(57)【要約】本発明は、記憶喪失がアルツハイマー病の対象の脳で発見された組織病理学上の特徴を随伴している薬理学上の非ヒト動物モデルの開発に関する。一実施形態では、若年成体のロングエバンスラットの左心室中に、Ｆｅ２＋、Ａβ４２及びブチオニンスルホキシミン（ＦＡＢ）溶液を４週間連続して注入すると、脳脊髄液の過リン酸化タウタンパク質濃度の上昇を伴った記憶障害が誘導された。処置した動物から得られた脳には、海馬と皮質に、神経炎性斑、変化、ニューロン欠損、アストログリオーシス及び小膠細胞症が見られた。本発明は、神経疾患の予防手段、治療手段、及び診断手段を評価するのに利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβ化合物、少なくとも１種の酸化促進化合物、及び少なくとも１種の抗酸化阻害剤の組み合わせの薬理学的に有効な量を非ヒト動物に灌流させる方法によって誘発された神経疾患を有する非ヒト動物であって、前記灌流が、記憶試験及び学習試験において動物の動作障害を起こし、しかも動物の脳に異常神経病理を誘発し、前記の動作障害及び異常神経病理が対照の非ヒト動物と比較して得られる、非ヒト動物。
【請求項２】
Ａβ化合物がＡβ４２を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
Ａβ化合物がＡβ４２のペプチド断片を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
Ａβ４２のペプチド断片が、Ａβ１〜４０又はＡβ２４〜３５の少なくとも１つを含む、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
Ａβ化合物がＡβ４２を模倣したペプチド模倣体を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
少なくとも１種の酸化促進化合物が、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸マンガン、及び硫酸亜鉛からなる群から選択される、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
少なくとも１種の酸化促進化合物が硫酸鉄を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
少なくとも１種の抗酸化阻害剤がブチオニンスルホキシミンを含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記方法が、有効量のホスファターゼ阻害剤を非ヒト動物に灌流させることをさらに含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
ホスファターゼ阻害剤が、オカダ酸、１−ノル−オカダオン、バイオアレトリン、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、エンドタル、エンドタルチオ無水物、フェンバレレート、オカドール、ペルメトリン、フェニルアルシン酸化物、ピロリン酸塩、フッ化ナトリウム、及びバナジン酸塩からなる群から選択される、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
ホスファターゼ阻害剤がオカダ酸を含む、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記方法が、有効量の炎症誘発性化合物を非ヒト動物に灌流させることをさらに含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
炎症誘発性化合物がＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１ｂからなる群から選択される、請求項１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
炎症誘発性化合物がＴＮＦ−αを含む、請求項１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
Ａβ化合物、少なくとも１種の酸化促進化合物、及び少なくとも１種の抗酸化阻害剤の組み合わせの薬理学的に有効な量を非ヒト動物に灌流させることを含む、非ヒト動物に神経疾患を誘発させる方法。
【請求項１６】
Ａβ化合物がＡβ４２を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ａβ化合物がＡβ４２のペプチド断片を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ａβ４２のペプチド断片が、Ａβ１〜４０又はＡβ２４〜３５の少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ａβ化合物がＡβ４２を模倣したペプチド模倣体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種の酸化促進化合物が、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸マンガン、及び硫酸亜鉛からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種の酸化促進化合物が硫酸鉄を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種の抗酸化阻害剤がブチオニンスルホキシミンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
有効量のホスファターゼ阻害剤を非ヒト動物に灌流させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ホスファターゼ阻害剤が、オカダ酸、１−ノル−オカダオン、バイオアレトリン、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、エンドタル、エンドタルチオ無水物、フェンバレレート、オカドール、ペルメトリン、フェニルアルシン酸化物、ピロリン酸塩、フッ化ナトリウム、及びバナジン酸塩からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ホスファターゼ阻害剤がオカダ酸を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
有効量の炎症誘発性化合物を非ヒト動物に灌流させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
炎症誘発性化合物がＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１ｂからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
炎症誘発性化合物がＴＮＦ−αを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
神経疾患の症状を改善する薬剤のスクリーニング方法であって、
薬剤と接触させた第１の非ヒト動物の記憶試験及び学習試験における動作を、薬剤と接触させなかった第２の非ヒト動物の動作と比較することを含み、
第１の非ヒト動物と前記第２の非ヒト動物がＡβ、少なくとも１種の酸化促進化合物、及び少なくとも１種の抗酸化阻害剤の薬理学的に有効量で共灌流されており、
前記共灌流が、記憶試験及び学習試験における動作障害と、第１の非ヒト動物及び第２の非ヒト動物の脳中の異常神経病理をもたらし、且つ、動作障害と異常神経病理が対照の非ヒト動物との比較において得られ、それによって、症状を改善する薬剤が、記憶試験と学習試験において第２の非ヒト動物と比較した場合に前記第１の非ヒト動物の優れた動作によって同定される、方法。
【請求項３０】
神経疾患を治療するのに有用な薬剤のスクリーニング方法であって、
薬剤と接触させた第１の非ヒト動物の記憶試験及び学習試験における動作を、薬剤と接触させなかった第２の非ヒト動物の動作と比較するステップであって、第１の非ヒト動物と前記第２の非ヒト動物がＡβ、少なくとも１種の酸化促進化合物、及び少なくとも１種の抗酸化阻害剤の薬理学的に有効量で共灌流されており、前記共灌流が、記憶試験と学習試験における動作障害と、第１の非ヒト動物及び第２の非ヒト動物の脳中の異常神経病理をもたらし、且つ、動作障害と異常神経病理が対照の非ヒト動物との比較において得られるステップと、
前記第１の非ヒト動物が、第２の非ヒト動物と比較して、記憶試験及び学習試験において優れた動作を示す場合に、第１の非ヒト動物と第２の非ヒト動物の脳中の神経病理を比較するステップであって、それによって、神経疾患を治療するのに有用な薬剤を、第２の非ヒト動物と比較した場合の第１の非ヒト動物における神経病理知見の減少によって同定するステップとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患擬態動物モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（「ＡＤ」）は、初老で発生する最も一般的な痴呆であり、６５才以上の人口の約１０％、８０才以上の人口の約４０％が罹患している。ＡＤは、記憶障害が神経組織学上の改変に関係しているが、この疾患の２つの特徴として、β４２−アミロイドペプチド（Ａβ４２）凝集に基づく神経炎性斑の形成とタウタンパク質過リン酸化に伴う神経原線維変化（「ＮＦＴ」）がある。この十年間に、ＡＤの生理病理学を説明するいくつかの仮説が明らかになっている。この疾患の原因に関する主たる現在の仮説は、「アミロイド形成（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）」（Ｈａｒｄｙ  ＪＤ及びＨｉｇｇｉｎｓ  ＧＡ、（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６（５０５４）：１８５〜１８５）；「カルシウムホメオスタシスの阻害（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）」（Ｋａｃｈａｔｕｒｉａｎ  ＺＳ、（１９８７）、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ、８（４）：３４５〜３４６）；「エネルギー不全（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ）」（Ｂｅａｌ  ＭＦ、（１９９２）、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、３１（２）：１１９〜３０）；「酸化ストレスの誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）」（Ｖｏｌｉｃｅｒ  Ｌ及びＣｒｉｎｏ  ＰＢ、（１９９０）、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ、１１（５）：５６７〜５７１）；最近では、「タウタンパク質の過リン酸化（ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」（Ｍｕｄｈｅｒ  Ａ及びＬｏｖｅｓｔｏｎｅ  Ｓ、（２００２）、ＴｉＮＳ、２５（１）：２２〜２６）である。これらの仮説の試験中に得られた多数のデータにもかかわらず、ＡＤの進行に関与する原因及び現象の根底にある機序は、依然として判明されていない。例えば、上述の仮説に基づいて開発された様々な薬剤については、臨床試験でいかなる有意な効果も証明されてはいない。
【０００３】
また、ＡＤに関する有効な治療を開発するにあたって、現時点での欠点の原因として、ＡＤ病態生理を擬態する関連動物モデルがないということがある。かかるモデルの開発は、すべての予防手段、治療手段、及び診断手段の開発の必須条件である。ＡＤを誘発し、ＡＤの一因となっている種々の因子を分析及び同定する目的で、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）突然変異を保持する種々のトランスジェニックモデルがマウスで構築されている（Ｊａｎｕｓ  Ｃら、（２０００）、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１５０２（１）：６３〜７５；Ｊａｎｕｓ  Ｃ及びＷｅｓｔａｗａｙ  Ｄ、（２００１）、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ、７３（５）：８７３〜８８６）。これらのモデルによりこの疾患に関する有用なデータは得られたが、それらのデータはヒトＡＤの病態生理を忠実に表現してはいない。これらのモデルは、ヒトに存在するＡＰＰ遺伝子の遺伝子改変に基づいている。ＡＰＰ突然変異は、ＡＤ患者の総数のごく一部（５％未満）に相当するのみである。言い換えれば、これらのトランスジェニックモデルは、遺伝病である家族性ＡＤの病態生理は示すが、ＡＤ症例の約９５％に相当する一般的な散発性ＡＤを示すものではない。さらに、これらのトランスジェニック動物のバックグラウンドが遺伝子組換えであるために、マウスにおける導入遺伝子／プロモーター構築物の組込みに関する神経学上の経過的予後及び補整効果について何も知られていない場合、挙動データの信頼性について疑わなければならない。さらにまた、ＮＦＴがないこと、及びニューロン欠損のないことは、この動物モデルがヒトＡＤと相違することを示している。
【０００４】
また過去には、動物脳の内部にβ−アミロイドペプチドを直接注入することによってＡＤ生理病理を再現する様々な試みが行なわれてきた。これらの試みは、使用ペプチドの種類、注入の局在性、注入の濃度及びタイミング等の種々の理由により決定的なものではなかった。さらには、これらのすべての試験においては、β−アミロイドペプチドは単独で注入されていた。このため、これまでの動物モデルは、神経疾患の予防手段、治療手段、又は診断手段を有効に開発するための適当な動物モデルを示していない。従って、新規な動物モデルが必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経疾患擬態非ヒト動物モデル、並びに前記動物モデルを調製するための方法及び組成物、並びにそれを用いる方法に関する。この神経疾患擬態非ヒト動物は、少なくとも１種の酸化促進化合物と少なくとも１種の抗酸化阻害剤とを組み合わせたＡβを動物に灌流させることにより得られる。さらに、ホスファターゼ阻害剤及び／又は炎症誘発性化合物で動物を灌流することもできる。得られた非ヒト哺乳動物は、脳に神経疾患が発症している。本動物モデルは、薬剤のスクリーニングプロトコルで使用可能であって、神経疾患の予防手段、治療手段、及び／又は診断手段の開発にこれを用いることができる。
【０００６】
一実施形態では、ＡＤに関する薬理学的動物モデルは、脳組織の組織病理学上の改変と記憶障害の両方を誘発させることにより開発することができ、これにより、ＡＤ脳で発生することが仮定されているのと同様な微小環境が脳中に作り出される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、学習試験及び記憶試験を無理なく実施することができる非ヒト動物モデル（好ましくは、サル、イヌ、又はげっ歯動物、例えば、マウス若しくはラット、又は他の動物）、並びに前記動物を調製し使用する方法及び組成物に関する。本動物には、動物脳においてヒト神経疾患で確認されている生理病理学上の改変を誘発可能な、Ａβ及び少なくとも１種の酸化促進化合物及び少なくとも１種の抗酸化阻害剤が共同注入されている。本明細書では、Ａβは、Ａβ４２、Ａβ４２のペプチド断片、例えば、Ａβ１〜４０又はＡβ２４〜３５等、或いはアミロイドを模倣したペプチド模倣体を意味する。さらに、ホスファターゼ阻害剤及び／又は炎症誘発性化合物を動物に灌流してもよい。灌流後、この動物は、短期間内に（通常３０日以内に）神経疾患を発症する。
【０００８】
さらに本発明は、神経疾患の予防手段、治療手段、及び／又は診断手段の開発において有用な化合物をスクリーニングする方法を対象とする。対象の化合物は、注入される動物に投与して、神経疾患治療における前記化合物の効果を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書では、「治療する」又は「治療」又は「療法」又は「治療上の」という用語は、これらに限定されるものではないが、対象のＡＤ、神経毒性、又はβ−アミロイド誘導神経毒性をはじめとする、神経疾患に関する疾患又は障害に随伴する障害又は疾患のすべての治療を意味し、また、これに限定されるものではないが、これらの障害又は疾患に罹患しやすいが、まだこれらの障害又は疾患に罹患しているとは診断されていない対象においてこれらの障害又は疾患が発病することを予防すること；これらの障害又は疾患を抑制すること、例えば、これらの障害又は疾患の進行を妨げること；これらの障害又は疾患を軽減すること、例えば、これらの障害又は疾患から回復させること；或いは、これらの疾患又は障害によって生じた症状を軽減すること、例えば、これらの疾患又は障害の症状を食い止めること、が含まれる。本明細書では、「神経疾患」は、上述したすべての障害及び／又は疾患を包含するものとする。
【００１０】
対象における神経疾患に関する疾患又は障害に関連した「予防する」又は「予防」という用語は、対象に疾患又は障害がこれまで発症していなかった場合には、疾患又は障害の発症がないことを意味し、或いは、すでに障害又は疾患の発症があった場合には、障害又は疾患のさらなる進行がないことを意味する。
【００１１】
特段の定めのない限り、本明細書に用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同様の意味を有する。
【００１２】
神経疾患を誘発するには、４週間、非ヒト動物の左心室に、Ａβを単独で、又は酸化促進化合物及び抗酸化阻害剤と組み合わせて含有している溶液を直接注入することができる。Ａβ４２は、ＡＤに主として関与しているペプチドである。上記のとおり、例えば、Ａβ１〜４０又はＡβ２４〜３５などのＡβ４２のペプチド断片、或いはアミロイドを模倣したペプチド模倣体もまた本発明において使用することができる。ヒトＡＤで確認されている生理病理学上の改変を誘発するためにＡβと組み合わせて利用される酸化促進化合物としては、例えば、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸マンガン、及び硫酸亜鉛を挙げることができる。硫酸鉄は酸化促進物質であって、神経炎性斑の成分である。さらに、ヒトＡＤで確認されている生理病理学上の改変を誘発するのを補助する脳の抗酸化防御の阻害剤としては、例えば、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）を挙げることができる。ブチオニンスルホキシミンは、脳の抗酸化防御を低下させるために使用可能なグルタチオン合成の阻害剤である。さらに、脳の抗酸化防御を低下させ得る任意の化学物質又は薬剤はＢＳＯの効果を擬態している可能性があり、従って、動物モデルにおける対象である。ＦｅＳＯ４及びＢＳＯを使用する目的の１つは、Ａβ毒性に有利な条件を作り出すことである。さらにＡβの投与に加えて、酸化促進化合物、及び抗酸化阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、及び炎症誘発性化合物を投与してもよい。ホスファターゼ阻害剤としては、例えば、オカダ酸、１−ノル−オカダオン、バイオアレトリン、カリクリンＡ、カンタリジン酸、カンタリジン、シペルメトリン、デルタメトリン、エンドタル、エンドタルチオ無水物、フェンバレレート、オカドール、ペルメトリン、フェニルアルシン酸化物、ピロリン酸塩、フッ化ナトリウム、及びバナジン酸塩が挙げられる。オカダ酸は、タウタンパク質の脱リン酸化を阻害し、このタンパク質の過リン酸化状態と、次いで、ＡＤの第２の組織学上の特徴であるＮＦＴの形成をもたらす。炎症誘発性化合物としては、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１ｂを挙げることができる。ＴＮＦ−αは、ＡＤで報告されている炎症過程を再現する。上述したこれらの化合物は、別々に、又は一緒に、同時に又は連続して併用投与することができる。さらには、アルミニウムを用いてアルツハイマー病状の生理病理を誘発することができる。これらの化合物は、「薬理学的に有効な量」で用いられる。これは、投与される化合物の濃度が、この投与の組み合わせにおいて、化合物が投与される期間にわたって送達される化合物がＡＤを誘発する濃度をもたらすような量であることを意味する。
【００１３】
動物に上記化合物の組合せを注入した後、動物は、種に好適な神経反応試験を用いることにより神経疾患の存在を測定し評価することができる。例えば、マウスの移動行動／探索行動に関する試験は、神経心理学を評価する標準的な手段である（Ｆｉｌｅ及びＷａｒｄｉｌｌ、（１９７５）、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉａ（Ｂｅｒｌ）４４：５３〜５９；Ｌｏｇｇｉら、（１９９１）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．３８：８１７〜８２２）。例えば、マウスについては、「コーナーインデックス」（ＣＩ）試験を用いる。これは、脳病理を証明するために動物をスクリーニングする迅速且つ簡単な神経反応試験である。また、動物の神経病理も評価される。ＣＩ試験を行なうには、試験マウス（尾部で把持）を、そのホームケージとは別の同じケージである清潔なケージの中心に置く。そのケージにマウスを入れた後、最初の３０秒間にマウスが試験ケージのコーナーを鼻でかぐ回数をＣＩとして記録する。また、ＣＩ基準に到達する前に明らかに瀕死の動物と目に見える発作を起こす動物も病気として診断する。昼行性活動の差異を調節するには、全動物を１４：３０から１８：３０の間の時間で試験することができる。
【００１４】
ラットに関しては、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）の水迷路試験を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓ、（１９８４）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．、１１：４７）。この試験の改良版をマウスで利用することができる。モリス水迷路試験の他に、空間の記憶障害を調査するＹ迷路試験、初期の新奇恐怖応答とその後の探索行動を測定するオープンフィールド試験、並びに自発的な物体認識を評価する非見本合せ（ｎｏｎ−ｍａｔｃｈｉｎｇ−ｔｏ−ｓａｍｐｌｅ）自発試験を用いることができる（Ｅｎｎａｃｅｕｒ及びＤｅｌａｃｏｕｒ、１９８８、Ａｇｇｌｅｔｏｎ、１９９３）。
【００１５】
特に、対象の症候群によって影響を受けることが知られている脳領域の変化について調査する。対象の疾患がＡＤである場合、調査する領域としては、皮質辺縁系領域、扁桃体、嗅球が挙げられ、モニターする症状としては、神経膠症、ニューロン死、ＮＦＴ形成、コリン作動性神経伝達障害、血液及び脳脊髄液中の神経ステロイド濃度、脳構造中の遺伝子発現の改変、グルコース吸収及び利用における変化、並びにＡβプラーク形成が挙げられる。しかし、長命でない動物種では、特定の疾患に随伴する行動変化及び／又は病理学上のすべての変化を確認できるとは限らない。短命の本動物種では、後発の症状の出現を特定できないとは考えにくい。この問題解決に係わる試験は、モデル動物自体を特性決定するためにすでに使用されている、或いは予定されている試験と同じである。
【００１６】
本発明の動物は、ＡＤを予防又は治療すると考えられる対象の化合物、例えば、ビタミンＥ又はラザロイドなどの抗酸化剤をスクリーニングするために用いることができる。動物に対象の化合物を投与し、未治療の動物と比較した場合の神経疾患の発病率の低下又は発症の遅発を予防の指標として検出することができる。使用する好ましい指標は、学習試験及び記憶試験の実施における変化など、生存動物で検出可能なものである。動物が死亡した場合、或いは動物が殺された場合には、病理学上の変化における影響によりその効果を確認することができる。さらに、ＡＤを改善又は回復させると考えられる対象の化合物をスクリーニングするために本動物を用いることができる。神経疾患のある動物を対象の物質で治療し、未治療の神経疾患のある動物と比較した場合の遅延死、又は神経反応における改善、神経膠症、又はグルコースの吸収／利用を改善又は治療の指標として検出する。
【００１７】
また、ＡＤを促進又は刺激する疑いがもたれている化合物のスクリーニング、又は状態（例えば、オキシダント又は頭部外傷）の試験を行なうため、本動物を前記化合物又は前記状態に暴露させ、ＡＤを誘発する試験物質又は状態の可能性の指標として、神経反応の低下、若死、神経膠症、グルコース吸収／利用の減少を測定することによって、本発明の動物を用いることができる。さらに本方法は、ＡＤを刺激する疑いのある化合物又は状態に動物を暴露させ、治療薬の効果を評価することによって、治療薬をスクリーニングすることを含み得る。
【００１８】
さらに、対象の神経疾患を診断するのに適用可能な診断薬を開発するための対象となり得るパラメーターを特性決定し、明らかにするために、本発明の動物を用いることができる。本動物は、ヒトの診断アッセイの改良に使用可能な液体、組織等における変化の検出に用いることができる。これは、認知障害を示す症状が出現する前の早期発見の場合に特に有用であると考えられる。
【００１９】
当業者は、本明細書の記載に基づいて、その最大限まで本発明を利用することができると思われる。本明細書に列挙されているすべての刊行物は、引用によってその全体を本明細書中に援用するものとする。従って、以下の特定の実施例は単なる例示として解釈されるべきものであって、本明細書の残りの記載を限定するものでは決してない。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
非ヒト動物における神経疾患の誘発。
動物：３００〜３２５グラム重のロングエバンス雄性ラットをケージに入れ、食物と水を適宜与えながら、自然の日夜サイクルを送らせた。
【００２１】
モリス水迷路プロトコル：外科的処置の前に、黒色の貯水槽（直径２００ｃｍ）中で、ラットに対して標準のモリス空間ナビゲーションタスクの訓練を課した。水は、水混和性の非毒性白ペンキ（Ｃｒａｙｏｌａ  Ｉｎｃ．）により不透明化した。異なる４箇所の任意に割り当てられたスタート位置にラットを置き、貯水槽中央の固定位置にある目に見えないプラットフォーム（直径２０ｃｍ）を探し出すように訓練した。水温は約２４℃であった。ラットがプラットフォームを発見するまで、或いは１２０秒が経過するまで、訓練を続けた。ラットが１２０秒以内にプラットフォームを発見できなかった場合、２０秒間プラットフォームにラットを置き、次いで、貯水槽から取り出した。次の訓練との間は３０分間置きながら、１日に４回、４日間連続してラットを訓練した。外科的処置は５日目に実施した。４週間（灌流期間）の終わりに、ラットの記憶力について再度試験を課した。
【００２２】
外科的処置：麻酔をかけたラット（エキテシン、３ｍｌ／ｋｇ、腹腔内）を定位固定フレーム上に置いた。電極マイクロマニピュレーターを使用し、浸透圧性マイクロポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ（カリフォルニア州））の出口を、ブレグマ前の座標Ｄ＝３．４ｍｍ、Ｌ＝１．４ｍｍ、及びＡＰ＝０．９２ｍｍに続く左心室へ埋め込んだ。浸透圧性ポンプのタンクは、ラット背中の肩甲骨中央領域の皮下ポケットに移植した。外科的処置を行なった後、回復用の加温毛布上にラットを置いた。全処置中、体温をモニターし、３７℃で安定しているようにしておいた。
【００２３】
最初に、洗浄溶液（脱イオン水中、ＮａＣｌ  ８ｇ／ｌ、デキストロース４ｇ／ｌ、ショ糖８ｇ／ｌ、塩化カルシウム０．２３ｇ／ｌ、無水カコジル酸ナトリウム０．２５ｇ／ｌ）でラットを心臓内経由で灌流した後、次いで、固定カコジル酸緩衝液（脱イオン水中、ショ糖４０ｇ／ｌ、パラホルムアルデヒド４０ｇ／ｌ、無水カコジル酸ナトリウム１０．７２ｇ／ｌ）で灌流した後、４週間後に脳を取り出した。脳は、処理するまで固定カコジル酸緩衝液中に保存した。
【００２４】
灌流：表１に示すとおり、ラットは、浸透圧性マイクロポンプタンクに入っている溶液の組成に関して６つの群に分けた。第Ｉ群は対照群としての役割を果たし、単なる人工脳脊髄液（「ＣＳＦ」）が注入された。
【表１】
2006519609.tif 000002
【００２５】
免疫組織化学：免疫組織化学と染色の処理を行なうために、１６個の脳をゼラチンブロックに直ちに埋め込み、４０μｍ厚の切片に切った（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ（テネシー州））。４０μｍ厚の脳切片は、以下の異なる主要抗体、すなわち、リン酸化Ｓｅｒ２０２を認識する抗リン酸化タウタンパク質（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ（カリフォルニア州））、活性化星状細胞に対する抗ＧＦＡＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（カリフォルニア州））、ペプチドのＣ末端３３〜４２ａａを特異的に認識する抗Ａβ４２（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｄｈａｍ（マサチューセッツ州））、及び活性化小膠細胞に対する抗ＣＤ１Ｉｂ（クローンＯＸ４２）（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）で処理した。
【００２６】
ＥＬＩＳＡ：ＥｌｉｓａキットＩＮＮＯＴＥＳＴ（商標）（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、過リン酸化タウタンパク質をＣＳＦ中で測定した。
【００２７】
染色：連続する４０μｍ厚の脳切片を以下のもので染色した：（１）１０分間クレジルバイオレット（０．５％、ｐＨ＝３．７）、その後、水性マウント媒体でマウントする；（２）Ｄｅ  Ｏｌｍｏｓアミノ銅（ＩＩ）銀染色法；（３）Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ銀染色法。クレジルバイオレットは、ニューロン中のニッスル小体及び核を染色する。ニューロンが死滅している場合、ニッスル小体は消失しており、染色が低下するか、染色されない。死滅ニューロンの細胞体、樹状突起、軸索、及び神経終末は、Ｄｅ  Ｏｌｍｏｓアミノ銅（ＩＩ）銀染色法により黒色に染色されて見える。Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ銀染色法は、神経炎性斑及びＮＦＴを特異的に明らかにする（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ（テネシー州））（Ｓｗｉｔｚｅｒ  ＩＩＩら、米国特許第５，１９２，６８８号（１９９３））。
【００２８】
統計分析：モリス水迷路データの統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡと、続いて多重比較Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を用いて実施した。
【００２９】
結果：Ａβ４２の単独投与は、記憶障害と、ヒトＡＤに関して十分に特性決定されているマーカーである、ＣＳＦ中にリン酸化タウタンパク質の出現を誘導するのには十分ではなかった（Ｇｒｅｅｎ  Ａ．Ｊ．Ｅ．、「アルツハイマー病及びクロイツフェルトヤコブ病の診断における脳脊髄液脳由来タンパク質（Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２８、４２７〜４４０（２００２）；Ｍｕｌｄｅｒ  Ｃ．ら、「アルツハイマー病の発症機序に関係しているＣＳＦマーカー（ＣＳＦ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ．１０９、１４９１〜１４９８（２００２）。またこれらのデータは、ＡＤの単独原因としてのＡβ４２及びアミロイド形成仮説に疑問がある。
【００３０】
鉄が神経炎性斑の成分であることから、輸液に鉄が添加されており（Ｌｏｖｅｌｌ  Ｍ．Ａ．ら、「アルツハイマー病老人斑に存在する鉄及び亜鉛（Ｉｒｏｎ  ａｎｄ  ｚｉｎｃ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ）」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５８（１）、４７〜５２（１９９８））、その存在は、脳中のステロイド形成の変化と、それによるその組織の内分泌バランスを変化させることに関与している（Ｂｒｏｗｎ  Ｒ．Ｃ．ら、「アルツハイマー病病理における酸化ストレス介在型ＤＨＥＡ形成（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＨＥＡ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、２４（１）、５７〜６５（２００３））。しかしながら、鉄と併用したＡβ４２は、動物の記憶に有意な影響は及ぼさず、ＣＳＦ中にリン酸化タウタンパク質の存在を誘導しなかった（図１Ｂ）。
【００３１】
このＡβ４２／鉄溶液の効果不足については、脳の抗酸化防御を低下させること、次いで、酸化ストレスを誘発させることにより修正された。これは、Ａβ４２／鉄溶液中にブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）（グルタチオン合成の阻害剤）を添加することによって達成された。Ｆｅ２＋−Ａβ４２−ＢＳＯ（ＦＡＢ）を注入したラットでは、記憶過程の変化を示すモリス水迷路試験において、プラットフォームを探索する待ち時間に有意な遅延の増加が認められた（図１Ａ）。このＦＡＢ誘発記憶障害は、ＡＤ患者について報告されている障害（Ｇｒｅｅｎ及びＭｕｌｄｅｒら、上述）を正確に再現する、ＣＳＦ中の過リン酸化タウタンパク質濃度の有意な上昇を伴っていた（図１Ｂ）。ヒトにおける場合、診断及び薬剤候補活性の評価でこのパラメーターを用いることができる。さらにこの記憶障害は、様々な組織学的方法によって前面に押し出されるようなＡＤ様の組織学上の変化を随伴していた。１か月の注入後、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ銀方法によって明らかなように、ＦＡＢラットは、主として海馬のＣＡ１領域（Ａβ４２毒性に感受性が高いことで知られている領域）（図２Ｃ〜２Ｅ）に神経炎性斑が発症した。また、海馬のＣＡ２とＣＡ３の領域（それぞれ、図２Ｆ及び図２Ｇ）、さらには帯状皮質及び側頭皮質（それぞれ、図２Ｋ及び図２Ｍ〜２Ｏ）においても神経炎性斑が認められた。さらに、Ａβ４２のＣ末端（アミノ酸３３〜４２）に対して特異的に産生される抗体を用いて、これらの脳領域におけるＡβ４２の存在を確認した（図３Ｅ〜図３Ｈ）。また、この特異的Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｐｉｔｚｅｒ染色により、海馬でＡβ４２及びニューロン内アミロイドーシスを含有している食細胞の小神経膠細胞が明らかになった。
【００３２】
ＣＳＦ中の過リン酸化タウタンパク質濃度の上昇に一致して、ＦＡＢラットは、海馬の異なる構造中に極度に染色されているＮＦＴを示した。これは、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色（図２Ａ〜図２Ｐ）よって明らかであり、且つ免疫染色（図３Ａ〜図３Ｄ）によって確認されているとおりである。さらにはＮＦＴ含有ニューロンが頭頂皮質及び帯状皮質中で認められた（それぞれ、図２Ｐ、図２Ｊ、及び図２Ｋ）（Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ  Ｅ．Ｍ．ら、「若年フィッシャーラットの扁桃体中へのアミロイド−β２５〜３５の両側注入：行動上、神経化学上、及び時間依存性組織病理学上の影響（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ−β２５−３５  ｉｎｔｏ  ａｍｙｇｄａｌａ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｒａｔｓ：ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ，ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ  ｔｉｍｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ．）」Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１８（６）、５９１〜６０８（１９９７））が、これは、Ａβ４２のＮＦＴ形成誘発能力を示唆している。
【００３３】
Ａβ４２が、重要な酸化ストレスに関係している場合にのみ、若年ラットの脳中にＮＦＴ形成を誘発するという知見は、少なくとも部分的に、老化脳中の頭蓋内条件を再現する。（Ｆｌｏｙｄ  Ｒ．Ａ．及びＨｅｎｓｌｅｙ  Ｋ．、「脳老化における酸化ストレス：神経変性障害の治療に対する影響（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ａｇｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．）」Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、２３、７９５〜８０７（２００２））。ＡＤの生理病理は、血管性痴呆について記載されている生理病理に類似の血管成分を有している。（Ｄｅ  Ｌａ  Ｔｏｒｒｅ  Ｊ．Ｃ．、「アルツハイマー病病因の血管成分（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．）」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７７、１９６〜２１５（２００２）；Ｍｉｙａｋａｗａ  Ｔ．「アルツハイマー病における血管病理（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７７、３０３〜３０５（２００２））。この血管成分は、疾患の予測及び診断で用いることができる。血管アミロイド付着は、死後のヒトＡＤ脳標本の血管構造で報告されている。しかし、高レベルの神経炎性斑を発現するトランスジェニックマウスは血管性アミロイドーシスを発症しない。（Ｊａｎｕｓ  Ｃ．（２０００）；Ｊａｎｕｓ  Ｃ．及びＷｅｓｔａｗａｙ  Ｄ．（２００１））。トランスジェニックとは対照的に、本ＦＡＢモデルは、Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色（図２Ｍ〜図２Ｏ）によって明らかなように、側頭皮質中に血管性アミロイドーシスを示し、本モデルの有効性がさらに強調される。
【００３４】
主として神経炎性斑の近くにある海馬のＣＡ１、ＣＡ３及び歯状回領域で確認された塊状のアストログリオーシス及び小膠細胞症（図２Ｃ〜Ｅ、２Ｇ、２Ｈ〜２Ｉ、及び４Ｂ〜４Ｃ）は、ＦＡＢ注入ラットの脳で起こっている重要な炎症過程を反映している。ＦＡＢ注入ラットの脳について記載したこれらの組織病理の改変により、主要ニューロンの死（アミノ銅（ＩＩ）銀染色及びクレジルバイオレット染色の両方によって検出される）が同時に生じていた（図５Ａ〜図５Ｈ）。ニューロン死はＣＡ１の海馬領域で本質的に生じたが、ＣＡ３領域及び帯状皮質でもまた死滅ニューロン体が確認された。
【００３５】
示したデータは、記憶喪失の発生能力を有する、アミロイド形成ペプチドＡβ４２、酸化促進カチオンＦｅ２＋、及びグルタチオン合成阻害剤ＢＳＯを含有する溶液を若年ラットの左心室へ連続して４週間点滴すると、ＡＤで見られる、ＣＳＦ中のリン酸化タウタンパク質の濃度の上昇とニューロン欠損をはじめとする組織病理上のプロファイルの増加があることを表している。従って、本ＦＡＢラットモデルは、ＡＤ疾患の発症及び進行に関与する分子機序の理解に有用なＡＤ病理を反映する動物モデル、並びにＡＤを診断、予防及び治療する新規な手段を速やかにスクリーニングするための有益なツールを提供する。
【００３６】
また、上に記載した概念に基づく本ＦＡＢ溶液に関するすべての改変及び付加も本発明内に包含される。
【００３７】
（実施例２）
神経疾患予防剤に関する試験。
本発明の動物は、ＡＤなどの神経疾患の発症に対して保護を付与する能力について化合物を試験するために用いることができる。試験化合物で神経疾患を示す動物を治療するが、未治療の神経疾患を示す対照動物を並行して行なう。治療動物において比較的低い神経疾患の発病率を保護の指標として検出する。治療動物及び未治療動物は、学習／探検／移動行動（ＣＩ試験）の低下、並びに２−デオキシグルコースの吸収／利用の低下、ニューロン死、コリン作動性神経伝達障害、神経炎性斑、ＮＦＴ形成及び脳の皮質辺縁系構造中の肥大神経膠症について分析する。治療が疾患の発症を予防又は遅延させることができるかどうかを判定するためには、動物、例えば、神経系疾患を発症することが知られているマウスの系由来の同腹の子の半数を、治療を受けさせるために任意に振り分け、他の半数を、偽薬を受けさせるために振り分け、所与のマウスの系について知られている最も早期の発症前の月齢で開始する。使用する同腹の子の数は、治療マウスと未治療マウスの間で観察される相違の程度によって決まる。
【００３８】
マウスは毎日観察する；これらの診断はＣＩ試験を使用することで容易になる。これは、実験群を知らない個人が１週間当たり３回行う。生存曲線と疾患発症及び死亡の平均月例を臨床の蓄積データから算出する。
【００３９】
前臨床結果は、実験群及び対照群の試料に関する神経病理試験及びグルコース取り込み試験を実施することにより確証する。神経膠症は、神経膠線維酸性タンパク質に対して産生される抗体及びＣＤ１１ｂ（クローンＯＸ−４２）を用いた免疫組織学的試験で評価する。グルコース取り込み試験は、Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋａら（（１９８６）Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６３：６０７）によって報告されているＳｏｋｏｌｏｆｆ法の改変法を用いて行なわれる。
【００４０】
（実施例３）
神経疾患治療剤に関する試験。
本発明の動物は、神経疾患を改善又は回復する能力について化合物を試験するために用いることができる。神経疾患を示す動物を試験化合物で治療するが、未治療の神経疾患を示す対照動物を並行して行なう。比較的遅発の死亡、或いは疾患の神経反応指標、病理学的指標、又は機能的指標における改善を保護の指標として検出する。治療動物及び未治療動物は、学習／探検／移動行動の低下、並びに２−デオキシグルコースの吸収／利用の低下、ニューロン死、コリン作動性神経伝達障害、神経炎性斑、ＮＦＴ形成及び脳の皮質辺縁系構造中の肥大神経膠症について分析する。
【００４１】
上記の結果が示す通り、非ヒトＦＡＢ哺乳動物における前臨床及び病理知見は、ＡＤなどの神経疾患のあるヒトにおける所見と、予期しないが著しい類似を示す。ＡＤを暗示する行動異常、生化学的異常及び病理学的異常の相関的な発現によって、非ヒト動物におけるＡＤの病態生理学及び神経生物学の研究に新たな可能性が付与される。
【００４２】
本発明の多数の実施形態が記載されている。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行なうことができることを理解されたい。従って、他の実施形態は添付の特許請求の範囲内にあり、本発明の範囲から逸脱することなく、上記の組成物、製剤、組合せ、及び方法に種々の変更が行われ得る場合、上記記載に含有されているすべての事項は、例示として説明され、意味を限定するものでないこととする。本明細書に挙げられているすべての特許文献及び参考文献は、引用により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】ラットの様々な群によって得られたモリス水迷路スコアの棒グラフである。結果は、ＳＤ（ｎ＝８）の平均として示している。＊＊＊は、対照群と比較してｐ＜０．００１。
【図１Ｂ】ラットＣＳＦ中のリン酸化タウ濃度の棒グラフである。平均±ＳＤ（ｎ＝６〜８）。＊＊＊は、対照群と比較してｐ＜０．００１。
【図２Ａ】対照群の海馬におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真（×４０）である。Ａβ４２を食菌する活性化小膠細胞（黄色の矢印）、神経炎性斑（赤色の矢印）、ＮＦＴ含有ニューロン（青色の矢印）、血管性アミロイドーシス（黒色の矢印）（図２中のすべての顕微鏡写真に適用可能）。
【図２Ｂ】ＦＡＢ群の海馬におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４０）。
【図２Ｃ】ＦＡＢ群のＣＡ１におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｄ】ＦＡＢ群のＣＡ１におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｅ】ＦＡＢ群のＣＡ１におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｆ】ＦＡＢ群のＣＡ２におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｇ】ＦＡＢ群のＣＡ３におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｈ】ＦＡＢ群の歯状回におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｉ】ＦＡＢ群の歯状回におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｊ】対照群の帯状皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４０）。
【図２Ｋ】ＦＡＢ群の帯状皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４０）。
【図２Ｌ】対照群の側頭皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｍ】ＦＡＢ群の側頭皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｎ】ＦＡＢ群の側頭皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｏ】ＦＡＢ群の側頭皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×４００）。
【図２Ｐ】ＦＡＢ群の頭頂皮質におけるアミロイド斑及び神経原線維変化のＣａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ染色の顕微鏡写真である（×１０００）。
【図３】（図３Ａから図３Ｄ）対照（３Ａ及び３Ｃ）ラット並びにＦＡＢ（３Ｂ及び３Ｄ）ラットにおける、免疫染色しているリン酸化タウの顕微鏡写真である。免疫反応性リン酸化タウは、対照（３Ａ及び３Ｃ）と比較して、ＣＡ１（３Ｂ）ニューロン及び歯状回（３Ｄ）ニューロン（黄色の矢印）で確認された。  （図３Ｅから図３Ｈ）対照（３Ｅ及び３Ｇ）ラット及びＦＡＢ（３Ｆ及び３Ｈ）ラットで免疫染色しているＡβ４２の顕微鏡写真である。ＦＡＢラットは、対照（３Ｅ及び３Ｇ）と比した場合、ＣＡ１（３Ｆ）、ＣＡ３（３Ｈ）、及び帯状皮質（３Ｆ）において強いＡβ４２免疫反応性を示す。
【図４】（図４Ａから図４Ｃ）対照（４Ａ）ラット並びにＦＡＢ（４Ｂ及び４Ｃ）ラットのＣＡ１における活性化星状細胞のＧＦＡＰ免疫染色の顕微鏡写真である。
【図５】（図５Ａから図５Ｈ）Ｄｅ  Ｏｌｍｏｓアミノ銅（ＩＩ）銀染色及びクレジルバイオレット染色によるニューロン死を表す顕微鏡写真である。死細胞は、ＦＡＢラットのＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３及び歯状回（５Ｂ）領域において、アミノ銅（ＩＩ）銀法により対照のラット（５Ａ）と比べて黒色に染色されている。対照（５Ｃ）と比較した場合、ＦＡＢラット（５Ｄ）のＣＡ１、ＣＡ３及び歯状回において認められた染色密度の低減によって明らかなように、ニューロンの減少がクレジルバイオレット染色によって確認された。また、対照（５Ｅ及び５Ｇ）と比較した場合、２種類の異なる染色法（５Ｆ及び５Ｈ）によって明らかなように、重要なニューロンの減少がＦＡＢラットの側頭皮質においても認められた。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図５】
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【国際調査報告】
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