(57)【要約】本発明は均一系から成る治療的用途用のヒトリンパ球細胞株の大規模増殖方法に関する。請求項記載の発明は均一的に培養されたリンパ球細胞の治療的投薬量の生産にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１×１０9の細胞が均一培養系で成長させられるＴＡＬＬリンパ球増殖物の増殖方法。
【請求項２】
該均一系がセルファクトリー（cell-factory）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
０．７×１０8から１×１０8の細胞数を得るまで、均一系での増殖がフラスコ中での先行増殖方法により実施される請求項２記載の方法。
【請求項４】
接種菌の細胞密度が少なくとも０．７×１０6細胞／ｍｌで、好ましくは０．７５×１０6細胞／ｍｌに等しく、そして、集菌時に細胞密度が２×１０6細胞／ｍｌより小さくて、好ましくは１×１０6より小さい請求項３記載の方法。
【請求項５】
セルファクトリーが１０室のユニットである請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＴＡＬＬリンパ球がＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１０３／２細胞株、所望ならば、遺伝子組み換えされたものから成るグループから選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＴＡＬＬがＴＡＬＬ−１０４リンパ球である請求項６による方法。
【請求項８】
セルファクトリーの増殖段階での完全培地が、最大１０％、好ましくは４から６％の範囲、より好ましくは５％のヒト血清を含み、所望ならば、０から１０％濃度の胎児血清と１００／ＩＵ濃度のインターロイキンを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
４８から９０時間ごとにインターロイキン−２が細胞培養に加えられる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
均一系での細胞成長が抗生物質の無い培養液で行われる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０による製法を包含する事実で特徴付けられる、少なくとも１×１０9細胞量のＴＡＬＬリンパ球の凍結バッグの調製方法。
【請求項１２】
０．１ｍｌから１ｍｌの細胞培養容量を封じ込める少なくとも一つのサンプリング室を作れるように、少なくとも二点で、しかもバッグ充填コレットに対して横方向にバッグがシールされて、品質管理を行うためにバッグに含まれる培養株からは物理的に分離されている請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該リンパ球が、ＣＤ３+およびＣＤ８+によっては最低限９８％好ましくは９９％以上、ＣＤ５６+によっては少なくとも９５％好ましくは９７％以上の免疫的標識発現で特徴付けられる、均一培養中における少なくとも１×１０9のＴＡＬＬリンパ球の治療的投薬量の調製方法。
【請求項１４】
リンパ球がＴＡＬＬ−１０４である請求項１３の方法。
【請求項１５】
該リンパ球が、適当な標的細胞への細胞毒性測定によって求められる生物活性が少なくともコントロールの７０％であることによって特徴付けられる請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１０記載の方法によって得られ得るＴＡＬＬリンパ球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離ヒト細胞の生体外細胞培養と大規模増殖に関する。
【背景技術】
【０００２】
坑腫瘍治療へのアプローチは、生体外で単離された細胞株あるいは細胞毒性活性を付与された細胞の使用に基づいている。
【０００３】
１９９０年代初期に、ＴＡＬＬと称される、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病を患った子供から由来した多くのＴ−リンパ球細胞株が単離された。それらにはＴ−細胞株 ＴＡＬＬ−１０４，ＴＡＬＬ−１０７，ＴＡＬＬ−１０３／２があり、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら（Ｂｌｏｏｄ，１９９１，７７：１５３４−１５４５）とＣｅｓａｎｏとＳａｎｔｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２８：６４８−６５６）によって記載されている。
【０００４】
それらは現在、動物モデルや人における腫瘍の治療に成功裏に使われているように、興味ある特性を示す（ＣｅｓａｎｏらＢｌｏｏｄ １９９１，８７：３９３−４０３；ＣｅｓａｎｏらＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６，５６：３０２１−３０２９，米国特許第５，２７２，０８２号、米国特許第５，６８３，６９０号、米国特許第５，７０２，７０２号）。                
【０００５】
ＴＡＬＬ細胞株は、細胞毒活性、特に抗腫瘍活性を付与されており、異なるタイプの腫瘍に活性がある：これらの細胞の主な特性は、それらがＭＨＣ（主要組織適合抗原）による拘束が無いということであり（ＣｅｓａｎｏらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，１５１：２９４３−２９５７）、従って、あらゆる患者に、しかも組織適合性抗原表現型に無関係に投与できる。更に、ある種の、例えばＴＩＬやＬＡＫのような細胞毒性Ｔリンパ球と異なり、ＴＡＬＬ細胞株は生体外投与の後でリンフォカインとの併用治療を必要としない。リンフォカインの同時投与はいくつかの欠点を有するので、これは該細胞の更なる長所でもある。
【０００６】
更に、ＴＡＬＬリンパ球はいろいろな腫瘍に成功裏に試験されてきた。これらの理由で、このＴＡＬＬリンパ球は興味ある治療代替物と認められている。しかしながら、これまでに使われている細胞増殖システムは限界がある。なぜなら、モノクローナル抗体や組み換え蛋白の調製に使われていた大規模細胞培養装置は、長い間利用されてはいたが、養子免疫療法に調製された細胞は、ＣｅｓａｎｏらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９６，５６：４４４４−４４５２と、ＶｉｓｏｎｎｅａｕらのＣｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ.,１９９７，３：１７８９−１７９７で記載されているように、単一のフラスコ中で成長した培養物に由来する。従って、このタイプの細胞に適した大規模培養システムが非常に待ち望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、均一培養系に基づくＴ−リンパ球の大規模な増殖と成長の製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の「ＴＡＬＬリンパ球の大規模容量」の表現は、少なくとも１×１０9の細胞を言う。
【０００９】
特に、請求項に記載の製法で使用される醗酵槽あるいは均一系は、望ましくは１０室のスタックからなるセルファクトリーである。本製造法によって増殖されるリンパ球は所望ならば遺伝子組み換えされた、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１０３／２から成るグループから選択される。
【００１０】
更なる実施態様によれば、本発明は細胞サンプリングの方法に関する。即ち、本発明のプロセスは、サンプリングに充分な量の細胞数を含むサンプリング室を少なくとも一つ作り出せる、バッグの充填コレットの封印法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明はＴＡＬＬリンパ球の大規模増殖方法に関するものであり、少なくとも１×１０9の細胞が、好ましくは単一醗酵槽ユニットから成る均一系で培養される。
【００１２】
ＴＡＬＬ（Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia））リンパ球は、リンパ芽球性白血病を患った小児科患者由来の細胞毒性のあるＴリンパ球株であり、Ｏ’ＣｏｎｎｅｒらのＢｌｏｏｄ，１９９１，７７：１５３４−１５４５と、ＣｅｓａｎｏとＳａｎｔｏｌｉのＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２８：６４８−６５６に記載されているようなＴＡＬＬ−１０４，ＴＡＬＬ−１０７，ＴＡＬＬ−１０３／２株を含む。望ましい細胞株はＴＡＬＬ−１０４である。またＴＡＬＬ細胞は遺伝子組み換えされたものでも良い。
【００１３】
それらリンパ球は、今までのところＴ１７５フラスコあたり最大およそ1×１０8の細胞まで、もっぱら単一フラスコで増殖されて来た。
【００１４】
従って、治療的に効果のある量の１０5から１０12、好ましくは１×１０7から１×１０10、いっそう好ましくは１×１０8から２．５×１０9の範囲の細胞を含むバッグの調製は、従来、多くの単一フラスコの同時増殖を必要としていた。
【００１５】
本発明の定義によれば、それぞれのフラスコは異なった培養微環境を意味するので、単一フラスコでの成長は不均一培養系を意味する。従って、且つ、ＦＤＡの指針である米国保健省の「工業への手引き：人の体細胞治療と遺伝子治療への手引き」（ＣＢＥＲ、３月号  １９９８年  要点III）―この指針は独立系で調製された細胞のそれぞれの混合物は別々に制御されるべきと推奨している―に従えば、先行技術によるそれぞれの単一フラスコ由来の細胞は異なったロットを意味しており、それ故に独立に制御されねばならない。このことは、治療用の細胞の均一系での培養システムの開発は、特にＴＡＬＬ細胞の開発は、ロット制御に関する限りでも、非常な利点を意味する。
【００１６】
更に、多くの単一フラスコで構成される不均一系での増殖は、作業者により行われる繰返し取扱い作業による汚染の高いリスクを引き起こす可能性がある。
【００１７】
ＴＡＬＬ細胞は通常懸濁液中で成長するが、驚くべきことに、それらは、この種の細胞の工業的スケールアップのための既知の系、例えば、スピナーフラスコやミニＰＥＲＭ中では増殖もされない。それ故に、例えば少なくとも２．５×１０9の細胞の治療投薬量の生産のような、生産されるべき細胞量が１０9を越える場合、市場から入手可能な最大のフラスコ（１７５）を使っても、最大でも１．５−２×１０8のＴＡＬＬ細胞を取得出来るに過ぎないので、細胞増殖のステップは非常に手間のかかるものとなる。
【００１８】
出願人は驚くべきことに、足場依存性の細胞に通常使用されるセルファクトリーのような均一系で、該細胞が効率的に成長増殖できることを見出した。逆に言えば、例えばＴＡＬＬ細胞に似た成長特性を示すハイブリドーマのような細胞の、懸濁系での大規模な成長に従来使われたスピナーフラスコや他の発酵槽は不適正であると結論付けられる。
【００１９】
「大規模生産」と言う表現は、均一系での少なくとも1×109のＴＡＬＬ細胞の生産を意味する。
【００２０】
本発明の方法においては、細胞数に関するデータは凡そ５％の許容範囲を有し、これはＢｕｒｋｅｒチャンバーで測定される細胞カウントにおいてあり得る誤差を意味する。例えば、１×１０6の表示は、実際には０．９５×１０6から１．０５×１０6の細胞数を意味する。測定誤差は変わり得るもので、採用される測定法次第である。
【００２１】
本発明方法によれば、セルファクトリーでのＴＡＬＬ増殖は、好ましくは、培養液への新鮮な完全培地の継続的追加による同じフラスコ（ここではフラスコは細胞培養容器を意味する）内での一連の容積的増殖から成る予備増殖によって先行され、次いで、全培養液を高容積フラスコへ継代培養、そして最終的には、Ｔ１７５フラスコのような商業的に入手できる最大容量且つ最大表面積のフラスコへの継代培養によって行われる。
【００２２】
本発明の好ましい特徴によると、予備的増殖はおよそ３−４×１０8の細胞が得られるまで行われ、その内のおよそ２−２．５×１０8の細胞はそれぞれのセルファクトリーへの接種に使われ、およそ１−１．５×１０8の細胞が並行してＴ１７５培養フラスコ中に保たれる。                     
【００２３】
細胞密度値を最適の接種値、即ち、０．７から１×１０8の細胞数／ｍｌに戻すように行われる細胞培養液の分割は、ここでは「継代」を意味する。この密度で、細胞は素早くおよそ２．５×１０9の細胞数／ｍｌに達する。
【００２４】
予備増殖は好ましくは完全培地で実施され、さらに好ましくは２ｍＭのグルタミン、２−２０％好ましくは５％の濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、およびサイトカイン好ましくはインターロイキン、更に好ましくはＩＬ−２あるいはＩＬ−５を含むＩＭＤＭで実施される。ＩＬ−２は好ましくは４８−７２時間毎に１００ＩＵ／ｍｌの量で追加される。均一系において、増殖段階の培地は予備増殖段階のものと同じである。しかしウシ胎仔血清は、少なくとも部分的にヒト血清ＡＢに置換される。また、この置換は均一細胞培養系への細胞移植前に、例えば、予備増殖段階の最終継代時に行っても良い。ＩＭＤＭは他の、例えばＲＰＭＩやＨａｍ’ｓ−Ｆ１２等のような培養培地に置き換えても良い。培地は好ましくは抗生物質フリーである。
【００２５】
２ｍＭのグルタミンを含み抗生物質フリーの培地、好ましくはＩＭＤＭ培地は、ここでは「完全培地」と称され、ＦＢＳやヒト血清で補足されても良い。
【００２６】
インターロイキン、好ましくはＩＬ−２かＩＬ−５が４８−７２時間毎に、５０から１５０ＩＵ／ｍｌの最終濃度で、より好ましくは１００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地に追加される。
【００２７】
細胞は、３７℃で、そして５−１２％のＣＯ2、好ましくは１０％のＣＯ2、好ましくは１０％のＣＯ2を含む混合空気中でインキュベートされる。細胞を想定する全ての継代や培地取扱い作業は殺菌状態で、例えば垂直層流のバイオハザードフード（クラス１００）中で実施される。
【００２８】
特に望ましい実施態様によると、予備増殖培養は、液体窒素中で貯蔵されていた、１×１０7から２×１０7細胞／チューブ／ｍｌを含み、３７℃の恒温浴で解凍された凍結ＭＣＢ（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）培養チューブかバイアル瓶から始められる。
【００２９】
バイアル瓶の内容物には、層流フードの中で、８倍から１０倍の高容量の冷たい解凍液（２０％ＦＢＳを含む完全ＩＭＤＭ）が加えられる。これらの細胞は（１５００ｒｐｍで１０分間）遠心分離される。上清が吸引除去されてから、細胞ペレットに１０ｍｌの完全培地が加えられ、再懸濁された細胞はＴ１２５フラスコに継がれる。完全培地で希釈されたＩＬ−２が、およそ１００ＩＵ／ｍｌの最終濃度で加えられる。倒立顕微鏡での観察状況で、細胞が全フラスコ表面を覆うような細胞密度になった時、細胞培養物は培地容量の２倍に増殖されている（２つのＴ２５フラスコ量に増殖される）。この目的のために、等容量のフレッシュな培地が加えられ、一般的には０．７×１０6から１×１０6の範囲の最適細胞密度（接種細胞密度）を復元するために、培養物は二つの同じ大きさのフラスコに分割され、ここでそれぞれのフラスコの容量は初期の容量に対応する。
【００３０】
細胞培地中での最適ガス交換を保つために、Ｔ２５フラスコの最適細胞培地容量は７から１２ｍｌ、好ましくは１０ｍｌであり、Ｔ７５フラスコでは２０から６０ｍｌ、好ましくは４０ｍｌであり、Ｔ１７５フラスコでは４０から２００ｍｌである。上記容量は概略値であり、最適細胞密度条件を意味する。
【００３１】
解凍後、通常３ないし７日後好ましくは５日後に最適細胞密度に到達する。およそ３日後に、これらの細胞は２つのＴ２５フラスコから２つのＴ７５フラスコに継がれる。もしフラスコに残っている細胞があれば、それは集菌される。ＩＬ−２が上述の濃度に準じて新鮮な培地に追加される。
【００３２】
およそ３日後に、これらの細胞は２つのＴ７５フラスコから２つのＴ１７５フラスコに継がれる。Ｔ７５フラスコにもし残っている細胞があれば、それは最終容量が４０ｍｌになるように完全培地で洗浄して集菌され、且つ比例量のＩＬ−２が加えられる。２−３日後に、これらの細胞は２つのＴ１７５フラスコから４つの２０ｍｌのＴ１７５に継がれ、そこに同じ容量の完全培地と比例量のＩＬ−２が直ちに加えられる。２日後に、これらの細胞は４つのＴ１７５から８つのＴ１７５フラスコに継がれる。それぞれのＴ１７５フラスコにはおよそ２０ｍｌの完全培地と比例量のＩＬ−２が加えられる。およそ２日後に、８つのＴ１７５フラスコには、２％から１０％の、好ましくは４％から６％の濃度範囲の、更に好ましくは５％のヒト血清と、比例量のＩＬ−２を含むおよそ４０ｍｌの完全培地が加えられる。２日後に、８つのＴ１７５フラスコには比例量のＩＬ−２を含むおよそ８０ｍｌの完全培地が加えられる。
【００３３】
Ｔ１７５フラスコの最終的な集菌容量は通常１４０から１８０ｍｌの範囲である。予備増殖段階はおよそ１５日後に完了し、ヒト血清を最終濃度で２％から５％好ましくは３％から４％、および所望ならばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を最終濃度で０％から５％好ましくは１．５％から３％を含む培地中で、細胞数は０．９×１０9から１．１×１０9の範囲に達する（この値は一般的には８つのＴ１７５フラスコに対応し、それぞれは１６０ｍｌの細胞懸濁液を含む）。
【００３４】
ＦＢＳを含む培地から好ましくはヒト血清を含む培地への継代は、フラスコ、好ましくはＴ１７５、での予備増殖の２つの最終継代中で、好ましくはヒト血清を含む新鮮な培地でＦＢＳを含む培養液を継代希釈することによって起こる。
【００３５】
セルファクトリーへの接種は、セルファクトリーの最終容量の１／６から１／１０の範囲、好ましくは１／８の容量で、１．５−２．５×１０7／室の範囲の細胞数を用いて実施される。最終容量が２リッターを有する１０室のセルファクトリーへの接種では、２００から３３０ｍｌ好ましくは２３０から２７０ｍｌの培地容量で、接種は１．５から２．５×１０8の範囲で行われ、直ちに同じ量の新鮮な完全培地が加えられる。この完全培地は最大で１０％、好ましくは５％のヒト血清とサイトカイン好ましくはインターロイキン、更に好ましくはＩＬ−２かＩＬ−５，更に好ましくはＩＬ−２を、最終濃度で８０−１２０ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１００ＩＵ／ｍｌで含む。
【００３６】
３−５日ごとに好ましくは４日ごとに、その間にこれらの細胞は一般に複製されるが、セルファクトリーに収容した容量に対応する完全培地の容量が、細胞増殖と成長を継続するために加えられ、それは最大最終容量が１０室のセルファクトリーあたり２リッターまで、そして細胞数が１．５×１０9から２．５×１０9になるまで続けられる。セルファクトリーでのＴＡＬＬ細胞の増殖には、最大１０％好ましくは３から７％、より好ましくは４から６％、更に好ましくは５％の量のヒト血清を含む新鮮な培地の追加が必要である。従って、本発明による均一培養系での増殖段階では、ウシ胎仔血清の使用はごく少量で済み、好ましくは使わなくても良い。本発明の方法の最終段階で存在するかもしれない痕跡量のＦＢＳ は、よしんばあるとしても、それはヒト血清を含む培地を用いてＦＢＳを含む培地を継代希釈していることの結果である。
【００３７】
簡単には、一般的スキームの手順によると、フラスコ中の予備増殖段階においても均一系での増殖段階においても、細胞密度は接種時には決して０．７×１０6細胞数／ｍｌ（この値は細胞培養液を４８から７２時間毎に２ないし３ケに分割することで得られる値に対応する）より小さくはならず、望ましくは０．７５×１０6／ｍｌである。逆に言えば、細胞集菌寸前の最終成長段階では、この値は決して２×１０6を越えず、好ましくは１．５×１０6／ｍｌである。
【００３８】
本発明の方法による細胞容量と細胞数は比例的に計算された―ここで本発明での接種は４０室を持つセルファクトリーに実施され、そのセルファクトリーは８リッターの最大容量の培地を有し、且つ、単一均一系で成長したおよそ８―１０×１０9の全細胞量を供給できる能力のものである。
【００３９】
本発明方法によると、ＴＡＬＬ細胞の最高の治療投薬量、即ち２．５×１０9の細胞を含む少なくとも一つのバッグ（各バッグは１×１０8から２．５×１０9の細胞を含む）が、均一培養系によって生産され得る。それ故に本発明の更なる実施態様によると、本製造法はまた、少なくとも１×１０9の量でのＴＡＬＬリンパ球の凍結ＢＡＧの調製法をも包含し、これらＴＡＬＬ細胞は均一培養系で増殖されると言う事実で特徴付けられる。使用されたバッグは可変容量であり、従って、異なった治療投薬量の細胞を含む。凍結用と輸液用のバッグが好ましくは使われ、更に好ましくはＢａｘｔｅｒ  Ｃｒｙｏｃｙｔｅバッグが使われる。
【００４０】
治療用のバッグを調製するために、集菌時のセルファクトリーからの細胞は５０ｍｌの殺菌チューブに採取され、公知の方法によってベータ粒子加速器（ベータトロン）中で照射処理される。この方法は、セシウム１３７のような伝統的な発生源によって供給されるのと同量の粒子を供給することが検証されている。ベータトロンを使うこの方法は放射性が無く、溶液を均一に照射してくれるという利点を有する。照射された後、これらの細胞は遠心分離される（１５００ｒｐｍで１０分間）。この時点で細胞試料が定量的試験のために抜取られる。
【００４１】
最終懸濁成分と一緒に照射された細胞と殺菌バッグは層流フード内に置かれる。これらの細胞は、８から３０ｍｌの培地中で、より好ましくは１×１０8から２．５×１０9の範囲でＴＡＬＬ細胞量を含む１０から２５ｍｌの完全培地中でＲｉｍｓｏ ５０（５０％ＤＭＳＯ）（２０％）と５％のヒトアルブミン（８０％）から成る凍結溶液中で再懸濁される。好ましくはバッグ中の細胞密度は１０6から１０8の細胞数／ｍｌである。照射された細胞は凍結前に４℃で２４時間以内保存される。
【００４２】
細胞濃度は、Ｂｕｒｋｅｒチャンバー内において、顕微鏡下で、または当業界で公知の他の方法でカウントされる。バッグは殺菌状態で充填される。
【００４３】
一旦バッグが充填されたら、それらは細胞を含むチャンバーを一つまたは好ましくは二つ作るために、バッグ充填コレットに対して、横方向に２点好ましくは３点でシール、例えば、ホットシールされる。ここで、そのような細胞は本発明の目的のための「基準試料」と称される。これら二つのバッグコレット部分に含まれる細胞分割量は別のものではあるが同じ培養バッチ由来のものである。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様によれば、コレットチャンバーに収容された細胞懸濁液の容量は０．１から１ｍｌ、好ましくは ０．３ｍｌの範囲であり、チャンバー当たりの細胞数は、少なくとも一連の適切な品質管理および／または殺菌管理に十分である。基準試料に対応する各チャンバーの細胞は全バッグを開けることなく容易に抜取れよう。
【００４５】
「基準試料」を含む該チャンバーや、一つあるいはそれより多くの点でバッグコレットをシールする方法及びバッグ基準試料を作成する方法は本発明の更なる目的である。
【００４６】
凍結保存用と輸液用のバッグは−８０℃で凍結される。
【００４７】
少なくとも１×１０9の細胞量のＴＡＬＬリンパ球の凍結バッグの調製方法を提供することも本発明の更なる目的であり、その量は単一の均一培養系に由来する。
【００４８】
本発明の方法によって増殖された細胞の品質管理は、均一培養系から集菌する細胞に対して、凍結前にも凍結後にも同じように実施され、ＴＡＬＬ細胞最終品の免疫学的標識と生物学的活性のパーセント量のような性質の安定性を調べることを意味する。本発明によって生産された細胞は凍結後も安定である。
【００４９】
品質管理は好ましくは公知の方法で実施される次の方法を含む：―生存率、好ましくはトリパンブルー（Trypan Blue）排除試験で求められ；少なくとも８０％が必要。
―生物学的活性、代替試験法が使われても良いが、好ましくは細胞毒性試験（アデニレート−キナーゼ測定法）で求められ、１０／１の比率で、標的細胞であるＫ６７２の６０％のリシス(lysis)よりも高くなければならない。
―内毒素レベル、好ましくはＬｙｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ比色分析試験  で求められ、０．５ＥＵ／ｍｌ以下でなければならない。
―免疫学的標識表現型、好ましくは免疫蛍光検査法（ＦＡＣＳ）で求められ、ＣＤ３+，ＣＤ８  +，ＣＤ５６+として知られる標識の少なくとも９０％の値を示さねばならない
―増殖性、好ましくは3Ｈ−ＴｄＲ取込み試験で実施され、７２時間後に測定された増殖性が、少なくともバックグラウンド値の２倍以上でなければならない。
【００５０】
本発明の方法によれば、免疫学的標識のパーセンテイジ、生物学的活性、および代謝標識活性、例えば、培養培地のグルコースレベルのような測定パラメーターは、不均一培養系で成長した細胞で測定される値よりも、均一培養系で成長した細胞で測定される値の方が変動性が少ない。
【００５１】
事実、均一培養系のセルファクトリーでは、ＴＡＬＬ細胞で表現される免疫学的標識のパーセンテイジは、ＣＤ３+やＣＤ５６+では少なくとも９０％で、好ましくは９５％で、より好ましくは９８％で、ＣＤ８+では少なくとも９０％で、より好ましくは少なくとも９３％であり、この値はフラスコ中で成長した細胞の値に対してよりは低い。ＣＤ５６+の標識発現値は少なくとも９５％好ましくは少なくとも９７％で、不均一フラスコ系中で成長した細胞よりは本発明の細胞の方がこの値は高い。同様に、通常好ましくはＫ５６２である標的細胞を使っての細胞毒性試験で求められた生物学的活性も、許容限界よりは高く、しかも、リシスが完全に誘発された適切な細胞数からなるコントロールに比べても常に７０％は高い。更なる実施態様によって、本発明は、本発明の製法で得られるＴＡＬＬリンパ球、好ましくはＴＡＬＬ １０４を包含する。
【００５２】
同様に、測定されたグルコースレベルを見ると、フラスコ中で成長した細胞に対して、本発明方法によるセルファクトリーで成長した細胞では、細胞の代謝条件がより均一であることを示す（図１）。事実、フラスコでの測定値は３００から４００ｍｇ／ｄｌの範囲のグルコース濃度だが、セルファクトリーでの測定値は３５０から３８０ｍｇ／ｄｌの範囲を示す。
【００５３】
簡易化された実施態様によると、本発明の製法は、公知の方法で実施されたいかなるＴＡＬＬ細胞の培養予備増殖段階をも包含する。それは、初期容量がセルファクトリーの最終容量の１／１０から１／６規模で、２×１０7の細胞／室でのセルファクトリーでの接種菌を包含し、そして、好ましくは１０室（最終容量がおよそ２リットル）のセルファクトリーでの細胞増殖段階で、およそ２５０ｍｌ中でおよそ２×１０8細胞の全接種菌を包含する。
【００５４】
本発明の手順で採用された条件下では、セルファクトリーでの大規模増殖において、最終増殖周期における最大回収密度に対する最小接種菌密度の比率が最適化される。事実、本発明の方法によると、最終増殖周期で細胞数はおよそ１０倍大きいが、（１．５から２．５×１０8細胞ら１．５から２．５×１０9細胞へ）容量は８倍大きいに過ぎない。均一系での更なる利点は：１)細胞成長の不均質条件の排除、２)取扱い作業数の減少および、従って、汚染可能性の減少、３)工数と人件費の減少である。
【００５５】
本発明による製法の更なる利点は、複数のフラスコ中での培養よりも汚染の危険性が減少することに由来して、抗生物質の無い培養培地を使用できることである。
【００５６】
本発明による製法のまた更なる利点は、好ましくは最大１０％濃度のヒト血清の使用である。従って、本発明の製法によれば、満足しうる細胞増殖が、好ましくは４から６％濃度のヒト血清によって得られる。
【００５７】
従って、セルファクトリーでの増殖段階の実施によって、ＴＡＬＬの治療的用途のためのバッグの調製の全工程が最適化され、大規模適用にかなっている。
【００５８】
本発明によるＴＡＬＬ増殖方法の利点は以下のように要約される：ｉ)品質管理が一つのサンプリング単位に限定され、それは一つの生産単位（セルファクトリー）に対応している。逆に言えば、もっと多くの単一醗酵単位で、しかも異なった時間で作業され、従って結果的に汚染のリスクが増加しやすい状態で増殖がなされる時には、汚染の可能性は増加する：ｉｉ）限られた数のバイオリアクターの使用によりおよそ３０％の時間節約と２５％のコスト削減が達成される。
【００５９】
このタイプの細胞に対しての公知の方法によれば、およそ２５個の１０8細胞のバッグあるいは一つの２．５×１０9細胞バッグに相当する２．５×１０9という細胞量が、３５個のＴ１７５と２．８リッターの培地を用いて得られた。しかも本発明の方法によれば、原材料（ヒト血清、培地、サイトカイン）の節約は３０％にも達する。
【００６０】
更なる利点は、最終ロットでなされるコントロールの数に関して得られる。つまり、公知の不均一系においては最終ロットが最大で１×１０8の細胞から成り、本発明で記載された均一系で生産されたロットよりも１０倍も多いということである。これは実際にコントロールの数が１０倍低いことを意味する。
【実施例】
【００６１】
１．原材料類
フラスコ：Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ；
セルファクトリー：ｃａｔ．Ｎｏ．１６４３２７あるいは１７０００９、デンマーク；www.nuncbrand.com;
培地：Ｉｓｃｏｖｅの 改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  １２−７２２、グルタミン補足培地；
グルタミンと血清を含むＣＭ（完全培地）；
ウシ胎仔血清：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国；
ヒト血清、タイプＡＢ、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；
ＩＬ−２ Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ １、Ｃｈｉｒｏｎ；
食塩水；ホスフェート緩衝食塩水、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；
ヒトアルブミン（５％）、Ｆａｒｍａ  Ｂｉａｇｉｎｉ；
ＲＩＭＳＯ ５０、Ｂａｘｔｅｒ；
凍結保存および輸液用バッグ、Ｃｒｙｏｃｙｔｅ  Ｂａｘｔｅｒ．
【００６２】
２．方法
全ての細胞培養はバイオハザードフード中、殺菌環境で実施された。あらゆる添加や取出し時に、入口噴水孔はイソプロパノールあるいは火炎で消毒された。
【００６３】
２．１．培地の調製
各血清ロットは、５６℃の恒温槽で１時間、補体非結合された。補非結合された血清の瓶は４℃に保たれ、補体非結合の日から一月以内に使用された。
【００６４】
２．２．予備的増殖段階用の完全培地
５００ｍｌのＩＭＤＭ瓶に補体非結合のＦＢＳ（５０ｍｌ）が加えられ、その瓶はロットで識別された。完全培地は４℃で保たれ、使用前に室温に加熱された。完全培地は調製日から一月以内に使用された。
【００６５】
２．３．セルファクトリーのスケールアップ用の完全培地
５００ｍｌのＩＭＤＭ瓶に２５ｍｌの補体非結合のヒト血清ＡＢが加えられた。培地は４℃で保たれ、使用前に室温に加熱された。完全培地は調製日から一月以内に使用された。
【００６６】
２．４．ＩＬ−２の調製
インターロイキン（１８×１０6ＩＵ／バイアル）が、およそ９×１０5ＩＵ／ｍｌを得るために２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁された。得られた溶液は０．２２μｍのフィルターで濾過され、バイアルは１ｍｌの分割量に調剤され、−８０℃で保存された。
【００６７】
この溶液（１ｍｌ）は、予備的増殖段階用の２．２．項の培地に対応して完全培地で希釈され、次いで１０4ＩＵ／ｍｌ溶液を得るために、増殖段階用の２．３．項の培地に対応する培地で希釈された。該溶液は、培地で同様に(１／１００)希釈して細胞懸濁液に添加された。
【００６８】
２．５．プロセス制御
汚染微生物数：微生物汚染は、ＴＡＬＬ細胞株を成長させるために使われた完全培地（ＩＭＤＭ＋補足血清）で求められた。得られる培地は０．４５μｍの孔の膜で濾過され、そのフイルターは、殺菌ランセットで取り除かれ、微生物汚染の可視化のために適当な培地中に入れられた（使用された培地はトリプシン大豆寒天であった）。このフィルターはプレート上に置かれた。黴の存在は少なくとも３日間の２０から２５℃のインキュベーション後に検出された、そして細菌の存在は、３０から３５℃で少なくとも３日間の更なるインキュベーションで検出された。プレートは微生物の成長を調べるために目視で検査された（最大で１００コロニー形成単位、ＣＦＵ）。
【００６９】
微生物のモニタリング：ＴＡＬＬ処理で使われたフードは、万が一、微生物が操作中に存在するか否かを調べるべく、管理されていた。作業者が細胞を扱っている間は（注入中やバッグ充填中）、ＴＳＢ寒天を入れたペトリ皿がフード中に露出され、操作完了時点でカバーされ、そして、黴の存在を検出するために２０から２５℃で少なくとも３日間インキュベーションされ、そして細菌の検出には３０から３５℃で少なくとも３日間インキュベーションされた。フラスコでの取扱い操作では、サンプリング中に微生物が二度見出されたが、セルファクトリーでの取扱い操作では汚染は検出されなかった。
【００７０】
実施例１  実験室規模での解凍と増殖
２０％ＦＢＳで補足されたＩＭＤＭからなる解凍液が調製され、使用前は４℃で保存された。
【００７１】
凍結された細胞を含むアンプルが液体窒素ドラムから取り出され、適宜解凍され、そして解凍培地で（１：１０）に希釈された。これらの細胞は１０分間、低速で遠心分離された。沈殿物ペレットは１０ｍｌの完全培地に再懸濁され、Ｔ２５フラスコに継代され、ＩＬ−２が１００ＩＵ／ｍｌの濃度になるまで加えられた。
【００７２】
これらの細胞は１０％ＣＯ2を含む環境下で５日間３７℃でインキュベートされた。
【００７３】
５日間のインキュベーション後に、同じ濃度のインターロイキン２を含む新鮮な培地中で、これらの細胞を（１：２）に分割し、そして密集成長まで到達させ、２日間保った。これらの細胞は静かにフラスコから取出され、同じＩＬ−２濃度（１００ＩＵ／ｍｌ）を有し、２０ｍｌ容量の最終培地を含むＴ７５フラスコへ継代された。およそ２−３日経って密集成長に達したら、その細胞は更に二日間放置され、それからＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）を有し４０ｍｌ容量の最終培地を含むＴ１７５フラスコ中で増殖された。二日後に、更に４０ｍｌのインターロイキン完全培地が追加され、これらの細胞は更に二日間成長させられ、そして最終容量８０ｍｌのもう二つのＴ１７５フラスコへ（１：２）に分割された。
【００７４】
これらの細胞の形態と密度は顕微鏡下で調べられた。それからこれらの細胞は、５％の完全培地（ヒト血清ＡＢを含むＩＭＤＭ）中で、１フラスコ当り１５０ｍｌの最終容量に持っていかれ、比例的にインターロイキンが加えられた。
【００７５】
これらの細胞は、最終容量１５０ｍｌの同じ数のＴ１７５フラスコへ（１：２）に分割された。
【００７６】
実施例２  ミニＰＥＲＭ醗酵槽とスピナーフラスコでのＴＡＬＬ細胞の動態的成長
これらの細胞は解凍されてＴ２５中で培養され、そして０．５リッターのスピナーフラスコあるいはミニＰＥＲＭ中への接種のために、７×１０5細胞数／ｍｌまで増殖された。
【００７７】
成長パラメーターを定めるのに意図された幾つかの測定はＴ７５中で実施された。これらの細胞が少なくとも１×１０6／ｍｌに達した時、それらは分割された。高い細胞生存率（最低９０％）とより高い細胞分割率を維持するために、細胞希釈は決して７×１０5細胞数／ｍｌより低くてはいけない、そして細胞成長は決して２×１０6細胞数／ｍｌを超えてはならない。最大細胞濃度において、グルコース水準はおよそ３２０−３８０ｍｇ／ｍｌであった。８０ｍｌの最終容量のＴ１７５において、全量おおよそ１００×１０6細胞数／フラスコに相当する、１．２５×１０6細胞数／ｍｌの濃度が得られた。
【００７８】
凍結と解凍中のより高い生存率のためには、細胞／バイアルの最少値が１．２×１０7よりも高くないといけないことが見極められた。同様に、対数的成長段階で凍結した細胞は、次に解凍後９−１０日以内で対数的成長段階に到達するが、他の成長段階で凍結した細胞はより長い時間遅れ（１０−１２日）を示すことが観察された。
【００７９】
スピナーフラスコ
０.５リッターのスピナーフラスコは３００ｍｌの実質容量を有していた。接種は１．５×１０7細胞で実施された。回転は３ｒｐｍに設定された。細胞生存率は４８時間後に測定され、５０％に等しいとわかった。１２０時間後には全ての細胞が死んだ。
【００８０】
更に、１０％ＣＯ2と下記の特定条件を使ってミニＰＥＲＭ（その容量にしては高い表面積を有し、ハイブリドーマ細胞のような懸濁液での細胞増殖には理想的なバイオリアクター）中で３つの増殖試験を実施した。
‐３０ｍｌ中７×１０7細胞で、１０ｒｐｍでの接種。細胞生存率は、すでに４８時間後には減少し始め、４日後には全ての細胞が死んだ。第二の試験では、回転数は５ｒｐｍに落された。成長の３日目に、細胞生存率は５２％であった。６日後に全ての細胞が死んだ。第三の試験では、接種は３×１０7細胞に減らされ、回転数も４ｒｐｍに減らされた。全ての細胞は第５培養日以内に全滅したが、第二日には、細胞生存率はまだかなり高かった（８０％）。これは、回転が細胞の生存にいかに重要かを示唆している。
【００８１】
両方の予備的醗酵試験から、懸濁系や足場非依存系での細胞に対し通常使われる伝統的な大規模成長条件下では、ＴＡＬＬ細胞は成長できないことが実証された。
【００８２】
実施例３  セルファクトリーでの大規模ＴＡＬＬ増殖
実施例１によるＴ１７５中での成長から得られた、およそ０．８×１０6細胞数／ｍｌを含む細胞懸濁液（２５０ｍｌ）が１０室のセルファクトリーに接種された。同量の完全培地が加えられた。４日後に、完全培地が５００ｍｌ×３回にわけて全容量が２リッターになるまで加えられた。
【００８３】
セルファクトリーは２５０ｍｌの殺菌バイアルへ移し変えられ、遠心分離され、殺菌ＰＢＳで洗浄された。これらの細胞はバイアルに回収され再び遠心分離された。接種８日後に、セルファクトリーから回収された細胞はおよそ２．３５×１０9であった。
【００８４】
１０室のセルファクトリーでの典型的な生産サイクルでは、一つのＭＣＢ（Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｌ）凍結バイアルから、７２の接種と増殖が行われた。全持続期間は１２０日、全細胞培養量は１４リッター。得られた細胞はおよそ１．４４×１０11であった。
【００８５】
表１は、１０室のセルファクトリーと４０室のセルファクトリーでの醗酵から得られたデータをそれぞれに示す。
【００８６】
【表１】
2006500936.tif 000002
【００８７】
セルファクトリーの細胞内容物は５０ｍｌの殺菌バイアルに混合されて、公知のβ粒子加速器（ベータトロン）中で照射された。セシウム１３７のような伝統的な照射源で供給されるのと同じ量の粒子を供給するように、本方法はその有効性を確認した。ベータトロンを使う方法は、放射性を有しないことと溶液に均一な照射をもたらす利点がある。
【００８８】
バッグの調製
照射後、細胞は遠心分離された（１５０ｒｐｍで１０分間）。細胞試料が定量試験用に抜取られ、凍結前に４℃で保存された。
【００８９】
最終懸濁成分と殺菌バッグと共に照射された細胞は層流フード中に置かれた。これらの細胞は、治療用量に必要な細胞量によって、Ｒｉｍｓｏ ５０（５０％ＤＭＳＯ）２０％とヒトアルブミン８０％からなる凍結溶液中に再懸濁された。これらの細胞はＢｕｒｋｅｒチャンバー中、顕微鏡下でカウントされ、バッグは殺菌条件下で適当量に充填された。バッグが充填されたら、充填コレットは３点でシールされた。こうしてそれぞれのバッグは基準試料となった。
【００９０】
セルファクトリー＞照射＞バッグのサイクルは、ロット毎に必要な数の細胞を得るために十分な回数繰返された。
【００９１】
殺菌管理
汚染微生物数殺菌管理、微生物学的モニタリングおよびマイコプラズマモニタリングは培地やフードで継続的に実施された。
【００９２】
実験例４  最終製品の管理と、実験室規模成長と大規模成長の比較
グルコース水準の測定：グルコース水準は、バッグ調製用の細胞集菌時に、セルファクトリーの細胞量に対応する３５のフラスコの中から１５のフラスコのサンプルについて測定された。図１に示されるように、グルコース濃度と細胞数は高い変動性がある。逆に言えば、１０室のセルファクトリーでは、６から１０日目の集菌時にはグルコースは一つの値（およそ３８０ｍｇ／ｄｌ）を示し、細胞は一つの密度（２×１０9／ｍｌ）を示す。フラスコ中で見出された、異なったグルコース水準と異なった細胞濃度は、不均一系代謝条件を示すもので、事実、培地中での高いグルコース水準は細胞培養の低い代謝活性に関連しており、一方、低いグルコース水準は細胞培養の高い代謝活性に対応している。
【００９３】
最終製品の品質管理
表２に表示した管理項目は照射された細胞について実施された。これらの値の許容限界値は右欄に記載されている。
【００９４】
【表２】
2006500936.tif 000003
【００９５】
生存率試験
測定は、１００μｌのＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ溶液で袋詰めにする前に、１００μｌの細胞懸濁液を希釈して行われた。適当な希釈後に、Ｂｕｒｋｅｒチャンバー中の染色された細胞をカウントして、顕微鏡下に管理は実施された。
【００９６】
生物学的活性
細胞毒性の決定は、袋詰めの前にキットＴｏｘｉｌｉｇｈｔTM（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ ＬＴ０７−２１７）を使って、細胞懸濁液で実施された。この方法は生物発光によるアデニレートキナーゼの測定に基づいている。細胞が膜完全性を失い、Ｍｇ++の存在下で基質のＡＤＰをＡＴＰに転換する時に、アデニレートキナーゼが細胞から放出されるので、その測定が可能になる。この決定は、１０5の標的細胞、Ｋ５６２を多数のウエル付きミクロプレート上に置くことで実施された。それぞれ１０．５および２．５に等しいＴ／Ｋ（あるいはエフェクター／標的）比率を得るために、本方法で調整された細胞が、１０6、５×１０5および２．５×１０5の量で加えられた。
【００９７】
一旦、標的細胞が一昼夜インキュベートされたら、本発明の方法で調製された細胞が生産したＫ５６２の％リシスは、超音波で溶解された１０5のＫ５６２細胞サンプルからなる最大値の常に７０％以上であった。
【００９８】
内毒素
内毒素量は、上述のように調製されたコレットを用いた試料について、中性ｐＨで、色素産生ＬＡＬ試験用のキットを使って、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第４版、２００２、頁１４０−１４５に記載された方法を適用して求められた。
【００９９】
表現型
バッグ充填前の細胞標識の測定による表現型の決定は、Ｍｏｌｍｅｄ’ｓ Ｑｕａｌｉｔｙ   Ｌａｂｓ社から入手できる適当な免疫標識（ＣＤ３+、ＣＤ８+、ＣＤ５６+）を用いた免疫蛍光法（ＦＡＣＳ）によって実施された。
【０１００】
【表３】
2006500936.tif 000004
【０１０１】
増殖試験
ＴＡＬＬ増殖の欠損はトリチウム化されたチミジンの取込みを測定して決定された。バッグ充填前に採取された細胞懸濁液の試料は、完全培地（ＩＭＤＭ＋血清＋ＩＬ−２）中で、異なった濃度のミクロプレートで４日間インキュベートされた。3Ｈ−ＴｄＲ（２μキュリー／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）が添加された。３７℃で３時間のインキュベート後に放射活性が測定された。ＴＡＬＬ細胞に関する毎分当たりのカウント数ｃｐｍはバックグラウンドの二倍以下でなければならない。
【０１０２】
表３はフラスコ中およびセルファクトリー中でそれぞれ成長した細胞バッチの増殖に関するデータを示す。
【０１０３】
表４は、免疫標識の存在下での異なった濃度での、照射後における、免疫学的標識の存在、細胞生存率、無菌性およびマイコプラズマによる汚染（もしあれば）の測定に関するデータである。
【０１０４】
【表４】
2006500936.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、フラスコ中で成長したＴＡＬＬ細胞のグルコースレベルと細胞密度を示す図である。次のパラメーターが１５個のフラスコのＴＡＬＬで測定された：細胞数／ｍｌ（−◆−）、グルコースレベル(棒グラフ)
【図１】
2006500936.tif 000006
【国際調査報告】
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2006500936.tif 000008