(57)【要約】本発明は、モラクセラ・カタラーリス感染に感受性の宿主に投与するための免疫原性組成物に広く関する。さらに詳細には、本発明は、モラクセラ・カタラーリスのＣｏｐＢタンパク質の交差反応性エピトープの同定に関する。
2006518379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物であって、該断片が配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項２】
断片がさらにＣｏｐＢエピトープとして規定されるところの、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
断片がキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
哺乳類の宿主に免疫原性量で投与した場合、組成物がモラクセラ・カタラーリス菌株の７５％より多くの菌株に拮抗して宿主を保護するところの、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
さらに追加の抗原を含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物であって、該断片が配列番号１、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項９】
断片がさらにＣｏｐＢエピトープとして規定されるところの、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
断片がキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
哺乳類の宿主に免疫原性量で投与した場合、組成物がモラクセラ・カタラーリス菌株の７５％より多くの菌株に拮抗して宿主を保護するところの、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
さらに追加の抗原を含む、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物であって、該断片が配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項１６】
断片がさらにＣｏｐＢエピトープとして規定されるところの、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
断片がキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
哺乳類の宿主に免疫原性量で投与した場合、組成物がモラクセラ・カタラーリス菌株の７５％より多くの菌株に拮抗して宿主を保護するところの、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
さらに追加の抗原を含む、請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
少なくとも三種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、第３ポリペプチドが少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項２４】
ポリペプチドがさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定されるところの、請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
ポリペプチドがキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
哺乳類の宿主に免疫原性量で投与した場合、組成物がモラクセラ・カタラーリス菌株の７５％より多くの菌株に拮抗して宿主を保護するところの、請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
さらに追加の抗原を含む、請求項２３記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
少なくとも三種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、第３ポリペプチドが少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項３１】
ポリペプチドがさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定されるところの、請求項３０記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項３０の免疫原性組成物。
【請求項３３】
ポリペプチドがキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項３０記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項３０記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
哺乳類の宿主に免疫原性量で投与した場合、組成物がモラクセラ・カタラーリス菌株の７５％より多くの菌株に拮抗して宿主を保護するところの、請求項３０記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
さらに追加の抗原を含む、請求項３０記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
少なくとも四種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、第３ポリペプチドが少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含み、第４ポリペプチドが少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項３８】
ポリペプチドがさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定されるところの、請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項３７の免疫原性組成物。
【請求項４０】
配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項３７の免疫原性組成物。
【請求項４１】
ポリペプチドがキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
哺乳類の宿主に免疫原性量で投与した場合、組成物がモラクセラ・カタラーリス菌株の７５％より多くの菌株に拮抗して宿主を保護するところの、請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
さらに追加の抗原を含む、請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
配列番号３のアミノ酸配列を含むモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物。
【請求項４６】
断片がさらにＣｏｐＢエピトープとして規定されるところの、請求項４５記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項４５記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
断片がキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項４５記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項４５記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
さらに追加の抗原を含む、請求項４５記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
配列番号４のアミノ酸配列を含むモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物。
【請求項５２】
断片がさらにＣｏｐＢエピトープとして規定されるところの、請求項５１記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項５１の免疫原性組成物。
【請求項５４】
断片がキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項５１記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項５１記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
さらに追加の抗原を含む、請求項５１記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物であって、断片が配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項５８】
断片がさらにＣｏｐＢエピトープとして規定されるところの、請求項５７記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定され、配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項５７の免疫原性組成物。
【請求項６０】
断片がキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項５７記載の免疫原性組成物。
【請求項６１】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項５７記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
さらに追加の抗原を含む、請求項５７記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
モラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、ポリペプチドが少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項６４】
ポリペプチドがさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定されるところの、請求項６３記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項６３記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
ポリペプチドがキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項６３記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項６３記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
さらに追加の抗原を含む、請求項６３記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
モラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、ポリペプチドが少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項７０】
ポリペプチドがさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定されるところの、請求項６９記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項６９の免疫原性組成物。
【請求項７２】
ポリペプチドがキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項６９記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項６９記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
さらに追加の抗原を含む、請求項６９記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
少なくとも二種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、免疫原性組成物。
【請求項７６】
ポリペプチドがさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定されるところの、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
配列番号３が、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定され、配列番号４が、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定されるところの、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
ポリペプチドがキャリアタンパク質に結合しているところの、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
さらに追加の抗原を含む、請求項７５記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドであって、少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、ポリペプチド。
【請求項８２】
複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドであって、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号３のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、ポリペプチド。
【請求項８３】
複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドであって、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、ポリペプチド。
【請求項８４】
複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドであって、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片、配列番号３のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、ポリペプチド。
【請求項８５】
複数の共有結合した配列番号３のモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む、単離したポリペプチド。
【請求項８６】
複数の共有結合した配列番号４のモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む、単離したポリペプチド。
【請求項８７】
請求項８１のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項８８】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項８７記載の免疫原性組成物。
【請求項８９】
さらに追加の抗原を含む、請求項８７記載の免疫原性組成物。
【請求項９０】
請求項８２のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項９１】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項９０記載の免疫原性組成物。
【請求項９２】
さらに追加の抗原を含む、請求項９０記載の免疫原性組成物。
【請求項９３】
請求項８３のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項９４】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項９３記載の免疫原性組成物。
【請求項９５】
さらに追加の抗原を含む、請求項９３記載の免疫原性組成物。
【請求項９６】
請求項８４のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項９７】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項９６記載の免疫原性組成物。
【請求項９８】
さらに追加の抗原を含む、請求項９６記載の免疫原性組成物。
【請求項９９】
請求項８５のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項１００】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項９９記載の免疫原性組成物。
【請求項１０１】
さらに追加の抗原を含む、請求項９９記載の免疫原性組成物。
【請求項１０２】
請求項８６のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項１０３】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１０２記載の免疫原性組成物。
【請求項１０４】
さらに追加の抗原を含む、請求項１０２記載の免疫原性組成物。
【請求項１０５】
請求項８１のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
請求項８２のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
請求項８３のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
請求項８４のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
請求項８５のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
請求項８６のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
請求項１０５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１２】
請求項１０６のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１３】
請求項１０７のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１４】
請求項１０８のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１５】
請求項１０９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１６】
請求項１１０のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１７】
請求項１１１のベクターによって形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染した宿主細胞。
【請求項１１８】
請求項１１２のベクターによって形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染した宿主細胞。
【請求項１１９】
請求項１１３のベクターによって形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染した宿主細胞。
【請求項１２０】
請求項１１４のベクターによって形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染した宿主細胞。
【請求項１２１】
請求項１１５のベクターによって形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染した宿主細胞。
【請求項１２２】
請求項１１６のベクターによって形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染した宿主細胞。
【請求項１２３】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、断片が配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含むところの、モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１２４】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、断片が配列番号１、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１２５】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、第３ポリペプチドが少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含むところの、少なくとも三種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１２６】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、第３ポリペプチドが少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、少なくとも三種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１２７】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号３のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１２８】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１２９】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１２３記載の方法。
【請求項１３０】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１２４記載の方法。
【請求項１３１】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１２５記載の方法。
【請求項１３２】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１２６記載の方法。
【請求項１３３】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１２７記載の方法。
【請求項１３４】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３５】
さらに追加の抗原を含む、請求項１２３記載の方法。
【請求項１３６】
さらに追加の抗原を含む、請求項１２４記載の方法。
【請求項１３７】
さらに追加の抗原を含む、請求項１２５記載の方法。
【請求項１３８】
さらに追加の抗原を含む、請求項１２６記載の方法。
【請求項１３９】
さらに追加の抗原を含む、請求項１２７記載の方法。
【請求項１４０】
さらに追加の抗原を含む、請求項１２８記載の方法。
【請求項１４１】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１２３記載の方法。
【請求項１４２】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１２４記載の方法。
【請求項１４３】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１２５記載の方法。
【請求項１４４】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１２６記載の方法。
【請求項１４５】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１２７記載の方法。
【請求項１４６】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１２８記載の方法。
【請求項１４７】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、断片が少なくとも配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、モラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１４８】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、第１ポリペプチドが少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドが少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、第３ポリペプチドが少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含み、第４ポリペプチドが少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含むところの、少なくとも四種のモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１４９】
モラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法であり、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片、配列番号３のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含むところの、複数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。
【請求項１５０】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１４７記載の方法。
【請求項１５１】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５２】
ポリペプチドが抗原キャリアタンパク質に結合しているところの、請求項１４９記載の方法。
【請求項１５３】
さらに追加の抗原を含む、請求項１４７記載の方法。
【請求項１５４】
さらに追加の抗原を含む、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５５】
さらに追加の抗原を含む、請求項１４９記載の方法。
【請求項１５６】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１４７記載の方法。
【請求項１５７】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５８】
さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含む、請求項１４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、微生物学、臨床細菌学および免疫学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）のＣｏｐＢタンパク質の新しい交差反応性エピトープの同定に関する。
【０００２】
（背景技術）
モラクセラ・カタラーリスは、ヘモフィルス・インフルエンザおよびストレプトコッカス・ニューモニアとともに、中耳炎（ＯＭ）の三つの主要な起因菌である。幼い子供の間、中耳炎は小児科医のところに訪れる最も多い原因であり、滲出液を伴う中耳炎は、十代の頃にまで至る発達障害を招き得る（Ｂｅｎｎｅｔｔら、２００１年）。モラクセラ・カタラーリスは、全ての中耳炎の症例の２３％の原因であると推定されている（Ｍｕｒｐｈｙ、１９９６年）。それに加えて、モラクセラ・カタラーリスは、年配の成人における呼吸器感染症、特に閉塞性肺疾患の増悪としばしば関連している（ＳｅｔｈｉおよびＭｕｒｐｈｙ、２００１年）。
【０００３】
従って、モラクセラ・カタラーリス感染を防ぐための免疫組成物は、これらの集団の健康に重大の恩恵をもたらす可能性がある。実際に、１９８９年のコンセンサスレポートでは、中耳炎の予防は、全年齢群の特定の集団と同様に、幼児および小児における発症による重要な健康管理の目標であると結論している（作者不明、「Consensus」、Pediatr.Infect. Dis. J.、８：５９４−５９７、１９８９年）。中耳炎についての総財政負担額は、少なくとも毎年２５億ドルであると推定されてきた。ワクチンが、中耳炎を予防するための最も望ましい方法として、コンセンサスレポートにおいて同定された。
【０００４】
モラクセラ・カタラーリスのＣｏｐＢタンパク質は、免疫原性組成物に含めるための数種の有望な候補抗原の一つである。この８０ｋＤａの外膜貫通型タンパク質は、鉄の獲得を媒介し、生体内での細菌の生存に不可欠である（Ｈｅｉｍｉｎｅｎら、１９９３ａ）。ｃｏｐＢ遺伝子は、検査した全ての単離体に存在し（Ｂｏｏｔｓｍａら、２０００年）、単離体から単離体に比較的良く保存されている（Ｓｅｔｈｉら、１９９７年；Ｈｅｌｍｉｎｅｎら、１９９３ｂ）。ＣｏｐＢタンパク質は、腸内細菌シデロホアに対する受容体として作用する、ナイセリアのＦｅｔＡタンパク質（以前はＦｒｐＢタンパク質として知られていた）と相同性を共有している（Ａｅｂｉら、１９９６年；Ｃａｍｐａｇｎａｎら、１９９４年；Ｃａｒｓｏｎら、１９９９年）。ＣｏｐＢが抗原の候補となる可能性があると考えられる主な理由は、ＣｏｐＢ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１０Ｆ３が補体依存性殺菌活性を示すことであり（Ａｅｂｉら、１９９８年）、肺のコロニー形成攻撃実験において、１０Ｆ３を有するマウスの受動免疫は細菌のクリアランスを促進する（Ｈｅｌｍｉｎｅｎら、１９９３ｂ）。
【０００５】
ＣｏｐＢ血清学に関して公開されたにすぎない情報はＭＡｂ反応性の研究に由来する。Ｈｅｌｍｉｎｅｎらは、ＭＡｂ１０Ｆ３がモラクセラ・カタラーリスの単離体の約７０％を認識したことを示した（Ｈｅｌｍｉｎｅｎら、１９９３ｂ）。反応性の類似したパターンはまた、Ｓｅｔｈｉらによって異なるＭＡｂのセットを用いて報告されており（Ｓｅｔｈｉら、１９９７年）、同じ研究室からのレポートは、ＣｏｐＢが免疫優勢エピトープを有することを示唆した（Ａｍｅｅｎら、１９９８年）。マッピングによって、ＭＡｂ１０Ｆ３に対するエピトープドメインがＣｏｐＢタンパク質のアミノ酸残基２９５および３０２の間に生じ、１０Ｆ３陽性単離体０３５Ｅのエピトープおよび１０Ｆ３陰性単離体ＴＴＡ２４のエピトープの間には単一のアミノ酸の相違があることが明らかになった（Ａｅｂｉら、１９９８年；国際出願ＷＯ９８／０６８５１）。
【０００６】
上記したように、モラクセラ・カタラーリスのＣｏｐＢ外膜タンパク質は、免疫原の候補として調査中である。効果的な免疫原は、その集団中に生じる全てのモラクセラ・カタラーリスの菌株ではないにしても、ほとんどの菌株に対して交差防御を誘導することを必要とする。高いパーセンテージのモラクセラ・カタラーリスの菌株に対する防御（すなわち交差防御）を与える一つまたはそれ以上のＣｏｐＢエピトープを同定することが、当該分野において非常に望ましい。そのようなＣｏｐＢ交差反応エピトープは、モラクセラ・カタラーリス感染に感受性の宿主に投与するための免疫原性組成物として医薬上有用であろう。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、モラクセラ・カタラーリス感染に感受性の宿主に投与するための免疫原性組成物に広く関する。さらに詳細には、本発明は、モラクセラ・カタラーリスのＣｏｐＢタンパク質の交差反応性エピトープの同定に向けたものである。
特に、本発明は、二つの新しいモラクセラ・カタラーリスのＣｏｐＢの血清群：血清群ＩＩＩは配列番号３のＣｏｐＢエピトープドメインを有する；血清群ＩＶは配列番号３のＣｏｐＢエピトープドメインを有する、の知見を用いるものである。
【０００８】
ある具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物に向けたものであり、その断片は配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含む。他の具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を与えるものであり、その断片は配列番号１、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を与えるものであり、その断片は配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む。一つの具体例として、その断片はさらにＣｏｐＢエピトープとして規定される。他の具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を与えるものであり、その断片は配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む。ある他の具体例として、配列番号３は、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列として規定される。さらに他の具体例として、配列番号４は、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列として規定される。
【０００９】
ある他の具体例として、断片はキャリアタンパク質に共有結合（共役）しており、さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含んでいて良い。好ましい具体例としては、免疫原性組成物は、哺乳類の宿主に免疫原性量で投与する場合、モラクセラ・カタラーリスの菌株の７５％より多くに対して宿主を保護する。
【００１０】
一つの具体例として、本発明は、少なくとも三つのモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物に向けたものであり、その第１ポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、その第２ポリペプチドは少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、その第３ポリペプチドは少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある具体例として、免疫原性組成物は、少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含む第４ポリペプチドをさらに含む。他の具体例として、本発明は、少なくとも三つのモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物に向けたものであり、その第１ポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、その第２ポリペプチドは少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、その第３ポリペプチドは少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の具体例として、本発明は、少なくとも二つのモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物に向けたものであり、その第１ポリペプチドは少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含み、その第２ポリペプチドは少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の具体例として、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物に向けたものである。さらに他の具体例として、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含むモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物に向けたものである。ある具体例として、第４ポリペプチドをさらに含む免疫原性組成物は、少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含む。さらに他の具体例として、ポリペプチドはさらにＣｏｐＢポリペプチドとして規定される。好ましい具体例として、配列番号３は、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、モラクセラ・カタラーリス単離体０４６Ｅまたはモラクセラ・カタラーリス単離体５６のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定される。さらに他の好ましい具体例として、配列番号４は、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１のＣｏｐＢポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列としてさらに規定される。他の具体例として、ポリペプチドはキャリアタンパク質に共有結合しており、さらに一つまたはそれ以上のアジュバントを含んでいて良い。ある具体例として、免疫原性組成物は、哺乳類の宿主に免疫原性量で投与する場合、モラクセラ・カタラーリスの菌株の７５％より多くに対して宿主を保護する。
【００１１】
本発明は、一つの特定の具体例として、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドに向けたものであり、そのポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号３のアミノ酸配列を含む断片を含む。他の具体例として、本発明は、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドに向けたものであり、そのポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含む。さらに他の具体例として、本発明は、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドに向けたものであり、そのポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片、配列番号３のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含む。一つの具体例として、本発明は、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに向けたものである。他の具体例として、本発明は、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを与える。さらに他の具体例として、本発明は、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換するか、トランスフェクションするかまたは感染した宿主細胞を与える。
【００１２】
ある具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法に向けたものであり、その方法はモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、その断片は配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含み、その方法は配列番号４のアミノ酸配列を含む断片をさらに含んでいて良い。
【００１３】
さらに他の具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法に向けたものであり、その方法はモラクセラ・カタラーリスポリペプチド断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、その断片は配列番号１、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含み、その方法は配列番号３のアミノ酸配列を含む断片をさらに含んでいて良い。
【００１４】
さらに他の具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法に向けたものであり、その方法は少なくとも三つのモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、その第１ポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、その第２ポリペプチドは少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、その第３ポリペプチドは少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含み、その方法は少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含む第４ポリペプチドをさらに含んでいて良い。
【００１５】
さらに他の具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法に向けたものであり、その方法は少なくとも三つのモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、その第１ポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、その第２ポリペプチドは少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、その第３ポリペプチドは少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含み、その方法は少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含む第４ポリペプチドをさらに含んでいて良い。
【００１６】
さらなる具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法に向けたものであり、その方法は多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、その多数の断片は少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号３のアミノ酸配列を含む断片を含み、その方法は少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含む第４断片をさらに含んでいて良い。
【００１７】
ある具体例として、本発明はモラクセラ・カタラーリス感染に対して宿主を免疫化する方法に向けたものであり、その方法は多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、その多数の断片は少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含み、その方法は少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含む第４断片をさらに含んでいて良い。
【００１８】
特定の具体例として、あらゆる上記の方法におけるポリペプチドが抗原キャリアタンパク質と結合していて良く、追加の抗原を含んでいて良く、且つ／または一つまたはそれ以上のアジュバントを含んでいて良い。
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明、それらの好ましい具体例および請求項から明らかになるであろう。
【００１９】
（図面の簡単な記載）
図１は、モラクセラ・カタラーリス単離体０３５Ｅ、ＴＴＡ２４、４３０：３４５、２１８：０３８、４１７：０８２および４６０８．１に由来するＣｏｐＢタンパク質のアミノ酸配列の配列を示す。網掛け領域は、ＭＡｂ１０Ｆ３によって規定される表面に露出したエピトープを示す。ボックスで囲まれた文字は単離体の間のアミノ酸配列の相違を反映している。
【００２０】
（発明の詳細な記載）
下記に示される発明は、モラクセラ・カタラーリス感染に感受性の哺乳類の宿主（例えば人間）に投与するための効果的な免疫原性組成物について、当該分野における要求を取り扱うものである。抗原または免疫原は、典型的には、免疫原性を基礎として規定される。免疫原性は体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導する能力として規定される。従って、抗原または免疫原という用語は、以下において規定されるように、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導する能力を有する分子である。
【００２１】
一つの特定の具体例として、本発明は、二つの新しいモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢ血清型群（以下、血清型群ＩＩＩおよび血清型群ＩＶ）を同定した。血清型群ＩＩＩの代表的な単離体は、モラクセラ・カタラーリス単離体４３０：３４５、単離体５６および単離体０４６Ｅである。血清型群ＩＶの代表的な単離体は、モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１である。血清型群ＩＩＩおよびＩＶは、モノクローナル抗体１０Ｆ３と結合しないモラクセラ・カタラーリス単離体（すなわち、１０Ｆ３陰性単離体）の特徴付けの中で同定された。モノクローナル抗体１０Ｆ３（以下、１０Ｆ３またはＭＡｂ１０Ｆ３）がモラクセラ・カタラーリス単離体の約７０％を認識することは当該分野にて公知であり（Ｈｅｌｍｉｎｅｎら、１９９３ｂ）、ＣｏｐＢが免疫優勢エピトープを有することが示唆されている（Ａｍｅｅｎら、１９９８年）。タンパク質の地図を作成することによって、ＭＡｂ１０Ｆ３に対するエピトープドメインがＣｏｐＢタンパク質のアミノ酸残基２９５および３０２の間に生じることが明らかになった。本明細書において規定されるように、１０Ｆ３によって認識されたＣｏｐＢエピトープドメインは、ＮＫＹＡＧＫＡＹという８残基のアミノ酸配列（配列番号１）を有し、その配列番号１は、およそアミノ酸残基２９５からおよそアミノ酸残基３０２までのモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢ血清型群１タンパク質中に含まれる。
【００２２】
単離体４３０：３４５（１０Ｆ３陰性単離体）に由来するｃｏｐＢ遺伝子を１０Ｆ３エピトープドメインに対応する領域において配列決定し、Ｏ３５Ｅ単離体（１０Ｆ３陽性単離体、表１および図２参照）の配列決定により四つのアミノ酸の違いが検出された。同様に、単離体４６０８．１（１０Ｆ３陰性単離体）に由来するｃｏｐＢ遺伝子を１０Ｆ３エピトープドメインに対応する領域において配列決定し、Ｏ３５Ｅ単離体（表１参照）の配列決定から三つのアミノ酸の違いが検出された。
【００２３】
本明細書において規定される、「１０Ｆ３陽性」単離体は、１０Ｆ３に結合するモラクセラ・カタラーリス単離体である。本明細書において規定される、「１０Ｆ３陰性」単離体は、１０Ｆ３に結合しないモラクセラ・カタラーリス単離体である。
【００２４】
本明細書において規定される、モラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢタンパク質の「ＣｏｐＢエピトープ」または「エピトープドメイン」は、８残基のアミノ酸配列ＮＫＹＡＧＫＧＹ（配列番号１）に関する。より詳細には、本明細書において規定される、モラクセラ・カタラーリス血清型群ＩのＣｏｐＢエピトープは、ＮＫＹＡＧＫＧＹ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。血清型群Ｉの代表的な単離体は、単離体Ｏ３５Ｅ、Ｏ１２ＥおよびＡＴＣＣ２５２４０である。本明細書において規定される、モラクセラ・カタラーリス血清型群ＩＩのＣｏｐＢエピトープは、ＤＫＹＡＧＫＧＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、下線を付した残基は配列番号１のアミノ酸配列と異なる残基を示す。血清型群ＩＩの代表的な単離体は、単離体ＴＴＡ２４である。本明細書において規定される、新しく認識されたモラクセラ・カタラーリス血清型群ＩＩＩのＣｏｐＢエピトープは、ＫＤＹＰＧＱＧＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を有し、下線を付した残基は配列番号１のアミノ酸配列と異なる残基を示す。血清型群ＩＩＩの代表的な単離体は、単離体４３０：３４５、Ｏ４６Ｅおよび５６である。本明細書において規定される、新しく認識されたモラクセラ・カタラーリス血清型群ＩＶのＣｏｐＢエピトープは、ＫＫＹＰＧＱＧＹ（配列番号４）のアミノ酸配列を有し、下線を付した残基は配列番号１のアミノ酸配列と異なる残基を示す。血清型群ＩＶの代表的な単離体は、単離体４６０８．１である。
【００２５】
従って、本発明の新しいＣｏｐＢ血清型群（血清型群ＩＩＩおよびＩＶ）の同定は、モラクセラ・カタラーリスの菌株の大部分（例えば、７５％より多く）に対して高いパーセンテージで保護する、免疫原およびそれらの組成物を開発する上で特に有用であろう。
【表１】
2006518379.tif 000003
１０Ｆ３エピトープに対応するドメインのアミノ酸配列はＤＮＡ配列から推論された。
ＴＢＤ＝寄託予定
【００２６】
Ａ．ＣｏｐＢポリペプチドおよびそれらの断片
特定の具体例として、本発明は、モラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープを含む免疫原を提供する。一つの特定の具体例として、これらの免疫原は、モラクセラ・カタラーリス感染に対して哺乳類の宿主を免疫化するための免疫原性組成物の調製に用いられる。好ましい具体例として、これらの免疫原は、高いパーセンテージの異種のモラクセラ・カタラーリス菌株に対して保護する（すなわち交差防御）。
【００２７】
従って、一つの具体例として、本発明は、モラクセラ・カタラーリスのポリペプチド断片を含む免疫原性組成物に向けたものであり、その断片は配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含む。他の具体例として、免疫原性組成物は、モラクセラ・カタラーリスのポリペプチド断片を含み、その断片は配列番号１、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の具体例として、免疫原性組成物は、モラクセラ・カタラーリスのポリペプチド断片を含み、その断片は配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
ある他の具体例として、本発明は、少なくとも三つのモラクセラ・カタラーリスポリペプチドを含む免疫原性組成物に向けたものであり、その第１ポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含み、その第２ポリペプチドは少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を含み、その第３ポリペプチドは少なくとも配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または少なくとも配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
ある他の具体例は、多数の共有結合したＣｏｐＢエピトープ断片に向けたものである。従って、一つの具体例として、本発明は、多数の共有結合したモラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢエピトープ断片を含む単離したポリペプチドを与え、そのポリペプチドは少なくとも配列番号１のアミノ酸配列を含む断片、配列番号２のアミノ酸配列を含む断片および配列番号３のアミノ酸配列を含む断片および／または配列番号４のアミノ酸配列を含む断片を含む。以下に記述するように、各々の断片はキャリアタンパク質に結合している。
【００３０】
好ましくは、本発明の全長のＣｏｐＢポリペプチドは組換えポリペプチドである。本発明のＣｏｐＢポリペプチド断片は、組換えによって発現させるか、または当該分野において知られたペプチド合成法によって調製してよい（Ｂａｒａｎｙら、１９８７年；米国特許第５２５８４５４号）。
【００３１】
本発明に従ったＣｏｐＢポリペプチドの生物学的等価物または変異体は、配列番号１−４によって規定されるＣｏｐＢエピトープドメインがポリペプチド配列中で保存される限りは、ＣｏｐＢポリペプチドに実質的に相同な部分を含むポリペプチドを含む。生物学的等価物または変異体はまた、ポリペプチドが修飾されたＣｏｐＢエピトープドメインを介して免疫原性反応を誘導する能力を維持する限りは、たとえ配列番号１−４によって限定されるＣｏｐＢエピトープドメインが修飾されるものであっても、かかるポリペプチドを含むものとする。
【００３２】
一般に、機能的な生物学的等価物または変異体は、ポリペプチドはＣｏｐＢエピトープドメインを介して免疫原性反応を誘導する能力を維持するところの、ＣｏｐＢポリペプチドの自然に生じるアミノ酸配列変異体である。
【００３３】
修正および変更を、本発明のポリペプチドの構造について行って良く、ＣｏｐＢエピトープ免疫原性を有する分子をそれでも得ることができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するものは、ポリペプチドの相互作用する能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列の置換は、ポリペプチド配列（または、当然その基礎にあるＤＮＡコード配列）中においてなされ、それでも同様の特性を有するポリペプチドが得られる。
【００３４】
そのような変更を行う上で、アミノ酸の疎水親水指数（hydropathic index）が考慮され得る。ポリペプチド上の相互作用性生物学的機能を与える、疎水親水アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。あるアミノ酸は類似した疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、類似した生物学的活性を有するポリペプチドがそれでもなお生じ得ることが知られている。各々のアミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴の基礎となる疎水親水指数を割り当てられた。それらの指数は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
【００３５】
アミノ酸残基の相対的疎水親水性が、生じるポリペプチドの二次および三次構造を決定し、それが、順次、酵素、基質、受容体、抗体、抗原およびその類似物のような他の分子とのポリペプチドの相互作用を規定すると考えられている。アミノ酸が類似した疎水親水指数を有する他のアミノ酸によって置換され、それでも機能的に等価なポリペプチドが得られる。そのような変更において、疎水親水指数が＋／−２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１以内であるアミノ酸の置換は特に好ましく、＋／−０．５以内であるアミノ酸の置換がより一層特に好ましい。
【００３６】
類似したアミノ酸の置換はまた、親水性を基礎にしてなされても良く、特に生物学的機能が等価なポリペプチドまたはポリペプチド断片が、免疫学的な実施形態において用いられることを意図している。米国特許第４５５４１０１号は、出典明示により本明細書の一部とするが、近接したアミノ酸の親水性によって決定されるような、ポリペプチドの局所平均親水性の大きさは、その免疫原性および抗原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性と相関することを述べている。
【００３７】
米国特許第４５５４１０１号において詳述されているように、次の親水価がアミノ酸配列に割り当てられた：アルギニン（＋３．５）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸は類似した親水価を有する他のアミノ酸によって置換することができ、それでもなお生物学的な等価な、特に免疫原性の等価なポリペプチドを得ることができると理解されている。そのような変更においては、親水価が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水価が±１以内であるアミノ酸の置換は特に好ましく、親水価が±０．５以内であるアミノ酸の置換は特に一層好ましい。
【００３８】
上で概略を述べたように、アミノ酸の置換は、一般にそれ故に、アミノ酸の側鎖の置換基の相対的な類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいている。様々な前述の特徴を考慮に入れた置換基の例が当業者にはよく知られており、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む（以下の表２参照）。本発明は、上で示したようなＣｏｐＢポリペプチドの機能的または生物学的等価性をそのように熟慮している。
【００３９】
【表２】
2006518379.tif 000004
【００４０】
本発明のＣｏｐＢポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のＣｏｐＢエピトープドメインを含むＣｏｐＢポリペプチドとの、実質的な配列の類似性、構造的な類似性および／または機能的類似性を含むあらゆるＣｏｐＢポリペプチドであると考えられている。それに加えて、本発明のＣｏｐＢポリペプチドは、特定の起源に限定されない。
【００４１】
本発明において熟考されていることは、さらなる構造的または機能的分析、またはＣｏｐＢポリペプチドはＣｏｐＢ関連ポリペプチドおよびＣｏｐＢ特異的抗体のような試薬の生成に利用するための断片に解離することが好都合である可能性がある。これは、精製したまたは精製していないＣｏｐＢポリペプチドを、エンドプロテアーゼｇｌｕ−Ｃのようなペプチダーゼで処理することによって達成し得る（Roche Diagnostics Corporation、インディアナポリス、ＩＮ）。シアン化臭素による処理は、ＣｏｐＢペプチド断片が天然のＣｏｐＢポリペプチドから生成することによる他の方法である。組換え技術もまた、一つまたはそれ以上のＣｏｐＢポリペプチドの特異的断片を、単独でまたは互いに共有結合した形で、生成するために用いられ得る。
【００４２】
加えて、特定のＣｏｐＢポリペプチド免疫原に立体的構造が類似した化合物は、ペプチド擬似物またはペプチドの擬似物と呼ばれる、ＣｏｐＢエピトープドメインの重要部分をまねて処方されてもよい。擬似物は、タンパク質の二次構造の要素に似たペプチドを含む分子である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３年；米国特許第５４２４３３４号；米国特許第４９９２４６３号および米国特許第５５５２４３１号参照）。ペプチドの擬似物の利用の基礎にある原理は、受容体およびリガンドのように、タンパク質のペプチド骨格はアミノ酸側鎖を主として分子の相互作用を促進するように配置するために存在するということである。
【００４３】
ペプチド擬似物の構想の成功した適用例は、タンパク質中のβターンの擬似物に大いに焦点を当ててきた。同様に、ＣｏｐＢ中のβターン構造は、当該分野において知られたコンピューターに基づいたアルゴリズムによって予測され得る。一旦ターンの成分のアミノ酸が決定されれば、擬似物は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３年において議論されているような、アミノ酸側鎖の本質的な成分の類似した空間的配置を達成するために構築され得る。
【００４４】
上記したような、本発明のＣｏｐＢポリペプチド断片（例えば、配列番号１−４）は、免疫原のように特に有用である。化学合成または組換え発現法によって生成される断片は、アミノ酸配列の全てではないが、一部が完全に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。その断片は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列の、少なくとも７またはそれ以上の（例えば、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれ以上）連続したアミノ酸を含み得る。断片は、「独立」していても良く、一つの部分または領域、より好ましくは単一の連続した領域を形成する、より大きなポリペプチド中に含まれていても良い。一つの具体例として、断片は、成熟ＣｏｐＢポリペプチド配列のエピトープドメイン（例えば、配列番号１）を含む。他の具体例として、多数のこれらのエピトープドメイン（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号４）は、より大きなポリペプチドエンティティを形成するために共有結合している。例えば、多数の共有結合した本発明のエピトープは、次の断片の配列：（例えば、配列番号１−配列番号２−配列番号３および／または−配列番号４）、またはそれらのあらゆる順序および／またはそれらの組み合わせの、縦列反復配列を含む。これは単なる例示にすぎず、本発明の範疇を制限するように解釈されるべきではない。
【００４５】
「融合タンパク質」とは、二つの、しばしば結合していない、融合遺伝子またはそれらの断片によってコード化される、タンパク質またはポリペプチドを指す。例えば、免疫グロブリンの定常領域の様々な部分を、他のヒトのタンパク質またはそれらの一部と共に含む融合タンパク質またはポリペプチドが記述されてきた。多くの場合において、融合タンパク質またはポリペプチドの一部として免疫グロブリンＦｃ領域を利用することが、例えば改良した薬物動態の特性をもたらす、治療および診断における使用に有利である。他方、いくつかの利用法については、融合タンパク質またはポリペプチドが発現、検出および精製した後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。
【００４６】
個々の具体例として、本発明は、組換え融合タンパク質としてまたは化学結合（すなわち共役）を介して、抗原キャリアタンパク質または細菌細胞に結合したＣｏｐＢポリペプチドを含む組成物および利用法に向けたものである。ポリペプチドをキャリアタンパク質に複合させる手段は、当該分野においてよく知られており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化ベンジジンを含む。
【００４７】
代表的な従来のタンパク質のキャリアとして、イー・コリＤｎａＫタンパク質、ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ、細菌においてガラクトース代謝の最初の工程を触媒する）、ユビキチン、α交配因子、βガラクトシダーゼおよびヘモフィルス・インフルエンザＮＳ−１タンパク質が挙げられるが、それだけには限定されない。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドのようなトキソイド（すなわち、毒素の活性を除去する十分な修飾を行った、自然に生じる毒素をコード化する配列）、それらそれぞれの毒素、およびこれらのタンパク質のあらゆる変異体もまた、キャリアとして利用して良い。キャリアタンパク質の例は、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の無毒性型、米国特許第５６１４３８２号参照）である。他のキャリアには、シュードモナスの外毒素Ａ、イー・コリの熱不安定毒素、ビブリオコレラおよびロタウィルス粒子（ロタウィルスおよびＶＰ６粒子を含む）を含む。あるいは、キャリアタンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを用いても良い。例えば、ハプテンは、細菌毒素のＴ細胞エピトープに結合してよい。米国特許第５７８５９７３号参照。類似した様々な細菌のヒートショックタンパク質、例えば、マイコバクテリウムｈｓｐ−７０を用いて良い。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、他の有用なキャリアである。当業者は、この関係において用いられるための適切なキャリアを、容易に選択できる。
【００４８】
ある具体例として、本発明は、多数の共有結合したＣｏｐＢエピトープ断片を含む組成物および利用法に向けたものである。ＣｏｐＢエピトープドメインが小さいサイズであるために、単一の断片は必ずしも最適の免疫原性を与えなくても良いと考えられている。従って、ある具体例として、本発明は、いくつかのｃｏｐＢ遺伝子の適切なエピトープ領域の遺伝子融合によって発現される、異なるＣｏｐＢ種の縦列の（すなわち多数の）ＣｏｐＢエピトープ断片を含む、組換えＣｏｐＢポリペプチドを与える。従って、多数または縦列のＣｏｐＢエピトープ断片は、互いにまたはキャリアタンパク質に共有結合した、あらゆる数および／またはあらゆる順序のＣｏｐＢエピトープ断片である。好ましい具体例として、多数のＣｏｐＢエピトープ断片を含む組換えポリペプチドは、少なくとも血清型群Ｉ、血清型群ＩＩおよび血清型群ＩＩＩ（例えば、配列番号１、配列番号２および配列番号３）に由来するＣｏｐＢエピトープドメインを含む。他の好ましい具体例として、多数のＣｏｐＢエピトープ断片を含む組換えポリペプチドは、少なくとも血清型群Ｉ、血清型群ＩＩおよび血清型群ＩＶに由来するＣｏｐＢエピトープドメインを含む。さらに他の具体例として、多数のＣｏｐＢエピトープ断片を含む組換えポリペプチドは、少なくとも血清型群Ｉ、血清型群ＩＩ、血清型群ＩＩＩおよび血清型群ＩＶに由来するＣｏｐＢエピトープドメインを含む。
【００４９】
従って、そのようなタンデム分子を操作して、連結点で適当な構造を維持し、免疫原性をもつのに十分大きく、幅広いスペクトルのモラクセラ・カタラーリスの菌株と交差反応する一並びのエピトープを発現させることができる。あるいは、個別の組換えによって生成するかまたは合成された断片は、多数の共有結合した断片を形成するための化学的方法によって結合して良い。
【００５０】
Ｂ．モラクセラ・カタラーリスのポリヌクレオチド
単離して精製した本発明のモラクセラ・カタラーリスポリヌクレオチドは、ＣｏｐＢポリペプチドおよびポリペプチド断片の生成に利用するために考案されている。より明確には、ポリヌクレオチドは、ＣｏｐＢポリペプチド断片または融合ポリペプチド、特に配列番号１−４のＣｏｐＢエピトープをコード化する。
【００５１】
特別な具体例として、本発明のポリペプチドはＤＮＡ分子であり、そのＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはｃＤＮＡであってよい。好ましい具体例として、本発明のポリヌクレオチドは、ＣｏｐＢポリペプチド（例えばＣｏｐＢエピトープドメイン）をコード化する組換えポリヌクレオチドである。好ましい具体例として、ＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリペプチドは、プラスミドベクターに含まれ、原核生物の宿主細胞において発現される。
【００５２】
以下で用いられている、「ポリヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合によって結合しているヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、５'末端から３'末端の方向で、以下で呈示されている。本発明のポリペプチドは、約１０から約数１０万の塩基対を含み得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、約１０から約３０００までの塩基対を含む。特定のポリヌクレオチドの好ましい長さは、以下で示すとおりである。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはヌクレオチドの類似物を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似物であってよい。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であっても良いが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であってよい。核酸塩基は単一の文字のコードによって以下で示される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）。
【００５４】
「単離した」とは、自然の状態から「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単離した」組成物または基質は、変化させられた、またはそれ元来の環境から取り除かれたもの、またはその両方である。例えば、以下でその用語を用いているように、生きている動物体内に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その自然の状態に共存している物質から隔離した同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。
【００５５】
好ましくは、「単離した」ポリヌクレオチドは、その核酸の由来する有機体のゲノムＤＮＡ中において、自然では核酸の側面に位置する配列（すなわち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列）をもたない。例えば、様々な具体例において、単離したＣｏｐＢ核酸分子は、その核酸の由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子の側面に元来位置する、約５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満または０．１のｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。しかしながら、ＣｏｐＢ核酸分子は、他のコード化タンパク質または調節配列に融合しており、それでもなお単離されているとみなされる。
【００５６】
本発明のＣｏｐＢポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーから、標準クローニングまたはスクリーニング技術を用いて得られる。本発明のポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、モラクセラ・カタラーリスライブラリー）などの自然源から得られるか、または周知の商業上入手できる技術を用いて合成される。
【００５７】
ＣｏｐＢポリヌクレオチドのオーソログおよびアレル変異体は、当該分野においてよく知られた方法を用いて容易に認識される。アレル変異体およびポリヌクレオチドのオーソログは、典型的には少なくとも約７０−７５％、より典型的には約８０−８５％、最も典型的には約９０−９５％またはそれ以上、配列番号１−４に示されるヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の断片を含む。そのような核酸分子は、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号１−４に示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の断片にハイブリダイゼーションすることが可能なものとして、容易に認識される。
【００５８】
ある好ましい具体例として、本発明のポリペプチドは、ＣｏｐＢエピトープドメインをコード化する断片、例えば配列番号１−４のうち一つのアミノ酸配列を有するポリペプチド断片のような、ＣｏｐＢポリペプチドまたは遺伝子のコード領域の断片のみを含む。
【００５９】
本発明のＣｏｐＢポリヌクレオチドがＣｏｐＢポリペプチドまたはポリペプチド断片の組換え生成に用いられる場合、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列を単独で、または読み枠の中の成熟ポリペプチドのコード配列を、先端または分泌配列、プレ、プロ、プレプロタンパク質配列または他の融合ペプチド部分をコード化するもののような、他のコード配列と共に含む可能性がある。例えば、融合したポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列は、コード配列に結合し得る（Ｇｅｎｔｚら、１９８９年参照、出典明示によりその内容を本明細書の一部とする）。従って、本発明において考慮されていることは、発現生成物のＨｉｓタグ精製を可能にする融合ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの調製である。ポリペプチドはまた、非コード５'および３'配列、例えば、転写され、翻訳されていない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含有してもよい。
【００６０】
モラクセラ・カタラーリス以外の種に由来する相同物およびオーソログを含む、本発明のＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（以下で議論されるもの）下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のポリペプチド断片をコード化するポリヌクレオチド配列；単離した全長のｃＤＮＡおよびポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを有する標識したプローブを用いた、またはそれらの断片適切なライブラリーをスクリーニングする工程を含む過程によって得られる。そのようなハイブリダイゼーション技術は、当業者にはよく知られている。当業者は、多くの場合において、ポリペプチドのコード領域がｃＤＮＡの５'末端で切断されて短いので、単離したｃＤＮＡ配列は不完全であると評価するであろう。これは、元来低い「作用性」（酵素が重合反応の間にｍＲＮＡの鋳型に結合し続けたままでいる能力の指標）を有し、最初の鎖のｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡの鋳型のＤＮＡコピーを完成させない酵素である、逆転写酵素を用いた結果である。
【００６１】
従って、ある具体例として、本発明によって与えられるポリペプチド配列情報（すなわち配列番号１−４）は、以下で開示する選択されたポリヌクレオチドの遺伝子配列に特異的にハイブリダイゼーションすることが可能な、比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列の調製を可能にする。以下で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、二つまたはそれ以上の、通例三つ（３）より多くの、典型的には十（１０）より多くで百（１００）までまたはそれより多くである（好ましくは二十および三十の間であるけれども）、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子として定義される。正確な大きさは、多くの要因に左右され、それもまたオリゴヌクレオチドの最終的な機能または利用に左右される。従って、本発明の特定の具体例として、適切な長さの核酸プローブは、選択されたヌクレオチド配列について考慮することを基礎として調製される。そのような核酸プローブの、ＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーションする能力は、種々の実施形態においてそれらに特定の有用性を与える。より重要なことは、プローブは、与えられた試料中の相補的配列の存在を検出するための様々なアッセイに用いられる。
【００６２】
ある具体例として、オリゴヌクレオチドプライマーを用いることが好都合である。これらのプライマーは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写またはそれらの組み合わせを含めた、あらゆる方法で生成して良い。そのようなプライマーの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、原核細胞に由来するＣｏｐＢポリペプチドをコード化するＣｏｐＢポリヌクレオチドの限定された分節を検出し、増幅し、または変異させるのに利用するために、本発明のポリヌクレオチドを用いて構築される。
【００６３】
ある具体例として、本発明のポリヌクレオチドを、ハイブリッド形成を検出するための適切な標識と組み合わせて利用することは好都合である。検出シグナルを与えることのできるアビジン／ビオチンのような、放射性の、酵素的なまたは他のリガンドを含めた、非常に多様な適切な標識が、当業者に知られている。
【００６４】
配列番号１−４のポリペプチド断片をコード化するヌクレオチド配列と同一、または十分同一であるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコード化する全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、配列番号１−４の配列のポリペプチド断片をコード化するポリヌクレオチドに高い配列の同一性を有する、他の遺伝子（モラクセラ・カタラーリス以外の種に由来する相同物およびオーソログをコード化する遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして用いて良い。典型的には、これらのヌクレオチド配列は、基準のポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％から約９５％同一である。プローブまたはプライマーは、一般に、少なくとも１５ヌクレオチドを含み、少なくとも１８、２１、２４、３０、４０または５０ヌクレオチドを有していて良い。特に好ましいプローブは、１５および５０の間のヌクレオチドを有するであろう。
【００６５】
例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅方法（ＲＡＣＥ）（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８年参照）に基づいたもののような、全長のｃＤＮＡを得るため、または短いｃＤＮＡを伸長するために利用可能で、当業者によく知られた、いくつかの方法が存在する。例えばＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）技術（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ、Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって例示されるような、技術の最近の修正は、有意に単純化されたより長いｃＤＮＡの検索法を有する。
【００６６】
本発明の特定の利点を得るためには、ハイブリダイゼーション研究またはアッセイに利用される好ましい核酸配列は、配列番号１−４のポリペプチドをコード化する、少なくとも１０から１８ヌクレオチドの長さの一連のポリヌクレオチドに相補的なプローブ分子を含む。長さが少なくとも１０ヌクレオチドの大きさは、断片が安定で選択的な二本鎖分子を形成するのに十分な長さであることを保証するのに役立つ。しかしながら、ハイブリッドの安定性および選択性を向上させ、それによって得られるハイブリッド分子の質および特異性の程度を改良するために、一般には、鎖上で長さが１０塩基以上の相補的配列を有する分子が好ましい。そのような断片は、例えば化学的方法による断片を直接合成することによって、ＰＣＲ技術（米国特許第４６８３２０２号、以下で出典明示により本明細書の一部とする）のような核酸再生技術の適用によって、または適切な挿入部位および適当な制限酵素部位を含む組換えプラスミドに由来する選別されたＤＮＡ断片を切り出すことによって、容易に調製される。
【００６７】
他の側面として、本発明は、ポリヌクレオチドが、ＣｏｐＢエピトープドメインを含むＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするところの、配列番号１−４のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの少なくとも連続した１０塩基の分節と同一、または相補的な、ヌクレオチド配列を含む、単離および精製したポリヌクレオチドのことを熟考している。
【００６８】
従って、本発明のポリヌクレオチドプローブ分子は、遺伝子の相補的なストレッチとの二本鎖分子を選択的に形成する能力のために用いられる。用途に応じて、標的配列に対するプローブの様々な選択性の程度を達成するために、様々なハイブリダイゼーションの厳しさの条件を利用することが望ましいであろう（以下の表３参照）。高い選択性を必要とする場合には、ハイブリッドを形成する比較的ストリンジェントな条件を利用することが望ましいであろう。例えば、基礎となる鋳型にハイブリダイズした変異したプライマー鎖を利用した変異体を調製することが望ましい、または他の細胞、機能的等価物またはその類似物に由来する相同なポリペプチドコード配列を単離しようとする場合には、それほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が、典型的にはヘテロ二本鎖の形成を可能にするために必要とされる（表３参照）。交差ハイブリダイゼーションする種は、それによって、ハイブリダイゼーションを調節することに関しては、陽性のハイブリダイゼーションシグナルとして容易に認識されるであろう。あらゆる場合において、ハイブリッド二本鎖を温度上昇と同じ方法で不安定化させることに供する、ホルムアミドの量を増加させる付加剤によって、条件はよりストリンジェントにされ得ると一般に評価されている。従って、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作され、このように一般的に望ましい結果に依存した選択する方法であるであろう。
【００６９】
本発明はまた、厳しさを低下させた条件下で、より好ましくはストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常にストリンジェントな条件下で、以下に記述したポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることが可能なポリヌクレオチドを含む。ストリンジェントな条件の例を以下の表３に示す：非常にストリンジェントな条件は、少なくとも例えば条件Ａ−Ｆと同じくらい厳しい条件であり；ストリンジェントな条件は、少なくとも例えば条件Ｇ−Ｌと同じくらい厳しい条件であり；厳しさを低下させた条件は、少なくとも例えば条件Ｍ−Ｒと同じくらい厳しい条件である。
【００７０】
【表３−１】
2006518379.tif 000005
【００７１】
【表３−２】
2006518379.tif 000006
【００７２】
（ｂｐ）１：ハイブリッドの長さは、ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションした領域を予測したものである。ポリヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする場合、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドをハイブリダイズする長さと考えられている。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションされる場合、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドの配列を並べ、最適の配列の相補性を有する領域または領域群を認識することによって決定される。
緩衝剤Ｈ：ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝剤において、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）と置換でき、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後１５分間行われる。
ＴＢ〜ＴＲ：長さが５０塩基対未満であると予測される、ハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より５−１０℃低くすべきであり、Ｔｍは次の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満であるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８および４９塩基対の間であるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中のＮはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝剤中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【００７３】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについてのストリンジェントな条件の追加の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、章９および１１、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、節２．１０および６．３−６．４、出典明示により本明細書の一部とする、において示される。
【００７４】
Ｃ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
もう一つ別の実施形態において、本発明は、モラクセラ・カタラーリスＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む。より一層好ましくは、本発明の発現ベクターは、エンハンサー−プロモーターに作動的に連結されたポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、本発明の発現ベクターは、原核生物のプロモーターに作動的に連結されたポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
本明細書で用いられている「ベクター」なる語は、他の核酸を結合した分子に輸送することのできる核酸分子をいう。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、別のＤＮＡセグメントをライゲートすることのできる環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの他のタイプはウィルスベクターであり、それは追加のＤＮＡセグメントがウィルスゲノムにライゲートし得る。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌のベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主のゲノムと共に複製される。その上、あるベクターは、作動的に連結された遺伝子を発現させることができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、交換して用いられ得る。しかしながら、本発明は、同等の機能をもつウィルスベクター（複製不完全レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス）のような、発現ベクターの他の形態を含めることを意図している。
【００７６】
原核生物のタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかを発現させる、構成性または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、イー・コリにおいて最も頻繁に実行される。融合ベクターは、その中にコード化されるタンパク質の、その組換えタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に多数のアミノ酸を付加する。そのような融合タンパク質は、典型的には三つの目的を満たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）組換えタンパク質の可溶性を高めること；および３）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を促進すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解解離部位は、融合部分、および組換えタンパク質を融合部分から分離して続いて融合タンパク質の精製を可能にする組換えタンパク質の、接合部で導入される。そのような酵素およびその同種の認識配列は、血液凝固因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。
【００７７】
典型的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８年）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｄｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ；ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含み、それらはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａと、標的組換えタンパク質がそれぞれ融合している。
【００７８】
一つの具体例として、ＣｏｐＢ遺伝子のコード配列（例えば、ＣｏｐＢエピトープドメインを有するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド）は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＧＳＴトロンビン解離部位ＣｏｐＢポリペプチドを含む、融合タンパク質をコード化するベクターを作るためのｐＧＥＸ発現ベクターにクローニングされる。融合タンパク質は、グルタチオンアガロースゲル樹脂を用いた親和性クロマトグラフィーによって精製される。ＧＳＴに融合していない組換えＣｏｐＢポリペプチドは、トロンビンを用いた融合タンパク質の解離によって回収され得る。
【００７９】
適当な誘導性非融合イー・コリ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８年）およびｐＥＴ  ＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０年）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの、宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ  ＩＩｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現しているウィルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎＩによって修飾されるＴ７ｇｎ１β−ｌａｃ融合プロモーターからの、転写に依存する。このウィルスポリメラーゼは、宿主のＢＬ２１種（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４種（ＤＥ３）によって、Ｔ７ｇｎＩ遺伝子を含んでいる内在するプロファージから、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下で供給される。
【００８０】
イー・コリにおける組換えタンパク質の発現を最大にするための一つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解によって解離する能力の損なわれた宿主細菌においてタンパク質を発現することである。他の方法は、各々のアミノ酸に対する個別のコドンがイー・コリにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである。本発明のそのような核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ突然変異誘発または合成技術によって実行される。
【００８１】
プロモーターは、典型的には、転写が開始する場所（すなわち転写開始部位）の前の（上流の）、約１００のヌクレオチドの対中にあるＤＮＡ分子の領域である。その領域は、典型的には、異なる遺伝子において類似した相対的位置に局在している、いくつかのタイプのＤＮＡ配列分子を含む。本明細書に用いられている、「プロモーター」という用語は、上流のプロモーター領域と当該分野で呼ばれているもの、プロモーター領域または汎用真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写単位のプロモーターを含む。
【００８２】
他のタイプの別々の転写調節配列分子は、エンハンサーである。エンハンサーは、特定のコード化領域（例えば遺伝子）についての、時間、位置および発現レベルの特異性を与える。エンハンサーの主要な機能は、エンハンサーに結合する一つまたはそれ以上の転写因子を含む細胞において、コード配列の転写レベルを高めることである。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在する限りは、転写開始部位から様々な距離に位置していても機能し得る。
【００８３】
本明細書において用いられている、「エンハンサー−プロモーター」という語は、エンハンサーおよびプロモーター分子の両方を含む複合単位を意味する。エンハンサー−プロモーターは、少なくとも一つの遺伝子生成物をコード化するコード配列に効果的に結合している。本明細書において用いられている、「効果的に結合している」という語は、エンハンサー−プロモーターが、コード配列の転写がエンハンサー−プロモーターによって制御および調節されるような、コード配列に結合していることを意味する。エンハンサー−プロモーターをコード配列に効果的に結合するための方法は、当該分野においてよく知られている。また当該分野においてよく知られていることであるが、転写が制御されているコード配列に関する正確な方向および位置は、特にエンハンサー−プロモーターの特定の性質に依存している。従って、ＴＡＴＡボックス最小プロモーターは、典型的には、転写開始部位より約２５から約３０塩基対上流に位置しており、上流のプロモーター分子は、典型的には、転写開始部位より約１００から約２００塩基対上流に位置している。対照的に、エンハンサーは、開始部位から下流に位置し、その部位から相当な距離が存在し得る。
【００８４】
本発明のトランスフェクション細胞はまた、抗体生成を誘導するか、または病原体に対してヒトおよび動物を免疫化するために有用である。移植したトランスフェクション細胞は、宿主の細胞性および体液性免疫応答を刺激することになる、免疫化抗原を輸送するために用いられ得る。これらの免疫応答は、モラクセラ・カタラーリス感染から宿主を保護するために（すなわち免疫化のために）、継続している感染に対する疾患との戦闘能力を刺激して増大させるように、または医薬上または診断目的に有用であるトランスフェクションした細胞によって、生体内で生成した抗原に対して向けられた抗体を生成するように構築し得る。除去可能な遮断装置は、抗原に対する曝露を終結させる単純な方法を可能にするために用いられ得る。あるいは、最終的には拒絶されるであろう細胞（異種または同種のトランスフェクションされた細胞）の利用は、細胞が拒絶された際に抗原生成が停止するので、抗原に対する曝露を制限するために用いられ得る。
【００８５】
本発明の他の側面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細胞に関係する。「宿主細胞」、「遺伝子処理した宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交互に用いられている。そのような用語は、特定の患者の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または子孫となり得るものも指すと考えられている。ある種の修飾が、突然変異または環境の影響のいずれかによって次世代に起こる可能性があるので、実際には、そのような子孫は親の細胞と同一でない可能性があるが、それでもなお本明細書に用いられている用語の範疇に含められる。宿主細胞は、あらゆる原核細胞または真核細胞であって良い。例えば、ＣｏｐＢポリペプチドエピトープドメインは、イー・コリ、モラクセラ・カタラーリスのような細菌細胞、（Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞のような）昆虫細胞、（エス．セレビジアエのような）酵母菌、または（中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳＯまたはＣＯＳ細胞のような）哺乳類細胞において発現され得る。他の適当な宿主細胞が、当業者に知られている。
【００８６】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換、感染またはトランスフェクション技術を介して、原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書において用いられている、「形質転換」、「感染」または「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、感染またはエレクトロポレーションを含めて、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該分野で認識された技術を指す。宿主細胞を形質転換、感染またはトランスフェクションする適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年」および他の研究室マニュアルにおいて見られる。
【００８７】
培養基にある原核生物または真核生物の宿主細胞などの、本発明の宿主細胞は、ＣｏｐＢポリペプチドを生成する（すなわち、発現する）ために用いられ得る。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてＣｏｐＢポリペプチドを生成する方法をさらに提供する。一つの具体例として、本方法は、ＣｏｐＢポリペプチドが生成されるまで、適当な媒質中で、（ポリペプチドをコード化する組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を培養することを含む。他の具体例として、本方法は、媒質または宿主細胞に由来するＣｏｐＢポリペプチドを単離することをさらに含む。
【００８８】
発現ベクターのコード配列は、転写終結領域に効果的に結合している。ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が起こる部位を介して、コード化ＤＮＡ配列を転写する。典型的には、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に局在しているＤＮＡ配列は、転写を終結させる。それらのＤＮＡ配列は、本明細書で転写終結領域と呼ばれている。それらの領域は、転写したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の効率的なポリアデニル化に必要とされる。転写終結領域は、当該分野においてよく知られている。本発明のベクター構築物において用いられている、好ましい転写終結領域は、ＳＶ４０またはプロタミン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。ｂＧＨポリアデニル化シグナルはまた、利用するのに適当である。
【００８９】
発現ベクターは、ＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド（例えば、ＣｏｐＢエピトープドメイン）を含む。そのようなポリペプチドは、非ＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド分節に由来する分節を識別するのに十分な長さの、ＣｏｐＢポリペプチドをコード化する核酸塩基の配列を含んでいなければならない。本発明のポリペプチドはまた、生物学的に機能的なポリペプチド、または交換されるアミノ酸の相対的疎水親水性のようなことを考慮することを基礎として選別された変化を有するような、様々なアミノ酸配列を有するＣｏｐＢポリペプチドをコード化する。これらの様々な配列は自然源から単離したもの、または部位特異的変異誘発などの変異誘発操作を用いて本明細書において開示されている配列において誘導される。
【００９０】
本発明のＤＮＡ分子、遺伝子またはポリペプチドは、当該分野においてよく知られたいくつかの技術によって、ベクターに組み込まれ得る。例えば、ベクターｐＵＣ１８は、特に価値のあることが立証されている。同様に、関連したＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９は、特にジデオキシ配列決定を実行する上で、本発明のある具体例において用いられ得る。
【００９１】
本発明の発現ベクターは、ＣｏｐＢポリペプチドをコード化する多量のＤＮＡを調製する方法としても、コード化したポリペプチドを調製する方法としても有用である。本発明のＣｏｐＢポリペプチドは組換え手段によって作られ、シャトル系として原核細胞または真核細胞の発現ベクターのいずれかを利用し得る。
【００９２】
さらに他の具体例として、本発明は、ＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドによって、形質転換、感染またはトランスフェクションした組換え宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のＣｏｐＢエピトープドメインをコード化するポリヌクレオチドによって、トランスフェクションされる。ＤＮＡ分子のような外来のポリヌクレオチドによって、形質転換またはトランスフェクションする方法は、当該分野においてよく知られており、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションおよびアデノウィルス注射（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９年）のような技術を含む。
【００９３】
最も広く用いられている方法は、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥデキストランのいずれかによって媒介されるトランスフェクションである。その機構は不明瞭のままであるが、トランスフェクションしたＤＮＡはエンドサイトーシスによって細胞の細胞質に入り、核に輸送されると考えられている。細胞の型によって、培養細胞の集団の９０％までが、どの時点においてもトランスフェクションされ得る。効率が高いので、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥデキストランによって媒介されるトランスフェクションは、多数の細胞における外来のＤＮＡの一過性の発現を必要とする実験の選択法である。また、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、外来のＤＮＡのコピーを組み込み、通常、ヘッド−テイル・タンデムアレイにて宿主細胞ゲノムに配置される、細胞系を確立する。
【００９４】
プロトプラスト融合法において、目的とするプラスミドの多数のコピーを運ぶ細菌に由来するプロトプラストは、培養した哺乳類細胞と直接混合する。（通例ポリエチレングリコールを用いた）細胞膜の融合の後、細菌の内容物は哺乳類細胞の細胞質に輸送され、プラスミドＤＮＡは核に輸送される。プロトプラスト融合は、一般に一過性の発現アッセイに用いられている多くの細胞系についてのトランスフェクションほど効率的ではないが、ＤＮＡのエンドサイトーシスが非効率的に起こる細胞系には有用である。プロトプラスト融合は、宿主の染色体に縦列に組み込まれるプラスミドＤＮＡの多数のコピーを、しばしば産出する。
【００９５】
高圧電気パルスを短時間、種々の哺乳類または植物細胞に適用することで、細胞膜中のナノメーターサイズの孔の形成がもたらされる。ＤＮＡは、これらの孔を介して、または孔の閉鎖に伴う膜成分の再分配の結果として、細胞の細胞質に直接取り込まれる。エレクトロポレーションは、極めて効率的であり、クローニングした遺伝子の一過性の発現および目的とする遺伝子を組み込んだコピーを有する細胞系の確立に用いられ得る。エレクトロポレーションは、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションおよびプロトプラスト融合とは対照的に、しばしば一つまたはせいぜい数個の外来ＤＮＡの組み込んだコピーを有する細胞系を生じさせる。
【００９６】
リポソームトランスフェクションは、リポソーム中へのＤＮＡおよびＲＮＡの封入、続いてリポソームの細胞膜との融合を伴う。どのようにしてＤＮＡが細胞に輸送されるかという機構は不明であるが、トランスフェクションの効率が９０％位となり得る。
【００９７】
ＤＮＡ分子の核へのマイクロインジェクションは、低ｐＨエンドソームのような細胞成分にＤＮＡを曝露しないという利点がある。マイクロインジェクションは、それゆえに、重要なＤＮＡの組み込んだコピーを運ぶ細胞系を確立する方法として第一に用いられる。
【００９８】
アデノウィルスを細胞のトランスフェクションのためのベクターとして利用することは、当該分野においてよく知られている。アデノウィルスベクター媒介細胞トランスフェクションは、様々な細胞について報告されている（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９２年）。
【００９９】
好ましい具体例として、本発明の組換え宿主細胞は、原核生物の宿主細胞である。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、エシェリキア・コリのＤＨ５α種の細菌細胞である。一般に、原核細胞は、ＤＮＡ配列を最初にクローニングし、本発明において有用なベクターを構築することが好ましい。例えば、イー・コリＫ１２種は、特に有用である可能性がある。用いられ得る他の微生物種は、イー・コリＢ、およびイー・コリＸ１９７６（ＡＴＣＣ  ３１５３７番）を含む。これらの例は、当然、説明することを意図したものであり、発明の範疇を制限することを意図したものではない。
【０１００】
原核生物はまた、発現のために用いられ得る。上記の株、ならびにイー・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３３２５番）、バシラス・サチリスのようなバシラス属、またはサルモネラ・ティフィムリウムまたはセラチア・マルセッセンスのような他の腸内細菌および様々なシュードモナス種が用いられ得る。
【０１０１】
一般に、宿主細胞と適合する種に由来する、レプリコンおよび調節配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と共に用いられる。ベクターは、通常、形質転換した細胞の表現型選別を行うことができるマーキング配列と共に、複製部位を有する。例えば、イー・コリは、イー・コリ種に由来するプラスミド、ｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら  １９７７年）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、かくして形質転換した細胞を識別する容易な方法を提供する。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージもまた、自己のポリペプチドの発現のための微生物によって用いられ得るプロモーターを含有するか、または含有するように修飾されなければならない。
【０１０２】
組換えＤＮＡ構築に最も一般的に用いられるプロモーターは、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、１９７８年；Ｉｔａｋｕｒａら、１９７７年；Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９年；Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９８０年）、およびトリプトファン（ＴＲＰ）プロモーター系（欧州特許第ＥＰ００３６７７６号；Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔら、１９８０年）を含む。これらは最も一般的に用いられるけれども、他の微生物プロモーターが発見されて利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開され、プラスミドベクターに機能的なプロモーターを導入することが可能になった（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔら、１９８０年）。
【０１０３】
トランスフェクションの後、細胞は、ＣｏｐＢポリペプチドの発現に十分な時間培養条件下で維持される。培養条件は、当該分野においてよく知られており、イオン組成物および濃度、温度、ｐＨ等を含む。典型的には、トランスフェクションした細胞は、培養媒質中で培養条件下で維持される。様々な細胞系についての適当な媒質が、当該分野においてよく知られている。好ましい具体例として、温度は約２０℃から約５０℃であり、より好ましくは、約３０℃から約４０℃であり、さらに一層好ましくは約３７℃である。
【０１０４】
ｐＨは、好ましくは約６．０の値から約８．０の値までであり、より好ましくは約６．８の値から約７．８の値であり、最も好ましくは約７．４である。重量オスモル濃度は、好ましくはリッターあたり約２００ミリオスモル（ｍｏｓｍ／Ｌ）から約４００ｍｏｓｍ／Ｌであり、より好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌから約３１０ｍｏｓｍ／Ｌまでである。コード化したポリペプチドのトランスフェクションおよび発現に必要とされる他の生物学的条件は、当該分野においてよく知られている。
【０１０５】
トランスフェクションした細胞は、ＣｏｐＢポリペプチドの発現に十分な時間維持される。適当な時間は、とりわけ用いられる細胞型によるが、熟練者によって容易に決定される。典型的には、維持時間は、約２日から約１４日である。
【０１０６】
組換えＣｏｐＢポリペプチドは、トランスフェクションした細胞または細胞を培養する媒質から回収または収集される。回収はＣｏｐＢポリペプチドの単離および精製を含む。ポリペプチドの単離および精製技術は、当該分野においてよく知られており、沈殿、濾過、クロマトグラフィー、電気泳動などのような手順を含む。
【０１０７】
Ｄ．ＣｏｐＢエピトープと免疫反応性の抗体
さらに他の具体例として、本発明は、ＣｏｐＢエピトープドメインと免疫反応する抗体を与える。一つの具体例として、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。他の具体例として、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体である。それに加えて、ＣｏｐＢポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むエピトープドメインを含むＣｏｐＢポリペプチド断片である。抗体を調製し、特徴づける方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、抗体「Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年参照）。
【０１０８】
簡潔に言うと、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む免疫原を有する動物を免疫化し、免疫化した動物由来の抗血清を収集することによって調製される。幅広い範囲の動物種が、抗血清の生成に用いられ得る。典型的には、抗抗血清の生成に用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギは相対的な血液体積が大きいので、ウサギはポリクローナル抗体の生成について好ましい選択である。
【０１０９】
当該分野においてよく知られているように、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫原性が変化して良い。それゆえに、本発明の免疫原（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）をキャリアと結合することがしばしば必要となる。例の好ましいキャリアは、ＣＲＭ１９７、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である。卵アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして用いられ得る。
【０１１０】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをキャリアタンパク質に結合させる方法は、当該分野においてよく知られており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化ベンジジンを含む。
【０１１１】
ポリクローナル抗体の生成に用いられる免疫原の量は、免疫化に用いられる動物と共に、とりわけ免疫原の性質によって変化する。様々な経路が、免疫原を投与するのに用いられ得る（皮下、筋内、皮内、静脈内および腹膜内）。ポリクローナル抗体の生成は、免疫化の後、様々な場所で免疫化した動物の血液をサンプリングすることによってモニターされる。免疫原性の望ましい水準が得られた場合、免疫化した動物から採血し、血清を単離して貯蔵し得る。
【０１１２】
他の側面として、本発明は、次の工程：（ａ）ＣｏｐＢポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを有する組換え宿主細胞をトランスフェクションし；（ｂ）ポリペプチドの発現に十分な条件下で宿主細胞を培養し；（ｃ）ポリペプチドを回収し；（ｄ）ポリペプチドに対する抗体を調製することを含む、ＣｏｐＢポリペプチドと免疫反応する抗体を生成する過程を熟考する。好ましくは、宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のＣｏｐＢエピトープドメインをコード化するポリヌクレオチドによってトランスフェクションされる。さらにより好ましくは、本発明は、上記の方法に従って調製した抗体を与える。
【０１１３】
本発明のモノクローナル抗体は、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第４１９６２６５号において例示されるような、よく知られた技術の利用を介して容易に調製される。典型的には、その技術は、選別した抗原（例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を有する適当な動物を、免疫応答を与えるのに十分な方法で、最初に免疫化することを含む。マウスおよびラットのような齧歯類は、好ましい動物である。免疫化した動物に由来する脾臓細胞は、その後、不死の骨髄腫細胞の細胞と融合させる。免疫化した動物がマウスである場合、好ましい骨髄腫細胞はネズミのＮＳ−１骨髄腫細胞である。
【０１１４】
融合した脾臓／骨髄腫細胞は、親細胞から融合した脾臓／骨髄腫細胞を選別するために、選択性媒質中で培養する。融合した細胞は、例えば組織培養媒質中でのヌクレオチド新生を阻害する試薬の付加によって、融合していない親細胞の混合物から分離される。例としての好ましい試薬は、アミノプテリン、メトトレキサートおよびアザセリンである。アザセリンがプリン合成のみを阻害するのに対して、アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジン両方の新生を阻害する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが用いられる場合、媒質はヒポキサンチンおよびチミジンをヌクレオチドの材料として補充する。アザセリンが用いられる場合、媒質はヒポキサンチンを補充する。
【０１１５】
この培養は、特定のハイブリドーマが選ばれる、ハイブリドーマ集団を提供する。典型的には、ハイブリドーマの選別は、マイクロタイタープレート中で単一クローン希釈によって細胞を培養し、続いて抗原ポリペプチドとの反応について個別のクローンの上澄みを検査することによって実行される。ついで、選別されたクローンを制限無く増殖させて、モノクローナル抗体を得る。
【０１１６】
本発明のモノクローナル抗体を利用することによって、本発明の特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、抗原として認識される。一度認識されると、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離され、抗体−アフィニティクロマトグラフィーのような技術によって精製される。抗体−アフィニティクロマトグラフィーにおいて、モノクローナル抗体は固体の基質に結合し、望ましい抗原を含む溶液に曝露される。抗原は、結合した抗原との免疫特異的反応を介して、溶液から除去される。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その後、容易に基質から除去され、精製される。
【０１１７】
加えて、抗体提示ライブラリーを生成し、スクリーニングする上で利用する方法、および特に敏感に反応する試薬の例は、例えば、米国特許第５２２３４０９号；国際出願ＷＯ９２／１８６１９；国際出願ＷＯ９１／１７２７１；国際出願ＷＯ９２／２０７９１；国際出願ＷＯ９２／１５６７９；国際出願ＷＯ９３／０１２８８；国際出願ＷＯ９２／０１０４７；国際出願ＷＯ９２／０９６９０；国際出願ＷＯ９０／０２８０９に見られる。
【０１１８】
加えて、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作ることのできる、組換え抗ＣｏｐＢ抗体は、本発明の範疇に含まれる。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野において知られた組換えＤＮＡ技術、例えば国際出願ＰＣＴ／Ｕ５８６／０２２６９；国際出願ＥＰ１８４１８７；国際出願ＥＰ１７１４９６；国際出願ＥＰ１７３４９４；国際出願ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４８１６５６７号；および国際出願ＥＰ１２５０２３に記述された方法を用いることによって生成し得る。
【０１１９】
抗ＣｏｐＢ抗体（例えばモノクローナル抗体）は、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降法のような標準的な技術によって、ＣｏｐＢポリペプチドを単離するために用いられる。抗ＣｏｐＢ抗体は、細胞、および宿主細胞において発現されている組換えによって生成したＣｏｐＢポリペプチドからの、ＣｏｐＢポリペプチドの精製を容易にする。その上、抗ＣｏｐＢ抗体は、ＣｏｐＢポリペプチドの存在量を評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞の上澄み中で）ＣｏｐＢポリペプチドを検出するために用いられる。抗ＣｏｐＢ抗体は、臨床検査手順の一部として、組織におけるタンパク質濃度をモニターするために、例えばアジュバント療法の効力を決定するために、診断的に用いて良い。検出は、抗体を検出可能な基質に結合させる（すなわち、物理的結合）ことによって促進される。検出可能な基質の例は、様々な酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な置換基複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオレンを含み、適当な放射活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５Ｓまたは３Ｈを含む。
【０１２０】
Ｅ．免疫原性および医薬組成物
ある好ましい具体例として、本発明は、ＣｏｐＢポリペプチド断片（すなわち、ＣｏｐＢエピトープドメイン免疫原）および生理的に許容できるキャリアを含む、免疫ＣｏｐＢ免疫原性および医薬組成物を与える。より好ましくは、その免疫原性および医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有するＣｏｐＢポリペプチド断片を含む。好ましい具体例として、免疫原性組成物は、配列番号１、配列番号２および配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む、少なくとも三つのエピトープドメインを含む。他の具体例として、本発明の医薬組成物は、ＣｏｐＢポリペプチドエピトープドメインをコード化するポリヌクレオチド、および生理的に許容できるキャリアを含む。
【０１２１】
ＣｏｐＢエピトープ断片は、哺乳類の患者、例えば人間に投与するのに適当な、医薬および免疫原性組成物に組み込まれている。そのような組成物は、典型的には、「活性のある」組成物および医薬上許容できるキャリアを含む。下記にて用いる「医薬上許容できるキャリア」なる語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含めることを意図している。医薬上活性のある物質に対するそのような媒質および試薬の利用は、当該分野においてよく知られている。何らかの従来の媒質または試薬が活性化合物と配合できない場合を除いては、そのような媒質は本発明の組成物において用いられ得る。補足の活性化合物はまた、本組成物に組み込まれ得る。
【０１２２】
本発明の医薬または免疫原性組成物は、意図した投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋内、腹膜内）、粘膜（例えば、経口、直腸、鼻腔内、口内、膣内、吸引）および経皮（局所）を含む。非経口投与、皮内投与または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液は、次の成分：注射用水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌の希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌薬；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調節剤を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような、酸または塩基によって調節し得る。非経口用製剤は、ガラスまたはプラスチックでできた、アンプル、使い捨ての注射器または多用量の薬瓶に封入され得る。
【０１２３】
注射可能な利用に適した医薬組成物は、滅菌の水溶液（水に可溶の場合）または分散媒、および滅菌の注射可能な溶液または分散媒を即座に調製するための滅菌の粉末を含む。静脈内投与について、適当なキャリアは、生理食塩水、静菌水、クレモフォアＥＬ（商標登録）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性があるべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保存ができなければならない。キャリアは、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールおよびその類似物）、およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒である。例えば、レシチンのような被覆剤を用いることによって、分散媒の場合は必要な粒子のサイズを維持することによって、界面活性剤を用いることによって、適当な流動性が維持される。微生物の作用の予防は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールおよびその類似物によって達成される。多くの場合において、張度調節剤、例えば組成物中のマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムのような糖類、ポリアルコールを含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、例えばモノステアリン酸ナトリウムおよびゼラチンのような、吸収を遅らせる試薬を組成物中に含むことによってもたらされる。
【０１２４】
滅菌の注射可能な溶液は、活性のある化合物（例えばＣｏｐＢエピトープドメイン）を、適切な溶媒中に、上で列挙した成分の一つまたは組み合わせて必要量を混合し、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散媒は、活性のある化合物を、基剤となる分散媒および上で列挙した以外の必要となる成分を含む滅菌ビヒクルに配合することによって調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ましい製法は、前もって滅菌濾過したその溶液から有効成分と付加的な所望の成分の散剤を得る、真空乾燥および凍結乾燥法である。
【０１２５】
経口用の組成物は、一般に、不活性の希釈剤または食用のキャリアを含む。それらは、ゼラチンのカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口投与療法の目的のために、活性のある化合物は、ビヒクルに混合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形態において用いられる。経口用の組成物はまた、流動性のキャリア中の化合物が口腔内で使用され、うがいに付され、吐き出されるかまたは嚥下されるところの、洗口剤として用いるために流動性キャリアを用いて調製される。医薬上適合しうる結合剤、および／または補助物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチおよびその類似物は、次の類似した性質をもつ成分または化合物のうちのいずれも含み得る：微晶質のセルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのようなビヒクル、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジの風味のような香味料。
【０１２６】
吸入による投与について、化合物は、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧した容器またはディスペンサー、またはネブライザーから、エーロゾルスプレーの形態で噴出される。全身投与は、経粘膜的または経皮的な方法によるものであってよい。経粘膜または経皮的投与について、障壁に適切に浸透する浸透剤が、処方に用いられる。そのような浸透剤は、一般に当該分野において知られており、例えば、粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。粘膜投与は、スプレー式点鼻薬または坐薬の利用によってなされる。経皮投与について、活性のある化合物は、一般に、当該分野において知られているように、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに処方される。
【０１２７】
化合物はまた、直腸輸送のために、坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような通常の坐薬用基剤を含む）または停留浣腸液の形態に調製される。
【０１２８】
一つの具体例として、活性のある化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル輸送系を含めた、解離調節処方のような、体内からの急速に化合物が除去されるのを防ぐようなキャリアと共に調製される。
【０１２９】
エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生物分解性、生体適合性のポリマーが用いられ得る。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から、市販で入手できる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的としたリポソームを含めて）はまた、医薬上許容されるキャリアとして用いられる。これらは、例えば、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第４５２２８１１号に記述されているような、当業者に知られた方法に従って調製される。
【０１３０】
特に都合がよいことは、投与が容易で用量を均一にするための投与単位形で、経口用または非経口投与用組成物を処方することである。本明細書において用いている、投与単位形は、治療する患者にとって投与単位として適し、各々の単位が、必要となる医薬上のキャリアと結合して望ましい薬効を得るために産出された予め決定された量の活性のある化合物を含む、物理的に不連続な単位を指す。本発明の投与単位形についての仕様は、活性のある化合物の特有の性質および達成される特定の薬効、および個体の治療についての活性のある化合物のような調合分野に固有の制約によって影響され、またそれに直接左右される。
【０１３１】
好ましい具体例として、組み合わせた免疫原性組成物は、本発明の三つまたはそれ以上のＣｏｐＢポリペプチド断片（例えば、配列番号１−４のエピトープドメイン）を含むことによって与えられる。中耳炎を引き起こす様々な細菌に対する多価免疫原性組成物は、ＵｓｐＡ１、ＵｓｐＡ２、Ｂ１、Ｃ／Ｄ、Ｅおよび７４ｋＤａタンパク質を含むがそれだけに限定されない、一つまたはそれ以上の他の既知のモラクセラ・カタラーリスポリペプチド、および／またはＰ２、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６およびＰＣＰタンパク質を含むがそれだけに限定されない、一つまたはそれ以上の既知の分類不能なヘモフィルス・インフルエンザポリペプチド、および／または現在利用可能な２３価肺炎双球菌カプセルポリサッカライドワクチンおよび７価肺炎双球菌ポリサッカライド−タンパク質結合体ワクチンを含むがそれだけに限定されない、一つまたはそれ以上の既知のストレプトコッカス・ニューモニアポリペプチドおよびポリサッカライド−タンパク質結合体と共に、本発明の三つまたはそれ以上のＣｏｐＢポリペプチドを含む。一つの特定の好ましい多価免疫原性組成物は、本発明の三つまたはそれ以上のポリペプチドを、Ｐ４、Ｐ６およびＵｓｐＡ２ポリペプチドと共に含む。
【０１３２】
医薬上許容できるビヒクルとは、副作用を引き起こさず、且つ例えば活性のある化合物の投与を容易にしたり、その活性持続時間および／または体内での効力を高めたり、溶液中への溶解度を高めたり、またはあるいはその保存状態を向上したりする、医薬上のまたは免疫原性組成物に加わる、化合物または化合物の組み合わせを呼ぶと理解されている。これらの医薬上許容できるビヒクルは当業者にはよく知られており、選択した活性のある化合物の投与の性質および方法に従って、適合させられるであろう。
【０１３３】
「アジュバント」は、免疫原の免疫原性の向上をもたらす物質である。従って、アジュバントは、しばしば免疫応答の増強をもたらし、当業者によく知られている。本明細書において考えられているアジュバントの例としては、リン酸アルミニウムおよび水酸化ナトリウムのようなアルミニウム塩（ミョウバン）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ボルデテラ・パーチュチス、細菌リポポリサッカライド、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）あるいはそれらの誘導体または類似物［Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手でき、米国特許第６１１３９１８号に記載されている（かかるＡＧＰの一つが、水性形態としてもしくは安定な乳化剤として処方される、２−［（Ｒ）−３テトラデカンオキシルオキシテトラデカンオキシルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−フォスフォノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカンオキシオキシテトラデカンオキシル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイオキシオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（５２９としても知られ（以前はＲＣ５２９として公知である）））である］、米国特許第４９１２０９４号に記載されているＭＰＬ（登録商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）（Ｃｏｒｉｘａ）、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（米国特許第６２０７６４６号）、ポリペプチド、米国特許第５０５７５４０号に記載されている、ＱｕｉｌＡまたはＳＴＩＭＵＬＴＯＮ（登録商標）Ｑｓ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｉｇｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のようなサポニン、百日咳毒素（ＰＴ）、またはイー・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９、例えば国際特許出願第ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照、コレラ毒素（野生型または変異型のいずれか、例えば、発表された国際特許出願第ＷＯ００／１８４３４号に従って、アミノ酸の２９位のグルタミン酸が他のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置換されるもの）を含むが、それだけに限定されない。様々なサイトカインおよびリンホカインが、アジュバントとして用いる上で適している。一つのそのようなアジュバントは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、それは米国特許第５０７８９９６号に記載されているヌクレオチド配列を有する。ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを含むプラスミドはイー・コリ中に形質転換され、バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８１番に住所を有するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、受け入れ番号３９９００で寄託された。サイトカインのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、米国特許第５７２３１２７号に記載されている他のアジュバントである。インターロイキン１α、１β、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロンα、βおよびγ、顆粒球コロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子αおよびβを含むが、それだけに限定されない、他のサイトカインまたはリンホカインは、免疫調節活性を有することが示さ���てきており、アジュバントとして利用する上で適している。
【０１３４】
本発明の組成物は、典型的には、標準的でよく知られた、生理的に許容できるキャリア、アジュバントおよびビヒクルを望ましいように含む、投与単位処方で非経口投与される。本明細書で用いている、非経口という用語は、静脈内、皮下、皮内、筋内、動脈内注射または点滴技術を含む。
【０１３５】
注射可能な調製、例えば滅菌の注射可能な水性または油性の懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いた既知の技術に従って処方される。滅菌の注射可能な調製はまた、非毒性の非経口投与で許容できる希釈剤または溶媒中の、滅菌の注射可能な溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタノール中の溶液であってよい。
【０１３６】
そのうちの利用される可能性のある許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、および生理食塩液である。加えて、滅菌の固定油は、伝統的に溶媒または懸濁媒として利用されている。この目的のため、刺激の少ないあらゆる固定油が、合成モノーまたはジグリセリドを含めて用いられ得る。それに加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射可能な調製に利用できる。
【０１３７】
好ましいキャリアは、リン酸、乳酸、トリスおよびその類似物で緩衝した中性の塩溶液を含む。ウィルスベクターを投与する場合、ベクターは、不完全干渉アデノウィルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質などの望ましくない汚染物質を実質的に含まず、ベクター構造物を受け取る個体において何ら不都合な反応を引き起こさないように十分精製される。ベクターを精製する好ましい手段は塩化セシウム勾配遠心法などの浮遊密度勾配の使用を含む。
キャリアはまたリポソームであって良い。輸送担体としてリポソームを用いる方法は、当該分野においてよく知られている。
【０１３８】
特定の具体例として、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子発現を調節する調節配列と効果的に結合している、本発明のポリヌクレオチド配列を含む。目的とするポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡの発現を促進する調節分子、すなわちプロモーターおよび／またはエンハンサー分子の調節の下、プラスミドのような発現ベクターに作りかえられる。好ましい具体例として、ヒトサイトメガロウィルス即時プロモーター／エンハンサーが用いられる（米国特許第５１６８０６２号）。プロモーターは細胞特異的であり、予め決められた細胞においてのみポリヌクレオチドの実質的な転写が可能であって良い。
【０１３９】
ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして宿主に直接導入されるか（米国特許第５５８０８５９号）、あるいはブピバカインおよび他の局所麻酔（米国特許第５５９３９７２号）および陽イオンポリアミン（米国特許第６１２７１７０号）のような、免疫化を促進する薬品と共に組成物中に処方される。
【０１４０】
このポリヌクレオチド免疫化手順において、本発明のポリペプチドはインビボにて一過的原理にて発現され；遺伝物質は一切宿主の染色体に挿入または組み込まれない。この手順は、その目的が染色体に重要な遺伝物質を挿入または組み込むことである、遺伝子治療とは区別されるべきである。アッセイは、免疫化によって投与されるポリヌクレオチドが、宿主の表現型の形質転換を生じさせないことを確認するために用いられている（米国特許第６１６８９１８号）。
本明細書で引用されている全ての特許および出版物は、出典明示により本明細書の一部とする。
【０１４１】
Ｆ．実施例
次の実施例は、特記した場合を除き、当業者によく知られた慣例的な手順である、標準的技術を用いて実行される。以下の実施例は説明を目的として示されるものであり、何ら本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【０１４２】
実施例１
材料および方法
モラクセラ・カタラーリス単離体およびモノクローナル抗体
モラクセラ・カタラーリス単離体Ｏ３５Ｅ、ＴＴＡ２４およびＯ４６Ｅは、Ｅ．Ｈａｎｓｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）によって与えられた。モラクセラ・カタラーリス単離体Ｂ４６およびＪ２６１は、Ｇ．Ｄｏｅｒｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏｗａ、ｌｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＩＡ）によって提供された。モラクセラ・カタラーリス単離体４６０８．１は、Ｔ．Ｍｕｒｐｈｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｕｆｆａｌｏ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）によって提供された。他の全ての単離体は、Ｄ．Ｈａｒｄｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）によって提供された。細菌を４０％グリセロールを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培養液中７０℃で貯蔵し、ＣＯ２５％、３７℃でインキュベートしてＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天上で慣用的に継代させた。単離体Ｏ３５Ｅに由来するＣｏｐＢに特異的なＭＡｂ１０Ｆ３を、Ｅ．Ｈａｎｓｅｎによって提供されるハイブリドーマクローンから培養上澄みの硫酸アンモニウム濃縮液として調製された。
【０１４３】
イー・コリ中のＣｏｐＢタンパク質の発現
ＣｏｐＢをコード化する遺伝子を単離体Ｏ３５ＥからＣｏｐＢリーダー配列をもたないｐＥＴ３０ａＴ７発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＬＰ１４１と称した。同様に、プラスミドｐＬＰ１３１を単離体ＴＴＡ２４からＰＣＲ増幅したｃｏｐＢ遺伝子を用いて構築し、ｐＥＴ２８ａＴ７発現系にクローニングした（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。両プラスミドを用いてイー・コリ発現宿主種ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。細菌増殖のために、形質転換したイー・コリ培養菌は、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）媒質（ＬＢ−Ｋａｎ）中３７℃でインキュベートした。組換えＣｏｐＢ（ｒＣｏｐＢ）タンパク質を単離するための細胞を調製するために、凍結した細胞をＬＢ−Ｋａｎ寒天培地上で元に戻し、その後ＬＢ−Ｋａｎ培養液中で一晩増殖させた。一夜培養した基に新しいＬＢ−Ｋａｎ培養液を接種して最終的なＡ６００を０．０５とし、Ａ６００が約１．５に到達するまで振盪しながらインキュベートした。この培養液に１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を誘導した。１０分後、リファンピシンを最終濃度０．１５ｍｇ／ｍｌまで加えた。誘導の３時間後、細菌を低速遠心によって採取した。
【０１４４】
ＣｏｐＢタンパク質の単離
採取した細菌細胞を１％トライトンＸ−１００を含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中に再び懸濁し、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに二度通した（Ａｍｉｎｃｏ  ＦＡ−０７８、ＳＬＭ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ）。細胞溶解物を２０分間３６０００×ｇで遠心分離した。主にｒＣｏｐＢ封入体からなるペレットをｐＨ８．０の０．１Ｍトリス中４℃で一晩中緩やかに揺らしながら６Ｍの尿素および０．５Ｍの塩化ナトリウムで抽出した。２０分間３６０００×ｇで遠心分離した後、可溶性ｒＣｏｐＢは上澄みに残存しており、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよびｐＨ８の０．１Ｍトリス中の１％トライトンＸ−１００で平衡に達した、サイズ排除カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通した。ｒＣｏｐＢを含む溶出液を遠心分離に付し、微粒子物質を除去した。この可溶性ｒＣｏｐＢは、１％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（１２％アクリルアミド）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、約８０ｋＤａのバンドとして移動した。タンパク質の純度は、クマシー染色ゲルのスキャニングに基づくと９０％であった。
【０１４５】
ＣｏｐＢペプチドの合成および結合
ＣｏｐＢペプチドを、Ｆｍｏｃ、ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰの二重結合化学を用いて、Ｇｌｉｓｏｎ  ＡＭＳ４２２マルチプルペプチドシンセサイザー（Ｇｌｉｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＷＩ）上で合成し、逆相ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）で精製した。これらのペプチドは、報告されている８個のアミノ酸のコアエピトープおよび両側から５つの側面の残基を含めて、長さが１８個のアミノ酸であった（表１参照）。０３５Ｅペプチドは、ＱＡＥＬＤＮＫＹＡＧＫＧＹＫＬＧＳＫ（配列番号５）の配列を有し；ＴＴＡ２５ペプチドは、ＱＡＥＬＤＤＫＹＡＧＫＧＹＫＬＧＳＫ（配列番号６）の配列を有し；４３０：３４５ペプチドは、ＬＡＥＬＮＫＤＹＰＧＱＧＹＫＬＧＫＫ（配列番号７）の配列を有する。システインは、ＣｏｐＢペプチドを遺伝子的に解毒したジフテリア毒素ＣＲＭ１９７に結合するために、各々のペプチドのＮ末端に付加した。
【０１４６】
ペプチド結合体を作るために、異種二官能性架橋結合試薬であるＮ−サクシニミジルブロモ酢酸を重量比１：１で用いて、まずＣＲＭ１９７をブロモアセチル化した。この反応により、マトリックス補助レーザー吸収／イオン化経過時間質量分光測定法によって決定されるように、ＣＲＭ１９７分子あたり１９個のリジン残基の修飾が導かれた。ペプチドを水中に溶解し、即座にブロモアセチル化したＣＲＭ１９７に重量比１：１で加えた。混合物を一晩中緩やかに攪拌しながらインキュベーションし、結合していないペプチドを除去するためにＰＢＳで透析した。結合の程度をアミノ酸分析によって評価した。酸加水分解すると、ＣＲＭ１９７とのペプチドチオエステル結合当たり、一個のＳ−カルボキシメチルシステインが解放された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ペプチド結合体は、非結合ＣＲＭ１９７よりも大きい分子サイズを有して移動した。
【０１４７】
マウスにおける免疫血清の生成
ＢＡＬＢ／ｃおよびＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは共に、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから購入した。ｒＣｏｐＢタンパク質に対する免疫応答を検査するために、６週齢から８週齢までの、１０のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標登録）；Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＮＴ）５０μｇおよびリン酸アルミニウム１００μｇを補足して、組換えタンパク質２０μｇを０週および４週に皮下投与して免疫化した。０、４および６週で採取した血清を、分析のために貯蔵した。ＣｏｐＢペプチド結合体に対するポリクローナル血清を調製するために、６週齢から８週齢までの、１０のメスのＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群を、２０μｇのＱＳ２１を補足して、ペプチド結合体１０μｇを０、３および６週に、皮下投与して免疫化した。０週の血清のプールおよび８週の血清のプールが、分析に用いられた。加えて、組換えＣＤタンパク質、およびＯ３５Ｅ単離体に由来する天然のＵｓｐＡに対する、マウスのポリクローナル血清を生成した。これらのマウスに由来する６週の血清を貯蔵し、アッセイにおける対照群として用いた。
【０１４８】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
貯蔵した血清中の全抗原特異的免疫グロブリン濃度を、標準的な酵素結合免疫測定法手順（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。これらのアッセイについて、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルの平底のポリスチレン媒質結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を、ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝剤中で２μｇ／ｍｌに希釈した、ｒＣｏｐＢタンパク質（６Ｍ尿素および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ８の０．１Ｍトリス中）で一晩中被覆した。タンパク質特異的抗体を、ヤギの抗マウス抗体を結合したアルカリフォスファターゼで検出した（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌａ、ＣＡ）。抗体滴定価は、血清試料希釈液の対数に対する吸光度の対数の直線プロットから外挿した、０．１の吸光度を有する血清希釈液の逆数として表現された。全ての症例について、０週の血清は、５０未満の抗体滴定価を示した。モラクセラ・カタラーリスの様々な単離体に対する、貯蔵した血清の全細胞滴定価は、Ｃｈｅｎら、１９９６年に記載されたように測定された。０週の血清は、検査した全ての単離体について、５０未満の全細胞滴定価を示した。
【０１４９】
ＣｏｐＢ遺伝子の配列決定
単離体４３０：３４５に由来するｃｏｐＢ遺伝子をクローニングするために用いられたＰＣＲプライマーの組は、オリゴヌクレオチド５'−ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧ（配列番号８）および５'−ＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣ（配列番号９）であり；単離体１１１：２１０および３１８：０８６に由来するのはオリゴヌクレオチド５'−ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＣＣＴＡＡＧＧ（配列番号１０）および５'−ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧ（配列番号１１）であり；単離体２１８：０３８および４１７：０８２に由来するのはオリゴヌクレオチド５'−ＣＴＧＡＣＡＴＴＧＧＣＧＧＴＧＡＧＴ（配列番号１１）および５'−ＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴ（配列番号１２）であった。オリゴヌクレオチドは、βシアノエチルホスホルアミダイト化学を用いて、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で合成した。ｃｏｐＢ遺伝子を、ＲｅｄｄｙＭｉｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｏｕｓｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、Ｕ．Ｋ．）で、適切なオリゴヌクレオチドを用いて、細菌細胞からＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．、Ｃａｒｉｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。ＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７自動化ＤＮＡ配列決定器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で、特異的に設計されたプライマーで、ＢｉｇＤｙｅターミネーター化学を用いて実行した。シークエンチャー（登録商標）４．０．５ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅ、Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてＤＮＡ配列を分析し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてタンパク質配列を分析した。
【０１５０】
実施例２
０３５Ｅ組換えＣｏｐＢおよびＴＴＡ２４組換えＣｏｐＢタンパク質の免疫原性
０３５ＥのｒＣｏｐＢおよびＴＴＡ２４のｒＣｏｐＢタンパク質は共に、二次免疫を高めたマウスにおいて良好な一次免疫応答を誘導した。０３５ＥのｒＣｏｐＢに対する抗体およびＴＴＡ２４のｒＣｏｐＢに対する抗体は交差反応性であった、すなわち、いずれかのｒＣｏｐＢによって産出されたポリクローナル血清は、タンパク質の異種の形態と同様に同種に対しても、高い抗体価を有していた（表４参照）。
【０１５１】
【表４】
2006518379.tif 000007
ａ１０のマウスから貯蔵した６週の血清についての抗体価
ｒＣｏｐＢタンパク質に対する高い抗体価はまた、二つの組換えタンパク質の混合物によって免疫化されたマウスから得られた血清についてもみられた。これらの結果は、０３５ＥおよびＴＴＡ２４ＣｏｐＢタンパク質が９８％以上の配列の同一性を有している（Ｓｅｔｈｉ、１９９７年；Ｈｅｌｍｉｎｅｎら、１９９３年）という事実と一致した。全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、非常に低い交差反応性が検出された（表５）。
【０１５２】
【表５】
2006518379.tif 000008
ａ１０のマウスから貯蔵した６週の血清についての全細胞力価
【０１５３】
抗０３５ＥｒＣｏｐＢ血清は、１０Ｆ３陽性単離体の全細胞と選択的に反応し、抗ＴＴＡ２４ＣｏｐＢ血清は、４３０：３４５を除いて、１０Ｆ３陰性単離体の全細胞と選択的に反応した。抗ＴＴＡ２４ＣｏｐＢ血清の１０Ｆ３陰性単離体に対する全細胞力価は、抗０３５ＥＣｏｐＢ血清の１０Ｆ３陽性単離体に対する全細胞力価と比較して、非常に低いということが理解できる。それにもかかわらず、二つの組換えタンパク質の混合物によって産出された抗血清は、単離体４３０：３４５を除いて、１０Ｆ３陽性単離体および１０Ｆ３陰性単離体の両方に対して同等の全細胞力価を示した。
【０１５４】
モラクセラ・カタラーリス細胞溶解物に対する、ウェスタンブロットにおける抗血清の反応性もまた検査された（データは示していない）。八つの検査した単離体のうち、四つの１０Ｆ３陽性単離体のＣｏｐＢタンパク質（すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて８０ｋＤａで移動しているバンド）は、０３５ＥｒＣｏｐＢに対するポリクローナル血清と強力に反応したが、ＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢに対するポリクローナル血清とはあまり反応しなかった。他方、四つの１０Ｆ３陰性単離体のうち三つのＣｏｐＢタンパク質は、ＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢに対するポリクローナル血清と強力に反応したが、０３５ＥｒＣｏｐＢに対するポリクローナル血清とはあまり反応しなかった。１０Ｆ３陰性単離体の４３０：３４５のＣｏｐＢはまた、例外であることが判明した。それは、０３５ＥｒＣｏｐＢに対する抗血清およびＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢの両方とわずかに反応した。ウェスタンブロットおよび全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいてみられた、二つのｒＣｏｐＢタンパク質によって誘導されたポリクローナル血清の特異性は、ＭＡｂ１０Ｆ３によって規定されるエピトープが細菌表面上の単一の免疫主要ドメインであるということを、強く示唆していた。
【０１５５】
実施例３
新しいＣｏｐＢ血清型群の検出
０３５ＥおよびＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢタンパク質に対するポリクローナル血清が、１０Ｆ３陰性単離体４３０：３４５に対して相対的に低い反応性しか有していないということは、特に興味深かった（表５参照）。従って、単離体４３０：３４５は新しい血清型群を提示している可能性があると考えられた。この仮説を検証するために、単離体４３０：３４５に由来するｃｏｐＢ遺伝子を、１０Ｆ３エピトープに対応する領域で部分的に配列決定し、Ｏ３５Ｅ単離体と四つのアミノの違いを検出した（図１）。この発見は、単一の免疫主要エピトープ仮説と矛盾せず、何故単離体４３０：３４５のＣｏｐＢタンパク質が、０３５ＥまたはＴＴＡ２４単離体のＣｏｐＢタンパク質と、免疫学的に異なっているのかの説明となる。
【０１５６】
単離体４３０：３４５のＣｏｐＢタンパク質に見られたエピトープ配列がまた、単離体０４６Ｅおよび５６のＣｏｐＢの発表された配列にも存在している（Ｓｅｔｈｉ、１９９７年；Ａｅｂｉら、１９９８年）ということは、これら三つの単離体が同一の血清型群に属するということを示唆している。
【０１５７】
実施例４
ウェスタンブロット分析によって特徴づけたＣｏｐＢの血清学
１０Ｆ３陰性単離体でのこの新しい血清型群の占有率を評価するために、モラクセラ・カタラーリスに感染した患者由来の１００以上の単離体を、ＭＡｂ１０Ｆ３との反応性についてドットブロット分析によってスクリーニングした。１０Ｆ３と反応しない１８の単離体を、１０Ｆ３と反応する４の単離体と共に、さらなる研究のために選別した。選別した単離体の全溶解物は、ウェスタンブロットによって、ＭＡｂ１０Ｆ３、および三つの血清型群の同一なエピトープ領域に対するポリクローナル血清との反応性について検査した。このために長さが１８アミノ酸である三つのペプチドを合成した。各々は、単離体０３５Ｅ、ＴＴＡ２４および４３０：３４５のペプチド配列にみられるように、８アミノ酸のコアエピトープおよび両側に５つの側面残基を有していた。ペプチドを、Ｎ末端でシステイン残基によってＣＲＭ１９７と結合させ、ペプチド結合体をマウスに投与して抗血清を生成した。議論を簡潔にするために、生じた血清を抗０３５Ｅペプチド血清、抗ＴＴＡ２４ペプチド血清および抗４３０：３４５ペプチド血清と呼ぶ。これらのエピトープ特異的抗体試薬を、二つのｒＣｏｐＢタンパク質に対して調製した血清、およびＤＮＡの配列決定と共に用いて、四つの血清型群：ＣｏｐＢ−Ｉ、ＣｏｐＢ−ＩＩ、ＣｏｐＢ−ＩＩＩおよびＣｏｐＢ−ＩＶの発見に至った。
【０１５８】
２２全ての単離体を、ウェスタンブロット分析によって検査した（データは示していない）。ＭＡｂ１０Ｆ３の特異性は、単離体０３５Ｅ、１２３０：３５９、１１０：０７０、１１５：１４２およびＢ４６（血清型群ＣｏｐＢ−Ｉ）のＣｏｐＢタンパク質に対する反応性によって、明瞭に説明された。抗ＴＴＡ２４ペプチド血清は、ほぼ選択的であり；三つの１０Ｆ３陰性単離体、ＴＴＡ２４、１１１：２１０および１１３：１３６（血清型群ＣｏｐＢ−ＩＩ）のＣｏｐＢタンパク質と最も強く反応した。抗０３５Ｅペプチド血清は、遙かに特異性が低く、４３０：３４５以外の全ての単離体を認識した。
【０１５９】
対照的に、抗４３０：３４５ペプチド血清に対する反応パターンは、より複雑であった。抗４３０：３４５ペプチド血清は、ほとんどの単離体における、様々な分子量のいくつかのタンパク質に対して弱い反応性を示すのに対し、４３０：３４５および０４６ＥのＣｏｐＢタンパク質とのみ強く反応した（データは示していない）。この観察は、さらに、単離体４３０：３４５および０４６Ｅが新しい血清学的グループ（血清型群ＣｏｐＢ−ＩＩＩ）を提示することを立証している。
【０１６０】
実施例５
全細胞ＥＬＩＳＡによるＣｏｐＢ血清型群のさらなる特徴付け
四つのＣｏｐＢ血清型群の発見は、細菌表面に露出している可能性のあるタンパク質のエピトープについてのさらなる調査を促した。そのために、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを、二つの組換えＣｏｐＢタンパク質および三つのＣｏｐＢペプチド結合体に対する血清を分析するために用いた。全細胞滴定価（表６）に基づいて、２２の単離体を、ウェスタンブロットによって以前に同定された、同一の四つのＣｏｐＢ血清型群に分類した。表７に要約されているように、血清型群ＣｏｐＢ−Ｉを、ＭＡｂ１０Ｆ３および抗０３５ＥｒＣｏｐＢ血清を有する単離体の特異的反応性によって規定し、血清型群ＣｏｐＢ−ＩＩを、抗ＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢ血清を有する単離体の特異的反応性によって規定し、血清型群ＣｏｐＢ−ＩＩＩを、抗４３０：３４５ペプチド血清を有する単離体の特異的反応性によって規定した。Ｏ３５ＥおよびＴＴＡ２４ペプチドに対する血清は、それらの単離体に由来するｒＣｏｐＢタンパク質に対する血清にみられるものに類似した反応性のパターンを示すが、力価は低かった（データは示していない）。ｒＣｏｐＢタンパク質および三つのＣｏｐＢペプチドに対する、これらのポリクローナル血清が比較的厳しい特異性を有することは、血清型群ＩＣｏｐＢ−Ｉ、ＣｏｐＢ−ＩＩおよびＣｏｐＢ−ＩＩＩの各々が、各々の単離体の細菌表面に単一の免疫優勢ドメインを有しているということを明確に示した。
【０１６１】
【表６】
2006518379.tif 000009
【０１６２】
【表７】
2006518379.tif 000010
【０１６３】
２２の単離体のＭＡｂ１０Ｆ３、０３５ＥおよびＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢタンパク質に対する抗血清、４３０：３４５ペプチドに対する血清との全細胞の反応性に基づいた、同定された四つのＣｏｐＢ血清型群の検出の特徴は、表７に要約されている。ポリクローナル抗体の交差反応性がないことは、血清型群ＣｏｐＢ−Ｉ、ＣｏｐＢ−ＩＩおよびＣｏｐＢ−ＩＩＩが、単一ではあるが異なる細菌表面の免疫主要エピトープによって各々規定されているということを立証した。
【０１６４】
実施例６
ＣｏｐＢ−ＩＩＩおよびＣｏｐＢ−ＩＶ単離体由来のｃｏｐＢ遺伝子の配列決定
単離体４３０：３４５および４６０８．１のｃｏｐＢ遺伝子を、クローニングして完全に配列決定した。予測されたこれらの単離体のＣｏｐＢタンパク質の配列を、その後発表されたものと比較した。ＣｏｐＢタンパク質配列の代表的な配列は、図１に示す。単離体４３０：３４５について予測されたタンパク質の配列は、単離体０４６Ｅのものと類似しており、５つの残基の違いしかなかった。対照的に、単離体４３０：３４５について予測されたタンパク質の配列は、単離体０３５ＥおよびＴＴＡ２４のものとは全く異なっていた。それらとは７５またはそれより多くの残基の違いがあった。興味深いことに、同一の免疫主要エピトープ配列ＫＤＹＰＧＱＧＹ（配列番号３）が、単離体４３０：３４５、０４６Ｅおよび５６のＣｏｐＢタンパク質においてみられた（図１および表１）。単離体４３０：３４５および０４６Ｅにおいて同一のエピトープドメインが存在することは、ウェスタンブロット（データは示していない）および全細胞ＥＬＩＳＡアッセイ（表６）において、これら二つの単離体に対する抗４３０：３４５ペプチド血清の特異的反応性よく相関していた。検査は行っていないが、単離体５６は、同様に４３０：３４５ペプチドに対して調製された抗体に結合することが予期されるであろう。
【０１６５】
血清型群ＣｏｐＢ−ＩＶ単離体は、ウェスタンブロットにおいてＭＡｂ１０Ｆ３または抗ＣｏｐＢペプチド血清のいずれかとの反応性を示さず（データは示していない）、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清特異的抗体試薬とも反応しなかった（表６）。それにもかかわらず、この単離体からｃｏｐＢ遺伝子を、クローニングして配列決定することができた。図１に示すように、単離体４６０８．１のｃｏｐＢ遺伝子から予測されたＣｏｐＢタンパク質は、単離体０３５Ｅ、ＴＴＡ２４および４３０：３４５のものとは全く異なっていた。ｃｏｐＢ遺伝子生成物がこの単離体によって作られるのか否かを決定するために、４６０８．１の細胞溶解物を、ウェスタンブロットにおいて０３５ＥおよびＴＴＡ２４ｒＣｏｐＢに対するポリクローナル血清を用いて調査した。前に言及したように、ｒＣｏｐＢタンパク質に対するポリクローナル血清は、表面に露出した免疫主要エピトープ以外の領域に対する抗体を含んでいた（表４）。単離体４６０８．１が予期されるサイズのＣｏｐＢタンパク質を発現していることが判明した。これらの結果は、４６０８．１が、ＣｏｐＢ−ＩＶと表されてきた、新しい血清型群に提示していることを示している。
【０１６６】
参考資料
国際出願番号 EP 125,023
国際出願番号 EP 171,496
国際出願番号 EP 184,187
国際出願番号 EP 173,494
国際出願番号 EP 264166
国際出願番号 PCT/US86/02269
国際出願番号 WO 86/01533
国際出願番号 WO 91/17271
国際出願番号 WO 92/01047
国際出願番号 WO 92/09690
国際出願番号 WO 92/15679
国際出願番号 WO 92/18619
国際出願番号 WO 92/20791
国際出願番号 WO 93/01288
国際出願番号 WO 00/63364
国際出願番号 WO 94/12650
国際出願番号 WO 93/13302
国際出願番号 WO 92/19265
国際出願番号 WO 00/18434
国際出願番号 WO 93/13202
国際出願番号 WO 96/05858
国際出願番号 WO 98/20734
国際特許 WO 98/42375
【０１６７】
米国特許第4,196,265号
米国特許第4,816,567号
米国特許第4,873,316号
米国特許第4,987,071号
米国特許第4,912,094号
米国特許第4,837,151号
米国特許第4,522,811号
米国特許第4,554,101号
米国特許第4,683,202号
米国特許第4,987,071号
米国特許第5,968,502号
米国特許第5,223,409号
米国特許第5,116,742号
米国特許第5,723,127号
米国特許第5,643,576号
米国特許第5,593,972号
米国特許第5,580,859号
米国特許第5,168,062号
米国特許第5,078,996号
米国特許第5,057,540号
米国特許第5,116,742号
米国特許第5,108,744号
米国特許第5,593,972号
米国特許第5,601,831号
米国特許第5,614,382号
米国特許第5,785,973号
米国特許第6,207,646号
米国特許第6,168,918号
米国特許第6,127,170号
米国特許第6,113,918号
【０１６８】
2006518379.tif 000011
【０１６９】
2006518379.tif 000012
【０１７０】
2006518379.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
（原文に記載なし）
【配列表】
2006518379.tif 000014
2006518379.tif 000015
2006518379.tif 000016
2006518379.tif 000017
2006518379.tif 000018
2006518379.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月30日(2005.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006518379000001.app
【国際調査報告】
2006518379.tif 000020
2006518379.tif 000021
2006518379.tif 000022
2006518379.tif 000023
2006518379.tif 000024
2006518379.tif 000025
2006518379.tif 000026