(57)【要約】皮膚パピローマのようなパピローマの治療に用いる医薬品の製造における、ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン）もしくは生物学的に活性なその改変体、または、これらのうちいずれかの生物学的に活性な断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピローマの治療で使用するための医薬品の製造における、ＨＡＭＬＥＴもしくは生物学的に活性なその改変体、または、これらのうちいずれかの生物学的に活性な断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体の使用。
【請求項２】
生物学的に活性な複合体は、アポフォールディング状態のα−ラクトアルブミンもしくはα−ラクトアルブミンの変異体、または、これらいずれかの断片、および、複合体を生物学的に活性な型に安定化する補因子を含み、α−ラクトアルブミンまたはその変異体の断片はいずれも、αドメインとβドメインとの境界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
補因子は、シスＣ１８：１：９もしくはＣ１８：１：１１脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
生物学的に活性な複合体は、ＨＡＭＬＥＴを含み、ＨＡＭＬＥＴは、ｐＨ４.６で沈殿させた乳汁のカゼイン分画から単離すること、陰イオン交換およびゲルクロマトグラフィーの組み合わせで、または、Ｃ１８：１脂肪酸で示されるヒトのミルクカゼイン由来の補因子の存在下で、α−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーで処理することのいずれかによって得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体は、
（ｉ）シスＣ１８：１：９もしくはＣ１８：１：１１脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸；および、
（ii）カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン、または、カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン変異体もしくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミン変異体；または、これらいずれかの断片を含み、断片はいずれも、αドメインとβドメインとの境界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
生物学的に活性な複合体は、カルシウム結合部位が、カルシウムに対する親和性が減少するように、または、機能しないように改変されたα−ラクトアルブミン変異体を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
変異体は、ウシα−ラクトアルブミンのＫ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７、および、Ｄ８８と同等なアミノ酸のいずれか１箇所に突然変異を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
改変体は、Ｄ８７に、Ｄ８７Ａ変異またはＤ８７Ｎ変異を有するα−ラクトアルブミン変異体を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
生物学的に活性な複合体は、α−ラクトアルブミンまたはその変異体の断片を含み、断片は、野生型タンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
α−ラクトアルブミンは、ヒトもしくはウシα−ラクトアルブミン、または、これらいずれかの変異体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
α−ラクトアルブミンは、ヒトα−ラクトアルブミンである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
α−ラクトアルブミンは、Ｓ７０Ｒ突然変異を含むウシα−ラクトアルブミン突然変異体である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
ＨＡＭＬＥＴもしくは生物学的に活性なその改変体、または、これらのうちいずれかの生物学的に活性な断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を、パピローマの治療を必要とする患者に投与することを含む、パピローマの治療方法。
【請求項１４】
実質的に実施例に関連して以後記載される、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パピローマの治療方法、および、皮膚パピローマまたは疣贅のようなパピローマの治療のための医薬品の製造における生物学的に活性な複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマは、皮膚および粘膜表面の腫瘍であり、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）で形質転換されたケラチノサイトによって形成される。ほとんどの皮膚病変は良性のままであるが、粘膜病変は、前ガン性であり、子宮頚癌が重要なＨＰＶ感染の続発症であり、毎年７５０,０００を超える症例が報告されている。ほとんどの子宮頚癌が、限定された数のＨＰＶ型（ＨＰＶ１６および１８）を含むが、皮膚パピローマは、このウイルス特異性を欠く。これらは、約１３０種の異なるＨＰＶ型のうち１またはそれ以上によって発症し、例えば足底疣贅、尋常性疣贅および扁平疣贅がある。免疫抑制された患者は、パピローマを発症させるリスクが高く、複数のＨＰＶ型を高い頻度で有する可能性がある。現在の治療としては、寒冷療法、掻爬、焼灼、局所的な殺ウイルス剤、レーザー、細胞分裂抑制薬、および、免疫活性化剤が挙げられる。子宮頚部のパピローマのためのＨＰＶワクチンが開発されているが、未だに使用されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン）（以前はＭＡＬとして知られる）は、アルファ−ラクトアルブミン（また、α−ラクトアルブミンと示される）の活性フォールディング変異体であり、健康な分化細胞ではなく形質転換細胞でアポトーシスを誘導する（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞の表面に結合し、細胞質に転移し、細胞核中に蓄積され、そこでＤＮＡ断片化を引き起こすことがわかっている（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。乳汁、特にヒトの乳汁から得られたこのタイプの生物学的に活性な複合体、および、抗菌剤としてのそれらの使用は、例えばＥＰ−０７７６２１４に説明されている。
【０００４】
本願において、ＨＡＭＬＥＴおよびこのタイプの複合体が、パピローマ、特に皮膚パピローマの治療に有用であることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に従って、パピローマの治療で使用するための医薬品の製造におけるα−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体の使用が提供され、このα−ラクトアルブミンは、ＨＡＭＬＥＴもしくは生物学的に活性なその改変体、もしくは、これらのうちいずれかの生物学的に活性な断片から選択される。
【０００６】
本医薬品を用いて治療可能なパピローマとしては、上に列挙した血清型のいずれかのパピローマが挙げられる。これらは、皮膚パピローマ、および、生殖器のパピローマを含む。
【０００７】
本発明で用いられる用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を意味し、これは、ｐＨ４.６で沈殿させた乳汁のカゼイン分画から単離すること、ＥＰ−Ａ−０７７６２１４の実施例で説明されたように、陰イオン交換とゲルクロマトグラフィーとの組み合わせ、または、ＷＯ９９／２６９７９に記載されたようなＣ１８
：１脂肪酸であることを特徴とするヒトのミルクカゼイン由来の補因子の存在下でα−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーで処理すること、のいずれかにより得ることができる。
【０００８】
α−ラクトアルブミンは、様々な哺乳動物源、例えばヒト、ウシ、ヒツジおよびヤギの乳汁から得ることができるが、好ましくはヒトまたはウシの乳汁であり、最も好ましくはヒトの乳汁である。このタンパク質の組換え型もまた用いることができる。
【０００９】
また、ヒトα−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換において、その他の試薬、特にオレイン酸のような脂質が有用であることがわかっている。特に、これまでに、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）が、ＨＡＭＬＥＴ生成に必要であることが報告されている（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。さらに最近になって、その他の脂肪酸が、同様に補因子として作用する可能性があることがわかっている。α−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換に最適な補因子は、シスコンフォメーションで、９位または１１位に二重結合を有するＣ１８：１脂肪酸である。
【００１０】
α−ラクトアルブミンは、４個のαへリックス（残基１〜３４、８６〜１２３）と、４個のジスルフィド結合（６１〜７７；７３〜９１；２８〜１１１、および、６〜１２０）で連結された逆平行βシート（残基３８〜８２）とを有する１４．２ｋＤａの球状タンパク質である（Ｋ．Ｒ．Ａｃｈａｒｙａ等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２１，５７１〜８１）。α−ラクトアルブミンの野生型コンフォメーションは、Ａｓｐ８２、Ａｓｐ８７およびＡｓｐ８８のカルボキシレート側鎖、Ｌｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニルの酸素、および、２個の水分子が配位した、高い親和性のＣａ2+結合部位によって定義される（Ｋ．Ｒ．Ａｃｈａｒｙａ等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２１，５７１〜８１）。このタンパク質は、ＨＡＭＬＥＴにおいて、低いｐＨに晒されたりキレート化剤の存在によって強く結合したＣａ2+イオンが解離される際に観察されるいわゆるアポコンフォメーションをとる（Ｄ．Ａ．Ｄｏｌｇｉｋｈ等，（１９８１年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１３６，３１１〜５；Ｋ．Ｋｕｗａｊｉｍａ，（１９９６年）Ｆａｓｅｂ
Ｊ，１０，１０２〜０９）。
【００１１】
生物学的に活性な複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは、一般的に、コンフォメーション変化またはフォールディング変化と、脂質補因子の存在の両方を必要とする。コンフォメーション変化は、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンを除去することによって適切に影響を受ける。好ましい実施形態において、これは、機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミン変異体を用いることによって適切に促進できる。
【００１２】
このような変異体を含む生物学的に活性な複合体は、本発明で用いられるＨＡＭＬＥＴの用語「改変体」に含まれる。しかしながら、本出願人等は、複合体が一度形成されれば、機能的なカルシウム結合部位の存在、および／または、カルシウムの存在は、複合体の安定性または生物学的活性に影響を与えないことを見出した。生物学的に活性な複合体は、活性を失うことなくカルシウムに対する親和性を保持しつづけることがわかった。それゆえに、本発明の複合体は、カルシウムイオンをさらに含んでもよい。
【００１３】
従って、特に、本発明は、生物学的に活性な複合体を用い、この複合体は、アポフォールディング状態のα−ラクトアルブミンもしくはα−ラクトアルブミンの変異体、または、これらいずれかの断片、および、複合体を生物学的に活性な型に安定化する補因子を含み、α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体のあらゆる断片が、αドメインとβドメインとの境界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含む。
【００１４】
適切には、補因子は、シスＣ１８：１：９もしくはＣ１８：１：１１脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸である。
【００１５】
特定の有用な実施形態において、本発明で用いられる生物学的に活性な複合体は、
（ｉ）シスＣ１８：１：９もしくはＣ１８：１：１１脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸；および、
（ii）カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン、または、カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン変異体もしくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミン変異体；または、これらいずれかの断片を含み、あらゆる断片が、αドメインとβドメインとの境界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含む。
【００１６】
本発明で用いられる表現「変異体」は、基礎となるタンパク質に相同な、適切なヒトまたはウシα−ラクトアルブミンであるが、基礎となるタンパク質が生成される塩基配列とは異なり、その配列中の１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸置換は、アミノ酸が、概して類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換されている「保存的」な置換とみなしてよい。非保存的な置換とは、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置換されていることである。大まかに言えば、多くの非保存的な置換が、ポリペプチドの生物学的活性を変化させる可能性があると考えられる。適切な変異体は、少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、または、８５％同一であり、特に好ましくは９０％、９５％、または、９８％同一であり、または、それ以上の同一性を有し得る。
【００１７】
同一性の度合いを測定するためにアミノ酸配列を比較するには、ＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰ（いずれもウィスコンシン・ジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）のソフトウェアパッケージより）のようなプログラムがある。例えばＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適なアライメントを作製する。ＧＡＰは、配列をそれらの全長にそって並べることができ、いずれかの配列に必要に応じてスペースを挿入することにより最適なアライメントを見出す。配列の同一性を考察する際、本発明に関して適切には、全長にそった配列アライメントにより比較を行う。
【００１８】
用語「それらの断片」は、完全なα−ラクトアルブミンアミノ酸配列を含む複合体と類似の活性を有する複合体を形成し得る所定のアミノ酸配列のあらゆる部分を意味する。断片は、完全長タンパク質からの２以上の部分を一緒に結合したものを含んでもよい。このような部分は、適切には、基礎となる配列からの、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含み得る。適切な断片は、適切には、長さが少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む欠失突然変異体であり得る。欠失突然変異体は、上記タンパク質からの小さい領域、または、それらの組み合わせを含む。
【００１９】
αドメインとβドメインとの境界面を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいて、構造中、アミノ酸３４〜３８および８２〜８６に定められる。従って、適切な断片は、これら領域を含む可能性があり、好ましくは天然型タンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を含む。
【００２０】
特に好ましい実施形態において、生物学的に活性名複合体は、カルシウム結合部位が、カルシウムに対する親和性が減少するように、または、機能しないように改変されたα−ラクトアルブミンの変異体を含む。
【００２１】
ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７、および、Ｄ８８が配位していることがわかっている。従って、例えば１またはそれ以上の酸性残基を除去することにより、非ウシα−ラクトアルブミンにおけるこの部位またはそれと同等の部位を改変すれば、この部位のカルシウムに対する親和性を減少させることができ、または、機能を完全に失わせることができ、このタイプの突然変異体は、本発明の好ましい形態である。
【００２２】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、３10ヘリックスとαヘリックスとからなり、２つのヘリックスを分ける短いターン領域を有する（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）。この結合部位には、２個のジスルフィド架橋が両側にあり、それにより分子のこの部分がほとんど動かないようにしている。Ｃａ2+を配位させる７個の酸素のうち５個の基は、Ａｓｐ８２、８７および８８のカルボキシレート側鎖、または、Ｌｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニルの酸素に起因する。２個の水分子は、残りの２個の酸素を供給する（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）。
【００２３】
これまでに、８７位のアスパラギン酸のアラニンへの部位特異的変異誘発（Ｄ８７Ａ）が、強固なカルシウム結合部位を不活性化することが示されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）、突然変異タンパク質はアポコンフォメーションをとる。
【００２４】
それゆえに、特定の実施形態において、ウシα−ラクトアルブミンタンパク質配列中のアミノ酸第８７位のアスパラギン酸残基が、非酸性残基、特に非極性または極性非電荷側鎖に変異する。
【００２５】
非極性側鎖としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、または、システインが挙げられる。特に好ましい例はアラニンである。
【００２６】
極性非電荷側鎖としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、または、チロシンが挙げられる。
【００２７】
突然変異タンパク質の構造的な歪みを最小限にするために、Ｄ８７はまた、アスパラギン（Ｎ）で置換されており（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）、これは、カルボキシレート基の補われていない負電荷を欠くが、同じ側鎖の容積と配置を有する。この突然変異タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、低い親和性（Ｋ−ca2×１０5Ｍ-1）でカルシウムと結合することが示された（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。このような突然変異体は、本発明のさらに好ましい実施形態において、生物学的に活性な複合体の要素を形成する。
【００２８】
従って、本発明の複合体において使用するのに特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７ＡおよびＤ８７Ｎ変異体、または、この突然変異を含む断片である。
【００２９】
本分子のこの領域は、ウシタンパク質とヒトタンパク質とでは異なり、すなわち、ウシα−ラクトアルブミンにおいては、３つの塩基性アミノ酸のうち１つが（Ｒ７０）がＳ７０に変わっており、従って１つの配位側鎖が除去されている。それゆえに、本発明の複合体にウシα−ラクトアルブミンを使用する場合、Ｓ７０Ｒ突然変異体を使用することが好ましいといえる。
【００３０】
Ｃａ2+結合部位は、様々な種からのα−ラクトアルブミンにおいて１００％保存されており（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）、このタンパク質に関するこの機能の重要性を物語っている。Ｃａ2+結合部位は、５個の異なるアミノ酸と、２個の水分子が配位している。最初に、Ｄ８７のカルボキシレート側鎖が、Ｄ８８と共に、カルシウムイオンをカチオン結合領域にドッキングさせ、内部の水素結合が形成され、構造を安定化する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。Ｄ８７またはＤ８８のいずれかがないと、Ｃａ2+結合が損なわれ、分子が部分的にアンフォールドした状態で安定化されることが示された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。
【００３１】
さらに、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位に２つの異なる点突然変異を有する突然変異タンパク質を使用してもよい。例えば、８７位のアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ８７Ａ）は、総じてカルシウム結合を行わず、タンパク質の三次構造を崩壊させることがわかった。アスパラギン酸をアスパラギンで置換した場合、そのタンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、カルシウムを結合させたままであり（ただしより低い親和性で）、三次構造の崩壊を示したが、Ｄ８７Ａ突然変異体でみられるほど著しくはなかった（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。これら突然変異タンパク質は、充填容積において最小限の変化しか示さなかったが、これは、いずれのアミノ酸も同じ平均容積１２５Å3を有し、アスパラギンのカルボキシレート側鎖がタンパク質にカルシウムを配位させる（ただし非効率的に）ためである（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。いずれの突然変異タンパク質も、生理学的な温度でアポコンフォメーションで安定であったが、このコンフォメーション変化にも関わらず、これらは生物学的に不活性であった。従って、アポコンフォメーションへのコンフォメーション変化だけでは、生物学的活性を誘導するには不十分であることがわかる。
【００３２】
α−ラクトアルブミンの構造は、当業界で既知であり、本発明において述べられた残基の正確なアミノ酸のナンバリングは、例えば上述のＡｎｄｅｒｓｏｎ等や上述のＰｅｒｍｙａｋｏｖ等で示された構造を参照することにより確認することができる。
【００３３】
本発明に従って製造される医薬品は、適切には、局所的な使用に適した形態の、例えばクリーム、軟膏、ゲル、または、水性または油性の溶液もしくは懸濁液としての医薬組成物である。これらは、製薬上許容できる一般的に知られたキャリアー、充填剤、および／または添加剤を含んでもよい。
【００３４】
局所用溶液またはクリームは、適切には、タンパク質複合体のための乳化剤を、希釈剤またはクリーム基材と共にを含む。このような製剤は、パピローマに直接的に塗布することができる。
【００３５】
活性化合物の一日量は、標準的な臨床の実践に従って、患者や治療しようとするパピローマの性質などによって様々である。一般的な規則として、生物学的に活性な複合体は、局所投与で２〜２００ｍｇ／用量で用いられる。
【００３６】
本出願人等は、免疫応答可能な患者と免疫抑制患者の皮膚パピローマで、パピローマへの局所的ＨＡＭＬＥＴ処置の効果に関する３種の試験を行った。第一の試験は、二重盲検でプラセボ対照試験であり、プラセボ溶液（０.１５Ｍ  ＮａＣｌ）、または、ＨＡＭＬＥＴ（１０ｍｇ／ｍｌ，０.７ｍＭ，ＮａＣｌ溶液中）のいずれかを４２人の患者に投与することによって行われた。１日１回、３週間、１滴の物質をパピローマに局所的に塗布し、治療期間中、週１回、パピローマを測定し、撮影した。観察は、治療が終了した後１
〜２ヶ月の間、継続した。全ての患者は、第二のオープンＨＡＭＬＥＴ試験を同じ期間継続し、観察は、治療が終了した後１ヶ月継続した。第三のオープン試験は、１.８ｍＭ（２５ｍｇ／ｍｌ）ＨＡＭＬＥＴを用いて行われた。パピローマ容量が７５％以上減少すると、有効な治療と定義した。
【００３７】
以下で詳述するが、プラセボ対照試験において、ＨＡＭＬＥＴ０.７ｍＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）は、ＨＡＭＬＥＴ摂取患者（８８／９２パピローマ）の１００％（２０／２０）において有効を示し（ｐ＜０.００１）、一方で、プラセボ摂取患者（１５／７９パピローマ）の１５％（３／２０）において有効を示した。ＨＡＭＬＥＴ摂取患者（１９／９２パピローマ）の４５％（９／２０）、および、プラセボ摂取患者（１１／７４パピローマ）の１５％（３／２０）において、治療期間中または治療の１ヶ月後にパピローマが完全に消失した。第二のオープンＨＡＭＬＥＴ試験では、患者の６８％（２３／３４）において有効が観察された（ｐ＜０.００１）。患者の２９％（１０／３４）のパピローマが、治療期間中または治療の１ヵ月後に完全に消失した（１８／１３９）。１.８ｍＭ（２５ｍｇ／ｍｌ）ＨＡＭＬＥＴを用いた第三のオープン試験において、患者の７０％（７／１０）、および、それらのパピローマの６６％（２１／３２）において有効が示された（ｐ＜０.００１）。患者の１０％（１／１０）のパピローマが、治療期間中または治療の１ヵ月後に完全に消失した（１／３２）。逆の反応はみられなかった。
【００３８】
免疫系の状態がＨＡＭＬＥＴ治療に影響があるかどうかを試験するために、免疫応答可能な患者および免疫抑制（免疫非応答）患者を試験に用いた。これらのグループ間での応答における有意差はみられなかった（ｐ＜０.００１）。同様に、ＨＡＭＬＥＴの効果は、患者の性には依存しなかった。
【００３９】
従って、ＨＡＭＬＥＴは、極めて有益なパピローマ治療であることが明白に示された。
【００４０】
本発明のさらなる形態において、パピローマの治療方法が提供され、本方法は、ＨＡＭＬＥＴもしくは生物学的に活性なその改変体、もしくは、これらのうちいずれかの生物学的に活性な断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物学的に活性な複合体を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【００４１】
生物学的に活性な複合体の好ましい例は上で説明した通りである。好ましくは生物学的に活性な複合体は、局所用組成物の形態（上で説明した通り）で投与される。
【実施例】
【００４２】
材料および方法
物質の製造と患者のランダム化
母乳のドナーは非喫煙者であり、ＨＡＭＬＥＴ製造の前にＨＩＶに関してスクリーニングされた。硫酸アンモニウム沈殿、続いてフェニル−セファロースクロマトグラフィー、および、サイズ排除クロマトグラフィーによって、α−ラクトアルブミンをヒトの乳汁から精製した。未熟児への投与に関する規則に従って、病院の乳汁バンクからの過剰の乳汁を用いた。文献で説明されたようにオレイン酸で調製したイオン交換クロマトグラフィーカラムで、野生型α−ラクトアルブミンからＨＡＭＬＥＴを得た。溶出分画を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
さらに、ＨＡＭＬＥＴを細菌のコンタミネーションに関してスクリーニングし、乾燥物質として−２０℃で保存した。
【００４３】
患者
難治性のパピローマの病歴を有する患者を、局所的ＨＡＭＬＥＴ治療のプラセボ対照試験に用いた。大多数が免疫応答性であり（ｎ＝３１）、その他の病気には罹っていなかっ
た。１１人の患者は、臓器移植（ｎ＝７）、全身性エリテマトーデス（ｎ＝１）、または、シェーグレン症候群（ｎ＝１）後の免疫抑制であり、および、２人は、低γ−グロブリン血症を有していた。
【００４４】
平均年齢２２.５歳（６〜６０の範囲）の２７人の女性（６４％）、および、１５人の男性（３６％）が参加した。ほとんどの病変は、サリチル酸または寒冷療法に対して反応を示さなかった。診断は、経験を積んだ皮膚科医による目視検査に基づく。対象となるパピローマ（ｎ＝１７３）は、結節性または扁平であり、手、前腕または足に局在していた。ほとんどの患者は、複数の病変を有していた（平均ｎ＝４，１〜９の範囲）。
【００４５】
患者をＨＡＭＬＥＴグループまたはプラセボグループにランダム化した。登録時、（治療期間の）３週間の間毎週、および治療が完了した１ヶ月後、パピローマは、検査、測定、撮影された。１滴のＨＡＭＬＥＴまたはプラセボ（０.１５Ｍ  ＮａＣｌ）を、１日１回、局所的に障害に塗布し、障害をコムフィール（Ｃｏｍｆｅｅｌ(R)）（コロプラスト（Ｃｏｌｏｐｌａｓｔ）ＡＢ，スウェーデン）とマイクロポアテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ  ｔａｐｅ）（３Ｍヘルスケア，ミネソタ州，米国）で覆った。治療期間中に病変を切り取ったりひっかいたりした患者は分析からはずした。全ての患者において試験が完了した際に、コードは破棄した。
【００４６】
分析
スチューデントのｔ検定とＣｈｉ２検定でグループを比較した。
【００４７】
結果：
ＨＡＭＬＥＴはパピローマに対して治療効果を有する
プラセボ対照試験において、ＨＡＭＬＥＴは、パピローマに顕著な効果を示した。ＨＡＭＬＥＴの局所塗布は、プラセボ対照グループと比べて、皮膚パピローマ容量の顕著な減少を示した。その効果は、治療完了後の１ヶ月以内に記録された最も低い病変容量として評価された。全てのＨＡＭＬＥＴ処置患者は、病変容量の減少を示し、結果的な平均残存容量は１４％（０〜３３％の範囲）であった。全てのＨＡＭＬＥＴ処置患者（２０／２０患者）で、および、それらの病変の９６％（８８／９２）で、７５％以上の減少が記録された。１以上の病変の完全な消失が患者の１５％（３／２０）において、および、彼等の病変の２１％において、記録された。
【００４８】
それに対して、プラセボ対照グループにおいては、病変容量の顕著な減少は記録されなかった。平均残存病変容量は、８１％（０〜７４％の範囲）であり、病変の２０％（１５／７４）において７５％以上の減少が記録された。１以上の病変の完全な消失が患者の１５％（３／２０）において、および病変の１５％（１１／７４）において、観察された。
【００４９】
ＨＡＭＬＥＴの効果は、患者の性および免疫状態に非依存的であった。ＨＡＭＬＥＴを摂取した４人の免疫抑制患者は、病変の大きさの顕著な減少を示し（７５％以上）、そのうち３人において、少なくとも１の病変が消失した。それに対して、プラセボグループの５人の免疫抑制患者は、病変の大きさの減少は示さなかった。ＨＡＭＬＥＴは、全ての女性および男性において顕著な減少を引き起こし、一方、１４人の女性のうち８人、および、６人の男性のうち１人において完全な消失が観察された。
【００５０】
ＨＡＭＬＥＴの効果はまた、位置および病変の特徴に非依存的であった。ＨＡＭＬＥＴ治療は、９６％（７６／７９）において結節性病変の病変容量を７５％以上減少させ、２４％（１９／７９）において消失させた。同様に、ＨＡＭＬＥＴ治療は、９２％（１２／１３）において扁平パピローマの容量を減少させたが、消失させなかった。手の病変容量は、９７％（６６／６８）において顕著に減少し、２４％（１６／６８）において病変が消失した。同様に、足の病変は、９２％（２２／２４）において減少し、１３％（３／２４）において病変が消失した。
【００５１】
さらなるオープン試験
上記と同じプロトコルを用いたオープン試験に、１０人の新しい患者を補充した。５人の患者は免疫応答性であり、残りの５人は免疫抑制であった。８人が女性（８０％）であり、２人が男性（２０％）であり、平均年齢は４７歳（１１〜５７の範囲）であった。含まれるパピローマ（ｎ＝３２）は、結節性（ｎ＝２７）または扁平であり、手（ｎ＝２７）または足に存在していた。ほとんどの患者は、複数の病変を有していた（平均ｎ＝３，１〜７の範囲）。
【００５２】
この試験においてＨＡＭＬＥＴの効果を記録した。患者は、１.８ｍＭ  ＨＡＭＬＥＴを投与された。これにより、患者の７／１０、および、それらの病変の６６％（２１／３２）において、病変容量の顕著な減少が引き起こされた。患者の１０％（１／１０）、全ての病変の３％（１／３２）において、少なくとも１の病変が完全に消失した。
【国際調査報告】
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