(57)【要約】   ヒトＭＡＰＫ遺伝子はＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能に関連する疾患の治療上の標的である。ＭＡＰＫの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンのモジュレーターを同定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を提供する工程と、 
（ｂ）試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させる工程と、 
（ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路調節剤として同定する工程と 
を含む、候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路調節剤を同定する方法。 
【請求項２】
アッセイ系がＭＡＰＫポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養細胞がさらに欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有する、請求項２に記載の方法。 
【請求項４】
アッセイ系がＭＡＰＫポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。 
【請求項５】
アッセイがキナーゼアッセイである、請求項４に記載の方法。 
【請求項６】
アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、及び低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 
【請求項７】
アッセイ系がＭＡＰＫポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。 
【請求項８】
アッセイ系がＭＡＰＫ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。 
【請求項９】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項８に記載の方法。 
【請求項１０】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項８に記載の方法。 
【請求項１１】
（ｄ）（ｃ）で同定された候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路調節剤を、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出する工程 
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項１２】
モデル系が欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有するマウスモデルである、請求項１１に記載の方法。 
【請求項１３】
Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能に欠陥がある細胞を、ＭＡＰＫポリペプチドと特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能が修復される、細胞のＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節する方法。 
【請求項１４】
Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項１３に記載の方法。 
【請求項１５】
候補モジュレーターが抗体及び小分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。 
【請求項１６】
（ｅ）ＭＡＰＫを発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供する工程と、 
（ｆ）二次アッセイ系を（ｂ）の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させる工程と、 
（ｇ）作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性を検出する工程 
をさらに含み、作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路調節剤であることが同定され、 
ここで第２アッセイが作用剤の影響を受けたＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路における変化を検出する、請求項１に記載の方法。 
【請求項１７】
二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１８】
二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１９】
非ヒト動物がＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の細胞をＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節する方法。
【請求項２１】
Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項２０に記載の方法。 
【請求項２２】
作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項２０に記載の方法。 
【請求項２３】
（ａ）患者から生体試料を得る、 
（ｂ）試料をＭＡＰＫ発現用のプローブと接触させる、 
（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較する、及び 
（ｄ）工程（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定する
ことを含む、患者の疾病を診断する方法。 
【請求項２４】
前記疾病が癌である、請求項２３に記載の方法。 
【請求項２５】
前記癌が、表１に示すように２５％より高い発現レベルである癌である、請求項２４に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及） 
本出願は、２００２年１１月２５日出願の米国特許仮出願第６０／４２９，０６１号及び２００２年１２月３０日出願の同第６０／４３７，１６３号の優先権を主張するものである。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景） 
細胞移行は正常な発達と生理的プロセス（例えば、被包、嚢胚形成、及び創傷治癒）を構成する重要な部分であり、また腫瘍の進行と転移、血管形成、炎症及びアテローム性動脈硬化症においても重要である。細胞移行のプロセスには、シグナルに応じた細胞間及び細胞−基質間の相互作用、並びにアクチン及び微小管細胞骨格の再編成が伴う。Ｒｈｏ／Ｒａｃファミリーの小ＧＴＰａｓｅは様々な分子と相互作用し、細胞運動性、細胞間接着及び細胞−基質間接着を制御する。Ｃｄｃ４２及びＲａｃは、細胞移行を開始させるのに必要な膜状仮足及び糸状仮足の形成に関係しており、Ｒｈｏは張力繊維及び局所接着の形成を制御している。Ｒｈｏ／Ｒａｃタンパク質はカドヘリン／カテニン媒介性の細胞間接着、及びインテグリンの下流の機能の効果器であり、細胞接着及び運動性に重要な細胞骨格の変化を制御する成長因子である。
線虫のＲｈｏ／Ｒａｃファミリーには５つのメンバーが存在する。ｒｈｏ−１は、ヒトＲｈｏＡ及びＲｈｏＣに最も近いタンパク質をコードし、ｃｄｃ−４２はヒトＣｄｃ４２のオルソログをコードし、そしてｃｅｄ−１０、ｍｉｇ−２、及びｒａｃ−２はＲａｃ関連タンパク質をコードする。ｃｅｄ−１０、ｍｉｇ−２及びｒａｃ−２は、虫の細胞数及び軸索移行の制御において一部重複する機能を有し、これら遺伝子の２つ又は全てを不活性化することにより、単一の突然変異と比較して遊走欠陥が亢進される。さらに、ｃｅｄ−１０とｍｉｇ−２の二重突然変異は、いずれの単一突然変異にも見られない肉眼的な形態上の欠陥と運動欠陥を有し、これは形態形成段階における細胞遊走又は細胞移行の欠陥の二次的な影響と考えられる。これらの欠陥には、完全貫通刺胞非協調表現型、並びに不定貫通刺胞遅成長欠陥、産卵口欠陥、萎縮した尾部、及び無菌性欠陥が含まれ、これらのいずれもが各単一突然変異には見られない。
【０００３】
βカテニンは、接着ジャンクションタンパク質である。接着ジャンクション（ＡＪ：Adherents Junction、接着帯とも呼ばれる）は、器官の表面上に並んでいるような上皮層の確立及び維持に重要な要素である。ＡＪは細胞間の接着を媒介し、隣接する細胞が存在するというシグナルを伝達し、アクチン細胞骨格を固着させる。このような役割を果たすうえで、ＡＪは通常の細胞成長及び細胞行動を調節している。胚形成、創傷治癒、及び腫瘍細胞転移といった複数の段階において、細胞は上皮を形成し、残していく。このプロセスは、上皮の細胞間接触の破壊と再構成を伴い、ＡＪの分解と組み立てにより調節される。ＡＪは「接触阻害」シグナルの伝達に寄与し、該信号は細胞に対し、上皮シートが完成したら分裂を止めるよう指示する。
ＡＪは、カドヘリンと呼ばれるカルシウム調製細胞接着分子の周りに集まった多タンパク質複合体である（Peifer, M.(1993) Science 262: 1667-1668）。カドヘリンは膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは隣接する細胞のカドヘリンとのホモタイプの接着を媒介し、細胞間ドメインは、接着シグナルを伝達してＡＪをアクチン細胞骨格に固着させる細胞質タンパク質と相互作用する。このような細胞質タンパク質には、α、β、及びγカテニンが含まれる。βカテニンタンパク質は、デスモソーム（別の種類の細胞内ジャンクション）に見られるプラコグロビン、及びショウジョウバエの断片極性遺伝子である「アルマジロ」の双方と７０％のアミノ酸同一性を共有する。アルマジロはショウジョウバエの多タンパク質ＡＪ複合体の一部であり、αカテニンとカドヘリンの相同体も含み、遺伝子研究により細胞接着と細胞骨格の整合性を必要とすることが示されている。
【０００４】
βカテニンは、細胞接着要素としてのその役割に加え、Ｔｃｆ及びＬｅｆ転写因子のファミリーとの相互作用によりＷｎｔシグナル伝達経路において転写共活性化因子として機能する（参考として、Polakins, (1999) Current Opinion in Genetics & Development, 9:15-21 及び Gat U.他, (1998) Cell 95:605-614を参照のこと）。
大腸癌、黒色腫、卵巣癌、及び前立腺癌を含む様々なヒト腫瘍の発達の初期に、βカテニンシグナル伝達の調節解除が頻繁に起こる。腫瘍抑制遺伝子であるＡｘｉｎ又はＡＰＣにおける機能喪失型突然変異、及びオンコジーンβカテニン自体の機能獲得型突然変異により、腫瘍細胞中にβカテニンシグナル伝達の活性化が起こる。Ａｘｉｎは通常、βカテニン、ＡＰＣ、及びセリン／スレオニンキナーゼＧＳＫ３−βに結合する足場タンパク質として機能する。この分解複合体の集合により、ＧＳＫ３−βによってβカテニンがリン酸化されることになり、その結果プロテアソームによる分解とβカテニンのユビキチン化が起こる。Ａｘｉｎ活性が無いと、βカテニンタンパク質は安定し、核に蓄積されてそこでＴＣＦの転写活性化補助因子として機能し、細胞周期制御因子サイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃを含む標的遺伝子の誘導に参画する。
【０００５】
結腸の腺腫様ポリポーシスの変異体であるＡＰＣ遺伝子は、βカテニンのシグナル伝達の負の制御因子である（Korinek, V.他, (1997) Science 275:1784-1787; Morin, P.J.他 (1997) Science 275:1787-1790）。ＡＰＣタンパク質は通常βカテニンに結合するもので、他のタンパク質（グリコーゲン合成キナーゼ−３ｂ及びアキシンを含む）と組み合わされて、ｂ−カテニンの効率的な分解に必要とされる。βカテニンを制御することは、ＡＰＣの腫瘍抑制効果に重要な要素であり、このような制御はＡＰＣまたはβカテニンの突然変異により回避することができる。 
哺乳動物が単一のβカテニン遺伝子しか有していないのに対し、線虫は３つのβカテニンを有する（Korswagen HC, 他 (2000) Nature 406:527-32）。各虫のβカテニンはそれぞれ固有の機能を行うと考えられる（Korswagen HC, 他 (2000) Nature 406:527-32, Nartarajan L 他 (2001) Genetics 159:159-172）。線虫における機能の相違により、線虫βカテニンＨＭＰ−２が媒介する、細胞接着におけるβカテニンの役割を特に研究することが可能である。
【０００６】
線虫遺伝子ｐｒｙ−１は、脊椎動物Ａｘｉｎの構造的及び機能的オルソログである（Korswagen HC等 (2002) Genes Dev. 16:1291-302）。ＰＲＹ−１は、Ａｘｉｎ中でＡＰＣとＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄにそれぞれ結合する保存されたＲＧＳ及びＤＩＸドメインを含むと予想される。ゼブラフィッシュにおける線虫ｐｒｙ−１遺伝子の過剰発現は、マスターブラインド（ｍａｓｔｅｒｂｌｉｎｄ）の突然変異表現型であるゼブラフィッシュＡｘｉｎ１突然変異を完全に救出することができる。ｐｒｙ−１機能喪失型突然変異はβカテニンシグナル伝達の増大に起因すると思われる複数の表現型を産生する（Gleason JE等 (2002) Genes Dev. 16:1281-90; Korswagen等、上掲）。
マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ４（ＭＡＰ４Ｋ４）は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化するセリン−スレオニンキナーゼであり、ＴＮＦαシグナル伝達に関与していると思われる（Yao, Z.等 (1999) J Biol Chem 274:2118-25; Huang, T. T.等 (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:1014-9）。
【０００７】
ＫＩＡＡ０５５１は、ＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路を活性化するマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ６（ＭＡＰ４Ｋ６）に対して高い類似性を有するタンパク質である。
Ｍｉｓｓｈａｐｅｎ／ＮＩＫ関連キナーゼ（ＭＩＮＫ）はキナーゼの胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）ファミリーのメンバーである。ＭＩＮＫはｃＪｕｎ  Ｎ末端キナーゼとｐ３８経路を活性化する（Dan, I.等 (2000) FEBS Lett 469:19-23）。
【０００８】
線虫などモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子及び経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与及びこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路及びこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる（たとえば、Dulubova I等、J Neurochem 2001 Apr;77(1):229-38; Cai T等、Diabetologia 2001 Jan;44(1):81-8; Pasquinelli AE等、Nature. 2000 Nov 2;408(6808):37-8; Ivanov IP等、EMBO J 2000 Apr 17;19(8):1907-17; Vajo Z等, Mamm Genome 1999 Oct;10(10):1000-4参照）。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現（たとえばノックアウト）または過剰発現（「遺伝的エントリーポイント（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｔｒｙ  ｐｏｉｎｔ）」と呼ばれる）を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントにより引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンなどの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。 
【０００９】
参照した特許、特許出願、公開公報、及びＧｅｎｂａｎｋ識別番号を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。 
【００１０】
（発明の概要） 
本発明者らは、線虫でＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）と呼ぶ。本発明は、これらのＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンモディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能及び／又はＭＡＰＫ機能の欠陥又は不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＭＡＰＫ調節剤を同定する方法を提供する。好ましいＭＡＰＫ調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、ＭＡＰＫポリペプチドに特異的に結合してＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を修復する。他の好ましいＭＡＰＫ調節剤は、アンチセンスオリゴマーやＲＮＡｉなど、たとえば対応する核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによってＭＡＰＫ遺伝子発現または生成物の活性を抑制する核酸モジュレーターである。 
【００１１】
ＭＡＰＫ調節剤は、ＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいインビトロまたはインビボのアッセイによって評価することができる。一実施態様では、ＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補ＭＡＰＫ調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。ＭＡＰＫ調節剤には、ＭＡＰＫ関連タンパク質（たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ＭＡＰＫに特異的な抗体；ＭＡＰＫに特異的なアンチセンスオリゴマー及び他の核酸モジュレーター；ＭＡＰＫと特異的に結合するか相互作用する、または（例えばＭＡＰＫ結合パートナーに結合することにより）ＭＡＰＫ結合パートナーと競合する化学剤が含まれる。特定の一実施態様では、キナーゼアッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施態様では、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管新生アッセイ、及び低酸素誘発アッセイから選択される。 
【００１２】
別の実施態様では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、細胞死、または細胞増殖の変化など、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路における変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路調節剤をさらに試験する。第２アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施態様では、この二次アッセイ系は、血管新生、細胞死、または細胞増殖の疾患（たとえば癌）などＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。 
【００１３】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のＭＡＰＫ機能及び／又はＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。 
【００１４】
（発明の詳細な記載） 
線虫における細胞遊走にも影響するＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路のモディファイヤーを同定するために遺伝子スクリーニングが設計された。Ｒａｃモディファイヤーについては、線虫の細胞遊走にも影響するＲａｃシグナル伝達経路のモディファイヤーを同定するためのスクリーニングが設計され、様々な特異的遺伝子をｃｅｄ−１０とｍｉｇ−２の二重突然変異背景においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により沈黙させた。Ａｘｉｎモディファイヤーについては、機能低下型ｐｒｙ−１（ａｘｉｎ）突然変異を使用した。βカテニンモディファイヤーについては、βカテニンの弱い対立遺伝子を使用した（βカテニンのホモ接合性生突然変異である対立遺伝子ｑｍ３９）。ｈｍｐ−２（ｑｍ−３９）染色により、第一段階の幼虫（Ｌ１）に貫通刺胞の多い不完全な体という表現型を持つ幼虫が生成された。様々な特異的遺伝子をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により沈黙させた。線虫の遺伝子を沈黙させるためのＲＮＡｉの使用方法は、従来技術に既知である（Fire A等、1998 Nature 391:806-811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); WO9932619）。ＺＣ５０４．４遺伝子が、上記のスクリーニングの全てにおいて虫の表現型に変化をもたらすモディファイヤーとして同定され、またＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、このモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるＭＡＰＫ遺伝子（すなわち核酸及びポリペプチド）は、癌などのＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンシグナル伝達経路の欠陥に関連する病変の治療における魅力的な薬剤標的である。 
【００１５】
本発明では、ＭＡＰＫ機能を評価するインビトロ及びインビボの方法を提供する。ＭＡＰＫまたはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態及び病態におけるＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路とそのメンバーとの関連性を理解し、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンに関連する病状の診断方法及び治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば酵素（たとえば触媒）活性または結合活性などのＭＡＰＫ機能に影響を与えてＭＡＰＫの発現を阻害または亢進することによって作用するＭＡＰＫ調節剤を同定することができる。ＭＡＰＫ調節剤は、診断、治療、及び製薬の開発に有用である。 
【００１６】
本発明の核酸及びポリペプチド 
本発明で使用することができるＭＡＰＫ核酸及びポリペプチドに関連する配列は、核酸はＧＩ＃２２０４１０６７（配列番号１）、２０５２１０８２（配列番号２）、１０４３９３４１（配列番号３）、６１１０３５１（配列番号４）、６１１０３５６（配列番号５）、６１１０３５９（配列番号６）、６１１０３６１（配列番号７）、６１１０３６４（配列番号８）、１７５１２１９５（配列番号９）、６１１０３４９（配列番号１０）、３３４１６３０９（配列番号１１）、２２０３５６０１（配列番号１２）、４７５８５２３（配列番号１３）、１８５５３０５５（配列番号１４）、３３２７１８７（配列番号１５）、６８０８４５８（配列番号１６）、１０４３８１７９（配列番号１７）、７０２２４２４（配列番号１８）、２２０３５６０３（配列番号１９）、２２０３５６０５（配列番号２０）、７６５７３３４（配列番号２１）、２１９６１５９４（配列番号２２）、２１３２１０２７（配列番号２３）、２１７５６１４３（配列番号２４）、２７４３６９１５（配列番号２５）、２７４３６９１６（配列番号２６）、２７４３６９１８（配列番号２７）、２０５４９２２７（配列番号２９）、５３４０６７９（配列番号３０）、及び３１８７４８４７（配列番号３１）、ポリペプチドはＧＩ＃６１１０３５０（配列番号３６）、２２０３５６０２（配列番号３７）、７６５７３３５（配列番号３８）、及び２０５４９２２８（配列番号４０）として、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されている（Ｇｅｎｂａｎｋ識別（ＧＩ）番号により参照）。加えて、配列番号２８、３２、３３、３４、及び３５の核酸配列、並びに配列番号３９のアミノ酸配列も本発明に使用できる。
【００１７】
用語「ＭＡＰＫポリペプチド」とは、完全長のＭＡＰＫタンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」ＭＡＰＫ断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型ＭＡＰＫタンパク質に関連する機能活性を１つまたは複数示す。ＭＡＰＫタンパク質、誘導体及び断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって（Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット）また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。一実施態様では、例えば細胞に基づくアッセイ又は動物アッセイにおいて、機能的に活性のあるＭＡＰＫポリペプチドは、内因性ＭＡＰＫ活性の欠陥を救援する能力を有するＭＡＰＫ誘導体であり、救援誘導体は同じ種由来でも、異なる種由来でもよい。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、キナーゼドメインや結合ドメインなどＭＡＰＫの構造ドメインを１つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2）。たとえば、配列番号３６、３７、３８、３９のＭＡＰＫのＣＮＨドメイン（ＰＦＡＭ００７８０）は、概ね、アミノ酸残基１０１８−１３０９、８４５−１１４４、９８２−１２７３、及び１２０９−１５５６にそれぞれ位置している。さらに、配列番号３６、３７、３８、３９のタンパク質キナーゼドメイン（ＰＦＡＭ０００６９）は、概ね、アミノ酸残基２５−２８９、２５−２８９、２５−２８９、及び２５−３１３にそれぞれ位置している。ＭＡＰＫポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施態様では、好ましい断片は、機能的に活性のある、ＭＡＰＫの少なくとも２５個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは７５個、最も好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施態様では、この断片はキナーゼ（の機能的に活性のある）ドメインの全体を含む。 
【００１８】
用語「ＭＡＰＫ核酸」とは、ＭＡＰＫポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。好ましくは、このＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトＭＡＰＫと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。オルソログの同定方法は当技術分野において既知である。通常、異なる種のオルソログは、１つ以上のタンパク質モチーフの存在及び／または３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、ＢＬＡＳＴ分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴ結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域及び／または残基をハイライトし、系統樹を作製してもよい。多様種の多重相同シーケンス（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソログシーケンスは、それら２種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法（例えばＰｒｏＣｅｒｙｏｎ（バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク）を使用したもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、線虫など単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある（パラログ）。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410;http://blast.wustl.edu/blast/README.html）によって作製されたギャップを導入した後の、対象配列（またはその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。％同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。 
【００１９】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。 
【００２０】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される（Smith及びWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute ; Smith及びWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197; Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)及びこれに引用される参考文献であるW. R. Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.）、Gribskovによって正規化された（Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763）スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（たとえば、ギャップ隙間ペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸張ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。 
【００２１】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、ＭＡＰＫの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイズ及び洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている（たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０である）、５×デンハルト溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間〜終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行い；６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ及び０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行い、；０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄する高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＡＰＫのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【００２２】
他の実施態様では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理し；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／体積）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行い；次いで、２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液で２度、１時間５５℃で洗浄する、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。 
【００２３】
あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間〜終夜、３７℃でインキュベートし；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行い；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間洗浄する、低いストリンジェントな条件を使用することができる。 
【００２４】
ＭＡＰＫ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション 
ＭＡＰＫ核酸及びポリペプチドは、ＭＡＰＫ機能を調節する薬剤の同定及び試験、ならびにＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路におけるＭＡＰＫの関与に関連する他の用途に有用である。ＭＡＰＫ核酸ならびにその誘導体及びオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、目的のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない（たとえば融合タンパク質の生成）。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などＭＡＰＫ機能を評価するのに使用するアッセイのためのＭＡＰＫタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる（たとえば、Higgins SJ及びHames BD編、Protein Expression:A PＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンtical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク）。具体的な実施態様では、組換えＭＡＰＫは、欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有することで知られている細胞系で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
【００２５】
ＭＡＰＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、ネイティブＭＡＰＫ遺伝子及び／またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／または特異的にプロセッシングする単離された宿主細胞系を使用することができる。 
【００２６】
ＭＡＰＫ遺伝子産物を検出するために、発現ベクターは、ＭＡＰＫ遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、１つまたは複数の複製起点、及び１つまたは複数の選択可能なマーカー（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）を含むことができる。あるいは、インビトロアッセイ系（たとえば免疫アッセイ）におけるＭＡＰＫタンパク質の物理的または機能的特性に基づいてＭＡＰＫ遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。 
【００２７】
たとえば精製または検出を促進するために、ＭＡＰＫタンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物（すなわち、ＭＡＰＫタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている）として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用（Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111）によってキメラ産物を作製することもできる。 
【００２８】
ＭＡＰＫ遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動、精製の文献を引用）を使用して遺伝子産物を単離及び精製することができる。あるいは、標準の方法（たとえば免疫親和性精製）によって、天然源から天然に生じたＭＡＰＫタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。 
【００２９】
本発明の方法では、ＭＡＰＫまたはＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。 
【００３０】
遺伝子改変動物 
候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤の活性を試験するため、または細胞死や細胞増殖などＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路のプロセスにおけるＭＡＰＫの役割をさらに評価するために、ＭＡＰＫの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、インビボアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したＭＡＰＫの発現により、正常なＭＡＰＫ発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管新生、または細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン発現が変化していてもよい（たとえばＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンノックアウト）。好ましい遺伝子改変動物は、特に、霊長類、げっ歯類（好ましくはマウス又はラット）などの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、及びショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物（たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照）、または異種核酸が生殖系列ＤＮＡ内（すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中）に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。 
【００３１】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である（トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、Wagner他による米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling、Science、1982年、218:348〜53及び米国特許第４，６７０，３８８号参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションについては、Houdebine及びChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照；トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A PＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンtical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる（Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号参照）。
【００３２】
一実施態様では、このトランスジェニック動物は、好ましくはＭＡＰＫ発現が検出不可能または僅かとなるようにＭＡＰＫ機能の低下をもたらす、内因性ＭＡＰＫ遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子（たとえばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性ＭＡＰＫ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスＭＡＰＫ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照）げっ歯類でない哺乳動物及び他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である（Houdebine及びChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183）。好ましい実施態様では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400）。 
【００３３】
別の実施態様では、このトランスジェニック動物は、たとえばＭＡＰＫの追加のコピーを導入することによって、またはＭＡＰＫ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を作用可能に挿入することによって、ＭＡＰＫ遺伝子の発現の変化（たとえば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。 
【００３４】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236；米国特許第４，９５９，３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355；米国特許第５，６５４，１８２号）。好ましい実施態様では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6）。 
【００３５】
遺伝学の研究において欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を使用してＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をＭＡＰＫ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／または候補治療剤を与えたＭＡＰＫ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。 
【００３６】
ＭＡＰＫ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能（及びそれ以外は正常なＭＡＰＫ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するインビトロアッセイのうち１つで同定された候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤の活性をインビボで評価するために、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンノックアウトマウスを使用することができる。好ましくは、候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤をＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。 
【００３７】
調節剤 
本発明は、ＭＡＰＫの機能及び／またはＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路と相互作用し及び／またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する様々な診断及び治療用途、ならびにＭＡＰＫタンパク質及びＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＭＡＰＫ相互作用剤または調節剤を投与することによってＭＡＰＫ活性を特異的に調節する工程を含む、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節する方法も提供する。 
【００３８】
ここで使用する「ＭＡＰＫ調節剤」とは、ＭＡＰＫ機能を調節する任意の薬剤、例えば、ＭＡＰＫと相互作用してＭＡＰＫ活性を阻害又は増強するか、或いは正常なＭＡＰＫ機能にその他の影響を与える薬剤である。ＭＡＰＫ機能への影響は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、いかなるレベルでもよい。好ましい実施態様では、ＭＡＰＫ調節剤はＭＡＰＫの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、ＭＡＰＫポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはＭＡＰＫの機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、これらの用語は、（たとえば、ＭＡＰＫの結合パートナーと、またはタンパク質／結合パートナー複合体と結合してＭＡＰＫ機能を変化させることによって）ＭＡＰＫと結合パートナー、基質、またはコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施態様では、ＭＡＰＫ調節剤はＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路のモジュレーターであり（例えばＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を回復させる及び／又は上方制御する）、よってＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤でもある。 
【００３９】
好ましいＭＡＰＫ調節剤には、小分子化合物；ＭＡＰＫ相互作用タンパク質；及びアンチセンスやＲＮＡ阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第１９版に出ている。 
【００４０】
小分子モジュレーター 
小分子は多くの場合、酵素機能を有し及び／またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が１０，０００以下、好ましくは５，０００以下、より好ましくは１，０００以下、最も好ましくは５００ダルトン以下である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定ＭＡＰＫタンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてＭＡＰＫ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である（Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969; Radmann J及びGunther J、Science、2000、151:1947〜1948）。 
【００４１】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。 
【００４２】
タンパク質モジュレーター 
特異的なＭＡＰＫ相互作用タンパク質は、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、ならびに他のＭＡＰＫ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、ＭＡＰＫ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なＭＡＰＫ機能に影響を与える。別の実施態様では、ＭＡＰＫ相互作用タンパク質は、癌などＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンに関連する疾患に関連性があるので、ＭＡＰＫタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（たとえば診断上の手段用）。 
【００４３】
ＭＡＰＫ相互作用タンパク質は、ＭＡＰＫ発現、局在化、及び／または活性を調節するＭＡＰＫ経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちＭＡＰＫと自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。ＭＡＰＫモジュレーターには、ＭＡＰＫ相互作用タンパク質及びＭＡＰＫタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母ツーハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＭＡＰＫ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている（Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A PＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンtical Approach、Glover D.及びHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203; Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14; Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70; Vidal M及びLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29；米国特許第５，９２８，８６８号）。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である（たとえば、Pandley A及びMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説）。 
【００４４】
ＭＡＰＫ相互作用タンパク質は、ＭＡＰＫに特異的な抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい（たとえば、Harlow及びLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory; Harlow及びLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー: Cold Spring Harbor Loboratory Press参照）。ＭＡＰＫ抗体については以下でさらに論じる。 
【００４５】
好ましい実施態様では、ＭＡＰＫ相互作用タンパク質はＭＡＰＫタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施態様では、ＭＡＰＫ調節剤はＭＡＰＫ基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。 
【００４６】
抗体 
別の実施態様では、このタンパク質モジュレーターはＭＡＰＫに特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＭＡＰＫモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにＭＡＰＫの通常のプロセッシング及び成熟を担当するＭＡＰＫ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。 
【００４７】
周知の方法を使用してＭＡＰＫポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＭＡＰＫポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＭＡＰＫに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦＡｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、ＭＡＰＫのアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のＭＡＰＫポリペプチドスクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるＭＡＰＫのエピトープを選択することができる（Hopp及びWood、1981年、Proc. Nati.Acad. Sci. U.S.A.、78:3824〜28;Hopp及びWood、1983年、Mol. Immunol.、20:483〜89; Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66）。記載の標準手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow及びLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies: Principles and PＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンtice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク；米国特許第４，３８１，２９２号；米国特許第４，４５１，５７０号；米国特許第４，６１８，５７７号）。ＭＡＰＫの粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＭＡＰＫ断片を使用する場合は、これらは、好ましくはＭＡＰＫタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施態様では、ＭＡＰＫに特異的な抗原及び／または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。 
【００４８】
固定した対応するＭＡＰＫポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＭＡＰＫに特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。 
【００４９】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＭＡＰＫポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する（Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci.、1984、81:6851〜6855; Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のネズミ配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される（Co MS及びQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501; Morrison SL.、1992年、Ann. Rev. Immun.、10:239〜265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。 
【００５０】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＭＡＰＫ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird、Science、1988年、242:423〜426; Huston他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、85:5879〜5883; Ward他、Nature、1989、334:544〜546）。 
【００５１】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む（Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる（Harlow及びLane、1988年、上掲）。 
【００５２】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分（ｍｏｉｅｔｙ）、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。 
【００５３】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（たとえば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６；国際公開公報ＷＯ００７３４６９号）。 
【００５４】
核酸モジュレーター 
他の好ましいＭＡＰＫ調節剤としては、一般的にＭＡＰＫ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、ＤＮＡの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのＭＡＰＫ  ＲＮＡの転位、ＭＡＰＫ  ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＭＡＰＫ  ＲＮＡをスプライシングして１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得ること、またはＭＡＰＫ  ＲＮＡに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、ＭＡＰＫ核酸の機能を妨げる。 
【００５５】
一実施態様では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＭＡＰＫ  ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＭＡＰＫに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチド長である。他の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、または３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。 
【００５６】
別の実施態様では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルホリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの１つを含む、４種の異なるモルホリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯ及び他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作製方法及び使用方法は、当分野で周知である（たとえば、国際公開公報ＷＯ９９／１８１９３号；Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton J及びWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号参照）。 
【００５７】
好ましい代替ＭＡＰＫ核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811; Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年; Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年; Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001; Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年；国際公開公報ＷＯ０１２９０５８号；国際公開公報ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498）。 
【００５８】
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（たとえば、米国特許第６，１６５，７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物及び人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65）。したがって、本発明の一態様では、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路におけるＭＡＰＫの役割、及び／またはＭＡＰＫとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、ＭＡＰＫに特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンに関連する病態を処置する治療剤として、ＭＡＰＫに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。 
【００５９】
アッセイ系 
本発明は、ＭＡＰＫ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系及びスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出及び／または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＭＡＰＫ核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＭＡＰＫ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する方式でＭＡＰＫに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＭＡＰＫモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。 
【００６０】
好ましい実施態様では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性（たとえばキナーゼ活性）が系によってもたらされる条件下で、ＭＡＰＫポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＭＡＰＫ活性を、したがってＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節することが示される。アッセイに使用するＭＡＰＫポリペプチド又は核酸は、上述の核酸又はポリペプチドのいずれを含んでもよい。 
【００６１】
一次アッセイ 
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。 
【００６２】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ 
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91及び付随の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質（内因性または組換えによって生成された）、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（たとえば受容体−リガンド結合）、転写活性（たとえばレポーター遺伝子）、酵素活性（たとえば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。 
【００６３】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＭＡＰＫを組換えによって発現する系及び個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母ツーハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにＭＡＰＫ相互作用タンパク質を使用する場合、ＭＡＰＫタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理（たとえば候補ＭＡＰＫに特異的に結合する作用剤の、ＭＡＰＫ発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力）、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、免疫原性（たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でＭＡＰＫに特異的な抗体を誘発する能力）など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。 
【００６４】
スクリーニングアッセイでは、ＭＡＰＫポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＭＡＰＫポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＭＡＰＫ活性を保持しているその断片でもよい。ＭＡＰＫポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＭＡＰＫポリペプチドは、好ましくはヒトＭＡＰＫ、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施態様では、スクリーニングアッセイで、ＭＡＰＫと内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはＭＡＰＫに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＭＡＰＫ遺伝子機能を評価することができる。 
【００６５】
ＭＡＰＫモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイはハイスループットまたはウルトラハイスループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する（Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603; Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53）。好ましい一実施態様では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはＤＮＡ−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RP及びPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451）。 
【００６６】
候補ＭＡＰＫ及びＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる（例えば、特に、米国特許第６，１６５，９９２号（キナーゼアッセイ）、同第５，５５０，０１９号及び６，１３３，４３７号（アポトーシスアッセイ）、同第５，９７６，７８２号、６，２２５，１１８号及び６，４４４，４３４号（血管新生アッセイ））。好ましい特異的なアッセイを以下に詳述する。 
【００６７】
プロテインキナーゼは、膜関連か、又は細胞内の重要なシグナル伝達タンパク質であり、タンパク質基質におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からセリン、スレオニン、又はチロシン残基へのガンマリン酸の伝達を触媒する。キナーゼ活性のアッセイには[ガンマ−３２Ｐ又は−３３Ｐ]ＡＴＰからの伝達をモニタするラジオアッセイが頻繁に使用される。例えば、ｐ５６（ｌｃｋ）キナーゼ活性のシンチレーションアッセイは、ガンマ−３３ＰＡＴＰからビオチン化したペプチド基質へのガンマリン酸の転移をモニターする；基質はシグナルを伝達するストレプトアビジン被覆ビーズに捕らえられる（Beveridge M他、J Biomol Screen、(2000) 5:205-212）。このアッセイはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用する。ＳＰＡにおいては、ＳＰＡビーズの表面に拘束された受容体に結合したラジオリガンドのみが、内部に固定化されたシンチラントによって検出され、それにより自由リガンドから結合体を分離することなく、結合を測定することができる。 プロテインキナーゼ活性のほかのアッセイでは、リン酸化した基質を特異的に認識する抗体を使用できる。例えば、キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、培養細胞中の無償レセプターを刺激するリガンドによりレセプターチロシンキナーゼ活性を測定し、次いで特異的抗体で可溶化されたレセプターを培養し、ホスホチロシンＥＬＩＳＡによりリン酸化を定量化する（Sadick MD, Dev Biol Stand (1999) 97:121-133）。 プロテインキナーゼアッセイのための抗体に基づくアッセイの別の例は、ＴＲＦ（時間分解蛍光光度法）である。この方法では、ユーロピウムキレート標識した抗ホスホチロシン抗体を利用してマイクロタイタープレート上にコーティングされた重合体基質へのリン酸の転移を検出する。次いで、時間分解、乖離増強蛍光を使用してリン酸化の量を検知する（Braunwalder AF, 他, Anal Biochem 1996 Jul 1;238(2):159-64）。 
【００６８】
アポトーシスアッセイ。細胞死用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、フルオレセイン−ｄＵＴＰの取り込み（Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747）を追跡することによって細胞死に特徴的な核ＤＮＡの断片化を測定すること（Lazebnik他、1994、Nature、371、346）に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によって細胞死をさらにアッセイすることができる（Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41）。その他の細胞に基づくアッセイには、カスパーゼ−３／７アッセイ及び細胞死ヌクレオソームＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。カスパーゼ−３／７アッセイは、多数のアポトーシス経路におけるプログラム細胞死の段階で発生する事象のカスケードの一部としてのカスパーゼ切断活性の活性化に基づいている。カスパーゼ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されているＡｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）同種カスパーゼ−３／７、ｃａｔ＃６７７９０）では、溶解緩衝液と基質を混合して細胞に添加する。カスパーゼ基質は活性のカスパーゼ３／７で切断すると蛍光性となる。ヌクレオソームＥＬＩＳＡアッセイは、当技術分野の専門家に周知の通常の細胞死アッセイであり、市販されている（Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ＃１７７４４２５）。このアッセイは、ＤＮＡとヒストンそれぞれに対して方向付けられたモノクローナル抗体を使用することにより、特に細胞可溶化物の細胞質断片中の単一及び少ヌクレオソームの量を決定する定量的サンドイッチ−酵素−イムノアッセイである。ＤＮＡ断片化が原形質膜の崩壊の数時間前に起こり、細胞質中に蓄積されるという事実から、単一及び少ヌクレオソームはアポトーシスの間に細胞質中で濃縮された。アポトーシスが起こっていない細胞の細胞質断片にヌクレオソームは存在しない。アポトーシスアッセイ系は、ＭＡＰＫを発現する細胞、及び任意選択で欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞死の誘発における変化により、候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞系を使用して最初に同定された候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、ＭＡＰＫ機能が細胞死において直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＰＫを過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した細胞死応答の差により、ＭＡＰＫが細胞死応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第６，１３３，４３７号にさらに記載されている。 
【００６９】
細胞増殖及び細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡにＢＲＤＵが取り込まれることにより、ＤＮＡが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J. Immunol. Meth.、107、79）、または他の手段によって、新しく合成されたＤＮＡを検出することができる。 
【００７０】
また、ヒストンＨ３のリン酸化による有糸分裂が起こった細胞集団を同定するホスホ−ヒストンＨ３染色によって細胞増殖をアッセイする。セリン１０におけるヒストンＨ３のリン酸化は、ヒストンＨ３のセリン１０残基のリン酸化形態に特異的な抗体を用いて検出される（Chadlee, D.N. 1995, J. Biol. Chem 270:20098-105）。また、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403; Jeoung, J.、1995年、J. Biol. Chem.、270:18367〜73）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が新しく合成されるＤＮＡ中に［３Ｈ］−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ  ３８００液体シンチレーション計数器）による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。別の細胞増殖アッセイでは、染料アラマーブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手可能）を使用する。これにより、生存細胞が減少した際には、蛍光発光させて細胞数を間接的測定値を提供する（Voytik-Harbin SL他, 1998, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46）。また別の増殖アッセイであるＭＴＳアッセイは、インビトロでの化成物の細胞障害性の評価に基づき、可溶性のテトラゾリウム塩であるＭＴＳを使用する。ＭＴＳアッセイとして例えばＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水溶性非放射性細胞増殖アッセイ（Ｃａｔ．＃Ｇ５４２１）などが市販されている。
【００７１】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる（Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。たとえば、ＭＡＰＫで形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、２週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。 
【００７２】
細胞増殖は代謝的活性細胞の指標としてＡＴＰレベルを測定することによってもアッセイできる。このようなアッセイとしては、Ｐｒｏｍｅｇａ社による発光同種アッセイであるＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）などが市販されている。
【００７３】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる（Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55）。ＭＡＰＫで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期の異なる段階における細胞の蓄積を示すフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能）で評価することができる。 
【００７４】
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、ＭＡＰＫを発現する細胞、及び任意選択で欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、無細胞アッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、ＭＡＰＫ機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＰＫを過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、ＭＡＰＫが細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。 
【００７５】
血管新生。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管新生をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）；血管新生エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管新生アッセイ系は、ＭＡＰＫを発現する細胞、及び任意選択で欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この血管新生アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管新生の変化により候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤を試験する二次アッセイとして、血管新生アッセイを使用することができる。また、ＭＡＰＫ機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管新生アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＰＫを過剰発現または過少発現する細胞で血管新生アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管新生の差により、ＭＡＰＫが血管新生において直接役割を果たすことが示唆される。特に、米国特許第５，９７６，７８２号、同第６，２２５，１１８号及び同第６，４４４，４３４号に様々な血管新生アッセイが記載されている。
【００７６】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットは、インビトロで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１は、糖分解酵素やＶＥＧＦをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、ＭＡＰＫで形質移入させた細胞を（たとえばＮａｐｃｏ７００１インキュベーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発生させた０．１％のＯ２、５％のＣＯ２、及び残りはＮ２を用いた）低酸素条件下及び正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下で増殖させ、その後Ｔａｑｍａｎ（登録商標）によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、ＭＡＰＫを発現する細胞、及び任意選択で欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンが過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤が同定される。本発明の一部の実施態様では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、ＭＡＰＫ機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＭＡＰＫを過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、ＭＡＰＫが低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。 
【００７７】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡで遮断し、再度洗浄する。化合物を２×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングし、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−ＡＭなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【００７８】
細胞−細胞接着アッセイでは、天然で生じたリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をＢＣＥＣＦなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。 
【００７９】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの１つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンド及びペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチド及びモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をインサイツで使用して測定される（Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53）。 
【００８０】
細管形成。細管形成アッセイは、培養細胞、通常内皮細胞の、一般に細胞外マトリックスの環境を刺激するマトリクス基質上での管状構造形成能力をモニターする。例示的基質には、ラミニンを含む基底膜タンパク質の抽出物であるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、コラーゲンＩＶ、及び４℃で液体であり、３７℃で堅いゲル状となるヘパリン硫酸プロテオグリカンが含まれる。適切な基質としては、他に、コラーゲン、フィブロネクチン及び／またはフィブリンが挙げられる。血管新生促進刺激薬により細胞を刺激し、画像化によりその細管形成能力を検出する。通常、刺激物により一晩インキュベートした後細管が検出されるが、それよりも長い、または短い時間を採用してもよい。管腔形成アッセイも当技術分野で周知である（たとえば、Jones MK他、1999年、Nature Medicine 5:1418-1423）。これらのアッセイは伝統的に血清による刺激、または成長因子ＦＧＦまたはＶＥＧＦによる刺激を使用している。血清は、非限定的な成長因子源を意味する。好ましい実施態様では、血清を含まない媒体中で培養した細胞にアッセイを行い、よって候補薬が変調するプロセスまたは経路を制御する。さらに、異なる標的遺伝子は、ＴＮＦアルファなどの炎症性血管新生因子を含む異なる血管新生促進剤による刺激に別の反応をすることを発見した。このように、さらに好ましい実施態様では、細管形成アッセイ系は、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＴＮＦアルファ、エフリンなど、様々な因子に対するＭＡＰＫの反応を試験することを含んでいる。 
【００８１】
細胞遊走。侵入／遊走アッセイ（遊走アッセイとも呼ぶ）では、細胞の、物理的障壁を克服して血管新生促進シグナルへ向かって移動する能力を試験する。遊走アッセイは当技術分野で周知である（たとえば、Paik JH他、2001年、J Biol Chem. 276:11830-11837）。典型的な実験設定では、培養した内皮細胞を通常の細胞より小さい径の孔を有する基質で被覆した薄膜に埋め込む。上述したように、基質は通常細胞外マトリックスの環境を刺激する。薄膜は典型的にはトランスウェル（transwell）ポリカーボネート膜（Corning Costar Corporation, マサチューセッツ州ケンブリッジ）などの膜であり、通常血管新生促進刺激物を含む下部チャンバと液体接点を有する上部チャンバの一部である。通常、刺激物で一晩インキュベートしてから遊走をアッセイするが、これよりも長い、または短い時間を採用してもよい。遊走の評価は薄膜を通過した細胞の数で行い、ヘモトキシリン（hemotoxylin）溶液（VWR Scientific, カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で染色した細胞を使用して検出するか、細胞の数を決定するためのその他任意の方法で検出することができる。別の例示的設定では、細胞を蛍光標識し、Ｆａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などの蛍光読み取りを使用して遊走を検出する。刺激物がなくても観察できる遊走はあるが、血管新生促進因子に反応して移動が大きく増加する。上述したように、遊走／侵入の好ましいアッセイ系は、腫瘍血管新生及び炎症性血管新生剤を含む様々な血管新生促進因子に対するＭＡＰＫの反応を試験すること、及び無血清培地での細胞培養を含む。 
【００８２】
発芽アッセイ。発芽アッセイは、ゲルベースのコラーゲン基質に埋め込まれた内皮細胞の細胞数決定スフェロイド凝集（「スフェロイド」）を使用する３次元のインビトロ血管新生アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックスへの侵入（「細胞発芽」と呼ぶ）による毛細血管状構造の出芽の開始点、及びそれに続く複合網状ネットワーク形成の役割を果たす（Korff及びAugustin、1999年、J Cell Sci 112:3249-58）。一例示的実験設定では、非接着性９６ウェルプレートの１つのウェルにつき、ヒト臍帯静脈内皮細胞４００個をピペットで取り分け、一晩スフェロイド凝集を行うことによりスフェロイドを調製する（Korff及びAugustin: J Cell Biol 143:1341-52、1998年）。スフェロイドを回収し、９００μｌのメトセル(methocel)コラーゲン溶液に蒔き、２４ウェルプレートの核ウェルにピペットで取り分け、コラーゲンゲル重合させる。３０分後、１０倍に濃縮した試験物質の作用希釈液１００μｌをゲル頂部にピペットで取ることにより試薬を加える。プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。パラホルムアルデヒドを添加することにより、実験的インキュベーション期間の最後にディッシュを固定する。自動化画像分析系により１スフェロイド当たりの累積発芽長を測定することにより、内皮細胞の発芽強度を定量化することができる。 
【００８３】
抗体モジュレーターの一次アッセイ 
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、ＭＡＰＫタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当分野で周知である（Harlow及びLane、1988年、1999年、上掲）。ＭＡＰＫに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
【００８４】
場合によっては、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも、抗体モジュレーターを試験するために使用できる。 
【００８５】
核酸モジュレーターの一次アッセイ 
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＭＡＰＫ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってＭＡＰＫを発現する２種の細胞プール）中のＭＡＰＫ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＭＡＰＫ  ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125; Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm DH及びGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＭＡＰＫタンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、インサイツ検出を含めた様々な手段が利用可能である（Harlow E及びLane D、1988年及び1999年、上掲）。 
【００８６】
場合によっては、特にＭＡＰＫ  ｍＲＮＡ発現を伴うアッセイ系において、小分子モジュレーターについて記載したスクリーニングアッセイも核酸モジュレーターを試験するために使用できる。 
【００８７】
二次アッセイ 
調節剤がＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関連する様式でＭＡＰＫに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＭＡＰＫ調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するＭＡＰＫ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がＭＡＰＫと相互作用する特異性を試験することもできる。 
【００８８】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってＭＡＰＫを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＭＡＰＫ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置または偽薬で処置した）細胞や動物と比較してＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンまたは相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。 
【００８９】
細胞に基づいたアッセイ 
細胞に基づいたアッセイでは内因性Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路活性を検出するか、あるいはこれはＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。 
【００９０】
動物アッセイ 
候補ＭＡＰＫモジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路のモデルでは、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（たとえば過剰発現または発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。 
【００９１】
好ましい実施態様では、新脈管形成及び血管新生をモニターすることによってＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路の活性を評価する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイにおける、ＭＡＰＫに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン及び正常なＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンを有する動物モデルを使用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、４℃の無菌的な液体として提供されるが、３７℃で迅速にゲルを形成する。液体のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦなど様々な血管新生剤、またはＭＡＰＫを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に皮下注入（ＳＣ）する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを有するマウスに、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、または静脈内（ＩＶ）経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後５〜１２日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを回収する（Ｓｉｇｍａ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｋｉｔ）。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新脈管形成の程度と相関していることが判明した。 
【００９２】
別の好ましい実施態様では、ＭＡＰＫにおける候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。腫瘍異種移植アッセイは、当技術分野において既知である（例えば、Ogawa K他, 2000, Oncogene 19:6043-6052を参照）。異種移植片は、通常、既存の腫瘍由来またはインビトロ培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、６〜７週齢の雌の無胸腺マウスに移植されたＳＣである。内因的にＭＡＰＫを発現する腫瘍を、マウス１匹あたり１×１０５〜１×１０７個の細胞を１００μＬの体積で、２７ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週２回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が１００ｍｇに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、大量瞬時投与によってＩＶ、ＳＣ、ＩＰ、またはＰＯで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、１日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、２つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を４％のパラホルムアルデヒド、０．１Ｍのリン酸、ｐＨ７．２で６時間、４℃固定し、ＰＢＳ中３０％のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。 
【００９３】
別の好ましい実施態様では、ホローファイバーアッセイを使用して腫瘍形成能をモニターする。ホローファイバーアッセイは米国特許第５，６９８，４１３号に開示されている。要約すると、本方法は、実験動物に対し、標的細胞を含む生体適合性の半透明なカプセル封入器を埋め込むこと、実験動物を候補調節剤で処置すること、及び候補モジュレーターに対する反応について標的細胞を評価することを含む。埋め込まれる細胞は、通常、既存の腫瘍又は腫瘍細胞系由来のヒト細胞である。適当な時間、通常約６日を置いて、埋め込んだ細胞を回収し、候補モジュレーターの評価に使用する。腫瘍形成能とモジュレーターの有効性は、マクロカプセル中に存在する生細胞の量をアッセイすることにより評価してもよく、これは、当技術分野において既知の試験、例えばＭＴＴ染色変換アッセイ、ニュートラルレッド染色取り込み、トリパンブルー染色、生細胞計算、軟寒天中に形成されたコロニーの数、細胞の回復能及びインビトロでの複製能等により決定できる。 
【００９４】
別の好ましい実施態様では、腫瘍形成能アッセイは、組織特異性の制御配列の制御の下で、優性オンコジーン、又は腫瘍サプレッサー遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物、通常マウスを使用する。これらのアッセイは通常トランスジェニック腫瘍アッセイと呼ばれる。好ましい用途では、トランスジェニックモデルにおける腫瘍の進行の特徴づけ又は制御が良好に行われる。例示的なモデルでは、「ＲＩＰ１−Ｔａｇ２」導入遺伝子は、インスリン遺伝子制御領域の制御の下でＳＶ４０大型Ｔ抗原オンコジーンを有し、膵臓β細胞に発現し、結果的に島細胞悪性腫瘍となる（Hanahan D, 1985, Nature 315:115-122; Parangi S等, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:2002-2007; Bergers G等, 1999, Science 284:808-812）。通常過剰増殖性の島細胞のサブセット中の静止毛細血管が血管新生性となるので、「血管新生スイッチ（angiogenic switch）」は、約５週目に起こる。ＲＩＰ１−ＴＡＧ２マウスは１４週で死亡する。候補モジュレーターは、血管新生スイッチの直前（例えば腫瘍予防のモデルの場合）、小規模腫瘍の成長期（例えば処置のモデルの場合）、又は大規模及び／又は湿潤性腫瘍の成長期（例えば退行のモデルの場合）を含め、様々な段階において投与できる。腫瘍形成能及びモジュレーターの有効性は、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、腫瘍の形態、血管密度、アポトーシス指数などを含め、寿命延長及び／又は腫瘍特性の評価であってもよい。 
【００９５】
診断及び治療上の使用 
特異的なＭＡＰＫ調節剤は、疾病または疾病予後が血管新生、細胞死、または増殖疾患などＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路の欠陥に関連している様々な診断及び治療用途に有用である。したがって、本発明は、ＭＡＰＫ活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与する工程を含む、細胞、好ましくはＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能の欠陥又は不全（例えば、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンの過剰発現、過少発現、又は誤発現、或いは遺伝子突然変異による）を有することが事前に確定されている細胞におけるＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能が修復されたことが示される。本明細書で使用する「機能が修復された」という表現、及びそれと同等の表現は、所望の表現型が達成されたか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づいたことを意味する。例えば、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能が修復されると、細胞増殖及び／又は細胞周期の進行が正常化するか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づく。本発明はまた、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路を調節するＭＡＰＫ調節剤の治療的有効量を投与することによる、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン機能不全に関連する疾患又は疾病の治療方法を提供する。さらに本発明は、ＭＡＰＫ調節剤を投与することによる、細胞、好ましくはＭＡＰＫ機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定されている細胞において、ＭＡＰＫ機能を調節する方法を提供する。これらに加えて、本発明は、ＭＡＰＫ調節剤の治療的有効量を投与することによる、ＭＡＰＫ機能不全に関連する疾患又は疾病の治療法を提供する。 
【００９６】
ＭＡＰＫがＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路に関係しているという発見により、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン経路の欠陥に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、ならびにこのような疾病及び疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。 
【００９７】
特定の試料でＭＡＰＫが発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley & Sons, Inc.、第4章; Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125 ;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm及びGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。ＭＡＰＫを発現する欠陥Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンシグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、ＭＡＰＫ調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン欠陥組織は正常組織に比べてＭＡＰＫを過剰発現する。たとえば、完全または部分ＭＡＰＫ  ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用した、腫瘍及び正常細胞系由来、または腫瘍及び同一患者からの対応する正常組織試料由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がＭＡＰＫを発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織及び腫瘍試料中のＭＡＰＫ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用する（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。 
【００９８】
たとえばＭＡＰＫオリゴヌクレオチドなどの試薬、及びＭＡＰＫに対する抗体を利用して、上に記載した（１）ＭＡＰＫ遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したＭＡＰＫ  ｍＲＮＡの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＭＡＰＫ遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに（３）ＭＡＰＫに媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。 
【００９９】
したがって、特定の実施態様では、本発明は、（ａ）患者から生体試料を得ること、（ｂ）試料をＭＡＰＫ発現用のプローブと接触させること、（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較すること、及び（ｄ）工程（ｃ）が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ＭＡＰＫ発現の変化と結び付けられる患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表１に示す癌である。プローブは、ＤＮＡまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。 
【実施例】
【０１００】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【０１０１】
Ｉ．線虫Ｒａｃエンハンサーのスクリーニング 
線虫における細胞遊走にも影響するＲａｃシグナル伝達経路のモディファイヤーを同定するために遺伝子スクリーニングを設計した。このスクリーニングは、ｃｅｄ−１０及びｍｉｇ−２の単一突然変異の形態及び運動が野生型虫に類似している一方、二重突然変異が大きな形態欠陥及び運動欠陥を有するという観察結果に基づいている。一次スクリーニングにおいて、Ｌ４段階にある野生型、ｃｅｄ−１０及びｍｉｇ−２の虫においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により個々の遺伝子の機能を不活性化した。その後、ＲＮＡで処理した動物の子孫を、ｃｅｄ−１０及びｍｉｇ−２の二重突然変異の形態上の欠陥と運動欠陥に類似する同欠陥について検査した。ｃｅｄ−１０又はｍｉｇ−２突然変異背景の表現型を示すが野生型背景の表現型を示さない遺伝子全てを直接細胞遊走アッセイにおいて試験した。細胞遊走アッセイでは、これらの細胞に発現されたＧＦＰマーカーを用いて、ＡＶＭ及びＡＬＭとして知られる機械感覚性のニューロンを、動物中のそれらの最終位置について採点した。この遊走アッセイは、野生型、及びｃｅｄ−１０又はｍｉｇ−２突然変異背景の両方で行った。ＡＶＭ及びＡＬＭ細胞は、第一幼生段階において通常その最終位置へ移動及び到達するので、位置の採点は後の幼生段階又は成虫段階で行った。野生型背景又はｒａｃ突然変異背景において不活性化したとき、これらニューロンの移動不足又は移動方向の間違いを起こす遺伝子を、細胞遊走に関連する疾病の治療に関連する可能性があるとした。ＺＣ５０４．４をエンハンサーとして同定した。
【０１０２】
ＩＩ．線虫ＡＸＩＮのスクリーニング
１５℃で成長させた温度感受性の機能低下型ｐｒｙ−１突然変異ｍｕ３８が、動物の９５％の内臓を破裂させ、Ｌ４脱皮段階で死に至らせる破裂性産卵口（Ｒｖｌ）表現型を産生することを発見した。ｐｒｙ−１  Ｒｖｌ突然変異表現型は、βカテニンオルソログｂａｒ−１及びＴＣＦオルソログｐｏｐ−１において機能喪失型突然変異により抑制された。また、Ｒｖｌ表現型は、コンセンサスＧＳＫ３−βリン酸化部位を排除するｂａｒ−１／βカテニンにおいて機能獲得型突然変異によっても産生され、ＢＡＲ−１のＡｘｉｎ媒介性分解を防ぐと予想される。
【０１０３】
ｂａｒ−１／βカテニン及びｐｏｐ−１／ＴＣＦに加えてβカテニンシグナル伝達においてポジティブに作用し、不活性化するとｐｒｙ−１／ＡｘｉｎのＲｖｌ突然変異表現型を抑制する遺伝子を同定するための遺伝子スクリーニングを設計した。ｐｒｙ−１（ｍｕ３８）Ｌ１幼虫において個々の遺伝子の機能をＲＮＡｉにより不活性化し、内蔵破裂せずに成虫になるまで生存した幼虫の数における統計的に有意な増大によりＲｖｌ表現型の抑制を採点した。続いて抑制遺伝子をカウンタースクリーニングし、βカテニンシグナル伝達に特異的に機能するものよりも、ｐｒｙ−１突然変異を非特異的に抑制すると思われるものを排除した。野生型背景において産卵口形成を遮断せず、且つβカテニンシグナル伝達に無関係の遺伝子において２つの突然変異（ｌｉｎ−１／Ｅｔｓ及びｄａｆ−１８／ＰＴＥＮ）のＲｖｌ表現型を抑制しない抑制遺伝子は特異的なｐｒｙ−１／Ａｘｉｎサプレッサーと考えられた。これら抑制遺伝子を不活性化すると、標的遺伝子のβカテニンの不適切な転写活性を抑制する傾向があり、よって癌治療に関連すると思われた。本スクリーニングにおいてＺＣ５０４．４をサプレッサーとして同定した。
【０１０４】
ＩＩＩ．線虫βカテニンのスクリーニング
βカテニンの細胞接着欠陥を抑制する突然変異を同定することにより、細胞移動又は転移を阻害する製薬的標的が得られた。まず、胚形態形成の間の身体伸張の欠陥を見つけるためのＥＭＳスクリーニングにおいてｈｍｐ−２を同定した（Costa等、(1998) The Journal of Cell Biology 1998, 141:297-308）。機能的対立遺伝子ｈｍｐ−２（ｚｕ３６４）が欠失している場合、胚死亡率は９９％を示し、突然変異の胚が伸張の途中で停止し、背面に異常な隆起が形成された。これらの胚の約１％が孵化して生存能力のある不完全な幼虫となった。機能的対立遺伝子ｈｍｐ−２（ｑｍ３９）を減少させた場合、特徴的で不完全な外観を有する生存可能な幼虫が生まれた。１５℃で成長させたとき、約９２％（ＳＤ３．９）のＬ１幼虫に不完全な表現型が見られ、脱皮により表現型の表限度が低下して、次の幼虫段階に以降した。このスクリーニングのため、Ｌ４幼虫段階においてｈｍｐ−２（ｑｍ３９）虫を１５℃で二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に浸し、プロジェニーを接着欠陥の変更させるＬ１幼虫として記録した。以下に本スクリーニングのプロトコルを説明する。
【０１０５】
１）ｈｍｐ−２（ｑｍ３９）動物を漂白し、ペプトンを含まないアガロースプレート上で孵化させて同調細胞集団を生産した。飢えさせたＬ１を、７５０μｌのＯＰ５０（ＴＢ中２５％ｗ／ｖ）を播種した１０×ペプトンプレートに移し、Ｌ４幼虫段階に進行させた。
２）ｄｓＲＮＡを９６ウェルの丸底プレートに６μｌずつ分配した（Ｎｕｎｃ  ＃２６２１６２）。Ｌ４動物をＭ９緩衝液に懸濁することにより回収し、Ｍ９で２回洗浄して余分なＯＰ５０をすべて除去した。ＲＮＡに２μｌずつ分配した結果、総虫濃度が１ウェル当たり７５−１００であった。対照群として、複数のウェルにＲＮＡ再懸濁緩衝液（１回の１Ｍ緩衝液）のみを分配した。
３）動物を１５℃でｄｓＲＮＡに２４時間浸した。
４）ｄｓＲＮＡに浸した後、２５μｌの液状ＮＧＭと３％のＯＰ５０を添加することによりウェルに動物を供給した。動物を１５℃に維持し、妊娠させてウェル内でプロジェニーを産ませた。これには約７２時間を要した。成熟の間食物レベルを視覚的にモニターし、必要に応じて食物を加えた。
５）成熟に続き、各ウェルの動物を個別の６ｃｍのペプトンを含まないアガロースプレート上に植え付け、１５℃で一晩置いた。
６）各プレート上の動物を、不満足な表現型の変化を精査する顕微鏡で視覚的に記録した。記録は定量的に行い、胚死亡の増大を増強として、及び野生型外観動物を欠陥の抑制として記録した。
７）同じプロトコルに続き、一部変更を加えた一次スクリーニングとして興味深いサプレッサー候補を再試験した。各サプレッサーについて複数の再試験を実行し、視覚によらずに記録できるように再試験した候補をコード化し、それらを定量的に記録した。全部で１００個の対象を記録することにより、各プレートの記録を行った。対象は、胚、又はＬ１段階の幼虫と定義した。各対象を、野生型外観動物、不満足な外観の動物、又は孵化しない胚の１つとして記録した。点数化は、記録した全対象に対する野生型外観の動物の割合で表した。野生型動物は、いかなる不満足な身体も有しない滑らかな外皮を有するＬ１幼虫と定義した。
確認されたサプレッサーは、４回の再試験中３回以上で、対照群の平均値から２以上の標準偏差を有するものであった。本スクリーニングにおいてＺＣ５０４．４をサプレッサーとして同定した。
【０１０６】
ＩＶ．配列分析
ＢＬＡＳＴ分析（Altschul他、上掲）を行って線虫ＺＣ５０４．４のオルソログを同定した。 例えば、ＭＡＰＫ由来の代表的配列である配列番号３６、３７、及び３８は、線虫ＺＣ５０４．４とそれぞれ４５％、４８％及び４５％のアミノ酸同一性を有していた。
【０１０７】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、及び機能的サブユニットを、ＰＳＯＲＴ（Nakai K.及びHorton P.、Trends Biochem Sci、1999年、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000年）、ＰＦＡＭ（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2）、ＳＭＡＲＴ（Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extＲａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニンellular protein sequences.  Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32）、ＴＭ−ＨＭＭ（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences.  In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998年）、及びクラスト（clust）（Remm M及びSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89）プログラムを使用して分析した。例えば、配列番号３６、３７、３８、及び３９のＭＡＰＫのＣＮＨドメイン（ＰＦＡＭ００７８０）は、概ねアミノ酸残基１０１８−１３０９、８４５−１１４４、９８２−１２７３、及び１２０９−１５５６にそれぞれ位置している。さらに、配列番号３６、３７、３８、及び３９のプロテインキナーゼドメイン（ＰＦＡＭ０００６９）は、概ねアミノ酸残基２５−２８９、２５−２８９、２５−２８９、及び２５−３１３にそれぞれ位置している。
【０１０８】
Ｖ．ハイスループットのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ蛍光偏光アッセイ 
蛍光標識したＭＡＰＫペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の試験剤と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ  ＦＰＭ−２  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がＭＡＰＫ活性の候補モディファイヤーであることが示される。 
【０１０９】
ＶＩ．ハイスループットのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ結合アッセイ 
３３Ｐ標識のＭＡＰＫペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ−アビジンでコーティングしたアッセイプレートのウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補Ｒａｃ、Ａｘｉｎ及びβカテニン調節剤として同定された。 
【０１１０】
ＶＩＩ．免疫沈降及び免疫ブロッティング 
形質移入させたタンパク質の共沈では、ＭＡＰＫタンパク質を含む３×１０６個の適切な組換え細胞を１０ｃｍのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入での総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び１％のノニデットＰ−４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離２回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。 
【０１１１】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、二フッ化ビニリデン樹脂膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のあるバンドを可視化させた。 
【０１１２】
ＶＩＩＩ．キナーゼアッセイ 
精製したか、部分的に精製したＭＡＰＫを、適切な反応緩衝液（例えば、塩化マグネシウムまたは塩化マンガン（１−２０ｍＭ）、及びミエリン塩基性タンパク質またはカゼインなどのペプチドまたはポリペプチド基質（１−１０μｇ／ｍｌ）を含むｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ５０ｍＭ）に希釈する。キナーゼの最終的な濃度は１−２０ｎＭである。酵素反応をマイクロタイタープレートで行い、アッセイのスループットを増大させることにより反応条件の最適化を促進する。９６ウェルのマイクロタイタープレートを用い、最終容量を３０−１００μｌとする。３３ＰガンマＡＴＰ（０．５μＣｉ／ｍｌ）を加えて反応を開始させ、０．５から３時間室温でインキュベートする。ＥＤＴＡ付加によりネガティブコントロールを行い、それにより酵素活性に必要な二価カチオン（Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）をキレート化する。インキュベーション後、ＥＤＴＡを使用して酵素反応を消光させる。反応物の試料を９６ウェルのガラフファイバーフィルタリングプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す。続いてフィルタをリン酸緩衝整理食塩水、希釈したリン酸（０．５％）、またはその他適切な媒体で洗浄し、過剰なラジオ標識ＡＴＰを除去する。シンチレーションカクテルをフィルタリングプレートに添加し、シンチレーションカウンティングにより取り込まれた放射能を定量化する（Wallac/Perkin Elmer）。活性は、ネガティブコントロール反応値（ＥＤＴＡクエンチ）の差引き後に検出される放射能の量と定義する。 
【０１１３】
ＶＩ．発現分析 
以下の実験で使用したすべての細胞系はＮＣＩ（米国立癌センター）の系であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、２０１１０〜２２０９）から入手可能である。正常組織及び腫瘍組織は、Ｉｍｐａｔｈ、ＵＣ  Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｒｄａｉｓ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ及びＡｍｂｉｏｎから得た。 
【０１１４】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を使用した。 
【０１１５】
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からＲＮＡを抽出して最終濃度５０ｎｇ／μｌにした。その後、ランダムヘキサマー及び各反応５００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）のプロトコル４３０４９６５に従ってＲＮＡ試料を逆転写させることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。 
【０１１６】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコルならびに以下の基準に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、ａ）ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、及びｂ）各プライマーの対が１つの産物のみを生成することである。発現分析は７９００ＨＴ機器を使用して行った。 
【０１１７】
製造者のプロトコルに従って、３００ｎＭのプライマー及び２５０ｎＭのプローブならびに約２５ｎｇのｃＤＮＡを、９６ウェルプレートでは２５μｌの全体積、３８４ウェルプレートでは１０μｌの全体積で使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のｃＤＮＡを含む混合物である、ヒトｃＤＮＡ試料のユニバーサルプール（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｏｏｌ）を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。１８ＳのｒＲＮＡ（すべての組織及び細胞中で普遍的に発現される）を使用して生データを正規化した。 
【０１１８】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが２倍以上高い場合に、ある遺伝子は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、ｃＤＮＡ試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差の２倍を超える場合（すなわち、腫瘍−平均（すべての正常試料）＞２×ＳＴＤＥＶ（すべての正常試料））に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【０１１９】
結果を表１に示す。各腫瘍種類について、同一患者から採取した腫瘍試料と一致する正常組織の対の数を示す。また、各腫瘍種類について、少なくとも二倍の過剰発現を示した試料の割合を示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子（または複数の遺伝子）の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
表１
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【０１２０】
Ｘ．ＭＡＰＫ機能アッセイ
ＲＮＡｉ実験を行い、小妨害ＲＮＡ（siRNA, Elbashir等、上掲）を用いて様々な細胞系のＭＡＰＫ配列の発現をノックダウンした。
細胞増殖及び成長に対するＭＡＰＫ  ＲＮＡｉの影響。上述のように、ＢｒｄＵ及びＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞増殖に対するＭＡＰＫ発現の低下の影響を研究した。その結果、配列番号１のＭＡＰＫのＲＮＡｉは、ＬＸ１肺癌及び２３１Ｔ乳癌細胞における増殖を低減させ、配列番号１２のＲＮＡｉは、ＬＸ１肺癌、２３１Ｔ乳癌、及びＨＣＴ１１６大腸癌細胞における増殖を低減させ、配列番号２１のＲＮＡｉはＨＣＴ１１６大腸癌及び２３１Ｔ乳癌細胞における増殖を低減させ、配列番号２９のＲＮＡｉはＬＸ１肺癌細胞における増殖を低減させた。
【０１２１】
上述のように、ＭＴＳ細胞増殖アッセイを行って細胞増殖に対するＭＡＰＫ発現の低下の影響を研究した。その結果、配列番号１のＭＡＰＫのＲＮＡｉはＡ５４９及びＬＸ１肺癌、並びにＭＤＡ２３１乳癌細胞における増殖を低減させ、配列番号２１のＭＡＰＫのＲＮＡｉはＡ５４９及びＬＸ１肺癌、並びにＭＤＡ２３１乳癌細胞における増殖を低減させ、配列番号１２のＭＡＰＫのＲＮＡｉはＡ５４９及びＬＸ１肺癌、並びにＭＤＡ２３１乳癌細胞における増殖を低減させ、配列番号２９のＲＮＡｉはＬＸ１肺癌細胞における増殖を低減させた。
上述のように、標準コロニー成長アッセイを行って細胞成長に対するＭＡＰＫ発現の低下の影響を研究した。その結果、配列番号１及び２１のＲＮＡｉはＬＸ１及びＡ５４９肺癌、ＭＤＡ２３１乳癌、並びにＡ２７８０卵巣癌系における細胞成長を低下させた。配列番号２９のＲＮＡｉはＬＸ１肺癌細胞における増殖を低減させた。
【０１２２】
アポトーシスに対するＭＡＰＫ  ＲＮＡｉの影響。上述のように、ヌクレオソームＥＬＩＳＡアポトーシスアッセイを行ってアポトーシスに対するＭＡＰＫ発現の低下の影響を研究した。その結果、配列番号１２のＲＮＡｉがＬＸ１肺癌細胞におけるアポトーシスを増大させた。
細胞周期に対するＭＡＰＫ  ＲＮＡｉの影響。上述のように、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）細胞周期アッセイを行って、細胞周期に対するＭＡＰＫ発現の低下がもたらす影響を研究した。その結果、配列番号１２のＲＮＡｉはＬＸ１肺癌細胞におけるサブＧ１ピークを増大させ、配列番号２１のＲＮＡｉはＬＸ１肺癌細胞におけるサブＧ１ピークを増大させた。サブＧ１の領域は、アポトーシスに関連するＤＮＡ分解が起こった細胞を表す。
【０１２３】
ＭＡＰＫ過剰発現分析。上述のようにコロニー成長アッセイにおいてＭＡＰＫ配列を過剰発現させ、試験した。配列番号１２のＭＡＰＫの過剰発現により、ＮＩＨ３Ｔ３コロニー成長が増大した。配列番号２１の過剰発現は、形態学的な影響を持たず、またコロニー成長に対して中程度の影響を持っていた。
また、種々の転写因子の発現に対する過剰発現ＭＡＰＫの影響を研究した。配列番号２１のＭＡＰＫの過剰発現は、以下の転写因子、即ちＥ２Ｆ、ＳＲＥ（血清応答要素）、ＡＰ１（活性化タンパク質１）、ＥＴＳ１（ＥＴＳオンコジーン；ｖ−ｅｔｓトリ赤芽球症ウイルスｅ２６オンコジーン相同体１）、ＳＴＡＴ３（転写３のシグナルトランスデューサー及び活性化因子）、及びＥＧＲ（早期成長応答）の発現を増大させた。
【配列表】
2006507008000001.app
【国際調査報告】
2006507008.tif 000003