNAベクター又はDNA構成物
【請求項９】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類の抗原決定基に対して結合するモノクロナール抗体
【請求項１０】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の、疾患の治療のための使用
【請求項１１】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の、病原体により引き起こされた疾患の治療のための使用
【請求項１２】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の、細菌、真菌またはウイルスにより引き起こされた疾患の治療のための使用
【請求項１３】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の、人間および動物、特に馬の疾患の治療のための使用
【請求項１４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の、不完全な免疫系の調節によって引き起こされる、あるいは不完全な免疫系の調節にともなって引き起こされる疾患の治療のための使用
【請求項１５】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の自己免疫疾患の治療のための使用
【請求項１６】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類の癌の治療のための使用
【請求項１７】
請求項１乃至３のいずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類のエイズの治療のための使用
【請求項１８】
請求項１乃至３に記載の一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類、および／又はこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類を含む医薬組成物
【請求項１９】
請求項１乃至３に記載の一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類、および／又はこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類、および少なくとも一つの亜酸化炭素誘導体を含む、請求項１８記載の医薬組成物
【請求項２０】
疾患の治療のための医薬製剤の調製のための、請求項１乃至３いずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、これらペプチド類の機能性を有する誘導体類、および／又はこれらシステイン含有ペプチド類の医薬上許容される塩類
【請求項２１】
病原体によって引き起こされる疾患の治療のための医薬製剤の調製のための、請求項１乃至３いずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、これらペプチド類の機能性を有する誘導体類、および／又はこれらシステイン含有ペプチド類の医薬上許容される塩類
【請求項２２】
癌の予防および／又は治療のための医薬製剤の調製のための、請求項１乃至３いずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、これらペプチド類の機能性を有する誘導体類、および／又はこれらシステイン含有ペプチド類の医薬上許容される塩類
【請求項２３】
癌の予防および／又は治療のための医薬製剤の調製のための、請求項１乃至３いずれかに記載のシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、これらペプチド類の機能性を有する誘導体類、および／又はこれらシステイン含有ペプチド類の医薬上許容される塩類であって、関係する癌が、脈絡膜メラノーマ、急性白血病、聴神経鞘腫、膨大部癌、肛門癌、星状腫、基底細胞腫、膵臓癌、膀胱癌、気管支癌、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮体癌、CUPシンドローム、結腸直腸癌、小腸癌、小腸腫瘍、卵巣癌、子宮内膜癌、上衣細胞腫、上皮癌類、ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胆嚢癌、子宮癌、子宮頸癌、グリア芽細胞腫、婦人科腫瘍、咽頭腫瘍、鼻部腫瘍、耳腫瘍、血液腫瘍、有毛細胞白血病、尿道癌、皮膚癌、脳腫瘍（グリア細胞腫）、脳転移癌、精巣癌、リンパ節癌（ホジキン病／非ホジキン病）、脳下垂体腫瘍、カルチノイド、カポジ肉腫、喉頭癌、胚細胞腫瘍、骨癌、大腸癌、頭部および頸部腫瘍、結腸癌、頭蓋咽頭腫、口腔癌（口腔部の中および唇の癌）、肝癌、肝転移癌、白血病、眼瞼癌、肺癌、リンパ腫、胃癌、悪性黒色腫、乳癌腫、直腸癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻癌、神経鞘腫、腎臓癌、非ホジキンリンパ腫、乏突起細胞腫、食道癌腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、形質細胞腫、前立腺癌、咽頭癌、直腸癌腫、網膜芽細胞腫、膣癌、甲状腺癌、シュネベルガ病、食道癌、脊髄性グリア細胞腫、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、胸腺腫、管癌腫、眼腫瘍、尿道癌、泌尿器腫瘍、尿路上皮癌、外陰癌、いぼ、軟部組織腫瘍、ウィルムス腫瘍、頸癌腫および舌癌を含む群から選択される前記化合物
【請求項２４】
請求項２３に記載のシステイン含有ペプチド類であって、関係する癌が、膀胱癌、乳癌、中枢神経の癌、大腸癌、胃癌、肺癌、皮膚癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、グリア細胞腫、前立腺癌、精巣癌、白血病、肝癌、腎癌そして上皮性癌類を含む群から選択される前記化合物
【請求項２５】
請求項１乃至３に記載の一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類、および／又はこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類を含有する、医薬
【請求項２６】
請求項１乃至３に記載の一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類、および／又はこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類と少なくともひとつの亜酸化炭素誘導体を含有する、請求項２５記載の医薬
【請求項２７】
請求項１乃至３に記載の一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類、および／又はこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類と少なくともひとつの細胞増殖抑制剤および／又は細胞増殖抑制活性を有する化合物を含有する、請求項２５または２６記載の医薬
【請求項２８】
ヘラボラス（Helleborus）植物種から抽出することによる、請求項１乃至３に記載のシステイン含有ペプチド類の抽出方法
【請求項２９】
請求項２８記載の方法であって、方法の第一段階として無極性溶媒、特にt−ブチルメチルエーテルを用いて、植物原料の脱脂をおこなう前記方法
【請求項３０】
遺伝子工学の手法による、請求項１乃至３のシステイン含有ペプチド類の抽出方法
【請求項３１】
請求項３０記載の方法であって、チオニンを産生する穀物のチオニン遺伝子をヘラボラス（Helleborus）植物種のチオニン遺伝子に置き換える前記方法
【請求項３２】
請求項１乃至３記載のシステイン含有ペプチド類およびこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類のペプチド合成による合成的な抽出方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高いシステイン組成のペプチド類、当該ペプチド類をコードする核酸配列、当該配列を含有するベクター、並びに当該ペプチド類を含む医薬組成物およびその医薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物（バクテリア、ウイルス、イースト 等）や伝達性因子（毒素 等）は病原体と呼ばれ、植物、動物、人間への疾病や無症状の感染を引き起こしうる。より広い意味では昆虫類や線虫類も病原体と呼ばれ、それらは感染因子を生命体へ運びうる。生体は病原体からの攻撃に対して複合的な非常に効果的な防御システムを備えている。病原体の侵入を防止し、既に侵入した病原体の破壊をすることは、それぞれ防御因子や免疫系の重要な役割である。この点に関して単純生物もいくつかの防御因子や保護機能を有している。脊椎動物の免疫系は、非常に複雑な細胞性のネットワークと個々の病原体に対して特異的な抗体を形成できる追加的能力を備えた体液性メカニズムがあり、それによって病原体を破壊する。
【０００３】
生体自体の防御力が病原体を破壊するのに十分でない場合は、例えば、抗生剤、抗菌剤、抗ウイルス剤やその他薬剤といった追加的な補助手段を用いなければならない。しかし、病原体をこの種の化学化合物によって制御する場合には重大な問題、すなわちその病原体株が使用された薬剤に対して非常に頻繁に抵抗性を獲得するということがある。この適応に対しては一時的には主薬投与量の増加により克服することができる。しかし、長期的には常に新たな化学化合物や生物学的な手段が病原体の制御には要求されることとなる。
【０００４】
ペプチドはアミノ酸により構成される化合物であり、含まれるアミノ酸の数によってジ−、トリ−、オリゴ−、又はポリペプチドと称される。蛋白質と称される場合は分子量が10kDaを越えるポリペプチドが該当する。本発明では10kDa未満の分子量を有するペプチドに対してペプチドという言葉を用いる。蛋白質やペプチド、それぞれはほとんどすべての細胞活動に深く関与している。生命活動においてそれらが主要な位置づけにあることは遺伝情報が結果としてポリペプチドの形式で発現されるということに反映されている。
【０００５】
生物学的な役割に基づいて、蛋白質は酵素蛋白、輸送蛋白、構造蛋白、防御蛋白、収縮性蛋白、受容体蛋白 等と称される。他の生物学的な役割の中で、ペプチドやより小さな蛋白質の多くは、ホルモン効果（例えば、インスリンやオキシトシン）、受容体へのシグナル伝達（例えば、エンケファリン類）、免疫防御のコントロール（例えば、サイトカイン）、あるいは非特異的防御（例えば、デフェンシン）といった前段階の役割を果たす。多くの生物学的に高い活性を有するペプチドは、通常は作用するその局所において大きな前駆蛋白質から放出される。このようにしてペプチドは最適の効果を発揮できる。
【０００６】
ペプチドはその高い薬理的効果、低い毒性そして良好な生体適合性にもかかわらず医薬としての使用には大きな制限がある。基本的な問題は、生体においては通常ペプチドは非常にすみやかに分解されて不活性になることにある。長きにわたって加水分解されにくい構造的要素である、例えばD−アミノ酸やその他手法によって、このすみやかな代謝を防ぐ試みがなされている。その場合の問題点は構造的な変化によって治療効果に非常に大きな影響を与えることにある。
【０００７】
経口投与では蛋白質／ペプチドは消化管内で分解されて実質的に不活性になってしまう。このためペプチド医薬にとって経口投与は非常に問題のある投与経路である。この理由のため治療に用いられているインスリンやエリスロポエチンなどの生体内にあるペプチドは大部分（＞90%）は非経口的（注射投与）にのみ投与されている。より大きなペプチドの実用化への新たな技術的な問題点としては産業的なスケールで調製することである。今までのところ満足できる解決が得られたのはほんのわずかなケースのみであろう。
【０００８】
内在性ペプチドに対して、外在性ポリペプチドを非経口的に投与するには基本的な問題を克服しなければならない。すべての高等生物の免疫系ではこのような“非自己”ペプチドに対して特異的な抗体をつくり、外在性ペプチドの中和や排除を試みる。この外在性ペプチドの抗原性は人為的にのみ抑制することができる。例えば、免疫抑制による手段や認識されにくい抗原構成などである。それによってさらなる副作用が引き起こされる可能性がある。最新の例として、慢性関節リウマチの治療に用いられるエタネルセプト（抗TNF抗体蛋白）をあげることができる。
【０００９】
外在性ペプチドは生体内で蛋白分解酵素によって分解される。分解された小さなペプチド切片は抗原反応を引き起こし、抗体の形成へと導く。もっぱら蛋白分解酵素に対して安定であるポリペプチドは明らかに抗原性が弱い。蛋白分解酵素を効果的に阻害する物質はいくつかの病状の治療に用いることができる。このような蛋白分解酵素阻害剤はすでにHIV感染の治療に用いられた。
【００１０】
チオニン類は小さな、強塩基性の植物由来のペプチドであり、システイン含量が非常に高いことが特徴である。チオニン類は主に４５から４８のアミノ酸残基で構成される（Rompp Lexikon der Chemie 9. Edition, Thieme Verlag Stuttgart 1992）。それは主に６又は８個のシステイン群を有しており、そのシステイン群が３又は４つの分子内ジスルフィド結合（-S-S-）を形成するため、ペプチドの構造がさらに安定化されている。比較的低い分子量（約５kDa）とそのひときわすぐれた安定構造のためにチオニン類はより薬理的に特異な特性を有する特徴が期待されるが、今までのところわずかな範囲でのみ認識され使用されたにすぎない。
【００１１】
技術文献では今までのところわずかに約５０のチオニン類が記述されている。最もよく知られているチオニン類はヤドリギ(Viscum album)由来のビスコトキシン類、大麦(Hordeum vulgaris)由来のホルドチオニン類、小麦(Triticum sativum)由来のプロチオニン類、エンバク(Avena-sativa)由来のアベノチオニン類、バッファローナッツ(Pyrularia-pubera)由来のパイルラリアチオニン類、そしてクランバスアベシニカス（Crambus abessinicus）由来のクランビンがある(D.E.A. Florack and W.J. Stiekema, Plant. Mol. Biol. 26, 25-37 (1994))。
【００１２】
植物チオニン類の正確な生理的効果は今までのところ明らかにされていない。チオニンを産生するいくつかの植物では、細菌や真菌に感染した場合にチオニンの発現増加が観察されている。この理由からチオニンは防御因子としていくつかの役割を果たしていると考えられた。それゆえに、真菌や細菌に対して強い抵抗性をもつ新種の経済性植物（例えば、米やトマト）を生み出すことを目的として、エンバク(Avena-sativa)からチオニン遺伝子を他のチオニンを産生しない経済性植物に組み込むことが行われた(US 5,942,663; US 6,187,995)。
【００１３】
例えば、大麦のアルファ−チオニン遺伝子配列をタバコのゲノムに組み込むことによって、シュードモナスサリンガ（Pseudomonas syringae） に対して抵抗性をもつタバコ種が創り出された(M.J. Carmona, A. Molina, J.A. Lopez-Fando and F. Garcia-Olmedo, Plant J. 3, 457-462 (1993)。チオニン類によるジャガイモ葉の植食性寄生生物の防止も記述されている(A. Molina, P.A. Groy, A. Fraile, R. Sanchez-Monge and F. Garcia-Olmedo, Plant Science 92, 672-679 (1993))。
【００１４】
チオニンを産生する遺伝子の組み込みによる、害虫に対して明らかに増大した抵抗性を有する多様の新種植物を生み出す方法が開発されている。これによって、人や環境を大きく汚染する農薬の使用が明らかに減少するであろう。チオニン類の高い有効性に加えて、この種の使用の重要な前提条件となるのはチオニン類が動物や人間に対して毒性が低いということである。ある特定のチオニンの有効性はそれぞれ特定の害虫や病原体に対してのみ極めて高い効果を有するので、さらに別の病原体に対しては新たなチオニン構造を見いださなければならない。
【００１５】
チオニン類は通常、動物や昆虫、細菌、酵母そして哺乳動物細胞に対して毒性があると頻繁に言われている(D.E.A. Florack and W.J. Stiekema, Plant. Mol. Biol. 26, 25-37 (1994))。しかし、単一のチオニンは他のチオニンと互いに著しく異なる毒性を有する特徴があり、その違いはチオニンの構造とそのわずかな投与方法の違いによる。例えば、ビスコトキシンＢはその構造が明らかにより毒性の強いビスコトキシンＡ−１のアミノ酸配列のわずか４アミノ酸だけが異なるだけであるにもかかわらず毒性が低い。異なるチオニンの毒性は一般的にはアルカリイオンの細胞膜の透過により細胞の壊死が引き起こされることにより説明される。細胞レベルでの作用機構はいくつかの事例で詳細に調べられた。例えば、パイルラリアチオニンによる膜イオンチャンネルの形成などがある(Hughes P. et al J. Biol. Chem. (2000) 275, 823-827)。しかし、最近おこなわれた研究で、ビスコトキシンはヒトリンパ球に毒性があるが、小麦由来のプロチオニンは同じヒトリンパ球に毒性効果を有しないことが示された(Bussing A. et al. Eur. J. Biochem. (1999) 262, 79-87)。
【００１６】
相当な量のチオニン類が、食品に使用されるたいていのトウモロコシ種に残存しており、非常に多くの飼料や食料品にも含まれている。これらチオニン類の経口摂取における毒性は人間や動物にはたいていの場合それほど大きくないことがわかっている。おそらくは腸管におけるチオニン類の分解やオーブンでの熱分解のためであろう。
【００１７】
純物質としてのチオニンや規格化された純粋なチオニン類混合物を直接的な人間への治療に使用することは今までのところ技術文献に記載されてはいない。
【００１８】
アジュバント癌療法に長期にわたって使用されているヤドリギ(Viscum album)からの調製物にはビスコトキシン類と称されるチオニン類がわずかに含まれていることが知られている。しかしながら、これらビスコトキシン類の腫瘍学的な効果に関しては信頼できる知見がない。ビスコトキシン類はヤドリギ調製物の癌療法の効果には直接的な関連はないと明確なまでにいう専門家もいる(US 5,547,674)。
【００１９】
この理由のために商用的に利用されるヤドリギ調製物ではそのビスコトキシン含量の規格化はなされていない。その実際的なビスコトキシン濃度は変動するが、すべての場合で1μg/mLの限界以下である。ヤドリギ抽出注射溶液2-4mLの通常投与量から最大で一日あたり0.004mgのビスコトキシンを患者は投与されることになる。哺乳動物の場合にLD50 = 0.1-1 mg/kgと測定されたビスコトキシン毒性値を用いると、実際には、大人の場合（体重70kg）に腫瘍細胞を死に導きうる程度の細胞傷害性効果を得ることはできない。
【００２０】
技術文献ではヤドリギ調製物の腫瘍学的効果は主として抽出物に含まれるレクチン類（糖結合性蛋白類）にあると考えられている(DE 4 221 836)。これらヤドリギのレクチン類は低い投与量（１ng/kg）で免疫刺激的な効果を示し、そのことはインビトロの数回の実験により確認されている(EP-A-0 602 686)。その結果、商用的に利用されるヤドリギ調製物の中にはヤドリギのレクチン類の含量を規格化したものがある。それにもかかわらず、純粋に精製されたヤドリギのレクチン類のインビボでの癌治療効果は確認できていない。このために、ヤドリギの多糖類や未だ同定されていない別のヤドリギ抽出物成分の寄与を仮定する専門家もいる(J.R. Ochocka and A. Piotrowski, Can. J. Plant Pathol. 24, 21-28 (2002))。
【００２１】
最近、対照の腫瘍に対してより低い濃度で観察されたパイルラリアチオニンの免疫刺激効果の利用が提唱された(WO 02/22159)。WO 02/22159では強い免疫刺激性を有するIL-2をチオニンに併用することも記載されている。これに関連して、癌細胞は正常細胞よりもずっと増殖性が高いという知見によれば、強いが非特異的な免疫刺激は癌細胞の増殖をも高めてしまうことが懸念される。
【００２２】
正常細胞に対してよりも癌細胞に対して明らかにより強い毒性を有するチオニン類は癌治療に特に適しているであろう。しかし、そのようなチオニン類は今までのところ同定されていない。パイルラリアチオニンを特定のCD5+ 抗体に結合させることが提唱されている(WO 96/41608)。CD5は癌細胞への特異的な標的になるものである。この複合体は今後癌細胞の選択性の制御に用いられるだろう。
【００２３】
癌とは互いに同質の疾病ではなく、200以上の異なる悪性の疾病を総称した言葉である。ほとんどすべての組織は癌に似た変性、ときにはいくつかの異なる類型の変性さえ引き起こしうる。この相違にもかかわらず、明らかにすべての腫瘍は類似した基礎的過程による変性を通じて発生する。
【００２４】
確立された癌治療はこの疾病の基礎的特性、すなわち増殖、浸潤、そして転移を根拠にしようとしている。癌治療においては化学療法は外科および放射線処置に加えて利用される非常に重要な手段である。特定の悪性腫瘍（精巣癌）では細胞増殖抑制剤を用いて良好に治療されうる。不幸にも悪性腫瘍が併発した場合（直腸癌に加えて乳癌、肺癌、前立腺癌）ではたいていの場合化学療法手段では治すことはできない。腫瘍の進展を止めることができなければ、癌細胞はますます強大になり、特定の段階からは癌細胞自体が拡散しはじめ（転移）、手術不能となるまで重要な器官を致命的に破壊する。その結果、患者は死に至る。
【００２５】
非特異的な作用による細胞侵害性の癌治療の根本的な不都合は多数の健康な細胞までをも殺傷してしまうことにある。このためにその使用に際しては重篤な副作用を考慮するのである。実際の化学療法のもう一つの不都合はその治療の間に使用された細胞増殖抑制剤に対して腫瘍細胞が抵抗性を獲得していくということである。このために適応される投与量の継続的な増量が必要となるとともに同時に有毒な副作用の増大につながり、あるいはいくつかの細胞増殖抑制剤を組み合わせた使用が必要となる。
【００２６】
エイズはHIVレトロウイルスの感染により引き起こされるT4リンパ球やさらにその他の免疫細胞の慢性的な破壊をともなう複雑な疾病症候群である。エイズと称される広く知られた免疫不全は免疫系が感染に対する攻撃力を失ってしまった後の場合にのみあてはまる。エイズの段階では患者は異なる、ほんのわずかな感染に対しても免疫防御力がなくその疾病の結果、死亡することになる。
【００２７】
ポリペプチドに加えて細胞性および体液性の免疫作用の調節に関係ある因子の探索によって、最近新たな種類の亜酸化炭素誘導体（carbon suboxide）が見いだされた(DE 196 00 301, EP 0874 851)。無機化合物である亜酸化炭素C3O2から得られたこれら天然の化合物は免疫グロブリン（Ig）やFc受容体といった一定の免疫学的に重要な蛋白質ととりわけ驚くべき特異的な相互作用をもつという特徴がある。さらに、これら亜酸化炭素誘導体はここに述べたペプチドだけでなくその他の高いシステイン組成を有するペプチドについてもその薬理学的毒性学的な特性に大きく影響を及ぼしうることが突き止められた。
【発明の開示】
【００２８】
本発明の目的はペプチド類の提供、すなわち、細菌、真菌、ウイルスその他の病原体に対して植物、動物あるいは人間生体が生まれながらにもつ防御機能を支えるペプチドの提供にある。この目的は、独立請求項１記載のシステイン含有ペプチド類、独立請求項１４記載の核酸配列、独立請求項１７記載の誘導体類、独立請求項１８記載の遺伝子ベクター、独立請求項１９記載のモノクロナール抗体、独立請求項２８記載の医薬組成物、独立請求項３４記載の薬剤、独立請求項３６、３８および４０記載の方法、の発明によって解決される。さらに発明の有利な点、詳細、設計が従属請求項、発明の説明、図面より示される。
【００２９】
発明のペプチドの構造は以下の通りアミノ酸の一文字コード表記で記される。すなわち、
Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン 
である。
【００３０】
ペプチドの二次、三次、四次構造はそれぞれのペプチドを構成するアミノ酸の側鎖のタイプによって決定される。これに関していえば、天然に存在するアミノ酸はその側鎖のタイプによって特徴付けられるアミノ酸グループに分類することができる。脂肪族側鎖をもつアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、そしてイソロイシンである。水酸基のある脂肪族側鎖をもつアミノ酸はセリンとトレオニンである。芳香族側鎖をもつアミノ酸はフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンである。塩基性側鎖をもつアミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンである。酸性側鎖をもつアミノ酸はアスパラギン酸とグルタミン酸である。アミド側鎖をもつアミノ酸はアスパラギンとグルタミンである。側鎖に硫黄をもつアミノ酸はシステインとメチオニンである。アミノ酸プロリンは第二級アミンを有し上述のいずれの分類にもあてはまらない。三次元構造へ影響を及ぼしこれにより生物学的な効力へも影響を及ぼすことの特段の意義は、特に水酸基を含むアミノ酸のエステル誘導体の形成によってもたらされることである。エステル体の形成はリン酸を用いておこなうことができる。このような誘導体の作製は化学合成的にまたはいわゆるホスホキナーゼを用いて酵素反応的におこなうことができる。
【００３１】
本発明は以下の構造を有するシステイン含有ペプチド類のことをいう。すなわち、XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXQXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX  の構造、XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXTXXCXXXXXX   の構造、そしてXXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXXXXXCXXXXXX  の構造である。ここで、Xは置換可能な残基を表す。すべてのXは互いに独立に選択され、かつ上述の天然に存在するあらゆるアミノ酸を意味する。
【００３２】
天然に存在するアミノ酸としては既存のL型アミノ酸に加えて、D型アミノ酸並びにアミノ酸誘導体類、例えば4-ヒドロキシプロリン、N,N,N-トリメチルリジン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、Ο-フォスフォセリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N-アセチルリジン、ω-N-メチルアルギニン、シトルリン、オルニチンといったものも含まれる。
【００３３】
ジスルフィド架橋は好ましくは下記のシステイン間で形成され、その好ましい構造は次の通りである。
【００３４】
【化１】
2006524985.tif 000003
【００３５】
本発明の特に好ましい態様は上記一般構造のシステイン含有ペプチド類であり、ここで後述のアミノ酸がペプチドの一定の配置によって定義される。好ましくは、１位にアミノ酸Ｋ、および／又は２位にアミノ酸Ｓ、および／又は５位にアミノ酸Ｒ、および／又は６位にアミノ酸Ｎ、および／又は７位にアミノ酸Ｔ、および／又は８位にアミノ酸Ｌ、および／又は１０位にアミノ酸Ｒ、および／又は１１位にアミノ酸Ｎ、および／又は１３位にアミノ酸Ｙ、および／又は１７位にアミノ酸Ｒ、および／又は２０位にアミノ酸Ｇが配列される。
【００３６】
さらに好ましくは構造１を有する以下のペプチドであり、構造
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXQXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX,
についてそれぞれ、１５位にアミノ酸Ｇ、および／又は１９位にアミノ酸Ｔ、および／又は２７位にアミノ酸Ｑ、および／又は２８位にアミノ酸Ｒ、および／又は３１位にアミノ酸Ｄ、および／又は３３位にアミノ酸Ｉ、および／又は３４位にアミノ酸Ｈ、および／又は３５位にアミノ酸Ｖ、および／又は３６位にアミノ酸Ｔ、および／又は３７位にアミノ酸Ｔ、および／又は３８位にアミノ酸Ｔ、および／又は４３位にアミノ酸Ｓ、および／又は４４位にアミノ酸Ｈ、および／又は４６位にアミノ酸Ｓが配列される。
【００３７】
さらに好ましくは構造２を有する以下のペプチドであり、構造
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXTXXCXXXXXX,
についてそれぞれ、１５位にアミノ酸Ｇ、および／又は１９位にアミノ酸Ｔ、および／又は２３位にアミノ酸Ｑ、および／又は２７位にアミノ酸Ｑ、および／又は２８位にアミノ酸Ｒ、および／又は３１位にアミノ酸Ｄ、および／又は３３位にアミノ酸Ｉ、および／又は３４位にアミノ酸Ｈ、および／又は３５位にアミノ酸Ｖ、および／又は３６位にアミノ酸Ｔ、および／又は３８位にアミノ酸Ｔ、および／又は４３位にアミノ酸Ｓ、および／又は４４位にアミノ酸Ｈ、および／又は４６位にアミノ酸Ｓが配列される。
【００３８】
さらに好ましくは構造３を有する以下のペプチドであり、構造
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXXXXXCXXXXXX,
についてそれぞれ以下のアミノ酸の組み合わせである。
【００３９】
【化２】
2006524985.tif 000004
【００４０】
【化３】
2006524985.tif 000005
【００４１】
【化４】
2006524985.tif 000006
【００４２】
【化５】
2006524985.tif 000007
【００４３】
【化６】
2006524985.tif 000008
【００４４】
さらに好ましくは構造４を有する以下のペプチドであり、構造
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX,
について、それぞれ以下のアミノ酸の組み合わせである。
【００４５】
【化７】
2006524985.tif 000009
【００４６】
【化８】
2006524985.tif 000010
【００４７】
【化９】
2006524985.tif 000011
【００４８】
【化１０】
2006524985.tif 000012
【００４９】
略称ASはアミノ酸を示す。
【００５０】
特に好ましくは以下の構造のシステイン含有ペプチド類、
KSCCRNTLGRNCYNGCRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS
(ヘレチオニン−Ａ), 
KSCCRNTLGRNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS
(ヘレチオニン−Ｂ１), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS 
(ヘレチオニン−Ｂ２), 
KSCCRNTLGRNCYNACRLPGTPQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR
(ヘレチオニン−Ｂ３), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGTSQPYCARLCDCIHVTTPTCPSSHPR 
(ヘレチオニン−Ｂ４), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR 
(ヘレチオニン−Ｂ５), 
KSCCRNTLARNCYNVCRFGGGSQAYCARFCDCIHVTTSTCPSSHPS 
(ヘレチオニン−Ｂ６), 
KSCCRNTLGRNCYNACRLTGTSQATCATLCDCIHVTATTCRPPYPS 
(ヘレチオニン−Ｃ), 
KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGILCDCIHVTTTTCPSSHPS 
(ヘレチオニン−Ｄ), 
KSCCRNTLGRNCYAACRLTGLFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS 
(ヘレチオニン−Ｅ１)                                                     および
KSCCRNTLGRNCYAACRLTGTFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS 
(ヘレチオニン−Ｅ２)    である。
【００５１】
特に好ましくは前述のヘレチオニン類の後述の誘導体類、例えばヘレチオニンＡ、ヘレチオニン−Ｂ１、ヘレチオニン−Ｂ２、ヘレチオニン−Ｂ３、ヘレチオニン−Ｂ４、ヘレチオニン−Ｂ５、ヘレチオニン−Ｂ６、ヘレチオニン−Ｃ、ヘレチオニン−Ｄ、ヘレチオニン−Ｅ１、ヘレチオニン−Ｅ２の誘導体類で、下表にあげるとおり以下のアミノ酸（初期AS）が別のアミノ酸（置換AS）に置き換わっているものがあげられる。
【００５２】
【化１１】
2006524985.tif 000013
【００５３】
さらにペプチドミメティクスの使用も可能である。この場合は化学物質が関わり、それが前述のペプチドのひとつを模することとなる。
【００５４】
本発明はエステル誘導体、アミド誘導体、塩誘導体、環状誘導体、そして上述のペプチドの改良された主鎖を有する誘導体も含まれる。
【００５５】
カルボン酸基を有するアミノ酸は、例えば塩、またはエステル、好ましくはC1-C16エステルあるいはアミドに置き換えることができ、任意に１あるいは２つのアルキル部分、好ましくはC1-C16アルキル部分をともなう。水酸基は、例えばチロシンやセリンの水酸基はエステルやエーテルに置き換えることができる。さらに、アセタール化、ケタール化、あるいはカルボネート化も可能である。これらの部分は1から16の炭素原子からなることが好ましい。さらに、その他知られたすべてのOH保護基を利用することができる。保護基に用いられるアルキル部分はさらに、例えばハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボニル基、チオール基、アリル基、分岐アルキル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミド基、および／またはエステル基に置き換えることができる。
【００５６】
特に非常に好ましい本発明の範囲は、システイン含有ペプチドのヘレチオニンＡ、ヘレチオニン−Ｂ１、ヘレチオニン−Ｂ２、ヘレチオニン−Ｂ３、ヘレチオニン−Ｂ４、ヘレチオニン−Ｂ５、ヘレチオニン−Ｂ６、ヘレチオニン−Ｃ、ヘレチオニン−Ｄ、ヘレチオニン−Ｅ１、ヘレチオニン−Ｅ２、並びにシステイン含有ペプチド化合物の１５箇所まで、およびこれらシステイン含有ペプチド化合物の誘導体類の１５箇所までで、それぞれにアミノ酸の変異をともなうこれらシステイン含有ペプチド類の誘導体であり、ここで、システインは位置や型に関わらず変異を受けない。特に好ましくは、アミノ酸変異がペプチド化合物類およびその誘導体類それぞれの１３箇所まで、１１箇所まで、９箇所まで、７箇所まで、５箇所まで、４箇所まで、３箇所まで、２箇所まで、１箇所のみの場合である。
【００５７】
システイン含有ペプチド化合物類、ヘレチオニンＡ、ヘレチオニン−Ｂ１、ヘレチオニン−Ｂ２、ヘレチオニン−Ｂ３、ヘレチオニン−Ｂ４、ヘレチオニン−Ｂ５、ヘレチオニン−Ｂ６、ヘレチオニン−Ｃ、ヘレチオニン−Ｄ、ヘレチオニン−Ｅ１、ヘレチオニン−Ｅ２、並びにこれらシステイン含有ペプチド化合物類の誘導体類が上述のアミノ酸誘導体のひとつであることを特徴とし、かつ同時に１位にアミノ酸Ｋ、および／又は２位にアミノ酸Ｓ、および／又は５位にアミノ酸Ｒ、および／又は６位にアミノ酸Ｎ、および／又は７位にアミノ酸Ｔ、および／又は８位にアミノ酸Ｌ、および／又は１０位にアミノ酸Ｒ、および／又は１１位にアミノ酸Ｎ、および／又は１３位にアミノ酸Ｙ、および／又は１７位にアミノ酸Ｒ、および／又は２０位にアミノ酸Ｇが配列されると特に好ましい。
【００５８】
本発明の特に好ましい態様は上述の一般構造を有するシステイン含有ペプチド類であり、ここでアミノ酸はペプチドの特定の位置に配列され、上記に明示した特定のアミノ酸グループから選択される。好ましくは、１位は塩基性側鎖を有するアミノ酸、および／又は２位は水酸基をもつ脂肪族側鎖を有するアミノ酸、および／又は５位は塩基性側鎖を有するアミノ酸、および／又は６位はアミド側鎖を有するアミノ酸、および／又は７位は水酸基をもつ脂肪族側鎖を有するアミノ酸、および／又は８位は脂肪族側鎖を有するアミノ酸、および／又は１０位は塩基性側鎖を有するアミノ酸、および／又は１１位はアミド側鎖を有するアミノ酸、および／又は１３位は芳香族側鎖を有するアミノ酸、および／又は１７位は塩基性側鎖を有するアミノ酸、および／又は２０位は脂肪族側鎖を有するアミノ酸が配列された、ペプチド類である。
【００５９】
本発明には上記一般構造のペプチド類にその末端あるいは両端に機能的な改変を施したものも当然に含まれる。特に、より長鎖のペプチド類も含まれ、例えば、ペプチドや上述の一般構造を超えるアミノ酸鎖などである。このように本発明によるペプチド類はより大きなペプチドの一部分に過ぎないような場合がある。本発明によるペプチド類の機能性、そしてその効力性はこれらの機能的な改変によって大きな影響を受けることはないであろう。
【００６０】
本発明による構造１−４並びに本発明による
XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXQXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX, XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXTXXCXXXXXX XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXXCXXXCXCXXXXXXXXCXXXXXX  の配列式のペプチド類が本発明に含まれるが、１位のXの前、および／又は４６位と４７位のXの後にそれぞれ任意の末端基あるいはさらに５０アミノ酸残基までの糖ペプチド鎖を特徴とするものを付加したものも含まれ、好ましくは３０アミノ酸残基までのものであり、さらに好ましくは１５アミノ酸残基までであり、特に好ましくは７アミノ酸残基までのものである。
【００６１】
さらに本発明はその核酸配列を含み、それは上述のシステイン含有ペプチド類をコードするものであり、その対応するRNA配列およびDNA配列、並びにその対応するアンチセンスDNAおよびアンチセンスRNAをも意味する。本発明はDNAベクターおよびDNA構成物をも含み、それは本発明によるペプチドに対応するcDNAまたはDNA並びに必要に応じて相応のプロモーターおよびエンハンサーを含む。
【００６２】
加えて、モノクロナール抗体も含まれ、それは上述のシステイン含有ペプチド類の抗原決定基に対して結合するものである。
【００６３】
本発明による高いシステイン組成を有するペプチド類はそれぞれ４６と４８のアミノ酸残基から構成される。その位置の計算はアミノ酸鎖のNH2末端から数える。
【００６４】
上述のヘレチオニン類のうち、ヘレチオニンＡ（HT-A）、ヘレチオニンＣ（HT-C）、ヘレチオニン（HT-D）と称するペプチドは以下に述べる方法によりそれぞれ単離された。ヘレチオニンＢとヘレチオニンＥの場合には、いくつかのアイソフォームが存在するが、６つのアイソフォーム（HT-B1、HT-B2、HT-B3、HT-B4、HT-B5、HT-B6）と２つのアイソフォーム（HT-E1、HT-E2）のアミノ酸配列がそれぞれ同定された。本発明によるペプチド類は純物質として、アイソフォームの混合物として、あるいは一またはそれ以上の他のヘレチオニンとのアイソフォーム混合物として使用することが可能であり、好ましくはいくつかのヘレチオニン類の混合物として使用できる。
【００６５】
単離されたあるいは合成的につくられた本発明のペプチド類のアミノ酸配列はエドマン法によるペプチド鎖の連続的分解とPTH（フェニルチオヒダントイン）誘導体の二次元HPLC同定により決定された。この方法の場合に通常用いられるペプチドの酵素的切断はペプチドの増加された酵素的安定性のために直接的に用いることはできなかった。このために初めにビニルピリジオンを用いたジスルフィド結合の還元と開裂がそれぞれ必要とされる。
【００６６】
本発明によるペプチド類のアミノ酸組成の別の確認として分子量測定をおこなった。この目的のためESI(electro-spray-ionization)やMALDI  (matrix-assisted-laser-desorption-ionization)の質量分析技術が用いられた。
【００６７】
NMRスペクトルにより決定されたペプチドHT-Dの三次元構造を図１に示す。全体構造はギリシア大文字ガンマ(Γ)の形に類似している。この構造類推における長手部はねじれながら二つのへリックスが形成されており、これに対して短手部は短いベータシートからなる。その両へリックスは１７位と２４位のアミノ酸間でループを形成してつながっている。
【００６８】
本発明のペプチド類の安定性には、３位−４０位（又はそれぞれ４２位）、４位−３２位、１２位−３０位（又はそれぞれ３１位）、そして１６位−２６位（又はそれぞれ２７位）のシステイン間での４つのジスルフィド結合が特に寄与している。この結果得られる蛋白分解酵素や他の酵素に対しての並はずれた安定性はここに記述するペプチドの使用に重要な意味をもつ特有の性質である。
【００６９】
本発明の範囲における好ましいペプチド類はアミノ酸配列の驚くべき高い保存性を特徴とする。この保存性は３６箇所までに関係し、よって全配列の約３／４となる。ポリペプチド鎖の組成における変異はおおよそ１５箇所またはそれ以下に限定される。
【００７０】
特に、システイン残基の位置は不変であり、本発明によれば、３位、４位、１２位、１６位、２６位またはそれぞれ２７位、３０位またはそれぞれ３１位、３２位、そして４０位またはそれぞれ４２位、に位置する。HT-E1およびHT-E2と称するペプチドの配列では、最後の３つのシステインは各１箇所（２６位の代わりに２７位）（３０位の代わりに３１位）、または２箇所（４０位の代わりに４２位）が置き換わっている。システイン残基は２つ一組になってジスルフィド結合により結合している。好ましくは、本発明のペプチド類における多数のシステイン残基の可能な組み合わせから、３→４０（又はそれぞれ４２）、４→３２、１２→３０（又はそれぞれ３１）、そして１６→２６（またはそれぞれ２７）の結合が形成され、それにより本発明によるペプチド類に一定の二次構造が形成される。
【００７１】
本発明によるペプチド類の使用にはいままでに知られた３つのジスルフィド結合を有するチオニン類に比較していくつかの利点がある。まず第一に、システイン架橋が追加されたために本発明のペプチド類は蛋白分解酵素に比べて安定性が向上し、またその結果、例えば既に述べたビスコトキシン類によりも低い免疫原性を示す。本発明によるペプチド類の更なる利点は水に対して驚くべき良好な溶解性にあり、それ故に達成されるより良い生物学的利用能にある。この利点は今までに知られた４つのジスルフィド架橋をもつチオニン類と比較して特に明らかである。例えば、プロチアニン類やアベノチアニン類またはホルドチアニン類といった４つのジスルフィド架橋をもつ既に述べたチアニンペプチド類は強い塩基性と脂肪親和性を有し、そのため水にはほとんど溶解しない。それらは石油エーテルのような無極の溶媒によって同様の穀物の種子から抽出される。このためにこれらペプチド類の水溶液は作製が困難であり、かつ使用が困難である。
【００７２】
−本発明によるペプチド類の単離と調製−
本発明は本発明によるシステイン含有ペプチド類の抽出法も含まれる。本発明による方法としてはヘラボラス（Helleborus）植物種の抽出法があげられる。この場合に特に好ましいのは、無極性溶媒または無極性溶媒の混合液を用いて植物原料を脱脂することであり、特にはt−ブチルメチルエーテルを使用して抽出法の第一段階として実施する。本発明による高いシステイン組成を有するペプチド類または本発明によるペプチド類混合物はラナンカレイシ科(Ranunculaceae)（バターカップ科）の植物から単離され、好ましくはヘラボラス（Helleborus）属（クリスマスローズ）の植物からである。空気乾燥された原料、好ましくは植物の地中部分（根や根茎）が単離に使用される。まず初めに、好ましくは植物原料を無極性溶媒、好ましくはTMB（t−ブチルメチルエーテル）を用いて脱脂する。その脱脂され空気乾燥された根を、有機アルコール／酸の混合液好ましくはメタノール／ギ酸、あるいは水を含んだ混合溶媒好ましくは水／エタノールで抽出し、続いて、それぞれ希釈した酸好ましくは0.1−12%の酢酸で抽出する。
【００７３】
フィルターろ過された抽出液を減圧下で初めの容量の1/10まで濃縮し、その後吸着剤で、好ましくは活性炭素で処理する。ろ液は減圧下濃縮し、乾燥残留を最少量の水に溶解する。その水溶液のｐH を酸性領域、好ましくはｐH0.1−3.0に希塩酸を用いて調整する。その水溶液を数倍、好ましくは10倍量の冷却した有機溶媒にまたは溶媒混合液に、好ましくはエタノール／アセトン １：３ にあわせる。生成した薄い黄色の沈殿物をろ取し、真空乾燥し、この後の精製工程に使用する。
【００７４】
もう一つの本発明によるペプチド類の抽出方法はイオン交換樹脂、好ましくは弱酸イオン交換樹脂への選択的な結合によりおこなわれる。樹脂に結合したペプチドは強イオン溶液、好ましくはＨＣｌまたはＮａＣｌで処理することにより遊離する。
【００７５】
本発明によるペプチド類の単離は特別な固相への選択的な結合によってもおこなうことができ、好ましくは抗原抗体反応あるいは類似した高い特異的な相互作用によって特に選択的な単離のできる固相があげられる。
【００７６】
本発明によるペプチド類の別の抽出法は予備的なスケールで高速液体クロマトグラフ（HPLC）を用いてその天然混合液を分離することによりおこなわれる。溶離剤として直線的なグラジエントをかけたアセトン／水混合液を使用する。pHは強酸、好ましくはトリフルオロ酢酸を添加することによりpH1から1.5の間に調整する。
【００７７】
さらに本発明は本発明によるシステイン含有ペプチド類の合成的な産生の方法およびペプチド合成によって得られたこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類をもいう。本発明によるペプチド類の合成的産生は個々のアミノ酸ビルディングブロックの段階的なカップリングによりおこなわれる。それゆえ自動的なペプチド合成法が用いられ、この場合固相による方法や液相による方法が好ましい。その方法はM. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis (B.M. Trost Edit.) Springer Verlag 1994 に詳細に記載されている。
【００７８】
さらに本発明は遺伝子工学の手法による本発明のシステイン含有ペプチド類の産生を含む。好ましくは植物の、好ましくは高等蛋白を産出する穀物種の遺伝子材料に本発明のペプチド類の遺伝子を組み込むことによる遺伝子工学的産生をいう。特に好ましい態様としてチオニンを産生する穀物のチオニン遺伝子をヘラボラス（Helleborus）植物種のチオニン遺伝子に置き換えることがあげられる。
【００７９】
本発明によるペプチド類の産生は形質転換したcDNA配列の発現によっても可能である。明らかにされたDNA配列（cDNAクローンとして、ゲノムDNAクローンとして、あるいはオリゴヌクレオチド合成により調製されたDNA配列によって）は生物学的な方式により発現されうる。本発明のシステイン含有ペプチド類の発現のための好ましい生物学的な方式はシェードモナス属大腸菌または酵母菌のようにある一定の容易に利用可能な微生物の培養系である。
【００８０】
植物の細胞培養は、そこは本発明のペプチド類をコードした遺伝子配列を組み込んだものであるが、本発明によるペプチド類の産生に良好な成果も提供する。公知の方法が植物細胞の形質転換に使用される。好ましくは、アグロバクテリウム属のTiプラスミド、エレクトロポレーション、あるいはマイクロインジェクションが用いられる。その遺伝的に改変された植物細胞は植物として再生もされ、その中では本発明のペプチド類をコードした遺伝子配列が安定にゲノムに組み込まれたままである。
【００８１】
医薬分野での本発明によるペプチド類の使用のために、ペプチド類の特別な化学的修飾をすることもでき、そのことによって生物学的利用能の増加がもたらされる。この故に本発明は大環状化合物に変換することによる本発明のペプチド類の化学的改変にも関する。好ましくは始点と終点のアミノ酸間でまたはペプチド鎖の両端の近傍で付加的な結合により閉じることによって得られる大環状化合物があげられる。その合成された大環状ペプチドは有利な生理的特性を特徴とし、特に蛋白分解酵素やその他の酵素に対して安定性が増している。環状化合物の調製のためには確立された試薬としてカルボジイミド、特に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド (EDAC)が用いられる。
【００８２】
本発明の範囲には標的とする一またはそれ以上のアミノ酸単位を天然のまたは合成アミノ酸、好ましくはチロシンのような芳香族アミノ酸に置換することによってヘレチオニン類を改変することも含まれる。このようなアミノ酸配列の改変は本発明によるペプチド類のDNA配列を有する遺伝子セグメントを標的にした変異によっておこなうことができる。それに関して好ましい方法としてSPI(selective pressure incorporation)法がある(C. Minks et al. in Tetrahedron, 56 (2000) 9431-9442)。
【００８３】
一またはそれ以上のアミノ酸ビルディングブロックによるヘレチオニン類のわずかな化学的転換によって生じうる誘導体類も本発明の一部である。このような誘導体化は目標とするペプチドの治療上の特性変化をもたらす。好ましくはトレオニンやチロシンといった水酸基を有するアミノ酸のエステル誘導体やハロゲン誘導体への転換があげられる。遊離のCOOH部分を有するアミノ酸をエステル誘導体やアミド誘導体に転換することも本発明の一部である。遊離のアミノ基や他の機能的な官能基のアルキル化、好ましくはメチル化はより良い生物学的利用能につながり、このことも本発明の一部である。
【００８４】
−本ペプチドの用途−
本発明によるシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類とこれらペプチドの機能性を有する誘導体類の混合物は疾患の治療、特に病原体によって引き起こされた疾患の治療に用いることができる。
【００８５】
また、本発明によるシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類とこれらペプチドの機能性を有する誘導体類の混合物は細菌、真菌およびウイルスによって引き起こされた疾患の治療に用いることができる。
【００８６】
本発明によるシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類とこれらペプチドの機能性を有する誘導体類の混合物は特に人間および動物の、特に大動物、好ましくは馬の場合の疾患の治療に用いることができる。
【００８７】
本発明によるシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類とこれらペプチドの機能性を有する誘導体類の混合物を疾患、不完全な免疫系の調節によって引き起こされる、あるいは不完全な免疫系の調節をともなって引き起こされる疾患の治療に用いることに特に有利な効果を有する。
【００８８】
また、本発明によるシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類とこれらペプチドの機能性を有する誘導体類の混合物は、特に効果的に自己免疫疾患の治療、癌の治療、エイズの治療に用いることができる。
【００８９】
また、本発明には本発明による一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類および／又はこれらペプチド類の機能性を有する誘導体類を含有する医薬組成物が含まれる。特に好ましくはさらに少なくともひとつの亜酸化炭素誘導体を含む医薬組成物があげられる。
【００９０】
本発明の範囲においては、“亜酸化炭素誘導体”との用語では、天然の物質と理解され、文献（DE 196 00 301, EP 0 874 851 B1 , Kerek et al., Biochim. Biophys. Acta 1567, 213-220 (2002)）に記載されるように、それは無機化合物である亜酸化炭素C3O2に由来するものである。この点でDE 196 00 301とEP 0 874 851 B1の明細書を参照として本発明に取り入れている。したがって、本出願の範囲で亜酸化炭素誘導体と言えば、この用語はDE 196 00 301において述べられているすべての化学化合物が含まれる。亜酸化炭素誘導体の調製と特性もDE 196 00 301とEP 0 874 851 B1に記載されている。
【００９１】
このように本発明は、特に本発明による化合物の少なくとも一つと、上述の並びにDE 196 00 301、EP 0 874 851 B1、Kerek et al., Biochim. Biophys. Acta 1567, 213-220 (2002) に記載された亜酸化炭素誘導体の少なくとも一つを併用した調製物にも関する。
【００９２】
本発明は、疾患の治療、特に病原体によって引き起こされる疾患の治療のための医薬組成物の調製のための、本発明によるシステイン含有ペプチド類、これらシステイン含有ペプチド類の混合物、これらペプチドの機能性を有する誘導体類、および／又は医薬上許容されるこれらシステイン含有ペプチド類の塩類をも含む。
【００９３】
これに関連して癌の予防および／又は治療のための医薬組成物の調製には特段の有利な効果がある。例えば脈絡膜メラノーマ、急性白血病、聴神経鞘腫、膨大部癌、肛門癌、星状腫、基底細胞腫、膵臓癌、膀胱癌、気管支癌、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮体癌、CUPシンドローム、結腸直腸癌、小腸癌、小腸腫瘍、卵巣癌、子宮内膜癌、上衣細胞腫、上皮癌類、ユーイング腫瘍、消化管腫瘍、胆嚢癌、子宮癌、子宮頸癌、グリア芽細胞腫、婦人科腫瘍、咽頭腫瘍、鼻部腫瘍、耳腫瘍、血液腫瘍、有毛細胞白血病、尿道癌、皮膚癌、脳腫瘍（グリア細胞腫）、脳転移癌、精巣癌、リンパ節癌（ホジキン病／非ホジキン病）、脳下垂体腫瘍、カルチノイド、カポジ肉腫、喉頭癌、胚細胞腫瘍、骨癌、大腸癌、頭部および頸部腫瘍、結腸癌、頭蓋咽頭腫、口腔癌（口腔部の中および唇の癌）、肝癌、肝転移癌、白血病、眼瞼癌、肺癌、リンパ腫、胃癌、悪性黒色腫、乳癌腫、直腸癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、ホジキン病、菌状息肉腫、鼻癌、神経鞘腫、腎臓癌、非ホジキンリンパ腫、乏突起細胞腫、食道癌腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、形質細胞腫、前立腺癌、咽頭癌、直腸癌腫、網膜芽細胞腫、膣癌、甲状腺癌、シュネベルガ病、食道癌、脊髄性グリア細胞腫、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、胸腺腫、管癌腫、眼腫瘍、尿道癌、泌尿器腫瘍、尿路上皮癌、外陰癌、いぼ、軟部組織腫瘍、ウィルムス腫瘍、頸癌腫および舌癌である。
【００９４】
好ましくは関連のある癌は以下の群から選ばれるものであり、膀胱癌、乳癌、中枢神経の癌、大腸癌、胃癌、肺癌、皮膚癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、グリア細胞腫、前立腺癌、精巣癌、白血病、肝癌、腎癌そして上皮性癌類である。
【００９５】
本発明はさらに細胞増殖抑制剤とともに本発明による前述の化合物類の少なくとも一つを併用した調製物も対象とする。細胞増殖抑制剤として考えられるものは、アルキル化薬、細胞増殖抑制特性をもつ抗生剤、代謝拮抗薬、アルカロイド類、ポドフィロトキシン類、白金含有化合物、タキサン類、細胞増殖抑制活性化薬そしてモノクロナール抗体である。これら化合物分類の例示としては例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、トロフォスファミド、テモゾロミド、クロランブシル、メルファラン、ブスルファン、トレオスルファン、チオテパ、エストラムスチン、ニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ダカルバジン、プロカルバジン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、エビルビシン（４−エピアドリアマイシン）、イダルビシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シトシン、アラビノシド、チオグアニン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサルプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ヒドロキシカルバミド（ヒドロキシウレア）、イマチニブ、ミルテフォシン、アムサクリン、トポテカン（トポイソメラーゼＩインヒビター）、ペントスタチン、ベキサロテン、トレチノイン、アスパラギナーゼ、トラスツズマブ（ハーゼプチン(登録商標)）、アレムツズマブ（マブキャンパス(登録商標)）、リツキシマブ（マブセラ(登録商標)）があげられる。
【００９６】
本発明は、本発明による一またはそれ以上のシステイン含有ペプチド類および／又はこれらペプチドの機能性を有する誘導体類を含有する医薬も含まれる。特に好ましくはさらに加えて少なくともひとつの亜酸化炭素誘導体および／又はそれぞれ一つの細胞増殖抑制剤と細胞傷害性化合物を含む医薬である。
【００９７】
本発明によるシステイン含有ペプチド類は病原体に対する防御薬としてまた病原体によって引き起こされた感染症や疾患を制御する医薬上の主薬として用いることができる。特に、慢性的な免疫調節不全に特徴がある疾患、例えば自己免疫疾患、癌、あるいはエイズに使用できる可能性がある。本発明によるシステイン含有ペプチドは単剤として単独で用いることができるが、いくつかのペプチド類やあるいはその他既に知られた主薬と基質物質との混合物としても用いることができる。
【００９８】
本発明による併用した調製物ならびに医薬上の組成物は、それは少なくとも本発明による一つのペプチドを含有するものであるが、通常用いられる固体又は液体基質あるいは希釈液を用いて公知の方法により製造され、また予定される適当な用量を含有する剤型にあわせて一般に用いられる医薬上の補助剤が使用される。好ましい医薬上の組成物や調製物は経口投与や吸入に適した剤形である。そのような剤形として例えば錠剤、フィルム剤、層錠、被膜錠、カプセル、マイクロカプセル、丸剤、顆粒剤、散剤、溶液、分散液、懸濁液、坐剤、エマルジョン、分散液、ゲル、軟膏、シロップ、デポ剤、あるいは吸入溶液および吸入パウダーのそれぞれがあげられる。加えて本発明による医薬上の組成物は特殊な剤形として制御放出および／又は持続放出するための層錠並びにマイクロカプセル化した製剤を含む。
【００９９】
このような医薬上の組成物はとりわけ吸入、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜皮膚、経口、直腸、経皮、局所、皮内、胃内、皮内、膣内、鼻腔内、口腔内、経皮、あるいは舌下の適用に適している。特に有利な剤形は経口投与、注射並びに吸入に適応されるものである。
【０１００】
適する錠剤は、例えば本発明に適する化合物および／又はその塩を公知の補助剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニット、ポリビニルピロリドンのような賦形剤、コーンスターチやアルギン酸のような崩壊剤、スターチやゼラチンのような結合剤、ステアリン酸マグネシウムやタルクのような滑沢剤、および／又はカルボキシルポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、フタル酢酸セルロース又はポリビニル酢酸のような持続効果をもたらす剤を混合することにより得ることができる。錠剤はまた多層よりなることもある。
【０１０１】
また、丸剤は、錠剤と類似した方法によりつくられた核に、一般的にコーティングに使用される例えばポリビニルピロリドン、セラック、アラビアゴム、タルク、二酸化チタン、あるいは糖、をコーティングすることにより得ることができる。丸剤のコーティングはまた多層よりなることもできるが、錠剤で述べた補助剤をさらに使用することもできる。
【０１０２】
本発明による主薬を含有する液剤または懸濁剤はさらにサッカリン、シクラメートまたは糖のような矯味剤並びにバニラエキスやオレンジエキスのような香料を含むことができる。さらにはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような懸濁助剤やp-ヒドロキシベンゾエイトのような保存剤を含むことができる。主薬を含むカプセルは例えば主薬とラクトースやソルビトールのような賦形剤を混合し、ゼラチンカプセルに充填してつくることができる。
【０１０３】
適する坐剤は例えば中性脂質やポリエチレングリコールのような基質とその誘導体をそれぞれ混合することにより得ることができる。
【０１０４】
このような組成物はとりわけ吸入、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜皮膚、経口、直腸、経皮、局所、皮内、胃内、皮内、膣内、鼻腔内、口腔内、経皮、あるいは舌下の適用に適している。
【０１０５】
薬理的に許容される基質としては、例えばラクトース、スターチ、ソルビトール、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸２カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニット、エチルアルコール、およびその同等物を用いることができる。散剤並びに錠剤では5%から95%がこれらの基質で構成される。
【０１０６】
結合剤としては、さらにスターチ、ゼラチン、天然糖類、アカシアゴムやグアールゴムのような天然および合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、アルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよび蜜蝋を用いることができる。滑沢剤としてホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびその同等物を用いることができる。
【０１０７】
さらに崩壊剤、着色剤、芳香剤および／又は結合剤を医薬上の組成物に加えることができる。
【０１０８】
液体組成物としては溶液、懸濁液、分散液、噴霧液およびエマルジョンがあげられる。例えば、非経口注射用として水、または水−プロピレングリコール液よりなる注射液があげられる。
【０１０９】
坐剤の調製には好ましくは低い融点をもつ蜜蝋、脂肪酸エステルおよびグリセリドが用いられる。
【０１１０】
カプセルは、たとえばメチルセルロース、ポリビニルアルコール、あるいは変性ゼラチンやスターチから調製される。
【０１１１】
崩壊剤としては、スターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、例えばイナゴマメゴム、カラヤガム、グアールゴム、トラガカントゴムおよび寒天のような天然および合成ゴム、並びにメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロースのようなセルロース誘導体、並びにアルギン酸塩、粘土類およびベントナイトを用いることができる。これら成分は重量で2%から30%の量を用いることができる。
【０１１２】
結合剤として糖類、トウモロコシ、米、芋類から精製したスターチ、アカシアゴムのような天然ゴム、ゼラチン、トラガカントゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウムカルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、並びに珪酸マグネシウムアルミニウムのような無機化合物類を添加することができる。結合剤は重量で1%から30%の量を添加することができる。
【０１１３】
滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸カリウム、ステアリン酸、高融点蜜蝋類のようなステアリン酸塩類、並びに塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ポリエチレングリコールのような水溶解性滑沢剤、またロイシンのようなアミノ酸を用いることができる。これら滑沢剤は重量で0.05%から15%の量を用いることができる。
【０１１４】
本発明によるシステイン含有ペプチド類の好ましい利用は、とりわけ植物の細菌、真菌、ウイルス、あるいはその他の病原体に対する生体の防御力の維持にある。植物に取り込まれる栄養／液体に当該ペプチドを処方することによって、あるいは植物の葉の表面に当該ペプチドを含む溶液を塗ることによって利用することができる。
【０１１５】
本発明は本発明のペプチド類を発現する遺伝子配列を疾患の脅威にさらされる生物のゲノムに、好ましくは植物のゲノムに組込むことも含まれる。この遺伝子変換によってつくり出された新たな生物の増強された抵抗性によって、今までに知られた化学農薬よりも明らかにより悪影響を少なく、人間や環境を病原体から保護することができる。
【０１１６】
本発明によるペプチド類は、異なるタイプの病原体感染に対して他の生物、とりわけ動物体の予防強化のために類似の方法で使用することができる。このような利用によって、昆虫、線虫、その他の病原体保有物を首尾よく押さえ込む。その結果、病原体の移動と拡散のそれぞれが非常に効率的に防止され、病原体の作用が働く前に効果を発揮する。
【０１１７】
本発明によるペプチド類の別の利用としては生物、とりわけ病原体に既に感染した動物体に利用される。その結果、バクテリア、ウイルス、または他の感染による損傷は中和されあるいは少なくとも最少になる。この目的のために、本ペプチド又はその混合物はその個体のもつ防御力とともに明らかにより効果的な病原体の制御に用いられる。
【０１１８】
本発明によるペプチド類は人間および動物のいくつかの炎症促進性のサイトカイン、特にIL-2、IL-3、IL-4およびγ-IFNの顕著な発現減少をもたらす。このように本発明によるペプチド類は自己組織に対して、特に自己免疫疾患の場合において、自己攻撃的な作用の顕著な減少をもたらす。とりわけ、自己免疫病態をともなう皮膚疾患、とくに乾癬の治療において、本発明によるペプチド類の局所投与により有望な実験結果が得られている。
【０１１９】
抑制性サイトカイン、特にTGFベータの刺激によって、本発明によるペプチド類は一次的なヒト免疫細胞、特に自己免疫疾患の場合での病態的な過剰活性となっているヒト免疫細胞の活性低下をもたらすことができる。
【０１２０】
本発明のペプチド類によって、抑制的に作用しかつ潜在的な調節性サイトカインであるIL-10の産生刺激をもたらされ、炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカイン間の正常な均衡が再調整される。
【０１２１】
本発明によるペプチド類は悪性腫瘍細胞の増殖に対して効果的かつ部分選択的な阻害を及ぼす。このことは細胞増殖実験によって確認することができた。
【０１２２】
本発明には本発明によるペプチド類またはペプチド類の混合物を有効成分として含有する医薬上の組成物や医薬品も含まれる。本発明はさらに本発明によるペプチド類またはペプチド類の混合物を、少なくとも一つの既に知られた主薬と共に、および／又は薬剤的に許容されかつ適当な化合物や基質と共に、含有する医薬上の組成物や医薬品を含む。
【０１２３】
MCSと称する亜酸化炭素誘導体と共に本発明のペプチド類を用いることにより本ペプチドの生物学的利用能および免疫調節効果に明らかな改善がもたらされ、特に腫瘍への利用の場合に顕著である（実施例参照）。
【０１２４】
悪性腫瘍細胞を抑制する場合の選択性の向上のために本発明によるペプチド類を腫瘍特異性抗原に結合させることができる。好ましい態様によれば、配列HT-C1を有するペプチドはその抗体と結合するが、それはヒト前立腺癌細胞に対して産生され、アフィニティクロマトグラフにより単離された。その結合はカルボジイミドのような確立されたカップリング試薬、好ましくは1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド (EDAC)水溶液を使っておこなわれる。
【０１２５】
本発明によるペプチド類単剤の使用に比べて本発明によるペプチド類混合物の使用は明らかに有利な効果を有する。一つの薬物の存在に比較していくつかの主薬の混合により病原体の耐性獲得を妨害する。ペプチド遺伝子を組み込んだ転換遺伝子発現による生体防御および既に疾患にかかった個体へのペプチドの投与による疾患抑制の両方の場合にも同様の効果がもたらされる。
【０１２６】
このように本発明によるペプチド類は主薬として上述の方法により使用することができる。本発明によるペプチド類単独の使用に加えて、本発明によるペプチド類はいくつかのペプチドの混合物としての使用並びに他の物質と共に、特に亜酸化炭素誘導体とともに用いられる。
【０１２７】
本発明によるペプチド類はすべての利用類型において0.0001%乃至10%溶液、特には0.01%乃至1%溶液、特に好ましくは約0.2%溶液で用いられる。特に好ましくは水溶性ペプチド混合物の使用である。治療では例えば一日あたり水溶性ペプチド溶液3 X 10mL の投与を行うことができる。
【０１２８】
本発明によるペプチド類は人間、動物、あるいは植物に純粋な化合物として又は医薬上の組成物として取り扱われて投与されることができるが、組成物の場合には治療上有効な用量で基質や希釈剤と混合して投与される。このような治療上有効な投与比率は別々に分けて投与したり、あるいは他の治療薬と組み合わせて投与したりすることができる。これに関連して言えば、癌治療への使用の場合には、細胞増殖抑制剤といった抗増殖剤、抗血管新生剤、あるいは5FUやシスプラチンといった細胞傷害性の抗腫瘍剤、あるいはFlk-1/KDR 阻害剤であるCGP 79787といったプロテインキナーゼ阻害剤も考えられ、さらに、Go7612といったインドロカルバゾール類化合物、LY 333531, GF109203x, Ro 32-0432, Ro 31-8220といったビスインドリメイルイミド類化合物、SPC 100840といったバラノール誘導体類化合物、CGP 64128A やVEGFアンチセンスオリゴヌクレオチドといったアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド類化合物、ET-18-OCH3といったアルキルリゾホスホリピド類化合物、抗HER2/neu 抗体といった増殖因子受容体活性化阻害剤、トラスツズマブ（ハーセプチン）、PQ 153035, ZD 1839 , CP-358774のフェニルアミノチナゾリン類化合物といった増殖因子受容体キナーゼ活性阻害剤、PD 158780, PD 166285, CGP 59326, CGP 60261, CGP 62706といったピリド−、ピロロ−、ピラゾロ−、ピリミド−、そしてフェニルアミドピリミジンを含むピリミジン置換体類化合物、チロフォスチン類AG1478, RG 13022, AG 825の化合物、ラベンドスチンAといったラベンドスチン類化合物、CGP54698といったジアニリノフォタルイミド類化合物、並びにPD098059, U0126 または SB203580といったMAPKKK阻害剤、MAPKK阻害剤、 MAPK 阻害剤、インターフェロンアルファ、組換血小板第４因子、アンジオテンシンまたは多価陰イオン化合物スラミンの群から選択される化合物があげられる。本発明には本発明によるペプチド類と上記化合物のいずれかとの組み合わせも含まれる。
【０１２９】
本発明によるペプチド類の処方、投薬の技術については、"Remington's Pharmaceutical Sciences"   Mack Publishing Co.  Easton PA を参照することができる。本発明によるペプチド類のいずれかを含む組成物は、本発明によるペプチド類が溶解した溶液状態でもよく、液剤やその他の処方、錠剤、丸剤、被膜錠、カプセル剤、ゲル剤、シロップ、スラリー、懸濁剤およびその類似物でもよい。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
−発明の具体化の方法−
本発明は図を用いて本文中の実施例に基づいて以下により詳細に説明する。
【実施例１】
【０１３１】
ペプチド混合物の抽出
約10kgの粗く破砕したヘラボラス ニジェール（Helleborus niger）（ラナンカレイシ科(Ranunculaceae family)）の根または根茎を、50LのTBM／ヘキサン混液（１：１）に６時間処理する。脱脂され空気乾燥された植物原料を室温にてわずかに攪拌しながら約24時間60Lの50%エタノール液で２回抽出する。抽出したアルコール／水溶液を合一し、70℃にてロータリーエバポレータで減圧下濃縮し、乾燥するまでおこなう。乾燥残留物を3Lの0.05N 塩酸で３回処理し、得られた水性エマルジョンを合一し、引き続きそれぞれ10Lのヘキサン、クロロホルム、TBMで抽出する。水層を減圧下約10Lに濃縮し、約200gの活性炭で（２時間）処理する。ろ液を減圧下1.0Lまで濃縮する。その水性濃縮液を1N塩酸溶液を用いてpH1.2に調整し、十分に攪拌しながら10倍量の冷やした（10℃）アセトンに注ぐ。生成する白色沈殿物を遠心分離により上清から分離し、減圧下で乾燥する。その後、その乾燥沈殿物を最少量の水に溶解させ、攪拌条件下で約10倍量の冷やしたアセトンに注ぐ。この沈殿操作をもう一度繰り返して、その結果、水に溶解したシステイン含有ペプチド混合物が得られ、凍結乾燥する。
【０１３２】
本発明によるペプチド類混合物はHPLC（図２）の特徴がある。長さ250mm、内径 21mm のヌクレオシール 100-7, C-18カラム（マケーリーナーゲル デューレン）を用いた。3ml/minの流速で、アセトニトリルを25分間で20%から50%に直線的にグラジエント溶出条件にて、本発明によるペプチド類が次の通り溶出する。
【０１３３】
ヘレチオニンA     14.4分
ヘレチオニンB1からヘレチオニンB6  16.1分
ヘレチオニンC     16.9分
ヘレチオニンD     18.3分
ヘレチオニンE1, ヘレチオニンE2   20.1分
【実施例２】
【０１３４】
純粋なペプチドHT-Dの抽出
約１kgの粉砕したヘラボラス パーパラセンス(Helleborus purpurascens)の根を４時間40℃にて10Lの希酢酸（水に5%）で抽出する。ろ液を1Lまで減圧下濃縮する。その後、約400gの硫酸アンモニウムをその濃縮液に溶解する。生成する沈殿物を遠心分離により分離し、最少量の水に溶解させ、それから3.6Lのアセトンと1.4Lのエタノール混液に十分な攪拌しながら加える。アセトン／エタノール混液での沈殿生成を２回繰り返し、その結果、水に溶解した未精製ペプチド混合物が得られ、凍結乾燥する。
【０１３５】
その後、ヘラボラス(Helleborus)種より得られたペプチドの凍結乾燥未精製混合物５gを0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する100mlの20%アセトニトリル／水溶液に溶解し、準備された高圧液体クロマトグラフ（HPLC）によって個々の成分に分離する。このためにサンプル溶液を等量に分けて長さ250mm、内径 21mm のヌクレオシール 100-7, C-18カラム（マケーリーナーゲル デューレン）に注入する。分離は3ml/minの流速で、アセトニトリルを30分間で20%から50%に直線的にグラジエント溶出させることによりおこなわれる。個々の純粋なペプチドをファルマシア−バイオテク社製FRAC-100型のサンプルコレクターを用いて採取する。純粋なペプチドHT-Dは溶出時間17.9分から18.7分の間に採取する。
【０１３６】
単離されたヘレチオニンDの純度試験は長さ200mm、内径4mmのフェノメネックス（オーフェンバッハ）製Luna-CNカラムを分析用HPLCに用いて、アセトニトリルを40分間で5%から85％に直線的にグラジエント溶出させておこなう。
【０１３７】
水における純粋なヘレチオニンDの1H NMRスペクトルはエドマン分解によって決定されたアミノ酸鎖と相関し、個々のシグナルはNOESY-とTOCSY-スペクトルによって割当てられた。表１にこの相関関係から得られたHT-Dの個々の共鳴シグナルを示す。
【０１３８】
【表１ａ】
2006524985.tif 000014
【０１３９】
【表１ｂ】
2006524985.tif 000015
【実施例３】
【０１４０】
初代ヒト免疫細胞のサイトカイン産生に対するペプチドHT-Aの効果
初代ヒト免疫細胞のサイトカイン産生に対するペプチドHT-Aの効果を、人血液由来のリンパ球培養液におけるサイトカイン濃度の測定により確認した。4-200μg/mlのヘレチオニンを投薬に用いたが、それは培養液中で計算された量になるように添加した。処理サンプルおよび対照サンプルにおける各サイトカイン濃度は市販されているR&D Biosystems 社製"Quantikine" （Minneapolis, USA）のELISAプレートを用いて測定した。その測定結果は対照サンプル、例えばペプチド無添加のリンパ球培養液と比較した。
【０１４１】
リンパ球培養液（1mlあたり細胞数400百万個）にそれぞれ4 μg と 200 μg のHT-Aを処置した場合には、以下のサイトカイン（およびサイトカイン受容体）濃度［pg/ml］が対照サンプル（ペプチド無添加）との比較により得られた。
【０１４２】
【表１ｃ】
2006524985.tif 000016
【０１４３】
これらのデータから、ペプチドHT-Aは例えばIL-2、IL-3、IL-4およびγ-IFNといった炎症性サイトカインの発現を阻害していることが認められる。これらサイトカインの産生を抑制することにより本ペプチドの使用は自己免疫疾患の有害な自己攻撃作用の望ましい減少をもたらす。
【０１４４】
さらに、ペプチドHT-AにはIL-10やTGF-β2といった抑制的に作用するサイトカインへの刺激作用が認められる。興味深いことにこれらサイトカインの刺激は低ペプチド濃度（4 μg/ml）の方が高濃度（200 μg/ml）に比較して明らかにより強い。高ペプチド濃度ではペプチドの非特異的な細胞毒性が低濃度で観察された刺激に重複しているためではないかと思われる。
【０１４５】
試験したペプチドHT-AはIL-6、TNF-αといったサイトカインの産生およびIL-1受容体の発現には顕著な影響は認められない。
【実施例４】
【０１４６】
ヒト癌細胞の増殖に対するペプチドHT-Cの効果
本検討には乳癌培養細胞株MCF-7を用いて実施した。比較としてMCF-10A型非分化胸部上皮細胞由来の培養細胞株を用いた。初めに、対応する細胞（サンプル当たり約105個 /ml）を標準DMEM培養培地中で刺激した。24時間後、ペプチドHT-Cを添加し、このようにして0.2μg/mlと400 μg/mlの間の濃度を調製した。ペプチドによって引き起こされる変化を６日までの期間で24時間間隔で検査した。ペプチドHT-Cは既に低い濃度で変化が認められ、すなわち既に2 μg/mlの濃度から非常に明らかなMFC-7細胞の増殖阻害が認められた（図３）。
【０１４７】
ペプチドHT-Cは同条件下でMCF-10型の非悪性上皮細胞の増殖に対して弱い阻害効果が認められた。
【実施例５】
【０１４８】
マウスでの腫瘍成長に対するペプチド混合物の効果
この検討では、体重20gから24gのWAZ-2T細胞を播種したBALB/c型雌マウスでの腫瘍成長に対する本発明のペプチド混合物の効果を調べた。はじめに、動物の右胸部に腫瘍細胞0個から106個を播種量を増加しながら播種することにより細胞株の病原性を測定した。この予備実験で、腫瘍細胞2.5 x 103個の播種量によって66.7%の腫瘍発生率が認められ、換言すればマウス3匹中２匹で明らかな腫瘍成長が認められた。腫瘍の直径を毎日測定し、その動物の皮膚の厚さ0.1cmで補正した。腫瘍を球形と仮定してその大きさを計算した。マウスは120日目かそれ以前に死亡し、その時腫瘍は直径1.8cm以上に達していた。動物80匹を20匹ずつ４つのグループ（IかIV）に群分けした。０日目にすべての動物に腫瘍細胞2.5 x 103個を含む懸濁液を播種した。
【０１４９】
グループＩ（コントロール群）の動物はペプチド混合物無添加の通常の食餌を与えた。陽性に反応した動物の場合では腫瘍の成長は播種後４週目で測定可能となる。播種後50日目でこのグループ合計14匹の動物で明瞭に測定可能な腫瘍に成長した。このように腫瘍は50日目で70%に発生した。陽性動物における腫瘍の平均容積は以下の通りであった。
【０１５０】
50日目    0.81cm3
60日目    1.23cm3
70日目    1.74cm3
グループIIの動物は播種後最初の日より食餌に本発明によるペプチド類混合物0.4μgを添加して毎日与えられた。播種後50日目では4匹の動物でのみ明瞭に測定可能な明らかな腫瘍であった。このように50日目の腫瘍発生率は25%であった。陽性動物における腫瘍の平均容積は以下の通りであった。
【０１５１】
50日目    0.32cm3
60日目    0.57cm3
70日目    0.71cm3
グループIIIの動物ではペプチド混合物の添加を播種後７日目からのみ開始した。動物当たりのペプチド混合物の一日の投与量0.4μgを食餌に添加した。播種後50日目に合計９匹の動物で明らかな腫瘍が明瞭に識別された。このように50日目の腫瘍発生率は45%であった。陽性動物における腫瘍の平均容積は以下の通りであった。
【０１５２】
50日目    0.48cm3
60日目    0.77cm3
70日目    0.93cm3
このように本発明によるペプチド類は動物の悪性腫瘍疾患の顕著な阻害と腫瘍成長の退縮を引き起こす。
【実施例６】
【０１５３】
マウス腹腔マクロファージに対するペプチドの効果
CD1マウスから採取したマウス腹腔マクロファージを使用した。5mlのPBSを用いて腹膜をフラッシングした。RPMI1640で３回洗浄後、その細胞を10%FCS-RPMI1640培地に1 x 106細胞/ml（200μl/well）の濃度で96穴培養プレートに分注し、24時間静置した。培養後細胞をRPMI1640で３回洗浄し、賦活薬を含まない10%FCS-RPMI1640培地（非賦活サンプル）または異なる賦活薬を添加した10%FCS-RPMI1640培地（賦活サンプル）に再懸濁した。培養24時間後、培養上清注のNO、IL-10およびTNF-αを測定した。
【０１５４】
【表１ｄ】
2006524985.tif 000017
【０１５５】
ペプチドHT-Cでは本検討で用いたマウスから採取した腹腔マクロファージに対してHT-Dよりもより明確に強い細胞傷害性の効果が認められた。被験ペプチドではマウス腹腔マクロファージにてNOは誘導されなかった。
【実施例７】
【０１５６】
癌細胞株COLO-205に対する個々のペプチドおよび亜酸化炭素化合物との混合物（MCS-18）の効果
方法：
細胞株：大腸癌細胞株：Colo 205 （ATCC番号 CCL-222）,   生物：ホモサピエンス,  
文献： Cancer Res., 38, 1345-1355, 1978. PNAS, 99, 10718-10723, 2002.
細胞の固着後（24時間の培養、細胞量1 x 104細胞／バッチ）、細胞をMCSおよび／またはペプチド（CZT, DZT）で24時間処置し、その後生存細胞率をMTT試験により測定した。
【０１５７】
細胞株：肺癌細胞株：A549（ATCC番号 CCL-185）,   生物：ホモサピエンス,  
文献： Giard DJ , et al.. J. Natl. Cancer Inst. 51: 1417-1423, 1973.
細胞の固着後（24時間の培養、細胞量5 x 103細胞／バッチ）、細胞をMCSおよび／またはペプチド（CZT, DZT）で72時間処置し、その後生存細胞率をAlamarBlue試験により測定した。
【０１５８】
MTT試験
MTT細胞増殖試験はアレイらに従い実施した(M.C. Alley et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 27:389, 1986; M.C. Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988)。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドの最終濃度は0.4mg/mlであった。
【０１５９】
AlamarBlue（商標）細胞胞増殖試験は製造者の仕様書にしたがい実施した(Serotec, Oxford, England, www.serotc.com)。
【０１６０】
結果：
表２に示す通り、Colo 205細胞の増殖はCZTおよびDZTペプチド存在下100μg/mlの濃度で24時間後にすでに強く阻害された。生存細胞数はわずか約50%である。物質MCS18をCZTペプチドに加えて添加した場合には、ペプチドの阻害効果の更なる改善が観察できる。MCS18そのものは100μg/mlの濃度でColo 205細胞の増殖には全く阻害効果を有しない（表３）。このようにCZTペプチドとMCSの組み合わせにより大腸癌の場合に抗腫瘍活性の増強をもたらすことができる。
【０１６１】
ペプチドBZT、CZTおよびDZTは100μg/mlの濃度で肺癌細胞株の増殖も阻害することができた（図４参照）。72時間後にわずか約50%の生存率が測定された。
【０１６２】
【表２】
2006524985.tif 000018
【０１６３】
【表３】
2006524985.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１はヘレチオニンHT-Dの構造を示す。
【図２】図２はヘレチオニン混合物のHPLCチャート図を示す。
【図３】図３は異なる濃度のヘレチオニンHT-Cの肺癌細胞MCF-7に対する効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【国際調査報告】
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