(57)【要約】植物における内在性ＰＡＲＧタンパク質の活性を減少させることにより、乾燥、高い光強度、高い温度、栄養制限等を含む非生物的ストレス又は不利な成長条件に対する植物の耐性を増加させる方法及び手段を提供する。
2006522595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物細胞にキメラ遺伝子を与えてトランスジェニック植物細胞を創生し、
該キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片
（ｉ）植物で発現可能なプロモーター、
（ii）転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、
（iii）転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域、
を含み；
（ｂ）該トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生し；そして
（ｃ）トランスジェニック植物系統の該集団内でストレス耐性植物系統を同定する、
段階を含む、ストレス条件に耐性の植物を産生する方法。
【請求項２】
該ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該キメラ遺伝子は、該ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードする該ＤＮＡ領域と該３′端部領域との間に自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域を更に含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
該ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡは、該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス領域と、該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、該センス領域及び該アンチセンス領域は該少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該ストレス条件が、熱、乾燥、栄養欠乏、酸化性ストレス又は高い光条件から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
該トランスジェニック植物系統を他の植物系統と交雑させてストレス耐性子孫植物を得ることを更に含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
（ａ）植物のｐａｒＧコード遺伝子の一部を含む少なくとも１００bpのＤＮＡ断片を単離し；
（ｂ）下記のＤＮＡ断片：
（ｉ）植物で発現可能なプロモーター領域、
（ii）該プロモーター領域と比較して順方向における該植物のｐａｒＧコード遺伝子の一部を含む該単離されたＤＮＡ断片、
（iii）該プロモーター領域と比較して逆方向における該植物のｐａｒＧコード遺伝子の一部を含む該単離されたＤＮＡ断片、
（iv）転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域、
を作動可能に連結することによりキメラ遺伝子を産生させ；
（ｃ）植物細胞に該キメラ遺伝子を与えてトランスジェニック植物細胞を創生し；
（ｄ）該トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生し；そして
（ｅ）トランスジェニック植物系統の該集団内でストレス耐性植物系統を同定する；
段階を含む、ストレス条件に耐性の植物を産生する方法。
【請求項９】
（ｉ）植物で発現可能なプロモーター、
（ii）転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、
（iii）転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域、
を含むＤＮＡ分子。
【請求項１０】
該ＤＮＡ領域が、配列番号１、２若しくは１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチド又は配列番号３、４、１５若しくは２３のヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項９又は１０のＤＮＡ分子を含む植物細胞。
【請求項１２】
請求項１１の植物細胞から本質的になる植物。
【請求項１３】
請求項１２の植物を他の植物と更に交雑させ段階を含む、ストレス耐性植物を産生する方法。
【請求項１４】
請求項９又は１０のキメラ遺伝子を含む、請求項１２に記載の植物の種子及び繁殖物質。
【請求項１５】
請求項８の方法により得ることができる又は得られた植物。
【請求項１６】
（ａ）植物細胞にキメラ遺伝子を与えてトランスジェニック植物細胞を創生し、
該キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片
（ｉ）植物で発現可能なプロモーター、
（ii）転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域であって、配列番号１、２若しくは１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチド又は配列番号３、４、１５若しくは２３のヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ領域、
（iii）転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域、
を含み；
（ｂ）該トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生し；そして
（ｃ）トランスジェニック植物系統の該集団内でストレス耐性植物系統を同定する、
段階を含む、ストレス条件に耐性の植物を産生する方法。
【請求項１７】
（ａ）植物細胞系統又は植物又は植物系統を突然変異誘発に付し；
（ｂ）内在性ＰａｒＧ遺伝子において突然変異を有するこれらの植物細胞又は植物を同定し；
（ｃ）同定された植物細胞又は植物をストレス条件にさらし；
（ｄ）コントロール植物よりも良好に該ストレス条件に耐える植物細胞又は植物を同定する；
段階を含むストレス条件に耐性の植物を産生する方法。
【請求項１８】
（ａ）ＰａｒＧ阻害剤に対して耐性である植物細胞系統又は植物又は植物系統を選択し；
（ｂ）内在性ＰａｒＧ遺伝子において突然変異を有するこれらの植物細胞又は植物を同定し；
（ｃ）同定された植物細胞又は植物をストレス条件にさらし；
（ｄ）コントロール植物よりも良好に該ストレス条件に耐える植物細胞又は植物を同定する；
段階を含むストレス条件に耐性の植物を産生する方法。
【請求項１９】
内在性ＰａｒＧ遺伝子において突然変異を含むストレス耐性植物細胞又は植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥、高い光強度、高い温度、栄養制限等を含む不利な成長条件に対する植物の耐性を増加させるための植物におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼの使用に関する。非生物的ストレス条件に対して耐性である植物を産生するための方法及び手段が提供される。
【０００２】
発明の背景
しばしば、非生物的ストレスは、不利な条件にさらされる植物の細胞のＤＮＡを直接又は間接に損傷させる。ゲノムの損傷は、もし修復されなければ、細胞死をもたらすことがある。植物により示されるストレス条件に対する耐性は、不利な条件にさらされた植物細胞が損傷を減少させ及び／又は修復しそして生き延びることができる能力の結果である。
【０００３】
植物細胞は、他の真核細胞と同様に、精巧なＤＮＡ修復システムを進化させた。ＤＮＡ鎖切断によるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化は、しばしばＤＮＡ損傷に対する最初の細胞応答の一つである。ＰＡＲＰは、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）の転換から得られたＡＤＰ−リボースの分子を引き続いて加えることによりタンパク質の翻訳後の修飾を触媒して、２００以下のＡＤＰ−リボース残基（植物においては約４０残基）を含有する多重分岐したポリマーを形成する。ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成のＤＮＡ鎖切断に対する依存、及びＤＮＡ修復、複製及び転写反応の重要なエフェクターを更に含有する多重タンパク質複合体におけるＰＡＲＰの存在は、この翻訳後の修飾が核酸の代謝及びＤＮＡ修復に関与していることを強く示唆している。ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成は細胞サイクル及び細胞死の調節に関与していることも示される。
【０００４】
タンパク質のポリ（ＡＤＰ−リボシル化）は生きている細胞において一過性である。
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリマーは、急速に代謝回転され（turned over）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（ＰＡＲＧ；Ｅ．Ｃ．３．２．１．１４３）のエキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼ活性により遊離ＡＤＰ−リボースに転換される。タンパク質受容体上のＡＤＰ−リボースの最も近位の単位（most proximal unit）は、他の酵素（ＡＤＰ−リボシルタンパク質リアーゼ）の作用により加水分解される。
【０００５】
細胞生存に対するＰＡＲＰのこのプラスの（ＤＮＡ−修復関連の）効果に加えて、ＰＡＲＰのマイナスの効果もある。ＤＮＡが損傷されるとＰＡＲＰを活性化するプロセスは、ＮＡＤ＋レベルの急速な低下と関連している。何故ならば、ＰＡＲＰにより移送される各ＡＤＰ−リボース単位はＮＡＤ＋の１つの分子を消費するからである。ＮＡＤ＋の欠乏はＡＴＰの欠乏をもたらす。何故ならば、ＮＡＤ＋の再合成は、ＮＡＤ＋の分子当り少なくとも（生合成経路に依存して）３つのＡＴＰの分子を必要とするからである。更に、ＮＡＤ＋の欠乏は、解糖期間中ＡＴＰを再合成するのに必要なグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をブロックする。最後に、ＮＡＤ＋は、電子輸送及び酸化性リン酸化を経由してＡＴＰを発生させるのに必要な電子の重要なキャリアーである。
【０００６】
ＮＡＤ＋及びＡＴＰ欠乏の生理学的結果は、ＤＮＡ損傷で誘発された細胞死に関して確立された。アポトーシスの完了は、絶対的にＡＴＰの存在に依存していること及びこのヌクレオチドの不存在下では、細胞の死亡のタイプはアポトーシスからネクロシスに切り替わることが示された。ネクロシスと関連している細胞溶解は隣接細胞への更なる損傷を発生するので、多細胞生物がネクロシスよりむしろアポトーシス細胞死の方を選ぶことが好ましい。
【０００７】
かくして、ＤＮＡ損傷を生き延びる細胞の潜在力に対するポリ（ＡＤＰ−リボシル）化のプラス及びマイナスの効果の微妙なバランスを考慮することが極めて重要である。
【０００８】
ＷＯ００／０４１７３は、内在性ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現及び／又は見かけの活性に影響を与える「ＰＣＤ調節キメラ遺伝子（PCD modulating chimeric genes）」の導入により真核細胞及び生物、特に植物細胞及び植物におけるプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）を調節するための方法を記載している。プログラムされた細胞死は、抑制されるか又は引き起こされることができる。本発明は、特に、ＰＣＤを調節するため、成長速度を高めるため又はストレス耐性細胞及び生物を産生するためのＰＡＲＰ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用に関する。
【０００９】
ＰＡＲＧをコードする遺伝子は、多数の動物、例えば、Rattus norvegicus（受託番号：ＮＭ＿０３１３３９、ＮＷ＿０４３０３０、ＡＢ０１９３６６）、Mus musculus（受託番号：ＮＴ＿０３９５９８、ＮＭ＿００３６３１、ＡＦ０７９５５７）、Homo sapiens（受託番号：ＮＴ＿０１７６９６、ＮＭ＿００３６３１、ＡＦ００５０４３）、Bos taurus（受託番号、ＮＭ＿１７４１３８、Ｕ７８９７５）、Drosophila melanogaster（受託番号：ＡＦ０７９５５６）において同定された。
【００１０】
植物においては、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）において遺伝子のクロックコントロールド（clock-controlled）転写、及び栄養成長から開花までの光周期依存性移行（ｔｅｊ）における影響を受けた突然変異体で不活性化された野生型遺伝子のマップベースクローニングにより同定された。遺伝子のヌクレオチド配列は、受託番号ＡＦ３９４６９０の下にヌクレオチドデータベースから得ることができる（Panda et al., 2002 Dev.Cell.3, 51-61）。
【００１１】
発明の要約
本発明は、植物細胞にキメラ遺伝子を与えてトランスジェニック植物細胞を創生する段階を含み、該キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：植物で発現可能なプロモーター（plant-expressible promotor）；転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、及び転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域を含む、ストレス条件に耐性の植物を産生する方法を提供する。トランスジェニック植物系統の集団をトランスジェニック植物細胞から再生させ、そしてストレス耐性植物系統をトランスジェニック植物系統の集団内で同定する。ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子（内在性ＰａｒＧ遺伝子）のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むことができる。ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子（内在性ＰａｒＧ遺伝子）のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこともできる。更に他の態様では、ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡは、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス領域と、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含むことができ、該センス領域及び該アンチセンス領域は該少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。キメラ遺伝子は、ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードする該ＤＮＡ領域と３′端部領域との間に自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域を更に含むことができる。ストレス条件は、熱、乾燥、栄養欠乏、酸化性ストレス又は高い光条件から選ぶことができる。
【００１２】
本発明の他の態様では、興味のある植物のｐａｒＧコード遺伝子の一部を含む少なくとも１００bpのＤＮＡ断片を単離し；植物で発現可能なプロモーター領域を、該植物のｐａｒＧコード遺伝子の一部を含む単離されたＤＮＡ断片に、該プロモーター領域と比較して順方向で、及び該植物のｐａｒＧコード遺伝子の一部を含む単離されたＤＮＡ断片に、該プロモーター領域と比較して逆方向で、及び転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域に、作動可能に連結することによりキメラ遺伝子を産生する段階を含む、ストレス条件に耐性の植物を産生する方法が提供される。次いでこれらのキメラ遺伝子を植物細胞に与えてトランスジェニック植物細胞を創生する。トランスジェニック植物系統の集団をトランスジェニック植物細胞から再生し、そしてストレス耐性植物系統をトランスジェニック植物系統の集団内で同定する。本発明はこの方法により得られたストレス耐性植物細胞及び植物にも関する。
【００１３】
本発明の更に他の態様では、植物細胞にキメラ遺伝子を与えて、転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域を含むトランスジェニック植物細胞を創生し、該ＤＮＡ領域は、植物で発現可能なプロモーター並びに転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域に作動可能に連結された配列番号１、２若しくは１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチド又は配列番号３、４、１５若しくは２３のヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み；該トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生し；そしてトランスジェニック植物系統の集団内でストレス耐性植物系統を同定する段階を含む、ストレス条件に耐性の植物を産生する方法が提供される。
【００１４】
本発明は、転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域並びに転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域に作動可能に連結された、植物で発現可能なプロモーターを含むＤＮＡ分子も提供する。ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子（内在性ＰａｒＧ遺伝子）のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むことができる。ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子（内在性ＰａｒＧ遺伝子）のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこともできる。更に他の態様では、ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡは、植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス領域、及び植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含むことができ、該センス領域とアンチセンス領域は該少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。キメラ遺伝子は、ｐａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードする該ＤＮＡ領域と３′端部領域との間に自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域を更に含むことができる。キメラ遺伝子は、配列番号１、２若しくは１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列なくとも２１〜１００ヌクレオチド又は配列番号３、４、１５若しくは２３のヌクレオチド配列の少なくとも２１〜１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むこともできる。
【００１５】
更に他の態様では、本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含む植物細胞及び本質的にこのような植物細胞からなる植物並びに、このような植物を他の植物と更に交雑させる段階を含むストレス耐性植物を産生する方法に関する。本発明のキメラ遺伝子を含むこのような植物の種子及び繁殖物質も提供される。
【００１６】
本発明は、植物細胞系統又は植物又は植物系統を突然変異誘発に付し；内在性ＰａｒＧ遺伝子において突然変異を有するこれらの植物細胞又は植物を同定し；同定された植物細胞又は植物をストレス条件にさらしそしてコントロール植物よりも良好に該ストレス条件に耐える植物細胞又は植物を同定する段階を含む、ストレス耐性植物を得る方法にも関する。別法として、植物細胞又は植物をＰａｒＧ阻害剤に対する抵抗について選びそしてこのパラグラフで述べたように更に処理することができる。
【００１７】
本発明は更に内在性ＰａｒＧ遺伝子において突然変異を有するストレス耐性植物細胞又は植物に関する。
【００１８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、一方では、ＰＡＲＰ遺伝子発現を減少するキメラ遺伝子を含むストレス耐性植物系統からの細胞が、形質転換されていない植物系統からの細胞より不利な条件下により高いＮＡＤ／ＡＴＰ含有率を示すという証明に基づいている。他方、サテライトウイルスに基づく一過性サイレンシングＲＮＡベクターを使用したタバコのＰＡＲＧコード遺伝子の発現のサイレンシング（silencing）は、同じサイレンシングシステムを使用したＰＡＲＰコード遺伝子のサイレンシングで観察された発現型と同様な発現型をもたらすことが観察された。更に、シロイヌナズナ及びタバコのような植物におけるＰＡＲＧコード遺伝子の発現をサイレンシングさせると、例えば、高い光条件により課せられたストレス条件の如きストレス条件に対してより高い耐性の植物をもたらした。
【００１９】
特異的作用様式に本発明を限定することを意図しないけれども、ＰＡＲＧ遺伝子発現のサイレンシングは、下記の理由でＰＡＲＰ遺伝子発現のサイレンシングと同様な表現型をもたらすことが予想される。図１から分かるとおり、ＮＡＤを消費するＰＡＲＰにより触媒されるＡＤＰリボースの重合の後に、ＰＡＲＧにより触媒されるポリＡＤＰ−リボースの解重合が続く。ＰＡＲＰタンパク質自体のポリＡＤＰリボシル化は、ＰＡＲＰタンパク質の不活性化をもたらす。ＮＡＤの欠乏及びその結果としてＡＴＰの欠乏をもたらす、ＡＤＰリボース重合／解重合サイクルが植物細胞で起こる速度は、ＰＡＲＰ遺伝子発現又はＰＡＲＰの酵素活性の減少により遅くするか又は停止させることができる。結果として、このような細胞を含む植物細胞及び植物は、不利な条件に対してより耐性である。ここで与えられたデータは、ＰＡＲＧ遺伝子発現又はＰＡＲＧ活性の減少によりそのサイクルを遅くするか又は停止させることにより同様な効果を得ることができることを示す。
【００２０】
本発明は、ＰａｒＧ遺伝子の発現のレベルを変えるか又はその植物細胞においてＰＡＲＧタンパク質の活性又は見かけの活性を変えることによる、不利な環境条件に応答する植物細胞死の減少及びその結果としての高められたストレス耐性に関する。便利には、キメラ遺伝子を導入してＰａｒＧ遺伝子の発現を変えるか又は発現シグナルを含む内在性ＰＡＲＧコード遺伝子を変えることにより、ＰａｒＧ遺伝子の発現のレベルを遺伝子的に制御することができる。
【００２１】
本発明の１つの態様では、
−植物細胞にキメラ遺伝子を与えてトランスジェニック植物細胞を創生し、
該キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
−植物で発現可能なプロモーター、
−転写されるとＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、
−転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域、
を含み、
−該トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生し、そして
−トランスジェニック植物系統の該集団内でストレス耐性植物系統を同定する、
段階を含む、ストレス条件又は不利な成長条件に耐性の植物を産生する方法が提供される。
【００２２】
本明細書で使用した「ストレス耐性植物」又は「ストレス条件又は不利な成長条件に耐性の植物」は、ある期間の時間不利な成長条件、例えば、乾燥、高い温度、栄養の限定された供給（特に窒素）、高い光強度にさらされると（それらに限定はされないが）、本発明の方法に従って処理されなかったコントロール植物よりも良好に成長する植物（特に本発明の方法に従って得られる植物）である。これは、通常植物の一般的外観から明らかであり、そして例えば、増加したバイオマス産生、不利な条件下の連続した栄養成長（vegetative growth）又はより高い種子収量により測定することができる。ストレス耐性植物は、より広い成長スペクトルを有する、即ち、それらは収量不利益なしに広範囲の気候的変化及び他の非生物的変化に耐えることができる。生化学的には、ストレス耐性は、ストレス条件下にコントロール植物に比べてストレス耐性植物のより高いＮＡＤ＋−ＮＡＤＨ／ＡＴＰ含有率及び反応性酸素種のより低い産生として明らかでありうる。ストレス耐性は、同じ条件下にコントロール植物に比べてストレス耐性植物におけるストレス条件下のより高いクロロフィル含有率、より高い光合成及びより低いクロロフィル蛍光として容易に認識することもできる。
【００２３】
植物を連続的にストレス耐性のための不利な条件下に成長させて明らかにすることは必要ではないことも明らかであろう。通常、本発明に従う植物又は植物細胞とコントロール植物又は植物細胞とのストレス耐性の差は、成長中に相対的に短い期間の不利な条件にさらすだけで明らかになるであろう。
【００２４】
本明細書で使用した、「ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子」は、好ましくは、転写後のサイレンシングにより植物細胞の内在性ＰＡＲＧコード遺伝子の発現を減少させることができるＲＮＡ分子である。ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子が転写後のサイレンシングによりＰＡＲＧコード遺伝子の発現を減少させる場合ですら、このようなＲＮＡ分子は、例えば、内在性ＰａｒＧ遺伝子のＤＮＡメチル化を誘導して、やはり最終的にＰＡＲＧコード遺伝子の発現を減少させる如く、細胞内で他の機能に影響を与えることもできることは明らかであろう。また、植物細胞の内在性ＰＡＲＧコード遺伝子の発現を、転写サイレンシングにより、例えば、内在ＰａｒＧ遺伝子のプロモーター領域を標的とするＲＮＡｉ又はｄｓＲＮＡを使用することにより減少させることもできる。
【００２５】
本明細書で使用された、「ＰＡＲＧコード遺伝子」又は「ＰａｒＧ遺伝子」は、ＰＡＲＧ（ポリＡＤＰ−リボースグリコヒドロラーゼ）タンパク質をコードすることができる遺伝子であり、ＰＡＲＧタンパク質は、エンドグリコリシス作用又はエキソグリコリシス作用により遊離ＡＤＰリボース単位を放出することによって、ポリＡＤＰ−リボースの解重合を触媒する。
【００２６】
ＰＡＲＧコード遺伝子は、配列番号１（Arabidopsis thaliana）又は配列番号２（Solanum tuberosum）又は配列番号１６（Oryza satiba）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその一部、例えば、配列番号３又は配列番号４又は配列番号１５又は配列番号２３（Zea mays）のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を含むことができる。
【００２７】
しかながら、当業者は、植物種からの上記したＰＡＲＧコード遺伝子由来のプローブとのハイブリダイゼーションにより又は動物種からの上記したＰＡＲＧコード遺伝子由来のプローブとのハイブリダイゼーションによってすら、変異体ＤＮＡ配列を他の植物種から単離することができることは明らかであろう。このために、プローブは、好ましくは、これらの上記したＰＡＲＧコード遺伝子配列のコード領域、好ましくは配列番号３又は配列番号４のコード領域からの少なくとも４０の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有するべきである。しかしながら、プローブは、上記したＰａｒＧ遺伝子のいずれかからの約、５０、６０、７５、１００、２００又は５００の連続したヌクレオチドの如きＰａｒＧ遺伝子由来のヌクレオチド配列のより長い領域を含むことができる。好ましくは、プローブは、動物からの異なるＰＡＲＧタンパク質をアラインメントすることにより同定された触媒ドメインの高度に保存された領域の1つをコードするヌクレオチド配列を含むべきである。これらの領域は、Arabidopsis thalianaからの同定されたＰＡＲＧタンパク質にも存在しそして、アミノ酸配列ＬＸＶＤＦＡＮＸＸＸＧＧＧ（位置２５２のアミノ酸から位置２６４のアミノ酸までの配列番号１に相当し；Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい）、ＬＸＶＤＦＡＮＸＸＸＧＧＧＸＸＸＸＧＸＶＱＥＥＩＲＦ（位置２５２のアミノ酸から位置２７７のアミノ酸までの配列番号１に相当する）、又はＬＸＶＤＦＡＮＸＸＸＧＧＧＸＸＸＸＧＸＶＱＥＥＩＲＦＸＸＸＰＥ（位置２５２のアミノ酸から位置２８２のアミノ酸までの配列１に相当する）、ＴＧＸＷＧＣＧＸＦＸＧＤ（位置４４９のアミノ酸から位置４６０のアミノ酸までの配列番号１に相当する）又はＴＧＸＷＧＣＧＡＦＸＧＤＸＸＬＫＸＸＸＱ（位置４４９のアミノ酸から位置４６８のアミノ酸までの配列番号１に相当する）を含む。他の保存された領域は、アミノ酸配列ＤＸＸＸＲＸＸＸＸＡＩＤＡ（位置３３５のアミノ酸から位置３４４のアミノ酸までの配列番号１に相当する）又はＲＥＸＸＫＡＸＸＧＦ（位置３６０のアミノ酸から位置３６９のアミノ酸までの配列番号１に相当する）又はＧＸＸＸＸＳＸＹＴＧＹ（位置３０３のアミノ酸から位置３１３のアミノ酸までの配列番号１に相当する）を有する。ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件下にあるべきである。
【００２８】
本明細書で使用した「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、もしプローブと標的配列との少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性があるならば、ハイブリダイゼーションが一般に起こるであろうということを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mMＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Denhardtの溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μg/mlの変性され、せん断された（sheared）キャリアーＤＮＡ、例えば、鮭精子ＤＮＡを含む溶液中での一夜のインキュベーション、次いで約６５℃で、例えば、約１０分間（２回）０．１×ＳＳＣにおいてハイブリダイゼーション支持体を洗浄することである。他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知でありそしてSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989)、特に１１節に例示されている。
【００２９】
別法として、ＰａｒＧコード遺伝子又はその一部は、プライマーとして上記したＰＡＲＧコード遺伝子又はその相補体のヌクレオチド配列からの少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用する、ＰＣＲをベースとする技術により単離することもできる。このようなプライマーは、上記した如き保存された領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、又はこのようなヌクレオチド配列に対して相補性であることができる。その目的に使用することができるオリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれかのヌクレオチド配列を含むことができる。使用することができるオリゴヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のオリゴヌクレオチドプライマーの如く、縮重していて（degernerate）もよい。
【００３０】
ＰａｒＧ遺伝子からの特異的ＰＣＲ断片は、例えば、ストリンジェントアニーリング条件下に、テンプレートＤＮＡとしてシロイヌナズナゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを使用する配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することにより、又は例えば、テンプレートＤＮＡとしてジャガイモゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを使用する配列番号７及び配列番号８のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することにより得ることができる。
【００３１】
単離された配列は、機能的ＰＡＲＧタンパク質又はその一部をコードすることができる。好ましくは、単離された配列は、他の場合に述べた上記したＰＡＲＧタンパク質の触媒ドメインからの高度に保存された領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含むべきである。
【００３２】
しかしながら、本発明の目的には、単離された配列が、機能的ＰＡＲＧタンパク質をコードすることは必要でもなければ、完全なコード領域を単離することも必要ではない。実際に、本発明のために必要なすべては、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡを産生することができる植物からの内在性ＰａｒＧ遺伝子の同定又は単離された配列に基づいて、キメラ遺伝子をデザインするか又は産生することができるということである。このようなＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を産生させるためにいくつかの替わりの方法を利用することができる。
【００３３】
１つの態様では、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子は、いわゆるアンチセンス技術に基づいている。換言すれば、キメラ遺伝子のコード領域は、その発現が減少させられるようにターゲッティングされている、植物細胞又は植物の内在性ＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。このようなキメラ遺伝子は、単離若しくは同定されたＰａｒＧ遺伝子又はこのような遺伝子の一部からの少なくとも２０のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、逆方向において、植物で発現可能なプロモーター並びに転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部形成領域に作動可能に連結することにより、都合よく構築することができる。単離されたＰａｒＧ遺伝子からのこのようなＤＮＡ断片の正確なヌクレオチド配列又は完全なヌクレオチド配列を知る必要はないことは直ちに明らかであろう。
【００３４】
他の態様では、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子は、いわゆるコサプレッション（co-suppression）技術に基づいている。換言すれば、キメラ遺伝子のコード領域は、その発現が減少させられるようにターゲッティングされている、植物細胞又は植物の内在性ＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。このようなキメラ遺伝子は、単離若しくは同定されたＰａｒＧ遺伝子又はこのような遺伝子の一部からの少なくとも２０のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、順方向において、植物で発現可能なプロモーター並びに転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部形成領域に作動可能に連結することにより、都合よく構築することができる。やはり、単離されたＰａｒＧ遺伝子からの使用されたＤＮＡ断片の正確なヌクレオチド配列を知ることは必要ではない。
【００３５】
内在性ＰａｒＧ遺伝子の発現を減少させることにおける上記したキメラ遺伝子の効率は、異常な非ポリアデニル化ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子の発現をもたらすＤＮＡエレメントの包含により更に高めることができる。その目的に適当な１つのこのようなエレメントは、ＷＯ００／０１１３３に記載の自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。
【００３６】
植物細胞の内在性ＰａｒＧ遺伝子の発現を減少させることにおける上記したキメラ遺伝子の効率は、アンチセンスＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載のキメラ遺伝子とセンスＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードする本明細書に記載のキメラ遺伝子を１つの植物細胞に同時に含ませることにより更に高めることもでき、該アンチセンス及びセンスＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子は、ＷＯ９９／５３０５０に記載のとおり、上記した少なくとも２０の連続したヌクレオチド間で塩基対形成することにより二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。
【００３７】
ＷＯ９９／５３０５０に更に記載のとおり、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるセンス及びアンチセンスＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ領域は、好ましくはスペーサー領域により分離された１つのＲＮＡ分子に存在することができる。スペーサー領域は、イントロン配列を含むことができる。このようなキメラ遺伝子は、その発現が減少させられるようにターゲッティングされている、単離若しくは同定された内在性ＰａｒＧ遺伝子からの少なくとも２０のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、逆方向繰り返しにおいて、植物で発現可能なプロモーター並びに転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部形成領域に作動可能に連結することにより、都合よく構築することができる。このようなキメラ遺伝子の構築を達成するために、ＷＯ０２／０５９２９４に記載のベクターを使用することができる。
【００３８】
ゆえに、本発明の態様は、
−植物細胞にキメラ遺伝子を与えてトランスジェニック植物細胞を創生し、該キメラ遺伝子は、下記の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
−植物で発現可能なプロモーター、
−転写されると該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；又は
−転写されると該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；又は
−転写されると、該植物細胞に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス領域及び該植物細胞中に存在するＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相補体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、該センス領域とアンチセンス領域は該少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、
−転写終結及びポリアデニル化に関与する３′端部領域；
を含み、
−該トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生し；そして
−トランスジェニック植物系統の該集団内でストレス耐性植物系統を同定する、
段階を含むストレス耐性植物系統を得る方法に関する。
【００３９】
本明細書で使用された「含む」は、言及された、述べられた特徴、整数、段階又は成分の存在を特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上の特徴、整数、段階、成分又はそのグループの存在又は追加を排除しない。かくして、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又はタンパク質は、実際に引用されたヌクレオチド又はアミノ酸よりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含むことができる、即ち、より大きい核酸又はタンパク質中に埋め込まれることができる。機能的に若しくは構造的に定義されているＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域等を含むことができる。
【００４０】
かくして、ＰａｒＧコード領域の約２０ntのアンチセンス又はセンスＲＮＡ領域の最小ヌクレオチド配列は、２０ntから標的遺伝子のサイズに等しい長さまでサイズが変わる、より大きいＲＮＡ分子内に含まれうることは明らかであろう。
【００４１】
かくして、上記したアンチセンス又はセンスヌクレオチド領域は、約２１ntから約５０００ntの長さ、例えば、２１nt、４０nt、５０nt、１００nt、２００nt、３００nt、５００nt、１０００nt、２０００nt又は約５０００nt以上の長さであることができる。
【００４２】
更に、使用された阻害性ＰａｒＧＲＮＡ分子のヌクレオチド配列又はキメラ遺伝子のコード領域は、その発現が植物細胞において減少させられるようにターゲッティングされている、内在性ＰａｒＧ遺伝子に対して完全に同じであるか又は内在性ＰａｒＧ遺伝子に対して完全に相補性であることは、本発明の目的には必要ではない。配列が長ければ長い程、総合的配列同一性に対する要求はより厳しさが少ない。かくして、センス又はアンチセンス領域は、内在性ＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列又はその相補体に対して約４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は１００％の総合的配列同一性を有することができる。しかしながら、述べたとおり、アンチセンス又はセンス領域は、内在性ＰａｒＧ遺伝子のヌクレオチド配列に対する約１００％配列同一性を有する２０の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、約１００％配列同一性のストレッチは約５０、７５又は１００ntであるべきである。
【００４３】
本発明の目的では、百分率として表された２つの関連したヌクレオチド配列の「配列同一性」は、比較した位置の数で割った、２つの最適にアラインメントされた配列における同じ残基を有する位置の数（×１００）を表す。ギャツプ、即ち、残基が１つの配列には存在するが他の残基には存在しないアラインメントにおける位置は、同一ではない残基を有する位置とみなされる。２つの配列のアラインメントは、Needleman and Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch 1970）により行われる。コンピューター支援配列アラインメントは、５０のギャップ発生ペナルティー（gap creation penalty）及び３のギャップ伸長ペナルティー（gap extension penalty）を有するデフォールトスコアリングマトリックス（default scoring matrix）を使用してWisconsin Package Version10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA）の一部であるＧＡＰの如き標準ソフトウエアプログラムを使用して都合良く行うことができる。
【００４４】
ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、対応するＤＮＡ分子のヌクレオチド配列に言及することにより定義される場合には、ヌクレオチド配列におけるチミジン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）により置き換えられるべきことは明らかであろう。ＲＮＡ又はＤＮＡ分子に対して言及されているかどうかは、適用の状況から明らかであろう。
【００４５】
特定の植物変異種又は植物種における特定のＰａｒＧ遺伝子に対する阻害性ＰａｒＧ遺伝子を産生することができるキメラ遺伝子を、他の植物変異種又は植物種におけるＰａｒＧ遺伝子発現を阻害するのに使用することもできることも明らかであろう。実際に、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ領域とＰａｒＧ遺伝子との間に十分な相同性が存在する場合、又はＰａｒＧ遺伝子が１９ヌクレオチドの同じストレッチを共有する場合には、これらの他の遺伝子の発現もダウンレギュレーションされるであろう。
【００４６】
核酸代謝におけるＰａｒＧの潜在的役割の点から、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡによる内在性ＰａｒＧ遺伝子の発現は完全には阻害されないことが有利でありうる。ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡをコードするキメラ遺伝子の導入による遺伝子サイレンシングによって特定の遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることは、ＰａｒＧ遺伝子の様々な程度のサイレンシングの分布を示す種々のトランスジェニック系統の集団をもたらすであろう。かくして、この集団は、内在性ＰａｒＧ遺伝子が必要な程度のサイレンシングとなるようにサイレンシングされている、個々のトランスジェニック植物系統を含有するであろう。当業者は、例えば、高い光強度、酸化ストレス、乾燥、熱等の如き特定の不利な条件に植物系統をさらし、そして処理を満足に成し遂げそして最善に生き抜くこれらの植物を選ぶことによって、このような植物系統を容易に同定することができる。
【００４７】
本明細書で使用された、「プロモーター」という用語は、転写の開始期間中ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されそして結合される（直接又は間接に）いかなるＤＮＡも示す。プロモーターは、転写開始部位及び転写開始因子及びＲＮＡポリメラーゼのための結合部位を含み、そして遺伝子発現調節タンパク質が結合することができる種々の他の部位（例えば、エンハンサー）を含むことができる。
【００４８】
本明細書で使用された「調節領域」という用語は、転写を駆動すること及び、与えられたＤＮＡ配列、例えば、タンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ、の転写のタイミング及びレベルを制御する（即ち、調節する）ことに関与しているいかなるＤＮＡも意味する。例えば、５′調節領域（又はプロモーター領域）は、コード配列の上流（即ち、５′）に位置しそしてプロモーター及び５′非翻訳リーダー配列を含むＤＮＡ配列である。３′調節領域は、コード配列の下流（即ち、３′）に位置し、そして１つ以上のポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終結（及び／又は調節）シグナルを含むＤＮＡ配列である。
【００４９】
本発明の１つの態様では、プロモーターは構成的プロモーターである。本発明の他の態様では、プロモーター活性は、外部刺激又は内部刺激（誘導性プロモーター）、例えば、ホルモン、化合物、機械的衝撃、非生物的若しくは生物的ストレス条件（それらに限定はされない）により高められる。プロモーターの活性は、時間的又は空間的に調節されうる（組織特異的プロモーター；発生的に調節されるプロモーター）。
【００５０】
本発明の目的には、プロモーターは、植物で発現可能なプロモーターである。本明細書で使用された「植物で発現可能なプロモーター（"plant-expressible promoter"）」という用語は、植物細胞の転写を制御する（開始する）ことができるＤＮＡ配列を意味する。これは、植物起源のいかなるプロモーターも含むが、植物細胞において転写を指向することができる非植物起源のいかなるプロモーターも含み、即ち、ウイルス若しくはバクテリア起源のある種のプロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ（Hapster et al., 1988）、地下クローバーウイルスプロモーター（subterranean clover virus promoter）Ｎｏ４又はＮｏ７（ＷＯ９６０６９３２）又はＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターを含むが、組織特異的又は器官特異的プロモーターも含み。これらは、種子特異的プロモーター（例えばＷＯ８９／０３８８７）、器官原基特異的プロモーター（organ-primordia specific promoters)(An et al., 1996）、茎特異的プロモーター（Keller et al., 1988）、葉特異的プロモーター（Hudspeth et al., 1989）、葉肉特異的プロモーター（例えば、光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター）、根特異的プロモーター（Keller et al., 1989）、塊茎特異的プロモーター（Keil et al., 1989）、脈管組織特異的プロモーター（Peleman et al., 1989）、雄しべ選択性プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ９２／１３９５６）、裂開ゾーン（dehiscence zone）特異的プロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）等を含むが、これらに限定はされない。
【００５１】
キメラ遺伝子の植物への導入方法は当該技術分野で周知されておりそしてアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換、粒子ガンデリバリー（particle gun delivery）、マイクロインジェクション、そのままの細胞のエレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、シリコンホイスカー（silicon-whiskers）媒介形質転換等を含む。次いで、この方法で得られた形質転換された細胞を成熟稔性植物（mature fertile plants）に再生させることができる。
【００５２】
本発明に従うトランスジェニック植物細胞及び植物系統は、ＷＯ００／０４１７３に記載されているとおりのＰＡＲＰ遺伝子の発現を減少させるキメラ遺伝子を更に含むことができる。これらの更なるキメラ遺伝子は、例えば、本発明のトランスジェニック植物系統を、ＰＡＲＰ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック植物と交雑させることにより導入することができる。トランスジェニック植物細胞又は植物系統は、本発明のキメラ遺伝子を、ＰＡＲＰ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物細胞に導入するか形質転換すること又はその逆により得ることもできる。別法として、ＰＡＲＰ及びＰＡＲＧ阻害性ＲＮＡ領域は、１つのキメラ遺伝子によりコードすることができそして１つのＲＮＡ分子として転写することができる。
【００５３】
本発明のキメラ遺伝子（又はそれに相当する阻害性ＲＮＡ分子）は、例えば、ウイルスベクター、例えば、ＷＯ００／６３３９７又はＷＯ０２／１３９６４に記載のウイルスＲＮＡベクターを使用して、一過性方式で植物細胞に導入することもできる。
【００５４】
この明細書を読めば、ＰＡＲＧ活性が減少している突然変異体植物細胞及び植物系統を使用して本明細書に記載されたトランスジェニック植物細胞及び植物系統と同じ効果とすることができることは当業者には直ちに明らかであろう。植物細胞又は植物のＰａｒＧ遺伝子における突然変異体は、当該技術分野で知られたスクリーニング法を使用して容易に同定することができ、その方法によれば、化学的突然変異誘発、例えば、ＥＭＳ突然変異誘発を鋭敏な検出方法（例えば変性ＨＰＬＣの如き）と組み合わせる。このような技術の例は、McCallum et al, Plant Physiology 123 439-442又はＷＯ０１／７５１６７に記載されたいわゆる“Targeted Induced Local lesions in Genomes”である。しかしながら、特定のゲノム領域又は対立遺伝子における突然変異を検出するための他の方法も利用可能であり、この方法は現存の又は新たに発生した挿入突然変異体植物系統のライブラリーのスクリーニングを含み、その際これらの突然変異体植物系統のゲノムＤＮＡのプールは、挿入されたＤＮＡ断片に特異的なプライマー及び挿入が予想されるゲノム領域又は対立遺伝子に特異的なプライマーを使用するＰＣＲ増幅に付す（例えば、Maes et al., 1999, Trends in Plant Science, 4, pp 90-96参照）。
【００５５】
植物細胞系統及び植物系統は、ＰａｒＧ阻害剤、例えばガロタンニンに対する抵抗についての選択により突然変異誘発に付すこともできる（Ying, et al.(2001).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(21)、12227-12232; Ying, W., Swanson, R.A.(2000). NeuroReport 11(7), 1385-1388）。
【００５６】
かくして、ＰａｒＧ遺伝子における突然変異を含む植物細胞及び植物系統を同定するための方法が当該技術分野で利用可能である。次いで、突然変異体細胞又は植物系統のこの集団は、異なる非生物的ストレスにさらされることがあり、そしてそれらの発現型又は生存は、容易に決定することができる。更に、ストレスを受けた細胞の ＮＡＤ及び／又はＡＴＰ含有率を決定しそしてストレスを受けていない細胞のこのような決定の結果と比較することができる。ストレス耐性細胞においては、ストレス条件下のＮＡＤ含有率の減少は、ストレスを受けていない細胞と比較する場合に、対応するコントロール細胞の場合よりも低くあるべきである。
【００５７】
本発明に従うキメラ遺伝子又はＲＮＡ分子を含有する植物細胞及び植物を提供することも本発明の目的である。伝統的育種方法により産生される本発明のキメラ遺伝子を含む植物の配偶子、種子、胚、接合体（zygotic）若しくは体細胞（somatic）、子孫（progeny）又はハイブリッドも本発明の範囲内に含まれる。
【００５８】
本明細書に記載された方法によって得られた植物を、さらに、他の植物と伝統的育種技術によって交雑させて、本発明のキメラ遺伝子を含むストレス耐性子孫植物を得ることができる。
【００５９】
本明細書に記載された方法及び手段は、すべての植物細胞及び植物、双子葉及び単子葉植物細胞及び植物に適当であると考えられ、それらは、綿、アブラナ属野菜、油料種子セイヨウアブラナ（oilseed rape）、コムギ、トウモロコシ（corn or maize）、オオムギ、アルファルファ、ピーナッツ、ヒマワリ、コメ、オートムギ、サトウキビ、ダイズ、シバ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、サトウキビ、野菜（チコリ、レタス、トマト、ズッキーニ、シシトウガラシ、ナス、キュウリ、メロン、タマネギ、リーキを含む）、タバコ、ジャガイモ、サトウダイコン、パパイア、パイナップル、マンゴー、Arabidopsis thalianaを含み、園芸、花キ園芸又は林業で使用される植物（ポプラ、モミ、ユーカリ等）も含むが、それらに限定はされない。
【００６０】
下記の非限定的実施例は、本発明に従う植物のストレス耐性を増加させるための方法及び手段を記載する。
【００６１】
実施例において特記しない限り、すべての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al, (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, Laboratory press, NY及びVolumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994) Current Protocols in  Molecular Biology, Current Protocols, USAに記載された標準プロトコールに従って行われる。植物分子研究のための標準材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK)及びBlackwell Scientific Publications, UKにより共同して刊行された、Plant Molecular Biology labfax(1993)by R.D.D.Croyに記載されている。標準分子生物学技術の他の参考文献は、Sambrook and Russell(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, NY及びVolumes I and II of Brown(1996)Molecular Biology Labfax, Second Edition, Academic Press(UK)を含む。ポリメラーゼ連鎖反応のための適当な標準材料及び方法は、Diffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press及びMcPherson et al.(2000)PCR-Basics: From Background to Bench, First, Edition, Springer Verlag, Germanyに見出すことができる。
【００６２】
説明及び実施例全体にわたり、下記の配列が参照される：
配列番号１：  Arabidopsis thalianaからのＰａｒＧタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号２：  Solanum TuberosumからのＰａｒＧタンパク質の一部のアミノ酸配列。
配列番号３：  Arabidopsis thalianaからのＰａｒＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号４：  Solanum TuberosumからのＰａｒＧタンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列。
配列番号５：ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列。
配列番号６：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列。
配列番号７：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列。
配列番号８：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列。
配列番号９：  Arabidopsis  ＰａｒＧ遺伝子配列に基づくＰａｒＧ発現を減少させるキメラ遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡベクターのヌクレオチド配列。
配列番号１０：  ＰＡＲＧタンパク質の保存された配列１のアミノ酸配列。
配列番号１１：  ＰＡＲＧタンパク質の保存された配列２のアミノ酸配列。
配列番号１２：  ＰＡＲＧタンパク質の保存された配列３のアミノ酸配列。
配列番号１３：  ＰＡＲＧタンパク質の保存された配列４のアミノ酸配列。
配列番号１４：  ＰＡＲＧタンパク質の保存された配列５のアミノ酸配列。
配列番号１５：  Oryza sativaからのＰａｒＧタンパク質のヌクレオチド配列。
配列番号１６：  Oryza sativaからのＰａｒＧタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１７：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーＰＧ１のヌクレオチド配列。
配列番号１８：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーＰＧ２のヌクレオチド配列。
配列番号１９：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーＰＧ３のヌクレオチド配列。
配列番号２０：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーＰＧ４のヌクレオチド配列。
配列番号２１：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーＰＧ５のヌクレオチド配列。
配列番号２２：  ＰａｒＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の一部のＰＣＲ増幅に適当なオリゴヌクレオチドプライマーＰＧ６のヌクレオチド配列。
配列番号２３：  Zea maysからのＰａｒＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２４：  ＰＡＲＧ発現を減少させることができるキメラ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターのヌクレオチド配列。
配列番号２５：  ＰＡＲＧ発現を減少させることができるキメラ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡベクターのヌクレオチド配列。
【００６３】
実施例
実施例１．ＰＡＲＰ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含有するトランスジェニックストレス耐性植物系統のエネルギー生産効率に対するストレスの影響の分析
ＷＯ００／０４１７３に記載のとおりのＰＡＲＰ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含むトランスジェニックBrassica napus植物の胚軸を成長培地で５日間培養した。次いで、外植片を３０mg/Lアスピリン又はアセチルサリチル酸（酸化性ストレス条件をもたらす）を含む液体培地に１日間移した。コントロール実験では、非トランスジェニックBrassica napus植物Ｎ９０−７４０の胚軸を同じ成長培地で培養し、次いで３０mg/Lアスピリンを含む液体培地中で１日間インキュベーションした。更に、トランスジェニック系統及びコントロール系統の両方の胚軸をアスピリンなしの同じ成長培地で培養した。
【００６４】
培養期間の後、１２５の外植片のＡＴＰ含有率を各実験について測定した。更に、１２５の外植片により３時間に消費された酸素を測定した。結果を表１に要約する。平均の標準誤差は６％未満であつた。コントロール植物における消費された酸素mg当りモルＡＴＰの比は、酸化性ストレスが加えられるときコントロール植物では減少するのに対して、ストレス耐性トランスジェニック植物系統における同じ比は、ストレス条件下に実際に増加し、そしてコントロール植物におけるよりも相当高かった（約２４％）。かくしてストレス耐性トランスジェニック系統は一定のエネルギー産生効率を維持したが、これに対してコントロール系統は減少したエネルギー産生効率を示した。更に、酸化性ストレスにさらされなかつたコントロール植物におけるスーパーオキシド産生の百分率として表されたスーパーオキシド産生は、ストレス条件にさらされたストレス耐性植物では増加しなかった。
【００６５】
【表１】
2006522595.tif 000003
【００６６】
他の態様では、ＷＯ００／０４１７３に記載されたＰＡＲＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含む４つの異なるシロイヌナズナ系統のＮＡＤ＋及びＡＴＰ含有率を高い光条件及び低い光条件下に測定し、そして同じ条件下に非形質転換コントロール系統で得られた値と比較した。４つの異なる系統は、例えば、それらの熱及び／又は乾燥条件に耐える能力により示されたとおり異なる程度のストレス耐性を示した。高い光ストレス下にＮＡＤ及びＡＴＰ含有率について得られた値は、低い光条件下のＮＡＤ及びＡＴＰ含有率の値の百分率として表され、そして図２にプロットされる。
【００６７】
結果は、高い光ストレスはコントロール植物細胞及び最も少なくストレス耐性であるトランスジェニック植物系統において有意なＮＡＤ減少をもたらすことを示す。トランスジェニック植物系統がよりストレス耐性であればあるほど、高い光ストレス条件下でのＮＡＤ減少は有意でなくなる。
【００６８】
他の実験では、ＷＯ００／０４１７３に記載されたＰＡＲＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ系統と非形質転換トウモロコシ系統との交雑から得られる分離集団のＮＡＤ＋及びＡＴＰ含有率を、栄養（窒素）欠乏の条件下に測定し、そして同じ条件下に非形質転換コントロール系統で得られた値と比較した。図３は、得られた結果のグラフ表示である。半接合系統（hemizygous lines）及び非接合系統（azygous lines）は、選択可能なマーカー遺伝子の存在の証明により識別された。ＮＡＤ及びＡＴＰ含有率は半接合ストレス耐性植物では非形質転換コントロール植物又は非接合植物におけるよりも有意に高かった。
【００６９】
実施例２．ＰａｒＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子の構築
例えば、シロイヌナズナ及び関連植物においてＰＡＲＧ遺伝子の発現を減少させるために、二本鎖ＲＮＡを形成することができるセンス領域とアンチセンス領域の両方を含むｄｓＲＮＡを発現することができるキメラ遺伝子を構築した。このようなｄｓＲＮＡは、配列相同性を共有している遺伝子の発現を、転写後のサイレンシングにより減少させるのに非常に有効である。キメラ遺伝子は下記のＤＮＡ断片：
●カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）からのプロモーター領域；
●順方向におけるArabidopsis thalianaからのＰａｒＧ遺伝子からの１６３bpを含むＤＮＡ断片（ヌクレオチド位置９７３から１１３５までのＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３９４６９０）；
●Flaveriaからのｐｄｋ遺伝子からのイントロン２をコードするＤＮＡ断片；
●逆方向におけるArabidopsis thalianaからのＰａｒＧ遺伝子からの１６３bpを含むＤＮＡ断片（ヌクレオチド位置９７３から１１３５までのＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３９４６９０）
●Agrobacterium tumefaciensからのオクトピンシンセターゼ遺伝子からの３′非翻訳端部の断片、
を含む。
【００７０】
このキメラ遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシンに対する抵抗を与える選択可能なマーカー遺伝子と共に、Ｔ−ＤＮＡからの左境界（left border）配列と右境界（right border）配列との間において、Ｔ−ＤＮＡベクターに導入された。
【００７１】
例えば、ジャガイモ及び関連植物においてＰＡＲＧ遺伝子の発現を減少させるために、シロイヌナズナＰＡＲＧタンパク質のＮ末端部分との高い配列同一性を有するタンパク質をコードすることができるジャガイモからのｃＤＮＡ配列のセンス領域及びアンチセンス領域の両方を含むｄｓＲＮＡを発現することができるキメラ遺伝子を構築する。このキメラ遺伝子は、下記のＤＮＡ断片：
●  カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）からのプロモーター領域；
●順方向におけるSolanum tuberosumからのＰａｒＧ相同体（ParG homologue）からの少なくとも１００bpの配列を含むＤＮＡ断片（Genbank 受託番号ＢＥ３４０５１０）；
●Flaveriaからのｐｄｋ遺伝子からのイントロン２をコードするＤＮＡ断片；
●逆方向におけるSolanum tuberosumからのＰａｒＧ相同体からの少なくとも１００bpの配列を含むＤＮＡ断片（Genbank 受託番号ＢＥ３４０５１０）
●Agrobacterium tumefaciensからのオクトピンシンセターゼ遺伝子からの３′非翻訳端部の断片、
を含む。
【００７２】
このキメラ遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシンに対する抵抗を与える選択可能なマーカー遺伝子と共に、Ｔ−ＤＮＡからの左境界配列と右境界配列との間において、Ｔ−ＤＮＡベクターに導入される。
【００７３】
実施例３．ＰａｒＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物系統の分析
実施例２のキメラ遺伝子を、アグロバクテリウム媒介形質転換により、それぞれシロイヌナズナ又はジャガイモに導入する。
【００７４】
得られたトランスジェニック系統の集団を、コントロール植物と共に下記のストレス条件にさらす：
●日中（温室）又は勤務時間（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の期間の加熱
●日中の期間の乾燥（drought）
●日中の期間の高い光条件
●栄養欠乏
【００７５】
上記したストレス条件をうまく生き延びる個々の植物系統を選ぶ。
【００７６】
上記した植物についてのＮＡＤ含有率及びＡＴＰ含有率をコントロール条件及びストレス条件下に測定する。
【００７７】
実施例４．植物細胞におけるＮＡＤ、ＡＴＰ及びスーパーオキシドラジカルの
定量的決定
植物組織におけるＡＴＰの定量は、基本的にRawyler et al.(1999), Plant Physiol.120, 293-300により記載のとおりに行われた。このアッセイは、Ａ２Ｓ３培地で４〜５日間培養された胚軸外植片又は２週齢のin vivoで培養されたシロイヌナズナ植物のＡＴＰ含有率の決定のために使用された。すべての操作は特記しない限り砕いた氷上で行う。
【００７８】
ＡＴＰ抽出
−植物材料を液体窒素で凍結する
・１００胚軸外植片
・±７００mgシロイヌナズナ植物（根＋芽）（約３２〜３７の１８日齢のＣ２４植物）
−凍結した胚軸を乳鉢に入れそして６％過塩素酸６mlを加える。
−抽出は、乳棒を使用して室温で行うことができる。抽出の後、サンプルをできる限り早く氷の上に置く。
−２４，０００g（Sorvall，１４，０００rpmにおけるＳＳ３４ローター）で４℃で１０分間遠心する。
−上澄液を５ＭのＫ2ＣＯ3で中和する（３mlの上澄液に５ＭのＫ2ＣＯ3３５０μlを加える）。
−ＫＣｌＯ4を上記したスピニング（spining）により除去する。
【００７９】
ＡＴＰの定量的生物発光測定
−ＳｉｇｍａからのＡＴＰ生物発光アッセイキットを使用する（ＦＬ−ＡＡ）。
−希薄な抽出物６０００×（約６ml抽出物から１００μlを採取し、それを１０００倍に希釈する）。希釈は、ＡＴＰ生物発光アッセイキットの「ＡＴＰアッセイミックス希釈緩衝液」（ＦＬ−ＡＡＢ）により行われる。
−発生される光の量は、Turner Designs (Sunnyvale, USA) のＴＤ−２０／２０ルミノメーターにより測定する。
−標準曲線：水１０ml中にキット（ＦＬ−ＡＡＳ）のＡＴＰ標準を溶解する（２×１０-6モル）。
【００８０】
下記の植物材料に対して、植物組織におけるＮＡＤ＋及びＮＡＤＨの定量を、本質的にKarp et al.(1983）又はFilipovic et al.(1999）により記載のとおりに行った：
Brassica napus：１５０の５日培養された胚軸外植片／サンプル
Arabidopsis：１０００mgの１８日齢のｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた植物（芽＋根）／サンプル（±６０のＣ２４植物に相当する）。
【００８１】
アッセイ溶液
（Ａ）ＮＡＤＨを測定するため：２５mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７
０．１mMＤＴＴ
３μM  ＦＭＮ（Fluka, 83810）
３０μMｎ−デカナール（Sigma, D-7384）
（Ｂ）ＮＡＤ＋＋ＮＡＤＨを測定するため：
ＮＡＤＨのみを測定するためと同じ  ＋２μg/mlアルコールデヒドロゲナーゼ（Roche, 102717）
【００８２】
抽出
−液体窒素で凍結する
−凍結した植物材料を冷却した乳鉢（−２０℃に冷却した）に入れそして抽出緩衝液５mLを加える。
−乳棒を使用して材料を粉砕する
−２４，０００g（Sorvall，１４，０００rpmにおけるＳＳ３４ローター）で４℃で１５分間遠心する
−上澄液１mLを分析のために採取する
【００８３】
アッセイ
ＮＡＤＨ
−アッセイ溶液Ａ３９０μL
−＋１０μL抽出物
−＋２μLＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮ酸化還元酵素
−＋１００μlルシフェラーゼ溶液
ＮＡＤ＋＋ＮＡＤＨ
−アッセイ溶液Ｂ３９０μL
−＋１０μL抽出物
−室温で２分
−＋２μLＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮ酸化還元酵素
−＋１００μlルシフェラーゼ溶液
発生される光の量は、Turner Designs（Sunnyvale, USA）
のＴＤ−２０／２０ルミノメーターにより測定する。
ＮＡＤＨ標準
ＮＡＤＨストック溶液：１mM（７．１mg／１０mLＨ2Ｏ）
ＮＡＤＨ：ニナトリウム塩、Roche，１０７７３５
１０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７中の希釈系列：（１０-2）；５×１０-3；
２×１０-3；１０-3；５×１０-4
アッセイ溶液Ａ３９０μl中に希釈物１０μlを加えそして反応を行う
標準曲線を作成する
【００８４】
De Block and De Brouwer(2002) Plant Physiol.Biochem.40, 845-852に記載のＸＴＴの減少を定量することによりスーパーオキシドラジカル産生を測定した。
【００８５】
ＢＲＡＳＳＩＣＡ  ＮＡＰＵＳ
培地及び反応緩衝液
播種培地（培地２０１）：
半分の濃度のムラシゲ及びスクーグ（Murasige and Skoog）塩
２％スクロース
ｐＨ５．８
０．６％寒天（Difco Bacto Agar）
２５０mg/l トリアシリン
カルス誘導培地Ａ２Ｓ３
ＭＳ培地、０．５g/l Ｍｅｓ（ｐＨ５．８）、３％スクロース、４０mg/l アデニン−ＳＯ4、０．５％アガロース、１mg/l ２，４−Ｄ、０．２５mg/l ＮＡＡ、１mg/l ＢＡＰ、２５０mg/l トリアシリン（triacillin）
インキュベーション培地：
２５mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．８
２％スクロース
２５ml培地について１滴のＴｗｅｅｎ２０
反応緩衝液
５０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４
１mMナトリウム３′−｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム}−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）＝ＸＴＴ（bts、Germany,cat番号2525）
２５mL緩衝液について１滴のＴｗｅｅｎ２０
【００８６】
種子の滅菌  −  種子の予備発芽  −  苗の成長。種子を７０％中に２分間浸漬し、次いで０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する次亜塩素酸ナトリウム溶液（約６％活性塩素を有する）中で１５分間表面滅菌する。最後に、種子を滅菌水道水１lですすぐ。滅菌水道水中で少なくとも１時間種子をインキュベーションする（発芽を抑制することがある成分の種子からの拡散を可能とするために）。種子を滅菌水道水５０ml（＋２５０mg/l トリアシリン）を入れた２５０mlのエルレンマイヤーフラスコに入れる。約２０時間振とうする。幼根が突き出している種子を播種培地約１２５mlを入れたDuchefaからのガラス製通気口付き容器（Vitro Vent containeras）に入れる（１０種子／容器、汚染による種子の損失を減少させためにあまり多すぎない）。種子を１日１６時間の長さで±２４℃及び１０〜３０アインシュタイン／ｓ-1ｍ-2で発芽させる。
【００８７】
胚軸外植片の前培養及びストレスの誘発
−播種の１２〜１４日後、胚軸を約７〜１０mmのセグメントに切断する。
−胚軸外植片（２５杯軸／Optilux Petridish, FalconS1005, Denmark）を、培地Ａ２Ｓ３で２５℃にて（１０〜３０□アインシュタイン／ｓ-1ｍ-2で）５日間培養する。
【００８８】
ＸＴＴアッセイ
−１５０の胚軸外植片を５０mlのFalconチューブに移す。
−反応緩衝液（ＸＴＴなし）で洗浄する。
−反応緩衝液２０mL＋ＸＴＴを加える。
（外植片は浸漬されなければならないが、真空浸透（vacuum infiltrate）しない）
−暗所で２６℃で約３時間インキュベーションする
−４７０nmにおける反応培地の吸光度を測定する
【００８９】
ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ  ＴＨＡＬＩＡＮＡ
培地及び反応緩衝液
植物培地
半分に濃縮されたムラシゲ及びスクーグ塩
Ｂ５ビタミン
１．５％スクロース
ｐＨ５．８
０．７％Ｄｉｆｃｏ寒天
インキュベーション培地：
１０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．８
２％スクロース
２５ml培地に１滴のＴｗｅｅｎ２０
【００９０】
反応緩衝液：
５０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４
１mMナトリウム３′−｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム}−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）＝ＸＴＴ（ｂｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ番号２５２５）
２５mL緩衝液について１滴のＴｗｅｅｎ２０
【００９１】
シロイヌナズナ植物
−シロイヌナズナ系統：コントロール
試験すべき系統
−シロイヌナズナ種子の滅菌
２分、７０％エタノール
１０分、漂白（６％活性塩素）＋溶液２０mlについて１滴のＴｗｅｅｎ２０
滅菌水道水で５回洗浄する
−種子の予備発芽
滅菌水道水１２mlを入れた９cmのオプテイルックスペトリ皿（Optilux Petridishes）（Falcon）中で。
２４時間まで夜どうし低い光
−シロイヌナズナ植物の成長
種子を植物培地±１２５mlを入れたFalconのインターグリッド組織培養ディスク（Intergrid Tissue Culture disks）に播種する：１種子／グリッド
植物を、２４℃、３０μアインシュタインｓ-1ｍ-2で、光１６時間、暗所で８時間にて約３週間成長させる（抽だい（bolting）の前に）。
【００９２】
ＸＴＴアッセイ
コントロール条件（ストレスなし）
−寒天プレートから芽（根を含む）を収穫し、次いでそれらを反応緩衝液（ＸＴＴなし）を入れた５０mlのファルコン（Falcon）チューブに直接入れる。
ストレスを受けた芽
−反応緩衝液（ＸＴＴなし）を入れた５０mlのFalconチューブに芽を移す
−反応緩衝液を、ＸＴＴを含有する緩衝液で置き換える（４０mL／チューブ）
−芽は浸漬されなければならないが、真空浸潤はしない
−暗所で２６℃で約３時間インキュベーションする
−４７０nmで反応培地の吸光度を測定する
【００９３】
クラーク（Clark）ポーラグラフィー電極を使用して酸素消費を測定することにより呼吸の定量
を下記の方法で行った。：
植物材料
Brassica napus
１５０〜２００*胚軸外植片
２５℃で５日間培養する
（ｃｆｒ．プロトコール活力アッセイ）
*１５０外植片誤差＜１０％；２００外植片誤差＜６％
Arabidopsis
Ｃ２４±１０００mg*ｉｎ  ｖｉｔｒｏ植物（芽＋根）（〜５０の１８日齢植物と相応する）について
播種の前に種子を予備発芽させる
２４℃で１８日間成長させる
（ｃｆｒ．プロトコールｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長Arabidopsis）
*誤差＜８％
【００９４】
インキュベーション培地
Brassica napus
２５mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．８
２％スクロース
Ｔｗｅｅｎ２０（１滴／２５ml）
Arabidopsis
１０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．８
２％スクロース
Ｔｗｅｅｎ２０（１滴／２５ml）
使用の前に、少なくとも数時間攪拌することにより培地を良く通気する（酸素で飽和させる）。
【００９５】
アッセイ
−インキュベーション培地を充填した１００mlのガラスボトル（Schott, Germany）中に外植片を入れる。同じ重量の芽を各ボトルに入れる（±７００mg）。
−オーバーフローするまでボトルを満たしそして密封する（大きな気泡を回避する）
−ボトルに外植片を含まないインキュベーション培地でも満たす（ブランク(blanco)）
−低い光で２４℃で３〜４時間（Brassica napus）、３時間（Arabidopsis）インキュベーションする
−インキュベーション期間中穏やかに振とうする（外植片のまわりの培地の酸素欠乏を回避するため）
−手持ち式の溶解酸素メーター（Cybersacan DO310; Eutech Instruments, Singapore）を使用してインキュベーション培地の酸素濃度（mg/l）を測定する
−mg/l 消費酸素＝［酸素］ブランク−［酸素］サンプル。
【００９６】
実施例５．ＰａｒＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物系統の分析
実施例２のキメラ遺伝子をアグロバクテリウム媒介形質転換によりArabidopsis及びNicotiana tabacum c.v. Petit Havana SR1に導入した。
【００９７】
トランスジェニック種子を、ＭＳ塩／２；Ｂ５ビタミン；１．５％スクロース；ｐＨ５．８及び０．７％Ｄｉｆｃｏ寒天を含有する培地で発芽させた。発芽させた種子を低い光（１４〜１８日間約３０μモルｍ-1ｓ-1の光合成光子フラックス（photosynthetic photon flux）にさらし、その後光強度を約６倍（約１９０μモルｍ-1ｓ-1の光合成光子フラックス）に増加させた。１日後、ＮＡＤ及びＮＡＤＨ含有率を、酵素サイクリング法（Karp et al.(1983)Anal.Biochem.128, pp 175-180）を使用して決定した。苗の一部を約３〜約日の間高い光条件下に更に培養し、その後損傷をスコアリングした。損傷は、若葉及び茎頂（shoot tip）の暗色化、古い葉の白化及び成長遅延として見ることができた。結果を、シロイヌナズナについて表１にそしてタバコについて表２に要約する。
【００９８】
【表２】
2006522595.tif 000004
【００９９】
【表３】
2006522595.tif 000005
【０１００】
トランスジェニック植物における高い光ストレスに対する耐性と細胞のＮＡＤ＋ＮＡＤＨ含有率との間に正の相関がある。ＴＴＣ減少能力と高い光耐性との間に逆相関が見られうる。
【０１０１】
実施例６．穀物植物における使用に適したＰａｒＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子の構築
穀物、例えば、コメ又はトウモロコシ（corn(maize)）及び関連植物におけるＰａｒＧ遺伝子の発現を減少させるために、ＰＡＲＧタンパク質コードヌクレオチド配列との高い配列同一性を有するタンパク質をコードすることができる、コメからのヌクレオチド配列のセンス及びアンチセンス領域の両方を含むｄｓＲＮＡを発現することができるキメラ遺伝子を構築する。キメラ遺伝子は、下記のＤＮＡ断片を含む：
●  カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）からのプロモーター領域；
●順方向におけるOryza satibaからのＰａｒＧ相同体（ParG homologue）から少なくとも１００bpの配列（配列番号１５）を含むＤＮＡ断片；
●Flaveriaからのｐｄｋ遺伝子からのイントロン２をコードするＤＮＡ断片；
●逆方向におけるOryza satibaからのＰａｒＧ相同体からの少なくとも１００bpの配列（配列番号１５）を含むＤＮＡ断片
●Agrobacterium tumefaciensからのオクトピンシンセターゼ遺伝子からの３′非翻訳端部の断片、
を含む。
【０１０２】
このキメラ遺伝子を、例えば、除草剤ホスフィノトリシンに対する抵抗を与える選択可能なマーカー遺伝子と共に、Ｔ−ＤＮＡからの左境界配列と右境界配列との間において、Ｔ−ＤＮＡベクターに導入する。
【０１０３】
穀物、例えば、コメ又はトウモロコシ（corn(maize)）及び関連植物におけるＰａｒＧ遺伝子の発現を減少させるために、ＰＡＲＧタンパク質コードヌクレオチド配列との高い配列同一性を有するタンパク質をコードすることができる、コメからのヌクレオチド配列のセンス及びアンチセンス領域の両方を含むｄｓＲＮＡを発現することができるキメラ遺伝子を構築する。キメラ遺伝子は、下記のＤＮＡ断片を含む：
●  カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）からのプロモーター領域；
●順方向におけるZea maysからのＰａｒＧ相同体からの少なくとも１００bpの配列（配列番号２３）を含むＤＮＡ断片；
●Flaveriaからのｐｄｋ遺伝子からのイントロン２をコードするＤＮＡ断片；
●逆方向におけるZea maysからのＰａｒＧ相同体からの少なくとも１００bpの配列（配列番号２３）を含むＤＮＡ断片
●Agrobacterium tumefaciensからのオクトピンシンセターゼ遺伝子からの３′非翻訳端部の断片、
を含む。
このキメラ遺伝子を、例えば、除草剤ホスフィノトリシンに対する抵抗を与える選択可能なマーカー遺伝子と共に、Ｔ−ＤＮＡからの左境界配列と右境界配列との間において、Ｔ−ＤＮＡベクターに導入する。前節に記載の２つの異なるキメラ遺伝子を含むこのようなＴ−ＤＮＡの２つの例のヌクレオチド配列は配列番号２４及び２５に表される。
【０１０４】
実施例７．ＰａｒＧ遺伝子発現を減少させるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物系統の分析
実施例６のキメラ遺伝子を、アグロバクテリウム媒介形質転換によりそれぞれコメ又はトウモロコシに導入する。
【０１０５】
得られたトランスジェニック系統の集団を、コントロール植物と共に下記のストレス条件にさらす：
●日中（温室）又は勤務時間（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の期間の加熱
●日中の期間の乾燥
●日中の期間の高い光条件
●栄養欠乏
【０１０６】
上記したストレス条件又はその少なくとも１つをうまく生き延びる個々の植物系統を選ぶ。
【０１０７】
上記した植物についてＮＡＤ含有率及びＡＴＰ含有率をコントロール条件下及びストレス条件下に測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】真核細胞におけるＰＡＲＰ／ＰＡＲＧの作用によるポリ−ＡＤＰリボース重合／解重合サイクルの略図表示。
【図２】高い光ストレス下でシロイヌナズナ系統のＮＡＤ＋及びＡＴＰ含有率のダイアグラム。暗いボックスは、低い光条件下に決定されたＮＡＤ含有率の値の百分率として表された高い光条件下のＮＡＤ含有率を表す。明るいボックスは、低い光条件下に決定されたＡＴＰ含有率の値の百分率として表された高い光条件下のＡＴＰ含有率を表す。
【図３】窒素欠乏ストレス下のトウモロコシ系統のＮＡＤ＋及びＡＴＰ含有率のダイアグラム。暗いボックスはＮＡＤ含有率を表し、これに対して明るいボックスはＡＴＰ含有率を表す。
【図１】
2006522595.tif 000006
【図２】
2006522595.tif 000007
【図３】
2006522595.tif 000008
【配列表】
2006522595000001.app
【国際調査報告】
2006522595.tif 000009
2006522595.tif 000010
2006522595.tif 000011