(57)【要約】生物学的溶液から完全にチオエート化された一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する方法であって、生物学的溶液を固定化金属イオン吸着クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂に接触させてアンチセンスオリゴヌクレオチドを樹脂に吸着させ、その後、樹脂からのアンチセンスオリゴヌクレオチドの脱着が起こる条件下で樹脂を溶出液に接触させる、溶液中の不正確にチオエート化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する方法。また、生物学的溶液から完全チオエート化一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離するための固定化金属イオン吸着クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的溶液から完全にチオエート化された一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する方法であって、生物学的溶液を固定化金属イオン吸着クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）樹脂に接触させてアンチセンスオリゴヌクレオチドを樹脂に吸着させ、その後、樹脂からのアンチセンスオリゴヌクレオチドの脱着が起こる条件下で樹脂を溶出液に接触させ、溶液中の不正確にチオエート化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する、方法。
【請求項２】
前記生物学的溶液がアンチセンスオリゴヌクレオチド合成で得られたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
不正確に合成されたオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
１〜５個（例えば１〜２個）の未チオエート化結合を有する不正確にチオエート化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記金属イオンがＺｒ２＋又はＦｅ３＋である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５〜３０塩基対、好ましくは１５〜２５塩基対の大きさである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの吸着時に生物学的溶液のｐＨが約７以下である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
単離したアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに精製する追加段階を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法で単離したアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
生物学的溶液から完全チオエート化一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを精製するためのキットであって、生物学的溶液中に存在する完全にはチオエート化されていないオリゴヌクレオチドから完全チオエート化オリゴヌクレオチドを分離するための固定化金属イオン吸着クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）樹脂を充填したクロマトグラフィカラムとその取扱い説明書とを備えるキット。
【請求項１１】
生物学的溶液中の不正確にチオエート化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドから完全チオエート化一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離するための固定化金属イオン吸着クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）樹脂の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的溶液の他の成分からアンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー法は、研究並びに新薬の製造を目的とした、タンパク質、ペプチド、核酸その他の生物化合物の生産に一段と広範に用いられている。これに関して、クロマトグラフィーはその用途が広く、化合物に対する感度が高いことから、好ましい精製法である。クロマトグラフィーという用語は、密接に関連した一群の分離法を包含するもので、互いに非混和性の２つの相を接触させるという原理に基づく。さらに具体的には、標的化合物を移動相に導入して、固定相と接触させる。標的化合物は移動相によって系を通過する際に固定相と移動相の間で一連の相互作用を受ける。相互作用は、試料中の各種成分の物理的又は化学的性質の差を利用する。
【０００３】
標的化合物と固定相に存在する金属キレート基との相互作用は、固定化金属イオン吸着クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）と呼ばれるクロマトグラフィー精製法（金属キレート化アフィニティクロマトグラフィー（ＭＣＡＣ）としても知られる。）に利用され、タンパク質の精製に多用されている。ＩＭＡＣの原理は、多くの遷移金属イオンが、リン酸基及び窒素原子に（例えばアミノ酸のヒスチジン、システイン及びトリプトファンの窒素原子にアミノ酸側鎖の電子供与基を介して）配位できるという事実に基づく。この相互作用をクロマトグラフィー用途に利用するには、金属イオンを不溶性担体に固定化しなければならない。これは、クロマトグラフィーマトリックスにキレート基を結合させることによって達成できる。さらに重要なことは、有用なものとするには、選択に係る金属が、精製すべき化合物よりもマトリックスに対して高い親和性を有していなければならないことである。適当な配位イオンの具体例は、Ｃｕ（II）、Ｚｎ（II）、Ｎｉ（II）、Ｃａ（II）、Ｃｏ（II）、Ｍｇ（II）、Ｆｅ（III）、Ａｌ（III）、Ｇａ（III）、Ｓｃ（III）などである。三座配位キレート剤であるイミノ二酢酸（ＩＤＡ）及び四座配位キレート剤であるニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などの様々なキレート基がＩＭＡＣ用として知られている。ＩＭＡＣ樹脂の溶出は、タンパク質に関しては、一般にイミダゾールの添加で実施される。別法として、溶出は従来からｐＨを下げることによっても実施されている。
【０００４】
近年、タンパク質及びペプチドの精製にＩＭＡＣが成功裡に用いられており、ＩＭＡＣによる効率的な精製を促進するためＨｉｓ−ｔａｇを組換え技術で導入することが行われている。こうして、ＩＭＡＣは大規模タンパク質及び／又はペプチド生産に重要な役割を果たすと考えられている。さらに、ＩＭＡＣは、タンパク質のトリプシン消化物からのリン酸化タンパク質及びペプチドの精製にも使用されている。かかるリン酸化タンパク質及びペプチドを次いでＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳで解析すれば、そのリン酸化部位を決定できる。
【０００５】
さらに、ＩＭＡＣが比較的目新しかった時期に、各種化合物の精製に使用することが示唆されてきた。例えば、１９８５年のＰｏｒａｔｈ他の米国特許第４６７７０２７号には、ポリマーとの金属キレート結合によってその表面を固定化金属イオンで置換した固相からなる生成物を用いて生体高分子及び粒子を分離できることが開示されている。想定される生体分子はウイルスと細胞であるが、多糖類、タンパク質及びオリゴヌクレオチドも挙げられている。しかし、それ以降、オリゴヌクレオチドには、最近の科学的知見によって新たな用途が見出されており、その新しい修飾物も必要とされている。
【０００６】
オリゴヌクレオチドを修飾する最近開発された分野の一例は、創薬におけるアンチセンス技術である。アンチセンス医薬品は遺伝子レベルで作用して、病原タンパク質の産生プロセスを阻害する。これが可能であるのは、タンパク質がヒトの代謝の事実上あらゆる側面で中心的役割を果たしていることが判明しているからである。ヒトのほとんどすべての疾患は、不適切なタンパク質産生又は異常なタンパク質挙動の結果である。これは癌のような宿主疾患及びＡＩＤＳのような感染性疾患のいずれにもあてはまる。伝統的な医薬品は、疾患の維持又は原因となるタンパク質分子と全身で相互作用するように設計されている。アンチセンス医薬品は病原タンパク質の産生を阻害するように設計される。これらは、感染症、炎症、循環器系疾患、癌を始めとする広範な疾患の治療用に設計することができ、従来の医薬品に比べて選択性が高く、効果的で低毒性のものにできる可能性がある。アンチセンス技術の機序は広範な文献に記載されており、例えばＵｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．９０，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，  Ｊｕｎｅ  １９９０を参照されたい。簡単に述べると、周知の通り、ＤＮＡからＲＮＡへの転写持に、ＤＮＡの２本の相補鎖が部分的に解けて、センス鎖として知られる鎖がアンチセンス鎖として知られる鎖から分離する。アンチセンス鎖は次いで転写として知られるプロセスでｍＲＮＡを合成する転写酵素群の鋳型として用られる。ｍＲＮＡは細胞内に移動し、そこで翻訳として知られるプロセスでリボソームがコード情報を読み取って、アミノ酸を一列に並べて特定のタンパク質を形成する。アンチセンス医薬品はｍＲＮＡの小さなセグメントの相補鎖であり、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。アンチセンス医薬品の製造には、ヌクレオチド同士を結合してオリゴヌクレオチドとして知られる短鎖を形成する。各アンチセンス医薬品は、そのｍＲＮＡ標的中の特定のヌクレオチド配列に結合して、標的ｍＲＮＡにコードされたタンパク質の産生を阻害するように設計される。
【０００７】
オリゴヌクレオチドの結合は、臨床研究及び市販医薬品供給のためのｃＧＭＰ条件下でのオリゴヌクレオチド合成用の市販自動固相合成装置で実施できる。かかる合成では、天然核酸の各塩基のリン酸基の酸素原子１個がイオウ原子で置換されたオリゴヌクレオチドが容易に作られる。ただし、かかるチオエート化オリゴヌクレオチド（本明細書中ではアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ぶ。）の合成に固有の問題は、１００％正確にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドが得られるように実施するのは実際上不可能であることである。その代わり、通常約７０〜７５％の収率が得られる。したがって、アンチセンス医薬品を調製する前に、十分な品質を確保するため合成した生成物を精製する必要がある。
【０００８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製には逆相ＨＰＬＣが一般に用いられている。しかし、高圧の使用は概して使用設備に対する要求が厳しく、プロセスが難しくなって、スケールアップに費用がかかることから、この種のプロセスに適した条件ではないと考えられる。さらに、この技術で常用される有機溶媒は用途によっては望ましくない。
【０００９】
Ｄｅｓｈｍｕｋｈ他（Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｒ．Ｒ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，  Ｄｅ  Ｌｅｏｎ，Ｐ．，  Ｌｅｉｔｃｈ，Ｗ．Ｅ．，  Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，  ４，  ２０５−２１３）は、ホスホロチオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製用アニオン交換クロマトグラフィー法の開発について記載している。具体的には、細胞接着分子ＩＣＡＭ−１のアンチセンス阻害剤である２０量体を合成した後、ポリスチレン系マトリックス上に第四級アンモニウム官能基を有するアニオン交換基（Ｓｏｕｒｃｅ  １５及びＳｏｕｒｃｅ  Ｑ３０、いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ）製）で精製している。溶出試験で最も有効な分解能が観察されたのは高いｐＨ値であり、ｐＨ１１であった。しかし、標的酸素の１以上がイオウで置換されていない２０量体から完全にチオエート化された２０量体を分離できるか否かは明らかにされていない。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製用イオン交換で得られる選択性は未だ十分に満足できるものではない。さらに、別の短所は、かかるアニオン交換クロマトグラフィーでのアンチセンスオリゴヌクレオチドの精製には、後で脱塩段階が必要となり、さらに処理段階を要するので全体としての処理コストが高くなることである。
【００１０】
同様に、Ｄｅｓｈｍｕｋｈ他（Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｒ．Ｒ．，  Ｗａｒｎｅｒ，Ｔ．Ｎ．，  Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｆ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．，  Ｌｅｉｔｃｈ，Ｗ．Ｅ．，  Ｄｅ  Ｌｅｏｎ，Ｐ．，  Ｓｒｉｖａｔｓａ，Ｇ．Ｓ．，  Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  ８９０  （２０００）  １７９−１９２）は、強アニオン交換メンブランを用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドの精製を示唆している。しかし、上述の方法と同様、得られる感度は未だ十分満足できるものではない。さらに、メンブランの使用は処理能力が低いため、そこそこ効率的なプロセスには大型のメンブランが必要とされる。また、この方法は、上述のアニオン交換と同様、後段での脱塩段階が必要とされる。
【００１１】
国際公開第９９／０９０４５号（Ｓｏｍａｇｅｎｉｃｓ社）は、結合能の向上したアンチセンス及び抗遺伝子治療薬並びにそれらの使用に関する。具体的には、その発明は、翻訳及び転写阻害性が向上するように標的核酸に形態的に結合し得るアンチセンス及び抗遺伝子オリゴヌクレオチドに関する。一実施形態では、核酸のホスホロチオエートアナログが開示され、末端リン酸又はヌクレオチド間リン酸のリンに結合した非橋かけ酸素に代えてイオウを有している。この修飾は、非修飾物よりもメタロアフィニティクロマトグラフィー媒体に強く結合できると記載されている。しかし、チオエート化度の種々異なるオリゴヌクレオチドの分離にメタロアフィニティクロマトグラフィーを使用できることに関しては何ら示唆されていないし、教示されてもいない。さらに、別の実施形態では、オリゴヌクレオチドに白金を結合している。かかる白金結合オリゴヌクレオチドは、調製用電気泳動又はイオン交換カラムクロマトグラフィーによって反応混合物から容易に分離される。また、白金結合オリゴヌクレオチドの精製法の一段階として水銀化カラムでのメタロアフィニティクロマトグラフィーを使用することが示唆されているが、これは単なる示唆にすぎない。この文献には、かかる精製が有効であることを示す証拠は何ら挙げられていないし、そもそもかかる精製がうまくことを示す証拠も挙げられておらず、「反応混合物」の成分も明らかにされていない。
【特許文献１】米国特許第４６７７０２７号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／０９０４５号パンフレット
【非特許文献１】Ｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．９０，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，  Ｊｕｎｅ  １９９０
【非特許文献２】Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｒ．Ｒ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，  Ｄｅ  Ｌｅｏｎ，Ｐ．，  Ｌｅｉｔｃｈ，Ｗ．Ｅ．，  Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，  ４，  ２０５−２１３
【非特許文献３】Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｒ．Ｒ．，  Ｗａｒｎｅｒ，Ｔ．Ｎ．，  Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｆ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．，  Ｌｅｉｔｃｈ，Ｗ．Ｅ．，  Ｄｅ  Ｌｅｏｎ，Ｐ．，  Ｓｒｉｖａｔｓａ，Ｇ．Ｓ．，  Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  ８９０  （２０００）  １７９−１９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の精製法、特にチオエート化度の種々異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを分離できる十分な感度をもつ方法に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的の一つは、生物学的溶液中の不正確に合成されたオリゴヌクレオチド及び／又は完全にはチオエート化されていないオリゴヌクレオチドからアンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する方法を提供することである。この目的は、特許請求の範囲に記載の方法で達成できる。
【００１４】
本発明の具体的な目的の一つは、従来技術の方法に比べて向上した感度を示す、生物学的溶液からのアンチセンスオリゴヌクレオチドの単離法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、従来技術の方法に比べて有機溶媒及び／又は高圧の必要性が低減した、生物学的溶液からのアンチセンスオリゴヌクレオチドの単離法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、従来技術の方法に比べてスケールアップが容易でコスト効率の高い、生物学的溶液からのアンチセンスオリゴヌクレオチドの単離法を提供することである。
【００１７】
本発明のその他の目的及び利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【００１８】
定義
本明細書中で「オリゴヌクレオチド」という用語は通常の意味で用いられ、ある配列のヌクレオチドを意味し、「ポリヌクレオチド」という用語はオリゴヌクレオチドよりも長い配列のヌクレオチドを意味する。
【００１９】
「ヌクレオチド」という用語は、無機リン酸と単糖とプリン塩基又はピリミジン塩基の３成分からなる残基を意味する。個々のヌクレオチドにおいて、３成分はリン酸−糖−塩基の順序で結合している。オリゴヌクレオチドでは、隣接ヌクレオチドモノマーの糖成分とリン酸成分がエステル結合で結合している。ヌクレオチドモノマー内の糖とリン酸もエステル結合で結合しており、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖骨格に沿った糖−リン酸−糖結合はホスホジエステル結合として知られる。
【００２０】
「クロマトグラフィー」という用語には、充填カラム、膨張ベッド、懸濁ベッド又はメンブランで実施されるクロマトグラフィー分離法が包含される。
【００２１】
「樹脂」という用語は、クロマトグラフィーに用いられる固相、つまり標的化学種を捕獲する吸着材を意味する。「樹脂」は、多孔性又は非多孔性の球状又は実質的に球状の粒子、ビーズ（例えば膨張ベッド吸着用のビーズなど）、モノリシック構造体のいずれの形態でも製造し得る。さらに、支持体上に樹脂を設けることによってメンブランを提供することができ、液体からの化学種の単離に有用である。樹脂は、当技術分野ではマトリックスとしても知られる。
【００２２】
「吸着」という用語は、本明細書中では、樹脂のリガンドへの化学種の結合を意味する。
【００２３】
「溶出液」という用語は、本明細書中では通常の意味で用いられ、固相（樹脂）と生成物（標的化学種）との相互作用を妨害して固相からの生成物の選択的解離を促進し得る溶液に用いられる。
【００２４】
したがって、「脱着」という用語は、上述の相互作用を妨害することを意味する。
【００２５】
「緩衝剤」又は「緩衝液」とは、酸と塩基の混合物であって、溶液中に存在すると酸又は塩基の添加によるｐＨ変化を低減もしくは調節するものを意味する。
【００２６】
「単離」という用語は、本明細書中では、他の成分からの分離を意味し、実質的に純粋なアンチセンスオリゴヌクレオチドのような実質的に純粋な標的化合物を得ることを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の第一の態様は、
生物学的溶液から完全にチオエート化された一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する方法であって、生物学的溶液を固定化金属イオン吸着クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）樹脂に接触させてアンチセンスオリゴヌクレオチドを樹脂に吸着させ、その後、樹脂からのアンチセンスオリゴヌクレオチドの脱着が起こる条件下で樹脂を溶出液に接触させ、溶液中の不正確にチオエート化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する方法である。かくして、本発明では、生物学的溶液中の他の成分から完全チオエート化一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを精製することができ、オリゴヌクレオチドを実質的に純粋な形態で得ることができる。
【００２８】
当業者に周知の通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成の際に、鎖長の不正確なオリゴヌクレオチドを除いて最も多い夾雑物は、完全にはチオエート化されなかったオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明は、治療その他の用途のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの生産における重要なニーズを満足する。
【００２９】
本願出願人の知る限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製に核酸の骨格ホスホロチオエート基と金属との相互作用を利用したのは本発明が最初である。本発明を特定の相互作用に限定することを望むものではないが、オリゴヌクレオチドのアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンの１以上の塩基の窒素原子がこの結合に関与し得ると考えられる。
【００３０】
本発明に関して、「完全」チオエート化という用語は、対応する天然オリゴヌクレオチドに存在するリン酸骨格基の１００％で、リン酸骨格中の非橋かけ酸素原子の１つがイオウ原子で置換されていることを意味する。
【００３１】
本発明方法で用いるＩＭＡＣ樹脂とは、「背景技術」で例示したものを始めとして、いかなる樹脂でもよい。簡単に述べると、金属キレート基としては、例えば、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）基、トリス（カルボキシメチル）−エチレンジアミン（ＴＥＤ）基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸基、並びにＮ−（メチル）及びＮ−（ヒドロキシメチル）ＩＤＡ基のような誘導体が挙げられる。これらの基は、標準的な脂肪族エーテル結合並びにビスオキシラン、エピクロロヒドリン及び１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンのような試薬によって天然又は合成高分子担体に架橋させることができる。天然高分子担体の具体例として、例えば、アガロース、アルギン酸塩、カラゲナン、ゼラチンなどが挙げられる。合成ポリマーの例としては、スチレン又はその誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどが挙げられるが、これらは適宜、ジビニルベンゼン、二官能性又は多官能性（メタ）アクリレートエステル、二官能性又は多官能性（メタ）アクリルアミド、トリアリルイソシアヌレート、ジビニルアミドなどの架橋剤で架橋されていてもよい。なお、本発明の方法で用いられるＩＭＡＣ樹脂は、担体にキレート基を結合させ、配位イオンで荷電したものからなる。適当な配位金属イオンの具体例は、例えば、Ａｌ、Ｃｅ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｌｕ、Ｎｉ、Ｒｕ、Ｓｂ、Ｓｃ、Ｓｎ、Ｙｃ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｔａ及びＴｈイオンである。本発明の一実施形態では、金属イオンはＺｒ２＋又はＦｅ３＋である。本発明のこの実施形態では、橋かけ基のリンに対して対応イオウよりも強い結合を与える。ＩＭＡＣ樹脂は市販されており、例えばいずれもＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ）から市販されているＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ  ＣｏｌｕｍｎｓやＣｈｅｌａｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどがある。
【００３２】
本発明に関して、「樹脂」という用語は、粒子及びビーズだけでなく、モノリシック構造体及びメンブランも包含した意味で用いられる。
【００３３】
生物学的溶液の様々な成分（主に生物学的溶液の性状に応じてタンパク質又は不正確に合成されたオリゴヌクレオチドなど）から所望アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離できる。例えば、一実施形態では、生物学的溶液はアンチセンスオリゴヌクレオチドの自動合成で得られたものである。したがって、一実施形態では、生物学的溶液は合成溶液である。同様の実施形態では、生物学的溶液は、非自動化法でアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した溶液である。例えば、合成は、周知の方法或いはＡＫＴＡ（商標）オリゴパイロット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ）製）のような市販の装置で溶液中で実施できる。別の実施形態では、生物学的溶液はヒト血清のような血清であり、本発明の方法の目的は、血清中に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドの定量であってもよい。この実施形態は、患者の血中医薬品（すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド）の存在量を試験することが望まれる治療法の一部であってもよい。
【００３４】
一実施形態では、単離した一重鎖（ｓｓ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜３０塩基（例えば１５〜２５塩基）の大きさのもの、特に１８〜２１塩基の大きさのものである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８〜２０塩基の大きさものである。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２５個以下（例えば２０個）の塩基からなる。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５個以上（例えば約１０個以上）の塩基からなる。ただし、本発明に関して、アンチセンス技術を用いて治療すべき病態の種類によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列や大きさなどの性状が決まることは周知であるので、アンチセンス技術による医薬品で有用であれば、さらに鎖長の短い又は長いオリゴヌクレオチドも本発明に包含されることは明らかである。かかる医薬品は、「背景技術」の項で述べた通り、癌のような宿主疾患及び感染症のいずれの治療にも有用である。
【００３５】
しかし、背景技術の項で述べた通り、アンチセンスオリゴヌクレオチド合成は、不正確に合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを部分的に生じることが多い。かかる合成で得られる生物学的溶液で最も一般的な不純物は、欠失配列、すなわち所望生成物よりも１塩基以上短いアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかる欠失オリゴヌクレオチドは、（ｎ−１）量体、（ｎ−２）量体、（ｎ−３）量体などとして表すことができ、ｎは所望の完全長生成物のヌクレオチド数を表す。したがって、本発明の一実施形態では、不正確に合成されたオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する。不正確に合成されたオリゴヌクレオチドのその他の例は、付加配列、つまり所望生成物よりも長いアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び枝分れ生成物である。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド合成で得られた生物学的溶液中の不要成分のその他の例は、不正確にチオエート化された配列、つまり完全にはチオエート化されていないオリゴヌクレオチドである。上述の通り、これらは、合成溶液中で最もよくみられる夾雑物の一種である。最もよくみられる形態は、１又は２つの未チオエート化結合を有するオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明の方法の一実施形態では、１〜５個（例えば１〜２個）の未チオエート化結合を有する不正確にチオエート化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドから完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する。
不正確にチオエート化されたオリゴヌクレオチドのさらに別の例は、例えば１個のホスホジエステル基が正確にはチオエート化されなかった２０量体オリゴヌクレオチドであり、したがって約９５％チオエート化されたオリゴヌクレオチドが完全チオエート化オリゴヌクレオチドから分離される。同様に、１個の塩基が正確にはチオエート化されなかった１９量体、１８量体又は１７量体オリゴヌクレオチドは約９４％チオエート化されている。したがって、一実施形態では、約９０％（例えば約９４％）、好ましくは約９５％チオエート化されたオリゴヌクレオチドから、完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する。別の実施形態では、約４０％、好ましくは約６０％、さらに好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％チオエート化されたオリゴヌクレオチドから、完全チオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する。
【００３７】
従来技術では、ＩＭＡＣを用いてタンパク質及び／又はペプチドを単離する際に、中性又は中性付近のｐＨ条件、例えば約７．５〜８．０のｐＨ条件が用いられてきた。今回、本発明者らは、ＩＭＡＣを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを単離する際、ｐＨが低い方が望ましいという予想外の知見を得た。そこで、本発明の一実施形態では、吸着条件は中性以下のｐＨ値によって規定される。ある特定の実施形態では、ｐＨを約７以下（例えば約５）に調節される。そこで、樹脂と接触させる際の生物学的溶液のｐＨは、０〜７、０〜６又は０〜５の範囲とすることができる。ｐＨの調節は、適当な緩衝液又は希酢酸のような酸の添加によって当業者が容易になし得る。好適な実施形態では、ｐＨは約５．０に調節され、用いる緩衝液は１５ｍＭ酢酸ナトリウムである。自明であろうが、オリゴヌクレオチドは極端なｐＨ値に敏感であるので、アンチセンスオリゴヌクレオチドを損ないかねないｐＨとならないように注意すべきである。
【００３８】
樹脂からの所望アンチセンスオリゴヌクレオチドの溶出は、ｐＨ及び又はリン酸塩（例えばリン酸カリウム）の増加勾配を用いる標準的方法で実施できる。勾配の具体例として、以下の実施例で用いた勾配は、吸着に用いたｐＨから出発し、０．１％酢酸から０．５Ｍリン酸カリウムである。別の実施形態では、勾配はｐＨ３．０から０．２Ｍのリン酸カリウムである。その他の周知の塩及び緩衝液も溶出に有用であり、溶出に適した条件の設定は当業者が容易になし得る。当業者には自明であろうが、塩の添加によってイオン強度が増し、そのためアンチセンスオリゴヌクレオチド周囲のｐＨはわずかに変化するであろう。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチド吸着時のｐＨは一般に、タンパク質分離用ＩＭＡＣ用途で公知の条件よりも低いであろう。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本発明方法は、単離したアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに精製する段階を含む。かかる精製は、ゲルろ過、脱トリチル化沈殿、脱塩、緩衝液の交換などによって当業者が容易に実施し得る。
【００４０】
下記に示した実施例は小規模の実験室スケールを利用しているが、当業者は容易に、生産プラントで有用な規模にまで本発明方法を拡大できる。したがって、本発明方法のひとつの利点は、従来示唆されてきた例えば逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）方法よりもより価格が安い溶媒及び設備しか必要としない点である。
【００４１】
本発明の第二の態様は、以上の方法で単離したアンチセンスオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明に係る完全チオエート化一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上（例えば１００％付近）の純度で得られる。
【００４２】
本発明の第三の態様は、生物学的溶液中の対応オリゴヌクレオチドからアンチセンスオリゴヌクレオチドを単離するための固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂の使用である。ＩＭＡＣ樹脂は、本発明の方法に関して説明した通りのものであればよく、上記の説明は本発明に係る使用にも適用できる。
【００４３】
最後に、本発明は、生物学的溶液から完全チオエート化一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを精製するためのキットであって、完全にはチオエート化されていないオリゴヌクレオチドから完全チオエート化オリゴヌクレオチドを分離するための固定化金属イオン吸着クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）樹脂を充填したクロマトグラフィカラムとその取扱い説明書とを備えるキットに関する。本キットは、実験室規模のカラム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの大規模生産に適した大きさのカラムのいずれを備えていてもよい。さらに、キットは、溶出及び適宜別のコンパートメントでの洗浄に適した緩衝液を含んでいてもよい。
【００４４】
図面の詳細な説明
図１は、全長７塩基の完全チオエート化ホスホロチオエート（ａ）、そのモノホスホジエステルアナログ（ｂ）、及び（ｎ−１）量体を与える単一欠失配列（ｃ）の例を示す。
【００４５】
図２は、実施例１に記載の金属イオンとしてＦｅ３＋を用いたＩＭＡＣを示し、同一塩基配列の２種類の異なるオリゴヌクレオチドの溶出を対比して示す。Ｘ軸はｍｌ単位の保持容量を示し、Ｙ軸は２６０ｎｍでのＵＶ吸光度をｍＡＵ単位で示す。一方のオリゴヌクレオチドは完全にチオエート化されたものであり（図２では２０Ｓとして示す。）、他方は未修飾のものである（図２では２０Ｐとして示す。）。ホスホジエステル（未修飾）形のオリゴヌクレオチドからアンチセンスオリゴヌクレオチドを分離することができ、チオエート化形は未修飾形よりも先に７．３ｍｌにおいて比較的狭いピークとして溶出されることがはっきりと分かる。クロマトグラムの初期段階で溶出された２つの小さなピークはおそらく合成に関連したもので、試料中のホスホロチオエート又はホスホジエステル基を全く含まない不純物によるものと思われる。
【００４６】
図３は、実施例２に記載の金属イオンとしてＺｒ２＋を用いたＩＭＡＣを示し、同一塩基配列の２種類の異なるオリゴヌクレオチドの溶出を対比して示す。Ｘ軸及びＹ軸は上記の通りである。オリゴヌクレオチドの一方は完全にチオエート化されたものであり（図３では２０Ｓとして示す。）、他方は未修飾のものである（図３では２０Ｐとして示す。）。ホスホジエステル（未修飾）形のオリゴヌクレオチドからアンチセンスオリゴヌクレオチドを分離することができ、チオエート化形は未修飾形よりも先に約９．４ｍｌにおいて比較的狭いピークとして溶出されることがはっきりと分かる。クロマトグラムの初期段階で溶出された２つの小さなピークは図２で説明した通りである。図２と図３との対比から、オリゴヌクレオチドがＦｅイオンよりもＺｒイオンに高いアフィニティをもつことが分かるが、使用条件が最適化されていないことに留意されたい。    
【００４７】
図４は、実施例３に記載の同一配列の２種類のオリゴヌクレオチドの効率的な分離の例を示す。具体的には、この図は、ＩＭＡＣを用いて、２つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（「２Ｐ」）から完全チオエート化（２０Ｓ）オリゴヌクレオチドを分離できる可能性が十分あることを示している。クロマトグラムでピークは明確に分離されている。溶出には、１５ｍＭ酢酸ナトリウムから０．２Ｍリン酸カリウムの１０ＣＶ（カラム体積）直線勾配を用いた。
【００４８】
図５も、実施例４に記載の同一配列の２種類のオリゴヌクレオチドを明確に分離できることを示す。具体的には、この図は、２つホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（「２Ｐ」）のピークから、完全チオエート化（２０Ｓ）オリゴヌクレオチドに対応するピークをベースラインで完全に分離できることを示している。したがって、本発明では、段階的溶出を用いたＩＭＡＣで、２つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドから完全チオエート化オリゴヌクレオチドを分離できることを示している。溶出には、０．１Ｍリン酸カリウムでの段階１と０．２Ｍリン酸カリウムでの段階２の段階的溶出を用いた。図４及び図５に示すような実施例３及び実施例４で得られた結果は、この結合では、塩基ではなくリン酸基が基本的に重要であることの裏付けとなる証拠を与える。これは、上述の国際公開第９９／０９０４５号で示唆されている事項、すなわちチオエート化度が高いほどＩＭＡＣ樹脂に強く結合するはずであるという記載を否定するものである。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は例示を目的とするものにすぎず、特許請求の範囲によって規定される本発明の技術的範囲を限定するものではない。本明細書中で引用した文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００５０】
実施例１
金属イオンとしてＦｅ３＋を用いたＩＭＡＣによる一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製
本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、配列ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡを有する２０量体であった。２種の異なるオリゴヌクレオチドを用いたが、一方は完全にチオエート化されたもので、他方は全く修飾していないもの（ホスホジエステル形）であった。
【００５１】
本実施例では、ＩＤＡ化学を利用した小型ＩＭＡＣカラムＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（容量１ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ）製、製品番号１７−０４０８−０１）を用いた。
【００５２】
本実施例で用いた溶媒／緩衝液は、ＩＭＡＣ用としては通常とは異なる。結合用「緩衝液」として、０．１％酢酸水溶液を用いた。溶出は０．１％酢酸水溶液から０．０５Ｍリン酸カリウムまでの１０カラム体積の直線勾配で行った。ただし、これらの条件は結合（吸着）に関しても溶出に関しても最適化したものではない。
【００５３】
溶出液の流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、検出は２６０ｎｍのＵＶで行った。このように、Ｆｅ３＋について試験したところ、本発明の方法における金属イオンとして有用であることが判明した。本実施例の結果を図２に示す。
【００５４】
実施例２
金属イオンとしてＺｒ２＋を用いたＩＭＡＣによる一重鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製
本実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、実施例１の２０量体であった。本実施例では、ＩＤＡ化学を利用した小型ＩＭＡＣカラムＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（容量１ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ）製、製品番号１７−０４０８−０１）を用いた。
【００５５】
本実施例では、結合用「緩衝液」は、実施例１と同様、０．１％酢酸水溶液であった。溶出は、０．１％酢酸水溶液から０．２Ｍリン酸カリウムまでの１０カラム体積の直線勾配で行った。ただし、これらの条件はいずれに関しても最適化したものではない。
【００５６】
溶出液の流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、検出は２６０ｎｍのＵＶで行った。
【００５７】
このように、Ｚｒ２＋について試験したところ、本発明の方法における金属イオンとして有用であることが判明した。本実施例の結果を図３に示す。
【００５８】
実施例３
直線勾配で溶出したＩＭＡＣによる、完全にはチオエート化されていないオリゴヌクレオチドからの合成（アンチセンス）オリゴヌクレオチドの精製
本実施例は、部分的にしかチオエート化されていないオリゴヌクレオチドから完全チオエート化オリゴヌクレオチドを本発明の方法で分離できることを示す。
【００５９】
本例で使用したオリゴヌクレオチドは、配列ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡを有する２０量体であった。２種の異なるオリゴヌクレオチドを用いたが、一方は完全にチオエート化されたもので、他方は全く修飾していないもの（ホスホジエステル形）であった。ホスホジエステル結合は１０位と１５位（５′末端から定義）にあった。
【００６０】
本例では、ＩＤＡ化学を利用した小型ＩＭＡＣカラムＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（容量１ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ）製、製品番号１７−０４０８−０１）を用いた。検討した金属イオンはＺｒ２＋であった。
【００６１】
本例で用いた溶媒／緩衝液は、ＩＭＡＣ用としては通常とは異なる。結合用緩衝液として、１５ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０を用いた。溶出は０．２Ｍリン酸カリウム，ｐＨ６．５で行った。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、検出は２６０ｎｍのＵＶで行った。
【００６２】
結果を図４に示すが、完全チオエート化（２０Ｓ）と２つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（「２Ｐ」）とを対比して示す。
【００６３】
実施例４
段階的勾配で溶出したＩＭＡＣによる、完全にはチオエート化されていないオリゴヌクレオチドからの合成（アンチセンス）オリゴヌクレオチドの精製
本実施例では、部分的にしかチオエート化されていないオリゴヌクレオチドから完全チオエート化オリゴヌクレオチドを本発明の方法で分離できることを示す第二の例である。出発物質及び機器は、実施例３に示した通りであり、緩衝液は１５ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０であり、本例では溶出を段階的勾配で行った。第１段階は０．１Ｍリン酸カリウムで２ＣＶであり、第２段階は、０．２Ｍリン酸化カリウムで２ＣＶである。結果を図５に示すが、この図は、完全チオエート化（２０Ｓ）と２つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（「２Ｐ」）の２種類のオリゴヌクレオチド混合物の分離を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】全長７塩基の完全チオエート化ホスホロチオエート（ａ）、そのモノホスホジエステルアナログ（ｂ）及び単一欠失配列（ｃ）の例を示す。
【図２】実施例１に記載の金属イオンとしてＦｅ３＋を用いたＩＭＡＣを示し、同一塩基配列の２種類の異なるオリゴヌクレオチドの溶出を対比して示す。
【図３】実施例２に記載の金属イオンとしてＺｒ２＋を用いたＩＭＡＣを示し、同一塩基配列の２種類の異なるオリゴヌクレオチドの溶出を対比して示す。
【図４】ＩＭＡＣを用いての、２つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（「２Ｐ」）からの完全チオエート化（２０Ｓ）オリゴヌクレオチドの効率的な分離の例。
【図５】段階的溶出によるＩＭＡＣを用いての、２つのホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（「２Ｐ」）からの完全チオエート化（２０Ｓ）オリゴヌクレオチドの明確な分離の例。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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