(57)【要約】本発明はハイスループットスクリーニングに適応可能な脂肪酸アミド加水分解酵素（ＦＡＡＨ）活性のアッセイ方法を提供する。該方法は、最低１種の標識加水分解生成物から標識基質を分離することを提供し、該分離は定量を助長する。本発明はまた、反応混合物への試験されるべき化合物の添加ならびに試験されるべき化合物の存在および非存在下での酵素活性の比較によるＦＡＡＨ活性の阻害剤若しくは活性化物質としての試験されるべき化合物の同定方法も提供する。該方法は患者例えば体外受精失敗の危険にさらされるかまたは濫用の危険にさらされる若しくはそれに苦しめられている者における変えられたＦＡＡＨ活性の検出における使用に適応可能である。
2006524482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸アミド加水分解酵素を含有することが疑われるサンプルを、脂肪酸アミド加水分解酵素の標識基質と組合せて反応混合物を形成させる段階；
脂肪酸アミド加水分解酵素に標識基質を加水分解させるのに十分な条件下で該反応混合物をインキュベートしてそれにより最低１種の標識加水分解生成物を形成させる段階；
選択的結合物質と該インキュベートされた反応混合物を接触させる段階（該選択的結合物質は標識基質若しくは標識加水分解生成物のいずれかを結合するがしかし双方はせず、それにより結合された標識複合体を形成する）；
結合された標識複合体をインキュベートされた反応混合物から分離する段階；および
加水分解された標識基質若しくは形成された標識加水分解生成物の量を測定してそれによりサンプルの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を示す段階
を含んでなる、脂肪酸アミド加水分解酵素の活性のアッセイ方法。
【請求項２】
サンプルが生物学的膜、脂質二重層若しくはミセルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基質が、エンドカンナビノイド、脂肪酸エタノールアミド、脂肪酸一級アミド、エンドカンナビノイド類似物、脂肪酸エタノールアミド類似物若しくは脂肪酸一級アミド類似物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
基質がアナンダミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
基質がオレアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
基質が２−アラキドノイルグリセロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
基質が放射性同位体で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
放射性同位体が３Ｈ若しくは１４Ｃである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
基質が蛍光標識で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
選択的結合物質が炭素を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
選択的結合物質が活性炭である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
活性炭がフィルターを構成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
選択的結合物質が標識基質を結合するがしかし標識生成物を結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
分離段階が濾過、重力沈降若しくは遠心分離を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
測定段階が、液体シンチレーション計数を介して若しくは蛍光エネルギーの測定により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
マルチウェルプレート中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ハイスループットスクリーニングプログラムの少なくとも一部分を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
薬物発見の試みに関連して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
反応混合物に添加された試験化合物の存在下および非存在下で請求項１に記載の方法によりアッセイされるところの脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を比較する段階を含んでなり、
脂肪酸アミド加水分解酵素の活性の変化が、該試験化合物が該脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を調節することの指標となる、
脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２０】
試験化合物が化合物のライブラリーから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試験化合物が脂肪酸アミド加水分解酵素活性の活性を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約５％阻害される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約２０％阻害される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約５０％阻害される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約８０％阻害される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約９５％若しくはそれ以上阻害される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験化合物が前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性を増大させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約５％増大される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約３０％増大される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約５０％増大される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約７０％増大される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が最低約１００％増大される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素活性が約２倍ないし約１０倍の間増大される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
マルチウェルプレートの使用を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
マルチウェルプレート中で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
ハイスループットスクリーニングの少なくとも一部分を構成する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
薬物発見の試みに関連して実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３８】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素が哺乳動物の脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素がブタの脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素がげっ歯類の脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素がネズミの脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素がラットの脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素がマウスの脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記脂肪酸アミド加水分解酵素がヒト脂肪酸アミド加水分解酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
患者から、細胞を含有するサンプルを得ること；
細胞を溶解して細胞ライセートを生じさせること；
細胞ライセートを脂肪酸アミド加水分解酵素の標識基質と組合せて反応混合物を形成させること；
細胞ライセート中に存在する脂肪酸アミド加水分解酵素に標識基質を加水分解させるのに十分な条件下で該反応混合物をインキュベートしてそれにより最低１種の標識加水分解生成物を生じさせること；
インキュベートされた反応混合物を選択的結合物質と接触させること（該選択的結合物質は標識基質若しくは標識加水分解生成物のいずれかを結合するがしかし双方はせず、それにより結合された標識複合体を形成する）；
結合された標識複合体をインキュベートされた反応混合物から分離すること；
加水分解された標識基質若しくは形成された標識加水分解生成物の量を測定してそれによりサンプルの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を示すこと；および
患者からのサンプルの活性を、活性について予め決められた値までの活性と比較して、該患者が活性について予め決められた値に関して変えられた脂肪酸アミド加水分解酵素活性を有するかどうかを決定すること
を含んでなる、患者における変えられた脂肪酸アミド加水分解酵素活性の測定方法。
【請求項４６】
前記患者が女性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
女性が妊娠しているか若しくは不妊治療をしようとしている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
サンプルが血液、組織若しくは体液を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
サンプルがリンパ球を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
細胞がホモジェナイズされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
細胞ライセートに存在する脂肪酸アミド加水分解酵素活性がサンプルから部分的に若しくは実質的に精製される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
予め決められた測定された値が、対照アッセイ、該患者からの以前の若しくは後のサンプル、正常個体からのサンプル、別の患者からのサンプル、標準ＦＡＡＨ若しくは予め決められた値からである、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂肪酸アミド加水分解酵素の活性の測定方法およびそれらの調節物質の同定方法に関する。より具体的には、本発明は脂肪酸アミド加水分解酵素活性を変える化合物についてのハイスループットスクリーニングに適応可能なアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
カンナビノイド１受容体の内因性リガンドとしてのアナンダミド（Ｎ−アラキドノイルエタノールアミン、ＡＥＡ）の同定（非特許文献１）は生物活性脂質の機能において大きな科学的興味を惹起した。内因性リガンドの他の例は、その睡眠誘発特性について最もよく知られる（非特許文献２）オレアミド（ｃｉｓ−９，１０−オクタデセノアミド）、および脳傷害後に神経保護性であることが報告された２−アラキドノイルグリセロール（非特許文献３）である。
【０００３】
アナンダミドの生物学的活性の終了の主な機序は加水分解であり（非特許文献４）；アナンダミド輸送体の存在もまた提案されている（非特許文献５）。
【０００４】
アナンダミド、オレアミドおよび２−アラキドノイルグリセロールの加水分解を司る酵素は１９９６年にクローン化され、そして脂肪酸アミド加水分解酵素すなわちＦＡＡＨと命名された（非特許文献６）。ＦＡＡＨ（ＥＣ  ３．５．１．４）は多様なヒト組織および細胞株で発現される広範な基質特異性をもつ膜結合型酵素である（総説については非特許文献７；非特許文献８を参照されたい）。
【０００５】
ＦＡＡＨの阻害剤が内因性カンナビノイドの効果を増強しかつそれにより睡眠、筋弛緩および鎮痛を促進することが予測された（非特許文献８）。有用な阻害剤を同定するための試みは、ハイスループットスクリーニングに適する単純な再現可能なアッセイの欠如により妨げられている。公表された方法は逆相ＨＰＬＣ（９）および薄層クロマトグラフィー（非特許文献９）を包含する。蛍光置換法もまた記述されている（非特許文献１０）。付加的なアッセイは、クロロホルム：メタノール混合物での加水分解生成物の抽出（非特許文献１１）、次いで放射活性の計数に頼る。しかしながら、この方法のクロロホルムの毒性および面倒な物理的操作はハイスループット形式へのこのアッセイの適応を不可能にする。
【０００６】
従って、ＦＡＡＨの活性の測定およびＦＡＡＨの調節物質の同定のための改良されたＦＡＡＨアッセイ、とりわけハイスループットスクリーニングに適応し得るものに対する当該技術分野における必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｄｅｖａｎｅら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１９４６−１９４９
【非特許文献２】Ｃｒａｖａｔｔら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１５０６−１５０９
【非特許文献３】Ｐａｎｉｋａｓｈｖｉｌｉら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：５２７−５３１
【非特許文献４】Ｇｉｕｆｆｒｉｄａら（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｔ．Ｔｈｅｒ．２９８：７−１４
【非特許文献５】ＣｏｍｐｔｏｎとＭａｒｔｉｎ（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｔ．Ｔｈｅｒ．２６３：１１３８−１１４３
【非特許文献６】Ｃｒａｖａｔｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：８７−８７
【非特許文献７】Ｕｅｄａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．１０８：１０７−１２１、（２０００）
【非特許文献８】Ｆｏｗｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：５１７−５２６、（２００１）
【非特許文献９】ＤｅｕｔｓｃｈとＣｈｉｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：７９１−７９６
【非特許文献１０】Ｔｈｕｍｓｅｒら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３：４３３−４３７
【非特許文献１１】Ｍａｕｒｅｌｌｉら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７７：８２−８６
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
一局面において、本発明は、脂肪酸アミド加水分解酵素（ＦＡＡＨ）基質およびその加水分解の生成物の物理化学的および結合の特性の差異に基づくＦＡＡＨの活性および量のアッセイ方法を提供する。例えばアナンダミドはＦＡＡＨによりアラキドン酸およびエタノールアミンに加水分解される（図１）。簡潔には、基質、例えば３Ｈ−アナンダミド（エタノールアミン１−３Ｈ）を反応混合物中でＦＡＡＨ活性の推定の供給源とともにインキュベートする。ＦＡＡＨ活性は、存在する場合、基質の加水分解を触媒して最低１種の放射標識加水分解生成物を形成し；例の基質３Ｈ−アナンダミドは標識されたエタノールアミンおよび未標識のアラキドン酸に転化される。この標識生成物および標識基質を相互から分離し、そして標識基質の喪失、若しくは好ましくは標識生成物の形成を測定する。ある好ましい態様において、該アッセイは同時に若しくは組で実施され、ここでＦＡＡＨ活性を調節する能力について試験されるべき化合物の存在下で実施されるアッセイを試験されるべき化合物の非存在下で実施されたものと比較する。他の好ましい態様において、患者からのサンプルをアッセイしてＦＡＡＨ活性が予め決められた活性値に関して変えられているかどうかを決定し得る。
【０００８】
一局面において、本発明は、脂肪酸アミド加水分解酵素を含有することが疑われるサンプルを脂肪酸アミド加水分解酵素の標識基質と組合せて反応混合物を形成させること；脂肪酸アミド加水分解酵素に標識基質を加水分解させる条件下で該反応混合物をインキュベートしてそれにより最低１種の標識加水分解生成物を形成させること；選択的結合物質と該インキュベートされた反応混合物を接触させること（該選択的結合物質は標識基質若しくは標識生成物のいずれかを結合するがしかし双方でなく、それにより結合された標識複合体を形成する）；結合された標識複合体を未結合の標識化合物から分離してそれにより標識生成物からの標識基質の分離を達成すること；および加水分解された標識基質の量若しくは形成された標識加水分解生成物の量を測定すること；それによりサンプルの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を示すことを含んでなる、脂肪酸アミド加水分解酵素活性の改良された測定方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の局面において、ＦＡＡＨ酵素の活性を調節し得る化合物の同定方法が提供される。該方法は、反応混合物に添加された試験化合物の存在下および非存在下で上の方法によりアッセイされるところのＦＡＡＨの活性を比較する段階（脂肪酸アミド加水分解酵素の活性の変化が、該試験化合物が該脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を調節することを示す）を含んでなる。多様な態様において、該方法はＦＡＡＨ活性の有用な阻害剤若しくは増強剤を同定するのに使用し得る。
【００１０】
本明細書で提供されるアッセイ方法は、ハイスループットスクリーニング系での使用に適応可能でありかつ薬物発見の試みで使用されることを企図している。本発明のアッセイ方法を使用するハイスループットスクリーニングは、試験化合物のライブラリー（例えばコンビナトリアル化学の技術により製造されるライブラリー）が、薬物の候補として有用であるＦＡＡＨ活性の阻害剤および増強剤を同定するための合理的なスクリーニングプログラムで使用されることを可能にすることができる。
【００１１】
別の局面において、本発明は患者における変えられたＦＡＡＨ活性の測定方法を提供する。該方法は、患者から、細胞を含有するサンプルを得る段階；細胞を溶解して細胞ライセートを生じさせる段階；細胞ライセートを脂肪酸アミド加水分解酵素の標識基質と組合せて反応混合物を形成させる段階；細胞ライセート中に存在する脂肪酸アミド加水分解酵素に標識基質を加水分解させるのに十分な条件下で該反応混合物をインキュベートしてそれにより最低１種の標識加水分解生成物を生じさせる段階；インキュベートされた反応混合物を選択的結合物質と接触させる段階（該選択的結合物質は標識基質若しくは標識加水分解生成物のいずれかを結合するがしかし双方はせず、それにより結合された標識複合体を形成する）；結合された標識複合体を未結合の標識化合物から分離してそれにより標識生成物からの標識基質の分離を達成する段階；加水分解された標識基質若しくは形成された標識加水分解生成物の量を測定してそれによりサンプルの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を示す段階；および患者からのサンプルの活性を、活性について予め決められた値と比較して、該患者が活性について予め決められた値に関して変えられた脂肪酸アミド加水分解酵素活性を有するかどうかを決定する段階を含んでなる。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の局面は、下に示す詳細な記述にさらに詳細に記述されるであろう。
［発明の詳細な記述］
本明細書に引用される受託番号（例えばＧｅｎＢａｎｋデータベース配列への受託番号）により示される配列を包含する参照研究、特許、特許出願および学術論文はこれによりそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
【００１３】
本文書を通じて多様な定義を使用する。大部分の語は当業者によりそれらの語に帰されうる意味を有する。下若しくは本文書の別の場所のいずれかで特別に定義される語は全体として本発明の文脈において提供される意味を有し、そしてそれは当業者により典型的に理解されるとおりである。可能な場合は、定義されない語は当業者にとっての通常の意味を有することが理解されるべきである。しかしながら、語若しくは句の技術で理解される定義と本明細で特別に教示されるところの語若しくは句の定義との間のいかなる不一致も後者に有利なように解消されるべきである。
【００１４】
当業者に既知の組換えＤＮＡ技術の一般原則を示す標準的参照研究は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（２００２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州プレーンビュー（２００１）；Ｋａｕｆｍａｎら編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカレイトン（１９９５）を包含する。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的若しくは化学的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は放射性同位体および蛍光標識を包含する。本発明の方法で使用しうる放射性同位体の例は３Ｈおよび１４Ｃを包含する。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「精製された」は、通常伴う他の分子からの分子の少なくとも部分的な分離を指す。例えば、精製されたタンパク質は、それが通常伴う他の細胞物質から少なくとも部分的に分離されているタンパク質である。
【００１７】
本明細書で使用されるところの「ネズミの」という用語は、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）のメンバーに起源をもつことを意味している。ネズミのＦＡＡＨは好ましくはマウス若しくはラットに起源をもつ。
【００１８】
第一の局面において、本発明は脂肪酸アミド加水分解酵素（ＦＡＡＨ）のアッセイ方法を提供する。現在好ましい一態様において、該アッセイ方法は、ＦＡＡＨを含有することが疑われるサンプルをＦＡＡＨの標識基質と組合せて反応を形成させる段階；脂肪酸アミド加水分解酵素に標識基質を加水分解させるのに十分な条件下で該反応混合物をインキュベートして１種若しくはそれ以上の標識加水分解生成物を形成させる段階；選択的結合物質と該インキュベートされた反応混合物を接触させる段階（該選択的結合物質は標識基質若しくは標識加水分解生成物のいずれかを結合するがしかし双方でなく、結合された標識複合体を形成する）；結合された標識複合体を結合されない標識化合物から分離してそれにより標識生成物からの標識基質の分離を達成する段階；および加水分解された標識基質若しくは形成された標識加水分解生成物の量を測定してそれによりサンプルの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を示す段階を含んでなる。
【００１９】
サンプルは、好ましい態様において生物学的サンプル、若しくは生物学的物質、とりわけ生物学的膜を含んでなるサンプルである。他の好ましい態様において、サンプルは生物学的供給源からのＦＡＡＨの精製における精製段階からである。サンプルは生物学的膜若しくはそれらの部分を含んでなるか、あるいは脂質二重層、または人工的膜系、単層、小胞若しくはミセルを含んでなる。サンプルは、いくつかの態様においてリン脂質を含有する反応混合物に再構築された精製された若しくは組換えのＦＡＡＨを含んでなる。
【００２０】
基質はＦＡＡＨのいかなる基質、推定の基質若しくは基質類似物であってもよい。該アッセイはＦＡＡＨの基質としての化合物の有用性を決定するための使用にもまた適応される。本発明の多様な態様における使用に好ましい基質は、限定されるものでないがエンドカンナビノイド若しくはそれらの類似物、脂肪酸エタノールアミド若しくはそれらの類似物、脂肪酸一級アミド若しくはそれらの類似物、および検出可能な標識で標識された前述のいずれかの類似物を挙げることができる。特定の目的の現在好ましい基質は例えばアナンダミド、オレアミドおよび２−アラキドノイルグリセロールを包含する。
【００２１】
基質は検出のために化合物を標識するための当該技術分野で既知のいずれの様式で放射性同位体標識してもよい。３Ｈ若しくは１４Ｃのような現在好ましい同位体は液体シンチレーション計数を介して容易に検出されかつハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイの適応を助長し得る。そのように標識された合成基質は商業的に容易に入手可能であるか若しくは合成し得る。
【００２２】
検出、例えば蛍光測定的検出が可能な蛍光標識のような他の標識もまたハイスループットスクリーニングに容易に適応される。好ましい蛍光標識は、存在するタンパク質および核酸双方を含む生物学的系において検出可能であり、従ってより粗な細胞ライセートおよびホモジェネートをアッセイする場合に好ましい標識は、これらの他の生物学的成分により遮蔽されない最良の励起および発射の双方を有する。一態様において、加水分解されない標識基質は加水分解生成物と同一の蛍光特性を有する。加水分解が蛍光の変化をもたらす、例えば加水分解されない分子中の色素−色素相互作用が基底状態を維持するのに必要とされる基質を設計することもまた可能である。こうした基質は本発明とともに有用である。比色的標識もまた本明細書で使用に企図されている。一般に、適切な標識は、酵素による加水分解に対する基質の感受性を変えずかつそのための検出系が開発されているものである。
【００２３】
好ましくは、基質は酵素の濃度に関して莫大な過剰の濃度で存在する。こうした条件下では、古典的な酵素のキネティクスを使用して反応の速度定数（Ｋｍ）および速度（Ｖｍａｘ）を決定し得る。キネティクス研究は機構的な研究に有用であり；それらはまた阻害剤を評価するための強力なツールでもある（下を参照されたい）。Ｓｅｇｅｌ，Ｉ．Ｈ．、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９３、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ  ０４７１３０３０９７）のような酵素キネティクスの当業者に向けられた標準的教科書がこれらのパラメータの確立に対する完全な手引きを提供し、そして、キネティクスパラメータの決定を単純化するためのグラフツールとしての例えばＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットの使用を示す。
【００２４】
ハイスループットスクリーニング系は当該技術分野で既知である。こうした系はしばしば数個から１００まで、数百若しくは数千もの同時に実施されるアッセイの数を増大させるためのマルチウェルプレートの使用を伴う。本発明の方法の現在好ましいハイスループットスクリーニングの適応は短時間で約１００ないし約１０００若しくはそれ以上のアッセイをスクリーニングする能力を提供する。現在好ましいハイスループットスクリーニング系は、正確さを向上させかつ多数のアッセイの労働集約的局面を排除するための例えばサンプルの取扱い、分注、試薬添加および他の機能のためのロボット構成要素を包含する。ハイスループットスクリーニングプログラムのための検出系は当業者に既知である。好ましい検出系は、限定されるものでないがシンチレーション計数（例えばγ若しくはβ粒子または発光サンプルをカウントするための固体および液体シンチレーション、フィルター計数、セレンコフ計数、ならびにシンチレート（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇ）マイクロプレート計数を包含する）、蛍光検出（例えば強度、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を包含する）、発光ならびに吸光度を挙げることができる。
【００２５】
現在好ましい一態様において、ハイスループットスクリーニングを達成するために、サンプルを多容器（ｍｕｌｔｉｃｏｎｔａｉｎｅｒ）担体若しくはプラットフォーム上に置く。多容器担体は複数の候補化合物の反応を同時に測定することを助長する。具体的説明の目的上、しかし制限としてでなく、９６若しくは３８４種の異なる試験反応を供給し得る９６若しくは３８４ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルマイクロプレートを担体として使用する。こうしたマルチウェルマイクロプレートおよび多数のアッセイでのそれらの使用方法は当該技術分野で既知でありかつＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＯＭＰＯＵＮＤ  ＡＮＤ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＲＥＡＧＥＮＴＳ、２００２、２４９５−２５１１ページのような供給源により商業的に入手可能である。
【００２６】
本発明の方法は小型化技術に適応可能である。ハイスループットスクリーニングの目的上のアッセイはしばしば小容量で実施される。多様な方法でアッセイの容量を低減させる手順は現在当業者に既知である。マイクロフルイディックスおよびマイクロキャピラリーの方法論は今や、実施されるべきアッセイをナノリットル量に低下させることを可能にする。方法およびアッセイの基本原理がアッセイの容量または物質が測定若しくは輸送される様式にもかかわらず当てはまることが理解されるべきである。
【００２７】
インキュベーション条件の決定方法は当該技術分野で慣例である。好ましいインキュベーション条件は例えば酵素の安定性に関する。至適温度はアッセイの仕様が与えられれば決定することは慣例であり、そして至適の結果のために所定の酵素および基質の組合せについて決定されるべきである。インキュベーションの時間および他の条件は同様に慣例の決定を必要とする。アッセイの直線性をもたらす条件が好ましい。現在好ましい温度および時間は、多様な供給源からのＦＡＡＨを使用しかつ基質としてアナンダミドを使用して室温１時間若しくは３７℃３０分を包含する。Ｓｅｇｅｌ、上記のような酵素アッセイの当業者に向けられた標準的教科書はインキュベーション条件を包含するアッセイの至適化に対する完全な手引きを提供する。好ましい態様のさらなる特徴付けは作業実施例に提供される。
【００２８】
該方法は、インキュベートした反応混合物を選択的結合物質と接触させる段階もまた含んでなる。本アッセイに好ましい選択的結合物質は選択された基質とともに変動しうることに注意することが重要である。選択的結合物質は、当該技術分野で既知である分離技術により大量の反応混合物から容易に分離し得る物質を含んでなる。効果的な分離は粒子径、密度、組成物および磁気感受性の差異に基づき得る。物質は例えば重力沈降、濾過（例えば膜分離を包含する）、遠心分離により反応混合物から分離する。選択的結合物質とインキュベートした反応混合物の現在好ましい接触方法は活性炭を含んでなる。
【００２９】
例えば基質がアナンダミドである場合、活性炭は吸着により基質および加水分解生成物の１種アラキドン酸を結合する。他の加水分解生成物エタノールアミンは活性炭に吸着しない。好ましい態様のため、アナンダミド基質をエタノールアミン部分で標識する。ＦＡＡＨは標識アナンダミドを標識エタノールアミンおよび未標識のアラキドン酸に加水分解する。標識基質および未標識のアラキドン酸の炭への吸着後に、溶液中の標識されたエタノールアミンは結合された標識基質から単純な濾過段階により分離し得る。これは基質からの妨害を伴わない生成物の測定を助長する。結合過程によりいくつかの化合物を除去することにより、サンプルは例えばクエンチングにより標識生成物の測定を妨害することがより少なくありそうである。既存の技術が既に例えばマルチウェルフィルター中で同時に多数のサンプルを濾過するために適応されている。この属性は従ってハイスループットスクリーニングプログラムにもまた適応可能である。
【００３０】
本発明の方法で生成物の形成を測定することがしばしば好ましいとは言え、基質の消失を測定するアッセイ条件および選択的結合物質を選択してもよい。この間接的方法は、とりわけ部分的に精製された若しくは実質的に精製された酵素を使用する場合、または基質が反応混合物から消失するただ１経路のみが存在することが既知である場合に適応可能である。基質を結合する選択的結合物質が容易に利用可能でない場合にもまた基質の消失を測定することが好ましい。これはとりわけ、基質が実行可能に結合されて遊離の加水分解生成物からのその分離を遂げ得ないがしかし加水分解生成物がより容易に結合されてそれを遊離の標識基質から効果的に分離し得る態様において有用であり得る。これはより広範な選択的結合物質から選択するという柔軟性を実務者に与える。
【００３１】
加水分解された標識基質若しくは形成された標識加水分解生成物の量の測定は、好ましくは存在する標識の量の直接定量方法である。上で論考されたとおり、多様な検出技術が本発明に適し、そして適切な検出方法は基質若しくは生成物に存在する標識の特性に関する。それぞれシンチレーション計数および蛍光検出によりそれぞれ定量される放射性同位体標識基質および蛍光標識基質が本発明の方法とともにの使用に現在好ましい。好ましい一態様において基質は３Ｈ−アナンダミドであり、検出は形成される生成物３Ｈ−エタノールアミンのものであり、そして該検出はマルチウェルプレート中で実施されるアッセイの濾液からの液体シンチレーション計数プレートリーダーを用いてである。
【００３２】
本発明の別の局面において、脂肪酸アミド加水分解酵素の調節物質の同定方法が提供される。該方法は、反応混合物に添加された試験化合物の存在下および非存在下に上で本明細書に記述されるところの方法によりアッセイされるところの脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を比較することを含んでなり；脂肪酸アミド加水分解酵素の活性の変化が該試験化合物が脂肪酸アミド加水分解酵素の活性を調節することを示す。
【００３３】
好ましい態様において、同定されるべき調節物質は化合物ライブラリー、例えばコンビナトリアル化学により形成される化合物のライブラリー、または研究プログラムの一部として同定若しくは合成された関連化合物のライブラリーの一部である。推定の調節物質（すなわち試験されるべき化合物、試験化合物）は好ましくはそれが製薬学的組成物に対する有用性を有することを可能にするであろう特性をもつ小分子である。好ましい調節物質は低い非特異的毒性およびＦＡＡＨの調節に対する高い特異性を有する。
【００３４】
調節物質はＦＡＡＨ活性の阻害剤およびＦＡＡＨの活性化物質を包含する。基質の濃度、インキュベーション条件および試験されるべき化合物の濃度のようなアッセイパラメータは、試験化合物の調節効果をより完全に認識するように変動させてよい。
【００３５】
阻害剤である好ましい調節物質は、試験化合物を欠く対照反応混合物の活性に関してＦＡＡＨの活性を低下させるそれらの能力により同定され得る。好ましくは、試験化合物の添加が反応容量を変える場合に試験化合物の添加を補償するように容量を調節することにより反応容量を一定に維持する。最も好ましくは、容量のいかなる差異も、試験化合物を溶解するベヒクルの差異に等しい容量の対応する添加により補償する。
【００３６】
本発明の一局面において、同定される調節物質はＦＡＡＨ活性の阻害剤である。酵素阻害剤は可逆的および不可逆的阻害剤を包含する。いくつかの態様において好ましい阻害剤は可逆的阻害剤である。ＦＡＡＨの可逆的阻害剤は、反応のみかけのＫｍを上昇させる競争的阻害剤、酵素のＶｍａｘを低下させる非競争的阻害剤ならびにＫｍおよびＶｍａｘ双方に影響を及ぼす阻害剤、すなわち混合型阻害剤および非競争的阻害剤を包含する。スクリーニングで同定される阻害剤の型は本発明の方法によるキネティックアッセイ研究の使用により決定し得る。しかしながら、本発明の目的上、酵素のみかけの活性を低下させるいかなる化合物も阻害剤型の調節物質とみなされる。他の好ましい態様において、阻害する調節物質は不可逆的阻害剤ならびにその作用が不可逆的であるかもしれない非競争的阻害剤を包含する。
【００３７】
好ましい態様において、試験化合物は、適切な統計学的検定による統計学的有意差により決定されるとおり再現可能にＦＡＡＨを阻害する。こうした検定は、生物学的若しくは生化学的系の測定のような科学的測定における統計学的決定の当業者に既知である。いくつかの態様において、試験化合物は脂肪酸アミド加水分解酵素活性を約１％、または最低約２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％、あるいは約９０％若しくはそれ以上、または１００％まで阻害する。他の好ましい態様において、阻害剤は統計学上有意に該反応のみかけのＫｍを増大若しくはそのＶｍａｘを低下させる。
【００３８】
本発明の別の局面において、試験化合物は脂肪酸アミド加水分解酵素活性を増大させる。多様な型の酵素活性化物質が当業者に既知である。いくつかの活性化物質は反応の速度を増大させることにより酵素反応を活性化することが既知であり、他者は達成される平衡を変えることが既知である。酵素反応成分（例えば酵素、基質または酵素−基質若しくは酵素−生成物中間体）と可逆的に結合して反応の速度を増大させる活性化物質が現在好ましい。非特異的活性化物質もまた反応速度を増大させるかもしれない。本発明の目的上、酵素のみかけの活性を増大させるいかなる化合物も活性化物質型の調節物質とみなされる。例えば多くの酵素はある種の陰イオンの存在下で活性を増大させることが既知である。他の酵素、とりわけ水不溶性かつ電荷が中性の分子に作用するものは負に荷電した親油性分子により活性化される。いくつかの膜結合型酵素は例えば特異的リン脂質により活性されることが既知である。
【００３９】
好ましい態様において、試験化合物は、適切な統計学的検定による統計学的有意差により測定されるとおり再現可能にＦＡＡＨを活性化する。こうした検定は生物学的若しくは生化学的系の測定のような科学的測定における統計学的決定の当業者に既知である。いくつかの態様において、脂肪酸アミド加水分解酵素活性は約１％、または最低約２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％、あるいは約９５％若しくはそれ以上、または１００％まで増大される。他の態様において、活性化は１０〜３０％、３０〜５０％、５０〜７０％、７０〜９０％、９０〜１１０％である。いくつかの態様において、活性化物質はＦＡＡＨ活性を１００〜３００％、３００〜５００％、５００〜７００％または７００〜９００％若しくはそれ以上増大させる。
【００４０】
本発明の方法のある好ましい態様において、脂肪酸アミド加水分解酵素は粗細胞ライセート若しくは細胞ホモジェネートである。いくつかの態様においてＦＡＡＨは細胞から部分的に若しくは実質的に単離されている。他の態様において脂肪酸アミド加水分解酵素は組換え的に製造される。脂肪酸アミド加水分解酵素はブタ、げっ歯類（ラットおよびマウスを包含する）ならびにヒトのような動物からの哺乳動物の脂肪酸アミド加水分解酵素を包含するいずれの生物学的供給源からであってもよいか、若しくはそれは組換えタンパク質の製造に有用であることが既知のいずれかの生物体中で製造された組換えＦＡＡＨであってもよい。特定の既知のアミノ酸配列若しくは活性のＦＡＡＨをもたらすいずれかの数の配列のコンセンサス若しくは組合せに基づく合成ＦＡＡＨもまた本明細書の使用に企図されている。
【００４１】
多様な生物学的供給源からの脂肪酸アミド加水分解酵素の既知のアミノ酸配列の例は例えば配列番号２、４、６および８を包含する。脂肪酸アミド加水分解酵素をコードする既知の核酸配列の例は配列番号１、３、５および７を包含する。当業者は、こうした配列および活性を保持するそれらの改変を、例えば生物学的ＦＡＡＨ、組換えＦＡＡＨ、過剰産生されたＦＡＡＨ若しくは遺伝子的に改変されたＦＡＡＨを生成させるために上で提供されたもののような参考文献で見出される技術に従って使用し得ることを認識するであろう。いかなる形態のＦＡＡＨも本発明の方法を用いるアッセイに適応されることを本明細書で企図している。
【００４２】
好ましい一態様において、該アッセイを使用して、変えられたアミノ酸配列をもつＦＡＡＨの活性を測定しかつ調節物質を同定する。こうした変えられたＦＡＡＨはＦＡＡＨ酵素をコードする遺伝子中の突然変異に由来し得る。一態様において、該アッセイを使用して、大麻濫用に関連した変えられたＦＡＡＨの活性を研究しかつその調節物質を同定する。例えば、Ｓｉｐｅら（ＰＮＡＳ  ９９：８３９４−８３９８、２００２）による最近の論文は位置１２９のＰｒｏの代わりのＴｈｒの置換とヒトにおける物質濫用との間の強い関連を記述している。本発明のアッセイの使用は、補償するための外的カンナビノイドを求める傾向に至る脳におけるエンドカンナビノイドの低下された濃度をもたらすより高い比活性若しくはより高レベルの正味の活性を伴うヒトからＦＡＡＨを同定するのに役立つかもしれない。
【００４３】
別の局面において、本発明は患者における変えられたＦＡＡＨ活性の測定方法を提供する。該方法は、患者から、細胞を含有するサンプルを得る段階；細胞を溶解して細胞ライセートを形成させる段階；細胞ライセートを脂肪酸アミド加水分解酵素の標識基質と組合せて反応混合物を形成させる段階；細胞ライセート中に存在する脂肪酸アミド加水分解酵素に標識基質を加水分解させるのに十分な条件下で該反応混合物をインキュベートしてそれにより最低１種の標識加水分解生成物を生じさせる段階；インキュベートされた反応混合物を選択的結合物質と接触させる段階（該選択的結合物質は標識基質若しくは標識加水分解生成物のいずれかを結合するがしかし双方を結合せず、それにより結合された標識複合体を形成する）；結合された標識複合体を未結合の標識化合物から分離してそれにより標識生成物からの標識基質の分離を達成する段階；加水分解された標識基質若しくは形成された標識加水分解生成物の量を測定してそれによりサンプルの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を示す段階；および患者からのサンプルの活性を活性について予め決められた値と比較して該患者が活性について予め決められた値に関して変えられた脂肪酸アミド加水分解酵素活性を有するかどうかを決定する段階を含んでなる。
【００４４】
好ましくは、患者に由来する液体若しくは組織のサンプルからの脂肪酸アミド加水分解酵素活性を測定する。血液、リンパ若しくは組織サンプルが現在好ましい。とりわけ好ましい態様においてサンプルは患者からのリンパ球からである。サンプルが女性からである好ましい態様において、結果は、医師が流産（自発的堕胎）の危険について妊娠女性をスクリーニングする若しくは体外受精処置の失敗の危険について不妊治療をしようとしている女性をスクリーニングすることを可能にする。好ましい態様において、患者のサンプルからの結果を正常個体、とりわけ人口統計学的基準に関して比較可能に配置された者のサンプルからの結果と比較する。本方法のアッセイの結果を使用して、変えられた比活性（ＦＡＡＨ総量の単位あたりのＦＡＡＨ活性）若しくは総ＦＡＡＨ活性（時間あたりに形成された生成物の正味量）のいずれか若しくは双方が決定されるかもしれない。例えば、活性の増大は、例えばアミノ酸変化、遺伝子突然変異などを介する活性部位の変化による、若しくは比活性の変化を伴わない存在するＦＡＡＨタンパク質の総量の変化によるＦＡＡＨの比活性の増大による可能性がある。
【００４５】
本発明の方法において、脂肪酸アミド加水分解酵素はリンパ球細胞ライセートから実質的に精製されていてよい。ＦＡＡＨは、ＦＡＡＨがＦＡＡＨ活性の潜在能力を保持するようないかなる起源に由来してもよい。例えば、ＦＡＡＨはＦＡＡＨを発現する細胞から精製してよく、ＦＡＡＨは限定されるものでないが細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を挙げることができる組換え系で製造してもよい。ＦＡＡＨはＦＡＡＨを産生するいずれの生物体由来であってもよい。例えば、ＦＡＡＨはヒト細胞、げっ歯類細胞（例えばマウスおよびラット細胞）のような哺乳動物細胞、若しくはＦＡＡＨ活性を有するＦＡＡＨを産生するいずれかの他の生物体由来であってよい。組換えＦＡＡＨはＦＡＡＨをコードするいかなる核酸配列を用いて当該技術分野で既知の技術を使用して製造してもよい。クローン化されたＦＡＡＨの例はブタＦＡＡＨ、げっ歯類ＦＡＡＨ（例えばマウスＦＡＡＨアッセイおよびラットＦＡＡＨ）ならびにヒトＦＡＡＨのような多様な哺乳動物ＦＡＡＨを包含する。ＦＡＡＨをコードするＤＮＡ配列および多様なＦＡＡＨのポリペプチド配列は付属として付けられる配列表に包含されている。
【００４６】
ＦＡＡＨは当該技術分野における標準的方法により精製してよい。ＦＡＡＨ調製物は細胞膜若しくは人工的膜と会合していていよいか、若しくは細胞物質を実質的に含まなくてよい。
【００４７】
本明細を通じて、ある種の刊行物および特許に引用がなされる。これらの参考文献のそれぞれのそっくりそのままの状態は本明細書に組込まれかつ本開示の一部を形成する。
［実施例］
【実施例１】
【００４８】
放射標識アナンダミド［１−３Ｈ−エタノールアミン］はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１０〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号ＡＲＣ−６２６；米国ミズーリ州セントルイス）から得た。アナンダミド［アラキドニル−５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−３Ｈ］は、放射標識アラキドン酸［５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−３Ｈ（Ｎ）］（１８０〜２４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号ＮＥＴ２９８Ｚ）がそうであったようにＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（１６０〜２４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号ＮＥＴ−１０７３、米国マサチューセッツ州ボストン）から得た。放射標識エタノールアミン（［２−１４Ｃ］エタン−１−オール−２−アミン塩酸塩）はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号ＣＦＡ３２９）から得た。メチルアラキドニルフルオロホスフェート（ＭＡＦＰ）およびオレイルトリフルオロメチルケトン（ＯＴＦＭＫ）はＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，（それぞれカタログ番号７０６６０および６２６０；米国ミシガン州アナーバー）から得た。活性炭はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国ミルウォーキーから得た。アラキドン酸、アナンダミド、オレイン酸、オレアミド、フッ化フェニルメチルスルホニルおよびＣｕＳＯ４はＳｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイスから得た。
【００４９】
Ｔ８４ヒト結腸直腸癌細胞（カタログ番号ＣＣＬ−２４８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州マナサス）は、ＤＮＡマイクロチップを使用する細胞株の遺伝子発現プロファイリングに基づきヒトＦＡＡＨを発現するとして同定された（示されない）。ハムのＦ−１２培地、ならびに５％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコの改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：１混合物中で該細胞を培養した。ＰＢＳ中に掻き取ることにより細胞を収集しそして１０００ｒｐｍの臨床遠心分離器中でペレットにした。生じるペレットはその後必要とされるまで−８０℃で保存した。
【００５０】
Ｔ８４凍結ペレットをＦＡＡＨアッセイ緩衝液（１２５ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％グリセロール、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ９）中でホモジェナイズし（Ｂｏｇｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５０４４−５０４９）かつ７０μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に希釈した。別の方法で示されない限り、アッセイ混合物は５０μｌの細胞ホモジェネート、１０μｌの適切な阻害剤、および１６ｎＭの最終トレーサー濃度のため最後に添加される４０μｌの４０ｎＭ  ３Ｈ−ＡＥＡよりなった。反応は元は３７℃で３０分間行ったが；しかし後の実験は該酵素が室温で良好な活性を表したことを示し、そして実験は別の方法で示されない限り室温で６０分間実施した。
【００５１】
１時間のインキュベーションの間に、９６ウェルマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）フィルタープレート（カタログ番号ＭＡＦＣＮＯＢ５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）に２５μｌの活性炭（マルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）カラムローダー、カタログ番号ＭＡＣＬ０９６２５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を負荷しかつ１００μｌのメタノールで１回洗浄した。また、インキュベーションの間に、９６ウェルダイネックス（ＤＹＮＥＸ）マイクロライト（ＭｉｃｒｏＬｉｔｅ）プレート（カタログ番号ＮＬ５１０４１０）に１００μｌのマイクロシント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ）４０（カタログ番号６０１３６４１、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国コネチカット州メリデン）を負荷した。１時間のインキュベーション後に６０μｌの反応混合物を炭プレートに移し、それをその後遠心分離整列枠（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｆｒａｍｅｓ）（カタログ番号ＭＡＣＦ０９６０４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してダイネックス（ＤＹＮＥＸ）プレートの上部に集成した。未結合の標識エタノールアミンを遠心分離して、上述されたとおりシンチラントで前被覆した下部プレートに通した（２，０００ｒｐｍで５分）。プレートを封止し、そしてＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄのトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）でカウントする前に室温で１時間放置した。Ｋｍ値の決定のために１μＭ  ３Ｈ−ＡＥＡを３０μＭの未標識ＡＥＡと合わせかつ連続的２倍希釈を行った。
【００５２】
切断されない３Ｈ−アナンダミドならびに未標識のアラキドン酸は炭により吸収される。対照的に、標識３Ｈ−エタノールアミンは真空若しくは遠心分離が適用される場合に炭ミニカラムを通って９６ウェル計数プレートに流れる。その後９６ウェルプレートをＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）上で読取ることができる（図２）。
炭はアナンダミドおよびアラキドン酸を選択的に結合するがしかしエタノールアミンはしない：
４種の異なる放射標識トレーサー、すなわち、２種のトリチウム化した形態のアナンダミド（エタノールアミン部分；アナンダミド［１−３Ｈ−エタノールアミン］若しくはアラキドン酸部分；アラキドン酸［５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−３Ｈ（Ｎ）］のいずれかで標識された）、ならびにトリチウム化したアラキドン酸および１４Ｃ標識エタノールアミンを使用して、該アッセイで使用した炭の結合特徴を探究した。特定量のこれらのトレーサーを方法に記述されるとおり膜調製物とともにインキュベートし、前洗浄した炭に添加しかつ遠心分離により回収した。回収された放射活性をカウントしかつ添加された量のパーセントとして表した。図３に示されるとおり、膜が存在しなかった、すなわちアナンダミドのアラキドン酸およびエタノールアミンへのＦＡＡＨに媒介される転化が存在しなかった場合、２種の標識された形態のアナンダミドのいずれもフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中で検出され得ず、該トレーサーが炭に結合されたことを示した。トリチウム化アラキドン酸もまた炭上に吸収されかつフロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）中で検出され得なかった。使用した４種のトレーサーのうち１４Ｃ−エタノールアミンのみが回収され得た。
【００５３】
ヒト癌細胞株ＨｅＬａ細胞はＦＡＡＨを発現しないことが既知である（Ｕｅｄａら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．１０８：１０７−１２１）。従って、陰性対照として、また、アナンダミドの加水分解に対するＦＡＡＨ以外の酵素の可能な寄与を検討するためにこの細胞株を使用した。ＨｅＬａ細胞膜との３Ｈ−アナンダミドのインキュベーション後に本質的に放射活性の回収が存在せず、ＦＡＡＨの非存在を確認した（図３）。
【００５４】
トレーサーをマウス肝若しくはＴ８４細胞から調製した膜とともにインキュベートした場合、放射活性の良好な回収がアミドのＮ末端で標識したアナンダミド（３Ｈ−エタノールアミン）について見出されたが、しかし脂肪酸の炭化水素鎖上にトリチウム標識を運搬するアナンダミド（３Ｈ−ＡＡ）についてはされなかった。全部の実験は、アナンダミドおよびアラキドン酸がエタノールアミンと対照的に炭カラム上で吸収されたことを一貫して示した。従って、放射標識したアナンダミドを、ＦＡＡＨを含有する細胞ライセートとともにインキュベートする場合にフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中で回収される放射活性は放射標識したエタノールアミンに帰されるはずである。この実験は、炭を使用してアナンダミドおよびエタノールアミンを分離することが可能であることを示す。ＳＡＸおよびＣ１８樹脂のような他の製品もまた試験したが、しかしより少なく効果的であった（示されない）。
ＦＡＡＨアッセイの特徴付け：
ＦＡＡＨ活性は多様な細胞中で見出される。げっ歯類では肝、次いで脳がＦＡＡＨの最高の発現を有するようである一方、ヒトでの該発現は膵および脳で最高であるがしかし肝ではより低い（Ｕｅｄａら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．１０８：１０７−１２１）。Ｔ８４細胞中でのヒトＦＡＡＨ  ｍＲＮＡの発現はＤＮＡマイクロアレイを使用する発現プロファイリングにより見出され（示されない）かつその後の実験により確認された。
【００５５】
アッセイのシグナル出力は０．４２〜３．５μｇ／ウェルのＴ８４膜の範囲で直線的であることが決定された。本発明の一態様はＨＴＳ適合性のアッセイであるため、使用したタンパク質の量で１時間以上にわたり該反応が直線的であったことが確認された。図４Ａに示されるとおり、室温での反応の速度は、３．５μｇ／ウェルのタンパク質を使用した場合に９０分の期間にわたり直線的であった。この実験を室温および３７℃の双方で実施し、該酵素は期待されたとおりより高温でわずかにより活性であった。ＨＴＳアッセイの実施のため、室温で１時間のインキュベーション期間および３．５μｇ／ウェルのタンパク質量を、これらの結果に基づいて選んだ。
ＦＡＡＨ活性のキネティック分析：
Ｔ８４ヒト結腸直腸癌細胞におけるＦＡＡＨによるアナンダミドの加水分解のキネティック分析は１．１±０．１７μＭのＫｍを示した。（図４Ｂ）。これはヒト脳について報告された値に近い（２μＭ、Ｍａｃｃａｒｒｏｎｅら（Ｍａｃｃａｒｒｏｎｅら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：３１４−３１８）を参照されたい）。全体として、ＦＡＡＨの反応についての文献中の報告されたＫｍ値は、使用した組織、種および方法に依存して０．８から８０μＭまで広範な範囲にわたる（Ｆｏｗｌｅｒら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：５１７−５２６）。例えば、Ｄｅｓａｒｎａｕｄら（Ｄｅｓａｒｎａｕｄら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、６０３０−６０３５）はラット脳ミクロソームを使用して１２．７μＭというＫｍを見出した。Ｎ１８マウス神経芽腫細胞株においてＫｍは９．０μＭであることが決定された（Ｍａｕｒｅｌｌｉら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７７：８２−８６）。種差を別にして、これらの値の変動性は、この酵素の基質および生成物の双方が、酵素活性に影響しうるミセルを形成し得るという観察結果に帰された（Ｆｏｗｌｅｒら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：５１７−５２６）。
参照化合物を使用するＦＡＡＨアッセイの検証：
文献中に記述されているＦＡＡＨ阻害剤のいくつかを、阻害剤を同定するその能力を検証するためのアッセイで試験した。商業的に入手可能である阻害剤のうち、細胞質ホスホリパーゼＡ２の阻害剤でもまたあるメチルアラキドニルフルオロホスフェート（ＭＡＦＰ）が、１〜３ｎＭの報告されたＩＣ５０値を伴い最も強力である（Ｕｅｄａら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．１０８：１０７−１２１；Ｄｅｕｔｓｃｈら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３、２５５−２６０）。ＦＡＡＨの阻害剤としてのその効力は０．８ｎＭのＩＣ５０値の決定を伴い確認された。
【００５６】
遷移状態阻害剤オレイルトリフルオロメチルケトンもまた、ここで提示される研究で７３．３ｎＭのＩＣ５０を伴うＦＡＡＨの強力な阻害剤であることが報告されており、それはＴｉｇｅｒら（２０００；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９、６４７−６５３）により見出された２８〜４１ｎＭのＩＣ５０値と同一の範囲にあった。
【００５７】
セリンプロテアーゼの阻害剤フッ化フェニルメタンスルホニルは、低効力を伴うとは言えＦＡＡＨの阻害剤であることが示された。別のグループでのラット脳ＦＡＡＨの阻害についてのｐＩＣ５０はｐＨに依存して５．９２と４．１６との間であった（Ｈｏｌｔら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３３、５１３−５２０）。１００μＭの濃度では、それはＮ１８マウス神経芽腫細胞中のアナンダミドの加水分解を消失した（Ｍａｕｒｅｌｌｉら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７７、８２−８６）。それは神経芽腫およびグリア細胞中でＦＡＡＨ活性を阻害するためにＤｅｕｔｓｃｈら（１９９３；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６、７９１−７９６）により１．５ｍＭの濃度で使用された。２５μＭでそれはラット脳ミクロソームのアナンダミドの加水分解を４８％阻害した（Ｄｅｓａｒｎａｕｄら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、６０３０−６０３５）。この研究で得られたＩＣ５０値（１６μＭ）は従って文献で報告された数に十分に対応する。
【００５８】
最後に、ＦＡＡＨの生成物オレイン酸およびアラキドン酸を使用することにより生成物阻害を試験した。Ｍａｕｒｅｌｌｉら（１９９５；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７７、８２−８６）は１００μＭのアナンダミドがＦＡＡＨの活性を消失させたことを見出した。この研究で、これらの化合物は低マイクロモル濃度範囲のＩＣ５０値を伴いＦＡＡＨ活性を阻害した（表１）。
【００５９】
これらの結果は、該アッセイがＦＡＡＨ活性の確実な評価方法を提供することを確認する。該アッセイは参照阻害剤を使用して成功裏に検証された。該アッセイは例えば９６ウェルプレート中でのように複数の反応で同時に実施してもよいため、該アッセイは化合物の集合物ならびに天然産物若しくはコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニングに適応可能である。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
それぞれ三重で行った２〜５回の実験で得た値の平均±Ｓ．Ｅ．を示す。右の欄の数字は文献のデータを指す。参考文献：（１）：Ｄｅｕｔｓｃｈら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７、５３：２５５−２６０。（２）：Ｕｅｄａら  Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．２０００、１０８：１０７−１２１。（３）Ｆｏｗｌｅｒら  Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００、１３１：４９８−５０４。（４）Ｔｉｇｅｒら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００、５９：６４７−６５３。（５）Ｈｏｌｔら  Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１、１３３：５１３−５２０。
【００６２】
前述の記述、例および付随する図面は本発明を全般的に記述する。該記述は具体的説明を提供する目的上であり；本発明は本明細書に記述される特定の態様により制限されない。当業者は、本発明の多様な改変を本明細書に記述されるものに加えて行ってよいことを認識するであろう。こうした改変は付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＦＡＡＨアッセイの図解。Ｔ８４膜中のＦＡＡＨ活性はアナンダミド［１−３Ｈ−エタノールアミン］を放射標識エタノールアミンおよび未標識のアラキドン酸に転化する。標識アナンダミドおよび未標識アラキドン酸はフィルタープレート中の炭に選択的に結合される一方、放射標識エタノールアミンはフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中に収集されかつカウントされる。
【図２】ＦＡＡＨアッセイ法の一態様を描く。反応は反応プレート中で室温で起こる。６０分後、６０μｌの反応混合物を、炭を充填したフィルタープレートに移す。フィルタープレートをダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）プレートの上部に嵌め；その後アセンブリを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
【図３】アラキドン酸およびアナンダミドは活性炭に結合するがしかしエタノールアミンはしない。４種の異なる放射標識トレーサー、すなわちアナンダミド［１−３Ｈ−エタノールアミン］、アナンダミド［アラキドニル−５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−３Ｈ］、アラキドン酸［５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−３Ｈ（Ｎ）］およびエタノールアミン（［２−１４Ｃ］エタン−１−オール−２−アミン塩酸塩）を使用した。トレーサーをマウス肝、Ｔ８４細胞、ＨｅＬａ細胞から調製した膜若しくはベヒクルとともに室温で６０分間インキュベートした。フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中に回収された総放射活性のパーセント（三重の測定の平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）から計算した）を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】好ましいアッセイの特徴付け。Ａ：室温かつ３７℃でのＦＡＡＨによる３Ｈ−アナンダミドの加水分解の時間経過。三重の測定の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。Ｂ：ＦＡＡＨのＫｍの決定。Ｔ８４細胞膜（ウェルあたり３．５μｇタンパク質）をある範囲の濃度の３Ｈ−アナンダミドとともにインキュベートした。反応は阻害剤（オレイルトリメチルフルオロケトン（ＯＴＦＭＫ）若しくはメチルアラキドニルフルオロホスフェート（ＭＡＦＰ）のいずれか）の存在若しくは非存在下に室温で実施した。オレイルトリメチルフルオロケトンを使用して非特異的結合を測定した実験を示し；ＭＡＦＰでの結果は似ていた。各点は三重の測定の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を反映する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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