(57)【要約】潜在的な結合部位のために高分子を分析するコンピュータに実装される方法が提供され、その方法は、高分子の複数の潜在的な結合部位において有機フラグメント（ＯＲＦ）のコンピュータ上の表示の存在を位置づける工程；Ｂの値を選択する工程であって、ここで、Ｂ＝μ’／ｋＴ＋ｌｎ＜Ｎ＞  （μ’：過剰化学ポテンシャル、ｋ；ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、＜Ｎ＞：ＯＲＦの平均分子数）である工程；エネルギー最小化状態が得られるまで、ＯＲＦの存在を再度位置づける工程；再度位置づけされたＯＲＦの存在の各々について、再度位置づけＯＲＦが高分子と、選択したＢ値で結合された潜在的な結合部位にて結合するか否かを評価する工程；選択したＢ値で結合された潜在的な結合部位において結合しないＯＲＦの存在を消去する工程；より低いＢ値で、上述の工程を反復する工程；およびＯＲＦの消えていない存在のリストを出力する工程を包含する、方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子における結合部位を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの有機フラグメント（ＯＲＦ）に対して、別個の値のパラメータＢで、その挿入溶媒として該ＯＲＦを用いて化学ポテンシャル計算の２以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；および
（ｂ）工程（ａ）により収束に至った解を比較して、該関連のあるＯＲＦが強力に結合する第１の位置を同定して、それによって、リガンド分子に結合するための候補部位を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
（ｃ）ＯＲＦに強力に結合する部位のクラスタを同定する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
（ｄ）１以上のＯＲＦの各々に対して、工程（ａ）および工程（ｂ）を実行して、そして、２以上の別個のＯＲＦが結合するクラスタを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、ここで、３以上の別個のＯＲＦに結合するクラスタが、同定される、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、該方法は、
クラスタの近傍の結合ストリージェンシーを低減して、生物活性因子の結合に対して寄与するエレメントをさらに同定する工程
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、
（ｅ）別個の値の化学ポテンシャルの測定値において、前記挿入溶媒として水を使用して、化学ポテンシャル計算の２以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；
（ｆ）工程（ｃ）によって収束に至った解を比較して、水が強く結合する位置を同定して、よって、リガンド分子の結合のための候補部位ではない水の位置を同定する工程；および
（ｇ）水の位置ではない第１の位置を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学ポテンシャル計算のシミュレーテッドアニーリングが、複数のサンプリング工程を包含し、ここで、該サンプリングの工程の数において、該ＯＲＦ位置が、少量ずつ変化され、そして、その得られた新たな位置が、該試みられた変化の結果としてのエネルギーの変化に基づいて許容されるかまたは棄却される、方法。
【請求項８】
高分子に結合する化合物の化学的特徴を同定する方法であって、
請求項３に記載の結合部位同定方法に従うクラスタに見出されたＯＲＦの官能基および相対的配向を調べる工程
を包含する、方法。
【請求項９】
高分子と相互作用をする化合物を同定するためのコンビナトリアル化学を実行する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項３に記載の結合部位同定方法に従ったクラスタにおいて見出されるＯＲＦの官能基によってモデリングされる反応物のクラスを同定する工程；
（ｂ）工程（ａ）において同定された少なくとも２つの種類の試薬を反応させる２以上の合成プロセスを要求するコンビナトリアル合成プロトコルを設計する工程；および
（ｃ）該コンビナトリアル合成プロトコルを実行して候補結合分子を生成する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
潜在的な結合部位のために高分子を分析するコンピュータに実装される方法であって、該方法は、
（１）該高分子の複数の潜在的な結合部位において有機フラグメントのコンピュータ上の表示の存在を位置づける工程；
（２）Ｂの値を選択する工程であって、ここで、Ｂ＝μ’／ｋＴ＋ｌｎ＜Ｎ＞であって、ここで、μ’は、過剰化学ポテンシャルであり、ｋは、ボルツマン定数であり、Ｔは、絶対温度であり、そして、＜Ｎ＞は、該有機フラグメントの平均分子数である、工程；
（３）エネルギー最小化状態が得られるまで、該有機フラグメントの存在を再度位置づける工程；
（４）該再度位置づけされた有機フラグメントの存在の各々について、該再度位置づけされた有機フラグメントが該高分子と、選択したＢ値で結合された潜在的な結合部位にて結合するか否かを評価する工程；
（５）該選択したＢ値で該結合された潜在的な結合部位において結合しない有機フラグメントの存在を消去する工程；
（６）より低いＢ値で、工程（１）〜工程（５）を反復する工程；および
（７）該有機フラグメントの消えていない存在のリストを出力する工程；
を包含する、方法であって、
但し、該有機フラグメントが水ではない、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記潜在的結合部位が、前記高分子の部位の偏りのないサンプリングを包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記位置づける工程が、前記高分子のコンピュータ読み取り可能表示としてグリッドを置く工程であって、ここで、該潜在的結合部位は、グリット交差点を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記グリッドの間隔は、前記有機フラグメントの最小の断面よりも小さい、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記潜在的な結合部位は、グリッド点を中心にし、そして、前記グリッドの間隔の約１０％の直径を有している球形状内の点をさらに含む、方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記潜在的結合部位は、グリット点を中心にし、前記グリッドの間隔の約１０％の寸法を有する直方体形状中に点をさらに含んでいる、方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、
（８）１以上のさらなる有機フラグメントについて、工程（１）〜工程（７）を反復する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、
（８）工程（１）〜工程（６）を反復する工程であって、ここで、前記有機フラグメントが水分子であり、ここで、工程（７）が、該水分子の消去されていない存在と結合していない有機フラグメントの消去されていない存在のリストを出力する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、
（９）工程（１）〜工程（６）を反復する工程であって、ここで、前記有機フラグメントが水分子であり、ここで、工程（７）が、該水分子の消去されていない存在と結合していない有機フラグメントの消去されていない存在のリストを出力する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、
（８）前記有機フラグメントの消去されていない存在のリストから潜在的な結合部位を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、  該方法は、以下：
（９）前記有機フラグメントの消去されていない存在の官能基および相対的配向を示す化合物を選択する工程；および
（１０）結合アッセイまたは機能アッセイを実行して、前記高分子に結合するかまたは該高分子の機能に影響を与える選択された化合物を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、該方法は、以下：
（９）前記有機フラグメントの消去されていない存在のリストから潜在的な結合部位を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
（１０）前記有機フラグメントの消去されていない存在の官能基および相対的配向を示す化合物を選択する工程；および
（１１）結合アッセイまたは機能アッセイを実行して、前記高分子に結合するかまたは該高分子の機能に影響を与える選択された化合物を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、工程（３）が、グランドカノニカルモンテカルロシミュレーションを実行する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質上の結合部位を同定する方法、タンパク質に結合するのに適切な化合物のクラスを同定するための方法、およびタンパク質と相互作用して生物学的プロセスと相互作用する化合物を同定する実験を実行する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、タンパク質構造決定は、目的のタンパク質の結晶を単離し、そして、Ｘ線結晶学的手法による構造を分析することによって実施されてきた。代表的には、そのタンパク質は、重金属成分と共結晶されるか、または、結晶学的データを解くための基準を提供する重金属を共結晶されてきた。
【０００３】
タンパク質の構造、重要な三次元構造を有する別の高分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の構造が決定すると、しばしば、研究者らは、生物学的プロセスに対して重要であるか、またはそれらに対して重要であり得る結合部位（酵素活性部位または別の高分子と相互作用するかもしくはそれ自体と相互作用するための部位）を同定することを試みてきた。計算機を用いた試みでは、これまで、分子の表面を差プリングして既知の結合因子との良好な適合を発見することに焦点が当てられてきた。これらの方法は、少々の成果を収めてきたが、これらの方法は、（ａ）十分な結合をする因子の構造、および、しばしば、（ｂ）そのタンパク質の機能の知識に依存する。多くの従来型のアプローチが、その高分子ととも結合物質を共結晶化して結合部位を同定することを要求してきた。その結合部位を同定することで、その部位に結合し得るだろう新規分子について知識に基づいた推測がなされ得る。これらの知識に基づく推測によって、合成法（コンビナトリアル化学法を含む）の指針となり、新規の分子の製造および試験を行い得る。このような予想による結合因子が有効な結合因子であるとわかり、そして、適切な生物学的モデルにおいても有効であることが見出されると、それらの結果から得られる構造的相関は、その結合部位に関する情報と結び付けられ、生物学的機能に対して重要な構造についてのなおさらなる推論を行い得る。この共結晶化アプローチは、活性因子の当初の知識に依存しており、実験的に困難であり、時間がかかるものである。
【０００４】
本発明者らは、高分子の三次元的構造解（three- dimensional structural solution ）から、その分子に対する結合部位を同定する方法を見出した。本方法にとっての基礎として使用される構造解は、結晶学的手法、分光学的分析法（例えば、ＮＭＲ）、計算による誘導法、または高分子の構造を決定する任意の他の方法により誘導され得る。本方法は、その高分子の機能に係る情報を必要せず、または、代表的に、そのような情報を利用しない。なぜならば、本方法は、主観的偏見を回避し、そして、その代わりに、物理学的パラメータのみ依拠する。さらに、本方法は、結合部位の可能な選択を狭め、そして、結合部位と効率的に相互作用する官能基（すなわち、有機フラグメント、つまりＯＲＦ）を同定するためにさらに精密にされ得る。ＯＲＦのために得られたデータによって、候補結合因子において有用である官能基の配向をさらに同定し、それによって、化学データベースをサーチして、候補結合因子を同定するツールを提供する。本明細書中で記載される方法は、１以上の潜在的な結合部位を同定し、これらの方法によって生成されたデータは、それらの結合部位をエネルギー的にランク付けして、それによって、どの部位が、分子のより強力に結合する能力があるのかを定量的に決定するために使用され得る。
【０００５】
本明細書中で記載の計算法は、従来の方法によって生成されたデータを編纂することによって生成されるマップとほぼ同一である結合部位の傾向のマップを生成するが、重要な違いが一つある。つまり、その重要な違いは、実験的データは、それを得るために多くの時間を必要とするが、本明細書中で記載されるようなデータは、数週間未満で生成され得る。
【０００６】
本発明は、生物学的高分子に結合して高分子の機能に影響を与える分子の特徴を予測するためのバイアスのない（unbiased）シミュレーション法における重要な発展を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施形態において、高分子における結合部位を同定する方法であって、その方法は、以下：（ａ）少なくとも１つの有機フラグメント（ＯＲＦ）に対して、別個の値のパラメータＢで、その挿入溶媒としてそのＯＲＦを用いて化学ポテンシャル計算の２以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；および（ｂ）工程（ａ）により収束に至った解を比較して、その関連のあるＯＲＦが強力に結合する第1の位置を同定して、それによって、リガンド分子に結合するための候補部位を同定する工程を包含する。好ましい局面において、本方法は、（ｃ）ＯＲＦに強力に結合する部位のクラスタを同定する工程をさらに包含する。別の好ましい局面において、本方法は、（ｄ）1以上のＯＲＦの各々に対して、工程（ａ）および工程（ｂ）を実行して、そして、2以上の別個のＯＲＦが結合するクラスタを同定する工程をさらに包含する。好ましくは、3以上の別個のＯＲＦに結合するクラスタが、同定される。本方法は、クラスタの近傍の結合ストリージェンシー（thebinding stringency ）を低減して、生物活性因子の結合に対して寄与するエレメントをさらに同定する工程を包含する。
【０００８】
別の好ましい局面において、本方法は、さらに、以下を包含する：（ｅ）別個の値の化学ポテンシャルの測定値において、上記挿入溶媒として水を使用して、化学ポテンシャル計算の２以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；（ｆ）工程（ｃ）によって収束に至った解を比較して、水が強く結合する位置を同定して、よって、リガンド分子の結合のための候補部位ではない水の位置を同定する工程；および（ｇ）水の位置ではない第１の位置を同定する工程。
【０００９】
さらに別の好ましい局面において、上述の化学ポテンシャル計算のシミュレーテッドアニーリングが、複数のサンプリング工程を包含し、ここで、そのサンプリングの工程の数において、そのＯＲＦ位置が、少量ずつ変化され、そして、その得られた新たな位置が、その試みられた変化の結果としてのエネルギーの変化に基づいて許容されるかまたは棄却される。
【００１０】
さらに、高分子に結合する化合物の化学的特徴を同定する方法が提供され、この方法は、上記のように概説した結合部位同定方法に従うクラスタに見出されたＯＲＦの官能基および相対的配向を調べる工程を包含する。
【００１１】
高分子と相互作用をする化合物を同定するためのコンビナトリアル化学を実行する方法もまた提供され、この方法は、以下を包含する：（ａ）上述の高分子の結合部位同定方法に従ったクラスタにおいて見出されるＯＲＦの官能基によってモデリングされる反応物のクラスを同定する工程；（ｂ）工程（ａ）において同定された少なくとも２つの種類の試薬を反応させる２以上の合成プロセスを要求するコンビナトリアル合成プロトコルを設計する工程；および（ｃ）そのコンビナトリアル合成プロトコルを実行して候補結合分子を生成する工程。
【００１２】
生物活性因子発見プロセスを実施する方法がさらに提供される。この方法は、さらに、以下が包含される：（ａ）化学物質または化学物質のプールの、コンビナトリアル合成プロトコルまたはコレクションが達成された群から、上述の結合部位同定方法から同定された、高分子選択基準を満たす高密度の化合物を提供するからなる群のそれらのメンバーを同定する工程；および（ｂ）結合アッセイまたは機能アッセイを実行して、上述の高分子に結合するかまたはそれらの機能に影響を与える、上述の同定されたコレクションまたはプロトコルから得られた化合物を同定する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の用語は、本願の目的で、以下に記載される代表的な意味を有する。
【００１４】
「生物活性因子」とは、細胞、ウイルス、器官または生物に対して作用して、その細胞、ウイルス、器官または生物の機能の変化を生じ得る、化学物質のような物質をいい、薬物（すなわち、医薬品）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、本発明の生物活性因子を同定するための方法は、約６００以下の分子量を有する有機分子、またはポリマー種（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、プロテオグリカンなど）に適用される。生物活性因子は、医薬品（すなわち、動物、好ましくはヒトの治療において使用される物質）であり得る。
【００１５】
「フリーグリッド点のクラスタ」とは、ＯＲＦがクラスタに挿入され得る合理的な確率を可能にするために十分な数の、近接または隣接するフリーグリッド点が存在するという点で、所定のＯＲＦに対して「クラスタ」内にあるフリーグリッド点をいう。従って、Ｈ２Ｏに対するフリーグリッド点のクラスタは、Ｈ２Ｏを受け入れ得る高分子の表面または内部の全ての体積を同定するように、規定されなければならない。しかし、全ての適切な体積がシミュレーションプロセスにおいてサンプリングされることを保証するために必要とされるので、選択基準は、Ｈ２Ｏを受け入れないいくらかの体積を、誤って同定するはずである。フリーグリッド点のクラスタは、ＯＲＦの大きさ（例えば、Ｈ２Ｏとベンゼンとを比較のこと）およびグリッドの間隔に依存して、異なって規定される。
【００１６】
「ＯＦＲ結合部位のクラスタ」とは、代表的に、さらなる考慮に値するために十分な親和性でＯＲＦを結合する、近くに位置する部位または重なる位置のパターンをいう。
【００１７】
「化合物のコレクション」とは、生物活性因子を同定するために試験され得ることを意図して収集または組織化された化合物（例えば、直接的にかまたは生物学的活性の代理（例えば、例えば、高分子への結合または高分子の機能の妨害）を介して測定される生物学的活性を有する）の、任意のコレクションをいう。このコレクションは、より単純な分子（これは、支持体に結合し得る）のコレクションから、多様な化学物質の生成のために設計された化学スキームによって、調製され得る。この後者の型のコレクションは、しばしば、「コンビナトリアルライブラリー」と称される。
【００１８】
「フリーグリッド点」とは、所定の認容された原子半径の定義について、グリッド点が、関連する高分子のマッピングされた原子の原子半径内に入らないという意味で「フリー」であるグリッド店（これらは、以下で議論される）をいう。
【００１９】
「高分子」とは、時間で平均された三次構造を有する分子または分子のコレクションをいう。従って、この用語は、代表的に、タンパク質、リボ核酸、核酸とタンパク質との両方から形成される構造体、炭水化物、上記のものの２つ以上から形成される構造体などをいうが、この用語はまた、他の分子（脂質が挙げられる）で形成された構造体をいい得る。高分子は、本明細書中に記載される方法において、それらの三次構造のマップを参照して使用される。このようなマップは、代表的に、Ｘ線回折研究によって作成され、この研究は、何千もの高分子のマップを作成した。しかし、マップは、他の方法（例えば、コンピュータを用いる方法、または他のデータ（例えば、ＮＭＲデータ）によって補充された、コンピュータを用いる方法）によって、作成され得る。コンピュータを用いる方法は、適用することが困難であったが、最近の研究は、いくらかの成功を達成しているようである。
【００２０】
「有機フラグメント」または「ＯＲＦ」とは、高分子との１つ以上の相互作用の様式（例えば、カルボニル、ヒドロキシル、アミド、炭化水素などの相互作用）をモデリングするために使用され得る、分子または分子フラグメントである。
【００２１】
「水の位置」とは、水が強く結合している位置であり、１つの実施形態において、例えば、転移点（）についてのＢ値以下のＢの値においてシミュレーションが実施される場合に、このシミュレーションが、水が結合したままであることを示し、高分子によって強く影響を受けている水分子を示す位置を意味する。図７には、Ｂの値（以下でさらに記載されるパラメータ）が次第に減少する、シミュレートされた結合した水分子の滴定の概念化が図示される。転移点とは、高分子によって強く影響を受けている水分子を示す。転移点の値以下のＢ値は、図示において点ＳＢによって示されるような、別の分子による競合的結合を起こりにくくするために十分な強度の水の結合を規定するように、指定され得る。代表的に、水溶性タンパク質について、この点ＳＢは、約１００〜約５０個の水分子が５０ｋｄのタンパク質に結合したままであるように選択される。
【００２２】
本発明のシミュレーションプロセスは、所定のＯＲＦを、高分子構造の表面または内部の、このようなＯＲＦが実際的な問題として存在する全ての部位に、偏らないサンプリングにおいて人工的に挿入することによって、働く。これらの部位は、「サンプリング部位」と称され得る。代表的に、多数のＯＲＦの各々についてのシミュレーションのスケジュールが実施され、各シミュレーションは、別個の値のパラメータＢにおいて実施され、このパラメータＢは、過剰の化学ポテンシャルに関連する。このスケジュールは、多数のＢ値の各々（代表的に、１０〜約−１５の範囲）において実施されるシミュレーションを提供する。所定のＢの値における各シミュレーションにおいて、このシミュレーションは、シミュレーションの各工程において、所定の部位におけるＯＲＦの挿入が認容されるか拒絶されるかを、グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数に基づく評価を用いて、評価する。シミュレーションの各工程において、このアルゴリズムは、その部位におけるＯＲＦの挿入をモデリングする。強制偏りカノニカル確率密度関数は、小さいステップ（例えば、±０．２Å、±３０°）でＯＲＦを並進および回転させて、シミュレーション工程の時点で適切なシミュレーションパラメータを考慮して、エネルギーが最小の挿入を同定するために使用される。次いで、挿入の確率が、グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数から決定され、そしてＯＲＦが、この確率値に対して重み付けされたランダム数発生プロトコルによって、その部位に存在することが表現され得る。この表現を行うために選択するための代替的な方法（例えば、挿入を表現する場合または表現しない場合についてのカットオフ値の適用）もまた、適用され得るが、さほど好ましくない。代表的に、首尾よい挿入に続いて、引き続く削除の試みは、その部位において、先に同定された、並進および回転されたＯＲＦを用い、そしてこの並進および回転されたＯＲＦは、削除の試みが成功するまで使用される。このシミュレーションは、代表的に、多数の工程（例えば、２×１０６工程）について実施され、その工程の大部分（例えば、１．５×１０６）は、認容された挿入の数が、平均して、削除の数と等しくなるように、このシミュレーションを「平衡化」するために必要とされる。
【００２３】
多数の偏っていないサンプルを、シミュレーションの後の過程にわたって、各サンプル部位において採用することによって、例えば、平衡が達成された後の２００工程ごとの挿入後に、そのサンプル部位において、所定のＢの値で存在するＯＲＦの占有確率が、評価され得る。次いで、この占有は、この方法の全体的な結果として、この可能性に基づいて、例えば、その確率に基づいて表現を行う乱数プロトコルを用いて決定され得る。ＯＲＦが並進または回転された程度もまた、このような並進および回転の確率に基づいて、表現され得る。
【００２４】
各ＯＲＦに対して、シミュレーションが、過剰の化学ポテンシャルの尺度の多数の値（例えば、Ｂ）の各々において、実施される。従って、この値が低くなるにつれて、所定のサンプリング部位におけるＯＲＦの保持は、高い相対結合親和性の指標である。
【００２５】
これらのサンプリング部位は、代表的に、図１に図示されるようなグリッドを作成することによって、達成される。図１は、グリッドが重ねられた（図１Ｂ）、解かれた結晶構造（図１Ａ）を図示する。例えば、このグリッドは、約１／２オングストロームから焼く１オングストロームの間隔を有し得、このグリッドの交差点は、サンプリング部位の候補を規定する。このグリッドの間隔は、好ましくは、ＯＲＦの最小の断面より小さいように選択される。この間隔は、代表的に、ＯＲＦの大きさに対して十分に小さいように選択され、その結果、フリーグリッド点クラスタを規定し得る自由体積が、以下に規定されるような有用なサンプリングを可能にするために十分なフリーグリッド点を有する確率。このような比較的小さい間隔は、どのようにグリッドを配向するかの選択が、そのアルゴリズムを、特定のＯＲＦ結合優先度を同定することに対してそのアルゴリズムを偏らせる機会を最小にする。サンプリング部位は、高分子によって占有されていない部位から選択される（図１Ｂ）。「グリッドの偏り」の最終的な排除は、試験挿入点を、以下に記載されるように、グリッド点における厳密な初期挿入から離して変化させることによって、達成される。
【００２６】
これらのサンプリング部位は、ＯＲＦが挿入されることを可能にする、高分子がない十分な隣接体積を有する部位に限定される。例えば、サンプリング部位は、少なくとも約２Å×２Å×２Å（＝８Å３、すなわち０．００８ｎｍ３）。または約２．５Å×２．５Å×２．５Å（＝１５．６Å３、すなわち０．０１５６ｎｍ３）、あるいは水については、２．８Å×２．８Å×２．８Åの開いた領域内のグリッド点に限定され得る。これらのグリッド点は、ＯＲＦの大きさおよびグリッドの間隔に依存して、フリーグリッドポイントのクラスタ（例えば、３個、１個、５個、６個、７個、８個、またはそれより多くのフリーグリッド点のクラスタ））の内部にあるフリーグリッド点について選択され得る。
【００２７】
１つの好ましい実施形態において、ＯＲＦは、必ずしも、最初にそのグリッド点に正確に挿入されず、そのグリッド点の短い距離内の挿入点のランダムなサンプリングに挿入される（例えば、そのグリッド点を中心とし、そしてそのグリッド間隔のおよそいくらかの百分率（例えば、１０％）の直径を有する球形状の内部、あるいはそのグリッド距離のおよそそのような百分率の幅、長さおよび高さを有するグリッド点を中心とする箱形状の内部の点）。上で議論されたように、初期の挿入点におけるこの「ゆらぎ」は、グリッドの配置が、所定の開いた体積が効率的にサンプリングされる機会を偶然減少させる場合に、グリッドの偏りを排除することを補助する。
【００２８】
エラスターゼ（具体的には、Ｂｒａｎｄｅｉｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＧ．Ａ．Ｐｅｔｓｋｏのブタパンクリアーゼエラスターゼの構造的解）の結晶学的解を使用して、この方法は、メタノールをＯＲＦとして使用して、例示され得る。図２Ａは、比較的高いＢ値（例えば、Ｂ＝１０）を使用した、最終解を示す。図２Ｂは、中程度の値（例えば、Ｂ＝６または７）を使用した、最終解を示す。図２Ｃは、より低い中程度の値（例えば、Ｂ＝０または−２または−４）を使用した、最終解を示す。図２Ｂは、限定的な値（例えば、Ｂ＝−１４）を使用した、最終解を示す。図示されるように、Ｂの値が低いほど、より少ないメタノール分子が、結合したままになる。これらの残っているメタノールフラグメントは、比較的高い親和性で結合するメタノールを示す。
【００２９】
このプロセスの次の工程は、さらなるＯＲＦを用いてシミュレーションを実施すること、および比較的高い親和性のＯＲＦ結合部位のクラスタを同定することである。従って、例えば、再度エラスターゼを使用して、シミュレーションが実施され、アンモニア、メタノール、ケトンおよびアミンに対するＯＲＦについての結合が決定され得る。比較的低いＢ値における組み合わせた結果が、図３Ａに図示される。ＯＲＦ結合部位のクラスタが、図３Ｂに図示される。本発明の方法は、ＯＲＦ結合部位のクラスタを同定することを求め、ここで、このクラスタは、１つのみの型のＯＲＦから構成され得る。しかし、好ましくは、クラスタは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれより多くの異なるＯＲＦについての結合部位を含む。
【００３０】
有用なＯＲＦの例としては、以下が挙げられる：
【００３１】
【表１】
2006519976.tif 000002
【００３２】
【表２】
2006519976.tif 000003
【００３３】
好ましくは、選択されるＯＲＦは、薬剤または他の生理活性化学物質の設計において有用であることが分かっている、化学的特徴の例である。
【００３４】
従って、分析の第１のモードにおいて、プロセスの重要な部分は、いくつかのＯＲＦを用いてシミュレーションを実行し、比較的高い親和性で複数のＯＲＦに結合する部位のクラスタを同定することである。これらのクラスタは、リガンド結合部位についての強力な候補部位である。さらに、ＯＲＦの相対位置付けは、良好な結合剤の特徴の指標である。例えば、以下に記載される方法によってエラスターゼ上で同定された結合部位において、２つのベンゼン環を有し、その間にアミドが挿入されたクラスタは、大規模調査プログラムに由来する最も強力なエラスターゼインヒビターのいくつかのモデルとなる。このインヒビターは、シミュレーションの炭素ベースのアミドの位置にスルホンアミドを有する。Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１４：１２７−１９４（１９９４）の表ＸＸＩＩＩおよびＸＸＶを参照のこと。
【００３５】
本発明のいくつかの実行において、ＯＲＦ結合部位のクラスタ単独は、リガンドが所定のタンパク質と相互作用する部位についての選択範囲を同定、または実質的に狭める。しかし、本発明のいくつかの実施形態において、水に強力に結合する部位が同定され、そして、強力な水結合部位と相互作用するクラスタが差し引かれる。従って、エラスターゼの例において、図３Ｂの候補リガンド結合部位は、図３Ｃに例示されるように、水結合部位を除くことによって狭められる。分析が、図３Ｄに例示されるように、５つのＯＲＦまで拡張される場合、単一の候補部位が残る。図３Ｅは、図３Ｄに例示されるのと同じ部位の、わずかに異なる斜視図を示す。この図では、６つのＯＲＦまで分析が拡張されている。図３Ｆは、候補部位（左パネル）が、いかに十分に、リガンドのトリフルオロアセチル−リシル−プロピル−ｐ−イソプロピルアニリドを含む共結晶の構造と一致するかを示す。
【００３６】
従って、分析の第２のモードにおいて、プロセスの任意の工程は、比較的強い水結合部位と相互作用するＯＲＦクラスタを除くことにより、リガンド結合部位についての選択を狭めることである。
【００３７】
ＯＲＦのクラスタは、代表的に、比較的低いＢ値において同定され、それにより、リガンドについての予想される結合部位を同定することを助けることに注意すべきである。しかし、予想される結合部位についてのさらなる情報は、予想される結合部位の近傍に、より弱く結合するＯＲＦを調べることによって収集され得る。この情報値は、より弱く結合するＯＲＦの予測から生じ、リガンド相互作用をモデリングし、これは、単離の際には弱いが、全体として生態活性因子のリガンド結合親和性への実際の寄与をモデリングする。図４Ａには、エラスターゼおよび公知のリガンドを用いる、６つの共結晶実験のデータから抽出された、アニリン結合部位が図示される。図４Ｂには、シミュレーションによって決定された、最も高い親和性のアミド結合部位のクラスタが図示される。図４Ｃには、図４ＢのアミドＯＲＦに加えて、このクラスタの近隣であるが２番目に高い親和性値でのシミュレーションにおいて現れるアミドが図示される。図示されるように、隣接する低親和性のＯＲＦ結合部位を見ることによって、結果を拡張する、この最後の工程は、共結晶学において見られる結果をよりよくモデリングすることを補助する。具体的には、クラスタ結果は、アミド結合部位の大部分が結晶学において見られる部位を同定するが、膨張は、アミドが実験的に位置決めされたエラスターゼにおける別の割れ目まで、結果を拡張する。さらに、膨張は、リガンド相互作用が見られる別の割れ目（他の図に図示されるような）の一部分を同定する。
【００３８】
従って、分析の第３のモードにおいて、分析の他のモードにより示されたリガンド結合部位の特徴は、ＯＲＦクラスタの近傍において、ストリンジェントの低いシミュレーション結果に目を向けることにより、拡張される。上記の例示は、１つの型のＯＲＦクラスタに焦点を当てたが、これは、多くの型のＯＲＦクラスタと適用可能であり、ここで、この拡張は、１つの型のＯＲＦまたは複数の型のＯＲＦに限定され得る。
【００３９】
図４Ａ〜４Ｃのデータは、重要な概念を例示する。実際のリガンド結合およびシミュレーションの両方において、所定の型の部分についての複数の有効結合位置および方向は、重なっていることが見出され得る。これは、複数の局所エネルギー最小値の存在を反映する。現実世界の作用において、結晶学により得られる低温平均化ではなく、結合相互作用が、このような局所最小値の範囲を反映する。
【００４０】
図５Ａおよび５Ｂにおいて、エラスターゼインヒビターの共結晶を用いて得られる解が、本明細書中に記載される方法により得られたデータと比較される。図５Ａにおいて、６つの共結晶化インヒビターが示され、このインヒビター分子は、互いにオーバーレイされている（非空間充填表示、エラスターゼセグメントは、空間充填図により表示される）。これらのインヒビターは、トリフルオロアセチル−１−リシル−１−プロピル−ｐ−イソプロピルアニリド（結晶解：Ｍａｔｔｏｓら、１９９４年４月３０日投稿）、トリフルオロアセチル−１−リシル−１−ロイシル−ｐ−イソプロピルアニリド（結晶解：Ｍａｔｔｏｓら、１９９４年６月２２日投稿）、トリフルオロアセチル−１−フェニルアラニル−ｐ−イソプロピルアニリド（結晶解：Ｍａｔｔｏｓら、１９９４年４月３０日投稿）、トリフルオロアセチル−１−フェニルアラニル−１−アラニル−ｐ−トリフルオロメチルアニリド（結晶解：Ｍａｔｔｏｓら、１９９５年２月１４日投稿）、トリフルオロアセチル−１−バリル−１−アラニル−ｐ−トリフルオロメチルアニリド（結晶解：Ｍａｔｔｏｓら、１９９５年２月１４日投稿）およびｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アラニル−アラニル）−ｏ−（ｐ−ニトロベンゾイル）ヒドロキシルアミン（結晶解：Ｄｉｎｇら、１９９５年７月１０日投稿）である。図５Ｂにおいて、そのそれぞれが高親和性のタンパク質結合状態にある、約１０のＯＲＦについての解が、オーバーレイされている。両方の方法が、芳香族部分の結合を好む領域を同定する。シミュレーションプロセスは、結晶学の結果と約９０％の三次元幾何学的な同一性を達成する。
【００４１】
図６Ａおよび６Ｂは、結晶学のデータにより示される、リガンド結合に関与するエラスターゼの領域を示し（図６Ａ）、そして、本明細書中に記載されるコンピュータの方法から得られる解により示される、リガンド結合に関与するエラスターゼの領域を示す（図６Ｂ）。
【００４２】
本発明のシミュレーションは、モンテカルロアルゴリズムを利用する。本発明において有用なモンテカルロシミュレーションの形態は、Frenkel and  Smit,Understaｎding  Molecular Sｉmulation : Froｍ Algoriｔｈmsto Applicatioｎs, Academic Press, New York (1996)に記載されている。本シミレーション法は、以下を包含し得る：
周期的セルにおいて数値表現体位置づける；
そのセル内での高分子の位置を最適化する；
その高分子内の全てのキャビティを、内部キャビティまたは表面キャビティであるか位置づける；
これらのキャビティにおいて、ＯＲＦ（水を含む）を挿入するか、または消去する；
グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数を使用して、ＯＲＦの占有確率を計算する；
化学ポテンシャルを変化させて、結合の相対自由エネルギーを得る；
この方法論、つまり、グランドカノニカルアンサンブルシミュレーションは、以下のように導入され得る：
（グランドカノニカルアンサンブルシミュレーション）
グランドカノニカルアンサンブルにおけるシミュレーションの際立った特徴は、そのシミュレーションの間に、その系における分子（ＯＲＦ）の数が変化するということである。換言すると、そのサンプリングは、所定の寸法のコンフィギュレーション空間に限定されるが、コンフィギュレーション空間の集合に拡張される。これらの分子数を変化させ、その結果得られる質量が変化することを許容するという複雑性にもかかわらず、このことによって、そのシミュレーションを、計算上、非常に効率よいものとなったことを出願人らは、思いがけず発見した。その分子数の変化は、グランドカノニカル分配関数
【００４３】
【数１】
2006519976.tif 000004
【００４４】
が、異なる数（Ｎ）の分子のその対応するカノニカル分配関数Ｑの線形結合であり、つまり、以下：
【００４５】
【数２】
2006519976.tif 000005
【００４６】
であるこという事実に対応する。ここで、Ｔは、絶対温度であり、μは、化学ポテンシャルであり、ｋは、ボルツマン定数であり、そして、Ｑ（Ｔ，Ｂ，Ｎ）は、
以下：
【００４７】
【数３】
2006519976.tif 000006
【００４８】
によって、定義される。
【００４９】
Ｎ個の分子（ＯＲＦ）のコンフィギュレーション空間のサンプリングは、メトロポリスモンテカルロ法を使用して実行可能であることが示された。ここで、そのサンプリング肯定の各々において、分子（ＯＲＦ）の位置は、少量ずつ変化され、そして、その得られる新規のコンフォメーションは、変化の結果として期待されるそのエネルギー変化ΔＥに基づいて許容または棄却される。この位置の移動は、その好ましい位置づけを同定するためのＯＲＦの「揺動（シェイキング；shaking）」与えることとして考えられる。そして、この「揺動」方法論は、力の方向にバイアスが与えられ得、これは、付勢バイアスモンテカルロ（ｆorcedbias Monte Carlo）と呼称され得る。この揺動が適用されると、このシミュレーションは、高い確率の方向性（probabilityorientations）を反映する。したがって、
【００５０】
【数４】
2006519976.tif 000007
【００５１】
である。
【００５２】
その温度（シミュレーションの間は一定に保たれている）が、エネルギー変化のスケーリング係数としてその許容された式（acceptance formula）を代入する。
【００５３】
カノニカルアンサンブルメトロポリス法を、グランドカノニカルアンサンブルにおけるシミュレーションに一般化することは、分子（ＯＲＦ）の数が変化する工程を必要とする。操作上、存在する分子の消去または新たな分子の「生成」、挿入のいずれかを必要とする。消去された分子が、無作為に選択されると、その消去は、以下の確率；
【００５４】
【数５】
2006519976.tif 000008
【００５５】
を伴って許容されることが示された。
ここで、μ’は、過剰化学ポテンシャルであり、Ｎは、分子（ＯＲＦ）の数であり、＜Ｎ＞は、そのボルツマン平均であり、そして、Ｖは、その系の体積（これは、そのシミュレーションの間一定である）である。ランダムな位置に分子（ＯＲＦ）を挿入するこころみは、以下の確率；
【００５６】
【数６】
2006519976.tif 000009
【００５７】
をもって、許容される。ここで、その化学ポテンシャルの効果は、Ｂパラメータを介してその許容される式に導入される。係数ＶおよびＮの存在は、そのカノニカル分配関数とグランドカノニカル分配関数との間の関係に、従う：分子（ＯＲＦ）は、この系から取り除かれ、その座標（ＱＮ）における積分によって、Ｖ因子が生じ、そして、Ｎは、Ｎ！の最後の因数である。これらは、確率論的な解釈が与えられえる：挿入部位は、確率１／Ｖで選択され、そして消去されるべき分子（ＯＲＦ）は、確率１／Ｎをもって選択される。
【００５８】
このシミュレーションは、分子（ＯＲＦ）を移動、挿入、消去し、かつ、それらが、式（３）〜（５）に定義されるように、確率
【００５９】
【数７】
2006519976.tif 000010
【００６０】
をもって、許容されるという代替的試みによって、進行する。十分に長い実行の後に、その分子（ＯＲＦ）の数であるＮは、そのボルツマン平均の周りで揺らぐ。所定の密度がシュミレートされると、一般に、様々なＢを試みる必要がある。これに関して、以下の関係：
【００６１】
【数８】
2006519976.tif 000011
【００６２】
に留意することが有用である。
【００６３】
本方法は、分子流体を適度な密度でシュミレートするのがに有用であるが、室温の液体がシミュレートされた場合困難にいたることがわかっている。その困難性は、その殆どの挿入の試みが、分子（例えば、解かれたタンパク質の構造）が存在する位置であり、それによって、大きなΔＥが生じ、そして、その試みが拒絶される可能性があるという事実に由来する。
【００６４】
その挿入の試みの効力を増大させるために、キャビティバイアス挿入技術（cavity-biased insertion technique）が導入される。挿入は、適切なサイズのキャビティが存在する場所のみで試みられ、それによって、許容の無視し得ない確率を確保し得る。しかし、それによって改変されたシミュレーションがその必要とされるボルツマン分布を生成することを確実にするために、挿入許容確率および消去許容確率の両方が、改変される必要がある。この改変された式は、Ｎ個の分子（ＯＲＦ）が存在する場合、キャビティを見出す確率
【００６５】
【数９】
2006519976.tif 000012
【００６６】
を含み、これは、以下：
【００６７】
【数１０】
2006519976.tif 000013
【００６８】
に従う。
【００６９】
この式８および９において、
【００７０】
【数１１】
2006519976.tif 000014
【００７１】
は、適切なサイズのキャビティを含む系の領域の体積を表す。このキャビティバイアス法は、そのキャビティをサーチするアルゴリズムによって、
【００７２】
【数１２】
2006519976.tif 000015
【００７３】
を、さらなる工程を必要とせずにもたらされる。種々の流体（水、ベンゼン）が、ＯＲＦを定義し、これらの種々の流体について計算することによって、そのキャビティバイアス法が、挿の試行の効率を増大させて、改良なくしては実行が不能とされてきた密度のモデリングを可能にしたことを確認した。
【００７４】
（水の結合）
本発明に使用されるシミュレーションの局面は、合成ポリペプチドに対する水の結合の強度を決定するように使用する計算で、例示され得る(Guarnieri and Mezei, J.Am.Claem. Soc. 118 : 8493-8494 (1996) )。この例示は、以下ように記載され得る：
このテキストは、化学ポテンシャルのシュミレーテッドアニーリングの方法によって、バルク水が結合水から区別されるようになり、そして、差次的結合する水がそれらの反応化学ポテンシャルに基づいて互いに区別され得ることが可能になる。ことは、それが、荷電したＤＮＡドデカマーの主溝よりもその副溝から溶媒和するためにより多くの自由エネルギーがかかることを示すことによって例示される。
【００７５】
グランドカノニカルアンサンブルシミュレーションは、一般に、分子を周期的なシミュレーションセルに入れ、パラメータＢ（これは、自由エネルギーの表現である）を、実験的に決定された密度を達成するような様式で設定し、キャビティバイアス法（Ｍｅｚｅｉ，Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓ．６１：５６５−５８２（１９９４）；ＲｅｓａｔおよびＭｅｚｅｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：７４５１−７４５２（１９９４））のような技術を使用して、シミュレーションセルに水分子を挿入し、そしてこのセルから水分子を削除することによって、この分子の周りの潜在的な水和位置をサンプリングし、そしてその試みを、グランドカノニカルアンサンブル確率関数（Ｔｏｌｍａｎ，Ｒ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＳｔａｔｓｔｉｃａｌＭｅｃｈａｎｉｃｓ，Ｄｏｖｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７１））を使用して、メトロポリスモンテカルロ（Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２１：１０８７−１０９２（１９５３））基準に基づいて認容または拒絶することによって、実施される。パラメータＢは、以下のように、過剰の化学ポテンシャルμ’に関連する：Ｂ＝μ’／ｋＴ＋ｌｎ＜Ｎ＞、ここで、ｋは、ボルツマン定数であり、Ｔは、絶対温度であり、そして＜Ｎ＞は、ＯＲＦの分子（これは、ここでは、Ｈ２Ｏである）の平均数である。シミュレートされた化学ポテンシャルのアニーリングの方法において、このシミュレーションは、大きい初期Ｂ値で開始され、その結果、より高い百分率の水の挿入の試みが、認容される。これによって、シミュレーションセルは、水分子で満たされる。高い過剰化学ポテンシャルにおいて、このグランドカノニカルアンサンブルシミュレーションが平衡化された後に、引き続くシミュレーションが、連続的に低下するＢ値で実施される。このようにＢ値を連続的に低下させることによって、シミュレーションセルからバルクの水分子が徐々に除かれる。化学ポテンシャルがさらに「アニーリング」されるので、水分子が容易にセルを離れない点に到達し、これによって、ＤＮＡにより強く影響される水分子（いわゆる「結合水分子」）を同定する。過剰化学ポテンシャルが再び下げられると、最終的に、これらの結合水のいずれかがこのセルを離れ始める。化学ポテンシャルは自由エネルギーであるので、この化学ポテンシャルのシミュレーテッドアニーリングは、異なる結合水分子の結合の異なる自由エネルギーの数的推定を生じる。用語「アニーリング」についての本発明者らの理解が化学ポテンシャルの値に厳密に適用し、そして温度が全てのシミュレーションにおいて一定（例えば、２９８Ｋ）に維持されることが強調されなければならない。全てのシミュレーションにおいて、ＤＮＡが固定されて維持され、水分子がセルの全ての部分全体にわたって添加および消去され、拡張カノニカルモンテカルロが、許容されたグランドカノニカルモンテカルロ工程の間で実行され、そして周期的境界条件が使用された。
【００７６】
この方法の例示として、ｄ（ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ）２についての化学ポテンシャルのシミュレーテッドアニーリングを実行し、Ｂ＝１．０で初めて、−２６まで３７の増分で下げ、２，０００，０００キャビティのバイアスグランドカノニカルアンサンブルモンテカルロ工程を各Ｂ値について実行した。Ｂ＝−６でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、１１２０個の結合水分子を有する。Ｂ＝−８でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、５３３個の水分子を結合した。Ｂ＝−９でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、３９０個の結合水分子を有する。Ｂ＝１１でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、２１５個の結合水分子を有する。この進行の最も際立った特徴は、ＤＮＡの主溝および副溝の差示的水和である。Ｂ＝６のシミュレーションは、ＤＮＡが本質的に不均一に溶媒和していることを示す。Ｂ＝−８でのシミュレーションは、２Ｂ単位で化学ポテンシャルを下げると、非バルク抽出水の大部分が、主溝に由来するが一方、副溝は、ほとんど影響を受けないままである。化学ポテンシャルをアニーリングするとさらに（Ｂ＝−９）、依然として、副溝を十分に水和させたままであるが、他方、主溝は、ほとんどはぎ取られる。Ｂをなおさらに低下させる（Ｂ＝−１１）と、主溝および副溝の両方からほとんど全ての水分子を除去する。化学ポテンシャルの関数としてのＤＮＡの水和の定量は、近似分析によって計算された（Ｍｅｈｒｏｔｒａ  ａｎｄ  Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：４２８７（１９８０）；近似分析についての異なるポテンシャルチャージの影響は、Ｍｅｚｅｉ，Ｍｏｌ．Ｓｉｍｕｌ．１：３２７−３３２（１９８８）に記載され、結果を表１に示す：
【００７７】
【表３】
2006519976.tif 000016
【００７８】
Ｂ＝−６とすると、主溝および副溝の第１水和殻（ラジカル分布関数の第１の最小値の位置によって規定される）は、匹敵する密度を有する（それぞれ、０．０１２および０．０１３）。その一方で、副溝の第２水和殻は、主溝の密度の２倍を有する。Ｂ＝−８とすると、その水和の差は、副溝で極めて顕著になる（第１殻および第２殻の水和密度は、それぞれ、主溝の２．５倍以上および５倍以上である）。Ｂ＝−１１とすると、その主溝および副溝の水和密度は、再び等しくなる。なぜなら、過剰な化学ポテンシャルのこの値では、両方の溝は、本質的に取り除かれて露出される。
【００７９】
ＤＮＡの主溝および副溝の差次的水和傾向を例示すると、コンピューター使用としては厳しくない（１回のアニーリングスケジュールを実施するためのＣＰＵ時間が３日および１回の近接分析（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施するためのＣＰＵ時間が３日（ボリュームエレメントの計算は、ＣＰＵ集約的であり得る。近接分析に対するボリュームエレメント計算の効果は、化学ポテンシャルのアニーリングのシミュレーションを使用して、ＳＧＩ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅに関してＭｅｚｅｉおよびＢｅｖｅｒｉｄｇｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｐａｃｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６），ｐｐ．２１−４７）に記載される）。なぜなら、化学ポテンシャルの大まかな「冷却」スケジュールしか必要としないからである。その化学ポテンシャルは、自由エネルギーであるので、非常に細かい冷却スケジュールが、そのＤＮＡの２つの異なる官能基またはさらに２つの異なる原子の水和自由エネルギー差を定量的に予測するために使用され得る。同じＢ値で脱溶媒和化（ｄｅｓｏｌｖａｔｅ）する２つの原子は、類似の溶媒和自由エネルギーを有するか、または代わりに、より細かい冷却スケジュールがその差異を解明することを要する。本明細書で使用されるモデル系は、２２の負電荷を有し、ナトリウム対イオンを有さないイオン性ＤＮＡからなることに注意すべきである。その副溝の優先的な水和について本明細書で示される知見は、Ｘ線結晶学的研究およびＮＭＲ研究からの結果に非常によく対応する。副溝において水分子がより強く結合することのあり得る理由としては、以下が挙げられ得る：リン酸基の電荷列が高密度であること。立体障害的拘束、および特異的な水−水相互作用、水−ＤＮＡ相互作用。
【００８０】
タンパク質上にある、水に対して強く結合する領域は、ＯＲＦ結合から排除されている領域である。従って、水によって占有されていないそのタンパク質上の残りの部位は、良好なＯＲＦ結合のための候補である。
【００８１】
(アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子）
本発明の方法によって同定される候補生物活性剤は、問題の高分子へのそれらの結合を評価するために試験され得る。その高分子が多くの生物学的機能（疾患状態を含む）を担う場合、その高分子の機能を刺激または阻害する化合物を同定するスクリーニング法を考案することは、それ故に望ましい。従って、さらなる局面において、本発明は、このような高分子の機能を刺激または阻害する化合物を同定する、化合物スクリーニングの方法を提供する。一般に、アゴニストまたはアンタゴニストは、疾患について治療目的および予防目的で使用され得る。化合物は、種々の供給源（例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然生成物の混合物）から同定され得る。
【００８２】
スクリーニング法は、その高分子への、またはその高分子を有する細胞もしくは膜への候補化合物の結合を簡単に測定し得る。その高分子は、シミュレーション方法において使用される高分子の改変体（例えば、そのシミュレーションにおいて同定された結合部位を保持するフラグメントまたは組換え合成方法をより実践的にするために使用される融合タンパク質）であり得る。そのスクリーニング法は、標識された競合因子（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）との競合を包含し得る。さらに、これらのスクリーニング法は、その候補化合物が、その高分子の活性化または阻害によって生成されるシグナルを生じるか否かを、その高分子を含む細胞に適した検出系を使用して試験し得る。活性化のインヒビターは、一般に、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、その候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に対して与える効果が観察される。さらに、そのスクリーニング法は、簡便なことには、候補化合物と、高分子を含む溶液とを混合する工程、その混合物中の高分子活性を測定する工程、およびその混合物の活性を、標準物質に対して比較する工程を包含し得る。
【００８３】
本発明はまた、高分子の作用（高分子のそれ自体との会合または別の高分子との会合を含む）を増強する化合物（アゴニスト）またはブロックする化合物（アンタゴニスト）を同定する、化合物スクリーニングの方法を提供する。そのスクリーニング法は、高スループット技術を包含し得る。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、合成反応混合物、細胞区画（例えば、膜、細胞エンベロープ（ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）または細胞壁）、またはこれらのいずれかの調製物（これらは、高分子および標識された基質またはこのようなポリペプチドのリガンドを含む）は、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下でインキュベートされる。その候補分子がその高分子を作動する能力またはその高分子と拮抗する能力は、標識されたリガンドの結合の減少または基質からの生成物の生成の減少において示される。必要なく結合する（すなわち、高分子の効果を誘導することがない）分子は、良好なアンタゴニストである可能性が最も高い。十分に結合し、場合に応じて、例えば、基質からの生成物生成速度を増大するか、シグナル伝達を増大するか、または化学物質チャネル活性を増大するは、アゴニストである。基質からの（場合に応じて）生成物の生成速度または生成レベル、シグナル伝達、または化学物質チャネル活性の検出は、レセプター系を使用して高められ得る。この点に関して有用であり得るレセプター系としては、生成物に変換される比色標識基質、高分子活性の変化に応答性のレポーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で引用される全ての刊行物および参考文献（特許および特許出願が挙げられるが、これらに限定されない）は、各個々の刊行物または参考文献が、十分に示されているとして、本明細書中に参考として援用されることが具体的かつ個々に示されるかのように、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。本願で優先権主張している任意の特許出願はまた、刊行物および参考文献に関して上記で記載される様式で、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００８４】
本発明は、好ましい実施形態に重きが置かれて記載されているものの、好ましいデバイスおよび方法における変形例が使用され得ること、ならびに本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは別なように実施され得ると解釈されることは、当業者に明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲内に包含される全ての改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１Ａは、解かれた結晶構造を示す。他方、図１Ｂは、配置されたグリッドとともにその構造を表示した。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、エラスターゼの結晶学的な解析結果に適用した本発明の方法を表示する。この方法は、そのＯＲＦとしてメタノールを使用して例示され得る。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、相対的に低いＢ値でのシミュレーションの後でエラスターゼに結合している数個のＯＲＦについての結果の合わせたものを示す。ここで、図３Ｂにおける結果は、これらの結合したＯＲＦのクラスタを同定するためにより分けたものである。図３Ｃは、強力な水結合部位を取り除いた後に残った図３Ｂの２つのクラスタを示す。そして、図３Ｄは、別のＯＲＦまでその分析を拡張した後に残った１つのクラスタを示す。図３Ｅは、なおさらなるＯＲＦまで拡張した分析を示す。図３Ｆのパネルでは、共結晶の結果に対してシミュレーションの結果を比較する。
【図４】図４Ａには、エラスターゼおよび既知のリガンドを用いた６つの共結晶実験のデータから抽出したアミド結合部位が示される。図４Ｂには、本発明のシミュレーション法によって決定された最も親和性の高いアミド結合部位のクラスタである。図４Ｃには、図４ＢのアミドＯＲＦとともにそのクラスタの近傍にあるが２番目に高い親和性結合値でシミュレーションに現れるアミドを加えたものである。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂにおいて、エラスターゼインヒビターの共結晶が、本明細書に記載の方法によって得られたデータと比較される。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、結晶学的データによって示されるような（図６Ａ）リガンドへの結合に関与するエラスターゼの表面、および本明細書中に記載される方法を用いて得られる解によって示されるような（図６Ｂ）リガンドへの結合に関与するエラスターゼの表面を示す。
【図７】図７は、相対的に強い水の結合を同定することを補助するために使用され得る、水が高分子に結合するタイプの滴定の概略図を示す。
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【図７】
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【国際調査報告】
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