(57)【要約】本発明は、線虫Ｌ３の表面抗原と結合する、２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられた、単離されたモノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１に関する。また本発明は、該モノクローナル抗体と結合する抗原、および線虫感染の診断および治療または予防における該モノクローナル抗体および抗原の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられた、線虫Ｌ３の表面抗原と結合する、単離モノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１。
【請求項２】
Ｔ．コルブリフォルミス（Ｔ．ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）のＬ３に由来し、還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動する抗原と結合する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３】
ａ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に４６ｋＤａおよび実質的に２２ｋＤａに泳動するＣ．クルチセイ（Ｃ．ｃｕｒｔｉｃｅｉ）の表面抗原、
ｂ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２２ｋＤａに泳動するＮ．スパチゲル（Ｎ．ｓｐａｔｈｉｇｅｒ）の表面抗原、
ｃ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動するＨ．コントルツス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）の表面抗原、
ｄ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５〜３９ｋＤａに泳動するＯ．シルキュムシンクタ（Ｏ．ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の表面抗原、
ｅ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動するＴ．アクセイ（Ｔ．ａｘｅｉ）またはＴ．ビトリヌス（Ｔ．ｖｉｔｒｉｎｕｓ）の表面抗原、
ｆ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３０〜４５ｋＤａに泳動するＯ．オステルタギ（Ｏ．ｏｓｔｅｒｔａｇｉ）の表面抗原、
ｇ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２０ｋＤａおよび実質的に４５ｋＤａに泳動するＣ．オンコフェラ（Ｃ．ｏｎｃｏｐｈｅｒａ）の表面抗原、
ｈ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に９ｋＤＡおよび実質的に１２ｋＤａに泳動するＮ．ブラジリエンシス（Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の表面抗原、
ｉ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３０ｋＤａに泳動するＤ．エッケルチ（Ｄ．ｅｃｋｅｒｔｉ）の表面抗原
から構成される群から選択されるＬ３の表面抗原と結合する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項４】
固体支持体と結合している場合に、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによって表面抗原を精製するために利用可能である、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項５】
２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられたモノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ１と結合する、線虫Ｌ３由来の単離された炭水化物表面抗原。
【請求項６】
還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２０〜３５ｋＤａの間に、または実質的に９ｋＤａおよび１２ｋＤａに泳動する、請求項５に実質的に記載の単離された抗原。
【請求項７】
Ｔ．コルブリフォルミスＬ３に由来する、請求項５に記載の単離された抗原。
【請求項８】
Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から取り出された線虫Ｌ３に由来する、請求項５に記載の単離された抗原。
【請求項９】
請求項５に記載の抗原と製薬上または獣医学上許容可能な担体または希釈剤とを含んでなる組成物。
【請求項１０】
線虫感染を予防し、治療し、該感染に対する感受性を低下させる組成物の製造における、請求項５に記載の抗原の使用。
【請求項１１】
Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から選択される線虫による、感受性のヒツジにおける線虫感染を予防し、治療し、該感染に対する感受性を低下させるための請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
これら他の種の線虫も前記のモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１との反応によって同定される幼虫表面抗原を有することを特徴とする、ヒツジ以外の感受性の動物における線虫感染を予防し、治療し、該感染に対する感受性を低下させるための請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種のアジュバントまたはサイトカインも含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
感受性動物において線虫感染を診断する方法であって、
ａ）動物から血液試料を得る工程、および
ｂ）適切なアッセイによって、請求項３に記載の抗原に対する抗体の存在について試料を分析する工程
からなる方法。
【請求項１５】
Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から選択された線虫を用いた不完全感染によって免疫化済みの動物の胃腸管粘液に由来している、請求項３に記載の単離抗体。
【請求項１６】
請求項９に記載の組成物を投与することによって、動物の線虫感染を予防し、治療し、または該感染に対する感受性を低下させる方法。
【請求項１７】
ヒツジまたは他の感受性動物において線虫感染を治療し、予防し、または該感染に対する感受性を低下させるために、ヒツジまたは他の感受性動物の腸粘液において抗体応答を惹起するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗原の使用。
【請求項１８】
ヒツジにおいて線虫感染を検出するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体および線虫幼虫抗原に関する。詳しくは、本発明は、寄生性線虫の第３期幼虫（Ｌ３）の表面抗原に特異的なモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒツジおよびウシなどの動物への線虫寄生生物による感染は、農業関係者にとっては経済的観点から重要である。従来、線虫感染は駆虫薬の投与によって治療されてきた。
しかし、従来の駆虫薬に関する主要な欠点は、広範なスペクトルの駆虫薬に対する線虫の耐性が現在ますます広くなってきているため、重大な懸念となっていることである（非特許文献１〜３）。
【０００３】
免疫を有するヒツジの腸から線虫が排除されることについて説明するために、いくつかの機構が提案されている（非特許文献４）。即時型の過敏性応答の要素が関与している証拠があり、その場合、ＩｇＥに感作された粘膜肥満細胞が抗原の刺激を受けることにより線虫の生存に影響し得る物質が粘膜に蓄積される（非特許文献５，６）。粘液の抗線虫性としては、化学メディエータ（非特許文献７，８）および抗体（非特許文献９〜１１）の存在が挙げられる。最近、本発明者らは、複数回の不完全感染によって免疫化されたヒツジから得た腸粘液が、幼虫と粘液との混合物を未処置の受け手側のヒツジの十二指腸に注入した後の幼虫定着の正常なパターンを変更し得ることを示した（非特許文献１２）。寄生性線虫トリコストロンギルス・コルブリフォルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）に対して免疫を有するヒツジの小腸から集めた粘液は、抗幼虫活性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは幼虫を凝集させ、十二指腸カニューレを介して幼虫と粘液とを注入した後の未処置ヒツジにおいて幼虫定着数の大幅な減少をもたらすことがわかった。
【０００４】
イムノブロッティングにより、免疫性粘液には、主に推定分子量３５ｋＤａの抗原を認識するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体が含まれていることが示された。免疫性粘液中でインキュベートした幼虫の表面から溶出した抗体も、幼虫ホモジネートのブロット上で３５ｋＤａの抗原と反応した。免疫蛍光および免疫金電子顕微鏡観察により、３５ｋＤａの抗原はＬ３のエピクチクラに存在し、Ｌ４への脱皮の際に脱ぎ捨てられることが示された。該抗原は卵、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ４または成虫には存在せず、感染前および感染後５日までのＬ３の抽出物中にのみ見られた。この結果は、抗体が幼虫の表面に結合することにより、幼虫がその好ましい部位に定着するのを防ぎ、これによって幼虫が腸から排除されたということを示唆する。部分精製した３５ｋＤａ抗原でヒツジを免疫化した結果、Ｔ．コルブリフォルミス負荷投与後の卵数が大幅に減少したが、このことは、ワクチンにおけるこの抗原の実用性の可能性を示唆する。
【０００５】
ＰＡＢ‐１と名付けられた、幼虫表面抗原に対するモノクローナル抗体を調製した。ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１およびヒツジ粘液抗体はいずれも、３５ｋＤａのＴ．コルブリフォルミス幼虫抗原を認識し、また、寄生性線虫ハエモンカス・コントルツス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）およびオステルタギア・シルキュムシンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）のＬ３抽出物のブロットで同様の分子量の抗原とも交差反応し、かつクーペリア・クルチセイ（Ｃｏｏｐｅｒｉａ  ｃｕｒｔｉｃｅｉ）およびネマトジルス・スパチゲル（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ  ｓｐａｔｈｉｇｅｒ）から抽出したＬ３抗原のブロットで２２ｋＤａ抗原と交差反応した。このことから、他の線虫種に、免疫化の可能性を有する共通表面抗原が存在し、ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１によって同定可能であることが示唆された。３５ｋＤａ幼虫抗原および関連分子は、宿主免疫の新たな標
的である可能性があり、したがって、線虫感染に対するワクチンまたはその他の免疫療法において利用できる可能性がある。
【０００６】
モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１は、標準的なアフィニティー・クロマトグラフィー技術によって表面抗原を免疫精製するために使用可能である。アガロースまたはセファロースなどの固相支持体と結合しているモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１は、Ｌ３の粗抽出物由来の表面抗原と結合する。該表面抗原は、低ｐＨバッファーを用いて抗体マトリックスから溶出可能であり、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって実質的に純粋であると示すことが可能である。このように精製した表面抗原は、免疫粘液由来のヒツジ抗体に対するイムノブロッティングによって検出され、かつ炭水化物を検出するために用いられる方法によって染色され得る。
【０００７】
３５ｋＤａの幼虫抗原および関連分子は主に炭水化物構造を有することがわかる。これは、この抗原がプロテイナーゼＫによる消化に対して耐性であり、高感度のタンパク質染色液で処理したゲル中で染色されず、炭水化物染色液で染色され、ビオチン‐ヒドラジドなどの炭水化物標識試薬で標識され得るためである。
【０００８】
したがって、ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１は、線虫感染に対するワクチンまたはその他の免疫療法を開発するための表面抗原の同定および単離において有用となり得る。
Ｔ．コルブリフォルミスに感染したヒツジの血清および腸粘液には、３５ｋＤａ幼虫抗原および関連分子を認識する抗体が含まれている。したがって、幼虫抗原に対する抗体の存在は寄生体に対する曝露を示すので、モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１は、感染動物の特定のための診断ツールとして有用となり得る。
【０００９】
本明細書に記載した、特許または特許出願をはじめとするすべての参照文献を、本願明細書に援用する。先行技術を構成する参照文献は認められない。参照文献の考察には、著者の主張することが記載されており、本出願者らは記載された文書の正確性および妥当性を批判する権利を留保する。本明細書にはいくつかの先行技術出版物が援用されているが、この援用は、これらの文書のいずれかが、ニュージーランドまたは他の国における当技術分野の共通の一般的な知識の一部を形成するということを是認するものではないことは明確に理解されるであろう。
【非特許文献１】ウォラー（Ｗａｌｌｅｒ）、「駆虫薬耐性（Anthelmintic Resistance ）」、Veterinary Parasitology 、１９９７年、３９１‐４１２ページ
【非特許文献２】サングスター（Ｓａｎｇｓｔｅｒ）ら、「駆虫薬耐性の薬理学（Pharmacology of Anthelmintic Resistance ）」、Parasitology Today、１９９９年、第１５巻、第４号
【非特許文献３】ヴァン・ウィック（Ｖａｎ  Ｗｙｋ）ら、「南アフリカにおける駆虫薬耐性：調査により示される、ヒツジおよびヤギの飼育における著しく深刻な状況（Anthelmintic Resistance in South Africa: Surveys indicate an extremely serious situation in sheep and goat farming）」、１９９９年
【非特許文献４】ロスウェル（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ）、Int J Parasitol 、１９８９年、第１９巻、１３９‐１６８ページ
【非特許文献５】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Vet Immunol Immunopathol、１９９６年、第５４巻、３３１‐３３６ページ
【非特許文献６】エメリー（Ｅｍｅｒｙ）ら、「ヒツジ胃腸管の線虫に対する免疫における、過敏性応答の役割の研究（Investigations of the role of hypersensitivity responses in immunity against ovine gastrointestinal nematodes ）」、ハズバンド（Ｈｕｓｂａｎｄ）編「粘液：粘膜の免疫学（Mucosal Solutions: Advances in Mucosal Immunology ）」、シドニー大学出版、１９９７年、３５９‐３６６ページ
【非特許文献７】ダッチ（Ｄｏｕｃｈ）ら、Int J Parasitol 、１９８３年、第１３巻、２０７‐２１２ページ
【非特許文献８】ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Int J Parasitol 、１９９０年、第２０巻、１０７５‐１０７９ページ
【非特許文献９】リーおよびオーグルビ（Ｌｅｅ  ＆  Ｏｇｉｌｖｉｅ）、「腸の線虫感染における粘液層（The mucus layer in intestinal nematode infections ）」、オグラ（Ｏｇｒａ）およびビエネンストック（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ）編「健康状態と疾患における粘膜免疫システム（The Mucosal Immune System in Health and Disease ）」、コロンブス：ロス・ラボラトリーズ（Columbus:Ross Laboratories）、１９８１年、１７５‐１８３ページ
【非特許文献１０】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Parasitology、１９８７年、第９４巻、Ｓ７７‐Ｓ１００
【非特許文献１１】カーライル（Ｃａｒｌｉｓｌｅ）ら、Immunology、１９９１年、第７４巻、５４６‐５５１ページ
【非特許文献１２】ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ら、Int J Parasitol 、１９９９年、第２９巻、４５９‐４６８ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、モノクローナル抗体および線虫幼虫抗原を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要約）
本発明の第１の態様によれば、２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられた、線虫のＬ３の表面抗原と結合する、単離モノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、Ｔ．コルブリフォルミスのＬ３に由来し、還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動する抗原と結合する、前記の単離モノクローナル抗体が提供される。
【００１３】
本発明の第３の態様によれば、
ａ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に４６ｋＤａおよび実質的に２２ｋＤａに泳動する、Ｃ．クルチセイ（Ｃ．ｃｕｒｔｉｃｅｉ）の表面抗原、
ｂ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２２ｋＤａに泳動する、Ｎ．スパチゲル（Ｎ．ｓｐａｔｈｉｇｅｒ）の表面抗原、
ｃ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動する、Ｈ．コントルツス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）の表面抗原および
ｄ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５〜３９ｋＤａに泳動する、Ｏ．シルキュムシンクタ（Ｏ．ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の表面抗原、
ｅ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動する、Ｔ．アクセイ（Ｔ．ａｘｅｉ）またはＴ．ビトリヌス（Ｔ．ｖｉｔｒｉｎｕｓ）の表面抗原、
ｆ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３０〜４５ｋＤａに泳動する、Ｏ．オステルタギ（Ｏ．ｏｓｔｅｒｔａｇｉ）の表面抗原、
ｇ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２０ｋＤａおよび実質的に４５ｋＤａに泳動する、Ｃ．オンコフェラ（Ｃ．ｏｎｃｏｐｈｅｒａ）の表面抗原、
ｈ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に９ｋＤＡおよび実質的に１２ｋＤａに泳動する、Ｎ．ブラジリエンシス（Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の表面抗原、
ｉ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３０ｋＤａに泳動する、Ｄ．エッケルチ（Ｄ．ｅｃｋｅｒｔｉ）の表面抗原
から構成される群から選択されるＬ３の表面抗原と結合する、前記の単離モノクローナル
抗体が提供される。
【００１４】
本発明の第４の態様によれば、固体支持体と結合している場合には、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによって表面抗原を精製するために利用可能である、前記の単離モノクローナル抗体が提供される。
【００１５】
本発明の第５の態様によれば、２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられたモノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ１と結合する、線虫Ｌ３由来の単離された炭水化物表面抗原が提供される。
【００１６】
前記抗原が１Ｍ  ＮａＯＨ中での煮沸にも耐えることが最も好ましい。
本発明の第６の態様によれば、還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２０〜３５ｋＤａの間に、または実質的に９ｋＤａおよび１２ｋＤａに泳動する、実質的に前記のような単離抗原が提供される。
【００１７】
本発明の第７の態様によれば、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３に由来する、実質的に前記のような単離抗原が提供される。
本発明の第８の態様によれば、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から取り出された線虫Ｌ３に由来する、実質的に前記のような単離抗原が提供される。
【００１８】
本発明の第９の態様によれば、実質的に前記のような抗原と、製薬上または獣医学上許容可能な担体または希釈剤とを含んでなる組成物が提供される。
本発明の第１０の態様によれば、線虫感染を予防し、治療し、または該感染に対する感受性を低下させる組成物の製造における、実質的に前記のような抗原の使用が提供される。
【００１９】
本発明の第１１の態様によれば、Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から選択される線虫による、感受性のヒツジにおける線虫感染を予防、治療するための、または該感染に対する感受性を低下させるための、実質的に前記のような組成物の使用が提供される。
【００２０】
本発明の第１２の態様によれば、これら他の種の線虫も前記のモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１との反応によって同定される幼虫表面抗原を有することを特徴とする、ヒツジ以外の感受性の動物において線虫感染を予防し、治療し、または該感染に対する感受性を低下させるための実質的に前記のような組成物が提供される。
【００２１】
これらの他の動物は、前記のように線虫感染に対して感受性の任意の動物であることが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウシ、シカなどが挙げられる。
【００２２】
本発明の第１３の態様によれば、少なくとも１種のアジュバントまたはサイトカインも含む、実質的に前記のような組成物が提供される。
本発明の第１４の態様によれば、
ａ）動物から血液試料を得る工程、および
ｂ）適切なアッセイによって、前記の本発明の第３の態様に記載の抗原に対する抗体の存在について該試料を分析する工程
からなる、感受性の動物における線虫感染の診断方法が提供される。
【００２３】
アッセイはＥＬＩＳＡまたはウェスタン・ブロッティング・アッセイであることが好ましいが、他の種類のアッセイが想定されるのを制限するほどとみなされるべきではない。
本発明の第１５の態様によれば、Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から選択された線虫を用いた不完全感染によって免疫化済みの動物の胃腸管粘液に由来している、実質的に前記のような単離抗体が提供される。
【００２４】
本発明の第１６の態様によれば、本発明の組成物を投与することによって、動物の線虫感染を予防または治療する方法が提供される。
本発明の第１７の態様によれば、ヒツジにおいて線虫感染を治療し、予防し、または該感染に対する感受性を低下させるために、ヒツジまたは他の感受性動物の腸粘液において抗体応答を惹起するための、本発明の抗原の使用が提供される。
【００２５】
本発明の第１８の態様によれば、ヒツジにおいて線虫感染を検出するための、実質的に前記のようなモノクローナル抗体の使用が提供される。
用語「単離（された）」とは、本発明のモノクローナル抗体または炭水化物がその本来の環境から取り出され、該抗体または炭水化物が得られた天然の系の中の一部またはすべての共存物質から分離されていることを意味する。
【００２６】
用語「Ｌ３」とは、線虫の生活環における特定の幼虫発生段階を指す。
３５ｋＤａ抗原という用語は、特に断りのない限り、通常は、ほぼこの分子量に泳動するＴ．コルブリフォルミス抗原を指す。用語「感受性の動物」とは、以下の種の線虫、Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチによる線虫感染に対して易発性のヒツジ、または、これらの線虫が既述のモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１によって検出される抗原を有することを特徴とする線虫感染に対して易発性の他の動物を指す。
【００２７】
（発明の開示）
本発明のモノクローナル抗体は、寄生性線虫のＬ３の炭水化物表面抗原を認識するモノクローナル抗体である。本発明者らによって、本モノクローナル抗体が、Ｔ．コルブリフォルミスに対して免疫化されたヒツジの腸粘液に存在する抗幼虫抗体と同一の特異性を有することが見出された。モノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１を産生するハイブリドーマは、２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられた。
【００２８】
以降、概括的な、非限定的な言葉で、本発明の抗体を同定および産生する手順について概説する。
線虫感染に対して易発性のヒツジを誕生から４カ月齢まで線虫のない状態で飼育し、４カ月齢の時点で、所定の数を、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３を用いる一連の不完全感染によって免疫化した。免疫化したヒツジの残りは線虫のない条件下で飼育を続けた。使用するヒツジは、一定期間をかけて３回の不完全感染に供され、各感染が所定の時間枠後に終結されたことが好ましい。指定時間枠が１４日であり、再感染が終結の約７日後に生じることが好ましいが、当然のことながらこれらの時間枠は限定的なものと捉えられるべきではない。
【００２９】
最後の感染の終結後、ヒツジを屠殺し、ほぼハリソンら（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａ
ｌ）、１９９９年の方法に従って、粘液を小腸から採取したが、この方法は限定的なものと捉えられるべきではなく、他の方法も使用可能である。未処置のヒツジ由来の粘液も、先に概説したのと同様に採取した。
【００３０】
免疫および未処置の粘液試料を得ると、次いで、タンパク質のプロファイルの相違について、例えば、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル、およびクマシーブルーもしくは銀での染色によって分析した。
【００３１】
次いで、粘液抗体の特性決定が可能となる。これはＬ３ホモジネート抗原をイムノブロッティングし、免疫および未処置粘液試料を用いて探査することによって達成することが好ましい。抗体の結合は、ヒツジ免疫グロブリンに対して作製され酵素とコンジュゲートされた市販の抗血清を用いた反応によって検出可能である。抗体結合はＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰによって検出可能であることが好ましい。
【００３２】
Ｌ３ホモジネートは、本願明細書に列挙した寄生性線虫種のいずれかの脱鞘したＬ３を、適切な界面活性剤または変性剤の存在または不在下で、機械的または化学的手段を用いて破壊し、続いて遠心分離および／または濾過により抽出物を清澄化することによって調製可能である。
【００３３】
Ｌ３ホモジネートは、液体Ｎ２中で凍結したＴ．コルブリフォルミスの脱鞘Ｌ３を、凍結Ｌ３が破壊されるまで粉砕するために乳鉢および乳棒を用いて破壊することによって調製可能であることが最も好ましい。次いで、幼虫成分を中性バッファー、例えば、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、尿素またはＳＤＳなどの可溶化剤を１〜２％含有する５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ  ｐＨ７．５に抽出する。１０００００×ｇで１時間の遠心分離か、または、例えば５．０μｍから０．２μｍへと孔径を小さくした一連の膜を通す濾過によって抽出物を清澄化する。
【００３４】
モノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ−１を生産する方法は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）の方法など、任意の適当な方法でもよい。
【００３５】
例えば、３５ｋＤａの抗原をポリアクリルアミド・ゲルの薄片から切り出し、等量の不完全オイル・アジュバントに浸して混合し、次いで、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウシ、シカなどの免疫化しようとする動物の腹腔、皮下組織、足蹠などに投与することが可能である。これらの動物の中では、マウスを用いることが好ましい。
【００３６】
脾細胞、リンパ球または末梢血細胞などの抗体産生細胞を免疫化した動物から回収し、骨髄腫細胞（腫瘍細胞株）と融合してハイブリドーマを形成することが可能である。抗体産生細胞としては脾細胞が好ましい。
【００３７】
細胞融合に用いる骨髄腫細胞としては、免疫化動物と同種（アロジェニック）である細胞株が好ましい。しかし、種々の動物の細胞株も使用可能である。
骨髄腫細胞としてＮＳ‐１細胞を使用するのが好ましい。しかし、これは本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【００３８】
本発明のモノクローナル抗体は通常はハイブリドーマによって産生された抗体であるが、かかる抗体を、プラスミン、ペプシンおよびパパインなどの、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼで処理することによって得られる抗体断片、すなわち、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｃｂなど、または分子クローニング技術によって得られる抗体断
片も、それらが本発明のモノクローナル抗体の特性を有する限りは、本発明のモノクローナル抗体に包含される。
【００３９】
本発明の炭水化物表面抗原は、Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチのＬ３の表面に見られる。
【００４０】
以降、概括的な、非限定的な言葉で、本発明の炭水化物抗原を同定および単離する手順について概説する。
本発明の炭水化物表面抗原は、本願明細書に列挙した線虫のＬ３の抽出物から単離可能である。炭水化物抗原は、前記のように調製したＴ．コルブリフォルミスＬ３の抽出物から単離可能であることが好ましい。まず、モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１を、固相支持体媒体、好ましくはプロテインＡ‐アガロースまたはプロテインＧ‐アガロースと結合させ、ゲルからの抗体漏出を防ぐために共有結合によって結合させることが可能である。
【００４１】
次いで、該ゲルをクロマトグラフィー・カラムに充填し、Ｌ３抽出物を供すればよい。中性バッファー、好ましくは、非特異的結合を防ぐために０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、結合している炭水化物抗原を、高ｐＨもしくは低ｐＨまたは高塩濃度の溶出バッファーを供することによってカラムから溶出させ得る。抗原を溶出するためにグリシン‐ＨＣｌバッファーｐＨ２．５〜２．８を使用することが好ましい。溶出後、１Ｍ  トリスを加えることによって炭水化物抗原のｐＨを中性まで上昇させることが可能である。次いで、電気泳動および免疫ヒツジ粘液由来の抗体に対するブロッティングを用いてさらに分析することによって、炭水化物抗原を同定する。炭水化物抗原の性質の決定は、炭水化物検出性銀染色で染色することによって、および炭水化物結合試薬ビオチン‐ヒドラジドを用いてブロットで標識することによって可能である。
【００４２】
当業者には当然のことであるが、他の炭水化物検出法も使用可能である。かかる方法としては、それだけには限らないが、レクチン結合、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、フルオロフォアを補助とする炭水化物電気泳動、ＭＳおよびＮＭＲが挙げられる。
【００４３】
薬剤組成物を調製するための方法および製薬上の担体は、「レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１９版、マックパブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）［米国ペンシルバニア州イーストン所在］などの教本に記されているように、当技術分野では十分に公知である。
【００４４】
本発明の化合物、ワクチンおよび組成物は、任意の適切な経路で投与可能であり、当業者ならば、治療しようとする状態に最も適した経路および用量を容易に決定できるであろう。投与量は主治医または担当獣医師の裁量にあり、治療しようとする状態の性質および状況、治療しようとする対象者の年齢および全身の健康状態、投与経路、および施された可能性がある何らかのこれまでの治療によって変わる。
【００４５】
担体または希釈剤、およびその他の賦形剤は、投与経路次第であり、この場合も同様に、当業者ならば、各個々の事例に最も適した処方を容易に決定し得るであろう。
本願明細書の目的上、単語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「それだけには限らないが含む」を意味すること、および単語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」が対応する意味を有することは明確に理解されよう。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、実施例のみを用いて、また添付の図面を参照して示される以
下の説明から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
１．材料および方法
１．１  不完全感染によるヒツジの免疫化
すべてのヒツジの実験は、ワラセビル（Ｗａｌｌａｃｅｖｉｌｌｅ）動物倫理委員会の承認のもとで実施した。ロムニー種ヒツジを、囲いの中で、市販のヒツジ用固形飼料、干草および水を随意与えて、誕生から線虫のない状態で飼育した。ヒツジは、免疫化感染の開始時に少なくとも４カ月齢であった。ヒツジを、４００００のＴ．コルブリフォルミスＬ３を用いる、少なくとも３回の不完全感染によって免疫化した。各感染は、オクスフェンダゾール（Ｓｙｓｔａｍｅｘ（登録商標）、シェリングプラウリミテッド社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ  Ｌｔｄ．）、４．５ｍｇ・ｋｇ−１）の経口ドレンチによって１４日後に終結させ、ドレンチの７日後にヒツジを再感染させた。一部の実験では、ヒツジに４回目の感染（追加免疫用量）を施したが、これらのヒツジは追加免疫の２〜３日後に屠殺したので、ドレンチによる終結はしなかった。
【００４８】
１．２  試料収集
ヒツジを家畜銃によって屠殺し、放血させた。小腸を５ｍ区分に結紮し、各部を４×１５０ｍｌの生理食塩水を通して洗浄して幼虫を回収した。生化学的分析およびｉｎ  ｖｉｖｏでの負荷投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）のために、小腸の最初の６ｍから粘液を回収し、以下の改変を加え既述（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ら、１９９９）のように処理した。１００ｍｌの生理食塩水で穏やかにすすいで腸内容物を回収した後、腸を４℃に２時間維持し、次いで、親指と指の間で強く圧迫することによって粘液を搾り出し、続いて生理食塩水を用いて２×５ｍｌの洗浄を行った。粘液および洗浄液をプールし、既述（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ら、１９９９）の通りに処理し、−２０℃で保存した。
【００４９】
４回の不完全感染のヒツジの群から、最後の免疫化後３日目、１６日目および３５日目に粘液の生検試料を回収した。手術では、十二指腸の位置を確認し、鉗子で穏やかに締めることによって５ｃｍの部位を孤立させた。平滑断端の１８ゲージニードルを用いて３ｍｌの生理食塩水を注入した。液体を１０回前後させて粘液を生理食塩水と混合し、次いで２〜３ｍｌの試料を採取した。切開を閉じヒツジを回復させた。
【００５０】
１．３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける種々の処理の粘液活性に対する効果
幼虫と結合する粘液の能力は、揺れ台上のエッペンドルフチューブ中３７℃で２０００の脱鞘Ｌ３を０．４ｍｌの粘液とともにインキュベートする幼虫凝集試験によって評価した。４時間後、試料を調べ、幼虫の凝集を測定し、未処置粘液または生理食塩水とともにインキュベートしたＬ３の対照物と比較した。
【００５１】
免疫粘液を種々の処置に供し、次いで、幼虫凝集活性について分析した。免疫粘液ＩＰ５のアリコート１ｍｌを生理食塩水に対して４℃で２４時間透析し、１００００×ｇ、５００００×ｇ、もしくは１０００００×ｇで遠心分離し、６０℃または１００℃で５分間加熱し、１０ｍＭのＤＴＴを用いて１時間処理してから氷上で３０分間２０ｍＭヨードアセトアミドと反応させることにより還元およびアルキル化し、続いてｐＨ７．４のＴＢＳに対して一晩透析して過剰の塩を除去した。ペプシン処理のためには、１Ｍ  ＨＣｌを用いて粘液をｐＨ４．５に調整し、０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ４．５に溶解した３ｍｇのペプシンを３ｍｌの粘液に加え、揺れ台上で３７℃で２０時間インキュベートした。トリスを２Ｍまで加えることによって反応を停止させた。粘液１ｍｌにつき、ｐＨ７．５の０．１Ｍトリスに溶かしたプロナーゼ１ｍｇを加え、揺れ台上で３７℃で２０時間インキュベートすることによってプロテアーゼ処理を実施した。プロテアーゼ阻害剤を加えることによって反応を停止させた。粘液１ｍｌ当たり、ｐＨ７．２のＰＢＳに溶かしたリパーゼ
１ｍｇを用いて粘液を処理し、３７℃で２０時間インキュベートし、次いで凍結保存した。酢酸を用いてｐＨ４．５に調整し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５中の過ヨウ素酸を加えて２０ｍＭとし、攪拌しながら暗所で室温で２時間インキュベートすることによって、粘液を酸化させた。次いで、水素化ホウ素ナトリウムを５０ｍＭまで加え、攪拌しながら１時間インキュベートした。免疫粘液ＩＰ５  ５ｍｌを２５０ｍｌのｐＨ７．２のＰＢＳに希釈し、Ｆｉｌｔｒｏｎ（商品名）１０００００ｍｗ膜で５ｍｌに濃縮し直すことによって、粘液を限外濾過した。次いで、１００００ｍｗ膜で濾液を５ｍｌに濃縮し、この濾液を３０００ｍｗ膜で５ｍｌまで減量させた。低ｍｗの濾液を凍結乾燥し、５ｍｌの蒸留水に再溶解し、ｍｗ１０００のチューブ中で蒸留水に対して透析した。
【００５２】
前記の処理の後、粘液試料をアッセイするまで凍結保存した。
１．４  ｉｎ  ｖｉｖｏ粘液アッセイ
４００００の脱鞘Ｌ３を、２．５〜１０ｍｌ容量の免疫または未処置粘液とともに４〜２４時間インキュベートし、その後、手術で埋め込んだカテーテルによって、寄生虫未処置のヒツジの十二指腸に注入した（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ら、１９９９）。１週間後、ヒツジを屠殺し、腸の各５ｍ区分における幼虫定着数を測定した。
【００５３】
４００００の脱鞘Ｌ３を、１０ｍｌ容量の免疫または未処置粘液とともに、または２×１０ｍｌ容量の１０００００×ｇで遠心分離した後の粘液上清とともに３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、未処置上清および免疫上清の１アリコートを２００×ｇで３分間遠心分離し、幼虫をペレットとした。上清を吸引によって除去し、Ｌ３を１０ｍｌの生理食塩水で洗浄し、前記のように遠心分離し、上清を除去し、Ｌ３を１０ｍｌの生理食塩水に再懸濁した。次いで、各１０ｍｌアリコートを十二指腸カニューレによって、未処置ヒツジの腸に注入した。１週間後、ヒツジを屠殺して幼虫を計数した。
【００５４】
１．５  粘液の生化学的分析
免疫および未処置粘液の試料群を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびクマシーブルーもしくは銀を用いた染色によって、タンパク質のプロファイルの相違について分析した。グリコシル化の相違は、ビオチン標識したレクチンを用いるレクチンのブロッティングで調べ、ストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼによって検出した。粘液中のＩｇＧの存在は、ＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰに対するブロッティングによって証明した。
【００５５】
１．６  粘液抗体の特性決定
Ｌ３ホモジネート抗原のイムノブロットを、免疫および未処置粘液試料で探査した。抗体の結合は、ＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰを用いて、またはヒツジＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭおよびＩｇＡに対するｍＡｂとそれに続いてＧＡＭ／Ｉｇ‐ＨＲＰを用いて検出した。
【００５６】
脱鞘Ｌ３を、粘液上清、４５％硫酸アンモニウム沈殿させた粘液由来の抗体、またはプロテインＧ精製した粘液由来の抗体とともに３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、幼虫をＴＢＳ‐Ｔｗで３回洗浄し、ｐＨ２．４の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ中で５分間インキュベートすることによって結合している抗体をすべて溶出させた。該溶出物を、１ｍトリスを用いて中和し、Ｔｃ、ＮｓおよびＣｃ由来のＬ３抗原のブロットを探査するために用いた。
【００５７】
免疫ヒツジ由来の５００ｍｌ容量の腸内容物を、４５％硫酸アンモニウムで処理して抗体を回収した。透析後、これらの抗体をＬ３抗原のブロットを探査するために用いた。幼虫を、粘液上清またはプロテインＧ‐セファロースから溶出した粘液抗体とともに２時間インキュベートし、ＴＢＳ‐Ｔｗで３回洗浄し、ＦＩＴＣ‐ＲＡＳ／ＩｇＧと反応させた。洗浄後、幼虫を蛍光顕微鏡観察によって調べた。
【００５８】
幼虫を、感染後種々の時点でヒツジから回収し、前記のような免疫蛍光およびイムノブロッティングによって、および免疫金電子顕微鏡観察によって分析した。幼虫を、ＢＧＰＡ固定液（０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．２中の１％グルタルアルデヒド、１５％飽和ピクリン酸、９０℃）で固定した。包埋された切片を、プロテインＧ精製した粘液抗体、続いて、金標識した抗ヒツジＩｇを用いて染色した。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの負荷投与実験に用いた粘液試料の抗体力価は、ＥＩＡによって測定した。マイクロタイター・プレートをＴｃＬ３抗原でコーティングし、粘液の希釈物と反応させた。洗浄後、結合している抗体を、ＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰを用いて、またはヒツジＩｇＡに対するｍＡｂ（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｋ））に続いてＲＡＭ／Ｉｇ‐ＨＲＰを用いて検出した。
【００６０】
１．７  モノクローナル抗体ＰＡＢ−１の調製
Ｔｃ幼虫表面抗原を含むポリアクリルアミド・ゲルの薄片でマウスを免疫化した。ゲル中の抗原の位置は、隣接するレーンをブロッティングし、既述のように抗原を粘液抗体で検出することによって調べた。抗原含有ゲルの薄片を、等容量の不完全オイル・アジュバントに浸し、混合し、２週間の間隔を空けて２回マウスに注射した。１０日後、試験用血液を採取し、未精製のＴｃ  Ｌ３抗原および部分精製した表面抗原に対してスクリーニングした。最も強い陽性のマウスの脾細胞を、モノクローナル抗体を調製する標準的な方法を用いてＮＳ‐１細胞と融合させた。ＥＬＩＳＡおよびブロッティング法を用いて１次および２次スクリーニングを実施し、特異性を確認した。ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１の大量培養物を調製し、小分け（アリコート）にして−２０℃で保存した。
【００６１】
モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１を、幼虫抗原のブロットを探査するために用いた。結合している抗体は、ＲＡＭ／ＩｇＧ‐ＨＲＰを用いて検出した。脱鞘幼虫を９０℃で２０分間加熱することによって固定し、ＰＡＢ‐１と反応させ、ＴＢＳ‐Ｔｗで徹底的に洗浄し、ＲＡＭ／ＩｇＧ‐ＦＩＴＣと反応させ、ｕｖ光下で調べた。無関係のタンパク質（ヒツジサイトカイン）に対して産生させたＰＡＢ‐１と同一サブクラスのｍＡｂを、負の対照として用いた。
【００６２】
１．８  幼虫抗原のイムノアフィニティー精製
モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１をプロテインＡ‐アガロースと反応させ、同抗体を結合させた。ＰＢＳで洗浄して結合していない抗体を除去した後、結合している抗体を、架橋剤ＤＳＳ（スベリン酸ジスクシンイミジル）と反応させることによって、プロテインＡに不可逆的に固定化した。さらに洗浄した後、Ｌ３抽出物を該ＰＡＢ‐１‐プロテインＡ‐アガロースカラムに通し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで徹底的に洗浄し、そして結合しているすべての抗原をｐＨ２．５の０．２Ｍグリシン‐ＨＣｌ中に溶出させた。溶出物を１Ｍトリスで中和し、ｐＨ８．０の５ｍＭトリスに対して透析し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）濃縮器で濃縮した。抗体カラムを、ＰＢＳで徹底的に洗浄することによって再平衡化した。
【００６３】
カラムから溶出した抗原の試料を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびブロッティングによって分析した（図２３）。炭水化物は、改良銀染色液で染色することによってゲル中で（キテルバーガーら（Ｋｉｔｔｅｌｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ）１９９３）、あるいはビオチン‐ヒドラジドと反応させることによってブロット上で（ブシェーズ‐マイヨットら（Ｂｏｕｃｈｅｚ−Ｍａｈｉｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ）、１９９９）検出した。
【００６４】
１．９  幼虫抗原の特性決定
脱鞘したＴｃ  Ｌ３を液体Ｎ２で凍結し、乳鉢と乳棒で粉砕し、２％Ｃｈａｐｓ＋２％Ｔｗｅｅｎ２０、１％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、２％ＳＤＳまたは９Ｍ尿
素のいずれかに可溶化することによってタンパク質を抽出した。抽出物を、１００００ｇで遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。卵、Ｌ１、Ｌ２および成虫線虫は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料用バッファー（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ  ｐＨ６．８中の２％ＳＤＳ、２０ｍＭ  ＤＴＴ）に直接可溶化した。ＳＤＳ抗原抽出物を、電気泳動およびブロッティング試験に用いた。Ｃｈａｐｓおよび尿素抽出物は、２Ｄ電気泳動に用いた。尿素抽出物は、化学的または酵素的処理の前に、ｐＨ７．４の５０ｍＭトリス‐ＨＣｌに対して２日間透析して尿素を除去した。電気泳動も、バッファーのみ、０．５％ＤＯＣまたは６Ｍ尿素を使用して、適切に可溶化した抗原で実施した。
【００６５】
２Ｄ電気泳動は、ＩＰＧｐｈｏｒ（商標）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いたｐＩ３〜１０のストリップ上のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商標）ＩＥＦでＴｃ  Ｌ３尿素抽出物を泳動し、続くＳＤＳ  ＰＡＧＥにより実施した。タンパク質はクマシーブルーもしくは銀で染色するか、ブロット上で粘液由来の抗体と反応させて抗原を検出するかのいずれかとした。Ｔｃ  Ｌ３の尿素可溶化抗原を前記のように透析し、等量の１０％ＴＣＡ、１０容量の冷アセトン、９容量のクロロホルム：メタノール（２：１）、または９容量のヘキサン：イソプロパノール（３：２）のいずれかを加えることによって沈殿させた。試料を渦流処理し、１０分間振動させ、１００００ｇで１０分間遠心分離し、沈殿したペレットをイムノブロッティングによって分析した。化学的および酵素的分解によって炭水化物の役割を調べた。抗原を、２０ｍＭ過ヨウ素酸を用いて３７℃で２４時間、または１Ｍ  ＮａＯＨ±８Ｍ  ＮａＢＨ４を用いて６０℃で１８時間処理した。試料を透析した後、電気泳動した。抗原を、ヒドラジンを用いて１００℃で７および１４日間、またはトリフルオロ酢酸を用いて４℃で４および１６時間処理し、その後、Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）遠心分離機を用いて化学物質を蒸発させ、残った抗原をＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料用バッファーに再び可溶化した。酵素消化は、各酵素を製造業者が推奨するバッファーに溶解し、抗原とともに３７℃で２２時間インキュベートすることによって実施した。用いた酵素は、Ｎ‐グリコシダーゼＦ、トリプシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ズブチリシン、リパーゼ、リゾチーム、エラスターゼ、コラゲナーゼ、ホスホイノシトール‐ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤであった。着色基質のカゼイン‐レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）およびエラスチン‐コンゴレッドを、プロテアーゼおよびエラスターゼ活性の対照として用いた。ある実験では、抗原を９０℃で２０分間加熱変性させ、その後トリプシンまたはＮａＯＨを用いて消化した。プロテイナーゼＫ消化も、０．５％  ＳＤＳ、１５ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡもしくは２ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて、または用いずに、５０℃で１８時間実施した。ハエモンカス・コントルツス、オステルタギア・シルキュムシンクタ、クーペリア・クルチセイおよびネマトジルス・スパチゲルの幼虫抽出物も、同様の条件下でプロテイナーゼＫを用いて処理した。
【００６６】
１．１０  ３５ｋＤａ抗原を用いた免疫化
１２カ月齢のロメニーヒツジ５頭に、Ｓｐａｎ８５、Ｔｗｅｅｎ８５およびゴマ油を含有する（比５．４：４．６：９０）植物油アジュバントに含めた３５ｋＤａ抗原を用いて、２週間の間隔を空けて３回腹腔内注射した。抗原は、電気泳動によって分離されたＴｃ
Ｌ３抗原のゲルの薄片から得た。電気泳動後、各ゲルの横側のストリップをニトロセルロースにブロッティングし、免疫粘液と反応させて３５ｋＤａ抗原を検出した。ＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰで明らかにした後、該ブロットをゲルの主要な部分と再度そろえて並べ、３５ｋＤａ抗原の位置に対応する薄片を切り出した。ゲルの薄片を、ｐＨ７．８の１００ｍＭトリスＨＣｌ中で透析チューブに入れ、該透析チューブを５０ｖで３時間ブロッティング槽に入れることによって抗原をゲルから電気的に溶出させた。複数の溶出物をプールし、ＢＣＡタンパク質アッセイによりタンパク質収率を０．２ｍｇ／ｍｌであると推定した。抗原を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（商品名）ホモジナイザーを用いて等容量の植物油アジュバントと混和した。各ヒツジには各注入において約０．２ｍｇの総タンパク質を投
与したが、炭水化物抗原の量は不明であった。対照のヒツジには生理食塩水およびアジュバントを腹腔内注射した。３回目の注射の２週間後、すべてのヒツジに４００００のＴｃ
Ｌ３を用いて経口感染で負荷投与した。負荷投与の３および４週間後に糞便の卵数データをとった。
【００６７】
２．結果
２．１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
全粘液または種々の処理に供した粘液の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける幼虫凝集力を表１に示す。この結果は、透析または低速の遠心分離は免疫粘液の幼虫凝集力に影響を及ぼさなかったということを示している。１０００００×ｇでの遠心分離は、界面活性剤Ｔｘ‐１００またはＣＨＡＰＳが存在する場合を除き、幼虫凝集作用を低下させた。幼虫凝集活性は、６０℃で５分間加熱した後も依然として存在していたが、１００℃で加熱した後には存在しなかった。プロテアーゼ消化または過ヨウ素酸酸化を用いて処理した粘液は活性を失ったが、リパーゼ処理では影響はなかった。幼虫凝集活性は、粘液の高分子量画分と関連していた。
【００６８】
２．２  ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
粘液容量を増加させてＬ３とともにインキュベートし、未処置の受け手側のヒツジにおけるその後の幼虫の排除と数の減少に及ぼす効果を図１に示す。５または１０ｍｌの未処置粘液中でインキュベートされた幼虫は、小腸の最初の５ｍに正常に定着することができた。免疫粘液中でインキュベートされた幼虫は、粘液容量が増すにつれて徐々に排除されるか、または拒絶された。幼虫を１０ｍｌの免疫粘液とともにインキュベートした結果、未処置粘液と比較して幼虫定着が８２％減少し、腸の最初の５ｍからは幼虫が１００％排除された。
【００６９】
Ｌ３を１０ｍｌ容量の粘液とともに種々な時間インキュベートすることによる影響を図２に示す。免疫粘液およびＬ３の、わずか１時間のインキュベーションの結果、幼虫定着が４６％低下し、最初の５ｍから８１％が排除された。４、１０または２４時間のインキュベーションの結果、＞９４％低下し、＞９３％が排除された。
【００７０】
Ｌ３を１６の未処置粘液試料および２５の免疫粘液試料とともにインキュベートすることによる幼虫定着に対する影響を図３に示す。全体では、Ｌ３＋免疫粘液を投与された受け手側のヒツジにおける幼虫定着（０〜９５％にわたる）が６７％減少し、Ｌ３＋免疫粘液を投与されたヒツジの腸の最初の５ｍにおける幼虫定着が８０％少なかった（Ｐ＜０．００１）。
【００７１】
粘液の抗幼虫性に対する粘液回収時間の影響を図４に示す。幼虫を最後に免疫化投与して２〜３日後に回収した粘液は、概して、１週間以上で回収した粘液よりも高活性であった。回帰分析により、保護と免疫化後の粘液回収時間との間に有意な負の相関が示された。
【００７２】
未処置または免疫粘液の１０００００×ｇの上清とともにＬ３をインキュベートし、その後の洗浄を伴う、または伴わない場合の効果を表２に示す（３４ページ参照）。この結果は、未処置の粘液、上清、または上清に洗浄を伴ってインキュベートされたＬ３は、未処置ヒツジにおいて定着可能であったことを示す。対照的に、免疫性の粘液、上清、または上清に洗浄を伴ってインキュベートされたＬ３は、ほとんどが定着を阻まれ、未処置粘液で処理されたＬ３を投与されているヒツジよりもＬ３が９１％少なかった。
【００７３】
２．３  粘液の生化学
粘液の電気泳動による分離を図５に示す。免疫および未処置粘液のタンパク質プロファ
イルは非常に複雑であり、これら２セットの粘液間では明確な相違は観察されなかった。レクチン・ブロッティングでも、両セットの粘液について複雑な糖タンパク質プロファイルが示され（図６、７、８）、このことから多様な炭水化物部分が存在することが示唆された。この場合も同様に免疫または未処置粘液とのレクチンの結合には明確な相違はなかったが、例外はピーナッツ凝集素であり（図７Ａ）、免疫試料のほとんどに関して、Ｉｇ重鎖および軽鎖に相当し得る約７００００および２８０００のｍｗにおいて染色の増加が見られた。しかし、粘液をＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰと反応させると、すべての試料において主要なバンドが５５０００および２７０００に見られ、これらはおそらくＩｇＧ重鎖および軽鎖に相当する（図８Ｂ）。
【００７４】
２．４  粘液ブロッティング
粘液または粘液から回収した抗体で探査した、ＴｃＬ３抗原のイムノブロットを図９に示す。６つの未処置粘液試料（レーン１３〜１８）は、Ｌ３抗原と反応しなかった。免疫粘液試料は主に３５ｋＤａのバンドと反応し、２個体の免疫ヒツジの腸内容物の硫酸アンモニウム沈殿によって回収した抗体も同様であった（レーン８および９）。プロテインＧ‐アガロースで精製した免疫粘液上清由来の抗体および免疫粘液とともにインキュベートしたＬ３から酸溶出させた抗体も、３５ｋＤａのバンドと反応した（レーン４、７および６、２０）。Ｌ３からＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の双方を溶出可能であった（図９、レーン６および２０）。Ｔｃを用いて３回の不完全感染を受けたヒツジの血清も、３５ｋＤａのバンドおよび多数のその他のバンド（示していない）を認識する抗体を含んでいた。３５ｋＤａバンドと反応する粘液中の抗体の抗体アイソタイプ特異性を図１０に示す。ＩｇＧ１およびＩｇＡアイソタイプの抗体が存在したが、ＩｇＧ２またはＩｇＭ抗体は検出されなかった。
【００７５】
腸寄生性線虫ネマトジルス・スパチゲル（Ｎｓ）およびクーペリア・クルチセイ（Ｃｃ）由来のＬ３抗原抽出物をＴｃ免疫ヒツジ由来の粘液で探査したイムノブロットは、２２ｋＤａのバンドと主な反応性を示した（図１１、レーン９および１３）。Ｎｓの不完全感染を受けたヒツジの血清は、ＮｓおよびＣｃのいずれの抗原とも反応し（レーン１２および１６）、またＴｃの３５ｋＤａバンドとも反応した（レーン８）。２ｍｌの免疫粘液を２６００００の脱鞘Ｔｃ  Ｌ３とともにインキュベートした結果、粘液から抗体が完全に枯渇した（レーン１）。コロイド金タンパク質染色を用いて、ブロット上のタンパク質を検出した（レーン４）。免疫粘液由来の抗体によって検出されるものに相当する領域には染色は見られなかった（レーン３および４）。腸線虫Ｎ．スパチゲルおよびＣ．クルチセイおよび第四胃線虫Ｈ．コントルツスおよびＯ．シルキュムシンクタのＬ３の抽出物を、Ｔｃ免疫ヒツジ粘液を用いて探査したが、ＴｃおよびＨｃについては３５ｋＤａ、Ｏｃについては３９ｋＤａ、Ｃｃについては４６および２２ｋＤａ、Ｎｓについては２２で反応が示された（図１２）。図３３は、腸線虫Ｔ．アクセイ（Ｔａ）、Ｔ．ビトリヌス（Ｔｖ）、Ｏ．オステルタギ（Ｏｏｉ）、Ｃ．オンコフェラ（Ｃｏ）およびＤ．エッケルチ（Ｄｅ）および第四胃線虫Ｈ．コントルツス（Ｈｃ）およびＯ．シルキュムシンクタ（Ｏｃ）の１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物のブロットを示すが、これらのブロットはＴｃ免疫ヒツジ粘液を用いて探査され、Ｔａ、ＴｖおよびＨｃについては３５ｋＤａ、Ｏｏについては４５、３５、３３および３０ｋＤａ、Ｃｏについては４５および２０ｋＤａ、Ｎｂについては１２および９ｋＤａ、ならびにＤｅについては３０ｋＤａで反応が示された。
【００７６】
粘液のＩｇＧおよびＴｇＡ抗体の力価と、ｉｎ  ｖｉｖｏの負荷投与に用いた粘液によって提供される保護との相関関係を、直線回帰によって分析した（図１３）。Ｌ３抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の力価と保護との間には有意な関係があった（Ｒ２＝０．６、Ｐ＜０．０１）。
【００７７】
粘液生検試料の抗体力価は免疫化後３日目では高かった（図１４）が、ＩｇＧおよびＩ
ｇＡの力価はいずれも１６日目までに減少した。しかし免疫化後３７日でも依然としてバックグラウンドは超えていた。
【００７８】
幼虫の免疫蛍光染色を図１５に示す。脱鞘Ｌ３は、免疫粘液由来の抗体とともにインキュベートした後に強い表面蛍光を示したが、未処置粘液を用いた場合は示さなかった（上部パネル）。２、３または４日間感染させたヒツジから集めた幼虫も、表面染色を示したが（示していない）、感染後５日では多数の幼虫が抗体では染まらず、一部は脱皮過程中と認められた（下部パネル）。脱皮したＬ３のクチクラは、免疫粘液由来の抗体と反応したが、新生Ｌ４は染まらなかった。感染後６および７日に回収したＬ４も表面染色を示さなかった。
【００７９】
免疫金電子顕微鏡観察により、Ｌ３の切片がエピクチクラ上で金粒子による表面標識を示す、同様のパターンの結果が示された（パネルＢ，図１６）。
金標識は感染後２日目でも観察され、３日目および４日目ではより弱く、５日目では存在しなかった（それぞれ、パネルＣ、Ｄ、ＥおよびＦ）。
【００８０】
卵、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３由来の抗原抽出物、および感染後種々の時点で回収した幼虫由来の抗原抽出物のイムノブロットを、粘液抗体で探査した（図１７＆１８）。感染前および感染後５日までのＬ３には３５ｋＤａ抗原が見られたが、卵期、Ｌ１もしくはＬ２、または感染後７日もしくは１４日後のＬ４、または成虫線虫では存在しなかった。
【００８１】
２．５  モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１
Ｔｃ  Ｌ３抗原に対する、ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１とＴｃ免疫ヒツジ粘液抗体の比較ブロッティング反応を図１９に示す。ｍＡｂは、３５ｋＤａの主なＴｃ  Ｌ３抗原、３５〜４０ｋＤａの拡散した抗原およびいくつかの低分子量抗原と反応した。
【００８２】
その他の線虫種における抗原の同定を図２０に示す。腸線虫Ｎ．スパチゲルおよびＣ．クルチセイおよび第四胃線虫Ｈ．コントルツスおよびＯ．シルキュムシンクタのＬ３の抽出物を、ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１で探査したところ、ＴｃおよびＨｃについては約３５ｋＤａで、Ｏｃについては３９ｋＤａで、Ｃｃについては４６および２２ｋＤａで、およびＮｓについては２２で反応を示した（図２０）。Ｌ３抽出物をプロテイナーゼＫで消化した後の、免疫粘液由来の抗体またはｍＡｂ  ＰＡＢ‐１に対するイムノブロッティングによって、幼虫抗原がこの酵素によっては破壊されないことが示された（図１９および２０）。
【００８３】
ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１の脱鞘Ｔｃ  Ｌ３との反応により、抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートを用いた染色後に強い表面蛍光が示された（図２１）。ＩｇＧ３の対照ｍＡｂは、幼虫表面と反応しなかった。
【００８４】
２．６  幼虫抗原のイムノアフィニティー精製
プロテインＡ‐アガロースに結合させたモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１を用いた、幼虫抗原のイムノアフィニティー精製の結果を図２２に示す。溶出物の銀染色により、幼虫抗原が泳動すると予想される領域にはタンパク質染色バンドが見られないことが示された。溶出物中には、免疫ヒツジ粘液由来の抗体を用いたイムノブロッティングによって検出された抗原と同一の分子量の位置に泳動した、単一の炭水化物の染色バンドが検出された。このバンドは、過ヨウ素酸酸化後の曝露されている糖残基と結合するビオチン‐ヒドラジド試薬でｉｎ  ｓｉｔｕ標識された。
【００８５】
２．７  幼虫抗原の特性決定
Ｌ３抗原の種々の化学的および酵素的処理による、該３５ｋＤａ抗原に対する粘液抗体のイムノブロット反応に対する影響を図２３〜３０に示す。抗原を３７℃で１８時間加熱
しても、３５ｋＤａ抗原とのイムノブロット反応に対して影響を及ぼさなかった（図２３、レーン２）。過ヨウ素酸またはリパーゼを用いた処理は、シグナル強度をわずかに低下させた（図２３、レーン３、５）が、プロナーゼは影響を及ぼさなかった（レーン４）。３５ｋＤａ抗原は、酸または溶媒による沈殿処理後には沈殿中に見られた（レーン６〜９）。
【００８６】
トリプシン、ペプシン、プロテイナーゼＫまたはホスホリパーゼＡ２を用いたＬ３抗原の処理により、ブロット反応がより拡散したものになったが、分子量は減少しなかった（図２４、レーン２、３、５、１１）。パパイン、ズブチリシンまたは溶解酵素を用いた処理によりシグナルが減少したが、分子量には変化はなかった（レーン６〜８）。プロナーゼ、リパーゼ、リゾチーム、ホスホイノシトール‐ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＤは影響を及ぼさなかった（レーン４、９、１０、１２、１３）。エラスターゼを用いた処理はわずかに低い分子量のバンドの出現をもたらした（図２５、レーン１）。３７℃でのコラゲナーゼおよびプロテイナーゼＫでは影響を及ぼさなかった（レーン２、３、４）。種々の条件下での５０℃で１８時間のプロテイナーゼＫ処理も、３５ｋＤａ抗原を破壊せず、同抗原は依然としてブロットで検出可能であった（レーン６〜９）。Ｎ‐グリコシダーゼＦを用いたＬ３抗原の処理によりブロット・シグナルがわずかに減少したが、該酵素が活性であることを示す、対照の糖タンパク質フェチュインが分解された（レーン２）条件下では３５ｋＤａ抗原の分子量は減少しなかった（図２６、レーン４）。６０℃で１８時間１Ｍ  ＮａＯＨで処理した結果、ブロットで見られる低分子量バンド数が増加したが、３５ｋＤａでの反応が依然として優勢であった（図２７、レーン２）。ＮａＯＨおよびＮａＢＨ４で処理した後、銀染色によるタンパク質は見られなかったが、３５ｋＤａ抗原のブロット反応は対照の抗原と比較して減少していなかった（図２７、レーン３）。
【００８７】
４℃で４８時間のヒドロフルオラス酸（ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏｕｓ  ａｃｉｄ）、または２０℃で１時間もしくは１００℃で１６時間のヒドラジンを用いたＬ３抗原の処理では、３５ｋＤａ抗原は破壊されなかった（図２８）。１００℃で７日または１４日間のヒドラジン処理により、未処理の対照抗原と比較してブロット・シグナルが減少した（図２９、レーン１、２）。４時間または１６時間のトリフルオロ酢酸処理により抗原が破壊された（図２９、レーン４、５）。
【００８８】
以下の手順によるＬ３抗原の処理は、イムノブロッティングによって示されるように３５ｋＤａ抗原を破壊しなかった（図３０）：５０℃で４時間または２０時間のプロテイナーゼＫ＋ＳＤＳ（レーン１＆２）：３７℃で１８時間の０．１〜１．０Ｍ  ＮａＯＨ処理（図３０、レーン３、６、７、８）：９０℃で２０分間の加熱変性とその後の１Ｍ  ＮａＯＨによる消化（レーン４）：９０℃で２０分間の加熱変性を伴う、または伴わない、３７℃で２２時間のトリプシン消化（レーン１０＆１４）：５０℃で２２時間のプロテイナーゼＫ＋ＳＤＳ＋ＤＴＴ（レーン１２）。５種の線虫種由来のＬ３抽出物のプロテイナーゼＫ消化では、Ｔｃの３５ｋＤａ抗原、または４６、３５もしくは２２ｋＤａで存在する他の種の交差反応性の抗原は破壊されなかった（図２０）。
【００８９】
Ｔｃ  Ｌ３抽出物を、非変性条件下および０．５％ＤＯＣもしくは６Ｍ尿素存在下での電気泳動およびブロッティングによって分析した。抗原はこれらの条件下では高分子量のスメアとして泳動した（図３２）。試料および電気泳動バッファーに還元剤（２０ｍＭ  ＤＴＴ）を加えても、これらのプロファイルは変わらなかった（図示せず）。
【００９０】
ｐＨ３〜１０の範囲に及ぶ、Ｔｃ  Ｌ３尿素抽出物の２Ｄ電気泳動分析により、３５ｋＤａで強いイムノブロット反応が示された（図３３）。強いブロット・シグナルにもかかわらず、相当する領域にタンパク質は見られなかった。
【００９１】
３．６  ヒツジ免疫化試験
ＦＥＣのデータを表３に示す。負荷投与の３週間後では群間でＦＥＣに有意な相違はなかったが、４週間後では、免疫化された群においてカウントが有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。両方のカウントを合わせると、免疫化された群におけるＦＥＣ全体の有意な低下も認められた（Ｐ＜０．０５）。
【００９２】
図３４は、非変性条件下（界面活性剤または還元剤を含まない）で実施した、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物（Ｌ３）および精製した炭水化物の幼虫抗原（Ｃ）のゲル電気泳動（８％  ＰＡＧＥ）およびイムノブロット分析を示す。ゲルをタンパク質または炭水化物について染色した。ブロットは、ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１に続いてウサギ抗マウスＩｇ‐ＨＲＰコンジュゲートと、または免疫ヒツジ粘液に続いてウサギ抗ヒツジＩｇ‐ＨＲＰコンジュゲートと反応させた。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
【表２】
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【００９５】
【表３】
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３．考察
幼虫を粘液とともにインキュベーションすることにより幼虫の篩から外への移動が阻害されるという初期の研究によって、免疫ヒツジの粘液の、線虫幼虫の生存に影響を及ぼす能力が示されていた（ダッチ（Ｄｏｕｃｈ）ら、１９８３）。最近、本発明者らは、幼虫は免疫粘液中でのインキュベーション後に凝集することが多いこと、およびこれらの幼虫が、十二指腸カニューレによって未処置ヒツジに注入されても正常に定着できないことを観察した（ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ら、１９９９）。これらの知見を本研究に拡大し、免疫粘液が幼虫の定着を効率的に防ぎ得ることを最終的に示した。感染に対する保護の程度は、免疫化後の粘液回収の時間、ならびに用量に応じて変化した。これは、免疫化後５週までの不完全感染ヒツジから採取した粘液生検試料に見られるような、経時的な粘
液中抗体レベルの減少と相関している。免疫粘液の１０００００×ｇ上清も幼虫の定着を防ぎ得たという知見から、この活性は粘液の可溶性画分にあり、粘液による物理的な遮断、例えば、粘性によるものではないことが示される。インキュベーション後に幼虫を洗浄しても免疫粘液上清の定着を防ぐ能力は影響を受けなかったが、このことはアクティバイト（ａｃｔｉｖｉｔｅ）因子が幼虫と結合していることを示している。
【００９６】
透析、遠心分離または分子量に応じた濾過による免疫粘液の処理後の、幼虫凝集のｉｎ
ｖｉｔｒｏ分析により、凝集活性は粘液の高分子量画分と関係があることが示された。加熱処理およびプロテアーゼ消化により、凝集には粘液のタンパク質成分が必要であることが示唆された。しかしながら、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析およびクマシーブルーもしくは銀染色によるタンパク質検出では、免疫粘液と未処置粘液の試料群の粗タンパク質プロファイルについて相違は示されなかった。同様に、レクチン・ブロッティングではピーナッツ凝集素を除いて２種の粘液間の糖タンパク質組成に相違は示されず、ピーナッツ凝集素では、重鎖および軽鎖に存在し免疫粘液試料に見られる炭水化物を検出した可能性がある。重鎖は７０ｋＤａであり、これはＩｇＡの存在を示す可能性がある。ブロッティングにより、すべての粘液試料中にＩｇＧが存在することも示された。
【００９７】
前記の知見および免疫粘液中のＩｇＧおよびＩｇＡの存在により、線虫抗原を認識する抗体が幼虫の凝集およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける保護を担っていることが示唆された。免疫粘液で探査した幼虫抗原のイムノブロットにより、３５ｋＤａの主要抗原および９、１２、２０、３０〜４５ｋＤａの拡散領域と主に反応するＩｇＧ１およびＩｇＡ抗体の存在が示された。注目すべきことに、免疫粘液中でインキュベートした後のそのままの脱鞘幼虫から溶出した抗体で探査したＬ３抗原のブロットも、この抗原との顕著な反応を示した。この結果と、さらに表面蛍光染色および免疫金電子顕微鏡観察により、エピトープが幼虫の表面に存在することが示される。抗３５ｋＤａ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏの負荷投与実験に用いた粘液試料中に存在しており、免疫粘液によって与えられる保護の程度とＩｇＧおよびＩｇＡの力価との間には有意な相関があった。Ｔ．コルブリフォルミス免疫ヒツジ由来の粘液抗体は、他の腸線虫Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチ由来の、および第四胃線虫Ｈ．コントルツスおよびＯ．シルキュムシンクタ由来の幼虫抽出物のブロット上の抗原も認識した。この交差反応性は、Ｔ．コルブリフォルミス３５ｋＤａ抗原と同様の機能を有する表面分子が他の線虫種に存在し、免疫化の標的となりうることを示す。モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１もこれらの抗原と反応し、したがって、寄生性線虫種由来のこれらの表面抗原を同定および精製するために使用できる可能性がある。これまでに調べたすべての交差反応性抗原がプロテイナーゼＫによる消化に対して耐性であるという知見は、それらもタンパク質ではなく、したがって、Ｔ．コルブリフォルミス３５ｋＤａ抗原と同様の特性を共有するという証拠となる。
【００９８】
プロテインＡアガロースと結合させたモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１は、Ｔ．コルブリフォルミスの幼虫表面抗原を精製可能であった。このＴ．コルブリフォルミス幼虫表面抗原は、プロテイナーゼＫをはじめとする一連のプロテアーゼによる消化に対し該抗原が耐性であること、炭水化物基を検出するように改良された銀染色液による染色、および曝露された糖残基と結合するビオチン‐ヒドラジド試薬を用いた標識によって示されるように、大部分は炭水化物であるとわかった。抗原は、銀染色、クマシーブルーまたは金などのタンパク質検出法では染まらなかった。抗原はリパーゼの作用による分解に対して耐性であり、有機溶媒に可溶性ではなかったが、このことは、脂質成分が存在しないか、接触できない状態にあることを示唆する。Ｎ‐グリコシダーゼＦ処理は抗原に影響を及ぼさなかったが、このことは、糖がＮ結合型でないか、酵素の攻撃に接触できない状態にあるかのいずれかであることを示す。アルカリ処理または広範なヒドラジン分解では抗原は破壊されなかったが、このことは、通常の炭水化物構造ではないことを示している可能性がある
。トリフルオロ酢酸を用いた強力な酸加水分解によって、抗原は分解された。
【００９９】
ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１で探査したＴ．コルブリフォルミス幼虫抽出物のブロットにおいて、低分子量抗原のラダー状態の多重バンド形成パターンが観察されたことから、３５ｋＤａ抗原の構造が比較的小さなユニットの重合体で構成されることを示す可能性があった。しかし、幼虫表面の自然の状態では、非変性条件を用いた電気泳動の結果によって示されるように抗原は高分子量の複合体である。ＳＤＳ＋ＤＴＴに可溶化することにより該複合体はブロット上で３５ｋＤａに検出可能な抗原へと小さくなるが、このことは、該複合体が３５ｋＤａ抗原の重合体または３５ｋＤａ抗原とまだ同定されていない他の構成要素とのヘテロ多量体であることを示唆している。抗原は、等電点電気泳動によって分離すると電荷の負均一性を示し、このことも複合体構造を示している。これらの結果は、幼虫の外表面に存在するこの分子複合体が、線虫の宿主の胃および腸で見られるすべての生理学的条件による分解に対して耐性であるらしいことを示唆している。幼虫表面抗原のこれらの特性の機能的意味についてはさらに調ベる必要があるが、この複合体は、幼虫が小腸の好みの部位に到達するまでに宿主系の不都合な環境を通過する間、幼虫を保護するために進化したと思われる。３５ｋＤａ抗原は、感染前および感染後５日までのＬ３でのみ見られたが、このことは、胃を通過する際の保護に被膜が必要であることを示唆している。小腸でのＬ４期への脱皮の際、該保護被膜は、もはや必要ないので脱ぎ捨てられる。この保護被膜に対する免疫応答により、線虫がその宿主中でうまく定着する能力を大きく損なわせることが可能であり、したがって、該免疫応答が線虫防除にとって広い意味を有し得ることは理解されよう。ヒツジでの予備的なワクチン試験では、部分精製した３５ｋＤａ抗原とオイル・アジュバントを含有するワクチンを用いた免疫化により、ワクチン接種群では対照と比較して糞便の卵数が有意に低下するという結果が得られた。
【０１００】
本発明の態様を単なる例として記載してきたが、当然のことながら、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく該態様に改変および付加を行うことが可能である。
【０１０１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】種々の量の未処置ヒツジの粘液または免疫ヒツジの粘液とともに幼虫をインキュベートした後の、未処置ヒツジにおける幼虫数を示す図。
【図２】未処置または免疫ヒツジの粘液とともに様々な時間幼虫をインキュベートした後の、未処置ヒツジにおける幼虫数を示す図。
【図３】未処置または免疫粘液中のＬ３の混合物を未処置の受け手側のヒツジに注入した後の、未処置ヒツジの腸の近位区分および遠位区分における幼虫数を示す図。
【図４】免疫化後種々の時点での免疫粘液の抗幼虫活性を示す図。
【図５】免疫および未処置粘液のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す図。
【図６】免疫および未処置粘液のレクチン・ブロッティングの結果を示す図。Ａ：ＵＥＡ‐１（α‐Ｌ‐フコース）  Ｂ：ＪＡＣ（α‐ｇａｌ‐Ｍｅ‐ピラノシド）  Ｃ：ＷＧＡ（Ｎ‐アセチルグルコサミン）  Ｄ：ＬＬ（マンノース、グルコース）
【図７】免疫および未処置粘液のレクチン・ブロッティングの結果を示す図。Ａ：ＰＮＡ（β‐ガラクトース‐Ｎ‐アセチルガラクトサミン）Ｂ：ＥｃｏｒＡ（β‐ガラクトース‐Ｎ‐アセチルグルコサミン）Ｃ：ＳＢＡ（Ｎ‐アセチルガラクトサミン）Ｄ：ＥＣＡ（β‐ガラクトース‐Ｎ‐アセチルガラクトサミン）
【図８】免疫および未処置粘液のレクチン・ブロッティングの結果を示す図。Ａ：ＳＮＡ（シアル酸）Ｂ：ＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰで探査したイムノブロット
【図９】Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抗原を、免疫ヒツジの腸粘液（レーン１、５、１０、１１、１２および１９）または未処置ヒツジの腸粘液（レーン１３〜１８）、免疫粘液の１０００００×ｇ上清（レーン３）、プロテインＧ‐アガロースから精製した免疫粘液上清（レーン４および７）、脱鞘Ｔ．コルブリフォルミスＬ３から溶出させた抗体（レーン６および２０）、免疫ヒツジ由来の腸管内腔液を硫酸アンモニウム沈殿させて得た抗体（レーン８および９）で探査した、イムノブロットの結果を示す図。レーン２は、コロイド金を用いて染色したＴ．コルブリフォルミスＬ３タンパク質を示す。ＩｇＧ抗体はＲＡＳ／ＩｇＧ‐ＨＲＰを用いて検出し（レーン１〜１８）、ＩｇＡはＭＡＳ／ＩｇＡに続いてＲＡＭ／ＩｇＧ‐ＨＲＰを用いて検出した（レーン１９および２０）。
【図１０】未処置または免疫粘液でＴ．コルブリフォルミスＬ３抗原を探査した結果を示す図。抗原ストリップを未処置粘液または免疫粘液と反応させ、続いてＲＡＳ／ＩｇＧ；ヒツジＩｇＧ１に対するｍＡＢ；ヒツジＩｇＧ２に対するｍＡＢ；ヒツジＩｇＡに対するｍＡＢ；ヒツジＩｇＭに対するｍＡＢのいずれかと反応させた。
【図１１】Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抗原、Ｃ．クルチセイＬ３抗原、Ｎ．スパチゲルＬ３抗原のイムノブロットの結果を示す図。
【図１２】Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｎ．スパチゲル、Ｃ．クルチセイおよびＴ．コルブリフォルミスのＬ３抽出物のイムノブロット分析結果を示す図。
【図１３】感染からの保護と、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抗原に対する腸粘液ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価との相関関係を示す図。
【図１４】腸粘液中のＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価の経時的低下を示す図。
【図１５】免疫または未処置粘液と反応させた脱鞘Ｔ．コルブリフォルミスＬ３を示す図（上部パネル）および感染後５日で回収し、免疫粘液と反応させたＴ．コルブリフォルミス幼虫を示す図（下部パネル）。
【図１６】未処置粘液（Ａ）または免疫粘液（Ｂ）との反応後の脱鞘Ｔ．コルブリフォルミスＬ３の電子顕微鏡写真を示す図。パネルＣ〜Ｆは、感染後２、３、４または５日で回収して免疫粘液と反応させたＴ．コルブリフォルミス幼虫を示す図である。
【図１７】Ｔ．コルブリフォルミスの卵、幼虫および成虫のＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング分析の結果を示す図。パネルＡ、ＣおよびＤは免疫粘液と反応させた。パネルＢはタンパク質を銀染色した。
【図１８】感染前および感染後の様々な時点における、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３のＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング分析の結果を示す図。
【図１９】免疫粘液またはモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１と反応させた、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物およびプロテイナーゼＫ消化したＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２０】モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１と反応させた、５種の線虫種のＬ３抗原抽出物およびプロテイナーゼＫ消化したＬ３抽出物のイムノブロット分析を示す図。
【図２１】対照モノクローナル抗体（左および中央パネル）、またはモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１（右パネル）と反応させた、脱鞘Ｔ．コルブリフォルミスＬ３の表面蛍光を示す図。
【図２２】モノクローナル抗体ＰＡＢ‐１を用いるイムノアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製したＴｃ幼虫表面抗原の分析を示す図。
【図２３】加熱、酸化、消化または有機溶媒による沈殿後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２４】プロテアーゼまたはリパーゼによる消化後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２５】プロテアーゼによる消化後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２６】グリコシダーゼによる消化後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２７】アルカリ分解後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２８】加熱およびアルカリまたは酸による分解後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図２９】加熱およびアルカリまたは酸による分解後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図３０】加熱、アルカリ分解またはプロテアーゼ消化後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析の結果を示す図。
【図３１】未変性条件下、または尿素もしくはデオキシコール酸ナトリウムの存在下での電気泳動後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析およびタンパク質染色の結果を示す図。
【図３２】２次元電気泳動後の、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物のイムノブロット分析およびタンパク質染色の結果を示す図。
【図３３】６種のさらなる線虫のＬ３抽出物中の炭水化物染色性分子の存在を示す図。
【図３４】非変性条件下（界面活性剤または還元剤を含まない）で実施した、Ｔ．コルブリフォルミスＬ３抽出物（Ｌ３）および精製した炭水化物の幼虫抗原（Ｃ）のゲル電気泳動（８％ＰＡＧＥ）およびイムノブロット分析を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月25日(2004.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられた、線虫Ｌ３の表面抗原と結合する、単離モノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ‐１。
【請求項２】
Ｔ．コルブリフォルミス（Ｔ．ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）のＬ３に由来し、還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動する抗原と結合する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３】
ａ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に４６ｋＤａおよび実質的に２２ｋＤａに泳動するＣ．クルチセイ（Ｃ．ｃｕｒｔｉｃｅｉ）の表面抗原、
ｂ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２２ｋＤａに泳動するＮ．スパチゲル（Ｎ．ｓｐａｔｈｉｇｅｒ）の表面抗原、
ｃ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動するＨ．コントルツス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）の表面抗原、
ｄ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５〜３９ｋＤａに泳動するＯ．シルキュムシンクタ（Ｏ．ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の表面抗原、
ｅ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３５ｋＤａに泳動するＴ．アクセイ（Ｔ．ａｘｅｉ）またはＴ．ビトリヌス（Ｔ．ｖｉｔｒｉｎｕｓ）の表面抗原、
ｆ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３０〜４５ｋＤａに泳動するＯ．オステルタギ（Ｏ．ｏｓｔｅｒｔａｇｉ）の表面抗原、
ｇ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２０ｋＤａおよび実質的に４５ｋＤａに泳動するＣ．オンコフェラ（Ｃ．ｏｎｃｏｐｈｅｒａ）の表面抗原、
ｈ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に９ｋＤＡおよび実質的に１２ｋＤａに泳動するＮ．ブラジリエンシス（Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の表面抗原、
ｉ）還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に３０ｋＤａに泳動するＤ．エッケルチ（Ｄ．ｅｃｋｅｒｔｉ）の表面抗原
から構成される群から選択されるＬ３の表面抗原と結合する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項４】
固体支持体と結合している場合に、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによって表面抗原を精製するために利用可能である、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項５】
２００２年１月２４日にＡＴＣＣに寄託され受託番号ＰＴＡ‐４００５を与えられたモノクローナル抗体ｍＡｂ  ＰＡＢ１と結合する、線虫Ｌ３由来の単離された炭水化物表面抗原。
【請求項６】
還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで実質的に２０〜３５ｋＤａの間に、または実質的に９ｋＤａおよび１２ｋＤａに泳動する、請求項５に実質的に記載の単離された抗原。
【請求項７】
Ｔ．コルブリフォルミスＬ３に由来する、請求項５に記載の単離された抗原。
【請求項８】
Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から取り出された線虫Ｌ３に由来する、請求項５に記載の単離された抗原。
【請求項９】
請求項５に記載の抗原と製薬上または獣医学上許容可能な担体または希釈剤とを含んでなる組成物。
【請求項１０】
線虫感染を予防し、治療し、該感染に対する感受性を低下させる組成物の製造における、請求項５に記載の抗原の使用。
【請求項１１】
Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から選択される線虫による、感受性のヒツジにおける線虫感染を予防し、治療し、該感染に対する感受性を低下させるための請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
これら他の種の線虫も前記のモノクローナル抗体ＰＡＢ‐１との反応によって同定される幼虫表面抗原を有することを特徴とする、ヒツジ以外の感受性の動物における線虫感染を予防し、治療し、該感染に対する感受性を低下させるための請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種のアジュバントまたはサイトカインも含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
感受性動物において線虫感染を診断する方法であって、
ａ）動物から血液試料を得る工程、および
ｂ）適切なアッセイによって、請求項３に記載の抗原に対する抗体の存在について試料を分析する工程
からなる方法。
【請求項１５】
Ｔ．コルブリフォルミス、Ｃ．クルチセイ、Ｎ．スパチゲル、Ｈ．コントルツス、Ｏ．シルキュムシンクタ、Ｔ．アクセイ、Ｔ．ビトリヌス、Ｏ．オステルタギ、Ｃ．オンコフェラ、Ｎ．ブラジリエンシスおよびＤ．エッケルチから構成される群から選択された線虫を用いた不完全感染によって免疫化済みの動物の胃腸管粘液に由来している、請求項３に記載の単離抗体。
【請求項１６】
請求項９に記載の組成物を投与することによって、動物の線虫感染を予防し、治療し、
または該感染に対する感受性を低下させる方法。
【請求項１７】
ヒツジまたは他の感受性動物において線虫感染を治療し、予防し、または該感染に対する感受性を低下させるために、ヒツジまたは他の感受性動物の腸粘液において抗体応答を惹起するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗原の使用。
【請求項１８】
ヒツジにおいて線虫感染を検出するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１９】
動物において線虫感染を判定するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗原の使用。
【請求項２０】
動物において線虫感染を判定するためのアッセイにおける、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗原の使用。
【請求項２１】
線虫感染の程度を測定するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗原の使用。
【請求項２２】
ａ）請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗原、および
ｂ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体
のうち少なくともいずれかから構成される群から選択される物質を用いて動物由来の試料をアッセイすることにより、動物における線虫耐性を判定する方法。
【国際調査報告】
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