(57)【要約】少なくとも１個のβ−イオノン環を有する環状カロテノイド類の生物変換を介して、アリール−カロテノイド類を産生する方法を提供する。適当な環状カロテノイド基質を産生する宿主細胞におけるカロテン・デサチュラーゼをコードする異種遺伝子（ｃｒｔＵ）酵素の発現が、アリールカロテノイド類の産生をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１個のβ−イオノン環を有する環状カロテノイドを含んでなる宿主細胞を準備し；
（ｂ）カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子で（ａ）の宿主細胞を形質転換させ；そして
（ｃ）アリールカロテノイドが産生される条件下に、（ｂ）の形質転換宿主細胞を増殖させる
ことを含んでなるアリールカロテノイド化合物の産生方法。
【請求項２】
アリールカロテノイドが非対称である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−イオノン環を有する環状カロテノイドが宿主細胞により内因的に産生される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
β−イオノン環を有する環状カロテノイドが外因的に宿主細胞に提供される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
β−イオノン環を有する環状カロテノイドがβ−カロテン；γ−カロテン；α−カロテン；ゼアキサンチン；β−イソレニエラテン（ｉｓｏｒｅｎｉｅｒａｔｅｎｅ）（φ，β−カロテン）；トルレン；１’，２’−ジヒドロ−γ−カロテン；７，８−ジヒドロ−γ−カロテン；７’，８’−ジヒドロ−β−カロテン；７’，８’，７，８−テトラヒドロ−β−カロテン；β−ゼアカロテン；エキネノン；３−ＯＨ−β−カロテン；１’，２’−ジヒドロ−１’−ＯＨ−トルレン；１６’−ＯＨ−トルレン；１６’−オキソ−トルレン；および１６’−カルボキシ−トルレンよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アリールカロテノイドがイソレニエラテン（φ，φ−カロテン）；β−イソレニエラテン（φ，β−カロテン）；クロロバクテン（φ，ψ−カロテン）；φ，ε−カロテン；１，２−ジデヒドロクロロバクテン；１’，２’−ジヒドロクロロバクテン；７，８−ジヒドロ−クロロバクテン；７’，８’−ジヒドロ−イソレニエラテン；７’，８’，７，８−テトラヒドロ−イソレニエラテン；７’，８’−ジヒドロ−クロロバクテン；β，φ−カロテン−４−オン；β，φ−カロテン−３−オール；３−ＯＨ−イソレニエラテン；３，３’−ジヒドロキシ−イソレニエラテン；７’，８’−ジデヒドロレニエラテン；ＯＨ−クロロバクテン；１’，２’−ジヒドロ−１’−ＯＨ−ジデヒドロクロロバクテン；１６’−ＯＨ−ジデヒドロクロロバクテン；１６’−オキソ−ジデヒドロクロロバクテン；および１６’−カルボキシ−ジデヒドロクロロバクテンよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子が配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｃｒｔＵ遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子がジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＢ０７０９３４、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ２７２７３７、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＪ１３３７２４、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ１３９９１６、およびジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＬ１０９９８９およびＡＬ１０９９６２、ならびに微生物ゲノムデータベースｇｎｌ｜ＴＩＧＲ｜マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）８９およびＣＴ０３２３（シアノベース（ＣｙａｎｏＢａｓｅ））よりなる群から選択されるｃｒｔＵ遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター・クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
形質転換宿主細胞がスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）よりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
形質転換宿主細胞がダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ラッカセイ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐｓ）、サトウダイコン、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライ麦、アマ、硬葉樹、軟葉樹、およびまぐさ（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓ）よりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）適当な調節配列の制御下に、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするカロテン・デサチュラーゼ遺伝子を、宿主細胞に導入し；そして
（ｂ）カロテン・デサチュラーゼ遺伝子が発現され、かつアリールカロテノイド生合成が制御される条件下に、（ａ）の宿主細胞を増殖させる
ことを含んでなる宿主細胞におけるアリールカロテノイド生合成の調節方法。
【請求項１４】
カロテン・デサチュラーゼ遺伝子がアップレギュレートされる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
マルチコピー・プラスミドで、該カロテン・デサチュラーゼ遺伝子が過剰発現される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
該カロテン・デサチュラーゼ遺伝子が誘導または調節プロモーターに作動可能に連結される請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
カロテン・デサチュラーゼ遺伝子がダウンレギュレートされる請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
該カロテン・デサチュラーゼ遺伝子がアンチセンス方向で発現される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該カロテン・デサチュラーゼ遺伝子がコード領域への外来ＤＮＡの挿入により中断される請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）β−カロテンを含んでなる宿主細胞を準備し；
（ｂ）カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子で（ａ）の宿主細胞を形質転換させ；そして
（ｃ）アリールカロテノイドが産生される条件下に、（ｂ）の形質転換宿主細胞を増殖させる
ことを含んでなるイソレニエラテンの産生方法。
【請求項２１】
（ａ）γ−カロテンを含んでなる宿主細胞を準備し；
（ｂ）カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子で（ａ）の宿主細胞を形質転換させ；そして
（ｃ）アリールカロテノイドが産生される条件下に、（ｂ）の形質転換宿主細胞を増殖させる
ことを含んでなるクロロバクテンの産生方法。
【請求項２２】
カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子に由来するプロモーターの制御下にある請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞がロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）である請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
β−カロテンが宿主細胞により内因的に産生される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
β−カロテンが宿主細胞に外因的に提供される請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
γ−カロテンが宿主細胞により内因的に産生される請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
γ−カロテンが宿主細胞に外因的に提供される請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００２年５月６日出願の、米国仮特許出願第６０／３７８３１２号の利益を請求する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、微生物学の分野である。より詳細には、本発明は、アリール−カロテノイド化合物の微生物による産生方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイド類は、自然界全体のいたる所に存在し、また全ての光合成生物、および一部の従属栄養的生育細菌および菌・カビで合成される色素である。カロテノイド類は花、野菜、昆虫、魚および鳥に色を与える。カロテノイド類の色は、黄色から赤色までの範囲であり、褐色および紫の変化を含む。ビタミンＡの前駆物質として、カロテノイド類は我々の食事の基本的な成分であり、またヒトの健康における重要な役割を担う。カロテノイド類の工業的使用としては、２、３の例を挙げると、医薬、栄養補助食品、動物の飼料添加物および化粧品の着色料などがある。
【０００４】
動物は、カロテノイド類を新規に合成することができないため、食餌という方法によって得なければならない。したがって、植物または細菌におけるカロテノイド産生および組成物の操作によって、カロテノイド類の新規なまたは改良されたソースを提供することができる。
【０００５】
カロテノイド類は、多くの異なる形態また化学構造で提供される。ほとんどの天然カロテノイド類は、８個のＣ５イソプレン単位（ＩＰＰ）の逐次縮合により誘導されるＣ４０メチル分枝炭化水素主鎖を含有する疎水性テトラテルペノイド類である。さらに、より長いまたはより短い主鎖を有する新規なカロテノイド類が、非光合成細菌の幾つかの種で見出される。カロテノイド類は大きな変化を示し、炭化水素主鎖の末端が環化して脂肪族構造または環状環構造を生じるかどうかによって非環式、単環式、または二環式である可能性がある（非特許文献１）。
【０００６】
カロテノイド生合成は、Ｃ５イソプレン単位、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成するためのイソプレノイド経路で開始する。次いで、ＩＰＰを、その異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と縮合して、Ｃ１０ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生成し、次いでこれを伸長してＣ１５ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を形成する。ＦＰＰ合成は、カロテン生成細菌および非カロテン生成細菌の両者でよくみられる。カロテノイド経路におけるさらなる酵素は、ＦＰＰ先駆物質からカロテノイド色素を生成することができ、２つのカテゴリー、（ｉ）カロテン主鎖合成酵素と、（ｉｉ）その後の修飾酵素と、に分かれる。主鎖合成酵素としては、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、およびリコピンシクラーゼ等々がある。修飾酵素としては、ケトラーゼ、ヒドロキシラーゼ、デヒドラターゼ、グリコシラーゼ等々がある。
【０００７】
β−カロテンは、カロテン・デサチュラーゼで、イソレニエラテン（ｉｓｏｒｅｎｉｅｒａｔｅｎｅ）に変換できることが知られている。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む若干の放線菌類で、カロテン・デサチュラーゼをコードするｃｒｔＵ遺伝子が同定されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。もう１つのアリール−カロテンであるクロロバクテンが、光合成緑色細菌で報告された（非特許文献５；非特許文献６）。生来のクロロバクテンおよび誘導体の合成に関与しているであろう、推定上のカロテン・デサチュラーゼ遺伝子が、最近の、緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）のゲノム配列決定で同定された（非特許文献７）。しかし、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）由来の推定上のカロテン・デサチュラーゼ遺伝子の機能は、未だ決定されていない。放線菌類由来のＣｒｔＵは、β−カロテンに加えて他の基質にも作用して、様々なアリール−カロテノイド類を産生する、たとえば、γ−カロテンをクロロバクテンに変換する、公算が高い。しかし、ｃｒｔＵを異種宿主で発現させるためのこれまでの試みは成功していない（非特許文献８）。カロテン・デサチュラーゼを異種宿主で発現させることができないことは不運であり、遺伝子操作による様々なアリール−カロテノイド類の合成の重大な障害となった。さらに、天然のアリール−カロテノイド類は、常に、アリール−カロテノイド類とそれらの前駆物質または誘導体との混合物として存在する（非特許文献９；非特許文献６）。純粋なアリール−カロテノイドの産生は、カロテン・デサチュラーゼを異種宿主で発現させることができることを必要とする。
【０００８】
【非特許文献１】Ｇ．アームストロング（Ｇ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）著、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、エルセビエール・プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９９年、２巻、３２１−３５２ページ）
【非特許文献２】クルーゲル（Ｋｒｕｇｅｌ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４３９：５７−６４（１９９９年）
【非特許文献３】クルバシク（Ｋｒｕｂａｓｉｋ）およびサンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ）、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２６３：４２３−４３２（２０００年）
【非特許文献４】ビベイロス（Ｖｉｖｅｉｒｏｓ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、１８７：９５−１０１（２０００年）
【非特許文献５】リアーエン・ジェンセン（Ｌｉａａｅｎ−Ｊｅｎｓｅｎ）ら、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ、１８：１７０３−１７１８（１９６４年）
【非特許文献６】タカイチ（Ｔａｋａｉｃｈｉ）ら、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６８：２７０−２７６（１９９７年）
【非特許文献７】エイセン（Ｅｉｓｅｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９９：９５０９−９５１４（２００２年）
【非特許文献８】シューマン（Ｓｃｈｕｍａｎｎ）ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２５２：６５８−６６６（１９９６年）
【非特許文献９】コール（Ｋｏｈｌ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２：２０７−２１３（１９８３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
解決しなければならない問題は、アリール−カロテノイド類を異種宿主で産生するために、機能性カロテン・デサチュラーゼ（ｃｒｔＵ）遺伝子を発現させることである。出願人は、ｃｒｔＵ遺伝子をブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）から単離し、該遺伝子をプラスミドからロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２菌株で発現させることにより、記載の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、カロテン・デサチュラーゼの存在下で、環状カロテノイド基質の生物変換によりアリールカロテノイド化合物を産生する方法を提供する。具体的には、本発明は、
（ａ）少なくとも１個のβ−イオノン環を有する環状カロテノイドを含んでなる宿主細胞を準備し；
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を、カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子で形質転換させ；そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、アリールカロテノイドが産生される条件下に増殖させる
ことを含んでなるアリールカロテノイド化合物の産生方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、
（ａ）適当な調節配列の制御下で、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするカロテン・デサチュラーゼ遺伝子を、宿主細胞に導入し；そして
（ｂ）該カロテン・デサチュラーゼ遺伝子が発現され、かつアリールカロテノイド生合成が制御される条件下に、（ａ）の宿主細胞を増殖させる
ことを含んでなる宿主細胞におけるアリールカロテノイド生合成の調節方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様において、本発明は、
（ａ）β−カロテンを含んでなる宿主細胞を準備し；
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を、カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子で形質転換させ；そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、アリールカロテノイドが産生される条件下に増殖させる
ことを含んでなるイソレニエラテンの産生方法を提供する。
【００１３】
別の好ましい実施態様において、本発明は、
（ａ）γ−カロテンを含んでなる宿主細胞を準備し；
（ｂ）（ａ）の宿主細胞を、カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子で形質転換させ；そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、アリールカロテノイドが産生される条件下に増殖させる
ことを含んでなるクロロバクテンの産生方法を提供する。
【００１４】
下記の詳細な説明、および本願の一部に関する添付の配列表から、本発明を、より十分に理解することができる。
【００１５】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、また世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則のセクション２０８および付則Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に従う。
【００１６】
配列番号：１〜３は、１６ｓ  ｒＲＮＡを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１７】
配列番号：４は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２由来の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号：５〜６は、ｃｒｔＯ遺伝子を増幅するためにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１９】
配列番号：７は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２  ｃｒｔＯ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号：８は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２  ｃｒｔＯ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号：９〜１０は、ｐＢＲ３２８配列を増幅するためにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２２】
配列番号：１１〜１２は、ＡＴＣＣ  ４７０７２  由来のｃｒｔＯを増幅するためにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２３】
配列番号：１３は、ｐＲＨＢＲ１７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ロドコッカス・シャトルプラスミドのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号：１４は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２のｄｘｓ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号：１５〜１７は、ＡＮ１２由来のｄｘｓを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２６】
配列番号：１８は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ１３９９１６を持つブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）ＡＴＣＣ  ９１７５由来のｃｒｔＵ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号：１９は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ１３９９１６を持つブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）ＡＴＣＣ  ９１７５由来のＣｒｔＵのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号：２０および２１は、ｃｒｔＵ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーである。
【００２９】
配列番号：２２は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＪ  ３０８３７６を持つクロラムフェニコール耐性マーカーのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号：２３および２４は、配列番号：２２により明確に規定されるクロラムフェニコール耐性マーカーを増幅および単離するために使用されるプライマーである。
【発明の詳細な記述】
【００３１】
本発明は、カロテン・デサチュラーゼ遺伝子（ｃｒｔＵ）の異種発現により、β−イオノン環を有する環状カロテノイド類を、対応するアリールカロテノイドに変換する方法を提供する。
【００３２】
異種宿主におけるｃｒｔＵの発現は、個々の、アリールカロテノイド類の産生、ならびにイソプレノイド生合成経路における他のカロテノイド類の調節および産生に、有用である。カロテノイド化合物は、化学的に製造することが非常に難しいため、これらの化合物の微生物による産生は、一般に、実際に役に立つ（ネイルス（Ｎｅｌｉｓ）およびリーンヒア（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７０：１８１−１９１（１９９１））。芳香族環の導入は、ことによるとカロテノイド類をより安定にすることができ、このことは、食品着色剤用等の、ある種の用途に望ましいであろう。
【００３３】
この開示では、特許請求の範囲および明細書を説明するために、多数の用語および略語が使用される。
【００３４】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略される。
【００３５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと略される。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「単離された核酸断片」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を場合により含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００３７】
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」は、炭素１０個のテルペノイド類を含む、イソプレノイド経路から誘導される化合物およびそれらの誘導体、たとえばカロテノイド類およびキサントフィル類を指す。
【００３８】
用語「ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２」または「ＡＮ１２」は同義的に使用され、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２菌株を指す。
【００３９】
用語「ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２」または「ＡＴＣＣ  ４７０７２」は同義的に使用され、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２菌株を指す。
【００４０】
用語「カロテノイド」は、炭素５個のイソプレン単位から縮合されるポリエン主鎖からなる化合物を指す。カロテノイド類は、非環式であってもよく、あるいは１個（単環式）または２個の（二環式）環状末端基で終結してもよい。用語「カロテノイド」は、カロテン類およびキサントフィル類の両者を包含することが可能である。「カロテン」は、炭化水素カロテノイドを指す。ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒド官能基の形で、あるいはグリコシド類、グリコシドエステル類、または硫酸塩内に、１個もしくはそれ以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、集合的に「キサントフィル類」として知られる。本発明で特に好適なカロテノイド類は、単環式および二環式のカロテノイド類である。
【００４１】
用語「カロテン・デサチュラーゼ」は、単環式もしくは二環式カロテノイド類のβ−イオノン環のメチル基または他の基を、不飽和化し、また移動させることができる、酵素群を指す。本明細書で使用するのに好ましいカロテン・デサチュラーゼは、ブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）ＡＴＣＣ  ９１７５から単離され、また配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するｃｒｔＵである。
【００４２】
用語「アリール−カロテノイド」は、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、クロロバクテン、および図１に示す誘導体を含む、少なくとも１個の芳香族末端基を有するカロテノイド類を指す。
【００４３】
用語「％同一性」は、当該技術分野で公知の通り、配列を比較することにより決定される、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列の連続間のマッチによって決定される、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列類似度も意味する。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（レスク（Ｌｅｓｋ）Ａ．Ｍ．編）オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｗ．編）アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編）、フマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（ＮＪ）（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ボン・ヘインジ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編）、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９９１）；に記載のものを含むがその限りではない、既知の方法で容易に算出することができる。同一性を決定する好ましい方法は、被験配列間で、最高のマッチを与えるようにデザインされる。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算一式のメグアライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム（ウィスコンシン州マジソンにあるＤＮＡスター・インク（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して、実施することが可能である。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）アラインメント方法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）とデフォルトパラメーター（ギャップ・ペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ・レングス・ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を使用して、配列のマルチプルアラインメントを実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）方法を使用したペアワイズアラインメントのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ギャップ・ペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ・セーブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝５であった。
【００４４】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されたオリゴヌクレオチド構成単位から組み立てることができる。これらの構成単位を連結し、アニーリングして遺伝子セグメントを形成し、次いでこれを酵素的に組み立てて、完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連しているとき、「化学的に合成された」は、成分ヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられたことを意味する。十分に確立した手順を使用して、ＤＮＡの手動式化学合成を遂行してもよく、あるいは多数の市販されている機械の１つを使用して、自動式化学合成を実施してもよい。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて、遺伝子を最適遺伝子発現に合わせて調整することができる。コドン使用が、宿主に好まれるコドンに偏る場合、当業者は、功を奏する遺伝子発現の可能性を十分に理解する。好ましいコドンの決定は、配列情報を入手できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査を根拠にしてもよい。
【００４５】
「遺伝子」は、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する調節配列を含む、ある特定の蛋白質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、独自の調節配列と共に自然界に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界に一緒に存在しない調節配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子ではない遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する調節配列およびコード配列を含んでなってもよく、あるいは同一ソースに由来する調節配列およびコード配列を含んでなるが、自然界に存在するものと異なる形で配置されていてもよい。「内在遺伝子」は、生物のゲノム中に生来の位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物中に通常は存在しないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非在来生物に挿入された天然遺伝子、すなわちキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【００４６】
「コード配列」は、ある特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適当な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含んでもよい。
【００４７】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。概して、コード配列は、３’からプロモーター配列までにある。プロモーターは、全体として、天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に存在する異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なる組織または細胞型で、あるいは発生の異なる段階で、または異なる環境条件または生理的条件に応じて、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指令する可能性があることは、当業者に理解されている。ほとんどの細胞で、大抵のときに、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらに、大抵の場合に、調節配列の正確な境界が完全に画定される訳ではないため、異なる長さのＤＮＡ断片が全く同じプロモーター活性を有する可能性があることも理解される。
【００４８】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置し、かつポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含むＤＮＡ配列を指す。該ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端への、ポリアデニル酸路の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００４９】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写に起因する生成物を指す。該ＲＮＡ転写物が、該ＤＮＡ配列の完璧な相補的コピーであるとき、該ＲＮＡ転写物は一次転写物と呼ばれ、あるいは該ＲＮＡ転写物は、一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であることもあり、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを持たず、かつ細胞により蛋白質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、かつｍＲＮＡから誘導される二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、したがって、細胞により翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を妨害するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５１０７０６５号明細書；国際公開第９９２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分と、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列であってもよい。「機能性ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または細胞の過程に影響を及ぼす未だ翻訳されていない他のＲＮＡを指す。
【００５０】
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方により影響を受ける、１つの核酸断片上の核酸配列の関連を指す。たとえば、プロモーターが、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、そのコード配列が該プロモーターの転写調節を受けている）とき、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列を、センス方向またはアンチセンス方向で、調節配列に作動可能に連結することができる。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「発現」は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００５２】
「形質転換」は、結果として遺伝学的に安定した遺伝を生じる、宿主生物のゲノムへの、核酸断片の移入を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００５３】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、多くの場合、細胞の中心的代謝部分ではない遺伝子を担持し、かつ通常は円形の二本鎖ＤＮＡ断片の形状である、染色体外要素を指す。このような要素は、任意のソースに由来する、一本鎖−または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状または円形の、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、多数のヌクレオチド配列が、適切な３’未翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を、細胞内に導入することができる独特の構築物に連結もしくは組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ該外来遺伝子に加えて、ある特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する、特異的なベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ該外来遺伝子に加えて、その遺伝子の外来宿主における発現を増強することが可能な要素を有する、特異的なベクターを指す。
【００５４】
ここで使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、またサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッツェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．著、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８９年）（以下、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；およびシルヘイビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．著、遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８４年）；およびオウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら著、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）に記載されている。
【００５５】
本発明は、β−イオノン環を有する環状カロテン類を、対応するアリールカロテノイドに、ｉｎ  ｖｉｖｏ生体内変換する方法を提供する。本方法は、カロテン・デサチュラーゼ（ｃｒｔＵ）酵素をコードする異種遺伝子を、適当な環状カロテン基質を産生する宿主細胞で発現させ、ここでβ−イオノン環を芳香環化して、対応するアリールカロテノイドを産生することにより進行する。
【００５６】
カロテン・デサチュラーゼ活性
ＣｒｔＵにより触媒される芳香族カロテノイド類の生合成は、環状カロテノイド類のβ−イオノン環の不飽和化およびメチル基転移により進行する（クルーゲル（Ｋｒｕｇｅｌ）ら、上掲）。自然の宿主で発現されたＣｒｔＵは、β−カロテン（２つのβ−イオノン環）を、イソレニエラテンの芳香族基に変換することが、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）およびマイコバクテリウム・オーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ）Ａ＋（クルーゲル（Ｋｒｕｇｅｌ）ら、上掲；クルバシク（Ｋｒｕｂａｓｉｋ）および  サンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ）、上掲；ビベイロス（Ｖｉｖｅｉｒｏｓ）ら、上掲）で証明されている。
【００５７】
多数のカロテン・デサチュラーゼが知られており、また本発明で好適である。たとえば、カロテン・デサチュラーゼは、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＢ０７０９３４）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ２７２７３７）、マイコバクテリウム・オーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＪ１３３７２４）、ブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ１３９９１６）、およびストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＬ１０９９８９およびＡＬ１０９９６２）、および微生物ゲノムデータベースｇｎｌ｜ＴＩＧＲ｜マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）８９、緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）ＴＬＳ（ＣｙａｎｏＢａｓｅ  ＣＴ０３２３）で同定されており、配列番号：１９によって記載される、ブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）から単離されるカロテン・デサチュラーゼが好ましい。
【００５８】
カロテン・デサチュラーゼに好ましい基質は、少なくとも１個のβ−イオノン環を有する環状カロテンである。代表的な適当な基質としては、β−カロテン；γ−カロテン；α−カロテン；ゼアキサンチン；β−イソレニエラテン（φ，β−カロテン）；トルレン；１’，２’−ジヒドロ−γ−カロテン；７，８−ジヒドロ−γ−カロテン；７’，８’−ジヒドロ−β−カロテン；７’，８’，７，８−テトラヒドロ−β−カロテン；β−ゼアカロテン；エキネノン；３−ＯＨ−β−カロテン；１’，２’−ジヒドロ−１’−ＯＨ−トルレン；１６’−ＯＨ−トルレン；１６’−オキソ−トルレン；および１６’−カルボキシ−トルレンなどがあるが、この限りではない。
【００５９】
環状カロテノイド上のβ−イオノン環の芳香環化によって産生される代表的なアリールカロテノイド類としては、イソレニエラテン（φ，φ−カロテン）；β−イソレニエラテン（φ，β−カロテン）；クロロバクテン（φ，ψ−カロテン）；φ，ε−カロテン；１，２−ジデヒドロクロロバクテン；１’，２’−ジヒドロクロロバクテン；７，８−ジヒドロ−クロロバクテン；７’，８’−ジヒドロ−イソレニエラテン；７’，８’，７，８−テトラヒドロ−イソレニエラテン；７’，８’−ジヒドロ−クロロバクテン；β，φ−カロテン−４−オン；β，φ−カロテン−３−オール；３−ＯＨ−イソレニエラテン；３，３’−ジヒドロキシ−イソレニエラテン；７’，８’−ジデヒドロレニエラテン；ＯＨ−クロロバクテン；１’，２’−ジヒドロ−１’−ＯＨ−ジデヒドロクロロバクテン；１６’−ＯＨ−ジデヒドロクロロバクテン；１６’−オキソ−ジデヒドロクロロバクテン；および１６’−カルボキシ−ジデヒドロクロロバクテンなどがあるが、この限りではない。本発明のアリールカロテノイド類は、たとえばβ−カロテンの場合のように、対称的（２個のβ−イオノン環を有する）であってもよく、またはたとえばγ−カロテンの場合のように、唯一のβ−イオノン環を有する非対称であってもよい。
【００６０】
本発明の状況の中で、好ましい基質は、ｃｒｔＵ遺伝子産物の作用によって、イソレニエラテンへと触媒されるβ−カロテンまたはクロロバクテンへと触媒されるγ−カロテンである。
【００６１】
組換え発現−微生物
カロテン・デサチュラーゼをコードする遺伝子（ｃｒｔＵ）は、異種微生物宿主で、組換え技術により発現されている。組換え微生物宿主ｃｒｔＵの発現は、今まで自然の宿主を使用すると実行できなかった新製品の合成に有用である。
【００６２】
本遺伝子および核酸断片の発現に好ましい異種宿主細胞は、菌・カビの（ｆｕｎｇａｌ）または細菌のファミリー内で広く見られ、また広範囲の温度、ｐＨ値、および溶剤耐性にわたって成長することができる微生物宿主である。たとえば、細菌、酵母、および糸状菌のいずれも、本ｃｒｔＵ遺伝子の発現に好適な宿主であると考えられる。
【００６３】
本ｃｒｔＵ遺伝子の発現は、多数の周知の因子を制御することによって調節されることを、当業者は十分理解するであろう。たとえば、光合成宿主または化学独立栄養的宿主の場合には、大規模増殖および機能性遺伝子発現は、広範囲の単純な炭水化物または複雑な炭水化物、有機酸類およびアルコール類、ならびに飽和炭化水素、たとえばメタンまたは二酸化炭素を使用することが可能である。しかし、ｃｒｔＵ等の機能性遺伝子は、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素または小さい無機イオンを含む微量元素の形および量を含んでもよい、具体的な増殖条件により、調節、抑制または低下される可能性がある。加えて、ｃｒｔＵ遺伝子の調節は、培養に添加され、かつ栄養物もしくはエネルギー源ではないと一般に考えられる、特定の調節分子の有無によって達成される。成長速度も、遺伝子発現における重要な調節因子であろう。
【００６４】
様々な微生物宿主細胞が、本ｃｒｔＵの異種発現に適する。宿主系統の例としては、細菌種、菌・カビ（ｆｕｎｇａｌ）種または酵母種、たとえば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、あるいは細菌種、たとえば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター・クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）などが挙げられるが、この限りではない。
【００６５】
微生物の発現システムおよび外来蛋白質の高レベル発現を指令する調節配列を含有する発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれかを使用すれば、本カロテン・デサチュラーゼを発現させるためのキメラの遺伝子を構築することができるであろう。次いで、形質転換により、これらのキメラの遺伝子を適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を実現することができるであろう。
【００６６】
したがって、適切なプロモーターの制御下に、本細菌酵素をコードするキメラ遺伝子を導入することにより、アリールカロテノイド類の産生または既存のイソプレノイド経路の調整を招くことが予期される。
【００６７】
適当な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該技術分野で周知である。代表的なベクターまたはカセットは、関連遺伝子、選択可能マーカー、および自律複製もしくは染色体の組込みを可能にする配列の転写および翻訳を指令する配列を含有する。好適なベクターは、転写開始調節を含む遺伝子の領域５’および転写終結を調節するＤＮＡ断片の領域３’を含んでなる。両調節領域がともに、形質転換宿主細胞に相応する遺伝子に由来するときが最も好ましいが、当然のことながら、このような調節領域は、産生宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はない。
【００６８】
望ましい宿主細胞の本ＯＲＦの発現を駆動するために有用な、開始調節領域またはプロモーターは、多数であり、また当業者によく知られている。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）；ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、およびｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーターを含むがこの限りではない、これらの遺伝子を駆動することができる実質的にあらゆるプロモーターが、本発明に適する。
【００６９】
終結調節領域も、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子に由来してもよい。場合により、終結部位は不要なこともあるが、含まれていれば、最も好ましい。
【００７０】
本遺伝子の配列を知っていることは、このような経路を有する生物におけるイソプレノイドまたはカロテノイド生合成経路を操作する際に有用である。遺伝経路を操作する方法は一般に知られており、また当該技術分野で周知である。ある特定の経路における選択された遺伝子を、様々な方法でアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることが可能である。さらに、遺伝子中断および類似の技術で、競合経路生物を排除または純化することが可能である。
【００７１】
いったん重要な遺伝経路を同定し、配列決定したら、特定の遺伝子をアップレギュレートして、経路の生産を増大させることが可能である。たとえば、ｐＢＲ３２２等のマルチコピー・プラスミドで、標的遺伝子の付加的コピーを、宿主細胞に導入してもよい。あるいは、標的遺伝子を、非在来プロモーターの制御を受けるように改変してもよい。細胞周期または発酵行程中のある特定の時点で、経路が作動することが望ましい場合、調節プロモーターまたは誘導プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然プロモーターを置換することが可能である。同様に、天然プロモーターまたは内因性プロモーターを改変して、遺伝子発現を増大できる場合もある。たとえば、突然変異、欠失、および／または置換により、内因性プロモーターをｉｎ  ｖｉｖｏで変えることができる（クミーク（Ｋｍｉｅｃ）、米国特許第５５６５３５０号明細書；ザーリン（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号パンフレット参照）。
【００７２】
あるいは、標的経路またはエネルギーもしくは炭素の競合シンクの役割を果たすことが可能な競合経路における、ある特定の遺伝子の発現を、減少もしくは排除することが必要なこともある。この目的のために、遺伝子をダウンレギュレートする方法が探索されてきた。中断すべき遺伝子の配列が判明している場合、最も効果的な遺伝子ダウンレギュレーション方法の１つは、転写を中断するために、外来ＤＮＡが構造遺伝子内に挿入される、標的遺伝子中断である。これは、中断すべき遺伝子の一部と高度の相同性を有する配列に隣接した、挿入すべきＤＮＡ（多くの場合、遺伝子マーカー）を含んでなる遺伝子カセットを作成することによって達成することができる。該カセットを宿主細胞に導入することにより、細胞の生来のＤＮＡ複製機構によって、外来ＤＮＡが構造遺伝子内に挿入される結果となる（たとえば、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１：４６１７−４６２２（１９８９年）、バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１−２１３（１９９３年）、ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４：２５１９−２５２４（１９９６年）、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：２７０−２７７（１９９６年）参照）。
【００７３】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が判明している場合に、遺伝子をダウンレギュレートするもう１つの方法である。これを達成するためには、所望の遺伝子由来の核酸セグメントをクローニングし、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、プロモーターに作動可能に連結する。次いで、この構築物を該宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を産生させる。アンチセンスＲＮＡは、当該蛋白質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることにより、遺伝子発現を阻止する。特定の遺伝子の発現を減少させるためには、アンチセンス技術の使用を特に考慮すべきであることが、当業者は分かるであろう。たとえば、適切なレベルのアンチセンス遺伝子発現には、当業者に公知の異なる調節要素を使用した異なるキメラ遺伝子の使用を必要とする可能性がある。
【００７４】
配列が判明している場合、標的遺伝子中断およびアンチセンステクノロジーは、遺伝子をダウンレギュレートする効果的な方法を提供するが、配列に基づかない、特異性の低い他の方法が開発されている。たとえば、細胞を紫外線に暴露し、次いで、所望の表現型についてスクリーンングする。化学薬品を用いた突然変異誘発も、突然変異体の生成に有効であり、よく使用される物質としては、非複製性ＤＮＡに影響を及ぼす化学薬品、たとえばＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨ、ならびに複製性ＤＮＡに影響を及ぼす薬剤、たとえば、フレームシフト突然変異を引き起こすことで注目すべきアクリジン色素などがある。放射線または化学薬品を使用して突然変異体を作る具体的な方法は、当該技術分野で十分に資料が提供されている。たとえば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．著、Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、（１９８９年）シネアー・アソシアーツ・インコーポレイデッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．）、またはデシュパンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、ムクンド（Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６，２２７，（１９９２年）を参照されたい。
【００７５】
もう１つの、遺伝子中断の非特異的方法は、転位因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡにランダムに入るが、その後、挿入が生じた場所を決定するために、配列に基づいて回収することができる遺伝因子である。ｉｎ  ｖｉｖｏ転位方法とｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位方法の両者が知られている。両方法とも、トランスポザーゼ酵素と組み合せた転位因子の使用を含む。トランスポザーゼの存在下で、転位因子またはトランスポゾンを核酸断片と接触させるとき、該転位因子は、核酸断片にランダムに入る。この技術は、中断された遺伝子を、該転位因子の配列に基づいて同定することが可能なため、ランダム突然変異誘発および遺伝子単離に有用である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位のためのキットが市販されている（たとえば、ニュージャージー州ブランチバーグにあるパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）から販売されている、酵母Ｔｙ１因子に基づいた、ザ・プラーマー・アイランド・トランスポジション・キット（Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）；マサチューセッツ州ベバリーにあるニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から販売されている、細菌のトランスポゾンＴｎ７に基づいた、ザ・ゲノム・プライミング・システム（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）；およびウィスコンシン州マジソンにあるエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から販売されている、Ｔｎ５細菌転位因子に基づいた、ＥＺ：：ＴＮトランスポゾン・インサーション・システムズ（ＥＺ：：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照されたい）。
【００７６】
本発明の状況の中で、選択された宿主細胞に、既存のイソプレノイド経路がある場合、たとえば、ｃｒｔＯによりコードされているケトラーゼをコードする遺伝子を中断することが有用であろう。これは、同一基質に関して、ｃｒｔＯの遺伝子産物がｃｒｔＵと競合するため、ｃｒｔＯの中断が、ｃｒｔＵの酵素的産物を増強すると予想される（図２参照）。
【００７７】
工業生産
本ｃｒｔＵ遺伝子を使用したアリール−カロテノイド化合物の量産が望ましい場合、様々な培養方法を応用することが可能である。たとえば、組換え微生物宿主から過剰発現する特異的遺伝子産物の大規模生産は、バッチ式培養法でも連続培養法でも、実現することが可能である。
【００７８】
伝統的なバッチ式培養方法は、培養開始時に培地の組成物がセットされ、培養工程中に、人工的変化を受けない、閉鎖系である。したがって、培養工程の開始時に、所望の生物を培地に接種し、系に何も追加せずに、増殖または代謝活動を起こさせる。しかし、一般に、「バッチ式」培養は、炭素源を加えることに関してバッチ式処理であって、ｐＨおよび酸素濃度等の調節因子への試みはしばしば行われる。バッチ系では、培養を終了させる時まで、系の代謝物およびバイオマス組成が絶えず変化する。バッチ式培養内では、静的ラグ期から高成長対数期まで、さらに最終的には、成長速度が低減または停止する定常期までずっと、細胞は適度である。処置しなれば、定常期の細胞は最終的には死ぬ。幾つかの系では、しばしば、対数期の細胞が最終生成物または中間体の生産の大部分に関与する。他の系では、定常期生産または指数期後生産を得ることができる。
【００７９】
標準的なバッチ系の変化形は、流加（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）系である。流加培養法も本発明で好適であり、また培養が進行するにつれて段階的に基質を追加すること以外は典型的なバッチ系を含んでなる。流加系は、異化生成物抑制が該細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、および培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。流加系の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２等の排ガス分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ式培養方法および流加培養方法はよく知られており、当該技術分野で周知であり、またブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）およびデシュパンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）（上掲）で例を見つけることができる。
【００８０】
アリール−カロテノイド類の量産は、連続培養で達成することもできる。連続培養は、確定した培地をバイオリアクター連続的に加え、処理のために同量の馴化培地を同時に除去する、開放系である。連続培養は、概して、細胞が主として対数期増殖中である一定の高い液相密度に細胞を維持する。あるいは、炭素および栄養物が連続的に追加され、かつ有用な生成物、副生成物、または廃棄物が細胞塊から連続的に除去される固定化細胞を用いて、連続培養を実行してもよい。細胞固定化は、天然および／または合成の材料で構成された広範囲の固体担体を使用して実施することができる。
【００８１】
連続培養または半連続培養は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。たとえば、１つの方法は、炭素源または窒素レベル等の制限的栄養物質を定率に維持し、全ての他のパラメーターを加減することができる。他の系では、培地濁度で測定される細胞濃度は一定に保たれるが、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって、培地の除去に起因する細胞喪失は、培養における細胞成長速度と均衡が取れていなければならない。連栄養物および成長因子を続培養方法に合わせて調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化するための技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、また様々な方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）により記述されている。
【００８２】
本発明における発酵培地は、適当な炭素基質を含有しなければならない。好適な基質としては、グルコースおよびフルクトース等の単糖類、ラクトースまたはスクロース等のオリゴ糖類、デンプンまたはセルロース等の多糖類、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖液、およびオオムギ麦芽等の、再生可能な供給原料由来の未精製混合物などがあるが、この限りではない。さらに、炭素基質は重要な生化学的中間体への代謝変換が実証されている、二酸化炭素、メタンまたはメタノール等の、一炭素基質であってもよい。メチロトローフ生物は、一炭素基質および二炭素基質のほかにも、多数の他の炭素含有化合物、たとえばメチルアミン、グルコサミン、および様々なアミノ酸を代謝活動に利用することが知られている。たとえば、メチロトローフ酵母は、メチルアミン由来の炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７回（１９９３年）、４１５−３２、編集者：ムーレルＪ．コリン（ＭｕｒｒｅｌｌＪ．Ｃｏｌｌｉｎ）；ケリー・ドンＰ（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ）。出版社：英国アンドーバーにあるインターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、様々な種のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５３：４８５−４８９（１９９０））。したがって、本発明で使用される炭素源は、多種多様の炭素含有基質を包含してもよく、生物の選択によって制限を受けるにすぎない。
【００８３】
組換え発現−植物
植物および藻類が、カロテノイド化合物を産生することも知られている。本発明のｃｒｔＵ遺伝子を使用して、カロテン・デサチュラーゼを発現できる力を有するトランスジェニック植物を作ることができる。好ましい植物宿主は、この酵素の高産生レベルを維持する変種である。好適な緑色植物としては、ダイズ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、コショウ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップ等々）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ラッカセイ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐｓ）、サトウダイコン、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライ麦、アマ、硬葉樹、軟葉樹、およびまぐさ（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓ）などがあるが、この限りではない。藻類としては、商業的に重要な宿主、たとえばスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などがあるが、この限りではない。アリールカロテノイド化合物の産生は、発生の所望の段階に、所望の組織における遺伝子の発現を指令することができるプロモーターに、コード領域が作動可能に連結された、本発明のキメラ遺伝子を先ず構築することにより、達成することができる。便宜上、キメラ遺伝子は、同一遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなってもよい。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も備えなければならない。本キメラ遺伝子は、遺伝子発現を容易にするために、１つもしくはそれ以上のイントロンも含んでなってもよい。
【００８４】
コード領域の発現を誘導することができるプロモーターおよびターミネーターの任意の組合せを、キメラ遺伝子配列で使用することができる。プロモーターおよびターミネーターの好適な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子に由来するものなどが挙げられる。使用することが可能な効率のよい植物プロモーターの１種は、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と作動可能に連結されているこのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進することができなければならない。本発明で使用することが可能な高レベル植物プロモーターとしては、ダイズ由来のリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３−４９８（１９８２年））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターなどがある。これらの２つのプロモーターは、植物細胞で光誘導されることが知られている（たとえば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８３年）、２９〜３８ページ；コルッツィ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３年）、およびダンスミュア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３年）参照）。
【００８５】
次いで、本キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物の形質転換に使用される方法によって異なる。当業者は、首尾よく形質転換するためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝因子を十分承知しており、該キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を選択して増殖させる。当業者は、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルおよびパターンの発現を招くであろうこと（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：２４１１−２４１８（１９８５年）；デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１８：７８−８６（１９８９年））、およびしたがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、多様な事象をスクリーニングをしなければならないことも認識するであろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）Ｊ．、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、およびタンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析で達成することが可能である。
【００８６】
幾つかの用途では、本タンパク質を異なる細胞区画に導くことは有用であろう。したがって、輸送配列等の適切な細胞内ターゲティング配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）Ｋ．、Ｃｅｌｌ、５６：２４７−２５３（１９８９））、シグナル配列または小胞体局在をコードする配列（クリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２１−５３（１９９１））、または核局在シグナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）Ｎ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．、１００：１６２７−１６３２（１９９２））が加えられかつ／または既に存在するターゲティング配列が除去された酵素をコードするように、コード配列を変更することによって、上述のキメラ遺伝子をさらに補足できると想定される。引用した参考文献は、これらのそれぞれの例を示すが、このリストは網羅的ではなく、本発明で有用な、より多くの実用的なターゲティングシグナルを将来的に発見する可能性がある。
【００８７】
カロテン・デサチュラーゼ（ｃｒｔＵ）酵素を含んでなる細胞がたぶん回収され、当該技術分野で周知の方法で、未精製細胞抽出物が調製される。あるいは、ｃｒｔＵ酵素は、標準技術を使用したイオン交換、ヒドロキシアパタイト、硫酸アンモニウム、サイジング・ゲル、およびＰＡＧＥ・ゲル電気泳動クロマトグラフィで精製することができる。
【００８８】
未精製細胞抽出物または精製されたタンパク質を緩衝溶液中に懸濁させ、アセトン等の適当な溶剤に溶解したカロテノイド基質（β−イオノン環を有する）と接触させることが可能である。これらの反応物を混合し、適当な時間、インキュベートし、カロテノイド生成物の溶剤抽出により、反応を停止させる。
【００８９】
好ましい実施態様の説明
本ｃｒｔＵ遺伝子およびその発現産物であるＣｒｔＵ（カロテン・デサチュラーゼ）は、アリール−カロテノイド化合物を産生できる力を有する組換え生物を作るのに有用である。ＣｒｔＵをコードする核酸断片は、ブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）の菌株から単離されており、またロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２で発現されている。ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２は生来、４−ケト−γ−カロテンを主要カロテノイドとして産生し、またγ−カロテンの４−ケト−γ−カロテンへの変換に関与するカロテノイドケトラーゼであるとして、ＣｒｔＯが同定されている（図２）。ＣｒｔＵにより触媒される芳香族カロテノイド類の生合成は、カロテノイド類のβ−イオノン環の不飽和化およびメチル基転移によって進行するため、β−カロテンまたはγ−カロテンのいずれも、なり得る基質である。ＣｒｔＵに利用可能なβ−イオノン環構造を作るために、生来のＣｒｔＯ活性を、ノックアウト突然変異によって、菌株から除去した。一例では、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｄｘｓ遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする）を使用して、Ｂ．リネンズ（Ｂ．ｌｉｎｅｎｓ）由来のｃｒｔＵ遺伝子を発現させ、これを使用して、イソプレノイド経路代謝物の流動を改善した。別の例では、クロラムフェニコール耐性遺伝子プロモーターを使用して、ｃｒｔＵ遺伝子を発現させ、これが発現レベルを向上させた。
【実施例】
【００９０】
本発明を、以下の実施例でさらに明確にする。当然のことながら、これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、例を挙げて説明するために示すに過ぎない。上記およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、また本発明を様々な使用および条件に適合させるために、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修飾を行うことができる。
【００９１】
一般法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、またサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッツェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．著、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；およびＴ．Ｊ．シルヘイビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら著、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）に記載されている。
【００９２】
細菌培養の維持および増殖に好適な材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに好適な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲルハード（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クレイグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、ワシントンＤＣのアメリカン・ソサイアティー・フォー・ミクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４年））またはブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）に詳述されている。細菌細胞の培養および維持に使用された全ての試薬、制限酵素および材料は、特に明記されていない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーにあるオールドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトにあるディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサスバーグにあるギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セント・ルイスにあるシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手した。
【００９３】
遺伝子配列の操作は、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にあるジェネティクス・コンピューター・グループ・インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）から販売されている一揃いのプログラム、ウィスコンシン・パッケージ・バージョン９．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））を使用して達成した。ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用した場合、ギャップ・クリエーション・デフォルト値１２、およびギャップ伸長デフォルト値４を使用した。ＧＣＧ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムを使用する場合、デフォルト・ギャップ・クリエーション・ペナルティ５０およびデフォルト・ギャップ伸長ペナルティ３を使用した。ファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラムを使用して、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを取り入れたマルチプルアラインメントを作成した（Ｗ．Ｒ．ピアーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日程１９９２年、１１１−２０。編集者：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンドール（Ｓａｎｄｏｒ）。出版社：プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））。これらのプログラムまたは他のプログラムで、プログラム・パラメーターが指示されていない場合はいつも、デフォルト値を使用した。
【００９４】
略語の意味は以下の通りである。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｐｐｍ」は百万分の１を意味し、および「ｎｍ」はナノメートルを意味する。
【００９５】
細菌菌株
以下の実施例で使用した細菌菌株およびそれらの入手先を下表に示す。
【００９６】
【表１】
2006502701.tif 000002
【００９７】
ベクター
以下の実施例で使用した形質転換ベクターおよび発現ベクターならびにそれらの入手先を下表に示す。
【００９８】
【表２】
2006502701.tif 000003
【００９９】
実施例１
菌株ＡＮ１２の単離および特性決定
この実施例は、唯一の炭素源およびエネルギー源としてのアニリンで増殖できることに基づいた、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）の菌株ＡＮ１２の単離について説明する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の分析は、菌株ＡＮ１２は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性菌と関連していることを示した。
【０１００】
アニリンで増殖する細菌を富化培養から単離した。該富化培養は、１２５ｍＬネジブタ式エルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ内で、活性汚泥１ｍＬを、Ｓ１２培地（１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、および０．０００１％ＦｅＳＯ４）１０ｍＬに接種することにより確立された。該活性汚泥は、汚水処理施設から入手した。培地に直接加えて、アニリン１００ｐｐｍを該富化培養に補足し、往復振盪しながら２５℃でインキュベートした。２〜３日ごとにアニリン１００ｐｐｍを加えることにより、該富化培養を維持した。培養９．９ｍＬを、同体積のＳ１２培地と交換することにより、１４日ごとに培養を希釈した。富化培養のサンプルをＳ１２寒天上に広げることにより、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアニリンを利用する細菌を単離した。各ペトリ皿の蓋の内側にアニリンを載せた。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、裏返して、室温（２５℃）でインキュベートした。次いで、代表的な細菌コロニーを、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアニリンを使用できる力についてテストした。コロニーを、初回単離に使用した最初のＳ１２寒天プレートから、新しいＳ１２寒天プレートに移し、各ペトリ皿の蓋の内側にアニリンを補充した。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、裏返して、室温（２５℃）でインキュベートした。
【０１０１】
各単離菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、以下の通りに分析した。各単離菌をＲ２Ａ寒天（マサチューセッツ州ベッドフォードにあるディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））上で増殖させた。培養皿のコロニー数個を、水１００μＬに懸濁した。この混合物を凍結し、次いで解凍した。製造会社の説明書（マサチューセッツ州ボストンにあるパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））に従って市販のキットを使用することにより、プライマーＨＫ１２（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号：１）およびＨＫ１３（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列番号：２）を用いて、ＰＣＲで１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅した。パーキン・エルマー・ジーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００で、ＰＣＲを実施した。サンプルを、９４℃で５分間インキュベートし、次いで、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を、３５回反復した。増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、製造会社の説明書に従って市販のキット（カリフォルニア州バレンシアにあるキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））から販売されているキアクイック・ＰＣＲ・ピュアリフィケーション・キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用して精製し、自動式ＡＢＩシーケンサーで配列決定した。配列決定反応は、プライマーＨＫ１２、ＨＫ１３、およびＨＫ１４（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＹＭＧＣＧＧＴ−３’）（配列番号：３、Ｙ＝ＣまたはＴの場合、Ｍ＝ＡまたはＣである）で開始した。各単離菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を、類似配列を探すためのジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）のＢＬＡＳＴ検索（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２（１９９７年））のクエリー配列として使用した。
【０１０２】
菌株ＡＮ１２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し（配列番号：４）、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）配列データベース中の他の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較した。菌株ＡＮ１２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、高Ｇ＋Ｃグラム陽性菌ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と９８％類似していた。
【０１０３】
実施例２
産生宿主としてのロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｃｒｔＯノックアウト突然変異体の構築
下記の手順を使用し、相同組換えによって、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２のｃｒｔＯノックアウト突然変異体を作った（以下４７０７２と称する）。ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２  ｃｒｔＯ配列（配列番号：７）に基づいて、ＰＣＲプライマーＡＮ１２＿Ｉ２＿Ｆ（５’−ＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＣＧＡ−３’：配列番号：５）およびＡＮ１２＿Ｉ２＿Ｒ（５’−ＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＣＧＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡ−３’：配列番号：６）をデザインした（下線を施した配列は操作されたＮｃｏＩ部位であった）。これらのプライマーを使用して、遺伝子のＮ末端に２７５ｂｐの切詰部分を有し、またＣ末端に１７３ｂｐの切詰部分を有する、４７０７２から１１５１ｂｐのｃｒｔＯ内部断片を増幅した。４７０７２から増幅されたｃｒｔＯ（配列番号：８）を配列決定により確認し、ＤＮＡレベルでＡＮ１２ｃｒｔＯと９５％同一性を示した。このｃｒｔＯ断片を先ずｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（カリフォルニア州カールズバッドにあるインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングした。次いで、このＴＯＰＯクローンをＮｃｏＩで消化し、続いて、ｃｒｔＯ断片を、ｐＢＲ３２８（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｌ０８８５８）のＮｃｏＩ部位にクローニングした。結果として得られた構築物を配列決定により確認し、ｐＤＣＱ１０２と呼んだ。ｐＤＣＱ１０２のＤＮＡおよそ１μｇを、４７０７２にエレクトロポレーションで導入し、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＮＢＹＥ（０．８％栄養ブロスおよび０．５％酵母エキス）プレート上にプレーティングした。ｐＢＲ３２８ベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）で複製せず、したがって、３０℃で３〜４日間インキュベートした後に得られたテトラサイクリン耐性形質転換体は、染色体の組込みによって作られた。標的とされた４７０７２の染色体上のｃｒｔＯ遺伝子への組込みを、ＰＣＲで確認した。遺伝子特異的プライマー（ｐＤＣＱ１０２上の挿入物の外）Ｉ２＿ＯＰ５（５’−ＡＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＡ−３’；配列番号：１１）およびＩ２＿ＯＰ３（５’−ＧＴＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴ−３’；配列番号：１２）と対合した、ベクター特異的プライマーＰＢＲ３（５’−ＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧ−３’；配列番号：９）およびＰＢＲ５（５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’；配列番号：１０）を、テトラサイクリン耐性形質転換体から調製した染色体ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲに使用した。予想されたサイズのＰＣＲ断片を、テトラサイクリン耐性形質転換体から増幅したが、野生型４７０７２からＰＣＲ産物は得られなかった。２つの遺伝子特異的プライマーを使用したとき、大きいベクターＤＮＡの挿入が原因で、テトラサイクリン耐性形質転換体ではＰＣＲ断片は得られなかった。ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを用いて得られたＰＣＲ断片を配列決定した。ベクターおよびｃｒｔＯ遺伝子の連結の配列分析で、予想部位で１つの乗換え組換えが起こり、標的とされたｃｒｔＯ遺伝子を中断することが確認された。
【０１０４】
【表３】
2006502701.tif 000004
【０１０５】
「ｎｒ」データベース（全ての非重複ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブン・プロテイン・データ・バンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）由来の配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に対してＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９３））検索を実行することにより、類似性について、ｃｒｔＯの配列を他の配列と比較した。米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））により提供されたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、これらの配列を、「ｎｒ」データベースに含まれている全ての公的に入手できるＤＮＡ配列との類似性について分析した。全ての読み枠のＤＮＡ配列を翻訳し、ＮＣＢＩにより提供されたＢＬＡＳＴＸ  ＢＬＯＳＵＭ６２アルゴリズムを使用し、残基のギャップコスト２ごとのギャップ存在コスト１１、フィルター処理した、ギャップアラインメント（ギッシュ（Ｇｉｓｈ）Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ）Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６−２７２（１９９３））を用いて、「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手できるタンパク質配列との類似性について比較した。
【０１０６】
各配列が最大の類似性を有する配列をまとめた表１に、ＢＬＡＳＴ比較の結果を示す。表１は、ＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づいたデータを、予想値で報告された値と共に示す。予想値は、所定のスコアを用いて、このサイズのデータベースの検索で全く偶然に予想されるマッチ数を特定し、マッチの統計学的有意性を推定する。
【０１０７】
ＢＬＡＳＴ分析は、ＣｒｔＯがフィトエンデヒドロゲナーゼと最高の相同性を有することを示したが、ＣｒｔＯのノックアウト突然変異体から、ＣｒｔＯは、カロテノイドケトラーゼをコードすることが示唆された。ｃｒｔＯ突然変異体、４７０７２（ｃｒｔＯ−）のコロニーが黄色であったのに対して、４７０７２野生型菌株はピンク色であり、このことから、ｃｒｔＯ突然変異体４７０７２（ｃｒｔＯ−）で、異なるカロテノイド色素が産生されたことが示唆される。４７０７２（ｃｒｔＯ−）からカロテノイド類を抽出するために、ＮＢＹＥ（０．８％栄養ブロス＋０．５％酵母エキス）中の細胞培養１００ｍＬを、好気的条件下、２６℃で定常期まで増殖させた。細胞を、４０００ｇで１５分間遠沈し、この細胞ペレットを、アセトン１０ｍＬ中に再懸濁させた。室温で１時間、絶えず振盪しながら、カロテノイド類をアセトン中に抽出した。細胞を遠沈し、上澄を回収した。抽出を１回繰り返し、両抽出の上澄を合併し、窒素下で乾燥させた。乾燥材料を、メタノール０．５ｍＬ中に再度溶解し、不溶物質を、１６，０００ｇにて２分間の遠心分離で除去した。ベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）（登録商標）ＨＰＬＣとベックマン・ゴールド・ヌーヴォー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（メリーランド州コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ））を使用して、このサンプルをＨＰＬＣで分析した。対応するガードカラムが付いた１２５×４ｍｍのＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（カリフォルニア州サンフェルナンドにあるヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ））に、抽出物（０．１ｍＬ）を負荷した。流量は、１ｍＬ／分であった。溶剤プログラムは、以下の通りであった。０〜１１．５分  水４０％／メタノール６０％からメタノール１００％までの直線勾配、１１．５〜２０分  メタノール１００％、２０〜３０分  水４０％／メタノール６０％。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）フォトダイオードアレイ検出器（１６８型）で、スペクトルデータを集めた。ＨＰＬＣ分析は、４７０７２（ｃｒｔＯ−）には、野生型菌株の主要カロテノイドピークがないことを示した。４７０７２（ｃｒｔＯ−）で確認された主要ピークは、溶離時間１５．５分のときであり、吸収最大は４３５ｎｍ、４５８ｎｍおよび４８６ｎｍであり、これはγカロテンの特徴と全く同じであった。このように、ＡＴＣＣ  ４７０７２（ｃｒｔＯ−）は、γカロテンを蓄積し、したがってｃｒｔＵが芳香族カロテノイド類を合成するための発現宿主として使用することができた。
【０１０８】
実施例３
ｐＲｈＢＲ１７１およびｐＤＣＱ２３シャトルベクターの構築
大腸菌−ロドコッカス（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の両者で機能する、一組の複製機能および抗生物質耐性マーカーを必要とする。出願人は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に関する複製機能をコードする潜在性ｐＡＮ１２プラスミドを同定した。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に関する抗生物質耐性マーカーを同定するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｐＢＲ３２８（ＡＴＣＣ  ＃３７５１７、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｌ０８８５８）をテストして、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）で機能するかどうかを調べた。プラスミドｐＢＲ３２８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能する、アンピシリン、クロラムフェニコール、およびテトラサイクリン耐性マーカーを担持する。ｐＢＲ３２８をＰｖｕＩＩで直線化してクロラムフェニコール耐性遺伝子を中断し、ＳｓｐＩで消化したｐＡＮ１２と連結した。このようにして得られたクローンを、ｐＲｈＢＲ１７（配列番号：１３）と呼んだ。
【０１０９】
シャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７のトランスポゾン突然変異誘発から、シャトルプラスミドのある領域は、プラスミド機能に必須ではない可能性があることが示唆される（表２）。これらの領域の１つは、ｐＢＲ３２８とｐＡＮ１２の接合部にある。プラスミドのこの領域が可欠であるかどうか、またシャトルプラスミドのサイズを削減できるかどうかを、試験することに決定した。シャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７をＰｓｔ  Ｉ（２部位／２５２０、３７００ｂｐ）およびＭｌｕ  Ｉ（１部位／４１０５ｂｐ）で消化し、下記のサイズの３断片を得た。９６５６、１１８０および４０５ｂｐ。製造会社の説明書に従って、消化したＤＮＡ断片を、マング・ビーン・ヌクレアーゼ（マサチューセッツ州ベバリーにあるニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で平滑末端化した。アガロースゲルを用いて、最大の９．７ｋｂ断片を大きさで分離し、キアエクスＩＩゲル・エクストラクション・キット（ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して精製した。ｐＲｈＢＲ１７の領域２５２０−４１０５ｂｐが欠失している、この９．７ｋｂのＤＮＡ断片を自己連結して、ｐＲｈＢＲ１７１と呼ばれる円形のプラスミドを形成した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ形質転換体からのプラスミド単離および制限酵素特性決定から、ｐＲｈＢＲ１７１の正確なサイズおよび消化パターンが分かった。Ｐｓｔ  ＩおよびＭｌｕ  Ｉ消化物は、親プラスミド上のアンピシリン耐性遺伝子に関するコード領域の一部が除去されたため、ｐＲｈＢＲ１７１プラスミドを包含する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で生育できる力を失った。ｐＲｈＢＲ１７１上のテトラサイクリン耐性遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）両者の、選択マーカーの役割を果たす。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）へのｐＲｈＢＲ１７１の形質転換を試験した。ｐＲｈＢＲ１７１は、その親プラスミドｐＲｈＢＲ１７と比較したとき、エレクトロポレーションで、コンピテント・ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２およびＡＮ１２細胞を、類似した頻度で形質転換した。トランスポゾン突然変異誘発によって示唆された通り、ｐＲｈＢＲ１７のこの領域（２５２０−４１０５ｂｐ）は必須ではないことが、これらの結果から分かる。クローニングにより便利な、より小さいシャトルベクターも提供される。
【０１１０】
【表４】
2006502701.tif 000005
【０１１１】
ｄｘｓ遺伝子とその天然プロモーター（配列番号：１４）を、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＮ１２菌株から、ＰＣＲで増幅した。２つの上流プライマー、Ｎｅｗ  ｄｘｓ  ５’プライマー、５’−ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣ−３’（配列番号：１５）、およびＮｅｗ２  ｄｘｓ  ５’プライマー、５’−ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号：１６）を、異なる長さを有するｄｘｓの天然プロモーター領域を含むように、デザインした。下流プライマー、Ｎｅｗ  ｄｘｓ  ３’プライマー、５’−ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴ−３’（配列番号：１７）は、下線を施したｄｘｓ遺伝子の停止コドンを含んでいた。Ｎｅｗ  ｄｘｓ  ５’＋Ｎｅｗ  ｄｘｓ  ３’を使用したＡＮ１２全ＤＮＡのＰＣＲ増幅で、全長ＡＮ１２  ｄｘｓコード領域およびすぐ上流の領域の約５００ｂｐ（ｎｔ．＃５００−＃３０１９）を含む、２５１９ｂｐのサイズの生成物を得た。Ｎｅｗ２  ｄｘｓ  ５’＋Ｎｅｗ  ｄｘｓ  ３’プライマー対を使用するとき、ＰＣＲ産物は、完全なＡＮ１２ｄｘｓ遺伝子および約１ｋｂ上流領域（ｎｔ．＃３４−＃３０１９）を含む、２９８５ｂｐのサイズである。製造会社の説明書（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従って、両ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクターでクローニングした。結果として得られたクローンをスクリーニングし、配列決定した。確認されたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ｄｘｓ遺伝子および各プラスミドから上流領域を含む２．５ｋｂ断片および３．０ｋｂ断片をクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素で処理し、大腸菌−ロドコッカス（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７１の特有のＳｓｐＩ部位にクローニングした。結果として得られた構築物ｐＤＣＱ２２（クローン＃４および＃７）およびｐＤＣＱ２３（クローン＃１０および＃１１）を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ選択を用いて、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２にエレクトロポレートした。
【０１１２】
ｐＤＣＱ２２およびｐＤＣＱ２３のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）形質転換体の色素は、ベクター対照で形質転換されたものと比較するとき、黒っぽく見えた。各ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）菌株のカロテノイド産生を計量するために、新たに培養された細胞１ｍＬを、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０および１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む用時調製した新たなＬＢ培地２００ｍＬに加え、定常期まで３０℃にて３日間、増殖させた（表３）。４０００ｇにて１５分間の遠心分離により細胞をペレット化し、各細胞ペレットの湿重量を測定した。振盪しながら、細胞ペレットからアセトン１０ｍＬ中にカロテノイド類を一晩抽出し、最高吸光度（４６５ｎｍ）にて定量した。４６５ｎｍという波長は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＡＴＣＣ  ４７０７２から単離されたカロテノイドのピーク吸光度の特徴である。吸収データを使用して、産生されたカロテノイドの量を算出した。この量を算出し、細胞ペースト重量または細胞密度（ＯＤ６００）のいずれかに基づいて、各菌株で標準化した。いずれの方法で算出したカロテノイド産生も、より短いプロモーター領域を有するｄｘｓ遺伝子を含む、ｐＤＣＱ２２を有する４７０７２の約１．６倍の増加を示した。
【０１１３】
【表５】
2006502701.tif 000006
【０１１４】
ｐＤＣＱ２３の場合のように、より長いプロモーター領域を有するｄｘｓ遺伝子が発現されたとき、カロテノイド産生は、さらに多く増加した（２．２倍）（表３）。１ｋｂ上流のＤＮＡがプロモーターおよび発現を増強する幾つかの因子を含むようである。野生型菌株、４７０７２（ｐＲｈＢＲ１７１）、およびｄｘｓ発現菌株、４７０７２（ｐＤＣＱ２２）または（ｐＤＣＱ２３）によって、同じカロテノイド類が産生されることが、ＨＰＬＣ分析でも確認された。
【０１１５】
実施例４
ｄｘｓ遺伝子の下流のブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＵの、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における発現
ｄｘｓ遺伝子（配列番号：１４）は、カロテノイド合成のためのイソプレノイド経路で、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルビン酸化合物前駆物質から１−デオキシキシルロース−５−リン酸を合成する第１ステップを触媒する１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする。実施例３で示した通り、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｄｘｓ遺伝子とその天然プロモーターを、マルチコピーシャトルベクター（ｐＤＣＱ２３）上に配置することにより、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）カロテノイド産生がおよそ２倍増加した。最初に、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＵ遺伝子（配列番号：１８）（クルバシク（Ｋｒｕｂａｓｉｋ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２６３：４２３−４３２（２０００年））を、ｐＤＣＱ２３上のｄｘｓ遺伝子の下流にクローニングした。この戦術を推進する論理的根拠は、２つであった。第１に、ｐＤＣＱ２３で作動できることが証明されていた、ｄｘｓプロモーターにより、ｃｒｔＵ遺伝子を、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）で発現させることができた。第２に、ｄｘｓを担持しない４７０７２と比較したとき、ｐＤＣＱ２３を有するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）菌株は、カロテノイドを２倍も産生した（表３）。ｐＤＣＱ２３上の特有のＭｓｃＩ部位がｄｘｓのすぐ下流で同定され、そこにｃｒｔＵ遺伝子をクローニングして、ポリシストロン性転写物を形成した。ＰＣＲで、フォワードプライマーｃｒｔＵ＿ＲＢＳ（Ｂｒｅｖｉ）（５’−ＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＡ−３’配列番号：２０）およびリバースプライマーｃｒｔＵ＿Ｒ（５’−ＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＣＴ−３’配列番号：２１）を使用して、ｃｒｔＵ遺伝子とその生来のリボソーム結合部位を、ブレビバクテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｎｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ９１７５）のゲノムＤＮＡから増幅した。１５５４ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で先ずクローニングして、プラスミドｐＤＣＱ１３８を得た。ｃｒｔＵ遺伝子を含むｐＤＣＱ１３８  ＤＮＡの１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼでフィルインし、ｐＤＣＱ２３のＭｓｃＩ部位に連結した。結果として得られた構築物ｐＤＣＱ１３９において、ｃｒｔＵ遺伝子は、ｄｘｓ遺伝子と同じ方向であった。１３１ｂｐのＤＮＡ配列によって隔てられているｄｘｓとｃｒｔＵとの間に、転写終結部位は存在しなかった。ｃｒｔＵは、ｄｘｓ遺伝子と同時転写されたと推定される。ｐＤＣＱ１３９構築物は、実施例２で説明したｃｒｔＯノックアウト宿主を作るために使用したものと同じマーカーである、テトラサイクリン耐性マーカーを含んでいた。ｄｘｓおよびｃｒｔＵ遺伝子群を含む６．０ｋｂのＨｉｎｄ  ＩＩＩ断片をｐＤＣＱ１３９から切取り、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）で選択するために、クロラムフェニコール耐性マーカー（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＪ３０８３７６、配列番号：２２）��有する別のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターｐＤＡ７１（ＡＴＣＣ  ７７４７４）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した（図４）。結果として得られた構築物、ｐＤＣＱ１４０（図３）を、配列決定により確認した。プラスミドｐＤＣＱ１４０およびベクター対照ｐＤＡ７１を、４７０４２（ｃｒｔＯ−）にエレクトロポレートした。０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンおよび４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ  ２００ｍＬ中、３０℃で２日間、細胞を増殖させた。アセトン２０ｍＬで、細胞ペレットからカロテノイド類を抽出し、窒素下で乾燥させ、メタノール１ｍＬに溶解した。実施例２に記載の通りに、各サンプル０．１ｍＬをＨＰＬＣ分析に使用した。ｐＤＡ７１ベクター対照を担持する（図４）４７０４２（ｃｒｔＯ−）では、γ−カロテンは１５．４分に溶離した。ｃｒｔＵを含むｐＤＣＱ１４０を有する４７０４２（ｃｒｔＯ−）では、カロテノイド類の大部分がγ−カロテンであり、１５．４分に溶離した。しかし、全カロテノイド類の７％に相当する新しいカロテノイドは、１５．１分に溶離した。この新しいカロテノイドは、ＣｒｔＵの変換生成物、クロロバクテンであり、次の実施例に記載の通りに確認した。
【０１１６】
実施例５
Ｃｍｒ遺伝子の下流のブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＵの、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における発現
γ−カロテンのほんの一部が、ｐＤＣＱ１４０上のｄｘｓの下流のｃｒｔＵによって転換されるに過ぎなかった。ｄｘｓは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるカロテノイド合成の律速段階であることが証明されていた（アルブレシュツ（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２１：７９１−７９５（１９９９年））ため、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるｄｘｓのプロモーターも強くなかった公算が高い。ｃｒｔＵ発現を改善する一法は、より強力なプロモーターを使用することであった。ｐＤＡ７１上のＣｍｒ遺伝子のプロモーター（配列番号：２２）は、候補である公算が高い。Ｃｍｒ遺伝子のプロモーターを使用するもう１つの利点は、このＣｍｒ遺伝子は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）のみで発現し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では発現しないことであって、このことより、サブクローニング段階中の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における毒性または安定性の問題が回避される。ｐＤＡ７１上のＣｍｒ遺伝子は、抗生物質マーカーカセットとして使用されており、該遺伝子およびそのプロモーターは、これまでは、１．８ｋｂのＢｂｒＰＩ−ＳｔｕＩ断片（デモット（ＤｅＭｏｔ）Ｒ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４３：３１３７−３１４７（１９９７）；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＪ３０８３７６）に局在化されていた。フォワードプライマーｃｍ＿Ｆ（５’−ｃｃａｔｇｇｃｇａａｇｔａｃｃｇｔｃａｃｇｔｇｃａｃ−３’；配列番号：２３）およびリバースプライマーｃｍ＿Ｒ（５’−ｃｃａｔｇｇｃａａｔｔｇｔｃａｇｇｃｔｇｇｇａｃｇｇｔｔｔｃｃｔ−３’；配列番号：２４）を使用して、上流領域の５００ｂｐを含むＣｍｒ遺伝子を、ｐＤＡ７１プラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅した。フォワードプライマー、ｃｍ＿Ｆは、ＢｂｒＰＩ部位（ボールド体）に架かった。リバースプライマー、ｃｍ＿Ｒは、ボールド体で表示されている遺伝子の停止コドンの相補的配列を含んでいた。両プライマーはともに、ＮｃｏＩ部位（下線）を含み、ｃｍ＿Ｒは、ＭｆｅＩ部位（イタリック体）を含んでいた。１６４０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でクローニングし、結果としてｐＤＣＱ１４１が得られた。ｐＤＣＱ１４１由来の１．６ｋｂのＮｃｏＩ断片を、ｐＲｈＢＲ１７１中のＮｃｏＩ部位にサブクローニングし、Ｃｍｒ遺伝子を含む新規な大腸菌−ロドコッカス（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルプラスミドｐＤＣＱ１４２を構築した。ｃｒｔＵ遺伝子およびそのリボソーム結合部位を含むｐＤＣＱ１３８  ＤＮＡの１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＤＣＱ１４２中のＣｍｒ遺伝子のすぐ下流の特有のＭｆｅＩ部位にサブクローニングした。結果として得られた構築物ｐＤＣＱ１４３は、Ｃｍｒ遺伝子の下流のｃｒｔＵ遺伝子を含んでおり、ＣｍｒおよびｃｒｔＵの両者は同一方向であった。この２つの遺伝子は、明らかな転写終結部位がない６２ｂｐのＤＮＡで隔てられていた。ｃｒｔＵ遺伝子は、おそらく、そのプロモーターによって、Ｃｍｒ遺伝子を含むポリシストロン性メッセージとして転写された可��性がある。プラスミドｐＤＣＱ１４３およびベクター対照ｐＤＣＱ１４２を、４７０４２（ｃｒｔＯ−）にエレクトロポレートした。０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンおよび４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ  ２００ｍＬ中、３０℃で２日間、細胞を増殖させた。アセトン２０ｍＬで、細胞ペレットからカロテノイド類を抽出し、窒素下で乾燥させ、メタノール１ｍＬに溶解した。各サンプル０．１ｍＬを、実施例２に記載のＨＰＬＣ分析に使用した。ｐＤＣＱ１４２ベクター対照を含む４７０４２（ｃｒｔＯ−）では、γ−カロテンが１５．３分に溶離した。ｃｒｔＵを含むｐＤＣＱ１４３を含む４７０４２（ｃｒｔＯ−）では、カロテノイドは１５．３分に溶離せず、全てのカロテノイドが１５．０分に溶離した。１５．０分に溶離したカロテノイドは、γ−カロテン（１５．３分に溶離した）と同じ吸収スペクトルを有していたため、１５．０分におけるカロテノイドがｐＤＣＱ１４３で産生された新規なカロテノイドであること、あるいはＨＰＬＣのばらつきが原因で、γ−カロテンが、僅かに異なる時点で溶離されたかどうかは、確実ではない。これらの２つの可能性を見分けるために、ｐＤＣＱ１４２対照菌株およびｐＤＣＱ１４３を含む菌株から抽出された同量のカロテノイド類を混合し、ＨＰＬＣに負荷した。カロテノイドのピークが２つ確認され、１５．０分に４１％が溶離し、１５．３分に５９％が溶離した。このことから、ｐＤＣＱ１４３を含む菌株から産生されたカロテノイドは、ｐＤＣＱ１４２ベクター対照菌株から産生されたγ−カロテンと異なることが強く示唆される。ｐＤＣＱ１４３上のＣｍｒ遺伝子の下流に発現されたｃｒｔＵは、γ−カロテンを新規なカロテノイドにほぼ１００％変換し、これを、実施例６に記載の通りに分析した。
【０１１７】
実施例６
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるクロロバクテン合成の、ＬＣ−ＭＳによる確認
クロロバクテンは、γ−カロテンと同じスペクトル吸収を示す。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるクロロバクテンの合成を確認するために、異なるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）菌株からのカロテノイド類の分子量を、ＬＣ−ＭＳで決定した。カロテノイド類は、野生型ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２、４７０７２（ｃｒｔＯ−）、およびｐＤＣＱ１４３を含む４７０７２（ｃｒｔＯ−）から、上述の通りに抽出した。７５％アセトニトリルおよび２５％アセトンを使用して、各サンプル５０μＬを、ゾルバクス（Ｚｏｒｂａｘ）２．１×１５０ｍｍのＳＢ−Ｃ１８  ＬＣカラムで定組成的に３０分間溶離的した（カリフォルニア州アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）。走査間遅延０．１秒、３ＫＶでのコロナ放電針および４５０℃でのＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）プローブが付いたＡＰＣＩモードで、質量分析計（英国マイクロマス・リミテッドのマイクロマス・クワトロ・ＬＣ・トリプル・クオードポール（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＬＣ  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ））を、０．９秒で、１００から１０００ＡＭＵまで走査した。ＬＣ−ＭＳ分析の結果を図５に示す。予想通り、野生型ＡＴＣＣ  ４７０７２  は、分子量５５０ダルトンを有する４−ケト−γ−カロテンを産生し（図５）、４７０７２（ｃｒｔＯ−）は、分子量５３６ダルトンを有するγ−カロテンを産生し、ｐＤＣＱ１４３を含む４７０７２（ｃｒｔＯ−）は、分子量５３２ダルトンを有する新規なカロテノイドを産生した。γ−カロテンと新規なカロテノイドとの間の４ダルトンの分子量の差は、２つのさらなる不飽和化ステップによる、γ−カロテンのβ−イオノン環の芳香環化と一致する。ｐＤＣＱ１４３を含む４７０７２（ｃｒｔＯ−）で産生された新規なカロテノイドは、ＣｒｔＵにより触媒されたγ−カロテンからの芳香化産物であるクロロバクテンであった。
【０１１８】
実施例７
野生型ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）におけるクロロバクテンの産生
実施例２に記載の通り、野生型ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２に存在する、カロテノイドケトラーゼＣｒｔＯ（配列番号：８）であれば、異種アロマターゼＣｒｔＵと、γ−カロテン基質に関して競合する。そこで、上述の通りに、ｃｒｔＵ遺伝子を４７０７２（ｃｒｔＯ−）で発現させた。野生型ＡＴＣＣ  ４７０７２宿主から、かなりの量のクロロバクテンが産生できるかどうかという疑問にも取り組んだ。野生型菌株は、宿主に関する抗生物質選択を持たず、成長速度が速い。Ｃｍｒ遺伝子の下流に発現した、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｔＵを含むプラスミドｐＤＣＱ１４３を、野生型ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２菌株に移入し、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢプレートで形質転換体を選択した。形質転換体からカロテノイド類を抽出し、実施例２に記載の通りに分析した。ＨＰＬＣ分析は、産生されたカロテノイド類大部分がクロロバクテンであることを示した。存在するカロテノイド類の１０％未満は、４−ケト−γ−カロテンであり、１４．５分に溶離した（４６５ｎｍにおける吸収最大）。サンプルを濃縮し、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）用の、厚さ２５０μｍのシリカゲル６０プレート（ニュージャージー州ギブズタウンにあるＥＭセパレーションズ・テクノロジー（ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））上にスポットした。図６は、７．５％アセトン＋９２．５％ヘキサンのシリカＴＬＣで分離した野生型ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）４７０７２、４７０７２（ｃｒｔＯ−）、ｐＤＣＱ１４３を含む４７０７２、およびｐＤＣＱ１４３を含む４７０７２（ｃｒｔＯ−）からのカロテノイド類の比較を示す。図５に示す通り、野生型における４−ケト−γ−カロテン、４７０７２（ｃｒｔＯ−）におけるγ−カロテン、およびｃｒｔＯ−（ｐＤＣＱ１４３）におけるクロロバクテンが、ＬＣ／ＭＳで今までに確認されている。ｐＤＣＱ１４３を担持する４７０７２では、予想通り、クロロバクテンと４−ケト−γ−カロテンの混合物が産生された。混合物中のカロテノイド類の大部分がクロロバクテンであったことから、クロロバクテン産生のためのｃｒｔＵ発現宿主として野生型ＡＴＣＣ  ４７０７２を使用することが可能なことがわかる。ｐＤＣＱ１４３プラスミドから発現したｃｒｔＵは、ＡＴＣＣ  ４７０７２の染色体上にコードされた単一コピーｃｒｔＯと十分に競合した。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
図面の簡単な説明および配列の説明
【図１】ＣｒｔＵによるカロテノイド類の酵素的芳香環化を示す図である。
【図２】ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２でアリール−カロテノイド類を合成する方法を示す図である。
【図３】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターに基づく、ｐＤＡ７１上のｄｘｓ遺伝子の下流のｃｒｔＵ発現を含むｐＤＣＱ１４０のプラスミド地図である。
【図４】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターに基づく、ｐＲｈＢＲ１７１上のＣｍｒ遺伝子の下流のｃｒｔＵ発現を含むｐＤＣＱ１４３のプラスミド地図である。
【図５】組換えロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）菌株により合成されたカロテノイド類のＬＣ／ＭＳ分析を説明する図である。
【図６】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）菌株で産生されたカロテノイド類のＴＬＣ分析を示す図である。
【配列表】
2006502701.tif 000007
2006502701.tif 000008
2006502701.tif 000009
2006502701.tif 000010
2006502701.tif 000011
2006502701.tif 000012
2006502701.tif 000013
2006502701.tif 000014
2006502701.tif 000015
2006502701.tif 000016
2006502701.tif 000017
2006502701.tif 000018
2006502701.tif 000019
2006502701.tif 000020
2006502701.tif 000021
2006502701.tif 000022
2006502701.tif 000023
2006502701.tif 000024
【図１】
2006502701.tif 000025
【図２】
2006502701.tif 000026
【図３】
2006502701.tif 000027
【図４】
2006502701.tif 000028
【図５】
2006502701.tif 000029
【図６】
2006502701.tif 000030
【国際調査報告】
2006502701.tif 000031
2006502701.tif 000032
2006502701.tif 000033
2006502701.tif 000034