(57)【要約】自己免疫状態の治療、緩和又は予防に対する治療組成物が、記載される。上記組成物は、治療され得る状態に適切な酵素及び免疫原を含む。上記組成物は、従来の方法で提供され得るが、皮内注射によって提供されるのが好ましい。
2006522086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫状態の治療に使用される医薬組成物であって、治療を必要とする個人において有利な効能を提供する投与量で、酵素と、免疫原とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記酵素が、肝酵素又はムコポリサッカリダーゼである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素が、β-グルクロニダーゼである請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
β-グルクロニダーゼが、β-D-グルクロノシドグルクロノソハイドロラーゼ（登録番号EC3.2.1.31）である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵素が、２００〜１０，０００フィッシュマン 単位/mlの濃度で存在する請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記酵素が、１，０００〜５，０００単位/mlの濃度で存在する請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記酵素が、０．５〜２．５mg/mlの濃度で存在する請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
安定剤及び/又は活性化剤をさらに含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記安定剤及び/又は活性化剤が、不活性タンパク質部分である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記安定剤及び/又は活性化剤が、硫酸プロタミン又は1,10-ジアミノデカンである請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記安定化剤及び/又は活性化剤が、20mg/lまでの濃度で存在する請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記安定化剤及び/又は活性化剤が、3〜9mg/lの濃度で存在する請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒドロキシル部分をさらに含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ヒドロキシル部分が、糖又はジオールによって提供される請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ヒドロキシル部分が、1,3-シクロヘキサンジオールによって提供される請求項１３又は１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヒドロキシル部分が、20μg/lまでの濃度で存在する請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
酸又は中性pHに緩衝化されている請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
５〜６のpHに緩衝化されている請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
コラーゲンをさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記コラーゲンが、１０〜1×１０15分子/mlの濃度で存在する請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記コラーゲンが、1×１０4〜1×１０14分子/mlの濃度で存在する請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
グリコサミノグリカンをさらに含む請求項１〜２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロネート（D-グルクロン酸N-アセチルD-グルコサミン）、コンドロイチン硫酸（D-グルクロン酸N-アセチルD-ガラクトサミン4又は6スルフェート）、デルマタン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸N-アセチルD-ガラクトサミン）、ケラタン硫酸（D-ガラクトースN-アセチルD-グルコサミンスルフェート）、及びヘパラン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸N-アセチルD-グルコサミン）から成る群から選択される請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン-6-スルフェートである請求項２２又は２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記グリコサミノグリカンが、０．１〜１．０mg/mlの濃度である請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記グリコサミノグリカンが、０．５mg/mlの濃度である請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
経皮注入又は皮内注射に好適な配合である請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
投与前の短時間又は投与直前に調製される請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項の組成物を調製するためのキットであって、酵素溶液及び免疫原溶液を含み、前記２種の溶液が、相互に導入され、治療を必要とする個人に投与する前に混合するようになっていることを特徴とするキット。
【請求項３０】
自己免疫状態を治療又は予防する方法であって、治療上有効量の、酵素及び免疫原を含む組成物を、治療を必要とする個人へ投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
関節リウマチの治療、緩和又は予防方法であって、治療上に有効量の、β-グルクロニダーゼ及びコラーゲンを含む組成物を、治療を必要とする個人へ投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
自己免疫状態の治療又は予防のための薬剤の調製における治療上有効量の酵素及び免疫原の使用。
【請求項３３】
関節リウマチの治療用薬剤の調製におけるβ-グルクロニダーゼ及びコラーゲンの使用。
【請求項３４】
関節リウマチの治療に使用される組成物であって、1000〜5000フィッシュマン 単位/mlのβ-グルクロニダーゼ、6μg/mlの硫酸プロタミン、1μg/mlの1,3-シクロヘキサンジオール、及び0.5mg/mlのコンドロイチン硫酸を含み、pH5.9に緩衝化され、2.5×1012、2.5×1010及び2.5×104分子/mlからなる群から選択されるコラーゲンの濃度であることを特徴とする組成物。
【請求項３５】
実施例１に関して及び実施例１に示されるようにここで実質的に記載されている組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、治療組成物に関する。特に、本発明は、自己免疫状態の治療、緩和又は予防のための治療組成物に関する。
自己免疫は、すべての人にいくらかの程度存在し、通常無害である。しかし、自己免疫は、自己免疫疾患、病気又は状態として一括して知られている広範囲の人の疾患を生じさせ得る。自己免疫状態は、良性自己免疫から病原性自己免疫への進行が存在する場合、異物又は生体異物又は他の異物又は部分でなく身体自体を攻撃するという誤った免疫反応が個人に生じる場合に生じる。この進行は、一般的影響及び環境的誘因によって決定される。
自己免疫反応が、ほぼ常に炎症を特徴とし、潜在的な修復方法を示す。しかし、自己免疫状態又は疾患において炎症は、慢性的であり得、組織損傷を生じさせる。例えば、関節リウマチにおいて、慢性炎症が、関節及び軟骨に特定の損傷を与える。これらの疾患の正確な由来及び病態生理学プロセスは、完全には知られていない。
自己免疫状態に関する最近の治療は、疼痛処理、抗-炎症性薬物の投与、失った物質の置き換え（例えば、糖尿病におけるインスリンの供給）又は１種以上の免疫抑制剤に一般的に関する。これらの治療は、一般的に局所また体内の他のところで副作用が生じ得るものではなく、全身性である。
これらのやり方は、一時的にこの状態を緩和し、又はこれらの進行を減少させ得る一方で、根底にある原因又は状態の病因学を除去し、減少し又は変えるのでなく実際の物理状態又は効果を直接妨げるためにしばしば作用する。例えば、多くの自己免疫反応は、T-細胞媒介応答に関与することが既知であり、従って、この応答に作用する自己免疫状態の治療を提供するのに有用となり得る。
【０００２】
自己免疫は、自己抗体（人体に対する抗体）及びホスト抗原と反応するT-細胞の存在によって証明される。自己免疫状態は、全身性の、例えば、全身性エリテマトーデス、又は臓器特異的に、例えば甲状腺炎であり得る。自己免疫状態の別の例には、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、若年性（１型）糖尿病、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑、悪性貧血、糸球体腎炎、及び肺繊維症が挙げられる。
状態の基本的な原因に作用することによって自己免疫状態に対して効果を媒介する治療組成物を提供することが、本発明の目的である。しかし、本発明は、物理的状態の効果又は状態にさらに作用し得る。
従って、本発明は、自己免疫状態に対する治療組成物を提供し、この組成物は、治療を必要とする個人に有用な効果を提供する投与量で、酵素及び免疫原を含む。
有利なことには、本発明の組成物は、自己免疫状態の根本原因に作用し又は作用する応答を媒介する。例えば、それは、T-細胞媒介反応を下方制御するように作用し得る。理論により拘束されることを望まないが、本発明者は、本発明の免疫原が、ランゲルハンス又は樹状細胞を経由して媒介される反応によって又は胸腺によって、間接的にT-細胞の活性を減少させ、この反応は、調節機能（例えば、IL-10産生）に対する抗原感受性リンパ球を変え又は免疫原の標的部位から離れて細胞活性を変えることを確信する。
ここで使用される「免疫原」という語は、免疫応答を誘起し得る物質を定義することを企図する。免疫原の特性、例えば分子量は、この語によって制限され得ることが、意図されない。
【０００３】
以下に続く詳細な説明において、本発明は、関節リウマチの治療に特に関連して記載される。しかし、本発明は、適切な免疫原の選択によって、他の疾患の治療に同等の有用性を見出す。例えば、多発性硬化症は、免疫原としてミエリン基礎タンパク質の使用によって治療され得、甲状腺炎又は橋本病は、免疫原として甲状腺タンパク質を使用して治療され得、また糖尿病は、免疫原としてインスリン又はβ-細胞タンパク質を使用して処理され得る。さらに、免疫原の混合物又は組み合わせは、特に、状態が１種以上の免疫原と関係し、又はそれに関連する場合に使用され得る。
好ましくは、この組成物に使用される酵素は、肝酵素又はムコポリサッカラーゼである。さらに好ましくは、この酵素は、グルクロニダーゼであり、最も好ましくは、β-グルクロニダーゼである。理想的には、β-グルクロニダーゼは、β-D-グルクロノシドグルクロノソヒドロラーゼである（登録番号EC 3.2.1.31）。この酵素が、防腐剤又はソルビトールを含まないという条件で、酵素源は、この組成物の活性に重要でないことが分かる。従って、酵素を精製し、よって本発明の組成物中に使用可能にすることが必要であり得る。精製のいかなる方法が、使用され得るが、ゲル濾過クロマトグラフィー又はクロスフロー濾過(tangential flow filtration)を使用するために便利であることが分かる。
酵素が少なくとも20,000フィッシュマン単位/mgの濃度まで精製されまた200〜10,000単位/ml及び理想的に1,000〜5,000単位/mlの濃度で組成物中に存在することが好ましい。
他のタンパク質による混入は、非常に低レベルでさえ、酵素活性に影響し得ることが分かっている。従って、安定剤及び/又は活性化剤は、この組成物中に存在することが好ましい。安定剤及び/又は活性化剤は、好ましくは、不活性タンパク質部分、例えば硫酸プロタミン又は1,10-ジアミノデカンである。好ましくは、安定剤及び/又は活性化剤は、20mg/lまでの濃度で存在する。ここで安定剤及び/又は活性化剤が、硫酸プロタミンであり、それは、好ましくは、1〜10mg/lの濃度で、さらに好ましくは3〜9mg/lの濃度で、理想的に約6mg/l(6μg/mlと等価)の濃度で存在する。
【０００４】
この組成物は、さらに、ヒドロキシル部分を含んでよい。ヒドロキシル部分は、好ましくは、少なくとも２つのヒドロキシル部分を有するポリオールにより、またより好ましくは、少なくとも２つのヒドロキシル部分を有する糖又はジオールによって提供される。好ましいヒドロキシル部分の源は、1,3-シクロヘキサンジオールである。好ましくは、この1,3-シクロヘキサンジオールは、20μg/lまでの濃度で、より好ましくは、1,3-シクロヘキサンジオールは、0.1〜10μg/lの濃度で、また理想的に1μg/lの濃度で存在する。1,3-シクロヘキサンジオールの立体化学は、本発明に悪影響を与えないことが分かり、従って、cis、又はtrans型又はラセミ混合物が、使用され得る。
この組成物は、好ましくは中性又は酸pHに緩衝化される。より好ましくは、この組成物は、5〜6.5のpHに緩衝化され、また理想的にこの組成物は、pH5.9に緩衝化される。
本組成物が、関節リウマチの治療に使用される本発明の好ましい態様において、好ましい免疫原は、コラーゲン又はその断片、誘導体、抱合体、ミメティックス又は他の生成物であり又は、コラーゲン型構造又は活性を天然又は合成又は変性であろうと源に関係なく、有する。以降で使用される「コラーゲン」の用語は、先述のコラーゲン生成物を含むように企図される。コラーゲンは、好ましくは溶液に存在する。コラーゲンは、いかなる源に由来し得るが、このコラーゲンは、防腐剤又はソルビトール又は他の添加剤を含まないことが好ましい。従って、本発明の組成物におけるその使用を可能にするためにコラーゲンを精製することが必要となり得る。精製のいかなる方法が使用され得るが、ゲル濾過クロマトグラフィー又はクロスフロー濾過を使用することが便利であることが分かった。
【０００５】
この組成物中に存在するコラーゲンの濃度は、10〜1×1015分子/mlであり得る。より好ましくは、この組成物に存在するコラーゲンは、1×104〜1×1013分子/mlの濃度であってよい。一般的に、この組成物に存在するコラーゲンの濃度は、求められる投与量によって変化するだろう。従って、コラーゲン投与された組成物の３つの範囲は、利用可能にされ、これらは、高〜低の濃度(strength)で変化し得ることが企図されている。高濃度範囲での組成物は、1×1010〜1×1015分子/mlの濃度でコラーゲンを含んでよく、より好ましくは、約1×1012〜1×1013分子/ml含んでよい。理想的に、高濃度組成物は、2.5×1013分子/ml含むだろう。中濃度範囲の組成物に対して、コラーゲンは、好ましくは、1×109〜1×1013分子/mlの程度の濃度で存在し、及びより好ましくは約1×1010〜1×1012分子/mlで含むだろう。理想的に、中濃度組成物は、2.5×1011分子/ml含むだろう。低濃度範囲の組成物に対して、コラーゲンは、好ましくは、1×102〜1×108分子/mlの程度の濃度で存在し、及びより好ましくは約1×104〜1×107分子/mlで含むだろう。理想的に、中濃度組成物は、2.5×105分子/ml含むだろう。
【０００６】
好ましくは、この組成物は、グリコサミノグリカン又はその混合物又は組み合わせをさらに含む。いかなるグリコサミノグリカンが、使用され得るが、このグリコサミノグリカンが、ヒアルロネート（D-グルクロン酸N-アセチルD-グルコサミン）、コンドロイチン硫酸（D-グルクロン酸N-アセチルD-ガラクトサミン1,3,4又は6スルフェート）、デルマタン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸N-アセチルD-ガラクトサミン）、ケラタン硫酸（D-ガラクトースN-アセチルD-グルコサミンスルフェート）、及びヘパラン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸N-アセチルD-グルコサミン）から成る群から選択されることが好ましい。最も好ましいグリコサミノグリカンは、コンドロイチン-6-スルフェートである。
グリコサミノグリカンは、好ましくは、0.1〜1.0mg/ml、最も好ましくは0.5mg/mlの濃度で組成物に存在する。理想的に、グリコサミノグリカンは、防腐剤又は糖がなく、これを確実にするために使用前にグリコサミノグリカンを精製することが必要であり得る。精製の従来の方法には、ゲル濾過クロマトグラフィー又はクロスフロー濾過が挙げられる。
本発明の組成物は、局所投与又は経皮注入によって、全身に又は局所的に、例えば経口-、非経口-、皮内-、局所的-、直腸-、経鼻-ルートでいかなる従来の方法で投与され得る。今や、この組成物は、皮下注射、好ましくは皮内注射、又は皮間注射のいかなる形態で投与されることが好ましい。組成物は、特に関節リウマチにおいては、自己免疫領域に局所的に投与される必要はないが、いかなる禁忌を最小化し、又は特別な位置で作用を促進させるために、他の状態で局所的にするのが好ましい。
【０００７】
好ましい態様において、この組成物は、投与前短時間で又は投与直前に調製される。この態様において、この組成物は、２種の調製物、酵素調製物及びコラーゲン調製物として提供されてよく、相互に導入されまた投与直前に混合される。この態様において、酵素溶液は、安定化された酵素、ヒドロキシル部分及び緩衝溶液中の酵素を含み、そのすべては、上記に存在する。このコラーゲン溶液は、上記のように緩衝されるようにコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含む。好ましくは、投与される時にこの組成物は、酵素溶液より多くのコラーゲン溶液、より好ましくは、少なくとも２倍量のコラーゲン溶液（体積）及び理想的に約４部のコラーゲン溶液を酵素溶液のそれぞれの体積部に対して含む。
従って、本発明は、さらに本発明の組成物の調製キットを提供し、このキットは、酵素溶液及び免疫原溶液を含み、２つの溶液は、相互に導入され、治療に必要な個人への投与前に混合されている。キットは、マルチチェインバー又はマルチバレルディスペンサー例えば、注射器などの形態で存在し得る。
本発明の組成物は、形成と使用の間に保存され得る。例えば、この組成物は、冷凍、乾燥、フリーズドライ、凍結乾燥(lyophilized)、カプセル化され又はさらに好適に選択された組成物のインビボ活性に悪影響を全く又はほとんど有しない防腐剤により、又は医薬品に従来使用され又は既知のいかなる他の保存技術により保存され得る。この組成物は、乾燥され又は凍結乾燥され又は上記とは別に固化され、この組成物は、経口投与用に、錠剤、カプセル、ロゼンジ又は他の固体投与形態に形成され又は溶液又は液体形態での使用、例えば注射用に再構成する。組成物又は投与単位量の成分を凍結させ、任意にシリンジで、個人又は医師により使用を促進することは、便利であり得る。
【０００８】
いかなる医薬的に許容される溶媒は、この組成物の液体形態を生成するために使用され得る。同様に、通常の結合剤、賦形剤、媒体、及び他の標準的な投与添加剤が、本発明の組成物に使用され得る。
本発明は、自己免疫状態の治療又は予防方法をさらに提供し、この方法は、医薬的に有効量の酵素及び免疫原を含む組成物を治療の必要な個人に対して投与する工程を含む。
本発明は、さらに関節リウマチを治療し、緩和し又は予防する方法を提供し、この方法は、医薬的に有効量のβ-グルクロニダーゼ及びコラーゲンを含む組成物を治療を必要とする個人への投与する工程を含む。
本発明は、さらに自己免疫状態の治療又は予防に対する薬剤の調製における医薬的に有効量の酵素及び免疫原の使用を提供する。
さらなる側面において、本発明は、さらに関節リウマチの治療用の薬剤の調製におけるβ-グルクロニダーゼ及びコラーゲンの使用を提供する。
最後の態様において、本発明は、0.5-2.5mg/mlのβ-グルクロニダーゼ、6μg/mlの硫酸プロタミン、1μg/mlの1,3-シクロヘキサンジオール、及び0.5mg/mlのコンドロイチン硫酸を含み、pH5.9に緩衝され、さらに関節リウマチの治療の使用に対して2.5×1013、2.5×1011又は2.5×105分子/mlのコラーゲンを含む組成物を提供する。
本発明の態様は、例示の目的のみで、以下の添付される図面に関して記載されるだろう。
【実施例１】
【０００９】
β-グルクロニダーゼ(EC 3.2.1.31)（海洋軟体動物ミミガイ属ミダエ(ハリオティス・ミダエ(Haliotis midae))(南アフリカアワビ)から得た）をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、存在するすべての防腐剤又はソルビトールを除去する。
精製したβ-グルクロニダーゼをpH5.9の緩衝溶液に添加し、最終濃度1.5mg/mlとした。1,3-シクロヘキサンジオール（英国、ドーセット、プール、シグマ社）を1μg/mlの最終濃度となるように添加した。沈殿を回避するために攪拌しながら、硫酸プロタミンBPを添加して、最終濃度を、6μg/mlとした。
別個に、天然コラーゲンII型をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、存在するすべての防腐剤又はソルビトールを除去した。
精製コラーゲンを溶液に溶解し、pH5.9に緩衝化して、最終コラーゲン濃度2.5×1013とした。この溶液に、コンドロイチン硫酸を添加して最終濃度0.5mg/mlとした。
0.01mlの酵素溶液を0.04mlのコラーゲン溶液に導入し、混合した。0.05mlボーラスの組成物をマウスの関節リウマチモデルに皮内注射として使用した。Paw質量及び体積をビヒクルのみ、コラーゲンのみ又はβ-グルクロニダーゼのみを受けたコントロールマウスに対して測定した。
【実施例２】
【００１０】
DBA/1マウスにおけるコラーゲン-誘起関節炎でのβ-グルクロニダーゼ/II型コラーゲンの影響
場所
この試験サンプルは、英国、バークシア、パングボーン(Pangbourne)、McEwen Laboratories Ltd.社により調製された。試験施設は、英国、ブリストル大学、医学部、病理学及び細菌学学科であった。
研究スケジュール
研究スケジュールは、以下である。
研究開始日：２００４年２月２日
評価終了日：２００４年３月２４日
研究の目的
本研究は、β-グルクロニダーゼと組み合わせたコラーゲン誘起関節炎の発生率及び重症度におけるII型コラーゲンの２種の試験投与量の効果を決定するために設計された。雄DBA/1マウスを研究のために選択し、関節炎を開始刺激として完全なフロインド(Freunds)アジュバンドにおけるII型コラーゲン（鶏）を使用して開始した。処理をII型コラーゲン及びβ-グルクロニダーゼの別個の例として提供した。サンプルを4℃に保ち、注射の直前に混合した。処理を、投与後１０日目に、首筋へ皮下注射される単一投与として与えた。動物を１７日〜５２日目の間、週に２回、関節赤色及び腫脹の観察による臨床的な関節炎に対して記録した。このスタディーセンターは、ブラインドであった。
材料及び方法
マウス
３０匹の雄DBA/1マウスをHarlan Olac社から６週齢で得た。動物を研究開始前、１２週齢に達するまで、ブリストル大学医学部の動物小屋で飼育した。０日目、すべてのマウスに完全なフロインドアジュバンド(CII/CFA)に乳化した鶏II型コラーゲン100μgを尾の基部に注射によって与えた。処置を１０日目、首筋に皮下注射によって与え、その後、臨床的な関節の腫脹を１７日〜５２日目の間週に２回記録した。
処置
β-グルクロニダーゼ(E.C. 3.2.1.31)(海洋性軟体動物ミミガイ属アワビから得られた)を凍結乾燥粉末として提供した。これは、（凍結乾燥工程で使用されるすべてのソルビトール及び塩を除去するために）サイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィーによりさらに精製され、pH5.9の緩衝液中で2mg/mlの濃度に希釈した。この溶液に1×10-8mg/mlの1,3-シクロヘキサンジオール及び6×10-5mg/mlの硫酸プロタミンを添加した。その後、この溶液を無菌でバイアルに充填し、また使用するまで２℃〜８℃まで保存した。
II型コラーゲン（鶏軟骨から得られる）を凍結乾燥された粉末として提供し、さらにゲル濾過クロマトグラフィーによって上記のように精製した。その後、これを0.5mg/mlのコンドロイチン硫酸（サメ軟骨から精製された）を含むpH5.9の緩衝溶液で希釈した。約50ng/mlと50fg/mlを示す二つの希釈を使用し、これらを別々にバイアルに無菌で分配し、使用まで２℃〜８℃で保存した。
処理はMcEwen Laboratories Ltd社によって提供され、以下のように標識した。
１．酵素A      上記のβ-グルクロニダーゼ溶液
２．CII A      上記の50fg/mlコラーゲン
３．酵素B      バッファコントロール
４．CII B      バッファコントロール
５．酵素C      上記のβ-グルクロニダーゼ溶液
６．CII C      上記の50ng/mlコラーゲン
サンプルの同一性をMcEwen Laboratories社によって記録したが、インライフフェーズの終了前にブリストル大学に開示されていない。A、B及びCサンプルを各動物への200μlの注入の前にたったの10分で1mlシリンジに混合した。サンプルを使用するまで4℃で保存し、冷蔵庫からの移動の後注入時点まで氷の上に置いた。
実験群（n=10/群）
群Ａ：0日目にCII/CFA、10日目に混合物Aによる処理
群Ｂ：0日目にCII/CFA、10日目に混合物Bによる処理
群Ｃ：0日目にCII/CFA、10日目に混合物Cによる処理
指標
関節腫脹の臨床スコアである。動物を１７日〜５２日目、毎週２回検査した。それぞれの時において、四肢のそれぞれに以下に従ってスコアを与えた（0=正常、1=関節全体の軽度の腫脹又は個々の指炎症、2=赤みを伴う関節全体の中等度の腫脹及び/又は二以上の指における炎症、3=適度な関節炎症及び多指(multiple digits)へ広がる赤み、骨再構築のいくつかの兆候、4=いくつかの関節炎症及び多指へ広がる赤み、骨再構築の明白な兆候）。
結果
サンプルの解読。治療サンプルの身元は、検死後、スタディーセンターに示された。
疾患は、このモデルに対する予期される発生率と重大性を伴ってコントロール群(B)に存在した。疾患は、検査の初日、すなわち１７日目に、非常に低レベルで存在するが、発生率及び重症度は、ライフフェーズの終わりまで、その日から増加した（図１）。この進行は、このモデルの関節炎の予期される経過と調和する。コントロール群の全体の疾患レベルは、試験設備で実施される多くの類似実験に比較して厳しかった。
低投与量治療群での疾患は、コントロールと比較して開始時に遅延していた（図２）。これは、単点T検定（single point T test）が、２９日目の試験として群Aと群Bの間の関節炎の重症度の重要な差を示すことを意味する（図３）。その後、疾患の重症度は、群Aにおいて増加した。実験の持続時間に対して群Bと比較すると重症度は減少し続けているが、全体のカーブは、２９日目を超えて有意な治療効果を示さなかった。
高投与量治療群における疾患は、２５日目〜実験の最後において群Bの疾患より低い（図４）。群Cの疾患は、このモデルの関節炎に対する正常な経過に従わず、疾患は、この実験の大部分の動物の標準数より低く作用し、全体として、群の重症度は、予想よりも非常に小さい。２匹の動物を除いては、群Cの疾患の重症度は、非常に低いままである。これら２匹の動物の保護作用の欠如は、群Cデータセットの分散が、相対的に高いことを意味した。しかし、関節炎の重症度は、42、46及び52日目の群Cと群Bを比較する（Mann-Whitney U試験）場合、極めて低い。52日目のデータ（最も高い疾患が記録される日として）は、図５に示される。さらに、クラスカル-ウォリス法ポスト検定(Kruskal Wallis post-test)によるAnnova解析は、群Bと比較して群Cの疾患のレベルでの全体の有意な差を示す(p=0.0196)。
結論
両方の治療投与量は、実験の関節炎の経過を変化させる。低投与量の治療による経過の遅延として表れた顕著な減少は、実験の範囲内で有意であった。高投与量治療後に観測される疾患の経過の変化は、有力な抗-関節炎の効果の示唆的である。群Cの疾患減少のレベルは、類似の実験の経過の間、確立された抗-関節炎薬が提供されると、範囲内で見られる。保護作用のこのレベルが、単一処置(single treatment)の後、観測されたという事実が、非常に有望である。低投与量での治療レベルの改良は、疾患進行につれて、所定のさらなる投与量によって達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】コントロール群（群B）の関節炎の経過を示すグラフである。
【図２】経時的な群Aと群Bとの疾患の経過の比較を示すグラフである。
【図３】２９日目の実験群A、B及びCのそれぞれにおける関節炎の重症度を示す。
【図４】経時的な群Bと群Cの疾患の経過の比較を示すグラフである。
【図５】52日目の実験群A、B及びCのそれぞれにおける関節炎の重症度を示し、高投与量治療が、ピークの関節炎スコアを有意に減少させたことを示す。
【図１】
2006522086.tif 000003
【図２】
2006522086.tif 000004
【図３】
2006522086.tif 000005
【図４】
2006522086.tif 000006
【図５】
2006522086.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月3日(2006.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫状態の治療に使用される医薬組成物であって、治療を必要とする個人において有利な効能を提供する投与量で、ムコポリサッカリダーゼと、１種以上の免疫原とを含み、それぞれの免疫原が、治療される自己免疫状態と関係し又は関連する自己抗原であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
治療される自己免疫状態が、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、若年性（１型）糖尿病、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑、悪性貧血、糸球体腎炎、肺繊維症、多発性硬化症又は糖尿病である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ムコポリサッカリダーゼが、グルクロニダーゼである請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記グルクロニダーゼが、β-グルクロニダーゼである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
β-グルクロニダーゼが、β-D-グルクロノシドグルクロノソハイドロラーゼ（登録番号EC3.2.1.31）である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ムコポリサッカリダーゼが、２００〜１０，０００フィッシュマン 単位/mlの濃度で存在する請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ムコポリサッカリダーゼが、１，０００〜５，０００単位/mlの濃度で存在する請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ムコポリサッカリダーゼが、０．５〜２．５mg/mlの濃度で存在する請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
安定剤及び/又は活性化剤をさらに含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記安定剤及び/又は活性化剤が、不活性タンパク質部分である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記安定剤及び/又は活性化剤が、硫酸プロタミン又は1,10-ジアミノデカンである請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記安定化剤及び/又は活性化剤が、20mg/lまでの濃度で存在する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記安定化剤及び/又は活性化剤が、3〜9mg/lの濃度で存在する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒドロキシル部分をさらに含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ヒドロキシル部分が、糖又はジオールによって提供される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヒドロキシル部分が、1,3-シクロヘキサンジオールによって提供される請求項１４又は１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ヒドロキシル部分が、20μg/lまでの濃度で存在する請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
酸又は中性pHに緩衝化されている請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
５〜６のpHに緩衝化されている請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
コラーゲンを含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記コラーゲンが、１０〜1×１０15分子/mlの濃度で存在する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記コラーゲンが、1×１０4〜1×１０14分子/mlの濃度で存在する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
グリコサミノグリカンをさらに含む請求項１〜２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロネート（D-グルクロン酸N-アセチルD-グルコサミン）、コンドロイチン硫酸（D-グルクロン酸N-アセチルD-ガラクトサミン4又は6スルフェート）、デルマタン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸N-アセチルD-ガラクトサミン）、ケラタン硫酸（D-ガラクトースN-アセチルD-グルコサミンスルフェート）、及びヘパラン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸N-アセチルD-グルコサミン）から成る群から選択される請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン-6-スルフェートである請求項２３又は２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記グリコサミノグリカンが、０．１〜１．０mg/mlの濃度である請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記グリコサミノグリカンが、０．５mg/mlの濃度である請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
経皮注入又は皮内注射に好適な配合である請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項の組成物を調製するためのキットであって、ムコポリサッカリダーゼ溶液及び免疫原溶液を含み、前記２種の溶液が、相互に導入され、治療を必要とする個人に投与する前に混合できるようになっていることを特徴とするキット。
【請求項３０】
自己免疫状態の治療又は予防のための薬剤の調製における治療上有効量のムコポリサッカリダーゼと、１種以上の免疫原の使用であって、それぞれの免疫原が、前記自己免疫状態と関係し又は関連する自己抗原であることを特徴とする使用。
【請求項３１】
自己免疫状態が、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、若年性（１型）糖尿病、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑、悪性貧血、糸球体腎炎、肺繊維症、多発性硬化症又は糖尿病である請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
関節リウマチの治療用薬剤の調製におけるβ-グルクロニダーゼ及びコラーゲンの使用。
【請求項３３】
関節リウマチの治療に使用される組成物であって、1000〜5000フィッシュマン 単位/mlのβ-グルクロニダーゼ、6μg/mlの硫酸プロタミン、1μg/mlの1,3-シクロヘキサンジオール、及び0.5mg/mlのコンドロイチン硫酸を含み、pH5.9に緩衝化され、2.5×1012、2.5×1010及び2.5×104分子/mlからなる群から選択されるコラーゲンの濃度であることを特徴とする組成物。
【請求項３４】
実施例１に関して及び実施例１に示されるようにここで実質的に記載されている組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
自己免疫は、自己抗体（人体に対する抗体）及びホスト抗原と反応するT-細胞の存在によって証明される。自己免疫状態は、全身性の、例えば、全身性狼蒼、エリテマトーデス、又は臓器特異的に、例えば甲状腺炎であり得る。自己免疫状態の別の例には、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、若年性（１型）糖尿病、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑、悪性貧血、糸球体腎炎、及び肺繊維症が挙げられる。
状態の基本的な原因に作用することによって自己免疫状態に対して効果を媒介する治療組成物を提供することが、本発明の目的である。しかし、本発明は、物理的状態の効果又は状態にさらに作用し得る。
従って、本発明は、自己免疫状態の治療に使用される医薬組成物であって、治療を必要とする個人に有利な効果を提供する投与量で、ムコポリサッカリダーゼ及び１種以上の免疫原とを含み、それぞれの免疫原が、治療される自己免疫状態と関係し又は関連する自己抗原であることを特徴とする組成物を提供する。
有利なことには、本発明の組成物は、自己免疫状態の根本原因に作用し又は作用する応答を媒介する。例えば、それは、T-細胞媒介反応を下方制御するように作用し得る。理論により拘束されることを望まないが、本発明者は、本発明の免疫原が、ランゲルハンス又は樹状細胞を経由して媒介される反応によって又は胸腺によって、間接的にT-細胞の活性を減少させ、この反応は、調節機能（例えば、IL-10産生）に対する抗原感受性リンパ球を変え又は免疫原の標的部位から離れて細胞活性を変えることを確信する。
ここで使用される「免疫原」という語は、免疫応答を誘起し得る物質を定義することを企図する。免疫原の特性、例えば分子量は、この語によって制限され得ることが、意図されない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
以下に続く詳細な説明において、本発明は、関節リウマチの治療に特に関連して記載される。しかし、本発明は、適切な免疫原の選択によって、他の疾患の治療に同等の有用性を見出す。例えば、多重硬化症は、免疫原としてミエリン基礎タンパク質の使用によって治療され得、甲状腺炎又は橋本病は、免疫原として甲状腺タンパク質を使用して治療され得、また糖尿病は、免疫原としてインスリン又はβ-細胞タンパク質を使用して処理され得る。さらに、免疫原の混合物又は組み合わせは、特に、状態が１種以上の免疫原と関係し、又はそれに関連する場合に使用され得る。
好ましくは、この組成物に使用される酵素であるムコポリサッカリダーゼは、グルクロニダーゼであり、最も好ましくは、β-グルクロニダーゼである。理想的には、β-グルクロニダーゼは、β-D-グルクロノシドグルクロノソヒドロラーゼである（登録番号EC 3.2.1.31）。この酵素が、防腐剤又はソルビトールを含まないという条件で、酵素源は、この組成物の活性に重要でないことが分かる。従って、酵素を精製し、よって本発明の組成物中に使用可能にすることが必要であり得る。精製のいかなる方法が、使用され得るが、ゲル濾過クロマトグラフィー又はクロスフロー濾過(tangential flow filtration)を使用するために便利であることが分かる。
酵素が少なくとも20,000フィッシュマン単位/mgの濃度まで精製されまた200〜10,000単位/ml及び理想的に1,000〜5,000単位/mlの濃度で組成物中に存在することが好ましい。
他のタンパク質による混入は、非常に低レベルでさえ、酵素活性に影響し得ることが分かっている。従って、安定剤及び/又は活性化剤は、この組成物中に存在することが好ましい。安定剤及び/又は活性化剤は、好ましくは、不活性タンパク質部分、例えば硫酸プロタミン又は1,10-ジアミノデカンである。好ましくは、安定剤及び/又は活性化剤は、20mg/lまでの濃度で存在する。ここで安定剤及び/又は活性化剤が、硫酸プロタミンであり、それは、好ましくは、1〜10mg/lの濃度で、さらに好ましくは3〜9mg/lの濃度で、理想的に約6mg/l(6μg/mlと等価)の濃度で存在する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
いかなる医薬的に許容される溶媒は、この組成物の液体形態を生成するために使用され得る。同様に、通常の結合剤、賦形剤、媒体、及び他の標準的な投与添加剤が、本発明の組成物に使用され得る。
本発明は、さらに自己免疫状態の治療又は予防に対する薬剤の調製における治療上有効量のムコポリサッカリダーゼ及び１種以上の免疫原の使用であって、それぞれの免疫原が、前記自己免疫状態と関係し又は関連する自己抗原であることを特徴とする使用を提供する。
さらなる側面において、本発明は、さらに関節リウマチの治療用の薬剤の調製におけるβ-グルクロニダーゼ及びコラーゲンの使用を提供する。
最後の態様において、本発明は、0.5-2.5mg/mlのβ-グルクロニダーゼ、6μg/mlの硫酸プロタミン、1μg/mlの1,3-シクロヘキサンジオール、及び0.5mg/mlのコンドロイチン硫酸を含み、pH5.9に緩衝され、さらに関節リウマチの治療の使用に対して2.5×1013、2.5×1011又は2.5×105分子/mlのコラーゲンを含む組成物を提供する。
本発明の態様は、例示の目的のみで、以下の添付される図面に関して記載されるだろう。
【国際調査報告】
2006522086.tif 000008
2006522086.tif 000009
2006522086.tif 000010
2006522086.tif 000011