(57)【要約】  本発明は、α２／δ１遺伝子のターゲティングされた破壊を含有する非ヒト哺乳動物および動物細胞を特徴とする。
2006524049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ２１７様突然変異を含むα２／δ１遺伝子を含む、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物であって、該修飾が：
ａ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから非アルギニンへの置換を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｂ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから脂肪族アミノ酸への置換を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｃ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンからアラニンへの置換を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｄ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｅ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を、そしてα２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｆ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、そしてα２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｇ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を、そしてα２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、α２／δ１ポリペプチド；および
ｈ）前記ＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニン以外の位で、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、ａ）〜ｇ）記載のα２／δ１ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする突然変異α２／δ１遺伝子を生じる、前記非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物であって、該修飾が：
ａ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから非アルギニンへの置換を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｂ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから脂肪族アミノ酸への置換を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｃ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンからアラニンへの置換を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｄ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｅ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を、そしてα２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｆ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、そしてα２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｇ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を、そしてα２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；および
ｈ）前記ＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニン以外の位で、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、ａ）〜ｇ）記載のα２／δ１ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする突然変異α２／δ１遺伝子を生じる、前記非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物であって、該修飾が：
ａ）２１５位、２１７位または両方にアルギニン以外のアミノ酸を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｂ）２１５位、２１７位または両方に脂肪族アミノ酸を有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｃ）２１５位、２１７位または両方にアラニンを有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；
ｄ）２１５位、２１７位または両方にリジンを有することを除いて、野生型α２／δ１ポリペプチドと同一である、α２／δ１ポリペプチド；および
ｅ）残基２１５および２１７以外の位で、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、ａ）〜ｄ）記載の野生型哺乳動物α２／δ１ポリペプチド；
ここで、前記α２／δ１ポリペプチドはリーダー配列を欠く
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする突然変異α２／δ１遺伝子を生じる、前記非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
請求項２の哺乳動物であって：
ａ）前記哺乳動物の中枢神経系へのα２／δリガンド結合が減少する表現型特性；
ｂ）前記哺乳動物の中枢神経系へのガバペンチン結合が減少する表現型特性；
ｃ）前記哺乳動物におけるα２／δリガンドの鎮痛効力が減少する表現型特性；
ｄ）前記哺乳動物におけるプレガバリンの鎮痛効力が減少する表現型特性；
ｅ）鎮静試験に供された前記哺乳動物において、α２／δリガンドの鎮静効力が減少する表現型特性；
ｆ）鎮静試験に供された前記哺乳動物において、α２／δリガンドの抗痙攣効力が減少する表現型特性；および
ｇ）鎮静試験に供された前記哺乳動物において、α２／δリガンドの抗不安効力が減少する表現型特性
からなる群より選択される表現型特性を、少なくとも１つ示す、前記哺乳動物。
【請求項６】
請求項１または２の哺乳動物であって：
ａ）げっ歯類；
ｂ）マウス；
ｃ）前記修飾に関してホモ接合性である、請求項２の非ヒト哺乳動物；
ｄ）前記野生型α２／δ１ペプチドが、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１に示される、請求項３の非ヒト哺乳動物；および
ｅ）請求項７の核酸配列を含む、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物
から選択される、前記哺乳動物。
【請求項７】
ａ）配列番号１７に示されるポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする配列を有する核酸分子；
ｂ）配列番号１８に示されるポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする配列を有する核酸分子；
ｃ）配列番号１９に示されるポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする配列を有する核酸分子；
ｄ）配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を含む、ａ）記載の単離核酸分子；
ｅ）配列番号２１または配列番号２２に示されるヌクレオチド配列を含む、ｂ）記載の単離核酸分子；および
ｆ）配列番号２３または配列番号２４に示されるヌクレオチド配列を含む、ｃ）記載の単離核酸分子
から選択される、単離核酸分子。
【請求項８】
請求項２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む、トランスジェニック動物を産生するためのターゲティングベクター。
【請求項９】
ａ）請求項８のベクターを含む宿主細胞；
ｂ）遺伝子修飾された動物細胞であって、該修飾が請求項２記載のポリペプチドをコードする突然変異遺伝子を含む、前記動物細胞；
ｃ）胚性幹（ＥＳ）細胞またはＥＳ様細胞である、ｂ）の動物細胞；
ｄ）突然変異遺伝子を生じる修飾を含有する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離された、ｂ）の動物細胞；
ｅ）胚性線維芽細胞、幹細胞、ニューロン、骨格筋または心筋細胞、筋芽細胞、褐色または白色脂肪細胞、肝細胞、または膵臓β細胞である、ｂ）の動物細胞；
ｆ）ネズミである、ｂ）の動物細胞；
ｇ）ヒトである、ｂ）の動物細胞；および
ｈ）前記修飾に関してホモ接合性である、ｂ）の動物細胞
から選択される細胞。
【請求項１０】
障害または活性に対する化合物の生理学的効果が、α２／δリガンドの生理学的効果を仲介するα２／δ１サブユニット・ポリペプチド残基に関連するかどうかを決定する方法であって：
ｉ）請求項２記載の哺乳動物の第１群および対応する野生型哺乳動物の第２群を提供し、
ｊ）前記各群の第１のサブセットをα２／δリガンドで処置し、
ｋ）前記各群の第２のサブセットを試験化合物で処置し、
ｌ）α２／δ１と関連する活性または障害に関して、各サブセットを試験し、そして
ｍ）前記各群およびサブセットの応答を比較する
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
α２／δ１サブユニット・ポリペプチドを通じて、障害または活性に対する生理学的効果を発揮する化合物を同定する方法であって
ａ）請求項２記載の哺乳動物の第１群および対応する野生型哺乳動物の第２群を提供し、
ｂ）前記各群を試験化合物で処置し、
ｃ）α２／δ１と関連する活性または障害に関して、各群を試験し、そして
ｄ）前記各群の応答を比較する
ことを含む、前記方法。
【請求項１２】
α２／δ１サブユニット・ポリペプチドを通じて、障害または活性に対する生理学的効果を発揮する化合物を同定する方法であって
ｅ）請求項２記載の哺乳動物の第１群および対応する野生型哺乳動物の第２群を提供し、
ｆ）前記群各々の第１のサブセットをα２／δ１サブユニット・ポリペプチドに結合するリガンドで処置し、
ｇ）前記群各々の第２のサブセットを試験化合物で処置し、
ｈ）α２／δ１と関連する活性または障害に関して、各サブセットを試験し、そして
ｉ）前記各群およびサブセットの応答を比較する
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記リガンドがガバペンチンまたはプレガバリンである、請求項１０または１２の方法。
【請求項１４】
活性または障害におけるα２／δ１ポリペプチドの役割を決定する方法であって
ｊ）請求項２記載の哺乳動物の第１群および対応する野生型哺乳動物の第２群を提供し、
ｋ）前記各群を、活性または障害の指標となる方法に供し、そして
ｌ）前記各群の応答を比較する
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記活性または障害が、疼痛、痛覚過敏、不安症、鎮静、癲癇、痙攣から選択される、請求項１０、１２または１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、突然変異α２／δ１サブユニット遺伝子を含有する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
α２／δ１は、電圧感受性カルシウムチャネルの補助的サブユニットである。このサブユニットは、これらのチャネルが適切に機能するのに必要である。α２／δ１は、癲癇、不安症、疼痛、無痛覚症、耳鳴り、偏頭痛予防、および体熱感において役割を果たすことが知られる。ＭｃＬｅａｎ  ＭＪら（１９９３）Ｎｅｕｒｏｌ．  ４３：２２９２−２２９８；Ｆｉｅｌｄら（２００１），  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３２（Ｊａｎ）：ｌ−４；Ｍａｕｒｉ  ＭＣら（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２１（３）：１６９−７４；Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｉら（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，  ２９６（２）（Ｆｅｂ）：２７０−５；Ｂａｕｅｒ  ＣＡおよびＢｒｏｚｏｓｋｉ  ＴＪ（２００１）ＪＡＲＯ  ２（１）（Ｍａｒ）：５４−６４；Ｍａｔｈｅｗ  ＮＴら（２００１）Ｈｅａｄａｃｈｅ  ４１（Ｆｅｂ）：１１９−２８；並びにＬｏｐｒｉｎｚｉら（２００２）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ，  ７７（１１）（Ｎｏｖ）：１１５９−６３を参照されたい。しかし、これらの疾患におけるこのタンパク質の病態生理学的役割は不明なままである。
【０００３】
このタンパク質は、これまでのところ、α２／δ１〜α２／δ４の４つのメンバーを含む、ファミリーのメンバーである。例えば、α２／δ１〜α２／δ４を、それぞれ、α２δ−Ａ、α２δ−Ｂ、α２δ−Ｃ、およびα２δ−Ｄと称する、ＷＯ  ００／２０４５０を参照されたい。α２／δ１サブユニットのＧｅｎｂａｎｋ寄託番号には：Ｍ７６５５９（ヒト）；Ｕ７３４８３、Ｕ７３４８４、Ｕ７３４８５、Ｕ７３４８６、およびＵ７３４８７（マウス）；Ｍ８６６２１（ラット）；並びにＡＦ０７７６６５（ブタ）が含まれる。ＢｒｏｗｎおよびＮ．  Ｇｅｅ．（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２５４５８−２５４６５もまた、参照されたい。
【０００４】
α２／δ１およびα２／δ２タンパク質は、抗痙攣剤、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸（ガバペンチン）に高親和性で結合することが示されてきている。ガバペンチンおよび他のα２／δ１リガンドがチャネル活性に何らかの機能的効果を有する能力に関しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイによって、相反する結果が示されてきている。Ｓｔｅｆａｎｉ  Ａら（２００１）Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓ；４３（３）：２３９−４８；およびＮｇ  ＧＹら（２００１）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｊａｎ；５９（１）：１４４−５２を参照されたい。ガバペンチンのブタα２／δ１サブユニットへの結合は、Ｒ２１７Ａ突然変異によって非常に減少することも可能であり；これは、２１７位（リーダー配列を有するこのポリペプチドでは２４１位）の単一のアミノ酸を、アルギニンからアラニンに突然変異させることによる（Ｗａｎｇ，  Ｍら（１９９９），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４２：３１３−３２０）。
【０００５】
Ｒ２１７ＡおよびＲ２１７Ａ様突然変異を含むα２／δ１突然変異体マウスを含む、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物などの研究ツールは、α２／δ１作用の生理学的役割をさらに定義し；α２／δ１リガンドのその結合部位への結合と関連する療法的関係をさらに定義し；これらの突然変異体動物をα２／δリガンドで処置し、そして該化合物がなお有効であり、そして／または同じ特性を保持するかどうかを決定することによって、α２／δリガンドの作用機構をｉｎ  ｖｉｖｏでさらに試験し；α２／δリガンドの効果を仲介する際の、α２／δ１ポリペプチドの相対的寄与を決定し；化合物をプロファイリングして、化合物のα２／δサブタイプ選択性を決定し；α２／δリガンドが関与するシグナル伝達経路を同定し；不安症、抑うつ症、統合失調症、双極性疾患、および他の障害を含む、疾患プロセスにおけるα２／δの役割を試験し；心臓血管疾患プロセスにおけるα２／δの役割を試験し；そしてこれらの突然変異体トランスジェニック動物を他の動物、好ましくは他のα２／δ突然変異体動物と交配させることによって、交配中間体として該動物を用い；そしてα２／δ活性に影響を及ぼす際のロイシンの役割を決定するのに有用である（Ｂｒｏｗｎ  ＪＰ，  Ｄｉｓｓａｎａｙａｋｅ  ＶＵ，  Ｂｒｉｇｇｓ  ＡＲ，  Ｍｉｌｉｃ  ＭＲ，  Ｇｅｅ  ＮＳ（１９９８）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊａｎ  １５；２５５（２）：２３６−４３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
上述のように、α２／δ１は、癲癇、不安症、疼痛および無痛覚症、耳鳴り、偏頭痛予防、および体熱感などの障害に役割を有することが知られている。しかし、これらの障害における該タンパク質の病態生理学的役割は不明のままである。
【０００７】
特定のタンパク質の生理学的役割および病理学的役割を研究するには、ノックアウト動物が価値ある研究ツールであることもまた知られている。例えば、Ｓｔｅｅｌｅ，  ＰＭ，  ＪＦ  Ｍｅｄｉｎａ，  ＷＬ  Ｎｏｒｅｓ，  およびＭＤ  Ｍａｕｋ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５（７）：８７９−８８２を参照されたい。
【０００８】
しかし、α２／δ１の場合、α２／δ１ポリペプチド／機能の完全な消滅は致死的であるため、完全なα２／δ１ノックアウト動物を産生する試みは失敗している。これに関連して、エクソン８を欠失させると（例えば図１）、カルシウムチャネル機能に関して機能しないα２／δ１タンパク質が生じた。しかし、ヘテロ接合体×ヘテロ接合体交配から生まれる動物はいずれも、４世代に渡って、ヌル（エクソン８欠失に関してホモ接合）の遺伝子型を持たなかった。
【０００９】
本発明は、突然変異α２／δ１遺伝子を含む、生存可能な、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物を含む。当業者は、本発明を記載するため、本明細書において、説明および付随する請求項で用いられる用語を完全に理解するであろう。にもかかわらず、本明細書に別に記載しない限り、以下の用語は、すぐ下に記載するとおりである。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、Ｒ２１７Ａ様突然変異を含む、生存可能な、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物を含む。１つの態様において、哺乳動物はげっ歯類であり；別の態様において、マウスであり；そして別の態様において、哺乳動物はＲ２１７様突然変異に関してホモ接合性である。「Ｒ２１７Ａ様突然変異」によって、α２／δ１ポリペプチドをコードする哺乳動物遺伝子において、少なくとも１つのヌクレオチドの置換または欠失を意味することが意図され、ここで前記置換または欠失を有する前記遺伝子を含み、そして前記ポリペプチドを発現する、遺伝子修飾された動物または動物細胞は、生存可能であり、そしてガバペンチン、またはガバペンチンおよび１以上の他のα２／δリガンドの結合が減少しているかまたは排除されている表現型を示す。本発明のこの側面において、「α２／δリガンド」には、限定されるわけではないが、プレガバリン、並びにＥＰ６４１３３０、ＷＯ０１２８９７８、ＷＯ０２／０８５８３９、ＰＣＴ／ＩＢ０３／００９７６、ＥＰ６４１３３０に記載されるもの、特に、プレガバリン、ＵＳ５５６３１７５、ＷＯ９７３３８５８、ＷＯ９７３３８５９、ＷＯ９９３１０５７、ＷＯ９９３１０７４、ＷＯ９７２９１０１、ＷＯ０２０８５８３９、ＷＯ９９３１０７５、ＷＯ９９２１８２４、ＷＯ０１９００５２、ＷＯ０１２８９７８、ＥＰ０６４１３３０、ＷＯ９８１７６２７、ＷＯ００７６９５８、ＰＣＴ／ＩＢ０３／００９７６、ＥＰ１１７８０３４、ＥＰ１２０１２４０、ＷＯ９９３１０７４、ＷＯ０３０００６４２、ＷＯ０２２２５６８、ＷＯ０２３０８７１、ＷＯ０２３０８８１、ＷＯ０２１００３９２、ＷＯ０２１００３４７、ＷＯ０２４２４１４、ＷＯ０２３２７３６およびＷＯ０２２８８８１、ＷＯ０３０８２８０７  Ａ２；米国出願第６０／５０７４４３号；米国特許、ＵＳ４０２４１７５、６６３５６７３  Ｂｌ、６６４２３９８  Ｂ２、および６５１８２８９  Ｂ１が含まれる。
【００１１】
１つの態様において、突然変異遺伝子は、２１７位（リーダー配列を有するポリペプチドでは２４１位）にアラニンを有する、α２／δ１ポリペプチドをコードする。２１７位の対応する野生型残基は、アルギニンであることが知られる。別の態様において、突然変異遺伝子は、２１５位（リーダー配列を有するポリペプチドでは２３９位）にアラニンを有する、α２／δ１ポリペプチドをコードする。１つの態様において、この哺乳動物はマウスである。本発明は、いかなる特定の機構にも限定されないが、２１７位または２１５位でのこのアルギニンからアラニンへの突然変異（それぞれ、Ｒ２１７ＡまたはＲ２１５Ａ）あるいは両方の突然変異等は、ガバペンチン結合活性が減少したかまたは排除されている；が、生存に必要とされるようである機能するカルシウムチャネルの形成に関与する能力を保持する、α２／δ１ポリペプチドを産生するトランスジェニック動物を産生すると想定される。この突然変異は、該突然変異を含むよう産生されるトランスジェニック動物に関して、組織特異的方式または偏在的方式で行われることも可能であることが認識される。
【００１２】
したがって、本発明は、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物であって、該修飾が、２１７位および／または２１５位のアルギニンをその位でアラニンに改変する突然変異α２／δ１遺伝子を生じる、前記非ヒト哺乳動物を含む。１つの態様において、この哺乳動物は、ガバペンチン、またはガバペンチンおよび１以上の他のα２／δリガンドの結合が、減少しているかまたは排除されている表現型を示す。１つの態様において、哺乳動物はげっ歯類であり；別の態様において、マウスであり；そして別の態様において、哺乳動物はＲ２１７Ａ様突然変異に関してホモ接合性である。
【００１３】
別の態様において、Ｒ２１７Ａ様突然変異は、アルギニン−アルギニン−アルギニン（ＲＲＲ）モチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから非アルギニンへの置換を含む。典型的には、このＲＲＲモチーフは、全野生型α２／δ１において、唯一のＲＲＲモチーフである。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：Ｍ７６５５９（ヒト）；Ｕ７３４８３；Ｕ７３４８４、Ｕ７３４８５、Ｕ７３４８６、およびＵ７３４８７（マウス）；Ｍ８６６２１（ラット）；並びにＡＦ０７７６６５（ブタ）を参照されたい。典型的には、このＲＲＲモチーフは、フォン・ウィルブラント・ドメインの１０〜１２残基Ｎ末端側に見られる（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎ  ＶおよびＡｒａｖｉｎｄ  Ｌ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．  ２５（１１）：５３５−７；Ｂｏｒｋ  ＰおよびＲｏｈｄｅ  Ｋ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２７９（３）：９０８−１０）。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ７３４８７に示すマウスα２／δ１ポリペプチドにおいて、フォン・ウィルブラント・ドメインは、残基２２７〜４１１（リーダー配列を有するポリペプチドでは２５１位〜４３５位）に見られ、一方、ＲＲＲモチーフは、残基Ｒ２１５〜Ｒ２１７（リーダー配列を有するポリペプチドでは２３９位〜２４１位）に見られる。例えば、α２／δ１サブユニットのＧｅｎｂａｎｋ参考文献：Ｍ７６５５９（ヒト）；Ｕ７３４８３、Ｕ７３４８４、Ｕ７３４８５、Ｕ７３４８６、およびＵ７３４８７（マウス）；Ｍ８６６２１（ラット）；並びにＡＦ０７７６６５（ブタ）を参照されたい。
【００１４】
別の態様において、ＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つのアルギニンから非アルギニンへの突然変異は、アルギニンから脂肪族アミノ酸への突然変異である。別の態様において、この突然変異は、アルギニンからアラニンへの突然変異である。別の態様において、この突然変異は、アルギニンからリジンへの突然変異である。
【００１５】
さらに別の態様において、Ｒ２１７Ａ様突然変異は、α２／δ１ポリペプチド由来のＲＲＲモチーフ内の隣接アルギニン残基の少なくとも１つの欠失を含む。例えば、本発明は、配列番号２９に示すα２／δ１ポリペプチドからのＲ２３９；Ｒ２４１；Ｒ２３９およびＲ２４１；またはＲ２３９、Ｒ２４０およびＲ２４１の欠失を含む。配列番号２９に示す残基Ｒ２３９〜Ｒ２４１は、成熟ポリペプチドのＲ２１５〜Ｒ２１７に対応する。「成熟」によって、同じポリペプチドであるが、リーダー配列を欠いているものが意図される。別の態様において、Ｒ２１７Ａ様突然変異は、ＲＲＲモチーフ内の隣接アルギニン残基の少なくとも１つの欠失に加えて、α２／δ１ポリペプチドから；ＲＲＲ残基のＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、そして／またはＲＲＲ残基のＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を含む。すなわち、Ｒ２１７Ａ様突然変異は、α２／δ１ポリペプチドから、１７までの連続残基の欠失を含み、ここで１０〜１２番目の欠失残基は、本明細書記載のＲＲＲ残基からなり；そして欠失は、ＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つを含む。例えばＲ２１７Ａ様突然変異は、配列番号２９に示すマウスα２／δ１ポリペプチドから残基２３０  ＰＮＫＩＤＬＹＤＶＲＲＲＰＷＹＩＱ  ２４６の欠失を含む。
【００１６】
本発明のＲ２１７様突然変異は、本明細書に言及するＧｅｎｂａｎｋ参考文献に示すα２／δ１サブユニット各々に、容易に適用可能である。
本発明はさらに、１以上のＲ２１７様突然変異に加えて、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むα２／δ１ポリペプチドを含む、生存可能な、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物をさらに含み；ここで前記保存的アミノ酸置換は、１以上のＲ２１７様突然変異を含むα２／δ１ポリペプチドの生物学的機能を有意には改変しない。すなわち、前記Ｒ２１７様突然変異（単数または複数）および前記保存的アミノ酸置換（単数または複数）を含む、遺伝子修飾された動物または動物細胞は、生存可能であり、そしてガバペンチン、またはガバペンチンおよび１以上の他のα２／δリガンドの結合が減少しているかまたは排除されている表現型を示す。
【００１７】
保存的アミノ酸置換は、当該技術分野に周知である。例えば、典型的には、保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ間での互いの交換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、並びに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での交換である。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性があるかに関する手引きは、Ｂｏｗｉｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見られる。保存的アミノ酸置換は、１つの群内のメンバーを同じ群内の別のメンバーと交換することを伴い、これらの群には、以下のように、芳香族、疎水性、極性、塩基性、酸性、および小さいアミノ酸の群が含まれる：
芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；
疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン；
極性：グルタミン、アスパラギン
塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン
酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
小：アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシン。
【００１８】
特定の態様において、本発明は、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物であって、該修飾が：
ａ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから非アルギニンへの置換を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｂ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンから脂肪族アミノ酸への置換を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｃ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の２つの隣接アルギニンの少なくとも１つに、アルギニンからアラニンへの置換を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｄ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、α２／δ１ポリペプチド；
ｅ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、
α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を、そして
α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、
α２／δ１ポリペプチド；
ｆ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＮ末端にすぐ接して９残基までの欠失を、そして
α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、
α２／δ１ポリペプチド；
ｇ）α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフのＣ末端にすぐ接して５残基までの欠失を、そして
α２／δ１ポリペプチドに唯一のＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニンの少なくとも１つの欠失を含む、
α２／δ１ポリペプチド；および
ｈ）前記ＲＲＲモチーフ中の隣接アルギニン以外の位で、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、ａ）〜ｇ）記載のα２／δ１ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする突然変異α２／δ１遺伝子を生じる、前記非ヒト哺乳動物を含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、遺伝子修飾された動物細胞であって、該修飾が突然変異α２／δ１遺伝子を含む、前記動物細胞を含む。１つの態様において、細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞またはＥＳ様細胞であり；別の態様において、細胞はネズミまたはヒトであり；そして別の態様において、細胞は、修飾に関してホモ接合性である。
【００２０】
さらに別の態様において、細胞は、突然変異α２／δ１遺伝子を生じる修飾を含む、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離される。特定の態様において、細胞は胚性線維芽細胞、幹細胞、ニューロン、骨格筋または心筋細胞、筋芽細胞、褐色または白色脂肪細胞、肝細胞、または膵臓β細胞である。
【００２１】
本発明はまた、癲癇、神経障害性疼痛、または不安症の療法剤を同定する方法であって、本明細書記載の本発明の遺伝子修飾された哺乳動物に剤を投与し、そして前記剤に対する該哺乳動物の応答を解析することを含む、前記方法も含む。１つの態様において、この哺乳動物は、突然変異α２／δ１遺伝子に関してホモ接合性である、非ヒト哺乳動物である。特定の態様において、この非ヒト哺乳動物はマウスである。癲癇、神経障害性疼痛、または不安症を評価するための方法は、当該技術分野に知られ、そして／または例として、本明細書の別の箇所に記載される。
【００２２】
本発明はまた、動物細胞において、α２／δ１活性が減少した結果として、発現修飾を示す遺伝子を同定する方法であって、突然変異α２／δ１遺伝子を含有する動物細胞の発現プロフィールを評価し、そして該プロフィールを野生型細胞由来のプロフィールと比較することを含む、前記方法も特徴とする。１つの態様において、細胞は、突然変異α２／δ１遺伝子に関してホモ接合性である。
【００２３】
別の態様において、本発明は、動物細胞において、α２／δ１活性が減少した結果として、発現修飾または翻訳後修飾を示すタンパク質を同定する方法であって、突然変異α２／δ１遺伝子を含有する動物細胞のプロテオミクス・プロフィールを評価し、そして該プロフィールを野生型細胞由来のプロフィールと比較することを含む、前記方法を含む。１つの態様において、細胞は、突然変異に関してホモ接合性である。
【００２４】
本明細書記載の突然変異を含有する本発明の哺乳動物または細胞が、前記哺乳動物または細胞に関して内因性のα２／δ１遺伝子に前記突然変異を含有することも可能であるし、あるいは突然変異を含有する遺伝子が、前記哺乳動物または細胞に関して部分的にまたは完全に異種であることも可能であることが認識される。したがって、本発明のこの側面において、哺乳動物または細胞は、該哺乳動物または細胞に部分的にまたは完全に異種であり、そしてＲ２１７様突然変異を含有するポリペプチドをコードする、α２／δ１遺伝子を含有する。例えば、本発明は、本明細書記載のＲ２１７様突然変異を含有するマウスであって、前記Ｒ２１７様突然変異が、非マウスα２／δ１哺乳動物遺伝子またはその部分に含有される、前記マウスを含む。
【００２５】
あるいは、哺乳動物または細胞は、該哺乳動物または細胞に内因性であるが、Ｒ２１７様突然変異を含有するポリペプチドをコードする、α２／δ１遺伝子を含有する。
「遺伝子修飾された」非ヒト哺乳動物または動物細胞は、遺伝子操作によって、非ヒト哺乳動物または動物細胞に導入された、あるいは先祖非ヒト哺乳動物または動物細胞に導入された修飾に関して、ヘテロ接合性またはホモ接合性である。修飾を導入するのに利用可能な、遺伝子操作の標準的方法には、相同組換え、ウイルスベクター遺伝子トラッピング、放射線照射、化学的突然変異誘発、および単独で、または触媒性リボザイムと組み合わせて、アンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列のトランスジェニック発現が含まれる。遺伝子を破壊する遺伝子修飾の好ましい方法は、遺伝子座に「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）核酸配列」を挿入することによって、例えば相同組換えまたはウイルスベクター遺伝子トラッピングによって、内因性遺伝子を修飾する方法である。「外来核酸配列」は、遺伝子において、天然に存在しない、外因性配列である。外来ＤＮＡのこの挿入は、α２／δ１遺伝子のいかなる領域中、例えばエンハンサー、プロモーター、制御因子領域、非コード領域、コード領域、イントロン、またはエクソンいずれで生じることも可能である。遺伝子破壊のための遺伝子操作の最も好ましい方法は相同組換えであり、この場合、外来核酸配列が、ターゲティング方式で、単独で、または内因性遺伝子配列の一部の欠失と組み合わせて、挿入される。
【００２６】
「突然変異」α２／δ１遺伝子によって、通常はα２／δ１遺伝子の野生型を発現する細胞において、突然変異遺伝子にコードされるα２／δ１ポリペプチドの細胞性活性が改変されるか、減少するか、または排除されるように、遺伝子修飾されたα２／δ１遺伝子が意味される（例えば上に論じるようなＲ２１７様突然変異）。遺伝子修飾が、細胞において、α２／δ１遺伝子のすべての野生型コピーを有効に排除する場合（例えば遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物または動物細胞が、α２／δ１遺伝子破壊に関してホモ接合性であるか、あるいは元来存在するα２／δ１遺伝子の唯一の野生型コピーが、現在、突然変異されている場合）、遺伝子修飾は、野生型α２／δ１遺伝子を発現する対照細胞に比較した際、α２／δ１ポリペプチド活性の改変、減少、または排除を生じる。好ましくは、この修飾は、野生型α２／δ１遺伝子を発現する対照細胞に比較した際、α２／δ１ポリペプチド活性の減少または排除を生じる。本発明はいかなる特定の機構にも束縛されないが、α２／δ１ポリペプチド活性のこの排除、減少、または改変は、突然変異α２／δ１遺伝子が、野生型α２／δ１ポリペプチドに比較して、機能が改変された、例えば減少するかまたは排除された、突然変異ポリペプチドをコードするために生じる。この側面において、活性の減少は、対応する野生型の活性に、突然変異ポリペプチドを発現している、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物または動物細胞におけるα２／δ１ポリペプチドの活性を比較することによって検出可能な量いずれかである。１つの態様において、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物または動物細胞におけるα２／δ１ポリペプチドの活性は、野生型レベルの５０％以下に減少し；別の態様において、２５％以下に減少し；そして別の態様において、１０％以下に減少する。特定の態様において、α２／δ１遺伝子突然変異は、野生型に比較して検出不能なα２／δ１活性を生じる。
【００２７】
１つの態様において、先行する段落に言及する活性は、リガンド結合活性である。結合アッセイなど、タンパク質へのリガンド結合を測定する方法が当該技術分野に知られる。１つの態様において、先行する段落に言及する活性は、ガバペンチン結合活性である。ガバペンチン結合を測定する方法は、当該技術分野に知られるか、または本明細書に別に開示される。例えば、Ｗａｎｇ，  Ｍ；Ｏｆｆｏｒｄ，  Ｊ；Ｏｘｅｎｄｅｒ  ＤＬ；およびＳＵ  Ｔ−Ｚ（１９９９），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４２：  ３１３−３２０を参照されたい。他のα２／δリガンドの結合が結合アッセイで測定可能であることが認識される。
【００２８】
「突然変異α２／δ１遺伝子を含有する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物」によって、突然変異α２／δ１遺伝子を含有するよう遺伝子操作することによって生成された非ヒト哺乳動物とともに、突然変異α２／δ１遺伝子を受け継いだ、こうした非ヒト哺乳動物の子孫が意味される。遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物は、例えば、望ましい遺伝子修飾を所持する胚盤胞または胚を生成して、そして次いで、この胚盤胞または胚を、子宮内発生のため、里親に移植することによって、産生可能である。遺伝子修飾された胚盤胞または胚は、マウスの場合、遺伝子修飾された胚性幹（ＥＳ）細胞をマウス胚盤胞に移植するか、または四倍体胚とＥＳ細胞を凝集させることによって、作成可能である。あるいは、多様な種の遺伝子修飾された胚を、核移植によって得ることも可能である。核移植の場合、ドナー細胞は体細胞または多能性肝細胞であり、そして該細胞は、α２／δ１遺伝子を破壊する、望ましい遺伝子修飾を含有するよう操作される。次いで、この細胞の核を、除核した受精卵母細胞または単為生殖卵母細胞に移植し；生じた胚を再構築して、そして胚盤胞に発生させる。次いで、上記方法のいずれかによって産生された、遺伝子修飾された胚盤胞を、当業者に周知の標準法にしたがって、里親に移植する。「遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物」には、子孫がα２／δ１遺伝子を破壊する遺伝子修飾の少なくとも１コピーを受け継いでいるならば、上述の方法によって生成された非ヒト哺乳動物のすべての子孫が含まれる。遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物のすべての体細胞および生殖系列細胞が修飾を含有することが好ましい。突然変異α２／δ１遺伝子を含有するよう遺伝子修飾された、好ましい非ヒト哺乳動物には、マウスおよびラットなどのげっ歯類、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、およびケナガイタチ（ｆｅｒｒｅｔ）が含まれる。
【００２９】
「突然変異α２／δ１遺伝子を含有する、遺伝子修飾された動物細胞」によって、突然変異α２／δ１遺伝子を含有するよう遺伝子操作することによって生成された、ヒト細胞を含む動物細胞とともに、突然変異α２／δ１遺伝子を受け継ぐ娘細胞が意味される。これらの細胞は、当該技術分野に知られる標準法いずれにしたがって、培養中で遺伝子修飾されることも可能である。培養中の細胞の遺伝子修飾の代替法として、α２／δ１遺伝子破壊を含有する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から、非ヒト哺乳動物細胞を単離することもまた可能である。本発明の動物細胞を、初代細胞または組織調製物とともに、培養に適応した腫瘍原性または形質転換細胞株から得ることも可能である。これらの細胞および細胞株は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、島細胞、ニューロン、および他の神経組織由来細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または臓器（例えば精巣、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、および皮膚）の細胞、筋細胞（骨格筋、平滑筋、および心筋由来の細胞を含む）、外分泌または内分泌細胞、線維芽細胞、および胚細胞および他の全能性または多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞、ＥＳ様細胞、および胚性生殖系列（ＥＧ）細胞、および他の幹細胞、例えば前駆細胞および組織由来幹細胞）由来である。好ましい遺伝子修飾された細胞は、ＥＳ細胞であり、より好ましくは、マウスまたはラットＥＳ細胞であり、そして最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞である。
【００３０】
「α２／δ１活性減少」によって、細胞において、機能するα２／δ１ポリペプチドのレベルの減少を引き起こす、α２／δ１遺伝子の遺伝子操作の結果として生じる、α２／δ１タンパク質のα２／δリガンド結合活性の減少が意味される。１つの態様において、α２／δ１活性の減少は、Ｒ２１７Ａ突然変異の結果としての、ガバペンチン結合活性減少に関する。
【００３１】
「ＥＳ細胞」または「ＥＳ様細胞」によって、胚由来、始原生殖細胞由来、または奇形癌腫由来の多能性幹細胞であって、無限に自己再生するとともに、３つの胚層すべての典型的な細胞種に分化することが可能な細胞が意味される。
【００３２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであろう。本発明は、特定の態様に関連して記載されているが、実施可能な他の変化および修飾もまた、本発明の一部であり、そしてやはり、付随する請求項の範囲内にあることが理解されるであろう。本出願は、一般的に、本発明の原理にしたがう、本発明の同等物、変動、使用、または適応いずれも含むことが意図され、これには、当該技術分野の技術範囲内の既知のまたは習慣的な実施内にあり、そして過度の実験を伴わずに確認可能である、本開示からの逸脱が含まれる。核酸およびポリペプチドを作成し、そして用いることに関する、さらなる手引きは、分子生物学、タンパク質科学および免疫学の標準的な教科書に見出される（例えばＤａｖｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．  ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  １９８６；Ｈａｍｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  ＩＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照されたい）。本明細書に言及するすべての刊行物は、公表特許出願および発行特許を含めて、完全に本明細書に援用される。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
発明の詳細な説明
破壊されたα２／δ１遺伝子を含有する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を提供する。本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物、およびヒト細胞を含む、遺伝子修飾された動物細胞は、α２／δ１遺伝子を破壊する修飾に関して、ヘテロ接合性またはホモ接合性である。動物細胞は、培養中の細胞を遺伝子操作することによって得られることも可能であるし、または非ヒト哺乳動物細胞の場合、細胞は、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離されることも可能である。
【００３４】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞は、α２／δ１作用の生理学的役割をさらに定義し；α２／δ１リガンドのその結合部位への結合と関連する療法的関係をさらに定義し；これらの突然変異体動物をα２／１リガンドで処置し、そして該化合物がなお有効であり、そして／または同じ特性を保持するかどうかを決定することによって、α２／δリガンドの作用機構をｉｎ  ｖｉｖｏでさらに試験し；α２／δリガンドの効果を仲介する際の、α２／δ１ポリペプチドの相対的寄与を決定し；化合物をプロファイリングして、該化合物のα２／δサブタイプ選択性を決定し；α２／δリガンドが関与するシグナル伝達経路を同定し；神経障害性疼痛；不安症、抑うつ症、統合失調症、双極性疾患、および他の障害を含む、疾患プロセスにおけるα２／δの役割を試験し；心臓血管疾患プロセスにおけるα２／δの役割を試験し；そしてこれらの突然変異体トランスジェニック動物を他の動物、好ましくは他のα２／δ突然変異体動物と交配させることによって、交配中間体として該動物を用い；そしてα２／δ活性に影響を及ぼす際のロイシンの役割を決定するのに有用である（Ｂｒｏｗｎ  ＪＰ，  Ｄｉｓｓａｎａｙａｋｅ  ＶＵ，  Ｂｒｉｇｇｓ  ＡＲ，  Ｍｉｌｉｃ  ＭＲ，  Ｇｅｅ  ＮＳ（１９９８）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊａｎ  １５；２５５（２）：２３６−４３）。
【００３５】
本発明の哺乳動物および動物細胞は、さらに、動物細胞において、α２／δ１活性が減少した結果、発現修飾を示す単数または複数の遺伝子を同定し、動物細胞において、α２／δ１活性が減少した結果、発現修飾または翻訳後修飾を示す単数または複数のタンパク質を同定し、野生型動物に比較して、α２／δ１仲介障害または活性において、応答修飾を有するトランスジェニック動物を産生し、障害または活性に対する化合物の生理学的効果が、α２／δリガンドの生理学的効果を仲介するα２／δ１サブユニット・ポリペプチド残基に関与するかどうかを決定し、化合物が、ガバペンチンが作用するのと同じα２／δ１サブユニット・ポリペプチド残基を通じて、障害または活性に対する生理学的効果を発揮するかどうかを決定し、α２／δ１サブユニット・ポリペプチドを通じて、障害または活性に対する生理学的効果を発揮する化合物を同定し、そして活性または障害におけるα２／δ１ポリペプチドの単数または複数の役割を決定するのに有用である。
【００３６】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を生成するため、当該技術分野に知られる遺伝子修飾のための技術を用いて、α２／δ１遺伝子座を突然変異させることも可能であり、これらの技術には、化学的突然変異誘発（Ｒｉｎｃｈｉｋ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１５−２１，１９９１、Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ２３（補遺２４）：２３−２９，  １９９４）、放射線照射（Ｒｕｓｓｅｌｌ、上記）、単独の、または触媒性ＲＮＡリボザイム配列と組み合わせた、α２／δ１遺伝子アンチセンスＲＮＡのトランスジェニック発現（Ｌｕｙｃｋｘら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９６：１２１７４−７９，  １９９９；Ｓｏｋｏｌら，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３６３−７１，  １９９６；Ｅｆｒａｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２０５１−５５，  １９９４；Ｌａｒｓｓｏｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：２２４２−４８，  １９９４）、および以下にさらに論じるような、α２／δ１遺伝子座への外来核酸配列の挿入による、α２／δ１遺伝子の破壊（Ｗａｔｔｌｅｒら  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：１１５０−１１６０，  １９９９）が含まれる。好ましくは、α２／δ１遺伝子は、外来核酸配列の挿入によって突然変異され、より好ましくは、相同組換えによって、またはウイルスベクターの挿入によって突然変異される。さらにより好ましくは、α２／δ１遺伝子破壊の方法は、相同組換えであり、そして内因性α２／δ１遺伝子配列の一部の欠失を含む。
【００３７】
外来配列の組込みは、以下の機構の１以上を通じて、α２／δ遺伝子を破壊する：α２／δ１遺伝子転写または翻訳プロセスに干渉することによって（例えばプロモーター認識に干渉することによって、またはα２／δ１遺伝子に転写終結部位または翻訳停止コドンを導入することによって）；正常機能を持つα２／δ１ポリペプチドをもはやコードしないように、α２／δ１遺伝子コード配列を歪めることによって（例えばα２／δ１遺伝子コード配列に外来コード配列を挿入することによって、フレームシフト突然変異またはアミノ酸（単数または複数）置換を導入することによって；または二重クロスオーバー事象の場合、機能するα２／δ１タンパク質発現に必要なα２／δ１遺伝子コード配列の一部を欠失させることによって）。
【００３８】
本説明に基づいて、細胞ゲノム中のα２／δ１遺伝子座に外来配列を挿入して、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を生成するため、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、リポソーム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクション、またはトランスファー感染（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）などの当該技術分野に知られる標準法にしたがって、細胞に外来ＤＮＡ配列を導入する（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １：８４１−８４５，  １９８２；Ｐｏｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：７１６１−６５，  １９８４；Ｃｈｕら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：１３１１−２６，  １９８７；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２，  １９８７；Ｂａｕｍら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：１０５８−６２，  １９９４；Ｂｉｅｗｅｎｇａら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１：６７−７５，  １９９７；Ｚｈａｎｇら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−７２，  １９９３；ＲａｙおよびＧａｇｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５９８−６０３，  １９９２；Ｌｏ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：１８０３−１４，  １９８３；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １０：９３−１０１，  １９９８；Ｌｉｎｎｅｙら，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．（オーランド）２１３：２０７−１６，  １９９９；ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５０−１５３，  １９８９；並びにＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：４４５−４８，  １９８６を参照されたい）。細胞に外来ＤＮＡを導入するのに好ましい方法は、エレクトロポレーションである。
【００３９】
１．相同組換え
相同組換えの方法は、α２／δ１遺伝子を含有する細胞に、α２／δ遺伝子ターゲティングベクターを導入することによって、破壊のため、α２／δ遺伝子をターゲティングする。該ベクターは、α２／δ１遺伝子に相同なベクター中のヌクレオチド配列を用いて、α２／δ１遺伝子をターゲティングする。この相同領域は、ベクターおよびα２／δ１遺伝子の内因性配列間のハイブリダイゼーションを容易にする。ハイブリダイゼーションすると、ターゲティングベクターおよびゲノム配列間のクロスオーバー事象の見込みは、非常に増加する。こうしたクロスオーバー事象によって、α２／δ１遺伝子座へのベクター配列の組込みが生じ、そしてα２／δ１遺伝子の機能破壊が生じうる。
【００４０】
ターゲティングに用いるベクターの構築に関する一般的な原理は、Ｂｒａｄｌｅｙら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：５３４，  １９９２）およびＷａｔｔｌｅｒら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：１１５０−１１６０，  １９９９）に概説される。相同組換えによってＤＮＡを挿入するのに使用可能な２種のベクターは、挿入ベクターおよび置換ベクターである。相同組換えによって、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を調製するのに好ましいベクターは、置換ベクターである。
【００４１】
挿入ベクターは、二本鎖破損とともにα２／δ遺伝子相同領域を含む、環状ＤＮＡ分子である。相同領域および内因性α２／δ１遺伝子間のハイブリダイゼーション後、二本鎖破損部位での単一クロスオーバー事象は、クロスオーバー部位での内因性遺伝子への全ベクター配列の挿入を生じる。
【００４２】
置換ベクターは、環状でなく直鎖である。α２／δ１遺伝子への置換ベクター組込みは、二重クロスオーバー事象、すなわちターゲティングベクターおよびα２／δ遺伝子間のハイブリダイゼーションの２部位でのクロスオーバーを必要とする。この二重クロスオーバー事象の結果、α２／δ１遺伝子に、クロスオーバー２部位間に挟まれたベクター配列が組み込まれ、そしてクロスオーバー２部位間に元来広がっていた、対応する内因性α２／δ１遺伝子配列の欠失が生じる（例えばＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉら，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２，  １９８７；Ｍａｎｓｏｕｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−５２，  １９８８；Ｍａｎｓｏｕｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：７６８８−７６９２，  １９９０；およびＭａｎｓｏｕｒ，  ＧＡＴＡ  ７：２１９−２２７，  １９９０を参照されたい）。
【００４３】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を生成するのに用いるターゲティングベクターにおける相同領域は、一般的に、長さ少なくとも１００ヌクレオチドである。最も好ましくは、相同領域は、長さ少なくとも１〜５キロ塩基（ｋｂ）である。相同領域に必要な最小の長さまたは最小の関連性の度合いは立証されていないが、相同組換えのターゲティング効率は、一般的に、ターゲティングベクターおよびα２／δ１遺伝子座間の長さおよび関連性の度合いに対応する。置換ベクターを用いる場合、そして内因性α２／δ１遺伝子の一部が相同組換えに際して欠失される場合、さらなる検討材料は、内因性α２／δ１遺伝子の欠失部分のサイズである。内因性α２／δ１遺伝子のこの部分が、長さ１ｋｂより大きい場合、組換え効率を増進するため、１ｋｂより長い相同領域を含むターゲティングカセットが推奨される。本説明に基づく相同組換えに有効な配列の選択および使用に関するさらなる手引きは、文献に記載される（例えばＤｅｎｇおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：３３６５−３３７１，  １９９２；Ｂｏｌｌａｇら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３：１９９−２２５，  １９８９；並びにＷａｌｄｍａｎおよびＬｉｓｋａｙ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：５３５０−５３５７，  １９８８を参照されたい）。
【００４４】
本発明に基づいて当業者が認識するように、本発明のα２／δ１遺伝子ターゲティングベクターの構築において、ベクター主鎖として、非常に多様なクローニングベクターを使用可能であり、これらには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ関連プラスミド（例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋１１）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤｌ０、ファージスクリプト、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢＫファージミド、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５  ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ＰＭＳＧ、およびｐＳＶＬ、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２２に基づくベクター、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージＣｈａｒｏｎ  ２８、ｐＫＢｌｌ、ｐＫＳＶ−１０、ｐＫｌ９関連プラスミド、ｐＵＣプラスミド、およびプラスミドのｐＧＥＭシリーズが含まれる。これらのベクターは、多様な商業的供給源（例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス；Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ；Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン；およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）から入手可能である。しかし、望ましい宿主において、複製可能で、そして生存可能である限り、他のベクター、例えばプラスミド、ウイルス、またはその一部のいずれを用いることも可能である。ベクターはまた、ゲノムを修飾しようとする宿主において、複製を可能にする配列を含むことも可能である。こうしたベクターを使用すると、組換えが生じうる相互作用期間が拡大され、ターゲティングの効率が増加することも可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  単元９．１６，  図９．１６．１を参照されたい）。
【００４５】
本発明のターゲティングベクターを増殖させるために使用する特定の宿主は、重大ではない。例には、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖａｒら，  Ｇｅｎｅ  ２：９５，  １９７７）、大腸菌Ｋ１２  ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、大腸菌ＭＭ２１（ＡＴＣＣ番号３３６７８０）、大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ番号３３８４９）、大腸菌株ＤＨ５α、および大腸菌ＳＴＢＬ２が含まれる。あるいは、Ｃ．セレビシエ（Ｃ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの宿主を使用可能である。上に言及する宿主は、商業的に入手可能である（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ；およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）。
【００４６】
ターゲティングベクターを生成するため、α２／δ１遺伝子ターゲティング構築物を、例えば上述のベクター主鎖などのベクター主鎖に付加する。本発明のα２／δ１遺伝子ターゲティング構築物は、少なくとも１つのα２／δ１遺伝子相同領域を有する。α２／δ１相同領域を作成するため、α２／δ１ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲプライマーを産生する基礎として用いる。これらのプライマーを用いて、高忠実度ＰＣＲ増幅によって、α２／δ１配列の望ましい領域を増幅する（Ｍａｔｔｉｌａら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４９６７，  １９９１；ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ  １：１７，  １９９１；および米国特許第４，６８３，２０２号）。ゲノム配列をゲノムクローンライブラリーから得るか、またはゲノムＤＮＡの調製物から得て、好ましくはα２／δ１遺伝子破壊のため、ターゲティングしようとする動物種から得る。α２／δ１ターゲティングベクターを作成するのに、α２／δ１  ｃＤＮＡ配列を用いることも可能である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕ２２４４５（ネズミ）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ９５９３６（ヒト）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｄ３００４１（ラット）、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ１８１２６０（雌鶏）、ＢＧ４１０２００（ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）））。好ましくは、本発明のターゲティング構築物には、陽性マーカータンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列もまた含まれる。ベクター組込み後の陽性マーカーの安定発現は、理想的には細胞生存性を危うくすることなく、同定可能な特性を細胞に与える。したがって、置換ベクターの場合、マーカー遺伝子が組込み後に発現されるように配置される方式で、二重クロスオーバー事象後、α２／δ１遺伝子にマーカー遺伝子が組み込まれるように、２つの隣接相同領域間に、マーカー遺伝子が配置される。
【００４７】
陽性マーカータンパク質が、選択可能表現型特性、例えば、マーカータンパク質が存在しなければ致死的である条件下で、細胞の生存を増進する特性を与えることが好ましい。したがって、選択可能条件を課すことによって、生存度に基づいて、ベクター配列組込みが成功しなかった他の細胞から、陽性選択可能マーカーをコードするベクター配列を安定して発現する細胞を単離することも可能である。陽性選択可能マーカータンパク質（およびその選択剤）の例には、ｎｅｏ（Ｇ４１８またはカナマイシン）、ｈｙｇ（ハイグロマイシン）、ｈｉｓＤ（ヒスチジノール）、ｇｐｔ（キサンチン）、ｂｌｅ（ブレオマイシン）、およびｈｐｒｔ（ヒポキサンチン）が含まれる（例えば、ＣａｐｅｃｃｈｉおよびＴｈｏｍａｓ、米国特許第５，４６４，７６４号、並びにＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−９２，  １９８９を参照されたい）。選択可能マーカーの代替物としてやはり使用可能な他の陽性マーカーには、β−ガラクトシダーゼ、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、またはＧＦＰなどのレポータータンパク質が含まれる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  単元９．５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  単元９．６，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  ２０００を参照されたい）。
【００４８】
上記陽性選択工程は、染色体位いずれかへのベクター配列のランダムな非相同組換えと、α２／δ１遺伝子座でのターゲティング相同組換えによってベクターが組み込まれた細胞とを区別しない。したがって、相同組換えのため、置換ベクターを用いて、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を作成する場合、陰性選択可能マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むこともまた、好ましい。陰性選択可能マーカーの発現は、特定の剤に曝露した際、このマーカーを発現する細胞の生存性を失わせる（すなわち、特定の選択可能条件下で、マーカータンパク質が細胞に致死的となる）。陰性選択可能マーカー（およびその致死剤）の例には、単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ（ガンシクロビルまたは１，２−デオキシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル）、Ｈｐｒｔ（６−チオグアニンまたは６−チオキサンチン）、およびジフテリア毒素、リシン毒素、およびシトシン・デアミナーゼ（５−フルオロシトシン）が含まれる。
【００４９】
陰性選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列は、置換ベクターの２つの相同領域の外に配置される。この配置のため、ランダム非相同組換えによって組込みが生じた場合にのみ、細胞が陰性選択可能マーカーを組み込み、そして安定に発現し；α２／δ１遺伝子およびターゲティング構築物中の２つの相同領域間の相同組換えは、陰性選択可能マーカー遺伝子をコードする配列が組み込まれるのを排除する。したがって、陰性条件を課すことによって、ランダム非相同組換えによってターゲティングベクターが組み込まれた細胞は、生存性を失う。
【００５０】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を作成するのに用いるターゲティング構築物においては、陽性および陰性選択可能マーカーの上述の組み合わせが好ましく、これは一連の陽性および陰性選択工程を設計して、相同組換えによるベクター組込みを経て、そしてしたがって潜在的に突然変異されたα２／δ１遺伝子を有する細胞のみがより効率的に選択可能であるためである。陽性−陰性選択スキーム、選択可能マーカー、およびターゲティング構築物のさらなる例が、例えば、米国特許５，４６４，７６４号、ＷＯ  ９４／０６９０８（米国において、米国特許第５，８５９，３１２号として発行）、並びにＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１：１４０２，  １９９１に記載されている。
【００５１】
ベクター組込みに際して、マーカータンパク質が安定に発現されるために、マーカーコード配列が、ベクター組込みの際に内因性α２／δ１遺伝子プロモーターに機能可能であるように連結されるように、ターゲティングベクターを設計することも可能である。次いで、通常、α２／δ１遺伝子を発現する細胞において、α２／δ１遺伝子プロモーターによって、マーカーの発現が駆動される。あるいは、ベクターのターゲティング構築物中の各マーカーは、α２／δ１遺伝子プロモーターと独立に発現を駆動する、自身のプロモーターを含有することも可能である。この後者のスキームは、α２／δ１遺伝子を典型的には発現しない細胞において、マーカーの発現が可能になるという利点を有する（ＳｍｉｔｈおよびＢｅｒｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ４９：１７１，  １９８４；ＳｅｄｉｖｙおよびＳｈａｒｐ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：２２７，  １９８９；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ５１：５０３，  １９８７）。
【００５２】
マーカー遺伝子発現を駆動するのに使用可能な外因性プロモーターには、細胞特異的または段階特異的プロモーター、恒常性プロモーター、および誘導性または制御可能プロモーターが含まれる。これらのプロモーターの限定されない例には、単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＭＣ１−ｎｅｏ、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、鳥類ベータグロビンプロモーター、ヒストンプロモーター（例えばマウスヒストンＨ３−６１４）、ベータアクチンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ、筋肉アクチンプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターが含まれる（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  ２０００；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤを参照されたい）。
【００５３】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を作成する間に、細胞が、ターゲティングされたα２／δ１遺伝子座に組み込まれたベクター配列を有するかどうかを確認するため、望ましいベクター組込み事象に特異的なプライマーまたはゲノムプローブを、ＰＣＲまたはサザンブロット解析と組み合わせて用いて、α２／δ１遺伝子座への望ましいベクター組込みの存在を同定することも可能である（Ｅｒｌｉｃｈら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−５１，  １９９１；ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５０，  １９８９；Ｍｏｕｅｌｌｉｃら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：４７１２，  １９９０；並びにＳｈｅｓｅｌｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：４２９４，  １９９１）。
【００５４】
３．遺伝子トラッピング
本説明に基づいて、α２／δ１遺伝子を破壊するため、α２／δ１遺伝子座に外来核酸配列を挿入するのに利用可能な別の方法は、遺伝子トラッピングである。この方法は、エクソンをスプライシングしてｍＲＮＡにする、すべての哺乳動物細胞に存在する細胞機構を利用して、ランダム方式で、遺伝子に、遺伝子トラップベクターコード配列を挿入する。ひとたび挿入されると、遺伝子トラップベクターは、トラッピングされたα２／δ１遺伝子を破壊しうる突然変異を生成する。相同組換えと対照的に、突然変異誘発のこの系は、広く、ランダム突然変異を生成する。したがって、突然変異α２／δ１遺伝子を含有する、遺伝子修飾された細胞を得るには、多様な遺伝子中にランダム突然変異を含有する細胞のプールから、この特定の突然変異を含有する細胞を同定し、そして選択しなければならない。
【００５５】
ネズミ細胞および他の細胞種を遺伝子修飾するのに用いられる、遺伝子トラッピング系およびベクターが記載されてきている（例えば、Ａｌｌｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：８５２−５５，  １９８８；Ｂｅｌｌｅｎら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：１２８８−１３００，  １９８９；Ｂｉｅｒら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ３：１２７３−１２８７，  １９８９；Ｂｏｎｎｅｒｏｔら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：４９８２−９１，  １９９２；Ｂｒｅｎｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５５１７−２１，  １９８９；Ｃｈａｎｇら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：７３７−４７，  １９９３；ＦｒｉｅｄｒｉｃｈおよびＳｏｒｉａｎｏ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２２５：６８１−７０１，  １９９３；ＦｒｉｅｄｒｉｃｈおよびＳｏｒｉａｎｏ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：１５１３−２３，  １９９１；Ｇｏｆｆ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：４６９−８１，  １９８７；Ｇｏｓｓｌｅｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４６３−６５，  １９８９；Ｈｏｐｅ，  Ｄｅｖｅｌｏｐ．  １１３：３９９−４０８，  １９９１；Ｋｅｒｒら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：７６７−７７６，  １９８９；Ｒｅｄｄｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：１５０７−１５１５，  １９９１；Ｒｅｄｄｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：６７２１−２５，  １９９２；Ｓｋａｒｎｅｓら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ６：９０３−９１８，  １９９２；ｖｏｎ  ＭｅｌｃｈｎｅｒおよびＲｕｌｅｙ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３２２７−３２３３，  １９８９；並びにＹｏｓｈｉｄａら，  Ｔｒａｎｓｇｅｎ．  Ｒｅｓ．  ４：２７７−８７，  １９９５を参照されたい）。
【００５６】
プロモータートラップベクター（または５’ベクター）は、５’から３’の順に、スプライス・アクセプター配列、その後、エクソンを含有し、エクソンは、典型的には、翻訳開始コドンおよびオープンリーディングフレームおよび／または内部リボソーム進入部位に特徴付けられる。一般的に、これらのプロモータートラップベクターは、プロモーターも、また機能可能であるように連結されたスプライス・ドナー配列も、含有しない。その結果、宿主細胞の細胞ゲノムに組み込まれた後、プロモータートラップベクター配列は、上流遺伝子の正常なスプライシングを妨害し、そして末端エクソンとして作用する。ベクターコード配列の発現は、ベクターが、適切な読み枠で、突然変異される遺伝子のイントロンに組み込まれることに依存する。こうした場合、細胞スプライシング機構は、ベクターコード配列の上流のトラッピングされた遺伝子からエクソンをスプライシングする（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、ＷＯ  ９９／５０４２６および米国特許第６，０８０，５７６号）。上記プロモータートラップベクターと類似の効果を生じる代替法は、プロモータートラップベクターのスプライス・アクセプターおよび翻訳開始コドンまたはポリアデニル化配列の間の領域に存在するか、または別の方式でこの領域内に入るよう操作された、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）の停止コドンセットを取り込んだベクターである。コード配列はまた、宿主細胞ゲノム内の組込み部位とは広く独立した方式で、該コード配列が発現されるように、独立リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有するよう、操作されることも可能である。必ずではないが典型的には、入れ子の停止コドンセットと組み合わせて、ＩＲＥＳが用いられる。
【００５７】
別の種類の遺伝子トラッピングスキームは、３’遺伝子トラップベクターを用いる。この種のベクターは、機能可能である組み合わせで、隣接するコード配列の発現を仲介するプロモーター領域、コード配列、およびコード配列エクソンの３’端を定義するスプライス・ドナー配列を含有する。宿主細胞ゲノムに組み込まれた後、該ベクタープロモーターが発現する転写物は、組み込まれた遺伝子トラップベクター配列の下流に位置するトラッピングされた遺伝子由来のスプライス・アクセプター配列にスプライシングされる。したがって、ベクターの組込みは、３’遺伝子トラップカセットのコード配列、並びに末端エクソンおよびそのポリアデニル化シグナルを含む、下流細胞エクソンいずれかを含む融合転写物の発現を生じる。こうしたベクターが遺伝子に組み込まれると、細胞スプライシング機構は、トラッピングされた遺伝子の３’エクソンの上流のベクターコード配列をスプライシングする。こうしたベクターの１つの利点は、３’遺伝子トラップベクターの発現が、遺伝子トラップカセット内のプロモーターによって駆動され、そして宿主細胞で通常発現される遺伝子への組込みを必要としないことである（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、ＷＯ  ９９／５０４２６および米国特許第６，０８０，５７６号）。３’遺伝子トラップベクターに取り込むことも可能な転写プロモーターおよびエンハンサーの例には、ターゲティングベクターに関して上に論じたものが含まれる。
【００５８】
プロモーターまたは３’遺伝子トラップベクターの構造構成要素として使用可能なウイルスベクター主鎖は、ターゲット細胞のゲノムに挿入されることが可能な、広い範囲のベクターから選択可能である。適切な主鎖ベクターには、限定されるわけではないが、単純疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、アルファ−ヘルペスウイルスベクター等が含まれる。ウイルスベクター、特に非複製細胞を修飾するのに適したウイルスベクター、および外因性ポリヌクレオチド配列の発現と組み合わせてこうしたベクターを用いる方法の詳細な概説は、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  サンディエゴ  １９９５に見出されることも可能である。
【００５９】
好ましくは、遺伝子トラッピングには、レトロウイルスベクターを用いる。これらのベクターを、米国特許第５，４４９，６１４号に記載されるレトロウイルス・パッケージング細胞株と組み合わせて用いることも可能である。非ネズミ哺乳動物細胞を遺伝子修飾のターゲット細胞として用いる場合、広宿主性または汎宿主性パッケージング細胞株を用いて、適切なベクターをパッケージングすることも可能である（Ｏｒｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ９３：１１４００−１１４０６，  １９９６）。本明細書に記載する３’遺伝子トラップベクターを生成するのに適応可能な、代表的なレトロウイルスベクターは、例えば米国特許第５，５２１，０７６号に記載される。
【００６０】
遺伝子トラッピングベクターは、相同組換えに用いたターゲティングベクターに関して上に論じた、陽性マーカー遺伝子を１以上含有することも可能である。ターゲティングベクターにおける使用と同様、これらの陽性マーカーを遺伝子トラッピングベクターで用いて、細胞ゲノムに該ベクターを組み込んだ細胞を同定し、そして選択する。マーカー遺伝子を操作して、ベクターがターゲット細胞ゲノムに組み込まれた位置とはほぼ独立な方式で、マーカーが発現されるであろうように、独立のリボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有するようにすることも可能である。
【００６１】
遺伝子トラップベクターが、かなりランダムな方式で、感染宿主細胞のゲノムに組み込まれるとすると、突然変異α２／δ１遺伝子を有する遺伝子修飾細胞を、ランダムなベクター組込みを経た細胞集団から同定しなければならない。好ましくは、細胞集団における遺伝子修飾は、集団が細胞ゲノムに見られる本質的にすべての遺伝子において突然変異を示すように、十分なランダムさおよび頻度で起こり、突然変異α２／δ１遺伝子を持つ細胞が集団から同定される可能性を高める（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、ＷＯ  ９９／５０４２６；Ｓａｎｄｓら、ＷＯ９８／１４６１４および米国特許第６，０８０，５７６号を参照されたい）。
【００６２】
例えば逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、α２／δ１遺伝子配列における突然変異を同定し、突然変異α２／δ１遺伝子を含有する個々の突然変異体細胞株を、突然変異細胞集団中で同定する。クローンをプールすることによって、このプロセスを能率化することも可能である。例えば、突然変異α２／δ１遺伝子を含有する個々のクローンを見出すため、遺伝子トラップベクターに係留される１つのプライマーおよびα２／δ１遺伝子配列中に位置するもう一方のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行う。ＲＴ−ＰＣＲの結果が陽性である場合、ベクター配列がα２／δ１遺伝子転写物にコードされ、遺伝子トラップ組込み事象によってα２／δ１遺伝子が突然変異されていることが示される（例えば、Ｓａｎｄｓら、ＷＯ９８／１４６１４および米国特許第６，０８０，５７６号を参照されたい）。
【００６３】
４．時間的、空間的、および誘導性α２／δ１遺伝子破壊
本発明の特定の態様において、内因性α２／δ１遺伝子の機能する破壊は、特定の発生段階または細胞周期段階（時間的破壊）あるいは特定の細胞種（空間的破壊）で起こる。他の態様において、α２／δ１遺伝子破壊は、特定の条件が存在する場合、誘導性である。リコンビナーゼ切除系、例えばＣｒｅ−Ｌｏｘ系を用いて、特定の発生段階で、特定の組織または細胞種において、または特定の環境条件下で、α２／δ１遺伝子を活性化するかまたは不活性化することも可能である。一般的に、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ技術を利用する方法は、ＴｏｒｒｅｓおよびＫｕｈｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７に記載されるように行われる。ＦＬＰ−ＦＲＴ系を利用して、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系に関して記載されるものと類似の方法論を使用することもまた可能である。相同組換えによって、またはウイルス挿入によって、遺伝子を条件的に破壊する、リコンビナーゼ切除系の使用に関するさらなる手引きは、例えば、米国特許第５，６２６，１５９号、米国特許第５，５２７，６９５号、米国特許第５，４３４，０６６号、ＷＯ  ９８／２９５３３、米国特許第６，２２８，６３９号、Ｏｒｂａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：６８６１−６５，  １９９２；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−５５，  １９９１；Ｓａｕｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：１４７−６１，  １９８９；Ｂａｒｉｎａｇａ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２６−２８，  １９９４；およびＡｋａｇｉら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：１７６６−７３，  １９９７に提供される。１より多いリコンビナーゼ系を用いて、本発明の非ヒト哺乳動物または動物細胞を遺伝子修飾することも可能である。
【００６４】
相同組換えを用いて、時間的、空間的、または誘導性の方式で、α２／δ１遺伝子を破壊する場合、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系などのリコンビナーゼ系を用いて、α２／δ１遺伝子コード領域の部分を、ｌｏｘＰ部位が隣接するα２／δ１遺伝子コード領域を含むターゲティング構築物と交換する。この遺伝子修飾を所持する非ヒト哺乳動物および動物細胞は、機能するｌｏｘＰが隣接するα２／δ１遺伝子を含有する。α２／δ１遺伝子破壊の時間的、空間的、または誘導性の側面は、さらなる導入遺伝子、Ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子の発現パターンによって引き起こされ、該導入遺伝子は、それぞれ、望ましい空間的に制御されるプロモーター、時間的に制御されるプロモーター、または誘導性プロモーターの調節下で、非ヒト哺乳動物または動物細胞において発現される。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位を組換えに関してターゲティングする。したがって、Ｃｒｅ発現が活性化される場合、ＬｏｘＰ部位は、組換えを経て、挟まれたα２／δ１遺伝子コード配列を切除し、α２／δ１遺伝子の機能破壊を生じる（Ｒａｊｅｗｓｋｉら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：６００−０３，  １９９６；Ｓｔ．−Ｏｎｇｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：３８７５−７７，  １９９６；Ａｇａｈら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００：１６９−７９，  １９９７；Ｂｒｏｃａｒｄら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１４５５９−６３，  １９９７；Ｆｅｉｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１０８８７−９０，  １９９６；およびＫｕｅｈｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２７−２９，  １９９５）。Ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子およびｌｏｘＰ隣接α２／δ１遺伝子両方を含有する細胞を、標準的トランスジェニック技術を通じて生成することも可能であるし、または遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物の場合、一方の親がｌｏｘＰ隣接α２／δ１遺伝子を含有し、そしてもう一方の親が望ましいプロモーターの調節下でＣｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子を含有する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物を交配することによって、生成することも可能である。α２／δ１遺伝子を時間的に、空間的に、または条件付きで破壊するためのリコンビナーゼ系および特定のプロモーターの使用に関するさらなる手引きは、例えば、Ｓａｕｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ２２５：８９０−９００，  １９９３、Ｇｕら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−０６，  １９９４、Ａｒａｋｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２２：９７７−８２，  １９９７、Ｄｙｍｅｃｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９３：６１９１−９６，  １９９６、およびＭｅｙｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：１３６−４１，１９９８に見出される。
【００６５】
α２／δ１遺伝子の誘導性破壊は、テトラサイクリン応答性バイナリー系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５５４７−５１，  １９９２）を用いることによってもまた、達成可能である。この系は、細胞を遺伝子修飾して、内因性α２／δ１遺伝子制御要素中にＴｅｔプロモーターを、そしてテトラサイクリン調節可能リプレッサー（ＴｅｔＲ）を発現する導入遺伝子を導入することを伴う。こうした細胞において、テトラサイクリンを投与すると、ＴｅｔＲが活性化され、これが次に、α２／δ１遺伝子発現を阻害し、そしてしたがって、α２／δ１遺伝子を破壊する（Ｓｔ．−Ｏｎｇｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：３８７５−７７，  １９９６、米国特許第５，９２２，９２７号）。
【００６６】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を生成するため、例えば、ＷＯ  ９８／２９５３３および米国特許第６，２８８，６３９号に記載されるような遺伝子修飾の方法として遺伝子トラッピングを用いる際、α２／δ１遺伝子の時間的破壊、空間的破壊、および誘導性破壊のための上述の系を、採用することも可能である。
【００６７】
５．遺伝子修飾された動物細胞の調製
遺伝子修飾のための上述の方法を用いて、動物由来の実質的にあらゆる種類の体細胞または幹細胞のα２／δ１遺伝子を破壊して、本発明の遺伝子修飾された動物細胞を生成することも可能である。本発明の遺伝子修飾された動物細胞には、限定されるわけではないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、および鳥類細胞が含まれる。これらの細胞は、培養に適応した細胞株、腫瘍原性細胞株、または形質転換細胞株などの動物細胞株いずれかを遺伝子操作することから得られることも可能であるし、あるいは望ましいα２／δ１遺伝子修飾を所持する、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離されることも可能である。細胞は、突然変異α２／δ１遺伝子に関して、ヘテロ接合性またはホモ接合性であることも可能である。α２／δ１遺伝子破壊に関してホモ接合性（−／−）である細胞を得るため、両方のアレルを直接、連続してターゲティングすることも可能である。陽性選択可能マーカーを再利用することによって、このプロセスを容易にすることも可能である。このスキームにしたがって、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系を用いて、１つのアレルを破壊した後、陽性選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列を除去する。したがって、ターゲティングの次の周期で、同一ベクターを用いて、第二のα２／δ１遺伝子アレルを破壊することも可能である（ＡｂｕｉｎおよびＢｒａｄｌｅｙ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６：１８５１−５６，  １９９６；Ｓｅｄｉｖｙら，  Ｔ．  Ｉ．  Ｇ．  １５：８８−９０，  １９９９；Ｃｒｕｚら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７１７０−７４，  １９９１；Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７０３６−４０，  １９９１；ｔｅ  Ｒｉｅｌｅら，  Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４８：６４９−６５１，  １９９０）。
【００６８】
α２／δ１であるＥＳ細胞を得る代替戦略は、α２／δ１遺伝子破壊に関してヘテロ接合性（α２／δ１  ＋／−）である細胞集団からの細胞のホモゲノタイゼーション（ｈｏｍｏｇｅｎｏｔｉｚａｔｉｏｎ）である。該方法は、選択可能薬剤耐性マーカーを発現するα２／δ１  ＋／−ターゲティングクローンを、非常に高い薬剤濃度に対して選択する戦略を用い；この選択は、薬剤耐性マーカーをコードする配列を２コピー発現し、そしてしたがって、α２／δ１遺伝子破壊に関してホモ接合性である細胞に有利に働く（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：２３９１−９５，  １９９２）。さらに、以下にさらに論じるように、生殖系列細胞において、α２／δ１  ＋／−である非ヒト哺乳動物を交配させることによって生成された、遺伝子修飾されたα２／δ１  −／−非ヒト哺乳動物から、遺伝子修飾された動物細胞を得ることも可能である。
【００６９】
望ましい細胞または細胞株を遺伝子修飾した後、当該技術分野に知られる標準的ＰＣＲまたはサザンブロッティング法にしたがって、ＰＣＲ解析によって、修飾部位として、α２／δ１遺伝子座を確認することも可能である。（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；およびＥｒｌｉｃｈら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３，  １９９１を参照されたい）。通常はα２／δ１遺伝子を発現する細胞において、α２／δ１遺伝子メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルおよび／またはα２／δ１ポリペプチドレベルが減少している場合、α２／δ１遺伝子の機能破壊のさらなる確認を行うこともまた可能である。逆転写酵素仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット解析、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いることによって、α２／δ１遺伝子ｍＲＮＡレベルの測定値を得ることも可能である。細胞が産生するα２／δ１ポリペプチドレベルの定量化を、例えば当該技術分野に知られる標準的イムノアッセイ法によって行うことも可能である。こうしたイムノアッセイには、限定されるわけではないが、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えばコロイド性金、酵素標識、または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、２次元ゲル解析、沈降反応、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いる、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれる。
【００７０】
本発明の好ましい遺伝子修飾された動物細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞およびＥＳ様細胞である。これらの細胞は、マウス（Ｅｖａｎｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  １２９：１５４−１５６，  １９８１；Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ７８：７６３４−７６３８，  １９８１）、ブタおよびヒツジ（Ｎｏｔａｎｉａｎｎｉら，  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔ．  Ｓｕｐｐｌ．，  ４３：２５５−２６０，  １９９１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６８，  １９９６）、並びにヒトを含む霊長類（Ｔｈｏｍｓｏｎら、米国特許第５，８４３，７８０号、Ｔｈｏｍｓｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７，  １９９５；およびＴｈｏｍｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：７８４４−７８４８，  １９９５）などの多様な種の着床前胚および胚盤胞から得られる。
【００７１】
これらの種類の細胞は、多能性であり、すなわち、適切な条件下で、３つの胚層：外胚葉、中胚葉および内胚葉すべてに由来する非常に多様な細胞種に分化する。培養条件に応じて、ＥＳ細胞の試料を、幹細胞として無期限に培養するか、単一試料内で、非常に多様な異なる細胞種に分化させるか、あるいはマクロファージ様細胞、ニューロン細胞、心筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、角化細胞、および造血細胞、例えば好酸球、マスト細胞、赤血球先駆細胞、または巨核球などの特定の細胞種への分化を導くことも可能である。分化の指示は、例えば、Ｋｅｌｌｅｒら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７：８６２−６９，  １９９５、Ｌｉら，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８：９７１，  １９９８、Ｋｌｕｇら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：２１６−２４，  １９９６、Ｌｉｅｓｃｈｋｅら，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２３：３２８−３４，  １９９５、Ｙａｍａｎｅら，  Ｂｌｏｏｄ  ９０：３５１６−２３，  １９９７、およびＨｉｒａｓｈｉｍａら，  Ｂｌｏｏｄ  ９３：１２５３−６３，  １９９９にさらに記載されるように、培養条件において特定の増殖因子またはマトリックス構成要素を含むことによって、達成される。
【００７２】
遺伝子修飾に用いる特定のＥＳ細胞株は重大ではない。例えば、ネズミＥＳ細胞株を用いる本発明の態様に関して、こうした細胞には、ＡＢ−１（ＭｃＭａｈｏｎおよびＢｒａｄｌｅｙ，  Ｃｅｌｌ  ６２：１０７３−８５，  １９９０）、Ｅ１４（Ｈｏｏｐｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：２９２−９５，  １９８７）、Ｄ３（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，  Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．  ８７：２７−４５，  １９８５）、ＣＣＥ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：４４５−４８，  １９８６）、ＲＷ４（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミズーリ州セントルイス）、およびＤＢＡ／１ｌａｃＪ（Ｒｏａｃｈら，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２２１：５２０−２５，  １９９５）が含まれることも可能である。
【００７３】
６．遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物の調製
本発明の遺伝子修飾された動物細胞を用いて、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物を調製することも可能である。１つの態様において、本発明の遺伝子修飾されたＥＳ細胞を用いて、公表された方法にしたがって、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物を生成することも可能である（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  １９８７，  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ監修，  オックスフォード：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．７１−１１２，  １９８７；Ｚｊｉｌｓｔｒａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８，  １９８９；およびＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：７９９−８０３，  １９８９）。
【００７４】
好ましい態様において、前記ＥＳ細胞はネズミＥＳ細胞（例えば１２９Ｓ６／ＳｖＥＶ）であり、そして前記の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物はマウスである。例えば、こうした遺伝子修飾されたマウスの調製において、α２／δ１遺伝子の望ましい機能破壊を含有するネズミＥＳ細胞を用いる。用いるネズミＥＳ細胞が、上述のようなα２／δ１遺伝子の望ましい機能破壊を含有することをまず、確認する。
【００７５】
次いで、当該技術分野に知られる方法にしたがって、α２／δ１突然変異ＥＳ細胞を用いて、キメラマウスを生成することも可能である（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ５：７０，  １９８９）。例えば、α２／δ１突然変異ＥＳ細胞を適切な胚盤胞宿主に注入することも可能である。本発明の実施に使用する特定のマウス胚盤胞は重大ではない。こうした胚盤胞の例は、本説明に鑑みて当業者に知られるであろうし、そしてＣ５７ＢＬ６マウス、Ｃ５７ＢＬ６アルビノマウス、Ｓｗｉｓｓ異系交配マウス、ＣＦＬＰマウス、およびＭＦＩマウス由来の胚盤胞が含まれる。あるいは、ＥＳ細胞を凝集ウェルにおいて、四倍体胚の間に挟むことも可能である（Ｎａｇｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：８４２４−８４２８，  １９９３）。
【００７６】
次いで、遺伝子修飾されたＥＳ細胞を含有する胚盤胞または胚を、偽妊娠雌マウスに移植し、そして子宮内で発生させる（Ｈｏｇａｎら，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー  １９８８；およびＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅ．Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ監修，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ワシントンＤ．Ｃ．，  １９８７）。里親から生まれた子孫をスクリーニングして、α２／δ１遺伝子破壊に関してキメラであるものを同定することも可能である。一般的に、こうした子孫は、遺伝子修飾されたドナーＥＳ細胞由来のいくつかの細胞とともに、元来の胚盤胞由来の他の細胞を含有する。こうした状況において、まず、モザイク外被色に関して、子孫をスクリーニングすることも可能であり、この場合、外被色選択戦略を使用して、胚盤胞の他の細胞からドナーＥＳ細胞由来の細胞を区別する。あるいは、子孫の尾組織由来のＤＮＡを用いて、遺伝子修飾された細胞を含有するマウスを同定することも可能である。
【００７７】
生殖系列細胞にα２／δ１遺伝子破壊を含有するキメラマウスの交配は、すべての生殖系列細胞および体細胞にα２／δ１遺伝子破壊を所持する子孫を生じる。次いで、α２／δ１遺伝子破壊に関してヘテロ接合性であるマウスを交配して、ホモ接合体を生じることも可能である（例えば米国特許第５，５５７，０３２号、および米国特許第５，５３２，１５８号を参照されたい）。
【００７８】
細胞から全動物に遺伝子修飾をトランスファーするための上述のＥＳ細胞技術の代替法は、核移植を用いるものである。この方法を使用して、マウス以外の、他の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物、例えばヒツジ（ＭｃＣｒｅａｔｈら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９：１０６６−６９，  ２０００；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：６４−６６，  １９９６；およびＳｃｈｎｉｅｋｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−３３，  １９９７）およびウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５６−５８，  １９９８）を作成することも可能である。簡潔には、体細胞（例えば線維芽細胞）または多能性幹細胞（例えばＥＳ様細胞）を核ドナーとして選択し、そしてα２／δ１遺伝子の機能破壊を含有するように遺伝子修飾する。ＤＮＡベクターを体細胞に挿入して、α２／δ１遺伝子を突然変異させる場合、α２／δ１遺伝子にベクターが組み込まれると、α２／δ１遺伝子プロモーターの調節下で、マーカー発現が生じるように、ベクターにおいて、プロモーターを含まないマーカーを用いることが好ましい（ＳｅｄｉｖｙおよびＤｕｔｒｉａｕｘ，  Ｔ．  Ｉ．  Ｇ．  １５：８８−９０，  １９９９；ＭｃＣｒｅａｔｈら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９：１０６６−６９，  ２０００）。次いで、適切なα２／δ１遺伝子破壊を有するドナー細胞由来の核を、除核した受精卵母細胞または単為生殖卵母細胞にトランスファーする（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４，  １９９６；Ｗｉｌｍｕｔら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０，  １９９７）。胚を再構築し、培養して桑実胚／胚盤胞段階に発生させ、そして満期子宮内発生のため里親にトランスファーする。
【００７９】
本発明はまた、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および遺伝子修飾された動物細胞の子孫も含む。子孫は、α２／δ１遺伝子を破壊する遺伝子修飾に関して、ヘテロ接合性またはホモ接合性であるが、続く世代で生じうる、α２／δ１遺伝子の元来の遺伝子破壊に加えて、突然変異または環境の影響のため、親非ヒト哺乳動物および動物細胞と遺伝的に同一でない可能性もある。
【００８０】
当業者に知られる技術を用いて、非ヒト遺伝子修飾動物由来の細胞を組織または臓器から単離することも可能である。１つの態様において、本発明の遺伝子修飾された細胞を不死化する。この態様にしたがって、テロメラーゼ遺伝子、発癌遺伝子、例えばｍｏｓまたはｖ−ｓｒｃ、あるいはアポトーシス阻害遺伝子、例えばｂｃｌ−２を遺伝子操作して細胞内に導入することによって、細胞を不死化することも可能である。あるいは、当業者に知られる技術を利用して、ハイブリダイゼーションパートナーと融合させることによって、細胞を不死化することも可能である。
【００８１】
７．「ヒト化」非ヒト哺乳動物および動物細胞
突然変異内因性α２／δ１遺伝子を含有する、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞（非ヒト）をさらに修飾して、ヒトα２／δ１配列を発現させることも可能である（本明細書において、「ヒト化」と称する）。細胞をヒト化するのに好ましい方法は、相同組換えによって、ヒトα２／δ１配列をコードする核酸配列（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：７２２０−２５，  １９９９）と、内因性α２／δ１配列を交換することを伴う。ベクターは、５’および３’相同アーム、並びに陽性／陰性選択スキームに関しては、ターゲティングベクターとして伝統的に用いるものと類似である。しかし、ベクターはまた、組換え後、内因性配列に対してヒトα２／δ１コード配列を置換するか、あるいはヒトα２／δ１をコードするように内因性配列を修飾する塩基対変化、エクソン置換、またはコドン置換を達成する配列も含む。相同組換え体が同定されたら、ＣｒｅまたはＦｌｐ仲介部位特異的組換え（Ｄｙｍｅｃｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９３：６１９１−９６，  １９９６）を用いることによって、選択に基づく配列（例えばｎｅｏ）を切除することが可能である。内因性配列に対してヒトα２／δ１配列を置換する際、これらの変化が、内因性翻訳開始部位のすぐ下流に導入されることが好ましい。この配置によって、α２／δ１遺伝子の内因性の時間的および空間的発現パターンが保持される。ヒト配列は、適切なプロセシングのため、３’端に付着したポリＡテールを含む全長ヒトｃＤＮＡ配列、または全ゲノム配列であることも可能である（Ｓｈｉａｏら，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ８：２９５−３０２，  １９９９）。細胞および非ヒト哺乳動物を遺伝子修飾して、内因性遺伝子発現をそのヒト対応物と交換する、これらの方法に関するさらなる手引きは、例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１７９７２−８０，  １９９７、Ｒｅａｕｍｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２３３８０−８８，  １９９６、およびＳｃｏｔｔら、米国特許第５，７７７，１９４号に見出される。
【００８２】
こうした「ヒト化」生物を生成するための別の方法は、内因性遺伝子を破壊した後、ノックアウト胚に前核をマイクロインジェクションすることによって、ヒト配列をコードする導入遺伝子を導入する、２工程プロセスである。
【００８３】
本発明のα２／δ１−／−非ヒト哺乳動物および動物細胞の表現型を調べることによって、α２／δ１機能および療法の妥当性をさらに解明することも可能である。例えば、遺伝子修飾されたα２／δ１−／−非ヒト哺乳動物および動物細胞を用いて、特定の疾患モデル、例えば不安症、抑うつ症、統合失調症、双極性疾患等を含む中枢神経系障害；神経障害性疼痛等を含む疼痛；および不整脈、高血圧等を含む心臓血管疾患のモデルにおいて、α２／δ１が、症状または表現型の発展を引き起こすかまたは防止する際に役割を果たすかどうかを決定することも可能である。野生型（α２／δ１＋／＋）またはヘテロ接合体（α２／δ１＋／−）非ヒト哺乳動物または動物細胞に比較して、非ヒト哺乳動物または動物細胞において、症状または表現型が異なるならば、α２／δ１ポリペプチドは、症状または表現型と関連する機能を制御するのに役割を果たしている。α２／δ１機能を評価するのに使用可能な試験の例には、ガバペンチンおよび他のα２／δリガンド結合に関して、野生型マウスにα２／δ１−／−マウスを比較すること；鎮静を評価する、尾懸垂試験（ＴＳＴ）；ホルマリン誘導痛覚過敏に対する感受性を評価するホルマリン足蹠法、神経障害性疼痛の長期構造性傷害（ＣＣＩ）誘導静的異痛症モデル、不安症を評価するＶｏｇｅｌ法；および抗痙攣活性を評価する最大電気ショック法が含まれる。Ｈａｉｎ  ＨＳ，Ｋｉｎｓｏｒａ  ＪＪ，  Ｂａｒｏｎ  ＳＰ，  Ｍｅｌｔｚｅｒ  ＬＴ（２０００）Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓ．  ３３６．１２；Ｌｏｔａｒｓｋｉ  ＳＭ，  Ｋｉｎｓｏｒａ  ＪＪ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＣＰ，  Ｂａｒｏｎ  ＳＰ（２００２）Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓ．  ３９６．８；Ｋｒａｌｌら（１９７８）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，  Ａｕｇ；１９（４）：４０９−２８を参照されたい。
【００８４】
さらに、剤がα２／δ１アゴニストまたはアンタゴニストとして同定されている（例えば剤がα２／δ１＋／＋またはα２／δ１＋／−非ヒト哺乳動物または動物細胞に投与された際、剤が１以上のα２／δ１ポリペプチド活性を有意に修飾する）状況下では、本発明の遺伝子修飾されたα２／δ１−／−非ヒト哺乳動物および動物細胞は、α２／δ１のアゴニズムまたはアンタゴニズムから生じることが知られるものに加えて、剤に引き起こされた他の効果いずれかを性質決定するのに有用である（すなわち該非ヒト哺乳動物および動物細胞を陰性対照として使用可能である）。例えば、α２／δ１＋／＋非ヒト哺乳動物または動物細胞において、剤の投与が、α２／δ１ポリペプチド活性と関連することが知られていない効果を引き起こす場合、対応するα２／δ１−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞に該剤を投与することによって、該剤が、単独で、または主にα２／δ１の調節を通じて、この効果を発揮するかを決定することも可能である。α２／δ１−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞において、この効果が存在しないか、または有意に減少しているならば、効果は、少なくとも部分的にα２／δ１によって仲介されている。しかし、α２／δ１−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞が、α２／δ１＋／＋またはα２／δ１＋／−非ヒト哺乳動物または動物細胞に匹敵する度合いの効果を示すならば、効果は、α２／δ１シグナル伝達を伴わない経路に仲介されている。
【００８５】
さらに、剤が、主にα２／δ１経路を介して効果を発揮する可能性があると推測される場合、α２／δ１−／−非ヒト哺乳動物および動物細胞は、この仮説を試験する陰性対照として有用である。剤が実際に、α２／δ１を通じて作用するならば、α２／δ１−／−非ヒト哺乳動物および動物細胞は、剤の投与に際して、α２／δ１＋／＋非ヒト哺乳動物または動物細胞で観察されるのと同じ効果は示さないはずである。
【００８６】
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を用いて、その発現が、それぞれの野生型対照に比較して、α２／δ１＋／−またはα２／δ１−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞で差別的に制御されている遺伝子を同定することもまた可能である。当業者に知られる技術を用いて、本説明に基づいて、こうした遺伝子を同定することも可能である。例えば、ＤＮＡアレイを用いて、α２／δ１発現不全を補償するため、その発現がα２／δ１＋／−またはα２／δ１−／−マウスで差別的に制御されている遺伝子を同定することも可能である。ＤＮＡアレイは当業者に知られる（例えばＡｉｇｎｅｒら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４４：２７７７−８９，  ２００１；米国特許第５，９６５，３５２号；Ｓｃｈｅｎａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０，  １９９５；ＤｅＲｉｓｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０，  １９９６；Ｓｈａｌｏｎら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６：６３９−６４５，  １９９６；およびＳｃｈｅｎａら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１０５３９−１１２８６，  １９９５を参照されたい）。
【００８７】
さらに、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を用いて、それぞれの野生型対照に比較して、その発現プロフィールまたは翻訳後修飾が、α２／δ１＋／−またはα２／δ１−／−非ヒト哺乳動物または動物細胞で改変されているタンパク質を同定することもまた可能である。当業者に知られる技術を用いて、本説明に基づいて、こうしたタンパク質を同定することも可能である。例えば、プロテオミクスアッセイを用いて、α２／δ１発現不全を補償するため、その発現プロフィールまたは翻訳後修飾がα２／δ１＋／−またはα２／δ１−／−マウスで改変されているタンパク質を同定することも可能である。プロテオミクスアッセイは当業者に知られる（例えば、Ｃｏｎｒａｄｓら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９０：８９６−８９０，  ２００２；Ｄｏｎｇｒｅら，  Ｂｉｏｐｌｏｙｍｅｒｓ  ６０：２０６−２１１，  ２００１；Ｖａｎ  Ｅｙｋ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３：５４６−５５３，  ２００１；Ｃｏｌｅら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１７７２−１７８１，  ２０００；Ａｒａｋｉら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１８０−１８８９，  ２０００を参照されたい）。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、本発明の例示であり；これらは範囲を制限することを意図しない。
【００８９】
（実施例１）
ターゲティングベクター構築
マウスα２／δ１タンパク質の残基２１７（リーダー配列の切断前の残基２４１に対応する）で突然変異を含むα２／δ１サブユニットを偏在性に発現するマウスを生成するため、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして本質的にＷａｔｔｌｅｒ  Ｓ，  Ｋｅｌｌｙ  Ｍ，およびＮｅｈｌｓ  Ｍ（１９９９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：１１５０−１１６０に記載され、そして以下にさらに説明するような技術を用いて、置換型ターゲティングベクターを構築した。
【００９０】
α２／δ１遺伝子座由来のゲノム配列を含有するＰＣＲ断片を生成するテンプレートとして、マウスゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応において、配列番号１および２に示す配列を用いた。このＰＣＲ断片の配列を配列番号３に示す。この断片を、ウラシルの栄養マーカーを含有する酵母選択カセット（配列番号１０）に連結した。マウスゲノムＤＮＡおよび酵母マーカーを含有する連結産物で、マウスゲノムライブラリーを所持する酵母株を形質転換した。ＰＣＲ断片、およびライブラリーに所持されるゲノム配列間で、相同組換えが起こる。これによって、α２／δ１遺伝子座に相同なゲノムクローンの単離が可能になる。いくつかのクローンを単離し、そして配列決定して、そしてエクソン８を含有するα２／δ１遺伝子座に関してコンティグを生成した。このコンティグを配列番号４に示す。この配列は、α２／δ１ゲノムＤＮＡの一部を含有する〜１４ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する。単離したクローンの１つ（ｐＫＯＳ２０）は、エクソン８を含有するマウスゲノム配列の一部を含有した。このゲノム配列を配列番号５に示す。この配列中、エクソン８に隣接する位に、ｎｅｏカセット、ｌｏｘＰ部位およびＦＲＴ部位を挿入した。図１を参照されたい。
【００９１】
図１は、α２／δ１ゲノム領域中のゲノムクローンの構成を示す（７６＝配列番号１５；７７＝配列番号１６；７４＝配列番号１３；７５＝配列番号１４；Ｎｅｏ３Ａ＝配列番号１１）。ｐＫＯＳ８６、ｐＫＯＳ８８、ｐＫＯＳ３９、ｐＫＯＳ５５、ｐＫＯＳ２０−ＴＶ、ｐＫＯＳ１６は、α２／δ１遺伝子座のエクソン８領域を含むゲノムクローンを指す。図１の上部バンドに示すゲノムα２／δ１遺伝子座の１４ｋｂを含むコンティグを生成するため、これらの配列番号に示す配列を組み立てて配列番号４にした。
【００９２】
ゲノム配列番号５を含有するターゲティングベクターを示すｐＫＯＳ２０−ＴＶを突然変異誘発して、２１７位（該ポリペプチドにおいて唯一のＲＲＲモチーフ中のｃ末端アルギニン）のアルギニンのコドンが、上述のものと類似の技術を用いて、アラニンに変換されているターゲティングベクターを生成した。この変化をコードするエクソン８の修飾を含有するオリゴヌクレオチドを利用して、ＰＣＲ反応を行った。この突然変異誘発プライマーを配列番号７に示す。エクソン８の野生型配列を配列番号６に示す。２つのＰＣＲ反応に、突然変異誘発プライマーを用いた。５’端では、配列番号７および８に示すプライマーを利用して、ＰＣＲ反応を行った。３’端では、配列番号７および９に示すプライマーを利用して、ＰＣＲ反応を行った。これらの２つのＰＣＲ反応の産物を酵母選択カセット（配列番号１０）上で連結して、そしてターゲティングベクターを所持する酵母を形質転換した。該配列は酵母中で組み換えられ、そしてアルギニン２１７をコードする残基（ＡＧＡ）がアラニンコドン（ＧＣＡ）に変換されていることを除いて、配列番号６と同一の配列を生成した。アラニン２１７をコードする残基を含むこの配列を、配列番号２０に示す。このターゲティングベクターを、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。ターゲティングベクターは、ネオマイシン耐性のマーカーを含有し、したがってトランスフェクションされた細胞を、Ｇ４１８における増殖によって選択した。Ｇ４１８に耐性であるＥＳ細胞を単離し、そして該細胞からＤＮＡを単離した。次いで、該ＤＮＡを、配列番号１１および１２のプライマーを用いたＰＣＲ解析に供した。ＤＮＡの組込みに関して陽性であるＥＳ細胞を、このＰＣＲ反応中、９００塩基対のバンドの存在に関して試験した。ターゲティングベクターが相同組換えを経て、そしてα２／δ１遺伝子中に挿入されていることを確認するため、陽性ＥＳ細胞由来のＤＮＡをサザン解析に供した。プライマー対、配列番号１３−配列番号１４および配列番号１５−配列番号１６を用いて、マウスゲノムＤＮＡからプローブを生成した。これらは、組み込まれたＤＮＡに隣接する領域のプローブを生成する。図２は、１５−１６プローブを用いたサザンブロットを示す。相同組換えが起こったターゲティングＥＳ細胞は、プローブにハイブリダイズする〜１５ｋｂのバンドを有するであろう。対照的に、野生型は１３．２ｋｂのバンドを有するであろう。
【００９３】
相同組換えを経たＥＳ細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の胚盤胞に移植した。次いで、これらの修飾胚盤胞を偽妊娠Ｃ５７Ｂｌ／６母に移植した。キメラの仔が生まれた。これらのキメラの仔をＣ５７Ｂｌ／６マウスと交配し、そして次いで、上に概略するＰＣＲアプローチを用いて、子孫の遺伝子型を決定した。生殖系列伝達が起きた動物は、このＰＣＲアッセイにおいて陽性であった。
【００９４】
生殖系列伝達が起きた動物を交配して、共通遺伝子系統を生成し、そして試験に使用可能なマウスを生成した。
【００９５】
（実施例２）
α２／δ１ノックインマウスの表現型性質決定
２（Ａ）ガバペンチン結合：
膜調製およびガバペンチン結合を、本質的にＷａｎｇ，  Ｍ；Ｏｆｆｏｒｄ，  Ｊ；Ｏｘｅｎｄｅｒ  ＤＬ；およびＳＵ  Ｔ−Ｚ（１９９９），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４２：３１３−３２０に記載されるように行った。マウス全脳から膜を調製した。次いで、これらの膜を、３Ｈガバペンチンの結合に用いた。３Ｈガバペンチンのトレーサーレベルを結合に用いた。競合剤の非存在下で総結合を測定した。１０μＭの非標識プレガバリンの存在下で、非特異的結合を測定した。図２は、ＥＳ細胞から単離して、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化した総ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を示す（Ｍ＝マーカーＤＮＡ；Ａ＝ＥＳ細胞Ａ；Ｂ＝ＥＳ細胞Ｂ；Ｃ＝ＥＳ細胞Ｃ；Ｄ＝ＥＳ細胞Ｄ；Ｅ＝ＥＳ細胞Ｅ；Ｆ＝ＥＳ細胞Ｆ；Ｇ＝対照、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した未ターゲティングＥＳ細胞ＤＮＡ）。ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル上で分離し、次いでニトロセルロースにトランスファーした。プライマー対、配列番号１３および配列番号１４を用いて、ゲノムＤＮＡから生成したＰＣＲ断片からなる３’プローブで、ニトロセルロース膜を探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【００９６】
図３に示す結果は、野生型マウス由来の脳膜に比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体マウス由来の脳膜へのガバペンチン結合が減少するか、または非常に消滅していることを示す。ウェスタンブロットによって、α２／δ１およびα２／δ２ポリペプチドのレベルが、図６に示すように、有意に変化しないことが示される。ウェスタンブロットを生成するため、マウス脳から膜分画を調製した。ポリアクリルアミドゲルのウェルあたり、１０μｇのタンパク質を装填し、電気泳動に供し、そしてＰＶＤＦ膜にブロッティングした。α２δ１またはα２δ２いずれかに特異的な抗体を用いて、ブロットを探査した。この方式で、３つの異なる野生型および３つの異なる突然変異体動物由来の脳膜を探査した。
【００９７】
２（Ｂ）：ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスと比較した、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏症／ホルマリン足蹠法：
体重１９〜４０グラムの雄α２／δ１  Ｒ２１７Ａ野生型マウス、ヘテロ接合性マウスおよびホモ接合性マウスを試験に用いた。１２時間の明期／暗期周期で動物を飼育し、食物および水は、自由に摂取可能であった。試験前日に動物を一晩絶食させた。試験日、動物をおよそ６０分間、観察チャンバーに順応させた。観察チャンバーは、床および３つの壁が硬いアクリルプラスチック鏡からなる８インチの正方形の箱であった。４番目の壁は、観察可能な透明アクリルであった。試験１２０分前に、投与体積１０ｍｌ／ｋｇで、動物にビヒクルまたはプレガバリンいずれかをＰＯ投与した。試験時、動物の左後足底表面に２５μｌの水中５％ホルマリン溶液を注射した。ホルマリン注射直後、４５分間の期間に渡って、注射した足をなめたり噛んだりすることに関して、動物を観察した。手持ちストップウォッチを用いてこれらの行動の時間を計り、そして５分間隔で記録した。応答の２つの別個の期によって、データを解析した。初期応答は０〜１０分を含み、そして後期応答は１１〜４５分を含んだ。各期で薬剤処置動物がなめるのに費やしたトータルの時間を、ビヒクル処置動物がなめるのに費やしたトータルの時間に比較した。
【００９８】
図４は、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較した、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏を示す。結果によって、２１７位のａｒｇをアラニンに変化させたマウスが、このアッセイにおいてプレガバリン効果の減少を示したことが示される。
【００９９】
２（Ｃ）Ｒ２１７Ａ突然変異体マウスおよび野生型マウスにおいて、尾懸垂試験（ＴＳＴ）におけるプレガバリンの効果：
重量２２〜３５グラムの雄α２／δ１  Ｒ２１７Ａ野生型マウスおよびホモ接合性マウスを試験に用いた。１２時間の明期／暗期周期で動物を飼育し、食物および水は、自由に摂取可能であった。試験前日に動物を一晩絶食させた。試験日、動物を８匹の群で保持ケージに入れ、投薬前に６０分間順応させた。用量体積１０ｍｌ／ｋｇで、試験１２０分前にビヒクルまたはプレガバリンを投与した。試験時、透明テープ片を尾の遠位部分の周りに貼った。次いで、このテープを電気機械装置に連結したフックに付着させ、マウスが動く時間量および運動中に用いた力をこの装置が記録した。フックは、２４ｘ１８ｃｍ試験チャンバーの最上部に位置した。動物をチャンバーの床からおよそ５ｃｍの高さで６分間、完全に空中に懸垂した。次いで、もがいている時間および運動の力の平均を８匹の各群に関して計算した。
【０１００】
動物を８匹の群で保持ケージに入れ、投薬前に３０〜６０分間順応させる。処置は、通常、試験の６０〜１２０分前に投与されるが、これもまた、特定の化合物にしたがって多様である。試験時、スコッチテープ片を尾の遠位部分の周りに貼る。次いで、このテープを電気機械装置に連結したフックに付着させ、マウスが動く時間量および運動中に用いた力をこの装置が記録する。フックは、２４ｘ１８ｃｍ試験チャンバーの最上部に位置する。すべての動物をチャンバーの床からおよそ５ｃｍの高さで６分間、完全に空中に懸垂する。装置はこの時間が終了すると、自動的に記録を停止し、そして動物はフックから解き放たれる。図５は、Ｒ２１７Ａ突然変異体マウスおよび野生型マウスにおいて、尾懸垂試験（ＴＳＴ）におけるプレガバリンの効果を示す。
【０１０１】
結果によって、プレガバリンが、ＴＳＴにおけるその鎮静および／または抗不安剤効果をα２／δ１ポリペプチドを通じて発揮することが示される。結果によって、プレガバリンのこの鎮痛効果が、少なくとも部分的に、野生型マウスα２／δ１のＲＲＲのＣ末端隣接アルギニン（Ｒ２１７）を通じて仲介されることがさらに示される。
【０１０２】
２（Ｄ）異痛症
長期結紮傷害（ＣＣＩ）モデル：
動物を麻酔チャンバーに入れ、そして２％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）Ｏ２混合物で麻酔した。右後太腿を剃毛し、そして１％ヨウ素で消毒した。次いで、動物を、処置の期間中、等温ブランケットに移し、そしてノーズコーンを介して、手術中、麻酔を維持した。大腿骨の線に沿って、皮膚を切開した。鈍的切開によって、大腿二頭筋を通じて、大腿の真ん中で、総坐骨神経を曝露した。坐骨神経が３つに分かれる箇所の近位で、神経の下にピンセットを挿入することによって、約５ｍｍの神経を自由にし、そして神経を大腿から穏やかに持ち上げた。ピンセットを数回、穏やかに開いたり閉じたりして、神経から筋膜を取り除くのを補助した。ピンセットを用いて、縫合糸を神経の下に引き込み、そしてわずかに抵抗が感じられるまで、単純な結び目で結び、そして次いで二重に結んだ。この方法を反復して、およそ１ｍｍ間隔で、神経の周りに３つの結紮糸（４−０シルク）をゆるく結んだ。切開を層状に閉じ、そして創傷を局所抗生物質で治療した。
【０１０３】
静的（ｓｔａｔｉｃ）異痛症の測定：
異痛症の評価前に、動物を針金の試験ケージに順応させた。後足の足底表面に昇順の力（０．００８、０．０２、０．０４、０．０７、０．０１６、０．４、０．６、１．０、１．５および２．０ｇ）で、フライ刺激毛（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒｓ）（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、米国イリノイ州ウッドデール）を適用することによって、静的異痛症を評価した。フライ刺激毛は各々、最大６秒間、または引っ込め（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）応答が生じるまで、足に適用された。フライ刺激毛に対する引っ込め応答が生じたら、引っ込めを生じたもの以下のフィラメントから始めて、そして続いて引っ込めが生じなくなるまで、降順の力順序で、残りのフィラメントを用いて、足を再試験した。この方式で、各動物の両方の後足を試験した。応答を引き出すのに必要な最低量の力を、足引っ込め閾値（ＰＷＴ）として、グラムで記録した。動物が、正常マウスには無害である０．０４ｇ以下の刺激に応答した場合、静的異痛症が存在すると定義した。この研究に用いたフライ刺激毛は、対数スケールで適用される力を生じる。したがって、本研究で得られたデータは、対数スケールを用いた、中央値および四分位数（値の範囲に相当する）として示した。
【０１０４】
Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスにおける長期結紮傷害（ＣＣＩ）誘導点状異痛症の発展：
神経傷害のモデルを用いて、Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスの疼痛表現型をさらに性質決定した。これらの研究のため、神経障害性疼痛のよく性質決定されたモデルである、ＣＣＩモデルを用いた。ＣＣＩ傷害前、ノックイン動物および野生型動物はどちらも、フライ刺激毛を用いて測定した場合、点状刺激に対して、類似のベースライン応答を示した。ＣＣＩ傷害後、マウスのどちらの群でも、フライ刺激毛適用に対する過敏性増加が発展し、これは傷害７日後にピークに達し、そして少なくとも３週間維持された。ノックインマウスおよび野生型マウス両方で、同様の疼痛行動の開始が見られた。結果を図７に示す。
【０１０５】
フライ刺激毛に対する、ベースライン（ＢＬ）足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を評価した。薬剤投与後、ＰＷＴを４時間まで再評価した。静的異痛症データを、群あたり６〜７匹の動物において、足引っ込めを誘導するのに必要な力（ｇ）の中央値として表す（垂直な線は、第１および第３四分位数を示す）。各時点でのビヒクル処置群からの＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５（マン・ホイットニーＵ検定）。
【０１０６】
ノックインマウスおよび野生型マウスにおけるＣＣＩ誘導静的異痛症に対するプレガバリンの効果：
ノックインマウスおよび野生型マウス両方において、プレガバリンが、抗異痛症作用を生じるかどうかを調べた。この研究では、ノックインマウスおよび野生型マウスはどちらも、ＣＣＩ手術後、点状刺激の適用に典型的な疼痛応答を示した。プレガバリンを皮下投与すると（３０〜１００ｍｇ／ｋｇ）、野生型マウスにおいて、ＣＣＩ誘導点状異痛症の有意な遮断が生じた。しかし、ノックインマウスでは、プレガバリンの同様の処置はまったく効果を生じず、ビヒクル処置対照と同様の疼痛行動があった。この結果を図８に示す。
【０１０７】
フライ刺激毛に対する、ベースライン（ＢＬ）足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を評価した。薬剤投与後、ＰＷＴを４時間まで再評価した。静的異痛症データを、群あたり６〜７匹の動物において、足引っ込めを誘導するのに必要な力（ｇ）の中央値として表す（垂直な線は、第１および第３四分位数を示す）。各時点でのビヒクル処置群からの＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５（マン・ホイットニーＵ検定）。
【０１０８】
ノックインＲ２１７Ａマウスおよび野生型マウスは、長期結紮誘導神経傷害後の慢性疼痛において、類似の疼痛表現型を示す。プレガバリン（３０〜１００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）は、野生型マウスにおいて、ＣＣＩ誘導異痛症に典型的な効能を示したが、ノックイン動物においては、同様の投与後、いかなる効能も示さなかった。これらのデータによって、プレガバリンの鎮痛作用が、電圧開口型カルシウムチャネルのα２−δ−１サブユニットとの相互作用によって仲介されることが立証される。
【０１０９】
２（Ｅ）マウスにおいて、プレガバリンの抗不安剤様効果および抗痙攣効果における、カルシウムチャネルのα２δ−１サブユニットの役割：遺伝子修飾されたマウスにおけるＲ２１７Ａ点突然変異の使用。
【０１１０】
遺伝子修飾されたマウスにおいて、Ｒ２１７Ａ点突然変異を用いてα２δ−１カルシウムチャネル補助タンパク質の役割を調べることによって、プレガバリンの作用機構（ＭＯＡ）を解明するため、本明細書に報告する研究を行った。プレガバリンの抗不安効果を評価するのにＶｏｇｅｌ法を用い、一方、プレガバリンの抗痙攣効果を評価するのに、最大電気ショック法（ＭＥＳ）を用いた。上述の方法にしたがい、２つの異なる系統、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、１２９Ｓ６／ＳｖＥＶを用いて、Ｒ２１７Ａノックインマウスを作成した。比較として、３つの異なるバックグラウンド系統に対応するデータもまた、生成した。さらに、３つの異なるマウス系統を維持し、これらを：−／−（突然変異なし）；＋／−（Ｒ２１７Ａ突然変異に関してヘテロ接合体）；および＋／＋（Ｒ２１７Ａ突然変異に関してホモ接合性）と示す。
【０１１１】
Ｒ２１７Ａ突然変異に関してホモ接合性であるノックインマウスにおいて、抗不安効果および抗痙攣効果は非常に減少する。マウスＶｏｇｅｌ水なめ葛藤（ｗａｔｅｒ−ｌｉｃｋ  ｃｏｎｆｌｉｃｔ）アッセイにおいて、プレガバリンは、野生型、ヘテロ接合性、またはバックグラウンド系統に比較した際、懲罰を受ける水なめに統計的に有意な増加を生じない。マウス抗痙攣アッセイにおいて、プレガバリンは、野生型、ヘテロ接合性、またはバックグラウンド系統におけるより、突然変異体マウスにおいて、発作に対して保護する能力がより劣っていた。これらのデータは、プレガバリンの作用機構およびプレガバリンに影響を受ける臨床的に関連する行動に、α２δ−１結合が重大な役割を果たしていることを裏付ける。これらのデータおよび適切な方法を以下に示す：
ＶＯＧＥＬ水なめ葛藤
【０１１２】
動物：雄マウス、野生型（ＷＴ）、Ｒ２１７−Ａ突然変異に関してヘテロ接合性（ＨＥＴ）およびノックイン（ＫＩ、Ｒ２１７−Ａ突然変異に関してヘテロ接合性）マウスを６週齢〜８週齢で受け入れ、そして試験前に２週間飼育した。各出荷から３２匹のＷＴ、ＨＥＴおよびＫＩマウスが試験に利用可能であり、これは必要な場合、実験プールを生じた。突然変異体マウスを生成するのに用いた、２つの系統、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および１２９Ｓ６／ＳｖＥＶ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）もまた、評価した。比較目的のため、アルビノまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒもまた実験に含んだ。１回の実験で各研究が完了するのに十分な数の、雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１２９Ｓ６／ＳｖＥＶ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）マウスを８週齢で受け入れた。親系統を試験前に１週間飼育した。すべての動物を、１２Ｌ：１２Ｄスケジュール（０６：００ｈに点灯）下、温度および湿度を調節した部屋で飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを針金ラック（１２／ケージ）で飼育したことを除き、すべてのマウスをアイソレーター（３〜５／ケージ）中で飼育した。
【０１１３】
ＶＯＧＥＬ装置：試験装置は、７Ｗｘ７Ｌｘ１２Ｈインチのサイズの１２モジュール操作チャンバー（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で構成された。各チャンバーの横には（床上１．５インチ）、モジュール光学的なめ行動測定装置（ｌｉｃｋｏｍｅｔｅｒ）が取り付けられた。なめ行動測定装置を用いて、チャンバーの外部に取り付けられた水ボトルに付着した飲用チューブからのなめ行動を測定した。飲用チューブの末端の隙間を渡るガラス棒を介して、光ビームを配した。被験者がチューブから水を飲む際に、被験者の舌がビームを遮断し、そして各なめ行動が自動的に記録された。さらに各標準的試験チャンバーを、３．５Ｄｘ６．７５Ｗｘ１．５Ｈインチのサイズの透明なプレキシグラスで作成した内部チャンバーで修飾した。チャンバー空間が減少して、動物の活動が制限され、そして１０分間のセッションの間に飲用チューブに向かう行動が導かれた。試験チャンバーの前面および背面は透明なプレキシグラスで作成された。前面のドアは覆われて、試験室の内部から注意を引くことを減らした。試験チャンバーの背面は壁に向かっていて、試験室の通行とは反対を向いており、そして観察の機会を提供するため、覆わないままであった。（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ）プログラム可能普遍的ショック装置を用いて、１秒間、格子の床および飲用チューブの間にショックを搬送するが、動物および飲用チューブ間の接触が遮断されたら直ちに停止した。各系統および突然変異体遺伝子型に関して、同時に試験する非ショック対照群に比較した際、８０％より多い飲水が一貫して抑制された強度として、ショック強度を実験的に決定した。
【０１１４】
方法：第１日、水摂取を２４時間絶った後、実験被験者を試験チャンバーに入れ、そして１０分間のトレーニングセッションの間、懲罰を与えずに水を飲ませた。マウスは、トレーニングセッションの間、１００〜１５０回なめる基準を完了することが必要であった。１０分間のセッション終了前にトレーニング基準を完了した被験者を取り除き、飲水がすべての被験者で、１日総摂取量の〜２５％に制限されるようにした。１００〜１５０回なめるのに失敗したマウスは、研究から除外した。第１日セッション直後、マウスをホームケージに戻し、そしてさらに２４時間、水および食物を絶った。試験第２日、ビヒクルまたは試験化合物をマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。６０〜１２０分間の吸収期間後、１０分間の試験セッションのため、マウスを試験チャンバーに入れた。試験中、固定比（ＦＲ）１０スケジュールで、ショックを搬送した。したがって、１０回なめるごとに、被験者に穏やかなショックを与えた。したがって、葛藤状況が存在し；マウスは水を飲むよう動機付けられているが、応答はショックによって阻害された。少数のショックエピソードを受け入れることは、不安に関連する行動を反映する。標準的抗不安薬剤は、マウスが行動阻害を克服し、そしてショックにもかかわらず水を飲むようにする効果を生じる。同時に行った対照よりも、ショックエピソードの数を有意に増加させる化合物は、抗不安剤様効果を生じると仮定された。一方向ＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎ法を用いて、すべてのデータを解析した。
【０１１５】
薬剤：すべての実験で、プレガバリンを生理食塩水に溶解した。陽性対照ジアゼパムを、生理食塩水中、２％  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒに懸濁した。すべての薬剤を、１０ｍｌ／ｋｇで投与した。
【０１１６】
実験設計
親系統におけるジアゼパムおよびプレガバリン試験：
各系統に用いたショック強度は、８０％より多い飲水を一貫して抑制する強度として、あらかじめ実験的に決定された（データ未提示）。各系統において、〜８０％の同様の抑制は、薬剤を評価する一貫したベースラインを提供した。ジアゼパムおよびプレガバリンに対する用量反応研究を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒおよび１２９Ｓ６／ＳｖＥＶマウス系統で試験して、各系統において、各薬剤の最小有効用量（ＭＥＤ）を決定した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを０．４ｍＡで試験し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒマウスを０．１ｍＡで試験し、そして１２９Ｓ６／ＳｖＥＶマウスを０．６ｍＡで試験した。各用量反応研究には、飲水抑制を評価するため、同時に行うビヒクル懲罰応答群に直接比較される、非ショックビヒクル対照群が含まれた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、１、３．２、１０および３２ｍｇ／ｋｇの用量でジアゼパム（−１時間、すべての系統に関してＩＰ）を試験し、そして３．２、１０、３２および１００ｍｇ／ｋｇの用量でプレガバリン（−２時間、すべての系統に関してＩＰ）を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒマウスにおいて、０．３２、１および３．２ｍｇ／ｋｇの用量でジアゼパムを試験し、そして３．２、１０、３２および１００ｍｇ／ｋｇの用量でプレガバリンを試験した。１２９Ｓ６／ＳｖＥＶマウスにおいて、０．３２、１および３．２ｍｇ／ｋｇの用量でジアゼパムを試験し、そして３．２、１０および３２ｍｇ／ｋｇの用量でプレガバリンを試験した。すべての実験に関して、投薬後、運動失調（不安定な足取り）および取り扱いに対する反応減少の両方の症状が観察された場合、鎮静が記録され、そして穏やか、中程度または重度と記載された。
【０１１７】
突然変異体マウスにおけるジアゼパムおよびプレガバリン試験
各遺伝子型に関して用いたショック強度は、８０％より多い飲水を一貫して抑制する強度として、あらかじめ実験的に決定された（データ未提示）。各遺伝子型において、〜８０％の同様の抑制は、薬剤を評価する一貫したベースラインを提供した。ジアゼパム（１、３．２および１０ｍｇ／ｋｇ、−１時間、ＩＰ）およびプレガバリン（１０、３２および１００ｍｇ／ｋｇ、−２時間、ＩＰ）に対する用量反応研究を、ＷＴ、ＨＥＴおよびＫＩマウスで試験して、各遺伝子型において、各薬剤のＭＥＤを決定した。ＷＴマウスを０．１ｍＡで試験し、ＨＥＴマウスを０．４ｍＡで試験し、そしてＫＩマウスを０．７ｍＡで試験した。各実験には、飲水抑制パーセントを決定するため、同時に行うビヒクル懲罰応答群に直接比較される、非ショックビヒクル対照群が含まれた。用量反応研究で見られた有意でない増加は、多数の研究をプールすることによる混乱であった可能性もあり、これに基づいて、単一用量のジアゼパム（３．２ｍｇ／ｋｇ）またはプレガバリン（１００ｍｇ／ｋｇ）もまた、選択した。これらの増加をさらに評価し、そして多数の研究をプールすることに伴うばらつきを減少させるように試みるため、単一用量実験を３つの遺伝子型すべてで行った。先に記載するように、観察者によって、鎮静が記録された。
【０１１８】
ＭＥＳ：
別の箇所に記載されるような（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）、電気痙攣発作モデルを用いることによって、抗痙攣有効性を決定した。マウスは食物および水に自由にアクセス可能であり、そして薬剤投与前、温度および光調節環境（１２時間明期／１２時間暗期）で飼育された。多様な電気ショック強度で、角膜電極を用いて、マウスに電気ショックを搬送した。定電流刺激装置（Ｗａｈｌｑｕｉｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ユタ州ソルトレークシティー）を用いて、電流を搬送した（６０Ｈｚ正弦波電流、１１〜１７ｍＡベースライン〜ピークに対して５０ｍＡ、０．２秒間）。すべてのマウスにおいて、各マウス系統および突然変異系統で、強直性伸展発作を生じるのに必要な電流強度を決定した。次いで、マウスをプレガバリンでさらに試験するため、これらの電流を用いた。薬剤効果がピークであることがあらかじめ決定された時点で、すべての用量反応試験を行った。各１０匹のマウスの群に０．９％生理食塩水に溶解したプレガバリン、ジアゼパム（ｖｅｈ）、またはフェニトインを多様な腹腔内用量で投与し、そして１０ｍｌ体積／ｋｇ体重で投与した。ＥＤ５０値（試験した動物の５０％で、最大電気ショック発作の後肢強直性伸展構成要素を阻害するのに必要であると計算された用量）を禁止解析（Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）によって決定し、そして化合物間の相対強度を比較するのに用いた。少なくとも４群のマウスおよび各動物を１回に使用した。異なる用量の試験薬剤であらかじめ処置した動物を、薬剤効果がピークであることがあらかじめ決定された時点（プレガバリン：１２０分；ジアゼパム：６０分；フェニトイン；６０分）で、１回の電気ショックに曝露した。
【０１１９】
結果／Ｖｏｇｅｌ法
Ｒ２１７Ａ／親系統相関
【０１２０】
【表１】
2006524049.tif 000003
【０１２１】
α２δ−１結合は、プレガバリンの抗不安剤様効果に重要である。
−プレガバリンは、Ｒ２１７Ａノックインでは有意な抗不安剤様効果を生じず、そして表現型が特定の親系統に関連する証拠は得られなかった。
【０１２２】
−ジアゼパム（＋対照）は、Ｒ２１７Ａノックインにおいて、抗不安剤様効果を生じるのに失敗した。データによって、１２９Ｓ６親系統の遺伝子型が、ジアゼパムの薬理学的プロフィールに関与しうることが示唆される。
【０１２３】
結果／ＭＥＳ
ＭＥＳ法を図９に示す。図９に関してさらに、すべてのバックグラウンド系統とともに突然変異体、ヘテロ接合性突然変異体、および野生型（すべての系統）は、フェニトインおよびジアゼパムの抗痙攣効果に完全に応答性であった。−／−マウスは、＋／＋マウスよりも、プレガバリンの効果により感受性でなかった。プレガバリンの抗痙攣効果は、＋／＋マウスに比較した際、−／−マウスで減少した。
【０１２４】
（実施例３）
配列データ特徴
配列番号１７
はエクソン８にコードされ、そして野生型に比較して、ＡｒｇからＡｌａへの突然変異を有するマウスポリペプチドを示す；突然変異は残基２２として示される。
配列番号１８
はエクソン８およびエクソン９にコードされ、そして野生型に比較して、エクソン８にＡｒｇからＡｌａへの突然変異を有するマウスポリペプチドを示す；突然変異は残基２２として示される。
配列番号１９
はエクソン８、エクソン９およびエクソン１０にコードされ、そして野生型に比較して、エクソン８にＡｒｇからＡｌａへの突然変異を有するマウスポリペプチドを示す；突然変異は残基２２として示される。
配列番号２０
は配列番号１７に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１
は配列番号１８に示すポリペプチドをコードする配列を含むマウスゲノムＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２
は配列番号１８に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号２３
は配列番号１９に示すポリペプチドをコードする配列を含むマウスゲノムＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４
は配列番号１９に示すマウスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、α２／δ１遺伝子ターゲティングベクターの模式図、内因性ネズミα２／δ１遺伝子におけるベクターの相同組換えの位置、および遺伝子ターゲティングを確認するために用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）戦略を示す。
【図２】図２は、ＥＳ細胞のサザンブロット解析を示す。
【図３】図３は、野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体マウス脳膜におけるガバペンチン結合を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏に対するプレガバリンの効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏に対するプレガバリンの効果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏に対するプレガバリンの効果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏に対するプレガバリンの効果を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏に対するプレガバリンの効果を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスのものに比較して、Ｒ２１７Ａ突然変異体ホモ接合性マウスにおける、ホルマリン誘導痛覚過敏に対するプレガバリンの効果を示す。
【図５】図５は、Ｒ２１７Ａホモ接合性突然変異体マウスおよび野生型マウスにおいて、尾懸垂試験（ＴＳＴ）におけるプレガバリンの効果を示す。
【図６】図６は、突然変異体（Ｒ２１７Ａ）マウスおよび野生型マウスから単離した膜のウェスタンブロットを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスにおける、長期結紮傷害（ＣＣＩ）誘導点状異痛症の発展を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスにおける、長期結紮傷害（ＣＣＩ）誘導点状異痛症の発展を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスにおける、ＣＣＩ誘導静的異痛症に対するプレガバリンの効果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスにおける、ＣＣＩ誘導静的異痛症に対するプレガバリンの効果を示す。
【図９】図９は、Ｒ２１７Ａマウスおよび野生型マウスにおいて、最大電気ショック法（ＭＥＳ）におけるプレガバリンの効果を示す（「ＫＩ」はノックイン、すなわちＲ２１７Ａ突然変異に関してホモ接合性であることを示す）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2006524049.tif 000060
【図４Ａ】
2006524049.tif 000061
【図４Ｂ】
2006524049.tif 000062
【図４Ｃ】
2006524049.tif 000063
【図４Ｄ】
2006524049.tif 000064
【図４Ｅ】
2006524049.tif 000065
【図４Ｆ】
2006524049.tif 000066
【図５】
2006524049.tif 000067
【図６】
2006524049.tif 000068
【図７Ａ】
2006524049.tif 000069
【図７Ｂ】
2006524049.tif 000070
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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