(57)【要約】本発明は、Ｌ−セリンの生合成に関与するタンパク質をコードする、コリネ型バクテリアのヌクレオチド配列並びにＬ−セリンの製造方法に関する。野生型ｓｅｒＡ配列のＣ末端において少なくとも７９のアミノ酸の欠失により、野生型と比べてＬ−セリンによるわずかなフィードバック阻害を有する３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼを産生することができた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１による遺伝子ｓｅｒＡを含む、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸、またはこの核酸配列の対立遺伝子、相同体または誘導体、またはこの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２による遺伝子ｓｅｒＡを含む、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸、またはこの核酸配列の対立遺伝子、相同体または誘導体、またはこの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３による遺伝子ｓｅｒＡを含む、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸、またはこの核酸配列の対立遺伝子、相同体または誘導体、またはこの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４による遺伝子ｓｅｒＡを含む、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸、またはこの核酸配列の対立遺伝子、相同体または誘導体、またはこの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５による遺伝子ｓｅｒＡを含む、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸、またはこの核酸配列の対立遺伝子、相同体または誘導体、またはこの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列。
【請求項６】
コリネ型バクテリアから単離される、請求項１〜５のいずれか1つに記載の核酸。
【請求項７】
コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウムから単離される、請求項１〜６のいずれか1つに記載の核酸。
【請求項８】
コリネバクテリウム  グルタミクムまたはブレビバクテリウム  フラブムから単離される、請求項１〜７のいずれか1つに記載の核酸。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか1つに記載の少なくとも１種の核酸配列並びに該核酸配列と作動可能に連結された調節配列を含む、遺伝子構築物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか1つに記載の少なくとも１種の核酸配列または請求項９記載の遺伝子構築物並びに、選択のための、宿主細胞中での複製のための又は宿主細胞−ゲノム内への組み込みのための付加的な核酸配列を有する、ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか1つに記載の核酸配列によりコードされた、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼまたはその一部。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７によるアミノ酸配列またはこのポリペプチド配列の改変された形またはそのイソ型を有する、請求項１１記載の脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８によるアミノ酸配列またはこのポリペプチド配列の改変された形またはそのイソ型を有する、請求項１１記載の脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９によるアミノ酸配列またはこのポリペプチド配列の改変された形またはそのイソ型を有する、請求項１１記載の脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０によるアミノ酸配列またはこのポリペプチド配列の改変された形またはそのイソ型を有する、請求項１１記載の脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１によるアミノ酸配列またはこのポリペプチド配列の改変された形またはそのイソ型を有する、請求項１１記載の脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ。
【請求項１７】
コリネ型バクテリアから由来する、請求項１１〜１６のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウムから由来する、請求項１１〜１７のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
コリネバクテリウム  グルタミクムまたはブレビバクテリウム  フラブムから由来する、請求項１１〜１８のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜８に記載の核酸少なくとも１種を複製可能な形で含む微生物であって、該核酸が野生型微生物に比べて増幅して発現するか及び(又は)そのコピー数が増加している、上記微生物。
【請求項２１】
複製可能な形の請求項９記載の遺伝子構築物または請求項１０記載のベクターを含む、請求項２０記載の微生物。
【請求項２２】
対応する野生型菌株に比べて、活性に脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼを有する請求項１１〜１９のいずれか1つに記載の少なくとも１種のポリペプチドを含む、請求項２０又は２１記載の微生物。
【請求項２３】
当該微生物がコリネ型バクテリアである、請求項２０又は２２記載の微生物。
【請求項２４】
当該微生物がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項２０〜２３のいずれか1つに記載の微生物。
【請求項２５】
当該微生物がコリネバクテリウム  グルタミクムまたはブレビバクテリウム  フラブムに属する、請求項２０〜２４のいずれか1つに記載の微生物。
【請求項２６】
Ｌ−セリンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を同定及び(又は)単離するプローブにおいて、該プローブが請求項１〜８のいずれか1つに記載の核酸から出発して製造され、そして検出のために適当な標識を含む、プローブ。
【請求項２７】
微生物によるＬ−セリンの製造方法において、
ａ）  請求項１〜８のいずれか1つに記載の少なくとも１種の核酸をコリネ型バクテリアから単離し、ついで微生物内に導入し、そこで発現させ、その際この対応してコードされたポリペプチドの遺伝子発現及び(又は)活性が、対応して遺伝的に改変されていない微生物と比べて増加され、
ｂ）  a）に由来する、この遺伝的に改変された微生物を、微生物による製造のために使用し、および
ｃ）  対応して生成されたＬ−セリンを培地から単離する、
上記Ｌ−セリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−セリンの生合成に関与するタンパク質をコードする、コリネ型バクテリアのヌクレオチド配列並びにＬ−セリンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸のＬ−セリンは、食品工業、飼料工業および薬剤工業並びに医薬品において使用される。さらに、このＬ−セリンは、工業的に使用可能な他の生成物合成のための、例えばインドールとＬ−セリンとからのＬ−トリプトファンの合成のための構成要素として利用される。
【０００３】
Ｌ−セリンはコリネ型バクテリアの菌株の発酵によって製造できることは公知である。例えば、コリネバクテリウム  グリシノフィリウム（Corynebacterium glycinophilum）の菌株はグリシンおよび炭水化物からＬ−セリンを形成することができる（非特許文献1）。グリシンからＬ−セリンへの変換には、この場合に酵素のＬ−セリン−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼが関与する（非特許文献2）。使用されたこの菌株はさらに、酵素のＬ−セリン−デヒドラターゼの活性の低下の原因となりえるＬ−セリン−分解がわずかである（非特許文献3）。
【０００４】
さらに、Ｌ−セリンはメタノールとグリシンとからメチロトローフバクテリア、例えばヒフォミクロビウム（Hyphomicrobium）菌株を用いて発酵法により生産される（非特許文献4）。両方の場合に、アミノ酸のグリシンをアミノ酸のＬ−セリンの形成のための前駆体として使用しなければならない。
【０００５】
さらに、他の前駆体を付加的に添加することなく、Ｌ−セリンを炭水化物から直接生産することができるコリネ型バクテリアは公知である。コリネバクテリウム  グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）属に属するこの菌株は、例えばＬ−セリン−類似体のセリン−ヒドロキサマートおよびβ−クロロアラニンに対して耐性であり、かつ無指向性の突然変異生成（undirected mutagenesis）により得られた（非特許文献5）。
【０００６】
さらに、無指向性の突然変異生成によりＬ−セリン−分解において欠失を有し、ｓｅｒＡによりコードされる３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの高められた活性を有し、かつ大腸菌（Escherichia coli）から由来する遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣを過剰発現するブレビバクテリウム  フラブム（Brevibacterium flavum）菌株は公知である（特許文献1）。この場合に使用された脱調節されたｓｅｒＡ−遺伝子は無指向性突然変異生成により得られ、かつ野生型の遺伝子とは唯一の塩基交換によってだけ異なっている。この遺伝子の発現は、復帰突然変異しやすく、それにより調節された状態に戻る可能性があるという欠点を有する。
【０００７】
今まで公知の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの欠点は、Ｌ−セリンによるそのフィードバック阻害にあり、それにより、例えばＬ−セリンの微生物による製造の生産性は低下してしまう。Ｌ−セリンによるこの調節の原因である領域は、タンパク質のＣ末端である。特許文献2からは、Ｅ．ｃｏｌｉからの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードし、そのＣ末端が２５％まで変更されているか、完全に欠失しているかまたは所定の領域に挿入が行われていて、Ｌ−セリンによりわずかな阻害が生じるＤＮＡは公知である。この３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼは、しかしながらわずかな活性を示すだけである。改善されたＬ−セリン産生は、この脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼを用いて行われていなかった。
【０００８】
野生型ｓｅｒＡ配列は一般に公知であり、かつ当業者に公知のデータバンクまたはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６による添付の配列表から推知することができる。
【特許文献１】欧州特許公開（A2）第0 931833号公報
【特許文献２】国際特許出願(WO)第93/12235号明細書
【非特許文献１】Kubota K, Kageyama K, Shiro T 及びOkumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I, Yamada K 及びOkumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18:365
【非特許文献２】Kubota K 及びYokozeki K (1989) Journal of Fermentation and Bioengineering, 67(6): 387 - 390
【非特許文献３】Kubota K, Kageyama K, Shiro T 及びOkumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K,(1985) Agricultural Biological Chemistry 49:7-12
【非特許文献４】Izumi Y, 及びTanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432
【非特許文献５】Yoshida H and Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagakukaishi 48: 201-208
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の課題は、前記した欠点を解消することができかつＬ−セリンまたはそのＬ−セリンから誘導可能な物質代謝産物、例えばトリプトファンの改善された産生を行うことができる方法を提供することであった。従って、本発明の課題は、天然由来の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼと比べて、活性を維持しながらわずかなＬ−セリンによるフィードバック阻害を示す３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸を提供することであった。この関連で、さらなる本発明の課題は、天然由来の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼもしくは３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼを有する微生物と比べて、活性を維持しながらわずかなＬ−セリンによるフィードバック阻害を示す３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ並びに微生物を提供することであった。さらに、本発明の課題は、Ｌ−セリンの微生物を用いた改善された製造方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１、２、３、４または５の上位概念から出発して、前記の課題は本発明の場合に、請求項１、２、３、４または５の特徴部に記載された特徴により解決される。さらに、前記課題は、請求項９の上位概念から出発して、本発明の場合に、請求項９の特徴部に記載された特徴により解決される。前記課題は、さらに、請求項１０の上位概念から出発して、本発明の場合に、請求項１０の特徴部に記載された特徴により解決される。前記課題は、同様に、請求項１１の上位概念から出発して、本発明の場合に、請求項１１の特徴部に記載された特徴により解決される。前記課題は、さらに、請求項２０の上位概念から出発して、本発明の場合に、請求項２０の特徴部に記載された特徴により解決される。請求項２６の上位概念から出発して、前記の課題は同様に、本発明の場合に、請求項２６の特徴部に記載された特徴により解決される。さらに、前記課題は、請求項２７の上位概念から出発して、本発明の場合に、請求項２７の特徴部に記載された特徴により解決される。
【００１１】
本発明による核酸並びにポリペプチドを用いて、天然由来のまたは遺伝子工学的に変更されていない核酸もしくは酵素に比べて、３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ−活性を維持しながら、Ｌ−セリンによるフォードバック阻害が無いかもしくはわずかなフィードバック阻害を示す３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼを提供することができる。この特性は、以後「脱調節された」という用語で表現される。さらに、今まで公知の微生物を用いた方法と比べてより高い収率でＬ−セリン生産を行うことができる微生物および方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
有利な実施態様は、引用形式請求項に記載されている。
【００１３】
本発明の対象は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、４または５に記載の遺伝子配列ｓｅｒＡを有する脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードする核酸（以後ＰＧＤと表す）、またはそのヌクレオチド配列の対立遺伝子、相同体または誘導体またはこの配列とハイブリダイズする核酸配列の提供である。Ｃ末端において１９７のアミノ酸の欠失を有するＰＧＤをコードする、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載の核酸は、特に有利であることが判明した。
【００１４】
この本発明による核酸は、コリネ型バクテリア、有利にコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属、特に有利にコリネバクテリウム  グルタミクムから単離されることを特徴としている。菌株培養の形で寄託されたコリネ型バクテリアの野生型の例は、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２並びにコリネバクテリウム  アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５８０６またはブレビバクテリウム  フラブムＡＴＣＣ１４０６７である。Ｌ−セリンの製造のために適した突然変異体または産生菌株の例は、アルスロバクター属、シュードモナス属、ノカルジア属、メチロバクテリウム属、ヒポミクロビウム属、アルカリゲネス属またはクレブシエラ属からなる微生物である。本発明は、前記した菌株の記載によりより詳細に特徴付けられるが、しかしながらこの菌株に限定されるものではない。
【００１５】
核酸または核酸フラグメントとは、本発明の場合に、一本鎖または二本鎖であることができ、かつ場合により天然の、化学的に合成された、変性されたまたは人工的なヌクレオチドを含有することができるＲＮＡまたはＤＮＡからなるポリマーであると解釈される。ＤＮＡポリマーの概念は、この場合に、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの混合物も含める。
【００１６】
対立遺伝子とは、本発明の場合に機能的等価物、つまり、ほぼ同じ作用のヌクレオチド配列であると解釈される。機能的に等価の配列は、例えば遺伝子コドンの縮重が原因で異なる核酸配列であるが、所望の機能をなお有している配列である。機能的等価物は、従って、ここに記載された配列の天然由来の変異体並びに人工的な、例えば化学合成により得られかつ場合により宿主生物のコドン利用に適合した核酸配列を含む。
【００１７】
機能的等価物とは、特に、さらに所望の機能を示す当初の単離された配列の天然のまたは人工的な突然変異であるとも解釈される。突然変異は、１つまたは複数のヌクレオチド基の置換、付加、欠失、交換または挿入を含む。この場合に、タンパク質レベルで例えば、タンパク質の活性に基本的に変化を生じさせず従って機能的に中性である、保存されたアミノ酸交換が行われることができる、いわゆるサイレント突然変異を含む。これは、タンパク質の機能に本質的に影響を与えずに、タンパク質レベルでタンパク質のＮ末端に該当するヌクレオチド配列の変更も含む。
【００１８】
本発明により、ヌクレオチド配列の変性により対応する誘導体の形で得られたヌクレオチド配列も含む。このような変性の目的は、例えばその中に含まれるコードする配列の付加的な限定または例えば付加的な制限酵素−切断箇所の挿入であることができる。
【００１９】
さらに、人工的ＤＮＡ配列も、この人工的ＤＮＡ配列が上記のように所望の特性を媒介する限り本発明の対象である。このような人工的ＤＮＡ配列は、例えばコンピュータアシストされたプログラム（分子モデリング）を用いて産生されたタンパク質の逆翻訳によってまたはインビトロ選択により探し出すことができる。宿主生物に対して特異的なコドン利用に従ってポリペプチド配列の逆翻訳により得られた、コードするＤＮＡ配列が特に適している。この特異的なコドン利用を、分子遺伝学的方法を熟知する専門家は、形質転換すべき生物の他の既に公知の遺伝子のコンピューター評価によって容易に探し出すことができる。
【００２０】
相同の配列とは、本発明の場合には、本発明によるヌクレオチド配列に相補的であり及び(又は)本発明によるヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列と解釈される。ハイブリダイズする配列の概念は、本発明の場合に、自体公知のストリンジェントな条件下で前記したヌクレオチド配列と特異的に相互作用（結合）する、ＤＮＡまたはＲＮＡのグループからのほぼ類似のヌクレオチド配列を含む。これには、例えば１０〜３０、有利に１２〜１５のヌクレオチドの長さを有する短いヌクレオチド配列も含まれる。これは、本発明の場合に、特にいわゆるプライマーまたはプローブも含む。
【００２１】
本発明の場合には、コードする領域（構造遺伝子）に先行する（５′−または上流の）配列領域及び(又は)後続する（３′−または下流の）配列領域も含まれる。特に、ここには調節機能を有する配列領域が含まれる。この配列領域は、転写、ＲＮＡ安定化またはＲＮＡプロセシング並びに翻訳に影響を及ぼすことができる。調節配列の例は、特にプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーターまたは翻訳エンハンサーである。
【００２２】
本発明の対象は、さらに、脱調節されたＰＤＧをコードする前記したヌクレオチド配列の少なくとも１種を含有し、並びにこの配列と作動可能に連結された、コードする配列の宿主細胞中での発現を制御する調節配列を有する遺伝子構築物である。
【００２３】
さらに、本発明は、宿主細胞内での複製のためまたは対応する宿主細胞ゲノム内への組み込みのための、脱調節されたＰＤＧをコードする前記した種類のヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列と作動可能に連結された調節ヌクレオチド配列並びに形質転換された宿主細胞の選択のための付加的なヌクレオチド配列含有するベクターに関する。さらに、本発明によるベクターは前記の種類の遺伝子構築物を含有することができる。
【００２４】
ベクターとしては、コリネ型バクテリア中で複製されるようなベクター、例えばｐＺ１（Menkel E, Thierbach G, Eggeling L, Sahm H., 1989, Appl Environ Microbiol 55(3): 684-688, pEKEx2 (Eikmanns 等, Gene 102: 93-98 (1991), pVWEx 又はpXMJ19が適している。他のプラスミドベクターも同様に使用することができる。しかしながら、これらの列挙は本発明を制限するものではない。
【００２５】
本発明による核酸配列の利用下で、対応するプローブまたはプライマーも合成することができ、かつ例えばＰＣＲ技術を用いて他の微生物、有利にコリネ型バクテリアから類似の遺伝子を増幅または単離するために使用される。
【００２６】
本発明の対象は、従って、Ｌ−セリンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の同定及び(又は)単離のためのプローブでもあり、その際このプローブは前記された種類の本発明による核酸配列から出発して製造され、かつ検出のための適当な標識を有している。このプローブは、本発明による配列の一部の断片、例えば保存領域からなる断片であることができ、この保存領域は例えば１０〜３０または有利に１２〜１５のヌクレオチドの長さを有し、かつストリンジェントな条件下で相同のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズすることができる。適当な標識は、多数の文献から公知である。このための手引書として当業者は、特に例えばＧａｉｔのハンドブック：  Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ，  １９８４年）およびＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ  ：  ＰＣＲ  （Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ，  １９９４年）または例えばＦｉｒｍａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）のハンドブック「Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，およびＬｉｅｂｌら著  （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （１９９１年）  ４１  ：  ２５５−２６０）に見ることができる。
【００２７】
本発明の対象は、更に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、４または５に記載の本発明による核酸配列によりコードされた脱調節されたＰＧＤまたはその一部であるかまたは前記の種類のその変異体である。同様に本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７、８、９、１０または１１によるアミノ酸配列を有する脱調節されたＰＧＤまたはこのポリペプチド配列の改変された形またはこのイソ型またはこれらからなる混合物である。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７によるアミノ酸配列を有する３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼが特に有利であることが判明した。
【００２８】
イソ型とは、異なる一次構造を有するが、同じまたは匹敵する基質特異性および作用特異性を有する酵素であると解釈される。
【００２９】
改変された形状とは、その変更が配列中の、特にペプチドのＮ末端でまたは保存アミノ酸領域に存在するが、酵素の機能が損なわれていない本発明による酵素であると解釈される。この変更をアミノ酸交換の形で自体公知の方法で行うことができる。
【００３０】
本発明の対象は、脱調節されたＰＧＤの機能を有するポリペプチドであり、このポリペプチドはそのアミノ酸配列中で、調節作用する化合物、例えば前記のポリペプチドの活性において調節する物質代謝−最終産物（Ｌ−セリン）に対して脱感作（フィードバック−脱感作）されるように変更されている。
【００３１】
この本発明によるポリペプチドは、コリネ型バクテリア、有利にコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属、特に有利にコリネバクテリウム  グルタミクム種またはブレビバクテリウム、特に有利にコリネバクテリウム  グルタミクムから由来することにより特徴付けられる。菌株培養の形で寄託されたコリネ型バクテリアの野生型の例は、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２並びにコリネバクテリウム  アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５８０６またはブレビバクテリウム  フラブムＡＴＣＣ１４０６７である。Ｌ−セリンの製造のために適した突然変異体または産生菌株の例は、アルスロバクター属、シュードモナス属、ノカルジア属、メチロバクテリウム属、ヒポミクロビウム属、アルカリゲネス属またはクレブシエラ属からなる微生物である。本発明は、前記した菌株の記載によりより詳細に特徴付けられるが、しかしながらこの菌株に限定されるものではない。
【００３２】
本発明の対象は、更に、脱調節されたＰＧＤ、対立遺伝子、その相同対または誘導体をコードする本発明による核酸配列またはその一部の少なくとも１種の宿主系内への導入(uebertragung)である。これは、本発明による遺伝子構築物またはベクターを宿主系内へ導入することも含める。このＤＮＡの宿主細胞内への導入は、遺伝子工学的方法により行われる。有利な方法として、形質転換および特にエレクトロポレーションによるＤＮＡの導入が挙げられる。
【００３３】
同族の宿主系が特に適していることが判明した。同族の宿主系とは、全ての類縁の科に属する微生物であると解釈される。本発明の場合には、これはコリネ型バクテリアであると解釈され、この中に本発明によるコリネ型バクテリアから単離された核酸が導入される。核酸の導入が正常に実施されたことにより得られた形質転換された微生物は、従って、対応する形質転換されていない微生物とは、形質転換された微生物が本発明による種類の付加的核酸を含有し、かつ対応して顕在化を行うことができることにより異なっている。適当な同族の宿主系に対する代用として、バクテリアのコリネバクテリウム  グルタミクムおよび有利に菌株ＡＴＣＣ  １３０３２が挙げられる。培養基としては、必要に応じて、複合培地、例えばＬＢ培地（T. Maniatis, E.F. Fritsch 及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989）または無機塩培地、例えばＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer, C. 等 1993, J. Bacteriol., 175:5593-5603）が適している。対応する培養に応じて、バクテリア懸濁液を収穫し、次の試験のために、例えば形質転換または核酸の単離のために、通常の方法を使用することができる。この手法は、他のコリネ型バクテリア菌株に関する手法と同様に行うことができる。この場合、宿主系としてコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のバクテリアが有利である。コリネバクテリウム属のなかでは、特にコリネバクテリウム  グルタミクムの種が有利であり、ブレビバクテリウム属のなかでは、ブレビバクテリウム  フラブムの種が有利である。これらの属の代表には、その特性において野生型として特徴付けられている菌株も挙げられる。これには、例えばコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ  １３０３２、コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ  １４７５２、コリネバクテリウム  アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １５８０６、コリネバクテリウム  アセトグルタミクムＡＴＣＣ  １５８０６、コリネバクテリウム  メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）ＡＴＣＣ  １７９６５、コリネバクテリウム  セルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム  フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ  １４７０６７、ブレビバクテリウム  ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ  １３８６９およびブレビバクテリウム  ジバリクタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ  １４０２０を挙げることができる。
【００３４】
さらに、本発明は宿主系としてＬ−セリンを産生する突然変異体またはアミノ酸産生菌株として優れているバクテリア菌株も含まれる。これは、例えば野生型菌株から出発して、典型的（化学的または物理的）方法または遺伝子工学的方法により製造することができる。本発明により適した菌株の例は、特にコリネバクテリウム  グルタミクム  ＡＴＣＣ  ２１５８６、コリネバクテリウム  グルタミクム  ＫＹ  １０１５０、コリネバクテリウム  グルタミクム  ＡＴＣＣ  １３０３２ΔｐａｎＢＣおよびブレビバクテリウム  ケトグルタミクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  ２１２２２である。さらに、本発明の場合に、当業者に微生物による製造方法から公知の産生菌株、例えば腸内細菌種、バチルス種または酵母種も適している。本発明は、微生物に関して選択された実施例により、詳細に特徴付けられるが、しかしながらこの実施例に制限されるものではない。
【００３５】
本発明は、さらに、前記した種類の本発明による核酸を複製可能な形で含有する遺伝的に改変された微生物に関し、この遺伝的に改変された微生物は対応する遺伝的に改変されていない微生物に比べて増強されて発現し及び(又は)そのコピー数が高められている。
【００３６】
同様に、本発明は、前記した種類の遺伝子構築物またはベクターを複製可能な形で含有する遺伝的に改変された微生物を含む。
【００３７】
本発明の対象は、さらに、前記した種類の脱調節されたＰＧＤの機能を有する本発明によるポリペプチドを含む遺伝的に改変された微生物でもあり、この遺伝的に改変された微生物は対応する遺伝的に改変されていない微生物に比べて、ＰＧＣ活性を維持しつつ、Ｌ−セリンによるビードバック阻害が抑制されているかもしくはフィードバック阻害を示さない。本発明により遺伝的に改変された微生物は、さらに、コリネ型バクテリア、有利にコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属、特に有利にコリネバクテリウム  グルタミクム種またはブレビバクテリウム  フラブム種であることにより特徴付けられる。
【００３８】
原則として、遺伝子は自体公知の方法により、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により短い合成されたヌクレオチド配列（プライマー）を用いて増幅し、引き続き単離することができる。使用されたプライマーの製造は、一般に、この遺伝子の保存された領域中に生じる相同性に基づき公知の遺伝子配列に基づいて及び(又は)調査すべき微生物のＤＮＡのＧＣ含有量を考慮しながら行われる。
【００３９】
コードするヌクレオチド配列を単離するための他の手法は、調査すべき遺伝子または対応するタンパク質の活性において少なくとも表現型で機能損失を有する調査すべき有機体のいわゆる欠失−突然変異体の相補性である。相補性とは、調査すべき微生物からの機能的遺伝子または遺伝子フラグメントの導入により達成される、突然変異体の遺伝子欠失の保管および当初の表現型の十分な回復であると解釈される。
【００４０】
欠失突然変異体の製造のための典型的な突然変異生成法は、例えばバクテリア細胞の薬品、例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる処理またはＵＶ照射である。突然変異を引き起こすためのこの種の方法は一般に公知であり、かつ特にＭｉｌｌｅｒ著（A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)またはハンドブック“Manual of Methods for General Bacteriology”of the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981)を参照することができる。
【００４１】
本発明は、さらに、コリネ型バクテリアから単離された少なくとも１種の本発明による核酸を宿主生物中へ導入し、その宿主生物中で発現させ、その際に、この対応してコードされたポリペプチドの遺伝子発現及び(又は)活性が、対応して遺伝的に改変されていない微生物に比べて増加され、この遺伝的に改変された微生物を微生物による製造のために使用し、対応して生成されたＬ−セリンを培地から単離する、微生物によるＬ−セリンの製造方法に関する。
【００４２】
高められた遺伝子発現（過剰発現）を達成するために、対応する遺伝子のコピー数を高めることができる。さらに、プロモーター領域及び(又は)調節領域及び(又は)構造遺伝子の上流に存在するリボソーム結合部位を、対応して高率で発現が行われるように変更することができる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは同様に作用する。誘導可能なプロモーターにより、さらにこの発現をＬ−セリンの発酵法による産生の過程で高めることも可能である。ｍＲＮＡの寿命を延長するための手法により、同様にこの発現は改善される。この遺伝子または遺伝子構築物は、多様なコピー数でプラスミド中に存在することができるかまたは染色体中に組み込まれて増幅されていてもよい。さらに、酵素自体の活性を高めるかまたは酵素タンパク質の分解を抑制することにより増強することもできる。これとは別に、さらに該当する遺伝子の過剰発現を培地組成および培養管理の変更により達成することもできる。
【００４３】
これらの解説については、当業者は、特にMartin等、 (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero等、  (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya 及びMorinaga (BioRechnology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns等 (Gene 102, 93-98 (1991)), 欧州特許第EPS 0 472 869号明細書, 米国特許第4,601,893号明細書, Schwarzer及びPuhler (Bio/Technology 9,84-87 (1991), Reinscheid等、 (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre等、 (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))，国際特許出願(ＷＯ)第96/15246号明細書, Malumbres等 (Gene 134, 15-24 (1993)), 日本特許公開平成10年229891号公報, Jensen及びHammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))および遺伝学および分子生物学の公知の教書を参照する。
【００４４】
本発明により製造された遺伝的に改変された微生物は、連続的または不連続的にバッチ法（回分培養）(set cultivation)でまたはフェドバッチ法（流加法）でまたは反復フェドバッチ法（反復供給法）で、Ｌ−セリンの産生のために培養することができる。公知の培養法に関する要約は、Chmielの教書 (Bioprozesstechnik 1.  Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 又はStorhasの教書 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００４５】
使用すべき培養基は、適当な方法でそれぞれの菌株の要求を満たさなければならない。多様な微生物の培養基は、ハンドブック“Manual of Methods for General Bacteriology”of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., 米国, 1981)に記載されている。炭素源として、糖および炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセリンおよびエタノールおよび有機酸、例えば酢酸を使用することができる。これらの材料は、個別にまたは混合物として使用することができる。窒素源として、窒素含有の有機化合物、例えばペプトン、酵母抽出液、肉抽出液、麦芽抽出液、トウモロコシ膨潤水、大豆粉末および尿素または無機化合物例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを使用することができる。これらの窒素源は、個別にまたは混合物として使用することができる。リン源として、リン酸、リン酸水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。この培養基は、さらに生長のために必須である金属塩、例えば硫酸マグネシウムおよび硫酸鉄を含まなければならない。最終的に必須の生長材料、例えばアミノ酸およびビタミンを、上記の材料に加えて使用することができる。この培養基に、さらに適当な前駆体を添加することもできる。前記した使用物質は、培地に１回のバッチの形で添加することができるかまたは適当な方法で培養の間に添加することができる。この培地のｐＨ制御のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、たとえバリン酸または硫酸が適当な方法で添加される。気泡発生の制御のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、この培地に適当な選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気性条件下に維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養に導入することができる。培養の温度は通常では約２０℃〜４５℃、有利に２５℃〜４０℃である。この培養は、Ｌ−セリンの最大値が生じるまで続けられる。この目標は、通常で１０時間〜１６０時間の間に達成される。
【００４６】
Ｌ−セリン形成の分析は、Spackman等、 (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)に記載されているようにアニオン交換クロマトグラフィーに引き続くニンヒドリン誘導化により、またはLindroth等、 (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)に記載されているように逆相ＨＰＬＣにより行うことができる。
【００４７】
本発明の対象である微生物は、Ｌ−セリンを、グルコース、サッカロース、ラクトース、マンノース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースまたはグリセリンおよびエタノールから製造することができる。既に詳細に記載したこの代表物は、コリネ型バクテリアであることができる。発酵の結果の選択は表６に記載されている。この場合に、本発明により遺伝的に改変された微生物は、対応する形質転換されていない微生物（野生型）または単に遺伝子挿入物なしのベクターを含む微生物に比べて、著しく改善されたＬ−セリン−酸性を特徴とする。本発明の特別な実施態様では、C. glutamicum ATCC 13032DpanBCpZ1serAΔ197中での相同のＣ末端で短縮されたｓｅｒＡ遺伝子の過剰発現が、対照菌株に比べて培地中でのＬ−セリン蓄積の少なくとも４０％までの向上を示す（表６）。Ｌ−セリン生合成経路に有利に作用する他の遺伝子の共通の過剰発現により、Ｌ−セリン−産生をさらに向上させることも期待することができる。
【００４８】
アミノ酸−産生菌株とは、本発明の範囲内で、典型的方法及び(又は)分子生物学的方法により、物質代謝がアミノ酸またはその誘導体の生合成の方向へ増強されて進行するように変更されているコリネバクテリウム  グルタミクム菌株または同様の微生物であると解釈される（代謝技術；ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。例えば、このアミノ酸産生菌株の場合に、この代謝経路において決定的なキーポジションまたは決定的に複合して調節するキーポジション（ボトルネック）にある１つまたは複数の遺伝子及び(又は)対応する酵素は、その調節作用において変更されているかまたは脱調節されている。本発明は、この場合に既に公知の全てのアミノ酸産生菌株、有利にコリネバクテリウム属または類似の生物を含む。さらに、本発明の場合に、当業者に同様の知識で他の微生物、例えば腸内細菌、バチルスまたは酵母−種から通常の方法により製造することができる産生菌株も含まれる。
【００４９】
これらの図面は、例示的に使用されたプラスミド並びにＰＧＤのプライマー構造の比較およびＰＣＲを用いて構築されたｓｅｒＡの対立遺伝子を示す。
【００５０】
図１は、多様な有機体からの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）の一次構造の比較；スケーリングはコリネバクテリアのＰＧＤのアミノ酸の数に相当する；Ｎ＝アミノ末端；Ｃ＝カルボキシ末端；ライトグレーの面積で示された領域Ａは、ヌクレオチド結合箇所を表す；ダークグレーの面積で示された領域Ｂは、基質結合領域を表す；黒色で示された領域Ｃはインヒビター結合領域を示す。
【００５１】
さらに、３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの２つの他のグループが存在し、これらは例示的に、E. coli(Tobey K.L. and Grant G.A., 1986, J. Biol. Chem., 261: 12179-12183) もしくはセルモトガ  マリチマ（Thermotoga maritima；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ０００５１２）により代表される。この場合に、超好熱菌のＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのタンパク質は３２７アミノ酸長で、最短であり、一方でＥ．ｃｏｌｉからの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼは４１０アミノ酸長で中間的な長さを有する。
【００５２】
図２は、脱調節された、Ｃ末端が短縮されたＰＧＤをコードする、ＰＣＲ法を用いて構築されたｓｅｒＡの対立遺伝子に関する一覧。野生型ｓｅｒＡ遺伝子領域（上側）および本発明による欠失構築物が示されている。ライトグレー、ダークグレーおよび黒色で示された領域は、図１と同様の定義を表す。
【００５３】
図３は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡを示す。
【００５４】
図４は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ７９を示す。
【００５５】
図５は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ１８８を示す。
【００５６】
図６は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７を示す。
【００５７】
図７は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ２０５を示す。
【００５８】
図８はプラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ２１１を示す。
【実施例１】
【００５９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの指向性の脱調節
ａ）  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼと、他の有機体の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼとの、コンピューターを使用したアミノ酸配列比較
まず最初に、脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの構築のための計画を立てた。特許データベース（Nakagawa, S., Mizogukchi, H., Ando, S., Hayashi, M., Ochiai,K., Yokoi, H., Tateishi, N., Senoh, A., Ikeda, M. and Ozaki, A. Patent: EP 1108790-A 7064 20 Jun 2001; KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. (JP); Pompejus, M., Kroeger, B., Schroeder, H., Zelder, O. 及びHaberhauer, G. Patent: WO 0100843-A 167 04-JAN 2001; BASF AKTIENGESELLSCHAFT (DE)）からのＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ遺伝子の配列を使用した。Corynebacterium glutamicumのｓｅｒＡ遺伝子（ＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．１２）から誘導されたポリペプチド鎖を、次にデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）からの対応する３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼと比較した。C. glutamicumからの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼは、Mycobacterium tuberculosis（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１２３４５６）からのものおよびいくつかの他のバクテリア、例えばbacteria Bacillus subtilis (Sorokin, A., Azevedo, V., Zuimstein, E., Galleron, N., Ehrlich, S.D. and Serror, P., Microbiology 142 (Pt 8), 2005-2016 (1996)) 及び Aquifex aeolicus（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ０００６５７）と同様に５３０アミノ酸長を有し非常に長いことが示された。このグループの酵素には、同様に動物、例えばラット(Achouri Y., Rider M.H., Van Schaftingen E. and Robbi M., 1997, Biochem J., 323:365-370)およびヒト(Cho HM, Jun Dy, Bae MA, Ahn JD, Kim YH., 2000, Gene 245(1):193-201) 並びに植物 (z. B. Arabidopsis thaliana; Ho CL, Saito K., 2001, Amino Acids. 20(3):243-59)も属する。このＥ．  ｃｏｌｉ酵素のＸ線構造解析は、この酵素が３つの機能的ドメインからなることを示した：ＮＡＤ／Ｈの結合のためのヌクレオチド結合ドメイン（アミノ酸１０８〜２９４）、並びに３−ホスホグリセラートが結合する２つに分かれた基質結合ドメイン（アミノ酸７〜１０７および２９５〜３３６）、並びにＬ−セリンのアロステリック結合の機能を担っている(Schuller DJ, Grant GA, Banaszak LF., 1995, Nature Struct. Biol. Vol 2 1:69-76)Ｃ末端の調節ドメイン（アミノ酸３３７〜４１０）。３つのタイプの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列比較は、Ｃ末端の調節ドメインの長さが本質的に異なることを示した（図１）。
【００６０】
完全な配列決定されたゲノムから公知である３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのクラスター分析は、Ｃ末端において差異があるにもかかわらず、このタンパク質の全てはオルソロジーの種類に属する、つまりこれらのタンパク質は進化上で共通の起源を有し、多様な種において異なる発展を遂げた。
【００６１】
ｂ）  Ｃ末端で短縮された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＰＣＲを用いてＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｓｅｒＡ遺伝子の対立遺伝子の構築
Ｃ末端出異なる長さの欠失を有する、Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの５種の異なる突然変異タンパク質が産生された（図２）。欠失突然変異体の構築は、野生型ｓｅｒＡ遺伝子の単離と同様にＰＣＲを用いて行った。このために、全部のプロモーター領域を把握するために、この遺伝子のスタートコドンの前方の領域２４０ｂｐに相同であるＰＣＲ−プライマー(serA-f: 5'-TCTAGAGCCGGAGACGTGAATAAAAT-3')を産生した。このプライマーを、全ての構築物に対して共通に使用し、かつこのプライマーは３′末端で制限酵素Ｘｂａｌに対する切断部位を有する。完全なｓｅｒＡ遺伝子の増幅のために、ストップコドンの後方の１９９ｂｐの長さを有しかつＢａｍＨＩ制限切断部位を有する第２の逆相補的プライマー(serA-r: 5' GGATCCGACTGGTGAGGGTCAAGTCC-3')が選択された。この期待されたＰＣＲ産物は、２０４０ｂｐの長さを有する。欠失の産生のために、遺伝子領域に存在しかつ全てが同様にＢａｍＨＩに対する切断部位を有する逆相補的プライマーを選択した。このプライマー serAΔ211-r (5'-GGATCCTTAACCGGAAACGTTCACAGC-3')は、スタートコドンの後方の９５６ｂｐにあり、その結果、１１９６ｂｐの長さのＰＣＲ産物が生じる。それにより、３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの最後の２１１アミノ酸が切断された。この欠失は、基質結合するドメインから調節するドメインへの推測上の移行領域にある（図１および図２参照）。このプライマーserAΔ205-r (5'-GGATCCTTACTCTTCGCCCACGCGACC-3')は、スタートコドンの後方の９８７ｂｐにあり、この期待すべきＰＣＲ産物は１２１４ｂｐの長さを有する。このＣ末端の欠失は、この場合２０５アミノ酸であり、このタンパク質は３２５の位置のアミノ酸のグルタメートの後方で終わる。この無指向性に産生されたこのアミノ酸のリシンへの交換は、Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの脱調節を引き起こす（ＥＰ  ０  ９３１  ８３３）。両方の欠失は、同様にラットからのタンパク質の欠失（Δ２０９アミノ酸）が産生された領域にある（Achouri Y., Rider M.H., Van Schaftingen E. 及びRobbi M., 1997, Biochem J., 323-365-370）。この２つのプライマーのserAΔ197-r (5'-GGATACCTTAAGCCAGAATCCATCCACACAG-3') 及びserAΔ188-r (5'-GGATCCTTACTTGCCAGCAAGAAAAGACC-3')は、ＡＴＧの後方の９９８ｂｐ並びに１０２５ｂｐにあり、Ｅ．  ｃｏｌｉの基質結合ドメインから調節ドメインへの移行部の上流に存在する。ＰＣＲにより期待されるべきＤＮＡフラグメントは、完全な３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼよりも対応して１９７もしくは１８８アミノ酸だけ短いポリペプチド鎖を産生する。この最短の欠失は、プライマーserAΔ79-r(5'-GGATCCTTAATCCAGGCCACGGCCATT-3')により産生され、７９アミノ酸の領域を切断し、これは、Ｅ．  ｃｏｌｉの調節領域に対して最大の類似性を示す（図２）。さらに、短縮されたタンパク質を生じる全ての逆相補的プライマーにおいて、切断部位の後方にストップコドンＴＡＡが挿入されていた。
【００６２】
このＰＣＲ反応は、３０サイクルで、デオキシヌクレオチド−トリホスフェート（dATP, dCTP, dGTP、dTTP）２００μＭの存在で、それぞれ対応するオリゴヌクレオチド１μＭ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０倍の反応緩衝液１／１０体積および熱安定性Ｔａｑ／Ｐｗｏ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ混合物（Expand High Fidelity PCR System of the Firm Roche Diagnostics, Mannheim, ドイツ）２．６単位を、サーモサイクラー（ＰＴＣ−１００，  ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，  ＵＳＡ）中で次の条件で実施した：９４℃で６０秒間、５０℃で９０秒間および７２℃で２分間。
【００６３】
このＰＣＲ反応の後に、得られたＤＮＡフラグメントをＱＩＡＥｘＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造元の指示に従って０．８％のアガロースゲルから単離し、ブラント末端をＳｕｒｅクローン−キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位中にクローニングした。このプラスミドは制限マッピングにより正確性を検査された。このクローニングは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant等, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 米国 (1990) 87: 4645-4649）中に行った。
【００６４】
引き続き、このｓｅｒＡ遺伝子およびｓｅｒＡ欠失構築物を、Ｅ．  ｃｏｌｉ／Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベクターｐＺ１（Menkel E. Thierbach G. Eggeling L. Sahm H., 1989, Appl Environ Microbiol 55(3): 684-688）中にクローニングした。このベクターはカナマイシン耐性を媒介する。このために、この欠失構築物の挿入物は、それぞれｐＵＣ１８−ベクターから制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切り出された。このＤＮＡの付着末端は、クレノウ処理を用いて補充され、かつこのフラグメントはブラント末端でＳｃａＩ切断されたベクターｐＺ１中にライゲーションされた。この野生型ｓｅｒＡ遺伝子は、ＥｃｏＲＩ−制限酵素により同様にクレノウ処理され、ブラント末端でＳｃａＩ切断されたベクターｐＺ１中にライゲーションされた。こうして得られた構築物は、ｐＺ１ｓｅｒＡ（図３）、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ７９（図４）、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１８８（図５）、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７（図６）、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ２０５（図７）およびｐＺ１ｓｅｒＡΔ２１１（図８）と命名された。
【実施例２】
【００６５】
野生型ｓｅｒＡ遺伝子並びに短縮されたｓｅｒＡ対立遺伝子のＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中での過剰発現
これらのプラスミドｐＺ１ｓｅｒＡ、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ７９、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１８８、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７、ｐＺ１ｓｅｒＡΔ２０５およびｐＺ１ｓｅｒＡΔ２１１を、エレクトロポレーションによりそれぞれＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中に導入した。
【００６６】
対照として、空のプラスミドｐＺ１をＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２にエレクトロポレーションした。こうして得られた菌株１３０３２ｐＺ１、１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡ、１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ７９、１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１８８、１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７、１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ２０５および１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ２１１を、次いで３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ酵素試験を用いて３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの過剰発現に関して分析した。このために、６種の菌株を複合培地（ＣｇＩＩＩ＝ＮａＣｌ  ２．５ｇ、Ｂａｃｔｏ−ペプトン１０ｇ、Ｂａｃｔｏ酵母抽出液１０ｇ、２％グルコースを用いてｐＨ７．４）中で培養し、この最少培地ＣＧＸＩＩをそれぞれ前培養から分離して摂取した。この培地は、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒらにより記載された培地ＣＧＸＩＩ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （１９９３年）  １７５  ：  ５５９３−５６０３）と同様であるが、付加的にカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有していた。Ｋｅｉｌｈａｕｅｒらにより記載された培地の組成を次の表１中に記載した。
【００６７】
表１
培地CGXIIの組成
【００６８】
【表１】
2006524032.tif 000002
【００６９】
この細胞を指数増殖期中で５〜８のＯＤ６００で収穫し、トリス−ＨＣｌ１００ｍＭ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。この細胞ペレットを引き続き分解するまで−２０℃で凍結した。この凍結したセルペレットを、次いで氷上で解凍し、冷たいトリス−ＨＣｌ  １００ｍＭ（ｐＨ７．５／グリセリン１０％）で再懸濁させ、Ｂｒｅｎｓｏｎ音波発生器中で１０分間分解させた。引き続き、細胞の残骸を遠心分離を用いて１３０００ｒｐｍで、４℃でＳｉｇｍａ−２０２  ＭＫ遠心分離器中で分離した。こうして得られた上澄液を粗製抽出液としてまず最初にＰＤ−１０カラムを介して製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の指示に従って脱塩し、次いですぐに酵素測定に使用した。この酵素試験は、３−ホスホグリセラートとＮＡＤとのホスホヒドロキシピルバートとＮＡＤＨへの反応におけるＮＡＤＨの形成の測光分析に基づく。試験結果を表２に示した：
表２
３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ活性の測定のための試験物質の成分
【００７０】
【表２】
2006524032.tif 000003
【００７１】
この試験物質を用いて、野生型の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼに対してタンパク質約１５０ｍＵ／ｍｇの比活性を測定することができた。完全なｓｅｒＡ遺伝子の過剰発現は３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ−比活性の約１６倍の向上が生じたことが示された。この構築物ｓｅｒＡΔ１９７は、野生型タンパク質に比べて１０倍の過剰発現が可能であった。この構築物ｓｅｒＡΔ１８８およびｓｅｒＡΔ２０５は、３〜３．４倍の過剰発現を可能にしたが、それに対して構築物ｓｅｒＡΔ２０５およびｓｅｒＡΔ７９については１．２〜１．５倍の過剰発現が可能となっただけであった。Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのＣ末端の１９７アミノ酸の欠失により産生された突然変異タンパク質ＳｅｒＡΔ１９７は機能性であり、および野生型の６０％以上の活性を有することが示された。
【００７２】
表３中には、この結果をまとめた。
【００７３】
表３
ｓｅｒＡ遺伝子並びにＣ末端が短縮されたｓｅｒＡ対立遺伝子の過剰発現
【００７４】
【表３】
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【００７５】
＊  菌株１３０３２ｐＺ１中の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ活性を１．０に基準化した。
【実施例３】
【００７６】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの野生型３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼおよびＣ末端が短縮された突然変異タンパク質ＳｅｒＡΔ１９７のＬ−セリンによる阻害についての調査
次に、Ｃ末端が短縮された突然変異タンパク質ＳｅｒＡΔ１９７についてＬセリンによりもはや阻害ができないかどうかを試験した。このために、まず最初にＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞不含の抽出液中でのＬ−セリンによる３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの阻害を上記の酵素試験を用いて調査した。このために、試験物質に付加的にＬ−セリン１．５および１０ｍＭを添加し、３０℃で５分間インキュベーションした。この反応を次いで３−ホスホグリセラート１５ｍＭの添加により開始させた。このインキュベーションは、阻害の検出を可能にするために必要であった（表４）。一定レベルの阻害が達成する前に数分間のインキュベーションが必要であるＬ−セリン−阻害の時間依存性は、他の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼについても、例えばＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓの生成された酵素に対しても記載されていた（Saski R. 及び Pitzer L., 1975, Eur. J. Biochem., 51:415-427）。
【００７７】
表４
C. glutamicumの野生型３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのＬ−セリンによる阻害
【００７８】
【表４】
2006524032.tif 000005
【００７９】
＊  Ｌ−セリンの添加なしでの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの活性を１００％に設定した。
【００８０】
この結果に基づいて、菌株１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡおよび１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７中での３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのＬ−セリン阻害を調査した。実際にＣ末端が短縮された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ−突然変異タンパク質はＬ−セリンによってもはや有意に阻害されることはなかった（表５）。
【００８１】
表５
菌株１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡおよび１３０３２ｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７中での過剰発現した３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのＬ−セリンによる阻害
【００８２】
【表５】
2006524032.tif 000006
【００８３】
＊  Ｌ−セリンの添加なしでの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの活性を１００％に設定した。
＊＊  Ｌ−セリンありおよびＬ−セリンなしでの３０℃で５分間インキュベーションした後で活性を測定
従って、Ｃ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼのＣ末端の欠失により指向性に脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ−突然変異タンパク質を産生することに成功した。
【実施例４】
【００８４】
脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡΔ１９７）についての遺伝子の過剰発現によるＬ−セリンの蓄積の向上
脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼを有する菌株のＬ−セリン排出の分析のために、プラスミドｐＺ１、ｐＺ１ｓｅｒＡおよびｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７を菌株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  １３０３２ＡｐａｎＢＣに形質転換した（Ｅ．  Ｒａｄｍａｃｈｅｒ，  Ａ．  Ｖａｉｔｓｉｋｏｖａ，  Ｕ．  Ｂｕｒｇｅｒ，  Ｋ．  Ｋｒｕｍｂａｃｈ，  Ｈ．  Ｓａｈｍ，  Ｌ．  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ著，  ２００２年，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （公開準備中））。この菌株は、パントテナート生合成遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣの欠失によりパントテナート栄養要求体であり、およびこの菌株はパントテナート制限下でピルバートの増強された蓄積に基づいてアラニン約５０ｍＭおよびバリン８ｍＭを排出することを特徴とする。さらに、この菌株はＬ−セリン１００μＭを産生し、従ってＬ−セリン−生産体の構築のための出発菌株として適している。プラスミドｐＺ１ｓｅｒＡで形質転換された菌株１３０３２ΔｐａｎＢＣｐＺ１ｓｅｒＡは、ブダペスト条約に従って、２００２年４月１１日にＤＮＳ寄託番号１４９２２でＤＳＭＺに寄託された。
【００８５】
Ｌ−セリン排出の試験のために、３種の菌株を複合培地（グルコース２％およびカナマイシン５０μｇ／ｌを有するＣｇＩＩＩ）中で培養し、発酵培地ＣＧＸＩＩ（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  （１９９３年）  １７５  ：  ５５９５−５６０３）にそれぞれ前培養から摂取した。この培地は、付加的にカナマイシン５０μｇ／ｌおよびパントテナート１μＭを有していた。２つの独立した発酵を実施した。１２０Ｕｐｍで回転振盪器で２４時間もしくは３５時間３０℃で培養した後に、この培地中に蓄積されたＬ−セリン量を測定した。アミノ酸濃度の測定は、高圧液体クロマトグラフィーを用いて行った（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔ  （１９８３年）  ２６６  ：  ４７１−  ４８２）。この発酵の結果を表６に記載し、既に野生型ｓｅｒＡ遺伝子の過剰発現は、培地中でのＬ−セリン蓄積の約１０％の向上を引き起こしたことが明らかとなった。
【００８６】
脱調節された３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼの過剰発現は、それに対して空のプラスミドの対照菌株に比べて４０％までの向上が達成された。従って、脱調節されたＬ−セリン−生合成酵素の３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼについて構築されかつ記載された遺伝子を利用することは、Ｌ−セリン産生を決定的に改善するための一つの方法である。
【００８７】
表６
遺伝子ｓｅｒＡもしくはｓｅｒＡΔ１９７の発現による１３０３２ΔｐａｎＢＣの培養基上澄み中でのＬ−セリンの蓄積
【００８８】
【表６】
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【００８９】
＊  ＴＧ＝細胞乾燥重量
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、多様な有機体からの３−ホスホグリセラート−デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）の一次構造の比較を示す。
【図２】図２は、脱調節された、Ｃ末端が短縮されたＰＧＤをコードする、ＰＣＲ法を用いて構築されたｓｅｒＡの対立遺伝子に関する一覧を示す。
【図３】図３は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡを示す。
【図４】図４は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ７９を示す。
【図５】図５は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ１８８を示す。
【図６】図６は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ１９７を示す。
【図７】図７は、プラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ２０５を示す。
【図８】図８はプラスミドベクターｐＺ１ｓｅｒＡΔ２１１を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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