(57)【要約】本発明は、哺乳動物のアポトーシス亢進に有用な組成物、および同様の組成物の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＬ−ＩＡＰに特異的に結合し、ＭＬ−ＩＡＰがカスパーゼ活性に対して有する阻害作用を放出する、単離したＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項２】
N2 はGluまたはAsp
N3 はVal、Ile、Leuまたは(2S, 3S)-3-メチルピロリジン-2-カルボン酸[(3S)-メチル-プロリン]
Ｎ４はホモフェニルアラニン、4-アミノ-フェニルアラニン、4-フェニル-フェニルアラニン、2,2-ジフェニルエチルアミン、(1S,2S)-(+)-2-アミノ-1-フェニル-1,3-プロパンジオール、3-トリフルオロメチルフェニルエチルアミン、(1R,2R)-(-)-2-アミノ-1-フェニル-1,3-プロパンジオール、トランス-2-フェニルシクロプロピルアミン、(1R,1S)-(+)-ノルエフェドリン、β-メチルフェニルエチルアミン、（S)-(-)-2-アミノ-3-フェニル-1-プロパノール、(R)-(-)-2-アミノ-1-フェニルエタノール、3-エトキシフェニルエチルアミン、5-ブロモ-2-メトキシフェニルエチルアミン、3-フルオロフェニルエチルアミン、(S)-(+)-α-（メトキシメチル）-フェニルエチルアミン、3-クロロフェニルエチルアミン、または、2-エトキシ・フェニルエチルアミンである、
配列AN2N3N4を含んでなる単離したＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項３】
ＡＶＧＶＰＷＫＳＥ（配列番号：６）、ＡＥＡＶＡＷＫＳＥ（配列番号：７）、ＡＴＡＶＩＥＫＳＥ（配列番号：８）、ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ（配列番号：９）、ＡＥＶＶＡＶＫＳＥ（配列番号：１０）およびＡＱＡＶＡＷＫＳＥ（配列番号：１１）よりなる群から選択した単離したＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項４】
さらにジペプチドアイソスターを含んでなる、請求項１ないし３に記載のＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項５】
細胞膜を越えて運搬する異種性配列に融合した、請求項１ないし４に記載のＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項６】
細胞障害性薬剤に結合している、請求項１ないし５に記載のＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項７】
細胞障害性薬剤が毒素、抗生物質、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択したものである、請求項６に記載のＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項８】
細胞に投与したときアポトーシスを誘導する、請求項７に記載のＢＤＢオリゴペプチド。
【請求項９】
細胞のアポトーシスを増加する方法であって、請求項１ないし６に記載のオリゴペプチドの有効量を前記細胞に作用させ、該アポトーシスが増加する方法。
【請求項１０】
前記細胞が癌細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が黒色腫細胞、乳がん細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣の癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、頸部癌細胞および白血病細胞よりなる群から選択したものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第二細胞障害性薬剤を投与することを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＰＯ２／ＴＲＡＩＬポリペプチドを投与することを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
第二細胞障害性薬剤がアドリアマイシン（ドキソルビシン）、4-第三ブチルフェノール、エトポシド、タキソール、カンプトセシン、ＭＴＸ、ビンクリスチン、タモキシフェン、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５‐フルオロウラシルまたはエスペラミシンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
担体と混合した、請求項１ないし６に記載の組成物。
【請求項１６】
前記担体が薬剤的に受容性のある担体である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
(ａ)容器；と
(ｂ)容器内に包含する請求項１ないし６に記載の組成物
(ｃ)該容器に貼付したラベル、または、該容器内に包含するパッケージ挿入物であって、癌の治療的処置または診断的検出を目的とした組成物の使用を示しているもの
を含んでなる製造品。
【請求項１８】
ＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストを検索する方法であって：
(ａ)共結晶構造を形成するためにML-IAPポリペチドのBIR領域を有する潜在的アンタゴニストを共結晶化し、潜在的アンタゴニストが該BIR領域に結合するかどうかを決定し；
(ｂ)アンタゴニスト未処理細胞と比較して、該アンタゴニストにより細胞のアポトーシスが増加するかどうかを決定する
ことを含んでなる方法。
【請求項１９】
共結晶構造を形成するためにＭＬ−ＩＡＰポリペチドのＢＩＲ領域を有する潜在的アンタゴニストを共結晶化し、潜在的アンタゴニストが該ＢＩＲ領域と結合するかどうかを決定することを含んでなるＭＬ−ＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストを検索する方法であって、ここでの結合は、共結晶構造に２．８オングストロームと同じかまたはより小さい候補分子と接ぎ当てた特異的アミノ酸残基との間に少なくとも一の接触がある場合に起こる方法。
【請求項２０】
ＭＬ−ＩＡＰポリペプチドの潜在的アンタゴニストを検索する方法であって：
(ａ)共結晶構造を形成するためにＭＬ−ＩＡＰポリペチドのBIR領域を有する潜在的アンタゴニストを共結晶化し、潜在的アンタゴニストが該BIR領域に結合するかどうかを決定し；
(ｂ)該潜在的アンタゴニストによりカスパーゼに対する該ＭＬ−ＩＡＰの結合が阻害されるかどうかを決定する
ことを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物のアポトーシス亢進に有用な組成物、および同様の組成物の使用方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アポトーシスまたはプログラム細胞死は脊椎動物と同様に無脊椎動物での発達および恒常性に重要な役割を持つ一般的および生化学的な調節機能である。未熟な細胞死を引き起こすアポトーシス異常は様々な発育性疾患に関与している。結果的に細胞死欠乏となるアポトーシス欠損は、癌および慢性ウイルス感染に関与している(Thompson等, (1995) Science 267, 1456-1462)。
アポトーシスにおけるある重要なエフェクター分子の一つがカスパーゼである（アスパラギン酸特異的プロテアーゼを含むシステイン）。カスパーゼはアスパラギン酸残基後を切断する強力なプロテアーゼであり、活性化されると細胞内から生細胞タンパク質を消化する。カスパーゼはとても強力なプロテアーゼなので、未熟な細胞死を予防するためにこのタンパク質ファミリーの厳重なコントロールが重要である。一般に、カスパーゼは主として不活性型チモーゲンとして合成され、活性化されるにはタンパク質分解過程を要する。このタンパク質分解過程はカスパーゼ調節の唯一の手段である。二次的機能はカスパーゼに結合して阻害するタンパク質ファミリーが介する。
【０００３】
カスパーゼを阻害する分子ファミリーはアポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）である(Deveraux等, J Clin Immunol (1999), 19:388-398)。ＩＡＰは本来そのＰ３５タンパク質を代用する機能的能力によってバキュロウイルスにおいて発見された抗アポトーシス遺伝子である(Crook等. (1993) J Virology 67, 2168-2174)。ＩＡＰはショウジョウバエからヒトにわたる生物体において記述されている。器官に関係なく構造的に、ＩＡＰは１から３のバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）ドメインを含み、それらのほとんどはカルボキシル末端ＲＩＮＧフィンガーモチーフも有している。ＢＩＲドメイン自体は４つのαヘリックスおよび３つのβ鎖を含む約７０残基のｚｉｎｃ結合ドメインであり、ｚｉｎｃイオンを配位するシステインとヒスチジンを有する(Hinds等, (1999) Nat. Struct. Biol. 6, 648-651)。カスパーゼを阻害し従ってアポトーシスを抑制することによって抗アポトーシス効果の原因となっていると考えられているのがＢＩＲドメインである。例として、ヒトＸ染色体結合型ＩＡＰ（ＸＩＡＰ）はカスパーゼ３、カスパーゼ７およびＡｐａｆ-１チトクロームＣ媒介カスパーゼ９活性化を阻害する(Deveraux等, (1998) EMBO J. 17, 2215-2223)。カスパーゼ３および７はＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインにより阻害されるのに対して、ＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインはカスパーゼ９活性の阻害を担っている。
【０００４】
黒色腫ＩＡＰ（ＭＬ−ＩＡＰ）は黒色腫におけるＩＡＰ発現を強く上方制御する(Vucic等, (2000) Current Bio 10:1359-1366)。タンパク質構造の決定により、ヒトＸＩＡＰ、Ｃ−ＩＡＰ１およびＣ−ＩＡＰ２に存在するドメインに対応する顕著な相同性を示すＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲおよびＲＩＮＧフィンガードメインが明らかにされた。ＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメインはＸＩＡＰのBIR2およびBIR3、C-IAP1およびC-IAP2に最も類似性があり、欠損解析に示されるようにアポトーシス阻害を担っていると思われる。さらに、Ｖｕｃｉｃ等はＭＬ−ＩＡＰが化学療法剤誘導性アポトーシスを阻害することを明らかにした。アドリアマイシンおよび４-第三ブチルフェノール（４−ＴＢＰ）等の薬剤をＭＬ−ＩＡＰを過剰発現する黒色腫の細胞培養系で試験すると、正常メラニン細胞対照と比較して化学療法剤が細胞を死滅する影響が著しく低かった。ＭＬ−ＩＡＰが抗アポトーシス活性を示す機構はカスパーゼ３、７、および９の阻害によるものである。ＭＬ−ＩＡＰはカスパーゼ１、２、６、または８を有効に阻害しなかった。
【０００５】
アポトーシスは多様な相互因子を持つ厳密に制御された経路であるので、ＩＡＰ自体が調節を受けるという発見は特異なことではなかった。ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、Reaper (rpr)、頭部退行欠損（Head Involution Defective）(hid)およびGRIMタンパク質が物理的に相互作用し、ショウジョウバエのＩＡＰファミリーの抗アポトーシス活性を阻害する。哺乳動物では、タンパク質SMAC/DIABLOがＩＡＰを遮断するように働き、アポトーシスが進行する。正常なアポトーシスではＳＭＡＣが活性型になると、ミトコンドリアから細胞質に放出され、物理的にＩＡＰに結合してＩＡＰがカスパーゼに結合するのを阻害することが示された。このＩＡＰの阻害により、カスパーゼは活性化された状態であるためアポトーシスが進行する。興味深いことに、ＩＡＰ阻害因子間の配列相同性は、進行した活性型タンパク質のＮ末端に４アミノ酸モチーフがあることを示している。このテトラアミノ酸はＢＩＲドメインの疎水性ポケット(pocket)内に結合していると思われ、ＢＩＲドメインのカスパーゼへの結合を崩壊する(Chai等, (2000) Nature 406:855-862, Liu等, (2000) Nature 408:1004-1008, Wu等, (2000) Nature 408 1008-1012)。
【０００６】
上述のようなアポトーシス研究の進歩にもかかわらず、癌の進行を抑制することを目的として哺乳動物におけるアポトーシス亢進能を有した付加的診断および治療用薬剤の需要が高い。例えば、ＸＩＡＰはほとんどの成人組織で発現されており(Duckett等, (1996) EMBO J. 15, 2685-2694)、それ故に癌治療に用いられる薬剤によりアンタゴニストは健康細胞に感作してアポトーシスを起こすであろう。ＭＬ−ＩＡＰは黒色腫に特異的であることが知られているため(Vucic等, (2000) Current Bio 10:1359-1366)、ＭＬ−ＩＡＰ特異的であるＩＡＰアンタゴニストの開発に有用性がある。したがって、本出願では、ＭＬ−ＩＡＰの構造へ結合する際の様々なペプチドにおける特異的なアミノ酸相互作用を明示するために、未処理のペプチドライブラリーおよび合成ペプチドライブラリーのファージディスプレイが用いられる。ペプチドＳＡＲ（構造活性化関係）実験と組み合わせて、選択したＭＬ−ＩＡＰを有するペプチドの共結晶化により、結合親和性および／または選択性の増加をもたらすペプチドを決定する。
【０００７】
（発明の概要）
一実施態様では、本発明は好ましくは特異的に前記または後記するＢＩＲドメイン（ＢＩＲドメイン結合オリゴペプチド；以降、ＢＤＢオリゴペプチド）に結合するオリゴペプチドを提供する。任意に本発明のＢＤＢオリゴペプチドは、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明のＢＤＢオリゴペプチドはＣＨＯ細胞または細菌細胞内で任意で産生され、好ましくは結合した細胞の死を誘導する。診断目的のために、本発明のＢＤＢオリゴペプチドを検出可能に標識したり、固形支持体に接着させたりしていてよい。
【０００８】
本発明の一実施態様では、本発明はここに示す結合オリゴペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターを含む宿主細胞も又提供する。例として宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌細胞、又は酵母菌細胞でもよい。さらに、ここに示す何れかの結合オリゴペプチドの生成工程を提供し、目的のオリゴペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養して細胞培養物から目的のオリゴペプチドを回収することを含む。
【０００９】
他の実施態様では、発明は、好ましくは前述又は後述の任意のＢＩＲドメインに特異的に結合する小有機分子（ＢＩＲドメイン結合小有機分子、以降ＢＤＢ小分子）を提供する。選択的に、本発明のＢＤＢ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明のＢＤＢ小有機分子は好ましくは結合した細胞のアポトーシスを誘導する。診断を目的として、本発明のＢＤＢ小有機分子を検出可能に標識したり、固形支持体に接着させたりしていてよい。
更なる実施態様では、発明は、ここに示すようにキメラＢＤＢオリゴペプチドを含む組成物に関する。もしくは、キメラＢＤＢオリゴペプチドは細胞膜を越えてＢＤＢオリゴペプチドの輸送を円滑にするペプチド又は小分子に融合したＢＤＢオリゴペプチドに関する。又、発明は、担体と組み合わせたキメラＢＤＢオリゴペプチド、ここに示すＢＤＢオリゴペプチド、又はここに示すＢＤＢ小有機分子に関する。場合によっては、担体は薬理学的受容性のある担体である。
【００１０】
他の実施態様では、発明は、容器と、容器内に包含する組成物とを含む製造品であり、ここでいう組成物がここに示すキメラＢＤＢポリペプチド、ここに示すＢＤＢオリゴペプチド、又はここに示すＢＤＢ小有機分子を含みうる製造品に関する。さらに、製造品は、容器に貼付したラベル、または、容器内に包含するパッケージ挿入物であって、腫瘍の治療的処置または診断的検出を目的とした組成物の使用を示しているものを選択的に含みうる。
【００１１】
本発明の他の実施態様では、キメラＢＤＢポリペプチド、ＢＤＢオリゴペプチド、又はＢＤＢ小有機分子に応答する治療条件で有効な医薬の調製を目的として、ここに示すキメラＢＤＢポリペプチド、ここに示すＢＤＢオリゴペプチド、又はここに示すＢＤＢ小有機分子の使用を示唆するものである。
本発明の他の実施態様では、キメラＢＤＢポリペプチド、ＢＤＢオリゴペプチド、又はＢＤＢ小有機分子に応答する治療条件で有効な医薬の調製を目的として、ここに示すキメラＢＤＢポリペプチド、ここに示すＢＤＢオリゴペプチド、又はここに示すＢＤＢ小有機分子の使用に関し、ＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメイン特異的なものである。
【００１２】
１．更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、ＢＩＲドメインを含むＩＡＰポリペプチドを発現する細胞の成長を阻害する方法に関し、該方法は細胞にＩＡＰポリペプチドに結合するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を作用させ、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子のＩＡＰポリペプチドへの結合によりＩＡＰポリペプチドを発現する細胞の成長が阻害されることを含む。好ましい実施態様では、細胞は癌細胞であり、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子のＩＡＰポリペプチドへの結合によりＩＡＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスが誘導されるものである。選択的にＩＡＰポリペプチドがＭＬ−ＩＡＰである。
本発明の方法に用いるＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子は選択的に、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明の方法に用いるＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子は選択的にＣＨＯ細胞、細菌細胞、又は合成物内で生成されうる。
【００１３】
さらに本発明の他の実施態様は、ＩＡＰポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物の治療的処置方法に関し、該方法はＩＡＰポリペプチドに結合するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の治療的有効量を哺乳動物に投与することによって、結果的に腫瘍を効果的に治療することを含みうる。選択的にＩＡＰポリペプチドがＭＬ−ＩＡＰである。本発明の方法に用いるＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子は選択的に、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明の方法に用いるＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子は選択的にＣＨＯ細胞、細菌細胞、又は合成物内で生成されうる。
さらに本発明の他の実施態様は、ＩＡＰポリペプチドの含有が推測される試料においてＩＡＰポリペプチドの存在を決定する方法に関し、該方法は試料をＩＡＰポリペプチドに結合するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子に曝し、試料中のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子のＩＡＰポリペプチドへの結合を決定することを含み、この結合の存在により試料中のＩＡＰポリペプチドの存在が示唆されるものである。選択的に試料はＩＡＰポリペプチドの発現が予測される細胞（癌細胞であってもよい）を含みうる。本発明の方法に用いるＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子は選択的に検出可能に標識したり、固形支持体に接着させたりしていてよい。
【００１４】
本発明の更なる実施態様では、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）前記哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ組織源又は型の既知の正常な非癌性細胞のコントロール試料中における、ＩＡＰポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなり、コントロール試料と比較して、試験試料中のＩＡＰポリペプチドのより高いレベルの発現が、試験試料が得られた哺乳動物での腫瘍の存在を示す。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料を、ＩＡＰポリペプチドと結合する抗体、オリゴペプチド又は小有機分子と接触させ、（ｂ）試験試料中での、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子とＩＡＰポリペプチドの間で形成される複合体を検出することを含んでなり、複合体の形成が、哺乳動物での腫瘍の存在を示す。場合によっては、用いられるＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、検出可能に標識されたり、固体支持体に付着されたりするか、及び／又は組織細胞の試験試料が癌牲腫瘍を有すると思われる個体から得られる。
【００１５】
本発明の更に他の実施態様は、ＩＡＰポリペプチドの改変、好ましくは増加された発現又は活性に関連した細胞増殖性疾患を治療又は予防する方法に関し、該方法はそのような治療を必要とする患者に、有効量のＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる。好ましくは、細胞増殖性疾患は癌であり、ＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストはＢＤＢオリゴペプチド、又はＢＤＢ小有機分子である。細胞増殖性疾患の効果的な治療又は予防はＩＡＰポリペプチドを発現する細胞の直接の死滅化又は成長阻害の結果又はＩＡＰポリペプチドをアンタゴナイズしてアポトーシス誘導剤への感受性を与えることによるものでありうる。
【００１６】
本発明の更に他の実施態様はＩＡＰポリペプチドを発現する細胞へＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を結合させる方法に関し、該方法は、ＩＡＰポリペプチドを発現する細胞を、該ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子に、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子が該ＩＡＰポリペプチドに結合するのに適した条件下で接触させ、それらの結合を可能にすることを含んでなる。
【００１７】
本発明の他の実施態様は、（ａ）ＢＤＢオリゴペプチド、又は（ｂ）ＢＤＢ小有機分子の、（ｉ）癌又は腫瘍の治療的処置又は診断的検出、又は（ｉｉ）細胞増殖性疾患の治療的処置又は防止に有用な医薬の製造における使用に関する。
本発明の他の実施態様は、癌細胞の成長を阻害する方法に関し、ここで、上記癌細胞の成長はＩＡＰポリペプチドの成長増強効果に少なくとも部分的に依存し、該方法は、ＩＡＰポリペプチドに結合するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子にＩＡＰポリペプチドを接触させることを含んでなり、それによってＩＡＰポリペプチドのアポトーシス阻害活性をアンタゴナイズし、次には癌細胞の成長を阻害する。好ましくは癌細胞の成長は完全に阻害される。更により好ましくは、ＩＡＰポリペプチドへのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の結合は癌細胞のアポトーシスを誘導する。本発明の方法に使用されるＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明の方法に用いられるＢＤＢオリゴペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞、細菌細胞又は合成物中で産生され得る。
【００１８】
本発明の更に他の実施態様は、哺乳動物において腫瘍を治療的に処置する方法に関し、ここで、上記腫瘍の成長はＩＡＰポリペプチドの成長増強効果に少なくとも部分的に依存し、該方法は、ＩＡＰポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は小有機分子を哺乳動物に投与することを含んでなり、それによって上記ＩＡＰポリペプチドの成長増強活性をアンタゴナイズし、腫瘍の効果的な治療的処置をもたらす。本発明の方法において使用されるＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートされうる。本発明の方法に用いられるＢＤＢオリゴペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞、細菌細胞又は合成物中で産生され得る。
【００１９】
本発明のさらに他の実施態様は、ＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲドメインの結晶構造の使用方法に関し、該結晶構造はＢＩＲドメインと潜在的阻害剤との作用残基を同定するために利用する。このような作用残基及び隣接残基はここで詳述する技術により置換の候補となる。このような変異が起こると、ここで述べるように変異のパネルはスクリーニングに用いられ、一以上の関連アッセイにより適当なＩＡＰ阻害物質が更なる開発のために選択されうる。
【００２０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
定義
ここで詳述した様々なオリゴペプチドを表すために用いられる「単離した」とは、同定され、天然環境の成分から分離及び／又は回収したオリゴペプチドを意味する。その天然環境の汚染成分とは、一般的にオリゴペプチドを診断又は治療へ用いる際の妨げとなる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質でありうる。好ましい実施態様では、オリゴペプチドは（１）スピンカップシークエネーターを用いてＮ末端又は内在アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、又は（２）クーマシーブルー又は、好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。しかしながら通常単離したポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製されるであろう。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取りフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２２】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＢＤＢポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。場合によっては、タグポリペプチドは細胞内へのキメラＢＤＢオリゴペプチドの挿入を容認する担体ポリペプチドである。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
【００２３】
「ＩＡＰ阻害物質」はアポトーシスタンパク質阻害物質（ＩＡＰ）の抗アポトーシス活性を遮断する分子である。天然に生じるＩＡＰポリペプチドの例として、哺乳動物のＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯタンパク質、及びショウジョウバエのＨＩＤ、ＲＰＲ及びＧＲＩＭタンパク質がある。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＩＡＰ阻害物質の生物学的的活性を保持するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＩＡＰが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘導する能力以外の、天然又は天然発生ＩＡＰ阻害物質によって引き起こされる生物機能を意味する。
【００２４】
「ＩＡＰ」又はアポトーシスタンパク質阻害物質は物理的に作用して活性を遮断することにより細胞のアポトーシスを阻害する分子であり、アポトーシス経路内のカスパーゼ分子である。ＩＡＰ分子の例としてＭＬ−ＩＡＰ（登録番号：ＢＩＲ７＿ＨＵＭＡＮ）、ＸＩＡＰ、ＮＡＩＰ、Ｃ−ＩＡＰ１及びＣ−ＩＡＰ２がある。構造的にＩＡＰは一以上のＢＩＲドメインを含み、多くのＩＡＰはカルボキシル末端ＲＩＮＧフィンガードメインを含む。
「カスパーゼ」はアスパラギン酸のＣ末端側でポリペプチド基質を切断するシステインプロテアーゼポリペプチドとして定義する。
「ＢＩＲドメイン含有ポリペプチド」は、特異的に結合して阻害することのできるタンパク質構造を含むポリペプチド、カスパーゼである。特に、ＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメインは登録番号：ＢＩＲ７＿ＨＵＭＡＮで示す配列のアミノ酸８７−１６８である。
【００２５】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ＩＡＰポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。同じように、「薬剤」という用語は最も広い意味で用いられ、天然のＩＡＰポリペプチド阻害物質の生物学的活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切な薬剤又はアンタゴニスト分子には、特にＢＤＢポリペプチド、ＢＤＢ小有機分子が含まれる。ＩＡＰポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、ＩＡＰポリペプチドと候補アンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＩＡＰポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
「オリゴペプチド」は３〜３０アミノ酸残基の長さの短いアミノ酸配列であり、オリゴペプチドに特定の立体配座の特性又はタンパク質分解耐性等の特定の生物学的活性を与えるために、単独又は天然に生じるアミノ酸残基と組み合わせて用いられる天然に生じるアミノ酸残基及び非天然に生じる残基類似体を包含する。
【００２６】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患に既に罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。本発明の方法に従ってＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な以下のような減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＩＡＰポリペプチド発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の緩和；疾病率及び死亡率の減少、及び生活の質問題の改善。ある程度、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、生存癌細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞毒性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
【００２７】
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、骨のスキャン及び骨への広がりを確かめるためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。ＣＴスキャンは、また、領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することで行うことができる。胸のＸ線、及び既知の方法による肝臓の酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００２８】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
【００２９】
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子が接着又は付着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＢＤＢオリゴペプチド）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
ここで定義されている「小」分子又は「小」有機分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
【００３０】
ここに開示するＢＤＢオリゴペプチド、ＢＤＢ小有機分子の「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的なＢＤＢオリゴペプチド、ＢＤＢ小有機分子又は他の薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
【００３１】
ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の「成長阻害量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の「細胞障害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＢＤＢ結合オリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の「細胞障害性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００３２】
「ＢＤＢオリゴペプチド」は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【００３３】
「ＢＤＢ小有機分子」とは、ここに記載されるようなＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＢＤＢ小有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。ＢＤＢ小有機分子は通常、約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、ここに記載される様なＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及びＷＯ００／３９５８５号参照）。
【００３４】
腫瘍関連ポリペプチド標的等の対象のＩＡＰポリペプチドに「結合する」ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子がＩＡＰポリペプチドを発現している細胞又は組織を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応しないように十分な親和性でＢＩＲドメインと結合するものである。そのような実施態様では、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の「非標的」タンパク質との結合の程度は、蛍光偏光法、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって定量して、その特定の標的タンパク質とのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の結合の約１０％よりも低いであろう。標的分子へのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、非特異的な相互作用とは測定して異なる結合を意味する。特異的な結合は、例えば、一般に結合活性を持たない類似した構造の分子であるコントロール分子の結合性と比較して、分子の結合性を定量することによって測定することができる。例えば、特異的な結合性は、標的、例えば過剰の非標識標的に類似したコントロール分子との競合によって定量することができる。この場合、プローブに対する標識標的の結合が過剰の非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が表示される。ここで使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、例えば標的に対して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、あるいはそれ以上のＫｄを持つ分子によって示されうる。一実施態様では、「特異的に結合する」という用語は、如何なる他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープへ実質的に結合することなく分子が特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに結合する結合を意味する。
【００３５】
「ＩＡＰポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子、又は「成長阻害」ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、適切なＩＡＰポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の測定可能な程の成長阻害を引き起こすものである。好ましい成長阻害ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、一般的には、試験されたＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールといった適切なコントロールと比較して、２０％より多く、好ましくは約２０％から約５０％、そしてさらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％から約１００％）でＢＩＲドメイン含有発現腫瘍細胞の成長を阻害する。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、下記の実験実施例に記載しているような種々の方法で確かめることができる。
【００３６】
「アポトーシスを誘導する」ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)等により決定されるようなプログラム細胞死を誘導するものである。細胞は、通常、ＩＡＰポリペプチドを過剰発現しているものである。好ましくは、細胞は腫瘍細胞、例えば前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、、メラノーマ、又は膀胱細胞である。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／クロマチン凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、アネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘導するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘導するという結果を生じるものである。
【００３７】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す又は記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ様悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、及び関連した転移が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００３８】
「ＢＩＲドメイン含有発現細胞」は、内因性又は形質移入されたＩＡＰポリペプチドを発現する。「ＩＡＰポリペプチド発現癌」は、ＩＡＰポリペプチドを有する細胞を含む癌である。場合によって、「ＩＡＰポリペプチド発現癌」は、その細胞内に十分なレベルのＩＡＰポリペプチドを生成し、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子はそれへ結合することができ、癌に関して治療的効果を有する。他の実施態様では、選択的に「ＢＩＲドメイン含有発現癌」は、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子アンタゴニストが結合することができ、癌に対して治療的有効量を有するように十分なレベルのＩＡＰポリペプチドを産生及び分泌する。ＩＡＰポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著により高いレベルのＩＡＰポリペプチドを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。ＩＡＰポリペプチド過剰発現は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞内に存在するＩＡＰタンパク質の増大したレベルを評価することによって定量されうる（例えば、ＩＡＰポリペプチドをコードする単離された核酸から、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離されたＩＡＰポリペプチドに対して調製した抗ＩＡＰポリペプチド抗体を用いた免疫組織化学アッセイを介して；ＦＡＣＳ分析など）。あるいは、又は付加的に、例えば、ＩＡＰコード化核酸又はその相補鎖と一致する核酸ベースプローブを使用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照せよ）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を介して、細胞のＩＡＰポリペプチドコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清のような生物学的体液中に流れている抗原を測定することによって、ＩＡＰポリペプチド過剰発現を研究してもよい（同じく、例えば、１９９０年６月１２日に発行の米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開の国際公開９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行の米国特許第５４０１６３８号；Sias等, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)を参照せよ）。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者に入手可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で選択的に標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって評価することができる。
【００３９】
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を作製するために、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００４０】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にＩＡＰ発現癌細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＩＡＰ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘導する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にし、その結果細胞の有糸分裂を阻害する。
【００４１】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００４２】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００４３】
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
【００４４】
（本発明の組成物及び方法）
メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００４５】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、１つ又は複数のカリケアマイシン分子と結合したＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。ＢＤＢオリゴペプチドが結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００４６】
他の細胞障害剤
本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子と結合可能な他の抗腫瘍剤には；アドリアマイシン（ドキソルビシン）、４-第三ブチルフェノールエトポシド、タキソール、カンプトセシン、メトトレキセート、ビンクリスチン又はタモキシフェン、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【００４７】
腫瘍を選択的に破壊するため、ＢＤＢオリゴペプチドは高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートしたタンパク質を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ＢＤＢオリゴペプチドは生物合成されるか、又は例えば水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【００４８】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)がＢＤＢオリゴペプチドに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
別法として、ＢＤＢオリゴペプチド及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
さらに他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)にＢＤＢオリゴペプチドをコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００４９】
Ａ．ＢＤＢオリゴペプチド
本発明のＢＤＢオリゴペプチドはここで記載される様なＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。ＢＤＢオリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。ＢＤＢオリゴペプチドは通常、少なくとも約３のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＩＡＰポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＢＤＢオリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【００５０】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合環境の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【００５１】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren, Z-J.ら (1998) Gene 215:439; Zhu, Z. (1997) CAN 33:534; Jiang, J.等 (1997) can 128:44380; Ren, Z-J.等 (1997) CAN 127:215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833; Efimov, V.P.等 (1995) Virus Genes 10:173）及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith,G.P.及びScott,J.K. (1993) Methods in Enzymology,217, 228-257; 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【００５２】
また、ここに記載するようにキメラＢＤＢオリゴペプチドを生成するために他のポリペプチド配列と融合したＢＤＢオリゴペプチドも取り込まれる。ショウジョウバエタンパク質ANTENNAPEDIAの研究により三つめの螺旋状ドメインの１６アミノ酸が細胞膜を越えて転座しており細胞質内に挿入していることを発見した (Prochiantz  A., (1996) Curr. Opinion Neurobiol. (5):629-34, Derossi等, (1998) Trends Cell Biol. (8) 84-87)。このペプチドはペネトラチン(Penetratin)(RQIKIWFQNRRMKWKK-NH2 (SEQ ID NO:54))と命名された。細胞膜転座が起こるメカニズムはまだ定義されていないが、分解することなく細胞質からANTENNAPEDIAペプチドが回収されることとその低細胞毒性であることにより、細胞に作用しうるキメラ分子を生成するために他のペプチド配列に融合して、活性を損なうことなく簡単に内部移行しうることが示される。このようなキメラ分子は、化学的結合反応が不要であることに有益性があり、キメラは直接的合成又はプラスミド発現ベクターへの挿入の何れかによる。さらに、ペネトラチン配列は修飾、例としてビオチン化又はリン酸化を加えて融合させ得ることにも有用性がある。さらに、エピトープタグ配列を加えることにより抗体を用いたキメラ分子回収を亢進することができる。ペネトラチン／ＳＭＡＣ融合を合成し、ＩＡＰとの相互作用を成功裏に示す(Arnt等, (2002) Jour. Bio. Chem. 277 (46) 44236-4424300)。Ａｒｎｔ等はＳＭＡＣの４〜８アミノ酸をペネトラチン配列に融合し、ビオチン化転位を加えた。３０分のインキュベーション後、ＳＭＡＣ／ペネトラチン融合ポリペプチドをストレプトアビジン−アガロースにより回収し、結合分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製し、免疫ブロット法により分析した。この実験によりＳＭＡＣ／ペネトラチン融合ポリペプチドは試験した細胞系のＸＩＡＰ及びｃＩＡＰ１への結合を示した。さらに、この研究班はＳＭＡＣ／ペネトラチン融合ポリペプチドがカスパーゼ活性が増強するにつれてＩＡＰの効果的阻害剤として働くことを証明した。ペネトラチンはここで明確に記載するように、内部移行することが立証された他のオリゴペプチド、ＴＡＴ転写因子、Ｈｅｒｐｅｓ、ＶＰ２２、ＦＧＦ−２及びラクトフェリンも又、組み込まれる。
【００５３】
Ｂ．ＢＤＢ小有機分子
ＢＤＢ小有機分子とは、ここに記載されるようなＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＢＤＢ小有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。ＢＤＢ小有機分子は通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なＩＡＰポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。ＢＤＢ小有機分子は、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【００５４】
Ｃ．所望する特性を有するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子のスクリーニング
ＩＡＰポリペプチドに結合するオリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の成長阻害効果を、例えば、内因的又はＩＡＰ遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでＩＡＰポリペプチドを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＩＡＰ形質移入細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度の本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子で処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体、オリゴペプチド又は小有機分子でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。好ましくは、腫瘍細胞は、ＩＡＰポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、ある実施態様では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のＩＡＰ発現腫瘍細胞のアポトーシスをインビトロ又はインビボで引き起こす。
【００５５】
細胞死を誘発するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ＩＡＰポリペプチド発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、細胞死誘発ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子として選択することができる。
【００５６】
関心のあるＩＡＰポリペプチド上のＢＩＲドメインへ結合するＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を選択するために、AnalystTM HT 96-384 (Molecular Devices Corp.) 等の偏光装置が用いられる。蛍光偏光親和性測定器の試料は、50mM Tris（pH 7.2）、120mM NaCl、1%ウシグロブリン及び0.05%オクチルグルコシド等の偏光緩衝液に５-カルボキシフルオレセイン結合ペプチドを最終濃度３〜５ｎＭになるように添加して調製する。インキュベーション工程の後、９６穴黒色ＨＥ９６プレート(Molecular Devices Corp.)上で反応液を標準的なカットオフフィルタを用いて蛍光性色素(lex = 485 nm; lem = 530 nm)を測定する。見かけのＫｄ値をＥＣ５０値から求めることができる。阻害定数（Ｋｉ）は以前詳述されているように決定することができる(Keating等, (2000) Proceedings of SPIE: In vitro diagnostic instrumentation Cohn, G.E., Ed. p128-137)。
【００５７】
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【００５８】
ＢＤＢオリゴペプチドの機能の実質的修飾は、（ａ）置換領域のＢＤＢオリゴペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、ＢＤＢオリゴペプチド変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【００５９】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
ＢＤＢオリゴペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、ＢＤＢオリゴペプチドの安定性を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【００６０】
特に好ましい型の置換変異体は、親ＢＤＢオリゴペプチドの一又は複数の残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親ＢＤＢオリゴペプチドと比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、ＢＤＢオリゴペプチド作用部位を変異させてその部位にアミノ酸置換を生成させる。このように生成されたＢＤＢオリゴペプチド変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、ＢＤＢオリゴペプチド結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。加えて、ＢＤＢオリゴペプチド／ＢＩＲドメイン複合体の結晶構造を分析してＢＤＢオリゴペプチドとＩＡＰポリペプチドＢＩＲドメインとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つＢＤＢオリゴペプチドを更なる開発のために選択することができる。
【００６１】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＩＡＰポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６２】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６３】
完全長ＢＤＢオリゴペプチド、及びＢＤＢオリゴペプチド融合タンパク質は、治療用のＢＤＢオリゴペプチドが細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、そのコンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌でのＢＤＢオリゴペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、ＢＤＢオリゴペプチドは、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、精製することができる。
【００６４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＢＤＢオリゴペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００６５】
グリコシル化ＢＤＢオリゴペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
【００６６】
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、ＢＤＢオリゴペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【００６７】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＢＤＢオリゴペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００６８】
ＢＤＢオリゴペプチドは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＢＤＢオリゴペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６９】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
【００７０】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＢＤＢオリゴペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００７１】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＢＤＢオリゴペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＢＤＢオリゴペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７２】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＢＤＢオリゴペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００７３】
より高等の真核生物によるＢＤＢオリゴペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＢＤＢオリゴペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００７４】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＢＤＢオリゴペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＢＤＢオリゴペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【００７５】
４．宿主細胞の培養
本発明のＢＤＢオリゴペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００７６】
Ｄ．ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を用いる診断及び治療
癌におけるＩＡＰ発現を定量するために、種々の診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＩＡＰポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＩＡＰタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＩＡＰポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＩＡＰが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＩＡＰが過剰発現していることを特徴としうる。
【００７７】
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＩＡＰ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ＩＡＰ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は有機分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
上に記載したように、本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子には、種々の非治療的用途がある。本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、ＩＡＰポリペプチドを発現している癌の診断及び染色にとって有用である（例えば、ラジオイメージングで）。また、例えば、他の細胞の精製の工程として混合細胞の集団からＩＡＰ発現細胞を死滅させて除去する等の、インビトロでのＩＡＰポリペプチドの検出及び定量化のために、このＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は有用である。
【００７８】
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の腫瘍標的化ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、疾患の初期診断時及び再発中におけるＩＡＰ-発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせてもよく、使用してもよい。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子による治療は、従来的治療の前又は後のいすれかに連続させて、他の形態の従来的治療と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した一又は複数の化学療法剤による治療と組合せて、癌患者にＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を投与することができる。特に、パクリタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【００７９】
特定の一実施態様では、細胞障害剤に結合したＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有する毒素コンジュゲートを患者に投与する。好ましい実施態様では、細胞障害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞障害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子又はその毒性コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の静脈内又は皮下投与が好ましい。
【００８０】
他の治療計画をＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。例として、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子と、プロ-アポトーシスポリペプチドＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(登録番号：TN10_HUMAN)との組合せ投与がある。前立腺腫瘍細胞系において、ＳＭＡＣｃＤＮＡの腫瘍細胞への形質移入により腫瘍細胞のＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬへの感受性が高まり、XIAP、c-IAP1及びc-IAP2の減少を引き起こす(Ng 等, (2002) Mol. Cancer Ther. (12) 1051-1058)。さらに、この実験によりジャーカット細胞のＳＭＡＣ過剰発現によりＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに著しい感受性を示すことが示唆された(Guo等, (2002) Blood 99, 3419-3426)。異なる実験では、Ｕ８７ＭＧ神経膠種細胞を胸腺欠損マウスの線条体に移植して、腫瘍を形成させた後に、ＳＭＡＣペプチドとＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを組み合わせて投与した。ＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独投与では腫瘍の大きさが減少するのに対して、ＳＭＡＣペプチドとＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組合せ投与では完全に根絶した(Fulda等, (2002) Nature Medicine (8) 808-815)。また、ＳＭＡＣペプチドとＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組合せ処置マウスは、ＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単独処置マウス又は対照マウスよりも顕著に長く生存した。
【００８１】
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の投与を組合せることが望ましい。
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類(hydroxyureataxanes)(例えばパクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗-エストロゲン化合物；抗-プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子(及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
【００８２】
しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するため)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益なことである。上述した治療摂生に加えて、抗体、オリゴペプチド又は有機分子治療の前、同時又は治療後に、外科的に癌細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくしてもよい。
【００８３】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の適切な用量は、上記のような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及びＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は静脈注入又は皮下注射により投与される。ＢＤＢオリゴペプチドの患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療によるＢＤＢオリゴペプチドの投与を考察する。ＢＤＢオリゴペプチドをコードする核酸の投与は「ＢＤＢオリゴペプチドの治療的有効量を投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
【００８４】
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はＢＤＢオリゴペプチドが必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【００８５】
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
【００８６】
本ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、哺乳動物におけるＩＡＰ-発現癌の治療又は一又は複数の癌の徴候の緩和に有用である。このような癌には、前立腺癌、尿道癌、肺癌、乳癌、結腸癌及び卵巣癌、特に前立腺癌腫(prostate adenocarcinoma)、腎細胞癌腫、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺細胞の扁平癌腫、及び胸膜中皮腫が含まれる。癌には、上述した任意の転移性癌が含まれる。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、哺乳動物においてＩＡＰポリペプチドを発現している癌細胞の少なくとも一部に結合可能である。好ましい実施態様では、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、インビボ又はインビトロで細胞のＩＡＰポリペプチドに結合して、ＩＡＰ発現腫瘍細胞を破壊又は死滅させるか、又はこのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的である。
【００８７】
本発明は、本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子と担体を含有する組成物を提供する。癌の治療のために、組成物はその治療の必要性に応じて患者に投与することができ、ここで組成物は一又は複数のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有し得る。さらなる実施態様においては、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む成長阻害剤又は細胞障害剤とこれらのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子と担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
また、本発明は、ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子の治療的有効量を、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＩＡＰポリペプチド-発現癌の治療又は癌の一又は複数の徴候を緩和するのに有用な方法を提供する。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子治療組成物は、医師の指示通りに、短い期間(急性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、ＩＡＰポリペプチド-発現細胞の成長を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。
【００８８】
本発明は少なくとも一つのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有するキット又は製造品も提供する。ＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有するキットは、例えば細胞殺傷アッセイへの用途が見出されている。例えば、ＩＡＰの単離及び精製のためには、キットはビーズ(例えばセファロースビース)に結合したＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有することができる。インビトロにおけるＩＡＰの検出及び定量化にＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有するキットを提供することもできる。検出に有用なこのようなＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子は、蛍光又は放射標識などの標識が付されて提供され得る。
【００８９】
Ｅ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、ＩＡＰ発現癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者にＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００９０】
種々の目的、例えばＩＡＰ発現細胞殺傷アッセイ、又は細胞からのＩＡＰポリペプチドの精製に有用なキットも提供される。ＩＡＰポリペプチドの単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含むことが可能である。インビトロにおけるＩＡＰポリペプチドの検出及び定量化のためのＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明のＢＤＢオリゴペプチド又はＢＤＢ小有機分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体、オリゴペプチド、又は小有機分子等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【００９１】
この発明は、ＩＡＰポリペプチド（アゴニスト）の効果を防ぐものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ＩＡＰポリペプチドに結合する又は複合体化する化合物を同定するように設計されている。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリのハイスループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に小分子薬剤候補の同定に適したものにする。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって薬候補をＩＡＰポリペプチドと接触させることを必要とする点で共通である。
【００９２】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＩＡＰポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＩＡＰポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＩＡＰポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【００９３】
アンタゴニストをアッセイするために、ＩＡＰポリペプチドを組成物とともに添加して特定の活性についてスクリーニングを行うと、ＩＡＰポリペプチド存在下で組成物が所望の活性を阻害することが、組成物がＩＡＰポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示唆する。または、ＩＡＰポリペプチドとＩＡＰポリペプチドの潜在的アンタゴニストを拮抗的阻害アッセイに好適な条件下で混合することによりアンタゴニストを検出することができる。ＩＡＰポリペプチドは放射性活性などにより標識して、拮抗物質に結合したＩＡＰポリペプチド分子数により潜在的アンタゴニストの効果を決定する。
潜在的アンタゴニストには、ＩＡＰポリペプチドのＢＩＲドメインに結合して、それによりＩＡＰポリペプチドの正常な生物学的活性を遮断するＢＤＢオリゴペプチド及びＢＤＢ小有機分子が含まれる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【００９４】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体の中で特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【００９５】
実施例１：タンパク質発現及び精製
ＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲ（アミノ酸残基６３−１７９）、Ｘ−ＩＡＰ  ＢＩＲ２（Ｃ２０２Ａ及びＣ２１３Ｇの変異を持つアミノ酸残基１２４−２４０(Sun等, (1999) Nature 401, 818-822))、及びＸ−ＩＡＰ  ＢＩＲ３（アミノ酸残基２４１−３５６、Sun等, (2000) J. Biol Chem. 275, 33777-33781))をコードする配列を細菌内発現のためにｐＥＴ１５ｂベクター(NovagenTM)にサブクローニングした。ｐＥＴ１５ｂ−ＸＩＡＰＢＩＲ２Ｃ２０２ＡＣ２１８Ｇ、ｐＥＴ１５ｂ−ＸＩＡＰＢＩＲ３、及びｐＥＴ１５ｂ−ＭＬＩＡＰＢＩＲベクターを大腸菌(Escherichia coli)系ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。一晩培養した培養物を１：１００に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加したＬＢ培地にてＡ６００で０．５〜０．７になるまで３０度で勢いよく振盪培養した。イソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、３０度で４時間成育させた。凍結細胞ペレットの１ｌｉｔｒｅを５ｍＭのイミダゾールを加えた緩衝液Ａ１００ｍｌ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ  ８．０］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭベンザミジン）に懸濁して、３０分氷上に置いた。ミクロフルイダイザーに繰返し通すことによって細胞を溶解した。溶解物を３０分間１５０００で遠心分離した。上澄をＮｉ−アガロースカラム(Qiagen)に通し、１０ｍＭのイミダゾールを加えた１０カラム量の緩衝液Ａで洗浄し、３００ｍＭのイミダゾールを加えた１０カラム量の緩衝液Ａにて溶出させた。ＢＩＲタンパク質を含む分画を貯蔵した。最終濃度５ｍＭ  ＤＴＴ及び１００ｍＭ酢酸亜鉛となるように添加した。貯蔵物を濃縮して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＴＭ  (Pharmacia) サイズカラムに通した。１カラム量あたり５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭ  ベンザミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  酢酸亜鉛、１ｍＭ  アジ化ナトリウム内にタンパク質を溶出させた。ＢＩＲタンパク質を含む分画を貯蔵して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭ  ベンザミジン、５０ｍＭ  酢酸亜鉛、１ｍＭ  アジ化ナトリウムを含む緩衝液の異なる４つを透析した。タンパク質を濃縮して、更なる解析のために−８０度で保存した。
【００９６】
実施例２：多価天然ポリペプチドファージライブラリーの構築
前述した方法(Sidhu等, (2000) Methods Enzymology 328, 333-363)により、６、８、１４、または２０の残基をそれぞれ含む融合タンパク質をコードする翻訳領域の発現を制御するＩＰＴＧ誘導Ｐｔａｃプロモーターを含むファジミドベクターを用いてライブラリーを構築した。
【００９７】
実施例３：ＢＩＲ結合ファージの選択
免疫吸着プレート(Nunc MaxisorpTM)を室温で１時間、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）中の５μｇ／ｍｌのＢＩＲドメイン（ＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲ、又はＸＩＡＰ−ＢＩＲ２、又はＢＩＲ３）にてコートし、その後１時間リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．２％  ＢＳＡにて遮断した。プレートをＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０にて洗浄した。４つの天然ペプチドファージライブラリーからファージを貯蔵し、ＢＩＲドメインでコートした免疫吸着プレート上で結合選択を３工程で行った。第１工程では、４．８  ｍｌのファージ混合液（１ｍｌあたり〜１０１３ファージのＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％  ＢＳＡ（ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ  緩衝液））を４８コーティングウェル（１００μｌ／ウェル）に添加した。室温での２時間の振盪インキュベーション後、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳにて洗浄して結合しなかったファージを除去した。結合したファージは０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．０（１００μｌ／ウェル）にて溶出させ、ファージ溶出物を１／６量の１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ, ｐＨ  ８．０を添加して中和した。溶出したファージをＭ１３−ＶＣＳＴＭヘルパーファージ(Stratagene)と共にＸＬ１−ｂｌｕｅＴＭ大腸菌細胞(Stratagene)中での増殖により溶出したファージを一昼夜増幅して、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降法により回収した。選択手法の第２工程は遮断緩衝液及びファージ混合液の両方においてＢＳＡの代わりに０．２％カゼインを用いるのに対して、第３工程は第１工程と同様に行った。各工程で得られた個々のファージクローンを単一ポイントファージＥＬＩＳＡ（実施例４を参照）によりＢＩＲドメイン特異的結合について解析した。ＢＩＲドメインに結合してＢＳＡでは結合が見られないポジティブクローンをＤＮＡ配列解析の対象とした。
【００９８】
実施例４：単一ポイントファージＥＬＩＳＡ
ファジミドを内部に持つ大腸菌ＸＬ１−青色コロニーの各々を９６ウェル形状の１．２ｍｌ培養チューブ中の成長培地５００μｌ（５０μｇ／ｍｌカルベニシリン及び１０１０ｐｆｕ／ｍｌのＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージを添加した２ＹＴ）に拾い上げる。一昼夜の成育後、チューブ試験管立てを１０分間２５００ｒｐｍで遠心分離した。ファージ上澄（３００μｌ）を９６ウェルプレートに移し、単一ポイントファージＥＬＩＳＡに直接用いた。ファージＥＬＩＳＡに、９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ免疫プレート(NUNC)をＢＳＡで遮断した５μｇ／ｍｌの捕獲標的タンパク質１００μｌでコートして洗浄した（実施例３に記述）。ファージ上澄（５０μｌ）を各々のウェルに添加し、１時間室温にて振盪培養した。プレートは０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳにて８回洗浄し、１：１００００の西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体コンジュゲート(Pharmacia)を含むＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液５０μｌ中で３０分間インキュベーションした後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭのＰＢＳにて８回及びＰＢＳにて２回洗浄した。プレートをテトラメチルベンジジン基質を用いて現像し(TMB, Kirkegaard及びPerry, Gaithersburg, MD)、１．０  Ｍ  Ｈ３ＰＯ４  （５０μｌ）にて欠失し、４５０ｎｍでの分光光度を計測した。
【００９９】
実施例５：ペプチド合成及び結合アッセイ
ペプチド合成。手動又は自動（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ  ９０５０ＴＭ）何れかの固相合成法にてＦｍｏｃ化学性を利用したＰＥＧポリスチレン樹脂の０．２ｍＭスケールでペプチドを合成した。０．１％トリフルオロ酢酸を添加したH2Oアセトニトリル勾配のＨＰＬＣを用いて精製を行った。熱スプレー質量分析法により各ペプチドの質量を求めた。
合成したペプチドの解析のために、ＡｎａｌｙｓｔＴＭＨＴ  ９６−３８４(Molecular Devices Corp.)にて分極実験を行った。蛍光分極親和性測定のために、分極緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ  ７．２］、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ウシグロブリン及び０．０５％オクチルグルコシド）中のＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３、又はＸＩＡＰ−ＢＩＲ２の何れかを５−カルボキシ蛍光色素結合ペプチド［ＡＶＰＦＡＫ（５−ＦＡＭ）Ｋ（Ｈｉｄ−ＦＡＭ）又はＡＶＰＩＡＱＫＳＥＫ（５−ＦＡＭ）（ＳＭＡＣ−ＦＡＭ）］に対して１：２、３〜５ｎＭの最終濃度となるように加えて試料を調整した。室温で１０分間インキュベーションした後、９６ウェル黒色ＨＥ９６ＴＭプレート(Molecular Devices Corp.)中で蛍光色素（λｅｘ＝４８５ｎｍ；λｅｍ＝５３０ｎｍ）について標準的なカットオフフィルターを用いて反応液を測定した。見かけのＫｄ値をＥＣ５０値より決定した。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３又はＸＩＡＰ−ＢＩＲ２タンパク質をＳＭＡＣ−ＦＡＭに対してはそれぞれ１、１〜２、又は３０μＭで、Ｈｉｄ−ＦＡＭに対してはそれぞれ０．２、０．５、又は３０μＭで、分極緩衝液中の連続的に希釈したアンタゴニストとプローブを含むウェルに添加することによって競合実験を行った。１０分間のインキュベーションの後、試料を計測した。ペプチドに対する阻害係数（Ｋｉ）を以前に記載したように決定した(Keating等, (2000) Proceedings of SPIE: In vitro diagnostic instrumentation Cohn, G.E., Ed. p128-137)。ペプチド結合アッセイの結果を以下の表１に示す。
【０１００】
表１：ファージ由来ペプチドのＫｉ値
2006514963.tif 000003
2006514963.tif 000004
a SMAC-由来対照ペプチド。ペプチド溶解を確実にするためにＫＳＥのＣ末端に付加した６残基ファージ選択的配列に一致した他の合成ペプチド。
【０１０１】
実施例６：結晶化及びデータ収集
１０ｍＭ  ＭＥＳ，  ｐＨ６．５中の凍結乾燥粉末からペプチドを元に戻した。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲタンパク質（貯蔵緩衝液中で２０ｍｇ／ｍｌ）に２：１モル以上でペプチドを添加した。ペプチド／タンパク質複合体を１：１の割合でウェル溶液（５０  ｍＭ  Ｎａ酢酸塩、ｐＨ５．０、５％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ３００、５ｍＭ  ＤＴＴ）に混合し、ウェル溶液に対して蒸気拡散することによって平衡化した。混合により速効性沈殿物が形成され、１日で油性の泡沫状の膜が生じ、続く１週間で小さな桿状の結晶に成長する。また、沈殿剤としてエタノール、イソプロパノール、又はｔ−ブタノールを用いて大きくした；ＰＥＧ３００は凍結防止剤としても働くので好ましい。
結晶は結晶化ドロップの膜から分離し、５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０及び１０％（ｖ／ｖ）  ＰＥＧ３００を含む安定剤に移し、２０分後に２０％ＰＥＧを含む同様の溶液に移した。第二低温安定剤に移してさらに２０分後に液体窒素にて結晶を凍結した。ＨＫＬ２０００ＴＭ（又はそれぞれＤＥＮＺＯＴＭ及びＳＣＡＬＥＰＡＣＫＴＭ）を用いてデータ集積と処理を行った。
【０１０２】
実施例７：構造決定及び精製
タンパク質内の天然亜鉛結合の変則的散乱を利用したＭＡＤ相を用いて、ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ（配列番号：９）ペプチド複合体の構造を解析した。亜鉛部位はＭＡＤデータから予想されるパターソンマップにおいて明らかに変則的かつ分散して存在しており、５つの部位はＣＮＸＴＭ(Accelrys, Inc.)のパターソン検索方法にて見つけられた。溶媒フリッピング（ＣＮＸＴＭを使用）を含む集積修飾により容易に解釈可能な密度を生成した。次にＤＩＡＰ（ＰＤＢ登録コード１ＪＤ４）のＢＩＲドメイン（２１７〜３１０残基）を非対称性単位の５つの各コピーの集積に手動で置き、強固体(rigid-body)を精製した。モデルのアミノ酸配列をＭＬ−ＩＡＰのものに変え、その結果生じたモデルを、ＣＮＸＴＭ、分散したマップの検討、モデルの再構築（結合ペプチドの構築を含む）を用いて、擬似アニーリング、ポジショナル精製、及び個々の原子Ｂ因子精製といったいくつかの工程の対象とした。ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）及びＡＥＶＶＡＶＫＳＥ（配列番号：１０）の両方の複合体構造はＭＡＤフェーズ(phase)データ(１５％より小さい交差Ｒ因子)と十分同形で、Ｆｏ（新しいペプチド）−Ｆｏ（ＭＡＤピーク波長）マップ，  精製した  ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ（配列番号：９）複合体構造を用いたフェーズの検討により、明らかに新しいペプチドを求めるためにはモデルが必須であることを示した。これらの変化 (主に結合ペプチド内の新しいアミノ酸への置換と、Ｌｙｓ１２１の高次構造の調節) を起こして、その結果生じたモデルをポジショナル精製及びＢ因子精製の一工程に用いる。
【０１０３】
実施例８：ＩＡＰ結合ペプチドの選択
ＭＬ−ＩＡＰ及びＸＩＡＰのＢＩＲドメインに結合するペプチド配列の多様性を確認するために、遺伝子ＶＩＩＩファージコートタンパク質上に線状ペプチドを表出する多価Ｍ-１３ファージライブラリをＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２、及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３について選別する。線状Ｘ６、Ｘ８、Ｘ１４、及びＸ２０ライブラリーを用意し、８×１０１０メンバーをライブラリーに与えて結合させた。各タンパク質標的について４工程の選別を行い、計９６個のクローンが単一ポイントファージＥＬＩＳＡ解析のために単離された。ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２及び−ＢＩＲ３によりＢＳＡへの結合がみられないがＢＩＲドメインに対して強い結合を示すクローンが得られた。シークエンスにより、ポジティブクローンの９５％がX6及びX8ライブラリーに由来していることが明示され、このことからペプチドはタンパク質ドメイン内の局在したエピトープに結合していることが示唆された。
新たに結合したＸ６及びＸ８ライブラリー（４×１０１０メンバー）を用いて選別と増幅を４工程行った後、ＭＬ−ＩＡＰについての単一ポイント解析にポジティブを示し、ＢＳＡへの結合を示さないクローンを単離した（図３）。
これらの実験において、ライブラリーの大きさはＸ６及びＸ８ライブラリーの理論的多様性よりも大きい。よって、８Ｎ末端部位のすべてのポジティブアミノ酸結合体を含むライブラリーからコンセンサス配列が得られた。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の両方についての選別から類似の配列を得た（図３）。両者の場合において、アラニン残基はＮ末端に一つだけみられる。クローンのおよそ５０％は２番目がＶａｌであり、９０％以上は３番目にＰｒｏを持つ。４番目の位置には強い選択的バイアスである芳香の疎水性残基として最も一般的にはフェニルアラニン、二番目に一般的な残基としてトリプトファンが存在する。その他の部位にはバイアスが認められないことから、４つのＮ末端残基がＢＩＲ結合に最も重要であることが示唆される。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３、ＡＶＰＦのコンセンサス配列はＨｉｄのＮ末端と一致している（図１）。
ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２についての選別結果は、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３のものと有意に異なる。アラニンは先と同様にＮ末端に高い保存性を有するが、２番目には酸性アミノ酸であるグルタミン酸が位置する。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の３番目の位置には多くの場合プロリンが配位するのに対して、小さい疎水性残基であるグリシン、アラニン、及びバリンは選択的に位置する。４番目には、疎水性残基のバリン及びイソロイシンよりＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３にあるようなより大きな芳香性アミノ酸が配位する。
【０１０４】
実施例９：ファージ由来ペプチドの結合親和性
異なるＢＩＲドメインに対するこれらペプチドの相対的親和性を比較するために、代表的ペプチドを合成し、プローブとしてＳＭＡＣ由来５-カルボキシ蛍光色素標識ペプチド（ＳＭＡＣ−ＦＡＭ）を用いた蛍光色素局在化に基づく競合アッセイにより親和性を決定した（表１）。それら標識タンパク質に対するファージ選択ペプチドの親和性は一般的にＳＭＡＣ由来ペプチドに対するものよりもわずかに高い。ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２への結合について選択されたペプチドはＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に比較してＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲに対して１０倍より大きい特異性を示す。これらペプチドはＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの結合に対してＳＭＡＣ由来ペプチドよりおよそ１０倍弱いが、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合に対しては１００倍よりも弱い。
【０１０５】
実施例１０：ＳＭＡＣ及びファージ由来ペプチドに結合したＭＬ−ＩＡＰ  ＢＩＲの構造
さらに、いくつかのファージ由来ペプチドにみられる特異性の相違を理解するために、ＳＭＡＣ由来ペプチド（ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ  （配列番号：１））及び対象とする２つの異なるペプチド（ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ  （配列番号：９）及びＡＥＶＶＡＶＫＳＥ  （配列番号：１０））それぞれとの複合体におけるＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメインを結晶化した。分解能２．２〜２．８Åの構造を決定した（表２）。それぞれの場合で、結晶の非対称性単位においてＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの５つのコピーがあり（図２）；最終的な原子モデルにはタンパク質残基７２−１６９（プロトマーＡ）、  ７２−１７１（プロトマーＢ−Ｄ）、及び７８−１７１（プロトマーＥ）を含む。驚くことに、５つのＢＩＲドメインのうちの一つ（プロトマーＥ）しかＳＭＡＣ結合ポケットのペプチドに結合しない；結合したペプチドは残基１’−４’に強い電子集積を有し、Ｃ末端の５つの残基には集積を有さない。プロトマーＡ−Ｄは近接したプロトマーと残基Ａｌａ７３−Ｔｈｒ７４−Ｌｅｕ７５−Ｓｅｒ７６を介してＳＭＡＣ結合ポケットである四量体を形成する。さらに、ヘプタエチレングリコール分子により中心にある多くのチロシンと相互作用してこの四量体を安定化する。
ペプチド結合ドメイン、２つの異なる高次構造にみられる残基１１６−１１９において障害となるＮ末端領域を除いて、各非対称性単位内の５つのＢＩＲドメインは残基７９−１１５及び１２０−１６８の重合に０．４５Å以下の平均バックボーンペアワイズＲＭＳ偏差（average backbone pairwise RMS deviations）でとても類似している。ＭＬ−ＩＡＰのＢＩＲドメインは５つのαヘリックス、３本鎖のβシート、及び３システインと１ヒスチジン残基によってキレート化される亜鉛原子を含む（図４）。よって、構造がＸＩＡＰ−ＢＩＲ３／ＳＭＡＣ(Wu等, (2000) Nature 408, 1008-1012)、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２／カスパーゼ−３(Riedl等., (2001) Cell 104, 791-800)、及びDIAP1-BIR2/GrimとHid (Wu等, (2001) Mol. Cell 8, 95-104)との複合体を含むペプチド結合ＢＩＲドメインのものと、すべてのＣ-α原子に対して０．７Åより小さいＲＭＳ偏差で類似している。
【０１０６】
ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲとＳＭＡＣ−及びファージ由来ペプチドとの結合相互作用は、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に結合するＳＭＡＣ由来ペプチドにみられるものと本質的に同一であり(Wu等, (2000) Nature 408, 1008-1012)、ペプチドのＮ末端の４つの残基のみでタンパク質と接する（図５）。ペプチドのＮ末端は、アスパラギン酸１３８及びグルタミン酸１４３のカルボキシル基側鎖にアミノ基のＡｌａ1'が水素結合して酸性となっている。ペプチド残基２’−４’は、Ｖａｌ／Ｇｌｕ２’アミドとＧｌｎ１３２カルボニル基、Ｖａｌ／Ｇｌｕ２’カルボニル基とＧｌｎ１３２アミド間の水素結合、Ｉｌｅ／Ｖａｌ４’アミドとＧｌｙ１３０カルボニル基との長い水素結合（Ｎ−Ｏ間が〜３．３Å）により、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの逆行性βシートに向かって高度にねじれて伸展している。ファージ由来ペプチド複合体においてはＧｌｕ２’のカルボキシル基側鎖とＳｅｒ１３３の水酸基側鎖間に水素結合が付加されうる。
さらに、ペプチドとＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ間の疎水性作用により相互作用が安定化される。Ａｌａ１’のメチル基はＬｅｕ１３１、Ｔｒｐ１３４、及びＧｌｕ１４３の側鎖により形成される疎水性ポケットに囲まれる。ペプチド残基２’（Ｖａｌ／Ｇｌｕ２’）の側鎖は各々３つの複合体内のＳｅｒ１３３のβメチレンとファンデルワールス作用を生じる。３複合体において残基３’は異なり、それぞれの場合において異なる疎水性作用を生じる。ＳＭＡＣ由来ペプチドでのＰｒｏ３’はＶａｌ２’の側鎖と同様にＴｒｐ１４７とファンデルワールス作用を生じる。ＡＥＶＶＡＶＫＳＥ  （配列番号：１０）のＶａｌ３’の側鎖はＴｒｐ１４７及びＰｈｅ１４８の側鎖により限定される疎水性溝に容易に適応するのに対して、ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ（配列番号：９）ペプチドのＡｌａ３’のメチル基側鎖はタンパク質と有意なファンデルワールス作用を有さない。また、結晶構造でみられるＭＬ−ＩＡＰ分子間の相互作用にみられるように、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲではペプチドのこの部位にLeuが容認される（図２）。最終的にペプチド残基４’（Ｉｌｅ／Ｖａｌ４’）の側鎖は、Ｇｌｙ１３０−Ｇｌｎ１３２により限定される疎水性ポケット、及びＴｈｒ１１６、Ｌｙｓ１２１、及びＡｒｇ１２３の脂肪族性部位を相互作用する。ファージ由来ペプチドとの複合体において、Ｉｌｅ４’がより小さいＶａｌ４’へと置き換わることにより空位のスペースを埋めるためにＬｙｓ１２１がＳＭＡＣペプチド複合体内の位置から移動していたことから、このポケットにいくらかの自由度があることが示唆される。
【０１０７】
表２：データ収集及び精製統計ａ
2006514963.tif 000005
ａ各例での空間群及び単位細胞はＰ３２、ａ＝８３．８、ｂ＝８３．８、ｃ＝９４．３。括弧内の数は最も高い分解能殻の統計である。全てのデータはBijvoet mates separateを保つ大きさであった。ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）構造は非対称ユニットの５分子を有し、全部で３９９７のタンパク質原子、３６８の水、５の亜鉛原子、及び１のヘプタエチレングリコール分子を持つ。また、他の構造も非対称ユニットの５分子を有し、ほぼ同じ数の原子を持つ。
b Rcryst = Σ|(Fobs) - (Fcalc)|/Σ(Fobs)。
c RfreeはRcrystと同様に定義されるが、モデル精製に用いられなかった全反射の試験的セット５％を含む。
【０１０８】
実施例１１：位置的スキャニング
ファージ選択及び続くＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ペプチド複合体の構造解析により、ペプチド修飾によりＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に比較してＭＬ−ＩＡＰに対する結合親和性及び選択性が増すであろうことが示唆される。より系統的な方法で２’、３’及び４’位での置換の影響を試験するために、ＳＭＡＣ由来ペプチドＡＶＰＩＡＱＫＳＥ  （配列番号：１）に一連の単一点突然変異を入れて合成し、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３両方に対する結合を測定した。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへ結合するＡＶＰＩＡＱＫＳＥ  （配列番号：１）のＫｉ値に対して相対的な変異型ペプチドのＫｉ値をプロットしたものを図６に、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３へ結合するペプチドのＫｉ値を表３に示す。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の両方へ結合するこれらの残基は、アラニンに置換したときにはその親和性が１０倍以下になることからその重要性が強調される。他の天然アミノ酸置換の中には、４’位のＰｈｅ及びＴｒｐは結果的にＳＭＡＣ由来ペプチドに比較して親和性が増加する。
いくつかの変異は結果としてＸＩＡＰ−ＢＩＲ３に比較してＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ特異性を改善する。特に、２’位でのＧｌｕ又はＡｓｐを持つ変異型ペプチドはＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ選択性を７〜８倍にする。Ｐｒｏ３’をＶａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへ置換すると、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ特異性が１０倍より大きく上がる。構造を元にしたモデリングにより、Ｐｒｏ３’を(2S, 3S)-3-メチルピロリジン-2-カルボキシル酸[(3S)-メチル-プロリン]に置換すると、Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕ置換ペプチドに比較してＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ親和性が改善される一方でこれらアミノ酸により与えられた特異性の利点を維持したペプチドとなるであろうことが示唆された。結果としてできたペプチドは初めのＳＭＡＣ由来ペプチドよりＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの親和性を７倍以上有し（０．５μＭと比較したときのＫｉ＝７０ｎＭ）、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３と比較してＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ特異性を１００倍有する。
４’位での非天然アミノ酸置換の多くも又結果的にＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ特異性を改善する。ホモフェニルアラニン（Ｘ１２）（〜７倍）に続いて、２−ナフチルアラニン（Ｘ１）、４−アミノ−フェニルアラニン（Ｘ４）、及び４−フェニル−フェニルアラニン（Ｘ１４）に大きな特異性亢進がみられる。４つすべての場合においてＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合親和性を減少させたのに対して、これらの置換のうち２−ナフチルアラニンのみがＳＭＡＣ由来ペプチド（〜３倍減少）と比較してＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ親和性を著しく減少させた。
【０１０９】
表３：ポジショナル走査ペプチド相同性のＫｉ値
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a 非天然アミノ酸は以下のように表す：Ｘ、 (3S)-メチル-プロリン；Ｘ１、 2-ナフチルアラニン；X2、フェニルアラニン-4-スルホン酸；X3、4-ニトロ-フェニルアラニン；X4、4-アミノ-フェニルアラニン；X5、3-メトキシ-フェニルアラニン；X6、シクロヘキシルアラニン；X7、シクロペンチルアラニン；X9、3,5-ジブロモ-チロシン；X10、4-ヨード-フェニルアラニン；X12、ホモフェニルアラニン；X13、4-ケトフェニル-フェニルアラニン；X14、4-フェニル-フェニルアラニン。
【０１１０】
実施例１２：フェニルエチルアミンスキャン
一連のフェネチルアミン誘導体（表４）を手動又は自動何れかの合成機（ＱｕｅｓｔＴＭ）により合成した。Ｎ−メチルピロリジン中の２％酢酸のシアノホウ化水素ナトリウム（３等価）を用いて１２時間でフェネチルアミンを還元的にＡｒｇｏＧｅｌ−ＭＢ−ＣＨＯＴＭ樹脂（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）にアミン化した。アミノ酸であるアラニン、バリン、及びプロリンは標準的Ｆｍｏｃ化学法を用いて付加した。フェネチルアミンペプチドはトリフルオロ酢酸を用いて樹脂から切断し、０．１％トリフルオロ酢酸とＨ２Ｏアセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣにより精製した。各物質の質量は熱スプレー質量分析法により確認した。
ファージディスプレイデータ、ペプチドアラニンスキャンデータ（データは示していない）、及びML-IAP-BIR/ペプチド複合体のＸ線結晶構造により、４つのＮ末端ペプチド残基がML-IAP-BIRへの高い結合親和性を十分有することが示され、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３についての以前の結果と一致する(Wu等, (2000) Nature 408, 1008-1012、Liu等, (2000) Nature 408, 1004-1008、Kipp等,. (2002) Biochemistry 41, 7344-7349)。
また、結晶構造の検討により、そのような４残基ペプチドのＣ末端カルボキシル基がペプチド結合に有意に関与していないことが示唆された。さらに、４’位での置換の効果を探求するために、アミノ酸を選択的にフェニルエチルアミン誘導体に置換した一連の化合物を合成し、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合についてペプチドＡＶＰＩ及びＡＶＰＦと比較した。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへ結合するＡＶＰＩのＫｉ値と比較した化合物のＫｉ値をプロットしたものを図７に示す（また、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３へ結合する化合物のＫｉ値を表４に示す）。
【０１１１】
前述のように９残基のＳＭＡＣ由来ペプチドの前後におけるＰ４アミノ酸スキャンのために、４残基ペプチドの前後のＩｌｅ４’をＰｈｅへ置換すると、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３の両方に対する結合親和性が有意に改善される。Ｐｈｅに構造的にとても類似している（S）-2-アミノ-3-フェニル-1-プロパノール（Ｘ３２）又は（S）α-（メトキシメチル）-フェニルエチルアミン（Ｘ３８）への置換は結果的に、４残基ペプチドＡＶＰＦでみられるのと同様な結合親和性をもたらす。加えて、いくつかのフェニルエチルアミン誘導体への置換は結果的に、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ特異性を改善する。最も特異性が亢進するのは、2,2-ジフェニルエチルアミン（Ｘ２４）(〜9倍)、続いてトランス（1R,2S）-2-フェニルシクロプロピル-1-アミン（Ｘ２８ａ）、及び(1R,2S)-ノルエフェドリン（Ｘ２９）へ置換したときにみられる。これらの置換のうち、2,2-ジフェニルエチルアミンはペプチドＡＶＰＩ（〜１０倍改善）又はＡＶＰＦ（〜３倍改善）よりもＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲに対して著しく高い親和性を示す。
ペプチド残基４’を2,2-ジフェニルエチルアミンに置換することによって生じる特異性及び親和性の改善をより完全に理解するために、ＳＭＡＣ由来とファージ由来ペプチドとの複合体に用いたのと同様な手順によりＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲをＡＶＰＸ２４と結晶化した。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ＡＶＰＸ２４複合体についてのデータはスタンフォードシンクロトロン照射実験(Stanford Synchrotron Radiation Laboratory)の９−１線(beamline)で集積した。ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ（配列番号：９）複合体からあらかじめ決定したＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの構造（ペプチドを含まない）を用いて、ＡＶＰＸ２４分子を容易に配置できるＦｏ  −  Ｆｃの異なる電子密度マップを作製した。2,2-ジフェニルエチルアミン分子部分の２つのフェニルリングの位置はあいまいであった。そして、複合体をＲｅｆｍａｃを用いた位置的及び個々の原子Ｂ因子精製の一工程の対象とした。
【０１１２】
２．３Åの分解度で構造を決定した（表２）。ＡＶＰＸ２４内のＡｌａ１’、Ｖａｌ２’、及びＰｒｏ３’の結合高次構造は、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）複合体でみられるものとほぼ同じである（図８）。2,2-ジフェニルエチルアミン分子部分のフェニルリングの一つは、タンパク質残基Ｔｈｒ１１６、Ｌｙｓ１２１−Ａｒｇ１２３、及びＧｌｙ１３０−Ｇｌｎ１３２と広く作用するように疎水性Ｐ４ポケット内に包まれている。対照的に、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）複合体のＩｌｅ４’側鎖はタンパク質残基Ｌｙｓ１２１、及びＧｌｙ１３０−Ｇｌｎ１３２にしか作用しない。2,2-ジフェニルエチルアミン分子部分の二つめのフェニルリングは、Ｌｙｓ１２１の疎水性側鎖に作用する一端を持つタンパク質の表面上にある。よって、ＡＶＰＩのＩｌｅ４’のＡＶＰＸ２４の2,2-ジフェニルエチルアミンへの置換によりみられるML-IAP-BIRへの親和性の１０倍の増加は後者の複合体の二つのフェニルリングにみられる付加的疎水性作用によって説明できる。同様に、ＡＶＰＦと比較したときの３倍の親和性増加は第二フェニルリングとタンパク質との付加的な疎水性作用の結果であるようである。
【０１１３】
表４：Ｐ４アミノ酸／フェニルエチルアミンスキャンのＫｉ値
2006514963.tif 000009
2006514963.tif 000010
aフェニルエチルアミン誘導体は以下に示すとおりである：X24、2,2-ジフェニル・エチルアミン；X25、（1S,2S）−(+)-2-アミノ-1-フェニル-1,3-プロパンジオール；X26、3-トリフルオロメチルフェニルエチルアミン；X27、（1R,2R）-（-）-2-アミノ-1-フェニル-1,3-プロパンジオール；X28a、トランス-（1R,2S）-2-フェニルシクロプロピル-1-アミン；X28b、トランス-（1S,2R）-2-フェニルシクロプロピル-1-アミン；X29、（1R,1S）-(+)-ノルエフェドリン；X31、β-メチルフェニルエチルアミン；X32、（S）-（-）-2-アミノ-3-フェニル-1-プロパノール；X33、(R)-（-）-2-アミノ-1-フェニルエタノール；X34、3-エトキシフェニルエチルアミン；X36、5-ブロモ-2-メトキシフェニルエチルアミン；X37、3-フルオロフェニルエチルアミン；X38、（S）-(+)-α-（メトキシメチル）-フェニルエチルアミン；X39、3-クロロフェニルエチルアミン；X40、2-エトキシフェニルエチルアミン。すべてのデータ（ＡＶＰＸ２４を除く）はBijvoet mates separateを保つ大きさであった。
【０１１４】
実施例１３：ジペプチドアイソスタースキャン
ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ペプチド複合体の結晶構造に基づく分子モデル研究により、Ｓｍａｃ由来ペプチドＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）のＶａｌ２’及びＰｒｏ３’が、タンパク質のＶａｌ２’及びＧｌｎ１３２間にみられる主鎖対主鎖の水素結合を維持するジペプチドアイソスターに置き換わっていることが示唆された。この仮説を試験するために図１０Ａに示す化合物を合成した。
ＩＡＱＫＳＥアミノ酸配列を標準的なＦｍｏｃ化学法を用いて樹脂上に合成した。(3S)-Fmoc-3-アミノ-1-カルボキシメチル-カプロラクタム（ＮｅｏｓｙｓｔｅｍＴＭ）をＰｙＢｏｐカップリング(１２時間)を用いてこの配列に添加した。アラニンは標準的なペプチド化学法を用いて付加し、ペプチドはトリフルオロ酢酸を用いて樹脂から切断し、０．１％トリフルオロ酢酸とH2Oアセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣにより精製した。この結果、配列Ａ（Ｘａａ）ＩＡＱＫＳＥ（配列番号：５３）、Ｘａａはこの実施例で示す一のジペプチドアイソスターである配列となった。各物質の質量は熱スプレー質量分析法により確認した。この結果できた化合物をＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合について試験するために、プローブとして５−カルボキシ蛍光色素コンジュゲートＨｉｄペプチド［ＡＶＰＦＡＫ（５−ＦＡＭ）Ｋ，  Ｈｉｄ−ＦＡＭ］を用いた蛍光色素局在化に基づく競合アッセイを用いた。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合に対するＫｉ値はそれぞれ１５．３及び３９．８μＭであった。よって、そのようなジペプチドアイソスターを含むペプチドはＩＡＰタンパク質に対する結合能及びアンタゴナイズ能を有する。Ｓｍａｃ由来ペプチドＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）と比較してこの化合物が有するＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの結合親和性における３０倍未満への減少が結果的に、Ｐｒｏ３’の側鎖とタンパク質間の作用の減少を部分的にもたらしているようである。よって、関連したジペプチドアイソスター、例として[3R,6S,10R]-6-アミノオクタヒドロ-5-オキソ-チアゾロ[3,2-a]アゼピン-3-カルボキシル酸、又は[3R,6S,9R]-6-アミノヘキサヒドロ-5-オキソ-チアゾロ[3,2-a]ピリジン-3-カルボキシル酸がＳｍａｃ由来ペプチドＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）のＰｒｏ３’とタンパク質間にみられるのと同様な作用を再導入することによってＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの結合親和性を改善したと予測される。さらに、構造に基づくモデリングにより、図１０Ｂ−１０Ｅに示すような[3R,6S,10R]-6-アミノオクタヒドロ-5-オキソ-2,2-ジメチル-チアゾロ[3,2-a]アゼピン-3-カルボキシル酸、又は[3R,6S,9R]-6-アミノヘキサヒドロ-5-オキソ-2,2-ジメチル-チアゾロ[3,2-a]ピリジン-3-カルボキシル酸等のジペプチドアイソスターにメチル基を導入するとＸＩＡＰ−ＢＩＲ３と比較してＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの親和性及びＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ特異性がさらに改善されるであろうことが示唆される（実施例１１に記載のようにＳｍａｃ由来ペプチドＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）内のＰｒｏ３’を(3S)-メチル-プロリンに置換した)。
【０１１５】
実施例１４：スクリーニングのためのML-IAP変異型
核磁気共鳴(NMR)に基づく方法は、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲに弱く結合する化合物を同定し、薬剤発見過程におけるリード化合物として用いられるより強力なアンタゴニスト開発の助けとなりうる。特に、ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲ（ＮＭＲによる構造的活性関係(structure-activity relationship by NMR))法及びその変法は薬剤発見ＮＭＲに広く適用されている(Shuker等, (1996) Science 274, 1531-1534)。
そのような方法は、タンパク質の化学変化を利用して、タンパク質上の結合部位を標的とした低親和性のリガンドを同定することに基づく。そのような化学変化マッピング法の必須条件は、二次元異核集積スペクトル（１５Ｎ，１Ｈ−  又は１３Ｃ，１Ｈ−集積スペクトルの何れか）におけるタンパク質共鳴の適度な分解能、及び好ましくは配列特異的な配置である。残念なことに、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲドメインはＮＭＲ分光法に必要な濃度範囲に著しく集積しているため質の悪いＮＭＲスペクトルしか得られず、低親和性リガンドを同定するためのタンパク質化学変化マッピング法を行うことができない。
しかし、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの結晶の非対称性単位の検討により、溶液相にみられる集積の原因となっているプロトマーＡ−Ｄにより形成される四量体内の疎水性領域が明らかとなる。よって、疎水性アミノ酸を持つＸ線結晶構造によって同定される領域内の疎水性アミノ酸のいくつかが置換すると、溶液集積が減少し、したがってＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのＮＭＲスペクトルの質が改善することが予測される。この仮説を試験するために、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ残基Ｐｈｅ８１及びＬｅｕ８９（図２）をそれぞれＧｌｕ及びＡｓｐに変異させた。野生型及びＰｈｅ８１Ｇｌｕ／Ｌｅｕ８９Ａｓｐ変異型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲタンパク質の１５Ｎ，１Ｈ−異核単一量子干渉性（ＨＳＱＣ）スペクトルを比較すると、四量体領域の残基の変異により劇的にスペクトルの質が改善した（図９）。このような変異の結果、ＮＭＲを元としたスクリーニング法に使用可能なＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ変異型となる。
【０１１６】
実施例１５：アポトーシスアッセイ
０．２μｇのレポータープラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ＋０．２μｇのＦａｓ、ＴＮＦＲ１、ＤＲ４又はＤＲ５をコードするプラスミド及び１．６μｇのバキュロウイルスＰ３５又はヒトＩＡＰベクターをコードするプラスミドを過渡的にＭＣＦ７細胞に形質移入した。アドリアマイシン又は４−ＴＢＰ処理のため、レポータープラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ及び対照ベクター又はＩＡＰを過渡的にＭＣＦ７細胞に形質移入した。形質移入から４時間後、アドリアマイシン(ドキソルビシン、Sigma)又は４−ＴＢＰ(Aldrich)を指示濃度で培地に添加した。Pan等, (1997) Science 277:815-818に記載の通りにアポトーシスアッセイを１６時間後に行った。黒色腫細胞系（８８８，６２４）又はメラニン細胞（ＮＨＥＭ細胞）を指示濃度の４−ＴＢＰで５時間処理して、プロピジウムヨウ化物及びアネキシンＶ(Clontech)染色によるＦＡＣＳ分析によりその生存を評価した。このアッセイを用いてＭＬ−ＩＡＰの抗アポトーシス活性を遮断するＳＭＡＣペプチドを検索した(Vucic等, (2002) J.Biol. Chem. 277; 12275-12279)。ＳＭＡＣ様ペプチドはＭＬ−ＩＡＰの抗アポトーシス活性を遮断する。０．１５ｍｇのレポータープラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及び０．８５ｍｇのベクター単独、ＭＬ−ＩＡＰ又はＸ−ＩＡＰの何れかをコードするプラスミドを過渡的にＭＣＦ７細胞に形質移入した。形質移入後、ＳＭＡＣ-アンテナペディア(ペネトラチン(penetratin)；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＮＨ２（配列番号：５４））融合タンパク質又は他の示したペプチド−アンテナペディア融合（５０ｍＭ）を添加し、３時間後に細胞をアドリアマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）に曝した。形質移入の２４時間後、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-b-D-ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）で染色された細胞の形態について調べた。データ（平均±標準偏差）は全β-ガラクトシダーゼ陽性細胞（ｎ＝３）のうちの機能としての活発なアポトーシス細胞の割合を表す。このデータを図１１に示す。
【０１１７】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した実施物は、本発明のある側面の一つの例示として意図されており、機能的に等価なあらゆるコンストラクトがこの発明の範囲内にあるため、寄託されたコンストラクトにより、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】活性化ヒト、マウス、及びツメガエルのカスパーゼ−９、活性化哺乳動物のＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＨｔｒＡ２／Ｏｍｉ、及びショウジョウバエＲｅａｐｅｒ、Ｈｉｄ、Ｇｒｉｍ、及びＳｉｃｋｌｅの小サブユニットの９つのＮ末端残基のアミノ酸配列。
【図２】（Ａ）ドメイン間の相互作用を表すＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ複合体の結晶非対称ユニットにおけるＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの５コピーの構造図を示す。疎水性作用領域の残基Ｐｈｅ８１及びＬｅｕ８９をＣＰＫ予想図に示す。プロモーターＥに結合したＳＭＡＣ由来のペプチドをｓｔｉｃｋ予想図に示す。（Ｂ）対称性の関連タンパク質分子のペプチドＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）又は残基Ｇｌｙ７２−Ａｌａ７３−Ｔｈｒ７４−Ｌｅｕ７５−Ｓｅｒ７６が占めるペプチド結合部位の最小四角形の重なりを示す立体図。ペプチドとタンパク質間の水素結合を細い線で示す。
【図３】ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３及びＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲに対するファージについて選択された結合ペプチドのアミノ酸優先（偏りについて矯正）。
【図４】ＳＭＡＣ由来ペプチド  ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（配列番号：１）複合体におけるＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの全体構造。５つのαヘリックス（残基８７−９２、１０５−１１０、１４０−１４７、１５２−１５８、及び１６０−１６８）及び三本鎖のβシート（残基１１３−１１５、１２２−１２４、及び１３０−１３２）を含んでなる第二構造。また、３つのＣｙｓ及び１つのＨｉｓ残基（Ｃｙｓ１２４、Ｃｙｓ１２７、Ｃｙｓ１５１、及びＨｉｓ１４４）によりキレート化したｚｉｎｃ原子を示す。
【図５Ａ】ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲのペプチド結合部位の溶媒集積表面を示す。また、ＳＭＡＣ由来ペプチド結合も示す。
【図５Ｂ】ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲとペプチド  ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ  （配列番号：１）、ＡＥＡＶＰＷＫＳＥ（配列番号：１９）とＡＥＶＶＡＶＫＳＥ（配列番号：１０）の複合体のペプチド結合部位の最小四角形の重なり（タンパク質残基７８−１７０及びペプチド残基１’−４’を介す）を示す立体図。ペプチドとタンパク質間の水素結合を細い線で示す。
【図５Ｃ】ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３及びＸＩＡＰ−ＢＩＲ２の構造に基づく配列。ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの第二構造は配列の上に示す。アステリスクで示す残基はＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ／ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ複合体構造においてＳＭＡＣ由来ペプチドの４オングストローム内である。
【図６Ａ】２’残基置換を持つＳＭＡＣ由来ペプチドのＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ（黒）またはＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（灰色）への結合を相対的に表した値Ｋｉ［Ｋｉ（変異型ペプチド／タンパク質）／Ｋｉ（ＳＭＡＣペプチド／ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ］のログプロット。ＳＭＡＣ−ＦＡＭ又はＨｉｄ−ＦＡＭ何れかのプローブを用いた蛍光偏光競合アッセイによりＫｉ値を決定した（材料及び方法に示す）。プローブに対するＫｄ値は、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの結合ではそれぞれ０．１５及び０．０３８μＭ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合ではそれぞれ０．２６及び０．１１μＭである。非天然アミノ酸は以下に示す通りである：βMe-Pro、(3S)-メチル・プロリン；X1、2-ナフチルアラニン；X2、フェニルアラニン-4-スルホン酸；X3、4-ニトロフェニルアラニン；X4、4-アミノ-フェニルアラニン；X5、3-メトキシ-フェニルアラニン；X6、シクロヘキシルアラニン；X7、シクロペンチルアラニン；X9、3,5-ジブロモ-チロシン；X10、4-ヨードフェニルアラニン；X12、ホモ・フェニルアラニン；X13、4-ケトフェニル-フェニルアラニン；X14、4-フェニル-フェニルアラニン。
【図６Ｂ】３’残基置換を持つＳＭＡＣ由来ペプチドのＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ（黒）またはＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（灰色）への結合を相対的に表した値Ｋｉ［Ｋｉ（変異型ペプチド／タンパク質）／Ｋｉ（ＳＭＡＣペプチド／ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ］のログプロット。ＳＭＡＣ−ＦＡＭ又はＨｉｄ−ＦＡＭ何れかのプローブを用いた蛍光偏光競合アッセイによりＫｉ値を決定した（材料及び方法に示す）。プローブに対するＫｄ値は、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの結合ではそれぞれ０．１５及び０．０３８μＭ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合ではそれぞれ０．２６及び０．１１μＭである。非天然アミノ酸は以下に示す通りである：βMe-Pro、(3S)-メチル・プロリン；X1、2-ナフチルアラニン；X2、フェニルアラニン-4-スルホン酸；X3、4-ニトロフェニルアラニン；X4、4-アミノ-フェニルアラニン；X5、3-メトキシ-フェニルアラニン；X6、シクロヘキシルアラニン；X7、シクロペンチルアラニン；X9、3,5-ジブロモ-チロシン；X10、4-ヨードフェニルアラニン；X12、ホモ・フェニルアラニン；X13、4-ケトフェニル-フェニルアラニン；X14、4-フェニル-フェニルアラニン。
【図６Ｃ】４’残基置換を持つＳＭＡＣ由来ペプチドのＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ（黒）またはＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（灰色）への結合を相対的に表した値Ｋｉ［Ｋｉ（変異型ペプチド／タンパク質）／Ｋｉ（ＳＭＡＣペプチド／ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ］のログプロット。ＳＭＡＣ−ＦＡＭ又はＨｉｄ−ＦＡＭ何れかのプローブを用いた蛍光偏光競合アッセイによりＫｉ値を決定した（材料及び方法に示す）。プローブに対するＫｄ値は、ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲへの結合ではそれぞれ０．１５及び０．０３８μＭ、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ３への結合ではそれぞれ０．２６及び０．１１μＭである。非天然アミノ酸は以下に示す通りである：βMe-Pro、(3S)-メチル・プロリン；X1、2-ナフチルアラニン；X2、フェニルアラニン-4-スルホン酸；X3、4-ニトロフェニルアラニン；X4、4-アミノ-フェニルアラニン；X5、3-メトキシ-フェニルアラニン；X6、シクロヘキシルアラニン；X7、シクロペンチルアラニン；X9、3,5-ジブロモ-チロシン；X10、4-ヨードフェニルアラニン；X12、ホモ・フェニルアラニン；X13、4-ケトフェニル-フェニルアラニン；X14、4-フェニル-フェニルアラニン。
【図７】４’残基で選択的アミノ酸又はフェニルエチルアミンへの置換を持つＳＭＡＣ由来ペプチドのＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ（黒）またはＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（灰色）への結合を相対的に表した値Ｋｉ［Ｋｉ（置換ペプチド／タンパク質）／Ｋｉ（ＡＶＰＩ／ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ］のログプロット。Ｈｉｄ−ＦＡＭプローブを用いた蛍光偏光アッセイによりＫｉ値を決定した（記載の通り）。フェニルエチルアミン誘導体は以下に示すとおりである：X24、2,2-ジフェニル・エチルアミン；X25、（1S,2S）-(+)-2-アミノ-1-フェニル-1,3-プロパンジオール；X26、3-トリフルオロメチルフェニルエチルアミン；X27、（1R,2R）-（-）-2-アミノ-1-フェニル-1,3-プロパンジオール；X28a、トランス-2-（1R,2S）-2-フェニルシクロプロピル-1-アミン；X28b、トランス-（1S,2R）-（-）-2-アミノ-1-フェニルシクロプロピル-1-アミン；X29、（1R,1S）-(+)-ノルエフェドリン；X31、β-メチルフェニルエチルアミン；X32、（S）-（-）-2-アミノ-3-フェニル-1-プロパノール；X33、(R)-（-）-2-アミノ-1-フェニルエタノール；X34、3-エトキシフェニルエチルアミン；X36、5-ブロモ-2-メトキシフェニルエチルアミン；X37、3-フルオロフェニルエチルアミン；X38、（S）-(+)-α-（メトキシメチル）-フェニルエチルアミン；X39、3-クロロフェニルエチルアミン；X40、2-エトキシフェニルエチルアミン。
【図８】ＡＶＰＸ２４とＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの複合体の結晶構造からのペプチド結合部位の溶剤可触性表面を表す（ここでＸ２４は２,２-ジフェニルエチルアミン）。結合ペプチド-フェニルエチルアミン誘導体は細い線で示す。
【図９】Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−６００  ＮＭＲ分光計により２５度で得られた５０  ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ  ７．２）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中の（Ａ）０．６ｍＭ  ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲ及び（Ｂ）０．６ｍＭ  Ｐｈｅ８１Ｇｌｕ／Ｌｅｕ８９Ａｓｐ変異型ＭＬ−ＩＡＰ−ＢＩＲの１５Ｎ，１Ｈ−ＨＳＱＣスペクトル。
【図１０】ＩＡＰタンパク質に結合及び拮抗することのできるジペプチドアイソスターの構造を示す。図１０ＡはＸａａが(3S)-3-アミノ-1-カルボキシメチル-カプロラクタムである配列Ａ（Ｘａａ）ＩＡＱＫＳＥを示し、図１０Ｂ−Ｅに任意のジペプチドアイソスターを示す。
【図１１】ＳＭＡＣ様ペプチドはＭＬ−ＩＡＰの抗アポトーシス活性を遮断する。ＩＡＰを形質導入した細胞はアドリアマイシンで処理したときアポトーシス減少を示す。アドリアマイシンとＢＤＢオリゴペプチドを組み合わせて添加するとアポトーシス量が増加する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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