(57)【要約】本発明は、ポリ不飽和脂肪酸の製造方法であって、炭素原子数が１３〜１８の鎖長を有するオレフィン系もしくはアセチレン系脂肪酸（基質）を、該基質の９位において配置Ｚを有する新結合を形成させるビール酵母菌イーストＷ３０３ａまたはΔElo1のハプロイドもしくはディプロイド野生菌株に取込ませることによる該製造方法に関する。新たな不飽和化は、被処理物中の元の不飽和結合が配置Ｅを有しているか、またはアセチレン結合であるときにのみおこなわれる。さらに、元の結合が配置Ｚを有するときには、基質は無変化で回収される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）および（ｂ）を含むことを特徴とするポリ不飽和脂肪酸の製造方法：
（ａ）モノ不飽和基質をビール酵母菌イーストの菌株と共に、０．２５〜１ｍＭ（好ましくは０．５ｍＭ）の基質を含有する液状培地ＹＰＤ−ダージトール（１％）中において、２００〜３００ｒｐｍ（好ましくは２００ｒｐｍ）の撹拌下、３７℃で２４〜４８時間培養し、次いで、
（ｂ）上記の工程（ａ）で得られた培養培地からからポリ不飽和脂肪酸を抽出して精製する。
【請求項２】
ビール酵母菌イーストの菌株が特に次の群に属する菌株である請求項１記載の方法：エロンガーゼを含有するＷ３０３ａハプロイド菌株、エロンガーゼを含有するＷ３０３ａディプロイド菌株、およびエロンガーゼ欠乏ΔElo1菌株。
【請求項３】
使用する基質が、炭素原子数が１３〜１８の鎖長を有して１１位に配置がＺもしくはＥの二重結合または三重結合を有するモノ不飽和脂肪酸である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
培養によって得られる９位に二重結合を有する生成物の鎖長がハプロイドもしくはディプロイドＷ３０３ａのイーストからのエロンガーゼにより延長されることによって、１１位と１３位に二重結合を有する新生成物がもたらされる請求項１から３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
該方法から得られる主要なポリ不飽和生成物が特に次の群に属する化合物である請求項４記載の方法：Z9，E11：13、 Z9，E11：14、 Z9，E11：15、 Z9，E11：16、 Z9，E11：18、 Z11：13、 Z11：14、 Z11：15、 Z11：16およびZ9，11，11：13。
【請求項６】
培養によって得られる９位に二重結合を有する生成物の鎖長が、エロンガーゼ欠乏ΔElo1菌株を使用することによって延長されない請求項１から３いずれかに記載の方法。
【請求項７】
該方法によって得られるポリ不飽和生成物が特に次の群に属する化合物である請求項６記載の方法：Z9，E11：13、 Z9，E11：14、 Z9，E11：15、 Z9， E11：16、Z9， E11：18、 Z11：13、 Z11：14、 Z11：15、 Z11：16およびZ9，11，11：13。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、薬剤工業、土壌栄養工業および化粧品工業における用途並びに精製化学、共役リノール酸（ＣＬＡ）および生物工学の分野における合成中間体としての用途に供されるポリ不飽和脂肪酸の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤工業、土壌栄養工業および化粧品工業において増大しているポリ不飽和脂肪酸の需要に対応するために、該脂肪酸が複雑な混合物の状態で存在する天然資源から抽出する方法が検討されているが、個々の成分をクロマトグラフィー法によって分離することは実際上不可能であるか、または非常に困難である。また、代替法として有機合成法が適用されているが、立体特異性が要求されるため、合成物は、一般に少量で調製されている。このため、合成物のコストは非常に高くなり、該合成物は研究に使用されているだけである。
【０００３】
この理由から、天然資源は、種々の方法（例えば、メチルエステルの分子蒸留、尿素を用いる識別、トリグリセリドの加水分解における識別用リパーゼの使用、並びにグリセロールのエステル化位置、エステルの特性、鎖長および二重結合の位置に関する特異性の開発等）によってポリ不飽和脂肪酸の濃縮物を調製するために見直されてきている（「脂質の合成と製造」、フランクＤ．ガンストン編、シェッフィールド・アカデミック・プレス（英国）、１９９９年）。
【０００４】
同様に、非共役酸から出発して共役ジエン脂肪酸を調製する方法が文献に記載されている。特に、共役リノール酸（ＣＬＡ）は癌細胞を低減させるか、または除去する機能を有し（セイデル、ＭＣ２００１、米国特許第６３１９９５０号）、心血管疾患を予防し、免疫系を改善し、また、肥満症の治療を補助するために最も重要である。
【０００５】
これらの共役リノール酸（ＣＬＡ）、リノール酸（シス−９，シス−１２−オクタジエン酸）を均一媒体中において、塩基（例えば、アルカリ水酸化物水溶液）を用いて管状流動反応器内で２３００ｐｓｉの圧力と高温の条件下において異性化させる方法（クラジェカ、Ｋ．Ｅ．、１９７９年、米国特許第４１６４５０５号）またはナトリウムメトキシドを用いて異性化させる方法（イワタＴ．ら、１９９８年、ヨーロッパ特許公報ＥＰ０８３９８９７Ａ１）および超強有機塩基（例えば、sec−ブチルリチウム、シェロッサー塩基またはカリウムトリメチルシリルメチルウレ等）を用いる−７８℃〜−２０℃における脱プロトン化法（シー・チュおよびチェン・チャ、２００１年、米国特許第６３１６６４５号）によって混合物として得られる。
【０００６】
均一触媒、例えば、トリス（トリフェニルホスフィン）クロロロジウム（デ・ジャラスＷ．およびガストＬ．、J. Am. Oil Chem. Soc.、１９７１年、第４８巻、第２１頁）およびアレンクロモカルボニル錯体（フランケルＥ．、J. Am. Oil Chem. Soc.、１９７０年、第４７巻、第３３頁）を用いる方法も知られており、これらの触媒を使用することにより、異性化反応は、上記の方法において必要な温度（１８０℃〜２００℃）よりも低温において促進される。しかしながら、これらの触媒は除去することが困難であり、また、環境にも適合しない。
【０００７】
このような理由から、あらかじめ活性化させたゼオライトに担持させたＮｉ触媒を用いる方法が最近開発されており、この方法によれば、異性化反応はｎ−デカンまたは１−オクタノールの溶液中において、８０℃〜１２０℃の温度でおこなうことができる（バーナスＡ．ら、Chem. Comun.、２００２年、第１１４２頁〜第１１４３頁）。
【０００８】
しかしながら、ＣＬＡの抗発癌性効果をもたらす成分はシス−９，トランス−１１異性体であることが確認されているので、このような異性体を得るための特異的異性化法が必要である。このような試みとして、リノール酸を第一胃のブチリビブリオ・フィブリソルベンスのバクテリアの由来のリノレエートイソメラーゼと反応させる方法（パリザＭ．Ｗ．およびハＹ．Ｌ．、１９９３年、米国特許第５２０８３５６号）およびシス−９，シス−１２配置において非共役二重結合を有する脂肪酸を共役二重結合を有する脂肪酸（少なくとも５０％はシス−９，トランス−１１配置の二重結合を有する）へ変換し得るラクトバシルス菌の実質上純粋な薬剤を併用する方法（パリザＭ．Ｗ．およびヤングＸ．Ｙ．、２０００年米国特許第６０６０３０４号）が知られている。
【０００９】
さらに、ｎ−ヘキサン中におけるＣＬＡとｎ−ブタノールの混合物のエステル化におけるリパーゼの選択性に関する研究もおこなわれている。この場合、所望の異性体シス−９，トランス−１１のエステル化においては、カンジダ・シリンドリシエ（Candida cylindricea）およびムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）のリパーゼが優れていることが観察されている［ヴァルヴェルＳ．およびボルクドルフＲ．、Biotechnology Letters、２０００年、第２２巻（１４）、第１１５１頁〜第１１５５頁］。
【００１０】
以下に説明するように、本発明においては、この活性な異性体は、１１−オクタデセン酸の特異的脱飽和によって確実に得ることができる。
【００１１】
ポリ不飽和脂肪酸を製造するためには、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）イーストが使用されており、異なる入手源からの脂肪酸の種々の脱飽和体の遺伝子組込みによって遺伝子的に形質転換された酵母が使用されている（スズキＯ．ら、ＷＯ２００１／０７５０６９Ａ１；ミチニカＹ．ら、J. of Oleo Science、２００１年、第５０巻（５）、第３５９頁〜第３６５頁）。
【００１２】
本発明においては、ビール酵母菌のΔ−９デサチュラーゼ（desaturase）をポリ不飽和脂肪酸の選択的製造に使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ポリ不飽和脂肪酸の新規な製造法を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、炭素原子数が１３〜１８のオレフィン性もしくはアセチレン性脂肪酸を基質として使用することによるポリ不飽和脂肪酸の製造方法であって、該基質の９位において配置がＺの新結合を形成させることができるビール酵母菌イーストＷ３０３ａまたはΔElo1のハプロイド（haploid）またはディプロイド（diploid）野生菌株と該脂肪酸を混合させることを含む該方法に関する。
【００１５】
この新たな脱飽和は、被処理基質中の元の不飽和結合がＥ配置を有するか、またはアセチレン結合のときにのみおこなわれ、元の結合がＺ配置を有する場合には、該基質は変化させずに回収される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、本発明者によって観察された次の知見に基づく。即ち、分子鎖のＣ−１１位から開始する１個もしくは数個の不飽和結合を有するモノ不飽和脂肪酸を基質として、ビール酵母菌種の菌株へ添加する場合には、鎖長がＣ１３〜Ｃ１８のポリ不飽和脂肪酸であって、元の炭素鎖の９位にＺ配置の付加的な不飽和結合を有する脂肪酸が該酵母のΔ−９デサチュラーゼによって形成される。
【００１７】
より詳細には、本発明は、ハプロイドもしくはディプロイドＷ３０３ａビール酵母菌の菌株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）および遺伝学的に変性されたΔElo1［エロンガーゼ（elongase）欠乏］（EUROSCARF）に、炭素鎖のＣ−１１位から開始する１もしくは複数の不飽和結合を有する脂肪酸を基質として混合した混合物を培養する工程を含む鎖長がＣ１３〜Ｃ１８のポリ不飽和脂肪酸の製造方法に関するものであって、該製造方法によれば、炭素鎖の９位にＺ配置の付加的な不飽和結合を有する化合物が得られる。該化合物としては、特に、ハプロイドもしくはディプロイドＷ３０３ａ菌株と共に培養する場合にはZ9，E11：13、 Z9，E11：14、 Z9，E11：15、 Z9，E11：16、 Z9，E11：18、 Z11：13、 Z11：14、 Z11：15、 Z11：16およびZ9，11，11：13に属する化合物が挙げられ、また、ΔElo1菌株と共に培養する場合には、Z9，E11：13、 Z9，E11：14、 Z9，E11：15、 Z9，E11：16、 Z9，E11：18、 Z11：13、 Z11：14、 Z11：15、 Z11：16およびZ9，11，11：13が挙げられる。
【００１８】
イーストへ供給されるＥもしくはトランス配置の二重結合を有する基質は、対応するＺもしくはシス配置を有する異性体よりも、該酵母のΔ−９デサチュラーゼによって迅速に脱飽和されて脂肪族鎖の９−位にＺもしくはシス配置の新たな二重結合を形成し、これによって対応する誘導体Ｚ９Ｅ１１（シス９，トランス１１）が生成されることが判明した。同様に、以下の表１に示すように次のことが判明した。即ち、ハプロイドもしくはディプロイドＷ３０３ａ菌株を使用する場合には、元の基質の２つの炭素鎖の部分的延長がおこなわれて脱飽和は新たな基質の９位において維持されるが、ΔElo1菌株を使用する場合には分子鎖の延長はおこなわれない。
【００１９】
上記の製造方法によって得られる生成物は、薬剤工業の分野においては抗癌剤（例えば、化合物Ｚ９Ｅ１１）としての用途を有し、また、土壌栄養（agroalimentary）工業においては栄養薬効剤（nutriceutical）としての用途を有し、さらに、化粧品工業と精製化学工業においては、生物学的に合理性のある方法によって昆虫伝染病の伝統的抑制に使用するための昆虫フェロモンの合成中間体としての用途を有する。
【００２０】
特許請求の範囲によって規定される本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
オレフィン性もしくはアセチレン性基質の取込みによるイーストを用いるポリ不飽和脂肪酸の製造
基質を用いる酵母培養
ハプロイドもしくはディプロイドＷ３０３ａおよびΔElo1（エロンゲース欠乏）イーストのコロニーの増殖を、ＹＰＤ−寒天プレートを有する固体培地上において３７℃で２４時間おこなった。脂肪酸基質の１Ｍエタノール溶液から出発して、ＹＰＤ−タージトール（１％）液状培地２ｍｌ中のイーストの単一コロニーへ該溶液を添加した。この場合、脂肪酸は、基質の最終濃度が０．２５〜１ｍＭ（好ましくは０．５ｍＭ）になるようにして添加した。得られた混合物を、２００〜３００ｒｐｍ（好ましくは２００ｒｐｍ）の条件下で撹拌させながら、３７℃で２４〜４８時間（好ましくは２４時間）増殖させた。
【００２２】
種々の酸の抽出法
培養培地をエッペンドルフ型フラスコ（１．５ｍｌ）へ移し、３０００ｒｍｐの条件下での遠心分離処理に５分間付した。上澄みを除去し、残留した培養培地を、上記の場合と同様にしてフラスコ内へ移して遠心分離処理に付した。上澄みを除去し、残留物を水（１ｍｌ）で洗浄した後、洗浄、遠心分離および上澄み除去の操作をさらに２回おこなった。最後に、残留物を３０００ｒｍｐの条件下での遠心分離に２分間付すことによって水を完全に除去した。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（２：１）混合液（１ｍｌ）を添加し、得られた混合物を機械的アームで１時間撹拌した。最後に、混合物を１３２００ｒｐｍの条件下での遠心分離処理に５秒間付し、得られた有機抽出物をフラスコ（３ｍｌ）内へ移した後、溶剤を蒸発させた。
【００２３】
脂肪酸の残留物を、ＫＯＨの０．５Ｎ溶液（溶媒：ＭｅＯＨ）を０．５ｍｌ添加することによってメタノール分解させ、３０分後に１ＮのＨＣｌ（０．５ｍｌ）を用いて中和処理をおこなった後、ヘキサン（０．５ｍｌ）を用いる抽出処理をおこなった。有機層を分離させた後、体積が２０μｌになるまで濃縮させ、該濃縮物をＣＧ−ＥＭによる分析処理に付した。
【００２４】
得られた酸の分析
メチルエステルは、次の温度プログラムに従って、ＨＰ−１無極性カラム内におけるＣＧ−ＥＭによって分析した：８０℃（０）／５／２００（０）１０／３００（１０）。
【００２５】
共役二重結合の位置は、ＭＴＡＤ（４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）との錯体形成によるＣＧ−ＥＭによって分析した。これらの錯体は、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）にＭＴＡＤ（１．２ｍｇ）を溶解させた溶液（２．５μｌ）をヘキサン抽出物（１０μｌ）に添加することによって形成され、この反応混合物は最終体積が２μｌになるまで撹拌下での蒸発処理に付した。濃縮物は、次の温度プログラムを伴うＣＧ−ＥＭ内へ導入した：８０℃（０）／５／２００（０）１０／３００（２５）。
【００２６】
共役二重結合の位置は、ＤＭＤＳ（ジメチルジスルフィド）との錯体形成によって決定された。これらの錯体は、ヘキサン抽出物（２０μｌ）に、ジメチルジスルフィド（５０μＬ）および１滴のヨウ素のジエチルエーテル溶液（６０ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって形成され、この混合物を４５℃〜５０℃で７２時間加温した。
【００２７】
加温処理が終了した後、得られた混合物をヘキサンで希釈し、ヨウ素はＮａ２Ｓ２Ｏ３の飽和溶液を用いて除去し、該希釈物をＨ２Ｏで洗浄した後、有機層を分離させた。ヘキサンの体積を２０μｌまで濃縮させ、該濃縮物（１μｌ）をＣＧ−ＥＭ内へ導入し、前記の条件下で分析した。
【００２８】
結果
基質としては、１１位に立体配置がＺもしくはＥの二重結合または三重結合を有する分子鎖中の炭素原子数が１３〜１８の一連のモノ不飽和脂肪酸を使用した。
【００２９】
これらの酸は市販品として入手するか、または実験室的方法もしくは常套法に従って合成した。以下の表１に示すように、立体配置がＥもしくはトランスである二重結合または三重結合を有する基質は、イーストによって９位において脱飽和された対応する誘導体Ｚ９Ｅ１１を生成するが、２００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で２４時間培養する条件下においては、立体配置がＺもしくはシスである対応する基質は変化せずに回収される。
【００３０】
エロンガーゼを含有するハプロイドおよびディプロイドＷ３０３ａ菌株は、基質に応じて炭素鎖を２つ延長させることができる。これらの場合、１３位または１５位に不飽和結合を有する新たに形成される脂肪酸は脱飽和されて対応するＺ９Ｅ１３およびＺ９Ｅ１５に変化する。
【００３１】
立体配置がＺ１１の二重結合を有する基質の場合には、立体配置がＺ１３およびＺ１５の二重結合を有する対応する基質は炭素鎖の延長によって得られるが、その後の脱飽和は観察されなかった。さらに、形成されるＺ９Ｅ１１ジエンは対応するＺ１１Ｅ１３およびＺ１３Ｅ１５まで延長させることができる。
【００３２】
エロンガーゼ欠乏イーストの菌株（ΔElo1）を使用する場合には、脱飽和に起因するジエンＺ９Ｅ１１のみが得られる。
【００３３】
全ての場合において、イーストに含まれる内因性酸（endogenous acid）、例えば、パルミトレイン酸（Ｚ９：１６）およびオレイン酸（Ｚ９：１８）が観察された。
【００３４】
【表１】
2006500938.tif 000002
【国際調査報告】
2006500938.tif 000003
2006500938.tif 000004
2006500938.tif 000005
2006500938.tif 000006