(57)【要約】生物学的システムのインビトロモデルにおいて示差的に発現している核酸分子を同定するための方法であって、（１）モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程；（２）それぞれの時点で集められた細胞から総ＲＮＡを得る工程；（３）それぞれの時点に由来する総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、多数のｃＤＮＡプールを提供する工程；（４）サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）をそれぞれの時点に由来するｃＤＮＡプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している核酸分子に由来するｃＤＮＡを段階的に増幅するようにする工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的システムのインビトロモデルにおいて示差的に発現している核酸分子を同定するための方法であって、下記の工程を含む方法：
（１）モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程；
（２）それぞれの時点で集められた細胞から総ＲＮＡを得る工程；
（３）それぞれの時点に由来する総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、多数のｃＤＮＡプールを提供する工程；
（４）サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）をそれぞれの時点に由来するｃＤＮＡプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している核酸分子に由来するｃＤＮＡを段階的に増幅するようにする工程。
【請求項２】
モデルシステムは血管形成に対するインビトロモデルである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２の方法によって同定される、血管形成時に示差的に発現している核酸分子。
【請求項４】
表１および表２に掲げられるものからなる群から選択される請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
生物学的システムのインビトロモデルにおいてアップレギュレーションされている核酸分子を同定するための方法であって、下記の工程を含む方法：
（１）モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程；
（２）それぞれの時点で集められた細胞から総ＲＮＡを得る工程；
（３）それぞれの時点に由来する総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、多数のｃＤＮＡプールを提供する工程；
（４）サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）をそれぞれの時点に由来するｃＤＮＡプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している核酸分子に由来するｃＤＮＡを段階的に増幅するようにする工程；
（５）増幅されたｃＤＮＡをクローン化する工程；
（６）各クローンに由来するＤＮＡをマイクロアレイ上において突き止める工程；
（７）前記所定の時間間隔でインビトロモデルから集められた細胞に由来する総ＲＮＡの逆転写によってアンチセンスＲＮＡを作製し、そのアンチセンスＲＮＡを標識する工程；および
（８）マイクロアレイを、０時間およびそれ以外の他の時点のそれぞれに由来する標識されたアンチセンスＲＮＡでプローブして、インビトロモデルにおいて前記時点でアップレギュレーションされている核酸分子に由来するｃＤＮＡを含有するクローンを別々に同定する工程。
【請求項６】
インビトロモデルは血管形成に対するインビトロモデルである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５または６の方法によって同定される核酸分子。
【請求項８】
表１および表２に掲げられるものからなる群から選択される請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項３，４，７または８のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１〜配列番号４４の一つに規定される配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１〜配列番号４４の一つに規定される配列を含むかまたは表１および表２に掲げられる単離された核酸分子またはそれらのフラグメントであって、血管形成プロセスにおいて役割を果たしているポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはそれらのフラグメント。
【請求項１２】
配列番号１〜配列番号４４の一つに規定される配列を含む核酸分子に対してまたは表１および表２に掲げられる核酸分子に対して少なくとも７０％の同一性を有する単離された核酸分子であって、血管形成プロセスにおいて役割を果たしているポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１３】
少なくとも８５％の同一性を有する請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
少なくとも９５％の同一性を有する請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
血管形成プロセスにおいて役割を果たしているポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、配列番号１〜配列番号４４の一つに規定されるヌクレオチド配列を含む核酸分子とまたは表１および表２に掲げられる核酸分子とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする単離された核酸分子。
【請求項１６】
血管形成に関連する疾患において役割を果たすポリペプチドをコードする請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子であって、前記疾患はがん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患を含むが、これらに限定されない単離された核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１〜配列番号４４に規定されるヌクレオチド配列のいずれか一つからなる単離された核酸分子。
【請求項１８】
血管形成プロセスに関与している全長のヒト遺伝子を同定および／または取得するための、配列番号１〜配列番号１５、配列番号１７〜配列番号３７および配列番号３９〜配列番号４４に規定される配列を有するＤＮＡ分子からなる群から選択される核酸分子の使用。
【請求項１９】
追加の配列が、前記核酸分子のうち一つ以上とのハイブリダイゼイション、インバースＰＣＲ、制限部位ＰＣＲ、歩行ＰＣＲ技術、またはＲＡＣＥを使用して得られる請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
配列番号１〜配列番号１５、配列番号１７〜配列番号３７および配列番号３９〜配列番号４４から選択される核酸分子の使用によって同定される遺伝子。
【請求項２１】
配列番号５１〜配列番号５８の一つに規定される配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号５１〜配列番号５８の一つに規定される配列を含むかまたは表１および表２に掲げられる単離されたポリペプチドまたはそれらのフラグメントであって、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている単離されたポリペプチドまたはそれらのフラグメント。
【請求項２３】
血管形成プロセスにおいて役割を果たし、配列番号５１〜配列番号５８の一つに規定されるアミノ酸配列に対してまたは表１および表２に掲げられる遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
少なくとも８５％の配列同一性を有する請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
血管形成プロセスに関連する疾患において役割を果たす請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドであって、前記疾患はがん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患を含むが、これらに限定されない単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号５１〜配列番号５８に規定されるアミノ酸配列のいずれか一つからなる単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項３０】
真核生物の細胞である請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
下記の工程を含むポリペプチドを調製する方法：
（１）請求項２９または３０に記載の細胞を、ポリペプチドの産生のために効果的な条件のもとで培養する工程；および
（２）ポリペプチドを集める工程。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法により調製されたポリペプチド。
【請求項３３】
血管形成を調節する方法であって、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を細胞内で調節する工程を含む方法。
【請求項３４】
核酸分子は配列番号１〜配列番号４４からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドが配列番号５１〜配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子のアンタゴニストまたはアゴニスト、または請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストの細胞への導入によって調節される請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスの細胞への導入によって調節される請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の相補体でありかつ前記核酸分子の発現またはレベルを調節することができる核酸分子の細胞への導入によって調節される請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチドである請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対して標的化された触媒作用核酸分子である請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
触媒作用核酸分子がＤＮＡザイムである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
触媒作用核酸分子がリボザイムである請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ポリペプチドの発現または活性がポリペプチドに結合することができる抗体によって調節される請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
抗体が完全なヒト抗体である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＦａｂフラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子またはその活性なフラグメントまたはその変化体を細胞に導入することによって調節される請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
核酸分子が請求項２８に記載の発現ベクターによって導入される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドを細胞に導入することによって調節される請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
血管形成が、制御されない血管形成または増強された血管形成である請求項３３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
血管形成が不適当に停止されているかまたは低下されている請求項３３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
血管形成関連障害の処置方法であって、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を調節する工程を含む方法。
【請求項５４】
核酸分子が配列番号１〜配列番号４４からなる群から選択される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ポリペプチドが請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ポリペプチドが配列番号５１〜配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子のアンタゴニストまたはアゴニスト、または請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストの細胞への導入によって調節される請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスの細胞への導入によって調節される請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の相補体でありかつ前記核酸分子の発現またはレベルを調節することができる核酸分子の細胞への導入によって調節される請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチドである請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対して標的化された触媒作用核酸分子である請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
触媒作用核酸分子がＤＮＡザイムである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
触媒作用核酸分子がリボザイムである請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ポリペプチドの発現または活性がポリペプチドに結合することができる抗体によって調節される請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
抗体が完全なヒト抗体である請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＦａｂフラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子またはその活性なフラグメントまたはその変化体を細胞に導入することによって調節される請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
核酸分子が請求項２８に記載の発現ベクターによって導入される請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドを細胞に導入することによって調節される請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
血管形成関連障害が、制御されない血管形成または増強された血管形成に関係するか、または低下された脈管構造が有利である障害である請求項５３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
障害が、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患からなる群から選択される請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
血管形成関連障害が、不適当に停止されているかもしくは低下されている血管形成に関係するか、または拡大された脈管構造が有利である障害である請求項５３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
障害が、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
血管形成関連障害を処置するための医薬品の製造における、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性の調節因子の使用。
【請求項７６】
核酸分子の配列は配列番号１〜配列番号４４からなる群から選択される請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
ポリペプチドが請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項７５に記載の使用。
【請求項７８】
ポリペプチドが配列番号５１〜配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子のアンタゴニストまたはアゴニスト、または請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストの細胞への導入によって調節される請求項７５に記載の使用。
【請求項８０】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスの細胞への導入によって調節される請求項７５に記載の使用。
【請求項８１】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の相補体でありかつ前記核酸分子の発現またはレベルを調節することができる核酸分子の細胞への導入によって調節される請求項７５に記載の使用。
【請求項８２】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子である請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチドである請求項８１に記載の使用。
【請求項８４】
核酸分子が請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対して標的化された触媒作用核酸分子である請求項８１に記載の使用。
【請求項８５】
触媒作用核酸分子がＤＮＡザイムである請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
触媒作用核酸分子がリボザイムである請求項８４に記載の使用。
【請求項８７】
ポリペプチドの発現または活性がポリペプチドに結合することができる抗体によって調節される請求項７５に記載の使用。
【請求項８８】
抗体が完全なヒト抗体である請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＦａｂフラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項８７に記載の使用。
【請求項９０】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子またはその活性なフラグメントまたはその変化体を細胞に導入することによって調節される請求項７５に記載の使用。
【請求項９１】
核酸分子が請求項２８に記載の発現ベクターによって導入される請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
ポリペプチドの発現または活性が、請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドを細胞に導入することによって調節される請求項７５に記載の使用。
【請求項９３】
血管形成関連障害が、制御されない血管形成または増強された血管形成に関係するか、または低下された脈管構造が有利である障害である請求項７５〜９２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９４】
障害が、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患からなる群から選択される請求項９３に記載の使用。
【請求項９５】
血管形成関連障害が、不適当に停止されているかまたは低下されている血管形成に関係するか、または拡大された脈管構造が有利である障害である請求項７５〜９２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９６】
障害が、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される請求項９５に記載の使用。
【請求項９７】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項９８】
請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の使用により同定される血管形成関連障害の処置に有用な化合物。
【請求項９９】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１００】
請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用により同定される血管形成関連障害の処置に有用な化合物。
【請求項１０１】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項２９または３０に記載の細胞の使用。
【請求項１０２】
請求項２９または３０に記載の細胞の使用により同定される血管形成関連障害の処置に有用な化合物。
【請求項１０３】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドを提供する工程；
（２）候補薬学的化合物を前記ポリペプチドに添加する工程；および
（３）前記ポリペプチドへの前記候補薬学的化合物の結合を決定する工程；
を含み、ポリペプチドに結合する化合物が候補薬学的化合物である方法。
【請求項１０４】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項２９または３０に記載の細胞を提供する工程；
（２）候補薬学的化合物を前記細胞に添加する工程；および
（３）前記細胞の機能的特性に対する前記候補薬学的化合物の効果を決定する工程；
を含み、前記細胞の機能的特性を変化させる化合物が候補薬学的化合物である方法。
【請求項１０５】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項２９または３０に記載の細胞を提供する工程；
（２）候補薬学的化合物を前記細胞に添加する工程；および
（３）前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子の発現に対する前記候補薬学的化合物の効果を決定する工程；
を含み、前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子の発現を変化させる化合物が候補薬学的化合物である方法。
【請求項１０６】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項２９または３０に記載の細胞を提供する工程；
（２）候補薬学的化合物を前記細胞に添加する工程；および
（３）前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性に対する前記候補薬学的化合物の効果を決定する工程；
を含み、前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を変化させる化合物が候補薬学的化合物である方法。
【請求項１０７】
請求項１０３〜１０６のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物。
【請求項１０８】
請求項９８，１００，１０２または１０７のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１０９】
請求項２１に記載の単離されたポリペプチドと免疫学的に反応する抗体。
【請求項１１０】
完全なヒト抗体である請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＦａｂフラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１２】
請求項１０に記載の核酸分子によってコードされるｍＲＮＡに対して標的化される短い干渉オリゴヌクレオチド。
【請求項１１３】
請求項１０に記載の核酸分子に対して標的化される触媒作用核酸分子。
【請求項１１４】
ＤＮＡザイムである請求項１１３に記載の触媒作用核酸分子。
【請求項１１５】
リボザイムである請求項１１３に記載の触媒作用核酸分子。
【請求項１１６】
血管形成関連障害の診断または予後における請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１１７】
血管形成関連障害の診断または予後における請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１１８】
血管形成関連障害の診断または予後における請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の抗体または請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載のポリペプチドに対する抗体の使用。
【請求項１１９】
血管形成関連障害の診断または予後のための方法であって、以下の工程：
（１）正常なヒトにおいて、請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の正常な発現および／または活性についてプロフィルを確立する工程；
（２）遺伝子の異常な発現および／または活性が疑われる対象において前記核酸分子の発現および／または活性のレベルを測定する工程；および
（３）測定した前記核酸分子の発現および／または活性のレベルを正常な発現および／または活性についてのプロフィルと比較する工程；
を含み、前記対象における前記核酸分子の発現および／または活性の変化したレベルが、血管形成関連障害の徴候であるか、またはその素因である方法。
【請求項１２０】
逆転写酵素ＰＣＲが発現のレベルを測定するために利用される請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
遺伝子またはそのフラグメントに由来するプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイが発現のレベルを測定するために利用される請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
血管形成関連障害の診断または予後のための方法であって、以下の工程：
（１）対象から請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子に対応するＤＮＡを得る工程；および
（２）前記対象からのＤＮＡを野生型核酸分子に対応するＤＮＡと比較する工程；
を含み、前記対象における変化したＤＮＡ特性が血管形成関連障害の徴候であるか、またはその素因である方法。
【請求項１２３】
核酸分子のＤＮＡが配列決定され、配列が比較される請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
核酸分子のＤＮＡがＳＳＣＰ分析に供される請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
血管形成関連障害の診断または予後のための方法であって、以下の工程：
（１）請求項９，２１〜２７または３２のいずれか一項に記載の野生型ポリペプチドの物理的特性を確立する工程；
（２）前記ポリペプチドが異常になっていると疑われる対象から前記ポリペプチドを得る工程；および
（３）前記対象によって発現されるポリペプチドの特性を測定し、それを野生型ポリペプチドの確立された特性と比較するする工程；
を含み、前記対象における変化したポリペプチド特性が、血管形成関連障害の徴候であるか、またはその素因である方法。
【請求項１２６】
特性が電気泳動移動度である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
特性がタンパク質分解的切断パターンである請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１２９】
請求項３，４，７，８または１０〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子の破壊を含む遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１３０】
動物が、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルおよびチンパンジーの如き非ヒト霊長類からなる群から選択される請求項１２８または１２９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１３１】
動物がマウスである請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１３２】
血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングにおける請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物の使用。
【請求項１３３】
血管形成関連障害が、制御されない血管形成または増強された血管形成に関係するか、または低下された脈管構造が有利である障害である請求項９７〜１０２または１３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３４】
障害が、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患からなる群から選択される請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３５】
血管形成関連障害が、不適当に停止されているかまたは低下されている血管形成に関係するか、または拡大された脈管構造が有利である障害である請求項９７〜１０２または１３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３６】
障害が、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される請求項１３５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成プロセスに関与する新規な核酸配列（「血管形成遺伝子」）に関する。血管形成遺伝子はそれぞれ、血管形成において役割を有するポリペプチドをコードする。これらの遺伝子が血管形成において役割を果たしているという認識を考慮して、本発明はまた、血管形成に関連する病理の治療、薬物を血管形成活性または抗血管形成活性についてスクリーニングすること、血管形成に関連する病理の診断および予後、ならびに、場合により、全長の血管形成関連遺伝子を同定および取得するための核酸配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の血管からの新しい血管の形成は、血管形成と名付けられたプロセスであり、正常な成長のために不可欠である。重要な血管形成プロセスには、胚形成、子宮内膜の更新、妊娠状態の黄体の形成および成長、創傷治癒、ならびに手術後の組織構造および組織機能の回復において行われるプロセスが含まれる。
【０００３】
新しい毛細血管の形成では、血管形成活性または抗血管形成活性のいずれかを有し得る多数の遺伝子の発現を通して媒介される協調した一連の事象が要求される。このプロセスは、通常的には血管内皮増殖因子または塩基性繊維芽細胞増殖因子などの増殖因子によって媒介される、存在する脈管構造に対する血管形成刺激により開始される。この後に、細胞外マトリックスの分解、細胞接着の変化（および破壊）、細胞透過性の増大、内皮細胞（ＥＣ）の増殖、ならびに血管形成部位に向かうＥＣの遊走が続く。その後のプロセスには、毛細管または内腔の形成、遊走中のＥＣによる安定化および分化が含まれる。
【０００４】
（正常な）健康な成人では、血管形成は事実上停止しており、必要なときにだけ生じる。しかしながら、数多くの病理学的状況が、増強された、制御されない血管形成によって特徴づけられる。これらの状態には、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬および心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）が含まれる。他の病変（例えば、虚血性四肢疾患など）または冠状動脈疾患では、拡大しつつある脈管構造の増進により新しい血管を成長させることは有益である。
【０００５】
血管形成を模擬すると考えられる数多くのインビトロアッセイが確立されており、これらは、血管形成プロセスが生じる機構、および、遺伝子が関与する可能性が最も高い機構を調べるための重要な手段を提供している。
【０００６】
内腔形成は血管形成における重要な段階である。血管形成を受けているＥＣの内部に空胞が存在することが報告されており、内腔形成におけるその関与が仮定されている（ＦｏｌｋｍａｎおよびＨａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ、１９８０；Ｇａｍｂｌｅ他、１９９３）。ＦｏｌｋｍａｎおよびＨａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ（１９８０）によって提案された内腔形成の一般的な機構は、空胞が、その後で管に変換される数多くの整列したＥＣの細胞質の内部に生じるというものであった。隣接する管の結合により、連続した単一細胞の毛細管内腔の形成がもたらされる。しかしながら、内腔形成を生じさせる細胞形態の変化、または、ＥＣがこの特徴を構築するために要求されるシグナルについてはほとんど知られていない。
【０００７】
血管形成のインビトロモデルが、３次元コラーゲンマトリックスに置かれたヒト臍帯静脈ＥＣから作製されている（Ｇａｍｂｌｅ他、１９９３）。ホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）の存在下において、これらの細胞は毛細管を２４時間以内に形成する。抗インテグリン抗体の添加により、（未成熟な、十分に分化していない表現型を反映すると考えられる）通常は単一細胞の管が、細胞−マトリックス相互作用の阻害および細胞−細胞相互作用の促進により多細胞性の内腔を形成するように変換される。このモデルは続いて、内腔形成において生じる形態学的事象の研究を可能にしている。
【０００８】
血管形成に関連する疾患を処置するために、このプロセスの分子遺伝学的機構を理解することは決定的に重要である。上記のインビトロモデル（Ｇａｍｂｌｅ他、１９９３）、すなわち、時間依存的かつ広く同期的な様式でインビボにおいて血管形成時に生じる極めて重要な事象を反映するモデルの使用は、関与する重要な遺伝子を同定するための手段を提供している。
【発明の開示】
【０００９】
生物学的モデル（この場合、血管形成に対するＧａｍｂｌｅ他（１９９３）のモデル）から特定の時点で集められた細胞に由来する総ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを調製し、その後、ｃＤＮＡを、示差的に発現している遺伝子に由来するｃＤＮＡを同定するために、サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を含む新規なプロセスに供した。
【００１０】
本発明の１つの局面によれば、生物学的システムのインビトロモデルにおいて示差的に発現している遺伝子を同定するための方法が提供され、この方法は下記の工程を含む：
（１）モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程；
（２）それぞれの時点で集められた細胞から総ＲＮＡを得る工程；
（３）それぞれの時点に由来する総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、多数のｃＤＮＡプールを提供する工程；
（４）サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）をそれぞれの時点に由来するｃＤＮＡプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している遺伝子に由来するｃＤＮＡを段階的に増幅するようにする工程。
【００１１】
従って、その発現が同じレベルでその後もアップレギュレーションされたままである遺伝子のアップレギュレーションが、ｃＤＮＡのレベルが上昇している最初の期間においてのみ検出される（ｃＤＮＡが増幅される）。これは、その後の時点に由来するプールにおけるｃＤＮＡの量が同じであるためである。冗長性におけるこの減少は、細胞ｍＲＮＡ発現プールにおける提示がより低い他の遺伝子が隠されるという可能性を低下させる。本発明の特に好ましい実施形態において、モデルシステムは血管形成に対するインビトロモデルである（Ｇａｍｂｌｅ他、１９９３）。
【００１２】
ＳＳＨプロセスにおいて示差的に発現していることが同定されたそのようなｃＤＮＡがクローン化され、マイクロアレイ分析に供され、これにより、血管形成プロセス時のそれらの発現においてアップレギュレーションされている数多くの遺伝子の同定がもたらされた。
【００１３】
本発明のさらなる局面によれば、生物学的システムのインビトロモデルにおいてアップレギュレーションされている遺伝子を同定するための方法が提供され、この方法は下記の工程を含む：
（１）モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程；
（２）それぞれの時点で集められた細胞から総ＲＮＡを得る工程；
（３）それぞれの時点に由来する総ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、多数のｃＤＮＡプールを提供する工程；
（４）サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）をそれぞれの時点に由来するｃＤＮＡプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現する遺伝子に由来するｃＤＮＡを段階的に増幅するようにする工程；
（５）増幅されたｃＤＮＡをクローン化する工程；
（６）各クローンに由来するＤＮＡをマイクロアレイ上において突き止める工程；
（７）前記所定の時間間隔でインビトロモデルから集められた細胞に由来する総ＲＮＡの逆転写によってアンチセンスＲＮＡを作製し、そのアンチセンスＲＮＡを標識する工程；および
（８）マイクロアレイを、０時間およびそれ以外の他の時点のそれぞれに由来する標識されたアンチセンスＲＮＡでプローブして、インビトロモデルにおいて前記時点でアップレギュレーションされている遺伝子に由来するｃＤＮＡを含有するクローンを別々に同定する工程。
【００１４】
これらのアップレギュレーションされている血管形成遺伝子のサブセットの機能的分析、ならびに、内皮細胞の機能および毛細管形成に対するそれらの影響が下記に詳しく記載される。
【００１５】
従って、本発明は、血管形成時のその発現においてアップレギュレーションされることが示されている単離された核酸分子を提供する（表１および表２を参照のこと）。これらの血管形成遺伝子の単離は血管形成関連障害の処置のための新規な標的を提供している。
【００１６】
本発明の第１の局面において、配列番号１〜配列番号４４によって規定されるような単離された核酸分子が提供される。
【００１７】
これらの分子、ならびに、表１および表２に示される分子は血管形成時のそれらの発現においてアップレギュレーションされるという認識に従うと、本発明は、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている、配列番号１〜配列番号４４によって規定され、また、表１および表２に示されるような単離された核酸分子またはそれらのフラグメントを提供する。そのようなプロセスには、胚形成、月経周期、創傷修復、腫瘍の血管形成、および運動により誘導される筋肉肥大が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００１８】
加えて、本発明は、血管形成プロセスに関連する疾患において役割を果たしている、配列番号１〜配列番号４４によって規定され、また、表１および表２に示されるような単離された核酸分子（以降、これらは、便宜上、「血管形成遺伝子」、「血管形成核酸」または「血管形成ポリペプチド」と呼ばれる）またはそれらのフラグメントを提供する。前記疾患には、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、および心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。有用なフラグメントには、特徴的であり、かつ、何らかの以前に同定された遺伝子と重なる部分を有しないフラグメント、既知の配列と重なる部分を有する特徴的なフラグメント、および、選択的スプライス接合部にまたがるフラグメントなどが含まれ得る。
【００１９】
本発明はまた、本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている単離された核酸分子を包含する。
【００２０】
そのような変化体は、血管形成遺伝子に対して、好ましくは少なくとも約８５％（最も好ましくは少なくとも約９５％）の配列同一性を有する。上記のポリヌクレオチド変化体のいずれか１つは、本発明の関連した血管形成遺伝子の少なくとも１つの機能的特徴または構造的特徴を含有するアミノ酸配列をコードすることができる。
【００２１】
配列同一性は、典型的には、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ６２の初期値行列とともに使用して計算される。
【００２２】
本発明はまた、本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つとストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションし、かつ、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている単離された核酸分子を包含する。
【００２３】
ゲノム配列を含めてポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを使用して、関連した血管形成遺伝子をコードする核酸配列を同定することができる。プローブの特異性（プローブが非常に特異的な領域（例えば、５’調節領域）から作製されるか、または、あまり特異的でない領域（例えば、保存されたモチーフ）から作製されるか）、および、ハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシーは、そのプローブにより、血管形成遺伝子をコードする天然に存在する配列、対立遺伝子変化体、または関連した配列のみが同定されるかどうかを決定する。
【００２４】
プローブはまた、関連した配列を検出するために使用することができ、従って、好ましくは、本発明の血管形成遺伝子コード配列のいずれかに対する少なくとも５０％の配列同一性を有しなければならない。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、血管形成遺伝子配列のいずれか１つに由来し得るか、または、血管形成遺伝子のプロモーター、エンハンサーおよびイントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【００２５】
血管形成遺伝子のいずれか１つをコードするＤＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションプローブを作製するための手段には、関連した血管形成遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列またはその誘導体を、ｍＲＮＡプローブを作製するためのベクターにクローン化することが含まれる。様々なそのようなベクターがこの分野では知られており、市販されている。ハイブリダイゼーションプローブは、放射性核種（例えば、３２Ｐまたは３５Ｓなど）によって、または酵素標識（例えば、アビジン／ビオチンのカップリングシステムを介してプローブにカップリングされるアルカリホスファターゼなど）によって、またはこの分野で知られている他の方法によって標識することができる。
【００２６】
ストリンジェントな条件のもとにおいて、３２Ｐ標識プローブとのハイブリダイゼーションが、最も好ましくは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、１Ｘデンハルト、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡにおいて４２℃で行われる。これらの条件に対する様々な有用な変化が当業者には容易に明らかである。ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程は、最も好ましくは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳにおいて６５℃で行われる。これらの条件に対する様々なさらなる変化が当業者には容易に明らかである。
【００２７】
本発明の核酸分子またはそのフラグメントは、天然の供給源から得ることができるヌクレオチド配列を有する。従って、本発明の核酸分子またはそのフラグメントには、天然に存在する正常な対立遺伝子、天然に存在する変異型対立遺伝子、天然に存在する多型対立遺伝子、様々にスプライシングされた転写物、スプライス変化体などが含まれる。天然の供給源には、動物の細胞および組織、体液、組織培養細胞などが含まれる。
【００２８】
本発明の核酸分子はまた、この分野で受け入れられている方法を使用して操作することができ、その結果、血管形成遺伝子をコードする配列を様々な目的のために変化させることができる。これらには、遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現の改変が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子フラグメントのＰＣＲ再組み立ておよび合成オリゴヌクレオチドの使用は、血管形成遺伝子ヌクレオチド配列を操作することを可能にする。例えば、オリゴヌクレオチド媒介の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位を生じさせる変異、グリコシル化パターンを変化させる変異、およびスプライス変化体を産生させる変異などを導入することができる。
【００２９】
遺伝暗号の縮重性の結果として、本発明の血管形成遺伝子をコードする数多くの核酸配列（この場合、いくつかが、任意の知られている天然に存在する遺伝子の核酸配列に対する最小限の類似性を有し得る）がもたらされ得る。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによって作製され得るポリヌクレオチド配列のあらゆる可能な変化体を包含する。これらの組合せは、天然に存在する血管形成遺伝子のポリヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に従って行われ、従って、そのような変化体はすべてが、具体的に開示されていると見なされなければならない。
【００３０】
本発明の核酸分子は典型的にはＤＮＡ分子であり、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方で、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態および混合ポリマーを包含し、そして、当業者によって理解されるように、化学的または生化学的に修飾することができ、あるいは、非天然型ヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有することができる。そのような修飾には、標識、メチル化、インターカレーター、アルキル化体および修飾された連結が含まれる。場合により、血管形成遺伝子をコードするヌクレオチド配列、または、天然に存在する遺伝子のコドン使用とは実質的に異なるコドン使用を有するその誘導体を作製することは好都合であり得る。例えば、コドンを、宿主が特定のコドンを利用する頻度と一致させて、特定の原核生物宿主または真核生物宿主におけるペプチドの発現速度を増大させるために選択することができる。血管形成遺伝子をコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を、そのコードされるアミノ酸配列を変化させることなく変化させるための他の理由には、天然に存在する配列から産生される転写物よりも望ましい性質（例えば、そのような転写物よりも大きい半減期など）を有するＲＮＡ転写物の産生が含まれる。
【００３１】
本発明はまた、すべてが合成化学による本発明の核酸分子の製造を包含する。合成配列は、好適な宿主における挿入されたコード配列の転写制御および翻訳制御のための必要なエレメントを含有する発現ベクターおよび細胞システムに挿入することができる。これらのエレメントには、調節配列、プロモーター、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、ならびに、血管形成遺伝子をコードする配列のより効率的な翻訳を可能にする特異的な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ開始コドンおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列など）が含まれ得る。その開始コドンおよび上流の調節配列を含む完全なコード配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる制御シグナルが必要とされないことがある。しかしながら、コード配列のみまたはそのフラグメントが挿入される場合、上記に記載されるような外因性の翻訳制御シグナルをベクターによって提供しなければならない。そのようなシグナルは、天然および合成の両方で様々な起源のものであり得る。発現効率は、使用される特定の宿主細胞システムについて適切なエンハンサーを含むことによって高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ他、１９９４）。
【００３２】
本発明はまた、本明細書中に記載される配列の相補体である核酸分子を包含する。
【００３３】
本発明は、精製されたポリペプチドまたはタンパク質の調製を可能にする。これを行うために、宿主細胞を、上記に記載されるような核酸分子でトランスフェクションすることができる。典型的には、前記宿主細胞は、本発明による核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクションされる。様々な発現ベクター／宿主システムを利用して、配列を含有し、発現させることができる。これらには、微生物、例えば、プラスミドまたはコスミドのＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌など；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム；あるいは、マウスまたは他の動物またはヒトの組織細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞もまた、本発明の特定の血管形成遺伝子によりコードされるタンパク質を、プラスミド、コスミドおよびウイルスシステム（例えば、ワクシニアウイルス発現システムなど）を含む様々な発現ベクターを使用して発現させるために使用することができる。本発明は、用いられる宿主細胞またはベクターによって限定されない。
【００３４】
本発明の核酸分子またはその変化体は、哺乳動物システムにおける組換えタンパク質の長期間にわたる産生を可能にするために細胞株において安定的に発現させることができる。本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つをコードする配列を、ウイルス複製起点および／または内因性の発現エレメント、および、同じベクターまたは別個のベクターにおける選択マーカー遺伝子を含有し得る発現ベクターを使用して細胞株に形質転換することができる。選択マーカーにより、選択因子に対する耐性が付与され、その存在により、導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長および回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンを、細胞タイプに対して適切な組織培養技術を使用して拡大することができる。
【００３５】
形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに依存して、分泌され得るか、または細胞内に保持され得る。当業者によって理解されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を通過するタンパク質の分泌を行わせるシグナル配列を含有するように設計することができる。
【００３６】
また、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または、発現したタンパク質を所望の様式でプロセシングするその能力のために選ぶことができる。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、グリコシル化、リン酸化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態の翻訳後切断もまた、タンパク質の標的化、折り畳みおよび／または活性を規定するために使用することができる。翻訳後活性のための特定の細胞装置および特徴的な機構を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＨｅＬａ細胞）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手することができ、また、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選ぶことができる。
【００３７】
本発明のさらに別の局面によれば、上記に記載されるような本発明の核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【００３８】
本発明のさらに別の局面によれば、上記に記載されるような本発明の核酸分子を含む細胞が提供される。
【００３９】
多量のタンパク質が、例えば、抗体製造などのために必要とされるとき、高レベルの発現を行わせるベクターを使用することができる（例えば、Ｔ５またはＴ７の誘導可能なバクテリオファージプロモーターを含有するベクターなど）。本発明はまた、タンパク質の重要な機能的ドメインを含有する融合タンパク質を作製および単離する際における上記の発現システムの使用を包含する。これらの融合タンパク質は、適切な抗体の作製だけでなく、結合研究、構造研究および機能研究のために使用される。
【００４０】
タンパク質を融合タンパク質として発現および精製するために、本発明の適切なポリヌクレオチド配列は、別のペプチド（例えば、グルタチオンスクシニルトランスフェラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターに挿入される。融合タンパク質は原核生物細胞または真核生物細胞から発現および回収される。その後、融合タンパク質は、融合ベクター配列に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができ、続いて、関連したタンパク質を融合タンパク質の酵素切断によって得ることができる。
【００４１】
本発明のポリペプチドのフラグメントはまた、固相技術を使用する直接的なペプチド合成によって作製することができる。自動化された合成を、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用することによって達成することができる。ポリペプチドの様々なフラグメントを別々に合成することができ、その後、組み合わせて全長の分子を作製することができる。
【００４２】
本発明の単離された核酸分子が部分的な遺伝子配列のみを表す場合、これらの部分配列は、全長の血管形成遺伝子のその対応する配列を得るために使用することができる。従って、本発明はさらに、血管形成プロセスに関与している全長のヒト遺伝子を同定および／または取得するための、配列番号１〜配列番号１５、配列番号１７〜配列番号３７および配列番号３９〜配列番号４４のいずれか１つによって規定されるヌクレオチド配列を含む本発明の部分核酸分子の使用を提供する。全長の血管形成遺伝子は、当業者にそれ自体は知られている方法によって、本発明の部分ヌクレオチド配列を使用してクローン化することができる。例えば、配列データベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において主催されるデータベースなど）のインシリコ分析を、重なるヌクレオチド配列を得るために検索することができる。これは、全長の遺伝子配列を得るための「歩行」法を提供する。このサイトにおいて検索するための適切なデータベースには、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（ＧｅｎＢａｎｋ配列、ＥＭＢＬ配列およびＤＤＢＪ配列の、それらのＥＳＴ部門由来のデータベース）または非冗長（ｎｒ）データベース（すべてのＧｅｎＢａｎｋ配列、ＥＭＢＬ配列、ＤＤＢＪ配列およびＰＤＢ配列を含有するが、ＥＳＴ配列、ＳＴＳ配列、ＧＳＳ配列、または、フェーズ０、フェーズ１もしくはフェーズ２のＨＴＧＳ配列を含まない）が含まれる。典型的には、検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズをＢＬＯＳＵＭ６２の初期値行列とともに使用して行われる。インシリコ「歩行」法により、完全な遺伝子配列を引き出すことができない場合、さらなる方法を用いることができる。これらには、その配列が知られているＤＮＡの一部分に隣接する未知の配列の取り出しを可能にする「制限部位ＰＣＲ」の使用が含まれる。この技術では、万能的なプライマーが、未知の配列を取り出すために使用される。インバースＰＣＲもまた使用することができ、この場合、知られている配列に基づくプライマーが、隣接する未知の配列を増幅するために設計される。これらの上流配列はプロモーターおよび調節エレメントを含むことができる。加えて、様々な他のＰＣＲ型技術を使用することができる。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能なキットは歩行ＰＣＲ技術を可能にし、５’ＲＡＣＥキット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）はさらなる５’遺伝子配列の単離を可能にし、一方、さらなる３’配列を、常法的に行われる技術（例えば、Ｇｅｃｚ他（１９９７）を参照のこと）を使用して得ることができる。
【００４３】
本発明のさらなる局面において、配列番号５１〜配列番号５８によって規定され、また、表１に示されるような単離されたポリペプチドが提供される。
【００４４】
本発明はまた、血管形成時のその発現においてアップレギュレーションされることが示されている単離されたポリペプチドを提供する（表１および表２に参照のこと）。
【００４５】
より具体的には、これらのポリペプチドが血管形成時のそれらの発現においてアップレギュレーションされるという認識に従うと、本発明は、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている、配列番号５１〜配列番号５８によって規定され、また、表１および表２に示されるような単離されたポリペプチドまたはそれらのフラグメントを提供する。そのようなプロセスには、胚形成、月経周期、創傷修復、腫瘍の血管形成、および運動により誘導される筋肉肥大が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４６】
加えて、本発明は、血管形成プロセスに関連する疾患において役割を果たしている、配列番号５１〜配列番号５８によって規定され、また、表１および表２に示されるような単離されたポリペプチドまたはそれらのフラグメントを提供する。疾患には、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、および心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明はまた、配列番号５１〜配列番号５８のいずれか１つに対して少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９５％）の同一性を有し、かつ、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている単離されたポリペプチドを包含する。
【００４８】
配列同一性は、典型的には、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ６２の初期値行列とともに使用して計算される。
【００４９】
本発明のさらなる局面において、上記に記載されるようなポリペプチドを調製する方法が提供され、この方法は下記の工程を含む：
（１）上記に記載されるような細胞を、ポリペプチドを産生させるために効果的な条件のもとで培養する工程；および
（２）ポリペプチドを集める工程。
【００５０】
本発明のさらに別の局面によれば、上記に記載されるプロセスの産物であるポリペプチドが提供される。
【００５１】
実質的に精製されたタンパク質またはそのフラグメントはその後、二次構造および三次構造を明らかにするために、さらなる生化学的分析において使用することができる。そのような方法論はこの分野で知られており、これには、タンパク質の結晶のＸ線結晶学、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）による方法が含まれるが、これらに限定されない。構造の決定により、タンパク質と相互作用するか、またはタンパク質の電荷配置を変化させるか、または他のタンパク質と電荷相互作用するか、あるいは、細胞におけるその機能を変化させるための医薬品の合理的設計が可能になる。
【００５２】
本発明は、血管形成に関与している可能性がある数多くの遺伝子を提供しており、従って、血管形成を調節するための方法を可能にする。血管形成は数多くの病理学的プロセスにおいて非常に重要であるため、従って、本発明はまた、すべての血管形成関連障害を処置するための治療的方法を可能にし、また、血管形成遺伝子のいずれか１つの発現および／または機能における異常に関連するすべての血管形成関連障害の診断または予後を可能にすることができる。
【００５３】
そのような障害の例には、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、および心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００５４】
（治療的適用）
本発明の別の局面によれば、上記に記載されるような血管形成関連障害を処置する方法が提供され、この方法は、本発明の血管形成遺伝子または血管形成タンパク質の選択的なアンタゴニストまたはアゴニストを、そのような処置を必要としている対象に投与することを含む。
【００５５】
本発明のさらに別の局面において、上記に記載されるような血管形成関連障害を処置するための医薬品の製造における本発明の血管形成遺伝子または血管形成タンパク質の選択的なアンタゴニストまたはアゴニストの使用が提供される。
【００５６】
制御されない血管形成または増強された血管形成をもたらす血管形成関連障害（これには、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、および心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）が含まれるが、これらに限定されない）を処置するためには、拡大しつつある脈管構造を阻害する治療が望ましい。これは、血管形成を促進することができる血管形成遺伝子または血管形成タンパク質のいずれか１つの阻害、あるいは、血管形成を阻害することができる血管形成遺伝子または血管形成タンパク質のいずれか１つの強化、刺激または再活性化を伴う。
【００５７】
阻害された血管形成または低下した血管形成によって特徴づけられる血管形成関連障害（これには、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患が含まれるが、これらに限定されない）を処置するためには、血管拡張を強化または促進する治療が望ましい。これは、血管形成を制限することができる血管形成遺伝子または血管形成タンパク質のいずれか１つの阻害、あるいは、血管形成を促進することができる血管形成遺伝子または血管形成タンパク質のいずれか１つの強化、刺激または再活性化を伴う。
【００５８】
例えば、ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１の発現を低下させることは、内皮細胞の活性を妨害し、これにより毛細管形成および血管形成の阻害を生じさせることが見出されている。従って、血管形成を制限する必要がある障害の治療では、これらの遺伝子の機能を阻害することが望ましい。あるいは、血管形成を刺激する必要がある障害の治療では、これらの遺伝子の機能を強化することが望ましい場合がある。
【００５９】
これらの場合のそれぞれについて、関連した治療は、血管形成遺伝子における損傷があるかどうかにかかわらず、血管形成関連障害を処置することにおいて有用である。
【００６０】
（遺伝子またはタンパク質の機能を阻害すること）
遺伝子またはタンパク質の機能を阻害することを様々な方法で達成することができる。アンチセンス核酸方法論は、障害の原因となっている遺伝子を不活性化するための１つの方法を表す。アンチセンス法または遺伝子標的化サイレンシング法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクション、および、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用（これらに限定されない）を含むことができる。ＲＮＡｉを、その発現が血管形成に寄与するとき、遺伝子を封じるためにインビトロおよびインビボで使用することができる（ＳｈａｒｐおよびＺａｍｏｒｅ、２０００；Ｇｒｉｓｈｏｋ他、２００１）。なおさらに、触媒作用核酸分子（例えば、ＤＮＡザイムおよびリボザイムなど）を遺伝子サイレンシングのために使用することができる（ＢｒｅａｋｅｒおよびＪｏｙｃｅ、１９９４；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８）。これらの分子は、従来のアンチセンス法の場合のようにその標的ｍＲＮＡ分子に単に結合するのではなく、その標的ｍＲＮＡ分子を切断することによって機能する。
【００６１】
本発明の１つの局面において、単離された核酸分子（これは、上記に記載される関連した血管形成核酸分子のいずれか１つの相補体である）を、そのような処置を必要としている対象に投与することができる。典型的には、血管形成遺伝子の任意の関連した遺伝子に対する相補体が、血管形成関連障害を処置または防止するために対象に投与される。さらなる局面において、相補体は、本発明の関連した血管形成遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子をコードすることができ、または、本発明の関連した血管形成遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）であり得る。
【００６２】
本発明のさらなる局面において、本発明の関連した核酸分子のいずれか１つの相補体であり、かつ、本発明の関連した血管形成遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＲＮＡ分子または短い干渉オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）をコードする単離された核酸分子の、血管形成関連障害を処置するための医薬品の製造における使用が提供される。
【００６３】
典型的には、関連した核酸分子のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを、血管形成関連障害（これには、上記に記載される障害が含まれるが、これらに限定されない）を処置または防止するために対象に投与することができる。ベクターを細胞または組織に導入するための多くの方法を利用することができ、これらは、インビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用のために等しく好適である。エクスビボ治療において、ベクターを、患者から採取され、自家移植のためにクローン拡大されて、その同じ患者に戻される幹細胞に導入することができる。トランスフェクションによる送達、リポソーム注入による送達、またはポリカチオン性アミノポリマーによる送達を、この分野で広く知られている方法を使用して達成することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ他（１９９７）を参照のこと）。
【００６４】
さらなる局面において、本発明による精製されたタンパク質を、本発明の任意の関連した血管形成タンパク質と特異的に結合する抗体を作製するために使用することができる。これらの抗体は、アンタゴニストとして直接的に使用することができ、あるいは、関連した血管形成タンパク質を発現する細胞または組織に薬学的薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤など）を運ぶための標的化機構または送達機構として間接的に使用することができる。そのような抗体には、当業者によって理解されるように、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体および単鎖抗体が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６５】
抗体を製造するために、様々な宿主（これには、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、ヒトなどが含まれる）を、本発明のタンパク質を用いた注射、あるいは、免疫原的性質を有するその任意のフラグメントまたはオリゴペプチドを用いた注射によって免疫化することができる。様々なアジュバントを、免疫学的応答を増大させるために使用することができ、これらには、フロイントの鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウムなど）および表面活性物質（例えば、リゾレシチンなど）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントには、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が含まれる。
【００６６】
関連した血管形成タンパク質に対する抗体を誘導するために使用されるオリゴペプチド、ペプチドまたはフラグメントは、少なくとも約５個のアミノ酸（より好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸）からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたはフラグメントは、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部分と同一であること、また、小さい天然に存在する分子の完全なアミノ酸配列を含有することもまた好ましい。これらのタンパク質に由来するアミノ酸の短い領域を別のタンパク質（例えば、ＫＬＨなど）の領域と融合することができ、そのようなキメラな分子に対する抗体を作製することができる。
【００６７】
任意の関連した血管形成タンパク質に対するモノクローナル抗体を、培養における連続した細胞株による抗体分子の作製を規定する任意の技術を使用して調製することができる。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ他（１９８５）；Ｃｏｔｅ他（１９８３）；Ｃｏｌｅ他（１９８４）を参照のこと）。
【００６８】
作製されたモノクローナル抗体には、マウス由来抗体、ヒト化抗体および完全なヒト抗体が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、抗体は、抗原投与刺激に応答して特異的なヒト抗体を産生するように操作されている遺伝子組換えマウスから得られる。この技術の一例において、ヒトの重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の標的化された破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入される。これらの遺伝子組換えマウスは、ヒトの抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、また、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために使用することができる。ヒト抗体を遺伝子組換えマウスから得るための方法が、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ他（１９９４）；Ｇｒｅｅｎ他（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒ他（１９９４）に記載される。
【００６９】
抗体はまた、文献に開示されるように、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導することによって、あるいは、免疫グロブリンライブラリーまたは非常に特異的な結合性試薬のパネルをスクリーニングすることによって作製することができる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ他（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒ他（１９９１）を参照のこと）。
【００７０】
任意の関連した血管形成タンパク質に対する特異的な結合部位を含有する抗体フラグメントもまた作製することができる。例えば、そのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、および、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって得られるＦａｂフラグメントが含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために構築することができる（例えば、Ｈｕｓｅ他（１９８９）を参照のこと）。
【００７１】
様々な免疫アッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに使用することができる。明らかにされた特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合アッセイまたは免疫放射アッセイのための数々のプロトコルがこの分野では広く知られている。そのような免疫アッセイは、典型的には、タンパク質とその特異的な抗体との複合体形成の測定を伴う。妨害しない２つのエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナル型免疫アッセイが好ましく、しかし、競合的結合アッセイもまた用いることができる。
【００７２】
さらなる局面において、アンタゴニストには、ペプチド、リン酸化ペプチド、または小さい有機化合物もしくは無機化合物が含まれ得る。これらのアンタゴニストは本発明の任意の関連した血管形成遺伝子の機能を妨げ、その結果、必要な治療的効果を提供するはずである。
【００７３】
治療的適用のために好適なペプチド、リン酸化ペプチド、または小さい有機化合物もしくは無機化合物は、下記に記載されるような薬物スクリーニング適用において本発明の核酸およびポリペプチドを使用して同定することができる。
【００７４】
（遺伝子またはタンパク質の機能を高めること）
遺伝子またはタンパク質の機能を強化、刺激または再活性化することを様々な方法で達成することができる。本発明の１つの局面において、上記に記載されるような単離された核酸分子の、そのような処置を必要としている対象への投与を開始することができる。典型的には、本発明の任意の関連した血管形成遺伝子を、血管形成関連障害を処置または防止するために対象に投与することができる。
【００７５】
さらなる局面において、血管形成関連障害を処置するための医薬品の製造における、上記に記載されるような単離された核酸分子の使用が提供される。
【００７６】
典型的には、任意の関連した血管形成遺伝子またはそのフラグメントもしくは誘導体を発現することができるベクターを、上記に記載される様々な障害（これらに限定されない）を含む障害を処置または防止するために対象に投与することができる。形質導入用のレトロウイルスベクターが、多くの場合、それらの大きな感染効率ならびに安定な組込みおよび発現のために、体細胞遺伝子治療のために使用される。任意の関連した全長の遺伝子またはその一部分をレトロウイルスベクターにクローン化することができ、発現を、その内因性のプロモーターから、またはレトロウイルスの長末端反復から、または目的とする標的細胞タイプについて特異的なプロモーターから行わせることができる。他のウイルスベクターを使用することができ、これらには、この分野で知られているように、トリ起源、マウス起源およびヒト起源のアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、パポバウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。
【００７７】
遺伝子治療が、確立された方法に従って行われる（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、１９９１；Ｃｕｌｖｅｒ、１９９６）。発現制御エレメントに連結され、細胞の内部において複製することができる任意の関連した血管形成遺伝子のコピーを含有するベクターが調製される。あるいは、ベクターは複製欠陥であり得るし、また、遺伝子治療における複製および使用のためにヘルパー細胞を必要とし得る。
【００７８】
インビトロでの感染の非ウイルス方法を使用する遺伝子移入もまた使用することができる。これらの方法では、ＤＮＡの直接的な注入、リン酸カルシウムの存在下でのネイクドＤＮＡの取込み、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合またはリポソーム送達を含む。遺伝子移入はまた、ヒト人工染色体の一部としての送達によって、または受容体媒介による遺伝子移入によって達成することができる。これは、特定の細胞表面受容体に結合して、エンドサイトーシスおよび哺乳動物細胞内へのＤＮＡの移動を誘導する標的化分子にＤＮＡを連結することを伴う。１つのそのような技術では、ポリ−Ｌ−リシンを使用して、アシアロ糖タンパク質がＤＮＡに連結される。アデノウイルスはまた、リソソームを乱し、従って、ＤＮＡが分解を回避し、核に移動することを可能にするために複合体に加えられる。これらの粒子の注入は、静脈内注入により、肝細胞内への遺伝子移入をもたらしている。
【００７９】
今日まで同定されていないが、血管形成関連障害を有する特定の個体は本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つに異常を含有することが考えられる。本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つの変異型形態を発現する罹患者では、変異型遺伝子との組換えが生じるように遺伝子の野生型コピーを罹患細胞に導入することによって障害を防止することが可能であり得る。これは、遺伝子の変異を修正するために二重の組換え事象を必要とする。これらの方法で遺伝子を導入するための様々なベクターがこの分野では知られており、任意の好適なベクターを使用することができる。あるいは、別の変異を有する遺伝子のコピーをさらに導入することを用いることができ、その結果、元の遺伝子変異を無効にし、かつ何らかの負の影響を阻止するようにすることができる。
【００８０】
さらにさらなる局面において、血管形成関連障害を処置する方法が提供され、この方法は、上記に記載されるようなポリペプチドまたはそのアゴニストを、そのような処置を必要としている対象に投与することを含む。
【００８１】
別の局面において、本発明は、血管形成関連障害を処置するための医薬品の製造における上記に記載されるようなポリペプチドまたはそのアゴニストの使用を提供する。そのような障害の例が上記に記載されている。
【００８２】
さらなる局面において、好適なアゴニストにはまた、関連した血管形成遺伝子の機能を模倣することができるペプチド、リン酸化ペプチド、または小さい有機化合物もしくは無機化合物が含まれ得るか、あるいは、機能を正常なレベルに回復することができる、任意の関連した血管形成遺伝子に対する抗体が含まれ得る。
【００８３】
治療的適用のために好適なペプチド、リン酸化ペプチド、または小さい有機化合物もしくは無機化合物は、下記に記載されるような薬物スクリーニング適用において本発明の核酸およびポリペプチドを使用して同定することができる。
【００８４】
さらなる実施形態において、本発明のアゴニスト、アンタゴニスト、相補的配列、核酸分子、タンパク質、抗体またはベクターは、他の適切な治療剤との組み合わせで投与することができる。適切な薬剤の選択は、従来の薬学原理に従って当業者によって行うことができる。治療剤の組合せは、上記に記載される様々な障害の処置または防止を達成するために相乗的に作用することができる。この方法を使用して、それぞれの薬剤のより低い投薬量を用いた治療効力を可能にすることができ、従って、これにより、有害な副作用に対する潜在的可能性を低下させることができる。
【００８５】
上記に記載される治療方法はどれも、例えば、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトなど）を含む、そのような治療を必要としている任意の対象に適用することができる。
【００８６】
（血管形成の調節）
本発明は、血管形成に関与する可能性がある数多くの遺伝子を提供しているため、従って、血管形成を調節するための方法が可能である。本発明のさらなる局面において、血管形成関連障害の処置のために使用される上記に記載される方法はどれも、細胞を含む任意のシステムにおける血管形成の調節のために使用することができる。これらのシステムには、インビトロアッセイシステム（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、コラーゲンアッセイ、ウシ毛細血管内皮細胞アッセイなど）、インビボアッセイシステム（例えば、インビボＭａｔｒｉｇｅｌ型アッセイ、ニワトリ漿尿膜アッセイ、単離された器官、組織または細胞など）、動物モデル（例えば、インビボ血管新生アッセイ、腫瘍血管形成モデルなど）、または処置を必要としている宿主（例えば、以前に記載されたような血管形成関連障害に罹患している宿主）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８７】
（薬物スクリーニング）
本発明のさらに別の局面によれば、本発明の核酸分子、同様に本発明のペプチド（特に、任意の関連した精製された血管形成ポリペプチドまたはそのフラグメント）、および、これらを発現する細胞は、血管形成関連障害を処置するための様々な技術における候補の薬学的化合物のスクリーニングのために有用である。
【００８８】
なおさらに、本発明は、ハイスループットスクリーニング技術が用いられる使用を提供する。
【００８９】
本発明に従ってスクリーニングすることができる化合物には、ペプチド（例えば、可溶性ペプチドなど）、リン酸化ペプチド、および小さい有機化合物または無機化合物（例えば、天然産物または合成された化学ライブラリーおよびペプチド模倣体など）が含まれるが、これに限定されない。
【００９０】
１つの実施形態において、スクリーニングアッセイは、競合的結合アッセイにおいて、関連した血管形成ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核酸分子で安定的に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する細胞型アッセイを含むことができる。結合アッセイでは、関連したポリペプチドまたはそのフラグメントと、試験されている化合物との間での複合体の形成について測定されるか、あるいは、試験されている化合物がどの程度、関連したポリペプチドまたはそのフラグメントと、その相互作用体またはリガンドとの間での複合体の形成を妨害するかが測定される。
【００９１】
非細胞型アッセイもまた、本発明のポリペプチドとその相互作用体との間での結合を妨げる化合物を同定するために使用することができる。そのようなアッセイがこの分野では知られており、これらには、例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ、米国）が含まれる。この適用は、各相互作用パートナーが抗体を介して別個のビーズに結合するようなビーズの使用に依拠する。各パートナーの相互作用はビーズを近寄らせ、その結果、レーザー励起により、数多くの化学反応が開始され、最終的には、光シグナルを放出する蛍光団を生じさせるようにする。関連した血管形成ポリペプチドとその相互作用体との結合を妨げる候補化合物は、その関与化合物の同定および単離を可能にする光放出の喪失をもたらす。
【００９２】
ハイスループット薬物スクリーニング技術ではまた、国際特許出願公開ＷＯ８４／０３５６４に記載されるような方法を用いることができる。固体基質上で合成された小さいペプチド試験化合物を、関連した血管形成ポリペプチドの結合および洗浄によってアッセイすることができる。その後、関連した結合した血管形成ポリペプチドが、この分野で広く知られている方法によって検出される。この技術の変法において、精製された血管形成ポリペプチドを、相互作用する試験化合物を同定するために、プレートに直接コーティングすることができる。
【００９３】
薬物スクリーニングのためのさらなる方法では、本発明の任意の関連した血管形成遺伝子に変異を有する宿主真核生物細胞株の使用を伴う。宿主細胞株はまた、ポリペプチドレベルにおいて欠陥を有する。他の細胞株を、関連した血管形成遺伝子の発現を調節（すなわち、過剰発現、過小発現またはスイッチオフ）することができる場合には使用することができる。宿主細胞株または宿主細胞は様々な薬物化合物の存在下で成長させられ、宿主細胞の成長速度が測定されて、その化合物が欠陥細胞の成長を調節することができるかどうかが明らかにされる。
【００９４】
本発明の血管形成ポリペプチドはまた、コンビナトリアルライブラリー技術の結果として開発された化合物をスクリーニングするために使用することができる。これにより、非常に多数の異なる物質を、ポリペプチドの活性を調節するそれらの能力について試験するための方法が提供される。ポリペプチド機能の調節因子として同定された物質は、現実にはペプチドまたは非ペプチドであり得る。非ペプチドの「小分子」は、多くの場合、多くのインビボ薬学的適用のために好ましい。また、そのような物質の模擬体または模倣体は薬学的使用のために設計することができる。既知の薬学的に活性な化合物（「リード」化合物）に基づく模倣体の設計は、新規な医薬品を開発するための一般的な方法である。これは、元の活性な化合物が合成困難であるか、または合成することに費用がかかる場合、あるいは、元の活性な化合物が不適当な投与方法をもたらす場合、望ましいことが多い。模倣体の設計では、標的の特性を決定することにおいて重要である元の活性な化合物の特定の部分が同定される。化合物の活性な領域に構成するこれらの部分または残基はそのファーマコフォアとして知られている。ファーマコフォア構造が見出されると、ファーマコフォア構造は、Ｘ線回折データおよびＮＭＲを含む様々な供給源からのデータを使用してその物理的性質に従ってモデル化される。その場合、ファーマコフォアを模擬する化学基が付加され得るテンプレート分子が選択される。その選択は、模倣体が容易に合成され、薬理学的に許容され得ることが考えられ、インビボで分解せず、かつ、リード化合物の生物学的活性を保持するように行うことができる。さらなる最適化または修飾を、インビボまたは臨床での検査のために有用である１つまたは複数の最終的な模倣体を選択するために行うことができる。
【００９５】
標的特異的な抗体を単離し、その後、その結晶構造を解明することもまた可能である。原理的には、この方法は、その後の薬物設計が上記のように基づき得るファーマコフォアをもたらす。機能的かつ薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を作製することによってタンパク質の結晶学を完全に回避することが可能となる場合がある。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は元の結合部位のアナログであることが予想される。その後、抗ｉｄは、化学的または生物学的に作製されたペプチドバンクからペプチドを単離するために使用することができる。
【００９６】
薬物スクリーニングのための別の代わりの方法は、構造に基づく合理的薬物設計に依拠する。本発明のポリペプチドの三次元構造の決定、または、これらのポリペプチドを取り込むことができるタンパク質複合体の三次元構造の決定は、生物学的に活性なリード化合物を同定するための、構造に基づく薬物設計を可能にする。
【００９７】
三次元構造モデルは、数多くの適用（それらのいくつかは実験的モデル（例えば、Ｘ線結晶学およびＮＭＲなど）を含む）によって作製することができ、かつ／または、構造データベース（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）など）からの情報を使用するインシリコ研究から作製することができる。また、三次元構造モデルは、ポリペプチドの一次配列に基づく数多くの知られているタンパク質構造予測技術（例えば、ＳＹＢＹＬ−Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、デノボタンパク質構造設計プログラム（例えば、ＭＯＤＥＬＥＲ−ＭＳＩ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＭＯＥ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ））、またはアブイニシオ法（例えば、米国特許第５３３１５７３号および同第５５７９２５０号を参照のこと）を使用して決定することができる。
【００９８】
ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造が決定されると、構造に基づく薬物発見技術を、これらの三次元構造に基づく生物学的に活性な化合物を設計するために用いることができる。様々なそのような技術がこの分野では知られており、これらには、ＤＯＣＫ（カリフォルニア大学、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）またはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの例が含まれる。コンピュータ計算によるドッキングプロトコルにより、予測されたタンパク質モデルに基づいてタンパク質活性のために重要であると考えられる１つまたは複数の活性な部位が特定される。その後、分子データベース（例えば、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＡＣＤ）など）が、タンパク質モデルを補足する分子についてスクリーニングされる。
【００９９】
これらの方法などの方法を使用して、潜在的な臨床的薬物候補を同定することができ、かつ、典型的な「ウェットラボ」薬物スクリーニング方法論に関連する時間および費用を減少するために、コンピュータ計算によりランク付けすることができる。
【０１００】
上記のスクリーニング方法から同定された化合物は、これらおよび薬学的に許容され得るキャリアを含有する薬学的組成物がそうであるように本発明の一部を形成する。
【０１０１】
（薬学的調製物）
上記に示されるようなスクリーニングアッセイから同定された化合物は、血管形成に伴う障害を処置または改善するために、治療効果的な用量で患者に投与することができる。治療効果的な用量は、障害の症状の改善を生じさせるために十分な化合物のそのような量を示す。
【０１０２】
そのような化合物の毒性および治療効力を細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる。これらの研究から得られたデータは、その後、ヒトにおける使用のための投薬量範囲の制定において使用することができる。
【０１０３】
本発明に従って使用される薬学的組成物は、広く知られている１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤を使用して従来の様式で配合することができる。許容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度において非毒性であり、これらには、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸など；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど；結合性薬剤、これには、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドンなど）が含まれる；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど；単糖、二糖および他の炭水化物、これらには、グルコース、マンノースまたはデキストリンが含まれる；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡなど；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが含まれる。
【０１０４】
本発明に従って使用される薬学的組成物の配合は、提案された投与経路に基づく。投与経路には、吸入投与、吹き込み投与（口または鼻のいずれかを介して）、経口投与、口内投与、直腸投与または非経口投与が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１０５】
（診断および予後の適用）
遺伝子の活性および／または発現を変化させて、血管形成関連障害を生じさせる、本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つにおける変異が存在するならば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、これらの障害の診断もしくは予後のために、またはそのような障害に対する素因のために使用することができる。そのような障害の例には、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、および心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患が含まれるが、これらに限定されない。適切な治療的介入を開始するために、診断または予後は、疾患状態の重篤度、タイプまたは段階を明らかにするために使用することができる。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、診断目的または予後目的のために使用することができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、ゲノムＤＮＡ、ならびに相補的なＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子が含まれる。ポリヌクレオチドは、血管形成遺伝子のいずれか１つにおける異常な発現または変異が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出および定量するために使用することができる。診断または予後のために使用されるゲノムＤＮＡは、身体の細胞（例えば、血液、組織生検、手術標本または剖検材料に存在する細胞など）から得ることができる。ＤＮＡは、特定の配列を検出するために単離され、そのまま使用することができ、または、分析の前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。同様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、ＰＣＲ増幅とともに、またはＰＣＲ増幅を伴うことなく使用することができる。特定の核酸配列を検出するために、直接的なヌクレオチド配列決定、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、特異的なオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション、制限酵素消化およびマッピング、ＰＣＲマッピング、ＲＮＡｓｅ保護、ならびに様々な他の方法を用いることができる。特定の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドを化学合成し、放射能または非放射能により標識して、膜もしくは他の固体支持体に固定化された個々のサンプルに対して、または溶液中においてハイブリダイゼーションすることができる。その後、血管形成遺伝子のいずれか１つの存在、非存在または過剰な発現を、オートラジオグラフィー、蛍光測定法または比色測定などの方法を使用して可視化することができる。
【０１０７】
特定の局面において、本発明のヌクレオチド配列は、関連する障害（特に、前述の障害）の存在を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ヌクレオチド配列は標準的な方法によって標識して、患者から得られた体液サンプルまたは組織サンプルに、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件のもとで加えることができる。好適なインキュベーション期間の後、サンプルは洗浄され、シグナルが定量され、標準値と比較される。患者サンプルにおけるシグナル量がコントロールサンプルとの比較において著しく変化している場合、サンプルにおけるヌクレオチド配列の変化したレベルの存在は、関連する障害の存在を示している。そのようなアッセイはまた、動物研究において、臨床試験において特定の治療的処置療法の効力を評価するために、または、個々の患者の処置をモニターするために使用することができる。
【０１０８】
本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つにおける変異に関連する血管形成関連障害の診断または予後のための基礎を提供するために、関連した遺伝子のヌクレオチド配列を、患者が変異型遺伝子を発現しているかどうかを明らかにするために、正常な組織と病的組織との間で比較することができる。
【０１０９】
本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つの異常な発現に関連する障害の診断または予後のための基礎を提供するために、発現についての正常または標準的なプロフィルが明らかにされる。これは、正常な対象（動物またはヒトのいずれか）から採取された体液または細胞抽出物を、関連した血管形成遺伝子をコードする配列またはそのフラグメントと、ハイブリダイゼーションまたは増幅のために好適な条件のもとで一緒にすることによって達成することができる。標準的なハイブリダイゼーションを、正常な対象から得られた値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが使用される実験からの値と比較することによって定量することができる。血管形成遺伝子のいずれか１つの発現についての正常または標準的なプロフィルを同定するための別の方法は定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究による。正常な個体の身体の細胞から単離されたＲＮＡ（特に、内皮細胞から単離されたＲＮＡ）が逆転写され、関連した遺伝子について特異的なオリゴヌクレオチドを使用するリアルタイムＰＣＲが、遺伝子の正常な発現レベルを明らかにするために行われる。これらの例の両方において得られた標準値を、障害について症状を示す患者に由来するサンプルから得られた値と比較することができる。標準値からのずれが、障害の存在を明らかにするために使用される。
【０１１０】
障害の存在が明らかにされ、処置プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究を、患者における発現レベルが、正常な対象において観測されるレベルに近づき始めているかどうかを明らかにするために定期的に繰り返すことができる。連続したアッセイから得られる結果は、数日から数ヶ月に及ぶ期間にわたって処置の効力を示すために使用することができる。
【０１１１】
本発明のさらなる局面によれば、本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つに関連する血管形成関連障害の診断または予後における、あるいは、そのような障害に対する素因における、上記に記載されるような血管形成ポリペプチドの使用が提供される。
【０１１２】
診断アッセイまたは予後アッセイが任意の関連した血管形成ポリペプチドに基づくことになるとき、様々な方法が可能である。例えば、診断または予後を、正常なタンパク質および変異型タンパク質の電気泳動移動度の違いをモニターすることによって達成することができる。そのような方法は、電荷置換が存在する変異体、または、挿入、欠失もしくは置換が、生じたタンパク質の電気泳動移動における著しい変化をもたらしている変異体を同定する際には特に有用である。あるいは、診断または予後は、正常なタンパク質および変異型タンパク質のタンパク質分解的切断パターンの違い、様々なアミノ酸残基のモル比の違いに基づくことができ、または、遺伝子産物の変化した機能を明らかにする機能的アッセイによることができる。
【０１１３】
別の局面において、関連した血管形成遺伝子産物と特異的に結合する抗体を、遺伝子の異常な発現によって特徴づけられる障害の診断または予後のために使用することができ、あるいは、関連した血管形成遺伝子もしくは血管形成タンパク質、またはアゴニスト、アンタゴニスト、またはその阻害剤で処置されている患者をモニターするためのアッセイにおいて使用することができる。診断目的または予後目的のために有用な抗体は、治療剤について上記に記載されたのと同じ様式で調製することができる。診断アッセイまたは予後アッセイには、ヒト体液におけるか、または、細胞もしくは組織の抽出物における関連したタンパク質を検出するために抗体および標識を利用する方法が含まれ得る。抗体は、修飾を伴って、または修飾を伴うことなく使用することができ、また、レポーター分子の共有結合的結合または非共有結合的結合によって標識することができる。
【０１１４】
ポリペプチドについて特異的な抗体の使用に基づいて関連した血管形成ポリペプチドを測定するための様々なアッセイがこの分野では知られており、これらのアッセイは、変化した発現レベルまたは異常な発現レベルを診断するための基礎を提供する。発現についての正常値または標準値が、正常な哺乳動物対象（好ましくはヒト）から採取された体液または細胞抽出物を、関連したタンパク質に対する抗体と、複合体形成のために好適な条件のもとで一緒にすることによって明らかにされる。標準の複合体形成の量は、この分野で知られている様々な方法によって定量することができる。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、フローサイトメトリー、組織学、電子顕微鏡観察、インシチュアッセイ、免疫沈殿、ウエスタンブロットなどが含まれるが、これらに限定されない、例えば、ＥＬＩＳＡ技術を使用する場合、抗体に結合している酵素は、例えば、分光光度法的手段、蛍光測定法的手段または可視的手段によって検出することができる化学成分をもたらすような様式で、適切な基質（好ましくは、発色性基質）と反応する。検出はまた、抗体または抗体フラグメントが放射能標識されるＲＩＡなどの他のアッセイを使用することによって達成することができる。抗体を蛍光化合物で標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が特定の波長の光にさらされる場合、その存在を蛍光により検出することができる。抗体はまた、抗体を化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。その場合、化学発光標識された抗体の存在は、化学反応の経過時に生じる発光の存在を検出することによって明らかにされる。
【０１１５】
生検組織に由来する対象サンプル、コントロールサンプルおよび疾患サンプルにおいて発現しているタンパク質の量が標準値と比較される。標準値と対象値との間におけるずれにより、疾患の診断または予後を行うためのパラメーターが明らかにされる。
【０１１６】
個体が疾患に関して診断または予後予測されると、効果的な処置を、上記に記載されるように開始することができる。制御されない血管形成または増強された血管形成によって特徴づけられる血管形成関連疾患の処置では、拡大しつつある脈管構造を阻害する必要がある。これは、血管形成を促進する本発明の関連した血管形成遺伝子または血管形成タンパク質を阻害することを伴う。加えて、処置はまた、その正常な役割が、血管形成を阻害することであるが、その活性が罹患者において低下しているか、または存在しない本発明の関連した血管形成遺伝子または血管形成タンパク質の発現または機能を刺激する必要がある場合がある。
【０１１７】
阻害された血管形成または低下した血管形成によって特徴づけられる血管形成関連疾患の処置では、血管の拡大を強化または促進する方法が望ましい。これは、本質的には上記に記載されるような方法を使用して達成することができ、しかし、その正常な役割が、血管形成を促進することであるが、その活性が罹患者において低下しているか、または存在しない関連した血管形成遺伝子または血管形成タンパク質の発現または機能を刺激することを伴う。あるいは、血管形成を制限する遺伝子またはタンパク質を阻害することもまた、処置に対する方法であり得る。
【０１１８】
（マイクロアレイ）
さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかに由来する完全なｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはより長いフラグメントはマイクロアレイにおけるプローブとして使用することができる。マイクロアレイは、非常に多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために、また、遺伝的な変化体、変異および多型を同定するために使用することができる。この情報は、遺伝子機能を明らかにするために、血管形成関連障害の遺伝的基礎を理解するために、血管形成関連障害の診断または予後を行うために、また、治療剤を開発し、その活性をモニターするために使用することができる。マイクロアレイは、この分野で知られている方法を使用して調製し、使用し、かつ分析することができる（例えば、Ｓｃｈｅｎａ他（１９９６）；Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７）を参照のこと）。
【０１１９】
（形質転換された宿主）
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む遺伝子改変（ノックアウト、ノックインおよび遺伝子組換え）された非ヒト動物モデルの作製を規定する。これらの動物は、関連した血管形成遺伝子の機能の研究のために、血管形成遺伝子のプロセスを研究するために、これらの遺伝子に関連づけられるような血管形成疾患の機構を研究するために、血管形成関連障害を処置するための候補の薬学的化合物をスクリーニングするために、タンパク質または変異型タンパク質を発現する外植された哺乳動物細胞培養物を作製するために、また、潜在的な治療的介入を評価するために使用される。
【０１２０】
本発明の動物モデルにおける使用のために好適である動物種には、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよび非ヒト霊長類（例えば、サルおよびチンパンジーなど）が含まれるが、これらに限定されない。最初の研究のためには、遺伝子改変されたマウスおよびラットが、これらの動物のノックイン、ノックアウトまたは遺伝子組換え体を作製することが比較的容易であること、それらの管理の容易さ、およびそれらのより短い寿命のために、非常に望ましい。特定の研究のためには、遺伝子組換えされた酵母または無脊椎動物が、それらは迅速なスクリーニングを可能にし、かつ、はるかにより容易な取り扱いを提供するため、好適かつ好ましい場合がある。より長い期間の研究のためには、非ヒト霊長類が、ヒトとのそれらの類似性のために所望されることがある。
【０１２１】
本発明の血管形成遺伝子のいずれか１つに基づく動物モデルを作製するために、いくつかの方法を用いることができる。これらには、相同的な動物遺伝子における特定の変異の作製、相同組換えによる野生型ヒト遺伝子および／またはヒト化動物遺伝子の挿入、野生型または変異型または人工的なプロモーターエレメントを使用するゲノムまたはミニ遺伝子のｃＤＮＡ構築物としての変異型ヒト遺伝子（１個または複数個）の挿入、あるいは、相同組換えによる内因性遺伝子の人為的に改変されたフラグメントの挿入が含まれるが、これらに限定されない。これらの改変では、変異型停止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、または、Ｃｒｅリコンビナーゼなどの酵素によって認識される組換えエレメント（ｌｏｘ  ｐ部位）を含むことが含まれる。
【０１２２】
遺伝子機能の獲得をインビボで研究するための遺伝子組換えマウスを作製するために、任意の関連した血管形成遺伝子を、卵母細胞顕微注入などの標準的な技術を使用してマウスの生殖系列に挿入することができる。遺伝子機能の獲得は、遺伝子およびそのタンパク質産物の過剰発現、または、調べられている遺伝子の変異の遺伝的相補を意味することができる。卵母細胞注入のために、１コピーまたは数コピーの野生型遺伝子または変異型遺伝子を受精直後のマウス卵母細胞の前核に挿入することができる。その後、この卵母細胞は偽妊娠里親に再移植される。生きて生まれたマウスは、その後、関連したヒト血管形成遺伝子配列の存在についての尾ＤＮＡの分析を使用して、組み込み体についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣまたは他の染色体ＤＮＡフラグメントとして注入された完全なゲノム配列、天然のプロモーターまたは異種のプロモーターのいずれかを有するｃＤＮＡ、あるいは、コード領域、および最適な発現のために必要であることが見出されている他のエレメントのすべてを含有するミニ遺伝子のいずれかであり得る。
【０１２３】
ノックアウトマウスまたはノックインマウスを作製するために、マウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えによる遺伝子標的化を適用することができる。ノックアウトマウスは、遺伝子機能の喪失をインビボで研究するために作製され、一方、ノックインマウスは機能の獲得の研究を可能にするか、または、特定の遺伝子変異の影響を研究することを可能にする。ノックインマウスは遺伝子組換えマウスに類似しており、しかしながら、組み込み部位およびコピー数が前者では規定される。
【０１２４】
ノックアウトマウスの作製のために、遺伝子標的化ベクターを、マウスゲノムにおける関連した血管形成遺伝子のタンパク質コード領域が破壊（ノックアウト）されるように設計することができる。本発明のノックアウト動物は本発明の関連した血管形成遺伝子の機能的破壊を含み、その結果、その遺伝子が生物学的に活性な産物を発現しないようにされる。それは、遺伝子によってコードされる少なくとも１つの機能的活性における実質的な欠損であり得る。遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現が実質的に存在しない（すなわち、本質的には検出できないほどの量が作製される）か、または、遺伝子産物の一部分のみが産生された場合などでは活性において不十分であり得る。対照的に、ノックインマウスを、関連した血管形成遺伝子を含有する遺伝子標的化ベクターがマウスゲノムにおける規定された遺伝的遺伝子座に組み込まれ得ることによって作製することができる。両方の適用のために、相同組換えが、相同的なＤＮＡ配列を認識し、それらを二重交差により交換する特異的なＤＮＡ修復酵素によって触媒される。
【０１２５】
遺伝子標的化ベクターは通常、エレクトロポレーションを使用してＥＳ細胞に導入される。その後、ＥＳ細胞の組み込み体が、標的化ベクター上に存在する抗生物質耐性遺伝子によって単離され、続いて、検討中の遺伝子が目的の遺伝子座に組み込まれているそのようなＥＳ細胞クローンを同定するために遺伝子型決定される。その後、適切なＥＳ細胞が、新規なマウス系統を作製するために生殖系列を介して伝達される。
【０１２６】
遺伝子除去が早期の胚致死性をもたらす場合、条件的遺伝子標的化を用いることができる。これは、遺伝子を時間的および空間的に制御された様式で欠失することを可能にする。上記のように、適切なＥＳ細胞が、新規なマウス系統を作製するために生殖系列を介して伝達され、しかしながら、遺伝子の実際の欠失は、組織特異的な様式または時間制御された様式で成体マウスにおいて行われる。条件的遺伝子標的化は、最も一般的には、ｃｒｅ／ｌｏｘ系の使用によって達成される。酵素ｃｒｅは３４塩基対のｌｏｘＰ配列を認識することができ、その結果、ｌｏｘＰ隣接（またはフロクス（ｆｌｏｘｅｄ））ＤＮＡがｃｒｅによって認識および切り出されるようになる。遺伝子組換えマウスにおける組織特異的なｃｒｅ発現は、遺伝子標的化されたフロクスマウスをｃｒｅ遺伝子組換えマウスと交配することによって組織特異的なノックアウトマウスの作製を可能にする。ノックアウトを、「欠失体」マウスを使用して、または、誘導可能なｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子組換えマウス（例えば、テトラサイクリン誘導可能なｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子組換えマウスなど）を使用してどの組織でも行うことができ（Ｓｃｈｗｅｎｋ他、１９９５）、あるいは、ノックアウトを、例えば、ＣＤ１９−ｃｒｅマウスの使用によって組織特異的にすることができる（Ｒｉｃｋｅｒｔ他、１９９７）。
【０１２７】
本発明のさらに別の局面において、候補の薬学的化合物をスクリーニングするための遺伝子改変された非ヒト動物の使用が提供される。
【０１２８】
図面の簡単な記述
数多くの先行技術刊行物が本明細書中に示されているが、この参照は、これらの文書のいずれかがこの分野またはオーストラリアまたは任意の他の国における共通する一般的な知識の一部を形成するということを認めるものでないことが明らかに理解される。本明細書および請求項の全体を通して、単語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、文脈が別途要求する場合を除いて、非排他的意味で使用される。
図１は血管形成のインビトロモデルにおける規定された時点の期間中における選択された示差的に発現しているクローンの発現プロフィルの例を示す。インビトロ管形成アッセイの０．５時間、３時間、６時間および２４時間の規定された段階での時点が、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために使用されたｃｙ５色素（赤）およびｃｙ３色素（緑）の対数比率に対してプロットされた。Ａ：最大の発現を０．５時間の時点で有するクローンの例；Ｂ：最大の発現を３時間の時点で有するクローンの例；Ｃ：最大の発現を６時間の時点で有するクローンの例；およびＤ：最大の発現を２４時間の時点で有するクローンの例。
図２は示差的に発現している遺伝子（ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１）の発現プロフィルを示す。両遺伝子は最大の発現をインビトロ管形成アッセイの６時間の時点で示している。Ａ：ＢＮＯ７８２；Ｂ：ＢＮＯ４８１。
図３はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定されたときの、ＢＮＯ７８２  ｓｉＲＮＡ２により媒介されるＢＮＯ７８２の発現ノックダウン、およびＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１により媒介されるＢＮＯ４８１の発現ノックダウンのレベルの分析を示す。それぞれの遺伝子に対して標的化された３つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは様々な程度に遺伝子の発現を低下させることができ、ＢＮＯ７８１  ｓｉＲＮＡ２はＢＮＯ７８１の発現を２４％阻害し（Ａ）、ＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１はＢＮＯ４８１の発現を３６％阻害した（Ｂ）。
図４はＢＮＯ７８２またはＢＮＯ４８１のｍＲＮＡ発現を低下させることにより、ＨＵＶＥＣ管形成が阻害されることを示す。ＢＮＯ７８２  ｓｉＲＮＡ２、ＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１、またはベクターコントロールを感染させたＨＵＶＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌに２４時間置床した。ベクター感染細胞は管構造の広範囲の網状組織を形成した（ＡおよびＣ）。対照的に、ＢＮＯ７８２  ｓｉＲＮＡ２またはＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１を感染させた細胞は、非常に多数の不完全な管伸長を伴う、複雑性が著しく低下した管構造の網状組織を示した（ＢおよびＤ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２９】
実施例１：インビトロ毛細管形成
血管形成のインビトロモデルは、本質的にはＧａｍｂｌｅ他（１９９３）に記載される通りである。アッセイをホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）および抗インテグリン（α２β１）抗体ＲＭＡＣＩＩの刺激下でのコラーゲン中で行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を２代〜４代の継代の間ですべての実験において使用した。
【０１３０】
細胞を大量培養から集め（ｔ＝０）、刺激を伴うコラーゲンゲルに再置床し、その後、アッセイ開始後の０．５時間、３．０時間、６．０時間および２４時間でコラーゲンゲルから集めた。これらの時点は、大きな形態学的変化がこれらの段階で生じるため選ばれた。簡単に記載すると、０．５時間までに、細胞がコラーゲンマトリックスに付着し、ゲル内への遊走を開始している。３．０時間までに、小さい細胞内小胞が視認される。６．０時間までに、これらの小胞は合体して、膜に結合した空胞を形成し、短い芽の形態で細胞がゲルに侵入する。この時間の後、これらの空胞は形質膜と融合し、従って、細胞間空間を拡大して、内腔を生じさせる（Ｍｅｙｅｒ他、１９９７）。これらのより大きい空胞の形成は内腔形成の不可欠な要件である（Ｇａｍｂｌｅ他、１９９９）。２４時間までに、毛細管の全体的な吻合している網状組織が形成されており、退化を開始している。
【０１３１】
実施例２：ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および増幅
指定された時点で集められた細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造者の条件に従って使用する総ＲＮＡの単離のために使用した。ＳＭＡＲＴ（ＲＮＡ転写物の５’末端での切り換え機構）技術を使用して、少量の総ＲＮＡを、ｃＤＮＡサブトラクションを行うことを可能にするための十分なｃＤＮＡに変換した（下記参照）。これは、ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ使用者マニュアルＰＴ３０４１−１）を製造者の推奨法に従って使用して達成された。ＳＭＡＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成プロトコルは、ｃＤＮＡサブトラクションのために続いてＰＣＲ増幅された大多数の全長ｃＤＮＡをもたらした。
【０１３２】
実施例３：サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）
ＳＳＨを、選択された時点によって規定されるｃＤＮＡ集団の間でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを受けているｃＤＮＡについて濃縮するために、ＳＭＡＲＴ増幅のｃＤＮＡに対して行った。この技術はまた、調節されたｃＤＮＡの「正規化」を可能にし、それにより、存在量が低いｃＤＮＡ（すなわち、良好に発現されないが、重要な遺伝子）をより容易に検出可能にする。これを行うために、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ使用者マニュアルＰＴ３０４１−１）およびＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡサブトラクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ使用者マニュアルＰＴ１１１７−１）を製造者の条件に基づいて使用した。これらの手法はサブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサプレッションＰＣＲ増幅に依拠した。ＳＳＨを下記の集団の間で行った：０−０．５時間；０．５−３．０時間；３．０−６．０時間；６．０−２４時間。
【０１３３】
実施例４：ｃＤＮＡクローンの示差的スクリーニング
ＳＳＨの後、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）を使用して、ｃＤＮＡフラグメントをＥａｇＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋における適合し得る唯一のＮｏｔＩ部位にクローン化した。これにより、フォワードおよびリバースのサブトラクションライブラリーがそれぞれの時間について得られた。最初に、フォワードサブトラクションライブラリーを、血管形成のインビトロモデルの期間中のそれらの発現においてアップレギュレーションされている遺伝子を表すそのようなクローンを同定するためにその後の研究において使用した。これを行うために、マイクロアレイ分析手法を採用した。
【０１３４】
マイクロアレイスライドの調製
４つのフォワードサブトラクションライブラリーに由来する合計で１００００個のクローン（０−０．５時間に由来する３２００クローン；０．５−３時間に由来する３０００クローン；３−６時間に由来する２８００クローン；６−２４時間に由来する１０００クローン）を選び、マイクロアレイスライドを構築した。これらのクローンに由来する挿入物を、隣接するＴ３およびＴ７のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクタープライマーを用いた標準的なＰＣＲ技術を使用して増幅した。各クローンに由来するＤＮＡを１枚のマイクロアレイスライドに二連でスポットした。適切な陽性コントロールおよび陰性コントロールもまたプレート上に含まれた。
【０１３５】
プローブの標識化
指定された時間（０時間、０．５時間、３時間、６時間および２４時間）で集められたヒト臍帯静脈内皮細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造者の条件に従って使用する総ＲＮＡの単離のために使用した。それぞれの時点から、０．５μｇの総ＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＴＭ  ａＲＮＡキットを使用してアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅するためのテンプレートとして使用した。簡単に記載すると、逆転写によって得られたメッセージのポリ（Ａ）テールから伸びるＴ７プロモーター配列を含有するｃＤＮＡを合成するために、総ＲＮＡをＴ７オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写した。ｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡテンプレートに変換し、そして、蛍光性ＣｙＤｙｅのカップリングを可能にするように５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰを取り込むａＲＮＡのインビトロ転写のために使用した。最初の総ＲＮＡが５％未満のｍＲＮＡを含有したことを仮定すると、典型的な増幅反応は約１０μｇのｍＲＮＡ（４００Ｘを越える増幅）をもたらしたと考えられる。
【０１３６】
マイクロアレイハイブリダイゼーション
ＣｙＤｙｅカップリング後、合成されたａＲＮＡをマイクロアレイスライドに対するハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用した（３．０μｇ〜３．５μｇ）。行われたハイブリダイゼーションは下記の通りであった：
１．０対０．５ｈ（６枚のスライド、３回のＤｙｅ交換）
２．０対３ｈ（４枚のスライド、２回のＤｙｅ交換）
３．０対６ｈ（４のスライド、２回のＤｙｅ交換）
４．０対２４ｈ（４枚のスライド、２回のＤｙｅ交換）
【０１３７】
多数のスライドを、いずれか１つのハイブリダイゼーションからの結果を確認するためにそれぞれの時点についてハイブリダイゼーションした。スライドを１６時間チャンバー内でハイブリダイゼーションし、洗浄し、その後、ＧｅｎｅＰｉｘ２０００スキャナーを使用して走査した。非常にアップレギュレーションされていることが示されたそのようなクローンをさらなる分析のために選んだ。
【０１３８】
まとめると、ＳＳＨを、アップレギュレーションされ、かつ、内皮細胞の活性化および血管形成の基礎となっている生物学的プロセスに関与し得る遺伝子を同定するために、マイクロアレイ分析との組合せで使用した。この方法は、遺伝子検出の冗長性を減少させ、かつ、内皮細胞トランスクリプトームにおける全体的な提示が低い遺伝子を検出する可能性を高めることを目指すヌクレオチドハイブリダイゼーション工程を伴うという点で新規である。ヌクレオチドに基づく連続した時点は、検出の冗長性を低下させる方法で、特定の遺伝子のアップレギュレーションが生じている時点を検出することを目指す。例えば、３時間においてアップレギュレーションされている遺伝子は、その発現がその後の時点においてもアップレギュレーションされたままであると、０．５−３時間のサブトラクション工程で検出されるだけである。対照的に、サブトラクションがすべてのその後の時点について０時間の時点とともに行われた場合、この例の遺伝子は、３時間の時点のサブトラクションの後のすべてのサブトラクション工程で検出される。これは、内皮細胞ｍＲＮＡ発現プールにおける提示がより低い他の遺伝子の可能な検出を遮蔽することをもたらし得る冗長性を持ち込む。マイクロアレイ分析のその後の使用は、それぞれの時点を０時間の時点とともに伴うＳＳＨ工程における比較サブトラクションハイブリダイゼーションに基づいている。これは、各遺伝子がアップレギュレーションされている時点にかかわらず、０時間に関してすべての時点にわたる各遺伝子の発現プロフィルの決定を可能にする。
【０１３９】
実施例５：クローン選択
マイクロアレイハイブリダイゼーションの分析から、合計で１９６３個のクローンが、血管形成のインビトロモデルの期間中の指定された時点でそれらの発現においてアップレギュレーションされていると同定された。図１は、クローンの選択のための、インビトロモデルにおける規定された時点の期間中に観測された発現プロフィルの一例を示す。１９６３個のクローンのそれぞれを配列決定し、続くインシリコデータベース分析を使用して、ベクター配列のみを含有するクローン、および、不良な配列が得られたクローンを除いた。この後、冗長性スクリーニングを使用して、クローンを、それらが表す個々の遺伝子に従ってグループ分けした。これにより、血管形成のプロセス期間中のそれらの発現においてアップレギュレーションされていることが見出された合計で５２３個の遺伝子が残った。
【０１４０】
表１、表２および表３は、配列されたアップレギュレーションされているクローンに関する情報を提供している。表１は、以前には特徴づけられていない遺伝子または新規な遺伝子を表すそのようなクローンを含み、一方、表２は、以前には血管形成と関連していなかった以前に同定されていた遺伝子に対応するクローンを含む。血管形成のプロセスに関与することが以前に示されている多数の遺伝子もまた同定されていた（表３）。これらのクローンの同定は、用いられた血管形成遺伝子同定戦略が有効であるということの原理の妥当性確認および証拠を示しており、また、表１および表２に示されるクローンがさらなる血管形成遺伝子候補であることを示唆している。
【０１４１】
実施例６：血管形成遺伝子の分析
血管形成における表１および表２の遺伝子の関与についてのさらなる証拠を、各遺伝子の機能的分析によって、例えば、それらの発現のノックダウンが内皮細胞（ＥＣ）の機能および毛細管形成に対して有する影響を調べることによって得ることができる。
【０１４２】
数多くのノックダウン技術およびアッセイを使用することができる。例えば、遺伝子の全長のコード配列を好適な発現ベクター（例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスなど）にセンス配向およびアンチセンス配向の両方でクローン化し、ＥＣへの感染のために使用することができる。レトロウイルス感染は、目的とする遺伝子を発現する長期間のＥＣ株をもたらし、これに対して、アデノウイルス感染は一過性の遺伝子発現をもたらす。その後、感染細胞は、血管形成における各遺伝子の役割を確認するために、増殖および毛細管形成を含む数多くのＥＣアッセイに供することができる。
【０１４３】
本研究では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）遺伝子ノックダウン技術が遺伝子機能の分析のために使用された（詳細な記載については下記を参照のこと）。この技術では、短い遺伝子特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドが、レトロウイルス感染により媒介されて培養中のＥＣに送達される。これらのオリゴヌクレオチドは研究中の遺伝子転写物に結合し、その分解を誘導し、これにより遺伝子発現のサイレンシングまたは減少をもたらす。続いて、遺伝子発現に対するこの変化の結果を、インビトロで増殖し、遊走し、かつ毛細管を形成するＥＣの能力を調べるアッセイを使用して研究することができる。本研究において採用されたＲＮＡｉ手法が下記に詳しく記載されており、これは、同定されたアップレギュレーションされている血管形成遺伝子のうちの２つの分析を記録している。これらの遺伝子の１つが、表１に示されるＢＮＯ７８２（その発現がインビトロ血管形成モデルにおいて６時間の時点で最大になる新規な遺伝子）であり（図２Ａ）、一方、もう一方の遺伝子は、表２に示されるようなＢＮＯ４８１（ＫＰＮＡ４）であり、これは、血管形成において役割を果たしていることが以前には示されていない以前に同定されていた遺伝子である。ＢＮＯ４８１の発現もまた、インビトロ血管形成モデルにおいて６時間の時点で最大になる（図２Ｂ）。
【０１４４】
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの設計
ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１のＲＮＡｉ媒介によるノックダウンのための短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを自作のコンピュータソフトウエアの適用によって同定した。このソフトウエアは、適切なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを選択するための一連のパラメーターを取り込む。これらのパラメーターは、ｓｉＲＮＡ配列がＡＡジヌクレオチドの後で開始し、ｓｉＲＮＡが遺伝子のオープンリーディングフレーム内およびＡＴＧ開始コドンの１００ｂｐ下流に存在し、ｓｉＲＮＡのＧＣ含有量が３５％〜６０％の間にあり、かつ、ｓｉＲＮＡが、４つ以上のＴヌクレオチド、Ａヌクレオチド、ＣヌクレオチドまたはＧヌクレオチドからなる領域を有しないことを保証する。複雑性が低い領域を有するｓｉＲＮＡ配列は使用しなかった。また、ＢＬＡＳＴ分析を使用して、多数の遺伝子と交差ハイブリダイゼーションするプローブを除くように選択した（“ｅｘｐｅｃｔ  ５００”および“ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ  ７”でのＢｌａｓｔｎ＿ｒｅｆｓｅｑ、ならびに、１９＞スコア＞１５で許容されたアラインメントスコア［この場合、アライメントスコア＝一致する長さ−（ギャップ＋ミスマッチ）］）。ｓｉＲＮＡをレトロウイルスベクターへのクローニングのためにヘアピン様式で合成した。各遺伝子について、３つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを選択し、各１つを遺伝子ノックダウンおよびＥＣ機能に対するそれらの影響について個々に調べた。
【０１４５】
ＨＵＶＥ細胞のレトロウイルス感染
それぞれのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドをヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に送達するためのレトロウイルスベクターにクローン化した。ｓｉＲＮＡベクターをｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の改変によって構築した。簡単に記載すると、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏの３’ＬＴＲをＸｂａＩ／ＮｈｅＩフラグメントの除去によって不活性化した。その後、Ｈ１−ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターカセットをベクターのＭＣＳに挿入した。アニーリングしたｓｉＲＮＡプライマーを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で消化された改変ベクター（ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（Ｈ１））に連結した。
【０１４６】
ＨＵＶＥＣの感染に先立つウイルスの作製のために、２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．０Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充され、抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、トランスフェクションの１８時間前〜２４時間前に６ウエルプレートのウエルあたり１ｘ１０６細胞の密度で置床した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇのレトロウイルスＤＮＡおよび１．５μｇのｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および１．５μｇのｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を５％ＣＯ２において３７℃で一晩インキュベーションした。翌日、ＤＮＡ／ＬＦ２０００複合体を含有する培地を除き、１０％ＦＣＳ、１．０Ｍ  Ｈｅｐｅｓおよび１％ＰＳＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＲＰＭＩと置き換えた。ウイルス含有上清をトランスフェクション後の４８時間〜７２時間で集めて、０．４５μＭのフィルターを使用してろ過した。ウイルスを小分けにして、−８０℃で保存した。
【０１４７】
ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）のレトロウイルス感染のために、細胞をＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）において６ウエルプレートのウエルあたり１．３ｘ１０５細胞の密度で感染２４時間前に置床した。翌日、５００μＬのウイルス上清を５００μＬのＥＧＭ−２完全培地と一緒にした。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を８．０μｇ／ｍＬの最終濃度に加えた。培地を細胞から吸引し、ウイルス混合物と置き換えた。細胞を５％ＣＯ２において３７℃でウイルス混合物とインキュベーションした。３時間のインキュベーションの後、さらに１．０ｍＬのＥＧＭ−２培地を加え、細胞をさらに２４時間インキュベーションした。この時間の後、ＨＵＶＥ細胞を１：２で分割して、６ウエルプレートに再置床した。細胞を分割後２４時間インキュベーションして、細胞を回復および接着させた。感染した細胞について選択するために、培地を、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を０．４μｇ／ｍＬの最終濃度で含有するＥＧＭ−２完全培地と置き換えた。細胞を、ピューロマイシンで処理された非感染の細胞が死滅し、感染した耐性細胞がコンフルエンスに成長するまでインキュベーションした。ピューロマイシンを含有する培地を、ピューロマイシンを補給し、細胞破片を除くために４８時間毎に取り替えた。耐性の細胞がコンフルエンスに成長すると（選抜を開始した約４〜５日後）、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理して、それらの性質を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ毛細管形成アッセイを使用して分析した。
【０１４８】
毛細管形成アッセイ
９６ウエル組織培養プレートを２層プロセスで４℃において５０μＬの冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、使用前に、少なくとも３０分間、３７℃で重合させた。トリプシン処理した細胞を５００μＬのＥＧＭ−２培地に集め、４００ｒｃｆで３分間遠心分離して、細胞をペレットにした。これは、アッセイを妨害し得るトリプシンの除去を可能にした。細胞ペレットを５００μＬのＥＧＭ−２培地に再懸濁し、血球計を使用して計数した。細胞をＥＧＭ−２培地において２．５ｘ１０５細胞／ｍＬに希釈した。１００μＬの希釈された細胞懸濁物を二連のＭａｔｒｉｇｅｌコーティングウエルに加えた。最終的な細胞密度は２５０００細胞／ウエルであった。プレートを加湿インキュベーターにおいて３７℃で５％ＣＯ２とともに２２時間インキュベーションした。画像を、４Ｘ対物レンズおよびＯｐｔｏｎｉｃｓ  ＭａｇｎａＦｉｒｅソフトウエアを用いるＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１顕微鏡を使用して得た。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析（下記参照）のためのＲＮＡを抽出するために、残る細胞を４００ｒｃｆで３分間ペレット化して、培地を除き、ペレットを−８０℃で保存した。行われたすべてのアッセイについて、ベクターコントロールが含められた。これは、ｓｉＲＮＡ挿入物を含有しないベクターについて行われたウイルスによる感染および選抜プロセスを受けているＨＵＶＥＣからなった。これは、コントロール（ベクター）と分析中の個々のｓｉＲＮＡとの間における毛細管形成能力の比較を可能にした。
【０１４９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
ＨＵＶＥＣにおいて生じる（ｓｉＲＮＡにより媒介される）遺伝子ノックダウンのレベルを測定するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた。これは、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉキットまたはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書（オンカラムＤＮａｓｅ処理を含む）に従って使用する感染細胞からのＲＮＡの単離を伴った。総ＲＮＡを、品質および純度について調べるために、臭化エチジウムを含有する１．２％ＴＢＥアガロースゲルにおいて可視化した。総ＲＮＡ濃度を分光光度計でのＡ２６０によって決定した。
【０１５０】
ｃＤＮＡを合成するために、総ＲＮＡ（少なくとも１μｇ、好ましくは１．０μｇ／μＬを越える濃度で）を、Ｍ−ＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って使用して逆転写した。簡単に記載すると、分析されるＲＮＡサンプルを水で１３μＬにし、１．０μＬのオリゴ−ｄＴプライマー（５００ｎｇ／μＬ）を加えた。７０℃で５分間インキュベーションした後、チューブを氷上に５分間置き、その後、５．０μＬのＭ−ＭＬＶ  ＲＴ  ５ｘ反応緩衝液、１．２５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１．０μＬのＭ−ＭＬＶ  ＲＴ（Ｈ点変異体）酵素および３．７５μＬの水を含有する１１μＬの事前に作製されたマスターミックスを加えた。この混合物を４０℃で１時間インキュベーションし、その後、反応を、７０℃で１５分間インキュベーションすることによって停止させた。
【０１５１】
リアルタイムＰＣＲをＲｏｔｏｒＧｅｎｅＴＭ２０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において行った。反応では、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、反応は製造者の説明書に従った。リアルタイムＰＣＲ反応は、典型的には２５μＬの体積で行われ、１Ｘ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ緩衝液、２００ｎＭ  ｄＮＴＰミックス、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（これは、使用されたプライマー組合せについて変化し得る）、０．３μＭの各プライマー、１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎミックス（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ）、１．２μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ酵素、および１０μＬの１：５希釈されたｃＤＮＡテンプレートからなった。
【０１５２】
サイクル処理条件は、典型的には、９４℃で１２分間、その後、９４℃で１５秒間、６０℃で１５秒間および７２℃で２０秒間の３５サイクルで行った。プライマーのアニーリング温度は、使用されたプライマーの性質に依存して変化させることができる。
【０１５３】
ＰＣＲサイクル処理の後、融解曲線の作製を、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＴＭ２０００ソフトウエアを使用して行った。この場合、アニーリングした生成物の量を、５０℃および９９℃の間でそれぞれの程度で保ち、吸光度を測定することによって求めた。すべての生成物を、融解曲線を観測することに加えて、特異性を調べるために、臭化エチジウムを含有する１．２％アガロースゲルで泳動した。
【０１５４】
特定の遺伝子のノックダウンのレベルを、その後、レトロウイルスベクターのみを感染させたＨＵＶＥＣと対比されるように、検討中の関連したｓｉＲＮＡを感染させたＨＵＶＥＣにおけるその発現レベルを比較することによって測定した。
【０１５５】
ＨＵＶＥＣ機能のインビトロ調節−ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１
ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１の発現をノックダウンするために設計されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号４５〜４７および配列番号４８〜５０によってそれぞれ表される。これらのｓｉＲＮＡをレトロウイルスにより感染させたＨＵＶＥＣのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、それぞれのｓｉＲＮＡが様々な程度でＢＮＯ７８２またはＢＮＯ４８１の発現をノックダウンすることができたことを明らかにした。ＢＮＯ７８２  ｓｉＲＮＡ（配列番号４６）によって媒介されるＢＮＯ７８２の発現ノックダウンのレベルは２４％（図３Ａ）であり、一方、ＢＮＯ４８１の発現は、ＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１（配列番号４８）を使用したとき、３６％減少した（図３Ｂ）。続いて、これらのｓｉＲＮＡはともに、それぞれの遺伝子についてのこのレベルのノックダウンが、毛細管形成に関係するＨＵＶＥＣの能力に対して有した影響を調べるために、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいて別々に使用された。図４において認めることができるように、ＢＮＯ７８２またはＢＮＯ４８１のｍＲＮＡレベルを低下させることにより、ＨＵＶＥＣ管形成が阻害される。ベクター感染細胞は管構造の広範囲の網状組織を形成し（図４Ａおよび図４Ｃ）、一方、ＢＮＯ７８２  ｓｉＲＮＡ２またはＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１を感染させた細胞は、非常に多数の不完全な管伸長を伴った、複雑性が著しく低下した管構造の網状組織を示した（図４Ｂおよび図４Ｄ）。この結果から、血管形成のプロセスにおけるＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１の両方についての役割が確認される。
【０１５６】
タンパク質相互作用研究
既知のタンパク質および未知のタンパク質と結合する本発明の血管形成タンパク質（ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１を含む）のいずれか１つの能力を調べることができる。酵母ツーハイブリッドシステムなどの手法が、何らかの機能的パートナーを発見および同定するために使用される。酵母ツーハイブリッド手法の基礎となっている原理は、酵母における転写活性化因子を含めて、真核生物の多くの転写活性化因子は、２つの異なったモジュール状ドメインからなるということである。第１のドメインは、特異的なプロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメインであり、第２のドメインは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体に、ＤＮＡ結合部位の下流側の遺伝子を転写することを行わせる活性化ドメインである。いずれのドメインも単独では転写を活性化することができないため、両方のドメインが転写活性化のために要求される。酵母ツーハイブリッド手法では、目的とする遺伝子またはその一部分（おとり）が、ＤＮＡ結合ドメインを有するペプチドに対する融合体として発現されるような方法でクローン化される。第２の遺伝子または数多くの遺伝子（例えば、ｃＤＮＡライブラリーに由来する遺伝子など）（標的）が、活性化ドメインに対する融合体として発現されるようにクローン化される。目的とするタンパク質とその結合パートナーとの相互作用はＤＮＡ結合ペプチドを活性化ドメインと一緒にし、レポーター遺伝子の転写を開始させる。第１のレポーター遺伝子は、相互作用するタンパク質を含有する酵母細胞のために選択される（このレポーターは通常、選択培地における成長のために要求される栄養遺伝子である）。第２のレポーターは確認のために使用され、一方、相互作用するタンパク質に応答して発現している間は通常、成長のために要求されない。
【０１５７】
相互作用する遺伝子およびタンパク質の性質もまた研究することができ、その結果、これらのパートナーもまた、薬物発見のための標的であり得るようになる。
【０１５８】
構造研究
本発明の組換え血管形成タンパク質を、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞において産生させることができ、結晶学研究およびＮＭＲ研究において使用することができる。タンパク質の分子モデル化と一緒になって、構造に由来する薬物設計を容易にすることができる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１Ａ−Ｂ】血管形成のインビトロモデルにおける規定された時点の期間中における選択された示差的に発現しているクローンの発現プロフィルの例を示す。Ａ：最大の発現を０．５時間の時点で有するクローンの例；Ｂ：最大の発現を３時間の時点で有するクローンの例。
【図１Ｃ−Ｄ】血管形成のインビトロモデルにおける規定された時点の期間中における選択された示差的に発現しているクローンの発現プロフィルの例を示す。Ｃ：最大の発現を６時間の時点で有するクローンの例；Ｄ：最大の発現を２４時間の時点で有するクローンの例。
【図２】示差的に発現している遺伝子（ＢＮＯ７８２およびＢＮＯ４８１）の発現プロフィルを示す。
【図３】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定されたときの、ＢＮＯ７８２  ｓｉＲＮＡ２により媒介されるＢＮＯ７８２の発現ノックダウン、およびＢＮＯ４８１  ｓｉＲＮＡ１により媒介されるＢＮＯ４８１の発現ノックダウンのレベルの分析を示す。
【図４】ＢＮＯ７８２またはＢＮＯ４８１のｍＲＮＡ発現を低下させることにより、ＨＵＶＥＣ管形成が阻害されることを示す。
【配列表】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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