(57)【要約】本発明は、それが生成されて可溶化された微生物の発酵ブロス又はホモジネートから所望の異種ポリペプチドを生成するための方法を開示する。本方法は、ポリペプチドの大部分が可溶性を維持する条件下においてブロス又はホモジネートに有効量の６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン乳酸塩（乳酸エタクリジン）溶液を添加することにより宿主細胞の不純物を沈降させること、及び所望のポリペプチドをブロス又はホモジネートから分離することを含む。また、乳酸エタクリジン及びポリペプチドを含むブロス又はホモジネートも開示する。
2006517415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の異種ポリペプチドを、それが生成されて可溶化された微生物発酵ブロス又はホモジネートから精製する方法であって、ポリペプチドの大部分が可溶性のまま維持されるような条件下でブロス又はホモジネートに有効量の乳酸エタクリジン溶液を添加することにより宿主細胞不純物を沈降させ、所望のポリペプチドをブロス又はホモジネートから分離することを含む方法。
【請求項２】
ブロス又はホモジネートが酵母又は原核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロス又はホモジネートが細菌に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ブロス又はホモジネートが真正細菌に由来する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ブロス又はホモジネートがグラム陰性細菌に由来する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ブロス又はホモジネートが大腸菌に由来する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドがホモジネートから分離される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドのｐＩが、宿主細胞不純物に含まれる宿主細胞の平均ｐＩよりも高い、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドのｐＩが少なくとも約７である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが抗体である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドがヒト化抗体である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが完全長抗体である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが抗体断片である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが軽鎖を有する抗体断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドがκ軽鎖を有する抗体断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦ（ａｂ’）２−ロイシンジッパー融合体である、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドがＦ（ａｂ’）２である、請求項１４ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗組織因子、２Ｃ４、抗Ｈｅｒ−２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０、或いは抗ＣＤ１１ａ抗体又は抗体断片である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗組織因子Ｆ（ａｂ’）２、完全長抗組織因子抗体、又は抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１ないし１１のいずれか１項又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
乳酸エタクリジンの濃度が約０．１〜５重量％／容積である、請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
乳酸エタクリジンの濃度が約０．４〜５重量％／容積である、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
乳酸エタクリジンの濃度が約０．６〜５重量％／容積である、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの伝導率が約１〜１５ｍＳである、請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートのｐＨが約５〜９である、請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートのｐＨが約６〜９である、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度を室温〜約７０℃とする、請求項１ないし２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度を約１〜６０分間室温〜約６５℃に保つ、請求項１ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度を約１〜６０分間約５０〜６５℃に保つ、請求項１ないし２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
遠心分離又は濾過により分離を行う、請求項１ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ブロス又はホモジネートから分離した後、クロマトグラフィー又は濾過により更にポリペプチドを精製する、請求項１ないし３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
乳酸エタクリジンの添加に先立って、ポリペプチドを溶解性断片に製造する、請求項１ないし３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが非溶解性であり、乳酸エタクリジンの添加に先立って可溶化剤に接触させることによりポリペプチドを溶解する、請求項１ないし３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
乳酸エタクリジン及び細胞に対して異種性のポリペプチドを含む微生物細胞発酵ブロス又はホモジネート。
【請求項３５】
細菌細胞に由来する、請求項３４に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項３６】
大腸菌に由来する、請求項３４又は３５に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項３７】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項３４ないし３６のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項３８】
ポリペプチドが抗体又は抗体断片である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項３９】
ポリペプチドがＦ（ａｂ’）２である、請求項３４ないし３８のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項４０】
ポリペプチドが、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗組織因子、２Ｃ４、抗Ｈｅｒ−２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０、或いは抗ＣＤ１１ａ抗体である、請求項３４ないし３８のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項４１】
ポリペプチドが、抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗組織因子Ｆ（ａｂ’）２、完全長抗組織因子抗体、又は抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３４ないし３８のいずれか１項又は請求項４０に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項４２】
乳酸エタクリジンの濃度が約０．１〜５重量％／容積である、請求項３４ないし４１のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
【請求項４３】
ポリペプチドがブロス又はホモジネートに溶解性である、請求項３４ないし４２のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、微生物発酵ブロス又はホモジネートから対象のポリペプチドを生成する工程に関する。具体的には、ブロス又はホモジネートに沈降剤を導入し、例えばタンパク質、ＤＮＡ、及び細胞片の除去を行う。
【０００２】
２．関連技術の説明
組換え技術の出現により、現在適切に形質転換した宿主細胞内に高いレベルのタンパク質を生成することができる。結果として、組換えにより生成したタンパク質を、速やかに、確実に、且つ効率よく回収できる方法に対する需要が高まっている。通常、タンパク質は、哺乳動物、昆虫、真菌、及び細菌の細胞系等の細胞を、対象のタンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドを挿入することによりタンパク質を生成するように操作したものを培養することにより生成される。使用する細胞系は生きてきる生物体であるので、通常動物血清の調製により供給されるような、糖、アミノ酸及び成長因子を含む複合成長培地を与えなければならない。細胞に与えた化合物の混合体、及び細胞自体の副産物から、ヒトの治療に使用するのに十分な純度まで所望のタンパク質を分離することは、困難な課題である。
細胞片からタンパク質を精製する手順は、第一に、タンパク質の発現部位に依存する。タンパク質には、細胞から周辺の成長培地へ直接分泌されるものと、細胞内で生成されるものがある。哺乳動物に細胞内で生成されるポリペプチドの精製の仕組みは、他の種類の宿主細胞に生成されるポリペプチドの同仕組みよりずっと容易である。哺乳動物はポリペプチドを搬出するので、成長培地からそのようなポリペプチドを回収することができる。成長培地において、ポリペプチドは比較的純粋な形態である。しかしながら、非哺乳動物、例えば菌類又は大腸菌等の細胞内にポリペプチドを生成した場合、ポリペプチドは細胞内又は細胞膜周辺腔で回収される（Kipriyanov及びLittle, Molecular Biotechnology, 12: 173-201 (1999); Skerra及びPluckthun, Science, 240: 1038-1040 (1988)）。よって、細胞溶解等の抽出法によりタンパク質を細胞から細胞外培地中に放出しなければならない。そのような破壊により、細胞の内容全体がホモジネート中へと放出され、それに加えて小さすぎることにより除去が困難な細胞成分分画が生成される。これらは通常差動遠心分離又は濾過により除去される。
【０００３】
一般に、細胞溶解は、均質化又はヘッドミル等の機械的破壊技術を用いて行われる。対象のタンパク質は通常効率的に遊離されるが、そのような技術には複数の欠点がある（Engler, Protein Purification Process Engineering, Harrison編, 37-55 (1994)）。処理の間にしばしば温度が上昇し、タンパク質の不活性化が起こる場合がある。さらに、結果として得られる懸濁液が幅広いスペクトルの汚染タンパク質、核酸及び多糖類を含む。核酸及び多糖類により溶液の粘度が増大し、その結果その後行われる遠心分離、交流式濾過、又はクロマトグラフィーによる処理が困難となる可能性がある。これら汚染物質が対象のタンパク質と複雑に関連することにより、生成プロセスが複雑化し、その結果十分な産生量が得られない場合がある。
よって、細胞内タンパク質を放出するのにもっと感度の良い手段を用いることにより、後続の処理が容易になる。細胞を透過性にするため、及び／又は細胞内タンパク質を抽出するための技術がこれまでに複数報告されている。これらの方法には、溶媒、洗浄剤、カオトロピック剤、抗体、酵素、及びキレート剤の使用により、細胞透過性を増強すること、及び／又は抽出を促進することが含まれている。細胞成長の間に発酵培地に特定の化合物、例えばグリシンを加えることにより、特定の細胞内酵素の放出を促進することもまた報告されている。最後に、凍結融解処理又は浸透圧ショックにより細胞内タンパク質のサブセットを放出することも示されている。
【０００４】
しかしながら、これら技術は必ずしも全ての細胞内微生物タンパクに適用できるわけではなく、いずれも大量処理への応用に限界を有し、及び／又はその他の欠点を有している。例えば、トルエン及びクロロホルム等の溶媒が細胞内タンパク質の放出を促進するが、これらの物質は毒性及び／又は発癌性を有することが知られている（Windholtz等., The Merck Index 10th Edition: 300及び1364 (1983)）。ＳＤＳのようなイオン性洗浄剤は、単離されたタンパク質を不可逆的に変性させてしまうことが多い。非イオン性洗浄剤により通常変性は起こらないが、回収されたタンパク質がしばしば洗浄剤ミセルと関連し、洗浄剤を含まない細胞を得るためには追加の処理が必要となる。尿素及び塩酸グアジニンなどのカオトロピック剤は、完全な放出に必要な濃度において変性を起こす場合があり、その効果は培地の増殖相に依存する。リゾチームの使用は比較的穏やかなタンパク質遊離手段であるが、その原価が比較的高いこと、及びその後酵素試薬から対象タンパク質を生成する必要があることから、その使用には限界がある。加えて、リゾチーム又はトルエン抽出等の他の可溶化／放出技術を強化するためにしばしば用いられるキレート剤は、宿主タンパク質を非特異的に放出するという欠点を有している。
他のタンパク質放出法も欠点を有している。例えば、浸透圧ショックでは、細胞は浸透圧の高い培地に置かれ、回収され、その後浸透圧の低い緩衝液中に置かれることになり、他の抽出手段に対して処理段階が多くなる（Moir等, Separation Processes in Biotechnology, Asenjo eds: 67-94 (1990)）か、又は低温の液体を大量に扱うことが必要になる。この方法のこのような特徴は、大量処理にとって魅力的でない。
【０００５】
凍結融解処理も細胞内タンパク質を放出するが、複数回の処理では産量が低下することが多いか、又はそれにより追加の処理が必要となる。さらに、他の抽出手段と比較して、細胞ペースト凍結により生じる追加処理の手間は小さくない。
最後に、グリシン等の試薬を発酵段階で添加することにより、細胞外培地へのタンパク質の放出を促進している（Aristidou等, Biotechnology Letters 15: 331-336 (1993)）。複数の細胞内タンパク質が部分的に放出されることが報告されているが、この方法では発酵と放出戦略が直接結びついていなければならず、その後、場合によっては複雑な細胞外ブロスから対象のタンパク質を分離しなければならない。
【０００６】
宿主細胞から対象のポリペプチドが放出されたら、他の細胞成分からそれを精製しなければならない。残念ながら、細胞溶解等の多くの抽出方法は、タンパク質を宿主細胞のプロテアーゼによる分解の危険に曝すだけでなく、結果として得られた懸濁液に含まれる他の要素からのタンパク質の分離をさらに困難にする。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リン脂質、及びリポ多糖（ＬＰＳ）等の負の電荷を持つ分子の存在により、陰イオン交換クロマトグラフィー（Sassenfeld, TIBTECH, 8: 88-93 (1990); Spears, Biotechnology, vol. 3--Bioprocessing, Rehm eds:40-51 (1993)）、及び／又は、硫酸プロタミン（Kelley等, Bioseparation, 1: 333-349 (1991) ; Scopes, Protein Purification Principles and Practice, 2nd edition, Cantor eds., pp. 21-71 (1987)）、硫酸ストレプトマイシン（Wang 等, eds, Fermentation and Enzyme Technology: 253-256 (1979)）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Kelley等、上掲; Sassenfeld、上掲; Cumming等, Bioseparation, 6: 17-23 (1996); Jendrisak, The use of polyethyleneimine in protein purification. Protein purification: micro to macro, ed. Alan R., Liss, Inc, 75-97 (1987); Salt等, Enzyme and Microbial Technology, 17: 107-113 (1995)）等のポリカチオンによる沈降、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／硫酸又はＰＥＧ／デキストラン等の非混和性ポリマー系を用いた水性二相抽出（Kelley等、上掲; Strandberg等, Process Biochemistry 26: 225-234 (1991)）の使用が必要となる。
別法では、硫酸アンモニウム又は塩化カリウム等の中性塩（Wheelwright, Protein Purification: Design and Scale up of Downstream Processing: 87-98 (1991); Englard等, Methods in Enzymology Volume 182, Deutscher eds.: 285-300 (1990)）及び／又はＰＥＧ又は硫酸デキストラン（Wang等、上掲; Wheelwright上掲）等のポリマーの添加により、対象のタンパク質を非タンパク質性ポリアニオン性混入物から沈殿させることができる。対象のタンパク質が正の電荷を有すると、そこに存在する負の電荷を有するあらゆる分子に結合する傾向を有するので、タンパク質の精製は殆ど不可能である。
【０００７】
一般に、研究者はまず上述のような細分化段階を行って、対象のタンパク質から不要なポリアニオンを分離する。残念ながら、初めに行ういずれの分離法も、特に製薬用試薬に使用される場合、重大な欠点を有している。例えば、細菌性可溶化液中に見られる大量の非タンパク質性ポリアニオン性混入物には、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂の結合能を低下させる傾向がある。加えて、ポリアニオンの樹脂への強い結合により、再生プロトコルの効果が失われることがままある（Spears、上掲）。最後に、タンパク質結合に有利なイオン強度の低い条件は、ばらばらなポリアニオン−タンパク質間の相互作用下では効果を失い、その結果分離が十分に行われない（Scopes, Protein Purification Principles and Practice, 3rd edition, Cantor eds., p. 171 (1994)）。硫酸プロタミンの調製は、プロテアーゼ及びウィルス汚染の懸念から困難である。さらに、この試薬の使用により、不要なタンパク質沈殿が起こりうる（Scopes, Protein Purification Principles and Practice, 2nd edition, Cantor eds., 21-71 (1987)）。
プロセス試薬として抗生物質を使用することには不安があるので、製薬用タンパク質の処理に一般的に硫酸ストレプトマイシンは使用されていない（Scawen等, Handbook of Enzyme Biotechnology 2nd edition, Wiseman eds.: 15-53 (1985)）。ＰＥＩの調製は、発癌性が疑われる様々な量のエチレンイミン単量体によって汚染されることが多い（(Scawen等、上掲)。ＰＥＩはまた、多くのクロマトグラフィー樹脂に不可逆的に結合する性質を有しており、それによりそれらの効果、及びＰＥＩ後の清澄に利用可能なクロマトグラフィー樹脂の数に限界がある。一般に、水性二相抽出システムは予想が難しく、また対象のタンパク質を適切な水性相に移動させる条件を決定するのに経験的手法が必要となることが多い（Kelley等、上掲）。
対象のタンパク質を特異的に沈降させる技術は、しばしば沈殿物に非タンパク質性の混入物が捕捉され、分離の効果が失われるという結果を伴う（Scopes、上掲; Wheelwright、上掲）。
【０００８】
タンパク質の回収及び精製について開示した特許文献の例は以下の通りである。
米国特許第5,665,866号には、正確に折り畳まれ、アセンブルされた形態の可溶性の抗体を得る方法が開示されている。この方法は、プロセス中適切な時点で実用温度を３４℃から６０℃に上げることにより、その後行われる正確に折り畳まれてアセンブルされた可溶性の抗体の分離を、他の抗体に関連する物質を実質的に何も使用せずに行うステップを含む。
【０００９】
米国特許第5,760,189号には、溶液にキレート剤を添加することにより、負の電荷を有する非タンパク質性の物質を含め、大腸菌から溶液中にチオレドキシン様融合タンパク質を放出し、該溶液に二価陽イオン／アルコール溶液を添加して、タンパク質を含む第一の可溶性の分画と、不要な混入物を含む第一の不溶性分画とを形成することにより、溶液中の負の電荷を有する非タンパク質性物質を沈降させる方法が開示されている。場合によっては、キレート剤添加前の温度はキレート剤添加後の温度より低くてもよい。二価陽イオンには、例えば、マグネシウム、マンガン、及びカルシウムの１つ又は組合せが含まれる。
米国特許第5,714,583号には、溶液中の因子ＩＸの精製法が開示されており、この方法では、因子ＩＸを含む溶液を陽イオン交換樹脂に適用し、樹脂から因子ＩＸを溶出するのには少し足りない伝導率を有する溶液で陽イオン交換樹脂を洗浄し、第１の溶出剤を用いて陽イオン交換樹脂を抽出して第１の溶出液を作成し、該溶出液をヘパリン又はヘパリン様（例えば負の電荷を有する基質）樹脂に適用し、第２の溶出液を用いてヘパリン又はヘパリン様樹脂を溶出して第２の溶出液を作成し、第２の溶出液をヒドロキシアパタイト樹脂に適用し、次いで第３の溶出液を用いてヒドロキシアパタイト樹脂を溶出し、精製された因子ＩＸを含む第３の溶出液を形成する。
【００１０】
米国特許第6,322,997号には、ポリペプチドの回収方法が開示されており、この方法では、ポリペプチドを含む組成物を、該ポリペプチドに結合して修飾する試薬に接触させ、その場合試薬を固相に固定し、次いで該組成物中の試薬の電荷と反対の電荷を有するフィルタに組成物を通すことにより、組成物から浸出した試薬を除去する。
米国特許第6,214,984号には、抗体精製のための低ｐＨ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＬＰＨＩＣ）が開示されている。特にこの特許文献は混入物から抗体を精製する方法を提供するもので、抗体と混入物とを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに入れ、約２．５〜４．５のｐＨを有する緩衝液を用いてカラムから抗体を溶出する。通常、カラムに入れられる混合物のｐＨは溶出緩衝液のｐＨとほぼ同じである。
【００１１】
米国特許第6,121,428は、ポリペプチドの回収方法を提供するものであり、この方法では、ポリペプチドを含む組成物を、このポリペプチドに結合して修飾する試薬に接触させ、その場合試薬を固相に固定し、次いで該組成物中の試薬の電荷と反対の電荷を有するフィルタに組成物を通すことにより、組成物から浸出した試薬を除去する。
米国特許第5,641,870号は、抗体の精製方法を提供するもので、抗体と混入物を含む混合物を場合によっては低い塩濃度でＬＰＨＩＣにかける。抗体はそれに結合しない分画でカラムから溶出される。抽出段階において、室温で、５ｍＭのＥＤＴＡ及び予めエタノールに溶解させた２０ｍＭの４，４’−ＤＴＰを含む、ｐＨ６．０の２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液に、凍らせた細胞ペレットを再度懸濁する（緩衝液３リットル／細胞ペレット１ｋｇ）。懸濁された細胞は、Mantin Gaulinホモジナイザーを通る通路により５５００〜６５００ＰＳＩで２つに分けられる。ホモジネートはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）により０．２５％（ｖ／ｖ）に調節され、同容量の２〜８℃の精製水により希釈される。次いで希釈したホモジネートの遠心分離を行う。上清に抗体断片が見られるようになる。
【００１２】
従来、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はヒト血清及び血漿から精製されていた（Putnam, ed., The Plasma Proteins, vol. 1 (Academic Press, 1975)）。精製プロセスは１又は複数のステップを含むことが多い。ＩｇＧの回収に最も広く使用される沈降スキームは、コーンによる分画である（Cohn 等, J. Amer. Chem. Soc., 72: 465 (1950)）。しかしながら、他の沈降技術も報告されている（Niederauer及びGlatz, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, v. 47 (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992); Steinberg及びHershberger, Biochim. et Biophys. Acta, 342: 195-206 (1974)）。芳香及び陽イオン性の高い染料である６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン乳酸塩（ＵＳＡＮ名及び本明細書で乳酸エタクリジンと呼び、またETHODIN（登録商標）又はRIVANOL（登録商標）としても知られる）を用いて血漿からＩｇＧを精製する先駆的な作業がHorsjsi及びSmetana, Acta Med. Scand., 155: 65 (1956)により報告された。続く１０年間に、６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン乳酸塩が持つ、血漿及び成長培地等の生物学的材料からのＩｇＧ及び他のタンパク質精製能が多数の文献に示された（Miller, Nature, 184: 450 (1959); Steinbuch及びNiewiarowski, Nature, 186: 87 (1960); Neurath及びBrunner, Experientia, 25: 668 (1969)）。乳酸エタクリジンの使用によるその他の出所からの抗体及びその他のタンパク質の回収が報告されている。例えば、Tchernov等, J. Biotechnol., 69: 69-73 (1999); 1982年7月28日公開のSU 944580; Franek 及びDolnikova, Biotech-Forum-Eur, 7: 468-470 (1990); 1987年12月23日公開のEP 250288; 1987年8月20日公開のDE3604947; Rothwell等, Anal. Biochem., 149: 197-201 (1985); Lutsik及びAntonyuk, Biokhimiya, 47: 1710-1715 (1982); 並びに、Aizenman等, Mikrobiol-Zh., 44: 69-72 (1982)を参照のこと。
微生物からポリペプチドを回収する第一段階は、多くの場合、細胞及び細胞片等の固体物質の除去に関与している。所望の産物を、それと特異的に相互作用する条件培地中の成分から分離する必要性を認識することが重要である。対象のタンパク質が正の電荷を有する場合、そこに存在する負の電荷を有するあらゆる分子に結合するので、従来の方法によりタンパク質の精製を行うことは非常に困難である。この段階で、未精製の微生物抽出物、例えば大腸菌ホモジネートからそれに混入している可溶性タンパク質を追加的に除去するには、単純にその後でクロマトグラフィーを行う。このような追加的除去は工業規模の生産に非常に有益であり、これによりクロマトグラフィーのカラムの大きさと生産時間を縮減できる。
【００１３】
発明の概要
本発明は、請求の範囲に記載の精製法に関する。
特に、一態様において、本発明は、それが生成されて可溶化された微生物の発酵ブロス又はホモジネートから、所望の異種ポリペプチドを生成するための方法を提供し、本方法は、ポリペプチドの大部分が可溶性を維持する条件下においてブロス又はホモジネートに有効量の６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン乳酸塩（乳酸エタクリジン）溶液を添加することにより宿主細胞の不純物を沈降させること、及び所望のポリペプチドをブロス又はホモジネートから分離することを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、乳酸エタクリジン及び細胞と異種のポリペプチドを含む微生物細胞発酵ブロス又はホモジネートを提供する。
沈降剤として乳酸エタクリジンを添加することにより、思いがけず宿主タンパク質を含む宿主片が劇的に除去された。この方法では、宿主タンパク質の大部分が細胞片と共に沈降物として回収され、ポリペプチドが精製された上清中に回収される。乳酸エタクリジンの使用によって精製された抽出物の純度が向上したことにより、カラムに必要な樹脂又はクロマトグラフィー培地の容積が小さくなり、よってその後必要とされる精製の規模を縮減することができる。また、クロマトグラフィーの工程の一部を省略することができるので、処理時間とコストが縮減できる。加えて、本明細書の方法により安定した供給原料が得られ、また本方法は中程度のｐＨで実施できる。
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
「微生物発酵ブロス又はホモジネート」という表現は、シェークフラスコや発酵槽といった使用する培養容器を問わず、培養され、栄養分を消費する、酵母、菌類、及び細菌等の原核生物を含む微生物由来のブロス、ペースト、又は抽出物を意味する。好ましくは、ブロス又はホモジネートは酵母又は原核生物に由来する。さらに好ましくは、ブロス又はホモジネートは細菌に由来する。本発明ではホモジネートを選択した。溶液の粘度が非常に高い場合、細胞を回収してそれらを再度懸濁することが好ましい場合があるが、そうでない場合は発酵槽から直接得られたホモジネートを使用することが好ましい。ブロス又はホモジネートの成分には、細胞片、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれる。よって、本発明で乳酸を添加することにより、宿主細胞タンパク質などを選択的に沈降させることができ、乳酸を使用しない場合と比較して精製が向上する。
「ポリペプチドの大部分が可溶性を維持する条件下」という表現は、標的のポリペプチドの大部分がブロス又はホモジネート中で沈降しないような量、温度及び伝導率でブロス又はホモジネートに乳酸エタクリジンを添加することをいう。好ましくは、そのような条件により約６０％超、さらに好ましくは約７０％超、さらに好ましくは約７５％超、さらに好ましくは約８０％超、さらに好ましくは約８５％超、さらに好ましくは約８５％超、さらに好ましくは約９０％超、及び最も好ましくは約９５％超のポリペプチドが沈降しない。この溶解度は、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー（ＨＰＡＣ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥと高性能のアフィニティークロマトグラフィー（ＨＰＡＣ）との組合せといった、適切なアッセイによって測定する。アッセイは、使用する宿主細胞の種類及び生産されるポリペプチドに応じて選択する。
【００１６】
本発明の目的のための「細菌」には、真正細菌及び古細菌が含まれる。これらのうち好ましいのは真性細菌であり、グラム陽性及びグラム陰性細菌が含まれる。グラム陰性細菌の方が好ましい。好ましい種類の細菌は腸内細菌科である。腸内細菌科に属する細菌として、大腸菌、エンテロバクター、Erwinia、クエルブシラ属、プロテウス属、サルモネラ、セラチア属、及び赤痢菌族が挙げられる。その他の適切な細菌の種類には、アゾトバクタ、シュードモナス属、根粒菌、Vitreoscilla、及びParacoccusが含まれる。本発明では大腸菌を選択した。適切な大腸菌宿主は、大腸菌W3110 （ATCC 27,325）、大腸菌294 （ATCC 31,446）、大腸菌B、及び大腸菌X1776 （ATCC 31,537）を含む。これらの例は、限定のためでなく説明を目的として挙げたのであり、W3110が好ましい。上述の細菌のいずれかの突然変異細胞も使用できる。当然ながら、細菌の細胞中のレプリコンの再製可能性を考慮して適切な細菌を選択しなければならない。例えば、pBR322、pBR325、pACYC177、又はpKN410等の周知の血漿を使用して複製を供給するとき、大腸菌、セラチア属、又はサルモネラ種を宿主として適切に使用することができる。適切な細菌宿主細胞の例に関しては、さらに後述を参照されたい。
本明細書で使用する「細胞」、「細胞系」、「菌株」及び「細胞培養」という表現は、互いに交換可能に使用され、そのような名称は全て子孫を含んでいる。従って、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、形質移入回数には関係無く、それに由来する初代の対象細胞及び培養物を含んでいる。また、故意又は偶然の変異のために、全ての産物のＤＮＡ含量が正確に一致しないかもしれないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫が含まれる。明確な規定が意図される場合には、それは文脈から明らかになるだろう。
【００１７】
本明細書で使用する「ポリペプチド」とは、約１０より多いアミノ酸を有する任意の細胞源由来のペプチド及びタンパク質を指す。「異種の」ポリペプチドは、大腸菌によって産生されるヒトタンパク質のような、利用される宿主細胞にとって外来のポリペプチドである。異種ポリペプチドは原核生物のものでも真核生物のものでもよいが、好ましくは真核生物のものであり、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトのものである。好ましくは、組換え技術によって生成されたものであるか、組換えポリペプチドである。
ポリペプチドは発酵ブロス又はホモジネート中で生成及び可溶化される。つまり、ポリペプチドはそのようなブロス又はホモジネート中においてつくられ、生成の結果既に可溶性の分画であっても、還元剤（ジチオスレイトール又はβメルカトルエタノール等）の存在化又は不在化で、カオトロープ（例えば尿素又はグアニジン）又は洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））等の可溶化剤で処理するか、そのような可溶化剤に接触させることにより可溶化される不溶性の分画であるか、不溶性の形態、又は相を有してもよい。本明細書で使用する場合、「可溶性」、「可溶化された」、「可溶化」、或いは「溶解」とは、遠心分離の後でポリペプチドが固体断片ではなく上清にあることを意味する。沈降又は可溶性の度合いは、上述のような適切なアッセイにより決定できる。
【００１８】
哺乳類ポリペプチドの例は、例えば、レニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子及びそれらの変異体、例えばＲＥＴＥＶＡＳＥ（登録商標）及びＴＮＫＡＳＥ（登録商標）；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；２Ｃ４等のＥｒｂＢ２ドメインに対する抗体（WO 01/00245; ハイブリドーマATCC HB-12697）であって、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン内の領域に結合するもの（例えば、ＥｒｂＢ２の概ね残基２２〜残基５８４の領域内における１又は複数の残基）、エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；DNase；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）などの栄養因子、又はＮＧＦ等の神経成長因子；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）等のカルジオトロフィン（心臓肥大因子）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５を含むＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ等のインターフェロン；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；抗−ＨＥＲ−２抗体；Ａｐｏ２リガンド；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；及び上に列挙した任意のポリペプチドの断片などの分子を含む。
【００１９】
本発明に好ましいポリペプチドには、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２Ｃ４、組織因子、抗組織因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ−２、へレグリン、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、ＶＥＧＦ及び、それらのレセプター及び抗体、例えばｒｈｕＦａｂ  Ｖ２及びＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、成長ホルモンとその変異体、例えばｈＧＨ、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン放出タンパク質（ＧＨＲＰ）、ＬＩＶ−１（EP1,263,780）、ＴＲＡＩＬ、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）及びそれに対する抗体、ＴＮＦレセプター及びその抗体、ＴＮＦレセプターＩｇＧ、ＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲＡＦｓ）及びそのインヒビター、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ  Ｂドメイン、インターフェロンγ等のインターフェロン、ＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、抗ＴＧＦ−β等の抗ＴＧＦ、アクチビン、インヒビン、抗アクチビン、抗インヒビン、組織プラスミノーゲン活性化因子及びｔ−ＰＡ、ＲＥＴＥＰＬＡＳＥ（登録商法）、及びＴＮＫａｓｅ等のそれらの変異体、抗Ｆａｓ抗体、Ａｐｏ−２リガンド；Ａｐｏ−２リガンドインヒビター；Ａｐｏ−２レセプター、Ａｐｏ−３、アポトーシス因子、Ｃｅｄ−４、ＤｃＲ３、細胞死受容体及びアゴニスト抗体（ＤＲ４、ＤＲ５）、リンホトキシン（ＬＴ）、プロラクチン、プロラクチンレセプター、ＳＯＢタンパク質、ＷＩＳＰ（ｗｎｔ誘発性分泌タンパク質）、神経毒−３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び抗ＮＧＦ、ＤＮａｓｅ、肝炎抗原、単純疱疹抗原、レプチン、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２等のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、及びそれらの結合タンパク質及びＩＧＦＢＰ−１−ＩＧＦＢＰ−６等のレセプター、インスリン、ＦＧＦ−１７等の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｔｏｌｌタンパク質、ＴＩＥリガンド、ＣＤ４０及び抗ＣＤ４０、イムノアドヘシン、サブチリシン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−８、ＩＬ−９等のインターロイキン、及びそれらに対する抗体、及び前立腺特異性癌抗原（ＰＳＣＡ）が含まれる。
【００２０】
ＨＥＲ２に結合する抗体の例としては、４Ｄ５、７Ｃ２、７Ｆ３及び２Ｃ４、並びにそれらのヒト化変異体を挙げることができ、そのようなヒト化変異体は、米国特許第5,821,337号の表３に記載のｈｕＭａｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、並びにWO01/00245に記載のヒト化２Ｃ４突然変異番号５６０、５６１、５６２、５６８、５６９、５７０、５７１、５７４又は５６８６９を含む。７Ｃ２及び７Ｆ３、並びにそれらのヒト化変異体はWO98/17797に開示されている。
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には、現在「リツキシマブ」（「ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）」と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」（米国特許第5,736,137号）；「Ｙ２Ｂ８」と命名されたイットリウム−[９０]−標識２Ｂ８マウス抗体（米国特許第5,736,137号）；随意で１３１Ｉにより標識されて「１３１Ｉ−Ｂ１」抗体（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））を生成するマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（米国特許第5,595,721号）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Press等, Blood, 69(2): 584-591 (1987)）；及び国際インターロイキン分類ワークショップ（International Leukocyte Typing Workshop）から入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３，Ｂ−Ｃ１又はＮＵ−Ｂ２（Valentine等, In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))が含まれる。
【００２１】
比較的好ましいポリペプチドは、２Ｃ４、抗組織因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ−２、ヘレグリン、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、ｒｈｕＦａｂ  Ｖ２等の抗ＶＥＧＦ、ｈＧＨ、ＧＨＲＰ、ＬＩＶ−１、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦに対する抗体及びＴＮＦレセプター及び関連抗体、ＴＲＡＦのインヒビター、ＴＮＦレセプターＩｇＧ、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ  Ｂドメイン、インターフェロンγ、ＴＧＦβ及び抗ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、抗アクチビン、抗インヒビン、ｔ−ＰＡ、ＴＮＫａｓｅ、抗Ｆａｓ抗体、Ａｐｏ−２リガンド；Ａｐｏ−２リガンドインヒビター；Ａｐｏ−２レセプター、Ａｐｏ−３、ＤｃＲ３、細胞死受容体及びアゴニスト抗体（ＤＲ４、ＤＲ５）、リンホトキシン（ＬＴ）、プロラクチン、プロラクチンレセプター、ＷＩＳＰ、抗ＮＧＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＤＮａｓｅ、ＧＨＲＰ、肝炎抗原、単純ヘルペス抗原、レプチン、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ１−６、インスリン、ＦＧＦ−１７、Ｔｏｌｌタンパク質、ＴＩＥリガンド、ＣＤ４０、イムノアドヘシン、サブチリシン、ＨＧＦ、並びにＴＰＯである。
その中でさらに好ましいポリペプチドは、２ＣＦ、抗組織因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ−２、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、ｒｈｕＦａｂ  Ｖ２等の抗ＶＥＧＦ、ｈＧＨ、ＬＩＶ−１、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦに対する抗体及びＴＮＦレセプター及び関連抗体、ＴＮＦレセプターＩｇＧ、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ  Ｂドメイン、インターフェロンγ、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、抗アクチビン、抗インヒビン、ｔ−ＰＡ、ＴＮＫａｓｅ、Ａｐｏ−２リガンド；Ａｐｏ−２リガンドインヒビター；Ａｐｏ−２レセプター、Ａｐｏ−３、ＤｃＲ３、細胞死受容体及びアゴニスト抗体（ＤＲ４、ＤＲ５）、ＷＩＳＰ、ＴＲＡＦのインヒビター、抗ＮＧＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、抗ＴＧＦ、ＤＮａｓｅ、ＧＨＲＰ、肝炎抗原、単純疱疹抗原、レプチン、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ１−６、インスリン、ＦＧＦ−１７、Ｔｏｌｌタンパク質、ＴＩＥリガンド、抗ＣＤ４０、ＨＧＦ、並びにＴＰＯである。
【００２２】
特に好ましいポリペプチドは組換えポリペプチドであり、さらに好ましくはモノクローナル抗体及びヒト化抗体を含む抗体である。そのような抗体は完全長抗体又は抗体断片でもよい。これらには、例えば、特に好ましいポリペプチドである２Ｃ４、抗組織因子Ｆａｂ’２及び完全長、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ−２、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８  Ｆａｂ’２及び完全長、抗ＶＥＧＦ完全長及びｒｈｕＦａｂ  Ｖ２、ＬＩＶ−１、ＤＲ４、ＤＲ５、及びＴＲＡＩＬが含まれる。
さらに好ましくは、抗体は抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗組織因子、２Ｃ４、抗Ｈｅｒ−２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０、又は抗ＣＤ１１ａ抗体である。ポリペプチドの定義に含まれる抗体断片は軽鎖を有することが好ましく、さらに好ましくはκ軽鎖を有する。そのような好ましい断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２−ロイシンジッパー（ＬＺ）融合物が含まれ、最も好ましくはＦ（ａｂ’）２である。最も好ましい抗体は抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗組織因子Ｆ（ａｂ’）２、完全長抗組織因子抗体、及び抗ＶＥＧＦ抗体である。
【００２３】
本明細書で「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、所望の生物学的活性を示す限り、特に完全な抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多重特異性（例えば）二重特異性的抗体、及び抗体断片を含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、つまり、集団を含む個々の抗体（群）は、少量存在するであろう自然発生し得る突然変異を別にすれば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位を志向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基を認識する。それらの特性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入せずに合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の特徴を示し、何か特定の方法で生産されたと解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256：495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができるか、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は、また、Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)及びMarks等, J. Mol.Biol., 222：581-597(1991)等に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００２４】
ここで、モノクローナル抗体は特に、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導されたか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたか又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれらの抗体の断片を含む（米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851-6855 (1984)）。 本明細書で対象となるキメラ抗体には、ヒト定常領域配列及び非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくは完全な抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２５】
「完全な」抗体は、抗原−結合可変部位、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）でもそのアミノ酸配列変異体でもよい。好ましくは、完全な抗体は１又は複数のエフェクター機能を有する。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体を持つＦｃ領域）に帰因するこれらの生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞障害活性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション(例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ)、等を含む。
【００２６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な抗体は異なる「クラス」に分類できる。五つの免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと命名された重鎖を有している。γ及びαのクラスは更に、ＣＨ配列中の比較的マイナーな差異及び機能に基づいて、サブクラスに分類される。例えば、ヒトは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスを発現する。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造がよく知られている。
「抗体依存性細胞媒介細胞障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)を発現する非特異性細胞障害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応に関する。ＡＤＣＣを媒介する第１の細胞であるＮＫ細胞はＦｃＲIIIのみを発現するのに対し、単球はＦｃＩ、ＦｃII及びＦｃIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の４６４ページの表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第5,500,362号又は5,821,337号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。このアッセイで使用できるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。他に、又はさらに対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:652-656(1998)に記載されている様な哺乳動物のモデルでインビボの評価がされうる。
【００２７】
「ヒトエフェクター細胞」は、一つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は、少なくともＦＣＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然ソースより単離されてもよい；例えばここにおいて記載の血液又はＰＢＭＣ類である。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２８】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２９】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３０】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, （Springer-Verlag, New York 1994）, pp. 269-315のPluckthunを参照のこと。抗-ＥｒｂＢ２抗体ｓｃＦｖ断片はWO93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号に記載されている。
【００３１】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、EP404,097；ＷＯ93/11161；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」形とは、非非と免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に、又はドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものを含んでなる。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmanら, Nature 332, 323-329(1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)を参照。
【００３２】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びタンパク質様又は他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「ロイシンジッパー」とは、複数の反復アミノ酸を有するペプチド（多くの場合約２０〜４０のアミノ酸残基長を有する）であり、反復するアミノ酸の７個ごとにロイシン残基が現れる。このようなロイシンジッパー配列は、両親媒性のαヘリックスを形成し、そのロイシン残基は疎水性の側に並んで二量体を形成している。本明細書におけるロイシンジッパーの例は、ヘテロ二量体（例えば二重特異性抗体）の形成に使用できるＦｏｓ−Ｊｕｎロイシンジッパー（O'Shea等, Science, 245: 646 (1989))、ホモ二量体（例えば単一特異性抗体）の形成に使用できる酵母由来のＧＣＮ１４ロイシンジッパー（Landschulz等, Science, 240: 1759-1764 (1988)）、及びＣ／ＥＢＰ及びｃ−ｍｙｃ等、他のＤＮＡ結合タンパク質に見られるロイシンジッパー、並びにそれらの変異体を含む。
【００３３】
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な対照配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーターは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３４】
ポリペプチドの「回収」という用語は、通常、産生された細胞から遊離したポリペプチドを得ることを意味する。
「宿主細胞不純物」とは、発酵ブロス又はホモジネート中の、ＤＮＡ及び細胞片等の混入物を含む宿主細胞及びその他の生体分子の不純物を意味する。
【００３５】
発明の実行モード
本発明の一態様は、所望の異種ポリペプチドを、それを生成及び可溶化したブロス又はホモジネートから生成する方法を提供する。ポリペプチドは生成の結果既に可溶性の分画であってもよく、不溶性であり（例えば不溶性の分画、相又は形態で生成され）、よってポリペプチドを溶解させるための接触又は処理を要するものでもよい。ポリペプチドが不溶性に生成される場合、乳酸エタクリジンを添加する前に、（上述のような）可溶化剤に曝すか接触させる。例えばそのような作用剤を不溶性ポリペプチドを含む分画に添加する。好ましくは、ポリペプチドは既に可溶性の分画である。本発明の方法は、ブロス又はホモジネートに対し、有効量の乳酸エタクリジンを添加することによりブロス又はホモジネート中に含まれる宿主不純物を沈降させることを含む。そのような添加は、大部分のポリペプチドがその可溶性を維持するような条件下で行う。次の段階では、細胞片、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含め、所望のポリペプチドをブロス又はホモジネートから分離する。
乳酸エタクリジンにより沈殿する大部分の宿主タンパク質は負の電荷を有し、一方標的のポリペプチドは正の電荷を有するので、沈殿した宿主タンパク質の上清中に回収されるように、標的ポリペプチドのｐＩは宿主細胞不純物に含まれる宿主タンパク質の平均ｐＩより高いことが好ましい。そのような平均ｐＩは、宿主タンパク質の２−Ｄゲルにより決定することができ、その場合のｐＩの幅は例えば約７．５〜５．０であり、平均は６．２５である。別法では、等電点電気泳動と同様に、等電点分離法（２−Ｄゲルの１次元）のみを用いて、平均ｐＩの決定、及びアミノ酸成分による計算を行うことができる。ポリペプチドのｐＩは、約７以上、好ましくは約７から１０であることがさらに好ましい。
使用に好ましいポリペプチドは上記のように定められている。
【００３６】
使用する乳酸エタクリジンの濃度は、例えば、溶液中に存在する宿主細胞不純物の大部分の表面上にある溶液中の負の電荷の量によって決定する。よって、乳酸エタクリジンの濃度は、少なくとも溶液中のＤＮＡ及び宿主タンパク質の濃度等の宿主細胞不純物の量に依存する。ホモジネート中の宿主タンパク質及びＤＮＡの濃度が大きい程、大量の乳酸エタクリジンが必要となる。したがって、乳酸エタクリジンと複合し、よって沈殿する負の電荷成分が大きい程、沈殿を最大にするために大量の乳酸エタクリジンが必要となる。乳酸エタクリジンの好ましい濃度は、一般に約０．１重量％／容積より大きい。さらに好ましくは、乳酸エタクリジンの濃度は、約０．１〜５、さらには約０．４〜５、そして最も好ましくは約０．６〜５重量％／容積である。
一般に、沈殿を起こす際に溶液の伝導率が小さい程、細胞片及びＤＮＡのポリペプチドの生成は効率的に行われる。伝導率は、例えば、ホモジネート又はブロス中の塩の量、或いは、水又は他の適切な溶媒を用いてホモジネート又はブロスを希釈することにより制御することができる。好ましくは、乳酸エタクリジン添加後のブロス又はホモジネートの伝導率は約１６ミリシーメンス（ｍＳ）未満、さらに好ましくは１〜１５ｍＳ、さらに好ましくは約１〜１０ｍＳ、最も好ましくは約１〜５ｍＳである。
【００３７】
沈殿を行っている間の伝導率は、少なくとも部分的に存在する塩の種類に依存する。ハロゲン化物は（例えば塩化化合物又はブロミド）好ましい陰イオンではないが、それらが存在する場合は、乳酸エタクリジン添加前の溶液中に約１００ｍＭ未満、乳酸エタクリジン添加後は約５０ｍＭ未満の濃度で存在することが好ましい。本発明に使用する塩の例をいくつか挙げるとすると、緩衝塩、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、酢酸塩、クエン酸塩が含まれる。存在する塩の濃度は乳酸エタクリジンを沈殿させる量より大きくてはいけない。正確な量は、主に塩の種類、及び塩と乳酸エタクリジンとの化学量論に依存し、化学量論の下限が限界である。つまり、下限は、乳酸エタクリジンより塩が多いことを意味する。
乳酸エタクリジン添加後のブロス又はホモジネートのｐＨは、例えば、ポリペプチドのｐＩ、ポリペプチドの負の表面電荷の量、溶液中の宿主細胞不純物の量、及び乳酸エタクリジンの濃度に依存する。好ましくは、ｐＨは、ポリペプチドのｐＩ以下である。通常、ｐＨは約４〜１０であるが、乳酸エタクリジンの電荷はこのｐＨより上で小さくなるので、宿主細胞の不純物を効率的に沈殿させるためには、乳酸エタクリジン添加後のブロス又はホモジネートのｐＨは約９以下であることが好ましく、好ましい範囲は約４〜９である。さらに好ましくは、乳酸エタクリジン添加後のブロス又はホモジネートのｐＨは、約５〜９、さらに好ましくは約６〜９である。ポリペプチドの負の表面電荷が大きくなる程この範囲内のｐＨは低下し、そのようなポリペプチドに好ましい範囲はｐＨ約６〜７である。
【００３８】
乳酸エタクリジン添加後、随意でブロス又はホモジネートを一定の時間に亘り高温でインキュベートする。温度を上げるかどうか、及びインキュベートを行う時間の長さは、対象ポリペプチドの修理、プロセス中そのような時間に亘り高温に曝した場合、起こるとすればどのような変化がポリペプチドに現れるか等、多くの要因によって決定する。例えば、抗組織因子Ｆ（ａｂ’）２精製のためには高温が好ましいが、完全長抗体には熱を用いないか又は、温度を約２５度以下に保つことが望ましい。これらの要因に留意すると、乳酸エタクリジン添加後のブロス又はホモジネートの温度は、室温〜約７０℃、さらに好ましくは室温〜約６５℃に約１〜６０分の間維持する。温度を上げる必要がある場合に好ましいのは、約５０〜６５℃で約１〜６０分維持することである。
別の態様では、本発明は、乳酸エタクリジン及び異種ポリペプチドを含む微生物細胞由来の発酵ブロス又はホモジネートである物質からなる組成物を提供する。好ましくはポリペプチドはブロス又はホモジネートに溶解される。細胞、ポリペプチド、濃度、及びブロス又はホモジネートの条件は上述の通りである。ポリペプチドの溶解度は、上述のようなアッセイ等の適切なアッセイにより決定できる。培養パラメータを使用し、常套的な方法でポリペプチドの生産を行う。常套的な方法の例を後述する。
【００３９】
Ａ．核酸の選択及びその修飾
本発明のポリペプチド、例えば抗体は、いずれの供給源（例えば完全な抗体の消化切断）からも生産できるが、好ましくは組換え技術により作成する。核酸が対象のポリペプチドをコードするならば、対象のポリペプチドをコードする核酸は、任意のソースに由来するRNA、cDNA、又はゲノムDNAが適当である。微生物宿主中で、異種性のポリペプチド（その変異体を含む）の発現に適切な核酸の選択方法は周知である。適切な核酸を選択し、微生物細胞培養物中に非抗体ポリペプチドを調製する方法が、当技術分野でよく知られている。
モノクローナル抗体を産生する場合、モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましいソースとして役に立つ。一度単離されると、DNAは発現ベクター中に配置され、次いで、微生物宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を行うためにここで示す細菌宿主細胞へ形質転換させる。抗体をコードするDNAの細菌中での組換体発現に関する総説には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)が含まれる。
【００４０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、超可変領域配列をヒト化抗体の対応配列と置換することによりWinter及び共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には超可変領域残基及びおそらく幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性の軽減のためには、ヒト化抗体を作成するために使用するヒトの可変ドメイン、軽鎖及び重鎖両方の選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」に従うと、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる（Sims等, J. Immunol., 151：2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196：901(1987)）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285(1992)；Presta等, J. Immunol., 151：2623 (1993)）。
【００４１】
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、超可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、免疫結合体を調製するために一又は複数の標的薬剤(類)と随意に結合している抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は無傷抗体、例えば無傷IgG1抗体であってもよい。
【００４２】
Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収され、F(ab')2断片（Carter等, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）を形成するために化学的にカップルされる。他のアプローチによると、F(ab')2断片は組換体宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、熟達した技術者にとっては明白である。他の実施態様において、選択された抗体は、単鎖Fv断片（scFv）（WO93/16185；米国特許第5,571,894号及び5,587,458号）である。また、抗体断片は、例えば、米国特許第5,641,870号中に記載されているような「直鎖抗体」であってもよい。このような直鎖抗体断片は単一特異的又は二重特異的であってもよい。
二重特異的抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的に結合する抗体である。例示的な二重特異的抗体は、Dkk-1タンパク質の２つの異なるエピトープに結合してもよい。二重特異的抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、F(ab')2二重特異的抗体）として調製することができる。
【００４３】
異なるアプローチによると、望ましい結合特異性を有する抗体の可変ドメインは（抗体−抗原結合部位）免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合される。融合は、好ましくは、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。軽鎖との結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（CH1）を有し、少なくとも融合の片方に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、必要ならば免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、安定細菌性宿主生物体に同時形質転換する。このことは、構築物中で用いられる３つのポリペプチド鎖の等しくない割合が至適な収量を提供する場合、実施態様中、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整する点に多大なる柔軟性を提供する。しかし、等しい割合の少なくとも２つのポリペプチドの発現により高い収量を生み出すか、その割合が特に有意でない場合、ある発現ベクターにおいて２又は全３つのポリペプチド鎖に対するコード配列を挿入する事は可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００４４】
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常領域のＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4,676,980号)、及びHIV感染の治療のために提案された(国際公開第91/00360号、同92/200373号、及び欧州特許第03089号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第4,676,980号等に開示されている。
【００４５】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
さらに、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収され、二重特異的抗体を形成するために化学的にカップリングされ得る（Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)）。
【００４６】
組換体の細胞培養物から直接二重特異的抗体断片を調製し、単離するための種々の方法も、記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生されている（Kostelny等, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの産生に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている（Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)）。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)）。
【００４７】
ポリペプチド変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、これらに限られないが、天然源からの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又はオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、又は該ポリペプチドの初期調製された変異体又は非変異体種のカセット突然変異誘発を含む。
エフェクター機能に関する本発明の抗体を修飾することは、例えばFcレセプター結合性を増強するために、望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することで達成される。あるいは、又は付加的にシステイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。
【００４８】
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されたようにして、抗体(特に抗体断片)にサルベージレセプター結合エピトープが導入される。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインヴィボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
ここでは、抗体の他の修飾が考慮される。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。
【００４９】
Ｂ．複製可能なベクターへの核酸の挿入
異種の核酸（例えば、cDNA又はゲノムDNA）は、適切なプロモーターのコントロールの下、微生物中における発現のための複製可能なベクターへ適切に挿入される。多くのベクターは、かかる目的のために利用可能であり、適当なベクターの選択は、主として挿入されるべき核酸のサイズ、及びベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、それが適合する特定の宿主細胞に依存する種々の成分を含む。特定の宿主タイプに依存し、一般にベクター成分には、限定はしないが、以下の一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、プロモーター、及び転写終結配列。
一般には、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、微生物宿主との関連で用いられる。そのベクターは、通常、複製部位、並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を保持する。例えば、大腸菌は、典型的には、E.coli種由来のプラスミドであるpBR322を使って形質転換される（例えば、Bolivar等、Gene, 2: 95 (1977)参照）。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、よって形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。そのpBR322プラスミド、もしくは他の微生物プラスミド又はファージもまた、選択マーカー遺伝子の発現のために宿主によって使用され得るプロモーターを含むか、又は含むよう改変される。
【００５０】
（i）シグナル配列成分
ここで対象となるポリペプチドをコードするDNAは、直接発現されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合体としても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入されたポリペプチドDNAの一部であってもよい。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。
天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識しない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばｌａｍＢ、ｏｍｐＦ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換できる。酵母分泌については、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダ−、α因子リーダー（酵母菌属及びkluyveromyce因子リーダーを含む。kluyveromyce因子リーダーについては米国特許第5,010,182号を参照のこと）、又は酸性ホスファターゼリーダー、白体グルコアミラーゼリーダー（1990年4月4日公開のEP362,179）、又は1990年11月15日公開のWO90/13646に開示されているシグナルである。
【００５１】
（ii）複製開始点成分
発現ベクターは、一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は様々な微生物に対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大腸菌などの大部分のグラム陰性細菌に好適である。
【００５２】
（iii）選択遺伝子成分
通常、発現ベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地中で生存できない。この選択可能マーカーは、この発明で利用され、定義されるような遺伝学的マーカーとは区別される。典型的な選択遺伝子は、(a)例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質又はその他の毒素に耐性を付与し、(b)遺伝学的マーカーの存在によって誘導される欠陥以外の栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバチラス菌に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。この場合、対象の核酸で首尾よく形質転換したこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するポリペプチドを産生する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン（Southern等, J. Molec. Appl. Genet, 1:327 (1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan等, Science, 209:1422 (1980)）又はハイグロマイシン（Sugden等, Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)）が使用される。上述の３つの例は、各々、適当な薬剤であるG418又はネオマイシン（ジェネティシン）、xgpt（ミコフェノール酸）、又はハイグロマイシンに対する耐性を伝達するために、真核生物でのコントロールの下、細菌性遺伝子を利用する。
【００５３】
（iv)プロモーター成分
対象のポリペプチドを産生するための発現ベクターは、宿主生物によって認識され、対象のポリペプチドをコードする核酸と作用可能に連結される適切なプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)）、アラビノースプロモータシステム（Guzman等, J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776）、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)）を含む。しかし、他の既知の細菌性プロモーターも適当である。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それにより、任意の必要な制限酵素サイトを供給するためのリンカー又はアダプターを用いて、当業者は対象のポリペプチドをコードするDNAにそれらを作用可能に連結する（Siebenlist等, Cell, 20:269 (1980)）ことが可能となる。
また、細菌のシステムで使用されるプロモーターも、通常、対象のポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガルノ(S.D.)配列を有する。該プロモーターは、制限酵素による切断により細菌由来のDNAから取り外すことができ、所望のDNAを含むベクター中へ挿入することができる。
【００５４】
酵母への使用に適切なプロモーターは当技術分野において周知である。酵母宿主での使用に好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzeman等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)）又は他の糖分解酵素（Hess等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌による発現に使用するのに適したベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００５５】
（v）ベクターの構築及び解析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を切断させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する解析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC31446)又は他の株を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析し、及び／又はSanger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法により、又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499（1980）の方法により配列決定を行った。
【００５６】
Ｃ．宿主細胞の選択及び形質転換
本発明においてベクターにＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞は、原核生物及び真菌細胞を含むあらゆる微生物細胞であり、酵母を含む。本発明の目的に適した原核生物には、上述のようなバクテリア、好ましくは真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体が含まれる。例として、大腸菌などの腸内細菌科、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、Erwinia、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチアmarcescans、及び赤痢菌属、並びに枯草菌（B. subtilis）やB. licheniformis等の桿菌（例えば、1989年4月12日公開のDD266,710に開示されたB. licheniformis 41P）、緑膿菌等のシュードモナス属、及びストレプトマイシンが挙げられる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌294(ATCC31,446)であるが、他の菌株、例えば大腸菌B, 大腸菌X1776(ATCC31,537)及び大腸菌W3110(ATCC27,325)も適している。これらの例は制限ではなく説明を目的としている。上述の菌株のうちいずれかの突然変異細胞もまた、開始宿主として使用することができ、この開始宿主はその後変異して、本発明で必要とされる少なくとも最少の遺伝子型を含む。
大腸菌株W3110は、組換えＤＮＡ産物の発酵に広く用いられる宿主株であるので、好ましい親大腸菌宿主である。親宿主として使用される開始大腸菌宿主の例を、その遺伝子型と共に、下記の表に示す。
【００５７】
2006517415.tif 000003
2006517415.tif 000004
【００５８】
また、36F8を作製する際の中間体、即ち、27B4（米国特許第5,304,472号）及び35E7（27B4より増殖の優れた自発的温度耐性単離コロニー）も適当である。さらに適当な株は、米国特許第4,946,783号、1990年8月7日発行中に開示されている変異体ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株である。
上記の株は、親株の染色体を組み込むこと、又は後述の実施例に記載する技術を含む他の技術により生成できる。
完全長抗体は、2002年8月8日公開のWO02/061090に記載の技術に従って大腸菌内で作成できる。
【００５９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ポリペプチドコード化ベクターのための適切な発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290:140 （1981）；1985年5月2日発行のEP139,383）；クルベロミセス宿主(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号；Fleer等, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)）、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574；Louvencourt等, J. Bacteriol., 737（1983））、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ ２４,１７８）、クルベロミセスワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Van den Berg等, Bio/Technology, 8:135 (1990)）、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP402,226）；ピチア・パストリス(Pichia pastoris)（EP183,070；Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28:265-278 （1988））；カンジダ；トリコデル・マレーシア(Trichoderma reesia)（EP244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 （1979））；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（1990年10月31日発行のEP394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO91/00357）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Balance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 （1983）；Tilburn等, Gene, 26:205-221 （1983）；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 （1984））、及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4:475-479 （1985））が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００６０】
ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ挿入する。好ましくは、宿主細胞を上述の発現ベクターで形質転換し、種々のプロモーターを誘導するのに適するように変更された通常の栄養培地中で培養することにより達成される。
使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそれらの細胞に適する標準的な技術を用いて行われる。Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)のセクション1.82に記載されるように、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理は、一般的に、原核細胞又は実質的に細胞壁障壁を含む他の細胞に用いられる。形質転換のための他の方法では、Chung及びMiller, Nucleic Acids Res., 16:3580 (1988)に記載されるように、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯが用いられる。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンを用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。
【００６１】
Ｄ．宿主細胞の培養
本発明のポリペプチドを生産するのに使用される原核細胞は、当技術分野で既知の培地において成長させたもので、選択された宿主細胞の培養に適しており、一般的にSambrook等、上掲に記載の培地を含む。細菌に適した培地には、ＡＰ５培地、栄養ブロス、Luria-Bertani（ＬＢ）ブロス、Neidhardt's最少培地、及びＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．最少又は完全培地に必要な栄養を補ったものが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、培地は発現ベクターの構造に基づいて選択された選択剤も含み、よって発現ベクターを含む原核細胞を選択的に成長させることができる。例えば、アンピシリン抵抗性の遺伝子を発現する細胞を成長させるために、培地にアンピシリンを加える。炭素、窒素、及び無機リン酸塩の供給源に加え、必要な補充物は、単独で、或いは、別の補充物又は複合窒素源等の培地と組み合わせて導入され、適切な濃度で含有される。場合によっては、培養培地は、グルタチオン、システイン、システアミン、チオグリコール酸、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択された１又は複数の還元剤を含んでよい。
適切な培地の例は、米国特許第5,304,472号及び同第5,342,763号に見ることができる。Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸塩制限培地は、３．５７ｇの（ＮＨ４）２（ＳＯ４）、０．７１ｇのＮａＣｉｔｒａｔｅ−２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５，３６ｇの酵母菌抽出物（認証済み）、５．３６ｇのＨｙｃａｓｅＳＦ（登録商標）−Sheffieldからなり、ＫＯＨによりｐＨを７．３に、ＳＱ  Ｈ２Ｏによりｑｓを８７２ｍｌに調整したものをオートクレーブしてから５５℃に冷却し、１１０ｍｌの１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）、１１ｍｌの５０％グルコース、７ｍｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４を補ったものである。次いでカルベニシリンを５０ｕｇ／ｍｌの濃度で導入培地に添加してもよい。
【００６２】
原核宿主細胞を適切な温度で培養する。例えば、大腸菌の成長に好ましい温度は約２０〜約３９℃、さらに好ましくは約２５℃〜約３７℃、さらに好ましくは約３０℃である。
アルカリホスフェートプロモーターが使用される場合、本発明の対象のポリペプチドの生産のために使用される大腸菌細胞は、Sambrook等, 上掲中に一般的に記載されるようにアルカリホスフェートプロモーターが部分的に又は完全に誘導され得る適切な培地中で培養される。必要とされる培養は、無機リン酸塩の非存在下又はリン酸塩欠乏レベル下では、決して起こらない。第一に、培地は無機リン酸塩をタンパク質合成の誘導レベル以上であり、細菌の増殖に十分な量の無機リン酸塩を含む。細胞が増殖し、リン酸塩を利用する場合、培地中のリン酸塩レベルを低下させ、それによりポリペプチドの合成の誘導を引き起こす。
プロモーターが、起こるべき誘導に関し誘導可能なプロモーターである場合、典型的に細胞はある最適な濃度、例えば、高い細胞濃度過程を用い、点誘導が開始される（例えば、誘導因子の添加、培地成分の除去により）約200のA550が達成されるまで培養され、対象のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導する。
【００６３】
必要ないかなる補充物も、単独で、或いは別の補充物又は複合窒素源等の培地と組み合わせて導入し、当業者に既知の適切な濃度で含めることができる。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜９とすることができる。大腸菌については、ｐＨは約６．８〜約７．４であることが好ましく、さらに好ましくは約７．０である。
酵母菌の培養に使用できる選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ-Ｕｒａ）である。
【００６４】
Ｅ．発現検出
遺伝子の発現は、ここでポリペプチドの配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来のサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識が使用され、最も一般的なものは、放射性同位体、特に３２Ｐである。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチドを用いるなど、他の技術も使用してよい。次いで、ビオチンはアビジンまたは抗体と結合するための部位として機能し、広範な種々の標識、例えば放射性核種、蛍光、酵素などで標識されてよい。あるいは、タンパク質の検出のためにアッセイ又はゲルが用いられてもよい。
【００６５】
Ｆ．ポリペプチドの精製
組換え技術を使用する場合、本発明のポリペプチドは、細胞内に、又は細胞膜周辺腔に生産することができる。ポリペプチドが細胞内生産されるときは、第一工程として、宿主細胞であれ溶解断片であれ、粒状細片を（均質化の過程で生じたもの）、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去し、細胞ブロス又はホモジネートを生成する。
次いで、本発明に従って、上述のような条件の下、乳酸エタクリジンを用いた沈降により、ホモジネート又はブロスから上述のような細胞不純物を取り除き、結果として得られる混合物を処理して不溶性の対象ポリペプチドを回収する。
ブロス又はホモジネートからの標的ポリペプチドの分離は、遠心分離や濾過等の当技術分野で周知の手段を含め、任意の適切な手段により行うことができる。好ましくは、分離は、遠心分離、又は例えば約３００キロダルトン〜１ミクロンのフィルタを用いた接線流式濾過によって行う。
【００６６】
ブロス又はホモジネートから分離したポリペプチドは、限外濾過／ダイアフィルトレーション又は接線流式濾過等の濾過、又はクロマトグラフィーを含め、任意の既知の手段により精製できる。特に、単独で又は組合せて行われる以下の手順は、適切な精製の手順の例であり、ポリペプチドの種類に応じて特異的な方法を使用する。それらは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、水性二相分離（ＡＴＰＳ）、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、シリカ上のクロマトグラフィー、イオン交換樹脂、例としてＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）及びＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降、限外濾過／ダイアフィルトレーション、接線流式濾過、及び例えばSEPHADEX（登録商標）G-75を用いたゲル濾過である。
例えば、タンパク質の回収プロセスの一部として、ポリペプチドに結合するか、又はポリペプチドを変質させる固定した試薬にポリペプチドを曝す。これにより、ポリペプチドに対し、抗体等のポリペプチドに特異的に結合する固定化試薬により抗体が捕捉されるアフィニティークロマトグラフィーが行われ、不純物はアフィニティークロマトグラフィーのカラムを通過する。次いで、ポリペプチドと固定化試薬の結合を解くような条件に変更することにより、カラムからポリペプチドを溶出することができる。固定化試薬はポリペプチドを変質させるプロテアーゼ等の酵素でもよい（Sahni等, Anal. Biochem., 193: 178-185 (1991) 及びVoyksner等, Anal. Biochem., 188: 72-81 (1990)）。
【００６７】
別の種類の精製方法は濾過である。流体からの細かい粒子の混入物の濾過は、様々な多孔性フィルタにより行われており、そのようなフィルタを混入組成物が通過すると、フィルタにより混入物が捕捉される。混入物の滞留は、機械的な濾過又は電気運動による粒子の捕捉及び吸収により起こる。機械的な濾過では、粒子がそれよりも小さな孔を通過しようとしたときに物理的に捕捉される。電気運動による捕捉のメカニズムでは、粒子が多孔性フィルタの表面に衝突し、短距離引力により表面上に保持される。電気運動による捕捉を行うには、フィルタの表面電荷の特性を変化させるのに電荷変更システムを用いることができる（例えばWO 90/11814参照）。例えば、除去すべき混入物が陰イオン性の場合、陽イオン変化モディファイヤーを用いて、フィルタが混入物を保持するようにフィルタの電荷特性を変化させることができる。
従来の抗体精製手順、例えばゲル濾過又は電気泳動法、透析法、ＨＩＣ、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡSEPHAROSE（登録商標）、プロテインＧ、抗原親和性又は抗ＩｇＧ親和性クロマトグラフィー、均質化、遠心分離濾過による清澄、沈降、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール又はカプリル酸による処理、イオン交換クロマトグラフィー、例えばヒドロキシアパタイト等の樹脂、セラミック−ヒドロキシアパタイト及びBIOGEL HT（登録商標）等、リン酸カルシウムを含む樹脂、及びジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び四級アミノエタン（ＱＡＥ）等、正の電荷を有する成分を有するものを含む陰イオン交換樹脂を用いるもの、例えばQ-SEPHAROSE FAST FLOW（登録商標）樹脂(Pharmacia)、 DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW（登録商標）樹脂、DEAE-TOYOPEARL（登録商標）樹脂、QAE-TOYOPEARL（登録商標）樹脂、POROS-Q（登録商標）樹脂、FRACTOGEL-DMAE（登録商標）樹脂、FRACTOGEL EMD-TMAE（登録商標）樹脂、MATREX CELLUFINE DEAE（登録商標）樹脂等により、モノクローナル抗体を沈殿物から適切に分離することができる。抗体の単離及び精製法については、さらに、Antibodies: A Laboratory Manual"; Harlow 及びLane, eds. (Cold Spring Harbor Laboratories, New York: 1988)を参照されたい。
【００６８】
特定の実施形態では、回収ステップは、ポリペプチドに結合するか、又はポリペプチドを変性する試薬が固定された固相に、可溶化したポリペプチドを曝すことを含む。一実施形態では、固相をカラムに充填し、固定化した試薬によりポリペプチドを捕捉する。別の実施形態では、試薬はポリペプチドを化学的及び／又は物理的に変性するもので、固相に固定化される、つまりカラムに充填されるなどしており、その組成はカラムに通される。例えば、ポリペプチドは、回収プロセスの一部で固定化した試薬によって除去される前駆ドメインを含んでよく、例えば、回収プロセスにおいて固定化されたペプシンにより除去される前駆ポリペプチドはロイシンジッパー二量体化ドメインを有する抗体である。
この実施形態では、ポリペプチド及び浸出した試薬（及び随意で１以上の混入物）を含む組成物を、組成物のｐＨにおいて試薬と反対の電荷を有するフィルタに通し、よって浸出された試薬を組成物から除去する。フィルタは、組成物のｐＨにおいて負の電荷を有する混入物、例えば、酸性プロテアーゼ、プロテインＡ、プロテインＧ又はアフィニティーカラムから浸出し得るその他試薬等を除去するために正の電荷を有することができる。或いは、塩基性プロテアーゼ等、組成物のｐＨにおいて正の電荷を有する混入物を除去するためにフィルタの電荷を負としてもよい。好ましくは、フィルタに通す組成物中の対象ポリペプチドは、ポリペプチドがフィルタにあまり保持されずに通過するような電荷特性を有する。フィルタは、前ステップにおいて処理した流出液と「連続して」配置する（つまり、流出液はフィルタを通って直接流出する）。これは、フィルタをカラム流出液口に直接接続した後、貯蔵タンクに溶出液を回収することによって達成される。使用するフィルタの種類に適した技術を使用してフィルタを再生してもよい。
【００６９】
ＨＩＣは抗体断片の精製にも使用されている。例えば、Inouye等, Protein Engineering, pp. 6, 8及び1018-1019 (1993); Inouye等, Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, 5: 609-616 (1993); Inouye等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 26: 27-39 (1993); Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); 及びRea等, Journal of Cell. Biochem., Suppl. 0, Abstract No. X1-206 (17 Part A), p. 50 (1993)を参照されたい。ＨＩＣカラムは、通常、疎水性リガンド（例えばアルキル基又はアリール基）が結合する基礎となる基質（例えば架橋アガロース又は合成共重合体物質）を有する。多くのＨＩＣカラムが市販されている。例えば、置換度が高いか又は低いフェニルSEPHAROSE 6 FAST FLOW（登録商標）カラム（Pharmacia LKB Biotechnology, AB／スウェーデン）、フェニルSEPHAROSE（登録商標）高性能カラム（Pharmacia LKB Biotechnology, AB／スウェーデン）、オクチルSEPHAROSE（登録商標）高性能カラム（Pharmacia LKB Biotechnology, AB／スウェーデン）、FRACTOGEL（登録商標）EMDプロピル又はＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＥＮＤフェニルカラム（E. Merck／ドイツ）、MACRO-PREP（登録商標）メチル又はMACRO-PREP（登録商標）ｔ−ブチルサポート（BioRad／カリフォルニア）、WP HI-Propyl (C3)（登録商標）カラム（J. T. Baker／ニュージャージー）、及びTOYOPEARL（登録商標）エーテル、フェニル又はブチルカラム（TosoHaas／ペンシルベニア）であるが、これらに限定しない。
バッチ式疎水性クロマトグラフィー基質の例は当技術分野で周知であり、それには、SEPHAROSE（登録商標）、アガロース、又はシリカ等の支持基質にリンクするＣ１８アルキル鎖、例えばブチル、フェニル、又はオクチルSEPHAROSE（登録商標）、又はセルロース又はポリスチレン等のポリマーが含まれる。米国特許第6,214,984号には、抗体及び抗体断片の精製のための低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＬＰＨＩＣ）の使用が開示されている。この方法は、抗体断片、特に正確に折り畳まれ、ジスルフィド結合した抗体断片（例えばＦａｂ断片）を、正確に折り畳まれておらず、及び／又はジスルフィド結合した汚染抗体断片から精製するのに特に有用である。ＬＰＨＩＣに先立ち、好ましくは細胞から調製された抗体組成物を、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製する。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは特定のヒト重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる(Lindmarkら, J.Immunol.Meth.62:1-13[1983])。プロテインＧが全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される(Gussら, EMBO J. 5:1567-1575[1986])。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用することができる。調整穴あきガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼンのように機械的に安定なマトリックスを使用すれば、アガロースの場合よりも速い流速と短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商品名）樹脂(J．T．Baker, ニュージャージー州フィリップスバーグ)が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）)によるクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂(ポリアスパラギン酸カラムなど)によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿のような他のタンパク質精製技術も、回収しようとする抗体によっては利用できる。
【００７０】
Ｇ．ポリペプチドの使用
このようにして回収されたポリペプチドは、製薬的に許容可能な担体に製剤化することができ、そのような分子に既知の様々な診断的用途、治療的用途、又はその他の用途に使用される。例えば、本明細書に開示するポリペプチドは、酵素イムノアッセイ等のイムノアッセイに使用できる。
本明細書に記載の方法を用いて精製されたポリペプチドの治療的な用途についても考慮する。例えば、成長因子又はホルモンを使用して思いのままに成長を促し、また、抗体をワクチンアジュバントとして細胞傷害性の再方向付け（例えば腫瘍細胞を死滅させるため）に使用することができ、よって血餅への血小板溶解薬の送達、腫瘍細胞への免疫毒素の送達、標的部位（例えば腫瘍）における酵素活性化プロドラッグの変換、感染症の治療、又は免疫複合体の細胞表面レセプターへの標的化を行うことができる。
【００７１】
所望の純度を有するポリペプチドを、随意で生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより、凍結乾燥させた固形物又は水溶液の形態で、保存用のポリペプチドの治療製剤が調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版、Osol, A.編(1980)）。
許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他有機塩などのバッファ；アスコルビン酸を含む抗酸化物；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩類形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００７２】
ポリペプチドはまた、コロイド性薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンにおいて、例えばコアセルベーション技術又は界面重合（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）により、マイクロカプセルに調製できる。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
インビボ投与に使用されるポリペプチドは、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜による濾過の前又は後に、凍結乾燥及び再構成することで容易に達成できる。通常抗体は凍結乾燥させた状態、又は溶液の状態で保存される。
【００７３】
治療用ポリペプチド組成物は通常、無菌入り口部を有する容器、例えば静脈内溶液用バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
ポリペプチドの投与経路は、既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、又は病巣内を経路とする注射又は注入、又は後述するような持続放出システムにより行う。ポリペプチドは、輸液により連続的に注入されるか、又は大量瞬時投与される。
【００７４】
持続放出製剤の好適な例は、本発明のポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載されたようなポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer等, 上掲）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。
エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等の重合体は１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化抗体は、長時間体内に残存すると、３７℃で水分に曝されることで、変性又は凝集し、生理活性が喪失したり、免疫原生が変化したりする。使用する機構によって抗体の安定性を得るための合理的な処置が考えられる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ―Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を変更し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリクス組成物を開発することで安定性を確立することができる。
【００７５】
ポリペプチドの持続放出組成物は、リポソーム的に包括されたポリペプチドを含む。抗体を含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、DE 3,218,121、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号、及びEP 102,324等による方法によって調製する。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上コレステロールであり、選択される割合がポリペプチドによる最適な治療法に対して調整された微小（約２００-８００オングストローム）な単ラメラ状のものである。
治療的に用いるのに効果的なポリペプチドの量は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態によって決まる。従って、治療専門家は、治療効果が最大となるように投与量を決定し、投与経路を修正しなければならない。典型的な毎日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ以上である。通常、臨床医は、所望の効果が得られる量に達するまでポリペプチドを投与する。この療法の進行状況は、従来のアッセイにより容易にモニターできる。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例を参照することにより、本発明に対する理解を深めることができる。しかしながら、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載する特許文献及び非特許文献のすべては、参照により本明細書に包含される。
【００７７】
実施例１
材料及び方法
Ａ．プラスミド、形質転換、発酵
１．ｒｈｕＦａｂ’２（ｘＣＤ１８）の生産
ａ．プラスミドの構築
コントロールプラスミドのｐＳ１１３０は、抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２のバイシストロン性の発現のために設計されたもので、Carter等によるBio/Technology, 10:163-167(1992)に記載のベクターに基づいている。この設計によって、単独のｐｈｏＡプロモーターの制御下においてＣ末端ロイシンジッパーを有する軽鎖及び重鎖断片両方について遺伝子の転写が行われる。転写は、重鎖−ロイシンジッパーのコード化配列の下流に位置するλｔ０転写ターミネーターで終了する（Scholtissek及びGrosse, Nucleic Acids Res., 15(7):3185 (1987)）。熱安定性エンテロトキシンＩＩのシグナル配列（ＳＴＩＩ）は各鎖のコード化配列に先行し、周辺質へのポリペプチドの分泌を導く（Lee等、Infect. Immun., 42:264-268(1983; Picken等、Infect. Immun., 42:269-275 (1983))。ロイシンジッパーを重鎖断片のＣ末端端部に付着させ、２つのＦａｂ’アームの二量体化を促した。
２つの分離した翻訳ユニットを包含するデュアルプロモータープラスミドpxCD18-7T3は、重鎖の転写から軽鎖の転写の一時的な分離を可能ならしめる。pS1130の場合、軽鎖はphoAプロモーターのコントロール下にとどまる。しかし、pxCD18-7T3中では、λt0転写終結因子が軽鎖コード化配列の後に配置される。この終結因子の下流に、tacIIプロモーターが重鎖断片／C末端ロイシンジッパーの転写をコントロールするために付加された（DeBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 80:21-25 (1983)）。第二のλt0転写終結因子はこのコード化配列の後に配置される。STIIシグナル配列のサイレントコドン変異は、両鎖の分泌を導くために使用された（Simmons及びYansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996)）。
単一のプロモーターコントロールプラスミドと二重プロモータープラスミドとの簡単な比較を図１に示す。ｐｘＣＤ１８−７Ｔ３の発現カセット配列を図２（配列番号１）に、２つの翻訳単位のアミノ酸配列（配列番号２及び３）をそれぞれ図３Ａ（軽鎖）及び３Ｂ（重鎖）に示す。
【００７８】
ｂ．発酵
発酵に用いた宿主系は、５９Ａ７と命名された大腸菌Ｗ３１１０の派生体であった。５９Ａ７の完全な表現型は、Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ ｐｈｏＡΔＥ１５Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｏＣ  ｄｅｇＰ４１  ｉｌｖＧ２０９６（Ｖａｌｒ）  Δｐｒｃ  ｓｐｒＷ１４８Ｒである。５９Ａ７宿主細胞をｐｘＣＤ１８−７Ｔ３プラスミドを用いて形質転換し、培地から成功した形質転換体を選択して成長させた。追加のプラスミドであるｐＭＳ４２１をｐｘＣＤ１８−７Ｔ３と同時形質転換した。この追加プラスミドｐＭＳ４２１は、ｌａｃＩｑを供給してｔａｃＩＩプロモーターの制御を向上させ、且つスペクチノマイシン及びストレプトマイシン耐性を与えるｐＳＣ１０１に基づくプラスミドである。
１０リットルの発酵毎に、１０〜１５％のＤＭＳＯ中１．５ｍｌの培地を含む単一のバイアルを、０．５ｍｌのテトラサイクリン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）及び１Ｍのリン酸ナトリウム溶液２．５ｍｌを補充した５００ｍｌのＬＢ培地を含む１−Ｌシェークフラスコ中に入れて溶かした。この種培養を３０℃で約１６時間成長させ、次いで１０リットルの発酵槽に播種するのに使用した。
初めに、約４．４ｇのグルコース、１Ｍの硫酸マグネシウム１００ｍｌ、微量要素溶液１０ｍｌ（最終的容量１リットル中、塩酸１００ｍｌ、塩化第二鉄六水化物２７ｇ、硫酸亜鉛七水化物８ｇ、塩化コバルト六水化物７ｇ、モリブデートナトリウム二水化物７ｇ、硫酸銅ペンタ水和物８ｇ、ホウ酸２ｇ、硫酸マンガン一水化物５ｇ）、テトラサイクリン溶液２０ｍｌ（エタノール中５ｍｇ／ｍｌ）、ＦＥＲＭＡＸアジュバント２７（登録商標）（又は何れかの同等な泡止め剤）１０ｍｌ、ＨＣＤ塩１袋（硫酸アンモニウム３７．５ｇ、二塩基性リン酸カリウム１９．５ｇ、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物９．７５ｇ、クエン酸ナトリウム７．５ｇ、一塩基性リン酸カリウム１１．３ｇ）、及びＮＺアミンＡ（タンパク質加水分解産物）２００ｇを含む培地約６．５リットルを発酵槽に入れた。３０度で気流１０ｓｌｐｍで発酵させ、ｐＨを７．０±０．２に調節した（時折この範囲を超える変動があった）。発酵槽内の酸素の移動率を操作するために、発酵槽の後の圧力及び攪拌速度を変更し、それにより細胞呼吸数を調節した。
【００７９】
シェークフラスコの細胞含有培地を用いて発酵槽に播種した後、演算に基づくアルゴリズムを用いて濃縮グルコース溶液を発酵槽に供給し、発酵槽内で培養物を成長させて細胞密度を高めた。また、ｐＨを調節するため、必要に応じて水酸化アンモニウム（５８％溶液）及び硫酸（２４％溶液）を発酵槽に加えた。さらに、場合によっては泡止め剤を加えて発泡を調節した。培養物の細胞密度が約４０  ＯＤ５５０に達したとき、１Ｍの硫酸マグネシウム約１００ｍｌを発酵槽に加えた。これに加えて、培養物が約２０  ＯＤ５５０に達したとき、発酵槽に対し、濃縮塩（水１リットル中硫酸アンモニウム約１０ｇ、二塩基性リン酸カリウム２６ｇ、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物１３ｇ、クエン酸ナトリウム二水和物２ｇ及び一塩基性リン酸カリウム１５ｇ）の供給を２．５ｍｌ／分の速度で開始し、供給量が１２５０ｍｌに達するまで継続した。一般に発酵は７２〜８０時間継続した。
発酵の間、発酵が溶解酸素の設定点に達したとき、溶解酸素プローブシグナルに基づいて濃縮グルコース溶液を供給することにより設定点における溶解酸素濃度を制御した。この結果、この対照スキームでは、攪拌速度や背圧といった発酵において酸素移動容量能力に影響する発酵槽操作パラメータの操作により、対応する細胞の酸素摂取率又は代謝率を操作した。
【００８０】
質量分析計を使用して、発酵からのオフガス消費をモニターすることにより、発酵中の酸素摂取量及び二酸化炭素放出率を計算することができた。
培養物の細胞密度が約２２０  ＯＤ５５０に達したら、約１２時間をかけて攪拌速度を初期値の１０００ｒｐｍから約７２５ｒｐｍに低下させた。約１２時間、培養物の細胞密度が２２０  ＯＤ５５０に達した後に２００ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）５０ｍｌを加えて重鎖合成を誘導した。
【００８１】
２．抗組織因子Ｆ（ａｂ’）２の製造
ａ．プラスミドの構築
上記の二重プロモータープラスミドｐＸＣＤ１８−７Ｔ３に類似の二重プロモータープラスミドｐｘＴＦ７Ｔ３を作成し、抗組織因子軽鎖及び重鎖の発現の一時的分離を可能にするために使用した。また、プラスミドｐＭＳ４２１由来のｌａｃＩ配列をｐｘＴＦ７Ｔ３に組み入れて、新規二重プロモータープラスミドｐＪＶＧ３ＩＬを作成した。
ｂ．発酵
これら発酵に使用する宿主株は、大腸菌Ｗ３１１０の派生体であり、これを６０Ｈ４と呼ぶ。６０Ｈ４の完全遺伝子型は、Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡΔｍａｎＡ  ｐｈｏＡΔＥ１５  Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｏＣ２  ｄｅｇＰ４１  ｉｌｖＧ２０９６（Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ  ｐｒｃ−抑制因子である。６０Ｈ４宿主細胞をｐＪＶＧ３ＩＬを用いて形質転換し、形質転換が成功したものを選択して培養物中で成長させた。
発酵は、上記の抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２に用いたものと同様な条件下で行い、但し実行時間を約７２〜１１４時間とし、培養物ＣＤ５５０が２２０に達した後、約４〜１２時間、ＩＰＴＧを用いて重鎖を誘発した。
【００８２】
３．完全長抗ＴＦ抗体の製造
ａ．プラスミドの構築
プラスミドｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬの発現カセットは、５’〜３’に、（１）ｐｈｏＡプロモーター（Kikuchi等、Nucleic Acids Res., 9(21):5671-5678 (1981)）、（２）ｔｒｐ  Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ（Yanofsky等、Nucleic Acids Res., 9:6647-6668 (1981)）、（３）ＳＴＩＩシグナル配列のサイレントコドン変異体（ＴＩＲ相対強度約７）（Simmons及びYansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996)）、（４）抗組織因子軽鎖コード化配列、（５）λｔ０ターミネーター（Scholtissek及びGrosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)）、（６）ｔａｃＩＩプロモーター（DeBoer等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)）、（７）第二ｔｒｐ  Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ、（８）ＳＴＩＩシグナル配列の第二サイレントコドン変異体（ＴＩＲ相対強度約３）、（９）抗組織因子完全長重鎖のコード化配列、及び（１０）第二λｔ０ターミネーターを含む。この発現カセットを大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のフレームワークにクローニングした（Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)）。
よって、ｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬのベクター設計は、同一ではなく、異なる２つのプロモーターを使用するので、各鎖の一時的な分離発現が可能になる。このプラスミドにおいて、軽鎖はｐｈｏＡプロモーターの制御下にある。しかし、重鎖の転写の制御には、ｔａｃＩＩプロモーターが使用される。当技術分野で既知であるように、ｐｈｏＡ及びｔａｃＩＩプロモーターは実質的に異なる条件下で誘発される。単独プロモータープラスミドｐａＴＦ１３０とｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬの概略的な比較を図４に示す。ｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬ（配列番号４）の発現カセットの核酸配列を図５に、及びそれによってコードされるポリペプチド配列（配列番号５及び６）を図６Ａ（軽鎖）及び図６Ｂ（重鎖）に、それぞれ示す。以下の宿主細胞を、ｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬ及びｐＪＪ２４７を用いて同時形質転換した。ｐＪＪ２４７は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ両方の発現をまずＤｓｂＡから連続的に駆動するｔａｃＩＩプロモーターをコードする。その作成方法はWO02/061090に開示されている。
【００８３】
ｂ．発酵
遺伝子型Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃＩｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１を有する小規模発現大腸菌株６１Ｄ６を宿主細胞として使用した。形質転換の後、選択した形質転換体候補を、３０℃の培養ホイール上で一晩成長させたカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地５ｍｌ中に播種した。WO02/061090に記載の培地を用いて１０リットル発酵を行った。基本的な発酵条件もWO02/061090に従ったが、以下の点について発酵工程を変更した：３００ｍＬの１Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０を約４０時間目に加え、濃度を約３０ｍＭにした。ＩＰＴＧの２００ｍＭ溶液１００ｍＬを約４４時間目に加え、濃度を約２ｍＭにした。播種から８０時間後に発酵物を回収した。
【００８４】
Ｂ．タンパク質の同定
一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法を、Ｎｏｖｅｘの線形アクリルアミド勾配４〜１２％中で実行した。具体的には、使用したシステムは、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳプレキャストゲル（低〜中程度の分子量のタンパク質用）から構成されるＮＯＶＥＸ（登録商標）ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）システムであった。
【００８５】
Ｃ．化学薬品
沈降剤乳酸エタクリジンは、Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した純度９８％のものであった。乳酸エタクリジンの分子量は３６１．４Ｄａである。その他全ての化学薬品については、分析用の等級を使用した。
【００８６】
Ｄ．沈降
Ｗａｔｔｓ  Ｆｌｕｉｄａｉｒ  Ｉｎｃ．（モデルＢ１２−０４ＤＪＣ、米国ミネソタ州キタリー）のマイクロフルイダイザーを用いて抗体−及びＦ（ａｂ’）２含有大腸菌材料をホモジナイズした。細胞は、４バール圧でマイクロフルイダイザーに３回通過させた。タンパク質が熱変性するのを防ぐため、マイクロフルイダイザーに通過させる度毎に冷水槽に材料を通過させた。Ｆ（ａｂ’）２ホモジネート中の総タンパク質濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。完全長抗ＴＦホモジネートは、再懸濁ペーストから得られたもので、その総タンパク質濃度は１８ｍｇ／ｍｌであった。抗ＴＦペーストを２５ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５に再懸濁した。
乳酸エタクリジン沈降剤を所望の最終濃度（ｗ／ｖ）になるまで水に溶かした。
１．ｐＨの検討
沈降実験は、乳酸エタクリジンの濃度を０．６重量％／容積に保って行われた。０．８％の乳酸エタクリジン溶液を調製し、大腸菌ホモジネートと３：１の割合、例えば乳酸エタクリジン３ｍｌに対して大腸菌ホモジネート１ｍｌの割合で混合した。所望のｐＨに応じて、ＨＣｌ又はＮａＯＨを用いてｐＨを調節した。
【００８７】
２．乳酸エタクリジン濃度の検討
乳酸エタクリジン保存液（ｐＨの検討と同様１：３）を用いてホモジネートを４倍に希釈し、各標的タンパク質についてｐＨを設定値に保った。抗ＣＤ１８のｐＨは８．５であり、抗ＴＦの場合はｐＨ７．５であった。沈降システムにおける乳酸エタクリジンの最終濃度は０．１５、０．３０、０．４５、０．６０、０．７５及び０．９重量％／容積であって。基準として、乳酸エタクリジン０％で一連の実験を行った。
３．伝導率／希釈度の検討
様々な濃度のＮａＣｌを抗ＣＤ１８ホモジネートに加え、タンパク質の沈降に対する伝導率の影響を評価した。検討したＮａＣｌの濃度は、０、５０、１００、１５０、２００、及び４００ｍＭであった。乳酸エタクリジンを含まない基準群についても評価を行い、いずれかのタンパク質が高い塩濃度により沈降するかを決定した。この塩スパイク試験におけるｐＨは８．５であり、抗ＣＤ１８ホモジネートは４倍に希釈したものであった。試料中の乳酸エタクリジン濃度は、基準試験について０．６％及び０％であった。
試料の伝導率を変えるため、ホモジネートを希釈する際の量を徐々に増加させ、ｐＨを抗ＣＤ１８についてはｐＨ８．５、及び抗ＴＦについては７．５で、それぞれ一定に維持した。全ての実験において最終的な乳酸エタクリジン濃度は０．６重量％／容積であった。ホモジネートは２、３、４、５、６、及び７倍に希釈した。
４．温度の検討
高温で複数の実験を行った。大腸菌ホモジネートを４倍に希釈し、乳酸エタクリジンの最終濃度を０．６％とした。抗Ｃｄ１８と抗ＴＦのｐＨはそれぞれ８．５及び７．５であった。所望の温度、即ち５０、６０、及び７０℃の恒温水槽中で試料をインキュベートした。温度を上昇させて試料を２０〜１２０分インキュベートした。５０℃で、長時間、即ち１６時間に亘るインキュベーションを１回行った。
沈降剤と大腸菌ホモジネートを混合し、ｐＨを調節した後、攪拌しながら試料を３０〜６０分間インキュベートした。沈降実験は４ｍｌの大きさのガラス管の中で行った。全ての実験は複数回行い、平均値を取った。
【００８８】
Ｅ．大腸菌タンパク質アッセイ
乳酸エタクリジンは、最も多く使用されるタンパク質測定アッセイ、例えばＢｒａｄｆｏｒｄ法、ＢＣＡ法及び２８０ｎｍで測定する分光吸収度に反応する。よって、総タンパク質濃度は一般的な大腸菌タンパク質ＥＬＩＳＡを用いて測定した。試料をアイシングラス含有バッファー（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮａＰＯ４、０．１％のアイシングラス、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０（登録商標）、０．０５％のＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００）で試料を希釈し、抗大腸菌タンパク質抗体に対する非特異的な結合を減らした。コーティングに使用した抗体はヤギ抗Ｗｈｏｌｅ  ＥＣＰであった。抱合抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼに接着させた抗抗体Ｗｈｏｌｅ  ＥＣＰであった。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅモデルＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＰＬＵＳ（登録商標）（米国カリフォルニア州サニーベール）のプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８９】
Ｆ．タンパク質Ｇアッセイ
回収されたＦ（ａｂ’）２及び抗体濃度を測定するため、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーアッセイを使用した。ＩＭＭＵＮＯ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ（登録商標）タンパク質ＧカラムをＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国マサチューセッツ州フレイミンガム）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いてカラムを均衡化し、ＨＣｌを用いてｐＨを２．２に調節したＰＢＳにより溶出した。乳酸エタクリジンによる干渉を最小化するため、アッセイに先立って試料を排除スピンカラム（ＢＩＯ−ＳＰＩＮ（登録商標）６Ｔｒｉｓカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／米国カリフォルニア州ハーキユリーズ）で処理した。スピンカラムは製造供給元の推奨に従って使用した。クロマトグラフィー法に塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＸ）洗浄工程を導入し（Fahrner等、Biotechnology及びGenetic Engineering Reviews, 18: 302-327 (2001)）、試料中の残留乳酸エタクリジンの干渉を最小化した。アッセイにはヒューレットパッカード（米国カリフォルニア州マウンテンビュー）のＨＰＬＣ（ＨＰ  １０９０（登録商標）液体クロマトグラフ）を用いた。試料はＰＢＳを用いて希釈した。精製したタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）を用いることにより、タンパク質の各々について検量線を作成した。
【００９０】
Ｇ．ＤＮＡアッセイ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（米国オレゴン州ユージーン）のＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎキットを用いて沈降後の上清のＤＮＡ濃度を測定した。これは蛍光試薬（Ｐｉｃｏ  ｇｒｅｅｎ）が二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光アッセイである。Ｐｉｃｏ  ｇｒｅｅｎ試薬は５０２ｎｍで励起され、５２３ｎｍにおける発光が報告されている。アッセイは、蛍光プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（米国カリフォルニア州サニーベール）のＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＮＩＮＩ  ＸＳ（登録商標）を使用して行われた。乳酸エタクリジンはＰｉｃｏ  ｇｒｅｅｎアッセイに反応するので、分析に先立って溶液中の沈降剤を取り除いた。乳酸エタクリジンは、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーアッセイの部分に記載されている、ＢＩＯ−ＳＰＩＮ（登録商標）６ＴＲＩＳカラムを用いて試料から除去した。
【００９１】
Ｈ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
乳酸エタクリジン沈降後に得られる上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｎｏｖｅｘ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）の４〜１２％の非還元ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ゲルを用いて、抗ＣＤ１８及び抗ＴＦの精製と回収を可視化した。プレキャストゲルが用いられ、使用した緩衝液はＭＯＰＳ（Ｎｏｖｅｘから購入した予め作成された濃度）であった。クーマシーブリリアントブルーＲ２５０（登録商標）の濾過溶液を用いてゲルを染色した。各浄化大腸菌抽出物に関して上清の容積を補充した。このようにして、乳酸エタクリジンによる沈降後に上清に１００％の収率が得られた場合、大腸菌抽出物及び試料中のタンパク質バンドの強度を同定した。よって、ゲルを使用することにより、沈降により得られる精製の範囲を正確に示すことができた。
【００９２】
Ｉ．乳酸エタクリジンの溶解度
２つの乳酸エタクリジン溶液、即ち０．６％及び１．２％の溶液を試験した。各溶液を、ｐＨ６．０とｐＨ９．０の２つに分割した。システムに若干の緩衝能を持たせるため、乳酸エタクリジンを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した。各乳酸エタクリジン溶液に徐々に容量を大きくしたＮａＣｌ、即ち０、５０、１００、１５０、２００、３００及び６００ｍＭのＮａＣｌに曝した。試料を３時間インキュベートした後、微量遠心管（ＳＯＲＶＡＬＬ  ＭＣ１２Ｖ（登録商標）、ＤｕＰｏｎｔ／米国デラウェア州ウィルミントン）中において１２０００ｇで２０分間遠心分離した。２７０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、乳酸エタクリジンの上清をアッセイした。使用した分光高度計は、ＡＧＩＬＥＮＴ  ８４５３  ＵＶ−ＶＩＳ（登録商標）分光光度計として知られる、ヒューレットパッカード（デラウェア州ウィルミントン）、現在はＡｌｉｇｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州パロアルト）のＨＰ８４５３  ＵＶ−ＶＩＳ（登録商標）であった。既知の乳酸エタクリジン濃度を有する溶液から検量線を得た。
【００９３】
Ｊ．濁度
時間及び温度の変化に伴う上清の安定性を測定するため、濁度をモニターした。使用した濁度検量器はＨＡＣＨ製であった（モデル２０１１Ｎ／米国アイオワ州アメス）。室温で試料を希釈することなく試料の測定を行った。
抗ＣＤ１８ホモジネートを、０．６％の乳酸エタクリジン、０．２％ＰＥＩ、又は水だけで処理した。３つの試料全てにおいて、抗ＣＤ１８ホモジネートは４倍に希釈されており、且つｐＨは７．２±０．２であった。４０００ｇで１時間遠心分離した後、上清を回収し、２つの分量に分けた。各試料の一部を室温（２１℃）で、他方の部分を４℃でインキュベートした。
【００９４】
結果と考察
ｐＨの影響
殆どのｐＨ間隔で、乳酸エタクリジン分子は正の電荷を有している（Miller, 上掲; Neurath and Brunner、上掲; Franek, Methods in Enzymology編、Langone, J.J., Van Vunakis, H., 121: 631-638 (1986)）。しかしながら、乳酸エタクリジンとの接触時に、ｐＨの変化がポリペプチドの電荷に影響を与え、またポリペプチドのｐＩと沈降を起こすｐＨは相関している（Neurath及びBrunner、上掲）ので、本発明の方法の精度の度合いに対するｐＨの影響を試験した。
抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦをそれぞれ含むホモジネートを、ｐＨ範囲４〜１０をカバーするように調節した０．６％の乳酸エタクリジン溶液に接触させた。これらタンパク質のそれぞれを乳酸エタクリジン処理及び遠心分離した後の浄化相を図８Ａ〜８Ｃに示す。
表１では、完全長抗体、及びＦ（ａｂ’）２として抗ＴＦを試験した。大腸菌ホモジネートを１：３の割合で０．８重量％／容積の乳酸エタクリジン溶液（すなわち試料中の乳酸エタクリジンの最終濃度０．６％）で処理した。所望のｐＨを得るために、それぞれＨＣｌとＮａＯＨを用いてｐＨを調節した。浄化細胞ホモジネートの各々に対して収率及び精製度を計算した。回収した上清のＤＮＡ濃度も表に示す。
【００９５】
表１
乳酸エタクリジンで処理したときのαＣＤ１８及びαＴＦの精製度及び収率に対するｐＨの影響
2006517415.tif 000005
＊値１は、乳酸エタクリジンで処理しない系に得られる精製度と同じであることを示す。
【００９６】
３つのタンパク質全てについて、ｐＨ範囲４〜１０のＤＮＡ濃度及び精製の範囲に対して逆Ｕ字型曲線が得られたことが分かる。中程度のｐＨ値、つまりｐＨ５〜９では、約５倍の精製が得られた。抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２及び抗ＴＦ抗体完全長及びＦ（ａｂ’）２の収率はｐＨが高まると減少し、抗ＴＦ抗体完全長及びＦ（ａｂ’）２のｐＨ依存性は抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２の同依存性よりも大きかった。ｐＨ範囲４〜１０において、抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２の収率は１００から８５％へ、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２の場合は９３から１８％へ低下した。１つの理論に限定されることなく、これは部分的には抗ＣＤ１８と比較して抗ＴＦのｐＩが低いこと、例えばそれぞれｐＩが８．９及び７．５であることによるものであるが、これらは理論的に計算されたｐＩ値である。
完全長抗ＴＦタンパク質のｐＨ依存性はタンパク質のＦ（ａｂ’）２バージョンよりもさらに大きい。完全長抗ＴＦの純度はｐＨ７．０で最も高い。８より大きいｐＨでは収率の減少が見られる（図８Ｃ）。完全長抗ＴＦについては、約７．０のｐＨ、つまり、７．１倍の精製、及び８６％の収率が好ましい。抗ＣＤ１８と比較した場合に抗ＴＦの減少が大きいことの原因として、そのｐＩより大きなｐＩでインキュベートされると、抗ＴＦは抗ＣＤ１８よりも大きな負の表面電荷を有することが挙げられるが、１つの理論に限定するものではない。これと同様に１つの理論に限定するものではないが、さらに大きな完全長抗ＴＦは、そのｐＩより大きなｐＩでインキュベートされると、対応するＦ（ａｂ’）２よりもさらに大きな負の表面電荷を有する場合があり、よってｐＨを増大させると有意に大きな収率現象が観察される。
【００９７】
しかしながら、細胞片及び宿主タンパク質以外の成分を標的ポリペプチドから除去しなければならない。そのような要素の１つはＤＮＡである。標的ポリペプチドに高いＤＮＡ濃度を持つことの欠点は、溶液の粘度が上昇することである。これは、その後の処理に悪影響を及ぼす。加えて、陰イオン交換カラムを第一捕捉カラムとして使用した場合、負の電荷を持つＤＮＡが樹脂に結合し、よってカラムのタンパク質能が低下する。
よって、乳酸エタクリジンによる沈降後の上清におけるＤＮＡ濃度を測定した。その結果、大腸菌ホモジネートに得られた初期ＤＮＡ濃度と比較して乳酸エタクリジン沈降後の上清中のＤＮＡ濃度が有意に減少することが示された。しかしながら、そのｐＨを低下させると上清中のＤＮＡ濃度は上昇し、ｐＨ５．０及び４．０においてそれぞれ０．１及び０．２μｇ／ｍｌであった。１つの理論に限定するものではないが、これは、ＤＮＡのリン酸の負の電荷が、低いｐＨで減少することに起因している場合がある。ｐＨが非常に高い場合、例えばｐＨ１０．０では、ＤＮＡ濃度が有意に増大し（０．３μｇ／ｍｌ）、タンパク質の純度も低下した。１つの理論に限定するものではないが、これは、部分的には、ｐＨが抗体及びＦ（ａｂ’）２のｐＩよりも高いことに起因する。しかしながら、部分的には乳酸エタクリジンの電荷がこのｐＨで小さいことに部分的に起因している可能性もある。
【００９８】
乳酸エタクリジン濃度の影響
大腸菌ホモジネートを乳酸エタクリジン溶液と１：３の割合で混合した。試料中の乳酸エタクリジンの濃度は、０〜０．９重量％／容積まで０．１５％ずつ増大させた。本試験は、抗ＣＤ１８、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗体それぞれについて、ｐＨ８．５、７．５、及び６．０で実施した。
表２は、精製及び収率に対する乳酸エタクリジン濃度の影響を示す。表２では、完全長抗体、及びＦ（ａｂ’）２として抗ＴＦを試験した。大腸菌ホモジネートを異なる濃度の乳酸エタクリジン溶液と１：３の割合で処理した。試料中の乳酸エタクリジンの最終濃度が報告されている。抗ＣＤ１８、抗ＴＦ（Ｆ（ａｂ’）２）、及び完全長抗ＴＦのｐＨはそれぞれ８．５、７．５及び６．０であった。回収した上清のＤＮＡ濃度も表に示す。
【００９９】
表２
乳酸エタクリジンの濃度を上げながら処理したときの抗ＣＤ１８及び抗ＴＦの純度及び収率に対する影響
2006517415.tif 000006
＊値１は、乳酸エタクリジンで処理しない系に得られる精製度と同じであることを示す。
【０１００】
抗体の純度が乳酸エタクリジンの濃度と強い相関関係を有することが示された（図９Ａ〜９Ｃ及び表２）。乳酸エタクリジンの濃度が約０．６％を超えると、乳酸エタクリジン濃度が純度の上昇に与える影響は小さい。しかしながら、乳酸エタクリジンの濃度が低いとき、つまり乳酸エタクリジンが不十分であるとき、わずかな沈降剤の添加によって必ずＦ（ａｂ’）２の純度が増大した。
抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２の収率は、様々な濃度の乳酸エタクリジンを添加しても影響されなかった。両方のＦ（ａｂ’）２のステップ回収は、全ての実験について約９０％であった。しかしながら、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２よりもＦ（ａｂ’）２抗ＣＤ１８の定量的回収を得るほうが容易であるように思われた。１つの理論に限定するものではないが、これは、試験したｐＨにおいて、抗ＣＤ１８  Ｆ（ａｂ’）２よりも抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２に負の表面電荷が多いことによるものであろう。完全長抗ＴＦの最大純度は、乳酸エタクリジン濃度が対応するＦ（ａｂ’）２タンパク質よりも低いときに、即ちそれぞれ０．３％と０．６％で得られた。１つの理論に限定するものではないが、これはおそらく、抗ＴＦ完全長ホモジネート中の全体のタンパク質濃度が低い、即ち完全長及びＦ（ａｂ’）２抗ＴＦについてそれぞれ１８及び８０ｍｇ／ｍｌであることによるものであろう。完全長及び抗ＴＦも再懸濁ペーストから得たものであり、Ｆ（ａｂ’）２はブロスとして発酵槽から直接採取した。従って、大腸菌ブロス中に存在する可溶性の培養培地要素は、再懸濁した完全長抗ＴＦ物質中には存在せず、これが唯一の理論というわけではないが、観察された差異を部分的に説明すると思われた。
上清中のＤＮＡ濃度はタンパク質精製について得られたデータと強い相関関係を有していた。０．６％以上の乳酸エタクリジンを添加したとき、上清からＤＮＡはまったく検出されなかった。また、ＤＮＡ濃度が減少する明らかな傾向があり、乳酸エタクリジン濃度を０から０．６％に増大すると、上清中のＤＮＡ濃度は７８から０μｇ／ｍｌに低下した。
【０１０１】
伝導率の影響
乳酸エタクリジンは、一つには分子の電荷特性によりタンパク質を沈降させる（Neurath及びBrunner、上掲）ので、試料の伝導率が、沈降後の抗体及びＦ（ａｂ’）２の純度に影響する場合がある。従って、試料の塩濃度が高い場合、つまり伝導率が高い場合、塩が乳酸エタクリジンからタンパク質を遮蔽することにより、精製効果を低減させる場合がある。
試料中のタンパク質濃度から伝導率の影響を分離するため、抗ＣＤ１８ホモジネートに２組の実験を行った。２組の実験両方にＮａＣｌを加えた（０〜４００ｍＭ）。一方の組の実験は０．６％の乳酸エタクリジンを含み、他方の組には水を使用した。ＮａＣｌによって沈降が生じる場合、それを乳酸エタクリジンによって得られる沈降と区別するために、水を含む系を対照群として使用した。乳酸エタクリジンを含まない系、つまり水を含む系では、ＮａＣｌ濃度０〜４００ｍＭにおいてタンパク質の沈降が観察されなかった（図１０Ａ）。乳酸エタクリジンを含む実験では、伝導率が低下すると抗ＣＤ１８の精製が大きく増大することが示された（図１０Ｂ）。
１つの理論に限定するわけではないが、低い伝導率で抗ＣＤ１８の精製が改善された１つの理由は、低い塩濃度では帯電した乳酸エタクリジンの遮蔽能が小さいことであると思われる。同様の遮蔽効果が、塩濃度を高めてタンパク質精製にＰＥＩを使用したときに見られた（Jendrisak、上掲）。しかしながら、さらに重要な因子は、塩濃度が高い程乳酸エタクリジンの可溶性が低下することである（Miller、上掲; Neurath及びBrunner、上掲; Franek、上掲）。１００ｍＭのＮａＣｌにより、抽出系に乳酸エタクリジンの沈降が観察され、塩濃度を上昇させると、乳酸エタクリジンの沈降が増大した。これは、系中に可溶であり、且つタンパク質及びその他生体分子を沈降させるのに利用可能な乳酸エタクリジンが少なくなったことを意味する。
【０１０２】
ＮａＣｌ濃度の変化に連動する乳酸エタクリジンの可溶性の研究において、ｐＨ依存性が観察された（図１１）。ｐＨ６では、０．６％の乳酸エタクリジン溶液と１．２％の乳酸エタクリジン溶液に有意な差異は観察されなかった。両方の溶液がＮａＣｌが５０ｍＭである場合に可溶であったが、１００ｍＭでは殆どすべてが沈降した。乳酸エタクリジンの電荷が小さいｐＨ９の溶液では、乳酸エタクリジンの２つの濃度における可溶性に有意な差異が見られた。０．６％の乳酸エタクリジン溶液は、それよりも高濃度の乳酸エタクリジン溶液よりも低い塩濃度で沈降した（図１１）。塩素イオンが乳酸エタクリジンを特に効率的に沈降させることが分かっている（Franek、上掲）。
実際には、沈降実験の伝導率は希釈因子によって決定する。従って、１組の実験を行って大腸菌ホモジネートの希釈因子の影響を試験した。全体の乳酸エタクリジン濃度を一定、つまり０．６重量％／容積に保ったが、試料の伝導率を希釈の増大に従って低下させた。結果を表３に示す。表３では、完全長抗体、及びＦ（ａｂ’）２として抗ＴＦを試験した。各実験において乳酸エタクリジンの濃度は０．６重量％／容積であった。抗ＣＤ１８、抗ＴＦ（Ｆａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦのｐＨはそれぞれ８．５、７．５、及び６．０であった。浄化細胞ホモジネートの各々について、収率と精製度を計算した。回収した上清中のＤＮＡ濃度も表に示す。
【０１０３】
表３
異なる量の大腸菌ホモジネートの希釈後の、抗ＣＤ１８及び抗ＴＦの純度及び収率に対する影響
2006517415.tif 000007
＊値１は、乳酸エタクリジンで処理しない系に得られる精製度と同じであることを示す。
【０１０４】
結果は、希釈を増大させて伝導率を低下させた場合、Ｆ（ａｂ’）２の精製が増大したことを示すものであった。しかしながら、３．５ｍＳ以下の伝導率では、伝導率の影響は小さかった。本実施例に使用した大腸菌ホモジネートに対しては、伝導率を３．５ｍＳ未満にするために４倍の希釈を施す必要があった。完全長抗ＴＦ抗体については、Ｆ（ａｂ’）２ホモジネートよりもやや小さい希釈を施すことができた。１つの理論に限定するものでないが、これは、完全長ホモジネートのタンパク質濃度が低いことが一因であると思われる。さらに、完全長材料は再懸濁ペースト由来であるので、沈降に影響を与え得る培地要素の一部は、乳酸エタクリジンの沈降に先立って除去されている。
これらの実験において、希釈の増大（伝導率の低下）に伴いタンパク質濃度は減少した。従って、乳酸エタクリジン濃度の検討において過剰濃度であることが分かった０．６％の乳酸エタクリジンを添加した場合も、希釈の足りない試料においては宿主タンパク質及びＤＮＡの最大除去が達成されなかった。これは、乳酸エタクリジン濃度の検討において用いられた試料と比較した場合、これら試料におけるホモジネート濃度、つまりタンパク質及びＤＮＡ全体の濃度が大きかったことによるものである。よって、タンパク質、ＤＮＡ、及びその他要素の全体的な濃度は乳酸エタクリジン濃度に影響するか、又は逆に必要な希釈に影響する。抗ＣＤ１８  Ｆ（ａｂ’）２及び完全長及びＦ（ａｂ’）２抗ＴＦの収率は、伝導率の低下と共に増大した。
ＤＮＡ除去の影響はまた、伝導率に依存していることが分かった。２倍に希釈した場合、つまり５．０ｍＳの場合、上清に高濃度のＤＮＡ、２０．７μ／ｇが得られた。しかしながら、３倍の希釈を行った場合、つまり４．０ｍＳでは、濃度は０．５μｇ／ｍｌに低下し、さらに希釈度を大きくした場合、ＤＮＡは全く検出できなかった。上述したように、この場合、希釈が大きくなるにつれて、つまり伝導率が低下するにつれて、タンパク質及びＤＮＡに対する乳酸エタクリジンの総量は増大する。よって、本実施例に見られる影響は、伝導率の低下及び乳酸エタクリジンの量の増大の両方である。
【０１０５】
温度の影響
気温は沈降実験を行う際の重要であることが知られている因子である。よって、高温条件下で乳酸エタクリジンを使用する場合を試験した。高温におけるインキュベーション時間の影響についても調査した。
高温、つまり５０〜７０℃でのインキュベーションは、２つのＦ（ａｂ’）２タンパク質の純度に良好に作用する（図１２Ａ及び１２Ｂ）。温度が高い程、精製の効率が良い。７０℃でのインキュベーションはＦ（ａｂ’）２タンパク質の純度を有意に向上させた。７０℃で試料を長時間、つまり２０分ではなく４０分間インキュベートしても、Ｆ（ａｂ’）２の純度は向上しなかったが、収率が約１０％低下した。しかし、試料を７０℃より高温でインキュベートした場合、Ｆ（ａｂ’）２並びに他の大腸菌タンパク質の温度沈降により、Ｆ（ａｂ’）２は回収されなかった。
インキュベーション時間をさらに詳しく調査するため、試料を５０℃で１６時間、及び３０分間インキュベートする実験を行った。その結果、この温度において、３０分間のインキュベートを行った試料と比較して１６時間のインキュベートを行った試料に有意な精製の向上は無かったことが示された。これは、温度沈降が急激に起こる現象であることを示し、長時間に亘るインキュベーションよりも、適切な温度まで急速に加熱する方が適当であることを示す。
完全長抗ＴＦについても高温で試験した。５０℃で１５分間インキュベーションしたところ、抗体の純度に若干の効果が見られ、室温でインキュベートした試料と比較して回収される物質に減少が見られなかった（図１２Ｃ）。しかしながら、温度を６０℃まで上昇させると、ほぼ全ての抗ＴＦが沈降した。データにより、Ｆ（ａｂ’）２抗ＴＦタンパク質と比べて高温における完全長抗ＴＦの安定性は低いことが示された。
温度の上昇は標的ポリペプチドに変化を生じさせるので、実施前に、対象とする特定のポリペプチドの高温での安定性を評価する必要がある。
【０１０６】
フィード流の安定性
可能な限りきれいなフィード流を回収することが重要である。しかし、フィード流の別の重要な特性は、長時間に亘る安定性である。したがって、乳酸エタクリジン又はＰＥＩ処理後の上清の安定性と、単に遠心分離を行った後の上清の安定性を比較した。各上清を２つの温度、つまり室温（２１℃）と４℃でインキュベートした。各試料の濁度を測定することにより安定性をモニターした。
図１３に、時間の経過に伴う濁度の変化を、３つの異なる上清、つまり乳酸エタクリジン、ＰＥＩ、及び非処理の浄化上清それぞれについて示す。多可電解質、つまり乳酸エタクリジン及びＰＥＩが上清の濁度を有意に低下させたことが明瞭に示されている。清澄の直後、浄化された非処理の上清の濁度は約７００ＮＴＵであり、それに対しＰＥＩ処理した試料の濁度はその半分、つまり３２７ＮＴＵに過ぎず、また乳酸エタクリジン上清の濁度は１ＮＴＵであった。ＰＥＩ処理した上清の濁度をモニターしたところ、経過時間及びインキュベーション温度のいずれについてもそれによる大きな差異は見られなかった。遠心分離だけを行った上清については、最初の４８時間は室温の試料の濁度が低い傾向があった。しかしながら、７２時間を経過した室温の試料は、試料の濁度が高いために測定不可能であった。乳酸エタクリジンで処理した上清の濁度は低く、４℃でインキュベートしてもそれ程上昇しなかった。試料を２１℃でインキュベートしたとき、その濁度は有意に、つまり７２時間で１から１００ＮＴＵまで、増大した。しかしながら、１００ＮＴＵという数字は、清澄直後の他の２つの上清に得られた濁度よりも小さい。従って、ｐＨ７の乳酸エタクリジン処理を行った後に回収される上清は安定したフィード流と結論付けることができる。
【０１０７】
結論
乳酸エタクリジンは、培養ブロス又はホモジネートからの異種ポリペプチドの一時的回収のための沈降剤として成功裏に使用することができる。乳酸エタクリジンを沈降剤として使用するとき、理想的な標的ポリペプチドは平均宿主タンパク質よりも高いｐＩを有することが好ましい。従って、多くのタンパク質は負の電荷を有し、乳酸エタクリジンにより沈降できると同時に、標的タンパク質は正の電荷を有し、上清中に回収される。
沈降に好ましい乳酸エタクリジンの濃度は、ブロス又はホモジネート中の宿主タンパク質及びＤＮＡの濃度に大きく依存する。ブロス又はホモジネート中のタンパク質及びＤＮＡの濃度が高い程、必要な乳酸エタクリジンの量は大きくなる。従って、乳酸エタクリジンと複合し、よって沈降する負の電荷を有する要素が多くなる程、沈降に好適な乳酸エタクリジンの量は大きくなる。沈降を行う際の溶液の伝導率が低い程、ポリペプチド精製の効率は大きくなる。沈降の段階を踏むことにより、細胞が除去され、有意義なポリペプチドの精製及びＤＮＡの減少が同時に行われる。
効率的な宿主タンパク質及びＤＮＡの精製のため、ｐＨは通常約４〜１０であり、これを超えるｐＨでは分子の電荷が小さくなる。好ましくは約ｐＨ９以下である。さらに好ましくは、ポリペプチド精製の際には乳酸エタクリジンは約ｐＨ５〜９で使用される。精製を向上させるため、高温で短時間のインキュベーションを行うことができる。しかしながら、標的ポリペプチドの沈降を避けるため、対象とする特定のポリペプチドについて高温での安定性を確認しなければならない。また、標的ポリペプチドに変化が生じていないことを確認するため、回収された標的ポリペプチドの質も調査しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２（−ロイシンジッパー）プラスミドｐＳ１１３０（単一プロモーター）及びｐｘＣＤ１８−７Ｔ３（二重プロモーター）の構成を示す概略図である。
【図２】二重プロモーターコンストラクトｐｘＣＤ１８−７Ｔ３の核酸配列の挿入された核酸配列（抗ＣＤ１８−７Ｔ３．ＤＮＡと命名される；配列番号１）を示す。
【図３】それぞれＳＴＩＩ＋抗ＣＤ１８軽鎖（図３Ａ）及びＳＴＩＩ＋抗ＣＤ１８重鎖（図３Ｂ）と命名されたコンストラクトｐｘＣＤ１８−７Ｔ３内部の２つの翻訳ユニットによりコードされるアミノ酸配列（抗ＣＤ１８−７Ｔ３．タンパク質として組み合わせて命名する）（配列番号２及び３）を示す。
【図４】抗組織因子ＩｇＧ１プラスミドｐａＴＦ１３０（ｐｈｏＡ／ｐｈｏＡプロモーター）及びｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬ（ｐｈｏＡ／ｔａｃＩＩ−プロモーター）の構造図である。
【図５】ｐｈｏＡ／ｔａｃＩＩプロモーターコンストラクトｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬの挿入された核酸配列（抗ＴＦ−７Ｔ３ＦＬ．ＤＮＡと命名される；配列番号４）を示す。
【図６】それぞれＳＴＩＩ＋抗ＴＦ軽鎖（図６Ａ）及びＳＴＩＩ＋抗ＴＦ重鎖（図６Ｂ）と命名されたコンストラクトｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬ内部の２つの翻訳ユニットによりコードされるアミノ酸配列（抗ＴＦ７Ｔ３ＦＬ．タンパク質として組み合わせて命名する）（配列番号５及び６）を示す。
【図７】乳酸エタクリジンの化学構造を示す。
【図８】Ａ〜Ｃは、乳酸エタクリジンによる沈降後の３つの上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル分析を示す。沈降は、各列に示す異なるｐＨ値で行った。Ｘで示した列は、各大腸菌ホモジネート、即ち抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦ（それぞれ図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃ）の清澄した上清である。ホモジネートを０．８％の乳酸エタクリジン溶液を用いて４倍に稀釈し、つまり各実験における最終的な乳酸エタクリジン濃度を０．６％にした。ゲルにかける前に全ての試料の容積を補充した。従って、１００％の回収が得られた場合、抽出物（Ｘ）に対しバンド強度を比較可能である。矢印は生成物バンドを示す。
【図９】Ａ〜Ｃは、乳酸エタクリジンによる沈降後の３つの上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル分析を示す。沈降は、各列に示す異なる乳酸エタクリジン濃度で行った。Ｘで示した列は、各大腸菌ホモジネート、即ち抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦ（それぞれ図９Ａ、図９Ｂ及び図９Ｃ）の清澄した上清である。抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦのｐＨはそれぞれ８．５、７．５、及び６．０であった。試料の伝導率は３．２±０．２ｍＳ／ｃｍであった。ゲルにかける前に全ての試料の容積を補充した。従って、１００％の回収が得られた場合、抽出物（Ｘ）に対しバンド強度を比較可能である。矢印は生成物バンドを示す。
【図１０】Ａ及びＢは、それぞれ水及び乳酸エタクリジンで稀釈した２つの上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル分析を示す。沈降は、異なる伝導率で行った。本試験には抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２を含む大腸菌ホモジネートを使用した。水（図１０Ａ）、又は各実験で最終的な乳酸エタクリジン濃度が０．６％となるように０．８％の乳酸エタクリジン（図１０Ｂ）を用いてホモジネートを４倍に稀釈し、ｐＨを８．３に調節した。伝導率を変化させるために、試料に対し、（図示するように）０〜４００ｍＭの異なる濃度のＮａＣｌを添加した。矢印は生成物バンドを示す。
【図１１】塩化ナトリウム濃度を上昇させたときの乳酸エタクリジンの溶解性を示すグラフである。試料を室温で３時間インキュベートした後、溶解性の乳酸エタクリジンの濃度を決定した。白い丸又は四角は１．２％の乳酸エタクリジン溶液を、黒い丸又は四角は０．６％の同溶液を示す。実線はｐＨ６．０における０．６％の乳酸エタクリジン溶液を、破線はｐＨ６．０における１．２％の乳酸エタクリジン溶液を、点線はｐＨ９における０．６％の乳酸エタクリジン溶液を、点破線はｐＨ９における１．２％の乳酸エタクリジン溶液を示す。
【図１２】Ａ〜Ｃは、乳酸エタクリジンによる沈降後の３つの上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル分析を示す。沈降は、高温で行った。Ｘで示した列は、各大腸菌ホモジネート、即ち抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦ（それぞれ図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃ）の清澄した上清である。ホモジネートを４倍に稀釈して最終的な乳酸エタクリジン濃度を０．６％とし、抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２、抗ＴＦ  Ｆ（ａｂ’）２、及び完全長抗ＴＦのｐＨをそれぞれ８．５、７．５、及び６．０に調節した。インキュベーションの温度と時間は図に示す。矢印は生成物バンドを示す。
【図１３】３つの異なる上清の時間の経過に伴う濁度の変化を示すグラフである。０．６％の乳酸エタクリジンで処理した抗ＣＤ１８ホモジネート由来の上清を、黒丸（４℃）又は白丸（２１℃）で、０．２％のＰＥＩで処理した試料を黒四角（４℃）又は白四角（２１℃）で示す。水で稀釈後濃縮した清澄抗ＣＤ１８ホモジネートから回収した上清を、黒三角（４℃）又は白三角（２１℃）で示す。いずれの場合も、抗ＣＤ１８ホモジネートは４倍に稀釈されており、ｐＨは７．２であった。
【図１】
2006517415.tif 000008
【図２】
2006517415.tif 000009
【図３】
2006517415.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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