(57)【要約】基質上で細胞を増殖させる細胞培養のプロセスにおける、海洋哺乳動物および硬骨魚からなる群より選択される動物から抽出されたコラーゲンを用いて、コラーゲン基質上で細胞を増殖させる工程を含む改良を提供する。好ましい態様には、コラーゲンがサケまたはアザラシのいずれかに由来する改良が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質上で細胞を増殖させる細胞培養プロセスにおける、コラーゲン基質上で該細胞を増殖させる工程を含む改良であって、該コラーゲンが海洋哺乳動物および硬骨魚からなる群より選択される動物から抽出される、改良。
【請求項２】
コラーゲンが海洋哺乳動物から抽出される、請求項1記載の改良。
【請求項３】
海洋哺乳動物がアザラシである、請求項2記載の改良。
【請求項４】
コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項3記載の改良。
【請求項５】
コラーゲンが硬骨魚から抽出される、請求項1記載の改良。
【請求項６】
硬骨魚がサケである、請求項5記載の改良。
【請求項７】
細胞が哺乳動物培養細胞である、請求項1記載の改良。
【請求項８】
哺乳動物培養細胞が上皮細胞である、請求項7記載の改良。
【請求項９】
上皮細胞がケラチノサイトである、請求項8記載の改良。
【請求項１０】
少なくとも部分的にコラーゲンで被覆された、細胞培養用の容器における改良であって、該コラーゲンが海洋哺乳動物または硬骨魚から抽出されるコラーゲンからなる群より選択される、改良。
【請求項１１】
皮膚科学製品における改良であって、該製品が、海洋哺乳動物および硬骨魚から抽出されるコラーゲンからなる群より選択される動物から抽出されるコラーゲンを含む、改良。
【請求項１２】
海洋哺乳動物および硬骨魚からなる群より選択される動物から抽出される、コラーゲン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はコラーゲンの抽出および使用に関し、特に海洋哺乳動物または硬骨魚のいずれかから抽出されるコラーゲンの抽出および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
コラーゲンは哺乳動物に最も豊富に存在するタンパク質である。水分を別にすれば、皮膚、軟骨組織、血管および歯の主要な構成成分である。これは一般的には、組織内の細胞の周りに見出され、エラスチンおよびプロテオグリカンのようなタンパク質と共に細胞外マトリックスを形成している。細胞外マトリックスの組成は組織ごとに多様である。例えば、エラスチンが非常に重要である腱と比べて、皮膚においてはコラーゲンよりもエラスチンの方が少ない。細胞外マトリックスは、形態、分化および遺伝子発現、接着、ならびに増殖を含む細胞の一生の多様な局面に、重大な影響を与える。老化過程において、細胞外マトリックスが相当変化することは注目に値する。化粧品業界の企業が、製品の製造販売において、コラーゲンの若返り（rejuvenating）特性を使用していることは公知である。コラーゲンの使用には、インビトロ細胞培養、医療装置、化粧用皮膚科学的使用などを含むことができる。
【０００３】
過去数年の間に、特に狂牛病（クロイツフェルト・ヤコブ病）の場合のプリオンおよび多くの型の動物性ウイルス（SARSに密接に関連するものや潜在的にヒト感染性のものを含む）の出現によって、ウシ、ブタ、およびニワトリ供給源に由来するコラーゲンの使用が問題となってきている。代替的なコラーゲン供給源の必要性が急迫している。コラーゲンは12以上の異なる型を含む繊維状タンパク質ファミリーである。これらの型は基本構造が類似性した一般的テーマに基づく変種である。
【０００４】
最も一般的な型は以下のとおりである：
全ての組織、特に皮膚、腱、骨および角膜において見出されるI型；
軟骨、椎間板および硝子体において見出されるII型；
循環系および、胎児の皮膚を含む間質の結合組織において見出されるIII型；
基底膜、内皮細胞の下方に隣接した基底膜および周囲の筋肉細胞において見出されるIV型；ならびに
胎盤の羊膜（aminos）および絨毛膜において見出されるV型。
【０００５】
細胞培養に用いられる場合、異なる型のコラーゲンは幾分異なる役割をもつ。したがって、I型コラーゲンは、フラスコ表面上での細胞付着および延展の増大に貢献し、細胞増殖を刺激し、かつ、実験者が用いる培地中の血清を少なくすることができる。I型はまた、接着および細胞形態に影響して、細胞生存度を増加させる。
【０００６】
III型コラーゲンは、細胞付着を増加させ、細胞挙動を変化させることが知られている。
【０００７】
IV型は細胞付着を助け、一方でV型は細胞、特に内皮細胞の増殖を増加させる。
【０００８】
様々な型のコラーゲンの特性のより詳細な解析については、Kuhn K (1987) The classical collagens: Type I, II, and III in Structure and Function of collagen Types (R. Mayne and R. E. Burgeson編) Academic Press NY p.1を参照されたい。
【０００９】
コラーゲンは三通りの状態で存在する：
i)  腱内でのような繊維状態；
ii)  結晶状態またはトロポコラーゲン；
iii)  ゼラチン内でのような変性状態。
【００１０】
コラーゲン分子は、一部の分子内結合を維持しながら可溶化されうる。1955年にGallop P. M. (Arch. Biochem. and Biophys.: 54, 486-495)は、イクシオコール（ichtyocol）または魚のコラーゲンを単離し、部分的に性質決定した。彼は、30℃での加熱によって、2時間で旋光度が-110°変化することを見いだした。また彼により、分子量および粘性が減少することが指摘された。その後、この分子が約10万ダルトンの三本のらせん状鎖からなり、これが単量体を形成すること、ならびに温度が上昇すると単量体が速やかに変性することが明らかになり、これにより、粘性の減少が説明される。未成熟コラーゲン内の鎖間に架橋が存在しないことによって、その基本構造単位、すなわちトロポコラーゲンの単離と性質決定が、後に可能となった。
【００１１】
トロポコラーゲンは285kDaの分子量を有する。I型コラーゲンは、二本のα-1鎖および、α-2と命名されたもう一本の鎖を含むヘテロ三量体である。その他の型のコラーゲンは三本の同一の鎖を有し、その各鎖は約1000アミノ酸で構成され、分子量285kDaである。グリシン残基の比率は非常に高い（三分の一）。また、他の任意の既知タンパク質の中では、プロリンの比率が最も高いことも認められるであろう。最後に、二つの特有アミノ酸であるヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジンが存在する。グリシン-プロリン-ヒドロキシプロリン配列は反復性である。
【００１２】
サケ科に属する種であるニジマスに由来するI型の皮膚コラーゲンの解析によって、特有の構成が明らかとなった。実際、コラーゲンは、それぞれα-1鎖、α-2鎖、およびα-3鎖の三量体、ならびに、二本のα-1鎖および一本のα-3鎖の三量体で構成されていることが見いだされた。硬骨魚においてしか、α-3鎖の存在は観察されていない。これら魚コラーゲンの安定性がより低いことは、少数のGly-Pro-Proトリプレットおよび多数のGly-Glyダブレット（doublet）の存在によって三重らせん構造が緩むという事実と関連していると考えられる。(M. Saito, Y. Takenouchi, N. Kunisaki, S. Kimura. Complete primary structure of rainbow trout type I collagen consisting of a1(1) a2(1) a3(1) heterotrimers European Journal of Biochemistry: 268(10) p2817, May 2001を参照されたい。)
【００１３】
ある種の動物細胞は懸濁状態で培養されうるが、他の細胞は生存のために細胞外マトリックスを必要とする。後者のタイプの接着細胞では、そのような層の欠如の結果として、形態的特徴が失われ、最終的には死に至る。
【００１４】
細胞が接着するための表面（フラスコ）が二種類市販されている：
i) 荷電した静電ポリマー；
ii) コラーゲンマトリックス。
【００１５】
市販の製品については、コラーゲンマトリックスで覆われたフラスコは、ポリマーで覆われたものより格段に高価である。大抵の場合、細胞にとって人工的であるこれらのポリマーよりもコラーゲンマトリックスを使用する方がより適切である。本発明においては、アザラシ皮膚由来のコラーゲンおよびサケ由来のコラーゲンを、細胞培養用の細胞マトリックスとして提案する。
【００１６】
コラーゲンマトリックス上で細胞を培養するために通常用いられる、以下の三つの異なる方法が存在する。
１．コラーゲン層の上部。
２．三次元培養用のコラーゲンゲル層への包埋。この場合、通常、細胞非含有コラーゲン底面層を培養フラスコ内に配置して、培養器表面への付着を防止する。その後、細胞を含む上層を底面層の上に配置する。
３．二つのコラーゲン層の間。
【００１７】
コラーゲン被覆表面上またはコラーゲンゲル上で日常的に培養される細胞には上皮細胞（例えば肝細胞、乳腺上皮細胞（mammary epithelial cell）、結腸上皮細胞、ケラチノサイト）、ある種の間葉細胞（例えば内皮細胞）、およびニューロンが含まれる。コラーゲン基質は、幹細胞の完全性を維持するために根本的に必要である。
【発明の開示】
【００１８】
本発明のコラーゲンが、いくつかの他の使用と同様に、細胞培養に理想的に適しているという点には、驚くべきである。このような業界では通常、細胞培養のためにゼラチン膜を最初に施さねばならず、次にその膜をコラーゲンで被覆している。本発明に従って抽出されるコラーゲンはそのような膜を必要とせず、フラスコ上または他の細胞培養基質上で直接用いることが可能である。
【００１９】
本発明に従って産生されるコラーゲンは医療装置においても用いることができる。従って、多くのそのような医療装置が体内に移植され、以下に示すように、本発明のコラーゲンの使用によって細胞の増殖が補助されると考えられる。さらに、アザラシ由来のコラーゲンは、既知の感染リスクを全く有さない。アザラシは毛皮で覆われた海水性哺乳動物であり、これまでどんな感染病の保有も認められたことがない。
【００２０】
医療装置においては、コラーゲンはその表面に被覆されることが好ましい。実際には、コラーゲンを医療用縫合糸に用いることさえも可能である。
【００２１】
本発明のコラーゲンのさらなる使用とは、皮膚科学的適用である。以下に示すようにコラーゲンは水に対して高い親和性を有しており、乳化剤として作用することができる。
【００２２】
上記に加えて、本発明のコラーゲンは、体内に注入されうる他の成分との混合物としても用いることができる。従って、例えば骨折の場合に容易に使用可能である。
【００２３】
以上に示されたように、海洋哺乳動物由来の、特にアザラシ由来のコラーゲンは、細胞培養のための優れた特性を示す。サケ由来のコラーゲンも同様に興味ある性質を示す。
【００２４】
細胞培養プロトコール
A.I型コラーゲンで覆われたフラスコ  (Biocoatコラーゲンコート細胞培養フラスコ（collagen cell ware flask）) 
カタログ番号354531、BD Bioscience （ラット尾腱）
マトリックス非含有Falconフラスコ
サケの皮膚コラーゲンで覆われたフラスコ
アザラシの皮膚コラーゲンで覆われたフラスコ
接着細胞  (BJ＝ヒト包皮由来の上皮細胞(ATCC)
ヒト臍帯静脈由来の内皮細胞
培地+ウシ胎仔血清+トリプシン
B.培養フラスコをコラーゲンでコーティング
2 mlの被験コラーゲンを、2 mlの培地と混合した。
形成された白濁沈殿を、フラスコ底面にQ-tipで一様に塗布した。
フラスコを、層流フード中で20分間、UV光下で維持した。
10 ml当たり約200万個の細胞をそれぞれのフラスコに入れた。
インキュベーション温度を37℃とし、95％O2/5％CO2下であった。
【００２５】
好ましい態様の説明
（表１）魚およびアザラシの皮膚コラーゲンの溶解度に対するpHの影響
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コラーゲンはpH変化に高感受性である。アザラシのコラーゲンはpH 4.7付近で沈殿するが、サケのコラーゲンは4.32から5.26の間で沈殿する。
【００２６】
（表２）魚およびアザラシの皮膚コラーゲンの溶解度に対するイオン強度の影響
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イオン強度は、コラーゲンの溶解度に影響を与えるもう一つの因子である。サケのコラーゲンと比べて、アザラシのコラーゲンを沈殿させるためにはNaCl濃度の大幅な変動が必要であることが、本発明者らによる結果から示されている。分光法および遠心分離後の沈殿形成という二つの異なる方法で、結果を判定している。分光法により、サケのコラーゲンは明確な変化点を有さないが、アザラシのコラーゲンでは明らかである。アザラシのコラーゲンは0.152 M のNaCl濃度で沈殿するのに対して、サケの皮膚コラーゲンが沈殿するためには0.647 Mというより高い塩濃度が必要である。
【００２７】
（表３）アザラシのコラーゲンの水分含量（水和）
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実験3は切片を乾燥する代わりに凍結乾燥した。二つの技術から得られた結果は同等であり、アザラシのコラーゲンが約98％の水分を吸収することが示されている。
【００２８】
アザラシおよび魚の皮膚からのコラーゲン抽出手順は、"Culture of Animal Cells" by Ian R. Freshney著、Alan R. 編、Lis Inc.、New Yorkの第二版に記載された、ElsdaleおよびBardの方法 (Elsdale, T., Bard，J. (1972) Collagen substrata for studies on cell behaviour. J.Cel Biol. 54: 626-634) Second Edition of the を参照されたい）を改変したものであった。
【００２９】
コラーゲンは低pHおよび低塩濃度の溶液に可溶である。pHを7.4まで上昇させかつイオン強度を増加させると、コラーゲンはゲル化する。
【００３０】
コラーゲンは以下のようにして抽出された。
材料
10×  BME （Eagle基礎培地）
7.5％  炭酸水素ナトリウム溶液
L-グルタミン (200 mM)
ウシ胎仔血清
Nanopure水
0.142 M NaOH
0.5 M  酢酸
【００３１】
図1では、タンパク質は、Laemmliの方法（Laemmli UK Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685を参照されたい）に従って、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された。
【００３２】
図2では、細胞は10％ウシ胎仔血清を補充したF12K培地(Sigma Chem. Co. St-Louis Mo USA)で培養された。
【００３３】
図3から図6に示した実験には、同様の培地が用いられた。
【００３４】
図面からわかるように、コラーゲンのマトリックス非存在下では、多くの細胞砕片が存在しており、細胞はフラスコに接着していないことに留意されたい。それぞれアザラシのコラーゲンおよびサケのコラーゲンを用いて培養した細胞が示されている図4および図6においては、細胞はマトリックスに十分に接着しており、細胞砕片はごくわずかしか存在していないことに留意されたい。
【００３５】
一方、市販のコラーゲンを用いてフラスコ内で培養された細胞では、先の例よりも増殖がゆっくりであると考えられることに留意されたい。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC ATCC CRL 1730を用いた場合にも、本質的に同様の結果が得られた。後者の場合、ヘパリンおよび内皮細胞成長サプリメント（Sigma Chem Co.製）が培地に添加された。
【００３６】
以上より、アザラシのコラーゲンはケラチノサイトなどの上皮細胞および内皮細胞のインビトロ増殖を支持し、医療装置におけるそれらの使用に適した特性を示すと考えられる。特に、そのような医療装置を、本コラーゲンと混合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】サケの皮膚およびアザラシの皮膚から抽出されたコラーゲンを他のコラーゲンと比較した電気泳動を示す。
【図２】マトリックス非存在下のヒト皮膚細胞を示す。
【図３】細胞外マトリックス非存在下で培養したヒト皮膚の細胞を示す。
【図４】アザラシのコラーゲンを用いたヒト皮膚細胞の増殖を示す。
【図５】市販のコラーゲンコートフラスコ内でのヒト皮膚細胞の増殖を示す。
【図６】サケの皮膚由来のコラーゲンマトリックス上でのヒト皮膚細胞の増殖を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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