(57)【要約】本発明は一般に、脳疾患を治療する方法及び脳疾患を治療する化合物に関し、より具体的には、アルツハイマー病及び精神分裂病などの脳疾患を治療する低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のグアニンヌクレオチド交換因子を調整することが可能な化合物の使用に関する。
2006525300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経障害又は神経変性疾患の治療用薬剤の調製に使用するグアニンヌクレオチド交換因子を調節する化合物。
【請求項２】
グアニンヌクレオチド交換因子が低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
グアニンヌクレオチド交換因子が低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐ１ファミリーに属するタンパク質のものである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物がｃＡＭＰエフェクターである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
グアニンヌクレオチド交換因子がＥＰＡＣ１又はＥＰＡＣ２のリストから選択される、請求項１から４までに記載の化合物。
【請求項６】
以下のリストから選択される、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２
Ｃ１０Ｈ６ＩＮＯ２Ｓ２
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２
【請求項７】
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３である、請求項１から６までに記載の化合物。
【請求項８】
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２である、請求項１から６までに記載の化合物。
【請求項９】
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２である、請求項１から６までに記載の化合物。
【請求項１０】
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓである、請求項１から６までに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２である、請求項１から６までに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３である、請求項１から６までに記載の化合物。
【請求項１３】
請求項６から１２までに記載の化合物のいずれかの機能的類似体である、請求項１から５までに記載の化合物。
【請求項１４】
請求項５から１１までに記載の化合物に対して９９％の構造的相同性を示す、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
請求項５から１１までに記載の化合物に対して９０％を超える構造的相同性を示す、請求項１３記載の化合物。
【請求項１６】
請求項５から１１までに記載の化合物に対して８０％を超える構造的相同性を示す、請求項１３記載の化合物。
【請求項１７】
神経障害又は神経変性疾患がアルツハイマー病である、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
神経障害又は神経変性疾患がパーキンソン病、ハンチントン病、ＡＬＳ又は精神分裂病である、請求項１から１６までに記載の化合物。
【請求項１９】
以下のリストから選択されるＥＰＡＣ選択的阻害剤として使用される化合物。
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２
Ｃ１０Ｈ６ＩＮＯ２Ｓ２
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２
【請求項２０】
神経障害又は神経変性疾患を治療するためのグアニンヌクレオチド交換因子を調節することが可能な化合物を含む医薬組成物。
【請求項２１】
グアニンヌクレオチド交換因子が低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のものである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
グアニンヌクレオチド交換因子が低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐ１ファミリーに属するタンパク質のものである、請求項２０及び２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
グアニンヌクレオチド交換因子がＥＰＡＣ１又はＥＰＡＣ２のリストから選択される、請求項２０から２２までに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ｃＡＭＰエフェクターである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物が以下のリストから選択される、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２
Ｃ１０Ｈ６ＩＮＯ２Ｓ２
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２
【請求項２６】
前記化合物がＣ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３である、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記化合物がＣ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２である、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記化合物がＣ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２である、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記化合物がＣ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓである、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記化合物がＣ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２である、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記化合物がＣ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３である、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記化合物が請求項２５から３１までに記載の化合物のいずれかの機能的類似体である、請求項２０から２４までに記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記化合物が請求項２５から３１までに記載の化合物に対して９９％を超える構造的相同性を示す、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記化合物が請求項２５から３１までに記載の化合物に対して９０％を超える構造的相同性を示す、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記化合物が請求項２５から３１までに記載の化合物に対して８０％を超える構造的相同性を示す、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項２０から３５までに記載の医薬組成物。
【請求項３７】
神経障害又は神経変性疾患が精神分裂病、パーキンソン病、ハンチントン病又はＡＬＳである、請求項２０から３５までに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
化合物をグアニンヌクレオチド交換因子と接触させるステップと、
前記化合物がグアニンヌクレオチド交換因子を活性化するか又は阻害するかを
判定するステップとからなる、
グアニンヌクレオチド交換因子を調節する化合物の同定方法。
【請求項３９】
神経障害又は神経変性疾患の治療での使用に適した化合物を同定するのに適している、請求項３８に記載の化合物同定方法。
【請求項４０】
ｓＡＰＰα分泌を調節する化合物を同定するステップを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞のタウタンパク質のリン酸化を制御する化合物を同定するステップを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
神経障害又は神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項３９から４１までに記載の方法。
【請求項４３】
神経障害又は神経変性疾患が精神分裂病、パーキンソン病、ハンチントン病又はＡＬＳである、請求項３９から４１までに記載の方法。
【請求項４４】
グアニンヌクレオチド交換因子が低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のものである、請求項３９から４３までに記載の方法。
【請求項４５】
グアニンヌクレオチド交換因子が低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐ１ファミリーに属するタンパク質のものである、請求項３９から４４までに記載の方法。
【請求項４６】
グアニンヌクレオチド交換因子がＥＰＡＣ１又はＥＰＡＣ２のリストから選択される、請求項３９から４５までに記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物がｃＡＭＰエフェクターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）グアニンヌクレオチド交換因子と接触させることによって、グアニンヌクレオチド交換因子を調節することが可能な化合物を同定するステップ、
（ｂ）グアニンヌクレオチド交換因子の修飾因子としてステップ（ａ）で同定された化合物を、薬学的に許容できる担体又は希釈液と混合することで医薬組成物を調製するステップとを含む、
グアニンヌクレオチド交換因子の上方制御又は下方制御に関係する病態を治療するための薬理組成物の調整方法。
【請求項４９】
ｓＡＰＰα分泌を調節する化合物を同定するステップを更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
細胞のタウタンパク質のリン酸化を制御する化合物を同定するステップを更に含む、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３である、神経障害又は神経変性疾患の治療に使用する化合物。
【請求項５２】
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２である、神経障害又は神経変性疾患の治療に使用する化合物。
【請求項５３】
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２である、神経障害又は神経変性疾患の治療に使用する化合物。
【請求項５４】
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓである、神経障害又は神経変性疾患の治療に使用する化合物。
【請求項５５】
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２である、神経障害又は神経変性疾患の治療に使用する化合物。
【請求項５６】
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３である、神経障害又は神経変性疾患の治療に使用する化合物。
【請求項５７】
神経障害又は神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項５１から５６までに記載の化合物。
【請求項５８】
神経障害又は神経変性疾患が精神分裂病、パーキンソン病、ハンチントン病又はＡＬＳである、請求項５１から５６までに記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、脳疾患を治療する方法及び脳疾患を治療する化合物に関し、より具体的には、アルツハイマー病などの脳疾患を治療するＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２などの低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のグアニンヌクレオチド交換因子を調整することが可能な化合物の使用に関する。また本発明は、多くの他の疾患の治療にも関与することができる。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患及び神経学的障害には、パーキンソン病、ハンチントン病及びアルツハイマー病に加えて、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性が関与する多くの病理学的状態を含む広範囲の疾患の状態が含まれる。他の精神病には、精神分裂病及び一般的な痴呆が含まれる。アルツハイマー病は、高齢者において最もよく見られる神経変性疾患のうちの１つである。これら疾患の事例は、おそらく人々の寿命の延長に関連して増加し続けており、公衆衛生上の重大な問題となっている。現在、これらの障害及び他の関連の神経障害は、治療及び予防が不可能である。
【０００３】
多くの神経障害では、いくらかの遺伝性が見られ、疾患に関する遺伝的要素が示されているが（パーキンソン病の場合は遺伝性がより低い）、多くの場合、疾患は集団において自然発生的に生じる。
【０００４】
アルツハイマー病に焦点を当てれば、本疾患は中枢神経系の進行性神経変性疾患である。アルツハイマー病の症状は、主に衰弱と記憶の減退である。アルツハイマー病は、初めは初老期痴呆として定義されていたが、現在は、この病態は発症年齢に無関係の痴呆であるとされている。したがって、アルツハイマー型痴呆という用語は、脳卒中、脳損傷又は飲酒などの明らかな器官的な原因によるものではないすべての痴呆を意味している。アルツハイマー病及び関連の痴呆の有病率は、６０歳頃から急上昇して、９５歳までには、約９０％に達する。アルツハイマー型痴呆は、脳組織の全般的な収縮に関連するが、皮質ニューロンの減少は比較的少ない。本疾患の２つの特徴として、アミロイド斑及び神経原線維変化の存在が挙げられる。これらの特徴は、正常な脳においても現れるが、数量が少ない傾向がみられる。
【０００５】
本発明の発明者らにより実施された研究では、アルツハイマー病においてＥＰＡＣ１遺伝子及びＥＰＡＣ２遺伝子は、それぞれ強く上方制御及び下方制御されることを示している。ＥＰＡＣ（ｃＡＭＰにより直接活性化される交換タンパク質）は、極めて最近発見されており（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９９８年、「Ｒａｐ１を直接活性化するｃＡＭＰ結合タンパク質ファミリー（Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃＡＭＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  Ｒａｐ１）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ２８２（５３９７）ｐ２２７５〜２２７９：ｄｅ  Ｒｏｏｊｉら、１９９８年、「Ｅｐａｃは、ｃＡＭＰにより直接活性化されるＲａｐ１グアニンヌクレオチド交換因子である（Ｅｐａｃ  ｉｓ  ａ  Ｒａｐ１  ｇｕａｎｉｎｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｃＡＭＰ．）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ３９６  ｐ４７４〜４７７）、広く発現して、非常に多様な細胞機能において意味を持つ、ｃＡＭＰに影響を及ぼすタンパク質として知られている。これらの発見により、ｃＡＭＰが細胞に影響を及ぼす新しい仕組みが特定された。図１にＥＰＡＣの作用をまとめて示す。細胞機能における遺伝子の任意の関与に関する正確な性質については最近、研究が始められたばかりである。従来、ＥＰＡＣ遺伝子とアルツハイマー病の間には関連が認められていなかった。
【０００６】
アルツハイマー病などの神経障害又は神経変性疾患を治療する化合物を提供することが有益であることは明らかである。
【０００７】
アルツハイマー病などの神経障害又は神経変性疾患の治療において有益な化合物を発見するスクリーニングを提供することが有益であることは明らかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の第１の目的は、ＥＰＡＣ１、ＥＰＡＣ２などのグアニンヌクレオチド交換因子を制御することが可能な化合物を含む、アルツハイマー病などの神経障害又は神経変性疾患を治療する薬物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病などの神経障害又は神経変性疾患の治療法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、ＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２などのグアニンヌクレオチド交換因子を調整又は制御することが可能であり、したがって、アルツハイマー病などの神経障害又は神経変性疾患の治療用化合物として有用である化合物の１つ又は複数のスクリーニング法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書を通じて、ＥＰＡＣに対する言及は、ＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２に関するものである。
【００１２】
本明細書を通じて言及される化合物の構造を図７に示す。
【００１３】
本発明の第１の態様では、神経障害又は神経変性疾患を治療するための薬剤の調製に用いられるグアニンヌクレオチド交換因子を調節する化合物を提供する。
【００１４】
好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のものである。
【００１５】
最も好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐ１ファミリーに属するタンパク質のものである。
【００１６】
好ましくは、化合物はｃＡＭＰエフェクターである。
【００１７】
最も好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、ＥＰＡＣ１又はＥＰＡＣ２のリストから選択される。
【００１８】
好ましくは、化合物は以下のリストから選択される。
Ｃ１５Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２
Ｃ１０Ｈ６ＩＮＯ２Ｓ２
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２
【００１９】
化合物の構造を図７に示す。
【００２０】
化合物はＣ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３であってもよい。
【００２１】
化合物はＣ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２であってもよい。
【００２２】
化合物はＣ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２であってもよい。
【００２３】
化合物はＣ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓであってもよい。
【００２４】
化合物はＣ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２であってもよい。
【００２５】
化合物はＣ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３であってもよい。
【００２６】
好ましくは、化合物は上記化合物のいずれかの機能的類似体である。
【００２７】
好ましくは、上記化合物のいずれかの類似体は、上記化合物に対して９９％を超える構造的相同性を示す任意の化合物である。
【００２８】
或いは、上記化合物のいずれかの類似体は、上記化合物に対して９０％を超える構造的相同性を示す任意の化合物である。
【００２９】
或いは、上記化合物のいずれかの類似体は、上記化合物に対して８０％を超える構造的相同性を示す任意の化合物である。
【００３０】
好ましくは、神経障害又は神経変性疾患とはアルツハイマー病である。
【００３１】
或いは、神経障害又は神経変性疾患とは精神分裂病である。
【００３２】
本発明の第２の態様では、以下のリストから選択される、ＥＰＡＣ選択的阻害剤として使用される化合物を提供する。
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２
Ｃ１０Ｈ６１ＮＯ２Ｓ２
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２
【００３３】
本発明の第３の態様では、神経障害又は神経変性疾患を治療するためのグアニンヌクレオチド交換因子を調節することが可能な化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のものである。
【００３５】
最も好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐ１ファミリーに属するタンパク質のものである。
【００３６】
最も好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、ＥＰＡＣ１又はＥＰＡＣ２のリストから選択される。
【００３７】
好ましくは、化合物はｃＡＭＰエフェクターである。
【００３８】
好ましくは、化合物は以下のリストから選択される。
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２
Ｃ１０Ｈ６ＩＮＯ２Ｓ２
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２
Ｃ１４Ｈ６Ｎ４Ｏ３
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２
【００３９】
化合物はＣ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３であってよい。
【００４０】
化合物はＣ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２であってよい。
【００４１】
化合物はＣ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２であってよい。
【００４２】
化合物はＣ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓであってよい。
【００４３】
化合物はＣ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２であってよい。
【００４４】
化合物はＣ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３であってよい。
【００４５】
好ましくは、化合物は上記化合物のいずれかの機能的類似体である。
【００４６】
好ましくは、上記化合物のいずれかの類似体は、上記化合物に対して９９％を超える構造的相同性を示す任意の化合物である。
【００４７】
或いは、上記化合物のいずれかの類似体は、上記化合物に対して９０％を超える構造的相同性を示す任意の化合物である。
【００４８】
或いは、上記化合物のいずれかの類似体は、上記化合物に対して８０％を超える構造的相同性を示す任意の化合物である。
【００４９】
好ましくは、神経障害又は神経変性疾患とはアルツハイマー病である。
【００５０】
或いは、神経障害又は神経変性疾患とはパーキンソン病、ハンチントン病又はＡＬＳである。
【００５１】
或いは、神経障害又は神経変性疾患とは精神分裂病である。
【００５２】
本発明の第４の態様では、
化合物をグアニンヌクレオチド交換因子と接触させるステップと、
この化合物がグアニンヌクレオチド交換因子を活性化するか又は阻害するかを判定するステップと
を含む、グアニンヌクレオチド交換因子を調節する化合物の同定方法を提供する。
【００５３】
この方法が神経障害又は神経変性疾患の治療での使用に適した化合物を同定するのに適していることが好ましい。
【００５４】
神経障害又は神経変性疾患の治療での使用に適した化合物の同定方法は、
ｓＡＰＰα（可溶アミロイド前駆体タンパク質α）の分泌を調節する化合物を同定する（図４ａ及び４ｂ参照）ステップを含んでいてもよい。
【００５５】
場合により、神経障害又は神経変性疾患の治療での使用に適した化合物の同定方法は、
細胞のタウタンパク質のリン酸化を制御する化合物を同定するステップも含んでいてもよい。
【００５６】
好ましくは、神経障害又は神経変性疾患とはアルツハイマー病である。
【００５７】
或いは、神経障害又は神経変性疾患とは精神分裂病である。
【００５８】
好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質のものである。
【００５９】
より好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐ１ファミリーに属するタンパク質のものである。
【００６０】
最も好ましくは、グアニンヌクレオチド交換因子がＥＰＡＣ１又はＥＰＡＣ２のリストから選択される。
【００６１】
好ましくは、化合物はｃＡＭＰエフェクターである。
【００６２】
本発明の第５の態様では、
（ａ）グアニンヌクレオチド交換因子と接触させることによって、グアニンヌクレオチド交換因子を調節することが可能な化合物を同定するステップと、
（ｂ）グアニンヌクレオチド交換因子の修飾因子としてステップ（ａ）で同定された化合物を、薬学的に許容できる担体又は希釈液と混合することで薬剤組成物を調整するステップと
を含む、グアニンヌクレオチド交換因子の上方制御又は下方制御に関係する病態を治療するための薬理組成物の調整方法を提供する。
【００６３】
薬理組成物の調整方法は、
ｓＡＰＰα分泌を調節する化合物を同定するステップを含んでいてもよい（ステップ（ｂ）の前に実施される）。
【００６４】
薬理組成物の調整方法は、
細胞のタウタンパク質のリン酸化を制御する化合物を同定するステップを含んでいてもよい（ステップ（ｂ）の前に実施される）。
【００６５】
本明細書を通じて、Ｒａｐに対するグアニンヌクレオチド交換因子とは、グアニンヌクレオチド交換因子とＲａｐとの直接的な物理的相互作用によって、ＲａｐからＧＤＰのＧＴＰとの交換を高めるすべてのタンパク質である。
【００６６】
本明細書を通じて、ＥＰＡＣ１は、登録番号ＡＦ１０３９０５の下、維持される配列により定義することができる。
【００６７】
本明細書を通じて、ＥＰＡＣ２は、登録番号ＮＭ＿００７０２３の下、維持される配列により定義することができる。
【００６８】
本明細書を通じて、アルツハイマー病という用語は、初老期痴呆及び脳卒中、脳損傷又は飲酒などの明らかな器官的な原因によるものではないすべての痴呆を含むアルツハイマー型のすべての痴呆に当てはまる。また、この用語は、βアミロイド蛋白の無定形の細胞外沈着又は神経細胞内微小管と通常関連するタンパク質のリン酸化型のフィラメントを含む神経原線維変化からなる、アミロイド斑の病理学的変化を示すいかなる疾患の状態にも当てはまると考えられる。
【００６９】
アルツハイマー病などの脳障害の治療的介入における疾患の標的を調査する際に、サイクリックヌクレオチドのシグナル伝達に関わる遺伝子活性を調べるマイクロアレイ技術を使用して研究を行った。結果として、本発明者らによりアルツハイマー病においてＥＰＡＣ１遺伝子及びＥＰＡＣ２遺伝子（配列表で配列番号１及び配列番号２）は、それぞれ強く上方制御及び下方制御されることが発見された。
【００７０】
サイクリックヌクレオチドのシグナル伝達カスケードは、多くの細胞機能に対して強力な制御機能を有する。このシステムを変更できる化学物質が、多くの疾患の状態に有益な効果を有することが認められている。ＥＰＡＣが発見されたのは極めて最近であるが、ＥＰＡＣの発見により、サイクリックＡＭＰが細胞に影響を及ぼす新しい仕組みが特定された。図１は、サイクリックＡＭＰに対するＥＰＡＣの作用を要約している。グアニンヌクレオチド交換因子を制御するこれらサイクリックＡＭＰは広く発現し、したがって、非常に多様な細胞機能において意味を持つ可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
ＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２とアルツハイマー病との関連を示す実験的エビデンス
ＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２とアルツハイマー病との関連を示すために次の手順を実施した（遺伝子配列の基本的な概要を、図２に示す）。
【００７２】
全細胞ＲＮＡ（１０〜２５μｇ）を使用して遺伝子チップに対する次のｃＤＮＡ合成を設定する。遺伝子チップスライドごとに２つのチューブ（すなわち、１つはＣｙ３用に、１つをＣｙ５用にする）が必要である。実験ごとに２つの遺伝子チップが必要であり、対照のサイダイ（Ｃｙ  ｄｙｅ）と患部ＲＮＡを遺伝子チップごとに換えて、更に２つの遺伝子チップ間で交換する。チューブ１及びチューブ２には、対照試料のＲＮＡを使用し、チューブ３及びチューブ４には患部試料のＲＮＡを使用する。
総ＲＮＡ（１μｇ／μＬ）                  ２３μＬ
ランダムヘキサマー（３μｇ／μＬ）        ４μＬ
小計                                      ２７μＬ
【００７３】
７０℃で１０分間インキュベートし、以下を各チューブに添加する前に２分間氷冷する。
５×緩衝液                                １０μＬ
０．１Ｍ  ＤＴＴ                          ５μＬ
ｄＮＴＰｍｉｘ（２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ）  １μＬ
１ｍＭ  Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（チューブ１及び３）又はＣｙ５−ｄＣＴＰ（チューブ２及び４）                                                  ５μＬ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  （２００Ｕ／μＬ）      ２μＬ
総計                                                  ５０μＬ
【００７４】
どちらのチューブがＣｙ３で、どちらのチューブがＣｙ５であるか書き留める。
【００７５】
２５℃で１０分間インキュベートした後、４２℃で最低５時間インキュベートする。
【００７６】
１Ｍ  ＮａＯＨ  １０μＬを添加した後、混合し、６５℃で１５分間インキュベートする。
【００７７】
１Ｍ  ＨＣｌ  １０μＬを添加する。
【００７８】
緩衝液ＰＢ（Ｑｉａｇｅｎ提供）３５０μＬを添加し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）カラムに移す。
【００７９】
室温（ｒ．ｔ）で、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【００８０】
緩衝液ＰＥ  ０．７５μＬをＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）カラムに添加する。
【００８１】
室温で、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【００８２】
カラムから流れた溶液を捨てる。
【００８３】
室温で、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【００８４】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）カラムを１．５ｍＬマイクロチューブに入れる。
【００８５】
溶出緩衝液３０μＬをＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）カラムの中央に添加する。
【００８６】
１分間静置する。
【００８７】
室温で、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【００８８】
溶出緩衝液３０μＬをＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）カラムの中央に添加する。
【００８９】
１分間静置する。
【００９０】
室温で、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【００９１】
ＤＮＡ溶液（合計６０μＬ）を取り出し、ほとんど完全に乾燥するまでｓｐｅｅｄ  ｖａｃで試料を乾燥させる（３０℃／５０〜６０分）。
【００９２】
ｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅハイブリダイゼーション緩衝液を６５℃になるまで予熱する。
【００９３】
予熱したハイブリダイゼーション緩衝液１１０μＬを乾燥させたｃＤＮＡペレットに添加し、気泡が混入しないようにピペットでよく混合する。
【００９４】
対照及び病変試料に対してＣｙ５とＣｙ３を混ぜて（チューブ１＋４、チューブ２＋３）、よく混合する。
【００９５】
混合物を２分間６５℃まで再加熱し、ピペットを数回繰り返し上下させる。
【００９６】
遠心沈殿させる（１３，０００ｒｐｍ／３０秒）
【００９７】
ＭＷＧのｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅをスライドグラスに塗布する（製造業者の指示通りに）。最初に個々のｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅを切取り線に沿って切り離す。
【００９８】
厚いポリエステルシートを注意深く取り除き、ｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅ１側を露出させる。
【００９９】
スライドグラス上の点状アレイのまわりにｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅを差し込む。
【０１００】
加熱ブロックで、ハイブリダイゼーション混合物を９５℃で３分間加熱する。
【０１０１】
３０〜６０秒間氷冷する。
【０１０２】
ｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅの薄いポリエステル支持シートを取り除く。ハイブリダイゼーション混合物をｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅの１側縁に沿ってマイクロアレイに塗布する。
【０１０３】
混合物が塗布してある側から反対側へ、工程中に気泡が入らないように注意して、ｇｅｎｅ  ｆｒａｍｅにポリエステルのカバーグラスを注意してあてがう。
【０１０４】
４２℃で１６〜２４時間インキュベートする。振盪培養器（１４０ｒｐｍ）を使用する。
【０１０５】
遺伝子チップを洗浄する前に、すべての緩衝液を３０℃まで予熱する。マイクロアレイを室温で５分間、洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）内でゆるやかに撹拌することにより洗浄する。
【０１０６】
マイクロアレイを室温で５分間、洗浄緩衝液２（０．５×ＳＳＣ）内でゆるやかに撹拌することにより洗浄する。（２回）
【０１０７】
余分の水をペーパータオルでスライド縁を軽くたたいて排出し、遮光にて放置し空気乾燥させる。アレイスキャンで粒状の場合、再洗浄を行い、アレイを５０ｍＬ遠心機に入れ、１，４００ｒｐｍで遠心するベンチで５分間２回遠心することによって乾燥させる。
【０１０８】
遺伝子チップの結果は、アルツハイマー病において、ＥＰＡＣ１は平均的な最大係数が２．４倍であったことから上方制御され、ＥＰＡＣ２は平均的な最大係数が２．９倍であったことから下方制御されていることを示していた。本発明者らが完全に異なるアルツハイマー病患者のプール検体と対照検体を使用した２番目の試験においても同様の結果が得られた。両方の試験とも、アルツハイマー病で最もよく病態が現れることで知られる部位である脳の海馬と前頭皮質を使用した。２番目の試験では、更に対照として、アルツハイマー病の損傷に対していくらかの耐性を有する部位である小脳について試験した。海馬及び前頭皮質部位から得られた結果と対比して、アルツハイマー病患者の小脳は、ＥＰＡＣ１がやや少なく（１．３倍）、ＥＰＡＣ２には検出可能な差が見られなかった。このことは、アルツハイマー病患者の前頭皮質及び海馬でのＥＰＡＣ１の大きな上方制御と、ＥＰＡＣ２の下方制御は本疾患の病態に関連していることを示していた。遺伝子配列技術を使用して検出可能な遺伝子発現の変化の程度は半定量的なものに過ぎないが、ＥＰＡＣに見られる変化は、アルツハイマー病で変化することが既知であるチップに対する対照遺伝子の変化と同等である。
【０１０９】
図３は、アルツハイマー病に関して本発明者らが注目した変化を示している。これらはＥＰＡＣ１の上方制御、ＥＰＡＣ２の下方制御を示している。また、本図はアルツハイマー病に関与することで知られる他の遺伝子の変化についても示しており、このことはこの結果の妥当性を更に支持するものである。
【０１１０】
また、結果を確認するためにノーザンブロット分析を行っている。この結果は図８ａ（ＥＰＡＣ１）及び図８ｂ（ＥＰＡＣ２）で見ることができる。
【０１１１】
神経障害の治療に使用する化合物をスクリーニングするためのＥＰＡＣ１、ＥＰＡＣ２などのグアニンヌクレオチド交換因子の使用
好ましい実施形態では、ＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２を、アルツハイマー病並びにその他の神経障害及び神経変性疾患の治療に有用であると考えられる化合物をスクリーニングするために使用する。以下に、ＥＰＡＣを活性化及び／又は抑制する化合物を同定するために適用可能なスクリーニング法の詳細を示す。
【０１１２】
ｃＡＭＰ競合の測定
この測定は、ＥＰＡＣで発見される特定のｃＡＭＰ結合部位でｃＡＭＰと結合を競合する化合物に依存する。放射標識ｃＡＭＰの存在下で、ＥＰＡＣタンパク質は放射標識される。したがって、ＥＰＡＣへの結合をｃＡＭＰと競合する化合物は、本化合物が放射標識タンパク質の量を減少することにより検出することができる。放射標識タンパク質量は、遊離放射標識ｃＡＭＰを木炭で沈殿させた後、上澄み部分を測定するか、ＥＰＡＣをタンパク質結合フィルターに固定して、未結合のすべてのｃＡＭＰを洗い流すことによって検出することができる。
【０１１３】
好ましいスクリーニング
本発明者らにより好まれる特定のライブラリスクリーニングを、ＥＰＡＣ１を使用して実施した。本スクリーニング法はあらゆる適切なライブラリに対して使用することが可能で、ＥＰＡＣ２又は低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｐファミリーに属するタンパク質の他のすべてのグアニンヌクレオチド交換因子に対して使用するために修正することができる。本スクリーニングでは、［３Ｈ］−サイクリックＡＭＰのＥＰＡＣ１（サイクリックＡＭＰにより直接活性化される交換タンパク質）への結合を阻害する試験化合物の能力を評価する。したがって、アルツハイマー病で上方制御されるＥＰＡＣ１遺伝子の、サイクリックＡＭＰの結合による活性化の阻害は、本疾患に対して潜在的な治療効果を有する可能性がある。
【０１１４】
本ステップは以下の通りである。
（１）ライブラリプレートは必要ならば解凍し、新しい娘プレートへ１０μＬを取り出す。
（２）１５％ＤＭＳＯ  ９０μＬを娘プレートに添加する。
（３）１０μＬを娘プレートから測定プレートへ移す。
（４）１５％ＤＭＳＯ  １０μＬを１列目のＡ〜Ｆに添加する。
（５）０．５Ｍ  ＤＴＥを緩衝液Ｅ（５０ｍＭトリス［６．０７ｇ／Ｌ］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ［２．９２ｇ／Ｌ］、５％ｖ／ｖグリセロール［５０ｍＬ／Ｌ］ｐＨ７．６）へ添加して、最終濃度５ｍＭにする。
（６）１０Ｍｍ冷却サイクリックＡＭＰを１ｍＭへ希釈する（１５％  ＤＭＳＯ  ９００ｕＬを１０ｍＭ貯蔵液１００ｕＬへ添加する）。サイクリックＡＭＰ  １０μＬをウェル１Ｇ及びＨへ添加する。
（７）［３Ｈ］サイクリックＡＭＰを作成し（２７０４Ｃｕ／ｍＭｏｌの１．５μＣｕ／ｍＬ）、５０μＬを測定プレートのすべてのウェルへ添加する。
（８）ＥＰＡＣ溶液を再懸濁し、次に、緩衝液Ｅで希釈する。溶液を小型ビーカーに添加し、撹拌棒で静かに撹拌する。５０μＬ／ウェルを列１〜１１へ添加する。
（９）プレート振盪機上で、室温で２０分間インキュベートする。
（１０）新しいろ板をセルハーベスターに入れる（すなわち、Ｐａｃｋａｒｄ（商標）セルハーベスター）。
（１１）緩衝液３００μＬ／ウェルで予洗する。３０ｍＬを緩衝液トレーに添加し、吸引する。
（１２）測定プレートを一番下のトレーに置き、吸引する。
（１３）３回洗浄する。
（１４）ハーベスター及び一番下のシールろ板を開く。
（１５）ハーベスターからろ板を取り出し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０（商標）５０μＬ／ウェルを添加する。
（１６）プレート振盪機で１５分間振盪する。
（１７）Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（商標）を読み取る。
【０１１５】
標準操作ではＧＳＴとグルタチオンビーズに固定したＥＰＡＣ（１又は２）ｃＡＭＰ結合ドメインとの融合タンパク質を使用する。
【０１１６】
以下の化合物がＥＰＡＣスクリーニングを使用することが発見された。
ＥＰＡＣ        ＥＰＡＣ２    （ＩＣ５０  μＭ）
１（ｎ＝２）    （ｎ＝２）
Ｃ１６Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ３      ４．３          １９．３
Ｃ１５Ｈ９ＮＯ６Ｓ          １．５          ０．９
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ２      １６．２        ９．３５
Ｃ１４Ｈ８ＣＩＮＯ２        ４１            ６６
Ｃ１７Ｈ２１Ｎ３Ｏ２Ｓ２      １６            ２４．８
Ｃ２０Ｈ１８Ｎ６Ｏ３Ｓ２      １２．３        １２．１
Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ４Ｓ       １６２          ２８４
Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｓ２      １６            １４
Ｃ１０Ｈ６ＩＮＯ２Ｓ２       ２３            ３０．５
Ｃ１６Ｈ１２ＣＩＮＯ５Ｓ３    ４              ３
Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２ＯＳ３        １５            １１．９
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ４Ｏ３Ｓ２       ２５            ２８．５
Ｃ１４Ｈ８Ｎ４Ｏ３            ２０            ２６．９
Ｃ１８Ｈ１１ＮＯ２            １４            ５．２５
Ｃ１５Ｈ１１ＣＩＮ２Ｏ２Ｓ２    ５３            ２６．５
【０１１７】
放射標識ＧＴＰによる活性化Ｒａｐの検出
この測定は、活性ＥＰＡＣにより活性化されるとＲａｐタンパク質がＧＤＰをＧＴＰと交換するという事実に依存する。放射標識ＧＴＰを使用することにより、ＥＰＡＣの活性を放射標識Ｒａｐ量を検出することにより測定することができる。放射標識タンパク質の量は、遊離放射標識ＧＴＰを木炭で沈殿させた後、上澄み部分を測定するか、ＥＰＡＣをタンパク質結合フィルターに固定して、未結合のすべてのＧＴＰを洗い流すことによって検出することができる。
【０１１８】
蛍光伝達
この測定はＲａｐがＲａｌに結合するという事実に依存する。この相互作用は、化学的生物発光（ＢＲＥＴ）法又はレーザ蛍光（ＦＲＥＴ）法によってＲａｐのタグを刺激することにより、Ｒａｌのタグが蛍光を発するか、冷光を発するといった方法で、これらタンパク質に融合した蛍光タグの間の電子の伝達を促進するために使用する。蛍光は、ＲａｐのＥＰＡＣ活性化の後、Ｒａｐ及びＲａｌがしっかり結合する場合だけ発するので、蛍光の検出をＥＰＡＣ活性を判定するために使用することができる。
【０１１９】
ＧＴＰ類似体ｔｎｐＧＴＰ
ｔｎｐＧＴＰの変化は、放射標識ＧＴＰによる活性化Ｒａｐの検出において記載したのと同じ原理を使用してタンパク質と結合するとき蛍光を発する。蛍光の変化の簡単な測定により、活性化Ｒａｐの量を測定することができ、更にそれ自身も、ＥＰＡＣ活性の指標となる可能性がある。
【０１２０】
Ｒａｌ  ＧＤＳ／Ｒａｐ  ＥＬＩＳＡ法
この方法は、ＥＰＡＣ活性化ＲａｐのＲａｌ  ＧＤＳへの結合に依存する。結合したＲａｐは、抗ＲＡＰ抗体を使用して測定することができる。本検出システムは、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ又はＢｅａｄａｌｉｔｅ（商標）／Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）などの他の適したすべての方法に基づいている。
【０１２１】
表面プラスモン共鳴
この方法は、チップ（例、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）装置）の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を測定できる装置に使用されるチップの表面へのＥＰＡＣの結合に依存する。ＥＰＡＣに結合する化合物を、化合物がチップを通過した後のＳＰＲの変化で検出することができる。
【０１２２】
細胞全体
ＥＰＡＣが無傷細胞でリアノジン受容体を活性化すると、Ｃａ２＋の流入を引き起こす。この活性化は、Ｆｕｒａ２又はＦｌｕｏ３などのバイオプローブを使用して検出することができる。フォルスコリン又はカフェインによる細胞の刺激により細胞内ｃＡＭＰが産生すると、ＥＰＡＣの活性化を引き起こす。ＥＰＡＣ阻害物質は、どの程度Ｃａ２＋の放出を阻害したか測定することにより検出することができる。このアッセイは、ＥＰＡＣによって活性化されるあらゆるタンパク質及び本活性化を検出可能なあらゆるバイオプローブも含めることが可能である。
【０１２３】
αスクリーン
このＰ＆Ｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の近接アッセイは、特定のイベントと相互作用するタンパク質と結合するビーズ間での蛍光伝達に依存する。ＥＰＡＣはＲａｐを活性化することで、Ｒａｌ  ＧＤＳとの相互作用が可能になる。したがって、αスクリーンビーズによりＲａｐ及びＲａｌ  ＧＤＳを標識することで、ＥＰＡＣ活性の検出のための基礎を提供する可能性がある。
【０１２４】
アルツハイマー病の治療における有用性を判定するための鉛化合物のスクリーニング
アミロイド細胞ベースアッセイ
前述のように、アミロイド斑はアルツハイマー病患者の脳で発見される。これらのアミロイド斑は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が正常な脳で発見される可溶性の神経保護ｓＡＰＰαではなく、不溶性アミロイドβに変換されることで生じることが発見されている。図４ａは、アミロイド前駆体タンパク質の代替のプロセッシング経路を示し、図４ｂはＡＰＰの代替のスプライスバリアントを示す。
【０１２５】
このことは、ＥＰＡＣの修飾因子であると特定される鉛化合物を、
ＩＭＲ３２神経芽細胞腫細胞系を使用し、
標準的な技術及びプロトコールを使用した血清不足の細胞、
試験化合物を添加し、
ｓＡＰＰα分泌のレベルを測定する
アミロイド細胞を基にした測定を用いることで、更にスクリーニングできることを意味している。
【０１２６】
ＡＰＰα誘導のスクリーニングの結果を図５に示す。
【０１２７】
リン酸−タウアッセイ
同様のスクリーニング法を使用して、神経原線維変化を調べることができる。アミロイド斑と同様に、神経原線維変化はアルツハイマー病に関連する。タウタンパク質が過剰にリン酸化されると、神経原線維変化が生じる。本測定は２次的スクリーニングか、リン酸−タウ動物モデルに基づく可能性がある。
【０１２８】
同定されるいかなる鉛化合物も、ＥＰＡＣに対する特異性を試験する酵素パネルでスクリーニングすることができる。このパネルに含まれる酵素は、ＰＫＡ、ｃＡＭＰ依存性イオンチャンネル及びヒトＰＤＥファミリーに含まれるすべての酵素である。
【０１２９】
本発明が多くの利点を提供することが分かる。特に、重要な治療標的並びにアルツハイマー病及び他の神経障害又は神経変性疾患の治療のための化学鉛を提供する。また、潜在的な治療用化合物のスクリーニング法も提供する。これはアルツハイマー病などの神経変性疾患とＥＰＡＣ１及びＥＰＡＣ２との関連に関する最初の指標である。
【０１３０】
上記の実施形態は例示目的でのみ記載されており、限界については考慮すべきでないことは当業者に理解されよう。添付した請求により定義される本発明の範囲を逸脱することなく、様々の変更及び修正が存在する。特に、実施形態の例として記載したスクリーニング法以外の代替のスクリーニング法が使用される可能性がある。
【０１３１】
アルツハイマー病の脳検体の提供に対して、カナダ脳組織バンク、トロント大学、ＵＨＮ−トロント西部病院（ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＵＨＮ−Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，３９９  Ｂａｔｈｕｒｓｔ  Ｓｔ．，Ｆｅｌｌ  Ｗｉｎｇ  ５−２２２Ａ＆Ｂ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ  Ｍ５Ｔ  ２５８）に感謝する。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】
2006525300.tif 000003
【図２】
2006525300.tif 000004
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2006525300.tif 000010
【図７−２】
2006525300.tif 000011
【図７−３】
2006525300.tif 000012
【図８ａ】
2006525300.tif 000013
【図８ｂ】
2006525300.tif 000014
【配列表】
2006525300000001.app
【国際調査報告】
2006525300.tif 000015
2006525300.tif 000016
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2006525300.tif 000019
2006525300.tif 000020
2006525300.tif 000021
2006525300.tif 000022
2006525300.tif 000023
2006525300.tif 000024