(57)【要約】遺伝子変異のデータベースを分析して単一の生物種の株についてのゲノムのハプロタイプマップを作成する。コンピュータによる方法を用いて、ハプロタイプマップ内のハプロタイプブロック上に複雑な表現型を速やかにマッピングする。マウスにおいて3つの異なる生物学的に重要な表現型形質を調節する特定遺伝子座をこれらのシステムおよび方法を用いて同定する。
2006519436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の生物種における複数の異なる生物によって示される表現型と該単一の生物種のゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付ける方法であって、該方法が、
ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点すること、ここで、該採点は表現型データ構造中の変化と該ハプロタイプブロック中の変化との間の相応関係を表し、該表現型データ構造は該複数の異なる生物によって示される該表現型の差を表し、該ハプロタイプマップは複数のハプロタイプブロックを含み、該ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックは該ゲノムの異なる部分を表す；および、
前記ハプロタイプマップ中の前記複数のハプロタイプブロックにおける各ハプロタイプブロックについて前記採点を繰り返すことにより、該複数のハプロタイプブロックにおいて、該複数のハプロタイプブロック中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上のハプロタイプブロックを同定すること、ここで、前記1以上の特定遺伝子座は、同定された前記1以上のハプロタイプブロックによって表される前記ゲノムの前記各異なる部分である；
を含む上記方法。
【請求項２】
前記複数のハプロタイプブロック中のハプロタイプブロックが複数の連続的な一塩基多型を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ハプロタイプブロック中の各一塩基多型が、該ハプロタイプブロック中の別の一塩基多型の閾値距離内にある、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記閾値距離が10メガベース以下である請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記閾値距離が1メガベース以下である請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のハプロタイプブロック中のハプロタイプブロックが複数のハプロタイプを表し、かつ該ハプロタイプブロックによって表されるハプロタイプのカットオフパーセンテージ未満のものが該ハプロタイプブロック中に1度だけ出現する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記カットオフパーセンテージが5％〜30％の範囲内である請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記カットオフパーセンテージが15％〜25％の範囲内である請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が前記採点の前に前記ハプロタイプマップを作成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記作成が、
(i)複数の連続的な一塩基多型を有する候補ハプロタイプブロックを同定すること、ここで、該候補ハプロタイプブロック中の各一塩基多型は該候補ハプロタイプブロック中の別の一塩基多型の閾値距離内にある、
(ii)前記候補ハプロタイプブロックに点数を割付けること、
(iii)前記同定ステップ(i)と前記割付ステップ(ii)とを可能な全ての候補ハプロタイプブロックが同定されるまで繰り返し、それにより、候補ハプロタイプブロックのセットを作成すること、
(iv)ハプロタイプマップのために候補ハプロタイプブロックのセット中で最高点を有する候補ハプロタイプブロックを選択すること、
(v)前記選択した候補ハプロタイプブロックと、該選択した候補ハプロタイプブロックの全てもしくは一部を上乗せした各候補ハプロタイプブロックとを、前記候補ブロックのセットから除去すること、
(vi)前記選択ステップ(iv)と前記除去ステップ(v)とを候補ハプロタイプブロックが前記候補ハプロタイプブロックのセット中に完全に残らなくなるまで繰り返すこと、ここで前記ハプロタイプマップはステップ(iv)の反復において選択された各候補ハプロタイプブロックを含む、
を含む請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記点数が、前記ブロックによって表されるハプロタイプ数の2乗で、前記候補ハプロタイプブロック中の一塩基多型の数を割算したものである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記点数が、ブロックによって表されるハプロタイプ数で、前記候補ハプロタイプブロック中の一塩基多型の数を割算したものである、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハプロタイプブロックの採点が、該ハプロタイプブロックに点数Sを割付けることを含み、ここで、Sは、
【数１】
2006519436.tif 000014
であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハプロタイプブロックの採点が、該ハプロタイプブロックに点数Sを割付けることを含み、ここで、Sは、
【数２】
2006519436.tif 000015
であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハプロタイプブロックの採点が点数Sを割付けることを含み、ここで、Sは比
【数３】
2006519436.tif 000016
の負、逆数、負の逆数、対数もしくは負の対数であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
ΣDintraまたはΣDinterが累乗される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記累乗が1/2、2または10乗である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記ハプロタイプブロックの採点が点数Sを割付けることを含み、ここで、Sは、下記の比
【数４】
2006519436.tif 000017
の負、逆数、負の逆数、対数または負の対数であり、ここで、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和であり、ΣDintraまたはΣDinterが累乗される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記累乗が1/2、2または10乗である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記１以上の特定遺伝子座における特定遺伝子座が0.5メガベース以下の長さを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記1以上の特定遺伝子座における特定遺伝子座が0.5メガベース〜2.0メガベースの長さを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記1以上の特定遺伝子座における特定遺伝子座が10メガベース以下の長さを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記表現型が糖尿病、癌、喘息、統合失調症、関節炎、多発性硬化症、またはリウマチ性疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
前記表現型が自己免疫疾患または遺伝病である請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
前記表現型データ構造がマイクロアレイ発現データである請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
前記単一の生物種が動物、植物、ショウジョウバエ（Drosophila）、酵母、ウイルス、またはシー・エレガンス（C.elegans）である、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
前記単一の生物種がマウスまたはヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物が5〜1000個体の生物である、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物が10〜100個体の生物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物が20〜75個体の生物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、
(i)前記複数のハプロタイプブロックにおいて、該複数のハプロタイプブロックにおける他の全てのまたは大部分のハプロタイプブロックよりも良い点数を有する前記1以上のハプロタイプブロック中のハプロタイプを選択すること；
(ii)前記ハプロタイプで表される前記単一の生物種における前記複数の異なる生物中の生物についての遺伝子型データを用いて、該単一の生物種についての二次ハプロタイプマップを作成すること；
(iii)前記二次ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点すること、ここで該採点は前記表現型データ構造中の変化と該ハプロタイプブロック中の変化との間の相応関係を表す；
(iv)前記二次ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックについて前記採点ステップ(iii)を繰り返し、それにより、該二次ハプロタイプマップ中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上の第2ハプロタイプブロックを同定すること；および
(v)(a)前記ハプロタイプが選択されたハプロタイプブロックに由来するハプロタイプブロック中の遺伝子座と(b)ステップ(iii)で同定された前記1以上の第2ハプロタイプブロックに由来する遺伝子座とを含む前記種についての生物学的経路を構築すること、を含む請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
前記表現型データ構造が前記複数の生物中の複数の細胞構成要素の測定値を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
前記表現型データ構造が前記複数の生物における各生物についての表現型アレイを含み、かつ該表現型アレイのそれぞれが該表現型アレイにより表される生物中の複数の細胞構成要素における各細胞構成要素についての示差的な発現値を含み、前記示差的な発現値の各々が(i)該複数の生物中の生物における細胞内構成要素の天然の発現値と(ii)該生物を擾乱剤に暴露した後の該生物における該細胞構成要素の発現値との間の差を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項３４】
前記擾乱剤が薬理学的剤である請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記擾乱剤が1000ダルトン以下の分子量を有する化合物である、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の異なる生物中の生物が、前記単一の生物種のメンバー、該単一の生物種のメンバーに由来する細胞組織、または該単一の生物種の該メンバーに由来する細胞培養物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数のハプロタイプブロック中のハプロタイプブロックが、複数の制限断片長多型、マイクロサテライトマーカー、ショートタンデムリピート、塩基配列長多型、またはDNAメチル化を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３８】
コンピュータシステムと協働して使用するためのコンピュータプログラム製品であって、該コンピュータプログラム製品がコンピュータ読取り可能な記憶媒体と、その製品中に格納されたコンピュータプログラム機構を含み、
該コンピュータプログラム機構が、
単一の生物種における複数の異なる生物のゲノム配列における変異を記録保存するための遺伝子型データベースと；
前記複数の異なる生物によって示される表現型の差を表す表現型データ構造と；
複数のハプロタイプブロックを含むハプロタイプマップであって、ここで該ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックは前記単一の生物種のゲノムの異なる部分を示している、前記ハプロタイプマップと；ならびに
前記複数の異なる生物によって示される表現型と前記単一の生物種のゲノムにおける1以上の特定遺伝子座とを関連付けるための表現型/ハプロタイプ処理モジュールとを含み、
該表現型/ハプロタイプ処理モジュールが表現型/ハプロタイプ比較サブルーチンを含み、
該表現型/ハプロタイプ比較サブルーチンが、
前記ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点するための命令であって、ここで該採点は前記表現型データ構造における変化と前記ハプロタイプブロックにおける変化との間の相応関係を表す、前記命令と；
前記ハプロタイプマップ中の前記複数のハプロタイプブロックにおける各ハプロタイプブロックについて採点するための前記命令を再実行するための命令；および
前記複数のハプロタイプブロックにおいて、該複数のハプロタイプブロック中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上のハプロタイプブロックを同定するための命令と、を含む前記コンピュータプログラム製品。
【請求項３９】
前記複数のハプロタイプブロック中のハプロタイプブロックが複数の連続的な一塩基多型を含む、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４０】
前記ハプロタイプブロック中の各一塩基多型が、該ハプロタイプブロック中の他の一塩基多型の閾値距離内にある、請求項39に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４１】
前記閾値距離が10メガベース以下である請求項40に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４２】
前記閾値距離が１メガベース以下である請求項40に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４３】
前記複数のハプロタイプブロック中のハプロタイプブロックが複数のハプロタイプを表し、かつ該ハプロタイプブロックによって表されるハプロタイプのカットオフパーセンテージ未満のものが該ハプロタイプブロック中に１度だけ出現する、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４４】
前記カットオフパーセンテージが5％〜30％の範囲内である、請求項43に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４５】
前記カットオフパーセンテージが15％〜25％の範囲内である、請求項43に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４６】
前記表現型/ハプロタイプ処理モジュールがハプロタイプマップ誘導サブルーチンをさらに含み、ここで該ハプロタイプマップ誘導サブルーチンが前記遺伝子型データベースを用いて該ハプロタイプマップを作成するための命令を含む、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４７】
作成するための前記命令が、
(i)複数の連続的な一塩基多型を有する候補ハプロタイプブロックを同定するための命令であって、該候補ハプロタイプブロック中の各一塩基多型が該候補ハプロタイプブロックにおける別の一塩基多型の閾値距離内にある、前記命令と；
(ii)前記候補ハプロタイプブロックに点数を割付けるための命令と；
(iii)前記遺伝子型データベース内の可能な全ての候補ハプロタイプブロックが同定されるまで、同定のための前記命令と割付けのための前記命令とを再実行し、それによって、未廃棄の候補ハプロタイプのセットを作成するための命令と；
(iv)ハプロタイプマップのために候補ハプロタイプブロックのセット中で最高点を有する候補ハプロタイプブロックを選択するための命令と；
(v)選択した候補ハプロタイプブロックと該選択した候補ハプロタイプブロックの全体または一部を上乗せする各候補ハプロタイプブロックとを、前記候補ハプロタイプブロックのセットから除去するための命令と；
(vi)候補ハプロタイプブロックが前記候補ハプロタイプブロックのセット中に完全に残らなくなるまで選択のための前記命令と除去ステップのための前記命令とを再実行するための命令であって、該ハプロタイプマップが選択された各候補ハプロタイプブロックを含む、前記命令、
を含む請求項46に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４８】
前記点数が、前記候補ハプロタイプブロック中の一塩基多型の数を、該ブロックによって表されるハプロタイプ数の2乗で割算したものである、請求項47に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４９】
前記点数が、前記候補ハプロタイプブロック中の一塩基多型の数を、該ブロックによって表されるハプロタイプ数で割算したものである、請求項47に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５０】
前記ハプロタイプブロックを採点するための前記命令が、点数Sを該ハプロタイプブロックに設定するための命令を含み、ここで、Sは、
【数５】
2006519436.tif 000018
であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５１】
採点のための前記命令が点数Sを前記ハプロタイプブロックに設定するための命令を含み、ここで、Sは、
【数６】
2006519436.tif 000019
であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５２】
採点のための前記命令が点数Sを割付けるための命令を含み、ここで、Sが下記の比
【数７】
2006519436.tif 000020
の負、逆数、負の逆数、対数または負の対数であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５３】
ΣDintraまたはΣDinterが累乗される、請求項51に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５４】
前記累乗が1/2、2または10乗である請求項53に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５５】
前記ハプロタイプブロックを採点するための前記命令が点数Sを割付けるための命令を含み、ここで、Sが下記の比
【数８】
2006519436.tif 000021
の負、逆数、負の逆数、対数または負の対数であり、ΣDintraは、前記ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する前記複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterは、該ハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない該複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和であり、ΣDintraまたはΣDinterが累乗される、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５６】
前記累乗が1/2、2または10乗である請求項55に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５７】
前記1以上の特定遺伝子座における特定の遺伝子座が0.5メガベース以下の長さを有する、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５８】
前記1以上の特定遺伝子座における特定遺伝子座が0.5メガベース〜2.0メガベースの長さを有する、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項５９】
前記1以上の特定遺伝子座における特定遺伝子座が10メガベース以下の長さを有する、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６０】
前記表現型が糖尿病、癌、喘息、統合失調症、関節炎、多発性硬化症、またはリウマチ性疾患である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６１】
前記表現型が自己免疫疾患または遺伝病である請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６２】
前記表現型データ構造がマイクロアレイ発現データである、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６３】
前記単一の生物種が動物、植物、ショウジョウバエ（Drosophila）、酵母、ウイルス、またはシー・エレガンス（C.elegans）である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６４】
前記単一の生物種がマウスまたはヒトである、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６５】
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物が5〜1000個体の生物である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６６】
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物が10〜100個体の生物である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６７】
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物が20〜75個体の生物である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６８】
前記表現型/ハプロタイプ処理モジュールが、
(i)前記複数のハプロタイプブロックにおいて、該複数のハプロタイプブロックにおける他の全てのまたは大部分のハプロタイプブロックよりも良い点数を有する前記1以上のハプロタイプブロック中のハプロタイプを選択するための命令と；
(ii)前記ハプロタイプで表される前記単一の生物種における前記複数の異なる生物中の生物についての遺伝子型データを用いて該単一の生物種についての二次ハプロタイプマップを作成するための命令と；
(iii)前記二次ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点するための命令であって、該採点が前記表現型データ構造中の変化と前記ハプロタイプブロック中の変化との相応関係を表す、前記命令と；
(iv)前記二次ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックについての採点のための前記命令(iii)を再実行し、それにより、該二次ハプロタイプマップ中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上の二次ハプロタイプブロックを同定するための命令と；および
(v)(a)前記ハプロタイプが選択されたハプロタイプブロックからのハプロタイプブロック中の遺伝子座と(b)採点のための命令(iii)の場合に同定された前記1以上の第2ハプロタイプブロックからの遺伝子座とを含む前記種についての生物学的経路を構築するための命令と、をさらに含む、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項６９】
前記遺伝子型データ構造が前記複数の生物中の複数の細胞構成要素の測定値を表す、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７０】
前記表現型データ構造が前記複数の生物中の各生物についての表現型アレイを含み、かつ該表現型アレイのそれぞれが該表現型アレイにより表される生物中の複数の細胞構成要素における各細胞構成要素についての示差的な発現値を含み、かつ前記示差的な発現値が(i)該複数の生物中の一生物における細胞内構成要素の天然の発現値と(ii)該生物を擾乱剤に暴露した後の該生物における該細胞構成要素の発現値との間の差を表す、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７１】
前記擾乱剤が薬理学的剤である請求項70に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７２】
前記擾乱剤が1000ダルトン以下の分子量を有する化合物である、請求項70に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７３】
前記複数の異なる生物中の生物が、前記単一の生物種のメンバー、前記単一の生物種のメンバー由来の細胞組織、または前記単一の生物種の前記メンバー由来の細胞培養物である、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７４】
前記複数のハプロタイプブロック中のハプロタイプブロックが複数の制限断片長多型、マイクロサテライトマーカー、ショートタンデムリピート、塩基配列長多型、またはDNAメチル化を含む、請求項38に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項７５】
複数の異なる生物によって示される表現型と、単一の生物種のゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付けるためのコンピュータシステムであって、該コンピュータシステムが、
中央処理装置；
中央処理装置と結合した記憶装置、記憶装置貯蔵部位；
前記単一の生物種における前記複数の異なる生物のゲノム配列中の変異を記録保存するための遺伝子型データベース；
前記複数の異なる生物によって示される表現型の差を表す表現型データ構造；
複数のハプロタイプブロックを含むハプロタイプマップであって、ここで、該ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックは前記単一の生物種のゲノムの異なる部分を表す、前記ハプロタイプマップ；
および、表現型/ハプロタイプ処理モジュールを含み、ここで、該表現型/ハプロタイプ処理モジュールが表現型/ハプロタイプ比較サブルーチンを含み、
該表現型/ハプロタイプ比較サブルーチンが、
該ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点するための命令であって、ここで該採点は該表現型データ構造における変化と該ハプロタイプブロックにおける変化との間の相応関係を表す、前記命令と；
および、該ハプロタイプマップ中の該複数のハプロタイプブロックにおける各ハプロタイプブロックについて採点するための該命令を再実行し、それにより、該複数のハプロタイプブロックにおける他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上のハプロタイプブロックを該複数のハプロタイプブロック中で同定するための命令とを含む、上記コンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は米国特許出願第10/352,846（出願日2003年1月27日）に基づく優先権を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組入れる。
【０００２】
１．発明の分野
この発明は表現型形質に影響する染色体領域を予測するシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
疾患に対する感受性を調節する遺伝子座の同定は、病態生理学的機構および通常のヒト疾患の新規治療の開発を見通してきた。家族調査は、喘息、自閉症、統合失調症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、1型および2型糖尿病などの多くの通常のヒト疾患に対する遺伝的素因をはっきりと示している。その総説については、Risch, Nature 405, 847-856,2000を参照されたい。この20年以上、嚢胞性繊維症、ハンチントン病およびデュシェーヌ型筋ジストロフィーなどの多くの高侵入性単一遺伝子（メンデル性）疾患の原因となる遺伝子突然変異が、ヒト集団における連鎖分析およびポジショナルクローニングによって同定されてきた。これらの成功は、ある種のゲノムの遺伝子組成（遺伝子型）とこの生物種によって示される1以上の身体的特性（表現型）との間で強い関連がある比較的稀な疾患において生じている。
【０００４】
同一の方法が一般大衆にありふれた疾患に対する感受性に関与する遺伝子変異を同定することに使用できることが望まれた。その総説については、LanderおよびSchork, Science 265, 2037-2048,1994を参照のこと。乳癌（BRCA-1および-2）、大腸癌（FAPおよびHNPCC）、アルツハイマー病（APP）ならびに2型糖尿病（MODY-1,-2,-3）などの一部の通常疾患のサブセットに対する感受性に関与する遺伝子変異がこれらの方法によって同定されており、期待が高まっている。しかし、これらの遺伝子変異は、これらの疾患に罹患している個体の非常に限定されたサブセットにおいてのみ非常に強く影響する（Risch, Nature, 405, 847-856,2000）。
【０００５】
相当な努力にも関わらず、一般大衆におけるありふれた非メンデル性疾患に対する感受性の原因となる遺伝子変異は同定されていない。複数の遺伝子座が関与し、かつ各個別の遺伝子座は全疾患感受性に対してわずかに寄与するため、慣用の連鎖法およびポジショナルクローニング法をヒト集団に適用することによって通常疾患の感受性遺伝子座を同定することはまったく困難であろう。ヒト集団における疾患感受性遺伝子のマッピングは、集団にわたる表現型の多様性、遺伝子不均一性、および自由な環境の影響によっても妨げられる。染色体lq42領域と全身性エリテマトーデスとの間の関連性における多様な報告は、ヒトの遺伝学研究において直面する困難性を例証している。あるグループはlq42領域（Tsao, J. Clin. Invest,99, 725-731,1997）とその領域内の遺伝子（PARP）のマイクロサテライト対立遺伝子との間の強力な関連性を報告した（Tsao, J. Clin. Invest. 103, 1135-1140,1999）。対照的に、幾つかの他のSLE集団の分析においては、PARPマイクロサテライトマーカーに関連する証拠は示されず（Criswellら, J. Clin. Invest, Jun ; 105, 1501-1502,2000 ; Delrieuら, Arthritis & Rheumatism 42, 2194-2197,1999）、lq42領域との非常に小さな関連性（Mucenski,ら, Molecular & Cellular Biology 6, 4236-4243,1986）または関連性がないこと（Lindqvistら, Journal of Autoimmunity, Mar ; 14, 169-178,2000）が見出された。追加のツールおよび手法が通常のヒト疾患の根底にある遺伝的要素を同定するために必要であろう。
【０００６】
ヒト疾患の生物学における実験マウス遺伝モデルの分析は、ありふれたヒト疾患についての感受性遺伝子座の同定を非常に容易にするであろう。実験マウスモデルは遺伝子分析について、近交の（ホモ接合の）親株が利用可能であり、制御された繁殖、共通の環境、制御された実験的介入、および速やかな組織の入手といった利点を有する。ヒト疾患生物学における非常に多くのマウスモデルが記載されており、多くは10年以上前から利用可能である。それにも関わらず、マウスモデルを用いて複雑な疾患についての感受性遺伝子座の同定においては、その進展は限られている。マウスモデルの遺伝子分析は、非常に多くの異種交配子孫の世代、表現型スクリーニングおよび遺伝子型分類を必要とする。現在利用可能なツールを用いる場合、これは労力を要し、高価でかつ時間のかかるプロセスであり、ヒトにおいて確認する前にマウスにおいて同定することができる遺伝子座の割合を非常に制限してきた。その総説については、NadeauおよびFrankel, Nature Genetics Aug ; 25, 381-384, 2000を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
通常の疾患に対する感受性などの表現型の変化と遺伝子の変異とを関連付ける際に直面する困難性により、当業界において量的形質または表現型に最も寄与しそうな染色体領域を同定するための追加のツールの必要性を生じる。この状況に鑑みれば、異種交配実験または困難なPCR後の操作などの時間のかかる技術に頼ることなく、表現型と生物ゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付ける技術を提供することが非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
３．発明の概要
本発明は、表現型と、単一の生物種のゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付けるコンピュータシステムおよび方法を提供する。この方法では、単一の生物種における複数の生物間での表現型の相違は、この生物の各ゲノム中の変化および/または類似性と相関する。この方法は最初に複数の生物における多型性に基づいてハプロタイプマップをコンピュータで計算する。続いて、この生物種に関連する表現型の分布をハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックにおける対立遺伝子の分布と比較することにより、潜在的に表現型を調節するかまたは表現型に影響するハプロタイプマップ内のハプロタイプブロックを同定する。
【０００９】
本発明の一態様は、単一の生物種における複数の異なる生物によって示される表現型と、この単一の生物種のゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付ける方法を提供する。この方法では、ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックは、表現型データ構造中の変化(variation)とハプロタイプブロック中の変化(variation)との間の相応関係に基づいて採点される。一部の実施形態では、表現型データ構造は複数の異なる生物によって示される表現型の差を表し、ハプロタイプマップは複数のハプロタイプブロックを含んでいる。ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックはゲノムの異なる部分を表している。採点(scoring)はハプロタイプマップにおける複数のハプロタイプブロック中の各ハプロタイプブロックについて行われる。これにより、複数のハプロタイプブロック中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数(score)を有する1以上のハプロタイプブロックが複数のハプロタイプブロック中で同定される。
【００１０】
一部の実施形態では、複数のハプロタイプブロックにおけるハプロタイプブロックは、複数の連続的な一塩基多型を含む。一部の実施形態では、ハプロタイプブロック中の各一塩基多型は、このハプロタイプブロック中の他の一塩基多型の閾値距離（threshold distance）内にある。一部の実施形態では、この閾値距離は10メガベース以下または1メガベース以下である。一部の実施形態では、ハプロタイプブロック中のSNP間の距離に制限はない。
【００１１】
一部の実施形態では、複数のハプロタイプブロックにおけるハプロタイプブロックは複数のハプロタイプを表し、かつこのハプロタイプブロックによって表されるハプロタイプのカットオフパーセンテージ未満のものはこのハプロタイプブロック中に1度だけ出現する。言い換えれば、所与のあらゆるハプロタイプブロック中のハプロタイプのカットオフパーセンテージ以下のものは複数の生物における単一生物のみによって示される。一部の実施形態では、カットオフパーセンテージは5％〜30％の範囲内である。
【００１２】
この発明の一部の実施形態は、採点の前にハプロタイプマップを作成するステップをさらに含む。ハプロタイプマップは種々の異なる方法によって作成することができる。このような方法の1つにおいては、候補ハプロタイプブロックが遺伝子型データベース中で同定される。候補ハプロタイプブロックは複数の連続的な一塩基多型を有する。一部の実施形態では、候補ハプロタイプブロック中の各一塩基多型は、この候補ハプロタイプブロック中の別の一塩基多型の閾値距離内にある。一部の実施形態では、候補ハプロタイプブロック内の一塩基多型間における距離に制限はない。候補ハプロタイプブロックに点数が割付ける。この同定と採点は、遺伝子型データベース中の可能な全ての候補ハプロタイプブロックが同定されるまで繰り返すことにより、候補ハプロタイプブロックセットを作成する。次に、候補ハプロタイプブロックのセット中で最高点を有する候補ハプロタイプブロックがハプロタイプマップのために選択される。続いて、選択された候補ハプロタイプブロックおよび選択された候補ハプロタイプブロックの全体または一部を上乗せする各候補ハプロタイプブロックが候補ブロックのセットから除かれる。ハプロタイプマップのために候補ハプロタイプブロックを選択する工程、ならびに選択したブロックおよび選択したブロックを上乗せする全てのブロックを未廃棄のブロックのセットから除去する工程が、候補ハプロタイプブロックが候補ハプロタイプブロックセット中に残らなくなるまで繰り返される。この手法において、ハプロタイプマップは候補ブロックのセットから選択された各候補ハプロタイプブロックを含む。一部の実施形態では、点数は、候補ハプロタイプブロック中の一塩基多型の数をこのブロックによって表されるハプロタイプ数の2乗で割算したものである。
【００１３】
本発明はさらに、ハプロタイプブロック中の変化と単一の生物種における複数の異なる生物によって示される表現型の変化との間の点数をコンピュータで計算する方法を提供する。一部の実施形態では、このような採点はハプロタイプブロックに点数Sを割付けることを含み、ここで、Sは、
【数１】
2006519436.tif 000003
【００１４】
であり、ΣDintraはハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する複数の生物中の生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterはハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない複数の生物中の生物間における表現型値の差の総和である。一部の実施形態では、このような採点はハプロタイプブロックに点数Sを割付けることを含み、ここで、Sは、
【数２】
2006519436.tif 000004
【００１５】
であり、ΣDintraとΣDinterは上に提示されるものと同一の意味を有する。一部の実施形態では、Sは上に提示される比(ratio)の負、逆数、負の逆数、対数または負の対数である。一部の実施形態では、ΣDintraまたはΣDinterは累乗される（例えば1/2、2または10乗）。一部の実施形態では、本発明のシステムおよび方法によって1以上の特定遺伝子座中で同定される特定遺伝子座は、0.5メガベース以下、0.5メガベース〜20メガベースまたは10メガベース以下の長さを有する。一部の実施形態では、本発明のシステムおよび方法によって調査される表現型は、糖尿病、癌、喘息、統合失調症、関節炎、多発性硬化症、リウマチ性疾患、自己免疫疾患、または遺伝病である。一部の実施形態では、表現型データ構造はマイクロアレイ発現データである。一部の実施形態では、本発明の方法を用いて調査される単一の生物種は、動物（例えば、ヒトもしくはマウス）、植物、ショウジョウバエ（Drosophila）、酵母、ウイルス、またはシー・エレガンス（C.elegans）である。一部の実施形態では、単一の生物種における複数の異なる生物は5〜1000個体の生物である。
【００１６】
単一の生物種における染色体領域とこの単一の生物種の生物によって示される表現型とを関連付ける方法を提供することに加えて、本発明のシステムおよび方法は、単一の生物種における生物学的経路を明らかにする方法を提供する。これを達成するためのそのような方法の1つは、(i)複数のハプロタイプブロックにおいて、上述される方法を用いて得られる1以上のハプロタイプブロック中のハプロタイプを選択するステップを含む。ハプロタイプが選択されるハプロタイプブロックは、複数のハプロタイプブロック中の他の全てのまたは大部分のハプロタイプブロックよりも良い点数を有する。二次ハプロタイプマップは、選択されたハプロタイプで表される単一の生物種における複数の異なる生物中の生物についての遺伝子型データを用いて、単一の生物種について作成される。続いて、二次ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点する。この点数は、表現型データ構造中の変化と選択されたハプロタイプブロック中の変化との間の相応関係(correspondence)を表す。二次ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを選択するステップ、および選択されたハプロタイプブロックを採点するステップが二次ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックについて繰り返され、それにより、二次ハプロタイプマップ中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上の第2ハプロタイプブロックを同定する。その後、単一の生物種についての生物学的経路が構築される。この経路は(a)ハプロタイプが選択されたハプロタイプブロックに由来するハプロタイプブロック中の遺伝子座と(b)他のハプロタイプブロックよりも良い点数を得た1以上の第2ハプロタイプブロックに由来する遺伝子座とを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、表現型データ構造は、複数の生物中の複数の細胞構成要素の測定値を表す。一部の実施形態では、表現型データ構造は複数の生物における各生物についての表現型アレイ（phenotypic array）を含み、各表現型アレイはこの表現型アレイによって表される生物中の複数の細胞構成要素中の各細胞構成要素についての示差的な発現値を含む。次に、示差的な発現値のそれぞれは、(i)複数の生物における生物中の細胞構成要素の天然の発現値と、(ii)生物が擾乱剤（perturbation）に暴露された後の生物における細胞構成要素の発現値との間の差を表す。一部の実施形態では擾乱剤は薬理学的剤である。一部の実施形態では、擾乱剤は1000ダルトン以下の分子量を有する化合物である。
【００１８】
本発明の一部の実施形態では、異なる複数の生物中の生物は単一の生物種のメンバー、単一の生物種のメンバーに由来する細胞組織、または単一の生物種のメンバーに由来する細胞培養物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、コンピュータシステムと協働して使用するためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品は、コンピュータ読取り可能な記憶媒体と、その製品中に格納されたコンピュータプログラム機構とを含む。コンピュータプログラム機構は遺伝子型データベース、表現型データ構造、ハプロタイプマップ、および表現型/ハプロタイプ処理モジュールを含む。遺伝子型データベースは、単一の生物種における複数の異なる生物のゲノム配列中の変異を記憶保存するためのものである。表現型データ構造は異なる複数の生物によって示される表現型の差異を表している。ハプロタイプマップは複数のハプロタイプブロックを含み、ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックは単一の生物種におけるゲノムの異なる部分を表している。表現型/ハプロタイプ処理モジュールは、複数の異なる生物によって示される表現型と、単一の生物種のゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付けるためのものである。表現型/ハプロタイプ処理モジュールは、表現型/ハプロタイプ比較サブルーチンを含む。表現型/ハプロタイプ比較サブルーチンは、ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを採点するための命令（この採点は表現型データ構造中の変化とハプロタイプデータ構造中の変化との間の相応関係を表す）、およびハプロタイプマップにおける複数のハプロタイプブロック中の各ハプロタイプブロックについて採点するための命令を再実行し、それにより、複数のハプロタイプブロックにおいて、複数のハプロタイプブロック中の他の全てのハプロタイプブロックよりも良い点数を有する1以上のハプロタイプブロックを同定するための命令を含む。
【００２０】
本発明の別の態様は、複数の異なる生物によって示される表現型と、単一の生物種のゲノム中の1以上の特定遺伝子座とを関連付けるためのコンピュータシステムを提供する。このコンピュータシステムは中央処理装置と中央処理装置に接続された記憶装置とを含む。記憶装置は、それぞれが上に提示されるものと同一の機能を有する、遺伝子型データベース、表現型データ構造、ハプロタイプマップ、および表現型/ハプロタイプ処理モジュールを備える。
【００２１】
4.  図面の簡単な説明
（後記参照のこと。）
同じ参照番号はこの図面の幾つかの図にわたる対応部分をさす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
5．発明の詳細な説明
本発明は、単一の生物種の生物のゲノムにおける変異に基づいてハプロタイプマップを構築するコンピュータシステムおよび方法に関する。本発明はさらに、この生物種に関連する表現型形質に潜在的に影響し得るハプロタイプマップ内のハプロタイプブロックを同定するコンピュータシステムおよび方法に関する。この同定ステップは、ハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロック内の対立遺伝子の分布が、調査中の単一の生物種に関連する表現型データとどの程度良く一致しているかを評価することによって実施される。
【００２３】
5.1  例示的システムの概要
図1は、表現型と、生物のゲノム中の1以上のハプロタイプブロックとを関連付けるためのシステム20を示している。
【００２４】
システム20は、
・中央処理装置22；
・ソフトウェアおよびデータを記憶保存するための1以上のハードディスクドライブを含んでいることが好ましい非揮発性記憶装置34（記憶装置34は典型的にはディスクコントローラー32によって制御される）；
・システム制御プログラム、データおよびアプリケーションプログラムを記憶するための、非揮発性記憶装置34からの搭載されるプログラムおよびデータを含むシステムメモリー38、好ましくは高速ランダムアクセスメモリー（RAM）（システムメモリー38は読取り専用記憶装置（ROM）も含むことができる）；
・マウス26、キーパッド30などの1以上の入力装置、およびディスプレイ28を含むユーザーインターフェース24；
・任意の有線もしくは無線コミュニケーションネットワークに接続するための任意のネットワークインターフェースカード36；ならびに
・前述されるシステムの要素を相互に連結するための内部バス33、
を含むことが好ましい。
【００２５】
システム20の動作は、主にオペレーティングシステム40によって制御され、中央処理装置22によって実行される。オペレーティングシステム40はシステムメモリー38に格納することができる。オペレーティングシステム40に加えて、システムメモリー38の代表的な実装には、
・本発明によって使用される様々なファイルおよびデータ構造へのアクセスを制御するためのファイルシステム42；
・表現型とハプロタイプマップ中の1以上のハプロタイプブロックとを関連付けるための表現型/ハプロタイプ処理モジュール44；
・単一の生物種における複数の生物のゲノム配列中の変異を記憶保存するための遺伝子型データベース52；
・単一の生物種に関連する1以上の表現型形質の測定された差異を含む表現型データ構造60、
が含まれる。
【００２６】
好ましい実施形態では、表現型/ハプロタイプ処理モジュール44には、
・単一の生物種の異なる生物間での表現型の変化を表す表現型データ構造を誘導するための表現型データ構造誘導サブルーチン46；
・単一の生物種の複数の生物のゲノムにおける変異からハプロタイプマップ80を作成するためのハプロタイプマップ誘導サブルーチン48；および
・表現型アレイとハプロタイプマップ80とを比較してハプロタイプマップ80内のハプロタイプブロック（該ブロック内の対立遺伝子の分布は調査中の種によって示される対立遺伝子の分布と一致する）を同定するための表現型/ハプロタイプ比較サブルーチン50、
が含まれる。
【００２７】
5.2  例示的な遺伝子型データベース
遺伝子型データベース52中に典型的に示される情報は単一の生物種のゲノム内の遺伝子座54の集合である。各遺伝子座54について、遺伝子変異情報が利用可能である生物56がデータベース52中に示される。示された生物56のそれぞれについて、変異情報58が与えられる。変異情報58は単一の生物種の生物間における遺伝子変異の任意の形態である。代表的な変異情報58には、限定されるものではないが、一塩基多型（SNP）、制限断片長多型（RFLP）、マイクロサテライトマーカー、ショートタンデムリピート、塩基配列長多型、およびDNAメチル化が含まれる。典型的な遺伝子型データベース52が表1に提供される。
【表１】
2006519436.tif 000005
【００２８】
5.3  ハプロタイプブロックの構築
図2は本発明の一実施形態に従って実行される方法を図示する。図2で図示される方法の最初の数ステップは、ハプロタイプマップ誘導サブルーチン48（図1）によって実行され、その結果、ハプロタイプブロックを含むハプロタイプマップが作成される。これらのステップは、遺伝子型データベース52がSNP情報を含む場合に使用することができる。遺伝子型データベース52はハプロタイプマップ誘導サブルーチン48への入力として使用される。言い換えれば、ハプロタイプマップ誘導サブルーチン48は遺伝子型データベース52中のデータを用いてハプロタイプブロックを作成する。
【００２９】
図2に図示されるステップを詳細に記載する前に、ハプロタイプブロックの簡単な説明が有益である。一般的に言うと、ハプロタイプブロックは、生物種における複数の生物にわたる種のゲノム中の、複数の連続的なSNPまたは他の遺伝子変異（例えば、RFLP、マイクロサテライトマーカー、ショートタンデムリピート、塩基配列長多型、もしくはDNAメチル化）を表す。図3A中の表302はハプロタイプブロックを図示している。図3Aでは、単一の生物種のゲノム中で互いに隣接する2つのSNP（SNP1とSNP2）が存在する。この単一の生物種は生物A〜Gによって表される。各生物はSNP1とSNP2のそれぞれについて多数(major)値「1」または少数(minor)値「0」のいずれか1つの値を有する。各値は、SNPによって示される遺伝子座のヌクレオチドが、この生物種の生物におけるその遺伝子座でより一般的に見られる（多数値、「1」）か、または一般的に見られない（少数値、「0」）ものであるかを示す。
【００３０】
図3A中の生物AにおけるSNP1とSNP2で示される遺伝子座の各ヌクレオチドは、これらの遺伝子座でより一般的に見られるヌクレオチドである。したがって、生物AにおいてSNP1とSNP2のいずれもが多数値を有する。対照的に、図3A中の生物BにおけるSNP1とSNP2で示される遺伝子座の各ヌクレオチドは、これらの遺伝子座であまり一般的に見られないヌクレオチドである。したがって、生物BにおいてSNP1とSNP2のいずれもが少数値を有する。
【００３１】
図3では、生物AとBは異なるハプロタイプを有する。一実施形態では、ハプロタイプは所与のハプロタイプブロックにおける所与の生物についてのSNP値の集合である。例えば、ハプロタイプは図3中で生物を示す任意の列における値である。図3Aにおいて生物Aは1,1のハプロタイプを有する。生物Bは図3Aにおいて0,0のハプロタイプを有する。図3Aにおいて、表304は表302中に表される全てのハプロタイプ、およびこの生物種におけるどの生物がこれらのハプロタイプを有するかを列挙している。
【００３２】
ハプロタイプブロックとハプロタイプという用語を紹介した上で、図2に図示される方法を記載する。ステップ202では、調査中の単一の生物種のゲノム中に複数の連続的なSNPを有する候補ハプロタイプブロックが同定される。これを行うため、ハプロタイプマップ誘導ルーチン48がハプロタイプマップに利用可能な第1のSNPで開始し、(1)このブロック内の先行のSNPの閾値距離内にあり、かつ(2)このハプロタイプブロック内で予め決定したハプロタイプの閾値パーセンテージ以下のものがハプロタイプブロック内に1度だけ出現する条件で、ブロックに連続的な更なるSNPを付加することによってハプロタイプブロックの構築を進める。上記2つの条件のいずれかが次の連続的なSNPをその後形成されるブロックへ付加することで満たされ得ない場合は、常にブロックの形成が終了する。一部の実施形態では、（示されないが）SNPが先行のSNPの閾値距離内にあるという要件は存在しない。ステップ204でブロックの形成が終了する際に、ハプロタイプマップ誘導ルーチン48はハプロタイプブロックに点数を割付ける（ステップ206）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ハプロタイプブロック中のSNP間の閾値距離は10メガベース以下、5メガベース以下、3メガベース以下、2メガベース以下、または1メガベース以下である。一部の実施形態では、閾値距離の要件は存在しない。一部の実施形態では、ハプロタイプブロック中のユニークなハプロタイプの予め決定した閾値パーセンテージは5〜10、10〜15、15〜20、20〜25、5〜30、15〜25、25〜30、30〜40、または40超の範囲内である。
【００３４】
図3はステップ202で適用される予め決定した閾値パーセンテージの適用を図示する。図3Aでは、候補ハプロタイプブロック302中に4種類のハプロタイプが存在する。3種類のハプロタイプ[(1,1)、(0,0)および(0,1)]は、それぞれ候補ハプロタイプブロックの構築に使用される2個体の生物によって示されている。したがって、これらの各ハプロタイプはハプロタイプブロック中に2度以上出現する。第4のハプロタイプ(1,0)は唯一の生物によってのみ示されている。したがって、第4のハプロタイプは候補ハプロタイプブロック中に1度だけ出現し、すなわち、ハプロタイプブロック302中のハプロタイプの少なくとも25％が候補ハプロタイプブロックを構築するために使用される唯一の生物のみによって示される。ステップ202における閾値パーセンテージが20に設定される場合は、ブロック302は候補ハプロタイプブロックとみなされないことになる。一方、閾値パーセンテージが30に設定される場合は、ブロック302は候補ハプロタイプブロックとみなすことになる。好適な実施形態では、閾値パーセンテージは20に設定され、ブロック302は候補ハプロタイプブロックとみなさない。図3Bでは、ハプロタイプブロック306において2度以上出現している3種のハプロタイプ[(1,1,1)、(0,0,0)、(0,1,1)]と1度だけ出現する唯一のハプロタイプ(1,0,0)とが存在する。図3Cでは、ハプロタイプブロック310において2度以上出現するわずか2種類のハプロタイプ[(1,1,1,1)、(0,0,0,0)]が存在するが、残りのハプロタイプはブロック310中にわずかに1度だけ出現する。したがって、閾値パーセンテージを20に設定した場合、ブロック306とブロック310のいずれもハプロタイプブロックとみなさないが、閾値パーセンテージを30に設定した場合は、ブロック306はそのようにみなす。
【００３５】
図3は候補ハプロタイプブロックに関する別のポイントを図示する。ステップ202に課せられる基準を満たす限り、候補ハプロタイプブロック中のSNPの数に制限はない。言い換えれば、(i)ブロック中のSNPが連続的であり、(ii)各SNPが生物のゲノム中の別のSNPのカットオフ距離内にあり、かつ(iii)ブロック中のハプロタイプのカットオフパーセンテージ未満のものがユニークである限り、候補ハプロタイプブロック中のSNPの数に制限はない。
【００３６】
上で述べたように、候補ハプロタイプブロックが同定された後、ステップ204で点数が割付される。本発明の一実施形態では、この点数はブロック内のSNPの数をブロック内の異なるハプロタイプの数の2乗で割算したものである。例えば、候補ハプロタイプブロック302（図3A）は2を4の2乗で割算した点数（0.125）を有する。候補ハプロタイプブロック306(図3B)は3を4の2乗で割算した点数（0.188）を有する。候補ハプロタイプブロック310(図3C)は4を5の2乗で割算した点数（0.160）を有する。当業者は候補ハプロタイプブロックを採点するために使用することができる多くの異なる採点機構が存在すること、およびそのような採点機構の全てが本発明の範囲内であることを理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ステップ204で使用される採点関数(scoring function)は、ブロック内の種々のハプロタイプ数で割算されたブロック内のSNP数である。他の実施形態では、ステップ204で使用される採点関数は、2を超える数で累乗（例えば3乗）されたブロック内の種々のハプロタイプ数で割算されたブロック内のSNP数である。
【００３７】
ステップ206では、可能な候補ハプロタイプブロックの全てが遺伝子型データベース52から作成されているか否かについて決定される。この決定をすることができる方法は数多く存在する。一実施形態では、新たなハプロタイプブロックの形成を始めるために考慮されていないSNPがデータベース52中に残っていない場合に、可能な候補ハプロタイプブロックの全てが遺伝子型データベース52から作成されている(206-はい)。予想されるブロックの全てが作成されていない場合には（206-いいえ）、制御(control)がステップ202へ戻し、別の候補ハプロタイプブロックを同定するための試行が開始される。
【００３８】
いったん遺伝子型データベース52中の可能な候補ハプロタイプブロックの全てが同定されると(206-はい)、最終的なハプロタイプブロック構造(ハプロタイプマップ)が作成される。最初はステップ202の段階で同定された全ての候補ハプロタイプブロックは考慮される資格を有する。ステップ208では、適格の候補ハプロタイプブロックのセット中で最高点を有する候補ハプロタイプブロックが最終的なハプロタイプブロックから選択され、適格の候補ハプロタイプブロックのセットから除かれる。ステップ210では、ステップ208で選択されたハプロタイプブロックと重複するあらゆるハプロタイプブロックが適格の候補ブロックのセットから除かれ、それ以後は無視される。2つのブロックが共通のSNPを少なくとも1つ共有する場合には、2つのハプロタイプブロックは互いに重複している。この段階で、適格のハプロタイプブロックのセット中に重複するハプロタイプブロックを有することは可能である。なぜなら、ステップ202から206は、ブロックが互いに重複しているかに関らず可能な適格のハプロタイプブロックの全てを作成するよう設計されているからである。
【００３９】
ステップ212では、適格のハプロタイプブロックのセット中に任意のハプロタイプブロックが残存しているかが決定される。もしそうであれば（212-はい）、制御がステップ208へ戻し、残存する適格の候補ハプロタイプブロックのセット間で最高点を有する候補ハプロタイプブロックが最終的なハプロタイプブロック中に含むように選択される。ステップ208から212は、ハプロタイプブロックが適格のハプロタイプブロックのセット中に残存しなくなるまで繰り返される。ステップ208の反復において選択されたハプロタイプブロックは最終的なハプロタイプブロック(ハプロタイプマップ)構造として同定される。
【００４０】
ステップ202から214はハプロタイプブロックマップを誘導するための一方法を説明する。ステップ202から214は少数の近交株(生物)が調査される生物種およびSNPデータが利用可能な生物種に有用である。しかし、本発明は図2のステップ202から214に概説されるハプロタイプブロックマップ構築ステップに限定されるものではない。事実、様々な方法を用いて作成されたハプロタイプブロックマップを本発明の方法において使用することができる。例えば、調査中の生物種がヒトであり、かつ非常に多くの生物が遺伝子型データベース52中に表されている場合には、Patilら, 2001, Science 294,1719-1723 ; Dalyら, 2001, Nature Genetics 29,229-232 ;およびZhangら, 2002, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99,7335-7339に記載されるような方法を使用することができる。さらに、本発明はSNPに基づくハプロタイプブロックの構築に限定されるものではない。あらゆる形態の遺伝子変異を、本明細書に記載されるものと同様の方法を用いてハプロタイプブロックの作成を進めるために使用することができる。少し例を挙げれば、ハプロタイプブロックは制限断片長多型(RFLP)、マイクロサテライトマーカー、ショートタンデムリピート、塩基配列長多型、およびDNAメチル化などの遺伝子変異から構築することができる。例えば、Kongらはマイクロサテライトマーカーを用いたヒトのハプロタイプマップの作成のための技術を記載する。Kongら, 2002, Nat. Genet 31,241-247を参照されたい。
【００４１】
5.4  ハプロタイプブロックの表現型データへの経験的マッピング
ステップ216では、この生物種によって示される表現型形質と最も高度に一致するハプロタイプブロックが最終的なハプロタイプブロック構造中で同定される。これは最終的なハプロタイプブロック構造中の各ハプロタイプブロックを、調査中の生物種によって示される表現型形質に対して採点することによってなされる。本発明の一実施形態においては、ステップ216で用いられる採点関数(scoring function)は図4に図示される仮定の表現型データを用いて示される。この実施形態では、より低い点数が表現型とハプロタイプブロック間のより優れた一致を示している。採点関数は、ハプロタイプブロック内の対立遺伝子の分布が仮定の表現型データといかに良く一致しているかを評価する。本明細書で用いられるように、ステップ216で用いられる採点関数によって生じたより良い点数とは、表現型とハプロタイプブロックとの間のより良い一致を表す任意の点数である。ステップ216のいくつかの実施形態で使用される採点関数のいくつかの形態において、より良い点数はより低い点数であるが、ステップ216のいくつかの実施形態で使用される採点関数の別の形態では、より良い点数はより高い点数である。
【００４２】
図4は候補ハプロタイプブロック402と404を図示する。ブロック404は生物AとBによって表されるハプロタイプ(0,1,1,0)、および生物CとDによって表されるハプロタイプ(1,0,0,1)を含む。ブロック406は生物A、C、およびDによって表されるハプロタイプ(1,0,1,1)、および生物Bによって表されるハプロタイプ(1,0,0,1)を含む。
【００４３】
図4Cは、候補ハプロタイプブロック402と404を採点する仮定の表現型データの値を図示する。仮定の表現型データは、例えば肺活量、血中コレステロール値など、調査中の生物種のいくつかの表現型を表すことができる。候補ハプロタイプブロックによって表される各生物についての表現型値(phenotypic value)が存在するため、生物Aは6恣意的ユニットを有する表現型PAを示し、生物Bは7.5恣意的ユニットを有する表現型PBを示し、以下も同様である。
【００４４】
この例示的な実施形態において、ステップ216(図2)で使用される採点関数は
【数３】
2006519436.tif 000006
【００４５】
であり（式１）、ここでΣDintraはハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有する生物の表現型値の差の総和であり、ΣDinterはハプロタイプブロック中に同一のハプロタイプを共有しない生物間における表現型値の差の総和である。
【００４６】
式1はハプロタイプグループ間の平均表現型値の差に対するハプロタイプグループ内での表現型値の差の比のマイナスlog（対数）である。
【００４７】
式1のコンピュータによる計算をブロック402と404について説明するために、セット408の表現型値の差の完全セットを考慮する(図4C)：
DAB=1.5
DAC=14
DAD=16
DBC=12.5
DBD=14.5
DCD=2
候補ハプロタイプブロック402についての点数S402は、2種類のハプロタイプ(0,1,1,0)と(1,0,0,1)が存在することを考慮することによりコンピュータ計算される。生物AとBは一方のハプロタイプに属し、生物CとDは他方のハプロタイプに属する。
【数４】
2006519436.tif 000007
【００４８】
候補ハプロタイプブロック406についての点数S406は、2種類のハプロタイプ(1,0,1,1)と(0,1,0,0)が存在することを考慮することにより計算される。生物A、C、およびDは一方のハプロタイプに属し、生物Bは他方のハプロタイプに属する。
【数５】
2006519436.tif 000008
【００４９】
式1で示される採点関数は、ブロック402が図４C中の仮定の表現型データに対してブロック406よりもより良く一致していることを示している。式1は単一の生物種によって示される表現型とより良く一致するハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックが、表現型と一致しないハプロタイプブロックよりも多く正の点数を得るように設計されている。
【００５０】
5.4.1  代替的な採点関数
式1で規定されるもの以外の別の採点関数をハプロタイプブロックマップ中の各ハプロタイプブロックを採点するために用いてもよい。一実施形態において、採点関数は、
【数６】
2006519436.tif 000009
【００５１】
であり、ここでΣDintraとΣDinterは式1と同一の意味を有する。式2は本発明の利点を強調する。式2は、ハプロタイプブロックをハプロタイプブロック中に表われる生物の表現型といかに良く対比するかに基づいて、ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックを区別することを可能にする。記述されているように、式2は表現型データとより良く一致するハプロタイプブロックにより小さな数を割付け、また、表現型データと良く一致しないハプロタイプにより大きな数を割付ける。式2.0は同時に、
【数７】
2006519436.tif 000010
【００５２】
に容易に書き直すことができ（式３）、ここでΣDintraとΣDinterは式1と同一の意味を有する。式3の場合、より小さな負の数が表現型データとより良く一致するハプロタイプブロックに割付けられ、また、より大きな負の数が表現型データ3とよく一致しないハプロタイプに割付けられる。肝心なことは、採点関数が、所与のハプロタイプとより密接に一致するハプロタイプブロックを所与のハプロタイプとより密接に一致しないハプロタイプブロックから区別することである。
【００５３】
当業者は、ステップ216で用いることができる多くの異なる採点関数が存在することを理解するであろう。一実施形態では、採点関数は、調査中の単一の生物種によって示される表現型と密接に一致するハプロタイプブロックと、この表現型と密接に一致しないハプロタイプブロックとを区別する任意の関数である。別の実施形態では、採点関数は、式1、2もしくは3のいずれか、負号を付けた式1、2もしくは3のいずれか、式1、2もしくは3の逆数のいずれか、または負号を付けた式1、2もしくは3の逆数のいずれかである。さらに別の実施形態では、採点関数は式2における比の対数、式2における比の逆数の対数、または式2における比の他の関数である。
【００５４】
5.4.2  重み付け採点関数
本発明の一部の実施形態において、採点関数に存在する比の分子および/または分母に重み付け(weight)が導入される。幾つかの例では、この重み付けは一定の値である。別の例では、重み付けの大きさは、表現型データと比較されるハプロタイプブロックで表される生物数の関数、考慮されるハプロタイプブロック中のSNP(またはRFLPなどの別形態の遺伝子変異)数の関数、あるいは基礎をなすデータと関連する他のいくつかの関連態様である。一部の実施形態では、点数は重み付け要素(weight factor)によって乗ぜられる。例えば、いくつかの実施形態では、式1のマイナスlog比が、採点されるハプロタイプブロックのサイズと構造を反映する重み付け要素によって乗ぜられる。
【００５５】
本発明の一部の実施形態では、ステップ216で使用される採点関数に存在する比の分子および/または分母が累乗(例えば、2乗根、2乗、10乗)される。例えば、いくつかの実施形態において、採点関数は、
【数８】
2006519436.tif 000011
【００５６】
である（式4）。
【００５７】
ステップ216の様々な実施形態で使用することができる多くの異なる採点関数が開示されている。これらの例は例示のみを目的としており、限定的なものではない。本発明の技術は、これらが生物種の表現型に影響する遺伝要素を生物種のゲノムの特定の領域へ局在化することを可能にするため有利である。本発明の技術によって同定されるゲノムの特定の領域の分析は、その後分析されてこの生物種によって示される特定の表現型に影響する特定の遺伝子をさらに同定することができる。
【００５８】
本発明の一部の実施形態において、式1が各ハプロタイプブロックを採点するために用いられる。各点数は採点されるハプロタイプブロックのサイズと構造とを反映する重み付け(weight)によって乗ぜられ、一致する生の点数が得られる。一致する生の点数は、平均の生の点数を引算し、かつ採点される全てのハプロタイプブロックについての標準偏差を割算することにより標準化される。得られた規準化された点数は平均点数を上回るかまたは下回る点数の標準偏差数を示す。
【００５９】
5.5  表現型
本発明の一部の実施形態において、上に開示される技術は調査中の生物種によって示される表現型と染色体中の特定のハプロタイプブロックとを関連付けることに使用される。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、調査中の生物種によって示される表現型と0.5メガベース(Mb)以下、１Mb以下、2Mb以下、0.5Mb〜2Mb、3Mb以下、4Mb以下、2Mb〜5Mb、5Mb以下、10Mb以下、1Mb〜10Mb、15Mb以下、または20Mb以下である染色体の領域とを関連付ける。
【００６０】
本発明の方法を用いて分析することができる表現型は、(単純なメンデル形質とは対照的な)あらゆる形態の複雑な形質である。複雑な形質には、群集連続(continuum)上で測定することができるあらゆる形質が含まれる。少し例を挙げれば、例えば、複雑な形質は身長、体重、血中の生体分子のレベル、および疾患に対する感受性であり得る。いくつかの実施形態では、研究される複雑な形質は、糖尿病、癌、喘息、統合失調症、関節炎、多発性硬化症、およびリウマチ性疾患などの複雑な疾患である。いくつかの実施形態では、調査される表現型は、限定されるものではないが、高血圧、異常なトリグリセリドレベル、異常なコレステロールレベル、または異常な高比重リポタンパク/低比重リポタンパクレベルなどの疾患の前臨床指標である。本発明の特定の実施形態では、表現型は特定の昆虫または病原体による感染に対する低い耐性である。本発明のシステムおよび方法を用いて調査し得る更なる例示的な表現型には、アレルギー、喘息、ならびに強行性障害、恐怖症、および心的外傷後ストレス障害などの強迫性障害が含まれる。
【００６１】
本発明の方法を用いて調査し得るさらに別の表現型には、自己免疫疾患(例えば、アディソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、慢性疲労症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎、糖尿病、線維筋肉痛、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病、狼瘡、メニエール病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ熱、類肉腫症、強皮症、脈管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症）、骨疾患(例えば、軟骨無形性症、骨癌、進行性骨化性線維形成異常症、線維性骨形成異常、レッグカルペペルテス病、骨髄腫、骨形成不全症、骨髄炎、骨粗しょう症、パジェット病、および側弯症)などの疾患が含まれる。
【００６２】
本発明の方法を用いて調査し得るさらに別の表現型には、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、婦人科癌、ホジキン病、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、および睾丸癌などの癌が含まれる。
【００６３】
本発明の方法を用いて調査し得るさらに別の表現型には、軟骨無形成症、色盲、酸性マルターゼ欠損症、副腎脳白質ジストロフィー、エカルディ症候群、α-1抗トリプシン欠乏症、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、形成異常症、毛細管拡張性運動失調、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維形成異常症、ぜい弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー-ギーディオン症候群、白質萎縮症、qt延長(long qt)症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症(mps)、爪膝蓋骨症候群、腎形成性異常、潜伏性糖尿病、神経線維腫症、ニーマン-ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラーダー-ヴィリ症候群、草老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルービンスタイン‐テービ症候群、サンフィリポ症候群、シュバッハマン症候群、鎌形赤血球症、スミス-マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ-サックス病、血小板減少・橈骨欠損(tar)症候群、トレチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素回路異常症、フォン・ヒッペル‐リンダウ症候群、ワールデンブルヒ症候群、ウィリアムズ症候群、およびウィルソン病などの遺伝病が含まれる。
【００６４】
本発明のシステムおよび方法を用いて調査し得るさらに別の表現型には、狭心症、形成異常症、アテローム性動脈硬化症/動脈硬化症、先天性心疾患、心内膜炎、高コレステロール血症、高血圧症、qt延長症候群、僧帽弁逸脱症、体位性起立頻脈症候群、および血栓症が含まれる。
【００６５】
本発明のシステムおよび方法を用いて研究し得るさらに別の表現型には、生物の寿命、生物の血中における抗体の基礎血清レベル、擾乱剤に生物を暴露した後の生物の血中における抗体の血清レベル、生物を鎮痛剤などに暴露した後の疼痛モデルにおける生物の応答が含まれる。
【００６６】
5.6  例示的な表現型データ
本発明の一部の実施形態では、表現型データ構造60はマイクロアレイ発現データである。マイクロアレイは数千の遺伝子の発現レベルを定量的に測定することが可能である、すなわち株および組織特異的な遺伝子発現データの巨大なデータベースを作成することを可能にする。例えば、Zhaoら, 1995, 「High-density cDNA filter analysis: a novel approach for large-scale, quantitative analysis of gene expression」Gene 156: 207-213；Blanchardら, 1996, 「Sequence to array: Probing the genome's secrets」Nature Biotechnology 14: 1649; Blanchardら, 1996,「High-Density Oligonucleotide Arrays」Biosensors & Bioelectronics 11: 687-90; Cheeら, 1996, 「Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays」Science 274: 610-614; Chait, 1996, 「Trawling for proteins in the post-genome era」Nat. Biotech. 14: 1544；Derisiら， 1996, 「Use of a cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer」Nature Genetics 14:457-460;およびDeRisiら, 1997, 「Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale」Science 278:680-686;Schenaら， 1995, 「Quantitative monitoring of gene expression pattern with a complementary DNA micro-array」Science 270:46
7-470;Schenaら, 1996，「Parallel human genome analysis; microarray-based expression monitoring of 1000 genes」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619;Shalonら, 1996, 「A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization」Genome Res. 6:639-645.を参照されたい。
【００６７】
本発明の一部の実施形態では、マイクロアレイ上の遺伝子または遺伝子産物についての平均発現レベルが入力として用いられ、データ中の変化が重み付け要素として用いられる。この能力により、ハプロタイプブロックにより正確なコンピュータによる株特異的遺伝子発現データをマッピングすることが可能になる。例えば、下記の実施例2の使用ケース3を参照されたい。
【００６８】
5.6.1  一般的なマイクロアレイ
本発明の一部の実施形態では、表現型データ構造60は単一の生物種における生物56の転写状態の測定値を含む。一部の実施形態では、プローブを固相からなるマイクロアレイへハイブリダイズすることによって転写状態の測定が行われる。固相の表面は、DNAまたはDNA模倣物(mimic)の集団、あるいは、RNAの集団など、固定化されたポリヌクレオチドの集団である。マイクロアレイは、例えば、細胞の転写状態（目的の薬剤の段階的なレベルに暴露された細胞の転写状態など）の分析に使用することができる。
【００６９】
一部の実施形態において、マイクロアレイは、細胞または生物のゲノム中の多くの遺伝子(好ましくは大部分のまたはほとんど全ての遺伝子)の産物についての結合(例えばハイブリダイゼーション)部位の規則正しいアレイをもつ表面を含む。マイクロアレイは多くの方法で作製することができ、その幾つかは下記に記載される。いかに作製されてもマイクロアレイは特定の特徴を共有する。すなわちアレイは再現可能であり、作製されるべき所与のアレイの多重コピーを可能にし、互いに容易に比較される。マイクロアレイは小さく(大抵5cm2より小さい)、かつこれらが結合(例えば核酸のハイブリダイゼーション)条件下で安定である物質から作製されることが好ましい。マイクロアレイ中の所与の結合部位または結合部位のユニークなセットは、細胞中の単一遺伝子の産物(例えば、特定のmRNA、またはそれらから誘導される特定のcDNA)と特異的に結合(例えばハイブリダイズ)するであろう。しかし、一般的に、その他の関連するまたは類似の配列は所与の結合部位と交差ハイブリダイゼーションするであろう。特異的RNAまたはDNA当たり2以上の物理的な結合部位が存在してもよいが、明瞭性を目的として、下記の説明は単一の完全な相補的結合部位が存在することと仮定する。
【００７０】
本発明の一実施形態に基づくマイクロアレイは1以上の試験プローブを含み、これらの各プローブは、検出されるべきRNAまたはDNAの部分配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有する。各プローブが異なる核酸配列を有することが好ましい。固相表面上の各プローブの位置が既知であることが好ましい。一実施形態では、マイクロアレイは高密度アレイであり、1cm2当たり異なるプローブが約60個を超える密度を有することが好ましい。一実施形態では、マイクロアレイは各位置が遺伝子によってコードされる産物（例えばmRNAまたはそれらから誘導されるcDNA）についての個別的な結合部位を示し、かつ結合部位が単一の生物種におけるゲノム中の大部分のまたはほとんど全ての遺伝子の産物を提示するアレイ(例えばマトリックス)である。例えば、結合部位は特定のRNAが特異的にハイブリダイズすることができるDNAまたはDNAの類似体であることができる。DNAまたはDNAの類似体は、例えば合成オリゴマー、全長cDNA、非全長cDNA、または遺伝子断片であることができる。
【００７１】
一部の実施形態において、マイクロアレイは単一の生物種におけるゲノム中の全てのまたはほとんど全ての遺伝子の産物についての結合部位を含むが、このような包括性は必ずしも必要とされない。ある場合では、マイクロアレイはゲノム中の遺伝子の少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも99％に対応する結合部位を有するであろう。マイクロアレイが目的の薬剤の作用に関連する遺伝子または目的の生物学的経路における遺伝子の結合部位を有することが好ましい。「遺伝子」はオープンリーディングフレーム(「ORF」)として同定され、生物中でまたは多細胞生物における一部の細胞中で転写されるメッセンジャーRNAが由来する、好ましくは少なくとも50、75または99アミノ酸の配列をコードする。ゲノム中の遺伝子数は生物により発現されるmRNA数、またはゲノムの十分に特徴付けられた部分からの推定によって見積もられる。目的の生物のゲノムが配列決定されている場合は、ORFの数を決定することができ、mRNAコード領域をDNA配列の分析によって同定することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムは完全に配列決定されており、かつ99アミノ酸より長い約6275個のORFを有することが報告されている。ORFの分析は、タンパク質産物をコードしていると思われる5885個のORFが存在することを示している(Goffeauら, 1996, Science 274 : 546-567)。
【００７２】
5.6.2  マイクロアレイ用のプローブの調製
上で述べたように、本発明の一部の実施形態において特定のポリヌクレオチド分子と特異的にハイブリダイズする「プローブ」は相補的ポリヌクレオチド配列である。一実施形態では、マイクロアレイのプローブは生物種のゲノム中の各遺伝子の少なくとも一部に対応するDNAまたはDNA「模倣物」(例えば、誘導体および類似体)である。一部の実施形態では、マイクロアレイのプローブは相補的RNAまたはRNA模倣物である。
【００７３】
DNA模倣物はDNAと特異的なワトソン-クリック様ハイブリダイゼーションが可能な、または特異的にRNAとハイブリダイゼーションが可能なサブユニットから構成されるポリマーである。核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。例示的なDNA模倣物として、例えばホスホロチオエートが含まれる。
【００７４】
DNAは、例えばゲノムDNA、cDNA(例えばRT-PCRによって)、またはクローン配列由来の遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって得ることができる。PCRプライマーは、ユニークな断片(例えばマイクロアレイ上の他のどんな断片とも連続して10塩基以上同一配列を共有しない断片)の増幅をもたらす遺伝子またはcDNAの既知の配列に基づいて選択されることが好ましい。Oligo version 5.0 (National Biosciences)などの当業界で周知のコンピュータプログラムが、要求される特異性および最適な増幅性質を有するプライマーの設計に有用である。典型的に、マイクロアレイの各プローブは約20塩基〜約12000塩基であり、一般的には約300塩基〜約2000塩基の長さであり、さらにより一般的には約300塩基〜約800塩基の長さであろう。PCR法は当業界で周知であり、例えばInnisら,編集, 1990, PCR Protocols : A Gzcide to Methods and Application, Academic Press Inc., San Diego, Califに記載されている。
【００７５】
マイクロアレイのポリヌクレオチドプローブを作製する別の手法は、例えばN-ホスホナートまたはホスホアミダイト化学を用いた合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成による(Froehlerら, 1986, Nucleic Acid Res. 14: 5399-5407; McBridら, 1983, Tetrahedron Lett. 24: 246-248)。合成配列は典型的には約15〜約500塩基の長さであり、約20〜約50塩基がより典型的である。一部の実施形態において、合成核酸には、限定することを意図するものではないが、イノシンなどの非天然塩基が含まれる。上で述べたように、核酸類似体はハイブリダイゼーションのための結合部位として使用され得る。適切な核酸類似体の例としてはペプチド核酸が含まれる(例えばEgholmら, 1993, Nature 363: 566-568; U.S. Pat. No.5,539,083を参照されたい)。
【００７６】
別の実施形態において、ハイブリダイゼーション部位(例えば、プローブ)は、遺伝子、cDNA(例えば、発現された配列タグ)のプラスミドまたはファージクローン、あるいはそこからの挿入物から作製される(Nguyenら, 1995, Genomics 29: 207-209)。
【００７７】
5.6.3  マイクロアレイの固相表面へのプローブの結合
プローブは、例えばガラス、プラスチック(例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または別の物質から作製し得る固相支持体または固相表面へ結合される。核酸を表面に結合させる好適な方法はSchenaら, 1995, Science 270: 467-470に一般的に記載されているように、ガラスプレート上でプリンティング(printing)することである。この方法はcDNAのマイクロアレイを調製するのに特に有用である。
【００７８】
マイクロアレイを作製するための第2の好適な方法は、高密度オリゴヌクレオチドアレイを作製することである。規定の配列と相補的な数千のオリゴヌクレオチドを含有するアレイを、in situ（その場）での合成のための写真平板技術を用いて表面上の規定の位置で作製するための技術(Fodorら, 1991, Science 251 : 767-773; Lockhartら, 1996, Nature Biotechnology 14: 1675; U.S. Pat. Nos.5,578,832; 5,556,752; および 5,510,270)、または規定のオリゴヌクレオチドの速やかな合成および沈着のための別の技術(Blanchardら, Biosensors & Bioelectronics 11: 687-690)が公知である。これらの方法が用いられる場合、既知の配列のオリゴヌクレオチド(例えば20マー)が、誘導化ガラススライドなどの表面上で直接合成される。通常、作製されるアレイは余剰的であり、RNAあたり数個のオリゴヌクレオチド分子を有する。オリゴヌクレオチドプローブは選択的にスプライシングされたmRNAを検出するために選択することができる。
【００７９】
例えばマスキングによってマイクロアレイを作製するための別の方法（MaskosおよびSouthern, 1992, Nuc. Acids. Res. 20: 1679-1684）も使用することができる。原則として、あらゆるタイプのアレイ（例えばナイロンハイブリダイゼーションメンブレン上のドットブロット）を使用することができる。
【００８０】
5.6.4  表現型データの別の供給源
本発明は表現型データ構造60(図2)用の表現型データの更なる供給源を提供する。例えば、上記のマイクロアレイ技術に加えて、細胞の転写状態を当業界で公知の遺伝子発現技術によって測定してもよい。二重の制限酵素消化とフェーズィング(phasing)プライマーとを組合せた方法（例えばZabeauら欧州特許O 534858 Al,出願日1992年9月24日を参照のこと)、または規定のmRNA末端と最も近接する部位をもつ制限断片を選択する方法（例えばPrasharら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 659-663を参照のこと）など、このような技術の幾つかは電気泳動分析のために複雑性を限定した制限断片のプールを作製する。別の方法は、例えば、複数のcDNAのそれぞれにおいて各cDNAを同定するために十分な塩基(例えば20〜50塩基)を配列決定することによって、または規定のmRNA末端に対する既知の位置で生じる短いタグ(例えば、9〜10塩基)を配列決定することによって(例えばVelculescu, 1995, Science 270: 484-487を参照のこと)、cDNAプールを統計的にサンプリングする。
【００８１】
本発明の様々な実施形態では、翻訳状態、活性状態またはそれらの混合状態など、転写状態以外の生物学的状態の態様を測定して表現型データ構造60用の表現型データを得ることができる。これらの実施形態の詳細はこの節に記載されている。
【００８２】
翻訳状態の測定  翻訳状態の測定はいくつかの方法によって実施し得る。例えば、タンパク質の全ゲノムモニタリング(例えば、「プロテオーム」、Goffeaら、前掲)を、結合部位が生物によってコードされる複数のタンパク質種に特異的な(好ましくはモノクローナル)固定化抗体を含むマイクロアレイを構築することによって実施することができる。抗体が、コードされるタンパク質の実質的な画分、または少なくとも目的の薬剤の作用に関連するこれらのタンパク質を提供することが好ましい。モノクローナル抗体を作製するための方法は周知である（例えばHarlow および Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。このような抗体アレイを用いて、細胞由来のタンパク質をアレイと接触させて、それらの結合が当業界で公知のアッセイを用いてアッセイされる。
【００８３】
あるいは、タンパク質は二次元ゲル電気泳動システムにより分離することができる。二次元ゲル電気泳動は当業界で周知であり、典型的には、一次元による等電点電気泳動(iso-electric focusing)に続く二次元によるSDS-PAGE電気泳動を含む。例えばHamesら, 1990,Gel Electrophoresis of Proteins : A Practical Approach, IRL Press, New York; Shevchenkoら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 1440-1445; Saglioccoら, 1996, Yeast 12: 1519-1533; およびLander, 1996, Science 274: 536-539を参照されたい。得られた電気泳動図は、質量分析技術、ウエスタンブロット、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析、ならびに内部およびN末端マイクロシーケンシングを含む、非常に多くの技術によって分析することができる。これらの技術を用いることで、薬剤に暴露された細胞(例えば酵母)あるいは例えば特定の遺伝子の欠失または過剰発現によって改変された細胞を含む、所与の生理的条件下で産生される全てのタンパク質の実質的な画分を同定することが可能である。
【００８４】
活性状態の測定  本発明の一部の実施形態では、表現型データ構造60を構築するために使用される表現型データは、単一の生物種の生物56中のタンパク質の活性状態の測定値である。活性の測定は、特徴付けられる特定の活性に適切なあらゆる機能的、生化学的、または物理的手法によって実施することができる。活性が化学変化を伴う場合は、細胞タンパク質は天然の基質と接触することができ、そして変化率が測定される。活性が多量体ユニットの会合体、例えば活性化されたDNA結合性複合体とDNAとの複合体に関与する場合は、会合体の関連タンパク質または転写されたmRNAの量などの二次的結果物(consequences)の量を測定することができる。また、機能的活性のみが知られる場合は、例えば、細胞周期における機能の制御、結果として観察することができる。どのように知られまたは測定されても、タンパク質活性の変化は本発明の方法に用いてハプロタイプブロックと照合することができる反応データを形成する。
【００８５】
生物学的状態の混合態様  代替的かつ非限定的な実施形態では、表現型データ構造(図2)は、単一の生物種における複数の異なる生物内の細胞構成要素（例えば、遺伝子、タンパク質、mRNA、cDNAなど）における生物学的状態の混合態様を用いて形成されてもよい。例えば、反応データは、例えば特定のmRNA富化の変化、特定のタンパク質富化の変化、および特定のタンパク質活性の変化の組合せから構築することができる。
【００８６】
この節で提供する例に加えて、複雑な形質の定量的測定を行うために使用することができるデータの供給源がいくらでもある（例えば、血中の化合物のレベルを分析することができ、肥満症測定モデルを用いることができる等）。
【００８７】
5.7  種および生物
本発明のシステムおよび方法を用いて、様々な種において表現型と染色体位置とを関連付けてもよい。本発明の一部の実施形態において、調査可能な生物種は、哺乳動物、霊長類、ヒト、ラット、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、またはサルなどの動物である。さらにその他の特定の実施形態において、調査可能な生物種は、植物、ショウジョウバエ(Drosophila)、酵母、ウイルス、またはシー・エレガンス(C.elegans)である。しかし、高近交系の生物(例えば、種々のマウス株)の使用により改善した結果を生ずるであろうと考えられる。生物種の各生物は、生物種(例えば特定のマウス株)のメンバー、生物種のメンバー由来の細胞組織または器官（例えば、特定のマウス株から得たマウスの脳）、あるいは生物種のメンバー由来の細胞培養物である。
【００８８】
5.8  コンピュータ分析の実施に影響する要素
多くの要素がコンピュータ分析の実施に影響する。表現型データ構造60（図1）が遺伝子型データベース52中のハプロタイプブロック内に存在する遺伝子変異を反映する場合に、本発明の方法がうまく機能する。表現型データ構造60または一部の重要な生物56（株）についてのハプロタイプ情報のいずれかにおける情報の欠落は、経験的(empirical)マッピングの実施に不利に影響する。分析される生物56の数は別の重要な要素である。コンピュータ予測は比較される異なる生物56の数を基礎とする。対様式の比較の数は分析される株数の組合せ関数（combinatorial function）である。一般的に使用される40〜50個体の近交系マウス株に及ぶハプロタイプマップにより、本発明のコンピュータ予測方法が広範囲の疾患関連表現型形質を調節する遺伝子座を同定する重要な能力を有することが可能になる。
【００８９】
本発明の一部の実施形態では、遺伝子型データベース52中に5〜1000個体の生物56についての遺伝子型データが存在する。本発明の一部の実施形態では、遺伝子型データベース52中に10〜100個体の生物56が存在する。本発明の一部の実施形態では、遺伝子型データベース52中に20〜75個体の生物56が存在する。
【００９０】
5.9  生物学的経路の解明
図11は、本発明のシステムおよび方法を用いた調査すべき単一生物種内に存在する生物学的経路を解明するための方法を説明する。生物学的経路は、遺伝子または遺伝子産物が調査すべき生物種における別の遺伝子または遺伝子産物の発現あるいは機能に影響するあらゆる生物学的プロセスを指すべく本明細書で用いられる。
【００９１】
ステップ1102では、調査中の単一の生物種についての一次ハプロタイプマップが、遺伝子型データベース52中の生物56のセットについての遺伝子型データを用いて構築される。これは、例えばステップ202から214(図2)を用いて行うことができる。次に、ステップ1104では、調査すべき単一の生物種によって示される表現型形質と高度に一致する第1ハプロタイプブロックが一次ハプロタイプマップ中で同定される。これは、例えば図2のステップ216について上述される技術を用いて行うことができる。
【００９２】
上記方法のこの段階で、ステップ1104で同定されたハプロタイプブロックにおけるハプロタイプが調査される。ブロック中の各ハプロタイプは遺伝子型データベース52中の1以上の生物56によって表される。ステップ1106では、ステップ1104で同定されたハプロタイプブロック中のハプロタイプが選択され、ステップ1108において、ステップ1106で同定されたハプロタイプ中に存在する、データベース52中の生物56からのデータ58（図2）のみを用いて、二次ハプロタイプマップが構築される。生物56のサブセットのみが二次ハプロタイプマップを構築するために使用されるため、二次ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックは一次ハプロタイプマップ中のハプロタイプブロックと異なるものになるようである。二次ハプロタイプマップの構築は、遺伝子型データベース52をサブグループに細分割する方法を提供するために有益である。次いで、これらのサブグループの分析により、調査すべき生物種における目的の表現型に影響する更なる遺伝子を同定することができる。図11中の残りのステップにより、これらのサブグループを分析することができる一方法が提供される。しかし、当業者は図11のステップ1110から1120を含んでなる方法に対する多くの変更態様が存在すること、およびそのような変更態様が本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【００９３】
ステップ1110では、表現型形質と相関するハプロタイプブロックが二次ハプロタイプマップ中に存在するか否かが決定がなされる。非自明な（nontrivial）ケースでは、二次ハプロタイプマップ中のこのハプロタイプブロックはステップ1104で同定された第1ハプロタイプブロックと重複しないであろう。表現型形質と相関するハプロタイプブロックが二次ハプロタイプマップ中で見出される場合（1110−はい）、（i）ステップ1104で同定された第1ハプロタイプブロック由来の遺伝子座、および（ii）ステップ1110で同定されたハプロタイプブロック由来の遺伝子座を含む生合成経路が解明される。
【００９４】
ステップ1114の実行の一例は下記の5.10.3節で提供される。5.10.3節では、マウスにおけるCyplalの発現と相関するハプロタイプブロックが同定された（ステップ1104）。5.10.3節で詳述されるように、このハプロタイプブロックは芳香族炭化水素レセプター（Ahr）遺伝子座を含むマウスゲノムの一部を含む。このハプロタイプブロックは図10B中に図示されている。5.10.3節では、図10Bで図示されるハプロタイプブロックのグループIIIにおいて表される生物種が二次ハプロタイプマップの構築に用いられた（図11；ステップ1108）。二次ハプロタイプマップはCyplalの発現と関連するハプロタイプブロックを含んでいた（図11；ステップ1110−はい）。この第2ハプロタイプブロックはArnt遺伝子座を含んでいた。このデータから、5.10.3節で詳述されるようにArnt遺伝子産物の高発現がマウスにおけるAhr遺伝子座の影響を改変することができるかが決定される（ステップ1114）。
【００９５】
図11へ戻り、調査すべき表現型形質に関連するハプロタイプブロックが二次ハプロタイプマップ中で見出されない場合には、任意の他の未選択のハプロタイプが第1ハプロタイプブロック中に残存するかが決定される（1112）。もしそうであれば（1112−はい）、そのようなハプロタイプの1つが1106で選択され、1108と1110が繰り返される。もしそうでなければ（1112−いいえ）、この工程が終了する（1120）。
【実施例１】
【００９６】
5.10  実施例
実施例1では、図2に開示される技術を用いて遺伝子型データベース52中に存在する株（生物）数の関数として作成されたハプロタイプブロックの特性が提供される。実施例2では、本発明のシステムおよび方法を用いて、近交系のマウス株から得た表現型データとハプロタイプブロックとを相関付ける。実施例3では、本発明のシステムおよび方法を用いて生物学的経路を構築する。実施例4では、本発明のシステムおよび方法を用いて染色体領域が擾乱剤（perturbation）に反応的であるかを判定する。
【００９７】
5.10.1  実施例1
この実施例で用いられる例示的な遺伝子型データベース52は（http:＼＼mouseSNP.Roche.com）で入手可能である。SNPの発見および対立遺伝子の特徴づけは、標的化ゲノム領域の再配列決定（re-sequencing）のための自動化高スループット法を用いて実行した。Grupeら, 2001, Science 292,1915-1918を参照されたい。分析されたゲノム領域は全て生物学的に重要な既知の遺伝子内のものであった。すなわち、この遺伝子内のエクソンおよび鍵となる遺伝子内調節領域が分析された。例示的な遺伝子型データベース52における対立遺伝子情報を分析して、これらの近交系マウス株間での遺伝子変異のパターンを特徴付けた。ヒトゲノムにおけるSNPについて述べたように（例えば、Patiletら, 2001, Science 294,1719-1723 ; Dalyら, 2001, Nature Genetics 29,229-232 ; Johnsonら, 2001, Nature Genetics 29, 233-237を参照のこと）、マウスゲノムにおいて物理的に密接に近接した対立遺伝子はしばしば互いに相関し、ブロック様構造（図5）内に出現する「SNPハプロタイプ」の存在をもたらす。ブロック内の各ハプロタイプは明らかに共通の祖先染色体が起源であるが、ブロックのサイズは組換えおよび突然変異を含む別の工程を反映する。
【００９８】
ハプロタイプブロックを定義するための幾つかの方法が存在し、適切な定義は予想される用途に依存する。ヒトの遺伝子変異の分析のために、各ブロック内のハプロタイプ多様性の十分な割合をカバーするのに必要なSNPの総数を最小にすることを目的としてハプロタイプブロック構造が作成される。例えば、Patilら, 2001, Science 294,1719-1723; Dalyら., 2001, Nature Genetics 29,229-232 ;およびZhangら, 2002, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 7335-7339を参照されたい。このタイプのハプロタイプブロック構造は関連性研究のために非常に多くの個体を遺伝子型分類することを要するヒトの遺伝子分析に有用である。しかし、この手法は実験マウス遺伝学のために最適ブロック構造を作成せず、すなわち、より少数の近交株の特徴付けを含む。より正確な結果は、マウスにおける関連性研究のためにサイズがより小さく、より多様性の少ないハプロタイプ組成を有するブロックを調査することによって生じる。
【００９９】
既知の方法で作成されるハプロタイプブロックよりも小さなサイズを有するハプロタイプブロックが所望であるため、図2中のステップ202から214を含んでなる新規方法を用いてマウスの遺伝子変異を分析し、マウスゲノムのハプロタイプブロック構造を明らかにした。この方法は、ハプロタイプブロックの構築のために（対立遺伝子頻度に関らず）全てのSNPおよび（共通のハプロタイプだけでなく）全てのハプロタイプを分析する。重要なことは分析に含まれる株の数およびタイプがハプロタイプブロックの構造に有意に影響したことである。一例として、ちょうど4株（129/SvJ、A/J、C57BL/6JおよびCAST/Ei）（図6A）の分析から生じるハプロタイプブロックの構造を近交系マウス（Mus Musculus）の13株を用いて作成されたものと比較した（示されない）。第1染色体上のハプロタイプブロックに示されるように、4株中に存在する遺伝子変異の分析により歪んだハプロタイプブロックを生じた。この状況で、生じた94個のハプロタイプブロックの33％以上がマイナーな（minor）対立遺伝子を有する唯一の株としてCAST/Eiを含んだ（すなわち、CAST/Eiは他の株に存在しない唯一のハプロタイプを有する）。したがって、マイナー対立遺伝子を有するCAST/EiまたはSPRET/Ei株のみに含まれるSNPはハプロタイプブロックの構築に用いず、すなわちハプロタイプブロックは13株のマウス（Mus Musculus）間の遺伝子変異の分析を基礎とした。図2のステップ202から214を用いた13株のマウス（Mus Musculus）の分析から生じた第1染色体上のハプロタイプブロックの一般的な特性は表2に示される。
【表２】
2006519436.tif 000012
【０１００】
分析がマウス（Mus Musculus）株に限定される場合でさえ、分析される株数はハプロタイプブロックの構造に有意に影響した。増加した数のマウス（Mus Musculus）株由来の多型性を分析した（すなわち追加の遺伝子変異として増加した数のSNPを分析中に含めた）。わずか3株を用いて構築したハプロタイプマップは13株を用いて得られたハプロタイプマップと有意に異なるものであった（図6B）。図6Bは3（A/J、129およびC57BL/6）または13株のマウス（Mus Musculus）を用いて、第12染色体上で構築されたハプロタイプブロック（29.6メガベース）の比較である。ブロックの境界に存在するSNPは線で結ばれている。
【０１０１】
分析した株数が3から13に増加されるに従い、新しい株として安定化されたハプロタイプブロックの一般的構造が分析中に含められた（表3）。
【表３】
2006519436.tif 000013
【０１０２】
表3に見られるように、各ブロック中の新規ハプロタイプの数を追加の新たな株としてほんのわずかだけ増加し、分析中に含めた。株当たり0.05の新規ハプロタイプの増加が加えられ（図7）、これは通常、各追加の株が各ブロック内に存在しているハプロタイプの範囲に適合する多型性のパターンを有したことを示している。ブロック内のハプロタイプの数は約8株を分析した後にプラトウーであるようだった。マウスゲノムにわたって、SNPの80％以上が4個以上のSNPを含有するブロックに入り、平均して各ブロックは14.6個のSNPおよび2.7種のハプロタイプを含んでいた。
【０１０３】
ランダム化試験は、図2のステップ202から214を含んでなる方法を用いて作成されたハプロタイプブロック構造が、ハプロタイプブロック内のSNP間における非常に高レベルの連鎖不平衡に起因することを示した。ランダム化のために、第1染色体上の1270個のSNPをランダムな順序に配置し、ランダムの順序のSNPを用いてハプロタイプブロック構造を作成した。1270個のSNPのランダムな順序は、セット（1,2…,1270）から一つずつ全ての数が引き出されるまで整数をランダムに引き出すことにより作成した。ランダム化ブロックの構造はランダムな順序に従ってSNP対立遺伝子情報を再配置することにより作成されるが、本来の染色体位置は保持されている。ブロック中の近隣のSNPは1メガベース内の間隔であった。このランダム化プロセスを10回繰り返した。生じたブロックの特性を各反復後に評価した。SNPの順序をランダム化した場合、少なくとも4個のSNPを有するブロック中のSNP％（23％±3％）、およびブロック当たりの平均SNP数（5.7±0.4）は著しく減少し、ブロック当たりの平均ハプロタイプ数（3.82±0.18）は適切に配置されたSNPに関連して有意に増加した。連続的に配置したSNPと無作為に配置したSNPとの間の強力な差異は、同一の連鎖群内におけるマウスSNPの連鎖不平衡の程度を示している。この高レベルな連鎖不平衡は、一般的に用いられる実験マウス株の比較的単純な血統の結果である。
【０１０４】
例示的な遺伝子型データベース52は27112個のユニークなSNPを含み、合計255547個の対立遺伝子が近交系マウスの15株の分析から生じる。例示的な遺伝子型データベース52中には異なる15株が存在し、M.CasteniusとM.Spretus株に固有な多型性を除外して、ハプロタイプブロック構造が歪められることを避けた。評価した13株間で多型的であった10766個のSNPの内、115個のSNPをこれらが二対立遺伝子（biallelic）でなかったことから除外し、3559個の別のSNPを7株以下で対立遺伝子が存在したために除外した。残りの7092個のSNPは1709個のブロックを形成し、443個は4個以上のSNPを有した（第1染色体上の全てのSNPの81％を含む）。少なくとも4個のSNPを有するハプロタイプブロックは、平均してブロック当たり11.3個のSNPと、ブロック当たり2.4種のハプロタイプを有し、および28.6Mbのマウスゲノムに及んだ。
【０１０５】
5.10.2  実施例２
米国特許出願09/737,918（タイトル「System and Method for Predicting Chromosomal Regions That Control Phenotypic Traits」、出願日2000年12月15日）および米国特許出願10/015,167（タイトル「System and Method for Predicting Chromosomal Regions That Control Phenotypic Traits」、出願日2001年12月11日）において、近交系マウス株から得た表現型データとゲノム領域内で共有する対立遺伝子の程度との相関的な分析により、複雑な形質を調節する染色体領域をコンピュータ予測し得る。複雑な表現型とマウスゲノムのハプロタイプマップとの比較が、マウスにおける複雑な形質をコンピュータで分析し、その後、米国特許出願09/737,918と米国特許出願10/015,167に開示された方法を実施するためのより良い方法であるかどうかについて決定された。相関関係はハプロタイプマップ中の各ハプロタイプブロックについて、ハプロタイプグループ間の表現型差異に対するハプロタイプ内の平均表現型差異の比のマイナスlog（式１）を計算することにより判断した。各ハプロタイプブロックについて式1を用いて計算した点数を、その後ハプロタイプブロックのサイズと構造に基づいて調整した。このプロセスはハプロタイプマップ中の全てのハプロタイプブロックについて反復され、最も一致するブロックが記録される。
【０１０６】
5.10.2.1  使用ケース１（MHC）
第1の使用ケースでは、本発明のハプロタイプに基づく経験的マッピング法を使用して、マウス第17染色体上に位置する、主要組織適合性複合体（MHC）のK遺伝子座（約33Mb）の染色体位置を予測した。近交系の13株のMHC K遺伝子座について知られるH2ハプロタイプをこの分析の入力表現型データとして用いた。13株それぞれのH2ハプロタイプを番号に変換した。同一のH2ハプロタイプを有する株は同一の番号を割付けた。この表現型データをその後、採点関数として式1を用いて表現型/ハプロタイプ処理モジュール44（図1）によってハプロタイプブロックとの相関性について分析した。図8Aで図示されるように、2つのハプロタイプブロックは表現型データと強い相関性を示した。図8Aにおいて、縦軸は標準偏差であり、横軸はマウス染色体の番号と位置である。計算された相関性は分析された全てのハプロタイプブロックについての平均を超える標準偏差5以上であった。これは、予測したハプロタイプブロックが表現型データと非常によく一致していることを示し（図９）、かつマウスゲノムにおいてこの表現型と比較可能な相関性を示す別のピークは存在しなかった。予測したハプロタイプブロックはいずれも第17染色体上にあり（33.7〜33.9Mbおよび33.9〜34.3Mb）、MHC K遺伝子座の既知の位置に直接的に隣接していた。図9はMHC Kハプロタイプ（k,d,b,u,?）と第17染色体上の１つの予測ハプロタイプブロックの構造(33.9〜34.3メガベース)との相関性を図示する。メジャーな（major）対立遺伝子とマイナーな(minor)対立遺伝子はそれぞれ濃い影と薄い影で示し、欠落したデータは陰影がなされていない。
【０１０７】
5.10.2.2  使用ケース2（Ahr）
第2の使用ケースでは、本発明のハプロタイプに基づく経験的マッピング法を使用して、AH表現型（すなわち近交系マウス株間におけるマウス肝ミクロソーム中の芳香族炭化水素ヒドロキシラーゼ活性の誘導レベル）を調節する遺伝子座を同定した。芳香族炭化水素レセプター（Ahr）は重要な環境物質の代謝を調節する細胞内タンパク質複合体のリガンド結合性成分であり、多環式芳香族炭化水素（タバコの煙やスモッグに見られる）および2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン（TCDD）が含まれる。マウス肝ミクロソーム中の芳香族炭化水素ヒドロキシラーゼ活性の誘導レベル（AH表現型）は、近交系マウス間で50倍以上変化し（Nebertら, 1982, Genetics 100,79-97を参照のこと）、この変化はAhrリガンド結合親和性の相違に起因すると考えられる（Changら, 1993, Pharmacogenetics 3,312-321を参照のこと）。40以上の近交系マウス株のAH表現型が既に特徴付けられており（Nebertら, 1982, Genetics 100,79-97）、7株が実施例1に記載されるマウスSNPデータベース中に存在した。AKR/JとDBA/2J株はAH非反応性であったが、A/J、A/HeJ、C57BL/6J、BALB/cJ およびC3H/HeJ株はAH反応性であった。これらの7株の表現型応答（phenotypic response）を、採点関数として式1を用いて、表現型/ハプロタイプ処理モジュール44（図1）により評価した。第12染色体上のAhr遺伝子座を含むハプロタイプブロック（29.6Mb）をモジュール44によってAH反応性を最も調節しそうな領域についてコンピュータ予測し、その表現型データとの相関性はこの第2使用ケースにおいて分析した全てのハプロタイプブロックについての平均を超える標準偏差10以上であった。図8Bにおいて、縦軸は標準偏差であり、横軸はマウス染色体の番号と位置である。
【０１０８】
5.10.2.3  使用ケース3（Cypla1）
近交系マウス株にわたる遺伝子発現プロファイルは、複雑な形質がどのようにして遺伝的に調節されるかを理解するために分析することができる有用な中間表現型を提供する。言い換えれば、遺伝子発現プロファイルは遺伝子型データ構造60（図1）としての役目を果たすことができる。表現型形質情報と同じように、株特異的遺伝子発現データをハプロタイプブロック上に経験的にマッピングして、示差的な遺伝子発現を調節する可能性のある遺伝子座を同定することができる。一例として、煙やダイオキシンを含む生体外物質の肺代謝に必要なチトクロムP450（Cypla1）（NebertおよびNegishi, 1982, Biochemical Pharmacology 31,2311-2317 ; Tukeyら 1982, Cell31, 275-284）は近交系マウス株から得た肺中で示差的に発現された（図10A）。特に、図10Aは、調査された各近交系マウス株についての肺性Cypla1遺伝子発現のレベルを図示する。
【０１０９】
図10A中のデータは以下のように決定した。総RNAをマウス肺の完全組織から単離した。mRNA（PolyA＋）の精製、cDNAの合成、標識化cRNAの生成およびU74v2 GeneChip（商品名）へのハイブリダイゼーションの設定はAffynzetrix Expression Analysis Technical Matiualに記載されるように行った。実験は各株について3個体のマウスで行った。画像ファイルは4つのスキャン（HP Gene array scanner）を用いたマイクロアレイから作製し、Affymetrix, Santa Clara, CAからのMAS 5.0ソフトウェアを用いて分析した。非常に多くの異なるチトクロム遺伝子がマイクロアレイデータ中に誤りを生じ得る可能性を排除するため、肺性Cypla1発現もPT-PCR分析（既知の方法に従って実施した）を用いて測定した。RT-PCR分析によって測定したCypla1の発現レベルはマイクロアレイ結果と完全に一致した（データは示されない）。
【０１１０】
わずか7個のSNPを、分析されたマウス（Mus Musculus）株中の完全8−kB Cypla1遺伝子内で同定した。これらのSNPの全てがエクソン内になく、株にわたる多型性のパターンは肺性Cypla1発現のレベルと相関しなかった。したがって、マウス（Mus Musculus）株間における量的に異なるレベルの肺性Cypla1発現は、トランスでCypla1発現を調節する別の遺伝子中の多型性が原因であるようであった。このような理由により、肺性Cypla1遺伝子発現データセットは、採点関数として式1を用いて、表現型/ハプロタイプ処理モジュール44（図1）によって評価した。5つのハプロタイプブロックがCypla1遺伝子と有意な相関性を有した。三番目に高いレベルの相関性を有する第12染色体上のハプロタイプブロックがAhr遺伝子座であった（図8C）。図8Cにおいて、縦軸は標準偏差であり、横軸はマウス染色体の番号と位置である。これはCypla1を含む非常に多くの薬物代謝酵素の誘導を調節する際のマウス芳香族炭化水素遺伝子系における既知の役割と一致する（Nebertら, 1982, Genetics 100,79-87を参照のこと）。
【０１１１】
Ahr遺伝子座内の多型性はCypla1の株特異的な示差的発現を引き起こすことができた。Ahr遺伝子座内で同定された79個のSNPにより、近交系マウス株を3種のハプロタイプグループに分類した。ハプロタイプグループIはB10.D2-H2/oSnJおよびC57BL/6J株を含み、グループIIはA/J、BALB/cJおよびC3H/HeJ株を含み、グループIIIは129/SvJ、AKR/J、DBA/2JおよびMRL/MpJ株を含む（図10B）。これらのSNPのかなりの数はエクソン中に位置し、すなわちコードタンパク質のアミノ酸配列中に有意な変化を生じさせた。4つのアミノ酸変異によりグループIの株を他の近交系マウス株と区別した。1つの多型性はグループI株（B10.D2-H2/oSnJおよびC57BL/6J）に見られる終止コドンを他の全ての株に見られるArgに変換し、その結果、コードタンパク質中に追加のカルボキシル末端配列を生じさせた。3つのアミノ酸変化によりグループIIの株をグループIIIの株と区別した。１つの多型性がグループＩ株（B10およびC57BL/6）に見出される停止コドンを他のすべての株においてArgに変換し、その結果、コードタンパク質中に追加のカルボキシル末端配列が生じた。3つのアミノ酸変異によりグループIIの株をグループIIIの株と区別した。1つの多型性はグループIIにおけるArgをグループIIIにおけるValに変換した。このSNPは、このタンパク質内の重要な（PAS）ドメインの折り畳みに寄与する（PAC）モチーフ（PontingおよびAravind, 1997, Current Biology 7, R674-R677を参照のこと）中に位置した。PASドメインハアゴニスト結合部位を有し、ならびに、PASドメイン含有タンパク質と二量化する表面を形成する(Burbachら, 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 8185-8189参照のこと)。この多型性および生じるアミノ酸変化のパターンは、株特異的な肺性Cypla1発現を遺伝的に調節するAhr遺伝子座と一致する。この使用ケースは、株特異的な遺伝子発現データを本発明のシステムおよび方法を用いてコンピュータ分析することができることを証明する。肺性Cypla1発現を調節する遺伝子座のコンピュータによる同定は、どのようにして遺伝子発現データ自身を遺伝子分析に直接利用することができるかの第1の例を提供する。Cypla1はマウス（Haggら, 2002, Archives of Toxicology 76,621-627）およびヒト（Hukkanenら, 2002, Critical Reviews in Toxicology 32,291-411）の肺で発現される主要な生体外物質代謝酵素である。マウスの肺におけるCypla1 mRNAおよびタンパク質発現が主な環境発癌性物質への実験的暴露後に増加することが示された（Haggら, 2002, Archives of Toxicology 76,621-627）。この酵素は、環境汚染物質およびたばこ煙中に存在する芳香族炭化水素の活性遺伝毒性代謝物質（active genotoxic metabolites）への転換に直接関与する。したがって、Cypla1は、肺癌（Nebertら, 1993, Annals of the New York Academy of Sciences 685,624-640 ;およびHukkanenら, 2002, Critical Reviews in Toxicology 32,291-411）および気腫などの喫煙と関連する肺性疾患の病因において重要な役割を果たすと考えられる。この実施例におけるコンピュータによる遺伝子分析は、Ahr遺伝子座内の遺伝子変異がマウスの肺におけるCypla1発現の基礎レベルを調節することを示す。
【０１１２】
総合すれば、実施例2における3種の使用ケースは、マウスにおける遺伝的に調節された複雑な生物学的プロセスを、ハプロタイプマップを用いてコンピュータにより分析することができることを証明する。米国特許出願第09/737,918および10/015,167中に開示される技術は、表現型データと20メガベースより大きなサイズの染色体領域とを互いに相関付けたが、本発明の方法は、実施例2に説明されるように、そのような形質の原因となる個々の遺伝子座を予測することができた。
【０１１３】
5.10.3  実施例3
遺伝子発現は、通常、1以上の経路におけるタンパク質の活性によって調節され、大抵は複数の遺伝子が関与する。したがって、遺伝子発現レベルの遺伝子的調節は、しばしば複数の上流遺伝子における多型性の一体的な影響から生じる。実施例2でなされた肺性Cypla1発現を調節する遺伝因子の分析は、複雑な経路を調節する遺伝因子を同定するために、どのように遺伝子発現データを本発明のマッピング法と組合わせて使用することができるかを説明する。実施例2におけるコンピュータ分析から、Ahrハプロタイプが肺におけるCypla1発現を調節するが、追加レベルの遺伝子調節が存在するかもしれないことが予測された。129/SvJマウスは同一のAhrハプロタイプを有する別の株よりも高いレベルで肺性Cypla1を発現した（図10B；グループIII）。これは、別の遺伝子中の多型性が同一のAhrハプロタイプを有するマウス間でのCypla1遺伝子発現を調節し得ることを示唆する。AhrハプロタイプグループIII株（129/SvJ,AKR/J, DBA/2JおよびMRL/MpJ)（図11;ステップ1106）からの発現データのみを用いて構築した遺伝子発現データのサブセットを本発明の方法を用いて分析した（図11；ステップ1110；5.9節も参照のこと）。第3染色体上のArnt遺伝子座を含むハプロタイプブロックは、平均を上回る標準偏差4以上から最大予測値5の間にあった（データは示されない）（図11；ステップ1110−はい）。Arnt遺伝子座で、129/SvJマウスは他のAhrハプロタイプIII株と明確に区別されるハプロタイプを有する。ArntはAhrと結合し、かつ肺性Cypla1転写を調節するヘテロダイマー複合体を形成することが知られている（Hogeneschら, 1997, Journal of Biological Chemistry 272,8581-8593 ; Reyesら, 1992, Science 256, 1193-1195; Hoffmanら, 1991, Science 252,954-958）。この分析は、Arntハプロタイプが129/SvJマウスにおけるAhrハプロタイプの影響を改変しうることを示唆する。129/SvJマウスの場合は、比較的低いレベルの肺性Cypla1発現がAhr遺伝子座におけるその
ハプロタイプに基づいて予想される。しかし、129/SvJマウスにおいて観察されたより高いレベルの肺性Cypla1発現はArnt遺伝子座における高発現ハプロタイプによる「救済(rescue)」に起因するかもしれない（図11、ステップ1114；5.9節）。この例においてなされた予測は個々に検証する必要があるが、この実施例は、複雑な経路を調節する遺伝因子を同定するために、どのようにしてマウスのハプロタイプを用いる本発明の方法を使用することができるかを示す。
【０１１４】
5.10.4  実施例４
本発明は、該生物を擾乱剤に暴露する前後に、単一の生物種における複数の生物の表現型と該単一種のゲノムにおける特定の位置とを相関付けるために使用し得る。この手法の一実施では、2セットの実験が実施される。第1のセットでは、本発明の方法を使用して、ハプロタイプマップと、単一の種の生物を擾乱剤に暴露する前の表現型の差異とを相関させる。実験の第2のセットでは、単一の種の生物をそれぞれ擾乱剤に暴露し、本発明の方法を使用して該生物種についてのハプロタイプマップと擾乱剤に暴露した後の生物によって示される表現型の変化とを相関させる。続いて、本明細書に記載される方法を用いて、実験の第1セットにおける最も良く一致するハプロタイプブロックを、実験の第2セットからの最も良く一致するハプロタイプブロックと比較する。これらの最も良く一致するハプロタイプブロックの2セット間の相違または類似性を比較することにより、擾乱剤に高反応性である単一の生物種のゲノムの領域を同定することが可能である。
【０１１５】
本発明における「擾乱（剤）」という用語は広範である。擾乱は、薬理学的剤または発癌性物質などの化合物への生物の暴露、生物ゲノム内への外因性遺伝子の付加、生物からの外因性遺伝子の除去、または生物中の遺伝子もしくはタンパク質の活性の変化であり得る。したがって、例えば複数の異なるマウス種を代表するマウス中の抗体血清レベルを、各マウス株を抗原に暴露する前後に測定することができる。続いて、複数の異なるマウス株における遺伝子型の相違が、マウスを擾乱剤に暴露する前後、観察される表現型と相関させる。マウスの表現型の変化が一致するハプロタイプブロックを擾乱剤に暴露する前後で比較することにより、擾乱剤に最も影響されるマウスゲノムの領域の位置を決めることが可能である。いくつかの実施形態では、擾乱剤は薬理学的剤である。一部の実施形態では、擾乱は1000ダルトン以下の分子量を有する化合物である。
【０１１６】
いったん擾乱剤に高反応性であるゲノムの領域が同定されれば、ゲノムの同定された部分を含む遺伝子チップ発現ライブラリーを調査し得る。(i)擾乱剤により損傷する前の生物種の株から作成される遺伝子チップライブラリーと(ii)擾乱剤により損傷した後の生物種の株から作成される遺伝子チップライブラリーにおける遺伝子の示差的発現の同定が特定の目的である。当業界で周知であるように、遺伝子チップライブラリーはmRNA発現レベルまたは、生物内の別個の遺伝子のタンパク質発現レベルなどの他のいくつかの測定基準の集合であり得る。2つの遺伝子チップライブラリーにおける遺伝子の示差的発現レベルの比較は、生物学的サンプルが擾乱剤へ暴露される前後において高度に異なる発現を示す別個の遺伝子の同定に導く。上に開示される相関測定基準を用いて同定されるこれらの別個の遺伝子の位置とゲノムの領域との相関により、擾乱剤に抗反応性である特定の遺伝子を同定する方法が提供される。
【０１１７】
例示的な遺伝子チップライブラリーは、例えばKarpら「Identification of complement factor 5 as a susceptibility locus for experimental allergic asthma」Nature Immunology 1 (3), 221- 226 (2000)およびRozzoら「Evidence for an Interferon-inducible Gene,Ifi202, in the Susceptibility of Systemic Lupus」Immunity 15,435-443 (2001)に開示される研究の中で用いられている。さらに、幾つかの異なるタイプの遺伝子チップライブラリーを作製する方法がHyseq (Sunnyvale California)およびAffymax (Palo Alto, California)などの販売業者により提供される。
【０１１８】
擾乱剤によって影響されるゲノム中の染色体領域を調べるために構築される別の手法では、表現型データ構造60は、遺伝子型データベース52中の複数の生物56における各生物についての表現型アレイを含み（図2）、これらの各表現型アレイは該表現型アレイによって表される生物56中の複数の細胞構成要素における各細胞構成要素について示差的な発現値を含む。一実施形態において、異なる発現値のそれぞれは、(i)複数の生物中の生物56における細胞構成要素の天然発現値と、(ii)生物56が擾乱剤に暴露された後の生物56における細胞構成要素の発現値との間の差を表す。
【０１１９】
本明細書で用いられる「細胞構成要素」という用語には、個々の遺伝子、タンパク質、遺伝子を発現するmRNA、および/または生物学的応答実験において当業者により典型的に測定される他のあらゆる細胞構成要素が含まれる。
【０１２０】
一部の実施形態では、擾乱は経路擾乱（pathway perturbation）である。様々な細胞のレベルで生物学的経路の擾乱を標的化する方法（経路擾乱）が当業界で公知でありかつ利用されている。特定の細胞構成要素（例えば、遺伝子発現、RNA濃度、タンパク質の豊化、タンパク質活性、またはその他）を（段階的な増加または活性化あるいは段階的な減少または阻害のいずれかによって）特異的に標的化しかつ制御可能に改変することができるどんな方法も経路擾乱を実行する際に使用することができる。細胞構成要素の制御可能な改変は、結果として改変された細胞構成要素の起源となる経路を制御可能に混乱させる。この発明においては、このような特定の細胞構成要素の起源となる経路を使用して薬物作用を表すことが好ましい。好適な改変方法により、複数の細胞構成要素のそれぞれを個々に標的化することができ、最も好ましくはそのような細胞構成要素の実質的な画分を個々に標的化することができる。例えば、米国特許6,453,241(Bassett, Jr.ら)に記載される方法を参照のこと。
【０１２１】
5.11  引用文献
本明細書で引用される全ての参考文献は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願の各々が、あらゆる目的のために、その全体を参照により明細書に取り込まれることが特定的にかつ個々に示されているかのごとく、それと同程度に、すべての目的のためにかつそれらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１２２】
5.12  代替的な実施形態
本発明は、コンピュータ読取り可能な記憶媒体に格納されたコンピュータプログラム機構を含むコンピュータプログラム製品として実行することができる。例えばコンピュータプログラム製品は図1に示されるプログラムモジュールを含むことができる。これらのプログラムモジュールはCD-ROM、磁気ディスク記録製品、あるいは他のすべてのコンピュータ読取り可能なデータまたはプログラム記録製品に記録されてもよい。コンピュータプログラム製品中のソフトウェアモジュールは、搬送波による（ソフトウェアモジュールが記録される）コンピュータデータシグナルの転送により、インターネットなどを介して電子的に配信されてもよい。
【０１２３】
本発明の多くの変更および変形は、当業者に明らかであるように、本発明の思想および範囲から逸脱することなく実施することができる。本明細書に記載される特定の実施形態は例示のみを目的として提供されものであるし、また、本発明は、添付の特許請求の範囲と、権利化される特許請求の範囲と均等な全範囲とによってのみ制限されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図1は、本発明の一実施形態に従って表現型と生物のゲノム中のハプロタイプブロックとを関連付けるコンピュータシステムを図示する。
【図２】図2は、本発明の一実施形態に従って表現型と生物のゲノム中のハプロタイプブロックとを関連付ける処理ステップを図示する。
【図３】図3A、3B、3Cは選択一塩基多型（SNP）データと選択SNPデータによって表されるハプロタイプとを図示する。
【図４】図4A、4Bは選択一塩基多型（SNP）データと選択SNPデータによって表されるハプロタイプとを図示する。図4Cは図4Aと図4Bに示された各株についての仮定の定量表現型値を示す。
【図５】図5は、マウス第1染色体上の48〜58メガベースのハプロタイプブロック構造を示し、各列は異なるマウス株（生物）を表し、各行はSNPを表している。2種の可能なSNP遺伝子型はそれぞれ濃い影と薄い影で表し、不明瞭なハプロタイプ（データの欠落に起因する）は陰影がなされていない。
【図６】図6AはA/J、129、C57BL/6およびCAST/Ei株を用いて構築された第7染色体上の代表的なハプロタイプブロック構造（22.7Mb）を示し、各ハプロタイプブロックは水平線によって区切られている。図6Bは3種（A/J、129およびC57BL/6）および13種のマウス（Mus Musculus）株を用いてそれぞれ構築されたハプロタイプブロックの比較を示し、ハプロタイプブロックの境界に存在するSNPは線で結ばれている。
【図７】図7Aは、マウス第1染色体上の全てのSNPを用いた場合の、ハプロタイプブロックに含まれるSNPの総数のパーセンテージ（四角）および、１ブロックあたりのSNP数（ひし形）をマウス株の数の関数として示す。図7Bは、マウス第1染色体上の全てのSNPを用いた場合の、１ブロックあたりのハプロタイプ数を分析された株数の関数として示す。
【図８】図8A、8Bおよび8Cは、本発明の一実施形態に従う、表現型データのハプロタイプブロック上へのコンピュータマッピングを示す。
【図９】図9は、MHC Kハプロタイプと第17染色体上の１つの予測されたハプロタイプブロック構造との間の相関性を示している。ここで主要な対立遺伝子は濃い影で示され、少数の対立遺伝子は薄い影で示され、陰影のないものは対立遺伝子データの欠落を示す。
【図１０】図10Aは各近交マウス株についての肺でのCypla1遺伝子発現のレベルを示す。図10Bは、第12染色体上のAhr遺伝子座のハプロタイプブロック構造における79個のSNPがどのように3種のハプロタイプ群を形成し、7個のエクソンSNP（a〜gで標識）がタンパク質中のアミノ酸の変化をどのように生じさせるかを示している。
【図１１】図11は本発明の方法を用いて生物学的経路を再構築するための処理ステップを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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