(57)【要約】テネウリンシグナリングの検出方法であって、開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、開裂テネウリン生成物の存在および／または量とテネウリンシグナリングの相関関係を明らかにする段階を含む方法が提供される。本方法は、可能性のある抗腫瘍薬剤またはニューロン分化をモジュレーションする薬剤をスクリーニングするのに使用され得る。テネウリンの細胞質ドメインまたはその各標的、例えばポンシン、ＰＭＬおよびｚｉｃの存在を増加または減少させる能力について、試験物質を検定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テネウリンシグナリングの検出方法であって、
ａ）テネウリンシグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物の存在を測定し、ただし該開裂テネウリン生成物は、テネウリンの細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、細胞核へターゲッティングするものとし、そして
ｂ）テネウリンシグナリングと該開裂テネウリン生成物の存在および／または量の相関関係を明らかにする
ことを含む方法。
【請求項２】
該テネウリンが、テネウリン−１、テネウリン−２、テネウリン−３またはテネウリン−４である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
開裂テネウリン生成物が腫瘍細胞で形成される、請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
開裂テネウリン生成物がニューロンで形成される、請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
テネウリンまたはテネウリンのＮ末端ドメインの少なくとも一部分およびテネウリンのＣ末端ドメインの少なくとも一部分を含むそのフラグメント、およびテネウリンを開裂する細胞成分を供給する段階をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
テネウリンが組換え体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
開裂テネウリン生成物がタグまたは標識を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
測定段階（ｂ）が、光度計による該タグまたは標識の検出を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該タグが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ヘマグルタニン、（ヒスチジン）７、ＤＮＡ結合ドメインから成る群から選択される、請求項７または８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
測定段階（ｂ）において、リポーター遺伝子に機能し得るように連結された調節配列を含む核酸にＤＮＡ結合ドメインを結合させ、該リポーター遺伝子の活性を検出する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該ＤＮＡ結合ドメインがＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該タグがＤＮＡ結合ドメインであり、さらにＮＦκＢドメインを含む、請求項９、１０または１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
該測定段階が、該開裂テナシン生成物の量の測定を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
開裂テネウリン生成物が、細胞標的の発現または活性を調節する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
該細胞標的の発現または活性の検出をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該細胞標的がＰＭＬである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該細胞標的がＺｉｃである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該細胞標的がポンシンである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
開裂テネウリン生成物の存在および／または量が特定疾患または状態と相関関係を示す、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該疾患または状態が、細胞増殖および／またはニューロン分化に依存する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
テネウリンシグナリングにより影響される神経病理学的または細胞病理学的病状の診断方法における、テネウリンシグナリングに随伴する検出可能な開裂テネウリン生成物の使用。
【請求項２２】
テネウリンシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、
（ａ）テネウリンを少なくとも１種の薬剤と接触させ、
（ｂ）該薬剤の存在下でテネウリンシグナリングに随伴する細胞成分による該テネウリンの開裂を検出し、そして
（ｃ）テネウリンシグナリングのモジュレーションに有効な薬剤の存在を示す場合と該薬剤が存在しない場合に関する該テネウリンの開裂における差異の相関関係を明らかにする
段階を含む方法。
【請求項２３】
段階（ａ）が、組換えテネウリンを発現する細胞に薬剤を振りかけることにより実施される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
テネウリンを介するシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、
（ａ）細胞を薬剤に曝露し、
（ｂ）該細胞においてテネウリンにより調節される遺伝子の発現または活性を検出し、そして
（ｃ）該遺伝子の発現または活性の変化とテネウリンシグナリングのモジュレーターの存在との相関関係を明らかにする
段階を含む方法。
【請求項２５】
神経病理学的病状の処置用または予防的処置用の医薬の製造における、請求項２２〜２４のいずれか１項記載の方法により検出される薬剤の使用。
【請求項２６】
腫瘍発生または癌の処置用または予防的処置用の医薬の製造を目的とする、請求項２２〜２４のいずれか１項記載の方法により検出される薬剤の使用。
【請求項２７】
腫瘍発生または癌の処置用または予防的処置用の医薬の製造を目的とする、テネウリンシグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物の使用であって、該開裂テネウリン生成物が、テネウリンの細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、細胞核へターゲッティングするものである使用。
【請求項２８】
神経病理学的病状の処置用または予防的処置用の医薬の製造を目的とする、テネウリンシグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物の使用であって、該開裂テネウリン生成物が、テネウリンの細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、細胞核へターゲッティングするものである使用。
【請求項２９】
腫瘍発生、癌または神経病理学的病状の処置または予防的処置を必要とする個体の処置方法であって、該個体の症状を改善するのに充分な有効量の請求項２２〜２４のいずれか１項により同定された薬剤を投与することを含む方法。
【請求項３０】
腫瘍発生、癌または神経病理学的病状の処置または予防的処置を必要とする個体の処置方法であって、該個体の症状を改善するのに充分なテネウリンの細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、細胞核へターゲッティングする有効量の開裂テネウリン生成物を投与することを含む方法。
【請求項３１】
開裂テネウリン生成物および開裂テネウリン生成物の細胞標的を含む組成物。
【請求項３２】
開裂テネウリン生成物が、テネウリンの細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、細胞核へターゲッティングする、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
該細胞標的がＰＭＬである、請求項３１または３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３４】
該細胞標的がＺｉｃである、請求項３１または３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３５】
該細胞標的がポンシンである、請求項３１または３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３６】
該細胞標的がｍｙｃである、請求項３１または３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３７】
該細胞標的がｐ５３である、請求項３１または３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３８】
テネウリンおよびプロテアーゼを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テネウリンシグナリングの検出方法、および神経生物学および腫瘍学分野での適用を伴うテネウリンシグナリングのモジュレーションに有効な薬剤のスクリーニング方法に関する。特に、テネウリンシグナリングに影響する薬剤は、抗腫瘍および／または抗腫瘍発生薬剤として、またはニューロン分化、発生あるいは再生のモジュレーションに
有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
テネウリンは、ショウジョウバエ（Drosophila）で最初に発見されたII型貫膜タンパク質のファミリーである。最初の要員はＴｅｎ−ａ（Baumgartner および Chiquet-Ehrismann (1993) Mech Dev 40: 165-76; Minet および Chiquet-Ehrismann (2000) Gene 257: 87-97）であり、テナシンのショウジョウバエ（Drosophila）相同体についての検索で見出されたもので、このタンパク質ファミリーと同じタイプのＥＧＦ様反復を共有する。テネウリンファミリーの第二要員、ショウジョウバエ Ｔｅｎ−ｍ／Ｏｄｄ ｏｚ（Ｏｄｚ； Baumgartner et al. (1994) Embo J 13: 3728-40）は、初期胚の胚盤葉段階中における７本の縞(stripe)で発現される。突然変異解析は、ｔｅｎ−ｍ／ｏｄｚが「ペア・ルール」遺伝子ファミリーの一員であり、胚分割決定において中心的役割を有する細胞外タンパク質についてコード化することを示した。発達中の胚およびハエ成虫における発現パターンは、このタンパク質の存在が、多くの場合、特に、原腸形成中、気管系の発生、初期軸索および発達中の眼における形態発生的細胞運動の場所と一致することから、後期発達過程におけるこのタンパク質のさらなる重要な活性を示唆している（Baumgartner et al. (1994) Embo J 13: 3728-40); (Levine et al. (1994) Cell 77: 587-98); (Levine et al. (1997) Dev Dyn 209: 1-14）。
【０００３】
脊椎動物は、それぞれｔｅｎ−ｍ１−４（Oohashi et al. (1999) J Cell Biol 145: 563-77）、ｏｄｚ１−４（Ben-Zur et al. (2000) Dev Biol 217: 107-20）またはテネウリン１−４（Minet および Chiquet-Ehrismann (2000) Gene 257: 87-97）と呼ばれる４種のｔｅｎ−ａ／ｔｅｎ−ｍ相同体を含む。最近の研究は、ニワトリにおけるこのファミリーのタンパク質の２種の新たな要員、すなわちテネウリン−１およびテネウリン−２を明らかにした。ショウジョウバエおよびニワトリタンパク質は両方とも、胚発生の初期段階、特に発達中の神経系で発現され、細胞骨格とテネウリン−２の相互作用を示唆している。神経芽細胞腫細胞系における組換えテネウリン−２の発現により、糸状仮足形成および拡大成長円錐が誘導されると思われる（Rubin et al. (1999) Dev Biol 216: 195-209）。
【０００４】
マウスＤＯＣ４、すなわちテネウリンファミリーの最初の脊椎動物要員は、小胞体におけるタンパク質折りたたみの摂動に応じて発現されるタンパク質についてのスクリーンで同定された（Wang et al. (1998) Embo J 17, 3619-30）。マウスＤＯＣ４および同定された他の全ての脊椎動物テネウリン−すなわち、マウステネウリンｔｅｎ−ｍ１−４／ｏｄｚ１−４（Oohashi et al. (1999) J Cell Biol 145: 563-7);(Ben-Zur et al. (2000) Dev Biol 217: 107-20）、ラットテネウリン−２オーソログ、ネウレスチン（Otaki および Firestein (1999) Dev Biol 212: 165-81）、ニワトリテネウリン−１、−２および−４（Minet et al. (1999) J Cell Sci 112: 2019-32); (Rubin et al. (1999) Dev Biol 216: 195-209); (Tucker et al. (2000) Mech Dev 98, 187-91); (Tucker et al. (2001) Dev Dyn 220: 27-39）およびゼブラダニオＴｅｎ−ｍ３およびＴｅｎ−ｍ４（Mieda et al. (1999) Mech Dev 87, 223-7）−は、中枢神経系の特異領域で顕著に発現されることが見出された。
【０００５】
神経系におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる転写物局在性および神経芽細胞腫におけるアクチン細胞骨格の組織におけるテネウリン−２の可能性のある関与以外、テネウリン類の分布および機能についてはほとんど知られていない。テネウリンは、貫膜タンパク質であることが知られており、シグナル変換に関与すると想定されている。テネウリンは、リガンドの同種または異種親和的結合時、細胞内側へシグナルを伝達する受容体タンパク質としてあるいは膜結合リガンドとして機能し得ると示唆されている。テネウリン−２については、細胞膜から細胞外ドメインの大部分を放出しながら細胞膜で開裂され、可溶性リガンドとして作用し得るか、または開裂はリガンド結合後に起こりシグナル変換を誘発し得ると考えられている（Rubin et al., Developmental Biology, 216, 195-209, 1999）。
【０００６】
貫膜タンパク質がシグナリング分子としてのそれらの役割を達成し得る可能な一シナリオは、調節された膜内部でのタンパク質切断（ＲＩＰ；Brown et al. (2000) Cell 100, 391-98で概説）として最近報告された機構によるものである。ＲＩＰは、膜および膜中における少なくとも２つの開裂段階を伴うことにより、可溶性細胞質部分を生じさせ、それが転写に関与する核へ転移される（Ebinu および Yankner (2002) Neuron 34(4):499-502）。ＲＩＰは、多様な細胞および発生過程を制御することが知られている。しかしながら、貫膜タンパク質は、代替的機構、例えばリガンド結合、受容体結合、およびキナーゼ／ホスファターゼカスケードを通したシグナリングなどによりシグナル伝達を開始させ得ることはよく知られている。事実、ショウジョウバエ ｔｅｎ−ｍは、シグナル伝達カスケードを介してショウジョウバエ ペア・ルール遺伝子、異常対合(Odd‐paired)（ｏｐａ）タンパク質の活性をモジュレーションすると想定されていたが（Baumgartner et al., 1994, EMBO J. 13: 3728-3740）、Ｏｄｚの細胞内開裂間の類似性はノッチの場合にたとえられている（Dgany and Wides, Biochem J. (2992) 363:633-643）。それにもかかわらず、Ｏｄｚのいずれかの部分が核へ転移するという証拠は全く存在しない。さらに、マウスＴｅｎ ｍ１の細胞外ドメインは、同種親和的結合を呈することにより、シグナル伝達経路を開始させることが見出された（Oohashi et al., 1999）。
【０００７】
Ｚｉｃ遺伝子（Ｚｉｃ１−４）は、ｏｐａと相同性のジンクフィンガータンパク質をコード化し、発達中および成熟ＣＮＳの両方で発現される。脊椎動物神経発達において、それらは、一般的に背側神経管で発現される。類似ジンクフィンガー遺伝子、Ｏｐｒはマウスでも報告されている（Furushima et al. (2000) Mech. of Development 98, 161-64）。Ｚｉｃ１は、ニューロン分化の進行を阻害することによりニューロン前駆体の拡大を制御する。ニューロン分化のノッチを介した阻害は、ノッチ１がマウスおよびニワトリの両方におけるＺｉｃ１過剰発現中の脊椎で上方制御されることから、Ｚｉｃ遺伝子の下流で作用すると思われる（Aruga et al. (2002) Dev Biol. 244(2):329-41）。マウスにおけるＺｉｃ２の発現低下により、二分脊椎および全前脳症が誘発される。重複発現パターンを有するＺｉｃ２の強力な相同体である、Ｚｉｃ１の破壊により、脳奇形がもたらされる。Ｚｉｃ２およびＺｉｃ１は、ニューロン分化を調節することにより共同して小脳の発達を制御することが示された（Aruga et al. (2002) J Neurosci 22(1):218-25）。
【０００８】
ポンシン（ponsin）（ＳＨ３Ｐ１２、ＣＡＰまたはＦＬＡＦ２としても知られている）遺伝子は、ポンシン／ＡｒｇＢＰ２／ベネキシンファミリーに属するタンパク質をコード化する。このファミリーの全要員は、３つのＳＨ３（ｓｒｃ homology ３ region）ドメインを含む。ポンシンタンパク質が、細胞−細胞および細胞−マトリックス接着結合で、Ｆ−アクチン結合タンパク質であるビンクリンと、または接着帯でアファジンと相互作用するのは、これらのＳＨ３ドメインを介している（Mandai et al. (1999) J. Cell Biol. 144: 1001-1017）。ポンシンはまた、非受容体焦点接着チロシンキナーゼｐ１２５ＦＡＫと直接相互作用する（Ribon et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273: 4073-4080）。ポンシンｍＲＮＡの幾つかのスプライス変異型が存在し、それらはＥＢ−１細胞におけるｐ５３の発現により、およびＴＫ６細胞のアドリアマイシン処理により特異的に上方制御される（Kostic et al. (2000) Oncogene 19(35):3978-87）。結腸腫瘍における野生型ｐ５３機能の喪失は、基底膜を横切る腫瘍塊の移動と一致する。
【０００９】
ＰＭＬ（前骨髄球性白血病におけるその優勢さ故に命名されたタンパク質）は、アポトーシス、細胞増殖および老化を制御する核タンパク質であり、ジンクフィンガー転写因子であると考えられている。急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の染色体転座に関与するＰＭＬ遺伝子は、ＰＭＬボディと呼ばれる核部分構造に位置し、腫瘍抑制においてある役割を演じるタンパク質をコード化する（Seeler et al. (1999) Curr Opin Genet Dev. 9(3):362-7; または Salomoni および Pandolfi (2002) Cell 108, 165-70で概説）。
【００１０】
神経病理学的、神経発生的および神経変性疾患または状態の発生ならびに他の治療領域、例えば癌に関与するシグナリング経路および遺伝子を発見することにより、より正確かつ有効にこれらの疾患を診断および処置することが要望されている。本発明により提供されるテネウリンシグナリング経路のより完全な描写および経路の成分の同定はこの要望を満たしている。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の第一局面によると、テネウリンシグナリング検出方法であって、（ｉ）テネウリンまたはそのフラグメント、ただしテネウリンのＮ−末端ドメインの少なくとも一部分およびテネウリンのＣ−末端の少なくとも一部分を含むフラグメント、および（ii）テネウリンを開裂する細胞成分を供給し、シグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、そして開裂テネウリン生成物の存在および／または量とテネウリンシグナリングとの相関関係を明らかにすることを含む方法が提供される。開裂テネウリン生成物は、テネウリンの細胞質ドメインまたはそのフラグメントを含み、ＰＭＬ核小体を含む腫瘍細胞またはニューロンに存在し得るが、これに限定されない。一実施態様において、テネウリンはテネウリン−１であり、別の実施態様ではテネウリン−２、テネウリン−３またはテネウリン−４である。
【００１２】
さらに、本発明のテネウリンシグナリング検出方法は、テネウリンを検出可能なタグまたは標識で標識することを含む。一局面では、標識テネウリンは組換え体である。本発明の別の実施態様では、開裂テネウリン生成物は、検出可能なタグまたは標識を含む。上記タグまたは標識は、光度計により検出され得、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）であり得るが、これらに限定されない。
【００１３】
一局面において、シグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物の存在および／または量の測定は定性的である。さらなる局面では、測定は定量的である（すなわち、開裂テネウリンの量がその存在だけではなく検出される）。
【００１４】
さらなる実施態様では、テネウリンシグナリング検出方法であって、さらに細胞またはその始原細胞へ導入された標的テネウリンについてコード化する核酸からタグ付きテネウリンを発現させることを含む方法が提供され、該タグは、リポーター遺伝子に機能し得るように連結された調節配列を含む核酸に結合するＤＮＡ結合ドメインを含み得る。該ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ ４ ＤＮＡ結合ドメインを含み得る、これに限定されない。別の実施態様において、該タグはさらにＮＦκＢドメインを含む。本発明は、さらに細胞、例えば腫瘍細胞またはニューロンで安定して発現されるタグ付きテネウリンについてコード化する核酸を含む。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、テネウリンシグナリング検出方法を提供し、その場合、開裂テネウリン生成物は、それ自体細胞増殖またはニューロン分化のモジュレーターである細胞標的、例えばＰＭＬ、Ｚｉｃ、ポンシン、ｐ５３およびｍｙｃの発現または活性を調節するか、または開裂テネウリン生成物は、核へターゲッティングする。開裂テネウリン生成物の該細胞標的は、発現アレイ解析により検出され得る。
【００１６】
また、検出可能な開裂テネウリン生成物の存在および／または量が特定疾患と相関関係を示すテネウリンシグナリング検出方法も提供される。この方法は、開裂テネウリン生成物が細胞増殖またはニューロン分化に関与するか否かを測定するために実施され得る。
【００１７】
一実施態様において、テネウリンを介したシグナリングに影響を及ぼす神経病理学的または細胞病理学的病状のインビトロ診断方法であって、診断が望まれる動物から抽出された細胞において本発明の上記方法を実施することを含む方法が提供される。
【００１８】
別の実施態様は、テネウリンシグナリングに影響を及ぼす神経病理学的または細胞病理学的病状のインビボ診断方法におけるテネウリンシグナリングに随伴する検出可能な開裂テネウリン生成物の使用に関するものであり、この方法は上記の本発明方法の実施を含む。
【００１９】
さらに本発明は、テネウリンシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、
（ａ）テネウリンを、細胞成分の存在下、少なくとも１種の薬剤と接触させ、
（ｂ）本発明方法の使用により上記薬剤の存在または非存在下でテネウリンの開裂を検出し、そして
（ｃ）上記薬剤の非存在下で得られた値と段階（ｂ）で得られた値の相関関係を明らかにし、そしてテネウリンシグナリングのモジュレーションに有効な薬剤の存在の指標として値間の差異の相関関係を明らかにする
段階を含む方法を提供する。
【００２０】
別の局面では、テネウリンシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、さらに（ａ）細胞における開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、（ｂ）テネウリンを発現する細胞を薬剤に曝露し、（ｃ）薬剤の存在下における開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、そして（ｄ）（ａ）および（ｃ）で得られた測定結果を比較することを含む方法が提供される。また、段階（ｂ）が細胞に薬剤を振りかけることにより実施される方法が提供される。
【００２１】
別の局面では、テネウリンを介したシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、（ａ）細胞においてテネウリンにより調節される遺伝子の発現または活性を測定し、（ｂ）細胞を薬剤に曝露し、（ｃ）薬剤の存在下、上記細胞においてテネウリンにより調節される遺伝子の発現または活性を測定し、そして（ｄ）テネウリンシグナリングを調節する薬剤の能力と段階（ｃ）と比べた段階（ａ）におけるモジュレーション値の相関関係を明らかにする段階を含む方法が提供される。
【００２２】
また、細胞増殖をモジュレーションする可能性についての化合物または神経変性疾患または障害の処置または癌の処置についての化合物のスクリーニング方法であって、本発明方法の使用によりテネウリンシグナリングをモジュレーションする化合物の能力を評価することを含む方法が提供される。別の実施態様では、さらに試験結果が陽性である薬剤の後続の単離および／または製造および／または処置方法での使用段階を含むスクリーニング方法が提供される。
【００２３】
さらなる局面では、腫瘍発生または癌の処置あるいは予防処置、または神経病理学的病状の処置または予防処置を目的とする、本発明スクリーニング方法により検出される組成物が提供される。スクリーニング方法により検出される組成物は、腫瘍発生または癌の処置あるいは予防処置用の医薬の製造、または神経病理学的病状の処置または予防処置用の医薬の製造に使用され得る。
【００２４】
また、腫瘍発生または癌あるいは神経病理学的病状の処置または予防処置用の医薬の製造を目的とする開裂テネウリン生成物の使用が提供される。
【００２５】
さらに、開裂テネウリン生成物および開裂テネウリン生成物の細胞標的、例えばＰＭＬ、Ｚｉｃ、ｐ５３、ｍｙｃまたはポンシンを含む組成物が提供される。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
細胞内経路は、時間的または空間的に特有な方法でモジュレーションを被る成分のカスケードにより調節されることが知られている。幾つかの病状は、個々のシグナリング成分（例、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼおよび転写因子）の活性改変を特徴とし得る。従って、これらの成分は、それら自体治療的介入についての魅力的な標的、またはシグナリング経路をモジュレーションすることにより生物学的効果を得ることを求める薬剤についての標的となっている。典型的には、シグナリング経路のモジュレーションは、様々な方法で特定刺激因子に対する細胞の応答を改変し得る。本発明に先行して、シグナリング経路におけるタンパク質の関与を明確に描写する試みにおいて多大な作業が実施されたが、テネウリンをシグナリング経路の成分に結び付ける仮説を前進させることは無かった。
【００２７】
本発明は、テネウリンが、遺伝子転写に影響を及ぼし、小脳の発達、ニューロン分化、アポトーシス、細胞増殖および老化に関与する細胞標的と相互作用するその細胞質ドメインにより細胞内シグナリングに関与していることを始めて立証した。従って、これらの標的に対するテネウリンシグナリングのモジュレーションは、神経精神病学的、神経発生的、および神経変性疾患および他のＣＮＳ疾患または状態における適用性を有し、ニューロン分化、細胞増殖および発癌の理解に有用であり得る。
【００２８】
本発明者らは、テネウリンが細胞内シグナリングに関与し、その細胞質ドメインを介して転写活性を呈することを見出した。テネウリン−２の細胞質ドメインは、細胞膜から放出され得、細胞核へ転移し、そこでｚｉｃ−１、ショウジョウバエ ｏｐａの脊椎動物相同体を含む様々な標的遺伝子の転写活性に影響を及ぼすことができる。テネウリンシグナリングは、多くの神経発生的および神経変性疾患ならびに障害、例えば統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイド血管症、および他の発達障害、例えば二分脊椎および精神遅滞において重要であり得る。さらに、テネウリンは、接着、シグナリング、細胞生存、増殖および分化の調節に重要であると考えられており、テネウリンシグナリングは細胞増殖、例えば癌における適用性を有し得る。Ｚｉｃ１は、ショウジョウバエ ペア・ルール遺伝子ｏｐａと相同的なジンクフィンガー転写因子、ショウジョウバエ テネウリンの一つの可能な下流標的である。
【００２９】
本発明者らは、細胞内シグナリングにおけるテネウリンの役割を研究し、細胞内テネウリン標的を見出した。標識またはタグ付きタンパク質を発現している細胞の生画像を用いて、発明者らは、テネウリン−２の細胞質ドメインを発現する構築物による細胞のトランスフェクションが、細胞質ドメインの細胞核への転移をもたらすことを示した。その発現は、細胞表面での蓄積を示す、テネウリン−２の貫膜ドメインを含むテネウリンの染色パターンとは対照的に核内の離散したスポットに限られていた（実施例１）。核局在性は、ＰＭＬ（前骨髄球性白血病）、すなわちＰＭＬ核小体に局在し、アポトーシス、細胞増殖および老化を制御するタンパク質についての染色により得られる非常に類似した断続パターンと一致していた。同一染色パターンがＰＭＬとテネウリン−２の細胞質ドメインのコトランスフェクション後に検出されたことから、転写調節におけるテネウリン−２の細胞質ドメインの関与が示唆された。
【００３０】
さらに、本発明者らは、Ｚｉｃ１とテネウリン−２の細胞質ドメインのコトランスフェクションにより、Ｚｉｃの転写活性が低減化されることを立証したため、ニューロン分化および他の神経学的状態を調節することによる小脳の発達の制御におけるテネウリンの役割が示唆されている。
【００３１】
酵母二重ハイブリッドスクリーンにおいて、テネウリン−１の細胞質ドメインは、アポトーシスおよび老化にも関与するｐ５３応答性遺伝子、ポンシンに結合することが見出された。本発明者らは、２つのタンパク質のコトランスフェクションおよび共免疫沈降によりこの結合を確認した。
【００３２】
アフィメトリックスＨＧ−Ｕ１３３Ａ ジーンチップ(登録商標)を用いてマイクロアレイ解析を実施することにより、テネウリンシグナリングにより調節される遺伝子を同定した。テネウリン−２により上方および下方制御された遺伝子の中で、多くは、細胞成長、分化およびアポトーシスの調節においてある役割を演じることが示された。テネウリン−２により下方制御された一群の遺伝子は、グルタチオニル化され細胞のレドックス状態の調節に関与していることが知られている遺伝子と相関関係を示した。テネウリン−２上方制御遺伝子の多くは、ｐ５３の標的であり、テネウリン−２下方制御遺伝子の多くはｍｙｃの標的である。
【００３３】
これらのデータを合わせると、テネウリンが、以前の研究からは判明しなかった細胞内シグナリング経路におけるある一定の役割を演じることが示される。概括的に、本発明は、テネウリンを介したシグナリングについての特異的「マーカー」としての開裂テネウリン生成物に関するものである。
【００３４】
従って、テネウリンシグナリング検出方法であって、（ａ）シグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、そして（ｂ）テネウリンシグナリングと開裂テネウリン生成物の存在および／または量の相関関係を明らかにすることを含む方法が提供される。所望により、さらにこの方法は、テネウリンまたはテネウリンのＮ末端ドメインの少なくとも一部分およびテネウリンのＣ末端ドメインの少なくとも一部分を含むそのフラグメントならびにテネウリンを開裂する細胞成分を供給することを含む。
【００３５】
「シグナリング」とは、時間的および空間的に特有な方法でモジュレーションを被る成分のカスケードにより調節される過程をいう（Gomperts et al., (2002), Signal transduction, サンディエゴ、アカデミック・プレス、424頁; または Krauss (2001), Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, ワイリー-VCH, 第二版、528頁）。個々の細胞内シグナリング成分（例えば、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、転写因子）の活性は、幾つかの病的状態で改変され得る。テネウリンシグナリングは、細胞成長、分化およびアポトーシスの調節においてある一定の役割を演じる、テネウリンの下流標的のモジュレーション（上方または下方制御）を分析することにより検出され得る。
【００３６】
本発明方法のために供給されるテネウリンタンパク質は、哺乳類テネウリン、好ましくはマウスまたはラットテネウリン、さらに好ましくはヒトテネウリンであり得る。それは、テネウリン−１、テネウリン−２、テネウリン−３またはテネウリン−４（Minet および Chiquet-Ehrismann (2000) Gene 257: 87-97に記載されている）から選択され得る。
【００３７】
テネウリンの「フラグメント」とは、プロテアーゼ開裂部位およびテネウリンのエキソドメインの少なくとも一部分、貫膜ドメイン、およびテネウリンの細胞質ドメインの少なくとも一部分を含むフラグメントを意味する。この部分は、典型的には少なくとも１個、好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上のアミノ酸残基長である。
【００３８】
本発明の意味における「細胞成分」とは、プロテアーゼ活性を有し、テネウリンを開裂することにより、シグナリングし、テネウリン標的に作用し得るフラグメントを供給し得る。この活性は、膜内部でのタンパク質切断（ＲＩＰ）を調節し得、その場合プロテアーゼによる少なくとも２つの開裂段階により、膜から細胞内部分が分離される。先端切除された細胞外または管内部分の第一の開裂および脱離は、第二の開裂にとっての必要条件である。後者は貫膜ドメイン内で行なわれる。それに続いて、生成した可溶性細胞質部分は核へ転移され、そこで転写に関与する（Brown et al. (2000) Cell 100, 391-98で概説）。すなわち、本発明の細胞成分は、別のプロテアーゼ活性と連携的に作用し得るが、貫膜ドメインまたはその中でテネウリンを開裂し得る少なくとも１個のプロテアーゼを含むことにより、テネウリンシグナリングに随伴する可溶性開裂テネウリン生成物を生じさせ得る。プロテアーゼは、部位１プロテアーゼ、部位２プロテアーゼ、またはアルファ−、ベータ−またはガンマ−セクレターゼを含む群から選択され得るが、これらに限定されない。これらのプロテアーゼは、調節された膜内部でのタンパク質切断（ＲＩＰ）伝達核シグナリングに関与することが示された（Ebinu および Yankner (2002) Neuron 34(4):499-502）。
【００３９】
本発明の開裂されたテネウリン生成物は、テネウリンの細胞質ドメインまたはそのフラグメントを含み、ＰＭＬ核小体を含む腫瘍細胞またはニューロンに存在し得るが、これに限定されない。テネウリンの細胞質ドメインは、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその変異型、例えば上記アミノ酸配列に対するアミノ酸欠失、付加（例、融合タンパク質）または置換を含む変異型であり得る。従って、これらのポリペプチドをコード化し得る様々な核酸は、ほとんどのアミノ酸が複数のトリプレットコドンによりコード化されるという点で、遺伝コードの縮重のために異なり得る。上記コドンの同一性は当業界ではよく知られており、この情報は、本発明の範囲内における核酸の構築に使用され得る。変異型は、野生型タンパク質の生物学的活性を高めるか、付加するか、または減じる１個またはそれ以上のアミノ酸置換を有する点で野生型タンパク質とは異なる。
【００４０】
「テネウリンの細胞質ドメインのフラグメント」とは、５〜４００、さらに好ましくは１０〜３００、最も好ましくは２０〜２００の範囲における多くのアミノ酸残基を有するポリペプチドのフラグメントを意味する。
【００４１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されたアミノ酸配列の機能均等物または誘導体の例としては、本発明ポリペプチドが、天然に存するアミノ酸以外の部分で置換、化学的、酵素的または他の適切な手段により共有結合的に修飾された分子が含まれる。共通の構造的特徴を保持する誘導体は、本発明タンパク質のフラグメント、特にテネウリンシグナリング活性を維持するフラグメントであり得る。
【００４２】
有用なフラグメントは、例えば配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生したポリクローナルまたはモノクローナル抗体により認識されるエピトープを呈し得る。特に好ましいフラグメントは、テネウリンシグナリングを誘導または阻害し得る配列を呈するものである。
【００４３】
本方法における測定段階には、ポナステロン（ponasterone）または薬理学的成分（これに限定されない）を含む別の推定もしくは既知活性化刺激因子への細胞または無細胞系の曝露による、テネウリン発現の誘導が先行し得る。
【００４４】
実施態様によっては、テネウリンシグナリング検出方法が、さらに検出可能なタグまたは標識でテネウリンまたは開裂テネウリン生成物を標識する段階を含む場合もある。一局面では、標識テネウリンは組換え体、例えば別のタンパク質、例えば、ポリペプチド（そのフラグメントを含む）のターゲッティングされた送達または検出を目的とするタグとの融合体形態である。タグまたは標識は容易に検出され得るのが望ましい。原則として、それは本質的に検出可能なもの（例えば、共鳴(consonant)抗体により同定され得るタンパク質）であり得る。免疫学的検出方法には、ウエスタン・ブロット、細胞または組織片の免疫組織化学的染色、および細胞培養の検定法があり、遺伝子産物の発現を直接定量する。試料液の免疫組織化学的染色および／または検定法に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、当業界でよく知られた慣用的方法により製造され得る。好都合には、抗体は、タグまたは標識の天然配列に対して製造され得る。
【００４５】
好ましい実施態様において、本発明の意味における「標識」は、スコアリングの容易さおよび／または感度を増すための特異的な検出可能標識を含み得る。最も好ましくは、標識タンパク質の活性、またはタンパク質それ自体は、測光法（特に蛍光定量法またはルミノメトリー(luminometry)）により評価され得る。これは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、昆虫ルシフェラーゼまたは発光細菌性ルシフェラーゼを用いることによる、直接的なものであり得る。別法として、放射性またはリン光性標識が使用され得る。
【００４６】
別の好ましい実施態様では、「タグ」が使用され得、その場合検出は間接的であり得、例えばシグナル遺伝子が、例えば染色においてカラーインジケーターにより検出される変化を誘発することによる。他の適切なシグナルタンパク質（容易に検出され得る活性を有する）は、当業界では公知であり、例えばβ−ガラクトシダーゼがあり、その基質から着色した生成物を生じさせ得る。シグナルは補因子を利用し得る。別法として、タグは、リポーター遺伝子に機能し得るように結合された調節配列を含む核酸に結合するＤＮＡ結合ドメインを含み得る。ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ＧＡＬ ４ ＤＮＡ結合ドメインであり得るが、これに限定されない。別の実施態様において、タグはさらにＮＦκＢドメインを含み得る。
【００４７】
すなわち、この方法は、テネウリンシグナリングが活性化されたとき、開裂テネウリン生成物の存在および／または量が増加するという点で、シグナリングに随伴する開裂テネウリン生成物および検出可能タグまたは標識の手段によるテネウリンシグナリングの検出を包含する。一般に、本方法で使用された条件下におけるタグまたは標識は、細胞または無細胞系を別の細胞成分、プロテアーゼと接触させる前には存在（または検出可能な形で存在）しない。開裂テネウリン生成物に結合された検出可能なタグまたは標識の存在および／または量の測定は、定性的または定量的であり得、そして相関関係は、不活化系でのタグまたは標識との比較に基づき得る（直接的、または歴史的あるいは同時比較に基づく）。例えば、検出可能開裂テネウリン生成物の量は、それぞれの場合においてスコアリングされ、スコアが比較され得る。
【００４８】
検出可能な開裂テネウリン生成物を含む適切な試験システムを製造するため、一般的には、安定してまたは一時的に発現される、テネウリンをコード化する核酸を使用するのが好ましい。従って、テネウリン、またはその標識あるいはタグ変異型をコード化する核酸を、細胞または始原細胞へ導入することにより、タンパク質の発現が達成され得る。好ましくは、テネウリンは、細胞において安定して発現される。別法として、テネウリンを発現する細胞、例えば腫瘍細胞、ニューロンまたはその始原細胞が使用され得る。好ましい実施態様では、培養腫瘍細胞が使用される。別法として、テネウリンを無細胞系で使用し得、例えば、抗体またはタンパク質−タンパク質相互作用を用いた検出が可能となる。
【００４９】
本発明の核酸または本発明で使用される核酸（例えば、標識テネウリンをコード化する）は、それらの自然環境から単離され、実質的に純粋または均質形態で、または由来する種の他の核酸を不含有あるいは実質的に不含有の形で供給され得る。本明細書で使用されている「単離された」の語は、これらの可能性を全て包含する。本発明による核酸は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび修飾核酸または核酸類似体の形態であるかまたはそれらから誘導され得る。すなわち、本発明はまた、さらなる局面で、様々な本発明方法における、検出可能標識に結合された上記テネウリンをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用に関するものである。
【００５０】
本発明による標識に結合させたタグ付きポリペプチドまたはペプチドをコード化する核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参考文献ならびに当業界で公知の技術を用いて当業者により容易に製造され得る（例えば、Sambrook, Fritsch および Maniatis, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、 1989, および Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（1992）参照）。これらの技術には、（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用による、例えばゲノム供給源からの関連核酸試料の増幅、（ii）化学合成、または（iii）ｃＤＮＡ配列の製造が含まれる。
【００５１】
すなわち、細胞に基づく本発明検定法において、興味の対象である標識タンパク質は、発現構築物またはベクターの細胞における発現を誘発または可能にすることにより誘導され得る。前記構築物は、かかる系に一般に含まれ、そして下記で報告されている他の調節配列または構造エレメントを含み得る。シグナル配列と同様、ベクター成分は、通常、１個またはそれ以上の複製起点、１個またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含むが、これらに限定されない。これらの成分の一つまたはそれ以上を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準ライゲーション技術を使用する。
【００５２】
１個またはそれ以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製させ得る核酸配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。例えば、様々なウイルス起源のもの（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるベクターのクローニングに有用である。特に好ましいのは、本明細書に記載された核酸を含む発現ベクターである。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージ、または細胞により取込まれ検出可能なマーカーの発現に使用され得る他の適切なベクターあるいは構築物の形態であり得る。
【００５３】
発現ベクターは、通常、興味の対象であるタンパク質をコード化している核酸配列に機能し得るように結合されたプロモーターを含み、それによってｍＲＮＡ合成が指令される。様々な可能性のある宿主細胞により認識されるプロモーターが、よく知られている。「機能し得るように結合された」とは、転写をプロモーターから開始させるのに適した配置および配向で、同じ核酸分子の一部として連結されていることを意味する。プロモーターに機能し得るように結合されたＤＮＡは、プロモーターの「転写制御下」にある。哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、牛パピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーターにより、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから制御されるが、ただし、上記プロモーターは宿主細胞系と適合し得るものとする。
【００５４】
本発明の発現ベクターはまた、１個またはそれ以上の選択遺伝子を含み得る。典型的選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒物、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完し、または（ｃ）複合培地から入手できない重大栄養素を供給するタンパク質をコード化し、例えばバチルス（Bacilli）についてのＤ−アラニンラセマーゼをコード化する遺伝子がある。
【００５５】
従って、本発明方法は、さらに、宿主細胞への核酸の導入を含む。一般的に「形質転換」と称され得る（特にインビトロ導入について）導入は、あらゆる利用可能な技術を用い得るが、これに限定されない。真核生物細胞の場合、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームを介したトランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアまたは昆虫細胞の場合バクロウイルスを用いた形質導入法が含まれ得る。例えば、Graham および van der Eb, Virology 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降方法が使用され得る。哺乳類細胞宿主系形質転換の総括的局面は、米国特許第４３９９２１６号に記載されている。様々な哺乳類細胞形質転換技術については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527 537 (1990) および Mansour et al., Nature 336:348-352 (1988)参照。
【００５６】
本明細書記載の発現またはクローニングベクターでトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞は、慣用的栄養培地で培養され得る。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨなどは、過度の実験を行わずとも当業者により選択され得る。一般に、細胞培養物の生産性を最大化するための原理、プロトコールおよび実践技術は、「Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach」、M. Butler編、 JRL プレス、 (1991) および Sambrook et al.（既述）に記載されている。
【００５７】
本発明の標識テネウリンについて、それが天然に存するようにタンパク質の完全長配列を含まなければならないという必要条件は無い。その活性を保持している変異型（例えば、テネウリンから誘導されたもの）が使用され得る。「誘導された」の語は、例えば完全長または先端切除配列へ変化を導入することによる、真正天然配列の修飾、例えば置換、挿入および／または欠失により製造された変異型を包含する。これは、エンドヌクレアーゼによるコーディング配列の制限、次いで選択された塩基配列の挿入（必要ならばリンカーを使用）および連結を含む、適切な技術により達成され得る。また、変異プライマーを用いることによる、ＰＣＲを介した突然変異導入も可能である。例えば、さらなるクローニングを容易にするための制限部位の付加または除去が好ましいことであり得る。
【００５８】
本発明による修飾配列は、テネウリンの配列と少なくとも６０％同一である配列を有し得る。典型的には、修飾配列および真正配列間の同一性は、８０％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、９５％またはそれ以上あるいは９８％またはそれ以上である。機能性が完全に失われるわけではないものとして、５以下、例えば１０以下または２０以下あるいはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸欠失、挿入および／または置換が完全長または部分長配列に加えられ得る。類似性または同一性は、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＴＢＬＡＳＴＮプログラム、またはウィスコンシンパッケージ、バージョン８、１９９４年９月（ジェネティクス・コンピューター・グループ、サイエンス・ドライブ５７５、マディソン、ウィスコンシン、米国、ウィスコンシン５３７１１）の一部であるＢｅｓｔＦｉｔにより特定および測定された通りであり得る。好ましくは、配列比較は、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰを用いて為される（Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98参照）。パラメーターは、好ましくは、デフォルトマトリックスを用いて以下の通り設定される：Ｇａｐｏｐｅｎ（ギャップにおける第一残基についてのペナルティ）：ＤＮＡについて−１６；Ｇａｐｅｘｔ（ギャップにおける追加残基についてのペナルティ）：ＤＮＡ ＫＴＵＰワード長について−４：ＤＮＡについて６。別法として、核酸の状況における相同性は、適切なストリンジェンシー条件下でのプロービングにより判定され得る。特定配列相同性の核酸分子間におけるハイブリダイゼーションの達成に要求されるストリンジェンシー条件を計算するための一共通式は、次の通りである（Sambrook et al.、１９８９）：Ｔｍ＝８１.５℃＋１６.６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０.４１（％Ｇ＋Ｃ）−０.６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ（デュプリケイトで）。
【００５９】
本発明者らは、テネウリンの細胞質ドメイン、本発明の開裂テネウリン生成物が、ＲＩＰ（調節された膜内部でのタンパク質切断）により調節されるタンパク質に特有なこととして転写活性を含むかまたは転写モジュレーターとして作用することを初めて立証した。テネウリンの細胞質ドメインは核へ転移し、細胞標的と相互作用し得ることが見出され得る。これらの標的は、ポンシン／ＡｒｇＢＰ２／ベネキシンファミリー（ポンシン、ＳＨ３Ｐ１２、ＣＡＰ、ＳＯＲＢ１、ＡｒｇＢＰ２、ベネキシン、ｎＡｒｇＢＰ２、ＦＬＡＦ２を含むが、これに限定されない）に属するタンパク質だが、これに限定されず、好ましくはポンシン（実施例３参照）、核標的、例えば核タンパク質ＰＭＬ（前骨髄球性白血病、実施例１参照）、または転写因子、例えばジンクフィンガータンパク質、例えば限定はされないが、Ｚｉｃ１−４、またはＯｐｒ、好ましくはＺｉｃ１（実施例２参照）、並びに発現アレイ解析により検出されるニューロン分化または細胞増殖に関与する他の標的（実施例５、表１および２）が含まれ、限定されるわけではないが、ニューロセルピン、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）またはテネウリンの他の現時点まで未知の標的が含まれ得ることが見出された。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、細胞増殖またはニューロン分化を調節する細胞標的の発現または活性を高めるかまたは阻害し得る組成物を提供する。従って、その細胞内標的の機能しだいで、本発明の開裂テネウリン生成物は、間接的に転写活性化を高めるかまたは阻害し得る。
【００６１】
さらなる局面において、本発明は、テネウリンシグナリングの検出方法であって、開裂テネウリン生成物が、それ自体細胞増殖またはニューロン分化のモジュレーターであり、ＰＭＬ、Ｚｉｃ、ポンシン、ｐ５３調節遺伝子、ｍｙｃ調節遺伝子を包含し得る（これに限定されない）細胞標的の発現または活性を調節するか、または開裂テネウリン生成物が核へターゲッティングする方法を提供する。開裂テネウリン生成物の細胞標的は、発現アレイ解析により検出され得る。
【００６２】
また、検出可能な開裂テネウリン生成物の存在および／または量と特定疾患との相関関係を明らかにするテネウリンシグナリング検出方法が提供される。この方法は、開裂テネウリン生成物が細胞増殖またはニューロン分化に関与するか否かを測定するために実施され得る。
【００６３】
本発明の開裂テネウリン生成物に関連した「疾患」は、細胞増殖またはニューロン分化が冒されたあらゆる疾患、あらゆる細胞病理学的または神経病理学的状態、例えば、神経発達および神経変性疾患および障害、例えば統合失調症、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイド血管症、および他の発達障害、例えば二分脊椎または精神遅滞、並びに癌を包含し得る（これに限定されない）。本発明の開裂テネウリン生成物の標的は、腫瘍発生（例えば、ｐ５３発現により上方制御されるポンシン、Kostic et al. (2000) Oncogene 19(35):3978-87に記載）、ニューロン分化および脳の発達（Ｚｉｃの発現低下による、二分脊椎および全前脳症、Aruga et al. (2002) Dev Biol. 244(2):329-41に記載）、または細胞増殖あるいはアポトーシス（ＰＭＬ、Salomoni および Pandolfi (2002) Cell 108, 165-70に記載）に関与することが示された。
【００６４】
一実施態様では、テネウリンを介したシグナリングに影響を及ぼす神経病理学的または細胞病理学的状態のインビトロ診断方法であって、診断が望まれる動物から抽出された細胞において上記の本発明方法を実施することを含む方法が提供される。
【００６５】
本明細書で開示されている開裂テネウリン生成物は、診断薬として使用され得る。開裂テネウリン生成物の発現または開裂テネウリン生成物の標的遺伝子の発現または活性は、特定疾患状態（統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイド血管症、二分脊椎、多発性硬化症、精神遅滞、または癌を含み得るが、これに限定されない）と相関関係を示し得、診断に基いて特定療法が選択され得る。すなわち、本発明は、特に神経病理学的状態または癌に関する診断方法および上記方法における本明細書に開示された材料の使用を提供する。
【００６６】
さらに本発明は、テネウリンシグナリングに影響を及ぼす神経病理学的または細胞病理学的状態のインビボ診断方法におけるテネウリンシグナリングに随伴した検出可能な開裂テネウリン生成物の使用であって、上記要領で本発明方法を実施することを含む方法を提供する。
【００６７】
インビボ方法の場合、本発明による宿主細胞（すなわち検出可能なテネウリンを含む）はトランスジェニック動物に含まれ得、そしてさらに本発明は、標識テネウリン、例えばテネウリンと蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を含むトランスジェニック動物、および同じくその使用を提供する。本発明のトランスジェニック生物体は全て、複数のそれらの細胞内に標識テネウリンをコード化するクローン化組換え体または合成ＤＮＡ配列を含む。
【００６８】
様々な標識およびタグを用いて本発明のトランスジェニック生物体を製造することが可能であるため、包括的に外因性遺伝物質について述べることにより、トランスジェニック生物体の製造について包括的に記載する。当業者であれば、この包括的記載を適合化することにより、上記特異的ＤＮＡ配列を生物体に組込み、下記方法および物質を用いてそれらの配列の発現を達成させ得る。トランスジェニック生物体および具体的にはトランスジェニックマウスの製造に関するさらなる詳細については、１９８９年１０月１０日付、米国特許第４８７３１９１号（トランスジェニックマウスの製造方法の開示において出典明示により本明細書に援用する）およびそこに言及および引用された多数の科学出版物に示されている。
【００６９】
外因性遺伝物質は、接合体の雄性または雌性前核に配置され得る。さらに好ましくは、それは、精子が卵子へ侵入後可能な限り早く雄性前核に配置される。言い換えれば、雄性前核の形成直後、前核が明白に画定され、充分に分離されたとき、各々接合体膜付近に配置される。受精したマウス卵子の雄性前核は、本発明の外因性遺伝物質を加えるのに好ましい部位である。
【００７０】
外因性遺伝物質は、卵核または接合体雌性前核によりそれがプロセッシングされる前に接合体の雄性ＤＮＡ相補性染色体に加えられるのが最も好ましい。卵核または雌性前核は、おそらく雄性ＤＮＡのプロタミンをヒストンと置き換えることにより、雄性ＤＮＡ相補性染色体に影響を及ぼす分子を放出し、それによって雌性および雄性ＤＮＡ相補性染色体を合わせて二倍体接合体を形成させるのを容易にすると考えられる。
【００７１】
すなわち、外因性遺伝物質は、雌性前核による影響を受ける前にＤＮＡ雄性相補性染色体または他のＤＮＡ相補体に加えられるのが好ましい。例えば、外因性遺伝物質は、雄性前核の形成後可能な限り早く、初期雄性前核に加えられ、そのとき雄性および雌性前核が完全に分離され、両方とも細胞膜近くに配置される。別法として、外因性遺伝物質は、脱凝縮を被るべく誘導された後、精子の核に加えられ得る。次いで、外因性遺伝物質を含む精子は卵に加えられ得るか、または脱凝縮精子は卵に加えられ、外因性遺伝物質がその後可能な限り早く加えられ得る。
【００７２】
本発明の目的の場合、接合体とは、本質的に完全な生物体に成長し得る二倍体細胞の形成である。一般的に、接合体は、一または複数配偶子からの２つの半数体核の融合により、自然にまたは人工的に、形成された核を含む卵により構成される。故に、配偶子核は、天然に適合し得るもの、すなわち、分化が行なわれ、機能する生物体に発達し得る生存可能な接合体を生じるものでなくてはならない。一般的には、正倍数性接合体が好ましい。異数性接合体が得られた場合、配偶子が由来する生物体の正倍数体数に関して染色体の数を複数個変えるべきではない。
【００７３】
同様の生物学的考察に加えて、同じく物理的考察により、接合体の核または接合体核の一部を形成する遺伝物質に付加され得る外因性遺伝物質の量も制御され得る。遺伝物質が全く除去されない場合、付加され得る外因性遺伝物質の量は、物理的崩壊をもたらすことなく吸収される量により制限される。一般的に、挿入される外因性遺伝物質の体積は約１０ピコリットルを越えない。物理的付加効果は、接合体の生存能力を物理的に破壊するほど大きいものであってはならない。形成される接合体の外因性遺伝物質を含めた遺伝物質は、接合体の機能的生物体への分化および発達を生物学的に開始および維持し得るものでなくてはならないため、ＤＮＡ配列の数および多様性の生物学的限界は、特定の接合体および外因性遺伝物質の機能により異なり、当業者には容易に理解できるものである。
【００７４】
接合体に付加されるＤＮＡ配列のコピー数は、付加される外因性遺伝物質の総量により異なり、遺伝的形質転換を行わせ得る量である。理論的には、一コピーで十分である。しかしながら、一般的には、一コピーが機能性であることを確実にするため、多数のコピー、例えば１０００〜２００００コピーの遺伝子が使用される。本発明に関しては、包括的に、挿入された外因性ＤＮＡ配列の各々の複数コピーを有することにより、外因性ＤＮＡ配列の表現型発現を高めるという利点がある。
【００７５】
核遺伝物質へ外因性遺伝物質を付加させる技術であれば全て、それが細胞、核膜または存在する他の細胞あるいは遺伝子構造に破壊的なものでない限り使用され得る。外因性遺伝物質は、顕微注入により遺伝物質へ優先的に挿入される。細胞および細胞構造の顕微注入は公知であり、当業界で使用されている。
【００７６】
すなわち、本発明は、適切な膜ターゲッティング配列をコード化するクローン化組換えＤＮＡ配列を受精哺乳類卵（好ましくはマウス卵）へ注入し得る方法を提供する。注入された卵を、偽妊娠の雌に着床させ、分娩まで成長させることにより、細胞が関連疾患の病理学に関連したタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを得る。注入された配列は、トランスジェニック哺乳類の特異的組織（特に著しくは神経組織）において所望のタンパク質を発現するようにプロモーター配列を連結させた形で構築される。例としては、Lewis et al（２０００）Nature Genetics ２５、４０２−４０５のプリオン特異的プロモーター、または神経特異的エノラーゼプロモーターが含まれ得る。
【００７７】
本発明のヒト以外の動物は、融合ポリペプチドにとって同型接合または異型接合であり得る。哺乳類動物には、ヒト以外の霊長類、げっ歯動物、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタが含まれる。げっ歯動物は、マウス、ラットおよびモルモットを含む。
【００７８】
本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳類は、特に、ニューロンの発達または細胞増殖の試験および不適当なテネウリンシグナリングが関係する病気の症状を軽減するように設計された治療法の開発において実験目的に使用され得る。「実験（の）」とは、上記実験が行われる研究施設に適用され得る有効な法律下で動物実験または試験目的での使用が許可され得ることを意味する。
【００７９】
本発明の重要な局面は、本明細書に開示されている検出可能なテネウリンまたは検出可能な開裂テネウリン生成物の使用による、テネウリンシグナリングに影響を及ぼすモジュレーター、例えばテネウリンにより調節される遺伝子の転写に影響する、したがって細胞増殖、アポトーシス、ニューロン分化、てんかん、神経変性、多発性硬化症、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイド血管症、および他の発達障害、例えば二分脊椎または精神遅滞に影響するモジュレーター（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）についてのスクリーニングである。これは、本明細書における開示に照らして、開裂テネウリン生成物の発現を高める（アゴニストの場合）かまたは抑制する（アンタゴニストの場合）（またはテネウリンにより調節される他のタンパク質の活性化または再分布を誘発する）か、またはテネウリンを開裂するプロテアーゼのプロテアーゼ活性を高めるかあるいは抑制する化合物を探すことにより達成され得る。すなわち、開裂テネウリン生成物についてのインジケーターは、癌状態を改善するかまたはニューロン再生を誘導する化合物についてのスクリーニングにとって有用である。
【００８０】
従って、本発明は、テネウリンシグナリングのモジュレーションについての化合物のスクリーニング方法であって、所望により標識されていてもよく、細胞核へターゲッティングする開裂テネウリン生成物の修飾、例えば転写因子について検定することを含む方法を提供する。
【００８１】
すなわち、本発明は、テネウリンシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、（ａ）テネウリンを、１種またはそれ以上の（テネウリンを開裂し得る）細胞成分の存在下、少なくとも１種の薬剤と接触させ、（ｂ）本発明方法の使用により上記薬剤の存在または非存在下でテネウリンの開裂を検出し、そして（ｃ）上記薬剤の非存在下で得られた値と段階（ｂ）で得られた値の相関関係を明らかにし、そしてテネウリンシグナリングのモジュレーションに有効な薬剤の存在の指標として値間の差異の相関関係を明らかにする段階を含む方法を提供する。開裂テネウリン生成物の増加は、テネウリンシグナリングのアゴニストまたはテネウリンの開裂過程に関与するプロテアーゼのアゴニストである薬剤と相関関係を示すため、抗腫瘍薬として使用され得る。開裂テネウリン生成物の減少は、テネウリンシグナリングのアンタゴニストまたはテネウリンの開裂過程に関与するプロテアーゼのアンタゴニストである薬剤と相関関係を示すため、ニューロン変性を阻害する薬剤として使用され得る。
【００８２】
すなわち、様々な上記方法は、開裂テネウリン生成物、またはテネウリンを開裂するプロテアーゼを、テネウリンシグナリングをモジュレーションする能力についての評価が望まれる１種またはそれ以上の薬剤と接触させ、該薬剤の存在または非存在下でのシグナリングを比較する段階をさらに含み得、相対値は、モジュレーターとしてのその活性と相関関係を示し得る。
【００８３】
従って、テネウリンシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、さらに（ａ）細胞における開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、（ｂ）テネウリンを発現する細胞を薬剤に曝露し、（ｃ）薬剤の存在下における開裂テネウリン生成物の存在および／または量を測定し、そして（ｄ）（ａ）および（ｃ）で得られた測定結果を比較すること、を含む方法が提供される。また、段階（ｂ）が細胞に薬剤を振りかけることにより実施される方法が提供される。
【００８４】
別の局面において、テネウリンを介したシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力の評価方法であって、（ａ）細胞においてテネウリンにより調節される遺伝子の発現または活性を測定し、（ｂ）細胞を薬剤に曝露し、（ｃ）薬剤の存在下、上記細胞においてテネウリンにより調節される遺伝子の発現または活性を測定し、そして（ｄ）テネウリンシグナリングを調節する薬剤の能力と段階（ｃ）と比べた段階（ａ）におけるモジュレーション値の相関関係を明らかにする段階を含む方法が提供される。
【００８５】
また、癌または糖尿病の処置を目的とする細胞増殖をモジュレーションする可能性についての薬剤、または神経変性疾患あるいは障害の処置を目的とする薬剤についてのスクリーニング方法であって、本発明方法の使用によりテネウリンシグナリングをモジュレーションする薬剤の能力を評価することを含む方法が提供される。
【００８６】
モジュレーターの同定方法が細胞に基づく系を用いる場合、さらにそれは、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ検定キット（シグマ）の使用により、標識開裂テネウリン生成物を発現する細胞の生存能力を試験する段階を含み得る。この段階は、生命の維持に必要な細胞機能の試験薬剤による介入の指標を提供し得る。
【００８７】
本質的に、本発明方法は、ハイスループットスクリーン、例えば当業界で公知のものと同様に使用され得る。例えば、国際公開第２０００１６２３１号（ナビサイト）、国際公開第２０００１４５４０号（チボテック）、ドイツ国特許第１９８４０５４５号（ジェリーニ・バイオツールズ）、国際公開第２０００１２７５５号（ハイアー・カウンスル・フォー・サイエンティフィック・リサーチ）、国際公開第２０００１２７０５号（Pausch MH、Wess J）、国際公開第２０００１１２１６号（ブリストル−マイヤーズ・スクイブ）、米国特許第０２７８７３号（ジェネンカーIntl.）、ドイツ国特許第１９８３５０７１号（カール・ツァイス；F ホフマン−ラ・ロシュ）、国際公開第２００００３８０５号（コンビケム）、国際公開第２００００２８９９号（バイオセプト）、国際公開第２００００２０４５号（ユーロスクリーン）、米国特許第６００７６９０号（アクララ・バイオサイエンシーズ）参照。
【００８８】
試験される薬剤は、関連したシグナリングについての評価が望まれるのであればいずれのものでもよい。
【００８９】
本発明方法は、一次スクリーンとして、新規阻害剤／モジュレーターを同定するため、または既知阻害剤／モジュレーターをさらに詳細に試験するための二次スクリーンとしての役割を果たし得る。
【００９０】
「薬剤」は、天然または合成化学的化合物であり得る。好ましくは血液脳関門を通過し得る、比較的小さい化学的化合物が好ましいものであり得る。膜部分からのテネウリンの細胞内部分の分離に関与するプロテアーゼの阻害により、シグナリングが遮断され、それによって転写が阻害または活性化され得る。従って、特異的プロテアーゼ阻害剤は、テネウリンシグナリングの阻害について可能性のある薬剤として特に有用であり得、シグナリング生成物の生成を阻止するための強力な道具としてまたは癌治療用の特異的標的として使用され得る。
【００９１】
当業者であれば、本発明のこの局面によるスクリーニング検定法で加えられる試験物質または化合物の量が、通常、使用される化合物のタイプによる試行錯誤により決定されることは容易に理解できるはずである。治療状況で現実に使用され得るレベル、すなわち患者にとって非致命的なものであるように選択され得る。典型的には、約０.０１〜１００ｎＭ濃度、例えば０.１〜１０ｎＭの推定モジュレーター化合物が使用され得る。
【００９２】
さらなる局面において、本発明のスクリーニング方法により検出される組成物は、腫瘍発生または癌の処置あるいは予防的処置、または神経病理学的状態の処置または予防的処置用に提供される。スクリーニング方法により検出される組成物は、腫瘍発生または癌あるいは糖尿病の処置または予防的処置を目的とする医薬の製造、または神経病理学的状態の処置または予防的処置、またはニューロン変性の阻害を目的とする医薬の製造に使用され得る。
【００９３】
上記の様々な局面によるスクリーニング検定方法の実施後、ニューロン分化、ニューロン発達または細胞増殖を妨害またはモジュレーションする能力について試験の結果陽性と判定された化合物、物質または分子の単離および／または製造および／または使用が行われ得る。
【００９４】
かくして同定された化合物は、診断、予知または治療的処置で使用される組成物に剤形化され得る。すなわち、本発明はまた、さらなる局面において、本明細書で提供されているスクリーニング方法により得られる１種またはそれ以上の阻害またはモジュレーター化合物を含む医薬製剤を包含する。
【００９５】
上記で同定された化合物は、製造され得、および／または組成物、例えば医薬、医薬組成物または薬剤の調製、すなわち製造または剤形化に使用され得る。これらは個体に投与され得る。
【００９６】
本発明のスクリーニング方法により同定された化合物の使用だけでなく、開裂テネウリン生成物の使用も、腫瘍発生または癌あるいは神経病理学的状態の処置または予防的処置用の医薬の製造に提供される。
【００９７】
上記要領で同定された化合物が、本発明によるポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、ミメティック（mimetic）または他の医薬上有用な化合物、または個体に与えられる開裂テネウリン生成物のいずれであろうと、投与は、好ましくは「予防有効量」または「治療有効量」（場合によっては、予防が治療とみなされ得るが）で行なわれ、これは個体に対し有益であることを示すのに充分なものである。実際の投与量、および投与の割合ならびに時間経過は、処置されているものの性質および重症度により異なる。処置の処方箋、例えば用量の決定などは、一般的開業医および他の医者の責務の範囲内である。
【００９８】
本発明による、および本発明に従って使用される医薬組成物は、有効成分に加えて、当業者によく知られている医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または他の物質を含み得る。上記物質は非毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、経口、または例えば皮膚、皮下または静脈内注射であり得る投与経路に依存しうる。
【００９９】
経口投与用医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤または液体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを含み得る。液体医薬組成物は、一般的に液体担体、例えば水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが含まれ得る。
【０１００】
静脈内、皮膚または皮下注射、または罹患部位での注入の場合、有効成分は、発熱物質不含有で、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液形態である。当業者であれば、例えば、等張性賦形剤、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液を用いて適切な溶液を製造できるはずである。保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤および／または他の添加物も必要に応じて含まれ得る。
【０１０１】
上記の技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、 Osol, A. (編)、（1980）に記載されている。
【０１０２】
薬剤は、脳または他の所望部位、例えば腫瘍組織へ局所的方法で投与され得るか、またはそれが脳または他の細胞をターゲッティングするような方法にて全身的に送達され得る。
【０１０３】
さらに、開裂テネウリン生成物および開裂テネウリン生成物の細胞標的であって、ＰＭＬ、Ｚｉｃまたはポンシンであり得る標的（これに限定されない）、または発現アレイ解析により同定される標的を含む組成物が提供される（表１および２）。開裂テネウリン生成物およびその細胞標的の組合せは、医薬として、または腫瘍発生または癌あるいは神経発達もしくは神経変性疾患の処置または予防的処置用の医薬の製造に使用され得る。診断、予知または治療的処置で使用される上記医薬の製造または投与は、上記要領で実施される。
【実施例】
【０１０４】
実施例は説明を目的として記載されており、本発明の範囲の制限を意図したものではない。本発明の他の実施態様については、当業者であればこれらに照らして容易に想到できるはずである。
【０１０５】
本開示に示されているが明確には記載されていない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド生化学ならびに免疫学の方法は、科学文献に報告されており、当業者には公知である。例えば、遺伝子工学における標準的方法は、本質的にSambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual、第３版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（２００１）に記載された要領で、また抗体関連技術は、Using antibodies : a laboratory manual / Ed Harlow, David  Lane、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク：コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、ｃ１９９９、ｘｉｖ、４９５頁に従って実施される。
【０１０６】
［抗体およびＤＮＡ構築物］
以下の抗体および構築物は、常用手順での方法により容易に製造され、および／または市販されている：抗テネウリン−２（Rubin et al. (1999) Dev Biol 216: 195-209）、抗ＶＳＶ（Kreis (1986) Embo J 5,931-41に記載されたアフィニティー精製ペプチド抗体）、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２、ストラタジーン）、抗ＧＡＬ4（ＤＧＢ ＲＫ５Ｃ１、サンタクルス・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド）、抗ＰＭＬ（ＰＧ−Ｍ３、サンタクルス）、抗ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ ９Ｅ１０、サンタクルス）、抗ＨＡ（１２ＣＡ５、ロシュ）、Ａｌｅｘａ５９４−およびＡｌｅｘａ４８８−コンジュゲートヤギ−抗マウスおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ（モレキュラー・プローブス）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスおよび抗ウサギＩｇＧ（（Soccochim）ソッコキム）。抗血清を、テネウリン−１の細胞質ドメインのＮ末端部分に対して産生させ（アミノ酸１〜１５８、Minet et al.１９９９）、エシェリキア・コリ（E.coli）においてＨｉｓ標識タンパク質として発現させ、ニッケルカラム（キアゲン）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。標準手順に従って、この抗血清のＩｇＧフラクションをプロテインＡセファロース（アマシャム）において精製した。
【０１０７】
構築物：ｐＦＲ−ｌｕｃ（ルシフェラーゼリポータープラスミド；ストラタジーン）、ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（プロメガ）、ｐＣＭＶ−ＡＤ、ｐＣＭＶ−ＢＤおよびｐＢＤ−ＮＦκＢ（ストラタジーン）、ｐＣＭＸ−ＰＭＬおよびｐ−ＣＭＸ−ＰＭＬ−ＲＡＲ（Doucas et al. (１９９３) Proc Natl Acad Sci U S A ９０(２０):９３４５−９に記載）、ｐＥＦ−ｚｉｃ１（Aruga et al. (１９９６) J Biol Chem. ２７１(２):１０４３−７に記載）、ｐＸＰ２−ＡＰＯＥ１８９（アポリポタンパク質Ｅプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼリポータープラスミド、Salero et al., (２００１) J Biol Chem. ２７６(３)：１８８１−８に記載）を下記で使用する。
【０１０８】
［テネウリン−２構築物］
７種の異なるテネウリン−２構築物、すなわちＢＤＡＤ−ＣＴＥＹ、ＢＤＡＤ−ＣＴＥ、ＢＤＡＤ−ＣＴ、ＢＤＡＤ−Ｃ、Ｃ、ＴＥ、ＴＥＹを使用した。それらは、それらのコーディング領域内に含まれるテネウリン−２タンパク質ドメインに従って命名されている：すなわち、細胞質ドメインを含むテネウリン−２のロング形態および細胞外ドメインの全ロング形態の完全コーディング領域を含む（Tucker et al. (2001) Dev Dyn 220: 27-39に記載、受入番号ＡＪ２７９０３１）ＣＴＥＹ（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ（細胞質）、Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ（貫膜）、ＥＧＦ様およびＹＤ反復）、細胞外ドメインの全ロング形態を含むＴＥＹ、テネウリン−２の短い変異型の完全コーディング領域を含むテネウリン−２の短いスプライス変異型に対応するＣＴＥ（受入番号ＡＪ２４５７１１）（Rubin et al. (１９９９) Dev Biol ２１６： １９５−２０９に記載）、または細胞質ドメインを伴わないテネウリン−２の短いスプライス変異型であるＴＥ。構築物Ｃは、テネウリン−２の可溶性細胞質ドメインを表す。それは、Rubin et al.（１９９９）で報告された（Rubin et al. (1999) Dev Biol 216: 195-209）テネウリン−２配列の最初の３７２アミノ酸それに次ぐ検出用のＶＳＶ−Ｇタグ（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質の残基５０１〜５１１の１１アミノ酸配列）をコード化する。４つの構築物では、テネウリン−２を、ＧＡＬ４結合ドメイン（ＢＤ）およびＮＦκＢ活性化ドメイン（ＡＤ）にカップリングすることにより、ＢＤＡＤ−テネウリン−２融合タンパク質が生成される。これらの構築物を多重ＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲ産物は、ＧＡＬ４結合ドメイン（ＢＤ）をコードするｐＣＭＶ−ＢＤの塩基６７５〜１１１８、（ＡＤ）をコードするｐＣＭＶ−ＡＤの塩基７０３〜１２６７およびＢｌｐＩ部位までテネウリン−２の細胞質ドメインの最初の２１０アミノ酸をコードするテネウリン−２の塩基１〜６３０を含んでいた。これらのフラグメントをＳＯＥ方法（重複的伸長による遺伝子スプライシング、Horton R.M. (1995) Mol. Biotechnol., 3(2); 93-99に記載）により連結させ、次いで生成した構築物を、上記の通り種々の長さのテネウリン−２構築物を含む既存のｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｏベクター（インビトロゲン）のＢａｍＨＩ／ＢｌｐＩ部位へクローン化した。
【０１０９】
［一時的トランスフェクション］
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０１２）およびＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル由来のＳＶ４０−形質転換腎臓線維芽細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）を、１０％ＦＣＳ（胎児牛血清）を補ったＤＭＥＭ培地（ダルベッコの修飾イーグルス培地）において常用手順で維持した。一時的トランスフェクションを行うため、細胞を６ウェルプレートまたは４ウェル染色皿（グレイナー）に播種した。１２時間後、それらを、ＦＵＧＥＮＥ−６（それぞれ１、２〜３または４つの異なるプラスミドについて３μｌ、６μｌまたは９μｌ）を用いることにより上記および実施例２（Ｚｉｃ）、実施例４および実施例５における構築物を含む発現ベクター（各ベクター１μｇ）でトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの少なくとも５時間後に以下の物質で４〜８時間採取前に処理した：ＡＬＬＮ（２５μｇ／ｍｌ；Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｎｏｒｌｅｕ−ＡＬ；シグマ）；ツニカマイシン（２μｇ／ｍｌ；シグマ）またはラクタシスチン（１０μＭ；例えば、シグマ）。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中ですすぎ、本質的には下記要領でルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性の測定、ウエスタン・ブロッティングまたは免疫蛍光用に処理した。
【０１１０】
［安定細胞系］
構築物Ｃを、エクジソン誘導性発現ベクターｐＩＮＤ（インビトロゲン）へサブクローニングし、製造会社のマニュアル（インビトロゲン）に従ってＥｃＲ２９３細胞へトランスフェクションした（ＥｃＲ細胞系は、エクジソン誘導性哺乳類発現系で使用される調節ベクター、ｐＶｇＲＸＲにより安定して形質転換された）。細胞系は、ｐＩＮＤおよびｐＩＮＤ（ＳＰ１）からのムリステロン依存的誘導を調節する、エクジソン受容体を発現する。抗ＶＳＶ抗体を用いた免疫ブロッティングにより増加濃度のポナステロン（１〜１０μｇ／ｍｌ；インビトロゲン）の添加による構築物Ｃの誘導性発現についてクローンを試験した。
【０１１１】
［ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ検定法］
リポーター溶菌緩衝液（プロメガ）を加えることにより細胞を溶解した。次いで、溶菌した細胞懸濁液の系列希釈液を、ミクロライト（Microlite、登録商標）ルシフェラーゼプレート（ダイネックス・テクノロジーズ）へピペットで移し、マイクロルマット（ＬＢ９６Ｐ、ＥＧ＋Ｇバーソルド）においてルシフェラーゼ基質溶液（２ｍＭルシフェリン、２５０ｍＭのグリシンｐＨ７.８中１００ｍＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＭｇＳＯ４）の自動注入によりルシフェラーゼ活性を測定した。全ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼベクターとコトランスフェクションすることにより、トランスフェクション効率に関して標準化した。β−ガラクトシダーゼ活性を測定するため、希釈細胞懸濁液を、３７℃で３０分間基質溶液（０.２ＭのＮａ−リン酸中４.５ｍＭの２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０.１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）とインキュベーションした。酵素反応を止めるため、試料体積の３倍の１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を加え、マイクロプレートリーダー（バイオラッド）において４０５ｎｍでＯＤを測定した。
【０１１２】
［ウエスタン・ブロッティング］
２０％β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料緩衝液を直接細胞に加えることにより（１００μｌ／３.５ｃｍプレート）、テネウリン−２構築物Ｃ、ＣＴおよびＣＴＥを抽出した。核構築物ＢＤＡＤおよびＢＤＡＤ−Ｃの抽出を、核分画を実施することにより達成した。氷上２００μｌ溶菌緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、０.５％トリトンＸ−１００、３００ｍＭのスクロース、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤（コンプリート（Complete、登録商標）、ロシュ・ディアグノスティクス））中で細胞層を剥がし、それに続いてエッペンドルフ遠心管中２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、トランスフェクションした細胞を採取した。生成したペレットを、溶菌緩衝液に再懸濁し、再び遠心分離にかけた。次いで、最終ペレットを、２０％β−メルカプトエタノール、６Ｍ尿素およびプロテアーゼ阻害剤（コンプリート(登録商標)）を含むＳＤＳ試料緩衝液に溶かした。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）でのローディング前、ＤＴＴを加えて１０ｍＭの最終濃度とした。
【０１１３】
貫膜構築物ＢＤＡＤ−ＣＴＥおよびＢＤＡＤ−ＣＴＥＹを、以下の手順により細胞から抽出した。細胞を氷上で２００μｌの低張性緩衝液（２ｍＭのＮａ−リン酸緩衝液ｐＨ７.５、２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）により抽出し、剥がし、エッペンドルフ遠心管中４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。生成したペレットを、１００μｌのデタージェント緩衝液（５０ｍＭのトリスｐＨ８、１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、６Ｍの尿素、プロテアーゼ阻害剤（コンプリート、登録商標））中で再構成し、３７℃で２０分間インキュベーションし、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。２０％β−メルカプトエタノール、６Ｍの尿素およびプロテアーゼ阻害剤（コンプリート、登録商標）を含む等体積のＳＤＳ試料緩衝液を、上清に加え、５２℃で１時間インキュベーションした。ＤＴＴを加えた後（１０ｍＭ）、試料を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。
【０１１４】
ゲルをＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）メンブランに転写した。タンパク質を、抗ＧＡＬ４抗体（ＢＤＡＤおよびＢＤＡＤ−Ｃ）または抗テネウリン−２血清（ＢＤＡＤ−ＣＴＥおよびＢＤＡＤ−ＣＴＥＹ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体およびＥＣＬ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（スーパーシグナル、登録商標）（ピアス）により検出した。
【０１１５】
［免疫蛍光］
４ウェル染色皿（グレイナー）で成長させた細胞を、室温で３０分間４％ＰＦＡにより固定し、５分間０.１％トリトンＸ−１００により透過性にした。一次抗体と６０分間および二次抗体と３０分間のインキュベーションを両方とも室温で実施し、各インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄した。最後に、試料をモビオール（Ｍｏｖｉｏｌ）（ヘキスト、フランクフルト、ドイツ国）にマウントし、３ＣＣＤカメラ（ソニー）と連結したツァイス・アキシォフォト(Axiophot)顕微鏡（カール・ツァイス・リミテッド）を用いて検査および撮影した。
【０１１６】
［マイクロアレイ解析］
アフィメトリックスＨＧ−Ｕ１３３Ａジーンチップス（GeneChips、登録商標）（アフィメトリックス、サンタクララ、米国）を用いて、マイクロアレイ解析を実施した。アフィメトリックスにより推奨されたプロトコール（GeneChip Expression Analysis: Technical Manual (2001) p. 2.1.14-2.1.16）に従ってｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト・チョイス・システム（ライフ・テクノロジーズ）を用いて、１０μｇの全ＲＮＡ（ＥｃＲ−２９３細胞（インビトロゲン）から単離）を逆転写した。プライミングに使用したオリゴヌクレオチドは、5’-ggccagtgaattgtaatacgactcactatagggaggcgg-(t)24-3’ （配列番号９）であった。二本鎖ｃＤＮＡを、フェノール：クロロホルム抽出により浄化し、水相を、フェーズ−ロックゲル（エッペンドルフ）による遠心分離により除去した。エンツォ・バイオアレイ・高収率ＲＮＡ転写標識キット（エンツォ・ディアグノスティクス、米国）を用い、製造会社のプロトコールに従ってインビトロ転写を１μｇのｃＤＮＡで実施した。ＲＮＡｅａｓｙクリーン‐アップカラム（キアゲン）を用いて、ｃＲＮＡを浄化した。カラムからの収率を改善するため、溶出水を２７ｇでマトリックス中へスピンし、次いでキアゲンにより推奨された標準的８０００ｇ遠心分離の前に１分間放置した。この低速湿潤段階により、溶出ＲＮＡの収率はほぼ２倍になった。１×フラグメント化緩衝液（４０ｍＭのトリス−酢酸ｐＨ８.１、１００ｍＭのＫＯＡｃ、３０ｍＭのＭｇＯＡｃ）中で加熱することにより、ｃＲＮＡをフラグメント化した。標準手順（４５℃、１６時間）を用いて、１０μｇのフラグメント化ｃＲＮＡを、ＨＧ−Ｕ１３３Ａジーンチップ（アフィメトリックス）とハイブリダイゼーションさせた。プロトコールＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４を用いて、洗浄および染色をフルイディクス・ステーション４００（アフィメトリックス）で実施し、アフィメトリックス・ジーンチップスキャナーで走査した。アフィメトリックス・マイクロアレイ総合ソフトウェアｖ５（チップスケーリングに使用した標的強度５００）およびジーンスプリング４.２.１（シリコン・ジェネティクス）を用いて、チップ解析を実施した。符号付きウィルコクソン順位検定（アフィメトリックスにより推奨された通り）を用いて複製間の一致する変化を捜すことにより、遺伝子発現の変化を評価した。「変化」ｐ値の閾値は、増加については＜０.００３であり、減少については＞０.９９７であった。一致分析後、これらの値は、それぞれ＜９×１０−６および＞０.９９９９９１となった。全実験条件において検出ｐ値が＞０.００５である遺伝子は全て、信頼できないデータであるものとして分析から除去された。
【０１１７】
実施例１：テネウリン−２細胞質ドメインの核への局在性およびＰＭＬとのその共局在性
この実施例は、テネウリンが、核小体においてＰＭＬ（前骨髄球性白血病タンパク質）と共局在することを立証する。テネウリン−２の細胞質ドメイン（構築物Ｃと呼称）は、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞へトランスフェクションされた場合、核へ転移されることが見出された。構築物ＣによるＨＴ１０８０細胞のトランスフェクションにより、核において細胞質ドメインが蓄積され、その存在は核内の離散スポットに限定されていた。対照的に、テネウリン−２の貫膜バージョン（構築物ＴＥＹ）により得られた免疫蛍光染色パターンは、細胞表面におけるタンパク質の蓄積を示した。
【０１１８】
核局在性は、ＰＭＬタンパク質についての染色により得られた非常に類似した断続パターンを反映していたため（Seeler et al. (１９９９) Curr Opin Genet Dev. ９(３):３６２−７;または Salomoni および Pandolfi (２００２) Cell １０８、１６５-７０で概説）、ＰＯＤ（前骨髄球発癌ドメイン）またはＰＭＬボディと呼ばれる核小体が強く示唆されている。Ｃトランスフェクション細胞の二重免疫蛍光染色は、テネウリン−２の細胞質ドメインの場合とのＰＭＬ染色の実質的重複を示していた。
【０１１９】
ＰＭＬボディは、転写制御に随伴した若干の機能に関与しているため（Zhong et al. (2000) Nat Cell Biol. ２(５):Ｅ８５−９０で概説）、核小体におけるテネウリン−２およびＰＭＬの共局在性について、ＣとＰＭＬ、またはＣとＰＭＬ−ＲＡＲ（ＰＭＬ−レチノイン酸受容体）のコトランスフェクションによりさらに研究した。内因性ＰＭＬタンパク質を含む細胞へＰＭＬをトランスフェクションすることにより、核小体が大きく拡大され（Doucas et al. (１９９６) Biochim Biophys Acta. １２８８(３):Ｍ２５−９）、ＰＭＬ−ＲＡＲのトランスフェクションにより、ＰＭＬボディ構造が破壊される（Mu et al. (１９９４) Mol Cell Biol. １４(１０):６８５８−６７）。本発明者らはまた、これらの効果も観察した。ＰＭＬおよびＣのコトランスフェクション後、同等の染色パターンが検出され、テネウリン−２Ｃ（すなわち、細胞質ドメイン）が、拡大されたＰＭＬボディから見出された。さらに、ＰＭＬ−ＲＡＲによるトランスフェクション後のＰＭＬボディ構造の破壊により、コトランスフェクションされたＣによる染色パターンが変化したため、核における離散スポットにもはや蓄積されておらず、細胞全体で均一に発現されていると思われた。これらの結果は、核小体内におけるテネウリン−２Ｃの存在を示唆しているため、テネウリン−２の細胞質ドメインの推定的転写調節機能を裏付けている。
【０１２０】
実施例２：テネウリン−２はＺｉｃ転写調節活性を阻害する
この実施例では、ジンクフィンガー転写因子Ｚｉｃ、ｏｐａの脊椎動物相同体が、テネウリン−２の細胞質ドメインに影響を及ぼすか、またはそれにより影響されるかを測定した。両タンパク質、すなわちテネウリン−２の細胞質ドメインおよびＺｉｃが、一時的トランスフェクションによりＨＴ１０８０細胞で発現されたとき、通常発現レベルと比べてテネウリン−２Ｃの著しい下方制御（１０倍を越える）が観察された。対照的に、２構築物のコトランスフェクションは、Ｚｉｃレベルに全く影響を及ぼさなかった。ＢＤＡＤは同様の分析においてＺｉｃの存在により下方制御されないため、この影響はテネウリン−２に特異的なものであった。テネウリン−２ＣのＺｉｃ誘導下方制御は、プロテアソーム阻害剤ラクタシスチンの添加により打ち消された。トランスフェクション細胞の免疫蛍光染色により、我々は、Ｚｉｃ−トランスフェクション細胞がＺｉｃの比較的拡散した核染色を示し、高レベルの量のＺｉｃタンパク質を含む核では、テネウリン−２Ｃの染色が全く見られないことを観察した。
【０１２１】
Ｚｉｃの転写活性に対するテネウリン−２Ｃの潜在的効果を調べるために、ＥｃＲ２９３細胞安定型トランスフェクタントを製造した。これらの細胞では、テネウリン−２Ｃは、テネウリン−２の細胞質ドメインの発現を誘導する、ポナステロン添加時に発現されただけであった。これらの細胞をＺｉｃおよびＺｉｃにより活性化されることが知られているＡｐｏＥ−ルシフェラーゼリポーター構築物で一時的トランスフェクションした。Ｚｉｃの存在により、ルシフェラーゼ活性は劇的に増加した。ポナステロンによるテネウリン−２Ｃの誘導後、リポーター遺伝子の発現レベルの著しい低下が観察された。これらの結果は、テネウリン−２の細胞質ドメインが、Ｚｉｃの転写活性に対する阻害効果を有しており、この効果が、テネウリン−２Ｃを安定させることが示されたＡＬＬＮの存在下ではさらに著しくなることを示唆していた。
【０１２２】
実施例３：ポンシンとテネウリン−１の機能的相互作用
ベイト（bait)としてテネウリン−１および−２の細胞質ドメインを用いた酵母二重ハイブリッドスクリーンを実施することにより、テネウリンが他のタンパク質と相互作用するか否かを測定した。ＤｕｐＬＥＸ−Ａ（登録商標）システム（オリジーン・テクノロジーズ、インコーポレイテッド）によりそれらのユーザーズ・マニュアル（バージョン２.９ ８／９８）に従ってスクリーンを実施した。まず、全細胞質ドメイン（テネウリン−１のアミノ酸１〜３００、Minet et al.１９９９およびテネウリン−２のアミノ酸１〜３７６；Rubin et al.１９９９）を使用した。しかしながら、これらの構築物は両方ともＬｅｘＡ依存的標的遺伝子の自己活性化をもたらしたため、相互作用パートナーについての検索には使用できなかった。次に我々は、２つの部分Ｔｅｎ−１ａ、Ｔｅｎ−１ｂおよびＴｅｎ−２ａ、Ｔｅｎ−２ｂのそれぞれにおいて細胞質ドメインの各々を分割した（Ｔｅｎ−１ａはテネウリン−１のアミノ酸１〜１５５を表し、Ｔｅｎ１ｂは１５６〜３００を表し、Ｔｅｎ−２ａはテネウリン−２のアミノ酸１〜１６８を表し、Ｔｅｎ−２ｂは１６９〜３７６を表す）。Ｔｅｎ−１ａおよびＴｅｎ−２ａは両方とも、依然としてＬｅｘＡ依存的遺伝子を自己活性化していることから、転写制御におけるテネウリンについての可能な機能を暗示している。Ｔｅｎ−１ｂおよびＴｅｎ−２ｂを、全マウス１９日胚ＤｕｐＬｅｘ−Ａ ｃＤＮＡライブラリー（オリジーン）のスクリーニングに使用することができる。Ｔｅｎ−１ｂによるスクリーンの結果、ポンシンと呼ばれるタンパク質の第三ＳＨ３ドメインをコード化する相互作用性ｃＤＮＡクローンが得られた（Mandai et al.１９９９）。
【０１２３】
テネウリン−１の細胞質ドメインへの完全長ポンシンの結合を、ｍｙｃタグ付き発現プラスミド（Mandai et al.（１９９９）に記載されているｐＣＭＶ５−Ｍｙｃにおけるポンシン−２）およびテネウリン−１の完全長細胞質ドメイン（アミノ酸１〜３００、Minet et al.１９９９）のＣｏｓ−７細胞におけるコトランスフェクションおよび共免疫沈降により確認した。Ｃｏｓ−７細胞の培養物（３.５ｃｍ皿、培養飽和密度の７０％）を、Ｆｕｇｅｎｅ（ロシュ）を用いて各ＤＮＡ１μｇによりコトランスフェクションした。４８時間後、細胞層をＰＢＳで洗浄し、細胞層をドライアイスで凍結することにより細胞を粉砕し、次いでプロテイナーゼ阻害剤（コンプリートプロテイナーゼ阻害剤カクテル錠剤、ロシュ）を含む３００μｌのＰＢＳ中へこすり落とした。この細胞抽出物を１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清に、１５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１％ＮＰ−４０、０.５％デオキシコール酸、０.１％ＳＤＳ、５０ｍＭのＮａＦ、０.５ｍＭのＮａ３ＶＯ４）を加え、次いで１μｇの抗テネウリン−１ＩｇＧにより免疫沈降させた。細胞ライゼートを４℃でゆっくりと回転させながら９０分間抗Ｔｅｎ−１抗体とインキュベーションした。次いで、ＲＩＰＡ緩衝液中で洗浄した３０μｌのプロテインＡセファロースビーズ（４ファースト・フロー、アマシャム）を加えた。４℃で６０分回転させた後、ビーズを遠心分離により集め、ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズを、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で沸騰させることにより溶出し、ウエスタン・ブロッティングにより分析した。溶出液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２つの平行レーンで移動させ、ＰＶＤＦメンブランにブロッティングした。免疫沈降したテネウリン−１は、抗ＦＬＡＧ抗体により検出され、共沈降したポンシンは抗ｍｙｃ、次いで二次抗体および化学発光キット（ＥＣＬ、アマシャム）を用いた検出法により検出された。免疫沈降したテネウリン−１はポンシンを含み、対照ＩｇＧによる沈澱物は検出可能なポンシンを含んでいなかった。
【０１２４】
コトランスフェクションした細胞の免疫組織化学により、テネウリン−１とポンシンの相互作用をさらに確認した。ポンシン単独のトランスフェクションにより、細胞質および細胞骨格関連発現パターンが得られ、テネウリン−１の可溶性細胞質ドメインが核に蓄積する。テネウリン−１の細胞質ドメインおよびポンシンのコトランスフェクション時、ポンシンは、テネウリン−１と一緒に核へ移入する。すなわち、テネウリン−１は、ポンシンと共局在および結合することから、それらは細胞接着、細胞骨格組立および恐らくは転写の調節における機能に互いに影響を及ぼし合うことがわかる。
【０１２５】
実施例４：テネウリン−２の細胞質ドメインを発現する細胞の形態学的変化
ＣＯＳ−７ミドリザル腎臓線維芽細胞からの細胞抽出物を、ＣＴＥＹ、ＴＥＹ、ＣＴＥおよびＴＥ構築物によるトランスフェクションの２４時間後に調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗テネウリン−２血清での免疫ブロッティングにより分析した。各構築物は、それぞれ２８０ｋＤ、２４０ｋＤ、１２０ｋＤおよび８０ｋＤのほぼ予想サイズの主要バンドの存在をもたらした。細胞質尾部を伴わないタンパク質（ＴＥＹおよびＴＥ）は、これらのドメインが存在する対応するタンパク質（ＣＴＥＹおよびＣＴＥ）より約４０ｋＤ小さかった。抗血清インキュベーション前の透過性にされていないトランスフェクション細胞の免疫染色は、細胞表面におけるテネウリン−２の細胞外ドメインの存在を示した。細胞質ドメインを含む構築物を発現する細胞の形態は、細胞質ドメインを伴わないものとは非常に異なっていた。ＣＴＥＹおよびＣＴＥは、トランスフェクション細胞において突起状糸状仮足を誘導し、ＴＥＹおよびＴＥは、滑らかな表面をもつ細胞に存在した。これは、テネウリン−２細胞質ドメインと細胞骨格成分との相互作用を意味する。
【０１２６】
実施例５：テネウリンの同種親和的結合は開裂を誘導する
テネウリン−２構築物を発現する安定した細胞系を単離するため、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞をトランスフェクションし、再平板培養することにより、トランスフェクション細胞をクローン増殖させた。構築物を表す幾つかのクローンを、免疫蛍光および免疫ブロッティングにより組換えタンパク質発現についてスクリーニングした。組換え発現されたテネウリン−２タンパク質のファロイジン染色および免疫組織化学による抗テネウリン−２抗体での検出を以下の要領で実施した：
【０１２７】
トランスフェクションの２４〜７２時間後、細胞をＣＡ２＋およびＭｇ２＋不含有ＰＢＳ（ＰＢＳ ＣＭＦ）で１回すすぎ、免疫組織化学試験用にＰＢＳ ＣＭＦ中４％のホルムアルデヒドで固定するかまたはウエスタン・ブロット分析用に皿からこすり取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に可溶化した。固定細胞を透過性にするため、ＰＢＳ ＣＭＦ中０.２％のトリトンＸ−１００に１５分間適用し、この段階後透過性にされた細胞を、無傷細胞と同様、ＰＢＳ ＣＭＦですすぎ、ブロック緩衝液（ＰＢＳ ＣＭＦ中３％のＢＳＡ）中で１５分間インキュベーションした。一次抗体（抗テネウリン−２、抗ＶＳＶタグ）、およびフルオレセイン結合二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ、インコーポレイテッド、ウエストグローブ、ペンシルベニア）をブロック緩衝液で希釈した。二次抗体と一緒にローダミン結合ファロイジンをインキュベーションした（シグマ、ブックス、スイス国）。各インキュベーション後、細胞をＰＢＳ ＣＭＦですすいだ。観察するため、細胞をモヴィオール（カルビオケム、ラジョラ、カリフォルニア）にマウントした。ウエスタン・ブロット分析を行うため、試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ナイロン膜に移し、Hagios et al.（１９９６）J Cell Biol.１３４（６）：１４９９−５１２に記載された要領で処理した。
【０１２８】
免疫ブロッティング用のテネウリン−２含有細胞抽出物を、以下の要領で調製した：５ｃｍ培養皿上の細胞を冷ＰＢＳで洗浄後、プレートをマイナス２０℃で冷凍した。解凍後、それらを氷上で３０分間６００μｌの低張性緩衝液（２０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａ−リン酸ｐＨ７.０／１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）により抽出した。細胞をラバーポリスマンでそぎ落とすことにより集め、エッペンドルフ管中に移した。１０分間最大速度で回転させた後、ペレットを３７℃で２０分間１プレートにつき６０μｌのデタージェントバファー（１５０ｍＭのＮＣｌ／５０ｍＭのトリスｐＨ８／１％ＮＰ−４０／６Ｍ尿素、５ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した。等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（０.２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６.８／４％ＳＤＳ／１７.４％グリセリン／２０％β−メルカプトエタノール／６Ｍ尿素）を加え、試料を５２℃で１時間インキュベーションした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブランに移した。テネウリンを、抗テネウリン抗血清により検出し（Rubin et al.（１９９９）Dev Biol.２１６(１)：１９５−２０９）、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム（アマシャム）を用いてシグナルを示した。
【０１２９】
我々は、細胞質ドメインを欠く２構築物、ＴＥＹおよびＴＥの幾つかのクローンを選択できた。細胞外ドメインのロング形態を発現するクローン（ＴＥＹ）は、位相コントラスト画像およびアクチン細胞骨格のファロイジン染色後の両方で観察され得る通り、親細胞（ＨＴ１０８０）または短いテネウリン細胞外ドメインを発現する細胞（ＴＥ）よりかなり平坦な形態を示した。それらの平らな形態にもかかわらず、ＴＥＹのクローンは、親細胞より突出したアクチン細胞骨格を含んではおらず、細胞は全て主として皮質アクチン染色を示した。
【０１３０】
平らな表現型に加えて、我々は、ＴＥＹの細胞クローンが上皮細胞様パッチで成長したことから細胞−細胞接着の増加が示唆されており、親細胞およびクローンＴＥが分散した線維芽細胞様細胞として成長したことに気づいた。したがって、我々は、これらのクローンが、懸濁液中の細胞の凝集検定法において細胞−細胞接着の増加を示すか否かを研究した。細胞を０.２％ＥＤＴＡとのインキュベーションにより採取し、遠心分離により沈澱させ、２.５×１０５細胞／ｍｌの割合で１％胎児牛血清（ギブコ）を含むレイボビッツＬ１５培地（ギブコ）に再懸濁した。各細胞懸濁液３ミリリットルを５ｃｍ細菌培養プレート（ステリン）に加え、８０ｒｐｍでの回転振とう器において３７℃でインキュベーションした。１５分間隔で写真撮影し、単細胞対２倍、３倍またはそれより高い数の凝集体での細胞を数えることにより、細胞凝集を分析した。凝集指数をＮ０−Ｎｔ／Ｎ０（式中、Ｎ０は細胞の総数に対応する粒子の最初の数であり、Ｎｔはインキュベーション時点ｔでの残りの粒子の数である）として計算した。親ＨＴ１０８０細胞およびＴＥ構築物を含む細胞は単細胞として残存し、長いテネウリン−２細胞外ドメインを発現するクローン（ＴＥＹ）は全て、細胞塊に凝集した。これらの細胞におけるテネウリン−２の細胞外ドメインの存在は、それらの同種親和的凝集を誘発した。細胞凝集の定量比較は、３０分のインキュベーション後には、ＴＥＹ細胞系は全て既に最大凝集値に近づいており、ＨＴ１０８０およびＴＥ細胞は９０分のインキュベーション後でさえ凝集しないことを示した。
【０１３１】
さらに、Ｎｂ２ａ神経芽細胞腫細胞に対するテネウリン−２構築物の発現の効果を調べた。Rubin et al.（１９９９）Dev Biol.２１６（１）：１９５−２０９で報告されたところによると、Ｎｂ２ａ細胞におけるＣＴＥ構築物の発現により、糸状仮足および拡大成長円錐が誘導された。細胞質ドメインを欠くＴＥ構築物のトランスフェクション後にこの効果は見られず、タンパク質は、主として神経突起ではなく細胞体に局在していた。これは、細胞質ドメインが、神経突起および成長円錐へのテネウリンタンパク質の転移に要求されることを示唆している。長い構築物ＣＴＥＹおよびＴＥＹのトランスフェクションにより、全く異なるテネウリン−２発現パターンが得られた。これらのタンパク質は両方とも細胞表面で発現され、細胞−細胞接触領域に高濃度で多量に存在することから、これらのニューロン細胞間における同種親和的相互作用が促進されたことをさらに裏付けていた。ファロイジン染色により示されたところによると、ＣＴＥＹ発現により、アクチンの蓄積に加えて、これらの高テネウリン細胞−細胞接触が誘導されたが、これはＴＥＹ構築物については当てはまらなかった。これはさらにテネウリン−２およびアクチン骨格間におけるその細胞質ドメインを介した相互作用を裏付けている。
【０１３２】
実施例６：細胞質ドメインの開裂および安定化
細胞質ドメインの核局在性およびその転写調節的役割は、野生型貫膜テネウリン−２が、恐らくはリガンド結合時、原形質膜またはその中で特異的に開裂されなければならないことを意味する。細胞質ドメインは、それによって放出され、核へ移入される。この過程を確立するため、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）およびＮＦκＢ活性化ドメイン（ＡＤ）に結合された貫膜ドメインを含む完全長テネウリン−２または小フラグメントの融合タンパク質を、ＨＴ−１０８０およびＣｏｓ−７細胞へ導入した。融合タンパク質の開裂およびＢＤＡＤ−Ｃの核への移入は、コトランスフェクションされたルシフェラーゼリポータープラスミドにおける特異的ＧＡＬ４結合配列へＢＤが結合し、その結果、それに続いてＡＤを通じてルシフェラーゼ遺伝子発現が開始されることにより検出され得る。
【０１３３】
この実験において陽性対照としての役割を果たすＢＤＡＤおよびＢＤＡＤ−Ｃは、抗ＧＡＬ４抗体による核抽出物のウエスタン・ブロットにおいて検出可能であった。さらに、核におけるＢＤＡＤ−Ｃ蓄積は、透過性にされた細胞の免疫蛍光染色により確認された。同時に、ＢＤＡＤ−ＣＴＥおよびＢＤＡＤ−ＣＴＥＹは、膜細胞画分のウエスタン・ブロットにより、そして非透過性化細胞の免疫蛍光法により（原形質）膜の一部として同定され得る。
【０１３４】
テネウリン−２融合構築物により誘導されるルシフェラーゼ活性を分析するため、ＨＴ１０８０細胞を、各ＢＤＡＤ−テネウリン−２構築物、ルシフェラーゼリポータープラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼ構築物とコトランスフェクションし、それによってトランスフェクション効率を標準化した。ＢＤＡＤ−ＣＴＥ、ＢＤＡＤ−ＣＴおよびＢＤＡＤ−Ｃは、陰性対照（ＢＤ構築物）に関してルシフェラーゼ活性を誘導するに至った。しかしながら、最大融合タンパク質であるＢＤＡＤ−ＣＴＥＹは、それほど高い活性には至らなかった。短い構築物の開裂は構成的であり得、完全長構築物の開裂は例えばリガンド結合により特異的に誘導される必要があり得る。
【０１３５】
実施例５に記載されている通り、テネウリン−２は、その細胞外ドメインにより同種親和的に結合することが示されており、ＢＤＡＤ−テネウリン−２融合タンパク質の細胞質ドメインの開裂および転移を誘導し得る。テネウリン−２の同種親和的相互作用が、その細胞質ドメインの開裂についてのシグナルを示すか否かを試験するため、ＢＤＡＤ−ＣＴＥＹおよび対照としてのＢＤＡＤ−ＣＴを、ＴＥＹまたはＴＥを表面で構成的に発現するＨＴ−１０８０細胞クローンへトランスフェクションし（上記実施例５に記載）、コトランスフェクションしたリポータープラスミドから生じたルシフェラーゼ活性を分析した。得られたルシフェラーゼ活性を、同構築物の野生型ＨＴ１０８０細胞へのトランスフェクションに標準化した。ＢＤＡＤ−ＣＴＥＹのＴＥＹ細胞へのトランスフェクション後に得られたルシフェラーゼ活性は、ＢＤＡＤ−ＣＴのトランスフェクション後よりも約６倍高く、ＴＥ細胞では、活性が、トランスフェクションに使用された構築物のタイプにより影響されることはなかった。すなわち、細胞外ドメインのＣ−末端は、テネウリン−２の細胞質ドメインの開裂を誘導するのに要求される。
【０１３６】
要約すると、ルシフェラーゼリポーター遺伝子の活性は、細胞表面においてテネウリン−２細胞外ドメインの短い先端切除型ではなく完全長型の同種親和的結合により特異的に上方制御され得るため、その活性は、膜での（または膜付近での）ＢＤＡＤ−テネウリン−２融合タンパク質の開裂から生じる。完全長テネウリン−２に結合されたＢＤＡＤ（ＢＤＡＤ−ＣＴＥＹ）により、プロセッシングがテネウリン−２の細胞外Ｃ−末端部分の同種親和的結合によって上方制御されたときのみ、ルシフェラーゼ遺伝子が顕著に誘導される。さらに、この活性化は、上記の先端切除テネウリン−２融合体では全く観察されなかった。それにもかかわらず、短い対応物質は、刺激が無くても開裂されると思われた。理論的に縛られたくはないが、大きなＢＤＡＤ−ＣＴＥＹ構築物は、その短い対応物質ほど有効には発現されず、開裂生成物は、プロテアソームで迅速に下方制御され得る。ＢＤＡＤ−ＣＴＥＹのトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の誘導は、事実、プロテアーゼ阻害剤、例えばＡＬＬＮおよびラクタシスチンの添加により著しく上方制御され得る。同様に、ＣＴＥタンパク質レベルもまた、ウエスタン・ブロットにより立証されている通り増加していた。ＡＬＬＮを加えることにより、２つの特定開裂生成物が安定化され、それらの一つは細胞質ドメイン単独のサイズに対応していた。
【０１３７】
実施例７：テネウリンシグナリングにより調節される遺伝子の同定
Ｃ−末端ＶＳＶタグを含むテネウリン−２の細胞質ドメインをコード化するｃＤＮＡを、ベクターｐＩｎｄ（インビトロゲン）にクローン化した。安定して組込まれたプラスミドｐＶｇＲＸＲ（インビトロゲン）を含むＥｃＲ−２９３細胞（インビトロゲン）を、細胞質ドメインをコード化するｐＩｎｄテネウリン−２プラスミドによりトランスフェクションした。安定したクローンを選択し、ポナステロン（インビトロゲン）添加後にテネウリン−２の細胞質ドメインの発現について試験した。Ｋ３と呼ばれる一陽性クローンの細胞を、さらなる分析に使用した。親ＥｃＲ−２９３細胞およびＫ３細胞を培養飽和密度の７０％まで増殖させた後、１０μＭのポナステロンを２４時間両細胞培養物に加えた。ポナステロンの添加を行わずに並行培養物を維持した。２４時間後、４種の異なる培養物：Ｋ３−ポナステロン、Ｋ３＋ポナステロン、ＥＣＲ２９３−ポナステロンおよびＥＣＲ２９３＋ポナステロンからトリゾール試薬（ギブコ）を用いてｍＲＮＡを単離した。この手順を典型的にはデュプリケイトで実施することにより、８ｍＲＮＡバッチを得た。ｍＲＮＡのこれらのバッチの各々を用いてプローブを製造し、２０'０００の潜在的転写物を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むアフィメトリックスチップ（Ｕ１３３）とハイブリダイゼーションさせた。ポナステロンの存在により差次的に発現される遺伝子を含むリストが誘導された。２つの独立して実施されたデュプリケイト試験の両リストに共通する遺伝子をさらに研究し、４リストの項目を作製した：Ｋ３アップ、Ｋ３ダウン（Ｋ３細胞においてポナステロンによりアップまたは下方制御された遺伝子）、ＥｃＲ−２９３アップ、ＥｃＲ−２９３ダウン（ＥｃＲ−２９３細胞においてポナステロンによりアップまたは下方制御された遺伝子）。ポナステロンにより直接影響される遺伝子があればそれを排除するため、ＥＣＲ２９３およびＫ３細胞のリストに共通する項目を排除することにより、テネウリン−２の細胞質ドメインの存在により上方制御される（表１）または下方制御される（表２）遺伝子の最終リストとした。表１は、細胞質ドメインにより上方制御される遺伝子およびアフィメトリックスにより割当てられた各データベースのＩＤ番号を示す。表２は、細胞質ドメインにより下方制御される遺伝子およびアフィメトリックスにより割当てられた各データベースのＩＤ番号を示す。テネウリン−２によりアップおよび下方制御された遺伝子の中で、多くは細胞成長、分化およびアポトーシスの調節においてある一定の役割を演じることが知られている。テネウリン−２により上方制御される一群の遺伝子は、ｐ５３の標的であることが知られている遺伝子（表１における番号７、２３、３３、５１、６５）と相関関係を示す。下方制御される遺伝子の別の一群は、ニューロン分化およびシナプス形成および機能においてある一定の役割を演じることが知られている遺伝子（表１の番号４、５、１１、１２、２７、２８、２９、３０、３４、３５、４０、５６、９０）と対応していた。テネウリン−２により下方制御される遺伝子の一群は、グルタチオニル化され、細胞のレドックス状態の調節に関与していることが知られている遺伝子（表２の番号３、４、１１、４４、４６、６９）と相関関係を示していた。下方制御される遺伝子の別の一群は、ｍｙｃの標的であることが知られている遺伝子（表２の番号１、３、４、１１、１４、３１、６９）と対応していた。
【０１３８】
実施例８：増殖検定法
細胞増殖に対するテネウリン−２の細胞質ドメインの発現効果を試験した。Ｋ３細胞（安定して組込まれたプラスミドｐＣｇＲＸＲ（インビトロゲン）および細胞質ドメインをコード化するｐＩｎｄテネウリン−２プラスミドを含むＥｃＲ２９３細胞（インビトロゲン）、実施例７に記載）を、テネウリン−２の細胞質ドメインの発現を誘導するポナステロンの存在または不存在下で培養した。典型的には、５日間にわたって、並行培養物を４％ホルムアルデヒドにより毎日固定し、クリスタルバイオレット（Ｈ２Ｏ中０.１％）で細胞を染色することにより細胞数を測定した。ポナステロンの存在下、すなわちテネウリンの細胞質ドメインの存在下、Ｋ３細胞についてそれらの成長速度を未処理細胞の約５０％に遅らせた。テネウリン−２のトランスフェクション細胞質ドメインを伴わないＥｃＲ−２９３細胞の増殖は、ポナステロンを加えても影響されなかったことから、成長遅延はテネウリン−２の細胞質ドメインの存在に特異的に左右されることが分かった。
【０１３９】
実施例９：テネウリン−１の細胞質ドメインは、線虫（C.elegans）胚細胞の核で検出され得る
Ｔｅｎ−１は、ショウジョウバエ ペア‐ルール遺伝子ｔｅｎ−ｍの線虫（C.elegans）オーソログである。本明細書で我々は、２つの異なるｔｅｎ−１転写物の発現を制御する２つのプロモーターを含むｔｅｎ−１の遺伝子構造を報告している。これは、細胞質ドメインが異なる２つのタイプII貫膜タンパク質変異型を発現させる。ｔｅｎ−１ ｃＤＮＡの５'末端を、５'プライマーとしてスプライスリーダー１（ＳＬ１）および３'プライマーとしてｔｅｎ−１特異的オリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲにより測定した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＮａｓｅＨ（−）逆転写酵素（ライフ・テクノロジーズ）を用いたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡフラグメントを調製した。５'ｃＤＮＡ末端を、混合段階の虫から調製されたｃＤＮＡを用いて、５'プライマーとしてＳＬ１および遺伝子特異的プライマーAGCACGTGTCGCTATCGTCG（配列番号１０）を用いるＥｘｐａｎｄＨｉＦｉポリメラーゼ（ロシュ）で増幅した。鋳型として混合段階ｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、サイズが異なる２種の生成物を得た。これらのバンドを配列決定することにより、２種の異なるｃＤＮＡを同定することができる。それらの一方は、５'末端に僅かな差異を伴うが予測される読み枠Ｒ１６Ｆ６.４の転写開始部に対応しており、他方は、新たに発見されたエクソンと一緒に予測される読み枠Ｆ２８Ｆ５.１をさらに含んでいた。すなわち、ｔｅｎ−１遺伝子は選択的プロモーターの制御下にあるため、Ｎ−末端配列が異なる２種のＴｅｎ−１タンパク質をコード化する２種の異なる転写物が得られる。長い形態は、Ｎ−末端から予測される貫膜配列２１８ａａの細胞質ドメインを含み、短い形態は両変異型間で共通している３７アミノ酸を有するだけである。細胞内配列は、予測されるドメインを全く含まないが、チロシンリン酸化についての共通配列を含む。長い形態は、Ｎ−末端に高プロリン伸長部および潜在的二部構成核局在性シグナルを含む。Ｎ−末端細胞質ドメインの後に貫膜ドメインが続くことにより、Ｔｅｎ−１はタイプII貫膜タンパク質となっている。
【０１４０】
ＤＮＡ構築物については、４Ｋｂの上流プロモーターを、プライマーＣＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧ（配列番号１１）およびＡＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＴＣＧ（配列番号１２）により増幅し、ｐＰＤ１１７.２８（A.Fire）のＡｓＣＩ／ＫｐｎＩ部位へクローン化した。３Ｋｂの下流プロモーターを、ＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧ（配列番号１３）およびＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＣ（配列番号１４）により増幅し、ｐＰＤ１１７.２８（A.Fire）のＳｐｈＩ／ＫｐｎＩ部位へクローン化した。長い細胞内ドメインをコード化するＤＮＡを、プライマーＣＡＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＴＣＧ（配列番号１５）およびＧＧＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号１６）により増幅した。短い細胞内ドメインをコード化するＤＮＡを、プライマーＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣ（配列番号１７）およびＧＧＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号１８）により増幅した。
【０１４１】
抗体製造については、抗Ｔｅｎ−１抗体を、長い変異型のＮ末端（MFQHRTTNAQGPPPNRPMPR）（配列番号１９）および共通Ｃ末端（PAHQSGLLASVHSWKFRKSE）（配列番号２０）からのＴｅｎ−１特異的ペプチドに対して産生させた。ペプチドを合成し、ウサギをネオシステム（ストラスブール、フランス国）で免疫化した。標準手順に従って、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂカラムに結合させた各ペプチドを用いて、全血清をアフィニティー精製した。
【０１４２】
長いｔｅｎ−１変異型のＮ末端に対する抗体（抗Ｎ）およびタンパク質のＣ末端に対する抗体（抗Ｃ）を用いて、線虫の初期胚を染色した。抗Ｃは全ての膜を染色し、抗ＮはさらにＴｅｎ−１発現細胞の核も染色した。これはまた胃腸管の内側を覆う細胞においても優勢であり、その場合抗Ｃは細胞膜を染色し、抗Ｎは主に核を染色した。理論に縛られたくはないが、内在性Ｔｅｎ−１は、通常タンパク質分解的にプロセッシングされ得、細胞質ドメインの転移は、Ｔｅｎ−１シグナリングにおける生理学的過程であり得る。Ｔｅｎ−１の長い細胞質ドメインの核転移は、熱ショックプロモーター下でのＧＦＰ融合タンパク質として両細胞質ドメインの過剰発現により確認され得る。これらの構築物の一時的発現は、長い細胞質ドメインが細胞の核に蓄積し、短い形態は細胞質の残存することを示していた。
【０１４３】
Ｔｅｎ−１は、線虫の新規貫膜タンパク質としての特徴を示し、配偶子形成、初期胚形成および皮下組織細胞移動に必要とされる。後期発達段階では、それは、ニューロンの移動および先導、遠位先端細胞移動および体性生殖腺の確立に関与する。さらに、それはまた、咽頭および胃腸管発達および適切な排便に必要とされる。理論に縛られることを期しないが、Ｔｅｎ−１は、形態形成信号についての受容体として作用し得、細胞膜からの細胞質ドメインのタンパク質分解的放出により、そして核への移入により直接核へシグナリングすることができる。
【０１４４】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１４５】
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月14日(2005.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006502723000001.app
【国際調査報告】
2006502723.tif 000034
2006502723.tif 000035
2006502723.tif 000036
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