(57)【要約】  本発明は、相乗的治療効果を提供するための、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの、化学療法剤と組み合わせた治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者における癌を処置するための方法であって、該患者に免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを化学療法剤と組み合わせて投与することを含み、ここで前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーおよび化学療法剤は相乗効果を作り出す、前記方法。
【請求項２】
イムノマーが、非ヌクレチドオリンカーによって結合された、１つより多い５’末端を有する少なくとも２つのオリゴヌクレトチドを含み、ここで前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは到達可能５’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーが、構造：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙは、シチジン、２’デオキシシチジン、アラビノシチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、その他の非天然ピリミジンヌクレオシド、または１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；
Ｚは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換アラビノグアノシン、２’デオキシイノシンまたはその他の非天然プリンヌクレオシドであり；
Ｎ１は、各々の場合に、天然に存在するかまたは合成のヌクレオシドまたは免疫刺激性部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルまたは修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、限定することなく、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択され；
Ｎｎは、各々の場合に、好ましくは天然に存在するヌクレオシドまたは免疫刺激性部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、および修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、好ましくは、アミノリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびメチルホスホネートヌクレオシド間結合からなる群から選択される；
で表される前記構造を有し、
ただし、Ｎ１またはＮｎの少なくとも１つは免疫刺激性部分であり；
ここで各ｎは独立して、０〜３０までの数であり；そして
ここで、イムノマーの場合は、３’末端は直接または非ヌクレオチドリンカーを介して他のオリゴヌクレオチドに結合されており、これは免疫刺激性であってもなくてもよい；
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
化学療法剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖非含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラギリン、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタインおよびポリフェルポサン、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール、グラモレク、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ヒカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトロキサントロン、メタレット／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナールＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、メシル酸イマチニブ／グリべック、ピシバニル／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロミド、エバセット／リポソームドキソルビシン、ユータキサン／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロアド／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）ＲＡＳ腫瘍遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口プラチナ、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミソール、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス／ラリトレキセド、ルイスタチン／クラドリビン、パキセックス／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルモルビシン／エピルビシン、デポシト、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタリミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン、カエチックス／リポソームドキソルビシン、ゲムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド、ＹＭ１１６、ロジンシード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシホスファミド、イフェス／メスネックス／イホスファミド、ブモン／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール／シスプラチン、ベペシド／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテレ／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェランおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アルパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロンブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロシキカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
イムノマーが、構造：
５’−ＴＣＧＴＴＧＸ−Ｙ−ＸＧＴＴＧＣＴ−５’
式中、ＸはＣ３リンカーであり、Ｙはグリセロールリンカーである、
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
イムノマーが、構造：
【化１】
2006528697.tif 000022
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーが、ピリミジン−プリンジヌクレオシドを含み、ここで該プリンヌクレオシドは、構造（ＩＩ）：
【化２】
2006528697.tif 000023
（ｉｉｉ）式中、
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各Ｌは、独立してＣ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択され；そして、
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
水素結合供与体が、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
水素結合受容体が、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝および芳香族複素環の環窒素原子からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
天然に存在しないプリンが６−チオグアニンまたは７−デアザグアニンである、請求項７に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー。
【請求項１１】
天然に存在しないピリミジンが、構造（Ｉ）：
【化３】
2006528697.tif 000024
（ｉｖ）式中、
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ｘは、炭素または窒素であり；そして
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
水素結合供与体が、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
水素結合受容体が、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、およびシトシンのＮ３を含む芳香族複素環の環窒素原子からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（Ｉ）の塩基部分が、天然に存在しないピリミジン塩基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
天然に存在しないピリミジン塩基が、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシンからなる群から、好ましくはＮ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（Ｉ）における糖部分Ｓ’が、天然に存在しない糖部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
天然に存在しない糖部分が、ヘキソース、アラビノースおよびアラビノース誘導体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーが、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さのリンカー、金属、溶解性または非溶解性の生体分解性ポリマービーズ、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドへの付着を許容する官能基を有する有機部分、生体分子、環式または非環式の小分子、脂肪族または芳香族炭化水素、からなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーを含み、これらのいずれもが、オリゴヌクレオチドに結合しているかまたはそれに付加されている直鎖において、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオ尿素；アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン、抗生物質、式：ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表され、式中、ｏおよびｐは独立して１〜約６の整数であるグリセロールまたはグリセロールホモログ、および１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体、からなる群から選択される１個または２個以上の官能基を随意的に含むことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーが、本質的にホスホジエステル結合からなるヌクレオシド間結合を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
癌患者における癌を処置するための方法であって、該患者に化学療法剤と組み合わせて免疫刺激性オリゴヌクレオチド結合体および／またはイムノマー結合体を投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー、化学療法剤および生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項２２】
ワクチンを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーまたはワクチン、または両方が、免疫原性タンパク質に結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アジュバントを投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年５月１６日に出願された米国仮出願第60/471,247号の利益を主張し、該仮出願は参照としてその全体が組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、イムノマーを治療薬として用いる抗癌用途に関する。
【０００３】
関連分野の概要
近年、数人の研究者らにより、オリゴヌクレオチドを免疫療法の用途において免疫刺激剤として用いることの有効性が示された。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘導できるとの観察は、これらの化合物を治療ツールとして開発することへの関心を創出した。これらの努力は、天然のジヌクレオチドＣｐＧを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに集中した。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含むホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンアルファおよびガンマの合成を誘導し、ナチュラルキラー活性を増強できることを教示している。Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)は、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)は、かかるオリゴヌクレオチドがヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、インフルエンザウィルスに対する免疫反応を増強することを教示している。McCluskie and Davis, J. Immunol.161:4463-4466 (1998)は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、強力なアジュバントとして作用し、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に対する免疫反応を増強することを教示している。
【０００４】
ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾は、免疫反応の調節剤として作用するそれらの能力にも影響を及ぼし得る。例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182；Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 52:1537-1544；Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502；Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458；Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054；Yu et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588；Yu et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267；およびKandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001)9:807-813を参照のこと。米国特許第6,426,334号は、これらの化合物が抗癌剤として期待されることを示す。
【０００５】
多くのマウスおよびヒト腫瘍が、宿主免疫システムによって認識できる免疫原性エピトープを有することがよく示されているにもかかわらず、多くの場合、宿主防御は適切な応答をしかけることに失敗し、癌患者における制御されない腫瘍の増殖をもたらす。宿主免疫システムが腫瘍細胞に対する防御の誘導に失敗することは、腫瘍抗原の低い免疫原性および／または宿主免疫システムそれ自体の欠陥に関連している可能性がある。
これらの報告は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの抗癌活性を増強する必要性の存在を明確にしている。
発明の簡単な概要
【０００６】
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド化合物の抗癌活性を増強するための方法を提供する。本発明による方法は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果と化学療法剤の治療効果の相乗効果を可能にする。免疫刺激性オリゴヌクレオチドを修飾して５’末端を最適に提示するようにすると、その抗癌活性が劇的に増強される。かかるオリゴヌクレオチドは、本明細書において「イムノマー（immunomer）」と呼ばれ、これは１つまたは２つ以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むことができる。
従って第１の側面において、本発明は、癌患者における癌を処置するための、該患者に免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを化学療法剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供し、ここで前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーおよび化学療法剤は相乗治療効果を創出する。
【０００７】
ある態様において、本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択される免疫刺激性ジヌクレオチドを含み、この式中、Ｃはシチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、他の非天然ピリミジンヌクレオシド、または１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’ 置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、そしてｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合である。ある好ましい態様において、免疫刺激性ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【０００８】
ある態様において、本発明による方法において用いる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、式（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙは、シチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシシチジン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、その他の非天然ピリミジンヌクレオシド、または１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；
Ｚは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシンまたはその他の非天然プリンヌクレオシドであり；
【０００９】
Ｎ１は、各々の場合に、好ましくは天然に存在するかまたは合成のヌクレオシドまたは免疫刺激性部分であって、これらは、脱塩基（abasic）ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルまたは修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、限定することなく、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択され；
【００１０】
Ｎｎは、各々の場合に、天然に存在するヌクレオシドまたは免疫刺激性部分であって、これらは好ましくは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、および修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、アミノリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびメチルホスホネートヌクレオシド間結合からなる群から選択される；
で表される免疫刺激性ドメインを含み、
ただし、Ｎ１またはＮｎの少なくとも１つは免疫刺激性部分であり；
ここでｎは０〜３０の数であり；
ここで３’ヌクレオシドは、随意的に、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して他のオリゴヌクレオチドに結合されており、これは免疫刺激性であってもなくてもよい。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、癌患者における癌を処置する方法を提供し、該方法は、上に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーと、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの到達可能５’末端以外の位置に結合された癌抗原とを含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー結合体を、化学療法剤と組み合わせて投与することを含む。
第３の側面において、本発明は、本発明による免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーまたはイムノマー結合体、化学療法剤および生理学的に許容し得る担体とを含む、医薬製剤を提供する。
【００１２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを抗癌剤として化学療法剤と組み合わせて治療に用いることに関する。本明細書に引用された、発行された特許、特許出願、および参考文献は、その各々が具体的また個別に参照として組み込まれると示された場合同様に、参照としてここに組み込まれる。本明細書に引用された任意の参考文献の任意の教示と本明細書の間に不一致がある場合は、本発明のために後者を優先する。
【００１３】
本発明は、癌の処置のための免疫療法用途で用いられる、免疫刺激性化合物によって生じる、抗癌効果を増強するための方法を提供する。本発明のイムノマーおよび／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、腫瘍または癌（例えば、脳、肺（例えば小細胞および非小細胞）、子宮、乳房、前立腺、直腸などの癌、グリオーマ、さらに他のメラノーマ、カルシノーマ、白血病、リンパ腫および肉腫）の発症および／または進行を処置する、抑制するまたは改善するために用いることができる。本発明による方法において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、化学療法剤と組み合わせて用いた場合に、相乗的治療効果を提供する。この結果は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーは免疫系細胞の細胞分裂を引き起こし、一方、化学療法剤は一般に、活発に分裂する細胞を殺すという事実からみれば驚くべきことである。
【００１４】
第１の側面において、本発明は、化学療法剤と組み合わせて免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを投与することを含む、癌患者における癌を処置するための方法を提供し、ここで後者は、該イムノマーが２個以上の５’末端を有するように一緒に結合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここでオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。本明細書において、用語「到達可能５’末端」とは、イムノマーを認識して結合し免疫系を刺激する因子が到達できるように、オリゴヌクレオチドの５’末端が十分に利用可能であることを意味する。随意的に、５’ＯＨは、ホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート部分、芳香族もしくは脂肪族リンカー、コレステロール、または到達可能性を損なわない他の実体と結合することができる。免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーは、脊椎動物に投与されると、免疫反応を引き起こすことができる。化学療法剤と組み合わせて用いると、相乗的治療効果が得られる。
【００１５】
本発明による方法において用いられる、好ましい化学療法剤は、限定することなく以下を含む：ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖非含有（non-sugar containing）クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（fragyline）、メグラミン（Meglamine）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン（carmustaine）およびポリフェルポサン（poliferposan）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシル（famesyl）トランスフェラーゼ阻害剤、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール（Lometexol）、グラモレク（Glamolec）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ヒカムチン／トポテカン（Hycamtin/Topotecan）、ＰＫＣ４１２、バルスポダール（Valspodar）／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトロキサントロン（Novantrone/Mitroxantrone）、メタレット／スラミン（Metaret/Suramin）、バチマスタット（Batimastat）、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル（Incel）／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット（Marmistat）、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール（Lemonal）ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、メシル酸イマチニブ／グリべック、ピシバニル（Picibanil）／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン（Metastron）／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロミド（Temodal/Temozolomide）、エバセット（Evacet）／リポソームドキソルビシン、ユータキサン（Yewtaxan）／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロアド／カペシタビン（Xeload/Capecitabine）、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス（Cyclopax）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール（Flavopiridol）、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）ＲＡＳ腫瘍遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口プラチナ、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール／レバミソール（Ergamisol/Levamisole）、エニルウラシル（Eniluracil）／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミソール（Campto/Levamisole）、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス／ラリトレキセド（Tumodex/Ralitrexed）、ルイスタチン／クラドリビン（Leustatin/Cladribine）、パキセックス（Paxex）／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス（Caelyx）／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルモルビシン／エピルビシン、デポシト（DepoCyt）、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタリミド（Bis-Naphtalimide）、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン（Dolastain）、カエチックス（Caetyx）／リポソームドキソルビシン、ゲムザール（Gemzar）／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド（Anormed）、ＹＭ１１６、ロジンシード（lodine seeds）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシホスファミド、
【００１６】
イフェス／メスネックス（Ifes/Mesnex）／イホスファミド、ブモン／テニポシド（Vumon/Teniposide）、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール（Plantinol）／シスプラチン、ベペシド（Vepeside）／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテレ／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェラン（melphelan）およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アルパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロンブシル（Chlorombucil）、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチン（Estramustine）リン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン（Floxuridine）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロシキカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（Lomustine）（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（Mechlorethamine）ＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ（Mesna）、ミトタン（Mitotane）（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）ＨＣｌ、オクトレオチド（Octreotide）、プリカマイシン（Plicamycin）、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（Amsacrine）（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（Hexamethylmelamine）（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（Semustine）（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシン。
【００１７】
本発明のこの側面による方法において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの投与は任意の好適な経路で実施でき、これには、限定することなく、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチまたは点眼液またはうがい薬の形態を含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの治療組成物の投与は、既知の方法を用いて、疾患の症状または代理マーカーを低減するのに効果的な用量および期間で、実施することができる。全身的に投与する場合、治療組成物は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルの血中濃度を達成するのに十分な用量で投与するのが好ましい。局所投与に対しては、これより大幅に低い濃度も効果的であることができ、そして大幅に高い濃度も耐容され得る。好ましくは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの総用量は、約０．０００１ｍｇ／患者・日〜約２００ｍｇ／体重１ｋｇ・日の範囲である。１種または２種以上の本発明の治療組成物の治療的に有効な量を、１回の処置として、同時にまたは連続して投与するのが望ましい。
【００１８】
本発明のこの側面のために、用語「組み合わせて」は、同一患者の同一疾患を処置する過程において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーおよび／または化学療法剤を任意の順序で投与することを含むことを意味し、これは同時投与および、数日間までの時間的に間隔をあけた順序での投与を含む。かかる組み合わせ処置はまた、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー、および／または単独の化学療法剤の、１回を超える投与を含むことができる。免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーおよび／または化学療法剤の投与は、同一または異なる経路で実施してよい。
ある態様において、本発明による方法において用いるイムノマーは、２つまたは３つ以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、（イムノマーとの関連において）これは同一または異なっていてよい。好ましくは、かかる免疫刺激性オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも１つの到達可能５’末端を有する。
【００１９】
本発明による方法のある態様において、イムノマーはまた、１つまたは２つ以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドに加えて、遺伝子に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において、用語「相補的な」とは、生理的条件の下で、オリゴヌクレオチドが遺伝子のある部位にハイブリダイズすることを意味する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは遺伝子の発現を下方制御する。かかる下方制御オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムオリゴヌクレオチド、小阻害性ＲＮＡ（small inhibitory RNA）およびデコイオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるのが好ましい。本明細書において、用語「遺伝子を下方制御する」とは、遺伝子の転写または遺伝子産物の翻訳を阻害することを意味する。従って、本発明による方法において用いられるイムノマーは、１つまたは２つ以上の特定疾患ターゲットを標的化し、一方で免疫システムを刺激するのに用いることができる。
【００２０】
ある態様において、本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において、用語「リボザイム」は、触媒作用を有するオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、リボザイムは、特定の核酸標的に結合して、該標的を開裂する。本明細書において、用語「デコイオリゴヌクレオチド」は、配列特異的様式で転写因子に結合し、転写活性を阻むオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドは二次構造を示し、これにはステムループまたはヘアピン構造を含むが、これらに限定はされない。ある態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはポリ（Ｉ）−ポリ（ｄＣ）を含む。ある態様において、少なくとも１組のＮｎは、３〜１０のｄＧｓおよび／またはＧｓのストリング、または２’−置換リボもしくはアラビノＧｓを含む。
【００２１】
本発明のためには、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指す。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法により製造される。好ましい態様においては、各ヌクレオシド単位は、複素環塩基および、ペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２'−デオキシ−２'−置換アラビノース、２'−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多くの知られたヌクレオシド間結合の任意のものによって互いに結合され得る。かかるヌクレオシド間結合は、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミダイト（phosphoramidate）、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミダイト、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１つまたは２つ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−もしくは （ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドも含む。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、任意のかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図し、前記結合がホスフェート基を含むか含まないかは問わない。ある好ましい態様においては、これらヌクレオシド間結合はホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２２】
ある態様において、イムノマーは、各々が約３〜約３５のヌクレオシド残基を、好ましくは約４〜約３０のヌクレオシド残基を、より好ましくは約４〜約２０のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５もしくは６〜約１８、または約５もしくは６〜約１４のヌクレオシド残基を含む。本明細書において、用語「約」とは、正確な数値が重要ではないことを意味する。従って、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要ではなく、１つもしくは２つ少ないヌクレオシド残基、または１つもしくは数個の余分なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明のためには、上記の態様の各々と等価であると考えられる。ある態様において、１つまたは２つ以上のオリゴヌクレオチドは１１個のヌクレオチドを有する。
【００２３】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定なく、タンパク質基、親油性基、インターカレート剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ポリマーを包含する他の任意の核酸塩基を含み、これらには、限定なしに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーやアミノリンカーをもつ骨格部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２４】
本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはこれらの混合物を含むことができる。本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分またはこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで述べるような非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様においては、修飾ヌクレオシドは２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシドである。
【００２５】
本発明のためには、用語「２’−置換リボヌクレオシド」は、ペントース部分の２’位におけるヒドロキシル基が置換されて２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドとなるリボヌクレオシドを含む。好ましくは、かかる置換は、１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によりなされ、かかるアルキルまたはアリール基は、置換されていなくてもよく、または、例えばハロ（halo）、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、もしくはアミノ基に置換されていてもよい。かかる２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドの例は、限定なく、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドを含む。
【００２６】
用語「２’−置換リボヌクレオシド」はまた、２’−ヒドロキシル基が、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基またはアミノもしくはハロ基により置換されている、リボヌクレオシドを含む。そのような２’−置換リボヌクレオシドの例は、限定なく、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドを含む。
用語「オリゴヌクレオチド 」はハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種より多いヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの好ましい１例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート部位およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えばPederson et al.の、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号などを参照）。
【００２７】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１種より多いヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい１例は、リボヌクレオチド、または２’−置換リボヌクレオチド部位、およびデオキシリボヌクレオチド部位を含む（例えばMetelevおよびAgrawal、米国特許第5,652,355号、第6,346,614号および第6,143,881号を参照)。
【００２８】
本発明のためには、用語「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、魚類、鳥類または哺乳類などの脊椎動物に投与された場合に免疫反応を引き起こす、上記のオリゴヌクレオチドを指す。本明細書において、用語「哺乳類」は、限定なく、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、家畜、ウシ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。有用な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Agrawal et al.らの、１９９８年１１月５日に公開されたWO 98/49288；２００１年２月２２日に公開されたWO 01/12804、２００１年８月２日に公開されたWO 01/55370、２００１年４月３０日に申請されたPCT/US01/13682；および２００１年９月２６日に申請されたPCT/US01/30137に記載されている。好ましくは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００２９】
ある態様において、イムノマーの少なくとも１つの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式：５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’で表される免疫刺激性ジヌクレオチドを含み、式中、Ｐｙｒは天然または合成ピリミジンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは天然または合成プリンヌクレオシドである。本明細書において、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がピリミジン塩基であるヌクレオシドを指す。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がプリン塩基であるヌクレオシドを指す。本発明のためには、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３０】
本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける好ましいピリミジンヌクレオシドは、構造（Ｉ）：
【化１】
2006528697.tif 000002
（ｉ）式中、
Ｄは、水素結合供与体（hydrogen bond donor）であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体（hydrogen bond acceptor）、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ｘは、炭素または窒素であり；そして
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００３１】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのＮ３を含む。
【００３２】
ある態様において、（Ｉ）の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しない好ましいピリミジン塩基の例は、限定なく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルを含む。ある態様において（Ｉ）の糖部分Ｓ’は、天然に存在しない糖部分である。本発明のためには、「天然に存在する糖部分」は、例えばリボースおよび２’−デオキシリボースなどの、核酸の一部として天然に存在する糖部分であり、「天然に存在しない糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しない任意の糖であるが、ヘキソースなどのオリゴヌクレオチドの骨格において用いることのできるものである。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００３３】
本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける、好ましいプリンヌクレオシド類似体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
2006528697.tif 000003
（ｉｉ）式中、
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され；
Ａは、水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各Ｌは、独立してＣ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択され；そして、
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００３４】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１を含む。
【００３５】
ある態様において、（ＩＩ）の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しない好ましいプリン塩基の例は、限定なく、６−チオグアニンおよび７−デアザグアニンを含む。ある態様において、（ＩＩ）の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について上記したように、天然に存在する糖部分である。
【００３６】
好ましい態様において、本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける免疫刺激性ジヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊、およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、この式中、Ｃは、シチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｃ＊は、２’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、他の非天然ピリミジンヌクレオシド、または１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；Ｇは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、Ｇ＊は、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’ 置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、そしてｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間結合である。ある好ましい態様において、免疫刺激性ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００３７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性部分を、免疫刺激性ジヌクレオチドの片側または両側に含むことができる。従って、ある態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、構造（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙは、シチジン、２’デオキシチミジン、２’デオキシシチジン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−デオキシチミジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、その他の非天然ピリミジンヌクレオシド、または１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり；
【００３８】
Ｚは、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換アラビノグアノシン、２’デオキシイノシンまたはその他の非天然プリンヌクレオシドであり；
Ｎ１は、各々の場合に、天然に存在するかまたは合成のヌクレオシドまたは免疫刺激部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルまたは修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシドからなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、限定することなく、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択され；
【００３９】
Ｎｎは、各々の場合に、好ましくは天然に存在するヌクレオシドまたは免疫刺激部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、および修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの３’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、好ましくは、アミノリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびメチルホスホネートヌクレオシド間結合からなる群から選択される；
で表される免疫刺激性ドメインを含み、
ただし、Ｎ１またはＮｎの少なくとも１つは免疫刺激性部分であり；
ここで各ｎは独立して、０〜３０の数であり；そして
ここで、イムノマーの場合は、３’末端は直接または非ヌクレオチドリンカーを介して他のオリゴヌクレオチドに結合されており、これは免疫刺激性であってもなくてもよい。
【００４０】
ある好ましい態様において、ＹＺは、アラビノシチジンまたは２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジンおよび、アラビノグアノシンまたは２’デオキシ−２’−置換アラビノグアノシンである。好ましい免疫刺激性部分はホスフェート骨格の修飾を含み、これには、限定なく、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホラミダイト、特に１級アミノ−ホスホラミダイト、Ｎ３ホスホラミダイトおよびＮ５ホスホラミダイト、および立体特異的結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）が含まれる。
【００４１】
本発明による好ましい免疫刺激性部分は、糖修飾を有するヌクレオシドをさらに含み、これには限定なく以下が含まれる：限定なく２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボース、および２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを含む、２’−置換ペントース糖；限定なく３’−Ｏ−メチルリボースを含む、３’−置換ペントース糖；１’，２’−ジデオキシリボース；アラビノース；限定なく１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシチルアラビノース、および２’−置換アラビノース糖を含む、置換アラビノース糖；限定なく１，５−アンヒドロヘキシトールを含む、ヘキソース糖；並びにアルファ−アノマー。修飾糖が３’−デオキシリボヌクレオシドまたは３’−Ｏ−置換リボヌクレオシドである態様においては、免疫刺激性部分は、２’−５’ヌクレオシド間結合によって隣接するヌクレオシドに付着している。
【００４２】
本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける好ましい免疫刺激性部分は、他の炭水化物骨格修飾物および置換物を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、これには以下が含まれる：ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、および約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有する骨格リンカー部を有するオリゴヌクレオチドであって、限定なくアルキルリンカーまたはアミノリンカーを含むもの。アルキルリンカーは、分枝または非分枝であってもよく、置換または無置換であってもよく、キラル的に純粋であってもラセミ混合物であってよい。最も好ましくは、かかるアルキルリンカーは約２〜約１８個の炭素原子を有する。ある好ましい態様においては、かかるアルキルリンカーは約３〜約９個の炭素原子を有する。あるアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオエーテルからなる群から選択される、１つまたは２つ以上の官能基を含む。かかる官能基アルキルリンカーのあるものは、式−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（ｎ＝１〜９）で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーである。かかる官能基アルキルリンカーの他のあるものは、ペプチドまたはアミノ酸である。
【００４３】
本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける、好ましい免疫刺激性部分は、限定なくβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドおよびα−デオキシリボヌクレオシドを含むＤＮＡアイソフォームを、さらに含む。好ましい免疫刺激性部分は、３’修飾を組み込み、そして、限定なく２’−５’、２’−２’、３’− ３’および５’−５’結合を含む、非天然のヌクレオシド間結合位を有するヌクレオシドをさらに含む。
本発明による方法において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおける、好ましい免疫刺激性部分は、修飾複素環塩基を有するヌクレオシドをさらに含み、これらは、限定なく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、７−デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、Ｃ５−プロピニルピリミジン、および限定なく２，６−ジアミノプリンを含むジアミノプリンを含む。
【００４４】
具体的な例により、そして限定することなく、例えば、構造（ＩＩＩ）の免疫刺激性ドメインにおいて、Ｎ１位またはＮｎ位のメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、免疫刺激性部分であり、リンカーは約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有し、Ｘ１位のＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーは免疫刺激性部分であり、そしてＸ１位のβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドは免疫刺激性部分である。免疫刺激性部分の代表的な位置および構造については、下の表１を参照のこと。特定位置における免疫刺激性部分としてのリンカーの言及は、その位置のヌクレオシド残基がその３’−ヒドロキシルにおいて指定のリンカーによって置換され、それによって、そのヌクレオシド残基と３’側の隣接するヌクレオシドとの間に修飾ヌクレオシド間結合を生成することを意味すると理解される。同様に、特定位置における免疫刺激性部分としての修飾ヌクレオシド間結合の言及は、その位置のヌクレオシド残基が、３’側の隣接するヌクレオシドに、列挙された結合によって結合されていることを意味する。
【００４５】
表１
【表１】
2006528697.tif 000004
表２は、上流増強ドメイン（upstream potentiation domain）を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド内の免疫刺激性部分の代表的な位置および構造を示す。本明細書において、用語「スペーサー９」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−、式中ｎは３である、で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーを指す。用語「スペーサー１８」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、式中ｎは６である、で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーを指す。本明細書において、用語「Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−、式中ｑは２〜１８の整数である、で表されるリンカーを指す。従って、用語「Ｃ３リンカー」および「Ｃ３アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−で表されるリンカーを指す。スペーサー９、スペーサー１８、およびＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーの各々について、リンカーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネート結合によって、隣接するヌクレオシドに結合される。
【００４６】
表２
【表２】
2006528697.tif 000005
表３は、下流増強ドメイン（downstream potentiation domain）を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド内の免疫刺激性部分の代表的な位置および構造を示す。
【００４７】
表３
【表３】
2006528697.tif 000006
本発明による方法において用いるイムノマーは、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して結合した、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。本発明のためには、「非ヌクレオチドリンカー」は、オリゴヌクレオチドに共有結合または非共有結合で結合できる任意の部分である。好ましくは、かかるリンカーの長さは約２オングストローム〜約２００オングストロームである。好ましいリンカーの幾つかの例が、以下に記されている。非共有結合は、限定はされないが、静電相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、および水素結合を含む。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上記のような、例えばホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート官能基などの、２つのヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基を直接結合するヌクレオシド間結合を指すことは意味しない。本発明のためには、かかる直接３’−３’結合は「ヌクレオチド結合」と考えられる。
【００４８】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは金属であり、限定なく、金粒子を含む。他のある態様において、非ヌクレオチドリンカーは溶解性または不溶解性の生体分解性ポリマービーズである。
さらに他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの付着を許容する官能基を有する有機部分である。かかる付着は、任意の安定な共有結合によるのが好ましい。
【００４９】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは生体分子であり、限定なく、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖を含む。他のある態様において、非ヌクレオチドリンカーは小分子である。本発明のためには、小分子は１，０００Ｄａ未満の分子量を有する有機部分である。ある態様において、小分子は７５０Ｄａ未満の分子量を有する。
ある態様において、小分子は脂肪族または芳香族炭化水素であり、これらのどちらも、随意的に、オリゴヌクレオチドを結合する直鎖においてまたはそれに付加されて、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオ尿素からなる群から選択される１つまたは２つ以上の官能基を含むことができる。小分子は、環式または非環式であることができる。小分子リンカーの例は、限定はされないが、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含む。しかし、非ヌクレオチドリンカーを記述するために、用語「小分子」はヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００５０】
ある態様において、小分子リンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表されるグリセロールまたはグリセロールホモログであり、式中、ｏおよびｐは独立して、１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である。他のある態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン誘導体である。幾つかのかかる誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨで表され、式中、ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である。
【００５１】
本発明による方法において用いるイムノマーにおける、ある非ヌクレオチドリンカーは、図１に模式的に示すように、２つより多いオリゴヌクレオチドの付着を許容する。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有的にそれに付着できる３個のヒドロキシル基を有する。本発明によるあるイムノマーは、従って、非ヌクレオチドリンカーに３’末端で結合する、２つより多いオリゴヌクレオチドを含む。幾つかのかかるイムノマーは、その各々が到達可能５’末端を有する、少なくとも２つの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。
【００５２】
本発明による方法において用いる免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、図５および図６に模式的に示されるように、また例にさらに記載されるように、自動合成装置およびホスホラミダイトアプローチを用いて好都合に合成することができる。ある態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、直線合成アプローチ（図５参照）により合成される。本明細書において、用語「直線合成」は、イムノマーの１つの末端から開始して、直線的に他の末端へと進行する合成を指す。直線合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成および／または組み込まれる化学修飾に関して）のモノマー単位を、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーに組み込むことを許容する。
【００５３】
イムノマーの合成の代替的な様式は「パラレル合成」であり、ここで合成は中心リンカー部分から外向きに進行する（図６参照）。パラレル合成には、米国特許第5,912,332号に記載されているように固体サポート付着リンカー（solid support attached linker）を用いることができる。代替的に、例えば制御ポアガラスサポートに付着したホスフェートなどのユニバーサル固体サポートを用いることもできる。
イムノマーのパラレル合成は、直線合成に対して幾つかの利点を有する：（１）パラレル合成は同一のモノマー単位の組み込みを許容する；（２）直線合成とは異なり、両方（または全て）のモノマー単位が同時に合成され、そのため合成に必要な合成ステップ数および時間が、モノマー単位のそれらと同じになる；および（３）合成ステップ数の減少は、最終イムノマー産物の純度および収率を改善する。
【００５４】
直線合成またはパラレル合成プロトコルによる合成の最後に、本発明による方法において用いる免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは好都合に脱保護することができ、これは濃縮アンモニア溶液を用いて、またはもし修飾ヌクレオシドが組み込まれる場合はホスホラミダイト供給者による推奨に従って行う。免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー産物は、逆相ＨＰＬＣにより好ましくは精製され、脱トリチル化され（detritylated）、脱塩されそして透析される。
【００５５】
表４は、本発明による方法において用いられる代表的イムノマーを示す。さらなるイムノマーは例に記載される。
表４．イムノマーの配列の例
【表４】
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【表５】
2006528697.tif 000008
【００５６】
第２の側面において、本発明は、患者に対して、化学療法剤を免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー結合体と組み合わせて投与することを含む、癌患者における癌を処置する方法を提供し、該結合体は、上記の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー、および到達可能５’末端以外の位置において免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーに結合される抗原を含む。ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、癌に関連する抗原を含み、該抗原はオリゴヌクレオチドに結合される。他のある態様において、抗原は、３’末端以外の位置においてオリゴヌクレオチドに結合される。ある態様において、抗原は、ワクチン効果を生じる。本発明のためには、用語「関連する」は、癌が存在する場合には抗原が存在するが、癌が不在の場合は、抗原が存在しないかまたは少ない量で存在することを意味する。
【００５７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、抗原に共有結合で結合するか、そうでなければ、抗原と動作可能に結合する。本明細書において、用語「動作可能に結合する」は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーおよび抗原の両方の活性を維持する任意の結合を指す。かかる動作可能な結合の非限定的な例は、同じリポソームまたは他のかかる送達ビヒクルもしくは試薬の一部となることである。さらに、抗原をコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングして、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーと組み合わせて投与することができる。本明細書において、用語「ベクター」は、それらが結合した他の核酸を輸送する能力のある核酸分子を指す。好ましいベクターは、それらが結合した核酸（例えばエピソーム）の自己複製および発現が可能なベクターである。それらが動作可能に結合した遺伝子の発現を方向付けることができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形をしており、通常、環状二本鎖ＤＮＡループと呼ばれ、そのベクター形態においてクロモソームに結合されない。本明細書において「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、同義的に用いられる。しかし、本発明は、等価な機能をもたらし、これから続いて当分野に知られるようになる発現ベクターの他の形態も包含することが意図される。
【００５８】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーが抗原に共有結合で結合している態様においては、かかる共有結合は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの到達可能５’末端以外の、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの任意の位置であるのが好ましい。例えば、抗原は、ヌクレオシド間結合に付着してもよく、または非ヌクレオチドリンカーに付着してもよい。代替的に、抗原はそれ自体が非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００５９】
第３の側面において、本発明は、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または免疫刺激性オリゴヌクレオチド結合体および／またはイムノマーまたはイムノマー結合体、化学療法剤および生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。本明細書において、用語「生理学的に許容し得る」とは、イムノマーの有効性を妨げず、細胞、細胞培養物、組織、または生物などの生体系と適合する物質を指す。好ましくは、生体系は脊椎動物などの生物である。好ましい化学療法剤は、限定なく、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖非含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラギリン、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタインおよびポリフェルポサン、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール、グラモレク、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ヒカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトロキサントロン、メタレット／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナールＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、メシル酸イマチニブ／グリべック、ピシバニル／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、
【００６０】
メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロミド、エバセット／リポソームドキソルビシン、ユータキサン／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロアド／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）ＲＡＳ腫瘍遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口プラチナ、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミソール、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス／ラリトレキセド、ルイスタチン／クラドリビン、パキセックス／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルモルビシン／エピルビシン、デポシト、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタリミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン、カエチックス／リポソームドキソルビシン、ゲムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド、ＹＭ１１６、ロジンシード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、
【００６１】
Ｄ４８０９／デキシホスファアミド、イフェス／メスネックス／イホスファミド、ブモン／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール／シスプラチン、ベペシド／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテレ／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェランおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アルパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロンブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロシキカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンを含む。
【００６２】
さらに他の態様において、製剤は、ＥＦＧ、抗イディオタイプ癌ワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫメラノーマワクチン、ＭＧＶガングリオシド結合ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、オバレックス（Ovarex）、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬテラトープ（theratope）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン（Melacine）、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡベース（MVA-vased）ワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣウィルスおよびImmunCyst/TheraCys、からなる群から選択される癌ワクチンを含む。
【００６３】
さらなる側面において、本発明は、モノクローナル抗体を本明細書に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーと組み合わせて患者に投与することを含む、癌患者における癌を処置する方法を提供する。抗体の形態、そして特にモノクローナル抗体の形態での受動免疫療法は、抗癌剤として多くの研究および開発の主題であった。本明細書における用語「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成の抗体分子を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。抗癌剤の例は、限定はされないが、パノレックス（Panorex）(Glaxo-Welicome)、リツキサン（Rituxan）(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、ミロターグ（Mylotarg）(Wyeth)、キャンパス（Campath）(Millennium)、ゼバリン（Zevalin） (IDEC and Schering AG)、ベキサール（Bexxar） (Corixa/GSK)、エルビタックス（Erbitux）(Imclone/BMS)、アバスチン（Avastin）(Genentech)およびヘルセプチン（Herceptin）(Genentech/Hoffman la Roche)を含む。抗体はまた、癌抗原を（免疫学的な意味において）模倣するように見える抗イディオタイプ抗体を利用する、能動免疫療法において用いてもよい。モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ技術の分野の業者に知られている方法によって、作製することができる。
【００６４】
本明細書において、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、溶解剤、脂質、または医薬製剤において用いるために当分野で知られている他の物質を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定用途のための投与経路に依存することが理解される。これらの物質を含む薬学的に許容し得る製剤の製造は、例えばRemingtonのPharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００６５】
本発明は、化学療法剤および免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを含むキットを提供し、ここで前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、イムノマーが１つより多い５’末端を有するように一緒に結合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。他の側面において、キットは、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または免疫刺激性オリゴヌクレオチド結合体および／またはイムノマーまたはイムノマー結合体、化学療法剤、および生理学的に許容し得る担体を含む。キットは一般に、使用のための指示書のセットも含む。
【００６６】
イムノマー構造と合成刺激性モチーフとの組み合わせ、例えばＣｐＲ（Ｒ＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン）は、合成刺激性モチーフなしの場合とは異なったサイトカイン発現プロファイルを誘導した。その結果ＩＭＯ化合物は、全細菌性産物で頻繁に見られるよりも副作用が少ないだけでなく、癌の種類に依存したより特異的な免疫反応を示す。
【００６７】
ＩＭＯ化合物の腫瘍周辺への繰り返しの適用は、確立された同系腫瘍ＣＴ２６．ＣＬ２５およびＢ１６．Ｆ０を強く阻害または根絶した。ＩＭＯモチーフの腹膜投与も、腹腔内に広がったＢ１６．Ｆ０、ＣＴ２６．ＷＴまたはＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍増殖を抑制した。ＩＭＯ化合物の幾つかの免疫特性がこの治療効果を説明する。特定の理論に束縛されないことを意図すると、ＩＭＯモチーフは、腫瘍小結節周辺に迅速な急性期反応を引き起こす可能性があり、該反応には、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞の補充および活性化並びにサイトカイン分泌の誘導が含まれる。免疫細胞の活性化と整合して、ＩＭＯ投与の後、血清ＩＬ−１２および循環ＮＫ細胞およびマクロファージ細胞は４時間以内に著しく増加し、２４時間持続する（データ示さず）。かかる細胞免疫反応の増強は、腫瘍細胞に対して厳しい環境を作り出し得る。さらに、かかる環境における腫瘍細胞の破壊により、腫瘍抗原が近くの樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージへ供給される。ＩＭＯ化合物は、ＤＣによる抗原提示およびマクロファージの機能的成熟を直接的かつ迅速に促進し、ＭＨＣおよび副刺激分子の表面発現を増加させることが示されている。活性化された抗原提示細胞は次に、腫瘍を有するマウスにおいて、Ｔリンパ球が媒介する特異的な強い適応免疫反応を引き起こす。
【００６８】
先天性免疫に加えて、ＣＴ２６結腸腫瘍を有するマウスの処置は、強い適応免疫反応の発達をもたらす。第１に、β-galをモデル抗原として発現する腫瘍を有するマウスのＩＭＯ処置は、強力なクラスＩＭＨＣ拘束性特異的Ｔ細胞反応を示した。第２に、腫瘍を有しＩＭＯ化合物で処置されたマウスは、同じ腫瘍細胞によるその後のチャレンジに対して特異的に保護され、メモリーＴリンパ球の関与が示唆された。第３に、腫瘍を有しＩＭＯ化合物で処置されたマウスから得た脾臓細胞を適合的に移植されたナイーブマウスは、特異的抗腫瘍免疫を発達させ、同じ腫瘍のチャレンジを拒絶した。
【００６９】
Ｔｈ２型サイトカインは抗腫瘍免疫力を下方制御し、Ｔｈ１細胞反応の活性化は抗腫瘍免疫力を増強することができる。従って、Ｔｈ１型サイトカイン産生へのシフトは、癌の免疫療法およびウィルス感染の処置への有望なアプローチとなり得る。高濃度のＴｈ２サイトカイン、ＩＬ−４が、ＰＢＳまたは非ＣｐＧのＤＮＡ対照で処置されたＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するマウスから得た脾臓細胞の培養物中に見出される。対照的に、ＩＭＯで処置された、同じ腫瘍を有するマウスからの脾細胞は、より高いＩＦＮ−γを産生し、ＩＭＯ化合物が、腫瘍を有するマウスにおいてＴｈ２型サイトカイン産生をＴｈ１反応に反転させ得ることを示唆する。さらに、ＩＭＯ療法は、循環β-gal特異的ＩｇＧ２ａの濃度を５倍増加させ（ＯＤ単位）、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率の大幅な増加をもたらした。さらに、ＩＬ−１２ｋｏマウスはＩＭＯ処置に応答せず、このＴｈ−１サイトカインの、ＩＭＯ抗腫瘍活性における役割を示唆した。総合すると、これは、ＩＭＯ化合物が腫瘍を有するマウスにおけるＴｈ１免疫反応を強力に活性化することを明白に示している。
【００７０】
化学療法単独での、または手術後の追跡治療としての化学療法の主な制限は、毒性および薬剤耐性である。免疫療法を手術および化学療法と組み合わせると、残留腫瘍細胞を一掃し薬剤用量を低減させるという利点を有することができる。これは特にＩＭＯに基づく免疫療法に関してあてはまり、なぜならば、先天性および適応免疫システムの両方を活性化するからである。ＩＭＯ処置は化学療法剤の免疫抑制効果を克服することができ、これは、腫瘍を有しＩＭＯ２とドセタキセルの組み合わせで処置されたマウスにおいて、腫瘍を有しドセタキセルのみで処置されたマウスと比べて、ＣＤ６９＋およびＣＤ８６＋細胞が大幅に減少することによって証拠付けられる。Ｂ１６．Ｆ０メラノーマまたは４Ｔ１乳癌を有するマウスの、それぞれドセタキセルまたはドキソルビシンを用いた従来の化学療法の効果は、ＩＭＯ化合物と組み合わせると大幅に増強された。
【００７１】
総合すると、現在の結果は、ＩＭＯ化合物が強い免疫薬学的効果および抗腫瘍効果をin vivoで誘導することを示唆する。ノックアウトマウスにおける腫瘍実験は、Ｔｈ１サイトカインであるＩＬ−１２が、ＩＭＯが誘導する抗腫瘍効果に必要とされることを示唆する。さらに、ＩＭＯ化合物による処置は、腫瘍の退縮をもたらすだけでなく、強い腫瘍特異的適応免疫反応の発達も導く。さらに、ヒト特異的ＩＭＯ化合物は、同系腫瘍モデルにおける有効な抗癌活性を示す。化学療法剤とＩＭＯ処置との組み合わせにより相乗効果が見出された。さらに、ＩＭＯ化合物は化学療法の後に免疫細胞活性化を示し、化学療法によって引き起こされた免疫抑制を克服するための方法として、組み合わせ療法が示唆される。ＩＭＯ処置に関連する毒性は、どの腫瘍モデルのマウスにおいても試験された用量では観察されなかった。
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００７２】
例
例１：免疫刺激性部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌスケールでＤＮＡ自動合成装置（Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）を用いて、図５および図６に概説した直線合成またはパラレル合成方法に従って合成した。
【００７３】
デオキシヌクレオシドホスホラミダイトは、Applied Biosystem (Foster City, CA)から入手した。１’，２’−ジデオキシリボースホスホラミダイト、プロピル−１−ホスホラミダイト、２−デオキシウリジンホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）ペンチルアミジル］−２−プロパノールホスホラミダイトおよびメチルホスホラミダイトは、Glen Researh (Sterling, VA)から入手した。β−Ｌ−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイト、α−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイト、モノ−ＤＭＴ−グリセロールホスホラミダイトおよびジ−ＤＭＴ−グリセロールホスホラミダイトは、ChemGenes (Ashland, MA)から入手した。（４−アミノブチル）−１，３−プロパンジオールホスホラミダイトは、Clontech (Palo Alto, CA)から入手した。アラビノシチジンホスホラミダイト、アラビノグアノシン、アラビノチミジンおよびアラビノウリジンは、Reliable Pharmaceutical (St. Louis, MO)から入手した。アラビノグアノシンホスホラミダイト、アラビノチミジンホスホラミダイトおよびアラビノウリジンホスホラミダイトは、Hybridon, Inc. (Cambridge, MA)にて合成した(Noronha et al. (2000) Biochem.,39:7050-7062)。
【００７４】
全てのヌクレオシドホスホラミダイトは、３１Ｐおよび１ＨＮＭＲスペクトルにより特性を明らかにした。修飾ヌクレオシドは、特定部位に通常のカプリングサイクルを用いて組み込んだ。合成の後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製して、透析した。ナトリウム塩形態の精製オリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。純度は、ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによりテストした。
【００７５】
例２：脾臓細胞増殖の解析
脾細胞増殖のin vitro解析を、前に記載した標準的方法（例えば、Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182(1996)を参照）を用いて行った。図８Ａに結果を示す。これらの結果は、高濃度において、２つの到達可能５’末端を有するイムノマー６は、到達可能５’末端を有さないイムノマー５または１つの到達可能５’末端を有するオリゴヌクレオチド４よりも、多くの脾細胞増殖をもたらすことが示される。イムノマー６はまた、ＬＰＳ陽性対照よりも多くの脾細胞増殖をもたらす。
【００７６】
例３：in vivo脾腫試験
in vitroでの結果をin vivoモデルに適用可能かどうかを試験するために、選択したオリゴヌクレオチドをマウスに投与し、免疫刺激活性レベルの指標として脾腫の程度を測定した。５ｍｇ／ｋｇの単回用量をＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜６週齢、Harlan Sprague Dawley Inc. Baltic, CT）に腹腔内投与した。オリゴヌクレオチド投与の７２時間後にマウスを犠牲にし、脾臓を採取して重量測定した。図８Ｂに結果を示す。これらの結果は、２つの到達可能５’末端を有するイムノマー６が、オリゴヌクレオチド４またはイムノマー５よりも大幅に高い免疫刺激効果を有することを示す。
【００７７】
例４：サイトカイン解析
脊椎動物細胞、好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞またはヒトＰＢＭＣにおける、ＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準サイトカインを含む必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAより購入した。ＥＬＩＳＡプレート（Costar）は、ＰＢＳＮ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの適当な抗体を用いて４℃にて１晩インキュベートし、次にＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて３７℃にて３０分間ブロッキングした。細胞培養上清および標準サイトカインは、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳで適切に希釈し、前記プレートにトリプリケート（triplicate）で添加し、２５℃で２時間インキュベートした。プレートに１μｇ／ｍＬの適当なビオチン化抗体を加え、２５℃で１．５時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Tween 20）でよく洗浄し、ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ（Sigma, St. Louis, MO）を加えた後２５℃で１．５時間さらにインキュベートした。プレートをSure Blue（登録商標）（Kirkegaard and Perry）発色試薬（chromogenic reagent）で発色させ、Stop Solution（Kirkegaard and Perry）を加えて反応を終了させた。色の変化をCeres 900 HDI分光光度計（Bio-Tek Instruments）で測定した。下の表５Ａに結果を示す。
【００７８】
健康なボランティアの末梢血から、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll-Paque密度勾配遠心分離（Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO）により単離した。簡単に述べると、ヘパリン化された血液を円錐遠心分離機内のHistopaque-1077上（等量）に層状にし、４００ｘｇで３０分間室温にて遠心分離した。単核細胞を含む軟膜（buffy coat）を注意して採取し、等浸透圧のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、２５０ｘｇで１０分間の遠心分離により洗浄した。得られた細胞ペレットは次に、Ｌ−グルタミンを含有するRPMI 1640培地（Media Tech, Inc., Herndon, VA）内に再懸濁させ、熱により不活性化させた１０％ＦＣＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充した。細胞は、２４ウェルプレートで異なる期間、１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルで、オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で培養した。インキュベーション期間の終わりに上清を収集し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−６（BD Pharmingen, San Diego, CA）、ＩＬ−１０（BD Pharmingen）、ＩＬ−１２（BioSource International, Camarillo, CA）、ＩＦＮ−α（BioSource International）および−γ（BD Pharmingen）およびＴＮＦ−α（BD Pharmingen）を含む種々のサイトカインのアッセイまで−７０℃で凍結して保存した。結果を下の表５に示す。
【００７９】
全ての場合において、細胞培養上清におけるＩＬ−１２およびＩＬ−１６の濃度は、同じ実験条件下で作製されたＩＬ−１２およびＩＬ−１６の標準カーブからそれぞれ計算した。細胞培養上清におけるＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−αの濃度は、同じ実験条件下で作製されたＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−αの標準カーブからそれぞれ計算した。
表５．ヒトＰＢＭＣ培養物におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表６】
2006528697.tif 000009
Ｄ１およびＤ２はドナー１およびドナー２である。
【００８０】
表５Ａ．ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞培養物におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
【表７】
2006528697.tif 000010
【００８１】
正体文字の表記は、ホスホロチオエート結合を示す；イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
【化３】
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さらに、図７Ａ〜７Ｃに示された結果は、２つの到達可能５’末端を有するイムノマー２は、それぞれ１つまたは０個の到達可能５’末端を有するオリゴヌクレオチド１または３と比べて、より低い濃度においてＩＬ−１２およびＩＬ−６濃度を上昇させるが、ＩＬ−１０濃度は上昇させないことを示す。
【００８２】
例５：非天然のピリミジンまたは非天然のプリンヌクレオチドを含むイムノマーの免疫刺激活性
表９〜１１に示すように、免疫刺激性ジヌクレオチドモチーフ内に非天然のピリミジンヌクレオシドまたは非天然のプリンヌクレオシドを含む、種々の長さのイムノマーでは、免疫刺激活性は維持された。
表９．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表８】
2006528697.tif 000012
【００８３】
表１０．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表９】
2006528697.tif 000013
【００８４】
表１１．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１０】
2006528697.tif 000014
【００８５】
例６：免疫刺激活性におけるリンカーの効果
２つのオリゴヌクレオチドを結合するリンカーの長さの効果を試験するため、同じオリゴヌクレオチドを含むがリンカーの異なるイムノマーを合成し、免疫刺激活性を試験した。表１２に示す結果は、リンカーの長さはイムノマーの免疫刺激活性に役割を果たすことを示唆する。最大の免疫刺激活性は、Ｃ３〜Ｃ６−アルキルリンカーまたは分散されたホスフェート電荷（interspersed phosphate charge）を有する脱塩基リンカーにより達成された。
【００８６】
表１２．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１１】
2006528697.tif 000015
【００８７】
例７：免疫刺激活性に及ぼすオリゴヌクレオチド主鎖の効果
一般に、天然のホスホジエステル主鎖を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドより免疫刺激性が低い。この低い免疫刺激活性の程度は、部分的に、実験条件下におけるホスホジエステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解による可能性がある。オリゴヌクレオチドの分解は、第１に３’エキソヌクレアーゼの結果であり、該ヌクレアーゼは３’末端からオリゴヌクレオチドを消化する。この例のイムノマーは遊離の３’末端を含まない。従って、ホスホジエステル骨格を有するイムノマーは、実験条件下において対応するモノマーオリゴヌクレオチドより長い半減期を有するはずであり、従って改善された免疫刺激活性を示す。表１３に示す結果はこの効果を示しており、イムノマー８４および８５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞培養におけるサイトカイン誘導によって決定される免疫刺激活性を示す。
表１３．イムノマー構造および免疫刺激活性
【表１２】
2006528697.tif 000016
Ｌ＝Ｃ３−リンカー
【００８８】
例８：化学療法剤と組み合わせたイムノマーのin vivo抗癌活性
ＰＣ３細胞を、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌの存在下で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む９０％Ham’sＦ１２Ｋ培地中で培養し、ヒト前立腺癌モデル（ＰＣ３）を確立した。４〜６週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウス（Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick MD）を、試験前に環境調節のため６日間順応させた。培養ＰＣ３細胞は、単層培養から収集し、Ham’sＦ１２Ｋ培地（１０％ＦＢＳ）で２回洗浄し、ＦＢＳなしのHam’sＦ１２Ｋ培地：マトリゲル基底膜マトリクス（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）（５：１；Ｖ／Ｖ）中に再懸濁させ、各マウスの左鼡径部に皮下注射した（５×１０６細胞、全量０．２ｍｌ）。動物は、通常の臨床的所見、体重、および腫瘍増殖について観察した。腫瘍増殖は、キャリパー（caliper）を用いて、移植組織の２つの直交する直径を測定して監視した。腫瘍質量（グラムによる重量）は、式：１／２ａ×ｂ２により計算し、式中「ａ」は長径（ｃｍ）、「ｂ」は短径（ｃｍ）である。平均腫瘍サイズが〜８０ｍｇに達したら、ヒト癌の異種移植片を有する動物を処置群および対照群（１郡あたり５匹）にランダムに分けた。対照群には無菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）のみを与えた。生理食塩水に無菌的に溶解したイムノマー２５５または２８５を、皮下注射により、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇ／日を３用量／週で投与した。ゲムシタビンＨＣｌ（Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN）を、腹腔内注射により、１６０ｍｇ／ｋｇで２回、０日目および３日目に与えた。詳細な処置のスケジュールを以下に示す。
【００８９】
Ｇ１：生理食塩水
Ｇ２：ゲムシタビン（１６０ｍｇ／ｋｇ／日、ＩＰ、０日目および３日目）
Ｇ３：２５５（１．０ｍｇ／ｋｇ／日、ＳＣ、３用量／週で６週間）
Ｇ４：２５５（０．５ｍｇ／ｋｇ／日、ＳＣ、３用量／週で６週間）
Ｇ５：２８５（１．０ｍｇ／ｋｇ／日、ＳＣ、３用量／週で６週間）
Ｇ６：２８５（０．５ｍｇ／ｋｇ／日、ＳＣ、３用量／週で６週間）
Ｇ７：２５５（０．５ｍｇ／ｋｇ／日、ＳＣ、３用量／週で６週間）＋ゲムシタビン（１６０ｍｇ／ｋｇ／日、ＩＰ、０日目および３日目）
Ｇ８：２８５（０．５ｍｇ／ｋｇ／日、ＳＣ、３用量／週で６週間）＋ゲムシタビン（１６０ｍｇ／ｋｇ／日、ＩＰ、０日目および３日目）
種々の処置の後の腫瘍の測定値は、表１４および図１３に示す。イムノマー２５５および２８５で処置した全動物は、生理食塩水対照群に比べて、腫瘍の増殖が顕著に阻害された（ｐ＜０．５）。これらの処置群には用量反応関係の傾向が見られた（図１３）。イムノマー２５５と２８５の間には有意な差はなかった（表１４）。
【００９０】
【表１３】
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【００９１】
【表１４】
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処置後の種々の期間における体重測定値を表１５および図１４に示す。イムノマー２５５または２８５単独の場合を対照と比較すると、体重増加には有意差は見られなかった。ゲムシタビンで処置した動物は、第１週目に体重減少を示し、その１週間後に回復した。イムノマー２５５または２８５との組み合わせは、ゲムシタビンの副作用プロファイルを変化させなかった。全群において、他の臨床的異常または死亡は観察されなかった。
【００９２】
表１５．２５５または生理食塩水による処置後の、腫瘍を有するマウスの体重
【表１５】
2006528697.tif 000019
まとめると、イムノマー２５５および２８５は、重大な副作用なしに、ヒト前立腺癌ＰＣ３異種移植片を有するヌードマウスにおける腫瘍増殖を有意に抑制した。イムノマー２５５または２８５をゲムシタビンと組み合わせて与えた場合、各化合物は、副作用プロファイルを変えることなく、ゲムシタビンの治療効果を有意に増加させた。さらに、イムノマー２５５または２８５の処置には用量反応関係の傾向が見られた。
【００９３】
例９：化学療法剤と組み合わせたイムノマーのin vivo抗癌活性
例８の実験を、ゲムシタビンの代わりにタキソテレを用いて繰り返した。タキソテレは、０日目および７日目に投与した。イムノマー１６５は週に５日投与した。イムノマー２５５および２８５は、０、２、４、７、９および１１日目に投与した。結果を下の表１６に示す。これらの結果は、イムノマーとタキソテレの間に明らかな相乗効果を示す。
【００９４】
【表１６】
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【００９５】
例１０
図１５に示すＩＭＯ化合物および非ＣｐＧＤＮＡ：（５’ＣＴＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴ−３’）を、上述のように合成、精製および解析した。
雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６、並びにＩＬ−６およびＩｌ−１２ノックアウト（ｋｏ）マウス（両方ともＣ５７ＢＬ／６バックグランドにてｋｏ）で５〜８週齢のものを、Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から購入した。ＣＴ２６．ＷＴ（ATCC, Rockville, MD）は、発癌物質誘導ＢＡＬＢ／ｃ未分化結腸癌である。ＣＴ２６．ＣＬ２５（ATCC, Rockville, MD）は、大腸菌β-gal遺伝子と共に形質導入されたＣＴ２６．ＷＴのサブクローンである。４Ｔ１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房腺癌細胞株である。Ｂ１６．Ｆ０は、Ｃ５７ＢＬ／６由来のメラノーマ（ＡＴＣＣ）である。ＣＴ２６．ＷＴおよび４Ｔ１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、熱で不活性化した１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Atlas Biologicals, Fort Colins, CO）、２ｍＭのＬグルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Mediatech, VA）中で培養した。ＣＴ２６．ＣＬ２５は、同じ培地＋４００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（Life Technologies, Grand Island, NY）中に維持する。Ｂ１６．Ｆ０細胞は、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ中で増殖させた。
【００９６】
血清サイトカイン濃度を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に腹腔内（ｉ．ｐ）、皮下（ｓ．ｃ）または筋肉内（ｉ．ｍ）注射で１０ｍｇ／ｋｇ（単回用量）のＩＭＯ化合物を投与した。血清を後眼窩採血（retro-orbital bleeding）によりＩＭＯ投与の４時間後に収集し、ＩＬ−１２およびＩＬ−６をサンドイッチＥＬＩＳＡで決定した。サイトカイン抗体および標準サイトカインは、PharMingen（San Diego, CA）から購入した。
【００９７】
血清抗体の解析のために、９６ウェルプレートを室温で３時間、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の２μｇ／ｍｌのβ-galタンパク質（Calbiochem Novabiochem, Pasadena, CA）でインキュベートした。固相は４℃で１晩、正常マウス血清（ＮＭＳ）または抗血清、またはβ-gal特異的モノクローナルＡｂ（Calbiochem Novabiochem, Pasadena CA）でインキュベートし、続いてマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体でインキュベートした。アイソタイプ解析のために、ＨＲＰでラベルしたヒツジの抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（Southern Biotechnology, Birmingham, AL）を用いた。抗体の結合を、免疫複合体とＡＢＴＳ基質（Zymed, San Francisco, CA）との反応後、４０５ｎｍにおける吸光度として測定した。
【００９８】
皮下の固形癌モデルについては、１００μｌのＰＢＳ中の１０６のＣＴ２６．ＣＴ２５細胞／マウスまたは５×１０５のＢ１６．Ｆ０細胞／マウスを、ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹低部に移植した。腫瘍サイズは、ＣＴ２６．ＣＴ２５については腫瘍接種の６日目に、Ｂ１６．Ｆ０については８日目に、５０〜２００ｍｇに達した。次に、腫瘍を有するマウスは、ＩＭＯ化合物または非ＣｐＧＤＮＡ対照を、１ｍｇ／ｋｇの用量で１日おきに１０回腫瘍周辺に注射して処置した。腫瘍増殖は、キャリパーを使って腫瘍の長径および短径を測定して記録した。腫瘍の容積はキャリパーを用いて測定し、式（０．５ｘ長さｘ幅２）を適用して、腫瘍増殖動態を決定した。
【００９９】
腹膜播種の腫瘍モデルについては、３×１０５のＣＴ２６．ＷＴまたはＣＴ２６．ＣＬ２５細胞および５ｘ１０４のＢ１６．Ｆ０細胞を、それぞれＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスにｉ．ｐ注射した。ＩＭＯ化合物または非ＣｐＧＤＮＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、週に２回、１日目から開始して全５回、ｉ．ｐ投与した。マウスは腫瘍増殖と生存について毎日チェックした。各用量群は６〜１０匹のマウスを有した。
４Ｔ１腫瘍モデルについては、ＰＢＳ１００μｌ中の５×１０５細胞／マウスを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹低部に移植した。５日目に平均腫瘍サイズが５０ｍｍ２に達した時、３０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（Bedford lab. Bedford, OH）を３回、５、６および７日目にｉ．ｐ注射してマウスに与えた。ＰＢＳ１００μｌ中に溶解したＩＭＯ２（１ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍周辺の注射により週に２回、全部で６回投与した。
【０１００】
Ｂ１６．Ｆ０メラノーマ腫瘍については、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、ＰＢＳ１００μｌ中の５ｘ１０４細胞／マウスをｉ．ｐ注射した。マウスは２日目に、２０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル（Aventis, Bridgewater, NJ）を１回ｉ．ｐ注射して処置し、次に３、６、９、１２および１５日目に、２．５ｍｇ／ｋｇのＩＭＯ２をｉ．ｐ注射により与えた。
ＣＴ２６．ＷＴまたはＣＴ２６．ＣＬ２５腹膜腫瘍を有し、ＩＭＯ化合物で処置されたマウスの長期生存動物（ｎ＝５）を、５×１０５の元の腫瘍細胞のｉ．ｐまたはｉ．ｖにより、さらなる処置なしで再チャレンジした。腫瘍を有するマウスにおけるＩＭＯ誘導抗腫瘍反応の特異性を評価するために、これらの長期生存動物（ｎ＝５）は、同系の臓器非関連乳房腫瘍４Ｔ１（５ｘ１０５）でも再チャレンジした。ｉ．ｖ再チャレンジ群では、マウスは１３日目に犠牲にし、肺を収集して、肺への転移を計測した。
【０１０１】
適合免疫細胞移植を試験するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスまたは、ＣＴ２６．ＷＴもしくはＣＴ２６．ＣＬ２５を有しＩＭＯ処置された長期生存マウスからの５×１０６の同系脾細胞を適合的にｉ．ｐ．移植し、次にマウス（５匹／群）を、３ｘ１０６のＣＴ２６．ＷＴ、ＣＴ２６．ＣＬ２５または４Ｔ１細胞にて３日目にｉ．ｐ．交差チャレンジした。
Ｔ細胞反応を決定するため、各群からの２匹または３匹のマウスをｓ．ｃ．腫瘍移植後２６日目またはｉ．ｐ．腫瘍接種後２１日目に犠牲にし、各群の脾細胞からのプールされたＴ細胞を、Ｔ細胞濃縮カラム（R&D systems, Minneapolis, MN）を用いて精製した。精製したＴ細胞（２．５×１０５）は、２．５×１０５の、マイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ、Sigma, St. Louis, MO）で処置したβ-galまたはＯＶＡペプチドパルス同系脾臓細胞で２４時間刺激した。次に、Ｈ−２ｄ拘束（H-2d restricted）された抗原特異的（β-gal８７６−８８４）再刺激に特異的に反応するＴ細胞を、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）およびＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴ解析により、製造業者（R&D Systems）の指示に従って決定した。スポットは電子的に計測した（Zellnet, New York, NY）。
【０１０２】
例１１：ＩＭＯ化合物の血清サイトカイン分泌プロファイル
ＩＭＯ１およびＩＭＯ２は強いＩＬ−１２分泌を誘導し、一方ＩＭＯ２は、in vitroで低いＩＬ−６産生を誘導する（図１６）。In vivoでの免疫薬理学的効果を評価するため、ＩＭＯ化合物、ＣｐＧイムノマー、および非ＣｐＧオリゴを、ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ、ｓ．ｃまたはｉ．ｍにて１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、４時間後にそれらの血清をＩＬ−１２およびＩＬ−６について評価した。ＩＭＯ化合物は両方とも、従来のＣｐＧオリゴと比べて、強い血清ＩＬ−１２分泌を誘導した（表１７）。しかし、合成ＣｐＲモチーフを含有するＩＭＯ２は、全３投与経路において、有意に低い血清ＩＬ−６を誘導し（表１７）、我々の初期のin vitroでの研究結果が確認された。対照の非ＣｐＧＤＮＡは、有意でないＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘導を示した。
表１７．異なる経路で投与されたＩＭＯ化合物によるin vivoでのサイトカインの誘導ａ
【表１７】
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【０１０３】
例１２：ＩＭＯ化合物はマウス結腸癌モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す。
ネズミ結腸癌ＣＴ２６．ＣＬ２５モデルにおけるＩＭＯ化合物の抗腫瘍活性を評価した。ＣＴ２６．ＣＬ２５皮下固形腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを、腫瘍接種６日目より、ＩＭＯ化合物１ｍｇ／ｋｇを１日おきに１０回腫瘍周辺に投与して処置した。ＩＭＯ化合物による処置は、７５％までの動物において腫瘍増殖の完全な拒絶または阻害を引き起こした（図１７Ａ）。非ＣｐＧＤＮＡで処置したマウスと比べて、２４日目に、平均の腫瘍増殖阻害率７２％および８５％がそれぞれＩＭＯ１およびＩＭＯ２によって処置されたマウスで観察された。さらに、腹膜播種性腹水（peritoneal disseminated ascites）ＣＴ２６．ＷＴ（図１７Ｂ）およびＣＴ２６．ＣＬ２５（図１７Ｃ）を有するマウスに対して、１ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭＯ２を腹膜投与すると、マウスの生存率が大きく増加した。
【０１０４】
例１３：β-gal特異的循環ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブクラスの濃度
ＩＭＯ化合物で処置後のＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するマウスの血清を、β-gal特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体濃度について解析した。ＩＭＯ化合物で処置したマウスは、抗β-gal特異的ＩｇＧ２ａ抗体濃度が５倍以上（ＯＤ単位）増加した（図１８）。従来のＣｐＧＤＮＡによる処置は、β-gal特異的ＩｇＧ２ａ濃度が約２倍増加しただけであった。対象的に、β-gal特異的ＩｇＧ１濃度は、中程度の０．５〜２倍の増加のみが観察された（図１８）。
【０１０５】
例１４：ＩＭＯ化合物は腫瘍特異的ＣＴＬ反応を誘導する。
腫瘍を有するマウスに対するＩＭＯによる処置が、腫瘍特異的ＣＴＬ反応を引き起こすかどうかを試験するため、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するマウスの異なる処置群から得た脾細胞から精製したＴ細胞を、マイトマイシンＣで処置したβ-galまたはＯＶＡペプチドパルス同系脾臓細胞で２４時間刺激した。対照の非ＣｐＧＤＮＡで処置したマウスに比べて、ＩＭＯ化合物およびＣｐＧＤＮＡで処置したマウスにおいては、より高いＩＦＮ−γ誘導（図１９Ａ）が検出されたがＩＬ−４は検出されなかった（図１９Ｂ）ように、Ｈ−２ｄ拘束（β-gal８７６−８８４）抗原への有意に高い腫瘍特異的ＣＴＬ反応が見出された。
【０１０６】
例１５：ＩＭＯ処置後の抗腫瘍メモリーの持続
ＩＭＯによる処置が、腫瘍特異的適応免疫反応も誘導するかどうかを試験するため、ＣＴ２６．ＣＬ２５腹膜腫瘍をＩＭＯ処置により除去されたマウスを、再チャレンジした。前にＩＭＯ２で処置したマウスは、ＣＴ２６．ＷＴおよびＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍のｉ．ｐ再チャレンジを拒絶した（図２０Ａおよび２０Ｂ）。腹膜注射した腫瘍からＩＭＯ２による処置後に生存したマウスはまた、ｉ．ｖ．接種の後の同じ腫瘍の肺転移を拒絶した（データ示さず）。同様の結果が、ＣＴ２６．ＷＴまたはＣＴ２６．ＣＬ２５細胞で再チャレンジした、ＣＴ２６．ＷＴ腫瘍モデル実験において見出された（データ示さず）。これらのデータは、ＩＭＯ２で処置したマウスは、モデル腫瘍抗原β-galに対してのみでなく、親腫瘍（ＣＴ２６）抗原に対しても適応免疫反応を発達させたことを示す。しかし、かかる免疫メモリーは腫瘍特異的であり、同じマウスは、同系の、臓器非関連４Ｔ１乳癌のチャレンジからは保護されなかった（図２０Ｃ）。
【０１０７】
例１６：ナイーブマウスは、ＩＭＯで処置したマウスからの免疫細胞の適合的移植の後に、抗腫瘍保護を発達させる。
ＩＭＯ２の処置が特異的な抗腫瘍免疫を誘導するという概念と整合して、ＩＭＯ処置後にＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を拒絶したマウスからの脾細胞をナイーブマウスに移植し、これらのマウスをＣＴ２６．ＣＬ２５または４Ｔ１腫瘍細胞でチャレンジした。ＩＭＯ２で処置したマウスからの脾細胞は、ナイーブマウスからの脾細胞と異なり、ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍細胞による致命的な腫瘍チャレンジに対して保護された（図２１Ａ）。腫瘍再チャレンジ実験の場合と同様に、この保護は腫瘍特異的であり、４Ｔ１腫瘍細胞チャレンジには当てはまらなかった（図２１Ｂ）。
【０１０８】
例１７：ＩＭＯ２はマウスメラノーマモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示しＩｇＧ２ａ抗体産生を誘導する。
ＩＭＯ２の抗腫瘍活性について、Ｂ１６．Ｆ０マウスメラノーマを有するマウスにおいてさらに試験した。Ｂ１６．Ｆ０メラノーマを有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、腫瘍接種の８日目に開始して、１日おきに１０回、１ｍｇ／ｋｇのＩＭＯ２を腫瘍周辺に投与して処置した。図２２Ａに示すように、ＩＭＯ２は、皮下にＢ１６．Ｆ０メラノーマを有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、７１％の腫瘍増殖の阻害をもたらした。ＩＭＯ１による処置もまた、ＩＭＯ２と同じ程度の腫瘍阻害をもたらした（データ示さず）。
ＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌の場合と同様、Ｂ１６．Ｆ０腫瘍を有するマウスのＩＭＯ２による処置は、対照の非ＣｐＧＤＮＡで処置したマウスと比べて、血清ＩｇＧ２ａの総循環の有意な増加と、総ＩｇＧ１濃度の減少または無変化をもたらした（図２２Ｂおよび２２Ｃ）。これらの結果は、Ｂ１６．Ｆ０メラノーマを有するマウスにおける、ＩＭＯ処置後の強力なＴｈ１型免疫反応を示唆する。
【０１０９】
例１８：ＩＭＯが誘導するＴｈ１型反応はＢ１６．Ｆ０メラノーマを有するマウスにおける抗腫瘍保護に必須である。
ＩｇＧ２ａ濃度の増加および腫瘍抗原特異的ＣＴＬ反応を含む上記のデータは、結腸癌モデルにおける、ＩＭＯ処置後の、Ｔｈ１優位反応（Th1-dominated response）への明確なシフトを示唆した。Ｂ１６メラノーマを有する、野生型（ｗｔ）、ＩＬ−１２ｋｏ、およびＩＬ−６ｋｏのＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＩＭＯ化合物の抗腫瘍効果を試験した。Ｂ１６．Ｆ０腫瘍を有するｗｔおよびＩＬ−６ｋｏ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの、ＩＭＯ２による処置は、腫瘍増殖の有意な減少をもたらした（図２３）。しかし、ＩＭＯによる処置は、同じ腫瘍を有するＩＬ−１２ｋｏマウスに対して有意な効果を有さず、ＩＭＯ誘導抗腫瘍活性にＩＬ−１２が必要であることを示唆している（図２３）。
【０１１０】
例１９：従来の化学療法剤とＩＭＯ化合物の組み合わせ療法の相乗効果
Ｂ１６．Ｆ０腹水腫瘍または４Ｔ１皮下固形腫瘍を有するマウスにおける、化学療法剤とＩＭＯ化合物の相乗効果を試験した。ＩＭＯ２の腫瘍周辺への注射およびドキソルビシン全身投与は、単独で、４Ｔ１腫瘍増殖の強力な阻害をもたらした（図２４Ａ）。組み合わせると、２つの処置はさらに強力であった（図２４Ａ）。ドセタキシルおよびＩＭＯ２の組み合わせ療法はまた、腹膜分散Ｂ１６．Ｆ０メラノーマに対して大きな相乗効果を示し、各剤単独での処置に比べて、マウスの生存率が延長された（図２４Ｂ）。
免疫細胞活性化に対するドセタキシルおよびＩＭＯ２処置の効果を、末梢血中のＣＤ６９＋およびＣＤ８６＋の集団の変化を測定して試験した。ＩＭＯ２で処置したマウスは、ＣＤ６９＋およびＣＤ８６＋細胞のパーセンテージの大幅な増加を示したが、１日目および３日目のドセタキシル３０ｍｇ／ｋｇの投与は、かかる活性化を阻害しなかった（図２４Ｃ）。
【０１１１】
例２０：ヒト特異的モチーフを含有するＩＭＯ３は強力な抗腫瘍活性を示し、腫瘍を有するマウスにおいてＴｈ−１サイトカイン、ＩＬ−１２を誘導する。
マウス特異的免疫刺激性モチーフを含有するＩＭＯ２の結果に基づき、ヒト特異的モチーフを含有するＩＭＯ３を合成し、マウスのＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍に対するその活性を試験した。ＩＭＯ３は、この腫瘍モデルに対しても強力な抗腫瘍活性を示した（図２５Ａ）。予想通り、ＩＭＯ２およびＩＭＯ３の両方は、マウスにおいてＩＬ−１２分泌を誘導した（図２５Ｂ）。さらに、図２６に示すように、ＩＭＯ３によるヒトＰＢＭＣの活性化は、ヘルセプチンの存在下でＨｅｒ−２陽性ＢＴ−４７４細胞の溶解を誘導した。
【０１１２】
例２１：ＩＭＯ化合物と組み合わせたリツキサンの増強された抗腫瘍効果
ナマルワ（Namalwa）Ｂ細胞リンパ腫細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射により移植して、高度Ｂ細胞ヒト非ホジキンスリンパ腫と同様の疾患を生成した。腫瘍を有するマウスは、５０ｍｇ／ｋｇのリツキサンを４、６、８日目に、および／または２．５ｍｇ／ｋｇのＩＭＯ２を４、６、８、１１、１４および２１日目に、腹腔内注射して処置した（図２７）。図２８に示すように、腫瘍増殖は、リツキサンとＩＭＯ２の組み合わせにより有意に阻害された。
【０１１３】
例２２：ＩＭＯ化合物はヘルセプチンの抗腫瘍効果を増強する
皮下移植されたＨｅｒ−２過剰発現ヒト乳房腫瘍（ＢＴ４７４）を有するヌードマウスを、１０ｍｇ／ｋｇのヘルセプチンの腹腔内注射および／または１ｍｇ／ｋｇのＩＭＯ化合物の腫瘍周辺注射により、週２回、６週間処置した（図２７）。ヘルセプチンまたはＩＭＯ２単独による処置の後の腫瘍増殖は、ＰＢＳ対照群と比べて７０％および６５％阻害された（図２９）。腫瘍増殖の９７％の著しい阻害が、ヘルセプチンとＩＭＯ２の組み合わせ処置により見出された（図２９）。
【０１１４】
例２３：ＩＭＯ化合物はヘルセプチンの抗腫瘍効果を増強する
皮下移植されたＨｅｒ−２過剰発現ヒト乳房腫瘍（ＢＴ４７４）を有するヌードマウス。腫瘍を有するマウスは、リツキサンを５、７、９および１１日目に、および／またはＩＭＯ２を５、７、９、１１および１３日目に、腹腔内注射して処置した。図３０に示すように、腫瘍増殖は、ＩＭＯ２および、リツキサンとＩＭＯ２の組合せにより、有意に阻害された。
【０１１５】
均等
前述の発明を、明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明の真の範囲および付属のクレームから乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明の代表的なイムノマーの模式図である。
【図２】本発明の幾つかの代表的なイムノマーを表す図である。
【図３】本発明のイムノマーの直線合成に好適な代表的小分子リンカーの群を表す図である。
【図４】本発明のイムノマーのパラレル合成に好適な代表的小分子リンカーの群を表す図である。
【図５】本発明のイムノマーの直線合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【０１１７】
【図６】本発明のイムノマーのパラレル合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【図７】図７ＡはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、オリゴヌクレオチド１およびイムノマー２〜３によるＩＬ−１２の誘導を示すグラフである。これらのデータは、到達可能５’末端を有するイムノマー２は、モノマーオリゴ１より強いＩＬ−１２の誘導因子であること、および、到達可能５’末端を有さないイムノマー３は、オリゴ１に比べて同等かまたは低い免疫刺激を生成することを示唆する。図７ＢはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、オリゴヌクレオチド１およびイムノマー２〜３によるＩＬ−６の誘導（それぞれ上から下へ）を示すグラフである。これらのデータは、到達可能５’末端を有するイムノマー２は、モノマーオリゴ１より強いＩＬ−６の誘導因子であること、および、到達可能５’末端を有さないイムノマー３は、オリゴ１に比べて同等かまたは低い免疫刺激を生成することを示唆する。図７ＣはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、オリゴヌクレオチド１およびイムノマー２〜３によるＩＬ−１０の誘導（それぞれ上から下へ）を示すグラフである。
【図８】図８Ａはそれぞれ到達不能５’末端および到達可能５’末端を有する異なる濃度のイムノマー５および６による、細胞培養におけるＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞増殖の誘導を示すグラフである。図８ＢはＣｐＧモチーフの５’フランキング配列に免疫化学的修飾を有するオリゴヌクレオチド４およびイムノマー５〜６による、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓の腫大を示すグラフである。ここでも、到達可能５’末端を有するイムノマー（６）は、到達可能５’末端を有さないイムノマー５およびモノマーオリゴヌクレオチド４と比べて、脾臓腫大を増加させるより強い能力を有する。
【図９】図９ＡはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴヌクレオチド４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１２の誘導を示すグラフである。図９ＢはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴヌクレオチド４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−６の誘導を示すグラフである。図９ＣはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴヌクレオチド４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１０の誘導を示すグラフである。
【図１０】図１０ＡはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、イムノマー１４、１５および１６による細胞増殖の誘導を示すグラフである。図１０ＢはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のイムノマー１４および１６による、ＩＬ−１２による細胞増殖の誘導を示すグラフである。図１０ＣはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のイムノマー１４および１６による、ＩＬ−６による細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【０１１８】
【図１１】図１１ＡはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、オリゴヌクレオチド４および１７並びにイムノマー１９および２０による細胞増殖の誘導を示すグラフである。図１１ＢはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴヌクレオチド４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−１２細胞増殖の誘導を示すグラフである。図１１ＣはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、異なる濃度のオリゴヌクレオチド４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−６細胞増殖の誘導を示すグラフである。
【図１２】オリゴヌクレオチド４並びにイムノマー１４、２３および２４を用いた、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓の腫大を示すグラフである。
【図１３】本発明による方法の、前立腺癌のヌードマウスモデルにおける腫瘍増殖に及ぼす効果を示す図である。
【０１１９】
【図１４】本発明による方法の、研究に用いたマウスの体重に及ぼす効果を示す図である。
【図１５】ＩＭＯ化合物の構造および修飾の例を示す図である。
【図１６】ＩＭＯ化合物のin vitroでのサイトカイン誘導プロファイルを示す図である。
【図１７】（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６．ＣＬ２５結腸腫瘍に対するＩＭＯ化合物の抗腫瘍活性を示す図である。ＩＭＯ１（丸）、ＩＭＯ２（三角）、または対照非ＣｐＧＤＮＡ（四角）。＊  非ＣｐＧＤＮＡ対照群と比較してｐ＜０．００１。プロットは、異なる処置群の（Ｂ）ＣＴ２６．ＷＴまたは（Ｃ）ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率を示す。ＰＢＳ（四角）または対照非ＣｐＧＤＮＡ（丸）またはＩＭＯ２（三角）。
【図１８】ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの２４日目におけるβ-gal特異的ＩｇＧ１（白いバー）およびＩｇＧ２ａ（黒いバー）の血清濃度を示す図である。
【図１９】種々の処置群において２４日目に、ＣＴ２６．ＣＬ２５結腸腫瘍を有するマウスの脾臓から単離した全Ｔ細胞（１０６）における、（Ａ）ＩＦＮ−γおよび（Ｂ）ＩＬ−４分泌Ｔリンパ球を示す図である。ＰＢＳ（白いバー）、β-gal（灰色のバー）、またはＯＶＡペプチド（黒いバー）。
【０１２０】
【図２０】ＩＭＯ処置後の抗腫瘍メモリーの維持を示す図である。ＣＴ２６．ＣＬ２５腹膜腫瘍を有するＩＭＯ処置マウスを、（Ａ）ＣＴ２６．ＷＴ結腸癌細胞、（Ｂ）ＣＴ２６．ＣＬ２５結腸癌細胞、または（Ｃ）４Ｔ１乳癌細胞で再チャレンジしたものの、長期生存動物の生存プロットである。ＩＭＯ２（丸）またはＩＭＯモチーフで処置しなかったナイーブマウス（四角）。
【図２１】ナイーブマウスは、腫瘍を有しＩＭＯ化合物で処置したマウスからの免疫細胞の適合的移植の後に、特異的抗腫瘍保護を発達させたことを示す図である（Ａ）ＩＭＯ２で処置したマウス（三角）またはナイーブマウス（丸）から得た免疫細胞の適合的移植の後の、親ＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍細胞によるチャレンジに対するマウスの生存率。（Ｂ）ＩＭＯ２で処置したマウス（三角）またはナイーブマウス（丸）から得た免疫細胞の適合的移植の後の、４Ｔ１乳癌細胞によるチャレンジに対するマウスの生存率。対照として、ＰＢＳを注射しＣＴ２６．ＣＬ２５細胞でチャレンジしたマウスが、両図において四角で示される。
【図２２】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、Ｂ１６．Ｆ０メラノーマに対するＩＭＯ化合物の抗腫瘍活性を示す図である。ＩＭＯ２（黒いバー）または対照非ＣｐＧＤＮＡ（白いバー）    ＊  非ＣｐＧＤＮＡ対照群と比較してｐ＜０．０１８３。Ｂ１６．Ｆ０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＩＭＯ２または対照非ＣｐＧＤＮＡによる処置２２日後における、全血清の（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２ａ抗体サブクラス。
【図２３】Ｂ１６．Ｆ０メラノーマを有するｗｔ、ＩＬ−６ｋｏおよびＩＬ−１２ｋｏ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの生存に及ぼすＩＭＯ２の効果を示す図である。非ＣｐＧＤＮＡの野生型（ｗｔ）（四角）に対する効果、並びに、ＩＭＯ２のｗｔ（ひし形）、ＩＬ−６ノックアウト（ｋｏ）（丸）およびＩＬ−１２ｋｏ（三角）に対する効果。
【０１２１】
【図２４】従来の化学療法とＩＭＯ免疫療法の組み合わせの、相乗的抗腫瘍活性を示す図である。（Ａ）種々の処置群のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１乳癌の増殖阻害。各丸印は単一の動物のデータを示し、＋は平均値を示す。＊  ＰＢＳ対照群と比較してｐ＝０．０００４。（Ｂ）種々の処置群における、腹膜に分散されたＢ１６．Ｆ０メラノーマを有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存のプロット。ＰＢＳ（四角）、ドセタキシル（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）の単一用量を２日目に（ひし形）、ＩＭＯ２（２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、３、６、９、１２および１５日目）（丸）またはドセタキシルとＩＭＯ２の単一療法と同じ用量およびスケジュールでの組み合わせ（三角）。（Ｃ）ＰＢＳ、ドセタキシル（Ｄｏｃｅ、３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、１および３日目）、ＩＭＯ２（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、１、３、５および７日目）またはドセタキシル（Ｄｏｃｅ）とＩＭＯ２で処置した、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＤ６９＋およびＣＤ８６＋細胞の活性化。ＣＤ６９＋（白いバー）およびＣＤ８６＋（黒いバー）。
【図２５】（Ａ）マウスおよびヒトＩＭＯ２、ＩＭＯ３それぞれの、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６．ＣＬ２５結腸腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す図である。ＩＭＯ２（丸）、ＩＭＯ３（三角）、または非ＣｐＧＤＮＡ（四角）。（Ｂ）ＩＭＯモチーフ投与の４時間後のマウスにおける血清ＩＬ−１２濃度を示す図である。
【図２６】ヒトＰＢＭＣのＩＭＯ３による活性化は、ヘルセプチンの存在下でのＨｅｒ−２陽性ＢＴ−４７４細胞の溶解を誘導することを示す図である。
【０１２２】
【図２７】ＩＭＯ化合物とリツキサンまたはヘルセプチンの組み合わせ処置において用いられる治療スケジュールを示す図である。
【図２８】リツキサンおよび／またはＩＭＯの処置により腫瘍が１．５ｇに到達するのに必要な日数とその割合を示す図である。
【図２９】ヘルセプチンおよび／またはＩＭＯ処置後の腫瘍増殖の阻害パーセンテージを示す。
【図３０】リツキサンおよび／またはＩＭＯ処置後の腫瘍増殖の阻害パーセンテージを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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