(57)【要約】本発明は、置換された多環式芳香族化合物を対応するカルボン酸および関連の化合物に酸化する生物触媒プロセスに関する。好ましい実施形態において、本発明では、２，６−ジメチルナフタレンから６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンおよび２，６−ナフタレンジカルボン酸を生成する方法について説明する。キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含む単一の組換え微生物で２，６−ジメチルナフタレンを酸化させることによって、これらの化合物が調製されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を式Ｉ
【化１】
2006500005.tif 000031
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は独立してＨまたはＣＨ３あるいはＣ１〜Ｃ２０の置換もしくは未置換のアルキルまたは置換もしくは未置換のアルケニルまたは置換もしくは未置換のアルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ８のうちの少なくとも２つが存在しかつＨではない）
に従う芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）Ｒ１〜Ｒ８のうちのいずれか１つまたはすべてが酸化される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる置換された多環式芳香族基質の酸化方法。
【請求項２】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の酵素をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて式Ｉ
【化２】
2006500005.tif 000032
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は独立してＨまたはＣＨ３あるいはＣ１〜Ｃ２０の置換もしくは未置換のアルキルまたは置換もしくは未置換のアルケニルまたは置換もしくは未置換のアルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ８のうちの少なくとも２つが存在しかつＨではない）
に従う芳香族基質と接触させることを含んでなり、
Ｒ１〜Ｒ８のうちのいずれか１つまたはすべてが酸化される、
置換された多環式芳香族基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸化方法。
【請求項３】
芳香族基質が２，６−ジメチルナフタレン、１，２−ジメチルナフタレン、１，３−ジメチルナフタレン、１，４−ジメチルナフタレン、１，５−ジメチルナフタレン、１，６−ジメチルナフタレン、１，７−ジメチルナフタレン、１，８−ジメチルナフタレン、２，３−ジメチルナフタレン、２，４−ジメチルナフタレン、２，５−ジメチルナフタレン、２，７−ジメチルナフタレン、２，８−ジメチルナフタレン、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸および２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンよりなる群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を２，６−ジメチルナフタレン、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸および２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）２，６−ナフタレンジカルボン酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を２，６−ジメチルナフタレンと接触させ、
（ｉｉｉ）６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレンが生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレンの製造方法。
【請求項６】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を２，６−ジメチルナフタレンおよび６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレンよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）６−メチル−２−ナフトエ酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる６−メチル−２−ナフトエ酸の製造方法。
【請求項７】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を２，６−ジメチルナフタレンおよび６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレンよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン酸の製造方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉｉ）の培養を細菌細胞の成長用の培養液および有機基質の受渡しのための有機溶媒を含んでなる培地にて行う請求項１または４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換え生物が細菌種、真菌種および酵母種よりなる群から選択される請求項１または４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組換え生物がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ノボスフィンゴビウム属（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア属（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア属（Ｄｅｌｆｔｉａ）およびコマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組換え生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
キシレンモノオキシゲナーゼ酵素が紅色非硫黄細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバから単離されたものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
紅色非硫黄細菌のメンバがバークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、ノボスフィンゴビウム属、スフィンゴモナス属、パンドレア属、デルフチア属およびコマモナス属よりなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｘｙｌＭサブユニットが、
（ｉ）配列番号１０、配列番号１６および配列番号２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対する９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と完全に相補性である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸によってコードされるものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ｘｙｌＡが、
（ｉ）配列番号１２、配列番号１８および配列番号２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対する９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と完全に相補性である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸によってコードされるものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）配列番号９、１１、１５、１７、１９および２１よりなる群から選択される核酸分子の一部を用いてゲノムライブラリをプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）し、
（ｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下で（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片のシークエンシングする
ことを含んでなり、
シークエンシングされたゲノム断片がキシレンモノオキシゲナーゼをコードするものである、
キシレンモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法。
【請求項１７】
（ｉ）配列番号９、１１、１５、１７、１９および２１よりなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅する
ことを含んでなり、
増幅されたインサートがキシレンモノオキシゲナーゼをコードするものである、
キシレンモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件出願は、２００１年８月１０日出願の米国仮特許出願第６０／３１１，４８６号の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関するものである。特に、本発明は、ＸｙｌＡサブユニットとＸｙｌＭサブユニットとを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼを、置換された多環式化合物や関連の環構造の酸化に利用するための方法に関する。特に興味深いのは、キシレンモノオキシゲナーゼを含有する組換え微生物の力で２，６−ナフタレンジカルボン酸ならびに２，６−ジメチルナフタレンの他の酸化誘導体を生成することである。
【背景技術】
【０００３】
さまざまな化学モノマーの生成に利用される一般的なプロセスに置換された多環式化合物の酸化がある。このプロセスの具体的な用途のひとつが２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ＮＤＣ）の生成である。
【０００４】
２，６−ＮＤＣは、繊維、フィルム、塗料、接着剤、飲料容器用として大量に取引されているポリエステルを製造する上で有益なモノマーの一種である。２，６−ＮＤＣに至るまでのさまざまな化学的経路が知られており、このなかには２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ＤＭＮ）の触媒酸化がある。さらに、ｐ−キシレンを酸化させてテレフタル酸を得るための方法を、２，６−ＤＭＮを酸化させて２，６−ＮＤＣを得る工程にも利用することができる。たとえば、特許文献１（アモコ（Ａｍｏｃｏ））には、重金属触媒と臭素化合物との存在下、低級脂肪族モノカルボン酸溶媒中で分子酸素含有ガスを用いてｐ−キシレンを液相にて酸化させ、テレフタル酸を直接形成するプロセスが教示されている（特許文献１）。具体的な実施形態では、ＮＨ４Ｂｒとテトラブロモエタンとの混合物を助触媒として使用し、９５％酢酸中でＣｏおよびＭｎによって反応を触媒する。この酸化は高温（１０９〜２０５℃）高圧（１５〜３０バール）の過酷な条件下で行われる。反応率が高く、ｐ−キシレンを基準とするテレフタル酸の収率も９５％と高い。しかしながら、主に臭素化合物とモノカルボン酸溶媒を使用していることに帰因する反応装置の腐食が激しい。よって、通常のステンレス鋼をこの反応装置の製造に用いることができず、ハステロイ（Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ）（登録商標）やチタンなどの高価な材料が必要とされる。さらに、大量の酸溶媒を使用しており、かつ酸化条件が厳しいことから、溶媒自体の燃焼を避けられず、溶媒の損失も無視できない。このように、上記の方法で２，６−ＤＭＮを酸化させることは可能ではあるが、いずれも費用を要する上に環境汚染物質を含有する廃棄流の生成を伴うため、別の経路が望ましいであろう。
【０００５】
通常、いくつかの理由から化学物質の生成には生物学的プロセスを用いることが望ましい。ひとつの利点として、生物学的反応を触媒する酵素には基質特異性がある点があげられる。したがって、化合物の複合混合物を含有する開始材料を使用して、生物学的プロセスによって特定のキラルまたは構造異性体を生成可能になる場合がある。もうひとつの利点として、生物学的プロセスは酵素の制御下で段階的に進行する点があげられる。結果として、生物学的プロセスの中間体を、類似の化学的プロセスでの中間体の場合よりも簡単に単離できる事例が頻繁に見られる。３つ目の利点として、生物学的プロセスは一般に化学的な製造プロセスよりも環境に対する有害性が低いとされている点があげられる。特にこうした利点がゆえに、２，６−ＮＤＣならびに２，６−ＤＭＮの部分酸化誘導体をバイオプロセスで製造するための開始材料として２，６−ＤＭＮを用いると望ましいのである。
【０００６】
トルエンおよびキシレン異性体などの芳香族環上のメチル基の生物酸化は周知である（特許文献２；非特許文献１、非特許文献２）。たとえば、Ｔｏｌ経路のｘｙｌ遺伝子を持つ細菌はトルエンのメチル基を連続的に酸化させてベンジルアルコール、ベンズアルデヒドと生成し、最後は安息香酸を作り出す。十分にキャラクタライズされたＴｏｌプラスミドｐＷＷＯ上にあるｘｙｌ遺伝子について、すでにその配列が決定されている（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら（上掲）、非特許文献３）。ｘｙｌ遺伝子は２つのオペロンになる。上流経路のオペロンはトルエンの安息香酸への酸化に必要な酵素をコードする。下流経路のオペロンは安息香酸をトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの中間体に変換する酵素をコードする。
【０００７】
キシレンモノオキシゲナーゼは、トルエンおよびキシレンのメチル基の水酸化を触媒することで、これらの化合物の代謝を開始する（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら（上掲））。キシレンモノオキシゲナーゼには還元当量をヒドロキシラーゼ成分（ＸｙｌＭ）に転送するＮＡＤＨアクセプタ成分（ＸｙｌＡ）がある（非特許文献４）。この酵素はプラスミドｐＷＷＯ上のｘｙｌＡとｘｙｌＭによってコードされる（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら（上掲））。ｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼについてクローニングされた遺伝子については、大腸菌での発現が認められている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。クローニングされたキシレンモノオキシゲナーゼは、さまざまな置換トルエンを酸化して対応するベンジルアルコール誘導体にする。Ｔｏｌ経路の第１の酸化ステップを担うのはキシレンモノオキシゲナーゼであり、これに続く２つの酸化ステップを担っているのはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の２種類の異なるデヒドロゲナーゼである（原山ら（上掲））が、クローニングされたｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼには緩い（ｒｅｌａｘｅｄ）基質特異性があり、ベンジルアルコールおよびベンズアルデヒドを酸化して安息香酸を生成する（ビューラー（Ｂｕｈｌｅｒ）ら（上掲））。
【０００８】
トルエンおよびキシレン異性体のメチル基以外にも、メチルナフタレンおよびジメチルナフタレンのメチル基の細菌による酸化が周知である（非特許文献８、非特許文献９）、ダッタ（Ｄｕｔｔａ）ら（上掲））。メチルナフタレンおよびジメチルナフタレンの酸化を担う遺伝子についてはまだ同定されていない。しかしながら、２，６−ＤＭＮ酸化の代謝経路はｐ−キシレン酸化のＴｏｌ経路と似通っている。２，６−ＤＭＮにある１個のメチル基の酸化が酵素によって触媒され、２−ヒドロキシメチル−６−メチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトアルデヒドおよび６−メチル−２−ナフトエ酸が生成される。主要な経路ではこの後に第１の環（すなわち、新たに形成されたカルボキシル基を有する環）の切断を伴う。第１の環が代謝されてしまうまで第２のメチル基は酸化されないのが普通であるが、少量の２，６−ＮＤＣがデッドエンド生成物として形成される場合がある（ダッタ（Ｄｕｔｔａ）ら（上掲））。
【０００９】
これらの文献報告に加えて、キシレンモノオキシゲナーゼを使用して、ヒドロキシメチル化５員芳香族複素環または６員芳香族複素環を生成するための方法（特許文献３）ならびに、野生型の細菌を用いて２，６−ＤＭＮから２，６−ＮＤＣを生成するための方法（特許文献４）についての説明がある。
【００１０】
上述した方法はナフタレンや関連の環構造の置換基を酸化する上で有用なものではあるが、これらの方法で２つ以上の置換基を酸化しようとすると多酵素プロセスが必要になる。多酵素プロセスで組換え生物を得る操作には費用と時間とを要し、必要な酵素をすべて調節して発現させなければならない。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第２，８３３，８１６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８７，５６９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２１７，８８４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０３０，５６８号明細書
【非特許文献１】ダグレー（Ｄａｇｌｅｙ）ら、Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６：１〜４６（１９７１）。
【非特許文献２】ダッタ（Ｄｕｔｔａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１８８４〜１８８９（１９９８）。
【非特許文献３】バーレージ（Ｂｕｒｌａｇｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：１３２３〜１３２８（１９８９）。
【非特許文献４】鈴木ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１６９０〜１６９５（１９９１）。
【非特許文献５】ビューラー（Ｂｕｈｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１００８５〜１００９２（２０００）。
【非特許文献６】ウッボルツ（Ｗｕｂｂｏｌｔｓ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６０８〜１５（１９９４）。
【非特許文献７】原山ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：４５５〜６１（１９８６）。
【非特許文献８】グリフォール（Ｇｒｉｆｏｌｌ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：３７１１〜３７２３（１９９５）。
【非特許文献９】宮地ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１５０４〜１５０６（１９９３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、解決しようとする課題は、置換された多環式化合物を酸化させて工業的に有用なカルボン酸ならびに関連の化合物を得るための環境的に安全で経済的な方法を提供することにある。本願出願人らは、ＸｙｌＭサブユニットとＸｙｌＡサブユニットとを有するキシレンモノオキシゲナーゼがあれば、別の酵素中間体による助けがなくても多環式化合物の複数の置換基を十分に酸化できるという発見を通して、上記の課題を解決した。特に、本願出願人らは、適切な基質の存在下で各酵素を大腸菌で別々に発現させることで、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１およびプラスミドｐＷＷＯからクローニングしたｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子とを含んでなる単一のキシレンモノオキシゲナーゼ種を用いて、２，６−ＮＤＣおよび２，６−ＤＭＮの部分酸化誘導体を生成可能であることを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、多環式カルボン酸および関連の化合物の生成を目的として多環式化合物のメチルおよび他の置換基を一ステップで酸化させる方法を提供するものである。この方法では、キシレンモノオキシゲナーゼの酵素活性を利用して、環構造上にあるメチルおよび他のアルキル基の同時酸化を達成する。今まで他のどのキシレンモノオキシゲナーゼでも酸化できるのは環のアルキル部分１つだけとしか知られていなかったため、この方法には従来技術にはない利点がある。
【００１４】
本発明のキシレンモノオキシゲナーゼは、次のスキーム：２，６−ジメチルナフタレン→６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン→６−メチル−２−ナフトアルデヒド→６−メチル−２−ナフトエ酸→６−ヒドロキシメチル−２−ナフトエ酸→６−カルボキシ−２−ナフトアルデヒド→２，６−ナフタレンジカルボン酸（図１）に従って、２，６−ジメチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸への変換を媒介することができる。
【００１５】
したがって、本発明は、
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を式Ｉ
【００１６】
【化１】
2006500005.tif 000002
【００１７】
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は独立してＨまたはＣＨ３あるいはＣ１〜Ｃ２０の置換もしくは未置換のアルキルまたは置換もしくは未置換のアルケニルまたは置換もしくは未置換のアルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ８のうちの少なくとも２つが存在しかつＨではない）
に従う芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）Ｒ１〜Ｒ８のうちのいずれか１つまたはすべてが酸化される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる置換された多環式芳香族基質の酸化方法を提供するものである。
【００１８】
この方法については、キシレンモノオキシゲナーゼを発現する組換え生物を利用してｉｎ  ｖｉｖｏにて行ってもよいし、あるいは精製酵素または部分的に精製酵素を使ってｉｎ  ｖｉｔｒｏにて行ってもよい。
【００１９】
具体的な実施形態において、本発明は、
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を２，６−ジメチルナフタレン、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸および２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）２，６−ナフタレンジカルボン酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造方法を提供するものである。
【００２０】
他の具体的な実施形態において、本発明は、置換された適切な多環基質と、ＸｙｌＡサブユニットとＸｙｌＭサブユニットとを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素とを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにて接触させ、所望の中間体を形成することを含んでなる、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンなどの部分酸化中間体の製造方法を提供するものである。
【００２１】
さらに、本発明は、
（ｉ）配列番号９、１１、１５、１７、１９および２１よりなる群から選択される核酸分子の一部を用いてゲノムライブラリをプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）し、
（ｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下で（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片のシークエンシングする
ことを含んでなり、
シークエンシングされたゲノム断片がキシレンモノオキシゲナーゼをコードするものである、
キシレンモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法を提供するものである。
【００２２】
あるいは、本発明は、
（ｉ）配列番号９、１１、１５、１７、１９および２１よりなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅する
ことを含んでなり、
増幅されたインサートがキシレンモノオキシゲナーゼをコードするものである、
キシレンモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法を提供するものである。
【００２３】
もうひとつの実施形態において、本発明は、
（ｉ）配列番号１０で示すアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１０で示すアミノ酸配列に対する少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする単離された分子、
（ｉｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ｉ）または（ｉｉ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）と完全に相補性である単離された核酸分子
よりなる群から選択されるキシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭサブユニットをコードする単離された核酸分子を提供するものである。
【００２４】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明ならびに添付の配列の説明から、本発明についてなお一層深く理解することができよう。
【００２５】
以下の配列の説明ならびに本願明細書に添付の配列表は、米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５に記載の特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に関する規則（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。配列の説明では、本願明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１〜３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５〜３７３（１９８４）に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って定義されるように、ヌクレオチド配列文字の表記については１文字コードを、アミノ酸については３文字コードを採用している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００２６】
配列番号１はプライマーｘｙｌＡＦ１である。
配列番号２はプライマーｘｙｌＡＲ１である。
配列番号３はプライマーＪＣＲ１４である。
配列番号４はプライマーＪＣＲ１５である。
配列番号５はスフィンゴモナス株ＡＳＵ１由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列である。
配列番号６は長さ１２，５９１ｂｐのコンティグ１２．５である。
配列番号７はプライマーＡＳＵ１ＭＡＦ１である。
配列番号８はプライマーＡＳＵ１ＭＡＲ１である。
配列番号９はスフィンゴモナスＡＳＵ１ｘｙｌＭ遺伝子についてのヌクレオチド配列である。
配列番号１０はスフィンゴモナスＡＳＵ１  ｘｙｌＭのアミノ酸配列である。
配列番号１１はスフィンゴモナスＡＳＵ１  ｘｙｌＡ遺伝子についてのヌクレオチド配列である。
配列番号１２はスフィンゴモナスＡＳＵ１ｘｙｌＡのアミノ酸配列である。
配列番号１３はプライマーＷＷＯＦ１である。
配列番号１４はプライマーＷＷＯＲ２である。
配列番号１５はシュードモナスｐＷＷＯ  ｘｙｌＭ遺伝子についてのヌクレオチド配列である。
配列番号１６はシュードモナスｐＷＷＯ  ｘｙｌＭのアミノ酸配列である。
配列番号１７はシュードモナスｐＷＷＯ  ｘｙｌＡ遺伝子についてのヌクレオチド配列である。
配列番号１８はシュードモナスｐＷＷＯ  ｘｙｌＡのアミノ酸配列である。
配列番号１９はスフィンゴモナスｐＮＬ１  ｘｙｌＭ遺伝子（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号ＡＦ０７９３１７）についてのヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、スフィンゴモナスｐＮＬ１  ｘｙｌＭ（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）のアミノ酸配列である。
配列番号２１はスフィンゴモナスｐＮＬ１  ｘｙｌＡ遺伝子（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）についてのヌクレオチド配列である。
配列番号２２はスフィンゴモナスｐＮＬ１  ｘｙｌＡ（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）のアミノ酸配列である。
【００２７】
発明の詳細な記述
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼの活性を利用して置換された多環式化合物を酸化させ、対応するカルボン酸および関連の化合物にするための方法である。本方法の具体的な用途のひとつに、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１由来のキシレンモノオキゲナーゼ酵素またはプラスミドｐＷＷＯ由来のキシレンモノオキゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を利用して、２，６−ＤＭＮおよび部分酸化化合物を２，６−ＮＤＣに変えるトランスフォーメーションがある。
【００２８】
本発明は、繊維、フィルム、塗料、接着剤、飲料容器で必要とされるポリエステルを製造する上で有益な２，６−ＮＤＣならびに２，６−ＤＭＮの他の部分酸化誘導体の生物生産に役立つ。本発明は、それまでのものよりもコスト効率が高く環境に有害な廃棄物の生成量を抑えた生物学的プロセスとして、２，６−ＮＤＣならびに２，６−ＤＭＮの他の部分酸化誘導体の合成に関する技術分野を発展させるものである。
【００２９】
本願の開示では、学術用語および略語をいくつか用いる。これについては、以下のように定義する。
【００３０】
「２，６−ナフタレンジカルボン酸」を２，６−ＮＤＣと略す。
「２，６−ジメチルナフタレン」を２，６−ＤＭＮと略す。
「６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン」を６−Ｍ−２−ＨＭＮと略す。
「６−メチル−２−ナフトエ酸」を６−Ｍ−２−ＮＡと略す。
「２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン」を２，６−ＨＭＮと略す。
「オープンリーディングフレーム」をＯＲＦと略す。
「ポリメラーゼ連鎖反応」をＰＣＲと略す。
【００３１】
本願明細書において使用する「ＡＴＣＣ」とは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．に所在する米国菌株保存機関の国際寄託当局を示す。「ＡＴＣＣ  Ｎｏ．」はＡＴＣＣでの寄託培養の受入番号を示す。
【００３２】
「生物トランスフォーメーション」および「生物変換」という用語については同義に使用し、化合物を別の形態または化合物に変える酵素的変換のプロセスを示す。この生物変換または生物トランスフォーメーションのプロセスは一般に、生体触媒によって行われる。
【００３３】
本願明細書において使用する「生体触媒」という用語は、特定の化合物（単数または複数）を生物変換できる酵素（単数または複数）を含有する微生物を示す。
【００３４】
「キシレンモノオキシゲナーゼ」という用語は、多環（ｐｏｌｙｃｙｌｉｃ  ｒｉｎｇ）構造のメチルおよび他のアルキル置換基を酸化して対応するカルボン酸にする機能を持つ酵素を示す。
【００３５】
「ｘｙｌＭ」という表現は、キシレンモノオキシゲナーゼの鉄含有ヒドロキシラーゼサブユニットをコードするＤＮＡ分子を示す。
【００３６】
「ｘｙｌＡ」という表現は、キシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ結合電子伝達サブユニットをコードするＤＮＡ分子を示す。
【００３７】
「置換された多環式芳香族基質」という用語は、一般式
【００３８】
【化２】
2006500005.tif 000003
【００３９】
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は独立してＨまたはＣＨ３あるいはＣ１〜Ｃ２０の置換もしくは未置換のアルキルまたは置換もしくは未置換のアルケニルまたは置換もしくは未置換のアルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ８のうちの少なくとも２つが存在しかつＨではない）
に従う化合物を示す。
【００４０】
「アルキル」という用語は、アルカンの任意の炭素原子から水素原子１個を除去して誘導される一価基すなわちＣｎＨ２ｎ＋１−を意味する。非分枝アルカンの末端炭素原子から水素原子１個を除去して誘導される基は、ノルマルアルキル（ｎ−アルキル）基のサブクラスすなわちＨ［ＣＨ２］ｎ−をなす。基ＲＣＨ２−、Ｒ２ＣＨ−（ＲはＨと等しくない）、Ｒ３Ｃ−（ＲはＨと等しくない）は、それぞれ第１級アルキル基、第２級アルキル基、第３級アルキル基である。
【００４１】
「アルケニル」という用語は、１個の炭素−炭素二重結合を有し、一般式ＣｎＨ２ｎで表される非環式の分枝炭化水素または非分枝炭化水素を意味する。２以上の二重結合を有する非環式の分枝炭化水素または非分枝炭化水素は、アルカジエン、アルカトリエンなどである。
【００４２】
「アルキリデン」という用語は、アルカンの同一炭素原子から水素原子２個を除去して形成される二価基を意味し、その遊離原子価は二重結合の一部（（ＣＨ３）２Ｃ＝プロパン−２−イリデンなど）である。
【００４３】
「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」という表現は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形での単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントで構成されるものであってもよい。
【００４４】
温度と溶液のイオン強度の適した条件下で一本鎖の核酸分子を他の核酸分子にアニールできる場合に、この核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」であるという。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、その一例が、サムブルック・ジェー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）の特に第１１章と表１１．１に記載されている（その内容全体を本願明細書に援用する）。温度およびイオン強度の条件次第でハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件については、遠縁の生物から得られる相同配列などの適度な類似性のある断片から、近縁の生物から得られる機能的酵素を複製する遺伝子などの極めて類似性の高い断片に至るまで、スクリーニングできるように調節することが可能である。ハイブリダイゼーション後の洗浄でストリンジェンシー条件を判定する。好ましい条件一組では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温にて１５分間に続いて、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃にて３０分間行い、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃にて３０分間ずつ２回繰り返す一連の洗浄を用いる。さらに好ましいストリンジェントな条件の組では上記よりも高い温度を使用する。この場合、最後に行う０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの３０分ずつ２回の洗浄時の温度を６０℃に上げること以外は上記と同じである。極めてストリンジェントな条件のもうひとつの好ましい組として、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの最後の２回の洗浄を６５℃にする形がある。ハイブリダイゼーションでは２つの核酸に相補的な配列が含まれている必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間にミスマッチがあってもよい。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、核酸長および相補性の度合いといった従来技術において周知の変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなればなるほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（高めのＴｍに対応）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に低くなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについてはＴｍを算出するための式が得られている（上掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、９．５０〜９．５１を参照のこと）。これよりも短い核酸すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置が一層重要になり、その特異性はオリゴヌクレオチドの長さによって決まる（上掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくと��約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最低長は少なくとも約１５ヌクレオチドであり、一層好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、プローブの長さなどの要因次第では、必要に応じて温度および洗浄液の塩濃度を調節してもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【００４５】
「相補的である」という表現については、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を示す際に使用する。たとえば、ＤＮＡに関していえば、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明には、添付の配列表に記載の完全配列に対して相補的である単離された核酸断片のみならず、実質的に類似の核酸配列も含まれる。
【００４６】
「コドンの縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなくヌクレオチド配列が変わる遺伝暗号の相違を示す。したがって、本発明は、配列番号１０、１２、１６、１８、２０および２２に記載のキシレンモノオキシゲナーゼ酵素サブユニットをコードしているアミノ酸配列の全体または大部分をコードする核酸断片に関するものである。当業者であれば、特定のアミノ酸を表すヌクレオチドコドンを使用する宿主細胞の「コドンバイアス」について十分に理解していよう。したがって、宿主細胞での発現を改善した遺伝子を合成する際は、遺伝子のコドン使用頻度がその宿主細胞での好ましいコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計すると望ましい。
【００４７】
「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手順で化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックからアセンブルすることが可能なものである。こうしたビルディングブロックを結合およびアニール処理して遺伝子セグメントを構成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関する「化学的に合成された」とは、コンポーネントであるヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルされたものであることを意味する。この場合、十分に確立された手順を使ってＤＮＡの化学合成を手作業で行ってもよいし、多様な市販の装置類のうちのいずれかを使って自動化学合成を行うことも可能である。したがって、ヌクレオチド配列の最適化を踏まえた最適な遺伝子発現に遺伝子の方を合わせ、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることが可能である。当業者であれば、使用されるコドンが宿主の好むコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を知ることができよう。好ましいコドンについては、配列情報を得られる宿主細胞に由来する遺伝子についての調査を行い、その結果に基づいて判断することが可能である。
【００４８】
「遺伝子」とは、コード配列の前にある（５’非コード配列）かまた後にある（３’非コード配列）制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなるあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて正常な位置にある天然遺伝子を示す。「外来遺伝子」とは、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子のことである。
【００４９】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列があげられる。
【００５０】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素よりなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５１】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上に核酸配列が会合した状態を示す。たとえばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響をおよぼすことができる（すなわちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ときに、そのコード配列と作動的に結合されていると言う。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで制御配列への作動的な結合が可能なものである。
【００５２】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。
【００５３】
「形質転換」とは、核酸断片が宿主生物のゲノムに移行し、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００５４】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００５５】
「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に役立つあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列解析ソフトウェア」は市販のものであってもよいし、独自開発のものであってもよい。一般的な配列解析ソフトウェアとしては、ＧＣＧパッケージのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ディエヌエースター・インコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）、１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）ならびにスミス・ウォーターマンアルゴリズムを取り入れたＦＡＳＴＡプログラム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１〜２０、編集者（ら）：スハイ・サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：ニューヨーク州ニューヨーク、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））があげられるが、これに限定されるものではない。本願の内容に関してだけ言えば、配列解析ソフトウェアを解析に利用する場合、特に明記しない限り、その解析結果は引用したプログラムの「デフォルト値」でのものとなる点は理解できよう。本願明細書において使用する「デフォルト値」とは、ソフトウェアを最初に初期化したときに最初からロードされるあらゆる値またはパラメータの組を意味するものとする。
【００５６】
本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知のものであり、サムブルック・ジェー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８９）（以下、「マニアティス」とする）およびシルハビー・ティ・ジェー（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン・エム・エル（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）およびエンキスト・エル・ダブリュ（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリーコールド出版局スプリングハーバー、ＮＹ（１９８４）ならびにオースベル・エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７）によって説明されている。
【００５７】
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼによって置換された多環式芳香族を酸化させるための方法について説明するものである。好ましいプロセスでは、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１由来またはシュードモナス属プラスミドｐＷＷＯ由来のキシレンモノオキゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を利用した２，６−ＤＭＮから２，６−ＮＤＣへの生物変換を伴う、２，６−ＮＤＣおよび部分酸化化合物の生成について説明する。キシレンモノオキゲナーゼ酵素の２つのサブユニット（ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡ）についての遺伝子をクローニングし、２，６−ＤＭＮおよび関連の化合物の生物変換用の組換え宿主で発現させた。
【００５８】
本発明に適した２つの例のキシレンモノオキシゲナーゼを単離して示した。一方のキシレンモノオキシゲナーゼは活性汚泥から単離した細菌で得られたものであり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列からスフィンゴモナス種であると判断された。配列番号９の核酸分子でコードされる、このスフィンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼＸｙｌＭサブユニットを、配列番号１０で示す。また、配列番号１１の核酸分子でコードされる、スフィンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼのＸｙｌＡサブユニットを、配列番号１２で示す。
【００５９】
本発明のもう一方のキシレンモノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プディタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ）株の細菌ＡＴＣＣ  ３３０１５に含まれるプラスミドｐＷＷＯから単離したものである。配列番号１５の核酸分子でコードされる、シュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼＸｙｌＭサブユニットを、配列番号１６で示す。配列番号１７の核酸分子でコードされる、シュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼのＸｙｌＡサブユニットを、配列番号１８で示す（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら、（上掲））。
【００６０】
上述したように、スピンゴモナス（Ｓｐｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼとシュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼは、２つの酵素的サブユニットで構成されている。一方のサブユニットは、ｘｙｌＡオープンリーディングフレームでコードされ、ＮＡＤＨ結合電子伝達サブユニットをコードする。もう一方のサブユニットは、鉄含有ヒドロキシラーゼをコードするｘｙｌＭオープンリーディングフレームでコードされる。標準的なアルゴリズムを使用してスピンゴモナスＸｙｌＭタンパク質の配列を公共のデータベースと比較したところ、他の周知の遺伝子のひとつに対してアミノ酸レベルで９８％同一性を有することが明らかになった。
【００６１】
キシレンモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物の単離
キシレンモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物は多種多様なソースから単離できるものである。好適なソースとしては、工業廃棄物流、汚染された工場用地および廃棄物流処理施設の土壌があげられる。本発明のキシレンモノオキシゲナーゼ含有微生物については、廃水処理プラントの活性汚泥から単離した。
【００６２】
少なくとも１種の置換された多環式芳香族有機基質を併用して好適な成長培地でインキュベーションすることで、キシレンモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物を含有している疑いのある試料を富化することができる。本発明で使用するのに適した芳香族有機基質としては、２−メチルナフタレン、２，６−ジメチルナフタレン、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン、２，６−ＮＤＣがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
微生物の富化とスクリーニングに必要な成長培地および手法は従来技術において周知であり、その一例が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・イー・マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン・ダブリュ・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス・エー・ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびジー・ブリッグズ・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン・ディーシー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４））またはトーマス・ディ・ブラック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。
【００６４】
キシレンモノオキシゲナーゼ含有微生物のキャラクタリゼーション
該当する微生物の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列を分析し、キシレンモノオキシゲナーゼ含有微生物（株ＡＳＵ１）の一例をスフィンゴモナス種として同定した。この１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅して標準プロトコール（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上掲））に従って株ＡＳＵ１からクローニングし、公共のデータベースに収録されている配列と比較した。比較の結果、ＡＳＵ１  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列にはスフィンゴモナス属のいくつかの株との間で有意に高い相同性があることが明らかになった。
【００６５】
スフィンゴモナス属は紅色非硫黄細菌のグループに含まれるが、バークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、ノボスフィンゴビウム属、パンドレア属、デルフチア属、コマモナス属が同じグループの例である。紅色非硫黄細菌は生理学的に異なる微生物群をなし、５つの亜門（α、β、γ、ε、δ）がある（マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、第８版、プレンティス・ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）、ニュージャージー州アッパーサドルリバー（ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ）（１９９７））。紅色非硫黄細菌の５つの亜門にはいずれも有機化合物を炭素源やエネルギとして利用する微生物が含まれる。単離した微生物は具体的にはスフィンゴモナス属であったが、芳香族化合物を代謝するための遺伝子がプラスミド上にある場合が多く、このプラスミドは紅色非硫黄細菌のメンバ間で移行可能なことが多いことが理由で、上記の方法で単離されるシュードモナス属（γ亜門）などの紅色非硫黄細菌の他のメンバでも適するであろうと考えられる（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら（上掲））、スプリンゲル（Ｓｐｒｉｎｇａｅｌ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２：３２８３〜３２９３（１９９６））。
【００６６】
したがって、バークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、ノボスフィンゴビウム属、パンドレア属、デルフチア属、コマモナス属を含むがこれに限定されるものではない細菌群から単離されるキシレンモノオキシゲナーゼであれば、いずれも本発明に適するものになるであろうと考えられる。
【００６７】
キシレンモノオキシゲナーゼ相同体の同定
本発明は、２，６−ＤＭＮを２，６−ＮＤＣに生物変換する機能を持つキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子および遺伝子産物の例を提供するものである。その一例には、スフィンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼ（配列番号９〜１２にて定義するようなもの）、シュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼ（配列番号１５〜１８にて定義するような、株ＡＴＣＣ  ３３０１５、アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら（上掲）））、スフィンゴモナスプラスミドｐＮＬ１（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）キシレンモノオキシゲナーゼ（配列番号１９〜２２にて定義するようなもの）が含まれるが、これに限定されるものではない。配列依存性プロトコールに準じて同様の基質特異性を持つ他のキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子を同定し、単離できるかもしれないことは理解できよう。
【００６８】
配列依存性プロトコールを利用した相同遺伝子の単離については従来技術において周知である。配列依存性プロトコールの例としては、核酸増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボル・エス（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、１０７４（１９８５））あるいは鎖置換増幅（ＳＤＡ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２））のさまざまな用途にみられるような核酸ハイブリダイゼーション法ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの増幅法があげられるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
たとえば、配列番号９、１１、１５、１７、１９、２１に示す核酸断片のうちの全部または一部を利用して、本キシレンモノオキシゲナーゼと同様のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離したり、あるいは当業者間で周知の方法を使って所望の細菌からライブラリをスクリーニングするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして単離することが可能であった。従来技術において周知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））で、本件核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、合成することができる。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識法などの当業者間で周知の方法で、完全配列を使ってＤＮＡプローブを直接合成したり、あるいは利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使ってＲＮＡプローブを直接合成したりすることも可能である。さらに、特定のプライマーを設計し、これを利用して本配列の一部または全長を増幅することが可能である。得られる増幅産物については、増幅反応時に直接標識してもよいし、増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシーの条件下で全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして利用してもよい。
【００７０】
ＰＣＲタイプのプライマーによる増幅手法では、プライマーの配列がそれぞれ違っていて互いに相補ではないのが普通である。所望の試験条件次第では、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を得られるようにプライマーの配列を設計しなければならない。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的なものであり、従来技術において周知である。（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウァランス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ケー・イー・デービス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）第３３〜５０ページ、バージニア州ヘーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、アイアールエル・プレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ））、リクリーク・ダブリュ（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）（１９９３）、ホワイト・ビー・エー（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、第３１〜３９ページ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ヒューマニア・プレス・インコーポレイテッド（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））。
【００７１】
通常、ＰＣＲプライマーを利用してＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードする長めの核酸断片を増幅することができる。しかしながら、一方のプライマーの配列を本件核酸断片由来のものとし、クローニングされた核酸断片のライブラリでポリメラーゼ連鎖反応を行うようにしてもよい。あるいは、第２のプライマーの配列をクローニングベクター由来の配列に基づくものとしても構わない。たとえば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコール（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従ってＰＣＲでｃＤＮＡを生成し、転写物中の一点と３’末端または５’末端との間の領域のコピーを増幅することができる。本件配列から、３’方向のプライマーと５’方向のプライマーとを設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のギブコビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を利用すれば、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）、ロウ（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【００７２】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号９、１１、１５、１７、１９および２１よりなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅する
ことを含んでなり、
増幅されたインサートがキシレンモノオキシゲナーゼをコードするものである、
キシレンモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法を提供するものである。
【００７３】
あるいは、本件配列を相同体同定用のハイブリダイゼーション試薬として利用してもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本となる構成要素としては、プローブ、該当する遺伝子または遺伝子断片を含むのではないかと思われる試料、特異的ハイブリダイゼーション法があげられる。本発明のプローブの典型は、検出対象となる核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出対象となる核酸配列に「ハイブリダイズ可能」なものである。プローブ長については５塩基から数万塩基まで可変であり、その長さは実施する具体的な試験に応じて決まる。一般に、プローブ長を１５塩基から約３０塩基にするのが適している。検出対象となる核酸配列と相補的でなければならないのは、プローブ分子の一部のみである。また、プローブと標的配列との間の相補性も完全である必要はない。ハイブリダイズされた領域に含まれる塩基の画分の中には正しい相補的塩基とペアにならないものが生じるが、不完全に相補的な分子間であってもハイブリダイゼーションは起こるのである。
【００７４】
ハイブリダイゼーション方法は十分に定義されている。一般に、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと試料とを混合しておかなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下にて、無機塩または有機塩の存在下でプローブと試料とを接触させる必要がある。このとき、プローブと試料の核酸との間で生じ得るハイブリダイゼーションを起こすことができる程度に十分な時間、プローブと試料の核酸とを接触させておかなければならない。ハイブリダイゼーションが起こるまでの時間は、混合物中におけるプローブまたは標的の濃度によって決まる。プローブまたは標的の濃度が高ければ高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短くなる。任意にカオトロピック剤を加えてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することで核酸を安定させる。さらに、カオトロピック剤を用いると、短いオリゴヌクレオチドプローブを使って感受性が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションを室温にて行うことができるようになる（ヴァン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。好適なカオトロピック剤としては、特に、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウムがあげられる。このカオトロピック剤については、一般に最終濃度を約３Ｍとして含有させる。必要があれば、ハイブリダイゼーション混合物に、一般には３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを加えることもできる。
【００７５】
さまざまなハイブリダイゼーション溶液を用いることが可能である。これらの溶液には一般に、約２０から６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶媒が含まれる。通常のハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５から１Ｍの塩化ナトリウムと、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの約０．０５から０．１Ｍの緩衝液と、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５から０．２％の洗浄剤あるいは、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）のファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、血清アルブミンが用いられている。また、一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸と、ウシ胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡなどの断片化した核ＤＮＡ、あるいは酵母ＲＮＡなどが含まれ、任意に約０．５から２％ｗｔ．／ｖｏｌ．のグリシンも含まれる。また、ポリエチレングリコールなどのさまざまな極性・水溶性または膨潤性の薬剤を含む体積排除剤、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオンポリマー、デキストラン硫酸などのアニオンサッカライドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）といった他の添加剤を含有させてもよい。
【００７６】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号９、１１、１５、１７、１９および２１よりなる群から選択される核酸分子の一部を用いてゲノムライブラリをプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）し、（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下で（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片のシークエンシングすることを含んでなり、シークエンシングされたゲノム断片がキシレンモノオキシゲナーゼをコードするものである、キシレンモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法を提供するものである。
【００７７】
組換え発現
本キシレンモノオキシゲナーゼ配列の遺伝子および遺伝子産物を微生物宿主細胞に導入することができる。本件遺伝子および核酸分子を発現させるのに好ましい宿主細胞は、真菌または細菌ファミリ内で広く見られ、温度、ｐＨ値、溶媒耐性の点で広範囲にわたって成長する微生物宿主である。転写がゆえに、翻訳およびタンパク質生合成装置は細胞原料とは無関係に同じであり、細胞バイオマスの生成に用いる炭素原料とは無関係に機能的遺伝子が発現される。大規模な微生物成長および機能的遺伝子発現で広範囲にわたる単純または複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、メタンなどの飽和炭化水素、あるいは光合成宿主または化学合成独立栄養宿主の場合は二酸化炭素を利用することができる。しかしながら、特定の成長条件によって機能的遺伝子を調節、阻止あるいは抑制するようにしてもよく、こうした成長条件としては、窒素、亜リン酸、硫黄、酸素、炭素または小さな無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量があげられる。また、培地に添加され、一般には栄養素またはエネルギ源とはみなされない特定の調節分子の有無によって機能的遺伝子を調節してもよい。成長速度も遺伝子発現における重要な調節因子になることがある。好適な宿主株の一例として、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピチア属、カンジダ属、ハンゼヌラ属などの真菌種または酵母種、あるいは、サルモネラ属、バシラス属、アシネトバクター属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、エシェリキア属、シュードモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、アナベナ属、チオバシラス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ノボスフィンゴビウム属、パラコッカス属、パンドレア属、デルフチア属、コマモナス属などの細菌種があげられるが、これに限定されるものではない。
【００７８】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本配列の遺伝子産物生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。これらのキメラ遺伝子を形質転換によって適当な微生物に導入し、酵素を高いレベルで発現させることができる。
【００７９】
好適な宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは従来技術において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とが含んでなる。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が生産宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【００８０】
所望の宿主細胞での本ＯＲＦの発現をドライブするのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子をドライブできるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア属での発現に有用）、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびに、バシラス属での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびさまざまなファージプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。任意に、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【００８２】
キシレンモノオキシゲナーゼを含んでなる好適な発現カセットを構築後は、これを利用して本方法で使用するのに適した宿主を形質転換してもよい。本発明において好ましいカセットは、キシレンモノキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）のｘｙｌＭサブユニットとｘｙｌＡサブユニットの両方を含むものであり、この場合、
ｘｙｌＭサブユニットは、
（ｉ）配列番号１０、配列番号１６および配列番号２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対する９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と完全に相補性である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸でコードされ、
ｘｙｌＡは、
（ｉ）配列番号１２、配列番号１８および配列番号２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対する９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と完全に相補性である単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸でコードされる。
【００８３】
２，６−ＮＤＣと中間体を製造するためのプロセス
本発明のキシレンモノオキシゲナーゼを利用すれば、さまざまな置換された多環式芳香族化合物を酸化させて対応するカルボン酸および関連の化合物を得ることができる。具体的には、本発明の方法を利用すれば、２，６−ＮＤＣと２，６−ＤＭＮの部分酸化誘導体の両方を生成することができる。
【００８４】
本反応に適した基質は以下の式
【００８５】
【化３】
2006500005.tif 000004
【００８６】
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は独立してＨまたはＣＨ３あるいはＣ１〜Ｃ２０の置換もしくは未置換のアルキルまたは置換もしくは未置換のアルケニルまたは置換もしくは未置換のアルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ８のうちの少なくとも２つが存在しかつＨではない）で定義される。
【００８７】
２，６−ＮＤＣの生成が望まれる場合、基質としては、２，６−ジメチルナフタレン、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、６−メチル−２−ナフトエ酸、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
２，６−ＮＤＣの生成が望まれる場合、好適な成長培地中でキシレンモノオキシゲナーゼを含有する組換え微生物を２，６−ＤＭＮと接触させ、２，６−ＮＤＣの生成について反応媒体を監視する。本件プロセスは、２，６−ＤＭＮから２，６−ＮＤＣへの生物変換時に発生し得る２，６−ＮＤＣ生合成経路の中間体の生成にも役立つものである。
【００８９】
２，６−ＮＤＣおよび他の生成物の量産が望まれる場合、さまざまな培養方法を適用することができる。たとえば、バッチ培養法または連続培養法のどちらでも組換え微生物宿主からの大規模生産品を製造することができる。
【００９０】
従来からのバッチ培養法は、培地の組成物を培養開始時に仕込み、培養工程の途中で人工的に変化させることのない閉じた系のひとつである。このため、培養工程開始時に所望の生物または複数の生物を培地に播種し、系に何も加えずに成長または代謝活性を引き起こさせる。しかしながら、一般に「バッチ」培養では炭素源の追加という意味ではまとめて処理が行われるため、ｐＨおよび酸素濃度などの要因を制御しようとする試みがなされることが多い。バッチ系では、培養を停止させるまで系の代謝物とバイオマス組成が絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は動きのない誘導期から大きく成長する対数期へと移り、最後に静止期において成長率が低下または停止する。未処理の状態では、静止期の細胞は最終的には死んでしまう。系によっては、最終生成物または中間体の大半が対数期の細胞によって作られることが多い。他の系では静止期または対数増殖期後期で生産品を得ることが可能である。
【００９１】
標準的なバッチ系のバリエーションのひとつにＦｅｄ−バッチ系がある。Ｆｅｄ−バッチ培養プロセスも本発明において好適であり、培養が進むにつれて基質を増やしながら加えること以外は一般的なバッチ系で構成される。Ｆｅｄ−バッチ系は、カタボライト抑制によって細胞の代謝が阻害されやすい場合や、培地に含まれる基質の量を制限するのが望ましい場合に有用なものである。Ｆｅｄ−バッチ系で実際の基質濃度を測定するのは困難であるため、ｐＨ、溶存酸素、ＣＯ２などの廃ガスの分圧といった測定可能な要因の変化に基づいて濃度を推測する。バッチ培養法およびＦｅｄ−バッチ培養法は一般的かつ従来技術において周知のものであり、その一例が、本願明細書に援用するトーマス・ディ・ブラック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）またはデシュパンド・ムカンド・ヴイ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７（１９９２）に記載されている。
【００９２】
連続培養を用いて２，６−ＮＤＣおよび関連の化合物を量産することもできる。連続培養は、処理時に一定の培養液を連続してバイオリアクターに加えると同時に、これと同じ量の条件培地を取り出す開いた系のひとつである。連続培養では細胞が主に成長の対数期にある一定の高い液相密度に細胞を維持するのが普通である。あるいは、炭素と栄養素とが連続的に加えられる固定化細胞を利用し、価値のある生成物、副生物または廃棄物を細胞塊から連続的に取り出す連続培養を行うようにしても構わない。細胞の固定化については、天然および／または合成の材料よりなる広い範囲の固体担体を使って行うことができる。
【００９３】
連続培養または半連続培養では、細胞の成長または最終生成物の濃度に影響する要因をひとつまたはいくつでも加減することができる。たとえば、ひとつの方法では、炭素源などの限られた栄養素または窒素濃度を一定率に維持し、他のすべてのパラメータを加減できるようにする。他の系では、培地の混濁度で測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する多数の要因を連続して変化させることができる。連続系は定常状態の成長条件を維持することを目指すものであるため、培養時における細胞の成長率と培地除去による細胞喪失とのバランスを保つようにしなければならない。連続発酵プロセスで栄養素と成長因子とを調節する方法ならびに、生成物の形成速度を最大限にするための手法は工業用微生物学の従来技術において周知であり、ブラック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）によってさまざまな方法が詳細に説明されている。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【００９５】
一般法
以下の実施例で使用するのに適した手法は、サムブルック・ジェー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（以下、「マニアティス」とする）に記載されている。
【００９６】
細菌培養の管理と成長に適した材料および方法が従来技術において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙフィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・イー・マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン・ダブリュ・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス・エー・ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびジー・ブリッグズ・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン・ディーシー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４））またはトーマス・ディ・ブラック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ、第２版、シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の成長および管理に用いる試薬および材料はいずれも、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のギブコビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））から入手した。
【００９７】
略語の意味は以下のとおりである。「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｐｐｍ」は百万分率（すなわち１リットルあたりのミリグラム数）を意味する。
【００９８】
培地：
合成Ｓ１２培地を使用して強化培養を得た。Ｓ１２培地には、１０ｍＭ  硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、０．０００１％ＦｅＳＯ４、２μＭ塩酸チアミンを含む。最終濃度が０．００１％になるように定期的に酵母エキスをＳ１２培地に補充した。
【００９９】
Ｓ１２寒天を使用して、２，６−ＤＭＮで成長する液体の強化培養から細菌を単離し、さまざまな炭素源およびエネルギ源を用いて単離物の成長を試験した。Ｓ１２寒天については、１．５％ノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天（ディフコ（ＤＩＦＣＯ））をＳ１２培地に加えて調製した。
【０１００】
２，６−ＤＭＮは水溶性が低いため、２，６−ＤＭＮのフレークを何枚か培養に直接加え、Ｓ１２培地で成長中の細菌にこの化合物を与えた。Ｓ１２寒天で成長している細菌には、ナフタレン、２−メチルナプタレン（ｍｅｔｈｙｌｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）または２，６−ＤＭＮのフレークを何枚かペトリ皿の蓋の内側に付け、この化合物を与えた。すべてのペトリ皿をパラフィルムで密閉し、蓋を下にしてインキュベートした。
【０１０１】
ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（バクト−トリプトン１％、バクト−酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ１％）および／または標準Ｍ９最小培地を使用して、クローニングされたキシレンモノオキシゲナーゼを持つエシェリキア・コリによる２，６−ＤＭＮの酸化をアッセイした。Ｍ９培地の構成は、４２．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２２．１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２とした。グリセロール（０．４％）または２，６−ＤＭＮを炭素源として利用した。
【０１０２】
細菌株とプラスミド：
工業廃水処理施設の活性汚泥から細菌スフィンゴモナス株ＡＳＵ１を単離した。また、米国菌株保存機関（バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））からシュードモナス・プディタ株ＡＴＣＣ  ３３０１５を入手した。ＳｕｐｅｒＣｏｓ  １コスミドベクターキット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））の一部として、大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲおよびＳｕｐｅｒＣｏｓ  １コスミドベクターを購入した。ギブコビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からエシェリキア・コリＤＨ５αのマックス・エフィシエンシー（Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（登録商標）コンピテント細胞を購入した。エシェリキア・コリ株ＴＯＰ１０とＰＣＲ産物のクローニングに用いるプラスミドベクターｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＭとを、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−ライフ・テクノロジズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））からキットとして購入した。
【０１０３】
スフィンゴモナス株ＡＳＵ１コスミドライブラリの構築：
ＬＢ培地２５ｍＬ中で１６時間、３０℃にて振盪しながらスフィンゴモナス株ＡＳＵ１を成長させた。ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＣ５Ｃ遠心機にてＳＳ３４ロータを使って４℃（ケンドロ・ラボ・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））で細菌細胞を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。上清をデカントし、ＴＥ（１０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）２ｍＬに細胞ペレットを静かに再懸濁させた。リゾチームを最終濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬになるように加えた。懸濁液を３７℃で１５分間インキュベートした。次にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように加え、プロテイナーゼＫを最終濃度が５０μｇ／ｍＬになるように加えた。この懸濁液を５５℃で２時間インキュベートした。懸濁液は透明になり、同容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で透明なライゼートを抽出した。１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心処理した後、水性相を慎重に取り除き、新しい管に移した。同容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて水性相を抽出した。１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心処理した後、水性相を慎重に取り除き、新しい管に移した。７．５Ｍの酢酸アンモニウム０．５容量と無水エタノール２容量とを加えてＤＮＡを沈殿させた。密閉したガラス製パスツールピペットでＤＮＡを静かにスプールした。このＤＮＡを７０％エタノールで静かに洗浄し、空気乾燥させた。ＤＮＡをＴＥ１ｍＬ中に再懸濁させた。このＤＮＡをＲｎａｓｅＡ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）で３０分間３７℃にて処理した。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、上述したようにして沈殿させた。ＤＮＡをＴＥ１ｍＬ中に再懸濁させ、４℃で保管した。２８０ｎｍでの吸光度に対する２６０ｎｍでの吸光度の比を求めることで、ＤＮＡの濃度および純度を分光光度的に求めた。
【０１０４】
ＳｕｐｅｒＣｏｓ  １コスミドベクターキットの取扱説明書に概要が説明されているようにして、染色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））で部分消化した。反応容量５０μＬで２５℃にて、０．８単位のＳａｕ３ＡでＤＮＡ（３０μｇ）を消化した。反応混合物が消耗されるまで反応チューブから５分間隔で５μＬずつアリコートを抜き取った。ゲルローディング緩衝液１μＬと０．５Ｍ  ＥＤＴＡが１μＬ入ったチューブに各アリコートを入れ、すべてのアリコートの回収が終わるまで氷上にて保管した。これらのアリコートを７５℃で加熱し、０．３％アガロースゲル上で分析して消化の度合いを判断した。染色体ＤＮＡのサイズの減少が反応時間の長さの増加に対応していた。反応容量５０μＬで２５℃にて３０分かけて、０．８単位のＳａｕ３ＡでＤＮＡ３０μｇを消化する予備反応を実施した。０．５Ｍ  ＥＤＴＡ１０μＬを加え、反応物を１０分間７５℃で加熱して消化を終了させた。この反応物を同容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで１回、同容量のクロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出した。７．５Ｍの酢酸アンモニウム０．５容量と無水エタノール２容量とを加えて水性相からＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを水５０μＬに再懸濁させた。部分消化されたＤＮＡを製造業者から得た反応緩衝液１００μＬ中で仔ウシ腸管粘膜由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（ギブコビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））１単位を使って脱リン酸処理した。この反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。さらに１ｕＬのＣＩＡＰを加え、反応物をさらに３０分間インキュベートした。停止用緩衝液（１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）を１００μＬ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２０μＬ、１Ｍ  ＮａＣｌを２ｍＬ、２０％ＳＤＳを２５０μＬ、水を６００μＬ）６００μＬを加え、反応物を７０℃で１０分間インキュベートして反応を終了させた。反応物を同容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで１回、同容量のクロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出した。７．５Ｍの酢酸アンモニウム０．５容量と無水エタノール２容量とを加えて水性相からＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡをＴＥ２０μＬに再懸濁させた。
【０１０５】
脱リン酸処理したＡＳＵ１  ＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＣｏｓ  １コスミドベクターキットに同梱の指示に従って調製したＳｕｐｅｒＣｏｓ  １ベクターＤＮＡにライゲートした。次にギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）（登録商標）ＩＩＩ  ＸＬパッケージング用エキスをストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が推奨している形で製造業者の指示どおりに使用して、ライゲートされたＤＮＡをλファージコートにパッケージングした。パッケージング後のＡＳＵ１ゲノムＤＮＡライブラリには、エシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲに感染させて感染細胞をＬＢ寒天にアンピシリンを加えた（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）ものに蒔いて求めると、ＤＮＡ１μｇあたりの力価１．２×１０３コロニー形成単位が含まれていた。無作為に選択した６つのエシェリキア・コリ形質転換体からコスミドＤＮＡを単離したところ、ＤＮＡの大きなインサート（２５〜４０ｋｂ）が含まれていることが分かった。
【０１０６】
株ＡＳＵ１コスミドライブラリのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子についてのスクリーニング：
アンピシリン含有ＬＢブロス（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートのウェルに分注（蒸発を防ぐ蓋（マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ）のコーニング・ライフ・サイエンシーズ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））と一緒にコスター（Ｃｏｓｔａｒ）（登録商標）Ｎｏ．３５９５を使用して、２００μＬ／ウェル）した。各ウェルにエシェリキア・コリの組換えコロニー１つを接種した。各プレートをエア・ポア（Ａｉｒ−Ｐｏｒｅ）フィルム（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））で覆い、揺動架台上でプレートを３７℃で１６時間インキュベートした。これらのマイクロタイタープレートを「培養セットＮｏ．１」とした。
【０１０７】
マイクロタイタープレートの個々の位置に対応するウェル全部から得たアリコート１０μＬを混合することによって培養セットＮｏ．１で得られるすべての培養を混和して９６種のプールを作製、すなわち、位置Ａ１のウェルをすべて混和し、位置Ａ２のウェルをすべて混和するといった具合にした。これらのプールを新しい９６穴のマイクロタイタープレートに入れた。
【０１０８】
各プールを１：１０に希釈し、プライマーｘｙｌＡＦ１（ＣＣＧＣＡＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＧＴ；配列番号１）とプライマーｘｙｌＡＲ１（ＧＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＡ；配列番号２）とを使用し、市販のキットを製造業者の指示（コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））どおりに使ってＰＣＲ（反応物５０μＬあたりプールした培養２μｌＬ）によるスクリーニングを実施した。シュードモナスプラスミドｐＷＷＯ（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｐ２１３９４）でコードされるＸｙｌＡ配列とスフィンゴモナスプラスミドｐＮＬ１（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ０７９３１７）でコードされるＸｙｌＡ配列とをアライメントし、２つのアミノ酸配列で保存された領域を同定して上記のプライマーを設計した。その後、保存されたアミノ酸配列に対応するｐＮＬ１ヌクレオチド配列をプライマーの設計に利用した。パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社のジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）９６００でＰＣＲを実施した。試料を１分間９４℃でインキュベートした後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルを４０回繰り返した。サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）  ９６水平ゲル電気泳動装置（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログＮｏ．１１０６８−１１１）を使用して、各反応物の試料５μＬをＴＥＡ緩衝液中にて０．８％アガロースゲル上で分析した。このとき、ゲルを９５ボルトで１時間動かし、ＴＥＡ中にて臭化エチジウム（最終濃度８μｇ／ｍＬ）で染色した。
【０１０９】
陽性プールの作製に利用した培養セットＮｏ．１の個々の培養を試験することで、長さ約９００塩基対のＰＣＲ産物が得られたプールをデコンボリュートした。アンピシリン含有ＬＢブロス（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートのウェルに分注（２００μＬ／ウェル）した。各ウェルに培養セットＮｏ．１の培養物１０μＬを接種した。マイクロタイタープレートをエア・ポア（Ａｉｒ−Ｐｏｒｅ）フィルムで覆い、揺動架台上で３７℃で１６時間インキュベートした。各培養を１：１０に希釈した。プライマーｘｙｌＡＦ１（配列番号１）とプライマーｘｙｌＡＲ１（配列番号２）とを使用して希釈培養をＰＣＲでスクリーニングし、上述したようにアガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分析した。
【０１１０】
コスミドインサートのシークエンシング：
以下のようにしてコスミドＤＮＡをシークエンシング用にサブクローニングした。クローンＥ２／６を使用し、ＳｕｐｅｒＣｏｓ  １コスミドベクターキットに同梱の製造業者の指示どおりに、いくつかのミニライゼートからコスミドＤＮＡを調製した。ＨａｅＩＩＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））での部分消化によって断片化しておいたＤＮＡを使い、サブクローニング後のコスミドＤＮＡのライブラリ１つを作製した。また、噴霧によって断片化しておいたＤＮＡを使い、サブクローニング後のコスミドＤＮＡよりなる第２のライブラリを作製した。
【０１１１】
反応容量５０μＬで２５℃にて、１単位のＨａｅＩＩＩでコスミドＤＮＡ（３０μＬ）を部分消化した。反応混合物が消耗されるまで反応チューブから５分間隔で５μＬずつアリコートを抜き取った。ゲルローディング緩衝液１μＬと０．５Ｍ  ＥＤＴＡが１μＬ入ったチューブに各アリコートを入れ、すべてのアリコートの回収が終わるまで氷上にて保管した。これらのアリコートを７５℃で加熱し、０．８％アガロースゲル上で分析して消化の度合いを判断した。コスミドＤＮＡのサイズの減少が反応時間の長さの増加に対応していた。同じようにして２５分間予備反応を実施した。０．５Ｍ  ＥＤＴＡ１０μＬを加え、７５℃で１０分間インキュベーションを行って反応を停止させた。部分消化されたＤＮＡの断片を、ＴＥＡ緩衝液中にて０．８％低融点アガロースゲルでサイズごとに分けた。サイズが２ｋｂから４ｋｂの範囲にあるＤＮＡ制限断片をゲルから切り出し、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットを製造業者の指示（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のキューバイオジーン（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ））どおりに用いて精製した。
【０１１２】
噴霧に用いる予定のコスミドＤＮＡ（４５μＬ）をＲＮＡｓｅ  Ａ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ；シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））で３７℃にて３０分間処理した。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させて精製した。このＤＮＡをＴＥ緩衝液５０μＬに再懸濁させた。ＤＮＡ（５０μＬ）を水１ｍＬで希釈し、濾過空気（２２ｐｓｉで３０秒間）を使って溶液を強制的にネブライザ（イリノイ州シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ）のアイピーアイ・メディカル・プロダクツ（ＩＰＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、カタログ番号４２０７）に通して断片化した。これらのＤＮＡ断片をエタノール沈殿によって濃縮し、ＴＥＡ緩衝液中にて０．８％低融点アガロースゲルでサイズごとに分けた。サイズが２ｋｂから４ｋｂの範囲にあるＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットを用いて精製し、水４０μＬに再懸濁させた。３７℃で１時間インキュベートしたポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）反応物（１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））４μＬと、１０ｍＭ  ＡＴＰ１μＬと、Ｔ４ポリメラーゼ（６単位／μＬ；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））１μＬと、ポリヌクレオチドキナーゼ（６単位／μＬ；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））１μＬと、噴霧したＤＮＡ３０μＬと、ｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ２．５ｎＭを含有するストック溶液）１．６μＬと、水１．４μＬ）４０μＬ中にてＤＮＡ断片の末端を修復した。７５℃で１５分間インキュベーションを行って反応を終結させた。ポリッシュしたＤＮＡをジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットを用いて精製し、水２０μＬに再懸濁させた。
【０１１３】
ＨａｅＩＩＩでの消化または噴霧によって生成されたコスミドＤＮＡの断片を、「レイディ・トゥ・ゴー（Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ）」キット（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のアマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に同梱されていたＳｍａｌカットプラスミドｐＵＣ１８にライゲートした。ライゲートされたＤＮＡをジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットで製造業者のプロトコールどおりに処理した後、エレクトロマックス（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ）ＴＭ  ＤＨ１０ＢＴＭエシェリキア・コリ細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に電気穿孔した。電気穿孔については、バイオ・ラド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ））を、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００ｚの設定にして行った。電気穿孔キュベットの中身を１．５ｍＬの微量遠心管に移し、３７℃で１時間インキュベートした。培養試料をアンピシリン含有ＬＢ寒天（５０μｇ／ｍＬ）およびＸ−ｇａｌ含有ＬＢ寒天（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド４μｇ／ｍＬ、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））に展開し、３７℃で１６時間インキュベートした。成長培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ、０．２％グルコース、２０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）  ＨＣｌを含有するＬＢ、ｐＨ７．５）１ｍＬを含む９６スクエアーウェルプレート（カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）のベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））の各ウェルに白色コロニー１つを接種した。これらのプレートを揺動架台上にて３７℃で１６時間インキュベートした。キアプレップ９６ターボミニプレップキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて各培養からプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１１４】
自動ＡＢＩシーケンサ（カリフォルニア州フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））でプラスミドのシークエンシングをした。ｐＵＣ１８ユニバーサルプライマーとリバースプライマーとを用いてシークエンシング反応を開始した。得られた配列をシークエンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）  ３．０（ジーン・コーズ・コーポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ））でアセンブルした。
【０１１５】
ＨＰＬＣ：
ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）  １１００シリーズをフォトダイオードアレイ検出器およびＬＣ／ＭＳＤ−ＥＳＩ負イオンでＨＰＬＣ系として使用した。アジリエント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カリフォルニア州フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））から購入した、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）パートＮｏ．８８０９７５−９０２  ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）（登録商標）ＳＢ−Ｃ１８（４．６×１２．５ｍｍ、５ミクロン）をカラムとして使用した。カラム温度を３０℃に制御した。移動相には０．０２ｍＭ酢酸アンモニウム［１Ｍ酢酸アンモニウム２０ｍＬを水１８００ｍＬ（溶媒−２＝Ｓ−２）に溶解］とアセトニトリル（溶媒−１＝Ｓ−１）とを用いた。勾配にはＳ−１が１０％でＳ−２が９０％を０〜３分で使用し、３３分で勾配をＳ−１が１００％まで増し、３分でＳ−１が１０％、Ｓ−２が９０％まで落とした。移動相に用いる流量は０．９ｍＬ／分とした。試料１００μＬを注入し、２，６−ジメチルナフタレンの中間体の検出には２３０ｎｍの波長を利用した。必要な中間体を市場で入手することができなかったため、中間体については以下のようにして調製した。調製した中間体は、６−メチル−２−ナフトエ酸（ｎａｐｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンであった。中間体の保持時間とダイオードアレイ走査を調製した標準に合わせた。試料に含まれる６−メチル−２−ナフトエ酸の質量分析計による断片化パターンは調製した標準のパターンに一致していた。
【０１１６】
ＧＣ／ＭＳ：
ＧＣ／ＭＳを使用した試料分析も行った。ＧＣ／ＭＳ分析用の試料には、同容量の酢酸エチル中で抽出し、抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させて濾過したものを用いた。穏やかな窒素流下にて完全に乾燥するまで抽出物から水分を除去した。次に、試料をＢＳＴＦＡ（ビス（トリメチルシリル）トリフルロアセタミド（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）シリル化試薬（ペンシルバニア州ベルフォンテ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）のスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）））で誘導体化した後、ＧＣカラムに注入した。機器には、フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）  ＳＳＱ（登録商標）７０００（カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）のサーモ・フィニガン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ））にヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）  ５９８０  ＩＩ  ＰＬＵＳ  ＧＣまたはヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）  ５９７０  ＭＳＤ  ｗｉｔｈ  ５９８０を使用したが、どちらの質量分析計もシングルステージ四重極式の機器である。スプリットレス注入１μＬ、質量分析計を入れるまでの遅延時間１３分でＧＣ試料をＭＤＮ−５Ｓカラム上で動かした。カラム温度勾配のＧＣ条件については、５０℃で５分、１０℃／分の一定割合で３００℃まで上昇させ、５分間保持とした。
【０１１７】
２，６−ＤＭＮ代謝物の同定：
２，６−ＤＭＮから２，６−ＮＤＣへの変換を逆相ＨＰＬＣで監視した。分析前に培養上清を０．２μｍのフィルタ（ゲルマン・アクロディスク（Ｇｅｌｍａｎ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録商標）ＣＲ  ＰＦＴＥ（ゲルマン／ポール・ライフ・サイエンシーズ（Ｇｅｌｍａｎ／Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ））またはミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）  ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）（登録商標）−ｇｓ（マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）））に通した。分析については、２１４ｎｍでミルトン・ロイ（Ｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｙ）  ＬＤＣ単波長検出器セットを取り付けたヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰＬＣモデル１０５０、あるいは、２５４ｎｍ（一次波長）、２３０ｎｍ（二次波長）、バックグラウンド基準として４５０ｎｍでダイオードアレイＵＶ−可視光線検出器セットを取り付けたヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰＬＣモデル１０９０のいずれかで行った。試料（１０μＬ）をゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）（登録商標）Ｃ８カラム（２．１ｍｍ×１５ｃｍ）に注入した。移動相の構成は（Ａ）リン酸／Ｌを２ｍＬ含有するＨ２Ｏおよび（Ｂ）アセトニトリルとした。勾配については以下の通りとした。ａ）１０％から２５％まで（Ｂ）を上昇で０分から２５分、ｂ）（Ｂ）を次の１２分をかけて９５％まで上昇、ｃ）（Ｂ）を９５％で３分間保持、ｄ）１分で（Ｂ）を１０％まで低減。キャリブレーションおよびデータの分析はいずれもヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）のケムステーション（Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ）ソフトウェアを使って行った。ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）（登録商標）ＲＸＣ８  ９．４ｍｍ×２５ｃｍ、注入容量５０〜２５０μＬのいずれかを用いて機器ＩＩでピーク収集（ｐｅａｋ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のための予備ＨＰＬＣを行った。移動相の構成は、（Ａ）リン酸／Ｌを２ｍＬまたは酢酸を２ｍＬ含有するＨ２Ｏおよび（Ｂ）アセトニトリルとした。ピーク収集の目的で、酢酸２ｍＬ／ミリ−キュー（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）（登録商標）水移動相（ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．））１Ｌ中で試料を動かした。該当するピークを２０ｍＬのガラスバイアルに収集した。続いて試料をサバント・スピード・バック（Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ）（登録商標）（ニューヨーク州ホルブルック（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ）のサーモ・サバント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ））にて濃縮した。
【０１１８】
分析標準として使用するための６−メチル−２−ナフトエ酸、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレンおよび２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレンの合成：
６−メチル−２−ナフトエ酸：
活性成分を６５％含有する次亜塩素酸カルシウム８．１６ｇを水３１．５ｍＬに溶解した後、炭酸カリウム５．７３ｇと水酸化カリウム１．７７ｇとを水１６．５ｍＬに入れた温かい溶液を加え、ウェルを振盪し、濾過し、沈殿物を蒸留水で１回洗浄して元の濾液に戻し、次亜塩素酸カリウム溶液を調製した。この次亜塩素酸カリウム溶液を攪拌しながら５５℃まで加熱し、６−メチル−２−アセトナフトン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））３．０ｇ（１６．２８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を一晩攪拌する際に温度を６０〜６５℃に維持した。ヒドロ亜硫酸ナトリウム（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））３．０ｇ（１７．２３ｍｍｏｌ）を水１５ｍＬに入れた溶液を加え、過剰な次亜塩素酸塩を消滅させた。この溶液を熱いうちに濾過した。室温まで冷却した後、反応混合物を１５０ｍＬ容のビーカーに移し、濃塩酸７．５ｍＬを用いて慎重に酸性化した。粗生成物をブフナー漏斗に回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた。９５％アルコール１００ｍＬから粗生成物を結晶化させ、ＣＨＣｌ３で洗浄したところ、６−メチル−２−ナフトエ酸１．９１ｇ（収率６３％）、ｍｐ２２６〜２２８℃（ｌｉｔ．２２５〜２２７℃、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１７８４（１９３２））が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）およびＩＲ（ＫＢＲ）と提示された構造とは一貫していた。元素分析：実測値：Ｃ，７７．１１、Ｈ，５．４１：計算値：Ｃ，７７．４０、Ｈ，５．４１。
【０１１９】
６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン：
窒素下で乾燥テトラヒドロフラン１４０ｍＬに６−メチル−２−ナフトエ酸０．５ｇを入れた中に、水素化リチウムアルミニウム０．２３８ｇ（６．２５ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を６時間還流加熱し、室温まで冷却した後、飽和塩化アンモニウム溶液を滴下して過剰な水素化リチウムアルミニウムを分解させた。スラリーを濾過し、回転エバポレータで濾液を濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィでクロロホルムを溶離液として用いて粗生成物を精製したところ、６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン０．４１７ｇ（収率９０％）が結晶質の白色固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲおよびＩＲは、所望の産物について予期したとおりである。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｓ，２．４５（３Ｈ）；ｓ，４．７８（２Ｈ）；ｍ，７．５０（６Ｈ）。
【０１２０】
２，６−ビス（カルボメトキシ）ナフタレン：
２，６−ナフタレンジカルボン酸（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））１．０３ｇ（４．７６ｍｍｏｌ）をＨ２ＳＯ４４３ｍＬに溶解し、乾燥メタノール１５０ｍＬを注意深く加えた。反応混合物を１時間還流加熱した。室温まで冷却した後、Ｎａ２ＣＯ３飽和水溶液で混合物を注意深く中和して濾過し、粗生成物を白色固体として得て、これをエタノールから再結晶化させ、１Ｈ  ＮＭＲ分析で純粋な２，６，−ビス（カルボメトキシ）ナフタレン０．９３８７ｇ（収率９３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｓ，４．０４（６Ｈ）；ｑ，８．００，（４Ｈ）；ｓ，８．６５，（２Ｈ）。
【０１２１】
２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン：
窒素下でテトラヒドロフラン１５０ｍＬに２，６−ビス（カルボメトキシ）ナフタレン（１．３６ｍｍｏｌ）０．２８８ｇを入れた中に、水素化リチウムアルミニウム０．２９０ｇ（７．６４ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を８時間還流加熱し、飽和塩化アンモニウム溶液を加えて過剰な水素化リチウムアルミニウムを分解させた。スラリーを濾過し、固形分を新鮮なテトラヒドロフランで洗浄して元の濾液に戻し、回転エバポレータで濾液を乾燥するまで濃縮し、粗生成物０．２３５ｇを白色固体として得て、これをＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２から再結晶化させて２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン１２０ｍｇ（収率４７％）、ｍｐ１７０〜１７２℃（ｌｉｔ．１７０〜１７０．５℃、米国特許第３，２８８，８２３号（１９６６））とした。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）およびＩＲ（ＫＢｒ）は透明であり、予期したとおりであった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＤＯ−ｄ６）：ｓ，４．９０（４Ｈ）；ｑ，７．８０（４Ｈ）；ｓ，８．０８（２Ｈ）。
【０１２２】
実施例１
スフィンゴモナス株ＡＳＵ１の単離およびキャラクタリゼーション
この実施例は、唯一の炭素源およびエネルギ源としての２，６−ＤＭＮで成長できることに立脚した、株ＡＳＵ１の単離について説明するものである。株ＡＳＵ１はさまざまな基質で成長できることから、この株ＡＳＵ１はＴＯＬ経路または同様の経路を利用して２，６−ＤＭＮを分解していることが明らかになった。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を分析したところ、株ＡＳＵ１がスフィンゴモナスの種に属するα−紅色非硫黄細菌のメンバに関連していることが明らかになった。
【０１２３】
２，６−ＤＭＮで成長する細菌を強化培養から単離した。強化培養については、１２５ｍＬ容のねじ蓋式エルレンマイヤーフラスコでＳ１２培地１０ｍＬに活性汚泥０．１ｍＬを接種して構築した。活性汚泥の方はデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）の廃水処理施設から入手した。２，６−ＤＭＮのフレークを何枚か培養液に直接加え、強化培養に付加用（ａｄｄｉｎｇ）酵母エキスを補充（最終濃度０．００１％）した。強化培養を揺動しながら２８℃でインキュベートした。培養９ｍＬを０．００１％酵母エキスとさらに何枚かの２，６−ＤＭＮフレークを加えた同じ容量のＳ１２培地に交換することで、４から７日ごとに培養を希釈した。２，６−ＤＭＮを唯一の炭素源およびエネルギ源として利用する細菌を、強化培養の試料をＳ１２寒天に展開して単離した。各ペトリ皿の蓋の内側に２，６−ＤＭＮを置いた。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、上下を逆さまにして２８℃でインキュベートした。続いて、代表的な細菌コロニーが２，６−ＤＭＮを唯一の炭素源およびエネルギ源として使う能力を試験した。Ｓ１２寒天プレートからＳ１２寒天プレートにコロニーを移し、各ペトリ皿の蓋の内側で２，６−ＤＭＮを与えた。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、上下を逆さまにして２８℃でインキュベートした。２，６−ＤＭＮを成長に利用した単離物を、他の芳香族化合物を含有するＳ１２寒天プレート上での成長について試験した。
【０１２４】
株ＡＳＵ１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、以下のようにして分析した。ＡＳＵ１をＬＢ寒天（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））で成長させた。０．２２μのフィルタに通しておいた水１００ｍＬにいくつかのコロニーを懸濁させた。細胞懸濁液を−２０℃で３０分凍結させ、室温にて解凍し、１０分かけて９０℃まで加熱した。ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＭＣ  １２Ｖ遠心機での１４，０００ＲＰＭで１分間の遠心分離によって夾雑物を除去した。プライマーＪＣＲ１４（ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ；配列番号３）とＪＣＲ１５（ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ；配列番号４）とを使用し、市販のキットを製造業者の指示（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））どおりに用いて上清の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲについてはパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）９６００で実施した。試料を９４℃で５分間インキュベートした後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３５回繰り返した。増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、市販のキットを製造業者の指示（キューアイエークイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）  ＰＣＲ精製キット、キアゲン・インコーポレイテッド（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））どおりに用いて精製し、自動ＡＢＩシーケンサでシークエンシングした。プライマーＪＣＲ１４（配列番号３）とＪＣＲ１５（配列番号４）とを用いてシークエンシング反応を開始した。各単離物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）で同様の配列をブラスト（ＢＬＡＳＴ）検索（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））する際のクエリ配列として使用した。
【０１２５】
株ＡＳＵ１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をシークエンシングし、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）配列データベースの他の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較した。株ＡＳＵ１（配列番号５）から得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、スフィンゴモナスの種に属するα−紅色非硫黄細菌のいくつかの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との間で有意に高い相同性を示していた。スフィンゴモナス株ＭＢＩＣ３０２０  （ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入（Ａｓｓｅｓｓｉｏｎ）番号ＡＢ０２５２７９．１）から単離した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して最も高い相同性（同一性９９．６％）を示したのはＡＳＵ１配列であった。
【０１２６】
表１に示すデータから、株ＡＳＵ１が２，６−ＤＭＮならびに他のいくつかのメチル化芳香族化合物で成長できることが明らかになった。しかしながら、株ＡＳＵ１はベンゼンを利用することができなかった。
【０１２７】
【表１】
2006500005.tif 000005
【０１２８】
実施例２
スフィンゴモナス株ＡＳＵ１からのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
この実施例は、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１からのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡ）のクローニングについて説明するものである。ＡＳＵ１からのｘｙｌＭ遺伝子およびｘｙｌＡ遺伝子は、プラスミドｐＮＬ１で見出されたキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子（ロミネ（Ｒｏｍｉｎｅ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１５８５〜６０２（１９９９））と相同であった。ＡＳＵ１  ｘｙｌＭ遺伝子およびｘｙｌＡ遺伝子をエシェリキア・コリで発現させた。
【０１２９】
ＡＳＵ１  ＤＮＡを含有する約７００のコスミドクローンの中から２つの陽性クローン（Ｅ２／６およびＧ９／６）を同定し、プライマーｘｙｌＡＦ１（配列番号１）およびｘｙｌＡＲ１（配列番号２）を使用してＰＣＲでスクリーニングした。どちらのクローンにも３５〜４０ｋｂのインサートが含まれていた。ｐＵＣ１８を使用してコスミドＥ２／６からサブクローンのライブラリを構築した。ｐＵＣ１８ユニバーサルプライマーとリバースプライマーとを用いてｐＵＣ１８サブクローンをシークエンシングした。シークエンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）３．０を使ってこれらの配列をアセンブルした。コンティグのうちの１つは長さが１２，５９１ｂｐであった。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）のデータベースに収録された配列に対する類似性をブラスト（ＢＬＡＳＴ）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴも参照のこと）検索し、上記の配列（コンティグ１２．５；配列番号６）を分析した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供しているＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで、コンティグ１２．５（配列番号６）をジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）のヌクレオチドデータベースに収録された公共利用可能なすべてのＤＮＡ配列と比較した。コンティグ１２．５（配列番号６）の大きな部分がプラスミドｐＮＬ１（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＦ０７９３１７；表２）との相同性を持っていることが見出された。ＮＣＢＩが提供しているＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ・ダブリュ（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステーツ・ディ・ジェー（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２（１９９３））でＯＲＦについてコンティグ１２．５（配列番号６）を分析し、これを利用して６つの読み枠すべてに含まれるコンティグ１２．５（配列番号６）を翻訳し、翻訳産物をジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）の「ｎｒ」データベースに収録された公共利用可能なすべてのタンパク質配列と比較して、コンティグ１２．５（配列番号６）のＯＲＦを検出した。コンティグ１２．５（配列番号６）の領域２には、プラスミドｐＮＬ１のｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＭ遺伝子と相同な２つのＯＲＦが含まれていた。タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴＸ分析に基づく配列比較を表３にあげておく。
【０１３０】
ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡを含有するＡＳＵ１  ＤＮＡの断片を小さなマルチコピープラスミドにクローニングした。プライマーＡＳＵ１ＭＡＦ１（ＴＡＡＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＧＡＣＴＧＣＧ；配列番号７）およびＡＳＵ１ＭＡＲ１（ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＴＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧ；配列番号８）を使用し、市販のキットを製造業者の指示（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））どおりに用いて２．３ｋｂの断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲについては、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）９６００でスフィンゴモナス株ＡＳＵ１から得られたＤＮＡを使用して実施した。試料を９４℃で１分間インキュベートした後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルを４０回繰り返した。最終サイクルの後、試料を７２℃でさらに１０分間インキュベートした。市販のキットを製造業者の指示（キューアイエークイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット、キアゲン・インコーポレイテッド（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））どおりに用いて、増幅されたＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＭにライゲートし、ＴＯＰＯＴＭＴＡクローニング（登録商標）キットを製造業者の指示（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））どおりに用いてエシェリキア・コリＴＯＰ１０に形質転換した。形質転換細胞を３７℃で２４時間かけてアンピシリン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天に展開した。次に、いくつかのコロニーが青くなるまでプレートを室温（約２５℃）にてさらに１から２日間インキュベートした。
【０１３１】
青色コロニーが形成されるのは、インドールがモノオキシゲナーゼによってインディゴに変換されるためである（ケイル（Ｋｅｉｌ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７６４〜７７０（１９８７）、オッコノー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４２８７〜４２９１（１９９７））。インディゴが形成されることから、クローンにＡＳＵ１  ｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子とが含まれ、クローニングした遺伝子から機能的キシレンモノオキシゲナーゼが発現されていたことが明らかになった。
【０１３２】
【表２】
2006500005.tif 000006
【０１３３】
【表３】
2006500005.tif 000007
【０１３４】
実施例３
シュードモナス・プチダからのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
この実施例は、シュードモナス・プチダからのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニングについて説明するものである。
【０１３５】
ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡを含むｐＷＷＯ  ＤＮＡの断片を小さなマルチコピープラスミドにクローニングした。プライマーＷＷＯＦ１（ＴＡＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＡＣ；配列番号１３）およびＷＷＯＲ２（ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＧＡＡＣＣＡＣ；配列番号１４）を使用して、市販のキットを製造業者の指示（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））どおりに用いて２．４ｋｂの断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲについては、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）９６００でシュードモナス・プディタ株ＡＴＣＣ  ３３０１５からのＤＮＡを使用して実施した。試料を９４℃で１分間インキュベートした後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルを４０回繰り返した。最終サイクルの後、試料を７２℃でさらに１０分間インキュベートした。市販のキットを製造業者の指示（キューアイエークイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット、キアゲン・インコーポレイテッド（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））どおりに用いて、増幅されたＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＭにライゲートし、ＴＯＰＯＴＭＴＡクローニング（登録商標）キットを製造業者の指示（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））どおりに用いてエシェリキア・コリＴＯＰ１０に形質転換した。形質転換細胞を３７℃で２４時間かけてアンピシリン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天に展開した。次に、いくつかのコロニーが青くなるまでプレートを室温（約２５℃）にてさらに１から２日間インキュベートした。
【０１３６】
青色コロニーが形成されるのは、インドールがモノオキシゲナーゼによってインディゴに変換されるためである（ケイル（Ｋｅｉｌ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７６４〜７７０（１９８７）、オッコノー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４２８７〜４２９１（１９９７））。インディゴが形成されることから、クローンにｐＷＷＯ  ｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子とが含まれ、クローニングした遺伝子から機能的キシレンモノオキシゲナーゼが発現されていたことが明らかになった。
【０１３７】
実施例４
クローニングされたＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子またはｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子を持つエシェリキア・コリ組換体による２，６−ＤＭＮの酸化
実施例４では、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１からクローニングした（クローン４ａ）、あるいはプラスミドｐＷＷＯからクローニングした（クローン６ｆ）キシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子を持つエシェリキア・コリ組換え体が、２，６−ＤＭＮを酸化して６−メチル−２−ヒドロキシメチルナフタレン（６−Ｍ−２−ＨＭＮ）と６−メチル−２−ナフトエ酸（６−Ｍ−２−ＮＡ）とを形成することを示した。また、クローン６ｆの培養上清で２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン（２，６−ＨＭＮ）を検出し、クローン４ａの培養上清で２，６−ＮＤＣを検出した。これらの結果から、２，６−ＤＭＮがＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼおよびｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼの基質であることが分かる。さらに、これらのモノオキシゲナーゼは、２，６−ＤＭＮの両方のメチル基を酸化させることができる。
【０１３８】
エシェリキア・コリ株ＴＯＰ１０（ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＭ）と、キシレンモノオキシゲナーゼを発現しているエシェリキア・コリのクローン（クローン４ａおよびクローン６Ｆ）を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを加えたＬＢ５０ｍＬの入った５００ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコに接種した。培養を揺動しながら３７℃で２５時間インキュベートした。各培養から遠心分離によって細胞を収集し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ、０．４％グリセロール、０．４％カザミノ酸（ディフコ（ＤＩＦＣＯ））、トリプトファン１００μｇ／ｍＬを加えたＭ９培地に、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での最終光学密度が０．８になるように再懸濁させた。再懸濁させた細胞のアリコート５０ｍＬを、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）ライニングをほどこしたねじ蓋のある、５００ｍＬ容の異なるガラス製エルレンマイヤーフラスコに分注し、各株ごとに一対のマッチ培養を得た。不活性有機キャリア相（１０ｍＬパーフルオロ化合物ＦＣ−７５（ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を各培養に加えた。各対のうち一方の培養のキャリア相に２，６−ＤＭＮを２４ｍｇ補充した。残りの培養を補充なしの対照として用いた。すべての培養を揺動させながら３７℃でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、２０％グリセロール１ｍＬを各培養に加えた。水性相の試料（１．０ｍＬ）を定期的に培養から取出した。これらの試料を遠心処理し、細菌を取り除いた。試料上清を０．２２μｍのアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録商標）ＣＲ  ＰＦＴＥフィルタに通し、２，６−ＤＭＮの代謝物をＨＰＬＣで分析した。塩酸を使用して最終試料（１０から１２ｍＬ）をｐＨ２．０まで酸性化し、同容量のエチルアセテートで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで処理して残留水分を除去し、さらに当業者に馴染みのある標準プロトコールで乾燥するまで水分を蒸発させた。乾燥残基をＢＳＴＦＡ（ビス（トリメチルシリル）トリフルロアセタミドシリル化試薬（スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、ペンシルバニア州ベルフォンテ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）））１ｍＬで標準プロトコールどおりに誘導体化し、ＧＣ／ＭＳで分析した。
【０１３９】
有機キャリア相に２，６−ＤＭＮが存在する場合、インキュベーションの１２０時間後にクローン４ａおよびクローン６ｆの培養中にＨＰＬＣで２，６−ＤＭＮ代謝物２つが検出された。代謝物の保持時間（ＲＴ）を６−Ｍ−２−ＨＭＮ（ＲＴ＝２２．０４１分）および６−Ｍ−２−ＮＡ（ＲＴ＝１４．２６２分）の確証のある保持時間と比較することで、上記の代謝物を推定的に同定した。クローン４ａおよびクローン６ｆによって６−Ｍ−２−ＨＭＮおよび６−Ｍ−２−ＮＡが生成されたことをＧＣ／ＭＳで確認した。どちらの代謝物も質量スペクトルが対応する標準の質量スペクトルと同じであった。２，６−ＤＭＮを含むＴＯＰ１０（ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＭ）の培養には２，６−ＤＭＮ代謝物は検出されなかった（データ示さず）。さらに、ＴＯＰ１０（ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＭ）、２，６−ＤＭＮを欠いたクローン４ａおよびクローン６ｆの培養ではいずれも２，６−ＤＭＮ代謝物が検出されなかった（データ示さず）。
【０１４０】
ＨＰＬＣでもともと検出された２つの代謝物だけでなく、クローン６ｆ（代謝物３）およびクローン４ａ（代謝物４）によってさらに別の代謝物が生成されていることが、インキュベーションの２８８時間後にＧＣ／ＭＳで検出された。クローン６ｆによって生成された代謝物３の質量スペクトルは確証のある２，６−ＨＭＮの質量スペクトルと一致していた。クローン４ａによって生成された代謝物４の質量スペクトルは確証のある２，６−ＮＤＣの質量スペクトルと一致していた。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】２，６−ジメチルナフタレンからの２，６−ナフタレンジカルボン酸の酵素的生成について説明する図である。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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