(57)【要約】本発明は、ある規定された配列のロックされた核酸オリゴヌクレオチドを介して、免疫活性化オリゴヌクレオチド（CpG）に連結されたDNAから成る組成物に関する。特に、本発明は、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を含有しておりLNA-CpGと複合体を形成しているプラスミドを含んでなり、このプラスミドが組織もしくは細胞に導入され、前記遺伝子が発現される組成物を提供する。さらに本発明は、CpGおよびLNAを共合成してDNAプラスミドワクチンのアジュバントとして用いられる組成物を形成する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のヌクレオチドリンカー残基を適宜介してLNA配列：5’-GGAAGGAAGGAAGG-3’（配列番号２）に連結された配列：5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’（配列番号１）の非メチル化CGジヌクレオチド（CpG）を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号３、配列番号14、配列番号18、配列番号20より選択された配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドが複数個連結したプラスミドを含んで成る複合体。
【請求項４】
配列全体を共合成することを含んで成る、LNA-CpGコンジュゲートの製造法。
【請求項５】
LNA-CpGコンジュゲートの配列が、プラスミドへの結合またはCpGアジュバント活性の阻害を抑制するように十分に低い予測自己アニーリングおよび二次構造形成能を有する、請求項４に記載のLNA-CpGコンジュゲートの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある規定された配列のロックされた核酸オリゴヌクレオチドを介して、免疫活性化オリゴヌクレオチド（CpG）が連結したDNAを含んで成る新規組成物に関する。特に、本発明は、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、かつ該LNA-CpGと複合体を形成しているプラスミドを含んで成る組成物を提供し、前記プラスミドは組織もしくは細胞に導入され、該遺伝子が発現される。さらに本発明は、DNAプラスミドワクチンのアジュバントとして用いられる組成物を形成させるためにCpGおよびLNAを共合成(co-synthesis)する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドに基づく遺伝子の送達、特に免疫付与あるいは遺伝子治療の目的で用いられるものは公知である。例えば、マウス筋肉に対する、注射によるむき出しの（naked）DNAの投与が、国際特許出願WO 90/11092の中でVicalにより概説されている。
【０００３】
JohnstonらはWO 91/07487の中で、脊椎動物細胞に遺伝子を導入する方法を記載している。この方法は、対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドによりコートされた微小発射物を用い、また、微小粒子を加速し、それにより該微小粒子が標的細胞に入ることを可能にするものである。
【０００４】
通常、DNAワクチンは、強力なウイルスプロモーターが挿入された細菌プラスミドベクター、抗原ペプチドをコードする対象遺伝子およびポリアデニル化／転写終結配列により構成される。該対象遺伝子は、全長タンパク質、または単に、防御しようとする病原体、腫瘍その他の物質に関する抗原ペプチド配列をコードしうる。該プラスミドは、例えば大腸菌のような細菌内で増殖させ、その後単離し、意図する投与法に応じて適当な媒体中で調剤した後宿主へ投与することが可能である。投与に引き続き、該プラスミドは該宿主の細胞に取り込まれ、該細胞内で該コードされたペプチドが産生される。該プラスミドベクターは、哺乳類宿主内でのプラスミド複製および関与する動物の染色体DNAへの組込みを防ぐために、真核細胞内で機能的である複製起点を含まないで作成されるのが好ましい。
【０００５】
DNAワクチン接種には、従来のワクチン接種技術と比較して多くの利点がある。まず、DNA配列にコードされているタンパク質が宿主内で合成されるため、該タンパク質の構造あるいはコンフォメーションが、病状に関与している生来のタンパク質と似ていることが予測される。また、DNAワクチン接種は、ウイルス株間で保存されたタンパク質のエピトープを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球反応を引き起こすことにより、異なる株のウイルスに対する防御を与える可能性がある。さらに、プラスミドは宿主細胞に取り込まれ、そこで抗原タンパク質が産生されうるために、長期間持続する免疫反応を誘発する。該技術はまた、単一の製剤に複数の免疫原を組み込む可能性を提供し、これによりいくつかの病状に対して同時に免疫付与することが容易になる。
【０００６】
DNAワクチン接種に関して参考になる背景情報が、Donnellyら、“DNA vaccines” Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648の中に提供されている。この文献の開示は、参照によってその全体が本明細書に含まれる。
【０００７】
従来のワクチン接種療法と比較したときの、DNAワクチン接種に付随する多くの利点にも拘らず、動物に投与されたプラスミドDNAにコードされたタンパク質により引き起こされる免疫反応を増大させるような改良技術の開発が所望されている。本発明は、これらの問題に対処するものである。
【０００８】
ロックされた核酸（locked nucleic acid: LNA）はRNAやDNAの類似体である。LNAという用語は、リボース環が2’-酸素と4’-炭素間のメチレン結合によって束縛されているヌクレオチドモノマー、および、１つかそれ以上のロックされた核酸のモノマーを含むオリゴヌクレオチドの両方を記述するのに用いられる。該メチレン架橋結合は、酸素（oxy-LNA）、硫黄（thio-LNA）、アミン（amino-LNA）を介しうる。この立体構造上の制約は、相補的配列に対する結合親和性を増大させる（Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7）。DNAあるいはRNAオリゴヌクレオチド中にLNAモノマーを導入すると、相補的DNAあるいはRNA配列に対する親和性が増大する。すなわち、例えば融解温度（Tm）のような二本鎖の熱安定性として測定したときに、実際の塩基の種類によるが、該オリゴヌクレオチド中に存在するLNAモノマーあたり3-8℃増加する（Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7）。LNAの合成については、国際特許出願第WO 99/14226号に記載されている。
【０００９】
ペプチド核酸オリゴヌクレオチドを用いた、ペプチドやその他の物質（例えばローダミンのような蛍光標識物）とDNAプラスミドとの結合は公知である（US6165720）。それらは細胞をトランスフェクトするのにも用いられている。極めて厳しい条件下でも保たれるPNA/DNA/PNA三本鎖についての報告がなされているが（50）、それらの研究は短いDNAオリゴヌクレオチドのみについてなされたものであり、大きな超らせん（スーパーコイル）状のプラスミドDNAについてはなされていない。後者においては、結合したPNAの安定性は、医薬またはワクチン製剤として、特に免疫療法のための粒子を介した送達（particle mediated immunotherapeutic delivery；PMID）用として投与されたとき、PNA結合蛍光発光団またはペプチドがプラスミドDNAと結合し続けられるには十分ではない。
【００１０】
WO 02/102825には、LNA結合官能基の、プラスミドDNAワクチン用アジュバントとしての使用が開示されている。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、DNAワクチンにより活性化される免疫反応を増強させるために用いられうる、新規LNA-免疫活性化オリゴヌクレオチド組成物を提供する。本発明における免疫活性化オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化CGジヌクレオチド（CpG）から成るオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
本発明の最初の態様においては、以下の配列番号１の非メチル化CGジヌクレオチド（CpG）が、１つ以上のヌクレオチドリンカー残基を適宜介して、以下のLNA配列（配列番号２）に連結されているオリゴヌクレオチドを含んで成る新規組成物を提供する：
5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’  配列番号１
5’-GGAAGGAAGGAAGG-3’        配列番号２。
【００１３】
好ましいLNA-CpG配列は以下の通りである：
5’-tccatgacgttcctgacgttXGGAAGGAAGGAAGG-3’  配列番号３
ここで、XはA、G、TまたはCでありうるが、Tであることが好ましい。
【００１４】
本発明の２番目の態様においては、配列全体を共合成することを含んで成るLNA-CpGコンジュゲートの製造法を提供する。本方法により生成するオリゴヌクレオチドは、配列番号３であることが好ましい。本発明の方法により形成されたコンジュゲートはまた、本発明の別の態様を成す。
【００１５】
本発明のいずれの態様においても、好ましいLNA-CpG配列は、配列番号３、14、18または20である。
【００１６】
in vivoで発現しうるようにプロモーターの制御下にある遺伝子を含むプラスミドDNAに本発明のLNA-CpGコンジュゲートを結合させることにより、DNAプラスミドワクチンを形成する方法もまた本発明の別の態様を成す。該LNAコンジュゲートは安定であり、プラスミドDNAと共にin vivoで投与しうる。これにより、該遺伝子を発現させる能力を保ったまま、該プラスミドと該CpGを細胞内で共に局在化させることが可能になる。LNAオリゴヌクレオチドは細胞内Dnase酵素による分解を受けにくいので都合がよい（Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7）。
【００１７】
本発明の２番目の態様の方法により生成するLNAコンジュゲートは、７-25塩基、好ましくは10-20塩基、さらに好ましくは11-15塩基のオリゴヌクレオチドから成り、それら塩基は少なくとも１つが、好ましくは少なくとも半分が、さらに好ましくはオリゴヌクレオチド全体が、LNA塩基により作られている。プラスミドDNAと結合させるときには、典型的には、少なくとも１つの、短くとも13 LNA残基の配列が、最適な安定性のために好ましい。本発明の２番目の態様に用いるのに好ましいLNA分子は、表１および表２に挙げられている。特に好ましいLNAオリゴヌクレオチドは、表１にLNA 11701、すなわち配列番号２として示されている。該LNAオリゴヌクレオチドは、DNAに対する最適な結合のために、自己相補的塩基対配列を含まないものであるべきである。この点に関し、CpG-LNAの理論的配列を、自己アニール能、および二次構造形成能について、Tolstrup ら、Nucleic Acids Research, 31: 3758-3762 (2003)に記載されているOligoDesign プログラムを用いて解析することができる。この文献に記載されている該方法の詳細は、参照によって全体が本明細書に含まれる。プラスミドの結合あるいはCpGアジュバント活性に対する妨害を防ぐために、該プログラムを用いて決定される自己ハイブリダイゼーションスコア（SHS)および二次構造スコア（SSS）が十分に低いことが好ましい（該組成物の自己アニール能あるいは二次構造形成能が十分に低くなるようにという意味で）。従って、SHSは45未満であることが好ましく、40未満であることがさらに好ましく、35未満であることが最も好ましい。また、SHSが60未満であることも好ましく、45未満であることがさらに好ましく、30未満であることが最も好ましい。
【００１８】
また予想されうる別の実施形態では、当初結合したLNAオリゴヌクレオチドの中に、さらなるLNAオリゴヌクレオチドに対する相補的な配列が存在し、それにより、複数のLNAオリゴヌクレオチド間のLNA：LNAハイブリダイゼーションにより形成されるひと並びのLNAオリゴヌクレオチドが、DNAの中の１つのLNA相補サイトに結合することが可能となる。
【００１９】
本発明においては、該LNAはCpG免疫活性化部分と結合し、それによりLNA/CpGが対象遺伝子をコードするDNAプラスミドと結合して宿主に投与されると、DNAプラスミドは該遺伝子を発現し、該結合部分を機能させることができる。
【００２０】
LNAおよびCpG、ならびにそれら２つの直接的な共合成は、以下の文献に記載されている方法により実現しうる：Verma, S. & Eckstein F., Annual Review of Biochemistry 1998, 67: 99-134, Modified oligonucleotides: synthesis and strategy for users、M.J. Gait編、 Oligonucleotide synthesis: a practical approach- book IRL / Oxford University Press, 1990、 Sudhir Agrawal編、Methods in Molecular Biology Vol 20: Protocols for oligonucleotides and analogs, synthesis and properties- book Humana Press, 1993。
【００２１】
本発明の２番目の態様に関して、LNAを介してDNAプラスミドと結合させるための特に好ましいアジュバントは、CpGオリゴヌクレオチドあるいはジヌクレオチドである（65、66）。該CpG免疫活性化配列は、しばしば：プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジンである；ここで、ジヌクレオチドCGモチーフはメチル化されていない。本発明のアジュバントあるいはワクチンとして用いられる好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは２つ以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含み、それらモチーフは少なくとも３つか、さらに好ましくは少なくとも６つ以上のヌクレオチドにより隔てられている。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオエート結合、さらに好ましくはホスホロチオエート結合である。ただし、ホスホジエステル結合あるいはその他のヌクレオチド間結合も、複数種類のヌクレオチド間結合が混在するオリゴヌクレオチドも含め、本発明の範囲内に入る。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドあるいはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドを形成する方法は、US5,666,153、US5,278,302あるいはWO 95/26204に記載されている。
【００２２】
好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。該配列は、好ましくはホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含む。
【００２３】
オリゴ１（配列番号４）：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
オリゴ２（配列番号５）：TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
オリゴ３（配列番号６）：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ４（配列番号１）：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
オリゴ５（配列番号７）：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
また別のCpGオリゴヌクレオチドは、重要ではない欠失や付加を有する上記の好ましい配列により構成されうる。本発明で利用されるCpGオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知であるいかなる方法（例えばEP468520）によっても合成されうる。簡便には、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成機を用いて合成されうる。
【００２４】
本発明で利用されるオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド間結合はホスホロジチオエート結合であり、さらに好ましいのはホスホロチオエート結合である。ただし、ホスホジエステルも本発明の範囲内である。例えば、ホスホロチオエートとホスホジエステルが混在しているような、異なるヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドも予想される。オリゴヌクレオチドを安定化させる他のヌクレオチド間結合も用いうる。
【００２５】
本発明の最初の態様においては、CpGはLNAと化学的に結合させられるが、このとき、市販の架橋剤のうちいかなるものを用いてもよい。以下に記載する例は、決して全てを網羅するものではなく、ペプチドあるいはタンパク質中に見られるアミノ基、アリール基、カルボキシル基、およびヒドロキシル基の利用を含み、（２）に広く概説されている。他のヘテロ二官能性架橋剤が、それらの反応基を結合させるために利用可能であり、カルボキシル基をアミンに結合させるためのカルボジイミド架橋剤、およびスルフヒドリル基またはアミノ基に結合させるための他の架橋剤が含まれる。カルボキシル基とアミンの結合については例えば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩、スルフヒドリル基についてはハロアセチル類やピリジルジスルフィドがあり、アミノ基についてはイミドエステル類または、サクシミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル（SMCC）やサクシミジル4-（p-マレイミドフェニル）-酪酸エステル（SMPB）を含むN-ヒドロサクシンイミドエステル類がある。
【００２６】
この発明の最初の２つの態様のいずれにおいても、１つの好ましい実施形態は、CpGとLNAオリゴヌクレオチドとの結合を、（おそらく生物学的反応を発揮させるために、）それらが細胞内に入ったときに、該LNAオリゴヌクレオチドおよび結合しているプラスミドから選択的に切断されうるように設計することである。これについてのそのような１つの例は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである該CpGアジュバントが、単一のDNAホスホルアミデート残基によってLNAオリゴヌクレオチドと結合している場合で、このとき該‘混合型’（hybrid）オリゴヌクレオチドは、細胞のエンドソーム区画に運ばれると細胞のホスホジエステル酵素により切断されうる。切断によってCpGアジュバントは自由なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとして遊離し、生物学的効果を発揮するにいたることが可能である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態においては、該LNA-コンジュゲートは遺伝子をコードするDNA分子と結合し、前記DNA分子は該LNAオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する。該DNAは好ましくはプラスミドの形態をとっており、また好ましくは抗原あるいは治療用のタンパク質をコードしている。
【００２８】
該プラスミドは、投与された宿主内でのプラスミド複製を防ぐために、好ましくは機能的な複製起点を含まない。プロモーターは、好ましくはCMVプロモーターのような強力なウイルス性プロモーターである。
【００２９】
該プラスミドには、複数のLNA/コンジュゲートが結合することが可能であるように、複数のLNA相補的結合配列をもたせることができる。該コンジュゲートは、別々の異なる官能基を有していてもよい。よって本発明の１つの態様においては、プラスミドは、核移行ペプチドと結合したLNA、および小分子アジュバントと結合したLNAと結合しうる。該プラスミドは典型的には４つ以上、好ましくは10から20の相補的LNA結合配列を有するものでありうるが、100以下の該結合配列を有することも可能である。従って、本発明の１つの態様においては、少なくとも４つのLNAコンジュゲートがプラスミドに結合しているプラスミドLNAコンジュゲート複合体が提供される。
【００３０】
好ましい実施形態においては、抗原はヒトの病原体に対する免疫反応を引き起こしうるものであり、抗原や抗原組成物は以下のようなものに由来する。HIV-1、（例えばtat、nef、gp120またはgp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev）、ヒトヘルペスウイルス、 例えばgH、gL、gM、gB、gC、gK、gEまたはgDまたはそれらの誘導体、または最初期タンパク質、例えばHSV1またはHSV2に由来するICP27、ICP47、ICP4、ICP36、サイトメガロウイルスの、特にヒト型に由来するもの（例えばgBまたはその誘導体）、Epstein Barrウイルスに由来するもの（例えばgp350またはその誘導体）、Varicella Zosterウイルスに由来するもの（例えばgpI、II、IIIおよびIE63）、または肝炎ウイルスに由来する抗原、例えばB型肝炎ウイルスに由来するもの（例えばB型肝炎表面抗原またはB型肝炎コア抗原またはpol）、 C型肝炎ウイルス抗原、E型肝炎ウイルス抗原、あるいは他のウイルス性病原体に由来する抗原、例えばパラミキソウイルスに由来するもの：呼吸器合胞体ウイルス（例えばFタンパク質およびGタンパク質またはその誘導体）、またはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばHPV6、11、16、18、 L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7）、フラビウイルス属（例えば黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞に由来する抗原（例えばHA、NP、NAまたはMタンパク質、またはそれらの組み合わせ）、または細菌性病原体に由来する抗原、例えばN. gonorrheaおよびN. meningitidis を含むNeisseria spp（例えばトランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、アドヘシン）；S. pyogenes（例えばMタンパク質またはその断片、C5Aプロテアーゼ）、S. agalactiae、S. mutans；H. ducreyi； Branhamella catarrhalis としても知られるM catarrhalisを含むMoraxella spp（例えば高分子量および低分子量アドヘシン（adhesin）、インベイシン（invasin））、；B. pertussis （例えばパータクチン（pertactin）、百日咳毒素またはその誘導体、線維状ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、B. parapertussisおよびB. bronchisepticaを含むBordetella spp；M. tuberculosis（例えばESAT6、Antigen 85A、-Bまたは-C、MPT 44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP 75、HSP90、PPD 19kDa [Rv3763]、PPD 38kDa [Rv0934]）、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatis を含むMycobacterium spp.、L. pneumophila を含むLegionella spp；毒素原性E. coli（例えば定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性E. coli、病原性 E. coli （例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含むEscherichia spp；V. cholera（例えばコレラ毒素またはその誘導体）を含むVibrio spp；S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexneriiを含むShigella spp、Y. enterocolitica（例えばYopタンパク質）、Y. pestis、Y. pseudotuberculosisを含むYersinia spp；C. jejuni （例えば毒素、アドヘシンおよびインベイシン）およびC. coliを含むCampylobacter spp；S. typhi、S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidisを含むSalmonella spp；L. monocytogenesを含むListeria spp.；H. pylori（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むHelicobacter spp；P. aeruginosaを含むPseudomonas spp；S. aureus、S. epidermidisを含むStaphylococcus spp.；E. faecalis、E. faeciumを含むEnterococcus spp.；C. tetani（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、C. botulinum（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、C. difficile（例えばA型またはB型クロストリジウム毒素およびその誘導体）を含むClostridium spp.；B. anthracis（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むBacillus spp.；C. diphtheriae（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）を含むCorynebacterium spp.；B. burgdorferi（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、 B. garinii（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. afzelii（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. andersonii（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. hermsiiを含むBorrelia spp.；E. equiおよびヒト顆粒球性エールリヒア症の病因細菌を含むEhrlichia spp.；R. rickettsii を含むRickettsia spp；C. trachomatis（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、C. pneumoniae（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、C. psittaciを含むChlamydia spp.；L. interrogans を含むLeptospira spp.；T. pallidum（例えばthe rare outer membrane proteins）、T. denticola、T. hyodysenteriaeを含むTreponema spp.；または寄生虫に由来する抗原、例えばP. falciparumを含むPlasmodium spp.；T. gondii（例えばSAG2、SAG3、Tg34）を含むToxoplasma spp.；E. histolyticaを含むEntamoeba spp.；B. microtiを含むBabesia spp.；T. cruziを含むTrypanosoma spp.；G. lambliaを含むGiardia spp.；L. majorを含むLeshmania spp.；P. cariniiを含むPneumocystis spp.；T. vaginalisを含むTrichomonas spp.；S. mansoniを含むSchisostoma spp.または酵母に由来する抗原、例えばC. albicansを含むCandida spp.；C. neoformansを含むCryptococcus spp.。
【００３１】
他のM. tuberculosisに対する好ましい特異的抗原は例えばRv2557、Rv2558、RPFs：Rv0837c、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450、Rv1009、aceA（Rv0467）、PstS1、（Rv0932）、SodA（Rv3846）、Rv2031c 16kDal.、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1である（WO 99/51748）。M. tuberculosisに対するタンパク質には、融合タンパク質およびその変異体も含まれ、それらは少なくとも２つ、好ましくは３つ以上のM. tuberculosisのポリペプチドが融合して大きなタンパク質を成している。好ましい融合タンパク質はRa12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTIを含む（WO 99/51748）。
【００３２】
クラミジアに対する最も好ましい抗原は、例えばHigh Molecular Weight Protein(HWMP)（WO 99/17741)、ORF3（EP 366 412）、および推定膜タンパク質（putative membrane proteins；Pmps）を含む。ワクチン設計における他のクラミジア抗原は、WO 99/28475に記載されている群より選択することが可能である。
【００３３】
好ましい細菌ワクチンは、S. pneumoniae（PsaA、PspA、ストレプトリジン、コリン結合性タンパク質(choline-binding proteins)）およびタンパク質抗原Pneumolysin（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins ら、Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）を含むStreptococcus sppに由来する抗原、およびその毒性のない変異誘導体から成る（WO 90/06951；WO 99/03884）。他の好ましい細菌ワクチンは、H. influenzae type B（例えばPRPおよびそのコンジュゲート）、分類されていない(non typeable)H. influenzaeを含むHaemophilus spp.に由来する抗原、例えばOMP26、高分子量アドヘシン、P5、P6、protein Dおよびリポタンパク質D、およびフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(US 5,843,464)、またはそれらの複数コピー変異体あるいは融合タンパク質から成る。
【００３４】
本発明に用いられうる抗原はさらに、マラリアを引き起こす寄生虫に由来する抗原から成ることが可能である。例えば、Plasmodia falciparumに由来する好ましい抗原は、RTS,SおよびTRAPを含む。RTSは混合型タンパク質であり、P.falciparumのポロゾイト周囲（circumsporozoite；CS）タンパク質のC末端部分のほぼ全てが、B型肝炎ウイルス表面抗原のpreS2部分の４アミノ酸を介してB型肝炎ウイルス表面(S)抗原に連結されたものである。その全体の構造は、英国特許出願第9124390.7号により優先権を主張し、WO 93/10152として公開された国際特許出願第PCT/EP92/02591号に記載されている。酵母内で発現したとき、RTSはリポタンパク質粒子として産生され、HBVのS抗原と共発現したときにはRTS,Sとして知られる混合粒子を形成する。TRAP抗原はWO 90/01496として公開されている国際特許出願第PCT/GB89/00895号に記載されている。本発明の好ましい実施形態は、抗原調合液がRTS,SとTRAP抗原の混合物から成るマラリアワクチンである。多段階マラリアワクチンの構成要素の候補になりうる他のプラスモジウム抗原は、P. faciparum MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびPlasmodium sppにおけるそれらの類似物である。
【００３５】
本発明は、抗腫瘍抗原の使用を意図するものであり、癌の免疫治療において有用であろう。例えば、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、黒色腫に対する腫瘍拒絶抗原がある。典型的な抗原は以下のものを含む：MAGE 1 、3およびMAGE 4またはWO 99/40188において開示されているような他のMAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage（NY Eos 1としても知られる）、SAGEおよびHAGE（WO 99/53061）またはGAGE (Robbins and Kawakami、1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636;  Van den Eyndeら、International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997投稿);  Correaleら(1997)、Journal of the National Cancer Institute 89, p293)。実際これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌といった広い範囲にわたる種類の腫瘍で発現している。
【００３６】
本発明で用いられるMAGE抗原は、発現エンハンサーあるいは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現されうる。特に、Mageタンパク質はインフルエンザ菌B型のProtein Dと融合されうる。該融合パートナーは、特に、Protein Dの最初の3分の1から成るものである可能性がある。このような構築体については、WO 99/40188において開示されている。癌特異的エピトープを含む可能性のある融合タンパク質の他の例は、bcr/abl融合タンパク質である。
【００３７】
好ましい実施形態においては、前立腺特異的抗原（Prostate specific antigen；PSA）、PAP、PSCA（PNAS 95(4) 1735-1740 1998）、PSMAあるいはプロスターゼ（Prostase）として知られる抗原のような前立腺抗原が用いられる。
【００３８】
プロスターゼは254アミノ酸長の前立腺特異的（トリプシン様）セリンプロテアーゼであり、３つのアミノ酸から成る保存されたセリンプロテアーゼ触媒配列H-D-Sを有し、かつアミノ末端にプレプロペプチド配列を有することから潜在的な分泌能を持つことが示唆される（P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, “Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119）。１箇所の推定上の糖鎖付加サイトが既に述べられている。予測される構造は、他の公知のセリンプロテアーゼと非常に似通っており、成熟ポリペプチドは単一ドメインに折り畳まれることが示されている。該成熟タンパク質は224アミノ酸長であり、１つのA2エピトープは自然に切除されることが示されている。
【００３９】
プロスターゼのヌクレオチド配列および推定されるポリペプチド配列および相同体は、Fergusonら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119）および国際特許出願第WO 98/12302号（および類似の認可された特許US 5,955,306）、第WO 98/20117号（および類似の認可された特許US 5,840,871およびUS 5,786,148）（前立腺特異的カリクレイン)および第WO 00/04149号 (P703P)に開示されている。
【００４０】
本発明はプロスターゼタンパク質および断片およびその相同体（“誘導体”）に基づくプロスターゼタンパク質融合体から成る抗原を提供する。それらの誘導体は、前立腺腫瘍の治療に適した治療用ワクチン設計への使用に適している。上記参照特許ならびに特許出願に開示されているように、一般的には該断片は少なくとも20、好ましくは50、さらに好ましくは100の連続するアミノ酸を含有する。
【００４１】
さらなる好ましい前立腺抗原は、P501Sとして公知のもので、WO 98/37814の配列番号113である。上記参照特許出願に開示されているように、少なくとも20、好ましくは50、さらに好ましくは100の連続するアミノ酸から成る、遺伝子によりコードされた免疫原性断片および部分が考えられる。特定の断片はPS108（WO 98/50567）である。
【００４２】
他の前立腺特異的抗原はWO 98/37418およびWO/004149により公知である。また別のものはSTEAP PNAS 96 14523 14528 7 -12 1999である。
【００４３】
本発明において有用な他の腫瘍関連抗原は、以下のものを含む：Plu-1 J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon ら、Bioessays 199, 21 61-70、米国特許第5654140号) 、Criptin（米国特許第5 981 215号）。さらに、癌治療におけるワクチンに特に適した抗原は、チロシナーゼおよびサバイビン（survivin）からも成る。
【００４４】
本発明はまた、Muc-1、Muc-2、EpCAM、her 2/ Neu、マンマグロビン（mammaglobin）（米国特許第5668267号）またはWO/00 52165、WO99/33869、WO99/19479、WO 98/45328に開示されているものなどのような、乳癌抗原との組み合わせにおいても有用である。Her2 neu抗原は特に、米国特許第5,801,005号において開示されている。好ましくはHer2 neuは、完全な細胞外ドメイン（概ねアミノ酸番号1-645より成る）またはその断片と、概ねC末端の580アミノ酸である細胞内ドメインの少なくとも免疫原性部分あるいは全体から成る。特に、細胞内部分はリン酸化ドメインまたはその断片から成るべきである。このような構造は、WO 00/44899に開示されている。特に好ましい構造は、ECD PDとして知られ、二番目はECD ΔPDとして知られている（WO/00/44899を参照）。
【００４５】
ここで用いられているようなher2 neuは、ラット、マウスあるいはヒト由来でありうる。
【００４６】
プラスミドは、例えばtie 2やVEGFのような腫瘍促進機構（例えば血管新生、腫瘍浸潤）に関連した抗原をコードしうる。
【００４７】
本発明のワクチンは、アレルギー、癌、感染症に加えて、慢性疾患の予防あるいは治療にも用いられうる。そのような慢性疾患には、喘息、粥状動脈硬化、アルツハイマー病、およびその他の自己免疫疾患のような疾病がある。避妊薬として用いられるワクチンも考慮されうる。
【００４８】
アルツハイマー神経変性疾患にかかりやすいか既にかかっている患者の予防あるいは治療に適した抗原は、特に、N末端39-43アミノ酸断片（Aβ。アミロイド前駆体タンパク質およびより小さな断片）である。この抗原は、国際特許出願第WO 99/27944号-（Athena Neurosciences）に開示されている。
【００４９】
自己免疫疾患に対するワクチンあるいは避妊ワクチンに含まれうることが見込まれる自己抗原は、以下のものを含む：サイトカイン群、ホルモン群、成長因子群あるいは細胞外タンパク質群、さらに好ましくは4-螺旋状サイトカイン、最も好ましくはIL13。サイトカインは、例えば以下のものを含む：IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL20、IL21、TNF、TGF、GMCSF、MCSFおよびOSM。 4-螺旋状サイトカインは、IL2、IL3、IL4、IL5、IL13、GMCSFおよびMCSFを含む。ホルモン群は、例えば、黄体形成ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、絨毛性ゴナドトロピン（CG）、VGF、GHrelin、アグーチ、アグーチ関連タンパク質およびニューロペプチドYを含む。成長因子は、例えば、VEGFを含む。
【００５０】
本発明のワクチンは、慢性的な状態や癌のような疾病の免疫治療に特に適しているが、持続感染の治療にもまた適している。よって、本発明のワクチンは、結核症（TB）、AIDSおよびB型肝炎（HepB）ウイルス感染のような感染症の免疫治療に特に適している。
【００５１】
従って、本発明により、TB、AIDSおよびHepBのような感染症の免疫治療のためのワクチン；およびTB、AIDSおよびHepBのような感染症の免疫治療のための医薬の製造における該ワクチンの使用が提供される。TBについては、本発明のワクチンを個体に投与することより成り、それにより該個体の体内細菌量を減らす、TB感染に見舞われた個体を治療する方法が提供される。細菌量の減少とは、肺喀痰中に見られるTB（結核菌）量の減少であって、TB症（結核症）の改善あるいは治癒につながる。
【００５２】
また、AIDSについて、AIDSにかかりやすいか既にかかっている個体を治療する方法が提案される。該方法は、個体に対する本発明のワクチンの投与より成り、それにより、その後のHIV感染により引き起こされるCD4+ T細胞の減少を抑えるか、あるいは既にHIVに感染している個体においてCD4+ T細胞の減少を遅くするか、止めるものである。
【００５３】
加えて、持続的B型肝炎ウイルス感染について、HepBに感染しやすいか既に感染している個体を治療する方法が提案される。従って、本発明のワクチンを個体に投与することより成り、それにより、血清中のHepB量レベル（DNAクリアランスによって測定される）の低下および肝損傷量の減少（血清中アラニントランスフェラーゼ（ALT）酵素レベルの低下または安定化によって検出される）が引き起こされる方法が提案される。
【００５４】
このように、LNA-CpG/DNA複合体は、薬剤、免疫原性組成物あるいはワクチンとして処方されうる。本発明の１つの実施形態においては、例えばUlmerら、Science 259:1745-1749, 1993に述べられているように、またCohen, Science 259:1691-1692, 1993で概説されているように、ポリヌクレオチドが、“むき出しの” （naked）DNAとして投与／送達される。ここで、該DNAは緩衝生理食塩水溶液中に調合され、組織中に直接注入される。むき出しのDNAの取り込みは、細胞内に効率よく運ばれる生体分解性のビーズに該DNAをコートさせるか、または別の公知のトランスフェクション促進剤を用いることにより増大させることができる。LNA-コンジュゲート/DNAは、例えばリポソームのようなキャリアと共に投与してもよい。一般的にはそのようなリポソームはカチオン性であり、例えばイミダゾリウム誘導体（WO95/14380）、グアニジン誘導体（WO95/14381）、ホスファチジルコリン誘導体（WO95/35301）、ピペラジン誘導体（WO95/14651）およびビグアニド誘導体である。該LNA-CpG/DNA複合体は、働きうるようにプロモーター配列と連結させたCTFRあるいはエリスロポエチン遺伝子のような対象遺伝子を送達しうる。従って、（嚢胞性線維症のように）その病因が遺伝子異常によって特徴付けられる疾病や疾患を正す、あるいは補正する方法が提案される。該方法は、それらの疾病について治療を要している哺乳類の患者に対して、好ましくはキャリアに組み入れられた形で、治療に効果的な量の該構築物を投与する段階を有する。
【００５５】
もう１つの実施形態においては、本発明の組成物は、その多くが既に記述されているような、粒子を撃ち込む方法によって送達されうる（WO 91/07487）。１つの実例においては、ガスによる粒子の加速が、Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK)およびPowderject Vaccines Inc. (Madison, WI)により製造されているもののような装置によって実現可能である。この実例のいくつかの例が、米国特許第5,846,796号；第6,010,478号；第5,865,796号；第5,584,807号および欧州特許第0500 799号に記載されている。この方法は、注射針の不要な送達方法を提供するもので、そこではポリヌクレオチドのような顕微鏡的な粒子の乾燥粉末製剤が、手持ち式の装置によって発生させられるヘリウムガスの噴流により高速に加速され、典型的には皮膚であるところの標的対象組織に向かって進む。該粒子は、好ましくは直径0.4-4.0μmの金ビーズであり、さらに好ましくは直径が0.6-2.0μmであり、その表面にDNAコンジュゲートがコートされ、そして“遺伝子銃”に収められるためにカートリッジに入れられている。
【００５６】
従って、対象遺伝子をコードしたDNAプラスミドでコートされた密度の高い微小ビーズより成るDNA送達装置が提案される。該プラスミドには、本発明のCpG組成物と連結した１つかそれ以上のLNAが結合している。好ましくは、金の微小ビーズに吸着させたCpG-LNA-プラスミドより成るワクチンあるいは免疫原性組成物が提案される。
【００５７】
関連する実施形態においては、本発明の組成物の、ガスによる注射針不要の注入に有用な他の装置あるいは方法は、Bioject, Inc.（Portland, OR）により提供されるものを含み、そのいくつかの例は米国特許第4,790,824号；第5,064,413号；第5,312,335号；第5,383,851号；第5,399,163号；第5,520,639号および第5,993,412号に記載されている。
【００５８】
本発明は以下の実施例によって説明されるが、これらによってなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
LNAオリゴヌクレオチド配列の必要条件と、超らせん状プラスミドDNAと結合させるための条件についての検討
プラスミド
本研究に用いられうる超らせん状プラスミドは、GFP発現ベクターであるpGG2XGFP（Gene Therapy Systems [GTS], Inc., San Diego, California, USA）である。これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを有し、CMVプロモーターの5’側のDNA配列内に複数のAAGGモチーフを有する（GTS カタログ 2002, 50）。
【００６０】
プラスミドpGG2XEMPTYはpGG2XGFPからGFP遺伝子を欠失させることにより得られる発現ベクターであるが、CMVプロモーターの制御下に対象遺伝子が発現するように、該遺伝子を挿入するためのポリリンカーを保持している。プラスミドpGG2XEMPTYをプラスミドpGG2XGFPから構築するために、後者を、GFP遺伝子をコードする領域を欠失させるために制限酵素NheIおよびBamHI（New England Biolabs, [NEB], Hitchin, Herts., UK）を用いて消化し、残りの5.1kbのプラスミド断片をゲル精製し、クレノーDNAポリメラーゼ（NEB）で処理し、T4 DNAリガーゼ（NEB）を用いて連結した後、E. coliに導入した（51）。プラスミドpGG2XEMPTYを保有する細菌細胞は、標準的な手順によって同定した（51）。
【００６１】
本研究で用いたLNAオリゴヌクレオチド
本研究に用いられたLNAオリゴヌクレオチドは、表１に記載されている。
【表１】
2006512064.tif 000002
【００６２】
LNA残基は大文字太字、DNA残基は小文字太字、PTO残基は小文字太字斜体で表してある。サイト数は、プラスミドgWizおよびpGG2XGFP内の理論上のオリゴヌクレオチド結合サイトの最大数を示している。X=‘PEGスペーサー’-9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール, 1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]- ホスホルアミダイト, スペーサー ホスホルアミデート9（Glen Research, USA）；O=8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸リンカー、g=グリシン、l=リジン、Fl=フルオレセイン、NH2=5’-アミノ-修飾剤 C12 ホスホルアミダイトスペーサー（Glen Research, USA）、PTO=ホスホロチオエート、S-S=チオール修飾剤, C6 S-Sホスホルアミデート（Glen Research, USA）。
【００６３】
全てのLNAオリゴヌクレオチドはProligo LLC, Colorado, USAにより合成された。大多数はAlexa Fluor色素（Molecular Probes, Netherlands）またはヘテロ二官能性リンカー、例えばMaleimideまたはSPDP（Perbio, USA）、によって標識するために、5’-アミノ-修飾剤 C12 ホスホルアミダイトスペーサー（Glen Research, USA）を用いて作成した。多くは100％がLNAモノマーであるが、LNA 5747（表３）はLNA 50％、DNA 50％である。この‘ビス’LNAオリゴヌクレオチドは、実施例1に記載の‘ビス’PNAクランプの類似体として作成され（50、52）、LNAとDNA残基の50：50混合物としてのみ効率よく合成することが可能であった。
【００６４】
LNAオリゴヌクレオチドの超らせん状プラスミドDNAへの結合のための条件の解析
LNAオリゴヌクレオチドのアニーリング／標識の条件は、刊行物（55）に記載の条件に基づくものとした。LNAの超らせん状プラスミドDNAへの結合効率を最大にするために、標識は無塩、６未満の低pHの緩衝液（10mMリン酸緩衝液、1mM EDTA、pH 5.8）中、16時間、37℃で行った。低pHにより、シトシン残基は偽シトシン残基と同様の効率でHoogsten塩基対を形成することが可能になるはずである（52）。はじめに、10μgのプラスミドDNAを、総容量20μlとして標識した。ここで、LNAオリゴヌクレオチドは該プラスミドDNA中に存在する、可能性のある結合サイトの最大数、10サイト、に対して20倍過剰なモル濃度で存在するようにした（表１、50を参照）。
【００６５】
上述の条件において、LNAはプラスミドに結合した形で検出することができた。
【実施例２】
【００６６】
共合成された‘混合型’（hybrid）ホスホチオエート（PTO）CpG/LNAオリゴヌクレオチド（配列番号３）の、オボアルブミン抗原を発現する超らせん状プラスミドDNAへの結合と、その結合が抗原の発現を妨げないことの証明
プラスミドとプラスミドDNA
プラスミドDNAはQiagen MaxiPrep（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）の手順を用いて、あるいはQiagen Endofree Plasmid Maxi Kitにより調製し、TE（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）pH8.0に１μg/μlで再懸濁した。プラスミドは、アガロースゲル電気泳動により95％より多くが超らせん状であるようにした（51）。
【００６７】
プラスミドpGG2XOVAcytは細胞質型ニワトリ オボアルブミン遺伝子（OVAcyt）を含み、CMV最初期プロモーターの制御下に該遺伝子を発現するものであって、該OVAcyt遺伝子の供給源としてpVac1OVAcyt（96）を、該CMVプロモーターとLNAオリゴヌクレオチドの結合サイトを与えるためにpGG2XEMPTYを用いて構築した（97,98）。簡潔に述べれば、（51）に記載されているように、pGG2XEMPTYのポリリンカーをSalIを用いて切断し、末端をクレノーポリメラーゼを用いて平滑化し、さらに該プラスミドをBglIIで消化した後に、ウシ腸管ホスファターゼで処理した。同様に、プラスミドpVac1OVAcytをNheIで消化後クレノー処理し、その後BglIIで消化し、OVAcyt遺伝子を含む1.8kbの断片をゲル生成し、消化済みのpGG2XEMPTYプラスミドと連結させ、プラスミドpGG2XOVAcytを作製した（51）。図１はプラスミドpGG2XOVAcytを示している。
【００６８】
本研究で用いたオリゴヌクレオチド
本研究で用いたLNA、PTO、およびPTO/LNAオリゴヌクレオチドは表２に記載されている。全てのLNA含有オリゴヌクレオチドはProligo LLC, Boulder, Colorado, USAにより合成された。全てのPTOのみから成るオリゴヌクレオチドは、MWG-Biotech AGにより合成された。
【００６９】
CpGアジュバント、TNFα誘発およびELISA検出アッセイのためにRAW264.7細胞にトランスフェクトされたいかなるオリゴヌクレオチドについても、そのエンドトキシンレベルはBiowhittaker QCL-1000 LAL kitあるいはPyrochrome LAL kitを用いて測定され、オリゴヌクレオチド1μgあたり0.1EU（endotoxin unit）未満であることが示された。
【表２】
2006512064.tif 000003
【００７０】
LNA残基は大文字太字、DNA残基は小文字太字、PTO残基は小文字太字斜体で表してある。サイト数は、プラスミドpGG2XGFP、またはpGG2XEMPTYあるいはpGG2XOVAcytのような、その誘導体内に存在する理論上のオリゴヌクレオチド結合サイトの最大数を示している。
【００７１】
Ulysis キットを用いたオリゴヌクレオチドの化学標識
オリゴヌクレオチドは、（97、98）に記載されているように、Alexa Fluor 488蛍光色素を含むUlysis 核酸標識キット（Molecular Probes, Leiden, Netherlands）を用いて標識した。
【００７２】
オリゴヌクレオチドの超らせん状プラスミドDNAへの結合
‘混合型’ PTO/LNAオリゴヌクレオチドのうち、蛍光標識されているものとされていないもの両者について、その超らせん状プラスミドDNAへの結合が（97、98）に記載されている。プラスミドpGG2XOVAcytを、PTOCpG、PTOGpC、PTOCpG2、PTOGpC2または対照用結合LNAオリゴヌクレオチド：5827、11701または5’SHGAと結合させた（一晩、37℃、10mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA pH5.8）。簡潔に述べれば、2.5μgのプラスミドDNAを、DNA 1μgあたり概ね90pmolのUlysis Alexa Fluor 488または5’Alexa Fluor 568標識オリゴと結合させ、得られた生成物をアガロースゲルを用いて解析した。
【００７３】
結果
(GA)n（PTOCpGおよびPTOGpC）、および(GGAA)n（PTOCpG2およびPTOGpC2）配列に基づくLNA/プラスミド結合配列を有する、蛍光標識された‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドは、プラスミドDNAと結合した形で検出され、5827あるいは11701のような、‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドのLNA部分に基づいている蛍光標識された対照LNA群と同様であった。このことは、13merの100％ LNAオリゴヌクレオチドの5’側への、21個のホスホロチオエートとDNA残基による伸長は、(GA)nおよび(GGAA)n結合モチーフの両者に基づくLNAモチーフについて、LNAのプラスミドDNAに対する結合能を阻害しないことを明確に示している。上記の条件での‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドのプラスミドDNAへの結合は、前述したように、いくらかのオリゴヌクレオチドをプラスミドDNAに結合しない遊離の状態で残している。
【００７４】
非標識‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドを、前述のようにプラスミドpGG2XOVAcytに結合させた（DNA 10μgあたりオリゴヌクレオチド1000pmol）。個々のプラスミド／オリゴヌクレオチドの結合反応は100μl以下で行われ、遊離の結合していないオリゴヌクレオチドは、後述するように、S400HRスピンカラムを用いてプラスミドおよび結合したオリゴヌクレオチドから除いた。
【００７５】
S400HRスピンカラムを用いた結合していないPTO/LNAオリゴヌクレオチドの分離
上記の条件での‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドのプラスミドDNAへの結合は、いくらかのオリゴヌクレオチドをプラスミドDNAに結合しない遊離の状態で残すものであった。プラスミドに結合していない遊離のオリゴヌクレオチドは、S400HRスピンカラムを用いた分離により取り除いた（Amersham Pharmacia Biotech）。
【００７６】
結合オリゴヌクレオチドの存在下あるいは非存在下でpGG2XOVAcytから発現したOVAcytタンパク質の発現レベルを測定するためのウエスタンブロットによる解析のために、プラスミドpGG2XOVAcytを、‘混合型’PTO CpG（あるいは対照のGpC）/LNAオリゴヌクレオチドと結合しているかしていない状態でCHO細胞にトランスフェクトした。以下これについて詳細に述べる。
【００７７】
CHO細胞の細胞培養およびトランスフェクション
CHO K1細胞は、10％胎児ウシ血清（FCS）、100 units/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、2mM グルタミン、MEM 非必須アミノ酸およびHT添加物を添加したIscoveの改良Dulbecco培地（Life Technologies）中で維持した。CHO K1細胞は、６穴プレート（Lab Tech, Nalge Nunc, Int.）中で、80％コンフルエントまで増殖させ、Optimemで２回洗浄し、Optimem中でプラスミドDNA：カチオン性脂質複合体（DNA：Transfast TM,[Promega]が1μg：6μlの割合、１ウェルあたりDNA 2.5μg）をトランスフェクトした。トランスフェクション混合液を24時間、細胞と接触させた後、細胞を洗浄し、増殖培地で満たした。トランスフェクション48時間後に細胞を回収し（リン酸緩衝食塩水で２回洗浄後）、100 μlの沸騰2X トリスグリシン還元サンプルバッファー（Invitrogen）に再懸濁した。
【００７８】
SDS/PAGE
SDS/PAGEは、製造業者の説明書に従って行った：上述の各細胞溶解液35 μlを、4-20％勾配トリスグリシン／SDS PAGE Novexゲル（Invitrogen, The Netherlands）にロードし、125Vで90分間電気泳動した。
【００７９】
ウエスタンブロット解析
タンパク質は、製造業者の説明書に従い、Novexウエスタン転写装置（Invitrogen, The Netherlands）を用いて、該ゲルより0.45 μm PVDF転写メンブレンであるImmobilon-P（Millipore）に転写した。転写されずにゲルに残ったタンパク質は、（51）に記載されているように、クマシーブルーで染色した。その後５％スキムミルク粉末／0.1％ Tween 20で該メンブレンをブロッキングし、500分の1に希釈したウサギ抗ニワトリ卵オボアルブミン１次抗体（Sigma）を作用させた。その後、メンブレンを洗浄し、10,000分の1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（DAKO）とインキュベートした。洗浄後、細胞質オボアルブミンタンパク質を、Bio West extended duration chemiluminescent substrate（UVP）を用いて検出し、UVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging SystemにてLabworks 4.0 packageを用いて可視化した。
【００８０】
結果
データは、１セットまたは２セットの‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドが、LNA部分である(GA)nと(GGAA)nの片方あるいは両方によって、プラスミドpGG2XOVAcyt内の結合サイトの２つの領域（例えばbGHpyAおよびCMVプロモーターの内部）に結合しているが、それらの結合はこのプラスミドからの抗原OVAcytの発現を妨げないことを明確に示している。このことは、この系においては、CpGアジュバントは該プラスミドからの抗原発現を妨げることなく２つの異なる結合サイトに加えられうることを意味している。
【実施例３】
【００８１】
自己相互作用を回避し、超らせん状プラスミドDNAとの結合効率および免疫アジュバント活性を最大化させるための、二次構造予測による、LNAおよび共合成された‘混合型’ホスホロチオエート（PTO）CpG/LNAオリゴヌクレオチドの最適な設計
ソフトウェアプログラムOligoDesign（99）の開発は、LNA含有オリゴヌクレオチドの融解温度、自己アニーリングおよび二次構造の予測を可能にするものである。該プログラムは、LNA：LNAあるいはLNA：DNA塩基対間の相互作用では、DNA：DNAの相互作用と比べて塩基対合の強度が増していることに対する重み付けを行うことを含んでおり、それ故、より合理的な‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの設計を可能にするものである（99）。該PTO（CpG）、および該LNA部分の間の予測される強い自己相互作用を回避したオリゴヌクレオチドは、以下の機能をより良く果たすはずである：
i）鎖置換物：より多くのLNAが自由にプラスミドDNAに接近し、結合しうることによる（97、98）；
ii）CpGに基づいたアジュバント：オリゴヌクレオチドの二次構造内に隔離されなければ、より多くの該CpG配列が接近しやすく（その受容体であるTLR9に結合するように）なりうることによる（100、実施例４を参照）。
【００８２】
該OligoDesignプログラムは、インターネットの公開ドメインhttp://lnatools.com/において利用可能であり、予測される‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの自己ハイブリダイゼーションおよび二次構造形成の尤度（likelihood）を得ることができる。
【００８３】
図２は本研究に記載された‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドについて、OligoDesignの予測を示している。
【００８４】
図２はOligoDesignにより予測された、‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの（I）分子間二量体形成（自己ハイブリダイゼーション）および（II）分子内二次構造形成（二次構造）を、それらの形成尤度を予測するスコアと共に示してある。図中、
（A）PTOCpG（配列番号14）
（B）PTOCpG2（配列番号18）
（C）PTOCpG3（配列番号20）
ここで留意すべきことは、20未満であるハイブリダイゼーションスコア（hybridization scores）は室温で安定でない傾向にあるが、30を超えるハイブリダイゼーションスコアは室温で安定な傾向にあることである。60未満のスコアは、摂氏温度での相互作用の融解温度の近似であると見なすことができる。スコアが低いほど、LNA部分が関わっている場合にはプラスミドの結合を、CpGモチーフが隔離されている場合にはCpGアジュバント活性を、相互作用が阻害する可能性が低い。
【００８５】
PTOに基づいたオリゴヌクレオチドにおいてCpG活性を保たせるために公知の設計ルールを用いると（101、102）、‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの該PTO配列を、CpGアジュバント活性を下げることなく、LNA配列との相互作用を減らすように修飾することが可能である。このことは、OligoDesignによって予測される自己相互作用スコアがより低くなることで確認される。例えば、マウスおよびげっ歯類細胞株における活性については、6merの‘コア’モチーフ：5’-側に２つのプリン塩基、3’-側に２つのピリミジン塩基をつなげた非メチル化CpGの保持は、最大のアジュバント活性を有するために必要である（101、102）。この‘コア’モチーフの外側にある他のヌクレオチドの変化はアジュバント活性にほとんど影響しない。このような設計の１つの例を以下に示す。‘混合型’PTO CpG/LNAオリゴヌクレオチドPTOCpG3（配列番号４）は、PTOCpG2（配列番号３）を基にして再設計されたものであるが、予測されるLNAおよびPTO塩基間相互作用による分子間オリゴヌクレオチド二量体形成および分子内二次構造形成の尤度は低くなっている（図５Ｃ参照）。
【実施例４】
【００８６】
自己相互作用を示唆する二次構造が予測される、共合成された‘混合型’ホスホロチオエート（PTO）CpG/LNAオリゴヌクレオチドは、同等量のPTO CpGオリゴヌクレオチドに比べて免疫アジュバント能が低い
RAW264.7細胞の培養、DNAトランスフェクションおよびオリゴヌクレオチドのインキュベーション
げっ歯類マクロファージ細胞株であるRAW264.7は、10％FCS、100 units/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、2mM グルタミンを添加したRPMI 1640培地（Life Technologies）中で維持した。RAW264.7細胞は、96穴プレート（Lab tech, Nalge Nunc. Int.）中でコンフルエントまで増殖させた。細胞を、１ウェルあたり250μlのPBSで１回洗浄し、150μlのOptimem中で、２時間、37℃でインキュベートした。0.01-10μMのCpGオリゴヌクレオチド、+/- FuGENE6 Transfection Reagent（Roche Molecular Biochemicals、それぞれ1μM オリゴヌクレオチド：0.5μl FuGENE6）より成るトランスフェクション混合液を、Optimem中に最終容量100μlとなるように加え、該混合液を室温で30分間インキュベートした。該トランスフェクション混合液をOptimem中の該RAW264.7細胞に添加し、14時間、37℃でインキュベートした。対照として、同じ手順をFuGENE6 Transfection Reagentのみで行った。
【００８７】
RAW264.7細胞からの腫瘍壊死因子α（TNFα）のELISA
CpGモチーフによる刺激後のげっ歯類TNFα産生に基づいたELISAアッセイを行うために、RAW264.7細胞を増殖させ、上記のようにオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした（84、85、86、87）。
【００８８】
製造業者のプロトコルに従い、Duoset ELISA development system kit（R&D systems, Minneapolis）を用いてげっ歯類TNFαレベルを検出するために、上記のインキュベーション14時間後に培養上清を採取した。希釈試薬（1％BSA添加PBS）で上清サンプルを希釈した後、96穴Nunc Immuno ELISA plates（ Nalge Nunc）中でELISAを行い、Molecular Devices Spectra Max 190を用いて450nmの吸光度を測定し、Softmax Pro 3.1.2 softwareの4-PL curve fitによってげっ歯類TNFα値を算出した。結果は二重サンプルの平均値（ng/ml）として表し、CpGオリゴヌクレオチド濃度（μM）に対してプロットした（図３を参照）。
【００８９】
上記のin vitro RAW264.7細胞インキュベーションアッセイを用いて、アジュバント活性について、PTOオリゴヌクレオチドCpG1826（表２）を同様の‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドPTOCpG（表１）およびCpGでない対照：GpC1745およびPTOGpCと比較した。図３は、PTOおよび‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドとインキュベートしたRAW264.7細胞におけるTNFα誘発についてのELISAデータのプロットを示している。該データは、どちらのCpG含有オリゴヌクレオチドもTNFα誘発を示すものの、同等の濃度の‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドPTOCpGにおける誘発レベルは、そのPTO類似体であるCpG1826に比べ、大きく低下していることを示している。PTOCpGにおけるこのCpG活性の低下についての最も適当な説明は、該CpGモチーフの接近しやすさを阻害しうる、このオリゴヌクレオチドにおいて予測される自己相互作用である。
【実施例５】
【００９０】
共合成された‘混合型’ホスホロチオエート（PTO）CpG/LNAオリゴヌクレオチド（配列番号４）の超らせん状プラスミドDNAへの結合
混合型PTO CpG/LNAオリゴヌクレオチドであるPTOCpG3（配列番号４）はPTOCpG2（配列番号３）に基づいて再設計されたものであるが、予測されるLNAおよびPTO塩基間の分子間オリゴヌクレオチド二量体形成および分子内二次構造形成の尤度が小さくなっていた（実施例３を参照）。蛍光標識された‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの超らせん状プラスミドDNAへの結合は、実施例１および２に記載されている（97、98）。プラスミドpGG2XGFPをPTOCpG2、PTOCpG3（配列番号４）、PTOGpC3および対照用結合LNAオリゴヌクレオチド：11701と結合させた（37℃、一晩、10mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA pH5.8）。簡潔に述べれば、2.5μgのプラスミドDNAを、DNA 1μgあたり概ね90pmolのUlysis Alexa Fluor 488または5’Alexa Fluor 568標識オリゴと結合させ、結果として得られた生成物をアガロースゲルを用いて解析した（図４を参照）。
【００９１】
図４は、5’アミノ基においてAlexa Fluor 568で標識されたか、あるいはUlysis Alexa Fluor 488 labelling kit（Molecular Probes, Leiden, Netherlands)を用いてN7G残基において化学標識されたLNAオリゴヌクレオチドとインキュベートされた超らせん状プラスミドDNAを解析するために、エチジウムブロマイド（EtBr）を加えずに行った2％アガロースゲル電気泳動を示している。
【００９２】
（A）UVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System、302nm uv、SYBR gold filter（UVP, Cambridge, UK）による、Labworks 4.0 packageを用いたゲル解析、EtBr染色前。
【００９３】
（B）（A）と同様、EtBr染色後。
【００９４】
1）pGG2XGFPプラスミド 2.5μg
2）1kb DNAラダー（Promega, Southampton, UK） 1μg
3）Alexa Fluor 568で標識された11701と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
4）空き
5）Ulysis Alexa Fluor 488で標識されたPTOCpG2と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
6）空き
7）Ulysis Alexa Fluor 488で標識されたPTOCpG3と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
8）Ulysis Alexa Fluor 488で標識されたPTOGpC3と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
PTOCpG3（配列番号４）と、そのCpGでない類似体PTOGpC3の両者が、LNA結合モチーフ(GGAA)nに対する結合サイトを有するプラスミドと結合している。
【００９５】
その他の刊行物
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】プラスミドベクターpGG2XOVAcytの構造を示した概略図である。
【図２】‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドについて、OligoDesignの予測を示す。
【図３】PTOおよび‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドとインキュベートしたRAW264.7細胞におけるTNFα誘発についてのELISAデータのプロットを示す。
【図４】蛍光標識されたLNAオリゴヌクレオチドとインキュベートされた超らせん状プラスミドDNAのアガロースゲル解析を示す。図４AはEtBr染色前の像、図４BはEtBr染色後の像である。
【図１】
2006512064.tif 000004
【図２】
2006512064.tif 000005
【図３】
2006512064.tif 000006
【図４】
2006512064.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月13日(2005.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のヌクレオチドリンカー残基を適宜介してLNA配列：5’-GGAAGGAAGGAAGG-3’（配列番号２）に連結された配列：5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’（配列番号１）の非メチル化CGジヌクレオチド（CpG）を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドが複数個連結したプラスミドを含んで成る複合体。
【請求項３】
配列全体を共合成することを含んで成る、LNA-CpGコンジュゲートの製造法。
【請求項４】
LNA-CpGコンジュゲートの配列が、プラスミドへの結合またはCpGアジュバント活性の阻害を抑制するように十分に低い予測自己アニーリングおよび二次構造形成能を有する、請求項３に記載のLNA-CpGコンジュゲートの製造法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
好ましいLNA-CpG配列は以下の通りである：
5’-tccatgacgttcctgacgttnGGAAGGAAGGAAGG-3’  配列番号３
ここで、nはA、G、TまたはCでありうるが、Tであることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
オリゴ１（配列番号１）：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
オリゴ２（配列番号５）：TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
オリゴ３（配列番号６）：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ４（配列番号４）：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
オリゴ５（配列番号７）：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
また別のCpGオリゴヌクレオチドは、重要ではない欠失や付加を有する上記の好ましい配列により構成されうる。本発明で利用されるCpGオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知であるいかなる方法（例えばEP468520）によっても合成されうる。簡便には、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成機を用いて合成されうる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本研究で用いたLNAオリゴヌクレオチド
本研究に用いられたLNAオリゴヌクレオチドは、表１に記載されている。
【表１】
2006512064.tif 000008
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
LNA残基は大文字太字、DNA残基は小文字太字、PTO残基は小文字太字斜体で表してある。サイト数は、プラスミドgWizおよびpGG2XGFP内の理論上のオリゴヌクレオチド結合サイトの最大数を示している。n=‘PEGスペーサー’-9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール, 1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]- ホスホルアミダイト, スペーサー ホスホルアミデート9（Glen Research, USA）；O=8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸リンカー、g=グリシン、l=リジン、Fl=フルオレセイン、NH2=5’-アミノ-修飾剤 C12 ホスホルアミダイトスペーサー（Glen Research, USA）、PTO=ホスホロチオエート、S-S=チオール修飾剤, C6 S-Sホスホルアミデート（Glen Research, USA）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
共合成された‘混合型’（hybrid）ホスホチオエート（PTO）CpG/LNAオリゴヌクレオチドの、オボアルブミン抗原を発現する超らせん状プラスミドDNAへの結合と、その結合が抗原の発現を妨げないことの証明
プラスミドとプラスミドDNA
プラスミドDNAはQiagen MaxiPrep（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）の手順を用いて、あるいはQiagen Endofree Plasmid Maxi Kitにより調製し、TE（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）pH8.0に１μg/μlで再懸濁した。プラスミドは、アガロースゲル電気泳動により95％より多くが超らせん状であるようにした（51）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
CpGアジュバント、TNFα誘発およびELISA検出アッセイのためにRAW264.7細胞にトランスフェクトされたいかなるオリゴヌクレオチドについても、そのエンドトキシンレベルはBiowhittaker QCL-1000 LAL kitあるいはPyrochrome LAL kitを用いて測定され、オリゴヌクレオチド1μgあたり0.1EU（endotoxin unit）未満であることが示された。
【表２】
2006512064.tif 000009
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
PTOに基づいたオリゴヌクレオチドにおいてCpG活性を保たせるために公知の設計ルールを用いると（101、102）、‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの該PTO配列を、CpGアジュバント活性を下げることなく、LNA配列との相互作用を減らすように修飾することが可能である。このことは、OligoDesignによって予測される自己相互作用スコアがより低くなることで確認される。例えば、マウスおよびげっ歯類細胞株における活性については、6merの‘コア’モチーフ：5’-側に２つのプリン塩基、3’-側に２つのピリミジン塩基をつなげた非メチル化CpGの保持は、最大のアジュバント活性を有するために必要である（101、102）。この‘コア’モチーフの外側にある他のヌクレオチドの変化はアジュバント活性にほとんど影響しない。このような設計の１つの例を以下に示す。‘混合型’PTO CpG/LNAオリゴヌクレオチドPTOCpG3は、PTOCpG2を基にして再設計されたものであるが、予測されるLNAおよびPTO塩基間相互作用による分子間オリゴヌクレオチド二量体形成および分子内二次構造形成の尤度は低くなっている（図５Ｃ参照）。
【実施例４】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
共合成された‘混合型’ホスホロチオエート（PTO）CpG/LNAオリゴヌクレオチドの超らせん状プラスミドDNAへの結合
混合型PTO CpG/LNAオリゴヌクレオチドであるPTOCpG3はPTOCpG2に基づいて再設計されたものであるが、予測されるLNAおよびPTO塩基間の分子間オリゴヌクレオチド二量体形成および分子内二次構造形成の尤度が小さくなっていた（実施例３を参照）。蛍光標識された‘混合型’PTO/LNAオリゴヌクレオチドの超らせん状プラスミドDNAへの結合は、実施例１および２に記載されている（97、98）。プラスミドpGG2XGFPをPTOCpG2、PTOCpG3、PTOGpC3および対照用結合LNAオリゴヌクレオチド：11701と結合させた（37℃、一晩、10mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA pH5.8）。簡潔に述べれば、2.5μgのプラスミドDNAを、DNA 1μgあたり概ね90pmolのUlysis Alexa Fluor 488または5’Alexa Fluor 568標識オリゴと結合させ、結果として得られた生成物をアガロースゲルを用いて解析した（図４を参照）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
1）pGG2XGFPプラスミド 2.5μg
2）1kb DNAラダー（Promega, Southampton, UK） 1μg
3）Alexa Fluor 568で標識された11701と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
4）空き
5）Ulysis Alexa Fluor 488で標識されたPTOCpG2と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
6）空き
7）Ulysis Alexa Fluor 488で標識されたPTOCpG3と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
8）Ulysis Alexa Fluor 488で標識されたPTOGpC3と37℃でインキュベートしたpGG2XGFPプラスミド 2.5μg
PTOCpG3と、そのCpGでない類似体PTOGpC3の両者が、LNA結合モチーフ(GGAA)nに対する結合サイトを有するプラスミドと結合している。
【国際調査報告】
2006512064.tif 000010
2006512064.tif 000011