(57)【要約】本発明は、一般的に、プレニルトランスフェラーゼ、特に、細菌細胞壁合成に重要な酵素である、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの構造に関する。本発明は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの結晶構造、並びに補因子及びリガンドとのその相互作用に関する。本発明はまた、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのリガンド及び補因子結合部位の構造にも関する。
2006524048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶型の連鎖球菌属（Streptococcus）ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを含む組成物であって、該シンターゼが配列番号1に少なくとも約80％相同なアミノ酸配列を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記シンターゼが、Asp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Ala71、Arg79、Leu90、Pro91、及びPhe143からなる群より選択されるアミノ酸残基を含むリガンド結合部位を含む、請求項1の組成物。
【請求項３】
前記シンターゼが、Asp28、Arg200、Arg206、Ser208、Glu219（B）、Gly250（B）、及びGly251（B）からなる群より選択されるアミノ酸残基を含むリガンド結合部位を含む、請求項1の組成物。
【請求項４】
前記シンターゼが、アミノ酸残基Asp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Ala71、Arg79、Leu90、Pro91、及びPhe143を含む第一のリガンド結合部位、又はアミノ酸残基Asp28、Arg200、Arg206、Ser208、Glu219（B）、及びGly250（B）若しくはGly251（B）のいずれかを含む第二のリガンド結合部位、又は前記の第一のリガンド結合部位及び前記の第二のリガンド結合部位の両方を含む、請求項1の組成物。
【請求項５】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的リガンドを同定する方法であって：
（a）図2記載の少なくともアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143の原子座標によって定義されるシンターゼの三次元構造を用い；
（b）該三次元構造を使用して潜在的リガンドを設計するか又は選択し；
（c）該潜在的リガンドを得て；そして
（d）該潜在的リガンドと該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを接触させて、該シンターゼに対する該潜在的リガンドの結合を測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項６】
（e）該シンターゼに結合可能な化学物質（chemical  entities）又はそのフラグメントを同定し；そして
（f）同定された化学物質又はそのフラグメントを単一分子に組み立てて、潜在的リガンドの構造を提供する
ことをさらに含む、請求項5の方法。
【請求項７】
突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的阻害剤を同定する方法であって：
（a）図2記載のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標によって定義されるウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの三次元構造を用い；
（b）三次元構造において、配列番号1の28、29、31、32、41、71、79、90、91、143、200、206、208、219、及び250若しくは251のいずれかから選択される、1以上のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼアミノ酸を、異なる天然存在アミノ酸で置換して、それによって突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを形成し；
（c）該三次元構造を使用して、潜在的阻害剤を設計するか又は選択し；そして
（d）該潜在的阻害剤と該突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ又は該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを、基質の存在下で接触させて、該潜在的阻害剤が、該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ又は該突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを阻害する能力を試験する
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ基質結合部位に結合可能なリガンドを同定する方法であって：
（a）適切なコンピュータプログラムに、シンターゼ基質に結合可能なアミノ酸の第一の原子座標を含む結合部位を定義する情報を導入し、ここで該プログラムは、結合部位の三次元構造を提示する；
（b）該コンピュータプログラムにおいて、試験化合物の三次元モデルを生成し；
（c）結合部位の構造に、該試験化合物の該モデルをドッキングさせ；
（d）シンターゼの基質又は阻害剤の第二の三次元モデルを生成し、そして第二のモデルを結合部位の構造にドッキングさせ；そして
（e）試験化合物のドッキング、及びシンターゼの基質又は阻害剤のドッキングを比較して、プログラムのアウトプットを提供する
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的阻害剤を同定する方法であって：
（a）図2記載のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標によって定義される該シンターゼの三次元構造を用い；
（b）前記三次元構造を使用して、潜在的阻害剤を設計するか又は選択し；そして
（c）該潜在的阻害剤と該シンターゼを、基質の存在下で接触させて、該潜在的阻害剤が該シンターゼを阻害する能力を測定する
ことを含む、前記方法。
【請求項１０】
少なくとも1つのリガンド結合部位を有する肺炎連鎖球菌（S．  pneumoniae）ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標を用いて、該リガンド結合部位と化学物質の相対的関係をコンピュータを使用して評価し、そしてアウトプットを示すことを含む、薬剤設計方法。
【請求項１１】
肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結晶の原子座標又はその部分を用いて、分子置換によって、該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの突然変異体、相同体（homolog）又は共複合体（co−complex）の結晶型を解くことを含む、結晶型を解く方法。
【請求項１２】
図2記載のアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143を含む原子座標を含む機械読み取り可能データをエンコードするデータ記憶材料を含む、機械読み取り可能データ記憶媒体。
【請求項１３】
機械読み取り可能データが、図2記載のアミノ酸残基200、206、208、及び219（B）からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む原子座標をさらに含む、請求項66の機械読み取り可能データ記憶媒体。
【請求項１４】
薬剤設計のためのコンピュータ実行ツールであって：
（a）少なくとも1つのリガンド結合部位を有する肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標によって定義される、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの三次元構造；
（b）化学物質のモデル；及び
（c）座標をアドレス指定し、そしてリガンド結合部位において化学物質をモデリングして、アウトプットを示すことが可能なコンピュータプログラム
を含む、前記ツール。
【請求項１５】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼリガンド結合部位の三次元像を示すコンピュータであって：
（a）図2記載のアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143を含む原子座標を含む機械読み取り可能データをエンコードするデータ記憶材料を含む、機械読み取り可能データ記憶媒体；
（b）機械読み取り可能データをプロセシングするための指示を記憶する作業メモリ；
（c）作業メモリ及び機械読み取り可能データ記憶媒体にカップリングした、機械読み取り可能データを三次元像にプロセシングするための、中央処理装置；及び
（d）中央処理装置にカップリングした、三次元像を提示するためのディスプレイ
を含む、前記コンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、酵素の結晶構造に関する。より具体的には、本発明は、イソプレノイド鎖の鎖伸長に関与する酵素の原子構造、及び薬剤設計における該構造の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プレニルトランスフェラーゼは、脂質、ペプチドグリカン、及び糖タンパク質生合成において重要な酵素である。これらの酵素は、5炭素イソプレノイド基質を有する分子に作用する。プレニルトランスフェラーゼは、プレニル鎖伸長において、産物のシス異性化又はトランス異性化を触媒するかにしたがって、2つの主な下位群に分類される。E型プレニルトランスフェラーゼはトランス異性化を触媒し、そしてz型プレニルトランスフェラーゼはシス異性体化を触媒する。トランス型プレニルトランスフェラーゼとは異なり、シス−プレニルトランスフェラーゼは、ほとんど分類されていない。特に、シス−プレニルトランスフェラーゼの活性部位の詳細な分子構造に関しては、ほとんど知られていない。その結果、シス−プレニルトランスフェラーゼの阻害剤は、構造に基づくアプローチを用いて確立することが困難であった。シス−プレニルトランスフェラーゼは、原核生物のペプチドグリカンの生合成及び真核生物の糖タンパク質の生合成に関与するため、この欠損は特に重要である。こうした経路は、生物の生存に決定的である。
【０００３】
細菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ（UPS）は、ウンデカプレニル二リン酸シンターゼとしても知られ、8分子のイソプレニルピロリン酸（IPP）とトランス，トランス−ファルネシルピロリン酸（FPP）の連続縮重を触媒して、ウンデカプレニルピロリン酸と称される55炭素分子を産生する、z型プレニルトランスフェラーゼである。ウンデカプレニルピロリン酸は、シンターゼから遊離し、そして脱リン酸化されて、ウンデカプレニルリン酸を形成し、このウンデカプレニルリン酸が、細菌細胞壁及びリポ多糖生合成において必須の炭水化物及び脂質キャリアーとして働く。ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの場合、その産物の立体化学及び産物鎖の長さが、プレニルトランスフェラーゼファミリーの他のメンバーとは異なる。
【０００４】
現在用いられている抗細菌剤に耐性が生じていることから、異なる機構によって作用する抗生物質が緊急に必要になってきている。ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、細菌に偏在性に存在し、そして細胞壁生合成経路において、必須でそして決定的な役割を果たしている。したがって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、細胞生存に必須であり、そして抗細菌薬剤を発見するため、有効で、そしてまだ利用されていない分子標的を提供する。したがって、阻害剤を開発するための、構造に基づくアプローチは、新規抗生物質を提供しうる。
【０００５】
基質又は補因子の非存在下で、M．ルテウス（M．  luteus）由来のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結晶の原子座標が示されている。Fujihashiら，  PNAS，  98：4337（2001）。原子座標は不完全であり、そしていくつかのアミノ酸残基は、結晶構造中で定義されていない。
【０００６】
同様に、基質又は補因子の非存在下で、大腸菌（E．  coli）由来のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結晶の原子座標が示されている。Koら，  J．  Biol．  Chem．，  276：47474（2001）。原子座標は不完全であり、そしていくつかのアミノ酸残基は、結晶構造中で定義されていない。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、一般的に、タンパク質結晶構造及び薬剤設計におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、結晶型の連鎖球菌属（Streptococcus）ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに関する。本発明はまた、結晶型の該シンターゼを含む組成物にも関する。組成物は、少なくとも1つのリガンドをさらに含むことも可能である。
【０００８】
1つの態様において、本発明は、結晶型の連鎖球菌属ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを含む組成物であって、該シンターゼが配列番号1に少なくとも約80％相同なアミノ酸配列を含む、前記組成物を含む。該シンターゼの好ましい態様において、アミノ酸配列は、配列番号1に少なくとも約90％相同である。
【０００９】
該シンターゼは、第一のリガンド結合部位、第二のリガンド結合部位、又は両方を有することも可能である。さらに、該シンターゼを含む組成物は、少なくとも1つのリガンドを含むことも可能である。リガンドは、シンターゼとともに共結晶化されることも可能である。適切なリガンドには、限定されるわけではないが、ファルネシルピロリン酸、（S）−ファルネシルチオピロリン酸、イソプレニルピロリン酸、マグネシウムイオン、及び硫酸イオンが含まれる。好ましくは、ファルネシルピロリン酸又は（S）−ファルネシルチオピロリン酸は、第一のリガンド結合部位と会合し、そしてイソプレニルピロリン酸又は硫酸は、第二のリガンド結合部位と会合する。
【００１０】
別の側面において、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、Asp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Ala71、Arg79、Leu90、Pro91、及びPhe143からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基に定義される、第一のリガンド結合部位を含む。好ましい態様において、結晶は、図2記載の原子座標を有する原子を有する、アミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143に定義される、第一のリガンド結合部位を含むことも可能である。
【００１１】
さらに別の側面において、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、二量体の一方の鎖（A）由来のAsp28、Arg200、Arg206、及びSer208、並びに二量体の他方の鎖（B）由来のGlu219及びGly250又はGly251いずれかからなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基によって形成される、第二の結合部位を含む。したがって、第二の結合部位には、どちらのポリペプチド鎖も寄与しうる。好ましい態様において、結晶は、図2記載の原子座標を有する原子を有するアミノ酸残基28、200、206、208、及び219（B）に定義される、第二のリガンド結合部位を含むことも可能である。
【００１２】
本発明はまた、肺炎連鎖球菌（S．  pneumoniae）ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼである、結晶型のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼにも関する。
さらに別の側面において、本発明は、結晶型のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼとともに、そのリガンドも含む組成物に関する。該シンターゼは、連鎖球菌に限定されない生物いずれ由来であることも可能である。
【００１３】
本発明の1つの側面は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的リガンドを設計するか又は同定する方法であって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの三次元構造を用い、該三次元構造を使用して潜在的リガンドを設計するか又は選択し、該潜在的リガンドを得て；そして該潜在的リガンドと該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを接触させて、該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに対する結合を測定することを含む、前記方法に関する。当業者は、該方法の工程を多様な順で実行可能であることを認識するであろう。結合部位の三次元構造は、図2記載のアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143の原子座標によって定義されることも可能である。
【００１４】
1つの態様において、該方法は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに結合可能な化学物質（chemical  entities）又はそのフラグメントを同定し；そして同定された化学物質又はそのフラグメントを単一分子に組み立てて、潜在的リガンドの構造を提供することをさらに含むことも可能である。
【００１５】
潜在的リガンドは阻害剤であることも可能である。1つの態様において、阻害剤は、競合的阻害剤である。別の態様において、阻害剤は、非競合的阻害剤である。リガンドは新規に設計可能である。あるいは、リガンドは既知の阻害剤から設計可能である。該方法は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに結合したリガンドの、図2記載の原子座標、又はその部分を用いることをさらに含むことも可能である。
【００１６】
本発明の別の側面は、突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的阻害剤を同定する方法であって、図2記載のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標によって定義されるようなウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの三次元構造を用い；三次元構造において、配列番号1の28、29、31、32、41、71、79、90、91、143、200、206、208、219、及び250若しくは251のいずれかから選択される、1以上のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼアミノ酸を、異なる天然存在アミノ酸で置換して、それによって突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを形成し；該三次元構造を使用して、潜在的阻害剤を設計するか又は選択し；該潜在的阻害剤を合成し；そして該潜在的阻害剤と該突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ又は該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを、基質の存在下で接触させて、該潜在的阻害剤が、該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ又は該突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを阻害する能力を試験することを含む、前記方法に関する。潜在的阻害剤をデータベースから選択することも可能である。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的阻害剤を同定する方法であって、図2記載のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標によって定義されるような該シンターゼの三次元構造を用い；前記三次元構造を使用して、潜在的阻害剤を設計するか又は選択し；該潜在的阻害剤を合成し；そして該潜在的阻害剤と該シンターゼを、基質の存在下で接触させて、該潜在的阻害剤が該シンターゼを阻害する能力を測定することを含む、前記方法に関する。
【００１８】
1つの態様において、三次元構造を、図2記載のアミノ酸残基200、206、及び208の原子座標によってさらに定義することも可能である。別の態様において、三次元構造を、図2記載のアミノ酸残基219（B）の原子座標によってさらに定義することも可能である。「B」と示すアミノ酸残基は、二量体の相補的ポリペプチド鎖由来である。
【００１９】
Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、及びArg79からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基と水素結合を形成するように、潜在的リガンドを設計することも可能である。さらに、又はあるいは、Arg200、Arg206、Ser208、Glu219（B）、及びGly250（B）若しくはGly251（B）のいずれかからなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基と水素結合を形成するように、潜在的リガンドを設計することも可能である。別の態様において、Ala71、Leu90、Pro91、及びPhe143からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基と疎水結合を形成するように、潜在的リガンドを設計することも可能である。
【００２０】
1つの側面において、本発明は、これらの方法によって同定されたリガンドに関する。
本発明はまた、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ基質結合部位に結合可能なリガンドを同定する方法であって：（a）適切なコンピュータプログラムに、シンターゼ基質に結合可能なアミノ酸の第一の原子座標を含む結合部位を定義する情報を導入し、ここで該プログラムは、結合部位の三次元構造を提示する；（b）該コンピュータプログラムにおいて、試験化合物の三次元モデルを生成し；（c）結合部位の構造に、該試験化合物の該モデルをドッキングさせ；（d）シンターゼの基質又は阻害剤の第二の三次元モデルを生成し、そして第二のモデルを結合部位の構造にドッキングさせ；そして（e）試験化合物のドッキング、及びシンターゼの基質又は阻害剤のドッキングを比較して、プログラムのアウトプットを提供することを含む、前記方法にも関する。1つの態様において、該方法は、コンピュータプログラムに、基質に結合した水分子の第二の原子座標を導入することをさらに含む。別の態様において、該方法は、コンピュータプログラムに、アルファらせん、310らせん、ベータシートの鎖、及びコイルからなる群より選択される、少なくとも1つのシンターゼ構造要素の第三の原子座標を導入することをさらに含む。
【００２１】
さらに別の態様において、該方法は：（f）シンターゼ活性の生物学的アッセイ又は生化学的アッセイに、該試験化合物を取り込み；そして（g）該試験化合物が、該アッセイにおいて、シンターゼ活性を阻害するかどうか決定することをさらに含む。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも1つのリガンド結合部位を有する肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標、又はその実質的な部分を用いて、該リガンド結合部位と化学物質の相対的関係をコンピュータを使用して評価することを含む、薬剤設計方法にも関する。該化学物質は、ファルネシルピロリン酸伸長反応の中間体、又はその類似体であることも可能である。
【００２３】
別の側面において、本発明は、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結晶の原子座標、又はその部分を用いて、分子置換によって、該ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの突然変異体、相同体（homolog）又は共複合体（co−complex）の結晶型を解くことを含む、結晶型を解く方法に関する。該方法は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに結合したリガンドの原子座標を用いることをさらに含むことも可能である。
【００２４】
本発明の1つの側面は、図2記載のアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143を含む原子座標を含む機械読み取り可能データをエンコードするデータ記憶材料を含む、機械読み取り可能データ記憶媒体に関する。1つの態様において、機械読み取り可能データは、図2記載の200、206、208、及び219（B）からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む原子座標をさらに含む。別の態様において、機械読み取り可能データは、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの三次元構造を含む。
【００２５】
別の側面において、本発明は、薬剤設計のためのコンピュータ実行ツールであって：（a）少なくとも1つのリガンド結合部位を有する肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標によって定義されるような、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの三次元構造；（b）化学物質のモデル；及び（c）座標をアドレス指定し、そしてリガンド結合部位において化学物質をモデリングして、アウトプットを示すことが可能なコンピュータプログラムを含む、前記ツールを含む。
【００２６】
さらに別の側面において、本発明は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼリガンド結合部位の三次元像を生じるコンピュータであって：（a）図2記載のアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91、及び143を含む原子座標を含む機械読み取り可能データをエンコードするデータ記憶材料を含む、機械読み取り可能データ記憶媒体；（b）機械読み取り可能データをプロセシングするための指示を記憶する作業メモリ；（c）作業メモリ及び機械読み取り可能データ記憶媒体にカップリングした、機械読み取り可能データを三次元像にプロセシングするための、中央処理装置；及び（d）中央処理装置にカップリングした、三次元像を提示するためのディスプレイを含む、前記コンピュータを含む。該コンピュータは、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのリガンド結合部位の三次元像を生じることもまた可能であり；そして機械読み取り可能データは、リガンド結合部位の原子座標を含むことも可能である。
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書記載の発明を完全に理解するため、以下の詳細な説明を示す。以下の表は、本明細書に用いるアミノ酸略語を列挙する。
【００２８】
【表１】
2006524048.tif 000003
【００２９】
便宜上、明細書、実施例、及び付随する請求項で使用する特定の用語をここに集める。別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者に、通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
用語「天然存在アミノ酸」は、天然存在アミノ酸のL異性体を意味する。天然存在アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン及びリジンである。特に示さない限り、本明細書において言及するアミノ酸はすべてL型である。
【００３１】
用語「非天然アミノ酸」は、タンパク質に天然には見られないアミノ酸を意味する。本明細書で用いる非天然アミノ酸の例には、セレノシステイン及びセレノメチオニンが含まれる。さらに、非天然アミノ酸には、D−フェニルアラニン、並びにノル−ロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、3−アミノ−2−ベンジルプロピオン酸、及びホモアルギニンのD型及びL型が含まれる。
【００３２】
用語「陽性荷電アミノ酸」には、通常の生理学的条件下で、陽性に荷電した側鎖を有する、いかなる天然存在アミノ酸又は非天然アミノ酸も含まれる。陽性荷電天然存在アミノ酸の例は、アルギニン、リジン及びヒスチジンである。
【００３３】
用語「陰性荷電アミノ酸」には、通常の生理学的条件下で、陰性に荷電した側鎖を有する、いかなる天然存在アミノ酸又は非天然アミノ酸も含まれる。陰性荷電天然存在アミノ酸の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００３４】
用語「疎水性アミノ酸」は、水に比較的不溶性の非荷電非極性側鎖を有するアミノ酸いずれかを意味する。天然存在疎水性アミノ酸の例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンである。ヒスチジン及びチロシンもまた、疎水結合に関与することも可能である。
【００３５】
用語「親水性アミノ酸」は、水に比較的可溶性の非荷電極性側鎖を有するアミノ酸いずれかを意味する。天然存在親水性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、及びシステインである。
【００３６】
用語「水素結合」を用いて、水素が架橋を形成する、N、O、及びSを含む極性原子間の相互作用を記載する。イオン性アミノ酸の側鎖及び親水性アミノ酸の側鎖、並びにペプチド主鎖中のアミド部分の側鎖が、水素結合の候補である。基質及び阻害剤中の極性部分及びイオン部分が、水素結合の候補である。
【００３７】
用語「疎水結合」を用いて、水又は極性基との相互作用よりもエンタルピー的に又はエントロピー的に好ましい、非極性部分のファンデルワールス相互作用を記載する。したがって、疎水結合の1つのモデルは、水の排除によって形成される自由エネルギーの獲得である。疎水結合を形成する有力候補は、ファルネシルピロリン酸の脂肪族テール、並びにフェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、ヒスチジン、及びチロシンを含むアミノ酸残基の側鎖である。
【００３８】
用語、アミノ酸残基中の「残基」は、ポリペプチドに取り込まれたアミノ酸の一部を指す。
用語「リガンド」は、シンターゼに結合するか、又はシンターゼと会合する化学物質を指す。常にではないが、しばしば、リガンドは小分子である。基質は、適切な条件下で、シンターゼが化学的に作用しうるリガンドである。具体的には、ファルネシルピロリン酸は、補因子として作用するマグネシウムイオンの存在下で、シンターゼに結合する基質であるが、第二の基質、すなわちイソプレニルピロリン酸が存在しない限り、そして触媒に必要な他の条件が満たされない限り、化学反応を受けない。
【００３９】
用語「突然変異体」は、配列番号1記載の、野生型ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ配列からの少なくとも1アミノ酸の置換によって特徴付けられる、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、すなわち野生型ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの生物学的活性を示すポリペプチドを指す。こうした突然変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発（oligonucleotide−directed  mutagenesis）、又は当該技術分野に周知の他の手段によって、コード配列があらかじめ改変されているウンデカプレニルプロリン酸シンターゼcDNAを発現することによって、調製可能である。
【００４０】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ突然変異体は、例えばNorenら，  Science，  244：182−88（1989）の一般的な生合成法を用いて、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼタンパク質に、非天然アミノ酸を部位特異的に取り込むことによってもまた、生成可能である。この方法において、野生型ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ中の目的のアミノ酸をコードするコドンを、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発を用いて、「ブランク」ナンセンスコドン、TAGで置換する。次いで、in  vitroで、このコドンに対して向けられるサプレッサーtRNAを、望ましい非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化する。次いで、このアミノアシル化されたtRNAをin  vitro翻訳系に添加して、非天然アミノ酸が部位特異的に取り込まれた、突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ酵素を得る。
【００４１】
以下に記載するように、セレノシステイン又はセレノメチオニンを野生型又は突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに取り込むことも可能である。この方法において、天然システイン又はメチオニンいずれか（あるいは両方）が枯渇しているが、セレノシステイン又はセレノメチオニン（あるいは両方）が強化されている増殖培地上、宿主生物において、野生型又は突然変異誘発されたウンデカプレニルピロリン酸シンターゼcDNAを発現させることも可能である。
【００４２】
改変された表面荷電は、野生型ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに比較した際、生理学的pHでの、突然変異体ポリペプチドの1以上の荷電単位の変化を記載する。これは、好ましくは、野生型ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの少なくとも1つのアミノ酸を、生理学的pHで、元来の野生型側鎖と異なる荷電を持つ側鎖を含むアミノ酸に突然変異させることによって、達成される。
【００４３】
表面荷電の変化は、置換されたアミノ酸を含有するポリペプチド分子の等電点（pI）を測定し、そしてこれを、野生型ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ分子の等電点に比較することによって、決定される。
【００４４】
改変された基質特異性は、突然変異体ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼが、FPP、IPP、又は両方の類似体に結合する能力、及び該シンターゼがこれらを用いる能力の変化を指す。
【００４５】
「競合的」阻害剤は、基質が結合するのと同じ型のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに結合し、したがってウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの活性部位に関して、基質と直接競合することによって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ活性を阻害するものである。競合的阻害は、基質濃度を十分に増加させることによって、完全に逆転させることも可能である。
【００４６】
「不競合的」阻害剤は、基質が結合するのと異なる酵素型に結合することによって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼを阻害するものである。こうした阻害剤は、基質が既に結合しているウンデカプレニルピロリン酸に結合し、そして未結合（free）酵素には結合しない。不競合的阻害は、基質濃度を増加させることによって、完全に逆転させることは不可能である。
【００４７】
「非競合的」阻害剤は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの未結合型又は基質結合型いずれにも結合可能なものである。
当業者は、例えばSegel，  I．H．，  Enzyme  Kinetics，  J．  Wiley  ＆  Sons，  （1975）記載の標準的な式を用いて、酵素動力学的データを適合させるコンピュータによって、阻害剤を、競合的、不競合的、又は非競合的と同定することも可能である。
【００４８】
用語「相同体」は、本明細書において、連鎖球菌属ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ、あるいはウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの機能ドメイン又は構造ドメインいずれかと、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、又はその部分を意味する。
【００４９】
用語「共複合体」は、化学物質又は化合物と共有的又は非共有的に会合した、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ、あるいはウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの突然変異体又は相同体を意味する。
【００５０】
用語「会合する」は、化学物質又は化合物、あるいはその部分、及びウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ分子又はその部分の間の近接条件を指す。会合は、非共有的であることも可能であり、この場合は、水素結合又はファンデルワールス相互作用又は静電相互作用によって、並列がエネルギー的に支持されるし、あるいは、会合は共有的であることも可能である。
【００５１】
用語「ベータシート又はβ−シート」は、伸長されたジグザグコンホメーションに引き伸ばされたポリペプチド鎖のコンホメーションを指す。「平行」に走る鎖と称されるポリペプチド鎖の部分は、すべて同一の方向、アミノ末端からカルボキシ末端に走る。「逆平行」の鎖と称されるポリペプチド鎖又はその部分は、反対の方向に走る。
【００５２】
用語「結合部位」は、リガンドが結合可能な、アミノ酸残基及び場合によって補因子で構成されるシンターゼ領域を指す。ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、少なくともファルネシルピロリン酸及びFPPのより長い鎖の誘導体、イソプレニルピロリン酸、マグネシウムイオン、及び硫酸イオンの結合部位を有する。
【００５３】
用語「活性部位」は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの以下の部位のいずれか又はすべてを指す：FPP結合部位、IPP結合部位、シンターゼ反応産物及び中間体の部位、マグネシウムイオン部位、及び硫酸部位。1つの特定の用法において、「活性部位」は、触媒反応が起こる部位を指す。
【００５４】
用語「原子座標」は、結晶型のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ分子の原子（散乱中心）によるX線の単色ビームの回折上で得られるパターンに関連させた、数学的式から得られる数学的座標を指す。回折データを用いて、結晶の反復単位の電子密度マップを計算する。電子密度マップを用いて、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立する。類似の用語「構造座標」は、個々の原子の数学的座標を指す。原子座標セットには、列挙されるような正確な座標だけでなく、原子の相対的な位置が維持されている限り、これらの座標の翻訳上の変動又は回転変動いずれも含まれることを理解しなければならない。
【００５５】
用語、原子座標の「実質的な部分」は、シンターゼ又はリガンドのいくつかの原子の位置を定義するか又は部分的に定義する、少なくとも12の複数の原子座標を指す。好ましくは、実質的な部分は、少なくとも24の座標である。より好ましくは、実質的な部分は、少なくとも36の座標である。座標は、標準偏差内であることも可能である。
【００５６】
用語「重原子誘導体化」は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの結晶の化学的修飾型を産生する方法を指す。実際には、重金属原子塩又は有機金属化合物、例えば塩化鉛、金チオリンゴ酸、チメロサール又は酢酸ウラニルを含有する溶液中に結晶を浸し、これらが結晶中に拡散し、そしてタンパク質表面に結合することも可能である。浸した結晶のX線回折解析によって、結合した重金属原子（単数又は複数）の位置（単数又は複数）を決定することも可能である。次にこの情報を用いて、酵素の三次元構造を構築するのに用いる位相情報を生成する。例えば、Blundel，  T．L．及びN．L．  Johnson，  Protein  Crystallography，  Academic  Press（1976）を参照されたい。
【００５７】
当業者は、X線結晶学によって決定される構造座標のセットは、標準偏差なしではないことを理解する。本発明の目的のため、図2に列挙する構造座標に対して、主鎖原子を用い、スーパーインポーズした際、タンパク質主鎖原子（N、Cα、C及びO）の0．75Å未満の根平均二乗変異を有する、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ又はウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ相同体又はウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ突然変異体のいかなる構造座標セットも、同一と見なされるものとする。
【００５８】
用語「単位格子」は、基本的な平行六面体型のブロックを指す。こうしたブロックを規則的に組み立てることによって、結晶の全体積を構築することも可能である。各単位格子は、パターンの単位の完全な表示を含み、単位格子の反復が結晶を構築する。
【００５９】
用語「空間群」は、結晶の対称要素の配置を指す。
用語「分子置換」は、未知の結晶の観察される回折パターンを説明するのに最適であるように、未知の結晶の単位格子内で、構造座標が既知である分子（例えば図2由来のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ座標）を配向し、そして配置することによって、構造座標が未知であるウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結晶の予備的モデルを生成することを含む方法を指す。次いで、このモデルから位相を計算して、そして観察された振幅と組み合わせて、座標が未知である構造の適切なフーリエ合成を得ることも可能である。次にこれを、いくつかの型の精密化のいずれかに供して、未知の結晶の最終的な正確な構造を提供することも可能である。例えばLattman，  Methods  in  Enzymology，  115：55−77（1985）；M．G．  Rossmann監修，  “The  Molecular  Replacement  Method”，  Int．  Sci．  Rev．  Ser．，  No．13，  Gordon  ＆  Breach，  ニューヨーク（1972）を参照されたい。本発明が提供するウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの構造座標を用い、分子置換を用いて、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの結晶突然変異体又は相同体、あるいはウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの異なる結晶型の構造座標を決定することも可能である。
【００６０】
例えば図2中の「原子種」は、座標を測定している元素を指す。図2の列の最初の文字は元素を定義する。
「X、Y、Z」は、測定する元素の原子位置を結晶学的に定義する。
【００６１】
「B」は、原子中心周囲の原子の運動を測定する温度因子である。
数学的操作によって、図2記載のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標を、元来のセットから修飾することも可能である。こうした操作には、限定されるわけではないが、生の構造座標の結晶学的順列（permutation）、生の構造座標の分断化（fractionalization）、生の構造座標セットへの整数加算（integer  addition）又は減算（subtraction）、及び上記の組み合わせいずれかが含まれる。図2の原子座標は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド鎖、並びにマグネシウムイオン、FPP、硫酸、及び複数の水分子を含む、該ポリペプチドに結合したいくつかの分子に相当する。
【００６２】
材料及び方法
クローニング及び発現
肺炎連鎖球菌UppSのアミノ酸10〜252（配列番号1を参照されたい）をpET28a（Novagen）誘導体にサブクローニングした。修飾融合タンパク質は、Hisタグ及びトロンビン・プロテアーゼ部位からなるN末端タグ（MHHHHHHSSGLVPRGSMA）（配列番号22）を有する。BL21  Gold細胞（Stratagene）において発現を行った。0．2％グルコースを補ったLB培地中、50μMイソプロピル−ベータ−D−チオガラクトシドで細胞を25℃で一晩誘導した。
【００６３】
天然肺炎連鎖球菌UPSの精製：
（his）6−UPS融合タンパク質を発現する大腸菌5リットル振盪フラスコ由来の約30グラムの細胞を、氷上で30分間静置した後、Branson  Sonifier  450を用いて、100mlの緩衝液（50mM  Tris−HCl、0．3M  NaCl、4mM  β−ME、pH8．0、1μg／mlペプスタチン、1μg／mlロイペプチン、1mM  PMSF、0．2mg／mlリゾチーム、10mM  MgCl2、3μg  DNA／ml）中で溶解した。40，000xgの遠心分離によって、溶解物を清澄にした。緩衝液A（50mM  Tris−HCl、0．3M  NaCl、4mM  β−ME、20mMイミダゾール、pH8．0、並びに1μg／mlペプスタチン及びロイペプチン）中で平衡化しておいた、15mlの固定金属アフィニティーカラム、Ni−NTAに可溶性タンパク質を適用した。緩衝液A＋40mMイミダゾールで洗浄した後、結合したタンパク質を緩衝液B（緩衝液A＋0．25Mイミダゾール、pH8．0）で段階溶出した。NuPAGE系を用いて、MES緩衝液中、10％ビス−trisゲル上のSDS−PAGEによって、分画を解析した。his−UPSを含有する分画をプールし、そしてさらに精製するため、50mM  Tris−HCl、0．3M  NaCl、4mM  β−ME、pH8．0を含有する緩衝液に対して透析した。
【００６４】
特異的トロンビン認識部位で、トロンビンを用いて消化することによって、（his）6タグを除去した。（his）6−UPSを、2活性単位／mg：（his）6−UPSのトロンビンで処理した。3時間後、PMSFを室温で1mMまで添加することによって反応を停止した。（his）6−UPSの単離に関して上述するように、クロマトグラフィーを行った。タグが除去されたUPSは、フロースルー及び洗浄分画中に単離された。残った（his）6−UPS及び切断された（his）6ペプチドを結合分画から取り除いた。NuPAGE系を用いて、MES緩衝液中、10％ビス−trisゲル上のSDS−PAGEによって、分画を解析した。さらに精製するため、脱his−UPSを含有する分画をプールした。
【００６５】
サイズ排除クロマトグラフィーによって、脱his−UPSをさらに精製した。タンパク質を10〜14mg／mlに濃縮し、そして50mM  Tris−HCl、0．3M  NaCl、8mM  DTT、pH7．5を含有する緩衝液中で平衡化しておいた、125ml  Superdex  200分取等級カラムに装填した。UPSは55kDa二量体として溶出した。NuPAGE系を用いて、MES緩衝液中、10％ビス−trisゲル上のSDS−PAGEによって、分画を解析した。動的光散乱（DLS）、及びLC／MSによって、最終プールを性質決定した。DLSによって、タンパク質が単分散であることが明らかになった。質量解析によって、7アミノ酸欠失に一致する、低レベルの一部切除（truncated）N末端が明らかになった。これはN末端配列解析によって確認された。上述の方式で単離したタンパク質を結晶化に用いた。
【００６６】
天然肺炎連鎖球菌UPSの結晶化：
50mM  Tris−HCl、0．3M  NaCl、8mM  DTT、pH7．5中で脱his−UPSを作成した。懸滴法を用いたスパースマトリックススクリーニングを行った。リザーバー上で、タンパク質濃度3mg／mlの滴をセットした。プレートを22℃でインキュベーションした。鉛はほとんど同定されなかった。最適化リザーバー条件の1つ（0．1M  HEPES、pH7．5、8％エチレングリコール、10％PEG8000）が〜350x250x25ミクロンの大きな平板結晶を生じた。
【００６７】
結晶実験に用いた構築物の配列を配列番号1に提供する。
データ収集
100°Kで急速凍結した結晶からX線回折データを収集した。結晶化リザーバー溶液に添加した25％エチレングリコールからなる凍結保護溶液に、結晶を簡単に浸した。次いで、これらを100°Kの冷窒素流に導入した。
【００６８】
結晶は斜方晶系であり、空間群I212121に属し、単位格子寸法は、a＝59．99Å、b＝118．20Å、c＝178．93Å、α＝β＝γ＝90°である。
ADSC  ccd検出装置を用い、Advance  Light  Source  of  Lawrence  Berkeley  Laboratoryのビームライン5．0．1で、2．3Åの最大分解能まで、3波長回折データを収集した。HKLプログラム一式を用いて、データを減少させた。総数212419の反射を収集し、28867がユニークな反射であり、7．4のデータ余分（redandancy）及び99．9％の完成を生じる。結晶モザイク性（mosaicity）は0．4度であり、Rmergeは7．6％である。すべて、データが優れた品質であることを示す。
【００６９】
構造決定
CCP4プログラム、及び検索モデルとしての公表された大腸菌構造（PDB  1JP3）を用いて、分子置換法によって、シンターゼ構造を解いた。
【００７０】
剛体精密化後、出発R因子は3．2Å分解能で46．9％である。ARP／wARPで実行されるような自動マップ追跡を用いて、マップを部分的に追跡し、そして該プログラムは、プログラムXtalViewを用いた手動の調整が容易に実行可能である度合いに、マップの品質を改善することが可能であった。CCP4プログラム一式に実行されるように、プログラムREFMACを用いて、すべてのモデル精密化を行った。
【００７１】
非対称単位あたり、2つのウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ分子がある。現在のモデルは、一方の分子の残基19〜246、及び他方の分子の残基18〜245、並びに119の結合した水分子からなる。このモデルは、2．3Åのすべてのデータに関して、全体のR因子が0．286、フリーR因子が0．336である。精密化統計を表1Aに示す。
【００７２】
表1A
【００７３】
【表２】
2006524048.tif 000004
【００７４】
肺炎連鎖球菌UPSの最終精密化座標を図2に示す。
連鎖球菌属ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの構造
シンターゼの全体のトポロジーは既知のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのものと類似であり、8つのαらせんに取り巻かれた6つの鎖の平行βシートからなる。
【００７５】
図1を参照すると、結晶構造によって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼが二量体として存在し、2回対称軸によって関連する2つの同一サブユニットがあることが明らかである。図1は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ二量体のリボン図を示す。図1に示すように、2つのサブユニットは緊密に会合している。
【００７６】
一方の分子では、Phe72からLeu90の残基が不規則であり、他方では、Phe72からArg79の残基が不規則である。酵素の構造解析によって、活性部位は、以下の残基の少なくとも1つからなると定義されることが示される：一方の鎖由来のAsp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Arg79、Leu90、Pro91、Phe143、Arg200、Arg206、及びSer208、並びに鎖Bと称される他方の鎖由来のGlu219及びGly251。肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの突然変異体又は相同体において、アミノ酸残基の番号付けを、肺炎連鎖球菌参照配列に規格化することも可能である。
【００７７】
肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、以下の表1Bに示すいくつかの構造特徴を有する。
表1B
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ二次構造割り当て
【００７８】
【表３】
2006524048.tif 000005
【００７９】
表1Bにおいて、ベータ鎖をS1〜S6と呼び、そしてらせんをH1〜H10と呼ぶ。らせんH3a及びH9は310らせんであり；他のものはアルファらせんである。プログラムProcheckで実行されるように、Kabsch及びSanderの方法にしたがって、二次構造を計算している。二次構造を計算するのに他のアルゴリズムを用いると、わずかに異なる割り当てを生じることも可能である。
【００８０】
肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、いくつかの注目すべき構造特徴を有し、この特徴には以下が含まれる。22〜27位のアミノ酸残基は、S1と称されるベータシート鎖の一部である。H1は、28位の触媒性アスパラギン酸にすぐ隣接するアルファらせんであり、そしてまた、Gly29、Asn30、Gly31及びArg32を含む、FPPに結合可能ないくつかの残基も有する。41〜62位のアミノ酸残基は、H2と称されるアルファらせんを形成する。66〜71位のアミノ酸残基は、S2と称されるベータシート鎖の一部である。柔軟なループであることが可能であると上述される、73〜84位のアミノ酸残基は、構造が不規則であるが、FPPのリン酸基と2つの水素結合を作成することが可能なArg79を含まなければならない。
【００８１】
さらに、該シンターゼは他の注目すべき特徴を有する。Asp81〜Ala104のアミノ酸は、H3bと称されるアルファらせんを形成しなければならない。重要なものとして、H3bらせんには、構造中、柔軟性を可能にしうるプロリンが含まれる。Lys108〜Ile112のアミノ酸残基は、S3と称されるベータシートの一部を形成する。Lys120〜Thr133のアミノ酸は、H4と称されるアルファらせんを形成する。Ile140〜Leu147のアミノ酸は、S4と称されるベータシートの一部を形成する。Gly149〜Leu165のアミノ酸残基は、H5と称されるアルファらせんを形成する。Glu176〜Gly180のアミノ酸残基は、H6と称されるらせんを形成する。Phe184〜His187のアミノ酸残基は、H7と称されるアルファらせんを形成する。Leu197〜Ang200のアミノ酸残基は、S5と称されるベータシートの鎖を形成する。Glu219〜Phe222のアミノ酸残基は、S6と称されるベータシートの鎖を形成する。Trp227〜Asp229のアミノ酸残基は、H9と称される310らせんを形成する。Glu232〜Asn243のアミノ酸残基は、H10と称されるアルファらせんを形成する。
【００８２】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの残基は、ファルネシルピロリン酸及びマグネシウムイオン補因子と相互作用しなければならない。Asp28は、ベータ位のカルボン酸官能基を有し、その酸素原子は、約2Åの距離のマグネシウムイオンと相互作用しなければならない。この金属配位は、約2Åの分子間距離で、ファルネシルピロリン酸のピロリン酸基の2つの酸素原子と相互作用する位置に、マグネシウムイオンを固定するように働くであろう。
【００８３】
FPPとのシンターゼ相互作用もまた、他のアミノ酸残基に仲介されると期待される。Arg32は、ファルネシルピロリン酸中のリン酸の酸素原子と相互作用可能な窒素原子を有し、窒素から酸素への水素結合相互作用は、約2．4〜3．2Åの距離を有すると期待される。Gly36は、窒素及び酸素基間で、ファルネシルピロリン酸の架橋酸素と水素結合を形成可能なアルファアミノ基を有する。Gly34は、水素結合によって、やはり同じ酸素原子と相互作用可能なアルファアミノ基を有する。Arg41は、ファルネシルピロリン酸中の末端リン酸基の酸素と水素結合を形成可能なグアニジノ官能基中の2つの窒素原子を有し、そして約2．4〜3．2Åの窒素から酸素の原子間距離を有すると期待される。Arg79は、ファルネシルピロリン酸のリン酸基の2つの酸素原子と相互作用可能な2つの酸素を有するグアニジノ基を有し、約2．4〜3．2Åの原子間距離の水素結合を形成する。
【００８４】
本発明の1つの側面は、結晶型の連鎖球菌属ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ及びリガンドを含む組成物に関する。一般的に、リガンドは、基質、阻害剤、又は補因子であることも可能である。より具体的には、リガンドは、マグネシウムイオン、ファルネシルピロリン酸、イソペンチルピロリン酸、硫酸イオン、及び基質結合部位に結合する阻害剤いずれかからなる群より選択可能である。阻害剤は、低親和性阻害剤又は高親和性阻害剤を含む、該シンターゼの阻害剤いずれであることも可能である。1つの側面において、結晶は、図2記載の原子座標、又はその部分を有する、リガンド、又はその部分を含む。
【００８５】
別の側面において、結晶ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、図2記載の原子座標、又はその実質的な部分を有するアミノ酸残基を含む。こうした結晶において、シンターゼは、好ましくは、同一ポリペプチド鎖の二量体である。1つの側面において、本発明は、配列番号1に対応するアミノ酸配列を含む。別の側面において、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼは、配列番号1の残基21〜252に対応するアミノ酸配列を含む。
【００８６】
本発明はまた、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの第一のリガンド結合部位及び第二のリガンド結合部位にも関する。第一のリガンド結合部位及び第二のリガンド結合部位は、リガンドの極性又はイオン性頭部基と相互作用するアミノ酸残基、及び場合によってリガンドの疎水性テールと相互作用する他のアミノ酸残基によって定義される。あるいは、結合部位のアミノ酸残基は、例えば、補因子に結合し、次に、この補因子が基質に結合することによって、又は別のアミノ酸残基に結合し、次に、このアミノ酸残基が基質に結合することによって、基質と間接的に相互作用することも可能である。
【００８７】
第一のリガンド結合部位は、Asp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Ala71、Arg79、Leu90、Pro91、及びPhe143からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基を含むと定義可能である。好ましい態様において、第一のリガンド結合部位は、これらのアミノ酸残基の少なくとも3つを含む。さらにより好ましい態様において、第一のリガンド結合部位は、これらのアミノ酸残基の少なくとも6つを含む。最も好ましい態様において、第一のリガンド結合部位は、10アミノ酸残基すべてを含む。
【００８８】
第一のリガンド結合部位は、あるいは、Asp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Ala71、Arg79、Leu90、Pro91、及びPhe143からなる群より選択されるアミノ酸残基の少なくとも約80％を含むことも可能である。好ましい態様において、第一のリガンド結合部位は、Asp28、Gly29、Gly31、Arg32、Arg41、Ala71、Arg79、Leu90、Pro91、及びPhe143からなる群より選択されるアミノ酸残基の少なくとも約90％を含む。
【００８９】
第二のリガンド結合部位は、二量体の一方の鎖（A）由来のAsp28、Arg200、Arg206、及びSer208、並びに二量体の他方の鎖（B）由来のGlu219及びGly250からなる群より選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基を含むと定義可能である。好ましい態様において、第二の結合部位は、これらのアミノ酸残基の少なくとも3つを含む。より好ましい態様において、第二の結合部位は、これらのアミノ酸残基の6つすべてを含む。
【００９０】
第二のリガンド結合部位は、あるいは、Asp28、Arg200、Arg206、Ser208、Glu219（B）、及びGly251（B）からなる群より選択されるアミノ酸残基の少なくとも約80％を含むことも可能である。好ましい態様において、第二のリガンド結合部位は、Asp28、Arg200、Arg206、Ser208、Glu219（B）、及びGly251（B）からなる群より選択されるアミノ酸残基の少なくとも約80％を含む。
【００９１】
本発明の別の側面は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的リガンドを設計するか又は同定する方法であって、図2記載のアミノ酸残基28、29、31、32、41、71、91及び143の原子座標を含む三次元構造を用いることを含む、前記方法に関する。好ましい態様において、座標は、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのものであるか、又はその実質的な部分である。該方法は、潜在的リガンドを得ることを含むことも可能であり、これには、リガンド全体又はその一部を合成すること、リガンドを借用すること、そしてリガンドを購入することが含まれることも可能である。
【００９２】
1つの側面において、本発明は、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標、又はその部分、及びコンピュータ上で実行され、原子座標をアドレス指定するコンピュータプログラムを含む、コンピュータを使用した組成物のモデルに関する。原子座標は、図2のもの、又はその実質的な部分であることも可能である。
【００９３】
別の側面において、本発明は、第二のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのリガンド又は潜在的阻害剤を設計するか又は同定する方法であって：（a）図2記載の原子座標、又はその実質的な部分によって定義されるような、第一のウンデカプレニルピロリン酸の三次元構造を用い；（b）第一のペプチド主鎖を有する少なくとも1つの第一のアミノ酸残基、及び部分的に、少なくとも1つのリガンド結合部位を定義するアミノ酸残基（単数又は複数）を同定し；（c）タンパク質並列手段を使用して、第二のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ中に、第一の主鎖と実質的に並列可能な第二のペプチド主鎖を有する、少なくとも1つの第二のアミノ酸を同定し；（d）三次元構造を使用して、第二のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの潜在的リガンドを設計するか又は選択し；（e）該潜在的リガンドを合成し；そして（f）該潜在的リガンドを第二のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼと接触させて、第二のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼへの結合を測定する；ここで第二のアミノ酸残基は、第一のアミノ酸残基とは異なる、ことを含む、前記方法に関する。
【００９４】
さらに別の側面において、本発明は、単離されたウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの活性部位の、コンピュータを使用したモデルであって、マグネシウムイオン補因子、並びに窒素原子を有するグアニジノ基を有する第一のアルギニン残基、及び酸官能基を形成する酸素原子を含むアスパラギン酸残基、ここで酸素原子は、補因子及び第一のアルギニン残基のグアニジノ基の少なくとも1つの窒素原子と配位する；及び配列Glu  Asn  Trp  Xaa  Arg  Pro（配列番号2）を含むポリペプチドループ中の第二のアルギニン残基を含むポリペプチドを含む、前記モデルに関する。Argは、リガンドの原子と配位可能な、少なくとも1つの窒素原子を有する。Xaaは、親水性、疎水性、及びイオン性アミノ酸残基を含む、アミノ酸残基いずれかである。補因子、アスパラギン酸残基、第一のアルギニン残基、及び第二のアルギニン残基は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの活性部位の少なくとも一部を形成する。1つの態様において、XaaはThrである。
【００９５】
さらに、活性部位は、配列Asp  Gly  Asn  Xaa  Arg（配列番号3）を含むアルファらせん中の第三のアルギニンをさらに含むことも可能であり、このArgは、リガンドの原子と配位可能な、少なくとも2つの窒素原子を有する。配列番号3のXaaは、親水性、疎水性、及びイオン性アミノ酸残基を含む、アミノ酸残基いずれかである。1つの態様において、XaaはGlyである。
【００９６】
本発明はまた、コンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムによる、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの活性部位の提示を含む、活性部位のコンピュータモデルにも関する。
【００９７】
1つの側面において、本発明は、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標を少なくとも12有するウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ、及びコンピュータ上で実行され、該原子座標をアドレス指定するコンピュータプログラムを含む、コンピュータを使用した組成物のモデルに関する。好ましくは、該モデルは、少なくとも24の原子座標、より好ましくは少なくとも36の原子座標、そして最も好ましくは少なくとも48の原子座標を含む。
【００９８】
コンピュータを使用したモデルは、アミノ酸残基配列Asp  Gly  Asn  Gly  Arg  Trp（配列番号4）をさらに含むことも可能であり、Argは少なくとも1つの窒素原子を有し、そしてリガンドは少なくとも1つの酸素原子を含み、この少なくとも1つの窒素原子が、約2．4Åで、該酸素原子と隣接する。
【００９９】
別の態様において、コンピュータを使用したモデルは、アミノ酸残基配列Asp  Gly  Asn  Gly  Arg  Trp（配列番号4）をさらに含むことも可能であり、各Glyは窒素原子を有し、そしてリガンドは少なくとも1つの酸素原子を含み、該窒素原子が、約3．3Åで、該酸素原子と隣接する。
【０１００】
さらに別の態様において、コンピュータを使用したモデルは、あるいは、アミノ酸残基配列Glu  Asn  Trp  Thr  Arg  Pro（配列番号5）をさらに含むことも可能であり、Argは少なくとも1つの窒素原子を有し、そしてリガンドは少なくとも1つの酸素原子を含み、該窒素原子が、約2．9Åで、該酸素原子と隣接する。
【０１０１】
さらに別の態様において、コンピュータを使用したモデルは、あるいは、アミノ酸残基配列Pro  Arg  Val  Phe  Gly  His（配列番号6）をさらに含むことも可能であり、Argは少なくとも1つの窒素原子を有し、そしてリガンドは少なくとも1つの酸素原子を含み、該窒素原子が、約3Åで、該酸素原子と隣接する。
【０１０２】
また、コンピュータを使用したモデルは、あるいは、アミノ酸残基配列Arg  Leu  Ser  Asn  Phe  Leu（配列番号7）をさらに含むことも可能であり、Serは少なくとも1つの窒素原子を有し、そしてリガンドは少なくとも1つの酸素原子を有し、該窒素原子が、約2．6Åで、該酸素原子と隣接する。
【０１０３】
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ阻害剤の設計
当業者は、多様な既知の方法いずれかを用いて、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼと、あるいはウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ活性部位の一部を含むMg2＋結合部位、FPP結合部位、又はIPP結合部位と会合する能力に関して、化学部分をスクリーニングすることも可能である。図2のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ座標に基づいて、リガンド結合部位のモデルを視覚的に検査すると、候補化学物質につながりうる。次いで、選択した化学物質を、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのリガンド結合部位の1つの内部の方向に配置することも可能である。Qanta及びSybylなどのソフトウェアを用いて配置を達成することも可能であり、そしてこれは、化学物質の位置を変化させるのにも有用である。次いで、CHARMM及びAMBERなどの標準的分子力学力場を用いて、結合のエネルギー及び分子動力学を最小限にすることも可能である。
【０１０４】
化学物質を選択する際に有用な他のコンピュータプログラムには、以下が含まれる：
1．  DOCK（Kuntzら，  “A  Geometric  Approach  to  Macromolecule−Ligand  Interactions”，  J．  Mol．  Biol．，  161：269−88（1982））。DOCKは、カリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能である。
【０１０５】
2．  GRID（Goodford，  “A  Computational  Procedure  for  Determining  Energetically  Favorable  Binding  Sites  on  Biologically  Important  Macromolecules”，  J．  Med．  Chem．，  28：849−57（1985））。GRIDは、オックスフォード大学、英国オックスフォードから入手可能である。
【０１０６】
3．  AUTODOCK（Goodsell及びOlsen，  “Automated  Docking  of  Substrates  to  Proteins  by  Simulated  Annealing”，  Proteins：Structure．  Function，  and  Genetics，  8：195−202（1990））。AUTODOCKは、Scripps  Research  Institute、カリフォルニア州ラホヤから入手可能である。
【０１０７】
4．  MCSS（Miranker及びKarplus，  “Functionality  Maps  of  Binding  Sites：A  Multiple  Copy  Simultaneous  Search  Method．”Proteins：Structure．  Function  and  Genetics，  11：29−34（1991））。MCSSは、Molecular  Simulations、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能である。
【０１０８】
部分の編成をまず、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの原子座標に関連させて視覚的に再検討して、全体を作成することによって、選択した部分を単一の化合物に組み立てることも可能である。Quanta又はSybylなどのソフトウェアを用いたモデル構築が、このプロセスを補完することも可能である。
【０１０９】
化学部分をリガンド又は阻害剤に構築するのに有用な他のプログラムには、以下が含まれる：
1．  CAVEAT（Bartlettら，  “CAVEAT：A  Program  to  Facilitate  the  Structure−Derived  Design  of  Biologically  Active  Molecules”．  “Molecular  Recognition  in  Chemical  and  Biological  Problems”中，  Special  Pub．，  Royal  Chem．  Soc．，  78：182−96（1989））。CAVEATは、カリフォルニア大学、カリフォルニア州バークレーから入手可能である。
【０１１０】
2．  MACCS−3D（MDL  Information  Systems、カリフォルニア州サンレアンドロ）などの3Dデータベース系。Martin，  “3D  Database  Searching  in  Drug  Design”，  J．  Med．  Chem．，  35：2145−54（1992））もまた参照されたい。
【０１１１】
3．  HOOK（Molecular  Simulations、マサチューセッツ州バーリントンより入手可能）。
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ阻害剤又はリガンドは、記載するように一度に1部分ずつ調製されることも可能である。さらに、阻害性又は他のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結合化合物は、空位の結合部位又は既知の阻害剤の部分いずれかを用いて、「新規に」設計することも可能である。このアプローチを支援するコンピュータプログラムには以下が含まれる：
1．  LEGEND（Nishibata及びItai，  Tetrahedron，  47：8985（1991））。LEGENDは、Molecular  Simulations、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能である。
【０１１２】
2．  LUDI（Bohm，  “The  Computer  Program  LUDI：A  New  Method  for  the  De  Novo  Design  of  Enzyme  Inhibitors”，  J．  Comp．  Aid．  Molec．  Design，  6：61−78（1992））。LUDIは、Biosym  Technologies、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能である。
【０１１３】
3．  LeapFrog（Tripos  Associates、ミズーリ州セントルイスから入手可能）。
分子モデリングの変型が本発明において有用である可能性もあり、そしてこれには：Cohenら，  “Molecular  Modeling  Software  and  Methods  for  Medicinal  Chemistry”，  J．  Med．  Chem．，  33．  883−94（1990）；並びにNavia及びMurcko，  “The  Use  of  Structural  Information  in  Drug  Design”，  Current  Opinions  in  Structural  Biology，  2：202−10（1992）が含まれる。
【０１１４】
コンピュータを使用することによって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに対するモデルリガンド結合の効率を評価し、そして最適化することも可能である。例えば、有効なウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ阻害剤は、結合に際して比較的小さい変形を誘導することも可能であり、すなわち、結合状態及び未結合状態のエネルギーは、同程度であろう。したがって、1つの態様において、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ阻害剤は、好ましくは、結合に際して、約8kcal／mol以下の変形エネルギーを有するはずである。ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ阻害剤が、1より多いコンホメーションで該シンターゼに結合可能である場合、変形結合エネルギーは、結合コンホメーションの平均エネルギーから未結合溶液中のエネルギーを差し引いた差分である。リガンド及びシンターゼ間のコンピュータを使用した反発電荷相互作用によって、結合をさらに増進させることも可能である。同様の方式で、双極子−双極子相互作用を減少させることも可能である。好適には、リガンド及びウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ間の純双極子−双極子相互作用及び電荷相互作用は、結合を支持する。
【０１１５】
変形のエネルギー、並びに静電反発力及び静電気引力のエネルギーを評価するのに有用なコンピュータソフトウェアには：Gaussian  92、改訂版C、M．J．  Frisch、Gaussian，  Inc．、ペンシルバニア州ピッツバーグ、（C）1992；AMBER、バージョン4．0、P．A．  Kollman、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、（C）1994；QUANTA／CHARMM、Molecular  Simulations，  Inc．、マサチューセッツ州バーリントン、（C）1994；及びInsight  II／Discover（Biosysm  Technologies  Inc．、カリフォルニア州サンディエゴ、（C）1994）が含まれる。これらのアプリケーションを適切なワークステーション上で用いることも可能である。他のハードウェア系及びソフトウェアパッケージは、当業者に周知であろう。
【０１１６】
次いで、官能基を変化させて、結合特性又は阻害特性を改善することによって、モデル・ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ結合化合物を修飾することも可能である。修飾基は、サイズ、体積、並びに極性官能基及び疎水性官能基の分布が同様であることも可能であるし、又は異なることも可能である。上述のコンピュータモデリング法によって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼへの適合に関して、修飾化合物を解析することも可能である。
【０１１７】
本発明の1つの側面は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼに結合し、そして該シンターゼの酵素活性を阻害することが可能な阻害剤を同定する方法であって：（a）適切なコンピュータプログラムに、基質に結合可能なアミノ酸の第一の原子座標を含むウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの結合部位を定義する情報を導入し、ここで該プログラムはその三次元構造を提示する；（b）コンピュータプログラムにおいて、試験化合物の三次元モデルを生成し；（c）活性部位の構造上に試験化合物モデルを提示し、そしてスーパーインポーズし；（d）試験化合物モデルが、空間的に活性部位に適合するかどうかを評価し；（e）試験化合物を生物学的シンターゼ活性アッセイに取り込み；そして（f）試験化合物がアッセイ中で酵素活性を阻害するかどうかを決定することを含む、前記方法を含む。
【０１１８】
該方法は、コンピュータプログラムに、基質に結合した水分子の第二の原子座標を導入することをさらに含むことも可能である。それによって、潜在的阻害剤結合の自由エネルギーに、結合した水の置換が含まれることも可能である。
【０１１９】
1つの態様において、該方法は、コンピュータプログラムに、該シンターゼのアミノ酸残基配列、又はその部分を導入することを含む。1つの好ましい態様において、該方法は、コンピュータプログラムに、配列Asn−Trp−Thrを含むシンターゼの最初の310らせん（H3a、表1Bを参照されたい）の第三の原子座標を導入することを含む。別の態様において、該方法は、コンピュータプログラムに、アルファらせん、第二の310らせん、ベータシートの鎖、及びコイルからなる群より選択される、少なくとも1つのシンターゼ構造要素の第四の原子座標を導入することをさらに含む。
【０１２０】
該方法のさらに別の態様において、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ構造要素は、本質的に、コイル及び（a）His  Ile  Gly  Ile  Ile  Met（配列番号8）からなる第一のベータシート鎖、又はその相同体、及び第二のコイル；（b）Asn  Gly  Arg  Trp  Ala  Lys（配列番号9）からなる第一のアルファらせん、又はその相同体、及び第三のコイル；（c）Arg  Val  Phe  Gly  His  Lys  Ala  Gly  Met  Glu  Ala  Leu  Gln  Thr  Val  Thr  Lys  Ala  Ala  Asn  Lys  Leu（配列番号10）からなる第二のアルファらせん、又はその相同体、及び第四のコイル；（d）Val  Ile  Thr  Val  Tyr  Ala（配列番号11）からなる第二のベータシート鎖、又はその相同体、及び第五のコイル；（e）Asn  Trp  Thrからなる第一の310らせん、及び第六のコイル；（f）Asp  Gln  Glu  Val  Lys  Phe  Ile  Met  Asn  Leu  Pro  Val  Glu  Phe  Tyr  Asp  Asn  Tyr  Val  Phe  Glu  Leu  His  Ala（配列番号12）からなる第三のアルファらせん、又はその相同体、及び第七のコイル；（g）Lys  Ile  Gln  Met  Ile（配列番号13）からなる第三のベータシート鎖、又はその相同体、及び第八のコイル；（i）Lys  Gln  Thr  Phe  Glu  Ala  Leu  Thr  Lys  Ala  Glu  Glu  Leu  Thr（配列番号14）からなる第四のアルファらせん、又はその相同体、及び第九のコイル；（j）Ile  Leu  Asn  Phe  Ala  Leu（配列番号15）からなる第四のベータシート鎖、又はその相同体、及び第十のコイル；（k）Gly  Arg  Ala  Glu  Ile  Thr  Gln  Ala  Leu  Lys  Leu  Ile  Ser  Gln  Asp  Val  Leu（配列番号16）からなる第五のアルファらせん、又はその相同体、及び第11のコイル；（l）Glu  Glu  Leu  Ile  Gly（配列番号17）からなる第六のアルファらせん、又はその相同体、及び第12のコイル；（m）Phe  Thr  Gln  His（配列番号18）からなる第七のアルファらせん、又はその相同体、及び第13のコイル；（n）Leu  Ile  Ile  Arg（配列番号19）からなる第五のベータシート鎖、又はその相同体、及び第14のコイル；（p）Glu  Leu  Tyr  Phe（配列番号20）からなる第六のベータシート鎖、又はその相同体、及び第16のコイル；（q）Trp  Pro  Aspからなる第三の310らせん、及び第17のコイル；及び／又は（r）Glu  Ala  Ala  Leu  Gln  Glu  Ala  Ile  Leu  Ala  Tyr  Asn（配列番号21）からなる第八のアルファらせん、又はその相同体、及び第18のコイルからなる。
【０１２１】
該方法のさらに別の態様において、第二のコイルは第一のアルファらせんに連結され、第三のコイルは第二のアルファらせんに連結され、第四のコイルは第二のベータシート鎖に連結され、第五のコイルは第一の310らせんに連結され、第六のコイルは第三のアルファらせんに連結され、第七のコイルは第三のベータシート鎖に連結され、第八のコイルは第四のアルファらせんに連結され、第九のコイルは第四のベータ鎖に連結され、第十のコイルは第五のアルファらせん鎖に連結され、第11のコイルは、第六のアルファらせんに連結され、第12のコイルは第七のアルファらせんに連結され、第13のコイルは第五のベータ鎖に連結され、第14のコイルは第二の310らせんに連結され、第15のコイルは第六のベータシート鎖に連結され、第16のコイルは第三の310らせんに連結され、そして／又は第17のコイルは第八のアルファらせんに連結される。この説明において、数字の形容詞、第一の、第二の、などは、必ずしも時間的順序又は空間的順序を示さず、むしろ、単に、そうでなければ同様に命名された要素を、互いに区別するためのものである。
【０１２２】
当業者が認識するであろうように、三次元構造を知ることで、分子置換法によって、阻害剤に結合したウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの結晶構造を解くことが可能になり、そして阻害剤の結合コンホメーションを決定するのに差フーリエ解析法を使用することが可能になる。次いで、結合コンホメーションを知ることで、よりよい特性を持つ阻害剤の設計が可能になる。
【０１２３】
同様に、三次元構造を知ることで、使用者が、分子置換法によって、他のいかなる生物由来のウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの構造も解くことが可能になる。
また、三次元構造を知ることで、使用者が、分子置換法によって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ突然変異体の構造を解くことが可能になり、これをウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ活性のプローブとして用いることも可能である。
【０１２４】
実施例
以下の限定されない実施例を提示して、本発明をさらに例示する。
（実施例1）
阻害剤の設計
図2に同定するような、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチド鎖の原子座標を、コンピュータ中で用いて、活性部位の三次元モデルを構築することも可能である。推定上の競合的阻害剤を酵素の結合部位に適合させることも可能である。1つのこうした推定上の阻害剤は、（2Z，6E，10E）−4−メチル−ゲラニルゲラニル二リン酸（Ohnumaら，  FEBS  Lett．，  257：71−74（1989）を参照されたい）である。推定上の阻害剤を修飾して、構造的に関連する化合物のバーチャルライブラリーを用意することも可能である。次いで、ドッキングプログラムを用いて、該シンターゼと各化合物の相互作用を評価し、そしてシンターゼに対する化合物の相対的結合を比較し、そしてランク付けすることも可能である。
【０１２５】
該シンターゼに比較的高い親和性を有するようである化合物を得るか又は合成して、そして生化学的アッセイ又は生物学的アッセイで評価することも可能である。適切な生物学的アッセイは、例えば細菌懸濁培養物の濁度の変化による、増殖測定であることも可能である。
【０１２６】
（実施例2）
新規リガンドを同定するための、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ活性の阻害剤の使用
既知の阻害剤、例えば（S）−ファルネシルチオピロリン酸、又は基質、例えばファルネシルピロリン酸を用いることによって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ基質結合部位に結合可能な新規リガンドを同定することも可能である。該シンターゼの有用な基質には、イソプレニルピロリン酸（C5PP）及びファルネシルピロリン酸（C15PP）に加えて、C20PP、C25PP、C30PP、C35PP、C40PP、C45PP、及びC50PPが含まれ、ここで下付き文字は、イソプレノイド鎖中の炭素原子の数を表す。（S）−ファルネシルチオピロリン酸の特性は、Chenら，  J．  Biol．  Chem．，  277：7369（2002）に記載される。
【０１２７】
基質結合部位を定義する情報を有する適切なコンピュータプログラムに、既知の阻害剤又は基質の原子特徴を導入する。典型的には、該情報には、図2に同定するように、既知のシンターゼ基質に結合可能なアミノ酸の原子座標が含まれる。次いで、コンピュータプログラムは、結合部位の三次元構造を提示することも可能である。次いで、コンピュータプログラムにおいて、試験化合物の三次元モデルを生成することも可能である。
【０１２８】
ドッキングプログラムを用いて、試験化合物モデルを結合部位の構造にドッキングさせることも可能である。すなわち、該プログラムは試験分子を結合部位に適合させ、分子の結合の回転を可能にして、試験分子のいくつかのコンホメーションを試験し、そして適合の特性を評価する。同様に、該シンターゼの基質又は阻害剤の三次元モデルを生成し、そしてドッキング情報を得ることも可能である。次いで、試験化合物のドッキングパラメーターを基質又は既知の阻害剤のものに比較することも可能である。次いで、ドッキングプログラムは、シンターゼに対する各試験分子又は比較分子の会合パラメーターをランク付けすることも可能なアウトプットを提供することも可能である。
【０１２９】
その結果、結合部位に高親和性を有する可能性が最も高い候補化合物を容易に同定可能である。最も強力な試験化合物を合成するか、又は別の方式で得ると、生化学的解析又は生物学的解析用の物理的分子を提供可能である。
【０１３０】
該方法は、場合によって、座標がコンピュータプログラムに利用可能であるように、基質に結合した水分子の原子座標を導入することを含むことも可能である。場合によって、当業者は、コンピュータプログラムに、少なくとも1つのシンターゼ構造要素の原子座標を導入することも可能である。典型的な構造要素は、アルファらせん、310らせん、ベータシート鎖、及びコイルである。310らせんは、配列Asn  Trp  Thrを有することも可能であり、これは基質と結合可能なポリペプチドループの一部である。
【０１３１】
該方法はまた、場合によって、試験化合物を、シンターゼの生化学的シンターゼ活性アッセイに取り込み；そして次いで、試験化合物が、アッセイにおいてシンターゼ活性を阻害するかどうかを決定することを含むことも可能である。例えば生物学的アッセイによって、細胞浸透性研究、生存度研究、及び菌血症研究において、適切な阻害剤をさらに評価することも可能である。
【０１３２】
（実施例3）
ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼアッセイ
標準法によって、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ活性を測定することも可能である。推定上の阻害剤の非存在下及び存在下、in  vitroでシンターゼ活性を測定して、該シンターゼに対する直接の影響に関する情報を得ることも可能である。比較して、推定上の阻害剤の非存在下及び存在下、生存細菌を用いて測定すると、in  vitro解析と比較した際、細胞浸透の情報を得ることも可能である。当業者は、ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ基質及びその近縁類似体が、正常条件下で、実質的に細胞不透過性であることを認識するであろう。
【０１３３】
in  vitro解析の1つの適切な方法は以下のとおりである。［14C］−IPP（55mCi／mmol）を、適切な緩衝溶液中、IPP（2〜400μM）、FPP（0．2〜10μM）、及びシンターゼ（0．01〜0．1μM）の存在下で、25℃で最長20分間インキュベーションする。適切な緩衝溶液は、50mM  KCl、0．5mM  MgCl2、100mM  KOH−HEPES、pH7．5中の0．1％  TritonX−100である。速度を測定するため、反応混合物のアリコットを定期的な時間間隔で取り除き、そして10mM  EDTAの溶液と混合して反応を停止する。1−ブタノールで反応産物を抽出し、相分離し、そしてシンチレーション計測によって、放射能物質を測定する。ウンデカプレニルピロリン酸を含有するブタノール相を蒸発させて、そして4．4単位／mlの酸ホスファターゼ、0．1％  TritonX−100、及び50mM酢酸ナトリウム、pH4．7を含有する20％プロパノール溶液中で、ピロリン酸基を加水分解することも可能である。生じたポリプレノールを1−ヘキサンで抽出し、そして逆相TLCプレート上にスポッティングし、そして移動相としてアセトン／水（19：1）を用いて展開する。次いでオートラジオグラフィーによって、TLCプレートを解析する。
【０１３４】
当業者は、推定上の阻害剤の非存在下及び存在下で、上述のアッセイを用い、in  vitroでシンターゼ活性を測定することも可能である。
同等物
本発明の具体的な態様を論じてきたが、上記明細は、例示であって限定ではない。本明細書を再検討すると、当業者には、本発明の多くの変型が明らかとなるであろう。付随する請求項は、その同等物の完全な範囲を伴って請求項を参照することによって、そしてこうした変型を伴って明細書を参照することによって、解釈しなければならない。
【０１３５】
本明細書に言及するすべての刊行物及び特許は、本明細書に列挙する項目を含めて、各個々の刊行物又は特許が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるかのように、本明細書に完全に援用される。不一致の場合は、本明細書のいかなる定義も含めて、本明細書が支配するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図1は、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ二量体の結晶構造の図解である。
【図２】図2は、肺炎連鎖球菌ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼの（A）及び（B）ポリペプチド鎖の原子座標を示す。配列番号1と比較した際のアミノ酸残基番号は、左から右に読むと、6番目の列に見られる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2006524048.tif 000070
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