(57)【要約】腫瘍、例えば前立腺腫瘍、乳房腫瘍、非ホジキンリンパ腫などの治療方法は、抗新脈管形成性シクロ−アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−含有ペンタペプチド（ｃＲＧＤペンタペプチド）の少なくとも１用量を患者に投与する工程；放射免疫治療薬（ＲＩＴ）の抗腫瘍有効量を患者に投与する工程；およびついでｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも１つの追加的用量を患者に投与する工程の連続工程を含む。ｃＲＧＤペンタペプチドは好ましくは、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）であり、ＲＩＴは好ましくは、キレート剤が腫瘍標的分子、例えばモノクローナル抗体に化学結合している放射性核種標識キレート剤−リガンド複合体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における腫瘍の治療方法であって、次の連続工程：
（ａ）抗新脈管形成性シクロ−（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）−含有ペンタペプチド（ｃＲＧＤペンタペプチド）の少なくとも１用量を患者に投与する工程；
（ｂ）放射免疫治療薬（ＲＩＴ）の抗腫瘍有効量を患者に投与する工程；および
（ｃ）ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも１つの追加的用量を患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項２】
ｃＲＧＤペンタペプチドが、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）におけるｃＲＧＤペンタペプチドの用量が、ＲＩＴの投与の約１時間前までに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、ｃＲＧＤペンタペプチドの最初の追加的用量は、ＲＩＴの投与後約２日以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）において、ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも５追加的用量が、連続的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｃＲＧＤペンタペプチドの各追加的用量が、用量間に、約２日未満の間隔で投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＩＴは、キレート剤が腫瘍標的化分子に化学的結合している、放射性核種標識キレート剤−リガンド複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍標的化分子がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、抗腫瘍モノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗腫瘍モノクローナル抗体が、抗−ＭＵＣ−１モノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗腫瘍モノクローナル抗体が、キメラＬ６モノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
抗腫瘍モノクローナル抗体が、Ｍ１７０抗−ＭＵＣ−１モノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
キレート剤が、ポリアザ大環状基またはポリオキサ大環状基である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記キレート基が、
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；
１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；および
１，５，９，１３−テトラアザシクロヘキサデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸
からなる群の一員に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
放射性核種が９０Ｙである、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
キレート剤が、Ｎ−置換１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸であり、Ｎ−置換基が−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−（Ｇｌｙ）３−Ｌ−（ｐ−イソチオシアナト）−Ｐｈｅ−アミドであり、放射性核種が９０Ｙである、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍が乳房腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
患者における腫瘍の治療方法であって、次の連続工程：
（ａ）シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の少なくとも１用量を患者に投与する工程；
（ｂ）放射免疫治療薬（ＲＩＴ）の抗腫瘍有効量を患者に投与する工程；および
（ｃ）シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の少なくとも１つの追加的用量を患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項１９】
工程（ａ）におけるシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）用量が、ＲＩＴの投与の約１時間前までに投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）において、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の最初の追加的用量が、ＲＩＴの投与後約２日以内に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）において、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の少なくとも５追加的用量が、連続的に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の各追加的用量が、各用量間に、約２日未満の間隔で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＩＴは、キレート剤が腫瘍標的化分子に化学的結合している、放射性核種標識キレート剤−リガンド複合体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍標的化分子がモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
モノクローナル抗体が、抗腫瘍モノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗腫瘍モノクローナル抗体が、抗−ＭＵＣ−１モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗腫瘍モノクローナル抗体が、キメラＬ６モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
抗腫瘍モノクローナル抗体が、Ｍ１７０抗−ＭＵＣ−１モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
キレート剤が、ポリアザ大環状基またはポリオキサ大環状基である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記キレート剤が、
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；
１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；および
１，５，９，１３−テトラアザシクロヘキサデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸
からなる群の一員に由来する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
放射性核種が９０Ｙである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
キレート剤が、Ｎ−置換１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸であり、Ｎ−置換基が−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−（Ｇｌｙ）３−Ｌ−（ｐ−イソチオシアナト）−Ｐｈｅ−アミドであり、放射性核種が９０Ｙである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が乳房腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＩＴの少なくとも１つの単位用量が入っている第一容器と、ｃＲＧＤペンタペプチドの全部で少なくとも２つの単位用量が入っている１つ以上の追加的容器とを含むキット。
【請求項３５】
容器が各々、容器の内容物、および医薬品および放射性物質に関する政府の規制によって要求されるその他のあらゆる関連情報を説明するラベルを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
容器内容物の腫瘍の治療への使用に関する印刷された説明書も更に含んでいる、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の治療方法に関する。より詳しくは本発明は、放射免疫療法とインテグリン受容体アンタゴニストとの組合わせを用いた腫瘍の治療に関する。
【０００２】
（関連出願へのクロス・リファレンス）
この出願は、１９９９年９月９日に出願された、同時係属中の米国特許出願第０９／７８７，３７４号の一部継続出願である。
【０００３】
（政府の関心についての説明）
本明細書に記載されている研究の一部分は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの助成金番号第ＰＯ１−ＣＡ−４７８２９号、および米国エネルギー省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）からの助成金番号第ＤＥＦＧ０１−００ＮＥ２２９４４号および第ＤＥＦＧ０３−８４ＥＲ６０２３３号による援助を受けている。米国政府は、この発明に一定の権利を保持しうる。
【背景技術】
【０００４】
新規かつ相乗的な治療の組合わせが、転移性乳癌、前立腺癌、ホジキンリンパ腫、およびその他の癌の治療に望ましい。これらの癌の多くは現在、標準的なマルチモダリティー療法では不治である。乳癌におけるｐ５３突然変異およびｂｃｌ−２タンパク質過剰発現の高い発生率は、化学療法および放射線治療法への耐性を増す。全身性腫瘍標的化放射免疫療法（ＲＩＴ）は、組織を特異的に標的し、かつ広範囲に広がった転移性病巣へ癌特異的細胞傷害性抗体を送達する可能性を有する。しかしながらヒト乳癌異種移植片モデルにおける研究は、単一作用物質としてのＲＩＴが、一般的には腫瘍を治癒させないことを証明している。放射線標識された抗体の腫瘍浸透は、均一でないことがあり、腫瘍のすべての部位において治癒を与えるには十分でないことがある。ＲＩＴとほかの治療モダリティーとの組合わせが現在利用されているが、追加の化学療法または外部放射線治療法は、骨髄毒性のリスクを増す。これは、ＲＩＴにおける主な用量限定的要因である。
【０００５】
抗新脈管形成剤が、腫瘍の治療として提案されてきた。これらの薬剤は、遺伝子的に正常な内皮細胞を標的化する。これらは、正常組織における非常に低い内皮ターンオーバー速度と比較して、腫瘍新脈管形成の間はるかに高い速度で増殖する。抗新脈管形成剤は、ほかの化学療法薬とともに、及び外部放射線治療法と組合わせて用いられた時、治療効果を高めることが証明されている。ＲＧＤアミノ酸配列を介していくつかのリガンドを結合するαｖβ３インテグリン受容体は、正常な脈管構造中に発現されるが、成長しつつある腫瘍脈管構造上で高度に発現し、これを抗新脈管形成剤に関する潜在的な標的にする。αｖβ３インテグリンの高い発現および活性化も、より転移性で侵襲的な乳房腫瘍と相関関係があるとされてきた。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）および環状ＲＧＤペンタペプチドによるαｖβ３活性の阻害は、内皮アポトーシスを誘発し、新脈管形成を阻害し、内皮単層浸透性を増すことが証明された。αｖβ３活性の阻害は、乳癌異種移植片および黒色腫異種移植片における腫瘍成長の減少と関連付けられた。環状ＲＧＤペンタペプチドと抗体ＩＬ−２融合タンパク質との相乗作用は結果として、黒色腫、結腸癌、および神経芽細胞腫のネズミモデルにおける治療効果の増加を生じた。選択的腫瘍取り込みは、放射線標識された環状ＲＧＤペンタペプチドを用いて証明された。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、腫瘍、例えば前立腺腫瘍、乳房腫瘍、リンパ腫などを有する患者の治療方法を提供する。この方法は、組合わされたモダリティーの放射免疫療法（ＣＭＲＩＴ）治療方式であって、抗新脈管形成性シクロ−（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）−含有ペンタペプチド（ｃＲＧＤペンタペプチド）および放射免疫治療薬（ＲＩＴ）を患者に投与することを含む治療方式である。この方法は、ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも１用量を患者に投与する第一工程を含む連続治療方式を含む。この最初のｃＲＧＤペンタペプチド治療の後、患者は、ＲＩＴの抗腫瘍有効量が投与される。ＲＩＴ治療後、患者は、ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも１つの追加的量が投与される。
【０００７】
各ｃＲＧＤペンタペプチド用量の量およびタイミングは好ましくは、患者への最大許容用量、すなわち患者へのｃＲＧＤペンタペプチドの毒性が治療的に許容しうる最大レベルであるか、その近くになるように選択される。
【０００８】
本発明のＣＭＲＩＴ方法は、同じ投薬量レベルにおいて、単独のＲＩＴ、または単独のｃＲＧＤペンタペプチドでの治療と比較して有意に大きい抗腫瘍効果を与える。ＣＭＲＩＴ方法はまた、同じ投薬量レベルにおいて、単独のＲＩＴ、または単独のｃＲＧＤペンタペプチドでの治療と比較して、腫瘍細胞および腫瘍内皮細胞のより大きいアポトーシスを与える。
【０００９】
１つの側面において、本発明はまた、ＲＩＴの少なくとも１つの単位用量が入っている第一容器と、ｃＲＧＤペンタペプチドの全部で少なくとも２つの単位用量が入っている１つ以上の追加容器とを含むキットも提供する。これらの容器は各々、容器の内容物、場合により投与順序、および医薬品および放射性物質に関する政府の規制によって要求されるその他のあらゆる関連情報を説明しているラベルを含んでいる。このキットはまた、本明細書に記載されている方法による腫瘍の治療に関する、容器内容物の使用についての印刷された説明書を含んでいることもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、多くの異なる形態の実施態様が可能である。具体的な実施態様が図面に示され、明細書および特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の開示は、本発明の原理の例示であり、本明細書に例証されている具体的な実施態様に限定されるわけではない。
【００１１】
患者における腫瘍の治療のための組合わせモダリティー放射免疫療法（ＣＭＲＩＴ）方法は、
（ａ）抗新脈管形成性シクロ−（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）−含有ペンタペプチド（ｃＲＧＤペンタペプチド）の少なくとも１用量を患者に投与する工程；
（ｂ）放射免疫治療薬（ＲＩＴ）の抗腫瘍有効量を患者に投与する工程；および
（ｃ）ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも１つの追加的用量を患者に投与する工程
の連続工程を含む。
各ｃＲＧＤペンタペプチド用量の量およびタイミングは好ましくは、患者への最大許容用量、すなわち患者へのｃＲＧＤペンタペプチドの毒性が治療的に許容しうる最大レベルであるか、その近くになるように選択される。最大許容用量は、製薬業で周知の方法によって容易に決定することができる。例えばｃＲＧＤペンタペプチドの毒性は、臨床研究から得ることができる。各投薬量の量は好ましくは、約０．０５ｍｇから約５００ｍｇ、より好ましくは約０．１から約１００ｍｇ、最も好ましくは約０．２から約２０ｍｇの範囲にある。毎日の総（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）投薬量は好ましくは、約０．００１から約２ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．００２から約１ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．００２から約０．２ｍｇ／ｋｇの範囲にある。しかしながら各々の対象とする患者の具体的な用量は、多くの因子、例えば用いられる具体的なｃＲＧＤペンタペプチド化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性、食餌療法、投与時間および経路、および排泄率、薬剤の組合わせ、およびこの療法が適用される同定の障害の重症度に依存する。非経口投与が好ましく、最も好ましくは腹腔内（ｉ．ｐ．）投与である。しかしながら経口、座薬、または局所投与も意図される。追加のｃＲＧＤペンタペプチド用量は、所望であればＲＩＴの投与後数ヶ月まで続行することができる。
【００１２】
ｃＲＧＤペンタペプチドは、医薬適合性の賦形剤およびキャリヤ、例えば当分野において公知の緩衝剤などとともに配合することができる。適切な賦形剤物質は、経腸（例えば経口または直腸）、非経口（例えば静脈内注射）、または局部（例えば局所、皮膚、眼、または鼻）投与、または吸入スプレーの形態における投与に適し、かつ新規化合物と反応しない有機または無機物質であり、その例は、水または水性等張食塩水、低級アルコール、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、およびほかの脂肪酸グリセリド、ゼラチン、大豆レシチン、炭水化物、例えばラクトースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、セルロース、および石油ゼリーである。
【００１３】
経口使用のためには、プレーン錠剤、被覆錠剤、カプセル、シロップ、ジュース、またはドロップが特に有用である。腸溶コーティングまたはカプセルシェルを有する被覆錠剤およびカプセルが特に有利である。座薬は直腸投与のために用いられ、溶液は非経口投与のため、好ましくは油性溶液または水溶液、同様に懸濁液、エマルジョン、またはインプラントが用いられる。
【００１４】
局所使用に適した形態の例は、目薬の形態で用いることができる溶液、および同様に例えば懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、または圧迫包帯である。吸入スプレーの形態での投与のためには、噴射ガスまたは噴射ガス混合物（例えば二酸化炭素またはフルオロクロロ炭化水素置換物）中に溶解または縣濁された活性成分を含むスプレーを用いることができる。この場合、活性成分は便宜的に微粉形態で用いられ、１つ以上の追加の生理学的適合性溶媒、例えばエタノールの存在も可能である。吸入溶液は、慣例的な吸入器を用いて投与することができる。ｃＲＧＤペンタペプチドはまた、凍結乾燥することもでき、その結果生じた凍結乾燥物は、例えば注射可能な製剤の製造のために用いることができる。これらの注射は、ボーラスとして、または連続注入（例えば静脈内、筋肉内、皮下、または鞘内）の形態で与えることができる。記載された製剤は、滅菌することができ、および／または助剤、例えば保存料、安定剤、および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝物質、着色料、および／または香味料を含んでいてもよい。所望であれば、ｃＲＧＤペンタペプチドはまた、１つ以上のほかの活性成分を含んでいてもよく、これには例えば１つ以上のビタミンなどが含まれる。
【００１５】
このｃＲＧＤペンタペプチドは、それ自体で、または生理的に許容しうるその塩の１つ以上として用いることができる。ｃＲＧＤペンタペプチドは内部塩へ、または酸を用いて会合酸付加塩に転換することができる。この反応に適した酸は特に、生理的に許容しうる塩を生じる酸である。したがって無機酸を用いることができる。これの例は、硫酸、硝酸、ハロ水素酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、例えば塩酸または臭化水素酸、リン酸、例えばオルトリン酸、スルファミン酸、およびまた有機酸、特に脂肪族、脂環式、アル脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族またはヘテロ環式一塩基性または多塩基性カルボン酸、スルホン酸、または硫酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、サリチル酸、２−または３−フェニルプロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタン−またはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレン−モノ−および−ジスルホン酸、ラウリル硫酸である。
【００１６】
あるいはまた、ｃＲＧＤペンタペプチドの酸形態は、塩基との反応によって、その生理的に許容しうる金属またはアンモニウム塩の１つに転換することができる。この状況において特に適切な塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、およびアンモニウム塩、およびまた置換アンモニウム塩、例えばジメチル−、ジエチル−、またはジイソプロピルアンモニウム塩、モノエタノール−、ジエタノール−、またはトリエタノールアンモニウム塩、シクロヘキシルアンモニウム塩、ジシクロヘキシルアンモニウム塩、ジベンジルエチレンジアンモニウム塩、およびまた例えばＮ−メチル−Ｄ−グルカミンまたはアルギニンまたはリシンとの塩である。
【００１７】
好ましくはこのｃＲＧＤペンタペプチドは、次のものである：
シクロ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（ＥＭＤ６６２０３）、
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（ＥＭＤ１２１９７４、ドイツ国ダルムシュタットのメルク社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手しうるシレンギチド（Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ））、または
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−１−アミノシクロヘキサンカルボン酸）（ＥＭＤ２７０１７９）であり、これの調製法は、Ｊｏｎｃｚｙｋらの米国特許第５，８６６，５４０号および第６，００１，９６１号に記載されている。これに関連した開示は、参考として本明細書に援用されている。最も好ましくはこのｃＲＧＤペンタペプチドは、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）である。
【００１８】
好ましくはｃＲＧＤペンタペプチドの最初の投薬量は、ＲＩＴの投与の約１時間前までに患者に投与される。好ましくはｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも１つの追加的用量は、ＲＩＴの投与の約２日以内に投与される。好ましい実施態様において、ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも約２つの追加的用量は、ＲＩＴ用量後に患者に投与され、より好ましくはｃＲＧＤペンタペプチドの約３つの追加的用量、最も好ましくは少なくとも約４つの追加的用量が投与される。特に好ましい実施態様において、ｃＲＧＤペンタペプチドの少なくとも約５つの追加的用量が、ＲＩＴ用量後に連続的に投与される。好ましくはｃＲＧＤペンタペプチドの各追加的用量は、用量間に、約２日未満の間隔で投与される。ＲＩＴの追加的用量の投与は、所望であれば１週間あたり約２用量の割合で数ヶ月間続行することができる。
【００１９】
ＲＩＴ投薬量は好ましくは、特定のＲＩＴ剤の放射能レベルに基づく。用いられるＲＩＴの量は好ましくは、９０Ｙを放射線源として用いる時に、１用量あたり約２０ｍＣｉから約２００ｍＣｉの範囲内の放射能投薬量を与える。しかしながら各々の対象とする患者に対する具体的な用量は、多くの因子、例えば用いられる特定のＲＩＴ化合物の放射能、用いられる同定の放射性核種、年齢、体重、一般的な健康状態、性、食餌療法、投与時間および経路、排泄率、薬剤の組合わせ、およびこの療法が適用されている特定の腫瘍のサイズおよび重症度による。例えば転移性前立腺癌または乳癌の治療において、キレート化９０Ｙと複合体化された抗−ＭＵＣ−１（Ｍ１７０）モノクローナル抗体は一般的に、腫瘍のサイズおよび上記のほかの因子に応じて、約２０ｍＣｉから約２００ｍＣｉの範囲内の総投薬量を送達するために、約５ｍＣｉ／ｍｇの抗体の比活性において投与される。ＲＩＴの非経口投与が好ましく、より好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）投与である。
【００２０】
腫瘍の治療のための放射免疫治療薬は、当分野で周知である。適切なＲＩＴ剤は、治療的に有用な放射性核種が付着されたあらゆる標的放射性核種療法を包含し、これらは、腫瘍または腫瘍脈管構造によって付着可能であるか、または捕獲可能である。このような有用なＲＩＴ剤は、腫瘍標的化または腫瘍脈管構造標的化リガンドまたは分子を含んでいる。放射性核種は、標的分子またはリガンドに直接付着されてもよく、またはキレート剤によってリガンドに付着されるか、これと会合されてもよい。あるいはまたリガンドは、キレート化または放射性核種捕獲基を含んでいてもよく、患者の腫瘍または腫瘍脈管構造に結合させるために、患者にコールド投与されてもよい。放射性核種のその後の投与の時、結合されたリガンドは、腫瘍部位において放射性核種を捕獲しうる（前標的化放射性核種療法）。標的分子またはリガンドには、抗体、抗体断片、抗体断片の組換え的組合わせ、ペプチド、または腫瘍または腫瘍脈管構造への選択的親和性を有するその他のあらゆるリガンドが含まれる。
【００２１】
好ましくはＲＩＴは、キレート剤が腫瘍標的化分子に化学的に結合されている、放射性核種で標識されたキレート剤−リガンド複合体である。好ましい腫瘍標的分子には、抗体、例えばモノクローナル抗体、または抗体断片が含まれる。より好ましくは腫瘍標的分子は、抗腫瘍抗体である。あらゆる抗腫瘍抗体を用いることができる。好ましくは、抗腫瘍抗体は、腫瘍脈管構造を標的化する。あるいはまた抗体は、腫瘍抗原、例えばｐ１８５ＨＥＲ２、ミルクムチン核タンパク質、ＴＡＧ−７２、ルイスａ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、９．２．２７抗体によって認識された高Ｍｒ黒色腫抗原、またはＯＶ−ＴＬ３またはＭＯＶ１８によって認識された卵巣関連抗原を標的化しうる。好ましい抗腫瘍抗体は、抗−ＭＵＣ−１モノクローナル抗体、例えばカナダ国エドモントンのバイオミラ社（Ｂｉｏｍｉｒａ  Ｉｎｃ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）から入手しうるＭ１７０ｍＡｂ、キメラＬ６−抗腫瘍モノクローナル抗体（ＣｈＬ６  ＭＡｂ）などである。
【００２２】
癌放射線治療方法に用いるのに適したあらゆる放射性核種を、本発明のＣＭＲＩＴ方法に用いることができる。適切な放射性核種には、非限定的に１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１９６Ｒｅ、および９０Ｙが含まれる。好ましくはこの放射性核種は、９０Ｙである。
【００２３】
適切なＲＩＴ剤およびこれらの調製法は、Ｍｅａｒｅｓらの米国特許第５，９５８，３７４号に記載されている。これに関連した開示は、参考として本明細書に援用されている。
【００２４】
好ましくはこのキレート剤は、ポリアザ大環状基またはポリオキサ大環状基である。より好ましくはこのキレート基は、次のものに由来する：
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；
１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸；または
１，５，９，１３−テトラアザシクロヘキサデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸。
【００２５】
より好ましくは、放射性核種標識キレート剤−リガンド複合体は、ＣｈＬ６ｍＡｂまたはＭ１７０ｍＡｂに化学的結合される。最も好ましくはＲＩＴは、９０Ｙ−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸−ペプチド−ＣｈＬ６（以後９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）、またはこれの抗−ＭＵＣ−１ｍＡｂ類似体である。
【００２６】
放射性核種は好ましくは９０Ｙである。１１１Ｉｎは、腫瘍を画像化するためにＲＩＴ中に含めることができる。好ましくは放射性核種標識キレート剤−リガンド複合体は、ＣｈＬ６  ＭＡｂまたはＭ１７０ｍＡｂに化学的結合される。
【００２７】
好ましい実施態様においてキレート剤は、Ｎ−置換１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸であり、この場合、Ｎ−置換基は、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−（Ｇｌｙ）３−Ｌ−（ｐ−イソチオシアナト）−Ｐｈｅ−アミド（以後ＤＯＴＡ−ペプチド）であり、放射性核種は９０Ｙである。
【００２８】
ＲＩＴは、ｃＲＧＤペンタペプチドの配合に関して上に記載されている、液体注射可能な配合物に適した、多様な医薬適合性の賦形剤とともに配合することができる。
【００２９】
本発明のＣＭＲＩＴ方法は、多様な癌を治療するために用いることができる。例えば本発明のＣＭＲＩＴ方法は、固形腫瘍を呈する癌、例えば乳癌、結腸癌、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌などを治療するために用いることができる。ＣＭＲＩＴ方法はまた、非固形腫瘍癌、例えば非ホジキンリンパ腫などを治療するためにも用いることができる。本発明のＣＭＲＩＴ方法は、好ましくは乳癌の治療法として用いられる。
【００３０】
本発明のＣＭＲＩＴ方法は、同じ投薬量レベルにおいて、単独のＲＩＴおよび単独のｃＲＧＤペンタペプチドでの治療の総合計（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｔｏｔａｌ）抗腫瘍効果に比べて、有意に大きい抗腫瘍効果を与える（すなわち相乗効果が見られる）。ＣＭＲＩＴ方法はまた、同じ投薬量レベルにおいて、単独のＲＩＴおよび単独のｃＲＧＤペンタペプチドでの治療に比べて、腫瘍細胞および腫瘍内皮細胞のより大きいアポトーシスも与える。
【００３１】
本発明はもう１つの側面において、ＲＩＴの少なくとも１つの単位用量が入っている第一容器と、ｃＲＧＤペンタペプチドの全部で少なくとも２つの単位用量が入っている１つ以上の追加的容器とを含むキットを提供する。これらの容器は各々、容器の内容物、場合により投与順序、および医薬品および放射性物質に関する政府の規制によって必要とされるあらゆるその他の関連情報を説明するラベルを含んでいる。このキットはまた、本明細書に記載されている方法による腫瘍の治療に関する、容器内容物の投与についての印刷された説明書を含んでいることもある。
【００３２】
これらの容器は、バイアル、アンプル、ボトルなどであってもよい。各容器には好ましくは単一単位用量が入っている。しかしながら多用量容器も用いることができる。これらの指示材料は好ましくはまた、安全および有効性情報も含んでいる。
【００３３】
次の非限定例は、本発明をさらに例証するために示される。
【００３４】
試薬
キャリヤを含まないイットリウム−９０（９０Ｙ）（ワシントン州リッチランドのパシフィック・ノースウエスト・ナショナル・ラボラトリー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｉｃｈｌａｎｄ，ＷＡ）またはマサチューセッツ州ボストンのニューイングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を、０．０５Ｍ  ＨＣｌ中の塩化物塩として購入した。キメラＬ６（ＣｈＬ６）、すなわちヒト−マウス抗体キメラ（ワシントン州シアトルのブリストル−マイヤーズ・スクイブ・ファーマシューティカル・リサーチ・インスティテュート（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ））が、ヒトの乳房、結腸、卵巣、および肺癌上に高度に発現された内在性（ｉｎｔｅｇｒａｌ）膜糖たんぱく質と反応する。シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（ＥＭＤ１２１９７４）は、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンに対して選択的なアンタゴニストであり、ＩＣ５０値は、単離されたαｖβ３インテグリンの場合は低いナノモル範囲内にあり、αｖβ３発現Ｍ２１黒色腫細胞の場合は低いマイクロモル範囲内にある。ペプチド合成および特徴決定を、Ｄｅｃｈａｎｔｓｒｅｉｔｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３０３３−４０（１９９９）によって既に記載されているように実施した。この文献に関連した開示は、参考として本明細書に援用されている。
【００３５】
細胞系統
ＨＢＴ３４７７、すなわちヒト乳房腺癌細胞系統は、ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・ファーマシューティカル・リサーチ・インスティテュート（ワシントン州シアトル）から入手した。ＨＢＴ３４７７細胞の７０％超が、Ｌ６で強力に染色される。ＨＢＴ３４７７細胞において、ｂｃｌ−２が発現され、ｐ５３は、エキソン１０にナンセンス突然変異を有する突然変異体であり、その結果として、ｐ５３タンパク質の部位における欠失を生じる。これは、テトラマー化、および二本鎖ＤＮＡ切断の検出において機能する。ＨＢＴ３４７７細胞は、機能的αｖβ５インテグリンを発現するが、αｖβ３インテグリンは発現しない。その理由は、ビトロネクチンへの付着は、αｖβ５特異的Ｐ１Ｆ６抗体によってブロックされるが、αｖβ３特異的ＬＭ６０９抗体によってブロックされないからである。シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）は、約５μＭのＩＣ５０で、ビトロネクチンへのＨＢＴ３４７７細胞の付着をブロックする。
【００３６】
９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６
ＣｈＬ６を、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）に複合体化し、ＤｅＮａｒｄｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３６：８２９−８３６によって記載されているように、８０パーセントまたはそれ以上の効率で９０Ｙで放射標識し、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６を調製した。９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６を、分子篩高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、セルロースアセテート電気泳動法（ＣＡＥ）、およびＨＢＴ３４７７細胞結合放射免疫反応性アッセイ（ＲＩＡ）によって、構造および機能的一体性について調べた。ＨＰＬＣおよびＣＡＥは、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６の９０％超が、ＣＡＥによって測定された場合、４％未満の高分子量種を有するモノマー形態にあることを示した。生きた細胞への免疫反応性結合は、９２％超の反応性を示した。すなわち、２００、２３０、または２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６の単一用量としての投与である。
【００３７】
マウス
メスの無胸腺Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（生後７から１０週；メリーランド州フレデリックのハーラン・スプラグ・ドーリー社（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ））を、カリフォルニア大学動物取り扱いガイドラインにしたがって維持管理した。対数期において採取されたＨＢＴ３４７７細胞（３．０×１０６）を、（特に言及されている場合を除いて）療法研究のために腹部の片側に、免疫病理研究のために両側に皮下注射した。ＲＩＴの注射は、尾静脈からであり、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）は、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって送達された。「０日目」は、ＲＩＴ注射の時、またはｃＲＧＤペンタペプチドのみのグループの場合は、最初のｃＲＧＤペンタペプチド注射として表わされた。免疫病理研究のためには、腫瘍負担が許容限界を超えた時、指示された時点で、または療法研究のためには８４日目に、マウスを頚部脱臼によって犠牲にした。
【００３８】
対照（非ＲＩＴ）処理グループ
グループは、処理を受けないマウス（２４匹のマウス、それぞれ２個の腫瘍を有する１４匹のマウス、および１個の腫瘍を有する１０匹のマウス）；非標識ＣｈＬ６抗体（３１５μｇ）（各々２個の腫瘍を有する８匹のマウス）；および０、２、４、６、８、および１０日目に２５０μｇの６用量として投与されたシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（各々１個の腫瘍を有する１８匹のマウス）からなっていた。
【００３９】
高用量ＲＩＴ処理グループ
グループは、ＲＩＴを単一作用物質（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６、（３９匹のマウス、各々２個の腫瘍を有する１５匹、および１個の腫瘍を有する２４匹））として受けているマウス；および２５０μｇの６用量としてのシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）と組合わされたＲＩＴ（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）であって、０日目にＲＩＴの１時間前に開始し、ついで２、４、６、８、および１０日目にさらに５用量を受けているマウス（４２匹、すべて各々１個の腫瘍を有する）からなっていた。
【００４０】
低用量ＲＩＴ処理グループ
グループは、ＲＩＴを単一作用物質（２００から２３０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６、（２８匹のマウス、２３０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６を受けた、以前の研究からの各々２個の腫瘍を有する９匹、および各々２００μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６で処理された、１個の腫瘍を有する１９匹のマウス））として受けているマウス；およびシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の６用量（各々２５０μｇ）と組合わされたＲＩＴ（２００μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）を受けているグループからなっていた。これらの用量は、０日目にＲＩＴの１時間前に与えられ、ついで２、４、６、８、および１０日目にさらに５用量が与えられた（３０匹のマウス、すべて各々１個の腫瘍を有する）。
【００４１】
殺腫瘍効果
腫瘍を、１週間あたり３回、３つの直交直径においてキャリパで測定した。腫瘍体積を、半楕円体についての式を用いて計算した（ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、３：７１−７９（１９９７））。当初腫瘍体積は、処理前の日の体積として規定した。完全に退行した腫瘍は、ゼロ体積を有すると考えられた。腫瘍応答を、次のように分類した。治癒（Ｃ）、腫瘍は消滅し、調査の終了（８４日）まで再成長しなかった；完全退行（ＣＲ）、腫瘍は少なくとも７日間消滅したが、後で再成長した；部分退行（ＰＲ）、腫瘍体積は、少なくとも７日間５０％以上減少したが、その後再成長した；無応答（ＮＲ）、腫瘍体積は、５０％未満しか減少しなかった。異なる応答を有する２個の腫瘍を有するマウスの場合、腫瘍応答は、両方の腫瘍応答にしたがって記載された。毒性によって３０日以前に死んだマウスは、腫瘍応答結果から除外された。
【００４２】
毒性
体重および血球数を、注射後１２週間、または死ぬまで、１週間あたり２から３回測定した。血液サンプルを、２μＬ微小毛管ピペットを用いて尾静脈から収集した。１用量グループ中のマウスからのサンプルをプールし、赤血球（ＲＢＣ）計数のためにリン酸塩−緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．９％食塩水／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６）中に１：２００希釈するか、血小板計数のために１％（ｗ／ｖ）アンモニウムオキサレート中に１：１００希釈するか、または白血球（ＷＢＣ）計数のために３％（ｗ／ｖ）酢酸中に１：２０希釈した。
【００４３】
細胞免疫病理学グループ
ほかの記載がなければ、グループは、各々２個の腫瘍を有する２匹のマウスからなっていた。全部で４個の腫瘍について、各時点で分析した。これらのグループは、次のものからなっていた：処理を受けないマウス（４匹のマウス、７個の腫瘍）；単一用量として与えられた２５０μｇのシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）、ついでペプチド注射の２時間、６時間、および１から５日後に犠牲にされた；ＲＩＴのみ（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）、ついで２時間目、６時間目、および１から６日目に犠牲にされた（３匹のマウス、５日目に５個の腫瘍）；およびＲＩＴの１時間前に与えられ、１０日間を通して一日おきに反復された、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（２５０μｇ）と組合わされたＲＩＴ（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）、ついでＲＩＴ後の２時間目、６時間目、および１から６日目に犠牲にされたマウス。腫瘍を除去し、半分に切断し、最適切断温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）媒質中で凍結し、切片化（ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）まで約−７０℃で保存した（１０−μｍ切片）。すべての時点を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ、Ｃａｖｒｉｅｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，１１９：４９３−５０１（１９９２））分析によって、アポトーシスについて評価し、選択された時点（未処理、１、５、および６日）を、増殖率（Ｋｉ６７）における差および微小血管密度（ＣＤ３１）について評価した。
【００４４】
総アポトーシスおよび内皮アポトーシスのＴＵＮＥＬ分析
腫瘍を、フィッシャー・スーパープラス（ｓｕｐｅｒｐｌｕｓ）スライド（ペンシルベニア州ピッツバーグのフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））上で、１０−μｍ切片に切断し、１時間空気乾燥し、１％パラホルムアルデヒド中の約１０分間の固定に続いて、製造業者の指示にしたがって、アポップタグ・レッド・キット（ＡｐｏｐＴａｇ  Ｒｅｄ  ｋｉｔ）（ニューヨーク州パーチェスのインタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）の、標識として用いられたローダミン）でのＴＵＮＥＬ分析まで、約−７０℃で凍結した。ＴＵＮＥＬ後、これらのスライドを濯ぎ洗いし、内皮細胞を同定するために、１：１００希釈におけるＣＤ３１に対するラット抗マウスＭＡｂ（カリフォルニア州サンディエゴのファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で、４℃において一晩インキュベートした。スライドを濯ぎ洗いし、ＦＩＴＣに連結された抗ラット抗体（１：５０希釈）（ファーミンゲン）で１時間インキュベートした。スライドを濯ぎ洗いし、バックグラウンド核染色のために４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、０．２μｇ／ｍｌ）中に短時間浸漬し、再び濯ぎ洗いし、標本にし（ｍｏｕｎｔ）、ついで定量まで約４℃で暗室に保存した。
【００４５】
総アポトーシスおよび内皮アポトーシスの定量
多重波長の同時観察を可能にするための、ＵＶ、ＦＩＴＣ、およびローダミンについての励起フィルター、および二重／三重帯域通過フィルターを有するクロマ・ピンクル・フィルターセット（バーモント州ブラットルボロのクロマ（Ｃｈｒｏｍａ，Ｂｒａｔｔｌｅｏｒｏ，ＶＴ））を備えたオリンパス顕微鏡を用いて、各切片の非壊死部位における６つの無作為に選択された×６００視野（ｆｉｅｌｄ）（１５０，０００μｍ２／視野）を定量した。視野は、ＤＡＰＩ標識を用いて、見える面積全体をカバーするように選択した。これは一般的に、約３００から３５０細胞を含んでいた。総アポトーシスは、各腫瘍について１視野あたりの陽性（プラス）核の平均数によって決定されたが、一方で、内皮アポトーシスは、ＦＩＴＣ（ＣＤ３１）およびローダミン（ＴＵＮＥＬ）の両方によって標識された細胞を計数するために、二重帯域通過フィルターで同じ視野を用いて決定された。視野は、腫瘍切片の非壊死性のように見える区域から選択されたが、その理由は、ＨＢＴ３４７７異種移植片が典型的には、ヌードマウスにおいて急速に成長し、６日でこれらの体積を二倍にし、その結果として未処理腫瘍の中央壊死が生じるからである。ＴＵＮＥＬは、あまり強力にではないが壊死細胞を標識しうるので、この戦略が、完全無作為プロセスに対して選択された。
【００４６】
増殖および微小血管密度分析
未処理マウス、およびｃＲＧＤペンタペプチド、ＲＩＴ、およびＣＭＲＩＴ方法で処理され、処理後１、５、および６日目に犠牲にされたマウスからの腫瘍の１０−μｍ切片を、氷冷アセトン中に１０分間固定し、ＰＢＳ中に濯ぎ洗いし、０．６％Ｈ２Ｏ２とともにメタノール中に短時間インキュベートした（５分）。ＰＢＳ中の濯ぎ洗い後、切片を、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清および１％ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックした。マウス抗−Ｋｉ６７ＭＡｂ（ファーミンゲン、クローンＢ５６）を、ブロック溶液（６．２５μｇ／ｍｌ）中に加え（ａｐｐｌｙ）、これらのスライドを、室温で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳ中で濯ぎ洗いをした。ヤギ抗マウスローダミン標識されるか、またはヤギ抗マウスＣｙ−３−標識された抗体を加え（ペンシルベニア州ウエスト・グローブのジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、１：１００）、これらのスライドを、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中の濯ぎ洗い後、これらの切片を、ラット抗マウスＣＤ３１抗体（ファーミンゲン、１：１００）とともに室温で１時間インキュベートし、ついでＰＢＳ中で濯ぎ洗いをし、その後１時間、ヤギ抗ラットＦＩＴＣ−標識された抗体（ファーミンゲン、１：５０）とともにインキュベートした。ＰＢＳ中の濯ぎ洗い後、これらのスライドを、ＤＡＰＩ（０．４μｇ／ｍｌ）で対比染色し、カバースリップ下バイオメダ（Ｂｉｏｍｅｄａ）ゲルマウント（フィッシャー）に取り付けた。Ｋｉ６７の定量を、増殖の評価のためにオリンパス顕微鏡を用いて×１，０００倍率で実施した。１個の腫瘍におけるＫｉ６７−陽性細胞／視野の平均総数を、ＤＡＰＩ染色によって無作為に選択された、１腫瘍あたり６視野からの計数によって決定した。微小血管密度は、×４００倍率で、１無作為視野あたりのＣＤ３１−染色された血管数を計数することによって決定した。隣接クラスターとは別個の、ＣＤ３１に対して陽性（プラス）のあらゆる内皮細胞または細胞クラスターを、１つの微小血管として計数した。１腫瘍切片あたり６つの無作為に選択された視野を用いて、各腫瘍についての平均を確立した。１つの処理グループについての平均微小血管密度は、４つの腫瘍／グループからの値を平均して決定した。
【００４７】
ヌードマウスにおけるＨＢＴ３４７７腫瘍によるβ３およびＣＤ３１発現
腫瘍を半分に切断し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．媒質（インディアナ州エルクハートのティシュー・テック、マイルズ社（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ，Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ））中で凍結し、薄片化まで約−７０℃で保存した。切片（１０−μｍ）を空気乾燥し、染色するまで約−７０℃で凍結した。ついで切片を氷冷アセトン中に１０分間固定し、ＰＢＳ中に濯ぎ洗いし、３０分間ＰＢＳ中１０％ヤギ血清中でブロックした。ハムスター抗マウスＣＤ６１（β３）ＭＡｂ（ファーミンゲン）を、１０μｇ／ｍｌで加え、これらのスライドを室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳ中の濯ぎ洗い後、抗ハムスターローダミン連結抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社）を加え（１：５０）、ついで室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中の濯ぎ洗い後、ラット抗マウスＣＤ３１抗体を加え（１：１００、ファーミンゲン）、これらのスライドを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの濯ぎ洗い後、抗ラットＦＩＴＣ連結抗体（１：５０、ファーミンゲン）を加え、これらのスライドを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中に濯ぎ洗いした。これらのスライドを、ＤＡＰＩ（０．２μｇ／ｍｌ）中に浸漬し、カバースリップ下のバイオメダゲルマウント（フィッシャー）で標本にした。β３とＣＤ３１との同時発現が、多重波長の同時観察を可能にするための、ＵＶ、ＦＩＴＣ、およびローダミンについての励起フィルター、および二重／三重帯域通過フィルターを有するクロマ・ピンクル・フィルターセット（バーモント州ブラットルボロのクロマ）を備えたオリンパス顕微鏡を用いて観察された。
【００４８】
統計分析
ＲＩＴおよびＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスについての死亡率データの統計分析を、スタットエグザクト（ＳｔａｔＥｘａｃｔ）ソフトウエアを用いるフィッシャー・エグザクトテストを利用して、死亡率が異なるかどうかを決定した。療法データの統計分析は、コホラン・マンテル・ヘンスゼル（Ｃｏｃｈｒａｎ  Ｍａｎｔｅｌ  Ｈａｅｎｓｚｅｌ）テストを用いて実施し、ＲＩＴおよびＣＭＲＩＴ方法グループについての結果に対するＲＩＴ用量の効果を評価した。ＲＩＴ対ＣＭＲＩＴ方法グループについてのほかのすべての応答との治癒率の比較を、フィッシャー・エグザクトテストによって実施した。最良の腫瘍応答を、統計目的のために２個腫瘍動物に対して用いた。異なる時点における免疫病理グループ間の統計差を、スタットビュー（ＳＴＡＴｖｉｅｗ）ソフトウエアを適切なものとして用いて、分散分析（ＡＮＯＶＡ）（フィッシャーＰＬＳＤ）によって評価した。ｐ＜０．０５が有意であると考えられた。
【００４９】
殺腫瘍効果
未処理マウス、単独のシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）を受けているマウス、およびＣｈＬ６非標識抗体を受けているマウスにおける大部分の腫瘍は、中断なく成長した。シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（一日おきに与えられた全部で６×２５０μｇ用量）の腫瘍成長に対する見かけ上の効果は観察されず、その結果として、テストされた１８匹のマウスに治癒は生じなかった。２匹の未処理マウスに加えて、非標識ＣｈＬ６抗体を受けている２匹のマウスは、これらの腫瘍の自然の退行が起こり、非−ＲＩＴマウスについて８％（４／５０）治癒率を生じた（表１、図１）。
【００５０】
表１において、カッコ内の数字は、２個の腫瘍を有するマウス（２個腫瘍マウス）からの最良の応答を用いて得られた合計を表わす。例えば２個腫瘍マウスが、治癒した１個の腫瘍と部分退行腫瘍１個とを有するならば、これは、この表の最悪応答分析（カッコなしのエントリー）において部分退行（ＰＲ）としてカウントされるであろうが、最良応答分析（カッコの数字）を用いた場合、治癒（Ｃ）とカウントされる。ＲＩＴを受けているマウスは、２６０μＣｉ（高用量）または２００から２３０μＣｉ（低用量）９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６単独で、またはシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の６用量と組合わせて（ＣＭＲＩＴ方法）処理された。ＲＩＴ後３０日以前に毒性によって死ぬマウスの腫瘍応答は、有効性評価から除外した。単独の高用量ＲＩＴの結果として、２６匹のマウス中４匹の治癒（１５％）を生じたが、一方で、単独の低用量ＲＩＴ結果として、２０匹のマウス中５匹の治癒（２５％）を生じた。低用量ＲＩＴでのＣＭＲＩＴ方法の結果として、２２匹のマウス中８匹の治癒（３６％、ｐ＝０．５１４）を生じたが、一方で、高用量ＲＩＴでのＣＭＲＩＴ方法の結果として、１９匹のマウス中１０匹の治癒（５３％、ｐ＝０．０１１）を生じた。統計分析は、ＲＩＴまたはＣＭＲＩＴ方法に対して調節された、ＲＩＴ用量に基づく治療の結果には差がないことを示した。結果は用量によって変化しなかったので（ｐ＞０．８）、ＲＩＴについての結果を、ＣＭＲＩＴ方法についての結果と比較した。これらの結果は、ＣＭＲＩＴ方法が結果として、ＲＩＴ（２０％治癒率）よりも有意に大きい治癒（４４％治癒率）を生じた（ｐ＝０．０２０）ことを示し、このことは、単独のＲＩＴに勝るＣＭＲＩＴ方法の高い有効性と一致する。
【００５１】
図１は、ＣＭＲＩＴ方法を用いて得られたマウスの乳癌異種移植片における治療の有効性の増加を示している。単一作用物質として、および組合わせ療法（ＣＭＲＩＴ方法）として用いられた９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６およびシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）への腫瘍応答が示されている。結果は、ＲＩＴ（２００から２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）についての組合わせ高用量および低用量結果を示している。グループは、未処理、３１５μｇ非標識ＣｈＬ６で処理されたマウス、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）２５０μｇの６用量で処理されたマウス、単独のＲＩＴで処理されたマウス、およびＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウス（シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）２５０μｇの６用量および１用量ＲＩＴ（２００および２６０μＣｉ））であった。応答は、８４日が終わった時に評価した。処理の有意に増加した有効性は、ＲＩＴ処理されたマウスと比較して、ＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスにおいて観察された（示されているように、２個腫瘍マウスに対して最悪の結果または最良の結果を用いた。後者の場合、ｐ＝０．０２である）。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の毒性
死亡率または毒性の増加は、未処理マウスと比較して、単独のシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（２５０μｇ、１０日間にわたって６用量）によって誘発されなかった（ＲＩＴを受けていないすべてのグループ（未処理、非標識ＣｈＬ６、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ））のうち、毒性によって死んだマウスは無かった）。
【００５４】
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）処理されたマウスおよび未処理マウスは、同様な体重変化、ＲＢＣ、ＷＢＣ、および血小板レベルを示した。高用量または低用量のどちらかのＲＩＴで処理されたマウス、およびＲＩＴとシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）との組合わせで処理されたマウスは、ＲＩＴを受けていないマウスと比較して、減少した体重、ＲＢＣ、ＷＢＣ、および血小板数を示したが、ＲＩＴとシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）との組合わせは、単独のＲＩＴで観察された値以上にはこれらの値を低下させなかった（図２ＡからＤ）。ＲＩＴの高用量において、死亡率は、ＲＩＴ（１３／３９匹のマウス（３３％））およびＣＭＲＩＴ方法（２３／４２匹のマウス（５５％））グループの両方において未処理マウスよりも高かったが、死亡率は、ＣＭＲＩＴ方法によって統計的には増加しなかった（フィッシャーエグザクト、ｐ＝０．０７３６）。同様に死亡率は、未処理マウスよりも低用量ＲＩＴおよびＣＭＲＩＴ方法グループにおいて増加したが、ＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスの死亡率（８／３０（２７％））は、ＲＩＴ以上には増加しなかった（８／２８（２９％））（フィッシャーエグザクト、ｐ＝１．０００）。低用量および高用量死亡率の結果が組合わされる時、ＣＭＲＩＴ方法は結果として、ＲＩＴ以上に増加した死亡率を生じない（フィッシャーエグザクト、ｐ＝０．１６５２）。これらの結果は、単独またはＲＩＴと組合わせて投与されたｃＲＧＤペンタペプチド、例えばシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）が、毒性を有意に増加させないことを示している。
【００５５】
図２は、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）療法も、ＣＭＲＩＴ方法も、毒性を増加しないことを示している。単一試験からの、未処理マウス（５匹）、単独のシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）（２５０μｇの６用量）で処理されたマウス（１３匹）、単独のＲＩＴ（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）で処理されたマウス（５匹）、およびＣＭＲＩＴ方法（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６および２５０μｇシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の６用量）で処理されたマウス（１３匹）のグループについてのＡ：ＲＢＣ、Ｂ：血小板、Ｃ：ＷＢＣ、およびＤ：マウス体重である。示されている結果は、各グループについてプールされた血液サンプル、および示された日における各グループについての平均体重±ｓ．ｅを表わす。単独またはＲＩＴと組合わせたｃＲＧＤペンタペプチドは、毒性を増加させなかった。
【００５６】
腫瘍および内皮細胞（全細胞）におけるアポトーシス
内皮細胞を同定するために、ＣＤ３１染色と組合わせたＴＵＮＥＬ方法によって、アポトーシスを評価した（図３）。１腫瘍あたりのＴＵＮＥＬ陽性腫瘍および内皮細胞の数（全細胞）を、細胞が視野全体の面積をカバーするように選択された非壊死組織の６つの無作為視野（×６００）から平均した。平均は、３５０細胞／視野であった。未処理腫瘍は、９±１．０陽性細胞／視野の平均を有した（２．６％）。ｃＲＧＤペンタペプチド（シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ））の単一用量は、処理の一日後、アポトーシスを有意に増加させた（１６．２±１．８９、４．６％）が、アポトーシスのこのレベルはその後減少した。未処理腫瘍と比較した場合、単独のＲＩＴは結果として、有意に増加したアポトーシス（図４に記載されているように）を生じた。アポトーシス細胞の最大数は、６日目に見られた（２１．４±２．９、６．１％）。ＣＭＲＩＴ方法後のアポトーシスは、６日目以外すべての時点でその他のすべての処理グループよりも高かった（有意に増加したアポトーシスが見られる。図４）。ＣＭＲＩＴ方法後のアポトーシスは、ＲＩＴ後５日目にピークになった（３０．７±２．０細胞／視野、８．８％）。下方のピークは、ＣＭＲＩＴ方法後の１日目であった（２１．９±２．６、６．３％）。アポトーシスのこれら２つのピークは、発生するアポトーシスの２つの「波」と一致する。しかしながらＲＩＴ腫瘍と比較して、ＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍において発生する全細胞アポトーシスにおける差は、付加的（ａｄｄｉｔｉｖｅ）であり、したがってほかのメカニズムも有効性に影響を与えることがあることを示唆している。
【００５７】
図３は、ＣＭＲＩＴ方法の結果としてアポトーシスの増加を生じることを証明する顕微鏡写真画像である。アポトーシス（アポップタグ・レッドでのＴＵＮＥＬ）およびＣＤ３１（ＦＩＴＣ）が、処理開始の５日後に評価された（Ａ）未処理、（Ｂ）ｃＲＧＤペンタペプチド処理された（２５０μｇ  シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の１用量）、（Ｃ）ＲＩＴ（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）、および（Ｄ）ＣＭＲＩＴ方法（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６および２５０μｇシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の６用量）マウスからの腫瘍の１０−μｍ切片において例証されている。アポトーシス（ローダミン）が、腫瘍細胞および内皮細胞（ＦＩＴＣ）において観察され、ここではローダミンおよびＦＩＴＣ染料が共局在している（矢印によって印が付けられているオレンジ色の細胞）。バックグラウンド核染色がＤＡＰＩを用いて得られた。切片を、ピンクルフィルターを備えたオリンパス顕微鏡を用いて×６００で撮影した。腫瘍および内皮細胞のアポトーシスの増加が、単独のＲＩＴで処理されたマウスと比較して、ＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスにおいて観察された（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。
【００５８】
内皮アポトーシス
ｃＲＧＤペンタペプチドが、脈管内皮細胞にアポトーシスを誘発すると以前に報告されているので、ｃＲＧＤペンタペプチド処理された（単一用量のシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ））腫瘍における内皮細胞アポトーシスを、未処理腫瘍と比較した。有意に増加したアポトーシスが、未処理腫瘍（０．６±０．１）と比較して、ｃＲＧＤペンタペプチド処理の１日後（２．５±０．５）および５日後（２．４±０．７）に観察された。しかしながら、ｃＲＧＤペンタペプチド処理と未処理腫瘍との間のアポトーシスのこれらの差は、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の多（６）用量を用いた場合でさえ、成長または腫瘍体積における差によって反映されなかった。単独のＲＩＴもまた結果として、初期の時点において未処理腫瘍と比較して、有意に増加した内皮アポトーシスを生じた（図４）。ＣＭＲＩＴは、ＲＩＴ後の１日目および５日目に、内皮細胞アポトーシスの２つのピークに関連していた。最高レベルは１日目であった（３．９±１．２細胞／視野）（図４）。ＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍における内皮アポトーシスの平均レベルは、３日目および６日目以外、すべての時点でほかのすべてのグループよりも高かった。しかしながら増加した内皮アポトーシスは、ＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍において全細胞アポトーシスに先行するようには見えなかった。ピークは１日目および５日目のどちらにも発生した。
【００５９】
図４は、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の結果として、単独のｃＲＧＤペンタペプチド、またはＣＭＲＩＴ方法処理後の１日目および５日目に、腫瘍および内皮細胞のアポトーシスの増加を生じることを示すデータのグラフ図面である。Ａ．全細胞（黒い記号）およびＢ．内皮細胞（ＥＣ）（白い記号）におけるアポトーシスは、未処理マウス（■）、ｃＲＧＤペンタペプチド（２５０μｇシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の１用量）で処理されたマウス（●）、ＲＩＴ（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６）で処理されたマウス（▲）、およびＣＭＲＩＴ方法（２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６および２５０μｇシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の６用量）で処理されたマウス（◆）からのＨＢＴ３４７７腫瘍において、ＴＵＮＥＬおよびＣＤ３１免疫組織化学分析によって評価された。アポトーシスは、１腫瘍あたり６つの無作為視野から×６００倍率で定量され、処理平均の決定のために４つの腫瘍が用いられた。全細胞アポトーシスは、塗りつぶされた記号によって示され、内皮アポトーシスは、塗りつぶされていない記号によって示されている。誤差棒（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）は、平均の標準誤差を示す。ＲＩＴ値よりも有意に大きいＣＭＲＩＴ方法の値（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）は、＊によって示され；未処理よりも有意に大きいｃＲＧＤペンタペプチドの値（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）は、＆によって示され；未処理よりも有意に大きいＲＩＴの値は、＄によって示されている。ＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍についての全細胞アポトーシスは、ＲＩＴ後の２時間目、１日目、および５日目にＲＩＴ腫瘍とは有意に異なっていた。内皮アポトーシスは、ＲＩＴ後の６時間目、２日目、および５日目にＲＩＴマウスよりもＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスにおいて、有意に増加していた。Ｘ軸は、初期の時点での変化を図解するためにスケールに合せて引かれていない。Ｙ軸の中断は、全細胞アポトーシスと内皮アポトーシスとの間のスケールの変化を示す。
【００６０】
全細胞増殖
Ｋｉ６７−プラス細胞の平均数が、未処理腫瘍および１、５、および６日目における腫瘍について決定された（ｃＲＧＤペンタペプチド処理された腫瘍は、６日目に決定されなかった）。Ｋｉ６７抗体は、細胞周期のすべての活性段階において増殖過程にある細胞の核中に存在するタンパク質を認識するが、Ｇ０において細胞中に見られるタンパク質を認識しない。これらの結果は、単独のＲＩＴまたはｃＲＧＤペンタペプチドが、未処理マウスと比較して、５日目に細胞周期において活性な細胞の増殖率を有意に減少させたことを示している（表２）。ＣＭＲＩＴ方法も同様に、未処理マウスと比較して増殖を減少させ、その結果、単独のＲＩＴと比較して、６日目に有意に減少した増殖を生じた（図５）。
【００６１】
図５は、ＲＩＴ処理に対する、ＣＭＲＩＴ方法処理後の腫瘍細胞の減少した増殖を示す腫瘍細胞の顕微鏡写真画像を示している。（Ａ）ＲＩＴおよび（Ｂ）ＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍における増殖細胞が、Ｋｉ６７マウスＭＡｂ、ついで抗マウスローダミン連結抗体によるＲＩＴの６日後の腫瘍の１０−μｍ凍結切片上で同定された。微小血管密度計数のために用いられた内皮細胞クラスターは、抗−ＣＤ３１ラットＭＡｂ、ついでＦＩＴＣに連結した抗−ラット抗体によって同定された。核染色はＤＡＰＩであった。増殖は、１腫瘍あたり６無作為視野から×１，０００倍率で定量された。処理平均の決定のために４つの腫瘍が用いられた。ＲＩＴの６日後、ＲＩＴ処理された腫瘍と比較して、ＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍においてより少ないＫｉ６７−陽性細胞が観察された。ただし微小血管数は、この時点では異ならなかった。切片は、ピンクルフィルターを備えたオリンパス顕微鏡を用いて、×６００で撮影された。
【００６２】
微小血管密度
各腫瘍についての微小血管密度は、未処理マウス、ｃＲＧＤペンタペプチド処理されたマウス、ＲＩＴおよびＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスからの各腫瘍の１つの切片からの６つの無作為に選択された視野における非隣接ＣＤ３１−染色領域の総数を、処理後の決定的時点において平均することによって決定された（表２）。未処理マウスと比較して有意に減少した微小血管密度が、単独のＲＩＴ、またはｃＲＧＤペンタペプチド（シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ））と組合わされたＲＩＴのどちらかを受けているマウスにおいて、ＲＩＴ処理の６日後に観察された。１日目および５日目中に観察された内皮アポトーシスの（ＲＩＴ以上の）増加は、微小血管密度における測定可能な差と関連しているようには見えず、全細胞アポトーシスに先行しなかった。これらのデータは、ＣＭＲＩＴ方法に関連して増加した内皮アポトーシスが治療結果に寄与しうるが、これに影響を与える唯一のメカニズムではなさそうであることを示している。さらには、６日目までずっと通したデータは、減少した微小血管数が、ＲＩＴとＣＭＲＩＴ方法との間の治療結果の差を説明することを示していない。
【００６３】
【表２】
2006508044.tif 000003
【００６４】
ＨＢＴ３４７７腫瘍上のαｖβ３の発現
マウスインテグリン（ＣＤ６１）と反応性がある抗β３抗体での免疫組織化学は、ヌードマウスにおけるＨＢＴ３４７７腫瘍の選択された領域の限定された標識を証明した（図６）。β３−標識部位は、ＣＤ３１認識抗体によって共標識された、環様脈管構造として現れる区域を含んでいた。このことは、これらの腫瘍に供給を与える血管におけるαｖβ３発現と一致する。ＣＤ３１よりも実質的に少ないβ３の発現が観察された。このことは、ＣＤ３１によって標識された内皮細胞の小さい割合が新生血管でありさえすれば、予想される。
【００６５】
図６は、β３およびＣＤ３１がＨＢＴ３４７７乳癌腫瘍細胞上に発現されていることを示す、腫瘍切片の顕微鏡写真画像である。未処理マウスから除去された腫瘍を、免疫組織化学技術を用いて、インテグリンβ３および内皮タンパク質ＣＤ３１の発現について分析した。マウスβ３へのハムスターＭＡｂを加え、ついで抗ハムスターローダミン連結抗体を加えた。その後ラット抗マウスＣＤ３１ＭＡｂを加え、ついで抗ラットＦＩＴＣ連結抗体を加えた。ローダミン（β３）とＦＩＴＣ（ＣＤ３１）との共局在（オレンジ色、矢印によって示されている）は、腫瘍に供給を与える血管におけるαｖβ３インテグリン発現と一致する。腫瘍切片を、ピンクルフィルターを備えたオリンパス顕微鏡で、×６００で撮影した。
【００６６】
これらの結果は、本発明のＣＭＲＩＴ方法が、従来のＲＩＴ単一療法に対して増加した毒性を伴なわずに腫瘍治療の有効性を増加したことを証明している。ＲＩＴの高用量を用いたＣＭＲＩＴ方法は、結果として、単独のＲＩＴについての１５％治癒、および単独のシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）についての０％治癒と比較して５３％治癒を生じたが、一方で、組合わされた用量レベルは、単独のＲＩＴについての２０％治癒と比較して、４４％治癒を生じた。より高い用量レベルにおいてＣＭＲＩＴ方法に関連した死亡の増加があったが、ＣＭＲＩＴ方法およびＲＩＴについての死亡率は、統計的に異ならなかった。これらの結果は、療法の有意に良好な結果が、単一作用物質を用いた療法と比較して、毒性における統計的増加を伴なうことなく、ＣＭＲＩＴ方法に関連しているということを示している。
【００６７】
ＤｅＮａｒｄｏらは、２５０μｇのｃＲＧＤペンタペプチド（ＥＭＤ２７０１７９）が、ＲＩＴの１時間前に、５０％までのＨＢＴ３４７７腫瘍によるＲＩＴの取り込みの増加を与えたことを報告している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１５：７１−７９（２０００））。しかしながら１１０μＣｉから３３０μＣｉの用量における９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６を用いた、このＨＢＴ３４７７モデルの以前の研究において、２６０μＣｉ９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ペプチド−ＣｈＬ６以上の注射用量の増加後に、増加した治癒率は生じなかった。これらの結果は、ｃＲＧＤペンタペプチドのペプチド、例えばシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）に関連したＲＩＴの取り込みの増加は、治癒の増加に関連する主な要因ではないことを強く示唆している。
【００６８】
ＣＭＲＩＴ方法への脈管の寄与を、腫瘍細胞アポトーシスと比較して、内皮アポトーシスおよびその時間経過を評価することによって調査した。ｃＲＧＤペンタペプチドが内皮アポトーシスを誘発し、その後内皮細胞の損失後に腫瘍細胞アポトーシスを誘発するならば、全細胞アポトーシスの増加の前に発生する内皮アポトーシスの増加が見られると予想される。ＲＩＴと組合わせたｃＲＧＤペンタペプチド（シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ））（例えばＣＭＲＩＴ方法）は、ほとんどすべての時点においてＲＩＴの場合に観察されたもの以上の内皮細胞および全細胞アポトーシスレベルの両方を上昇させた。１日目および５日目にレベルが有意に増加した。さらには、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の単一用量は、未処理と比較して、同じ時点で内皮アポトーシスを有意に増加させた。全細胞アポトーシスに先行する内皮アポトーシスの明確なパターンは存在しないが、ＲＩＴと比較して、ＣＭＲＩＴ方法において内皮アポトーシスの持続的な上昇があった。しかしながらこの差の効果は、評価された時点において微小血管密度の差によって直接には反映されなかった。シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）が、微小脈管組織の質に影響を与えた可能性がある。このことは、微小血管密度によって反映されなかった。これは、ＲＩＴ処理された腫瘍と比較して、ＣＭＲＩＴ方法において６日目に観察された増殖の減少と一致する。これは、評価された最後の時点であり、この時、微小血管数は、ＲＩＴおよびＣＭＲＩＴ方法で処理された腫瘍の両方において減少した。
【００６９】
ＣＭＲＩＴ方法とＲＩＴとの間のほかの可能な差は、ｃＲＧＤペンタペプチド、例えばシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）の間接的阻害効果に関連し得た。放射線は、照射の１から４時間以内に、腫瘍血管上のβ３インテグリンの蓄積および活性化を誘発することが証明された。この増加は、照射された腫瘍血管のルーメンにおける血小板の蓄積と関連している。内皮細胞への血小板接着は、αｖβ３インテグリンへの抗体でのブロックによって阻害され、血小板は、α−顆粒に含まれている成長因子を介して腫瘍新脈管形成に寄与する可能性がある。シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）は、αｖβ３に関する５ｎＭと比較して、単離α２ｂβ３受容体に関する４２０ｎＭのＩＣ５０を有すると報告されている。シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）は、このマウスモデルにおいてこの用量で、照射に応答して腫瘍脈管構造における血小板の蓄積を阻害し、したがって腫瘍細胞へのパラクリン相互作用を減少させた可能性がある。さらにはαｖβ３インテグリン受容体は、脈管内皮成長因子−２（ＶＥＧＦＲ−２）受容体の完全活性化に参加すると報告されている。さらには、ｃＲＧＤペンタペプチドによる阻害は、内皮細胞へのＶＥＧＦＲ−２受容体の下流効果、例えば隣接腫瘍細胞への成長因子放出の減少を阻害することができ、これは、腫瘍細胞増殖の全体的阻害を導きうる。
【００７０】
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）阻害（単一モダリティー）へのＨＢＴ３４７７皮下腫瘍成長の応答性の欠如は、このモデルにおいて腫瘍成長が既存血管を利用するか、または十分な血管成長が、ｃＲＧＤペンタペプチドの存在下においてでさえ発生することを示している可能性がある。ＲＩＴ後、血管密度が実質的に減少した時、ｃＲＧＤペンタペプチド阻害は、腫瘍細胞の減少および照射損傷からの内皮細胞回復につながることがあり、その結果として、治療有効性の増加に関連した、アポトーシスの連鎖的波及（ｗａｖｅｓ）としての腫瘍細胞死の増加を生じる。
【００７１】
本発明のＣＭＲＩＴ方法は、組合わせ治療の抗新脈管形成性環状ＲＧＤペンタペプチドから結果として生じる腫瘍の治療に対するＲＩＴの有効性の増加を与える。本発明のＣＭＲＩＴ方法について観察された治療的相乗作用は、いくつかのメカニズムの組合わせ効果による可能性があり、これは、アポトーシスの増加および細胞増殖の減少につながる。しかしながらＣＭＲＩＴ方法の場合に観察された内皮アポトーシスのより高いレベルは、内皮損失と一致し、これは腫瘍細胞損失に影響を与え、かつ治癒において観察される増加に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
図面において、
【図１】単独のＲＩＴおよび単独のｃＲＧＤペンタペプチドでの処理に対する、本発明のＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスにおける腫瘍治癒率の増加を示す棒グラフである。ＰＲは、部分退行を意味し、ＣＲは完全退行を意味する。
【図２】単独のＲＩＴおよび単独のｃＲＧＤペンタペプチド処理と比較した、本発明のＣＭＲＩＴで処理されたマウスにおける毒性データのグラフ図面を示す。
【図３】腫瘍細胞の顕微鏡写真画像を示す。これは、本発明のＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスからの腫瘍におけるアポトーシスの増加を示している。
【図４】ＴＵＮＥＬ方法によって決定された、本発明のＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスからの腫瘍における（Ａ）全細胞、および（Ｂ）内皮細胞（ＥＣ）におけるアポトーシスを示すデータのグラフ図面を示す。
【図５】腫瘍細胞の顕微鏡写真画像を示しており、これは、単独のＲＩＴおよび単独のｃＲＧＤペンタペプチドで処理されたマウスに対する、本発明のＣＭＲＩＴ方法で処理されたマウスからの腫瘍における細胞増殖の減少を示す。
【図６】ＨＢＴ３４７７乳房腫瘍細胞の顕微鏡写真画像を示す。これは、細胞上のβ３およびＣＤ３１発現を示している。
【図１】
2006508044.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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