(57)【要約】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来の一連の遺伝子は、毒性に関係する生成物をコードすることが示される。従って、これらの遺伝子の同定は、弱毒化微生物を生じさせることを可能にする。さらに、この遺伝子またはこれらにコードされる生成物は、抗菌薬物を同定するために、病原体関連疾患の同定についての診断方法ために、およびワクチンの製造において用いられ得る。本発明は、一部には、４６遺伝子の発見に基づく。グラム陰性細菌の毒性を低くするように変異させた場合、それらは、新規の抗菌治療方法において用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌株に由来する弱毒化細菌変異体であって、ここで、該弱毒化変異体は、以下：
（ｉ）ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子の変異；ならびに
（ｉｉ）同遺伝子型細菌株の存在下において観察される増殖と比較する場合、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖の減少された阻害、
を有する、弱毒化変異体。
【請求項２】
前記変異が、挿入不活化または遺伝子欠失である、請求項１に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項３】
前記変異体が、グラム陰性細菌である、請求項１に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項４】
前記弱毒化グラム陰性細菌変異体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種である、請求項３に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項５】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、請求項４に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項６】
前記弱毒化Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ変異体が、ＭＵＴ１；ＭＵＴ２；ＭＵＴ３；ＭＵＴ４；ＭＵＴ５；ＭＵＴ６；ＭＵＴ７；ＭＵＴ８；ＭＵＴ９；ＭＵＴ１０；ＭＵＴ１１；ＭＵＴ１２；ＭＵＴ１３；ＭＵＴ１４；ＭＵＴ１５；ＭＵＴ１６；ＭＵＴ１７；ＭＵＴ１８；およびＭＵＴ１９からなる群より選択される、請求項５に記載の弱毒化Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ変異体。
【請求項７】
前記グラム陰性細菌変異体が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種である、請求項３に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項８】
前記Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項７に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項９】
前記弱毒化Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体が、ＭＵＴ２０；ＭＵＴ２１；ＭＵＴ２２；ＭＵＴ２３；ＭＵＴ２４；ＭＵＴ２５；ＭＵＴ２６；ＭＵＴ２７；ＭＵＴ２８；ＭＵＴ２９；ＭＵＴ３０；ＭＵＴ３１；ＭＵＴ３２；ＭＵＴ３３；ＭＵＴ３４；ＭＵＴ３５；ＭＵＴ３６；ＭＵＴ３７；ＭＵＴ３８；ＭＵＴ３９；ＭＵＴ４０；ＭＵＴ４１；ＭＵＴ４２；ＭＵＴ４３；ＭＵＴ４４；ＭＵＴ４５；およびＭＵＴ４６からなる群より選択される、請求項８に記載の弱毒化Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体。
【請求項１０】
抗菌薬を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）候補組成物を、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、少なくとも１つのポリペプチドと接触させる工程；ならびに
（ｂ）該候補組成物の存在下および非存在下において、該ポリペプチドの生物活性を比較する工程であって、ここで、該ポリペプチドの生物活性の変化は、該候補組成物が抗菌薬であることを示唆する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記候補組成物が、少なくとも２つの分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補組成物が、少なくとも１つの約５００ダルトン未満の分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記候補組成物が、少なくとも１つの約５００ダルトンを超える分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記候補組成物が、ポリペプチド、多糖、脂質、核酸またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
抗菌薬を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）候補組成物を、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させる工程；ならびに
（ｂ）該候補組成物の存在下および非存在下において、該ポリヌクレオチドの発現を比較する工程であって、ここで、該ヌクレオチドの発現の変化は、該候補組成物が抗菌薬であることを示唆する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記候補組成物が、少なくとも２つの分子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記候補組成物が、少なくとも１つの約５００ダルトン未満の分子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記候補組成物が、少なくとも１つの約５００ダルトンを超える分子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記候補組成物が、ポリペプチド、多糖、脂質、核酸またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの分子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸が、リボ核酸である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記核酸が、低分子干渉リボ核酸である、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
被験体中の病原体の毒性の程度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１の被験体由来のサンプル中の、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、少なくとも１つのポリペプチドの発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリペプチドの量を、該病原体の存在を有さないことが公知の第２の被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプルと比較した、該第１の被験体中の該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該病原体の毒性の程度を示唆する工程、を包含する、方法。
【請求項２４】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項２４に記載の哺乳動物被験体。
【請求項２６】
被験体中の病原体の毒性の程度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記第１の被験体由来のサンプル中の、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリヌクレオチドの量を、該病原体の存在を有さないことが公知の第２の被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリヌクレオチドの量と比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプルと比較した、該第１の被験体中の該ポリヌクレオチドの発現レベルにおける変化が、該病原体の毒性の程度を示唆する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項２７に記載の哺乳動物被験体。
【請求項２９】
前記変異体が、異種抗原をコードし、そして発現する、請求項１に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項３０】
前記変異体が、真核細胞において、異種抗原をコードし、そして発現するプラスミドを含む、請求項１に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項３１】
病原性微生物によって引き起こされる疾患に対するワクチンであって、以下：
（ａ）薬学的に有効な投薬量の、１つ以上の請求項１に記載の弱毒化細菌変異体、および；
（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤または薬学的に受容可能なキャリア
を含む、ワクチン。
【請求項３２】
病原性細菌株に由来する弱毒化細菌変異体であって、ここで該弱毒化変異体は、以下：
（ｉ）ｐｃｈＥ、ｐｃｈＦ、ｐｃｈＧ、ｐｃｈＨおよびｐｃｈＩからなる群より選択される遺伝子の変異；ならびに
（ｉｉ）同遺伝子型細菌株の存在下において観察される増殖と比較する場合、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖の減少された阻害；
を有する、弱毒化変異体。
【請求項３３】
ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子をコードするオペロンを含む細菌株であって、ここで、該細菌株は、該変異を欠如する同遺伝子型細菌株に関連して、該遺伝子の発現を減少させる変異を含む、細菌株。
【請求項３４】
前記変異が、該変異を欠如する同遺伝子型細菌株の存在下において、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖と比較した場合、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖の阻害を減少させる、請求項３３に記載の細菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、毒性遺伝子および毒性タンパク質、ならびにこれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、グラム陰性細菌から得られた遺伝子およびタンパク質／ペプチド、ならびに治療および薬物のスクリーニングにおけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヘルスケアの専門家によると、微生物によって引き起こされる感染性疾患は、世界中でいずれの他の単一の原因よりも、より多くの死の原因である。アメリカ合衆国単独での感染性疾患を処置するための医療の年間コストの現在の見積もりは、約１２００億ドルである。抗生物質処置が、多くの微生物感染に対して有効である一方、病原性細菌の間の抗生物質耐性は、健康の懸念を増大させる。実際、アメリカ医師会は、「抗菌薬に対する耐性の世界的な増加は、すべての利用可能な抗菌薬に対して耐性である細菌株の出現を含み、それは、潜在的に危機的な比率の公衆衛生問題を作り出している」と結論を下している。
【０００３】
ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａは、グラム陰性細菌の２つの属であって、感染された宿主生物体に対して、重大な健康リスクをもたらす。それは、一部には、多くの抗生物質に対するそれらの耐性のためである。これらの細菌は、特に、肺において、生命にかかわる感染を引き起こすことで有名である。ガン患者および火傷患者もまた、一般に、重篤なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染を被り、これは、免疫系欠損を有する特定の他の個人と同様である。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．は、多くの型の感染の原因である一方、医療環境の外で、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌によって引き起こされる最も一般的な感染は、肺炎である。
【０００４】
当該分野において、新規の抗菌治療の方法についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、一部には、４６遺伝子の発見に基づく。グラム陰性細菌の毒性を低くするように変異させた場合、それらは、新規の抗菌治療方法において用いられ得る。本発明は、病原性株に由来する弱毒化細菌変異体を提供する。これらの弱毒化細菌株は、本明細書中で、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６として同定されるＶＩＲＸ遺伝子中に変異を有し；そして、同遺伝子型細菌株の存在下において観察される増殖と比較した場合、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバ増殖の低減された阻害を示す。本明細書中で使用される場合、用語「病原性の」は、宿主生物に対して、疾患、損傷または害を引き起こす薬剤の能力として定義される。本明細書中で使用される場合、用語「弱毒化された」は、同遺伝子系毒性生物に対して、より毒性が低くなった生物を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「変異体」は、その生物の表現型において発現される遺伝子の特定の変異を有する生物を意味する。変異は、挿入不活性化または遺伝子の欠失であり得る。その変異は、遺伝子の挿入不活性化であることが好ましい。
【０００６】
本発明はまた、病原性グラム陰性細菌株に由来する弱毒化細菌変異体を提供する。これらの弱毒化グラム陰性細菌株は、本明細書中で、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６として同定されるＶＩＲＸ遺伝子において変異を有し；そして、同遺伝子型細菌株の存在下において観察される増殖と比較した場合、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバ増殖の低減された阻害を示す。変異は、挿入不活性化または遺伝子の欠失であり得る。その変異は、遺伝子の挿入不活性化であることが好ましい。弱毒化グラム陰性細菌変異体が、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＫｌｅｂｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．に由来することもまた、好ましい。この弱毒化グラム陰性細菌変異体が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの株であることが、より好ましい。
【０００７】
本発明はさらに、オペロンの一部であり得るＶＩＲＸ遺伝子を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「オペロン」は、いくつかの遺伝子を含み、通常は補完的な機能を有する、細菌遺伝子発現および細菌遺伝子調節の単位である。オペロン中の遺伝子への挿入は、代表的には、この遺伝子の機能およびオペロン中の下流または上流に位置する他の遺伝子の機能を干渉する。遺伝子に起因する機能とは、その機能および／または同じオペロン中の下流もしくは上流に位置する任意の遺伝子の機能をいう。従って、本発明はまた、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される、遺伝子をコードするオペロンを含む細菌株を提供し、この細菌株は、変異を欠如する同遺伝子型細菌株に対して、ＶＩＲＸ遺伝子の発現を減少させる変異を含む。１つの実施形態において、変異を欠如する同遺伝子型細菌株の存在下において、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖と比較した場合、その変異は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバ増殖の阻害を減少させる。
【０００８】
本発明は、１以上の、以下の弱毒化Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ変異体株を提供する：ＭＵＴ１；ＭＵＴ２；ＭＵＴ３；ＭＵＴ４；ＭＵＴ５；ＭＵＴ６；ＭＵＴ７；ＭＵＴ８；ＭＵＴ９；ＭＵＴ１０；ＭＵＴ１１；ＭＵＴ１２；ＭＵＴ１３；ＭＵＴ１４；ＭＵＴ１５；ＭＵＴ１６；ＭＵＴ１７；ＭＵＴ１８；およびＭＵＴ１９。本発明はまた、１以上の、以下の弱毒化Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体株を提供する：ＭＵＴ２０；ＭＵＴ２１；ＭＵＴ２２；ＭＵＴ２３；ＭＵＴ２４；ＭＵＴ２５；ＭＵＴ２６；ＭＵＴ２７；ＭＵＴ２８；ＭＵＴ２９；ＭＵＴ３０；ＭＵＴ３１；ＭＵＴ３２；ＭＵＴ３３；ＭＵＴ３４；ＭＵＴ３５；ＭＵＴ３６；ＭＵＴ３７；ＭＵＴ３８；ＭＵＴ３９；ＭＵＴ４０；ＭＵＴ４１；ＭＵＴ４２；ＭＵＴ４３；ＭＵＴ４４；ＭＵＴ４５；およびＭＵＴ４６。
【０００９】
さらに、本発明は、抗菌薬を同定するための方法であって、候補組成物が、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドと接触される方法を提供する。候補組成物の存在下におけるポリペプチドの生物学的活性は、候補組成物の非存在下におけるポリペプチドの生物学的活性と比較される。ポリペプチドの生物学的活性の変化は、その候補組成物が抗菌薬であることを示唆する。いくつかの実施形態において、その候補組成物は、少なくとも２種の分子を含有する。その候補組成物は、少なくとも１つの約５００ダルトン未満の分子または少なくとも１つの約５００ダルトンを超える分子を含有し得る。この候補組成物は、例えば、免疫グロブリン、多糖、脂質、核酸またはこれらの組み合わせであり得る。
【００１０】
さらに、本発明は、抗菌薬を同定するための方法であって、候補組成物が、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触される方法を提供する。候補組成物の存在下におけるポリヌクレオチドの発現は、候補組成物の非存在下におけるポリヌクレオチドの発現と比較される。ポリヌクレオチドの発現の変化は、その候補組成物が抗菌薬であることを示唆する。いくつかの実施形態において、その候補組成物は、少なくとも２種の分子を含有する。その候補組成物は、少なくとも１つの約５００ダルトンの未満の分子または少なくとも１つの約５００ダルトンを超える分子を含有し得る。この候補組成物は、ポリペプチド、多糖、脂質、核酸（例えば、リボ核酸）またはこれらの組み合わせであり得る。好ましい実施形態において、候補組成物のリボ核酸は、低分子干渉（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）リボ核酸である。
【００１１】
さらに、本発明は、被験体中に存在する病原体の毒性の程度を決定するための方法であって、以下：
（ａ）第１の被験体由来のサンプル中の、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４３、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の上記サンプル中の上記ポリペプチドの量を、上記病原体の存在を有さないことが公知の第２の被験体由来のコントロールサンプル中に存在するポリペプチドの量と比較する工程であって、ここで、上記コントロールサンプルと比較した、第１の被験体中のポリペプチドの発現レベルにおける変化は、病原体の毒性の程度を示唆する工程、を包含する方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施形態において、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、その被験体は、ヒトである。
【００１３】
本発明はまた、被験体中に存在する病原体の毒性の程度を測定するための方法であって、以下：
（ａ）第１の被験体由来のサンプル中の、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現のレベルを測定する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の上記サンプル中の上記ポリヌクレオチドの量を、上記病原体の存在を有さないことが公知の第２の被験体由来のコントロールサンプル中において存在するポリヌクレオチドの量と比較する工程であって、ここで、上記コントロールサンプルと比較した、第１の被験体中におけるポリペプチドの発現レベルにおける変化は、病原体の毒性の程度を示唆する工程、を包含する方法を提供する。
【００１４】
好ましい実施形態において、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、その被験体は、ヒトである。
【００１５】
さらに、本発明は、外来抗原および外来ＤＮＡのためのワクチンならびにベクターとして用いられ得る、弱毒化細菌株を提供する。これらの弱毒化細菌株は、対応する細菌株に関連する疾患に対して有効なワクチンの調製のために有用である。好ましい実施形態において、弱毒化細菌株は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．に由来する。
【００１６】
さらに、本発明は、他の病原体からクローニングされた外来遺伝子のためのベクターとして用いられ得る弱毒化細菌株を提供する。それらの遺伝子はタンパク質中に発現され、それらが由来する病原体に対する防御的免疫応答を惹起する。好ましい実施形態において、ベクターとして用いられる弱毒化細菌株は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．に由来する。
【００１７】
他に定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって、一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似するか、または等価な方法および材料は、本発明の実施においてか、または本発明の試験において用いられ得るが、適切な方法および材料は、下に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が、参考として援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、単なる実例であって限定されることは意図されない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部には、グラム陰性細菌の毒性を低くするように変異させた場合の４６遺伝子の発見に基づく。これら毒性遺伝子の１９個は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＴ８９４において同定されたが、一方、残りの２７個の遺伝子は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの変異誘発に由来した。これらの細菌変異体は、同遺伝子型細菌株に対して弱毒化毒性を有し、「ＭＵＴＸ」と名付けられる。本明細書中に、各々の新規の弱毒化ＭＵＴＸ株に影響する毒性遺伝子、およびそれらによってコードされるヌクレオチドおよびポリペプチドが、提供される。作用した遺伝子によってコードされる配列は、集合的に「ＶＩＲＸ核酸」または「ＶＩＲＸポリヌクレオチド」と称され、対応するコードポリペプチドは、「ＶＩＲＸポリペプチド」または「ＶＩＲＸタンパク質」と称される。他に示されない限り、「ＶＩＲＸ」は、本明細書中に開示される任意の新規配列を称することを意味する。
【００２０】
本発明のペプチドおよび遺伝子は、感染を処置するための治療薬の調製のために有用である。なぜならば、これらは、野生型病原体の毒性を弱毒化するからである。治療は、予防的または治療的であり得る。治療を受ける被験体は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ゴリラまたはチンパンジー）、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコまたはげっ歯動物（マウスまたはラットを含む）であり得る。
【００２１】
（Ｉ．毒性因子をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ遺伝子の同定）
宿主生物に対する毒性因子（例えば、病原体または毒素）をコードする遺伝子を、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの増殖を比較することによって同定した。この同定は、２００２年６月７日出願の国際出願ＰＣＴ／ＩＢ０２／０３２７７に詳細に述べられているような、同定可能な遺伝子変化を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの試験変異体の存在下および非存在下において行われた。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような細菌を、食作用によって摂食する。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌と共にプレートする場合、各アメーバは、細菌が食菌された領域の細菌生育（ｌａｗｎ）中に、プラークを形成する。病原性細菌（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＴ８９４）をＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌の生育に加えることにより、アメーバの増殖を阻害する。
【００２２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの試験変異体を、当該分野で公知の方法に従うトランスポゾン挿入によって作製し、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイ（２００２年６月７日出願のＰＣＴ／ＩＢ０２／０３２７７を参照のこと）において毒性について試験した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体をまた、当該分野で公知の方法に従うトランスポゾン挿入によって作製し、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイ（２００２年６月７日出願のＰＣＴ／ＩＢ０２／０３２７７を参照のこと）において、毒性細菌に対して特に感受性であると見出された株であるＰＨＧ１ａ変異体Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ株（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（４４）：３４２８７−９２，２０００）を用いて毒性を試験した。詳細には、プラスポゾン（ｐｌａｓｐｏｓｏｎ）ｐＮＫＢＯＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ３１０１３６）を用いた標準的な細菌エレクトロポーレーション技術によって、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体を得て、そして５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する固体ＬＢ培地上で選択した（Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌら，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５２（５）：４８１−５，２００１）。当該分野で公知の他の変異誘発方法（例えば、紫外線照射曝露、挿入剤または形質転換ファージを用いた処置）もまた、変異体を作製するために用いられ得る。低減した毒性を生じる変異を、変異体病原体に曝露されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ試験宿主生物の増殖が、野生型病原体に曝露されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ試験宿主生物より大きい場合に同定した。続いて、低減した毒性を示す病原体中の特異的な遺伝子変異を、当該分野で周知の技術によって同定し、そして特徴付けた。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体中の特異的な遺伝子変異の同定を、プラスミドレスキューおよび（Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌら，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５２（５）：４８１−５，２００１）に従ってＢｇｌＩＩまたはＡｐａＩ制限酵素を用いた挿入部位変異体におけるゲノムＤＮＡのクローニングによって実施した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ変異体における特異的な遺伝子の変異の同定を、トランスポゾンおよびアクセプタープラスミド中へ周囲の細菌ゲノムＤＮＡのサブクローニングによって、実施した。トランスポゾンの挿入部位を同定するために、増殖したレスキュープラスミドについて、ＤＮＡ配列決定を実施した。Ｊｏｉｎ−Ｌａｍｂｅｒｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５（２）：５７１−６、２００１によって記載されたような、ラットの死亡率アッセイは、哺乳動物宿主中での弱毒化毒性活性を実証するために使用され得る。
【００２３】
ＶＩＲＸ遺伝子を有する１９種のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ弱毒化ＭＵＴＸ生物を、下の表１に要約する。
【００２４】
【表１−１】
2006524984.tif 000002
【００２５】
【表１−２】
2006524984.tif 000003
本発明において開示され、毒性について新規の役割を指定されるＶＩＲＸ遺伝子を有する２７種のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ弱毒化ＭＵＴＸ生物を、下の表２に要約する。
【００２６】
【表２−１】
2006524984.tif 000004
【００２７】
【表２−２】
2006524984.tif 000005
（ＩＩ．弱毒化細菌変異体）
（Ａ．弱毒化Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ変異体）
（ＭＵＴ１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＰＡ０６５０）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表３Ａに示すＶＩＲ１核酸（配列番号１）をコードする。
【００２８】
【表３Ａ】
2006524984.tif 000006
配列番号１によってコードされるＶＩＲ１タンパク質（配列番号２）は、表３Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００２９】
【表３Ｂ】
2006524984.tif 000007
毒性におけるＶＩＲ１の役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００３０】
（ＭＵＴ２）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ２）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＡＴＰスルフリラーゼ小サブユニット（ＣｙｓＤ；ＰＡ４４４３）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表４Ａに示すＶＩＲ２核酸（配列番号３）をコードする。
【００３１】
【表４Ａ】
2006524984.tif 000008
配列番号３によってコードされるＶＩＲ２タンパク質（配列番号４）は、表４Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００３２】
【表４Ｂ】
2006524984.tif 000009
毒性におけるＶＩＲ２の役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００３３】
（ＭＵＴ３）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ３）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＣｙｓＱ（ＰＡ５１７５）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表５Ａに示すＶＩＲ３核酸（配列番号５）をコードする。
【００３４】
【表５Ａ】
2006524984.tif 000010
配列番号５によってコードされるＶＩＲ３タンパク質（配列番号６）は、表５Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００３５】
【表５Ｂ】
2006524984.tif 000011
（ＭＵＴ４）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ４）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの小サブユニット（ｄａｄＡ；ＰＡ５３０４）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表６Ａに示すＶＩＲ４核酸（配列番号７）をコードする。
【００３６】
【表６Ａ】
2006524984.tif 000012
配列番号７によってコードされるＶＩＲ４タンパク質（配列番号８）は、表６Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００３７】
【表６Ｂ】
2006524984.tif 000013
毒性におけるＶＩＲ４の役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００３８】
（ＭＵＴ５）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ５）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼのシクラーゼサブユニット（ｈｉｓＦ；ＰＡ５１４０）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表７Ａに示すＶＩＲ５核酸（配列番号９）をコードする。
【００３９】
【表７Ａ】
2006524984.tif 000014
配列番号９によってコードされるＶＩＲ５タンパク質（配列番号１０）は、表７Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００４０】
【表７Ｂ】
2006524984.tif 000015
（ＭＵＴ６）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ６）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、Ｎ−アセチル−グルタミル−リン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ；ＰＡ０６６２）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表８Ａに示すＶＩＲ６核酸（配列番号１１）をコードする。
【００４１】
【表８Ａ】
2006524984.tif 000016
配列番号１１によってコードされるＶＩＲ６タンパク質（配列番号１２）は、表８Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００４２】
【表８Ｂ】
2006524984.tif 000017
毒性におけるＶＩＲ６の役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００４３】
（ＭＵＴ７）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ７）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＡｃｅＦ；ＰＡ５０１６）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表９Ａに示すＶＩＲ７核酸（配列番号１３）をコードする。
【００４４】
【表９Ａ】
2006524984.tif 000018
配列番号１３によってコードされるＶＩＲ７タンパク質（配列番号１４）は、表９Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００４５】
【表９Ｂ】
2006524984.tif 000019
（ＭＵＴ８）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ８）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ鎖Ｈ（ｎｕｏＨ；ＰＡ２６４３）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１０Ａに示すＶＩＲ８核酸（配列番号１５）をコードする。
【００４６】
【表１０Ａ】
2006524984.tif 000020
配列番号１５によってコードされるＶＩＲ８タンパク質（配列番号１６）は、表１０Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００４７】
【表１０Ｂ】
2006524984.tif 000021
（ＭＵＴ９）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ９）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ピオベルジン（ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ）シンターゼＤ（ＰｖｄＤ；ＰＡ２３９９）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１１Ａに示すＶＩＲ９核酸（配列番号１７）をコードする。
【００４８】
【表１１Ａ−１】
2006524984.tif 000022
【００４９】
【表１１Ａ−２】
2006524984.tif 000023
【００５０】
【表１１Ａ−３】
2006524984.tif 000024
配列番号１７によってコードされるＶＩＲ９タンパク質（配列番号１８）は、表１１Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００５１】
【表１１Ｂ】
2006524984.tif 000025
（ＭＵＴ１０）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１０）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＲＮＤ多剤排出トランスポーターＭｅｘＤ（ｍｅｘＤ；ＰＡ４５９８）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１２Ａに示すＶＩＲ１０核酸（配列番号１９）をコードする。
【００５２】
【表１２Ａ】
2006524984.tif 000026
配列番号１９によってコードされるＶＩＲ１０タンパク質（配列番号２０）は、表１２Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００５３】
【表１２Ｂ】
2006524984.tif 000027
（ＭＵＴ１１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１１）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＰＡ３７２１をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１３Ａに示すＶＩＲ１１核酸（配列番号２１）をコードする。
【００５４】
【表１３Ａ】
2006524984.tif 000028
配列番号２１によってコードされるＶＩＲ１１タンパク質（配列番号２２）は、表１３Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００５５】
【表１３Ｂ】
2006524984.tif 000029
（ＭＵＴ１２）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１２）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＰＡ０５９６をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１４Ａに示すＶＩＲ１２核酸（配列番号２３）をコードする。
【００５６】
【表１４Ａ】
2006524984.tif 000030
配列番号２３によってコードされるＶＩＲ１２タンパク質（配列番号２４）は、表１４Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００５７】
【表１４Ｂ】
2006524984.tif 000031
（ＭＵＴ１３）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１３）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＰＡ５２５６をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１５Ａに示すＶＩＲ１３核酸（配列番号２５）をコードする。
【００５８】
【表１５Ａ】
2006524984.tif 000032
配列番号２５によってコードされるＶＩＲ１３タンパク質（配列番号２６）は、表１５Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００５９】
【表１５Ｂ】
2006524984.tif 000033
（ＭＵＴ１４）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１４）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ピオチェリン（ｐｙｏｃｈｅｌｉｎ）生合成タンパク質ｐｃｈＣ（ＰＡ４２２９）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１６Ａに示すＶＩＲ１４核酸（配列番号２７）をコードする。
【００６０】
【表１６Ａ】
2006524984.tif 000034
配列番号２７によってコードされるＶＩＲ１４タンパク質（配列番号２８）は、表１６Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００６１】
【表１６Ｂ】
2006524984.tif 000035
（ＭＵＴ１５）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１５）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ジヒドロアエルギノイック酸（ｄｉｈｙｄｒｏａｅｒｕｇｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）シンテターゼｐｃｈＥ（ＰＡ４２２６）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１７Ａに示すＶＩＲ１５核酸（配列番号２９）をコードする。
【００６２】
【表１７Ａ−１】
2006524984.tif 000036
【００６３】
【表１７Ａ−２】
2006524984.tif 000037
配列番号２９によってコードされるＶＩＲ１５タンパク質（配列番号３０）は、表１７Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００６４】
【表１７Ｂ】
2006524984.tif 000038
（ＭＵＴ１６）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１６）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ピオチェリンシンテターゼｐｃｈＦ（ＰＡ４２２５）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１８Ａに示すＶＩＲ１６核酸（配列番号３１）をコードする。
【００６５】
【表１８Ａ−１】
2006524984.tif 000039
【００６６】
【表１８Ａ−２】
2006524984.tif 000040
配列番号３１によってコードされるＶＩＲ１６タンパク質（配列番号３２）は、表１８Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００６７】
【表１８Ｂ】
2006524984.tif 000041
（ＭＵＴ１７）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１７）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＡＢＣトランスポーターの推定のＡＴＰ結合構成要素であるｐｃｈＨ（ＰＡ４２２３）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表１９Ａに示すＶＩＲ１７核酸（配列番号３３）をコードする。
【００６８】
【表１９Ａ】
2006524984.tif 000042
配列番号３３によってコードされるＶＩＲ１７タンパク質（配列番号３４）は、表１９Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００６９】
【表１９Ｂ】
2006524984.tif 000043
毒性におけるＶＩＲ１７の役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００７０】
（ＭＵＴ１８）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１８）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＡＢＣトランスポーターの推定のＡＴＰ結合構成要素であるｐｃｈＩ（ＰＡ４２２２）をコードする遺伝子として同定した。この遺伝子は、表２０Ａに示すＶＩＲ１８核酸（配列番号３５）をコードする。
【００７１】
【表２０Ａ】
2006524984.tif 000044
配列番号３７によってコードされるＶＩＲ１８タンパク質（配列番号３６）は、表２０Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて提示される。
【００７２】
【表２０Ｂ】
2006524984.tif 000045
毒性におけるＶＩＲ１８の役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００７３】
（ＭＵＴ１９）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌変異体（ＭＵＴ１９）を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型株ＰＴ８９４中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ血清型０９推定Ｏ抗原生合成経路（ＶＩＲ１９）をコードする遺伝子クラスターとして同定した。ＭＵＴ１９中でＶＩＲ１９遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２１に示す。
【００７４】
【表２１】
2006524984.tif 000046
毒性におけるこのクラスターの役割を、ファージを用いて、同遺伝子型細菌株と比較したＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて弱毒化毒性を再び観察した野生型ＰＴ８９４株に、この変異を再び形質導入して、確認した。
【００７５】
（Ｂ．弱毒化Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ変異体）
（ＭＵＴ２０）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２０）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、メット（ｍｅｔ）Ｇ−ｄｌｄ遺伝子内領域における仮定の転写調節因子（ＶＩＲ２０）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２０中でＶＩＲ２０遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２２に示す。
【００７６】
【表２２】
2006524984.tif 000047
（ＭＵＴ２１）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２１）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、シスタチオナーゼ（ＶＩＲ２１）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２１中でＶＩＲ２１遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２３に示す。
【００７７】
【表２３】
2006524984.tif 000048
（ＭＵＴ２２）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２２）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、リボソーム結合因子Ａ（ＶＩＲ２２）として同定した。ＭＵＴ２２中でＶＩＲ２２遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２４に示す。
【００７８】
【表２４】
2006524984.tif 000049
（ＭＵＴ２３）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２３）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＶＩＲ２３）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２３中でＶＩＲ２３遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２５に示す。
【００７９】
【表２５】
2006524984.tif 000050
（ＭＵＴ２４）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２４）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）シンテターゼ（ＶＩＲ２４）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２４中でＶＩＲ２４遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２６に示す。
【００８０】
【表２６】
2006524984.tif 000051
（ＭＵＴ２５）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２５）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ（ＶＩＲ２５）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２５中でＶＩＲ２５遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２７に示す。
【００８１】
【表２７】
2006524984.tif 000052
（ＭＵＴ２６）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２６）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ホモセリントランススクシニラーゼ（ｔｒａｎｓｓｕｃｃｉｎｙｌａｓｅ）（ＶＩＲ２６）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２６中でＶＩＲ２６遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２８に示す。
【００８２】
【表２８】
2006524984.tif 000053
（ＭＵＴ２７）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２７）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホサルフェートレダクターゼ（ＶＩＲ２７）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２７中でＶＩＲ２７遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表２９に示す。
【００８３】
【表２９】
2006524984.tif 000054
（ＭＵＴ２８）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２８）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、Ｓｆｉタンパク質（ＶＩＲ２８）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２８中でＶＩＲ２８遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３０に示す。
【００８４】
【表３０】
2006524984.tif 000055
（ＭＵＴ２９）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ２９）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、転写活性化因子タンパク質ＬｙｓＲ（ＶＩＲ２９）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ２９中でＶＩＲ２９遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３１に示す。
【００８５】
【表３１】
2006524984.tif 000056
（ＭＵＴ３０）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３０）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＴｒｐＤ（ＶＩＲ３０）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３０中でＶＩＲ３０遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３２に示す。
【００８６】
【表３２】
2006524984.tif 000057
（ＭＵＴ３１）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３１）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ（ＶＩＲ３１）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３１中でＶＩＲ３１遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３３に示す。
【００８７】
【表３３】
2006524984.tif 000058
（ＭＵＴ３２）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３２）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＷａａＱ（ＶＩＲ３２；Ｒｅｇｕｅら．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（１２）：３５６４−７３，２００１）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３２中でＶＩＲ３２遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３４に示す。
【００８８】
【表３４】
2006524984.tif 000059
（ＭＵＴ３３）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３３）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＶＩＲ３３）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３３中でＶＩＲ３３遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３５に示す。
【００８９】
【表３５】
2006524984.tif 000060
（ＭＵＴ３４）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３４）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＶＩＲ３４）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３４中でＶＩＲ３４遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３６に示す。
【００９０】
【表３６】
2006524984.tif 000061
（ＭＵＴ３５）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３５）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＵＤＰ−ガラクトピラノースムターゼ（ＶＩＲ３５；Ｃｌａｒｋｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：５４１１−１８，１９９５）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３５中でＶＩＲ３５遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３７に示す。
【００９１】
【表３７】
2006524984.tif 000062
（ＭＵＴ３６）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３６）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、Ｏ−抗原輸送系（ｅｘｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ）パーミアーゼタンパク質ｒｆｂａ（ＶＩＲ３６；Ｂｒｏｎｎｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４：５０５−１９，１９９４）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３６中でＶＩＲ３６遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３８に示す。
【００９２】
【表３８】
2006524984.tif 000063
（ＭＵＴ３７）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３７）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ウリジルトランスフェラーゼ（ＶＩＲ３７）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３７中でＶＩＲ３７遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表３９に示す。
【００９３】
【表３９】
2006524984.tif 000064
（ＭＵＴ３８）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３８）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ピリドキシンホスフェート生合成タンパク質ＰｄｘＪ−ＰｄｘＡ（ＶＩＲ３８）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３８中でＶＩＲ３８遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４０に示す。
【００９４】
【表４０】
2006524984.tif 000065
（ＭＵＴ３９）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ３９）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＶＩＲ３９）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ３９中でＶＩＲ３９遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４１に示す。
【００９５】
【表４１】
2006524984.tif 000066
（ＭＵＴ４０）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４０）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＶＩＲ４０）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４０中でＶＩＲ４０遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４２に示す。
【００９６】
【表４２】
2006524984.tif 000067
（ＭＵＴ４１）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４１）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ガラコシル（ｇａｌａｃｏｓｙｌ）トランスフェラーゼ（ＶＩＲ４１；Ｃｌａｒｋｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：５４１１−１８，１９９５）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４１中でＶＩＲ４１遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４３に示す。
【００９７】
【表４３】
2006524984.tif 000068
（ＭＵＴ４２）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４２）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、シロヘムシンテターゼ（ＶＩＲ４２；Ｋｏｌｋｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：３２８−３５，２００１）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４２中でＶＩＲ４２遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４４に示す。
【００９８】
【表４４】
2006524984.tif 000069
（ＭＵＴ４３）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４３）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼ（ＶＩＲ４３）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４３中でＶＩＲ４３遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４５に示す。
【００９９】
【表４５】
2006524984.tif 000070
（ＭＵＴ４４）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４４）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＶＩＲ４４）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４４中でＶＩＲ４４遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４６に示す。
【０１００】
【表４６】
2006524984.tif 000071
（ＭＵＴ４５）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４５）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、ＤＮＡメチル化酵素（ＶＩＲ４５）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４５中でＶＩＲ４５遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４７に示す。
【０１０１】
【表４７】
2006524984.tif 000072
（ＭＵＴ４６）
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細菌変異体（ＭＵＴ４６）を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．野生型株中へのトランスポゾン挿入によって作製した。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ増殖アッセイにおいて、変異した微生物は、同遺伝子型細菌株と比較して、より毒性が少なかった。トランスポゾン挿入の直後にヌクレオチド配列をクローニングし、推定の内膜タンパク質（ＶＩＲ４６）をコードする遺伝子として同定した。ＭＵＴ４６中でＶＩＲ４６遺伝子を同定する挿入部位核酸配列を、表４８に示す。
【０１０２】
【表４８】
2006524984.tif 000073
（ＩＶ．適切な標的病原体）
他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．ならびに多くの他の微生物（グラム陰性細菌株を含む）は、本明細書中で同定されるアミノ酸へのアミノ酸配列同一性もしくは類似性を有するＶＩＲＸ関連ペプチドまたはＶＩＲＸ関連タンパク質をコードする毒性遺伝子を含む可能性が高い。適切な細菌病原体としては、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明の病原性ミコバクテリアとしては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられ得る。本発明の病原性真菌としては、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げら得る。本発明の病原性単細胞真核生物としては、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉが挙げられ得る。
【０１０３】
本発明に従ってＶＩＲＸ遺伝子を同定すると、他の微生物中の関連遺伝子または関連ペプチドを検索するために、その遺伝子配列を使用することが可能である。このことは、既存のデータベース（例えば、ＥＭＢＬまたはＧｅｎＢａｎｋ）の中の検索によって、実行され得る。遺伝子配列の間の同一性のレベルおよびアミノ酸配列の間の同一性または類似性のレベルは、公知の方法を用いて計算され得る。本発明に関して、同一性および類似性を決定するための方法に基づく、公に利用可能なコンピューターとしては、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９０；２１５：４０３−４１０）、ＮＣＢＩから利用可能なＢＬＡＳＴＸプログラム、ならびにＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩから利用可能なＧａｐプログラムが挙げられる。
【０１０４】
好ましくは、本発明の種々の局面において有用であり得るペプチドは、本明細書中で同定されたペプチドと４０％を超える類似性を有する。より好ましくは、そのペプチドは、６０％を超える配列類似性を有する。最も好ましくは、そのペプチドは、８０％を超える配列類似性（例えば、９５％の類似性）を有する。本明細書で同定されたポリヌクレオチド配列に関連して、本発明の種々の局面において有用であり得る関連ポリヌクレオチドは、本明細書中で同定された配列と４０％を超える同一性を有し得る。より好ましくは、そのポリヌクレオチド配列は６０％を超える配列同一性を有する。最も好ましくは、そのポリヌクレオチド配列は、８０％を超える配列同一性（例えば、９５％の同一性）を有する。
【０１０５】
他の微生物由来の関連分子に加えて、本発明は、本明細書中で同定されたペプチドおよびポリヌクレオチドに対して作製された生物学的機能を顕著に変化させない改変体を含む。遺伝暗号の縮重が、本明細書中で特定されたポリヌクレオチドからの微小な塩基変化を有するポリヌクレオチドを生じ得るが、それにもかかわらず、そのポリヌクレオチドは同じペプチドをコードするということは、当業者には明らかである。相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。アミノ酸レベルにおける保存的な置換もまた、認識される。例えば、種々の酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸は、実質的な機能の喪失を伴わずに置換され得る。
【０１０６】
転写を調節する高度に洗練された機構は、細菌において発展し、存在していることが当該分野で認識される。ほとんどの細菌遺伝子は、オペロン中に組織化される。このオペロンは、関連タンパク質をコードする遺伝子の群である。オペロンは、抑制され得るか、またはそのようにそれら遺伝子の調節を誘導され得るかのどちらかである。オペロンは、オペレーター、プロモーター、調節因子、および構造遺伝子からなる。この調節遺伝子は、オペレーターに結合するリプレッサータンパク質をコードし、構造遺伝子のプロモーター（従って、転写）を妨害する。この調節因子は、オペロン中の他の遺伝子に隣接される必要はない。リプレッサータンパク質が除かれると、転写が起こり得る。
【０１０７】
トランスポゾン変異誘発は、通常は、トランスポゾンが挿入される遺伝子、および同じオペロンの下流の任意の遺伝子を不活化する。ＶＩＲＸ遺伝子がオペロン中の構造遺伝子である場合、ＶＩＲＸ遺伝子の不活化は、同じオペロン中および不活化ＶＩＲＸ遺伝子の下流に位置する、他の構造遺伝子の発現を乱す。例えば、ｐｃｈＥ遺伝子中への挿入はまた、ｐｃｈＦ遺伝子、ｐｃｈＧ遺伝子、ｐｃｈＨ遺伝子およびｐｃｈＩ遺伝子を不活化する。なぜなら、それらすべては、ｐｃｈＥＦＧＨＩオペロンの内部に存在し、かつ不活化ｐｃｈＥ遺伝子の下流だからである。従って、本発明は、オペロン中に存在するＶＩＲＸ遺伝子の変化および同じオペロン中およびＶＩＲＸ遺伝子の下流に位置する構造遺伝子の発現の減少を引き起こす核酸の変化に起因する毒性の弱毒化を含む。１つの実施形態において、本発明は、本発明のＶＩＲＸ遺伝子を保有するオペロンの第一の遺伝子を不活化する改変である。ＶＩＲＸ遺伝子およびＶＩＲＸ含有オペロンの核酸の改変は、挿入不活性化または遺伝子欠失であり得る。ＶＩＲＸ遺伝子およびＶＩＲＸ含有オペロンの核酸の変化は、挿入不活性化であることが好ましい。
【０１０８】
本発明はまた、ＶＩＲ１、ＶＩＲ２、ＶＩＲ３、ＶＩＲ４、ＶＩＲ５、ＶＩＲ６、ＶＩＲ７、ＶＩＲ８、ＶＩＲ９、ＶＩＲ１０、ＶＩＲ１１、ＶＩＲ１２、ＶＩＲ１３、ＶＩＲ１４、ＶＩＲ１５、ＶＩＲ１６、ＶＩＲ１７、ＶＩＲ１８、ＶＩＲ１９、ＶＩＲ２０、ＶＩＲ２１、ＶＩＲ２２、ＶＩＲ２３、ＶＩＲ２４、ＶＩＲ２５、ＶＩＲ２６、ＶＩＲ２７、ＶＩＲ２８、ＶＩＲ２９、ＶＩＲ３０、ＶＩＲ３１、ＶＩＲ３２、ＶＩＲ３３、ＶＩＲ３４、ＶＩＲ３５、ＶＩＲ３６、ＶＩＲ３７、ＶＩＲ３８、ＶＩＲ３９、ＶＩＲ４０、ＶＩＲ４１、ＶＩＲ４２、ＶＩＲ４４、ＶＩＲ４５およびＶＩＲ４６からなる群より選択される遺伝子をコードするオペロンを含む細菌株を提供し、この細菌株は、変異を欠如する同遺伝子型細菌株に対して、ＶＩＲＸ遺伝子の発現を減少させる変異を含む。１つの実施形態において、この変異は、変異を欠如する同遺伝子型細菌株の存在下において、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖と比較した場合、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍアメーバの増殖の阻害を低減させる。別の実施形態において、弱毒化細菌株は、同遺伝子型細菌株と比較した場合、ＶＩＲＸ遺伝子を含有するオペロンの２つ以上の変異を有する。
【０１０９】
（Ｖ．ＶＩＲＸ核酸およびＶＩＲＸポリペプチドは、抗菌薬剤を同定するために使用され得る）
（Ａ．スクリーニング）
別個の実施形態において、本明細書中で開示されるＶＩＲＸ遺伝子、またはそれらのポリヌクレオチド生成物もしくはポリペプチド生成物は、潜在的な抗菌薬の同定のためのスクリーニングアッセイにおいて用いられる。慣用的なスクリーニングアッセイは当業者に公知であり、適切な方法における本発明のＶＩＲＸ生成物を用いて、適合され得る。例えば、本発明の生成物は、潜在的な薬物のための標的として用いられ得、この潜在的な薬物は、その潜在的な抗菌活性を示唆する標的を、不活化または結合する薬物の能力を備える。本発明の方法において、１種以上の試験化合物は、アッセイ混合物において提示され得るか、または生成され得る。好ましくは、アッセイ混合物において、１つの化合物が提示されるか、または生成される。
【０１１０】
（Ｂ．抗菌候補組成物の特徴）
ＶＩＲＸ核酸およびポリペプチドは、本発明において有用な候補組成物または病原体関連疾患もしくは感染の処置における、薬物または治療法を同定するために用いられ得る。候補組成物は、スクリーニングアッセイにおける分析のための１以上の分子を含み得、そして合成分子または半合成分子であり得る。そのような分子は、無機化学分子および有機化学分子を含む。その分子は、約５００ダルトン未満であり得るか、または５００ダルトンを超え得る。その分子は、天然に存在し得る。天然に存在する分子としては、例えば、糖類、脂質、ペプチド、タンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせ（例えば、アミノ配糖体、糖脂質、リポ多糖類またはマクロライド）が挙げられ得る。タンパク質は、免疫グロブリン（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）であり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））であり得る。その分子の正確な供給源は、本発明の方法にとって重要ではない。その分子は、例えば、市販の合成化合物ライブラリー（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）または細菌、真菌、植物、および動物の抽出物（例えば、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）から利用可能）の形態で天然に存在する分子のライブラリーに由来し得る。合成（もしくは、半合成）分子または天然に存在する分子は、当該分野で公知の標準的な化学的方法、物理的方法、または生化学的方法を用いて改変され得る。
【０１１１】
（ＶＩ．ＶＩＲＸ核酸およびＶＩＲＸポリペプチドは、病原体の毒性の程度を検出するために、使用され得る）
診断試験は、疾患の型および適切な関連治療を決定する際に、医師を補助し得る。以下のように、本発明の別個の実施形態は、病原体、病原体関連疾患または病原体の毒性の存在を検出するための毒性マーカーとしてのＶＩＲＸ遺伝子、またはそれらのポリヌクレオチドもしくは核酸生成物の使用を提供する。当業者に公知の多くの診断アッセイのアプローチが存在する。概して、使用される診断方法は、（ａ）潜在的に疾患の被験体または疾患の被験体からサンプルを得る工程；（ｂ）サンプル中の、少なくとも１つのポリペプチド毒性マーカーまたはポリヌクレオチド毒性マーカーのレベルを測定する工程；および（ｃ）工程（ａ）のサンプル中に存在する毒性マーカーの量を、病原体の存在を有さないことが公知の第二の被験体由来のコントロールサンプル中の毒性マーカーの量と比較する工程を包含する。この方法において、コントロールサンプルと比較した場合の第一の被験体中の毒性マーカーの発現レベルにおける変化は、病原体、病原体関連疾患、または病原体の毒性の存在を示唆する。好ましくは、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、その被験体は、ヒトである。当業者は、診断試験が、アレイ型フォーマットにおいて実施され得ることを認識する。このアレイ型フォーマットにおける、例えば、２以上のＶＩＲＸ遺伝子またはＶＩＲＸ遺伝子産物の存在は、病原体、病原体関連疾患、または病原体の毒性の存在を示唆する。
【０１１２】
（ＶＩＩ．本発明の弱毒化生物は、ワクチン調製において使用され得る）
別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載された弱毒化生物の、ワクチン調製における使用を提供する。弱毒化微生物に基づくワクチンの調製は、当業者に公知である。ワクチン組成物は、感染に対する有効な免疫化を提供するために、必要とされるか、または所望される場合、適切なキャリアまたはアジュバント（例えば、ミョウバン）と共に処方され得る。ワクチン処方物の調製は、当業者に明らかである。弱毒化微生物は、本明細書中で同定される任意のＶＩＲＸ遺伝子の発現を乱す変異体と共に調製され得る。当業者は、特定のＶＩＲＸ遺伝子の発現を乱すための方法に気付く。用いられ得る技術としては、挿入不活性技術または遺伝子欠失技術が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従う弱毒化微生物はまた、他の遺伝子中（例えば、本明細書中で同定された第二の遺伝子、または微生物の増殖に必要とされる別個の遺伝子（例えば、Ａｒｏ変異）中に）にさらなる変異を含む。弱毒化微生物はまた、異種抗原、治療タンパク質、または核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の送達のためのキャリアシステムとして用いられ得る。この実施形態において、弱毒化微生物は、異種抗原、タンパク質または核酸を、インビボで特定の部位へ送達するために用いられる。異種抗原、ペプチドまたは核酸の弱毒化微生物への導入は、従来技術によって実行され得る。その技術としては、組み換え構築物（例えば、ベクター）の使用が挙げられ、そのベクターは、異種抗原または治療タンパク質を発現するポリヌクレオチドを含み、適切なプロモーター配列もまた含む。あるいは、異種抗原またはタンパク質をコードする遺伝子は、その生物のゲノムおよびコントロール発現に対して用いられる内因性プロモーターに組み入れられ得る。本発明のワクチンにおいて、投与される本発明の変異体の薬学的に有効な投薬量は、被験体の年齢、体重および性別、ならびに投与の形態に依存して異なり得る。その被験体は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ゴリラまたはチンパンジー）、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、またはげっ歯動物（マウスまたはラットを含む）であり得る。
【０１１３】
（ＶＩＩＩ．定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語の各々は、この節中におけるそれと関連する意味を有する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「病原体」は、疾患を引き起こす因子（特に、細菌または真菌のような生きている微生物）を含むことが意図される。用語「薬剤（ａｇｅｎｔ）」および「因子（ｆａｃｔｏｒ）」は、本発明の方法において有用な病原体または毒素を記載するために、本明細書中で相互変換可能に使用される。病原体としては、任意の細菌、マイコバクテリア、真菌および単細胞真核生物が挙げられ、それらの野生型およびそれらの変異体を含み、それら病原体は、宿主生物に対して疾患を引き起こすか、または損傷もしくは害をもたらす。病原体はまた、有毒物質（例えば、毒素）であり得、生きている細胞または生物によって生成され、宿主に導入された場合、疾患を引き起こす能力を有する。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「病原性」は、宿主生物に対する疾患、損傷または害を引き起こす薬剤の能力として定義される。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、用語「弱毒化」は、同遺伝子系病原性生物に対して、より毒性が低く作製された生物を意味する。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「毒性」は、宿主生物に対する薬剤の病原性の程度を測定することである。毒性は、通常は、薬剤の用量または病原体の細胞数として表され、所定の期間内に宿主生物における病理学的応答を誘発する。本明細書中で使用される場合、「毒性の減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）」は、病原体によって媒介される、宿主生物に対する疾患、損傷もしくは害の進行、または経過を、弱毒化、縮小（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、抑制するか、または抑止する化合物の能力として定義される。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「宿主生物」は、任意の生きている生物を含むことが意図される。好ましくは、その宿主生物は、真核生物（例えば、脊椎動物）である。より好ましくは、その宿主生物は、哺乳動物である。最も好ましくは、その宿主生物は、ヒトである。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「変異体」は、その生物の表現型において発現される遺伝子の特異的変異を保有する生物である。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「変異」は、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の１以上の核酸の変化である。変異としては、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列へのさらなる核酸の挿入（例えば、遺伝子の挿入不活性化）が挙げられ得る。あるいは、変異としては、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の核酸の１以上の欠失が挙げられ得るが、これに限定されない。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「オペロン」は、通常補完的な機能を有するいくつかの遺伝子を含む細菌遺伝子発現および細菌遺伝子調節の一単位である。代表的には、オペロンとしては、遺伝子産物の調節因子によって認識され得る核酸中の、核酸および制御要素が挙げられる。オペロン中の遺伝子への挿入は、その遺伝子の機能および、そのオペロン中の下流または上流に位置する他の遺伝子の機能を干渉する。本明細書中では、遺伝子に帰属する機能とは、その機能および／または同じオペロン中の下流または上流に位置する任意の遺伝子の機能を称することが理解される。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に有効な投薬量」は、少なくとも部分的には、所望される効果を達成するため、または処置される特定の状態の発症を遅らせるため、処置される特定の状態の進行を阻害するため、または処置される特定の状態の発症もしくは進行を完全に停止するために必要な量を意味する。
【０１２３】
用語「類似性」および「同一性」は、当該分野で公知である。用語「同一性」の使用は、比較される配列中の対応する同一の位置の間の同一の適合に基づく配列比較を称する。用語「類似性」は、アミノ酸配列の間の比較を称し、対応する位置の同一のアミノ酸だけでなく、対応する位置の機能的に類似のアミノ酸もまた配慮する。従って、ポリペプチド配列の間の類似性は、配列類似性に加えて、機能類似性を示す。
【０１２４】
（等価物）
本発明の特定の実施形態の前述の詳細な説明から、細菌遺伝子が同定され、毒性における新規の役割を割り当てられたことは、明らかであるはずである。さらに、これらの遺伝子およびそれらの生成物は、抗菌薬の同定、病原性関連疾患または感染の診断およびワクチンの調製において有用である。特定の実施形態は、本明細書中で詳細に開示されているが、これは、例示のみの目的のための実施例によってなされ、以下の添付された特許請求の範囲の範囲に対して、限定されることは意図されない。特に、種々の代替、変化および改変が、特許請求の範囲によって定義されたような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に成され得ることが、本発明者らによって企図される。例えば、特定の病原体の選択、またはアッセイもしくは予防接種のために選択される病原体の組み合わせ、本発明の病原体を利用する診断アッセイにおいて用いられる試験条件、または弱毒化変異体を誘導するために用いられる変異誘発の方法は、本明細書中に記載された実施形態の知識を有する当業者にとって、慣用的な様式であると考えられる。
【実施例】
【０１２５】
この実施例は、例示のみの目的のために提供され、本発明が、決してこの実施例に限定されるものとして解釈されるべきではないが、むしろ提供された教示の結果として明白になる任意の変形物およびすべての変形物を含むことが解釈されるべきである。
【０１２６】
（実施例１  試験細菌変異体中の弱毒化毒性についてのスクリーニングのために用いた株および培養条件）
これらの研究で用いたＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ野生型株ＤＨ１−１０は、ＤＨ１のサブクローンである（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（４４）：３４２８７−９２，２０００）。２１℃においてＨＬ５培地（１４．３ｇ／ｌ  ペプトン（Ｏｘｏｉｄ），７．１５ｇ／ｌ  酵母抽出物，１８ｇ／１  マルトース，０．６４ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ，０．４９ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．７）（Ｃｏｒｎｉｌｌｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１０７（Ｐｔ  １０）：２６９１−７０４，１９９４）中で細胞を増殖させ、一週間に２度、継代培養した。
【０１２７】
３７℃においてＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上で、細菌を一晩増殖させた。５０ｍｌフラスコ中の５ｍｌ  ＰＢ（２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプトン，０．３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ，１％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｋ２ＳＯ４）（Ｅｓｓａｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２（２）：８８４−９００，１９９０）に、単一コロニーを播種し、使用の前に、３７℃において８時間増殖させた。種々の株の増殖を、栄養分のある（ｒｉｃｈ）培地（ＰＢ）中で、播種後の異なった時間において培養物の吸光度（６００ｎｍ）を測定することにより試験し、用いたすべての株について同等であることを見出した。これらの条件下において、各株について類似したＯＤ６００ｓを得、菌体密度感知（ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の誘導は最大であった。最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、微量希釈方法（Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙら，ＮＣＣＬＳ，３：４８−５６，１９８３）によってミュラー−ヒントン培養液中で決定した。減少した毒性を産出する変異を、変異体病原体に曝露されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ試験宿主生物の増殖が、野生型病原体に曝露されたＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ試験宿主生物の増殖を超えた場合に同定した。減少した毒性を示す病原体における特異的な遺伝的変異を、当該分野で周知の技術によって同定し、特徴付けた。
【配列表】
2006524984.tif 000074
2006524984.tif 000075
2006524984.tif 000076
2006524984.tif 000077
2006524984.tif 000078
2006524984.tif 000079
2006524984.tif 000080
2006524984.tif 000081
2006524984.tif 000082
2006524984.tif 000083
2006524984.tif 000084
2006524984.tif 000085
2006524984.tif 000086
2006524984.tif 000087
2006524984.tif 000088
2006524984.tif 000089
2006524984.tif 000090
2006524984.tif 000091
2006524984.tif 000092
2006524984.tif 000093
2006524984.tif 000094
2006524984.tif 000095
2006524984.tif 000096
2006524984.tif 000097
2006524984.tif 000098
2006524984.tif 000099
2006524984.tif 000100
2006524984.tif 000101
2006524984.tif 000102
2006524984.tif 000103
2006524984.tif 000104
2006524984.tif 000105
2006524984.tif 000106
2006524984.tif 000107
2006524984.tif 000108
2006524984.tif 000109
2006524984.tif 000110
2006524984.tif 000111
2006524984.tif 000112
2006524984.tif 000113
2006524984.tif 000114
2006524984.tif 000115
2006524984.tif 000116
2006524984.tif 000117
2006524984.tif 000118
2006524984.tif 000119
2006524984.tif 000120
2006524984.tif 000121
2006524984.tif 000122
2006524984.tif 000123
2006524984.tif 000124
2006524984.tif 000125
2006524984.tif 000126
2006524984.tif 000127
2006524984.tif 000128
2006524984.tif 000129
2006524984.tif 000130
2006524984.tif 000131
2006524984.tif 000132
2006524984.tif 000133
2006524984.tif 000134
2006524984.tif 000135
2006524984.tif 000136
2006524984.tif 000137
2006524984.tif 000138
2006524984.tif 000139
2006524984.tif 000140
2006524984.tif 000141
2006524984.tif 000142
2006524984.tif 000143
2006524984.tif 000144
2006524984.tif 000145
2006524984.tif 000146
2006524984.tif 000147
2006524984.tif 000148
2006524984.tif 000149
2006524984.tif 000150
2006524984.tif 000151
2006524984.tif 000152
2006524984.tif 000153
2006524984.tif 000154
2006524984.tif 000155
2006524984.tif 000156
2006524984.tif 000157
2006524984.tif 000158
2006524984.tif 000159
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月31日(2005.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006524984000001.app
【国際調査報告】
2006524984.tif 000160
2006524984.tif 000161
2006524984.tif 000162
2006524984.tif 000163
2006524984.tif 000164
2006524984.tif 000165
2006524984.tif 000166