(57)【要約】本発明は、脂肪代謝を調節するため、ならびに被験体において脂肪ホメオスタシスを実現するための方法および化合物を提供する。体重を調節し、体脂肪を低減し、体重減少を誘導するための方法および化合物も提供する。肥満を予防または治療するため、ならびに脂肪代謝の改変に関連した疾病、例えば肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症などを予防または治療するための方法および化合物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の脂肪代謝または脂肪代謝過程を調節する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体の脂肪代謝または脂肪代謝過程を調節することを含む方法。
【請求項２】
被験体の脂肪代謝または脂肪代謝過程を調節する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体の脂肪代謝または脂肪代謝過程を調節することを含む方法。
【請求項３】
前記ＨＩＦαの安定化が、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体のＨＩＦαを安定化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性がＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性である、請求項２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記安定化がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記安定化がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が細胞、組織および臓器からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体が動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪代謝過程が脂肪取り込み、脂肪輸送、脂肪貯蔵、脂肪プロセッシング、および脂肪利用からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＩＦαがＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、およびＨＩＦ３αからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼがＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
被験体における脂肪ホメオスタシスを実現する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体における脂肪ホメオスタシスを実現することを含む方法。
【請求項１５】
被験体における脂肪ホメオスタシスを実現する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体における脂肪ホメオスタシスを実現することを含む方法。
【請求項１６】
被験体の肥満を治療または予防する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体の肥満を治療または予防することを含む方法。
【請求項１７】
被験体の肥満を治療または予防する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体の肥満を治療または予防することを含む方法。
【請求項１８】
被験体の体重を調節する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体の体重を調節することを含む方法。
【請求項１９】
被験体の体重を調節する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体の体重を調節することを含む方法。
【請求項２０】
被験体の体脂肪を低減する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体の体脂肪を低減することを含む方法。
【請求項２１】
被験体の体脂肪を低減する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体の体脂肪を低減することを含む方法。
【請求項２２】
前記体脂肪が内臓脂肪である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記体脂肪が腹部脂肪である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
被験体において体重減少を誘導する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体において体重減少を誘導することを含む方法。
【請求項２５】
被験体において体重減少を誘導する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体において体重減少を誘導することを含む方法。
【請求項２６】
被験体における脂肪調節因子の発現を改変する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体における脂肪調節因子の発現を改変することを含む方法。
【請求項２７】
被験体における脂肪調節因子の発現を改変する方法であって、該被験体にＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによって該被験体における脂肪調節因子の発現を改変することを含む方法。
【請求項２８】
脂肪調節因子が、レプチン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、サイトゾルアシルＣｏＡチオエステラーゼ１、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）１、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＩ−１，ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３、およびＰＰＡＲ−γからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
被験体の酸素消費を減少する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体の酸素消費を減少することを含む方法。
【請求項３０】
被験体の脂肪利用における代謝シフトを誘導する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体の脂肪利用における代謝シフトを誘導することを含む方法。
【請求項３１】
被験体において嫌気的代謝への代謝シフトを誘導する方法であって、該被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって該被験体において嫌気的代謝への代謝シフトを誘導することを含む方法。
【請求項３２】
被験体において好気的代謝を低減しおよび嫌気的代謝を増大する方法であって、
（ａ）該被験体における解糖因子の発現を改変すること、
（ｂ）該被験体における脂肪調節因子を協調的に改変すること、
を含み、それにより好気的代謝の低減および嫌気的代謝の増大を誘導する方法。
【請求項３３】
解糖因子がＰＦＫ−Ｐ、ＰＦＫ−Ｌ、エノラーゼ１、Ｇ１ｕＴ−１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ＩＦＧＢＰ−１、およびＩＧＦからなる群より選択され、脂肪調節因子がレプチン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、サイトゾルアシルＣｏＡチオエステラーゼ１、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）１、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＩ−１、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３、およびＰＰＡＲ−ｇからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪のホメオスタシスおよび代謝と、体重の調節とに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、それぞれ参照によりその全体において本明細書に組み込まれる２００２年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６０／４３１，３５１号；２００３年６月６日に出願された米国特許仮出願第６０／４７６，３３１号；および２００３年６月６日に出願された米国特許仮出願第６０／４７６，７２６号の優先権を主張するものである。
【０００３】
肥満は、典型的にはボディマスインデックス（ＢＭＩ）が３０又はそれ以上として定義され、特に先進工業世界においては主要な健康問題である。肥満は現在推定２億５千万の成人の問題であり、この数値は、体重超過の青年が肥満成人に成長すると実質的にさらに高くなると予測されている。上述したように、肥満は多くの有害な健康状態と関連しており、例えば、糖尿病や心疾患の危険性の増大が挙げられる。腹部肥満は、腹部に過剰の脂肪組織が分布したものであり、特に糖尿病および心疾患、例えば代謝症候群と相関することが示されている。過剰の脂肪は、心臓麻痺、発作、または他の種の心血管疾患、高血圧、高コレステロール、糖尿病、癌（閉経期乳癌、ならびに子宮内膜、大腸および腎臓の癌など）、関節炎、胆石、睡眠時無呼吸、ならびに成人発症喘息の頻度の上昇と相関している。従って、体重減少を達成し、相関する疾病の発症または進行の危険性を最小限にするために、脂肪代謝を調節する有効な手段および一体的な方法が当該分野で必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
脂肪代謝および脂肪ホメオスタシスの改変または欠陥と関連する多数の有害な状態、ならびに肥満および調節できない体重増加の頻度の上昇を考慮して、脂肪代謝を調節するための方法が必要とされている。さらに、脂肪の生成、利用および貯蔵を調節することにより体重を調節する方法が当該分野で必要とされている。また、肥満治療のための方法および化合物が当該分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、被験体において脂肪代謝を調節し、脂肪ホメオスタシスを実現し、体重を調節し、脂肪貯蔵を低減し、そして減量（体重減少）を誘導する方法及び化合物に関する。肥満、例えば食餌誘発性肥満、糖尿病に関連した肥満などを治療または予防する方法および化合物も提供する。
【０００６】
様々な実施形態において、被験体は、細胞、組織、または器官である。他の実施形態では、被験体は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。被験体が細胞である場合、本発明は、この細胞が原核または真核の単離細胞であり得ることを特に企図する。被験体が組織である場合、本発明は、内在性組織、および、例えば培養において増殖した組織など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織の両方を特に企図する。好ましい実施形態では、被験体が動物であり、特に、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および霊長類の種を含めた哺乳動物種の動物である。最も好ましい実施形態では、被験体がヒトである。
【０００７】
本発明は、被験体の脂肪代謝を調節する方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化し、該被験体の脂肪代謝を調節することによって被験体の脂肪代謝を調節することを含む。様々な態様において、ＨＩＦαはＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、またはＨＩＦ３αである。好ましい態様では、ＨＩＦαの安定化がＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量、被験体に投与し、それゆえＨＩＦαを安定化することを含む。
【０００８】
ＨＩＦαの安定化は、当業者にとって利用可能であり、かつ既知な方法のいずれによってでも実施でき、ＨＩＦα、または、ＨＩＦαと相互作用する因子（例えばＨＩＦαを基質とする酵素など）と相互作用するか、結合するか、またはこれを改変するいかなる薬剤を使用するものでもあり得る。ある特定の態様では、本発明は、例えば安定したＨＩＦミューテインなどの構成的に安定したＨＩＦα変種、またはそのような変種をコードするポリヌクレオチドの提供を企図する。他の態様では、本発明は、ＨＩＦαの安定化が、ＨＩＦαを安定させる薬剤の投与を含むことを企図する。そのような薬剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、他のタンパク質、炭化水素、脂肪、脂質、ならびに、例えば小分子などの有機物および無機物で構成され得る。好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＦαを安定化する薬剤を被験体に投与することによって、例えば被験体におけるＨＩＦαを安定化することを企図するが、この薬剤は、ＨＩＦαを安定化する例えば小分子化合物などの化合物である。
【０００９】
本発明は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与し、被験体の脂肪代謝を調節することによって、被験体の脂肪代謝を調節する方法をさらに企図する。一態様では、本発明の化合物は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。好ましい態様では、本発明の化合物は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。別の好ましい態様では、ＨＩＦヒドロキシラーゼは、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３からなる群より選択される。
【００１０】
本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体の脂肪代謝過程を調節することによって、被験体の脂肪代謝過程を調節する方法を提供する。様々な実施形態において、脂肪代謝過程は、例えば、脂肪取り込み、脂肪輸送、脂肪貯蔵、脂肪プロセッシング、脂肪利用および脂肪合成からなる群より選択される。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体における脂肪調節因子（fat regulatory factor）の発現を変化させることによって、被験体における脂肪調節因子の発現を変化させる方法を企図する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体における脂肪調節因子の発現を増強することによって、被験体における脂肪調節因子の発現を増強する方法を提供する。さらなる実施形態では、脂肪調節因子は、レプチン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、サイトゾルアシルＣｏＡチオエステラーゼ−１、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−１、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびＰＡＩ−１からなる群より選択される。特定の態様では、脂肪調節因子の発現の増強が持続的増強である。
【００１３】
さらに脂肪生成因子（adipogenic factor）の発現を改変する方法を包含する。一実施形態において、本発明は、被験体におけるＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３の発現を増大させる方法を包含し、該方法は、被験体のＨＩＦαを安定化させる、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与し、それにより該被験体におけるＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３の発現を増大させることを含む。別の実施形態において、本発明は、被験体におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−γの発現を低減する方法を提供し、該方法は、被験体のＨＩＦαを安定化させる、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与し、それにより該被験体におけるＰＰＡＲ−γの発現を増大することを含む。
【００１４】
本発明は、被験体における脂肪ホメオスタシスを実現するための方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、被験体における脂肪ホメオスタシスを実現することによって、被験体における脂肪ホメオスタシスを実現することを含む。別の態様では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体における脂肪ホメオスタシスを実現することによって、被験体における脂肪ホメオスタシスを実現することを含む。
【００１５】
本発明は、被験体の体重を調節する方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化し、被験体の体重を調節することによって被験体の体重を調節することを含む。別の態様では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体の体重を調節することによって、被験体の体重を調節することを含む。
【００１６】
本発明は、被験体の体脂肪を減少させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、被験体の体脂肪を減少させることによって、被験体の体脂肪を減少させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体の体脂肪を減少させることによって、被験体の体脂肪を減少させることを含む。様々な態様において、この体脂肪は、蓄積脂肪または沈着脂肪であり、この減少は貯蔵脂肪（すなわち、脂肪貯蔵）の減少である。他の態様では、これらの方法は、脂肪の蓄積または沈着を防止すること、例えば、貯蔵脂肪の増大を防止することに適用される。さらなる態様では、この体脂肪は、内臓脂肪または腹部脂肪である。
【００１７】
本発明は、被験体における体重減少を誘導する方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、体重減少を誘導することによって、被験体における体重減少を誘導することを含む。別の態様では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、体重減少を誘導することによって、被験体における体重減少を誘導することを含む。好ましい態様では、本発明の化合物は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。一実施形態では、本発明は、筋肉の減失を伴わずに、被験体における体重減少を誘導する方法を提供する。特定の実施形態では、この体重減少は用量依存性である。
【００１８】
本発明は、被験体における肥満を治療または予防する方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、肥満を治療または予防することによって、被験体における肥満を治療または予防することを含む。別の実施形態では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、肥満を治療または予防することによって、被験体における肥満を治療または予防することを含む。ある特定の態様では、肥満が食餌誘発性肥満であることを企図する。他の態様では、例えば、糖尿病発症の危険因子としての肥満、または、疾患の進行に伴いもしくはその結果発生する肥満など、肥満が糖尿病に関連しているものである。
【００１９】
本発明は、被験体の酸素消費を減少させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、被験体の酸素消費を減少させることによって、被験体の酸素消費を減少させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、被験体の酸素消費を減少させることによって、被験体の酸素消費を減少させることを含む。特定の実施形態では、本発明の方法は被験体における酸素必要量を低下させる。様々な実施形態では、被験体は細胞、組織、器官、多器官系、または、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含めた生物全体（個体）である。さらに本発明の方法は、例えば、培養で増殖した細胞における酸素必要量を低下させ、代謝効率を増大させるのに使用できる。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、低酸素条件下において被験体内でエネルギーを生成する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、例えば、酸素消費を減少させるなど、酸素消費における代謝シフトを誘導する方法を提供する。様々なレベルの運動を実現または維持するのに必要な酸素消費を最小にする方法を特に企図する。これらの方法は、例えば水中、高地、例えば戦場などの強いストレス状態における、例えば運動競技、激しい身体運動などの激しさの高い運動に関与する適用に特に有用でありうる。
【００２１】
上述の方法は、本発明の化合物の使用を特に企図するものである。ある特定の態様では、本発明の化合物は、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨからなる群より選択される。一態様では、この化合物は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼミメティックである。さらなる態様では、この２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼミメティックは、置換複素環式カルボキサミドである。本発明は、この置換複素環式カルボキサミドが、キノリン、イソキノリン、フェナントロリン、ピリジン、ピリミジン、β−カルボリンなどからなる群より選択される実施形態を特に企図する。
【００２２】
様々な実施形態で、本発明は、本発明の化合物を含む製剤、医薬、または医薬組成物、ならびに、そのような製剤、医薬、または医薬組成物を製造および使用する方法を提供する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、脂肪ホメオスタシス障害に関連した状態を有する被験体における、そのような状態を治療または予防する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化するか、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与することを含み、それによって被験体における状態を治療または予防する方法を包含する。様々な実施形態で、この脂肪ホメオスタシス障害に関連した状態は、食餌誘発性の肥満；遺伝誘発性の肥満；例えばインスリンに基づく治療など、ある特定の治療療法によって引き起こされるかまたはこれに関連して発生する肥満；高脂血症；低脂血症；コレステロール血症；またはアテローム性動脈硬化症を含めた肥満である。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、脂肪代謝障害に関連した状態を有する被験体における、そのような状態を治療または予防する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体における状態を治療または予防する方法を包含する。様々な実施形態で、この脂肪ホメオスタシス障害に関連した状態は、食餌誘発性の肥満；遺伝誘発性の肥満；例えばインスリンに基づく治療など、ある特定の治療療法によって引き起こされるかまたはそれに関連して発症する肥満；高脂血症；低脂血症；コレステロール血症；およびアテローム性動脈硬化症などを含めた肥満である。
【００２５】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示に照らして、当業者であれば容易に想起されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の組成物および方法を記載する前に、これらは多様であり、本発明は、記載する特定の方法、プロトコール、細胞系、アッセイ、および試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するものであり、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
【００２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、その文章によって別のことが明確に指示されない限り、複数に対する言及も含まれる。したがって、例えば、「ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」に対する言及には、複数のそのような断片も含まれ、「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ」に対する言及は、１つまたは複数の化合物と、本明細書に記載する等価物、および当業者に公知の等価物とに対する言及である。
【００２８】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書に記載されたものと同様または等価ないかなる方法および物質も用いることができるが、好ましい方法、装置、および物質をこれより記載する。本明細書に引用するすべての文献を、それらの文献に報告された、本発明との関連において使用し得る可能性のある方法、試薬、および道具を記載および開示する目的で、参照によりそれら全体として本明細書に組み込む。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行したとする権利が得られないことを承認するものとして解釈するべきではない。
【００２９】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、化学、生化学、分子生物学、細胞生理学、遺伝子学、免疫、および薬学のいかなる在来法も、当技術分野の技術の範囲内で利用されよう。そのような技法は文献に完全に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０年）、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｌ．Ｅ．、およびＧｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．編（２００１年）、The Pharmacological Basis of Therapeutics、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ら編、Methods In Enzymology、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．編（１９８６年）、Handbook of Experimental Immunology、第Ｉ〜ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら編集（１９８９年）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編（１９９９年）、Short Protocols in Molecular Biology、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら編（１９９８年）、Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．およびＧｒａｈａｍ，Ａ．編（１９９７年）、PCR (Introduction to Biotechniques Series)、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ。
【００３０】
定義
本明細書において、「脂肪調節」および「脂肪代謝の調節」という用語は、それによって、細胞、組織、器官、器官系、または生物個体が、脂肪代謝における特定の過程を改変することによって、例えば、増大または減少させることによって、脂肪ホメオスタシスを実現および／または維持する過程を指す。脂肪代謝は、脂肪、例えばトリグリセリド、脂肪酸、コレステロール、脂質およびリン脂質などが合成、輸送、取り込み、プロセッシング、利用、または貯蔵される過程を包含する。脂肪代謝および調節の特定の態様には、血中の脂肪の輸送および移動と、細胞による脂肪の保持または分泌とを促進するリポタンパク質または酵素の発現；例えば脂質分解および脂質生成酵素、例えばアシルトランスフェラーゼ、オキシダーゼ、リポキシゲナーゼなどの脂肪の利用または生成に関与する酵素の発現および／または活性の改変；ならびに、体内、例えば、組織、脂肪体などの中もしくは周囲、または、間質（すなわち、細胞外）液、細胞内液、血液、尿、および同様のものを含めた体液中の脂肪分布の改変が含まれる。
【００３１】
「代謝性疾患（metabolic condition）」および「代謝障害」という用語は、互換性をもって使用され、脂肪調節の改変に関連するか、またはこれによって悪化したいかなる障害も指す。そのような障害には、アテローム性動脈硬化症、心疾患、および肥満などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
「肥満」という用語は、体脂肪が過剰であることを指す。当業者によって認められ、かつ使用されているいかなる尺度によっても肥満症を判定することができる。現在認められている、肥満の基準の１つがボディマスインデックス（ＢＭＩ）であり、これは、メートルでの身長の二乗に対するキログラムでの体重で表す尺度である。通常、年齢が２０歳を越えた成人では、ＢＭＩが１８．５と２４．９との間であると正常とみなされ、ＢＭＩが２５．０と２９．９との間であると太り過ぎとみなされ、ＢＭＩが３０．０以上であると肥満とみなされ、ＢＭＩが４０以上であると病的な肥満とみなされる（例えば、Ｇａｌｌａｇｈｅｒら（２０００年）、Am J Clin Nutr、第７２巻、６９４〜７０１ページ参照）。これらのＢＭＩの範囲は、疾患の危険性の増大に対する体重の影響に基づいている。太り過ぎおよび肥満に関連したいくつかの一般的な状態には、心血管疾患、高血圧、骨関節炎、癌、および真性糖尿病が含まれる。ＢＭＩは体脂肪と相関するが、ＢＭＩと実際の体脂肪との関係は年齢および性別によって異なっている。例えば、ＢＭＩが同じ場合、女性の方が男性より高いパーセントの体脂肪を有する可能性がより高い。
【００３３】
肥満の別の尺度は体脂肪率である。間接的に体脂肪を測定するには、皮下脂肪厚測定、水密度測定（hydrodensitometry）、生体電気インピーダンス分析（ＢＩＡ）、二重エネルギーＸ線吸収法、全身カリウム測定、およびｉｎ  ｖｉｖｏ中性子放射化分析を含めた様々な方法が利用可能である。水密度測定、すなわち静水計量法（ＨＷ）では、水中および空気中での被験体の体重の相違を測定することによって、身体の総体積を決定する。同様に、空気置換プレチスモグラフィー（ＡＰ）測定は、一定の空気体積を有するチャンバーに被験体が入ることによって引き起こされるチャンバー体積の減少を測定することによって、身体の総体積を決定する。その後、全身密度および体組成を、実証済みの予測方程式を用いて計算する。ＢＩＡは、電極間を流れる小な電流から引き起こされる電圧低下から身体の電気抵抗、すなわちインピーダンスを推算する。インピーダンスのレベルは、身体における水および電解質組成の指標であり、その後、除脂肪組織組成および体水分量を、展開（developed）回帰方程式から推算するのに使用される。除脂肪組織の水分率を仮定して、別の回帰方程式を用いて、除脂肪体重と体脂肪量を推算する。女性の体脂肪率は、通常約１７から２７パーセントであるべきであるが、３１パーセントまでは許容範囲とみなされる。男性では、体脂肪率は、通常１０から２０パーセントであるべきであるが、２５パーセントまでは許容範囲とみなされる。
【００３４】
「ＨＩＦα」という用語は、低酸素症誘発因子タンパク質のアルファサブユニットを指す。ＨＩＦαは、ヒトＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ１６６６５）、ＨＩＦ−２α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＢ４１４９５）、およびＨＩＦ−３α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ２２６６８）；マウスＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ６１２２１）、ＨＩＦ−２α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ２０１３０およびＡＡＢ４１４９６）、およびＨＩＦ−３α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ７２７３４）；ラットＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ７０７０１）、ＨＩＦ−２α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＢ９６６１２）、およびＨＩＦ−３α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＢ９６６１１）；ならびにウシＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ７８６７５）を含めたいずれのヒトもしくは哺乳動物タンパク質、またはその断片であってもよい。また、ＨＩＦαは、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＢ９６６２８）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＣ４８５１）、およびニワトリＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ３４２３４）を含めたいずれの非哺乳動物タンパク質またはその断片であってもよい。また、ＨＩＦα遺伝子配列は、例えば上述のＨＩＦα遺伝子配列の全体または一部をプローブとして用いて、別の種のＨＩＦα遺伝子配列を回収および決定することによって、通常のクローニング技法によって入手してもよい。
【００３５】
ＨＩＦαの断片には、ヒトＨＩＦ−１αアミノ酸４０１から６０３（Ｈｕａｎｇら、同上）、アミノ酸５３１から５７５（Ｊｉａｎｇら（１９９７年）、J Biol Chem、第２７２巻、１９２５３〜１９２６０ページ）、アミノ酸５５６から５７５（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、同上）、アミノ酸５５７から５７１（Ｓｒｉｎｉｖａｓら（１９９９年）、Biochem Biophys Res Commun、第２６０巻、５５７〜５６１ページ）、およびアミノ酸５５６から５７５（Ｉｖａｎら（２００１年）、Science、第２９２巻、４６４〜４６８ページ）で定義される領域が含まれる。さらに、ＨＩＦαの断片には、例えばＨＩＦα天然配列中のＬ３９７ＴＬＬＡＰおよびＬ５５９ＥＭＬＡＰにある、少なくとも１回現れるＬＸＸＬＡＰモチーフを含有するいかなる断片も含まれる。さらに、ＨＩＦα断片には、ＨＩＦαの少なくとも１つの機能的または構造的特性を保持するいかなる断片も含まれる。例えば、実施例９のスクリーニングアッセイで使用に供するＨＩＦαペプチドは、ＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号１）を含むものでもよい。
【００３６】
「ＨＩＦヒドロキシラーゼ」という用語は、ＨＩＦタンパク質、特にＨＩＦαサブユニットのアミノ酸残基をヒドロキシル化することができるいかなる酵素も指す。このアミノ酸残基は、プロリンおよび／またはアスパラギン残基であることが好ましい。
【００３７】
「ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼ」という用語は、ＨＩＦタンパク質中のアスパラギン残基をヒドロキシル化することができるいかなる酵素も指す。ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼによってヒドロキシル化されるアスパラギン残基は、例えばＨＩＦ−１α中のＮ８０３残基、または別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なアスパラギン残基を含むことが好ましい。ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼには、ＨＩＦαのトランス活性化の調節を担うアスパラギニルヒドロキシラーゼであるＨＩＦ阻害因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＨＩＦ）（ＦＩＨ）が含まれる（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ２７３０８；Ｍａｈｏｎら（２００１年）、Genes Dev、第１５巻、２６７５〜２６８６ページ；Ｌａｎｄｏら（２００２年）、Science、第２９５巻、８５８〜８６１ページ；Ｌａｎｄｏら（２００２年）、Genes Dev、第１６巻、１４６６〜１４７１ページ。Ｅｌｋｉｎｓら（２００２年）、J Biol Chem、Ｃ２００６４４２００も参照のこと）。
【００３８】
「ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ」および「ＨＩＦ−ＰＨ」という用語は、ＨＩＦタンパク質中のプロリン残基をヒドロキシル化できるいかなる酵素も指す。ＨＩＦ  ＰＨによってヒドロキシル化されるプロリン残基は、例えばヒトＨＩＦ−１α天然配列中のＬ３９７ＴＬＬＡＰおよびＬ５５９ＥＭＬＡＰにあるようなＬＸＸＬＡＰモチーフの中にあるプロリンを含むことが好ましい。ＨＩＦ  ＰＨには、Ｔａｙｌｏｒ（２００１年、Gene、第２７５巻、１２５〜１３２ページ）によって記載され、ＡｒａｖｉｎｄおよびＫｏｏｎｉｎ（２００１年、Genome Biol、第２巻、ＲＥＳＥＡＲＣＨ０００７）、Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年、Cell、第１０７巻、４３〜５４ページ）、ならびにＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ（２００１年、Science、第２９４巻、１３３７〜１３４０ページ）によって特徴決定されたＥｇｌ−Ｎｉｎｅ（ＥＧＬＮ）遺伝子ファミリーのメンバーが含まれる。ＨＩＦ  ＰＨ酵素の例には、ヒトＳＭ−２０（ＥＧＬＮ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＧ３３９６５；Ｄｕｐｕｙら（２０００年）、Genomics、第６９巻、３４８〜５４ページ）、ＥＧＬＮ２アイソフォーム１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１０；Ｔａｙｌｏｒ、同上）、ＥＧＬＮ２アイソフォーム２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６００２５）、およびＥＧＬＮ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１１；Ｔａｙｌｏｒ、同上）；マウスＥＧＬＮ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１５）、ＥＧＬＮ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１１）、およびＥＧＬＮ３（ＳＭ−２０）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１７）；ならびにラットＳＭ−２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ１９３２１）が含まれる。加えて、ＨＩＦ  ＰＨには、線虫（Caenorhabditis elegans）ＥＧＬ−９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ５６３６５）およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＣＧ１１１４遺伝子産物（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ５２０５０）が含まれうる。また、ＨＩＦ  ＰＨには、上述した完全長タンパク質のいかなる活性断片も含まれる。
【００３９】
用語「試料」は、被験体から直接または間接的に得られる任意の材料を意味しうる。試料は、例えば限定されるものではないが、唾液、血液、尿、血清、血漿、硝子体液、滑液、脳脊髄液、羊水、および器官組織（例えば、生検された組織）；細胞から単離された染色体、細胞小器官、または他の膜；ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど；および透明化した細胞または組織、あるいはそのような細胞または組織からのブロットまたはインプリントを含めた、例えば、体液、分泌液、組織、細胞、または培養細胞などから得てもよいしまたはそれに由来するものとすることができる。試料は、例えば、ヒト被験体、または非ヒト哺乳動物被験体などのいかなる供給源に由来するものでもよい。また、いかなる疾患動物モデルに由来する試料も企図される。試料は、溶液中に存在することも、例えば、基質に固定または結合されていることもある。試料は、代謝調節に関連した転写産物もしくはタンパク質の存在を調べるのに、または脂肪およびグルコースレベルを測定するのに適したいかなる物質も指すことがある。そのような試料を入手する方法は、当技術分野における技術レベルの範囲内にある。
【００４０】
用語「被験体」は、原核もしくは真核の単離細胞、または培養中で増殖した組織を指し、またはより好ましくは、動物、特にラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および霊長類、特にヒトを含めた哺乳動物種を指す。
【００４１】
発明
本発明は、脂肪代謝を調節し、脂肪ホメオスタシスを実現し、そして脂肪ホメオスタシスおよび脂肪代謝の改変または欠陥と関連する疾病を治療もしくは予防、またはそれを発症する危険性を最小限にするための方法および化合物を提供する。そのような疾病としては、限定されるものではないが、肥満などが含まれる。貯蔵脂肪のレベルを調節するため、体重を維持または低減するため、脂肪のプロセッシング、取り込み、輸送、貯蔵、合成、利用および分布を調節するための方法および化合物もまた本明細書に記載される。具体的には本発明は、肥満を治療または予防する、例えば体重増加を予防もしくは低減するおよび／または脂肪減少を誘導する方法を提供する。一態様において、これは、細胞の一次エネルギー源としての脂肪および／または脂肪酸の利用に対して代謝シフトを薬理学的に誘導することによって達成される。
【００４２】
本発明は、低酸素症誘発因子のアルファサブユニット（ＨＩＦα）の安定化が脂肪沈着を低減し、ＨＩＦαの安定化により脂肪代謝が調節されるという発見に関する。本発明はさらに、脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪代謝過程、例えば脂肪の輸送、取り込み、プロセッシング、利用、貯蔵などを効率的に調節するための方法および化合物を提供する。
【００４３】
低酸素症誘発因子（ＨＩＦ）は、酸素の低減、すなわち低酸素症に対する細胞、組織および器官の応答に関与する。低酸素症に曝露された場合、例えば高地においては、食欲減退と体重減少が生じることが知られている（例えば、Ｆｕｓｈｉｋｉら（１９９２年）Can J Physiol Pharmacol第７０巻、１５２２〜１５２４頁；Ｇｕｎｇａら（２００３年）Eur J Appl Physiol第８８巻、４９７〜５０５頁；ＴｓｃｈｏｐおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００１年）Hypoxia: From genes to the bedside（ＲＣ Ｒｏａｃｈら編、Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.を参照されたい）。ＨＩＦαは、標準酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）すなわち正常な酸素条件下で分解され、低酸素すなわち酸素が少ない条件下では、ＨＩＦαは安定化される。安定化の際、ＨＩＦαはＨＩＦβと会合して多くの下流の作用をもたらす。最近になって、ＨＩＦαサブユニット上の特定残基のヒドロキシル化が、ＨＩＦαを分解の標的となり、それによって正常な酸素条件下における安定したＨＩＦ複合体の形成が阻止されることが判明し、さらに、このヒドロキシル化が、ある特定のＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素の活性によって起こると決定された（例えば、Ｉｖａｎら（２００１年）、Science、第２９２巻、４６４〜４６８ぺ一ジ；Ｊａａｋｋｏｌａら（２００１年）、Science、第２９２巻、４６８〜４７２ぺ一ジ；Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年）、Cell、第１０７巻、４３〜５４ぺ一ジ；ならびにＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ（２００１年）、Science、第２９４巻、１３３７〜１３４０ぺ一ジを参照）。これらのＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲテーゼ酵素ファミリーに属する。これらの酵素は酸素に依存しており、酸素が少ない条件、すなわち低酸素条件下では、ＨＩＦα残基のヒドロキシル化が阻害される。治療上のＨＩＦαの安定化、およびＨＩＦαのヒドロキシル化を阻害することによるＨＩＦαの安定化に関しては以前に記載されている（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれている国際公開第ＷＯ０３／０４９６８６号を参照）。
【００４４】
方法
一態様では、本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化させることによって、脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、脂肪ホメオスタシスを実現する方法を提供する。さらなる態様では、これらの方法は、被験体のＨＩＦαヒドロキシル化を阻害することによって、脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、脂肪ホメオスタシスを実現することを含む。好ましい態様では、本発明の方法は、被験体の少なくとも１つのＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素の活性を阻害することによって脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、脂肪ホメオスタシスを実現する方法を包含する。最も好ましい態様では、これらの方法は、ＨＩＦプロリヒドロキシラーゼ酵素の活性を阻害することによって脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、脂肪ホメオスタシスを実現することを含む。
【００４５】
ＨＩＦαの安定化は、当業者に利用可能であり、かつ公知の方法のいずれでも実施することができ、ＨＩＦα、または、例えばＨＩＦαを基質とする酵素を含めたＨＩＦαと相互作用する因子と、相互作用するか、結合するか、またはこれをを改変するいかなる薬剤の使用によっても行うこともできる。ある特定の態様では、本発明は、例えば安定なＨＩＦミューテインなどの構成的に安定なＨＩＦα変種、またはそのような変種をコードするポリヌクレオチドの提供を企図する（例えば、米国特許第６，５６２，７９９号および第６，１２４，１３１号；ならびに米国特許第６，４３２，９２７号を参照）。他の態様では、本発明は、ＨＩＦαの安定化がＨＩＦαを安定化する薬剤の投与を含むことを企図する。この薬剤は、例えばアンチセンス配列などのポリヌクレオチド（例えば、国際公開第ＷＯ０３／０４５４４０号参照）、ポリペプチド、抗体、他のタンパク質、炭化水素、脂肪、脂質、ならびに例えば小分子などの有機物および無機物で構成することができる。好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＦαを安定化する薬剤を被験体に投与することによって、例えば被験体におけるＨＩＦαを安定化することを企図するが、この薬剤は、ＨＩＦαを安定化する例えば小分子化合物などの化合物である。
【００４６】
他の実施形態では、本発明の方法は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼファミリーのメンバーより選択される少なくとも１つの酵素の活性を阻害することによって、ＨＩＦαを安定化することを含む。好ましい実施形態では、この酵素は、例えば、ＥＧＬＮ−１、ＥＧＬＮ−２、ＥＧＬＮ−３などのＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素である（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（２００１年）、Gene、第２７５巻、１２５〜１３２ページ；Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年）前掲；ＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、前掲；Ｍａｈｏｎら、前掲；Ｌａｎｄｏら、前掲を参照）。しかし、この酵素が、例えばプロコラーゲンリジルヒドロキシラーゼ（ＬＨ）−１、−２、および−３、プロコラーゲンプロリル３−ヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル４−ヒドロキシラーゼα（Ｉ）およびα（ＩＩ）、チミン７−ヒドロキシラーゼ、アスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ、ε−Ｎ−トリメチルリシンヒドロキシラーゼ、およびγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼなどを含めた２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼファミリーより選択されるいかなる酵素であることも、特に企図されている（例えば、Ｍａｊａｍａａら（１９８５年）、Biochem J、第２２９巻、１２７〜１３３ページ；ＭｙｌｌｙｈａｒｊｕおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９７年）、EMBO J、第１６巻、１１７３〜１１８０ページ；Thornburgら（１９９３年）、３２巻、１４０２３〜１４０３３ページ；およびＪｉａら（１９９４年）、Proc Natl Acad Sci USA、９１巻、７２２７〜７２３１ページ参照）。
【００４７】
特定の実施形態では、これらの方法は、例えばプロリン残基、アスパラギン残基など、ＨＩＦαにおける特定残基のヒドロキシル化を阻害することによって、脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、そして脂肪ホメオスタシスを実現することを含む。好ましい実施形態では、これらの残基がプロリン残基である。特定の実施形態では、これらの残基は、ＨＩＦ−１α中のＰ５６４残基もしくは別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なプロリン、またはＨＩＦ−１α中のＰ４０２残基もしくは別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なプロリンなどでありうる。他の実施形態では、本方法は、例えば、ＨＩＦ−１α中のＮ８０３残基または別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なアスパラギン残基などのＨＩＦαアスパラギン残基のヒドロキシル化を阻害することも包含しうる。
【００４８】
化合物
一態様では、本発明は、本発明の化合物を被験体に投与することによって脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、そして脂肪ホメオスタシスを実現する方法を提供する。本発明の化合物は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素の活性を阻害するか、または他の方法でモジュレートする任意の化合物である。２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素には、ヒドロキシラーゼ酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒドロキシラーゼ酵素は、標的基質残基をヒドロキシル化するものであり、これには、例えば、プロリル、リジル、アスパラギニル（アスパラギル、アスパラチル）ヒドロキシラーゼなどが含まれる。ヒドロキシラーゼは、例えば、ＨＩＦヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンヒドロキシラーゼなど、標的基質で記載されるときも、および／または、例えば、プロリルヒドロキシラーゼ、リジルヒドロキシラーゼなど、基質中の標的残基で記載されるときも、または、例えば、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼなど、基質および残基の両方で記載されるときもある。代表的な２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素には、例えば、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３などのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼと、例えばＨＩＦ阻害因子（ＦＩＨ）などのＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼとを含めたＨＩＦヒドロキシラーゼ；例えば、プロコラーゲンリジルヒドロキシラーゼ、ならびに、例えばプロコラーゲンプロリル３−ヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル４−ヒドロキシラーゼα（Ｉ）およびα（ＩＩ）などのプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼなどのプロコラーゲンヒドロキシラーゼ；チミン７−ヒドロキシラーゼ；アスパラチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ；ε−Ｎ−トリメチルリシンヒドロキシラーゼ；およびγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。酵素活性には、いずれの２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼに付随する活性も含まれうるが、基質中のアミノ酸残基のヒドロキシル化が特に企図される。基質中のプロリンおよび／またはアスパラギン残基のヒドロキシル化が明確に含まれるが、他のアミノ酸のヒドロキシル化も企図される。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。様々な実施形態で、この活性は、例えば、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、またはＥＧＬＮ３などのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼによるものである。他の実施形態では、この活性は、限定されるものではないがＦＩＨなどを含めたＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼによるものである。
【００５０】
一態様では、例えば、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物が、さらにコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害することがあり、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物が、さらにＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害することがあるなど、１つまたは複数の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素に対する阻害活性を示す本発明の化合物が、別の１つまたは複数の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素に対する阻害活性を示すことがある。
【００５１】
一態様では、本発明は、本発明の化合物を被験体に投与することによって脂肪組織形成および脂肪沈着を低減し、脂肪貯蔵を動員し、脂肪代謝を調節し、そして脂肪ホメオスタシスを実現する方法を提供する。本発明の化合物は、例えばＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する小分子化合物でありうる。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。この阻害は、直接的にも、間接的にも可能であり、競合的にも、非競合的にも可能である。本発明のさらに別の化合物を同定するための例示的化合物および方法を以下に提供する。
【００５２】
一態様では、本発明は、本発明の化合物を被験体に投与することによって、脂肪組織形成および脂肪沈着を低減させる方法、脂肪貯蔵を動員する方法、脂肪調節をモジュレートする方法、および脂肪ホメオスタシスを実現する方法を提供する。本発明の化合物は、体重を調節するか、または例えば体重過多もしくは肥満の被験体における、体重の減少を促進するのに用いることができる。さらに、この化合物は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、肥満などを含めた脂肪代謝に関連した障害または状態を治療するのに用いることができる。
【００５３】
一態様では、本発明は、化合物を用いて障害を予防または治療する方法であって、有効量の上記化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを、単独で、または薬学的に許容される賦形剤と併せて、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、例えば体重制御における困難または肥満など、素因となる状態に基づいて、この化合物を投与することができる。
【００５４】
これらの化合物は、他の様々な治療手法と併用して投与することができる。一実施形態では、この化合物を、例えば、グルココルチコイド、例えばヒト組換型インスリンなどの外来性インスリン、例えばチアゾリジンジオンなどのＰＰＡＲγアゴニスト、または食欲抑制剤など、同じ作用様式または異なる作用様式を有する別の治療薬と共に、またはその代わりに投与する。
【００５５】
脂肪調節因子の発現
本発明の方法は、例えば、身体全体における脂肪の輸送、取り込み、利用、合成、プロセッシング、および貯蔵など、脂肪代謝に関与する調節因子の発現を改変する手段を提供する。一態様では、これらの方法は、そのような過程を調節するための身体の自然な機構における、例えば、レプチン、プラスミノーゲン活性化因子抑制因子（ＰＡＩ）−１、インスリンなどの生理学的因子の産生および／またはそれに対する反応の改変による欠損を補うものである。別の態様では、この方法は、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３、ペルオキシソーム増殖関連受容体（ＰＰＡＲ）など、脂肪輸送、取り込み、および利用に関与する、例えば転写調節因子などの調節因子のレベルおよび／または活性をモジュレート（例えば増大または低減）する。
【００５６】
レプチンは、体重の主要な調節因子であり、食物摂取およびエネルギー消費の両方に対して影響を及ぼす。レプチン産生の主要な供給源は脂肪細胞であるが、胎盤、骨格筋、胃粘液、および乳房上皮を含めた他の組織もレプチンを産生する（例えば、ＡｈｉｍａおよびＦｌｉｅｒ（２０００年）、Annu Rev Physiol、第６２巻、４１３〜４３７ページ；ならびにＦａｎｔｕｚｚｉおよびＦａｇｇｉｏｎｉ（２０００年）、J Leukocyte Biol、第６８巻、４３７〜４４６ページを参照）。レプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂ）は、慢性的な食物摂取過多により極度に体重過多であり、ｏｂ／ｏｂマウスに外来性レプチンを投与することによって、食物摂取の劇的な減少と、体重減少とが生じる（Ｚｈａｎｇら（１９９４年）、Nature、第３７２巻、４２５〜４３１ページ；Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら（１９９５年）、Science、第２６９巻、５４０〜５４３ページ；Ｈａｌａａｓら（１９９５年）、Science、第２６９巻、５４３〜５４６ページ；およびＣａｍｐｆｉｅｌｄら（１９９５年）Science、第２６９巻、５４６〜５４９ページ）。同様に、レプチン受容体欠損マウス（ｄｂ／ｄｂ）も体重過多である。また、確立された抗肥満効果を有する主要なストレス誘導性遺伝子であるＰＡＩ−１のアップレギュレーションも、肥満および糖尿病など、脂肪ホメオスタシスに関連した障害において有益な効果を提供するであろう。
【００５７】
本発明の方法および化合物は、レプチン発現を増強したので、これらの方法および化合物は、脂肪代謝、エネルギー利用、および満腹度の調節に有用である。これらの方法は、被験体における体重増加を防止するのに特に有用であろう。さらに、本発明の方法および化合物は、プラスミノーゲン活性化因子抑制因子（ＰＡＩ）−１発現も増強した。したがって、これらの方法はまた、被験体における体重の調節に有用であり、特に、肥満および糖尿病など、脂肪ホメオスタシスに関連した障害において有益な効果を提供する。
【００５８】
ＰＰＡＲと呼ばれるリガンドによって活性化される転写因子ファミリーは、脂肪酸およびトリグリセリドに対する細胞応答を調節する。ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３は、スプリット転写抑制因子ファミリーのショウジョウバエ（Drosophila）におけるｈａｉｒｙ／Ｅｎｈａｎｃｅｒのメンバーであるが、例えば、ＰＰＡＲ−γ２の発現を抑制することが知られている。ＰＰＡＲ−γ２は、脂肪細胞の分化に必要であり、かつ、肥満および２型糖尿病と関連する転写因子である（例えば、Ｙｕｎら（２００２年）、Dev Cell、第２巻、３３１〜３４１ページ；Ｇｉｕｓｔｉら（２００３年）、Diabetes、第５２巻、１６７３〜１６７６ページ；およびＭｕｌｌｅｒら（２００３年）、Diabetes、第５２巻、１８６４〜１８７１ページを参照）。したがって、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３および／またはＰＰＡＲ、例えばＰＰＡＲ−γ２のモジュレーションは、脂肪取り込みおよび細胞によるプロセッシングに関与する因子を含めた脂肪生成因子の発現を調節することによる別な効果を提供するであろう。
【００５９】
本発明の方法および化合物は、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３と、脂肪レベルに対する細胞応答に関与するペルオキシソーム増殖関連受容体（ＰＰＡＲ）とを含めた因子群のレベルをモジュレートするので、これらの方法および化合物は、脂肪に対する細胞応答に関与する遺伝子、特に、脂肪酸およびトリグリセリドの細胞取り込みおよびプロセッシングに関与する遺伝子の発現調節に有用である。
【００６０】
本発明は、その産物が脂肪代謝に関与する遺伝子を協調的に調節する方法を提供する。そのような遺伝子には、例えば、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、長鎖脂肪アシルＣｏＡシンターゼ、カルニチンアセチルトランスフェラーゼなど、食物脂肪の取り込みおよび輸送、新規生成脂肪の合成および輸送、ならびに脂肪プロセッシング（分解）および利用などに関係する遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。治療による脂肪代謝酵素および飽食因子のアップレギュレーションは、効果的に脂肪蓄積を低減し、体重を減少させ、それによって、例えば肥満などの代謝障害を有する患者において、有益な効果を生み出すであろう。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、その産物が脂肪輸送に関与する遺伝子の協調的な調節を提供する。そのような遺伝子には、アポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ａ−ＩＶが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
細胞内のアシルＣｏＡレベルは、例えば、ＣｏＡチオエステラーゼ（ＣＴＥ）およびカルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）によって調節されている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｅｊら（２０００年）、Mol Genet Metab、第７１巻、１３９〜１５３ページ；Ｈｕｈｔｉｎｅｎら（２００２年）、J Biol Chem、第２７７巻、３４２４〜３４３２ページ）。長鎖アシルＣｏＡエステルは、トリグリセリド合成およびβ酸化において使用される。さらに、長鎖アシルＣｏＡエステルは、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）−αの活性を刺激して、それによって遺伝子転写に影響を及ぼすことがある。ＡｐｏＡ−ＩＶは、キロミクロンおよび高密度リポタンパク（ＨＤＬ）粒子の構成成分であり、過剰発現された場合には、コレステロール含有細胞からの流出を促進する（Ｃｏｈｅｎら（１９９７年）、J Clin Invest、第９９巻、１９０６〜１９１６ページ）。また、ＡｐｏＡ−ＩＶの過剰発現は、アテローム性動脈硬化症に対する予防となる（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら（１９９６年）、Science、第２７３巻、９６６〜９６８ページ。例えば、Ｏｒｄｏｖａｓら（１９８９年）、J Biol Chem、第２６４巻、１６３３９〜１６３４２ページ；Ｏｔｈａら（１９８５年）、J Clin Invest、第７６巻、１２５２〜１２６０ページ；およびVerges（１９９５年）、Diabetes Metab、第２１巻、９９〜１０５ページも参照されたし）。したがって、例えばＣＴＥ−１およびＡｐｏＡ−ＩＶなどの脂肪調節に関与する遺伝子の発現を、本発明が実証するように、本発明の化合物および方法を用いて増大させることは、脂肪の代謝および輸送に対する直接的調節と間接的調節との両方を提供しうる。
【００６２】
したがって、本発明の方法および化合物は、脂肪代謝に関与する因子のレベルをモジュレートするものであり、被験体における脂肪代謝を調節するのに有用である。一態様では、本発明の方法は、トリグリセリドの生成および／または利用に関与するタンパク質の発現を調節する。治療による脂肪代謝酵素のアップレギュレーションは、効果的に脂肪蓄積を低減し、体重を減少させ、それによって、例えば肥満などの代謝障害を有する患者において、有益な効果を生み出すであろう。さらに、本発明の方法および化合物は、アポリポタンパク質など、脂肪輸送に関与する因子のレベルをモジュレートする。したがって、本発明の方法は、脂肪酸およびトリグリセリドのプロセッシングと、筋肉、肝臓、心臓、および脂肪を含めた、細胞間での輸送を調節するのに使用できる。輸送過程を変化させることによって、脂肪の貯蔵よりも利用への傾向が強くなり、さらに脂肪の利用が促進される。
【００６３】
本発明は、摂取の際に特定の器官で活性化するプロドラッグ化合物の選択的な設計を特に企図する。例えば、肝臓は脂肪ホメオスタシスに関与する多数のタンパク質を生成するので、本発明は、本発明の方法において選択的に肝臓を標的とすることを企図する。肝臓における、例えばＡｐｏＡ−ＩＶなどの遺伝子の選択的なアップレギュレーションは、肝臓特異な酵素によって不活性型から活性型に転換される化合物を用いることで実現できる。例えば、活性化合物のカルボン酸を対応するアルコールに置換することができる。肝臓内のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性がそのような化合物を活性型に変換するであろう。他の器官にはＡＤＨ活性がないので、この化合物は、肝臓においてのみ選択的に活性化されよう。同様に、他の器官、例えば、脂肪組織、腎臓、骨格筋、心臓などを、本発明の方法で使用される化合物の標的にしてもよい。
【００６４】
エネルギー生成における代謝シフト
身体は脂肪酸および炭化水素利用からエネルギーを得る。グルコースおよび脂肪酸の両方は、摂取された直後にエネルギーとして利用できるが、現在のエネルギー要求を超えて消費された量は後の使用のために保存される。グルコースは、グリコーゲンとして限られた量しか保存することができないので、消費されたグルコースの大部分は、脂肪酸に変換されて、脂肪組織に保存される。したがって、脂肪組織は、生物の主要なエネルギー予備を含有する。さらに、脂肪組織はエネルギー貯蔵の供給源として機能するだけでなく、多数の内分泌および体温調節機能を果たしており、また、グルコース代謝の調節にも関与する。
【００６５】
上記に論じたように、肝臓は、脂肪およびグルコース代謝にも関与しており、これらの重要な栄養の血中濃度を適切に維持する重要かつ中心的な役割を演じる。グルコースはニューロンおよび赤血球の主要な燃料であるが、他のほとんどの組織はその基本的なエネルギー需要を脂肪酸に依存している。正常な血糖値が減少すると、肝臓はグリコーゲンを分解し、脂肪組織はトリグリセリドを分解して、血液にグルコースおよび脂肪酸を供給する。インスリンは、この代謝平衡の重要な調節因子であり、脂肪および筋肉のグルコース取り込み、グリコーゲン合成、および脂肪生成を刺激する。インスリンレベルが低いと、インスリン応答性組織におけるグルコース取り込みが減少し、肝臓での糖新生およびグリコーゲン分解が促進され、グリコーゲン合成が減少し、そして、保存された脂肪酸の脂肪からの動員が促進される。
【００６６】
エネルギー源として脂肪を必要とする経路を含むように身体のエネルギー生産をシフトさせることが望ましい場合がある。低血糖値状態、または、例えば糖尿病など、グルコース調節が障害された状態では、脂肪をエネルギー源として使用することによって、ほとんどの組織に代替燃料を提供して、それによって、グルコースを必要とする器官に潜在的に限定にされた量のグルコースを利用可能にすることができる。加えて、エネルギー源としての脂肪の利用を増大させれば、貯蔵脂肪の減少を引き起こし、それによって、例えば肥満個体における体重減少を誘導するか、または、糖尿病などの状態に関連した肥満の発生および進行を防止することができる。本発明は、脂肪代謝を調節することによって、例えば、脂肪調節因子などの発現を促進することによって、脂肪利用を促進して、脂肪貯蔵を減少させ、脂肪のさらなる沈着を防止する方法および化合物を提供する（例えば、下記の実施例３、５、および６を参照のこと）。したがって、一態様では、本発明の方法および化合物は、エネルギー源として体脂肪の利用を促進する代謝シフト、すなわちエネルギー源が脂肪の利用、すなわち脂肪からのエネルギー生産に移行した代謝シフトを提供する。
【００６７】
脂肪生成酵素の調節（例えば、実施例３参照）は、上で議論した理由で、グルコース輸送、解糖、および糖新生の調節と協調して起こる。例えば、事前に絶食させた動物に高炭水化物低脂肪の餌を与えると、脂肪酸およびトリグリセリド生合成に関与する酵素の増大と、解糖と、グルコーストランスポーターを介したグルコース取り込みの増大とが引き起こされる（例えば、ＳｕｌおよびＷａｎｇ（１９９８年）、Annu Rev Nutr、第１８巻、３３１〜３５１ページ参照）。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、その産物がグルコース取り込みおよび利用に関与する遺伝子の協調的な調節を提供する。そのような遺伝子には、ホスホフルクトキナーゼ、エノラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、およびヘキソキナーゼを含めた解糖系酵素；ならびにグルコーストランスポーター（ＧｌｕＴ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。解糖の増大は、グルコース取り込みおよび利用の増大につながり、これは血糖値の減少を伴いうる。本発明の方法は、脂肪調節因子発現の促進と、脂肪をエネルギー源として移用する身体の能力の増進とに、同時に適用できるので、本発明は、グルコースおよび脂肪のホメオスタシスを同時に実現および／または維持する防御機構を提供する。したがって、本発明の方法および化合物は、特に、例えば糖尿病など、高血糖値、肥満、または肥満の傾向によって実証される、グルコースおよび脂肪の調節における改変または障害が原因として関係しうる状態の治療または予防に適用性を有する。
【００６８】
加えて、嫌気性過程である解糖の増大と、脂肪酸利用の増大とに向かったシフトは、正味の酸素消費を効果的に減少させる可能性がある（例えば、実施例１２を参照）。このようなエネルギー利用における代謝シフト、およびそれに伴う体重減少は、高度が高いことに関連した低酸素症が体重減少、特に体脂肪の減少として現れる体重減少を誘導するという報告と一致するものである（例えば、Ｆｕｓｈｉｋｉら、同上；Ｇｕｎｇａら、同上；ならびにＴｓｃｈｏｐおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、同上を参照）。この手法は、例えば、エネルギーを生成する身体の能力を保存または増強するのに使用できる。これは、例えば低酸素条件下、または、激しい身体運動などを維持または増強する身体の能力を促進することが望ましい状態の下で望ましい場合がある。したがって、一態様では、本発明は、酸素消費における代謝シフトを誘導する方法および化合物、すなわち、細胞生存率に影響を与えることなく、細胞の酸素消費を用量依存的に減少させる方法および化合物を提供する。本発明は、好気性呼吸より非効率的な過程である嫌気性エネルギー生産にシフトさせることによって、身体がエネルギー源として脂肪を利用する必要性が増大され、それによって、例えば、脂肪を主要エネルギー源とする方向に向かったさらなる代謝シフトを生じるであろうことを企図する。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、被験体における好気的代謝の減少と、それに伴う嫌気性代謝の増大を誘導する方法であって、（ａ）解糖因子の発現を変化させること；および（ｂ）脂肪調節因子を協調的に変化させることを含む方法を企図する。様々な実施形態で、この解糖因子は、ＰＦＫ−Ｐ、ＰＦＫ−Ｌ、エノラーゼ−１、ＧｌｕＴ−１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ＩＧＦＢＰ−１、およびＩＧＦからなる群より選択され、脂肪調節因子は、レプチン、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、サイトゾルアシルＣｏＡチオエステラーゼ１、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−１、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＩ−１、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３、およびＰＰＡＲ−γからなる群より選択される。
【００７０】
本発明は、本発明の一化合物の投与によって、少なくとも１つの脂肪調節因子と、少なくとも１つのグルコース調節因子の協調的なアップレギュレーションを同時に実現する連携治療手法を特に企図する。
【００７１】
本発明は、以下に記載する例示的過程に限定されるものではないが、例えば体脂肪の減少（例えば、実施例５および６などを参照）、およびトリグリセリドの短期的増加（例えば、実施例１３を参照）によって実証される、エネルギー源としての脂肪の利用の増大が、正味のエネルギー効率を効率的に低下させ、被験体がエネルギーを生成するのにさらに多くのカロリーを燃焼させるようにし、それによって体重減少を誘導することを企図する。長期なトリグリセリドレベルの低下（例えば、実施例８を参照）は、この理論を支持するものであり、脂肪代謝過程を調節することにおける本発明の方法の最終的な効果が、脂肪ホメオスタシスを実現および維持するように身体を駆動させるものであることを実証する。
【００７２】
したがって、一態様では、本発明は、被験体のエネルギー効率を低下させて、それによって体重減少を誘導する方法であって、被験体のＨＩＦａを安定化させることを含む方法を提供する。
【００７３】
治療方法
本発明は、脂肪代謝およびホメオスタシスに関連した代謝障害を治療する方法および化合物を提供する。さらに、本発明は、例えば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病などになる危険性が高い個体など、代謝障害を発症する可能性が高い患者を、本明細書に記載した化合物を用いて治療する方法を提供する。アテローム性動脈硬化症および糖尿病の危険因子には、例えば、高脂血症、および腹部の肥満が含まれる。
【００７４】
被験体の代謝状態は、主要な代謝産物の血漿中レベルに反応する因子によって生理的に制御されており、栄養の利用および貯蔵を適切に管理する一群の遺伝子の発現を変化させる。例えば、脂肪組織の代謝ホメオスタシスは、グルコースおよびトリグリセリドの取り込みおよび貯蔵と、脂肪酸放出との間のバランスを必要とする。本発明は、被験体の代謝状態を調節する方法および化合物であって、この被験体が培養で増殖した細胞、または動物であってもよく、好ましくは、この動物が哺乳動物であり、より好ましくはこの哺乳動物がヒトである方法を提供する。
【００７５】
脂肪代謝の改変もしくは障害、または脂肪貯蔵の過剰もしくは不足は、脂肪貯蔵が過剰な場合には、糖尿病の悪化要因である腹部肥満を含めた肥満；脂肪貯蔵が欠如または少ない場合には免疫機能障害；および他の代謝異常を引き起こすことがある。
【００７６】
肥満、特に腹部または中央肥満は、２型糖尿病の患者では極めて一般的である。脂肪細胞は、インスリンの主要な標的器官であり；脂肪細胞は、レプチン、腫瘍壊死因子α、および遊離脂肪酸など、インスリンの分泌および作用をモジュレートする多数の生物学的産物を分泌する。したがって、過剰な脂肪組織は、インスリン抵抗性に寄与しうる。例えば、レプチンをコードする遺伝子における機能喪失変異は、齧歯動物における糖尿病への素因と関連している（Ｃｈｅｎら（１９９６年）、Cell、第８４巻、４９１〜４９５ページ）。
【００７７】
脂肪調節に関連するいくつかの他のタンパク質は、糖尿病および血管疾患においての有益な効果を提供するようである。例えば、ＡｐｏＡ−ＩＶは、抗アテローム生成的な特性を有し；また、ＰＡＩ−１を欠失したマウスは体重制御が行えず、高脂肪食を摂っていると野生型マウスより速く体重を増加させる（例えば、Ｃｏｈｅｎら（１９９７年）、J Clin Invest、第９９巻、１９０６〜１９１６；Ｖｅｒｇｅｓ（１９９５年）、Diabetes Metab、第２１巻、９９〜１０５ページ；Ｏｓｔｏｓら（２０００年）、Atherosclerosis、第１５３巻、２０９〜２１７ページ；およびＭｏｒａｎｇｅら（２０００年）、Arterioscler Thromb Vasc Biol、第２０巻、１１５０〜１１５４ページ）。さらに、ＰＡＩ−１の発現は、悪液質誘発性サイトカインであるＴＮＦ−αと、チアゾリジンジオン型の抗糖尿病薬化合物とによって促進される（Ｃｉｇｏｌｉｎｉら（１９９９年）、Atherosclerosis、第１４３巻、８１〜９０ページ；および、Ｉｈａｒａら（２００１年）、FASEB J、第１５巻、１２３３〜１２３５ページ）。加えて、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−１などのタンパク質の発現は、インスリン感受性の促進を引き起こし、体脂肪質量の減少に寄与する。
【００７８】
肥満は、交感神経系の活性強化、血管収縮エンドセリン−１の血漿中レベルの上昇、およびインスリン誘発性の内皮依存的血管拡張反応の減弱に関連することがある。さらに、脂肪細胞は、アンギオテンシノーゲンなどの血管原性ペプチドを分泌することができる。２型糖尿病、内臓肥満、動脈の高血圧、および脂質障害は、相当な冠状動脈の危険性を引き起こす代償性の高インスリン血症を伴ったインスリン感受性によって引き起こされた症候群に属しうる（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｗｉｅｌａｎｄら（１９９８年）、Basic Res Cardiol、第９３巻、１３１〜１３４ページ）。
【００７９】
したがって、本発明の方法は、ＨＩＦαを薬理学的に安定化させ、それによって、低酸素環境の刺激に関連した食欲抑制と、それに続く体重減少とを起こさせるのに適用できる。本発明は、本明細書に記載した方法によって、体脂肪の選択的減少が引き起こされることを実証するものであり、それは、腹部脂肪体の消滅、および動物モデルにおける臓器重量の相対的な増加として肉眼で観測された。これらの効果は、遺伝的に正常な動物で観測され、これらの方法が、体脂肪質量を効果的に減少させるのに必要な因子をすべて適切にアップレギュレートできることを実証するものである。
【００８０】
本発明の方法は、脂肪輸送、取り込み、プロセッシング、利用、および貯蔵を含めた脂肪調節の多態な状態を効果的にモジュレートするので、この方法は、脂肪調節に関連した障害を治療または予防するのに有用である。そのような障害には、肥満、アテローム性動脈硬化症などが含まれるが、これらに限定されるものではない。過剰な脂肪および脂質は、糖尿病の発症に関連する危険性に寄与することが公知であるので、本発明の方法を用いた治療は、糖尿病の可能性、頻度、または重篤度を減少させるのに有益な効果がありうる。さらに、遊離脂肪酸または脂質の高血清レベルは、インスリン抵抗性を増強することが公知であるが、これは、糖尿病の病態生理をさらに悪化させるものである。
【００８１】
本発明の化合物および方法は、筋肉質量の減失を伴わずに体質量の減失または減少を誘導して、体重を調節するのに用いることができる。詳細には、内臓脂肪レベルおよび沈着を減少させる際に本発明の方法を用いることができる。さらに、本発明の方法は、脂質生成を減少させて、脂肪蓄積を調節し、それによって効果的に体重増加を制御する可能性を有する。そのような方法は、脂肪代謝における障害の治療、または適切な体重の維持を促進するのに有用である。さらに、本発明の方法および化合物は、過度のカロリー摂取中においてさえ体重増加を減少させるのに有効である。したがって、ＨＩＦ安定化の薬理調節は、例えば肥満など、脂肪調節に関連した合併症、疾患、および病態を治療または予防する新規の治療手法を提供するものである。レプチン、ＰＡＩ−１、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＩＧＦＢＰなどの抗脂肪生成因子を増大させることによって、ＨＩＦ安定化は、肥満と関連合併症に治療効果を提供する。
【００８２】
医薬製剤および投薬経路
本発明の組成物は、当技術分野で周知なように、直接的に、または賦形剤を含有する医薬組成物中において送達することができる。本発明の治療方法は、代謝障害、特に、例えばアテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病など、脂肪調節に関連した障害を有する被験体、またはその危険性を有する被験体に、本発明の化合物を有効量、投与することを含みうる。好ましい実施形態では、被験体が哺乳動物被験体であり、最も好ましい実施形態では、被験体がヒト被験体である。
【００８３】
有効量、例えば化合物または薬物の用量は、通常の実験によって容易に決定でき、有効かつ好都合な投与経路および適切な剤形も同様である。様々な剤形および薬物送達系が当技術分野で利用可能である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ編（２０００年）、Remington's Pharmaceutical Sciences、同上；ならびに、Ｈａｒｄｍａｎ、Ｌｉｍｂｉｒｄ、およびＧｉｌｍａｎ編（２００１年）、The Pharmacological Basis of Therapeutics、同上を参照のこと）。
【００８４】
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、局所、鼻腔内、肺内、眼、腸内、および非経口投与が含まれうる。非経口投与のための主要経路には、静脈内、筋肉内、および皮下投与が含まれる。投与の二次経路には、腹腔内、動脈内、関節内、心臓内、槽内、皮内、病巣内、眼内、胸膜内、髄腔内、子宮内、および脳室内投与が含まれる。治療される徴候、ならびに、薬物の物理的、化学的、および生物学的性質によって、使用される剤形の種類および投与経路が決定され、局所送達および全身送達のどちらが好ましいかも同様である。
【００８５】
本発明の化合物の医薬剤形は、即時放出、制御放出、持続放出、または標的薬物送達系で提供することができる。一般的に使用される剤形には、例えば、溶液および懸濁液、（マイクロ）エマルジョン、軟膏剤、ゲル、パッチ、リポソーム、錠剤、糖剤、軟カプセル剤または硬カプセル剤、坐剤、腟坐薬、インプラント、非晶質または結晶質粉末薬、エーロゾル、および凍結乾燥製剤が含まれる。用いられる投与経路に応じて、薬物の適用または投与に、例えば、注射器および針、吸入器、ポンプ、注射ペン、塗布器、特別なフラスコなどの特別な装置が必要となりうる。医薬剤形は、薬物、賦形剤、および容器／密閉系で構成されることが多い。賦形剤は、不活性成分とも呼ばれるが、薬物の製造、安定性、投与、および安全を改善または促進するために、１つまたは複数の賦形剤を本発明の化合物に添加することができ、それによって望ましい薬物放出プロフィールを実現する方法を提供することができる。したがって、薬物に添加される賦形剤の種類は、例えば薬物の物理的および化学的性質、投与経路、製造手順など、様々な要因に依存しうる。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野で利用可能であり、これらには様々な薬局方に記載されているものが含まれる（例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）、日本薬局方（ＪＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、および英国薬局方（ＢＰ）、米国食品医薬品局（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ）、医薬評価および研究センター（ＣＥＤＲ）公報、例えば、Inactive Ingredient Guide、１９９６年、ならびにＡｓｈおよびＡｓｈ編、２００２年、Handbook of Pharmaceutical Additives、Synapse Information Resources, Inc.、Endicott, NYを参照）。
【００８６】
本発明の化合物の医薬剤形は、例えば、従来の混合、ふるい分け、溶解、溶融、顆粒化、糖衣剤作成、打錠、懸濁、押出し、スプレー乾燥、研和、乳化、（ナノ／マイクロ）カプセル封入、封入、または凍結乾燥プロセスなど、当技術分野で周知の方法のいずれで製造してもよい。上述のように、本発明の組成物は、活性分子を薬学的使用に供する製剤に加工するのを促進する１つまたは複数の生理的に許容できる不活発な成分を含むことができる。
【００８７】
適切な剤形は、望ましい投与経路に依存する。静脈内注入用には、例えば上記組成物を水溶液中に、必要に応じて、剤形ｐＨを調節するために、例えばリン酸、ヒスチジン、またはクエン酸を含めた生理的に適合した緩衝剤、および例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤を用いて製剤してもよい。経粘膜または鼻腔内投与用には、場合によっては透過増強剤を含有する、半固体、液体製剤、またはパッチが好ましいことがある。そのような湿潤剤は、概して当技術分野で公知である。経口投与用には、上記化合物を、液体または固体剤形に、そして即時または制御／持続放出製剤として製剤できる。被験体による経口摂取用に適切な剤形には、錠剤、錠剤、糖剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。上記化合物は、坐剤および停留浣腸剤など、例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有した直腸用組成物に製剤してもよい。
【００８８】
固形経口投与薬は、賦形剤を用いて得ることができ、賦形剤には、充填剤、崩壊剤、結合剤（乾式および湿式）、溶解抑制剤、潤滑剤、滑沢剤、抗粘着剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒａｎｔ）、陽イオン性交換樹脂、湿潤剤、酸化防止剤、保存剤、着色、および矯味剤が含まれうる。これらの賦形剤は、合成原料ものでも、天然原料のものでもありうる。そのような賦形剤の例には、セルロース誘導体、クエン酸、第二リン酸カルシウム、ゼラチン、炭酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム／マグネシウム、マンニトール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ケイ酸化物、二酸化ケイ素、安息香酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、ステアリン酸またはその塩、糖（すなわち、ブドウ糖、スクロース、乳糖など）タルク、トラガント粘滑薬、植物油（硬化油）、およびワックスが含まれる。エタノールおよび水は顆粒化補助剤として機能しうる。ある特定の例では、錠剤を、例えば、味遮蔽フィルム、胃酸耐性フィルム、または遅延放出性フィルムでコーティングすることが望ましい。天然および合成ポリマーは、着色剤、糖、および有機溶剤または水と併用して、しばしば、錠剤をコーティングするのに用いられ、糖衣剤となる。錠剤よりカプセルが好ましい場合には、薬物粉末、懸濁液、またはその溶液は、適合した硬カプセル剤または軟カプセル剤に入れて送達することができる。
【００８９】
一実施形態では、本発明の化合物を、例えば、ゲル、（マイクロ）エマルジョン、軟膏剤、溶液、（ナノ／ミクロ）懸濁液、またはフォームなどの皮膚用パッチ剤、半固形または液体製剤を通して局所的に投与することができる。皮膚およびその下層組織中への薬物の浸透を、例えば、透過増強剤を用いて；水、有機溶剤、ワックス、油、合成ポリマー、天然ポリマー、界面活性剤、乳化剤を含めた親油性、親水性、および両親媒性賦形剤の適切な選択および組合せによって；ｐＨ調節によって；そして、錯形成剤の使用によって、調節することができる。本発明の化合物の皮膚透過性を調節するために、イオン泳動などの他の技法を用いてもよい。例えば、全身曝露を最小にした局所送達が望ましい状況では、経皮または局所投与が好ましいであろう。
【００９０】
吸入による投与、または鼻への投与を行うためには、本発明による使用に供する化合物を、溶液、懸濁液、エマルジョン、または半固体エーロゾルの形態で、気密容器またはネブライザーから、通常、例えばメタンまたはエタンから誘導されたハロゲン化炭素、二酸化炭素、またはいかなる他の適当なガスなどの噴霧剤を使用して送達するのが便利である。局所エーロゾルには、ブタン、イソブテン、およびペンタンのような炭化水素が有用である。加圧されたエーロゾルの場合には、適切な用量単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって、測定してもよい。吸入器またはインサフレーターでの使用用に、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方してもよい。これらは、通常、上記化合物の粉末混和物および乳糖またはデンプンなどの適当な粉末薬基剤を含有する。
【００９１】
注入による非経口投与用に製剤された組成物は、通常、無菌であり、例えば、アンプル、シリンジ、および注射ペンなどの単位剤形、または多用量用容器で提供することができるが、後者は、通常、保存剤を含有する。上記組成物は、油性または水性媒体による懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ってもよく、また、緩衝剤、等張化剤、薬剤を促進する粘着性や、界面活性剤、懸濁剤、分散剤、酸化防止剤、生体適合ポリマ−、キレート剤、保存剤などの製剤物質を含有してもよい。注入部位に応じて、媒体は、水、合成油、植物油および／または、有機助溶媒を含有してもよい。ある特定の例では、凍結乾燥製剤または濃縮液などを用いて、非経口製剤を、投与前に再構成または希釈してもよい。デポー製剤は、本発明の化合物の制御放出または持続放出を提供するが、これには、ナノ／マイクロ粒子の注入可能懸濁液、またはナノ／マイクロもしくは非微粒化結晶が含まれうる。ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、またはその共重合体などのポリマーは、当技術分野で周知の他のものに加えて、調節／持続放出性マトリクスとして使用することができる。他のデポー送達系は、インプラントと切開を必要としたポンプの形態で提供されうる。
【００９２】
本発明の分子の静脈内注入に適した担体は当技術分野で周知あり、これには、例えば水酸化ナトリウムなどのイオン化化合物を形成する塩基、ショ糖、または塩化ナトリウム、等張化剤として、例えばリン酸またはヒスチジンを含有する緩衝剤を含有する水性溶液が含まれる。例えば、ポリエチレングリコールなどの助溶媒を添加してもよい。これらの水性基剤系は、本発明の化合物を溶解するのに有効であり、全身性投与の際に生じる毒性が少ない。溶液系における構成成分の比率は、溶解性および毒性特性を破壊することなく、かなり変動させることができる。さらに、構成成分の種類も多様でありうる。例えば、ポリソルベートまたはポロキサマーなどの低毒性界面活性剤を用いてもよく、ポリエチレングリコールまたは他の助溶媒を使用することもでき、ポリビニルピロリドンなどの生体適合ポリマーを添加してもよく、また、ブドウ糖の代わりに他の糖およびポリオールを用いてもよい。
【００９３】
本発明の治療方法に有用な組成物の治療上有効な量は、まず当技術分野で周知の様々な技法を用いて推算することができる。動物実験で用いられる初期量は、細胞培養アッセイで定めらた実効濃度に基づいたものでもよい。例えば、動物実験および細胞培養アッセイから得られたデータを用いて、ヒト被験体に適切な用量範囲を決定することができる。
【００９４】
薬剤、例えば本発明の化合物の有効量または治療上有効な用量もしくは量とは、被験体における、症候の改善または延命もたらす薬物または化合物の量を指す。そのような分子の毒性および有効性は、細胞培養または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）の測定など、標準的な薬学手法を行うことで決定できる。治療効果をもつ用量に対する毒性作用をもつ用量の比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比率として計算できる。高い治療係数を示す薬剤が好ましい。
【００９５】
有効量または治療上有効な量は、組織、系、動物、またはヒトにおける、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が求める生物学的または医学的反応、例えば、脂肪代謝の調節、体脂肪の減少、体重減少、疾患（例えば肥満）の治療もしくは予防などを引き起こすであろう化合物または医薬組成物の量である。
【００９６】
用量は、毒性がないか、またはほとんどないＥＤ５０を含んだ循環濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および／または投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与経路、用量、および投与間隔は、当技術分野で公知の方法に従って、被験体の状態の詳細を考慮して選択されるべきである。
【００９７】
投薬量および間隔は、例えば、脂肪代謝調節、体重、脂肪貯蔵などの減少などの所望の効果を実現するのに十分な、活性部分の血漿中レベル、すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供するように個別に調整してもよい。ＭＥＣは、各化合物によって異なるであろうが、例えば、インビトロデータおよび動物実験から推算できる。ＭＥＣを実現するのに必要な用量は、個別の特性と投与経路とに依存するであろう。局所投与または選択的摂取の場合では、薬物の有効局所濃度が血漿中濃度とは関係ないことがある。
【００９８】
投与される薬剤または組成物の量は、治療対象の被験体の性別、年齢、および体重、疾患の重篤度、投与方法、ならびに処方する医師の判断を含めた様々な因子に依存しうる。
【００９９】
本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有したパックまたは調剤装置に入れて提供してもよい。そのようなパックまたは装置は、例えば、ブリスター包装などの金属もしくはプラスチックホイル、またはバイアルなどにおけるガラス栓およびゴム栓などを含んでもよい。このパックまたは調剤装置には、投与用の説明書が付随してももよい。適合した薬学的担体中に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製し、適当な容器内に配置し、そして、示された状態の治療用に標識することもできる。
【０１００】
化合物およびそのスクリーニング方法
本発明の化合物は、ヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物であり、詳細には、上記ヒドロキシラーゼ活性は２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素の活性である。上記ヒドロキシラーゼ活性は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素の活性であることがより好ましい。上記ヒドロキシラーゼ活性は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ酵素の活性であることが最も好ましい。
【０１０１】
本発明の方法は、ＨＩＦαの安定化に基づいて、被験体における特定の結果を実現する方法である。本発明の方法は、その被験体のＨＩＦαを安定化し、特定の結果を実現するために、化合物を投与することで実行されることが好ましい。これらの方法は、本発明の化合物を投与して実行されることが最も好ましい。
【０１０２】
本発明の化合物は、ＨＩＦαの安定化に関する本発明の方法において、例示的に使用される。詳細には、本発明は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性および／またはＨＩＦαのヒドロキシル化を阻害する化合物、ＨＩＦαを安定させる化合物などをさらにスクリーニングして、同定するための方法および化合物を提供する。本発明の化合物には、ヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物が含まれ、好ましくは上記ヒドロキシラーゼ活性が２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素の活性であり、また、より好ましくは上記ヒドロキシラーゼ活性がＨＩＦヒドロキシラーゼの活性である。上記ＨＩＦヒドロキシラーゼは、ＨＩＦタンパク質、好ましくはＨＩＦαサブユニットにおける、例えばプロリン残基およびアスパラギン残基などを含めた、いずれのアミノ酸をヒドロキシル化するものでもよい。特に好ましい実施形態では、上記ヒドロキシラーゼ活性は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼおよび／またはＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼの活性である。
【０１０３】
２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ活性の阻害剤は当技術分野で公知である。例えば、プロコラーゲンプロピル４−ヒドロキシラーゼの小分子阻害剤がいくつか同定されている（例えば、Ｍａｊａｍａａら（１９８４年）、Eur J Biochem、第１３８巻、２３９〜２４５ページ；Ｍａｊａｍａａら（１９８５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、第２２９巻、１２７〜１３３ページ；ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＭｙｌｌｙｈａｒｊｕ（１９９８年）、Matrix Biol、第１６巻、３５７〜３６８ページ；Ｂｉｃｋｅｌら（１９９８年）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第２８巻、４０４〜４１１ページ；Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２０００年）、Proc Natl Acad Sci USA、第９７巻、４７３６〜４７４１ページ；ならびにＦｒａｎｋｌｉｎら（２００１年）、Biochem J、第３５３巻、３３３〜３３８ページを参照；これらすべてを参照により全体として本明細書に組み込む）。ＨＩＦヒドロキシラーゼの小分子阻害剤も同定されている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０７４９８１号、第ＷＯ０３／０４９６８６号、および第ＷＯ０３／０８０５６６号を参照；これらすべてを参照により全体として本明細書に組み込む）。本発明は、これらの化合物、および当技術分野で公知の方法を用いて同定可能な他の化合物の使用を特に企図する。
【０１０４】
２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼファミリーにおけるすべての酵素が、それらのヒドロキシラーゼ活性に酸素、Ｆｅ２＋、２−オキソグルタル酸、およびアスコルビン酸を必要とする。（例えば、Ｍａｊａｍａａら（１９８５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、第２２９巻、１２７〜１３３ページ；ＭｙｌｌｙｈａｒｊｕおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９７年）、ＥＭＢＯ  Ｊ、第１６巻、１１７３〜１１８０ページ；Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら（１９９３年）、３２巻、１４０２３〜１４０３３ページ；ならびにＪｉａら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９１巻、７２２７〜７２３１ページを参照）。したがって、本発明の化合物には、鉄キレート剤、２−オキソグルタル酸ミメティック、および、例えばプロリンまたはアスパラギンの修飾アミノ酸類似体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
特定の実施形態では、本発明は、２−オキソグルタル酸の構造ミメティックの使用を提供する。そのような化合物は、標的の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素を、２−オキソグルタル酸に関しては競合的に、そして鉄に関しては非競合的に阻害しうる（Ｍａｊａｍａａら（１９８４年）、同上；およびＭａｊａｍａａら（１９８５年）、同上）。例えば、参照によりすべて本明細書に全体として組み込まれているＭａｊａｍａａら、同上；ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＭｙｌｌｙｈａｒｊｕ（１９９８年）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ、第１６巻、３５７〜３６８ページ；Ｂｉｃｋｅｌら（１９９８年）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第２８巻、４０４〜４１１ページ；Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２０００年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９７巻、４７３６〜４７４１ページ；Franklin（１９９１年）、Biochem Soc Trans、第１９巻、８１２〜８１５ページ；Ｆｒａｎｋｌｉｎら（２００１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、第３５３巻、３３３〜３３８ページ；ならびに国際公開第ＷＯ０３／０４９６８６号に記載された化合物が特に企図される。
【０１０６】
例示的化合物には、限定されるものではないが、米国特許第５，９１６，８９８号および第６，２００，９７４号、ならびに国際公開第第ＷＯ９９／２１８６０号に記載のものを含めたフェナントロリン；限定されるものではないが、例えば米国特許第５，７１９，１６４号および第５，７２６，３０５号に記載の置換キノリン−２−カルボキサミドおよびそのエステルを含めた複素環式カルボニルグリシン；例えば米国特許第６，０９３，７３０号に記載の置換イソキノリン−３−カルボキサミドおよびそのエステル；例えば欧州特許第０６５０９６１号および米国特許第５，６５８，９３３号に記載の３−メトキシピリジンカルボニルグリシンおよびそのエステル；例えば米国特許第５，６２０，９９５号および第６，０２０，３５０号に記載の３−ヒドロキシピリジンカルボニルグリシンおよびそのエステル；例えば米国特許第５，６０７，９５４号、第５，６１０，１７２号、および第５，６２０，９９６号に記載の５−スルホンアミドカルボニルピリジンカルボン酸およびそのエステルが含まれる。これらの特許に記載されたすべての化合物、特に、化合物請求項に記載された化合物、および実施例における最終産物を、参照により本明細書に組み込む。
【０１０７】
したがって、本発明の好ましい化合物には、例えば、複素環式カルボキサミドが含まれる。特に好ましい複素環式カルボキサミドには、例えばイソキノリン、キノリン、ピリジン、シンノリン、カルボリン誘導体などが含まれる。加えて、好ましい化合物の構造クラスには、アントラキノン、アザフルオレン、アザフェナントロリン、ベンゾイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾピラン、ベンゾチオフェン、カテコール、クロマノン、α−ジケトン、フラン、Ｎ−ヒドロキシアミド、Ｎ−ヒドロキシ尿素、イミダゾール、インダゾール、インドール、イソチアジアゾール、イソチアゾール、イソオキサジアゾール、イソオキサゾール、α−ケト酸、α−ケトアミド、α−ケトエステル、α−ケトイミン、オキサジアゾール、オキサリルアミド、オキサゾール、オキサゾリン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピリダジン、ピリジン、キナゾリン、フェナントロリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チアゾリン、チオフェン、およびトリアゾールが含まれる。
【０１０８】
次の例示的化合物が、本明細書に記載された本発明の方法を実証するのに本発明の実施例で用いられた。すなわち、［（７−クロロ−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ａ）、［（１−クロロ−４−ヒドロキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｂ）、［（４−ヒドロキシ−７−フェノキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｃ）、４−オキソ−１，４−ジヒドロ−［１，１０］フェナントロリン−３−カルボン酸（化合物Ｄ）、［（１−クロロ−４−ヒドロキシ−７−メトキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｅ）、［（３−ヒドロキシ−６−イソプロポキシ−キノリン−２−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｆ）、［（３−ヒドロキシ−ピリジン−２−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｇ）、および［（７−ベンジルオキシ−１−クロロ−４−ヒドロキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸メチルエステル（化合物Ｈ）である。
【０１０９】
本発明の化合物、すなわちヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を同定するのに、以下に記載するものを含めた様々なアッセイおよびスクリーニング技術を用いることができる。これらの化合物は、本発明の方法での使用に適している。当業者ならば利用可能なアッセイおよびスクリーニング法を用いて、本発明の方法での使用に適した他の化合物、すなわちＨＩＦαを安定化する化合物を同定できる。
【０１１０】
通常、アッセイは、反応基質の消費または反応生成物の生成に付随した検出可能なシグナルを提供するであろう。検出には、例えば、蛍光色素、放射性同位元素、酵素結合体、および他の当技術分野で周知の検出可能な標識を用いることができる。結果は、定性的でも、定量的でもよい。反応生成物の単離は、ビオチンまたはヒスチジン標識など、沈殿またはアフィニティクロマトグラフィーを介して他の反応成分からの精製を可能にする標識によって促進されてもよい。
【０１１１】
ヒドロキシラーゼ活性のアッセイは、当技術分野において標準的なものである。そのようなアッセイは、直接的に、または間接的にヒドロキシラーゼ活性を測定することができる。例えば、アッセイは、例えば酵素基質、標的タンパク質、合成ペプチドミメティック、またはその断片中に存在する、ヒドロキシル化された、例えばプロリン、アスパラギンなどの残基を測定することができる（例えば、Ｐａｌｍｅｒｉｎｉら、（１９８５年）、J Chromatogr、第３３９巻、２８５〜２９２ページ参照）。化合物の存在下におけるヒドロキシル化プロリンまたはアスパラギンの減少は、ヒドロキシラーゼの活性を阻害する化合物であることを示すものである。別法として、アッセイは、ヒドロキシル化反応の他の産物、例えば２−オキソグルタル酸からのコハク酸の生成を測定することもできる（例えば、Ｃｕｎｌｉｆｆｅら（１９８６年）、Biochem J、第２４０巻、６１７〜６１９ページを参照）。ＫａｕｌｅおよびＧｕｎｚｌｅｒ（１９９０年；Anal Biochem、第１８４巻、２９１〜２９７ページ）は、２−オキソグルタル酸からのコハク酸の生成を測定する例示的操作法を記載する。
【０１１２】
ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するのに、上述のものなどの操作法を用いることができる。例示的な操作法を実施例８（下記）に記載する。標的タンパク質には、ＨＩＦαまたはその断片、例えばＨＩＦ（５５６〜５７５）；例えば、実施例９に記載するアッセイでの使用に供された例示的基質であるＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号１）が含まれうる。酵素には、例えばＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＧ３３９６５などを参照）、またはＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼ（例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ２７３０８などを参照）が含まれ、いかなる供給源から入手したものでもよい。酵素は、未精製細胞溶解液または部分的に精製された形態で存在していてもよい。例えば、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を測定する手法は、Ｉｖａｎら（２００１年、Science、第２９２巻、４６４〜４６８ページ；２００２年、Proc Natl Acad Sci USA、第９９巻、１３４５９〜１３４６４ページ）、およびＨｉｒｓｉｌａら（２００３年、J Biol Chem、第２７８巻、３０７７２〜３０７８０ページ）に記載されており；別の方法が国際公開第ＷＯ０３／０４９６８６号に記載されている。化合物の非存在下および存在下における酵素活性を測定し、比較することによって、ＨＩＦαのヒドロキシル化を阻害する化合物が同定されよう。
【０１１３】
ＨＩＦαの安定化および／またはＨＩＦ活性化のアッセイでは、試料中にあるＨＩＦαの直接測定（例えば、下記の実施例８を参照）、例えば、フォンヒッペルリンダウタンパク質と会合したＨＩＦαの減少を測定すること（例えば、国際公開第ＷＯ００／６９９０８号参照）によるＨＩＦαの間接的測定、またはＨＩＦ反応性標的遺伝子もしくはレポーター構築物の活性化（例えば、米国特許第第５，９４２，４３４号を参照）を行う。この化合物の非存在下および存在下におけるＨＩＦおよび／またはＨＩＦ反応性標的タンパク質のレベルを測定し、比較することによって、ＨＩＦαを安定化する化合物および／またはＨＩＦを活性化する化合物が同定されよう。
【０１１４】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示に照らして、当業者ならば容易に想起されよう。
【０１１５】
本発明は、本発明を例示することのみを意図する以下の実施例を参照にすることで、さらに理解されよう。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載する発明を例証することのみのために提供する。実施形態は本発明の一態様のみの例示として意図されており、本発明の範囲は、例示された実施形態によって限定されない。機能上等価であるいかなる方法も本発明の範囲に包含される。当業者には、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、以上の記述および添付の図から明らかになるであろう。そのような変更も、添付された特許請求項の範囲に包含されるものである。
【実施例１】
【０１１６】
試験物質
本発明の化合物は、当業者に公知である標準的な化学的方法によって合成した。化合物は、高速液体クロマトグラフィーで純度を分析し、光から保護しながら室温で保存した。様々な用途のために製剤する間、均一粒径を促進するために、化合物を、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ  ７平床式マイクロミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＧＭＢＨ社、独国）を用いて、懸濁液中、５００ｒｐｍで２５分間または７５０ｒｐｍで１０分間かけて微粉化した。
【０１１７】
強制経口投与用の微粉化化合物の懸濁液は、使用直前に調製した。化合物は、０．５％ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｇａｒｄｅｎａ  ＣＡ）、および０．１％ポリソルベート８０（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ社、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）を含有する水溶液に懸濁し、用量投与（dose administration）中にはマグネチックスターラまたは回転振盪機を用いて定常的に撹拌した。懸濁液の濃度は、所与の体積において意図した用量レベルが実現するように計算した。別法として、化合物は、重量を計量し、適切な大きさの経口投与用ゼラチンカプセル中に入れるか（この場合対照動物には同じ大きさの空のカプセルを与えた）、または化合物を１００ｍＭヒスチジン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ社）溶液に溶解して、水の代わりに自由に提供した。
【０１１８】
注入による投与用には、最初に、化合物を等モル量の水酸化ナトリウムと、１０％グルコース（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社）または塩化ナトリウムと化合した２５ｍＭヒスチジン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ社）の等張水溶液中で混合した。
【実施例２】
【０１１９】
選択した細胞型におけるレプチンのインビトロでの発現増大
脂肪調節、特に脂肪代謝および満腹と関連する因子の発現に対する本発明の方法および化合物の効果を以下のように試験した。ヒトＨｅＬａ（頸部上皮腺癌）、２９３Ａ（アデノウイルスで形質転換した胎児腎臓上皮；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌）、ＨＦＦ（包皮繊維芽細胞）、ＨＭＥＣ−１（微小血管内皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（臍帯静脈内皮細胞）、および脂肪細胞を、別々に１ウエルあたり１００，０００細胞で２４ウエル培養皿中に接種し、以下の培地中で、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で培養した：すなわち、１％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中でＨｅＬａ、２９３ＡおよびＨｅｐ３Ｂを；内皮増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）中でＨＭＥＣ−１およびＨＵＶＥＣを；１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中でＨＦＦを；脂肪細胞培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ ＮＣ）中で脂肪細胞を培養した。続いて、培地を、ＨｅＬａ、２９３Ａ、Ｈｅｐ３ＢおよびＨＦＦ培養物中の血清レベルが０．５％ＦＢＳに低減したことを除いて、上述の通り新鮮な培地と交換した。ビヒクル対照（０．５％ＤＭＳＯ）または化合物Ｂを添加し、細胞をさらに３日間インキュベートした。細胞非含有上清を回収し、レプチンレベルをＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）をメーカーの指示に従って使用して定量した。
【０１２０】
図１Ａに示すように、本発明の化合物による処置の後、脂肪細胞におけるレプチンの発現の上昇が観察されたが、他の細胞型においては観察されなかった。
【０１２１】
別の実験において、前脂肪細胞をウエル当たり４５，０００細胞で２４ウエルプレートに播種し、前脂肪細胞培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ）中で３日間培養した。続いて培地を分化培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ）に交換し、細胞をビヒクル対照（０．５％ＤＭＳＯ）または２５もしくは５０μＭでの化合物Ｂのいずれかで最大１２日間にわたり処置した。培養培地の半分を３日毎に交換し、細胞非含有培養上清を得て、レプチンの分泌レベルをＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）をメーカーの指示に従って使用して分析した。
【０１２２】
図１Ｂに示すように、前脂肪細胞の化合物Ｂによる処置によって、ビヒクル対照で処置した細胞と比較してレプチンの分泌が用量依存的に増大した。このレプチンレベルは全１２日の期間にわたって増大し続けた。
【０１２３】
類似の実験において、ウエル当たり１００，０００細胞で２４ウエルプレートの脂肪細胞培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ）中に前脂肪細胞を播種し、ビヒクル対照、２５μＭの化合物Ａ、化合物Ｅ、または化合物Ｆ、あるいは２５μＭもしくは５０μＭの化合物Ｂで処置した。培養培地の半分を３日毎に交換し、細胞非含有培養上清を得て、レプチンの分泌レベルをＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）をメーカーの指示に従って使用して分析した。
【０１２４】
図１Ｃに示すように、脂肪細胞の本発明の化合物による処置によって、ビヒクル対照で処置した細胞と比較してレプチンの分泌が増大した。このレプチンレベルは全１２日の期間にわたって増大し続けた。
【０１２５】
レプチンは、脂肪調節および代謝、すなわち輸送、貯蔵、プロセッシング、利用等、および食欲抑制などに関与する調節因子である。本発明の化合物および方法がレプチンの発現を調節する能力は、脂肪代謝を調節するため、そして特定の被験体への適用においては体重増加の低減もしくは防止のため、またはさらには体重減少の誘導のための本化合物および方法の使用を示唆するものである。
【実施例３】
【０１２６】
脂肪調節に関与する因子の発現の増大
本発明の化合物および方法が脂肪代謝を調節する能力、特に脂肪の輸送、利用および貯蔵に関与する因子の発現を増大する能力を以下のように分析した。遺伝子誘導の経時パターンを測定するために、２４匹のオスのスイスウェブスターマウス（３０〜３２ｇ）をＳｉｍｏｎｓｅｎ社から入手し、これらに０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）（０ｍｇ／ｋｇ）または１．２５％化合物Ｂ（０．５％ＣＭＣ中に２５ｍｇ／ｍｌ）（１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、４ｍｌ／ｋｇの容量で強制経口投与する処置を行った。最終投与の４、８、１６、２４、４８、または７２時間後に、動物をイソフルランで麻痺にかけた。その後マウスを犠牲にし、腎臓、肝臓、脳、肺、および心臓の組織試料を単離し、ＲＮＡＬＡＴＥＲ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）中に−８０℃で保存した。
【０１２７】
次のプロトコールを用いて、ＲＮＡを単離した。各器官から５０ｍｇの切片を切り取り、ＲＬＴ緩衝液（ＲＮＥＡＳＹキット；Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）８７５μｌを添加し、この断片を、ローター／ステーターＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  ＯＨ）を用いて約２０秒間ホモジナイズした。不溶性物質をペレットにするためにホモジネートを３分間、微量遠心し、上清を新しいチューブに移し、メーカーの指示に従ってＲＮＥＡＳＹキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用することで、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを８０μＬの水で溶出し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）を用いて定量した。その後、メーカーの指示に従ってＤＮＡ−ＦＲＥＥキット（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）を用いることでＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去した。２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの純度および濃度を決定した。
【０１２８】
別法では、組織試料を切り出し、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）中で、ローター／ステーターＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを室温に戻し、０．２体積のクロロホルムを添加し、試料を激しく撹拌した。混合物を室温で数分間インキュベートし、その後、４℃、１２，０００ｇで、１５分間、遠心した。水相を収集し、０．５体積のイソプロパノールを添加した。試料を混合し、室温で１０分間インキュベートし、４℃、１２０００×ｇで１０分間、遠心した。上清を除去し、ペレットを７５％ＥｔＯＨで洗浄し、４℃、７５００ｇで５分間、遠心した。その後、メーカーの指示に従ってＤＮＡ−ＦＲＥＥキット（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）を用いることでＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去した。２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの純度および濃度を決定した。
【０１２９】
ＲＮＡは、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、５０ｎｇ／ｍｌグリコーゲン、および２．５体積のエタノール中において、２０℃で１時間かけて沈殿させた。試料を遠心分離し、ペレットを８０％冷エタノールで洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁した。二本鎖ｃＤＮＡは、メーカーの指示に従って、Ｔ７−（ｄＴ）２４第１鎖プライマー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）と、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＣＨＯＩＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて合成した。最終ｃＤＮＡは、ＰＨＡＳＥ  ＬＯＣＫ  ＧＥＬインサート（Ｂｒｉｎｋｍａｎ社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ  ＮＹ）を用いて、等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール２５：２４：１で抽出した。水相を収集し、０．５体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２．５体積のエタノールとを用いてｃＤＮＡを沈殿させた。別法では、メーカーの指示に従ってＧＥＮＥＣＨＩＰサンプルクリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用することで、ｃＤＮＡを精製した。
【０１３０】
ビオチン標識ｃＲＮＡは、メーカーの指示に従ってＢＩＯＡＲＲＡＹ  ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ  ＲＮＡ転写物ラベリングキット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ  ＮＹ）を使用することで、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）反応によってｃＤＮＡから合成した。最終標識産物は、メーカーの指示に従ってＧＥＮＥＣＨＩＰサンプルクリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用することで精製および断片化した。
【０１３１】
ハイブリダイゼーションカクテルは、５μｇのプローブを１ｘハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ［Ｎａ＋］、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、０．０３ｎＭ対照オリゴＢ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および１ｘＧＥＮＥＣＨＩＰ真核細胞ハイブリダイゼーション対照（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に希釈して１００μｌにすることで調製した。このカクテルを、９９℃で５分間、そして４５℃で５分間、順次にインキュベートし、その後５分間、遠心した。マウスゲノムＵ７４ＡＶ２アレイ（ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を室温にし、その後、回転させながら１ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で、４５℃、１０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、この緩衝液をハイブリダイゼーションカクテル８０μｌで置換し、カウンタバランスを用いて、４５℃、６０ｒｐｍで１６時間、アレイのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、アレイを６ｘＳＳＰＥ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、その後、洗浄し、メーカーのｍｉｃｒｏ＿１ｖ１プロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に従って、Ｒフィコエリトリン結合ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）と、ビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）と、ＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００測定器（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）とを使用することによって染色した。アレイは、ＧＥＮＥＡＲＲＡＹスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）とＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）とを用いて分析した。
【０１３２】
マウスゲノムＵ７４ＡＶ２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）は、マウスＵｎｉＧｅｎｅデータベースビルド７４（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）における、機能上の特徴決定を行った全配列（約６０００）と、未解明の約６０００のエクスプレスドシーケンスタグ（ＥＳＴ）クラスタとを表すものである。
【０１３３】
図２Ａに示すように、脂肪の代謝および輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現が、本発明の化合物による処置の後で、肝臓において協調的に増強された。図２Ａに示された転写産物パターンには、（１）アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、（２）サイトゾルアシルＣｏＡチオエステラーゼ１、（３）インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−１、および（４）カルニチンアセチルトランスフェラーゼが含まれる。タイムコースでは、これらのタンパク質のｍＲＮＡレベルが、早期にピークに達し、その後２４時間後に対照レベルに戻った。図２Ｂは、ＰＡＩ−１についての特異的発現の時間経過を示し、これは、本発明の化合物による処置後の発現の同様ではあるがより初期の誘導を示している。
【０１３４】
これらのデータは、本発明の方法および化合物が、脂肪の貯蔵、取り込み、輸送、合成、プロセッシングおよび利用と関連する因子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を、直接的（例えば、ＡｐｏＡ−ＩＶ、カルニチンチオエステラーゼ、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＩなど）または間接的（例えば、ＩＧＦＢＰ−１など）に増大することによって、脂肪代謝を調節することを示している。本発明の方法および化合物は、高コレステロールに関連する症状（例えばアテローム性動脈硬化症など）、および脂肪代謝障害の治療または予防のために治療的に使用することができる。
【実施例４】
【０１３５】
脂肪細胞分化に関与する調節因子の発現改変
本発明の方法および化合物が脂肪代謝および脂肪生成に関連する遺伝子の発現に及ぼす効果をさらに調べるために、実施例３に記載のように行った実験を、特異的脂肪生成因子（adipogenic factor）について分析した。図３Ａに示すように、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３の発現は、化合物Ｂで処置した動物の肝臓において最初は増大し、続いて投与の７２時間後までに基底値に徐々に戻った。ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３は、ＰＰＡＲ−γ２核ホルモン受容体の発現を抑制することが知られ、脂肪細胞の分化に必要である（例えば、Ｙｕｎら、前掲；Ｇｉｕｓｔｉら、前掲；およびＭｕｌｌｅｒら、前掲参照）。従って、ＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３発現が増大すると、ＰＰＡＲ−γの発現は低減すると予想され、これにより脂肪酸に対する細胞の応答が低減し、特に、脂肪細胞の分化および脂肪組織の生成が遅延すると考えられる。
【０１３６】
本発明の方法および化合物が脂肪生成因子の発現に及ぼす効果をさらに調べるため、１２匹のオスのスイスウェブスターマウス（３０−３２ｇ）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ社より入手）に、０．５％ＣＭＣ（０ｍｇ／ｋｇ／日）、化合物Ｄ（０．５％ＣＭＣ中に２５ｍｇ／ｍｌ）（１００ｍｇ／ｋｇ／日）、または化合物Ｂ（０．５％ＣＭＣ中に７．５ｍｇ／ｍｌおよび２５ｍｇ／ｍｌ）（それぞれ、３０および１００ｍｇ／ｋｇ／日）を、４ｍｌ／ｋｇの容量で１日に１回強制経口投与する処置を４日間行った。最終投与の４時間後に、動物に麻酔をかけ、屠殺し、約１５０ｍｇの脂肪、心臓、腎臓、肝臓、肺および筋肉を摘出し、ＲＮＡＬＡＴＥＲ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）中に−２０℃で保存した。ＲＮＡの単離および遺伝子発現分析は実施例３に記載のとおり行った。
【０１３７】
図３Ｂに示すように、化合物Ｄまたは化合物Ｂのいずれかの投与により、種々の組織（脂肪、腎臓、肝臓および筋肉など）においてＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３の発現が増大した。化合物Ｂはまた、肺および心臓におけるＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３の発現をも増大した（図３Ｂ）。さらに、処置の４日後においても発現の増大が依然として顕著であった。またさらに、化合物Ｄまたは化合物Ｂのいずれかの投与により、前述のように、ＰＰＡＲ−γの発現は、例えば心臓組織において低減した（図３Ｃ）。
【０１３８】
これらのデータは、本発明の化合物および方法が、脂肪（例えばトリグリセリド）の合成、利用、輸送および貯蔵に対する細胞応答に関与する因子の発現を改変することによって、脂肪代謝を調節することを示す。特に、本発明の方法および化合物は、脂肪細胞の分化をモジュレートし、脂肪貯蔵を低減するために用いることができる。
【実施例５】
【０１３９】
体重および脂肪のｉｎ ｖｉｖｏ調節
例えば脂肪貯蔵に対する作用を介した、体重および脂肪の調節に対する本発明の化合物および方法の効果を以下の通りに検査した。Ｓｉｍｏｎｓｅｎ社から入手した５０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６〜７週齢）に、０．５％ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、または２０、６０、１００もしくは２００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物Ｂを、１日に１度の強制経口投与によって連続して１４日間投与した。体重および明白な毒性の徴候における変化、ならびに死亡率に関して動物をモニターした。１５日目に、水を自由に利用可能な状態で終夜絶食させた後、動物をイソフルランで麻痺にかけ、腹腔を開き、血液を下大静脈から採取した。約１ｍｌの全血の一試料を血液分析用にＥＤＴＡを含有するチューブに採取し、約１ｍｌの第２の試料を血清化学分析用に抗凝血物質を含まないチューブに採取した。血液試料分析は、ＩＤＥＸＸ社（Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）が行った。血液採取後、隔膜を切開し、動物を犠牲にした。各動物における、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、肺、胃、小腸の肉眼観察測を記録し、大腸を、生化学的および／または組織学的な評価のために採取した。
【０１４０】
図４Ａに示すように、本発明の化合物で処置した動物は、体重増加における用量依存的な遅延を示した。動物の検査法により、処置した動物における、ほとんどの器官の絶対重量は、対照の処置されなかった動物における、それぞれの臓器重量と有意に異なっておらず、したがって成長には一般的な遅延がなかったことが示された。例えば、化合物で処置した動物の絶対心臓重量は、未処置対照の絶対心臓重量と本質的に同じであった（図４Ｂ）。しかし、相対的臓器重量（器官の重量を、総体重の比率として表す）は、未処置対照と比較して、処置した動物において有意に増大した。例えば、処置動物における相対心臓重量は、対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの化合物で処置した動物において、有意に増大していた（ｐ＝０．０３６、片側ＡＮＯＶＡ／チューキー検定）。
【０１４１】
絶対臓器重量は有意に減少しなかったので、処置した動物には、一般的な増殖遅延過程はなかった。しかし、相対臓器重量が有意に増大していたので、別の組織に選択的損失があった。図５に示すように、化合物で処置した動物においては内臓脂肪（腹部脂肪）の用量依存的な減少が観察された。上部パネルの矢印は、低用量の化合物で処置した動物に存在する内臓脂肪体を示し、一方、下部のパネルは、より高用量の化合物で処置した動物における、脂肪体の完全な不在を示すものである。
【０１４２】
これらの結果は、本発明の化合物および方法は、体重を調節するために用いることができることを示している。特に、本発明の方法および化合物は、筋肉質量の減失を伴わずに、体重増加を防止または低減するために有用でありうる。本化合物および方法は、例えば腹部または内臓脂肪の貯蔵を低減することにより、脂肪調節をモジュレートするために使用することができる。
【実施例６】
【０１４３】
食餌誘発性肥満動物モデルにおける体重増加の低減
本発明の化合物および方法が脂肪調節、例えば脂肪取り込みおよび貯蔵などに対して、ならびに体重の調節に対して及ぼす効果を以下のように分析した。高脂肪食を与えたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、重度の肥満、高血糖、および高インスリン血症を発症し、食餌誘発性肥満、２型糖尿病、および耐糖能異常のモデルとされている。４０匹のオスＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥ）から入手し、次の実験群に分割した。群１：標準的なマウス固形飼料を与えたビヒクル対照動物（ｎ＝１０）；群２：高脂肪マウス固形飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社から入手した４５％脂肪飼料）を与えたビヒクル対照動物（ｎ＝１０）；群３：高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｅを強制経口投与で投与した動物（ｎ＝１０）；群４：高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａを強制経口投与で投与した動物（ｎ＝１０）。この食餌計画は、毎週、体重を測定しながら２８日間継続された。その後、動物を犠牲にし、それらの器官および脂肪体を採取し、重量測定した。
【０１４４】
図６Ａに示すように、高脂肪食を与えた動物（群２）は、標準的固形飼料を与えた動物（群１）より有意に重い体重を有した（ｐ＜０．０５）。しかし、高脂肪食を与えられたが、化合物Ｅまたは化合物Ａで処置した動物（それぞれ群３および群４）は、有意に少ない体重増加を示した（ｐ＜０．０５）。実際、高脂肪食にもかかわらず、化合物で処置した動物は本質的には正常食を与えられた動物と同じ体重を有した（群３および群４を群１と比較されたし）。同様に、図６Ｂに示すように、高脂肪を与えた動物（群２）は、標準的固形飼料を与えた動物（群１）、および高脂肪食を与え、また、本発明の化合物で処置した動物（群３および群４）の両方と比較して、腹部脂肪体の重量が有意に増大していた。図６Ｂからわかるように、高脂肪食を与え、かつ化合物で処置した動物は、正常食を与えられた動物と本質的には同じ重量の脂肪体を有した。図６Ｃは、この効果が、腎臓、肝臓、および心臓を含むほかの臓器の重量がいずれの実験群間でも本質的に同一であったことから、脂肪体の重量に特異的であったことを示す。
【０１４５】
これらの結果は、化合物投与または非投与の高脂肪摂取動物間で観測された体重の相違が、特異的に脂肪貯蔵の減少による結果であり、成長率の低下によるものではなかったことを示した。さらに、これらのデータは、本発明の化合物で動物を処置したことによって、高脂肪食摂取と関連した過剰な体重増加がなくなったことを示した。さらに、各群から得られた発現プロフィールの分析は、本発明の化合物が、群２の動物においてアップレギュレートされた（データは示さない）脂肪酸結合タンパク質３およびミトコンドリア非共役タンパク質１などの遺伝子の発現を正常化することを証明している。このように、本発明の化合物は、有害な食餌摂取の下でさえ、体重増加を治療によって減少させるのに有用である。さらに、本発明の方法および化合物による体重増加の調節は、肥満患者において、治療によって体重減少を調節するのにも、そのような化合物が有用であることを示唆する。
【実施例７】
【０１４６】
肥満マウスにおける体重減少
動物における体重減少に対する本発明の化合物の投与効果を、以下の通り検査する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥ）から入手する。高脂肪食を与えられたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、重度の肥満、高血糖、および高インスリン血症を発症し、食餌誘発性肥満、２型糖尿病、および耐糖能異常のモデルとされている。高脂肪食（４５％のカロリーが脂肪）を８週間マウスに与えるが、その後には、マウスは肥満となっている。肥満マウスを２つの実験群に分割する。群１動物は、対照の肥満マウスであり、群２動物は、本発明の化合物で処置した肥満マウスである。年齢が適合した非肥満体マウスの追加群も検査に含まれる。その後、動物を本発明の化合物またはビヒクル対照で毎日処置する。マウスの体重は、２１日間、１週間に２回測定する。２１日目に、動物は、体重を量り、その後犠牲にする。腹部脂肪体、肝臓、腎臓、および心臓を、分析用に単離し、重量を計る。
【０１４７】
化合物投与による体重減少は、肥満患者において、治療によって体重を減少させるのに、本発明の化合物が有用であることを示す。
【実施例８】
【０１４８】
血清トリグリセリドの長期間にわたる減少
血清トリグリセリドレベルに対する本発明の化合物投与の効果を、以下の糖尿病のマウスモデルを用いて調べた。２０匹のオスのｄｂ／ｄｂマウス（Ｈａｒｌａｎ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ；レプチン受容体のホモ機能喪失変異を有する）を入手し、ビヒクル（１００μＭヒスチジン）または化合物Ａ（１００ｍＭヒスチジン中に０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する飲料水を８週間、マウスに自由に与えた。検査終了時に、動物を終夜絶食させ、全身麻酔の下に尾部大静脈から血液試料を採取し、血清分離チューブに入れた。血液試料は分析のためにＱｕａｌｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｓ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に送った。
【０１４９】
ｄｂ／ｄｂマウスのトリグリセリドレベルは、正常マウスと比較して、少なくとも１．５〜２倍上昇しており、年齢と共に次第に増大する（Ｎｉｓｈｉｎａら（１９９４年）、Metabolism、第４３巻、５４９〜５５３ページ；ＴｕｍａｎおよびＤｏｉｓｙ（１９７７年）、Diabetologia、第１３巻、７〜１１ページ）。図７に示すように、対照ｄｂ／ｄｂマウスのトリグリセリドレベルは、実験の終了時に約１２０ｍｇ／ｄＬであった。しかし、本発明の化合物で処置した動物のトリグリセリドレベルは、対照より有意に低く、約８５ｍｇ／ｄＬであった。トリグリセリドレベルの増大は、心血管疾患になる危険性の増大に関連しており、高トリグリセリドは代謝症候群の要素である。本発明の化合物および方法は、例えば糖尿病、症候群Ｘ、大血管疾患、または他の異脂肪血症など、高トリグリセリドに通常、関連する状態において、トリグリセリドレベルを効果的に低下または維持するので、本発明の方法は、そのような状態を有するか、またはその危険性のある個体を治療するのに有用である。
【実施例９】
【０１５０】
ＨＩＦαを安定化し、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物の同定
本発明の方法において使用するための本発明の化合物は、ＨＩＦαを安定化し、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性および／またはＨＩＦヒドロキシル化などを阻害する。従って、例えばＨＩＦαを安定化する能力により、化合物を同定しうる。本発明の化合物および方法を用いたＨＩＦαの安定化を以下の通りに調べた。アデノウイルスで形質転換した胎児腎臓上皮（２９３Ａ）、頸部上皮腺癌（ＨｅＬａ）、肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）、扁平上皮癌（ＳＳＣ−２５）、および肺線維芽細胞（ＨＬＦ）に由来するヒト細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ；およびＱｂｉｏｇｅｎｅ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡを参照）を、別々に１００ｍｍ培養皿中に接種し、以下の培地、すなわち、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中でＨｅＬａ細胞を；ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中でＨＬＦ細胞を；ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ中で２９３Ａ細胞を；そして、最少必須培地（ＭＥＭ）、アールのＢＳＳ（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ＢＳＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社、Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＶＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ中でＨｅｐ３Ｂ細胞を、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞層が集密状態に達したときに、培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）で置換し、細胞層を３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で、約２４時間インキュベートした。その後、本発明の化合物（化合物Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＧもしくはＨ）またはビヒクル対照（０．５〜１％ＤＭＳＯ）を、既存の培地に添加し、インキュベーションを終夜で継続した。
【０１５１】
インキュベーションの後、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＩＧＥＰＡＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）中で氷上で１５分間、溶解した。細胞溶解液を４℃、３０００ｘｇで、５分間、遠心し、サイトゾル画分（上清）を収集した。核（ペレット）を再懸濁し、１００μｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、およびプロテアーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）中で溶解し、４℃、１３０００ｘｇで、５分間、遠心し、核タンパク質画分（上清）を収集した。
【０１５２】
タンパク質濃度に基づいて核分画を正規化し、４〜１２％のＴＧゲル上に添加し、還元状態下で分画した。タンパク質のＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）上への転写を５００ｍＡで１．５時間行った。膜のブロッキングをＴ−ＴＢＳ、２％ミルク中、室温で、１時間行い、Ｔ−ＴＢＳ、２％ミルクに１：２５０で希釈したマウス抗ヒトＨＩＦ−１α抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）と、終夜インキュベートした。ブロットは、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＷＥＳＴ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を用いて現像した。図８Ａに示すように、本発明の代表的化合物（化合物Ｄ）は、様々な細胞型においてＨＩＦαを安定化し、ＨＩＦαが細胞内に蓄積するのを可能にした。
【０１５３】
別法では、メーカーの指示に従って、核分画をＮｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用いて調製し、ＴＲＡＮＳＡＭ  ＨＩＦ−１  ＥＬＩＳＡキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社）を用いることで、ＨＩＦ−１αを分析した。図８Ｂに見られるように、本発明の様々な化合物（化合物Ｂ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）で処置した上皮細胞（２９３Ａ）および肝細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）が、ビヒクルで処置した対照細胞と比較して、ＨＩＦαの安定化および蓄積を示したことも明らかにする。
【０１５４】
本発明の方法に有用な化合物は、例えばＨＩＦ特異的なプロリルヒドロキシラーゼ活性をモジュレートする能力により同定することができる。ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性のモジュレーションは、ヒドロキシル化に共役した２−オキソ［１−１４Ｃ］グルタル酸の脱炭酸に基づいたアッセイを用いて同定することができる（Ｈｉｒｓｉｌａら（２００３年）、J．Biol．Chem.、第２７８巻、３０７７２〜３０７８０ページを参照）。この反応は、内在性ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼまたは組換え型ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを発現する細胞から得た可溶化した細胞抽出物、１０〜１００μＬの界面活性剤、例えばトリトン−Ｘ−１００など；例えばＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号１）などの基質ペプチド０．０５μｍｏｌ；０．００５μｍｏｌ ＦｅＳＯ４、０．１６ｍｍｏｌ ２−オキソ［１−１４Ｃ］グルタル酸、２μｍｏｌアスコルビン酸、６０μｇカタラーゼ、０．１μｍｏｌジチオトレイトール、および２５℃でｐＨ７．８に調整された５０μｍｏｌトリス−ＨＣｌ緩衝液を含有する１．０ｍｌの反応体積で行われる。酵素反応は、３７℃で２０分間行う。反応によって生成された１４ＣＯ２を、反応混合物上の雰囲気に懸垂した塩基含浸濾紙に捕捉し、シンチレーションカウンターで測定する。
【実施例１０】
【０１５５】
グルコースの取り込みおよび利用に関与する調節因子の発現
本発明の化合物および方法は、グルコース調節と厳密に協調的に脂肪代謝を調節するため、該化合物および方法がグルコース取り込みおよび代謝に及ぼす効果を分析した。ヒトＳＳＣ−２５（扁平上皮細胞癌）またはラットＨ９ｃ２（心室心筋細胞）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中、１０％ＣＯ２、３７℃において、１００ｍｍ培養皿中で集密状態に増殖させた。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ビヒクル対照、化合物Ｄ（１０および２５μＭ）、または化合物Ｃ（５、１０、および２０μＭ）と１６時間インキュベートした。プレートを氷上に置き、培養上清を除去し、溶解緩衝液１（ＬＢ−１：１０ｍＭトリスｐＨ７．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ＩＧＥＰＡＬ）を添加した。細胞を掻きとって採取し、氷上で１５分間インキュベートし、その後４℃、３０００ｘｇで、５分間、遠心した。サイトゾル画分である上清を回収し、サイトゾルタンパク質を、還元条件下で、１レーンあたりに添加するタンパク質を等量にして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離した。
【０１５６】
１５０Ｖで２時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、その後、タンパク質のＰＶＤＦ膜上への転写を、４℃、４００ｍＡで、１．５時間かけて行った。膜をブロッキング緩衝液中で、２時間、または終夜インキュベートし、Ｔ−ＴＢＳで１回洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液中に実効濃度に希釈した抗ＧｌｕＴ−１抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を添加した。穏やかに撹拌しながら、４℃で終夜インキュベートした後、膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中に希釈した複合化二次抗体と室温で１時間インキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、Ｘ線フィルムとＥＣＬ  ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＷＥＳＴ  ＰＩＣＯ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とをメーカーの指示に従って使用して、現像および可視化を行った。
【０１５７】
図９Ａは、グルコース取り込みを媒介する主要な誘導性グルコーストランスポーターであるＧｌｕＴ−１のタンパク質レベルが、化合物Ｄおよび化合物Ｃの両方によって、それぞれＳＣＣ−２５およびＨ９ｃ２細胞で増大したことを示す。これらの結果は、本発明の化合物および方法が、グルコースの取り込みに関与するタンパク質の発現を潜在的に増大するものであり、それゆえグルコース取り込みを増大する治療的手法を提供することを示した。
【０１５８】
グルコース調節に対する本方法および化合物のさらなる分析においては、ヒト２９３Ａ細胞を３５ｍｍ培養皿中に集密状態にまき、５％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中、３７℃、１０％ＣＯ２で１日間培養した。培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に変え、さらに１８から２４時間インキュベーションを続けた。その後、ビヒクル対照または化合物Ｂを培地に添加し、細胞をさらに２４時間、４８時間、または７２時間インキュベートした。プレートを氷上に置き、培養上清を除去し、溶解緩衝液１（ＬＢ−１：１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ＩＧＥＰＡＬ）を添加した。細胞溶解物を掻きとって採取し、サイトゾル画分を回収し、サイトゾルタンパク質を、前述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。分離後、タンパク質のＰＶＤＦ膜上への転写を、４℃、４００ｍＡで、１．５時間かけて行った。膜をブロッキング緩衝液中で、２時間、または終夜インキュベートし、Ｔ−ＴＢＳで１回洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液中に実効濃度に希釈した抗アルドラーゼ抗体を添加した。穏やかに撹拌しながら、４℃で終夜インキュベートした後、膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中に希釈した複合化二次抗体と室温で１時間インキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、Ｘ線フィルムとＥＣＬ  ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＷＥＳＴ  ＦＥＭＴＯまたはＰＩＣＯ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とをメーカーの指示に従って使用して、現像および可視化を行った。
【０１５９】
図９Ｂに見られるように、アルドラーゼ発現は、化合物Ｂで２４、４８、および７２時間、処置した細胞において時間の経過と共に増大し、一方、ビヒクル対照で処置した培養物はアルドラーゼ発現の増大を示さなかった。化合物Ｂで処置した培養物は、βチューブリン発現の増大を示さなかったが、これはアルドラーゼの増大が特異的であり、タンパク質発現の全般的な増大を伴っていないことを示すものである。
【０１６０】
これらの結果は、本発明の化合物および方法が、グルコース調節を改変することをさらに示し、本発明の化合物による処置が、脂肪およびグルコースホメオスタシスをモジュレートすることによりエネルギー生成における代謝シフトをもたらすことを示唆するものである。
【実施例１１】
【０１６１】
グルコース調節に関与する調節因子の発現増強
本化合物および方法がグルコース取り込みおよび利用をｉｎ  ｖｉｖｏで変化させることを実証するために、上記の実施例３にある通りに入手した試料をさらに分析して、解糖遺伝子の誘導パターンにおける経時的変化を特定した。図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示されるように、グルコース調節に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が、化合物Ｂによる処置の後で、協調的に増強された。図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示された転写産物パターンには、血小板型ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）−Ｐ（１）、肝臓型ＰＦＫ−Ｌ（２）、エノラーゼ−１（３）、グルコーストランスポーター（ＧｌｕＴ）−１（４）、乳酸デヒドロゲナーゼ−１（５）、アルドラーゼ−１（６）、およびヘキソキナーゼ−１（７）が含まれる。タイムコースでは、ほとんどのｍＲＮＡレベルが、化合物の投与後の早期にピークに達し、その後２４から４８時間後に対照レベルに戻った。さらに、解糖系酵素をコードする遺伝子の発現は、種々の器官相互で同様なものであったが、腎臓（図１０Ａ）、肝臓（図１０Ｂ）、および肺（図１０Ｃ）では、相対的な発現レベルにおける増大と、特定のｍＲＮＡの増大の持続時間との両方で相違を示した。これらの相違は、それぞれの組織において極めて重要なエネルギー供給源が、特にストレス時に、どの程度、解糖活性によって提供されるかの相違に一部関係する。これらの結果は、本発明の化合物が解糖作用を特異的に誘導すること、および、これらの作用には組織によって相違があることを示した。
【実施例１２】
【０１６２】
酸素消費の影響
脂肪およびグルコースからのエネルギー生産は、通常、酸化的呼吸によって起こる。しかし、低酸素条件下では、酸素濃度の低下を補うためにエネルギー利用がシフトする。通常、嫌気性解糖が増強され、脂肪酸酸化は酸素の利用可能性に基づいた範囲内で利用される。全体的に見て、正味のエネルギー需要を満たすための酸素需要量は減少するはずである。本発明の方法によってエネルギー利用を変化させた際、細胞酸素必要量が減少するかどうか判定するために、以下の実験を行った。ヒト２９３Ａ細胞およびＨｅＬａ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））を、別々に、高濃度グルコース（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社、Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＶＡ）および１％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中、３７℃、１０％ＣＯ２で集密状態になるまで増殖させた。細胞を収集し、培地で５００，０００細胞／ｍｌの密度に再懸濁し、０．２ｍｌの細胞懸濁液を９６ウェルＯｘｙｇｅｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）の各ウェルに添加した。Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｏｒプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は、酸素の非存在下でより強い蛍光を発するルテニウム錯体を含有している。したがって、蛍光の計測値は、プレート中の酸素を消費する細胞の存在によって増大する。細胞は、平衡をより低い酸素飽和量と、より強い蛍光との方向に変化させる。
【０１６３】
次の処置を、１０μｌの体積でウェルの３連セットに加えた。１）０．５％  ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）；２）２００μＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；酸素消費のない陽性対照として）；３）５、２５、または５０μＭの化合物Ｂ；４）１０、１００、または１０００μＭのデスフェリオキサミンメシラート（ＤＦＯ）、および５）培地のみ。プレートのバックグラウンド蛍光の適切な対照を提供するために、０．２ｍｌの培地のみ、または、１００ｍＭ  ＳＤＳを含んだ培地も、または細胞なしのウェルでインキュベートした。
【０１６４】
さらに７２時間培養をインキュベートし、その後、プレートの蛍光をＦＬ６００フルオリメーターで４８５ｎｍの励起波長と５９０ｎｍの発光波長において測定した（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ  ＶＴ）。データを蛍光の関数としてプロットし、Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ  ＷＡ）を用いて記述的統計的分析を行った。
【０１６５】
本発明の化合物で処置したＨｅＬａ細胞および２９３Ａ細胞の両方が、溶媒対照で処置した細胞と比較して、用量依存的な蛍光の低下を示し、酸素消費が減少したことを示した（図１１を参照）。細胞活性または生存率の低下は、細胞毒性を示唆するものであるが、ＷＳＴ−１比色分析アッセイ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて測定したところ、酸素消費の減少は、細胞活性または生存率の低下によるものではなかった。他の細胞型および実験終了点を用いた追加実験によっても、酸素消費の低下がこの化合物の細胞毒性に関連したものではなかったことを確認した。
【０１６６】
これらのデータは、本発明の化合物による処置が、様々な組織起源の細胞において、正味の酸素消費量を減少させる細胞代謝のシフトを引き起こすことを示す。
【実施例１３】
【０１６７】
血漿中トリグリセリドの短期的増大
実施例５の記載の通りにＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系ラットに処置を行い、試料を収集した。血液試料の分析は、６０、１００、および２００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを投与することによって、本発明の方法により血漿中トリグリセリドに有意な増大が生じることを示した。しかし、血漿中コレステロールにおける対応する増大は観測されなかった。したがって、このようなトリグリセリドの増大は、エネルギー需要に供給するための、脂肪貯蔵の利用に向かった代謝シフトによるもののようであった。さらに、酸素を必要とするクレブス回路の非存在下では、解糖のいかなる増大も、副産物としてトリグリセリドを生成する可能性がある。
【０１６８】
当業者には、本明細書に示されたものに加えて、本発明の様々な修正が、以上の記述から明らかになるであろう。そのような修正も、添付された特許請求項の範囲に包含されるものである。
【０１６９】
本明細書に引用された全引用文献を、全体として参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明の様々な化合物で処置した後における、ヒト細胞培養培地中のレプチンレベルを示す図である。図に示す細胞系は、前脂肪細胞、脂肪細胞、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、アデノウイルスで形質転換された胎児腎臓上皮細胞（２９３Ａ）、および子宮頸部上皮癌細胞（ＨｅＬａ）である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の化合物で処置した動物の肝臓における、脂肪代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の増大および分布を示す図である。図２Ａは、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アシルＣｏＡチオエステラーゼ、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−１を含めた様々な脂肪代謝遺伝子の発現を示す。図２Ｂはプラスミノーゲン活性化因子抑制因子（ＰＡＩ）−１遺伝子の発現を示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、脂肪酸およびトリグリセリドに対する細胞応答に関与する因子をコードする遺伝子の発現変化を示す。図３Ａは、本発明の化合物で処置した後におけるＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３発現の経時変化を示す。図３Ｂは、処置を行った後における、いくつかの組織でのＤＥＣ１／Ｓｔｒａ１３の発現増加を示す。図３Ｃは、本発明の化合物で処置した後におけるペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）−γの発現低下を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、様々な用量の本発明の化合物で処置した動物の体重および臓器重量における変化を示す図である。図４Ａは、本発明の化合物で処置した動物の体重増加の用量依存的遅延を示す。図４Ｂは、動物の体重減少が、筋肉、および／または、心臓などを例とする重要臓器の重量減によるものではないことを示す。
【図５】図５は、本発明の化合物で処置した動物における内臓脂肪の用量依存的減少を示す。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、食餌誘発性肥満の動物モデルにおける、本発明の化合物で処置した際の体重増加の低減および腹部脂肪体重量増加の低減を示す図である。
【図７】図７は、本発明の化合物で処置した糖尿病動物モデルにおける血清トリグリセリドレベルの低減を示す図である。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、本発明の化合物で処置した細胞における、用量依存的なＨＩＦ−１αの安定化を示す図である。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、本発明の化合物で処置した細胞における、グルコーストランスポーター−１（ＧｌｕＴ−１）およびアルドラーゼの誘導を示す図である。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、本発明の化合物で処置した動物の腎臓、肝臓、および肺における、グルコース調節に関与する遺伝子の発現の増大を示す図である。
【図１１】図１１は、化合物で処置した子宮頸部腺癌細胞（ＨｅＬａ）および形質転換された胎児腎臓細胞（２９３Ａ）における、酸素消費の用量反応を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006514113.tif 000008
【図７】
2006514113.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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