(57)【要約】本発明は、線維性疾患、特に心血管系の線維性疾患の治療において、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤の使用、好ましくはスレオニンプロテアーゼ阻害剤の形態での使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来物質に対する炎症性反応によって生じない線維性疾患の治療のための少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤の使用。
【請求項２】
過負荷によって生じた心臓線維症、うっ血によって生じた肝臓線維症、高血圧によって生じた腎臓線維症、または関節不良肢位の場合の関節線維症の治療のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
動脈性高血圧の慢性圧力ストレス下での過負荷によって生じた心臓線維症の治療および／または心筋梗塞の場合の無処置残存心筋の代償的運動過剰症における過負荷によって生じた心臓線維症の治療のための請求項２記載の使用。
【請求項４】
ＡＣＥ阻害剤、ＡＴ−１アンタゴニストおよび／またはエンドセリン受容体アンタゴニストによる治療が示される心臓線維症の治療のための請求項２または３記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤を約０．５μｇ／ｋｇ体重〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは約１μｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で患者に投与される請求項１〜４のいずれか一に記載される使用。
【請求項６】
線維性疾患は線維性器官疾患に関連する線維性疾患、好ましくは肺、肝臓、皮膚、関節、骨格および／または腺の線維性疾患、特に心血管系疾患に関連することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一に記載の使用。
【請求項７】
プロテアソーム阻害剤は低分子量有機化合物または分子生物学的化合物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一に記載の使用。
【請求項８】
プロテアソーム阻害剤はスレオニンプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、プロテアソーム系の遺伝子発現阻害剤および／またはプロテアソーム系の少なくとも１つの成分、好ましくはユビキノンおよび／またはプロテアソームに対する結合性タンパクまたは結合性ペプチドであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一に記載の使用。
【請求項９】
プロテアソーム阻害剤はペプチドアルデヒド、ペプチドボロネート、ペプチドビニルスルフォン、ペプチドエポキシケトン、ラクタシスチン、ペプチドαケトアルデヒド、α−ケトアミド、インダノンペプチド、ポリアルキレンアルデヒド、ポリフェノール、特にカテキン−３−没食子酸塩、プロテアソーム系の少なくとも１つの成分に対する核酸および／またはプロテアソーム系の少なくとも１つの成分に対する抗体もしくはその結合性反応部分またはその誘導体であることを特徴とする、１〜８のいずれか一に記載の使用。
【請求項１０】
プロテアソーム阻害剤は、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＭＧ１３２）、Ｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＰＳＩ）、ＣＥＰ１６１２、ピラジルカルボニル−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ボロネート（ＰＳ−３４１）、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ボロネート（ＤＦＬＢ）、モルフォリノ−ナフチルアラニン−Ｌｅｕ−ボロネート（ＭＧ２７３）、ＮＩＰ−Ｌｅｕ３−ビニルスルフォン（ＮＬＶＳ）、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ３−ＶＳ、ＮＩＰ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＶＳ、Ａｄａ−Ｔｙｒ−Ａｈｘ３−Ｌｅｕ３−ＶＳ、Ａｄａ−Ｌｙｓ（Ｂｉｏ）−Ａｈｘ３−Ｌｅｕ３−ＶＳ、Ａｃ（Ｍｅ）−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＥＸ（エポクソマイシン）、ジヒドロエポネマイシン、ラクタシスチン、クラスト−ラクタシスチン−β−ラクトン（オムラリド）、ＰＳ−５１９、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ａｌ（ＡＬＬＮ）、３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド（Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ  ＳＣ）、ＴＭＣ−９５Ａ、グリオトキシン、（−）−エピガロカテキン−３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）、リトナビール、ロバスタチン、アクラシノマイシンＡ（アクラルビシン）、シクロスポリン、プロテアソームコード配列に対するアンチセンスＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、プロテアソームコード配列に対する２本鎖形成オリゴヌクレオチドおよび／またはプロテアソームコード配列に対するノックアウト構築物であり、ここで、Ｚはベンジルオキシカルボニル基であり、ａｌはアルデヒド基であり、ＶＳはビニルスルフォン基であり、ＮＩＰは３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニルアセテート基であり、そして、Ｂｉｏはビオチン基であることを特徴とする、１〜９のいずれか一に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は線維性疾患、特に心血管系の線維性疾患の治療のための少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋線維症は、心筋の過負荷に対する反応であり、これは例えば高血圧、心筋梗塞または心筋症によって生じるであろう。多くの病態生理学的メカニズムは、例えば大きなマトリックス形成につながる心臓結合組織細胞の増殖のような現象に寄与する。機能的最終状態は心筋の質量増加と増大した線維再構築（線維症）である。すなわち、心臓再構築の１つの指標は、心筋壁の増大した硬さとなる間質性線維症である。これは機能面から弛緩性機能障害となり、さらに心筋の弱さを悪化させるであろう。部分的には、これらの効果は心筋の主要なコラーゲンであるコラーゲンＩおよびＩＩＩのような細胞外マトリックスタンパクをコードする遺伝子の増大した発現によって生じる。
【０００３】
心臓線維症の低下のために現在もっともよく確立された戦略は、例えばＡＣＥ阻害剤またはアンジオテンシンＩＩブロッカーによるレンニン−アンジオテンシン系の薬理学的阻害剤である。しかしながら、これらの物質は、患者の不耐性効果が事例の少なくとも５％となるという欠点を有する。さらに、これらはレニン−アンジオテンシン系により仲介される心臓線維症にのみ効果があるが、ＴＧＦ−ベータ（成長因子βを形質転換する）またはエンドセリン−１などの他のアゴニストにより仲介される心筋線維症の発症には効果がない。すなわち、心筋線維症を低下または予防することができる他の方法が必要である。
【非特許文献１】リー(Lee)、D.H.ら、(1998)  Trends Cell  Biol., 8397-403
【非特許文献２】ユ(Yu)C.-L.ら、(1997) J. Biol.Chem., 272,14017-14020
【非特許文献３】ヘルディン(Heldin）C.-H.ら、(1999) Nat. Cell Biol.,1,E195-E197
【非特許文献４】デステッロ(Desterro) J.M.P.ら、(2000) Cell Mol Live Sci., 57, 1207-1219)
【非特許文献５】ダールマン(Dahlmann)B.ら、(2000) J.Mol. Biol., 303, 643-653
【非特許文献６】キッセレブ(Kisselev)A.F.およびゴールドバーグ(Goldberg)A.L. (2001) Chemistry & Biology, 8, 739-758
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
目下、驚くべきことにプロテアソーム系の阻害が心筋線維症を効果的に低下するかまたは予防することができ、改善された心筋機能となることが見出された。
【０００５】
本発明の課題は、線維性疾患の治療のために少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤を使用することにある。線維性疾患は肺、肝臓、皮膚、関節、骨格および／または腺のような非常に異なった組織系に影響を与え得る。特に、本発明は心臓血管系の線維性疾患に関する。
【０００６】
ユビキチン−プロテアソーム系は、例えばシグナル仲介物質、細胞周期タンパク質および転写因子などの真核生物細胞中での細胞内タンパク質の分解における主要な代謝経路である。プロテアソームの阻害は細胞増殖を阻害し、異なったシグナル経路を妨害し、かつ、遺伝子発現に影響を与えることが示された（非特許文献１−４）
【０００７】
プロテアソーム阻害剤として好適なものは、一方では低分子量有機化合物であり、他方、分子生物学的化合物であり、これらの物質は好ましくは実質的に特異的な方法でプロテアソームを阻害する。阻害試験は、例えばダールマン（非特許文献５）に記載されるようにして実施され得る。本発明では「実質的に特異的」との言葉は、阻害剤が例えばカルパイン、カテプシンまたはＴＰＰＩＩなどの他の分子内プロテアーゼよりもより顕著な方法でプロテアソームを阻害することを意味し、ここで、この阻害は他の細胞内プロテアーゼの阻害よりも約１０倍強く、特に約１００倍強く、主に約１０００倍強い。
【０００８】
阻害値は一般的にＩＣ５０（５０％阻害での阻害剤濃度）として示され、互いに比較される。本発明の低分子量有機化合物とは、１０００以下、好ましくは ８００以下の相対的モル質量を有する有機化合物をいう。本発明の分子生物学的化合物とは、プロテアソーム系の成分の発現、例えばプロテアソームをコードする核酸の転写または翻訳、またはタンパク質、特に結合ペプチドまたは結合タンパク質への発現を阻害する核酸、特にＲＮＡまたはＤＮＡをいう。これらの物質はプロテアソーム系の少なくとも１成分、好ましくはユビキチンおよび／またはプロテアソームに対して向けられる。この核酸は例えばプロテアソームをコードする配列に対するアンチセンスＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、プロテアソームをコードする配列に対する２本鎖形成オリゴヌクレオチド、および／またはプロテアソームをコードする配列に対するノックアウト構築物である。結合タンパク質または結合ペプチドとして好適なものは、例えば抗体またはそれらの結合性反応部分、例えば１本鎖抗体（ｓｃＡｂ）またはＦａｂ断片またはそれらの誘導体、例えばプロテアソーム系の少なくとも１成分に対する二重特異的抗体である。プロテアソーム系および好適なプロテアソーム阻害剤についての説明は、例えば非特許文献６に見られる。
【０００９】
すなわち、プロテアソーム阻害剤の好適な例としては、特にスレオニンプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤および／またはシステインプロテアーゼ阻害剤、特にペプチドアルデヒド、ペプチドボロネート、ペプチドビニルスルフォン、ペプチドエポキシケトン、ラクタシスチン、ペプチドα−ケトアルデヒド、α−ケトアミド、インダノンペプチド、ポリアルキレンアルデヒドおよび／またはポリフェノール、特に例えば緑茶から抽出され得るカテキン−３−没食子酸塩がある。プロテアソーム阻害剤として特に好適なものは、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＭＧ１３２）、Ｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ａｌ（ＰＳＩ）、ＣＥＰ１６１２、ピラジルカルボニル−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ボロネート（ＰＳ−３４１）、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ボロネート（ＤＦＬＢ）、モルフォリノ−ナフチルアラニン−Ｌｅｕ−ボロネート（ＭＧ２７３）、ＮＩＰ−Ｌｅｕ３−ビニルスルフォン（ＮＬＶＳ）、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ３−ＶＳ、ＮＩＰ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＶＳ、Ａｄａ−Ｔｙｒ−Ａｈｘ３−Ｌｅｕ３−ＶＳ、Ａｄａ−Ｌｙｓ（Ｂｉｏ）Ａｈｘ３−Ｌｅｕ３−ＶＳ、Ａｃ（Ｍｅ）−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＥＸ（エポクソマイシ）、ジヒドロエポネマイシン、ラクタシスチン、クラスト−ラクタシスチン−β−ラクトン（オムラリド）、ＰＳ−５１９、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ａｌ（ＡＬＬＮ）、３，４−ジクロロイソスマリン（ＤＣｌ）、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド（Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ  ＳＣ）、ＴＭＣ−９５Ａ、グリオトキシン、（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、リトナビール、ロバスタチン、アクラシノマイシンＡ（アクラルビシン）および／またはシクロスポリンがある。これらは全て非特許文献６および図３により詳細に説明される。ここで、Ｚはベンジルオキシカルボニル基であり、ａｌはアルデヒド基であり、ＶＳはビニルスルフォン基であり、ＮＩＰは３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニルアセテート基であり、かつ、Ｂｉｏはビオチン基である。これらのクラスの全化合物のうち、特に好ましいものはスレオニンプロテアーゼ阻害剤であり、これのうち、特にＭＧ１３２、ＭＧ２６２、ラクタシスチンおよび／またはエポクソマイシンであり、とりわけＭＧ１３２および／またはＭＧ２６２である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、プロテアソーム阻害剤が心臓線維症に及ぼす効果が自然発症高血圧ラット（ＳＨ−ラット）で研究された。１ｋｇ当たり毎日１ｍｇ用量で特定プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を使用した１２週間の長期治療では、我々は驚くべきことに約４０％の心臓線維症の有意な阻害、さらには阻害剤が非常に十分に耐容性を示すことを見出した。上記効果は、ＭＧ１３２処理動物における改良された心室機能となった。インビトロで示されたものは、心臓性線維芽細胞の成長における濃度依存性阻害および約７５％のコラーゲンＩα２および約９０％のコラーゲンＩＩＩα１の特異的濃度依存性下方制御であった。細胞毒性を発生する重大な細胞性システムの阻害剤として、プロテアソーム阻害剤を使用する全身性治療を誰しも期待していたけれども、上記長期治療は測定可能な副作用を示さず、逆に十分な耐容性を示した。すなわち、プロテアソーム阻害剤は線維性疾患の治療、特に心血管系の治療において好ましい適合性を示す。
【発明の効果】
【００１１】
すなわち、本発明はまた線維性疾患、好ましくは心血管系線維症を患っている患者の治療に関する。全身性適用および局所適用の双方は、適用形態として可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下の方法および対応する図１〜３に示される結果は、本発明をこれらに限定することなく、例示により本発明をより詳細に説明することを意図する。
【００１３】
方法
方法１：心臓線維芽細胞の調製
新生児心臓の非筋細胞画分をプレートすることによって、新生児ウィスターラットから心臓線維芽細胞を調製した。心臓は２〜３日齢である新生児ラットから除去した。心室の組織をハンクス・バランスド塩生理食塩水（ＨＢＳＳ）（Ｃａ２＋−およびＭｇ２＋−フリー、Invitron（登録商標）、Karlsruhe、Germany）中の５０ｍｇ／ｍｌトリプシンを使用して４℃で一夜、処理し、レーボヴィッツ培地（Ｌ−１５、Invitron（登録商標）、Karlsruhe、Germany）中のコラーゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して３７℃で４５分間、処理した。洗浄後、細胞を１時間、３７℃でプレプレートした。粘着性細胞は有意に心臓性線維芽細胞であった。次いで、これらは１０％新生牛血清、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシン（Invitron（登録商標）、Karlsruhe、Germany）を有する標準Ｍ１９９−培地中で標準条件下にさらに培養した。この実験では、我々は継代培養された３〜７継代の線維芽細胞を使用した。
【００１４】
方法２：増殖試験
ＭＧ１３２、ＡＬＬＭおよびＭＧ２６２をCalbiochemＲ(San Diego、Calfornia、USA)から購入し、１０ｍＭ  ＤＭＳＯ原液を準備した。心臓線維芽細胞（５×１０４細胞／ｍｌ）を２４穴プレート中に播種した。粘着細胞を１０％血清培地中、ＭＧ１３２（０．１および１μＭ）またはＤＭＳＯ（０．１％）のいずれかでもって刺激し、さらに７日間、培養した。培地を２日毎に交換した。トリパンブルー排除試験を使用して、１日毎に、３回、生細胞を係数して、増殖を測定した。この方法は生細胞と死細胞の区別を可能とする。細胞に添加された染料、トリパンブルーは、欠損細胞膜を有する細胞中にのみ入ることができ、その結果、青色に染色される。無傷の細胞膜を有する生細胞は染色されない。
【００１５】
方法３：線維症の組織学的測定
病理組織学的評価のために、ラット心臓をパラフィンに包埋し、厚さ３μｍを有する切片に切断し、ヘマトキシリン・エオシンとシリウスレッド染色に付し、そしてホッヒャー(Hocher) Bら(1999)、Hypertension, 3, 816-822に記載されるように分析した。心臓線維症の程度は、画像分析システム（Quantimed500、Image1.61 program）を使用するシリウスレッド染色切片の定量的形態計測でもって評価した。この分析で、赤色染色組織（結合性組織）と全切片組織の割合を測定した。
【００１６】
方法４：ＲＮＡおよびＲＴ−ＰＣＲ分析
トリゾール試薬（Invitrogen（登録商標）、Karlsruhe、Germany）を使用して全ＲＮＡを抽出した。次いで、ＲＮＡを逆転写(ＡＭＦリバーストランスクリプターゼ、Roche Biochemicals、Mannheim、Germany)に付し、ＤＮａｓｅ(Ambion、Huntington、UK)で処理した。我々はプライマーエクスプレス・ソフトウェア、バージョン１．２(PerkinElmer/Applied Biosystems、Wellesley、MA、USA)を使用して、ラットコラーゲンＲＮＡＩα１、Ｉα２、ＩＩＩα１のためのＰＣＲプライマー、マトリックス−メタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）２および９のためのＰＣＲプライマー、および「ハウスキーピング」遺伝子ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のためのＰＣＲプライマーを設計した。次いで、それぞれのプライマーをTIB Molbiol、Berlin、Germanyから得た。ＰＣＲ反応を製造者の指示書に従って、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ５７００配列検出計(PerkinElmer/Applied Biosystems、Wellesley、MA、USA)で行った。相対的数量化は比較ＣＴ法でもって製造者が記載するようにして行った。
【００１７】
方法５：動物研究
同年齢の雄ＳＨラットをJackson Laboratory、Maine、USAから得た。動物を研究室動物の飼育と使用に関する国際的ガイドラインに従って保有した。６週齢ラットを１２週間、ＭＧ１３２（１ｍｇ／ｋｇ体重）、０．１％ＤＭＳＯの溶媒コントロールで処理するか、または生理学的食塩水でもって処理した（ｎ＝１０／グループ、毎日、腹腔内注射）。動物に高塩食餌を与えた（２％塩化ナトリウムの飲料水）。標準的テイルカット法でもって血圧を毎週、測定した。標準法でもって血液成分値および腎臓および肝臓の標準的研究室マーカーを処理後、６週間および研究の最後に測定した。研究の最後では２０％ウレタン溶液（０．９ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射して動物を麻酔し、左心室圧力パラメーターをサラゴカ(Saragoca) Mら、(1981) Hypertension、3、380-385に記載されるようにして測定した。器官を取り出して重量測定し、そして液体窒素中でショック冷凍するか、あるいは組織学的分析のためのパラフィン中に包埋した。上記したパラメーターに関してＤＭＳＯ処理と塩処理ＳＨラットの間には相違点が見られなかったから、ＤＭＳＯ処理動物をＭＧ１３２処理のためのコントロールとした。特に断りのない限り、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の形でデータを測定した。左心室圧力パラメーターおよび心臓線維症定量の有意差をスチューデントＴ検定によって測定した。細胞増殖試験においてコントロール群に対するＭＧ１３２の退化係数を比較して有意差を測定した。誤差確率ｐ＜０．０５を有意であると考えた。ソフトウェアＳＰＳＳ９．０を全統計的算出のために使用した。
【００１８】
結果
自然発症高血圧ラットを特定プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で１２週間、処理することは、この長期間中、一般的に十分な耐容性を示した。６週間後および研究の最後に採取した血液試料では、腎臓または肝臓における副作用を示す差動的血液画像または研究室マーカーの変化のいずれも見られなかった。さらに、ＭＧ１３２処理動物は収縮期の血圧および心臓重量において有意な変化を示さなかった（表１）。
【００１９】
【表１】
2006502998.tif 000002
ＢＤは血圧を意味し、ＫＧは体重を意味し、かつ、ＨＧは心臓重量を意味する。
【００２０】
図１Ａ〜１Ｃに示されるように、左心室のシリウスレッド染色切片の定量的形態計測による結果を測定したところ、ＭＧ１３２処理ＳＨラットはコントロール動物に比べて心臓線維症の有意な低下（−３８％）を示した。
【００２１】
ＭＧ１３２処理ＳＨラットの心臓線維症の予防は、正常左心室機能に十分に関連していた。一方、コントロールは図１Ｄ〜１Ｆに示されるように左心室機能障害の初期徴候を示した。充填圧力（ＬＶＥＤＰ）は有意に低かった（図１Ｄ：１５±２対５±３ｍｍＨｇ、ｐ＝０．０１７）。心臓変力および心臓弛緩のパラメーターである最大圧力増加割合ｄｐ／ｄｔｍａｘ（図１Ｅ：８０１０±５３８対３３７５±６６２ｍｍＨｇ、ｐ＝０．００３）および最大圧力低下割合ｄｐ／ｄｔｍｉｎ（図１Ｆ：−５０４６±７２６対−２２９０±４２２ｍｍＨｇ／ｓ、ｐ＝０．０１５）は、コントロールＳＨラットに比べてＭＧ１３２処理ＳＨラットでは２倍以上大きかった。
【００２２】
プロテアソーム阻害が低下した心臓線維症にインビボで寄与している可能性ある機構を明らかにするために、ラットの原発性心臓線芽細胞をプロテアソーム阻害剤で処理した。図２Ａに示されるように、０．１および１μＭ  ＭＧ１３２による心臓線維芽細胞の処理は、用量依存性増殖阻害を誘発した。さらに、コラーゲンＩα２およびＩＩＩα１のＲＮＡ発現は７３％までおよび９１％まで用量依存法のＭＧ１３２によって阻害された（図２Ｂ）。これとは逆に、コラーゲンＩα１の発現は影響されなかった。ＭＧ１３２のホウ酸塩誘導体である第２の特定プロテアソーム阻害剤ＭＧ２６２は、比較的有効な方法でコラーゲン発現を阻害し（図２Ｂ）、プロテアソーム阻害の特異性を示した。ペプチドアルデヒド（ＡＬＬＭ−ａｌ）として構造的にＭＧ１３２に関連しているカテプシン阻害剤ＡＬＬＭは反対にコラーゲン発現において効果を示さなかった（図２Ｂ）。
【００２３】
風土的発生であって、かつ健康政策の面から極めて重要な器官線維症（特に心筋線維症）は、外来物質の炎症反応の形態である線維性過程の極端な変異種と完全に区別されなければならない（シリコーン埋め込みの場合の被膜形成も参照）。これは、2001年4月19〜21日、マンハイム、「Deutsche Gesellschaft fur Kardiologie-Herz- und Kreislaufforschung」の第６７回大会のH.ルップ(Rupp)、P.ニュールゼッラ（Newrzella）、H.ケーニッヒ（Konig）およびB.メーシュ（Maisch）、「転写因子ＮＦ−κＢの遮断による心臓線維症の抑制」に報告されている。
【００２４】
特に、何百万回も発生し、かつ、本発明において予防または治療のためのプロテアソーム阻害剤の適用によって治療され得る心筋線維症の場合、病態生理学的薬剤は、カテコールアミン、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン−１、ＴＧＦ−βおよび他の因子などの血管収縮メディエーターを放出する神経内分泌学的活性化である。これらは全身性過負荷（例えば、動脈性高血圧の場合、慢性圧力ストレス）または領域性過負荷（例えば、心筋梗塞の場合、無処置残存心筋の代償的運動過剰症）の状態で大きく放出される。その血管収縮性のほかに、これらのメディエーターは心臓筋肉細胞の大きな集団増加および増殖の面から強い成長誘発効果を有し、かつ、心臓線維芽細胞の細胞外マトリックス形成の形で大きな合成結果を示す。過負荷により損傷され、かつ本発明によるプロテアソーム阻害剤により治療される線維性心臓の場合、通常、炎症性反応の徴候は、科学的に十分に証明される。過負荷によって誘発される前記心臓線維症は炎症性転写因子ＮＦκＢの活性化とは独立し、ＴＧＦ−βのシグナル経路に続く（キタモト(Kitamoto)ら、Circulation 2000;102:806-12；リネン(Lijnen)ら、Mol Gen Metab 2000; 71:418-35）。本発明によりプロテアソーム阻害剤で治療され得る心血管関連線維症は、継続的な神経内分泌学的活性化とともに、過負荷の異なった形態によるＮＦκＢから独立して引き起こされる。
【００２５】
これらの状態は、線維症の発生に対して導かれるか、または線維症の抑制に寄与する主たる物質群が特異的に血管に作用する仲介物質に拮抗的な効果を奏することによって明白に支持されている。この良好な例としては、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、アンジオテンシンＩＩ型１−受容体アンタゴニスト（ＡＴ−１アンタゴニスト）およびエンドセリン受容体アンタゴニストがある。
【００２６】
プロテアソーム阻害剤で治療され得る、主要な炎症成分を有しない、本発明の他の好ましい形態の器官線維症は、うっ血で生じた肝臓線維症、高血圧によって生じた腎臓線維症および不良肢位の場合の関節線維症である。
【００２７】
本発明の実験データは、プロテアソーム阻害剤の抗線維性効果が炎症性転写因子ＮＦκＢの活性化とは独立していることを立証する。
【００２８】
１．コラーゲンおよびＭＭＰ２およびＭＭＰ９発現のリアルタイムＰＣＲ分析（図４）：
この分析では、心臓線維芽細胞を無血清条件下に２４時間、プロテアソーム阻害剤で処理した。次いで、調製されたＲＮＡを用いてリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲによって、コラーゲンＩα１、Ｉα２およびＩＩＩα１の発現およびＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現を測定した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、本発明のプロテアソームの阻害はコラーゲンの発現を有意に阻害するのみならず、ＭＭＰの発現をも阻害した。本発明のプロテアソーム阻害剤の阻害効果は基本的な条件下であって、細胞のさらなるサイトカイン刺激がなくても観察された。
プロテアソーム阻害剤もまたＮＦκＢ活性化サイトカイン、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）による刺激によって生じたＭＭＰの誘発後に、これらの効果を示すかどうかを調査するために、心臓線維芽細胞をＩＬ−１βおよびプロテアソーム阻害剤で共刺激した。
【００２９】
ＩＬ−１β刺激はＭＭＰ、特にＭＭＰ９発現の有意な増加となった（図４Ａ）。このＭＭＰはＮＦκＢによって活性化され、かつサイトカイン処理によって刺激され得るプロテアーゼとして記載されている（グム(Gum)ら、J Biol Chem, 1996; 271:10672-80）。プロテアソーム刺激剤の同時投与はＩＬ−１β誘発発現増加を阻害するのみならず、驚くべきことに、発現をＤＭＳＯコントロール値より小さく低下させた（図４Ａ）。これは本発明のプロテアソーム阻害剤によるＭＭＰ発現阻害を証明する。これはＩＬ−１β仲介ＭＭＰ発現阻害よりも強いＭＭＰ発現の阻害となり、ＮＦκＢの活性化阻害とは独立したプロセスである。
【００３０】
本発明の線維性疾患の予防および治療におけるＮＦκ阻害とは独立したプロテアソーム阻害効果は、ＩＬ−１β刺激下のコラーゲン発現の分析で、なお一層、印象的に証明された（図４Ｂ）。
【００３１】
既に、シウィック(Siwik)ら、（シウィック（Siwik）ら、Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 280:C53-C60）に記載されるように、ＩＬ−１β治療は心臓線維芽細胞中のコラーゲン発現の下流制御となった（図４Ｂ）。この抑制はコラーゲン発現における活性化ＮＦκＢの抑制効果によるコラーゲンのプロモーターでＮＦκＢ要素を下流制御することにより説明され得る（クーバ(Kouba)ら、J. Immunol. 1999; 162:3226-34）。しかしながら、ＩＬ−１βとプロテアソーム阻害剤による線維芽細胞の共刺激は、プロテアソーム阻害剤によるＮＦκＢの活性化阻害において期待されたようなＮＦκＢによるコラーゲン抑制の逆転との結果にならなかったが、驚くべきことに、ＩＬ−１βのみによって達成されるよりもさらに強いコラーゲン発現抑制となった（図４Ｂ）。
【００３２】
本発明の研究は、プロテアソーム阻害剤による本発明の線維性疾患の治療がＮＦκＢの活性化阻害とは独立していることを証明する。有利なことに、本発明はＮＦκＢの活性化阻害とは独立した方法で、線維性疾患のＭＭＰとコラーゲンの発現阻害を可能とする。好ましいことに、本発明はＮＦκＢにより仲介されない、または主に仲介されない線維性疾患の予防および治療を可能とする。
【００３３】
２．活性ＭＭＰ２およびＭＭＰ９検出における酵素電気泳動法（図５）
プロテアソーム阻害剤による基本的条件、すなわちＮＦκＢ刺激でない条件下に心臓線維芽細胞中の活性化ＭＭＰ２の本発明の発現阻害もまた、酵素電気泳動法実験で立証された（図５）。これらの実験では、細胞培養上清を酵素電気泳動法によるゼラチナーゼ活性におけるＩＬ−１βの不存在（図５Ａ）および存在（図５Ｂ）下にプロテアソーム阻害剤とともにインキュベートした後、調査した。
【００３４】
本発明では、ＭＭＰ２生成はＩＬ−１βの不存在下、すなわちＮＦκＢとは独立した方法でプロテアソーム阻害剤によって既に低下している（図５Ａ）。ＩＬ−１β誘発ＭＭＰ２およびＭＭＰ９活性化もプロテアソーム阻害剤の同時投与によって低下した（図５Ｂ）。
【００３５】
３．活性ＮＦκＢの検出におけるバンドシフト分析（図６）
上記した結果は、コラーゲン発現およびＭＭＰ発現における本発明のプロテアソーム阻害剤の阻害効果は、非刺激心臓線維芽細胞中で生じ、すなわちＮＦκＢ活性化阻害とは独立している。これはＮＦκＢ−ＤＮＡ結合部位を含むオリゴヌクレオチドを使用するバンドシフト分析にて、さらに確認された。この試験では、ＩＬ−１βの存在または不存在下に経時的に、０．５μＭ  ＭＧ１３２またはＤＭＳＯ（溶媒コントロール）でそれぞれ処理した心臓線維芽細胞から核抽出物を調製した。
【００３６】
図６に示されるように、心臓線維芽細胞は非刺激、基本的条件下に活性ＮＦκＢ複合体を有していない（コントロールバンド参照）。ＩＬ−１β刺激下では、バンドシフトとして示されるＮＦκＢの活性化が生じる。０．５μＭ  ＭＧ１３２を使用する同時治療は６時間以上かかり、ＮＦκＢにおける小さな阻害効果となる。しかしながら、これはＭＧ１３２とＩＬ−１βの同時適用の場合、ＭＭＰ２とＭＭＰ９の発現の驚くべき強い低下を決して説明するものではない（上記参照、図４Ａ）。２４時間後、ＭＧ１３２を使用するか、使用しないＮＦκＢのＩＬ−１β誘発活性化の低下を観察した。すなわち、インビトロ実験はコラーゲンおよびＭＭＰの発現における本発明のプロテアソーム阻害剤の阻害効果は炎症性転写因子ＮＦκＢとは独立して仲介されることを示す。
【００３７】
自然発生的高血圧ラットの動物モデルにおける心臓線維症阻害の初期に示されたデータもまた、本発明のＭＧ１３２−仲介のコラーゲン発現抑制が炎症性刺激と独立している証拠を示す。本発明では、この動物モデルは炎症性刺激を心臓線維症の誘因として見ないが、ラットの明白な高血圧症の誘因として見る。
【００３８】
本発明では、プロテアソーム阻害剤はコラーゲン発現およびＭＭＰ発現の阻害様式を干渉するだけでなく、線維芽細胞増殖の抑制においてその広い活性範囲を示す。
【００３９】
本発明の治療処置法は好ましくはプロテアソーム阻害剤の全身的使用を含む。このアプローチでは、好ましくは少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤が患者に１用量投与される。そこではプロテアソーム阻害剤の全身的副作用、特に細胞毒性副作用が有利にも避けられるか、あるいは少し生じるだけである。線維症の予防および治療のための本発明のプロテアソーム阻害剤の使用は、充分に容認され、好ましくは特定の抗線維性治療が可能であり、したがって様々な患者において本発明の予防および治療を可能とする。
【００４０】
好ましい実施態様では、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤の全身的使用は心臓線維症、好ましくは過負荷によって生じる心臓線維症、好ましくは動脈性高血圧における慢性圧力ストレスのもとでの過負荷によって生じる心臓線維症、好ましくは心筋梗塞の場合の無処置残存心筋の代償的運動過剰症における過負荷によって生じる心臓線維症、好ましくは継続的神経内分泌学的活性化による過負荷によって生じる心臓線維症、好ましくはＡＣＥ阻害剤、ＡＴ−１アンタゴニストおよび／またはエンドセリン受容体アンタゴニストによる治療が暗示される心臓線維症、好ましくはうっ血によって生じる肝臓線維症、好ましくは高血圧によって生じる腎臓線維症および好ましくは関節の不良肢位の場合の関節線維症全ての予防および治療を可能とする。
【００４１】
本発明による線維症の予防および治療では、患者には少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤が約０．５μｇ／ｋｇ体重〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは約１μｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で与えられる。これらの用量は本明細書中に記載されるプロテアソーム阻害剤の全て、特にスレオニンプロテアーゼ阻害剤、特に、ＭＧ１３２およびＭＧ２６２に言及される。好ましくは、本明細書の初めに記載されたプロテアソーム阻害剤の少なくとも１つ、好ましくはＭＧ１３２が投与される。この目的には、好ましくは専門家が熟知する有利な医薬品製剤、好ましくは固体および液体薬剤、好ましくは専門家には公知であり、かつ医薬組成物の有効期限および／または副作用の低下に寄与する少なくとも１つの医薬品添加物を含む輸液用溶液を使用する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】シリウスレッド染色された左心室顕微鏡切片の定量的形態計測により測定された心臓線維症のＳＨラットのＭＧ１３２処理の効果（図１Ａ−１Ｃ）および心臓機能（図１Ｄ−１Ｆ）を示す。  図１Ａは増大した心筋線維症を示す未治療コントロールＳＨラットの心臓の代表的断面図を示す。線維性組織は星印で模範として示される。横棒は２０μｍに等しい。  図１Ｂはプロテアソーム阻害のもとに有意に低下した心臓線維症を示すＭＧ１３２処理動物の心臓の典型的断面図を示す。  図１Ｃはコンピューター画像解析による定量的評価を示す。ここでの効果は、ＭＧ１３２処理のもとに心臓線維症が約４０％まで低下したことにある。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均の標準誤差＝標準偏差／√ｎ）、ｎ＝７〜１０、＊：ｐ＜０．０５  図１ＤはＭＧ１３２処理動物における著しく低下した血圧度を示すラットの左心室の拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝６〜１０、＊：ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  図１ＥはＭＧ１３２処理動物における有意に高い最大血圧上昇割合（ｄｐ／ｄｔｍａｘ）を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝６〜１０、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１  図１ＦはＭＧ１３２処理における２つの因子により増加した最大血圧低下割合（ｄｐ／ｄｔｍｉｎ）を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝６〜１０、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１
【図２】ラットの原発性心臓線維芽細胞の増殖およびコラーゲン発現におけるプロテアソーム阻害効果を示す。  図２ＡはＭＧ１３２による増殖の用量依存性阻害を示す。細胞を０．１μＭおよび１μＭのＭＧ１３２または０．１％ＤＭＳＯで刺激し、毎日、計測した。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３  図２Ｂは「リアルタイム」ＰＣＲ分析を用いたコラーゲンＩα１、Ｉα２およびＩＩＩα１のｍＲＮＡ量の数量化を示す。ＭＧ１３２処理では、コラーゲンＩα２およびＩＩＩα１の発現の用量依存性および劇的低下を観察する。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝２
【００４３】
【図３】図３ＡおよびＢは異なったプロテアソーム阻害剤の化学構造を示す。
【図４】基本的条件下（図４Ｃまたは図４Ｄ）およびＭＧ１３２およびＩＬ−βによる共刺激（図４Ａまたは図４Ｂ）の双方でのＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現およびコラーゲンＩα１、Ｉα２およびＩＩＩα１の発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図５】基本的条件（図５Ａ）またはプロテアソーム阻害剤およびＩＬ−βによる共刺激（図５Ｂ）下での活性ＭＭＰ２およびＭＭＰ９検出のための酵素電気泳動法実験を示す。
【図６】ＭＧ１３２および／またはＩＬ−βによる刺激後の核抽出物中の活性ＮＦκＢの検出におけるバンドシフト分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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