(57)【要約】液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のための方法が開示され、当該方法は、一体の分離トレー（該分離トレーは、別個の同一の直立チャンバーを間隔を置いて配置したアレイと、各直立チャンバーの少なくとも一部に配置された分離媒体とを有し、各直立チャンバーは、開放上方端部と開放下方端部とを示す）を提供すること；該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放上方端部に液体サンプルを適用すること；次いで、該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放上方端部に溶出液体を適用すること；及び該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放下方端部から流出する少なくとも１つの生成物分画を集めること；を含み、ここで、該分離媒体として圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスが使用され、該モノリスは、液体で膨潤した非圧縮状態で、該モノリスが配置されている該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有し、かつ、液体で膨潤した状態でそれぞれのチャンバーの壁と直接的に接触している。このような方法において使用されるモノリスの製造方法及び該方法において使用するための分離デバイスもまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のための方法であって、
一体の分離トレーを提供することを含み、ここで、該分離トレーは、別個の同一の直立チャンバーを間隔を置いて配置したアレイと、各直立チャンバーの少なくとも一部に配置された分離媒体とを有し、各直立チャンバーは、開放上方端部と開放下方端部とを示す；
該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放上方端部に液体サンプルを適用することを含み；
次いで、該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放上方端部に溶出液体を適用することを含み；及び
該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放下方端部から流出する少なくとも１つの生成物分画を集めることを含み；
ここで、該分離媒体として圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスが使用され、該モノリスが、液体で膨潤した非圧縮状態で、該モノリスが配置されている該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有し、かつ、液体で膨潤した状態でそれぞれのチャンバーの壁と直接的に接触している、
方法。
【請求項２】
圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスが、以下からなる群から選択される１つ以上のモノマーの溶液を重合することによって得られるクライオゲルである、請求項１に記載の方法：
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
スチレン及び環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
溶媒の結晶化点よりも低い温度での凍結下重縮合によりポリマーを形成することができるモノマー、ここで、該温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結し、クライオゲルが形成される。
【請求項３】
圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスが、ポリビニルアルコールの水溶液、あるいはアガロース、寒天、カラギーナン、澱粉及びセルロース、及びそれらのそれぞれの誘導体又はこれら多糖の混合物からなる群から選択される少なくとも１つのゲル形成多糖の水溶液を、系中の溶媒が溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結し、クライオゲルが形成される温度まで冷却することによって得られるクライオゲルであり、該冷却が、必要であれば、該水溶液中で少なくとも１つのカオトロピック剤の存在下で行われ、ポリマー溶液が凍結される前のゲル形成を防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリマー及び多糖がそれぞれ架橋されている、請求項２及び３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポリマー及び多糖がそれぞれ、リガンド、荷電基及び疎水基からなる群から選択されるメンバーをそれに導入することによって修飾されている、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
モノリスが、クライオゲルのシートを丸めること又は折り畳むことによって形成されている、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスが、
ダブルエマルジョン系でのゲル形成；
ポリマー溶液の凍結乾燥；
ポロゲンとして使用される粒状物質の、予め形成されたポリマーモノリスからの濾過；
ゲル形成が泡中で進行する場合、ポロゲンとして気泡の使用；及び
ポリマー粒子又は繊維（不織材料）の凝集；
からなる群から選択される方法によって製造されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のための方法において使用するための分離デバイスであって、当該分離デバイスが、別個の同一の直立チャンバーを間隔を置いて配置したアレイと、各直立チャンバーの少なくとも一部に配置された分離媒体とを有する一体の分離トレーを有し、各チャンバーが、開放上方端部と開放下方端部とを示し、ここで、該分離媒体が、圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスを含み、該モノリスが、液体で膨潤した非圧縮状態で、該モノリスが配置されている該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有し、かつ、液体で膨潤した状態でそれぞれのチャンバーの壁と直接的に接触している、分離デバイス。
【請求項９】
モノリスが請求項２〜７のいずれかに記載のものである、請求項８に記載の分離デバイス。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法において使用するための分離媒体の製造方法であって、当該方法が、
ａ）剛性材料の鋳型を提供することを含み、ここで、該鋳型は、それを貫通する複数の孔を有し、該孔は、製造される分離媒体が使用されるべき分離トレーの直立チャンバーの断面形状に適合した断面形状を有するが、該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有する；
ｂ）不浸透性の取り外し可能プレートによって、該鋳型の孔をその底部で密封することを含み；
ｃ）クライオゲルが製造されうる物質の溶液を該鋳型の孔に導入することを含み；
ｄ）溶媒の結晶化点よりも低い温度で、該鋳型をその孔内の該溶液と共に冷却し、クライオゲルモノリスを形成することを含み、ここで、該温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結する；
ｅ）該鋳型をその中に含まれる該クライオゲルモノリスと共に解凍することを含み；
ｆ）開口部を有するネットで該不浸透性の取り外し可能プレートを置き換えることを含み、ここで、該開口部は、そこを通過する液体の自由な流れを可能とするのに十分に大きいが、形成されたクライオゲルモノリスがそこを通過するのを防止するのに十分に小さい；
ｇ）適切な洗浄媒体を用いて該モノリスを洗浄することを含み；及び
ｈ）該鋳型から該モノリスを取り出すことを含む；
方法。
【請求項１１】
工程ｅ）とｆ）とを逆の順序で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｃ）で使用する溶液が、
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
スチレン及び環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成することができるモノマー；
からなる群から選択される１つ以上のモノマーの溶液である、請求項１０及び１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）で使用する溶液が、ポリビニルアルコールの水溶液、あるいはアガロース、寒天、カラギーナン、澱粉及びセルロース、及びそれらのそれぞれの誘導体又はこれら多糖の混合物からなる群から選択される少なくとも１つのゲル形成多糖の水溶液であり、必要であれば、該水溶液中で少なくとも１つのカオトロピック剤が存在し、ポリマー溶液が凍結される前のゲル形成を防止する、請求項１０及び１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
クライオゲルモノリスが、工程ｈ）の前に１つ以上の化学修飾に供される、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
クライオゲルモノリスが架橋反応に供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クライオゲルモノリスが、リガンド、荷電基及び疎水基からなる群から選択されるメンバーをそれに導入することによって修飾される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法において使用するための分離媒体の製造方法であって、当該方法が、
ａ）細長い管状の鋳型を提供することを含み、ここで、該鋳型は、閉鎖端部を有し、かつ、製造される分離媒体が使用されるべき分離トレーの直立チャンバーの断面形状に適合した断面形状を有するが、該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有する；
ｂ）クライオゲルが製造されうる物質の溶液を該鋳型に導入することを含み；
ｃ）溶媒の結晶化点よりも低い温度で、該鋳型をその中の該溶液と共に冷却し、クライオゲルモノリスを形成することを含み、ここで、該温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結する；
ｄ）該鋳型をその中に含まれる該クライオゲルモノリスと共に解凍することを含み；
ｅ）該鋳型の閉鎖端部を除去することを含み；
ｆ）適切な洗浄媒体を該鋳型に通すことによって該モノリスを洗浄することを含み；
ｇ）該鋳型から該モノリスを取り出すことを含み；及び
ｈ）分離トレーの直立チャンバーにおいて使用するのに適したサイズのピースに該モノリスを切断することを含む；
方法。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法において使用するための分離媒体の製造方法であって、当該方法が、
ａ）クライオゲルが製造されうる物質の溶液を、該溶液の溶質に対して非溶媒である冷たい有機媒体中に直接押し出し、ここでゲル形成が起こり、ほぼ均一な断面の連続糸を形成すること；及び
ｂ）分離トレーの直立チャンバーにおいて使用するのに適したサイズのピースに該糸を切断すること；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー分離方法、分離デバイス、及びそこで使用するための分離媒体の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のためのデバイス及び方法、並びに当該方法で使用される分離媒体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体サンプルに含まれる物質を、分離媒体が配置されている分離カラムに該サンプルを適用し、該カラムから１つ以上の生成物分画を溶出することによってクロマトグラフィー分離することは、周知の先行技術に属する。
【０００３】
伝統的に、物質のクロマトグラフィー分離および単離は、１つの同じクロマトグラフィーカラムへのサンプルの順次適用によってなされてきた。しかし、特に医薬研究において、多数のサンプルの分析に対して大きな要求がある。複数のサンプルの並行クロマトグラフィー処理を容易にするために、１９９５年５月２３日発行のＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３は、コレクショントレーと係合して重層関係で搭載された一体の試験トレーを含むアッセイトレーアセンブリの使用を示唆し、該アッセイトレーは、チャンバーの形態の複数の分離「カラム」を含み、該チャンバーには分離媒体が配置されていた。ＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３の図１は、９６個のチャンバー、すなわち８列に配置されたカラム（各列に１２個のチャンバーを有する）からなるアッセイトレーを示す。コレクショントレーは、相互混合又は交差汚染無しにチャンバー（カラム）溶出液をウエルへ直接移動させることを可能とするように配置された９６ウエルを示す。
【０００４】
チャンバー内のクロマトグラフィー媒体は、下と上のフリット（それぞれ図３のアイテム３１と３２）の間に保持され、通常多孔性である。下のフリット３１は、各チャンバーの底端部で環状フランジ８によって所定の場所に保持され、それによってチャンバー３内にショルダーを提供する。試験中の液体は、通常、所定容積がピペットで量り取られてカラムに入れられる。液体クロマトグラフィーでは、カラムの排液はクロマトグラフィー性能に有害であるので、クロマトグラフィーカラムは常に液体で満たされるべきである。非制御のカラム排液を防止するために、カラムを通る液体の流れは、いくらかの背圧（溶出液が集められる際に解放される）をかけるか、または多孔性を有するフリット（これは、毛管力によってカラム内に液体を保つことを可能とする）を用いるかのいずれかによって制御される。後者の場合、溶出液は、カラムの上方又は下方に人工的な圧力ドロップを作り出すことによって、又は液体を遠心力によってカラムを通して押し出すことによって集められる。
【０００５】
Ｃ．ＧｏｔｔｓｔｅｉｎおよびＲ．Ｆｏｒｄｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１０，ｐｐ  ７７５−７７７，２００２）は、組換え蛋白質サンプルの並行精製のためのアフィニティクロマトグラフィーシステムを開示しており、該システムでは、複数のアフィニティカラム（７）が、共通のプレートの孔に搭載されており、液体は、シリンジ（６）（各カラムに１つ）によってカラムに提供され、流出流れはチューブ（８）に集められる。カラム（７）は、アフィニティ樹脂で満たされる。このシステムは、並行して２４種の組換え蛋白質の精製を可能とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のための方法を提供することであり、当該方法は、複数のサンプルの並行した分析について上記で開示した先行技術のシステムよりも複雑でないシステムを用いることによって実施することができる。
【０００７】
本発明の別の目的は、複数のサンプルの並行した分析のための物質のクロマトグラフィー分離の方法において使用するための分離媒体の製造方法を提供することであり、当該分離媒体は、上記先行技術によって開示された装置よりも複雑でない装置の使用を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらのおよび他の目的は、本発明によって達成される。
【０００９】
発明の開示
本発明の１局面によれば、液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のための方法が提供され、当該方法は、
一体の分離トレー（該分離トレーは、別個の同一の直立チャンバーを間隔を置いて配置したアレイと、各直立チャンバーの少なくとも一部に配置された分離媒体とを有し、各直立チャンバーは、開放上方端部と開放下方端部とを示す）を提供すること；
該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放上方端部に液体サンプルを適用すること；
次いで、該直立チャンバーの少なくとも１つの該開放上方端部に溶出液体を適用すること；及び
該直立チャンバーの少なくとも１つの開放下方端部から流出する少なくとも１つの生成物分画を集めること；
を含み、
ここで、該分離媒体として圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスが使用され、該モノリスは、液体で膨潤した非圧縮状態で、該モノリスが配置されている該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有し、かつ、液体で膨潤した状態でそれぞれのチャンバーの壁と直接的に接触している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のこの局面の１実施態様によれば、本発明の方法は、ＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３（その開示は、本明細書中で参考として援用される）によって開示されるような、コレクショントレーと係合して重層関係で取り外し可能に搭載された一体の試験トレーを含むアッセイトレーアセンブリを使用して行いうるが、しかし、下と上のフリット（それぞれ３１と３２）を有する分離媒体は、上記の圧縮性マクロポーラスゲルのロッド形状のモノリスによって置き換えられる。
【００１１】
本発明に従って、分離媒体として、液体で膨潤した非圧縮状態で、先行技術の試験トレーのチャンバー３の下方部分６の断面積よりもやや大きい、例えば２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有する圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスを使用することによって、環状フランジ８を省略することができる。なぜなら、モノリスは、圧縮されたゲルモノリスと分離チャンバーの内壁との間の摩擦によって所定の場所に保持されるであろうからである。従って、アッセイトレーの構成は単純化される。更に、分離チャンバーの下方端部から流出する液体の流量範囲に制限は無い。
【００１２】
本発明の方法で使用される分離媒体によって与えられる更なる利点は、モノリスの多孔性が、毛管力によって液体がモノリス内に保持されるのを可能とし、それによって、分離媒体が「乾燥する」のを防止することである。
【００１３】
ＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３は、各チャンバーが円錐形の頂部開口部と円筒形の下方部分とを有して形成されることを開示する。このような形状に加えて、本発明は、その長さにそってほぼ一定の断面積を有するチャンバーの使用を意図する。その長さに沿って変化の無い断面積を有するチャンバーの形状は、分離トレーの製造をかなり簡単にする。更に、各チャンバーの円形断面は好適なものではあるが、液体で膨潤した状態で、チャンバー（この中にゲルモノリスが配置されている）の壁との直接的な接触が得られるように、ゲルモノリスの断面が適合されているならば、本発明に従って任意の不定の断面形状が意図され得る。従って、チャンバーとモノリスの断面は、例えば、三角形、正方形、長方形、楕円、五角形、六角形などであってもよく、不規則な形状を示すことさえありうる。
【００１４】
ＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３は、チャンバーの下方部分の一部のみを占める分離媒体を開示するが、それに加えて、本発明は、チャンバーの下方円筒（又は他の断面形状）部分を完全に占めるモノリス、または、その長さに沿って一定の断面積を有するチャンバーの場合、チャンバー全体を完全に占めるモノリスでさえ、意図する。
【００１５】
例えば、直立チャンバーの開放下方端部で、ネットなどの支持手段を適用する必要性を避けるために、モノリスは、チャンバーの長手軸方向のその長さとその断面寸法との間の比が臨界値（この値を下回ると、モノリスが曲げられてチャンバー壁との直接的な接触が失われ得る）を超えるような比を示すべきである。従って、例えば、円筒形モノリスおよびチャンバーの場合、モノリスの長さは、好ましくは、モノリスの直径の５０％、より好ましくは６０％、最も好ましくは７０％を超えるべきである。
【００１６】
本発明の方法で使用される圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスは、種々の重合系から製造することができる。
【００１７】
従って、本発明の方法の１つの好適な実施態様によれば、圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスは、以下からなる群から選択される１つ以上のモノマーの溶液を重合することによって得られるクライオゲルである：
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
スチレン及び環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
溶媒の結晶化点よりも低い温度（この温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結し、クライオゲルが形成される）での凍結下重縮合によりポリマーを形成することができるモノマー。
【００１８】
このようなクライオゲルとその製造の詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５６（ＷＯ０３／      ）に記載され、その開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００１９】
クライオゲルを製造する際に使用される溶媒又は溶媒系は、水、水混和性有機溶媒、水と水混和性有機溶媒との混合物、及び有機溶媒の混合物からなる群から選択されうるが、好ましくは、水、又は水と水混和性有機溶媒との混合物が、上記群の水溶性モノマーと組み合せて、溶媒として使用される。
【００２０】
本発明の方法の別の好適な実施態様によれば、圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスは、ポリビニルアルコールの水溶液、あるいはアガロース、寒天、カラギーナン、澱粉及びセルロース、及びそれらのそれぞれの誘導体又はこれら多糖の混合物からなる群から選択される少なくとも１つのゲル形成多糖の水溶液を、系中の溶媒が溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結し、クライオゲルが形成される温度まで冷却することによって得られるクライオゲルであり、該冷却は、必要であれば、該水溶液中で少なくとも１つのカオトロピック剤の存在下で行われ、ポリマー溶液が凍結される前のゲル形成を防止する。
【００２１】
このようなクライオゲルとその製造の詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５７（ＷＯ０３／      ）に記載され、その開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２２】
成形によるモノリスの製造に加えて、本発明の方法で使用されるモノリスは、クライオゲルのシートを丸めることまたは折り畳むことによって形成されうる。
【００２３】
更に、本発明の方法では、ここで使用されるモノリスは、ダブルエマルジョン系でのゲル形成；ポリマー溶液の凍結乾燥；ポロゲンとして使用される粒状物質の、予め形成されたポリマーモノリスからの濾過；ゲル形成が泡中で進行する場合、ポロゲンとして気泡の使用；及び、ポリマー粒子又は繊維（不織材料）の凝集；からなる群から選択される方法によって製造から製造されてもよい。
【００２４】
上記マクロポーラスゲルの製造方法に加えて、マクロポーラス圧縮性ゲルを生じる、他の現存する方法又は将来開示される方法は、原則として、本発明の方法において使用するためのモノリスの製造に使用され得る。
【００２５】
上記の好適な実施態様のシステムを用いて製造されるマクロポーラスクライオゲルは、ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５６（ＷＯ０３／      ）及びＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５７（ＷＯ０３／      ）に開示のように異なる方法で修飾され得る。
【００２６】
従って、例えば、モノマーから製造されるクライオゲル、並びに多糖又はポリビニルアルコールに基くクライオゲルは、例えば、前者の場合には、アルキレンジアミン、グルタルアルデヒド、ジ−及びトリグリシジル化合物およびジビニルスルホン、後者の場合には、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、グルタルジアルデヒド、アジドベンゾイルヒドラジド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸塩、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、３−（２−ピリジル−ジチオ）−プロピノイルヒドラジド、ジメチルアジピミデート−２ＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロ−フェニルアミノ）ヘキサノエートおよびスルホスクシンイミジル−（４’−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート、ジ−及びトリグリシジル化合物からなる群から選択される架橋剤によって架橋されるようになってもよい。
【００２７】
あるいは、又は、それに加えて、クライオゲルは、リガンド、荷電基及び疎水基からなる群から選択されるメンバーをそれに導入することによって修飾されてもよい。
【００２８】
本発明の別の局面に従って、液体サンプルに含まれる物質のクロマトグラフィー分離のための本発明の方法において使用するための分離デバイスが提供され、当該分離デバイスは、別個の同一の直立チャンバーを間隔を置いて配置したアレイと、各直立チャンバーの少なくとも一部に配置された分離媒体とを有する一体の分離トレーを有し、各チャンバーは、開放上方端部と開放下方端部とを示し、ここで、該分離媒体は、圧縮性マクロポーラスゲルのモノリスを含み、該モノリスは、液体で膨潤した非圧縮状態で、該モノリスが配置されている該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有し、かつ、液体で膨潤した状態でそれぞれのチャンバーの壁と直接的に接触している。
【００２９】
最も単純な実施態様では、一体の分離トレーは、金属又はポリマーなどの剛性で不活性な材料のプレートを含み、分離媒体を収容する直立チャンバーをその中に形成する複数の円筒形孔を備える。
【００３０】
一体の分離トレーの他の可能な実施態様は、上記本発明の方法の説明から明白であるはずである。
【００３１】
本発明の分離デバイスで使用されるモノリスの詳細な説明は、本発明の方法に関連して上記で見出され、及び本発明の方法で使用される分離媒体の製造方法と関連して下記で見出される。
【００３２】
本発明の更なる局面に従って、本発明の方法で使用するための分離媒体の製造方法が提供され、当該方法は、
ａ）剛性材料の鋳型（該鋳型は、それを貫通する複数の孔を有し、該孔は、製造される分離媒体が使用されるべき分離トレーの直立チャンバーの断面形状に適合した断面形状を有するが、該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有する）を提供すること；
ｂ）不浸透性の取り外し可能プレートによって、該鋳型の孔をその底部で密封すること；
ｃ）クライオゲルが製造されうる物質の溶液を該鋳型の孔に導入すること；
ｄ）溶媒の結晶化点よりも低い温度（この温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結する）で、該鋳型をその孔内の該溶液と共に冷却し、クライオゲルモノリスを形成すること；
ｅ）該鋳型をその中に含まれる該クライオゲルモノリスと共に解凍すること；
ｆ）開口部を有するネット（該開口部は、そこを通過する液体の自由な流れを可能とするのに十分に大きいが、形成されたクライオゲルモノリスがそこを通過するのを防止するのに十分に小さい）で該不浸透性の取り外し可能プレートを置き換えること；
ｇ）適切な洗浄媒体を用いて該モノリスを洗浄すること；及び
ｈ）該鋳型から該モノリスを取り出すこと；
を含む。
【００３３】
この方法の代替では、工程ｅ）とｆ）とを逆の順序で行ってもよい。
【００３４】
本明細書および請求の範囲で使用される句「直立チャンバーの断面形状に適合した断面形状を有する孔」は、例えば、以下を意味すべきである：直立チャンバーが円筒形状である場合、鋳型の孔もまた円筒形であるが、やや広い直径を有し、直立チャンバーの断面積よりもやや大きい断面積が得られる。同様に、直立チャンバーの三角形断面の場合、鋳型の孔もまた、直立チャンバーの角度と同一の角度を有する三角形断面であるが、やや長い辺を有する。
【００３５】
上記のように、鋳型の孔および分離トレーの直立チャンバーの断面形状に特別の制限は無い。しかし、実用的な観点からは、円形断面が好ましい。
【００３６】
本発明の方法の工程ｃ）で使用する溶液は、クライオゲルの製造において以前に使用された任意の溶液でありうる。
【００３７】
本発明の方法の１つの好適な実施態様によれば、工程ｃ）で使用する溶液は、以下からなる群から選択される１つ以上のモノマーの溶液である：
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
スチレン及び環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
溶媒の結晶化点よりも低い温度（この温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結し、クライオゲルが形成される）での凍結下重縮合によりポリマーを形成することができるモノマー。
【００３８】
このようなクライオゲルとその製造の詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５６（ＷＯ０３／      ）に記載され、その開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００３９】
クライオゲルを製造する際に使用される溶媒又は溶媒系は、水、水混和性有機溶媒、水と水混和性有機溶媒との混合物、及び有機溶媒の混合物からなる群から選択されうるが、好ましくは、水、又は水と水混和性有機溶媒との混合物が、上記群の水溶性モノマーと組み合せて、溶媒として使用される。
【００４０】
本発明の方法の別の好適な実施態様によれば、工程ｃ）で使用する溶液は、ポリビニルアルコールの水溶液、あるいはアガロース、寒天、カラギーナン、澱粉及びセルロース、及びそれらのそれぞれの誘導体又はこれら多糖の混合物からなる群から選択される少なくとも１つのゲル形成多糖の水溶液を、系中の溶媒が溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結し、クライオゲルが形成される温度まで冷却することによって得られるポリビニルアルコールの水溶液または少なくとも１つのゲル形成多糖の水溶液であり、該冷却は、必要であれば、該水溶液中で少なくとも１つのカオトロピック剤の存在下で行われ、ポリマー溶液が凍結される前のゲル形成を防止する。
【００４１】
このようなクライオゲルとその製造の詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５７（ＷＯ０３／      ）に記載され、その開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００４２】
本発明の方法の修飾によれば、例えば、ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５６（ＷＯ０３／      ）及びＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５７（ＷＯ０３／      ）に開示のように、形成されたクライオゲルモノリスは、工程ｈ）の前に１つ以上の化学修飾に供されうる。
【００４３】
従って、例えば、モノマーから製造されるクライオゲル、並びに多糖又はポリビニルアルコールに基くクライオゲルは、例えば、前者の場合には、アルキレンジアミン、グルタルアルデヒド、ジ−及びトリグリシジル化合物およびジビニルスルホン、後者の場合には、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、グルタルジアルデヒド、アジドベンゾイルヒドラジド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸塩、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、３−（２−ピリジル−ジチオ）−プロピノイルヒドラジド、ジメチルアジピミデート−２ＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロ−フェニルアミノ）ヘキサノエートおよびスルホスクシンイミジル−（４’−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート、ジ−及びトリグリシジル化合物からなる群から選択される架橋剤との反応によって、架橋反応に供されてもよい。
【００４４】
あるいは、又は、それに加えて、クライオゲルモノリスは、リガンド、荷電基及び疎水基からなる群から選択されるメンバーをそれに導入することによって修飾されうる。
【００４５】
本発明に従って製造されるクライオゲルモノリスに導入されうるリガンドの例は、ペプチド、金属キレート、糖誘導体、ボロネート誘導体、酵素基質およびそれらのアナログ、酵素阻害剤およびそれらのアナログ、蛋白質阻害剤、抗体およびそのフラグメント、コンビナトリアル化学により得られるリガンド構造物、及びチオール含有物質である。
【００４６】
本発明に従って製造されるクライオゲルモノリスに導入されうる荷電基の例は、イオン交換基である。
【００４７】
本発明によれば、本発明の方法において使用するための分離媒体の別の製造方法もまた提供され、当該方法は、
ａ）細長い管状の鋳型（該鋳型は、閉鎖端部を有し、かつ、製造される分離媒体が使用されるべき分離トレーの直立チャンバーの断面形状に適合した断面形状を有するが、該直立チャンバーの断面積よりも２−１５％、好ましくは４−１２％、最も好ましくは５−１０％大きい断面積を有する）を提供すること；
ｂ）クライオゲルが製造されうる物質の溶液を該鋳型に導入すること；
ｃ）溶媒の結晶化点よりも低い温度（この温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結分画で濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結する）で、該鋳型をその中の該溶液と共に冷却し、クライオゲルモノリスを形成すること；
ｄ）該鋳型をその中に含まれる該クライオゲルモノリスと共に解凍すること；
ｅ）該鋳型の閉鎖端部を除去すること；
ｆ）適切な洗浄媒体を該鋳型に通すことによって該モノリスを洗浄すること；
ｇ）該鋳型から該モノリスを取り出すこと；及び
ｈ）分離トレーの直立チャンバーにおいて使用するのに適したサイズのピースに該モノリスを切断すること；
を含む。
【００４８】
この代替の方法で使用される溶液は、上記方法に関連して既に記載したものであり得、製造されたクライオゲルへの修飾はまた、上記のように行うことができる。
【００４９】
本発明によれば、本発明の方法において使用するための分離媒体の更なる代替の製造方法もまた提供され、当該方法は、
ａ）クライオゲルが製造されうる物質の溶液を、該溶液の溶質に対して非溶媒である冷たい有機媒体中に直接押し出し、ここでゲル形成が起こり、ほぼ均一な断面の連続糸を形成すること；及び
ｂ）分離トレーの直立チャンバーにおいて使用するのに適したサイズのピースに該糸を切断すること；
を含む。
【００５０】
本発明の方法に従って製造したクライオゲルモノリスは、液体で膨潤した状態又は乾燥状態のいずれかで、分離トレーの各直立チャンバーに少なくとも１つ挿入されうる。乾燥モノリスを挿入する場合、分離トレーの下に取り外し可能ネット又はフィルムを一時的に使用することは、所定の位置にモノリスを保持するために有利に適用され得る。ネット又はフィルムは取り外され、クライオゲルは、分離トレーの使用前に、直立チャンバー内部で浸漬される。
【００５１】
本発明の方法は、上記のように、ＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３によって開示されるようなアッセイトレーアセンブリを用いて、そして、好ましくは上記のように改変された試験トレーと共に、実施することができる。コレクショントレーはまた、請求の範囲で規定した本発明の範囲から逸脱せずに、ＵＳ−Ａ−５  ４１７  ９２３に開示されたものと比較して改変されうる。従って、例えば、分離トレーの直立チャンバーに対応する数および相互関係（場所）のウエルを有する通常のミクロタイタープレートは、コレクショントレーとして使用することができる。分離トレーの直立チャンバーの数と、コレクショントレーのウエルの数とは、ミクロタイタープレートで通常使用されるものの１つ、例えば、４８、９６、１９２、又は３８４ウエルでありうる。
【実施例】
【００５２】
今、本発明を幾つかの実施例によって説明する。これら実施例は、例示目的のみのためであり、限定として意図されない。
【００５３】
実施例１．クライオゲルモノリスおよび分離トレーの製造
ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ；酸化アルミニウムカラム上で安定化剤から精製した１．８５ｍｌ）およびＮ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（ＭＢＡＡｍ；０．６６３ｇ）を脱イオン水４０ｍｌに溶解した。次いで、０．２４３ｍｌのアリルグリシジルエステル（ＡＧＥ）を、連続的に撹拌しながら混合物に加え、体積を脱イオン水で５０ｍｌに調整した。混合物を真空下で１０−１５分間脱気し、溶解酸素を除去した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−メチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）によってフリーラジカル重合を開始した。ＴＥＭＥＤ（３１．２５μｌ）の添加後、溶液を氷浴で１５分間冷却した。新たに調製したＡＰＳの溶液を加え（反応混合物中のＡＰＳの最終量２６．３ｍｇ）、混合物を１分間温和に撹拌した。次いで、反応混合物０．５ｍｌを、９６のウエルを有する金属ミクロタイタープレート鋳型の各ウエル（直径７．１ｍｍ）に非常に素早く加えた（マルチチャンネルピペットを用いて鋳型を充填するために用いたピペットチップ及び鋳型を、充填前に−１２℃に冷却した）。金属プレートは９６個の円筒孔を有し、この孔は、７．１ｍｍの直径を有し、その材料を貫通して開けられている。プレートは、その底部を密閉する金属プレート上に配置され、それによって、溶液を充填すると、それは孔の底部に留まり、そこでゲルが形成される。ミクロタイタープレート鋳型中の溶液は、ＡＲＣＴＥＳＴ冷却チャンバー中、−１２℃で１０分以内に凍結した。サンプルを凍結したまま−１２℃で一晩保持し、次いで室温で解凍した。鋳型をその底部で密封する金属プレートは、ワイアネットで置き換えた。次いで、各ウエルに脱イオン水１０ｍｌを通過させることによって、クライオゲルマトリックスを洗浄した。次いで、クライオゲルを、金属９６ウエル鋳型からクロマトグラフィー適用のために開発したプラスチックミクロタイタープレート（９６個の底無しの丸いウエルを有するミクロタイタープレート、ウエル体積１．５ｍｌ、ウエル直径６．９ｍｍ）に移した。各ウエルは、モノリスで充填後、モノリスの上方に約１ｍｌのデッドボリュームを有する。そのウエルにモノリスが含まれたミクロタイタープレートは、本発明の方法において使用するための分離トレーを構成する。
【００５４】
実施例２．分離トレー中でのクライオゲルモノリスへのＣｕ２＋  ＩＤＡリガンドのカップリング
実施例１で開示した分離トレーのクライオゲルモノリス（０．５ｍｌ）を詰めた各ウエルに、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液４ｍｌを通した。次いで、各ウエルを、１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．０中の０．５Ｍ  ＩＤＡで平衡化させた。最終的に、クライオゲルモノリスを有するミクロプレートを、４００ｍｌの１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．０中の０．５Ｍ  ＩＤＡを含む容器に配置し、室温で温和に振盪しながら一晩インキュベートした。ミクロプレート中の修飾クライオゲルは、ｐＨが中性になるまで、水で洗浄した。各ウエルに２ｍｌの０．５Ｍ  ＣｕＳ０４（蒸留水に溶解）を通すことによって、ＩＤＡ−クライオゲルにＣｕ２＋を結合させた。最終的に、各ウエルを水で洗浄し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０で平衡化した。
【００５５】
実施例３．Ｃｕ２＋−ＩＤＡクライオゲル分離トレーでのリゾチームのクロマトグラフィー
０．５ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶解した異なる量のリゾチーム（２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００及び２５０μｇ）を、実施例２で開示したように調製した分離トレーの異なるウエル中のＣｕ２＋  ＩＤＡクライオゲルに適用した。モノリスは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０（ランニング緩衝液）で予め平衡化させた。吸着段階後、各分析ウエルをランニング緩衝液２ｍｌで洗浄した。結合したリゾチームは、ランニング緩衝液中の０．２Ｍイミダゾール２．５ｍｌで溶出した。各リゾチーム濃度を有するクロマトグラフィーは、５つの無作為に選択したウエルで行った（表１）。異なるウエル間の平均偏差は６−８％であった。
【００５６】
【表１】
2006522334.tif 000002
【００５７】
２５μｇのリゾチームを無作為に選択したウエル上に適用した場合のリゾチーム回収の動力学を、表２に示す。
【００５８】
【表２】
2006522334.tif 000003
【００５９】
実施例４．モノリス分離トレーを用いる、粗ホモジネートからの乳酸脱水素酵素の直接的な定量
ヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ付き乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞ホモジネートの異なる量を、０．２Ｍ  ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．３（緩衝液Ａ）で平衡化した実施例２の分離トレーの異なるウエル（０．５ｍｌ）中のＣｕ２＋  ＩＤＡクライオゲルモノリスに適用した。５分間のインキュベーション後、ウエルを同緩衝液で洗浄し、未結合蛋白質と細胞残渣を取り除いた。次いで、反応混合物（０．４５ｍＭ  ＮＡＤＨ及び２．０ｍＭピルベートを含む０．５ｍｌの緩衝液Ａ）を加え、２分間ウエル内でインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を、０．５ｍｌの緩衝液Ａを加えることによってウエルから「押し出し」、３４０ｎｍでの吸光度を測定することによって分析した。対照実験では、細胞ホモジネートの代わりに緩衝液Ａを用いた。ΔＡ３４０は、対照ウエルおよびホモジネート負荷ウエルからの反応混合物において得られた３４０ｎｍでの吸光度の値の間の差である。各ホモジネート負荷は、５個の異なる無作為に選択したウエルについて分析した。ΔＡ３４０は適用したホモジネートの量の増加と共に増加し、これによって、サンプルに存在するＬＤＨ量の直接的な概算が可能となった。実験の平均偏差は７．５％であった。
【００６０】
実施例５．ポリビニルアルコールからのモノリスクライオゲル（モノリスクライオＰＶＡ）及び分離トレーの製造
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、分子量６７０００、加水分解度８７．７％）の水溶液（５％ｗ／ｖ）を調製し、ｐＨを、５Ｍ  ＨＣｌで１．０に調整した。溶液を氷浴で１０分間冷却した。架橋剤のグルタルアルデヒド（０．５％ｗ／ｖ）を加え、反応混合物を１分間撹拌した。次いで、溶液０．５ｍｌを、９６個のウエルを有する金属ミクロタイタープレート鋳型の各ウエル（直径７．１ｍｍ）に非常に素早く加えた（マルチチャンネルピペットを用いて鋳型を充填するために用いたピペットチップ及び鋳型を、充填前に−１５℃に冷却した）。金属プレートは９６個の円筒孔を有し、この孔は、７．１ｍｍの直径を有し、その材料を貫通して開けられている。プレートは、その底部を密閉する金属プレート上に接続され、それによって、溶液を充填すると、それは孔の底部に留まり、そこでゲルが形成される。ミクロタイタープレート鋳型中の溶液は、ＡＲＣＴＥＳＴ冷却チャンバー中、−１５℃で１０分以内に凍結した。サンプルを凍結したまま−１５℃で一晩保持し、次いで室温で解凍した。鋳型をその底部で密封する金属プレートは、ワイアネットで置き換えた。次いで、各ウエルに脱イオン水５ｍｌを通すことによって、クライオゲルマトリックスを洗浄した。次いで、クライオゲルを、金属９６ウエル鋳型からクロマトグラフィー適用のために開発したプラスチックミクロタイタープレート（９６個の底無しの丸いウエルを有するミクロタイタープレート、ウエル体積１．５ｍｌ、ウエル直径６．９ｍｍ）に移した。各ウエルは、モノリスで充填後、モノリスの上方に約１ｍｌのデッドボリュームを有する。そのウエルにモノリスが含まれたミクロタイタープレートは、本発明の方法において使用するための分離トレーを構成する。
【００６１】
実施例６．分離トレー中でのモノリスクライオＰＶＡへの官能性エポキシ基のカップリング
モノリスクライオＰＶＡを有する分離トレーを実施例５に従って調製した。各ウエルに、脱イオン水（５ｍｌ）、次いで５ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを通した。０．５Ｍ  ＮａＯＨ中のエピクロロヒドリンエマルジョン（２％、ｖ／ｖ）を、リサイクル様式で４８時間、カラムに適用した。最終的に、エポキシ含有モノリスクライオＰＶＡを詰めたウエルを、ｐＨが７未満になるまで、脱イオン水で洗浄した。
【００６２】
実施例７．分離トレー中でのイオン交換モノリスクライオＰＶＡの製造
エポキシ含有モノリスクライオＰＶＡを有する分離トレーを、実施例６に従って調製した。エポキシ含有モノリスクライオＰＶＡ（０．５ｍｌ）を詰めた各ウエルに、脱イオン水（５ｍｌ）、次いで５ｍｌの０．１Ｍ  炭酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ９．５を通した。０．１Ｍ  炭酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ９．５中の３−ジメチルアミノプロピルアミンの溶液を、リサイクル様式で２４時間、適用した。最終的に、イオン交換モノリスクライオＰＶＡを詰めたウエルを、ｐＨが７未満になるまで、脱イオン水で洗浄した。
【００６３】
実施例８．アクリルアミドからの丸めたクライオゲルの製造
アクリルアミド（ＡＡｍ、３．７６ｇ）およびＮ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（ＭＢＡＡｍ）１．６２ｇを水８０ｍｌに溶解した。全体積を脱イオン水で１００ｍｌに調整した。混合物を真空下で１０−１２分間脱気し、溶解酸素を除去した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−メチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）によってフリーラジカル重合を開始した。ＴＥＭＥＤ（６３μｌ）の添加後、溶液を氷浴で２０分間冷却した。新たに調製したＡＰＳの溶液（０．５ｍｌの水中の４８ｍｇ）を加え、混合物を１分間撹拌した。次いで、反応混合物を、金属製丸形鋳型（鋳型の高さ１ｃｍ及び直径１０ｃｍ）に、鋳型の高さの半分（即ち、０．５ｃｍ）まで注いだ。反応混合物の表面は、軽いプラスチック蓋で覆った。混合物を−１８℃で約１６−１９分間凍結させた。凍結サンプルを−１８℃で一晩保存した。解凍後、クライオゲルシートを脱イオン水で洗浄した。丸形クライオゲルシートを平滑な表面上に置き、８ｃｍｘ７ｃｍの長方形を切り取った。次いで、遊離水を、四角い形状のクライオゲルシートから軽く搾り出した。クライオゲルシートを丸め、直径１．９ｃｍのガラスチューブに入れた。クライオゲルカラムの高さは８ｃｍで、体積は２０ｍｌであった（クライオゲルシートの全体積２８ｍｌの１．４分の１）。クライオゲルカラム直径の圧縮は、丸めたシートにおいて、特に、丸めたシートの中央においていかなるスペースをも避けるために重要であった。ガラスカラムにアダプターを取り付け、ポンプに接続した。Ｎａ２ＣＯ３（０．５Ｍ、２００ｍｌ）を、流速１ｍｌ／分でカラムに通した。イミノ二酢酸の溶液（１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３中の０．５Ｍ）を、流速２ｍｌ／分にて、リサイクル様式で２４時間、カラムに適用した。その後、カラムを脱イオン水で洗浄した（ｐＨが中性になるまで）。１００ｍｌの０．２Ｍ  ＣｕＳ０４をカラムに通し、１００ｍｌの０．２Ｍ  ＣｕＳ０４をカラムに通し、次いで水で洗浄することによって、ＩＤＡ−クライオゲルカラムにＣｕ２＋を結合させた。
【００６４】
実施例９．分離トレー中でのエポキシ活性化クライオゲルモノリスへのコンカナバリンＡの固定化
１０個のエポキシ活性化クライオゲルモノリス（０．５ｍｌ）を、実施例６に従って調製した分離トレーに配置した。１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む０．０５Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０（緩衝液Ａ）２ｍｌを、各モノリスに通し、次いで、緩衝液Ａ中のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）溶液（４ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを適用した。次いで、緩衝液Ａ中のＣｏｎＡ溶液（４ｍｇ／ｍｌ）１２ｍｌを含むバイアルにモノリスを配置した。インキュベーションを、連続的に振盪しながら、室温で２０時間行った。振盪器を用い、クライオゲルを緩衝液Ａ中の０．１Ｍエタノールアミン１４ｍｌと共に室温で２時間インキュベートすることによって、未反応エポキシ基をブロックした。最後に、修飾クライオゲルを分離トレーに配置し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６．５（緩衝液Ｂ）で洗浄した。ＣｏｎＡクライオゲルは、緩衝液Ｂ中、＋４℃で保持した。
【００６５】
実施例１０．ＣｏｎＡ−クライオゲルモノリス分離トレーを用いる、代謝活性による酵母細胞の直接的な定量
酵母細胞を、０．９５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．５６ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４１ｍＭ  ＮａＨＣ０３及び０．０１ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．４（緩衝液Ｄ）に懸濁した。酵母細胞の異なる量を、実施例９に従って調製した分離トレーのウエルにおいて、緩衝液Ｄで平衡化したＣｏｎＡ−クライオゲルモノリス（０．５ｍｌ）を詰めたウエルに適用した。１０分間のインキュベーション後、ウエルを１．５ｍｌの緩衝液Ｄで洗浄し、非結合細胞を除去した。次いで、ウエルを、ニュートラルレッド（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含む緩衝液Ｄ中のグルコース（５０ｍＭ）溶液０．５ｍｌで３時間インキュベートした。次いで、反応液体を、脱イオン水１ｍｌで置き換え、５２８ｎｍでの吸光度を測定することによって分析した（表３）。ニュートラルレッドを含む溶液の５２８ｎｍでの吸光度は、ｐＨと共に線形的に変化する。酵母細胞代謝は、プロトンの生成を含み、培地のｐＨの減少を生じる。酵母細胞、グルコースおよびニュートラルレッドを含む培地における５２８ｎｍでの吸光度の変化は、代謝活性（これは、固定化した生存細胞の数に比例する）の変化の計算を可能とする。
【００６６】
【表３】
2006522334.tif 000004
【００６７】
実施例１１．ｃｏｎａ−クライオゲル分離トレーを用いる、炭水化物と糖酵素との競合結合アッセイ
固定化ＣｏｎＡの結合能力は、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０．１Ｍ  ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．０（緩衝液Ｅ）で平衡化した、実施例９に従って調製した分離トレーのＣｏｎＡ−クライオゲルモノリスに、純粋な糖酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼの異なる量を適用することによって概算した。吸着段階後、モノリスを、１Ｍ  ＮａＣｌを含む２ｍｌの緩衝液Ｅで洗浄し、非特異的に結合したペルオキシダーゼを除去した。結合蛋白質の量は、適用した蛋白質の量と非結合の蛋白質の量との間の差を計算することによって決定した（表４）。
【００６８】
【表４】
2006522334.tif 000005
【００６９】
競合結合アッセイ（表５）は以下のように行った：グルコースを含むサンプル０．５ｍｌに、酵素６μｇを含むペルオキシダーゼ溶液１５μｌを加えた。グルコースの異なる量を含むサンプルおよびペルオキシダーゼ６μｇを、ＣｏｎＡ−クライオゲルモノリスを詰めた無作為に選択したウエルに適用した。５分間のインキュベーション後、ウエルを、１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで洗浄した。次いで、基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩）０．５ｍｌを加え、ウエル内で１０分間放置した。反応混合物は、０．５ｍｌの緩衝液Ｅを加えることによって置き換え、５２０ｎｍでの吸光度を測定することによって分析した。
【００７０】
【表５】
2006522334.tif 000006
【国際調査報告】
2006522334.tif 000007
2006522334.tif 000008