(57)【要約】  下記ａ），ｂ）およびｃ）：  ａ）支持体、  ｂ）生物学的プローブを結合できる官能基を含むゼラチン層、ならびに該支持体と該ゼラチン層との間に置かれた  ｃ）該支持体および該ゼラチン層との接触を維持できる接着剤中間層を含むプロテインマイクロアレイ要素。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記a), b)および c):
a)     支持体、
b)     生物学的プローブを結合できる官能基を含むゼラチン層、ならびに該支持体と該ゼラチン層との間に置かれた
c)     該支持体および該ゼラチン層との接触を維持できる接着剤中間層
を含むプロテインマイクロアレイ要素。
【請求項２】
支持体が有機あるいは無機であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
支持体がガラスあるいは溶融シリカであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
支持体の厚さが0.1ないし5.0 mmの間にあることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
支持体の厚さが0.5ないし2.0 mmの間にあることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
接着剤中間層がプロテイン、プロテイン誘導体、ゼラチン、ゼラチン誘導体あるいは親水性水透過性コロイドを含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
接着剤中間層が合成ポリマーペプタイザー、担体あるいは結合材を含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
接着剤中間層がポリビニルアルコール、ポリビニルラクタム、アクリルアミドポリマー、ポリビニルアセタール、アクリル酸およびメタクリル酸アルキルおよびスルフォアルキルのポリマー、加水分解ポリビニルアセテート、ポリアミド、ポリビニルピリジンあるいはメタクリルアミド共重合体を含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
接着剤中間層がゼラチンを含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
有機溶媒あるいは溶媒の混合物がゼラチンと組合されていることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１１】
有機溶媒あるいは溶媒の混合物がアセトン、アルコール、酢酸エチル、メチレンクロライド、エーテルあるいはこれらの混合物を含むことを特徴とする請求項１０に記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
架橋剤、珪酸塩あるいは分散助剤がゼラチンと組合されていることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
ゼラチンがアルカリで予備処理されていることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
ゼラチンが豚ゼラチンあるいは魚ゼラチンであることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
ゼラチン被覆が0.2ないし100 g/m2であることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１６】
ゼラチン被覆が10ないし50 g/m2であることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１７】
下記a)、b)およびc):
a)     支持体、
b)     該支持体上に置かれ、該支持体とおよび下記cとの接触を維持できる接着層、ならびに
c)     三官能性化合物A-L-Bを有するゼラチン層（Aはゼラチンと相互作用できる官能基であり、LはAおよびBと相互作用できる結合基であり、Bはプロテイン捕捉剤と相互作用できる官能基であり、AはBと同じでも異なっていてもよい）
を含むプロテインマイクロアレイ要素。
【請求項１８】
三官能性化合物A-L-Bが該ゼラチン層に固定されたポリマースカフォールドであることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
ポリマースカフォールド中のポリマーがプロテインと相互作用できる反応性ユニットに富むことを特徴とする請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２０】
ゼラチン層とAとの間の相互作用が物理的結合あるいは化学反応であることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２１】
AもしくはB又はAおよびBがアルデヒド、エポキシ、ヒドラジド、ビニルスルフォン、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、マレイミド、ジチオ、ヨードアセチル、イソシアネート、イソチオシアネートあるいはアジリジンであることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２２】
Bが、非共有結合的にプロテイン捕捉剤（これは基材表面上に固定化されることになる）と相互作用できる親和性タグであることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２３】
支持体を提供する工程、
該支持体上に接着層を塗布する工程、
該接着層上に三官能性化合物A-L-Bを含むゼラチンの層を塗布する工程（Aはゼラチンと相互作用できる官能基であり、LはAおよびBと相互作用できる結合基であり、Bはプロテイン捕捉剤と相互作用できる官能基であり、AはBと同じでも異なっていてもよい）
を含むプロテインアレイを製造するためのゼラチン系基材の製造。
【請求項２４】
接着剤層上にゼラチンを塗布している間に該三官能性化合物ALBが固定されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
接着剤層上にゼラチンを塗布後に該三官能性化合物ALBが固定されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
プロテイン捕捉剤が抗体、プロテインスカフォールド、ペプチド、核酸リガンドあるいは分子刷込みポリマーであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ポリマースカフォールド中のポリマーがプロテインを固定化できる反応性ユニットに富むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にプロテインマイクロアレイの製造に関し、特に生物分子の特異的結合性を高めるようにゼラチン表面を修飾したゼラチン系基材を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトの完成はプロテオミクスの新しい学際的な分野の急速な成長に拍車をかけた。このプロテオミクスには、ゲノムによりコード化された完全なセットのプロテインの同定と特徴づけ、プロテインの合成、後翻訳修飾ならびに細胞の制御レベルでのプロテイン相互作用の詳細なマッピングが含まれる。
【０００３】
質量分析法と組合わせた二次元ゲル電気泳動法がなおプロテオミクス研究における主たる技術として残っている一方、DNAマイクロアレイ技術の遺伝子プロファイリングへの首尾良い注入と応用および遺伝子発見は、科学者がプロテインマイクロアレイ技術を開発し、マイクロチップに基づいたプロテイン分析をプロテオミクスの分野に適用するのを促進した。例えば、WO 00/04382およびWO 00/04389において、プロテインマイクロアレイの製造が開示されている。この開示における主たる要素は、表面にプロテインあるいはプロテイン捕捉剤が固定化できる単一層の有機薄膜が塗布されている固体支持体からなる基材である。
【０００４】
ニトロセルロース膜は、ウェスタンブロット法および酵素免疫測定法（ELISA）におけるプロテインブロット基材として広汎に使われた。WO 01/40312およびWO 01/40803においては、グリッディング（gridding）ロボット装置を用いて抗体をニトロセルロース膜上にスポットする。この様なニトロセルロース膜基材上にスポットされた抗体マイクロアレイは、プロテイン混合物を大規模に平行して分析するのに有用であることが示された。
【０００５】
WO 98/29736において、L.G. MendozaらはN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルで修飾されたガラス基材上に固定化された抗体を有する抗体マイクロアレイについて記載している。米国特許第5,981,734号およびWO 95/04594において、DNAマイクロアレイの製造のためのポリアクリルアミド系のヒドロゲル基材技術が記載されている。より最近、Anal. Biochem. (2000) 278, 123-131において、同じヒドロゲル技術を、プロテインマイクロアレイを製造するのにプロテインの固定化のための基材と同様に有用として示している。
【０００６】
上に挙げた例において、これらの異なる取組み法の間に共通する特徴は固体支持体の表面上へプロテインあるいはプロテイン捕捉剤を共有結合のあるいは非共有結合の付着をさせる固体支持体の要求である。DNAマイクロアレイ技術においては、予備合成したオリゴヌクレオチドおよびPCRにより調製されたcDNAプローブの付着のためにいろいろな表面が調製された。例えば、EP 1,106,603 A2において、ビニルスルフォニル反応基を表面に調製してDNAチップを製造する方法が開示されている。この発明はDNAチップを製造するには有用であるが、プロテインマイクロアレイの応用には適していない。DNAとは違って、プロテインは非特異的に表面と結合し易く、そうする事により、それらの生物活性を失う。かくして、プロテインマイクロアレイ基材の属性はDNAマイクロアレイ基材の属性と以下の点で異なる。プロテインマイクロアレイ基材はプロテイン捕捉剤と相互に作用し合うことができる表面官能性を提供できるだけでなく、プロテイン捕捉剤が付着されていない領域への非特異的プロテイン結合に抵抗しなければならない。
【０００７】
ウシ血清アルブミン（BSA）は、非特異的表面結合からプロテインを遮断するのに有用な試薬であることが示されている。ポリエチレングリコールおよびリン脂質もまた表面を不動態化し、非特異的結合に対して抵抗性のある表面を提供するのに使われている。しかしながら、表面調整に長時間を要するか、表面修飾が複雑か困難な故にすべてのこれらの方法は不利であり、この方法が大規模な工業的生産に対する理想的な選択とならない。
【０００８】
米国特許出願第10/020,747号および第10/091,644号はゼラチン塗膜を用いてプロテイン捕捉剤を固定化する反応性表面を作り出し、プロテインマイクロアレイ基材を製造する低コストな方法を記載している。ゼラチン修飾の表面は効果的に非特異的プロテイン結合を除く一方、使用上の便利さのために、この様な表面を寸法安定な固体支持体上に塗布するのが望ましい。
【０００９】
この技術は、プロテイン捕捉剤の固定化に対し化学官能性を有する寸法的に安定な基材を必要とするが、この様な基材はその表面で十分な接着力を有していて塗布されたゼラチンの上層と結合し、任意の生物学的プロセシングの際に塗被基材が湿潤化してもゼラチン層にしわが寄らず、塗被基材が乾燥してもゼラチン層が剥離しないようにしなければならない。
【００１０】
ガラス板は当該技術では寸法的に安定であることが知られ、生物学的用途には好まれる固体支持体である。親水性結合材、例えばゼラチン、をガラスに塗布するのは非常に過酷な仕事である。相溶性の接着剤中間層をガラスと結合材の間に塗布しなければならないからである。この様な接着剤中間層は次の様な性質を持たなければならない、１．中間層は、プロテインマイクロアレイの適用に対して光学的干渉をしない薄膜でなければならない、２．中間層は、結合材表面上に組込んだプロテイン捕捉剤付着ケミストリと化学的に干渉するいかなる成分も含んではならない、３．中間層は容易に製造されなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記で論じた問題の幾つかを解決するプロテインマイクロアレイ要素を提供し、またこの様なプロテインマイクロアレイ要素を製造する方法を提供するのが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記a), b)および c):
a)     支持体、
b)     生物学的プローブを結合できる官能基を含むゼラチン層、ならびに該支持体と該ゼラチン層との間に配置された
c)     該支持体および該ゼラチン層との接触を維持できる接着剤中間層
を含むプロテインマイクロアレイ要素を提供することにより、上記で論じた問題を解決する。
【００１３】
本発明の別の態様は、下記a)、b)およびc):
a)     支持体、
b)     該支持体上に置かれ、該支持体とおよび下記cとの接触を維持できる接着層、ならびに
c)     三官能性化合物A-L-Bを有するゼラチン層（Aはゼラチンと相互作用できる官能基であり、LはAおよびBと相互作用できる結合基であり、Bはプロテイン捕捉剤と相互作用できる官能基であり、AはBと同じでも異なっていてもよい）
を含むプロテインマイクロアレイ要素を開示する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、
支持体を提供する工程、
該支持体上に接着層を塗布する工程、
該接着層上に三官能性化合物A-L-Bを含むゼラチンの層を塗布する工程（Aはゼラチンと相互作用できる官能基であり、LはAおよびBと相互作用できる結合基であり、Bはプロテイン捕捉剤と相互作用できる官能基であり、AはBと同じでも異なっていてもよい）
を含むプロテインアレイを製造するためのゼラチン系の基材の製造方法を開示する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、プロテインマイクロアレイを製造するのに特に有用である。本発明は、表面に固定化されるプロテイン捕捉剤と特異的に相互作用できる官能基を有する基材であって、非特異的結合に実質的に抵抗する基材を提供する。
【００１６】
非修飾ゼラチン基材を比較すると、本発明により調製した基材は、アナライトが生物学的試料中に非常に低い濃度でも、このアナライトを検出できる。本発明のゼラチン基材は低コストで容易に製造できる。プロテイン付着のためのクレイムされた基材の有用性は、幾つかの化学的修飾方法と酵素免疫測定法（ELISA）を用いて下記の実施例中で示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
一般に、本発明のプロテインマイクロアレイは、先ず固体支持体、すなわちプロテインマイクロアレイ支持体を修飾し、ついで色々なプロテイン捕捉剤を、修飾された支持体上所定の位置に置くことにより調製できる。プロテインマイクロアレイ適用に選ばれる支持体は有機あるいは無機であることができる。普通に使われる支持体材料にはガラス、プラスチックス、金属および半導体が含まれる。支持体は透明あるいは不透明、可撓性あるいは硬質である。ある場合には、支持体は多孔性膜、例えば、ニトロセルロースおよびポリビニリデンジフロライドであり、プロテイン捕捉剤は物理的吸着により膜上に置かれる。しかしながら、耐久性と再現性を向上させるために、寸法安定性を有する固体支持体を使用するのがより望ましい。
【００１８】
この技術では、ガラスあるいは溶融シリカが最も普通に使用されるマイクロアレイ支持体である。Edwin P. Plueddemannが “Silane Coupling Agents” 2nd Ed., Plenum Press, New York, 1991に記載している様に、ガラス表面にプロテイン付着ケミストリを生じさせる通常の方法はシランカプリングケミストリを使用して適切なプロテイン付着ケミストリをガラス表面に移植することである。この様な移植を行なうためには、ガラス表面をプラズマ放電処理するかあるいは化学試薬で化学処理して親水性表面を生じさせなければならない。しかしながら、これらの処理で高度に均一で欠陥の無い表面を生じさせるのは非常に困難である。さらに、これらの処理を、プロテインマイクロアレイ基材を作る低コストかつ製造可能な手段にする塗布方法に組込むのは容易ではない。
【００１９】
一般に、ガラス支持体は平面状であり、高度の平坦さと透明性を有している。好ましくは、ガラスは蛍光を発生せず、厚さが0.1mmないし5 mm、好ましくは0.5ないし2.0 mmである。ガラス支持体は任意の寸法にでき、意図する使用に従って色々な寸法に切断できる。本発明の好ましい実施態様においては、ガラス表面に中間層を塗布し親水性表面を提供し、次に行なうプロテイン捕捉剤固定化ケミストリと混合した上部ゼラチン層の塗布に備える。
【００２０】
ゼラチンは写真工業において、色々な化学成分の結合材として使われて来ており、高品質のゼラチンを製造するプロセスは写真工業において十分に確立されている。ゼラチンは生物材料で作られているので、プロテインマイクロアレイ上ではプロテイン捕捉剤と生物学的に適合性がある。ゼラチンを塗布された表面は、プロテイン捕捉剤をプロテインマイクロアレイ上に固定化するのに生物学的に快適な表面を提供する。本発明で示される様に、ゼラチンはまた表面を実質的にバックグラウンドノイズ（これは非特異的結合の結果である）を減らしたものにする。
【００２１】
通常は、ゼラチンを支持体上に塗布し、ゼラチン溶液あるいはゼラチンおよび他の物質の懸濁液が定常的な流れを示さない連続三次元網目構造を形成するプロセスによりゲル化が起る。ゲル化は、多官能基モノマーの存在下、反応性側鎖を有する溶解ポリマーの共有結合架橋による重合により、および第二結合、例えば、溶液中のポリマー分子間の水素結合により発生できる。ゼラチンの様なポリマーは後者のタイプである熱的ゲル化を示す。ゲル化すなわち固化のプロセスは、粘度の不連続な上昇により特徴付けられる。（P.I. Rose, “The Theory of the Photographic Process”, 4th Edition, T.H. James ed. Pages 51 to 67を参照されたい）。
【００２２】
ゼラチンをガラス、プラスチック、金属などの固体支持体上に塗布する場合は、任意の生物学的プロセシングの際に上部ゼラチン塗膜が湿潤化してもゼラチン塗膜にしわが寄るのを防止し、上部ゼラチン塗膜が乾燥してもゼラチン塗膜が剥離するのを防止するために中間層が必要である。一般に、中間層は薄膜を形成する親水性コロイド材料あるいは親水性結合材からなる。
【００２３】
ゼラチン層を結合するための十分な接着力を与えるのに加えて、中間層はまた光学的に透明であるべきで、また蛍光を発すべきではない。典型的な中間層材料には、プロテイン、プロテイン誘導体、ゼラチン（例えば、ウシ骨ゼラチンあるいは獣皮ゼラチン等のアルカリ処理したゼラチン、あるいはブタ皮ゼラチン等の酸処理したゼラチン）、およびゼラチン誘導体（例えば、アセチル化ゼラチン、フタール化ゼラチン、等）等の天然物質が含まれるが、これらに限られる訳ではない。親水性水透過性コロイドはまたビヒクルエキステンダーとして有用である。これらには、合成ポリマー性ペプチタイザー、キャリヤーおよび/あるいはポリビニルアルコール、ポリビニルラクタム、アクリルアミドポリマー、ポリビニルアセタール、アクリル酸およびメタクリル酸アルキルおよびスルフォアルキルのポリマー、加水分解ポリビニルアセテート、ポリアミド、ポリビニルピリジン、メタクリルアミド共重合体、等が含まれる。
【００２４】
好ましい中間層材料としてのゼラチンの場合、一つの有機溶媒あるいは有機溶媒混合物もまた製剤中に含めるべきである。この様な有機溶媒の例としては、アセトン、アルコール、酢酸エチル、メチレンクロライド、エーテルあるいはこれらの混合物が含まれるが、これらに限られる訳ではない。ゼラチンをこれらの有機溶媒と均一に混合するためには、有機酸あるいは塩基等の分散助剤を製剤に加える（必ずしも必要ではないが）ことができる。中間層の接着力を向上させるために、珪酸ナトリウム等の珪酸塩もまた中間層製剤中に含ませられる。中間層の機械的力を向上させるために、一つあるいは二つ以上の架橋剤を使って中間層中のゼラチンを硬化させることが好ましい。ゼラチン硬化剤の例は、The Theory of the Photographic Process, T.H. James, Macmillan Publishing Co., Inc. (New York 1977)あるいはResearch Disclosure, September 1996, Number 389, Part IIB (hardeners(硬化剤))などの標準の参考文献に見出すことができる。無機硬化剤は有機硬化剤よりも好ましい。
【００２５】
本発明の別の実施態様においては、ポリマーの支持体は、プロテイン捕捉剤固定化ケミストリと混合したゼラチン層を塗布するために使用できる。本発明による支持体表面を形成する典型的なポリマーの支持体には、硝酸セルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースエステル；ポリビニルアセタールポリマー、ポリカーボネート、ポリエステル、例えば、ポリヒドロキシアルコール等の二官能基のポリヒドロキシ有機化合物と縮合した、二官能基の飽和および不飽和脂肪族および芳香族ジカルボン酸の線状ポリエステルなどのポリエステル、---例えばアルキレングリコールおよび/あるいはグリセロールとテレフタール酸、イソフタール酸、アジピン酸、マレイン酸、フマール酸および/あるいはアゼライン酸のポリエステル；ポリビニルクロライド等のポリハロ炭化水素；およびポリスチレンおよびポリオレフィン、特に2ないし20炭素原子を有するオレフィンのポリマー等のポリマーの炭化水素が含まれる。これらの支持体は、単独で使用されるかあるいは金属、ガラスおよび他の固体表面上の塗膜として利用できる。支持体は、湿潤時に実質的に寸法安定性を有することが好まれる。
【００２６】
ポリマー支持体を用いる場合、ゼラチン層を結合するための適切な接着性を持たせるために表面処理が必要である。例えば、米国特許第2,764,520, 3,497,407, 3,145,242, 3,376,208, 3,072,483, 3,475,193及び3,360,448号、英国特許第788,365号等に記載されている様に、放電処理、フレーム処理、紫外線処理、高周波処理、活性プラズマ処理、レーザー処理、グロー放電、LTV暴露、電子ビーム処理等を用いることができる。ポリマー支持体を、ジクロロ酢酸およびトリクロロ酢酸、レゾルシノールおよびp-クロロ-m-クレゾール等のフェノール誘導体を含む接着促進剤で表面処理し、例えば上記のゼラチン中間層のようなゼラチンの下塗りをする中間層を上塗りする前に溶媒による洗浄で表面処理することができる。表面処理あるいは接着促進剤による処理に加えて、ビニリデンクロライド含有共重合体、ブタジェン系の共重合体、アクリル酸あるいはメタクリル酸グリシジル含有共重合体、無水マレイン酸含有共重合体等のポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリカーボネート等の縮合ポリマー、これらの混合物およびブレンド、等を含有するさらなる接着促進プライマーあるいは結合層（tie layer）をポリエステル支持体に塗布できる。特に好ましいプライマーあるいは結合層（tie layer）は、塩素含有ラテックスあるいは溶媒塗布可能な塩素含有ポリマー層を含む。ビニルクロライドおよびビニリデンクロライド含有ポリマーは本発明のプライマーあるいはゼラチンの下塗り層として好ましい。
【００２７】
米国特許第3,864,132号および英国特許第1,066,944号に記載されているように、親水性コロイド層を、支持体表面および親水性コロイド層に接触している無機酸化物接着層により疎水性ポリマー支持体表面にしっかり結合されていることが当該技術分野では認識されている。この様な接着層（この技術では一般にゼラチン下塗り層（subbing layer）呼ばれる）は、無結合剤層であり、この無結合材層は本質的に無機金属酸化物からなり、親水性コロイド層と疎水性ポリマー支持体表面の両方に直接かつ強靭に結合でき、これまで著しく多くの複雑なポリマー層により行なわれた働きを遂行する。“無結合剤層”なる語は、実質的に有機接着材料が無い層を指し、特に天然および合成のポリマー結合材およびコロイド状ビヒクルの様なこの技術で普通に利用される有機接着材料および結合材料が存在しないことを指す。無結合剤接着剤層は結晶性あるいは非結晶性無機酸化物により形成できる。一酸化珪素および二酸化珪素の様な珪素酸化物が好ましい無機酸化物である。これらは実質的に水に不溶性であり写真処理および使用環境において化学的に不活性であり、また本質的に透明だからである。酸化珪素はまた、本発明の実施において利用される他の無機酸化物を気化させるのに要求される温度と比較して低い気化温度に加熱することにより蒸着できるので、好ましい。酸化アルミニウム、硼素-珪素酸化物、酸化マグネシウム、酸化タンタルおよび酸化チタンならびにこれらの混合物は本発明の実施に特に適している。無機酸化物接着剤層はガラス支持体上で利用できる。
【００２８】
さらに、米国特許第3,511,661および3,860,426号に記載されている様に接着剤中間層は金属支持体上に使用できる。例えば、アルミニウムは、その入手しやすさと低コストの故にリトグラフィー板工業における好ましい金属支持体である。一般に、米国特許第4608,131, 4,092,169および4,446,221号に記載されている様に、陽極酸化は接着剤中間層の塗布前にアルミニウム支持体上で行なわれる。
【００２９】
プロテイン捕捉剤を固定化するために、接着剤中間層を塗布された支持体は所定の化学官能基剤により修飾されたゼラチンの層をさらに塗布する必要が有る。一般に、化学官能基剤はA-L-Bで表される二官能性分子であり、ここにAおよびBは、ゼラチンおよびプロテイン捕捉剤分子と反応あるいは相互作用して基質上に固定化されることができる化学官能基であり、Lは結合基である。好ましくは、Lは、AをBに結合する両端の間の最短スルー結合パスが10原子以内である様な長さのジラジカルである。
【００３０】
次の二つのクラスの二官能基剤がある：1). A=Bならばホモ官能基剤、2). A ≠ Bならば異官能基剤である。若干の通常使用されるAおよびBにはアルデヒド、エポキシ、ヒドラジド、ビニルスルフォン、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、マレイミド、ジチオ、ヨードアセチル、イソシアネート、イソチオシアネート、アジリジンが含まれるが、これらに限られる訳ではない。結合基Lは、二つの官能基AおよびBを結合するのに十分な比較的に安定な共有結合化学ユニットの任意の合理的な組合わせを含む。これらの化学ユニットは以下からなることができるが、しかし必ずしもこれらに限られるものではない、単一結合、炭素原子、酸素原子、硫黄原子、カルボニル基（-CO-）、カルボン酸エステル基（-CO-O-）、カルボン酸アミド基（-CO-NX-）、スルフォニル基（-SO2-）、スルフォンアミド基（-SO2NY-）、エチレンオキシ基、ポリエチレンオキシ基あるいはアミノ基（-NZ-）、ここに置換基X, YおよびZは各々独立して水素原子あるいは1ないし10炭素原子を有するアルキル基；および線状あるいは分枝状、1ないし10炭素原子を有する飽和あるいは不飽和アルキル（メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、t-ブチル、ヘキシル、デシル、ベンジル、メトキシメチル、ヒドロキシエチル、イソブチルおよびn-ブチル等）；6ないし14炭素原子を有する置換あるいは未置換アリール基（フェニル、ナフチル、アンスリル、トリル、キシリル、3-メトキシフェニル、4-クロロフェニル、4-カルボメトキシフェニルおよび4-シアノフェニル等）；シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロオクチル等の5ないし14炭素原子を有する置換あるいは未置換のシクロアルキル基；置換あるいは未置換、飽和あるいは不飽和複素環状基（ピリジル、ピリミジル、モルフォリノおよびフラニル等）；シアノ基。若干の可溶化基もまたA-L-Bに導入でき、これらの可溶化基の例としては、カルボン酸、スルフォン酸、フォスフォン酸、ヒドロキサミン酸、スルフォンアミドおよびヒドロキシ基（およびこれらの対応する塩）が含まれるが、これらに限られるものではない。AおよびBは架橋剤に対し容易に反応する官能基の形であることもでき、その例としてはカルボキシ、アミノおよびクロロメチル等が含まれるが、これらに限られはしない。AおよびBは、基質上に固定化されるように意図したプロテイン捕捉剤と非共有結合的に相互作用できる親和性タグであることができる。例えば、若干の普通に使われるタグシステムには、ストレプタビジンタグおよびビオチンタグ、ヒスチジンタグおよびニッケル金属イオン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼおよびグルタチオンが含まれるが、これに限られる訳ではない。この技術に精通する者は、再結合DNA技術を使用して融合蛋白質捕捉剤を作ることができ、タグ認識ユニットのエレメントをこのようにしてプロテイン捕捉剤に導入できる。
【００３１】
本発明は、プロテインの固定化に有用な非常に高密度の化学部分（moieties）を得る様に設計されている。これを達成するために、本発明は“ポリマースカフォールド法”を用いる。本発明の目的のために、“ポリマースカフォールド”なる語は特定の官能基に富み表面から三次元の様子で伸びる線状あるいは分枝状のポリマーを指す。この場合、官能基はプロテインを固定化できる化学ユニットであり、表面がプロテインである。プロテイン受容性ポリマースカフォールドの調製の一つの基本的な方法においては、プロテインを固定化する化学官能基に変換され得るユニットに富んだ前駆体ポリマーが利用される。前駆体ポリマーはゼラチン表面に添付され、ついで化学剤の後処理によりプロテイン受容性の形態に変換される。“固定され（affixed）”なる語で、前駆体ポリマーをゼラチン表面に塗布し、イオン間の相互作用、共有結合、配位結合、水素結合およびファンデルワールス相互作用を含む多くの化学的および物理的引力を持つ機構の一つによりゼラチンに接着させることを意味する。
【００３２】
一つの好ましい実施態様において、化学剤は上記で定義したA-L-B構造の一つであり、前駆体ポリマーは、チオール、アミン、フォスフィン、アルコールあるいはカルボン酸の様な反応性ユニットに富んでいる。好ましくは、反応性ユニットは第一あるいは第二アミンである。本目的に使用できる具体的ポリマーは、ポリプロピレンイミンおよびN-アミノプロピル（メタ）アクリルアミドおよびその第二アミン誘導体のポリマーおよび共重合体、（メタ）アクリル酸N-アミノエチルおよびその第二アミンの形態、ジアリルアミン、ビニルベンジルアミン、ビニルアミン、（メタ）アクリル酸、ビニルベンジルメルカプタンおよび（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチルからなるセットから選ぶことができるが、必ずしもこれらに限られる訳ではない。好ましくは、ポリマーはポリビニルアミン、ポリプロピレンイミンあるいはポリN-アミノプロピルメタクリルアミドである。
【００３３】
スカフォールドポリマーのゼラチン表面への固定は、任意の公知の化学剤あるいは技術を用いて達成でき、ポリマーの反応性ユニットおよびゼラチンのアミン官能基あるいはカルボン酸官能基の間の共有結合を形成するに至る。例えば、カルボジイミド、ピリジルジカチオンエーテルあるいはカルバモイルピリジニウム化合物等の脱水剤を使ってアミン含有ポリマーあるいはカルボン酸含有ポリマーをアミド結合によりゼラチン表面に結合できる。同様に、ビス（ビニルスルフォニル）化合物を用いてポリエチレンイミンをゼラチン表面に結合できる。一度スカフォールドポリマーがゼラチン表面に固定されると、ついでこのポリマーを過剰な適切なA-L-B化合物で処理して、高レベルの反応性ユニットを有する反応性表面を生じる。
【００３４】
プロテイン受容性ポリマースカフォールドを調製するための第二の基本的な方法は、プロテインを固定化する化学官能基に富むポリマーのゼラチン表面上への直接固定を伴う。この様な官能基は、アルデヒド、エポキシ、ヒドラジド、ビニルスルフォン、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、マレイミド、ジチオ、ヨードアセチル、イソシアネート、イソチオシアネートおよびアジリジンを含むが、必ずしもこれらに限られる訳ではない。なお、二つ以上のタイプのポリマースカフォールドポリマーを同じゼラチン基質に添付して良い。
【００３５】
式Iはポリマースカフォールドを形成するための好ましいポリマーを表す。
【００３６】
【化１】
2006528351.tif 000002
【００３７】
ここにR1は水素原子あるいはC1-C6アルキル基である。好ましくは,R1は水素原子である。
Qは-CO2-あるいはCONR1であり、
vは1あるいは0であり、
Lは、-CO2-および-CONR1からなる群から選ばれた一つ以上の結合を含み、3ないし15の炭素原子を含む二価の結合基、あるいは-O-,-N(R1)-,-CO-,-SO-,-SO2-,-SO3-,-SO2N(R1)-、-N(R1)CON(R1)-および-N(R1)CO2-からなる群から選ばれた一つ以上の結合を含み、1ないし12の炭素原子を含む（ここにR1は上記で定義したのと同じ意味を有する）二価の原子であり、
R2は-CH=CH2あるいは-CH2-CH2X1（ここにX1は求核性の基により置き換え得るあるいは塩基によりHX1の形で放出し得る置換基）である。X1は -S2O3-、-SO4--、-Cl、-Br、-I、第四アンモニウム、ピリジニウムおよび-CN、およびスルフォン酸エステル（メシレートやトシレートの様な）で良いが、これらに限られる訳ではない。xおよびyは両者とも10ないし90および90ないし10の範囲にあるモルパーセントを表す。好ましくは、xおよびyはそれぞれ25ないし75および75ないし25の範囲にある。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様においては、ペンダントビニルスルフォンユニットあるいはペンダントビニルスルフォン前駆体ユニットを含むポリマーはポリマースカフォールドを生じさせるためにゼラチンと反応させることができる。本実施態様において好まれるポリマーは式1の構造式で表され、 “G” モノマー（これはポリマーに好都合な溶解性を与える）と “H” モノマー（これはビニルスルフォン部分（moiety）あるいはより好ましくは残りの基をβの位置に置くスルフォニルエチル基の様なビニルスルフォン前駆体機能を含む）の重合生成物からなる。同じポリマー中に二つ以上のタイプのGモノマーおよびHモノマーがそれぞれ存在しても良い。ポリマーは任意の分子量を持っていて良いが、1,000ないし200,000 AMUの間の分子量（Mn）が好ましい。ポリマーが水あるいは水および水と相溶性の溶媒（メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン等）との混合物に溶解するならば、分子量は2,000ないし50,000 AMUが特に好ましい。ガラス転移温度、表面性質および具体的な応用に必要とされる他の製剤成分との相溶性等の性質を修飾するために付加的なモノマーを混合することができる。付加的なモノマーの選択は応用に依存し、この技術に精通している者にとって明らかである。
【００３９】
Gは、ポリマーに水溶性を賦与する重合したα,β-エチレン性不飽和の付加重合性モノマーである。Gを得ることができるモノマーには、イオン性モノマーおよび非イオン性モノマーが含まれる。イオン性モノマーには、例えば、アクリル酸2-フォスファトエチルカリウム塩、メタクリル酸3-フォスファトプロピルアンモニウム塩、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイン酸およびその塩、アクリル酸およびメタクリル酸スルフォプロピル、アクリル酸およびメタクリル酸およびこれらの塩、N-ビニルピロリドン、アルキルフォスフォネートのアクリル系およびメタクリル系エステル、スチレニックス、アミンアンモニウム官能基を含むアクリル系およびメタクリル系モノマー、スチレンスルフォン酸およびその塩、アルキルスルフォネートのアクリル系およびメタクリル系エステル、ビニルスルフォン酸およびその塩等の陰イオン性エチレン性不飽和モノマーが含まれて良い。非イオン性モノマーには、ポリエチレンオキサイドセグメント、炭水化物、アミン、アミド、アルコール、ポリオール、窒素含有複素環およびオリゴペプチド等の親水性非イオン性ユニットを含むモノマーが含まれて良い。例には、アクリル酸およびメタクリル酸ポリエチレンオキサイドエステル、ビニルピリジン、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸およびメタクリル酸グリセロールエステル、（メタ）アクリルアミドおよびN-ビニルピロリドンが含まれるが、これらに限られる訳ではない。
【００４０】
好ましくは、Gは、アクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メタンプロピオン酸ナトリウム、アクリル酸およびメタクリル酸スルフォプロピル塩あるいはスチレンスルフォン酸ナトリウムの重合した形態である。
【００４１】
モノマーHは、QおよびLからなる有機スペーサー（この中でQは任意の成分である）により重合可能性α,β-エチレン性不飽和官能基に共有的に結合したビニルスルフォンあるいはビニルスルフォン前駆体ユニットの重合した形態である。
【００４２】
本実施態様に有用なビニルスルフォンおよびビニルスルフォン含有前駆体“H”モノマーには、米国特許第4,548,869および4,161,407号（参考文献としてここに組入れられる）に開示された化合物ならびに式IIの化合物が含まれるが、必ずしもこれらに限られる訳ではない。
【００４３】
【化２】
2006528351.tif 000003
【００４４】
ポリマーは任意の分子量を持つことができるが、1,000ないし200,000 AMUの間の分子量（Mn）が好まれる。2,000ないし50,000 AMUの間の分子量（Mn）が特に好まれる。
【００４５】
固体支持体、対応する中間層製剤およびゼラチン結合層製剤を一度選択すると、マイクロアレイ基質の製造の際にオンラインプロセスを使って中間層および上部ゼラチン層を固体支持体に塗布するのが好まれる。しかしながら、これらは別々のプロセスで作っても良い。Edward CohenおよびEdgar B. Gutoffにより “Modern Coating And Drying Technology” (Interfacial Engineering Series; v.1), (1992), VCH Publishers Inc., New York, NY の第一章に広汎に記載されている方法を用いて、中間層および上部ゼラチン層を支持体上に塗布できる。中間層の塗布により超薄膜の塗膜を達成するためには、米国特許第3,283,712, 3,468,700および4,325,995号に記載されている様にグラビア法を用いるか、米国特許第3,000,349, 3,786,736, 3,831,553および4,033,290号に記載されている様に非常に厄介な塗布法を用いて中間層を塗布するのが望ましい。
【００４６】
本発明において述べるゼラチン層は、任意の固体支持体上に塗布するか、あるいは一つの固体硬化剤あるいはゲル中で混ぜた幾つかの硬化剤の組合わせと共に塗布する。硬化剤のレベルは、全塗布ゼラチンに対して0ないし20質量%、好ましくは0.5ないし8質量%にするのが良い。
【００４７】
ゼラチンには、酸前処理したゼラチンとアルカリ前処理したゼラチンの二つのタイプがある。好ましいゼラチンはウシ骨髄からのアルカリ前処理されたゼラチンであるが、他の源から得ることもできる。例としては豚ゼラチンおよび魚ゼラチンが含まれる。二官能基剤A-L-Bは、ゼラチンを固体支持体上に塗布する際か後で導入出来る。
【００４８】
一般に、流体塗膜組成物は、結合材、成分を溶解あるいは懸濁させるための溶媒、および表面活性剤、分散剤、可塑剤、殺生物剤、靭性と不溶性のための架橋剤および帯電を最小にするための導電材料等の任意の添加剤を含む。全成分は混合され、溶解あるいは分散され、塗布流体はアプリケーターに送られ、ここで幾つかの塗布技術の一つにより基材に塗布される。ついで、熱を塗膜に加え、溶媒を蒸発させて望ましい薄膜を生じさせるか、あるいは紫外線輻射あるいは電子ビームの作用により塗膜を固化させる。
【００４９】
塗布速度を含む最も適当な塗膜方法は望む質と官能基および使われる材料、例えば、基材、溶媒、塗膜の質量および粘度等に依存する。単層様式に対しては、適当な塗布方法は、浸漬塗布、ロッド塗布、ナイフ塗布、ブレード塗布、エアナイフ塗布、グラビア塗布、前進逆進ロール塗布およびスロットおよび押出し塗布が含まれる。
【００５０】
塗布方法の選択において、塗布速度もまた重要な決定要素であり得る。大抵の方法は低速度で使用でき、すべての方法は上限の速度を有するが、若干の方法は高速で良く働く。流し塗は、薄膜の完全性を維持するために最小の流れを必要とする。したがって、薄膜を得るためには、この方法は高速に限られている。多重層のスライド塗布においては、層が非常に薄い時には、スライドの際に境界間の不安定さがより起り易くなる。スライドの際の早い流れと厚い層を伴う高速は、これらの不安定さを避け易くなる。上記、 “Modern Coating and Drying Technology”の12ページを参照されたい。
【００５１】
ゼラチンは、0.2ないし100 g/m2、好ましくは10ないし50 g/m2のレイダウンを有する。
【００５２】
ビード塗布あるいは流し塗り等の任意の公知の塗布法を用いてゼラチン基材を調製できる。表面活性剤や増粘剤等の任意の他の塗布助剤と共にゼラチンを塗布してゼラチンの物理的性質を調整することができる。本発明で用いられるゼラチンは、塗布プロセスの前、最中あるいは後で化学的に修飾してより多くの化学官能基（この官能基はこの基質に付着させる様に意図した生物学的に活性な分子あるいはアッセンブリーと反応あるいは相互作用できる）を作る様にして良い。
【００５３】
一般に、ゼラチン塗布方法を使ってプロテイン捕捉剤固定化のための反応性表面を調製する二つの方法がある。第一の取組みにおいては、化学剤あるいはポリマースカフォールドを所定の塗布助剤と共にゼラチンと混合し、混合物を上に述べた固体支持体上に塗布する。第二の取組みにおいては、上記の様にゼラチン塗膜を固体支持体上に調製し、乾燥した後で,ゼラチン塗膜を、化学剤（例えば、A-L-B、ポリマースカフォールド）を含む溶液に浸漬し、反応性ケミストリをゼラチン表面に添付する。代わりに、付着ケミストリはまたゼラチン表面に塗布できる。ゼラチン塗布の際、ポリマースカフォールドを基質表面に導入し、製造プロセスを簡単化するのが好ましい。
【００５４】
一度プロテインマイクロアレイ基材をポリマースカフォールドで修飾すると、プロテイン捕捉剤は基質上に置かれ、プロテインマイクロアレイコンテントを生じる。プロテイン分子は、線状に共有結合的に結合されている20種のアミノ酸からなる。若干のプロテインは、フォスフォイル化およびグリコシル化を含む後翻訳プロセスにより選択したアミノ酸においてさらに修飾される。プロテイン分子をプロテイン捕捉剤として使用できる。ここで使われている様に、“プロテイン捕捉剤”なる語は高い親和性と高い特異性でプロテインと相互作用できる分子を意味する。典型的には、プロテイン捕捉剤と標的プロテインとの間の親和性結合定数が106 M-1より大であることが望ましい。プロテイン捕捉剤としてプロテインマイクロアレイ上で使用できる幾つかのクラスの分子が有る。抗体は、標的を高い親和性と特異性で結合できる一つのクラスの天然プロテイン分子である。抗体を使用する性質とプロトコル（protocols）は “Using Antibodies; A Laboratory Manual”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring NY 1999)に見出すことができる。もし抗体が検出の意図した標的であるならば、抗原もまたプロテイン捕捉剤として使用できる。全プロテイン/酵素等のプロテインスカフォールドあるいはスカフォールドのフラグメントはプロテイン捕捉剤としても使用できる。例としては、ホスファターゼ、キナーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、加水分解酵素、サイトカインあるいは合成ペプチドが挙げられる。核酸リガンドは、所定の標的へのそれらの結合親和性および特異性に対する in vitro 選択および冨化の後プロテイン捕捉剤分子として使用できる。この様な選択プロセスの原理は、Science, Vol. 249, 505-510, 1990およびNature, Vol. 346, 818-822, 1990に見出すことができる.  U.S. Pat. No. 5,110,833は、抗体結合親和性および特異性をまねでき、いわゆる分子刷込みポリマー（MIP）により容易に調製できる代わりのクラスの合成高分子を開示する。この技術は、Chem. Rev. Vol. 100, 2495-2504, (2000)で検討されている。
【００５５】
実際に、プロテインマイクロアレイが生物学的な流体試料と接触すると、試料中のプロテインは特異的プロテイン捕捉剤でスポットされた領域とプロテイン捕捉剤の無い領域の両方に吸着される。プロテインマイクロアレイは、チップ上のプロテイン捕捉剤と生物学的流体試料中の所定のプロテインあるいは他の分子との間の特異的相互作用の測定に使用されるように意図されているので、試料プロテインのスポットされていない領域への非特異的結合は高いバックグラウンドノイズを生じる。非特異的結合なる語は、プロテイン分子が非選択的な様子で固体表面へ接着する傾向を指す。非特異的結合の結果生じるこの高いバックグラウンドノイズは、もし非特異的結合が適切な方法で遮断されなければ、スポットされた領域からの検出すべきレポーター信号と干渉する。典型的には、プロテインマイクロアレイを遮断剤を含む溶液中に浸漬して、プロテインマイクロアレイが意図されたアナライト溶液と接触する前に非特異的結合部位を遮断する。プロテインの非特異的結合を遮断するために一般に使われている方法は、基材の表面を大量の過剰なウシ血清アルブミンで処理することである。スポットされていない表面領域もまたポリエチレングリコール（PEG）、リン脂質あるいはポリリジンで化学的に修飾して、非特異的結合を防止できる。
【００５６】
本発明は、以下の具体的な実施例を参照すればより良く理解できる。
【実施例】
【００５７】
実施例１
本実施例により中間層と上部ゼラチンメルトの製剤とメルトのガラス支持体上への塗布法を説明する。本実施例は、中間層の使用が、ゼラチンをガラス表面上へ結合させるのに必要な接着性を与えるのに有用なことを説明する。
製剤１−１（ゼラチンメルト）
溶液１： 2237.706 gの水中の726.54 gの膨潤タイプIVゼラチン（24.8% w/v）、16 gのノニルフェノキシポリグリセロールの塗布助剤、20.4 gのオクチルフェノールポリエテネオキシスルフォン酸ナトリウム（塗布助剤）を添加することによって、この溶液は調製された。
【００５８】
溶液２：800.79 gのエテン、 1,1’-（メチレンビス（スルフォニル））ビス（1.8% w/v）および2,199 gの蒸留水を加えることにより、この溶液は調製された。
【００５９】
溶液１および溶液２を等容積で混合して、塗布前の単一メルトを作る。
製剤１−２（中間層メルト）
2.5 gのゼラチン、16.3 gのクロムミョウバン、34.7 gのメタノール、33.9 gの蒸留水中の12.7 gの珪酸ナトリウムを加えることにより、この中間層メルトは調製された。
【００６０】
対照：製剤１−１を、塗布装置を用いてガラス板上に塗布した。製剤をスロット塗布ダイにより温度45℃で、3.1m/min の速度で動く 20.3 cm幅の基材上に導入した。86.1 g/m2のゼラチン被覆のレベルを生じるように流れ速度を調整した。塗膜は、温度4℃および56.6% RHに維持した9.1 m長さの冷却セクションで冷却セットし、ついで全長34 m、温度35℃および湿度18.3% RHの3乾燥セクションで乾燥した。
【００６１】
発明：製剤１−２を温度45℃の鍋（pan）に加える。溶液をロールにより接触させ、溶液をグラビアロールに移す。溶液を削り, 望ましい厚さを得る。溶液をロールにより拾い上げ、基材と接触させる。溶液の薄層を基材上に置く。基材は10 mの乾燥セクションを51.6℃で運ばれる。この溶液を基材の最上部に塗布し、製剤１-１の接着層として作用する。
【００６２】
本発明は、湿潤プロセシングの際に上部ゼラチン層がガラスにしっかり結合した満足な塗膜を生じさせるが、対照においては、ゼラチン層は乾燥プロセスの際にしわが寄る。
【００６３】
実施例２
本実施例では、修飾した酵素免疫測定法（ELISA）を用いて、ゼラチンを塗布したプロテインマイクロアレイ基材を評価する方法を説明する。
【００６４】
修飾したELISAを行なう方法は以下の様である。
【００６５】
１．  シグマからの抗マウス抗体（ヒツジ）IgGをPBS（リン酸緩衝溶液、pH 7.4）緩衝溶液中に1 mg/mLの濃度まで溶解した。一連の希釈された抗マウス抗体（ヒツジ）IgGを手動でニトロセルロース膜上および塗膜されたゼラチン基質にスポットした。スポットされた基材を湿潤な部屋で室温にて1時間インキュベートした。
【００６６】
２．  基材を1% Triton X100TM を有するPBS緩衝溶液中で各回5分間振蕩しながら4回洗浄した。
【００６７】
３．  洗浄した基材を1%グリシンを有するPBS緩衝溶液中で一定の振蕩をしながら15分間インキュベートした。
【００６８】
４．  基材を1% Triton X100TM を有するPBS緩衝溶液中で振蕩しながら4回洗浄した。
【００６９】
５．  シグマからのマウスIgGを0.1% TweenTMを有するPBS緩衝溶液中に20ないし1 μg/mLまで希釈し、基材の全表面を覆う様にし、基材を室温で1時間インキュベートした。
【００７０】
６．  基材を1% Triton X100TM を有するPBS緩衝溶液中で各回5分間一定の振蕩をしながら4回洗浄した。
【００７１】
７．  基材を、抗マウス抗体（ヒツジ）IgG西洋ワサビペルオキシダーゼ共役（1%グリシンを有するPBS中で適切な力価まで希釈された）溶液中で室温で1時間振蕩しながらインキュベートして、基材の全表面を覆う様にした。
【００７２】
８．  基材を1% Triton X100TM を有するPBS緩衝溶液中で各回5分間一定の振蕩をしながら4回洗浄し、水中で2回すすいだ。
【００７３】
９．  SuperSignal（登録商標）ELISA化学発光基質溶液（PIERCE ENDOGENから購入した）を含む西洋ワサビペルオキシダーゼ基質溶液中で、発色させた。化学発光像は、SuperSignal（登録商標）ELISA化学発光基質溶液（PIERCE ENDOGENから購入した）の薄層と塗膜された基材とを接触させることにより捕捉された。放出は、コダックイメージステイション440上で測定され、装置に供給されているRegion of Interest (ROI)ソフトウエアを使って定量化した。
【国際調査報告】
2006528351.tif 000004
2006528351.tif 000005
2006528351.tif 000006