(57)【要約】プラスミドＤＮＡを細胞ライセートから分離するために有用なポリマーを、多孔質マトリックスの孔隙全体に分散させることで、クロマトグラフィー用収着剤を形成することができる。このようなポリマーの例は式（Ｉ）：【化１】2006512457.tif 000006のポリマーであり、式中、Ｒ１はＣ１〜６アルキルであり；Ｒ２はそれぞれ独立にＨ等から成る群より選択され；Ｒ３はＨ等から選択され；ｎはそれぞれ独立に１〜６の整数であり；ａ、ｂ、ｚは少なくとも１であり；ｗは０〜１０の整数であり；Ｘは陰イオンであり；少なくとも１つのＹはペンダントアミン基でそれぞれが置換されている複数のモノマーを含む直鎖ホモポリマーであり、「-----」はポリマーの残りの部分を表す。
2006512457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、（ｉｉ）疎水性アクリルモノマー、及び（ｉｉｉ）アクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する架橋コポリマーと、
（ｂ）ペンダントアミン基でそれぞれが置換されている複数のモノマーを含む直鎖ホモポリマーと、
を含み、前記架橋コポリマーが前記直鎖ホモポリマーと共有結合している、ポリマー。
【請求項２】
前記架橋コポリマーが、アクリルスペーサーモノマーをさらに含有する、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記直鎖ホモポリマーの前記ペンダントアミン基が、第２級又は第３級アミンである、請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
前記直鎖ホモポリマーが、ポリ−ジメチルアミノプロピル−メタクリルアミド、ポリ−ジエチルアミノエチル−メタクリルアミド、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリリシンから成る群より選択される、請求項３に記載のポリマー。
【請求項５】
前記疎水性モノマーが、脂肪族基及び芳香族基の一方又は両方を含むモノマーから選択される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
前記疎水性モノマーが、ｔｅｒｔ−ブチル−アクリルアミド、ｎ−ブチル−アクリルアミド、ｎ−イソプロピル−アクリルアミド、ｔｅｒｔ−オクチル−アクリルアミド、メチル−ウンデシル−アクリルアミド、オクタデシル−アクリルアミド、フェニル−アクリルアミド、アクリルアミド−フェニルアラニンエチルエステル及びこれらの混合物から成る群より選択される、請求項５に記載のポリマー。
【請求項７】
式：
【化１】
2006512457.tif 000005
［上式中、
Ｒ１はＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｈ、及び１〜３個のＯＨ基で置換されていてもよいＣ１〜６アルキルから成る群より選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、及び（Ｃ１〜１４アルキル）アリールから選択され；
ｎはそれぞれ独立に１〜６の整数であり；
ａは少なくとも１であり；
ｂは少なくとも１であり；
ｗは０〜１０の整数であり；
ｚは少なくとも１であり；
Ｘは陰イオンであり；
Ｙはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、及び前記直鎖ホモポリマーから成る群より選択され、但し少なくとも１つのＹが前記直鎖ホモポリマーであり；
-----は前記ポリマーの残りの部分を表す。］
で表される、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
（ａ）（ｉ）（Ａ）第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、（Ｂ）疎水性アクリルモノマー、及び（Ｃ）アクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する架橋コポリマーと（ｉｉ）ペンダントアミン基でそれぞれが置換されている複数のモノマーを含む直鎖ホモポリマーとを含み、前記架橋コポリマーが前記直鎖ホモポリマーと共有結合しているポリマーと、
（ｂ）多孔質マトリックスと、
を含み、前記ポリマーが前記多孔質マトリックスの孔隙内に分散している、クロマトグラフィー用収着剤。
【請求項９】
前記多孔質マトリックスが、金属酸化物、セラミックス、天然ポリマー、合成ポリマー、及びこれらの混合物から成る群より選択される多孔質マトリックスである、請求項８に記載の収着剤。
【請求項１０】
前記多孔質マトリックスが金属酸化物である、請求項９に記載の収着剤。
【請求項１１】
前記金属酸化物が、シリカ、アルミナ、ハフニア、チタニア及びジルコニアから成る群より選択される金属酸化物である、請求項１０に記載の収着剤。
【請求項１２】
前記多孔質マトリックスが天然ポリマーである、請求項９に記載の収着剤。
【請求項１３】
前記天然ポリマーが、アガロース、デキストラン、セルロース、キチン及びこれらの誘導体、並びにアルギン酸から成る群より選択される多糖である、請求項１２に記載の収着剤。
【請求項１４】
前記多孔質マトリックスが合成ポリマーである、請求項９に記載の収着剤。
【請求項１５】
前記合成ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルポリマー、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアミド及びこれらのポリフッ化誘導体、並びにこれらのコポリマーから成る群より選択される合成ポリマーである、請求項１４に記載の収着剤。
【請求項１６】
前記多孔質マトリックスがビーズの形態である、請求項８に記載の収着剤。
【請求項１７】
前記ビーズの直径が約１０μｍ〜約５００μｍである、請求項１６に記載の収着剤。
【請求項１８】
前記ビーズの密度が約１ｇ／ｃｍ３〜約１０ｇ／ｃｍ３である、請求項１６に記載の収着剤。
【請求項１９】
（ａ）ＤＮＡプラスミドを含有するライセートを、
（ｉ）（Ａ）第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、（Ｂ）疎水性アクリルモノマー、及び（Ｃ）アクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する架橋コポリマーと（ｉｉ）ペンダントアミン基でそれぞれが置換されている複数のモノマーを含む直鎖ホモポリマーとを含み、前記架橋コポリマーが前記直鎖ホモポリマーと共有結合しているポリマー上に投入することによって、前記プラスミドを前記ポリマーに吸着させるステップと、
（ｂ）吸着したプラスミドが結合している前記ポリマーを平衡化緩衝液で洗浄することによって、非プラスミド材料を除去するステップと、
（ｃ）塩溶液を含む溶離液を吸着したプラスミドが結合している前記ポリマーに加えることによって、前記プラスミドを前記ポリマーから脱着させるステップと、
を備えるＤＮＡプラスミドの分離の方法。
【請求項２０】
前記ライセートが清澄化されたライセートである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離がクロマトグラフィーカラム中で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離が、懸濁液中の前記ポリマー上、又は反応容器、マイクロタイタープレート、ピペットチップ、撹拌棒若しくはテストストリップ上に固定された前記ポリマー上のいずれかにおいてバッチ方式で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ライセートが、少なくとも２つの異なる形態で存在するプラスミドを含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記異なる形態のプラスミドを分離するステップをさらに備える、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）ＤＮＡプラスミドを含むライセートを、
（ｉ）（Ａ）（１）第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、（２）疎水性アクリルモノマー、及び（３）アクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する架橋コポリマーと（Ｂ）ペンダントアミン基でそれぞれが置換されている複数のモノマーを含む直鎖ホモポリマーとを含み、前記架橋コポリマーが前記直鎖ホモポリマーと共有結合しているポリマーと、
（ｉｉ）多孔質マトリックスと、を含み、前記ポリマーが前記多孔質マトリックスの孔隙内に分散しているクロマトグラフィー用収着剤上に投入することによって、前記プラスミドを前記収着剤に吸着させるステップと、
（ｂ）吸着したプラスミドが結合している前記収着剤を平衡化緩衝液で洗浄することによって、非プラスミド材料を除去するステップと、
（ｃ）塩溶液を含有する溶離液を吸着したプラスミドが結合している前記収着剤に加えることによって、前記プラスミドを前記収着剤から脱着させるステップと、
を備えるＤＮＡプラスミドの分離の方法。
【請求項２６】
前記多孔質マトリックスが金属酸化物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記金属酸化物がジルコニアである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記多孔質マトリックスがビーズの形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記分離が充填床中又は流動床中で実施される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、（ｂ）疎水性アクリルモノマー、（ｃ）直鎖ホモポリマー、及び（ｄ）アクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する組成物を、重合触媒の存在下で重合させるステップを備える、請求項１に記載のポリマーを調製する方法。
【請求項３１】
前記組成物がアクリルスペーサーモノマーをさらに含有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項８に記載の収着剤を調製する方法であって、
（ａ）（ｉ）第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、（ｉｉ）疎水性アクリルモノマー、（ｉｉｉ）アクリル系多官能性架橋性モノマー、及び（ｉｖ）直鎖ホモポリマーを含む組成物を、前記多孔質マトリックスの前記孔隙中に導入するステップと、
（ｂ）前記組成物を重合触媒の存在下で重合させるステップと、
（ｃ）前記収着剤を洗浄するステップと、
を備える方法。
【請求項３３】
前記組成物がアクリルスペーサーモノマーをさらに含有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマーが、前記多孔質マトリックスの前記孔隙の約５０％〜約１００％を占める、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）入口端及び出口端を有する管状部材と、
（ｂ）前記管状部材内部に配置されている第１及び第２の固定された多孔質部材と、
（ｃ）前記第１及び第２の多孔質部材の間で前記管状部材の内部に充填された請求項１に記載のポリマーと、
を備える、クロマトグラフィーカラム。
【請求項３６】
前記カラムの体積が約１ミリリットル〜約５０００リットルである、請求項３５に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３７】
前記カラムの体積が約１リットル〜約１００リットルである、請求項３６に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３８】
前記ポリマーを通過して液体試料が流れるようにするための１つ以上の流体制御装置をさらに備える、請求項３５に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３９】
前記入口端と前記出口端の間に一連の複数の段を含む、請求項３５に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４０】
（ａ）入口端及び出口端を有する管状部材と、
（ｂ）前記管状部材内部に配置されている第１及び第２の固定された多孔質部材と、
（ｃ）前記第１及び第２の多孔質部材の間で前記管状部材の内部に充填された請求項１１に記載の収着剤と、
を備える、クロマトグラフィーカラム。
【請求項４１】
前記カラムの体積が約１リットル〜約５０００リットルである、請求項４０に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４２】
前記カラムの体積が、約１リットル〜約１００リットルである、請求項４１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４３】
前記収着剤を通過して液体試料が上方に流れるようにするための１つ以上の流体制御装置をさらに備える、請求項４０に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４４】
前記入口端と前記出口端の間に一連の複数の段を含む、請求項４０に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４５】
ウェルの中に配されたある量の請求項１に記載のポリマーを複数含む、複数のウェルを有するフィルタープレート。
【請求項４６】
２〜９６のウェルを有する、請求項４５に記載のフィルタープレート。
【請求項４７】
２４〜４８のウェルを有する、請求項４６に記載のフィルタープレート。
【請求項４８】
請求項３５に記載のカラムと、１種類以上の緩衝液と、それらをクロマトグラフィーに使用するための取扱説明書と、を備えるキット。
【請求項４９】
請求項４０に記載のカラムと、１種類以上の緩衝液と、それらをクロマトグラフィーに使用するための取扱説明書と、を備えるキット。
【請求項５０】
請求項４５に記載の複数のウェルを有するフィルタープレートと、１種類以上の緩衝液と、それらをクロマトグラフィー用途に使用するための取扱説明書と、を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、混合モードのポリマー、ならびに分離科学におけるそれらの製造及び使用の工程に関する。
【０００２】
組み換えＤＮＡの登場により、医薬品グレードのＤＮＡに使用されるような、より精密なＤＮＡ精製方法の開発の必要性が高まってきた。細胞ライセート中の異なる形態の核酸の分離、または細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの回収のための公知の技術は、典型的には、密度勾配遠心分離法、または毒性のある有機溶媒を使用する抽出に依拠している。しかし、遠心分離法は大規模精製の場合に実用的でも経済的でもなく、毒性のある有機溶媒の使用は医薬品用途において多くの問題を発生させる。
【０００３】
プラスミドＤＮＡを分離精製する他の方法では、古典的な陰イオン交換樹脂を使用する。これらの場合、典型的には、プラスミドＤＮＡフラクション中にＲＮＡが実質的な量で存在する。そのため、クロマトグラフィーによる分離の前にＲＮＡを消化するためのＲＮＡｓｅが加えられ、これにより、精製されたプラスミドＤＮＡがＲＮＡｓｅで汚染される可能性が非常に高くなる。精製された生成物中にＲＮＡｓｅが存在すると、精製されたＤＮＡを後に使用する場合に悪影響が生じうる。
【０００４】
米国特許第５，５６１，０６４号には、医薬品用プラスミドＤＮＡの製造方法が開示されている。プラスミドＤＮＡを含有する細胞ライセートは最終的に、複数の異なるＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿及びクロマトグラフィーのステップにかけられる。
【０００５】
米国特許第５，９１０，５８４号には、細胞ライセートからＲＮＡを吸着するための種々のリン酸カルシウム粒子の使用が開示されている。
【０００６】
米国特許第５，８４３，３１２号には、ＤＮＡをＲＮＡから分離するための収着剤が開示されている。この収着剤は、シラン化試薬で改質された金属酸化物を主成分としている。しかし、このシラン化試薬は、重合が起こりやすく、その使用のために不活性雰囲気が通常必要となる。
【０００７】
最後に、国際公開第９６／３６７０６号パンフレットには、プラスミドＤＮＡを分離及び精製する方法が開示されている。この方法は、清澄化されたライセートに対して、複数の濾過ステップと、場合によりＲＮＡｓｅによる処理と、逆相クロマトグラフィーとを行うことを含む。
【０００８】
プラスミドＤＮＡの精製用にデザインされた多数のクロマトグラフィー用収着剤に代表されるような進歩が見られるにもかかわらず、毒性のある溶媒、ＲＮＡｓｅ、及び煩雑な装置を全く使用せずに、ＤＮＡを精製するための収着剤の開発がなお必要とされ続けている。さらに、このような収着剤の化学的性質を高度に制御することができ、それによって種々の形態のプラスミドＤＮＡをより精密に分離できることが望ましい。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、これらの要求及びその他の要求を、経済的で適応性が高く、ＤＮＡの分離及び精製に特に有用なクロマトグラフィー用収着剤を提供することによって満たすものである。プラスミドＤＮＡの分離は、１つの段階で実施することができ、ＲＮＡｓｅなどの潜在的な汚染物質の使用が回避される。さらに、この収着剤の製造方法は、容易に入手可能であり空気中で安定な試薬のみを必要とする。
【００１０】
本発明の一実施形態は、直鎖ホモポリマーに共有結合した架橋コポリマーを含むポリマーである。この架橋コポリマーは、第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、疎水性アクリルモノマー、及びアクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する。上記直鎖ホモポリマーは、ペンダントアミン基でそれぞれが置換されている複数のモノマーを含有する。好ましい一実施形態では、この架橋コポリマーがアクリルスペーサーモノマーをさらに含有する。
【００１１】
直鎖ホモポリマー上のペンダントアミン基としては、第１級、第２級、及び第３級のアミンが挙げられ、好ましくは第２級または第３級のアミンである。この場合の代表的なホモポリマーとしては、ポリ−ジメチルアミノプロピル−メタクリルアミド、ポリ−ジエチルアミノエチル−メタクリルアミド、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリリシンが挙げられる。
【００１２】
架橋コポリマーの疎水性アクリルモノマーは、好ましくは、脂肪族基、芳香族基又はその両方を含有するモノマーから選択される。モノマーとしては、ｔｅｒｔ−ブチル−アクリルアミド、ｎ−ブチル−アクリルアミド、ｎ−イソプロピル−アクリルアミド、ｔｅｒｔ−オクチル−アクリルアミド、メチル−ウンデシル−アクリルアミド、オクタデシル−アクリルアミド、フェニル−アクリルアミド、アクリルアミド−フェニルアラニンエチルエステル及びこれらのモノマーの混合物が挙げられる。
【００１３】
好ましい一実施形態では、本発明のポリマーは、以下の一般化学式：
【化１】
2006512457.tif 000003
に相当するものである。
【００１４】
上記式中、Ｒ１はそれぞれＣ１〜６アルキルであり；Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｈ、及び１〜３個のＯＨ基で置換されていてもよいＣ１〜６アルキルから成る群より選択され；Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、及び（Ｃ１〜１４アルキル）アリールから選択される。
【００１５】
さらに、ｎはそれぞれ独立に１〜６の整数である。この式は、ポリマーが、下付き文字「ａ」、「ｂ」、「ｚ」、及び場合により含まれる「ｗ」で表されるモノマーを、その順序を問わず、以下により詳細に記載される相対量で含有することを意味する。したがって、このポリマーは、第４級アンモニウム基を有する少なくとも１つのアクリルモノマーを含有しており、これは少なくとも１であることに対応している。同様に、ｂ及びｚはそれぞれ少なくとも１であり、これによりポリマーがアクリル系架橋性モノマー及び疎水性アクリルモノマーをそれぞれ少なくとも１つ含有する。このポリマーは、アクリルスペーサーモノマーを含有していてもよく、ｗは０〜１０の整数である。
【００１６】
ポリマーの第４級アンモニウム部分は、陰イオンＸとで電荷のバランスがとられている。Ｙはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、及び上記直鎖ホモポリマーから成る群より選択される。ただし、上記式中の少なくとも１つのＹは、上記直鎖ホモポリマーでなけばならない。最後に、破線（すなわち、「-----」）は、ポリマーの残りの部分を表しており、架橋性モノマーを介して結合し、この部分は下付き文字「ａ」、「ｂ」、「ｚ」、及び場合により含まれる「ｗ」によって表されるモノマーを含んでいる。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリマーと多孔質マトリックスとを含有するクロマトグラフィー用収着剤（sorbent）である。このポリマーは、多孔質マトリックスの孔隙内に分散している。多孔質マトリックスは、金属酸化物、セラミックス、天然ポリマー、合成ポリマーなどの材料から選択される。多孔質マトリックスは、これらの材料の混合物であってもよい。
【００１８】
好ましい一実施形態では、多孔質マトリックスは、シリカ、アルミナ、ハフニア、チタニア、及びジルコニアから選択される金属酸化物である。あるいは、多孔質マトリックスは、天然ポリマー、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、キチン及びこれらの誘導体、並びにアルギン酸から選択される多糖である。多孔質マトリックスは、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルポリマー、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアミド、及びこれらのポリフッ化誘導体並びにこれらポリマーのコポリマーから選択される合成ポリマーであってもよい。
【００１９】
多孔質マトリックスは、ビーズの形態で存在することが好ましい。ビーズの寸法は、約１０μｍ〜約５００μｍの範囲である。ビーズは、それらの密度に関して特徴づけることもでき、この密度は約１ｇ／ｃｍ３〜約１０ｇ／ｃｍ３で変動させることができる。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態は、前述のポリマー上でＤＮＡプラスミドを分離する方法である。この方法では、ＤＮＡプラスミドを含有する含有するライセートを本発明のポリマー上に投入して、プラスミドをポリマーに吸着させる。次に、非プラスミド材料を除去するために、ＤＮＡプラスミドが結合しているポリマーの洗浄液として平衡化緩衝液を加える。最後に、塩溶液を含有する溶離液をポリマーに加えることによってＤＮＡプラスミドをポリマーから脱着させる。
【００２１】
この方法は、好ましくはクロマトグラフィーカラムで実施されるが、ポリマーが溶液中に懸濁されるバッチ式分離法などの他の場合に使用することもできる。あるいは、反応容器、マイクロタイタープレート（micro titer plates）、ピペットチップ、撹拌棒、または試験ストリップの表面上にポリマーを固定した状態で分離を実施することができる。
【００２２】
上記ライセートは、清澄化されたライセートであることが好ましい。より好ましくは、ライセートは、少なくとも２つの異なる形態のＤＮＡプラスミドを含有する。この場合、この方法は、異なる形態のプラスミドの分離をさらに備える。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態は、前述のクロマトグラフィー用収着剤上でＤＮＡプラスミドを分離する方法である。この方法では、ＤＮＡプラスミドを含むライセートを収着剤上に投入して、プラスミドをポリマーに吸着させる。次に、非プラスミド材料を除去するために、ＤＮＡプラスミドが結合しているポリマーの洗浄液として平衡化緩衝液を加える。最後に、塩溶液を含有する溶離液をポリマーに加えることによってＤＮＡプラスミドをポリマーから脱着させる。
【００２４】
収着剤の多孔質マトリックスは金属酸化物であることが好ましい。最も好ましい金属酸化物はジルコニアである。多孔質マトリックスは、ビーズの形態であってもよく、これによって充填床または流動床クロマトグラフィーにこの方法が適用可能となる。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明のポリマーの調製方法である。この方法は、第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、疎水性アクリルモノマー、上記直鎖ホモポリマー、及びアクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する組成物を重合させるステップを備える。この重合反応は重合触媒の存在下で実施される。好ましくは、この組成物はアクリルスペーサーモノマーを含有する。
【００２６】
関連する実施形態では、本発明は、前述のクロマトグラフィー用収着剤の調製方法を提供する。第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマー、疎水性アクリルモノマー、上記直鎖ホモポリマー、及びアクリル系多官能性架橋性モノマーを含有する組成物を、前述の多孔質マトリックスの孔隙中に導入する。次に、この組成物を重合触媒の存在下で重合させる。最後に、この収着剤を洗浄して未反応材料を除去する。好ましくは、この組成物はアクリルスペーサーモノマーをさらに含有する。さらに、この重合によって得られたポリマーは、多孔質マトリックスの孔隙の約５０％〜約１００％を占める。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態は、クロマトグラフィーカラムである。このカラムは、入口端及び出口端を有する管状部材を備える。管状部材内部には、２種類の固定された多孔質部材が存在し、それらの間に、本発明のポリマーが充填される。あるいは、管状部材に、前述のクロマトグラフィー用収着剤を充填することもできる。
【００２８】
カラム体積は、約１ミリリットル〜約５０００リットルであることが好ましく、約１リットル〜約１００リットルであることがより好ましい。
【００２９】
好ましい実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、ポリマーまたはクロマトグラフィー用収着剤を通過して液体試料が上方に流れるようにするための１つ以上の流体制御装置をさらに備える。さらに、カラムは、入口端及び出口端の間に一連の複数の段（stage）を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、複数のウェルを有するフィルタープレート（マルチウェルフィルタープレート）である。ある量（volume）の前述のポリマーの複数が、フィルタープレートのウェル中に配される。好ましくは、フィルタープレートは２〜９６のウェルを有する。さらにより好ましくは、フィルタープレートは２４〜４８のウェルを有する。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態は、前述のいずれかのカラムと、１種類以上の緩衝液と、カラムを使用するための取扱説明書とを備えるキットである。あるいは、このキットは、前述の複数のウェルを有するプレートと、１種類以上の緩衝液と、複数のウェルを有するプレートを使用するための取扱説明書とを備える。
【好適な実施形態の詳細な説明】
【００３２】
本発明者らは、本発明の「混合モード（mixed mode）」のポリマーによって、非常に高いＤＮＡプラスミド分離能力が得られることを見出した。すなわち、親水性部分第４級アンモニウム基及びペンダントアミン基の形態の親水性部分が１つのモードを構成し、一方、疎水性部分が別のモードとなり、これらのそれぞれがプラスミドＤＮＡに対するポリマー選択性に寄与する。
【００３３】
本発明のポリマーの混合モードの性質は、部分的には、第４級アンモニウム部分を有するアクリルモノマーと、疎水性アクリルモノマーとを含有する組成物を重合させることによって得られる。典型的な第４級アンモニウム部分は、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムのようなテトラ−（低級アルキル）アンモニウム基である。第４級アンモニウム部分は、（エチル）トリメチルアンモニウム及び（メチル）トリブチルアンモニウムのような「混合」アンモニウム基として存在していてもよい。アンモニウム部分は、ハロゲン化物（たとえば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−）、ナイトレート、ホスフェート、及びテトラフルオロボレートのようなボレートなどのあらゆる一般的な陰イオンによって電荷のバランスがとられる。第４級アンモニウム部分を有するアクリルモノマーとしては、メタクリルアミド（低級アルキル）−トリ（低級アルキル）アンモニウム塩が好ましい。この場合に特に好ましいモノマーは、メタクリルアミドプロピル−トリメチルアンモニウムクロリドである。
【００３４】
疎水性アクリルモノマーは、典型的には、脂肪族部分又は芳香族部分、あるいはその両方を含有する。代表的な脂肪族基は、オクチル、オクタデシル、及びウンデシルなどの長鎖アルキル基、ならびにメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、及びヘキシルなどの低級アルキル基である。芳香族基はフェニル、ビフェニル、及びナフチルのようなＣ６〜Ｃ１２炭化水素である。脂肪族基及び芳香族基としては、たとえばベンジル及びフェネチルのような、種々の組み合わせを採用することができる。代表的な疎水性モノマーとしては、ｔｅｒｔ−ブチル−アクリルアミド、ｎ−ブチル−アクリルアミド、ｎ−イソプロピル−アクリルアミド、ｔｅｒｔ−オクチル−アクリルアミド、メチル−ウンデシル−アクリルアミド、オクタデシル−アクリルアミド、フェニル−アクリルアミド、アクリルアミド−フェニルアラニンエチルエステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明のポリマーは、アクリルスペーサーモノマーを含有することが好ましい。これにより、第４級アンモニウム基で置換されているアクリルモノマーと、疎水性アクリルモノマーとの間の距離が制御される。典型的には、このスペーサーモノマーは、二置換アクリルアミドであり、それらの置換基は水素及びＣ１〜６低級アルキル基から選択される。これらの低級アルキル基は１〜３個のヒドロキシ基で置換されていてもよい。好ましいスぺーサーモノマーとしては、ジメチルアクリルアミド及び（トリスヒドロキシメチル）アクリルアミドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明のポリマーは、直鎖ホモポリマーも含有する。このホモポリマーの個々のモノマーは、それぞれペンダントアミン基で置換されている。当該ポリマーの総合的な効果は、ブロックで配列したアミン基の導入によって得られる。第２級及び第３級アミンが好ましい。これらの一般的な基準内で、ｐＨが約４まで低くなる水性媒体中で帯電していない（すなわち、プロトン化していない）状態に維持されるように、アミンが選択されるべきである。本発明のホモポリマーとしては、ポリアクリルアミド主鎖を有するポリマーが挙げられるが、これに限定されるものではない。したがって、炭素−炭素及び炭素−窒素多重結合などの重合性部分と、ペンダントアミン部分とを有するモノマーであれば、直鎖ホモポリマーを生成させるため用いることができると考えられる。直鎖ホモポリマーの具体例としては、ポリ−ジメチルアミノプロピル−メタクリルアミド、ポリ−ジエチルアミノエチル−メタクリルアミド、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリリシンが挙げられる。特に好ましい直鎖ホモポリマーは、ポリ−ジメチルアミノプロピル−メタクリルアミドである。直鎖ホモポリマーの分子量は、特に制限されないが、約５キロダルトン（ｋＤ）〜約５０００ｋＤであることが好ましい。
【００３７】
本発明のポリマーは、アクリル系多官能性架橋性モノマーをさらに含み、これは、前述の組成物が重合するときに、ポリマーネットワークを形成する機能を果たす。この架橋性モノマーは、重合過程で利用される少なくとも２つのアクリルアミド基を有する必要がある。典型的には、これらのアクリルアミド基は、メチレン、エチレン、またはプロピレンなどの低級アルキレンスペーサーで分離されている。架橋性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミドが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
直鎖ホモポリマー及び各モノマーの本発明のポリマーの調製のために重合される相対濃度は広範囲で変動させることができる。その結果、ポリマーの物理化学的特性を直接調整することができる。一般に、直鎖ホモポリマーの量は約１〜約９０％（ｗ／ｗ）の範囲であり、第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマーの量は約０．２〜約９０％（ｗ／ｗ）の間で変動し、疎水性アクリルモノマーの量は約０．２〜約７０％の範囲であり、アクリル系多官能性架橋性モノマーの量は約１〜約７０％の間で変動し、アクリルスペーサーモノマーの量は０〜約７０％の範囲である。これらの重量％値は、共重合前の直鎖ホモポリマー及びモノマーの乾燥総重量を基準としている。
【００３９】
前述の化学的考察を考慮すると、本発明のポリマーの構造は、次式：
【化２】
2006512457.tif 000004
によって表すことができる。
【００４０】
この一般構造において、「ａ」、「ｂ」、「ｚ」、及び「ｗ」で表されるモノマーは、あらゆる順序、ならびに上述の好ましい相対濃度で現れることができる。当技術分野で認識されているポリマーの表示に従って、上式は単に理想的な構造を表している。したがって、この構造は、後述のポリマーの製造方法によって得ることが可能な異なる分子量、異なる架橋度、及び長さを有するポリマーの多分散混合物を包含していることを意味する。これに関連して、破線（すなわち、「-----」）は、ランダムに繰り返す「ａ」、「ｂ」、「ｚ」、及び場合により「ｗ」のモノマーにより得られる架橋ポリマー構造のより広い高分子の性質を表していることも理解される。発明の概要で前述したように、少なくとも１つのＹは直鎖ホモポリマーである。本発明者らは、直鎖ホモポリマーが、驚くべきことに、独立した成分として存在するのではなく、本発明の架橋ポリマー全体と共有結合していることを見出した。さらに、この直鎖ホモポリマーは、少なくとも部分的には、架橋ポリマーを前述の多孔質マトリックスに結合させる働きを有する。
【００４１】
本発明のポリマーは、それ自体を収着剤として使用することができるが、本発明のポリマーの表面積、したがってその分離能力は、多孔質マトリックス中に混合させることによって大きく増加する。さらに、収着剤の機械的強度は、ポリマーの機械的強度よりも大きい。多孔質マトリックスは、あらゆる多孔質固体材料から適切なものを選択することができる。このような材料の最も好ましい種類は、シリカ、アルミナ、ハフニア、チタニア、及びジルコニアなどの金属酸化物であり、これらは商業的に利用可能である。あるいは、このような材料を公知の手順によって製造することもできる。たとえば、好ましい多孔質マトリックスには、ジルコニアがあり、これは米国特許第５，１４１，６３４及び第５，２０５，９２９号に開示される方法によって調製することができる。合成ポリマー及び天然ポリマーなどの他の材料も許容される多孔質マトリックスであり、たとえば、米国特許第５，５９３，５７６号、第５，５９９，４５３号、及び第５，９０６，７３４号に記載されている。本発明の収着剤の利点の１つは、個々の収着剤粒子の多孔度及び形状を調整可能なことであり、これによって、収着剤の全体の吸着性能を相当に制御することができる。典型的には、本発明の収着剤は、約１０μｍ〜約５００μｍの間、及び約１ｇ／ｃｍ３〜約１０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度のビーズの形態で存在する。
【００４２】
本発明のポリマーは、重合化学反応によって直接調製される。前述のモノマー及び直鎖ホモポリマーを、重合触媒の存在下、単一の溶媒または混合溶媒中に溶解する。好ましい溶媒は水である。触媒は典型的には、従来のアクリル重合触媒から選択される。この場合の代表的な触媒としては、アゾビス−アミジノプロパン及びアゾ−ビス−イソブチロニトリルなどの感熱性触媒が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ラジカルを形成する物質もフリーラジカル触媒として許容される。そのようなものとしては、たとえば、過硫酸アンモニウム、過酸化水素及び過酸化ベンゾイルなどの過酸化物と、テトラメチルエチレンジアミンなどの第３級アミンとの混合物が挙げられる。重合は、ＵＶ領域の光に対して活性である公知の光重合開始剤を使用することによって開始させることもできる。
【００４３】
本発明のクロマトグラフィー用収着剤は、モノマー、直鎖ホモポリマー及び重合触媒の組成物を最初に多孔質マトリックスの孔隙に浸透させる必要があることを除いて、同様に調製される。これは、多孔質マトリックスを最初に乾燥させることによって容易に実現することができる。金属酸化物を使用する場合は、使用前にこれらを不動態化するべきである。次に、組成物の体積を多孔質マトリックスの全孔隙体積と一致させることが好ましいが、必ずしも必要ではない。最後に、直前に説明したように組成物を重合させる。不純物を除去するために広範囲に洗浄した後で得られる収着剤は、典型的にはヒドロゲルとしての架橋ポリマーとなり、これは多孔質マトリックスの孔隙の約５０％〜約１００％を占める。
【００４４】
本発明の利点の１つは、疎水性アクリルモノマーと、第４級アンモニウム部分で置換されているアクリルモノマーとの相対濃度を単に変化させることによって、ポリマーの疎水性−イオン性のバランスを調整できることである。アクリルスペーサーモノマー濃度によって、さらなる制御が可能となり、この濃度が高いほど疎水性アクリルモノマーと第４級アンモニウムアクリルモノマーとの間の距離が統計学的に増加する。別の利点は、反応物として直鎖ホモポリマーを使用することによって、必須であるアミンのブロック配列を実現できることである。構成モノマーのランダム重合では、前述したようにプラスミドＤＮＡの分離に必要なこの必須のアミンブロック配列は得られないと予測される。
【００４５】
本発明は、プラスミドＤＮＡの分離方法にも関する。この方法は、ミリグラム、グラム、またさらにはキログラムの量の医薬品グレードのプラスミドＤＮＡの製造に有用である。一般に、この方法は、最初に、本発明のポリマーまたはクロマトグラフィー用収着剤上に細胞ライセートを投入（load）するステップを備える。細胞ライセートは、細菌、酵母、真菌、哺乳動物、または昆虫の細胞に由来するものであってよく、たとえば、振盪フラスコ培養、バイオリアクター、または発酵層などのあらゆる従来の方法によって得ることができる。好ましいホストは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物細胞である。好ましくは、プラスミドＤＮＡを細胞片及び他のホストの汚染物質から実質的に取り出すために、粗精製ライセートを清澄化すべきである。
【００４６】
したがって、投入される試料は、プラスミドＤＮＡ及び大量のＲＮＡを含む核酸を含有する。試料は、染色体ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡも含有していてもよい。本発明のプラスミドＤＮＡとしては、共有結合で閉じた環状ＤＮＡ（すなわち、スーパーコイルモノマー）、連結した形態（たとえば、スーパーコイルダイマー）、及びニックのある環状形態（すなわち、弛緩したモノマー）が挙げられる。ＲＮＡｓｅを加えることによってＲＮＡを除去する必要がある従来技術での方法とは対照的に、本発明の方法にはＲＮＡｓｅは不要である。
【００４７】
次に、本発明のポリマーまたはクロマトグラフィー用収着剤にプラスミドＤＮＡを選択的に吸着させる。平衡化緩衝液で洗浄して、ＲＮＡを含む未結合のあらゆる材料を除去する。本発明のクロマトグラフィー用収着剤の利点の１つは、核酸が自由に拡散できない小さな孔隙を有することである。この結果、洗浄ステップによって、未結合のＲＮＡが容易に除去される。これを実現するために、平衡化緩衝液のイオン強度を、プラスミドＤＮＡのポリマーまたは収着剤からの回収率が低くなるのを十分に防止する程度には高く維持しながら、プラスミドＤＮＡをポリマーまたは収着剤に充分に結合させられる程度には十分低く維持するべきである。たとえば、平衡化緩衝液は、粗精製ライセートのｐＨ、典型的にはｐＨ約５に便宜的に維持される。さらに、このイオン強度は、塩化ナトリウムの場合には約０．５〜０．７５ｍＭの間に維持される。
【００４８】
次に、充填したポリマーまたは収着剤に塩水溶液を加えることによって、プラスミドＤＮＡを脱着することができる。塩としては塩化ナトリウム及び塩化カリウムが例示されるが、これらに限定されるものではない。塩濃度は、典型的には約１．０Ｍ以下である。塩溶液のｐＨを増加させるステップを場合により追加することによって、プラスミドＤＮＡの脱着を促進することができる。脱着ステップの後、ポリマーまたは収着剤は、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄することによって再生することができる。
【００４９】
前述したように、ポリマーまたはクロマトグラフィー用収着剤のいずれかを分離方法に使用することができる。しかし、一般には収着剤の方が機械的堅牢性が高い。好ましい一実施形態では、たとえば、本発明の収着剤を、充填床または流動床クロマトグラフィー中で使用することができる。
【００５０】
この方法は、バッチ式分離法の場合にも実施することができる。たとえば、本発明のポリマーまたは収着剤を、懸濁液中に自由に分散した粒子として使用することができる。あるいは、本発明のポリマーまたは収着剤を、反応容器の壁、またはマイクロタイタープレートのウェル中などの表面に塗布することもできる。小規模分離法を、適宜被覆したピペットチップ、撹拌棒、またはテストストリップ上で行うことも可能である。
【００５１】
本発明の方法によって精製されるプラスミドＤＮＡの典型的な純度は約７０％〜約９９％の範囲であり、好ましくは８５％〜約９９％の範囲であり、最も好ましくは約９０％〜約９９％の範囲である。
【００５２】
前述の分離方法は、固定床、流動床、及びバッチ式のクロマトグラフィーを使用する分取方法などの種々の技術に使用するように適合させることができる。あるいは、この方法は、装置の容積が数μｌと少ないスピンカラムまたはマルチウェルプレートフォーマットなどの小型装置を使用するハイスループット分離技術の場合にも実施可能である。
【００５３】
バッチ式吸着／分離法を使用する場合、本発明のポリマーまたは収着剤をライセート溶液に直接加え、得られた混合物を、プラスミドＤＮＡをポリマーまたは収着剤に結合させるのに十分な時間、穏やかに撹拌する。次に、プラスミドＤＮＡが吸着したポリマーまたは収着剤は、遠心分離法または濾過によって取り出すことができ、続いて、前述の分離ステップにおいてプラスミドを固体基材から溶出させる。
【００５４】
あるいは、カラムクロマトグラフィーを使用することができる。固定床カラムクロマトグラフィーでは、ポリマーまたは収着剤をカラムに充填し、プラスミドＤＮＡが固体基材に結合できる速度で、収着剤を通過するように注ぐことによって、分離すべきプラスミドＤＮＡを含有するライセートをポリマーまたは収着剤に加える。
【００５５】
固定床クロマトグラフィーの利点としては、カラム体積及び水の消費量が最小限になることが挙げられる。カラムクロマトグラフィー法の欠点は、カラムを通過する液体の流速が遅く、そのため時間がかかることである。カラムに加えられる材料が粒子を含む場合にさらにこの流速が遅くなりうるが、その理由は、このような粒子材料が固体基材をある程度「詰まらせる」場合があるからである。
【００５６】
流動床カラムクロマトグラフィーでは、力の増加に対する均衡を維持するために、洗浄濾過流を増加させ、大型／高密度粒子を使用する。反対側の上部に１〜５段を含む実質的に垂直なカラムが使用され、各段（ステージ）に連続的に溶液が通され、上側の段の上部でオーバーフローさせることによって排出される。好ましくは、カラムは３つの段を有する。最上段を除いた各段は、２つの分配系によって分離され、その一方は対象となる段の底部で溶液を分配し、他方はすぐ上の段に向けて溶液を分配する。
【００５７】
流動床の利点は、固定床クロマトグラフィーと比較すると、より低い圧力で流速がより速いことである。より速い流速によってクロマトグラフィー分離法ではある程度が得られるものの、この方法はいくつかの欠点を有する。この方法は、高い上昇液体速度においてのみ膨張する大きな粒子径及び／または高密度のいずれかの樹脂が必要である。大きな直径のポリマーまたは収着剤粒子は、小さな樹脂を使用する場合よりも単位体積当たりの表面が小さく、これに対応して表面結合能力も低くなる。これは、ビーズ樹脂が高密度であることが求められる場合には、小さなビーズの樹脂や収着材が好ましいためである。
【００５８】
一方、流動床クロマトグラフィーでは、詰まり、洗浄の必要性、圧縮及び洗浄によって誘導される樹脂の劣化などの固定床の重大な欠点の多くが回避される。実際、流動床では、詰まりを起こすおそれがなく溶液中の固体不純物が自由に通過することができ、あまり厳重な洗浄を必要としないため樹脂の寿命が大きく延長される。しかし、生物学的物質用のクロマトグラフィー用収着剤は、一般に、水に非常に近い密度を有し粒度測定において小さすぎ、流動床クロマトグラフィーには適していない。このため、粒子を流束中に引き込まずに流動化することは不可能である。生物学的物質の流動床クロマトグラフィーの別の問題は、一般的には、ビーズ間の大きな空間に関するものであり、これによって効率が低下する。
【００５９】
これらの要因を考慮して、バッチ式及び固定床のクロマトグラフィーが、プラスミドＤＮＡの従来の分離技術において選択されている方法である。一方、本発明のポリマーまたは収着剤は、バッチ式、固定床、または流動床のクロマトグラフィーにおいて使用することができる。
【００６０】
したがって、好ましい実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の固体基材が充填された管状部材であるクロマトグラフィーカラムを提供する。この管状部材は、ガラス、プラスチック、または金属などのあらゆる適切な材料でできていてもよい。充填された固体基材は、各端部において多孔質部材が接しており、これによって基材が管状部材内部に維持される。
【００６１】
ある実施形態においては、溶離液が重力流でカラムを通過すれば十分である。別の実施形態では、カラムは、溶離液がカラムを通過して上方に流れるようにするための１つ以上の流体移動装置を備えていてもよい。このような装置としては、クロマトグラフィー装置と関連して典型的に使用されているポンプ、インジェクターやあらゆる装置が挙げられる。
【００６２】
本発明のクロマトグラフィーカラムの体積は特に限定されない。たとえば、実験室規模における分離では、約１ミリリットルの小さなカラム体積で品質を保証することができる。生物学的物質の大規模な精製及び単離は、５０００リットルまでの体積のカラムで実施することができる。より典型的な体積は１リットル〜１００リットルの間である。本発明のカラムは、概形が管状であるが、その他の長さまたは直径においては特に限定されない。カラムが使用される状況に依存するが、カラム径は約０．５ｍｍ〜約１０００ｍｍの間で変動させることができる。さらに、カラム長さは約５０ｍｍ〜約１０００ｍｍの間で変動させることができる。したがって、本発明は、種々の寸法及び対応する体積のカラムを考慮している。
【００６３】
連続する複数のフラクションをカラムから回収し、標準的なゲル電気泳動で分析することによって、異なる形態の溶出するプラスミドＤＮＡを同定することができる。前述の一般条件下では、ダイマー及びニックを有する形態のプラスミドＤＮＡはスーパーコイルＤＮＡの前に溶出する。しかしゲノムＤＮＡは、前述したように水酸化ナトリウムで再生した後に得られるフラクション中に実質的に見られる。
【００６４】
本発明のカラムは、異なる不純物を試料から除去するために有効となる他の固体基材を含むカラムと直列に使用することができる。したがって、本発明のカラムの利点は、他のカラムすなわち従来のカラムの性質と相補的であるとみなすことができる。この場合、このようにカラムを直列に配列することで、溶離液及び平衡化緩衝液が節約され、そのため追加の試料操作及び調製が不要となる。
【００６５】
本発明は複数のウェルを有するフィルタープレート（マルチウェルプレート）も意図する。ウェルは典型的には、スクリーニングの目的に適した構成で配列される。好ましい構成は、「Ｘ−Ｙ」マトリックスなどの規則的なパターンである。各ウェルは、ある量の本発明のポリマーまたはクロマトグラフィー用収着剤を含んでいる。前述の一般的な分離方法を使用すると、ＤＮＡフラクションを含有する上澄み液がウェルに得られ、これを第２のマルチウェルフィルタープレートに移すことができる。個々の量のＤＮＡが、エタノールまたはイソプロパノールなどの適切な溶媒を加えることによって沈殿する。ＤＮＡ沈殿物を、少量の低塩緩衝液に再溶解し、第３のマルチウェルプレートに回収して、最後に電気泳動ゲルクロマトグラフィーを行う。したがって、本発明のマルチウェルプレートによって、同じ平衡化緩衝液を使用して異なる性質のポリマーまたは収着剤、または異なる平衡化緩衝液を使用して１種類のポリマーまたは収着剤の性質を調べることができる。さらに、本発明のマルチウェルプレートによって、異なるホストから得られた複数のライセートの、プラスミドＤＮＡフラクションに関するスクリーニングが可能となる。あるいは、特定のライセートから得られたプラスミドＤＮＡの分離に最も効率的なポリマーまたは収着剤を特定するために、各ウェル中に異なるポリマーまたは収着剤を導入することが望ましい場合がある。標準的な電気泳動クロマトグラフィーに適合したマルチウェルプレートの構成によって、ハイスループットのスクリーニングが可能となる。
【００６６】
マルチウェルプレートはよく知られた実験装置である。典型的にはウェル数は２〜９６の範囲である。好ましくは、ウェル数は約２４〜４８である。
【００６７】
本発明のキットは、前述のクロマトグラフィーカラム、またはマルチウェルフィルタープレートを備える。このキットは、プラスミドを分離するために必要な緩衝液または溶離液に加えて、カラムまたはマルチウェルプレートの使用法に関してエンドユーザーに十分な説明を与えるための取扱説明書もさらに提供する。
【００６８】
以下の実施例により本発明を説明する。しかし、これらの実施例に記載される特定の条件または詳細な内容に本発明が限定されないものと理解すべきである。
実施例１：ジルコニアビーズ中のクロマトグラフィー用収着剤の調製
【００６９】
この実施例は、ジルコニアビーズの孔隙内に分散した混合モードのポリマーの調製を実証することを目的とするものである。
Ａ．直鎖ホモポリマーの調製
【００７０】
３０ｍＬの純粋ジメチル−アミノプロピル−メタクリルアミドを７０ｍＬの蒸留水と混合した。得られた混合物を、０．５ｇの過硫酸アンモニウムと１ｍＬのテトラメチル−エチレンジアミンとを互いに混合することで調製した触媒で処理した。この混合物を室温下で５時間放置した。線状ポリマーの生成が溶液粘度の増加によって確認された。
【００７１】
この直鎖ホモポリマーを、アセトンで沈殿させて分離した後、重合していない材料、余剰の触媒、及び副生成物を除去するために数回の洗浄を行った。最後に、線状ポリマーを真空乾燥した。
Ｂ．収着剤の調製
【００７２】
１０ｍｌの水に以下の生成物：（Ａ）で前述のように調製した線状ポリマー０．３ｇ、ｔｅｒｔ−ブチル−アクリルアミド０．１ｇ、ジメチルアクリルアミド０．９ｇ、メタクリルアミドプロピル−トリメチルアンモニウムクロリド０．８ｇ、及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−メタクリルアミド０．１ｇ、を溶解した。得られたアルカリ性溶液（ｐＨ１２）に室温下で、５０ｍｇのアゾビス−アミジノプロパンを重合触媒として加えた。次にこの混合物に、乾燥させ不動態化させた多孔質ジルコニアビーズを加えた。ビーズの量は、溶液の体積が酸化ジルコニウムの孔隙体積と等しくなるように計算した。
【００７３】
ジルコニアビーズの孔隙内部に溶液全体が吸着するように、ジルコニアビーズ及び重合溶液の混合物を約１０分間振盪した。続いて、この混合物を、窒素雰囲気下で８５℃まで均一に加熱した。これらの条件下で、多孔質ジルコニアビーズの孔隙体積内の重合を開始させた。得られたポリマーは、ビーズ内部に取り込まれたヒドロゲルとして現れたが、薄層としてビーズ外面上で見ることができた。
【００７４】
すべての余剰の試薬及び副生成物がなくなるまで、得られた収着剤をアルカリ溶液及び酸性溶液で十分に洗浄した。
【００７５】
前述したように、同じポリマー主鎖上に、ペンダントアミン（線状ポリマー由来）及び第４級アンモニウム部分の形態の親水性部分のブロックととともに疎水性（ｔ−ブチル）基を含有するので、この収着剤は「混合モード」と呼ばれる。このポリマーの親水性は、１．０ＭのＮａＯＨでポリマーを洗浄し、１０ｍＭのＨＣｌで滴定して、標準ｐＨ曲線を作成し、その結果得られるポリマーのｐＫ値によって定量化される。ポリマーの疎水性は、前述のように平衡化緩衝液で洗浄する前のクロマトグラフィー用収着剤のカラムに注入したｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル（ＢＰＨＢ）の保持時間を測定することによって定量化される。ＢＰＨＢは０．１ＭのＮａＯＡｃ、０．０７ＭのＮａＣｌのｐＨ５における水性移動相によって溶出する。たとえば、この場合の典型的な測定では、ＨＰＬＣシステムを使用してＢＰＨＢの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬを１ｍＬ／分の速度で注入することが必要となる。溶出したＢＰＨＢは、２５４ｎｍのＵＶ吸光度で検出した。得られる保持因子Ｋ’は、未処理のジルコニア上に、同じ移動相を使用した対照実験を実施することで算出される。したがって、ポリマーの疎水性モードの尺度である保持因子を使用して、種々の収着剤／移動相の組み合わせを比較することができる。
実施例２：プラスミドＤＮＡの分離
【００７６】
この実施例は、実施例１で調製した収着剤上でのプラスミドＤＮＡの分離法を実証することを目的とする。
【００７７】
実施例１により調製した収着剤を、クロマトグラフィーカラムに充填した後、５０ｍＭの酢酸塩及び０．６５ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ５の緩衝液で平衡化させた。
【００７８】
このカラムに、当該技術分野で公知の標準的な手順によってタンパク質及びその他の不純物をあらかじめ除去して清澄化されたＥ．ｃｏｌｉのライセートを投入した。このライセートにはＲＮＡｓｅは加えなかった。
【００７９】
次に、非プラスミドＤＮＡ材料を除去するために十分な量の緩衝液でカラムを洗浄した。プラスミドＤＮＡフラクションを脱着させ溶出させるため最大１Ｍまでの塩化ナトリウム水溶液のグラジエントをカラムに投入した。このグラジエントの終了時に、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液をカラムに通して、収着剤を再生した。
【００８０】
溶離液フラクションを回収し、十分に確立されたプロトコルに従ってアガロースゲル電気泳動で分析した。これらのフラクションから、すべてのＲＮＡが初期の緩衝液洗浄液中に含まれたことが分かった。塩化ナトリウムグラジエント下で、ダイマー及びニックを有するプラスミドＤＮＡフラグメントは、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの前に溶出した。ゲノムＤＮＡは、水酸化ナトリウムによる再生洗浄によって溶出した。
【００８１】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は単に説明を目的としており、それらを考慮した種々の修正または変形は当業者によって提案され、それらは本出願の意図及び範囲、ならびに添付の請求の範囲の中に含まれるものと理解されたい。本明細書に引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願を、あらゆる目的で本明細書に組み入れる。
【国際調査報告】
2006512457.tif 000007
2006512457.tif 000008