(57)【要約】開示されているのは二次元タンパク質分離方法である。それは、クロマトフォーカシングによりタンパク質サンプルを複数のアリコートに分離してから各アリコートを個別のキャピラリーチューブ中に充填し；そして多重化キャピラリー電気泳動により各アリコートを分離して分離されたタンパク質の二次元アレイを生成する。このシステムに好ましい統合緩衝液もまた開示されている。
2006519400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二次元タンパク質分離方法であって、
複数のタンパク質を含有すると推測される試験サンプルを取得すること；
該サンプルをクロマトフォーカシングシステムで処理して第1の分離されたタンパク質サンプルを生成すること；
その後、該第1の分離されたタンパク質試験サンプルの少なくとも一部分を多重化ゲル電気泳動で処理して第2の分離されたタンパク質サンプルを生成すること；
クロマトフォーカシングと多重化キャピラリー電気泳動との組合せデータから該サンプルのタンパク質の内容を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
クロマトフォーカシングと多重化キャピラリー電気泳動の両方で使用可能である好適な統合緩衝液で前記サンプルを緩衝化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液が、約214nmにおいて吸光度検出を行うように設定された多重化キャピラリー電気泳動システムに適合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
分離されたタンパク質サンプルを出力で生成するクロマトフォーカシングシステムとタンパク質サンプルを受け取る入力を有する多重化キャピラリー電気泳動システムとを含むタンパク質分離装置であって、
該分離されたタンパク質サンプルが該多重化キャピラリー電気泳動システムによりさらに分離されるように、該クロマトフォーカシングシステムからの出力が該多重化キャピラリー電気泳動システムへ入力される、前記タンパク質分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、タンパク質を二次元分離するためのクロマトフォーカシング・多重化キャピラリーゲル電気泳動システムおよびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
1つの分離技術だけを用いてタンパク質混合物を分離するのは困難なことがある。したがって、二次元分離または多次元分離がときどき使用される。二次元とは、1つの分離技術を用いてサンプル混合物が部分的に分離され(一次元で)、次に、第2の分離技術を用いてこの第1の分離からの出力がさらに分離される(第2の次元で)という事実に関連付けられる。次元の数は、利用する分離技術の数に等しい。分離分解能を最大化するために、第1の次元のサンプル分離を決定するサンプル特性は第2の次元のサンプル分離を決定する特性と異なっていなければならない。分離を決定するサンプル特性が両方の次元でまったく異なる場合、次元は直交すると言われる。このことが望ましいのは、それにより分離分解能が向上するからである。
【０００３】
二次元分離の例は、米国特許出願公開U.S. 2002/0033336 A1号中にLiuおよびLe Vanにより記載されている。第1の次元は高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)であり、第2の次元は複数の電気泳動カラムである。LiuおよびLe Vanはまた、第1の次元が等電点電気泳動であり、第2の次元がキャピラリーゲル電気泳動チャネルのアレイである分離を開示している。
【０００４】
二次元分離の他の例は、米国特許第6,013,165号中にWiktorowiczおよびRaysbergにより記載されている。発明の一実施形態では、第1の次元はサイズおよび電荷によりサンプルを分離するゲル電気泳動であり、第2の次元は等電点電気泳動である。
【０００５】
米国特許出願公開US 2002/0153252 A1号中において、Akinsは、第1の次元がカチオン性電気泳動であり、第2の次元が、変性電気泳動、タンパク質分解切断後電気泳動、等電点電気泳動、非平衡pHゲル電気泳動、または固定化pH勾配電気泳動のうちの1つである2次元システムのさらなる例を記載している。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、第1の次元としてクロマトフォーカシング(CF)および第2の次元として多重化キャピラリーゲル電気泳動(MCGE)を利用する直交二次元システムである。これらの2つの次元は、以上に記載の他の次元のいくつかとは異なり、完全に直交するので、より高度の分離分解能が得られる。
【０００７】
本発明者らには理由は十分にはわからないが、これまで2つの次元としてCFとMCGEとを組み合わせた者はいない。おそらく、この理由は、それらが比較的新しい技術であること、それらの直交性が認識されていないこと、およびそれぞれに使用される緩衝試薬のいくつかが不相溶性であることにある。しかしながら、出願人らは、CFとMCGEとの組合せが最小限の時間で良好な分解能を達成しかつ効果的に使用可能であることを見いだした。
【０００８】
タンパク質分析用として広く一般に認められている技術は、伝統的な2Dゲル電気泳動である。これは、互いに直角方向を向いた2つの次元で変位させることによりサンプル中のタンパク質を分離および同定する方法である。第1の次元は、タンパク質を等電点(pI)の差に基づいて分離する等電点電気泳動(IEF)であり、一方、第2の次元は、タンパク質をそのサイズに基づいて分離するポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)である。
【０００９】
しかしながら、2Dゲル電気泳動に関しては多くの欠点が存在する。それは、労力がかかり、時間がかかり、しかも自動化が不十分である。通常、分析を完了させるのに数日間を要する。プロテオミクス研究では、次の特徴：(1)増大された分解能および速度、(2)さまざまな特性(等電点、分子量、疎水性)を有するタンパク質を分析する能力、(3)単純性および自動化、ならびに(4)高スループット分析を行う能力、を有する新しい技術の開発が必要とされる。
【００１０】
MCGEと組み合わされたCFは、伝統的な2Dゲル電気泳動に代わる良好な手段である。それは、より速い速度(それは分析を完了させるのに数時間を要するが、伝統的な2Dゲル電気泳動では数日間を要する)、自動化、および高いスループットを提供する。データ出力は、伝統的な2Dゲル電気泳動の結果と直接比較可能である。
【００１１】
CFは、イオン交換クロマトグラフィーの形態である。CFの目的は、タンパク質をその等電点の順にカラムから溶出させることである。等電点とは、溶液中で分子上の実効電荷がゼロになるpHである。弱アニオン(アニオンCFにおいて)交換カラムを高pHにおいて低イオン強度緩衝液で平衡化させる。サンプルタンパク質をカラム上に充填する。タンパク質を高pHにおいてアニオン交換体に結合させる。次に、第2のより低いpHの緩衝液を添加することにより、pH勾配を生成させる。この緩衝液は、広範囲のpKaを有する種を含有する。この範囲のpKaにより、勾配の全pH領域を横切って一様な緩衝能を提供する。カラムのpHが減少するにつれて、タンパク質の正電荷はより強くなるので、カラムとタンパク質との間の相互作用は小さくなる。最終的には、タンパク質はカラムと相互作用しなくなって溶出する。結合されたタンパク質は、その等電点の高いものから低いものへと順に溶出される。
【００１２】
高性能MCGEは、小さいイオンから大きい生体分子までに及ぶ多種多様な化合物を分離するための重要な分析用ツールに急速になってきている。MCGEは、一般的な分離、エナンチオマーの分離、タンパク質の分離、タンパク質のペプチドマッピング、アミノ酸の分析、核酸の分画、ならびに酸解離定数(pKa値)およびオクタノール-水分配係数(log Pow値)の定量的測定に使用される。
【００１３】
これらのMCGE用途のすべてに共通しているのは、化学種を同定する手段としてのキャピラリーチューブ中における化学種の移動度の測定である。従来の分離を行うために、キャピラリーチューブに緩衝溶液を充填し、サンプルをキャピラリーチューブの一端に充填し、キャピラリーチューブの両端を緩衝溶液中に浸漬し、そしてキャピラリーチューブを横切って大きな電位を印加する。サンプル成分は、キャピラリーチューブを通って移動するときに電気泳動により分離される。UV検出システムでは、キャピラリーチューブのセクションがUV光源で照射される。光ディテクターは、チューブを透過する光を検出する。UV吸収性サンプル成分がキャピラリーチューブの照射部分を通過するときに、光ディテクターは低透過光を検出する(吸光を示す)。このようにして、吸光度vs時間のプロットであるエレクトロフェログラムを作成することができる。
【００１４】
生物学的技術および製薬技術の急速な発展は、高スループット分析法という難題を提起した。たとえば、コンビナトリアルケミストリーの最近の発展により、1日あたり何百さらには何千もの化合物を1バッチで合成できるようになった。そのような膨大な数の化合物の特性付けおよび分析は、障害を生じている。並列処理(すなわち、同時マルチサンプル分析)は、スループットを増大させる自然な方法である。高性能液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーとは異なり、何十ものサンプルを同時に分析することのできる高多重化CE装置を構築することが実用的である。そのようなシステムは、PCT出願WO 01/18528A1号に開示されている。
【００１５】
高速かつ高分解能の多次元分離技術の開発が引き続き必要とされている。現在までのところ、クロマトフォーカシング(CF)と多重化キャピラリー電気泳動(MCGE)とを組み合わせた者はいない。これは両方の技術が比較的新しいからであると考えられる。つまり、クロマトフォーカシングは1978年に開示されたものであり、MCGEはさらに歴史が浅いので、それらの直交関係を二次元技術に使用することがこれまで認識されていなかったからであると考えられる。
【００１６】
CFとMCGEがタンパク質分離用として組み合わされないできた他の理由は、CFに使用される緩衝液がMCGEで利用される吸収検出を妨害することが多いことである。タンパク質の吸光度は、280nmの波長のときよりも214nmの波長のときのほうが強い。したがって、214nmではより大きい検出感度が可能になるので、MCGE検出システムには214nmが好ましい。しかしながら、典型的なCFシステムでは、280nmにおけるタンパク質の吸光度検出が使用される。理由は、用いられる緩衝液(一般的には、Amersham BioSciencesから入手可能なPolybufferTM)が214nmにおいて強い吸収を示すことである。PolybufferTMを214nmにおける検出システムと併用した場合、吸光度は、ベースラインを歪めて、タンパク質の検出を妨害する。要するに、2つの技術が組み合わされないできた1つの理由は、好ましくは214nmにおいて、両方のシステムで良好に機能する緩衝液が欠如していたことである。本出願人らは、そのような緩衝液を見いだした。
【００１７】
本出願人らは、本明細書に記載されるようにCFとMCGEとを組み合わせる多次元分離が完全自動化可能であるという利点を有することを見いだした。それにより、特定の作業能率を達成した。さらに、CFを、これまで行われてきたような等電点電気泳動よりもMCGEと組み合わせるほうが有利である。これはCFが多量のサンプルを取り扱う能力を有するからである。これは検出および分離のための第2の次元(MCGE)に有益である。第1の次元からのサンプルの量が少なすぎた場合、第2の次元で感度の問題を生じうる。
【００１８】
さらに、CFからの出力が溶液の多数のアリコートであるので、CFとMCGEとを組み合わせることはとくに有利である。MCGEを用いれば、多重化により、すべてのアリコートを個別のキャピラリーチューブ中で同時に分析することができる。
【００１９】
本発明の主目的は、高速かつ高分解能の分離を提供するようにCFとMCGEとを組み合わせた二次元直交分離技術を設計することである。この主目的および他の目的を達成する方法および形態は、以下の詳細な説明から自明なものとなろう。
【００２０】
発明の概要
本発明は、二次元の分離システムおよびサンプル成分(とくにタンパク質)の分離方法に関する。第1の次元はクロマトフォーカシングであり、第2の次元はキャピラリーゲル電気泳動である。本発明の態様には2つの側面がある。すなわち、第1の側面は、タンパク質分離のためのCFとMCGEとの一体化である。第2の側面かつ第1の側面を補完する側面は、一体化されたCF/MCGEシステムで使用するのに適合した緩衝液である。
【００２１】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、先に本明細書中で説明したように、吸光度に基づくMCGEと一体化されたCFシステムである。本発明のシステムおよび方法は、化学種(とくにタンパク質)の分離、検出、および同定を目的とする。
【００２２】
図1について説明する。最初に、高pHに調整された出発溶液でカラム16を平衡化させる。平衡化後、サンプルインジェクター14を介してサンプルをカラム16に注入する。サンプルインジェクター14は、高性能液体クロマトグラフィーに使用されるものと同じである。サンプル注入後、より低いpHの緩衝溶液10をポンプ12によりカラム16の方向に移送する。カラム16には、弱アニオン交換樹脂が充填されている。サンプルタンパク質は、等電点に基づいてカラム中で分離される。カラムを通り過ぎたところに、検出器18が存在する。検出器は、所与の波長(好ましくは214nm)でタンパク質の光吸収を測定する。次に、インラインに存在するのは、カラムを出た後の溶液のpHを測定するpHモニター20である。次に、特定の時間間隔(時間モードで操作する場合)で96ウェルタイタープレート中に画分を収集するプログラム可能なサンプルハンドリングシステム38を用いてサンプルを収集する。サンプルハンドリングシステム38はまた、次の機能：液体試薬の添加などの液体ハンドリング機能およびMCGEシステム中にサンプルを導入するためのサンプリングの位置決め機能をも有する。所要のサンプル処理を終了した後、タイタープレートを第2の次元の分離および分析のためのMCGEシステムに送る。サンプルの移送は、人を介して行いうるが、好ましくは、CFにおけるサンプルの注入とMCGEによるデータ解析との間を完全自動化すべくロボットアームにより行いうる。
【００２３】
キャピラリーチューブ24の入口端は、サンプルトレー22内の緩衝溶液中に浸漬される。緩衝溶液のうちのいくつかは、第1の次元の分離からの画分をも含有する。サンプルは、キャピラリーチューブ中に充填される。キャピラリーチューブ24を横切って大きな電位差が印加されると、タンパク質は電気泳動により分離される。
【００２４】
光ビームは、光源28で発生し、次に、コリメータレンズ30、キャピラリーチューブ24のプレーナーアレイ、フラットフィールドレンズ32、光フィルター36を通って伝播し、そしてディテクター中に収集される。タンパク質サンプルは、光源により照射されたキャピラリーチューブの領域を通過するときに光吸収により検出される。
【００２５】
光源28から光を放出する領域とキャピラリーチューブ24のプレーナーアレイと間の距離は、本発明を実施するうえで決定的に重要であるわけではない。しかしながら、光源28から光を放出する領域とキャピラリーチューブ24のプレーナーアレイと間の距離が短いほど、キャピラリーチューブのプレーナーアレイはより多くの光を受ける。キャピラリーチューブのプレーナーアレイが受ける光が多いほど、検出は高感度になる。
【００２６】
好ましくは、キャピラリーチューブ24のプレーナーアレイとディテクター34との間の距離は、キャピラリーチューブ24のプレーナーアレイの平面に直交して測定されるキャピラリーチューブの断面距離の少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約100倍である。決定的に重要な特性は、アレイ全体が観測可能でありかつその焦点が合うような距離でなければならないということである。したがって、キャピラリーチューブ24のプレーナーアレイとディテクター34との間の距離は、好ましくは約1センチメートル〜約100センチメートル、より好ましくは約3cm〜約40センチメートル、最も好ましくは約20センチメートル〜約40センチメートルである。
【００２７】
「キャピラリーチューブ」24とは、少なくとも3本またはそれ以上、好ましくは少なくとも約10本、より好ましくは少なくとも約90本、望ましくは本明細書に記載のシステムにより収容しうるかぎり多くの本数を意味する。キャピラリーチューブ24は、光源28に対向するキャピラリーチューブ24の壁を介して、キャピラリーチューブ24中のサンプルを介して、かつディテクターに対向するキャピラリーチューブ24の壁を介して、光源28からの光を透過することができる。したがって、キャピラリーチューブ24の壁は望ましくは透過性であるが、いくつかの場合には、キャピラリーチューブ24の壁は半透過性でありうる。チューブの壁の少なくとも一部分が光源28からの光を透過することができ、結果として、キャピラリーチューブ24中のサンプルが照射され、かつ吸収種およびサンプルにより吸収されない光がディテクターにより検出可能であるかぎり、キャピラリーチューブ24の壁全体が上記の光源28からの光を通過することができる必要はない。
【００２８】
一般的には、キャピラリーチューブ24は、平滑な表面と均一な厚さの壁とを有し、かつ吸光度の検出または測定の対象となるサンプル中の吸収種により吸収される光の波長範囲にわたり透過性である材料から作製されたものでなければならない。キャピラリーチューブ24の好ましい材料としては、プラスチック、石英、溶融シリカ、およびガラスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。キャピラリーチューブ24の断面は、本発明に決定的に重要であるわけではない。しかしながら、キャピラリーチューブ24の断面が小さいほど、キャピラリーチューブ24は、高多重化用途に有用である。なぜなら、より少量の空間でより多数のキャピラリーチューブ24を使用することができるからである。同様に、キャピラリーチューブ24の壁の厚さは、本発明に決定的に重要であるわけではない。壁は、キャピラリーチューブ24の構造的一体性を保持するのに十分な厚さでなければならないが、キャピラリーチューブ24を介する光の透過に対して有害な妨害を引き起こすほど厚くあってはならない。キャピラリーチューブ24の形状もまた、本発明に決定的に重要であるわけではない。キャピラリーチューブ24は、任意の好適な形状を有しうる。しかしながら、キャピラリーの好ましいサイズおよび形状は、150μmの外径、75μmの内径、および円形の形状である。望ましくは、キャピラリーチューブ24の形状は、密に充填しかつ容器による迷光の生成を最小限に抑えるのに役立つ。キャピラリーチューブ24は、好ましくは約10cm〜約200cmの長さである。
【００２９】
キャピラリーチューブ24は、Polymicro Technologies, Inc., Phoenix, AZをはじめとするいくつかの供給元により市販されている。キャピラリーチューブ24は、好ましくは、機械的に安定になるようにポリイミドのようなポリマーでコーティングされる。コーティングは、光源28により照射される領域では除去されていなければならない。エキシマーレーザーを用いて、ポリマーコーティングを除去することができる。
【００３０】
好ましくは、プレーナーアレイ中のキャピラリーチューブ24は、互いに実質的に平行にかつ隣接して配置される。隣接するキャピラリーチューブ24は、その長さの全部または一部分に沿って互いに物理的に接触しうるが、キャピラリー壁直径またはアレイの他の特性のわずかな不一致により、その全長に沿って接触するのを防止しうる。
【００３１】
電気泳動分離に使用される電位は、本発明に決定的に重要であるわけではない。高圧電力26の電源により生成される典型的な電位は、5,000〜30,000Vの範囲である。
【００３２】
方法実施時に、とくにキャピラリーチューブ24のプレーナーアレイの近傍で、大量の熱が発生する場合、熱を散逸させるために冷却を利用すべきである。過度の熱は、隣接するキャピラリーチューブ24間で機械的振動を引き起こす可能性があり、結果として、過剰のノイズを発生させる可能性がある。ファンによりキャピラリーチューブ24を冷却することができる。
【００３３】
ディテクター34は、吸収を検出する任意の好適な手段を含みうる。好ましくは、ディテクター34は、複数の吸収検出素子(たとえば、望ましくはリニアアレイで位置決めされた複数の感光素子)を含むが、二次元イメージアレイディテクターを使用しうる。望ましくは、ディテクター34は、キャピラリーチューブ24のリニアアレイと平行かつ整合して存在する。ディテクター34は、望ましくは、フリッカーノイズを減少させるべく強固に装着される。
【００３４】
好ましくは、ディテクター34は、リニアフォトダイオードアレイ(PDA)である。望ましくは、PDAは、リニアイメージセンサーチップ、駆動/増幅回路、および望ましくは約0℃〜約-40℃の温度にセンサーチップを熱電冷却する温度コントローラーを搭載する。温度を低下させれば、ダークカウントが減少し、温度ドリフトが最小限に抑えられので、広いダイナミックレンジにわたり信頼性のある測定を行うことができる。駆動/増幅回路は、望ましくは、I/Oボードを介してコンピューターに接続され、好ましくは、リニアイメージセンサーにより必要とされるマスタークロックパルスおよびマスタースタートパルスを提供するパルスジェネレーターとしても機能する。PDAは、二次元ではなくリニアにイメージを記録する。好ましくは、取得したデータは、リアルタイムでハードディスクに直接書き込まれる。また、好ましくは、少なくとも10個までのPDA素子からのシグナルがリアルタイムで表示される。
【００３５】
好ましくは、PDAは、リニアにアライメントされたピクセルを含む。その場合、各キャピラリーチューブは、約10個未満のピクセル、より好ましくは約7〜約9個のピクセルに光結合され、ピクセルの一部は、キャピラリーの壁に結合され、ピクセルの少なくとも1つはキャピラリーの内腔に結合される。露光されたピクセルは、入射光の強度に比例した電子シグナルを発生する。
【００３６】
光源28は、好ましくは約180nm〜約1500nmの範囲の波長の光を放出する。好適な光源28の例としては、水銀ランプ(紫外(UV)光吸収用)、タングステンランプ(可視光吸収用)、ヨウ素ランプ(UV光吸収用)、亜鉛ランプ(UV光吸収用)、カドミウムランプ(UV光吸収用)、キセノンランプ(UV光吸収用)、または重水素ランプ(可視光吸収用)が挙げられる。望ましくは、光源28は、対象となる種により吸収される光の波長を放出する。どの波長の光が対象となる種により吸収されるかは、標準的な吸収分光計を用いて決定しうる。他の選択肢として、そのような情報を提供する分光表は、National Institute of Science and Technologyなどを介して当技術分野で入手可能である。望ましくは、より少量の吸収種を検出できるように、検出または測定の対象となる所与の種に対して最大吸収波長の光を選択する。光源28は点光源でありうる。また、好ましくは、光源28は、約0.5mW〜約50mWのパワー出力を有する。
【００３７】
光フィルター36は、望ましくは、キャピラリーチューブ24のプレーナーアレイとディテクター34との間に位置決めされる。光フィルター36は、外部環境からの迷光がディテクター34に達するのを防止する。フィルター36は、光源28から放出される波長およびその近傍の波長の光を透過し、他の波長の光を遮断する。
【００３８】
フラットフィールドレンズ32は、望ましくは、キャピラリーチューブ24のプレーナーアレイとディテクター34との間に位置決めされる。フラットフィールドレンズ32は、各サンプル中の1種以上の吸収種により吸収されない光をディテクター34に結合する。フラットフィールドレンズでないレンズを本発明に関連して使用することができるが、実際には全領域を一様に結像しないので不利である。したがって、領域の縁では歪みを生じるので、レンズの領域の縁に位置決めされたキャピラリーチューブ24の吸収の検出や測定を行うことができない。フラットフィールドレンズ32は、プレーナーアレイのイメージを反転させてディテクター34の面上に結像する。
【００３９】
コリメータレンズ30は、望ましくは、光源28とキャピラリーチューブ24のプレーナーアレイとの間に位置決めされる。コリメータレンズ16は、キャピラリーチューブ24がより効果的に照射されるように光源28からの光を集束させる。
【００４０】
複数のキャピラリーチューブ24のプレーナーアレイ中の各キャピラリーチューブ24に任意の好適な方法によりサンプルを導入することができるが、好ましくは、圧力、重力、真空、毛管作用、または電気泳動作用によりキャピラリーチューブ24にサンプルを導入する。
【００４１】
上記のコンポーネントは、実質的に、望ましくは完全に、迷光を回避するように配置される。2種の迷光が存在する。1種の迷光は、側壁および内腔を有するキャピラリーチューブ24に起因するグレアである。他の種の迷光は、他のキャピラリーチューブ24の存在によるものである。この種の迷光は「クロストーク」と呼ばれる。クロストークは、本質的には、他のキャピラリーチューブ24に由来するグレアである。したがって、サンプルとフラットフィールドレンズ32との間は、実質的に、望ましくは完全に、2種のグレアを回避するのに十分な距離である必要がある。距離の増加に伴う迷光の減少率により、容器からのほとんどのグレアが回避されるであろう。グレアは、容器中の完全吸収材料を測定することにより評価可能である。なんらかの光が検出されたとすれば、その光はグレアによるものである。
【００４２】
好ましくは、生データセットを単一ダイオードのエレクトロフェログラムとして抽出し、そして連続ブランク参照(対照)として緩衝溶液だけを含有するキャピラリーチューブ24を用いてディテクター34で収集された透過光強度を吸光度値に変換することにより解析する。他の選択肢として、全光強度を増大させるために、アレイの各キャピラリーチューブ24に対して、5個程度、好ましくは3個の隣接するダイオードをまとめてもよい。エレクトロフェログラム中の根平均二乗ノイズは、アナライトピークのうちの1つの近傍のベースライン部分を用いて得られる。数学的平滑化を用いれば、シグナルに歪みを生じさせることなく、ノイズを顕著に減少させることができる。この点に関して、平滑化のためにより多くのデータ点が提供されるように、できるかぎり速いデータ取得速度を利用すべきである。二項式平滑化、ボックスカー平滑化、およびSavitzky-Golay平滑化をはじめとする種々のアルゴリズムは、好ましい数学的平滑化法である。
【実施例】
【００４３】
実施例1
(卵白タンパク質の分離)
出発材料は卵白であった。出発溶液は、塩酸でpH9.5に調整された25mMジエタノールアミンであった。卵白を出発溶液で初期濃度の1/4に希釈し、13,400rpmで5分間遠心分離した。上清をクロマトフォーカシングカラム16に注入した。カラム16は、Mono Pアニオン交換樹脂が充填されたPharmacia Biotech製のMono P HR 5/20であった。サンプル注入前に出発溶液でカラム16を平衡化させた。サンプル注入後、2mM N-[2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]グリシン(トリシン, pKa=8.1)、2mM 3-(シクロヘキシルアミノ)-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸(CAPSO, pKa=9.6)、2mM 3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸(CAPS, pKa=10.4)、2mMイミノ二酢酸(pKa=2.98)、2mMグリシン(pKa1=2.35, pKa2=9.78)、2mM 4-モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS, pKa=7.2)、2mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES, pKa=6.1)、2mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris, pKa=8.3)、2mM 2-[(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ]エタンスルホン酸(TES, pKa=7.4)、2mMアラニン、2mM 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES, pKa=7.5)、2mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(3-プロパンスルホン酸(EPPS, pKa=8.0)、2mM N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(ACES, pKa=6.8)、2mM N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(AMPSO, pKa=9.0)、2mM 2-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES, pKa=9.3)、2mM [(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ]-1-プロパンスルホン酸(TAPS, pKa=8.4)、2mM 1,1,1,3,3,3-ヘキサキス(ジメチルアミノ)ジホスファゼニウムテトラフルオロボレート(Bis-Tris)、および2mMアルギニン(pKa1=1.82, pKa2=8.99)の溶液10(10%酢酸でpH3.5に調整した)で、カラム16を溶出させた。
【００４４】
図2は、クロマトフォーカシングカラム16からの出力を示している。カラムを出た溶液のpHおよび任意の種の吸光度(280nm)を時間の関数としてモニターする。5つの異なる画分、すなわち、1、2、および3と記された小さい吸光度ピークに対してそれぞれ1つの画分、ならびに大きい吸光度ピークに対して2つの画分4および5、を収集した。
【００４５】
クロマトフォーカシング装置から収集された画分をMCGEシステムのキャピラリー24に動電的に注入した。15kVにおいて30分間の稼働時間で分離を行った。
【００４６】
図3は、5つの画分について同時に得られたエレクトロフェログラムを示している。エレクトロフェログラムはすべて、クロマトフォーカシング単独で達成されたよりもさらに大きい卵白タンパク質分解能を示す。たとえば、画分3では1つのタンパク質吸光度ピークであったものが、エレクトロフェログラム3では、1つの大きいピーク、1つの中程度のピーク、およびいくつかの小さいピークにさらに分離された。それらはすべて、異なるタンパク質に対応する。
【００４７】
以上の説明からわかるように、本発明は、有効に機能し、価値のある分離システムを提供し、そして記載の目的を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図1は、多重化キャピラリー電気泳動システムと一体化されたクロマトフォーカシングシステムの概略図を示している。
【図２】図2は、クロマトフォーカシングカラム16からの出力を示している。
【図３】図3は、5つの画分について同時に得られたエレクトロフェログラムを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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