(57)【要約】本発明はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ2の活性、例えば酵素活性および発現を低下させる方法を含む。さらに本発明はそのような活性を低下させるのに有用な化合物を同定する方法、およびそのような化合物を投与することにより虚血損傷を減少させる方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MK2の活性を低下させる化合物を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の虚血性損傷を減少させる方法。
【請求項２】
該活性がMK2発現である請求項1記載の方法。
【請求項３】
虚血性損傷が脳虚血、心筋虚血、および重大な四肢の虚血からなる群から選ばれる請求項1記載の方法。
【請求項４】
該化合物がMK2の転写を阻害する請求項1記載の方法。
【請求項５】
該化合物がアンチセンス核酸である請求項4記載の方法。
【請求項６】
該アンチセンス核酸分子が少なくとも10ヌクレオチドを含み、その配列がMK2ポリペプチドをコードするmRNAと相補性である請求項5記載の方法。
【請求項７】
該アンチセンス核酸がDNAであり、該DNAの転写がMK2ポリペプチドをコードするmRNAと相補性の核酸生成物を生じる請求項5記載の方法。
【請求項８】
該化合物がMK2と機能的に連結している制御配列と結合している請求項1記載の方法。
【請求項９】
MK2発現阻害剤を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の虚血性損傷を減少させる方法。
【請求項１０】
MK2の活性を低下させる化合物を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の虚血性損傷を減少させる方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む細胞中のMK2発現を阻害する化合物を同定する方法：
(a) MK2を発現する細胞を得、
(b) 被検化合物存在下で該細胞を培養し、
(c) 該細胞中のMK2の発現レベルを検出する
(ここで、被検化合物の非存在下の発現レベルに比べた該被検化合物存在下の該発現レベルの低下は該被検化合物が該細胞中のMK2の発現を阻害することを示す。)。
【請求項１２】
請求項11記載の方法により同定される化合物。
【請求項１３】
MK2アンタゴンストである請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
(a) MK2発現細胞を得、
(b) 該MK2発現細胞を被検化合物と接触させ、
(c) 該被検化合物がMK2の活性を調節するか否かを決定することを含む
MK2の活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ。
【請求項１５】
細胞ベースのアッセイである請求項14記載のアッセイ。
【請求項１６】
無細胞アッセイである請求項14記載のアッセイ。
【請求項１７】
該無細胞アッセイがリガンド結合アッセイである請求項16記載のアッセイ。
【請求項１８】
該被検化合物がMK2の活性を調節する請求項14記載のアッセイ。
【請求項１９】
該被検化合物がMK2アンタゴンストである請求項14記載のアッセイ。
【請求項２０】
該被検化合物がMK2アゴニストである請求項14記載のアッセイ。
【請求項２１】
該被検化合物がMK2と結合する請求項14記載のアッセイ。
【請求項２２】
虚血性損傷の治療に有用な化合物を同定するための請求項14記載のアッセイ。
【請求項２３】
請求項14記載のアッセイにより同定される化合物。
【請求項２４】
MK2アンタゴンストである請求項23記載の化合物。
【請求項２５】
虚血性損傷の治療方法であって、治療的有効量の請求項23記載の化合物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２６】
(a) 虚血性損傷を受けた患者を同定し、
(b) 該患者に治療的有効量のMK2モジュレーターを投与することを含む虚血性損傷の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は2002年8月23日出願の米国仮出願第60/405,586号の利益を主張し、その内容は本明細書の一部を構成する。
【０００２】
本発明は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2の活性例えば酵素活性および発現を低下させる方法を含む。特に、本発明はそのような活性を低下させるのに有用な化合物を同定する方法、および該化合物を投与することにより虚血性損傷を減少させる(緩和する)方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
3つのマイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼファミリーには、細胞外調節キナーゼ(ERK)、c-jun N末端キナーゼ/ストレス活性化プロテインキナーゼ(JNK/SAPK)およびp38 MAPキナーゼが含まれる。これらMAPキナーゼは種々の細胞機能、例えば細胞増殖、分化、および生存に関与している(Cano, E. and Mahadevan, L. C. Trends Biochem. Sci. 20: 117-122(1995))。
【０００４】
p38経路はTNF-αの産生に重要であることが知られており、既存のp38阻害剤のSB203580はTNF生成物をブロックし、急性および慢性炎症ならびに卒中および心筋梗塞の動物モデルで活性がある。MAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2(「MK2」)はストレス刺激に応じたp38 MAPキナーゼによる直接リン酸化を介してのみ調節される種々のキナーゼの一つであり、MK2はp38 MAPキナーゼシグナリング経路の即下流キナーゼである。MK2欠損マウスは腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターフェロン(IFN)-γ、インターロイキン(IL)-1、IL-6および酸化窒素の細菌リポ多糖(LPS)誘導生合成の低下を示し(Kotlyarovら、Nat. Cell Biol. 1: 94-97 (1999))、炎症性サイトカイン産生におけるMK2の重要な役割を示唆する。
【０００５】
虚血は臓器または組織に対する血液供給障害により生じる局所的貧血である。例えば、心筋虚血は、血液の心筋への不適切な循環により、通常、冠状動脈疾患の結果として生じる。
【０００６】
脳虚血は、虚血脳組織における酸素およびグルコースの欠乏を生じる脳への血液供給の減少により生じる、最終的に細胞死(壊死およびアポトーシス)および炎症を生じる病的状態である(Wang, X. K. and Feuerstein, G. Z., Drug News Perspect. 13: 133-140 (2000))。ERK、JNK、およびp38 MAPキナーゼの同時活性化は、アレチネズミおよびラットの一過性脳虚血モデルで報告されており(Suginoら、J. Neurosci 20: 4506-4514 (2000); Irvingら、Mol. Brain Res. 77: 65-75 (2000))、ある種のMAPキナーゼが脳虚血性損傷に関与している。
例えば、選択的MEK1阻害剤によるERK1/2の阻害はマウスにおける一過性脳虚血後の有意な神経保護を示した(Alessandriniら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96: 12866-12869 (1999); Wangら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 869-874 (2001) )。p38 MAPキナーゼの阻害はラットの中脳動脈の永久閉塞(MCAO)後の脳損傷および神経学的欠損を減少させた(Baroneら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 296: 312-321 (2001)。しかしながら、p38の阻害は炎症性(proinflammatory)サイトカイン(TNF-αおよびIL-1β)の低下および望ましくない抗炎症性サイトカイン(IL-10)の減少をもたらす。
【０００７】
したがって、虚血の有害作用を低下させるのに有用な虚血に関連した標的の活性を調節するのに有用な化合物を同定する必要がある。本発明はそのような要求に叶うことを目指すものである。
(発明の要約)
【０００８】
本発明はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2の活性例えば酵素活性および発現を低下させる方法を含む。特に、本発明は該活性を低下させるのに有用な化合物を同定する方法、および該化合物の投与により虚血性損傷を減少させる方法を含む。
【０００９】
ある局面において、本発明はMK2の活性例えば酵素活性および発現を低下させる化合物を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の虚血性損傷を減少させる方法を含む。虚血性損傷は例えば脳虚血、心筋虚血、または重大な四肢の虚血であってよい。
【００１０】
別の局面において本発明は(a)虚血性損傷を受けた哺乳動物を同定し、(b)MK2の発現を低下させる化合物を哺乳動物に導入する工程を含む哺乳動物の虚血性損傷を減少させる方法を含む。該化合物はMK2の転写を阻害し、MK2と機能的に(operably)連結した制御配列と結合することができよう。該化合物は、配列がMK2ポリペプチドをコードするmRNAと相補性である少なくとも10ヌクレオチドを含むことがあるアンチセンス核酸であってよい。該アンチセンス核酸は、DNAの転写がMK2ポリペプチドをコードするmRNAと相補性の核酸生成物をもたらすDNAであるかもしれない。
【００１１】
別の局面において、本発明はMK2(例えばmRNAおよびタンパク質)発現の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の虚血性損傷を低下させる方法を含む。
【００１２】
別の局面において、本発明はMK2の活性を低下させる化合物を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の虚血性損傷を低下させる方法を含む。
【００１３】
別の局面において、本発明は以下の工程を含む細胞におけるMK2の発現を阻害する化合物を同定する方法を含む：(a)MK2を発現する細胞を得、(b)被検化合物の存在下で細胞を培養し、(c)細胞中のMK2の発現レベルを測定する(ここで、被検化合物存在下の発現レベルの該化合物非存在下の発現レベルに比べての低下は該被検化合物が細胞中のMK2の発現を阻害することを示す)。本発明は該方法により同定されるMK2アンタゴニストのような化合物も含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は(a)MK2発現細胞を得、(b)MK2発現細胞と被検化合物を接触させ、(c)該化合物がMK2の活性を調節するか否かを測定することを含むMK2の活性を調節する化合物を同定するためのアッセイを含む。該アッセイは細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイであってよい。無細胞アッセイはリガンド結合アッセイであってよい。被検化合物はMK2の活性を調節することができ、MK2アンタゴンストまたはMK2アゴニストであってよい。また、被検該化合物はMK2と結合することができよう。該アッセイは虚血性損傷の治療に有用な化合物を同定するためのものであってよい。本発明は該アッセイにより同定されるMK2アンタゴンストのような化合物も含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は虚血性損傷の治療方法であって上記アッセイにより同定された化合物の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法を含む。
【００１６】
別の局面において、本発明は(a)虚血性損傷を受けた患者を同定し、(b)治療的有効量のMK2モジュレーターを患者に投与することを含む虚血性損傷の治療方法を含む。
(図面の簡単な説明)
【００１７】
図1は一過性および永久MCAO後のMK2-/-および野生型マウスの梗塞サイズを示す。
図2はMK2-/-および野生型マウスにおける神経学的欠損に対する一過性MCAOの効果を示す。
図3は一過性MCAO後のMK2-/-および野生型マウスにおけるIL-1βおよびTNFαのmRNA発現を示す。
図4はMK2-/-および野生型マウスにおける一過性および永久MCAO後のIL-1βの発現レベルを示す。
図5AはMCAO後のMK2-/-および野生型マウスの脳中の活性カスパーゼ-3(p20)の発現を示す。
図5BはMCAO後のMK2-/-および野生型マウスの脳中のDNA断片化を示す。
(発明の詳細な説明)
【００１８】
本発明はMK2の活性例えば酵素活性および発現を調節することにより虚血(例えば脳虚血)を減少させる方法を含む。本発明において「虚血を減少させる」とは、限定されるものではないが組織または臓器への血液供給の減少、該組織または臓器に対する酸素およびグルコースの欠乏、細胞死(壊死およびアポトーシス)、および炎症を含む通常虚血に関連する症状のあらゆる改善を意味する。本発明において遺伝的にMK2が欠損したマウスを用いて中脳動脈閉塞(「MCAO」)により誘導された一過性および永久限局性卒中における虚血、特に脳虚血に対するMK2の効果を確認した。組織学的および機能的変数を炎症およびアポトーシスの生化学的マーカーとともに検討した。
【００１９】
本発明において、MK2は公表されたMK2配列を含む。単に例示として、本発明において有用なMK2は表2に示すGenbank受託番号NP 004750により同定されるアミノ酸配列を有するアイソフォーム1タンパク質をコードする表1に記載のGenbank受託番号NM 004759により同定される核酸配列を有する転写変異体1であるかもしれない。
表1
MK2変異体1のヌクレオチド配列：Genbank受託番号NM 004759
【００２０】
【表１】
2006502142.tif 000002
【００２１】
【表２】
2006502142.tif 000003
(配列番号1)
表2
MK2アイソフォーム1のアミノ酸配列：Genbank受託番号NP 004750
【００２２】
【表３】
2006502142.tif 000004
(配列番号2)
【００２３】
単に例示として、本発明において有用なMK2は表4に記載のGenbank受託番号NP 116584により同定されるアミノ酸配列を有するアイソフォーム2タンパク質をコードする表3に記載のGenbank受託番号NM 032960により同定される核酸配列を有する転写変異体2であるかもしれない。
表3
MK2変異体2のヌクレオチド配列：Genbank受託番号NM 032960
【００２４】
【表４】
2006502142.tif 000005
(配列番号3)
表4
MK2アイソフォーム2のアミノ酸配列：Genbank受託番号NP 116584
【００２５】
【表５】
2006502142.tif 000006
(配列番号4)
【００２６】
転写変異体1はその3’領域に内部断片を含み、変異体2に比べて上流翻訳終止コドンを含む。すなわち、変異体1によりコードされるアイソフォーム1はアイソフォーム2とC末端が異なる。
【００２７】
当業者は、本発明に用いるのに適したMK2が望ましくはネズミまたはヒト由来であるが、あらゆる適切な生物由来のMK2を含んでよいことを認識するであろう。これら生物のタンパク質およびゲノム配列はGenbankまたはThe National Center for Biotechnology Informationを介して容易に入手できる。本発明で用いる「MK2活性」には限定されるものではないがMK2酵素活性例えばキナーゼ活性および細胞におけるMK2の発現を含む。
【００２８】
さらに、MK2の誘導体および相同物を本発明に用いることができよう。例えば本発明のMK2をコードする核酸配列はMK2の機能的に等価な保存的変異体をもたらす置換、付加、または欠失により変化させることができよう。例えば、配列内の1またはそれ以上のアミノ酸残基は、例えば正に荷電したアミノ酸(アルギニン、リジン、およびヒスチジン)、負に荷電したアミノ酸(アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩)、極性中性アミノ酸、および非極性アミノ酸のような同様の特性の別のアミノ酸により置換することができる。
【００２９】
他の保存的アミノ酸置換は以下の表5から選ぶことができる。
表5
保存的アミノ酸置換
【００３０】
【表６】
2006502142.tif 000007
【００３１】
本発明内の他の類似体にはタンパク質の安定性が増大する修飾を有するものがあり、そのような類似体は例えばタンパク質配列内に1またはそれ以上の非ペプチド結合(ペプチド結合を置換する)を含むかもしれない。また、天然のL-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸または非天然または合成アミノ酸、例えばβまたはγアミノ酸を含む類似体も含まれる。
【００３２】
本発明に用いるMK2は例えばリン酸化、硫酸化、アシル化、および他のタンパク質修飾により修飾することができよう。該MK2は、限定されるものではないが放射性同位元素および蛍光化合物を含む検出可能なシグナルを直接または間接的に得ることができる標識で修飾してもよい。
【００３３】
常套的スクリーニングアッセイを本発明の方法に用いてMK2モジュレーターを同定してよいことは当業者に明らかであろう。
【００３４】
単に例示として、本発明に用いるのに適したアッセイにはin-gel(インゲル)キナーゼアッセイおよびin vitroキナーゼアッセイ、例えば下記「材料と方法」に記載のものが含まれる。これらアッセイは潜在的MK2調節化合物のスクリーニングに有用である。さらに、MK2活性に影響を及ぼすことがわかった化合物は、そのような化合物のin vivo活性を試験するために適切な動物モデルに導入することができよう。種々のMK2の下流標的はMK2によりリン酸化および制御されることが報告されており、そのようなアッセイに有用である。これら標的には熱ショックタンパク質27(Rouseら、Cell 78: 1027-1037 (1994))、リンパ球特異的タンパク質1(Huangら、J. Biol. Chem. 272: 17-19 (1997))、チロシンヒドロキシラーゼ(Thomasら、Eur. J. Biochem. 247: 1180-1189 (1997))、および5-リポキシゲナーゼ(Werzら、J. Biol. Chem. 277: 14793-14800 (2002))が含まれる。
【００３５】
本発明において、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、望ましい活性、例えば本発明のMK2に対するリガンドの結合を検出するための条件下で遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローンし、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換し、遺伝子を発現させることが含まれよう。当該分野で知られた技術は例えばランダム突然変異技術により作製した多数の配列をスクリーニングするための高処理能力(throughput)分析に従う。高処理能力アッセイに次いでさらに例えば当業者がアゴニストをアンタゴニストから識別するのを可能にする生物活性を同定するための二次スクリーニングを行うことができる。用いる二次スクリーニングの種類は試験する必要がある望ましい活性に依存するであろう。
【００３６】
本発明は薬剤スクリーニングアッセイも提供する。本発明の精製および組換えMK2またはその断片を製造することにより当業者はこれらを用いてMK2の細胞シグナリングにおいて正常な細胞機能または役割のアゴニストまたはアンタゴンストである薬剤をスクリーニングすることができる。ある局面において、該アッセイは本発明のMK2と天然のリガンドの結合を調節する化合物の能力を評価する。用語「調節する(modulating)」にはMK2活性の増強、衰退、活性化、または不活化が含まれる。MK2と結合し、その活性を調節することができるペプチド、タンパク質、低分子、および抗体を含む本発明のMK2に対するリガンドを同定するのに有用なアッセイが本発明に含まれる。種々のアッセイ形式を本発明に用いてよく、当業者に知られている。
【００３７】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムにおいて、一定期間に調査する化合物数を最大にするため高処理能力アッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質を用いるような無細胞系で行うアッセイは被検化合物が介在する分子標的の変化の急速な発現および比較的容易な検出を可能にするためにことができる一次スクリーニングとして好ましいことが多い。
【００３８】
上記のアッセイを用いて同定される化合物はMK2のアンタゴンストまたはアゴニストであり、MK2と結合し、MK2活性を調節することができよう。MK2と結合し、その活性を調節することができるペプチド、タンパク質、低分子、および抗体を含む本発明のMK2に対するリガンドは本発明に含まれる。これら化合物はMK2の活性の調節およびMK2関連障害の治療に有用である。
【００３９】
「MK2関連障害」は、MK2タンパク質が該障害または疾患の代謝経路に調節的役割を果たすあらゆる障害また病状を表す。本明細書で用いている用語「治療する」は患者の特定の障害の症状の改善、特定障害に関連する確認できる測定値の改善、または特定の免疫、炎症、または細胞反応の防止(予防)を表す。
【００４０】
より具体的には本発明のアッセイにより同定される化合物は血管閉塞、脳梗塞、卒中、および関連脳血管疾患(脳血管傷害および一過性虚血発作を含む)から生じる虚血を含む虚血の治療に有用である。したがって、該化合物を用いて心筋梗塞、冠状動脈疾患、非Q波MI、鬱血性心不全、心室肥大、心不整脈、不安定狭心症、慢性安定狭心症、Prinzmetal狭心症、高血圧、間欠性跛行、無症候性虚血、および末梢性閉塞性動脈疾患(例えば、末梢動脈疾患、重大な四肢の虚血、例えば重篤な脚の虚血、切断の予防、および心血管病状、例えばMI、卒中または死亡の予防)を治療することができよう。
【００４１】
さらに、虚血の治療におけるその活性を考慮して本発明に従って同定した化合物は、血栓症、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、および血栓性または血栓塞栓性症状、または以下の1またはそれ以上に関連し、および/またはそれにより生じる結果を治療することができよう：血栓塞栓性卒中(心房細動、または心室もしくは大動脈壁血栓から生じるものを含む)、静脈血栓症（深部静脈血栓症を含む）、動脈血栓症、脳血栓症、肺塞栓症、脳塞栓症、血栓性素因（例えば、第V因子変異分子(R506Q)(Factor Ｖ Leiden)またはホモシスチン血症(homocystinenimia)、凝固症候群および凝固障害（例えば、汎発性血管内凝固）、再狭窄（例えば、内因性および外因性に生じた動脈損傷後）、心房細動および心室肥大（拡張型心筋症および心不全を含む）。
【００４２】
本発明により同定された化合物は、アテローム硬化性疾患および障害、例えばアテローム硬化性血管疾患、アテローム斑破裂、アテローム斑形成、移植性アテローム性動脈硬化症、および血管再形成アテローム性動脈硬化症の症状または結果を治療するのに用いることができよう。
【００４３】
本発明により同定された化合物は、さらに癌、手術、炎症、全身感染、人工表面（例えばステント、および血液酸素付加装置、シャント、血管アクセス・ポート、血管移植片、人工弁など）、インターベンショナル循環器科、例えば経皮経管冠動脈形成(PTCA)、不動（immobility)、薬物療法（例えば経口避妊薬、ホルモン補充療法およびヘパリン）、妊娠および胎児死(fetal loss)、および網膜症、ネフロパシーおよびニューロパシーを含む糖尿病の合併症に関連した血栓性または血栓塞栓性病状の症状または結果を治療するのに用いることができよう。
【００４４】
本発明により同定された化合物は、組織の保存、例えば臓器移植および外科的操作に関連した組織の保存に用いることもできよう。該化合物は、虚血病状に関連する他の組織または筋肉における疾患または障害の治療、および/または組織および筋肉の強度または安定性の増強に用いることができよう。例えば、該化合物は、筋細胞損害および壊死の治療および/またはスポーツ選手の能力の増強に用いることができよう。
【００４５】
本発明により同定された化合物で治療することができるさらなる疾患および障害は、脳虚血、例えば脳梗塞、脳水腫などに関連したCNS障害を含む。本発明により同定された化合物は、アルツハイマー病のような神経外傷および神経学的疾患の治療に用いることもできよう。
【００４６】
MK2モジュレーターとして働く化合物は生(raw)化学薬品として治療的使用のために投与し、または医薬製剤の活性成分であるかもしれない。本発明のかかる製剤は下記の他の治療剤を含み、例えば、医薬製剤の分野でよく知られているような技術にしたがって所望の投与方法に適したタイプの医薬的添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、保存料、安定化剤、香味料など）ならびに従来の固体または液体ビークルまたは希釈剤を使用することにより製剤化することができよう。
【００４７】
本発明の化合物は、あらゆる適切な手段により、例えば経口的に、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤または粉末剤の形で；舌下に；バッカルで；非経口的に、例えば皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内注射もしくは注入技術(例えば無菌注射用水性または非水性溶液剤またはサスペンジョン剤)；経鼻的、例えば吸入スプレーにより；局所的に例えばクリームまたは軟膏の形で；または直腸内に例えば坐剤の形で；無毒性の医薬的に許容されるビークルまたは希釈剤を含む用量単位製剤で投与することができよう。
【００４８】
該化合物は、例えば即時放出または持続放出に適した形で投与することができよう。即時放出または持続放出は、本発明の化合物を含む適切な医薬組成物の使用、または特に持続放出の場合は皮下インプラントまたは浸透圧ポンプのような装置の使用によって達成されるかもしれない。本発明の化合物はリポソームで投与することもできよう。
【００４９】
経口投与用の典型的な組成物は、例えばバルクを与えるための微晶質セルロール、懸濁化剤としてアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロース、および当該分野で知られているような甘味料または香味料を含むかもしれないサスペンジョン剤；ならびに例えば微晶質セルロース、リン酸2カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび/またはラクトース、および/または当該分野で知られているような他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、および潤滑剤を含むかもしれない即時放出錠剤を含む。
【００５０】
本発明の化合物は、舌下および/またはバッカル投与により口腔を介して供給することもできよう。成形錠剤、圧縮錠剤または冷凍乾燥錠剤が用いられるかもしれない典型的な形である。典型的な組成物は、本発明化合物をマンニトール、ラクトース、ショ糖および/またはシクロデキストリンのような速く溶解する希釈剤とともに製剤化するものを含む。
【００５１】
そのような製剤にはセルロース（アビセル）またはポリエチレングリコール(PEG)のような高分子量賦形剤も含むことができよう。該製剤は、粘膜への付着を助ける賦形剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ナトリウムカルボキシメチルセルロース(SCMC)、無水マレイン酸共重合体（例えばGantrez)、ならびに放出を制御する薬剤、例えばポリアクリル酸共重合体(例えばCarbopol 934)も含んでいてよい。潤滑剤、流動促進剤、香味料、着色料、および安定化装置も製造および使用し容易さのために加えられるかもしれない。
【００５２】
鼻エアロゾルまたは吸入投与用の典型的な組成物には、例えばベンジルアルコールまたは他の適切な保存料、生物学的利用能を増強する吸収促進剤、および/または当該分野で知られているような他の可溶化もしくは分散剤を含んでいてよい生理食塩水中の溶液剤が含まれる。
【００５３】
非経口投与用の典型的な組成物には、例えば適切な無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えばマンニトール、1,3-ブタンジオール、水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液、または合成モノまたはジグリセリドおよびオレイン酸を含む脂肪酸を含む他の適切な分散もしくは湿潤および懸濁化剤を含んでいてよい注射用溶液剤またはサスペンジョン剤が含まれる。
【００５４】
直腸の投与用の典型的な組成物には、例えば常温で固体であるが、直腸腔内で液化および/または溶解して薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤、例えばカカオバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールを含んでいてよい坐薬が含まれる。
【００５５】
局所投与用の典型的な組成物は、Plastibase（ポリエチレンでゲル化した鉱油）のような局所用担体を含む。
【００５６】
本発明の化合物の有効量は当業者が決定してよく、活性化合物を１日当たり約0.1〜100mg/kg体重の成人に対する典型的投与量を含み、これを単用量または個々の分割用量の形で例えば1日当たり1〜4回投与することができよう。あらゆる特定の対象に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は変化してよく、用いる特定化合物の活性、該化合物の代謝安定性および作用の長さ、対象の種、年齢、体重、一般健康状態、性別および食生活、投与方法および時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、および特定病状の重症度を含む種々の因子に依存するだろう。好ましい治療対象には、MK2関連障害に罹患しやすい動物、最も好ましくは哺乳類種、例えばヒトおよび家畜、例えばイヌ、ネコなどが含まれる。
【００５７】
本発明の化合物は、単独でまたは互いにおよび/または虚血のようなMK2関連障害の治療に有用な他の適切な治療剤と組み合わせて用いることができよう。
【００５８】
別の局面において、本発明は「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用に関する。本明細書で用いている「アンチセンス」療法は細胞条件下で本発明のMK2をコードし、例えば転写および/または翻訳を阻害することによりコードされたタンパク質の発現を阻害するように細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体の投与またはin situ生成に関する。一般に、「アンチセンス」療法は当該分野で一般に用いる技術の範囲を表し、オリゴヌクレオチド配列との特異的結合に依存するあらゆる療法を含んでいる。
【００５９】
アンチセンス療法に有用な遺伝子構築物は、あらゆる生物学的に有効な担体、例えばin vitroで細胞に核酸配列を効果的に送達することができるあらゆる製剤もしくは組成物を用いて投与することができよう。アプローチには、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、およびヘルペスシンプレックスウイルス-1を含むウイルスベクター、または組換え細菌または真核性プラスミドに対象遺伝子を挿入することが含まれる。ウイルスベクターは直接細胞をトランスフェクションし、ウイルスベクターによる細胞感染の利点は標的細胞の大部分が核酸を受け取ることができることである。種々のウイルス送達系が当該分野で知られており、本発明を実施する者が利用することができる。
【００６０】
ウイルス伝達法に加えて非ウイルス的方法を用いることができよう。遺伝子導入のほとんどの非ウイルス的方法は、巨大分子の取り込みと細胞内輸送のために哺乳動物細胞が用いる正常メカニズムに依存する。このタイプの典型的な遺伝子送達系には、リポソーム誘導系、ポリリジンコンジュゲート、および人工的ウイルスエンベロープが含まれる。核酸配列は遺伝子構築物の直接注射またはエレクトロポーレーションにより細胞に導入することもできよう。
【００６１】
臨床的環境では、遺伝子送達系は当該分野で知られた多くのあらゆる方法により患者に導入することができる。例えば、遺伝子送達系の医薬的調製物は例えば静脈内注射により全身的に導入することができ、標的細胞におけるタンパク質の特定の形質導入は主として遺伝子送達ビークル、レセプター遺伝子の転写制御配列制御発現による細胞型または組織型発現、またはその組み合わせによりもたらされるトランスフェクションの特異性により生じる。
【００６２】
遺伝子療法構築物の医薬的調製物は本質的に許容される希釈剤中の遺伝子送達系からなるか、または遺伝子送達ビークルが組み込まれている徐放性マトリックスを含むことができる。あるいはまた、完全な遺伝子送達系を組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから完全に生成することができる場合、医薬調製物は遺伝子送達系を生成する１またはそれ以上の細胞を含むことができる。
【００６３】
以下の項に本発明および以下の実施例で用いる材料と方法を述べる。
材料および方法
１．略語
CBF=脳血流(量);
ERK=細胞外調節キナーゼ;
ECA=外総頚動脈;
ELISA=酵素免疫測定法;
ICA=内総頚動脈;
IL=インターロイキン;
LPS=リポ多糖;
JNK/SAPK=c-jun N末端キナーゼ／ストレス活性化プロテインキナーゼ;
MAP=マイトジェン活性化タンパク質;
MCA=中脳動脈;
MCAO=中脳動脈の閉塞;
MK2=MAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２;
PBS=リン酸緩衝生理食塩水;
TNF=腫瘍壊死因子;
TTC=2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド。
2. 限局性脳虚血
【００６４】
MK2-/-マウスは、Katlyarovら(Nat. Cell Biol. 1: 94-97 (1999))に記載の混合129v x C57BL/6バックグラウンドを有し、該コロニーをさらにCharles River Laboratories (Wilmington、MA 01887)で拡大させた。MK2-/-の遺伝子型別は以下のオリゴヌクレオチドを用いる3プライマーPCRを用いて行った：
5'-cgtgggggtggggtgacatgctggttgac (5'MK2) (配列番号5)
5'-ggtgtcaccttgacatcccggtgag (3'MK2) (配列番号6)
5'-tgctcgctcgatgcgatgtttcgc (Neo) (配列番号7)。
約500bpの破片長は野生体を示し、800bpは遺伝子破壊を表わす。
成熟MK2-/-およびC57BL/6マウス(18-22g、性別と体重を対にする、Charles River Laboratories、Wilmington、MA)を実験全体にわたって用いた。動物は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [DHEW (DHHS) Publication No. (NIH) 85-23、1996年改訂、Office of Science and Health Reports、DRR/NIH、Bethesda、MD 20205]に従って収容および飼育した。実験動物を用いる手順は、Institutional Animal Care and Use Committee of Bristol-Myers Squibb Companyにより承認された。
マウスは、30%酸素(0.3リットル/min; Airgas East, Inc.、Salem、NH))および70%亜酸化窒素(0.7リットル/min; Airgas East, Inc.、Salem、NH))の混合物からなるガス吸入により麻酔した。ガスは初期導入時3-4%イソフルラン(Hanna's Pharm Supply Co.、Wilmington、DE)および手術時1.5-2%を供給するように設定したイソフルラン気化器(VetEquip Inc.、Pleasanton、CA)を通過させた。そのような条件下で右総頚動脈領域の先端で皮膚を切開し、外総頚動脈(ECA)および内総頚動脈(ICA)の分岐部を確認した。ECAに小さな切開を施し、5-0モノフィラメント縫合糸(先端円形、長さ9-11mm)(Sherwood Medical、St. Louis、MO)をECAを介してICA中を通した。縫合糸を中脳動脈(MCA)に向かって進め、限局性の虚血を作製した。永久脳虚血の場合には、縫合糸を除去しなかったが一過性脳虚血ではMCAOの30分後に縫合糸を除去した。縫合糸を頚動脈に挿入しない以外は同じ手順を用いて疑似手術を行った。試験終了時に、マウスをガス吸入で麻酔し、前脳を各図の凡例に示すように虚血、再還流または疑似手術後種々の時間で取り出した。生化学分析については、同側および対側性の脳半球全体を解剖し、速やかに液体窒素で凍結し、後で使用するため-80℃で保存した。
【００６５】
梗塞の容積を測定するため、脳をMCAOの24時間後に取り出し、2mm厚の脳薄片を2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)(Sigma Co.、St. Louis、MO)染色を用いて評価した。染色した脳組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の10%ホルマリン(VWR Scientific Products、West Chester、PA)で固定した。画像をMicrotek ScanMaker 4 DUO Scanner (Micro Warehouse Lakewood、NJ)で取り込み、Image Pro Plus 4.1ソフトウエア(Media Cybernetics、Silver Spring、MD)を用いて定量した。
3. 神経学的欠損
【００６６】
神経学的欠損はZhangら(Brain Res. 766: 83-92 (1997))から適応および修飾した5ポイントスケールを用いてMCAO(n=10)後第1日および第3日に試験した。具体的には、神経学的欠損無し=0；右ホルナー症候群は1ポイントとカウントする；左前肢および後肢の伸長不全、各1ポイント；左に変化、1ポイント；および左に旋回、1ポイント。
4. 生理学的パラメーター
【００６７】
生理学的パラメーターは、上記ガス吸入およびペントバルビタール(50mg/kg、i.p.) (Abbott Laboratories、North Chicago、IL)の２つの麻酔条件下で測定し、確認した。任意に選択した動物において、局所的脳血流量(CBF)をレーザードップラー還流モニター(Laser Doppler Perfusion Monitor)(Moor Instruments Inc.、Wilmington、DE)を用いて測定した。麻酔後、右眼窩と外耳道の間の中間点で小切開を施した。側頭筋を収縮させ、下層にある筋膜を除去した。レーザードップラープローブを同側脳半球のブレグマの1.5mm後部、3.5mm側面に置いた。（あらゆる大血管を避けるため）CBFをMCAO中(15min)およびその前および後(30min)に注意深くモニターした。相対的CBFをMCAO前のレベルに対するパーセンテージとして計算した。
【００６８】
動脈血圧および心拍数を、MP100 Workstationを用い大腿動脈にチューブを接続することにより測定し、AcqKnowledge software (BIOPAC Systems, Inc、Santa Barbara、CA)を製造業者の仕様書に従って用いて分析した。大腿動脈血試料をPE-50チューブからi-STAT G3+カートリッジに直接回収してpH、酸素(pO2)および二酸化炭素(pCO2)を分析し、ポータブル臨床分析装置(Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)で処理した。
5. リアルタイムRT-PCR
【００６９】
全RNAを、RNA単離キット(Qiagen (Valencia、CA))を用い、一過性MCAOまたは偽手術後の、同側および対側性の頭脳組織(n=8)から単離した。リアルタイムRT-PCRのために用いるプライマーおよびプローブ（表6)をPrimer-Express 1.0ソフトウェア(PE Applied Biosystems (Foster City、CA))を用いて設計した。IL-1β、TNFα、およびハウスキーピング遺伝子、rpL32に対するPCRプライマーの特異性をTaqMan定量前にPerkin-Elmerサーモサイクラー(thermocycler)(Model 9600; Foster City、CA)を用いる標準的PCRプロトコールを用いて試験し、ゲル電気泳動により確認した。
【００７０】
PCRプライマー（F、フォワード；R、リバース）およびプローブをそれぞれマウスTNF-α（GenBank受託番号M13049）、IL-1β（GenBank受託番号M15131）およびrpL32(GenBank受託番号AK002353)cDNA配列にしたがって合成した。TaqManプローブはIL-1βおよびTNFαのために5’末端に6-FAM、およびrpL32のためにVICを含む。プローブはすべて３’末端にクエンチャー色素、6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン(TAMRA))を有する。
表６
リアルタイムPCRに用いたプライマーおよびTaqManプローブ
【００７１】
【表７】
2006502142.tif 000008
【００７２】
リアルタイムPCRは以下の変更を行ったWangら、(J. Neurosci. Res. 59: 238-246 (2000)の記載に従って行った。ワンステップRT-PCRをGibco BRL PLATINUM Taq System(GIBCO BRL、Grand Island、NY)を製造業者の仕様書に従って行った。反応は反応容量25μlに総RNA 0.5〜1μgで出発した。反応混合物は12.5μlの2x反応混合物、0.6μlの50mM MgSO4、0.125μlのRNase阻害剤、各0.5μlの10μMフォワードおよびリバースプライマー、0.5μlの5μMプローブ、および0.3μlのRT/Taq混合物を含んだ。混合物を50℃で30分間、95℃で5分間インキュベーションし、次いで95℃15秒および60℃60秒のPCRサイクル40サイクルを開始した。各RT-PCRをデュプリケートで同時に行った。データをSequence Detector V1.6.3プログラム (Perkin-Elmer)を用いて分析した。
6. IL-1βの酵素免疫測定法
【００７３】
同側および対側脳試料由来の組織溶解物(IL-1βのピーク発現についてMCAO後15時間、n>7)を液体窒素下、磁器乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。粉砕した脳組織を4℃で1時間、溶解用緩衝液(10mM Tris pH.8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF、1% Triton x-100)および5μl/mlのプロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma、P-8340)中でインキュベーションした。10,000gで10分間遠心した後、組織溶解物の上清を回収し、酵素免疫測定法(ELISA)およびBio-Rad DC Protein Assayキット(Bio-Rad、Hercules、CA)を用いるタンパク質濃度測定用に部分標本とした。脳組織中のIL-1βタンパク質レベルをマウスIL-1β用のELISAキット(Pierce Endogen、Rockford、IL)を製造業者の仕様書に従って用い測定した。組織抽出物(50μl)をELISA用に各ウェルに適用し、最終測定値をプレートリーダーを用い450nmで計測した。各試料中のIL-1βタンパク質の濃度を該キットを用い標準(組換えマウスIL-1βタンパク質)に従って測定した。測定したIL-1β濃度はすべて標準曲線の直線部分にあった。各試料をその総タンパク質濃度(mg)で正規化した。
7. ウエスタンブロット分析
【００７４】
ウエスタンブロット分析を用い、一過性MCAO後24時間におけるMK2-/-(n=8)および野生型(n=9)マウスにおける活性型カスパーゼ-3レベルを評価した。粉砕した脳組織を溶解し、先のIL-1βの酵素免疫測定法の項に記載のごとく処理した。組織溶解物の可溶性成分をWangら、Stroke 32: 1020-1027 (2001) (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz、CA)に記載のカスパーゼ-3に対するマウスモノクローナル抗体(sc-7272)を用いるウエスタンブロット(タンパク質100μg/レーン)に用いた。ブロットを剥離し(stripped)、ヤギポリクローナル抗アクチン抗体(sc-1616) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)に再プローブした。
8. アポトーシス分析
【００７５】
アポトーシスは、Cell Death Detection ELISAキット(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)を用い、一過性MCAO後24時間におけるMK2-/-(n=8)および野生型(n=9)におけるDNA断片化を定量することにより測定した。このサンドイッチ酵素免疫アッセイはDNAおよびヒストン両方に対するモノクローナル抗体を用いる光度反応に基づくヒストン関連DNA断片(モノおよびオリゴ-ヌクレオソーム)の定量的測定値をもたらす。凍結粉砕脳組織を該キットが提供する溶解用緩衝液を用いて溶解し(室温で30分間)、次いでペレットとした(200xg)。上清の部分標本を製造業者のプロトコールに従ってアッセイに用いた。
9. 統計分析
【００７６】
明細書および図中のデータは動物の示した数(N)についての平均±標準誤差である。統計的比較は分散分析(ANOVA; Fisherの保護最小二乗差(protected least squares difference))で行い、p<0.05の値を有意とみなした。
10. イン-ゲルキナーゼアッセイ
【００７７】
細胞0.5x106個に相当する全細胞溶解物およびMK2-IP(細胞2-5x106個に相当)を10% SDS/PAGEゲルにロードした。Mini Proteanシステム(Bio-Rad)を用い、分離ゲルは0.15mg/mlの精製組換えヒト5-LOまたはHSP25を含んでいた。電気泳動後、ゲルを緩衝液A [50mM Tris HCl (pH8)中の20%(vol/vol)イソプロピルアルコール]の60mlアリコート中でRTで5x10分間洗浄し、SDSを除去した。次に、ゲルを緩衝液B (50mM Tris-HCl、pH8/1mM DTT)の60mlアリコート中、室温で5x10分間洗浄した。ゲル中のタンパク質を緩衝液C (50mM Tris・HCl、pH8/20mM DTT/2mM EDTA/6Mグアニン・HCl)中、室温で1時間インキュベーションして変性させた。タンパク質を復元するためゲルを室温で10分間、60mlの緩衝液D (50mM Tris-HCl、pH8/1mM DTT/2mM EDTA/0.04% Tween 20)で1回洗浄し、次いで300mlの同じ緩衝液中で撹拌しながら一夜インキュベーションした。30mlのキナーゼ緩衝液(20mM Hepes、pH7.6/20mM MgCl2/25mMグリセロホスフェート/10mM 4-ニトロフェニルホスフェート/2mM DTT/0.2mM Na3VO4)中で室温で1時間プレインキュベーションした後、最後にゲルを50μM ATPおよび10μCi/ml [-32P]ATPを含むキナーゼ緩衝液10ml中で撹拌しながら30℃で1時間インキュベーションした。無反応[-32P]ATPを除去するためゲルを洗浄用緩衝液[1%(wt/vol)ピロリン酸ナトリウムおよび5%(wt/vol)トリクロロ酢酸]の50mlアリコートで数回緩衝液を交換しながら2日間洗浄し、次いで乾燥(真空下)させ、オートラジオグラフィーにかけた。
11. In Vitroキナーゼアッセイ
【００７８】
in vitroリン酸化のために精製組換え5-LOまたはHSP25(3μg)をATP(100μM)および[-32P]ATP(2μCi/ml)を含むキナーゼ緩衝液(25mM Hepes、pH7.5/25mM MgCl2/25mMグリセロホスフェート/2mM DTT/0.1mM Na3VO4)中で細胞溶解物由来の活性MK2またはMK2-IPとインキュベーションした。終量は20μlであり、インキュベーション時間は30℃で30分間であった。SDS-bを加え、95℃で6分間加熱して反応を止めた。試料をSDS/PAGE(「ウエスタンブロット」参照)で分離し、リン酸化タンパク質を乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化した。
【実施例】
【００７９】
上記材料および方法を用い、虚血脳損傷を一過性または永久MCAO後のMK2欠損および野生型マウスにおいて観察した。以下に示すように、虚血性脳損傷は野生型マウスに比べてMK2欠損マウスで有意に減少した。
【００８０】
脳虚血後のMK2-/-および野生型マウスにおける生理学的パラメーターを観察した。脳血流量、心拍数、動脈血圧、pH、血液酸素(pO2)および二酸化炭素(pCO2)を一過性MCAOの前および後のMK2-/-および野生型マウスにおいて測定した(表7)。マウスを30分間MCAOに付し、次いで再還流させた。生理学的データをMCAOの「前」(MCAOの前)、「中」(MCAO中」(MCAO後15分間)、および「後」(30分間再還流)に測定した。CBF、脳血流(%任意単位；MCAO前の相対任意単位を100%として示す)；HR、心拍数(/分)；MABP、平均動脈血圧(mmHg)。*野生型マウスに比べてp<0.05。
表7
MCAO後再還流野生型およびMK2-/-マウスの生理学的条件
【００８１】
【表８】
2006502142.tif 000009
【００８２】
MCAOの前および後でMK2-/-および野生型マウスの間でCBF、心拍数、および血液ガスに有意差はみられなかった。唯一の有意差は、再還流後30分間における野生型マウスに比べてMK2-/-マウスの平均動脈血圧の11%の増加であった(p<0.05;表7)、しかしながら、血圧のこの少しの増加はマウスの正常範囲内である。
【００８３】
MK2-/-は虚血脳損傷からの部分的防御をもたらすことがわかった。図1に示すように、MK2-/-マウスにおいて対になった野生型マウスに比べて梗塞サイズの有意な減少が一過性(64%減少、n=13、p<0.05)および永久(76%減少、n=10、p<0.01)MCAO後に観察された。虚血脳損傷に対するMK2-/-マウスの耐性は神経学的欠損の減少によっても裏付けられた(図2)。神経学的欠損は一過性MCAO後3日間まではMK2-/-マウスで有意に減少しなかった(野生型マウスに比べて34%減少、n=14、p<0.01)。その一方、神経学的欠損の有意の減少が永久MCAO後24時間で観察された(野生型マウスに比べてMK2-/-マウスで52%減少、n=10、p<0.01)(図2)。これらの動物は24時間で梗塞サイズ評価のために処理したので永久MCAO後の3日間神経学的欠損データは回収しなかった。
【００８４】
MCAO後のMK2-/-および野生型マウスの虚血脳におけるサイトカイン遺伝子発現を測定した。図3は一過性MCAO後12時間のMK2-/-および野生型マウスにおける2つの鍵となる炎症性サイトカイン、IL-1βおよびTNFαのmRNA発現を示す。野生型マウスにおいて同側(虚血)脳組織で対側脳組織より両サイトカインmRNAの有意な誘導が観察された(TNFαおよびIL-1βmRNAについてそれぞれ4.3および3.4倍)。しかしながら、MK2-/-マウスにおいて、MCAO後にTNFαmRNA(同側脳組織で3.6倍増加)でのみ有意な誘導がみられ、IL-1βmRNAではみられなかった(1.6倍増加)(図3)。虚血脳組織におけるIL-1βmRNAの発現レベルはMK2-/-マウスにおいて野生型マウスより有意に低かった(p<0.05、n=8)。
【００８５】
ELISA分析は、IL-1βの発現レベルが一過性および永久MCAO後15時間において虚血脳組織で野生型マウスの非虚血(対側)組織よりそれぞれ3.3倍(n=11、p<0.05)および7.9倍(n=7、p<0.01)増加したことを示した。そのmRNA誘導プロフィールと同様に脳虚血後のIL-1βの発現レベルはMK2-/-マウスで有意に低かった(図4)(すなわち、一過性および永久MCAO後の野生型マウスにおいてそれぞれ49%(n=9、p<0.05)および21%(n=8、p<0.05)のみ)。
【００８６】
MCAO後のMK2-/-および野生型マウスにおけるカスパーゼ-3活性化およびアポトーシスの比較分析を行った。MAPキナーゼは脳虚血損傷後の細胞の生存およびアポトーシスに関与するので、アポトーシスの鍵となるマーカー、すなわち、カスパーゼ-3の活性化(活性カスパーゼ-3の発現を評価)およびDNA断片化の評価を行った。ウエスタン分析を用いてMCAO後の脳における活性カスパーゼ-3(p20)の発現を検出した。虚血脳中の活性カスパーゼ-3レベルはMK2-/-および野生型両マウスでMCAO後24時間で有意に上昇し、対側組織よりそれぞれ1.8および2.0倍の増加を示した。しかしながら、これら2つの実験群で有意差はみられなかった(図5A)。
【００８７】
同様に、ELISA法を用いるDNA断片化の測定により評価したDNA断片化の3.9および4.3倍の増加が脳虚血後のそれぞれMK2-/-および野生型マウスに観察されたが、これら2つの群に有意差はみられなかった(図5B)。
考  察
【００８８】
上記実施例に示すように、虚血脳損傷は一過性または永久MCAO後においてMK2欠損マウスで野生型マウスに比べて有意に減少した。MK2欠損マウスは、正常条件下または卒中後において野生型動物に比べて種々の鍵となる血行動態、血液学的、および生化学的パラメーターに差がみられなかったが、それらはより小さな梗塞サイズおよび神経学的機能の改善により示されるように一過性および永久MCAOから防御された。卒中に対するMK2-/-マウスの相対的抵抗性は梗塞サイズの減少および運動機能の改善により明らかになった(図1および2)。
【００８９】
具体的には、限局性虚血にされたMK2-/-マウスは野生型マウスに比べて一過性および永久MCAO後の梗塞サイズがそれぞれ64%および76%顕著に減少した。さらにMK2-/-マウスでは神経学的欠損が有意に減少した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析では虚血損傷後の野生型動物よりMK2-/-マウスにおいてインターロイキン-1βmRNAの発現が有意に低いことがわかったが(53%減少)、腫瘍壊死因子mRNA発現の有意な低下はなかった。インターロイキン-1βの有意の減少は、酵素免疫測定法によりMK2-/-マウスでも確認された。MK2-/-マウスにおける虚血脳傷害からの顕著な神経防御作用は血行動態または全身的変数の変化、カスパーゼ-3の活性化、およびアポトーシスと関連しなかった。これらの結果は限局性虚血脳損傷におけるMAPキナーゼ経路の関与を示し、この作用が該虚血脳組織におけるインターロイキン-1βの発現と関連することを示す。
【００９０】
本発明を特定の態様について説明したが、本発明はさらに修飾することができ、本願が一般に本発明の原理に従い、本発明の技術分野内の既知の実施または慣行内にあり、先に記載の本質的特徴に適用され、特許請求の範囲の範囲内にある本明細書の開示からのそのような離脱を含む本発明のあらゆる変化、使用、または適応に及ぶことを意図することは理解されよう。本明細書に記載のすべての参考文献は本明細書の一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】一過性および永久MCAO後のMK2-/-および野生型マウスの梗塞サイズを示す。
【図２】MK2-/-および野生型マウスにおける神経学的欠損に対する一過性MCAOの効果を示す。
【図３】一過性MCAO後のMK2-/-および野生型マウスにおけるIL-1βおよびTNFαのmRNA発現を示す。
【図４】MK2-/-および野生型マウスにおける一過性および永久MCAO後のIL-1βの発現レベルを示す。
【図５】図5AはMCAO後のMK2-/-および野生型マウスの脳中の活性カスパーゼ-3(p20)の発現を示し、図5BはMCAO後のMK2-/-および野生型マウスの脳中のDNA断片化を示す。
【図１】
2006502142.tif 000010
【図２】
2006502142.tif 000011
【図３】
2006502142.tif 000012
【図４】
2006502142.tif 000013
【図５】
2006502142.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月26日(2005.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006502142000001.app
【国際調査報告】
2006502142.tif 000015