(57)【要約】本発明は、ヒトおよびヒト以外の動物を包含する対象において、損傷および創傷を包含する種々の疾患、異常および/または症状、ならびに、例えば全体もしくは一部がβ細胞質量の減少、β細胞数の減少、および/またはβ細胞機能の低下に関連しまたはそれらによって特徴付けられる疾患、異常および/または症状を治療するための方法を特徴とするものである。この方法は、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体を包含する1またはそれ以上の化合物の有効量を対象に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において減少したβ細胞質量および/または減少したβ細胞数を特徴とする、もしくはそれらを含む、またはそれらを改善することによりある程度緩和できる症状の治療方法であって、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記プレプチンが、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu（配列番号1）を含むヒトプレプチン、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leu（配列番号2）を含むラットプレプチン、およびアミノ酸配列 Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leu（配列番号3）を含むマウスプレプチンよりなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2もしくは3のアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記フラグメントが、配列番号1、2または3の残基17-34を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2または3と少なくとも約60%一致するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2または3と少なくとも約80%一致するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2または3と少なくとも約90%一致するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2または3と少なくとも約95%一致するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記プレプチンアゴニストが、約14までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記プレプチンアゴニストが、約10〜13までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記プレプチンアゴニストが、約6〜9までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記プレプチンアゴニストが、約2〜5までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、β細胞質量および/またはβ細胞数を増加または維持する方法。
【請求項１４】
前記プレプチンが、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu（配列番号1）を含むヒトプレプチン、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leu（配列番号2）を含むラットプレプチン、およびアミノ酸配列 Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leu（配列番号3）を含むマウスプレプチンよりなる群から選ばれる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2もしくは3のアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記フラグメントが、配列番号1、2または3の残基17-34を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記プレプチンアゴニストが、(1) 配列番号1、2または3と少なくとも約60%一致するアミノ酸配列、(2) 配列番号1、2または3と少なくとも約80%一致するアミノ酸配列、(3) 配列番号1、2または3と少なくとも約90%一致するアミノ酸配列、および(4)  配列番号1、2または3と少なくとも95%一致するアミノ酸配列、よりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
前記プレプチンアゴニストが、(1) 約14までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(2) 約10〜13までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(3) 約6〜9までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(4) 約2〜5までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、を含むペプチドよりなる群から選ばれる、請求項13に記載の方法。
【請求項１９】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、β細胞増殖の成長および/またはβ細胞質量の増加を刺激する方法。
【請求項２０】
前記プレプチンが、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leuを含むヒトプレプチン、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leuを含むラットプレプチン、およびアミノ酸配列 Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leuを含むマウスプレプチンよりなる群から選ばれる、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2もしくはは3のアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記フラグメントが、配列番号1、2または3のアミノ酸残基17-34を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記プレプチンアゴニストが、(1) 配列番号1、2または3と少なくとも約60%一致するアミノ酸配列、(2) 配列番号1、2または3と少なくとも約80%一致するアミノ酸配列、(3) 配列番号1、2または3と少なくとも約90%一致するアミノ酸配列、および(4) 配列番号1、2または3と少なくとも約95%一致するアミノ酸配列、よりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
前記プレプチンアゴニストが、(1) 約14までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(2) 約10〜13の保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(3) 約6〜9までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(4) 約2〜5までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、を含むペプチドよりなる群から選ばれる、請求項19に記載の方法。
【請求項２５】
前記プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を対象に投与することを含む、該対象における、β細胞又はβ細胞機能不全によって全体もしくは一部が仲介される仲介疾患、症状の異常を治療する方法。
【請求項２６】
前記プレプチンが、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leuを含むヒトプレプチン、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leuを含むラットプレプチン、およびアミノ酸配列 Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leuを含むマウスプレプチンよりなる群から選ばれる、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2もしくは3のアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が、1型糖尿病または2型糖尿病である、請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
プレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストの有効量を対象に投与することを含む、該対象におけるインスリン分泌を増大させる方法。
【請求項３０】
前記プレプチンが、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leuを含むヒトプレプチン、アミノ酸配列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leuを含むラットプレプチン、およびアミノ酸配列 Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leuを含むマウスプレプチンよりなる群から選ばれる、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2もしくは3のアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の量を、疾患、症状もしくは異常、またはそれらの1以上の症候を治療あるいは改善する有効量で含む容器；ならびに、
対象への投与を含む、損傷、創傷、β細胞質量減少、β細胞数減少、もしくはβ細胞機能低下を含む疾患、症状もしくは異常、またはそれらの1以上の症候の治療あるいは改善のための、当該容器の内容物の使用についての説明書、
を含む製造品。
【請求項３３】
包装材料；ならびに、
疾患、症状もしくは異常、またはそれらの1以上の症候の治療あるいは改善に有効な量で、該包装材料に内包された、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物；
を含む製造品であって、
当該包装材料が、対象における損傷、創傷、またはβ細胞喪失もしくはβ細胞機能不全によって全体または一部が仲介される症状を治療するための、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる前記1またはそれ以上の化合物の使用を記載しあるいはそれに言及する、前記製造品。
【請求項３４】
i) 内部損傷；
ii) 外部損傷；
iii) 内部創傷；
iv) 外部創傷；
v) 全体または一部がβ細胞質量減少によって特徴付けられる症状；
vi) 全体または一部がβ細胞数減少によって特徴付けられる症状；
vii) β細胞質量の増大または維持；
viii) β細胞数の増大または維持；
ix) 細胞分化または新生を介したβ細胞増殖の刺激；
x) 細胞分化または新生を介したβ細胞質量の増大；
xi) β細胞仲介疾患；
xii) 全体または一部が、望ましくない低インスリン分泌によって特徴付けられる症状；および、
xiii) 全体または一部がインスリン耐性によって特徴付けられる症状；
xiv) 全体または一部が高血糖によって特徴付けられる症状；および、
xv) 全体または一部が食後高血糖によって特徴付けられる症状、
のうちのいずれか1つまたはそれ以上にある対象の治療のための医薬製造における、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の使用。
【請求項３５】
前記プレプチンが、ヒト、ラットまたはマウスのプレプチンである、請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
前記プレプチンアゴニストが、配列番号1、2もしくは3のアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を含む、請求項34に記載の使用。
【請求項３７】
前記フラグメントが、配列番号1、2または3のアミノ酸残基17-34を含む、請求項36に記載の使用。
【請求項３８】
前記プレプチンアゴニストが、(1) 配列番号1、2または3と少なくとも約60%一致するアミノ酸配列、(2) 配列番号1、2または3と少なくとも約80%一致するアミノ酸配列、(3) 配列番号1、2または3と少なくとも約90%一致するアミノ酸配列、および (4) 配列番号1、2または3と少なくとも95%一致するアミノ酸配列、よりなる群から選ばれるペプチドを含む、請求項34に記載の使用。
【請求項３９】
前記プレプチンアゴニストが、(1) 約14までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(2) 約10〜13までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(3) 約6〜9までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、(4) 約2〜5までの保存的その他のアミノ酸置換を有する配列番号1、2または3、を含むペプチドよりなる群から選ばれる、請求項34に記載の使用。
【請求項４０】
前記β細胞仲介疾患が、1型糖尿病または2型糖尿病のいずれかである、請求項34に記載の使用。
【請求項４１】
薬学的に許容されるカプセルまたはマトリックス、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される好適な共同物質（co-active）、薬学的に許容される緩衝剤、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される浸透圧剤、および/または薬学的に許容される希釈剤のうち1またはそれ以上を用いて投与または自己投与されるべく調合された、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物を含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法において有用な、あるいは該方法における使用に好適な投薬単位。
【請求項４２】
前記のプレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、その塩、およびその誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の量が、対象の体重当たり約10〜約40μg/Kgから対象の体重当たり約200〜約500μg/Kgから対象の体重当たり約600〜約1000μg/Kgの範囲内である、請求項41に記載の投薬単位。
【請求項４３】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を含む組成物を損傷または創傷に適用することを含む、対象におけるまたは対象上の損傷あるいは創傷を治療するための方法。
【請求項４４】
前記対象がヒトである、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象がヒト以外である、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記創傷が、皮膚もしくはその他の外表面が裂け、穴があき、切断され、またはその他の態様で破壊されている創傷である、請求項43〜45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
前記創傷が、肉は貫通しているが下部の骨または生存臓器は実質的に損傷されていない創傷である、請求項43〜45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
前記創傷が皮膚表面の損傷である、請求項43〜45のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記創傷が内出血である、請求項43〜45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が軟膏、クリームまたはゲルである、請求項43〜45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
前記創傷が、化学的熱傷、熱傷、皮膚移植ドナー部位、皮膚移植の移植部位、皮膚潰瘍、外科的創傷、創傷離開、角膜外傷、角膜移植部位、抜歯部位、口腔手術創傷、粘膜崩壊、皮膚崩壊、および結合組織の崩壊よりなる群から選ばれる、請求項43〜45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
前記の皮膚潰瘍が、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、鬱血性潰瘍、およびリポイド類壊死症性潰瘍よりなる群から選ばれる、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記の粘膜崩壊が、胃腸管内部の粘膜崩壊、および膀胱内部の粘膜崩壊よりなる群から選ばれる、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
前記の胃腸管内の粘膜崩壊が潰瘍性大腸炎を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記の胃腸管内の粘膜崩壊がクローン病を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５６】
前記の皮膚崩壊が擦過傷を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５７】
前記の結合組織崩壊が擦過傷を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５８】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を創傷に局所適用することを含む、創傷治癒を亢進するための方法。
【請求項５９】
間葉由来細胞および/または細胞質量の増殖を促進する化合物の適用あるいは投与によって対象の症状を治療する方法において、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を該対象に投与することを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項６０】
前記間葉由来細胞が線維芽細胞を含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
末梢神経系損傷を治療および/または防止し、運動ニューロンの細胞死を減少させ、筋終板を増加させ、損傷した坐骨神経の機能回復を促進し、化学療法中のまたはその結果としての末梢運動麻痺を防止し、アルツハイマー病を治療および/または防止し、卒中を治療および/または防止し、筋萎縮性側索硬化症を治療および/または防止し、パーキンソン病を治療および/または防止し、筋ジストロフィーを治療および/または防止し、糖尿病性神経障害を治療および/または防止し、心筋機能を改善し、心筋炎および心筋梗塞を包含する心筋症を治療および/または防止し、心臓病および急性発作を治療および/または防止し、そして虚血により惹起される急性腎不全を治療および/または防止するための、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を含む組成物の投与。
【請求項６２】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を対象に適用または投与することを含む、組織の成長を促進する化合物の適用または投与によって該対象の組織の成長を促進する方法。
【請求項６３】
前記組織が結合組織および上皮組織よりなる群から選ばれる、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、それらの塩、およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を対象に適用または投与することを含む、免疫機能を改善する化合物の適用または投与によって該対象の免疫機能を改善する方法。
【請求項６５】
前記の免疫機能の改善がリンパ球増殖の改善を含む、請求項64に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉由来細胞の増殖、増強、および分化物質として有用な化合物、ならびにかかる化合物を活性成分として含有する組成物に関するものである。より詳細には、本発明は、プレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニスト、ならびにそれらの塩および誘導体を包含する生物活性化合物、該化合物の新規な用途、それらの化合物を含有する医薬組成物、ならびに該化合物を使用する方法に関するものである。該化合物の新規な用途は、線維芽細胞および膵臓β細胞ならびにそれらの細胞前駆体を包含する細胞の増殖および分化を刺激する能力に関連し、糖尿病患者の治療ならびに内部および内部創傷治癒への適用を包含する、様々な疾患、異常および症状におけるそれらの用途を包含する。
【背景技術】
【０００２】
膵島β細胞は、例えば中間代謝に甚大な影響を及ぼすペプチドホルモンであるインスリンの分泌を通じて、生理に大きな役割を果たしている。真性糖尿病は高血糖とβ細胞機能の変化を特徴としている。1型糖尿病は膵島β細胞の自己免疫的破壊に起因する膵臓の内分泌機能の早期喪失を特徴とし、高インスリン血症と高血糖を招く。2型糖尿病は、遺伝的因子と環境作用の相互作用で引き起こされる多遺伝子性で非均質性の疾患である。例えばKecha-Kamoun et al. (2001) Diabetes Metab Res Rev, 17:146-152を参照されたい。2型糖尿病は最初は高インスリン血症を特徴とするものの、β細胞機能の喪失と最終的なβ細胞不全の結果、インスリンレベルは結局低下する。正常なグルコース寛容からグルコース寛容減損、2型糖尿病、および2型糖尿病後期への進行は、β細胞機能の変化、β細胞喪失、および最終的にはインスリン分泌の低下に結びついている。例えば、Dickson et al. (2001) J.Biol.Chem., 276:21110-21120を参照されたい。
【０００３】
膵島β細胞は糖尿病研究の中心にある。これは、他の組織の代謝要求を満足させるためにインスリンを分泌する、グルコース応答性細胞である。末梢インスリン耐性とその結果起こる高血糖が2型糖尿病の特徴である。β細胞はしばしば、インスリン分泌能とβ細胞質量の両方を増大させることによってこのインスリン耐性を補償する。ところが、β細胞が、インスリンに対する耐性の増大を克服するに充分なインスリン産生レベルの維持ができなくなるにつれ、高血糖症が悪化する（Kaytor et al. (2001) J.Biol Chem. 16:16）。最終的なβ細胞不全は、最初は機能不全であるが、後に、1型糖尿病に見られるようなβ細胞の喪失へと移行する。
【０００４】
最も顕著な機能的β細胞欠損の1つは、急性グルコース誘導性インスリン分泌（GIIS）の消失である。β細胞は、最初、インスリン要求の増大に適応するが、その後、2型糖尿病が悪化するにつれて補償作用が働かなくなる。一つの仮説は、β細胞が分化しなくなり、GIISのような特化した機能の喪失を導くというものである。β細胞の非分化は、インスリン遺伝子発現の低下を含む部分的膵切除ラットモデルで報告されている（Weir et al. (2001) Diabetes, 50 Supplement 1, S154-S159）。
【０００５】
シグナル伝達事象の統合ネットワークは、連携して働き、インスリン要求に対するβ細胞質量の適合を調節する。β細胞成長の増大が、循環している成長因子に一部起因していることを示唆する幾つかの証拠がある。例えば、インスリン耐性マウスの膵臓または腎膜中に正常な島を移植すると、β細胞質量の著明な増大が導かれることを報告している、Flier et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 98:7475-7480を参照されたい。
【０００６】
適当な成長因子を同定し内因性成長経路の刺激に利用することは、例えばβ細胞質量を増大させるために有用であろう。幾つかの糖尿病動物モデルにおいてβ細胞質量を増大させる努力が報告されている。例えば、Efrat,S. (2001) Diabetes, 50 Supplement 1:S189-S190；およびTourrel et al. (2002) Diabetes, 51:1443-1452を参照されたい。
【０００７】
インスリン様成長因子2（IGF-II）は胎児生存中の膵臓の細胞成長と分化に重要な役割を果たしていると言われている。IGF-IIは哺乳動物の胎児と成人の膵臓に局在し、β細胞前駆体である膵島管上皮で発現される（Ilieva et al. (1999) Pancreas, 19:297-303）。成人の膵臓では、β細胞と管細胞のみにIGF-II免疫反応性が見出される（Portela-Gomes et al. (2000) Journal of Endocrinology, 165:245-251）。プロインスリン様成長因子II（pro-IGF-II）のAsp69-Leu102に対応すると報告されている34アミノ酸ペプチドであるプレプチンは、膵島β細胞に存在し、グルコースにより仲介されるインスリンとの共分泌を受ける。Cooper and Buchanan, 「プレプチン機能性を有するペプチド」, WO 00/78805 (PCT/NZ00/00102）を参照されたい。プレプチンはインスリン分泌を増強するが開始はさせないことが報告されている。Buchanan et al. (2001) Biochem. J. 360:431-439を参照されたい。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、部分的には、プレプチンおよびその他のペプチドが例えば線維芽細胞および膵島β細胞の増殖を刺激する能力の発見に基づくものである。さらに本発明は、例えば線維芽細胞および膵島β細胞の前駆細胞といった他の細胞の、線維芽細胞および膵島β細胞への分化を促進するこのような化合物の能力に基づき、該化合物が有用であるとの決定に基づくものである。
【０００９】
ある態様では、本発明は、対象におけるβ細胞質量の減少、β細胞数の減少、および/またはβ細胞機能の低下という症状を治療するための方法を特徴とするものである。この方法は、プレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、または上記物質の塩もしくは誘導体のうち1またはそれ以上のものの有効量を対象に投与することを包含する。本明細書中使用するβ細胞とは、膵島β細胞を包含する。
【００１０】
この対象は、例えばβ細胞の部分的喪失、例えばβ細胞の約80%未満の喪失を伴う疾患に罹患しているかも知れない。このような疾患の例は2型真性糖尿病であるが、これに限定される訳ではない。この対象はまた、より実質的または完全なβ細胞喪失を伴う、例えばβ細胞の約80%を越える喪失を特徴とする疾患に罹患しているかも知れない。このような疾患の例は、例えば1型真性糖尿病および2型糖尿病の後期を包含するが、これらに限定されない。
本明細書中使用する「プレプチン」とは、その配列が以下の式(I)：
【００１１】
1              5              10                15                 20      
Asp Val Ser Thr R1 R2 R3 Val Leu Pro Asp R4 Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe 
25                30
Phe R5 R6 Asp Thr Trp R7 Gln Ser R8 R9 Arg Leu                             式(I)
【００１２】
［式中、R1はSerもしくはPro、またはいずれかの保存的変異体であり；R2はGlnもしくはProまたはいずれかの保存的変異体であり；R3はAlaもしくはThrまたはいずれかの保存的変異体であり；R4はAspもしくはAsnまたはいずれかの保存的変異体であり；R5はGlnもしくはLysまたはいずれかの保存的変異体であり；R6はTyrもしくはPheまたはいずれかの保存的変異体であり；R7はArgもしくはLysまたはいずれかの保存的変異体であり；R8はAlaもしくはThrまたはいずれかの保存的変異体であり；そしてR9はGlyもしくはGlnまたはいずれかの保存的変異体である。］
【００１３】
に開示されている配列を包含する、単離された、純粋なもしくは精製された、または実質的に純粋な、34アミノ酸長のペプチドおよびその類縁体である。
【００１４】
プレプチンはヒトプレプチンまたはプレプチン群、ラットプレプチンまたはプレプチン群、およびマウスプレプチンまたはプレプチン群、ならびにこれら各々のアレル変異体および種変異体を包含する。ヒト、ラット、およびマウスのプレプチンの配列例を下に示す：
【００１５】
ヒトプレプチン（配列番号1）：
1               5                 10                  15                 20
Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys 
25                  30
Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu
【００１６】
ラットプレプチン（配列番号2）：
1               5                 10                  15                 20
Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys 
25                  30
Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leu
【００１７】
マウスプレプチン（配列番号3）：
1               5                 10                  15                 20
Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys 
25                  30
Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Leu。
【００１８】
プレプチンの類縁体は、プレプチンの機能的等価物、例えば式(I)で示される化合物の機能的等価物を包含する。プレプチン自体については、機能的等価物は、プレプチンと免疫学的交差反応性である蛋白および1またはそれ以上のプレプチンの機能を有する蛋白、例えばプレプチン（例えば配列番号1-3のいずれか）と実質的に同じ機能または機能群を有する蛋白を包含する。様々なプレプチン類縁体は、例えばプレプチン1-33、プレプチン1-32、プレプチン1-31、プレプチン1-30、プレプチン1-29、プレプチン1-28、およびプレプチン1-27を包含するプレプチンのC末端切除物を包含する。その他のプレプチン類縁体は、例えばプレプチン2-34、プレプチン3-34、プレプチン4-34、プレプチン5-34、プレプチン6-34、プレプチン7-34、およびプレプチン8-34を包含するプレプチンの様々なN末端切除物を包含する。その他のプレプチン類縁体は、N末端切除とC末端切除の両方を持つ様々なフラグメント、例えばプレプチン2-33およびプレプチン3-32を包含する。
【００１９】
その他のプレプチン類縁体は、プレプチン活性部位または部位群を含むペプチドを包含する。さらに別の本発明の範囲内の化合物は、1またはそれ以上のアミノ酸置換、好ましくは1またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有するプレプチンおよびプレプチン類縁体を包含する。その他のプレプチン類縁体は、プレプチンまたはその類縁体の付加および除去突然変異体、ならびに、プレプチンもしくはそのフラグメントもしくは突然変異体と他のアミノ酸もしくはペプチドとの融合物を含む、または本質的に該融合物で構成される、または該融合物で構成されるペプチドを包含する。
【００２０】
「プレプチンアゴニスト」とは、(1) プレプチン結合受容体に対する高いまたはその他望ましい親和性、例えば約10-7ないし約10-9M、または約10-8ないし約10-9M、またはそれ以上のKa（例えばMotulsky and Mahan (1984) Mol. Pharmacol. 25:1に記載のフォーマットを有する受容体結合検定で測定できる）を有する化合物；および/または (2) プレプチンのように、ある種の細胞、例えば線維芽細胞、例えばNIH-3T3細胞、またはβ細胞、例えばINS-1E β細胞の増殖を刺激する化合物、である。
【００２１】
本発明の範囲内にあるアゴニストは、(B) IGF-IIに対応するアミノ酸配列の全体または一部（即ちpro-IGF-II 1-68）、に直接または間接的に、好ましくはプレプチンのN末端において結合している 、(A) プレプチンまたはその機能的フラグメントを含む、または本質的にそれらで構成される、またはそれらで構成される化合物を包含する。これらのペプチド、即ちペプチド(A)および(B)は、1またはそれ以上の他のアミノ酸、例えばアルギニン残基を介して間接的に結合させることができる。
【００２２】
さらに別のアゴニストは、(C) pro-IGF-II 103-156に対応するアミノ酸配列の全体または一部に直接または間接的に、好ましくはプレプチンのC末端において結合している 、(A) プレプチンまたはその機能的フラグメントを含む、または本質的にそれらで構成される、またはそれらで構成される化合物を包含する。これらのペプチド、即ちペプチド(A)および(C)は、1またはそれ以上の他のアミノ酸、例えばアルギニン残基を介して間接的に結合させることができる。
【００２３】
さらに別のアゴニストは、任意の組み合わせで直接または間接的に結合したペプチド(A)および(B)および(C)を含む、または本質的にそれらで構成される、またはそれらで構成される化合物を包含する。したがってそのようなペプチドは、例えばペプチド(B)が直接または間接的にペプチド(A)に連結し、これが次にペプチド(C)に直接または間接的に連結しているもの；ペプチド(A)が直接または間接的にペプチド(B)に連結し、これが次にペプチド(C)に直接または間接的に連結しているもの；ペプチド(B)が直接または間接的にペプチド(C)に連結し、これが次にペプチド(A)に直接または間接的に連結しているもの；等を包含する。
【００２４】
さらに別のアゴニストは、プレプチンの全体、即ち34の全アミノ酸を配列に含むpro-IGF-IIのフラグメントを包含する。
【００２５】
さらに、例えばプレプチンアゴニストは、約87未満のアミノ酸または20より多いアミノ酸を含み、または本質的にそれらで構成され、またはそれらで構成され、且つ配列番号1、2または3の任意の部分または全体、好ましくは全体を連続配列として含むペプチドであってよい。別の例では、プレプチンアゴニストは、約87未満のアミノ酸または35より多いアミノ酸を含み、または本質的にそれらで構成され、またはそれらで構成され、且つ配列番号1、2または3のアミノ酸配列の任意の部分または全体、好ましくは全体を連続配列として含むペプチドであってよい。
【００２６】
ある態様では、本明細書に記載の方法は、式(I)または配列番号1、2もしくは3のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、または本質的にそれらで構成される、またはそれらで構成されるプレプチンの有効量を対象に投与することを包含する。
【００２７】
ある態様では、本明細書に記載の方法は、式(I)または配列番号1、2もしくは3に記載のペプチドのうちいずれかのアレル変異体または種変異体であるプレプチンの有効量を対象に投与することを包含する。
【００２８】
別の態様では、本明細書に記載の方法は、例えば式(I)または配列番号1、2もしくは3のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、または本質的にそれらで構成される、またはそれらで構成されるプレプチンの類縁体を包含するプレプチン類縁体の有効量を対象に投与することを包含する。
【００２９】
別の態様では、本方法は、プレプチンアゴニストの有効量を対象に投与することを包含する。このような態様は、式(I)または配列番号1、2もしくは3と少なくとも約60%（例えば少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%ないし少なくとも約98%、または少なくとも約99%）一致するアミノ酸配列を含むプレプチンアゴニストの有効量を対象に投与することを包含する。
【００３０】
さらに別の態様では、本方法は、14までの保存的アミノ酸置換を有する配列番号1、2または3を含むプレプチンアゴニストの有効量を対象に投与することを包含する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、β細胞の質量を増大させるまたは維持するための方法を特徴とする。この方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニストの有効量を投与することを包含する。本明細書中使用する対象は、実質的に正常なβ細胞質量、増大したβ細胞質量、低下したβ細胞質量を持っているかも知れず、またはこの対象はβ細胞喪失もしくは機能不全の危険性があるかも知れない。さらなる態様では、本発明は、β細胞成長を刺激する、またはβ細胞数を増加させるための方法を特徴とする。作用についての何らかの特別な理論またはメカニズムに拘束されることを望む訳ではないが、このような刺激または増加は例えば細胞分化または新生を介したものであり得る。この方法は、それを必要とする対象に、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の有効量を投与することを包含する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、対象における、β細胞によって全体もしくは一部が仲介される任意の疾患、異常もしくは症状、全体もしくは一部にβ細胞が関与する任意の疾患、異常もしくは症状、および全体的または部分的にβ細胞機能不全を特徴とする任意の疾患、異常もしくは症状、または、β細胞機能の増強が利益をもたらす任意の疾患、異常もしくは症状を治療する方法であって、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の有効量を対象に投与することを含む方法に関するものである。プレプチンは、式(I)、および配列番号1、2もしくは3のいずれかのアミノ酸配列を包含する。プレプチンアゴニストは例えば配列番号1、2もしくは3のいずれかのアミノ酸配列のフラグメントまたは全体を包含する。
【００３３】
別の態様は、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の有効量を対象に投与することを含む、該対象においてインスリン分泌を増大させる方法である。この対象は、例えばインスリンの産生または機能が低下している対象である（例えば、インスリン抵抗性もしくは低下したβ細胞質量、または低下したβ細胞機能、または例えば糖尿病と診断されている）。ある態様では、本方法は該対象のβ細胞によってまたは該対象のβ細胞におけるインスリン分泌を増大させること、またはそれらのβ細胞質量を増大させること、またはそれらの数を増加させることを含む。
【００３４】
別の態様では、本明細書に記載の方法は、ある対象がβ細胞質量、β細胞数、β細胞成長、またはβ細胞機能の調節（例えば、増大、維持、等）を必要とすることを決定することを包含する。対象の症状の決定は、主観的（例えば、対象もしくは健康管理者の意見、または観察もしくはその他の一般症状もしくはパラメータに基づく）であってよく、また、細胞質量、細胞機能、もしくは細胞数の直接もしくは間接的な分析または評価または予測による客観的（例えば、試験または診断マーカーにより測定可能な）なものであってもよい。
【００３５】
別の態様では、本発明は、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の有効量を用いて、β細胞の質量、数もしくは機能の喪失を治療する方法を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体を用いて、β細胞の質量、数もしくは機能を増大させまたは維持する方法を提供する。
【００３７】
本発明はさらに、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体を内包する容器；ならびに、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の有効量を対象に投与することを含む、例えばβ細胞の質量、数もしくは機能の低下（正常なβ細胞の質量、数もしくは機能に比較して、あるいは正常なβ細胞の質量、数もしくは機能以下であることを示す他の診断）を含む疾患の治療のための内容物の使用説明書を包含する、製造品を特徴とする。
【００３８】
さらに本発明の範囲内には、包装材料；および該包装材料に内包された1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体を包含する製造品がある。該包装材料は、内容物が、対象のある症状、例えばβ細胞の喪失または機能不全により仲介される症状（例えば1型または2型真性糖尿病）の治療に使用できることを示すラベルを含んでいる。別の態様では、このラベルは投薬情報を含んでいる。
【００３９】
別の態様では、本発明は、他の材料もしくは材料群（例えば、他の活性成分、賦形剤、希釈剤等および/または投薬単位以内であることを規定する容器）を使用してもしくは使用せずに、本発明方法における使用のためにまたは本明細書に記載または提供された任意の目的のために有効な投薬単位を製造する際の、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の有効量の使用を目的とするものである。
【００４０】
さらなる態様では、本発明はさらに、任意の広範囲の損傷（創傷を包含する）を治療する際の、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体の使用を提供する。1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体を用いて治療できる創傷の種類の例は、化学的および熱による熱傷；皮膚移植ドナーおよび移植部位；皮膚潰瘍（褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、鬱血性潰瘍、およびリポイド類壊死症性潰瘍を包含するがこれらに限定されない）；外科的創傷、創傷離開（腹部、大腿部および胸部を包含するがこれらに限定されない）；角膜外傷および移植；抜歯および口腔手術；粘膜崩壊（胃腸管（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）および膀胱を包含するがこれらに限定されない）；ならびにその他広範囲の皮膚または結合組織の外傷性崩壊および分断（例えば擦過傷）を包含するがこれらに限定される訳ではない。
【００４１】
局所投与用に設計された本発明にかかるある好ましい製剤は、例えば軟膏、クリーム、およびゲルを包含する。本発明に従う使用のための好ましい局所用製剤は軟膏である。
【００４２】
別の態様では、本発明は、対象において、もしくは対象上の損傷または創傷を治療するための方法であって、当該損傷または創傷に、または当該対象に、プレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩もしくは誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を含む組成物を適用または投与することを含む方法を提供する。好ましくはこの対象はヒトである。他の対象はヒト以外であってよく、家畜化されたおよび商業的な動物を包含する。該組成物は、軟膏、クリーム、およびゲルを包含するがこれらに限定される訳ではない。
【００４３】
本発明に従って治療され得る創傷の例は、(1) 皮膚またはその他の外表面が裂け、穴があき、切断され、またはその他の態様で破壊されている創傷；(2) 肉が貫通しているが下部の骨または生存臓器が損傷されていないまたは実質的に損傷されていない創傷；(3) 皮膚表面の損傷、を包含するがこれらに限定される訳ではない。別の例では、創傷は内出血を含む。
【００４４】
別の態様では、本発明は、創傷治癒を亢進するための方法であって、例えばかかる創傷に、プレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの塩および/または誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物を局所または内部に適用することを含む方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、間葉由来細胞および/または細胞質量の増殖を促進する化合物の適用または投与によって対象の症状を治療するための方法を提供するものであって、その改善は、プレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、あるいはそれらいずれかの、1もしくはそれ以上の塩又は誘導体よりなる群から選ばれる1もしくはそれ以上の化合物の有効量を当該対象に投与することを含む。間葉由来細胞は線維芽細胞を包含するが、これに限定されない。
【００４６】
別の態様では、本発明は、末梢神経系損傷、アルツハイマー病、卒中、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病等、筋ジストロフィー、糖尿病性神経障害、および心筋症（心筋炎および心筋梗塞を包含する）、心臓病、および急性発作、および虚血により惹起される急性腎不全のうち任意の1またはそれ以上を治療および/または防止するための、プレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニストよりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を含む組成物の投与を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、運動ニューロンの細胞死を減少させ、筋終板を増加させ、損傷した坐骨神経の機能回復を促進し、化学療法中に見られる末梢運動麻痺を防止し、そして心筋梗塞を改善するための、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、およびそれらいずれかの塩および/または誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を含む組成物の投与を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、対象の組織の成長を促進する化合物を適用または投与することにより、対象の組織の成長を促進するための方法であって、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、およびそれらいずれかの塩および/または誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を当該対象に適用または投与することを含む方法を提供する。好ましい組織は結合組織および/または上皮組織および/または膵臓組織である。
【００４９】
別の態様では、本発明は、免疫機能を改善する化合物の適用または投与により、対象の免疫機能を改善する方法であって、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、およびそれらいずれかの塩および/または誘導体よりなる群から選ばれる1またはそれ以上の化合物の有効量を当該対象に適用または投与することを含む方法を提供する。本発明のこの態様の一例はリンパ球増殖の改善を包含する。
【００５０】
本発明の別の態様では、例えば類縁体、フラグメント、アゴニスト、および融合蛋白を包含する、上記もしくは本明細書に記載のポリペプチドまたは本発明にかかる蛋白コンストラクトのうちいずれか一つをコードしているあるいは含んでいる、ポリヌクレオチドもしくはベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを包含する）または形質転換されたもしくはトランスフェクトされた細胞（単離された、精製された、または純粋なポリヌクレオチド、ベクター、および単離された形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞を包含する）をも提供する。したがって、様々な態様において、本発明は、プロモーターと機能的に結合した任意のこのようなポリヌクレオチドを含む組換えクローニングまたは発現コンストラクトを提供する。
【００５１】
別の態様では、そのような組換えクローニングまたは発現コンストラクトで形質転換されもしくはトランスフェクトされた、またはその他の態様でそれらを含んでいる、宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えばβ細胞疾患または熱傷もしくはその他の創傷のためのex vivo遺伝子治療を包含するex vivo細胞治療を受ける対象の細胞を包含する。
【００５２】
関連する態様では、例えばプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト蛋白を包含する、本発明にかかるポリペプチドまたは蛋白またはその他のコンストラクトを製造する方法であって、(a) 本明細書に記載または提供する宿主細胞を、該コンストラクト、例えばプレプチン類縁体または融合蛋白を発現させる条件の下で培養し；そして、(b) そのコンストラクト、例えばプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト蛋白を、宿主細胞または宿主細胞培養から単離する、という工程を含む方法を提供する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、例えば、本発明にかかるポリペプチドまたは蛋白コンストラクト（例えばプレプチン類縁体、アゴニスト、および/または融合蛋白を包含する）のいずれかをコードしている、例えば単離された、精製された、または純粋なポリヌクレオチドを、生理学的に許容される担体と組み合わせて含む、または例えば遺伝子治療デリバリー媒質もしくはベクターと組み合わせて含む、または該媒質もしくはベクター中に含む、医薬組成物を提供する。
【００５４】
本発明にかかるその他の特徴、目的、および利点は、この説明および図面、ならびに請求項から明白であろう。
【００５５】
本発明は、間葉由来細胞および/または細胞質量または機能、例えば線維芽細胞の増殖または拡大を刺激するための、そしてβ細胞成長の増殖またはβ細胞質量および/または機能の増大を刺激するための、プレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの、塩および/または誘導体のうち1またはそれ以上の使用に関するものである。何らかの特別な理論または作用メカニズムに拘束されることを望む訳ではないが、このような刺激または増大は、例えば細胞分化または新生を介したものであり得る。
【００５６】
プレプチンは、例えばBuchanan et al. (2001) Biochem. J. 360:431-439に従う方法で膵島β細胞から単離できる。プレプチンならびにプレプチン類縁体およびアゴニスト、およびその塩および誘導体は、合成法を用いて製造することもできる。固相および液相ペプチド合成を包含するペプチドおよびそれらの塩および誘導体の合成は、当分野で充分確立されている。例えば、Stewart, et al. (1984) 「固相ペプチド合成」 (2nd Ed.)；およびChan (2000) 「Fmoc固相ペプチド合成、実際のアプローチ」, Oxford University Pressを参照されたい。ペプチドは自動ペプチド合成機（例えばPioneer(登録商標) Peptide Synthesizer, Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて合成できる。例えばペプチドをメチルベンジルヒドリルアミン樹脂上で製造し、その後、フッ化水素により脱保護し、樹脂から開裂させる。
【００５７】
本発明において有用な蛋白およびペプチドは、組換え法によって製造することもできる。本発明は、本発明において有用な蛋白およびペプチドの発現を指令することのできる組換え発現コンストラクトを提供する。本明細書で言及する様々なアミノ酸配列中に出現するアミノ酸は、周知の三文字または一文字略語に従って特定する。本明細書で言及する様々なDNA配列またはそのフラグメント中に出現するヌクレオチドは、当分野で常套的に使用する標準的一文字表記で表記する。与えられたアミノ酸配列は、些少の変化、例えば、共有結合による化学的修飾、挿入、除去および置換（これらは例であってこれらに限定される訳ではない)(さらにこれらは保存的置換または非天然アミノ酸による置換を包含できる）のみを有する配列といったように、似通ってはいるが変化したアミノ酸配列をも包含できる。互いに似通ったアミノ酸配列は、配列相同性を持つ実質的領域を共有し得る。同様に、ヌクレオチド配列は、些少の変化、例えば共有結合による化学的修飾、挿入、除去および置換（これらは例であってこれらに限定される訳ではない)(さらにこれらは遺伝コードの縮重によるサイレント突然変異を包含する）のみを有する実質的に類似のヌクレオチド配列を包含し得る。互いに似通ったヌクレオチド配列は、配列相同性を持つ実質的領域を共有し得る。
【００５８】
本明細書中使用する「アミノ酸」とは、中心炭素原子（アルファ(α)炭素原子）が水素原子、カルボン酸基（その炭素原子を本明細書では「カルボキシ炭素原子」と称する）、アミノ基（その窒素原子を本明細書では「アミノ窒素原子」と称する）、および側鎖基Rと結合している構造を有する分子である。ペプチド、ポリペプチド、または蛋白に組み入れられると、アミノ酸は脱水反応でそのアミノおよびカルボキシ基の1またはそれ以上の原子を失い、それにより1個のアミノ酸が別のアミノ酸と連結する。その結果、蛋白に組み込まれると、アミノ酸を「アミノ酸残基」と称することもある。天然に存在する蛋白の場合、アミノ酸残基のR基が、そこから蛋白が典型的に合成される20のアミノ酸の差違を生じさせるが、蛋白中の1またはそれ以上のアミノ酸残基は、蛋白に組み入れられた後に生物学的系において誘導体化または修飾されることがある（例えば、グリコシル化によって、および/または、折り畳まれた蛋白コンホメーションの安定化にしばしば重要な役割を果たすジスルフィド共有結合をもたらす、2個の非隣接システインアミノ酸残基のチオール側鎖の酸化によるシスチンの形成によってなど）。
【００５９】
当業者は理解できるであろうが、非天然アミノ酸もまた、蛋白、特に固相およびその他の自動合成法を包含する合成法によって製造される蛋白中に組み込むことができる。かかるアミノ酸の例は、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、L-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルレンシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトラリン、システイン酸、t-ブチルグリイン、t-ブチルアラニン、フェニルイリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、β-メチルアミノ酸、α-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸）および一般的アミノ酸類縁体を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【００６０】
さらに、α炭素原子が4個の異なる基を持つ場合（α炭素原子に結合した2個の水素原子を有するグリシンを除いて、20のアミノ酸が生物学的系によって蛋白の合成に使用される場合のように）、各アミノ酸につき、DおよびLと称される2種類の異なるエナンチオマー型が存在する。
【００６１】
哺乳動物においては、L-アミノ酸のみが天然ポリペプチドに組み込まれる。本発明は、1またはそれ以上のD-およびL-アミノ酸を組み込んでいる蛋白、ならびにD-またはL-アミノ酸残基のみを含む蛋白を包含する。
【００６２】
本明細書では、以下のアミノ酸（およびそれらの残基）に対して以下の略語を使用できる：アラニン（Ala、A）；アルギニン（Arg、R）；アスパラギン（Asn、N）；アスパラギン酸（Asp、D）；システイン（Cys、C）；グリシン（Gly、G）；グルタミン酸（Glu、E）；グルタミン（Gln、Q）；ヒスチジン（His、H）；イソロイシン（Ile、I）；ロイシン（Leu、L）；リジン（Lys、K）；メチオニン（Met、M）；フェニルアラニン（Phe、F）；プロリン（Pro、P）；セリン（Ser、S）；スレオニン（Thr、T）；トリプトファン（Trp、W）；チロシン（Tyr、Y）；およびバリン（Val、V）。非極性（疎水性）アミノ酸、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを包含する。中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。負に荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。
【００６３】
「蛋白」または「ペプチド」とは、2またはそれ以上の個々のアミノ酸（天然に存在するか否かに拘わらず）がペプチド結合を介して連結している任意のポリマーを指し、あるアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα-炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシ炭素原子が、隣接するアミノ酸のα-炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子と共有結合している場合に存在する。「蛋白」という語は、その意義内に「ポリペプチド」および「ペプチド」（これらは時に本明細書において互換的に使用できる）という語を包含し、その逆もまたあり得ると理解できる。さらに、複数のポリペプチドサブユニットまたはその他の構成成分を含む蛋白もまた、本明細書で使用する「蛋白」の意義内に包含されると理解できる。同様に、蛋白、ペプチド、およびポリペプチドのフラグメントもまた本発明の範囲内にあり、本明細書中で「蛋白」と称することができる。
【００６４】
生物学的系において（それらが無細胞系を包含するin vivo系であれ、in vitro系であれ）、与えられた蛋白の具体的アミノ酸配列（即ち、アミノ末端からカルボキシ末端へと記載したそのポリペプチドの「一次構造」）は、mRNAのコード部分のヌクレオチド配列によって決まり、そのヌクレオチド配列は、遺伝情報、典型的にはゲノムDNA（本発明の目的のため、これはオルガネラDNA、例えばミトコンドリアDNAおよび葉緑体DNAを包含すると理解できる）によって明示されている。無論、特定生物のゲノムを構成する任意の型の核酸（例えば、殆どの動物および植物の場合の二本鎖DNA、幾つかのウイルスの場合の一本鎖または二本鎖RNA等）が、その特定生物の遺伝子産物をコードしていると理解できる。遊離アミノ酸の重合を触媒するリボソーム上でメッセンジャーRNAが翻訳され、その具体的実体がmRNAの特定コドン（mRNAに関して、そのmRNAのコード領域中の3個の隣接するA、G、CまたはUリボヌクレオチド）によって明示され、次いで発生期のポリペプチドへと翻訳される。
【００６５】
組換えDNA技術は、生きている生物において天然に生成されたものと同じ一次配列を有する蛋白およびポリペプチド（例えば、ヒトインスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、等）の大規模合成を可能にした。さらに、このような技術はこれらのおよびその他の蛋白の類縁体の合成を可能にし、その類縁体は、天然蛋白と比較して1またはそれ以上のアミノ酸除去、挿入、および/または置換を含み得る。組換えDNA技術は全く新規な蛋白の合成をも可能にしている。
【００６６】
非生物学的系（例えば固体状態の合成を用いる系）においては、蛋白の一次構造（これはジスルフィド（シスチン）結合の所在をも含む）を使用者が決定できる。その結果、生物学的に産生された蛋白の一次構造を複製した一次構造を持つポリペプチドが獲得でき、かかる蛋白の類縁体もまた獲得できる。加えて、完全に新規なポリペプチドを合成することができ、非天然アミノ酸を組み込んだ蛋白もまた合成できる。
【００６７】
「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖の生成に関わるDNAのセグメントを意味し；さらにまた、ポリペプチドコード領域に先行および後置される領域、例えば「リーダーおよびトレーラー」、ならびに関連する個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）をも包含し得る。
【００６８】
本明細書に記載するように、本発明は、その融合蛋白の検出、機能の変化、単離および/または精製（これらは例であって限定ではない）を可能にするさらなる機能的ポリペプチド配列に融合、またはその他の態様で結合したポリペプチド配列の発現を提供する、さらなる天然または作られた配列に融合またはその他の態様でフレーム内で連結しているプレプチンコード配列を有する核酸により、全体または部分的にコードされ得るペプチドを提供するものである。
【００６９】
ポリペプチドの修飾は、当業者に知られる任意の手段で実施できる。本発明において好ましい方法は、例えばプレプチン蛋白、類縁体またはアゴニストをコードしているDNAの修飾、ならびに該修飾DNAの発現に依拠するものである。本発明にかかるペプチドコンストラクトの一つをコードしているDNAは、下に記載する方法を包含する標準法を用いて変化させまたは突然変異させることができる。
【００７０】
アミノ酸の保存的置換は周知であり、一般に、得られる蛋白分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。例えば、このような置換は一般に、極性残基、荷電残基、疎水性残基、小残基、等の群内で相互交換することにより実施する。必要ならば、in vitro生物検定で適当な細胞表面受容体に結合する能力について、または適当な抗原もしくは所望の標的分子に結合する能力について、得られる修飾蛋白を試験するだけで経験的にこのような置換を決定することができる。
【００７１】
本発明はさらに、例えば本明細書に記載のプレプチン-、プレプチン類縁体-、および/またはプレプチンアゴニスト-コード化ポリヌクレオチド配列を包含する本発明にかかるコンストラクトとハイブリダイズする核酸、または、当業者には極めて明白であろうが、配列間に少なくとも約70%、または少なくとも約80-85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%、96%、97%、98%もしくは99%の一致がある、それらの相補物に関するものである。
【００７２】
本発明は特に、緊縮条件下で、例えば本明細書で言及するプレプチン-、プレプチン類縁体-、および/またはプレプチンアゴニスト-コード化核酸とハイブリダイズする核酸に関するものである。本明細書中使用する、明記した緊縮条件下で「ハイブリダイズする」とは、2個の一本鎖核酸分子の間に形成されるハイブリッドの安定性を記述するために用いる。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、典型的には、かかるハイブリッドがアニーリングされ、次いで洗浄されるイオン強度および温度の条件で表現される。「緊縮条件」という語は、ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。
【００７３】
緊縮条件は、塩濃度、有機溶媒（例えばホルムアミド）の濃度、温度、およびその他の当分野で周知の条件によって定義できる。特に、塩の濃度を低下させることにより、または有機溶媒（例えばホルムアミド）の濃度を増大させることにより、またはハイブリダイゼーション温度を上げることにより、緊縮性を増大させることができる。
【００７４】
例えば、緊縮塩濃度は通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、そして最も好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低緊縮ハイブリダイゼーションは有機溶媒、例えばホルムアミドの不在下で達成でき、一方高緊縮ハイブリダイゼーションは有機溶媒の存在下（例えば少なくとも約35%ホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約50%ホルムアミド）で達成できる。緊縮温度条件は通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、そして最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を包含する。さらなるパラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの包含または排除、を変化させることは当業者に周知である。必要に応じてこれら様々な条件を組み合わせることによって様々なレベルの緊縮性を達成でき、それらは当分野の技術の範囲内にある。
【００７５】
その他の典型的な「高」、「中等度」および「低」緊縮性は、以下の条件またはこれらと同等の条件を包含する：高緊縮性：0.1 x SSPEまたはSSC、0.1%SDS、65℃；中等度緊縮性：0.2 x SSPEまたはSSC、0.1%SDS、50℃；および低緊縮性：1.0 x SSPEまたはSSC、0.1%SDS、50℃。当業者に知られるように、ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変化は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程に用いる時間、温度および/または溶液の濃度を変えることで達成でき、好適な条件は、使用するプローブおよびブロッティングされるプロバンド核酸試料の特定のヌクレオチド配列にも一部依存し得る。
【００７６】
したがって、過度の実験を行うことなく適切な緊縮条件を容易に選択でき、1またはそれ以上のあるプロバンド配列とハイブリダイズするがある別のプロバンド配列とはハイブリダイズしない能力に基づき、該プローブの望ましい選択性を同定できるということが理解できるであろう。
【００７７】
本明細書中使用する、好ましい「緊縮条件」とは一般に、配列間に少なくとも約90-95%、または少なくとも約97%の一致がある場合にのみ起こるハイブリダイゼーションを指す。例えば本明細書で言及するプレプチン-、プレプチン類縁体-、および/またはプレプチンアゴニスト-コード化核酸とハイブリダイズする核酸コンストラクトは、好ましい態様では、例えばcDNAによりコードされているプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードしている。
【００７８】
本明細書中ポリヌクレオチドとも呼称する、本発明にかかる核酸は、RNA、例えばmRNAの形態、またはDNAの形態（このDNAは、cDNA（「相補的DNA」とも呼ばれ、特定のメッセンジャーRNAに相補的なDNA分子である）、ゲノムDNA、および合成DNAを包含する）をとる。このDNAは二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖の場合それはコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってよい。本発明で使用するプレプチンをコードしているコード配列は、例えば当分野で既知のもしくは本明細書に記載のコード配列と同一の部分を含むこともあれば、遺伝コードの重複性または縮重の結果、プレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストポリペプチドの全体もしくは一部を包含する同じコンストラクトまたはその一部をコードしている、異なったコード配列であることもある。
【００７９】
本発明にかかる使用のための本発明において有用なコンストラクトをコードしている核酸は、プレプチンのコード配列を包含していさえすればよいが、これに限定される訳ではない。プレプチンを「コードしている核酸」または「コードしているポリヌクレオチド」という語は、例えばプレプチンポリペプチドのコード配列のみを包含する核酸、および、さらなるコード配列および/または非コード配列を包含する核酸を包含する。
【００８０】
本明細書に記載のように使用のための核酸およびオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の任意の方法によって合成できる（例えば、WO93/01286、米国出願第07/723454号；米国特許第5218088号；米国特許第5175269号；米国特許第5109124号を参照されたい）。種々のオリゴヌクレオチドおよび核酸配列の同定もまた当分野で知られる方法を含んでいる。例えば、クローニングに役立つオリゴヌクレオチドの望ましい性質、長さおよびその他の特性はよく知られている。ある態様では、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、スルホン、スルファート、ケチル、ホスホロジチオアート、ホスホロアミダート、リン酸エステルのような結合およびアンチセンス適用に有用であることが分かっているその他の結合を含むことにより、宿主の内因性核酸分解酵素による分解に抵抗する合成オリゴヌクレオチドおよび核酸配列を設計することができる。
【００８１】
例えば、Agrwal et al., Tetrahedron Lett. 28:3539-3542(1987)；Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665(1971) ；Stec et al., Tetrahedron Lett. 26:2191-2194(1985)；Moody et al., Nucl. Acids Res. 12:4769-4782(1989) ；Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989) ；Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143(1984) ；Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402(1985)；Eckstein, Trends Biol. Sci. 14:97-100(1989) ；「Stein In: オリゴデオキシヌクレオチド 遺伝子発現のアンチセンス阻害剤」, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp.97-117(1989)；Jager et al., Biochemistry 27:7237-7246(1988)。
【００８２】
本明細書中使用する「除去」とは、当業者が理解するその一般的意義を有し、例えば本明細書に記載の末端切除分子の場合のように、対応する完全長分子と比較して、末端または非末端領域のいずれかから1またはそれ以上の配列部分を喪失している分子を指すことができる。核酸分子またはポリペプチドのような直線状の生物学的ポリマーである末端切除分子は、該分子のいずれかの末端からの1またはそれ以上の除去、および/または該分子の末端以外の領域からの1またはそれ以上の除去を有し得る。
【００８３】
本発明はさらに、本発明にかかるコンストラクト、例えばプレプチンポリペプチドのフラグメント、類縁体および/または誘導体をコードしている本明細書に記載の核酸の変異体に関するものである。本発明にかかるコンストラクトをコードしている核酸の変異体は、天然に存在する、そこに含まれる核酸配列の1またはそれ以上の部分の天然型アレル変異体であってよく、または、例えば配列を変化させるための当分野で知られる方法を用いる分子工学によって変化させた配列を包含する、そのような配列または部分または配列の、非天然型変異体であってもよい。当分野で知られるように、アレル変異体は、1またはそれ以上のヌクレオチドの置換、除去または付加のうち少なくとも1個を有し得、そのいずれもが、例えばコードされているプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストの機能を実質的にまたは不適当に変化させない、核酸配列の代替型である。
【００８４】
本発明にかかるコンストラクト、例えばプレプチン蛋白の変異体および誘導体は、例えばプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストポリペプチドまたはその一部をコードしているヌクレオチド配列の突然変異によって取得できる。天然アミノ酸配列の変更は、幾つかの常法のうちいずれかによって達成できる。例えば、天然配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限酵素部位に隣接する突然変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異を特定座位に導入することができる。ライゲーションの後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または除去を有する類縁体をコードしている。
【００８５】
別法として、例えばオリゴヌクレオチド指定位置特異的突然変異誘発法を使用して、前もって決められたコドンが置換、除去または挿入により変更されている変化した遺伝子を得ることができる。このような変化を作り出す方法の例は、Walder et al., 1986 Gene 42:133；Bauer et al., 1985 Gene 37:73；Graik, January 1985 BioTechniques 12-19；Smith et al., January 1985 「遺伝子工学:生物工学の原理と方法12-19」；Costa GL, et al., 「高速PCR型方法を用いる位置指定突然変異誘発法」, 1996 Methods Mol Biol. 57:239-48；Rashtchian A., 「ポリメラーゼ連鎖反応を用いて遺伝子をクローニング及び設計するための新規な方法」, 1995 Curr Opin Biotechnol. 6(1):30-6；Sharon J, et al., 「抗体混合位置のオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発法（Oligonucleotide-directed mutagenesis of antibody combining sites）」, 1993 Int Rev Immunol. 10(2-3):113-27；Kunkel, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488；Kunkel et al., 1987 Methods in Enzymol. 154:367；および米国特許第4518584および4737462号に開示されている。
【００８６】
一例として、DNA鋳型に変化を導入し増幅するプライマーを使用するDNA増幅法、例えば部分重複伸長によるPCRスプライシング（SOE）の使用、と組み合わせた、蛋白をコードしているDNAの位置指定突然変異誘発によって、DNAの修飾が実施できる。位置指定突然変異誘発は、典型的には一本鎖および二本鎖型のファージベクター、例えば周知であり商業的に入手できるM13ファージベクターを用いて実施する。一本鎖ファージ複製起点を含むその他の適当なベクターも使用できる。例えば、Veira et al., 1987 Meth. Enzymol. 15:3を参照されたい。一般に、位置指定突然変異誘発は、目的とする蛋白をコードしている一本鎖ベクターを製造することによって実施できる（例えば、与えられた結合プレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト蛋白の全体または構成要素部分）。該一本鎖ベクターのDNAに対する相同性領域内に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを該ベクターとアニーリングし、その後DNAポリメラーゼ、例えばE.coli DNAポリメラーゼI（Klenowフラグメント）を添加するが、これは、プライマーとしてこの二本鎖領域を使用し、一方の鎖が変化した配列をコードし、他方が元の配列をコードしているヘテロ二本鎖を生成する。このヘテロ二本鎖を適当な細菌細胞中に導入し、所望の突然変異を含むクローンを選択する。得られた変化したDNA分子を適当な宿主細胞で組換え発現し、修飾された蛋白を生成することができる。
【００８７】
例えば、アミノ酸残基もしくは配列の付加または置換、あるいは生物活性に必要ないまたは求められない末端もしくは内部残基もしくは配列の除去のコードを含む等価なDNAコンストラクトもまた本発明に包含される。
【００８８】
「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」とは、ベクター、例えば発現ベクターを含む細胞、または組換え技術によりその他の態様で操作して目的蛋白を発現するようにさせた細胞である。宿主生物とは、本発明にかかるコンストラクト、例えば本発明にかかる組換えコンストラクトによりコードされているプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストの組換え産生を起こすことのできる生物、例えば、細菌（例えばE.coli）、酵母（例えばSaccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastoris）、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を包含し、in vitroおよびin vivo発現を包含する。したがって宿主生物は、組み立て、繁殖、発現または本明細書で提供する組成物の産生におけるその他の工程のための生物を包含できる。宿主は、本明細書に記載のように、その中で免疫反応が起こる対象を包含する。グリコシル化蛋白を産生する、本発明にかかるコンストラクトの産生のために現在好ましい宿主生物は、グリコシル化蛋白の発現と回収を可能にする哺乳動物細胞またはその他の細胞系である。その他のセルラインは近交系マウスの系統およびマウスセルライン、およびヒトの細胞およびセルラインを包含する。
【００８９】
本発明で使用する所望のコンストラクトをコードしているDNAコンストラクトを、適当な宿主で発現させるため、ベクター、例えばプラスミド中に導入する。好ましい態様では、宿主は哺乳動物宿主、例えば哺乳動物セルラインである。配列は好ましくは特定宿主における発現のためにコドンが最適化されている。したがって、例えばあるコンストラクトがヒトプレプチンまたはプレプチン類縁体または誘導体またはアゴニストであって細菌中で発現される場合、そのコドンを細菌での使用のために最適化することができる。小さなコード領域のためには、その遺伝子を単一オリゴヌクレオチドとして合成できる。より大きな蛋白のためには、複数のオリゴヌクレオチドのスプライシング、突然変異誘発、または当業者に既知のその他の技術を利用できる。プロモーターおよびオペレーターといった調節領域である、プラスミドまたはその他のベクター中のヌクレオチド配列は、転写のために相互に機能的に結びついている。所望蛋白をコードしているヌクレオチド配列は、分泌シグナルをコードしているDNAをも包含でき、それにより生成するペプチドは前駆体蛋白である。生成したプロセシングを受けた蛋白は、周辺腔または発酵培地から回収できる。
【００９０】
好ましい態様では、DNAプラスミドは転写ターミネーター配列をも包含する。本明細書中使用する「転写ターミネーター領域」とは、転写終結のシグナルを伝達する配列である。完全な転写ターミネーターは蛋白コード遺伝子から取得でき、それは挿入された遺伝子またはプロモーターの起源と同じであっても異なっていてもよい。転写ターミネーターは本明細書に記載の発現系の任意成分であるが、好ましい態様で使用される。
【００９１】
本明細書で使用するプラスミドまたはその他のベクターは、目的とする蛋白またはポリペプチドをコードしているDNAと機能的に結びついたプロモーターを包含し、そのプラスミドの望ましい用途に応じて（例えば遺伝子治療）、上に記載のような好適な宿主（例えば、細菌、マウス、またはヒト）中で蛋白を発現するよう設計されている。本明細書に記載の蛋白およびポリペプチドの発現に適したプロモーターは広く取得可能であり、当分野で周知である。調節領域に連結した誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターが好ましい。かかるプロモーターは、例えばE.coli由来のT7ファージプロモーターおよびその他のT7様ファージプロモーター、例えばT3、T5およびSP6プロモーター、trp、lpp、およびlacプロモーター、例えばlacUV5；バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のP10またはポリヘドリン遺伝子プロモーター（例えば米国特許第5243041、5242687、5266317、4745051、および5169784号を参照されたい）ならびにその他の真核生物発現系由来の誘導的プロモーターを包含するが、これらに限定される訳ではない。蛋白の発現のためにこのようなプロモーターを、lacオペロンのような制御領域と機能的に連結させてプラスミド中に挿入する。
【００９２】
好ましいプロモーター領域は、例えば哺乳動物細胞において誘導的且つ機能的であるプロモーター領域である。細菌発現にとって好適な誘導的プロモーターおよびプロモーター領域の例は、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドに応答性のE.coli lacオペレーター（IPTG；Nakamura et al., 1979 Cell 18:1109-1117を参照されたい）；重金属（例えば亜鉛）誘導に応答性のメタロチオネインプロモーター金属調節要素（例えば、米国特許第4870009号を参照されたい）；IPTGに応答性のファージT7 lacプロモーター（例えば、米国特許第4952496号；およびStudier et al., 1990 Meth. Enzymol. 185:60-89）およびTACプロモーターを包含するが、これらに限定される訳ではない。使用する発現宿主系に応じて、場合によりプラスミドは、その宿主において機能する選択マーカー遺伝子または遺伝子群を包含してよい。したがって、例えば選択マーカー遺伝子は、形質転換された細菌細胞が同定され、大多数の非形質転換細胞の中で選択的に成長することのできる表現型を細菌に付与する任意の遺伝子を包含する。細菌宿主のための好適な選択マーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性遺伝子（Ampr）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Tcr）およびカナマイシン耐性遺伝子（Kanr）を包含する。細菌発現のためにはカナマイシン耐性遺伝子が現在好ましい。
【００９３】
種々の発現系において、プラスミドまたはその他のベクターは、機能的に連結した蛋白の分泌のためのシグナルをコードしているDNAをも包含してよい。使用のために好適な分泌シグナルは広く取得可能であり、当分野で周知である。E.coliにおいて機能する原核および真核生物の分泌シグナルが利用できる。発現系に応じて、現在好ましい分泌シグナルは、以下のE.coli遺伝子がコードしているものを包含できるが、これらに限定されない：ompA、ompT、ompF、ompC、β-ラクタマーゼ、およびアルカリホスファターゼ等（von Heijne, J. Mol. Biol 184:99-105, 1985）。さらに、細菌pelB遺伝子分泌シグナル（Lei et al., J. Bacteriol. 169:4379, 1987）、phoA分泌シグナル、および昆虫細胞で機能するcek2が利用できる。ある発現系のために最も好ましい分泌シグナルはE.coli ompA分泌シグナルである。当業者に既知のその他の原核および真核生物分泌シグナルもまた利用できる（例えば、von Heijne, J. Mol. Biol 184:99-105, 1985を参照されたい）。本明細書に記載の方法を用いて、当業者は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞のいずれかで機能してそれらの細胞から蛋白を分泌させる分泌シグナルに置換することができる。
【００９４】
E.coliの形質転換のために好ましいプラスミドはpET発現ベクターを包含する（例えば、pET-11a、pET-12a-c、pET-15b；米国特許第4952496号参照；Novagen, Madison, WIから取得可能）。その他の好ましいプラスミドは、pKKプラスミド、特にpKK 223-3を包含し、これはtacプロモーターを含んでいる（Brosius et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6929；Ausubel et al., 「分子生物学の一般的プロトコール」；米国特許第5122463、5173403、5187153、5204254、5212058、5212286、5215907、5220013、5223483、および5229279号）。プラスミドpKKは、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えることにより修飾した（Pharmaciaより入手可能；pUC4Kから取得、例えばVieira et al. (1982 Gene 19:259-268；および米国特許第4719179号を参照されたい）。バキュロウイルスベクター、例えばpBlueBac（pJVETLおよびその誘導体とも呼ばれる）、特にpBlueBac III（例えば米国特許第5278050、5244805、5243041、5242687、5266317、4745051、および5169784号；Invitrogen, San Diegoから入手可能）もまた、昆虫細胞における該ポリペプチドの発現に利用できる。その他のプラスミドは、pIN-IIIompAプラスミド（例えば米国特許第4575013号；Duffaud et al., Meth. Enz. 153:492-507, 1987をも参照されたい）、例えばpIN-IIIompA2を包含する。
【００９５】
別の態様では、1またはそれ以上のDNA分子が細菌細胞で複製される場合、宿主の一例はE.coliである。好ましいDNA分子は、当該DNA分子がその細菌の世代から世代へと確実に維持されるための細菌複製起点をも含むような系である。このようにして、大量のDNA分子が細菌中で複製されることによって産生され得る。このような発現系では、好ましい細菌複製起点はf1-oriおよびcol E1複製起点を包含するが、これらに限定される訳ではない。かかる系のための好ましい宿主は、誘導的プロモーター、例えばlacUVプロモーターと機能的に連結したT7 RNAポリメラーゼをコードしているDNAの染色体コピーを含む（米国特許第4952496号を参照されたい）。このような宿主は、溶原菌E.coli菌株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)およびBL21(DE3)を包含するがこれらに限定されない。菌株BL21(DE3)が好ましい。pLys菌株は、T7 RNAポリメラーゼの天然インヒビターである低レベルのT7ライソザイムを供給する。
【００９６】
提供されるDNA分子はリプレッサー蛋白をコードしている遺伝子をも含み得る。リプレッサー蛋白は、そのリプレッサー蛋白が結合するヌクレオチド配列を含むプロモーターの転写を抑制することができる。このプロモーターは細胞の生理的条件を変えることにより抑制解除することができる。例えば、オペレーターまたは調節蛋白もしくは該DNAのその他の領域と相互作用する能力を阻害する分子を成長培地に添加することによって、または、成長培地の温度を変えることによって、その変化を達成することができる。好ましいリプレッサー蛋白は、IPTG誘導に応答性のE.coli lacIリプレッサー、温度感受性λcI857リプレッサー等を包含するがこれらに限定される訳ではない。E.coli lacIリプレッサーが好ましい。
【００９７】
一般に、本発明にかかる組換えコンストラクトは転写および翻訳に必要な要素をも含む。特に、プレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト蛋白をコードしている核酸配列を含む組換え発現コンストラクトを宿主細胞または生物で発現させようとする場合、そのような要素が好ましい。本発明のある態様では、当該遺伝子をプロモーターの調節下に置くことにより、細胞型優先的または細胞型特異的発現が達成できる。プロモーターの選択は、形質転換される細胞型および所望の調節の程度または種類に依存する。プロモーターは構成的または活性であってよく、さらに、細胞型特異的、組織特異的、個別細胞特異的、事象特異的、時間特異的または誘導的であってよい。細胞型特異的プロモーターおよび事象型特異的プロモーターが好ましい。構成的または非特異的プロモーターの例は、SV40初期プロモーター（米国特許第5118627号）、SV40後期プロモーター（米国特許第5118627号）、CMV初期遺伝子プロモーター（米国特許5168062号）、およびアデノウイルスプロモーターを包含する。ウイルスプロモーターに加えて、細胞プロモーターもまた本発明の状況の範囲内にある。特に、いわゆるハウスキーピング遺伝子のための細胞プロモーターが有用である。一般にウイルスプロモーターは細胞プロモーターより強力なプロモーターであることから、ウイルスプロモーターが好ましい。高等真核生物を包含する多くの真核生物の遺伝子内でプロモーター領域が同定されており、その結果、当業者には、特定の宿主で使用するのに適したプロモーターが容易に選択できる。
【００９８】
誘導的プロモーターもまた使用できる。これらのプロモーターは、デキサメタゾンにより誘導され得るMMTV LTR（PCT WO 91/13160）；重金属により誘導され得るメタロチオネインプロモーター；およびcAMPにより誘導され得るcAMP応答要素を伴うプロモーターを包含する。誘導的プロモーターを使用することにより、プレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト蛋白をコードしている核酸配列を、本発明にかかる発現コンストラクトによって細胞にデリバリーし、インデューサーを添加するまで休止状態にしておくことができる。このことにより、遺伝子産物の産生のタイミングをさらに制御することができる。
【００９９】
事象型特異的プロモーターは、ある事象、例えば腫瘍形成またはウイルス感染の発来時にのみ活性化またはアップレギュレーションされる。HIV LTRは事象特異的プロモーターの良く知られた例である。このプロモーターは、ウイルス感染時に出現するtat遺伝子産物が存在しない限り不活性である。幾つかの事象型プロモーターは組織特異的でもある。
【０１００】
さらに、特定の細胞遺伝子と協同して調節されるプロモーターを使用できる。例えば、本発明にかかる特定のコンストラクト、例えばプレプチン-、プレプチン類縁体-、および/またはプレプチンアゴニスト-コード化遺伝子の発現が、1またはそれ以上のさらなる内因性または外因性導入遺伝子の発現を強調することを望む場合、協同して発現される遺伝子のプロモーターを使用できる。この型のプロモーターは、免疫系の特定組織における免疫反応の誘導に関連する遺伝子発現のパターンが分かっている場合にとりわけ有用であり、その結果、当該組織内の特異的免疫コンピテント細胞が活性化され、またはその他の態様で免疫反応に参加すべく動員される。
【０１０１】
プロモーターに加えて、リプレッサー配列、負のレギュレーター、または組織特異的サイレンサーを挿入して、ある状況、例えば治療戦略の一部として一時的に免疫無防備状態となっている宿主におけるプレプチン-、プレプチン類縁体-、および/またはプレプチンアゴニスト-コード遺伝子の非特異的発現を低下させることができる。複数のリプレッサー要素をプロモーター領域に挿入できる。転写の抑制は、リプレッサー要素の向きやプロモーターからの距離には依存しない。リプレッサー配列の一つの型は絶縁体配列である。かかる配列は転写を阻害し（Dunaway et al., 1997 Mol Cell Biol 17:182-9；Gdula et al., 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93:9378-83, Chan et al., 1996 J Virol 70:5312-28；Scott and Geyer, 1995 EMBO J 14:6258-67；Kalos and Fournier, 1995 Mol Cell Biol 15:198-207；Chung et al., 1993 Cell 74:505-14）、望ましくないバックグラウンド転写を停止させる。
【０１０２】
II型（軟骨）コラーゲン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、アルブミン（Hu et al., 1992 J. Cell Growth Differ. 3(9):577-588）、ホスホグリセラートキナーゼ（PGK-2)(Misuno et al., 1992 Gene 119(2):293-297）の遺伝子のプロモーター領域、および6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ遺伝子にも、リプレッサー要素が同定されている。（Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11(2):1099-1106）。さらに、負の調節要素Tse-1が多数の肝特異的遺伝子中に同定されており、肝細胞における遺伝子活性化のcAMP応答要素（CRE）−仲介誘導をブロックすることが示されている（Boshart et al., 1990 Cell 61(5):905-916）。
【０１０３】
好ましい態様では、所望生成物の発現を増大させる要素をこのコンストラクトに組み込むことができる。このような要素は内部リボソーム結合部位（IRES；Wang and Siddiqui, 1995 Curr. Top. Microbiol Immunol 203:99；Ehrenfeld and Semler, 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203:65；Rees et al., 1996 Biotechniques 20:102；Sugimoto et al., 1994 Biotechnology 12:694）を包含する。IRESは翻訳効率を増大させる。同様に、その他の配列も発現を増強させることがある。幾つかの遺伝子については、特に5'末端にある配列が転写および/または翻訳を阻害する。これらの配列は通常ヘアピン構造を形成できるパリンドロームである。デリバリーしようとする核酸内のこのような配列は一般に除去される。転写または翻訳生成物の発現レベルを検定して、どの配列が発現に影響するかを確証または確認する。転写レベルはノーザンブロットハイブリダイゼーション、RNアーゼプローブ保護等を包含する任意の既知の方法によって検定できる。蛋白レベルはELISA、ウェスタンブロット、免疫細胞学を包含する任意の既知の方法、またはその他の周知の技術によって検定できる。
【０１０４】
本発明にかかるコンストラクト、例えばプレプチン、プレプチン類縁体またはアゴニスト蛋白をコードしている本発明にかかるコンストラクトに、その他の要素を組み込むことができる。好ましい態様では、このコンストラクトは、ポリアデニル化配列を包含する転写ターミネーター配列、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびにエンハンサーを包含する。哺乳動物細胞またはその他の真核細胞における該コンストラクトの発現および維持に役立つその他の要素を組み込むこともできる（例えば、複製起点）。該コンストラクトは細菌細胞で都合良く作製できることから、細菌中での繁殖に必要な、またはそれを増強する要素を組み込む。そのような要素は、複製起点、選択マーカー等を包含する。
【０１０５】
本明細書に記載のように、本発明にかかるコンストラクトを産生または発現させるための宿主細胞は、例えば高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、もしくは下等真核生物細胞、例えば酵母細胞とすることができ、または、宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞とすることができる。本発明にかかる適当な宿主細胞の代表例は、E. coli、Streptomyces、Salmonella typhimuriumのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Drosophila S2およびSpodoptera Sf9のような昆虫細胞；CHO、COSまたは293細胞のような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞、または既にin vitro繁殖に適合している、もしくはde novoでそのように樹立した任意の適当な細胞を包含するが、これらに限定する必要はない。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の技量範囲内にあると考えられる。種々の哺乳動物細胞培養系もまた組換え蛋白の発現に利用できる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman, 1981 Cell 23:175に記載のサル腎臓線維芽細胞のCOS-7系、および適合性ベクターを発現できるその他のセルライン、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHKセルラインを包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに5'近傍非転写配列を含むであろう。SV40スプライスから誘導したDNA配列およびポリアデニル化部位を使用して必要な非転写遺伝要素を提供できる。
【０１０６】
宿主細胞へのこのコンストラクトの導入は、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、または電気穿孔を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当業者が熟知している種々の方法で実施できる（Davis et al., 1986 Basic Methods in Molecular Biology）。
【０１０７】
本発明はさらに、ベクター、本発明にかかる核酸を包含する既知ベクターから製造するコンストラクト、および特に、種々の既知コンストラクトを包含する「組換え発現コンストラクト」（例えば、本明細書に記載の本発明にかかるプレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニストをコードしている任意の核酸を包含する、遺伝子治療に有用なデリバリーコンストラクトを包含する）；本発明にかかるベクターおよび/またはその他のコンストラクトによって遺伝学的に作り替えられた宿主細胞、ならびに、組換え技術により、例えば本発明にかかるプレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニストをコードしている核酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む発現またはその他のコンストラクトを投与する方法に関するものである。
【０１０８】
本発明にかかる様々なコンストラクトを、そのコンストラクトの性質（例えば、上記のようなプロモーターの種類）および所望の宿主細胞の性質（例えば、分裂後期で最終分化しているのか活発に分裂しているのか；例えば、発現コンストラクトが宿主細胞中にエピソームとして存在するのか宿主細胞ゲノム中に統合されているのか）に応じて、適当なプロモーターの制御下で、遺伝子治療に使用する場合のin vivo宿主細胞を包含する、こと実上任意の宿主細胞で発現させることができる。原核および真核生物宿主と共に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターが、例えば、Sambrook, et al., 「分子クローニング: 研究室マニュアル」, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989）に記載されており；本明細書に記載のように、本発明の特に好ましい態様では、本発明にかかる組換え発現コンストラクトでトランスフェクトまたは形質転換された哺乳動物細胞で、組換え発現を実施する。
【０１０９】
さらに、例えば、Machida, CA., 「遺伝子治療にためのウィルスベクター: 方法及びプロトコール」；Wolff, JA, 「遺伝子治療：直接遺伝子導入の方法と適用」 (Birkhauser 1994)；Stein, U and Walther, W (eds. P, 「癌の遺伝子治療：方法及びプロトコール」 (Humana Press 2000)；Robbins, PD(ed.), 「遺伝子治療プロトコール」 (Humana Press 1997)；Morgan, JR(ed.), 「遺伝子治療プロトコール」 (Humana Press 2002)；Meager, A(ed.), 「遺伝子治療技術、適用と規則:研究室から臨床へ」 (John Wiley & Sons Inc. 1999)；MacHida, CA and Constant, JG, 「遺伝子治療のためのウィルスベクター: 方法とプロトコール」 (Humana Press 2002)；「遺伝的代謝疾患のための遺伝子治療の新規な方法 NIHガイド」, Volume 22, Number 35, October 1, 1993を参照されたい。
【０１１０】
また、米国特許第6384210号（「生体高分子合成のための溶媒、溶媒微飛沫及び使用方法」）；6384202（「細胞サイクルによって調節される細胞特異的活性化合物」)；6384018（「ポリヌクレオチド結核ワクチン」)；6383814（「治療分子の分子内デリバリーのためのカチオン性両親媒性物質」）；6383811（「ポリイオンを細胞にデリバリーするための多両性電解質」）；6383795（「アデノウィルスの効率的な精製」）；6383794（「高力価組換えアデノ関連ウィルス産生方法」）；6383785（「自己増大、薬理学的に制御可能な発現系」）；6383753（「酵母哺乳類の細胞増殖レギュレーター」）；6383746（「CCR5のための機能性プロモーター」）；6383743（「遺伝子発現の連続解析のための方法」）；6383738（「ヘルペス・シンプレックス・ウィルスORF Pは、ウィルス蛋白合成のリプレッサーである」）；6383737（「ヒト オキサリル-CoAデカルボキシラーゼ」）；6383733（「癌の治療のための薬理活性化合物のスクリーニング方法」）；6383522（「抗新生物及びサメの軟骨抽出物を含む低毒性組成物」）；6383512（「水疱性複合体、及び当該複合体を製造し使用する方法」）；6383481（「造血幹細胞の移植方法」）；6383478（「脈管形成を促進するポリマー性カプセル化システム」）；6383138（「被検体の経皮的なサンプリング方法」）；6380382（「診断、予防、治療及び他の用途を有する遺伝子コード蛋白」）；6380371（「エンドグリカン: セレクチンリガンド及びケモカイン表示活性を有する新規蛋白」）；6380369（「ヒトDNAミスマッチリペア蛋白」）；6380362（「ポリヌクレオド、ポリヌクレオチドによって発現されるポリペプチド及びそれらの用途」）；380170（「構造遺伝子の発現によって調節される細胞サイクルのための核酸コンストラクト」）；6380169（「オリゴヌクレオチド開裂化合物を含む金属複合体及び治療」）；6379967（「ウィルスベクターとしてのヘルペスウィルス・サイミリ（saimiri））；6379966（「非ウィルス性核酸プロテアーゼ蛋白の血管内デリバリー及びその用途」）を包含する、ワクチンを含む遺伝子治療に関する最近の米国特許をも参照されたい。
【０１１１】
典型的には、例えば発現コンストラクトはプラスミドベクターから誘導する。一つの好ましいコンストラクトは改変pNASSベクター（Clontech, Palo Alto, CA）であり、これはアンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびT7プロモーター部位をコードしている核酸配列を有する。その他の好適な哺乳動物発現ベクターも良く知られている（例えば、Ausubel et al., 1995；Sambrook et al., 上記；さらに、Invitrogen, San Diego, CA；Novagen, Madison, WI；Pharmacia, Piscataway, NJ；およびその他のカタログをも参照されたい）。目下、好適な調節制御下でプレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニストの産生レベルの増強を促進する（このレベルは好適な選択剤（例えばメソトレキサート）適用後の遺伝子増幅から導かれる）ための、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）コード配列を含む、好ましいコンストラクトを製造することができる。
【０１１２】
一般に組換え発現ベクターは、上記のように、宿主細胞の形質転換をさせる複製起点と選択マーカー、および下流の構造配列の転写を指令する、高度発現遺伝子から誘導したプロモーターを含む。このヘテロローガスな構造配列を、適当な相で翻訳開始および終結配列と共に組み立てる。したがって、例えば本明細書に記載のコード核酸によるプレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニストが、宿主細胞中でプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストポリペプチドを発現するための組換え発現コンストラクトとして、様々な発現ベクターコンストラクトのいずれか一つに含まれ得る。ある好ましい態様では、このコンストラクトがin vivo投与される製剤中に含まれる。そのようなベクターとコンストラクトは、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えばSV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；酵母プラスミド；プラスミドとファージDNA、ウイルスDNA、例えば下に記載のようなワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病、または複製欠損性レトロウイルスの組み合わせから誘導したベクターを包含する。しかしながら、その他任意のベクターを、組換え発現コンストラクトの製造に使用でき、好ましい態様では、そのようなベクターは宿主内で複製可能且つ生存可能である。
【０１１３】
好適なDNA配列を、例えば様々な方法によってベクター中に挿入することができる。一般にDNA配列は、当分野で既知の方法により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。クローニング、DNA単離、増幅および精製、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応の標準技術、ならびに様々な分離技術が当業者に知られ、一般的に使用されている。幾つかの標準技術が、例えばAusubel et al.（1993 「分子生物学の一般的プロトコール」, Greene publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA）；Sambrook et al. (1989 「分子クローニング」, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY）；Maniatis et al. (1982 「分子クローニング」, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY）；Glover (Ed.)(1985 「DNAクローニング」 Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK）；Hames and Higgins (Eds.), (1985 「核酸ハイブリダイゼーション」, IRL Press, Oxford, UK）；他に記載されている。
【０１１４】
発現ベクター内のDNA配列は、mRNA合成を指令するために、少なくとも1個の好適な発現調節配列（例えば、構成的プロモーターまたは調節性プロモーター）と機能的に連結している。このような発現調節配列の代表例は、上記のような真核細胞またはそれらのウイルスのプロモーターを包含する。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有するその他のベクターを用いて任意の所望遺伝子から選択することができる。真核生物プロモーターは、CMV即時初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iを包含する。適切なベクターとプロモーターの選択は、充分に当分野における通常の技術のレベル内にあり、プレプチン、プレプチン類縁体、およびプレプチンアゴニストポリペプチドをコードしている核酸と機能的に連結した少なくとも1個のプロモーターまたは調節性プロモーターを含むある特に好ましい組換え発現コンストラクトの製造を本明細書に記載する。
【０１１５】
高等真核生物による本発明に包含される蛋白およびポリペプチドをコードしているDNAの転写は、そのベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大させることができる。エンハンサーとは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常約10ないし300bpのDNAのシス作動エレメントである。例として、複製起点の後期側のbp100ないし270のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。
【０１１６】
遺伝子治療は、遺伝的材料を使用して、疾患を治療することである。これは、欠陥遺伝子を置き換える、または細胞および/または組織に新たな遺伝子を付加する戦略を含み、癌の治療、代謝異常の是正、および免疫療法の分野における適用のために開発されつつある。本発明にかかる遺伝子治療は、本明細書に記載の疾患、異常、および/または症状の治療のための、別個の担体またはデリバリー媒質またはコンストラクトを伴うあるいは伴わない、本発明にかかる種々のコンストラクトの使用を包含する。
【０１１７】
In vivo遺伝子治療は、患者またはヒトの疾患の動物モデル中に遺伝材料を直接注射することを含む。例えば糖尿病の治療を目的とする治療のような組織特異的in vivo治療では、局所遺伝子デリバリーおよび/または発現/ターゲッティング系が好ましい。特定組織を標的とする多様な遺伝子治療ベクターが設計されており、例えばカテーテル型技術を用いる、物理的に特定組織にターゲッティングするための方法が開発されており、これらは全て本発明が企図するものである。
遺伝子治療に対するex vivo生体外アプローチもまた本発明で企図されており、患者自身の細胞の除去、遺伝子修飾、拡張および再投与を包含する。例として、糖尿病治療のためのβ細胞移植または前駆細胞の遺伝的修飾がある。
【０１１８】
有用な遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクター、およびレトロウイルスベクターを包含する。遺伝子治療はさらに、「裸のDNA」、リポソームに基づくデリバリー、脂質に基づくデリバリー（正に荷電した脂質に結合したDNAを包含する）、および電気穿孔を用いて実施することもできる。
【０１１９】
本明細書に記載するように、遺伝子治療の態様を包含する（但しこれに限定されない）ある態様では、ベクターはレトロウイルスベクターのようなウィルスベクターとすることができる。Miller et al., 1989 BioTechniques 7:980；Coffin and Varnus, 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY。例えば、そこからレトロウイルスプラスミドベクターが誘導されるレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１２０】
ウィルスベクターでの使用に好適なプロモーターは一般に、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMiller, et al., 1989 Biotechniques 7:980-990に記載のヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、細胞性プロモーター、例えば、ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを包含する（但しこれらに限定されない）真核生物細胞性プロモーター）を包含できるが、これらに限定される訳ではない。利用できるその他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は本明細書に記載の教示から当業者には自明であり、調節性プロモーターまたは上記のようなプロモーターのいずれかから選択することができる。
【０１２１】
本明細書に記載のものと同じものをコードしている1またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む本発明にかかるコンストラクトまたは組成物（例えば、とりわけ遺伝子治療のために、宿主細胞においてin vivo またはin vitroでプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト蛋白の発現をさせる条件下で、且つそれに充分な時間投与される）は、周知の方法に従って投与のための医薬組成物に製剤化できる。医薬組成物は、一般に、1またはそれ以上の組換え発現コンストラクト、および/またはかかるコンストラクトの発現生成物を、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む。このような担体は、使用する用量および濃度において受容者にとって非毒性である。
【０１２２】
核酸を基礎とする製剤、または本発明にかかる組換えコンストラクトの発現生成物を含む製剤については、約0.01μg/kg〜約100mg/kg(体重）を、例えば典型的には皮内、皮下、筋肉内もしくは静脈内の経路、またはその他の経路によって投与する。好ましい用量は、例えば約1μg/kg〜約1mg/kgであり、約5μg/k〜約200μg/kgが特に好ましい。投与の回数と頻度は宿主の反応に依存することが、当業者には明らかであろう。
【０１２３】
治療用途のための「薬学的に許容される担体」は薬学技術において周知であり、例えばRemingtonの「薬学」, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。例えば、生理的pHの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝化食塩水が使用できる。保存料、安定剤、色素および香料でさえこの医薬組成物に配合することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルを保存料として添加することができる。同書、1449。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤も使用できる。同書。
【０１２４】
合成したペプチドをアフィニティカラムクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーのような方法でさらに精製できる。NMR（13C、1H、19Fまたは31P）およびIRを包含する標準的物理化学的特性決定技術は当分野で知られており、これらにより、その合成品の実体と純度の確実な証拠を得ることができる。そのペプチドのアミノ酸組成を確認するため、アミノ酸分析もまた使用できる。合成品の分子量を確認するため、質量分析を使用できる。
【０１２５】
例えば脂肪酸誘導体化により、またはグリコシル化により、またはモノメトキシポリエチレングリコール（PEG）および/または燐脂質（PEG-脂質コンジュゲートを包含する）とコンジュゲートさせることにより、誘導体を製造できる。PEG例の分子量は2000および5000であるが、600ないし12000の範囲のPEGを包含する（但し、これらに限定されない）他のPEGを使用することもできる。誘導体の脂質部分は、例えば飽和または不飽和PEG、コレステロール、短鎖（C8）セラミド、中間鎖（C14）および長鎖（C20）脂肪酸アミドを有するセラミド等を包含する。
【０１２６】
プレプチンならびにプレプチン類縁体およびアゴニスト、ならびにその塩および誘導体は、機能を亢進させ、そして/または半減期を延長するために、二量体またはより大きな凝集物として製造することもできる。
【０１２７】
プレプチンアゴニストをNIH-3T3細胞、またはその他の同様な細胞、または例えばINS-IE β細胞を包含するβ細胞の増殖を刺激する能力についてin vitroで試験することができる。下記の具体例を参照されたい。当分野の方法により、in vivoスクリーニングを実施することもできる。例えば、Burks and White(2001) Diabetes 50 Suppl 1:S140-5；Flier et al.(2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(13):7475-80；Guiot et al.(2001) Diabetes 50 Suppl 1:S188；Kjems et al.(2001) Diabetes 50(9):2001-2012；Moore et al. (2001) Diabetes 50(10):2331-6を参照されたい。
【０１２８】
本発明が提供する配列情報を用いて、様々な方法を使用して任意の種からプレプチンの変異体を取得できる。このような方法は例えば、cDNAライブラリーのスクリーニング、RT-PCR、ゲノムライブラリーのスクリーニング、ならびにEST、cDNA、およびゲノムデータベースのコンピューター支援検索を包含するが、これらに限定される訳ではない。このような方法は当業者に周知である（例えば、www.MolecularCloning.com；「分子生物学の一般的プロトコール」, John Wiley and Sons, Incを参照されたい）。例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニングは、一般にオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーを用いて実施する。
【０１２９】
本明細書に記載の種のいずれかから誘導するプレプチンの配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーを合成し、それを、ハイブリダイゼーションまたはPCR技術によって他の生物由来のcDNAまたはゲノムDNAライブラリー中に陽性クローンを同定するために利用できる。陽性クローンとは、所望の緊縮性を持つハイブリダイゼーション条件の下で、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとハイブリダイズするプレプチンの配列に対して充分な類似性を示すクローンである。
【０１３０】
プローブおよび/またはプライマーは、少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、そして最も好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド長でなければならない。かかるオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーと共に使用するのに適したハイブリダイゼーションおよびPCR技術は当分野で周知である。陽性クローンは、制限酵素消化、DNA配列決定等で分析できる。プレプチンコード化ヌクレオチド配列を含むと同定されたまたは含むと思われるクローンを、当分野で周知の技術を用いて発現させることができる。当分野で周知の技術を用いて適当な宿主細胞中で核酸コード配列を発現させることにより、いかなる種由来のプレプチンをも取得することができる。好適な宿主細胞は原核生物または真核生物またはセルライン、例えば酵母、E.coli、昆虫細胞およびCOS1細胞を包含する。好ましくは、真核生物系を利用してプレプチンを発現させる。本発明にかかる組換え発現ベクターを使用して、プレプチン蛋白を単離するために宿主細胞中でプレプチンを発現させることができる。
【０１３１】
本発明にかかる精製プレプチン蛋白は、一般に、プレプチンをコードしている組換え核酸を宿主細胞中に導入し、その宿主細胞中でその蛋白を発現させ、単離精製することを含む、当分野で周知の方法によって製造できる。好ましくは、組換え核酸は組換え発現ベクターである。蛋白を発現している宿主細胞からその蛋白を単離し、硫酸アンモニウム沈殿化、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等）、電気泳動、および最終的には結晶化を包含する標準法に従ってその蛋白を精製できる（一般的には、「酵素精製と関連する技術」, (1971) Methods in Enzymology, 22:233-577。引用により本明細書の一部とする）。
【０１３２】
「β細胞成長」とは、β細胞数の増加および/またはβ細胞質量の増大と定義する。
「β細胞質量」という語はβ細胞の質量および/または重量を指す。
「β細胞増殖」という語は、β細胞数の増加を指す。
「β細胞またはβ細胞質量の減少または無防備状態」とは、全体として、または部分的に、正常または望ましい身体機能にとって正常以下のまたは不充分なβ細胞および/またはβ細胞質量を特徴とする状態を包含する。
【０１３３】
本明細書中使用する「対象」という語は、ヒト、家畜化された動物（または獣医が診察しそうなその他の動物）を包含する哺乳動物、ならびに馬、牛、豚、羊、鳥等を包含する（但しこれらに限定されない）商業的動物を指すが、これらに限定される訳ではない。
【０１３４】
「治療する」という語は、1またはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、プレプチンアゴニスト、およびそれらいずれかの塩および/または誘導体の有効量またはその他の所望量を含む組成物を対象に適用または投与することとして定義する。
【０１３５】
該対象は、例えばβ細胞の質量、数もしくは機能の喪失、β細胞の質量、数もしくは機能の喪失症状、β細胞の質量、数もしくは機能の喪失に続発する疾患もしくは異常、またはβ細胞の質量、数もしくは機能の喪失の素因があるか、またはあると判定されているかも知れず、β細胞の質量、数もしくは機能の喪失、β細胞の質量、数もしくは機能の喪失症状、β細胞の質量、数もしくは機能の喪失に続発する疾患もしくは異常、またはβ細胞の質量、数もしくは機能の喪失の素因を治癒し、軽減し、緩和し、矯正し、または改善することを目的とする。
【０１３６】
「有効量」とは、治療される対象に治療効果またはその他の望ましい効果、例えばβ細胞の質量、数もしくは機能に及ぼす効果を付与する、プレプチン、プレプチン類縁体、もしくはプレプチンアゴニストの量を指す。治療効果もしくはその他の望ましい効果は、客観的（即ち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能な）であっても主観的（即ち、対象が効果を指摘または感じる）であってもよい。上記のプレプチン、プレプチン類縁体、もしくはプレプチンアゴニストまたはそれらいずれかの塩もしくは誘導体の有効量は、約10〜約40μg/Kg(体重）から約200〜約500μg/Kg(体重)から約600〜約1000μg/Kg(体重）の範囲であってよい。有効用量は、投与経路、ならびに（例に過ぎないが）グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、成長ホルモン（GH）、グルコース依存インスリン向性ポリペプチド（GIP）肝細胞成長因子（HGF）、PTH関連蛋白（PTHrP）、β−セルリン、胎盤ラクトゲン（PL）および島新生関連蛋白（INGAP）といった化合物を使用して、例えばβ細胞増殖を刺激、またはβ細胞質量を増加させるのに有用なその他の物質を併用する可能性によって変化することがある。
【０１３７】
2個のアミノ酸配列の「一致パーセント」は、Karlin and Altschul(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載のように改変したKarlin and Altschul(1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムを用いて決定できる。このようなアルゴリズムをAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）中に組み込む。XBLASTプログラム、評点=50、語長=3でBLAST蛋白検索を実施して、本明細書に記載のペプチド分子に相同的なアミノ酸配列を取得できる。2個の配列間にギャップが存在する場合は、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のようにGapped BLASTを利用できる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を使用できる。
【０１３８】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が化学的に類似のまたは誘導体化された側鎖を有する別の残基に置き換わっている置換である。例えば類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーには、例えば、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸がある。アミノ酸類縁体（例えば、リン酸化アミノ酸）もまた本発明において企図されており、D-アミノ酸、βアミノ酸、および？アミノ酸を包含する（但し、これらに限定されない）非天然アミノ酸で置換されているペプチドもまた同様である。
【０１３９】
本明細書中使用される「単離された」という語は、天然に存在する材料の場合、その材料が天然もしくは元の環境から分離され、またはもはや天然もしくは元の環境に随伴していないことを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然の蛋白またはポリペプチドは単離されていないが、天然系に共存している材料の幾らかまたは全てから分離されている同じ核酸またはポリペプチドは、単離されている。かかる蛋白またはポリペプチドはある組成物の一部であることもあるが、かかる組成物が天然環境の一部ではないという点で、依然として単離されている。天然に存在しない材料、例えば本発明にかかる組換え製造された蛋白またはポリペプチドの場合、「単離された」という語は、例えば製造中に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料、例えば、所望の程度に精製された蛋白およびペプチドを包含し、当分野で既知の技術により測定した時に、好ましくはそれらは例えば少なくとも約80%純度、より好ましくは少なくとも約90%、そしてさらに好ましくは少なくとも約95%純度である。
【０１４０】
「実質的に精製された」という語は、天然にまたは製造中に付随し得る他の構成成分を、少なくとも約60%含まない、好ましくは少なくとも約75%含まない、そして最も好ましくは少なくとも約90%もしくはそれ以上含まないペプチドを指す。
本明細書中使用する「精製された」とは、完全に純粋である必要はなく、当該蛋白またはその他の物質が、細胞内の天然環境またはその他の環境、例えば製造環境にあるよりも純粋である場合の相対的用語であることを意図している。実際に当該材料を典型的には例えば分画に付して種々のその他の成分を除去したところ、得られた材料は、その望ましい生物活性または生物活性群を実質的に保持していた。
【０１４１】
「真性糖尿病」という語は、β細胞またはβ細胞機能の喪失を含む任意の疾患または症状を指し、本明細書に記載の疾患または状況のうち任意のものを包含する。
「β細胞仲介疾患」とは、その疾患の病理において、全体または何らかの部分にβ細胞が関わっている任意の疾患である。β細胞仲介疾患は、例えば1型または2型糖尿病を包含する。
【０１４２】
本明細書中使用する「プレプチン(群)」、「プレプチン類縁体(群)」、および「プレプチンアゴニスト(群)」は、薬学的に許容される塩または誘導体を包含すると定義し、適当なプレプチン、プレプチン類縁体またはプレプチンアゴニストの混合物を除外するものではない。
【０１４３】
薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機および有機酸および塩基から誘導するものを包含する。適当な酸塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、琥珀酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩を包含する。その他の酸、例えば蓚酸は、自身は薬学的に許容されるものではないが、本発明化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を取得する際の中間体として有用な塩の製造に使用できる。適当な塩基から誘導する塩は、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN-(アルキル)4+塩を包含する。本発明はさらに、本明細書に開示する化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化をも構想するものである。水または油に可溶性または分散性の生成物がこのような四級化によって取得できる。塩酸塩および酢酸塩が好ましい。
【０１４４】
1またはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、もしくはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの塩および/または誘導体の有効量、ならびに薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物もまた本発明の範囲内にある。
【０１４５】
「薬学的に許容される担体」という語は、1またはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、もしくはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの塩および/または誘導体の有効量と共に対象に投与でき、それらの薬理活性を損なわず、且つ当該プレプチン(群)、プレプチン類縁体(群)、および/またはプレプチンアゴニストのデリバリーに十分な用量を投与した時に非毒性である担体（アジュバントまたは媒質）を指す。
【０１４６】
上記の医薬組成物に使用できる薬学的に許容される担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物デリバリーシステム（SEDDS）、例えばd-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシナート、医薬剤型に使用される界面活性剤、例えばツイーン類またはその他の類似ポリマーデリバリーマトリックス、血清蛋白、例えばヒト血清アルブミン、緩衝剤物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、トリ珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース型物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ロウ、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１４７】
α-β-、およびγ-シクロデキストリンのようなシクロデキストリン類、または、2-および3-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン類を包含するヒドロキシアルキルシクロデキストリン類のような化学的に修飾された誘導体、またはその他の可溶化した誘導体もまた、本明細書に記載の式で示される化合物のデリバリーを亢進するために有利に利用できる。
【０１４８】
油の溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは類似の分散剤をも含有することができ、これらは乳濁液および/または懸濁液のような薬学的に許容される剤型の調合に一般的に使用される。
【０１４９】
内部および外部創傷を包含する損傷を治療するための方法、またはβ細胞喪失もしくは機能喪失を治療するための方法、またはβ細胞の質量、数、もしくは機能を増大もしくは維持するための方法を実施するために、1もしくはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト、またはそれらいずれかの誘導体の塩を対象に投与できる。プレプチン、プレプチン類縁体、またはプレプチンアゴニスト、塩または誘導体は、他の薬物と組み合わせて、そして/または適当な賦形剤と共に、例えば生理食塩水のような薬学的に許容される担体に入れて投与できる。これは例えば注射（例えば静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内、または皮下）、経口、頬腔、鼻内、経粘膜、局所、眼内製剤、吸入、頭蓋内注射または注入技術によって投与できる。本明細書に記載の方法は、所望のまたは記載した効果を達成するために化合物または化合物の組成物の有効量を投与することを企図するものである。上記の用量より低いまたは高い用量が望ましい、または必要であることもある。特定の対象のための個別的用量および治療計画は、当分野で理解できるように、無論、使用する個別化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、食餌、投与時間、排泄速度、薬物併用、疾患、症状または症候の重篤度および経過、該疾患、症状または症候に対する対象の素因等を包含する様々な因子、ならびに治療する医師の判断に依存する。
【０１５０】
経口投与しようとする医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、乳濁液および水性懸濁液、分散液および溶液を包含する（但しこれらに限定されない）任意の許容される経口剤型とすることができる。経口使用用錠剤の場合、一般的に用いられる担体は乳糖およびコーンスターチを包含する。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもまた典型的に添加する。カプセル形態での経口投与のためには、有用な希釈剤は乳糖および乾燥コーンスターチを包含する。水性懸濁液および/または乳濁液を経口投与する場合、活性成分を油相に懸濁または溶解し、これを乳化剤および/または懸濁化剤と合する。所望により何らかの甘味料および/または香料および/または着色料を添加できる。
【０１５１】
非経口投与しようとする医薬組成物は、任意の許容される剤型であってよく、皮下、静脈内、筋肉内、真皮内、intrastemal注射または注入技術といった投与経路のうちいずれか（但しこれらに限定されない）によって投与できる。例えば、滅菌注射用組成物（例えば、水性もしくは油性懸濁液またはその他の調合物）は適当な分散化または湿潤化剤（例えばツイーン80）および懸濁化剤を用いて当分野で既知の技術に従って調合できる。
【０１５２】
所望の治療が局所適用によって容易に到達可能な領域または臓器を含んでいる場合は医薬組成物の局所投与が有用である。皮膚への局所適用のためには、その医薬組成物を、担体に懸濁または溶解した活性成分を含有する適当な軟膏を用いて処方すべきである。本発明にかかる化合物の局所投与のための担体は、鉱油（mineral oil）、鉱油（liquid petroleum）、白色油（white petroleum）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウおよび水を包含するが、これらに限定される訳ではない。あるいは、この医薬組成物は、適当な乳化剤で担体中に懸濁または溶解した活性化合物を含有する適当なローションまたはクリームを用いて処方できる。
好適な担体は、鉱油（mineral oil）、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート60、セチルエステルロウ、セテアリールアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１５３】
本発明にかかる医薬組成物は、直腸用坐剤製剤によって、または適当な浣腸剤で、下部腸管に局所適用することもできる。局所適用する経皮またはその他のパッチもまた本発明に包含される。
【０１５４】
医薬組成物を鼻用エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬調合分野で周知の技術に従って製造し、ベンジルアルコールまたはその他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティーを亢進する吸収促進剤、フルオロカーボン、および/またはその他の当分野で既知の可溶化または分散化剤を使用して、生理食塩水溶液として製造できる。
【０１５５】
軟膏は、例えば (1) 油性基剤、例えば固定油または炭化水素、例えば白色ワセリンもしくは鉱油からなるもの、または (2) 吸収性基剤、例えば無水物または水を吸収できる物質、例えば無水ラノリンからなるもの、のいずれかを用いて製造できる。通例、油性であるか吸収性であるかに拘わらず、基剤を製造した後に活性成分、例えば1またはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニストを所望濃度を与える量で添加する。
【０１５６】
クリームは例えば油/水エマルジョンであってよい。これらは、例えば油相（内相）、典型的には例えば固定油、炭化水素等、例えばロウ、ワセリン、鉱油等、ならびに、水および任意の水溶性物質、例えば塩を含む水相（連続相）からなる。二つの相は、乳化剤、例えば界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム；親水コロイド、例えばアカシアコロイド性粘土、ビーガム等を使用して安定化させることができる。エマルジョン製造に際し、通常、活性成分（1またはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト）を所望濃度を達成する量で添加する。
【０１５７】
ゲルは、油性基剤、水、または本明細書に記載のエマルジョン-サスペンジョン基剤、から選択する基剤を含み得る。基剤中にマトリックスを形成し、その粘度を増大させるゲル化剤を基剤に添加することができる。ゲル化剤の例は、例えばヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマー等を包含する。通常、活性成分（1またはそれ以上のプレプチン、プレプチン類縁体、および/またはプレプチンアゴニスト）は、ある時点、例えばゲル化剤の添加前の時点で所望濃度であるようにその調合物に添加する。
【０１５８】
本発明を以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は例示目的のためにのみ供するものであって、いかなる態様においても本発明を限定すると解してはならないことを理解すべきである。
【実施例】
【０１５９】
実施例1
＜NIH-3T3細胞の増殖の刺激＞
NIH-3T3細胞は、有糸分裂促進性の調査に関する研究を包含する様々な目的のために使用できる。例えば、Buergisser et al. (1990). BiochemBiophys Res Comm 169(3):832-839；Burgisser et al. (1991). J Biol Chem 266(2):1029-33；Yang et al. (1996). Endocrinol 137(7):2766-2773；Geddes et al. (2001). Prot Engin 14(1):61-65を参照されたい。
【０１６０】
NIH-3T3細胞を3 x 104細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに蒔いた。細胞を、高グルコースDMEM（30mM 炭酸水素ナトリウム、2mM L-グルタミン、105 IU/lペニシリン、0.01% 硫酸ストレプトマイシンを添加）および10% 牛胎児血清中で37℃で24時間成長させ、その後これらを高DMEMおよび0.2% BSA中で24時間血清枯渇させた。最終濃度10、50、100および500nMのプレプチン/ウェルとなるようこのウェルにプレプチンを加え、細胞をさらに15時間インキュベートし、その後各ウェルに1μCiの3H-チミジンを添加した。さらに1時間インキュベートした後、培地を吸引し、細胞を、冷PBSで2回、5%TCAで2回、そして100%エタノールで2回洗浄した。次いでプレートを30分間風乾し、その後細胞を0.2M NaOH 200μlで可溶化した。次にこのアルカリ性細胞溶解液を0.2M HCl 200μlで中和し、その後300μlアリコートをStarscintシンチレーション液2mlと混合し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０１６１】
細胞増殖を測定する一つの方法は、細胞分裂の間に新たに合成されたDNAへの標識ヌクレオチド（例えば[3H]-チミジン）の取り込みによるものである。例えば、細胞増殖を定量するための最も良く知られ且つ広く用いられている方法の一つは、トリチル化チミジン（[3H]-チミジン）取り込みの測定である。細胞はこの標識DNA前駆体を新たに合成されたDNA中に取り込み、その結果、液体シンチレーションカウンターによって測定した取り込み量が、細胞増殖の相対的尺度となる。同様に、この実施例では、シンチレーションカウンターから得られる1分あたりのカウント（cpm）の増加が3H-チミジン取り込みの増加を示し、結果として細胞増殖の増大を示す。細胞増殖の結果を図１に示す。
【０１６２】
実施例2
＜INS-1E β細胞の増殖の刺激＞
INS-1E細胞を2 x 105細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに蒔いた。細胞を、改良RPMI-1640（GIBCO R-1383 Lot108H83032；23.8mM 炭酸水素ナトリウム、2mM L-グルタミン、10mM HEPES、50μM β-メルカプトエタノール、1mM ピルビン酸ナトリウム、105 IU/lペニシリン、0.01% 硫酸ストレプトマイシンを添加）および10% 牛胎児血清中で37℃で24時間成長させ、その後これらを改良RPMI-1640中で24時間血清枯渇させた。次にこの無血清培地を、0% 牛胎児血清（負の対照）、10% 牛胎児血清（正の対照）、10nM ラットプレプチン（rPreptin 10nM）、10nM ヒトGLP-1（hGLP-1 10nM）、10nM ヒトIGF-II（hIGF-II 10nM）を含有するRPMI-1640 500μlに交換し、細胞をさらに18時間インキュベートし、その後各ウェルに5μCiの3H-チミジンを添加した。さらに6時間インキュベートした後、培地を吸引し、細胞を、冷PBSで2回、冷5%TCAで1回、そして冷100%エタノールで2回洗浄した。次いでプレートを30分間風乾し、細胞を0.5M NaOH 400μlで可溶化した。次にこのアルカリ性細胞溶解液を0.5M HCl 400μlで中和し、その後500μlアリコートをStarscintシンチレーション液2mlと混合し、シンチレーションカウンターで計数した。シンチレーションカウンターから得られる1分あたりのカウント（cpm）の増加が3H-チミジン取り込みの増加を示し、結果として細胞増殖の増大を示す。細胞増殖の結果を図２に示す。
【０１６３】
本明細書で引用または記載する全ての特許、刊行物、科学記こと、ウェブサイト、ならびにその他の文書および資料は本発明が属する分野における当業者の技術レベルを示しており、そのような引用文書および資料は、引用により、あたかもその全体を個別的に引用して本明細書の一部とし、または本明細書にその全体を開示したかのように、本明細書に組み入れる。出願人は、そのような特許、刊行物、科学記こと、ウェブサイト、電子的に入手し得る情報、ならびにその他の引用資料または文書のいずれかから得た任意且つ全ての資料および情報を、本明細書中に物理的に組み入れる権利を留保するものである。
【０１６４】
本特許の書面による記載部分は全請求項を包含する。さらに、全ての原請求項ならびに任意且つ全ての優先権主張文書由来の全請求項を包含する全ての請求項は、引用によりその全体を本明細書の書面による記載部分の一部とし、また、出願人は、本出願の書面による記載またはその他任意の部分に、任意且つ全てのかかる請求項を物理的に組み入れる権利を留保するものである。したがって例えば、本発明は、請求項の正確な用語が本発明の書面による記載部分にそのまま開示されていないという主張に基づいて、本発明を、申し立てにより書面による請求項の記載が提供されていないと解釈してはならない。
【０１６５】
本請求項は法律に従って解釈する。しかしながら、任意の請求項またはその一部の解釈の、申し立てられもしくは認められた容易性または難解性に拘わらず、この特許に至る出願または出願群の遂行中、請求項もしくはその任意の部分のいかなる調整または補正も、先行技術の一部を形成しない任意且つ全ての等価物に対する権利を喪失したものと解釈してはならない。
【０１６６】
本明細書に開示した全ての特徴は、任意の組み合わせで合することができる。したがって、別途記載の無い限り、開示したそれぞれの特長は、等価または類似の特徴の包括的な一組の一例であるに過ぎない。
【０１６７】
本発明をその詳細な説明に関連して記載してきたが、前記の説明は本発明の例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではなく、本発明の範囲は付記した請求項の範囲によって規定されることを理解すべきである。したがって前記のことから、本発明の具体的態様を例示目的で本明細書に記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の修飾を加え得ることが理解できるであろう。その他の態様、利点、および修飾もまた以下の請求項の範囲内にあり、本発明は付記した請求項による制限を除いては限定されない。
【０１６８】
本明細書に記載の具体的方法および組成物は好ましい態様の代表であり例示的なものであって、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。その他の目的、側面、および態様は、本明細書を考察する時当業者に想起され、請求項の範囲によって規定される本発明の精神の中に包含される。本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に開示する本発明に対して様々な置換および修飾を施せるということが、当業者には直ちに明白であろう。例示的に本明細書に適切に記載した本発明は、本明細書に具体的に本質的であると開示されていない要素もしくは要素群、または制限もしくは制限群の不在下で実施できる。したがって、例えば本明細書中の各例において、本発明の態様または実施例では、「含んでいる」、「包含する」、「内包する」等の語は、拡張的且つ限定無しに読み取られるべきである。例示的に本明細書に適切に記載した方法およびプロセスは、異なる工程順序で実施でき、それらは必ずしも本明細書または請求項で指摘した工程順序に限定される訳ではない。
【０１６９】
使用している用語および表現は、説明の用語として使用するものであって限定の用語として使用するものではなく、そのような用語の使用に際し、示された、そして記載された特徴の等価物またはその一部を排除する意図は無く、特許請求した本発明の範囲内で様々な修飾が可能であると認識される。したがって、本発明を様々な態様および/または好ましい態様および所望による特徴によって具体的に開示してきたが、当業者の実施できる本明細書に開示した概念の任意且つ全ての修飾および変形は、付記した請求項に規定した本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１７０】
本発明をここに広範且つ包括的に記載した。この包括的開示内にある、より狭い種および下位概念群の各々も、本発明の一部を形成する。削除した要素が具体的に本明細書に詳述されているか否かに拘わらず、何らかの内容をその類概念から除去する但し書きまたは負の限定付きで、これは本発明にかかる包括的説明を包含する。
【０１７１】
「含んでいる」または「含む」という語が「包含している」または「包含する」という語をも指すことは理解できるであろう。さらに、本明細書および付記した請求項で使用する単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかにそれに反する旨を記載していない限り、複数表示をも包含し、そして、「Xおよび/またはY」は「X」もしくは「Y」または「X」および「Y」の両者を意味し、そして、名詞に続く「ｓ」という文字はその名詞の複数形と単数形の両方を指す、ということもまた理解できるであろう。加えて、本発明の特徴または側面がMarkush群に関して記載されている場合、当業者は、本発明はMarkush群の任意の個別的成員または該成員の下位群に関しても記載されていることが認識できるであろう。
【０１７２】
その他の態様は以下の請求項の範囲内にある。本特許は本明細書に具体的および/または明確に開示した特定の実施例または態様または方法に限定されるものと解釈してはならない。本発明は、その陳述が具体的でない限り、そして出願人による応答書面で特に採用されている資格または留保無しに、特許商標庁の審査官またはその他任意の職員もしくは従業員によってなされるいかなる陳述によっても制限を受けるものと解してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、NIH-3T3線維芽細胞の増殖に及ぼすプレプチンの用量依存効果を示す（トリチウム化チミジン取り込みによって測定）。
【図２】図２は、INS-1E β細胞の増殖に及ぼすプレプチン、GLP-1およびIGF-IIの効果を比較するものである（トリチウム化チミジン取り込みによって測定）。
【図１】
2006500341.tif 000002
【図２】
2006500341.tif 000003
【国際調査報告】
2006500341.tif 000004
2006500341.tif 000005