(57)【要約】ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸について記載する。この核酸を細胞中で発現させ、キメラ受容体及び細胞活性化プロセスを調節することができる他のタンパク質を産生させることができる。このような調節性細胞は、医学、例えば、感染性、炎症性及び自己免疫疾患の治療において有用である。
2006518984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸であって、少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する核酸。
【請求項２】
少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列は一次細胞質シグナル伝達配列である請求項１記載の核酸。
【請求項３】
前記一次シグナル伝達配列はＩＴＡＭを含む請求項２記載の核酸。
【請求項４】
前記一次シグナル伝達配列は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｄに由来する請求項３記載の核酸。
【請求項５】
前記一次シグナル伝達配列はＩＴＩＭを含む請求項３記載の核酸。
【請求項６】
少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列は二次細胞質シグナル伝達配列である請求項１記載の核酸。
【請求項７】
前記二次細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ又はＣＤ１５４に由来する請求項６記載の核酸。
【請求項８】
３種の細胞質シグナル伝達配列をコードする請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
同じ読み枠でコードされる前記第一の細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
ｉ）ＣＤ１３４に由来する細胞質シグナル伝達配列と、続いて同じ読み枠でｉｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達配列をコードする請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
ｉ）ＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列と、続いて同じ読み枠でｉｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達配列をコードする請求項９記載の核酸。
【請求項１２】
同じ読み枠でコードされる前記第二の細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１３】
ｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達ドメインと、続いて同じ読み枠でｉｉ）ＣＤ１３４に由来する細胞質シグナル伝達ドメインをコードする請求項１２記載の核酸。
【請求項１４】
ｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達ドメインと、続いて同じ読み枠でｉｉ）ＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達ドメインをコードする請求項１２記載の核酸。
【請求項１５】
同じ読み枠でコードされる前記第一の細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４若しくはＩＣＯＳに、又は二次細胞質シグナル伝達配列に由来する請求項８記載の核酸。
【請求項１６】
同じ読み枠でｉ）ＣＤ２８に由来する細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、及びｉｉｉ）ＣＤ１３４に由来する細胞質シグナル伝達配列をコードする請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
同じ読み枠でｉ）ＣＤ２８に由来する細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列をコードする請求項１５記載の核酸。
【請求項１８】
細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインを含み、細胞質シグナル伝達ドメインは、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸でコードされるキメラ受容体タンパク質をコードする核酸。
【請求項１９】
細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインを含み、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４に由来する単一の細胞質シグナル伝達配列を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸。
【請求項２０】
細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインを含み、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳに由来する単一の細胞質シグナル伝達配列を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸。
【請求項２１】
前記細胞外リガンド結合ドメインは、抗体、又はその抗原結合フラグメントである請求項１８又は２０に記載の核酸。
【請求項２２】
前記抗原結合フラグメントはＦａｂ’又はｓｃＦｖである請求項２１記載の核酸。
【請求項２３】
前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ又はＣＤ１５４に由来する請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２４】
前記膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来する請求項２３記載の核酸。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項２５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸でコードされる細胞質シグナル伝達分子を含むペプチド又はポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸でコードされるキメラ受容体タンパク質。
【請求項２９】
請求項２７記載のペプチド若しくはポリペプチド又は請求項２８記載のキメラ受容体タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項３０】
休止しているか老化したＴリンパ球である請求項２６又は２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
治療で使用するための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項２５記載のベクター。
【請求項３２】
治療で使用するための請求項２８記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項３３】
請求項２７記載のペプチド又はポリペプチド、請求項２８記載のキメラ受容体タンパク質、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項２５記載のベクターを、薬学的に許容できる賦形剤と併せて含む組成物。
【請求項３４】
ヒト又は動物の疾患を治療又は予防するための薬物の製造における、請求項２７記載のペプチド若しくはポリペプチド、請求項２８記載のキメラ受容体タンパク質、又は請求項３３記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細胞質シグナル伝達分子、それらをコードする核酸、並びに医学及び研究におけるそれらの核酸及び細胞質シグナル伝達分子の使用に関する。
【０００２】
本出願を通じて、様々な刊行物を著者及び刊行年によって参照する。それらの刊行物に関する完全な引用は、本発明の詳細な説明及び実施例の後に示す。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ２８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上で恒常的に発現される共刺激分子であり、ＣＤ２８とそのリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７．１）又はＣＤ８６（Ｂ７．２）との相互作用は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２産生及びナイーブＴ細胞の生存率を増強させる。最近、さらに多くの共刺激経路が報告されており、それらは２つのスーパーファミリー、ＣＤ２８／Ｂ７及びＴＮＦ／ＴＮＦＲに分類される。これらの共刺激経路は、Ｔ細胞分化及び活性化の異なる段階で働くようであり、異なるエフェクター機能を促進する役割を果たすことが分かっている。
【０００４】
ヒト誘導型共刺激（ＩＣＯＳ）分子は、ＣＤ２８／Ｂ７スーパーファミリーのメンバーであり、休止ではなく活性化Ｔ細胞上で発現される５５〜６０ｋＤａのジスルフィド結合したグリコシル化ホモ二量体である（Ｃａｒｒｅｎｏ及びＣｏｌｌｉｎｓによる総説、２００２）。ＩＣＯＳのライゲーションは、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を亢進するが、ＣＤ２８と異なり、ＩＬ−２産生を増加させない。ＩＣＯＳ架橋は、Ｂリンパ球の増殖因子であるＩＬ−１０産生の劇的な増加を促進する。ＩＣＯＳは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ−Ｌ（Ｂ７ｈ、ＧＬ５０、ＢＲＰ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＬＩＣＯＳ）などの様々なリガンドと結合するが、その親和性は、ＣＤ８０に対するＣＤ２８の親和性と類似している。
【０００５】
ＣＤ１３４は、ＯＸ４０としても知られ、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞活性化における共刺激分子として関与することが知られている。ＣＤ１３４は、活性化の１から２日後に活性化（主にＣＤ４＋）Ｔ細胞上で発現される４８ｋＤａの糖タンパク質である（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ他、２０００）。発現は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介するシグナル伝達に依存し、ＣＤ２８シグナル伝達により亢進される（Ｒｏｇｅｒｓ他、２００１）。ＣＤ１３４を介する共刺激は、増殖及びサイトカイン産生を亢進し、腫瘍免疫を亢進し、記憶Ｔ細胞の発生を亢進することが分かっている。ＣＤ１３４は、Ｔ細胞応答を延長し、長期の生存及び記憶を促進すると考えられる。ＣＤ１３４は、ＴＮＦ受容体ファミリーの他のメンバーと同様、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）シグナル伝達分子であるＴＲＡＦ−２、−３及び−５と会合し、ＮＦｋＢを活性化する。
【０００６】
免疫細胞シグナル伝達の領域における研究から、抗原受容体関与の下流で起きるシグナル伝達事象に関するかなりの量の情報が得られている。相当数の研究は、受容体そのもの、及び抗原結合に応答して刺激される酵素に重点を置いてきた（Ｗｅｉｓｓ及びＬｉｔｔｍａｎによる総説、１９９４；ＤｅＦｒａｎｃｏ、１９９７）。
【０００７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の個々の成分の特徴は十分に明らかにされており、多くの場合、受容体サブユニット又はドメインの機能性は、キメラ受容体タンパク質の構築によって決定されてきた（Ｋｕｗａｎａ他、１９８７；Ｒｏｍｅｏ他、１９９２）。細胞質シグナル伝達ドメイン、特にＴＣＲ活性化におけるそれらの役割は、このアプローチを用いて識別されてきた。この情報は、細胞活性化プロセスを調節することができるキメラ受容体の開発につながった（例えば、Ｆｉｎｎｅｙ他、１９９８及び公開された国際特許明細書ＷＯ９７／２３６１３、ＷＯ９６／２３８１４、ＷＯ９６／２４６７１、ＷＯ９９／００４９４、ＷＯ９９／５７２６８を参照）。
【０００８】
細胞活性化の生物学的作用、例えば、細胞増殖の増加、サイトカインの発現増加、細胞溶解活性の刺激、他のエフェクター機能の区別、抗体分泌、食作用、腫瘍浸潤及び／又は細胞接着の増加をキメラ受容体によって制御する能力は、かなりの治療的可能性を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
今日利用可能なキメラ受容体は、細胞を効率的に活性化することができるものの、このようなキメラ受容体の細胞質シグナル伝達ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインから二次メッセンジャー経路の下流メンバーまでシグナルを伝達するように有効性を改善する余地がある。また、ＣＤ２８によって得られるよりもＴ細胞応答を亢進及び延長する、代わりの細胞質シグナル伝達ドメインを提供することが必要である。また、代わりの細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達が不十分か欠けている状況において効率的なシグナル伝達を達成することを求められる。例えば、慢性炎症状態及び感染性疾患から加齢及び免疫不全（Ａｒｏｓａ、２００２）までの多くの状況においてよく見られるＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞は、それらの表面上にＣＤ２８をもはや発現せず、ＣＤ２８経路を介してシグナルを伝達することはもはやできないことがある。特定の状況では、それらの細胞に共刺激シグナル伝達を提供することが望ましいことがあり、それには、代替経路を介する共刺激が必要となることがある。
【００１０】
単一分子におけるＴＣＲζとＣＤ２８シグナル伝達領域双方を持つ融合受容体の発現及びシグナル伝達の成功は、Ｊｕｒｋａｔ（Ｆｉｎｎｅｙ他、１９９８）及び培養一次ヒトＴ細胞（Ｅｓｈａｒ他、２００１；Ｈｏｍｂａｃｈ他、２００１；Ｍａｈｅｒ他、２００２）で明らかにされている。しかしながら、レトロウイルス形質導入には細胞周期にある細胞が必要なため、ヒト一次Ｔ細胞へのキメラ受容体の形質移入は、活性化一次Ｔ細胞に限定されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ他、１９９０）。その結果、休止ヒト一次Ｔ細胞では共刺激受容体の発現及び機能は報告されていない。休止Ｔ細胞では通常発現されないと思われるシグナル伝達領域を含む受容体が、通常の経路を介してシグナル伝達を仲介することができるか否かはまだ不明である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳポリペプチドの少なくとも一部を含み、休止Ｔ細胞を活性化することができる新規なキメラ受容体及び新規な細胞質シグナル伝達分子を提供することによりそれらの困難に対処する。また、本発明は、２種以上の二次メッセンジャー経路を介してシグナルを伝達することにより、Ｔ細胞応答を亢進及び延長させ、細胞活性化をより効率的に仲介することができる新規な細胞質シグナル伝達分子を提供する。
【００１２】
驚いたことに、発明者他は、キメラ受容体の一部としてのＣＤ１３４又はＩＣＯＳポリペプチドの使用が、ＣＤ２８シグナル伝達の非存在下で休止Ｔ細胞において発現された受容体との細胞外リガンド結合に応答した細胞活性化をもたらすことを立証することができた。発明者他は、休止Ｔ細胞の共刺激が、内因性ＴＣＲ複合体の刺激によって一次活性化シグナルが提供される場合と、一次活性化シグナル配列が同じキメラ受容体の一部である場合の双方で起きることを立証することができた。特に、発明者他は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳが、少なくとも１種の他の細胞質シグナル伝達配列と併せて用いられ、細胞質シグナル伝達分子を形成している場合、細胞質シグナル伝達分子に新規かつ予想外の特性を付与することができることを立証した。例えば、少なくとも１種の他の細胞質シグナル伝達配列と共にＣＤ１３４又はＩＣＯＳを含む細胞質シグナル伝達分子がキメラ受容体の細胞質シグナル伝達ドメインとして用いられ、休止Ｔ細胞において発現される場合、細胞活性化の得られるレベルは、予想されるよりもはるかに高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
したがって、本発明の一態様によれば、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達分子を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び単一の細胞質シグナル伝達ドメイン（ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する単一の細胞質シグナル伝達配列を含む）を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様において、少なくとも２種の細胞質シグナル伝達配列（ここで、少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する）を含む細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸を提供する。本発明の細胞質シグナル伝達配列は、腫瘍壊死因子受容体経路を介し、又はＢ７／ＣＤ２８シグナル伝達経路を介してシグナルを伝達することが好ましい。本発明の一態様において、各細胞質シグナル伝達配列は、異なる二次メッセンジャー経路を介してシグナル伝達を仲介する。
【００１６】
一実施形態において、少なくとも２種の細胞質シグナル伝達配列（ここで、１種の細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する）を含む細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸を提供する。
【００１７】
本明細書で使用する用語「細胞質シグナル伝達配列」は、より大きなドメインの少なくとも実質的部分を形成し、細胞内で生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達することができるユニットとして機能することが知られているアミノ酸の任意の配列を意味する。
【００１８】
ＣＤ１３４及びＩＣＯＳポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達を担う細胞質ドメインからなる。したがって、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列は、同一の機能を有する細胞質ドメイン又はその誘導体若しくは変異体を含むことになる。用語「誘導体」又は「変異体」は、１個又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を含む任意の分子種変異体又は任意の変異体を意味するが、ただし、誘導体又は変異体は、元の親配列と同一の機能を実質的に保持するものとする。本発明の細胞質シグナル伝達分子は、ＩＣＯＳのアミノ酸残基１６６〜１９９（Ｈｕｔｌｏｆｆ他、１９９９）若しくはＣＤ１３４の残基２１３〜２４９（Ｌａｔｚａ他、１９９４）を含む細胞質シグナル伝達配列又はその誘導体若しくは変異体を含むことが好ましい。
【００１９】
本発明において使用するのに好ましい他の細胞質シグナル伝達配列の例には、抗原受容体関与の後にシグナル伝達を開始するのに呼応して作用するＴＣＲ及びコレセプターの細胞質配列、並びにそれらの配列の任意の誘導体又は変異体（前述の）及び同一の機能を有する任意の合成配列が含まれる。
【００２０】
ＴＣＲのみを介して発生されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、及び二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲを介して抗原依存的一次活性化を開始させる配列（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）によって仲介されていると言える。
【００２１】
本発明の一態様において、細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列及び少なくとも１種の一次細胞質シグナル伝達配列を含む。
【００２２】
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的、或いは抑制的にＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことがあり（Ｒｅｔｈ、１９８９）、一方、抑制的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフすなわちＩＴＩＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことがある（Ｂｕｒｓｈｔｙｎ他、１９９９）。
【００２３】
したがって、本明細書に記載の本発明のこの態様又は任意の態様において使用するための一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、又は免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含むことが好ましい。
【００２４】
本発明において特に有用である一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例には、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭが含まれる。これらの分子に由来する細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲζのアミノ酸残基３１〜１４２、ＦｃＲγのアミノ酸残基２７〜６８、ＦｃＲβのアミノ酸残基２０１〜２４４、ＣＤ３γのアミノ酸残基１１７〜１６０、ＣＤ３δのアミノ酸残基１０７〜１５０、ＣＤ３εのアミノ酸残基１３１〜１８５、ＣＤ５のアミノ酸残基３７８〜４７１、ＣＤ２２のアミノ酸残基６８８〜８２８、ＣＤ７９ａのアミノ酸残基１３４〜１９４、ＣＤ７９ｂのアミノ酸残基１５４〜２０１、又はＣＤ６６ｄのアミノ酸残基１４３〜２１８を含むことが好ましい。
【００２５】
本発明のこの態様による細胞質シグナル伝達分子は、ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
【００２６】
代わりの実施形態において、本発明の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列及び少なくとも１種の他の二次細胞質シグナル伝達配列を含む。
【００２７】
本明細書に記載の本発明のこの態様又は任意の態様において使用するのに適している二次細胞質シグナル伝達配列を含む分子には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、及びＣＤ１５４が含まれる。これらの分子に由来する細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ２のアミノ酸残基２１２〜３２７、ＣＤ４のアミノ酸残基３９６〜４３３、ＣＤ５のアミノ酸残基３７８〜４７１、ＣＤ８αのアミノ酸残基１８６〜２１４、ＣＤ８βのアミノ酸残基１７５〜１８９、ＣＤ２８のアミノ酸残基１６２〜２０２、ＣＤ１３７のアミノ酸残基２１４〜２５５、ＣＤ１３４のアミノ酸残基２１３〜２４９、ＩＣＯＳのアミノ酸残基１６６〜１９９又はＣＤ１５４のアミノ酸残基１〜２２を含むことが好ましい。ＣＤ２８に由来する二次シグナル伝達配列は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列と併せて用いられることが特に好ましい。
【００２８】
また、発明者他は、２種の他の細胞質シグナル伝達分子と共にＣＤ１３４又はＩＣＯＳを含む細胞質シグナル伝達分子が、キメラ受容体の細胞質シグナル伝達ドメインとして用いられた場合、シグナル伝達を仲介する際に特に効率的であることを見いだした。
【００２９】
したがって、本発明の他の態様は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する少なくとも１種の細胞質シグナル伝達配列及び少なくとも２種の他の細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸を提供する。
【００３０】
少なくとも２種の追加細胞質シグナル伝達配列の一方又は双方は、上述のように一次細胞質シグナル伝達配列或いは二次細胞質シグナル伝達配列であってよい。しかしながら、少なくとも１種の追加細胞質シグナル伝達配列は一次細胞質シグナル伝達配列であり、少なくとも１種の他の細胞質シグナル伝達配列は二次細胞質シグナル伝達配列であることが特に好ましい。上述の一次及び二次細胞質シグナル伝達配列のいずれも、本発明のこの態様に従って細胞質シグナル伝達分子中に取り込むことができるが、ＴＣＲζに由来する一次シグナル伝達配列とＣＤ２８に由来する二次シグナル伝達配列の組合せが好ましい。
【００３１】
本発明の細胞質シグナル伝達分子内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな又は特定の順番でお互いと連結することができる。場合により、短いオリゴ又はポリペプチドリンカー、好ましくは長さが２〜１０個のアミノ酸が結合を形成することができる。グリシン−セリンダブレットは、特に適しているリンカーを提供する。
【００３２】
したがって、細胞質のＣＤ１３４又はＩＣＯＳ及び１種の追加細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸は、ｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列及びｉｉ）一次細胞質シグナル伝達配列；ｉ）一次細胞質シグナル伝達配列及びｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列；ｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列及びｉｉ）二次細胞質シグナル伝達配列；又はｉ）二次細胞質シグナル伝達配列及びｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列を読み枠にコードすることができる。このような細胞質シグナル伝達分子の具体例には、アミノ末端からカルボキシル末端までの順序でｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ及びｉｉ）ＴＣＲζ；ｉ）ＴＣＲζ及びｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ；ｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ及びｉｉ）ＣＤ２８；ｉ）ＣＤ２８及びｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ；ｉ）ＣＤ１３４及びｉｉ）ＩＣＯＳ；ｉ）ＩＣＯＳ及びｉｉ）ＣＤ１３４に由来する細胞質シグナル伝達配列を含む分子が含まれる。
【００３３】
本発明の細胞質シグナル伝達分子がＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列及び少なくとも２種の追加細胞質シグナル伝達配列を含む場合、それらは、場合により前述のリンカーを介し、ランダムな又は特定の順番で連結することができる。したがって、そのような細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸は、ｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）一次細胞質シグナル伝達配列及びｉｉｉ）二次細胞質シグナル伝達配列；ｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）二次細胞質シグナル伝達配列及びｉｉｉ）一次細胞質シグナル伝達配列；ｉ）一次細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列及びｉｉｉ）二次細胞質シグナル伝達配列；ｉ）一次細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）二次細胞質シグナル伝達配列及びｉｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列；ｉ）二次細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）一次細胞質シグナル伝達配列及びｉｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列；又はｉ）二次細胞質シグナル伝達配列、ｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列及びｉｉｉ）一次細胞質シグナル伝達配列をコードすることができる。
【００３４】
このような細胞質シグナル伝達分子の具体例には、アミノ末端からカルボキシル末端までの順序でｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ、ｉｉ）ＴＣＲζ及びｉｉｉ）ＣＤ２８；ｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ、ｉｉ）ＣＤ２８及びｉｉｉ）ＴＣＲζ；ｉ）ＴＣＲζ、ｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ及びｉｉｉ）ＣＤ２８；ｉ）ＴＣＲζ、ｉｉ）ＣＤ２８及びｉｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ；ｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＴＣＲζ及びｉｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ；並びにｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ及びｉｉｉ）ＴＣＲζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む分子が含まれる。また、具体例には、任意の順序でＴＣＲζ又はＣＤ２８と組み合わされたＣＤ１３４とＩＣＯＳ双方を含む細胞質シグナル伝達分子が含まれる。
【００３５】
本発明の新規な細胞質シグナル伝達分子は、単独で、或いはキメラ受容体などのより大きなタンパク質の構成部分として使用することができる。それらの伝達分子は、個々のタンパク質分子として、エフェクター細胞中に導入、又はエフェクター細胞中で発現され、その細胞内ですでに発現されている免疫細胞受容体に代わる細胞質シグナル伝達配列としての役割を果たすことができる。このようにして、それらの伝達分子は、受容体を介してシグナル伝達の効率を高め、Ｔ細胞応答を延長又は亢進することができる。それらの伝達分子は、細胞の細胞質中に可溶性ポリペプチドとして存在するか、細胞膜に固着又は固定されて細胞質中に広がることができ、所与の生理学的細胞条件下でシグナル伝達を仲介することができる。
【００３６】
しかしながら、本発明の細胞質シグナル伝達分子は、キメラ受容体タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインとして用いられた場合、シグナル伝達を仲介するために使用されることが好ましいと考えられる。また、このようなキメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。
【００３７】
したがって、本発明のこの態様によれば、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する単一の細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供する。一実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも２種の異なる二次メッセンジャー経路を介するシグナル伝達を仲介する。
【００３８】
細胞外リガンド結合ドメインの取り込みは、特定のリガンド又はリガンド類に対する特異性を示す能力をキメラ受容体に付与する。この特異性を用い、受容体を活性化することができるリガンド又はリガンド類を正確に規定することができる。このように、選択されたリガンド類又は個々のリガンドと結合して発現される細胞を活性化するように受容体を設計することができる。
【００３９】
リガンドとキメラ受容体中の対応する結合ドメインの間の接触は、細胞質シグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達をもたらす。キメラ受容体の細胞質ドメインとしての役割を果たすように選択された本発明の細胞質シグナル伝達分子内の細胞質シグナル伝達配列の組合せは、伝達されるシグナルの大きさに影響を与え、結果的に細胞が活性化されるレベルを制御する。
【００４０】
したがって、本発明の他の実施形態は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメイン（ここで、細胞質シグナル伝達ドメインは、本発明の前述した態様のいずれかによる細胞質シグナル伝達分子をコードする核酸でコードされる）を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００４１】
本明細書で使用する用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、リガンドを結合することができる任意のオリゴ又はポリペプチドと定義される。したがって、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループ又はＣＤＲ、受容体結合ドメイン及び他のリガンド結合ドメイン（その例は、当業者には明らかであろう）は、この用語によって記述される。このドメインは、細胞表面分子と相互作用できることが望ましい。本発明において特に有用な細胞表面分子との結合に関係するタンパク質の例には、抗体可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）、Ｔ細胞受容体可変領域ドメイン（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ）、又はＣＤ８α、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ４９Ｂ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ６１、ＣＤ４１、又はＣＤ５１の鎖が含まれる。場合によってはドメイン又は鎖全体を使用するのが有効なこともあるが、適切な場合にはフラグメントを使用することができる。Ｆａｂ’フラグメント又は、特に単鎖Ｆｖフラグメントは、特に有用な結合成分である。
【００４２】
ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定しているリガンドのタイプと数に依存している。例えば、細胞外リガンド結合ドメインを、特定の病状に関係した標的細胞上の細胞表面マーカーとしての役割を果たすリガンドを認識するために選ぶことができる。したがって、リガンドとしての役割を果たすことができる細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、自己免疫疾患及び癌細胞に関係するマーカーが含まれる。後者の場合、細胞表面マーカーの具体例は、肺癌細胞上に発現されるボンベシン受容体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、多形性上皮性ムチン（ＰＥＭ）、ＣＤ３３、葉酸受容体、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）及びｅｒｂ−Ｂ２である。好まれて用いられる他のリガンドは、細胞表面接着分子、自己免疫疾患において存在する炎症細胞、及び自己免疫を起こすＴ細胞受容体又は抗原である。上に列挙した可能性があるリガンドは、例として挙げたもので、このリストは、限定的であることを意図するものではなく、他の例は、当業者にとって極めて明白であろう。
【００４３】
キメラ受容体は、二重又は多重特異的に設計することができる。すなわち、２種以上のリガンド結合ドメインを含み、それによって２種以上のリガンドに対して特異性を示すことができる。そのような受容体は、細胞免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、又は肥満細胞）、又は或いは補体カスケードの成分を動員することができる。
【００４４】
キメラ受容体の他の成分は、膜貫通ドメインである。これは、天然供給源又は合成供給源から誘導することができる。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質から誘導することができる。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４から誘導する（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）ことができる。或いは、膜貫通ドメインは、合成的であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むことになる。フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見いだされることが好ましい。場合により、短いオリゴ又はポリペプチドリンカー、好ましくは長さが２〜１０個のアミノ酸が、キメラ受容体の膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成することができる。グリシン−セリンダブレットは、特に適しているリンカーを提供する。
【００４５】
細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインの間、又は細胞質シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメインを取り込むことができる。本明細書で使用する用語「スペーサードメイン」は、一般的に、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメイン及び／又は細胞質シグナル伝達ドメインと連結する働きをする任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含むことができる。
【００４６】
スペーサードメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、又はＣＤ２８の細胞外領域の全部又は部分から、又は抗体定常領域の全部又は部分からなど、天然に存在する分子の全部又は部分から誘導することができる。或いは、スペーサーは、天然に存在するスペーサー配列に相当する合成配列か、完全な合成スペーサー配列であってもよい。
【００４７】
スペーサードメインは、キメラ受容体の恒常的会合を最小限に抑え、細胞における恒常的活性化の回数を低減するか、そのような会合を促進し、細胞における恒常的活性化のレベルを亢進するように設計することができる。どちらの可能性も、他のポリペプチド鎖におけるアミノ酸の側鎖と共有結合的又は非共有結合的に相互作用することができる側鎖残基を有する膜貫通及び／又はスペーサードメイン中のアミノ酸及び天然に存在する配列を欠失、挿入、変化、さもなければ改変することにより人為的に達成することができる。通常会合を促進すると予想されるアミノ酸の例には、システイン残基、荷電アミノ酸又は潜在的なグリコシル化部位内のセリン又はスレオニンなどのアミノ酸が含まれる。
【００４８】
キメラ受容体は、スペーサー及び膜貫通成分が遊離チオール基を有し、それによって多量体化、特に二量体化能力のある受容体を提供するように設計することができる。そのような多量体受容体、特に二量体が好ましい。ＣＤ２８成分に由来するスペーサードメイン及び/又は抗体ヒンジ配列及びＣＤ２８に由来する膜貫通領域及び天然Ｔ細胞受容体のζ鎖を有する受容体が特に好ましい。
【００４９】
本発明は、新規な細胞質シグナル伝達分子及びキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供するだけではなく、タンパク質自身にまで及ぶ。
【００５０】
本発明において使用するための細胞質シグナル伝達配列の配列をコードする核酸は、特定されたアミノ酸配列から容易に誘導することができる。他の核酸配列は科学文献に広く報告されており、公開データベースでも利用できる。ＤＮＡは、当業者には明らかなように、市販されているか、ｃＤＮＡライブラリーの一部であるか、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて作成することができる。特に適している技法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチド指向突然変異、オリゴヌクレオチド指向合成技法、ギャップ付きオリゴヌクレオチドの酵素切断又は酵素的穴埋めが含まれる。このような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＦｒｉｔｓｃｈ（１９８９）によって、及び以下の文中に含まれる実施例中に記載されている。
【００５１】
本発明の核酸は、キャリアと一緒に使用することができる。キャリアは、ベクターであるか、標的細胞及び/又は標的宿主細胞にｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を導入するのに適した他のキャリアであってもよい。適切なベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）及び単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）などのウイルスベクターが含まれる。リポソームベクター及び国際特許出願番号ＷＯ９６／１００３８、ＷＯ９７／１８１８５、ＷＯ９７／２５３２９、ＷＯ９７／３０１７０及びＷＯ９７／３１９３４に記載されている陽イオン脂質などの縮合剤に基づくベクターなどの非ウイルスベクターも使用することができる。適切な場合、ベクターは、レトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、ＡＡＶ反復配列、ＳＶ４０及びヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター及び/又はエンハンサー、スプライシング及びポリアデニル化シグナル及びＥＢＶ及びＢＫウイルス複製機能などのプロモーター及び調節配列及び/又はウイルス由来の複製機能を含むことができる。ＴＣＲ−αプロモーター、Ｅ−セレクチンプロモーター及びＣＤ２プロモーターなどの組織特異的調節配列並びに遺伝子座制御領域も使用することができる。キャリアは、抗体であってもよい。
【００５２】
また、本発明には、本発明の前述した態様のいずれかによる核酸を含むクローニング及び発現ベクターが含まれる。そのような発現ベクターは、適切な場合に本発明の核酸分子とインフレームで連結した適切な転写及び翻訳制御配列、例えば、エンハンサーエレメント、プロモーター−オペレーター領域、終止停止配列、ｍＲＮＡ安定化配列、開始及び終止コドン又はリボソーム結合部位を取り込む。
【００５３】
さらに、タンパク質配列の中に本来有効なシグナルペプチドが存在しない場合、特定の宿主から組換え細胞質シグナル伝達タンパク質を分泌させるのに好都合なことがある。したがって、そのようなベクターの他の成分は、分泌シグナル伝達及びプロセシング配列をコードする核酸配列を含むことができる。
【００５４】
本発明によるベクターには、プラスミド及びウイルス（バクテリオファージと真核ウイルス双方を含む）が含まれる。異種タンパク質の発現に適している多くの発現系は、当技術分野においてよく知られており、文書化されている。例えば、異種ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントを発現させるための大腸菌などの原核細胞の使用は、よく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＦｒｉｔｓｃｈ、１９８９、Ｇｌｏｖｅｒ、１９９５ａを参照）。同様に、真核生物発現系はよく開発されており、異種タンパク質発現に一般的に使用されている（例えば、Ｇｌｏｖｅｒ、１９９５ｂ及びＯ’Ｒｅｉｌｌｙ他、１９９３を参照）。真核細胞の中では、酵母を別として、好んで使用されるベクターはウイルスをベースにしている。特に適しているウイルスベクターは、バキュロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルスベースのベクターである。
【００５５】
関連調節配列（プロモーター、終止、ポリアデニル化、及びエンハンサー配列、マーカー遺伝子を含む）を含むベクターは、文献に記述されたベクターから選択するか、標準的な分子生物学技法を用いて本発明のタンパク質を発現するために容易に構築することができる。そのような技法及び核酸の操作、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡ変換及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析に関するプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ他、１９９２又はＲｅｅｓ他、１９９３に詳細に記載されている。
【００５６】
本発明の細胞質シグナル伝達分子及びキメラ受容体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現に適している宿主細胞には、原核細胞、例えば大腸菌、真核生物酵母、例えばサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、スキゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、哺乳類細胞系及び昆虫細胞が含まれる。或いは、本発明のキメラ受容体は、例えば、昆虫幼生、植物細胞、又はより好ましくは哺乳類組織などの様々な宿主においてｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。
【００５７】
核酸は、任意の適切な技法により宿主細胞中に導入することができる。真核細胞において、これらの技法には、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメント、リポソーム媒介性形質移入又はレトロウイルス、アデノウイルス若しくはワクシニア、又は昆虫細胞の場合にはバキュロウイルスなどの他のウイルスを使用する形質導入が含まれる。細菌細胞において、適切な技法には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション又はバクテリオファージを使用する形質移入が含まれる。核酸は、細胞内にエピソームの形態で留まるか、細胞のゲノム中に組み込まれる。後者が望ましい場合、ゲノムとの組換えを促進する配列を核酸中に含める。宿主細胞への核酸の導入後、必要に応じて、キメラ受容体タンパク質の発現を亢進又は誘導する条件下で細胞を培養することができる。
【００５８】
したがって、本発明の他の態様は、本明細書に記載の細胞質シグナル伝達分子及び/又はキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞、及びそのようなタンパク質を発現する宿主細胞を提供する。
【００５９】
さらに他の態様によれば、本発明の核酸は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの治療に用いることができる。
【００６０】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの使用の場合、核酸は、エフェクター細胞（標的宿主から取り出された）中に、当技術分野においてよく知られている方法、例えば、形質移入、形質導入（ウイルス形質導入を含む）、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、原形質融合、リン酸カルシウム媒介性ＤＮＡ変換、エレクトロポレーション、カチオンリポフェクション、又は標的型リポソームを用いて導入することができる。次いで、標準的技法を用い、エフェクター細胞を宿主に再導入する。本発明のアダプタ受容体の発現に適しているエフェクター細胞の例には、リンパ球、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、好中球、好塩基球などの免疫系に関係する細胞、又はＴヘルパー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球又はＮＫ細胞が含まれる。細胞傷害性Ｔリンパ球を使用することが好ましい。休止Ｔリンパ球を使用することが特に好ましい。
【００６１】
本発明の核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に特に適している。これを行うため、核酸、好ましくは、ＤＮＡは、前述のキャリアが、望ましいエフェクター細胞に核酸を誘導することができる標的キャリアシステムの形態をとることができる。適している標的型送達システムの例には、標的型の裸のＤＮＡ、ＤＮＡを封入しかつ／又はＤＮＡと複合体を形成している標的型リポソーム、標的型レトロウイルスシステム並びにプロタミン及びポリリジン縮合ＤＮＡなどの標的型縮合ＤＮＡが含まれる。
【００６２】
ターゲティングシステムは当技術分野においてよく知られており、例えば、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ３、セレクチン（例えば、Ｅ−セレクチン）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２４などの、標的細胞上でｉｎ  ｖｉｖｏで発現される細胞表面抗原、及び活性化抗原（例えば、ＣＤ６９及びＩＬ−２Ｒ）に対する抗原又はそのフラグメントを使用することが含まれる。或いは、他の受容体−リガンド相互作用を、例えば、ＨＩＶｇｐ１６０発現標的細胞を標的とするＣＤ４を標的とするために使用することができる。
【００６３】
一般的に、抗体を標的とするＤＮＡの使用が好ましく、具体的には抗体を標的とする裸のＤＮＡ、抗体を標的とする縮合ＤＮＡの使用が好ましく、抗体を標的とするリポソームの使用が特に好ましい。使用することができるリポソームのタイプには、例えば、低いｐＨで切断されるリンカーを用い、抗体をリポソームに連結することができるｐＨ感受性リポソームが含まれる。また、本発明の核酸は、細胞膜と融合するカチオン性リポソームを使用することにより、細胞質を直接標的とすることができる。また、本発明において使用するリポソームは、それらの表面に付着された親水性分子、例えばポリエチレングリコールポリマーを有し、リポソームの循環半減期を延ばすことができる。リポソーム又は他のキャリアにＤＮＡを付着させるのに適している基については当技術分野において多くの例があり、例えば、国際特許出願番号Ｗ０８８/０４９２４、Ｗ０９０/０９７８２、Ｗ０９１/０５５４５、Ｗ０９１/０５５４６、Ｗ０９３/１９７３８、Ｗ０９４/２００７３及び Ｗ０９４/２２４２９を参照されたい。抗体又は他の標的分子は、従来型の連結基及び抗体における反応性官能基、例えばチオール又はアミン、及びＤＮＡ或いはＤＮＡ含有材料における反応性官能基を用い、ＤＮＡ、縮合ＤＮＡ或いはリポソームに連結することができる。
【００６４】
非標的型キャリアシステムも使用することができる。これらのシステムでは、タンパク質の標的型発現が有利である。これは、例えば、ζプロモーターなどのＴ細胞特異的プロモーターシステム、ＣＤ２プロモーター及び遺伝子座制御領域、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲα及びＴＣＲβプロモーター、ＩＬ２プロモーターなどのサイトカインプロモーター、及びパーフォリンプロモーターを使用することにより行うことができる。
【００６５】
本発明の細胞質シグナル伝達分子及びキメラ受容体タンパク質、又はそれらをコードする核酸は、哺乳類、特にヒト患者の治療法に応用することを意図している。本発明により作成される細胞質シグナル伝達分子及びキメラ受容体は、多くの疾患又は障害の治療において特に有用である。そのような疾患又は障害には、感染性疾患の一般的表題として記載される疾患又は障害、例えばＨＩＶ感染；炎症性疾患/自己免疫、例えば喘息、湿疹；先天性の、例えば嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚科の、例えば、乾癬；神経性の、例えば、多発性硬化症；移植、例えば、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患；代謝性/特発性疾患、例えば、糖尿病；癌が含まれる。
【００６６】
例えば、Ｔ細胞の表面上における本発明のキメラ受容体の発現は、標的細胞上でリガンドにリガンド結合ドメインが結合すると、その細胞の活性化を開始することができる。続いての、受容体のシグナル伝達機能の活性化によって刺激された炎症性メディエータの放出は、標的細胞の破壊を確実にもたらす。
【００６７】
本発明によるキメラ受容体が、免疫系のエフェクター細胞において発現された場合、標的との結合は、エフェクター細胞を活性化することになり、この活性化の下流作用も標的細胞の破壊をもたらすことができる。キメラ受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ある免疫細胞上の表面マーカーに対して特異性を示す場合、エフェクター細胞を疾患部位に動員することができる。したがって、罹患細胞における本発明のキメラ受容体の発現は、その細胞の破壊を確実にもたらすであろう。
【００６８】
単一宿主細胞内の多重特異性キメラ受容体タンパク質、又は２種以上のキメラ受容体（異なるリガンド特異性を持つ）の発現は、受容体に二重の機能を付与することができる。例えば、キメラ受容体のその標的との結合は、エフェクター細胞自身を活性化するだけでなく、さらに、他の免疫エフェクターを疾患の部位に引き寄せることができる。このように、標的細胞を、免疫系の活性化によって破壊することができる。
【００６９】
本発明の細胞質シグナル伝達分子及びキメラ受容体タンパク質、又はそれらをコードする核酸を用い、老化したＴ細胞、例えば、炎症状態及び加齢などの多くの状況においてよく見られるＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞に共刺激シグナル伝達を提供することができる（Ａｒｏｓａ、２００２）。このような細胞は、表面上にＣＤ２８をもはや発現せず、低い増殖能を有し、機能的なＣＤ２８シグナル伝達経路をもはや有していない。場合によっては、これらの細胞に共刺激シグナルを提供することが望ましことがあり、それには、ＩＣＯＳ又はＣＤ１３４などの異なる経路を介してシグナルを伝達する共刺激シグナルが必要である。
【００７０】
本発明の他の態様は、前述の本発明の態様のいずれかによる細胞質シグナル伝達分子、若しくはキメラ受容体、又は細胞質シグナル伝達分子若しくはキメラ受容体をコードする１種又は複数の核酸を、薬学的に許容できる賦形剤と共に含む組成物を提供する。
【００７１】
適している賦形剤は、当業者にはよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、場合により塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水、生理食塩液、グリコール又はエタノールなどの液体；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。湿潤剤或いは乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も存在することができる。薬学的に許容できる賦形剤に関する徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）に出ている。組成物は、非経口投与、例えば、注射又は注入、例えば、ボーラス注入若しくは持続注入又は微粒子仲介注射に適した形態であることが好ましい。組成物が注射又は注入用である場合には、油或いは水性媒体中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形態をとるか、また、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び/又は分散剤などの製剤補助剤を含有することができる。或いは、組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。微粒子仲介投与用には、顕微鏡サイズの金粒子などの粒子上にＤＮＡをコーティングすることができる。
【００７２】
また、組成物を投与された個体に有害な抗体の産生を誘導せず、過度の毒性を生じることなく投与することができるキャリアを使用することができる。適しているキャリアは、通常、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子である。また、医薬組成物は、保存中の有効期限を延ばすために保存剤を含有することができる。
【００７３】
組成物が経口投与に適している場合、製剤は、活性成分の他に、デンプン（例えば、ジャガイモ、トウモロコシ又はコムギデンプン、セルロース）、微結晶性セルロースなどのデンプン誘導体、シリカ、ラクトースなどの様々な糖、炭酸マグネシウム及び/又はリン酸カルシウムなどの添加物を含有することができる。経口投与に適している製剤は、患者の消化器系に良好な耐容性を示すことが望ましい。この目的で、粘液形成剤及び樹脂を含むことが望ましい。また、胃液に不溶であるカプセルに組成物を製剤化することによって耐容性を改善することが望ましいことがある。さらに、組成物を放出制御製剤に含めることが好ましいことがある。
【００７４】
本発明のさらに他の態様によれば、ヒト又は動物における疾患を治療又は予防するための薬物の製造における、新規な細胞質シグナル伝達分子若しくはキメラ受容体タンパク質をコードする核酸、又はそのようにコードされているポリペプチド、又はそのような核酸若しくはポリペプチドを含有する医薬組成物の使用も提供される。
【００７５】
次に、本発明の様々な態様及び実施形態を実施例によってより詳細に説明する。本発明の範囲から逸脱することなく細かな改変を行えることは理解されるであろう。
【実施例】
【００７６】
実施例１：受容体クローニングカセットの構築
キメラ受容体フォーマットにおけるシグナル伝達領域の組合せの構築及び分析を容易にするため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のクローニングカセットを考案した。このクローニングカセットは、結合成分カセット及びスペーサー／膜貫通カセットからなる。
【００７７】
この新しいカセットシステムを図１に示す。結合成分は、５’（コード方向に対して）Ｎｏｔ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位並びに３’（この場合もコード方向に対して）Ｓｐｅ  Ｉ制限部位を有する。細胞外スペーサーは、Ｓｐｅ  Ｉ部位（したがって、５’末端でＴｈｒ、Ｓｅｒをコードする）及びＮａｒ  Ｉ部位（したがって、３’末端でＧｌｙ、Ａｌａをコードする）に隣接している。膜貫通成分は、その５’末端でＮａｒ  Ｉ部位と（したがって、Ｇｌｙ、Ａｌａをコードする）並びに３’末端でＭｌｕ  Ｉ（したがて、Ｔｈｒ、Ａｒｇをコードする）及びＢａｍＨ  Ｉ部位（したがって、Ｇｌｙ、Ｓｅｒをコードする）と隣接している。細胞質シグナル伝達ドメインは、ＢａｍＨ  Ｉ部位中にインフレームでクローニングすることができる。このＢａｍＨ  Ｉ部位に続いて、転写停止のための終止コドンが存在し、全構築物の取り出しを容易にするため、この下流に位置するＥｃｏＲ  Ｉ部位も存在する。
【００７８】
ａ）結合成分カセット（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩからＳｐｅ  Ｉ）
これは、短いリンカー配列によって結ばれている抗ＣＤ３３抗体のＶＬ及びＶＨ領域からなる。ＶＬ領域は、オリゴＡ５２６７及びＦ２２７８５と共にｈＰ６７ｓｃＦｖ（ＷＯ９７／２３６１３）からＰＣＲクローニングし、制限酵素で消化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩからＢｇｌ  ＩＩフラグメントを作成した。ＶＨ領域は、オリゴＦ２２７８６及びＦ２２７８７と共にｈＰ６７ｓｃＦｖ（ＷＯ９７／２３６１３）からＰＣＲクローニングし、制限酵素で消化し、Ｂｇｌ  ＩＩからＳｐｅＩフラグメントを作成した。次いで、これら２種のフラグメントをリンカー配列と一緒にクローニングベクター中にコライゲーションした。リンカーは、５’リン酸基を有するオリゴＦ２２９６６とＦ２２９６７をアニールすることによって作成した。これらのアニールされたオリゴは、Ｂｇｌ  ＩＩオーバーハングと適合したが、ライゲーションでＢｇｌ  ＩＩ部位を再形成しなかった。
【００７９】
ｂ）ｈ．２８スペーサー／ＣＤ２８膜貫通カセット（終止コドンの前にシグナル伝達カセットをクローニングするための、内部にＢａｍＨＩ部位のあるＳｐｅ  ＩからＥｃｏＲＩ）
細胞外スペーサー成分ｈ．２８は、ヒトＩｇＧ１ヒンジの残基２３４〜２４３及びヒトＣＤ２８の残基１１８〜１３４からなる。膜貫通成分は、ヒトＣＤ２８の残基１３５〜１６１からなる（Ａｒｕｆｆｏ及びＳｅｅｄ１９８７）。
【００８０】
このカセットを作成するため、ＷＯ０２／３３１０１の実施例１（ｂ）に記載の方法を用い、２００ｂｐフラグメントをＰＣＲ構築した。このフラグメントは、ＳｐｅＩ部位から始まり、細胞外スペーサーｈ．ＣＤ２８、ヒトＣＤ２８マック貫通領域、ＢａｍＨＩ部位、終止コドンからなり、ＥｃｏＲＩ部位で終わる。
【００８１】
ｃ）Ｇ１スペーサー／ＴＣＲζ膜貫通カセット（終止コドンの前にシグナル伝達カセットをクローニングするための、内部にＢａｍＨＩ部位のあるＳｐｅ  ＩからＥｃｏＲＩ）
「Ｇ１」と呼ばれる細胞外スペーサーは、ヒンジＣＨ２及びＣＨ３領域、ヒトＩｇＧ１の残基１３４〜４７８からなる（Ｋａｂａｔ他、１９９１）。
【００８２】
Ｇ１スペーサーは、個々に交換できるようにスペーサーと膜貫通領域の間に内部ＮａｒＩ部位のあるヒトＴＣＲζ膜貫通領域、残基１０〜３０（Ｗｅｉｓｓｍａｎ他、１９９８；Ｍｏｉｎｇｅｏｎ他、１９９０）と一緒にクローニングした。ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３は、５’オリゴＦ２４６７５及び３’オリゴＦ２４６７６と共に、既報（Ｆｉｎｎｅｙ他、１９９８）の構築物からクローニングした。Ｆ２４６７５は、ヒンジ領域の８個のアミノ酸と相補性があり、５’ＳｐｅＩ部位に付加する。Ｆ２４６７６は、ＣＨ３の１０個のアミノ酸と相補性があり、内部のＮａｒＩ部位へさらに付加し、ＴＣＲζ膜貫通領域の２１個のアミノ酸と相補性があり、３’のＭｌｕＩ部位へ付加する。このＰＣＲフラグメントをＳｐｅＩ及びＭｌｕＩで切り出し、ｓｃＦｖ／ｈ．２８／ＣＤ２８ＴＭ／−ベクター内のｈ．２８スペーサー及びＣＤ２８膜貫通領域と置き換えた。或いは、このＰＣＲフラグメントをＳｐｅ  Ｉ及びＮａｒ  Ｉで切り出し、ｓｃＦｖ／ｈ．２８／ＣＤ２８ＴＭ／−ベクター内のｈ．２８スペーサーのみと置き換えた。
【００８３】
実施例２：細胞質シグナル伝達配列の様々な組合せを持つキメラ受容体の構築
次いで、細胞質シグナル伝達配列を、上記カセットのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。各シグナル伝達配列は、ＢｃｌＩからＢａｍＨＩフラグメント上にあるため、これらの配列のディレクショナルクローニングは、３’末端のＢａｍＨＩ部位のみを保持し、続く第二及び第三の細胞質シグナル伝達配列のクローニングを可能にする。このクローニング方法は、各シグナル伝達配列間に２アミノ酸スペーサー（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）を生じる。
【００８４】
ａ）ζシグナル伝達カセット（Ｂｃｌ  ＩからＢａｍＨ  Ｉフラグメント）
これは、ヒトＴＣＲζ鎖の残基３１〜１４２からなり（Ｗｅｉｓｓｍａｎ他、１９８８；Ｍｏｉｎｇｅｏｎ他、１９９０）、ｐＨＭＦ４９２（国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ００／０１４５６に記載のζキメラ受容体）由来のオリゴＦ３４７２９及びＦ３４７３０を用いてＰＣＲクローニングし、制限酵素ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩで消化した。
【００８５】
ｂ）ＣＤ２８シグナル伝達カセット（Ｂｃｌ  ＩからＢａｍＨ  Ｉフラグメント）
これは、ヒトＣＤ２８の細胞内成分を含み、ＣＤ２８の残基１６２〜２０２からなる（Ａｒｕｆｆｏ及びＳｅｅｄ１９８７）。この成分は、５’リン酸基のあるオリゴＢ０７３５及びＢ０７３６をアニールすることによって作成され、これらのアニールされたオリゴの一本鎖オーバーハングは、５’ＢｃｌＩ部位の半分及び３’ＢａｍＨＩ部位の半分を形成する。
【００８６】
ｃ）ＣＤ１３４シグナル伝達カセット（Ｂｃｌ  ＩからＢａｍＨ  Ｉフラグメント）
これは、ヒトＣＤ１３４の細胞内成分を含む残基２１３〜２４９からなり（Ｌａｔｚａ他、１９９４）、５’リン酸基のあるオリゴＦ１８６０５及びＦ１８６０６をアニールすることによって作成される。これらのアニールされたオリゴの一本鎖オーバーハングは、５’ＢｃｌＩ部位の半分及び３’ＢａｍＨＩ部位の半分を形成する。
【００８７】
ｄ）ＩＣＯＳシグナル伝達カセット（Ｂｃｌ  ＩからＢａｍＨ  Ｉフラグメント）
これは、ヒトＩＣＯＳの細胞内成分を含む残基１６６〜１９９からなり（Ｈｕｔｌｏｆｆ他、１９９９）、５’リン酸基のあるオリゴＦ３４７３１及びＦ３４７３２をアニールすることによって作成される。これらのアニールされたオリゴの一本鎖オーバーハングは、５’ＢｃｌＩ部位の半分及び３’ＢａｍＨＩ部位の半分を形成する。
【００８８】
本発明の受容体を記述するのに使用した命名法は、ｓｃＦｖと、続いてスペーサー領域、次いでシグナル伝達領域である。シグナル伝達領域が２種以上の成分を含む場合、膜に最も近い領域を最初に列挙する。例えば、Ｐ６７／ｈ．２８／ζは、Ｐ６７ｓｃＦｖ結合領域、ｈ．２８細胞外スペーサー及びＴＣＲζシグナル伝達領域を持つ受容体を表す。Ｐ６７／ｈ．２８／ＣＤ２８−ζ−ＣＤ１３４は、Ｐ６７ｓｃＦｖ結合領域、ｈ．２８細胞外スペーサー及びＣＤ１３４シグナル伝達領域と融合しているＴＣＲζシグナル伝達領域と融合しているＣＤ２８シグナル伝達領域を持ち、ＣＤ２８が膜に最も近い受容体を表す。
【００８９】
実施例３：受容体の分析
ａ）発現プラスミドの構築。
キメラ受容体構築物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋から、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩからＥｃｏＲ  Ｉ制限フラグメント上の発現ベクターｐＱＢＩ−ＣＭＶ５（ＣＴ）（ＱＢＩＯｇｅｎｅ）中へサブクローニングした。空の発現ベクター（すなわち、キメラ受容体遺伝子を欠く基本ベクター）を陰性対照として用いた。
【００９０】
ｂ）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の精製及びヒト一次Ｔ細胞サブセットの単離。
全血は、ヘパリン処理したバキュテイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を用い、静脈穿刺によって健常志願者から採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で３倍に希釈し、５０ｍｌ管のＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）１５ｍｌの上に注意深く層状にし、４５０ｇで３０分間遠心分離し、ブレーキをかけずにローターを停止させた。勾配の境界にある細胞を注意深く取り出し、ＰＢＳで５倍以上に希釈し、３００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、細胞の最後のＰＢＳ洗浄を行い、２００ｇで１０分間遠心分離した。細胞を数え、適切な容積の磁気ビーズデプリーション（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）用ＭＡＣ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。次いで、ＶａｒｉｏＭａｃｓ（商標）磁気選別機及び全Ｔ細胞単離キット、ＣＤ４＋Ｔ細胞或いはＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットを製造者（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＧｍｂＨ）による指示のとおり正確に使用するＬＳカラム上のデプリーションにより、これらのＰＢＭＣから望ましい細胞集団を精製した。
【００９１】
ｃ）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）装置を用いるヒト一次Ｔ細胞の形質移入
４〜８×１０６個の精製ヒト一次Ｔ細胞を、供給キュベット中でプラスミドＤＮＡ５〜１０μｇと混合した製造者の供給「Ｔ細胞溶液」１００μｌに再懸濁し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置（ａｍａｘａ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｍｂＨ）におけるプログラムＵ−１３にかけた。直ちにキュベットから細胞を取り出し、３７℃／８％ＣＯ２において１０％ＦＣＳ、４ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（商標）、Ｕ．Ｋ．）を添加したＲＰＭＩ中で培養した。
【００９２】
ｄ）形質移入されたヒト一次Ｔ細胞の刺激
抗ヒトＣＤ３ε抗体であるＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）は、ｐＨ９．０（０．１５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４）からｐＨ２．０（０．１Ｍクエン酸）までの緩衝液のｐＨ勾配でタンパク質を溶出するタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）でハイブリドーマ上清から精製した。溶出した抗体は、２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和し、次いで、Ｄｉａｆｉｌｔｅｒリグ（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用い、ＰＢＳ、ｐＨ７．０中に濃縮して緩衝液交換した。可溶性ヒトＣＤ３３は、マウスＰ６７アフィニティーカラム（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）上のアフィニティークロマトグラフィーによりＮＳ０安定細胞系（Ｆｉｎｎｅｙ他、１９９８）由来の上清から精製した。このタンパク質は、０．１Ｍクエン酸緩衝液で溶出し、次いで、２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。可溶性ＣＤ３３は、Ｄｉａｆｉｌｔｅｒリグ（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＫ）を用い、ＰＢＳ、ｐＨ７．０中に濃縮して緩衝液交換した。９６ウエルプレートのウエル当たり２〜５×１０６個のＴ細胞を、ＯＫＴ３若しくはＣＤ３３又は双方をコーティングしたプレートで刺激した。プレートは、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中、室温において少なくとも２時間、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体又は／及びＣＤ３３でコーティングした。次いで、これらのプレートをＰＢＳで洗浄し、細胞の添加に先立って乾燥した。細胞は、サイトカイン産生の分析については４８時間、細胞形態の変化の分析については５日間、Ｋｉ６７発現の分析については６日間刺激した。
【００９３】
ｅ）サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＧＭ−ＣＳＦのアッセイは、製造者（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）による指示のとおり、Ｄｕｏｓｅｔキットを用いて行った。Ｎｕｎｃ（商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートは、ＰＢＳで希釈した捕捉抗体４μｇ／ｍｌと共に室温において一夜インキュベートした。次いで、それらのプレートを、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／５％ショ糖で２時間ブロックした。次いで、サンプル上清及び陽性対照タンパク質の標準滴定１００μｌを室温において２時間インキュベートし、前述同様にプレートを４回洗浄した。ビオチン化検出抗体の推奨ＰＢＳ希釈液を１時間インキュベートし、プレートを再び洗浄し、次いで、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）と共に１５分間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）基質で色検出し、続いてＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｅｘプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いて６３０ｎｍで吸光度を読み取った。標準曲線を作成し、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＩＩソフトウエア（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いてデータを分析した。
【００９４】
ｆ）細胞形態及び増殖の変化の分析
細胞形態の変化は、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／５％  ＦＣＳ）中で細胞を洗浄することによって測定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて側方散乱に対する前方散乱のドットプロットを分析した。データを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【００９５】
増殖は、増殖マーカーであるＫｉ６７の発現レベルを調べることにより分析した。１から２×１０５個の細胞を、５ｍｌの管の中で１０〜２０倍容積のＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／５％ＦＣＳ）で洗浄し、次いでｃｙｔｏｆｉｘ−ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｌに再懸濁し、４℃において２０分間インキュベートした。細胞をＰｅｒｍ−ｗａｓｈ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、同じ緩衝液２００μｌに再懸濁した。フルオレセイン標識抗Ｋｉ６７抗体（Ｄａｋｏ）抗体１０μｌを加え、細胞を４℃において３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／５％ＦＣＳ）に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。データを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【００９６】
ｇ）標的細胞の溶解
Ｔ細胞を単離して前述のように形質移入し、形質移入後３時間静置し、次いで、２×１０５個の細胞を、エフェクター細胞：標的細胞比５：１、１０：１、２０：１、４０：１及び８０：１で丸底の９６ウエルプレート中で標的細胞と共にインキュベートすることにより刺激した。標的細胞は、ヒトＣＤ３３構築物（抗原陽性）又は対照ベクター（抗原陰性）を形質移入したマウス骨髄腫ＮＳ０細胞とした。これらの標的細胞は、ＲＰＭＩ培地中で３７℃において１５分間、５μＭ  ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と共にインキュベートすることによって標識し、ＰＢＳで２回洗浄した。エフェクターＴ細胞及び標的細胞を、加湿した３７℃のインキュベーター中で４０時間インキュベートし、次いで、フローサイトメトリーにより標的細胞の生存度を分析した。ＣＦＳＥ標識標的細胞は、それらのＦＬ１チャンネル蛍光によってエフェクター細胞と区別し、生細胞は、ＦＬ３チャンネルで検出されるヨウ化プロピジウムを排除する能力によって検出した。標的細胞溶解の割合を、（エフェクター細胞非存在下の生存標的細胞のパーセント）−（エフェクター細胞存在下の生存標的細胞のパーセント）として算出した。
【００９７】
実施例４：結果
図２は、休止ヒト一次ＣＤ４＋Ｔ細胞において発現された場合、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳシグナル伝達領域を含むキメラ受容体が、細胞外リガンド結合ドメイン（Ｐ６７ｓｃＦｖ）と結合するリガンド（ＣＤ３３）の結合によってＯＫＴ３−媒介性ＩＬ−２産生を共刺激できることを示している。これらの受容体を、シグナル伝達領域を持たない対応する対照キメラ受容体と比較している。
【００９８】
図３は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ由来の細胞質シグナル伝達配列が、キメラ受容体のＴＣＲζ一次シグナル伝達領域と共に細胞質シグナル伝達領域に取り込まれた場合、細胞外リガンド結合ドメインとのリガンド結合によるこのキメラ受容体の活性化が、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦの産生で示されるように、細胞活性化をもたらすことを示している。ＴＣＲζ一次シグナル伝達領域のみを持つ対応する対照キメラ受容体に比べ、この細胞活性化は大きく亢進される。
【００９９】
図４は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ由来の細胞質シグナル伝達配列が、キメラ受容体のＴＣＲζ一次シグナル伝達領域と共に細胞質シグナル伝達領域に取り込まれた場合、細胞外リガンド結合ドメインとのリガンド結合によるこのキメラ受容体の活性化が、細胞形態の変化で示されるように、細胞活性化をもたらすことを示している。シグナル伝達領域においてＣＤ１３４或いはＩＣＯＳを含むキメラ受容体を発現する細胞は、活性化によってＴ細胞ブラストを形成する。これらのブラストは、より大きなダイビング（ｄｉｖｉｎｇ）細胞である。この細胞活性化は、ＴＣＲζ一次シグナル伝達領域のみを持つ対応する対照キメラ受容体では見られない。
【０１００】
図５は、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ由来の細胞質シグナル伝達配列が、キメラ受容体のＴＣＲζ一次シグナル伝達領域と共に細胞質シグナル伝達領域に取り込まれた場合、細胞外リガンド結合ドメインとのリガンド結合によるこのキメラ受容体の活性化が、増殖マーカーであるＫｉ６７の発現で示されるように、細胞活性化をもたらすことを示している。シグナル伝達領域においてＣＤ１３４或いはＩＣＯＳを含むキメラ受容体を発現する細胞は、活性化によって増殖する。この細胞活性化は、ＴＣＲζ一次シグナル伝達領域のみを持つ対応する対照キメラ受容体では見られない。
【０１０１】
図２〜５は、ＣＤ１３４及びＩＣＯＳが、ＣＤ２８シグナル伝達の非存在下で休止Ｔ細胞を活性化することができるという驚くべき知見を説明している。
【０１０２】
図６は、ＣＤ１３４由来の細胞質シグナル伝達配列が、キメラ受容体のＴＣＲζ一次シグナル伝達領域及びＣＤ２８二次シグナル伝達領域と共に細胞質シグナル伝達領域に取り込まれた場合、細胞外リガンド結合ドメインとのリガンド結合によるこのキメラ受容体の活性化が、ＩＬ−２、ＧＭＣＳＦ及びＩＦＮ−γの発現で示されるように、細胞活性化の亢進をもたらすことを示している。この細胞活性化は、ＴＣＲζ一次シグナル伝達領域のみを持つ対応する対照キメラ受容体並びにＴＣＲζ一次シグナル伝達領域及びＣＤ２８二次シグナル伝達領域を持つ対照キメラ受容体に比べて亢進される。
【０１０３】
図７は、休止Ｔ細胞において発現されたキメラ受容体の、標的細胞殺滅を仲介する能力に対する共刺激領域を含むことの効果を示している。ζシグナル伝達のみを含むキメラ受容体を、ζと共に、順次にＣＤ２８、ＣＤ１３４又はＩＣＯＳを含む受容体と比較した。対照（ベクター）を形質移入したＴ細胞又は抗原陰性細胞では、標的細胞殺滅は一切観察されなかった。ζ受容体は、エフェクター細胞と標的細胞の比が１０：１を超えると、刺激の４０時間以内に抗原特異的標的細胞溶解を仲介した。この標的細胞溶解は、休止Ｔ細胞において通常発現される共刺激領域（ＣＤ２８）とＴＣＲ及びＣＤ２８刺激後までは通常発現されない共刺激領域（ＣＤ１３４及びＩＣＯＳ）の双方を含めることによって亢進された。驚いたことに、ＩＣＯＳは、ＣＤ２８に比べ、はるかに標的細胞殺滅を亢進した。
【０１０４】
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【０１０５】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＣＤ１３４又はＩＣＯＳ由来の細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体、及び対照キメラ受容体を構築するためのクローニングカセットを示す図である。
【図２】休止ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において発現されたＩＣＯＳ及びＣＤ１３４共刺激受容体を介するシグナル伝達によって誘発されるＩＬ−２産生を示す図である。内因性ＣＤ３の一次刺激は、プレート結合ＯＫＴ３によって提供され、共刺激は、プレート結合ＣＤ３３を介する共刺激受容体によって提供される。
【図３】ＴＣＲζ細胞質シグナル伝達配列の他にＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達ドメインを有する休止ＣＤ８＋ヒト一次Ｔ細胞において発現されたキメラ受容体タンパク質の抗原特異的刺激によって誘発されるサイトカイン産生を示す図である。キメラ受容体の刺激は、プレート結合ＣＤ３３による。
【図４】ＴＣＲζ細胞質シグナル伝達配列の他にＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達ドメインを有する休止ＣＤ８＋ヒト一次Ｔ細胞において発現されたキメラ受容体タンパク質の抗原特異的刺激によって誘発される幼若化反応を示す図である。キメラ受容体の刺激は、プレート結合ＣＤ３３による。
【図５】ＴＣＲζ細胞質シグナル伝達配列の他にＣＤ１３４又はＩＣＯＳに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む細胞質シグナル伝達ドメインを有する休止ＣＤ８＋ヒト一次Ｔ細胞において発現されたキメラ受容体タンパク質の抗原特異的刺激によって誘導されるＫｉ６７発現を示す図である。キメラ受容体の刺激は、プレート結合ＣＤ３３による。
【図６】２種の二次シグナル伝達配列及び１種の一次シグナル伝達配列（ここで、二次シグナル伝達配列のうち１種は、ＣＤ１３４に由来する）を含む細胞質シグナル伝達ドメインを有する休止全ヒト一次Ｔ細胞において発現されたキメラ受容体タンパク質の抗原特異的刺激によって誘発されるサイトカイン産生を示す図である。キメラ受容体の刺激は、プレート結合ＣＤ３３による。
【図７】休止Ｔ細胞において発現されたキメラ受容体の、標的細胞殺滅を仲介する能力に対する共刺激領域を含むことの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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