(57)【要約】本発明は、個体において多量体タンパク質を生産する、新規、効果的、かつ効率的な方法を提供する。多量体タンパク質は、会合した多量体タンパク質（２つ以上が会合したポリペプチド）および多価多量体タンパク質（２つ以上の目的遺伝子によってコードされた単一ポリペプチド）を含む。個体における多量体タンパク質の発現および／または形成は、その個体に、多量体タンパク質の部分をコードする目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットを投与することにより達成される。ポリヌクレオチドカセットは、１つ以上のプロ配列、プレプロ配列、セクロピンプレプロ配列、および／または切断部位配列を、別に含有してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各目的遺伝子がプロヌクレオチド配列に操作可能に結合され、かつ２つ以上の目的遺伝子のそれぞれが同じであるかまたは異なる、２つ以上の目的遺伝子および２つ以上のプロヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記２つ以上のプロヌクレオチド配列の最も５’側のプロヌクレオチド配列が、プレプロヌクレオチド配列の一部である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
２つの目的遺伝子および２つのプロヌクレオチド配列が、プレプロヌクレオチド配列；第一の目的遺伝子；プロヌクレオチド配列；および第二の目的遺伝子、の順に配置された、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記プレプロヌクレオチド配列がセクロピンプレプロヌクレオチド配列であり、かつ前記プロヌクレオチド配列はセクロピンプロ配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記プレプロヌクレオチド配列が配列番号３または配列番号４で示される配列を含み、かつ前記プロヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号２で示される配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
第一の目的遺伝子が抗体の重鎖をコードし、かつ第二の目的遺伝子が抗体の軽鎖をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
個体において多量体タンパク質を生産する方法であって、２つ以上の目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを前記個体に投与することを含み、各目的遺伝子が前記多量体タンパク質の一部をコードし、各目的遺伝子がプロヌクレオチド配列に操作可能に結合され、かつ２つ以上の目的遺伝子のそれぞれが同じであっても異なっていてもよい、個体において多量体タンパク質を生産する方法。
【請求項８】
前記多量体タンパク質が会合した多量体タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多量体タンパク質が多価多量体タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記２つ以上のプロ配列の最も５’側のプロヌクレオチド配列が、プレプロヌクレオチド配列の一部である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、プレプロヌクレオチド配列；第一の目的遺伝子；プロヌクレオチド配列；および第二の目的遺伝子、の順に配置された２つの目的遺伝子および２つのプロヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
第一の目的遺伝子が抗体の重鎖をコードし、かつ第二の目的遺伝子が抗体の軽鎖をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
個体においてタンパク質を生産する方法であって、１つ以上の目的遺伝子に操作可能に結合されたセクロピンプレプロヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、各目的遺伝子が多量体タンパク質をコードする、個体においてタンパク質を生産する方法。
【請求項１４】
第一の目的遺伝子が抗体の重鎖であり、かつ第二の目的遺伝子が抗体の軽鎖である、請
求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が多量体タンパク質であり、かつ前記セクロピンプレプロヌクレオチド配列が２つ以上の目的遺伝子に操作可能に結合され、各目的遺伝子が前記多量体タンパク質の一部をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記多量体タンパク質が会合した多量体タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多量体タンパク質が多価多量体タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
個体において多量体タンパク質を生産する方法であって、２つ以上の目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを個体に投与することを含み、各目的遺伝子が前記多量体タンパク質の一部をコードし、かつ各目的遺伝子が切断部位をコードする遺伝子に操作可能に結合されている、個体において多量体タンパク質を生産する方法。
【請求項１９】
トランスポゾン系ベクターはポリヌクレオチドを含み、さらに第一のプロモータに操作可能に結合されたトランスポザーゼ遺伝子を含み、
ａ）前記第一のプロモータが、ＡＣＣＡＴＧを含む改変されたＫｏｚａｋ配列を含み、
ｂ）前記２つ以上の目的遺伝子が、それぞれ１つ以上の別のプロモータに操作可能に結合され、そして
ｃ）前記２つ以上の目的遺伝子およびそれらの操作可能に結合されたプロモータが、トランスポザーゼ遺伝子によりコードされたトランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列で隣接されている、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
トランスポゾン系ベクターがポリヌクレオチドを含み、さらに第一のプロモータおよび鳥類に最適化されたポリＡ配列に操作可能に結合されたトランスポザーゼ遺伝子を含み、
ａ）前記２つ以上の目的遺伝子が、それぞれ１つ以上の別のプロモータに操作可能に結合され、そして
ｂ）前記２つ以上の目的遺伝子およびそれらの操作可能に結合されたプロモータが、トランスポザーゼ遺伝子によりコードされたトランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列で隣接されている、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記多量体タンパク質が会合した多量体タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記多量体タンパク質が多価多量体タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドがさらに、切断部位を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含む動物。
【請求項２５】
前記動物が鳥である、請求項２４に記載の動物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の動物により生産される卵。
【請求項２７】
前記卵が、前記単離されたポリヌクレオチドによりコードされる多量体タンパク質を含む、請求項２６に記載の卵。
【請求項２８】
前記動物が哺乳動物である、請求項２４に記載の動物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の哺乳動物により生産される乳。
【請求項３０】
前記乳が、前記単離されたポリヌクレオチドによりコードされる多量体タンパク質を含む、請求項２９に記載の乳。
【請求項３１】
ａ）許容可能な担体中に請求項１に記載の前記ポリヌクレオチドを含む組成物を、卵を産む動物に投与し、そして
ｂ）前記１つ以上の目的遺伝子を多量体タンパク質として発現させること、
を含む、多量体タンパク質を生産する方法。
【請求項３２】
ａ）前記卵を産む動物から卵を集め、
ｂ）前記多量体タンパク質を含有する卵白を回収し、そして
ｃ）前記多量体タンパク質を精製すること、
をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記卵を産む動物が鳥である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）許容可能な担体中に請求項１に記載の前記ポリヌクレオチドを含む組成物を、哺乳動物の乳房内の管系に投与し、そして
ｂ）前記１つ以上の目的遺伝子を多量体タンパク質として発現させること、
を含む、多量体タンパク質を生産する方法。
【請求項３５】
ａ）前記哺乳動物から前記多量体タンパク質を含む乳を集め、そして
ｂ）前記多量体タンパク質を精製すること、
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記プレプロヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号４で示される配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記２つ以上のプロヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号１または配列番号２で示される配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記プレプロヌクレオチド配列がセクロピンプレプロヌクレオチド配列である、前述の請求項のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記プロヌクレオチド配列がセクロピンプロヌクレオチド配列である、前述の請求項のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は包括的に、多量体タンパク質をコードする遺伝子がシグナル配列またはシグナル配列の部分に操作可能に結合された、トランスジェニック個体における多量体タンパク質の生産に関する。
【０００２】
米国政府は、本発明に一定の権利を有する。本発明の開発は、一部米国農務省からのＨＡＴＣＨ助成金下で米国政府により資金提供され、一部米国農務省からのフォーミュラ１４３３基金で米国政府により資金提供され、かつ一部陸軍により授与される契約ＤＡＡＤ１９−０２０１６下で米国政府により資金提供された。
【背景技術】
【０００３】
トランスジェニック動物中で多量体タンパク質を生産する方法は、様々な理由（薬学的、診断的、および工業的に使用される多量体タンパク質を生産する生物学的工場としての、上記トランスジェニック動物の潜在能力を含む）のため望ましい。多量体タンパク質の組み換え生産に使用される設備の不十分な能力およびこれらの設備の使用に対する製薬工業からの高まる要求に起因して、この潜在能力は工業にとって魅力的である。トランスジェニック動物を生産する数々の試みは、遅い遺伝子取り込み速度および不安定な遺伝子取り込みを含む、いくつかの問題に直面してきた。したがって、多量体タンパク質を生産するトランスジェニック動物の開発には、改良された遺伝子技術が必要とされる。
【０００４】
従来技術の遺伝子送達技術のいくつかは、潜在的に望ましくない副作用および安全性問題と関連があるウイルスを用いた。遺伝子療法に有用な最新の遺伝子送達技術はほとんどが、もはや複製しないよう弱毒化されたウイルス系の送達ベクター、例えばアデノおよびアデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびその他のウイルスによる（Kay, M.A., et al. 2001. Nature Medicine 7: 33-40）。
【０００５】
ウイルスベクターの使用に関連した多くの問題が存在する。第一に、ウイルスベクターは組織特異的ではない。実際、アデノウイルスを用いる遺伝子療法試験は、ベクターが患者の精子中に存在するため、近年中止された（療法が子供の遺伝子作製を変え得るという恐れにもかかわらず、続行される遺伝子試験。The New York Times, December 23, 2001）。第二に、ウイルスベクターは一時的に組み入れられると思われ、これは、特定時間間隔で患者を再治療する必要がある（Kay, M.A., et al. 2001. Nature Medicine 7: 33-40）。第三に、ウイルスベースのベクターは、毒性形態に戻り、疾患を引き起こし得る、という問題が存在する。第四に、ウイルスベースのベクターは、安定組込みのために分裂細胞を要する。第五に、ウイルスベースのベクターは、種々の細胞中に無差別に組み込まれ、これが望ましくない生殖系列組込みを生じ得る。第六に、所望の作用を達成するために必要とされる必要高力価は一患者の死を生じ、それらは別個の試験における癌の誘導に関与すると考えられる（Science, News of the Week, October 4, 2002）。
【０００６】
したがって必要なのは、これらの遺伝子を含有するベクターが疾患または他の不要な副作用を生じない、トランスジェニック動物およびヒトにおいて多量体タンパク質を生産する新規な方法である。また、動物およびヒトの組織内または細胞内（複製しない、休止状態の細胞を含む）に安定に取り込まれるＤＮＡ構築物に対する必要性もある。さらに、動物およびヒトの特異的な組織および細胞に遺伝子を送達することが可能なＤＮＡ構築物と、これらの動物およびヒトにおいて多量体タンパク質を生産する技術の必要性も認識されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、個体において多量体タンパク質を生産する、新規、効果的、かつ効率的な方法を提供する。多量体タンパク質は、会合した多量体タンパク質（２つ以上が会合したポリペプチド）および多価多量体タンパク質（２つ以上の目的遺伝子によってコードされた単一ポリペプチド）を含む。個体における多量体タンパク質の発現および／または形成は、その個体に、目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットを投与することにより達成される。ポリヌクレオチドカセットは、１つ以上のプロ配列、プレプロ配列、セクロピン(cecropin)プレプロ配列、および／または切断部位配列を、別に含有してもよい。
【０００８】
本発明は、各目的遺伝子はプロヌクレオチド配列に操作可能に結合される、２つ以上の目的遺伝子および２つ以上のプロポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドカセットを提供する。各目的遺伝子は、多量体タンパク質の一部を形成するポリペプチドをコードする。本発明の１つの発見は、プレプロシグナル配列のプロ部分を使用すると、個体における多量体タンパク質の適切なプロセシング、発現、および／または形成を容易にすることである。プロポリヌクレオチドが由来し得るまたはその一部であり得るプレプロポリヌクレオチドのいくつかの例は、セクロピンプレプロ、リゾチームプレプロ、オボムチンプレプロ、オボトランスフェリンプレプロ、腫瘍壊死因子受容体に対するシグナルペプチド（配列番号６）、配列番号７〜５４のうちの１つで提供されるポリヌクレオチド配列によりコードされるシグナルペプチド、および配列番号５５で提供されるシグナルペプチドである。プレプロまたはプロポリヌクレオチドは、セクロピンＡ１、セクロピンＡ２、セクロピンＢ、セクロピンＣ、セクロピンＤ、セクロピンＥ、およびセクロピンＦから成る群より選ばれるセクロピンプレプロまたはプロポリヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態において、プロポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２で示される配列を有するセクロピンＢプロポリヌクレオチドである。好ましいプレプロポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４で示される配列を有するセクロピンＢポリヌクレオチドである。
【０００９】
本発明の別の発見は、セクロピンプレプロ配列が、個体において、多量体タンパク質を含むタンパク質の適切なプロセシング、発現、および／または形成を容易にすることである。したがって、本発明は、セクロピンプレプロ配列に操作可能に結合された１つ以上の目的遺伝子を含有する、ポリヌクレオチドカセットを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、セクロピンプレプロ配列に操作可能に結合された２つ以上の目的遺伝子を含有する。好ましいセクロピンプレプロポリヌクレオチドは、配列番号３および配列番号４で提供される。本発明は、プロ配列は目的遺伝子の間に位置する、セクロピンプレプロポリヌクレオチドに操作可能に結合された２つ以上の目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットも含む。
【００１０】
これらのポリヌクレオチドカセットは、ポリペプチド配列の発現およびタンパク質、より好ましくは多量体タンパク質の形成のため、個体に投与される。好ましくは、個体は、上記タンパク質を回収することができる動物である。好ましい動物は、卵を産むまたは乳を生産する動物である。
【００１１】
一実施形態において、卵を産むトランスジェニック動物は、鳥類（avian）である。本発明の方法は、走鳥類（Ratites）、オウム目、タカ目、キツツキ目、フクロウ目、スズメ目、ブッポウソウ目（Coraciiformes）、クイナ目（Ralliformes）、ホトトギス目、ハト目、キジ目、カモ目、およびサギ目（Herodiones）を含む鳥類において使用されてよい。好ましくは、上記卵を産むトランスジェニック動物は、家禽鳥である。より好ましくは、上記鳥は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウまたはウズラである。別の好ましい鳥は、走鳥類、例えばエミュー、ダチョウ、レアまたはヒクイドリである。他の好
ましい鳥類は、ヤマウズラ（partridge）、クジャク、キーウィ、オウム、インコ、コンゴウインコ、ハヤブサ、ワシ、タカ、ハト、バタインコ、鳴禽類（song birds）、カケス、クロウタドリ、フィンチ、ムシクイ（warbler）、カナリア、オオハシ、ハッカチョウ（mynah）、またはツバメである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドカセットは、個体のＤＮＡ中へのカセットの取り込みを可能にするトランスポゾン系ベクター（transposon-based vector）中に位置する。本発明のトランスポゾン系ベクターは、第一プロモータに操作可能に結合されたトランスポザーゼと第二プロモータに操作可能に結合された目的のタンパク質またはぺプチドをコードする配列とを含み、上記目的のタンパク質またはペプチドをコードする配列およびその操作可能に結合されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列で隣接される。また、上記トランスポゾン系ベクターは、以下の特性を含む：ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えることなく、各コドンの３番目の塩基位置のヌクレオチドがＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸に対するコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する、1つ以上の終止コドンの付加；および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するのにトランスポザーゼに操作可能に結合された効果的なポリＡ配列の付加。いくつかの実施形態において、効果的なポリＡ配列は、鳥類に最適化したポリＡ配列である。
【００１３】
一実施形態において、上記トランスポゾン系ベクターは、鳥類に最適化したポリＡ配列を含むが、ＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を有する改変されたＫｏｚａｋ配列を含まない。かかるトランスポゾン系ベクターの一例は、ｐＴｎＭＣＳベクター（配列番号５６）である。別の実施形態において、上記トランスポゾン系ベクターは、ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えることなく、各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸に対するコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する、1つ以上の終止コドンの付加；およびｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するのにトランスポザーゼに操作可能に結合された効果的なポリＡ配列の付加、を含む。かかるトランスポゾン系ベクターの一例は、ｐＴｎＭｏｄベクター（配列番号５７）である。
【００１４】
したがって本発明の目的は、個体において多量体タンパク質を生産する、改良された方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、卵を産む動物または乳を生産する動物において、多量体タンパク質を生産する、改良された方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる別の目的は、ニワトリまたはウズラにおいて、多量体タンパク質を生産する、改良された方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、多量体タンパク質を含有する卵または乳を生産する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の利点は、従来技術の方法よりずっと効率的にかつ経済的にトランスジェニック動物から多量体タンパク質が生産されることにより、多量体タンパク質の大量生産に関する手段を提供する、ことである。
【００１９】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴および利点は、開示される実施形態および
特許請求の範囲の以下の詳細な説明の再検討後に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、個体において多量体タンパク質を生産する、新規、効果的、かつ効率的な方法を提供する。多量体タンパク質は、会合した多量体タンパク質（２つ以上が会合したポリペプチド）および多価多量体タンパク質（２つ以上の目的遺伝子によってコードされた単一ポリペプチド）を含む。個体における多量体タンパク質の発現および／または形成は、その個体に、目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットを投与することにより達成される。ポリヌクレオチドカセットは、１つ以上のプロ配列、プレプロ配列、セクロピンプレプロ配列、および／または切断部位配列を、別に含有してもよい。
【００２１】
本発明は、各目的遺伝子はプロヌクレオチド配列に操作可能に結合される、２つ以上の目的遺伝子および２つ以上のプロポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドカセットを提供する。各目的遺伝子は、多量体タンパク質の一部を形成するポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチドカセットは、ポリペプチド配列の発現および多量体タンパク質の発現および／または形成のため、個体に投与される。好ましくは、上記個体は、上記多量体タンパク質を回収することができる動物である。好ましい動物は、卵を産むまたは乳を生産する動物である。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドカセットは、個体のＤＮＡ中へのカセットの取り込みを可能にするトランスポゾン系ベクター中に位置する。
【００２２】
目的遺伝子に操作可能に結合されるプロポリヌクレオチド配列は、自然において細胞から分泌されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドと一般に会合したプレプロポリヌクレオチド配列のプロ部分を含む。プレポリヌクレオチド配列は、その結果得られたタンパク質を小胞体に向けるように機能し、そのタンパク質を含有する細胞の小胞体またはゴルジ複合体の中でプロ配列が切断されてもよい。プレプロポリヌクレオチド配列は自然では分泌されたポリペプチドと会合する一方、本発明の１つの発見は、プレプロシグナル配列のプロ部分を使用すると、多量体タンパク質、特に会合した多量体タンパク質、の適切なプロセシング、発現、および／または形成を容易にすることである。本発明において、各目的遺伝子は、プロポリヌクレオチド配列と操作可能に結合される。図１は、２つの目的遺伝子を含有する１つのポリヌクレオチドカセットの概略図であり、各目的遺伝子は、プロポリヌクレオチド配列に操作可能に結合されている。第一の目的遺伝子は、プレプロポリヌクレオチド配列の一部であるプロポリヌクレオチド配列に操作可能に結合され、一方、第二の目的遺伝子は、プレプロポリヌクレオチド配列の一部ではないプロポリヌクレオチド配列に操作可能に結合されるが、プレプロポリヌクレオチド配列から由来してもよい。したがって、「プロ配列」という用語は、プレプロ配列の一部であるプロ配列およびプレプロ配列の一部ではないプロ配列を包含するが、プレプロ配列から由来してもよい。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドカセット中で最も５’側のプロポリヌクレオチド配列は、プレプロポリヌクレオチド配列の一部である。
【００２３】
プロポリヌクレオチドが由来し得るかまたはその一部である、プレプロポリヌクレオチドのいくつかの例は、セクロピンプレプロ、リゾチームプレプロ、オボムチンプレプロ、オボトランスフェリンプレプロ、腫瘍壊死因子受容体に対するシグナルペプチド（配列番号６）、配列番号７〜５４のうち1つで提供されるポリヌクレオチド配列によりコードされるシグナルペプチド、および配列番号５５に提供されるシグナルペプチドである。プレプロおよびプロポリヌクレオチドは、セクロピンＡ１、セクロピンＡ２、セクロピンＢ、セクロピンＣ、セクロピンＤ、セクロピンＥおよびセクロピンＦから成る群より選ばれる、セクロピンプレプロまたはプロポリヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態において、プロポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２で示される配列を有するセクロピンＢプロポリヌクレオチドである。好ましいプレプロポリヌクレオチドは、配列番号
３または配列番号４で示される配列を有するセクロピンＢポリヌクレオチドである。
【００２４】
図１は、本発明の一実施形態を提供し、ここでポリヌクレオチドカセットは、プレプロポリヌクレオチド、第一の目的遺伝子、プロポリヌクレオチドおよび第二の目的遺伝子の順で配置された２つの目的遺伝子および２つのプロポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、配列は、ポリヌクレオチドカセットの５’末端から出発して、上述の順番で配置される。図２は、本発明のより具体的な実施形態を提供し、第一および第二の目的遺伝子は抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドである。しかし、本発明は、少なくとも２つの目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットを含む。各目的遺伝子は、プロポリヌクレオチドに操作可能に結合される。これらの各プロポリヌクレオチドは、同じか、またはそれぞれ異なってもよい。一実施形態において、ポリヌクレオチドカセット中の全てのプロポリヌクレオチドは、同じであり、かつセクロピンプロポリヌクレオチドである。図３に示されるように、最も５’側のセクロピンプロポリヌクレオチドは、好ましくはセクロピンプレプロポリペプチドの一部である。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドカセットは、個体における多量体タンパク質の生産用に個体に投与されてよい。したがって、本発明は、個体において多量体タンパク質を生産する方法を含み、この方法は、少なくとも２つの目的遺伝子（それぞれは多量体タンパク質の一部をコードし、各目的遺伝子はプロポリヌクレオチド配列に操作可能に結合される）を含むポリヌクレオチドカセットを個体に投与することを含む。また、本発明は、個体において多量体タンパク質を生産する方法を含み、２つ以上の目的遺伝子（各目的遺伝子は多量体タンパク質の一部をコードする）に操作可能に結合されたセクロピンプレプロ配列を含むポリヌクレオチドカセットを個体に投与することを含む。この第二の方法では、ポリヌクレオチドカセット中でのセクロピンプレプロ配列自体の使用が多量体タンパク質のプロセシング、発現、および／または形成を容易にするため、各目的遺伝子へのプロポリヌクレオチドの結合は必要ない。セクロピンプレプロポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドカセットは、少なくとも２つの目的遺伝子を含有し得る。好ましくは、セクロピンプレプロポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドカセット中の目的遺伝子の５’側に位置する。図３に、１つの代表的なポリヌクレオチドカセットを示す。好ましい実施例において、プレプロ配列は、配列番号３または配列番号４で示される配列を含む。図３に示されるように、セクロピンプレプロポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドカセットは、それぞれの２つの目的遺伝子の間に切断部位を含有することが好ましい。このような切断部位（単数または複数）は、酵素切断部位、プロポリヌクレオチド、および感光性切断部位、化学切断部位、および自己スプライシング切断部位（即ちインテイン）を含む任意の切断部位をコードするヌクレオチドであってよいが、これらに限定されない。以下に、切断部位をより詳細に説明する。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドカセットは、個体における多量体タンパク質の生産に特に好適である。個体は、ヒトおよび動物の両方を含む。好ましい動物は、卵を産む動物および乳を生産する動物である。本明細書中で使用される場合、「卵を産む動物」という用語は、羊膜類全て、例えば鳥、亀、トカゲおよび単孔類を含む。単孔類は卵を産む哺乳動物であり、カモノハシおよびハリモグラを含む。「鳥」または「家禽」という用語は、本明細書中で使用される場合、鳥綱の動物の一員として定義され、これは温血性の、卵を産む、最初に飛ぶことに適合した脊椎動物に特徴付けられる。鳥類は、走鳥類、オウム目、タカ目、キツツキ目、フクロウ目、スズメ目、ブッポウソウ目、クイナ目、ホトトギス目、ハト目、キジ目、カモ目およびサギ目を含むが、制限は無い。「走鳥類」という用語は、本明細書中で使用される場合、いくつかの目から成る、飛べない、たいていは大型の走る鳥群として定義され、エミュー、ダチョウ、キーウィおよびヒクイドリを含む。「オウム目」という用語は、本明細書中で使用される場合、オウムを含み、対指足類（zygodactylism）を示し、かつ強いかぎ形のくちばしを有する、単一の科から成る（monofamilial）目
の鳥を示す。「オウム」とは、インコ科（オウム目の単一科）鳥類の任意の一員として定義され、短い、頑丈な、強いかぎ形のくちばしにより識別される。好ましい鳥類は、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ガチョウおよびアヒルを含む家禽鳥である。「ニワトリ」という用語は本明細書中で使用される場合、食用卵の生産に使用されるニワトリ、例えば卵型ニワトリ、大衆の肉の消費用に育てられたニワトリ、またはブロイラー、並びに卵および肉の生産用に育てられたニワトリ（「兼用」ニワトリ）等を意味する。「ニワトリ」という用語は、第一次飼育会社により生産されたニワトリ、または大衆の食用卵、肉、若しくは食用卵および肉の消費用に育てられたニワトリの親、祖父母、曽祖父母等であるニワトリを意味する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドカセットが卵を産むまたは乳を生産する動物に投与されると、ポリヌクレオチドカセットを含有するトランスジェニック動物が創出され、この動物はトランスジェニックな多量体タンパク質を生産する。その結果得られた多量体タンパク質が、卵中または乳中に蓄積されることが好ましい。卵中または乳中での多量体タンパク質の蓄積を達成するのに、多種の異なるシグナル配列およびプロモータが使用されてよく、以下にこれらをより詳細に説明する。本発明のポリヌクレオチドカセットを含有するトランスジェニック動物を達成するため、上記ポリヌクレオチドカセットを、任意のベクター、裸のＤＮＡとして用いて個体に投与する、すなわち任意のベクター、裸のＤＮＡとしてまたは任意の送達構築物若しくは溶液中に含有させることができる。個体中へのポリヌクレオチドカセットの取り込みに好ましいベクターは、以下に説明するトランスポゾン系ベクターである。
【００２８】
定義
本明細書中並びに特許請求の範囲で用いる場合、「一つの（ａ）」または「一つの（ａｎ）」は、それが用いられる情況によって、１つまたは複数を意味し得る、と理解されるべきである。したがって例えば「一つの（ａ）細胞」という言及は、少なくとも１つの細胞が利用され得ることを意味し得る。
【００２９】
「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」という用語と互換的に用いられ、かつ一般的に「抗原」または「免疫原」と呼ばれる外来物質の存在に応じて動物または免疫系の細胞により合成されるタンパク質と本明細書中では定義される。抗体という用語は、抗体のフラグメントを包含する。抗体は、抗原上の部位に対する特異的親和性により特性化され、この場合、部位は「抗原決定基」または「エピトープ」と呼ばれる。抗原は、天然であるかまたは人工的に工学処理される。人工的工学処理抗原としては、ハプテン、例えば高分子、例えばタンパク質、核酸または多糖に結合される小分子、例えば小ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。天然抗体の人工的に設計されるかまたは工学処理された変異体、並びに天然には生じない人工的に設計されるかまたは工学処理された抗体は全て、本定義に含まれる。このような変異体としては、同類置換アミノ酸、並びにタンパク質およびポリペプチドに関する節に記載されるようなその他の形態の置換を包含する。
【００３０】
「卵」という用語は、鳥類および爬虫類により生産される多孔性石灰質のまたは堅い殻に取り囲まれた大型雌性細胞を包含する、と本明細書中で定義される。「卵子」という用語は、雌性配偶子と定義され、卵としても既知である。したがって鳥類および爬虫類以外の全ての動物における卵生産は、本明細書中で用いる場合、卵巣からの卵子の生産および排出、あるいは「排卵」と定義される。したがって、「卵」という用語は、本明細書中で用いる場合、鳥類または爬虫類がそれを生産する場合は、多孔性石灰質のまたは堅い殻に取り囲まれた大型雌性細胞と定義され、または、それが他の全ての動物により生産される場合、それは卵子である、と理解されるべきである。
【００３１】
「遺伝子」という用語は本明細書中で、介在配列、例えばイントロンを含むか若しくは
含まない、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチドを含むと定義される。
【００３２】
「多量体タンパク質」という用語は本明細書中で、ジスルフィド結合を含む任意の手段により会合または接合された、１つ以上のポリペプチドを含むと定義される。この型の多量体タンパク質の例は、ジスルフィド結合により会合された重鎖と軽鎖の両方を含有する抗体である。これらの多量体タンパク質は本明細書中で、「会合した多量体タンパク質」と称される。「多量体タンパク質」という用語はまた、２つ以上の目的遺伝子によりコードされるポリペプチドも含む。この型の多量体タンパク質の例は、重鎖ポリペプチド（第一の目的ポリペプチド）および軽鎖ポリペプチド（第二の目的ポリペプチド）を含有する単一ポリペプチドである。これらの実施形態において、種々の目的ポリペプチドは、他のポリペプチド配列、例えばスペーサーポリペプチドおよび切断部位ポリペプチドにより分離されてもよい。これらの型の多量体タンパク質は本明細書中で、「多価多量体タンパク質」と称される。
【００３３】
「乳を生産する動物」という用語は、本明細書中では哺乳動物を指し、例としてはウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。乳を生産する動物としては、ウシ、ラマ、ラクダ、ヤギ、トナカイ、コブウシ、スイギュウ、ヤク、ウマ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「トランスジェニック動物」という用語は、そのＤＮＡ中に組み入れられたトランスポゾン系ベクターＤＮＡの少なくとも一部を有する動物を指す。トランスジェニック動物としてはトランスポゾン系ベクターＤＮＡが生殖系列ＤＮＡ中に組入れられる動物を包含するが、しかしトランスジェニック動物は、任意の期間中、トランスポゾン系ベクターＤＮＡの一部を含有する１つまたは複数の体細胞中のＤＮＡを有する動物も包含する。好ましい実施形態では、トランスポゾン系ベクターの一部は目的遺伝子を含む。さらに好ましくは目的遺伝子は、少なくとも５日間、さらに好ましくは動物の繁殖期間中、最も好ましくは動物の一生の間、動物のＤＮＡ中に組入れられる。さらに好ましい実施形態では、動物は鳥類である。
【００３５】
「ベクター」という用語は、「構築物」、「ＤＮＡ構築物」および「遺伝子構築物」という用語と互換的に用いられて、遺伝子物質の操作、例えば細胞、組織または生物体、例えば鳥中への外因性遺伝子物質のクローニング、サブクローニング、シーケンシングまたは導入（これらに限定されない）のために用いられる合成ヌクレオチド配列を意味する。ベクターは合成ＤＮＡ配列、天然ＤＮＡ配列またはその両方を含有し得る、と当業者に理解される。本発明のベクターは、本明細書中に記載されているようなトランスポゾン系ベクターである。
【００３６】
２つのヌクレオチド配列に言及する場合、一方は調節配列であり、「操作可能に結合される」という用語は、２つの配列が調節配列を他方のヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼさせるように会合される、ということを意味するよう本明細書中で定義される。操作可能に結合された配列は介在配列（単数または複数）を持たずに互いに直接隣接する、ということは必要でない。
【００３７】
「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサーおよびその他の発現制御要素、例えばポリアデニル化配列、マトリックス結合部位、単一構築物上の多遺伝子の発現のためのインシュレーター領域、リボソーム進入／結合領域、発現を増強し得るイントロン、並びにサイレンサーを包含する、と本明細書中で定義される。
【００３８】
トランスポゾン系ベクター
以下の記述に縛られる必要はないが、しかしＤＮＡ構築物の性質はトランスジェニック動物を首尾よく生産するのに重要な因子であると考えられる。全ての種、特に鳥類におけるトランスジェニック作業のためにほとんど普遍的に従来用いられてきた「標準」型のプラスミドおよびウイルスベクターは低効率性を有し、かつ従来観察された低率の形質転換の主な理由を構成し得る。従来用いられたＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物はしばしば、宿主ＤＮＡ中に組み込まず、または低頻度でのみ組み込む。その他の因子は、標的細胞中へのベクターの不十分な進入といったような役割も演じてきたことであろう。本発明は、低トランス遺伝子組込み頻度に関する従来技術の問題を克服する動物に投与され得るトランスポゾン系ベクターを提供する。トランスポザーゼ、目的遺伝子およびその他のポリヌクレオチド配列が導入され得る本発明の２つの好ましいトランスポゾン系ベクターは、ｐＴｎＭＣＳ（配列番号５６）およびｐＴｎＭｏｄ（配列番号５７）と呼ばれる。
【００３９】
本発明のトランスポゾン系ベクターは、従来のベクターで達成されたよりも大きい大きさのオーダーの組込み頻度を生じる。特に従来技術のトランスポゾン系ベクターを用いて実施される精巣内注射（米国特許第５，７１９，０５５号に記載されている）は、４１％の精子陽性雄鶏を生じ、一方、本発明の新規のトランスポゾン系ベクターを用いて実施された精巣内注射は７７％の精子陽性雄鶏を生じた。組込みの実際の頻度は、精子からのＰＣＲシグナルの比較強度並びに定量的ＰＣＲによる精巣および精子の組織学的評価のいずれかまたは両方により概算された。
【００４０】
本発明のトランスポゾン系ベクターは、第一プロモータに操作可能に連結されたトランスポザーゼ遺伝子を含み、第二プロモータに操作可能に結合された所望のタンパク質またはペプチドのコード配列を含み、所望のタンパク質またはペプチドのコード配列およびその操作可能に連結されたプロモータは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポザーゼ挿入配列で隣接される。また、トランスポゾン系ベクターは、以下の１つ以上の特性を含む：ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えずに各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸配列に対する１つ以上のコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する１つ以上の終止コドンの付加；および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強する、トランスポザーゼに操作可能に連結された有効なポリＡの付加。一実施形態において、トランスポゾン系ベクターは、鳥類に最適化したポリＡ配列を含み、ＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を含む改変されたＫｏｚａｋ配列を含まない。かかるトランスポゾン系ベクターの一例としては、ｐＴｎＭＣＳベクター（配列番号５６）がある。別の実施形態において、トランスポゾン系ベクターは、ａ）トランスポザーゼの発現を増強する、第一プロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を含む１つ以上の改変されたＫｏｚａｋ配列；ｂ）対応するアミノ酸を変えずに各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、トランスポザーゼのＮ−末端の最初のいくつかのアミノ酸配列に対する１つ以上のコドンの改変；ｃ）トランスポザーゼ合成の終了を増強する１つ以上の終止コドンの付加；およびｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強する、トランスポザーゼに操作可能に連結される有効なポリＡ配列の付加、を含む。かかるトランスポゾン系ベクターの一例としては、ｐＴｎＭｏｄベクター（配列番号５７）がある。トランスポゾン系ベクターは、別にまたは代替的に、トランスポザーゼに操作可能に連結されたプロモータを含む、任意のプロモータの３’末端に以下の１つ以上のＫｏｚａｋ配列を含む：ＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号５８）、ＡＡＧＡＴＧＴ（配列番号５９）、ＡＣＧＡＴＧＡ（配列番号６０）、ＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号６１）、ＧＡＣＡＴＧＡ（配列番号６２）、ＡＣＣＡＴＧＡ（配列番号６３）、ＡＣＣＡＴＧＡ（配列番号６４）、およびＡＣＣＡＴＧＴ（配列番号６５）。
【００４１】
トランスポザーゼおよび挿入配列
本発明のさらなる実施形態では、トランスポゾン系ベクター中に見出されるトランスポザーゼは、変更標的部位（ＡＴＳ）トランスポザーゼであり、挿入配列はＡＴＳトランスポザーゼにより認識されるものである。しかしながらトランスポゾン系ベクター中に位置するトランスポザーゼは改変ＡＴＳトランスポザーゼに限定されず、任意のトランスポザーゼに由来し得る。従来技術で既知のトランスポザーゼとしては、ＡＣ７、Ｔｎ５ＳＥＱ１、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００（γδ）、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、点状トランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ｄＳｐｍトランスポゾンおよびＩトランスポゾンに見出されるものが挙げられる。本発明に従って、これらのトランスポザーゼおよびそれらの調節配列は、以下の機能改善のために改変される：ａ）トランスポザーゼに操作可能に結合されるプロモータの３’末端にＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）を含む１つまたは複数の改変されたコザック配列の付加；ｂ）トランスポザーゼの最初のいくつかのアミノ酸に関するコドンの変更（この場合、各コドンのうち１つまたは複数の第三塩基は対応するアミノ酸を変更することなくＡまたはＴに変更される）；ｃ）トランスポザーゼ合成の停止を増強するための１つまたは複数の終止コドンの付加；および／またはｄ）トランスポザーゼ遺伝子の発現をさらに増強するためにトランスポザーゼに操作可能に結合される有効ポリＡ配列の付加。
【００４２】
以下の記述に縛られる必要はないが、しかしトランスポザーゼ遺伝子の最初のいくつかのＮ末端コドンの改変は、一部は二本鎖解離を増大することにより、トランスポザーゼ遺伝子の転写を容易にする、と考えられる。コードされたアミノ酸を変えることなく、各コドンの第三塩基がＡまたはＴに変更されるよう、トランスポザーゼの最初のＮ末端コドンの約１〜２０、さらに好ましくは３〜１５、最も好ましくは４〜１２のうち１つまたは複数が改変されるのが好ましい。一実施形態では、トランスポザーゼ遺伝子の最初の１０個のＮ末端コドンがこのようにして改変される。米国特許第５，７１９，０５５号で考察されているように、トランスポザーゼが、それを好ましい挿入部位に低特異性にし、したがってトランス遺伝子の挿入の割合を増大する突然変異を含有するのも好ましい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、トランスポゾン系ベクターは、ベクターＤＮＡのメチル化パターンを変更することにより、特定の宿主中での発現に関して最適化される。例えば原核生物メチル化は、トランスポゾン系ベクターの生産のためにメチル化欠損生物を用いて低減され得る。トランスポゾン系ベクターは、真核生物宿主中での発現に関して真核生物ＤＮＡに似せるためにもメチル化され得る。
【００４４】
同じく改変され、用いられ得る他の類似の真核生物トランスポゾン系ベクターからのトランスポザーゼおよび挿入配列は、例えば米国特許第６，２９１，２４３号に開示されたショウジョウバエＰ因子（P element）由来ベクター、；Sherman et al. (1998)に記載されたショウジョウバエマリナー因子；あるいはＳｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。Hackett et al. (1999); D. Lampe et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11428-11433; S. Fischer et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 6759-6764; L. Zagoraiou et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 11474-11478;およびD. Berg et al. (Eds.), Mobile DNA, Amer. Soc. Microbiol. (Washington, D.C., 1989)も参照されたい。しかしながら、レシピエント種における真核生物トランスポザーゼはトランス遺伝子のまわりにある原核生物挿入配列を認識する可能性が低いので、細菌トランスポゾン系要素が好ましい、ということに留意すべきである。
【００４５】
多数のトランスポザーゼは異なる挿入配列を認識し、したがってトランスポゾン系ベクターは、トランスポゾン系ベクター中にも見出される特定のトランスポザーゼにより認識
される挿入配列を含有する、と理解されるべきである。本発明の好ましい実施形態では、挿入配列は、１００を十分に上回る塩基対を有する挿入配列を典型的に含有する野生型トランスポゾンに見出されるものと比較して、約７０塩基対の長さに短縮されている。
【００４６】
以下に提供される例は、挿入事象後に破壊される「切断および挿入」Ｔｎ１０系ベクターを組入れるが、しかし本発明は、「回転複製」型トランスポゾン系ベクターの使用も包含する。回転複製型トランスポゾンの使用は、トランスポゾン／トランス遺伝子の多コピーを単一トランス遺伝子構築物および挿入されたコピーから作製させる。この型のトランスポゾンベース系はそれにより単一ゲノム中へのトランス遺伝子の多コピーの挿入を提供する。回転複製型トランスポゾン系ベクターは、目的遺伝子に操作可能に結合されるプロモータが宿主細胞に対して内因性であり、かつ高コピー数で存在するかまたは高度に発現される場合に、選択され得る。しかしながら回転複製系の使用は、挿入事象を非致死レベルに限定するための厳しい制御を必要とし得る。Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ９、Ｔｎ２１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ５５１、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０およびＴｎ２６０３は回転複製型トランスポゾンの例であるが、しかしＴｎ５は回転複製並びに切断および挿入型トランスポゾンの両方であり得る。
【００４７】
終止コドンおよびポリＡ配列
一実施形態では、トランスポゾン系ベクターは、トランスポザーゼにおよび／または目的遺伝子に操作可能に結合される２つの終止コドンを含有する。代替的実施形態では、ＵＡＡまたはＵＧＡのうちの１終止コドンがトランスポザーゼにおよび／または目的遺伝子に操作可能に結合される。以下の記述に縛られることは望ましくないが、終止コドンＵＡＧは、翻訳停止において効果的ではないため、本明細書中に記載される構築物において望ましくないと考えられる。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、「有効ポリＡ配列」は、アデニン塩基を含有する多数のおよび連続したヌクレオチド（Ａポリヌクレオチド鎖）を含有し、そしてそれが操作可能に結合される遺伝子の発現を増大する合成または非合成配列を指す。ポリＡ配列は、トランスポゾン系ベクター中の任意の遺伝子、例えばトランスポザーゼ遺伝子および目的遺伝子（これらに限定されない）に操作可能に結合され得る。好ましいポリＡ配列は、宿主動物またはヒトに用いるために最適化される。一実施形態では、ポリＡ配列は、鳥類種、特にニワトリにおける使用のために最適化される。鳥類に最適化したポリＡ配列は一般に、Ａポリヌクレオチド鎖に先行し、それによりＡポリヌクレオチド鎖から終止コドンを分離する最低４０の塩基対、好ましくは約４０〜数百の塩基対、さらに好ましくは約７５の塩基対を含有する。本発明の一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６６で提供されるような、そしてGenBank寄託番号Ｙ００４０７、塩基対１０６５１〜１１０５８から得られるようなコナルブミンポリＡ配列を含む。別の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６７で示される合成ポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６８で提供される鳥類に最適化したポリＡ配列を含む。ニワトリ最適化ポリＡ配列は、合成ポリＡ配列と比較して、ＣＴリピート数の低減も示し得る。
【００４９】
このような鳥類に最適化したポリＡ配列は、非鳥類に最適化したポリＡ配列と比較して、鳥類においてそれが操作可能に結合されるポリヌクレオチドの発現を増大する、ということは、本発明の意外な発見である。したがって本発明は、目的遺伝子の組入れの方法またはその増大を包含し、この場合、目的遺伝子はトランスポザーゼ遺伝子を含有するトランスポゾン系ベクター中に存在し、そしてトランスポザーゼ遺伝子は鳥類に最適化したポリＡ配列に操作可能に結合される。本発明は、鳥類における目的遺伝子の発現の増大方法であって、鳥類に目的遺伝子を投与することを包含する方法も含み、この場合、目的遺伝子は鳥類に最適化したポリＡ配列に操作可能に結合される。鳥類最適化ポリＡヌクレオチド鎖は、Ａポリヌクレオチド鎖、並びにＡポリヌクレオチド鎖に先行する最低４０の塩基
対、好ましくは約４０〜数百の塩基対、さらに好ましくは約７５の塩基対を含有するポリヌクレオチドと本明細書中で定義される。本発明はさらに、鳥類に最適化したポリＡ配列に操作可能に結合される目的遺伝子またはトランスポザーゼ遺伝子を含有するトランスポゾン系ベクターを提供する。
【００５０】
プロモータおよびエンハンサー
トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に結合される第一のプロモータ、並びに目的遺伝子に操作可能に結合される第二のプロモータは、構成性プロモータまたは誘導性プロモータであり得る。構成性プロモータとしては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）最初期プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ライソザイムプロモータ、初期および後期ＣＭＶプロモータ、初期および後期ＨＳＶプロモータ、β−アクチンプロモータ、チューブリンプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、並びに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモータとしては、組織特異的プロモータ、発生的調節プロモータおよび化学的誘導性プロモータが挙げられる。組織特異的プロモータの例としては、グルコース６ホスフェート（Ｇ６Ｐ）プロモータ、ビテロゲニンプロモータ、オボアルブミンプロモータ、オボムコイドプロモータ、コナルブミンプロモータ、オボトランスフェリンプロモータ、プロラクチンプロモータ、腎臓ウロモジュリンプロモータおよび胎盤ラクトゲンプロモータが挙げられる。一実施形態では、ビテロゲニンプロモータは、配列番号６９のポリヌクレオチド配列を包含する。Ｇ６Ｐプロモータ配列は、GenBank寄託番号Ｕ５７５５２．１で提供されるラットＧ６Ｐ遺伝子非翻訳上流領域に起源を有し得る。発生調節プロモータの例としては、ホメオボックスプロモータおよびいくつかのホルモン誘導性プロモータが挙げられる。化学的誘導性プロモータの例としては、生殖ホルモン誘導性プロモータおよび抗生物質誘導性プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータおよび亜鉛誘導性メタロチオニンプロモータが挙げられる。
【００５１】
その他の誘導性プロモータ系としては、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）により誘導可能であるＬａｃオペレーターリプレッサー系（Cronin, A. et al. 2001. Genes and Development, v. 15）、エクジソンベースの誘導系（Hoppe, U.C. et al.
2000. Mol. Ther. 1: 159-164）；エストロゲンベースの誘導系（Braselmann, S. et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1657-1661）；ＧＡＬ４結合ドメインおよび単純ヘルペスウイルス転写活性化ドメインＶＰ１６、並びにリガンドを結合する能力を保持し、そしてＲＵ４８６により作動され得る切頭化形態のヒトプロゲステロン受容体から成るハイブリッドタンパク質であるキメラレギュレーターＧＬＶＰを用いたプロゲステロンベースの誘導系（Wang, et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8180-8184）；遺伝子発現を調節するための二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を用いたＣＩＤベースの誘導系、例えばラパマイシンが細胞タンパク質ＦＫＢ１２およびＦＲＡＰの二量体化を誘導する系（Belshaw, P.J. et al. 1996. J. Chem. Biol. 3: 731-738; Fan, L. et al. 1999. Hum. Gene Ther. 10: 2273-2285; Shariat, S.F. et al. 2001. Cancer Res. 61: 2562-2571; Spencer, D.M. 1996. Curr. Biol. 6: 839-847）が挙げられる。化学的に誘導可能なプロモータを活性化する化学物質は、当業者に既知の任意の方法により目的トランス遺伝子を含有する動物に投与され得る。
【００５２】
細胞または組織特異的並びに構成性プロモータのその他の例としては、平滑筋ＳＭ２２プロモータ、例えばキメラＳＭ２２α／テロキンプロモータ（Hoggatt A.M. et al., 2002. Circ Res. 91(12): 1151-9）；ユビキチンＣプロモータ（Biochim Biophys Acta, 2003. Jan. 3; 1625 (1): 52-63）；Ｈｓｆ２プロモータ；マウスＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）プロモータ；初期Ｂ細胞特異的ｍｂ−１プロモータ（Sigvardsson M., et al., 2002. Mol. Cell Biol. 22(24): 8539-51）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモータ（Yoshimura I. et al., 2002, J. Urol. 168(6): 2659-64）；エクソロ
ドプシンプロモータおよび松果体発現促進要素（Asaoka Y., et al., 2002. Proc. Natl.
Acad. Sci. 99(24): 15456-61）；神経および肝臓セラミダーゼ遺伝子プロモータ（Okino N. et al., 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299(1): 160-6）；ＰＳＰ９４遺伝子プロモータ／エンハンサー（Gabril M.Y. et al., 2002. Gene Ther. 9(23): 1589-99）；ヒトＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子のプロモータ（Kuriki C., et al., 2002. Biol. Pharm. Bull. 25(11): 1476-8）；ＶＬ３０プロモータ（Staplin W.R. et al., 2002. Blood October 24, 2002）；並びにＩＬ−１０プロモータ（Brenner S., et al., 2002. J. Biol. Chem. December 18, 2002）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
鳥類プロモータの例としては、卵白タンパク質、例えばオボアルブミン、オボトランスフェリン（コナルブミン）、オボムコイド、ライソザイム、オボムチン、ｇ２オボグロブリン、ｇ３オボグロブリン、オボフラボプロテイン、オボスタチン（オボマクログロビン）、シスタチン、アビジン、チアミン結合タンパク質、グルタミルアミノペプチダーゼ小糖タンパク質１型、小糖タンパク質２型の発現を制御するプロモータ；並びに卵黄タンパク質、例えばビテロゲニン、極低密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、コバラミン結合タンパク質、リボフラビン結合タンパク質、ビオチン結合タンパク質の発現を制御するプロモータが挙げられるが、これらに限定されない（Awade, 1996. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 202: 1-14）。ビテロゲニンプロモータを用いる利点は、それが動物の生活環の産卵状態中に活性であり、このことが目的タンパク質が適切なターゲッティング配列に装備される場合に卵黄中への目的タンパク質の移入に目的タンパク質の生産を一時的に結合させるという点である。いくつかの実施形態では、鳥類プロモータは卵管特異的プロモータである。本明細書中で用いる場合、「卵管特異的プロモータ」という用語は、オボアルブミン、オボトランスフェリン（コナルブミン）、オボムコイド、ライソザイム、オボムチン、ｇ２オボグロブリン、ｇ３オボグロブリン、オボフラボプロテイン、並びにオボスタチン（オボマクログロビン）プロモータを包含するが、しかしこれらに限定されない。
【００５４】
本発明の肝臓特異的プロモータとしては、以下のプロモータが挙げられるが、これらに限定されない：ビテロゲニンプロモータ、Ｇ６Ｐプロモータ、コレステロール−７−α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ）プロモータ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）プロモータ、プロテインＣ遺伝子プロモータ、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）プロモータ、ビリルビンＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼプロモータ、アルドラーゼＢプロモータ、フリンプロモータ、メタロチオネインプロモータ、アルブミンプロモータおよびインスリンプロモータ。
【００５５】
乳を生産する動物の乳中への目的タンパク質の発現を標的化するために用いられ得るプロモータも、本発明に含まれ、例としてはβラクトグロビンプロモータ、乳清酸性タンパク質プロモータ、ラクトアルブミンプロモータおよびカゼインプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
免疫系の細胞に関連したプロモータも用いられ得る。急性期プロモータ、例えばインターロイキン（ＩＬ）−１およびＩＬ−２が用いられ得る。重鎖および軽鎖Ｉｇのためのプロモータも用いられ得る。Ｔ細胞受容体構成成分ＣＤ４およびＣＤ８のプロモータ、Ｂ細胞プロモータ並びにＣＲ２（２型補体受容体）のプロモータも用いられ得る。免疫系プロモータは、好ましくは、所望のタンパク質が抗体タンパク質である場合に用いられる。
【００５７】
単一プロモータの要素が重複され、改変され、またはその他の方法で変更される改変プロモータ／エンハンサーも、本発明に含まれる。一実施形態では、オボアルブミンプロモータのステロイドホルモン結合ドメインが、約−６．５ｋｂから目的遺伝子の最初の約１０００塩基対内まで移動される。プロモータ中に天然では見いだされないプロモータ／エ
ンハンサー要素による既存のプロモータの改変、並びに完全合成プロモータの構築、あるいは非天然主鎖上での一斉の種々の遺伝子からのプロモータ／エンハンサー要素の複製(drawing)は、全て本発明に包含される。
【００５８】
したがって、本発明のトランスポゾン系ベクター内に含入されるプロモータは完全プロモータ配列またはプロモータ配列のフラグメントであり得る、と理解されるべきである。例えば一実施形態では、目的遺伝子に操作可能に結合されるプロモータは、ニワトリオボアルブミンプロモータの約９００塩基対フラグメントである（配列番号７０）。トランスポゾン系ベクター内に含入される構成性および誘導性プロモータは、ＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）の１つまたは複数の改変されたコザック（Ｋｏｚａｋ）配列の付加によっても改変され得る。
【００５９】
上記のように、本発明は、１つまたは複数のエンハンサーを含有するトランスポゾン系ベクターを含む。これらのエンハンサーは、それらのネイティブプロモータに操作可能に結合され得ることもそうでないこともあり、そしてそれらの操作可能に結合されるプロモータから任意の距離に置かれ得る。エンハンサーに操作可能に結合されるプロモータは、本明細書中では、「増強プロモータ」と呼ばれる。トランスポゾン系ベクター内に含入されるエンハンサーは、好ましくは鳥類に見出されるエンハンサーであり、さらに好ましくはオボアルブミンエンハンサーであるが、しかしこれらの種類のエンハンサーに限定されない。一実施形態では、オボアルブミンプロモータの約６７５塩基対エンハンサー要素がエンハンサーおよびプロモータを分離する３００塩基対のスペーサーＤＮＡと共にオボアルブミンプロモータの上流にクローン化される。一実施形態では、本発明の一部として用いられるエンハンサーは、GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１からのニワトリオボアルブミンエンハンサーの塩基対１〜６７５を含む。このエンハンサーのポリヌクレオチド配列は、配列番号７１で提示される。
【００６０】
キャップ部位およびキャップ部位のフラグメントも、本発明のトランスポゾン系ベクターのうちのいくつかに含まれる。一実施形態では、キャップ部位が存在する約５０塩基対の５’非翻訳領域が、増強プロモータまたはプロモータの３’末端に付加される。５’非翻訳領域の例は、配列番号７２で提示される。この５’非翻訳領域に存在する推定キャップ部位は、好ましくは配列番号７３で提示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
本発明の一実施形態では、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に結合される第一プロモータは構成性プロモータであり、そして目的遺伝子に操作可能に結合される第二プロモータは組織特異的プロモータである。第二の実施形態では、第一構成性プロモータの使用は、トランスポザーゼ遺伝子の構成性活性化並びに事実上全ての細胞型、例えばレシピエント動物の生殖系列への目的遺伝子の組入れを可能にする。目的遺伝子は、一般的に生殖系列中に組入れられるが、組織特異的方式で発現されるに過ぎない。トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に結合される構成性プロモータを有するトランスポゾン系ベクターは任意の経路により投与され、一実施形態では、ベクターは卵巣に、または卵巣に通じる動脈に投与される。別の実施形態では、ベクターは卵管の管腔に、または卵管に供給する動脈に投与される。
【００６２】
本明細書中に記載したような細胞または組織特異的発現は、好ましい細胞または組織以外の細胞または組織中に発現が全く存在しないことを必要としない、ということに留意すべきである。代わりに、「細胞特異的」または「組織特異的」発現は、それぞれ好ましい細胞または組織中での特定の目的遺伝子の発現の大多数を指す。
【００６３】
生殖系列中への目的遺伝子の組入れが好ましくない場合、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に結合される第一プロモータは組織特異的プロモータであり得る。例えば卵管特異
的プロモータ、例えばオボアルブミンプロモータに操作可能に結合されるトランスポザーゼ遺伝子を含有するトランスポゾン系ベクターのトランスフェクションは、卵管の細胞中でのトランスポザーゼ遺伝子の活性化並びに目的遺伝子の組入れを提供するが、しかし一般的に生殖系列およびその他の細胞中での活性化および組入れは提供しない。この実施形態では、目的遺伝子に操作可能に結合される第二プロモータは、構成性プロモータまたは誘導性プロモータであり得る。好ましい実施形態では、第一プロモータおよび第二プロモータは共にオボアルブミンプロモータである。組織特異的発現または組入れが望ましい実施形態では、トランスポゾン系ベクターは目的組織に、または目的組織に通じる動脈に直接投与されることが好ましい。好ましい実施形態では、目的組織は卵管であり、そして投与は卵管の管腔または卵管に通じる動脈への直接注射により達成される。さらなる好ましい実施形態では、投与は、卵管の筒状部または漏斗の管腔中への直接注射により達成される。
【００６４】
したがって細胞特異的プロモータは、選定された組織中での転写を増強するために用いられ得る。例えば鳥類では、ファロピウス管の細胞中に見出されるプロモータ、例えばオボアルブミン、コナルブミン、オボムコイドおよび／またはライソザイムは、ファロピウス管の上皮細胞および管状腺細胞中の目的遺伝子の転写を保証して、遺伝子によりコードされる所望のタンパク質の合成並びに卵白中への蓄積を生じさせるためにベクターの中で用いられ得る。哺乳動物では、乳腺の腺胞の上皮細胞に特異的なプロモータ、例えばプロラクチン、インスリン、βラクトグロビン、乳清酸性タンパク質、ラクトアルブミン、カゼインおよび／または胎盤ラクトゲンが、乳中への蓄積のための所望のタンパク質の生産のためのこれらの細胞のトランスフェクションに用いられるベクターの設計に用いられる。肝細胞では、タンパク質生産のための目的遺伝子の転写を駆動するために、Ｇ６Ｐプロモータが用いられ得る。鳥類の肝臓中で製造されるタンパク質は、卵黄に送達され得る。
【００６５】
トランスポザーゼ遺伝子のより高度のまたはより効率的な発現を達成するために、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に結合されるプロモータおよびその他の調節配列は、宿主由来のものであり得る。これらの宿主特異的調節配列は、上記のように組織特異的であり得るし、あるいは構成性のものであり得る。例えば鳥類アクチンプロモータおよびその関連ポリＡ配列は、鳥類へのトランスフェクションのためのトランスポゾン系ベクター中のトランスポザーゼに操作可能に結合され得る。トランスポザーゼに操作可能に結合され得るその他の宿主特異的プロモータの例としては、ミオシンおよびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼプロモータが挙げられる。
【００６６】
指示配列（Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）
本発明のいくつかの実施形態では、目的遺伝子は、指示配列または目的遺伝子によりコードされる所望のタンパク質に適正立体配座を提供する配列に操作可能に結合される。本明細書中で用いる場合、「指示配列」という用語は、シグナル配列およびターゲッティング配列の両方を指す。卵指示配列としては、オボムコイドシグナル配列、オボアルブミンシグナル配列、セクロピンプレプロシグナル配列、およびビテロゲニンターゲッティング配列が挙げられるが、これらに限定されない。「シグナル配列」という用語は、それが真核生物中の小胞体、さらに好ましくは小胞体中の転移孔、または原核生物中の形質膜、または例えばミトコンドリア性疾患のための遺伝子療法のためにミトコンドリアに結合されるタンパク質を生産させる（direct）アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、その一部若しくはその全体を指す。シグナルおよびターゲッティング配列は、例えばトランスポゾン系ベクターが乳を生産する動物に投与される場合、乳中に所望のタンパク質を生産させるために用いられ得る。
【００６７】
シグナル配列は、例えばトランスポゾン系ベクターが鳥類またはその他の卵を産む動物に投与される場合、卵黄または卵白中への組入れのための分泌経路中に所望のタンパク質
を生産させるためにも用いられ得る。本発明は、シグナル配列を含有する二次遺伝子に操作可能に結合される目的遺伝子も包含する。このような実施形態の一例は、この場合、目的遺伝子はオボアルブミンシグナル配列を含有するオボアルブミン遺伝子に操作可能に結合される。トランスポゾン系ベクター中に含まれ得るその他のシグナル配列としては、オボトランスフェリンおよびライソザイムシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シグナル配列はオボアルブミンシグナル配列、例えば配列番号７４で示される配列である。別の実施形態では、シグナル配列は、配列番号７５または配列番号７６で示される配列を含む短かい(shortened)オボアルブミンシグナル配列である。
【００６８】
本明細書中でさらにまた用いる場合、「ターゲッティング配列」という用語は、アミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指し、このアミノ酸配列は細胞の外側に位置する受容体により認識される。受容体とターゲッティング配列との結合は、細胞によるターゲッティング配列に操作可能に結合されたタンパク質またはペプチドの取込みを生じる。ターゲッティング配列の一例は、卵母細胞の外側上のビテロゲニン受容体（または低密度リポタンパク質受容体）により認識されるビテロゲニンターゲッティング配列である。一実施形態では、ビテロゲニンターゲッティング配列としては配列番号７７のポリヌクレオチド配列が挙げられる。別の実施形態では、ビテロゲニンターゲッティング配列としては、ビテロゲニン遺伝子の全部または一部が挙げられる。その他のターゲッティング配列としては、ＶＬＤＬおよびＡｐｏ  Ｅが挙げられ、これらもビテロゲニン受容体と結合し得る。ＡｐｏＥタンパク質は鳥類では内因的に発現されないため、その存在は本発明のトランスポゾン系ベクターを保有する鳥を同定するために有益に用いられ得る。
【００６９】
目的遺伝子
ポリヌクレオチドカセットの目的遺伝子は、いかなる遺伝子でもよく、好ましくは多量体タンパク質の部分をコードする遺伝子である。目的遺伝子は、目的遺伝子の最初のいくつかのＮ−末端アミノ酸配列におけるコドンの改変を含んでよく、対応するアミノ酸を変えずに各コドンの３番目の塩基がＡからＴに変わる、目的の遺伝子の最初のいくつかのＮ−末端のアミノ酸配列に対するコドンの改変を含有してもよい。一実施形態において、目的遺伝子は、抗体遺伝子または抗体遺伝子の部分である。図２は、２つの目的遺伝子として抗体の重鎖および抗体の軽鎖を含むポリヌクレオチドカセットの概略図を示す。本発明のポリヌクレオチドカセットに使用されるまたは本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされる抗体は、これらに限定されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、λ鎖、κ鎖、二重特異性抗体、およびそれらのフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｃフラグメント、およびＦａｂフラグメント、並びに二量体、三量体、オリゴ体型の抗体フラグメントが挙げられる。所望の抗体は、これらに限定されないが、自然に生じる抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、自己抗体およびハイブリッド抗体が挙げられる。自然に生じる抗体の改変された変種またはそれらのフラグメントをコードする遺伝子および人工的に設計された抗体またはそれらのフラグメントをコードする遺伝子は、本発明のトランスポゾン系ベクターに組み込まれ得る。また、所望の抗体は、特異的リガンドに結合する能力のある抗体、例えば癌関連分子と会合するタンパク質に対する抗体（抗ｈｅｒ２または抗ＣＡ１２５等）が挙げられる。したがって、本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖およびＩｇの軽鎖をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドカセットを包含する。
【００７０】
本発明を用いて生産され得る抗体は、これらに限定されないが、特異的抗原に対する癌免疫療法に使用するための、または感染性疾患または毒物に対する動物またはヒトに受動免疫を与えるための、抗体が挙げられる。本発明の方法を用いて調製される抗体は、当業者に既知の手段により検出されてもよい特異的な標識を有するように設計されてもよい。例えば、抗体は、特異的波長に暴露されて検出されるように結合された、蛍光標識で標識
されてもよい。かかる標識抗体は、特異的抗原に向けられた一次抗体、例えばローダミン標識ウサギ抗成長ホルモンでよく、または標識二次抗体、例えば蛍光標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧでもよい。かかる標識抗体は当業者に既知である。抗体は、当業者に既知の手段により精製に有用な特異的配列を有するように設計されてもよい。また、抗体への結合に有用な標識も、当業者に既知である。これらの標識には、「Handbook of Fluorescent Probes and Research Products」, ninth edition, Richard P. Haugland (ed) Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)（これは全体が本明細書により援用される）に記載される。本発明を用いて生産される抗体は、放射免疫測定、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫親和性カラムおよび当業者に既知の抗体を必要とする他の手法を含む非常に多くの用途に、実験用試薬として使用されてもよい。かかる抗体は、標識されていてもまたは標識されていなくてもよい、一次抗体、二次抗体、および三次抗体が挙げられる。
【００７１】
本発明を実施することにより作成され得るさらなる抗体には、一次抗体、二次抗体、デザイナー抗体、抗タンパク質抗体、抗ペプチド抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＲＮＡ抗体、抗ホルモン抗体、抗下垂体刺激ペプチド、非天然抗原に対する抗体、抗脳下垂体前葉ホルモン抗体、抗脳下垂体後葉ホルモン抗体、抗毒液抗体、抗腫瘍マーカー抗体、並びに抗ウィルス、抗菌、抗原生動物、抗真菌、駆虫性、抗受容体、抗脂質、抗リン脂質、抗成長因子、抗サイトカイン、抗モノカイン、抗イディオタイプ、および抗アクセサリー（提示）タンパク質抗体を含む、感染症に関連するエピトープに対する抗体が含まれるが、それらに限定されない。軽鎖であれ、重鎖であれ、本発明により作成される抗体を用いて、酵素活性を阻害してもよい。
【００７２】
本発明を用いて生成され得る抗体には、以下のタンパク質に対して作成された抗体が含まれるが、それらに限定されない。ウシγ−グロブリン、血清；ウシＩｇＧ、血漿；ニワトリγ−グロブリン、血清；ヒトγ−グロブリン、血清；ヒトＩｇＡ、血漿；ヒトＩｇＡ1、ミエローマ；ヒトＩｇＡ2、ミエローマ；ヒトＩｇＡ2、血漿；ヒトＩｇＤ、血漿；ヒトＩｇＥ、ミエローマ；ヒトＩｇＧ、血漿；ヒトＩｇＧ、Ｆａｂフラグメント、血漿；ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、血漿；ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント、血漿；ヒトＩｇＧ1、ミエローマ；ヒトＩｇＧ2、ミエローマ；ヒトＩｇＧ3、ミエローマ；ヒトＩｇＧ4、ミエローマ；ヒトＩｇＭ、ミエローマ；ヒトＩｇＭ、血漿；ヒトイムノグロブリン、軽鎖κ、尿；ヒトイムノグロブリン、軽鎖κおよびλ、血漿；マウスγ−グロブリン、血清；マウスＩｇＧ、血清；マウスＩｇＭ、ミエローマ；ウサギγ−グロブリン、血清；ウサギＩｇＧ、血漿；およびラットγ−グロブリン血清。一実施形態では、トランスポゾン系ベクターは、ヒトセミノプロテインに対して特異性を示すマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖のコード配列（軽鎖および重鎖に対して、それぞれGenBank寄託番号ＡＹ１２９００６およびＡＹ１２９３０４）を有する。
【００７３】
他の抗体を認識し、かつ本発明を用いて生成され得る抗体のさらなる非限定的なリストは以下の通りである。抗ニワトリＩｇＧ、重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖特異的（ヒツジ）；抗ヤギγ−グロブリン（ロバ）；抗ヤギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（ウサギ）；抗モルモットγ−グロブリン（ヤギ）；抗ヒトＩｇ、軽鎖、タイプκ特異的；抗ヒトＩｇ、軽鎖、タイプλ特異的；抗ヒトＩｇＡ、α鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＡ、Ｆａｂフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＡ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＡ、分泌性；抗ヒトＩｇＥ、ε鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＥ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ、ＨおよびＬ鎖特異的（ヤギ）；抗ヒトＩｇＧ1、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ2、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ2、Ｆｄフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＧ3、ヒンジ特異的；抗ヒトＩｇＧ4、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＭ、Ｆｃフラグメント特異的；抗ヒトＩｇＭ、μ鎖特異的；抗マウスＩｇＥ、ε鎖特異的；抗マウスγ−グロ
ブリン（ヤギ）；抗マウスＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＧ、γ鎖特異的（ヤギ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；抗マウスＩｇＧ、ＨおよびＬ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＭ、μ鎖特異的（ヤギ）；抗マウスＩｇＭ、ＨおよびＬ鎖特異的（ヤギ）；抗ウサギγ−グロブリン（ヤギ）；抗ウサギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（ヤギ）；抗ウサギＩｇＧ、ＨおよびＬ鎖特異的（ヤギ）；抗ラットγ−グロブリン（ヤギ）；抗ラットＩｇＧ、ＨおよびＬ鎖特異的；抗アカゲザルγ−グロブリン（ヤギ）；および抗ヒツジＩｇＧ、ＨおよびＬ鎖特異的。
【００７４】
特定のリガンドと結合する抗体も生成され得る。例示的なリガンドは以下の通りである。アデノメジュリン、アミリン、カルシトニン、アミロイド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、胃酸分泌抑制ペプチド、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン、インターフェロン、コルチスタチン、ソマトスタチン、エンドセリン、サラフォトキシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ニューロキニン、サブスタンスＰ、レプチン、神経ペプチドＹ、メラニン凝集ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オルファニン、エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、エンケファリン、ロイモルフィン、ペプチドＦ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、上皮小体ホルモン、ウロコルチン、コルチコトロピン放出ホルモン、ＰＨＭ、ＰＨＩ、血管活性腸管ポリペプチド、セクレチン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、アンジオスタチン、ボンベシン、エンドスタチン、ブラジキニン、ＦＭＲＦアミド、ガラニン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）関連ペプチド、ＧｎＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン、インヒビン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モチリン、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレッシン、オステオカルシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、ペプチドＹＹ、プロオピオメラノコルチン、形質転換成長因子、血管内皮増殖因子、小胞性モノアミン輸送体、小胞性アセチルコリン輸送体、グレリン、ＮＰＷ、ＮＰＢ、Ｃ３ｄ、プロキネチカン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、β−リポトロピン、メラトニン、カリクライン、キニン、プロスタグランジン、エリスロポエチン、ｐ１４６（配列番号７８、アミノ酸配列、配列番号７９、ヌクレオチド配列）、エストロゲン、テストステロン、コルチコステロイド、鉱質コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、胸腺ホルモン、結合組織タンパク質、核タンパク質、アクチン、アビジン、アクチビン、アグリン、アルブミン、並びにそれらのプロホルモン、プロペプチド、スプライス変異体、フラグメントおよび類似体。
【００７５】
以下は、本発明の方法により生成され得るさらに別の非限定的な抗体である。アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）、アブシキシマブ抗血小板凝集モノクローナル抗体、抗ＣＤ１１ａ（ｈｕ１１２４）、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）抗体、抗ジゴキシン抗体、抗Ｂ型肝炎抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、ＧＤ３糖脂質に対する抗イディオタイプ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ−２Ｒ抗体、転移抑制ガン抗体（ｍＡｂ１７−１Ａ）、抗狂犬病抗体、抗呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）抗体、抗Ｒｈ抗体、抗ＴＣＲ、抗ＴＮＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体およびそのＦａｂ断面、ガラガラヘビ毒液抗体、クロゴケグモ毒液抗体、サンゴヘビ毒液抗体、超後期抗原−４（ＶＬＡ−４）に対する抗体、ＥＧＦ受容体に対するＣ２２５ヒト化抗体、ＴＮＦαに対するキメラ（ヒトおよびマウス）抗体、ヒト血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体、ガンマグロブリン、抗Ｂ型肝炎イムノグロブリン、ヒト抗Ｄイムノグロブリン、黄色ブドウ球菌に対するヒト抗体、ヒト破傷風イムノグロブリン、上皮成長受容体−２に対するヒト化抗体、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに対するヒト化抗体、ヒト化抗体ＣＴＬＡ４ＩＧ、ＩＬ−２Ｒα−鎖に対するヒト化抗体、ヒト化抗ＣＤ４０−リガンドモノクローナル抗体（５ｃ８）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、ラウス肉腫ウィルスに対するヒト化ｍＡｂ、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）に対するヒト化組み換え抗体（ＩｇＧ１ｋ）、リンパ球イムノグロブリン（抗胸線細胞抗体）、リンパ球イムノグロブリン、因子ＶＩ
Ｉに対するｍＡｂ、ＨＥＲ−２に対するＭＤＸ−２１０二重特異性抗体、ＭＤＸ−２２、腫瘍上のＴＡＧ−７２に対するＭＤＸ−２２０二重特異性抗体、ＦｃγＲ１受容体に対するＭＤＸ−３３抗体、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性抗体、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性ヒト化抗体、ＭＤＸ−ＲＡ免疫毒素（リシンＡ結合）抗体、Ｔ細胞上のＣＤ２受容体に対するＭｅｄｉ−５０７抗体（ＢＴＩ−３２２のヒト化形態）、モノクローナル抗体ＬＤＰ−０２、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体、ＯＫＴ３（「ムロモナブ−ＣＤ３」）抗体、ＰＲＯ５４２抗体、ＲｅｏＰｒｏ（「アブシキシマブ」）抗体、およびＴＮＦ−ＩｇＧ融合タンパク質。
【００７６】
本発明の使用により製造され得る抗体の別の非限定的リストは、Phoenix Pharmaceuticals, Inc.（www.phoenixpeptide.com; 530 Harbor Boulevard, Belmont, CA）、Peninsula Labs（San Carlos CA）、SIGMA（St.Louis, MO www.sigma-aldrich.com）、Cappel ICN（Irvine, California, www.icnbiomed.com）およびCalbiochem（La Jolla, California,
www.calbiochem.com）といった会社の製品カタログに提示されており、それらは全て、全体の参照により本明細書に援用される。これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、科学文献、特許、およびデータベース、例えばGenBankから得ることができる。あるいは当業者は、所望の抗体中の各アミノ酸をコードするコドンを選択することにより、抗体ポリヌクレオチド配列を設計してもよい。
【００７７】
タンパク質およびペプチドホルモンをコードする遺伝子は、本発明における目的遺伝子の好ましいクラスである。かかるタンパク質およびペプチドホルモンは、エンドクリン系により合成され、限定されないが、視床下部ホルモンおよび脳下垂体刺激ホルモン、下垂体の前葉、中葉および後葉ホルモン、膵島ホルモン、胃腸で生産されるホルモン、腎臓ホルモン、胸腺ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質および髄質ホルモンが挙げられる。具体的には、本発明を用いて生産されることが可能なホルモンは、限定されないが、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン、エリトロポイエチン、グルカゴン、ＩＧＦ−１、オキシトシン、血小板由来増殖因子、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、ゴナドトロピン放出ホルモンおよびそれらの類似体、バソプレシン、オクトレオチド、ソマトスタチン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激放出ホルモン（ＴＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ドーパミン、メラトニン、サイロキシン（Ｔ4）、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）、グルココルチコイド（例えばコルチゾール）、ミネラルコルチコイド（例えばアルドステロン）、アンドロゲン（例えばテストステロン）、アドレナリン（エピネフリン）、ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）、エストロゲン（例えばエストラジオール、プロゲステロン）、グルカゴン、カルシトロール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、神経ペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ3-36、アンジオテンシノーゲン、トロンボポイエチンおよびレプチンが挙げられる。適切なポリヌクレオチド配列を用いることにより、種特異的ホルモンがトランスジェニック動物により生産され得る。
【００７８】
本発明の一実施形態において、目的遺伝子はプロインスリン遺伝子であり、所望の分子はインスリンである。プロインスリンは、３つの部分、すなわちＣペプチドおよび共に連結してインスリン分子を形成する２本のアミノ酸鎖（αとβ鎖）からなる。これらの実施形態において、プロインスリンは、卵管の管状腺細胞に発現し、その後卵白に沈着する。プロインスリンポリヌクレオチド配列の一例としては、配列番号８０に示され、Ｃペプチド切断部位は３１位のＡｒｇから６５位のＡｒｇまでにわたる。
【００７９】
さらに、免疫系により合成されるタンパク質およびペプチド、例えば胸腺、リンパ節、脾臓および胃腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）系により合成されるものをコードする目的遺伝子が、本発明に包含される。本発明のポリヌクレオチドカセットを用いてトランスジェ
ニック動物中で製造され得る免疫系タンパク質およびペプチドタンパク質としては、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、α−インターフェロンＡ、α−インターフェロン１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に含まれるその他のサイトカインとしては、カルジオトロフィン、ストロマ細胞由来因子、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、メラノーマ成長刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、２、３α、３β、４および５が挙げられる。
【００８０】
また、細胞を溶解するペプチド（例えばｐ１４６）をコードする遺伝子は、本発明の目的遺伝子に含まれる。一実施形態において、ｐ１４６ペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。また、本発明は、配列番号７９の配列を有するｐ１４６核酸を含むポリヌクレオチドカセットを包含する。
【００８１】
酵素は、本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされ得る別のクラスのタンパク質である。かかる酵素としては、アデノシンデアミナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ、ラクターゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、パンクレアチン、パパイン、ストレプトキナーゼＢ、サブチリシン、スーパーオキシドジスムターゼ、トロンビン、トリプシン、ウロキナーゼ、フィブリノリジン、グルコセレブロシダーゼおよびプラスミノーゲン活性因子が挙げられるが、これらに限定されない。酵素が有害作用を有し得るいくつかの実施形態では、機能性酵素の発現を防止するために、付加的アミノ酸およびプロテアーゼ切断部位が目的の酵素のカルボキシ末端に付加される。プロテアーゼによる酵素のその後の消化は、酵素の活性化を生じる。
【００８２】
細胞外マトリックスタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされ得る所望のタンパク質の一クラスである。例としては、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、ラミニンおよびフィブロネクチン並びにそれらのサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内タンパク質および構造タンパク質は、本発明におけるその他のクラスの所望のタンパク質である。
【００８３】
成長因子は本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされ得る別の所望クラスのタンパク質であり、例としては、形質転換増殖因子−α（「ＴＧＦ−α」）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ酸性アイソフォーム１および２、ＦＧＦ塩基性型２、並びにＦＧＦ４、８、９および１０、神経成長因子（ＮＧＦ）、例えばＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓおよびβＮＧＦ、並びにニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、赤血球の生産の刺激のための増殖因子、白血球の生産の刺激のための増殖因子、骨成長因子（ＢＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、肝細胞増殖因子、神経膠細胞神経栄養増殖因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦα、β、β１、β２、β３、骨格成長因子、骨マトリックス由来増殖因子、骨由来増殖因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
製造され得る別の望ましいクラスのタンパク質は本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされ、レプチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、腫瘍壊死因子αおよびβ、ＥＮＢＲＥＬ、アンジオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、骨形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質２および７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、
並びにオステオカルシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
目的遺伝子によりコードされるタンパク質のさらに別の所望のクラスは、アルブミン、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ）（接触活性化コファクター；フィッツジェラルド（Fitzgerald）、Ｆｌａｕｊｅａｃ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ因子）、因子Ｉ（フィブリノゲン）、因子ＩＩ（プロトロンビン）、因子ＩＩＩ（組織因子）、因子ＩＶ（カルシウム）、因子Ｖ（プロアクセレリン、不安定因子、促進性（Ａｃ−）グロブリン）、因子ＶＩ（Ｖａ）（アクセレリン）、因子ＶＩＩ（プロコンベルチン）、血清プロトロンビン変換促進因子（ＳＰＣＡ）、（コトロンボプラスチン）、因子ＶＩＩＩ（抗血友病因子Ａ、抗血友病グロブリン（ＡＨＧ））、因子ＩＸ（クリスマス因子、抗血友病因子Ｂ、血漿トロンボプラスチン成分（ＰＴＣ））、因子Ｘ（スチュアート−プロ−ワー因子）、因子ＸＩ（血漿トロンボプラスチン前駆体（ＰＴＡ））、因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）、因子ＸＩＩＩ（ロトランスグルタミナーゼ、フィブリン安定因子（ＦＳＦ）、フィブリノリガーゼ）、フォン・ウィルブランド因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩを含む、血液タンパク質または凝固カスケードタンパク質である。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされ得るペプチドおよびタンパク質の非限定的一覧表は、Phoenix Pharmaceuticals, Inc.（www.phoenixpeptide.com; 530 Harbor Boulevard, Belmont, CA）、Peninsula Labs（San Carlos CA）、SIGMA（St.Louis, MO www.sigma-aldrich.com）、Cappel ICN（Irvine, California, www.icnbiomed.com）およびCalbiochem（La Jolla, California, www.calbiochem.com）といった会社の製品カタログに提示されている。これらの目的タンパク質およびペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、科学文献、特許、およびデータベース、例えばGenBankから得られる。あるいは当業者は、所望のタンパク質またはペプチド中の各アミノ酸をコードするコドンを選択することにより、ゲノム中に組入れられるべきポリヌクレオチド配列を設計してもよい。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードこれら所望のタンパク質またはペプチドの中には、以下のものが含まれるがそれらに限定されない。アドレノメジュリン、アミリン、カルシトニン、アミロイド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、胃酸分泌抑制ペプチド、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン、インターフェロン、コルチスタチン、ソマトスタチン、エンドセリン、サラフォトキシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インシュリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ、ＣＮＰ、ニューロキニン、サブスタンスＰ、レプチン、ニューロペプチドＹ、メラニン凝集ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オルファニン、エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、ロイモルフィン、ペプチドＦ、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ関連ペプチド、上皮小体ホルモン、ウロコルチン、コルチコトロビン放出ホルモン、ＰＨＭ、ＰＨＩ、血管活性腸管ポリペプチド、セクレチン、ＡＣＴＨ、アンジオテンシン、アンジオスタチン、ボンベシン、エンドスタチン、ブラジキニン、ＦＭＲＦアミド、ガラニン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）関連ペプチド、ＧｎＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン、インヒビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モチリン、ニューロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、オステオカルシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、ペプチドＹＹ、プロオピオメラノコルチン、形質転換成長因子、血管内皮成長因子、水疱性モノアミントランスポーター、水疱性アセチルコリントランスポーター、グレリン、ＮＰＷ、ＮＰＢ、Ｃ３ｄ、プロキネチカン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、ベータ−リポトロピン、メラトニン、カリクレイン、キニン、プロスタグランジン、エリスロポイエチン、ｐ１４６（配列番号７８、アミノ酸配列、配列番号７９、ヌクレオチド配列）、胸線ホルモン、結合組織タンパク質、核タンパク質、アクチン、アビジン、アクチビン、アグ
リン、アルブミン、アポリポタンパク質、アポリポタンパクＡ、アポリポタンパクＢ、並びにそれらのプロホルモン、プロペプチド、スプライスバリアント、フラグメント、および類似体。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされ得る他の所望のタンパク質には、バシトラシン、ポリミキシンｂ、バンコマイシン、シクロスポリン、抗ＲＳＶ抗体、アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）、抗サイトメガロウィルス抗体、抗肝炎抗体、抗阻害剤凝固剤複合体、抗狂犬病抗体、抗Ｒｈ（Ｄ）抗体、アデノシンデアミナーゼ、抗ジゴキシン抗体、抗ガラガラヘビ科毒素（ガラガラヘビ毒液抗体）、抗ゴケグモ属毒素（クロゴケグモ毒液抗体）、抗ミクルルス属（micrurus）毒素（サンゴヘビ毒液抗体）、アプロチニン、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、ジフテリア抗毒素、リンパ球免疫グロブリン（抗胸線細胞抗体）、プロタミン、チロトロピン、カプレオマイシン、α−ガラクトシダーゼ、グラミシジン、ストレプトキナーゼ、破傷風トキソイド、チロトリシン、ＩＧＦ−１、水疱ワクチンのタンパク質、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−２ｒ抗体、抗ＨＥＲ−２抗体、ＯＫＴ３（「ムロモナブ−ＣＤ３」）抗体、ＴＮＦ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲｅｏＰｒｏ（「アブシキシマブ」）抗体、ＡＣＴＨフラグメント１−２４、デスモプレッシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ヒストレリン、ロイプロリド、リプレシン、ナファレリン、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａを血小板に結合させるペプチド（インテグリリン）、ゴセレリン、カプレオマイシン、コリスチン、抗呼吸器合胞体ウィルス、リンパ球免疫グロブリン（チモグロビン、アトガム）、パノレックス、アルファ−アンチトリプシン、ボツリニン、肺胞界面活性剤タンパク質、腫瘍壊死受容体−ＩｇＧ融合タンパク質（エンブレル）、ゴナドレリン、インフルエンザワクチンのタンパク質、ロタウィルスワクチンのタンパク質、ヘモフィルスｂ共役ワクチンのタンパク質、ポリオウィルスワクチンのタンパク質、肺炎球菌共役ワクチンのタンパク質、髄膜炎菌性Ｃワクチンのタンパク質、インフルエンザワクチンのタンパク質、巨大核細胞成長および発達因子（ＭＧＤＦ）、ニューロイムノフィリンリガンドＡ（ＮＩＬ−Ａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、レプチン（原生）、レプチンＢ、レプチンＣ、ＩＬ−１ＲＡ（インターロイキン−１ＲＡ）、Ｒ−５６８、新規赤血球生成促進タンパク質（ＮＥＳＰ）、ラウス肉腫ウィルスに対するヒト化ｍＡｂ（ＭＥＤＩ−４９３）、グルタミル−トリプトファンジペプチドＩＭ８６２、ＬＦＡ−３ＴＩＰ免疫抑制薬、ヒト化抗ＣＤ４０−リガンドモノクローナル抗体（５ｃ８）、ゲルソニン酵素、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、髄膜炎Ｂワクチンのタンパク質、転移抑制ガン抗体（ｍＡｂ１７−１Ａ）、ＴＮＦαに対するキメラ（ヒトおよびマウス）ｍＡｂ、因子ＶＩＩに対するｍＡｂ、リラキシン、カプレオマイシン、グリコペプチド（ＬＹ３３３３２８）、組み換えヒト活性化タンパク質Ｃ（ｒｈＡＰＣ）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、アルテパーゼ、抗ＣＤ２０抗体、Ｃ２Ｂ８抗体、インシュリン様成長因子−１、心房性ナトリウム利尿ペプチド（アナリタイド）、テネクタプラーゼ、抗ＣＤ１１ａ抗体（ｈｕ１１２４）、抗ＣＤ１８抗体、ｍＡｂＬＤＰ−０２、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＡｂのＦａｂフラグメント、ＡＰＯ２リガンド（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発因子）、γＴＧＦ−β（形質転換成長因子−β）、アルファ−アンチトリプシン、アナナイン（パイナップル酵素）、ヒト化ｍＡｂ  ＣＴＬＡ４ＩＧ、ＰＲＯ５４２（ｍＡｂ）、Ｄ２Ｅ７（ｍＡｂ）、子ウシ腸アルカリホスファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｌ−ガラクトシダーゼ（ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、骨形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＨＩＶワクチンのタンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ペプチドワクチン、ＴＣＲペプチド、Ｖベータ３およびＶベータ１３．１．（ＩＲ５０２）、（ＩＲ５０１）、超後期抗原−４（ＶＬＡ−４）に対するＢＩ１０５０／１２７２ｍＡｂ、ＥＧＦ受容体に対するＣ２２５ヒト化ｍＡｂ、ＧＤ３糖脂質に対する抗イディオタイプ抗体、ピロリ菌に対する抗菌性ポリペプチド、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性ヒト化ｍＡｂ、抗サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Ｍｅｄｉ−４９１  Ｂ１９パルボウィルスワクチン、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）に対するヒト化組み換えｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）、尿
路感染ワクチン（大腸菌株の「線毛」に対する）、ボレリア・ブルグドルフェリタンパク質に対するライム病ワクチンのタンパク質（ＤｂｐＡ）、Ｍｅｄｉ−５０１ヒト乳頭腫ウィルス−１１ワクチン（ＨＰＶ）のタンパク質、肺炎連鎖球菌ワクチン、Ｔ細胞上のＣＤ２受容体に対するＭｅｄｉ−５０７  ｍＡｂ（ＢＴＩ−３２２のヒト化形態）、ＦｃγＲ１受容体に対するＭＤＸ−３３  ｍＡｂ、ＭＤＸ−ＲＡ免疫毒素（リシンＡ結合）ｍＡｂ、ＨＥＲ−２に対するＭＤＸ−２１０二重特異性ｍＡｂ、ＥＧＦ受容体に対するＭＤＸ−４４７二重特異性ｍＡｂ、ＭＤＸ−２２、腫瘍上のＴＡＧ−７２に対するＭＤＸ−２２０二重特異性ｍＡｂ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（モルグラモスチム）、ＩＬ−２Ｒα−鎖に対するヒト化ｍＡｂ（バシリキシマブ）、ＩｇＥに対するｍＡｂ（ＩＧＥ０２５Ａ）、ミエリン塩基性タンパク変性ペプチド（ＭＳＰ７７１Ａ）、上皮成長受容体−２に対するヒト化ｍＡｂ、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに対するヒト化ｍＡｂ、低分子量ヘパリン、抗血友病因子、および殺細菌性透過性増大作用タンパク質（ｒ−ＢＰＩ）。
【００８９】
本発明を用いて生産され得る他の多量体タンパク質は、以下の通りである：ＤＮＡの合成または複製に関与する因子（例えばＤＮＡポリメラーゼαおよびＤＮＡポリメラーゼδ）；ｍＲＮＡの生産に関与するタンパク質（例えばＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＨ）；細胞、核または他の、膜会合タンパク質（例えばホルモンおよび他のシグナル伝達受容体、活性輸送タンパク質およびイオンチャネル、ヘモグロビン、フィブリノゲンおよびフォン・ヴィレブランド因子を含む血液中の多量体タンパク質）；細胞内で構造を形成するタンパク質（例えばアクチン、ミオシンおよびチューブリン、および他の細胞骨格タンパク質）；細胞外環境で構造を形成するタンパク質（例えばコラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチン）；細胞内外輸送に関与するタンパク質（例えばキネシン、ダイニン、ＳＮＡＲＥファミリーのタンパク質（可溶性ＮＳＦ結合タンパク質受容体）およびクラスリン；クロマチン構造の制御を助長するタンパク質（例えばヒストンおよびプロタミン、Ｓｗｉ３ｐ、Ｒｓｃ８ｐおよびモイラ（moira)）；多量体転写因子（例えば、Ｆｏｓ、ＪｕｎおよびＣＢＴＦ（ＣＣＡＡＴボックス転写因子）；多量体酵素（アセチルコリンエステラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ）；シャペロンタンパク質（例えばＧｒｏＥ、Ｇｒｏ  ＥＬ（シャペロニン６０）およびＧｒｏ  ＥＳ（シャペロニン１０））；抗毒素（例えばヘビ毒液（venom)、ボツリヌス毒、黄色ブドウ球菌スーパー抗原；リシン（バクテリオファージおよびウイルス由来の酵素）；並びにアロステリックタンパク質。
【００９０】
本発明を用いて製造される多量体タンパク質は、当業者に既知の標識および技術を用いて標識され得る。これらの標識のいくつかは、"Handbook of Fluorescent Probes and Research Products", ninth edition, Richard P. Haugland (ed) Molecular Probes, Inc.
Eugene, OR（この記載内容は、全体として参照により本明細書中で援用される）に記載されている。これらの標識のいくつかは、選択された多量体タンパク質の発現のためにポリヌクレオチド配列中に遺伝子工学処理され得る。ペプチドおよびタンパク質は、そうでなければ標識することが困難であるかまたは不可能であるタンパク質の標識を可能にするために組入れられる標識を組入れる「ハンドル」も有し得る。
【００９１】
種々のクラスの所望のペプチドおよびタンパク質、並びにこの節に記載された特定のペプチドおよびタンパク質は、トランスジェニック動物中に組入れられた遺伝子中に所望のアミノ酸置換のために選択されたコドンを挿入することにより、下記のように改変され得る、と理解されるべきである。
【００９２】
本発明は、タンパク質およびペプチド以外の所望の分子を生産するためにも用いられ、例としてはリポタンパク質、例えば高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、ＨＤＬ−ミラノ、および低密度リポタンパク質、脂質、炭水化物、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態では、目的遺伝子は、所望の分子の生産
に向けられる核酸分子またはタンパク質をコードする。
【００９３】
本発明はさらに、内因性（即ち非ベクター）タンパク質生産を抑制するための抑制分子の使用を包含する。これらの抑制分子としては、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよび抑制タンパク質が挙げられる。好ましい実施形態では、その発現が抑制される内因性タンパク質は卵白タンパク質であり、例としては、オボアルブミン、オボトランスフェリンおよびオボムチン、オボムコイド、オボインヒビター、シスタチン、オボスタチン、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、アビジン、およびチアミン結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、転写時に二本鎖ＲＮＡ分子を形成するオボアルブミンＤＮＡ配列を含有するポリヌクレオチドカセットは、動物、例えば鳥中にトランスフェクトされ、鳥での内因性オボアルブミンタンパク質の生産は、ＲＮＡ干渉メカニズム（ＲＮＡｉ）により低減される。その他の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、１つより多い卵白タンパク質の発現を抑制する抑制ＲＮＡ分子をコードする。さらに、内因性タンパク質生産の低減または抑制を達成するために、内因性タンパク質の誘導性ノックアウトまたはノックダウンが作製され得る。内因性卵白生産は、鳥類においていかなる時期でも抑制され得るが、しかし好ましくは卵の回収に先立って、または直前に抑制される。
【００９４】
改変された所望のタンパク質およびペプチド
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」は、そのα炭素が、一アミノ酸のα炭素のカルボキシル基ともう一つのアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応により形成されるペプチド結合を介して結合されるアミノ酸（典型的にはＬ−アミノ酸）の鎖である。鎖の一端の末端アミノ酸（即ちアミノ末端）は遊離アミノ基を有する一方、鎖のもう一つの端の末端アミノ酸（即ちカルボキシ末端）は、遊離カルボキシル基を有する。このように、「アミノ末端」（略してＮ末端）という用語は、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸上の遊離αアミノ基を指すか、あるいはタンパク質内の任意の他の位置のアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与する場合にはイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」（略してＣ末端）という用語は、タンパク質のカルボキシ末端のアミノ酸上の遊離カルボキシル基を指すか、あるいはタンパク質内の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシル基を指す。
【００９５】
典型的には、タンパク質を作り上げているアミノ酸は、アミノ末端から出発して、タンパク質のカルボキシ末端方向に漸増して、順に番号を付される。したがってあるアミノ酸が別のアミノ酸の「後ろにある」と言われる場合、そのアミノ酸は先行アミノ酸よりタンパク質のカルボキシ末端に近い方に位置する。
【００９６】
「残基」という用語は、アミド結合によりタンパク質に組み込まれる、アミノ酸（ＤまたはＬ）またはアミノ酸擬似体を指すのに本明細書中で使用される。したがって、残基は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、あるいは特に限定されない限りは、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する天然アミノ酸の既知の類似体（すなわち、アミノ酸擬似体）を包含し得る。さらに、アミド結合擬似体として、当業者に既知のペプチド骨格改変が含まれる。
【００９７】
さらに、当業者は、コードされた配列における、単一アミノ酸または少数のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更、付加または欠失する、個々の置換、欠失または付加は、保存的に改変された変化であり、ここでこの変化は、アミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸での置換をもたらすことを理解するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する同類置換された表が当該技術分野で既知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いに同類置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００９８】
同類置換は、置換するアミノ酸（天然または改変）が置換されているアミノ酸に構造的に関連する、即ち置換されているアミノ酸とほぼ同一のサイズおよび電子特性を有する置換である。したがって置換するアミノ酸は、元のアミノ酸と同一または類似の側鎖中の官能基を有する。「同類置換」は、側鎖中の官能基が適切な保護基で保護される点を除いて、置換されているアミノ酸と同一である置換するアミノ酸を利用することも指す。
【００９９】
適切な保護基は、Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John
Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991（この教示内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。好ましい保護基は、例えばペプチドの親水性を低減しかつ親油性を増大することにより、膜を介してのペプチドの輸送を促し、そして加水分解によりまたは酵素的に切断され得るものである（Ditter et al., 1968. J. Pharm. Sci. 57: 783; Ditter et al., 1968. J. Pharm. Sci. 57: 828; Ditter et al., 1969. J. Pharm. Sci. 58: 557; King et al., 1987. Biochemistry 26: 2294; Lindberg et al., 1989. Drug Metabolism and Disposition 17: 311; Tunek et al., 1988. Biochem. Pharm. 37: 3867; Anderson et al., 1985 Arch. Biochem. Biophys. 239: 538;およびSinghal et
al., 1987. FASEB J. 1: 220）。好適なヒドロキシル保護基としては、エステル、カルボネートおよびカルバメート保護基が挙げられる。好適なアミン保護基としては、Ｎ末端保護基に関して上記されたように、アシル基およびアルコキシまたはアリールオキシカルボニル基が挙げられる。好適なカルボン酸保護基としては、Ｃ末端保護基に関して以下に記載されるように、脂肪族、ベンジルおよびアリールエステルが挙げられる。一実施形態では、本発明のペプチド中の１つまたは複数のグルタミン酸またはアスパラギン酸残基の側鎖中のカルボン酸基は、好ましくはメチル、エチル、ベンジルまたは置換ベンジルエステルとして、さらに好ましくはベンジルエステルとして保護される。
【０１００】
以下に提示されるのは、グループ中の各アミノ酸が同様の電子および立体特性を有する天然および改変アミノ酸のグループである。したがって同類置換は、一アミノ酸を、同一グループの別のアミノ酸で置換することにより成され得る。これらのグループは非限定的であり、即ち各グループに包含され得る付加的改変アミノ酸が存在する、と理解されるべきである。
【０１０１】
グループＩはロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、および以下の側鎖、すなわちエチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチルを有する改変アミノ酸を含む。好ましくは、グループＩはロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンを含む。
【０１０２】
グループＩＩはグリシン、アラニン、バリン、およびエチル側鎖を有する変性アミノ酸を含む。好ましくは、グループＩＩはグリシンおよびアラニンを含む。
【０１０３】
グループＩＩＩはフェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロへキシルメチルグリシン、および置換されたベンジルまたはフェニル側鎖を有する変性アミノ残基を含む。好ましい置換基には、以下の１つまたは複数が含まれる：ハロゲン、メチル、エチル、ニトロ、−ＮＨ2、メトキシ、エトキシ、およびＣＮ。好ましくは、グループＩＩＩはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む。
【０１０４】
グループＩＶはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸の
置換または無置換の脂肪族、芳香族、またはベンジル型エステル（たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロヘキシル、ベンジル、または置換ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、−ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミンまたはアスパラギン（たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、並びに側鎖−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨを有する変性アミノ酸、そのエステル（置換または無置換の脂肪族、芳香族、またはベンジル型エステル）、そのアミド、およびその置換または無置換のＮ−アルキル化アミドを含む。好ましくは、グループＩＶはグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジルおよびグルタミン酸メチル、グルタミン酸エチルおよびグルタミン酸ベンジル、グルタミンおよびアスパラギンを含む。
【０１０５】
グループＶはヒスチジン、リシン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、２−アミノ−４−グアニジノ酪酸、リシンの相同体、アルギニンの相同体、およびオルニチンの相同体を含む。好ましくは、グループＶはヒスチジン、リシン、アルギニン、およびオルニチンを含む。アミノ酸の相同体は１個〜約３個のメチレンユニットが側鎖に追加されるか、そこから取り除かれる。
【０１０６】
グループＶＩはセリン、スレオニン、システイン、およびＯＨまたはＳＨで置換されたＣ１〜Ｃ５の直鎖または分岐状アルキル側鎖（たとえば、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、またはＣＨ2ＣＨ2ＯＨＣＨ3）を有する改変アミノ酸を含む。好ましくは、グループＶＩはセリン、システイン、またはスレオニンを含む。
【０１０７】
別の態様では、アミノ酸残基に関する好適な置換としては、「厳密な」置換が挙げられる。「厳密な置換」は、置換されるアミノ酸と比較して、置換するアミノ酸（天然または改変）が有意に異なるサイズおよび／または電子特性を有する置換である。したがって置換するアミノ酸の側鎖は置換されるアミノ酸の側鎖より有意に大きく（または小さく）てもよく、かつ／または置換されるアミノ酸と有意に異なる電子特性を伴う官能基を有し得る。この型の厳密な置換の例としては、アラニンに代わるフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンの、グリシンに代わるイソロイシンの、対応するＬアミノ酸に代わるＤアミノ酸、あるいはアスパラギン酸に代わる−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ2）5−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−の置換が挙げられる。代替的には官能基は、側鎖に付加されるか、側鎖から欠失されるか、または別の官能基と交換され得る。この型の厳密な置換の例としては、バリン、ロイシンまたはイソロイシンの付加、アミンによるアスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖中のカルボン酸の交換、またはリシンまたはオルニチンの側鎖中のアミン基の欠失が挙げられる。さらに別の代替では、置換するアミノ酸の側鎖は、置換されるアミノ酸の官能基と有意に異なる立体および電子特性を有し得る。このような改変の例としては、グリシンに代わるトリプトファン、アスパラギン酸に代わるリシン、およびセリンの側鎖に代わる−（ＣＨ2）4ＣＯＯＨが挙げられる。これらの例は限定的であることを意味しない。
【０１０８】
別の実施形態では、たとえば長さが２６アミノ酸のペプチドを合成する際、個々のアミノ酸は以下の方法に応じて置換されてもよい。
ＡＡ1はセリン、グリシン、アラニン、システイン、またはスレオニンであり、
ＡＡ2はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、またはセリンであり、
ＡＡ3はバリン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、リシン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、または２−アミノ−４−グアニジノ酪酸であり、
ＡＡ4はプロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
ＡＡ5はトリプトファン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、またはグリシンで
あり、
ＡＡ6はセリン、グリシン、アラニン、システイン、またはスレオニンであり、
ＡＡ7はプロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
ＡＡ8はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、またはセリンであり、
ＡＡ9はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、またはセリンであり、
ＡＡ10はロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはバリンであり、
ＡＡ11はセリン、グリシン、アラニン、システイン、またはスレオニンであり、
ＡＡ12はロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはバリンであり、
ＡＡ13はロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはバリンであり、
ＡＡ14はグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、またはグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
ＡＡ15はアルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、または２−アミノ−４−グアニジノ酪酸であり、
ＡＡ16はプロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、またはメチオニンであり、
ＡＡ17はセリン、グリシン、アラニン、システイン、またはスレオニンであり、
ＡＡ18はグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、またはグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
ＡＡ19はアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、またはグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
ＡＡ20はバリン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、リシン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン、または２−アミノ−４−グアニジノ酪酸であり、
ＡＡ21はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、またはセリンであり、
ＡＡ22はアラニン、スレオニン、グリシン、システイン、またはセリンであり、
ＡＡ23はヒスチジン、セリン、スレオニン、システイン、リシン、またはオルニチンであり、
ＡＡ24はスレオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、またはグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
ＡＡ25はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、またはグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の置換若しくは無置換の脂肪族若しくはアリールエステルであり、
ＡＡ26はシステイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、リシン、またはオルニチンである。
【０１０９】
これらのアミノ酸置換は、上記の先行例における２６ｍｅｒより長いかまたは短いペプチドに関して、並びにタンパク質に関して創出され得る、と理解されるべきである。
【０１１０】
本発明の一実施形態では、対応するアミノ酸を変えることなく各コドンの第三塩基がＡまたはＴに変更されるよう、トランスポザーゼの最初の数個のＮ末端アミノ酸のコドンが改変される。対応するアミノ酸を変えることなく各コドンの第三塩基がＡまたはＴに変更されるよう、目的遺伝子の最初のＮ末端コドンの約１〜２０個、さらに好ましくは３〜１５個、最も好ましくは４〜１２個が改変されるのが好ましい。一実施形態では、目的遺伝子の最初の１０個のＮ末端コドンはこのようにして改変される。
【０１１１】
数個の所望のタンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドが、多価多量体タンパク質と同様に、ゲノム中に組入れられるべき目的遺伝子中でコードされる場合、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸から成るス
ペーサー分子、例えばペプチドにより分離され得る、と当業者は理解する。一般にスペーサーは、所望のタンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドを一緒に結びつけること、またはそれらの間の何らかの最小距離またはその他の空間的関係を保存すること以外の特定の生物学的活性を有さない。しかしながらスペーサーの構成アミノ酸は、分子の何らかの特性、例えばフォールディング、正味電荷または疎水性に影響を及ぼすよう選択され得る。スペーサーはまた、精製ハンドルを用いてヌクレオチド配列内に含入されるか、または切断部位、例えばタンパク質分解的切断部位により隣接され得る。
【０１１２】
かかるポリペプチドスペーサーは、約１〜約１００アミノ酸、好ましくは３〜２０アミノ酸、さらに好ましくは４〜１５アミノ酸を有し得る。ポリペプチド中のスペーサーは独立して選択されるが、好ましくは全て同一である。スペーサーは、空間中の動きの柔軟性を可能にすべきであり、したがって典型的には小さいアミノ酸、例えばグリシン、セリン、プロリンまたはアラニンに富んでいる。好ましくはペプチドスペーサーは、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％のグリシンまたはアラニンを含有する。さらに、ペプチドスペーサーは一般に、生物学的および抗原性活性をほとんどまたは全く有さない。好ましいスペーサーは、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）x（配列番号８１）および（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）yであり、ここで、ｘは約３〜約９の整数であり、ｙは約１〜約８の整数である。適切なスペーサーの具体的な例としては、以下のものが挙げられる：
（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）3
配列番号８２    ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙ
（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）3
配列番号８３    ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ、または
（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）4
配列番号８４    ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ。
【０１１３】
スペーサーを含有する多価多量体タンパク質の一例は、黄体ホルモン（ＬＨ）であり、通常別々のαとβ鎖として作成され、Galet et. al, Mol. Cell Endocrinology, 2001, 174 (1-2):31-40に記載されるような単一ポリペプチドとして作成される。したがって、多量体タンパク質の生産は、切断部位を含有しても含有しなくてもよいスペーサー配列を用いて簡素化され得る。免疫グロブリンの場合では、例えば、プロセシング時に、自然免疫グロブリンを生産させるための同様な重鎖と軽鎖の付加を促して、近接な結合で重鎖と軽鎖の連結を生産するように、トランスジェニック動物に自然に存在するプロテアーゼ部位を有するスペーサー配列を用いて単一ポリペプチドとして重鎖および軽鎖が合成され得る。このモデルでは、スペーサー配列の除去は必要とされてもよく、または必要とされなくてもよい。他の多量体タンパク質は、生体工学化された生体内に同様の方法で作製されてもよい。
【０１１４】
発現組み換えタンパク質の精製に有用であり得る残基の生成をコードするヌクレオチド配列も、ベクター中で構築され得る。このような配列は当該技術分野で既知であり、例としてはグルタチオンＳトランスフェラーゼによるグルタチオン結合ドメイン、ポリリジン、ヘキサ−ヒスチジンまたはその他の陽イオン性アミノ酸、チオレドキシン、ヘマグルチニン抗原、およびマルトース結合タンパク質が挙げられる。
【０１１５】
さらに、タンパク質またはペプチドがタンパク質分解的切断に関するシグナルを生じる１個〜約６個のアミノ酸を含み得るよう、組入れられるべき目的遺伝子中にヌクレオチド配列が挿入され得る。このようにして、遺伝子がトランスジェニック動物中に１つまたは複数の目的ペプチドまたはタンパク質を作成するよう設計される場合、酵素により認識さ
れるアミノ酸をコードする特定のヌクレオチド配列が遺伝子中に組入れられて、所望のペプチドまたはタンパク質またはその両方への大型タンパク質またはペプチド配列の切断を促す。例えば、シグナル配列が目的遺伝子によりコードされるタンパク質またはペプチドから切断され得るよう、タンパク質分解的切断部位をコードするヌクレオチドが目的遺伝子中に導入され得る。ｐＨ感受性、化学的感受性、または感光性（photolability）を示すその他のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もベクターに付加されて、目的ペプチドまたはタンパク質からのシグナル配列の分離を促し得る。
【０１１６】
タンパク質分解的切断部位としては、エキソペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＩおよびジペプチジルアミノペプチダーゼ；エンドペプチダーゼ、例えばトリプシン、Ｖ８−プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、Ｘa因子、コラゲナーゼ、エンドプロテイナーゼ、ズブチリシンおよびトロンビン；並びにプロテアーゼ、例えばプロテアーゼ３Ｃ  ＩｇＡプロテアーゼ（Ｉガーゼ）、ライノウイルス３Ｃ（プレ分離）プロテアーゼにより認識される切断部位が挙げられる。化学的切断部位も、本明細書中で用いられるような切断の定義に含まれる。化学的切断部位としては、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、蟻酸および酢酸により切断される部位が挙げられるが、これらに限定されない。自己スプライミング切断部位（例えばインテイン）も、本発明に含まれる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の切断部位は、多数の目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットに組み込まれる。図４は、切断部位を間に含有する２つの目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットの一例を描く。目的遺伝子は、異なるタンパク質またはペプチドをコードしてもよく、同じタンパク質またはペプチドをコードしてもよく、または同じタンパク質またはペプチドの改変された変種をコードしてもよい。図４は、２つの目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットを示すが、本発明は目的遺伝子のいかなる数をも含有するポリヌクレオチドカセットを包含する。目的遺伝子間に位置付けられている切断部位は、いかなる手段でも切断される任意のアミノ酸配列をコードすることができる。以上述べたように、切断部位は、プロテアーゼおよび化学反応により切断されるアミノ酸配列をコードすることができ、感光部位でもよくプロポリヌクレオチドでもよい。
【０１１８】
本発明は、反復ポリペプチド鎖（ここでは以下に提示した構造式にＰとして指定された、２つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、Ｂとして指定されたペプチドスペーサーまたは切断部位によりそれぞれ分離される）をコードするポリヌクレオチドカセットを含む。ポリペプチド多価リガンド（多価タンパク質ともいう）は、本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされる多量体タンパク質の形態であり、構造式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにより表示される。それぞれのペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合を介して別のペプチドまたはタンパク質、リンカーグループ、スペーサー、または切断部位、に結合される。それぞれのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、同じでもよくまたは異なっていてもよく、それぞれのリンカー、スペーサー、切断部位または共有結合は、独立に選択される。
【０１１９】
「ポリペプチド多価タンパク質」は、２つ以上のペプチドＰがそれぞれペプチドリンカーグループ、スペーサーまたは切断部位により分離される複数の反復ポリペプチド鎖である。ポリペプチド多価リガンドは、構造式ＩＩおよびＩＩＩに提示される。
Ｉ      Ｂ−（Ｌ−Ｐ）ｎ
式中、Ｂはペプチドスペーサーまたは切断部位であり、ｎは２〜約２０の整数である。それぞれＬは、共有結合、結合基、または、存在または未存在の切断部位である。また、それぞれＰは、約４〜約２００アミノ酸残基を有するペプチドである。
ＩＩ    Ｐ−（Ｂ−Ｐ）ｍ−Ｂ−Ｐ
式中、ｍは０〜約２０の整数である。
ＩＩＩ  Ｐａ−（Ｂ）ｎ−Ｐａ
式中、ｎは１〜２０の整数であり、好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜７、さらに式中ａは１である。
多価タンパク質の別の例を以下に挙げる：
ＩＶ    Ｐｙ−Ｌｘ−Ｂｎ−Ｌｘ−Ｐｙ
Ｖ      Ｐｙ−Ｂ−Ｐｙ
本発明のポリヌクレオチドカセットによりコードされる、前記の構造式ＩＶとＶのポリペプチド多価リガンドにおいて、各Ｐは約４〜約２００アミノ酸残基を有するペプチドであり、ｙは１であり、ｘは１〜３の整数であり、かつｎは１〜２０の整数で、好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜７である。各Ｂは、ペプチドスペーサーまたは少なくとも２つのアミノ酸または切断部位を含む切断部位である。各ペプチドＰと各Ｂは独立して選択され、同じでもよくまたは異なっていてもよい。
【０１２０】
適したリンカー（Ｌ）は互いにペプチドとタンパク質を結合することができるグループである。一例では、リンカーは不活側鎖を有するアミノ酸からなる約１〜約１０アミノ酸のオリゴペプチドである。適したオリゴペプチドとしては、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン並びにアラニルおよび／またはセルニルおよび／またはプロリニルおよび／またはグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドが挙げられる。構造式ＩＩにおいて、ｍは０〜約２０の整数である。
【０１２１】
多価タンパク質におけるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、共有結合、リンカーグループ、スペーサー、または切断グループ、またはそれらの組み合わせ、により互いに結合することができる。リンカーグループは同じでも異なっていても良い。
【０１２２】
構造式（ＩＩ）で示されたポリペプチドスペーサーは、約５〜約４０アミノ酸残基を有するペプチドである。ポリペプチド多価リガンドにおけるスペーサーは、独立に選択され、同じでもよくまたは異なっていてもよい。スペーサーは、フランキングペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質Ｐの空隙で柔軟な動きを可能にするはずであり、したがって通常、小さなアミノ酸、例えばグリシン、セリン、ピロリンまたはアラニンリッチとなる。好ましくは、ペプチドスペーサーは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％のグリシンまたはアラニンを含有する。また、ペプチドスペーサーは、概して生物学的活性および抗原活性をほとんど有さないかまたは全く有さない。好ましいスペーサーは、（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）x（配列番号８１）および（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）ｙであり、ここでｘは約３〜約９の整数であり、ｙは約１〜約８の整数である。適したスペーサーの具体的な例としては、（Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）3（配列番号８２）が挙げられる。また、スペーサーは、タンパク質分解的切断のシグナルを創出する１〜約４つのアミノ酸を含み得る。
【０１２３】
本発明の別の実施形態において、ＴＡＧ配列は目的遺伝子に連結される。ＴＡＧ配列は３つの目的のために役立つ：１）自然タンパク質またはシグナル配列、すなわちビテロゲニンからの障害がないように、ＴＡＧは単離されるべきペプチドまたはタンパク質の自由なローテーションを可能にし、２）アフィニティ精製を用いてタンパク質を単離する「精製処理」を提供し、かつ３）シグナル配列および精製配列から所望のタンパク質を除去する切断部位を含む。したがって、本明細書中で用いる場合、ＴＡＧ配列は、スペーサー配列、精製処理および切断部位を含む。ＴＡＧタンパク質のスペーサー配列は、配列番号８５に示されているように、１つまたは複数の反復を含有する。好ましいスペーサー配列は、配列番号８６で提供される配列を含む。精製処理の一例は、ＨＩＶ  Ｉ由来のｇｐ４１ヘアピンループである。代表的なｇｐ４１ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、配列番号８７および配列番号８８でそれぞれ提供される。しかしながら、ｇｐ４１の任意
の抗原領域を含む、任意の抗原領域またはそうでなければいかなる会合領域（例えばアビジン／ビオチン）が、精製処理として使用されてもよいということが理解されよう。好ましい精製処理は、高特異的抗体を顕在化させるものである。加えて、切断部位は、当業者に既知の任意のタンパク質切断部位でもよく、ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ配列（配列番号８９）を含むエンテロキナーゼ切断部位およびｆｕｒｉｎ切断部位を含む。本発明の一実施形態において、ＴＡＧ配列は配列番号９０のポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
ポリヌクレオチドカセットの投与方法
上記したポリヌクレオチドカセットに加えて、本発明は、動物へのポリヌクレオチドカセットの投与方法、目的遺伝子は動物の生殖細胞系に組み込まれるトランスジェニック動物の生産方法、および目的遺伝子は動物の生殖細胞系ではない細胞に組み込まれるトランスジェニック動物の生産方法も含む。ポリヌクレオチドカセットは、投与される場合に任意のベクターまたは送達溶液中に存在してもよく、または裸のＤＮＡであってもよい。一実施形態において、トランスポザーゼにより認識される２つの挿入配列間にポリヌクレオチドカセットを含有するトランスポゾン系ベクターは、動物に投与される。本発明のポリヌクレオチドカセットは、当業者に既知の任意の方法（これらに限定されないが、体腔内、精巣内、卵管内（intraoviduct）、卵巣内、乳腺の管系、腹腔内、動脈内、静脈内、局所、経口、経鼻および前核への注入投与法、およびその任意の組み合わせを含む）を介して、動物に投与されてもよい。また、ポリヌクレオチドカセットは、器官の内腔内、器官内、体腔内、脳脊髄液内に、泌尿器系、性尿器系、生殖器系、または所望の細胞に到達する任意の経路を通って、投与されてもよい。
【０１２５】
ポリヌクレオチドカセットは、血管により供給される細胞に分配されるべき血管系を通って送達されてもよい。例えば、組成物は、組織の細胞をトランスフェクトするのに、卵巣を供給するまたは卵管を供給する動脈に入れてもよい。この方法では、卵胞は生殖細胞系トランスジェニック動物を創出するのにトランスフェクトされ得る。代替的には、卵管に導く動脈を通って組成物を供給することは、管状腺および上皮細胞を好ましくトランスフェクトする。かかるトランスフェクトされた細胞は、卵白に沈着する所望のタンパク質またはペプチドを製造する。門脈を通る、組成物の投与は、肝細胞の取り込みと形質転換を目的とする。尿道を通る膀胱内への投与は、膀胱の移行上皮を標的とする。膣と子宮頚部による投与は、子宮の内面およびファローピウス管の上皮細胞を標的とする。内乳動脈または乳腺の管系による投与は、乳中に所望のタンパク質またはペプチドを合成しかつ分泌するように所望の機能を行うのに、泌乳腺の分泌細胞をトランスフェクトする。
【０１２６】
ポリヌクレオチドカセットは単一投与、複数投与、連続的に、または断続的に投与されてもよい。ポリヌクレオチドカセットは、カテーテル、浸透性ミニポンプまたは任意の別の方法を介して、注入により投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、複数の投与（それぞれポリヌクレオチドカセットおよび異なるトランスフェクト用の試薬を含有する投与）で動物に投与される。
【０１２７】
好ましい実施形態において、動物は卵を産む動物、より好ましくは鳥類である。一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットを含有するトランスポゾン系ベクターの約１〜１５０μｇ、１〜１００μｇ、１〜５０μｇ、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは５〜１０μｇが、鳥の卵管に投与される。ニワトリでは、約１〜１００μｇまたは５〜５０μｇが投与されることが好ましい。ウズラでは、約５〜１０μｇが投与されることが好ましい。最適な範囲は鳥の種類と鳥の性的成熟段階に依存する。本発明のトランスポゾン系ベクターの卵管内投与は、輸卵管組織でＰＣＲ陽性シグナルをもたらし、一方、血管内投与は肝臓でＰＣＲ陽性シグナルをもたらす。他の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、輸卵管または肝臓に供給する動脈に投与される。これらの投与方法は、トランスフェクションを促進する任意の方法（制限はないが、エレクトロポレーション、遺伝
子銃、裸のＤＮＡの注入およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用を含む）の組み合わせであってもよい。
【０１２８】
トランスポゾン系ベクターは、動物の生存期間の任意の時点で動物に投与されてもよいが、性的成熟期に達する前の動物に投与されるのが好ましい。トランスポゾン系ベクターは、標準的家禽飼育法が使用される場合には、約１４〜１６週齢のニワトリおよび約５〜１０週齢、より好ましくは５〜８週齢、最も好ましくは５〜６週齢のウズラの輸卵管に投与されるのが好ましい。ベクターは、鳥で早い性的成熟を誘導する外因性ホルモンが使用される時は、より早い週齢で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、トランスポゾン系ベクターは、輸卵管上皮細胞および／または管状腺細胞増殖の増加の後に動物の輸卵管に投与されてもよい。かかる増殖の増加は、通常、輸卵管部分（area）への生殖ホルモンの流入に続く。動物が鳥類の場合、トランスポゾン系ベクターは、輸卵管上皮細胞の増殖の増加に続いて、鳥類が卵白構成成分を生産し始める前に鳥類の輸卵管に投与される。
【０１２９】
また、本発明は、以下のステップ：１）その卵内の胚が上死点（top dead center)に移動するのを可能にするのに室温で２時間片側上の卵をインキュベートすること；２）下にある卵殻膜を貫通せずに殻を貫いて穴を開けること；３）胚に溶液中のトランスポゾン系ベクターを注入すること；４）卵の穴を封入すること；および５）孵化するために卵をインキュベーターに置くことを含む鳥類の胚へのポリヌクレオチドカセットを含有するトランスポゾン系ベクターの胚体内投与を含む。トランスポゾン系ベクター系ベクターの投与は、卵が産卵の直後（胚がステージＸである時）〜孵化中にいつでも行うことができる。好ましくは、トランスポゾン系ベクターは、卵の産卵の１〜７日後に投与され、より好ましくは卵の産卵の１〜２日後である。トランスポゾン系ベクターは、約５．０μｇ〜１０ｐｇ、好ましくは１．０μｇ〜１００ｐｇの範囲の量で導入されてもよい。加えて、トランスポゾン系ベクター溶液の容量は、ウズラで約１μｌ〜７５μｌ、ニワトリで約１μｌ〜５００μｌでよい。
【０１３０】
また、本発明は、鳥にトランスポゾン系ベクター、適切な担体および適切なトランスフェクション試薬を含む組成物の注入を含む、ポリヌクレオチドカセットを含有するトランスポゾン系ベクターの精巣内投与方法を含む。一実施形態において、鳥には性的成熟前に注入され、好ましくは約４〜１４週齢、より好ましくは約６〜１４週齢、最も好ましくは８〜１２週齢である。別の実施形態において、成体鳥はトランスポゾン系ベクター、適切な担体および適切なトランスフェクション試薬が注入される。成体鳥は任意の鳥でよいが、一例として成体鳥はウズラである。
【０１３１】
鳥は血液精巣隔壁の発達前に注入されるのが好ましい（これは、トランスポゾン系ベクターの細精管への進入を促し、かつ精原細胞または他の生殖細胞のトランスフェクションを促進する）。４，６，８，１０および１２週に、およびその間のニワトリの精巣がトランスフェクションには最もふさわしいように思われる。この齢の範囲では、血液精巣隔壁はまだ形成されておらず、別のタイプの細胞数（例えば精子等、J. Kumaran et al., 1949. Poultry Sci., 29:511-520を参照。またE. Oakberg, 1956. Am. J. Anatomy, 99:507-515;およびP. Kluin et al., 1984. Anat. Embryol., 169:73-78も参照)に対して精原細胞数が比較的多い。
【０１３２】
トランスポゾン系ベクターは、約０．１μｇ〜１０μｇ、好ましくは１μｇ〜１０μｇ、より好ましくは３μｇ〜１０μｇの範囲量で精巣に導入されてもよい。ウズラでは、約５μｇの量が好ましい。ニワトリでは、１つの精巣あたり約５μｇ〜１０μｇが好ましい。ベクターＤＮＡのこれらの量は、一回投与または複数の投与でおよび精巣の一箇所または複数箇所に注入されてもよい。好ましい実施形態において、ベクターＤＮＡは、単一の
精巣において複数の部位で投与され、両精巣はこの方法で注入される。一実施形態において、注入は３箇所の注入部位に広がり、両末端に一箇所ずつ、中央に一箇所である。加えて、トランスポゾン系ベクター溶液の容量は、ウズラでは約１μｌ〜７５μｌおよびニワトリでは約１μｌ〜５００μｌでよい。好ましい実施形態において、トランスポゾン系ベクター溶液の容量は、ウズラでは約２０μｌ〜６０μｌ、ニワトリでは約５０μｌ〜２５０μｌでよい。それぞれの精巣に注入されるベクターＤＮＡの容量および総量の両方は鳥の齢および大きさに基づいて決められてよい。
【０１３３】
本発明によれば、ポリヌクレオチドカセットが許容可能な担体および／またはトランスフェクション試薬とともに投与される。許容可能な担体としては、水、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）およびリオトロピック液晶が挙げられるが、これらに限定されない。用いられ得る、一般的な当業者に既知のトランスフェクション試薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：陽イオン性脂質トランスフェクション試薬、陽イオン性脂質混合物、ポリアミン試薬、リポソームおよびそれらの組合せ；ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｔｅ、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ（登録商標）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）およびパーフェクチン（Gene Therapy Systems）；リポフェクタミン、セルフェクチン、ＤＭＲＩＥ−ＣオリゴフェクタミンおよびＰＬＵＳ試薬（InVitrogen）；Ｘｔｒｅｍｅ遺伝子、フゲン、ＤＯＳＰＥＲおよびＤＯＴＡＰ（Rohe）；ＬｉｐｏｔａｘｉおよびＧｅｎｅｊａｍｍｅｒ（Strategene）；並びにＥｓｃｏｒｔ（SIGMA）。一実施形態では、ポリヌクレオチドカセットを含有するトランスフェクション試薬はＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）である。ＤＮＡ対トランスフェクション試薬の割合は、投与方法に基づいて変わり得る。一実施形態では、トランスポゾン系ベクターは卵管に投与され、そしてＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比は１：１．５〜１：１５、好ましくは１：２〜１：１０（全て重量／容積として表す）であり得る。トランスフェクションは、一般的な当業者に既知のその他の手段、例えば電気穿孔、遺伝子銃、裸のDNAの注入、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用を用いても成し遂げられ得るが、これらに限定されない。
【０１３４】
トランスフェクションのための標的にされる細胞または組織型によっては、トランスポゾン系ベクターの形態は重要であり得る。細菌から回収されるプラスミドは一般に閉環スーパーコイル分子であり、そしてこれは、調製が容易であるため、遺伝子送達のためのベクターの好ましい状態である。いくつかの場合には、トランスポザーゼの発現および挿入は、弛緩型閉環立体形状において、または線状立体構造においてより効率的であり得る。さらにその他の場合には、精製トランスポザーゼタンパク質は、より即時的な挿入のために目的遺伝子を含有するトランスポゾン系ベクターと同時注入され得る。これは、精製トランスポザーゼタンパク質およびトランスポゾン系ベクターの両方と複合されたトランスフェクション試薬を用いることにより成し遂げられ得る。
【０１３５】
トランス遺伝子を保有する動物に関する試験および繁殖
動物へのトランスポゾン系ベクターの投与後、ＤＮＡを動物から抽出して、目的遺伝子の組込みを確認する。本発明により提供される利点としては、卵管内または卵巣内経路により鳥に投与され（例えば卵管または卵巣に通じる動脈への動脈内投与）、トランスポゾン系ベクター内に含有された場合の、目的遺伝子の高率の組込みまたは組入れおよび転写が挙げられる。
【０１３６】
組込みの実頻度は、ＰＣＲシグナルの比較強度により、又定量的ＰＣＲによる組織の組織学的評価により概算され得る。トランス遺伝子挿入率を概算するための別の方法は、いわゆるプライムドｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法（ＰＲＩＮＳ）である。この方法は、どの細胞が目的トランス遺伝子を保有するかだけでなく、遺伝子が挿入された
染色体はどれか、そして染色体のどの部分かも確定する。要するに、標識化プライマーが１回のＰＣＲにより染色体展開物（スライドガラスに固着）とアニーリングされて、次にスライドは標準ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手法により現像される。この技法は、ｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲおよび蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の最良特徴を組合せて、問題となっている別個の染色体位置および目的遺伝子のコピー数を提供する。２８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、この手法が正常に機能していることを確認するための精原細胞の陽性コントロールとして使用される。トランス遺伝子および２８ｓ遺伝子に対して異なる蛍光標識を用いることで、２種類の異なる色タグで蛍光を発するトランス遺伝子を含有する細胞が生じる。
【０１３７】
トランス遺伝子の生殖系列伝達が起きたか否かを確定するために、繁殖実験も実行される。本発明に従って実施される一般鳥類繁殖実験では、各雄鳥は２〜３羽の異なる雌成鳥に各々３〜４日間曝露された。この手法は、合計６〜１２週間の間、異なる雌を用いて継続された。トランスジェニック雄への最終曝露後１４日までの間、卵は毎日収集され、各卵は標準的なインキュベーター中で孵化される。その結果生じる胚は、ＰＣＲを用いて３または４日目にトランス遺伝子の存在に関して検査される。
【０１３８】
トランス遺伝子胚を生産する任意のオスをさらにメスと交配させる。これらのメス由来の卵は、インキュベートされ、孵化され、かつヒヨコは外因性ＤＮＡに対して試験される。死んだ胚は検視され、かつトランス遺伝子またはトランス遺伝子によりコードされたタンパク質に対して蛍光またはＰＣＲにより直接試験される。孵化し、かつ外因性ＤＮＡに対して陽性になることが見出された子孫は、成熟期まで育てられる。トランスジェニック生産の効率および生殖細胞系中へのトランス遺伝子の安定な組み込みを検証するのに、これらの鳥を交配しトランスジェニックトリのさらなる世代を産出させる。得られた胚は、ＰＣＲを用いて３または４日目にトランス遺伝子の存在に対して試験された。
【０１３９】
上記の手法は鳥以外の動物に合わせて変更され得るし、そして選択繁殖技法は遺伝子コピー数およびタンパク質産出量を増幅するために実施され得る、と理解されるべきである。
【０１４０】
卵白中の所望の多量体タンパク質の生産
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含有するトランスポゾン系ベクターは、卵白中の所望のタンパク質またはペプチドの生産のために、鳥に投与され得る。これらのトランスポゾン系ベクターは、好ましくは１つまたは複数のオボアルブミンプロモータ、オボムコイドプロモータ、オボアルブミンシグナル配列およびオボムコイドシグナル配列を含有する。卵管特異的オボアルブミンプロモータは、B. O'Malley et al., 1987. EMBO
J., vol. 6, pp. 2305-12 ; A. Qiu et al., 1994. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), vol. 91, pp. 4451-4455; D. Monroe et al., 2000. Biochim. Biophys. Acta, 1517 (1): 27-32; H. Park et al., 2000. Biochem., 39: 8537-8545; およびT. Muramatsu et al., 1996. Poult. Avian Biol. Rev., 6: 107-123に記載されている。
【０１４１】
卵黄中での所望の多量体タンパク質の生産
本発明は、卵黄中での低溶解性の組み換えペプチドおよびタンパク質の生産に特に有益である。かかるタンパク質としては、膜会合または膜結合タンパク質、親油性化合物；付着因子、受容体および二次メッセンジャー形質導入機構の構成成分が挙げられるが、これらに限定されない。低溶解性ペプチドおよびタンパク質は、水ベースの親水性環境中で凝集するため、慣用的組み換えタンパク質生産技法（細胞および組織培養）を用いて生産するのに特に誘発性である。かかる凝集は、組み換えにより生産されたタンパク質の変性および再フォールディングを必要とし、これはそれらの構造および機能に有害に作用し得る。さらに高可溶性組み換えペプチドおよびタンパク質でさえ、組み換えタンパク質生産系中で十分に多い量で生産される場合、沈殿し、そして変性および復元を要し得る。本発明
は、大量の組み換えタンパク質の生産中のタンパク質およびペプチド溶解性の問題の有益な解決を提供する。
【０１４２】
本発明の一実施形態では、卵黄中への所望のタンパク質の蓄積は、所望のタンパク質をコードする目的遺伝子に対する卵黄ビテロゲニン受容体と結合し得るタンパク質をコードする配列を結合することにより、成し遂げられる。このポリヌクレオチドカセットは、卵母細胞による所望のタンパク質の受容体媒介性取り込みのために用いられ得る。好ましい実施形態では、ビテロゲニン受容体との結合を保証する配列は、ビテロゲニンタンパク質のターゲッティング配列である。本発明は、種々のビテロゲニンタンパク質およびそれらのターゲッティング配列を包含する。好ましい実施形態では、ニワトリビテロゲニンタンパク質ターゲッティング配列が用いられるが、しかしながらビテロゲニンタンパク質配列間の高度の保存、およびそれらの卵黄受容体とのビテロゲニンターゲッティング配列の既知の種間反応性のため、その他のビテロゲニンターゲッティング配列は置換され得る。本発明のトランスポゾン系ベクター中に用いるための、そして卵黄中のインスリンタンパク質の蓄積のための構築物の一例は、ビテロゲニンプロモータ、ビテロゲニンターゲッティング配列、ＴＡＧ配列、プロインスリン配列および合成ポリＡ配列を含有するトランスポゾン系ベクターである。本発明は、ビテロゲニンのＮ末端ドメイン中に、特にリポビテリンＩ中に存在するビテロゲニンターゲッティング配列を包含するが、これに限定されない。一実施形態では、ビテロゲニンターゲッティング配列は、配列番号７７のポリヌクレオチド配列を含有する。
【０１４３】
好ましい実施形態では、トランスポゾン系ベクターは、構成性プロモータに操作可能に結合されたトランスポザーゼ遺伝子、および肝臓特異的プロモータに操作可能に結合された目的遺伝子、並びにビテロゲニンターゲッティング配列を含有する。
【０１４４】
所望の多量体タンパク質の単離および精製
タンパク質の大規模生産のために、トランス遺伝子に関して同系接合性である動物繁殖ストックが選択される。このような同系接合性個体は、例えば標準動物繁殖手法またはＰＣＲプロトコールにより生成され、同定される。
【０１４５】
一旦発現されると、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に既知の標準手法、例えば硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、免疫沈降法等に従って精製され得る。約５０〜９９％均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、８０〜９５％またはそれ以上の均質性が治療薬として用いるために最も好ましい。
【０１４６】
本発明の一実施形態では、所望のタンパク質が生産される動物は、卵を産む動物である。本発明の好ましい実施形態では、動物は鳥類であり、そして所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は卵白から単離される。外因性タンパク質またはペプチドを含有する卵白は、卵工業で既知の種々の方法のいずれかにより工業規模で、卵黄およびその他の卵構成要素から分離される（例えばW. Stadelman et al. (Eds.), Egg Science & Technology, Haworth Press, Binghamton, NY (1995)参照）。その他の卵白構成要素からの外因性ペプチドまたはタンパク質の単離は、当業者に既知の多数のポリペプチド単離および精製方法のいずれかにより成し遂げられる。これらの技法としては、例えばクロマトグラフィー法、例えば、単独でのまたは組合せた、ゲル浸透、イオン交換、アフィニティー分離、金属キレート化、ＨＰＬＣ等が挙げられる。クロマトグラフィー分離法の代わりにまたはそれに加えて、単離または精製のために用いられ得る別の手段としては、電気泳動が挙げられる。良好な単離および精製は、標準分析技法により、例えばＨＰＬＣ、質量分光分析および分光測光法により確証される。分離の第一段階が卵白の内因性オボアルブミン分画の除去である場合、そうすることはさらに精製されるべき総タンパク質含量を約５０％
低減するので、しばしばこれらの分離方法は促進される。
【０１４７】
所望のタンパク質またはペプチドの容易なまたは可能な精製には、ポリヌクレオチドカセットとして１つまたは複数の別のエピトープまたはドメインを含む。かかるエピトープまたはドメインとしては、酵素的、化学的または感光的切断部位（限定されないが、エンテロキナーゼ切断部位）をコードするＤＮＡ配列；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ由来のグルタチオン結合ドメイン；ポリリシン；ヘキサヒスチジンまたは他の陽イオン性アミノ酸、および臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ギ酸および酢酸により切断される部位；チオレドキシン；ヘマグリチニン抗原；マルトース結合タンパク質；ＨＩＶ由来のｇｐ４１フラグメント、および当業者に一般に既知の他の精製エピトープまたはドメインが挙げられる。ポリヌクレオチドカセットに含まれ得る他のタンパク質分解的切断部位は、エキソペプチダーゼ（例えばカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＩおよびジペプチジルアミノペプチダーゼ）、エンドペプチダーゼ（例えばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、Ｘa因子、コラゲナーゼ、エンドプロテイナーゼ、サブチリシンおよびトロンビン）、およびプロテアーゼ（例えばプロテアーゼ３Ｃ  ＩｇＡプロテアーゼ（Ｉｇａｓｅ）ライノウイルス３Ｃ（プレシジョン）プロテアーゼ）により認識される切断部位である。また、自己スプライシング切断部位（例えばインテイン）も、本発明のポリヌクレオチドカセットに含まれてもよい。
【０１４８】
代表的一実施形態では、卵白からの所望のタンパク質の精製は、オボアルブミン担体タンパク質の抗原性、並びにオボアルブミンおよび所望のタンパク質に及ぶＴＡＧリンカー配列の特定の属性を利用する。ＴＡＧ配列は、それが１）高度抗原性エピトープ、ＨＩＶからのｇｐ４１フラグメント（緊縮アフィニティー精製を可能にする）、並びに２）所望のタンパク質に直接的に並置されるプロテアーゼのエンテロキナーゼに関する認識部位を含有するため、この方法において特に有用である。好ましい実施形態では、ＴＡＧ配列は約５０アミノ酸を含む。代表的ＴＡＧ配列を以下に提示する。
【０１４９】
【表１】
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【０１５０】
下線を付した配列は、ＨＩＶ  ｇｐ−４１のヘアピンループドメインから得られた（配列番号８７）。イタリック体の配列は、エンテロキナーゼによる切断部位を表す（配列番号８９）。ループドメインの上流のスペーサー配列は、（ＰｒｏＡｌａＡｓｐＡｓｐＡｌａ）（配列番号８５）の反復から作製されて、自由回転を提示し、そしてオボアルブミン担体タンパク質からのヘアピンループの表面有用性を促進する。
【０１５１】
所望のタンパク質の単離および精製は、以下のように実施される：
１．  オボアルブミンおよびトランスジェニックオボアルブミンＴＡＧ−所望のタンパク質を含有する卵白タンパク質の濃縮。
２．  狭範囲の分子量内のタンパク質のみを単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（過程１のさらなる濃縮）。
３．  オボアルブミンアフィニティークロマトグラフィー。オボアルブミンに対する高特異的抗体は、オボアルブミンおよびトランスジェニックオボアルブミンＴＡＧ−所望タンパク質以外の全ての外来性卵白タンパク質を事実上排除する。
４．  抗ｇｐ４１抗体を用いるｇｐ４１アフィニティークロマトグラフィー。この過程のストリンジェントな適用は、事実上純粋なトランスジェニックオボアルブミンＴＡＧ
−所望のタンパク質を生じる。
５．  トランス遺伝子産物の切断は２つの方法のうちの少なくとも１つで成し遂げられ得る：
ａ．トランスジェニックオボアルブミンＴＡＧ−所望タンパク質は過程４からのｇｐ４１アフィニティー樹脂（ビーズ）に付着されたままであり、そしてプロテアーゼエンテロキナーゼが付加される。これはｇｐ４１アフィニティー樹脂からトランス遺伝子標的タンパク質を遊離するが、一方、オボアルブミンＴＡＧ配列は保持される。遠心分離（バッチ法）またはフロースルー（カラム精製）による分離は、所望のタンパク質をエンテロキナーゼと一緒に溶液中に残す。エンテロキナーゼは回収され、再使用される。
ｂ．あるいはエンテロキナーゼは、プロテアーゼの非触媒領域へのポリリジン部分の付加により、樹脂（ビーズ）上に固定される。過程４のアフィニティーカラムから溶離されたトランスジェニックオボアルブミンＴＡＧ−所望タンパク質は次に、プロテアーゼ樹脂に適用される。プロテアーゼ作用は所望タンパク質からオボアルブミンＴＡＧ配列を切断して、両存在物を溶液中に残す。固定化エンテロキナーゼ樹脂は再装填され、再使用される。
ｃ．これらの代替物の選択は、トランス遺伝子標的タンパク質のサイズおよび化学組成によってなされる。
６．  これら２つの（５ａまたは５ｂ）タンパク質混合物の最終分離は、サイズ排除またはエンテロキナーゼアフィニティークロマトグラフィーを用いてなされる。この過程は、必要に応じて、脱塩、緩衝液交換および／またはポリッシングを可能にする。
【０１５２】
エンテロキナーゼによるトランス遺伝子産物（オボアルブミンＴＡＧ−所望タンパク質）の切断は次に、２つの生成物：オボアルブミンＴＡＧおよび所望タンパク質を生じる。ＴＡＧ標識を用いた単離のためのさらなる特定の方法は、実施例に提示される。いくつかの所望のタンパク質は、当業者に既知のような上記のアプローチの付加または改変を必要とし得る。主に適用される技術がこれらの設定の各々において良好に実証されるという理由から、方法は、実験室作業台から試験的および生産設備まで規模を拡大できる。
【０１５３】
本発明のトランスジェニック動物により生産される典型的鶏卵は、少なくとも０．００１ｍｇ、約０．００１〜１．０ｍｇ、または約０．００１〜１００．０ｍｇの外因性タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを、卵白の正常構成要素のほかに（またはおそらくは後者の小分画を置き換えて）含有する、と考えられる。
【０１５４】
生物学的発現または精製後、所望のタンパク質、そのフラグメントおよびペプチドはタンパク質、そのフラグメントおよびペプチドのネイティブ立体配座とは実質的に異なる立体配座を保有し得る、と当業者は認識する。この場合、タンパク質を変性し、還元し、そして次にタンパク質を好ましい立体配座に再フォールディングさせることがしばしば必要である。タンパク質を還元し、変性し、そして再フォールディングを誘導する方法は、当業者には既知である。
【０１５５】
乳中の多量体タンパク質の生産
トランスジェニックタンパク質またはペプチドを含有する卵の生産方法のほかに、本発明は、トランスジェニックタンパク質またはペプチドを含有する乳の生産方法を包含する。これらの方法は、哺乳動物への上記のトランスポゾン系ベクターの投与を包含する。一実施形態では、トランスポゾン系ベクターは、構成性プロモータに操作可能に結合されるトランスポザーゼ、および乳腺特異的プロモータに操作可能に結合される目的遺伝子を含有する。目的遺伝子としては、抗ウイルスおよび抗細菌タンパク質および免疫グロブリンが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１５６】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために役立つが、しかしながら同時に、いか
なる点でも本発明を限定するものでない。それどころか、本発明の精神を逸脱しない限り、本明細書中の記述を読めば当業者には明らかになる種々の実施形態、修正および等価物を用いることができることは、明らかに理解されるべきである。
【実施例１】
【０１５７】
トランスポゾン系ベクターｐＴｎＭｏｄの調製
真核生物細胞のゲノム中に所望のコード配列を挿入するためにベクターを設計し、配列番号５７として以下に示した。ｐＴｎＭｏｄと呼ばれる配列番号５７のベクターを構築し、その配列を立証した。
【０１５８】
このベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを用いた。改変されたコザック配列（ＡＣＣＡＴＧ）（配列番号５）をプロモータに付加した。トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド三つ組コドン中のゆらぎ位置のヌクレオチドをアデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）に変えたが、これは、このコドンによりコードされるアミノ酸を変えなかった。２つの終止コドンを付加し、合成ポリＡを用いて、強力な終結配列を提供した。このベクターは、安定組込みの可能性を増大するために（任意の誘導を伴わずに）細胞の進入後直ぐに活性であるよう設計されたプロモータを用いる。付加的終止コドンおよび合成ポリＡは、下流の潜在的遺伝子まで通して読取ることなく、適正な終結を保証する。
【０１５９】
このベクターの構築の第一段階は、所望の変化を有するようトランスポザーゼを改変することであった。トランスポザーゼに対する改変は、プライマー高効率正プライマー（Ｈｅｆ）変更トランスポザーゼ（ＡＴＳ）−Ｈｅｆ５’ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣ３’（配列番号９１）および変更トランスポザーゼ−高効率逆プライマー（Ｈｅｒ）５’ＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴＡＡＣＣ３’（配列番号９２、逆相補プライマー）を用いて成し遂げた。５’正プライマーＡＴＳ−Ｈｅｆでは、配列ＣＴＣＧＡＧ（配列番号９３）は、制限酵素ＸｈｏＩに関する認識部位であり、これは増幅遺伝子の方向性クローニングを可能にする。配列ＡＣＣＡＴＧ（配列番号５）は、コザック配列およびトランスポザーゼに関する開始コドンを含有し、そして下線を付した塩基は最初の１０個のアミノ酸に関するコドンのＡまたはＴへのゆらぎ位置における変化を表す（コドンによりコードされるアミノ酸の変化を伴わない）。プライマーＡＴＳ−Ｈｅｒ（配列番号９２）は、ネイティブ終止コドンＴＧＡのほかに付加的終止コドンＴＡＡを含有し、そしてＢｃ１Ｉ制限部位ＴＧＡＴＣＡ（配列番号９４）を付加して、方向性クローニングを可能にする。これらのプライマーを、トランスポザーゼおよびＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＰＣＲ系（酵素、緩衝液、ｄＮＴＰ’ｓ、ＭｇＣｌ2およびＰＣＲエンハンサーを含む；Epicentre Technologies, Madison, WI）のための鋳型として、ｐＴｎＬａｃ（ｐはプラスミドを意味し、ｔｎはトランスポゾンを意味し、そしてｌａｃはラクトース遺伝子のβフラグメントを意味する。これはマルチクローニングサイトを含有する）を用いるＰＣＲ反応に用いた。増幅ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動処理し、臭化エチジウムで染色して、紫外線トランスイルミネーターで可視化した。予測サイズに対応する帯域をゲルから切り出して、ザイモ・クリーンゲル回収キット（Zymo Clean Gel Recovery Kit）（Zymo Research, Orange, CA）を用いてアガロースから精製した。メーカーのプロトコールに従って、精製ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（５’）およびＢｃｌＩ（３’）（New England Biolabs, Beverly, MA）で消化した。ザイモＤＮＡクリーンおよびコンセントレイターキット（Zymo Research）を用いて、消化ＤＮＡを制限酵素から精製した。
【０１６０】
プラスミドｇＷｈｉｚ（Gene Therapy Systems, San Diego, CA）を、ＸｈｏＩおよびＢｃｌＩと互換性を有するがそれらが結合すると制限部位が破壊されるＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ（New England Biolabs）により消化した。消化ｇＷｈｉｚをアガロースゲル上
で分離し、所望の帯域を切り出して、上記と同様に精製した。このようにしてベクターを切断して、ＣＭＶプロモータおよび合成ポリＡ間の改変トランスポザーゼ（ｍＡＴＳ）の方向性クローニングを促した。
【０１６１】
ｇＷｈｉｚ中のＣＭＶプロモータおよび合成ポリＡ間にｍＡＴＳを挿入するために、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴ４リガーゼキット（Stratagene, Inc. La Jolla, CA）を用い、そしてメーカーのプロトコールに従って、連結を行った。Invitrogenのプロトコールに従って化学的形質転換を用いて、連結生成物を大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）中で形質転換した。形質転換細菌を１ｍｌのＳＯＣ（Gibco BRL、カタログ番号＃１５５４４−０４２）培地中で３７℃で１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬＢ（ルリア・ベルタニ培地（ブロスまたは寒天））プレート（ＬＢ／ａｍｐプレート）に展開させた。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートし、その結果生じたコロニーをＬＢ／ａｍｐブロスに３７℃で一晩増殖させた。アルカリ性溶解プロトコール（Sambrook et al., 1989）の変法を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、１％アガロースゲル上で電気泳動処理して、臭化エチジウムで染色後に、ＵＶトランスイルミネーターで可視化した。予測サイズ（約６．４ｋｂｐ）のプラスミドを生産するコロニーを少なくとも２５０ｍｌのＬＢ／ａｍｐブロス中で培養して、メーカーのプロトコール（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）に従って、Qiagenマキシ−プレップキット（カラム精製）を用いて、プラスミドＤＮＡを回収した。カラム精製ＤＮＡをシーケンシングのための鋳型として用いて、トランスポザーゼ中に作製された変化が所望の変化であり、そしてＰＣＲ増幅に起因するさらなる変化または突然変異は起きなかった、ということを立証した。シーケンシングのために、Perkin-Elmerのビッグダイシーケンシングキット（Big Dye Sequencing Kit）を用いた。パーキン・エルマー３７７型自動シーケンサーでのシーケンシングのために、全ての試料を、Gene Probes and Expression Laboratory（LEU School of Veterinary Medicine）に送った。
【０１６２】
一旦クローンが正しい配向で所望のｍＡＴＳを含有すると同定されたら、プライマーＣＭＶｆ−ＮｇｏＭ  ＩＶ（５’ＴＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴ（配列番号９５）；下線を付した塩基はＮｇｏＭ  ＩＶ認識部位を意味する）およびＳｙｎ−ポリＡ−ＢｓｔＥ  ＩＩ（５’ＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡ（配列番号９６）；下線を付した塩基はＢｓｔＥ  ＩＩ認識部位を意味する）を用いて、ｐＴｎＬａｃ中のトランスポゾンの上流でのクローニングのために、全ＣＭＶプロモータ、ｍＡＴＳおよび合成ポリＡをＰＣＲ増幅した。上記と同様にＦａｉｌＳａｆｅ（商標）を用いてＰＣＲを実行し、ザイモ・クリーンおよびコンセントレイターキットを用いて精製し、末端をＮｇｏＭ  ＩＶおよびＢｓｔＥ  ＩＩ（New England Biolabs）で消化して、ザイモキットで再び精製し、以下のようにｐＴｎＬａｃ中のトランスポゾンの上流でクローン化した。
【０１６３】
プラスミドｐＴｎＬａｃをＮｇｏＭ  ＩＶおよびＢｓｔＥ  ＩＩで消化して、ｐｔａｃプロモータを除去して、トランスポザーゼおよびフラグメントをアガロースゲル上で分離した。ベクターおよびトランスポゾンに対応する帯域を切り出して、アガロースから精製し、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs）で脱リン酸化して、自己アニーリングを防止した。ザイモＤＮＡクリーンおよびコンセントレイター−５を用いて、ベクターから酵素を除去した。精製ベクターおよびＣＭＶｐ／ｍＡＴＳ／ポリＡを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴ４リガーゼキットを用いて一緒に連結し、上記と同様に大腸菌中で形質転換した。
【０１６４】
この形質転換に起因するコロニーを上記と同様にスクリーニングし（ミニ−プッレプ）、正しいサイズであるクローンを、上記と同様にＤＮＡ配列分析により立証した。ベクターはｐＴｎＭｏｄ（配列番号５７）の名称を与えられ、以下の構成成分を含む：
塩基対１〜１３０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）からのＦ１（−）ｏｎの残部であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）の塩基対１〜１３０に対応する；
塩基対１３１〜１３２は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結の残基である；
塩基対１３３〜１７７７は、ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサーであり、ｐＧＷｉｚのｂｐ２２９〜１８７３に対応する。ＣＭＶプロモータは、ＡＴＧの上流のＡＣＣ配列の付加により改変された；
塩基対１７７８〜１７７９は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結の残基である；
塩基対１７８０〜２９８７は、トランスポザーゼｍＲＮＡの安定性のために、そしてタンパク質の発現のためにコドンを最適化することにより、Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）から改変されたトランスポザーゼに関するコード配列である。特に、トランスポザーゼの最初の１０個のアミノ酸に関するコドンの各々において、このような置換がコードされたアミノ酸を変えない場合、ＧまたはＣをＡまたはＴに変更した；
塩基対２９８８〜２９９３は、２つの工学処理終止コドンである；
塩基対２９９４は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結の残基である；
塩基対２９９５〜３４１０は、ｐＧＷｉｚベクター（Gene Therapy Systems）から得られた合成ポリＡ配列であり、１０  ｐＧＷｉｚのｂｐ１９２２〜２３３７に対応する；
塩基対３４１５〜３７１８は、ベクターｐＮＫ２８５９の残余である非コードＤＮＡである；
塩基対３７１９〜３７６１は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードλＤＮＡである；
塩基対３７６２〜３８３１は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０ｂｐの左挿入配列である；
塩基対３８３２〜３８３７は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結の残基である；
塩基対３８３８〜４５２７は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（２０）からのマルチクローニングサイトであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）のｂｐ９２４〜２３５に対応する。このマルチクローニングサイトを用いて、任意の目的コード配列をベクター中に挿入し得る；
塩基対４５２８〜４５３２は、ベクターを構築するために用いられた制限酵素部位の連結の残基である；
塩基対４５３３〜４６０２は、トランスポゾンＴｎ１０により認識される７０ｂｐの右挿入配列である；
塩基対４６０３〜４６４４は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードλＤＮＡである；
塩基対４６４５〜５４８８は、ｐＮＫ２８５９の残余である非コードＤＮＡである；
塩基対５４８９〜７６８９は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）塩基ベクター−（Stratagene, Inc.）に由来し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）のｂｐ７６１〜２９６１に対応する。
【０１６５】
完成ｐＴｎＭｏｄは、ｃｏｌＥ  Ｉ複製起点および抗生物質耐性マーカー（アンピシリン）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖である。
【０１６６】
上記の全ての非コードＤＮＡ配列は、任意のその他の非コードＤＮＡ配列（単数または複数）で置き換えられ得る、ということに留意すべきである。上記構築物中のヌクレオチド配列がないことは、制限部位レムナントを表す。
【０１６７】
標準手法により、全てのプラスミドＤＮＡを単離した。要するに、プラスミドを含有する大腸菌を、ＬＢブロス（適切な抗生物質を補足）の５００ｍＬアリコート中で、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。メーカーのプロトコールに従って、Qiagenマキシ−プレプキット（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）を用いて、細菌からプラスミドＤＮＡを回収した。プラスミドＤＮＡを５００μＬのＰＣＲ等級水中に再懸濁して、使用されるまで−２０℃で保存した。
【実施例２】
【０１６８】
トランスポゾン系ベクターｐＴｎＭＣＳ
真核生物細胞のゲノム中に所望のコード配列を挿入するために、別のトランスポゾン系ベクターを設計した。このベクターをｐＴｎＭＣＳと命名し、その構成要素を以下に提示する。ｐＴｎＭＣＳベクターの配列は、配列番号５６で提示される。ｐＴｎＭＣＳベクターは、トランスポザーゼ遺伝子に操作可能に結合される鳥類に最適化したポリＡ配列を含有する。鳥類に最適化したポリＡ配列は、Ａヌクレオチド鎖に先行する約７５ヌクレオチドを含有する。
Ｂｐ１〜１３０：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）（Stratagene）ｂｐ１〜１３０のＦ１（−）ｏｒｉの残部。
Ｂｐ１３３〜１７７７：ベクターｐＧＷｉｚ（Gene Therapy Systems）ｂｐ２２９〜１８７３から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
Ｂｐ１７８３〜２９９１：Ｔｎ１０（GenBank寄託番号Ｊ０１８２９）ｂｐ１０８〜１３１６からのトランスポザーゼ。
Ｂｐ２９９２〜３３４４：ベクターｐＮＫ２８５９からの非コードＤＮＡ。
Ｂｐ３３４５〜３３８７：ｐＮＫ２８５９からのλＤＮＡ。
Ｂｐ３３８８〜３４５７：Ｔｎ１０からの７０ｂｐの左側ＩＳ１０。
Ｂｐ３４６４〜３６７０：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）からＸｍａＩ部位ｂｐ９２４〜７１８までのマルチクローニングサイト。
Ｂｐ３６７１〜３７１５：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）から、ＸｍａＩ部位から、ＸｈｏＩ部位までのマルチクローニングサイト。これらの塩基対は、ｐＴｎＭＣＳｂｐ７１７〜６７３中にクローニングする場合、通常は失われる。
Ｂｐ３７１６〜４１５３：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）から、ＸｈｏＩ部位ｂｐ６７２〜２３５からのマルチクローニングサイト。
Ｂｐ４１５９〜４２２８：Ｔｎ１０からの７０ｂｐのＩＳ１０右。
Ｂｐ４２２９〜４２７０：ｐＮＫ２８５９からのλＤＮＡ。
Ｂｐ４２７１〜５１１４：ｐＮＫ２８５９からの非コードＤＮＡ。
Ｂｐ５１１５〜７３１５：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｋ（−）塩基ベクター−（Stratagene, Inc.）ｂｐ７６１〜２９６１。
【実施例３】
【０１６９】
卵白における抗体生産
ＣＭＶプロモータ／セクロピンプレプロ／抗体重鎖／セクロピンプロ／抗体軽鎖／コンアルブミンポリＡ（配列番号９７）を含有するトランスポゾン系ベクターを、ウズラおよびニワトリの卵管内に注入した。全２０個体の鳥（１０個体はニワトリおよび１０個体はウズラ）に注入し、かつ卵が生まれ次第、卵を鳥から回収した。次に、部分的に精製した卵白タンパク質（ＥＷ）を、両還元下および非還元下でゲルに流した。図５は、ゲルの写真である。レーン１および１８：分子量マーカ、レーン２および３：ＥＷ１番、それぞれ非還元、還元；レーン４および５：ＥＷ２番、それぞれ非還元、還元、レーン６および７：ＥＷ３番、それぞれ非還元、還元、レーン８および９：ＥＷ４番、それぞれ非還元、還元；レーン１０および１１：ＥＷ５番、それぞれ非還元、還元；レーン１２および１３：ＥＷ６番、それぞれ非還元、還元；レーン１４および１５：ＥＷ７番、それぞれ非還元、還元；レーン１６および１７：ＥＷ８番、コントロール、それぞれ非還元、還元。ゲルの
結果に基づくと、処理されたニワトリおよびウズラ中の卵白が上記のトランスポゾン系ベクターにより生産された抗体を含有する可能性は排除することができない。
【実施例４】
【０１７０】
動物への投与のための付加的トランスポゾン系ベクター
以下の例は、本発明の種々のトランスポゾン系ベクターおよび本発明のトランスポゾン系ベクター中への挿入のためのいくつかの構築物の説明を提供する。これらの例は、いかなる点においても限定的であることを意味しない。トランスポゾン系ベクター中への挿入のための構築物は、上記のクローニングベクターｐＴｎＭＣＳ中またはｐＴｎＭｏｄ中の両方に提供される。
【０１７１】
ｐＴｎＭＯＤ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＰＡ）（配列番号９７）
Ｂｐ１〜４０９０：ベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ１−４０９０由来。
Ｂｐ４０９６〜５７３９：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）、ｂｐ２３０−１８６４から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
Ｂｐ５７４６〜５９１６：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ５９２３〜７２８７：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７２８８〜７３０２：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３３（リシンを含む）から得られたプロ。
Ｂｐ７３０９〜７９５３：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７９６０〜８３７２：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ８３７４〜１１９７３：クローニングベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ４０９１−７６９０由来。
【０１７２】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＨＯＶｅｐ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−ＣＰＡ）（配列番号９８）
Ｂｐ１〜３７１５：ベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ１−３７１５由来。
Ｂｐ３７２１〜４３９５：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１、ｂｐ１−６７５から得られたニワトリオボアルブミンエンハンサー。
Ｂｐ４４０２〜５７３８：GenBank寄託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９、ｂｐ１−１３３６から得られたニワトリオボアルブミンプロモータ。
Ｂｐ５７４５〜５９１５：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ５９２２〜７２８６：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７２８７〜７２９８：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３０（リシンを含まない）から得られたプロ。
Ｂｐ７３０５〜７９４９：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７９５６〜８３６３：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ８３６５〜１１９６４：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７３】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＨＯｖｅｐ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＰＡ）（配列番号９９）
Ｂｐ１〜３７１５：ベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ１−３７１５由来。
Ｂｐ３７２１〜４３９５：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１、ｂｐ１−６７５から得られたニワトリオボアルブミンエンハンサー。
Ｂｐ４４０２〜５７３８：GenBank寄託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９、ｂｐ１−１３３６から得られたニワトリオボアルブミンプロモータ。
Ｂｐ５７４５〜５９１５：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ５９２２〜７２８６：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７２８７〜７３０１：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３３（リシンを含む）から得られたプロ。
Ｂｐ７３０８〜７９５２：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７９５９〜８３６６：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ８３６８〜１１９６７：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７４】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−ＣＰＡ）（配列番号１００）
Ｂｐ１〜３７１５：ベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ１−３７１５由来。
Ｂｐ３７２１〜５３６４：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）、ｂｐ２３０−１８６４から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
Ｂｐ５３７１〜５５４１：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ５５４８〜６９１２：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ６９１３〜６９２４：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３０（リシンを含まない）から得られたプロ。
Ｂｐ６９３１〜７５７５：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７５８２〜７９８９：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ７９９１〜１１５９０：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７５】
ｐＴｎＭＣＳ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−Ｌｙｓ−ＣＰＡ）（配列番号１０１）
Ｂｐ１〜３７１５：ベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ１−３７１５由来。
Ｂｐ３７２１〜５３６４：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）、ｂｐ２３０−１８６４から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
Ｂｐ５３７１〜５５４１：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ５５４８〜６９１２：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ６９１３〜６９２７：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３３（リシンを含む）から得られたプロ。
Ｂｐ６９３４〜７５７８：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７５８５〜７９９２：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ７９９４〜１１５９３：クローニングベクターｐＴｎＭＣＳ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７６】
ｐＴｎＭｏｄ（ＣＨＯｖｅｐ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−ＣＰＡ）（配列番号１０２）
Ｂｐ１〜４０９０：ベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ１−４０９０由来。
Ｂｐ４０９６〜４７７０：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１、ｂｐ１−６７５から得られたニワトリオボアルブミンエンハンサー。
Ｂｐ４７７７〜６１１３：GenBank寄託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９、ｂｐ１−１３３６から得られたニワトリオボアルブミンプロモータ。
Ｂｐ６１２０〜６２９０：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ６２９７〜７６６１：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７６６２〜７６７３：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３０（リシンを含まない）から得られたプロ。
Ｂｐ７６８０〜８３２４：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ８３３１〜８７３８：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ８７４０〜１２３３９：クローニングベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７７】
ｐＴｎＭｏｄ（ＣＨＯｖｅｐ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−ＬＹＳ−ＣＰＡ）（配列番号１０３）
Ｂｐ１〜４０９０：ベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ１−４０９０由来。
Ｂｐ４０９６〜４７７０：GenBank寄託番号Ｓ８２５２７．１、ｂｐ１−６７５から得られたニワトリオボアルブミンエンハンサー。
Ｂｐ４７７７〜６１１３：GenBank寄託番号Ｊ００８９９−Ｍ２４９９９、ｂｐ１−１３３６から得られたニワトリオボアルブミンプロモータ。
Ｂｐ６１２０〜６２９０：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ６２９７〜７６６１：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７６６２〜７６７６：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３３（リシンを含む）から得られたプロ。
Ｂｐ７６８３〜８３２７：Mark Glassy (Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ８３３４〜８７４１：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ８７４３〜１２３４２：クローニングベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７８】
ｐＴｎＭｏｄ（ＣＭＶ−ｐｒｅｐｒｏ−ＨＣＰｒｏ−ＣＰＡ）（配列番号１０４）
Ｂｐ１〜４０９０：ベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ１−４０９０由来。
Ｂｐ４０９６〜５７３９：ベクターｐＧＷＩＺ（Gene Therapy Systems）、ｂｐ２３０−１８６４から得られたＣＭＶプロモータ／エンハンサー。
Ｂｐ５７４６〜５９１６：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ５６３−７３３から得られたキャップ部位／プレプロ。
Ｂｐ５９２３〜７２８７：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体Ｒ
Ｍ２から得られた重鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７２８８〜７２９９：GenBank寄託番号Ｘ０７４０４、ｂｐ７１９−７３０（リシンを含まない）から得られたプロ。
Ｂｐ７３０６〜７９５０：Mark Glassy(Shantha West, Inc)により提供された抗体ＲＭ２から得られた軽鎖遺伝子構築物。
Ｂｐ７５５７〜７９６９：GenBank寄託番号Ｙ００４０７、ｂｐ１０６５１−１１０５８から得られたコンアルブミンポリＡ。
Ｂｐ７９７１〜１１９７０：クローニングベクターｐＴｎＭｏｄ、ｂｐ３７１６−７３１５由来。
【０１７９】
上記で引用した特許、出版物および抄録は全て、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。上記は本発明の好ましい実施形態に関するに過ぎず、特許請求の範囲に明示したような本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、多数の変更または代替は本明細書中で成され得る、と理解されるべきである。
【表２−１】
2006512921.tif 000003
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【表２−３０】
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【表２−３１】
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【表２−３２】
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【表２−３３】
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【表２−３４】
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【表２−３５】
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【表２−３６】
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【表２−３７】
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【表２−３８】
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【表２−３９】
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【表２−４０】
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【表２−４１】
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【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】２つのプロポリヌクレオチドに操作可能に結合された２つの目的遺伝子を含有するポリヌクレオチドカセットを描く概略図であり、ここで第一のプロポリヌクレオチドはプレプロポリヌクレオチドの一部である。「Ｐｒｏｍ」はプロモータを表わす。
【図２】抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドカセットを描く概略図である。「Ｏｖａｌ  ｐｒｏｍ」は、オボアルブミンプロモータを表わす。上記ポリヌクレオチドカセットは、プロおよびプレプロ配列を含有し、トランスポザーゼにより認識される挿入配列（ＩＳ）で隣接されている。
【図３】２つの目的遺伝子に操作可能に結合されたセクロピンプレプロ配列を含有するポリヌクレオチドカセットを描く概略図である。目的遺伝子の間に、「ＣＳ」で表わされる切断部位が存在する。
【図４】２つの目的遺伝子、プロモータ（ｐｒｏｍ）、シグナル配列（ＳＳ）、および切断部位（ＣＳ）を含有するポリヌクレオチドカセットを描く概略図である。ポリヌクレオチドカセットは、トランスポザーゼにより認識される挿入配列（ＩＳ）で隣接されている。
【図５】減圧条件および非減圧条件下で実施された、部分的に精製されたトランスジェニック鳥類由来の卵白を示すゲルの写真である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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