(57)【要約】本発明は、アテローム性動脈硬化症、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患（PAOD）の治療に、または再狭窄の治療に用いることができる化合物の同定のための新規標的としての、PDE4、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症または再狭窄を抑制する化合物を同定するためのPDE4の使用。
【請求項２】
PDE4がPDE4Dである、請求項1記載の使用。
【請求項３】
PDE4DがPDE4D5またはPDE4D7である、請求項2記載の使用。
【請求項４】
PDE4DがPDE4D7である、請求項2記載の使用。
【請求項５】
化合物が末梢動脈閉塞性疾患を抑制する、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
PDE4のホスホジエステラーゼ活性の活性化または阻害を測定する段階を含む、アテローム性動脈硬化症または再狭窄の治療法のための化合物を同定し、かつ得るための方法。
【請求項７】
PDE4がPDE4Dである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
PDE4DがPDE4D5またはPDE4D7である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
PDE4DがPDE4D7である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
化合物が末梢動脈閉塞性疾患の治療のために得られる、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
PDE4の活性化剤または阻害剤であると推測される化合物を、アテローム性動脈硬化症または再狭窄が誘導されている動物に投与する段階、およびアテローム性動脈硬化症または再狭窄の程度を対照処理動物と比較して測定する段階を含む、アテローム性動脈硬化症または再狭窄の治療法のための化合物を同定し、かつ得るための方法。
【請求項１２】
PDE4がPDE4Dである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
PDE4DがPDE4D5またはPDE4D7である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
PDE4DがPDE4D7である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
化合物が末梢動脈閉塞性疾患の治療法用である、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
請求項6〜15のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
【請求項１７】
請求項16記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
アテローム性動脈硬化症、再狭窄の治療用の薬剤を調製するための、請求項16記載の化合物の使用。
【請求項１９】
化合物が、末梢動脈閉塞性疾患の治療用の薬剤を調製するために用いられる、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
特に前出の例を参照して実質的に上述したとおりの、化合物、方法、使用および組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アテローム性動脈硬化症におけるPDE4D
PDE4ホスホジエステラーゼは、PDE4A、PDE4B、PDE4CおよびPDE4Dの4種類の酵素が属するファミリーとして存在する。PDE4アイソザイムは、cAMPを特異的に分解し、かつ抗うつ薬（たとえば、ロリプラム）のような薬理学的な物質のための共通の標的である。PDE4Dアイソフォームのうち、いくつかのスプライス型が公知である。その中に、長アイソフォームがあり、その6種類、すなわち、PDE4D3、PDE4D4、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D7およびPDE4D8が公知である。これらのすべてが、LR1およびUCR1部位およびこれらの部位のC末端に位置するドメインを共通して有するが、しかしそれらは異なるN末端ドメインを有する。アイソフォームPDE4D5はBolgerら（Characterization of five different proteins produced by alternatively spliced mRNAs from the human cAMP-specific phosphodiesterase PDE4D gene, Biochem. J. (1997), 328, 539-548）によって開示された。アイソフォームPDE4D7は国際公開公報第02/074992号に近年開示された。PDE4D遺伝子座は卒中と関連づけられている（国際公開公報第02/074992号）。しかし、アテローム性動脈硬化症または再狭窄におけるPDE4Dの関与について示すものはこれまで存在しなかった。
【発明の開示】
【０００２】
本発明では、PDE4、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7が、アテローム性動脈硬化症の、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患（PAOD）の治療に、または再狭窄の治療に用いることができる化合物の同定のための新規標的として同定された。
【０００３】
本発明では、PDE4はアテローム性動脈硬化症の、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患（PAOD）の、または再狭窄の治療法のための化合物を同定するための新規標的として同定された。図7および8に示す通り、PDE4阻害剤シロミラスト（cilomilast）はPAODについてのラットモデルにおいて歩行能力を改善した。好ましい態様では、その新規標的はPDE4Dであり、さらにより好ましい態様では、新規標的はPDE4D5（配列番号：4および他種由来の相同体）またはPDE4D7（配列番号：1から3および他種由来の相同体）である。最も好ましい態様では、新規標的はPDE4D7である。図1および4に示す通り、PDE4D5および特にPDE4D7はバルーン傷害ラット頸動脈の中膜および内膜においてアップレギュレートされる。
【０００４】
このように、本発明はアテローム性動脈硬化症、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患（PAOD）、または再狭窄を抑制する化合物を同定するための、PDE4の、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の新規の使用を提供する。最も好ましくは、PDE4D7が用いられる。
【０００５】
本発明はまた、PDE4、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7、最も好ましくはPDE4D7のホスホジエステラーゼ活性の活性化または阻害を測定することを含む、アテローム性動脈硬化症の治療法のための化合物を同定し、かつ得るための新規の方法、および該方法によって同定される化合物を提供する。最も好ましくは、該化合物はPDE4の、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の阻害剤である。最も好ましくは、該化合物はPDE4D7の阻害剤である。ホスホジエステラーゼ活性を測定するための手順は当技術分野で公知である。そのような測定法の非限定的な一例が実施例に記載される。アテローム性動脈硬化症の、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患の、または再狭窄の治療法のための化合物の同定はまた、ラットバルーン傷害モデル、または、別の非限定的な例では、西洋型食餌または対照として通常の固形飼料の食餌を与えられたApoEノックアウトマウス（たとえばNakashima et al., ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree, Arterioscler. Thromb. (1994) Jan ;14(1): 133-40に記載されたような）、またはラウリン酸モデル（Kawamura et al., 1985, Arzneimittelforschung 35/7A）: 1154-1156）などの、アテローム性動脈硬化症、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患、または再狭窄が誘導さている動物に、PDE4、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7、最も好ましくはPDE4D7を阻害すると推測される化合物を投与することを含みうる。好ましくは、該動物は非ヒト動物である。このように、本発明はまた、アテローム性動脈硬化症、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患、または再狭窄が誘導されている動物に、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の活性化剤または阻害剤であると推測される化合物を投与する段階、および、アテローム性動脈硬化症、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患、または再狭窄の程度を、プラセボまたは担体で処置した動物と比較して測定する段階を含む、アテローム性動脈硬化症の、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患、または再狭窄の治療法のための化合物を同定し、かつ得るための方法を提供する。最も好ましくは、該化合物は、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の、最も好ましくはPDE4D7の阻害剤である。
【０００６】
PDE4Dについての活性化剤または阻害剤を同定するための方法は、すべてのPDE4D長型アイソフォームに共通したアミノ酸配列を有するPDE4Dである、コアPDE4D構造（配列番号：5）の使用を含みうる。図5はロリプラムによるコアPDE4D活性の阻害を示す。
【０００７】
本明細書において用いられる、「PDE4の活性化剤または阻害剤」、「PDE4Dの活性化剤または阻害剤」、「PDE4D5またはPDE4D7の活性化剤または阻害剤」という用語は、PDE4、PDE4D、PDE4D5および/またはPDE4D7のホスホジエステラーゼに直接作用することによって、またはPDE4、PDE4D、PDE4D5および/またはPDE4D7の機能を、たとえばその細胞内ターゲッティングを変化させることにより、間接的に調節することによって、PDE4、PDE4D、PDE4D5および/またはPDE4D7の細胞機能を活性化または阻害する化合物をいう。
【０００８】
本発明はまた、上述の方法のうち任意のものによって同定された化合物に関する。
【０００９】
これに加えて、本発明は、上述の方法によって同定される、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7のホスホジエステラーゼ活性の活性化剤または阻害剤、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。最も好ましくは、該薬学的組成物は、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7のホスホジエステラーゼ活性の阻害剤を含む。
【００１０】
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書においては、堅実な医学的判断（sound medical judgement）の範囲内で、過剰の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わない、妥当な損益比に見合った、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適している化合物、材料、組成物、および/または剤形をいうのに用いられる。
【００１１】
本明細書において用いられる、「薬学的に許容される塩」とは、その酸または塩基の塩を作ることによって親物質が改変されている、同定された物質の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例は、アミンなどの塩基残基の無機酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸残基のアルカリ塩または有機塩などを含むがそれらに限定されない。薬学的に許容される塩は、従来の無毒性塩、またはたとえば、無毒性無機酸または無毒性有機酸から生じた親化合物の4級アンモニウム塩を含む。たとえば、そのような従来の無毒性塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来する塩；および、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルモイン（palmoic）酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩を含む。 
【００１２】
本発明の薬学的に許容される塩は、塩基または酸部分を含む親物質から従来の化学的手法によって合成することができる。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を、化学量論的な量の適当な塩基または酸と水中または有機溶媒中、または両者の混合物中で反応させることによって調製することができる；一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルといった非水系媒質が好ましい。適当な塩の一覧は、参照により本明細書に組み入れられる、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p.1418に見られる。
【００１３】
本発明の方法によって同定される物質は、（i）作用部位、活性スペクトルの改変、および/または（ii）効力の改善、および/または（iii）毒性の減少（治療係数の改善）、および/または（iv）副作用の減少、および/または（v）作用開始、効果持続期間の改変、および/または（vi）動態パラメータ（吸収、分布、代謝および排泄）の改変、および/または（vii）物理化学パラメータ（溶解度、吸湿性、色、味、におい、安定性、状態）の改変、および/または（viii）一般的特異性、器官/組織特異性の改善、および/または（ix）適用形態および経路の最適化を達成するために、（i）カルボキシル基のエステル化、または（ii）炭素酸を用いた水酸基のエステル化、または（iii）たとえばリン酸塩、ピロリン酸塩または硫酸塩またはヘミコハク酸塩に向けた水酸基のエステル化、または（iv）薬学的に許容される塩の形成、または（v）薬学的に許容される複合体の形成、または（vi）薬理学的に活性なポリマーの合成、または（vii）親水性部分の導入、または（viii）芳香環または側鎖上の置換基の導入／交換、置換基パターンの変化、または（ix）等価性または生物学的等価性部分の導入による改変、または（x）同族化合物の合成、または（xi）分枝側鎖の導入、または（xii）アルキル置換基の環状類似体への変換、または（xiii）水酸基のケタール、アセタールへの誘導体化、または（xiv）アミド、フェニルカルバメートへのN-アセチル化、または（xv）マンニッヒ塩基、イミンの合成、または（xvi）ケトンまたはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チオゾリジン（thiozolidine）またはその組み合わせへの変換によって；および（b）該改変の産物を、薬学的に許容される担体、または芳香もしくは香味組成物もしくは製品に許容される担体/希釈剤とともに処方することによって、改変されうる。
【００１４】
任意の従来の担体材料を利用することができる。担体材料は、経腸、経皮または非経口投与に適した有機または無機材料でよい。適当な担体は、水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリンなどを含む。さらに、その薬学的調製物は、他の薬学的に活性な物質を含みうる。香料、安定剤、乳化剤、緩衝剤などの追加の添加物を、調剤についての認められた業務に従って加えることができる。
【００１５】
一態様では、本発明の方法は、PDE4mRNA、好ましくはPDE4DmRNA、より好ましくはPDE4D5mRNAまたはPDE4D7mRNA、最も好ましくはPDE4D7mRNAの転写または翻訳を阻止するように、PDE4、好ましくはPDE4D、またはより好ましくはPDE4D5またはPDE4D7をコードする任意のゲノムDNAまたはmRNA分子と特異的に結合することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療上有効な量の投与を含む。「アンチセンス」とは、特定の核酸配列の「センス」鎖と相補的である核酸配列を含む組成物を意味する。細胞へ一旦導入されれば、相補的ヌクレオチドはその細胞によって産生された内因性配列と結合して二重鎖を生じ、転写または翻訳を遮断する。たとえば、Agrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ; Alama et al. (1997) Pharmacol. Res. 36: 171-178; Crooke, S. T. (1997) Adv. Pharmacol. 40: 1-49;および Lavrosky et al. (1997) Biochem. Mol. Med. 62(1): 11-22を参照されたい。アンチセンス配列は、DNA、RNAを含む任意の核酸物質、または任意の核酸模倣体または類似体でありうる。たとえば、Rossi et al. (1991) Antisense Res. Dev. 1: 285-288; Pardridge et al. (1995) Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 5592-5596; Nielsen and Haaima (1997) Chem. Soc. Rev. 96: 73-78;およびLee et al. (1998) Biochemistry 37: 900-1010を参照されたい。アンチセンス配列の送達は、組み換えベクターを用いる細胞内送達によるといったさまざまな手段で達成しうる。
【００１６】
核酸塩基約15から25個のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、容易に合成して所望の阻害作用をもたらすことができるため、典型的には好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体もまたこの目的に用いることができ、かつ医薬製品において有益な、安定性、分布、または限定された毒性といった追加の長所を有しうる。加えて、鉄結合エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA-Fe）のような化学的反応基を、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合してもよく、ハイブリダイゼーションの部位でRNAの切断を引き起こす。遺伝子のインビトロ転写を阻害するための、アンチセンス法のこれらおよび他の使用は、当技術分野で公知である。たとえば、Marcus-Sakura (1988) Anal. Biochem. 172: 289を参照されたい。
【００１７】
PDE4、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7、最も好ましくはPDE4D7の阻害もまた、RNA干渉を用いて達成しうる。RNA干渉は、非限定的な一例として、細胞または組織における標的遺伝子の発現の阻害のための、GB2372995に開示される方法によって得ることができ、この方法には、（a）該標的遺伝子の一部に対して相同であるヌクレオチド配列を含むセンスRNA鎖を発現している１本鎖リボ核酸（ssRNA）を含むウイルス粒子、および（b）該標的遺伝子の一部に対して相同であるヌクレオチド配列を含むアンチセンスRNA鎖を発現している１本鎖リボ核酸（ssRNA）を含むウイルス粒子による、該細胞または組織の感染が含まれる。
【００１８】
ラット頸動脈バルーン傷害は、動脈中の増殖性現象を研究するための広く認められた技術である。それは元来はアテローム性動脈硬化症の平滑筋細胞増殖要素の分析を補助するために用いられたが、近年はまた、血管形成術後の再狭窄のモデルとして用いられた。傷害に対するSMC反応は大腿動脈および頸動脈において同様である。技術的にはるかに容易であり、および実験的にはるかに再現性が高いため、本モデルは頸動脈に適用された。大腿動脈におけるアテローム性動脈硬化症である、末梢動脈閉塞性疾患PAODの顕著な特徴のモデルとなることが必ず意図される。表1に示す通り、PDE4阻害剤ロリプラムはこのモデルにおいて新生内膜形成を阻害する。
【００１９】
このように、本発明はまた、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の活性化剤または阻害剤を、アテローム性動脈硬化症、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患、または再狭窄に罹患している対象に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の、好ましくは末梢動脈閉塞性疾患の、または再狭窄の治療の方法を提供する。最も好ましい態様では、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の、最も好ましくはPDE4D7の阻害剤が投与される。このように、本発明は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄または、好ましくは、末梢動脈閉塞性疾患の治療用の薬剤を調製するための、PDE4、好ましくはPDE4D、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の活性化剤または阻害剤の使用に関する。最も好ましい態様では、PDE4、好ましくはPDE4Dの、より好ましくはPDE4D5またはPDE4D7の、最も好ましくはPDE4D7の阻害剤が用いられる。
【００２０】
本発明はまた、特に前出の例を参照して実質的に上述したとおりの、化合物、方法、使用および組成物を提供する。
【００２１】
実施例
傷害ラット頸動脈におけるPDE4D5およびPDE4D7発現
動物手術
雄（300〜400g）Wistar Kyotoラット（RoRo）はBRLCH-Fullinsdorfから入手した。動物は5mg/kgキシラジン（Rhompun, Bayer, FRG）および50mg/kgケタミン（Ketasol 100, Graeub, CH）の腹腔内投与で麻酔した。左頸動脈は分岐部で露出し、および2F塞栓摘出カテーテル（Edwards laboratories, USA）を挿入した。膨らませたバルーンを総頸動脈に3回通過させた。外頸動脈の永久結紮後、創を閉じ、動物を２個体ずつ市販の固形飼料および水の自由摂取下で維持した。
【００２２】
組織採取
傷害後6週で、動物を再麻酔し、麻酔薬の経静脈過量投与で屠殺した。体腔を開けてのち、ラットを大動脈弓内に配置したカテーテルを通じて冷PBSで潅流して血液を洗い流し、および頸動脈を採取した。watchmakerピンセットを用いて外膜組織を動脈から除去した。頸動脈を縦方向に開き、残りの内皮をピンセットのスライド動作によって除去した。頸動脈はこれで平滑筋細胞組織のみから成る。この段階で、頸動脈を液体窒素中で急速凍結し、プールし、摂氏−80度にて保存した。
【００２３】
実験群
4つの実験群をプールした：
1.バルーン傷害頸動脈11検体、バルーン処置後6週
2.対側の非傷害頸動脈11検体
3.未操作ラットの左頸動脈12検体
4.未操作ラット由来の対側の右頸動脈12検体
【００２４】
抗体
抗ペプチド抗体は、ヒトPDE4D7に特異的な配列
2006522594.tif 000002
に基づいて作製した。この抗体は、アフィニティクロマトグラフィー用のカラム結合合成ペプチドを用いて精製した。この抗体の特異性は、試料としてヒトPDE4D3、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D7、PDE4D8の組み換え調製物を用いてウェスタンブロッティングによって試験した。本抗体はこれらの実験においてhPDE4D7だけを検出した。図3に示す通りの、ヒトPDE4D7と、ラットまたはマウスPDE4D7との間の高度な保存によって、ラットまたはマウスと交差反応する本抗体の能力が示唆された。
【００２５】
抗PDE4D5ペプチド抗体は、特異的配列
2006522594.tif 000003
に基づいて同様の手段で調製されおよび特徴づけられた。再び、図2に示す通りの、ヒトPDE4D5とラットPDE4D5のN末端部分における高度な同一性によって、交差反応する能力が示唆された。
【００２６】
二次元電気泳動のための試料の調製
凍結した頸動脈を液体窒素で冷却した乳鉢で粉末化した。ホモジネートを試料溶液（7M尿素、2Mチオ尿素、50mMトリス、2%（w/v）CHAPS（2-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]1-プロパンスルホネート、Roche Diagnostics,Mannheim, Germany）、0.4%（w/v）、ジチオエリトリトール、0.5%（v/v）アンフォライト（Resolytes 3.5-10, BDH, Poole, England））に入れ、室温にて15分間放置した。ホモジネートを100,000×gで1時間4℃にて遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度はBioRadプロテインアッセイを用いて推定した。
【００２７】
二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
固定pHグラジエントストリップ（11cm、pH4〜7、Amersham Biosciences, Little Chalfont, England）を7M尿素、2Mチオ尿素、CHAPS、0.4%（w/v）、ジチオエリトリトール、0.5%（v/v）アンフォライト中で6時間再膨張させ、ProteanIEFセルカップローディングトレイ（BioRad, Hercules, CA）に置いた。等しいタンパク質量（0.5mg）の試料をカップに充填し、等電点電気泳動を下記のプロトコルを用いて実施した：250V、2時間；2500Vへ8時間で漸増；2500Vにて8時間。ストリップを、6M尿素、50mMトリス-HCl pH7.5、30%（v/v）グリセロール、2%（w/v）SDS、30mMジチオエリトリトール中で、および6M尿素、50mMトリス-HCl pH7.5、30%（v/v）グリセロール、2%（w/v）SDS、136mMチオアセトアミド中で各15分間、2回連続のインキュベートによって平衡化した。平衡化したストリップをCriterion 4〜15%ゲルのIEFウェルに置いた。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動およびニトロセルロース膜（BioRad）へのブロッティングを、ゲル製造元の推奨に従って実施した。分子量マーカー（Magic Marker, Invitrogen）を分子量推定のために含めた。
【００２８】
ウェスタンブロッティング
ブロットは、5%脱脂粉乳のTBS溶液を用いて一晩4℃にて振とうしてブロックした。洗浄後、100ng/mlのアフィニティ精製抗PDE4D7抗体を含むTBS＋0.1%（v/v）Tween20を加え、ブロットを振とうしながら90分間室温にてインキュベートした。ブロットを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体を加え（1/50000希釈、BioRad）、ブロットと共にさらに90分間インキュベートした。洗浄後、ブロットをSuper Signal West Femto基質（PIERCE, Rockford, IL）を用いて発色させ、フィルムに5〜10分間露光した。
【００２９】
バルーンカテーテル傷害ラット頸動脈における新生内膜形成のPDE4阻害剤ロリプラムによる阻害
薬物投与
適当な濃度のロリプラムをPEG400で調製し（25mgまたは2.5mg/ml）、および浸透圧ミニポンプ（2002 Alzet）に充填して、ラット１個体当たりそれぞれ0.8または8mg/kg/日の一定用量を送達した。ミニポンプは麻酔下でバルーンカテーテル傷害を目的とした手術中にラットの頚部の皮下に設置した。ミニポンプはシラスチックカテーテルを介して頸静脈に接続し、14日間の全実験期間を通じた一定の経静脈輸液を確実にした。
【００３０】
血清レベルは実験終了時にLCMSMSを用いて測定した。
【００３１】
バルーンカテーテル傷害後の結果（上記の動物手術の項を参照）：
表1に示す通り、ロリプラムはバルーンカテーテル傷害ラット頸動脈における新生内膜形成を0.8および8mg/kg/日静注で有意に阻害した。結果を確認するために、より高用量を新しい組のラットを用いて独立した実験で繰り返した（実験2）。PEG400溶液のポンプ速度は水より低速であるため、実験終了時に、元の用量の20%がまだポンプ内に存在する。したがって、実験終了時に測定される血漿レベルは、定常状態曝露を反映する。血漿レベルがPDE4酵素についてのロリプラムのKiの予想される範囲のかなり内側であることは興味深い。
【００３２】
【表１】
2006522594.tif 000004
【００３３】
表1は、プラスチック包埋切片（頸動脈1検体当たり2個）についての組織形態計測によって測定された新生内膜形成のロリプラム媒介阻害の効力データの要旨を示す。
【００３４】
組み換えPDE4D5およびPDE4D7アイソフォームの発現
PDE4Dアイソフォーム5および7およびコア構造のクローニング
コア構造：
すべてのPDE4Dアイソフォーム3〜8に共通の、アミノ酸配列FDVカルボキシ末端で始まりLF1スプライス部位までのコア断片をコードするcDNAは、HindIIIクローニング部位（gatgaattcaagctttttgatgtggacaatggcaca）を有する5'オリゴヌクレオチドを用いて、FDV配列の前に2個の追加のアミノ酸（KおよびL）を導入して、PCRによって作製した。3'末端においては、天然の配列（gtgatatctcattatcacgtgtcaggagaacgatcatctatgaca）を作製する一組のプライマーか、または、組み換えタンパク質の迅速な精製を可能にするためのHis残基6個をコードする配列（gtgatatctcattatcaatgggatggtgatggtgcgtgtcaggagaacgatcatctatgac）を付加する一組のプライマーを用いた。コア構造をコードするcDNAは、EcoRI-EcoRV断片として発現ベクターpENTR（商標）1a（GIBCO/BRL）へクローニングした。
【００３５】
アイソフォーム（コア構造を除く）：
アイソフォーム特異的N末端をコードするDNA断片は、方向性クローニングのために組み込まれたEcoRIおよびHindIIIのための末端制限酵素部位を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて作製した。これらのアイソフォーム特異的DNA断片は2個の追加のアミノ酸残基（KおよびL）を導入して、HindIII部位を介してコア構造配列へ融合した。クローンの完全性は、発現前のDNA配列決定によって確認した。
【００３６】
昆虫細胞におけるPDE4Dアイソフォームおよびコア構造の発現
昆虫細胞における発現のために、cDNAをpFASTBAC1ベクター（Life Technologies. Inc）へクローニングし、かつ産物を配列決定によって確認した。バキュロウイルスゲノムへの組み換え後、精製したウイルスDNAで昆虫細胞を形質転換した。Sf9細胞を27℃にて、5%（v/v）ウシ胎仔血清を含むTC100培地（BioWhittaker）中で培養した。ウイルスストックは1.5×109pfu/mlの力価で作製した。アイソフォームの大量産生のために、Sf9細胞の発酵1〜24Lを、MOI 1で感染させた。
【００３７】
一例では、6×Hisタグ化PDE4DポリペプチドDC、D5およびD7を、Sf9細胞において1Lスピナーフラスコ中でSF1培地を用いて血清の非存在下で産生した。感染細胞は組み換えバキュロウイルスの感染後3日で採取した。
【００３８】
別の一例では、PDE4Dコア構造DCを、培地（血清0%のSF1）15L、脂質0.15LおよびSf9細胞9Lを用いて24LのAirlifter発酵槽で産生した。全発酵手順の間は、細胞をpH6.2、27.0±0.2℃およびpO230.0±0.5%にて培養した。細胞は3日間増殖させた。感染時の細胞数は2.3×106細胞/mlであった。細胞は450mlの組み換えバキュロウイルスを用いて感染させた。細胞は感染後68時間で採取し、かつ、細胞ペレットおよび濃縮した上清を以降の処理まで−80℃にて保存した。
【００３９】
6×Hisタグ化PDE4Dアイソフォームの精製
各アイソフォームを過剰発現している、培養液1リットルに由来するSf9 細胞を、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤混合物錠「完全、EDTA不含」1錠； Roche）を添加した50mlの50mM HEPES pH7.8、300mM NaCl、10mMイミダゾール、1mM DTTに氷上にて再懸濁した。細胞の破壊は50ml Dounceホモジナイザーを用いて実施し、および均一な混合物を1時間70,000gおよび4℃にて遠心分離した（Kontron TFT 45.94ローター、30,000rpmにて）。上清は孔径1.2μMのフィルター （Minisart; Sartorius, Germany）を通してろ過し、次いで6ml Ni-NTAアガロースカラムへ2ml/分にて加えた。50mM HEPES pH7.8、300mM NaCl、10mMイミダゾールで平衡化後、タンパク質を10mMから230mMのイミダゾールを含む同一の緩衝液の直線30mlグラジエントを用いて溶出した。クーマシー染色SDS-PAGEによって分析した際にPDE4Dアイソフォームを含む画分をプールし、−80℃にて凍結保存した。アイソフォームのクロスコンタミネーションを防ぐため、異なるPDE4Dアイソフォーム調製ごとに新しいNi-NTAアガロース材料を用いた。
【００４０】
6×Hisタグ化PDE4Dアイソフォームの特異的活性
Ni-NTAアガロース精製アイソフォーム調製物の相対濃度はSDS-PAGEによって推定した。等容量のアイソフォーム調製物をグラジエントゲル（4〜12% NuPage; Invitrogen）にアプライした。電気泳動後、クーマシー染色ポリアクリルアミドゲルをビデオ画像処理システムによって撮影した。PDE4Dバンドの光学密度を、Macintoshコンピューターおよびパブリック・ドメイン・ソフトウェアの「NIHImage」バージョン1.61（U.S. National Institutes of Healthで開発、およびインターネット上でhttp://rsb.info.nih.gov/nih-image/にて入手可能）を用いて積算した。ソフトウェアによって戻された、PDE4Dバンド毎の積算された任意単位は、元のプール中のPDE4D相対濃度を反映する。PDE4Dおよびチューブリンバンドの同一性は、独立したSDS-PAGE、相当するバンドの切り出し、トリプシン切断およびトリプシン消化ペプチドのMALDI-MSによる同定によって検証した。
【００４１】
106倍希釈した精製アイソフォームの等容量の活性を、市販の放射性ホスホジエステラーゼアッセイ（cAMP依存性ホスホジエステラーゼ[3H]アッセイ；Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、製造元の取扱説明書に従って測定した。得られた任意活性単位は、元のプール中のPDE4D相対活性を反映する。
【００４２】
PDE4Dアイソフォームの相対比活性は、相対活性値を相対濃度値で割って計算した。
【００４３】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による凝集の定量的評価
Ni-NTAアガロース精製アイソフォーム調製物50μlを、50mMトリスHCl pH 7.7、100mM NaCl、0.5mM MgCl2で平衡化したSuperose12サイズ排除カラム（タイプPC3.2/30；Amersham Pharmacia Biotech）に流速0.1 ml/分で4℃にて注入した。クロマトグラムを278nmで記録した。溶出容量から開始して、カラム溶出液を50μl画分として回収した。
【００４４】
ホスホジエステラーゼ活性の活性アッセイおよび阻害
ホスホジエステラーゼ活性の測定にはIMAP FPアッセイを用いた。コア構造およびPDE4D3、5または7のホスホジエステラーゼ活性はHEFPホスホジエステラーゼアッセイキット（Molecular Devices）を用いて測定した。2μlのPDE4D5または7またはPDE4Dコア構造、2μlのcAMP（終濃度40nMに）および1μlの被験基質または担体を、45分間、振とう機上でインキュベートした。キットにより提供される12μlの結合溶液（1：320希釈されたビーズを含む）を加え、および反応混合物を振とう機上で2時間インキュベートした。試料の蛍光偏光を、Packard BioScience Fusion a-FP HTで、放出フィルターとしてPolarizer535、および励起フィルターとしてFluorescein485/20を用いて測定した。PDE4Dコア構造のホスホジエステラーゼ活性の阻害は、ロリプラムを阻害剤として用い、およびPDE4Dコア構造を30ng/mlにて用いて測定した。
【００４５】
PAODに関するラットラウリン酸モデル（Kawamura et al., 1985, Arzneimittelforschung 35/7A）: 1154-1156）
ラットは75μgのラウリン酸を含む10μlの純エタノールを動脈内注射された。近位大腿動脈の注射部位はヒストアクリルを用いて塞いだ。創を閉じ、動物を回復させた。ラットはラウリン酸注射前に図6に示す通りトレッドミル上を歩くように訓練されていた。薬物は胃管栄養法により記載の通り与えた。その処理は、小血管における炎症を引き起こし、それはPAODに繋がりうる。ラットは、疲労するまで25m/分および4.5%傾斜のトレッドミル上で運動するように強制された。疲労は、ラットがトレッドミル上を走ることを再開するために計5回の小電気刺激が累積的に与えられるまでの所要時間として定義した。
【００４６】
PDE4阻害剤シロミラストをPDE3阻害剤シロスタゾールと比較した。シロスタゾールはPAODの治療に用いられ、従って陽性対照となる。シロミラストは、シロスタゾールと比較して等しい効力の有効性を示した（図7）。
【００４７】
この実験は、PDE4阻害剤がPAODに関するラットモデルにおいて歩行距離を改善できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】（a）カテーテル傷害頸動脈試料を上部に示す。アフィニティ精製抗PDE4D7ウサギポリクローナル抗体を用いて、明らかに、約80kDaのタンパク質が検出されている。PDE4D7は傷害されていない右頸動脈（（a）下部）にも未処置動物由来の対照頸動脈（b）にも検出されず、バルーンカテーテル傷害の結果としてのPDE4D7発現の強い誘導を示す。
【図２】A：交差反応性ヒトおよびラットPDE4D5N末端：ヒトおよびラットPDE4D5は98.85%同一である。B：PDE4サブファミリーA、B、CおよびDのUCR1、UCR2および触媒ドメイン間の比較は、UCRが触媒ドメインとほぼ同程度によく保存されていることを示す。
【図３】交差反応性ヒト−ラット−マウスPDE4D7。Q8CG05：マウスPDE4D7（配列番号：1）；Q8CH04：ラットPDE4D7（配列番号：2）； Q8IVD2；ヒトPDE4D7（配列番号：3）。ヒト−ラット：96.8%。ラット−マウス：98.8%。
【図４】バルーン傷害ラット頸動脈におけるPDE4D5およびPDE4D7発現。レーン1、2、3：中膜および内膜、バルーン傷害、左頸動脈、バルーン傷害後3日。レーン4、5、6：中膜、右頸動脈（非傷害、対照）、3日。レーン7：中膜および内膜、バルーン傷害、左頸動脈、傷害後14日。レーン8：右頸動脈、非傷害、対照、14日。レーン9、10：中膜および内膜、バルーン傷害、左頸動脈、傷害後7日。レーン11、12：右頸動脈、非傷害、7日。
【図５】ロリプラム阻害。PDE4Dコア構造（DC）のホスホジエステラーゼ活性はロリプラムによって阻害することができる。DCホスホジエステラーゼ活性のロリプラム阻害によるIC50は0.34±0.06μMであった。
【図６】ラウリン酸モデルにおける歩行能力に及ぼすPDE4阻害剤シロミラストの作用：動物はトレッドミル上を歩行する能力に基づいて選択し、4群にそろえた。PDE3阻害剤シロスタゾールを陽性対照として用いた。
【図７】ラウリン酸モデルにおける歩行能力に及ぼすPDE4阻害剤の作用：最大歩行距離を週間隔で測定した。
【図８】ラウリン酸ラットモデルにおける歩行能力に及ぼすPDE4阻害剤の作用の個別結果。
【図９】ラウリン酸ラットモデルにおける体重に及ぼすPDE4阻害剤の作用。
【図１０】ラウリン酸ラットモデルにおけるPDE4阻害剤の副作用：異常糞便/下痢。
【図１１】ラウリン酸実験のPK解析：経口投与後のPDE4阻害剤の血清レベル。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月2日(2005.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症または再狭窄を抑制する化合物を同定するためのPDE4の使用。
【請求項２】
PDE4がPDE4Dである、請求項1記載の使用。
【請求項３】
PDE4DがPDE4D5またはPDE4D7である、請求項2記載の使用。
【請求項４】
PDE4DがPDE4D7である、請求項2記載の使用。
【請求項５】
化合物が末梢動脈閉塞性疾患を抑制する、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
PDE4のホスホジエステラーゼ活性の活性化または阻害を測定する段階を含む、アテローム性動脈硬化症または再狭窄の治療法のための化合物を同定し、かつ得るための方法。
【請求項７】
PDE4がPDE4Dである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
PDE4DがPDE4D5またはPDE4D7である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
PDE4DがPDE4D7である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
化合物が末梢動脈閉塞性疾患の治療のために得られる、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
PDE4の活性化剤または阻害剤であると推測される化合物を、アテローム性動脈硬化症または再狭窄が誘導されている動物に投与する段階、およびアテローム性動脈硬化症または再狭窄の程度を対照処理動物と比較して測定する段階を含む、アテローム性動脈硬化症または再狭窄の治療法のための化合物を同定し、かつ得るための方法。
【請求項１２】
PDE4がPDE4Dである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
PDE4DがPDE4D5またはPDE4D7である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
PDE4DがPDE4D7である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
化合物が末梢動脈閉塞性疾患の治療法用である、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
請求項6〜15のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
【請求項１７】
請求項16記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
アテローム性動脈硬化症、再狭窄の治療用の薬剤を調製するための、請求項16記載の化合物の使用。
【請求項１９】
化合物が、末梢動脈閉塞性疾患の治療用の薬剤を調製するために用いられる、請求項18記載の使用。
【国際調査報告】
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