(57)【要約】ビオチン結合ドメインが欠失され、カルボキシトランスフェラーゼドメインが欠失され、且つ機能的なビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインを有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）を含むペプチドを記載する。上記ペプチドをコードする核酸および前記核酸を含み、且つコードしたペプチドを発現する組換え宿主細胞もまた記載する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビター、殺真菌薬、および除草剤の同定方法も本明細書中に記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン結合ドメインが欠失され、カルボキシトランスフェラーゼドメインが欠失され、機能的なビオチンカルボキシラーゼドメインを有する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）を含むペプチド。
【請求項２】
前記ＡＣＣアーゼが、哺乳動物、昆虫、酵母、子嚢菌門、担子菌門、および卵菌門のＡＣＣアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記カルボキシラーゼが、ウスチラゴ・メイデス（Ustilago maydis、トウモロコシ黒穂菌）のカルボキシラーゼである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記カルボキシラーゼが、フィトフソラ・インフェスタンス（Phytopthora infestans）のカルボキシラーゼである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記カルボキシラーゼが、マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea、イネいもち病菌）のカルボキシラーゼである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記カルボキシラーゼが、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae、出芽酵母）のカルボキシラーゼである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記カルボキシラーゼがヒトのカルボキシラーゼである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１７〜配列番号７１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドがモノマーである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドがソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）に結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドがソラフェンに結合し、ソラフェン解離定数が１０-7Ｍから１０-14Ｍまでである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
（ａ）水性キャリア溶液と、
（ｂ）前記水性キャリア溶液中に溶解された請求項１のペプチドと
を含む組成物であって、
前記組成物中に含まれる前記ペプチドが、前記水性キャリア溶液１ｍｌあたり０．００１ｎｇから２０ｍｇまでの量であり、
前記組成物中の前記ペプチドのソラフェン解離定数が１０-7Ｍから１０-14Ｍまでであり、
前記組成物のｐＨが５から９までである、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含み、且つコードされたペプチドを発現する、組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ａ）請求項１に記載のペプチドとビオチンカルボキシラーゼドメインに結合する能力について試験される化合物とを、前記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合できる条件下で組み合わせるステップと、
ｂ）前記化合物が前記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合するかどうかを決定するステップと
を含み、結合の存在は前記化合物がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターまたはアクチベーターであるか、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターまたはアクチベーターである可能性を示す、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターまたはアクチベーターの同定方法。
【請求項１７】
ｃ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性の阻害または促進を検出するアッセイにおいて、ステップ（ｂ）で結合すると同定された化合物を使用するステップと、
ｄ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を阻害または活性化するステップ（ｃ）で同定された化合物を選択するステップと
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）請求項１に記載のペプチドとビオチンカルボキシラーゼドメインに結合する能力について試験される化合物とを、前記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合できる条件下で組み合わせるステップと、
ｂ）前記化合物が前記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合するかどうかを決定するステップと、ここで、結合の存在は前記化合物が殺真菌薬であるか殺真菌薬である可能性を示し、
ｃ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性の阻害を検出するアッセイにおいて、ステップ（ｂ）で結合すると同定された化合物を使用するステップと、
ｄ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を阻害するステップ（ｃ）で同定された化合物を選択するステップと
を含む殺真菌薬の同定方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１の第１のペプチドと、
（ｂ）請求項１の第２のペプチドと
を組み合わせて含み、
前記第１および第２のペプチドが異なる種に由来する、キット。
【請求項２０】
前記第１のペプチドが非哺乳動物ペプチドであり、前記第２のペプチドが哺乳動物ペプチドである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
（ａ）請求項１の第１のペプチドと、
（ｂ）ビオチン結合ドメインが欠失され、カルボキシトランスフェラーゼドメインが欠失され、且つ非機能的なビオチンカルボキシラーゼドメインを有するＡＣＣアーゼを含む第２のペプチドと
を組み合わせて含み、
前記第１および第２のペプチドが同一の種に由来する、キット。
【請求項２２】
前記第１および第２のペプチドが共にＳ．セリバサエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖａｓａｅ）ペプチドである、請求項１９のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００２年８月５日に提出された米国特許仮出願番号６０／４０１，１７０号（その開示全体が参照することにより本明細書中で組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターの同定に有用であり、それにより特に殺真菌薬、殺虫剤、殺線虫剤、除草剤、および医薬品として有用なビオチンカルボキシラーゼドメインおよびそのフラグメントを含むペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）は、第１の脂肪酸生合成関連ステップを触媒し、化学的に除草剤および殺真菌薬標的とも確証されている。構造的には、ＡＣＣアーゼは、以下の３つのドメイン：ビオチンカルボキシラーゼドメイン、ビオチン結合部位、およびカルボキシトランスフェラーゼドメインから構成されるビオチン化多機能酵素である。原核生物のＡＣＣアーゼでは、ほとんどの植物のＡＣＣアーゼの色素体イソ型と同様に、３つの異なる解離可能なタンパク質上に３つのドメインが存在する。対照的に、ほとんどの真核生物のＡＣＣアーゼでは、１６０ｋＤ〜２８０ｋＤの１つのポリペプチド上に３つのドメインが存在する。その天然の状態では、真核生物の当該酵素は、典型的には、約４００〜８００ｋＤの範囲のサイズの二量体または四量体である。
【０００４】
ＡＣＣアーゼ反応は、以下の２つの部分的反応、すなわち、酵素結合ビオチン補欠分子族のＡＴＰ依存性カルボキシル化およびマロニルＣｏＡを形成するためのその後のビオチンからアセチルＣｏＡへのカルボキシル基の転移を介して２つの触媒部位で起こる。天然産物ソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）は、ＡＣＣアーゼのビオチンカルボキシラーゼ反応の阻害によって作用する広範な殺真菌薬であることが証明されている。ＡＣＣアーゼは、豊富でなく且つ不安定なタンパク質であることが公知である。これらの性質により、新規のＡＣＣアーゼインヒビターの同定が妨げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターの同定に有用であり、それにより特に殺真菌薬、殺虫剤、殺線虫剤、除草剤、および医薬品として有用なビオチンカルボキシラーゼドメインおよびそのフラグメントを含むペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態によれば、本発明は、ビオチン結合ドメインが欠失され、カルボキシトランスフェラーゼドメインが欠失され、且つ機能的なビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメイン（例えば、ソラフェンに結合することができる）を有する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）を含むペプチドに関する。このようなＢＣドメインを上記のペプチドまたはＢＣドメインと組み合わせてカウンターセレクション用薬剤として使用する本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドまたはＢＣドメインは非機能的である。
【０００７】
本明細書中で使用される、「機能的な」は、酵素的に活性な全長ＡＣＣアーゼタンパク質と類似の親和性でソラフェンに結合するＢＣドメインをいう。したがって、本明細書中で使用される、「非機能的」は、ソラフェンに結合しないＢＣドメインをいう。これらの非機能的ＢＣドメインは、インタクトなＡＣＣアーゼに組み込まれた場合に酵素活性／触媒機能に関して機能的である。
【０００８】
カルボキシラーゼ（および対応するペプチド）は、任意の適切な供給源（植物、動物（例えば、哺乳動物）、昆虫、酵母、および真菌のカルボキシラーゼ／ペプチドが含まれる）に由来してもよい。
【０００９】
本発明の他の実施形態によれば、カルボキシラーゼ（および対応するペプチド）は、ウスチラゴ・メイデスカルボキシラーゼに由来する。
【００１０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、カルボキシラーゼ（および対応するペプチド）は、フィトフソラ・インフェスタンスカルボキシラーゼに由来する。
【００１１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、カルボキシラーゼ（および対応するペプチド）は、マグナポルテ・グリセア、サッカロマイセス・セレビシエ、およびホモ・サピエンスに由来する。
【００１２】
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、各ペプチドがそれぞれビオチン結合ドメインを欠失し、カルボキシトランスフェラーゼドメインを欠失し、且つ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６に詳述したアミノ酸およびそのフラグメントを含む機能的ビオチンカルボキシラーゼドメインおよびその機能的フラグメントを有する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）である上記分子に関する。
【００１３】
本発明の他の実施形態によれば、上記分子はそれぞれモノマーである。
【００１４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明は、各カルボキシラーゼドメインがアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を調整する化合物に結合する上記分子に関する。
【００１５】
本発明の他の実施形態によれば、カルボキシラーゼドメインは、競合インヒビター、非競合インヒビターに結合し、且つソラフェンにも結合する。
【００１６】
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、ビオチン結合ドメインを欠失し、カルボキシトランスフェラーゼドメインを欠失され、且つ機能的ビオチンカルボキシラーゼドメインを有する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）を含むペプチドをコードする核酸（上記のものおよび以下にさらに記載するもの）に関する。
【００１７】
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、上記核酸を含み、且つコードされたペプチドを発現する組換え宿主細胞に関する。
【００１８】
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、ａ）上記ペプチドとビオチンカルボキシラーゼドメインに結合する能力を試験すべき化合物とを、上記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合できる条件下で組み合わせるステップと、ｂ）上記化合物が上記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合するかどうかを決定するステップとを含み、結合の存在が上記化合物がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターであるかアセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターである可能性を示す、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターまたはアクチベーターの同定方法に関する。このような化合物は、農薬（殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌薬および／または除草剤が含まれるが、これらに限定されない）および／または医薬品（抗真菌薬が含まれるが、これに限定されない）の候補であり、且つ農薬および／または医薬品として有用である。
【００１９】
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、ｃ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性のインヒビターを検出するアッセイにおいてステップ（ｂ）で結合と同定された化合物を使用するステップと、ｄ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を阻害するステップ（ｃ）で同定された化合物を選択するステップとをさらに含む、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターの同定方法に関する。
【００２０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明は、ａ）上記のペプチドと上記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合する能力を試験すべき化合物とを、上記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合できる条件下で組み合わせるステップと、ｂ）上記化合物が上記ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合するかどうかを決定するステップと、ここで、結合の存在は上記化合物が殺真菌薬であるか殺真菌薬である可能性を示し、ｃ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性の阻害を検出するアッセイにおいてステップ（ｂ）で結合と同定された化合物を使用するステップと、ｄ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を阻害するステップ（ｃ）で同定された化合物を選択するステップとを含む、殺真菌薬の同定方法に関する。
【００２１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明は、上記方法を実施するための上記のペプチドまたは化合物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、本発明の好ましい実施形態を示された添付の図面を参照して以後より完全に記載される。しかし、本発明は、異なる形態を実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではない。むしろ、この開示が詳細且つ完全であり、当業者に本発明の範囲が完全に伝達されるように、これらの実施形態を提供する。本明細書中で引用された米国特許の全引例の開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
【００２３】
新規のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）インヒビターの発見のための組換え単離ビオチンカルボキシラーゼドメインの使用が本明細書中に記載される。担子菌ウスチラゴ・メイデスのＡＣＣアーゼ遺伝子由来のビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインを、単離し、クローニングし、発現し、そして特徴付けた。単離ＢＣドメインは、全長タンパク質と類似の高親和性ソラフェン結合特性を有することが示された。しかし、全長タンパク質（図１）と対照的に、ＢＣドメインは、有意により小さく、且つより高いレベルで発現することができ、より安定であり、且つモノマーとして存在する。単離ＢＣドメインは、新規のＡＣＣアーゼインヒビターのスクリーニングに有用である。卵菌フィトフソラ・インフェスタンス由来のＢＣドメインもクローニングした。この生物由来の全長ＡＣＣアーゼ配列は公開されていない。ウスチラゴ遺伝子で同定されたソラフェン結合ドメインに隣接する配列と相同性を示す公開されたＥＳＴ由来のプライマーを使用したＰＣＲを使用して適切なフラグメントをクローニングした。組換え発現したフィトフソラＢＣドメインは高親和性ソラフェン結合を示した。Ｍ．グリセア、Ｓ．セレビサエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、およびＨ．サピエンス由来のＢＣドメインもまた同様にクローニングされており、抗親和性ソラフェン結合を示すことが決定され、遠縁の生物へのこのアプローチの適用可能性が証明された。
【００２４】
本発明の説明で使用されたテクノロジーは、特定の実施形態の説明のみを目的とし、本発明の制限を意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他で明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。
【００２５】
本明細書中で使用される、「単離」核酸（例えば、「単離ＤＮＡ」または「単離ゲノムＲＮＡ」）は、天然に存在する生物またはウイルスの少なくともいくつかの他の成分（例えば、細胞またはウイルス構造成分または他のポリペプチド）から分離されているか実質的に遊離した核酸または核酸と結合した一般に見出される核酸を意味する。
【００２６】
同様に、「単離」ポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの少なくともいくつかの他の成分（例えば、細胞またはウイルス構造成分または他のポリペプチド）から分離されているか実質的に遊離したポリペプチドまたはポリペプチドと結合した一般に見出される核酸を意味する。本明細書中で使用される、用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、同一の意味を有する。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「欠失された」又は「欠失」は、一般的用途に基づいて特定のセグメントの全欠失またはセグメントを作動不可能もしくは非機能的にする（例えば、機能的ペプチドをコードしない。ここで、「機能的」はソラフェンへの結合能力と定義する）ための特定のセグメントの十分な部分の欠失のいずれかを意味する。例えば、米国特許第６，１８０，３６２号および米国特許第５，６８９，０３９号を参照のこと。
【００２８】
本明細書中で使用される、用語「アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性の調整」は、化合物の酵素活性を変化させる能力をいう。変化は、酵素活性の増減または化合物の非存在下で認められるもの以外の様式で酵素を機能させることによってもよい。
【００２９】
また、本明細書中で使用される、用語「アクチベーター」は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を開始および／または増強する化合物（例えば、アゴニスト）の能力をいう。
【００３０】
本明細書中で使用される、用語「インヒビター」は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を減少および／または終結させる化合物（例えば、アンタゴニスト）の能力をいう。
【００３１】
本明細書中で使用される、「試験化合物」は、ビオチンカルボキシラーゼドメインに結合できる条件下で、ビオチンカルボキシラーゼドメインを結合することができる化合物をいう。結合の存在は、化合物がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターであるか、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターである可能性を示す。さらに、ビオチンカルボキシラーゼドメインへの化合物の結合は、化合物が殺真菌薬、殺虫剤、殺線虫剤、または除草剤である可能性があるか、医薬品（例えば、ヒトまたは動物被験体の体重増加を減少、調節、阻害、または制御する化合物、詳細にはヒトまたは哺乳動物ＡＣＣ２のインヒビターである化合物、より詳細には好ましくはヒトまたは哺乳動物ＡＣＣ２を阻害または拮抗し、且つヒトまたは哺乳動物ＡＣＣ１を阻害または拮抗しない化合物を）である可能性があることを示し得る（例えば、Ｌ．Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，２６１３（３０  Ｍａｒｃｈ  ２００１）を参照のこと）。さらに、試験化合物の結合は、ＢＣドメインと試験化合物との間の結合相互作用が高い特異的結合をいう。ＢＣドメイン複合体の解離定数は、約１０-4Ｍから約１０-14Ｍまで、より好ましくは約１０-7Ｍ〜約１０-14Ｍ、さらにより好ましくは約１０-8Ｍ〜約１０-14Ｍ、最も好ましくは２×１０-9Ｍ未満である。試験化合物を、任意の利用可能な手段（下記の化学進化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）過程が含まれるが、これに限定されない）によって同定することができる。
【００３２】
本明細書中に開示のアミノ酸配列を、アミノ→カルボキシ方向（左から右）で示す。アミノ基およびカルボキシル基を、配列中に示さない。ヌクレオチド配列を、本明細書中で、５’→３’方向（左から右）での一本鎖のみで示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会または米国特許法規則１．８２２条および確立された用途に関する（アミノ酸についての）三文字表記によって推奨された様式で示す。例えば、Ｐａｔｅｎｔ  Ｉｎ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ，９９−１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）を参照のこと。
【００３３】
一般に、用語「ペプチド」は、生物活性（例えば、ソラフェンに結合する能力）を有するアミノ酸の分子鎖をいう。必要に応じて、例えば、グリコシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化によってインビボおよび／またはインビトロで修飾することができるので、特に、オリゴペプチドおよびポリペプチドが含まれる。しかし、本発明のペプチドは、開示のペプチドを含み得る天然のタンパク質まで拡大しないと理解される。本明細書中に開示のペプチドを、例えば、当該分野で公知の合成または組換え技術によって得ることができる。アミノ酸配列および核酸配列は、さらなる残基を含んでいても除外してもよく（Ｎ末端もしくはＣ末端アミノ酸または５’もしくは３’配列の付加または欠失など）、配列が上記基準（生物活性（例えば、ソラフェンへの結合能力）の維持が含まれる）を満たす限り、なおさらに本質的な本明細書中の開示と同様であり得るとも理解される。したがって、機能的ビオチンカルボキシラーゼドメイン（例えば、ソラフェン結合）が保持される限り、約１０、２０、３０、または約４０個までのアミノ酸をペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のいずれかまたは両方から欠失することができる。このようなペプチドの例は、本明細書中に記載の配列番号１４、１６、および１７〜７１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドである。ヒトＡＣＣ１およびＡＣＣ２のＢＣドメインについて、機能的ビオチンカルボキシラーゼドメイン（例えば、ソラフェン結合）が保持される限り、１０２および２４４個までのアミノ酸を、それぞれＮ末端のみからまたは上記Ｃ末端欠失と組み合わせて欠失させることができることに留意のこと。
【００３４】
本明細書中に記載の、「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖であり、且つセンスまたはアンチセンス鎖を示し得るオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチド、およびゲノムまたは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡをいう。ＡＣＣアーゼビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインをコードする適切な核酸配列（すなわち、ビオチン結合ドメインが欠失し、カルボキシトランスフェラーゼドメインが欠失しているＡＣＣアーゼ）には、例えば、ウスチラゴ・メイデスＢＣドメインをコードする核酸が含まれる。このようなものの例を、本明細書中で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５として記載する。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドには、本明細書中に開示のペプチドと相同であり、且つ本質的に同一の生物学的特性を有するペプチドをコードするもの、例えば、本明細書中に配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５として開示のＤＮＡ配列が含まれる。この定義は、その天然の対立遺伝子配列を含むことが意図される。したがって、本発明の単離ＤＮＡまたはクローニングされた遺伝子は、任意の起源の種でもよい。したがって、任意の１つまたは複数の本明細書中に配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５として開示のＤＮＡ配列とハイブリッド形成し、且つＡＣＣアーゼＢＣドメインの発現をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。本発明のタンパク質またはペプチドの発現をコードする他のポリヌクレオチドを本明細書中の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５のＤＮＡとハイブリッド形成させる条件を、公知の技術によって決定することができる。
【００３６】
例えば、このような配列のハイブリッド形成を、標準的なハイブリッド形成アッセイにおいて本明細書中の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５のＤＮＡに対して低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはストリンジェントな条件下（例えば、３７℃での５×Ｄｅｎｈａｒｄ液、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥを含む３５〜４０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーに代表される条件；４２℃での５×Ｄｅｎｈａｒｄ液、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥを含む４０〜４５％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーに代表される条件；および４２℃での５×Ｄｅｎｈａｒｄ液、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥを含む５０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーに代表される条件）で行うことができる。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照のこと。一般に、本発明のタンパク質またはペプチドをコードし、且つ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５のＤＮＡとハイブリッド形成する配列は、例えば、１つまたは複数の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５と少なくとも６０％または７５％同一または相同、８５％同一または相同、９０％同一または相同、さらに９５％またはそれ以上同一または相同である。
【００３７】
数学的アルゴリズムを使用して、２つの配列の同一率を決定することができる。数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７を修正したＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズム；Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同アラインメントアルゴリズム；およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８の類似性検索法である。
【００３８】
配列同一性の決定のためのこれらの数学的アルゴリズムを基本とした種々のコンピュータ実行プログラムがデザインされている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）上記のアルゴリズムに基づく。本発明のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得るための検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム（スコア＝１００、ワードレングス＝１２）を使用して実行することができる。本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム（スコア＝５０、ワードレングス＝３）を使用することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載のギャップＢＬＡＳＴの使用によってギャップアラインメントを得ることができる。分子間の距離関係を検出するために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）上記を参照のこと。全ＢＬＡＳＴプログラムについて、各プログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。
【００３９】
さらに、本発明のタンパク質もしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、および１５のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチド、または上記と配列同一性または相同性を有するが、例えば、遺伝コードの縮重によってコドン配列が異なるポリヌクレオチドも本発明の態様である。遺伝コードの縮重（異なる核酸配列により同一のタンパク質またはペプチドがコードされる）は文献で周知である。例えば、Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，７５７，００６号の表１の第２列を参照のこと。
【００４０】
クローニングされた遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換宿主細胞、タンパク質、およびタンパク質フラグメントの産生は周知である。例えば、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，７６１，３７１号（第６段落３行目〜第９段落６５行目）；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，８７７，７２９号（第４段落３８行目〜第７段落６行目；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇに付与された米国特許第４，９１２，０３８号（第３段落２６行目〜第１４段落１２行目）；およびＷａｌｌｎｅｒに付与された米国特許第４，８７９，２２４号（第６段落８行目〜第８段落５９行目）を参照のこと。
【００４１】
ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、所望の量が得られるまで一連のサイクルで標的ＤＮＡ分子の相補鎖を同時にコピーするための技術である。第１に、標的領域に隣接するＤＮＡに相同なヌクレオチド配列を有するプライマーを合成する。ＤＮＡを加熱して相補鎖を分離し、その後プライマーを冷却して隣接配列に結合させる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを添加し、一連の複製サイクルで反応を進行させる。２０サイクルで１００万倍の増幅因子が得られ、３０サイクルで１０億倍の増幅因子が得られる。
【００４２】
ベクターは、複製ＤＮＡ構築物である。本明細書中に記載のベクターを使用して、本発明のタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを増幅するか、本発明のタンパク質またはペプチドを発現する。発現ベクターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が適切な宿主中で本発明のタンパク質またはペプチドを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されている複製可能なＤＮＡ構築物である。このような調節配列の必要性は、選択された宿主および選択した形質転換法によって変化する。一般に、調節配列には、転写プロモーター、転写を調節するための任意選択的なオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。複製ベクターは、発現調節ドメインに必要ない。通常、複製起点および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子によって付与される宿主中で複製する能力のみが必要である。
【００４３】
ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、レトロウイルス、および組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、組換えによって宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）を含む。ベクターは、複製されて宿主ゲノムから独立して機能するか、ある場合には、ゲノム自体に組み込まれてもよい。発現ベクターは、宿主生物中で発現されて操作可能な遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターおよびＲＮＡ結合部位を含むべきである。
【００４４】
ＤＮＡ領域は、これらが互いに機能的に関連する場合に、作動可能に連結されるか作動可能に関連づけられる。例えば、配列の転写を調節する場合、プロモーターがコード配列に作動可能に連結され、翻訳するために位置付けられる場合、リボゾーム結合部位がコード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結する」は隣接を意味し、リーダー配列の場合、隣接および読み取り段階を意味する。
【００４５】
形質転換宿主細胞は、本発明のタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされており、且つタンパク質またはペプチドを発現する必要のない細胞である。しかし、本発明では、細胞は、タンパク質またはペプチドを発現することが好ましい。
【００４６】
適切な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、または高等真核生物の細胞が含まれる。原核生物宿主細胞には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、大腸菌（E. coli）またはバチルス）が含まれる。高等真核細胞には、下記の哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。宿主細胞の例は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）である。広範な適切な原核生物ベクターおよび微生物ベクターが利用可能である。大腸菌は、典型的には、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２，９５（１９７７）を参照のこと。組換え微生物発現ベクターで最も一般に使用されているプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５，６１５（１９７８）およびＧｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１，５４４（１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，４０５７（１９８０）およびＥＰＯ  Ａｐｐ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．３６，７７６）、およびｔａｃプロモーター（Ｈ．Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，２１（１９８３）が含まれる。プロモーターおよびシャイン−ダルガルノ配列（原核生物宿主発現用）は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結される（すなわち、伝令ＲＮＡからＤＮＡへの転写を促進するために位置付けられる）。
【００４７】
発現ベクターは、宿主生物によって認識されるプロモーターを含むべきである。これは、一般に、意図する宿主から得たプロモーターを意味する。組換え細菌発現ベクターで最も一般的に使用されているプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５，６１５（１９７８）およびＧｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１，５４４（１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，４０５７（１９８０）およびＥＰＯ  Ａｐｐ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．３６，７７６）、およびｔａｃプロモーター（Ｈ．Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，２１（１９８３）が含まれる。これらが一般的に使用されているが、他の微生物プロモーターも適切である。当業者がプラスミドまたはウイルスベクター中でタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能にライゲーションすることができる多数のヌクレオチド配列に関する詳細が発表されている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０，２６９（１９８０））。プロモーターおよびシャイン−ダルガルノ配列（原核生物宿主発現用）は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結される（すなわち、タンパク質伝令ＲＮＡからＤＮＡへの転写を促進するために位置付けられる）。
【００４８】
酵母培養物などの真核微生物を、適切なタンパク質コードベクターで形質転換することができる。例えば、米国特許第４，７４５，０５７号を参照のこと。サッカロマイセス・セレビシエは、下等真核宿主微生物間で最も一般的に使用されているが、多数の他の株も一般的に利用可能である。酵母ベクターは、２ミクロンの酵母プラスミド由来の複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化配列および転写終結配列、ならびに選択遺伝子を含んでもよい。プラスミドの例は、ＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２，３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７，１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０，１５７（１９８０）である。このプラスミドは、トリプトファン中での成長能力を欠く酵母の変異株のための選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５，１２（１９７７）））を含む。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換の検出のための有効な環境が得られる。
【００４９】
酵母ベクター中の適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，２０７３（１９８０）または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７，１４９（１９６８）；およびＨｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７，４９００（１９７８）（エノラーゼ、グルセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムスターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど）のプロモーターが含まれる。酵母発現で使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰＯ  Ｐｕｂｌｎ．Ｎｏ．７３，６５７にさらに記載されている。
【００５０】
多細胞生物由来の細胞の培養物は、組換えタンパク質合成のための望ましい宿主である。原則的に、脊椎動物または無脊椎動物培養物（昆虫細胞が含まれる）のいずれに由来しても、任意の高等真核細胞培養物は機能し得る。細胞培養におけるこのような細胞の増殖は、日常的な手順となりつつある。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）を参照のこと。有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶ、およびＭＤＣＫ細胞株である。このような細胞のための発現ベクターには、通常、（必要に応じて）複製起点、リボゾーム結合部位と共に発現すべき遺伝子の上流に存在するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が含まれる。
【００５１】
脊椎動物細胞の形質転換で使用される発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は、しばしばウイルス供給源によって得られる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、およびサルウイルス４０（ＳＶ）に由来する。例えば、米国特許第４，５９９，３０８号を参照のこと。共にＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、初期および後期プロモーターが有用である。Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３，１１３（１９７８）を参照のこと。さらに、このような調節配列が選択した宿主細胞に適合する場合、タンパク質プロモーター、調節配列および／またはシグナル配列を使用することもできる。
【００５２】
ＳＶ４０または他のウイルス起源（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）に由来し得るものなどの外因性起源を含めるためのベクターの構築によるか、宿主細胞染色体複製機構によって複製起点を得ることができる。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。
【００５３】
Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌに付与された米国特許第４，７４５，０５１号および米国特許第４，８７９，２３６号に記載のように、昆虫細胞（例えば、培養スポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda）細胞）などの宿主細胞およびバキュロウイルス発現ベクター（例えば、オウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＭＮＰＶ、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、ラチプルシア・オウ（Rachiplusia ou）ＭＮＰＶ、またはガレリア・オウ（Galleria ou）ＭＮＰＶ由来のベクター）などの発現ベクターを使用して、本発明の実施に有用なタンパク質を作製することができる。一般に、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリヘドリン転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位まで範囲の位置でのバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの転写調節下でのポリヘドリン遺伝子に挿入された発現すべき遺伝子を含むバキュロウイルスゲノムを含む。
【００５４】
本発明のタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養物由来のタンパク質の発現および回収に適切な条件下で培養することができる。形質転換細胞によって産生されたタンパク質を、使用した配列および／またはベクターに依存して細胞内で分泌させるか含めることができる。当業者に理解されるように、本発明のタンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を介してタンパク質またはペプチドが直接分泌されるシグナル配列を含むようにデザインすることができる。他の構築物を使用して、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列にタンパク質またはペプチドをコードする配列を連結することができる。このような精製促進ドメインには、固定化金属上で精製されるヒスチジン−トリプロファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製されるプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）で利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されない。精製ドメインと本発明のタンパク質またはペプチドとの間への第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的な配列などの切断可能なリンカー配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の封入を使用して、精製を容易にすることができる。１つのこのような発現ベクターにより、本発明のタンパク質またはペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前の６つのヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質を発現する。Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載のように、ヒスチジン残基により、ＩＭＡＣ（固定金属イオン親和性クロマトグラフィ）での精製が容易になる一方で、エンテロキナーゼ切断部位により、融合タンパク質からの本発明のタンパク質またはペプチドの精製手段が得られる。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）に記載されている。
【００５５】
ＡＣＣアーゼ活性を分光光度測定および同位体交換技術によって測定することができる。ＡＣＣアーゼ活性を、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを使用したＡＤＰの産生とＮＡＤＰＨの酸化との組み合わせによって分光高度的に測定した。このアッセイを使用して、基質としてのアセチルＣｏＡの供給によって全ＡＣＣアーゼ活性を測定した。全長ウスチラゴＡＣＣアーゼの活性を、図２に詳述する。ＡＣＣアーゼがアセチルＣｏＡおよび重炭酸塩からのマロニルＣｏＡの形成を触媒するという事実に基づいて、ＡＣＣアーゼ活性を同位体交換によって測定した。重炭酸塩からマロニルＣｏＡ産物への14Ｃの組み込みをモニターするように同位体交換アッセイをデザインする。
【００５６】
ＢＣドメインへの結合を検出するために結合アッセイを実施し、それにより試験化合物を同定することができる。結合アッセイの実施方法は、当該分野で周知である。典型的には、平衡結合条件下での一定量の標的ペプチドとの高濃度の放射性標識リガンドのインキュベーションおよびその後の特異的に結合した標識プローブ量の決定によって、放射性標識リガンドの結合の直接測定を行う。「特異的に結合した」を、全結合−非特異的結合（「非特異的結合」を、過剰な非標識リガンドの存在下で決定する）と定義する。ＢＣドメインとソラフェンとの間の結合相互作用の強度は高く、全長ＡＣＣアーゼへのソラフェンの結合に匹敵する（図２、３、および４）。ＢＣドメイン複合体の解離定数（例えば、ソラフェンについて）は、約１０-4Ｍから約１０-14Ｍまで、好ましくは約１０-7Ｍ〜約１０-14Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０-8Ｍ〜約１０-14Ｍ、さらにより好ましくは２×１０-9Ｍ未満である。共有または非共有相互作用によって複合体を形成することができる。一旦標的タンパク質に結合する放射性標識リガンドを有すると、競合結合アッセイを使用して、同一の部位への結合について放射性標識していない任意のさらなる化合物をアッセイすることができる。平衡条件下での高濃度の試験化合物との一定濃度の標的タンパク質および放射性標識リガンドのインキュベーションおよびその後の特異的に結合した放射性標識リガンドの量の決定よって競合結合アッセイを行う。
【００５７】
したがって、本発明のさらなる態様は、（ａ）水性キャリア溶液および（ｂ）前記水性キャリア溶液中に可溶化したペプチド（または本明細書中に記載のＡＣＣアーゼＢＣドメイン）を含む組成物である。組成物は、特に、本明細書中に記載の結合またはスクリーニングアッセイに有用である。一般に、「可溶化」は、本明細書中に記載の結合事象（例えば、ソラフェン結合）での関与に利用することができる組成物中にペプチドを作製する様式で、ペプチドをキャリア溶液均一または一様に溶解または分散させることを意味する。キャリア溶液は、他の典型的な任意選択的成分（緩衝液、ｐＨ調整剤、防腐剤など）と共に水を含むか、それらからなるか、本質的にそれらからなる任意の適切な任意の水溶液であってもよい。一般に、ペプチドは、任意の適切な量（例えば、水性キャリア溶液１ｍｌあたり０．００１、０．０１、または０．１ｎｇから０．１、１、１０、または２０ｍｇまで）で組成物中に含まれる。ペプチドは、組成物中で、結合アッセイに適切な物理的形態であり、それにより前記組成物のソラフェン解離定数は、例えば、１０-4Ｍから１０-14Ｍまでである。組成物のｐＨは、ｐＨ５〜９などの結合研究に適切なｐＨでもよく、このｐＨに調整することができる。好ましくは、本明細書中で参照した化学進化過程を使用して、ＢＣドメインに結合する試験化合物を同定することができる。このような例では、組成物は、１０-8Ｍ〜１０-9Ｍのソラフェン解離定数を有するＢＣドメインペプチドを含む水性キャリア溶液から構成されるべきである。ＢＣドメインを０．０２〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用し、平衡結合を起こすことができるように１つまたは複数のＲＮＡ結合試験化合物と組み合わせてｐＨ７で１時間インキュベートした。適用したストリンジェンシーレベルに依存して、低親和性試験化合物がＢＣドメインペプチドから洗浄除去され、高親和性結合化合物が保持される。保持された化合物は、潜在的なＡＣＣアーゼインヒビターである。
【００５８】
あるいは、ＡＣＣアーゼインヒビターを、ソラフェンとの競合結合原理に基づいたスクリーニングで同定することができる。前記のように、競合結合を検出するための１つの方法は、放射性標識ソラフェンの使用である。このような例では、組成物は、ソラフェン解離定数が１０-8Ｍ〜１０-9ＭであるＢＣドメインペプチドを含む水性キャリア溶液から構成されるべきである。平衡結合を起こすことができるために、ＢＣドメインの濃度の１０％〜９０％の3Ｈ−ソラフェン（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌを超える比活性）、１０-4Ｍ〜１０-10Ｍの濃度の１つまたは複数の試験化合物と組み合わせてｐＨ７で１時間またはそれ以上インキュベートしたＢＣドメインを５ｎＭ〜１０ｎＭの濃度で使用する。ＢＣドメインに結合したまま3Ｈ−ソラフェンの量を決定する。ソラフェン結合量の減少は、試験化合物がＢＣドメインと同一の部位に結合することができることを示すので、潜在的なＡＣＣアーゼインヒビターを示す。
【００５９】
ソラフェンとの競合結合の原理に基づいたＡＣＣアーゼインヒビターをスクリーニングするための別の好ましい方法は、蛍光偏光アッセイである。この方法では、ＢＣドメインに対して高い親和性を保持する蛍光ソラフェン誘導体は、標準的な合成手順を介して獲得されるか調製される必要がある。このような例では、組成物は、１０-6Ｍ〜１０-9Ｍの蛍光ソラフェン誘導体解離定数を有するＢＣドメインペプチドを含む水性キャリア溶液から構成されるべきである。蛍光プローブの解離定数とほぼ等しい濃度でＢＣドメインを使用し、平衡結合を可能にするために１０-4Ｍ〜１０-10Ｍの濃度の１つまたは複数の試験化合物の存在下で１時間またはそれ以上インキュベートする。次いで、蛍光偏光を測定する。蛍光偏光は、結合した蛍光−ソラフェン誘導体の量に正比例し、蛍光偏光の減少は、試験化合物がＢＣドメイン上の同一の部位に結合することができることを示すので、潜在的なＡＣＣアーゼインヒビターを示す。
【００６０】
本明細書中に記載の化学進化（ＥＣ）は、核酸に結合した第１の化学反応体のプールと遊離化学反応体のプールとの組み合わせによって産物ライブラリーが形成される過程に関する。結合した核酸は、産物ライブラリーに至る化学反応を媒介することができ、さらに、所定の所望の特徴を有する産物を富化させて産物ライブラリーから同定することができるように核酸を増幅可能である。その最も一般的な形態では、第１の反応体（Ｒ）と試験混合物中の各核酸（１０2〜１０8個の無作為の配列を有する核酸を含有する）との結合によって核酸−反応体試験混合物を形成する。核酸−反応体試験混合物を、第１の反応体（Ｒ）と組み合わせる他の遊離反応体で処理して異なる産物を形成する。核酸試験混合物（ＮＡ）から、個別の核酸配列が異なる形状の産物（例えば、配列Ａ、配列Ｂ、および配列Ｃと示す）の形成の促進に関連して示すことに留意することが重要である。産物は、形状、反応性、または形状および反応性の両方が異なってもよい。標的との結合または反応によって所望の産物の形状または反応性を分割する。タンパク質、小分子、脂質、糖類などは全て標的（Ｔ）の例である。標的との結合または反応後、配列Ｂおよび配列Ｃと結合する非相互作用産物を、配列Ａと分離し、破棄する。次いで、当業者に公知の種々の方法によって核酸配列Ａを増幅する。次いで、配列Ａを使用して、特定の反応の促進による所望の産物のアセンブリを容易にして出発反応体の混合物での処理において選択産物が形成される。典型的な反応では、配列Ａを第１の反応体に再結合することができるが、この再結合は常に必要なわけではない。これは理想的な場合であり、多数の例では、核酸促進剤は、出発混合物由来の１つを超える産物を組み立てることができるが、全ての選択した産物が標的との所望の結合性または化学反応性を有するわけではない。ＥＣは、米国特許第６，０４８，６９８号；同第６，０３０，７７６号；同第５，８５８，６６０号；同第５，７８９，１６０号；同第５７２３，５９２号；および同第５，７２３，２８９号により完全に記載されている。
【００６１】
要するに、ウスチラゴｐＣＳ８に例示されるＢＣペプチドドメインを高レベルで発現し、均一に精製することができ、典型的な実験条件下で安定であり、全長ＡＣＣアーゼに匹敵する高親和性ソラフェン結合を示す（図５）。したがって、標的ベースの親和性結合スクリーニングおよび選択（ＡＣＣアーゼインヒビターの同定のための化学進化選択が含まれるが、これらに限定されない）で使用するための優れた薬剤である。
【００６２】
いくつかのアッセイでは、本発明の第１のペプチドをカウンターセレクション用薬剤として作用する第２のペプチドと（例えば、連続的または同時に）組み合わせて使用することが望ましい。１つの実施形態のために、カウンターセレクション用薬剤は、第１のペプチドと同種のペプチド（すなわち、第１のペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有する）でもよいが、第１のペプチドと非特異的に結合する（例えば、ソラフェン結合部位ではない）薬剤に対して選択するための（例えば、欠失または置換変異の移入による）非機能的ＢＣドメインを有する。例は、Ｓ．セリバサエの第１のペプチドおよびソラフェン結合を崩壊させる変異（例えば、Ｓ７７→Ｙ）を含む対応するＳ．セリバサエの第２のペプチドである。別の実施形態では、第２のペプチドカウンターセレクション用薬剤は、第１の種（第２の種ではない）に結合して作用する薬剤を検出するための第１のペプチドと異なる種のペプチドでもよいが、機能的ＢＣドメインを有する。例えば、第１のペプチドは非哺乳動物であり、第２のペプチドは（例えば、哺乳動物またはヒトのＡＣＣアーゼに対して活性な薬剤に対して選択するための）哺乳動物またはヒトでもよい。種がヒトなどのように２つの異なるＡＣＣアーゼを含む場合、第１および第２のペプチドは同種であるが異なるＡＣＣアーゼ（例えば、ヒトＡＣＣ１およびヒトＡＣＣ２）でもよい。いずれかの実施形態では、第１および第２のペプチドを、これら自体または共に保存、利用、および／または包装することができる、任意選択的に本明細書中に記載のアッセイでのその使用のための説明書を含む上記の組成物／処方物のいずれかのキットまたはセットとして共に得ることができる。
【００６３】
本発明は主にウスチラゴ・メイデス（図６；配列番号２）、フィトフソラ・インフェスタンス（図７；配列番号４）、マグナポルテ・グリセア（配列番号６）、サッカロマイセス・セレビシエ（配列番号８）、およびホモ・サピエンス（配列番号１０、１２、１４、１６）から単離したＡＣＣアーゼＢＣドメインに関して記載しているが、本明細書中に記載の生物を遠縁の生物と置換することができるをことが認識される。例えば、本発明のペプチドを、他の真菌、昆虫、または植物種（本明細書中に記載の界、門、綱、目、または科の任意の他のメンバーならびに線虫および哺乳動物が含まれる）から単離することができる（以下の表１〜３に記載のものなど）。
【００６４】
【表１】
2006500013.tif 000002
【００６５】
【表２】
2006500013.tif 000003
【００６６】
【表３】
2006500013.tif 000004
【００６７】
本発明を以下の本明細書中に記載の非限定的な実施例および図面でより詳細に説明し、以下の略語を使用した。ｐＣＳ８−ウスチラゴ・メイデス、担子菌類、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグＢＣドメイン、６４．６ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ  １１−ウスチラゴ・メイデス、担子菌類、Ｃ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ（２４１．４ｋＤａタンパク質）を有する全長ＡＣＣアーゼ；ｐＣＳ  １５−フィトフソラ・インフェスタンス、卵菌Ｃ末端Ｈｉｓ−タグＢＣドメイン、６３．３ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ１６−サッカロマイセス・セレビシエ、野生型Ｎ末端Ｈｉｓ−タグＢＣドメイン、６８．０ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ  １６Ｍ−  サッカロマイセス・セレビシエ、Ｓ７７Ｙ変異体、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグＢＣドメイン、６８．０ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ１７−マグナポルテ・グリセア、子嚢菌、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグＢＣドメイン、６８．２ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ１９−ホモ・サピエンス、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグＡＣＣ１  ＢＣドメイン、７１．２ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ２０−ホモ・サピエンス、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグＡＣＣ２ＢＣドメイン、８６．７ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ２０１−大腸菌、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグＢＣタンパク質、５１．６ｋＤａタンパク質；ｐＣＳ２０４−サッカロマイセス・セレビシエ、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ野生型全長ＡＣＣアーゼタンパク質、２５４．３ｋＤａタンパク質；およびｐＣＳ２０４Ｍ−サッカロマイセス・セレビシエ、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグＳ７７Ｙ変異全長ＡＣＣアーゼタンパク質、２５４．３ｋＤａタンパク質。
【実施例１】
【００６８】
Ａ．ＢＣドメインペプチドの調製
Ｎ末端またはＣ末端ｈｉｓ−タグを有するＢＣドメイン（ｐＣＳ５８については図５に例示）のためのタンパク質発現構築物で形質転換した大腸菌培養物を、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）の添加によってＯＤ600＝０．５にてインキュベートした。培養物を、１８℃で一晩成長させ、回収し、−８０℃で保存した。細菌ペレットを、５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、プロテアーゼインヒビター、および１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む緩衝液中に再懸濁した。溶解物を超音波処理し、ヌクレアーゼを添加した。次いで、溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）と共に４℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液でｐＣＳ８を溶離した。ｐＣＳ８を含む画分を合わせ、硫酸アンモニウム（４０％硫酸アンモニウム）で沈殿させた。硫酸アンモニウム沈殿由来のペレットを、ＳＢ（ＳＢ＝２００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１０％グリセロール）中に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した。精製タンパク質を、−８０℃で保存した。
【００６９】
Ｂ．ＢＣドメインペプチドの精製
Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースでのｈｉｓタグ化ＢＣドメインペプチド（ｐＣＳ８について例示する）のワンステップ精製により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断したところ純度が約９０〜９５％であるタンパク質が得られ、これを使用した。この方法は、Ｃ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｆｏｕｒ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ａｂｏｌｉｓｈ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｂｙ  Ｂｉｏｔｉｎ，」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３８，ｐｐ．３３９３−３４００（１９９９）に記載の酵素の変異形態のアミノ末端に結合したヒスチジン−タグおよびニッケルアフィニティクロマトグラフィを使用して行った精製と類似している。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムからの溶離後、ｐＣＳ８タンパク質を、同体積の飽和硫酸アンモニウムの添加によって沈殿させた。次いで、沈殿したタンパク質を、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度までＳＢ中で再懸濁し、使用するまで−８０℃で保存した。この方法を、本明細書中に記載の全てのＢＣドメインの精製で使用する。いくつかの目的のためにより純度の高い調製物が必要であるかもしれないので、さらなる精製ステップを調査した。この目的のために、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースクロマトグラフィ後のシングルＵＮＯ−Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）陰イオン交換ステップにより、ｐＣＳ８が高収率で外見上均一に精製された。ＵＮＯ−Ｑは、スケールアップの影響を容易に受けやすいファーストフローマトリクスである。図８も参照のこと。
【実施例２】
【００７０】
ＡＣＣアーゼ活性アッセイ
以下の方法を使用して、ＡＣＣアーゼ活性を検出した。図９Ａおよび９Ｂも参照のこと。
【００７１】
方法１：分光光度アッセイ
ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを使用したＡＤＰの産生とＮＡＤＨの酸化の組み合わせによってＡＣＣアーゼ活性を分光光度的に測定した。このアッセイを使用して、基質としてのアセチルＣｏＡの供給による全ＡＣＣアーゼ活性または基質としての遊離ビオチンの供給によるＢＣ活性のいずれかを測定した（しかし、これは「原核生物型」ＢＣでのみ証明されていることに留意のこと）。このアッセイは、精製タンパク質に最も適切である。このアッセイを使用して、単離ＢＣドメインの結合によって同定された化合物の酵素活性（ＥＣプロセスが含まれるが、これに限定されない）について試験する。
【００７２】
このアッセイを確立するために、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：３３９３−３４００，１９９９）にしたがって大腸菌ビオチンカルボキシラーゼを最初にクローニングして発現させた。図９Ａで認められるように、遊離ビオチン基質に対する大腸菌ＢＣ活性を容易に検出可能である。アッセイ条件下で、活性は４０ｎｇタンパク質ほどしか検出されず、最大速度は２μｇと２０μｇとの間のｐＣＳ２０１に達した。しかし、複数のｐＣＳ８調製物での繰り返す場合、７μｇまでのタンパク質を使用しても活性は検出されなかった。本発明者らは、このような活性が真核生物ＢＣドメインを使用して検出されないので、予想通りｐＣＳ８は遊離ビオチンをカルボキシル化することができないと結論付けた。
【００７３】
全ＡＣＣアーゼ活性を測定するために、全長ウスチラゴ・メイデスＡＣＣアーゼをクローニングし、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ（ｐＣＳ１１）を有する大腸菌で発現させ、精製した。図９Ｂ（ｉ）で認められるように、３４０ｎｍでの吸光度の減少によって検出されたＮＡＤＨの時間依存性酸化は、ｐＣＳ１１タンパク質およびアセチルＣｏＡ基質の両方に依存した。
【００７４】
方法２：14Ｃ同位体交換アッセイ
ＡＣＣアーゼは、アセチルＣｏＡおよび重炭酸塩からのマロニルＣｏＡの形成を触媒する。重炭酸塩からマロニルＣｏＡ産物への14Ｃの組み込みをモニターするように同位体交換アッセイをデザインする。マロニルＣｏＡは酸であり且つ熱安定性であるので、未反応Ｈ14ＣＯ3-を酸性化およびその後の蒸発によって除去することができる。図９Ｂ（ｉｉ）で認められ、分光光度アッセイと一致するように、活性（14ＣのマロニルＣｏＡへの組み込みとして測定される）は、ｐＣＳ１１タンパク質およびアセチルＣｏＡ基質の両方に依存していた。これが終点アッセイであるので、これは分光光度アッセイよりも速度測定に適切ではない；しかし、粗調製物における活性の検出には優れている。単離ＢＣドメイン（ＥＣプロセスが含まれるが、これに限定されない）へのその結合によって同定される化合物の酵素活性を試験するためにも使用される。
【実施例３】
【００７５】
ソラフェン結合アッセイ
親和性ベースのスクリーニングおよび選択アッセイ（ＥＣ選択が含まれるが、これに限定されない）は、小分子の結合に依存するが、酵素活性の阻害に依存しない。したがって、酵素活性の欠損にもかかわらず、全長ウスチラゴＡＣＣアーゼの高親和性ソラフェン結合アッセイが保持される場合、ｐＣＳ８は適切な親和性ベースのスクリーニング薬または選択薬である。ソラフェンＡは、Ｓｉｂｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）で標識されたトリチウムであり、ｐＣＳ８タンパク質を使用した結合試験に使用した。簡単に述べれば、６．７ｎＭ精製ｐＣＳ８タンパク質を、種々の濃度（約０．５〜２０ｎＭ）の3Ｈ−ソラフェンを含むＰＮＴ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐＨ７．０））と室温で４５分間インキュベートした。ｐＣＳ８タンパク質（結合したリガンドを含む）を、ＮＡＰ−５脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遊離リガンドから分離し、3Ｈ−ソラフェンの結合量を、液体シンチレーションカウンティングによって決定した。２μＭの放射能を含まないソラフェンを含む二連のサンプルを使用して、非特異的結合を決定した。非線形回帰によって１部位リガンド結合式：Ｙ＝Ｂmax*Ｘ／（ＫD＋Ｘ）（Ｙ＝結合リガンドおよびＸ＝遊離リガンド）にデータを導入した。
【００７６】
ｐＣＳ８は、１つの高親和性結合部位に一致する3Ｈ−ソラフェンの可飽和結合を示した（図３）。ｐＣＳ８について示したデータは、調製物毎の変動がほとんどない独立したタンパク質調製物を使用した２つの試験から組み合わせている。ネガティブコントロールは、ｐＣＳ２０１により提供された。ｐＣＳ２０１は、ソラフェンによって阻害されないＮ末端Ｈｉｓタグ化酵素活性大腸菌ＢＣをコードする。予想されたように、ｐＣＳ２０１は高親和性ソラフェン結合を示さなかった。
【００７７】
データの非線形回帰への導入により、ソラフェン−ｐＣＳ８相互作用のＫDが１．５ｎＭと評価された（図４）。これは、ソラフェン−ｐＣＳ１１全長ＡＣＣアーゼのＫDの評価（１．６ｎＭ）と良好に一致し（図２）、ウスチラゴＡＣＣアーゼ活性のソラフェン阻害についての公開されたＫi値（１．４ｎＭ）と良好に一致する（Ｈｅｉｋｅ  Ｂｅｈｒｂｏｈｍ  Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  Ｔｅｃｈｎ．Ｕｎｉｖ．，１９９６）。したがって、ｐＣＳ８は、全長ウスチラゴＡＣＣアーゼに匹敵する高親和性ソラフェン結合を保持するので、適切な親和性ベースのスクリーニングおよび選択薬である。
【実施例４】
【００７８】
ｐＣＳ８のさらなる特徴づけ
ＳＢ可溶化ｐＣＳ８ペプチドの室温で２４時間のインキュベーション後にタンパク質分解またはソラフェン結合の喪失は認められなかった。ＳＢ可溶化ｐＣＳ８ペプチドの−８０℃で５週間の保存後（複数の凍結融解を含む）にタンパク質分解またはソラフェン結合の喪失は認められなかった。
【実施例５】
【００７９】
作製されたＢＣドメインの部分的なまとめ
本明細書中で特徴付けられ、且つ親和性ベースのスクリーニングまたは選択（化学進化を使用した選択が含まれるが、これに限定されない）での使用に十分な量で精製することができる多数のビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインおよび５つのＢＣドメインを以下に示す。ウスチラゴ・メイデス、フィトフソラ・インフェスタンス、マグナポルテ・グリセア、およびサッカロマイセス・セレビシエ由来の野生型；ならびにサッカロマイセス・セレビシエ由来の変異型。発現ドメインのアミノ酸配列アラインメントを、図１０に示す。同一の残基をアスタリスクで示し、ソラフェン結合を消失させるＳ．セラビサエ（Ｓ．ｃｅｒａｖｉｓａｅ）のＳ→Ｙ変異を太字で示す。
【実施例６】
【００８０】
マグナポルテ・グリセアＢＣドメインの作製
マグナポルテ・グリセア（子嚢菌、イネイモチ病の病原体）の全ゲノムの予備配列が、ノースカロライナ州立大学Ｒａｌｐｈ  Ｄｅａｎ研究所と共同でＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによってパブリックドメインに最近リリースされた。全長Ｍ．グリセアＡＣＣアーゼ遺伝子を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、クローニングし、配列決定した。１つの推定小イントロンを除去して全長ｃＤＮＡを作製した。ビオチンカルボキシラーゼドメインを、サブクローニングし（本発明者らのｐＣＳ８  Ｕ．メイデスＢＣドメインとのアラインメントに基づく）、ｐＥＴベクター（５’Ｈｉｓタグ）に挿入してｐＣＳ７を作製した。ｐＣＳ１７を大腸菌中で発現させ、Ｈｉｓタグ化ＢＣドメインを精製し、ソラフェン結合についてアッセイした。予想どおり、図１１に示すように、マグナポルテＢＣドメインは、高親和性ソラフェン結合を示した。
【実施例７】
【００８１】
ヒトＡＣＣアーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
ヒトにおいて少なくとも２つのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素形態が存在する。ＡＣＣ１は、肝臓および脂質生成組織において高レベルで存在する細胞質ゾル酵素であり、脂肪酸合成を担う主な種である。ＡＣＣ２は、主に心臓および筋肉組織で見出されるミトコンドリア酵素であり、脂肪酸酸化を調節すると考えられている。ヒトＡＣＣアーゼ由来のビオチンカルボキシラーゼドメインは、哺乳動物毒性に対して選択する能力を有するカウンターセレクション用薬剤として潜在的に有用かもしれない。さらに、ＡＣＣ１とＡＣＣ２のＢＣドメインを区別することができるヒトＡＣＣアーゼのアゴニストおよびインヒビターは、潜在的な薬学的適用性を有し得る。
【００８２】
両遺伝子の完全なゲノムＤＮＡ配列は利用可能である。そのＢＣドメイン（本発明者らのｐＣＳ８ウスチラゴクローンとの相同性に基づく）を、ゲノムＤＮＡ由来の小エクソンの増幅および互いにスプライシングするためのＰＣＲの使用によって首尾よくクローニングした。ＡＣＣ１  ＢＣドメインは、１８９６ｂｐ（配列番号９）のＢＣドメインｃＤＮＡを作製するために組み立てられた１４個のエクソン（１０４ｂｐ〜２３７ｂｐ長）からなる。ＡＣＣ２  ＢＣドメインは、２３２２ｂｐ（配列番号１１）のＢＣドメインｃＤＮＡを作製するために組み立てられた１４個のエクソン（１０８ｂｐ〜６６１ｂｐ長）からなる。両ＢＣドメインをｐＥＴ３０にクローニングして、３’Ｈｉｓタグ化融合タンパク質を作製した。ＡＣＣ１クローンをｐＣＳ１９と命名し、７１．２ｋＤの融合タンパク質を産生するはずである。ＡＣＣ２クローンをｐＣＳ２０と命名し、８６．７ｋＤの融合タンパク質を産生するはずである。発現分析により、ＡＣＣ１融合タンパク質が大腸菌中で低レベルで発現し、可溶性画分から精製することができることが示された。精製ｐＣＳ１９タンパク質は、高親和性ソラフェン結合を示した（図１２を参照のこと）。ウスチラゴおよびヒトのＡＣＣアーゼドメインのアラインメントを、図１３に示す。選択的農薬の同定に有用であることに加えて、ヒトＢＣドメインの特に魅力的な用途は、このようなインヒビターが体重の制御に有用であることが認められているので、ＡＣＣ２ドメインを優先的にターゲティングするがＡＣＣ１ドメインはターゲティングしない特異的インヒビターを同定することである。
【実施例８】
【００８３】
本実施例は、ｐＣＳ８が親和性ベースのスクリーニングまたは選択手順での使用に利用可能な結合特性を有することを証明する。
【００８４】
ソラフェンオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）決定。結合相互作用の速度局面は、親和性ベースのスクリーニングおよび選択アッセイ（ＥＣが含まれるが、これに限定されない）の至適条件のデザインにおける重要なパラメータである。したがって、ウスチラゴＢＣドメイン（ｐＣＳ８）を使用して結合相互作用のオフレートを決定するためにソラフェン解離試験を行った。５３．６ｐｍｏｌのｐＣＳ８タンパク質を、体積２ｍｌで３０ｐｍｏｌの3Ｈ−ソラフェンと１５分間インキュベートした。結合ソラフェンを有するタンパク質を、ＮＡＰ５カラムによって遊離ソラフェンから分離し、全部で４ｍｌ溶離した。放射能を含まないソラフェンを２μＭまで添加し、種々の時間での０．５ｍｌアリコートの除去および遊離放射性標識からの結合物の再分離のためのＮＡＰ５カラムへのこれらの適用によって結合ソラフェンの解離を追跡した。溶離画分中の3Ｈ−ソラフェンを、液体シンチレーションカウンティングによって定量し、データを以下の式：Ｙ＝Ｙmax*ｅ-kt＋ＮＳに導入した（図１４）。
【００８５】
このオフレートは、１０．７分の半減期に相当する。Ｋd＝ｋoff／ｋonであり、それによりｋon＝９．３１×１０5Ｍ-1ｓ-1であるので、オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）をこのデータから計算することができることに留意のこと。１０μＭタンパク質では、非常に低濃度のリガンドでさえもこのような結合相互作用は非常に容易に平衡に近づく。
【実施例９】
【００８６】
競合結合アッセイ
単離ビオチンカルボキシラーゼドメインおよび放射性標識ソラフェンを、任意の化合物のソラフェン結合部位に結合する能力を試験するために競合結合アッセイで使用することができる。ソラフェンのように、このような化合物はＡＣＣアーゼ活性を阻害する可能性がある。このアッセイを例示するために、本発明者らは、第５位（ソラフェンＡ−コンジュゲート体）または第１１位（ソラフェンＣ−コンジュゲート体）が修飾された２つのソラフェン誘導体を調製した。次いで、両誘導体を、ｐＣＳ８およびｐＣＳ１１タンパク質の両方を使用した競合結合アッセイで試験した。タンパク質を、3Ｈ−ソラフェンおよび種々の濃度の２つのコンジュゲート体と１時間インキュベートした。次いで、結合した3Ｈ−ソラフェンを、ＮＡＰ５カラムで非結合物から分離し、シンチレーションカウンティングによって定量した。コンジュゲート体のＫiを評価するために、得られたデータを以下のリガンドが欠失した異種競合結合方程式に導入した（Ｈ．Ｊ．Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ，１９９９，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ，ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）：
【数１】
2006500013.tif 000005
【００８７】
ソラフェンＡ−コンジュゲート体をＡ−ｃｏｎｊと表示し、ソラフェンＣ−コンジュゲート体をＣ−ｃｏｎｊと表示した各データを図１５に示す。予想通り、ＢＣドメイン（ｐＣＳ８）（図１５Ａ）および全長タンパク質（ｐＣＳ１１）（図１５Ｂ）に対するコンジュゲート体の親和性の有意差は認められなかった。本アッセイのためのポジティブコントロールとして、競合物として放射能を含まないソラフェンＡを使用した試験を行い、Ｋjは１．１ｎＭと評価され（データ示さず）、これは直接飽和結合試験と一致していた。
【実施例１０】
【００８８】
ソラフェン耐性サッカロマイセス・セレビシエＡＣＣアーゼおよびＡＣＣアーゼＢＣドメイン変異体−カウンターセレクション用薬剤
Ｓ．セレビシエＡＣＣアーゼタンパク質のセリン７７からチロシンへの変異により、ソラフェン耐性を付与することが示されている（欧州特許出願第９４８１０７１０号、１９９４および米国特許第５，６４１，６６６号、１９９７）。
【００８９】
このソラフェン耐性変異を、ｐＣＳ２０４（Ｓ．セレビシエにおけるＨｉｓタグ化ＡＣＣアーゼの誘導性過剰発現のための発現ベクターｐＹＥＳ２へのＰＣＲ増幅全長Ｓ．セレビシエＡＣＣアーゼ遺伝子のクローニングによって構築した全長Ｓ．セレビシエＡＣＣアーゼ遺伝子を含む酵母発現ベクター）に移入した。得られた構築物を、ｐＣＳ２０４Ｍと命名した。次いで、ｐＣＳ２０４およびｐＣＳ２０４Ｍ由来のＳ．セレビシエビオチンカルボキシラーゼドメインを大腸菌ｐＥＴ発現ベクターにサブクローニングしてそれぞれｐＣＳ１６およびｐＣＳ１６Ｍを形成させた。ｐＣＳ８のように、これらの両構築物は、精製を容易にするためのＮ末端Ｈｉｓタグ化融合タンパク質としてその各ＢＣドメインを発現する。発現分析により、ｐＣＳ１６およびｐＣＳ１６Ｍは共に精製可溶性タンパク質に匹敵する量で得られることが証明された。次いで、産物を、サイズ排除クロマトグラフィによって分析し、ｐＣＳ８タンパク質のように、共に主にモノマーを示す（９０％超）ことが見出された。次いで、タンパク質をソラフェン結合について試験し、結果を図１６に示す。ｐＣＳ１６タンパク質は、ｐＣＳ８タンパク質に匹敵する高親和性ソラフェン結合を示した。対照的に、ｐＣＳ１６Ｍによるソラフェン結合は、非特異的コントロールと類似し（データ示さず）、ＢＣドメインへのこの１アミノ酸変異の移入によりソラフェン結合が喪失することが確認された。したがって、ｐＣＳ１６Ｍタンパク質は、非ソラフェン結合部位相互作用を消失させるための優れたカウンターセレクション用薬剤である。
【００９０】
全長ＡＣＣアーゼに対する変異の効果も評価した。ｐＣＳ２０４およびｐＣＳ２０４ＭをＳ．セレビシエ中で過剰発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによって精製させた。両タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同一なようであった（データ示さず）。
【００９１】
次いで、14Ｃ同位体交換アッセイを使用して、ＡＣＣアーゼ活性についてタンパク質をアッセイした。得られたデータは、野生型および変異酵母由来の内因性タンパク質活性と比較して、公開された報告（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５：９５−１００（１９９４））由来のデータと類似し、ｐＣＳ２０４Ｍタンパク質活性は、ソラフェンに感受性を示さないが、依然としてアビジン阻害に感受性を示すことが証明された（表４）。
【００９２】
【表４】
2006500013.tif 000006
【００９３】
最後に、ｐＣＳ２０４およびｐＣＳ２０４Ｍを、ソラフェンＡ結合についてアッセイし、結果を図１７に示す。全長ｐＣＳ２０４タンパク質は、ｐＣＳ１６によって発現されたＢＣドメインと類似の高親和性でソラフェンと結合した。ｐＣＳ２０４Ｍによるソラフェン結合は、ｐＣＳ１６Ｍのそれと同様に、非特異的コントロールに匹敵した。
【００９４】
上記は本発明の例示であり、本発明を制限するものと解釈すべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物も本発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】詳述した３つの機能的ドメインを有するウスチラゴ・メイデス（ｐＣＳ１１）由来の全長ＡＣＣアーゼタンパク質を示す図である。
【図２】全長ｐＣＳ１１タンパク質へのソラフェン結合および阻害を示す図である。
【図３】全長ＡＣＣアーゼに対する類似の親和性を有するウスチラゴＢＣドメイン（ｐＣＳ８）へのソラフェン結合を示す図である。
【図４】フィトフソラ・インフェスタンスＢＣドメインへのソラフェン結合を示す図である。
【図５】全長ウスチラゴＡＣＣアーゼと比較したウスチラゴペプチド（ｐＣＳ８）のビオチンカルボキシラーゼドメインを示す図である。
【図６】ウスチラゴ・メイデスＡＣＣアーゼＢＣドメイン（アミノ酸２〜５６０）（ｐＣＳ５８、配列番号２）（Ｔａｋｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＡＣＣａｓｅ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｚ４６８８６；Ａ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｋｅｏｎ，Ｊ．Ｏｗｅｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，ＡＣＣ１  ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９（２），１９１−２０１（１９９５））のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】フィトフソラ・インフェスタンスＡＣＣアーゼＢＣドメイン（アミノ酸１〜５５５）（ｐＣＳ１５、配列番号４）のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ｐＣＳ８ペプチドの陰イオン交換クロマトグラフィを示す図である。
【図９Ａ】大腸菌ＢＣの分光光度アッセイの吸光度の軌跡を示す図である。
【図９Ｂ】ｐＣＳ１１タンパク質における（ｉ）分光光度アッセイおよび（ｉｉ）１４Ｃ同位体交換活性アッセイを示す図である。
【図１０】ウスチラゴ（配列番号２）、フィトフソラ（配列番号４）、マグナポルテ（配列番号６）、および酵母（配列番号８）のＡＣＣアーゼＢＣドメインのアラインメントを示す図である。
【図１１】マグナポルテＢＣドメインへのソラフェン結合を示す図である。
【図１２】ヒトＡＣＣ１  ＢＣドメインへのソラフェン結合を示す図である。
【図１３】ウスチラゴＡＣＣアーゼＢＣ（配列番号２）ドメインを有するヒトＡＣＣ１  ＢＣ（配列番号１０）およびＡＣＣ２  ＢＣ（配列番号１２）ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１４】ウスチラゴＡＣＣアーゼＢＣドメインのソラフェンオフレートを決定するための［3Ｈ］−ソラフェンを使用した解離実験を示す図である。
【図１５】（Ａ）ウスチラゴＡＣＣアーゼＢＣドメインおよび（Ｂ）全長ウスチラゴＡＣＣアーゼタンパク質への［3Ｈ］−ソラフェンＡおよびソラフェンＣコンジュゲート体の結合を示す図である。
【図１６】野生型および変異Ｓ．セレビシエＡＣＣアーゼＢＣドメインペプチドへのソラフェン結合を示す図である。
【図１７】野生型および変異全長Ｓ．セレビシエＡＣＣアーゼへのソラフェンＡ結合を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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