(57)【要約】本発明は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）からのｋｓｔＤプロモーターを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、制御可能な転写活性化因子として非常に好都合に使用することができる。前記制御機能は、前記単離ポリヌクレオチドに、前記プロモーターの転写調節因子をコードするヌクレオチド配列を与えることによって提供することができる。本発明では、このような転写調節因子を、ステロイド化合物の導入などによって外的に誘導し得る。本発明の選択的実施形態では、前記単離ポリヌクレオチドは、ｋｓｔＤプロモーターの転写調節因子としてｋｓｔＲ遺伝子又はそのホモログ又は機能性部分を含み得る。
2006508684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス属からのプロモーターを含み、前記プロモーターがｋｓｔＤプロモーターであることを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ロドコッカス属がロドコッカスエリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３の配列からのヌクレオチド１−１５８又はその機能性部分を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記プロモーターの転写調節因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列の発現がステロイド化合物によって制御される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記調節因子が、ｋｓｔＲ遺伝子又はそのホモログ又は機能性部分を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記プロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
選択マーカー、逆選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
シグナル配列をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１１】
マルチクローニングサイトを有するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞がアクチノマイセテス目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）からの細菌である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、アクチノマイセス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）、ミコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する細菌から選択される、請求項１３に記載の細菌宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌から選択される、請求項１３に記載の細菌宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、Ｎｏ．ＤＳＭ  １５２３１の下にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている細菌、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１０である、請求項１３に記載の細菌宿主細胞。
【請求項１７】
機能性ｋｓｔＲ遺伝子又はそのホモログ又は機能性部分を含まない、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞を請求項１０又は１１に記載の組換えベクターで形質転換することを含む、宿主細胞において所望タンパク質を生産するための方法。
【請求項１９】
請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む微生物発現系。
【請求項２０】
請求項１７に記載の宿主細胞をポリヌクレオチド構築物で形質転換することを含み、対象タンパク質のコード領域の発現がｋｓｔＤプロモーターの制御下にある、前記対象タンパク質の構成的発現のための方法。
【請求項２１】
異種タンパク質の発現の誘導のためのステロイドの使用であって、前記発現はｋｓｔＤプロモーターの制御下にあり、前記ステロイドはｋｒｔＲ遺伝子産物によって及ぼされるリプレッサー機能を取り除くものである、前記使用。
【請求項２２】
請求項１２から１７のいずれかに記載の宿主細胞を、ｋｓｔＤプロモーターの活性を調節する能力を測定しようとする少なくとも１つの化合物に接触させること、及び前記細胞の調節されるｋｓｔＤプロモーター活性に関して観測することを含む、ｋｓｔＤプロモーターの活性を調節する化合物を特定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、特にロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）からのプロモーター、その調節及び異種適用における発現系としてのこのプロモーターの使用とその調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌類、特にロドコッカス属の細菌は、複雑な分子を代謝する能力で知られている。ロドコッカス属の幾つかの種は、燃料、ベンゼン、さらにはＴＮＴを分解することができ、従って、これらは、生化学的経路及び細胞工場（セルファクトリー）に関する微生物学の分野で広く検討されている。天然及び人類起源の炭化水素を酸化し、及び生物圏の生物地質化学的過程への積極的関与体である、例えば地球のために無炭化水素大気を生産することに寄与する微生物の中で、ロドコッカス属は主要な位置を占める。
【０００３】
幾つかのロドコッカス属菌種は天然フィトステロールも分解し、これは経路中間体としてのステロイドの形成によって進行する。これらのステロイドは、次に、医薬的に活性な化合物の生産における前駆体として使用し得る。
【０００４】
微生物の経路中間体としての医薬前駆体化合物を高い量で生産するために、生産株は、常套的に、対象遺伝子の発現を最適化するように及び／又は中間体の蓄積を達成するためにある種の代謝経路を遮断するように形質転換される。このような形質転換は、しばしばタンパク質の異種発現を含む。異種タンパク質の発現のためにロドコッカス及び他のアクチノマイセテス菌（ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種など）の使用が増加すると共に、このような発現の改善された調節及び分子ツールに対する需要が増大しつつある。
【０００５】
現在、所望特性を有する突然変異株は紫外線照射などの古典的突然変異誘発によって単離されるが、これらの株は、遺伝的不安定性及び／又は低い生物変換効率の故に工業的工程においてはしばしば不適切である。分子学的に定義された（構築された）突然変異株は、古典的突然変異誘発によって生成された突然変異株に比べて重要な利点を備える。構築突然変異株は遺伝的により安定であり、導入される突然変異は十分に定義された遺伝的修飾である。形質転換によって遺伝子操作された菌株の構築はまた、ある種の不用経路を遮断するために化学物質を利用し得る。主として酵素活性を遮断するために使用される化学物質は、しばしば反応特異的ではなく、他の重要な酵素反応を阻害することがあり、これは生物変換効率にマイナスの作用を及ぼし得る。遺伝子工学による定義された突然変異株の使用はこのような問題を克服する。
【０００６】
例えばロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に認めることができる、ステロイド代謝における重要な酵素は、その遺伝子がいわゆるｋｓｔＤ１遺伝子座に位置する３−ケトステロイド△１−デヒドロゲナーゼ（ＫＳＴＤ１、ＥＣ１．３．９９．４）である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）。ステロイド異化遺伝子の分子機構は種々のロドコッカス菌種の間で異なり得ることが知られているが、この遺伝子のホモログが、アルトロバクター・シンプレクス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、シュードモナス菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ノカルジア・レストリクタス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）、ノカルジア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ノカルジア・オパカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｐａｃａ）及びミコバクテリウム・ホルツイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などの幾つかの他の細菌において認められた。ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）菌株ＳＱ１のｋｓｔＤ遺伝子の配列が、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅらによって国際公開広報第ＷＯ０１／３１０５０号に開示され、配列番号１に記述されている。
【０００７】
同じ細菌株のイソ酵素ＫＳＴＤ２が対応する遺伝子ｋｓｔＤ２と共に知られている。ｋｓｔＤ１遺伝子を破壊しても３−ケトステロイド△１―デヒドロゲナーゼ（ＫＳＴＤ）活性は完全に排除されないことが示されており、イソ酵素の存在により活性は存続する（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅら、２００２、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：３２８５−３２９２；国際公開広報第ＷＯ０１／３１０５０号）。
【０００８】
ＫＳＴＤ活性はステロイド核分解のために必須であり、ステロイド中間体を蓄積するためにはｋｓｔＤ遺伝子の不活性化が必要である。遺伝子の不活性化は、遺伝子機能を分析するため及び代謝ブロックを導入するための強力なツールである。選択マーカーを担持する非複製ベクターによる遺伝子破壊は、遺伝子不活性化のために一般的に使用される方法である。
【０００９】
遺伝子破壊突然変異株Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＤＨ４２０における野生型ＫＳＴＤ活性は、４−アンドロステン−３，１７−ジオンなどの３−ケト−△４−ステロイドの適用によって誘導できることが認められ、ステロイド依存性調節機構の存在を示唆した。ｋｓｔＤ遺伝子座の上流で、その機能はこれまでのところ未知であるが、ＴｅｔＲファミリーのリプレッサータンパク質のコンセンサス配列を担う推定上の調節遺伝子と記述された遺伝子（ＯＲＦ２）が特定された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）。
【発明の開示】
【００１０】
今や、ｋｓｔＤ１遺伝子についてのプロモーターはロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）のｋｓｔＤ遺伝子座に存在すること及びこのプロモーターは、以下ｋｓｔＲと称する、この細菌のＯＲＦ２の遺伝子産物による抑制を通して調節されることが認められた。また、ｋｓｔＲ遺伝子産物によるｋｓｔＤプロモーターの抑制は、ステロイド化合物による発現の誘導によって克服されることも認められている。ｋｓｔＤ遺伝子−ｋｓｔＲリプレッサー系の組合せのこの特性は、前記組合せを、放線菌属ファミリーなどの細菌における異種タンパク質の発現に特に適するものとする。
【００１１】
１つの側面では、本発明は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）からのプロモーターを含み、前記プロモーターがｋｓｔＤプロモーターであることを特徴とする、単離ポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
前記ポリヌクレオチドは、制御可能な転写活性化因子として非常に好都合に使用できる。このような制御機能は、前記単離ポリヌクレオチドに前記プロモーターの転写調節因子をコードするヌクレオチド配列を与えることによって提供され得る。本発明では、このような転写調節因子を、ステロイド化合物の導入などによって外的に誘導し得る。
【００１３】
本発明の選択的実施形態では、前記単離ポリヌクレオチドは、ｋｓｔＤプロモーターの転写調節因子としてｋｓｔＲ遺伝子又はそのホモログ又は機能性部分を含み得る。
【００１４】
本発明の単離ポリヌクレオチドは異種発現系として非常に好都合に使用できるので、本発明のポリヌクレオチドは、前記プロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【００１５】
発現系を導入する細菌に選択可能な形質を与えるために、前記ポリヌクレオチドは、選択マーカー、逆選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードする配列をさらに含み得る。
【００１６】
もう１つの側面では、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。このような組換えベクターは、適切には、マルチクローニングサイトであるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドを生産すること及び当該菌株を前記ポリヌクレオチドで形質転換することを含む、ステロイド核を分解する能力を持たない微生物の遺伝的に修飾された菌株を構築するための方法に関する。
【００１８】
もう１つの側面では、本発明は、本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、好ましくはアクチノマイセテス目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）からの細菌である。非常に適切な宿主細胞は、アクチノマイセテス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）、ミコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する細菌、特にロドコッカス属の細菌である。
【００１９】
もう１つの側面では、本発明は、宿主細胞を本発明の組換えベクターで形質転換することを含む、宿主細胞において所望タンパク質を生産するための方法に関する。
【００２０】
もう１つの側面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む微生物発現系に関する。
【００２１】
さらにもう１つの側面では、本発明は、宿主細胞をポリヌクレオチド構築物で形質転換することを含み、対象タンパク質のコード領域の発現がｋｓｔＤプロモーターの制御下にある、前記対象タンパク質の構成的発現のための方法に関する。
【００２２】
もう１つの側面では、異種タンパク質の発現の誘導のためのステロイドの使用であって、前記発現はｋｓｔDプロモーターの制御下にあり、前記ステロイドはｋｒｔR遺伝子産物によって及ぼされるリプレッサー機能を取り除くものである、前記使用に関する。
【００２３】
ここで使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、あらゆる長さの重合体形態のヌクレオチドを指す。従って、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【００２４】
ここで使用する「組換えポリヌクレオチド」という用語は、その起源又は操作によって、（１）天然で結合しているポリヌクレオチドの全部又は一部に結合していない；又は（２）天然で結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合している；又は（３）天然では生じない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意図する。
【００２５】
「形質転換」及び「形質転換すること」は、ここで使用するとき、挿入のために使用する方法、例えば直接取込み、形質導入、ｆ−接合又は電気穿孔、に関わりなく、宿主細胞への外来性ポリヌクレオチドの挿入を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えばプラスミド、として維持され得るか、あるいは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得る。
【００２６】
「宿主細胞」とは、ベクターを含み、そのベクターの複製及び／又は発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生動物又は哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はアクチノマイセテス目の細菌細胞である。
【００２７】
ここで使用する「作動可能に連結された」という用語は、そのように表わされる成分が意図されるように機能し得る関係にある、近位を指す。もう１つ別の制御配列及び／又はコード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、その制御配列と適合する条件下でコード配列の転写及び／又は発現が達成されるように連結されている。一般に、作動可能に連結された、とは、連結されている核酸配列が隣接していること及び２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、隣接し且つ同じ読み枠内にあることを意味する。
【００２８】
ここで使用する「プロモーター」は、（構造）遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは、（構造）遺伝子の転写開始部位に近位の、遺伝子の５’領域に位置する。プロモーターが誘導的プロモーターである場合は、転写の速度は誘導物質に応答して上昇する。これに対し、プロモーターが構成的プロモーターである場合は、転写の速度は誘導物質によって調節されない。
【００２９】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体を指し、その生成物の特定の長さには言及しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等、には言及しない又は発現後修飾を排除しない。例えば天然に生じる及び非天然に生じる、アミノ酸の１又はそれ以上の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、置換結合並びに当技術分野において公知の修飾を有するポリペプチドは、前記の定義に包含される。
【００３０】
ここで使用するとき、核酸に関する「異種」は、外来種から生じる、又は同じ種からである場合は、意図的な人為介入措置によって天然の状態とは異なる天然ゲノム遺伝子座にある核酸である。例えば異種構造遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、その構造遺伝子が由来するものとは異なる種からであるか、又は同じ種からである場合は、そのプロモーターと遺伝子は天然では作動可能に連結されていない。異種タンパク質は、外来種から生じ得るか、又は同じ種からである場合は、異種核酸からの発現を通して生産される。
【００３１】
「リプレッサータンパク質」又は「リプレッサー」は、構造遺伝子の５’側に位置するＤＮＡ配列（オペレーター）に含まれるヌクレオチド配列を認識する又は前記ヌクレオチド配列に結合することができるタンパク質である。リプレッサータンパク質とそのコグネイトオペレーターとの結合は、構造遺伝子の転写の阻害を生じさせる。
【００３２】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離又は方向に関わりなく、転写の効率を高めることができるＤＮＡ調節エレメントである。
【００３３】
「単離」という用語は、その天然に生じる環境において認められるように通常それに付随する又はそれと相互作用する成分を実質的に又は基本的に含まない、核酸などの物質を指す。単離ＤＮＡ分子は、分離されており、及びもはやそれが由来する生物のゲノムＤＮＡには組み込まれていないＤＮＡの断片である。
【００３４】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。
【００３５】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子である。典型的には、遺伝子発現は、構成的又は誘導的プロモーター、調節エレメント及び／又はエンハンサーを含む、ある種の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は、調節エレメントに「作動可能に連結されて」いると言い、及びその発現は、調節エレメントの「制御下に」あると言う。
【００３６】
「選択マーカー」という用語は、トランスジェニック生物と非トランスジェニック生物の分離を可能にする代謝形質をコードするポリヌクレオチド配列を指し、主として抗生物質耐性の付与を指示する。選択マーカーは、例えばａｐｈＩＩによってコードされるカナマイシン耐性マーカーである。
【００３７】
「逆選択マーカー」という用語は、その発現が、しばしば選択マーカーの場合のように耐性を生じさせる代わりに、致死的であるポリヌクレオチド配列を指す。逆選択マーカーは、例えばその発現がスクロースの存在下で致死的である、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子である。
【００３８】
ここで使用する「レポーター遺伝子」という用語は、同定することができる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、［β］−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びグリーン蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない。レポーター遺伝子の産物についての同定方法は、酵素アッセイ及び蛍光アッセイを含むが、これらに限定されない。レポーター遺伝子及びこれらの産物を検出するためのアッセイはこの分野において周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）及び定期的最新版に述べられている。
【００３９】
配列番号４に示されている、ロドコッカスのＯＲＦ２と称される配列は、ＴｅｔＲ型のリプレッサータンパク質（ｋｓｔＲと称される）をコードすると言われている、ｋｓｔＤ１遺伝子を保有する染色体遺伝子クラスターの部分であるとみなされてきた（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）。しかし、リプレッサー機能が行使される又は取り除かされる状況はこれまで開示されていなかった。また、ｋｓｔＲのリプレッサー機能とｋｓｔＤ１遺伝子のプロモーターとの関係はこれまで確立されていなかった。
【００４０】
アルスロバクター・シンプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｍｐｌｅｘ）において、ｋｓｔＤ遺伝子及び推定上のリプレッサーをコードするＯＲＦ（ｋｄｓＲと称される）の類似ゲノム組成物が記述されている（Ｍｏｌｎａｒ，Ｉ．ら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：８９５−９０５）。この場合、リプレッサータンパク質とステロイド酵素の発現との関係は確認されていない。
【００４１】
ｋｓｔＤ１遺伝子のプロモーター領域は正確には決定されていない。ｋｓｔＤ１遺伝子の開始コドンとｋｓｔＲ遺伝子の開始コドン（ｋｓｔＤ１遺伝子と比較して逆の順序で存在する）との間の領域は、ｋｓｔＤ１遺伝子についてのプロモーターを含み、おそらくｋｓｔＲについてのプロモーターも含む、約１５８塩基対の配列である。このプロモーターが二方向的に働く場合、リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の発現はｋｓｔＤ１プロモーターによっても駆動され得る。
【００４２】
本発明に従ったプロモーターは、ロドコッカスにおいてｋｓｔＤ遺伝子の発現を駆動するプロモーターであり、好ましくは、配列番号３に記載の１５８塩基対のヌクレオチド配列又はプロモーターの機能的能力、すなわちその発現を制御するタンパク質の発現を駆動する能力をまだ保持するその短縮形態（例えば５’末端で欠失している）を含む。いかにしてプロモーター欠失突然変異株に到達するかはこの分野において周知であり、またこのような欠失突然変異株についてのプロモーター活性を特定するために必要な実験は、過度の負担を伴わず、及び当業者に周知である。本発明の実施のために有用なポリヌクレオチド操作のための手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、第１−３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）及びその定期的最新版などの、様々な参考文献に述べられている。
【００４３】
ｋｓｔＤプロモーターの活性断片を特定するための方法は当業者に公知であり、このような方法は、例えばｍＲＮＡの転写の測定又はレポーター遺伝子からのポリペプチドの発現（機能性プロモーターの添加を必要とする）を含み得る。作動可能に連結されたコード配列の転写及び／又は発現を制御することができる活性ｋｓｔＤプロモーター断片の存在を判定するために、当業者は、プロモーターの機能性試験が実施できることを容易に理解する。このような試験は、例えばベクター内で本発明のプロモーターとレポーター遺伝子を作動可能に連結し、そのベクターを適切な宿主細胞に導入して、前記宿主を発現のための適切な条件に供し、プロモーターの機能性を判定するために前記レポーター遺伝子産物の存在を判定することを含み得る。
【００４４】
前記プロモーター（プロモーターエレメントを含む）のヌクレオチド配列が配列番号３に示されているが、プロモーター又はプロモーターエレメントの機能に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を施し得ることは認識される。
【００４５】
当業者は、ここで開示するｋｓｔＤプロモーター配列に、転写を活性化する配列の能力を変化させずに、点突然変異及び欠失を施し得ることを認識する。それに加えて、ｋｓｔＤプロモーターの活性断片を得ることができる。同様の方法が、ｋｓｔＤプロモーターの他の活性断片を特定するために使用できる。ｋｓｔＤプロモーターの活性断片を特定するための他の方法は、当技術分野において常套的であり、周知である。例えばｋｓｔＤプロモーターの重複断片を合成し、適切な発現ベクターにクローニングして、活性ｋｓｔＤプロモーター断片を判定することができる。同様に、例えば部位指定突然変異誘発を使用して又は１又はそれ以上のあらかじめ定められた位置にランダムなヌクレオチドを有する配列を合成することによって、開示されているｋｓｔＤプロモーター配列に点突然変異を導入することができる。
【００４６】
本発明は、１つの実施形態として、ｋｓｔＤプロモーター又はその活性断片を含む単離ポリヌクレオチドを包含する。これらの単離ポリヌクレオチドは、ｋｓｔＤプロモーターが通常天然で結合している染色体遺伝物質の約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含む。ｋｓｔＤプロモーターで「基本的に構成される」単離ポリヌクレオチドは、ｋｓｔＤが位置する染色体に由来する他のプロモーターを含まない。この「単離」及び「基本的に構成される」という用語は、ｋｓｔＲリプレッサーエレメントにも同様に適用される。例えばｋｓｔＲリプレッサーで基本的に構成される単離ポリヌクレオチドは、それぞれｋｓｔＲが位置する染色体上に存在するエンハンサー又はプロモーターなどのポリヌクレオチド物質を含まない。
【００４７】
ｋｓｔＤプロモーターを含み又はｋｓｔＤプロモーターで基本的に構成され、及びｋｓｔＲリプレッサー又はその活性断片をコードする単離ポリヌクレオチドは、この分野において公知の手法によって作製し得る（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら）。これらの手法は、例えばここで提供する配列情報を使用してプライマー及びプローブを入手し、ｋｓｔＤゲノムクローンのＰＣＲ特異的領域によって増幅することあるいは化学合成又は組換え手段によることを含む。
【００４８】
ｋｓｔＤプロモーター又はその活性断片を含む組換えポリヌクレオチド並びにここで述べる他のｋｓｔＤ転写調節エレメントを含み得る組換えポリヌクレオチドは、ここで提供する配列情報を使用して当業者の何らかの手法によって作製し得る。
【００４９】
実験の章において、前記プロモーターが、おそらくプロモーターに結合し、及びそれによって制御するタンパク質の発現を阻害すると考えられる、リプレッサータンパク質によって調節されることを明らかにする。ｋｓｔＤプロモーターを含む組換えポリヌクレオチドはまた、ｋｓｔＤが促進する遺伝子転写の抑制を引き起こし、及び細胞を以下に述べるような誘導物質に接触させることによって取り除かれ得る調節機構を提供するｋｓｔＲリプレッサーについてのコード配列（配列番号４に示すような）を含み得る。
【００５０】
ｋｓｔＤプロモーターを含む組換えポリヌクレオチドはまた、前記プロモーターの制御下でコード配列の転写を生じさせる、前記プロモーターが作動可能に連結されたコード配列を含み得る。コード配列は、相同又は異種ポリペプチドのいずれかをコードし得る。しかし、これらはまた、これらの転写形態において望ましい他の成分もコードし得る。例えばコード配列は、中でも特に、転写因子に結合するおとりポリヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ及び関心対象の様々なポリペプチド（例えば細胞内ワクチンとして役立つウイルスタンパク質、マーカーとして使用できるタンパク質等）、ｋｓｔＤタンパク質を発現する細胞において発現させるという商業目的のためのポリペプチド、及び特に細胞代謝の調節及び医薬前駆体の生産において有用なタンパク質をコードし得る。
【００５１】
プロモーターの制御下でのタンパク質の細胞発現のために、プロモーターと対象遺伝子をコードするＤＮＡの間にシグナル配列を挿入することができる。このようなシグナル配列は、タンパク質を特定細胞画分に標的するために提供される。好ましくは、このシグナル配列は、Ｒ．ｅｑｕｉ内に存在し、アクセッション番号ＡＪ２４２７４６の下にＧｅｎｂａｎｋに寄託されているコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子のシグナル配列である（Ｎａｖａｓ，Ｊ．ら、２００１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４７９６−４８０５も参照のこと）。
【００５２】
プロモーターはいかなる宿主細胞においても使用できるが、好ましくは原核生物宿主細胞、より好ましくはアクチノマイセテス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）、ミコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）等のような科に属する細菌などの、アクチノマイセテス目からの細菌において使用できる。より好ましくは、宿主細胞は、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌である。最も好ましくは、ロドコッカス・アエテロボランズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｔｈｅｒｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドコッカス・エキ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・エリスロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、ロドコッカス・グロベルラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカスジョスティイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス・コレエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・マンシャネシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａａｎｓｈａｎｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・マリノナセンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｏｎａｓｃｅｎｓ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス・ペルコラタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ）、ロドコッカス・ピリジニボランズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス・ロドニ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・ラバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｂｅｒ）、ロドコッカス・ツキサムエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｕｋｉｓａｍｕｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・ラチスラヴィエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・ゾフィイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）種等の細菌株のようなロドコッカス属の細菌である。
【００５３】
また本発明の一部は、リプレッサータンパク質についての遺伝子を持たない、プロモーターを備えた細菌宿主細胞である。好ましくはこの宿主細胞は、Ｎｏ．ＤＳＭ  １５２３１の下に２００２年１０月９日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されたロドコッカスエリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１０細菌である。この細菌では、実施例１で示すように、サプレッサータンパク質をコードする遺伝子が欠失している。
【００５４】
サプレッサー遺伝子が欠失したこのような宿主細胞は、タンパク質の発現のために使用することができる。好ましくは（前記宿主細胞はまだその内因性ｋｓｔＤプロモーターを有していてもよいが）、本発明のｋｓｔＤプロモーター（対象タンパク質の発現を制御する）を保有するベクターを前記細胞に導入すべきである。このようなベクターを構築すること及びこのようなベクターの宿主細胞への形質転換又はトランスフェクションは、当業者には一般的に実施される作業である。このようにして、実施例１に示すように、ｋｓｔＤプロモーターは抑制されず、構成的プロモーターとして働く。
【００５５】
単離ｋｓｔＤプロモーター又はその活性断片を含む本発明に従った宿主細胞が、形質転換された原細胞（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｃｅｌｌ）の子孫を包含することは理解される。単一親細胞の子孫は、天然、偶発的又は意図的突然変異のために、形態においてあるいはゲノム又は全ＤＮＡ相補物において必ずしももとの親と完全に同一でない場合があることは理解される。
【００５６】
ｋｓｔＲ以外の、ｋｓｔＤプロモーターエレメント内の特定ヌクレオチド又は領域を、調節のために必要ならば特定し得ることは認識される。これらのヌクレオチドの領域は、多数のプロモーター突然変異株の機能的能力を分析することにより、エレメントの微細構造精査によって位置づけ得る。単一塩基対突然変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクノロジーを利用して作成できる。米国特許第４，６８３，２０２号。突然変異したプロモーター領域を、標準手法を用いて再びレポーター構築物内にもどし、適切な細胞へのトランスフェクションによって評価して、レポーター遺伝子機能に関して検定することができる。この分析はまた、プロモーター機能に影響を及ぼさないヌクレオチド変化も特定する。
【００５７】
本発明のさらなる側面は、リプレッサータンパク質をコードする配列、及び、その配列がｋｓｔＤプロモーターに作動可能に連結された場合、制御可能に発現される必要のあるタンパク質をコードする配列を細胞に与えることにより、制御された発現のためにリプレッサー及びその誘導性を使用することである。ｋｓｔＲリプレッサータンパク質についての配列は、ｋｓｔＤプロモーター−対象遺伝子構築物と同じ発現構築物上に含まれ得るが、別の構築物上であってもよい。また、宿主細胞が、プラスミド上又は染色体上のいずれかに位置するリプレッサー遺伝子を既に含むことが考慮される。この場合、ｋｓｔＤプロモーターを保有する構築物でこのような宿主細胞を形質転換することによって発現系が確立される。同様に、宿主細胞は、対象遺伝子の発現を制御するプロモーターを既に含むことがある。リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の付加は、リプレッサータンパク質が産生されたとき対象遺伝子の発現を停止させ、リプレッサー機能を取り除くことによって再び発現を誘導することができる。また、ｋｓｔＲリプレッサー配列の発現は構成的プロモーターの制御下であってもよい。
【００５８】
ｋｓｔＤ−ｋｓｔＲ系によって対象遺伝子の発現を制御するためのさらなる方法は、ｋｓｔＤプロモーターのあとにインサイチュで対象遺伝子のコード配列を挿入することによって、通常はｋｓｔＤプロモーターの制御下にあるｋｓｔＤ遺伝子を置換することである。これは、相同的組換え及び／又は組換え酵素とｃｒｅ−ｌｏｘ系のようなこれらの認識部位の使用などの、当技術分野で一般的に公知の手法によって実施できる。
【００５９】
ｋｓｔＲ遺伝子産物によって及ぼされるｋｓｔＤプロモーターの抑制は、３−ケト−△４−官能性を有するステロイド化合物の添加によって取り除かれうる。特に、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）、エストロ−４−エン−３，１７−ジオン（ｅｓｔｒ−４−ｅｎｅ−３，１７−ｄｉｏｎｅ）、テストステロン、プロゲステロン、ノルジオン、７α−メチル−ノルジオン、１１−メチレン−ノルジオンのような化合物だけでなく、プレグネノロン及びスタノロン（１７β−ＯＨ−５α−アンドロスタン−３−オン）、１９−ＯＨ−７−デヒドロ−アンドロステン−３，１７−ジオン及び９α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン（９ＯＨＡＤ）のような化合物も、ｋｓｔＤプロモーターの抑制を取り除くことができる。
【００６０】
選択的調節化合物も特定し得る。例えばｋｓｔＤプロモーターの制御下でレポーター遺伝子の産物を発現する細胞は、ｋｓｔＤプロモーターの活性を調節する物質を特定するために有用である。従って、ｋｓｔＤプロモーターの制御下でレポーター遺伝子産物を発現する宿主細胞はスクリーニングのために有用であり、ｋｓｔＤプロモーターの活性を調節する化合物を特定するための方法を提供することは本発明のさらなる目的である。前記方法は、ｋｓｔＤプロモーターの活性を調節する能力を測定しようとする少なくとも１つの化合物に、ｋｓｔＤプロモーターを含む細胞を接触させることを含む。これらの細胞を、次に、調節によって引き起こされる変化に関して観測する。
【００６１】
（実施例）
【実施例１】
【００６２】
ｋｓｔＲ非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失後のｋｓｔＤの構成的発現
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１におけるｋｓｔＤ遺伝子（３−ケトステロイド△１−デヒドロゲナーゼＫＳＴＤ１をコードする）の転写調節因子をコードする遺伝子、ｋｓｔＲの非標識遺伝子欠失のために突然変異誘発性プラスミドｐＲＥＧ１０４を構築した（図１）。簡単に述べると、ｐＳＤＨ２０５（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）を制限酵素ＮｒｕＩ及びＢａｌＩで消化し、次に自己連結させて、プラスミドｐＲＥＧ１０３を作成する。ｋｓｔＲ遺伝子欠失を含む、ｐＲＥＧ１０３のＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を、その後、ＥｃｏＲＩ消化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターにクローニングして、ｐＲＥＧ１０４を作成する。記述されているｓａｃＢ対立選択法（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ．ら、２００１、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０５：１９７−２０２）により、ｐＲＥＧ１０４を使用して、非標識ｋｓｔＲ遺伝子欠失突然変異Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１０をＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１から単離した。正プライマー（ＲＥＧ−ＦＯＲ）５’ＧＧＣＧＡＣＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＡＴＴ３’及び逆プライマー（ＲＥＧ−ＲＥＶ）５’ＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＡ３’を使用したポリメラーゼ連鎖反応によって真正ｋｓｔＲ遺伝子欠失を確認した。親菌株ＳＱ１のゲノムＤＮＡ（対照）に関して６１８ｂｐのＰＣＲアンプリコンを得た。ｋｓｔＲ遺伝子欠失突然変異株ＲＧ１０のゲノムＤＮＡに関しては、アンプリコンは３９３ｂｐに低下し、ｋｓｔＲ遺伝子欠失を確認した。
【００６３】
構成的ｋｓｔＤ１発現を、突然変異株ＲＧ１０及び親菌株ＳＱ１の細胞をグルコース（２０ｍＭ）無機培地（１ｇ・ｌ−１ＮＨ４ＮＯ３、０．２５ｇ・ｌ−１Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５ｇ・ｌ−１ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ・ｌ−１ＮａＣｌ、５ｍｇ・ｌ−１ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２））中、３０℃で３日間増殖させ、続いて５時間ステロイド誘導すること（０．５ｇ／ｌ−１、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ））によって確認した。対照として、ステロイド誘導なしの細胞培養物を使用した。ＡＤをＤＭＳＯ（５０ｍｇ／ｍｌ−１）に溶解し、高圧滅菌した培地に加えた。細胞ペレット（３０分間、７，３００×ｇ、４℃）をリン酸緩衝液２００ｍｌ（ＫＨ２ＰＯ４２．７２ｇｌ−１；Ｋ２ＨＰＯ４３．４８ｇ−ｌ−１；ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ２．４６ｇ・ｌ；ｐＨ７．２）で洗浄した。洗浄した細胞懸濁液（５ｍｌ）をフレンチプレス細胞（１４０Ｍｐａ）に２回通して破壊した。細胞抽出物を２５，０００×ｇで２０分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。ＫＳＴＤ活性に関して染色した未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってｋｓｔＤの発現を確認した（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）（表１）。菌株ＲＧ１０の非誘導細胞から調製した無細胞抽出物に関してＫＳＴＤ１活性のバンドを認め、ｋｓｔＲ遺伝子欠失がｋｓｔＤ遺伝子の構成的発現をもたらすことを示唆した（表１）。
【００６４】
【表１】
2006508684.tif 000003
【実施例２】
【００６５】
微生物ステロイド△１−脱水素反応のためのｋｓｔＤ２の構成的発現
ｐＲＥＧ１０４（図１、実施例１参照）を使用して、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ９（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ．ら、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１００７−１０１８）のｋｓｔＲ遺伝子欠失突然変異株を構築し、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１７と称した。従って、菌株ＲＧ１７は、ｋｓｔＤプロモーターの転写調節因子に加えて、３−ケトステロイド△１−デヒドロゲナーゼ（ＫＳＴＤ１及びＫＳＴＤ２）及び３−ケトステロイド９α−ヒドロキシラーゼ（ＫＳＨ）活性を持たない、ｋｓｔＤ  ｋｓｔＤ２  ｋｓｈＡ１  ｋｓｔＲの四遺伝子欠失突然変異株である。この突然変異株のｋｓｔＤ  ｋｓｔＤ２  ｋｓｈＡ表現型の故に、菌株ＲＧ１７は、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）及び９α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン（９ＯＨＡＤ）の代謝が完全にブロックされる。
【００６６】
Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）のｋｓｔＤプロモーターの制御下での遺伝子発現のためにロドコッカス発現ベクターを構築した。ｋｓｔＤプロモーターを使用すると、ｋｓｔＲ遺伝子欠失を有するＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）突然変異株における遺伝子の発現は、ｋｓｔＤ発現のリプレッサーが存在しないため構成的である。ｋｓｔＤプロモーター領域（１５８ｂｐ）を、正プライマー
【００６７】
【化１】
2006508684.tif 000004
及び逆プライマー
【００６８】
【化２】
2006508684.tif 000005
を使用したＰＣＲ増幅（Ｔａｑポリメラーゼを使用して、２５サイクル：３０秒間、９５℃、３０秒間、６４℃、３０秒間、７２℃）によってＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１染色体ＤＮＡから単離した。ｋｓｔＤ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに対象遺伝子を正確にクローニングできるようにＮｄｅＩ部位（下線部）をアンプリコンに組み込んだ。そのアンプリコン（１７５ｂｐ）を、シャトルベクターｐＲＥＳＱ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ．ら、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１００７−１０１８）のユニークＳｎａＢＩ制限部位に平滑末端連結し、生じたロドコッカス発現ベクターをｐＲＥＳＸと称した（図２）。
【００６９】
Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１におけるＫＳＴＤ２イソ酵素をコードするｋｓｔＤ２遺伝子を、正プライマー
【００７０】
【化３】
2006508684.tif 000006
（ＮｄｅＩ部位に下線を付している）及び逆プライマー
【００７１】
【化４】
2006508684.tif 000007
（ＢａｍＨＩ部位に下線を付している）
を使用したＰＣＲ（条件：前記参照）によって親菌株ＳＱ１の染色体ＤＮＡから単離した。導入したＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位を使用して、ｋｓｔＤ２アンプリコンをＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＲＥＳＸベクターに連結した。生じたプラスミドをｐＲＥＳＸ−ＫＳＴＤ２と称した。
【００７２】
プラスミドｐＲＥＳＸ−ＫＳＴＤ２を電気的形質転換（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２０００、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２０２９−２０３６）によってＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）菌株ＲＧ１７に導入し、１つの形質転換体をＡＤバイオトランスフォーメーションのために使用した。ＫＳＴＤ２によるＡＤのＡＤＤへのバイオトランスフォーメーションを、カナマイシン（２００μｇ／ｍｌ−１）の存在下にＹＧ１５  １００ｍｌ（１５ｇ／ｌ−１酵母抽出物、１５ｇ／ｌ−１グルコース）培地中２８℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた細胞に関して実施した。後期対数増殖期まで（５−９のＯＤ６００）増殖させた後、ＡＤ（０．１％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ  ８０中１ｇ／ｌ）を加えて、ＡＤＤへのＡＤバイオトランスフォーメーションを数日間進行させた。ＨＰＬＣ分析のために、培養試料をメタノール／水（７０：３０）で５倍希釈し、ろ過した（０．４５ｍ）。ステロイドをＨＰＬＣ（２５０×３ｍｍの逆相Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  １０ＲＰ１８カラム［Ｖａｒｉａｎ  Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ］、２５４ｎｍでの紫外吸収検出、及び３５℃のメタノール／水［６０：４０］の液相を用いる）によって分析した。
【００７３】
ｐＲＥＳＸ−ＫＳＴＤ２を保有する、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）菌株ＲＧ１７の細胞に関するバイオトランスフォーメーション実験は、ＡＤのＡＤＤへのバイオトランスフォーメーションをほぼ完了まで生じさせる、ＫＳＴＤ２ステロイド△１−デヒドロゲナーゼ活性の存在を示した。これに対し、野生型ＫＳＴＤ１及びＫＳＴＤ２イソ酵素を有するが、ＫＳＨ反応が遮断されているロドコッカス属菌突然変異株は、おそらく調節機構のために（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ．ら、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１００７−１０１８）、通常は５０％を越えない収率でＡＤをＡＤＤに変換する。
【実施例３】
【００７４】
ｋｓｈＡイソ遺伝子、ｋｓｈＡ２の発現はｋｓｈＡ突然変異株表現型を相補する
Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ．ら、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１００７−１０１８）のｋｓｈＡ遺伝子のホモログを、紫外線誘導ロドコッカス菌突然変異株の相補性実験によって単離したＤＮＡ断片のヌクレオチド配列決定に従って同定した。Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１は少なくとも２個のｋｓｈＡイソ遺伝子を含み、これらをｋｓｈＡ及びｋｓｈＡ２と称した。
【００７５】
Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１のｋｓｈＡ遺伝子欠失突然変異株、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ２（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ  Ｒ．ら、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１００７−１０１８）は、唯一の炭素及びエネルギー源としてＡＤ（０．２５ｇ／ｌ−１）を添加した無機塩寒天平板（１ｇ・ｌ−１ＮＨ４ＮＯ３、０．２５ｇ・ｌ−１Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５ｇ・ｌ−１ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ・ｌ−１ＮａＣｌ、５ｍｇ・ｌ−１ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２）、１．５％寒天）で増殖を示さない。従って、ｋｓｈＡ２は、これらの増殖条件下でＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ２において発現されない。
【００７６】
ｋｓｈＡ２遺伝子をｐＲＥＳＸにおいてｋｓｔＤプロモーターの制御下においた。これを実現するため、ｋｓｈＡ２遺伝子を、正プライマー
【００７７】
【化５】
2006508684.tif 000008
（ＮｄｅＩ部位に下線を付している）及び逆プライマー
【００７８】
【化６】
2006508684.tif 000009
（ＳｐｅＩ部位に下線を付している）
を使用したＰＣＲによってＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）染色体ＤＮＡから鋳型として増幅した。得られたｋｓｈＡ２アンプリコンを、最初にＥｃｏＲＶ消化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ（ｐＫＳＨ３１１）に連結し、その後ＮｄｅＩ／ＳｐｅＩ断片としてＮｄｅＩ／ＳｐｅＩ消化したｐＲＥＳＸにサブクローニングして、ｐＫＳＨ３１２を生成した。
【００７９】
プラスミドｐＫＳＨ３１２を電気的形質転換によってＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ２に導入し、生じた形質転換体を、０．２５ｇ／ｌのＡＤを唯一の炭素及びエネルギー源として含む無機塩寒天培地でレプリカ平板法を実施した。全ての形質転換体がＡＤ無機塩培地で増殖することができ、ｋｓｔＤプロモーターの制御下でのｋｓｈＡ２の機能的発現及びｋｓｈＡ突然変異表現型の相補性を示唆した。
【実施例４】
【００８０】
ステロイド及び構成的発現の誘導
ステロイドがＫｓｔＤ遺伝子のリプレッサー−プロモーター系を誘導することができるかどうかを評価するため、前述したＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１（野生型）及びＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１０（ｋｓｔＲ−突然変異型）の両方の細胞培養を、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）、テストステロン、プロゲステロン、ノルジオン、エストロン、７α−メチル−ノルジオン、１１−メチレン−ノルジオン、スタノロン（１７βＯＨ−５α−アンドロスタン−３−オン）、１９ＯＨ−７−デヒドロ−アンドロステン−３，１７−ジオン及びプレグネノロンによる誘導条件下で試験した。４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）誘導を陽性対照として用いた。
【００８１】
誘導した培養から、前述したように無細胞抽出物を調製し、ＤＣＰＩＰを電子受容体とし、ＡＤを基質として使用してＫＳＴＤ活性に関して試験した。エストロンを除いて、試験した全てのステロイドがＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１においてＫＳＴＤ活性を誘導できることを認めた。活性のレベルは、試験した全てのステロイドについて同じではなかった。未変性ゲルの対照は、全ての陽性ケースで実際にＫＳＴＤ１活性が誘導されたことを確認した。
【００８２】
さらに、ＫＳＴＤ１がＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１０において構成的に発現されるかどうかを検討した。ＡＤ誘導細胞培養から及び非誘導細胞培養から無細胞抽出物を調製した。これらの抽出物を、ＤＣＰＩＰを電子受容体とし、ＡＤを基質として使用してＫＳＴＤ活性に関して試験した。比較のために、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１に関して同じ手順を実施した。
【００８３】
Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＲＧ１０の誘導並びに非誘導培養の両方において、ＫＳＴＤ活性が存在することを認めた。Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＳＱ１では、他方で、ＫＳＴＤ活性はＡＤ誘導培養においてのみ検出された。未変性ゲルの対照は、全ての陽性ケースで実際にＫＳＴＤ１活性が誘導されたことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ｋｓｔＲ非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失のための突然変異誘発性プラスミドｐＲＥＧ１０４の構築の概略図である。
【図２】図２は、ｐＲＥＳＱに由来するロドコッカス発現ベクターｐＲＥＳＸ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１００７−１０１８）の概略図である。黒色の湾曲したバーはｋｓｔＤプロモーター領域を示す。白色の湾曲したバーは、自律複製をコードするロドコッカス属菌遺伝子を示す。ａｐｈＩＩはカナマイシン耐性をコードする。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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