(57)【要約】本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ  ＣｏＶ）を検出する試薬および方法を提供する。本発明は、関連した組成物、キット、システムおよびコンピューターも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１２および１５〜２４ならびにその相補体からなる群から選択される配列を有する核酸からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１〜１２および１５〜２４ならびにその相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、１００以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
プローブ核酸またはプライマー核酸を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
４０以下のヌクレオチドを有する、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含み、１００以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記核酸は配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体の１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
４０以下のヌクレオチドを有する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する方法であって、
（ａ）試料からの核酸と、配列番号１〜１２および１５〜２４およびその相補体からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１つのプライマー核酸とを、少なくとも１つの核酸増幅反応で接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の間あるいは後の核酸増幅反応からの核酸および／またはその１つまたは複数のアンプリコンを検出して、これにより試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する工程と
を含む方法。
【請求項１４】
前記プライマー核酸の少なくとも１つは修飾されたプライマー核酸を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンプリコンの少なくとも１つは長さが約４４０のヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅反応の少なくとも１回は配列番号１１または２２および配列番号１２または２０から選択される配列を含むプライマー核酸を使用して実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸増幅反応の少なくとも１回は配列番号１５または１８および配列番号１６または１９から選択される配列を含むプライマー核酸を使用して実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸増幅反応はｎｅｓｔｅｄポリメラーゼ連鎖反応法を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマー核酸の少なくとも１つは少なくとも１つの標識を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）は、標識によって生じる検出可能なシグナルを検出すること、または標識によって生じる検出可能なシグナルを増幅して増幅シグナルを生成し、この増幅シグナルを検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）は、アンプリコンと、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターすることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドは配列番号２７または配列番号２８から選択される配列を有する５’−ヌクレアーゼプローブを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在を決定する方法であって、
（ａ）試料からの核酸および／またはそのアンプリコンを、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの核酸を含む１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
（ｂ）前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターする工程とを含み、前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の検出可能な結合は、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在を判定する方法。
【請求項２５】
工程（ａ）は、前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとを少なくとも４２℃の温度の溶液中で少なくとも１５分間接触させることを含み、前記溶液の総重量は約５０％のホルマリンを含み、約１ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）と工程（ｂ）を少なくとも１つの追加試料を使用して少なくとも１回反復し、工程（ｂ）における核酸および／またはそのアンプリコンと、前記オリゴヌクレオチドとの間の結合を、少なくとも１回繰り返された工程（ｂ）に対し比較することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸の少なくとも１つのセグメントは工程（ａ）に先行してまたはその間にアンプリコンを生成する少なくとも１つの核酸増幅手法を用いて増幅され、工程（ｂ）は増幅の間あるいは後に前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターすることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
対象に由来する試料と、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドからなる組成物。
【請求項２９】
（ａ）配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、１００以下のヌクレオチドからなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および以下の
（ｂ）試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在が未知であるか未確認の状態で、前記試料からの核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターすることによって前記試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在を判定するための説明書、または
（ｃ）少なくとも前記オリゴヌクレオチドを包装するための少なくとも１つの容器の
１つまたは複数を含むキット。
【請求項３０】
少なくとも１つの酵素をさらに含む請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出するシステムであって、
（ａ）配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含み、１００以下のヌクレオチドからなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記試料からの核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の結合を検出する少なくとも１つの検出器と、
（ｃ）前記検出器と作動可能に連結した少なくとも１つのコントローラーとを含み、前記コントローラーは前記検出器で検出された結合を試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在と関連付ける１組または複数組の説明書
を含むシステム。
【請求項３２】
（ａ）配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体の１つまたは複数に対応する複数の配列に対応する複数の文字列を含むデータセットを含むコンピューターまたはコンピューター可読媒体と、
（ｂ）前記コンピューターまたはコンピューター可読媒体の出力に連結した自動シンセサイザーとを含み、前記自動シンセサイザーは前記コンピューターまたはコンピューター可読媒体から命令を受け、前記命令は前記データセット内の１つまたは複数の文字列と対応する１つまたは複数の核酸の合成を命令するシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]  本出願は、あらゆる目的において参照により完全に組み込まれている２００３年４月２１日出願の米国仮出願６０／４６４，１１５；２００３年４月２２日出願の６０／４６４，３４５；２００３年４月２３日出願の６０／４６４，６４３；２００３年４月２４日出願の６０／４６４，９６５；および２００３年８月１９日出願の６０／４９６，０１６の権益を主張する。
【０００２】
発明の分野
[0002]  本発明は、分子生物学および核酸化学の分野に関するものである。本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ  ＣｏＶ）を検出するための方法および試薬を提供し、したがって、医学的診断および予後診断の分野にも関する。
【０００３】
発明の背景
[0003]  重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、２００２年１１月の遅くに中国広東省で最初に確認された。続く数ヶ月の間に、中国の他の地域、ベトナム、カナダ、シンガポール、台湾および他の国で大流行が報告された。この疾患は、感染した個人の近くで接触した医療従事者および家族の間で示された高い感染性を有する点で普通ではない。さらに、感染した患者は急性の地域感染型定型的または非定型的肺炎のための経験的な抗微生物療法に反応しないことも報告されている（参照により組み込まれているＰｅｉｒｉｓら（２００３）「Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１３１９〜１３２５頁）。
【０００４】
[0004]  ＳＡＲＳ感染患者からの臨床検査材料により王冠型のＣｏＶ粒子の存在が明らかになったので、ＳＡＲＳの原因は新規コロナウイルス（ＣｏＶ）と特定された（参照によって組み込まれているＤｒｏｓｔｅｎら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７〜１９７６頁）。この新しいＣｏＶは、したがってＳＡＲＳ  ＣｏＶと称された。ＳＡＲＳ  ＣｏＶの完全長ゲノム配列は異なる分離株から報告され、ＳＡＲＳ  ＣｏＶのゲノム構成は他のＣｏＶのそれと類似していることが明らかとなった（参照により組み込まれているＭａｒｒａら（２００３）「Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９９〜１４０４頁およびＲｕａｎら（２００３）「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １４  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１７７９〜１７８５頁）。
【０００５】
[0005]  ＣｏＶはコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）と呼ばれるプラス（＋）鎖ＲＮＡのエンベロープを有するウイルスの一科であり、現在は新しく樹立されたＮｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目に分類されている。この目は、コロナウイルス科およびアルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）を含む。Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓという名称は、ラテン語の巣を意味するｎｉｄｕｓに由来し、ウイルス感染の間に生じる亜ゲノムｍＲＮＡの３’共末端の「入れ子」セットを指している（参照により組み込まれているＣａｖａｎａｇｈ（２００３）「Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｏｒｄｅｒ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ」、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４：６２９〜６３３頁）。ＳＡＲＳ  ＣｏＶゲノムは非常に大きく、２９．７ｋｂあり（参照により組み込まれている上記Ｍａｒｒａら（２００３）および上記Ｒｕａｎら（２００３））、推定上の２３のタンパク質をコードする。主要な構造タンパク質としては、ヌクレオカプシド（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）、スパイク、膜および小さなエンベロープがある。非構造タンパク質としては、パパイン様プロティナーゼ、３Ｃ様プロティナーゼ、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、ヘリカーゼならびにウイルスの複製および転写に関係する他の多くのタンパク質がある（参照により組み込まれている上記Ｃａｖａｎａｇｈ（２００３）、およびＮｇら（２００２）「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ，１６−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  １ａ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：６２５７〜６２６７頁）。他のＣｏＶでは、非構造タンパク質の多くはウイルスの配列で僅かに保存されるだけであるが、ＲｄＲｐは例外であり、多くのＣｏＶで高度に保存されている。
【０００６】
[0006]  感染性病原体の認識のためのプライマーおよび／またはプローブとしてのオリゴヌクレオチド配列の使用は、問題を含む免疫学的識別アッセイおよび他の既存の方法の１つの代替手段である。例えば、標的核酸配列を検出するために、標的核酸配列に相補性の核酸プローブがハイブリダイゼーション方法、例えばサザンブロットおよびドットブロットで使われている。これらのハイブリダイゼーション方法の多くは生物の培養および／または濃縮に依存しているので、通常、迅速な診断には不適当である。中でもＰＣＲ法などの特定の核酸配列を迅速に増幅する手法の出現により、プライマーおよびプローブ核酸を臨床検査材料に対して直接使用する機構が提供され、それによりハイブリダイゼーションアッセイを実施する前に病原体を濃縮してｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する必要がなくなった。したがって、増幅に基づくハイブリダイゼーションアッセイは、臨床試料中の病原体、例えばＳＡＲＳ  ＣｏＶの検出のための簡易で迅速な診断手法を提供できる。
【０００７】
発明の概要
[0007]  本発明は、コロナウイルス属の他の種または他属の種を実質的に検出せず、またそれらとの交差反応なしの、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの迅速で信頼でき、かつ感度の高い検出のための方法および試薬を提供する。さらに、本発明の方法および試薬を利用して特定のＳＡＲＳ  ＣｏＶウイルス型とは無関係にそのウイルスを検出することができる。オリゴヌクレオチド、組成物および反応混合物に加えて、本発明はこれらの病原体を検出するためのキットおよびシステム、ならびに関連したコンピューターおよびコンピューター読取り媒体にも関する。
【０００８】
[0008]  一態様では、本発明は配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体からなる群から選択される配列を有する核酸からなるオリゴヌクレオチドを提供する。他の態様では、本発明は配列番号１〜１２および１５〜２４ならびにその相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドを有する。他の態様では、本発明は配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体の１つと少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の配列同一性を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドを有する。一般的に、これらの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドはプライマー核酸、プローブ核酸またはその他である。ある実施形態において、本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドは、長さが約１２から約５０のヌクレオチドの配列を有する。例えば、一部の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは４０以下のヌクレオチド（例えば３５以下のヌクレオチド、３０以下のヌクレオチド、など）を有する。さらに実例を示すと、一部の実施形態ではこのようなオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、例えば本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変更するために変更される。一部の実施形態において、本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー分子を含む。ある実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む。
【０００９】
[0009]  他の態様において、本発明は試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する方法に関する。この方法は、（ａ）試料からの核酸と、配列番号１〜１２および１５〜２４およびその相補体からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１つのプライマー核酸とを、少なくとも１つの核酸増幅反応（例えばｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法など）で接触させる工程を含む。さらに、この方法は（ｂ）工程（ａ）の間あるいは後の核酸増幅反応からの核酸および／またはその１つまたは複数のアンプリコンを検出する工程も含み、これにより試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する。試料は、一般的には哺乳類の対象、例えばヒト対象に由来する。ある種の実施形態では、アンプリコンの少なくとも１つは、長さが約４４０のヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも１回の核酸増幅反応は、配列番号１１または２２および配列番号１２または２０から選択される配列を含むプライマー核酸を使用して実施される。ある実施形態では、少なくとも１回の核酸増幅反応は、配列番号１５または１８および配列番号１６または１９から選択される配列を含むプライマー核酸を使用して実施される。任意選択的に、少なくとも１つのプライマー核酸は、修飾されたプライマー核酸を含み、かつ／または少なくとも１つの標識を含む。いくつかの実施形態では、例えば、修飾されたプライマー核酸は核酸増幅特異性を変化させる修飾、および／または制限部位リンカー修飾を含む。ある種の実施形態では、工程（ｂ）はアンプリコンと、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターすることを含む。一般的に、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識、および／または少なくとも１つのクエンチャー分子を含む。ある種の実施形態では、例えば、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２７または配列番号２８から選択される配列を有する５’−ヌクレアーゼプローブを含む。これらの実施例では、任意選択的に工程（ｂ）は標識によって生じる検出可能なシグナルを検出すること、または、標識によって生じる検出可能なシグナルを増幅して増幅シグナルを生成し、この増幅シグナルを検出することを含む。
【００１０】
[0010]  他の態様では、本発明は試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在を判断する方法を提供し、この方法は（ａ）試料からの核酸および／またはそのアンプリコンと、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの核酸を含む１つまたは複数のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む。前記方法は、（ｂ）前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の結合をモニター（例えば、単一時点、複数の異なる時点、選択された期間内に連続的に、など）する工程も含み、前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとの間の検出可能な結合は、試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在を判定する。試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在は、通常工程(ａ)の前には未知であるか、または未確認である。ある実施形態において、工程(ａ)は前記核酸および／またはそのアンプリコンと前記オリゴヌクレオチドとを少なくとも４２℃の温度の溶液中で少なくとも１５分間接触させることを含み、前記溶液の総重量は約５０％のホルマリンを含み、また約１ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。さらに、前記方法は一般的にシークエンシング反応以外の反応を含む。試料は、一般的には哺乳類の対象、例えばヒト対象に由来する。ある実施形態において、前記核酸および／またはそのアンプリコンならびにオリゴヌクレオチドは、溶液内で接触させられる。任意選択的に、固体支持体が前記核酸および／またはアンプリコン（例えば、固体支持体上に配列される）を含む。他のオプションとして、固体支持体が前記オリゴヌクレオチドを含む。
【００１１】
[0011]  一部の実施形態において、核酸の少なくとも１つのセグメントは、工程(ａ)に先行してまたはその間に、アンプリコンを生成する少なくとも１つの核酸増幅手法を用いて増幅され、また工程（ｂ）は、増幅の間か後に核酸および／またはそのアンプリコンとオリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターすることを含む。例えば、前記核酸増幅手法は、一般的にＰＣＲ法（例えばｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法など）、リガーゼ連鎖反応および／またはその他を含む。これらの実施形態では、前記セグメントは配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つのプライマー核酸を用いて任意選択に増幅される。これらの実施形態の一部において、前記プライマー核酸は本明細書で記載されているかさもなければ当技術分野で公知の少なくとも１つの標識を含む。任意選択的に、前記プライマー核酸は修飾されたプライマー核酸（例えば、核酸増幅特異性を変化させる修飾、制限部位リンカーおよび／またはその他）を含む。
【００１２】
[0012]  他の態様では、本発明は対象に由来する試料と、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを含む組成物に関し、前記オリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドからなる。試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在は、通常未知であるかまたは未確認である。一般的に、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの化学的に合成された核酸を含む。ある実施形態において、任意のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは修飾される（例えば、修飾されていないヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変更するために修飾される）。
【００１３】
[0013]  一般的には、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー分子を含む。実例を示すと、前記標識は任意選択的に蛍光色素、弱蛍光性標識、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、質量修飾基、放射性同位体、酵素、その他を含む。
【００１４】
[0014]  本発明の組成物のオリゴヌクレオチドは、様々な形態で提供される。一部の実施形態において、例えば少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは溶液形態である。他の実施形態では、固体支持体が少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。このような実施形態では、オリゴヌクレオチドは非共有結合あるいは共有結合で固体支持体と結合している。これらの実施形態で利用される固体支持体の例は、例えばプレート、マイクロウェルプレート、ビーズ、ミクロビーズ（例えば磁気ミクロビーズ、その他）、チューブ（例えばマイクロチューブ、その他）、線維、ホイスカー、コーム、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層、などから任意選択的に選択される。
【００１５】
[0015]  さらに実例を示すと、前記オリゴヌクレオチドはビオチンまたはビオチン誘導体と任意選択的にコンジュゲートされ、固体支持体はアビジンまたはアビジン誘導体、あるいはストレプトアビジンまたはストレプトアビジン誘導体と任意選択的にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、リンカーはオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させる。このリンカーは、一般的には例えばオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴエチレングリセロール、オリゴアクリルアミド、アルキル鎖、などから選択される。任意選択的に、切断可能なアタッチメントがオリゴヌクレオチドを固体支持体に連結する。前記切断可能なアタッチメントは、通常、例えば熱、酵素、化学薬剤、電磁放射線、その他によって切断が可能である。
【００１６】
[0016]  他の態様では、本発明はキットを提供し、このキットは（ａ）配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、１００以下のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド；および下記の１つまたは複数、すなわち（ｂ）試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在が未知であるか未確認の状態で、試料からの核酸および／またはそのアンプリコンとオリゴヌクレオチドとの間の結合をモニターすることによって前記試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在を判定するための説明書、あるいは(ｃ)少なくとも前記オリゴヌクレオチドを包装するための少なくとも１つの容器を含む。一部の実施形態において、前記キットは少なくとも１つの酵素（例えばポリメラーゼ、その他）および／または１つまたは複数のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド、その他）をさらに含む。
【００１７】
[0017]  一部の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは溶液形態であり、他においては固体支持体がオリゴヌクレオチドを含む。この固体支持体は、例えばプレート、マイクロウェルプレート、ビーズ、ミクロビーズ、チューブ、線維、ホイスカー、コーム、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層、などから任意選択的に選択される。
【００１８】
[0018]  一般的に、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識、および／または少なくとも１つのクエンチャー分子を含む。標識の例としては、例えば蛍光色素、弱蛍光性標識、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、質量修飾基、放射性同位体、酵素、その他がある。
【００１９】
[0019]  他の態様において、本発明は試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出するシステム（例えば自動化システム）を提供する。このシステムは（ａ）配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する核酸を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドからなる。このシステムは、（ｂ）試料からの核酸および／またはそのアンプリコンとオリゴヌクレオチドとの間の結合を検出する少なくとも１つの検出器、および（ｃ）前記検出器と作動可能に連結した少なくとも１つのコントローラーも含み、前記コントローラーは前記検出器で検出された結合を試料中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの存在と関連付ける１組または複数組の命令を含む。さらに、一般的に、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識、および／または少なくとも１つのクエンチャー分子を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの容器または固体支持体がオリゴヌクレオチドを含む。これらの実施形態では、前記システムは任意選択的に（ｄ）容器内または支持体上の温度を調整するために容器または固体支持体に作動可能に接続している少なくとも１つの温度調整器、および／または（ｅ）例えば容器内または支持体上などで１つまたは複数の核酸増幅手法を実施するために、流動体を容器または固体支持体へ、かつ／またはそこから移す少なくとも１つの流動体輸送要素をさらに含む。
【００２０】
[0020]  他の態様では、本発明は（ａ）配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体の１つまたは複数に対応する複数の配列に対応する複数の文字列を含むデータセットを含むコンピューターまたはコンピューター可読媒体を含むシステムを提供する。前記システムは、（ｂ）前記コンピューターまたはコンピューター可読媒体の出力に連結した自動シンセサイザーも含み、前記自動シンセサイザーは前記コンピューターまたはコンピューター可読媒体から命令を受け、前記命令はデータセット内の１つまたは複数の文字列と対応する１つまたは複数の核酸の合成を命令する。
【００２１】
付録
[0021]  本出願は、合計２２頁の付属書とともに申請されている。この付録は、本発明の特定の態様をさらに説明するものであり、参照により組み込まれている。
【００２２】
詳細な説明
Ｉ．定義
[0028]  本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定のオリゴヌクレオチド（例えばプライマー核酸、プローブ核酸、その他）、方法、組成物、反応混合物、キット、システム、コンピューターまたはコンピューター可読媒体に限られていないこと、それらは当然変化し得ることを理解するべきである。本明細書で使われる専門用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であり、限定するものではないことも理解されたい。さらに、別に定義されていなければ、本明細書で使われる技術用語および科学用語の全ては、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明を記載しかつ／または請求する際に、以下の専門用語および文法上の変種が、下で述べられる定義に従って使われる。
【００２３】
[0029]  「５’−ヌクレアーゼプローブ」は、少なくとも２つの標識を含み、２つの標識の１つが切断されるかさもなければプローブから切り離された後に強度の増加した放射光を発するオリゴヌクレオチドを指す。ある種の実施形態では、例えば、５’−ヌクレアーゼプローブは２つの異なる蛍光色素、例えば５’末端レポーター色素および３’末端クエンチャー色素または分子で標識される。プローブが無傷のとき、エネルギー転移が一般的にこの２つの蛍光団の間で起こり、レポーター色素からの蛍光発光が消光する。ＰＣＲ法の伸張段階の間、例えば、テンプレート核酸と結合した５’−ヌクレアーゼプローブは、例えばＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素の蛍光発光はもはや消光しない。例示的な５’−ヌクレアーゼプローブは、例えば参照により組み込まれている、１９９３年５月１１日にＧｅｌｆａｎｄらに発行された米国特許第５，２１０，０１５号「ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＡＳＳＡＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＮＵＣＬＥＡＳＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  Ａ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ」、１９９９年１１月３０日にＨｉｇｕｃｈｉに発行された米国特許第５，９９４，０５６号「ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ」、および２００１年１月９日にＨｉｇｕｃｈｉに発行された米国特許第６，１７１，７８５号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＦＯＲ  ＨＥＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ」で記載されている。
【００２４】
[0030]  用語「変化」は、核酸配列の変化を指し、これには、それには限定されないが置換、挿入および／または欠失が含まれる。
【００２５】
[0031]  「増幅反応」は、１つまたは複数の標的核酸配列またはその相補体の、プライマーによって開始される複製を指す。
【００２６】
[0032]  「アンプリコン」は、別の分子の複製または転写によって生成する分子、例えば転写、クローニングおよび／またはポリメラーゼ増幅反応（「ＰＣＲ」）（例えばｎｅｓｔｅｄＰＣＲ、鎖置換ＰＣＲ増幅（ＳＤＡ）、複式ＰＣＲ増幅、その他）あるいは他の核酸増幅手法で生成する分子を指す。一般的に、アンプリコンは選択された核酸（例えばテンプレートまたは標的核酸）の複製であるか、またはそれに相補的である。
【００２７】
[0033]  「増幅シグナル」は、増幅反応の不在下または共存下で生じる増加した検出可能なシグナルを指す。シグナル増幅手法の例は、例えば参照により組み込まれているＣａｏら（１９９５）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｉｔｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｑｕｎａｔｉｆｙｉｎｇ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ」、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １１（３）：３５３〜３６１頁、ならびにＳｅｇｅｖへの米国特許第５，４３７，９７７号、Ｄｅｌａｉｒらへの米国特許第６，０３３，８５３号、およびＨｏｒｎへの米国特許第６，１８０，７７７号で記載されている。
【００２８】
[0034]  「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子または少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされ、リガンドとの検出可能な結合に関わることができるポリペプチドを指す。この用語は、天然に生じる形態ならびに断片および誘導体を含む。本明細書で使われる用語の範囲内の断片としては、様々なペプチダーゼによる消化で生成するもの、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２断片、化学的解離および化学開裂によって生成するものがあるが、その断片は標的分子、例えば疾患を示す抗原との検出可能な結合をする能力を維持するものとする。
【００２９】
[0035]  「アレイ」は、要素の集合を指す。この集合は空間的に整列している（「パターン化アレイ」）か、または乱雑（「ランダムパターン化」アレイ）である。このアレイは１つまたは複数の官能要素（例えばマイクロアレイ上のプローブ部位）を形成するかまたは含むことができ、あるいは、非官能的でもよい。
【００３０】
[0036]  用語「結合した」または「コンジュゲートした」は、物質または化合物が互いに連結しているかさもなければ結合している相互作用関係および／または状態を指す。これらの相互作用および／または状態は、一般的には例えば、共有結合、イオン結合、化学吸着、物理吸着およびその組み合わせによって生じる。ある種の実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドは固体支持体に結合する。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチドはビオチンとコンジュゲートされ（即ち、ビオチン化され）、固体支持体はアビジンとコンジュゲートされ、その結果前記オリゴヌクレオチドは例えばビオチンとアビジンとの結合相互作用を通して前記固体支持体に結合する。
【００３１】
[0037]  分子種は、それらが共有結合的および／または非共有結合的相互作用を通して互いに結ばれるときに「結合する」。例えば、２つの相補的一本鎖核酸は、互いにハイブリダイズして少なくとも１つの二本鎖領域を有する核酸を形成することができる。さらに実例を示すと、抗体および対応する抗原も、非共有結合的に互いに結びつくことができる。
【００３２】
[0038]  用語「切断」は、物質または化合物をアタッチメントから他の物質または化合物を放出する過程を指す。ある種の実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば固体支持体から切断されて溶液相の方法による前記オリゴヌクレオチドの分析を可能にする。例えば、参照により組み込まれているＷｅｌｌｓら（１９９８）「Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｒｅｓｉｎ  Ｂｅａｄｓ」、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：６４３０頁を参照。
【００３３】
[0039]  文字列の文字に関して使用される「文字」は、前記文字列のサブユニットを指す。一実施形態では、文字列の文字は、コードされた生体分子の１つのサブユニットをコードする。したがって、例えばコードされた生体分子がポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである場合、文字列の一文字は単一のヌクレオチドをコードする。
【００３４】
[0040]  「文字列」は、配列情報（例えば生体分子のサブユニット構造、例えば核酸のヌクレオチド配列など）を保存することができるいかなる実体である。一実施形態では、文字列は文字（文字、数字または他の記号）の単純な配列でよく、あるいは、そのような情報を有形または無形（例えば電子、磁気、その他）の形態で表した数字またはコードでもよい。文字列は「線形」である必要はなく、いくつかの他の形態、例えば、リンクリストまたは他の非線形アレイ（例えば、文字の線形アレイを生成するためのコードとして使われる）、またはその他の形態でも存在することができる。文字列は一般的に、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖を直接的にまたは間接的にコードするものであり、例えばいかなる暗号化された文字列、または画像またはオブジェクトの配列などであり、これらはポリヌクレオチドの単量体または多量体、またはその他のもの（天然または人工の単量体でできているにせよ）の配列を表わしている文字列に明白に転換することができる。
【００３５】
[0041]  用語「その相補体」は、ある核酸と同じ長さであり正確に相補性の核酸を指す。
【００３６】
[0042]  「組成物」は、２つ以上の異なる成分の組み合わせを指す。ある種の実施形態では、例えば、組成物は１つまたは複数の、例えば、支持体の表面に共有結合または非共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを含む固体支持体を含む。他の実施形態では、組成物は１つまたは複数の溶液状のオリゴヌクレオチドを含む。
【００３７】
[0043]  核酸配列との関連で用語「欠失」は、少なくとも１つのヌクレオチドが核酸配列から、例えば核酸配列の５’末端から、３’末端から、および／または内部の位置から取り出される変化を指す。
【００３８】
[0044]  用語「誘導体」は、他の物質と構造的に関連した化学物質、または、例えば化学的または酵素的修飾を通して他の物質（すなわち、それが由来する物質）から作ることができる化学物質を指す。実例を示すと、オリゴヌクレオチドはビオチンまたはビオチン誘導体と任意選択的にコンジュゲートされる。さらに実例を示すと、１つの核酸は、例えば、他の核酸の配列に関する知識に基づく化学合成、他の核酸の増幅、またはその他の過程を通して他の核酸から「誘導する」ことができる。
【００３９】
[0045]  用語「検出可能に結合する」は、１つまたは複数の検出方法を使用してバックグラウンドシグナル（例えばノイズ）より多く検出することが可能な少なくとも２つの分子種（例えばプローブ核酸と標的核酸、配列特異抗体と標的核酸、など）の間の結合を指す。
【００４０】
[0046]  核酸は、更なるヌクレオチド（あるいは、他の類似分子）が核酸に取り込まれるときに「伸展」または「伸長」する。例えば、核酸は、一般的に核酸の３’末端にヌクレオチドを加えるポリメラーゼなどの生体触媒を取り込んでいるヌクレオチドによって、任意選択的に伸展させられる。
【００４１】
[0047]  「伸展したプライマー核酸」は、１つまたは複数の更なるヌクレオチドが加えられるかまたはさもなければ取り込まれた（例えば、共有結合でそれに結合した）プライマー核酸を指す。
【００４２】
[0048]  核酸は、一般的に溶液内でお互いに結びつくとき、「ハイブリダイズ」または「結合」する。核酸は、特性の明確な様々な物理化学的力、例えば水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなどによりハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関しての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）によるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｏｂｅｓパートＩ第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（ニューヨーク）、ならびに参照により組み込まれているＡｕｓｕｂｅｌ（編）によるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻、１９９７で見られる。ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、イングランド（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  １）、ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、イングランド（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  ２）は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識化、検出および定量化に関する詳細を提供する。ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  １および２は、両方とも参照により組み込まれている。
【００４３】
[0049]  核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは実験、例えば核酸増幅反応、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション、その他との関連で、「厳密なハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲なガイドは、上記Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、およびＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、１および２で見られる。
【００４４】
[0050]  本発明の目的において、「非常に厳密な」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、既定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも少なくとも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に一致するオリゴヌクレオチドに対し試験配列の５０％がハイブリダイズする温度（既定のイオン強度およびｐＨの下で）である。非常に厳密な状態は、特定のオリゴヌクレオチドのＴｍと等しくなるように選択される。
【００４５】
[0051]  サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上の相補性核酸のハイブリダイゼーションのための厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む４２℃の５０％ホルマリンを使用し、ハイブリダイゼーションは一晩実施される。厳密な洗浄条件の例は、６５℃での０．２×ＳＳＣによる１５分間の洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明に関しては、参照により組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.（２００１）を参照）。しばしば、バックグラウンドのプローブシグナルを取り除くために、厳密性の高い洗浄には、厳密性の低い洗浄が先行する。厳密性の低い洗浄の例は、４０℃での２×ＳＳＣによる１５分間の洗浄である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブで観察されるものの５倍（あるいはより高い）ＳＮ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００４６】
[0052]  本発明の核酸を同定するために、比較ハイブリダイゼーションを用いることができる。
【００４７】
[0053]  特に、本発明との関連で厳密なハイブリダイゼーションが検出されることは、例えば、本明細書内の配列リストで示した核酸との構造上の高い類似性を示す。例えば、厳密条件下において本明細書内の例示核酸にハイブリダイズする試験核酸を同定することが望まれる。厳密なハイブリダイゼーションの測定手段の１つは、厳密条件下でリストされた核酸（例えば、配列番号１〜１２および１５〜２４およびその相補体から選択される配列を有する核酸）の１つと検出可能にハイブリダイズする能力である。厳密なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、いかなる試験核酸に対しても経験的に簡単に決定することができる。
【００４８】
[0054]  例えば、非常に厳密なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を決定する際には、一組の選択された基準が満たされるまでハイブリダイゼーションの厳密性および洗浄条件を徐々に高くする（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄において温度を上げることにより、塩濃度を低くすることにより、界面活性剤の濃度を高めることにより、および／またはホルマリンなどの有機溶媒の濃度を高めることにより）。例えば、ハイブリダイゼーションの厳密性および洗浄条件は、配列番号１〜１２および１５〜２４およびその相補性のポリヌクレオチド配列から選択される１つまたは複数の核酸配列からなるかまたはそれらを含むオリゴヌクレオチドが、完全に一致する相補性の標的（同じく、配列番号１〜１２および１５〜２４およびその相補性のポリヌクレオチド配列から選択される１つまたは複数の核酸配列を含む核酸）と結合してオリゴヌクレオチドと試料中に存在する非標的核酸（例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ以外の生物からの核酸）とのハイブリダイゼーションで観察されるものよりも少なくとも５倍高いＳＮ比になるまで徐々に高くする。
【００４９】
[0055]  非常に厳密な条件下において配列番号１〜１２および１５〜２４で表される核酸にハイブリダイズする標的核酸が検出されることは、本発明の特徴である。そのような核酸の例には、与えられた核酸配列と比較して１つまたは２、３のサイレントまたは保存的な核酸置換を有するものが含まれる。
【００５０】
[0056]  ２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で用語「同一の」または「同一性」パーセントは、例えば当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定することによりまたは目視検査により最大の対応関係を並べて比較したときに、同じであるかまたは特定割合の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性割合および配列類似性パーセントを決めるのに適当なアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴプログラムであり、これらは例えば参照により組み込まれているＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁、Ｇｉｓｈら（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２頁、Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１頁、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁、およびＺｈａｎｇら（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ  ｎｅｗ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６頁に記載されている。他の多くの最適アラインメントアルゴリズムも当技術分野で公知であり、配列同一性パーセントを決定するために任意に利用される。
【００５１】
[0057]  用語「溶液中」は、アッセイまたは反応のある条件を指し、そこではアッセイまたは反応の成分は固体支持体に結合していなく、液体媒体中に存在する。液体媒体の例は、水性および有機の液体である。例えば、本発明のあるアッセイは、ハイブリダイゼーションを起こさせるためにオリゴヌクレオチドをＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸アンプリコンと共に溶液中でインキュベートすることを含む。
【００５２】
[0058]  核酸配列との関連で用語「挿入」は、少なくとも１つのヌクレオチドが核酸配列の例えば核酸配列の５’末端、３’末端および／または内部の位置に加えられる変化を指す。
【００５３】
[0059]  「標識」は、分子と結合（共有結合または非共有結合で）しているかまたは結合することができる部分を指し、この部分はその分子に関する情報（例えば、その分子に関する記述的情報、識別情報、その他）または標識分子が相互に作用（例えば、ハイブリダイゼーションなど）する他の分子に関する情報を提供するあるいは提供することができる。標識の例としては、蛍光標識（例えばクエンチャーまたは吸収剤）、弱蛍光性標識、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えばペルオキシダーゼ、ホスファターゼなど）、その他がある。
【００５４】
[0060]  「リンカー」は、共有結合によりまたは非共有結合により化合物または置換基を他の部分、例えばプローブ核酸、プライマー核酸、アンプリコン、固体支持体、その他と結合させる化学分子を指す。例えば、リンカーはオリゴヌクレオチドを固体支持体（例えば、線状または他のロジックプローブアレイ）と結合させるために任意に用いられる。さらに実例を示すと、リンカーは任意選択的に標識（例えば蛍光色素、放射性同位体、その他）をプローブ核酸、プライマー核酸、その他と結合させる。リンカーは、一般的に少なくとも二機能性化学分子であり、ある実施形態において、それらは切断可能なアタッチメントを含み、これらは例えば熱、酵素、化学薬剤、電磁放射線、その他によって切断して、例えば固体支持体から物質または化合物を放出することができる。リンカーを慎重に選択することで、化合物およびアッセイ方法の安定性と適合する適当な条件下において切断することができる。通常、リンカーは化学種を互いに結合させるかそのような化学種の間の最短距離または他の空間関係を保つこと以外には、特定の生物的活性を有しない。しかし、リンカーの成分は、結合される化学種のある特性、例えば三次元構造、実効電荷、疎水性、その他に影響を及ぼすように選択することができる。リンカーの例としては、例えばオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴエチレングリセロール、オリゴアクリルアミド、アルキル鎖などがある。リンカー分子に関しては、例えば参照により組み込まれているＨｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）、Ｌｙｔｔｌｅら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１４）：２７９３頁、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏら（２００１）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０：３６９頁、Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００１）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０：１００７頁、Ｔｒａｗｉｃｋら（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：９００頁、Ｏｌｅｊｎｉｋら（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９１：１３５頁、およびＰｌｊｅｖａｌｊｃｉｃら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５（１２）：３４８６頁でさらに説明されている。
【００５５】
[0061]  「質量修飾」基は、一般的にはダルトン単位の分子量で測定されるその基を含む分子の質量を変更する。例えば、塩基１つ分大きさまたは配列が異なる少なくとも２つの核酸間の相違を増加させる質量修飾基は、例えば分子量測定を用いて配列決定を容易にするために使用することができる。
【００５６】
[0062]  「混合物」は、２つ以上の異なる成分の組み合わせを指す。「反応混合物」は、与えられた反応に関わることおよび／またはそれを容易にすることができる分子を含む混合物を指す。「増幅反応混合物」は、増幅反応を実施するのに必要な試薬を含む溶液を指し、一般的に適当な緩衝液中にプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および二価金属カチオンを含む。反応混合物は、反応を実施するのに必要な全ての試薬を含む場合は完全であると称され、それが必要な試薬の部分集合だけを含むならば不完全であると称される。反応成分は、便宜上、貯蔵安定性のため、または成分濃度の用途依存的な調整を可能にするために、各々が全成分の部分集合を含む別々の溶液として日常的に保存されること、また反応成分は反応前に合わされて完全な反応混合物が作製されることは当業者には理解されよう。さらに、反応成分は商品化のために別々に包装され、役に立つ市販のキットは、本発明の修飾されたプライマーを含めて反応成分のいかなる部分集合も含むことができることは当業者によって理解されよう。
【００５７】
[0063]  「修飾されたプライマー核酸」は、そのプライマー核酸に所望の特性を提供するヌクレオチド部分または配列を含むプライマー核酸を指す。ある種の実施形態では、例えば、修飾されたプライマー核酸は、例えば非特異的核酸増幅を減らし（例えば、プライマー二量体形成その他を最小にする）、意図した標的アンプリコンの収率を増やし、かつ／またはその他の働きをする「核酸増幅特異性を変更する修飾」を含む。核酸増幅特異性変更修飾の例は、例えば参照により組み込まれている、１９９９年１２月１４日Ｗｉｌｌに発行された米国特許第６，００１，６１１号「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＰＲＩＭＥＲＳ」で記載されている。他のプライマー核酸修飾の例としては、選択された制限部位を含むヌクレオチド配列が、例えばプライマー核酸の５’末端に結合している「制限部位リンカー修飾」がある。制限部位リンカーは、一般的に以降のアンプリコンクローニングなどを容易にするために、プライマー核酸と結合される。
【００５８】
[0064]  「部分」または「基」は、分子などのあるものが分割されて生成した部分の１つ（例えば官能基、置換基など）を指す。例えば、オリゴヌクレオチドは任意選択的にクエンチャー部分、標識化部分、またはその他を含む。
【００５９】
[0065]  用語「核酸」は、ヌクレオチド（例えばリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、その他）および直鎖または分岐状に共有結合で互いに結ばれたそのようなヌクレオチドを含むポリマーを指す。核酸の例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、ｃＤＮＡ、アプタマー、アンチセンス核酸、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、分子ビーコン、核酸プローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ（商標））、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体、ＰＮＡ−ＲＮＡ複合体、ＬＮＡ（商標）−ＤＮＡ複合体、ＬＮＡ（商標）−ＲＮＡ複合体、その他がある。
【００６０】
[0066]  核酸は一般的に一本鎖または二本鎖であり通常はホスホジエステル結合を含むが、本明細書で概説されているように一部のケースでは代わりの骨格を有する核酸類似体、例えばそれには限定されないが、リンアミド（参照により組み込まれているＢｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５頁およびその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００頁；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９頁；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７頁；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁；ならびにＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９頁）、ホスホロチオエート（参照により組み込まれているＭａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７頁；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（参照により組み込まれているＢｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１頁）Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（参照により組み込まれているＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（参照により組み込まれているＥｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５頁；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８頁；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６頁；および、Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７頁を参照）が含まれる。他の類似核酸としては、正に荷電した骨格を有するもの（参照により組み込まれているＤｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７頁）；非イオン性骨格を有するもの（参照により組み込まれている米国特許第５，３８６，０２３号、５，６３７，６８４号、５，６０２，２４０号；５，２１６，１４１号および４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３頁；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７頁；第２章および３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５頁；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７頁；およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３頁(１９９６)、ならびに非リボース骨��を有するもの、例えば参照により組み込まれている米国特許第５，２３５，０３３号および５，０３４，５０６号、および第６章および７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｖｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編で記載されているものがある。１つまたは複数の炭素環糖類を含む核酸も、核酸の定義の範囲に含まれる（参照により組み込まれているＪｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９〜１７６頁を参照）。いくつかの核酸類似体が、例えば、参照により組み込まれている１９９７年６月２日Ｒａｗｌｓ，Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ３５頁でも記載されている。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、標識などの別の部分の追加を容易にするため、または生理的環境でのそのような分子の安定性および半減期を変更するために加えることができる。
【００６１】
[0067]  核酸で一般的に見られるこれらの天然の複素環塩基（例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）に加えて、核酸類似体には非天然の複素環式または修飾された塩基を有するものも含まれ、その多くは本明細書で記載されているか、さもなければ引用されている。特に、多くの非天然の塩基は、参照により組み込まれているＳｅｅｌａら（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７４：１７９０頁、Ｇｒｅｉｎら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１〜９７６頁およびＳｅｅｌａら（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８２：１６４０頁でさらに記載されている。さらに実例を示すと、融点（Ｔｍ）修飾因子として作用するヌクレオチドで使われるある塩基が、任意選択的に含まれる。例えば、これらのいくつかを例示すると、７−デアザプリン（例えば７−デアザグアニン、７−デアザアデニンなど）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えばプロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣなど）、その他がある。例えば、参照により組み込まれている、１９９９年１１月２３日にＳｅｅｌａに発行された米国特許第５，９９０，３０３号「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ７−ＤＥＡＺＡ−２’−ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」を参照。他の代表的な複素環塩基としては、例えばヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ８−アザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピニルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル、その他がある。
【００６２】
[0068]  修飾された塩基およびヌクレオチドの例は、例えば参照により組み込まれている、１９９６年１月１６日にＦｒｏｅｈｌｅｒらに発行された米国特許第５，４８４，９０８号「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ５−ＰＲＯＰＹＮＹＬ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」、１９９７年７月８日にＦｒｏｅｈｌｅｒらに発行された米国特許第５，６４５，９８５号「ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＴＲＩＰＬＥ−ＨＥＬＩＸ  ＡＮＤ  ＤＯＵＢＬＥ−ＨＥＬＩＸ  ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」、１９９８年１１月３日にＦｒｏｅｈｌｅｒらに発行された米国特許第５，８３０，６５３号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＩＮＧ  ＯＬＩＧＯＭＥＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＳ」、２００３年１０月２８日にＫｏｃｈｋｉｎｅらに発行された米国特許第６，６３９，０５９号「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」、２００１年１０月１６日にＳｋｏｕｖに発行された米国特許第６，３０３，３１５号「ＯＮＥ  ＳＴＥＰ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＩＮ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥＳ」、および２００３年５月１５日に公開されたＫｏｃｈｋｉｎｅらによる米国特許出願２００３／００９２９０５「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」でも記載されている。
【００６３】
[0069]  用語「核酸検出試薬」は、検出可能にＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション、抗体抗原認識、その他における水素結合、または他の種類の結合相互作用）する試薬を指す。例えば、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体から選択される配列を含む核酸（例えば、プローブ核酸、プライマー核酸など）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と結合する。他の例示的な核酸検出試薬としては、特異的にＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と結合する配列特異抗体がある。
【００６４】
[0070]  「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルを指す。例えば、ヌクレオチドはヌクレオシドの糖残基の５’位置で共有結合する１つ、２つ、３つまたはより多くのリン酸基を含むことができる。
【００６５】
[0071]  「ヌクレオチドを取り込む生体触媒」は、核酸へのヌクレオチドの取り込みを触媒する触媒を指す。ヌクレオチドを取り込む生体触媒は、一般的に酵素である。「酵素」は、他の化合物または「基質」が関係する化学反応の活性化エネルギーを減らす作用をする、タンパク質ベースおよび／または核酸ベースの触媒である。「ヌクレオチドを取り込む酵素」は、例えば核酸増幅などの間に、核酸へのヌクレオチドの取り込みを触媒する酵素を指す。ヌクレオチドを取り込む酵素の例としては、例えばポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼなどがある。
【００６６】
[0072]  「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）、一般的には３つを超えるモノマー単位、より一般的には１０を超えるモノマー単位を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、通常、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用などの様々な因子によって決まる。オリゴヌクレオチドは、任意選択的にいかなる適当な方法、例えば、それには限定されないが、既存または天然の配列の単離、ＤＮＡの複製または増幅、逆転写、適当な配列のクローニングおよび制限消化、またはＮａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９頁のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１頁のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２頁のジエチルホスホルアミダイト法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５〜３１９１頁のトリエステル法；自動合成法；または米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法または当技術分野で公知の他の方法などの方法による直接的化学合成で調製される。これらの参考文献の全ては、参照により組み込まれている。
【００６７】
[0073]  用語「プローブ核酸」または「プローブ」は、適当な条件下で標的核酸と選択的にハイブリダイズすることができる、標識化または非標識のオリゴヌクレオチドを指す。一般的に、プローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸試料中の特定の標的配列と、選択されたハイブリダイゼーション条件下、例えばそれには限定されないが厳密なハイブリダイゼーション条件下において前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション二重鎖を形成するのに十分に相補的である。プローブを使用して十分に厳密なハイブリダイゼーション条件下において実施されるハイブリダイゼーションアッセイは、特異的な標的配列の選択的な検出を可能にする。用語「ハイブリダイゼーション部位」は、標的配列と正確にまたは実質的に相補的であり、したがってそれとハイブリダイズする核酸の部位を指す。配列内の単一のヌクレオチドの相違を識別するためのハイブリダイゼーションアッセイで使用するには、ハイブリダイゼーション部位は、一般的にヌクレオチド数が約８から約１００の長さである。ハイブリダイゼーション部位は通常、オリゴヌクレオチド全体を指すが、プローブは、例えばプローブ配列を固体支持体などと結合するための部位を提供するリンカー結合部位として機能する更なるヌクレオチド配列を含むことができる。ある実施形態において、本発明のプローブは１つまたは複数の標識（例えばレポーター色素、クエンチャー部分、その他）、例えば５’−ヌクレアーゼプローブ、ＦＲＥＴプローブ、分子ビーコンその他を含み、これらは試料中のプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出するためにも利用することができる。一部の実施形態において、プローブのハイブリダイゼーション部位は、標的配列と完全に相補的である。しかし、一般に、完全な相補性は必要ではなく、安定した二重鎖はミスマッチの塩基またはマッチしていない塩基を含むことができる。１つまたは複数の塩基対とミスマッチまたはマッチしない塩基との安定したハイブリダイゼーション二重鎖の形成を可能にするために、厳密な条件の修正が必要かもしれない。参照により組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.（２００１）は、適当な修正の手引きとなる。標的／プローブ二重鎖の安定性は、様々な変数、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、温度ならびにイオン条件によって決まる。当業者ならば、一般に、与えられたプローブの正確な相補体も同様にプローブとして有用なことを理解しよう。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と結合する本発明のプローブの例としては、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドがある。当業者ならば、ある実施形態において、プローブ核酸はプライマー核酸としても使うことができることを理解しよう。
【００６８】
[0074]  「プライマー核酸」または「プライマー」は、テンプレート核酸（例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸）とハイブリダイズすることができ、例えばヌクレオチドを取り込む生体触媒、例えばポリメラーゼを使用して適当な反応条件下で鎖の伸展または伸長を可能にする核酸である。プライマー核酸は、一般的に天然または合成のオリゴヌクレオチド（例えば一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドなど）である。他のプライマー核酸の長さも任意選択的に利用されるが、それらは一般的にヌクレオチド数が約８から約１００の長さのハイブリダイゼーション部位を含む。短いプライマー核酸は、通常、テンプレートＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を利用する。テンプレートＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸の部分配列と少なくとも部分的に相補的なプライマー核酸は、一般的にテンプレートとハイブリダイズして伸張が起こるのに十分である。所望によりプライマー核酸は、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の手法により検出可能な標識を取り込むことによって標識することができる。実例を示すと、有用な標識としては、放射性同位体、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（一般にＥＬＩＳＡで使われるように）、ビオチン、または抗血清またはモノクローナル抗体が利用できるハプテンおよびタンパク質がある。これらの標識および他の標識の多くは本明細書でさらに記載され、かつ／またはさもなければ当技術分野で公知である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と結合する本発明のプライマー核酸の例としては、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドがある。当業者ならば、ある実施形態において、プライマー核酸はプローブ核酸としても使うことができることを理解しよう。
【００６９】
[0075]  「クエンチャー部分」または「クエンチャー」は例えば蛍光または発光放射などの、さもなければその放射を発した供給源からの、放射の検出可能な発光を削減しかつ／または削減することができる部分を指す。クエンチャーは、一般的に、供給源から放出された検出可能な発光を少なくとも５０％、一般的には少なくとも８０％、より一般的には少なくとも９０％削減する。クエンチャーの例は、例えば参照により組み込まれている、２００２年１０月１５日にＨｏｒｎらに発行された米国特許第６，４６５，１７５号「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＲＯＢＥＳ  ＢＥＡＲＩＮＧ  ＱＵＥＮＣＨＡＢＬＥ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＬＡＢＥＬＳ，ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ」で提供されている。
【００７０】
[0076]  用語「試料」は、１つまたは複数のＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を含むか含むと推定されるいかなる物質をも指し、例としては、それには限定されないが、臨床試料（例えば、１つまたは複数の対象または個体から分離された組織または液体）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分、環境試料などがある。試料の例としては、血液、血漿、血清、大便、気管支肺胞洗浄液、鼻咽頭の拭き取りおよび組織、尿、滑液、精液、精漿、前立腺液、膣液、子宮頸部液、子宮液、子宮頸管掻き取り物、羊水、肛門掻き取り物、粘液、痰、組織などがある。
【００７１】
[0077]  用語「対象に由来する試料」は対象から得られた試料を指し、その試料は分析の前に１つまたは複数のプロセシング段階（例えば溶菌、デブリ除去、安定化、その他）を経ていようがいまいが関係ない。実例を示すと、試料は掻き取り、静脈穿刺、拭き取り、生検または当技術分野で公知の他の手法により対象から得ることができる。
【００７２】
[0078]  用語「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス」または「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ」は、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目コロナウイルス科に属する正鎖ＲＮＡのエンベロープを有するウイルスを指し、このウイルスに感染した対象で重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こす。例えば、参照により組み込まれているＫｉａｚｅｋら（２００３）「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９５３〜１９６６頁、Ｄｒｏｓｔｅｎら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７〜１９７６頁、Ｍａｒｒａら（２００３）「Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９９〜１４０４頁、Ｒｕａｎら（２００３）「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １４  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｕｔａｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１７７９〜１７８５頁、およびＣａｖａｎａｇｈ（２００３）「Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｏｒｄｅｒ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ」、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４：６２９〜６３３頁を参照。ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの完全な配列のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号の例は、ＮＣ＿００４７１８、ＡＹ２８３７９４、ＡＹ２７８４８９、ＡＹ２７８７４１、ＡＹ５５９０９７、ＡＹ５５９０９６、ＡＹ５５９０９５、ＡＹ５５９０９４、ＡＹ５５９０９３、ＡＹ５５９０９２、ＡＹ５５９０９１、ＡＹ５５９０９０、ＡＹ５５９０８９、ＡＹ５５９０８８、ＡＹ５５９０８７、ＡＹ５５９０８６、ＡＹ５５９０８５、ＡＹ５５９０８４、ＡＹ５５９０８３、ＡＹ５５９０８２、ＡＹ５５９０８１、ＡＹ２７４１１９、ＡＹ３２３９７７、ＡＹ２９１３１５などである。さらに実例を示すと、図１はＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌで決定されたＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノム（Ｕｒｂａｎｉ系統）のヌクレオチド配列を提供する。
【００７３】
[0079]  用語「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス核酸」または「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸」は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよび／またはそのアンプリコンに由来するかそれから単離された核酸を指す。
【００７４】
[0080]  核酸検出試薬との関連で用語「選択的に結合する」または「選択的な結合」は、同じハイブリダイゼーション条件下において対象外の核酸と結合するよりも強くＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と結合する核酸検出試薬を指す。
【００７５】
[0081]  用語「選択的に検出する」は、他の生物からの核酸よりも強くＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を検出する能力を指す。
【００７６】
[0082]  「選択的にハイブリダイズすること」または「選択的なハイブリダイゼーション」は、対象外の核酸配列とのハイブリダイゼーションと比べて、核酸配列が特定の核酸標的配列と検出可能により強くハイブリダイズするときに起こる。選択的にハイブリダイズする配列は、互いに少なくとも５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％以上の配列同一性、例えば一般的には９５〜１００％の配列同一性（すなわち相補性）を有する。
【００７７】
[0083]  核酸の「配列」は、核酸中のヌクレオチドの順序および識別を指す。配列は一般的に５’から３’の方向に読まれる。
【００７８】
[0084]  「配列特異抗体」は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と検出可能に結合する抗体を指す。
【００７９】
[0085]  「配列決定反応」は、例えばターミネーターヌクレオチドの使用を含み、与えられた核酸中のヌクレオチドの配列を解明するように設計されている反応を指す。
【００８０】
[0086]  「セット」は、少なくとも２つのものの集合を指す。例えば、セットは２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１，０００または他の数の分子または配列型を含むことができる。例えば、本発明のある態様は、アンプリコンのセットを有する反応混合物を含む。「サブセット」は、セットのいかなる部分をも指す。
【００８１】
[0087]  「固体支持体」は、化学物質部分、例えばオリゴヌクレオチドなどで誘導体化されるかまたはさもなければそれと結合することができる固体物質を指す。固体支持体の例としては、プレート、ビーズ、ミクロビーズ、チューブ、線維、ホイスカー、コーム、ハイブリダイゼーションチップ（マイクロアレイ基質、例えばＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）その他）、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層などを含む。
【００８２】
[0088]  オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと試料中に存在するかもしれない非標的配列との間に存在するミスマッチの数より少ないならば、このオリゴヌクレオチドは標的配列に「特異的」である。存在するミスマッチの数がオリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数以下の場合だけ安定した二重鎖が形成されるような、ハイブリダイゼーション条件を選択することができる。そのような条件において、標的特異的なオリゴヌクレオチドは、標的配列だけと安定した二重鎖を形成することができる。したがって、標的特異的なプライマーを十分に厳密な増幅条件下で使用することにより、標的プライマー結合部位を含むそれらの配列の特異的な増幅が可能になる。同様に、標的特異的プローブを適切に厳密なハイブリダイゼーション条件下で使用することにより、特異的な標的配列の検出が可能になる。
【００８３】
[0089]  試験核酸は、完全にマッチした相補性標的とのハイブリダイゼーションに比べて少なくとも半分よくオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするとき、すなわち、完全にマッチしたオリゴヌクレオチドが完全にマッチした相補性標的と結合してＳＮ比が試料中の対象外の核酸とのハイブリダイゼーションで観察されるものの少なくとも約５〜１０倍高くなる条件下において、ＳＮ比が標的とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの少なくとも半分の高さのときに、そのオリゴヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」と言われる。
【００８４】
[0090]  「対象」は、生物を指す。一般的に、この生物は哺乳動物、特にヒトである。ある実施形態では、例えば、対象はＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染症を有することが疑われている患者である。
【００８５】
[0091]  「部分配列」または「セグメント」は、核酸配列全体のいずれかの部分を指す。
【００８６】
[0092]  核酸またはポリペプチドとの関連で「実質的に同一の変異体」は、例えば配列比較アルゴリズムまたは目視検査により測定し、最大の対応を比較し並べたときに、互いに少なくとも８５％、一般的には少なくとも９０％、より一般的には９５％のヌクレオチドあるいは配列の同一性を有する２つ以上の配列を指す。実質的同一性は通常、長さが少なくとも約１５のヌクレオチドまたはアミノ酸である配列領域、より一般的には長さが少なくとも約２０のヌクレオチドまたはアミノ酸である領域に渡って存在し、より一般的には配列は長さが少なくとも約２５のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って実質的に同一である。いくつかの実施形態では、例えば、配列は比較している核酸またはポリペプチドの全長に渡って実質的に同一である。
【００８７】
[0093]  核酸配列との関連で用語「置換」は、核酸配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、異なるヌクレオチドで置換される変更を指す。
【００８８】
[0094]  用語「標的配列」、「標的領域」および「標的核酸」は、増幅、検出、さもなければ分析する核酸領域を指す。
【００８９】
[0095]  「ターミネーターヌクレオチド」は、核酸へ取り込まれると、例えば少なくとも１つのヌクレオチド取込み生体触媒による、更なる核酸の伸張を阻止するヌクレオチドを指す。
【００９０】
[0096]  「熱安定酵素」は、熱に安定で、耐熱性があり、選択された時間温度を上昇させても十分な触媒活性を保持する酵素を指す。例えば、熱安定ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性に必要な時間温度を上昇させても、以降のプライマー伸張反応に十分な活性を保持する。核酸の変性に必要な加熱条件は当技術分野で公知であり、参照により組み込まれている米国特許第４，６８３，２０２号および４，６８３，１９５号で例示されている。本明細書で使われるように、耐熱性ポリメラーゼは一般的にポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）などの温度サイクリング反応での使用に適当である。耐熱性ポリメラーゼに関しては、酵素活性はテンプレート核酸（例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸）に相補性のプライマー伸張産物を形成するための適当な方法によるヌクレオチドの複合化の触媒作用を指す。
【００９１】
ＩＩ．概要
[0097]  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（疾病予防管理センター、ＣＤＣ）は、重症急性呼吸器症候群、すなわちＳＡＲＳの世界的流行の原因と考えられているコロナウイルスのゲノム配列を決定した。図１は、このＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムのヌクレオチド配列を示し、それはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＹ２７８７４１に相当する。また、参照により組み込まれているＲｏｔａら（２００３）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００（５６２４））：１３９４〜１３９９頁を参照。この配列データから、ＳＡＲＳコロナウイルスは以前には認められていないコロナウイルスであることが確認される。リーダー配列を除いて、全ての配列はウイルスＲＮＡに直接由来した。ＣＤＣによって配列決定されたＳＡＲＳコロナウイルスのゲノムは、長さ２９，７２７のヌクレオチドであり、ゲノム構造は他のコロナウイルスのそれと類似している。例えば、参照によって組み込まれているＤｒｏｓｔｅｎら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７〜１９７６頁を参照。ポリメラーゼタンパク質（ポリメラーゼ１ａ、１ｂ）、スパイクタンパク質（Ｓ）、小膜タンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）に対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が特定された。
【００９２】
[0098]  本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの選択的な検出に関するものである。特に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの選択された標的領域を利用した新しい検出戦略に基づき、本明細書で記載されている方法および試薬を使用して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染症を診断することができる。ある実施形態では、例えば、本明細書で記載されているある核酸検出試薬は、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードし、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの他の領域と比較して突然変異に対して安定なことが判明したＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの領域を標的にする。本明細書で記載されている核酸検出試薬は、通常、選択されたアッセイ条件下において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに存在するが他の生物種には存在しないヌクレオチド配列と検出可能に結合し、したがって例えば偽陽性の発生を最小にする。本発明のある核酸検出試薬によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸の検出例は、例えば下記実施例で示されている。本発明の他の多くの特徴も本明細書で記載されている。
【００９３】
[0099]  さらに実例を示すと、本発明のある方法は、核酸検出試薬を対象（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染症が疑われるヒト患者、その他）に由来する試料中のまたは試料からの核酸と接触させるか、またはインキュベートすることを含む。ある実施形態において、試料中の核酸の標的領域は、核酸検出試薬との接触の前または同時に増幅される。これらの方法は、核酸および／またはアンプリコンと核酸検出試薬との間の結合をモニター（例えば、１時点で、複数の異なる時点で、選択された期間連続的に、その他）して、例えば試料を採取した患者の診断のため、ＳＡＲＳ感染症と診断された患者の治療経過をモニターするため、および／またはその他のためにＳＡＲＳ−ＣｏＶが試料中に存在するか判断することも含む。
【００９４】
[0100]  本発明の他の方法は、試料からの核酸を、核酸増幅反応において配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つの核酸を含む少なくとも１対のプライマー核酸と接触させるかまたはインキュベートすることを含む。さらに、これらの方法は試料中にＳＡＲＳ−ＣｏＶが存在するかどうかを検出するために、増幅反応の間またはその後にアンプリコンを検出することも含む。また、これらの方法は、選択された時点で任意選択的に繰り返される。
【００９５】
[0101]  組成物および反応混合物に加えて、本発明はＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するためのキットおよびシステム、ならびに関連したコンピューターおよびコンピューター読取り媒体にも関する。
【００９６】
ＩＩＩ．核酸検出試薬
[0102]  本発明の核酸検出試薬としては、プローブ核酸、プライマー核酸および配列特異抗体を含む様々な実施形態がある。一部の実施形態では、例えば、本明細書で記載されているある核酸検出試薬は、ＲｄＲｐをエンコードするＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムのセグメントを標的にする。ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムのこの領域は、参照により組み込まれているＮｇら（２００４）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：３４７〜３５０頁でも参照されている。
【００９７】
[0103]  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を標的とする核酸検出試薬の例としては、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドがある。配列番号１〜１２および１５〜２４を表１で示す。
【００９８】
【表１】
2006524052.tif 000002
【００９９】
[0104]  さらに実例を示すと、図２は様々なＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株およびお互いに関係のある特定の非標的の生物からのヌクレオチド配列のアラインメントを示す。図示の如く、第１群はヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）２２９Ｅ（登録番号ＮＣ＿００２６４５）およびブタ流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）（登録番号ＮＣ＿００３４３６）からの非標的のヌクレオチド配列のアラインメントを、標的ヌクレオチド配列である３つの異なるＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株、すなわち、トロント（登録番号ＮＣ＿００４７１８）、シンガポール（登録番号ＡＹ２８３７９４）および広州（登録番号ＡＹ２７８４８９）からのものと共に示している。図示の如く、配列番号２３および２４と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの位置には下線で示している。第２群はウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）（登録番号ＮＣ＿００３０４５）およびマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）（登録番号ＮＣ＿００１８４６）からの非標的のヌクレオチド配列のアラインメントを、標的ヌクレオチド配列は第１群で示した異なるＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株からのものと共に示している。配列番号２３および２４と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの位置も、第２群のアラインメント内における下線で示している。第３群はニワトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（登録番号ＮＣ＿００１４５１）からの非標的のヌクレオチド配列のアラインメントを、標的ヌクレオチド配列は第１群で示した異なるＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株からのものと共に示している。配列番号２３および２４と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの位置にも、第３群のアラインメント内における下線で示している。
【０１００】
[0105]  上記のように、本発明のある実施形態において、核酸検出試薬はオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ核酸、プライマー核酸、その他）を含む。他の長さも任意選択的に利用されるが、オリゴヌクレオチドは通常、長さが一般的に約８〜約１００のヌクレオチド、より一般的には約１０〜約７５のヌクレオチド、より一般的には約１２〜約５０のヌクレオチド、より一般的には約１５〜約３５のヌクレオチド（例えば約２０、約２５または約３０のヌクレオチド）の配列を含む。オリゴヌクレオチドを調製する方法、例えば核酸合成はさらに下で記載されている。
【０１０１】
[0106]  ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と選択的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体から選択される配列を有する核酸の実質的に同一な変異体）を設計するために、当業者は様々な方法を利用することができる。実例を示すと、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）から入手可能なＤＮＡｓｔａｒソフトウェアパッケージが、配列アラインメントのために使うことができる。例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムおよび非標的配列の核酸配列は、個々のファイルとしてＤＮＡｓｔａｒ  ＥｄｉｔＳｅｑプログラムにアップロードすることができる。さらに実例を示すと、配列ファイルの組はＤＮＡｓｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎ配列アラインメントプログラムで開くことができ、また、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法を適用することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントで使われるパラメータは、任意選択的にソフトウェアのデフォルト設定である。ＭｅｇＡｌｉｇｎは、一般的に２つの配列間の同一性パーセントの概要を提供しない。これは通常、手動で計算する。アラインメントからは、例えばお互いに８５％未満の同一性を有する領域が一般的に特定され、これらの領域のオリゴヌクレオチド配列を選択することができる。多くの他の配列アラインメントアルゴリズムおよびソフトウェアパッケージも、任意選択的に利用される。配列アラインメントアルゴリズムは、例えば参照により組み込まれているＭｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、およびＤｕｒｂｉｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）でも記載されている。
【０１０２】
[0107]  さらに実例を示すと、比較のために最適な配列アラインメントは、例えば参照により組み込まれているＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁のローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁のホモロジーアラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４頁の類似性検索法、およびこれらのアルゴリズムのコンピューター上での実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（マディソン、ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によっても行うことができる。
【０１０３】
[0108]  配列同一性パーセントを決定するのに適当な他のアルゴリズムの例は、参照により組み込まれているＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁で記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析のバージョンを実施するためのソフトウェアは、２００４年４月２０日現在、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立バイオテクノロジー情報センター、ＮＣＢＩ）を通してウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から公的に入手することができる。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列内の同じ長さのワードと並べたときに正の値の閾値スコアＴにマッチするかそれを満たす、クエリー配列内の長さＷのショートワードを特定することによって、高いスコアの配列の組（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ、ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰの検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、次に累積アラインメントスコアが増加するまで、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列のためにはパラメータＭ（一組のマッチング残基のリワードスコア；常に＞０）およびパラメータＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアの計算のためにはスコアリングマトリックスが用いられる。各方向へのワードヒットの拡張は、以下の場合停止される：累積アラインメントスコアが量Ｘによってその最大の達成値から下落する場合；累積スコアが、１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積によってゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）  １１、期待値（Ｅ）  １０、カットオフ値  １００、Ｍ＝５、Ｎ＝-４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長（Ｗ）  ３、期待値（Ｅ）  １０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（参照により組み込まれているＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９の）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５頁を参照）。
【０１０４】
[0109]  配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析も実施する（参照により組み込まれているＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７頁を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性測定手段の１つは、最小合計確率（Ｐ(Ｎ)）であり、それは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が約０．１未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満のとき、核酸は参照配列と類似している（したがって、相同）とみなされる。
【０１０５】
[0110]  有用な配列アラインメントアルゴリズムの更なる例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的なペアワイズアラインメントを使用して一群の関連した配列から複数の配列アラインメントを形成する。それは、アラインメントを作成するのに使用される、クラスタリング関係を示すツリーを図示することもできる。ＰＩＬＥＵＰは、参照により組み込まれているＦｅｎｇとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０頁の累進的アラインメント法の簡略法を用いる。使用される方法は、参照により組み込まれているＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３頁によって記載されている方法と類似している。このプログラムは、例えば最大長５，０００文字の最高３００の配列を一列に並べることができる。複数のアライメント方法では２つの最も類似した配列のペアワイズアラインメントから開始され、２つのアラインメントされた配列のクラスターを生じる。次に、このクラスターは、次の最も関連した配列またはアラインメントされた配列のクラスターと一列に並べることができる。２つの配列クラスターは、個々の２つの配列のペアワイズアラインメントを単純に拡張することによって並べることができる。最終的なアラインメントは、一連の累進的ペアワイズアラインメントによって達成される。このプログラムは、クラスタリング関係のデンドログラムまたはツリーを表示するのにも用いることができる。このプログラムは、特定の配列およびそれらの配列比較領域のアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより実施される。
【０１０６】
[0111]  本発明のプローブおよびプライマーは任意選択的に１つまたは複数の標識を含み、これについては下でさらに記載される。さらに、プローブおよびプライマーは、任意選択的に様々な他の修飾、例えばハイブリダイゼーション融点を変える修飾されたヌクレオチド、アンプリコンクローニングを容易にする制限部位リンカー、核酸増幅反応の特異性を高めるモディファイヤー基、および／またはその他を含む。例えば、より小さなプローブおよびプライマー、例えば、約８〜約１４のヌクレオチドを含むものが使用できるように、核酸ハイブリダイゼーション融点を高くするある修飾されたヌクレオチドが任意選択的に含まれる。これらの修飾されたオリゴヌクレオチドの例としては、１つまたは複数のＬＮＡ（商標）モノマーを有するものがある。このようなヌクレオチド類似体は、例えば参照により組み込まれている、２００３年１０月２８日にＫｏｃｈｋｉｎｅらに発行された米国特許第６，６３９，０５９号「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」、２００１年１０月１６日にＳｋｏｕｖに発行された米国特許第６，３０３，３１５号「ＯＮＥ  ＳＴＥＰ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＩＮ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥＳ」、および２００３年５月１５日に公開されたＫｏｃｈｋｉｎｅらによる米国特許出願２００３／００９２９０５「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ  ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」でさらに記載されている。ＬＮＡ（商標）モノマーを含むオリゴヌクレオチドは、例えばＥｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ（ＶｅｄｂａｅＫ（ＤＫ））を通して購入することができる。更なるプローブおよびプライマー修飾は、上で提供されている定義を含め本明細書で参照されている。
【０１０７】
[0112]  ある実施形態では、本明細書で記載されているように利用される核酸検出試薬は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を標的とする配列特異抗体である。本発明のこれらの実施形態での使用に適した抗体は、従来の方法および／または遺伝子操作によって調製することができる。抗体断片は遺伝子操作により、例えば軽鎖および／または重鎖の超可変部を含む可変部（ＶＨおよびＶＬ）から、またはＶＨおよびＶＬ部の両方から調製することができる。例えば、本明細書で使用される用語「抗体」としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびその生物学的活性断片があり、例えば中でも「一価」抗体（Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９５：７１２頁）；共有結合または非共有結合で凝集したＦａｂ’およびＦ(ａｂ’)２断片を含むＦａｂタンパク質；軽鎖または重鎖単独、一般的には重鎖可変部および軽鎖可変部（ＶＨおよびＶＬ部）、より一般的には超可変部（別名ＶＨおよびＶＬ部の相補性決定部（ＣＤＲ））を含む；Ｆｃタンパク質；１つより多くの抗原を結合させることができる「ハイブリッド」抗体；定常−可変部キメラ；異なる起源の重鎖および軽鎖を有する「複合」免疫グロブリン；標準の組換え手法、突然変異誘発手法、または当技術分野で公知の他の定方向進化手法によって調製され、改善された特異性および他の特性を有する「変更された」抗体などが含まれる。
【０１０８】
[0113]  本明細書で記載されているように利用される配列特異抗体は、標識されていても非標識であってもよい。適当な標識としては、例えば放射性核種、酵素、補酵素、蛍光色素、化学発光色素、色原体、酵素基質またはコファクター、酵素阻害剤、フリーラジカルなどがある。そのような標識化試薬は様々な公知のアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光免疫法、などで使用することができる。例えば、参照により組み込まれている米国特許第３，７６６，１６２号；３，７９１，９３２号；３，８１７，８３７号；および４，２３３，４０２号を参照。他の標識がさらに本明細書で記載されている。
【０１０９】
[0114]  一部の実施形態において、上で参照されたＲｄＲｐのようなポリペプチドが検出の対象である。タンパク質を検出するための多くの手法は、当技術分野で公知である。例えば、様々な電気泳動アッセイ（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）、イムノアッセイ、質量分析アッセイ（例えば、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）に基づく分析、表面増強レーザ脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）に基づくアッセイなど）および／または他の方法を用いてＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸によってコードされるタンパク質を検出することができる。これらの方法および他の適当なタンパク質検出法の多くは、本明細書の引用文献で記載されている。
【０１１０】
[0115]  本発明を実践する際に、分子生物学および組換えＤＮＡの従来の多くの手法が任意選択的に使われる。これらの手法は公知であり、例えば参照により組み込まれているＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻、１９９７（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ編）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．（２００１）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻、１９８５年（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４年（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８５年（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、１９８４年（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８６年（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、１９８６年（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ、１９８４年、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；シリーズＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、１９８７年（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５４巻および第１５５巻（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、Ｗｕ編）で説明されている。
【０１１１】
ＩＶ．配列変異
[0116]  標的配列またはそれらの標的配列を検出する剤であるかどうかに関係なく、多数の核酸およびポリペプチド配列が本発明の範囲内である。
【０１１２】
サイレント変異
[0117]  遺伝子コードの縮重によりポリペプチドをコードしている多数のＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸配列が生じ、そのいくつかは本明細書で明確に開示されている核酸配列と最小限の配列相同性を有しているかもしれないことは当業者によって認められよう。例えば、コドン表（表ＩＩ）を見ると、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵは全てアミノ酸アルギニンをコードすることが分かる。したがって、アルギニンがコドンによって特定されている本発明の核酸のあらゆる位置で、コドンはコードされるポリペプチドを変えることなく、上述の対応するコドンのいずれにも変更することができる。ＲＮＡ配列内のＵはＤＮＡ配列内のＴに対応することが理解されている。
【０１１３】
【表２】
2006524052.tif 000003
【０１１４】
[0118]  そのような「サイレント変異」は、以下に記す「保存的に修飾された変異」の１種である。当業者は、核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧを除いて）は、標準の手法により機能的に同一のポリペプチドをコードするように修飾することができることは理解しよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された配列のいずれにおいても明示的ではない。例えば、本発明は可能なコドンの選択に基づいて組み合わせを選択することによって作ることができる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲｄＲｐをコードしている核酸配列の各々のおよびあらゆる可能な変異を提供する。これらの組み合わせは、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲｄＲｐをコードしている核酸配列に適用される標準のトリプレット遺伝子コード（例えば、表IIで示したような）に従って作られる。本明細書のあらゆる核酸のそのような変異の全ては具体的に提供されており、遺伝子コードと組み合わせた配列を考慮して記載されている。
【０１１５】
保存的な変異
[0119]  特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」、または単に「保存的な変異」は、同一のまたは基本的に同一のアミノ酸配列をエンコードする核酸、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には基本的に同一の配列を指す。コードされる配列で単一のアミノ酸または低い割合（一般的に５％未満、より一般的に４％未満、２％未満または１％未満）のアミノ酸を変更するか、加えるか、または削除する個々の置換、欠失または付加は「保存的に修飾される変異」であり、その変化の結果として、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換が起こることは、当業者ならば認めるであろう。
【０１１６】
[0120]  機能的に類似したアミノ酸を提供している保存的置換表は、当技術分野で公知である。表ＩＩＩは、お互いに「保存的な置換」であるアミノ酸を含む６群を示す。
【０１１７】
【表３】
2006524052.tif 000004
【０１１８】
[0121]  したがって、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲｄＲｐの「保存的に置換された変異」は、低い割合、一般的に５％未満、より一般的に２％未満または１％未満において、ポリペプチド配列のアミノ酸の、同じ保存的置換群の保存的に選択されたアミノ酸による置換を含む。
【０１１９】
[0122]  核酸分子によりコードされたものの活性を変更しない配列の付加、例えば機能を持たない配列の付加は、基本的な核酸の保存的な変異である。
【０１２０】
[0123]  当業者は、本明細書で記載されている核酸の多くの保存的変異は、機能的に同一な核酸を与えることを認めるであろう。例えば、上で示したように、遺伝子コードの縮重のために、「サイレント置換」（すなわち、コードされるポリペプチドの変化をもたらさない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の暗示的特徴である。同様に、アミノ酸配列の１つまたは２、３のアミノ酸における「保存的なアミノ酸置換」は、非常に類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換され、また、開示されている構築物と非常に類似しているとして容易に特定される。開示されている各配列のそのような保存的変異は、本発明の特徴である。
【０１２１】
Ｖ．オリゴヌクレオチド合成
[0124]  本発明のオリゴヌクレオチドは、基本的に当技術分野で公知のいかなる手法を用いても任意選択的に調製される。ある種の実施形態では、例えば、本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドは、基本的にいかなる核酸合成法、例えば参照により組み込まれているＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９〜１８６２頁で記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法、または当技術分野で公知の他の合成手法、例えば参照により組み込まれているＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.１２：６１５９〜６１６８頁で記載されている自動シンセサイザーを用いた手法で化学的に合成される。自動化されたオリゴヌクレオチド合成のために、多種多様な装置が市販されている。マルチヌクレオチド合成方法（例えばトリヌクレオチド合成など）も任意選択的に利用される。さらに、本明細書で記載されているプライマー核酸は、任意選択的に様々な修飾を含む。例えばある種の実施形態では、例えば以降のアンプリコンクローニングその他を容易にするために、プライマーは制限部位リンカーを含む。さらに実例を示すと、参照により組み込まれている１９９９年１２月１４日Ｗｉｌｌに発行された米国特許第６，００１，６１１号「ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＰＲＩＭＥＲＳ」で記載されているように、増幅反応の特異性を改善するためにプライマーはまた任意選択的に修飾される。プライマーおよびプローブは、本明細書で記載されているように、さもなければ当技術分野で公知のように、他の様々な修飾を用いて合成することができる。
【０１２２】
[0125]  基本的に、本発明の核酸検出試薬を標識するためにいかなる標識でも任意選択的に利用される。例えばいくつかの実施形態では、標識は蛍光色素（例えばローダミン色素（例えばＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、その他）、フルオレセイン色素（例えば、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭ、その他）、ハロフルオロセイン色素、シアニン色素（例えばＣＹ３、ＣＹ３．５、ＣＹ５、ＣＹ５．５、その他）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素（例えばＦＬ、５３０／５５０、ＴＲ、ＴＭＲ、その他）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素（例えば４８８、５３２、５４６、５６８、５９４、５５５、６５３、６４７、６６０、６８０、その他）、ジクロロローダミン色素、エネルギー転移色素（例えば、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ  １色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ  ２色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ  ３色素、その他）、ルシファー色素（例えばルシファーイエロー、その他）、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、オレゴングリーンなどを含む。蛍光色素の更なる例は、例えば参照により組み込まれているＨａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第９版（２００３）およびその最新版で提供されている。蛍光色素は、通常、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．（ユージン、ＯＲ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、ＣＡ）などの様々な供給元から容易に入手可能である。他の標識としては、例えばビオチン、弱蛍光性標識（Ｙｉｎら（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（７）：３９３８頁、Ｂａｂｅｎｄｕｒｅら（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１７（１）；１頁、およびＪａｎｋｏｗｉａｋら（２００３）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６（３）：３０４頁）、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識（Ｗｉｌｓｏｎら（２００３）Ａｎａｌｙｓｔ．１２８（５）：４８０頁およびＲｏｄａほか（２００３）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １８（２）：７２頁）、ラマン標識、電気化学的標識、生物発光標識（Ｋｉｔａｙａｍａら（２００３）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７７（３）：３３３頁、Ａｒａｋａｗａら（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１４（２）：２０６頁およびＭａｅｄａ（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．３０（６）：１７２５頁）ならびに例えば２００２年１１月２２日に出願された米国特許仮出願６０／４２８４８４で記載されているαメチルＰＥＧ標識試薬があり、これらの参考文献は参照により組み込まれている。核酸標識は、さらに下で記載されている。
【０１２３】
[0126]  さらに、基本的にいかなる核酸（また、標準または非標準を問わず実質的にいかなる標識化核酸）も、様々な供給業者、例えばＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｌｉｇｏ  ＬＬＣ、その他多くの会社のいずれかから、注文生産によりまたは規格品を入手することもできる。
【０１２４】
ＶＩ．試料調製および核酸増幅
[0127]  試料は通常、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染が疑われる対象、一般的には哺乳類の対象、より一般的にはヒト対象に由来するか単離される。試料または検体の例としては、血液、血漿、血清、大便、気管支肺胞洗浄液、鼻咽頭の拭き取り物および組織、尿、滑液、精液、精漿、前立腺液、膣液、子宮頸部液、子宮液、子宮頸管掻き取り物、羊水、肛門掻き取り物、粘液、痰、組織などがある。基本的に、これらの試料を得るためのいかなる手法、例えば掻き取り、静脈穿刺、拭き取り、生検または当技術分野で公知の他の手法でも任意選択的に利用される。検体を保存する方法、細胞を培養する方法、これらの採取源から核酸を単離して調製する方法は、一般に当技術分野で公知であり、これらの多くは本明細書で提供されている参考文献および／または実施例でさらに記載されている。様々な実験生物学的安全性レベル（ＢＳＬ）のための推奨されている設備、実際および保護具も、ＣＤＣ／ＮＩＨ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓマニュアル（ＢＭＢＬ）で見ることができ、これは２００４年４月２０日現在、ウェブサイトｃｄｃ.ｇｏｖ／ｏｄ／ｏｈｓ／ｂｉｏｓｆｔｙ／ｂｍｂｌ４／ｂｍｂｌ４ｔｏｃ.ｈｔｍで利用可能である。
【０１２５】
[0128]  実例を示すと、血液および尿検体は、ＢＳＬ−２実験室でＳｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒｅｃａｕｔｉｏｎｓ（元Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｅｃａｕｔｉｏｎｓ）を使用して扱うことができる。実験室作業者は、粘膜表面の露出を防止するために、ディスポーザブル手袋、実験室上衣、眼保護具および手術用マスクまたは防災面を含む保護具を着用しなければならない。手袋の除去後、特に眼または粘膜表面に触れる前には手の衛生に注意が必要である。
【０１２６】
[0129]  微粒状のエアゾールを発生させる可能性のある方法（例えば開放管内の検体の撹拌または音波破砕）は、いずれも生物学的に安全なキャビネット（ＢＳＣ）内で実施しなければならない。利用できるならば、密封された遠心分離ローターまたは試料カップを遠心で使用しなければならない。理想的には、これらのローターまたはカップの取り出しはＢＳＣ内で行う必要がある。
【０１２７】
[0130]  ＢＳＣの外で実施される方法は、偶発的な試料放出による露出の危険性を最小にするように実施しなければならない。
【０１２８】
[0131]  作業台および設備は、検体を処理した後に除染しなければならない。脂質のエンベロープを有するウイルスに対して有効な標準の除染剤は、十分でなければならない。
【０１２９】
[0132]  上述の安全設備が利用できないならば、リスク削減のために管理措置および／または更なる個人的な保護具を使用することができる。このことは、実験室安全管理者による慎重なリスクアセスメントとの関連で実施しなければならない。例えば、遠心分離の間は最小限の数の労働者が存在するように、実験室の仕事の流れを調節することができる。
【０１３０】
[0133]  偶発的な試料放出の可能性が高まる遠心分離または他の処置の間に作業者が使用するように、呼吸保護手段の準備を考慮してもよい。許容できる呼吸保護手段としては、着用状態が適切に検査されたＮＩＯＳＨ承認のフィルター呼吸保護具（Ｎ−９５、または、より高性能）；または、高性能微粒子（ＨＥＰＡ）フィルターを備えている電動ファン付き呼吸用保護具（ＰＡＰＲ）がある。正確な着用状態の試験は、呼吸用保護具の有効な使用の重要な要素である。顔の毛または他の着用制限のために適合する呼吸用保護具を着ることができない者は、やや大きめのフード付きまたはヘルメット付きのＰＡＰＲを着用するべきである。
【０１３１】
[0134]  また、設備の十分な参照実験室への検体の委託も考慮することができる。
【０１３２】
[0135]  さらに例示すると、本明細書で記載されている標的核酸を分析する前に、それらの核酸を一般的に異なる成分の複合混合物を含む試料から精製または単離することができる。収集した試料中の細胞は、一般的には細胞含有物を放出させるために溶解する。例えば、特定の試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染が疑われる細胞は、様々な酵素、化学物質と接触させることによって溶解することができ、かつ／または当技術分野で公知の他の方法で溶解することができる。一部の実施形態において、核酸は細胞溶解物中で直接分析される。他の実施形態では、核酸は検出の前に細胞溶解物からさらに精製または抽出される。基本的に、試料中の核酸を精製するのに本発明の方法で利用されるいかなる核酸抽出法でも用いることができる。核酸の精製に使うことができる手法の例としては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、固体支持体上で固定したプローブへのハイブリダイゼーション、液液抽出（例えばフェノール−クロロホルム抽出、その他）、沈殿（例えば、エタノール、その他を使用して）、濾紙による抽出、ミセル形成試薬（例えばセチル−トリメチルアンモニウムブロミド、その他）による抽出、固定化挿入色素（例えばエチジウムブロミド、アクリジン、その他）への結合、シリカゲルまたは珪藻土への吸着、カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子または有機金属シラン粒子への吸着、および／またはその他がある。試料の処理は、例えば参照により組み込まれている米国特許第５，１５５，０１８号、６，３８３，３９３号および５，２３４，８０９号でも記載されている。
【０１３３】
[0136]  さらに例示すると、修飾されていない核酸は、シリカ表面を有す物質と結合することができる。本発明の方法を実施するときに使用されるように任意選択的に適合化されたこれらの方法の多くは、当技術分野で記載されている。例示すると、参照により組み込まれているＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：６１５〜６１９頁は、ヨウ化ナトリウムの存在下でフリント擦りガラスを使ったアガロースゲルからの核酸の精製を記載している。参照により組み込まれているＭａｒｋｏら（１９８２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３８２〜３８７頁は、過塩素酸ナトリウムの存在下での、ガラス粉上での細菌からの核酸の精製を記載している。参照により組み込まれているＤＥ−Ａ  ３７３４４４２では、ガラス繊維フィルター上で核酸が単離されている。これらのガラス繊維フィルターと結合した核酸は、洗浄されてからメタノール含有トリス／ＥＤＴＡ緩衝液で溶出される。類似した方法が、参照により組み込まれているＪａｋｏｂｉら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５：１９６〜２０１頁で記載されている。特に、Ｊａｋｏｂｉらは、カオトロピック塩溶液中でのガラス表面への核酸の選択的な結合、および汚染物質、例えばアガロース、タンパク質および細胞残渣からの核酸の分離を記載している。ガラス粒子を汚染物質から分離するために、粒子を遠心分離するか、または、ガラス繊維フィルターを通して液体を抜き取ることができる。さらに、塩およびエタノールを加えて沈殿後に磁性粒子を使用して核酸を固定することが、例えば参照により組み込まれているＡｌｄｅｒｔｏｎら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：１６６〜１６９頁およびＰＣＴ／ＧＢ９１／００２１２で記載されている。この方法において、核酸は磁性粒子と共に凝集する。凝集物は、磁場を与え、１つまたは複数の洗浄ステップを実施することによって元の溶媒から分離される。少なくとも１つの洗浄ステップの後、核酸は一般的にトリス緩衝液で溶解する。
【０１３４】
[0137]  例えばストレプトアビジンを含む層で被覆されている多孔性ガラスマトリックス内の磁性粒子は、本発明のある実施形態でも利用することができる。これらの粒子は、例えばビオチン結合化核酸およびタンパク質の単離に使うことができる。フェリ磁性、強磁性体および超常磁性粒子も、任意選択的に利用される。本明細書で記載されている方法を実施する際の使用に適合させることのできる磁性ガラス粒子および関連した方法は、例えば参照により組み込まれている国際公開０１／３７２９１でも記載されている。
【０１３５】
[0138]  核酸を引き出し検出するための最も強力な基本的技術の１つは、核酸増幅である。本発明において、興味の対象となる核酸の増幅は、一般的にそのＤＮＡの検出に先立つかまたは同時である。さらに、本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドは、例えば化学合成その他の後に任意選択的に増幅もされる。一部の実施形態において、例えば当技術分野で公知の分岐核酸または他のシグナル増幅フォーマットを用いて、検出可能なシグナルが増幅される。
【０１３６】
[0139]  本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドおよび方法で任意選択的に利用される、またはそれらの使用に適合された増幅方法としては、例えば様々なポリメラーゼまたはリガーゼ媒介増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）および／またはその他がある。これらおよび他の増幅方法の使用に関する詳細は、参照により組み込まれているＢｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら（２００１）「Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：２１〜２７頁を含む様々な記事および／または様々な標準テキストのいずれかで見られる。多くの利用できる生物学テキストも、ＰＣＲおよび関連した増幅方法に関して広範な考察を含む。核酸増幅は、例えば参照により組み込まれているＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号およびＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３頁でも記載されている。ＰＣＲにより大きな核酸を増幅する改善方法は、参照により組み込まれているＣｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４頁で総括されている。ある実施形態において、標的核酸を増幅するために二重ＰＣＲが利用されている。二重ＰＣＲ増幅は、例えば参照により組み込まれているＧａｂｒｉｅｌら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｍａｉｎｓ  ｂｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｔＤＮＡ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ」、Ｃｒｏａｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．４４（３）２９３、およびＬａら（２００３）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｄｕｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ  ｉｎ  ｐｉｇ  ｆｅｃｅｓ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（７）：３３７２頁でさらに記載されている。任意選択的に、例えばアンプリコンなどの検出を容易にするために、試料中の核酸を増幅するために標識化プライマー（例えばビオチン化プライマー、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、その他）が利用される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、例えば参照により組み込まれているＷｈｉｔｃｏｍｂｅら（１９９９）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（８）：８０４〜８０７頁でも記載されている。標識はさらに本明細書��記載されている。
【０１３７】
[0140]  アンプリコンは、当技術分野で公知のいくつかの方法、例えば電気泳動法、クロマトグラフィー、沈殿、透析、濾過および／または遠心分離のいずれかにより、他の反応成分から任意選択的に回収されて精製される。核酸精製の態様は、例えば参照により組み込まれているＤｏｕｇｌａｓら、ＤＮＡ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、およびＳｃｈｏｔｔ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ、＃２７、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９８４）で記載されている。ある実施形態において、アンプリコンは検出の前に精製されない。アンプリコンの検出は、さらに下で記載される。
【０１３８】
ＮＥＳＴＥＤ  ＰＣＲ
[0141]  本発明は、試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出する方法、およびコロナウイルスをタイピングする方法を提供する。例示的な方法は、次の通りである：
（ａ）２組みの増幅プライマーを使ったＮｅｓｔｅｄＰＣＲ。１組のプライマー（「内部」プライマーと呼ばれる）の標的ＤＮＡ配列の位置を、第２の組のプライマー（「外部」プライマーと呼ばれる）の標的配列内で決める。実際には、「外部プライマー」を使用して患者試料で先ず標準のＰＣＲ反応を実施する。その後、第１の反応の生成物を増幅標的として使用して第２のＰＣＲ反応を「内部プライマー」で実施する。この方法では、第２の反応で第１の反応の生成物を再増幅することにより、アッセイの感度が高くなる。内部プライマーは第１のＰＣＲ反応が特異的な生成物を生んだときだけ増幅するので、アッセイの特異性は高くなる。ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法の概略図を、図３で示す。
（ｂ）試料を、ハイブリダイズする条件下で、コンセンサスＳＡＲＳウイルスプライマー核酸、重合のための薬剤およびデオキシヌクレオシド５’−三リン酸で処理する。コンセンサスＳＡＲＳウイルスプライマーは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの標的領域とハイブリダイズするのに十分に相補性の少なくとも１組のプライマーを含み、伸張生成物またはアンプリコンがその組の少なくとも１つの構成メンバーから合成されるようなオリゴヌクレオチドの混合物である。相補鎖から分離すると、アンプリコンは１組のプライマー核酸の他の構成メンバーの伸張生成物またはアンプリコンの合成のための、テンプレートの役目を果たすことができる。
（ｃ）プライマー伸張生成物またはアンプリコンをそれらのテンプレートから分離して一本鎖分子にするために、変性条件下で試料を処理する。
（ｄ）ステップ(ｃ)で生成した一本鎖分子をテンプレートとして使用して更なるプライマー伸張生成物が合成されるような条件でステップ（ｂ）の生成物をステップ(ａ)のコンセンサスプライマーで処理する。
（ｅ）ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すことにより検出可能な量の標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコンを合成して増幅されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列を提供する。
（ｆ）ステップ（ｄ）で調製された反応混合物をハイブリダイズ条件で一般のプローブで処理することによって増幅が起こったか、またハイブリダイゼーションおよび増幅が起こったかどうかを決定する。
（ｇ）増幅されたＤＮＡに型特異的なＤＮＡプローブをハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを決定する。
【０１３９】
[0142]  ＰＣＲ法による核酸の増幅は、参照により組み込まれている米国特許第４，６８３，２０２号および４，６８３，１９５号でも記載されている。一般に、核酸のＰＣＲ増幅は、核酸の熱変性、増幅する核酸セグメントに連なる配列へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびアニールされたプライマーのポリメラーゼによる伸長のサイクルの繰り返しを含む。プライマーは標的配列の反対側の鎖にハイブリダイズし、その位置はポリメラーゼによる核酸合成がプライマー間の領域全体で進行し、前のサイクルで合成された標的核酸の量が効率的に倍増するようになっている。この結果、標的核酸の指数関数的な蓄積が起こる。
【０１４０】
[0143]  一般に、ＰＣＲに用いられるプライマーの選択によって増幅反応の特異性が決定する。本発明の方法の増幅ステップにおいて、型に関係なく試料中に存在するＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列を増幅する「コンセンサス」プライマーが使われる。本発明のコンセンサスプライマーとしては、縮重プライマー、いくつかのヌクレオチドのいずれか１つがプライマーに取り込まれるように合成されたオリゴヌクレオチドの混合物があり、試料に存在するいかなるＳＡＲＳ−ＣｏＶの核酸配列を増幅することができるように全ての種類のＳＡＲＳ−ＣｏＶに十分に相補的である。
【０１４１】
[0144]  本発明は、それまで未知のＳＡＲＳ−ＣｏＶの系統または型の発見をもたらすこともできる。
【０１４２】
５’−ヌクレアーゼ反応
[0145]  本発明のオリゴヌクレオチドは、５’−ヌクレアーゼＰＣＲ反応でＳＡＲＳ−ＣｏＶをリアルタイムで検出するために、５’−ヌクレアーゼプローブとして利用することもできる。
【０１４３】
[0146]  ５’−ヌクレアーゼ反応は、一般的に５’−ヌクレアーゼプローブを使用して、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を使用することによって特異的なＰＣＲ生成物を検出する。ある実施形態において、５’−ヌクレアーゼプローブは、その３’末端の伸張を阻止するためにブロックされる。５’−ヌクレアーゼプローブは一般的に部位特異的配列を含み、蛍光レポーター色素および蛍光クエンチャー色素で標識化される。一般的に、５’−ヌクレアーゼプローブは、ＰＣＲ反応で使われるプライマー配列の３’末端から下流の標的配列とハイブリダイズする。ＰＣＲの過程で、５’−ヌクレアーゼプローブは、標的領域内のその相補的な一本鎖核酸配列とハイブリダイズする。増幅が起こるとき、５’−ヌクレアーゼプローブは、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のために分解し、それにより伸張の過程でクエンチャーはレポーターから分離される。レポーターに対する消光効果の解放のために、レポーター色素の検出可能な蛍光強度は増加する。増幅過程の間、この発光は通常指数的に増加する。レポーター色素からの発光は、一般的に分光測光法でモニターされる。レポーター色素の蛍光強度の増加は標的配列のプローブハイブリダイゼーションおよび増幅が起こったときだけ達成されるので、５’−ヌクレアーゼアッセイは特異配列の有無を決定するための感度の高い方法（わずか２、３ｃｆｕ／ｍｌの濃度のウイルス核酸が検出される）を提供する。したがって、この手法は特に診断用途、例えば臨床試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出のための試料のスクリーニングなどで有用である。
【０１４４】
[0147]  ５’−ヌクレアーゼ反応における試料中ＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出に有用なプローブの例としては、例えば配列番号１７および２１と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドがある。実例を示すと、５’−ヌクレアーゼプローブは、５’末端でＦＡＭ蛍光団を取り込むことができ、３’末端でＴＡＭＲＡクエンチャーを取り込むことができる。さらに実例を示すと、本発明のある実施形態で、配列番号２１に対応する配列を有する５’−ヌクレアーゼプローブが、配列番号１１および配列番号２０と対応する配列を有するプライマー核酸と、リアルタイムＰＣＲ反応で任意選択的に使われる。
【０１４５】
[0148]  試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するために５’−ヌクレアーゼ反応で任意選択的に使われる条件の例を、下で示す。標的核酸が比較的高い比率で存在することが予想されるならば、反応条件ＩＩは通常より有用である。反応条件の最適化は、当業者の裁量で考慮される。
【０１４６】
反応条件Ｉ
２．５μｌ  １０×  ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ａバッファ    １×
３．０μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                            ３ｍＭ
０．７５μｌ  １０ｍＭ  ｄＡＴＰ                            ３００μＭ
０．７５μｌ  １０ｍＭ  ｄＣＴＰ                            ３００μＭ
０．７５μｌ  １０ｍＭ  ｄＧＴＰ                            ３００μＭ
０．７５μｌ  １０ｍＭ  ｄＵＴＰ                            ６００μＭ
０．０７５μｌ  １００μＭ順方向プライマー                  ３００ｎＭ
０．２２５μｌ  １００μＭ逆方向プライマー                  ９００ｎＭ
０．２５μｌ  １０μＭプローブ（配列番号１７または２１）    １００ｎＭ
０．１２５μｌ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（５Ｕ／μｌ）  ０．０２５Ｕ／μｌ
０．２５μｌ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）  ＵＮＧ（１Ｕ／μｌ）      ０．０１Ｕ／μｌ
１３．５７５μｌ  ヌクレアーゼフリーの水
２．０μｌ  ＤＮＡ標準／試料
総容積＝２５μｌ
サイクル条件
５０℃で２分間
６０℃で３０分間
９５℃で５分間
９５℃１５秒および６０℃１分を４０サイクル
２５℃で２分間
【０１４７】
反応条件ＩＩ
５μｌ  １０×  ＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファ  Ａ    １×
１１μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                            ５．５ｍＭ
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＡＴＰ                              ２００μＭ
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＣＴＰ                              ２００μＭ
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＧＴＰ                              ２００μＭ
１μｌ  ２０ｍＭ  ｄＵＴＰ                              ４００μＭ
１μｌ  １０μＭ順方向プライマー                        ２００ｎＭ
１μｌ  １０μＭ逆方向プライマー                        ２００ｎＭ
１μｌ  １０μＭプローブ（配列番号１７または２１）      １００ｎＭ  
０．５  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（５Ｕ／μｌ）  ０．０５  Ｕ／μｌ
０．５μｌ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（１Ｕ／μｌ）  ０．０１Ｕ／μｌ
１．２５μｌ  ２％グリセリン                            ０．０５％
２３．０８μｌ  ＲＮＡ分解酵素フリーの水
１．６７μｌ  ＤＮＡ標準／試料
総容積＝５０μｌ
サイクル条件
５０℃で２分間
９５℃で５分間
９５℃１５秒および６０℃１分を４０サイクル
２５℃で２分間
【０１４８】
[0149]  ５’−ヌクレアーゼ反応を用いたＲＴ−ＰＣＲを行うための網羅的なマニュアルは、本明細書で完全に組み込まれている２００２年４月に印刷されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」パートＮｏ．４３１０２９９  Ｒｅｖ.Ｃから利用できる。この刊行物は、２００４年４月２０日現在、ウェブサイトｕｃｌ.ａｃ.ｕｋ／ｗｉｂｒ／2／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｒｅｌｄｏｃｓ／1ｓｔｅｐｐｃｒ.ｐｄｆで利用可能であった。
ＶＩＩ．オリゴヌクレオチドアレイ
【０１４９】
[0150]  本発明のある実施形態において、本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドは共有結合または非共有結合により固体支持体に結合し、固体支持体は次に対象からの、増幅され標識された核酸を含む試料と接触させる。他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは溶液内で遊離の状態で提供される。基本的に、いかなる基質材も本発明のこれらの態様での使用のために任意選択的に応用される。例えばある種の実施形態では、基質はシリコン、ガラスまたはポリマー材（例えばガラスまたはポリマーの顕微鏡スライド、シリコンウエハース、その他）から作られる。顕微鏡スライドを含めて適当なガラスまたはポリマーの基質は、様々な供給元、例えばＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ＰＡ）その他から入手可能である。一部の実施形態において、本発明で利用される固体支持体は膜である。適当な膜材は、例えばポリアラミド膜、ポリカーボネート膜、多孔性のプラスチックマトリックス膜（例えばＰＯＲＥＸ（登録商標）Ｐｏｒｏｕｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ、その他）、多孔性の金属マトリックス膜、ポリエチレン膜、ポリ(二フッ化ビニリデン）膜、ポリアミド膜、ナイロン膜、セラミック膜、ポリエステル膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））膜、編メッシュ膜、精密濾過膜、ナノ濾過膜、限外濾過膜、透析膜、複合膜、親水性の膜、疎水性膜、ポリマーベースの膜、非ポリマーベースの膜、粉末活性炭膜、ポリプロピレン膜、ガラス線維膜、ガラス膜、ニトロセルロース膜、セルロース膜、硝酸セルロース膜、セルロースアセテート膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ポリオレフィン膜、その他から任意選択的に選択される。これらの膜材の多くは、広く様々な供給元、例えばＰ．Ｊ．Ｃｏｂｅｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（セントルイス、ＭＯ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ベッドフォード、ＭＡ）、その他から入手可能である。任意選択的に利用される他の固体支持体の例としては、例えばセラミックス、金属、樹脂、ゲル、プレート、ビーズ、ミクロビーズ（例えば磁気ミクロビーズなど）、チューブ（例えばマイクロチューブなど）、ホイスカー、線維、コーム、単結晶および自己集合単層がある。
【０１５０】
[0151]  本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば利用できるいかなる化学的または物理的方法によって、直接または間接的に（例えばリンカー、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを通して）支持体と結合される。分子を多種多様な固体支持体へ結合するために多種多様な結合化学の手法が利用できる。より具体的には、核酸は共有結合により、例えばカップリング剤による結合により、または静電的相互作用、水素結合もしくは抗体抗原結合のような非共有結合により、またはその組み合わせにより固体支持体に結合させることができる。典型的なカップリング剤としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌プロテインＡ／ＩｇＧ抗体Ｆｃ断片およびストレプトアビジン／プロテインＡキメラ（参照により組み込まれているＳａｎｏら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７８頁）、またはこれらの薬剤の誘導体もしくは組み合わせがある。核酸は、光切断可能な結合、静電結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合またはこれらの結合の組み合わせによって固体支持体に結合することができる。核酸は、選択的に解放可能な結合、例えば４，４’−ジメトキシトリチルまたはその誘導体によっても、任意選択的に固体支持体に結合される。有用であることを認めた誘導体としては、３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−ヒドロキシメチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−クロロメチル−安息香酸、およびこれらの酸の塩がある。
【０１５１】
[0152]  上で言及したように、オリゴヌクレオチドは核酸および固体支持体間のリンカーを通して固体支持体に任意選択的に結合される。有用なリンカーとしては、先に述べたように他のまたは更なる結合パートナーへ結合するための、あるいは固体支持体との結合を切断可能にするための結合剤がある。
【０１５２】
[0153]  切断可能な結合は、オリゴヌクレオチドと固体支持体との間に切断が可能な化学部分、例えばオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴアクリルアミド、オリゴエチレングリセロール、炭素原子数約６〜２０のアルキル鎖およびその組み合わせを結合することにより作製することができる。これらの部分は、例えば化学薬剤の添加、電磁放射線または酵素によって切断することができる。酵素によって切断が可能な結合の例としては、プロテアーゼで切断が可能なペプチド結合、およびヌクレアーゼで切断が可能なホスホジエステル結合がある。
【０１５３】
[0154]  β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および他の還元剤のような化学薬剤は、ジスルフィド結合を切断する。有用な他の薬剤としては、酸化剤、水和剤および他の選択的活性化合物がある。紫外線のような電磁放射線、赤外線および可視光は光切断性結合を切断する。結合は、例えば熱または酵素処理などにより可逆性でもよく、または可逆性化学結合もしくは磁性結合でもよい。解放および再結合は、例えば磁気または電場を使用して実施することができる。
【０１５４】
[0155]  アレイベースのハイブリダイゼーションは多くのアンプリコンの存在を同時に検出するために用いることができるので、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸の検出に特に適当である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの供給元から入手可能なものを含めいくつかのアレイシステムが記載されており、本発明での使用に応用することができる。アレイ構築および使用の態様は、例えば参照により組み込まれているＳａｐｏｌｓｋｙら（１９９９）「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ」、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１８７〜１９２頁；Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９８）「Ｍｕｔａｎｔ  ｙｅａｓｔ  ｏｎ  ｄｒｕｇｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１２３５〜１２３６頁；Ｆｏｄｏｒ（１９９７）「Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ」、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：Ａ８７９；Ｆｏｄｏｒ（１９９７）「Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３９３〜３９５頁；およびＣｈｅｅら（１９９６）「Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０〜６１４頁でも記載されている。
【０１５５】
ＶＩＩＩ．核酸ハイブリダイゼーション
[0156]  標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、適当なハイブリダイゼーション条件を選ぶことによって達成することができる。プローブ−標的核酸ハイブリッドの安定性は、一般的にアッセイおよび洗浄条件と適合するように選択されるので、プローブと標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸との間でだけ安定して検出可能なハイブリッドが形成する。１つまたは複数の異なるアッセイパラメータの操作により、特定のハイブリダイゼーションアッセイの正確な感度および特異性が決定する。
【０１５６】
[0157]  より具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡの組み合わせの相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電強度、緩衝液組成などが異なる多種多様な条件で起こる。これらの条件およびそれらを適用する方法の例は、例えば上記Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）および上記ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓに記載されている。通常、ハイブリダイゼーションはハイブリダイズする配列の性質およびその長さによって、約０℃から約７０℃の間で約１分から約１時間の間起こる。しかし、ハイブリダイゼーションは反応の状態によっては数秒または数時間で起こることが認められる。実例を示すと、２つの２０量体の混合物の典型的なハイブリダイゼーション条件は、混合物を６８℃の温度にし、次に５分間室温（２２℃）に冷却するか、または２μｌで２℃などの極低温にすることである。核酸間のハイブリダイゼーションは、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）、トリス−ＨＣｌおよびＨＥＰＥＳのような緩衝液、塩溶液（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２）または他の水溶液、試薬および化学物質を用いて促進することができる。これらの試薬の例としては、一本鎖結合タンパク質、例えばＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌一本鎖結合タンパク質および主要またはマイナーな核酸溝結合タンパク質がある。そのような試薬および化学物質の他の例としては、二価イオン、多価イオンおよび挿入物質、例えばエチジウムブロミド、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシンなどがある。
【０１５７】
ＩＸ．検出およびオリゴヌクレオチド変異
[0158]  上で言及したように、本発明の方法で利用される試料中の増幅された標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸は、オリゴヌクレオチド−標的ハイブリダイゼーション二重鎖の検出のために任意選択的に標識される。一般に、標識は、例えば増幅のために利用されるプライマーに結合して検出可能なシグナル（例えば定量可能なシグナル）を提供することができるいかなる部分でもよい。標識は、当技術分野で公知の様々な手法によって直接または間接にプライマーと結合することができる。使われる標識の種類にしたがい、標識は末端（プライマーの５’もしくは３’末端）または非末端ヌクレオチドに結合することができ、また様々な大きさおよび組成物のリンカーまたはスペーサーアームを通して間接的に結合することができる。市販のホスホラミダイト試薬を使用すると、適切に保護されたホスホラミダイトを仲立ちにして５’または３’末端に官能基（例えばチオールまたは一級アミン）を含むオリゴマーを生成することができ、また例えばＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）で記載されているプロトコルを使用してそのようなオリゴヌクレオチドを標識することができる。一実施形態では、標識は５’末端でプライマーと共有結合で結合したビオチン分子からなる。用語「ビオチン化プライマー」は、プライマーへ直接、または介在リンカー分子を通して間接的に結合した１つまたは複数のビオチン分子を有するプライマーを指す。
【０１５８】
[0159]  さらに実例を示すと、オリゴヌクレオチド−標的ハイブリダイゼーション二重鎖の検出は、例えば参照により組み込まれている市販のＷｈｉｔｅｈｅａｄら（１９８３）Ｎａｔｕｔｒｅ  ３０（５）：１５８頁で記載されているように、ルミノールベースの試薬を使った化学発光アッセイによって任意選択的に行われる。標識化標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの後、標的ＤＮＡと結合しているビオチン分子は、例えばストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）とコンジュゲートされる。あるいは、標的ＤＮＡを西洋ワサビペルオキシダーゼで直接標識し、それによって別のコンジュゲートステップを省略することができる。いずれにせよ、以降に西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素でルミノールを酸化すると光量子が放出され、光量子は次に例えば標準のオートラジオグラフィーフィルム上で検出される。シグナル強度は、ＤＮＡ量の関数である。通常、既知量のＤＮＡを含む一連のＤＮＡ標準が１つまたは複数の未知試料と共に分析される。既知のＤＮＡ標準の信号強度により、信号強度およびＤＮＡ量間の関数関係を経験的に決定でき、これにより未知試料の定量化が可能になる。他の多くの検出方法も、本発明の方法を実施するために任意選択的に利用され、また本明細書の引用文献で言及されており、かつ／または一般に当技術分野で公知である。
【０１５９】
[0160]  ＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコンの検出に利用できるいかなる方法も、本発明で使うことができる。一般の方法としては、分子ビーコンまたは５’−ヌクレアーゼプローブによるリアルタイムの増幅検出、挿入色素の検出、増幅プローブまたは増幅された核酸そのものに取り込まれた標識の検出（例えば、電気泳動により取り込まれなかった標識から増幅生成物を分離した後）、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ（例えば、アレイベースのアッセイ）および／または核酸と結合する二次試薬の検出がある。
【０１６０】
[0161]  さらに実例を示すと、分子ビーコンまたは５’−ヌクレアーゼプローブは、任意選択的に本発明のオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号１〜１２および１５〜２４から選択されるまたはその相補体）を含むように設計され、その分子ビーコンまたは５’−ヌクレアーゼプローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコンを検出するのに用いることができる。分子ビーコンまたは５’−ヌクレアーゼプローブは下でさらに記載される。これらの一般的方法に関する詳細は本明細書の引用文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌで見られる。核酸を標識するための更なる標識戦略および対応する検出戦略は、例えば参照により組み込まれているＨａｕｇｌａｎｄ（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で見られる。
【０１６１】
[0162]  分子ビーコン（ＭＢ）は、標的核酸（例えば標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコン）のリアルタイム検出および定量化のために設計されたオリゴヌクレオチドである。ＭＢの５’および３’末端は、共同でＭＢの検出可能な特性を付与する一対の部分を含む。末端の１つは蛍光団と結合し、他は蛍光団の蛍光発光を消光することができるクエンチャー分子と結合する。例えば、蛍光団−クエンチャーの組の１つの例では、ＥＤＡＮＳまたはフルオレセインなどの蛍光団を、例えば５’末端に、Ｄａｂｃｙｌのようなクエンチャーを、例えば３’末端に使用することができる。ＭＢが溶液中に遊離している場合、すなわち第２の核酸とハイブリダイズしていない場合、ＭＢの幹は相補的な塩基の対合によって安定化する。この自己相補的対合の結果、蛍光団およびクエンチャー部分がお互いに近接したＭＢの「ヘアピンループ」構造が形成する。この確認において、蛍光部分は蛍光団によって消光する。分子ビーコンのループは、一般的に本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドを含み（すなわち、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体から選択される）、したがって標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸中の検出する配列に相補的であるので、標的中の相補配列とループとのハイブリダイゼーションは幹の分離を起こし、それによって蛍光団とクエンチャーとの距離は互いに遠くなる。この結果、蛍光団の消光は起こらず、ＭＢの蛍光は増加する。
【０１６２】
[0163]  ＭＢの作製および使用の標準方法に関する詳細は文献で確立されており、ＭＢはいくつかの試薬販売元から入手可能である。ＭＢの製造および使用の方法に関する詳細は、例えば参照により組み込まれているＬｅｏｎｅら（１９９５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＡＳＢＡ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＮ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２１５０〜２１５５頁；Ｈｓｕｉｈら（１９９７）「Ｎｏｖｅｌ，ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ」  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３４：５０１〜５０７頁；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｌｅｌｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８〜１２２９頁；Ｓｏｋｏｌら（１９９８）「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ：ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１５３８〜１１５４３頁；Ｔｙａｇｉら（１９９８）「Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９〜５３頁；Ｆａｎｇら（１９９９）「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ」  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２９２１〜２９２２頁；およびＭａｒｒａｓら（１９９９）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ」  Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４：１５１〜１５６で見られる。ＭＢ構築および使用の態様は、特許文献、例えば参照により組み込まれているＴｙａｇｉらの米国特許第５，９２５，５１７号（１９９９年７月２０日）「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｕａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ，ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」；Ｔｙａｇｉら（２０００年１１月２１日）への米国特許第６，１５０，０９７号「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ」、およびＴｙａｇｉら（２０００年３月１４日）の米国特許第６，０３７，１３０号「Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」でも見られる。
【０１６３】
[0164]  ＭＢ成分（例えば、蛍光団またはクエンチャーで標識したものを含めオリゴ）は、従来法で合成することができる。これらの方法の一部は上でさらに記載されている。例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）は、標準の方法を使用して市販の自動オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ合成機で合成することができる。自動合成の間または前記した合成反応後に標識をオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡに結合することができる。例えば上記ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６）を参照。官能化オリゴヌクレオチドの合成に関する態様は、参照により組み込まれているＮｅｌｓｏｎら（１９８９）「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＣＰＧ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ａｒｅ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｓｅ  Ｐａｉｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７１８７〜７１９４ページでも見られる。標識／クエンチャーは、例えば孔制御ガラスカラムを用いて例えばクエンチャー（例えば、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニル部分（ＤＡＢＳＹＬ））を導入することにより、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡに導入することができる。例えば、クエンチャーは自動合成の間にオリゴヌクレオチドの３’末端に加えることができる。結合部位が一級アミノ基であるときは、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）のスクシンイミジルエステルを使うことができる。結合部位がスルフヒドリル基であるときは、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）を使うことができる。同様に、フルオレセインは、ヌクレオシドをフルオレセインで置換するフルオレセインホスホラミダイトを用いて、またはリンカーを通してチミジン環にフルオレセイン部分を導入するフルオレセインｄＴホスホラミダイトを用いてオリゴヌクレオチドに導入することができる。フルオレセイン部分を末端部位に結合させるために、ヨードアセトアミドフルオレセインをスルフヒドリル基に結合することができる。テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）は、５’−テトラクロロ−フルオレセインホスホラミダイトを使用して自動合成の間に導入することができる。他の反応性蛍光団誘導体およびそのそれぞれの結合部位としては、アミノ基に結合した５−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＨＤ）のスクシンイミジルエステル；スルフヒドリル基に結合したテトラメチルローダミンのヨードアセトアミド；アミノ基に結合したテトラメチルローダミンのイソチオシアネート；または、スルフヒドリル基に結合したＴｅｘａｓ  ｒｅｄのスルホニルクロリドがある。これらの標識化成分の合成の間、コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡは、所望により例えば高圧液体クロマトグラフィーまたは他の方法によって精製することができる。
【０１６４】
[0165]  様々な供給元、例えばＣｒｕａｃｈｅｍ（ｃｒｕａｃｈｅｍ.ｃｏｍ）、Ｏｓｗｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．（英国；ｏｓｗｅｌ.ｃｏｍ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ハンツヴィルＡＬの一部門（ｒｅｓｇｅｎ.ｃｏｍ））、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミッドランド、ＴＸ  ｍｃｒｃ.ｃｏｍ）およびＧｏｒｉｌｌａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＬＬＣ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）などが標準および注文製品の分子ビーコンを生産している。分子ビーコンを利用する様々なキット、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラホーヤ、ＣＡ）からのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎキット、ならびにＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃＳＡ（ベルギー、ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ.ｃｏｍ）およびＩｓｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ（オランダ、ｉｓｏｇｅｎ.ｃｏｍ）からの様々なキットも市販されている。
【０１６５】
[0166]  上でも言及したようにある実施形態において、１つまたは複数の５’−ヌクレアーゼプローブを含むリアルタイムＰＣＲアッセイ系が、増幅されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を検出するために使われる。これらの系はある種のポリメラーゼの内因性ヌクレアーゼ活性を用いて作動し、本発明のクエンチャーおよび標識を含むオリゴヌクレオチドからクエンチャーまたは標識を切断し、その結果、標識は消光しなくなる。ポリメラーゼは複製が開始したときだけ、すなわちオリゴヌクレオチドがテンプレートと結合してポリメラーゼがプライマーを伸張するときだけクエンチャーまたは標識を切断する。したがって、適切に標識化されたオリゴヌクレオチドおよび適当なヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼは、興味の対象であるＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を検出するのに用いることができる。ＦＲＥＴまたはその他（および関連したリアルタイム逆転写ＰＣＲ）によるリアルタイムＰＣＲ生成物の解析は、リアルタイムＰＣＲモニタリングのための、様々な状況で使用され本明細書で記載されているプローブおよび方法での使用に応用することができる公知の手法を提供する（参照により組み込まれているＬａｕｒｅｎｄｅａｕら（１９９９）「ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ＩＮＫ４  ｌｏｃｕｓ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４５（７）：９８２〜６頁；Ｌａｕｒｅｎｄｅａｕら（１９９９）「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＹＣ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ」Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５９（１２）：２７５９〜６５頁；およびＫｒｅｕｚｅｒら（１９９９）「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｒ／ａｂ１  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９（１３）：３１７１〜４頁を参照）。さらに実例を示すと、本発明の５’−ヌクレアーゼプローブの例としては、５’−（６−ＦＡＭ）−ＡＧＣＴＡＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣＡＡＧＴＡＴＴＡＡＧＴＧＡＧＡＴＧ−（ＴＡＭＲＡ）（リン酸）−３’（配列番号２７）、および５’−（６−ＦＡＭ）−ＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＴＡＡＣＡＴ(ＮＦＱ)−３’（配列番号２８）がある。
Ｘ．システム
【０１６６】
[0167]  本発明は、試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するシステムも提供する。本明細書で記載されているようにこのシステムは１つまたは複数の核酸検出試薬を含む（例えば、プローブ核酸、配列特異抗体、その他）。ある実施形態において、核酸検出試薬は固体支持体上に配列され、他の実施形態では、例えば溶液内で実施されるアッセイのために、それらは１つまたは複数の容器に入れられて提供される。このシステムは、試料からの核酸および／またはそのアンプリコンと核酸検出試薬との間の結合を検出する少なくとも１つの検出器（例えばスペクトロメータなど）も含む。他の検出器はさらに下で記載されている。さらに、このシステムは検出器に作動可能に接続されている少なくとも１つのコントローラーも含む。コントローラーは、検出器で検出された結合を試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在と相関させる１組または複数組の命令を含む。
【０１６７】
[0168]  一部の実施形態において、少なくとも１つの容器は核酸検出試薬を含む。これらの実施形態では、このシステムは容器内の温度を調整するために容器に作動可能に接続されている少なくとも１つの温度調整器、および／または例えば容器内などで１つまたは複数の核酸増幅手法を実施するために、流動体を容器へ、かつ／またはそこから移す少なくとも１つの流動体輸送要素（例えば自動ピペッタなど）を任意選択的にさらに含む。
【０１６８】
[0169]  本明細書で記載される核酸検出試薬（例えば、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド、配列特異抗体、その他）を使用してＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を検出するために任意選択的に利用される市販システムの例としては、例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（インディアナポリス、ＩＮ）から入手可能なＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システム（例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）またはＣＯＢＡＳ  ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（オースティン、ＴＸ）から入手可能なＬＵＭＩＮＥＸ  １００（商標）システム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、ＣＡ）から入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムなどがある。
【０１６９】
[0170]  本発明は配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体の１つまたは複数に対応する複数の配列に対応する複数の文字列を含むデータセットを含むコンピューターまたはコンピューター可読媒体をさらに提供する。一般的に、このコンピューターまたはコンピューター可読媒体は、このコンピューターまたはコンピューター可読媒体の出力に連結した自動シンセサイザーをさらに含む。この自動シンセサイザーは前記コンピューターまたはコンピューター可読媒体から命令を受け、この命令は、例えばデータセット内の１つまたは複数の文字列と対応する１つまたは複数のプローブ核酸の合成を命令する。システムおよびシステムコンポーネントの例は、さらに下で記載される。
【０１７０】
[0171]  検出器は、システムの他の要素の中または近く（例えば、容器内、固体支持体上、その他）で生じた検出可能なシグナルを検出する構造になっている。これらのシステムで任意選択的に利用されるかまたはそこでの使用のために応用されるに適した信号検出器は、例えば蛍光、リン光、放射能、吸光度、屈折率、発光、またはその他を検出する。検出器は任意選択的に、例えば与えられたアッセイ段階の実施の上流および／または下流からの一つまたは複数のシグナルをモニターする。例えば、検出器は位置的に「リアルタイム」結果と一致する複数の光学シグナルを任意選択的にモニターする。検出器またはセンサーの例としては、光電子増倍管、ＣＣＤアレイ、光センサー、温度センサー、圧力センサー、ｐＨセンサー、伝導度センサー、スキャニング検出器、またはその他がある。これらならびに他の種類のセンサーの各々は、任意選択的に本明細書で記載されているシステムに容易に取り込まれる。任意選択的に、本発明のシステムは複数の検出器を含む。
【０１７１】
[0172]  これらのシステムで任意選択的に利用されるより特異的な検出器の例としては、例えば共鳴光散乱検出器、放出分光器、蛍光分光器、リン光分光器、発光分光器、分光光度計、光度計などがある。様々な合成要素も本発明のシステムで利用されるか応用され、これらの例としては、例えば本明細書で記載されているオリゴヌクレオチドを合成するための自動核酸シンセサイザーがある。任意選択的に本発明のシステムに含まれる検出器および合成要素は、例えば参照により組み込まれているＳｋｏｏｇら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第５版、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８）およびＣｕｒｒｅｌｌ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）でさらに記載されている。
【０１７２】
[0173]  一般的に本発明のシステムは、要素の作動を制御するために、システムの１つまたは複数の要素（例えば検出器、合成要素、温度調整器、流体輸送要素、その他）に作動可能に接続されたコントローラーも含む。より具体的には、通常コントローラーは分離または一体化されたシステムコンポーネントとして含まれ、例えば、検出器からのデータを受信するため、容器内の温度を有効にしかつ／もしくは調節するため、選択された容器へのまたは容器からの流動を有効にしかつ／もしくは調節するため、またはその他の目的のために使用される。コントローラーおよび／または他のシステムコンポーネントは、任意選択的に適切にプログラムされたプロセッサ、コンピューター、ディジタル素子または他の情報機器（例えば、必要に応じてＡＤコンバータまたはＤＡコンバータ）に連結され、これらは前もってプログラムされたかまたはユーザーが入力した指示に従ってこれらの機器の動作を指示し、これらの機器からデータおよび情報を受信し、この情報を解釈し、操作し、ユーザーに報告する役目をする。適当なコントローラーは一般に当技術分野で公知であり、様々な供給元から入手可能である。
【０１７３】
[0174]  いかなるコントローラーまたはコンピューターも任意選択的にモニターを含み、しばしばブラウン管（「ＣＲＴ」）のディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えばアクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイなど）、その他が使用される。コンピューター回路は、多数の集積回路チップ、例えばマイクロプロセッサ、メモリー、インタフェース回路、その他を含む箱内に置かれることが多い。箱は、任意選択的にハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、大容量リムーバブルドライブ、例えばライタブルＣＤ−ＲＯＭ、および他の一般の周辺要素を含む。キーボードまたはマウスのような入力装置は、任意選択的にユーザーからの入力を可能にする。これらの要素は、さらに下で例示される。
【０１７４】
[0175]  一般的にコンピューターは、一組のパラメーターフィールドへの、例えばＧＵＩによるユーザー入力の形式、または、前もってプログラムされた命令、例えば様々な異なる具体的な作業のために事前にプログラムされた命令の形式の、いずれかのユーザーの指示を受け取るための適当なソフトウェアを含む。このソフトウェアは、次に、所望の作業を実施するために、１つまたは複数のコントローラーの動作を指示するための適当な言語にこれらの命令を変換する。次にコンピューターは、例えばシステム内に含まれるセンサー／検出器からデータを受け取り、データを解釈し、ユーザーが理解できるフォーマットで提供するか、または例えば重量計などから受け取った流重量データに応じて流動調節器を制御するなどのプログラミングに従って、そのデータを用いて更なるコントローラー命令を開始する。
【０１７５】
[0176]  コンピューターは、例えばＰＣ（インテル×８６またはＰｅｎｔｉｕｍチップ互換ＤＯＳ（商標）、ＯＳ２（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ  ＮＴ（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９５（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ９８（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ２０００（商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ  ＸＰ（商標）、ＬＩＮＵＸベースの機、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ（商標）Ｐｏｗｅｒ  ＰＣまたはＵＮＩＸベースの（例えばＳＵＮ（商標）ワークステーション）ＰＣ）、あるいは当業者に公知の他の一般の市販コンピューターでよい。標準のデスクトップアプリケーション、例えばワードプロセッシングソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ（商標）またはＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（商標））およびデータベースソフトウェア（例えば表計算ソフト、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標）、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ（商標）、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ（商標）またはＰａｒａｄｏｘ（商標）のようなデータベースプログラム）は、本発明に適用することができる。例えば、温度調整器および流動調節器の制御を実施するためのソフトウェアは、標準プログラミング言語、例えばＶｉｓｕａｌ  ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａまたはその他を使用して当業者によって任意選択的に構築される。
【０１７６】
[0177]  図４および５は、代表的なシステム例を示している概略図であり、本発明の様々な態様が具現化される論理装置を含む。本明細書で提供される教示から当業者が理解するように、本発明はハードウェアおよび／またはソフトウェアで任意選択的に実施される。一部の実施形態において、本発明の異なる態様は、クライアント側論理またはサーバー側論理で実施される。当技術分野で理解されるように、本発明またはその構成要素は、適切に構成されたコンピューティング装置にロードされたときに、論理命令および／またはデータを含む媒体プログラム要素（例えば固定媒体要素）内で実施することができ、その装置が本発明に従って実施するようにさせる。また当技術分野で理解されるように、論理命令を含む固定媒体はビューアーのコンピューターに物理的にロードするために固定媒体上のビューアーに送達することができ、あるいは、論理命令を含む固定媒体は、ビューアーがプログラム要素をダウンロードするために通信媒体を通してアクセスするリモートサーバー上にあってもよい。
【０１７７】
[0178]  詳細には、図４は検出器４０２および流体輸送構成要素４０４が作動可能に接続されたコンピューター４００を図示する。任意選択的に、検出器４０２および／または流体輸送構成要素４０４は、サーバー（図４では示されていない）を経由して作動可能にコンピューター４００に接続される。作動中、流体輸送構成要素４０４は一般的に流体、例えば標識化ＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコンを含む試料アリコートを、例えば本明細書で記載されているようにその上に並べられたオリゴヌクレオチド、配列特異抗体などを含む核酸検出試薬アレイ４０６へ移す。その後、検出器４０２は一般的に、流体輸送構成要素４０４を使用して核酸検出試薬アレイ４０６からハイブリダイズしなかった核酸を洗い流すために１回または複数回の洗浄段階を経てから、核酸検出試薬アレイ４０６に結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする標識化アンプリコンによって生じた検出可能なシグナル（例えば蛍光発光など）を検出する。さらに示したように、温度調整器４０８も作動可能にコンピューター４００と接続される。ハイブリダイゼーションアッセイを実施する前に、標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸は、標識化プライマー核酸（例えば、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体から選択される配列を含むプライマー）を使用して増幅することができる。次に、これらの増幅反応のアンプリコンは、一般的に先に述べたように結合アッセイを実施するために、流体輸送構成要素４０４を使用して核酸検出試薬アレイ４０６へ移動される。一部の実施形態では、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含む分子ビーコン、５’−ヌクレアーゼプローブ、その他を使用して温度調整器４０８内でＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸増幅と並行して結合アッセイが実施される。これらの実施例では、検出器４０２は温度調整器４０８を使用して増幅反応を実施するときに生じる検出可能なシグナルを検出する。
【０１７８】
[0179]  図５は、媒体５０２および／またはネットワークポート５０４からの命令を読み取ることができる論理装置として理解される情報機器またはディジタル素子５００を図式的に示し、これは固定媒体５０８を有するサーバー５０６と任意選択的に接続することができる。ディジタル素子５００は、当技術分野で理解されるように、その後サーバーまたはクライアント論理に命令を出すためにそれらの命令を使い、本発明の態様を具現化することができる。本発明を具現化することができる論理装置の１つの型は５００で例示されたコンピューターシステムであり、これはＣＰＵ  ５１０、オプションの入力装置５１２および５１４、ディスクドライブ５１６およびオプションのモニター５１８を含む。固定媒体５０２、またはポート５０４上の固定媒体５０８は、そのようなシステムをプログラムするために用いることができ、代表的なものはディスクタイプの光学または磁気媒体、磁気テープ、ソリッドステートダイナミックメモリまたはスタティックメモリ、その他である。具体的な実施形態において、本発明はこの固定媒体上に記録されるソフトウェアとしてその全体または一部を具現化することができる。通信ポート５０４は、そのようなシステムをプログラムするのに用いられる命令を最初に受け取るのに用いることができ、いかなる種類の通信接続をも意味する。任意選択的に、本発明は特定用途向け集積回路（ＡＣＩＳ）またはプログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）の回路内で、その全体または一部が具現化される。そのような場合、本発明はコンピューターが理解でき、ＡＳＩＣまたはＰＬＤの作製に使用できる記述言語で具現化することができる。
【０１７９】
[0180]  図５は、サーバー５０６を経由して作動可能にディジタル素子５００に接続している自動シンセサイザー３５０も含む。任意選択的に、自動シンセサイザー５２０はディジタル素子５００に直結している。作動中、自動シンセサイザー５２０は、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有して実質的に同一なその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数のプライマーまたはプローブを合成する命令を受け取り、これらのデータは例えばディジタル素子５００および／またはコンピューターが読み取れる媒体、例えば固定媒体５０２および／または５０８に含まれるデータセットに含まれる。
【０１８０】
XI．キット
[0181]  本発明の方法で使用される核酸検出試薬（例えばプライマー核酸、プローブ核酸、その他）は、任意選択的にキットにパックされる。本明細書で記載されているように、本発明の核酸検出試薬は標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸と検出可能に結合する。さらに、キットは適切にパックされた核酸固定化、ハイブリダイゼーションおよび／または検出に必要な試薬および物質、例えば固体支持体、緩衝液、酵素および核酸標準、ならびにアッセイを行うための説明書を含むことができる。任意選択的に、本発明の核酸検出試薬（例えばオリゴヌクレオチド、配列特異抗体、その他）は、既に結合した状態で、さもなければ固体支持体上に固定された状態で提供される。他のオプションとして、例えば本発明の検出法を液相で実施するために、核酸検出試薬は容器中の溶液に遊離した状態で提供される。これらの一部の実施形態では、キットの核酸検出試薬は、例えば分子ビーコン、５’−ヌクレアーゼプローブ、またはその他が配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含む場合などには、標識および／またはクエンチャー部分を含む。ある実施形態において、キットは試料中の標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列を増幅するための標識化プライマーをさらに含む。
【０１８１】
[0182]  キットは、核酸検出試薬を試料からの核酸またはそのアンプリコンと接触させ、核酸検出試薬とＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸との間の結合を検出するための１組の説明書、または核酸検出試薬および１組の説明書を包装するための少なくとも１つの容器の、１つまたは複数も含む。本発明のキットに含まれる固体支持体の例は、例えばプレート、マイクロウェルプレート、ビーズ、ミクロビーズ、チューブ（例えばマイクロチューブ、その他）、線維、ホイスカー、コーム、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層、などから任意選択的に選択される。
【０１８２】
[0183]  一部の実施形態において、キットは、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸のセグメントを増幅するための、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸の少なくとも１つのセグメントと少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つのプライマー核酸をさらに含む。これらの実施例では、キットは一般的にその核酸の１つまたは複数の部分配列をプライマー核酸で増幅するための１組の説明書、ヌクレオチドを取り込む少なくとも１つの生体触媒（例えばポリメラーゼ）、および１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態において、プライマー核酸は少なくとも１つの標識（例えば、蛍光色素、放射性同位体、その他）を含む。適切な標識はさらに本明細書で記載されている。例えば、プライマー核酸はビオチンまたはビオチン誘導体と任意選択的にコンジュゲートされる。これらの実施例では、例えば本発明の核酸検出試薬と標的核酸との間の結合の検出を実施するために、キットは一般的にアビジンもしくはアビジン誘導体、またはストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン誘導体とコンジュゲートされた酵素をさらに含む。これらの実施形態では、キットは通常、ヌクレオチドを取り込む少なくとも１つの生体触媒（例えばポリメラーゼ、リガーゼ、またはその他）をさらに含む。これらの実施形態では、キットは一般的に、例えば標的核酸を増幅するための１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む。任意選択的に、ヌクレオチドの少なくとも１つは標識を含む。これらの実施形態の一部では、キットは、例えばピロリン酸分解を最小にするための少なくとも１つのピロホスファターゼ（例えば耐熱性のピロホスファターゼ）、例えばキャリーオーバー汚染に対する保護が望ましい用途における使用のためのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（例えば耐熱性ＵＮＧ）をさらに含む。
【０１８３】
ＸＩＩ．実施例
[0184]  本明細書で記載されている実施例および実施形態は例示だけが目的であり、請求されている発明の範囲を限定するものではない。本明細書で記載されている実施例および実施形態を考慮した様々な修正または変更は、当業者に提案され、かつこの出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれるものとする。
【０１８４】
実施例１：ＳＡＲＳコロナウイルスのｎｅｓｔｅｄＰＣＲ検出
[0185]  ＳＡＲＳコロナウイルス検出ＲＴ−ＰＣＴ診断は、ＳＡＲＳを有することが疑われる患者を検出するために特異的に設計されている。試薬はエンドポイントＰＣＲで使用され、生成物はアガロースゲル電気泳動によって分析される。逆転写酵素およびＴａｑポリメラーゼの選択に柔軟性をもたせるように、試薬は設計されている。
【０１８５】
[0186]  提供試薬（１０項目）：
１．陽性対照（プライマー配列を含む２．５ｋｂのＤＮＡ断片）Ｎｅａｔ
２．陽性対照１／１０希釈
３．陽性対照１／１００希釈
４．陰性対照Ａ（水または緩衝溶液だけ）
５．陰性対照Ｂ（陽性対照断片のクローニングベクター）
６．ＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｆ（１０μＭ）（配列番号１１）
７．ＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｒ（１０μＭ）＊（配列番号１２または２０）
８．ＧＩＳＳＡＲＳＩＮ＿Ｆ（１０μＭ）（配列番号１３（＝ＳＡＲ１Ｓ；Ｄｒｏｓｔｅｎら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７〜１９７６頁を参照）、配列番号１５または１８）
９．ＧＩＳＳＡＲＳＩＮ＿Ｒ（１０μＭ）（配列番号１４（＝ＳＡＲ１Ａｓ、上記Ｄｒｏｓｔｅｎら（２００３）を参照）、配列番号１６または１９）
１０．ＰＣＲ用滅菌水
＊ＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｒは、第１鎖ｃＤＮＡ合成および第１回目のＰＣＲの両方の３’−プライマーとして使われる。
【０１８６】
[0187]  必要であるが提供されない試薬：
１．ＲＮＡ抽出
推奨供給元：
Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．第１鎖ｃＤＮＡ合成
推奨供給元：
Ｅｘｐａｎｄ逆転写酵素（ロシュ）またはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
３．ｄＮＴＰミックス
推奨供給元：
ｄＮＴＰｓ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）またはｄＮＴＰｓ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
４．Ｔａｑポリメラーゼ
推奨供給元：
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅまたはＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（ロシュ）
【０１８７】
プロトコル：
[0188]  ＳＡＲＳ感染が疑われる患者からの試料、例えば血液および組織は、ＷＨＯ（２００４年４月２０日現在のウェブサイトｗｈｏ.ｉｎｔ／ｅｎ／）またはＣＤＣ（２００４年４月２０日現在のウェブサイトｃｄｃ.ｇｏｖ／）の勧告に従って扱う必要がある。
１．ＲＮＡは、メーカーの説明書（ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）またはＱｉａｇｅｎキット）によって抽出する。
２．第１鎖ｃＤＮＡの合成は、２０μｌの反応容積でＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｒ（２μｌ）を使用して抽出されたＲＮＡの上で実施する。
３．第１回目のＰＣＲ：２５μｌの反応容積でＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｆ（１．２５μｌ）およびＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｒ（１．２５μｌ）を用い、ｃＤＮＡ生成物（２．５μｌ）をテンプレートとして使う。試料のウイルス力価が非常に高いならば、この段階で４４０ｂｐの断片が検出される。注：対照テンプレート（１μｌ）は、ＰＣＲ反応ごとに一緒に試験することができる。
ＰＣＲ条件：
９４℃で２分間
９４℃で１０秒間
５０℃で３０秒間    ３５サイクル
７２℃で１分間
７２℃で７分間
４．第２回目ＰＣＲ：２５μｌの反応容積でＧＩＳＳＡＲＳＩＮ＿Ｆ（１．２５μｌ）およびＧＩＳＳＡＲＳＩＮ＿Ｒ（１．２５μｌ）を用い、第１回目のＰＣＲからの生成物（２．５μｌ）を第２回目のＰＣＲのテンプレートとして、第１回目のＰＣＲと同じＰＣＲ条件で使う。注：対照テンプレート（１μｌ）は、ＰＣＲ反応ごとに一緒に試験することができる。
５．生成物は、１．２〜１．５％のアガロースゲル上で分析する。陽性ＳＡＲＳの確認のために１２０ｂｐの断片を検出することができる。図６を参照。
【０１８８】
実施例２：リアルタイムＰＣＲによるＳＡＲＳコロナウイルスの検出
[0189]  実施例１で記載されている標準ＲＴ−ＰＣＲ方法ではなくリアルタイムＰＣＲを使用して臨床試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出することができる。
以下を２０μＬの反応液に混合する：
１０μＬ  ２×  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
１．８μＬ  １０μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  １（例えば配列番号１１）
１．８μＬ  １０μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  ２（例えば配列番号２０）
０．５μＬ  １０μＭ  ５’−ヌクレアーゼプローブ（例えば配列番号２１）
４．９μＬの水
１．０μＬのテンプレート
【０１８９】
[0190]  ＰＣＲプライマーの最終濃度は９００ｎＭである；
５’−ヌクレアーゼプローブの最終濃度は２５０ｎＭである。
【０１９０】
[0191]  反応は好ましくは二つ組で行う。
【０１９１】
[0192]  ＰＣＲサイクルは９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒の変性および６０℃で１分のアニーリングおよび伸張の４０サイクルが続く。
【０１９２】
[0193]  システムメーカーによって記載されているように、アニーリングおよび伸張サイクルの間、蛍光をモニターする。
【０１９３】
[0194]  以上、本発明を明快さおよび理解の目的のために若干詳細に述べたが、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および細部の様々な変更を加えることができることは、この開示の解釈から当業者には明らかとなろう。例えば、上述の全ての手法および装置は、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願および／または他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願および／または他の文書が個々に全ての目的のために参照により組み込まれていることが示されているかのように、全ての目的のために参照により完全に組み込まれている。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【付録１】
【０１９４】
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【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】疾病対策予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  アトランタ、ＧＡ、ＵＳＡ）で決定されたＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】様々なＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株およびお互いに関係のある特定の対象外の生物からのヌクレオチド配列を示す図である。
【図３】試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するためのｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法を図式的に表す図である。
【図４】試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するための代表的なシステムの例を示すブロック図である。
【図５】本発明の様々な態様を実施することができる、コンピューターおよびコンピューター可読媒体を含む代表的なシステムの例を示すブロック図である。
【図６】配列番号１１および配列番号１２のプライマーを試薬６および７として使用し配列番号１３および配列番号１４のプライマーを試薬８および９としてそれぞれ使用し、実施例２の方法に従って実施した陽性臨床試料におけるｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法の結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図１】
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【図２】
2006524052.tif 000043
【図３】
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【図４】
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【配列表】
2006524052000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月16日(2006.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
[0078]  用語「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス」または「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ」は、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目コロナウイルス科に属する正鎖ＲＮＡのエンベロープを有するウイルスを指し、このウイルスに感染した対象で重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こす。例えば、参照により組み込まれているＫｉａｚｅｋら（２００３）「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９５３〜１９６６頁、Ｄｒｏｓｔｅｎら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７〜１９７６頁、Ｍａｒｒａら（２００３）「Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９９〜１４０４頁、Ｒｕａｎら（２００３）「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １４  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｕｔａｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１７７９〜１７８５頁、およびＣａｖａｎａｇｈ（２００３）「Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｏｒｄｅｒ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ」、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４：６２９〜６３３頁を参照。ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの完全な配列のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号の例は、ＮＣ＿００４７１８、ＡＹ２８３７９４、ＡＹ２７８４８９、ＡＹ２７８７４１、ＡＹ５５９０９７、ＡＹ５５９０９６、ＡＹ５５９０９５、ＡＹ５５９０９４、ＡＹ５５９０９３、ＡＹ５５９０９２、ＡＹ５５９０９１、ＡＹ５５９０９０、ＡＹ５５９０８９、ＡＹ５５９０８８、ＡＹ５５９０８７、ＡＹ５５９０８６、ＡＹ５５９０８５、ＡＹ５５９０８４、ＡＹ５５９０８３、ＡＹ５５９０８２、ＡＹ５５９０８１、ＡＹ２７４１１９、ＡＹ３２３９７７、ＡＹ２９１３１５などである。さらに実例を示すと、表４（配列番号１３）はＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌで決定されたＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノム（Ｕｒｂａｎｉ系統）のヌクレオチド配列を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
ＩＩ．概要
[0097]  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（疾病予防管理センター、ＣＤＣ）は、重症急性呼吸器症候群、すなわちＳＡＲＳの世界的流行の原因と考えられているコロナウイルスのゲノム配列を決定した。表４（配列番号１３）は、このＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムのヌクレオチド配列を示し、それはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＡＹ２７８７４１に相当する。また、参照により組み込まれているＲｏｔａら（２００３）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００（５６２４））：１３９４〜１３９９頁を参照。この配列データから、ＳＡＲＳコロナウイルスは以前には認められていないコロナウイルスであることが確認される。リーダー配列を除いて、全ての配列はウイルスＲＮＡに直接由来した。ＣＤＣによって配列決定されたＳＡＲＳコロナウイルスのゲノムは、長さ２９，７２７のヌクレオチドであり、ゲノム構造は他のコロナウイルスのそれと類似している。例えば、参照によって組み込まれているＤｒｏｓｔｅｎら（２００３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７〜１９７６頁を参照。ポリメラーゼタンパク質（ポリメラーゼ１ａ、１ｂ）、スパイクタンパク質（Ｓ）、小膜タンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）に対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が特定された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
[0104]  さらに実例を示すと、表５−７は様々なＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株およびお互いに関係のある特定の非標的の生物からのヌクレオチド配列のアラインメントを示す。図示の如く、第１群（表５）はヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）２２９Ｅ（登録番号ＮＣ＿００２６４５）およびブタ流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）（登録番号ＮＣ＿００３４３６）からの非標的のヌクレオチド配列のアラインメントを、標的ヌクレオチド配列である３つの異なるＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株、すなわち、トロント（登録番号ＮＣ＿００４７１８）、シンガポール（登録番号ＡＹ２８３７９４）および広州（登録番号ＡＹ２７８４８９）からのものと共に示している。図示の如く、配列番号２３および２４と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの位置には下線で示している。第２群（表６）はウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）（登録番号ＮＣ＿００３０４５）およびマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）（登録番号ＮＣ＿００１８４６）からの非標的のヌクレオチド配列のアラインメントを、標的ヌクレオチド配列は第１群で示した異なるＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株からのものと共に示している。配列番号２３および２４と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの位置も、第２群のアラインメント内における下線で示している。第３群（表７）はニワトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（登録番号ＮＣ＿００１４５１）からの非標的のヌクレオチド配列のアラインメントを、標的ヌクレオチド配列は第１群で示した異なるＳＡＲＳ−ＣｏＶ分離株からのものと共に示している。配列番号２３および２４と対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの位置にも、第３群のアラインメント内における下線で示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
ＮＥＳＴＥＤ  ＰＣＲ
[0141]  本発明は、試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出する方法、およびコロナウイルスをタイピングする方法を提供する。例示的な方法は、次の通りである：
（ａ）２組みの増幅プライマーを使ったＮｅｓｔｅｄＰＣＲ。１組のプライマー（「内部」プライマーと呼ばれる）の標的ＤＮＡ配列の位置を、第２の組のプライマー（「外部」プライマーと呼ばれる）の標的配列内で決める。実際には、「外部プライマー」を使用して患者試料で先ず標準のＰＣＲ反応を実施する。その後、第１の反応の生成物を増幅標的として使用して第２のＰＣＲ反応を「内部プライマー」で実施する。この方法では、第２の反応で第１の反応の生成物を再増幅することにより、アッセイの感度が高くなる。内部プライマーは第１のＰＣＲ反応が特異的な生成物を生んだときだけ増幅するので、アッセイの特異性は高くなる。ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法の概略図を、図１で示す。
（ｂ）試料を、ハイブリダイズする条件下で、コンセンサスＳＡＲＳウイルスプライマー核酸、重合のための薬剤およびデオキシヌクレオシド５’−三リン酸で処理する。コンセンサスＳＡＲＳウイルスプライマーは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの標的領域とハイブリダイズするのに十分に相補性の少なくとも１組のプライマーを含み、伸張生成物またはアンプリコンがその組の少なくとも１つの構成メンバーから合成されるようなオリゴヌクレオチドの混合物である。相補鎖から分離すると、アンプリコンは１組のプライマー核酸の他の構成メンバーの伸張生成物またはアンプリコンの合成のための、テンプレートの役目を果たすことができる。
（ｃ）プライマー伸張生成物またはアンプリコンをそれらのテンプレートから分離して一本鎖分子にするために、変性条件下で試料を処理する。
（ｄ）ステップ(ｃ)で生成した一本鎖分子をテンプレートとして使用して更なるプライマー伸張生成物が合成されるような条件でステップ（ｂ）の生成物をステップ(ａ)のコンセンサスプライマーで処理する。
（ｅ）ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すことにより検出可能な量の標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコンを合成して増幅されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列を提供する。
（ｆ）ステップ（ｄ）で調製された反応混合物をハイブリダイズ条件で一般のプローブで処理することによって増幅が起こったか、またハイブリダイゼーションおよび増幅が起こったかどうかを決定する。
（ｇ）増幅されたＤＮＡに型特異的なＤＮＡプローブをハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを決定する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
[0177]  図２および３は、代表的なシステム例を示している概略図であり、本発明の様々な態様が具現化される論理装置を含む。本明細書で提供される教示から当業者が理解するように、本発明はハードウェアおよび／またはソフトウェアで任意選択的に実施される。一部の実施形態において、本発明の異なる態様は、クライアント側論理またはサーバー側論理で実施される。当技術分野で理解されるように、本発明またはその構成要素は、適切に構成されたコンピューティング装置にロードされたときに、論理命令および／またはデータを含む媒体プログラム要素（例えば固定媒体要素）内で実施することができ、その装置が本発明に従って実施するようにさせる。また当技術分野で理解されるように、論理命令を含む固定媒体はビューアーのコンピューターに物理的にロードするために固定媒体上のビューアーに送達することができ、あるいは、論理命令を含む固定媒体は、ビューアーがプログラム要素をダウンロードするために通信媒体を通してアクセスするリモートサーバー上にあってもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
[0178]  詳細には、図２は検出器４０２および流体輸送構成要素４０４が作動可能に接続されたコンピューター４００を図示する。任意選択的に、検出器４０２および／または流体輸送構成要素４０４は、サーバー（図２では示されていない）を経由して作動可能にコンピューター４００に接続される。作動中、流体輸送構成要素４０４は一般的に流体、例えば標識化ＳＡＲＳ−ＣｏＶアンプリコンを含む試料アリコートを、例えば本明細書で記載されているようにその上に並べられたオリゴヌクレオチド、配列特異抗体などを含む核酸検出試薬アレイ４０６へ移す。その後、検出器４０２は一般的に、流体輸送構成要素４０４を使用して核酸検出試薬アレイ４０６からハイブリダイズしなかった核酸を洗い流すために１回または複数回の洗浄段階を経てから、核酸検出試薬アレイ４０６に結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする標識化アンプリコンによって生じた検出可能なシグナル（例えば蛍光発光など）を検出する。さらに示したように、温度調整器４０８も作動可能にコンピューター４００と接続される。ハイブリダイゼーションアッセイを実施する前に、標的ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸は、標識化プライマー核酸（例えば、配列番号１〜１２および１５〜２４またはその相補体から選択される配列を含むプライマー）を使用して増幅することができる。次に、これらの増幅反応のアンプリコンは、一般的に先に述べたように結合アッセイを実施するために、流体輸送構成要素４０４を使用して核酸検出試薬アレイ４０６へ移動される。一部の実施形態では、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に同一のその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含む分子ビーコン、５’−ヌクレアーゼプローブ、その他を使用して温度調整器４０８内でＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸増幅と並行して結合アッセイが実施される。これらの実施例では、検出器４０２は温度調整器４０８を使用して増幅反応を実施するときに生じる検出可能なシグナルを検出する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
[0179]  図３は、媒体５０２および／またはネットワークポート５０４からの命令を読み取ることができる論理装置として理解される情報機器またはディジタル素子５００を図式的に示し、これは固定媒体５０８を有するサーバー５０６と任意選択的に接続することができる。ディジタル素子５００は、当技術分野で理解されるように、その後サーバーまたはクライアント論理に命令を出すためにそれらの命令を使い、本発明の態様を具現化することができる。本発明を具現化することができる論理装置の１つの型は５００で例示されたコンピューターシステムであり、これはＣＰＵ  ５１０、オプションの入力装置５１２および５１４、ディスクドライブ５１６およびオプションのモニター５１８を含む。固定媒体５０２、またはポート５０４上の固定媒体５０８は、そのようなシステムをプログラムするために用いることができ、代表的なものはディスクタイプの光学または磁気媒体、磁気テープ、ソリッドステートダイナミックメモリまたはスタティックメモリ、その他である。具体的な実施形態において、本発明はこの固定媒体上に記録されるソフトウェアとしてその全体または一部を具現化することができる。通信ポート５０４は、そのようなシステムをプログラムするのに用いられる命令を最初に受け取るのに用いることができ、いかなる種類の通信接続をも意味する。任意選択的に、本発明は特定用途向け集積回路（ＡＣＩＳ）またはプログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）の回路内で、その全体または一部が具現化される。そのような場合、本発明はコンピューターが理解でき、ＡＳＩＣまたはＰＬＤの作製に使用できる記述言語で具現化することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
[0180]  図３は、サーバー５０６を経由して作動可能にディジタル素子５００に接続している自動シンセサイザー３５０も含む。任意選択的に、自動シンセサイザー５２０はディジタル素子５００に直結している。作動中、自動シンセサイザー５２０は、配列番号１〜１２および１５〜２４、配列番号１〜１２および１５〜２４の１つと少なくとも９０％の配列同一性を有して実質的に同一なその変異体、ならびに配列番号１〜１２および１５〜２４および前記変異体の相補体からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数のプライマーまたはプローブを合成する命令を受け取り、これらのデータは例えばディジタル素子５００および／またはコンピューターが読み取れる媒体、例えば固定媒体５０２および／または５０８に含まれるデータセットに含まれる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
プロトコル：
[0188]  ＳＡＲＳ感染が疑われる患者からの試料、例えば血液および組織は、ＷＨＯ（２００４年４月２０日現在のウェブサイトｗｈｏ.ｉｎｔ／ｅｎ／）またはＣＤＣ（２００４年４月２０日現在のウェブサイトｃｄｃ.ｇｏｖ／）の勧告に従って扱う必要がある。
１．ＲＮＡは、メーカーの説明書（ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）またはＱｉａｇｅｎキット）によって抽出する。
２．第１鎖ｃＤＮＡの合成は、２０μｌの反応容積でＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｒ（２μｌ）を使用して抽出されたＲＮＡの上で実施する。
３．第１回目のＰＣＲ：２５μｌの反応容積でＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｆ（１．２５μｌ）およびＧＩＳＳＡＲＳＯＵＴ＿Ｒ（１．２５μｌ）を用い、ｃＤＮＡ生成物（２．５μｌ）をテンプレートとして使う。試料のウイルス力価が非常に高いならば、この段階で４４０ｂｐの断片が検出される。注：対照テンプレート（１μｌ）は、ＰＣＲ反応ごとに一緒に試験することができる。
ＰＣＲ条件：
９４℃で２分間
９４℃で１０秒間
５０℃で３０秒間    ３５サイクル
７２℃で１分間
７２℃で７分間
４．第２回目ＰＣＲ：２５μｌの反応容積でＧＩＳＳＡＲＳＩＮ＿Ｆ（１．２５μｌ）およびＧＩＳＳＡＲＳＩＮ＿Ｒ（１．２５μｌ）を用い、第１回目のＰＣＲからの生成物（２．５μｌ）を第２回目のＰＣＲのテンプレートとして、第１回目のＰＣＲと同じＰＣＲ条件で使う。注：対照テンプレート（１μｌ）は、ＰＣＲ反応ごとに一緒に試験することができる。
５．生成物は、１．２〜１．５％のアガロースゲル上で分析する。陽性ＳＡＲＳの確認のために１２０ｂｐの断片を検出することができる。図４を参照。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
【図１】試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するためのｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法を図式的に表す図である。
【図２】試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するための代表的なシステムの例を示すブロック図である。
【図３】本発明の様々な態様を実施することができる、コンピューターおよびコンピューター可読媒体を含む代表的なシステムの例を示すブロック図である。
【図４】配列番号１１および配列番号１２のプライマーを試薬６および７として使用し配列番号１３および配列番号１４のプライマーを試薬８および９としてそれぞれ使用し、実施例２の方法に従って実施した陽性臨床試料におけるｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法の結果を示すアガロースゲルの写真である。
【国際調査報告】
2006524052.tif 000046
2006524052.tif 000047
2006524052.tif 000048
2006524052.tif 000049
2006524052.tif 000050
2006524052.tif 000051
2006524052.tif 000052
2006524052.tif 000053