(57)【要約】アカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）をコードするＤＮＡを単離し、クローニングし、配列決定した。ＣＥＡをコードする遺伝子は一般にヒト癌の発生に関連付けられる。本発明は異常ＣＥＡ発現が癌又はその発生に関連付けられるＣＥＡ腫瘍関連抗原により発現される蛋白質産物に対する免疫を誘発又は強化するための組成物と方法を提供する。本発明は特にｒｈＣＥＡをもつアデノウイルスベクター構築物を提供し、癌を予防及び治療するためのワクチン及び医薬組成物におけるその使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
核酸がＤＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
核酸がｍＲＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
核酸がｃＤＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
組換え宿主細胞におけるアカゲザル癌胎児性抗原（ＣＥＡ）蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；
（ｂ）前記アカゲザルＣＥ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項９】
組換え宿主細胞におけるアカゲザル癌胎児性抗原（ＣＥＡ）蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項５に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；
（ｂ）前記アカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項１０】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む単離精製アカゲザルＣＥＡポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１８に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１２】
核酸がＤＮＡである請求項１１に記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
核酸がｍＲＮＡである請求項１１に記載の単離核酸分。
【請求項１４】
核酸がｃＤＮＡである請求項１１に記載の単離核酸分。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
組換え宿主細胞におけるアカゲザル癌胎児性抗原（ＣＥＡ）蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；
（ｂ）前記アカゲザルＣＥ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項１９】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む単離精製アカゲザルＣＥＡポリペプチド。
【請求項２０】
単離核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む癌の予防又は治療方法であって、単離核酸分子が配列番号２又は配列番号１８に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む前記方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ベクターがアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ベクターがアデノウイルスＥ１領域に欠失とアデノウイルスＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、挿入が
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ベクターがプラスミド部分と、
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含むプラスミドワクチンベクターである請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
Ｅ１領域に欠失とＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターであって、挿入が
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む前記アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項２６】
Ａｄ５ベクターである請求項２５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
Ａｄ６ベクターである請求項２５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
プラスミド部分と発現カセット部分を含むワクチンプラスミドであって、発現カセット部分が
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む前記ワクチンプラスミド。
【請求項２９】
哺乳動物を癌から保護する方法であって、
（ａ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；
（ｂ）所定時間経過させる段階と；
（ｃ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む前記方法。
【請求項３０】
第１のベクターがプラスミドであり、第２のベクターがアデノウイルスベクターである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、第２のベクターがプラスミドである請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
結腸直腸癌の哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；
（ｂ）所定時間経過させる段階と；
（ｃ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む前記方法。
【請求項３３】
第１のベクターがプラスミドであり、第２のベクターがアデノウイルスベクターである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、第２のベクターがプラスミドである請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般には癌の治療に関する。より詳細には、本発明は腫瘍関連ポリペプチド癌胎児性抗原のアカゲザルホモログ（本明細書ではｒｈＣＥＡと言う）、この蛋白質をコードする単離核酸分子、並びにこの蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター及び宿主に関する。本発明はｒｈＣＥＡをもつアデノウイルスベクター構築物と、癌の予防及び治療用ワクチン及び医薬組成物におけるその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は細胞間接着等の種々の機能をもつ蛋白質をコードする多数の遺伝子から構成される。ＩｇＳＦ蛋白質は適正な分子間結合相互作用を維持するために重要な少なくとも１個のＩｇ関連ドメインを含む。このような相互作用はＩｇＳＦメンバーの各種生体機能に必要であるため、多くのＩｇＳＦ接着分子の破壊又は異常発現が多くのヒト疾患に関連付けられている。
【０００３】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は細胞表面糖蛋白質から構成されるＩｇスーパーファミリーのサブファミリーに属する。ＣＥＡサブファミリーのメンバーはＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）として知られている。最近の科学文献では、ＣＥＡ遺伝子はＣＥＡＣＡＭ５と改名されているが、蛋白質の呼称はＣＥＡのままである。機能的には、ＣＥＡＣＡＭはホモタイプとヘテロタイプの両者の細胞間接着分子として作用することが示されている（Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌら，Ｃｅｌｌ  ５７：３２７−３３４（１９８９））。細胞接着に加え、ＣＥＡは細胞外マトリックスからの細胞の分離に起因する細胞死を抑制し、Ｂｃｌ２やＣ−Ｍｙｃ等の所定のプロト癌遺伝子に関連する細胞形質転換に関与しているらしい（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０（８）：２１９７−２２０７（２００２）参照）。
【０００４】
胎児発生中と成人結腸粘膜ではＣＥＡの正常発現が検出されている。ＣＥＡ過剰発現は３０年以上前にヒト結腸腫瘍で最初に検出され（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９−４６２（１９６５））、その後、ほぼ全結腸直腸腫瘍で検出されている。更に、ＣＥＡ過剰発現は高い百分率の膵臓腺癌、乳腺癌及び肺腺癌で検出可能である。これらの腫瘍種でＣＥＡ発現率が高いため、ＣＥＡはこれらの癌の管理と予後診断で広く臨床使用されている。
【０００５】
ＣＥＡ発現と転移増殖の相関により、ＣＥＡは結腸直腸癌治療の分子及び免疫介入のターゲットとしても認められている。ＣＥＡをターゲットとする治療アプローチの１つは抗ＣＥＡ抗体の使用であり（Ｃｈｅｓｔｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ８−Ｓ１２（２０００）参照）、別のアプローチはＣＥＡワクチンを使用してＣＥＡを発現する腫瘍を攻撃するように免疫系を活性化する方法である（詳細についてはＢｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，前出参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトＣＥＡをコードする配列はクローニング及び特性決定されている（米国特許第５，２７４，０８７号；米国特許第５，５７１，７１０号；及び米国特許第５，８４３，７６１号。更にＢｅａｕｃｈｅｍｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１−３２３０（１９８７）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：９２０−９２４（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（９）：２９６５−６９（１９８７）参照）。これらのＣＥＡ遺伝子が単離同定されているにも拘わらず、有効で自己寛容に妨害されない癌ワクチンの開発を実現できるようにＣＥＡをコードする他の哺乳動物遺伝子を同定することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は配列番号２又は配列番号１８に記載の新規アカゲザル癌胎児性抗原（以下、ｒｈＣＥＡと言う）をコードするヌクレオチド配列を含む単離又は精製核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本明細書に開示するＤＮＡ分子は選択宿主細胞にトランスフェクトすることができ、組換え宿主細胞は発現される機能的ｒｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２及び配列番号１８）の実質的レベルのソースを提供する。
【０００８】
本発明は更に新規アカゲザルＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする単離核酸分子に関し、このＤＮＡ分子は本明細書に配列番号１として開示するヌクレオチド配列を含む。アカゲザルＣＥＡをコードするヌクレオチド配列を本明細書ではｒｈＣＥＡＣＡＭ５と言う。本発明のこの部分の１好適側面を図１Ａに開示し、同図は新規ｒｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２）をコードするＤＮＡ分子（配列番号１）を示す。
【０００９】
本発明の別の側面は新規アカゲザルＣＥＡ蛋白質（配列番号１８）をコードする単離核酸分子であり、前記核酸分子は図１Ｂに示す配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明は更に本明細書全体に開示する核酸分子を含む原核及び真核両者の組換えベクター及び組換え宿主細胞に関する。
【００１１】
本発明は更に組換え宿主細胞におけるアカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現方法に関し、（ａ）配列番号１又は配列番号５に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；（ｂ）前記アカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む。
【００１２】
本発明の１好適側面は図２Ａ（配列番号２）に開示するアミノ酸配列から構成されるアカゲザルＣＥＡ蛋白質の実質精製形である。
【００１３】
本発明の別の好適側面は図２Ｂ（配列番号１８）に開示するアミノ酸配列から構成されるアカゲザルＣＥＡ蛋白質の実質精製形である。
【００１４】
本発明の別の好適側面はｒｈＣＥＡ蛋白質を発現する配列番号１又は配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞から得られ、実質精製され、完全にプロセシング（タンパク分解プロセシング、グリコシル化及び／又はリン酸化を含む）された成熟ｒｈＣＥＡ蛋白質に関する。組換え宿主細胞は哺乳動物細胞株等の真核宿主細胞が特に好ましい。
【００１５】
本発明の更に別の側面は単離核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む癌の予防又は治療方法であり、単離核酸分子は配列番号２又は配列番号１８に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明は更に、Ｅ１領域に欠失とＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、挿入は（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。
【００１７】
本発明は更に、プラスミド部分と発現カセット部分を含むワクチンプラスミドに関し、発現カセット部分は（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターをを含む。
【００１８】
本発明の別の側面は哺乳動物を癌から保護する方法又は癌の哺乳動物の治療方法であり、（ａ）ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；（ｂ）所定時間経過させる段階と；（ｃ）ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む。
【００１９】
本明細書と特許請求の範囲を通して使用する単数形は文脈からそうでないことが明白である場合を除き、複数も含む。
【００２０】
本明細書と特許請求の範囲を通して以下の定義及び略語を適用する。
【００２１】
「プロモーター」なる用語はＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成し、転写活性を開始及び誘導する。複合体は「エンハンサー」と呼ばれる活性化配列又は「サイレンサー」と呼ばれる抑制配列により修飾することができる。
【００２２】
「カセット」なる用語は発現させようとする核酸配列を含む本発明の配列を意味する。カセットはカセットテープと同様の概念であり、各カセットはそれ自体の配列をもつ。従って、カセットを交換することにより、ベクターは別の配列を発現する。５’及び３’末端の制限部位により、カセットは容易に挿入、除去又は別のカセットで置換することができる。
【００２３】
「ベクター」なる用語はＤＮＡフラグメントを宿主生物又は宿主組織に導入することができる手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージ及びコスミド等の種々のベクターがある。
【００２４】
アデノウイルスベクターに関して使用する「第１世代」なる用語はこのアデノウイルスベクターが複製欠損型であることを意味する。第１世代アデノウイルスベクターは一般に欠失又は不活化Ｅ１遺伝子領域をもち、欠失又は不活化Ｅ３遺伝子領域をもつことが好ましい。
【００２５】
「ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡ」なる表記はイントロンＡをもつヒトＣＭＶ極初期（ＩＥ）プロモーターと、完全長アカゲザルＣＥＡ遺伝子と、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列と、最小ｐＵＣバックボーンを含む本明細書に開示するプラスミド構築物を意味する。
【００２６】
「ｐＭＲＫ−Ａｄ５−ｒｈＣＥＡ」及び「ＭＲＫ−ｒｈＣＥＡ」なる表記はＥ１及びＥ３領域を欠失するＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む本明細書に開示する構築物を意味する。このプラスミドにおいて、Ｅ１領域はイントロンＡをもたないヒトＣＭＶプロモーターの制御下でＥ１と同じ向きに配置したアカゲザルＣＥＡ遺伝子と、その後に配置されたウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルで置換されている。
【００２７】
「ｐＢＳ−ｒｈＣＥＡ」なる表記はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）プラスミドと完全長ｒｈＣＥＡ遺伝子を含む本明細書に開示する構築物を意味する。
【００２８】
「有効量」なる用語は免疫応答を生じるように十分なレベルのポリペプチドを生産するために十分なワクチン組成物を導入することを意味する。当業者に自明の通り、このレベルは可変である。
【００２９】
「他の核酸を実質的に含まない」とは他の核酸を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、更により好ましくは９９．９％除去していることを意味する。「他の核酸を実質的に含まない」、「実質精製」、「単離核酸」又は「精製核酸」なる用語は交換可能に使用され、他の細胞成分を除去したアカゲザルＣＥＡ蛋白質のコーディング領域を含むＤＮＡ分子も意味する。従って、他の核酸を実質的に含まないアカゲザルＣＥＡ  ＤＮＡ調製物はその合計核酸の百分率として非アカゲザルＣＥＡ核酸の含有率が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、更により好ましくは０．１％以下である。所与アカゲザルＣＥＡ  ＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含まないか否かは例えばアガロースゲル電気泳動と適当な染色法（例えば臭化エチジウム染色）の併用等の慣用核酸純度評価技術又は配列決定により判定することができる。
【００３０】
「他の蛋白質を実質的に含まない」又は「実質精製」とは他の蛋白質を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、更により好ましくは９９．９％除去していることを意味する。従って、他の蛋白質を実質的に含まないアカゲザルＣＥＡ蛋白質調製物その合計蛋白質の百分率として非アカゲザルＣＥＡ蛋白質の含有率が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、更により好ましくは０．１％以下である。所与アカゲザルＣＥＡ蛋白質調製物が他の蛋白質を実質的に含まないか否かは例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と適当な検出法（例えば銀染色又はイムノブロッティング）の併用等の慣用蛋白質純度評価技術により判定することができる。
【００３１】
「他の蛋白質を実質的に含まない」又は「実質精製」、又は「単離アカゲザルＣＥＡ蛋白質」又は「精製アカゲザルＣＥＡ蛋白質」なる用語は交換可能に使用され、天然ソースから単離されたアカゲザルＣＥＡ蛋白質も意味する。「単離」又は「精製」なる用語の使用はアカゲザルＣＥＡ蛋白質がその通常の細胞環境から取出されていることを示す。従って、単離アカゲザルＣＥＡ蛋白質は無細胞溶液中に存在していてもよいし、天然に存在するとは別の細胞環境に配置してもよい。単離なる用語は単離アカゲザルＣＥＡ蛋白質が唯一の存在する蛋白質であるという意味ではなく、単離ｒｈＣＥＡ蛋白質が天然でｒｈＣＥＡ蛋白質とインビボ関連する他の蛋白質及び非アミノ酸物質（例えば核酸、脂質、炭水化物）を実質的に含まないという意味である。従って、原核又は真核細胞で組換え発現され、このｒｈＣＥＡ蛋白質を天然で（即ち介入なしには）発現しないこの宿主細胞から実質精製されたアカゲザルＣＥＡ蛋白質は当然のことながら本明細書に記載する任意状況下で「単離アカゲザルＣＥＡ蛋白質」である。上述のように、単離又は精製ｒｈＣＥＡ蛋白質であるｒｈＣＥＡ蛋白質調製物は他の蛋白質を実質的に含まず、その合計蛋白質の百分率として非アカゲザルＣＥＡ蛋白質の含有率が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、更により好ましくは０．１％以下である。
【００３２】
「保存アミノ酸置換」とはあるアミノ酸残基を別の化学的に類似するアミノ酸残基で置換することを意味する。このような保存置換の例は疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン、又はメチオニン）の相互置換、同一電荷の極性残基の相互置換（例えばリジン→アルギニン；アスパラギン酸→グルタミン酸）である。
【００３３】
「ｒｈＣＥＡ」とはアカゲザル癌胎児性抗原を意味する。
【００３４】
「哺乳動物」なる用語はヒトを含む任意哺乳動物を意味する。
【００３５】
「Ａｇ」なる略語は抗原を意味する。
【００３６】
「Ａｂ」及び「ｍＡｂ」なる略語は夫々抗体とモノクローナル抗体を意味する。
【００３７】
「ＯＲＦ」なる略語は遺伝子のオープンリーディングフレームを意味する。
【００３８】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードする遺伝子は一般に腺癌発生に関連付けられる。本発明は異常ＣＥＡ発現が癌又はその発生に関連付けられるＣＥＡ腫瘍関連抗原により発現される蛋白質産物に対する免疫を誘発又は強化するための組成物と方法に関する。異常ＣＥＡ発現が腫瘍発症時に存在していても腫瘍進行後期に検出できない場合や、その逆の場合もあるので、異常ＣＥＡ発現と癌の関連には、ＣＥＡ蛋白質がその発生の全時点で腫瘍組織に発現される必要はない。
【００３９】
この目的のために、アカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明の分子は細胞性免疫により腺癌に対して有効な免疫予防を提供するために組換えアデノウイルス又はプラスミドワクチンで使用することができる。脊椎動物に直接インビボ導入する場合には、本発明のポリヌクレオチドはコードされる蛋白質の発現を霊長類、イヌ及びヒト等の哺乳動物を含む動物の体内に誘導する。
【００４０】
本発明は配列番号２又は配列番号１８に記載の新規ｒｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は他の核酸を実質的に含まない。
【００４１】
本発明の単離核酸分子としてはデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）が挙げられ、例えば１本鎖（コーディング鎖又は非コーディング鎖）でも２本鎖でもよいゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）や、合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡが挙げられる。本発明の単離核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）でもよい。ほとんどのクローニング目的には、ＤＮＡが好適核酸である。
【００４２】
本発明の１好適ＤＮＡ分子は図２Ａに示すアカゲザルＣＥＡ蛋白質（配列番号２）をコードする本明細書に配列番号１（図１Ａ）として開示するヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
本発明の別の好適ＤＮＡ分子は図２Ｂに配列番号１８として示すアカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードする本明細書に配列番号５（図１Ｂ）として開示するヌクレオチド配列（以下、「第２のｒｈＣＥＡ」ＤＮＡ配列と言う）を含む。これらのｒｈＣＥＡ核酸分子は実施例２に詳述するようにＲＴ−ＰＣＲにより同定した。第２のｒｈＣＥＡ  ＤＮＡ配列（配列番号５）は第１の配列と２ヌクレオチドが相違し、別のアカゲザルに由来する結腸組織からクローニングした。このＤＮＡ配列は第１のアカゲザルＣＥＡ蛋白質と２アミノ酸相違するアカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードする。
【００４４】
単離ｃＤＮＡクローン、関連ベクター、宿主、組換えサブ細胞フラクション及び膜、並びに発現及び成熟形ｒｈＣＥＡは癌ワクチンの開発に有用である。
【００４５】
本発明は新規ｒｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１又は５の生体活性フラグメント又は突然変異体も含む。このような任意生体活性フラグメント及び／又は突然変異体はｒｈＣＥＡ蛋白質の医薬的性質と少なくとも実質的に類似する蛋白質又は蛋白質フラグメントをコードし、限定されないが、配列番号２又は配列番号１８に記載のＣＥＡ蛋白質か挙げられる。このようなポリヌクレオチドとしては必ずしも限定されないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシ末端短縮が挙げられる。本発明の突然変異体は癌ワクチン開発に有用となるように真核細胞で機能的ｒｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４６】
本発明はｒｈＣＥＡ蛋白質をコードする合成ＤＮＡにも関し、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１及び配列番号５のヌクレオチド配列と有意に相違するが、配列番号２又は配列番号１８に記載のｒｈＣＥＡ蛋白質をコードする。このような合成ＤＮＡも本発明の範囲に含むものとする。
【００４７】
従って、本発明は同一蛋白質を発現する多数のＤＮＡ分子を生じる可能性があるコドン冗長を開示する。本明細書の趣旨では、１個以上の置換コドンをもつ配列を縮重変異として定義する。発現される蛋白質の最終物性を実質的に変化させないＤＮＡ配列又は翻訳蛋白質の変異も本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンをバリン、リジンをアルギニン、又はグルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能は変化し得ない。
【００４８】
天然ペプチドの性質と異なる性質をもつペプチドをコードするようにペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変できることが知られている。ＤＮＡ配列の改変方法としては限定されないが、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。改変される性質の例としては限定されないが、基質に対する酵素の親和性又はリガンドに対する受容体の親和性の改変が挙げられる。
【００４９】
ストリンジェント条件下で配列番号１又は配列番号５とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明に含まれる。例えば、限定されないが、高ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下の通りである：６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、及び変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌから構成される緩衝液中でＤＮＡを含むフィルターのプレハイプリタイゼーションを６５℃で２時間〜一晩実施する。変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌと３２Ｐ標識プローブ５〜２０Ｘ１０６ｃｐｍを含有するプレハイプリタイゼーション混合物中でフィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液で３７℃にて１時間フィルターの洗浄を行う。次に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃にて４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーにかける。高ストリンジェンシー条件を使用する他の方法としては、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション段階を４２℃で１２〜４８時間実施する方法や、０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄段階を６５℃で３０〜６０分間実施する方法が挙げられる。
【００５０】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを実施するための上記方法で記載した試薬は当分野で周知である。これらの試薬の組成の詳細は例えば参考資料として本明細書に組込むＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されている。上記以外に、使用可能な他の高ストリンジェンシー条件も当分野で周知である。
【００５１】
本発明の１好適側面は図２Ａに開示するアミノ酸配列（配列番号２）を含むアカゲザルＣＥＡ蛋白質の実質精製形である。
【００５２】
本発明の別の好適側面は図２Ｂに開示するアミノ酸配列（配列番号１８）を含むアカゲザルＣＥＡ蛋白質の実質精製形である。
【００５３】
本発明はｒｈＣＥＡの種々の機能的ドメインとこれらの配列の少なくとも１個を含むハイブリッド分子にも関する。ＣＥＡ蛋白質はプロセシングされたリーダー配列をもつアミノ末端ドメインと疎水性カルボキシ末端ドメインを含む。ＣＥＡは更に３個のＩｇ様内部ドメインを含む。ＣＥＡの細胞間接着機能にはＮ末端ドメインのサブドメインが必要であることがＴａｈｅｒｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（３５）：２６９３５−２６９４３（２０００））により示されている。
【００５４】
本発明は更に配列番号２又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むｒｈＣＥＡ蛋白質の生体活性フラグメント及び／又は突然変異体を含み、必ずしも限定されないが、これらの突然変異が診断、治療又は予防用蛋白質又は蛋白質フラグメントを提供し、癌ワクチン開発に有用となるようなアミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシ末端短縮が挙げられる。
【００５５】
本発明のアカゲザルＣＥＡ蛋白質は「成熟」蛋白質の形態でもよいし、融合蛋白質等の大型蛋白質の一部でもよい。分泌又はリーダー配列、プロ配列、精製を助長する配列（例えば多重ヒスチジン残基）、又は組換え生産中の安定性のための付加配列を含む付加アミノ酸配列を加えると有利なことが多い。
【００５６】
本発明は更にｒｈＣＥＡ融合構築物に関し、限定されないが、種々のマーカー（限定されないが、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープ、ＧＳＴ、及びＦｃ）に連結したアカゲザルＣＥＡ蛋白質を発現する融合構築物が挙げられる。このような任意融合構築物を該当細胞株で発現させ、本明細書に開示するアカゲザルＣＥＡ蛋白質のモジュレーターをスクリーニングするために使用することができる。アカゲザルＣＥＡに対する免疫応答を強化するように構築された融合構築物も含まれ、限定されないが、ＤＯＭやｈｓｐ７０が挙げられる。
【００５７】
本発明は更に本明細書を通して開示される実質精製核酸分子を含む組換えベクターにも関する。これらのベクターはＤＮＡ又はＲＮＡから構成することができる。ほとんどのクローニング目的には、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的ベクターとしてはプラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、及びｒｈＣＥＡ蛋白質をコードすることができる他の形態のエピソーム又は組込みＤＮＡが挙げられる。特定遺伝子導入又は他の用途に適したベクターを決定することは当業者が容易に実施可能である。
【００５８】
組換え宿主でｒｈＣＥＡを発現させるためにはｒｈＣＥＡ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用することができる。発現ベクターとしては限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特殊設計プラスミド又はウイルスが挙げられる。更に、所望により細菌細胞で組換えｒｈＣＥＡを発現させるためには種々の細菌発現ベクターを使用することができる。更に、真菌細胞で組換えｒｈＣＥＡを発現させるためには種々の真菌発現ベクターを使用することができる。更に、昆虫細胞で組換え蛋白質を発現させるためには種々の昆虫細胞発現ベクターを使用することができる。
【００５９】
本発明は更に、本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞に関する。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、限定されないが、大腸菌等の細菌、酵母等の真菌細胞、限定されないが、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類に由来する細胞株等の哺乳動物細胞、並びに限定されないが、ショウジョウバエやカイコに由来する細胞株等の昆虫細胞が挙げられる。このような組換え宿主細胞はｒｈＣＥＡ又は生物学的に等価の形態を生産するのに適した条件下で培養することができる。
【００６０】
上述のように、組換え宿主細胞でｒｈＣＥＡを発現させるためにはｒｈＣＥＡ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用することができる。従って、本発明の別の側面は組換え宿主細胞におけるアカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現方法であり、（ａ）配列番号１又は配列番号５に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；（ｂ）前記アカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む。
【００６１】
宿主細胞でｒｈＣＥＡの発現後、ｒｈＣＥＡ蛋白質を回収し、活性形態のｒｈＣＥＡ蛋白質が得られる。数種のｒｈＣＥＡ蛋白質精製方法が利用可能であり、使用に適している。塩析分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの各種組み合わせ又は個別適用により細胞溶解液及び抽出液から組換えｒｈＣＥＡ蛋白質を精製することができる。更に、全長ｒｈＣＥＡ蛋白質又はｒｈＣＥＡ蛋白質のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体から作製したイムノアフィニティーカラムの使用により他の細胞蛋白質から組換えｒｈＣＥＡ蛋白質を分離することもできる。
【００６２】
本発明の核酸を融合し、ヒト細胞で蛋白質の効率的発現を可能にするように設計された配列を含む発現カセットとすることができる。カセットはプロモーターや終結配列等の関連転写及び翻訳調節配列を全長ｒｈＣＥＡ遺伝子に機能的に連結することが好ましい。１好適態様では、プロモーターはイントロンＡ配列をもたないサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）であるが、当業者に自明の通り、強力なイムノグロブリン又は他の真核遺伝子プロモーター等の多数の他の公知プロモーターも使用できる。１好適転写ターミネーターはウシ成長ホルモンターミネーターであるが、他の公知転写ターミネーターも使用できる。ＣＭＶ−ＢＧＨターミネーターの組み合わせが特に好ましい。
【００６３】
本発明によると、アカゲザルＣＥＡ発現カセットをベクターに挿入する。ベクターはアデノウイルスベクターが好ましいが、プロモーターに連結した直鎖ＤＮＡや、アデノ随伴ウイルス又は改変ワクチンウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスベクター等の他のベクターも使用できる。
【００６４】
選択するベクターがアデノウイルスである場合には、ベクターは所謂第１世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは非機能的Ｅ１遺伝子領域、好ましくは欠失アデノウイルスＥ１遺伝子領域をもつことを特徴とする。所定態様では、アデノウイルスＥ１遺伝子が正常に配置されている位置に発現カセットを挿入する。更に、これらのベクターは場合により非機能的又は欠失Ｅ３領域をもつ。使用するアデノウイルスゲノムはＥ１及びＥ３領域の両者を欠失していることが好ましい（ΔＥ１ΔＥ３）。アデノウイルスはウイルスＥ１遺伝子を発現する公知細胞株（例えば２９３細胞、又はＥＲＣ．６細胞）又は別の蛋白質を発現するように一過的又もしくは安定的に軽質転換された２９３もしくＰＥＲＣ．６細胞に由来する細胞株で複製することができる。例えば、テトラサイクリン調節型プロモーターシステムのように制御下の遺伝子発現を可能にする構築物を使用する場合には、細胞株は調節システムに関与する成分を発現することができる。このような細胞株の１例はＴ−Ｒｅｘ−２９３であり、他の例も当分野で公知である。
【００６５】
アデノウイルスベクターを操作し易くするために、アデノウイルスをシャトルプラスミド形とすることができる。本発明はプラスミド部分とアデノウイルス部分を含むシャトルプラスミドにも関し、アデノウイルス部分はＥ１を欠失し、場合によりＥ３も欠失しており、アカゲザルＣＥＡを含む発現カセットを挿入したアデノウイルスゲノムを含む。好適態様では、アデノウイルスベクターを容易に除去できるようにプラスミドのアデノウイルス部分の両側に制限部位を配置する。シャトルプラスミドは原核細胞又は真核細胞で複製することができる。
【００６６】
本発明の１好適態様では、発現カセットをｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶＯアデノウイルスプラスミドに挿入する（参照により本明細書に組込むＥｍｉｎｉら，ＷＯ０２／２２０８０参照）。このプラスミドはＥ１領域とＥ３領域を欠失するＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶＯプラスミドの設計はウイルスパッケージングの最適化に重要であることが分かっているエレメントを組込むように５’シス作用性パッケージング領域を更にＥ１遺伝子まで延ばし、ウイルス増幅を強化することにより従来のアデノベクターを改善している。この強化型アデノウイルスベクターは高度の継代増殖後に遺伝的安定性を維持できるという利点がある。
【００６７】
ＤＮＡ構築物を作製及び精製するための標準分子生物学技術により、本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミド及びＤＮＡ免疫原を作製することができる。
【００６８】
上記ベクターは異常ＣＥＡ発現に関連する腺癌発生の予防及び／又は既存癌の治療のための免疫原組成物及びワクチンで使用することができる。この点で、本発明の１側面は単離核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む癌の予防又は治療方法であり、単離核酸分子は配列番号２又は配列番号１８に記載のアカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
上記方法によると、任意哺乳動物の癌を治療又は予防するためにワクチンベクターを投与することができる。本発明の１好適態様では、哺乳動物はヒトである。
【００７０】
更に、当業者は上記治療及び予防方法で使用するために任意の型のベクターを選択することができる。ベクターはアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターが好ましい。本発明の１好適態様では、ベクターはアデノウイルスＥ１領域に欠失とアデノウイルスＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、挿入は（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。
【００７１】
本発明は更にＥ１領域に欠失とＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、挿入は（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む。
【００７２】
本発明のこの側面の１好適態様において、アデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターである。
【００７３】
本発明の別の態様において、アデノウイルスベクターはＡｄ６ベクターである。
【００７４】
別の側面において、本発明はプラスミド部分と発現カセット部分を含むワクチンプラスミドに関し、発現カセット部分は（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む。
【００７５】
本発明の所定態様において、本明細書に開示する組換えアデノウイルスワクチンは強化免疫応答を誘導するためにプラスミド型ポリヌクレオチドワクチンと各種プライム／ブーストの組み合わせで使用される。この場合、２種のベクターを「プライム及びブースト」レジメンで投与する。例えば、第１の型のベクターを投与した後に所定時間、例えば１カ月、２カ月、６カ月、又は他の適当な間隔後に第２の型のベクターを投与する。ベクターは同一ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド組み合わせをコードする発現カセットをもつことが好ましい。プラスミドＤＮＡも使用する態様では、ベクターは哺乳動物又は昆虫細胞により認識される１種以上のプロモーターを含むことが好ましい。１好適態様では、プラスミドは限定されないが、ＣＭＶプロモーター等の強力プロモーターを含む。発現させるアカゲザルＣＥＡ遺伝子又は他の遺伝子をこのようなプロモーターと連結する。このようなプラスミドの１例は文献に記載されているような哺乳動物発現プラスミドＶ１Ｊｎｓである（参照により本明細書に組込むＪ．Ｓｈｉｖｅｒら，ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌｉｕら編，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８−２０８（１９９６））。
【００７６】
上述のように、アデノウイルスベクターワクチン及びプラスミドは免疫応答を誘導するために単独治療レジメンの一部として脊椎動物に投与することができる。この点で、本発明は哺乳動物を癌から保護する方法に関し、（ａ）ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；（ｂ）所定時間経過させる段階と；（ｃ）ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む。
【００７７】
上記保護方法の１態様において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。代替態様において、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００７８】
本発明は更に腺癌の哺乳動物の治療方法に関し、（ａ）ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；（ｂ）所定時間経過させる段階と；（ｃ）ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む。
【００７９】
上記治療方法の１態様において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。代替態様において、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００８０】
ワクチンレシピエントに導入される発現可能なＤＮＡ又は転写ＲＮＡの量は使用されるプロモーターの強度と発現される遺伝子産物の免疫原性に部分的に依存する。一般に、プラスミドワクチンベクター約１ｎｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇの免疫又は予防有効用量をマウス組織に直接投与する。組換えアデノウイルスの有効用量は粒子約１０６〜１０１２個、好ましくは約１０７〜１０１１個である。皮下注射、皮内導入、経皮圧入、及び他の投与方法（例えば腹腔内、静脈内、又は吸入送達）も考えられる。ブースターワクチン接種を行うことも考えられる。本発明のワクチンの非経口導入と同時又はその後にインターロイキン１２蛋白質等のアジュバントを静脈内、筋肉内、皮下又は他の投与手段等で非経口投与しても有利である。
【００８１】
本発明のワクチンベクターは裸のままでもよく、即ち蛋白質、アジュバント又はレシピエントの免疫系に影響を与える他の物質を伴っていなくてもよい。この場合に、ワクチンベクターを生理的に許容可能な溶液とすることが望ましく、限定されないが、滅菌食塩水又は滅菌緩衝食塩水が挙げられる。あるいは、アジュバント、サイトカイン、蛋白質、又は他のキャリヤー等の免疫刺激剤を本発明のワクチン又は免疫原組成物と共に投与すると有利である。従って、本発明は本発明の組成物及び方法とこのような免疫刺激剤の併用を含む。本明細書で使用する免疫刺激剤とは外来抗原に対する（抗体及び／又は細胞性）免疫応答を強化又は増強するほぼ任意物質を意味する。前記免疫刺激剤はＤＮＡ又は蛋白質の形態で投与することができる。種々の免疫刺激剤の任意のものを本発明のワクチン及び免疫原組成物と併用することができ、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、破傷風トキソイド、ＩＬ１２、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１が挙げられる。前記免疫刺激剤は当分野で周知である。ＤＮＡの細胞取込みを助長する物質も使用することができ、限定されないが、カルシウムイオンが挙げられる。これらの物質を一般にトランスフェクション助長剤及び医薬的に許容可能なキャリヤーと言う。当業者は特定の免疫刺激剤又は医薬的に許容可能なキャリヤーと許容可能な投与時間及び投与方法を決定することができよう。
【００８２】
ｒｈＣＥＡをクローニングするためには種々の方法の任意のものを使用することができる。これらの方法としては限定されないが、以下の方法が挙げられる。（１）ＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２（１９８８））。５’及び／又は３’ＲＡＣＥを実施して全長ｃＤＮＡ配列を作製することができる。このストラテジーはｒｈＣＥＡｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。これらの遺伝子特異的プライマーは多数の公共入手可能な核酸及び蛋白質データベースを検索することにより同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定により設計される；（２）適当な発現ベクターシステムでｒｈＣＥＡを含むｃＤＮＡライブラリーの構築後にｒｈＣＥＡｃＤＮＡの直接機能的発現；（３）バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したｒｈＣＥＡを含むｃＤＮＡライブラリーをｒｈＣＥＡ蛋白質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニング；（４）バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したｒｈＣＥＡを含むｃＤＮＡライブラリーを、ｒｈＣＥＡ蛋白質をコードする部分ｃＤＮＡ蛋白質でスクリーニング。この部分ｃＤＮＡはｒｈＣＥＡ蛋白質に関連する他の膜蛋白質について分かっているアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することによりｒｈＣＥＡ  ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる；（５）バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したｒｈＣＥＡを含むｃＤＮＡライブラリーを、哺乳動物ｒｈＣＥＡ蛋白質と相同性をもつ部分ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドでスクリーニング。このストラテジーでは上記のようにＥＳＴとして同定されたｒｈＣＥＡｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用してもよい；あるいは（６）配列番号１を鋳型として５’及び３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計し、公知ＲＡＣＥ法により全長ｃＤＮＡを作製できるようにするか、又はｒｈＣＥＡをコードするヌクレオチド配列の全長形を単離するためにコーディング領域の一部を作製及び単離して多種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーのうちの１個をスクリーニングするためのプローブとして使用するようにこれらの公知同一ＲＡＣＥ法によりコーディング領域の一部を作製できるようにする。
【００８３】
当業者に自明の通り、他の型のライブラリーや、他の細胞型又は種型から構築したライブラリーもｒｈＣＥＡをコードするＤＮＡ又はｒｈＣＥＡホモログを単離するのに有用である。他の型のライブラリーとしては限定されないが、他の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。ｒｈＣＥＡをコードするｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーを構築するのに使用される細胞又は細胞株の選択はまずこのような目的に利用可能な任意公知アッセイを使用して細胞関連ｒｈＣＥＡ活性を測定することにより実施することができる。
【００８４】
ｃＤＮＡライブラリーの構築は当業者に周知の標準技術により実施することができる。周知ｃＤＮＡライブラリー構築技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されている。相補的ＤＮＡライブラリーは多数の商業ソースからも入手でき、限定されないが、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）やＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が挙げられる。
【００８５】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、及び組換え蛋白質はｒｈＣＥＡのレベルをスクリーニング及び測定するために使用することができる。組換え蛋白質、ＤＮＡ分子、及びＲＮＡはｒｈＣＥＡの検出とタイピングに適したキットの構築に有用である。このようなキットは少なくとも１個の容器を緊密に拘束保持するのに適した区画化キャリヤーを含む。キャリヤーは更にｒｈＣＥＡを検出するのに適した組換えｒｈＣＥＡ又は抗ｒｈＣＥＡ抗体等の試薬を含む。キャリヤーは更に標識抗原又は酵素基質等の検出手段を加えることができる。
【００８６】
本明細書に引用する全刊行物は本発明に関連して使用可能な方法及び材料を記載及び開示する目的で参照により組込む。本明細書の如何なる記載も本発明が先発明により前記開示以前の日付を享受する資格がないと認めるものであると解釈すべきではない。
【００８７】
以上、添付図面を参照して本発明の好適態様を記載したが、当然のことながら本発明はこれらの厳密な態様に限定されず、当業者は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲又は精神から逸脱せずに種々の変更及び変形を行うことができる。
【００８８】
以下、実施例により本発明を例示するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００８９】
アカゲザルからのＲＮＡの単離
分子操作は当分野で周知の標準操作に従って実施した（例えば、参照により本明細書に組込むＡｕｓｕｂｅｌら．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９９２）及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。
【００９０】
アカゲザルＣＥＡｃＤＮＡの単離用ＲＮＡを得るために、２頭の別個のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  Ｍｕｌａｔｔａ）に由来する結腸試料を使用した。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＰＲＣ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，オランダ）から凍結組織を入手した。アカゲザル結腸試料から全ＲＮＡを抽出するために、組織を機械的に粉砕し、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ＲＮＡ試薬（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を製造業者の指示に従って添加した。精製ＲＮＡの完全性をホルムアルデヒド変性アガロースゲルにより確認した。試料を分画し、−８０℃で保存した。
【実施例２】
【００９１】
アカゲザルＣＥＡｃＤＮＡ増幅
ヒトＣＥＡファミリーの全公知メンバーの５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に由来するヌクレオチド配列を整列させ、ＣＥＡ  ＤＮＡの高度保存領域を同定した（図３参照）。同定したＣＥＡ遺伝子ファミリー相同性に基づき、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、アカゲザルＣＥＡｃＤＮＡを以下に記載するように逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅するようにＰＣＲ条件を最適化した。完全ｃＤＮＡを増幅するために使用したプライマーは５’−ＲｈＣＥＡ  ＥｃｏＲＩ  ５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＣＡＳＡＧＣＡＧＲＣＡＧＣＡＧＲＳＡＣＣ−３’（配列番号３）及びＣＥＡ−８  ＲｈＸｈｏＩ  ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号４）とした。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑキット（インビトロｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して増幅を実施した。ＲＮＡ１μｇ、両者プライマー２００ｐｍｏｌ、及び１０％  ＤＭＳＯ（終濃度）からなる反応容量１００μｌを使用した。
【００９２】
逆転写段階を実施するために、２頭のアカゲザルの各々から単離した全ＲＮＡ試料を４５℃で３０分間インキュベートした後、２分間９４℃でインキュベートした。９４℃１５秒、５２℃３０秒、及び６８℃２分２０秒を１サイクルとし、得られた鋳型のＰＣＲ増幅を４０サイクル実施した。
【００９３】
ＣＥＡＣＡＭ−５ホモログの予想寸法である約２１００ｂｐの増幅ＰＣＲ産物を両者ＲＮＡ試料から個々に獲得し、アガロースゲルから精製した。両者ＰＣＲ産物の部分配列分析の結果、ヒトＣＥＡＣＡＭ−５との高い相同性が判明した。
【００９４】
内部反復配列の高い相同性により、図５に示す制限部位を使用してＤＮＡフラグメントを精製することにより完全遺伝子配列が得られた。各サルから得られたアカゲザルＣＥＡヌクレオチド配列を本明細書の図１に開示し、配列番号１（以下、ｒｈＣＥＡＣＡＭ−５と言う）及び配列番号５（以下、ｒｈＣＥＡＣＡＭ−５＃２と言う）に示す。ＣＥＡヌクレオチド配列分析の結果、７０５アミノ酸ポリペプチドをコードする２１１８ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が判明した。２頭のアカゲザルから得られたｒｈＣＥＡヌクレオチド配列を比較すると、２種の異なる蛋白質（図２Ａ及び２Ｂ参照）をコードする２ヌクレオチド変異があることが判明した（図１Ａ及び１Ｂ参照）。
【００９５】
アカゲザルＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列（配列番号１）を更に公開ヒトＣＥＡＣＡＭ−５配列（配列番号６）に比較した処、ヌクレオチドレベルで８８％の相同度が判明した（図６参照）。同様にアカゲザル（配列番号２）とヒト（配列番号７）のＣＥＡポリペプチド配列を比較した処、アミノ酸レベルで７８．９％の一致度が判明した（図７参照）。興味深いことに、アカゲザルＣＥＡのカルボキシル末端にはヒトＣＥＡに比較して３アミノ酸挿入が存在しており、恐らくグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）変異のシグナルに関係があると予想される。
【実施例３】
【００９６】
λアカゲザルＣＥＡ特異的ライブラリーの作製とスクリーニング
ＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅ｒｈＣＥＡ産物（実施例２参照）をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、製造業者の指示に従ってＺＡＰ−ＣＭＶ  ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にライゲートした。ライゲーション産物をＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔと共にインキュベートし、得られたファージをＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞に感染させた。このＣＥＡ特異的一次ライブラリーを次に増幅し、〜１×１０６ｐｆｕ／ｍｌの力価を得た。ナイロンフィルターに転写することによりプラーク〜５×１０３個のスクリーニングを実施した。ＣＥＡ分子の５’及び３’末端に対応する２種の異なるＤＮＡプローブとフィルターをハイブリダイズさせた。二重陽性プラークをＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞中で切り出し、誘導された繊維状ファージをＸＬ−ＯＬＲ細胞中で増幅した。次にファージミドを増殖させ、制限消化により分析した。配列分析とＧｅｎｂａｎｋ比較の結果、ヒトＣＥＡＣＡＭ−５と最高の相同度であることが判明した。
【実施例４】
【００９７】
プラスミド構築物とアデノウイルス作製
ｐＣＭＶ−ｓｃｒｉｐｔ  ＥＸファージミドベクターからＰｓｔＩ／ＸｈｏＩでＲｈＣＥＡを切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳベクターに挿入し、ｐＢＳ−ＲｈＣＥＡを得た。挿入部分を完全に配列決定した後、ＳｍａＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＶＩＪｎｓＡベクターにサブクローニングし、ｐＶＩＪ−ＲｈＣＥＡを得た。同一フラグメントをｐｏｌｙＭＲＫベクターにサブクローニングすることによりアデノウイルス作製用シャトルプラスミドｐＭＲＫ−ＲｈＣＥＡを得た。ＲｈＣＥＡ及びＥ１フランキングＡｄ５領域用発現カセットを含むｐＭＲＫ−ＲｈＣＥＡからのＰａｃＩ／ＳｔｕＩフラグメントをＢＪ５１８３大腸菌細胞でＣｌａＩにより直鎖化したｐＡｄ５又はｐＡｄ６に組換えた。得られたプラスミドをｐＡｄ５−ＲｈＣＥＡ及びｐＡｄ６−ＲｈＣＥＡとした。両者プラスミドをＰａｃＩで切断し、アデノウイルスＩＴＲを遊離させ、ＰｅｒＣ−６細胞にトランスフェクトした。連続継代によりウイルス増幅を実施した。標準ＣｓＣｌ精製プロトコールを使用してＡｄ５−ＲｈＣＥＡ及びＡｄ６−ＲｈＣＥＡを精製し、Ａ１０５緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７５ｍＭ  ＮａＣｌ，５％スクロース，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で十分に透析した。
【実施例５】
【００９８】
インビトロ  ＲｈＣＥＡ発現及び検出
作製したベクターによるＲｈＣＥＡの発現をウェスタンブロットとＦＡＣＳ分析により確認した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してプラスミドをＨｅＬａ又はＰｅｒＣ．６細胞にトランスフェクトした。無血清培地で３０分間３７℃にてアデノウイルス感染を行った後に新鮮な培地を加えた。４８時間インキュベーション後にヒトＣＥＡに対するウサギポリクローナル血清（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，１５００倍希釈液）を使用して全細胞溶解液をウェスタンブロットにより分析した。選択した全アカゲザルＣＥＡクローンはＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合に１８０〜２００ＫＤａ蛋白質を発現した（図４参照）。
【００９９】
ＦＡＣＳ分析のために、細胞をトリプシンで剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ，１％ＦＣＳ）に再懸濁した。２５０倍に希釈したウサギポリクローナル抗ＣＥＡ抗体と共に３０分間インキュベーション後に細胞を洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＰＥと共に３０分間インキュベートし、最後にＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。
【実施例６】
【０１００】
ペプチド
免疫した動物でアカゲザルＣＥＡに対する細胞性免疫応答を分析するために、完全蛋白質に対応するように１１アミノ酸がオーバーラップする１５量体ペプチドを設計した。凍結乾燥アカゲザルＣＥＡペプチドをＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに４０ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。ペプチドをプールＡ（ＲｈＣＥＡ−１〜ＲｈＣＥＡ−３４，３４ペプチド）；プールＢ（ＲｈＣＥＡ−３５〜ＲｈＣＥＡ−７９，４５ペプチド）；プールＣ（ＲｈＣＥＡ−８０〜ＲｈＣＥＡ−１２４，４８ペプチド）；及びプールＤ（ＲｈＣＥＡ−１２５〜ＲｈＣＥＡ−１７３，５３ペプチド）の４個のプールに分けた。終濃度はＡ＝１．１７６ｍｇ／ｍｌ；プールＢ＝０．８８８ｍｇ／ｍｌ；プールＣ＝０．８５１ｍｇ／ｍｌ；プールＤ＝０．７６９ｍｇ／ｍｌとした。ペプチドとプールを−８０℃で保存した。
【実施例７】
【０１０１】
ｒｈＣＥＡ免疫によるマウスにおけるＣＥＡ特異的細胞性免疫応答の発生
ＣＥＡ．Ｔｇマウスはヒトに類似する組織分布でヒトＣＥＡを自己抗原として発現するトランスジェニックマウスである。科学文献に広く実証されているように、これらのマウスは検出可能なＣＥＡ特異的血清抗体が存在せず、ＣＥＡに対するインビトロ脾臓Ｔ−ｃｅｌｌ応答を発生することができないことからＣＥＡ非応答性である。同種抗原をコードする異種遺伝子によるＤＮＡ免疫が同系メラノーマ細胞による腫瘍攻撃からマウスを保護することは多くの報告に示されている。異種ＤＮＡワクチン接種によりこのモデルで自己抗原に対する免疫応答を誘発できることを立証するために、ＣＥＡ．アカゲザルＣＥＡ（異種）をコードするベクターでＴｇマウスを免疫した。
【０１０２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ，イタリー）から購入した。ＣＥＡ．ｔｇマウス（Ｈ−２ｂ）はＨＬ  Ｋａｕｆｍａｎ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から入手し、標準条件下で飼育した。
【０１０３】
電気的遺伝子導入（ＥＧＴ）のために、マウス大腿四頭筋にｐＶＩＪ−ＲｈＣＥＡ５０μｇを外科的に接触させるか又は直接注入し、従来記載されているように電気刺激した（Ｒｉｚｚｕｔｏら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７−２２（１９９９））。アデノウイルス注入のために、Ａｄ５−ＲｈＣＥＡ  １×１０１０ｖｐをマウス大腿四頭筋に注入した。
【０１０４】
マウスの大腿四頭筋にｐＶＩＪ−ＲｈＣＥＡ５０μｇを注入し、注入直後に週１回ずつ４週間電気刺激した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用した。アカゲザルＣＥＡに対する抗体がこれらのマウスに由来する血清中でウェスタンブロットにより検出され、体液性免疫応答が立証された。ｈＣＥＡに対するマウスモノクローナルＡｂを陽性対照として使用し、免疫前血清とモック感染細胞抽出液を陰性対照として使用した（データは示さず）。重要な点として、ヒトＣＥＡ蛋白質に対する交差反応性抗体はアカゲザルＣＥＡ免疫群でしか測定することができず（図８）、平均力価は１：１１０であった。これらのデータによると、トランスジェニックマウスモデルでは異種ＤＮＡワクチン接種により寛容を解除することが可能である（抗ＣＥＡ自己抗体として測定）。
【実施例８】
【０１０５】
抗体検出及び力価測定
眼窩後方採血により抗体力価測定用血清を採取した。ウェスタンブロット検出のために、Ａｄ５−ｒｈＣＥＡを導入したＨｅＬａ細胞からの抽出液をＳＤＳ−ｐａｇｅゲルで泳動させ、ニトロセルロースフィルターに転写した。血清をプールし、４℃でのＯ／Ｎインキュベーション用に５０倍に希釈した。抗マウスＩｇＧ−ＡＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ，１：２５００）を検出用に使用した。力価測定のために、コーティング用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ  ９．４）で希釈したＣＥＡ（高純度ＣＥＡ；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ  ＭＡ）１００ｎｇ／ウェルでＥｌｉｓａプレート（Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐ）をコーティングし、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。次に５％ＢＳＡを添加したＰＢＳでプレートを１時間３７℃でブロックした。マウス血清をＰＢＳ５％ＢＳＡで希釈した（血清変換の評価には５０倍希釈；力価値の評価には１０倍〜３１，２５０倍希釈）。免疫前血清をバックグラウンドとして使用した。希釈した血清を４℃でＯ／Ｎインキュベートした。ＰＢＳ，１％  ＢＳＡ，０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄を行った。検出抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＰＢＳ，５％  ＢＳＡで２０００倍に希釈し、シェーカーで２〜３時間室温にてインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）１００μｌ／ウェルで展開した。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液２５μｌ／ウェルで反応を停止し、プレートを４５０ｎｍ／６２０ｎｍで読み取った。同一希釈倍率の自己免疫前血清の吸光度の少なくとも３倍の吸光度を生じる血清の限界希釈倍率として抗ＣＥＡ血清力価を計算した。
【実施例９】
【０１０６】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
９６ウェルＭＡＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に滅菌ＰＢＳ中２．５μｌ／ｍｌの精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１，クローンＲ４−６Ａ２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を１００μｌ／ウェルの割合でコーティングした。滅菌ＰＢＳで洗浄後、プレートをＲ１０培地２００μｌ／ウェルで３７℃にて少なくとも２時間ブロックした。
【０１０７】
脾細胞作製のために、屠殺したマウスから脾臓を滅菌摘出し、グリッドで細断した。０．１×ＰＢＳ１ｍｌを細胞ペレットに加え、１５秒以内ボルテックスすることにより赤血球の浸透圧溶解を行った。次に２×ＰＢＳ１ｍｌを加え、ＰＢＳ１×で容量を４ｍｌにした。１２００ｒｐｍで１０分間室温にて遠心後、細胞ペレットをＲ１０培地１ｍｌに再懸濁し、生存細胞をカウントした。脾細胞を５×１０５個及び２×１０５個／ウェルの割合でプレーティングし、Ｒ１０中各ペプチド１μｇ／ｍｌを加え、２０時間３７℃のＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）５μｇ／ｍｌを各マウスで陽性内部対照として使用した。ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄後、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ−５％ＦＢＳ−０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２５０倍に希釈したビオチン標識ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｒａｔ  ＩｇＧｌ，クローンＸＭＧ１．２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）５０μｌ／ウェルと共にプレートを４℃でＯ／Ｎインキュベートした。
【０１０８】
翌日、プレートを洗浄し、アッセイ緩衝液で２５００倍に希釈したストレプトアビジン−ＡＰコンジュゲート（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に２時間室温でインキュベートした。十分に洗浄後、スポット展開が顕微鏡で観察されるまでＮＢＴ／Ｂ−ＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μｌ／ウェルを加えることによりプレートを展開した。プレートを蒸留水で十分に洗浄することにより反応を停止した。プレートを完全に風乾し、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用してスポットをカウントした。
【０１０９】
細胞性免疫応答のために、ＣＥＡ．ＴｇマウスにｈＣＥＡ発現ベクター又はｒｈＣＥＡ発現ベクターをワクチン接種した。２群を分析し、第１群は最終ＤＮＡ注入から２１日後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析し、第２群はＡｄ５−ｈＣＥＡ又はＡｄ５−ＲｈＣＥＡ  １×１０１０ｖｐをブースター投与し、２週間後に分析した。その結果、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した場合に４回のＤＮＡ注入後にｈＣＥＡに対する有意細胞性免疫応答は観察されなかった（図示せず）。他方、Ａｄ５をブースター投与したマウスは顕著な応答増加を示し、ＣＥＡに対する免疫寛容の解除に一致した。この所見は、ＣＥＡ自己抗原に有用な１つのワクチン接種プロトコールがＥＧＴによるＤＮＡの反復投与後にアデノウイルスブーストを行う方法（混合法）であることを示唆している。重要な点として、野生型マウスとトランスジェニックマウスのいずれにおいてもアカゲザルＣＥＡの免疫はヒトＣＥＡペプチドとの交差反応を生じ、逆の場合にも交差反応を生じた（データは示さず）。特に、ヒトＣＥＡに対する免疫応答はｒｈＣＥＡを免疫原として使用したトランスジェニックマウスのほうが著しく良好であった（図９参照）。これらの結果によると、アカゲザル（異種）遺伝子を使用してトランスジェニックマウスでＣＥＡに対する良好な応答を得ることができる。アカゲザルＣＥＡペプチドに対する応答を図１０に示す。
【実施例１０】
【０１１０】
ｒｈＣＥＡによるアカゲザルの免疫
結腸直腸腺癌で発現されるヒト腫瘍抗原ＣＥＡのアカゲザルホモログによるアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の免疫効率を評価するために、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＰＲＣ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，オランダ）で免疫試験を実施した。この免疫試験はアカゲザルＣＥＡ抗原による免疫に対するＢ及びＴ細胞両者の応答を評価するように設計した。
【０１１１】
この試験（ＣＶ−１）では、アカゲザルＣＥＡＣＡＭ−５を発現するプラスミドＤＮＡベクター及びアデノウイルスベクターで１群のサル（雄２頭と雌２頭）を免疫した。プライミングのために、ｒｈＣＥＡを発現するＤＮＡを０、４、８、１２、及び１６週にＤＮＡ注入後に電気刺激により動物に筋肉内ワクチン接種した。ＤＮＡ注入はプラスミドＤＮＡ５ｍｇを含有する１ｍｌ溶液（２部位に分けて各部位０．５ｍｌずつ）を体重２〜５キロの動物に注入した。麻酔下に動物に注入した（ケタミン／キシラジン混合物）。
【０１１２】
電気刺激については、方形バイポーラパルス１００バルス２系列（各１秒）を１秒間隔で発生し、合計３秒間処理した。パルス長は２ｍｓｅｃ／位相とし、パルス周波数及び振幅は夫々１００Ｈｚ及び１００ｍＡ（定電流モード）とした。
【０１１３】
上記免疫プロトコールを使用してＣＥＡに対する免疫応答を測定するために、血液試料を４週間おきに採取した。細胞性応答はＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより測定し、体液性応答はＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。１６週で有意免疫応答が得られなかったので、ｒｈＣＥＡを発現するＡｄ５を使用して更に２回注入した（２４週及び２８週）。Ａｄ５注入後に夫々ペプチドプールＣ及びプールＢ＋Ｃに対応する２頭のサル（ＲＩ１３７及びＣＯ１２）でｒｈＣＥＡに対する測定可能な免疫応答が検出された。細胞性免疫応答は両者サルで３５週目に低下し始めた。
【０１１４】
ＤＮＡ注入後に体液性免疫応答を経時的に追跡した。３頭のサル（ＣＯ１２，ＲＩ３１１及びＲＩ００２）は１：１４３〜１：２０９９の良好な抗ＣＥＡ抗体力価を示し、最初の注入から１２〜１６週間後にピークに達した。
【０１１５】
これらのデータによると、ｒｈＣＥＡをコードする遺伝子ベクターは霊長類でこの腫瘍抗原に対する免疫寛容を解除することができた。免疫応答には細胞性（処理したサルの５０％）と体液性（処理したサルの７５％）のどちらの免疫も検出された。
【実施例１１】
【０１１６】
ヒト腫瘍関連抗原のアカゲザルホモログによるアカゲザルの免疫
いずれも結腸直腸腺癌で発現されるヒト腫瘍抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｅｐ−ＣＡＭ及びＣＥＡのアカゲザルホモログによるアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の免疫効率を評価するために、第２系列の免疫試験を実施した。プロトコールはこれらの腫瘍抗原の組み合わせに対するＢ及びＴ細胞両者の応答を評価するように設計した。
【０１１７】
この試験では、ヒト腫瘍抗原Ｅｐ−ＣＡＭ（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＥｐＣＡＭ）、ＣＥＡ（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡ）、及びＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＨＥＲ２）のアカゲザルホモログを発現する３種のプラスミドＤＮＡベクターの混合物で第２群のアカゲザル４頭（雄２頭と雌２頭）を免疫した。
【０１１８】
０、４、８、１２、及び１６週にプラスミドＤＮＡの筋肉内注射後に電気刺激により動物をプライミングした。ＤＮＡ注入は体重２〜５キロの動物にプラスミドＤＮＡ６ｍｇを含有する１ｍｌ溶液（２部位に分けて各部位０．５ｍｌずつ）を注入した。麻酔下に動物に注入した（ケタミン／キシラジン混合物）。
【０１１９】
電気刺激については、方形バイポーラパルス１００バルス２系列（各１秒）を１秒間隔で発生し、合計３秒間処理した。パルス長は２ｍｓｅｃ／位相とし、パルス周波数及び振幅は夫々１００Ｈｚ及び１００ｍＡ（定電流モード）とした。
【０１２０】
アカゲザルＣＥＡ（Ａｄ５−ｒｈＣＥＡ）、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ａｄ５−ｒｈＨＥＲ２）、及びアカゲザルＥｐＣＡＭ（Ａｄ５−ｒｈＥｐＣＡＭ）を発現する３種のＡｄ５の混合物の注入により同一群の動物をブーストした。合計量３×１０ｅｘｐ１１ウイルス粒子（ｖｐ）を２３週と２７週に注入した（３種のウイルスを各々１×１０ｅｘｐ１１  ｖｐ）。
【０１２１】
上記免疫プロトコールを使用して３種の腫瘍抗原に対する免疫応答を測定するために、血液試料を４週間おきに採取した。細胞性免疫応答はＩＦＮ−γ＋ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定し、体液性応答はＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１２２】
サルＲＩ４４９及びＲＩ５１９はＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した場合に検出可能なＨＥＲ２特異的細胞性応答を示した。同様の分析でｒｈＣＥＡ及びｒｈＥｐＣＡＭに対する有意応答は検出されなかった。
【０１２３】
第３の試験では、０、２及び４週にＡｄ５誘導体の筋肉内注射によりＡｄ５−ｒｈＨＥＲ２、Ａｄ５−ｒｈＣＥＡ及びＡｄ５−ｒｈＥｐＣＡＭの混合物でアカゲザル４頭を免疫した。３×１０ｅｘｐ１１  ｖｐ（３種のＡｄ５ウイルスを各々１０ｅｘｐ１１）を含有する１ｍｌ溶液（２部位に分けて各部位０．５ｍｌずつ）を体重２〜５キロの動物に麻酔下（ケタミン／キシラジン混合物）に投与した。
【０１２４】
細胞性応答はＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。Ｈｅｒ２／Ｎｅｕでは、４頭のサルのうちの３頭が検出可能な応答を示した。ｒｈＣＥＡとｒｈＥｐＣＡＭでは有意細胞性応答は測定されなかった。
【０１２５】
まとめると、上記免疫プロトコールはアカゲザルでｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕに対する特異的免疫応答を誘導するのに有効であった。３種の異なる腫瘍抗原をもつベクターによる同時免疫がｒｈＣＥＡのみを免疫原として使用した試験１に比較してｒｈＣＥＡに対する免疫応答を誘導するのに有効でない理由は不明である。理論に拘束する意図はないが、ｒｈＨＥＲ２／Ｎｅｕの発現と免疫ドミナントエピトープの存在がサブドミナントｒｈＣＥＡ特異的Ｔ細胞の生産と発現を制限したのではないかと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】配列番号１（図１Ａ）及び配列番号５（図１Ｂ）に記載のアカゲザルＣＥＡｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。実施例２参照。
【図１Ｂ】配列番号１（図１Ａ）及び配列番号５（図１Ｂ）に記載のアカゲザルＣＥＡｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。実施例２参照。
【図２Ａ】配列番号２（図２Ａ）に記載の第１のアカゲザルＣＥＡ蛋白質と配列番号１８（図２Ｂ）に記載の第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質の予想アミノ酸配列を示す。第１及び第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質間の２アミノ酸変異を図２Ｂに太字下線で示す。
【図２Ｂ】配列番号２（図２Ａ）に記載の第１のアカゲザルＣＥＡ蛋白質と配列番号１８（図２Ｂ）に記載の第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質の予想アミノ酸配列を示す。第１及び第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質間の２アミノ酸変異を図２Ｂに太字下線で示す。
【図３】ヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの５’非翻訳領域のアラインメントを示す。指定配列を比較及び使用して実施例２に記載するように縮重プライマーを設計した。他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの対応するヌクレオチドと同一のヌクレオチドを白抜き表示した。破線は配列のアラインメントを助長するためにスペースを加えたことを示す。ＧｅｎＢａｎｋに開示されているような各ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド数を括弧内に示す。
【図４】アカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現を示す。λ−ＣＥＡライブラリーのスクリーニングにより得られたファージミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、ヒトＣＥＡ蛋白質に対するウサギポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロットを実施した。１５個のクローンのうちの２個の発現を示す。
【図５】アカゲザルＣＥＡコーディング領域の模式図を示す。内部反復配列を示し、遺伝子断片化用制限部位と配列を報告する。
【図６Ａ】ヒト（配列番号６）及びアカゲザル（配列番号１）ＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のヌクレオチド変異を太字で示す。
【図６Ｂ】ヒト（配列番号６）及びアカゲザル（配列番号１）ＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のヌクレオチド変異を太字で示す。
【図６Ｃ】ヒト（配列番号６）及びアカゲザル（配列番号１）ＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のヌクレオチド変異を太字で示す。
【図７】ヒト（配列番号７）及びアカゲザル（配列番号２）ＣＥＡＣＡＭ−５オープンリーディングフレームのアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のアミノ酸変異を太字で示す。
【図８】ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＡに対する体液性応答を示す。アカゲザルＣＥＡを免疫した群とヒトＣＥＡを免疫した群の２つのマウス群の平均抗体力価を示す（実施例７）。
【図９】ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＡに対する細胞性免疫応答を示す。ｈＣＥＡを発現するベクター又はｒｈＣＥＡを発現するベクターをＣＥＡトランスジェニックマウスにワクチン接種した（実施例９）。
【図１０】アカゲザル又はヒトＣＥＡを免疫したＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるアカゲザルＣＥＡペプチドに対する細胞性免疫応答を示す。
【配列表】
2006518202.tif 000002
2006518202.tif 000003
2006518202.tif 000004
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2006518202.tif 000016
2006518202.tif 000017
【図１Ａ】
2006518202.tif 000018
【図１Ｂ】
2006518202.tif 000019
【図２Ａ】
2006518202.tif 000020
【図２Ｂ】
2006518202.tif 000021
【図３】
2006518202.tif 000022
【図４】
2006518202.tif 000023
【図５】
2006518202.tif 000024
【図６Ａ】
2006518202.tif 000025
【図６Ｂ】
2006518202.tif 000026
【図６Ｃ】
2006518202.tif 000027
【図７】
2006518202.tif 000028
【図８】
2006518202.tif 000029
【図９】
2006518202.tif 000030
【図１０】
2006518202.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月2日(2004.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
核酸がＤＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
核酸がｍＲＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
核酸がｃＤＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
組換え宿主細胞におけるアカゲザル癌胎児性抗原（ＣＥＡ）蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；
（ｂ）前記アカゲザルＣＥ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項９】
組換え宿主細胞におけるアカゲザル癌胎児性抗原（ＣＥＡ）蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項５に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；
（ｂ）前記アカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項１０】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む単離精製アカゲザルＣＥＡポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号８に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１２】
核酸がＤＮＡである請求項１１に記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
核酸がｍＲＮＡである請求項１１に記載の単離核酸分。
【請求項１４】
核酸がｃＤＮＡである請求項１１に記載の単離核酸分。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
組換え宿主細胞におけるアカゲザル癌胎児性抗原（ＣＥＡ）蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する段階と；
（ｂ）前記アカゲザルＣＥ蛋白質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項１９】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む単離精製アカゲザルＣＥＡポリペプチド。
【請求項２０】
単離核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む癌の予防又は治療方法であって、単離核酸分子が配列番号２又は配列番号８に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む前記方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ベクターがアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ベクターがアデノウイルスＥ１領域に欠失とアデノウイルスＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、挿入が
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ベクターがプラスミド部分と、
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含むプラスミドワクチンベクターである請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
Ｅ１領域に欠失とＥ１領域に挿入をもつアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターであって、挿入が
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む発現カセットを含む前記アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項２６】
Ａｄ５ベクターである請求項２５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
Ａｄ６ベクターである請求項２５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
プラスミド部分と発現カセット部分を含むワクチンプラスミドであって、発現カセット部分が
（ａ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｂ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む前記ワクチンプラスミド。
【請求項２９】
哺乳動物を癌から保護する方法であって、
（ａ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；
（ｂ）所定時間経過させる段階と；
（ｃ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む前記方法。
【請求項３０】
第１のベクターがプラスミドであり、第２のベクターがアデノウイルスベクターである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、第２のベクターがプラスミドである請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
結腸直腸癌の哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第１のベクターを哺乳動物に導入する段階と；
（ｂ）所定時間経過させる段階と；
（ｃ）（ｉ）アカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む第２のベクターを哺乳動物に導入する段階を含む前記方法。
【請求項３３】
第１のベクターがプラスミドであり、第２のベクターがアデノウイルスベクターである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、第２のベクターがプラスミドである請求項３２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は配列番号２又は配列番号８に記載の新規アカゲザル癌胎児性抗原（以下、ｒｈＣＥＡと言う）をコードするヌクレオチド配列を含む単離又は精製核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本明細書に開示するＤＮＡ分子は選択宿主細胞にトランスフェクトすることができ、組換え宿主細胞は発現される機能的ｒｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２及び配列番号８）の実質的レベルのソースを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の別の側面は新規アカゲザルＣＥＡ蛋白質（配列番号８）をコードする単離核酸分子であり、前記核酸分子は図１Ｂに示す配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の別の好適側面は図２Ｂ（配列番号８）に開示するアミノ酸配列から構成されるアカゲザルＣＥＡ蛋白質の実質的精製形である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の更に別の側面は単離核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む癌の予防又は治療方法であり、単離核酸分子は配列番号２又は配列番号８に記載のアカゲザル癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明は配列番号２又は配列番号８に記載の新規ｒｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は他の核酸を実質的に含まない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明の別の好適ＤＮＡ分子は図２Ｂに配列番号８として示すアカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードする本明細書に配列番号５（図１Ｂ）として開示するヌクレオチド配列（以下、「第２のｒｈＣＥＡ」ＤＮＡ配列と言う）を含む。これらのｒｈＣＥＡ核酸分子は実施例２に詳述するようにＲＴ−ＰＣＲにより同定した。第２のｒｈＣＥＡ  ＤＮＡ配列（配列番号５）は第１の配列と２ヌクレオチドが相違し、別のアカゲザルに由来する結腸組織からクローニングした。このＤＮＡ配列は第１のアカゲザルＣＥＡ蛋白質と２アミノ酸相違するアカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明は新規ｒｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１又は５の生体活性フラグメント又は突然変異体も含む。このような任意生体活性フラグメント及び／又は突然変異体はｒｈＣＥＡ蛋白質の医薬的性質と少なくとも実質的に類似する蛋白質又は蛋白質フラグメントをコードし、限定されないが、配列番号２又は配列番号８に記載のＣＥＡ蛋白質か挙げられる。このようなポリヌクレオチドとしては必ずしも限定されないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシ末端短縮が挙げられる。本発明の突然変異体は癌ワクチン開発に有用となるように真核細胞で機能的ｒｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明はｒｈＣＥＡ蛋白質をコードする合成ＤＮＡにも関し、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１及び配列番号５のヌクレオチド配列と有意に相違するが、配列番号２又は配列番号８に記載のｒｈＣＥＡ蛋白質をコードする。このような合成ＤＮＡも本発明の範囲に含むものとする。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明の別の好適側面は図２Ｂに開示するアミノ酸配列（配列番号８）を含むアカゲザルＣＥＡ蛋白質の実質精製形である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本発明は更に配列番号２又は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むｒｈＣＥＡ蛋白質の生体活性フラグメント及び／又は突然変異体を含み、必ずしも限定されないが、これらの突然変異が診断、治療又は予防用蛋白質又は蛋白質フラグメントを提供し、癌ワクチン開発に有用となるようなアミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端短縮及びカルボキシ末端短縮が挙げられる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
上記ベクターは異常ＣＥＡ発現に関連する腺癌発生の予防及び／又は既存癌の治療のための免疫原組成物及びワクチンで使用することができる。この点で、本発明の１側面は単離核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む癌の予防又は治療方法であり、単離核酸分子は配列番号２又は配列番号８に記載のアカゲザルＣＥＡ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
【図１Ａ】配列番号１（図１Ａ）及び配列番号５（図１Ｂ）に記載のアカゲザルＣＥＡｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。実施例２参照。
【図１Ｂ】配列番号１（図１Ａ）及び配列番号５（図１Ｂ）に記載のアカゲザルＣＥＡｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。実施例２参照。
【図２Ａ】配列番号２（図２Ａ）に記載の第１のアカゲザルＣＥＡ蛋白質と配列番号８（図２Ｂ）に記載の第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質の予想アミノ酸配列を示す。第１及び第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質間の２アミノ酸変異を図２Ｂに太字下線で示す。
【図２Ｂ】配列番号２（図２Ａ）に記載の第１のアカゲザルＣＥＡ蛋白質と配列番号８（図２Ｂ）に記載の第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質の予想アミノ酸配列を示す。第１及び第２のアカゲザルＣＥＡ蛋白質間の２アミノ酸変異を図２Ｂに太字下線で示す。
【図３】ヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの５’非翻訳領域のアラインメントを示す。指定配列を比較及び使用して実施例２に記載するように縮重プライマーを設計した。他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの対応するヌクレオチドと同一のヌクレオチドを白抜き表示した。破線は配列のアラインメントを助長するためにスペースを加えたことを示す。ＧｅｎＢａｎｋに開示されているような各ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド数を括弧内に示す。
【図４】アカゲザルＣＥＡ蛋白質の発現を示す。λ−ＣＥＡライブラリーのスクリーニングにより得られたファージミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、ヒトＣＥＡ蛋白質に対するウサギポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロットを実施した。１５個のクローンのうちの２個の発現を示す。
【図５】アカゲザルＣＥＡコーディング領域の模式図を示す。内部反復配列を示し、遺伝子断片化用制限部位と配列を報告する。
【図６Ａ】ヒト（配列番号６）及びアカゲザル（配列番号１）ＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のヌクレオチド変異を太字で示す。
【図６Ｂ】ヒト（配列番号６）及びアカゲザル（配列番号１）ＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のヌクレオチド変異を太字で示す。
【図６Ｃ】ヒト（配列番号６）及びアカゲザル（配列番号１）ＣＥＡＣＡＭ−５ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のヌクレオチド変異を太字で示す。
【図７】ヒト（配列番号７）及びアカゲザル（配列番号２）ＣＥＡＣＡＭ−５オープンリーディングフレームのアラインメントを示す。２種のＣＥＡＣＡＭ−５配列間のアミノ酸変異を太字で示す。
【図８】ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＡに対する体液性応答を示す。アカゲザルＣＥＡを免疫した群とヒトＣＥＡを免疫した群の２つのマウス群の平均抗体力価を示す（実施例７）。
【図９】ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＡに対する細胞性免疫応答を示す。ｈＣＥＡを発現するベクター又はｒｈＣＥＡを発現するベクターをＣＥＡトランスジェニックマウスにワクチン接種した（実施例９）。
【図１０】アカゲザル又はヒトＣＥＡを免疫したＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるアカゲザルＣＥＡペプチドに対する細胞性免疫応答を示す。
【国際調査報告】
2006518202.tif 000032
2006518202.tif 000033
2006518202.tif 000034
2006518202.tif 000035
2006518202.tif 000036
2006518202.tif 000037
2006518202.tif 000038