(57)【要約】  エンテロバクテリアセアエ科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバーである菌株ＤＣ２６０から、ゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）合成酵素（ＣｒｔＥ）、フィトエンシンターゼ酵素（ＣｒｔＢ）、フィトエンデサチュラーゼ（ＣｒｔＩ）、リコペンシクラーゼ（ＣｒｔＹ）、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ＣｒｔＺ）、およびゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ＣｒｔＸ）活性を有する遺伝子を単離した。これらの遺伝子および遺伝子産物はファルネシルピロリン酸をカロテノイドに変換するために有用である。これらのＤＮＡセグメントを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、形質転換された宿主生物内で組み替えＤＮＡ技術によりこれらの酵素を生成せしめる方法を開示する。
2006528885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子と、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子と、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して相補的な単離された核酸分子、
よりなる群から選択される、カロテノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１よりなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
菌株ＤＣ２６０から単離された請求項１に記載の単離された核酸フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２よりなる群から選択される請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺ遺伝子を含んでなる配列番号１８に記載の単離された核酸分子または配列番号１８に対して少なくとも９５％の同一性をもつ単離された核酸分子であって、単離された核酸分子はｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺのすべてのポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した時に、スミス−ウォーターマン法によるアライメントに基いて少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも３０１個のアミノ酸のゲラニルゲラニルピロリン酸シンテターゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した時に、スミス−ウォーターマン法によるアライメントに基づいて少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも４２５個のアミノ酸のゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号６に記載の配列を有するポリペプチドと比較した時に、スミス−ウォーターマン法によるアライメントに基づいて少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも３８８個のアミノ酸のリコペンシクラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した時に、スミス−ウォーターマン法によるアライメントに基づいて少なくとも７７％の同一性をもつ少なくとも４９３個のアミノ酸のフィトエンデサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１０に記載の配列を有するポリペプチドと比較した時に、スミス−ウォーターマン法によるアライメントに基づいて少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも３０９個のアミノ酸のフィトエンシンターゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した時に、スミス−ウォーターマン法によるアライメントに基づいて少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも１７７個のアミノ酸のβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１３】
適当な調節配列に操作可能に結合された請求項１または請求項６〜１１のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項１４】
請求項６に記載の単離された核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項６に記載の単離された核酸分子を含んでなる形質転換された宿主。
【請求項１７】
宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項１５または１６に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｌｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）よりなる群から選択される請求項１７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）（ｉ）適当なレベルのファルネシルピロリン酸と、
（ｉｉ）適当な調節配列の制御下で配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２よりなる群から選択される酵素をコードする核酸分子の組
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を適当な増殖条件下で有効量の発酵可能な炭素基質と接触させ、これによってカロテノイド化合物を生成せしめる
ことを含んでなるカロテノイド化合物の製造方法。
【請求項２０】
（ａ）（ｉ）適当なレベルのファルネシルピロリン酸と、
（ｉｉ）適当な調節配列の制御下で請求項６に記載の単離された核酸分子の組
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を適当な増殖条件下で有効量の発酵可能な炭素基質と接触させ、これによってカロテノイド化合物を生成せしめる
ことを含んでなるカロテノイド化合物の製造方法。
【請求項２１】
形質転換された宿主細胞がＣ１代謝性宿主、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ１代謝性宿主がメタノトローフであり、発酵可能な炭素基質がメタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン、メチル化チオール、および二酸化炭素よりなる群から選択される請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｃ１代謝性宿主が、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質上で増殖し、
（ｂ）ピロリン酸塩依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる機能エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含んでなる
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｃ１代謝性宿主細胞がメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａとして知られ且つＡＴＣＣ指示ＰＴＡ２４０２を有する高増殖性メタノトローフ細菌菌株である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
形質転換された宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）よりなる群から選択される請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２６】
製造されるカロテノイド化合物がアンテラキサンチン（ａｎｔｈｅｒａｘａｎｔｈｉｎ）、アドニルビン（ａｄｏｎｉｒｕｂｉｎ）、アドニキサンチン（ａｄｏｎｉｘａｎｔｈｉｎ）、アスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）、カンタキサンチン（ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ）、カプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン（ｃｒｙｐｔｏｘａｎｔｈｉｎ）、α−カロテン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）、β−カロテン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）、イプシロン−カロテン（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）、エキネノン（ｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ）、３−ヒドロキシエキネノン（３−ｈｙｄｒｏｘｙｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ）、３’−ヒドロキシエキネノン（３’−ｈｙｄｒｏｘｙｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ）、γ−カロテン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）、４−ケト−γ−カロテン（４−ｋｅｔｏ−γ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）、ζ−カロテン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）、α−クリプトキサンチン（ｃｒｙｐｔｏｘａｎｔｈｉｎ）、デオキシフレキシキサンチン（ｄｅｏｘｙｆｌｅｘｉｘａｎｔｈｉｎ）、ジアトキサンチン（ｄｉａｔｏｘａｎｔｈｉｎ）、７、８−ジデヒドロアスタキサンチン（７，８−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）、フコキサンチン（ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ）、フコキサンチノール（ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎｏｌ）、イソレニエラテン（ｉｓｏｒｅｎｉｅｒａｔｅｎｅ）、ラクチュカキサンチン（ｌａｃｔｕｃａｘａｎｔｈｉｎ）、ルテイン（ｌｕｔｅｉｎ）、リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）、ミクソバクトン（ｍｙｘｏｂａｃｔｏｎｅ）、ネオキサンチン（ｎｅｏｘａｎｔｈｉｎ）、ニューロスポレン（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒｅｎｅ）、ヒドロキシニューロスポレン（ｈｙｄｒｏｘｙｎｅｕｒｏｓｐｏｒｅｎｅ）、ペリジニン（ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ）、フィトエン（ｐｈｙｔｏｅｎｅ）、ロドピン（ｒｈｏｄｏｐｉｎ）、ロドピングルコシド（ｒｈｏｄｏｐｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、４−ケト−ルビキサンチン（４−ｋｅｔｏ−ｒｕｂｉｘａｎｔｈｉｎ）、シフォナキサンチン（ｓｉｐｈｏｎａｘａｎｔｈｉｎ）、スフェロイデン（ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｎｅ）、スフェロイデノン（ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｎｏｎｅ）、スピリロキサンチン（ｓｐｉｒｉｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）、４−ケト−トルレン（４−ｋｅｔｏ−ｔｏｒｕｌｅｎｅ）、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｋｅｔｏ−ｔｏｒｕｌｅｎｅ）、ウリオリド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ）、ウリオリドアセテート（ｕｒｉｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ビオラキサンチン（ｖｉｏｌａｘａｎｔｈｉｎ）、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ−β−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、およびゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）よりなる群から選択される請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２７】
生物内で配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１８よりなる群から選択される少なくとも１種のカロテノイド遺伝子を過剰発現することを含んでなり、それにより生物内でカロテノイド生合成を改変する、生物内でカロテノイド生合成を調節する方法。
【請求項２８】
該カロテノイド遺伝子をマルチコピープラスミド上で過剰発現させる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該カロテノイド遺伝子を誘導可能なまたは調節されたプロモータに操作可能に結合する請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
該カロテノイド遺伝子をアンチセンス方向で発現させる請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
該カロテノイド遺伝子を、外来ＤＮＡをコード領域に挿入することによって分裂させる請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１６に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んでなる菌株ＤＣ２６０。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００３年５月２０日に提出された米国仮特許出願第６０／４７１，９０４号および２００３年１２月３日に提出された米国仮特許出願第６０／５２７，０８３号によって優先権を主張するものである。これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれている。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学と微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、微生物を使用したカロテノイド化合物（たとえばリコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、ゼアキサンチン−β−グルコシド）の生成に役立つ酵素をコードするエンテロバクテリアセアエ属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌の新規な菌株から単離された核酸フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイドは、天然色素のうちもっとも広く分布し、構造的に多様なクラスの１つであり、淡黄色、オレンジ、深紅色に渡る色素の色を生成せしめる。カロテノイド生成組織として目を引く例には、ニンジン、トマト、赤トウガラシ、および、ラッパズイセンとキンセンカの花弁を含む。カロテノイドはすべての光合成生物、および、一部の細菌、菌・カビ類によって合成される。これらの色素は、光合成、栄養、光酸化による損傷からの保護において重要な機能を有する。たとえば動物は、カロテノイド合成能を有しておらず、栄養的に重要なこれらの化合物を食事源を介して得なければならない。
【０００４】
自然界では６００超のカロテノイドの存在が確認されているにもかかわらず、産業的にはほんのわずかなカロテノイドが、食品着色料、飼料、医薬品、化粧品に使用されているだけである。これは主に生産が難しいためである。現在、産業目的で使用されるほとんどのカロテノイドは、化学合成によって生成される。しかしこれらの化合物の化学的な生成は非常に難しい（非特許文献１）。天然カロテノイドは植物材料からの抽出、または微生物を使った合成で得ることができる。しかし産業用カロテノイド生産に広く使用される植物はわずかであり、これらの植物におけるカロテノイド合成の生産性は比較的低い。この結果、これらの植物から生成されたカロテノイドは非常に高価である。生合成の生産能力を増加させる１つの方法は、ＤＮＡ組み換え技術を適用することであろう（非特許文献２）。したがって、カロテノイド非生成細菌および酵母においてカロテノイドを生成し、これによって最も適切で効率的な生産者生物の品質、量、選択を制御できるようになると望ましい。後者は、消費者に対する商業的な生産の経済（したがって入手可能性）にとって特に重要である。
【０００５】
構造上、最も一般的なカロテノイドは４０炭素（Ｃ４０）テルペノイドである。しかし一部の種では３０炭素原子だけを有するカロテノイドも検出されている（Ｃ３０。ジアポカロテノイド（ｄｉａｐｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ））。これらのタイプの各カロテノイドの生合成は、イソプレン生合成経路、およびこの経路の五炭素ユニバーサルイソプレン構成ブロック、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）から抽出される。この生合成経路は２つの部分に分割することができる。
１）  上流イソプレン経路ではファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）が形成される。
２）  下流カロテノイド生合成経路はＦＰＰを長鎖Ｃ３０とＣ４０カロテノイド化合物に変換する種々のｃｒｔ遺伝子を含む。この２つの経路部分を図１に示す。
【０００６】
典型的には、フィトエン形成は、Ｃ４０カロテノイドの生合成に特有の最初のステップを表す（図１と図２）。フィトエン自体は無色のカロテノイドで、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼによるＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸塩（ＤＭＡＰＰ）異性化によって生成される。この反応に続いて３回の一連のプレニルトランスフェラーゼ反応が起こり、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が生成される。ＧＧＰＰシンターゼ酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＥは後者の反応に関与する。最後に、ＧＧＰＰ２分子が縮合してフィトエン（ＰＰＰＰ）が生成される。この反応はフィトエンシンターゼ酵素（遺伝子ｃｒｔＢによってコードされる）によって触媒される。
【０００７】
リコペンはフィトエンから生成される第１の「有色の」カロテノイドである。リコペンは、熟したトマトに特有の赤色を与えて、食物着色剤として大きな有用性を有する。またリコペンは、一部の細菌、菌・カビ類、緑色植物における他のカロテノイドの生合成の中間物質である。リコペンは、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）が触媒する、水素８原子を除去することによる４つの連続的な脱水素反応を介して、フィトエンから生合成される。この反応における中間物（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｉｅｓ）はフィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレンである。
【０００８】
リコペンシクラーゼ（ＣｒｔＹ）はリコペンを第２の「有色の」カロテノイドであるβ−カロテンに変換する。β−カロテンは、黄色からオレンジの範囲の色スペクトルを有する典型的なカロテンである。β−カロテンは、マーガリンとバターの着色剤、ビタミンＡ生成の原料、最近では一部の癌に対する潜在的な予防効果を有する化合物としての用途などがある。
【０００９】
β−カロテンは、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる）作用から生じるヒドロキシル化反応によってゼアキサンチンに変換される。たとえば、ゼアキサンチンはトウモロコシの種子に含まれる黄色の色素である。ゼアキサンチンはめんどりや有色のコイの餌に含まれており、これらに色を付けるための重要な色素源である。最後に、ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン−β−モノグルコシドと、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換することができる。この反応はゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＸ遺伝子によってコードされる）によって触媒される。
【００１０】
フィトエン、リコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、ゼアキサンチン−β−グルコシドの生成に係わるカロテノイド生合成遺伝子と酵素以外に、次の反応によって多くの他の機能カロテノイド化合物を生成せしめるＣ４０化合物の分子間変換を可能にする種々の他のｃｒｔ遺伝子が知られている。（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスの任意の組み合わせ。
【００１１】
エンテロバクテリアセアエ属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（これには次の属が含まれるが、これらに限定されるものではない。アルテロコッカス（Ａｌｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルセノホヌス（Ａｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓ）、ブレネリア（Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ）、ブチュネラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、ブドビシア（Ｂｕｄｖｉｃｉａ）、ブチオークセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、セデセア（Ｃｅｄｅｃｅａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エウィンゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、レクレルシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）、レミノレラ（Ｌｅｍｉｎｏｒｅｌｌａ）、モエレレラ（Ｍｏｅｌｌｅｒｅｌｌａ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、オベサムバクテリウム（Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ホトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、プラジア（Ｐｒａｇｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、ラーネラ（Ｒａｈｎｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ソダリス（Ｓｏｄａｌｉｓ）、タツメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）、トラバルシエラ（Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ）、ウィグルスウォルティア（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｈｉａ）、クセノルハブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、イエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ヨケネラ（Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ）の多くは、自然の色素を有するので、これらの生物がカロテノイド生成能を有することを示す。いくつかのレビューがカロテノイド色素生合成の遺伝学を論じている。この中には、Ｇ．アームストロング（Ｇ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）（非特許文献３、非特許文献４）などがある。カロテノイド生合成とＣｒｔＥ、Ｘ、Ｙ、Ｉ、Ｂ、Ｚをコードする遺伝子配列は特にパントエア属でよく研究されてきた。パントエア属はかつてはエルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）に属するものとして知られていたすべての細菌の幅広い群の中に分類される生物の小さな群である（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、およびＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号Ｍ８７２８０、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号Ｄ９００８７、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＹ１６６７１３、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＢ０７６６６２をそれぞれ参照のこと）（以前の大きなエルウィニア属を、エルウィニア属、ペクトバクテリウム属、ブレネリア属新種、パントエア属を含む４つの系統発生的な群への再分類の詳細については非特許文献５を参照のこと）。しかし、既存の文献では、ｃｒｔＥＸＹＩＢＺをコードするがパントエア属に属さないエンテロバクテリアセアエ属の他の生物から遺伝子配列に関する情報はわずかしかない。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，６５６，４７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５５４５，８１６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５３０，１８９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３０，１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４２９，９３９号明細書
【特許文献６】国際公開第０２／０７９３９５  Ａ２号パンフレット
【非特許文献１】ネリス（Ｎｅｌｉｓ）とリーンヘーア（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１−１９１（１９９１）
【非特許文献２】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）とシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｙｈ．５９：１６９−１８１（１９９８）
【非特許文献３】Ｇ．アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６：４７９５−４８０２（１９９４）
【非特許文献４】Ｇ．アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６２９−６５９（１９９７）
【非特許文献５】ハウベン（Ｈａｕｂｅｎ）ら、Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１（３）：３８４−３９７（１９９８年８月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって解決すべき問題は、エンテロバクテリアセアエ属に分類されるがパントエア属には分類されない生物からカロテノイド生合成酵素の全部または一部をコードする核酸配列を同定し、研究を促進してカロテノイド生合成経路の理解を深め、これらの経路を操作するための遺伝子ツールを提供し、適当な宿主内に適当な遺伝子を導入、発現させることによりカロテノイドを大量に合成する手段を提供することである。これは合成方法より優れたカロテノイド生成につながる。
【００１４】
出願者らは、菌株ＤＣ２６０と示される、エンテロバクテリアセアエ属に属する黄色の色素を有する細菌からＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺの酵素をコードするカロテノイド生合成経路内で６つの独自のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を分離することにより、上記の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、リコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、ゼアキサンチン−β−グルコシドを含む種々のカロテノイドの合成に関与することが示されたＤＣ２６０から単離された６つの遺伝子を提供する。この遺伝子は同じオペロン上にクラスタ化されており、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子を含む。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子のＤＮＡ配列は、ＯＲＦ１−６と配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１にそれぞれ対応する。
【００１６】
したがって本発明は、次の構成要素よりなる群から選択されるカロテノイド生合成の酵素をコードする、単離された核酸分子を提供する。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子。
（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子。０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、ついで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して相補的である単離された核酸分子。
【００１７】
さらに本発明は、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、植物内の遺伝子の遺伝子発現に関する適当な調節領域を含む、本発明の遺伝子および遺伝子キメラがコードするポリペプチド、および、これを含む形質転換された宿主を提供する。
【００１８】
同様に、本発明は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺの遺伝子を含んでなる配列番号１８に記載の単離された核酸分子または配列番号１８に対して９５％の同一性をもつ単離された核酸分子であって、単離された核酸分子は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺのすべてのポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
本発明は、カロテノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。この方法は、
（ａ）本発明の核酸分子でゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）本発明の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含む遺伝子フラグメントの配列決定をすることであって、配列決定された遺伝子フラグメントはカロテノイド生合成酵素をコードする、配列決定することを含んでなる。
【００２０】
同様に、本発明は、カロテノイド生合成酵素コードする核酸分子を得る方法を提供する。この方法は、
（ａ）本発明の核酸配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマを合成し、
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマを使用して、クローニングベクターの中に存在する挿入部を増幅することであって、増幅された挿入部は、カロテノイド生合成酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、挿入部を増幅することを含んでなる。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明はカロテノイド化合物を生成せしめる方法を提供する。この方法は、
（ａ）（ｉ）適当なレベルのファルネシルピロリン酸と、
（ｉｉ）適当な調節配列の制御下で本発明によるカロテノイド酵素をコードする核酸分子の組とを含んでなる、形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）適当な増殖条件下でステップ（ａ）の宿主細胞と、有効量の発酵可能な炭素基質を接触させ、これによってカロテノイド化合物を生成せしめることを含んでなる。
【００２２】
たとえば特定の好ましい実施形態では、本発明は、たとえばメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ２４０２）などの増殖能の高いメタン酸化細菌など、Ｃ１代謝宿主中でカロテノイド化合物を生成せしめる方法を提供する。ここでＣ１代謝宿主は、
（ａ）メタンとメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質上で成長し、
（ｂ）ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる、機能エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含んでなる。
【００２３】
さらに本発明は、生物内でのカロテノイド生合成を調節する方法を提供する。この方法は、カロテノイド生合成が生物内で改変されるように、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１よりなる群から選択される少なくとも１種のカロテノイド遺伝子を過剰発現させることを含んでなる。
【００２４】
代替の実施形態では、本発明は、次のステップを含んでなる方法によって生成された、改変された生物活性を有するカロテノイド酵素をコードする、突然変異遺伝子を提供する。このステップは、
（ｉ）ヌクレオチド配列の混合を制限エンドヌクレアーゼで消化するステップであって、この混合は、
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１よりなる群から選択されるカロテノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子と、
ｂ）ステップ（ａ）の前記単離された核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団と、
ｃ）ステップ（ａ）の前記単離された核酸分子とハイブリダイズしないヌクレオチドフラグメントの第２の集団とを含み、これによってこの制限フラグメントの混合物を生成せしめる、消化ステップと、
（ｉｉ）制限フラグメントの前記混合物を変性するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記制限フラグメントの変性した混合物をポリメラーゼ存在下で培養するステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを繰り返すステップであって、改変された生物活性を有するタンパク質をコードする突然変異したカロテノイド遺伝子が生成されるステップとを含んでなる。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１６に記載の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を含む菌株ＤＣ２６０を提供する。
【００２６】
配列と生物学的寄託の説明
本発明は、付随する詳細な説明と、本出願の一部を形成する配列の説明とからより完全に理解されるであろう。
【００２７】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）、および、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯとＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２と４９．５（ａ−ｂｉｓ）、管理指示のセクション２０８と付録Ｃ）に準拠する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のデータに使用する記号とフォーマットは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に述べられた規則に準拠する。
【００２８】
表１に示すように、配列番号１から１２は完全長遺伝子またはタンパク質である。
【００２９】
【表１】
2006528885.tif 000003
【００３０】
配列番号１３から１５と１７は、それぞれ、プライマＨＫ１２、ＪＣＲ１４、ＪＣＲ１５、ＴＥＴ−１  ＦＰ−１をコードするヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１６は、菌株ＤＣ２６０の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を提供する。
【００３２】
配列番号１８は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子をコードする、菌株ＤＣ２６０由来のＤＮＡの６９９９ｂｐフラグメントのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１９はプライマｐＷＥＢ２６０Ｆの核酸配列である。
【００３４】
配列番号２０はプライマｐＷＥＢ２６０Ｒの核酸配列である。
【００３５】
出願者らは、特許手続きのための微生物寄託に関する国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に、次の生物の寄託を行った。
【００３６】
【表２】
2006528885.tif 000004
【００３７】
本明細書では「ＡＴＣＣ」は、米国ＶＡ２０１１０−２２０９、マナサス、ユイバーシティブルーバード１０８０１のＡＴＣＣにあるアメリカンタイプカルチャーコレクション国際寄託当局を指す。「国際デポジトリ指示」はＡＴＣＣに寄託した培養物の登録番号である。
【００３８】
一覧された寄託は、少なくとも３０年この国際デポジトリに維持され、これを開示する特許が許可されると公に利用可能になる。寄託の有効性は、政府の措置によって与えられる特許権の逸脱中に本発明を実行するライセンスとなるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の遺伝子およびその発現産物は、種々のカロテノイド化合物の生成能を有する組み換え生物の作成に有用である。ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺをコードする核酸フラグメントは、菌株ＤＣ２６０から分離され、当業界でよく知られたＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの各アルゴリズムを使用して、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列を含む公的データベースと比較することによって同定された。本発明の遺伝子および遺伝子産物は、カロテノイド化合物の強化または操作のために種々の方法で使用することができる。
【００４０】
これらの化合物を化学的に作成することは非常に難しいため（ネリス（Ｎｅｌｉｓ）とリーンヘーア（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１−１９１（１９９１））、カロテノイド化合物の微生物生産には一般的な実際的な有用性がある。ほとんどのカロテノイドは強い色を有し、天然色素または着色剤とみることができる。さらに、多くのカロテノイドは強力な酸化防止特性を有するので、食物中に化合物を混入することは健康によいと考えられる。よく知られた例はβ−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチンである。さらにカロテノイドは水産養殖で必要な因子である。サケとエビの価値に関して、カロテノイドによる着色は非常に重要なため、サケとエビの水産養殖は本発明の特に有用な応用分野である。（シャヒディ、Ｆ．（Ｓｈａｈｉｄｉ  Ｆ．）とブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、Ｊ．Ａ．、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８（１）：１−６７（１９９８））。最後に、カロテノイドは、ステロイド、着香料、香水、および、電気光学用途の可能性を有する化合物の合成における中間体としての有用性を有する。
【００４１】
次の開示は、ＤＣ２６０からのカロテノイド合成遺伝子の分離、遺伝子工学によるこれらの遺伝子の修飾、大腸菌、細菌、酵母、菌・カビ類、高等植物内でのクローニングと発現に適した適合性のあるプラスミドへこれらの遺伝子を挿入することに関する詳細な説明を提供する。
【００４２】
定義
本開示では、多くの用語と略語を使用する。次の定義を提供する。「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略す。「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略す。「高速液体クロマトグラフィー」はＨＰＬＣと略す。
【００４３】
「イソプレノイド化合物」という用語は、イソプレン（２−メチルブタ−１，３−ジエン：ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２）から形式が抽出された化合物を指す。この骨格は、一般に分子中に繰り返して出現することによって見分けることができる。これらの化合物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）で開始し、イソプレンユニットの頭−尾縮合によって形成され、たとえば、長さがたとえば５、１０、１５、２０、３０、４０炭素長の分子が生成される、イソプレノイド経路を介して生合成によって生成される。
【００４４】
図１に示すように、「カロテノイド生合成経路」という用語は、本発明の上流イソプレノイド経路および／または下流カロテノイド経路のメンバーを含む遺伝子を指す。
【００４５】
「上流イソプレノイド経路」、「上流経路」という用語は相互交換可能に使用され、ピルビン酸塩とグリセリンアルデヒド−３−リン酸をファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に変換することに関与する酵素を指す。これらの酵素は次の遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。「ｄｘｓ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸塩合成酵素をコード）、「ｄｘｒ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸塩レダクトイソメラーゼをコード）、「ｉｓｐＤ」遺伝子；（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジルトランスフェラーゼ酵素をコード。ｙｇｂＰしても知られる）、「ｉｓｐＥ」遺伝子（４−ジホスホシチジル（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｃｙｔｉｄｙｌ）−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼ。ｙｃｈＢとしても知られる）、「ｉｓｐＦ」遺伝子（２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトール２，４−サイクロジフォスフェート（ｃｙｃｌｏｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）合成酵素をコード。ｙｇｂＢとしても知られる）、「ｐｙｒＧ」遺伝子（ＣＴＰ合成酵素をコード）、ジメチルアリル二リン酸の形成に関与する「ｌｙｔＢ」遺伝子、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の合成に関与する「ｇｃｐＥ」遺伝子、「ｉｄｉ」遺伝子（ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸塩への分子内変換を行う）、イソプレノイド経路の「ｉｓｐＡ」遺伝子（ゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシル二リン酸合成酵素をコード）。
【００４６】
「下流カロテノイド生合成経路」と「下流経路」という用語は交換可能に使用され、ＦＰＰを一連のカロテノイドに変換する酵素を指す。これらは、ジアポフィトエン（この合成はＣ３０カロテノイドの生合成に特有の最初の一歩を表す）またはフィトエン（この合成はＣ４０カロテノイドの生合成に特有の最初の一歩を表す）のいずれかの直接合成に関与する遺伝子と遺伝子産物を含む。種々のＣ３０からＣ４０カロテノイドの生成につながるこの後のすべての反応は、下流カロテノイド生合成経路内に含まれる。これらの遺伝子と遺伝子産物はすべての「ｃｒｔ」遺伝子を含み、この中には次の遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ｃｒｔＭ、ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、ｃｒｔＡ、ｃｒｔＣ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＦ、ｃｒｔＵ。最後に、「カロテノイド生合成酵素」はこの経路内の酵素のうち任意の酵素およびすべての酵素を指す。次のような酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＣｒｔＭ、ＣｒｔＮ、ＣｒｔＮ２、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＷ、ＣｒｔＯ、ＣｒｔＡ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤ、ＣｒｔＦ、ＣｒｔＵ。
【００４７】
本出願については、「カロテノイド化合物」という用語は、形式がイソプレンから抽出される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスと定義される。この分子クラスは、トリテルペン（Ｃ３０ジアポカロテノイド（ｄｉａｐｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ））とテトラテルペン（Ｃ４０カロテノイド）、これらの酸化誘導体を含む。またこれらの分子は典型的には強い光吸収性を有し、分子長の範囲はＣ２００を超える場合がある。たとえば、長さがＣ３５、Ｃ５０、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ８０である他の「カロテノイド化合物」が知られている。
【００４８】
「Ｃ３０ジアポカロテノイド（ｄｉａｐｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）」は、イソプレノイドユニットの配置が分子の中央部で逆転しているので、２つの中央のメチル基の位置関係は１，６−、残りの非末端メチル基の位置関係は１，５−になるように結合したイソプレノイド６ユニットからなる。すべてのＣ３０カロテノイドは、次の反応によって、共役二重結合の長い主鎖を有する非環式Ｃ３０Ｈ４２構造から形式的に抽出することができる。（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスの任意の組み合わせ。
【００４９】
「テトラテルペン」または「Ｃ４０カロテノイド」はイソプレノイドユニットの配置が分子の中央部で逆転しているので、２つの中央のメチル基の位置関係は１，６−、残りの非末端メチル基の位置関係は１，５−になるように結合した、イソプレノイド８ユニットからなる。すべてのＣ４０カロテノイドは、共役二重結合の長い主鎖を有する非環式Ｃ４０Ｈ５６構造（次の化学式Ｉ）から（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスの任意の組み合わせによって、形式的に抽出することができる。またこのクラスは、炭素骨格の再配置（化学式Ｉ）、またはこの構造の一部の除去（形式的な）から生じる所定の化合物も含む。
【００５０】
【化１】
2006528885.tif 000005
【００５１】
便宜のためにカロテノイドの化学式はしばしば、次のような（次の化学式ＩＡ）略式で書かれる。
【００５２】
【化２】
2006528885.tif 000006
【００５３】
ここで破線はイソプレノイドユニットへの形式上の分割を示す。
【００５４】
「機能化された」または「機能化」は、カロテノイドバックボーンの任意の部分の（ｉ）水素添加、（ｉｉ）脱水素、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、または（ｖ）エステル化／グリコシル化を指す。このバックボーンは共役二重結合の長い主鎖として定義される。また機能化は、上記のプロセスの任意の組み合わせから生じる場合もある。
【００５５】
「ＣｒｔＥ」という用語は、ｃｒｔＥ遺伝子によってコードされ、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸塩とイソペンテニル二リン酸塩をピロリン酸とゲラニルゲラニル二リン酸に変換するゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素を指す。代表的なｃｒｔＥ遺伝子は配列番号１として提供される。
【００５６】
「ＣｒｔＸ」という用語は、ｃｒｔＸ遺伝子によってコードされ、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換するゼアキサンチングルコシル基トランスフェラーゼ酵素を指す。代表的なｃｒｔＸ遺伝子は配列番号３として提供される。
【００５７】
「ＣｒｔＹ」という用語は、ｃｒｔＹ遺伝子によってコードされ、リコペンをβ−カロテンに変換するリコペンシクラーゼ酵素を指す。代表的なｃｒｔＹ遺伝子は配列番号５として提供される。
【００５８】
「ＣｒｔＩ」という用語は、ｃｒｔＩ遺伝子によってコードされるフィトエンデサチュラーゼ酵素を指す。ＣｒｔＩは、４つの二重結合を導入することによって、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレンの中間物を介してフィトエンをリコペンに変換する。代表的なｃｒｔＩ遺伝子は配列番号７として提供される。
【００５９】
「ＣｒｔＢ」という用語は、ｃｒｔＢ遺伝子によってコードされ、プレフィトエン（ｐｒｅｐｈｙｔｏｅｎｅ）二リン酸からフィトエンへの反応を触媒するフィトエンシンターゼ酵素を指す。代表的なｃｒｔＢ遺伝子は配列番号９として提供される。
【００６０】
「ＣｒｔＺ」という用語は、ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされ、β−カロテンからゼアキサンチンへのヒドロキシル化反応を触媒するβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素を指す。代表的なｃｒｔＺ遺伝子は配列番号１１として提供される。
【００６１】
「エムデン−マイヤーホフ経路」という用語は、グルコースとフルクトースなどのヘキソースを、グリセルアルデヒド３−リン酸、ジオキシアセトンリン酸、ホスフェノールピルビン酸、ピルビン酸などの重要な細胞内３炭素中間物へ変換する一連の生化学反応を指す。典型的には、これらの反応は生化学的に有用なエネルギをＡＴＰの形で純産生する。エムデン−マイヤーホフ経路に特有のキー酵素はホスフォフルクトキナーゼおよびフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼである。
【００６２】
「エントナー−ドウドロフ経路」という用語は、グルコースまたはフルクトースなどのヘキトースを、生化学的に有用なエネルギの純産生なく、重要な３炭素細胞内中間物のピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸へ変換する一連の生化学反応を指す。エントナー−ドウドロフ経路に特有のキー酵素は６−ホスホグルコン酸脱水素酵素と、ケトデオキシホスフォグルコン酸アルドラーゼ（ｋｅｔｏｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ）である。
【００６３】
「Ｃ１炭素基質」または「単一炭素基質」という用語は、炭素−炭素結合を欠く任意の炭素含有分子を指す。例としては、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、蟻酸塩、メチル化アミン（たとえば、モノ−、ジ−、トリ−メチルアミン）、メチル化チオール、二酸化炭素である。
【００６４】
「Ｃ１メタボライザ」という用語は、単一炭素基質をエネルギとバイオマスの唯一の源として使用する機能を有する微生物を指す。典型的には、Ｃ１メタボライザは典型的にはメチロトローフおよび／またはメタノトローフである。
【００６５】
「メチロトローフ」という用語は、炭素−炭素結合を含まない有機化合物を酸化させることができる生物を意味する。メチロトローフがＣＨ４を酸化することができる場合、メタノトローフとも呼ばれる。
【００６６】
「メタノトローフ」または「メタノトローフ細菌」という用語は、主要な炭素源とエネルギ源としてメタンを使用することができる原核生物を意味する。メタンから二酸化炭素への完全酸化は好気的分解経路によって生じる。本発明に役立つメタノトローフの例は、メチロモナス、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）を含む（これらに限定されるものではない）。
【００６７】
「高増殖能メタノトローフ菌株」という用語は、メタンまたはメタノールを唯一の炭素源およびエネルギ源として成長し、機能エムデン−マイヤーホフ炭素流束経路を有して、代謝されるＣ１基質１グラムについて、高い増殖率を有し多くの細胞量を生成せしめることのできる細菌を指す。本明細書に記述する特定の「高増殖能メタノトローフ菌株」は、「メチロモナス１６ａ」「１６ａ」または、「メチロモナスｓｐ．１６ａ」と呼ばれる。これらの用語は交換可能に使用され、メチロモナスｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）菌株（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）を指す。
【００６８】
メチロモナスの「ｃｒｔ遺伝子クラスタ」という用語は、メチロモナス１６ａの自然のＣ３０カロテノイド生合成経路内で活性を有する、ｃｒｔＮ１、ａｌｄ、ｃｒｔＮ２を含むオープンリーディングフレームを指す。
【００６９】
「ＣｒｔＮ１」という用語は、メチロモナス１６ａの自然のカロテノイド生合成経路内で活性を有する、ｃｒｔＮ１遺伝子によってコードされた酵素を指す。本遺伝子は、メチロモナスのｃｒｔ遺伝子クラスタに位置する第１の遺伝子である。
【００７０】
「ＡＬＤ」という用語は、メチロモナス１６ａの自然のカロテノイド生合成経路内で活性を有する、ａｌｄ遺伝子によってコードされた酵素を指す。この遺伝子は、メチロモナスのｃｒｔ遺伝子クラスタに位置する第２の遺伝子である。
【００７１】
「ＣｒｔＮ２」という用語は、メチロモナス１６ａの自然のカロテノイド生合成経路内で活性を有する、ｃｒｔＮ２遺伝子によってコードされた酵素を指す。この遺伝子は、メチロモナスのｃｒｔ遺伝子クラスタに位置する第３の遺伝子である。
【００７２】
「ＣｒｔＮ３」という用語は、ｃｒｔＮ３遺伝子によってコードされ、メチロモナス１６ａの中の自然のカロテノイド生合成に影響を与える。この遺伝子はｃｒｔ遺伝子クラスタ内にはない。代わりに、この遺伝子は、メチロモナスゲノム（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）内の異なる遺伝子座の中にある。
【００７３】
「色素なし」または「白い変異株」、または「無色素の菌株」という用語は、自然のピンクの色素（例えばＣ３０カロテノイド）が生成されないメチロモナス１６ａ細菌を指す。したがって、細菌細胞はピンクではなく白く見える。メチロモナス１６ａの白い変異株は、自然のＣ３０カロテノイド遺伝子の全部または一部を欠失することによって操作させたものである。たとえばメチロモナス１６ａにおいて、ａｌｄ／ｃｒｔＮ１遺伝子、または、自然のｃｒｔ遺伝子クラスタのプロモータのいずれかを分裂すると、Ｃ４０カロテノイド生成により適した無色素の（「白い」）変異株が生成される（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。
【００７４】
「メチロモナス１６ａＭＷＭ１０００」または「ＭＷＭ１０００」という用語は、メチロモナス１６ａの自然なａｌｄ遺伝子とｃｒｔＮ１遺伝子の一部を欠失することにより作成された無色素のメタノトローフ菌株を指す（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。欠失により、ＭＷＭ１０００の中のＣ３０カロテノイド生成が分裂された。ａｌｄ／ｃｒｔＮ１欠失は「Δａｌｄ／ｃｒｔＮ１」として示す。
【００７５】
本明細書では「単離された核酸分子」は単一鎖または二重鎖構造のＲＮＡあるいはＤＮＡのポリマであり、場合により、合成、非自然、または改変ヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡポリマの形態の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントを含んでいてもよい。
【００７６】
核酸分子の単一鎖形式が、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で別の核酸分子とアニールできる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡの分子などの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件はよく知られており、その例は、サムブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ  Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．）、マニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８９）の特に第１１章と表１１．１（今後「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」と呼ぶ）にある。温度とイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシーの程度」を決定する。ストリンジェンシーな条件を調節して、適度な類似性を有するフラグメント（近縁性の薄い生物由来の相同配列など）から、類似性の高いフラグメント（近縁生物種由来の機能酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を測定する。好ましい条件の組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間で開始し、ついで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃で３０分繰り返し、ついで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分２回繰り返す一連の洗浄を使用する。さらに好ましいストリンジェンシー条件の組ではより高い温度を使用する。ここで洗浄条件は上記と同じであるが、最後の２回の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ内の３０分の洗浄温度を６０度に上げることだけが異なる。高度なストリンジェンシー条件の別の好ましい組は、最後の２回の洗浄を０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ  ６５℃で行う。別のストリンジェンシー条件の組の例は、たとえば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、ついで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを行う。
【００７７】
ハイブリダイゼーションでは、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に依存して、塩基間のミスマッチも可能である。核酸ハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシー条件は、核酸の長さと相補性の程度に依存し、この変数は当業界ではよく知られている。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さで１００ヌクレオチド長を越えるハイブリッドについては、Ｔｍを計算する等式が導出されている（上記のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さが特異性を決定する（上記マニアティス１１．７−１１．８を参照）。１実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、もっとも好ましくは、少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者であれば、プローブの長さなどの因子にしたがって、必要に応じて温度と洗浄溶液の塩濃度を調節できることが理解されるであろう。
【００７８】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、ポリペプチドのアミノ酸配列を十分含む部分か、または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含む部分であって、当業者によって配列を手動で評価するか、またはＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアライメントサーチツール。アルチュール  Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用するコンピュータで自動化された配列比較と同定によって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定で同定できる部分である。一般に、ポリペプチド配列または核酸配列と知られたタンパク質または遺伝子の相同性を推定で同定するためには、１０以上の隣接するアミノ酸配列、または、３０以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０から３０の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、配列に依存した遺伝子同定の方法（たとえばサザンハイブリダイゼーション）と分離の方法（たとえば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用することができる。さらに、プライマを含む特定の核酸フラグメントを得るために、１２から１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲの増幅プライマとして使用することができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定および／または分離するための十分な配列を含む。本明細書は、１つまたは複数の特定の微生物タンパク質をコードする、部分的または完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告する配列の利点を有する当業者であれば、当業界で知られた目的のために、開示された配列の全部または実質的な部分を使用することができる。従って本発明は、付随する配列リストに報告される完全な配列、および、上記の配列の実質的な部分を含む。
【００７９】
「相補的な」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用する。たとえばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって本発明は、付随する配列リストに報告される完全な配列、および、実質的に同様な核酸配列に対して相補的な、単離された核酸フラグメントを含む。
【００８０】
「パーセント同一性」という用語は、当業界で知られているように、２つ以上のポリペプチド配列、または、２つ以上のポリヌクレオチド配列を配列比較して決定した関係を示す。当業界では、「同一性」という用語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列の列の間を一致させることによって決定される場合など、配列間の関係性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、知られた方法によって容易に計算できる。知られた方法には、次の文献に記述される方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。
１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｔｙ（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ニューヨーク（１９８８）、２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ニューヨーク（１９９３）、３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ：ニュージャージー（１９９４）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（フォン・ハインジ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ），Ｅ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）、５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ニューヨーク（１９９１）。同一性を決定する好ましい方法は、配列を検査した配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性と類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラム内に体系化されている。配列アライメントとパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）のメグアラインプログラム（Ｍｅｇａｌｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して行なうことができる。配列のマルチアライメントは、クラスタルアライメント法（Ｃｌｕｓｔａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）とシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９））でデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を使用して行われる。クラスタル方法を使用したペアワイズアライメントのデフォルトパラメータは次のとおりである。ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【００８１】
適当な核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書に報告されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性をもつポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されたアミノ酸配列に対して約８５％の同一性をもつアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の同一性をもつアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本明細書に報告されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の同一性をもつアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントである。適当な核酸フラグメントは上記の相同性を有するだけでなく、典型的には、少なくとも５０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００のアミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも２５０のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８２】
「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えないで、ヌクレオチド配列の変化が可能である遺伝コードの性質を指す。したがって本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２に記載の本発明の微生物ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全部または実質的な部分をコードする任意の核酸フラグメントに関する。当業者であれば、所与のアミノ酸を指定するために特定の宿主細胞がヌクレオチドコドンの使用において示す「コドン−バイアス」を熟知しているであろう。したがって、宿主細胞中の発現を改善するために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【００８３】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学合成によってオリゴヌクレオチド構成ブロックから組み立てることができる。これらの構成ブロックをライゲート、アニールして遺伝子セグメントを形成し、ついで酵素で組み立てて全遺伝子を構成する。ＤＮＡ配列に関して「化学合成された」という用語は、構成要素のヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み合わせられたことを意味する。ＤＮＡの手動の化学合成はよく確立された手順を使用して行ってもよいし、または、いくつかの市販の機械のうち１つを使用して自動化学合成を行ってもよい。したがって遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、遺伝子発現を最適にするために調節することができる。当業者であれば、コドンの使用を宿主が好むコドンにバイアスすると、遺伝子発現が成功する可能性が高くなることを理解されるであろう。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能な宿主細胞由来の遺伝子に関する調査に基づいていてもよい。
【００８４】
「遺伝子」は、コード配列前の調節配列（５’非コード配列）と、コード配列後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「自然の遺伝子」はそれ自体の調節配列を備えた自然に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然の遺伝子ではない遺伝子を指し、自然界では共には存在しない調節配列とコード配列を含む。したがってキメラ遺伝子は、異なる源由来の調節配列とコード配列、または同じ源由来であるが自然とは異なる方法で配置された調節配列とコード配列を含んでいてもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムの自然な位置にある自然の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物には通常存在しないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、自然ではない生物またはキメラ遺伝子に挿入された自然の遺伝子を含んでいてもよい。「トランス遺伝子」は形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００８５】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適当な調節配列」はコード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列の中、コード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたはＲＮＡの安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモータ、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクタ結合部位、ステム−ループ構造を含んでいてもよい。
【００８６】
「プロモータ」は、コード配列か機能ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモータ配列の３’側に位置する。プロモータは自然の遺伝子から全体として抽出することもできるし、または、自然に存在する異なるプロモータ由来の異なる要素を含む場合もあるし、合成ＤＮＡセグメントを含む場合もある。当業者であれば、異なるプロモータは、異なる組織または細胞タイプ、または異なる発達段階、または異なる環境状態または生理状態に応答して遺伝子の発現を指令することが理解されるであろう。ほとんどの時にほとんどのタイプの細胞で遺伝子を発現するプロモータは一般に「構成プロモータ」と呼ばれる。さらにほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントでも同一のプロモータ活性を有する場合があることが認識されるであろう。
【００８７】
「３’非コード配列」という用語は、コード配列の下流に位置し、ポリアデニル化認識配列、および、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることのできる調節シグナルをコードするその他の配列を含む、ＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化シグナル（通常真核生物に限定される）は通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’側に対するポリアデニル酸断片の付加に影響を与えるという特徴を有する。
【００８８】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒された転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合には一次転写物と呼ばれ、一次転写物の転写後プロセシングから導出されたＲＮＡ配列である場合は成熟ＲＮＡと呼ばれる場合もある。「メッセンジャーＲＮＡ」すなわち「ｍＲＮＡ」は、イントロンを含まず、細胞によってタンパク質に翻訳されるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに対して相補的でありｍＲＮＡから導出される二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、したがって細胞によってタンパク質に翻訳されるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、ターゲット一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的で、ターゲット遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の任意の部分、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、コード配列のいずれかに対する相補性であってよい。「機能ＲＮＡ」という用語は、翻訳されていないが細胞プロセスに影響を有する、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または他のＲＮＡを指す。
【００８９】
「操作可能に結合させる」という用語は、一つの核酸配列の機能が他方によって影響される単一の核酸フラグメント上の核酸配列の連合を指す。たとえばプロモータがコード配列の発現に影響を与えることができる場合、プロモータはコード配列と操作可能に結合されている（すなわちコード配列はプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列と操作可能に結合させることができる。
【００９０】
本明細書で使用される「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す場合もある。
【００９１】
「成熟した」タンパク質という用語は、翻訳後プロセシングを受けたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物に存在するプレペプチドまたはプロペプチドが除去されたポリペプチドを指す。「前駆」タンパク質という用語は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、すなわち、プレペプチドまたはプロペプチドがまだ存在するものを指す。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在シグナルであってもよい（これに限定されるものではない）。
【００９２】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌された成熟タンパク質の前方にあるアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは成熟タンパク質から開裂されるので、成熟タンパク質には存在しない。シグナルペプチドは、細胞膜を介して分泌されるタンパク質の方向を指示し移動させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナルタンパク質とも呼ばれる。
【００９３】
「共役」は、ＤＮＡ（たとえば細菌プラスミドからの）の一方向の転移が、ある細菌細胞（すなわち「ドナー」）から別の細菌細胞（すなわち「レシピエント」）に起きる、特定のタイプの変換を指す。このプロセスは、細胞間の直接の接触を含む。共役を促進するために別の細菌細胞（すなわち「へルパー」）が存在する場合もある。
【００９４】
「形質転換」は、宿主生物のゲノムへ核酸フラグメントが導入され、この結果遺伝的に安定な形質が生じることを指す。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「遺伝子組み換え」、「組み換え」、または「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００９５】
「プラスミド」、「ベクター」、「カセット」という用語は、余分の染色体要素を指す。これらはしばしば細胞の中心的な代謝の一部とはなっておらず、通常は環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態の遺伝子を担持する。このような要素は、自己複製配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線形または環状の要素であって、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、任意の源に由来する。この中でいくつかのヌクレオチド配列が、適当な３’非翻訳配列と共に、選択される遺伝子産物のプロモータフラグメントとＤＮＡ配列を細胞に導入できる独特な構成に結合または組み替えられている。「形質転換カセット」という用語は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」という用語は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主内の遺伝子の発現を強化する要素を有する特定のベクターを指す。
【００９６】
「改変された生物活性」という用語は、アッセイ法で測定できるヌクレオチド配列がコードするタンパク質と関連し、自然の配列と関連する活性より大きいかまたは小さい活性を指す。「強化された生物活性」という用語は、自然な配列に関連する活性よりも大きな、改変された活性を指す。「減弱された生物活性」という用語は、自然な配列に関連する活性よりも小さな、改変された活性を指す。
【００９７】
「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は市販されている場合もあるし独立して開発する場合もある。典型的な配列解析ソフトウェアには次のようなソフトウェアが含まれるが、これらに限定されるものではない。１．）ＧＣＧスィートプログラム（ウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン９．０、ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、マディソン、ウィスコンシン州）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ；（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）、４．）スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２年、１１１−２０、編集者、スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク、ニューヨーク州）、５．）ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ＮＴＩバージョン７．０プログラム（インフォーマックス社（Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．）、ベテスダ、メリーランド州）。本出願の内容においては、配列解析ソフトウェアを解析に使用する場合、別段の記載のない限り、解析の結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づいていることを理解されたい。本明細書では、「デフォルト値」は、最初に初期化されたときにソフトウェアと共にロードされた任意の値またはパラメータの組を意味する（製造業者によって設定される）。
【００９８】
本明細書で使用する標準組み換えＤＮＡと分子クローニング技術は、当業界で知られており、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上記）、および、シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．、エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．のＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）  ニューヨーク（１９８４）、および、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）に記述されている。
【００９９】
カロテノイド生成に関与する遺伝子
カロテノイド化合物の生合成に関与する酵素経路は、利便のために２つの部分に分けて見ることができる。この２つの部分は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸をファルネシルピロリン酸に変換する上流イソプレノイド経路と、ジアポフィトエンまたはフィトエンおよびこの後に生成されるすべてのカロテノイドを合成する下流カロテノイド生合成経路である（図１）。上流経路は多くの微生物に普遍的であり、これらの場合、所望のカロテノイドを生合成するためには下流経路を含む遺伝子を導入するだけでよい。２つの経路間の分割は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の合成に関する。ＦＰＰが自然に存在する場合、下流カロテノイド経路の要素だけが必要となる。しかし、下流経路カロテノイド遺伝子が有効にカロテノイド生成せしめるためには、宿主細胞が細胞内に適当なレベルのＦＰＰを有する必要があることを理解されたい。宿主細胞がＦＰＰ合成を提供しない場合、ＦＰＰ生成に必要な遺伝子を導入することが必要となる。次にこれらの経路の各々を詳細に論じる。
【０１００】
上流イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、２つの経路のいずれかを介して行われ、共通に、Ｃ５イソプレンサブユニット、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成せしめる。まず、よく知られたアセテート／メバロン酸経路によってＩＰＰが合成される。しかし、最近の研究で、メバロン酸依存経路がすべての生体系中で機能するわけではないことが実証された。ＩＰＰ生合成のための代替の非メバロン酸経路が、細菌、緑藻類、高等植物において同定されている（ホルバッハ（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５−１４０（１９９３）。ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７−５２４（１９９３）。シュウェンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３−８０（１９９６）。アイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６４３１−６４３６（１９９６））。
【０１０１】
メバロン酸イソプレノイド経路の多くのステップが知られている（図１）。たとえば、ＩＰＰ生成につながる代替の経路の最初のステップは、コール（Ｃｏｌｅ）らが結核菌で研究した（Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：５３７−５４４（１９９８））。経路の最初のステップは、２つの３炭素分子（ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）を縮合し、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として知られる５炭素化合物を産出することを含む。この反応は、ｄｘｓ遺伝子がコードするＤｘｓ酵素によって起きる。次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化と還元により、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸が生成される。異性化と還元過程に関与する酵素のうちの１つは、遺伝子ｄｘｒがコードするＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｄｘｒ）である。ついで２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸は、まだアノテートされていない遺伝子ｙｇｂＰがコードする酵素によるＣＴＰ依存反応において、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに変換される（コール（Ｃｏｌｅ）ら、上記）。しかし最近、ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスタの一部としてｉｓｐＤと名前を変更した（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｑ４６８９３）。
【０１０２】
次に、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの２位の水酸基が、ｙｃｈＢ遺伝子がコードする酵素によるＡＴＰ依存反応でリン酸化される。この産物は４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールをリン酸化し、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸が生じる。ｙｃｈＢ遺伝子も、ｉｓｐ遺伝子クラスタの一部としてｉｓｐＥと名前を変更した（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｐ２４２０９）。最後に、ｙｇｂＢ遺伝子の産物は４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸を、ＣＴＰ依存的に２Ｃ−メチル−Ｄエリスリトール２，４−シクロジホスフェートに変換する。この遺伝子も最近名前が変わっており、ｉｓｐ遺伝子クラスタに属する。具体的には、ｙｇｂＢ遺伝子の新しい名前はｉｓｐＦである（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｐ３６６６３）。ｐｙｒＧ遺伝子の産物はＣＴＰ合成酵素としてこれらの反応において重要である。
【０１０３】
ｌｙｔＢ遺伝子とｇｃｐＥ遺伝子（おそらく他にも遺伝子はある）がコードする酵素は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の形成につながる反応に関与すると考えられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子がコードするＩＰＰイソメラーゼによってＤＭＡＰＰに異性化される。しかしこの酵素は生存にとって不可欠なわけではなく、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路を使用する一部の細菌には存在しない場合もある。最近の証左は、ＭＥＰ経路がＩＰＰの前に分岐し、ｌｙｔＢ遺伝子産物を介して別々にＩＰＰとＤＭＡＰＰを生成せしめることを示唆する。ＩＰＰとＤＭＡＰＰの両方を補充した培地以外では、大腸菌にとってｌｙｔＢノックアウト突然変異は致死的である。
【０１０４】
ＦＰＰ合成は、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）へのＩＰＰの異性化を介して行われる。この反応についで、ｉｓｐＡが触媒する２つのプレニルトランスフェラーゼ反応が続いて置き、この結果、それぞれ、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ。１０炭素分子）とファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ。１５炭素分子）が生成される。
【０１０５】
下流カロテノイド生合成経路
上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド経路の間の区分は、いくぶん主観的である。ＦＰＰ合成がカロテノイド生成細菌と非生成細菌の間で共通なので、出願者は、下流カロテノイド生合成経路の第１のステップは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）変換経路が２つに分岐し、それぞれＣ３０ジアポカロテノイドかＣ４０カロテノイドのいずれかが形成される分岐点から開始すると考えている。
【０１０６】
Ｃ４０経路内では、生合成経路の第一歩は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をＩＰＰの付加によってゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）として知られる２０炭素分子に変換するプレニルトランスフェラーゼ反応で始まる。ＧＧＰＰ合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＥ（ＥＣ  ２．５．１．２９）が、プレニルトランスフェラーゼ反応に関与する。ついで、ＧＧＰＰの２分子の縮合反応によりフィトエンが形成される（７、８、１１、１２、７’、８’、１１’１２’−ω―オクタヒドロ−ω，ω−カロテン、またはＰＰＰＰ）。これは下流カロテノイド生合成経路の最初の４０炭素分子である。この酵素反応はＣｒｔＢ（フィトエンシンターゼ酵素ＥＣ  ２．５．１−）によって触媒される。
【０１０７】
化合物フィトエンから、これに続く水素添加、脱水素、環化、酸化、またはこれらのプロセスの任意の組み合わせにより、一連のＣ４０カロテノイドが生成される。たとえばリコペンは「赤色」のスペクトルを与えるが、ｃｒｔＩ遺伝子（フィトエンデサチュラーゼをコード）が触媒する水素８原子の除去による４つの連続的な脱水素反応を介してフィトエンから生成される（図２を参照）。リコペンシクラーゼ（ＣｒｔＹ）はリコペンをβ−カロテン（β，β−カロテン）に変換する。β−カロテンは、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ遺伝子がコード）の活性から生じるヒドロキシル化反応を介してゼアキサンチン（（３Ｒ，３’Ｒ）β，β−カロテン−３，３’−ジオール）に変換される。ゼアキサンチンは、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．−。ｃｒｔＸ遺伝子によってコード）によってゼアキサンチン−β−グルコシドに変換される。
【０１０８】
組み合わせると、フィトエン、リコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、ゼアキサンチン−β−グルコシドの生成に使用されるｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの遺伝子に加えて、直鎖Ｃ４０化合物の分子内変換を可能にし、他の多くの機能カロテノイド化合物を生成できる種々のｃｒｔ遺伝子が知られている。当業者であれば公的に使用可能な文献（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）など）、特許文献、カロテノイド生成能を有する微生物の実験分析によって、種々の他のｃｒｔ遺伝子を同定することができるであろう。例としては次のとおりである。
・  β−カロテンは、ｃｒｔＷ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＦ２１８４１５、Ｄ４５８８１、Ｄ５８４２０、Ｄ５８４２２、Ｘ８６７８２、Ｙ１５１１２）、ｃｒｔＯ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号Ｘ８６７８２、Ｙ１５１１２）またはｂｋｔがコードするβ−カロテンケトラーゼによってカンタキサンチンに変換される。エキネノンはこの反応における中間生成物である。
・  カンタキサンチンは、ｃｒｔＺ遺伝子がコードするβ−カロテンヒドロキシラーゼによってアスタキサンチンに変換される。アドニルビンはこの反応における中間生成物である。
・  ゼアキサンチンは、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、または、ｂｋｔがコードするβ−カロテンケトラーゼによってアスタキサンチンに変換される。アドニキサンチンはこの反応における中間生成物である。
・  スフェロイデンは、ｃｒｔＡ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＪ０１０３０２、Ｚ１１１６５、Ｘ５２２９１）がコードするスフェロイデンモノオキシゲナーゼによってスフェロイデノンに変換される。
・  ｃｒｔＣ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＢ０３４７０４、ＡＦ１９５１２２、ＡＪ０１０３０２、ＡＦ２８７４８０、Ｕ７３９４４、Ｘ５２２９１、Ｚ１１１６５、Ｚ２１９５５）、ｃｒｔＤ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＪ０１０３０２、Ｘ６３２０４、Ｕ７３９４４、Ｘ５２２９１、Ｚ１１１６５）、ｃｒｔＦ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＢ０３４７０４、ＡＦ２８８６０２、ＡＪ０１０３０２、Ｘ５２２９１、Ｚ１１１６５）の各遺伝子がそれぞれコードする、ヒドロキシニューロスポレンシンターゼ、メトキシニューロスポレンデサチュラーゼ、ヒドロキシニューロスポレン−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの一連の作用により、ニューロスポレンはスフェロイデンに変換され、リコペンはスピリロキサンチンに変換される。
・  β−カロテンは、ｃｒｔＵ（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＦ０４７４９０、ＡＦ１２１９４７、ＡＦ１３９９１６、ＡＦ１９５５０７、ＡＦ２７２７３７、ＡＦ３７２６１７、ＡＪ１３３７２４、ＡＪ２２４６８３、Ｄ２６０９５、Ｕ３８５５０、Ｘ８９８９７、およびＹ１５１１５）がコードするβ−カロテンデサチュラーゼによってイソレニエラテンに変換される。
【０１０９】
これらの例は限定的なものではなく、このＣ４０下流カロテノイド生合成経路内には他の多くのカロテノイド遺伝子と遺伝子産物が存在する。したがって、十分なＦＰＰ源が宿主生物で使用可能であれば、ｃｒｔＥ  ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子を種々に組み合わせ、さらに場合により、植物、動物、および／または、細菌などの源から単離された任意の他の知られたｃｒｔ遺伝子と共に使用し、本発明の方法を使用することにより、無数の異なるカロテノイドとカロテノイド誘導体を生成せしめることができる。
【０１１０】
本発明の有用な産物は本明細書に定義する任意のカロテノイド化合物を含むことを意図するが、これらに限定されるものではない。化合物の例は、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、イプシロン−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、ラクチュカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シフォナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン。さらに本発明は、水酸基−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒドの各官能基、または、配糖体エステルあるいは硫酸塩を作成するためのこれらの分子の誘導体化も含む。菌株ＤＣ２６０カロテノイド生合成遺伝子と酵素の配列同定。
【０１１１】
種々のヌクレオチド配列は、Ｃ４０下流カロテノイド経路に含まれる遺伝子産物をコードする菌株ＤＣ２６０から分離されたものである。たとえばＯＲＦ１−６は下流カロテノイド生合成経路において、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子をコードし（図１および図２を参照）、これらの酵素産物は色素を有するカロテノイドであるリコペン、β−カロテン、ゼアキサンチン、ゼアキサンチン−β−グルコシドの生成につながる。
【０１１２】
本明細書では、菌株ＤＣ２６０から単離された遺伝子の全セット（ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺ）は、単一の配列（配列番号１８）として開示する。この遺伝子クラスタをベクターに導入し、微生物宿主の中で発現させてカロテノイド化合物の生成を行った。当業者であれば、すべてのコードされたポリペプチドが発現され、酵素活性を有するのであれば、遺伝子クラスタの有用性に影響を与えることなく、核酸のわずかな置換、付加、欠失（特定の宿主細胞発現のための好ましいコドンの置換など）が可能であることを理解されるであろう。したがって、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの遺伝子、または、少なくとも配列番号１８と９５％の同一性をもつ単離された核酸分子を含む、配列番号１８に指定される単離された核酸分子を提供することも本発明の範囲内である。ここで単離された核酸分子は、ポリペプチドｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺをすべてコードする。
【０１１３】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、上記）を使用して、ｃｒｔＥヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ１）を公的データベースと比較すると、もっとも類似性の高い知られた配列は、３０１アミノ酸長に渡って本明細書に報告されたＣｒｔＥアミノ酸配列との間で約５４％の同一性をもつことが明らかになる。より好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に開示された配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。同様に、本発明のＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＥコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、本明細書に記すｃｒｔＥの核酸配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。
【０１１４】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン、上記）を使用して、ｃｒｔＸヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ２）を公的データベースと比較すると、もっとも類似性の高い知られた配列は４２５アミノ酸長に渡って、本明細書に記載するＣｒｔＸのアミノ酸配列に対して約５２％の同一性をもつことが明らかになる。より好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に記す配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。同様に、本発明のＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＸコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、本明細書に記すｃｒｔＸの核酸配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。
【０１１５】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン、上記）を使用してｃｒｔＹヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ３）を公的データベースと比較すると、もっとも類似性の高い知られた配列は、３８８アミノ酸長に渡って、本明細書に記載するＣｒｔＹのアミノ酸配列に対して約５３％の同一性をもつことが明らかになる。より好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に記す配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。同様に、本発明のＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＹコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、本明細書に記すｃｒｔＹの核酸配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。
【０１１６】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン、上記）を使用して、ｃｒｔＩヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ４）を公的データベースと比較すると、もっとも類似性の高い知られた配列は、４９３アミノ酸長に渡って、本明細書に記載するＣｒｔＩのアミノ酸配列に対して約７７％の同一性をもつことが明らかになる。より好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に記す配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。同様に、本発明のＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＩコード核酸配列は活性タンパク質をコードするものであり、本明細書に記すｃｒｔＩの核酸配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。
【０１１７】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン、上記）を使用してｃｒｔＢヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ５）を公的データベースと比較すると、もっとも類似性の高い知られた配列は、３０９アミノ酸長に渡って、本明細書に記載するＣｒｔＢのアミノ酸配列に対して約６０％の同一性をもつことが明らかになる。より好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に記す配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。同様に、本発明のＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、本明細書に記すｃｒｔＢの核酸配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。
【０１１８】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン、上記）を使用して、ｃｒｔＺヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ６）を公的データベースと比較すると、もっとも類似性の高い知られた配列は、１７７アミノ酸長に渡って、本明細書に記載するＣｒｔＺのアミノ酸配列に対して約６６％の同一性をもつことが明らかになった。より好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に記す配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。同様に、本発明のＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＺコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、本明細書に記すｃｒｔＺ核酸配列に対して少なくとも約７０％から８０％の同一性を有し、８５％から９０％の同一性をもつ配列が特に適しており、約９５％の同一性をもつ配列がもっとも好ましい。
【０１１９】
ホモログの分離
本発明のＣ４０下流カロテノイド生合成経路の各核酸フラグメントを使用し、同じ微生物種（または植物種）または別の微生物種（または植物種）から相同タンパク質をコードする遺伝子を分離することができる。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の分離は当業界で知られている。配列依存プロトコルの例としては次のようなものが含まれるが、これらに限定するものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法。２．）ＤＮＡとＲＮＡの増幅法。この例は、種々の各核酸増幅技術を使用する方法である（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号明細書、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら）。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２／１０７４（１９８５））、タボール  Ｓ．（Ｔａｂｏｒ、Ｓ．）ら）。またはストランド置換増幅（ＳＤＡ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３９２（１９９２））、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら）。３．）ライブラリの構成と相補性によるスクリーニング法。
【０１２０】
たとえば、本明細書に記述されるＣ４０下流カロテノイド生合成経路と同様なタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明の核酸フラグメントの全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業界でよく知られた方法を使用して任意の所望の細菌からライブラリをスクリーニングすることで直接分離できる（Ｃ４０カロテノイド生成細菌が好ましい）。本発明の核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当業界で知られた方法によって設計および合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）。さらに、全配列を直接使用し、当業界で知られた方法（たとえばランダムプライマＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術）によってＤＮＡプローブを合成することもできるし、使用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成することができる。さらに、本発明の配列の一部（または全長）を増幅するために、特異的プライマを設計、使用することもできる。この結果得られる増幅産物は増幅反応中に直接標識するかまたは増幅反応後に標識し、適当なストリンジェンシーな条件の下で完全長ＤＮＡフラグメントを分離するプローブとして使用することができる。
【０１２１】
典型的には、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマは異なる配列を有し、互いに相補的ではない。所望の実験条件に依存して、プライマ配列は効率よく、またターゲット核酸を忠実に複製するように設計すべきである。ＰＣＲプライマ設計の方法は一般的で、当業界で知られている（タイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ中、Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）ｐ３３−５０  ＩＲＬ。ヘーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）ＶＡ、およびリクリク（Ｒｙｃｈｌｉｋ）Ｗ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）Ｂ．Ａ．（編）（１９９３）Ｖｏｌ．１５、ｐ３１−３９  ＰＣＲプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｕｍａｎｉａ：トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）  ニュージャージー州）。
【０１２２】
一般に、本発明の配列の２本の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードする長い核酸フラグメントを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は、クローニングされた核酸フラグメントのライブラリについても行うことができる。ここで１本のプライマ配列は本発明の核酸フラグメントに由来し、他のプライマ配列は、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端にポリアデニル酸断片の存在を利用する。
【０１２３】
別法としては、第２のプライマ配列はクローニングベクター由来の配列に基づいていてもよい。たとえば当業者であればＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８５：８９９８（１９９８））によりＰＣＲを使用して転写物の単一のポイントと３’末端または５’末端の間の領域のコピーを増幅することによりｃＤＮＡを生成せしめることができる。本発明の配列から、３’末端方向および５’末端方向のプライマが設計できる。市販の３’ＲＡＣＥシステムまたは５’ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ、ガイザースバーグ、メリーランド州）を使用して、特異的な３’ｃＤＮＡフラグメントまたは５’ｃＤＮＡフラグメントを分離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）。ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【０１２４】
別法としては、本発明のＣ４０下流カロテノイド生合成経路の配列は、ホモログ同定用のハイブリダイゼーション試薬として使用することができる。核酸ハイブリダイゼーション実験の基本的な構成要素は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子フラグメントを含むと考えられているサンプル、特定のハイブリダイゼーション法を含む。本発明のプローブは、典型的には、検出する核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出すべき核酸配列に「ハイブリダイズ」することができる。プローブ長は５塩基から数万塩基に渡り、行う特定の実験に依存する。典型的には、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適切である。検出する拡散シーケンスに対して相補的な部分はプローブ分子の一部だけであってよい。さらに、プローブとターゲット配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは相補性が不完全な分子間でも起きるので、この結果、ハイブリダイズされた領域の中の塩基の所定の部分は正しい相補的塩基と対にならない。
【０１２５】
ハイブリダイゼーション法はよく定義されている。典型的には、プローブとサンプルは核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件下で混合しなければならない。これには、プローブとサンプルを、適当な濃度と温度条件の下で、無機塩または有機塩の存在下で接触させることが含まれる。プローブとサンプルの核酸は十分に長く接触させ、プローブとサンプルの核酸の間のハイブリダイゼーションが起きるようにしなくてはならない。混合物中のプローブまたはターゲットの濃度により、ハイブリダイゼーションが起きるために必要な時間が決定される。プローブまたはターゲットの濃度が高ければ、必要なハイブリダイゼーション培養時間は短い。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤はヌクレアーゼ活性を抑制することによって核酸を安定化する。さらにカオトロピック剤を使用すると、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブを感度の高いストリンジェンシーな条件でハイブリダイズすることが可能になる（ヴァン  ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）とチェン（Ｃｈｅｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１（１９９１））。適当なカオトロピック剤としては特に、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩、チオシアン酸ナトリウム、リチウムテトラクロロアセテート、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロアセテート、ヨウ化カリウム、セシウムトリフルオロアセテートを含む。典型的には、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。場合によっては、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを添加してもよい。濃度は典型的に３０−５０％（ｖ／ｖ）である。
【０１２６】
種々のハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。典型的には、これらは、極性有機溶媒のボリュームの約２０％から６０％、好ましくは３０％である。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０−５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５から１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５から０．１Ｍバッファ（たとえばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲は約６から９））、約０．０５から０．２％の洗剤（たとえば硫酸ドデシルナトリウム）あるいは０．５から２０のｍＭ  ＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００から５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０から５００ｋｄａｌ）、血清アルブミンを使用する。さらに、典型的なハイブリダイゼーション溶液は、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの標識されないキャリア核酸、フラグメント化された核ＤＮＡ（たとえば子ウシの胸腺かサケ精子のＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および場合により約０．５から２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンが含まれる。種々の極性水溶性または膨張できる物質（たとえばポリエチレングリコール）、陰イオンポリマ（たとえばポリアクリレートまたはポリアクリル酸メチル）、陰イオンの多糖高分子（たとえば硫酸デキストラン）を含むボリューム排除物質などの、他の添加物も含まれる場合がある。
【０１２７】
核酸ハイブリダイゼーションは種々のアッセイフォーマットに適応可能である。最も適当なアッセイのうちの１つはサンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、非変性条件下のハイブリダイゼーションに特に適応可能である。サンドイッチタイプのアッセイの主な構成要素は固体支持体である。固体支持体は、標識されず、配列の一部に対して相補的である、固定核酸プローブを吸収しているか、または共有結合している。
【０１２８】
本発明のヌクレオチドと推定アミノ酸配列の使用可能性により、ＤＮＡ発現ライブラリの免疫スクリーニングが促進される。本発明のアミノ酸配列の一部を表わす合成ペプチドを合成することができる。これらのペプチドを使用して動物を免疫し、アミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質に対して特異性を有する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成せしめることができる。ついでこれらの抗体を使用してＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングし、目的の完全長ＤＮＡクローンを分離することができる（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）Ｒ．Ａ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４）。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）上記）。
【０１２９】
微生物中の組み換えの発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、特に微生物宿主の細胞など異質の宿主細胞内で生成できる。組み換え微生物宿主内の発現は、これまでその宿主を使用する場合は不可能であった、種々の経路中間産物の発現、および／または、新しい産物合成のために宿主内にすでに存在する経路の変更に有用である。
【０１３０】
本発明の適当な上流イソプレン経路遺伝子をコードする遺伝子、下流カロテノイド生合成経路遺伝子（場合により他のｃｒｔ遺伝子）の種々の組み合わせを、適当な微生物宿主に導入する方法は一般的である。当業者には明らかであるが、特定のカロテノイド産物を生成せしめるために宿主生物に導入する必要がある特定の機能は、宿主細胞（およびその自然のイソプレノイド化合物生成）、基質の使用可能性、所望の最終産物に依存する。
【０１３１】
存在するｃｒｔ遺伝子でカロテノイドを効果的に生成せしめるためには、宿主細胞が細胞内に適当なレベルのＦＰＰを有することが必要であることが理解されるであろう。ＦＰＰは外因的に供給してもよく、または自然な遺伝経路または導入された遺伝経路を介して細胞が内因的に生成してもよい。したがって当業者であれば、特定の宿主細胞が適当なレベルのＦＰＰを生成せしめる遺伝機構を有しない場合、上流イソプレノイド経路の任意の必要な遺伝子を得て、これらの遺伝子を宿主内に導入してカロテノイド生合成の開始材料としてＦＰＰを生成できることが理解されるであろう。ＦＰＰ前駆物質として、ＩＰＰはよく知られたアセテート／メバロン酸経路を介して合成することができる。別法としては、最近の研究により、メバロン酸依存経路がすべての生物で機能しているわけではないことが示されている。代替の、ＩＰＰ生合成の非メバロン酸経路は、細菌、緑藻類、高等植物で特徴付けられている（ホルバッハ（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５−１４０（１９９３）。ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７−５２４（１９９３）。シュウェンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３−８０（１９９６）。アイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６４３１−６４３６（１９９６））。
【０１３２】
たとえば、本発明の下流Ｃ４０カロテノイド生合成経路ｃｒｔＥＸＹＩＢＺ配列のうち１つまたは複数をコードするキメラ遺伝子を導入すると、選択される宿主微生物においてカロテノイド化合物が生成されることが期待できる。適当な遺伝形質転換系で、種々の非カロテノイド生成に遺伝子操作を行うことが可能である。これは、エルウィニアヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ｃｒｔ遺伝子を使用して、宿主の大腸菌、アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ビール酵母菌、ピヒアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（酵母）、偽巣性コウジ菌（菌・カビ類）、ロドバクテル  スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、高等植物などの宿主の中に種々のカロテノイドを生成せしめることが示されている（米国特許第５，６５６，４７２号明細書）。したがって、本明細書に上述するように、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、イプシロン−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、ラクチュカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シフォナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチンは、次のようなｃｒｔ酵素機能を種々に組み合わせて導入することにより本明細書に記載の技術を用いて微生物宿主で生成せしめることができる。これらの酵素は例である。ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＷ、ＣｒｔＯ、ＣｒｔＡ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤ、ＣｒｔＦ、ＣｒｔＵ。したがってＦＰＰからフィトエンを生成せしめるためにはＣｒｔＥとＣｒｔＢが必要である。ＦＰＰからリコペンを合成するために必要なカロテノイド特異的な遺伝子は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩを含む。ＦＰＰからβ−カロテンを生成せしめるために必要な遺伝子は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹを含む。このｃｒｔ遺伝子間の関係を理解すれば、所望のカロテノイド産物を発現させるために、適当な微生物宿主細胞とｃｒｔ遺伝子を選択することができる。
【０１３３】
外来タンパク質の高レベルの発現を指示する微生物発現系と、調節配列を含む発現ベクターは当業界ではよく知られている。これらのうち任意のものを使用して、本発明の配列の遺伝子産物のうち任意の産物を生成せしめるキメラ遺伝子を作成することができる。ついで、これらのキメラ遺伝子を適当な微生物に導入し、形質変換を介して酵素の高レベルの発現を提供することができる。
【０１３４】
適当な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当業界でよく知られている。典型的には、ベクターまたはカセットは、適当な遺伝子、選択可能なマーカー、および、自律増殖または染色体の統合を可能にする配列の、転写および翻訳を指示する配列を含んでいる。適当なベクターは、転写開始制御を提供する遺伝子の５’領域、および、転写終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含む。両方の制御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子由来であるともっとも好ましいが、このような制御領域は生成宿主として選択される特定の種の自然な遺伝子に由来する必要はないことを理解されたい。
【０１３５】
所望の宿主細胞において本発明のＯＲＦの発現を駆動するために有用な開始制御領域またはプロモータは多く、当業者にはよく知られている。これらの遺伝子を駆動することのできる実質的に任意のプロモータが本発明に適している。この中には次のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（たとえば、サッカロミセスにおける発現に有用である）。ＡＯＸ１（たとえばピヒアにおける発現に有用である）。ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（たとえば大腸菌における発現で有用である）。ａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒの各プロモータと、たとえばバチルスにおける発現で有用である種々のファージプロモータ。さらに、デオキシ−キシルロースリン酸合成酵素またはメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモータ（スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １６０：１１９−１２４（１９９８））、ポリヒドロキシアルカノイック酸合成のプロモータ（フェルナー（Ｆｏｅｌｌｎｅｒ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２８４−２９１（１９９３））、メチロトローフ内の自然のプラスミドから同定されたプロモータ（ＥＰ２９６４８４号明細書）、Ｐｌａｃ（トヤマ（Ｔｏｙａｍａ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：５９５−６０２（１９９７）、ＥＰ６２９７１号明細書）、Ｐｔｒｃ（ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）ら、Ｇｅｎｅ  ２７：１６１−１７２（１９８４））、メタノトローフから同定されたプロモータ（ＰＣＴ／ＵＳ０３／３３６９８号明細書）、抗生物質抵抗性と関連のあるプロモータ［たとえば、カナマイシン（スプリンガー）ら、上記。ウエダ（Ｕｅｄａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：９２４−９２６（１９９１））、またはテトラサイクリン（米国特許第４，８２４，７８６号明細書）］は、Ｃ１メタボライザ内での発現に適している。
【０１３６】
ベクターがリボゾーム結合部位（「ＲＢＳ」）を提供しない場合、発現すべき遺伝子の上流に人工ＲＢＳを含めることが必要である。これは、単一のプロモータがオペロンの第１、第２、第３などの遺伝子群の発現を駆動する場合、第２、第３などの遺伝子を発現させるためにしばしば必要である。特定の宿主生物の中で、この合成部位の作成手段としてＲＢＳの好ましい配列を同定する方法は当業界ではよく知られている。
【０１３７】
終了制御領域も、好ましい宿主の種々の自然な遺伝子由来であってもよい。場合により終始部位は必要でない場合もある。しかし、終始部位が含まれていることがもっとも好ましい。
【０１３８】
クローニングベクターに遺伝子を挿入するだけでは、必要なレベルでの発現は保証されない。高い発現レートに対する必要性に応じて、転写、翻訳、タンパク質の安定性、酸素限定、宿主細胞からの分泌といった側面を制御する、多くの異なる遺伝子要素を操作することによって、多くの特別な発現ベクターが作成されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子には次のような特徴が含まれる。１．）適当な転写プロモータ配列とターミネータ配列の性質。２．）リボソーム結合部位の強度。３．）クローニングされた遺伝子のコピー数、遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノムに統合されているか。４．）合成された外来タンパク質の最終的な細胞内の部位。５．）宿主生物中の翻訳の効率。６．）宿主細胞内のクローニングされた遺伝子タンパク質の固有の安定性。７．）コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン利用の頻度に近づくような、クローニングされた遺伝子内のコドンの使用。これらのタイプの修飾も、Ｃ４０カロテノイドの発現をさらに最適化する手段としてそれぞれ本発明に包含されている。
【０１３９】
最後に、Ｃ４０カロテノイドの蓄積を促進するために、ターゲット経路内の所定の遺伝子、またはエネルギまたは炭素の受け皿としての役割を果たす競合経路における所定の遺伝子の発現を低減または除去することが必要な場合もある。別法としては、所望のカロテノイドの中間産物の上流にある種々の遺伝子を過剰発現させ、生成を強化することも有用である。上述の目的のための遺伝経路を操作する方法は一般的で、当業界でよく知られている。
【０１４０】
たとえば、主要遺伝経路を同定、配列決定すると、特定の遺伝子をアップレギュレートして経路の出力を増加させることができる。たとえばターゲット遺伝子の追加のコピーを、ｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミド上で宿主細胞に導入することができる。別法としては、ターゲット遺伝子を変更して、自然ではないプロモータの制御下に置くこともできる。経路が細胞周期または発酵の特定のポイントで作動することが望ましい場合、調節されたプロモータまたは誘導可能なプロモータを使用してターゲット遺伝子の自然のプロモータに置き換えることができる。同様に、場合によっては、自然または内因性のプロモータを修飾して遺伝子発現を増加させることもできる。たとえば、突然変異、欠失、および／または、置換により、ｉｎ  ｖｉｖｏで内因性プロモータを変更することができる（米国特許第５，５６５，３５０号明細書、ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号明細書）。
【０１４１】
別法としては、分裂すべき遺伝子の配列が知られている場合、もっとも効率的に遺伝子をダウンレギュレーションする方法はターゲット遺伝子を分裂することである。ここで外来ＤＮＡを構造遺伝子に挿入して転写を分裂する。これは、分裂すべき遺伝子の一部に対して高い程度の相同性を有する配列によってフランクされた、挿入すべきＤＮＡ（しばしば遺伝子マーカー）を含む遺伝子カセットを作成することによって可能である。宿主細胞へのカセットの導入により、細胞の自然なＤＮＡ複製機構を介して外来ＤＮＡが構造遺伝子に挿入される（たとえばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２（１９８９）。バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ  １３６：２１１−２１３（１９９３）。グエルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４（１９９６）。スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０−２７７（１９９６）を参照されたい）。
【０１４２】
ターゲット遺伝子の配列が知られている場合、アンチセンス技術は遺伝子のダウレギュレーションの別の方法である。これを行うために所望の遺伝子から核酸セグメントをクローニングし、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、プロモータに操作可能に結合させる。次にこの構成を宿主細胞に導入すると、ＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。アンチセンスＲＮＡは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を阻害することによって遺伝子発現を抑制する。当業者であれば、特定の遺伝子の発現を低減するためにアンチセンス技術を使用することに関し、特別のいくつかの留意点があることが理解されるであろう。たとえば、アンチセンス遺伝子の適当な発現レベルのためには、当業者に既知の異なる調節要素を使用して異なるキメラ遺伝子を使用する必要がある。
【０１４３】
配列が知られている場合、ターゲット遺伝子の分裂とアンチセンス技術は、遺伝子のダウンレギュレーションの効果的な手段を提供するが、配列に基づかない特異性の低い方法も開発されている。たとえば、細胞をＵＶ放射に曝露し、所望のフェノタイプについてスクリーニングする。さらに、化学物質による突然変異生成は突然変異体の生成に効果的であり、一般的に使用される物質には、ＤＮＡの非複製に影響を与える化学物質（たとえばＨＮＯ２とＮＨ２ＯＨ）、ＤＮＡの複製に影響を与える物質（たとえばフレームシフト変位の原因として有名なアクリジン染料）が含まれる。放射または化学物質を使用して突然変異体を作成する特定の方法は当業界でよく証明されている。たとえば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第２版（１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．、マサチューセッツ州サンダーランドのトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、または、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３６：２２７−２３４（１９９２）のデシュパンデ  ムクンド  Ｖ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ）を参照されたい。
【０１４４】
適当な宿主菌株の例は次のとおりであるが、これらに限定されるものではない。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクテル（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メタン酸化細菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｉｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、硫黄菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｌｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒホミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）などの菌・カビ類性または酵母菌種。
【０１４５】
本発明の内容においては、上記の方法のうち任意の方法でカロテノイド生合成経路の発現を調節することが有用である。たとえば本発明は、カロテノイド経路内の酵素をコードする多くの単離された遺伝子（すなわち、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺの遺伝子）と、Ｃ４０カロテノイド生成につながる多くの方法を提供する。したがって、本明細書のｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＺの遺伝子の種々の組み合わせを過剰発現してＣ４０カロテノイド生成の増加を促進することに加え、最初の３炭素化合物（ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の最初の縮合をアップレギュレートし、５炭素化合物Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸（ｄｘｓ遺伝子が仲介する）の生成を増加させることも有用である。これによりカロテノイド生合成経路に入る炭素の流れが増加し、Ｃ４０カロテノイドの生成が増加する。別法としては（または追加として）、微生物宿主がＣ３０カロテノイドを合成できる場合、これらのタイプの化合物の合成につながるｃｒｔＭ／ｃｒｔＮ遺伝子をノックアウトすることが望ましい場合もある。または、自然な機能ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子を有する系では、β−カロテンまたはゼアキサンチンの蓄積は、上述の方法のうちの任意の１つの方法によって、下流の遺伝子（たとえばｃｒｔＺまたはｃｒｔＸ）を分裂することで達成することができる。
【０１４６】
好ましい微生物宿主
本発明の下流カロテノイド生合成経路の遺伝子と核酸フラグメントを発現するための好ましい異種の宿主細胞は、菌・カビ類か細菌類に広く存在し、広範囲の温度、ｐＨ値、溶媒耐性で成長する、微生物の宿主である。たとえば、任意の細菌、酵母、糸状菌類が本発明の核酸フラグメントの発現に適した宿主である。転写、翻訳、タンパク質生合成装置は、細胞フィードバックに関わりなく同じであるので、機能遺伝子は、細胞バイオマスを生成せしめるために使用される炭素フィードバックに関わりなく発現する。大規模な微生物の増殖と機能遺伝子の発現は、幅広い単純炭水化物または複合炭水化物、有機酸とアルコール、および／または、飽和炭化水素（例えば光合成宿主または化学的独立栄養の宿主の場合のメタンまたは二酸化炭素）を使用する。しかし、機能遺伝子は、特定の増殖条件によって調節、抑制、または、低下するかも知れない。これらの条件には、窒素の形態と量、リン、硫黄、酸素、炭素、または、小さな無機イオンを含む任意の微量栄養素の量が含まれる。さらに、機能遺伝子は、培養に添加され、典型的には栄養素やエネルギ源とは考えられない特定の調節分子の存在か不在によって調節される場合もある。また増殖率が遺伝子発現の重要な制御因子の場合もある。
【０１４７】
適当な宿主菌株の例は次のとおりであるが、これらに限定されるものではない。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセスなどの菌・カビ類性または酵母種。またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクテル（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メタン酸化細菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種。
【０１４８】
微生物宿主としてのメチロトローフとメチロモナス１６ａ
多くのカロテノイドが組み換え微生物源から生成されている［たとえばリコペン生成用の大腸菌とカンジダユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）（ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）Ｗ．Ｒ．および、リャオ（Ｌｉａｏ）Ｊ．Ｃ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：５７−６１（２００１）。ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１６：９２２−９２６（２０００）。ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）Ｎ．および、シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１６９−１８１（１９９８）。シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２６７６−２６８０（１９９８）。β−カロテン生成用の大腸菌、カンジダユチリス、赤色酵母（Ｐｆａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１：７９１−７９５（１９９９）。ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２２６−１２２９（１９９８）。米国特許第５，６９１，１９０号明細書）。ゼアキサンチン生成のための大腸菌とカンジダユチリス（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、上記。ミウラ（Ｍｉｕｒａ）ら、上記）。アスタキサンチン生成のための大腸菌と赤色酵母（米国特許第５，４６６，５９９号明細書、米国特許第６，０１５，６８４号明細書、米国特許第５，１８２，２０８号明細書、米国特許第５，９７２，６４２号明細書）。また、米国特許第５，６５６，４７２号明細書、米国特許第５，５４５，８１６号明細書、米国特許第５，５３０，１８９号明細書、米国特許第５，５３０，１８８号明細書、米国特許第５，４２９，９３９号明細書、米国特許第６，１２４，１１３号明細書を参照されたい］。これらの異なるｃｒｔ遺伝子の種々の組み合わせを使用したカロテノイド製造方法は、生産量が低く比較的高価な原料に依存するという欠点を有していた。したがって、安価な原料から微生物宿主内でカロテノイドをより多く生成せしめる方法を同定することが望ましい。
【０１４９】
唯一のエネルギ源として単一炭素基質を使用する多くの微生物がいる。このような微生物は本明細書では「Ｃ１メタボライザ」と呼ぶ。これらの生物は、エネルギとバイオマスの唯一の源として炭素−炭素結合を欠く炭素基質を使用できるという特徴を有する。これらの炭素基質は次のものを含んでいるが、これらに限定されるものではない。メタン、メタノール、ギ酸塩、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン（たとえば、モノ−、ジ−、トリ−メチルアミン）、メチル化チオール、二酸化炭素、任意の炭素−炭素結合を欠く種々の還元された炭素化合物。
【０１５０】
Ｃ１代謝微生物はすべて全般に、メチロトローフと分類される。メチロトローフは、炭素−炭素結合を含まない有機化合物を酸化できる任意の生物として定義することができる。しかし、通性メチロトローフ、偏性メチロトローフ、偏性メタノトローフはすべて、メチロトローフの種々の一部である。具体的には次のとおりである。
・  通性メチロトローフは、炭素−炭素結合を含まない有機化合物を酸化する機能を有するが、糖質および複合炭水化物などの他の炭素基質をエネルギとバイオマスとして使用することができる。通性メチロトローフ細菌は多くの環境に存在するが、最も一般には土、埋立、廃棄物処理場から分離される。多くの通性メチロトローフがプロテオ細菌のβサブグループとγサブグループのメンバーである。（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］。７ｔｈ（１９９３）、ｐ２８５−３０２。ムレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ）、Ｊ．コリン（Ｃｏｌｌｉｎ）、ドン  Ｐ．ケリー（Ｄｏｎ  Ｐ．Ｋｅｌｌｙ）編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ：アンドーバー（Ａｎｄｏｖｅｒ）、英国。マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、第８版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ：アッパーサドルリバー（Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ）、ニュージャージー州（１９９７））。
・  偏性メチロトローフは、エネルギ産生のために炭素−炭素結合を含まない有機化合物だけしか使用しない有機体である。
・  偏性メタノトローフはメタンを酸化する別の能力を有する偏性メチロトローフである。
【０１５１】
さらに、単一炭素基質を使用する能力は細菌に制限されず、酵母と菌・カビ類も含まれる。多くの酵母種は、より複雑な材料に加え、単一炭素基質をエネルギ源として使用することができる（すなわちメチロトローフ酵母）。
【０１５２】
多くのメチロトローフ生物が知られているが、産業プロセスで材料合成に有効利用されている微生物はわずかである。また、単一炭素基質はコスト効率の良いエネルギ源であるが、これらの微生物の遺伝子操作が困難であること、および遺伝子機構に関する情報が不足していることにより、使用は主に自然な産物の合成に限られていた。
【０１５３】
これらの困難はあるが、多くのメタノトローフは、色素を合成できる固有のイソプレノイド経路を含み、これらの微生物を操作して他の非内因性イソプレノイド化合物を生成せしめる可能性が考えられている。メタノトローフは単一炭素基質（すなわちメタンあるいはメタノール）をエネルギ源として使用することができるので、これらの生物の中で低価格でカロテノイドを生成せしめることは可能である。メタノトローフをβ−カロテンの生産のために操作する１つの例は、国際公開第０２／１８６１７号パンフレットに記述されている。
【０１５４】
本発明では、単独のエネルギ源として単一の炭素基質を使用することができる微生物における、カロテノイド化合物の生合成に関与する遺伝子の発現の方法を提供する。宿主微生物は、カロテノイドの代謝前駆物質としてファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を合成する機能を有する任意のＣ１メタボライザであってよい。より具体的には、本発明で適当な通性メチロトローフ細菌は次の細菌を含むが、これらに限定されるものではない。メチロフィルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサンソバクテル（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）。本発明に有用な特定のメチロトローフ酵母は次の酵母を含むが、これらに限定されるものではない。カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）。また、例としてのメタノトローフは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシクティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５５】
本発明にとって特に興味のある酵母は、エネルギ的に好ましい炭素流束経路を有する高増殖能の偏性メタノトローフである。たとえば出願者らは、炭素流速操作に特に有用ないくつかの経路特徴を有するメタノトローフの特定の菌株を発見した。この菌株はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）として知られる。また、この特定の菌株と他の関連するメチロトローフは、Ｃ４０カロテノイド生成に有用な本発明の遺伝子産物の発現のための好ましい微生物宿主である。（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。
【０１５６】
メチロモナス１６ａは自然にＣ３０カロテノイドを生成せしめる。オドム（Ｏｄｏｍ）らは、メチロモナス１６ａにおけるＣ４０カロテノイド遺伝子の発現によりＣ３０とＣ４０のカロテノイド混合物が生成されたと報告している（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。この菌株の中でＣ３０カロテノイド生成に関与する遺伝子のいくつかが同定されており、この中にはｃｒｔＮ１、ａｌｄ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＮ３の各遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ｃｒｔＮ１  ａｌｄ遺伝子の分裂、または、ｃｒｔＮ１／ａｌｄ／ｃｒｔＮ２遺伝子クラスタの発現を駆動するプロモータの分裂により、Ｃ４０カロテノイド生成により適した種々の色素を有しない突然変異株（「白い突然変異株」）が生成された（米国仮特許出願第６０／５２７０８３号明細書。参照により本明細書に組み込まれている）。たとえば色素を有しないメチロモナス１６ａ菌株ＭＷＭ１０００は、ａｌｄ遺伝子とｃｒｔＮ１遺伝子を分裂することによって作成された。
【０１５７】
メチロモナス１６ａ菌株は炭素利用経路にいくつかの変則を含む。たとえば遺伝子配列データに基づいて、菌株はヘキソース代謝の２つの経路に関する遺伝子を含むと示されている。エントナー−ドウドロフ経路（ケト−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ酵素を使用する）が菌株中に存在する。これは偏性メタノトローフにおける作動経路であることは一般に認められている。しかしさらに、エムデン−マイヤーホフ経路（フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素を使用する）も存在する。この経路は偏性メタノトローフ内では存在しないかまたは作用しないことが知られている。エネルギ的には、後者の経路の方が有利であり、生物学的に有用なエネルギをより多く産生し、最終的にはメチロモナス１６ａの細胞量および他の細胞量依存産物をより多く生成せしめる。メチロモナス１６ａ菌株におけるこの経路の活性は、ＡＴＰの減少を測定するマイクロアレイデータと生化学的知見によって確認された。メチロモナス１６ａ菌株はエムデン−マイヤーホフ経路酵素とエントナー−ドウドロフ経路酵素の両方を有すると示されているが、データは、エムデン−マイヤーホフ経路酵素がエントナー−ドウドロフ経路酵素より強力に発現することを示唆する。この結果は驚くべきであり、メタノトローフ細菌の解糖代謝に関する既存の考えを覆すものである。出願者らは、たとえばメチロモナスクララ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃｌａｒａ）、およびメチロシヌススポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ）を含む、この特性を有する他のメタノトローフ細菌を発見した。ほとんどの細菌系で酵素の典型的なホスホリルドナーであるＡＴＰを伴う酵素の活性がないため、この活性はメタノトローフで発見されなかったと考えられる。
【０１５８】
メチロモナス１６ａ菌株におけるエムデン−マイヤーホフ経路の特に新規で有用な特徴は、重要なホスホフルクトキナーゼステップがＡＴＰ依存ではなくピロリン酸依存ということである。この特徴により、ＡＴＰの代わりにピロリン酸を使用することによって、経路のエネルギ産生量が増加する。
【０１５９】
メタノトローフ細菌では、メタンはリブロース一リン酸経路またはＲｕＭＰサイクルとして知られる環状の一連の反応を介して生体分子に変換される。この経路は三段階を含み、各段階は一連の酵素ステップである。第１ステップは、Ｃ−１（ホルムアルデヒド）をペントースに「固定」または組み込み、ヘキソースまたは六炭糖を形成するステップである。これは五炭糖（ペントース）とホルムアルデヒドの間の縮合反応によって起き、ヘクスロース一リン酸合成酵素によって触媒される。第２段階は「開裂」と呼ばれ、ヘキソースは２つの３炭素分子に分割される。これらの３炭素分子のうちの１つは、ＲｕＭＰ経路を介してリサイクルされ、もう１つの３炭素フラグメントは細胞増殖のために使用される。
【０１６０】
メタノトローフとメチロトローフにおいては、ＲｕＭＰ経路が３つの変異形のうちの１つとして発現する。しかし一般に存在するのは、これらの変異形のうち、ＦＢＰ／ＴＡ（フルクトースビスホスホターゼ／トランスアルドラーゼ）経路、または、ＫＤＰＧ／ＴＡ（ケトデオキシホスホグルコネート／トランスアルドラーゼ）経路の２つだけである（ディクイゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）Ｌ．、デブリース（Ｄｅｖｒｉｅｓ）Ｇ．Ｅ．、「Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ中；コリン・マレル（Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ）およびハワード・ダルトン（Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ）編、Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク、１９９２）。
【０１６１】
メチロモナス１６ａは「開裂」ステップを扱う方法が独自である。このステップでは重要な中間物としてフルクトースビスリン酸を介して「開裂」変換を行う遺伝子が見つかっている。フルクトースビスホス酸アルドラーゼとトランスアルドラーゼの遺伝子は１断片のＤＮＡで共にクラスタとなっていることが発見されている。第２に、ケトデオキシホスホグルコネート中間物を含む他の変形遺伝子もクラスタになっていることが発見されている。入手可能な文献は、これらの生物（偏性メチロトローフとメタノトローフ）がＫＤＰＧ経路のみに依存し、ＦＢＰ依存性固定経路は通性メチロトローフが使用していることを教示している（ディクイゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）ら、上記）。したがって、後者の観察は期待されるが、前者は観察されない。偏性メタン使用細菌中のＦＢＰ遺伝子に関する発見は驚くべきであり、有用性を示唆するものである。ＦＢＰ経路はＫＤＰＧ経路より多くのエネルギ（ＡＴＰ）を使用できるようになるという事実のため、宿主微生物にとってエネルギ的に有利である。したがって、ＦＢＰ経路を使用する生物はＫＤＰＧ経路を使用する生物に対してエネルギ上の利点と増殖上の利点を有することなる。またこの利点は、菌株内のエネルギを必要とする生成経路にも有効である。メタン使用細菌は、単一の細胞タンパク質、または、ＲｕＭＰ経路を介した炭素の流れから導出される任意の他の産物（たとえばカロテノイド）に関する生成プラットフォームとして、この経路を使用することによって、他のメタン使用生物に対して利点を有する。
【０１６２】
従って本発明は、高成長でエネルギ的に有利なメチロモナス菌株内でカロテノイド化合物を生成せしめるための方法を提供する。このメチロモナス菌株は次の特徴を有する。
（ａ）メタンとメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質上で増殖する。
（ｂ）機能エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含む。この経路はピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含む。
【０１６３】
Ｃ１代謝細菌の形質転換
Ｃ１代謝細菌の形質転換技術はまだよく開発されていないが、当業界で知られた他の細菌に使用される一般的な方法を適用することができる。エレクトロポレーションは、次の形質転換に使用され、成功を収めている。メチロバクテリウム  エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）  ＡＭ１（トヤマ（Ｔｏｙａｍａ）Ｈ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１−７（１９９８））、メチロフィルス  メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）  ＡＳ１（キム（Ｋｉｍ）Ｃ．Ｓ．およびウッドＴ．Ｋ．（Ｗｏｏｄ）．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５−１０８（１９９７））、メチロバシラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株１２Ｓ（ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）  Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２３：７８７−７９１（２００１））。しかし当業界で知られているように、特定のエレクトロポレーションパラメータを１つの特定のＣ１代謝使用生物から別の生物へ外挿することは困難である。
【０１６４】
ドナー細胞とレシピエント細胞の直接接触に依存する細菌接合はしばしば、遺伝子をＣ１代謝細菌に導入するためにより容易に改変できる。簡単に言えば、この細菌接合プロセスは「ドナー」細胞と「レシピエント」細胞を互いに混合し密接に接触させることを含む。接合はドナー細菌とレシピエント細菌の間に細胞質接続が形成されることによって起こり、新しく合成されたドナーＤＮＡがレシピエント細胞に直接導入される。当業界でよく知られているように、接合におけるレシピエントは、ドナー細菌から水平転移を介してＤＮＡを受容できる任意の細胞と定義される。接合転移におけるドナーは、接合プラスミド、接合トランスポゾン、または可動プラスミドを含む細菌である。ドナープラスミドの物理的な転移は、次に記述する２つの方法のうち１つで起きる。
１．ある場合では、接合に必要なのはドナーとレシピエントだけである。これは、転移されるプラスミドが、接合プラスミドでかつ可動プラスミドである自己伝達性プラスミドである場合に起きる（すなわち、ｔｒａ遺伝子とＭｏｂタンパク質をコードする遺伝子の両方を担持する）。一般に、このプロセスは次のステップを含む。１．）二本鎖プラスミドＤＮＡのｏｒｉＴ内の特定の部位でニックが形成される。２．）孔または毛の構造を介して一本鎖ＤＮＡをレシピエントに解放する。
３．）ＤＮＡリラカーゼ（ｒｅｌａｘａｓｅ）酵素はｏｒｉＴ部位で２本鎖ＤＮＡを開裂し、解放された５’末端に結合する（中間段階構造としてリラクソソームを形成する）。４．）続いて、補助タンパク質複合体がｏｒｉＴ部位で組み合わされ、ＤＮＡ転移プロセスを促進する。
２．別法としては、ドナープラスミドからレシピエントに転移するために「トリペアレンタル（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ）接合が必要である。この種の接合では、ドナー細胞、レシピエント細胞、「ヘルパー」プラスミドが関与する。ドナー細胞は可動プラスミドまたは接合トランスポゾンを担持する。可動ベクターはニッカーゼをコードする遺伝子であるｏｒｉＴを含み、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかしＭｏｂタンパク質だけではゲノム転移は達成できない。したがって、ヘルパープラスミド（ドナー内にあるかまたは「ヘルパー」細胞内にある）によって適当な接合システムが提供されなければ、可動プラスミドはそれ自体の転移を促進できない。接合プラスミドは孔または毛の形成に関与する転移のためのタンパク質（Ｔｒａ）をコードするので、接合プラスミドは対の形成とＤＮＡ転移のために必要である。
【０１６５】
Ｃ１代謝細菌を含む接合の成功例としては次のような研究がある。ストロイヤー（Ｓｔｏｌｙａｒ）ら、（Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ  ６４：  ６８６−６９１（１９９５）（５））。モトヤマ（Ｍｏｔｏｙａｍａ）ら、（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２：  ６７−７２（１９９４）（１））。ロイド（Ｌｌｏｙｄ）ら、（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １７１（６）：３６４−３７０（１９９９））。オドム（Ｏｄｏｍ）ら、（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。
【０１６６】
カロテノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオ変換
別法としては、本出願のバイオ変換をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことが可能である。ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺの基質が宿主細胞によって内因的に合成されない場合、基質を外因的に添加することが可能である。この実施形態では、適当なカロテノイド基質は中性洗剤（たとえばＤＭＳＯ）で可溶性になっているかまたはリン脂質液胞と混合していてもよい。場合により、細胞への輸送を助けるために、適当な溶解力のあるトルエンなどで宿主細胞に透過性を与えてもよい。このタイプのカロテノイド基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオ変換方法には当業界に基礎がある（たとえば、ハンドル（Ｈｕｎｄｌｅ）Ｂ．Ｓ．ら、ＦＥＢＳ、３１５：３２９−３３４（１９９３）。ブラムレー（Ｂｒａｍｌｅｙ）Ｐ．Ｍ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６：１９３５−１９３９（１９８７）を参照）。
【０１６７】
組み換え微生物を使用した商業生産
本発明のタンパク質の商業生産が望ましい場合、種々の培養法を適用することができる。たとえば、組み換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子産物の大量生産は、バッチ培養法でも連続培養法でも可能である。
【０１６８】
古典的なバッチ培養法はクローズドシステムであり、培地の組成は培養の最初に設定され、培養プロセスの間に人為的な変更を受けることはない。したがって培養プロセスの最初に、培地に所望の生物を植菌し、系に何も添加せずにそのまま成長活性または代謝活性を発現させる。しかし典型的には「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチなのであり、ｐＨや酸素濃度などの因子を制御する試みはしばしば行われる。バッチ系では、系の代謝物質とバイオマスの組成は、培養が終了するまでたえず変化する。バッチ培養における細胞は、静止誘導期から対数増殖期へ、最後に、成長速度が低減するか止まる静止期へ穏やかに移行する。処理を行わなければ静止期の細胞は最終的には死ぬ。対数期中の細胞はしばしば、最終産物または一部の系では中間産物の大量の生成をもたらす。
静止期または対数期を過ぎた生成は他の系で得ることができる。
【０１６９】
標準のバッチ系の変形例は流加系である。流加培養プロセスは本発明にも適切であり、培養の進行に伴って基質がインクリメントで追加されるという点を除いて、典型的なバッチ系を含んでなる。異化物質抑制が細胞の代謝を抑制する傾向がある場合、また、培地中の基質の量を限定することが望ましい場合に流加培養系は有効である。流加系内の実際の基質濃度の測定は困難なので、ｐＨ、溶解酸素、ＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定できる因子の変化に基づいて推定する。バッチ培養法と流加培養法は一般的で当業界でよく知られており、例はブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上記）とデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）（上記）が記載している。
【０１７０】
本発明のタンパク質の商業生産は連続培養でも可能である。連続培養は開放系であり、定義された培養培地を連続的にバイオリアクタに添加し、同時に、調整された同量の培地を除去して処理する。連続培養は一般に、主に細胞が対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。別法としては、連続培養は固定化細胞で行うことができる。固定化細胞では炭素と栄養素が連続的に添加され、価値のある産物、副産物、または廃棄物が細胞量から連続的に除去される。細胞の固定化は自然材料および／または合成材料を含む幅広い固体支持体を使用して行うことができる。
【０１７１】
連続培養または半連続培養では、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を与える１つまたは任意の数の因子の調節が可能である。たとえば１つの方法では、固定レートに炭素源または窒素レベルなどの栄養素を制限し、他のパラメータを中程度に制限する。他の系では、成長に影響を与えるいくつかの因子を連続的に変えながら、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保つ。連続系では、安定した増殖条件を維持しようとするので、培地を取り除いたために失われる細胞は、培養内の細胞増殖率に対してバランスをとらなければならない。連続培養プロセスのための栄養素と成長のための因子を調節する方法、および、産物形成レートを最大化する技術は、工業微生物学ではよく知られており、種々の方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）によって詳細に記されている。
【０１７２】
本発明の発酵培地は適当な炭素基質を含まなければならない。適当な基質は次のようなものを含んでいてよいが、これらに限定されるものではない。単糖（たとえばグルコースとフルクトース）、二糖類（たとえばラクトースまたはスクロース）、多糖類（たとえばスターチ、またはセルロース、またはこれらの混合物）、再生可能な原料からの精製されない混合物（たとえば、チーズホエー浸透、コーンスティープリカー、甜菜糖蜜、大麦麦芽）。さらに、炭素基質は、主な生化学的中間物への代謝変換が示されている二酸化炭素、メタン、またはメタノールなどの１炭素基質であってもよい。１つおよび２つの炭素基質に加えて、メチルアミン、グルコサミン、種々のアミノ酸などの化合物を含むいくつかの他の炭素を代謝活性のために使用するメチロトローフ生物も知られている。たとえばメチロトローフ酵母は、メチルアミンの炭素を使用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ］．７ｔｈ（１９９３）、４１５−３２。マレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ）、Ｊ．コリン（Ｃｏｌｌｉｎ）、ケリー  ドン（Ｋｅｌｌｙ  Ｄｏｎ）  Ｐ．編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ：アンドーバー、英国）。同様に、種々のカンジダはアラニンあるいはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。したがって、本発明で使用する炭素源は、基質を含む幅広い炭素を包含し、生物の選択によってのみ制限されることを意図するものである。
【０１７３】
植物における組み換え生産
植物と藻類もカロテノイド化合物を生成せしめることが知られている。本発明のｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各核酸フラグメントは、微生物タンパク質を発現する機能を有する遺伝子導入植物を作成するために使用することができる。好ましい宿主植物は、本発明のタンパク質の多量生産レベルを支持する任意の種類であってよい。適当な緑色植物としては次のような植物が含まれるが、これらに限定されるものではない。大豆、菜種（西洋アブラナ、Ｂカンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ヒマワリ（ヘリアンタス  アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、綿（ゴッシピウム  ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナ  タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メジカゴ  サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、小麦（トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ＤＳＰ））、大麦（ホルデウム  バルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、オーツ（アベナ  サティバＬ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ））、モロコシ（ソルガム  バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、米（オリザ  サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、じゃがいも、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草の実の農作物、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ、ライ麦、亜麻、硬材木、軟材木、飼料草。藻類は、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）および緑藻類（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）など商業的に重要な宿主を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１７４】
カロテノイド化合物の過剰発現はまず、所望の発達段階にある所望の組織内で、遺伝子の発現を指示できるプロモータにコード領域を操作可能に結合させることにより、本発明によるキメラ遺伝子を構成することで行う。便宜的な理由で、キメラ遺伝子はプロモータ配列と、同じ遺伝子から導出された翻訳リーダー配列を含んでいてもよい。転写終了シグナルをコードする３’非コード配列も提供しなければならない。また本発明のキメラ遺伝子は、遺伝子発現を促進する１つまたは複数のイントロンを含んでいてもよい。
【０１７５】
コード領域の発現を誘発する任意のプロモータと任意のターミネータの組み合わせを、キメラ遺伝子配列に使用することができる。プロモータとターミネータのいくつかの適当な例は、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものを含む。使用できる１つの効率的な植物プロモータのタイプは、高レベルの植物プロモータである。このようなプロモータを本発明の遺伝子配列と操作可能に結合させれば、本発明の遺伝子産物の発現を促進することができるはずである。本発明で使用できる高レベルの植物プロモータは次のものを含む。
１．）大豆由来の、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモータ（ベリー−ロー（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．１：４８３−４９８（１９８２））。
２．）クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモータ。
これらの２つのプロモータは植物細胞内で光誘導性であることが知られている（たとえば  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．カシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）編、Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク（１９８３）、ｐ２９−３８。コルッツィ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：１３９９（１９８３）。ダンスムイア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）  Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：２８５（１９８３））。
【０１７６】
ついで本発明のキメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを構成する。プラスミドベクターの選択は、宿主植物の形質転換のために使用する方法に依存する。当業者であれば、キメラ遺伝子を含む宿主細胞を形質転換、選択、増殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝因子を熟知しているであろう。また当業者であれば、異なる独立した形質転換イベントにより、異なる発現レベルとパターンが生じることも認識しているであろう（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８（１９８５）。デアルマイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６（１９８９））。したがって所望の発現レベルとパターンを示す細胞株を得るためには多数のイベントをスクリーニングしなければならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン解析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析（クロチェック（Ｋｒｏｃｚｅｃｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン解析、またはフェノタイプ解析によって可能である。
【０１７７】
一部の応用では、本発明のタンパク質を異なる細胞分画に向けることが有効である。したがって、適当な細胞間ターゲット配列を加えるか、および／またはすでに存在しているターゲット配列を除去することによって、酵素をコードするコード配列を改変することにより、上記のキメラ遺伝子をさらに補足することができる。
１．）トランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）、Ｋ．、Ｃｅｌｌ  ５６：２４７−２５３（１９８９））。
２．）シグナル配列。または
３．）小胞体局在化をコードする配列（クリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３（１９９１））、または、核局在化シグナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）Ｎ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２（１９９２））。
引用された参照は個別の例を挙げているが、このリストは包括的なものではなく、将来的には本発明により有用なターゲットシグナルが発見される可能性もある。
【０１７８】
タンパク質の操作
本発明のｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各ヌクレオチドを、強化された活性または改変された活性を有する遺伝子産物の生成に使用することが企図されている。自然の遺伝子配列に突然変異を起こし、改変されるかまたは強化された活性を有する遺伝子産物を生成せしめる種々の方法が知られている。この中には次のような方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。１．）エラープローンＰＣＲ（メリニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６−１０６２（１９９９年２月１５日））。２．）部位特異的変異導入法（クームズ（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、ｐ２５９−３１１、１  ｐｌａｔｅ．アンジェルッティ，ルース  ホーグ）（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ：サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）  カリフォルニア州）。３．）「遺伝子シャフリング」（米国特許第５，６０５，７９３号明細書。米国特許第５，８１１，２３８号明細書。米国特許第５，８３０，７２１号明細書。米国特許第５，８３７，４５８号明細書。これらは参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１７９】
遺伝子シャフリング法は、容易な実装、高率の突然変異生成、容易なスクリーニングのために特に魅力的である。遺伝子シャフリングプロセスは、目的の遺伝子に類似していてもよく異なっていてもよい領域を有する追加のＤＮＡフラグメント群の存在下で、目的の遺伝子を制限エンドヌクレアーゼにより、特定の大きさのフラグメントに開裂することを含む。ついでこのフラグメントのプールを変性し、再びアニーリングして突然変異した遺伝子を作成する。ついで、突然変異遺伝子を改変された活性についてスクリーニングする。
【０１８０】
この方法により、本発明の本微生物配列は、改変または強化された活性について、突然変異およびスクリーニングすることができる。配列は二重鎖構造で、５０ｂｐから１０ｋＢの範囲の種々の範囲にわたるべきである。配列は、当技術でよく知られた制限エンドヌクレアーゼを使用して約１０ｂｐから１０００ｂｐの範囲のフラグメントにランダムに消化することができる。（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）。本発明の微生物の配列に加えて、微生物配列のすべてまたは一部とハイブリダイズできるフラグメント群を追加してもよい。同様に、本配列とハイブリダイズできないフラグメント群を追加してもよい。典型的には、これらの追加フラグメント群は全核酸に対して重量で約１０倍から２０倍過剰な量を追加する。一般にこのプロセスに従う場合、混合物内の異なる特定の核酸フラグメントは約１００から約１０００になる。ランダムな核酸フラグメントの混合群を変性し、一本鎖核酸フラグメントを形成して、再アニーリングする。他の一本鎖核酸フラグメントと相同な領域を有する一本鎖核酸フラグメントだけが再アニーリングする。ランダム核酸フラグメントは加熱により変性することができる。当業者であれば二本鎖核酸を完全に変性するために必要な条件を決定することができるであろう。好ましくは、温度は約８０℃から１００℃である。核酸フラグメントは冷却すると再アニーリングすることができる。好ましくは、温度は約２０℃から７５℃である。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を添加すると復元を加速することができる。適当な塩濃度は０ｍＭから２００ｍＭの範囲であってよい。ついでアニーリングした核酸フラグメントを、核酸ポリメラーゼとｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下で培養する。核酸ポリメラーゼは、クレノーフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、または当業者に知られているその他のＤＮＡポリメラーゼであってよい。ポリメラーゼは、アニーリングの前にランダム核酸フラグメントに追加してもよいし、または、アニーリングと同時、またはアニーリングの後に追加してもよい。ポリメラーゼ存在下で変性、復元、培養のサイクルを所望の回数だけ繰り返す。好ましくは、サイクルは、約２回から５０回繰り返し、より好ましくは１０回から４０回繰り返す。この結果、約５０ｂｐから約１００ｋＢの範囲の大きな二本鎖ポリヌクレオチドである核酸が得られる。これを標準のクローニングプロトコルと発現プロトコルによって、発現と改変された活性についてスクリーニングする（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）上記）。
【０１８１】
さらに、遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）を使用して機能ドメインを融合させることによって、ハイブリッドタンパク質を組み立てることができる（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１０６９−１０７３（１９９７））。本発明の遺伝子の機能ドメインを他の遺伝子の機能ドメインと組み合わせて、所望の触媒機能を有する新規な酵素を作成することができる。ＰＣＲオーバーラップ伸張法を使用してハイブリッド酵素を構成し、当業界で知られた技術を使用して種々の発現ベクターにクローン化することができる。
【実施例】
【０１８２】
本発明はさらに次の例の中で定義される。これらの例は本発明の好ましい実施形態を示しているが、説明の目的のためだけに与えられていることを理解されたい。当業者であれば、上記の議論および実施例から本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神および範囲から離れることなく、本発明に対して種々の変更および修正を行って種々の使用法と条件に適応させることが可能である。
【０１８３】
一般的な方法
例の中で使用する標準の組み換えＤＮＡと分子クローニング技術は当業界でよく知られており、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上記）、シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）（上記）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上記）の文献に記述されている。
【０１８４】
細菌培養の維持と増殖に適した材料および方法も当業界で知られている。次の例で使用するために適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ  ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ、マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス  Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル  Ｒ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）（１９９４）。またはブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上記）。細菌細胞の増殖と維持に使用するすべての試薬、制限酵素、材料は、他に別段の記載のない限り、アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト、ミシガン州）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ゲイザーズバーグ、メリーランド州）、またはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（セントルイス、ミズーリ州）から得た。
【０１８５】
配列データは、ベクターと挿入特異的プライマを組み合わせ、ダイターミネータ技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、ＥＰ２７２，００７号明細書）を使用してＡＢＩ自動シーケンサ上で生成した。配列の編集と組み立てはセクエンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）ＴＭバージョン４．０．５（ジーンコード社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、アナーバー、ミシガン州）で行った。すべての配列は両方の方向で少なくとも２回のカバレッジを示す。遺伝子配列の操作は、ベクターＮＴＩ  ７．０プログラム（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ７．０）（インフォーマックス社（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）ベテスダ、メリーランド州）を使用して行った。ペアワイズ比較はベクターＮＴＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ）でデフォルト値を使用して行なった。ＢＬＡＳＴ解析は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトに掲載されたデフォルトの値の組を使用して行った。
【０１８６】
略語の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒、「ｍｉｎ」は分、「ｈ」は時間、「ｄ」は日、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）、「Ｍ」はモル、「ｍｍｏｌ（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）」はミリモル、「μｍｏｌ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）、「ｇ」はグラム、「μｇ」はマイクログラム、「ｎｇ」はナノグラム、「Ｕ」はユニット、「ｂｐ」は塩基対、「ｋＢ」はキロベース。
【０１８７】
実施例１
カロテノイド生成菌株ＤＣ２６０の分離
この実施例では、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する、菌株ＤＣ２６０と示される、黄色の色素を有する細菌の分離と同定を説明する。この生物の中で生成された自然のカロテノイドの分析により、ゼアキサンチン、種々のゼアキサンチン前駆物質、ゼアキサンチン誘導体が確認される。
【０１８８】
菌株の分離と１６Ｓ  ｒＲＮＡのタイピング
新規なカロテノイド生成細菌の菌株を分離するために、色素を有する微生物を環境サンプルの収集物から単離された。デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）の郊外で西向きの壁にあるれんがの面を１０ｍＬの水道水で洗い、この水を収集した。ループでかきとった１０μＬの水をルリアブロス（Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）平板上に画線し、平板を３０℃で培養した。種々のコロニーの外見を呈する色素を有する細菌を相同性に関してＬＢ平板上に２回画線し、３０℃で培養した。これらのコロニーから、淡黄色の滑らかな半透明のコロニーを形成したコロニーを「菌株ＤＣ２６０」と名づけた。
【０１８９】
菌株ＤＣ２６０は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによってタイピングした。具体的には、菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＨＫ１２（配列番号１３）とＪＣＲ１４（配列番号１４）のプライマを使用してＰＣＲ法によって増幅した。増幅した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して製造業者の指示（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））にしたがって精製し、自動ＡＢＩシーケンサ上で配列決定した。配列決定反応はＨＫ１２、ＪＣＲ１４、ＪＣＲ１５（配列番号１５）のプライマで開始した。組み立てた１３２７ｂｐの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１６）を、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に対するＢＬＡＳＴＮ検索（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））のクエリー配列として使用した。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定により、この菌株が、レクレルシア  アデカルボキシラータ（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ  ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａ）とエンテロバクター  インターメディウス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）という２つのＢＳＬ１生物としてタイピングされた菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９８％の配列の類似性を共有しており、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）族に属することが示唆された。
【０１９０】
ＤＣ２６０のカロテノイド分析
ＤＣ２６０の中の黄色の色素をＨＰＬＣで抽出および解析した。菌株をＬＢ１００ｍＬの中で、３０度で１８時間培養した。細胞を１５分４０００ｇの遠心分離にかけて収集した。細胞ペレットを５ｍＬアセトン＋５ｍＬメタノールで抽出した。窒素存在下で溶媒を乾燥し、カロテノイドを０．５のｍＬアセトン＋０．５ｍＬメタノールに再懸濁してＨＰＬＣ解析を行った。抽出物をアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録商標）ＣＲ２５ｍｍシリンジフィルタ（パルコーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）アナーバー、ミシガン州）でろ過し、アジレント１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ  ＳＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  １１００ＬＣ／ＭＳＤ  ＳＩ）（アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して解析した。
【０１９１】
サンプル（２０μＬ）を、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ＺＯＲＢＡＸ  Ｃ１８（３．５μｍ粒子）カラム（アジレントテクノロジーズ社）にロードした。カラムの温度を４０℃に維持した。流量は１ｍＬ／ｍｉｎで、使用した溶媒実行プログラムは次の通りである。
・  ０−２分。９５％バッファＡ、５％バッファＢ。
・  ２−１０分。９５％バッファＡと５％バッファＢから、６０％バッファＡと４０％バッファＢへ線形勾配。
・  １０−１２分。６０％バッファＡと４０％バッファＢから、５０％バッファＡと５０％バッファＢへ線形勾配。
・  １２−１８分。５０％バッファＡと５０％バッファＢ。
・  １８−２０分。９５％バッファＡと５％バッファＢ。
バッファＡは９５％アセトニトリルと５％ｄＨ２Ｏであり、バッファＢは１００％テトラヒドロフランであった。
【０１９２】
ＨＰＬＣ解析（図３）により、菌株ＤＣ２６０は、カロテネイチャー社（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ）（ルプシンゲン（Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ）、スイス）から購入した本物のゼアキサンチンとβ−クリプトキサンチンの標準との比較によって、ゼアキサンチン（５．７６分ピーク）、β−クリプトキサンチン（９．７８分ピーク）を生成したことが示された。ＭＳ分析により、ゼアキサンチンピークの分子量が５６９、β−クリプトキサンチンピークの分子量が５５３であることを確認した。ゼアキサンチンより早く溶出した他のピークは、ＬＣ／ＭＳによってゼアキサンチン誘導体である可能性が示唆された（たとえばゼアキサンチンモノグルコシドとジグルコシド）。
【０１９３】
実施例２
菌株ＤＣ２６０の有色素コスミドクローンの同定
実施例２では、菌株ＤＣ２６０からゲノムＤＮＡの約４０ｋＢフラグメントを発現できる大腸菌コスミドクローンの形成を説明する。この形質転換体は、ゼアキサンチン、種々のゼアキサンチン前駆物質、ゼアキサンチン誘導体を生成した。
【０１９４】
染色体ＤＮＡの調製
ＤＣ２６０は、通気しながら１晩にわたって３０℃でＬＢ培地２５ｍＬで培養した。細菌細胞は１０分間、４，０００ｇの遠心分離を行った。細胞ペレットを、５０ｍＭ  トリス−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８）５ｍＬの中で静かに再懸濁し、リゾチームを加えて最終濃度を２ｍｇ／ｍＬとした。この懸濁液を３７℃で１時間培養した。ついで、硫酸ドデシルナトリウムを加え、最終濃度を１％とし、１００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを加えた。懸濁液を５５℃で２時間培養した。懸濁液は透明になり、透明な溶解物を等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）２回抽出し、ついでクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。４，０００ｒｐｍの遠心分離を２０分間行い、液相を注意深く取り出して新しいチューブに移した。２ボリュームのエタノールを添加し、ＤＮＡを密閉ガラスパスツールピペットで静かにスプールした。ＤＮＡは７０％エタノールを含む管に浸けた。空気乾燥の後、ＤＮＡをＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍＬ）存在下のＴＥ（１０ｍＭトリス−１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）４００μＬの中で再懸濁し、４℃で保存した。ＤＮＡの濃度および純度は、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の分光測光法で測定した。
【０１９５】
コスミドライブラリ（化合物群）の構築
ＤＣ２６０コスミドライブラリを、エピセンターテクノロジーズ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）が市販するｐＷＥＢコスミドクローニングキットを使用して、製造業者の指示にしたがって構成した。ゲノムＤＮＡをシリンジニードルを介して通過することにより剪断した。剪断されたＤＮＡの末端を処理し、４０−ｋＢ標準との比較により、低い融点のアガロース上でサイズを選択した。約４０ｋＢ長のＤＮＡフラグメントを精製し、ブラント末端クローニング準備ｐＷＥＢコスミドベクターの中にライゲートした。ライブラリを、高性能マックスプラックスラムダパッケージングエクストラクト（ＭａｘＰｌａｘ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ）を使用してパッケージし、ＥＰＩ１００大腸菌細胞上に置いた。コスミドライブラリクローンから２つの黄色のコロニーが同定された。２つのクローンからのコスミドＤＮＡは同様な制限消化パターンを有していたので、この後の解析は１つのクローンについて行った。
【０１９６】
黄色のコスミドクローンのカロテノイド解析
実施例１で説明したように、コスミドｐＷＥＢ−２６０を含む大腸菌ＥＰＩ１００中のカロテノイドをＬＣ−ＭＳで解析した。ＨＰＬＣの結果を図４に示す。ＵＶスペクトル、分子量、本物の標準との比較に基づき、５．７４分のピークはゼアキサンチンと同定された。β−カロテン、またはβ−クリプロキサンチンの中間物は蓄積しなかった。ゼアキサンチンより早く溶出した他のピークは、ゼアキサンチン誘導体（たとえばゼアキサンチンモノグルコシドとジグルコシド）の可能性が高い。
【０１９７】
実施例３
カロテノイド生合成遺伝子の同定
この実施例では、コスミドｐＷＥＢ−２６０内の菌株ＤＣ２６０  ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺの各遺伝子の同定について説明し、他の知られたパントエアｃｒｔ遺伝子に対するこれらの遺伝子の関連性を比較する。
【０１９８】
ＨＰＬＣ解析は、コスミドｐＷＥＢ−２６０がゼアキサンチンとゼアキサンチン誘導体を合成する遺伝子を含むことを示唆している。カロテノイド合成遺伝子を配列決定するために、コスミドＤＮＡｐＷＥＢ２６０をエピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）が市販するＥＺ：：ＴＮ＜ＴＥＴ−１＞キットを使用して、製造業者の指示に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏ転移した。ＴＥＴ−１  ＦＰ−１フォワードプライマ（配列番号１７）を使用して、トランスポゾンの末端から２００のテトラサイクリン耐性トランスポゾン挿入の配列を決定した。配列の組み立ては、シーケンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）プログラム（ジーンコード社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、アナーバー、ミシガン州）で行った。ＤＣ２６０由来のカロテノイド合成遺伝子を含む６９９９ｂｐコンティグ（配列番号１８）を構成した（図５）。
【０１９９】
ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺをコードする遺伝子は、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（非冗長ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）ＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンクから導出された配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪの各データベースの全部を含む）に含まれる配列に対する類似性について、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアライメント検索ツール。アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｃｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、上））検索を行って同定した。配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して「ｎｒ」データベースに含まれるすべての公的に使用可能なＤＮＡ塩基配列に対する類似性に関して解析した。すべてのリーディングフレームでＤＮＡ配列を翻訳し、ＮＣＢＩが提供するＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュＷ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）、ステーツ、Ｄ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２（１９９３））を使用して、「ｎｒ」データベースに含まれるすべての公的に使用可能なタンパク質配列に対する類似性に関して比較した。
【０２００】
すべての比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを使用して行った。ＢＬＡＳＴ比較の結果は表２に示す。表２は各遺伝子がもっとも高い類似性を有する配列をまとめたものである。表２は、ＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づいたデータを示し、値は予想値を示す。期待値は、このサイズのデータベースの検索において偶然絶対に期待できる、所与のスコアに対する一致の統計的な有意性を推定し、一致の数を指定する。
【０２０１】
菌株ＤＣ２６０のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を種々のパントエア菌株由来のヌクレオチド配列とアミノ酸配列に比較した。表３はペアワイズ比較に関する同一性をまとめたものである。
【０２０２】
【表３】
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【０２０３】
【表４】
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【０２０４】
【表５】
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【０２０５】
実施例４
メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおけるＤＣ２６０のｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスタの発現
次の実施例は、β−カロテンなど望ましい４０−炭素カロテノイドの合成を可能にするために、ＤＣ２６０（実施例３）由来のｃｒｔＥＸＹＩＢの各遺伝子を含むｃｒｔ遺伝子クラスタを、メチロモナス１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ２４０２）に導入した実験を説明する。
【０２０６】
まずプライマｐＷＥＢ２６０Ｆ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１９）と、ｐＷＥＢ２６０Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号２０）を使用し、ＰＣＲによってｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子を含む、ＤＣ２６０由来のフラグメントを増幅した。コスミドＤＮＡ  ｐＷＥＢ−２６０をテンプレートとして、Ｐｆｕターボポリメラーゼ（ストラータジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホーヤ、カリフォルニア州）と共に使用し、次の温度サイクル条件を使用した。９２℃（５分）、９４℃（１分）、６０℃（１分）、７２℃（９分）で２５サイクルと、７２℃（１０分）。ゲル電気泳動を行い、約５．８ｋＢの単一の産物を観察した。Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））を７２℃１０分の反応で使用し、追加の３’アデノシンヌクレオチドをフラグメントに付加して、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールズバッド、カリフォルニア州））の中へＴＯＰＯクローニングした。大腸菌ＴＯＰ１０細胞への形質転換を行うと、いくつかのコロニーが黄色になり、これらがカロテノイド化合物を生成していることが示された。ついで、遺伝子クラスタを、広い宿主域ベクトルｐＢＨＲ１（モビテック  ＬＬＣ社（ＭｏＢｉＴｅｃ，ＬＬＣ）、マルコ島、フロリダ州）へサブクローニングし、大腸菌１０Ｇ細胞（ルチゲン社（Ｌｕｃｉｇｅｎ）ミドルタウン、ウィスコンシン州）へエレクトロポレーションした。この結果得られた、プラスミドｐＤＣＱ３２９を含んだ形質転換体を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ培地上で選択した。
【０２０７】
プラスミドｐＤＣＱ３２９はトリペアレンタルコンジュガルメイティング法（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｍａｔｉｎｇ）でメチロモナス属１６ａへ転移した。ｐＲＫ２０１３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３７１５９）を含む大腸菌ヘルパー菌株と、ｐＤＣＱ３２９を含む大腸菌１０Ｇドナー菌株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地で１晩培養し、ＬＢ内で３回洗浄し、元の培養ボリュームの約６０倍の濃度を表すＬＢボリューム内で再懸濁した。
【０２０８】
メチロモナス属１６ａ  ＭＷＭ１０００（Δａｌｄ／ｃｒｔＮ１）菌株は、ａｌｄ／ｃｒｔＮ１遺伝子の単一のクロスオーバノックアウトを含んでおり、これによって自然なＣ３０カロテノイドの合成が分裂された（米国仮特許出願第６０／５２７０８３号）。この（Δａｌｄ／ｃｒｔＮ１）菌株を、国際公開第０２／１８６１７号パンフレットに記述される一般条件を使用してレシピエントとして増殖した。簡単に言えば、メチロモナス属１６ａ  ＭＷＭ１０００菌株を、血清ストッパホイートンボトル（ｓｅｒｕｍ  ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ  Ｗｈｅａｔｏｎ  ｂｏｔｔｌｅ）（ホイートンサイエンティフィック社（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ホイートン  イリノイ州）の中で、少なくとも８：１の割合の気体／液体比を使用して（すなわち、１６０ｍＬの全ボリュームの中に硝酸塩溶液「ＢＴＺ−３」培地を２０ｍＬ）常に振動させて３０℃で増殖した。
【０２０９】
本明細書では「定義された培地」または「ＢＴＺ−３」培地とも呼ばれる硝酸塩液体培地は、次に示す（表４と５）溶液１と混合した種々の塩を含むか、または、指定された硝酸塩を１５ｍＭ塩化アンモニウムと置換した培地である。溶液１は、微量金属の１００倍濃縮保存溶液の組成を提供する。
【０２１０】
【表６】
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【０２１１】
【表７】
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【０２１２】
培養のための標準気相は２５％のメタンを空気中に含む。ＭＷＭ１０００レシピエントはこの条件下で４８時間に渡ってＢＴＺ−３培地で培養し、ＢＴＺ−３で３回洗浄し、元の培養ボリュームの１５０倍の濃度を表すＢＴＺ−３のボリュームの中に再懸濁した。
【０２１３】
ついで、ドナー細胞、ヘルパー細胞、レシピエント細胞のペーストを１：１：２の比で、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物を含むＢＴＺ−３寒天平板面上で組み合わせた。平板を３０℃で２５％メタン存在下で１６時間から７２時間に渡って放置し、接合を発生させ、この後細胞ペーストを収集してＢＴＺ−３内に再懸濁した。希釈液を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＢＴＺ−３寒天に乗せ、１週間に渡り２５％メタン存在下で３０℃で培養した。黄色の被接合体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＢＴＺ−３寒天上に画線した。
【０２１４】
カロテノイド組成を解析するために、被接合体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む２５ｍＬのＢＴＺ−３内で培養し、２５％メタンを単一の炭素源として３０℃で３日から４日に渡って培養した。遠心分離によって細胞を収集し、−２０℃で冷凍した。融解してペレットを抽出し、ＨＰＬＣでカロテノイド内容を解析した。これは実施例１に記述した通りである。
【０２１５】
ｐＤＣＱ３２９を含むメチロモナス１６ａからの抽出物についてＨＰＬＣ解析を行ったところ、ほとんどβ−カロテンだけが生成されていることが示された（図６）。保持時間、ＵＶスペクトル、１４分のピーク分子量は、本物のβ−カロテン標準（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス  ミズーリ州）と一致する。これにより、ペクトバクテリウムシプリペディＤＣ２６０由来のｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスタを使用したメタノトロフ宿主内で、Ｃ４０カロテノイドが合成されたことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】上流イソプレン生合成経路と下流カロテノイド生合成経路を示す図である。
【図２】ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺによって触媒される特定の化学変換を示す、下流Ｃ４０カロテノイド生合成経路の一部を示す図である。
【図３】ペクトバクテリウムシプリペディＤＣ４１６の中に含まれるカロテノイドのＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図４】コスミドｐＷＥＢ−４１６を含む形質転換体大腸菌内に含まれるカロテノイドのＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図５】カロテノイド生合成遺伝子ｃｒｔＥＸＹＩＢＺを含む遺伝子クラスタを示す図である。
【図６】ｐＤＣＱ３３１を含むメチロモナス１６ａ  ＭＷＭ１０００（ａｌｄ−／ＣｒｔＮ１−）菌株由来のカロテノイドのＨＰＬＣ解析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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