(57)【要約】肺高血圧症およびそれに関連する他の状態の処置のための方法が提供される。特に、この方法は、エストラジオール代謝産物、または生分解性微粒子もしくはナノ粒子と結合したエストラジオール代謝産物を、単独でか、または、他の治療剤と組合せて使用する、肺高血圧症の処置を含む。好ましいエストラジオール代謝産物としては、２−メトキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、および４−ヒドロキシエストラジオール、ならびに／またはこれらの合成誘導体およびアナログ、またはこれらのプロドラッグが挙げられる。この組成物はまた、制御放出処方物の形態であり得る。
2006518393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における肺高血圧症を処置する方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体における中心静脈圧を低下させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項６】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の心臓重量を減少させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺重量を減少させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の右心室肥大を減少させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺血管抵抗を減少させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺の血管線維症を減少させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
個体における心不全を処置する方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺、心臓および肺動脈における、炎症、細胞増殖、脈管再構築および脈管内皮増殖因子の発現を減少させる方法であって、以下：
該個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記エストラジオール代謝産物が、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記エストラジオール代謝産物のプロドラッグをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、制御放出処方物を含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００３年２月２０日に出願された、米国仮出願番号６０／４４８，１１８から優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、肺高血圧症、ならびにその続発症（心不全ならびに肺機能不全および心臓機能不全が挙げられる）を、エストラジオール代謝産物を使用して処置する方法に関する。より具体的には、本発明は、エストロゲン様活性が低いエストラジオール代謝産物（例えば、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、および４−メトキシエストラジオールであり、これらは全て、肺高血圧症および関連する状態の処置のための、制御放出処方物中で送達され得る）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺における上昇した血圧によって特徴付けられる、複雑な健康上の問題である。ＰＨに罹患する個体において、肺動脈内の血圧は、安静時の正常レベルである約１４ｍｍ  Ｈｇをはるかに超えて上昇する。ＰＨ患者において見られる代表的なレベルは、安静時の２５ｍｍ  Ｈｇから労作の間の３０ｍｍ  Ｈｇ以上までの範囲である。この上昇した圧力は、肺における小さい血管の変化に関連し、これらの血管を通る血流の増加した抵抗を生じる。この増加した抵抗は、次に、心臓の右心室にひずみを起こし、従って、この右心室は、十分な量の血液を肺に通して移動させるために通常であるよりも激しく働かなければならない。
【０００４】
経時的に、肺における血管の瘢痕または線維症は、このような血管を、血流に対してより抵抗性にし、そしていくつかは、完全に遮断され得る。さらに、血管内の瘢痕および肺における炎症の存在は、これらの全体の重量を増加させる。瘢痕組織および血管内の過剰の抵抗の連続的な増加は、損なわれた血管に通して血液を移動させるために、より激しくポンピングしなければならない心臓を生じる。最終的に、この心臓は、その要求に適合する目的で拡大し、そしてサイズの増加は、低下した収縮性および効率に関連し、これは最終的に、心不全をもたらし得る。不運なことに、現時点になってやっと、ＰＨに罹患する個体のほとんどは、診断および処置を開始されている。
【０００５】
ＰＨのための療法は、存在しない、いくつかの処置の選択肢が存在し、そして血流を増加させるための治療剤（例えば、血餅が形成することを予防するための抗血液凝固薬、および肺動脈における狭窄を軽減するためのカルシウムチャネル遮断薬）が挙げられる。さらに、狭窄した血管は、留置カテーテルを通してのプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリンアナログの連続的な静脈内注入または皮下注入によって、軽減され得る。他の治療としては、肺動脈の圧力を低下させるためのエンドセリンアンタゴニスト、全身流体蓄積を低下させるための利尿薬、心拍出量の効率を増加させるためのジゴキシン、および血液への酸素の供給を増加させるための予備的酸素の投与が挙げられる。ＰＨ患者は、任意の所定の時点において、１つの処置の状態にあっても、処置の組み合わせの状態にあってもよい。
【０００６】
不運なことに、多くの患者は、これらの治療にほとんど応答しないか、または経時的に、これらの治療に対する応答を止める。この時点で間に合う唯一残っている選択肢は、肺移植である。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ（ＵＮＯＳ）によれば、肺移植を受けた全ての患者に対する患者の生存率は、１９８７年と１９９２年との間に移植された患者について、１ヶ月目で８５％、１年目で６９％、および３年目で５１％である。これらの年以来、結果はわずかにより良くなっている。ＰＨに罹患する患者に対するさらなる障害は、心不全に起因する、心臓と肺との両方の移植の必要性であり得る。全ての年齢の患者、およびいずれの性の患者も助けるための、この危険かつ非常に高価な最終報告の代替としての、効果的な治療剤が必要とされる。
【０００７】
本発明は、ここで使用されるエストラジオール代謝産物はほとんど副作用を有さないので、特に有用である。さらに、エストラジオール代謝産物は、徐放を提供する薬学的処方物内で投与され得、これは、この組成物の、肺高血圧症および関連する状態の処置のための治療剤としての、広範な用途を提供する利点である。
【０００８】
本明細書中の文献の引用は、そのいずれかが関連する先行技術であるという受入れとしては意図されない。これらの文献の日付に関する全ての言及または内容に関する表現は、本出願人に利用可能な情報の主観的な特徴付けに基づくのであり、これらの文献の日付または内容の正確さに関して、いかなる受入れをも構成しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
個体における、肺高血圧およびこれに関連する他の状態（心不全を含む）を処置するための方法が提供される。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の実施形態の１つ以上によって達成される。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、個体における肺高血圧を処置するための方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１２】
好ましい実施形態において、エストラジオール代謝産物は、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオールおよび４−メトキシエストラジオールからなる群より選択される。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、この組成物は、エストラジオール代謝産物のプロドラッグである。
【００１４】
さらなる好ましい実施形態において、この組成物は、制御放出処方物を含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体における中心静脈圧を低下させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の心臓重量を減少させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１７】
なお別の局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺重量を減少させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の右心室肥大を減少させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺血管抵抗を減少させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺の血管線維症を減少させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、肺高血圧症を罹患する個体を処置して、該個体の肺、心臓および肺動脈における、炎症、細胞増殖、脈管再構築および脈管内皮増殖因子の発現を減少させる方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、個体における心不全を処置する方法を特徴とし、この方法は、この個体に、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、特定の実施形態をさらに明示するために含まれる。これらの実施形態は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１以上のこれらの図面を参照することによって、より良く理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（Ｉ．定義）
用語「生分解性」とは、特定の治療状況において許容可能な時間内にインビボで溶解または分解するポリマーをさす。この時間は、生理的ｐＨおよび生理的温度（例えば、６〜９の範囲のｐＨおよび２５℃〜４０℃の範囲の温度）に暴露された後、代表的には、５年間未満であり、通常は、１年間未満である。
【００２６】
「肺高血圧症」または「ＰＨ」とは、肺高血圧症に関連する症状のうちのいずれか１つまたはすべてを指す。診断上のＰＨカテゴリーとしては、肺動脈高血圧症、原発性肺高血圧症、他の原因に関連する肺動脈高血圧症、呼吸器系障害に関連する肺高血圧症、慢性血栓疾患または慢性塞栓疾患に起因する肺高血圧症、肺血管を直接冒す障害に起因する肺高血圧、コラーゲン脈管疾患に関連する肺動脈高血圧症、慢性ＨＩＶ感染に関連する肺高血圧症、薬物または毒素に関連する肺高血圧症、および肺静脈高血圧症が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＰＨ患者は、中心静脈圧の増加に起因する心不全に罹患する危険があり得るか、または現在その心不全に罹患している。ＰＨと呼ばれる疾患の多くの症状発現に起因して、本発明は、上記の障害のうちのいずれかまたはすべてを指すために、用語「肺高血圧症」または「ＰＨ」を使用する。
【００２７】
用語「エストラジオール」とは、１７β−エストラジオールを指す。
【００２８】
用語「エストラジオール代謝産物」とは、エストラゲン活性をほとんど発揮せずそのエストラゲンレセプターについて低い親和性を有する、１７β−エストラジオールの代謝産物（例えば、カテコールエストラジオールおよびメトキシエストラジオール）ならびに／またはその合成誘導体および／またはアナログを指す。その例としては、２−メトキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、および４−ヒドロキシエストラジオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「個体」とは、いずれかの性別の動物またはヒトを指す。
【００３０】
用語「プロドラッグ」とは、エストラジオール代謝産物を放出する化合物を指す。
【００３１】
本発明によると、単離されたエストラジオール代謝産物または生物学的に純粋なエストラジオール代謝産物は、その天然環境から取り出された化合物を指す。このように、「単離された」および「生物学的に純粋な」とは、その化合物が精製された程度を必ずしも反映しない。本発明の単離された化合物は、その天然供給源から得られ得るか、分子生物学的技術を使用して生成され得るか、または化学合成により生成され得る。
【００３２】
（ＩＩ．方法）
本発明は、ＰＨおよび関連状態（例えば、心不全ならびに肺機能不全および心機能不全）を処置するためにエストラジオール代謝産物を使用する方法を提供する。具体的には、本発明は、ＰＨを有する個体において中心静脈圧および中心動脈圧を低下させる方法、ならびに心臓重量、肺重量、右心室肥大、血管抵抗、血管線維症を減少させる方法、ならびにそのような個体における肺、心臓および肺動脈における、炎症、細胞増殖、脈管再構築および脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を減少させる方法。本発明はまた、そのような障害の処置のための、エストラジオール代謝産物を含む治療有効量の組成物を投与する方法も提供する。
【００３３】
本発明の方法を実行するために使用されるエストラジオール代謝産物としては、エストラゲン活性をほとんど発揮せずそのエストラゲンレセプターについて低い親和性を有する、１７β−エストラジオールの代謝産物（例えば、カテコールエストラジオールおよびメトキシエストラジオール）（その例としては、２−メトキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、および４−ヒドロキシエストラジオールが挙げられる）ならびに／またはその合成誘導体および／またはアナログが挙げられる。
【００３４】
制御放出処方物において使用され得る生分解性微粒子または生分解性ナノ粒子は、１種以上のポリマー（例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グルコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グルコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリアセチル、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、生分解性ポリウレタン、ならびにそれらのブレンドおよびコポリマー）を含む。
【００３５】
（エストラジオール代謝産物）
本発明に従って使用されるエストラジオール代謝産物としては、カテコールエストラジオール（例えば、２−ヒドロキシエストラジオール（エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−２，３，１７−トリオール（１７β）または４−ヒドロキシエストラジオール（エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，４，１７−トリオール（１７β））、あるいはメトキシエストラジオール（例えば、２−メトキシメトキシエストラジオール（エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−２−メトキシ−３，１７−ジオール（１７β））または４−メトキシエストラジオール（エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−４−メトキシ−３，１７−ジオール（１７β））が挙げられる。これらの化合物のすべての市販の調製物が、容易に利用可能である。
【００３６】
エストラジオール代謝産物はまた、制御放出処方物中に組み込まれ得る。このような制御放出処方物は、生分解性微粒子、生分解性ナノ粒子、パッチ、結晶、ゲル、ヒドロゲル、リポソームなどであり得る。さらに、そのエストラジオール代謝産物は、デバイス（例えば、移植片、膣内リング、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、および経皮送達デバイス）中に組み込まれ得る。本発明によると、エストラジオール代謝産物ならびにその合成誘導体およびアナログの、プロドラッグもまた、使用され得る。具体例としては、ヒドロキシエストラジオールのエステル、およびメトキシエストラジオールのエステルが挙げられる。
【００３７】
上記に列挙される化合物は、単なる例示に過ぎないこと、そして多くの変化形が使用され得、それは、親エストラジオール化合物上での特定のヒドロキシル化またはメチル化に依存することが、当業者にとって明らかである。例えば、エストラジオールは、多くの部位でヒドロキシル化またはメチル化され得、そのような変化形は、当該分野で公知である。
【００３８】
（投与形態）
本発明の治療用組成物は、処置されるべき個体が寛容し得る賦形剤中に処方され得る。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、ハンクス溶液、および生理学的平衡塩類溶液が挙げられる。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドのような非水系賦形剤がまた、用いられ得る。他の有用な処方物としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロースのような粘度増強剤を含有する懸濁液、ソルビトール、またはデキストランが挙げられる。賦形剤はまた、少量の等張性および化学安定性を増強する物質のような添加物も含み得る。
【００３９】
本発明の実施するために用いられ得る緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、炭酸水素緩衝液、およびトリス緩衝液が挙げられるが、保存料の例としては、チメロサール、クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方物は、注射用の液体または注射のための懸濁液もしくは溶液として適切な液体中に加えられ得る固体のいずれかであり得る。従って、非流動性処方物において、上記賦形剤は、ブドウ糖、ヒト血清アルブミン、保存剤などが含まれ得、これらに滅菌した水または生理食塩水が、投与前に添加される。
【００４０】
本発明はまた、本明細書中に提供される薬学的化合物の適切な局所性処方物、経口処方物、全身性処方物および非経口処方物を用いて実施され得る。この処方物は、投与のための従来の賦形剤中に多岐にわたる治療投薬形態で投与され得る。例えば、この化合物は、錠剤、カプセル剤（徐放性（ｔｉｍｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）処方物および徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）処方物をそれぞれ含む）、丸剤、散剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップおよびエマルジョンの形態で経口投与のために処方され得る。同様に、これらはまた、薬学分野の当業者に周知である形態を全て用いて、血管形成術／カテーテル法の間に静脈内に（ボーラスおよび輸液の両方）、腹腔内に、閉鎖してまたは閉鎖せずに局所的に、または筋肉内に投与され得る。
【００４１】
本発明の治療用組成物はまた、キャリアも含み得る。キャリアは、処置される個体内において治療用組成物の半減期を増加させる化合物を含む。適切なキャリアとしては、ポリマー制御放出型賦形剤、生分解性移植物、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞およびグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
（制御放出処方物）
本発明の方法はまた、本発明の組成物を個体へ徐々に放出することが可能である制御放出処方物を使用し得る。本明細書中で使用される場合、制御放出処方物は、制御放出型賦形剤中に本発明の組成物を含み得る。このような制御放出処方物は、当該分野で周知である。適切な制御放出処方物としては、生体適合性ポリマー、他のポリマー基質、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ナノ粒子、パッチ（米国特許第６，２３８，２８４号および同第５，７３６，１５４号を参照のこと）、結晶（米国特許第５，８２７，５３１号を参照のこと）、ボーラス調製物、リポソーム（米国特許第６，３３９，０６９号および同第６，１４３，７１６号）脂質球（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、ゲル（米国特許第５，８３０，５０６号を参照のこと）およびヒドロゲル（米国特許第６，３７２，８１３号；同第６，３７２，２４８号；および同第６，３６７，９２９号）が挙げられるが、これらに限定されない。このような制御放出型賦形剤はまた、膣輪（ｖａｇｉｎａｌ  ｒｉｎｇ）のようなデバイス（米国特許第６，１０３，２５６号および同第５，７８８，９８０号を参照のこと）、移植物（米国特許第６，２５１，４１８号および同第５，８７４，０９８号を参照のこと）、浸透圧性ポンプ、拡散デバイス、ならびに経皮送達システムが挙げられる。本発明の他の制御放出処方物は、個体への投与の際に、インサイチュで固体またはゲルを形成する液体および懸濁液を含む。好ましい制御放出処方物は、生分解性である。全てのこのような組成物は、当該分野において周知である。
【００４３】
本発明の方法はまた、本発明の組成物の治療用量レベルを得かつ維持するために十分な速度で、個体へ本発明の組成物を放出することが可能である制御放出処方物を使用し得る。治療用組成物は好ましくは、１日〜約１２ヶ月の期間にわたって放出される。より好ましくは、このような治療用組成物は、２日〜３０日の期間にわたって放出される。
【００４４】
（投与量）
投薬レジメンのパラメータは、有効な方法における本発明の治療用組成物の投与に応じて変化され得る。このようなパラメータとしては、個々の用量の大きさ、用量数、用量投与の頻度、および投与方法が挙げられる。このようなパラメータの変更は、当業者によって達成され得る。適切な単一用量は、適切な期簡にわたり一回以上投与された場合、動物またはヒトを疾患から防護する（すなわち、予防するまたは処置する）ことが可能である用量である。治療用組成物のさらなる投与の必要性は、患者の所定の状態に応じて当業者によって決定され得る。
【００４５】
（肺高血圧症の処置）
肺高血圧症は、五つの主要な種類に分けられる。第一は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）であり、肺動脈損傷を有する患者を含む。二つの型のＰＡＨ、原発性肺高血圧症（ＰＰＨ）および他の原因に関連する肺動脈高血圧症が存在する。肺動脈高血圧症は、いかなる明らかな原因がなくとも生じるが、原因の約１０％は、遺伝子成分を有するように見える。なぜならば、肺動脈高血圧症は、ＰＰＨの病歴を有する家系に生じるからである。さらに、満期児または過期児は、心臓機能または肺機能に障害を示し得る。この型のＰＰＨは、新生児の持続性肺高血圧症と称され、チアノーゼおよび頻呼吸を伴う呼吸困難により特徴付けられる。幼児の胸部のレントゲン写真は、吸引性肺炎、横隔膜ヘルニアまたは肺硝子膜症と両立し得る種々の異常を示し得る。新生児の持続性肺高血圧症は、心エコー図により確認され得る。
【００４６】
他の原因に関連する肺動脈高血圧症は、毒素（例えば、フェンフラミンまたはデキスフェンフラミンを含む肥満抑制薬、コカインまたはメタンフェタミンのような非合法物質または汚染食物または汚染水）への曝露と関連する。ＰＡＨのこの下位区分の他の原因としては、疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染）、膠原血管病（例えば、強皮症）、狼瘡または慢性関節リウマチ、または肝疾患（例えば、慢性肝疾患）、または門脈閉塞が挙げられる。
【００４７】
ＰＨの第二の種類は、呼吸系の障害と関連する肺高血圧症である。これは、多くの場合、気腫、ぜん息性気管支炎、睡眠時無呼吸症、慢性閉塞性肺疾患、間隙性肺疾患、睡眠障害呼吸（ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、肺胞性換気過少障害（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｈｙｐｏｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、新生児肺疾患、肺胞−毛細血管形成異常または高所への慢性的な曝露を既に罹患している患者に見られる。
【００４８】
肺高血圧症の第三の種類は、慢性血栓疾患または慢性塞栓性疾患に起因する。これは、多くの場合、肺動脈に血餅を示す患者、肺塞栓症または鎌状赤血球病を示す患者に見出される。さらに、末端肺動脈の閉塞（例えば、血栓、腫瘍、寄生生物または異物による）を有する患者もまた、慢性血栓疾患または慢性塞栓疾患に起因するＰＨを有すると分類される。
【００４９】
肺高血圧症の第四の種類は、肺血管に直接影響する障害に起因する。このカテゴリーは、多くの場合、炎症性疾患（例えば、住血吸虫症またはサルコイドーシスまたは肺毛細血管疾患）を有する患者に観察される。
【００５０】
第五の種類は、肺静脈高血圧症（ＰＶＨ）である。これは、心臓の左側の疾患または欠損（例えば、左側の心房もしくは心室の心臓疾患）；左側の弁の心臓疾患；中央の肺静脈の外因性圧縮（例えば、線維形成性縦隔炎もしくはアデノパシーもしくは腫瘍を伴う中央の肺静脈の外因性圧縮）；または肺静脈閉塞疾患により引き起こされる。ＰＶＨを罹患する患者は、肺動脈圧の上昇を示すが、これは、例外的にしか重篤なＰＡＨを引き起こさない。
【００５１】
ＰＨの初期の症状としては、息切れ、および疲労、眩暈感、失神、腫れた足首もしくは足および胸痛の連続的な感覚が挙げられる。心エコー図、心電図、右心カテーテル法、六分間歩行試験による患者の心臓および肺のさらなる評価および／または日常生活の仕事における機能の評価の際に、それらは、特定の診断分類に適合し得ないが、ＰＨに対する多くの基準を有する。さらに、任意の型のＰＨを有する患者は、中心静脈圧の断続的な増加に起因する心不全の危険性がある。ＰＨと呼ばれる疾患の多くの徴候に起因して、本発明は、上に列挙した症状の任意の部分集合をいうために、用語「肺高血圧」または「ＰＨ」を使用する。
【００５２】
本発明に従ってＰＨを処置する場合に、エストラジオール代謝産物が、生分解可能な微粒子またはナノ粒子に組み込まれ得、そして、患者に投与され得る。ＰＨの処置のための他の薬剤（「ＰＨ薬剤」）を少なくとも一つ含む生分解可能な微粒子またはナノ粒子と一体になったエストラジオール代謝物を投与することもまた本発明の範囲内である。ＰＨ薬剤は、例えば、抗凝血剤、カルシウムチャンネル遮断剤、プロスタサイクリン、プロスタサイクリンアナログ、利尿薬、ジゴキシン、エンドセリンアンタゴニスト、ホスホジエステラーゼインヒビター、プロスタグランジンアナログ、一酸化窒素、アデノシン、酸素または任意の他の適切な薬剤であり得る。処置は、単一の組成物、もしくはエストラジオール代謝物およびＰＨ薬剤の両方を含む薬理学的処方物を投与することによって、または、患者を二つの別個の組成物または処方物を用いて同時に処置することによって達成され得、ここで、一方の組成物は、生分解可能なポリマーと一体になったか、または一体となっていないエストラジオール代謝物を含み、そしてもう一方の組成物は、ＰＨ薬剤を含む。
【００５３】
あるいは、任意のエストラジオール代謝物処置は、数分〜数週間の範囲の間隔で、ＰＨ薬剤処置に先行し得るか、またはその後に行い得る。ＰＨ薬剤および任意のエストラジオール代謝物が、別個に投与される例において、一般に、ＰＨ薬剤およびエストラジオール代謝物が、状態に対して有利な複合（例えば、相乗）効果をなお発揮し得るように、各送達の時間の間に、かなりの期間が満了しないことを保証する。このような例において、二つの治療剤が互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、最も好ましくは、約１２時間のみの遅延時間で、投与されることが企図される。いくつかの状況において、治療剤のみを用いる処置の期間を延長することが好ましく、それぞれの処置の間は、例えば、数日間（２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、または７日間）から数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間）経過することが好ましい。組合せ治療に使用するために適した薬剤は、ＰＨを有する患者に対して有用な任意の化学的化合物であるか、または任意の処置方法である。
【００５４】
本発明に従う肺高血圧症を処置する際に、生分解可能な微粒子またはナノ粒子に組み込まれ得、そして、また別の薬剤と同時投与され得るエストラジオール代謝物は、肺血管肥大および線維症を予防および／または処置するために作用する。これは、肺脈管における圧力を低下させ、そして／または心臓の症状および肺の症状を減少させるために機能する。
【００５５】
本発明は、ここで、さらに例証されるが、以下の実施例に決して限定されない。実施例に記載される技術が、本発明の実施において良好に機能する、本発明者らによって発見された技術を表すことが当業者に明らかであり、従って、その実施のための現在の好ましい様式を構成することが考慮され得る。しかし、材料および方法の両方に対する多くの改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、特定の実施形態においてなされ得ることは、当業者には明らかである。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
（実験計画）
全部で２７匹の、雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）（３７８＋／−１２グラム）を本実験に利用した。動物を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの動物飼育施設（温度２２℃、光周期１２時間、相対湿度５５％）に収容した。動物に、Ｐｒｏ  Ｌａｂ  ＲＨＭ  ３０００げっ歯類用飼料（ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｃ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を給餌し、水を自由に与えた。動物福祉のための施設の指針に従い、そしてＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが実験プロトコールを承認した。
【００５７】
動物を、皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ，ｎ＝６）またはモノクロタリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＭＣＴ、６０ｍｇ／ｋｇ皮下）（ｎ＝２１）を受容するようにランダムに割当てた。モノクロタリンは、肺高血圧症を誘導することが知られている薬剤である。最初の注入の６時間後、コントロール動物に、ビヒクル（ポリエチレングリコール  ４００、２．５μｌ／時）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む浸透圧小型ポンプ（ｍｏｄｅｌ  ２ＭＬ４，Ａｌｚａ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を移植し、一方ＭＣＴ処置動物に、ビヒクル（ＭＣＴ群；ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオール（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩ）（１０μｇ／ｋｇ／時、ＭＣＴ＋２ＨＥ群、ｎ＝７）または２−メトキシエストラジオ−ル（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩ）（１０μｇ／ｋｇ／時、ＭＣＴ＋２ＭＥ群、ｎ＝７）のいずれかを含む浸透圧小型ポンプを移植した。ＭＣＴ群、ＭＣＴ＋２ＨＥ群およびＭＣＴ＋２ＭＥ群への割り当てを、ランダムに行った。
【００５８】
２１日後、動物を計量し、ペントバルビタール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（５０ｍｇ／ｋｇ）によって腹腔内的に麻酔し、そして血圧、心拍数および中心静脈圧の測定のための機器を取付けた。中心静脈圧の継続的測定のために、ＰＥ−５０カテーテルを右頸動脈内に挿入し、そしておよそ１インチ進めて、低血圧分析器（ＬＰＡ，Ｍｉｃｒｏ−Ｍｅｄ．，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）に接続した。血圧および心拍数の継続的測定のために、別のＰＥ−５０カテーテルを左頸動脈内に挿入し、血圧分析器（ＢＰＡ，Ｍｉｃｒｏ−Ｍｅｄ．，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）と接続した。追加麻酔の送達のために、ＰＥ−５０カテーテルと接続された２２−Ｇの針を、尾静脈に挿入した。６０分後、血行動態パラメータの記録を３０分行った。
【００５９】
動物を、過剰用量の麻酔薬によって殺し、心臓および肺を除去して計量した。両心房を慎重に除去し、右心室を左心室から慎重に切除した。両心室を計量し、そして左心室＋中隔に対する右心室の比を計算した。
【００６０】
右心室、左心室、主肺動脈および肺の右下葉を切断し、１０％ホルマリン緩衝液で固定した。固定した標本をパラフィンで包埋し、その後の光学顕微鏡分析および免疫組織化学分析のため、４ミクロン厚の切片へと切断した。
【００６１】
増殖の評価のため、一次モノクローナルマウス抗体（１／２００希釈；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を標識し、ウサギポリクローナル抗体（１／５０希釈，Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いてＶＥＧＦ発現を測定した。単球／マクロファージ細胞質抗原に特異的なポリクローナルＥＤ１抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を、脈管（主肺動脈）および肺性マクロファージを標識するために使用した。非特異的染色の測定のため、一次抗体をリン酸緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）に置き換えた。切片を洗浄し、製造者（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）の指示にしたがって、アビジンおよびペルオキシダーゼ結合ビオチンに連結した二次抗体を含むＬＳＡＢ２キットを用いて、さらに発色させた。ＰＣＮＡおよびＶＥＧＦについての免疫化学染色を、免疫染色分析のために設計された特別なソフトウェア（Ｉｍｍｕｎｏ−Ａｎａｌｙｓｉｓ，バージョン４．１，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いたＳＡＭＢＡ  ４０００  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）によって、定量的に評価した。ソフトウェアは、一次抗体がＰＢＳで置換された陰性コントロール組織においていくつかの領域を平均することによって、密度閾値を設定した。次いで、全組織において背景の減算を行った。１０個の高出力領域（×４００）を、染色密度、壁厚またはＥＤ−１について陽性標識された細胞に関して評価した。ＰＣＮＡおよびＶＥＧＦについての結果を、標識指数として報告する。これは、陽性に染色された全調査面積のパーセンテージを表す。陽性面積の染色強度もまた評価し（平均光学密度）、次いで、平均迅速点数（ｍｅａｎ  ｑｕｉｃｋ  ｓｃｏｒｅ）（平均光学密度×標識指数）を計算した。炎症反応データを、１０個の高出力領域あたりのＥＤ１＋細胞の総数として表す。
【００６２】
脈管再構築の評価のため、肺動脈の脈管平滑筋細胞を、平滑筋α−アクチンＡｂ−１マウスモノクローナル抗体（１／１００希釈，Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で染色した。壁および中膜の厚さを、市販の画像化ソフトウェアを用いて、小サイズの肺動脈（５０〜２００ミクロン）において測定した。ほぼ環状の輪郭を有する脈管のみを分析した。
【００６３】
Ｎｕｍｂｅｒ  Ｃｒｕｎｃｈｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌソフトウェアプログラム（Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，Ｕｔａｈ）を用いて統計学的分析を行った。一因子分散分析（１−Ｆ  ＡＮＯＶＡ）、それに続くＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ試験を用いた事後比較により、群比較を行った。全てのデータは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示される。
【００６４】
（結果）
実験動物へのモノクロタリンの投与は、肺高血圧症のモデルの作製に使用される（例えば、Ｂ．Ｍｅｙｒｉｃｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２３９（５）：Ｈ６９２（１９８０），およびＴａｎｉｎｏ，Ｙ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ５９（６）：１０７６（２００１）を参照のこと、これらの開示は、本明細書において参考として援用される）。モノクロタリンが脈管の筋内膜の増殖を誘導する場合、最初に、小型および大型の肺動脈における構造変化が生じる。これは、肺重量の増加をもたらす肺の肺胞マクロファージ活性の増加を引き起こし、次に、種々の炎症メディエータを刺激する。モノクロタリンの投与に起因する、肺におけるこれらの変化の全ては、肺脈管抵抗の上昇および右心室重量の増加をもたらす右心室肥大をもたらす。
【００６５】
本実験におけるモノクロタリンの投与は、予測された結果を生じた。図１に見られるように、これらの動物において、肺重量の観察可能な増加および肺脈管抵抗の顕著な上昇があった。モノクロタリンで処理された動物において、肺脈管抵抗の上昇は、肺高血圧症をもたらし、次いで、図２に見られるような心肥大、ならびに図３に見られるような右心室肥大および右心室重量の増加をもたらした。さらに、モノクロタリン処理動物は、図４に示すように、より大きな、左心室＋中隔に対する右心室の重量比を示した。中心静脈圧は、肺高血圧症の特徴であり、図５に示されるように、やはりモノクロタリン処理動物において、より高かった。
【００６６】
対照的に、モノクロタリンと２−ヒドロキシエストラジオールまたは２−メトキシエストラジオールとで処理された動物は、同じレベルの、モノクロタリン処理に関する有害な結果を示さなかった。これらの動物が、図１、２、３および４に見られるような肺高血圧症、肺重量の増加、心肥大または右心室肥大を経験しなかったため、エストラジオール代謝産物は、モノクロタリンの陰性効果を大きく減少させた。さらに、２−メトキシエストラジオールは、中心静脈圧の減少において、特に有効であった。言い換えると、これらの動物を心不全から保護した（図５を参照のこと）。
【００６７】
肺、右心室および主肺動脈における増殖（ＰＣＮＡ染色）の定量分析を、図６Ａ〜図６Ｃにそれぞれ提示する。モノクロタリン誘導性内皮損傷およびその後の肺高血圧症は、顕著な増殖性応答を伴った。増殖細胞に関する染色の増加は、コントロール動物と比較して、モノクロタリン処理動物において肺（図６Ａ）、右心室（図６Ｂ）および主肺動脈（図６Ｃ）で検出された。右心室におけるＰＣＮＡ陽性細胞の分布は、心線維芽細胞の増殖の増加を示唆した；一方、肺動脈では、中膜および外膜において、明らかな増殖性応答が検出された。２ＨＥおよび２ＭＥの両方は、肺（−６０％および−７０％）（図６Ａ）、右心室（−８１％および−７７％）（図６Ｂ）および主肺動脈（−８３％および−９４％、それぞれ２ＨＥおよび２ＭＥ；図６Ｃ）の増殖性応答を、顕著に（ｐ＜０．００１）阻害した。
【００６８】
肺高血圧症の発生はまた、肺における有意な炎症（ｐ＜０．００１）に関連する（図７Ａ、コントロール対ＭＣＴ、ｐ＜０．００１）。炎症性（ＥＤ１＋）細胞はまた、ＭＣＴ処理動物の肺動脈において検出された（図７Ｂ）。エストラジオール代謝産物は、肺における炎症性応答をほぼ完全に消滅させ（ｐ＜０．００１）、そして肺動脈において炎症性細胞の浸潤を阻害した（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）。ＶＥＧＦ発現の免疫組織化学分析は、より顕著でない変化を示した。同様のパーセントの使用された肺組織が、ＶＥＧＦに関して陽性に染色された（標識指数３４．２±２．２、４２．８±２．６、３７．６±３．３および３７．６±３．９、それぞれコントロール群、ＭＣＴ群、ＭＣＴ＋２ＨＥ群およびＭＣＴ＋２ＭＥ群；ｐ＝０．４８２）。しかし、この染色の密度（平均光学密度）および迅速点数指数は、コントロール動物と比較して、ＭＣＴ群においてより高かった（図８）。
【００６９】
ＭＣＴ処理ラットの肺におけるＶＥＧＦ分布の半定量分析は、気道（すなわち、上皮および上皮下平滑筋細胞）において最も高い発現を示した。重要なことには、どちらの代謝産物も、これらの変化を消滅させる傾向があった。ＭＣＴ処理動物における肺高血圧症の発症は、脈管の再構築と関連した。小さなサイズの肺動脈の免疫組織化学分析（平滑筋α−アクチン染色）は、ＭＣＴラットにおける顕著な中膜肥大を検出した（コントロール動物と比べて、ＭＣＴ群における８７％までの壁厚の増加；図９）。重要なことには、どちらのエストラジオール代謝産物も、中膜のＭＣＴ誘導性肥大を減衰させた（−５０％および−４０％、それぞれＭＣＴ＋２ＨＥおよびＭＣＴ＋２ＭＥ；ｐ＜０．００１）。
【００７０】
開示された方法および組成物が、本発明の特定の実施形態に関して記載されたが、本願発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく改変が適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤が本明細書において記載された薬剤と置き換えられ得る一方、同じかまたは同様の結果が達成されることは、明らかである。当業者に明らかな全てのこのような同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内にあると判断される。したがって、本明細書における図面および記載は、本発明の理解を容易にするためにのみ提供され、そして本明細書の範囲を限定すると解釈されるべきではないことが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明に従う、肺重量（左側のパネル）（「肺」）および体重に対する肺の比（右側のパネル）（「肺／体重」）における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｇ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。左側のＹ軸は、グラムの単位であり、そして右側のＹ軸は、１ｋｇ体重当たりのグラムの単位である。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定（ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ）を用いて行った。
【図２】図２は、本発明に従う、心重量（左側のパネル）（「心臓」）および体重に対する心重量の比（右側のパネル）（「心臓／体重」）における処置の効果を示す。動物を、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）で処理した。左側のＹ軸は、グラムの単位であり、そして右側のＹ軸は、１ｋｇ体重当たりのグラムの単位である。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図３】図３は本発明に従う、右心室重量（左側のパネル）（「右心室」）および体重に対する右心室重量の比（右側のパネル）（「右心室／体重」）における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。左側のＹ軸は、グラムの単位であり、右側のＹ軸は、１キログラム体重当たりのグラムの単位である。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図４】図４は、右心室重量を、左心室＋中隔の重量で除算することによって得られる比における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図５】図５は、本発明に従う、中心静脈圧（「ＣＶＰ」）における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、肺（図６Ａ）、右心室（図６Ｂ）および肺動脈（図６Ｃ）における細胞増殖（ＰＣＮＡ染色）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。ラベリングは、ポジティブに染色された、試験した全体の面積のパーセンテージを表す（ラベリング指標）。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、肺（図７Ａ）および肺動脈（図７Ｂ）における炎症細胞（ＥＤ１＋細胞）（「ＥＤ１＋細胞の数」）における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。ラベリングは、ポジティブに染色された、試験した全体の面積のパーセンテージを表す（ラベリング指標）。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図８】図８は、肺の血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）発現における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオール（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）を含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。ラベリングは、ポジティブに染色された、試験した全体の面積のパーセンテージを表す（ラベリング指標）。ポジティブな領域の染色強度を、平均光学濃度（左側のＹ軸）（「平均光学濃度」）として評価し；平均光学濃度について調整した全体の染色を、クイックスコア（ｑｕｉｃｋ  ｓｃｏｒｅ）（右側のＹ軸）（「クイックスコア」）として評価した。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図９】図９は、小さいサイズの肺動脈におけるアクチン染色によって評価した壁厚（ミクロン）（「壁厚」）における、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）（「コントロール」）（ｎ＝６）、ビヒクル（ポリエチレングリコール４００、２．５μｌ／時間）を含む皮下モノクロタリン（「ＭＣＴ」）（６０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、２−ヒドロキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＨＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）、および２−メトキシエストラジオールを含む皮下モノクロタリン（６０ｍｇ／ｋｇ）（「ＭＣＴ＋２ＭＥ」）（１０μｇ／ｋｇ／時間）（ｎ＝７）の効果を示す。データを、１因子分散分析（１Ｆ−Ａｎｏｖａ）によって分析して、各群の平均間で全体的な差異を得た。ｈｏｃ後比較（アスタリスク）を、フィッシャーの最下位差異検定を用いて行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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