(57)【要約】本発明はLPS誘導細胞シグナル伝達経路のモジュレーターをスクリーニングするためにCARD-4分子を使用する方法を提供する。さらにCARD-4欠損マウス、LPS誘導細胞シグナル伝達経路を調節する方法、および、細菌感染を治療または予防する方法も包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NF-κBのリポ多糖類（LPS）媒介活性化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、
LPSを保有し、かつ、CARD-4のカスパーゼリクルートメントドメイン（CARD）、ヌクレオチド結合部位（NBS）またはロイシンリッチリピート（LRR）ドメインを含むポリペプチドを発現する細胞を提供する段階；
該細胞を試験化合物に曝露する段階；および、
該細胞内のNF-κB活性化を測定する段階、
を含み、
試験化合物非存在下におけるNF-κB活性化と比較した場合の試験化合物存在下における改変されたNF-κB活性化が、試験化合物がNF-κBのLPS媒介活性化を調節する候補化合物であることを示す、方法。
【請求項２】
細胞がフレクスナー赤痢菌に感染している請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞がサルモネラ・チフィムリウムに感染している請求項1記載の方法。
【請求項４】
細胞がヘリコバクター・ピロリに感染している請求項1記載の方法。
【請求項５】
JNKキナーゼ活性のLPS媒介活性化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、
LPSを保有し、かつ、CARD-4のCARD、NBSまたはLRRドメインを含むポリペプチドを発現する細胞を提供する段階；
細胞を試験化合物に曝露する段階；および、
細胞内のJNKキナーゼ活性化を測定する段階、
を含み、
試験化合物非存在下におけるJNKキナーゼ活性化と比較した場合の試験化合物存在下における改変されたJNKキナーゼ活性化が、試験化合物がJNKキナーゼ活性のLPS媒介活性化を調節する候補化合物であることを示す、方法。
【請求項６】
細胞がフレクスナー赤痢菌に感染している請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞がサルモネラ・チフィムリウムに感染している請求項5記載の方法。
【請求項８】
細胞がヘリコバクター・ピロリに感染している請求項5記載の方法。
【請求項９】
LPS誘導免疫応答を調節する候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、
CARD-4のCARD、NBSまたはLRRドメインを含むポリペプチドを発現する細胞を提供する段階；
LPSを該細胞内に導入する段階；
該細胞を試験化合物に曝露する段階；および、
該細胞内のポリペプチドのオリゴマー化を測定する段階、
を含み、
試験化合物非存在下におけるポリペプチドのオリゴマー化と比較した場合の試験化合物存在下における改変されたポリペプチドのオリゴマー化が試験化合物がLPS誘導免疫応答を調節する候補化合物であることを示す、方法。
【請求項１０】
細胞がフレクスナー赤痢菌に感染している請求項9記載の方法。
【請求項１１】
細胞がサルモネラ・チフィムリウムに感染している請求項9記載の方法。
【請求項１２】
細胞がヘリコバクター・ピロリに感染している請求項9記載の方法。
【請求項１３】
NF-κBまたはJNKのLPS誘導活性化を調節する方法であって、該方法は、
細胞内LPSを保有する細胞を提供する段階；および、
該細胞内におけるNF-κBまたはJNKのLPS誘導活性化を調節するために十分な量のCARD-4の発現または活性化を調節する化合物に該細胞を接触させる段階、
を含む方法。
【請求項１４】
個体におけるLPS誘導免疫応答を調節する方法であって、該方法は、
細胞内のLPSを保有する細胞を含む個体を選択する段階；および
個体におけるLPS誘導免疫応答を調節するために十分な量のCARD-4の発現または活性化を調節する化合物を個体に投与する段階、
を含む方法。
【請求項１５】
個体が細菌感染を有すると診断される請求項14記載の方法。
【請求項１６】
細菌感染がフレクスナー赤痢菌感染である請求項15記載の方法。
【請求項１７】
細菌感染がサルモネラ・チフィムリウム感染である請求項15記載の方法。
【請求項１８】
細菌感染がヘリコバクター・ピロリ感染である請求項15記載の方法。
【請求項１９】
細菌感染を処置または予防する方法であって、該方法は、
細菌感染を有する、または、有する危険性のある個体を選択する段階；および
細菌感染を処置または予防するために十分な量のCARD-4の発現または活性を調節する化合物を個体に投与する段階；
を含む方法。
【請求項２０】
内因性CARD-4遺伝子の崩壊をゲノムが含むマウスであって、該崩壊により該内因性CARD-4遺伝子の低下した発現または発現の欠如がもたらされ、これによりサルモネラ・チフィムリウムまたはヘリコバクター・ピロリ感染を浄化するマウスの能力の低下がおこるマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細菌産物の生得的な免疫認識はヒト、ショウジョウバエおよび植物のように多種多様にわたる種において顕著な類似性を共有している宿主防御の古来の系である（Koppら、1999,Curr.Opin.Immunol.,11：13-18）。認識される細菌産物が、例えばグラム陰性生物のリポ多糖類（LPS）およびグラム陽性生物の細胞壁由来のペプチドグリカン（PG）のような構造的成分を含む一様な分子であることは意外なことではない（Koppら、1999,Curr.Opin.Immunol.,11：13-18）。総括してこれらの微生物産物は病原体関連分子パターン(pathogen-associated molecule pattern)即ちPAMPと称される。Toll/Toll様受容体（TLR）と称される受容体のファミリーはショウジョウバエとヒトの両方における生得的な免疫の中枢である。植物はTLRへの顕著な類似点を示す疾患耐性タンパク質即ちRタンパク質と称される膜結合性のサイトゾル分子のクラスを介して病原体の侵入を検知する。例えばサイトゾルではないがタバコ植物のNタンパク質はTLRに共通するC末端TIRドメイン並びにTLRの細胞外タンパク質のものと同様のN末端ロイシンリッチリピート（LRR）ドメインを有する（Medzhitovら、1998,Curr.Opin.Immunol.,10：12-15）。これらのRタンパク質は代謝的改変および病原体侵入部における局在化した細胞死をもたらす植物における過敏性の応答を媒介する。
【０００２】
骨髄様細胞系統の細胞におけるPAMP応答性の媒介におけるTLRに関して知られている事柄とは対照的に、上皮細胞における病原体認識におけるTLRにより果たされる役割は殆どわかっていない。上皮細胞はTLRを発現するがこれらの細胞は大部分が細胞外LPSに対して、かつ、非病原性細菌に対しては非応答性であることから、生得的な免疫検知におけるその機能は解明されていない（Carioら、2000,J.Immunol.,164：966；Philpottら、2000,J.Immunol.,165：903）。これとは対照的に、マイクロインジェクションされた、または、侵襲性のフレクスナー赤痢菌によりサイトゾル内に供給された細胞内LPSは、NF-κBおよびその標的遺伝子の1つであるIL-8の活性化により評価したところ炎症性応答の強力な誘導物質である（Philpottら、2000,J.Immunol.,165：903）。しかしながら、細胞内LPSがこれらの応答を活性化させるメカニズムは不明である。
【０００３】
核因子-κB（NF-κB）は多くの細胞型において発現される転写因子であり、そのプロモーター内にκB部位を有する相同または非相同の遺伝子を活性化する。NF-κB活性化を調節する分子はアポトーシスおよび炎症の両方において重要な役割を果たす。静止期のNF-κBはp50およびp65と称されるタンパク質のヘテロ二量体として細胞質中に存在し、調節タンパク質I？Bと複合体化している。IκBへのNF-κBの結合によりNF-κBは細胞質内に残存できる。2ダースのNF-κBを活性化する刺激物質は少なくとも2ダースの存在が知られており（New England Journal of Medicine,336：1066,1997）、そしてそれらにはサイトカイン、タンパク質キナーゼCアクチベーター、酸化物質、ウィルスおよび免疫系刺激物質が含まれる。NF-κB活性化刺激物質はIκBをリン酸化してその分解をもたらす特定のIκBキナーゼを活性化する。IκBから遊離した後、NF-κBは核に転座し、そのプロモーター内にκB部位を有する遺伝子を活性化する。前炎症性のサイトカインTNF-αおよびIL-1はその細胞表面受容体に結合してNF-κB誘導キナーゼNIKおよびNF-κBを活性化することにより、NF-κBの活性化を誘導する。NIKはIκBをホスホリル化するIκBキナーゼαおよびβをホスホリル化し、その分解をもたらす。
【０００４】
NF-κBおよびNF-κB経路は喘息、潰瘍性結腸炎、慢性関節リウマチのような炎症性疾患における慢性炎症の媒介に関与するとされており（Epstein,New England Journal of Medicine 336：1066,1997）、かつ、NF-κBまたはNF-κB経路を抑制することはこれらの疾患の処置の有効な方法であると考えられる。NF-κBおよびNF-κB経路はまた、特に媒介脂肪線条形成においてアテローム性動脈硬化症に関与するとされており（Navabら、American Journal of Cardiology,76：18C,1995）、かつ、NF-κBまたはNF-κB経路を抑制することはアテローム性動脈硬化症の有効な治療法であると考えられる。NF-κBにより活性化される遺伝子の中には、cIAP-1、cIAP-2、TRAF1およびTRAF2が含まれ、これら全てはTNF-α誘導細胞死から細胞を保護することが分かっている（Wangら、Science,281：1680-83,1998）。CLAP、即ちCARDを誘導するタンパク質は、Apaf-1-カスパーゼ-9経路を活性化し、NIKおよびIκBキナーゼの上流に作用することによりNF-κBを活性化する（Srinivasulaら、前記）。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は少なくとも部分的にはCARD-4がNF-κBおよびJNKの活性化により媒介される生得的な免疫応答に関わること、および、CARD-4が細菌感染への免疫応答に関わることを発見したことに基づいている。
【０００６】
本明細書に記載するCARD-4のcDNA（配列番号:1）は953アミノ酸のタンパク質（配列番号:2）をコードする2859ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配列番号:1のヌクレオチド245〜3103；配列番号:3）を有する。CARD-4はCARDドメイン（配列番号:2のアミノ酸15〜114）を有する。ヒトCARD-4もまた配列番号:2の概ねアミノ酸198から概ねアミノ酸397に伸張するヌクレオチド結合ドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸202から概ねアミノ酸209に伸張するWalker Box「A」；配列番号:2の概ねアミノ酸280から概ねアミノ酸284に伸張するWalker Box「B」；配列番号:2の概ねアミノ酸127から概ねアミノ酸212に伸張するキナーゼ1a（Pループ）サブドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸273から概ねアミノ酸288に伸張するキナーゼ2サブドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸327から概ねアミノ酸338に伸張するキナーゼ3aサブドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸674から概ねアミノ酸950に伸張する10ロイシンリッチリピートを有する。第1のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸674から概ねアミノ酸701に伸張する。第2のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸702から概ねアミノ酸727に伸張する。第3のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸728から概ねアミノ酸754に伸張する。第4のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸755から概ねアミノ酸782に伸張する。第5のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸783から概ねアミノ酸810に伸張する。第6のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸811から概ねアミノ酸838に伸張する。第7のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸839から概ねアミノ酸866に伸張する。第8のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸867から概ねアミノ酸894に伸張する。第9のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸895から概ねアミノ酸922に伸張する。第10のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸923から概ねアミノ酸950に伸張する。
【０００７】
本明細書に記載したCARD-4配列の他に、その全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,340,576号または同第6,369,196号に記載されたCARD-4のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列も本発明の実施において使用できる。例えば米国特許第6,340,576号または6,369,196号に記載されたCARD-4配列またはそのフラグメント（例えば機能的ドメイン、例えばCARD、NBSまたはLRRドメイン）のいずれも本明細書に記載した方法において使用できる。
【０００８】
CARD-4はNF-κB経路を活性化し、カスパーゼ-9活性を増強する。さらに、CARD-4はCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9およびBCLXと会合する。活性化により、CARD-4はヌクレオチドと結合すると考えられ、これによりCARD-4はCARD-CARD相互作用を介してCARD含有カスパーゼと結合して活性化し、これにより細胞内における炎症および/またはアポトーシスのシグナル伝達経路を活性化する。CARD-4は米国特許第6,340,576号または同第6,369,196号に詳細に記載されている。
【０００９】
本発明は細菌感染または細菌起源の障害を有する個体の診断および処置の方法を包含する。細菌性病原体は、マイコバクテリウム種、ヘリコバクター種（例えばヘリコバクター・ピロリ）、サルモネラ種（例えばサルモネラ・チフィムリウム）、シゲラ種（例えばフレクスナー赤痢菌）、大腸菌、リケッチア種、リステリア種、レジオネラ種（例えばレジオネラ・ニューモニア）、シュードモナス種、ビブリオ種およびボレリア種（例えばボレリア・バーグドルフェン）の細菌を含むが、これらに限定されない。細菌起源の障害は例えば、上気道の細菌感染（例えば鼻咽頭炎、副鼻腔炎、可能性および急性の中耳炎、扁桃周囲膿瘍）、慢性閉塞性肺疾患（例えば気腫および気管支炎）、中枢神経系の細菌感染（例えば細菌性髄膜炎、硬膜下蓄膿および敗血症性血栓静脈炎）の敗血症、炎症性腸疾患（例えば細菌性赤痢、クローン病、潰瘍性結腸炎、虚血性結腸炎、憩室炎または憩室症および虫垂炎）および敗血症および敗血症性ショックである。
【００１０】
細菌性LPSに応答したCARD-4によるNF-κBおよびJNKの活性化によって例えばサイトカインおよびケモカインといった数種の重要な生得的な免疫のメディエーター、の生産をもたらすと推定される。従って、免疫応答性は細胞内のCARD-4の発現または活性を調節（増大または減少）することにより調節（増大または減少）できる。
【００１１】
細菌性LPSは敗血症性ショックとして知られている劇的な全身反応を誘導する能力を有するグラム陰性細菌の細胞壁成分である。この症候群は制御不可能な全身性細菌感染の結果として生じる場合が多い、サイトカイン、特にTNF-αの圧倒的な分泌の結果である。敗血症性ショックはCARD-4のLPS誘導活性化に干渉することにより予防または処置できると期待される。例えば、NF-κBのCARD-4誘導活性化は敗血症性ショックに関連する症状を低減または抑制すると期待される。
【００１２】
本発明はLPSおよび細菌感染により活性化される本明細書に記載するCARD-4シグナル伝達経路を調節する処置の方法を包含する。更にまた、これらのCARD-4経路のモジュレーター（アクチベーターまたはインヒビター）をスクリーニングする方法も包含される。
【００１３】
本発明はまたCARD-4の発現を調節（DNA、mRNAまたはタンパク質レベルで、例えばmRNAスプライシングを改変することにより）する化合物を投与することによる、または、CARD-4の活性を改変することによる、アポトーシス性の細胞死の異常なレベルまたは速度（望ましくない程度の高値または望ましくない程度の低値）、Fas/APO-1受容体複合体の異常な活性化、TNP受容体複合体の異常な活性化、またはカスパーゼの異常な活性化に関わる障害に罹患した患者の診断および処置の方法を包含する。このような化合物の例は小分子、アンチセンス核酸分子、リボザイムおよびポリペプチドを含む。
【００１４】
特定の障害は、アポトーシスが抑制されるか、またはアポトーシスが望ましくない程度に低い速度で起こる場合に、生産され生存または増殖を持続する生存細胞の増大した数量に関連している。CARD-4の発現または活性を調節する化合物を用いてこのような障害を処置または診断することができる。これらの障害は癌（特に濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、黒色腫、結腸癌、肺癌、p53の突然変異に関わる癌、ならびに、例えば乳癌、前立腺癌、および卵巣癌のようなホルモン依存性の腫瘍）を包含する。このような化合物はウィルス感染症（例えばヘルペスウィルス、ポックスウィルスおよびアデノウィルスによるもの）の処置にも使用できる。発生の間に生じる、または免疫応答の間の身体的突然変異の結果として生じる自己免疫細胞の除去が行えない場合、自己免疫疾患が生じる場合がある。即ち、自己免疫障害は望ましくない程度に低いレベルのアポトーシスにより生じる場合がある。従って、CARD-4の活性または発現のモジュレーターは自己免疫障害（例えば全身性エリテマトーシス、免疫関連糸球体腎炎および関節炎）を処置するために使用できる。
【００１５】
多くの疾患が望ましくない程度に速いアポトーシスに関わっている。CARD-4の発現または活性のモジュレーターはこのような障害の処置または診断のために使用できる。例えば細胞集団はウィルス感染の事象の際には枯渇する場合が多く、恐らくは最も劇的な例としてヒト免疫不全ウィルス（HIV）により生じる細胞の枯渇が挙げられる。意外にも、HIV感染の間に死滅する大部分のT細胞はHIVに感染しないと考えられる。多くの説明が提案されたが、最近の証拠によれば、CD4受容体の刺激が未感染T細胞がアポトーシスを起こしやすい傾向を増強していることが示唆されている。多種多様の神経学的疾患は特定のセットのニューロンの経時的消失を特徴としている。このような障害にはアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、色素性網膜炎、棘筋萎縮および種々の形態の小脳変性が包含される。これらの疾患における細胞の消失は炎症性応答を誘導せず、そしてアポトーシスが細胞死のメカニズムであると考えられる。更にまた、多くの血液学的疾患が血液細胞の生産の減少と関わっている。これらの障害には慢性疾患に関わる貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少症および脊髄形成異常症候群が包含される。血液細胞の生産の障害、例えば脊髄形成異常症候群および一部の形態の再生不良性貧血は骨髄内のアポトーシス性細胞死の亢進に関わっている。これらの障害はアポトーシスを促進する遺伝子の活性化、体細胞または造血性生存因子における後天性の不全、または、毒素および免疫応答のメディエーターの直接の作用に起因していると考えられる。細胞死に関わる2種の一般的な障害は、心筋梗塞および卒中である。両障害において、血流の急速な消失の事象において生じる虚血の中央領域内の細胞が壊死の結果として急速に死滅すると考えられる。しかしながら、中央の虚血領域の外では細胞はより延長された時間にわたって死滅し、形態学的にはアポトーシスにより死滅すると考えられる。
【００１６】
CARD-4ポリペプチド、核酸およびCARD-4の発現または活性のモジュレーターは免疫障害の処置に使用できる。このような免疫障害は、炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性結腸炎）を含む慢性炎症性疾患および障害；反応性関節炎（例えばライム病）および慢性関節リウマチを含む関節炎；インスリン依存性糖尿病；多発性硬化症、ハシモト甲状腺炎およびグレーブ病を含む臓器特異的自己免疫；接触性皮膚炎；乾癬；移植片拒絶反応；移植片対宿主病；サルコイドーシス；喘息およびアレルギー（例えばアレルギー性鼻炎）を含むアトピー性症状；食物アレルギーを含む胃腸アレルギー；好酸球増多症；結膜炎；糸球体腎炎；蠕虫感染（例えばリーシュマニア症）を含む特定の病原体への感受性亢進、HIVを含む特定のウィルス感染、ならびに結核およびらい腫らいを含む細菌の感染；気管支炎および慢性閉塞性肺疾患呼吸管を含む炎症性障害であるが、これらに限定されない。
【００１７】
上記した障害のほかに、CARD-4ポリペプチド、核酸およびCARD-4の発現および活性のモジュレーターは細胞シグナル伝達の障害およびCARD-4が発現される組織の障害の処置のために使用できる。
【００１８】
CARD-4核酸は配列番号:1、配列番号:3またはその補体に示されるヌクレオチド配列と少なくとも45％（または55％、65％、75％、85％、95％または98％）の同一性を有する核酸分子を包含する。
【００１９】
CARD-4核酸は配列番号:1、配列番号:3またはそれら補体に示されるヌクレオチド配列の少なくとも150（300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1300、1600または1931）ヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子を包含する。
【００２０】
CARD-4核酸は配列番号:2のアミノ酸配列に少なくとも45％（または55％、65％、75％、85％、95％または98％）の同一性であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。
【００２１】
CARD-4核酸は配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子を包含し、フラグメントは配列番号:2の少なくとも15（25、30、50、100、150、300、400または540、600、700、800、900）の連続アミノ酸を含む。
【００２２】
CARD-4核酸は配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸分子を包含する。一般的に、遺伝子の対立遺伝子変異体は前記遺伝子の同じ染色体位置にマッピングされるものとして容易に同定され得る。例えば、ヒトCARD-4遺伝子の染色体位置はSHGC-31928遺伝子マーカーに近接する染色体7上にある。ヒトCARD-4の対立遺伝子変異体は遺伝子マーカーSHGC-31928の近傍の染色体7上のヒトCARD-4遺伝子座にマッピングされるものとして容易に同定され得る。
【００２３】
CARD-4タンパク質には、配列番号:2のアミノ酸配列に少なくとも約65％、好ましくは75％、85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のCARDドメイン（例えば配列番号:2の概ねアミノ酸残基15〜114）に少なくとも約85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のヌクレオチド結合ドメイン（例えば配列番号:2の概ねアミノ酸残基198〜397）に少なくとも約85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のキナーゼ1a（P-ループ）サブドメイン（例えば配列番号:2の概ねアミノ酸127〜概ねアミノ酸212）に少なくとも約85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のキナーゼ2サブドメイン（例えば配列番号:2の概ねアミノ酸273〜概ねアミノ酸288）に少なくとも約85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のキナーゼ3aサブドメイン（例えば配列番号:2の概ねアミノ酸残基327〜238）に少なくとも約85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のロイシンリッチリピート（例えば配列番号:2の概ねアミノ酸残基674〜701）に少なくとも約85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたCARD-4タンパク質；配列番号:2のアミノ酸702〜アミノ酸727；配列番号:2のアミノ酸728〜アミノ酸754；配列番号:2のアミノ酸755〜アミノ酸782；配列番号:2のアミノ酸783〜アミノ酸810；配列番号:2のアミノ酸811〜アミノ酸838；配列番号:2のアミノ酸839〜アミノ酸866；配列番号:2のアミノ酸867〜アミノ酸894；配列番号:2のアミノ酸895〜アミノ酸922；および、配列番号:2のアミノ酸923〜アミノ酸950）が包含される。
【００２４】
CARD-4核酸分子はCARDスーパーファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子と比較してCARD-4核酸分子を特異的に検出するために使用できる。例えば、1つの態様においては、CARD-4核酸分子は配列番号:1、配列番号:3またはその補体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。別の態様においてはCARD-4核酸分子は少なくとも300（350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1300、1600、1900、2100、2400、2700、3000または3382）ヌクレオチド長であり、配列番号:1、配列番号:3またはその補体に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。別の態様においては、単離されたCARD-4核酸分子はCARD-4のCARDドメインをコードする配列番号:1のヌクレオチド287〜586またはその補体を含む。更に別の態様においては、本発明はCARD-4核酸のコーディング鎖に対するアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。
【００２５】
CARD-4核酸を含むベクター、例えば組み換え発現ベクターを本発明の方法において使用できる。別の態様において、本発明はこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまたCARD-4タンパク質が生産されるように組み換え発現ベクターを含む本発明の宿主細胞を適当な倍地中で培養することによるCARD-4タンパク質の製造方法を提供する。
【００２６】
好ましいCARD-4タンパク質およびポリペプチドは天然に存在するヒトCARD-4が有する少なくとも1種の生物学的活性の、例えば（1）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質:タンパク質相互作用を示す能力；（2）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とCARD-CARD相互作用を示す能力；（3）CARD-4リガンド（例えばCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9および/またはBCLX）に結合する能力；（4）細胞内標的に結合する能力；（5）カスパーゼ-9活性を増強する能力；および（6）NF-κB経路を活性化する能力を有する。他の活性には、（1）細胞増殖の調節；（2）細胞分化の調節；（3）細胞死の調節；および（4）炎症および/または生得的な免疫応答の調節が包含される。
【００２７】
CARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分は非CARD-4ポリペプチド（例えば非相同のアミノ酸配列）と作動可能に連結してそれぞれCARD-4融合タンパク質を形成できる。本発明は更に、CARD-4タンパク質に特異的に結合する抗体、例えばモノクローナルまたはポリクローナルの抗体も特徴とする。更に、CARD-4タンパク質または生物学的に活性なその部分は、任意で薬学的に許容される単体を含む薬学的組成物に配合することができる。
【００２８】
本発明はCARD-4活性の存在が生物学的試料において検出されるようにCARD-4活性のインジケータを検出することができる薬剤に生物学的試料を接触させることにより生物学的試料中のCARD-4の活性または発現の存在を検出するための方法を提供する。
【００２９】
別の局面において、本発明は細胞内のCARD-4の活性または発現が調節されるようにCARD-4の活性または発現を調節（抑制または刺激）する薬剤に細胞を接触させることを含むCARD-4活性を調節するための方法を提供する。1つの態様においては、薬剤はCARD-4タンパク質に特異的に結合する抗体である。別の態様においては、薬剤はCARD-4遺伝子の転写、CARD-4mRNAのスプライシングまたはCARD-4mRNAの翻訳を調節することによりCARD-4の発現を調節する。更に別の態様においては、薬剤はCARD-4mRNAまたはCARD-4遺伝子のコーディング鎖に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【００３０】
1つの態様においては、本発明の方法は、異常なCARD-4タンパク質または核酸の発現または活性を特徴とする、または、CARD-4の発現または活性に関連する障害を有する対象に、CARD-4のモジュレーターである薬剤を投与することにより前記対象を処置するために使用される。別の態様においては、CARD-4モジュレーターはCARD-4核酸分子である。別の態様においては、CARD-4モジュレーターはペプチド、ペプチドミメティックまたは他の小分子である。
【００３１】
本発明はまた（i）CARD-4タンパク質をコードする遺伝子の異常な調節または突然変異；（ii）CARD-4タンパク質をコードする遺伝子の誤制御(misregulation)；（iii）異常なRNAスプライシング；および（iv）遺伝子の野生型がCARD-4活性を有するタンパク質をコードするようなCARD-4タンパク質の異常な翻訳後修飾、の少なくともいずれかによって特徴付けられる遺伝子の病変または突然変異の有無を同定するための診断アッセイ法を提供する。
【００３２】
別の局面において、本発明はCARD-4タンパク質に結合するかその活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。一般的に、このような方法は試験化合物の存在下および非存在下においてCARD-4タンパク質の生物学的活性を測定すること、および、CARD-4タンパク質の活性を改変する化合物を同定することを包含する。
【００３３】
本発明は更に化合物の存在下および非存在下におけるCARD-4の発現を測定することによってCARD-4の発現を調節する化合物を同定する方法を特徴とする。
【００３４】
本発明は更に、NF-κBおよび/またはJNKのCARD-4媒介活性化に干渉する化合物（例えば小分子、ペプチド等）を同定するための方法を特徴とする。NF-κBおよびJNK活性化に関する適当なアッセイ法は後述の通りである。更にまた、活性化は例えば後述する試験法を用いて細胞の核内のホスホ-c-Junの濃度を測定することにより評価することができる。NF-κB活性化の場合は、NF-κBの活性化が相対的にCARD-4特異的であるかどうかを調べるためにTNF-α活性化を測定することが望ましい。
【００３５】
更にまた本発明は、LPSに対する細胞、例えば上皮細胞の応答に干渉する化合物を同定するための方法を特徴とする。このような化合物はLPSの存在下または非存在下にCARD-4のオリゴマー化（またはCARD-4のCARDドメインのオリゴマー化）に干渉する化合物を同定することにより同定してよい。このようなアッセイ法はインビボまたはインビトロで行うことができる。本発明はまたCARD-4の活性化または活性をブロックすることにより細胞内病原体に関わる毒性ショックまたは炎症を処置するための方法を特徴とする。例えばCARD-4のNBSドメインに結合するヌクレオチドに干渉する化合物を投与することが望ましい。CARD-4活性のインヒビターは優性の陰性突然変異体として機能するポリペプチドを包含する。例えばCARDドメインを欠いた変異体CARD-4が挙げられる。
【００３６】
本発明はNF-κBのリポ多糖類（LPS）媒介活性化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、前記方法は：LPSを保有し、かつ、CARD-4のカスパーゼリクルートメントドメイン（CARD）、ヌクレオチド結合部位（NBS）またはロイシンリッチリピート（LRR）ドメインを含むポリペプチドを発現する細胞を提供すること；この細胞を試験化合物に曝露すること；および、この細胞内のNF-κB活性化を測定すること、を含み、試験化合物非存在下におけるNF-κB活性化と比較した場合の試験化合物存在下における改変されたNF-κB活性化が、試験化合物がNF-κBのLPS媒介活性化を調節する候補化合物であることを示す方法を特徴とする。一部の態様においては、細胞はフレクスナー赤痢菌、サルモネラ・チフィムリウムまたはヘリコバクター・ピロリに感染している。
【００３７】
本発明は更にJNKキナーゼ活性のLPS媒介活性化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、前記方法は：LPSを保有し、かつ、CARD-4のCARD、NBSまたはLRRドメインを含むポリペプチドを発現する細胞を提供すること；この細胞を試験化合物に曝露すること；および、この細胞内のJNKキナーゼ活性を測定すること、を含み、試験化合物非存在下におけるJNKキナーゼ活性と比較した場合の試験化合物存在下における改変されたJNKキナーゼ活性が、試験化合物がJNKキナーゼ活性のLPS媒介活性化を調節する候補化合物であることを示す方法を特徴とする。一部の態様においては、細胞はフレクスナー赤痢菌、サルモネラ・チフィムリウムまたはヘリコバクター・ピロリに感染している。
【００３８】
本発明はまた、LPS誘導免疫応答を調節する候補化合物を同定するための方法であって、前記方法は下記工程：CARD-4のCARD、NBSまたはLRRドメインを含むポリペプチドを発現する細胞を提供すること；LPSをこの細胞内に導入すること；この細胞を試験化合物に曝露すること；および、この細胞内のポリペプチドのオリゴマー化を測定すること、を含み、ここで、試験化合物非存在下におけるポリペプチドのオリゴマー化と比較した場合の試験化合物存在下における改変されたポリペプチドのオリゴマー化が、試験化合物がLPS誘導免疫応答を調節する候補化合物であることを示す方法を特徴とする。一部の態様においては、この細胞はフレクスナー赤痢菌、サルモネラ・チフィムリウムまたはヘリコバクター・ピロリに感染している。
【００３９】
本明細書に記載するスクリーニング方法において使用するポリペプチドは場合により組み換えポリペプチドであることができる。方法は場合によりポリペプチドをコードする非相同核酸を細胞内に導入する更なる工程を含む。ポリペプチドは配列において天然に存在するまたは存在しないCARD-4配列に相当することができる。
【００４０】
本発明はまた、NF-κBまたはJNKのLPS誘導活性化を調節する方法であって、前記方法は：細胞内LPSを保有する細胞を提供すること；および、この細胞内におけるNF-κBまたはJNKのLPS誘導活性化を調節するために十分な量のCARD-4の発現または活性化を調節する化合物に細胞を接触させること、を含む方法を特徴とする。
【００４１】
本発明はまた、個体におけるLPS誘導免疫応答を調節する方法であって、前記方法は：細胞内のLPSを保有する細胞を含む個体を選択すること；および個体におけるLPS誘導免疫応答を調節するために十分な量のCARD-4の発現または活性化を調節する化合物を個体に投与すること、を含む方法を特徴とする。一部の態様においては個体は細菌感染、例えばフレクスナー赤痢菌感染、サルモネラ・チフィムリウム感染またはヘリコバクター・ピロリ感染を有すると診断される。
【００４２】
本発明はまた、細菌感染を処置または予防する方法であって、前記方法は：細菌感染を有する、または、その危険性のある個体を選択すること；細菌感染を処置または予防するために十分な量のCARD-4の発現または活性を調節する化合物を個体に投与すること；を含む方法を特徴とする。
【００４３】
本発明はまた、内因性CARD-4遺伝子の崩壊をゲノムが含むマウスであって、前記崩壊により前記内因性CARD-4遺伝子の発現の低下または発現の欠如がもたらされ、これによりサルモネラ・チフィムリウムまたはヘリコバクター・ピロリ感染を浄化するマウスの能力の低下がおこるマウスを特徴とする。
【００４４】
本発明の他の局面および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかにされるとおりである。
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は部分的にはCARD-4がNF-κBおよびJNKの活性化により媒介される生得的な免疫応答に関わること、および、CARD-4が細菌感染への免疫応答に関わることを発見したことに基づいている。
【００４６】
CARD-4はフレクスナー赤痢菌および細胞内LPSに応答したNF-κBおよびJNKの活性化を媒介する
細胞内LPSへの細胞応答が多くの刺激に対するストレス応答において重要なキナーゼであるc-Jun N末端キナーゼ（JNK）の活性化を含むかどうか調べるために実験を行った。JNKの標的であるc-Junはセリン63および73上でこのキナーゼによりホスホリル化され、この事象は転写を活性化するその能力を増強する。c-Junは炎症応答における別の重要な調節物質である転写因子AP-1の成分である（Folettaら、（1998）J Leukoc Biol 63：139-52）。
【００４７】
HeLa細胞を以前に記載されているように、2時間、野生型の侵襲性のフレクスナー赤痢菌菌株M90Tまたはプラスミドキュアされた非侵襲性の菌株BS176に感染させた（Philpottら、2000,J.Immunol.165：903-14）。次に感染させた細胞を、ホスホ-c-Junに関してはこのタンパク質に対するホスホ特異的モノクローナル抗体を用いて（Lallemandら、1998,EMBO J.,17：5615）およびLPSについては感染細菌を標識するためにウサギポリクローナル抗LPS抗体を用いて共に染色した。染色された細胞は従来の蛍光顕微鏡を用いて観察した。セリン63上でホスホリル化されたc-Junに対して特異的な抗体による感染細胞の免疫蛍光染色によれば、JNKは野生型フレクスナー赤痢菌により活性化され、ホスホ-c-Junの核蓄積をもたらしたことが示唆された（図1A）。これとは対照的に、非侵襲性の菌株はc-Junホスホリル化を誘導しなかった（図1A）。NF-κB誘導に関して以前から明らかにされているように（Philpottら、2000,J.Immunol.,165：903）、フレクスナー赤痢菌によるJNKの活性化はLPSのマイクロインジェクションにより模倣できた（図1B）。慨すれば、HeLa細胞にFITCデキストランをマイクロインジェクションし、マイクロインジェクションされた細胞と緩衝液単独または精製大腸菌LPS 0111：B4マイクロインジェクションされた細胞を以前に報告されているように同定した（Philpottら、2000,J.Immunol.,165：903）。37℃、5％CO2条件下で1時間インキュベートした後、細胞をホスホ-c-Junに関して染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４８】
LPSを感知するための上皮細胞内に存在する細胞内の検出系は、細胞内LPS検出からNF-κBおよびJNKの活性化に至るシグナル伝達経路を調べることにより検討した。TNFaおよびIL-1により誘導されるシグナル伝達経路に関しては多くのことが知られており、これら両方のシグナルはNF-κBとJNKの活性化をもたらす（Songら、1997,Proc.Natl.Acad.Sci.,94：9792；O’Neillら、1998,J.Leuko Biol.63：650）。更にまた、TLRにより媒介された細胞内LPS検出からNF-κBおよびJNKに至るシグナル伝達経路はIL-1経路のものと同一である（O’Neillら、1998,J.Leuko Biol.63：650）。従って、フレクスナー赤痢菌誘導シグナル伝達経路がTNFaおよびIL-1誘導経路に共通のシグナル伝達成分を共有している可能性について検討した。TLR/IL-1特異的シグナル伝達タンパク質であるTRAF6（Caoら、1996,Nature 383：443）並びにTNFa特異的タンパク質TRAF2（Songら、1997,Proc.Natl.Acad.Sci.,94：9792）の優性陰性型を上皮細胞内で過剰発現させ、NF-κB応答性ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイ法を用いてフレクスナー赤痢菌誘導NF-κB活性化に対するその作用を調べた。
【００４９】
慨すれば、HEK293細胞を、トランスフェクションの効率を規格化するためにNF-κBルシフェラーゼレポータープラスミドおよびβ-ガラクトシダーゼプラスミドを用いながら、ベクター単独またはTRAF2（DN-TRAF2）またはTRAF6（DN-TRAF6）の優性陰性形態をコードするDNA漸増量でトランスフェクトした。30時間後、細胞に野生型のフレクスナー赤痢菌を感染させるか、または、TNFa（100ng/ml）またはIL-1（10ng/ml）のいずれかを4時間投与し、次に以前に報告されている通りにルシフェラーゼ活性についてアッセイした（Philpottら、2000,J.Immunol.165：903-14）。
【００５０】
優性陰性TRAF2およびTRAF6発現のいずれもそれぞれTNFaおよびIL-1によるNF-κB誘導を抑制した濃度ではNF-κBルシフェラーゼレポーターのフレクスナー赤痢菌誘導に影響せず（図3Aおよび3B）、そして優性陰性発現プラスミドのより高用量ではわずかな抑制が観察されたのみであった。
【００５１】
これらの所見はフレクスナー赤痢菌誘導NF-κB活性化がTRAF2およびTRAF6非依存性であることを示している。少なくともTNFaについてはリクルートメント因子のTRAFファミリー内に機能的重複性があることが明確である。例えば、TRAF2欠損マウスはなおTNFaに応答することが可能であり（Yeh,1997,Immunity,7：715）、かつ、重複性はTLR/IL-1シグナル伝達経路にも存在する可能性がある。従って、TRAF6の上流のTLR/IL-1経路内の因子がフレクスナー赤痢菌感染によるNF-κBおよびJNKの誘導のために必須である可能性について検討した。これはTRAF6の上流のIL-1シグナル伝達成分を欠損している3種の異なるHEK293上皮細胞系統を用いて調べた（Liら、1999,Mol.Cell.Biol.,19：4643）。これらの細胞系統の1つである11AはNF-κBとJNKの両方のLPS誘導活性化に関与することがわかっているインターロイキン-1受容体関連キナーゼ（IRAK）が欠損している（Kanakarajら、1998,J.Exp.Med.,187：2037）。他の2細胞系統である12Aおよび13AはIRAKの上流の未知の因子が欠損している（Liら、1999,Mol.Cell.Biol.,19：4643）。慨すれば、フレクスナー赤痢菌感染、TNFa投与またはIL-1投与の後のNF-κBの活性化を親HEK293細胞および3種のIL-1シグナル伝達欠損細胞系統において比較した。NF-κB活性はNF-κB受容体アッセイ法またはEMSAにより感染またはサイトカイン投与の後に評価した（Philpottら、2000,J.Immunol.165：903-14）。フレクスナー赤痢菌感染は行ったがIL-1投与は行わなかった場合、IRAK欠損293上皮細胞（11A細胞）並びに他の2種のIL-1シグナル伝達欠損細胞系統においてNF-κB（図3C）とJNKの両方が活性化された。
【００５２】
IRAKの相同体であるIRAK2は、LPSのTLR媒介応答性におけるその役割は調べられていないが、IL-1シグナル伝達に関与しているとされている（Muzioら、1997,Science,278：1612）。
【００５３】
IRAK2がIRAK欠損細胞においてフレクスナー赤痢菌によるNF-κB誘導を媒介するかどうかを調べるため、優性陰性IRAK2をこれらの細胞（11A細胞）において過剰発現させ、次にフレクスナー赤痢菌を感染させるか、またはIL-1を投与した。優性陰性IRAK2はIRAK欠損細胞のIL-1投与後に観察されたNF-κBの活性化の僅かな誘導を消失していたたが、この分子はフレクスナー赤痢菌誘導活性化に対しては作用を有していなかった。これらの所見を合わせると、NF-κBおよびJNKのフレクスナー赤痢菌誘導活性化は共にIRAKおよびIRAK2非依存性であることを示している。
【００５４】
MyD88はNF-κBおよびJNKへのTLR/IL-1シグナル伝達に関与している重要なアダプタータンパク質である（O’Neillら、1998,J.Leuko Biol.63：650）。実際MyD88はこの因子を欠損しているマウス、例えばTLR4突然変異C3H/HeJマウス（Poltorakら、1998,282：2085）がLPSに高度に耐性である（Kawaiら、1999,Immunity 11：115）であることから、LPS応答性に必須である。従って侵襲性フレクスナー赤痢菌によるNF-κBの誘導におけるMyD88の役割を検討した。慨すれば優性陰性MyD88をコードするDNAの漸増量をNF-κBおよびβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドと共にHEK293細胞にトランスフェクトし、4時間後にこの細胞のルシフェラーゼ活性を調べた。NF-κBレポーターアッセイ法を少なくとも3回2連で実施した。この研究によれば、優性陰性MyD88はNF-κBルシフェラーゼレポーター遺伝子のIL-1誘導活性化を抑制したが、フレクスナー赤痢菌誘導NF-κB活性化は僅かに影響を受けたのみであった（図3D）。まとめると、これらの所見は、NF-κBおよびJNKのフレクスナー赤痢菌誘導活性化はTLR/IL-1シグナル伝達経路とは異なる経路を経て起こることが示される。従って、TLR以外の異なるLPS検出シグナル伝達系が哺乳類細胞に存在しており、この代替系が細胞内LPSに応答すると考えられる。
【００５５】
CARD-4のLRRドメインはやはりNBSドメインを含んでいるタバコNタンパク質およびアラビドプシスRPS2タンパク質を含む数種の植物疾患耐性タンパク質と有意なアミノ酸類似性を有している（図4A）。植物Rタンパク質とのその類似性およびNF-κBを活性化するその能力により、フレクスナー赤痢菌に感染した上皮細胞における細胞内LPSの検出におけるCARD-4の役割を検討することにした。CARD-4はApaf-1と構造的および機能的な類似性を有している。例えば両方のタンパク質はCARDドメインおよびNBSドメインを有する。更にまた、両方ともに自己オリゴマー化を介して下流のレギュレーターを活性化する。一連の研究を実施することによりフレクスナー赤痢菌感染がCARD-4の活性化をその自己オリゴマー化を介して誘導するかどうかを調べた。完全長のmyc-タグCARD-4を完全長のヘマグルチニン（HA）タグCARD-4とともに同時発現させることにより、フレクスナー赤痢菌感染後の同時免疫沈降実験を行った。慨すれば、HeLa細胞を空ベクターまたはHA-CARD-4またはMyc-CARD-4のいずれかをコードする発現ベクターで24時間トランスフェクトし、種々の時間にわたり、未感染のまま、またはフレクスナー赤痢菌感染の状態で放置する。細胞を収集し、タンパク質抽出液（Ext）をMycまたはHAに対するウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いたウエスタンブロッティングに供し、過剰発現タンパク質の発現濃度を同定した。タンパク質抽出液の他の画分を用いてポリクローナル抗HA抗体を用いた免疫沈降を行った。オリゴマー化されたCARD-4はMycタグCARD-4に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによる免疫沈降で明らかにされた。CARD-4の増強された自己会合は侵襲性フレクスナー赤痢菌感染後20分もの早期に観察された（図4B）。これらの研究は上皮細胞による細胞内病原体の認識におけるCARD-4の役割の生物学的証拠である。
【００５６】
フレクスナー赤痢菌により誘導されたCARD-4の活性化が細胞内LPS検出とNF-κBおよびJNK活性化を含む下流のシグナル伝達事象の活性化との間の重要なつながりであるかどうかを決定するための実験を行った。CARDドメインはCARD-4過剰発現研究におけるNF-κB活性化に必要であるため、このドメインを欠いたCARD-4変異体はフレクスナー赤痢菌によるNF-κBおよびJNK誘導の優性陰性インヒビターとして機能すると考えられる。即ち、一連の実験をCARD-4欠失突然変異体を用いて行った。慨すれば、そのCARDドメインを欠失しているCARD-4変異体（ΔCARD CARD-4）またはLRRドメインを欠失しているCARD-4変異体（ΔLRR CARD-4）のいずれかをコードするプラスミドをNF-κBおよびβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドと共にHEK293細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は上記した通りフレクスナー赤痢菌感染またはTNFa投与の4時間後に調べた。ΔCARD CARD-4分子の過剰発現はフレクスナー赤痢菌誘導NF-κB活性化を用量依存的に抑制する作用を示した（図5A）。
【００５７】
TNFaによるNF-κB受容体コンストラクトの誘導についてはΔCARD CARD-4の過剰発現による影響ははるかに低く、この応答の相対的特異性を証明していた。更にまた、ΔCARD CARD-4分子の過剰発現はインビトロキナーゼアッセイ法で評価した場合フレクスナー赤痢菌によるJNK誘導をブロックしていた（図5C）。フレクスナー赤痢菌感染後のΔCARD CARD-4過剰発現により誘導された優性陰性作用は、NBSドメインを介したCARD-4のオリゴマー化後のシグナルの増幅における干渉、または、LRRドメインを介したCARD-4の上流のLPS誘導シグナル伝達経路の滴定のいずれかによるものと考えられる。
【００５８】
CARD-4のLRRドメインが過剰発現されるのみの実験を行った。慨すれば、HeLa細胞を空ベクターまたはCARD-4完全長（CARD-4-FL）、ΔCARD CARD-4またはCARD-4のLRRをコードする発現ベクターで40時間トランスフェクトした。次に細胞を侵襲性（i）または非侵襲性（ni）のフレクスナー赤痢菌に感染させた。約20分後、細胞を収集しタンパク質抽出液をJNKキナーゼアッセイ法により分析した。規格化されたJNKの倍加活性化をベクターのみの細胞におけるフレクスナー赤痢菌誘導活性化に対して行った。この研究によれば、単独で発現されたLRRドメインはフレクスナー赤痢菌によるNF-κBおよびJNKの両方の活性化を抑制した（図5Bおよび5C）。この結果は、LRRドメインの過剰発現が感染により開始される上流のシグナル伝達経路に干渉するという考え方と合致している。この研究はまた、フレクスナー赤痢菌に感染した細胞におけるJNKの活性化が完全長分子の過剰発現後に増強されたことを示しており（図5C）、このタンパク質の低い内因性濃度が活性化を制限していることを示唆している。CARD-4のLRRドメインの過剰発現はまた、細胞内LPSにより誘導されたシグナル伝達を抑制する。LRRドメインを過剰発現している細胞においては、ベクターのみを発現している細胞と比較してLPSのマイクロインジェクションの後に核内で活性化されたNF-κBおよびホスホ-c-Junを示している細胞数はより少数であった（表1）。
【００５９】
表1に総括した実験にでは、HeLa細胞をベクター単独またはCARD4のLRRドメインのいずれかでトランスフェクトし、トランスフェクト後24時間にLPSをマイクロインジェクションし（Philpottら、2000,J.Immunol.165：903）,、そしてホスホ-c-Jun（前述）またはNF-κBのp65サブユニット（Philpottら、2000,J.Immunol.165：903）について染色した。少なくとも50個の細胞を各条件について計数した。これらの所見を総括すると、NF-κBおよびJNKの活性化により媒介される生得的な免疫応答を誘導することができる細胞内LPS検出系の要素としてのCARD-4が示唆される。
【００６０】
（表１）トランスフェクトされた細胞へのLPSのマイクロインジェクション-NF-κBおよびホスホ-c-Junの誘導に関する検討
2006512045.tif 000002
【００６１】
本明細書に記載の結果によれば、病原体関連分子パターンの内部対外部の提示に基づいて、上皮細胞内に識別系が発生することが示されている。上皮細胞は細胞外LPSに対して耐性があり、細胞内部に提示される同じ分子は炎症応答を開始することが可能である。即ち、これらの細胞は植物と同様の細胞内PAMP検出方法を発生させており、本明細書に提示した所見はCARD-4がこの検出系において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【００６２】
CARD-4はC末端LRRおよびNBSを有するタンパク質の新しいファミリーのメンバーである。しかしながら「シグナル伝達モジュール」ドメインは可変であると考えられる。CARD-4に関するこの研究は、このタンパク質ファミリーが植物疾患耐性タンパク質のヒト相同体となることを示唆している。これらのサイトゾルタンパク質は異なる細胞内病原体または病原体産物への防御応答の媒介に関与していると考えられる。TLRについて示されたとおり、異なる細菌産物の認識に関与する種々のCARD-4様タンパク質が存在すると考えられる。
【００６３】
細菌感染におけるCARD-4の役割
インビボの感染過程におけるCARD-4の役割を調べるために、野生型およびCARD-4欠損マウスにサルモネラ・チフィムリウムまたはヘリコバクター・ピロリのいずれかを感染させ、感染後種々の組織において細菌数を調べた。
【００６４】
サルモネラ・チフィムリウム感染については、6週齢の野生型またはCARD-4欠損マウスを胃経路により5x107コロニー形成単位（CFU）の伝染性サルモネラ・チフィムリウム菌株C52に感染させた。パイアー斑、脾臓および肝臓を感染後5または10日に収集した。組織を粉砕し、希釈し、次にプレーティングして各臓器内のCFU数を評価した。第10日のパイアー斑を除き、第5日および10日の両方で各組織の野生型マウスと比較してCARD-4欠損マウスは各々の臓器で細菌負荷が高値となった。これらの差はCARD-4欠損と野生型マウスの間で対数値で2より多くの有意差となった（図6）。これらの結果によれば、CARD-4はマウスにおけるサルモネラ・チフィムリウム感染の間の細菌クリアランスにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している。
【００６５】
ヘリコバクター・ピロリ感染については、CARD-4欠損および野生型のマウスを胃経路により1x106CFUのマウス感染適合型ヒト病原菌株ヘリコバクター・ピロリ菌株SS1に感染させた。感染1ヵ月後に胃を採取し、胃組織グラム当たりのCFU数を連続希釈プレーティング試料により評価した。平均して対数値で2の差がCARD-4欠損マウスと野生型マウスとの間に観察された（図7）。これらのデータは更に、胃における細菌の増殖および/または感染臓器のクリアランスの制御におけるCARD-4の役割を示唆している。
【００６６】
CARD-4タンパク質および核酸
ヒトCARD-4タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図1A〜1Fに示す（配列番号:1；配列番号:3はオープンリーディングフレームのみを含む）。CARD-4タンパク質の予測されるアミノ酸配列も図1A〜1Fに示す（配列番号:2）。図1A〜1FのヒトCARD-4cDNAは約108kDaの分子量を有する（翻訳後修飾を除く）。
【００６７】
ヒトCARD-4をコードするcDNAを含むプラスミド（pC4L1）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、Manasass,VA）に1998年7月7日に寄託されており、アクセッション番号203035に登録されている。本寄託は特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際認識に関するブタペスト条約の条項の下に維持される。本寄託は当業者の利便としてのみ行っており、寄託が35U.S.C 112条の下に必要とされることを受け入れるものではない。
【００６８】
CARD-4はCARDドメイン（配列番号:2のアミノ酸15〜114）を有する。CARD-4はまた配列番号:2の概ねアミノ酸198から概ねアミノ酸397に伸張するヌクレオチド結合ドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸202から概ねアミノ酸209に伸張する推定Walker Box「A」；配列番号:2の概ねアミノ酸280から概ねアミノ酸284に伸張する推定Walker Box「B」；配列番号:2の概ねアミノ酸197から概ねアミノ酸212に伸張する推定キナーゼ1a（Pループ）ドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸273から概ねアミノ酸288に伸張する推定キナーゼ2ドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸327から概ねアミノ酸338に伸張する推定キナーゼ3aサブドメイン；配列番号:2の概ねアミノ酸674から概ねアミノ酸950に伸張する10推定ロイシンリッチリピートを有する。第1のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸674から概ねアミノ酸701に伸張する。第2のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸702から概ねアミノ酸727に伸張する。第3のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸728から概ねアミノ酸754に伸張する。第4のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸755から概ねアミノ酸782に伸張する。第5のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸783から概ねアミノ酸810に伸張する。第6のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸811から概ねアミノ酸838に伸張する。第7のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸839から概ねアミノ酸866に伸張する。第8のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸867から概ねアミノ酸894に伸張する。第9のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸895から概ねアミノ酸922に伸張する。第10のロイシンリッチリピートは配列番号:2の概ねアミノ酸923から概ねアミノ酸950に伸張する。
【００６９】
CARD-4は特定の保存された構造的および機能的特徴を有する分子のファミリーのメンバーである。本発明のタンパク質および核酸分子を指す場合の「ファミリー」という用語は、共通の構造ドメインを有し本明細書に定義する十分なアミノ酸またはヌクレオチドの配列の同一性を有するタンパク質または核酸分子の2個以上を意味するものとする。このようなファミリーメンバーは天然に存在するものであることができ、かつ同じかまたは異なる種に由来するものであることができる。例えば、あるファミリーはヒト起源の第1のタンパク質およびネズミ起源のそのタンパク質の相同体、並びにヒト起源の第2の異なるタンパク質およびそのタンパク質のネズミ相同体を含むことができる。ファミリーのメンバーはまた共通の機能的特徴を有してよい。
【００７０】
1つの態様においては、CARD-4タンパク質は配列番号:2のCARDドメインと少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは約85％、95％または98％のアミノ酸配列の同一性を有するCARDドメインを含む。
【００７１】
本発明の方法において使用される好ましいCARD-4ポリペプチドは配列番号:2のCARDドメインアミノ酸配列と十分同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７２】
CARD-4ポリペプチドは配列番号:2のヌクレオチド結合ドメインと十分同一であるアミノ酸配列、配列番号:2のWalker Box「A」または配列番号:2のWalker Box「B」と十分同一であるアミノ酸配列、配列番号:2のキナーゼ1aサブドメインと十分同一であるアミノ酸配列、配列番号:2のキナーゼ2サブドメインと十分同一であるアミノ酸配列、配列番号:2のキナーゼ3aサブドメインと十分同一であるアミノ酸配列、または、配列番号:2のロイシンリッチリピートと十分同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７３】
本明細書においては、「十分同一」という用語は第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分または最低数の同一または等価な（例えば同じ側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指し、その場合、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチドの配列は共通の構造ドメインおよび/または共通の機能的活性を有するものとする。例えば、約65％の同一性、好ましくは75％の同一性、より好ましくは85％、95％または98％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチドの配列が本明細書においては十分同一であると定義される。
【００７４】
本明細書において互換的に使用される場合、「CARD-4活性」、「CARD-4の生物学的活性」または「CARD-4の機能的活性」とは、標準的な手法によりインビボまたはインビトロにおいて測定されたCARD-4応答性細胞に対するCARD-4タンパク質、ポリペプチドまたは核酸により発揮される活性を指す。CARD-4活性は直接の活性、例えば第2のタンパク質との会合またはこれに対する酵素活性、または、間接的な活性、例えば第2のタンパク質とのCARD-4タンパク質の相互作用により媒介される細胞シグナル伝達活性であることができる。1つの態様においては、CARD-4活性は以下の活性、即ち、（1）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質:タンパク質相互作用を示す能力；（2）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とCARD-CARD相互作用を示す能力；（3）CARD-4リガンド（例えばCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9および/またはBCLX）に結合する能力；（4）細胞内標的に結合する能力；（5）カスパーゼ-9活性を増強する能力；および（6）NF-κB経路を活性化する能力の一つまたは複数を有する。他の活性には、（1）細胞増殖の調節；（2）細胞分化の調節；（3）細胞死の調節；および（4）炎症および/または生得的な免疫応答の調節が包含される。
【００７５】
1.単離された核酸分子
本発明の1つの局面はCARD-4タンパク質をコードする単離された核酸分子またはその生物学的活性部分、並びにCARD-4核酸分子の増幅または突然変異のためのPCRプライマーとして使用するためのCARD-4コード核酸（例えばCARD-4mRNA）およびフラグメントを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子を用いる方法に関する。本明細書においては「核酸分子」という用語はDNA分子（例えばcDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（例えばmRNA）およびヌクレオチド類縁体を用いて発生させたDNAまたはRNAの類縁体を包含するものとする。核酸分子は1本鎖または2本鎖であることができるが、好ましくは2本鎖DNAである。
【００７６】
「単離された」核酸分子は核酸の天然の原料中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。好ましくは「単離された」核酸は核酸の由来元である生物のゲノムDNA中の核酸に天然にフランキング(naturally flank)しているもの（即ち核酸の5’または3’末端に位置する配列）である配列（好ましくはタンパク質コード配列）を含まない。例えば、種々の態様において、単離されたCARD-4核酸分子は核酸の由来元である細胞のゲノムDNA中の核酸分子に天然にフランキングしているヌクレオチド配列の約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満を含むことができる。更にまた、「単離された」核酸分子、例えばcDNA分子は、組み換え法により生産されたものである場合は他の細胞物質または培地を実質的に含まないか、または、化学的に合成されたものである場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものである。
【００７７】
核酸分子、例えば配列番号:1、配列番号:3のヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの補体を有する核酸分子は、標準的な分子生物学的手法および本明細書に記載する配列情報を用いて単離することができる。配列番号:1または配列番号:3の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用しながら、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング手法を用いて（例えばSambrookら編、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring rbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989に記載の通り）CARD-4核酸分子を単離できる。
【００７８】
核酸は鋳型としてのcDNA、mRNAまたはゲノムDNAおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを標準的PCR増幅手法に従って使用しながら増幅できる。このようにして増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、DNA配列分析により特性化できる。更にまた、CARD-4ヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは例えば自動化DNA合成装置を用いながら標準的な合成手法により調製できる。
【００７９】
別の態様においては、単離された核酸分子は配列番号:1、配列番号:3に示すヌクレオチド配列またはその部分の補体である核酸分子を含む。所与のヌクレオチド配列に相補である核酸分子はその所与のヌクレオチド配列にハイブリダイズして安定な二重らせんを形成できるほど十分にその所与のヌクレオチド配列に対して相補的であるものである。
【００８０】
更にまた、核酸分子はCARD-4をコードする核酸配列の一部のみ、例えばプローブまたはプライマーとして使用できるフラグメントまたはCARD-4の生物学的活性部分をコードするフラグメントを含むことができる。ヒトCARD-4のクローニングにより決定されるヌクレオチド配列は例えば他の組織に由来する他の細胞型におけるCARD-4相同体、並びに他の哺乳類に由来するCARD-4の相同体および相同分子種の同定および/またはクローニングにおいて使用するために設計されたプローブおよびプライマーの発生を可能にする。プローブ/プライマーは典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは典型的には配列番号:1、配列番号:3または配列番号:1または配列番号:3のいずれか一方の天然に存在する突然変異体のセンスまたはアンチセンスの配列の少なくとも約12、好ましくは約25、より好ましくは約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350または400連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００８１】
CARD-4ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて同じまたは同様のタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出できる。プローブはそれに結合した標識基、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターを含む。このようなプローブは本発明のCARD-4タンパク質の対立遺伝子変異体および相同分子種の同定、対象由来の細胞の試料中のCARD-4コード核酸の濃度の測定などによるCARD-4タンパク質を誤発現している細胞または組織の同定、例えばCARD-4mRNA濃度の検出またはゲノムCARD-4遺伝子が突然変異または欠失しているかどうかの測定のための診断用試験キットの一部として使用できる。
【００８２】
CARD-4の「生物学的活性部分」をコードする核酸フラグメントはCARD-4の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:1または配列番号:3の部分を単離し、CARD-4タンパク質のコードされた部分を発現し（例えばインビトロ組み換え発現によるなど）、CARD-4のコードされた部分の活性を評価することにより調製できる。例えばCARD-4の生物学的活性部分をコードする核酸フラグメントは、CARD、NBSまたはロイシンリッチリピートドメインを包含する。CARD-4の生物学的活性部分は場合によりカスパーゼ-9に結合、カスパーゼ-9活性を増強、NF-κB経路を活性化、および/またはJNKを活性化することができる。
【００８３】
本発明は更に遺伝子コードの縮重により配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列とは異なっており、従って、配列番号:1または配列番号:3に示すヌクレオチド配列によりコードされるものと同じCARD-4タンパク質をコードする核酸分子も包含する。
【００８４】
配列番号:1または配列番号:3に示すCARD-4ヌクレオチド配列のほかに、CARD-4のアミノ酸配列の変化をもたらすDNA配列多型が集団内（例えばヒト集団内）に存在してよいことは当業者によって認識され得る。CARD-4遺伝子におけるこのような遺伝子多型は天然の対立遺伝子変異により集団内の個体内に存在する場合がある。本明細書においては、「遺伝子」および「組み換え遺伝子」という用語はCARD-4タンパク質、好ましくは哺乳類CARD-4タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然の対立遺伝子変異は典型的にはCARD-4遺伝子のヌクレオチド配列内の1〜5％の変異をもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありそしてCARD-4の機能的活性を改変しないCARD-4におけるありとあらゆる、このようなヌクレオチド変異およびその結果生じるアミノ酸多型は本発明の範囲内に包含されるものとする。即ち、CARD-4のアミノ酸の例えば1％、2％、3％、4％または5％が他のアミノ酸により置き換えられ、好ましくはアミノ酸は保存的置換により置き換えられる。
【００８５】
更にまた、本明細書に開示したCARD-4とは異なるヌクレオチド配列を有する他の種に由来するCARD-4タンパク質（CARD-4相同分子種/相同体）をコードする核酸も本発明の範囲に包含されるものとする。
【００８６】
一般的に、遺伝子の対立遺伝子変異体は前記遺伝子と同じ染色体位置にマッピングされるものとして容易に発見される。ヒトCARD-4の対立遺伝子変異体は遺伝子マーカーSHGC-31928の近傍の染色体7上のヒトCARD-4遺伝子座にマッピングされるものとして容易に同定可能である。
【００８７】
従って、別の態様において、単離された核酸分子は少なくとも300（325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1300、1600または1931）ヌクレオチド長であり、配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列、好ましくはコーディング配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００８８】
本明細書においては、「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」という表現は、相互に少なくとも60％（65％、70％、好ましくは75％）同一のヌクレオチド配列が典型的には相互にハイブリダイズしたまま残存する下でハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を指すものとする。このようなストリンジェントな条件は当業者の既知であり、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley ＆ Sons,N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6で見出される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的例としては、約45ECにおける6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）におけるハイブリダイゼーション、その後、50〜65EC（例えば50ECまたは60ECまたは65ECにおける0.2×SSC、0.1％SDS中の洗浄一回または複数回である。好ましくは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書においては、「天然に存在する」核酸分子とは自然に存在する（例えば自然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を指す。
【００８９】
集団中に存在する可能性があるCARD-4配列の天然に存在する対立遺伝子変異体のほかに、当業者の知るとおり、変化は配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列内への突然変異により導入することができ、これによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列をタンパク質の機能的能力を改変することなく変化させる。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は生物学的活性を改変することなくCARD-4の野生型配列を改変できる残基であり、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性のために必要である。例えば種々の種のCARD-4タンパク質内で保存されたアミノ酸残基は特に改変されにくいと予測される。
【００９０】
例えば、本発明の好ましいCARD-4タンパク質は少なくとも1つのCARDドメインを含む。更に、タンパク質はまた少なくとも1つのキナーゼドメインまたは少なくとも1つのリンカードメインを含む。CARDドメインは少なくとも1つのヌクレオチド結合ドメインまたはロイシンリッチリピートを含む。このような保存されたドメインが突然変異を受けやすいとは考えにくい。しかしながら他のアミノ酸残基（例えば種々の種のCARD-4内で保存されていないもの、または、半保存されているのみのもの）は活性のために必須ではなく、従って改変されやすいと考えられる。
【００９１】
従って、本発明の別の局面は活性のために必須ではないアミノ酸残基における変化を含むCARD-4タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなCARD-4タンパク質は配列番号:2のアミノ酸配列とは異なり、そして生物学的活性を保持している。1つの態様において単離された核酸分子は配列番号:2のアミノ酸配列に少なくとも約45％同一、65％、75％、85％、95％または98％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
配列番号:1のものとは異なる配列を有するCARD-4タンパク質をコードする単離された核酸分子は、一つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされたタンパク質に導入されるようにCARD-4のヌクレオチド配列（配列番号:1または配列番号:3）に一つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製できる。突然変異は部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような標準的手法により導入できる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は一つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基において行う。即ち、例えば、アミノ酸の1％、2％、3％、5％または10％を保存的置換により置き換えることができる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。即ち、CARD-4中の予測される非必須アミノ酸残基は好ましくは同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基により置き換えられる。または、突然変異は飽和突然変異誘発によるなどしてCARDのコーディング配列の全部または一部に沿って無作為に導入することができ、そして得られた突然変異体をCARDの生物学的活性に関してスクリーニングすることにより活性を保持している突然変異体を同定する。突然変異誘発の後、コードされたタンパク質を無作為に発現させ、タンパク質の活性を測定できる。好ましい突然変異体は天然に存在するヒトCARD-4が有する少なくとも1種の生物学的活性、例えば（1）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質:タンパク質相互作用を示す能力；（2）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とCARD-CARD相互作用を示す能力；（3）CARD-4リガンド（例えばCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9および/またはBCLX）に結合する能力；（4）細胞内標的に結合する能力；（5）カスパーゼ-9活性を増強する能力；および（6）NF-κB経路を活性化する能力を有する。他の活性には、（1）細胞増殖の調節；（2）細胞分化の調節；（3）細胞死の調節；および（4）炎症および/または生得的な免疫応答の調節が包含される。
【００９３】
本発明はアンチセンス核酸分子、即ちタンパク質をコードするセンス核酸に相補的な、例えば2本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的、または、mRNA配列に相補的な分子を包含する。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は全CARD-4コーディング鎖に対し、または、その部分のみに対し、例えばタンパク質コーディング領域（またはオープンリーディングフレーム）の全部または一部に対して相補的であることができる。アンチセンス核酸分子はCARD-4をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対してアンチセンスであることができる。非コーディング領域（「5’および3’未翻訳領域）はコーディング領域にフランキングし、そしてアミノ酸に翻訳されない5’および3’配列である。本明細書に記載するCARD-4をコードするコーディング鎖配列の場合、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則にしたがって設計できる。アンチセンス核酸分子はCARD-4mRNAの全コーディング領域に対して相補的であることができるが、より好ましくは、CARD-4mRNAのコーディングまたは非コーディング領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチド長であることができる。本発明のアンチセンス核酸は当技術分野において知られた操作法を用いて化学合成および酵素的ライゲーション反応により構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増大させるか、またはアンチセンスとセンスの核酸との間に形成される二重らせんの物理的安定性を増大させるために設計された多様に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成でき、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用できる。アンチセンス核酸の生成のために使用できる修飾ヌクレオチドの例は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、2-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）wおよび2,6-ジアミノプリンを包含する。または、アンチセンス核酸は核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に製造できる（即ち、挿入された核酸から転写されたRNAは後のサブセクションにおいて更に説明するとおり対象となる標的核酸に対してアンチセンス方向となる）。
【００９４】
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的にはそれらがCARD-4タンパク質をコードする細胞内のmRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズするか結合して例えば転写および/または翻訳を抑制することによりタンパク質の発現を抑制するように、対象に投与するかインサイチューで発生させる。ハイブリダイゼーションは安定な二重らせんを形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであるか、または、例えばDNA二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主溝内の特異的な相互作用を介するものである。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位への直接の注射を包含する。または、アンチセンス核酸分子は選択された細胞をターゲティングするように修飾し、その後全身投与することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、修飾できる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載するベクターを用いて細胞に送達できる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下にあるように位置づけられたベクターコンストラクトが好ましい。
【００９５】
本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー型の核酸分子であることができる。αアノマー型核酸分子は通常のβ-ユニットとは逆に鎖が相互に平行して走っている相補RNAと特異的な2本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultierら、1987,Nucleic Acids.,Res.,15：6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた2’-o-メチルリボヌクレオチド（Inoueら、1987,Nucleic Acids Res.,15：6131-6148）またはキメラRNA-DNA類縁体（Inoueら、1987,FEBS Lett.,215：327-330）を含むことができる。
【００９６】
本発明はまたリボザイムを包含する。リボザイムはそれらが相補領域を有するmRNAのような1本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。即ち、リボザイム（例えばハンマーヘッドリボザイム（HaselhoffおよびGerlach,1988,Nature 334：585-591に記載））を用いてCARD-4mRNA転写物を触媒的に切断することによりCARD-4mRNAの翻訳を抑制できる。CARD-4をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムは本明細書に記載したCARD-4 cDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えばテトラヒメナL-19IVS RNAの誘導体を、活性部位のヌクレオチド配列がCARD-4をコードするmRNA内で切断するべきヌクレオチド配列に相補であるように構築できる。例えばCechらの米国特許第4,987,071号およびCechらの米国特許第5,116,742号を参照。または、CARD-4mRNAを用いてRNA分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択できる。例えばBartelおよびSzostak（1993）,Science 261：1411-1418を参照。
【００９７】
本発明はまた三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えばCARD-4遺伝子の発現はCARD-4の調節領域（例えばCARD-4のプロモーターおよび/またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングして標的細胞内のCARD-4遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより抑制できる。一般的にHelene（1991）Anticancer Drug Des.6（6）：569-84；Helene（1992）Ann.N.Y.Acad.Sci.,660：27-36；およびMaher（1992）Bioassays,14（12）：807-15を参照。
【００９８】
態様においては、本発明の核酸分子は例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善するために塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において修飾できる。例えば核酸のデオキシリボホスフェート骨格を修飾してペプチド核酸を生成することができる（Hyrupら、1996,Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry,4（1）：5-23参照）。本明細書で使用される「ペプチド核酸」または「PNA」という用語はデオキシリボースホスフェート骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられ、4種の天然の核酸塩基のみが保持されている核酸ミメティック、例えばDNAミメティックを指す。PNAの中性の骨格は低いイオン強度の条件下でDNAおよびRNAへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが分かっている。PNAオリゴマーの合成はHyrupら、1996（前記）、Perry-O’Keefeら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,93：14670-675に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施できる。
【００９９】
CARD-4のPNAは処置および診断用途に使用できる。例えば転写または翻訳の停止を誘導するか、または複製を抑制することによる遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗原性の薬剤としてPNAを使用できる。CARD-4のPNAはまた例えばPNA定方向、PCRクランピングによる遺伝子における1塩基対突然変異の分析において；他の酵素、例えばS1ヌクレアーゼと組み合わせて使用する場合の人工の制限酵素として（Hyrup,1996、前記）；またはDNA配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（Hyrup,1996、前記；Perry-O’Keefeら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,93：14670-675）使用できる。
【０１００】
別の態様においては、PNAに親油性または他のヘルパー基を連結することにより、PNA-DNAキメラを形成することにより、または、当技術分野において知られているリポソームまたは他の薬剤送達技術を使用することにより、例えばその安定性または細胞取り込みを増強するためにCARD-4のPNAを修飾することができる。例えばCARD-4のPNA-DNAキメラはPNAおよびDNAの好都合な特性が組み合わせられるように発生させることができる。このようなキメラはDNA認識酵素、例えばRNAseHおよびDNAポリメラーゼのDNA部分への相互作用を可能とし、PNA部分は高い結合親和性および特異性を与える。塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数および方向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いてPNA-DNAキメラを連結できる（Hyrup,1996、前記）。PNA-DNAキメラの合成はHyrup,1996、前記およびFinnら、1996,Nucleic Acid Research,24（17）：3357-63に記載の通り実施できる。例えばDNA鎖を標準的なホスホロアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成でき、修飾されたヌクレオシド類縁体、例えば5’-（4-メトキシトリチル）アミノ-5’-デオキシチミジンホスホロアミダイトをPNAおよびDNAの5’末端の間で使用することができる（Magら、1989,Nucleic Acid Res.17：5973-88）。次にPNA単量体を段階的にカップリングして5’PNAセグメントおよび3’DNAセグメントを有するキメラ分子を製造する（Finnら、1996,Nucleic Acid Research,24（17）：3357-63）。または、キメラ分子は5’DNAセグメントおよび3’PNAセグメントを用いて合成できる（Peterserら、1975,Bioorganic Med.Chem.Lett.,5：1119-11124）。
【０１０１】
別の態様においては、オリゴヌクレオチドは他の付随基、例えばペプチド（例えばインビボで宿主細胞受容体をターゲティングするため）または細胞膜（例えばLetsingerら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：6553-6556；Lemaitreら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：648-652；国際公開公報第88/09810号参照）または脳血管障壁（例えば国際公開公報第89/10134号参照）を経由する輸送を促進する物質を含んでよい。更にまた、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーショントリガー性の切断剤（例えばKrolら、1988,Bio/Techniques,6：958-976）またはインターカレーション剤（例えばZon,1988,Pharm.Res.5：539-549参照）を用いて修飾することもできる。この目的のためには、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー性の交差結合剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショントリガー性の切断剤等にコンジュゲートしてよい。
【０１０２】
II.単離されたCARD-4タンパク質およびCARD-4抗体
本発明の1つの局面は抗CARD-4抗体を作製するための免疫原として使用するために適する、CARD-4タンパク質、およびその生物学的活性部分並びにポリペプチドフラグメントを使用する方法に関する。1つの態様においては、未変性のCARD-4タンパク質を細胞または組織の原料から、適切な精製スキームにより、標準的なタンパク質精製手法を用いて単離できる。別の態様においては、CARD-4タンパク質を組み換えDNA手法により作製する。組み換え体の発現の代わりに、CARD-4タンパク質またはポリペプチドは標準的なペプチド合成手法を用いて化学的に合成できる。
【０１０３】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的活性部分は、CARDタンパク質の由来元である細胞または組織の原料から生じる細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないものであるか、または、化学的に合成されたものである場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものである。「細胞物質を実質的に含まない」の言語とは、タンパク質がその単離元または組み換え生成原料の細胞の細胞成分から分離されているようなCARD-4タンパク質の調製を含む。即ち、細胞物質を実質的に含まないCARD-4タンパク質は非CARD-4タンパク質（本明細書においては「夾雑タンパク質」とも称する）約30％、20％、10％または5％（乾燥重量）未満を有するCARD-4タンパク質の調製物を包含する。CARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分が組み換えにより製造される場合は、培地を実質的に含まないことが好ましく、即ち、培地はタンパク質調製物の容量の約20％、10％または5％未満に相当する。CARD-4タンパク質が化学合成により製造される場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、即ち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。従って、CARD-4タンパク質のこのような調整物は化学的前駆体または非CARD-4物質の約30％、20％、10％、5％（乾燥重量）未満を有する。
【０１０４】
CARD-4タンパク質の生物学的活性部分は、完全長CARD-4タンパク質より少ないアミノ酸を含み、CARD-4タンパク質の活性少なくとも1種を示す、CARD-4タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号:2に示すアミノ酸配列）と十分同一であるかこれより誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。典型的には、生物学的活性部分はCARD-4タンパク質の少なくとも1種の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。CARD-4タンパク質の生物学的活性部分は例えば10、20、50、100以上のアミノ酸長であるポリペプチドであることができる。好ましい生物学的活性ポリペプチドは一つまたは複数の同定されたCARD-4の構造ドメイン、例えば、CARDドメイン、NBSドメインまたはロイシンリッチリピートを包含する。好ましい生物学的活性ポリペプチドは以下の活性の一つまたは複数、すなわち（1）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質:タンパク質相互作用を示す能力；（2）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とCARD-CARD相互作用を示す能力；（3）CARD-4リガンド（例えばCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9および/またはBCLX）に結合する能力；（4）細胞内標的に結合する能力；（5）カスパーゼ-9活性を増強する能力；および（6）NF-κB経路を活性化する能力を有する。他の活性には、（1）細胞増殖の調節；（2）細胞分化の調節；（3）細胞死の調節；および（4）炎症および/または生得的な免疫応答の調節が包含される。
【０１０５】
更に、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的活性部分を組み換え手法により調製することができ、未変性のCARD-4タンパク質の機能的活性の一つまたは複数に関して評価できる。
【０１０６】
CARD-4タンパク質は配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する。他の有用なCARD-4タンパク質は配列番号:2に実質的に同一であり、配列番号:2のタンパク質の機能的活性を保持しているがなお、天然の対立遺伝子変異または突然変異誘発によりアミノ酸配列において異なる。
【０１０７】
有用なCARD-4タンパク質は配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも約45％、好ましくは55％、65％、75％、85％、95％または99％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号:2のCARD-4タンパク質の機能的活性を保持しているタンパク質である。
【０１０８】
2種のアミノ酸配列または2種の核酸の％同一性を決定するためには、配列を至適な比較目的のために整列させる（例えば第1のアミノ酸または核酸の配列内に、第2のアミノ酸または核酸の配列と至適アライメントのために、ギャップを導入することができる）。次に、相当するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列内の位置が第2の配列内の相当する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されている場合、分子はその位置において同一である。2種の配列の間の％同一性は配列により共有されている同一の位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置数/総位置数x100）。
【０１０９】
2種の配列の間の％相同性の決定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2種の配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例としては、KarlinおよびAltschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：2264-2268に記載され、KarlinおよびAltschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：5873-5877において改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはAltschulら、1990,J.Mol.Biol.,215：403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラム内に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラムを用いて、スコア＝100、ワード長＝12で実施することにより本発明のCARD-4核酸分子と同様または相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索はXBLASTプログラムを用いて、スコア＝50、ワード長＝3で実施することにより本発明のCARD-4タンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。ギャップのあるアライメントを比較目的のために得る場合は、GappedBLASTをAltschulら、1997,Nucleic Acid Res.25：3389-3402に記載のように利用できる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合は、該当するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用できる。http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照できる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的例はMyersおよびMiller,CABIOS（1989）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはGCG配列アライメントソフトウエアパッケージの部分であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれる。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM120重量残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティー12およびギャップペナルティー4を使用できる。
【０１１０】
2種の配列の間の％同一性はギャップを許容するか許容することなく、上記した手法に類似の手法を用いて決定できる。％同一性の計算においては、典型的には厳密なマッチを計数する。
【０１１１】
本発明はまたCARD-4キメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される、CARD-4の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非CARD-4ポリペプチドに作動可能に連結したCARD-4ポリペプチドを含む。「CARD-4ポリペプチド」とは、CARD-4の全部または一部（好ましくは生物学的活性部分）に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、「非CARD-4ポリペプチド」とはCARD-4タンパク質に実質的に同一ではないタンパク質、例えばCARD-4タンパク質とは異なり、同じかまたは異なる生物から誘導されたタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内において、「作動可能に連結した」という用語はCARD-4ポリペプチドおよび非CARD-4ポリペプチドが相互にインフレームに融合していることを指すものとする。非相同のポリペプチドはCARD-4ポリペプチドのN末端またはC末端に融合できる。
【０１１２】
1つの有用な融合タンパク質はCARD-4配列がGST配列のC末端に融合しているGST融合タンパク質である。このような融合タンパク質は組み換えCARD-4の精製を容易にすることができる。別の態様においては、融合タンパク質は別のタンパク質のシグナル配列を含む。特定の宿主細胞（例えば哺乳類宿主細胞）においては、CARD-4の発現および/または分泌は非相同シグナル配列を使用することにより増大できる。例えば、バキュロウィルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を非相同シグナル配列として使用できる（Current Protocols in Molecular Biology,Ausubelら編、John Wiley ＆ Sons,1992）。真核生物の非相同シグナル配列の他の例は、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列を包含する（Stratagene,La Jolla,California）。更に別の例においては、有用な原核生物の非相同シグナル配列にはphoA分泌シグナル（Molecular cloning,Sambrookら、second edition,Cold Spring harbor laboratory press,1989）およびプロティンA分泌シグナル（Pharmacia Biotech；Piscataway,New Jersey）が包含される。
【０１１３】
更に別の態様において、融合タンパク質はCARD-4の全部または一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合しているCARD-4免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のCARD-4免疫グロブリン融合タンパク質は薬学的組成物に配合して対象に投与することにより、CARD-4リガンドと細胞表面上のCARD-4タンパク質の間の相互作用を抑制し、これによりインビボのCARD-4媒介シグナル伝達を抑制することができる。CARD-4免疫グロブリン融合タンパク質はCARD-4同族体リガンドの生態利用性に影響するために使用できる。CARD-4リガンド/CARD-4の相互作用の抑制は増殖および分化の障害の処置、並びに、細胞の生存性の調節（例えば促進または抑制）のための両方について処置上有用である。相互作用の抑制は炎症性障害の処置のために使用してよい。更にまた、本発明のCARD-4免疫グロブリン融合タンパク質は、対象における抗CARD-4抗体の生産のため、CARD-4リガンドの精製のため、およびCARD-4リガンドとのCARD-4の相互作用を抑制する分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法において使用できる。
【０１１４】
好ましくは本発明のCARD-4キメラまたは融合タンパク質は標準的な組み換えDNA手法により製造する。例えば異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを従来の方法により、例えばライゲーションのための平滑末端またはスタッガー末端、制限酵素消化を使用して適切な末端を形成し、適宜、粘性末端をフィルインし、アルカリホスファターゼ処理を行って望ましくない結合を回避し、そして酵素的ライゲーションを行うことにより、インフレームにともにライゲーションする。別の態様においては、融合遺伝子は自動化DNA合成装置を含む従来の方法により合成できる。または、後にアニーリングされて再増幅されキメラ遺伝子配列を発生させることのできる2個の連続した遺伝子フラグメントの間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのPCR増幅を行うことができる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausbelら、John Wiley ＆ Sons,1992参照）。更にまた既に融合部分（例えばGSTポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。CARD-4をコードする核酸は、融合部分がCARD-4タンパク質にインフレームに連結されるようにこのような発現ベクター内にクローニングできる。
【０１１５】
本発明はまたCARD-4アゴニスト（ミメティック）またはCARD-4アンタゴニストのいずれかとして機能するCARD-4タンパク質の変異体に関する。CARD-4タンパク質の変異体は突然変異誘発、例えば個別の点突然変異またはCARD-4タンパク質のトランケーションにより発生できる。CARD-4タンパク質のアゴニストはCARD-4タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同様のもの、またはそのサブセットを保持していることができる。CARD-4タンパク質のアンタゴニストは例えばCARD-4タンパク質の関与する細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することによりCARD-4タンパク質の天然に存在する形態の活性一つまたは複数を抑制できる。即ち、特定の生物学的作用は限定された機能の変異体の投与により発揮することができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体を対象に投与することは、CARD-4タンパク質の天然に存在する形態の投与と比較して、対象に与える副作用が小さい。
【０１１６】
CARD-4アゴニスト（ミメティック）またはCARD-4アンタゴニストのいずれかとして機能するCARD-4タンパク質の変異体は、CARD-4タンパク質アゴニストまたはアンタゴニストの活性に関してCARD-4タンパク質の突然変異体、例えばトランケーション突然変異体のコンビナトリアルなライブラリをスクリーニングすることにより発見できる。1つの態様においては、CARD-4変異体の多様なのライブラリを核酸レベルでコンビナトリアルな突然変異誘発により発生させ、多様なの遺伝子ライブラリによりコードさせる。CARD-4変異体の多様なのライブラリは、例えば潜在的なCARD-4配列の変性したセットが個々のポリペプチドとして、または、そのセットのCARD-4配列を内部に含んでいるより大きい融合タンパク質のセット（例えばファージディスプレイ用）として発現可能であるように遺伝子配列内に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることにより製造できる。変性したオリゴヌクレオチド配列から潜在的CARD-4変異体のライブラリを製造するために用いることができる種々の方法がある。変性した遺伝子配列の化学的分析を自動化DNA合成装置中で行うことができ、そして次に合成遺伝子を適切な発現ベクター内にライゲーションする。遺伝子の変性したセットを使用することにより潜在的CARD-4配列の所望のセットをコードする配列の全てを1混合物中に与えることができる。変性したオリゴヌクレオチドの合成のための方法は当技術分野において知られている（例えばNarang,1983,Tetrahedron,39：3；Itakuraら、1984,Annu.Rev.Biochem.,53：323；Itakuraら、1984,Science,198：1056；Ikeら、1983,Nucleic Acid Res.,11：477）。
【０１１７】
CARD-4の有用なフラグメントは本明細書に記載したドメインまたはサブドメイン、例えばCARDドメイン、NBSドメインまたはLRRドメインを含むかこれからなるフラグメントを包含する。
【０１１８】
更にまたCARD-4タンパク質のコーディング配列のフラグメントのライブラリを用いてCARD-4タンパク質の変異体のスクリーニングおよびその後の選択のためのCARD-4フラグメントの多様なの集団を発生させることができる。1つの態様においては、ニッキングが分子当たり概ね1回のみ起こる条件下においてヌクレアーゼによりCARD-4コーディング配列の2本鎖PCRフラグメントを処理し、2本鎖DNAを変性し、DNAを再生して異なるニッキング産物に由来するセンス/アンチセンス対を含むことができる2本鎖DNAを形成すること、S1ヌクレアーゼで処理することにより再生された二重らせんから1本鎖部分を除去すること、および、得られたフラグメントライブラリを発現ベクターにライゲーションすることにより発生することができる。この方法により、CARD-4タンパク質の種々の大きさのN末端および内部のフラグメントをコードする発現ライブラリを誘導できる。
【０１１９】
点突然変異またはトランケーションにより形成されるコンビナトリアルなライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、選択された特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリをスクリーニングするためのいくつかの手法が当技術分野において知られている。これらの手法はCARD-4タンパク質のコンビナトリアルな突然変異誘発により発生する遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適用できる。大遺伝子ライブラリをスクリーニングするための高スループット分析が可能な最も広範に使用されている手法は典型的には複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリをクローニングすること、得られるベクターライブラリで適切な細胞を形質転換すること、および、所望の活性の検出が遺伝子の産物が検出されるその遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアルな遺伝子を発現することを包含する。ライブラリ内の機能的突然変異体の頻度を増大させる帰納的調和突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis＝REM）をスクリーニングアッセイ法と組み合わせて用いることによりCARD-4変異体を同定する（ArkinおよびYourvan,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：7811-7815；Delgraveら、1993,Protein Engineering,6（3）：327-331）。
【０１２０】
単離されたCARD-4タンパク質またはその部分またはフラグメントを免疫原として用いて標準的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製のための標準的手法によりCARD-4に結合する抗体を発生することができる。完全長のCARD-4タンパク質を用いるか、または、本発明は免疫原として使用するためのCARD-4の抗原性のペプチドフラグメントを提供する。CARD-4の抗原性ペプチドは配列番号:2に示すアミノ酸配列の少なくとも8個（好ましくは10、15、20または30個）のアミノ酸残基または配列番号:2のアミノ酸128〜139または287〜298を含有するポリペプチドを含み、そしてペプチドに対抗して作製された抗体がCARD-4と特異的免疫複合体を形成するように、CARD-4のエピトープを包含する。
【０１２１】
有用な抗体には本明細書に記載したCARD-4のドメインまたはサブドメイン（例えばキナーゼドメイン、CARDドメインまたはロイシンリッチドメイン）に結合する抗体を包含する。
【０１２２】
抗原ペプチドに包含される好ましいエピトープはタンパク質表面に位置するCARD-4の領域、例えば親水性領域である。他の重要な基準には、末端配列に対する優先性、高い抗原指数（例えばJameson-Wolfアルゴリズムで推定されるもの）、ペプチド合成の容易さ（例えばプロリンの回避）および高い表面確率（例えばEminiアルゴリズムで予測されるもの；図8および図9）が包含される。
【０１２３】
CARD-4の免疫原は典型的には、免疫原で適当な対象（例えばウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫化することにより抗体の調製のために使用される。適切な免疫原性製剤は例えば組み換え発現されたCARD-4タンパク質または化学合成されたCARD-4ポリペプチドを含むことができる。製剤は更にアジュバント、例えばフロイントの完全または不完全アジュバントまたは同様の免疫刺激剤を含むことができる。免疫原性CARD-4製剤による適当な対象の免疫化によりポリクローナル抗CARD-4抗体応答が誘導される。例えば、ヒトCARD-4のアミノ酸128〜139または287〜298を含むポリペプチドをKLHにコンジュゲートし、得られたコンジュゲートを用いてウサギを免疫化し、2種の免疫原ペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体を発生させた。
【０１２４】
従って、本発明の別の局面は抗CARD-4抗体に関する。本明細書において使用される「抗体」という用語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ちCARD-4のような抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。CARD-4に特異的に結合する分子はCARD-4には結合するが試料中、例えばCARD-4を天然に含有する生物学的試料中の他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより発生できるF（ab）およびF（ab’）2フラグメントを含む。本発明はCARD-4に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書において使用される、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、CARD-4の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の唯一の種を含む抗体分子の集団を指す。即ちモノクローナル抗体組成物は典型的にはそれが免疫反応する相手となる特定のCARD-4タンパク質に対する単結合親和性を示す。
【０１２５】
ポリクローナル抗CARD-4抗体はCARD-4免疫原で適当な対象を免疫化することにより上記したとおり調製できる。免疫化された対象における」抗CARD-4抗体の力価は固定化されたCARD-4を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）のような標準的手法により経時的にモニタリングできる。必要に応じて、CARD-4に対して指向された抗体分子を哺乳類（例えば血液）から単離し、プロテインAクロマトグラフィーのような周知の手法により更に精製してIgG画分を得ることができる。免疫化の後の適切な時期において、例えば抗CARD-4抗体力価が最高値となった時点で、抗体生産細胞を対象より獲得し、KohlerおよびMilstein,1975,Nature,256：495-497に本来記載のハイブリドーマ手法、ヒトB細胞ハイブリドーマ手法（Kozborら、1983,Immunol.Today,4：72）、EBVハイブリドーマ手法（Coleら、1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）、trioma手法のような標準的手法によりモノクローナル抗体を調製できる。種々の抗体モノクローナル抗体ハイブリドーマを製造するための手法は周知である（一般的にはCurrent Protocols in Immunology,1994.Coliganら、（編）John Wiley ＆ Sons,Inc.,New York,NYを参照できる）。慨すれば、不死細胞系統（典型的には骨髄腫細胞）を前述の通りCARD-4免疫原で免疫化した哺乳類からリンパ球（典型的には脾細胞）と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄みをスクリーニングしてCARD-4に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。
【０１２６】
リンパ球と不死化細胞系統とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルを抗CARD-4モノクローナル抗体を発生させる目的のために適用できる（例えばCurrent Protocols in Immunology,前記；Galfreら、1977,Nature,266：55052；R.H.Kenneth,Monoclonal Antibodies：A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Publishing Corp.,New York,New York,1980；およびLerner,1981,Yale J.Biol.Med.,54：387-402参照）。更にまた、当業者の知るとおりやはり有用である方法の多くの変法も使用してよい。典型的には、不死細胞系統（例えば骨髄腫細胞系統）をリンパ球と同じ哺乳類種由来である。例えば、ネズミハイブリドーマは本発明の免疫原製剤で免疫化したマウスから得たリンパ球を不死化マウス細胞系統、例えばヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「HAT培地」）に対して感受性である骨髄腫細胞系統と融合させることにより作製できる。標準的な手法に従って多くの骨髄腫細胞系統、例えばP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫細胞系統を融合相手に使用できる。これらの骨髄腫細胞系統はATCCより入手できる。典型的にはHAT感受性マウス骨髄腫細胞をポリエチレングリコール（「PEG」）を用いてマウス脾細胞と融合させる。次に融合により得られたハイブリドーマ細胞を、未融合および非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺傷する（未融合の脾細胞は形質転換されていないため数日後に死滅する）HAT培地で選択する。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は例えば標準的なELISAアッセイ法を用いてCARD-4に結合する抗体を目標にハイブリドーマ培養上澄みをスクリーニングすることにより検出される。
【０１２７】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、モノクローナル抗CARD-4抗体はCARD-4を用いて組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングしてCARD-4に結合する免疫グロブリンライブラリのメンバーを単離することにより同定して単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作製してスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばファルマシアリコンビナントファージアンチボディシステム、カタログ番号27-9400-01；およびストラタジーンSurfZAPファージディスプレイキット、カタログ番号240612）。更にまた、抗体ディスプレイライブラリの作製およびスクリーニングにおいて使用するのに特に適する方法および試薬の例は例えば米国特許第5,223,409号；国際公開公報第92/18619号；国際公開公報第91/17271号；国際公開公報第92/20791号；国際公開公報第92/15679号；国際公開公報第93/01288号；国際公開公報第92/01047号；国際公開公報第92/09690号；国際公開公報第90/02809号；Fuchesら、1991,Bio/Technology 9：1370-1372；Hayら、1992,Hum.Antibod.Hybridomas,3：81-85；Huseら、1989,Science,246：1275-1281；Griffithsら、1993,EMBO J.,12：725-734に記載されている。
【０１２８】
更に、標準的な組み換えDNA手法を用いて作製できるヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組み換え抗CARD-4抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体も本発明の範囲内に包含される。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は例えば国際公開公報第87/02671号；欧州特許出願0184187号；欧州特許出願0171496号；欧州特許出願0173494号；国際公開公報第86/01533号；米国特許第4,816,567号；欧州特許出願0125023号；Betterら、1988,Science,240：1041-1043；Liuら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：3439-3443；Liuら、1987,J.Immunol.139：3521-3526；Sunら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：214-218；Nishimuraら、1987,Canc,Res.,47：999-1005；Woodら、1985,Nature 314：446-449；およびShawら、1988,J.Natl.Cancer Inst.,80：1553-1559；Morrison,1985,Science,229：1202-1207；Oiら、1986,Bio/Techniques4：214；米国特許第5,225,539号；Jonesら、1986,Nature,321：552-525；Verhoeyanら、1988,Science,239：1534；およびBiedlerら、1998,J.Immunol.,141：4053-4060に記載の方法を用いて当技術分野において知られた組み換えDNA手法により製造できる。
【０１２９】
抗CARD-4抗体（例えばモノクローナル抗体）を用いてアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的手法によりCARD-4を単離できる。抗CARD-4抗体は細胞由来の天然のCARD-4および宿主細胞内に発現される組み換え生産されたCARD-4の精製を容易にする。更にまた、抗CARD-4抗体はCARD-4タンパク質の発現の量およびパターンを評価する目的でCARD-4タンパク質（例えば細胞溶解物または細胞上澄み中）を検出するために使用できる。抗CARD-4抗体を診断的に使用することにより、臨床試験操作法の一部として、例えばある処置計画（treatment regimen)の効果を調べるために、組織中のタンパク質量のモニタリングを行うことができる。検出は抗体を検出可能な物質にカップリングさせることにより容易に行える。検出可能な物質の例は種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質および放射性物質を包含する。適当な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子群の複合体の例はストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを含み；ルミネセント物質の例はルミノールを包含し；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、かつ適当な放射性物質の例は125I、131I、35Sまたは3Hを包含する。
【０１３０】
III.組み換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面のCARD-4（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書に使用されるように、「ベクター」という用語はそれが連結されていた別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの1つの型は「プラスミド」であり、これは別のDNAセグメントをライゲーションすることができる環状の2本鎖DNAループを指す。別の型のベクターはウィルスベクターであり、これにおいては別のDNAセグメントをウィルスゲノム内にライゲーションできる。特定のベクターはそれらが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムとともに複製される。更にまた、特定のベクター、発現ベクターはそれらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向することができる。一般的に組み換えDNA手法において利用される発現ベクターはプラスミド（ベクターの形態である場合が多い。しかしながら、本発明は等価な機能を示すウィルスベクター（例えば複製欠損レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス）のような発現ベクターの他の形態も包含するものとする。
【０１３１】
本発明の組み換え発現ベクターは宿主細胞内の核酸の発現に適する形態で本発明の核酸を含んでおり、このことは、組み換え発現ベクターが発現すべき核酸配列に作動可能に連結された発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択された制御配列一つまたは複数を含むことを意味する。組み換え発現ベクターに関して、「作動可能に連結」とは、対象となるヌクレオチド配列が（例えばインビトロ転写/翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で制御配列に連結していることを意味する。「制御配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現を調節する要素を含むものとする（例えばポリアデニル化シグナル）。このような制御配列は例えばGoeddel,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology,185,Academic Press,San Diego,CA（1990）に記載されている。制御配列には多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指向するもの、および、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向するものを含む（例えば、組織特定的制御配列）。当業者の知るとおり、発現ベクターの設計は形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現濃度などの要因に応じて依存される。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入することにより、本明細書に記載した核酸によりコードされた融合タンパク質またはペプチドのようなタンパク質またはペプチドを製造できる（例えばCARD-4タンパク質、CARD-4の突然変異型、融合タンパク質等）。
【０１３２】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核生物または真核生物、例えば細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクター使用）、酵母細胞または哺乳類細胞におけるCARD-4の発現のために設計できる。適当な宿主細胞はGoeddal,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA（1990）に記載されている。または、組み換え発現ベクターは例えばT7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを使用しながらインビトロで転写、翻訳できる。
【０１３３】
原核生物中のタンパク質の発現は最も頻繁には融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成または誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌中で行われる。融合ベクターは、そこにコードしているタンパク質に対し、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端に多くのアミノ酸を添加できる。このような融合タンパク質は典型的には3つの目的、即ち1）組み換えタンパク質の発現を増大させ、2）組み換えタンパク質の溶解度を増大させ、および3）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組み換えタンパク質の精製に寄与するという働きを有する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、タンパク質分解型の切断部位が融合部分と組み換えタンパク質の接合部に導入されることにより、融合タンパク質の精製の後に融合部分からの組み換えタンパク質の分離が可能となる。このような酵素およびその同族体認識配列にはファクターXa、トロンビンおよびエンテロキナーゼが包含される。典型的な融合発現ベクターにはpGEX（Pharmacia Biotech Inc；SmithおよびJohnson,1988,Gene 67：31-40）、pMAL（New England Biolabs,Beverly,MA）およびpRIT5（Pharmacia,Piscataway,NJ）が包含され、これらはそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを標的組み換えタンパク質に融合させる。
【０１３４】
適当な誘導非融合大腸菌発現ベクターの例はpTrc（Amannら、1988,Gene 69：301-315）およびpET11d（Studierら、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California,1990,60-819）を包含する。pTrcベクターからの標的遺伝子発現はハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存している。pBT 11dからの標的遺伝子発現は同時発現されたウィルスRNAポリメラーゼにより媒介されるT7 gn10-lac融合プロモーター（T7 gnl）からの転写に依存している。このウィルスポリメラーゼはlacUV5プロモーターの転写制御下のT7 gnl遺伝子を有する常在λプロファージから宿主菌株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により供給される。
【０１３５】
大腸菌内の組み換えタンパク質発現を最大にするための1つの方策菌は、組み換えタンパク質をタンパク質分解的に切断できる能力が損なわれている宿主細胞菌内でタンパク質を発現することである（Gottesman,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California,1990,119-128）。別の方策は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌内で優先的に利用されるものであるように発現ベクター内に挿入されるべき核酸の核酸配列を改変することである（Wadaら、1992,Nucleic Acid Res.,20：2111-2118）。本発明のこのような核酸配列の改変は標準的なDNA合成手法により実施できる。
【０１３６】
別の態様においては、CARD-4発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロマイセス・セレビシアエ内での発現のためのベクターの例は、pYepSecl（Baldariら、1987,EMBO J.,6：229-234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz,1982,Cell,30：933-943）、pJRY88（Schultzら、1987,Gene 54：113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation,San Diego,CA）、pGBT9（Clontech,Palo Alto,CA）、pGAD10（Clontech,Palo Alto,CA）、pYADE4およびpYGAE2およびpYPGE2（BrunelliおよびPall,1993,Yeast,9：1299-1308）、pYPGE15（BrunelliおよびPall,1993,Yeast,9：1309-1318）、pACTII（Dr.S.E.Elledge,Baylor College of Medicine）およびpicZ（In Vitrogen Corp,San Diego,CA）である。
【０１３７】
また、CARD-4をバキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞内で発現することができる。培養昆虫細胞（例えばSf9細胞）においてタンパク質を発現するために使用できるバキュロウィルスベクターはpAcシリーズ（Smithら、1983,Mol.Cell Biol.,3：2156-1265）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers,1989,Virology,170：31-39）を包含する。
【０１３８】
更に別の態様において、本発明の核酸は哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例はpCDM8（Seed,1987,Nature,329：840）、pCI（Promega）およびpMT2PC（Kaufmanら、1987,EMBO J.,6：187-195）を包含する。哺乳類細胞において使用する場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウィルス調節要素により与えられる。例えば、一般的に使用されているプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス2、サイトメガロウィルスおよびシミアンウイルス40から誘導される。原核生物および真核生物の細胞の両方に対する他の適当な発現ベクターについてはSambrookら（前記）の第16および17章に記載されている。
【０１３９】
別の態様において、組み換え哺乳類発現ベクターは特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向することができる（例えば組織特異的調節要素を用いて核酸を発現する）。組織特異的調節要素は当技術分野において知られている。適当な組織特異的プロモーターの非限定的例はアルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkertら、1987,Genes Dev.,1：268-277）、リンパ様特異的プロモーター（CalameおよびEaton,1988,Adv.Immunol.,43：235-275）、特にT細胞受容体プロモーター（WinotoおよびBaltimore,1989,EMBO J.,8：729-733）および免疫グロブリン（Banerjiら、1983,Cell,33：729-740；QueenおよびBaltimore,1983,Cell,33：741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター、ByrneおよびRuddle,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：5473-5477）、膵特異的プロモーター（Edlundら、1985,Science,230：912-916）および乳腺特異的プロモーター（例えば乳しょう(milk whey)プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願0264166）を包含する。発生調節（developmentally-regulated）プロモーターもまた包含され、例えばネズミhoxプロモーター（KesselおよびGruss,1990,Science,249：374-379）およびαフェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman,1989,Genes Dev.,3：537-546）が挙げられる。
【０１４０】
本発明は更にアンチセンス方向に発現ベクター中にクローニングされた本発明のDNA分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。即ち、DNA分子はCARD-4mRNAに対してアンチセンスであるRNA分子の発現（DNA分子の転写による）を可能にする方法で制御配列に作動可能に連結している。アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動可能に連結している制御配列は種々の細胞型内のアンチセンスRNA分子の連続発現を指向するようなもの、例えばウィルスプロモーターおよび/またはエンハンサーを選択でき、または、制御配列はアンチセンスRNAの構成的、組織特異的または細胞型特異的な発現を指向するようなものを選択できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下に製造されその活性がベクターを導入した細胞型により決定されるような、組み換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウィルスの形態であることができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の説明はWeintraubら、（Reviews-  Trends in Genetics,Vol.1（1）1986）を参照。
【０１４１】
本発明の別の局面は、本発明の組み換え発現ベクターまたは本発明の単離された核酸分子が導入されている宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」という用語は本明細書において互換的に使用する。このような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も包含するものとする。特定の修飾が後続する世代において突然変異または環境の影響により起こる場合があるため、このような子孫は実際は親細胞と同一でない場合があるが、なお本明細書において使用する用語の範囲に包含されるものとする。
【０１４２】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれであることもできる。例えば、CARD-4タンパク質は大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類の細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞）中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当技術分野において知られている。
【０１４３】
本発明のベクターDNAまたは単離された核酸分子は従来の形質転換またはトランスフェクションの手法を介して原核細胞または真核細胞に導入できる。本明細書に使用されている、「形質転換」および「トランスフェクション」の用語とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム同時沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む宿主細胞への外来核酸（例えばDNA）の導入のための当技術分野において知られた手法の種々のものを指す。形質転換またはトランスフェクション宿主細胞のための適当な方法はSambrookら（前記）および他の実験マニュアルに記載されている。
【０１４４】
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのためには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション手法に応じて、僅か少量の画分の細胞がそのゲノム内に外来性DNAを組み込んでよいことがわかっている。場合により、ベクターDNAは宿主細胞により保持される。別の場合においては、宿主細胞はベクターDNAを保持せず、ベクターにより担持された本発明の単離された核酸分子のみを保持する場合がある。場合により、本発明の単離された核酸分子を用いてベクターを用いることなく細胞を形質転換する場合もある。
【０１４５】
これらの組み込み体を同定して選択するためには、選択マーカー（例えば抗生物質への耐性）をコードする遺伝子を対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入することが一般的である。好ましい選択マーカーはG418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を与えるものを包含する。選択マーカーをコードする核酸はCARD-4をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入するか、または、別のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は薬剤選択により同定できる（例えば選択マーカーの遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１４６】
培養物中の原核生物または真核生物の宿主細胞のような本発明の宿主細胞はCARD-4タンパク質を生産（即ち発現）するために使用できる。従って、本発明は更に本発明の宿主細胞を用いたCARD-4タンパク質の製造方法を提供する。1つの態様においては、方法はCARD-4タンパク質が生産されるような適当な倍地中で（内部には組み換え発現ベクターまたはCARD-4をコードする単離された核酸分子が導入されている）本発明の宿主細胞を培養することを包含する。別の態様においては、方法は培地または宿主細胞からCARD-4を単離することを更に含む。
【０１４７】
本発明の宿主細胞は非ヒトのトランスジェニック動物の製造のために使用できる。例えば1つの態様においては、本発明の宿主細胞は受精卵母細胞または胚性幹細胞であって、これらにはCARD-4コード配列が導入されている。その後、このような宿主細胞を用いて、そのゲノムに外因性CARD-4配列が導入されている非ヒトのトランスジェニック動物、または、内因性CARD-4配列が改変されている相同組み換え動物を作製することができる。このような動物はCARD-4の機能および/または活性を研究するため、および、CARD-4活性のモジュレーターを同定および/または評価するために有用である。本明細書で使用される、「トランスジェニック動物」の用語は、動物の細胞の一つまたは複数がトランスジーンを含んでいる非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類、例えばラットまたはマウスである。トランスジェニック動物の他の例には非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類が包含される。トランスジーンとは、トランスジェニック動物が発生する元となり、成熟動物のゲノム内にも残存することによりトランスジェニックの細胞型または組織の一つまたは複数においてコードされた遺伝子産物の発現を指向する細胞のゲノム内に組み込まれる外因性DNAである。本明細書で使用される、「相同組み換え動物」の用語は動物の発生の前に、内因性CARD-4遺伝子が、内因性の遺伝子と動物の細胞内、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性のDNA分子との間の相同組み換えにより改変されている非ヒト、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスである。
【０１４８】
本発明のトランスジェニック動物は例えばマイクロインジェクション、レトロウィルス感染により受精卵母細胞の雄性前核内にCARD-4コード核酸を導入し、卵母細胞を擬似妊娠の雌性擬似親動物内で発生させることにより作製できる。例えば配列番号:1または配列番号:3のCARD-4cDNA配列は非ヒト動物のゲノム内にトランスジーンとして導入できる。または、ヒトCARD-4遺伝子の非ヒト相同体または同族体、例えばマウスCARD-4遺伝子をヒトCARD-4cDNAに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離し、トランスジーンとして使用できる。例えば、CARD-4のマウス同族体を用いて標準的な方法によりトランスジェニック動物を作製できる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまたトランスジーン内に含めれば、トランスジーンの発現の効率を高めることができる。組織特異的制御配列をCARD-4トランスジーンに作動可能に連結することにより、特定の細胞にCARD-4タンパク質の発現を指向させることができる。胚の操作およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作製方法は、従来技術となっており、かつ例えば米国特許第4,736,866号および4,870,009号、米国特許第4,873,191号およびHogan,Manipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1986）に記載されている。同様の方法を用いて他のトランスジェニック動物も製造される。トランスジェニック始祖動物はそのゲノム内のCARD-4トランスジーンの存在および/または動物の組織または細胞におけるCARD-4mRNAの発現に基づいて同定できる。次にトランスジェニック始祖動物を用いてトランスジーンを保有する別の動物と交配する。更にまた、CARD-4をコードするトランスジーンを保有しているトランスジェニック動物を更に別のトランスジーンを保有している別のトランスジェニック動物と交配できる。
【０１４９】
相同組み換え動物を作製するためには、CARD-4遺伝子を改変、例えば機能的に破壊するために欠失、付加または置換が導入されているCARD-4遺伝子（例えばヒトまたは非ヒトのCARD-4遺伝子相同体、例えばネズミCARD-4遺伝子）の少なくとも一部を含むベクターを作製する。1つの態様においては、ベクターは、相同組み換えの際に内因性CARD-4遺伝子が機能的に破壊されるように設計する（例えば機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターとも称する）。または、ベクターは、相同組み換えの際に内因性CARD-4遺伝子が突然変異されるか、または何らか別の改変を受けるがなお機能的タンパク質をコードするように設計することもできる（例えば上流の調節領域を改変することにより内因性CARD-4タンパク質の発現を改変できる）。相同組み換えベクターにおいては、CARD-4遺伝子の改変された部分をその5’および3’末端において、CARD-4遺伝子の別の核酸によりフランキングさせ、これによりベクターにより担持される外因性CARD-4遺伝子と胚性幹細胞中の内因性CARD-4遺伝子との間で相同組み換えが起こるようにする。別のフランキングするCARD-4核酸は、内因性遺伝子との良好な相同組み換えのために十分な長さのものである。典型的には、フランキングDNA（5’および3’末端の両方）の数キロ塩基をベクターに含める（例えば相同組み換えベクターの説明についてはThomasおよびCapecchi,1987,Cell,51：503を参照）。ベクターを胚性幹細胞系統に（例えばエレクトロポレーションにより）導入し、導入されたCARD-4遺伝子が内因性CARD-4遺伝子と相同組み換えされた細胞を選択する（例えばLiら、1992,Cell,69：915参照）。次に選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注射して凝集キメラを形成する（例えばBradley,in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach,Robertson,ed.（IRL,Oxford,1987）pp.113-152参照）。次にキメラ胚を適当な擬似妊娠の雌性擬似親動物内に移植して胚を満期出産とする。その生殖細胞内に相同組み換えDNAを保有する子孫を用いて、トランスジーンの生殖細胞移行により、動物の全細胞が相同組み換えDNAを含む動物を育種することができる。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物を構築するための方法は更に、Bradley（1991）Current Opinion in Bio/Technology,2：823-829および国際公開公報第90/11354、国際公開公報第91/01140、国際公開公報第92/0968および国際公開公報第93/04169に記載されている。
【０１５０】
別の態様においては、トランスジェニック非ヒト動物はトランスジーンの調節発現を可能にする選択系を含むように製造することができる。このような系の1例はバクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/loxPリコンビナーゼ系については、例えばLaksoら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：6232-6236に記載されている。リコンビナーゼ系の別の例はサッカロマイセス・セレビシアエのFLPリコンビナーゼ系である（O’Gormanら、1991,Science,251：1351-1355）。cre/loxPリコンビナーゼ系を使用してトランスジーンの発現を調節する場合は、Creリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードするトランスジーンを含む動物が必要である。このような動物は例えば一方が選択されたタンパク質をコードするトランスジーンを含み、他方がリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む、2種のトランスジェニック動物を交配することにより「二重」トランスジェニック動物の構築を介して得ることができる。
【０１５１】
本明細書に記載した非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまたWilmutら、1997,Nature,385：810-813および国際公開公報第97/07668号および国際公開公報第97/07669号に記載の方法に従って製造することができる。慨すれば、トランスジェニック動物由来の細胞、例えば体細胞を単離し、成長周期から外れるように誘導してG0期に進入させる。次に静止期の細胞を、静止期の細胞を単離したものと同じ種の動物から摘出された卵母細胞に、例えば電気パルスの使用により融合させる。次に再構築された卵母細胞を桑実胚または胚盤胞にまで発生するまで培養し、次に擬似妊娠の雌性擬似親動物内に移す。この雌性擬似親動物の出生仔は細胞、例えば体細胞の単離元の動物のクローンである。
【０１５２】
トランスジェニック動物または相同組み換え動物の調整において使用できるネズミCARD-4をコードする核酸の配列は米国特許第6,369,196号に記載されており、その内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１５３】
IV.薬学的組成物
本発明のCARD-4核酸分子、CARD-4タンパク質および抗CARD-4抗体（本明細書においては「活性化合物」とも称する）は投与に適する薬学的組成物に配合できる。このような組成物は典型的には核酸分子、タンパク質または抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用される、「薬学的に許容される担体」という表現は製薬の投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張性付与剤および吸収遅延剤等を包含するものとする。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。活性化合物に任意の従来の媒体または薬剤を除き、組成物中の使用が意図される。補助的な活性化合物もまた組成物に配合できる。
【０１５４】
本発明は本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するための薬学的組成物の調製方法を包含する。このような方法は本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する薬剤と共に薬学的に許容される担体を製剤することを含む。このような組成物は更に別の活性薬剤を含むことができる。即ち、本発明は更に本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する薬剤および別の活性化合物一つまたは複数と共に薬学的に許容される担体を製剤することによる薬学的組成物の調製方法を包含する。
【０１５５】
発現または活性を調節する薬剤は、例えば、小分子であってよい。例えば、このような小分子には、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類縁体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類縁体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物（即ちヘテロ有機または有機金属化合物を含む）、モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、およびそのような化合物の塩、エステルおよび他の薬学的に許容される形態が包含される。小分子薬剤の適切な用量は当技術分野の医師、獣医師または研究者のよく知る多くの要因に依存する。小分子の用量は例えば、投与すべき対象または試料の名称、大きさおよび状態により異なり、そして更に、組成物を投与する経路により異なり、そして場合により、本発明の核酸またはポリペプチドに対して小分子が有することを医師が望んでいる作用により異なる。例示される用量は対象または試料の重量のキログラム当たり小分子ミリグラムまたはマイクログラムの量を包含し、例えばキログラム当たり約1マイクログラム〜キログラム当たり約500ミリグラム、キログラム当たり約約100マイクログラム〜キログラム当たり約5ミリグラム、または、キログラム当たり約1マイクログラム〜キログラム当たり約50マイクログラムである。更にまた、小分子の適切な用量は調節すべき発現または活性に関する小分子の力価により異なる。このような適切な用量は本明細書に記載のアッセイ法を用いて決定してよい。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するためにこれらの小分子の一つまたは複数動物（例えばヒト）に投与しなければならない場合は、医師、獣医師または研究者は例えばまず比較的低用量を処方し、その後適切な応答が得られるまで用量を漸増する。更にまたいずれかの特定の対象に対する特定の用量レベルは種々の要因、例えば使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身状態、性別および食餌、投与時期、投与経路、排出速度、任意の複合薬剤および調節すべき発現または活性の程度により異なる。
【０１５６】
本発明の薬学的組成物は意図される投与経路に適合するように製剤する。投与経路の例は非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与を包含する。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分、即ち滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート形成剤、例えばエチレンジアミン4酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および浸透圧調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。pHは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いて調節できる。非経口製剤はガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量のバイアルに充填できる。
【０１５７】
注射用途に適する薬学的組成物は滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、滅菌注射溶液または分散液の要時調製用の滅菌粉末を包含する。静脈内投与の場合は適当な担体には生理食塩水、殺菌水、Cremophor EL？（BASF,Parsippany,NJ）またはリン酸塩緩衝食塩水（PBS）が包含される。全ての場合において組成物は滅菌されなければならず、そして容易にシリンジ操作ができる程度まで流動性でなければならない。製造および保存の条件下で安定であり、細菌およびカビのような微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の予防は種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により行うことができる。多くの場合において、組成物に浸透圧調節剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間持続吸収は組成物に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことにより達成できる。
【０１５８】
滅菌注射溶液は必要に応じて上記した成分の1種または組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えばCARD-4タンパク質または抗CARD-4抗体）を配合し、その後、濾過滅菌することにより調製できる。一般的に分散液は分散媒体基剤および上記した必要な他の成分を含有する滅菌溶剤に活性化合物を配合することにより調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、好ましい調製方法は活性化合物と任意の他の所望の成分のあらかじめ滅菌濾過された溶液から調製された粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１５９】
経口組成物は一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。これらはゼラチンカプセルに充填するか、圧縮して錠剤とする。経口治療投与の目的のためには、活性化合物は賦形剤と共に配合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用する。経口組成物はまたマウスウオッシュとして使用するための液体担体を用いて調製され、その場合、液体担体中の化合物は経口適用され、局所使用され(swished)、吐き出し、または嚥下される。薬学的に適合性のある結合剤および/またはアジュバント物質を組成物の部分として含有できる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は以下の成分または同様の性質の化合物、即ち、バインダー、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えば澱粉または乳糖、錠剤崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelもしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes；滑沢剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーを含有できる。吸入による投与の場合は、化合物を適当な噴霧剤、例えば二酸化炭素のような気体の入った加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で供給する。
【０１６０】
全身投与は経粘膜または経皮的手段により行うこともできる。経粘膜または経皮的な投与のためには、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は当技術分野において一般的に知られており、例えば経粘膜投与の場合は、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が包含される。経粘膜投与は鼻用のスプレーまたは座剤の使用により行う。経皮的投与のためには、当技術分野において知られている通り、活性化合物は軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤される。
【０１６１】
化合物はまた直腸投与のための座剤（例えばカカオ脂または他のグリセリドのような従来の座剤基剤を使用）または貯留型浣腸の形態で調製できる。
【０１６２】
1つの態様においては、活性化合物は身体からの急速な排出から化合物を保護する担体と共に調製され、例えばインプラントおよびマイクロカプセルの送達システムのような制御放出製剤とされる。生体分解性、生体適合性の重合体、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。このような製剤の調製方法は当技術分野において知られている。材料はまたAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.より市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス性抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされたリポソームを包含する）もまた薬学的に許容される担体として使用できる。これらは当業者の知る方法、例えば米国特許第4,522,811号に記載の通り調製できる。
【０１６３】
投与を容易にし、投薬を均一化するための単位投与形態で経口または非経口組成物を製剤することが特に好都合である。本明細書で使用されるは単位投与形態とは、処置すべき対象に対して単一的な用量として適する物理的に個別の単位を指すものであり、各単位は必要な製薬用担体と共に所望の治療作用を与えるために計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与形態に関する仕様は活性化合物の独特の性質および達成すべき特定の治療効果、および、個体の処置のためにこのような活性化合物を製剤する技術分野に固有の制約事項により決定されるものであり、直接これらに依存している。
【０１６４】
抗体の場合は、好ましい用量は0.1mg/kg〜100mg/kg体重（一般的に10mg/kg〜20mg/kg）である。抗体を脳に作用させる場合は、50mg/kg〜100mg/kgの用量が通常は適切である。一般的に、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は他の抗体よりもヒト身体内でより長い半減期を有する。従って、より低用量および低頻度の投与が可能である場合が多い。脂質化のような修飾を行って抗体を安定化させたり取り込みや組織浸透性（例えば脳内）を増強させることができる。抗体の脂質化の方法はCruikshankら、1997,J.Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retorovirology,14：193によって記載されている。
【０１６５】
本発明の核酸分子はベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号）により、または、定位注射（例えばChenら、1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：3054-3057参照）により対象に供給できる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み、または、遺伝子送達溶剤が包埋されている遅延放出マトリックスを含むことができる。または、完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウィルスベクターを組み換え細胞から未損傷で製造できる場合は、薬学的調製物は遺伝子送達システムを与える一つまたは複数の細胞を含むことができる。
【０１６６】
薬学的組成物は投与の説明書と共に容器、パックまたはディスペンサー中に封入される。
【０１６７】
V.本発明の使用および方法
本明細書に記載した核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体および抗体は以下の方法の一つまたは複数、即ちa）スクリーニングアッセイ法；b）検出アッセイ法（例えば染色体マッピング、組織タイピング、法医学的生物学）、c）予測的医療（例えば診断アッセイ法、予後アッセイ法、モニタリング治験および薬理ゲノミクス）；およびd）処置方法（例えば治療および予防）において使用できる。CARD-4タンパク質は他の細胞内タンパク質と相互作用を示し、このため、（i）細胞の増殖の調節；（ii）細胞の分化の調節；および（iii）細胞の生存の調節のために使用できる。本発明の単離された核酸分子はCARD-4タンパク質の発現のため（例えば遺伝子治療用途における宿主細胞内の組み換え発現ベクターを介して）、CARD-4mRNA（例えば生物学的試料中）またはCARD-4遺伝子における遺伝子病変の検出のため、およびCARD-4活性を調節するために使用できる。更に、CARD-4タンパク質を用いてCARD-4の活性または発現を調節する薬剤または化合物のスクリーニング、並びに、CARD-4タンパク質の不十分または過剰な生産またはCARD-4の野生型タンパク質と比較して低値または異常な活性を有するCARD-4タンパク質の生産を特徴とする障害の処置を行うことができる。更にまた、本発明の抗CARD-4抗体を用いてCARD-4タンパク質の検出および単離、および、CARD-4活性の調節を行うことができる。
【０１６８】
本発明は更に本明細書に記載した上記スクリーニングアッセイ法により同定される新規薬剤および処置のためのその使用に関する。
【０１６９】
A.スクリーニングアッセイ法
本発明はCARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分に結合するか、または、例えばCARD-4の発現またはCARD-4の活性に対して刺激または抑制作用を有するモジュレーター、即ち候補または試験化合物または薬剤（例えばペプチド、ペプチドミメティック、小分子または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書においては「スクリーニングアッセイ法」とも称する）を提供する。ヒトCARD-4の生物学的活性部分の例はCARDドメインをコードするアミノ酸1〜145またはロイシンリッチリピートドメインを含むヒトCARD-4のアミノ酸406〜953である。
【０１７０】
本発明により提供されるスクリーニングアッセイ法には、本発明のCARD含有ポリペプチドの2量化を防止する分子を同定するためのスクリーニング、本発明のCARD含有ポリペプチド（例えばCARD-4）へのCARD含有ポリペプチドの結合をブロックする分子を同定するためのスクリーニング、本発明のCARD含有ポリペプチド、例えばヒトCARD-4のヌクレオチド結合部位へのヌクレオチドの結合の競合的インヒビターを同定するためのスクリーニング、本発明のCARD含有ポリペプチドのロイシンリッチリピートとロイシンリッチリピートに結合するリガンドとの間の相互作用をブロックする化合物を同定するためのスクリーニングが包含される。
【０１７１】
1つの態様においては、本発明はCARD-4タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的活性部分に結合するか、またはその活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイ法を提供する。スクリーニングされるべき活性は、一つまたは複数、即ち（1）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質:タンパク質相互作用を示す能力；（2）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とCARD-CARD相互作用を示す能力；（3）CARD-4リガンド（例えばCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9および/またはBCLX）に結合する能力；（4）細胞内標的に結合する能力；（5）カスパーゼ-9活性を増強する能力；および（6）NF-κB経路を活性化する能力を含む。他の活性には、（1）細胞増殖の調節；（2）細胞分化の調節；（3）細胞死の調節；および（4）炎症および/または生得的な免疫応答の調節が包含される。
【０１７２】
本発明の試験化合物は当技術分野において知られているコンビナトリアルライブラリ法、例えば生物学的ライブラリ；空間的位置指定可能なパラレル固相または溶液相のライブラリ；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法；「1ビーズ-1化合物」ライブラリ法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ法における多くの方法のいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリ方法はペプチドライブラリに限定されるが、他の4種の方法はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリに適用可能である（Lam,1997,Anticancer Drug Des.,12：145）。分子ライブラリの合成のための方法の例は、例えば、DcWittら、1993,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,90：6909；Erbら、1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：11422；Zuckermannら、1994,J.Med.Chem.,37：2678；Choら、1993,Science,261：1303；Carrellら、1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33：2059；Carellら、1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33：2061；およびGallopら、1994,J.Med.Chem.,37：1233に記載されている。
【０１７３】
化合物のライブラリは溶液中（例えばHoughten,1992,Bio/Techniques,13：412-421）、またはビーズ（Lam,1991,Nature,354：82-84）、チップ（Fodor,1993,Nature,364：555-556）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（特許第5,571,698；5,403,484および5,223,409号）、プラスミド（Cullら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：1865-1869）、または、ファージ上（ScottおよびSmith,1990,Science,249：386-390；Devlin,1990,Science,249：404-406；Cwirlaら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87：6378-6382；およびFelici,1991,J.Mol.Biol.222：301-310）上に提示してよい。
【０１７４】
試験化合物がCARD-4またはその生物学的活性部分の活性を調節する能力の測定は、例えば、CARD-4標的分子に結合するかこれと相互作用を示すCARD-4タンパク質の能力を測定することにより行うことができる。本明細書で使用される、「標的分子」とは、CARD-4タンパク質が本来結合するか相互作用を示す相手である分子、例えば細胞膜の内側表面に会合している分子、または、細胞質分子である。CARD-4標的分子は非CARD-4分子または本発明のCARD-4タンパク質またはポリペプチドであることができる。1つの態様においては、CARD-4標的分子はアポトーシスシグナル伝達経路の成分、例えばCARD-4である。標的は例えば触媒活性を有する第2の細胞内タンパク質、または、CARD-4との下流のシグナル伝達分子の会合を促進するタンパク質であることができる。
【０１７５】
CARD-4またはその生物学的活性部分の活性を調節できる試験化合物の能力の測定は、例えば、CARD-4標的分子として上記パラグラフにおいて列挙した特定のタンパク質のいずれかに結合するかこれと相互作用を示すCARD-4タンパク質の能力を測定することにより行うことができる。別の態様においては、CARD-4標的分子は、二重ハイブリッド系結合アッセイ法においてCARD-4タンパク質またはそのフラグメントに結合する全てのタンパク質を包含し、前記アッセイ法はcDNAまたはゲノム二重ハイブリッド系ライブラリからそのようなタンパク質を単離するための予定外の実験を行うことなく使用できる。本セクションに記載する結合アッセイ法は細胞系または無細胞（後述）のものであることができる。
【０１７６】
CARD-4標的分子と結合するかこれと相互作用を示すCARD-4タンパク質の能力の測定は、直接の結合を測定するための上記した方法の1つにより行うことができる。1つの態様においては、CARD-4タンパク質がCARD-4標的分子に結合するかこれと相互作用を示す能力の測定は標的分子の活性を測定することにより行うことができる。例えば標的分子の活性は、標的の細胞内第2メッセンジャー（例えば細胞内Ca2＋、ジアシルグリセロール、IP3等）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒/酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（例えば検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結したCARD-4応答調節エレメント）の誘導を検出すること、または、細胞の応答、例えば細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖を検出することにより、測定できる。CARD-4はカスパーゼ-9の活性を増強するため、カスパーゼ-9媒介アポトーシス細胞応答またはカスパーゼ-9酵素活性をアッセイすることにより、活性をモニタリングできる。更に別の態様において、CARD-4発現により誘導される遺伝子は、細胞系統においてCARD-4を発現させること、および、空発現ベクターで形質転換された細胞系統およびCARD-4発現ベクターで形質転換された細胞系統のmRNA発現パターンを比較する転写プロファイリング実験を行うことにより、同定することができる。CARD-4発現により誘導される遺伝子のプロモーターはルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼまたはβガラクトシダーゼのようなスクリーニングに適するレポーター遺伝子に作動可能に連結でき、得られるコンストラクトは適切な発現ベクターに導入できる。CARD-4を含みレポーター遺伝子に作動可能に連結したCARD-4応答性プロモーターを含む発現ベクターでトランスフェクトされた組み換え細胞系統を用いて、試験化合物への組み換え細胞系統の接触に応答したレポーター遺伝子の発現をアッセイすることにより、CARD-4活性を調節する試験化合物を発見することができる。CARD-4アゴニストはレポーター遺伝子の発現を増大させるものとして同定され、CARD-4アンタゴニストはレポーター遺伝子の発現を低下させるものとして同定される。
【０１７７】
本発明の別の態様においては、CARD-4またはその生物学的活性部分の活性を調節する試験化合物の能力は、CARD-4の作用を媒介するCARD-4標的タンパク質が既知または未知である、CARD-4依存性の経路または過程を調節する試験化合物の能力をアッセイすることにより測定できる。潜在的なCARD-4依存性の経路または過程は、これに限定されないが、細胞シグナル伝達経路およびその関連の第2のメッセンジャー分子（例えば細胞内Ca2＋、ジアシルグリセロール、IP3、cAMP等）、細胞内酵素活性、細胞内応答（例えば細胞の生存、細胞の分化、または、細胞の増殖）、または、細胞内または非相同性のmRNAまたはタンパク質の誘導または抑制の調節を含む。CARD-4依存性の経路または過程は研究下の経路または過程に対して適切な標準的な細胞系または無細胞のアッセイ法より行う。別の態様においてはCARD-4およびNF-κBルシフェラーゼレポーター遺伝子により同時トランスフェクトされた細胞を試験化合物と接触させ、CARD-4活性をブロックする試験化合物を、そのCARD-4依存性NF-κB経路ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低減により、同定する。CARD-4に作動的な試験化合物はレポーター遺伝子発現を増大すると予測される。別の態様においては、CARD-4をある細胞系統において発現させ、組み換えCARD-4発現細胞系統を試験化合物に接触させる。CARD-4活性を抑制する試験化合物は、NF-κB経路レポーター遺伝子、NF-κB核局在化、IκBホスホリル化またはタンパク質分解のアッセイ法、または、当業者の既知の他の標準的NF-κB経路活性化アッセイ法により測定されるCARD-4依存性のNF-κB経路刺激のその低減により同定される。
【０１７８】
更に別の態様において本発明のアッセイ法は、試験化合物にCARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分を接触させること、および、CARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分に結合する試験化合物の能力を測定することを含む、無細胞アッセイ法である。CARD-4タンパク質への試験化合物の結合は上記したとおり、直接または間接的に測定できる。1つの態様においては、競合的結合アッセイ法は、CARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分をCARD-4に結合することが分かっている化合物に接触させてアッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物に接触させること、および、CARD-4タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを包含し、ここでCARD-4タンパク質と相互作用する試験化合物の能力のを測定は、既知結合化合物と比較した場合の試験化合物がCARD-4またはその生物学的活性部分に優先的に結合する能力の測定である。
【０１７９】
別の態様においては、アッセイ法は試験化合物にCARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分を接触させること、および、試験化合物がCARD-4タンパク質または生物学的活性部分の活性を調節（例えば刺激または抑制）する能力を測定することを含む無細胞のアッセイ法である。CARD-4の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば、直接の結合の測定について上記した方法の1つによりCARD-4標的分子に結合するCARD-4タンパク質の能力を測定することにより達成できる。別の態様においては、CARD-4の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、CARD-4標的分子を更に調節するCARD-4タンパク質の能力の測定により行うことができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒/酵素的活性を前述の通り測定できる。
【０１８０】
更に別の態様においては無細胞アッセイ法はCARD-4に結合する既知化合物にCARD-4タンパク質またはその生物学的活性部分を接触させてアッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物に接触させること、およびCARD-4タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、ここでCARD-4タンパク質と相互作用する試験化合物の能力の測定は、CARD-4標的分子に優先的に結合するか、その活性を調節するCARD-4タンパク質の能力の測定を含む。本発明の無細胞アッセイ法はCARD-4の可溶性形態または膜会合形態の両方の使用に適している。CARD-4の膜会合形態とは膜結合標的分子と相互作用するCARD-4をさす。CARD-4の膜会合形態を含む無細胞アッセイ法の場合は、CARD-4の膜会合型が溶液内に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。このような可溶化剤の例は、非イオン性界面活性剤、例えばn-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルシルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、トリトンλ X-100、トリトンλ X-114、Thesitλ、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）n、3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、3-［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）、または、N-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートをなす。
【０１８１】
本発明の上記アッセイ方法の複数の態様において、CARD-4またはその標的分子を固定化することにより、タンパク質の一方または両方の未複合体化形態からの複合体化物の分離を容易にし、並びに、アッセイ法の自動化に対応することが望ましい場合がある。候補化合物の存在下および非存在下のCARD-4への試験化合物の結合、または、標的分子とのCARD-4の相互作用は、反応体を含むのに適するいずれかの容器内において実施できる。このような容器の例はマイクロプレート、試験管およびマイクロ遠沈管を包含する。1つの態様においては、タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合できるようなドメインを付加するような融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/CARD-4融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical；St.Louis,MO）またはグルタチオン誘導体化マイクロプレート上に吸着させ、次にこれを試験化合物、または、試験化合物と非吸着標的タンパク質またはCARD-4タンパク質と合わせ、そして混合物を複合体形成を誘導する条件下（例えば塩およびpHについて生理学的な条件下）にインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロプレートのウェルを洗浄して未結合の成分を全て除き、ビーズの場合はマトリックスを固定化し、複合体を例えば上記したとおり直接または間接的に測定する。または、複合体をマトリックスから解離させ、CARD-4結合または活性のレベルを標準的な手法を用いて測定する。別の態様においては、MYCまたはHAエピトープタグCARD-4融合タンパク質またはMYCまたはHAエピトープタグ標的融合タンパク質を抗MYCまたは抗HA抗体コーティングマイクロビーズまたは抗MYCまたは抗HA抗体コーティングマイクロプレートに吸着させ、次にこれを試験化合物、または、試験化合物と非吸着標的タンパク質またはCARD-4タンパク質のいづれかと合わせ、そして混合物を複合体形成を誘導する条件下（例えば塩およびpHについて生理学的な条件下）にインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロプレートのウェルを洗浄して未結合の成分を全て除き、ビーズの場合はマトリックスを固定化し、複合体を例えば上記したとおり直接または間接的に測定する。または、複合体をマトリックスから解離させ、CARD-4結合または活性のレベルを標準的な手法を用いて測定する。
【０１８２】
マトリックスにタンパク質を固定化する他の手法も本発明のスクリーニングアッセイ法において使用できる。例えば、CARD-4またはその標的分子をビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化することができる。ビオチニル化されたCARD-4または標的分子を当技術分野において周知の手法（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals；Rockford,IL）を用いてビオチン-NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンコーティング96穴プレート（Pierce Chemicals）のウェルに固定化する。または、CARD-4または標的分子に対する抗体であるが標的分子へのタンパク質の結合を妨害しないものをプレートのウェルに誘導し、未結合の標的またはタンパク質を抗体コンジュゲーションによりウェル内に捕獲する。このような複合体を検出するための方法は、GST固定化複合体およびエピトープ固定化複合体に関して上記したもののほかに、CARD-4または標的分子と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出、並びに、CARD-4または標的分子と会合している酵素活性を検出することに基づいている酵素結合アッセイ法を包含する。
【０１８３】
別の態様においては、CARD-4発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物に接触させ、細胞内のCARD-4プロモーター、mRNAまたはタンパク質の発現を測定する方法において同定される。候補化合物存在下のCARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現のレベルを候補化合物の非存在下のCARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現のレベルと比較する。次に、この比較に基づいてCARD-4の発現のモジュレーターとして候補化合物を同定することができる。例えば、CARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下において、非存在下の場合より多い（統計学的に有意に高値）場合、候補化合物はCARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。または、CARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下において、非存在下の場合より少ない（統計学的に有意に低値）場合、候補化合物はCARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現の抑制物質として同定される。細胞内のCARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現のレベルはCARD-4 mRNAまたはタンパク質の検出に関して本明細書に記載した方法により測定できる。CARD-4プロモーターの活性は、CARD-4プロモーターをレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼまたはβガラクトシダーゼと連結し、得られたコンストラクトを適切なベクターに導入し、宿主細胞系統をトランスフェクトし、試験化合物に応答したレポーター遺伝子の活性を測定することによりアッセイすることができる。
【０１８４】
本発明の更に別の態様においては、CARD-4タンパク質を二重ハイブリッドアッセイ法または三重ハイブリッドアッセイ法における「ベイトタンパク質(bait protein)」として使用する（例えば米国特許第5,283,317号；Zervosら、1993,Cell,72：223-232；Maduraら、1993,J.Biol.Chem.,268：12046-12054；Bartelら、1993,Bio/Techniques,14：920-924；Iwabuchiら、1993,Oncogene 8：1693-1696；および国際公開公報第94/10300号参照）ことにより、CARD-4に結合するかこれと相互作用を示し（「CARD-4結合タンパク質」または「CARD-4-bp」）、CARD-4活性を調節する別のタンパク質を同定できる。このようなCARD-4結合タンパク質はまた例えばCARD-4経路の上流または下流のエレメントとして、CARD-4タンパク質によるシグナルの伝播にも関与していると考えられる。
【０１８５】
二重ハイブリッド系は分離可能なDNA結合および活性化ドメインからなる大部分の転写因子のモジュール型の性質に基づいている。慨すれば、アッセイ法は2種の異なるDNAコンストラクトを使用する。1つのコンストラクトにおいては、CARD-4をコードする遺伝子を既知転写因子（例えばGAL-4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。もう1つのコンストラクトにおいては、未同定のタンパク質（「プレイ(prey)」または「試料」）をコードするDNA配列のライブラリに由来するDNA配列を既知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「ベイト」および「プレイ」のタンパク質がインビボで相互作用してCARD-4依存性複合体を形成できる場合は、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは接近する。この接近により、転写因子に応答して転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えばLacZ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、これを用いてCARD-4と相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
【０１８６】
本発明の1つの態様においては、CARD-4またはその生物学的活性部分の活性を調節する試験化合物の能力は、二重ハイブリッド系においてCARD-4のその標的タンパク質への結合をブロックする試験化合物の能力を試験することにより測定できる。CARD-4とその標的タンパク質との間の相互作用をブロックする試験化合物をスクリーニングするためには、相互作用するベイトとプレイのコンストラクト、例えばCARD-4ベイトコンストラクトを同時発現する酵母二重ハイブリッドスクリーニング系統を試験化合物と接触させ、二重ハイブリッド系レポーター遺伝子、通常はHIS3、lacZまたはURA3の活性を試験する。細胞系統が生存を維持するがレポーター遺伝子活性の大きな低下を示す場合は、これは、試験化合物がベイトとプレイのタンパク質の間の相互作用を抑制したことを示している。この試験はハイスループットの薬剤スクリーニング目的のために自動化される。本発明の別の態様においては、CARD-4およびその標的タンパク質は効率的な薬剤スクリーニングのために特に設計されたリバース二重ハイブリッド系に構成される（Vidalら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：10321-6およびVidalら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：10315-20）。リバース二重ハイブリッド系においては、標的タンパク質とのCARD-4の物理的相互作用の抑制によりレポーター遺伝子の誘導がもたらされ、これは、通常の二重ハイブリッド系では標的タンパク質とのCARD-4の物理的相互作用の抑制によりレポーター遺伝子の抑制が起こることとは対照的である。リバース二重ハイブリッド系は、レポーター遺伝子の誘導がレポーター遺伝子の抑制よりも容易に調べられることから、薬剤スクリーニングには好ましい。
【０１８７】
本発明の別の態様はCARD-4に結合するタンパク質と物理的に相互作用することが分かっているタンパク質である。CARD-4相互作用物質、これに限定されないがhNUDCおよびCARD-3は、二重ハイブリッド系のベイトに構成することができ、二重ハイブリッドスクリーニングにおいて使用され、CARD-4経路の別のメンバーを同定できる。このようにして同定されたCARD-4相互作用物質の相互作用物質はCARD-4関連の疾患および病態における治療介入のための有用な標的であり、その酵素活性または結合活性の試験はCARD-4の活性を調節する試験化合物の同定のために有用である。
【０１８８】
本発明は更に上記したスクリーニングアッセイ法により同定された新しい薬剤および本明細書に記載した処置のためのその使用に関する。
【０１８９】
B.検出アッセイ法
本明細書において同定されたcDNA配列の部分またはフラグメント（および相当する完全な遺伝子配列）はポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用できる。例えば、これらの配列は、（i）染色体上のその対応する遺伝子をマッピングし、これにより遺伝子疾患に関連する遺伝子の領域を位置するため；（ii）少量の生物学的試料から個体を同定するため（組織タイピング）；および（iii）生物学的試料の法医学的同定に寄与するために使用できる。これらの用途は以下のサブセクションにおいて説明する。
【０１９０】
1.染色体マッピング
ある遺伝子の配列（または配列の一部）が単離されれば、この配列を用いて染色体上の遺伝子の位置をマッピングすることができる。従って、本明細書に記載したCARD-4核酸分子またはそのフラグメントを用いて染色体上のCARD-4遺伝子の位置をマッピングすることができる。染色体へのCARD-4配列のマッピングは疾患に関連する遺伝子にこれらの配列を相関させる重要な第1段階である。
【０１９１】
慨すれば、CARD-4遺伝子をCARD-4配列からPCRプライマー（好ましくは15〜24bp長）を調製することにより染色体にマッピングできる。CARD-4配列のコンピューター分析により、ゲノムDNAの1エクソンより長くないため増幅過程を複雑化できるプライマーを迅速に選択できる。次にこれらのプライマーを個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために使用できる。CARD-4配列に相当するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを与える。
【０１９２】
体細胞ハイブリッドは種々の哺乳類に由来する体細胞（例えばヒトまたはマウスの細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが成育して分割するにつれて、それらは無作為な順序でヒトの染色体を喪失するが、マウスの染色体は維持する。マウスの細胞は特定の酵素を欠いているために成育できないがヒトの細胞は成育できるような培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含むその1つのヒト染色体が保持される。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞系統のパネルが樹立される。パネル内の個々の細胞系統は単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および、マウス染色体の全セットを含んでおり、これにより特定のヒト染色体への個々の遺伝子のマッピングを容易にしている（D’Eustachioら、1983,Science,220：919-924）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドもまた転座および欠失を有するヒト染色体を用いることにより作製できる。
【０１９３】
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは特定の染色体に特定の配列を割り付けるための迅速な操作法である。単一の熱サイクラーを用いながら一日当たり3種以上の配列を割り付けることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためのCARD-4配列を使用しながら特定の染色体のフラグメントのパネルによりサブローカリゼーションが可能となる。CARD-4配列をその染色体にマッピングするために同様に使用できる他のマッピング手段にはインサイチューハイブリダイゼーション（Fanら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：6223-27に記載）、標識されたフローソーティングされた染色体のプレスクリーニング、および、染色体特異的cDNAライブラリへのハイブリダイゼーションによる前選択が包含される。
【０１９４】
分裂中期の染色体のスプレッドへのDNA配列の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）を用いて1工程で厳密な染色体位置を与えることもできる。染色体スプレッドは有糸分裂紡錘体を破壊するコルセミドのような化学薬品により分裂中期においてその細胞分裂がブロックされている細胞を用いて作製できる。染色体をトリプシンで短時間処理し、次にギームザ染色する。各染色体上に明部と暗部のパターンが生じ、これにより、染色体が個々に識別できるようになる。FISH法は500または600塩基の短いDNA配列と共に使用できる。しかしながら、100塩基より大きいクローンは単純な検出のための十分なシグナル強度を有する独特の染色体位置への結合のより高い可能性を有する。好ましくは1,000塩基、およびより好ましくは2,000塩基が合理的な時間量で良好な結果を得るために十分である。この手法を検討するためには、Vermaら（Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques（Pergamon Press,New York,1988））が参考になる。
【０１９５】
染色体のマッピングのための試薬を個々に使用することにより単一の染色体またはその染色体上の単一の部位をマークでき、または、試薬のパネルを使用して複数の部位および/または複数の染色体をマークすることができる。遺伝子の非コーディング領域に相当する試薬が実際にはマッピング目的には好ましい。コーディング配列は遺伝子ファミリー内で保存されている可能性がより高く、従って、染色体マッピングの間の交差ハイブリダイゼーションの機会を増大させる。
【０１９６】
厳密な染色体位置に配列をマッピングした後、染色体上の配列の物理的位置を遺伝子地図データに相関することができる（このようなデータは例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Manに記載されており、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryよりオンライン入手可能である）。次に同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の関係を、例えばEgelandら、1987,Nature,325：783-787に記載の連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通じて同定できる。
【０１９７】
更にまた、CARD-4遺伝子に関連する疾患に罹患した個体と罹患しない個体との間のDNA配列の相違を決定できる。ある突然変異が罹患した個体の一部または全部において観察されるが、いずれの未罹患の個体にも観察されない場合、その突然変異は特定の疾患の原因体であると考えられる。罹患および未罹患の個体の比較においては、一般的に、まず染色体スプレッドに認められる、または、そのDNA配列に基づいたPCRを用いて検出できる、欠失または転座のような染色体の構造的改変を探す。最終的には、数個体の遺伝子の完全な配列決定を行うことにより突然変異の存在を確認し、多型による突然変異を識別することができる。
【０１９８】
2.組織タイピング
本発明のCARD-4配列はまた少量の生物学的試料から個体を同定するために使用できる。例えば米国陸軍は個人の同定のための制限フラグメント長多型（RFLP）の使用を検討している。この手法においては、個体のゲノムDNAを一つまたは複数の制限酵素で消化し、サザンブロット上でプローブし、同定のための独特のバンドを得る。この方法は、消失、取り違えまたは盗難にあう可能性があり正しい同定を困難にしている現在の「ドッグタグ(Dog Tag)」の限界がない。本発明の配列はRFLPの別のDNAマーカーとして有用である（米国特許第5,272,057に記載）。
【０１９９】
更にまた、本発明の配列は個体のゲノムの選択された一部の実際の塩基ごとのDNA配列を決定する代替法を提供する。即ち、本明細書に記載したCARD-4配列を用いて配列の5’および3’末端から2個のPCRプライマーを作製できる。次にこれらのプライマーを使用して個体のDNAを増幅し、その後配列決定することができる。
【０２００】
この様式で作製された個体の相当するDNA配列のパネルは、各個体が対立遺伝子の相違によりこのようなDNA配列の独特のセットを有することから、独特の個体識別を可能とする。本発明の配列を用いて個体および組織に由来するこのような識別配列を得ることができる。本発明のCARD-4配列はヒトゲノムの部分を個別に提示する。対立遺伝子変異はこれらの配列のコーディング領域においてある程度まで、そして非コーディング領域ではより高度に生じる。ヒト個体間の対立遺伝子変異は各500塩基当たり約1回の頻度で起こると推定されている。本明細書に記載した配列の各々は、ある程度までは個体のDNAを識別目的のために比較することができる標準物質として使用できる。非コーディング領域ではより多数の多型が起こるため、個体の区別に必要な配列はより少数である。配列番号:1の非コーディング配列は好都合にも、各々が100塩基の非コーディング増幅配列を与える恐らくは10〜1,000プライマーのパネルで正しい個体区別を可能とする。例えば配列番号:3のような予測されたコーディング配列を使用する場合、正しい個体識別のためのプライマーのより適切な数量は500〜2,000となる。
【０２０１】
本明細書に記載したCARD-4配列から得られる試薬のパネルを用いて個体に関する独特の識別データベースを作製する場合、これらの同じ試薬を後にその個体の組織の識別に使用できる。独特の識別データベースを使用することにより生死にかかわらず個体の正しい識別が極めて少量の組織試料から可能となる。
【０２０２】
3.法医学的生物学における部分配列の使用
DNA系識別手法は法医学的生物学においても使用できる。法医学的生物学は例えば犯罪者を正しく識別する手段として犯行現場において発見される生物学的証拠の遺伝子タイピングを使用する科学的分野である。このような識別を行うためには、PCR手法を用いて犯行現場において発見される組織、例えば毛髪または皮膚、または体液、例えば血液、唾液または精液のような極めて少量の生物学的試料から得られたDNA配列を増幅することができる。次に増幅された配列を標準物質と比較することにより、生物学的試料の起源の識別が可能になる。
【０２０３】
本発明の配列を用いてヒトゲノムの特定の遺伝子座にターゲティングされたポリヌクレオチド試薬、例えばPCRプライマーを提供することができ、これは例えば、別の「識別マーカー」（即ち特定の個体に特有の別のDNA配列）を提供することによりDNA系法医学的識別の信頼性を向上できる。上記したとおり、実際の塩基配列の情報は制限酵素により生じたフラグメントにより形成されるパターンの正確な代替として識別のために使用できる。配列番号:1の非コーディング領域にターゲティングされた配列は、より多数の多型が非コーディング領域に存在するためにこの手法を用いて個体を識別することをより容易にしていることから、上記使用に特に適している。ポリヌクレオチド試薬の例はCARD-4配列またはその部分、例えば少なくとも20または30塩基の長さを有する配列番号:1の非コーディング領域から誘導されたフラグメントを包含する。
【０２０４】
本明細書に記載した配列は更に、特定の組織、例えば脳の組織を識別するために例えばインサイチューハイブリダイゼーション手法において使用できる、ポリヌクレオチド試薬、例えば標識された、または標識可能なプローブを提供するために使用できる。これは未知の起源の組織が法医学的病理学者に提示された場合に極めて有用である。このようなCARD-4プローブのパネルを用いて種および/または臓器の型により組織を識別できる。
【０２０５】
類似の様式において、これらの試薬、例えばCARD-4プライマーまたはプローブを用いることにより汚染について組織培養物をスクリーニングすること（即ち培養物中の細胞の種々の型の混合物の存在についてスクリーニングすること）ができる。
【０２０６】
C.予測的医療
本発明はまた、予後（予測）目的のために診断アッセイ法、予後アッセイ法、薬理ゲノミクスおよびモニタリング治験を用いることにより個体を予防的に処置する予測的医療の分野に関する。従って、本発明の1つの局面は生物学的試料（例えば血液、血清、組織）の文脈内でCARD-4タンパク質および/または核酸の発現並びにCARD-4の活性を測定することによりある個体が異常なCARD-4の発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症する危険性を有するかどうかを判断するための診断アッセイ法に関する。本発明はまた、個体がCARD-4タンパク質、核酸の発現または活性に関わる障害を発症する危険性があるかどうかを判断するための予後（または予測）アッセイ法を提供する。例えばCARD-4遺伝子における突然変異を生物学的試料においてアッセイできる。このようなアッセイ法を予後または予測の目的のために使用することにより、CARD-4タンパク質、核酸の発現または活性を特徴とするまたはこれに関わる障害の発症よりも前に個体を予防的に処置することが可能となる。
【０２０７】
本発明の別の局面は個体におけるCARD-4タンパク質、核酸の発現またはCARD-4活性を測定してその個体に対する適切な治療または予防の薬剤を選択するための方法（本明細書においては「薬理ゲノミクス」と称する）を提供する。薬理ゲノミクスは個体の遺伝子型に基づいて個体の治療的または予防的な処置のための薬剤（例えば薬品(drug)）を選択可能とする（例えば個体の遺伝子型を調べることにより特定の薬剤に応答するその個体の能力を調べる）。
【０２０８】
本発明の別の局面は臨床治験におけるCARD-4の発現または活性に対する薬剤（例えば薬品または他の化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２０９】
これらおよび他の薬剤には以下のセクションに詳述する。
【０２１０】
1.診断アッセイ法
生物学的試料中のCARD-4の存在または非存在を検出するための例示される方法は、試験対象から生物学的試料を採取すること、および、生物学的試料中でCARD-4の存在が検出されるように、生物学的試料をCARD-4タンパク質またはCARD-4タンパク質をコードする核酸（例えばmRNA、ゲノムDNA）を検出することができる化合物または薬剤と接触させることを包含する。CARD-4のmRNAまたはゲノムDNAを検出するための薬剤は、CARD-4mRNAまたはゲノムDNAにハイブリダイズできる標識された核酸プローブである。核酸プローブは例えば完全長のCARD-4核酸、例えば配列番号:1または3の核酸、またはその部分、例えば、少なくとも15、30、50、100、250または500ヌクレオチド長でありmRNAまたはゲノムDNAにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド、または、米国特許第6,340,576号または6,369,196号に記載のもののようなヒトCARD-4スプライス変異体であることができる。本発明の診断アッセイ法に使用するのに適する別のプローブは本明細書に記載するとおりである。
【０２１１】
CARD-4タンパク質を検出するための薬剤は、CARD-4タンパク質に結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体であることができる。抗体はポリクローナルであることができ、または、より好ましくはモノクローナルである。例えば、ヒトCARD-4のアミノ酸128〜139および287〜298に相当するポリペプチドを用いてウサギを免疫化し、ヒトCARD-4を特異的に認識するポリクローナル抗体が作製されている。未損傷の抗体またはそのフラグメント（例えばFabまたはF（ab’）2）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して使用する「標識された」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリング（即ち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接の標識、並びに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識を包含するものとする。間接的な標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、および、蛍光標識されたストレプトアビジンにより検出できるようするビオチンによるDNAプローブの末端標識が包含される。「生物学的試料」という用語は対象より単離した組織、細胞および生物学的液体、並びに対象内に存在する組織、細胞および液体を包含するものとする。即ち、本発明の検出方法はインビトロ並びにインビボで生物学的試料中のCARD-4mRNAタンパク質またはゲノムDNAを検出するために使用できる。例えば、CARD-4mRNAの検出のためのインビトロの手法はノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションを包含する。CARD-4タンパク質の検出のためのインビトロの手法は酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光分析が包含される。CARD-4ゲノムDNAの検出のためのインビトロの手法はサザンハイブリダイゼーションを包含する。更にまた、CARD-4タンパク質の検出のためのインビボの手法は対象に標識された抗CARD-4抗体を導入することを含む。例えば、対象中の存在および位置が標準的な画像化手法により検出できる放射性マーカーで抗体を標識できる。
【０２１２】
1つの態様においては、生物学的試料は試験対象から得たタンパク質分子を含有する。または、生物学的試料は試験対象から得たmRNA分子または試験対象から得たゲノムDNA分子を含有できる。生物学的試料は対象から従来の方法で単離した末梢血白血球試料である。
【０２１３】
別の態様においては、方法は更に、対照対象から対照生物学的試料を得ること、CARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの存在が生物学的試料中で検出されるようにCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAを検出できる化合物または薬剤に対照試料を接触させること、および、対照試料中のCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの存在を試験試料中のCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの存在と比較することを包含する。
【０２１４】
本発明はまた生物学的試料（試験試料）中のCARDの存在を検出するためのキットを包含する。このようなキットはCARD-4の異常な発現に関連する障害（例えば免疫学的障害）に対象が罹患しているかまたはそれを発症する危険性が高いかどうかを判断するために使用できる。例えば、キットは生物学的試料中のCARD-4タンパク質またはmRNAを検出することができる標識された化合物または薬剤、および、試料中のCARD-4の量を検出するための手段（例えば抗CARD-4抗体またはCARD-4をコードするDNAに結合するオリゴヌクレオチド）を含む。キットはまた、CARD-4タンパク質またはmRNAの量が正常値より高値または低値である場合にCARD-4の異常な発現に関連する障害に試験対象が罹患しているかまたは発症する危険性が高いことを観察するための取扱説明書を含んでよい。
【０２１５】
抗体系のキットについては、キットは例えば、（1）CARD-4タンパク質に結合する第1の抗体（例えば固体支持体に結合したもの）；および任意で（2）CARD-4タンパク質または第1の抗体に結合して検出可能な薬剤をコンジュゲートする第2の異なる抗体、を含んでよい。
【０２１６】
オリゴヌクレオチド系のキットについては、キットは例えば、（1）CARD-4核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチド、または、（2）CARD-4核酸分子を増幅するために有用なプライマー対、を含んでよい。
【０２１７】
キットはまた、例えば緩衝剤、保存料またはタンパク質安定化剤を含んでよい。キットはまた検出可能な薬剤（例えば酵素または基質）を検出するために必要な成分を含んでよい。キットはまた、アッセイされ、比較される試験化合物と比較される対照試料または対照試料のシリーズを含有してよい。キットの各成分は通常は個々の容器内に封入され、種々の容器の全てがCARD-4の異常な発現に関連する障害に試験対象が罹患しているかまたは発症する危険性が高いことを観察するための取扱説明書と共に単一のパッケージに含まれている。
【０２１８】
2.予後アッセイ法
本明細書に記載した方法は更に異常なCARD-4の発現または活性に関連する障害に罹患しているかそれを発症する危険性が高い対象を同定するための診断または予後のアッセイ法として利用できる。例えば、前記した診断アッセイ法または後述するアッセイ法のような本明細書に記載したアッセイ法を利用してCARD-4タンパク質、核酸の発現または活性に関わる障害を有するかそれを発症する危険性が高い対象を同定することができる。または、予後アッセイ法を利用してこのような疾患または障害に罹患しているかそれを発症する危険性が高い対象を同定することができる。即ち、本発明は試験試料を対象より入手し、CARD-4タンパク質または核酸（例えばmRNA、ゲノムDNA）を検出する方法を提供し、その際、CARD-4タンパク質または核酸の存在は異常なCARD-4の発現または活性に関わる疾患または障害を有するかそれを発症する危険性が高い対象の診断材料となる。本明細書で使用される、「試験試料」とは対象となる対象から得た生物学的試料をさす。例えば試験試料は生物学的液体（例えば血清）、細胞試料または組織であることができる。更にまた本明細書に記載する予後アッセイ法は、対象に薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティイク、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬剤候補）を投与することにより異常なCARD-4発現または活性に関連する疾患または障害を処置することができるかどうかを調べるために使用できる。例えば、このような方法を用いて、特定の薬剤または薬剤のクラス（例えばCARD-4活性を低下させる型の薬剤）で対象を効果的に処置できるかどうかを判断できる。即ち、本発明は異常なCARD-4の発現または活性に関連する障害に対してある薬剤で患者を効果的に処置できるかどうかを判断する方法を提供し、その際、試験試料を入手し、CARD-4タンパク質または核酸を検出する（例えばCARD-4タンパク質または核酸の存在は、異常なCARD-4の発現または活性に関連する障害を処置するために薬剤を投与できる対象に関する診断材料となる）。
【０２１９】
本発明の方法はまた、CARD-4遺伝子における遺伝子の病変または突然変異を検出することにより、病変した遺伝子を有する対象が異常な細胞の増殖および/または分化を特徴とする障害の危険性があるかどうかを判断するために使用できる。好ましい態様においては、方法は対象由来の細胞の試料中、CARD-4タンパク質をコードする遺伝子の一体性に影響する改変の少なくとも1種またはCARD-4遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝子病変の存在または非存在を検出することを包含する。例えば、このような遺伝子病変は少なくとも1つの存在、即ち、1）CARD-4遺伝子由来のヌクレオチド一つまたは複数の欠失；2）CARD-4遺伝子へのヌクレオチド一つまたは複数の付加；3）CARD-4遺伝子のヌクレオチド一つまたは複数の置換；4）CARD-4遺伝子の染色体再配列；5）CARD-4遺伝子のメッセンジャーRNA転写物のレベルの改変；6）ゲノムDNAのメチル化パターンの場合のようなCARD-4遺伝子の異常な修飾；7）CARD-4遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型のスプライシングパターンの存在（例えばスプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位における突然変異により誘発されるもの）；8）CARD-4タンパク質の非野生型のレベル；9）CARD-4遺伝子の対立遺伝子消失；および10）CARD-4タンパク質の不適切な翻訳後修飾を確認することにより検出できる。本明細書に記載するとおり、CARD-4遺伝子の病変を検出するために使用できる多数のアッセイ技術が当技術分野において知られている。生物学的試料は対象から従来の手段により単離された末梢血白血球試料である。
【０２２０】
特定の態様においては、病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
（例えば米国特許第4,683,195号および4,683,202号参照）、例えばアンカーPCRまたはRACE PCRにおける、または、ライゲーション連鎖反応（LCR）（例えばLandegranら、1988,Science,241：1077-1080；およびNakazawaら、1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：360-364）におけるプローブ/プライマーの使用を包含し、後者はCARD-4遺伝子の点突然変異を検出するために特に有用である（例えばAbravayaら、1995,Nucleic Acid Res.,23：675-682参照）。この方法は、患者から細胞の試料を採取し、試料の細胞から核酸（例えばゲノム、mRNAまたは両方）を単離し、CARD-4遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でCARD-4遺伝子と特異的にハイブリダイズするプライマー一つまたは複数に核酸試料を接触させること、および、増幅産物の有無を検出すること、または、増幅産物の大きさを検出することおよび対照試料と長さを比較することの工程を包含する。PCRおよび/またはLCRは本明細書に記載する突然変異を検出するために使用される手法のいずれかと組み合わせて予備増幅工程として使用するのが望ましい場合がある。
【０２２１】
代替増幅方法には、自己持続性配列複製（Guatelliら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：1874-1878）、転写増幅系（Kwohら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：1173-1177）、Q-βレプリカーゼ（Lizardiら、1988,Bio/Technology6：1197）またはその他の核酸増幅方法、その後の当技術分野において周知の手法を用いた増幅分子の検出を包含する。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少数のみ存在する場合にそのような分子の検出のために特に有用である。
【０２２２】
別の態様においては、試料のCARD-4遺伝子中の突然変異は制限酵素切断パターンの改変により同定できる。例えば、試料および対照のDNAを単離し、増幅（任意で）し、一つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメント長をゲル電気泳動で測定して比較する。試料および対照のDNAの間のフラグメント長の相違は試料DNAの突然変異を示している。更にまた、配列特異的リボザイム（例えば米国特許第5,498,531号参照）を使用してリボザイム切断部位の発生または消失により特異的突然変異の存在を評価できる。
【０２２３】
他の態様においては、CARD-4の遺伝子突然変異は、試料および対照の核酸、例えばDNAまたはRNAをオリゴヌクレオチドプローブ数百〜数千を含む高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定できる（Croninら、1996,Human Mutation,7：244-255；Kozalら、1996,Nature Medicine,2：753-759）。例えばCARD-4の遺伝子突然変異は、Croninら（前記）に記載の光発生DNAプローブを含む2次元アレイにおいて同定できる。慨すれば、プローブの第1のハイブリダイゼーションアレイを用いて試料および対照中のDNAの長ストレッチに渡ってスキャンしながら、逐次的に重複するプローブの直線的アレイを作製することにより配列の間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異の同定が可能となる。この工程の後に、検出された全ての変異体または突然変異に相補的なより小さい特殊化されたプローブアレイを用いることにより特異的突然変異の特性を可能とする第2のハイブリダイゼーションアレイを使用する。各突然変異アレイは平行プローブセットからなり、1つは野生型遺伝子と相補であり、もう一方は突然変異遺伝子と相補である。
【０２２４】
更に別の態様において、当技術分野において知られている種々の配列決定反応のいずれかを用いてCARD-4遺伝子を直接配列決定し、相当する野生型（対照）配列と試料CARD-4の配列を比較することにより突然変異を検出することができる。配列決定反応の例は、MaxamおよびGilbert,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74：560またはSanger,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74：5463により開発された手法に基づくものを包含する。更にまた診断アッセイ法（（1995）Bio/Techniques 19：448）を実施する際には種々の自動化配列決定操作法のいずれかを利用することができ、例えば、質量スペクトルによる配列決定が挙げられる（例えば国際公開公報第94/16101号；Cohenら、1996,Adv.Chromatogr.,36：127-162；およびGriffinら、1993,Appl.Biochem.Biotechnol.,38：147-159参照）。
【０２２５】
CARD-4遺伝子内の突然変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護を用いてRNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二重らせん中におけるミスマッチ塩基を検出する方法が包含される（Myersら、1985,Science,230：1242）。一般的に、「ミスマッチ切断」の技術は組織試料から得た潜在的に突然変異体であるRNAまたはDNAに野生型のCARD-4配列を含む（標識された）RNAまたはDNAをハイブリダイズすることにより形成されたヘテロ二重らせんを与えることにより開始する。対照および試料の鎖の間の塩基対ミスマッチにより存在するもののような二重らせんの1本鎖領域を切断する薬剤で2本鎖二重らせんを処理する。例えばRNA/DNA二重らせんをRNaseで処理し、そしてDNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理することにより、ミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。別の態様においては、DNA/DNAまたはRNA/DNAの二重らせんのいずれかをヒドロキシルアミンまたは4酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することにより、ミスマッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域の消化の後、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離し、突然変異部位を決定する。例えばCottonら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85：4397；Saleebaら、1992,Methods Enzymol.,217：286-295を参照。1つの態様においては、対照のDNAまたはRNAを検出のために標識できる。
【０２２６】
更に別の態様においては、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料から得たCARD-4cDNAにおける点突然変異の検出およびマッピングのための画定された系において2本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識するタンパク質一つまたは複数（いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば大腸菌のmutY酵素はG/AミスマッチにおいてAを切断し、HeLa細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチにおいてTを切断する（Hsuら、1994,Carcinogenesis,15：1657-1662）。例示される態様においては、CARD-4配列、例えば野生型CARD-4配列に基づくプローブを試験細胞のcDNAまたは他のDNA産物にハイブリダイズする。二重らせんをDNAミスマッチ修復酵素で処理し、そして切断産物がある場合は、これを電気泳動プロトコル等から検出することができる。例えば米国特許第5,459,039号を参照。
【０２２７】
他の態様においては、電気泳動における移動性の変化を用いてCARD-4遺伝子における突然変異を同定する。例えば1本鎖コンホーメーション多型（SSCP）を用いて突然変異対および野性型の核酸の間の電気泳動の移動性における相違を検出してよい（Oritaら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：2766、またCotton,1993,Mutat.Res.,285：125-144；およびHayashi,1992,Genet Anal.Tech.Appl.,9：73-79参照）。試料および対照のCARD-4核酸の1本鎖DNAフラグメントを変性させ、再生させる。1本鎖核酸の二次構造は配列により変動し、その結果生じる電気泳動の移動性における改変により、1塩基変化であっても検出が可能となるのである。DNAフラグメントは標識し、標識されたプローブにより検出してよい。二次構造が配列の変化により感受性であるRNAを（DNAよりはむしろ）使用してアッセイの感度を向上させてよい。1つの態様においては、対象となる方法は電気泳動の移動性の変化に基づいて2本鎖ヘテロ二重らせん分子を分離するためにヘテロ二重らせん分析を利用する（Keenら、1991,Trends Genet,7：5）。
【０２２８】
更に別の態様においては、変性の勾配を有するポリアクリルアミドゲル中の突然変異対または野生型フラグメントの移動を、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用いてアッセイする（Myersら、1985,Nature,313：495）。DGGEを分析方法として使用する場合、例えばPCRにより高融点GCリッチDNAの約40bpのGCクランプを添加することにより、DNAを完全には変性しないように修飾する。更に別の態様においては、変性勾配の代わりに温度勾配を用いて対照および試料のDNAの移動性の相違を同定する（RosenbaumおよびReissner,1987,Biophys.Chem.265：12753）。
【０２２９】
点突然変異を検出するための別の手法の例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長を包含するが、これらに限定されない。例えばオリゴヌクレオチドプライマーを既知突然変異が中央に位置するように作製し、次に完全なマッチが発見される場合のみハイブリダイゼーションが可能となる条件下に標的DNAにハイブリダイズしてよい（Saikiら、1986,Nature 324：163）；Saikiら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：6230）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合し、そして標識された標的DNAにハイブリダイズする場合に、PCR増幅した標的DNAまたは多くの異なる突然変異体にハイブリダイズする。
【０２３０】
また、選択的PCR増幅に依存した対立遺伝子特異的増幅手法を本発明の方法と共に使用してよい。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、対象となる突然変異を、分子の中心（増幅が示差的ハイブリダイゼーションに依存するように）（Gibbsら、1989,Nucleic Acids Res.,17：2437-2448）に、または、適切な条件下ではミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止または低減することができる一方のプライマーの3’最端末端において保有している（Prossner,1993,Tibtech,11：238）。更にまた、新しい制限部位を突然変異の領域に導入することにより切断に基づく検出を行うことが望ましい場合がある（Gaspariniら、1992,Mol.Cell Probes,6:1）。特定の態様においては、増幅はまた増幅のためのTaqリガーゼを用いて行ってもよい（Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：189）。そのような場合には、増幅の有無を調べることにより特定の部位における既知突然変異の存在を検出可能とする5’配列の3’末端における完全なマッチがある場合のみにライゲーションが起こる。
【０２３１】
本明細書に記載した方法は、例えば本明細書に記載した少なくとも1種のプローブ核酸または抗体試薬を含む予備パッケージされた診断キットを利用することにより行ってよく、これは例えばCARD-4遺伝子の関与する疾患または病気の症状を有するか家族性の病歴を有する患者を診断する臨床的状況において好都合に使用してよい。
【０２３２】
更にまた、CARD-4が発現されているいずれかの細胞型または組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に記載した予後アッセイ法に利用してよい。
【０２３３】
3.薬理ゲノミクス
本明細書に記載したスクリーニングアッセイ法により同定されるCARD-4活性（例えばCARD-4遺伝子発現）に対して刺激性または抑制性の作用を有する薬剤またはモジュレーターを個体に投与することにより、異常なCARD-4活性に関わる障害（例えば免疫障害）を処置（予防的または治療的に）することができる。このような処置に関しては、個体の薬理ゲノミクス（即ち個体の遺伝子型とその個体の外来性化合物または薬剤への応答との間の関係に関する研究）が考慮される。治療学の代謝の相違は、薬理学的活性剤の用量と血中濃度との間の関係を改変することにより重度の毒性または治療の失敗をもたらす場合がある。即ち、個体の薬理ゲノミクスにより、個体の遺伝子型を考慮した予防的または治療的な処置のための有効な薬剤（例えば薬品）の選択が可能となる。このような薬理ゲノミクスを更に適切な用量および治療計画(therapeutic regimen)の決定のために使用できる。従って、個体におけるCARD-4タンパク質の活性、CARD-4核酸の発現またはCARD-4遺伝子の突然変異含量を調べることができ、これにより、個体の治療的または予防的な処置のための適切な薬剤を選択できる。
【０２３４】
薬理ゲノミクスは罹患した人間における改変された薬剤の性質および異常な作用による薬剤への応答の臨床的に重大な遺伝的変異を取り扱う。例えばLinder,1997,Clin.Chem.,43（2）：254-266を参照。一般的に、薬理ゲノミクス学的条件の2種を分別できる。身体に薬剤が作用する方法を改変する単一の因子として伝達される遺伝子的条件（改変された薬品の作用）または薬剤に対して身体が作用する方法を改変する単一の因子として伝達される遺伝子的条件である（改変された薬品の代謝）。これらの薬理ゲノミクス学的条件は希少な欠損または多型のいずれかとして生じる。例えば、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損（G6PD）は主な臨床的合併症が酸化性薬剤（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン類）の服用およびソラマメの摂取後の溶血である一般的な遺伝的酵素病である。
【０２３５】
例示される態様として、薬剤代謝酵素の活性は薬剤作用の強度および持続時間の両方の主な決定因子である。薬剤代謝酵素（例えばN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT 2）およびチトクロームP450酵素CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝子多型の発見は一部の患者が標準的で安全な用量の薬剤の服用後に期待される薬剤の作用を被らず、または、増強された薬剤応答および重篤な毒性を示す理由を説明している。これらの多型は集団における2種の表現型、即ち過剰代謝者（EM）および過少代謝者（PM）において発現される。PMの蔓延度は種々の集団内で異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は高度に多型性であり、数種の突然変異がPMで同定されており、これらは全て機能的CYP2D6の非存在をもたらしている。CYP2D6およびCYP2C19の過少代謝は標準的用量の投与後に増強された薬剤応答および副作用を示す場合が極めて頻繁である。代謝産物が活性な治療部分である場合、PMは、そのCYP2D6形成代謝産物モルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛作用に関して示される通り、治療応答を示さない。他の究極的な例は標準的な用量に応答しないいわゆる超急速代謝者である。近年、超急速代謝の分子的根拠がCYP2D6の遺伝子増幅によるものであるとわかった。
【０２３６】
即ち、個体におけるCARD-4タンパク質の活性、CARD-4核酸の発現またはCARD-4遺伝子の突然変異量を測定することにより、個体の治療的または予防的な処置のための適切な薬剤を選択できる。更にまた、薬理ゲノミクス的研究により薬剤代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子タイピングを個体の薬剤応答性の表現型の同定に適用できる。この知見は用量決定または薬剤の選択に適用すれば、副反応または治療過誤を回避でき、これにより、本明細書に記載した例示されるスクリーニングアッセイ法の1つにより同定されるモジュレーターのようなCARD-4モジュレーターを対象に投与する際の治療的または予防的な効率が向上する。
【０２３７】
4.臨床治験の間の作用のモニタリング
CARD-4の発現または活性（例えば異常な細胞増殖および/または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば薬品、化合物）の影響のモニタリングは基礎的な薬剤スクリーニングのみならず臨床治験にも適用できる。例えば、CARD-4遺伝子発現、タンパク質濃度を上昇させるかCARD-4活性をアップレギュレートすることが本明細書に記載したスクリーニングアッセイ法により決定された薬剤の有効性は低減したCARD-4遺伝子発現、タンパク質濃度またはダウンレギュレートされたCARD-4活性を示す対象の臨床治験によりモニタリングすることができる。または、CARD-4遺伝子の発現、タンパク質濃度またはダウンレギュレートされたCARD-4活性を低減することがスクリーニングアッセイ法によりわかった薬剤の有効性は、増大されたCARD-4遺伝子発現、タンパク質濃度またはアップレギュレートされたCARD-4活性を示す対象の臨床治験においてモニタリングできる。このような臨床治験において、CARD-4および好ましくは例えば細胞増殖障害において関連ありとされている他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「リードアウト」またはマーカーとして使用できる。
【０２３８】
例えば、限定としてではないが、CARD-4活性を調節する（例えば上記したスクリーニングアッセイ法において同定される）薬剤（例えば化合物、薬品または小分子）の投与により細胞内において調節されたCARD-4を含む遺伝子を同定できる。即ち、例えば臨床治験において細胞増殖性障害に対する薬剤の作用を検討するためには、細胞を単離し、RNAを調製し、そしてCARD-4および障害に関係する他の遺伝子の発現の濃度を分析する。遺伝子発現の濃度（即ち遺伝子発現のパターン）は、本明細書に記載の通りノーザンブロット分析またはRT-PCRにより、または、本明細書に記載の方法の1つにより生産されたタンパク質の量を測定することにより、または、CARD-4または他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより、定量できる。このようにして、遺伝子発現パターンは薬剤への細胞の生理学的応答を示すマーカーとして機能する。従って、この応答状態を薬剤による個体の処置の前、およびその間の種々の時点において測定してよい。
【０２３９】
1つの態様において、本発明は、工程、すなわち、（i）薬剤の投与の前に対象から投与前試料を得ること；（ii）投与前試料中のCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現または活性の濃度を検出すること；（iii）対象から投与後試料一つまたは複数を得ること；（iv）投与後試料中のCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現または活性の濃度を検出すること；（v）投与前試料中のCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAの発現または活性のレベルを投与後試料中のCARD-4タンパク質、mRNAまたはゲノムDNAと比較すること；および（vi）対象への薬剤の投与を相応に改変すること、を含む、薬剤（例えば本明細書に記載したスクリーニングアッセイ法で同定されるアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬品候補）の対象への投与の有効性をモニタリングするための方法を提供する。例えば、薬剤の有効性を増大させるためには検出された値より高値にまでCARD-4の発現または活性を上昇させるために、増量投与が望ましい場合がある。または、薬剤の有効性を低減するためには検出された値より低値にまでCARD-4の発現または活性を低下させるために、減量投与が望ましい場合がある。
【０２４０】
5.転写プロファイリング
小型オリゴヌクレオチドを含む本明細書に記載したCARD-4核酸分子は転写プロファイリングに使用できる。例えばこれらの核酸を用いて正常な組織および細胞および疾患状態にある組織または細胞対象、例えば対象となる疾患を有する患者から得た組織または細胞、または、対象となる疾患状態をモデリングまたは反映している培養細胞、例えば培養腫瘍細胞系統の細胞におけるCARD-4の発現を調べることができる。CARD-4の発現を共に、または個別に測定することにより正常および疾患状態における発現の特徴が表れる。この特徴を診断的に、および、治療計画の有効性の検討のために使用できる。
【０２４１】
C.処置方法
本発明は異常なCARD-4の発現または活性に関連する障害の危険性がある（罹患しやすい）または障害を有する対象を処置するための予防的および治療的な方法の両方を提供し、その例を本明細書に記載する。
【０２４２】
1.予防的方法
1つの局面において、本発明はCARD-4の発現またはCARD-4の活性少なくとも1種を調節する薬剤を対象に投与することによる、異常なCARD-4の発現または活性に関連する疾患または症状を対象において予防するための方法を提供する。異常なCARD-4の発現または活性により誘発される、またはこれが寄与している疾患の危険性が高い患者は、例えば、本明細書に記載した診断または予後アッセイ法のいずれかまたはその組み合わせにより同定できる。予防的薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、または、進行が遅延するように、CARD-4の異常性に特徴的な症状の顕在化の前に行うことができる。CARD-4の異常性の種類に応じて、例えばCARD-4アゴニストまたはCARD-4アンタゴニストの薬剤を用いて対象を処置することができる。適切な薬剤は本明細書に記載するスクリーニングアッセイ法に基づいて決定できる。
【０２４３】
2.治療的方法
本発明の別の局面は治療目的のためにCARD-4の発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞に関連するCARD-4タンパク質の活性の一つまたは複数を目する薬剤に細胞を接触させることを包含する。CARD-4タンパク質の活性を調節する薬剤は、本明細書に記載する薬剤、例えば核酸またはタンパク質、CARD-4タンパク質の天然に存在する同族体リガンド、ペプチド、CARD-4ペプチドミメティック、または他の小分子であることができる。1つの態様においては、薬剤はCARD-4タンパク質の生物学的活性の一つまたは複数を刺激する。このような刺激剤の例は活性なCARD-4タンパク質および細胞に導入されたCARD-4をコードする核酸分子を包含する。別の態様においては、薬剤はCARD-4タンパク質の生物学的活性の一つまたは複数を抑制する。このようなインヒビターの例は、アンチセンスCARD-4核酸分子および抗CARD-4抗体を含む。これらの調節法はインビトロ（例えば細胞を薬剤と共に培養）またはインビボ（例えば対象に薬剤を投与）で実施できる。このようにして本発明はCARD-4タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害、またはCARD-4の発現または活性に関連する障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。1つの態様においては、方法はCARD-4の発現または活性を調節（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレート）する薬剤（例えば本明細書に記載したスクリーニングアッセイ法により同定される薬剤）または薬剤の組み合わせを投与することを包含する。別の態様においては、方法は、低減した、または異常なCARD-4の発現または活性を補うための治療としてCARD-4タンパク質または核酸分子を投与することを包含する。治療目的のために調節されるCARD-4の活性は、これらに限定されないが、（1）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とのタンパク質:タンパク質相互作用を示す能力；（2）アポトーシスシグナル伝達経路におけるタンパク質とCARD-CARD相互作用を示す能力；（3）CARD-4リガンド（例えばCARD-4、CARD-3、カスパーゼ-9および/またはBCLX）に結合する能力；（4）細胞内標的に結合する能力；（5）カスパーゼ-9活性を増強する能力；および（6）NF-κB経路を活性化する能力を含む。治療目的のために調節される他の活性は、（1）細胞増殖の調節；（2）細胞分化の調節；（3）細胞死の調節；（4）炎症および/または生得的な免疫応答の調節；および（5）CARD-4 mRNAまたはタンパク質の発現の調節を包含する。
【０２４４】
CARD-4が異常にダウンレギュレートされる、および/または、上昇したCARD-4活性が有利な作用を有すると考えられる状況においては、CARD-4活性の刺激が望ましい。逆に、CARD-4が異常にアップレギュレートされる、例えば心筋梗塞等、および/または、低下したCARD-4活性が有利な作用を有すると考えられる状況においては、CARD-4活性の抑制が望ましい。CARD-4はサイトカインのプロセシングに関与していると考えられているため、異常な炎症を有する患者においては、CARD-4の活性または発現の抑制が有利であると考えられる。
【０２４５】
本出願を通じて引用した全ての参考文献、特許および公開された特許出願は参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】ヒトCARD-4のcDNA配列（配列番号:1）および推定されるアミノ酸配列（配列番号:2）を示す。CARD-4のオープンリーディングフレームは配列番号:1のヌクレオチド245からヌクレオチド3103に伸びる（配列番号:3）。
【図２Ａ】フレクスナー赤痢菌感染がchmのホスホリル化をもたらすことを示す実験の結果である。
【図２Ｂ】LPSのマイクロインジェクションがc-Junのホスホリル化を活性化することを示す実験の結果である。
【図３Ａ】TRAF2の優性陰性形態が侵襲性のフレクスナー赤痢菌によるNF-κBの誘導を抑制しないことを示す実験の結果である。
【図３Ｂ】TRAF6の優性陰性形態が侵襲性のフレクスナー赤痢菌によるNF-κBの誘導を抑制しないことを示す実験の結果である。
【図３Ｃ】IL-1特異的シグナル伝達成分を欠損したHEK293においてフレクスナー赤痢菌がNF-κBを誘導することを示す実験の結果である。
【図３Ｄ】優性陰性分子MyD88（Dn-MyD88）が侵襲性のフレクスナー赤痢菌によるNF-κBの活性化を抑制しないことを示す実験の結果である。
【図４Ａ】植物疾患耐性タンパク質タバコNタンパク質およびアラビドプシスRPS2タンパク質と比較したCARD-4のドメイン構造を示す。
【図４Ｂ】フレクスナー赤痢菌感染後のCARD-4のオリゴマー化を示す実験の結果である。
【図５Ａ】ACARD CARD4がフレクスナー赤痢菌によるNF-κB誘導を抑制するがTNFaは抑制しないことを示す実験の結果である。
【図５Ｂ】単離されたCARD-4 LRRドメインがフレクスナー赤痢菌によるNF-κB誘導を抑制するがTNFaは抑制しないことを示す実験の結果である。
【図５Ｃ】JNK活性化に対するCARD-4の完全長およびトランケーション形の過剰発現の影響を示す実験の結果である。
【図６】サルモネラ・チフィムリウムに感染後の野生型マウスおよびCARD-4欠損マウスの細菌負荷を示す。
【図７】ヘリコバクター・ピロリに感染後の野生型マウスおよびCARD-4欠損マウスの細菌負荷を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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