(57)【要約】改善された凝集イムノアッセイは、ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体と、分析物を含み得るサンプル流体とを反応すること、次いで、決定されるべき分析物に特異的な抗体を添加することにより特徴づけられる。この分析物に特異的な抗体を添加することにより生じる凝集は、測定され、そしてサンプル中の分析物の量と相関される。本発明は、概して、改良された凝集イムノアッセイとして記載され得、ここで、反応成分の一つにおいて、決定されるべき分析物の結合体を含むことを必ずしも必要としない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の凝集によってサンプル中の分析物の存在を決定するための方法であって、該方法は以下：
（ａ）ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体を含む第１の試薬を得る工程；
（ｂ）該分析物に特異的な抗体を含む第２の試薬を得る工程；
（ｃ）該サンプルと該第１の試薬とを合わせる工程；
（ｄ）該第２の試薬を、工程（ｃ）の該合わせたサンプルおよび第１の試薬に添加する工程；
（ｅ）工程（ｄ）により生じる凝集の度合を測定する工程；および
（ｆ）工程（ｅ）において測定された凝集の度合を、該サンプル中の分析物の量と相関させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記分析物が、デオキシピリジノリン（Ｄｐｄ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分析物が、ジゴキシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分析物が、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ジェネリック抗体が、マウスＩｇＧに対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マウスＩｇＧが、Ｆｃ部分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記マウスＩｇＧに対する抗体が、ウサギに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記マウスＩｇＧに対する抗体が、ヤギに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記分析物に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
粒子の凝集によってサンプル中の分析物の存在を決定するためのシステムであって、該システムは以下：
（ａ）ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体を含む第１の試薬；
（ｂ）該分析物に特異的な抗体を含む第２の試薬であって、該試薬は、該試薬を合わせた場合に、（ａ）の該ラテックス粒子の凝集を引き起こす、試薬；および
（ｃ）該ラテックス粒子の凝集によって、所定の波長で吸収される光の量を測定し、それにより、該サンプルが、該第１の試薬と該第２の試薬とを合わせた場合に、サンプル中の該分析物の存在の効果を決定する、手段、
を備える、システム。
【請求項１１】
前記分析物が、Ｄｐｄである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記分析物が、ジゴキシンである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記分析物が、テオフィリンである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ジェネリック抗体が、マウスＩｇＧに対する抗体である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１５】
前記マウスＩｇＧが、Ｆｃ部分である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１６】
前記マウスＩｇＧに対する抗体が、ウサギに由来する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記マウスＩｇＧに対する抗体が、ヤギに由来する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記分析物に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１９】
粒子の凝集によってサンプル中の分析物の存在を決定するための方法であって、該方法は以下：
（ａ）ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体を含む第１の試薬を得る工程；
（ｂ）該分析物に特異的な抗体を含む第２の試薬を得る工程；
（ｃ）該第２の試薬と該第１の試薬とを合わせる工程；
（ｄ）該サンプルを、工程（ｃ）の該合わせた第１の試薬および第２の試薬に添加する工程；
（ｅ）工程（ｄ）により生じる凝集の度合を測定する工程；および
（ｆ）工程（ｅ）において測定された凝集の度合を、該サンプル中の分析物の量と相関させる工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、イムノアッセイに関する。このイムノアッセイにおいて反応物の凝集の度合は、サンプル中に存在する分析物の量を示すために用いられる。凝集アッセイは、長年に亘り抗原の存在または非存在の決定において用いられてきた。例えば、Ｕ．Ｓ．３，１７１，７８３は、妊娠を診断するための凝集アッセイの使用を記載する。より具体的には、本発明は、アッセイに関し、このアッセイにおいて、凝集は、特定の分析物に対するラテックス粒子に結合体化した抗体と、目的の分析物とキャリア分子との間の別の結合体との複合体の形成により生じる。サンプルが分析物を含む場合、これは結合体化した分析物と競合し、そして複合体の形成を減少させ、従って凝集を阻害する。凝集の度合に対する効果は、分光光度計において光の吸収によって測定され得る。しかしながら、この方法は欠点を有し、例えば、測定されるべき特定の抗原（分析物）を、アッセイにおいて用いられる試薬の一つとして供給することが必要である。さらに、別の試薬は、測定されるべき抗原（分析物）に特異的な抗体を含まねばならず、この抗体はまたラテックス粒子に結合体化されている。
【０００２】
凝集アッセイの実行は、アッセイにおいて用いるために、目的の分析物に特異的な抗体を、一般的には動物においてこのような抗体を発生させ、そしてこの抗体を回収および精製することによって得ることを必要とする。この抗体は、ラテックス粒子に結合体化（付着）され、そしてアッセイの第１の成分として用いられる。サンプル中に存在すると予測されるものに対応する分析物（抗原）は、合成的調製により、あるいは天然の供給源からの精製により得られ、次いで、キャリア分子（例えば、タンパク質またはポリマー）に結合体化され、そしてアッセイの第２の成分として用いられる。この抗原および抗体は一緒に結合するので、アッセイの第１の成分および第２の成分を合わせる場合、上に記載される大きな複合体が形成される。しかしながら、結合体化した分析物を含むサンプルが、第２の成分と最初に混合される場合、サンプル中に存在する任意の分析物は第２の成分中の分析物と競合し、そして凝集処理を干渉する。このような干渉の影響は、サンプル中の分析物の量に依存し、そしてこれは分光学的に決定され得る。
【０００３】
本発明は、ちょうど記載された凝集技術を用いて、分析物（デオキシピリジン、Ｄｐｄ）に対するイムノアッセイの開発中に、予想外に発見された。ラテックス粒子に結合体化した非特異的抗体が、凝集において生じる、分析物に特異的な抗体と結合する能力を有することが見出された。この効果は、サンプル中の分析物の存在によって阻害され、そしてサンプル中の分析物の量を決定するために測定され得た。分析物が、ラテックス粒子に結合体化している分析物に特異的な抗体と合わさったキャリアに結合体化した場合に、凝集が起こると予測されてきた。しかしながら、凝集は、分析物が存在しない場合でさえ起こることが見出された。さらに、分析物の非存在下で、分析物に特異的な抗体は、非特異的（ジェネリック）抗体に結合していた。サンプル中に分析物が存在する場合、これは存在する分析物の量に応じて凝集を干渉し、より単純であるが、しかし類似の凝集アッセイを可能にする。以下の実施例において示されるように、この新しい方法は、これが種々の供給源からの抗体に対して使用可能であると示されてきたので、一般的適用を有すようである。
【０００４】
ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの存在をモニタリングすることは、骨コラーゲンの分解を決定するための方法として示唆されてきた。例えば、Ｕ．Ｓ．５，６２０，８６０において、およびＵ．Ｓ．５，７３６，３４４において、抗体とピリジニウム（ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンを含む）架橋との間に形成される免疫複合体の量が、ピリジニウム架橋の存在を示すために測定された。この免疫複合体を測定するために使用される手段は、比色定量シグナルを生成するためのレポーター酵素、好ましくはアルカリホスファターゼの使用を含んだ。
【０００５】
Ｕ．Ｓ．４，４６９，７９７は、心臓病患者に投与される薬物であるジゴキシンの濃度をモニタリングする方法を考察する。凝集技術を含む、種々のタイプのイムノアッセイを使用され得ることが示唆された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、概して、改良された凝集イムノアッセイとして記載され得、ここで、反応成分の一つにおいて、決定されるべき分析物の結合体を含むことを必ずしも必要としない。
【０００７】
本発明は、以下の工程：
・ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体（例えば、マウスＩｇＧに対する抗体）を含む第１の試薬を得る工程；
・決定されるべき分析物に特異的な抗体（例えば、この分析物のモノクローナル抗体）を含む第２の試薬を得る工程；
・サンプル流体と第１の試薬とを合わせる工程；
・第２の試薬を、合わせた第１の試薬およびサンプルに添加する工程；
・合わせた第１の試薬およびサンプルに、第２の試薬を添加することにより生じた凝集の度合いを測定する工程；
・この凝集の度合を、サンプル中の分析物の量と相関させる工程、
を包含するように、より具体的に記載され得る。
【０００８】
一つの実施形態において、分析物はデオキシピリジノリン（Ｄｐｄ）である。別の実施形態において、分析物はジゴキシンである。第３の実施形態において、分析物はテオフィリンである。
【０００９】
別の局面において、本発明は上記のイムノアッセイを実行するためのシステムを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（好ましい実施形態の説明）
（予想外の発見）
骨密度を測定するための試験、骨粗鬆症および特定の疾患の検出のための試験における強い関心のために、デオキシピリジノリン（Ｄｐｄ）の存在についてのイムノアッセイが開発されてきた。例えば、上で議論されたＵＳ５，６２０，８６１（ここで、標識された抗体が、尿中でＤｐｄの存在に対して呈色反応を生成するために使用される）を参照のこと。本発明者らは、Ｄｐｄを測定するために凝集技術を使用することの可能性を調査していた。本発明者らは、ラテックスに結合体化したジェネリック抗体に、Ｄｐｄ特異的抗体を付加することにより、ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体（すなわち、Ｄｐｄに非特異的）の粒子サイズを決定しようと意図した。このラテックスに結合体化した抗体がジェネリックであり、そしてＤｐｄに特異的で無かったので、Ｄｐｄ特異的抗体の単層のみが、ラテックス粒子に付加されるだろうと予想された。驚いたことに、このＤｐｄ特異的抗体は、ラテックス粒子に付加し続け、従って、誰も予想していなかった凝集が生成されたことが見出された。次いで、Ｄｐｄを付加することにより凝集を阻害することが見出された際に、改善されたアッセイが、実現可能であることが発見された。
【００１１】
（抗体）
この新しいイムノアッセイにおいて有用な抗体は、市販のものを含む種々の供給源から得られ得る。抗体作製の方法は、当該分野において公知であり、そして本発明の一部ではない。以下の実施例は、抗マウスＩｇＧ（免疫グロブリンクラス）ならびにウサギおよびヤギからの抗体を、ラテックスに結合体化したジェネリック抗体として使用したが、他の類似の抗体の供給源（例えば、ヒツジ）も使用可能である。特定の分析物に対する抗体へのジェネリック抗体の結合体化は、重鎖（すなわち、Ｆｃ部分）で生じる必要があることが見出された。抗体の軽鎖（Ｆａｂ２部分）に対して特異的なジェネリック抗体は、十分な凝集反応を提供しなかった。
【００１２】
測定される分析物に特異的な抗体は、それらが分析物上の一つの特異的エピトープに対する結合体化を提供するので、通常モノクローナル抗体である。分析物に特異的なポリクローナル抗体が試験されていないとはいえ、モノクローナル抗体の応答に類似の応答が見出されるだろうということが考えられている。
【００１３】
（分析物）
実施例において、本発明の方法がデオキシピリジノリン、ジゴキシンおよびテオフィリンを用いて実証されてきたことが理解される。しかしながら、本発明はこれらの分析物に限定されず、イムノアッセイにおいて目的の他の分析物（例えば、ｈＣＧおよびトロポニン）と共に使用され得る。
【００１４】
（ラテックス粒子）
ラテックス粒子は、イムノアッセイの分野において周知であり、そして市販されている。それらは、一般的に水溶懸濁液の形態において供給される。この粒子は、典型的には約１〜１００μｍの直径を有し、そして抗体に結合体化し得る反応性の成分を含み、本発明の第１の試薬である、ジェネリック抗体に結合体化したラテックス粒子を形成する。
【００１５】
（新しい方法）
サンプル中の分析物の存在は、ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体を含む第１の試薬を、分析物を含んでいると予想されるサンプルと合わせ、次いでその分析物に特異的な抗体を含む第２の試薬が添加された場合に生じる凝集の度合により測定される。凝集の度合は、サンプル中の分析物の量に相関する。あるいは、第２の試薬が最初に添加され、サンプルが２番目に添加され得るが、必ずしも同一の結果を伴わない。
【００１６】
（マウスＩｇＧに対するラテックス結合抗体の調製）
以下の実施例において使用されるマウスＩｇＧに対するラテックス結合体化抗体の代表的な調製は、以下のとおりである：
使用される材料は以下である：
・１８１ｕｅｑ／ｇで１００ｎｍ粒子を有する１０％ラテックス−ＣＯＯＨ（Ｂａｎｇｓ  Ｐ０００１０４０ＣＮ）；
・２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．１−２．６６５ｇｍのＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ５２８３）を４５０ｍＬの水に添加し、０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．１に調整し、５００ｍＬにして、０．２２μｍフィルターを通して濾過することによって、５００ｍＬ調製した；
・２５ｍＭ  ＭＯＰＳＯ（３−Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ｐＨ７．４−０．２８１０ｇｍのＭＯＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ  ８３８９）を４５０ｍＬの水に添加し、０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、５００ｍＬにして、０．２２μｍフィルターを通して濾過することによって調製した；
・ＥＤＡＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロライド）（１０ｍｇ／ｍＬ）−１５．２ｍｇのＥＤＡＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ１７６９）を秤量し、使用の直前に１．５２ｍＬの水を添加して調製した；
・ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（５０ｍｇ／ｍＬ）；
・０．５Ｍエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ９５０８）ｐＨ８．５−ストック１６Ｍエタノールアミンを１：３２に希釈し、酢酸でｐＨ８．５に調整することによって調製した；
・マウスＩｇＧに対する抗体−ウサギまたはヤギ由来（Ｐｉｅｒｃｅ  ３１１９４またはＳｉｇｍａ）；
・保存緩衝液：０．１Ｍグリシン、ｐＨ８．２、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１７Ｍ  ＮａＣｌ、０．２％ＮａＮ３。
【００１７】
ストックラテックスを、５．０ｍＬの２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．１と共に２．２ｍＬのストック１０％ラテックス粒子を添加することによって洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心機ローターＪＡ−２０において、１６×７６ｍｍ遠心管を用いて、２０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。上清を捨て、そしてこのラテックスペレットを５ｍＬ  ＭＥＳ緩衝液中に再懸濁した。遠心分離を繰り返し、そして上清を捨てた。このラテックスペレットを、ＭＥＳ緩衝液で２．２ｍＬまで再懸濁させ、次いでこの混合物を氷槽において３０秒間超音波処理し、次いで使用時まで５℃で保管した。
【００１８】
保存したラテックス粒子を、再び超音波処理し、そして粒子サイズを測定した（平均１０９．３ｎｍ）。超音波処理した粒子の吸光度を、５３０ｎＭで測定し、そして固体の割合を、標準曲線から決定した（８８．６ｍｇ／ｍＬまたは８．８６％固体）。
【００１９】
２００μＬのラテックス粒子（２０ｍｇ）を、５００，０００ｍｗカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎコンセントレーター中の８００μＬの２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．１に添加した。０．１０４４ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＡＣ溶液を添加した。次いで、この混合物を２００ｒｐｍで回転させながら９０分間混合した。
【００２０】
このセントリコンを、回転板から取りだし、そして５，５００ｒｐｍで５０分間遠心分離し、濾液を捨てた。９００μＬの、このＭＥＳ緩衝液を、セントリコン中の２０ｍｇラテックス粒子に添加し、そしてこの混合物を超音波処理した。２００μｇの抗マウスＩｇＧを、ボルテックスしながらこのラテックスに添加した（１０μｇ抗体／ｍｇラテックス）。この混合物を、２００ｒｐｍで６０分間回転させ、選択した抗体へのラテックス粒子の結合体化を完了させた。
【００２１】
２０μＬの０．５エタノールアミンを、２０ｍｇの抗体／ラテックスに添加し、そして２００ｒｐｍで２０分間回転した。次に、１０μＬの５％ＢＳＡ溶液を添加し、そしてこの混合物を２００ｒｐｍで３０分間回転した。このエタノールアミンおよびＢＳＡは、ラテックス粒子に結合体化していない抗体上の結合部位をブロックするために供する。
【００２２】
過剰抗体（結合していない）を、次に２５ｍＭ  ＭＯＰＳＯ溶液を用いて、ラテックス粒子から４回洗浄した。各洗浄に対して、９００μＬのＭＯＰＳＯ溶液を、セントリコンコンセントレーターに添加し、超音波処理し、次いで５，５００ｒｐｍで５０分間遠心分離した。濾液を、遠心分離の各期間の後に取り除き、そしてすべての過剰ＢＳＡがいつ取り除かれたか決定するために吸光度を２８０ｎＭで測定した。
【００２３】
この洗浄工程により得られたラテックスに結合体化した抗体ペレットを、９００μＬの緩衝液と合わせ、超音波処理し、そしてバイアルに移した。次いで、さらに９００μＬの緩衝液を、このＣｅｎｔｒｉｃｏｎ管に添加し、超音波処理し、そしてバイアルに移した。十分な緩衝液を、このバイアルに添加し、総量を３ｍＬにし、そして超音波処理した。５３０ｎＭで吸光度を測定し、ラテックス濃度を決定した。
【実施例】
【００２４】
（実施例１：比較）
本実施例において、慣習的な凝集プロトコルを、操作可能であるように示す。５３０ｎＭの光波および３７℃で凝集の度合を測定するＲｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ分析器を使用した。ラテックス粒子とマウスＩｇＧ（Ｆｃ画分）に対する抗体との結合体（２００μＬ）を、０ｎＭまたは２００ｎＭのＤｐｄを含んでいる２５μＬのサンプルと混合した。次いで、Ｄｐｄに対する抗体を添加し、そして吸光度を読取り、Ｄｐｄの存在に関連する凝集の度合いを示した。ニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）：ビオチン（ラテックス粒子を含んでいるものとラテックス粒子を含んでいないものの両方）と結合体化したＤｐｄ（分析物）を含んでいるサンプルについて試験した。下の表において、「ダブルラテックスシステム」と標識される試験とは、マウスＩｇＧ抗体およびＤｐｄ（分析物）を含むサンプルの両方がラテックス粒子に結合体化された試験をいう。「シングルラテックスシステム」と標識される試験においては、Ｄｐｄを含むサンプルはラテックス粒子に結合体化されないが、Ｒ１−９〜Ｒ−１１と標識される結果については、Ｄｐｄはニュートラビジン：ビオチンに結合体化された。Ｒ１−１４およびＲ１−１７の結果において、Ｄｐｄはキャリアに結合体化されなかった。後者の試験において、Ｒ１−１４およびＲ１−１７と標識される結果は、サンプル中にＤｐｄ（分析物）が存在しない場合を示し、Ｄｐｄに対する抗体をマウスＩｇＧ抗体／ラテックスと合わせた場合に、凝集がさらに起こり、そしてＤｐｄが存在する場合、凝集は減少された。試験Ｒ１−９、Ｒ１−１０、Ｒ１−１１およびＲ１−１４を比較試験する場合、この結果は、ニュートラビジン：ビオチンキャリアまたはラテックス粒子の使用に依存しなかったことが理解され得る。従って、従来の凝集アッセイは、本発明によって単純化され得る。ラテックス粒子に結合体化したジェネリック抗体は、目的の分析物に特異的な抗体と接触した場合、凝集を引き起こし、そしてこの凝集の度合いは、分析物の存在によって減少される。
【００２５】
【表Ａ１】
2006518042.tif 000002
（１）ダブルラテックスシステムにおける、ラテックス粒子に対するアビジン：ビオチンキャリアに結合体化したＤｐｄ（分析物）の量。
【００２６】
（２）（３）ｍＡ／分において報告される吸光度に対する、サンプル中に存在するＤｐｄの量。
【００２７】
（４）ｍＡ／分における吸光度における違い。
【００２８】
（５）Ｄｐｄ（＜Ｄｐｄ＞）に対する抗体の添加後の、吸光度測定の時間。
【００２９】
（実施例２）
上の試験において、マウスＩｇＧに対する抗体を、（Ｄｐｄに対する抗体のような）抗体のＦｃ画分であると示した。上記のＲ１−１４およびＲ１−１７のように報告された試験と類似の試験において、Ｄｐｄに対する抗体は、Ｆｃ画分ではなく、代わりにＦ（ａｂ’）（２）フラグメントであった。このＦ（ａｂ’）（２）フラグメントは、抗原に結合体化する抗体の一部分であり、一方Ｆｃ部分は抗原を破壊し得る免疫系の細胞（例えば、貪食細胞）に結合体化する。実施例１において示された結果とは対照的に、Ｄｐｄに対する抗体のＦ（ａｂ’）（２）フラグメントは、凝集を引き起こさないことが見出された。分析物（抗原）に対する抗体は、Ｆｃ部分であるべきであり、そして凝集は分析物に対する抗体のＦｃ部分によって影響を受けると結論付けられ得る。
【００３０】
（実施例３）
実施例１におけるＲ１−１４およびＲ１−１７の試験と類似するが、分析物としてＤｐｄの代わりにピリジノリン（Ｐｙｄ）を使用して、別の試験を実施した。凝集が起こったことが見出されたが、それはＰｙｄによってほとんど阻害されていないことが見出された。従って、本発明のアッセイは、Ｄｐｄの存在を測定するために有用であるが、Ｐｙｄ化合物には関しないと結論付けられた。
【００３１】
（実施例４）
実施例３の結果を、実施例１（Ｒ１−１４およびＲ１−１７）におけるＤｐｄに対する抗体の変わりに、ジゴキシンに対する抗体を用いた別の試験において確認した。凝集は達成されたが、分析物としてＤｐｄを添加することにより、凝集を阻害しなかった。従って、このアッセイのＤｐｄに対する特異性および、非特異的結合が確認された。
【００３２】
（実施例５）
実施例１において使用した吸光度における変化、すなわち０分と２分との間の差を報告する第２の方法を選択して、試験を実施し、従来の凝集アッセイと本発明のアッセイ方法とを比較した。各アッセイにおいて使用される３つの成分を以下のようにまとめた：
【００３３】
【表Ａ２】
2006518042.tif 000003
１０μｇの結合体化したマウスＩｇＧおよび４０μgのニュートラビジン：ビオチン−Ｄｐｄを、５μｇ／ｍｇのＤｐｄに対する抗体（すなわち、従来のアッセイにおける＜Ｄｐｄ＞）と合わせた。本発明のアッセイにおいて、１０μｇの結合体化したマウスＩｇＧ（Ｆｃ）を、５μｇ／ｍｇの＜Ｄｐｄ＞と合わせた。このＤｐｄを、漸増量で添加し、２分後に吸光度を測定した。結果を表Ｂにまとめた。
【００３４】
【表Ｂ】
2006518042.tif 000004
Ｄｐｄの添加に伴う吸光度の変化は、マウスＩｇＧに対する抗体に結合体化したラテックス粒子の凝集における阻害を示す。吸光度についての効果は、従来のアッセイと比較して、本発明のアッセイにおいて有意に大きいことが理解され得る。
【００３５】
より詳細な研究を、本発明のアッセイに対して実施し、その精度を試験した。０ｎＭ〜２００ｎＭの範囲のＤｐｄにおいて、変異係数は１０％未満であったことが見出された。
【００３６】
（実施例６）
本発明のアッセイを、Ｄｐｄではなくジゴキシン（治療用薬物）を用いて繰返した。使用した要素は以下のとおりである：
第１の成分：ラテックス−マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対する抗体、１０μｇ
第２の成分：ジゴキシンに対する抗体（＜ジゴキシン＞）、５μｇ／ｍｇ
サンプル：ジゴキシン
このアッセイを、ジゴキシンをＤｐｄに置き換えて繰返した。この試験の結果を以下の表に示す。
【００３７】
【表Ｃ】
2006518042.tif 000005
実施例４のＤｐｄシステムにおける、ジゴキシンの使用において真だったように、Ｄｐｄはジゴキシンシステムの凝集を阻害しなかったということが理解され得る。しかしながら、本発明のアッセイは、第２の成分がジゴキシンに対する抗体であった場合に、ジゴキシンの存在を測定することにおいて有用であった。
【００３８】
（実施例７）
凝集の阻害が、ラテックス粒子に結合体化したマウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対する抗体の濃度によって影響を受けることが見出されてきた。最適な濃度は、実験において見出され、上記の実施例において代表的に使用した１０μｇ／ｍｇ濃度のマウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対する抗体を、１０倍、２０倍および４０倍に希釈した。Ｄｐｄ（分析物）の０ｎＭの添加と１００ｎＭの添加との間の吸光度変化を測定し、そして以下の表において比較した。Ｄｐｄに対する抗体を、また変えた。なぜならその濃度が凝集の度合に影響を及ぼすからである。Ｄｐｄ抗体の３種類の濃度（５．３４μｇ／ｍｇ、１３．３４μｇ／ｍｇおよび２６．６８μｇ／ｍｇ）を試験した。
【００３９】
【表Ｄ】
2006518042.tif 000006
１３．３４μｇ／ｍＬのＤｐｄに対する抗体（＜Ｄｐｄ＞）での、ラテックス／抗マウスＩｇＧの約２０倍希釈の最適な希釈が、凝集阻害において最大の変化を提供することが理解され得る。
【００４０】
（実施例８）
ラテックス粒子に結合体化したマウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対する抗体（１０μｇ／ｍｇ）の２０倍希釈および実施例７において見出されるＤｐｄに対する抗体（＜Ｄｐｄ＞）（１３．３４μｇ／ｍＬ）を使用して、最適な凝集阻害、種々の濃度のＤｐｄ（分析物）の一連の１６複製物を提供した。概して、変異係数は１０％以下であることが見出された。例外を、Ｄｐｄの最も低い濃度に限定した。
【００４１】
（実施例９）
前述の実施例により、ヤギおよびウサギの供給源から得たマウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するラテックスに結合体化した抗体を使用して得た結果を報告してきた。マウスＩｇＧに対する抗体の他の供給源のさらなる試験を実施し、そして以下に報告する。使用した供給源は、以下のとおりであった：
（ａ）マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するウサギ由来抗体
（ｂ）マウスＩｇＧに対するウサギ由来抗体−異なる供給業者からの（ａ）の複製
（ｃ）マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するヤギ由来抗体
（ｄ）マウスＩｇＧ（Ｆａｂ２）に対するヤギ由来抗体
（ｅ）マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖）に対するウサギ由来抗体
（ｆ）マウスＩｇＧ（重鎖）に対するヤギ由来抗体
（ｇ）ヒト血清タンパク質に対して吸収される、マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するヤギ由来抗体。
【００４２】
これらの抗体（ａ）〜（ｇ）の各々を、ラテックス粒子（１０μｇ／ｍＬ）に結合体化させた。Ｄｐｄに対する抗体の濃度は、１３．３４μｇ／ｍＬであった。Ｄｐｄ（分析物）を、０ｎＭと３０９ｎＭとの間の濃度で添加した。０．５秒後および１２０秒後に吸光度を測定した。結果を以下の表に示す：
【００４３】
【表Ｅ】
2006518042.tif 000007
マウスＩｇＧに対する抗体の供給源は、この結果に関し重要では無かったが、使用される抗体の一部分は、Ｄにおいて示される（Ｆａｂ２部分が凝集しなかった）ように重要であり得たことが見出され得る。サンプル間の吸収の変化において、有意な差が存在した。
【００４４】
（実施例１０）
本発明の方法を、ヒト血清中のテオフィリンの存在をモニタリングするために使用した場合、ヒト血清が凝集に影響を及ぼすようであることが見出された。実験において、マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するウサギ由来抗体の１０μｇと結合体化したラテックスを、ヒト血清中において、テオフィリンに対するモノクローナル抗体および３つの既知濃度のテオフィリン（Ｃｈｉｒｏｎ）と合わせた。
【００４５】
ヒト血清の効果のさらなる研究を、マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するウサギ由来抗体およびテオフィリンに対するモノクローナル抗体を用いて実施した。テオフィリンを含まない血清を、試験し、次いで血清で希釈し、血清が血清中にテオフィリンを含む場合に見られた結果の原因であるか否か決定した。結果を以下の表に示す。
【００４６】
【表Ｆ】
2006518042.tif 000008
上の表から、血清が凝集を強く阻害していたことは明らかである。血清を緩衝溶液で１：５１２の比率で希釈した後、血清の効果は実質的に排除された。
【００４７】
その後、血清のサンプルを、１０，０００分子量、１００，０００分子量および５００，０００分子量未満の分子を遮断するＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを通して濾過した。これらの濾過した血清サンプルを、次いで類似のアッセイにおける濾過していない血清と比較し、以下の結果を伴った：
【００４８】
【表Ｇ】
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血清サンプルにおいて、１０，０００分子量および１００，０００分子量よりも大きい分子は、凝集に有意に影響せず、一方５００，０００ＭＷ未満の分子を含むサンプルは凝集を阻害したので、血清中の約１００，０００ＭＷよりも大きい分子が、阻害効果の原因であるということが結論付けられた。
【００４９】
（実施例１１）
８７個の臨床的尿サンプルのセットを、ラテックス粒子に結合体化したマウスＩｇＧ（Ｆｃ）に対するウサギ由来抗体の１０μｇ／ｍＬおよびＤｐｄに対する抗体の１３．３４μｇ／ｍＬを用いて試験した。この結果を、Ｂａｙｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ−１ＴＭ  Ａｕｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｐｄ  Ａｓｓａｙ）を用いて得られた結果と比較した。この結果は、方向性は似ていたが、相関を８５％まで改善する４つの範囲外にある値を取り除いたにも関わらず、統計的な相関はわずかに約５０％であった。
【国際調査報告】
2006518042.tif 000010