(57)【要約】本発明は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）の選択的結合剤を提供する。より具体的には、本発明は、ＩＦＮγに選択的に結合し、そして関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫および炎症性疾患に関連する状態を防止するかまたは治療するのに使用可能な、抗体および抗原結合ドメインを提供する。前記の抗体および抗原結合ドメインをコードする核酸分子、並びに該核酸分子を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞もまた、提供する。
2006502739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−ガンマ・タンパク質に結合し、そしてアンタゴニスト抗体である、抗体または抗原結合ドメイン、あるいはその断片、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）または誘導体。
【請求項２】
インターフェロン−ガンマ・タンパク質が哺乳動物インターフェロン−ガンマ・タンパク質である、請求項１の抗体。
【請求項３】
インターフェロン−ガンマ・タンパク質がヒト・インターフェロン−ガンマ・タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項２の抗体。
【請求項４】
免疫原性断片が、ヒト・インターフェロン−ガンマ・タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む、請求項３の抗体。
【請求項５】
インターフェロン−ガンマ・タンパク質のインターフェロン−ガンマ受容体への結合を阻害する、請求項１の抗体。
【請求項６】
炎症を阻害する、請求項１の抗体。
【請求項７】
阻害する、請求項１の抗体。
【請求項８】
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される、請求項１の抗体。
【請求項９】
ヒト抗体である、請求項１の抗体。
【請求項１０】
抗体または抗原結合ドメインであって：
（ａ）図３（配列番号６６）、図４（配列番号６８）、図５（配列番号７０）、図６（配列番号７２）、図７（配列番号７４）、図８（配列番号７６）、図９（配列番号７８）、図１０（配列番号８０）、図１１（配列番号８２）、図１２（配列番号８４）または図１３（配列番号８６）に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列の保存的アミノ酸置換を含む、重鎖アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列に少なくとも約８０％同一である、重鎖アミノ酸配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片または誘導体
を含み、ＩＦＮγに選択的に結合する、前記抗体または抗原結合ドメイン。
【請求項１１】
カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖をさらに含む、請求項１０の抗体。
【請求項１２】
ヒトＦｃ領域をさらに含む、請求項１０の抗体。
【請求項１３】
図３（配列番号６６）、図４（配列番号６８）、図５（配列番号７０）、図６（配列番号７２）、図７（配列番号７４）、図８（配列番号７６）、図９（配列番号７８）、図１０（配列番号８０）、図１１（配列番号８２）、図１２（配列番号８４）または図１３（配列番号８６）に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列、および図１４（配列番号８８）、図１５（配列番号９０）、図１６（配列番号９２）、図１７（配列番号９４）、図１８（配列番号９６）、図１９（配列番号９８）、図２０（配列番号１００）、図２１（配列番号１０２）、図２２（配列番号１０４）、図２３（配列番号１０６）または図２４（配列番号１０８）に示すようなＦａｂ軽鎖アミノ酸配列を含む抗体または抗原結合ドメインに認識される、ヒトＩＦＮγ上のエピトープを認識する、抗体または抗原結合ドメイン。
【請求項１４】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体または抗原結合ドメインであって：
各Ｖｌ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖｌ）、ＣＤＲ２（Ｖｌ）およびＣＤＲ３（Ｖｌ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖｌ）が：
【化１】
2006502739.tif 000089
からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖｌ）が：
【化２】
2006502739.tif 000090
からなる群より選択され、
そしてＣＤＲ３（Ｖｌ）が：
【化３】
2006502739.tif 000091
からなる群より選択され、
ＣＤＲ１（Ｖｌ）、ＣＤＲ２（Ｖｌ）およびＣＤＲ３（Ｖｌ）が互いに独立に選択され；そして
各Ｖｈ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖｈ）、ＣＤＲ２（Ｖｈ）およびＣＤＲ３（Ｖｈ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖｈ）が：
【化４】
2006502739.tif 000092
からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖｈ）が：
【化５】
2006502739.tif 000093
からなる群より選択され、
ＣＤＲ３（Ｖｈ）が：
【化６】
2006502739.tif 000094
からなる群より選択され；
ＣＤＲ１（Ｖｈ）、ＣＤＲ２（Ｖｈ）およびＣＤＲ３（Ｖｈ）が互いに独立に選択される、
前記抗体または抗原結合ドメイン。
【請求項１５】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む、請求項１４の抗体であって：
Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号０２）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＮＱＲＰＳ（配列番号１３）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＧＳＡＷＶ（配列番号２４）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＴＳＷＮＡＧＧＰＩＤＹ（配列番号５５）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＹＹＶＱ（配列番号０３）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号１４）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＲＮＳＬＶ（配列番号２５）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＲＶＧＹＳＳＳＬＬＤＹ（配列番号５６）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＲＡＴＱＳＬＬＨＧＮＧＨＮＹＬＤ（配列番号０４）を有するＣＤＲ１、配列ＭＧＳＮＲＡＳ（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＬＰＰＴ（配列番号２６）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３６）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４６）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＫＧＳＲＩＴＩＦＧＶＶＧＳＡＧＦＤＹ（配列番号５７）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号０５）を有するＣＤＲ１、配列ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号１６）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＴＱＬＰＹＴ（配列番号２７）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号３７）を有するＣＤＲ１、配列ＨＩＦＳＮＤＥＥＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号４７）を有するＣＤＲ２、および配列ＬＬＬＹＥＧＦＤＰ（配列番号５８）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＳＧＤＶＬＡＲＫＹＡＲ（配列番号０６）を有するＣＤＲ１、配列ＫＤＲＥＲＰＳ（配列番号１７）を有するＣＤＲ２、および配列ＹＳＡＡＤＮＲＧＶ（配列番号２８）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＨ（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４８）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＬＶＬＴＭＴＳＲＲＡＡＦＤＩ（配列番号５９）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＧＧＤＮＬＧＧＫＳＬＨ（配列番号０７）を有するＣＤＲ１、配列ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号１８）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＶＷＤＧＳＳＤＱＲＶ（配列番号２９）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＹＳＭＮ（配列番号３９）を有するＣＤＲ１、配列ＳＩＳＳＧＳＳＹＲＹＤＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＱＷＧＴＩＳＧＮＤＹ（配列番号６０）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＴＮＥＹＮＹＬＤ（配列番号０８）を有するＣＤＲ１、配列ＬＧＳＮＲＡＰ（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＴＰＲＴ（配列番号３０）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号４０）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５０）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＷＰＴＹＶＷＧＳＹＲＰＫＧＹＦＤＹ（配列番号６１）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＮＮＹＶＨ（配列番号０９）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号２０）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＮＳＮＳＦＶＶ（配列番号３１）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＧＧＹＳＷＳ（配列番号４１）を有するＣＤＲ１、配列ＹＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５１）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＤＷＧＹＦＤＹ（配列番号６２）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＲＡＳＱＹＶＳＳＮＳＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲ１、配列ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号２１）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＱＹＧＳＳＰＩＴ（配列番号３２）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＮＹＭＳ（配列番号４２）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５２）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＡＤＧＧＤＹＧＹ（配列番号６３）を有するＣＤＲ３を含むか；または
Ｖｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＲＳＮＧＹＮＹＬＡ（配列番号１１）を有するＣＤＲ１、配列ＬＡＳＮＲＡＳ（配列番号２２）を有するＣＤＲ２、および配列ＶＨＧＶＨＩＰＹＴ（配列番号３３）を有するＣＤＲ３を含み；そしてＶｈ鎖が、配列ＳＮＥＡＧＶＧ（配列番号４３）を有するＣＤＲ１、配列ＬＬＹＷＤＤＤＫＲＹＳＰＳＬＲＳ（配列番号５３）を有するＣＤＲ２、および配列ＲＬＶＲＹＧＧＹＳＴＧＧＦＤＶ（配列番号６４）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている、前記抗体。
【請求項１６】
ヒトＦｃ領域をさらに含む、請求項１４または１５の抗体。
【請求項１７】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３３の生殖系列配列（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項１８】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３４の生殖系列配列（配列番号１２３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項１９】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４２の生殖系列配列（配列番号１３１）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３５の生殖系列配列（配列番号１２４）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２０】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４３の生殖系列配列（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３３の生殖系列配列（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２１】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４４の生殖系列配列（配列番号１３３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３６の生殖系列配列（配列番号１２５）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２２】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４５の生殖系列配列（配列番号１３４）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３７の生殖系列配列（配列番号１２６）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２３】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４６の生殖系列配列（配列番号１３５）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３８の生殖系列配列（配列番号１２７）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２４】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３９の生殖系列配列（配列番号１２８）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２５】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４３の生殖系列配列（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図４０の生殖系列配列（配列番号１２９）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２６】
可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体であって：
Ｖｌ鎖が、図４１の生殖系列配列（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして
Ｖｈ鎖が、図３４の生殖系列配列（配列番号１２３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてインターフェロン−ガンマ・タンパク質に選択的に結合する、前記抗体。
【請求項２７】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、または異種抗体である、請求項１の抗体。
【請求項２８】
請求項１、１０、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のいずれかの抗体をコードする、単離核酸分子。
【請求項２９】
請求項２８の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
ＣＨＯ細胞である、請求項３０の宿主細胞。
【請求項３２】
核酸分子の発現を可能にする条件下で、請求項３１の宿主細胞を培養することを含む、抗体産生法。
【請求項３３】
ＩｇＧアイソタイプがＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤから選択される、請求項１、１０、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７の抗体。
【請求項３４】
アイソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項３３の抗体。
【請求項３５】
請求項１、１０、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のいずれかの抗体または抗原結合ドメイン、あるいはその断片、変異体または誘導体、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む組成物。
【請求項３６】
請求項３５の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、自己免疫疾患を防止するかまたは治療する方法。
【請求項３７】
請求項３５の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、炎症状態を防止するかまたは治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト・インターフェロン・ガンマ（ｈＩＦＮγ）に結合し、そして該分子と同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体、ＩＦＮγ−Ｒとの相互作用を阻害し、そして／またはＩＦＮγに誘発される生物学的作用を修飾する、新規完全ヒト抗体Ｆａｂ断片に関する。より具体的には、本発明は、ファージ・ディスプレー・ライブラリーであって、ユニークなＦａｂ断片を含有し、該断片が次いで、全長ヒトＩｇＧ抗体に変換される、前記ファージ・ディスプレー・ライブラリーのｈＩＦＮγ親和性選択を通じて単離される中和Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）に関する。ｈＩＦＮγ中和活性、高親和性、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの長い半減期という望ましい特質を有する、ｈＩＦＮγに対するこれらの新規完全ヒト抗体を用いて、多様な自己免疫および炎症性疾患を防止するかまたは治療することも可能である。本発明の完全ヒトＦａｂを産生するための核酸分子、ベクターおよび宿主細胞もまた提供する。
【０００２】
発明の背景
抗体は、生物薬剤学研究および薬剤発見の試みにおいて、長年、非常に重要な役割を果たしてきた。ヒト疾患の治療のための療法剤としての抗体の有用性は、抗体が：（ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長く；（ｂ）高い親和性および特異性で標的（単数または複数）に結合可能であり；そして（ｃ）免疫エフェクター機能（補体結合および抗体依存性細胞傷害作用など）を仲介する能力を持ちうるため、長年、理想とされてきた。
【０００３】
しかし、今までは、非ヒト種から得た抗体に、不都合な免疫原性があり、抗体の長期臨床的有用性が制限されることから、療法抗体の概念を実行することは、大幅に制限されていた。最近の技術的進歩によって、免疫原性がより低く、そして長期の療法潜在能力を持つ、完全ヒト抗体を得る手段を提供することによって、これらの制限を克服する新規の方法が提供されてきている。さらに、コンビナトリアル・ライブラリー法および抗体操作における発展によって、抗体親和性、半減期、および／またはエフェクター機能を修飾する機会が得られるようになってきた。
【０００４】
高親和性、高特異性であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を持つ抗体を発見するのに、ファージ・コートタンパク質に融合された抗体断片の繊維状ファージ・ディスプレー・コンビナトリアル・ライブラリー（いわゆる「ファージ・ディスプレー・ライブラリー」）を使用する、こうした技術の１つが有効に用いられてきている。
【０００５】
ヒト・インターフェロン・ガンマ（ｈＩＦＮγ）は、活性化Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞に産生されるリンホカインである。該分子は、抗増殖活性、抗ウイルス活性および免疫調節活性を示し、そして免疫系の大部分の初代細胞上にあるヘテロ二量体受容体、ｈＩＦＮγ−Ｒに結合し；Ｌａｎｇｅｒら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ９：３９３（１９８８）、そして炎症につながる事象カスケードを誘発する。ＩＦＮγの抗ウイルス活性および免疫調節活性は、いくつかの臨床状態に有益な影響を有することが知られる。しかし、ＩＦＮγ活性が有害な影響を有することが知られる、多くの臨床設定がある。例えば、自己免疫疾患は、高レベルの血中ｈＩＦＮγと関連し、そして現在、ＩＦＮγの隔絶が、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫疾患の症状軽減と関連することを示唆する証拠がある：例えばＳｋｕｒｋｏｖｉｃｈら，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  １４：２３−３２（１９９８）；Ｇｅｒｅｚら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １０９：２９６−３０３（１９９７）を参照されたい。ＩＦＮγ活性はまた、悪液質、敗血症ショックおよびクローン病などの疾患状態にも関連付けられてきている。
【０００６】
ｈＩＦＮγのその受容体への相互作用を遮断することは、これに関連する最も上流の段階に介入することに相当するため、ｈＩＦＮγ中和活性を持つ完全ヒト抗体は、魅力的な療法製品候補に相当する。ヒト・インターフェロン−ガンマ（ｈＩＦＮγ）を療法標的として用いる抗体を同定するのに、ファージ・ディスプレー・ライブラリー技術を使用することが、本発明の目的である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ヒト・インターフェロン−ガンマ（ｈＩＦＮγ）に結合する、新規完全ヒト抗体Ｆａｂ断片を提供する。１つの態様において、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、ｈＩＦＮγとその同族受容体、ｈＩＦＮγ−Ｒとの相互作用を、部分的にまたは完全に阻害し、そしてそれによって、ｈＩＦＮγ活性を、部分的にまたは完全に阻害する方式で、ｈＩＦＮγに結合する；すなわち抗体は、ｈＩＦＮγのアンタゴニストである。好ましくは、ｈＩＦＮγは哺乳動物ｈＩＦＮγである。より好ましくは、ｈＩＦＮγは、可溶性型または細胞表面結合型であることも可能なヒトｈＩＦＮγ、あるいはその断片、誘導体および変異体（ｖａｒｉａｎｔ）である。
【０００８】
本発明の抗体は、ネズミまたはヒトｈＩＦＮγなどのｈＩＦＮγ、好ましくはヒトｈＩＦＮγ、あるいはその免疫原性断片、誘導体または変異体で、動物を免疫することによって、調製可能である。さらに、ｈＩＦＮγがトランスフェクション細胞で発現されて、そしてその表面に結合するように、ｈＩＦＮγをコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクションされた細胞を用いて、動物を免疫することも可能である。あるいは、ｈＩＦＮγへの結合に関して、抗体または抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって、抗体を得ることも可能である。こうしたライブラリーは、組み立てられたファージ粒子表面上に発現されるバクテリオファージ・コートタンパク質へのタンパク質融合体またはペプチド融合体、およびファージ粒子内に含有されるコードＤＮＡ配列として、バクテリオファージ中で、好適に調製される（いわゆる「ファージ・ディスプレー・ライブラリー」）。１つの例において、ファージ・ディスプレー・ライブラリーは、可変軽鎖および重鎖などのヒト抗体をコードするＤＮＡ配列を含有する。
【０００９】
抗体または抗原結合ドメインは、ｈＩＦＮγに結合可能であり、そして部分的にまたは完全にｈＩＦＮγ活性を中和する、天然抗体に類似の四量体糖タンパク質であることも可能であるし、あるいは一本鎖抗体；Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’断片、二重特異性抗体、異種抗体、あるいはそれらの他の断片、変異体、または誘導体であることも可能である。抗体または抗原結合ドメインを、ハイブリドーマ細胞株（例えばマウス骨髄腫細胞に融合させた脾臓細胞などの、抗体産生細胞）で産生することも可能であるし、あるいは前記抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子でトランスフェクションした異種細胞株で産生することも可能である。
【００１０】
本発明の抗体または抗原結合ドメインは：
（ａ）図３〜１３（配列番号６５〜配列番号８６）に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列の保存的アミノ酸置換を含む、重鎖アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列に少なくとも約８０％同一である、重鎖アミノ酸配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片または誘導体
を含み、ｈＩＦＮγに選択的に結合する。
【００１１】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、上記と同一の図３〜１３に示すようなＦａｂ重鎖アミノ酸配列（配列番号６５〜配列番号８６）および図１４〜２４に示すようなＦａｂ軽鎖アミノ酸配列（配列番号８７〜配列番号１０８）を含む抗体または抗原結合ドメインに認識される、ヒトｈＩＦＮγ上のエピトープを認識する。
【００１２】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：
各Ｖｌ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖｌ）、ＣＤＲ２（Ｖｌ）およびＣＤＲ３（Ｖｌ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖｌ）が：
【００１３】
【化１】
2006502739.tif 000003
【００１４】
からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖｌ）が：
【００１５】
【化２】
2006502739.tif 000004
【００１６】
からなる群より選択され、
そしてＣＤＲ３（Ｖｌ）が：
【００１７】
【化３】
2006502739.tif 000005
【００１８】
からなる群より選択され、
ＣＤＲ１（Ｖｌ）、ＣＤＲ２（Ｖｌ）およびＣＤＲ３（Ｖｌ）が互いに独立に選択され；そして
各Ｖｈ鎖が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されるＣＤＲ１（Ｖｈ）、ＣＤＲ２（Ｖｈ）およびＣＤＲ３（Ｖｈ）と称されるＣＤＲアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１（Ｖｈ）が：
【００１９】
【化４】
2006502739.tif 000006
【００２０】
からなる群より選択され、
ＣＤＲ２（Ｖｈ）が：
【００２１】
【化５】
2006502739.tif 000007
【００２２】
からなる群より選択され、
ＣＤＲ３（Ｖｈ）が：
【００２３】
【化６】
2006502739.tif 000008
【００２４】
からなる群より選択され；
ＣＤＲ１（Ｖｈ）、ＣＤＲ２（Ｖｈ）およびＣＤＲ３（Ｖｈ）が互いに独立に選択される。
【００２５】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００２６】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号０２）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＮＱＲＰＳ（配列番号１３）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＧＳＡＷＶ（配列番号２４）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＴＳＷＮＡＧＧＰＩＤＹ（配列番号５５）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００２７】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＹＹＶＱ（配列番号０３）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号１４）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＲＮＳＬＶ（配列番号２５）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＳ（配列番号３５）を有するＣＤＲ１、配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＲＶＧＹＳＳＳＬＬＤＹ（配列番号５６）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００２８】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＲＡＴＱＳＬＬＨＧＮＧＨＮＹＬＤ（配列番号０４）を有するＣＤＲ１、配列ＭＧＳＮＲＡＳ（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＬＰＰＴ（配列番号２６）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３６）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４６）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＫＧＳＲＩＴＩＦＧＶＶＧＳＡＧＦＤＹ（配列番号５７）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００２９】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号０５）を有するＣＤＲ１、配列ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号１６）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＴＱＬＰＹＴ（配列番号２７）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号３７）を有するＣＤＲ１、配列ＨＩＦＳＮＤＥＥＳＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号４７）を有するＣＤＲ２、および配列ＬＬＬＹＥＧＦＤＰ（配列番号５８）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３０】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＳＧＤＶＬＡＲＫＹＡＲ（配列番号０６）を有するＣＤＲ１、配列ＫＤＲＥＲＰＳ（配列番号１７）を有するＣＤＲ２、および配列ＹＳＡＡＤＮＲＧＶ（配列番号２８）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＹＡＭＨ（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４８）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＬＶＬＴＭＴＳＲＲＡＡＦＤＩ（配列番号５９）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３１】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＧＧＤＮＬＧＧＫＳＬＨ（配列番号０７）を有するＣＤＲ１、配列ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号１８）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＶＷＤＧＳＳＤＱＲＶ（配列番号２９）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＹＳＭＮ（配列番号３９）を有するＣＤＲ１、配列ＳＩＳＳＧＳＳＹＲＹＤＡＤＳＶＫＧ（配列番号４９）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＱＷＧＴＩＳＧＮＤＹ（配列番号６０）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３２】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＴＮＥＹＮＹＬＤ（配列番号０８）を有するＣＤＲ１、配列ＬＧＳＮＲＡＰ（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、および配列ＭＱＡＬＱＴＰＲＴ（配列番号３０）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号４０）を有するＣＤＲ１、配列ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５０）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＷＰＴＹＶＷＧＳＹＲＰＫＧＹＦＤＹ（配列番号６１）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３３】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＮＮＹＶＨ（配列番号０９）を有するＣＤＲ１、配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号２０）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＳＹＤＮＳＮＳＦＶＶ（配列番号３１）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＧＧＹＳＷＳ（配列番号４１）を有するＣＤＲ１、配列ＹＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５１）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＤＷＧＹＦＤＹ（配列番号６２）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３４】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＲＡＳＱＹＶＳＳＮＳＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲ１、配列ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号２１）を有するＣＤＲ２、および配列ＱＱＹＧＳＳＰＩＴ（配列番号３２）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＮＹＭＳ（配列番号４２）を有するＣＤＲ１、配列ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５２）を有するＣＤＲ２、および配列ＤＡＤＧＧＤＹＧＹ（配列番号６３）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３５】
別の態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み：Ｖｌ鎖が、配列ＲＳＳＱＳＬＬＲＳＮＧＹＮＹＬＡ（配列番号１１）を有するＣＤＲ１、配列ＬＡＳＮＲＡＳ（配列番号２２）を有するＣＤＲ２、および配列ＶＨＧＶＨＩＰＹＴ（配列番号３３）を有するＣＤＲ３を含み；そして
Ｖｈ鎖が、配列ＳＮＥＡＧＶＧ（配列番号４３）を有するＣＤＲ１、配列ＬＬＹＷＤＤＤＫＲＹＳＰＳＬＲＳ（配列番号５３）を有するＣＤＲ２、および配列ＲＬＶＲＹＧＧＹＳＴＧＧＦＤＶ（配列番号６４）を有するＣＤＲ３を含み；
各Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、フレームワーク・アミノ酸配列によって分離されている。
【００３６】
本発明の抗体および抗原結合ドメインは、軽鎖および重鎖アミノ酸配列をコードするゲノムＤＮＡに存在する生殖系列核酸由来である。抗体は、生殖系列配列再編成突然変異および体細胞突然変異の産物である核酸配列にコードされる。
【００３７】
１つの態様において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み、Ｖｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３３におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そして抗体は、ＩＦＮγポリペプチドに選択的に結合する。
【００３８】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３４におけるようなＶＨ１生殖系列遺伝子（配列番号１２３）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００３９】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４２におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３１）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３５におけるようなＶＨ２生殖系列遺伝子（配列番号１２４）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４０】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４３におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３３におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４１】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４４におけるようなＶλ３生殖系列遺伝子（配列番号１３３）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３６におけるようなＶＨ３生殖系列遺伝子（配列番号１２５）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４２】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４５におけるようなＶλ３生殖系列遺伝子（配列番号１３４）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３７におけるようなＶＨ３生殖系列遺伝子（配列番号１２６）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４３】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４６におけるようなＶκ３生殖系列遺伝子（配列番号１３５）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３８におけるようなＶＨ３生殖系列遺伝子（配列番号１２７）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４４】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３９におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２８）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４５】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４３におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３３におけるようなＶＨ４生殖系列遺伝子（配列番号１２２）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４６】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４３におけるようなＶκ２生殖系列遺伝子（配列番号１３２）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図４０におけるようなＶＨ２生殖系列遺伝子（配列番号１２９）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４７】
別の態様において、Ｖｌ鎖が、図４１におけるようなＶλ６生殖系列遺伝子（配列番号１３０）の再編成変異体または体細胞変異体を含み；そしてＶｈ鎖が、図３４におけるようなＶＨ１生殖系列遺伝子（配列番号１２３）の再編成変異体または体細胞変異体を含む。
【００４８】
本発明の選択的結合剤（抗体または抗原結合ドメイン）は、ＩＦＮγの少なくとも１つの活性、例えばＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を、部分的にまたは完全に阻害する。
１つの態様において、ＩＦＮγアンタゴニスト、例えば抗体または抗原ドメインは、狼瘡様疾患、関節炎、または多発性硬化症様症候群を経験しているか、またはこれらを発展させるリスクがある動物に投与される。ＩＦＮγアンタゴニストを用いて、ループス腎炎、関節リウマチ、および／または多発性硬化症を防止し、そして／または治療することも可能である。
【００４９】
本発明の抗体または抗原結合ドメインおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む組成物もまた、提供する。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト・インターフェロン−ガンマ・タンパク質（ｈＩＦＮγ）に選択的に結合する剤（「選択的結合剤」）を提供する。好ましくは、該剤は、ＩＦＮγアンタゴニストまたは阻害剤であり、ＩＦＮγの少なくとも１つの活性、例えばＩＦＮγのその同族受容体への結合を、部分的にまたは完全に阻害する。１つの態様において、完全ヒト抗体断片は、ＩＦＮγのその同族受容体への結合を、部分的にまたは完全に遮断し、そしてＩＦＮγ活性を、部分的にまたは完全に阻害するように、ＩＦＮγに選択的に結合する。
【００５１】
用語「選択的結合剤」は、ＩＦＮγに優先的に結合する分子を指す。選択的結合剤には、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または小分子量化合物が含まれることも可能である。好ましい態様において、選択的結合剤は抗体であり、例えば可溶性型または結合型で、標識されていることも可能である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体とともに、限定されるわけではないが、酵素切断、ペプチド合成または組換え技術を含む既知の技術によって提供される、それらの断片、領域または誘導体である。本発明の抗ＩＦＮγ選択的結合剤は、ＩＦＮγの部分に結合することが可能であり、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒ受容体への結合を阻害する。
【００５２】
本発明の抗体および抗原結合ドメインは、ＩＦＮγに選択的に結合し、すなわち、これらは他の抗原より高い結合親和性で、優先的にＩＦＮγに結合する。抗体は、ヒトＩＦＮγに選択的に結合するが、ネズミＩＦＮγなどの非ヒトＩＦＮγにもまた検出可能であるように結合することも可能である。あるいは、抗体は、非ヒトＩＦＮγに選択的に結合するが、ヒトＩＦＮγにもまた検出可能であるように結合することも可能である。あるいは、抗体は、もっぱらヒトＩＦＮγに結合し、非ヒトＩＦＮγには検出可能に結合しないことも可能である。
【００５３】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、ここで、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識するであろう。用語「モノクローナル」は、抗体を作成するいかなる特定の方法にも限定されない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら；Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）に記載されるようなハイブリドーマ法によって作成することも可能であるし、また例えば本明細書記載の技術を用いて、ファージ・ライブラリーから単離することも可能である。
【００５４】
用語「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」は、選択的結合剤（例えば抗体分子）の部分であって、抗原と相互作用し、そして該結合剤に、抗原に対する特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する、前記部分を指す。好ましくは、抗原結合領域は、ヒト起源のものであろう。他の態様において、抗原結合領域は、他の動物種、特にウサギ、ラットまたはハムスターなどのげっ歯類に由来することも可能である。
【００５５】
用語「エピトープ」は、１以上の結合剤の抗原結合領域で、選択的結合剤（例えば抗体）によって認識され、そして結合されることが可能な分子いずれかの部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性である表面集団からなり、そして特定の三次元構造特性とともに特定の電荷特性を有する。「阻害性エピトープおよび／または中和エピトープ」は、選択的結合剤に結合された際、そのエピトープを含有する分子または生物のｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｓｉｔｕでの、より好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏでの、ＩＦＮγのその受容体への結合を含めた、生物学的活性の損失を生じるエピトープを意図する。用語「軽鎖」は、抗体に関して用いた場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個の種類を指す。
【００５６】
用語「重鎖」は、抗体に関して用いた場合、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる５つの別個の種類を指す。重鎖のこれらの別個の種類は、抗体の５つのクラス、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを生じさせ、これには、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。
【００５７】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、典型的には、重鎖ではアミノ末端の約１２０〜１３０アミノ酸、そして軽鎖では約１００〜１１０アミノ酸であり、抗体間で配列が大規模に異なり、そして特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性において用いられる、軽鎖の部分および重鎖の部分を指す。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中しており、一方、可変ドメイン中のよりよく保存される領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。軽鎖のＣＤＲおよび重鎖のＣＤＲは、抗原と抗体の相互作用に関与する。
【００５８】
用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、Ｆｃ受容体との相互作用など、多様なエフェクター機能を示す、軽鎖のカルボキシ末端部分および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。
【００５９】
用語「ヒト・インターフェロン−ガンマ」または「ヒト・インターフェロン−ガンマ・ポリペプチド」は、その開示が本明細書に援用されるＰＣＴ公報ＷＯ  ８３／０４０５３に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変異体；スプライス変異体；断片；誘導体；置換変異体、欠失変異体、および挿入変異体；融合ポリペプチド；並びに種間相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）が含まれる。免疫反応を生じるのに十分なＩＦＮγの可溶性型もまた含まれる。ＩＦＮγは、本明細書に定義するような成熟ポリペプチドであることも可能であり、そして調製した方法に応じて、アミノ末端メチオニン残基を有することもまた持たないことも可能である。
【００６０】
用語「断片」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、全長アミノ酸配列に満たない配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。こうした断片は、例えばアミノ末端の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、カルボキシ末端の一部切除、および／またはアミノ酸配列からの残基（単数または複数）の内部欠失から生じることも可能である。断片は、選択的ＲＮＡスプライシング、またはｉｎ  ｖｉｖｏプロテアーゼ活性から生じることも可能である。
【００６１】
用語「変異体」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、天然配列または非修飾配列に比較した際に、１以上のアミノ酸配列置換、欠失、および／または付加を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、ＩＦＮγ変異体は、天然ＩＦＮγのアミノ酸配列に対する１以上の変化から生じることも可能である。やはり例として、ＩＦＮγの選択的結合剤の変異体は、天然のまたはあらかじめ修飾されていない選択的結合剤のアミノ酸配列に対する１以上の変化から生じることも可能である。変異体は、対立遺伝子変異体またはスプライス変異体などの天然存在変異体であることも可能であるし、あるいは人工的に構築することも可能である。ポリペプチド変異体は、前記変異体をコードする、対応する核酸分子から調製することも可能である。
【００６２】
用語「誘導体」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、化学的に修飾されているポリペプチドまたはペプチド、あるいはその変異体、断片または誘導体を指す。例には、１以上のポリマー、例えば水溶性ポリマー、Ｎ連結、またはＯ連結炭水化物、糖、リン酸、および／または他のこうした分子の共有結合が含まれる。誘導体は、付着する分子の種類または位置いずれかが、天然存在または出発ペプチドまたはポリペプチドと異なる方式で修飾されている。誘導体には、ペプチドまたはポリペプチド上に天然に存在する１以上の化学基の欠失がさらに含まれる。
【００６３】
用語「融合」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、ペプチドまたはポリペプチド、あるいはその断片、変異体および／または誘導体と、異種ペプチドまたはポリペプチドとの連結を指す。
【００６４】
用語「生物学的に活性」は、ＩＦＮγに関連して、またはタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、ＩＦＮγまたは選択的結合剤の少なくとも１つの活性特性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。ＩＦＮγの選択的結合剤は、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性に関して、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、あるいは中和活性または遮断活性を有することも可能である。
【００６５】
用語「天然存在」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的材料に関連して用いた場合、天然に見出され、そして人間によって操作されていないものを指す。
用語「単離」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、天然環境で見出される混入ポリペプチドを少なくとも１つ含まないペプチドまたはポリペプチドを指し、そして好ましくは、療法使用および診断使用に干渉するであろう、いかなる他の混入哺乳動物ポリペプチドも実質的に含まないペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００６６】
用語「成熟」は、ＩＦＮγに関連して、またはＩＦＮγのタンパク質性選択的結合剤に関連して用いた場合、リーダー配列を欠くペプチドまたはポリペプチドを指す。該用語はまた、アミノ末端（リーダー配列を含むまたは含まない）および／またはカルボキシ末端のタンパク質分解的プロセシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化等のペプチドまたはポリペプチドの他の修飾も含むことも可能である。
【００６７】
用語「有効量」および「療法的有効量」は、ＩＦＮγの選択的結合剤に関連して用いた場合、ＩＦＮγの１以上の生物学的活性レベルの観察可能な変化を支持するのに有用であるかまたは必要である、選択的結合剤の量を指す。前記変化は、ＩＦＮγ活性レベルの増加または減少いずれであることも可能である。
【００６８】
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたはまったく影響しないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基を他の非極性残基いずれかで置換することから生じる。さらに、アラニン・スキャニング突然変異誘発に関して、先に記載されているように、ポリペプチド中の天然残基いずれかをアラニンで置換することもまた可能である；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）。保存的アミノ酸置換の典型的な規則を表Ｉに示す。
【００６９】
表Ｉ
保存的アミノ酸置換
【００７０】
【表１】
2006502739.tif 000009
【００７１】
保存的アミノ酸置換はまた、典型的には、生物学的系における合成よりも化学的ペプチド合成によって取り込まれる、非天然存在アミノ酸残基も含む。これらには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転型または反転型が含まれる。
【００７２】
アミノ酸配列に対する保存的修飾（およびコードするヌクレオチドに対する対応する修飾）は、天然存在ＩＦＮγまたは選択的結合剤と類似の機能特性および化学特性を有するＩＦＮγポリペプチド（およびそのタンパク質性選択的結合剤）を産生可能である。対照的に、（ａ）置換領域における分子主鎖の構造、例えばシートまたはらせんコンホメーション、（ｂ）標的部位での、分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖バルクの維持に対する影響が有意に異なる置換を選択することによって、ＩＦＮγ（およびそのタンパク質性選択的結合剤）の機能特性および／または化学特性の実質的な修飾を達成することも可能である。天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、グループに分けることも可能である：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７３】
非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴うことも可能である。
２以上の核酸分子および／またはポリペプチドの「同一性または類似性」は、２以上の別個の配列の関連性の測定値を提供する。用語「同一性」は、２つの別個のアミノ酸配列の対応する位で同一であるアミノ酸を指す。用語「類似性」は、２つの別個のアミノ酸配列の対応する位で、同一であるか、または上に定義するような保存的置換であるアミノ酸を指す。
【００７４】
同一性または類似性の度合いは、限定されるわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー，  １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．監修，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏら，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３（１９８８）に記載されるものを含む、既知の方法によって、容易に計算可能である。
【００７５】
同一性および／または類似性を決定する好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大のマッチを得る。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する典型的なコンピュータプログラム法には、限定されるわけではないが、ＧＡＰ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２：３８７（１９８４）；遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０（１９９０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌら  ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  メリーランド州ベセスダ）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を決定することもまた可能である。
【００７６】
ＩＦＮγポリペプチド
本発明の選択的結合剤をスクリーニングし、そして同定するため、ＩＦＮγポリペプチド、並びにその断片、変異体および誘導体を標的分子として用いる。選択的結合剤として抗体を調製することが望ましい場合、ＩＦＮγポリペプチドは、好ましくは免疫原性であり、すなわち、これらは動物に投与された際に、免疫応答を誘発する。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術によって抗体を調製する場合、標的分子として用いられるＩＦＮγポリペプチドは、抗体または抗原結合ドメインと検出可能に結合することが可能である。
【００７７】
生物学的方法または化学的方法によって、ＩＦＮγポリペプチドを調製する。組換えＩＦＮγをコードするＤＮＡ配列の発現などの生物学的な方法が当該技術分野に知られる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５：２１４９（１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：５１３２（１９８５）、並びにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  イリノイ州ロックフォード（１９８４）に示されるような化学合成法を用いて、本発明のＩＦＮγポリペプチドを調製することもまた可能である。こうしたポリペプチドを、アミノ末端メチオニンを伴い、または伴わずに合成することも可能である。化学的に合成したＩＦＮγポリペプチド、あるいはその断片または変異体を、これらの参考文献に示される方法を用いて酸化して、ジスルフィド架橋を形成することも可能である。化学合成によって調製された本発明のＩＦＮγポリペプチドは、組換えによって産生されたか、または天然供給源から精製された、対応するＩＦＮγポリペプチドに匹敵する生物学的活性を、少なくとも１つ有するであろう。
【００７８】
ＩＦＮγポリペプチドを、ＩＦＮγポリペプチドが天然に見出される供給源組織および／または体液などの生物学的試料から単離することによって、得ることも可能である。ＩＦＮγポリペプチドの供給源は、起源が、ヒトまたは非ヒトであることも可能である。電気泳動による分離、その後の電気的溶出、多様な種類のクロマトグラフィー（アフィニティー、免疫親和性、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高圧液体クロマトグラフィーなどの、当該技術分野に知られる方法を用いて、天然存在ＩＦＮγポリペプチドの単離を達成することも可能である。例えば、組換えで産生したＩＦＮγポリペプチドまたはそのペプチド断片に対して調製した抗体を用いて、精製中のＩＦＮγポリペプチドの存在を監視することも可能である。
【００７９】
本発明のポリペプチドには、単離ＩＦＮγポリペプチド、並びに上に定義するような、断片、変異体、融合ポリペプチド、および誘導体を含む、ＩＦＮγポリペプチドに関連するポリペプチドが含まれる。本発明のＩＦＮγ断片は、アミノ末端（リーダー配列を含むまたは含まない）の一部切除、カルボキシ末端の一部切除、および／またはポリペプチド内部の欠失から生じることも可能である。こうしたＩＦＮγポリペプチド断片は、所望によって、アミノ末端メチオニン残基を含むことも可能である。本発明のポリペプチドは、抗体応答を誘発可能である点で、免疫原性であろう。
【００８０】
本発明のＩＦＮγポリペプチド変異体には、天然ＩＦＮγアミノ酸配列に比較した際、１以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失が含まれる。アミノ酸置換は、上に定義するように保存的であることも可能であるし、または非保存的であることも、あるいはその組み合わせいずれかであることも可能である。変異体は、カルボキシ末端またはアミノ末端いずれかに、アミノ酸残基の付加を有することも可能である（この場合、アミノ末端は、リーダー配列を含んでもよいし、また含まなくてもよい）。
【００８１】
本発明の態様には、ＩＦＮγグリコシル化変異体およびシステイン変異体が含まれる。ＩＦＮγグリコシル化変異体には、天然ＩＦＮγポリペプチドに比較して、グリコシル化部位の数および／または種類が改変されている変異体が含まれる。１つの態様において、ＩＦＮγグリコシル化変異体は、天然ＩＦＮγに比較して、より多くのまたはより少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。
【００８２】
Ｎ連結炭水化物鎖の再編成を含むＩＦＮγグリコシル化変異体であって、１以上のＮ連結グリコシル化部位（典型的には天然存在であるもの）が除去され、そして１以上の新規Ｎ連結部位が生成されている、前記変異体もまた提供する。ＩＦＮγシステイン変異体は、天然ＩＦＮγに比較して、より多い数の、あるいはより少ない数のシステイン残基を含む。１つの態様において、１以上のシステイン残基が欠失されるか、または別のアミノ酸（例えばセリン）で置換される。ＩＦＮγのシステイン変異体は、変性状態から単離された後、ＩＦＮγが生物学的に活性であるコンホメーションに再フォールディングするのを補助することによって、生物学的に活性であるＩＦＮγの回収を改善することも可能である。
【００８３】
ＩＦＮγポリペプチド変異体の調製は、当該技術分野の技術レベル内である。１つのアプローチにおいて、天然ＩＦＮγに１以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を導入することも可能であり、ここでＩＦＮγ変異体は、ＩＦＮγの天然構造および／または少なくとも１つの生物学的活性を保持する。１つのアプローチは、比較的低いそして高い同一性および／または類似性の領域を同定するため、多様な異なる種由来のＩＦＮγポリペプチドの配列を比較することである。比較的低い同一性および／または類似性を有するＩＦＮγポリペプチドの領域は、構造および活性に必須である可能性はより低く、そしてしたがって、アミノ酸改変、特に非保存性である改変に、より耐性でありうると認識される。比較的保存される領域であっても、活性を保持しつつ、保存的アミノ酸置換を導入可能であることもまた認識される。
【００８４】
別のアプローチにおいて、構造−機能関連性を用いて、類似のポリペプチドにおいて、活性または構造に重要な残基を同定することも可能である。例えば、ＩＦＮγ、および構造−機能解析が利用可能な腫瘍壊死因子ファミリーの他のメンバーの間で保存されるアミノ酸残基を比較し、そしてこうした比較に基づいて、ＩＦＮγ中のどのアミノ酸残基が活性または構造に重要であるかを予測することも可能である。当業者は、こうして予測されたＩＦＮγの重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することも可能である。
【００８５】
さらに別のアプローチにおいて、ＩＦＮγの二次構造または三次構造（ＩＦＮγ結晶のＸ線回折によって、または構造予測法によって決定されるものいずれか）の解析を行って、ＩＦＮγポリペプチド内の実際の構造または予測される構造に関して、特定のアミノ酸残基の位置を決定することも可能である。この情報を用いて、ＩＦＮγポリペプチドの二次構造および／または三次構造をできるだけ多く保持することを模索する方式で、アミノ酸変化を導入することも可能である。さらに別のアプローチにおいて、アミノ酸置換を導入し、そして本明細書に記載するアッセイを用いて、生物学的活性に関して、改変されたＩＦＮγポリペプチドを試験することによって、特定の位でアミノ酸を改変する影響を実験的に試験することも可能である。
【００８６】
アラニン・スキャニング突然変異誘発などの技術（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、上記）が、このアプローチに特によく適している。ＩＦＮγ中の多様なアミノ酸位で、多くの置換を導入し、そしてファージ・ディスプレー・ライブラリーの一部として、改変されたポリペプチド集団をスクリーニングすることによって、多くの改変された配列を好適に試験することも可能である。このアプローチを用いて、活性に必須のＩＦＮγポリペプチドの領域を容易に決定することも可能である。
【００８７】
上記方法は、天然構造を保持するＩＦＮγ変異体を生成するのに有用である。したがって、各変異体に対して作成された抗体は、ＩＦＮγの天然構造決定基またはエピトープを認識する可能性があり、そしてまた、天然ＩＦＮγに結合する可能性もある。しかし、いくつかの場合、天然ＩＦＮγ構造を保持しないか、あるいは部分的にまたは完全に空白である（ｕｎｆｉｌｌｅｄ）ＩＦＮγ変異体を産生することが望ましい可能性もある。こうしたタンパク質に対して作成された抗体は、ＩＦＮγ上の覆い隠されたエピトープを認識するであろう。
【００８８】
本発明はまた、異種ペプチドまたはタンパク質に融合された、ＩＦＮγポリペプチド、並びにその断片、変異体、および誘導体を含む、ＩＦＮγ融合ポリペプチドも提供する。異種ペプチドおよびタンパク質には、限定されるわけではないが：ＩＦＮγ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質またはその部分、例えば細胞外ドメイン、または膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその部分；触媒として活性である酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するタンパク質またはペプチド、例えばロイシンジッパードメイン；および安定性を増加させるタンパク質またはペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域が含まれる。
【００８９】
ＩＦＮγポリペプチドをそれ自体、あるいはその断片、変異体、または誘導体と融合させることも可能である。融合は、ＩＦＮγポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端いずれで行うことも可能であるし、そしてリンカー分子またはアダプター分子を伴わずに直接であることも、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を介したものであることも可能である。また、リンカー分子またはアダプター分子を、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼの切断部位を含んで設計して、融合部分の分離を可能にすることも可能である。本発明のさらなる態様において、ＩＦＮγポリペプチド、断片、変異体および／または誘導体をヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合させる。１つの例において、当業者に知られる方法を用いて、ＩＦＮγポリペプチドのＮ末端またはＣ末端いずれかに、ヒトＩｇＧヒンジ、ｃｈ２およびｃｈ３領域を融合させることも可能である。別の例において、ヒンジ領域、並びにｃｈ２およびｃｈ３領域の部分を融合させることも可能である。タンパク質アフィニティーカラムを使用することによって、こうして産生したＩＦＮγ・Ｆｃ融合ポリペプチドを精製することも可能である。さらに、Ｆｃ領域に融合させたペプチドおよびタンパク質は、融合させていない対応物よりも、実質的により長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示すことも見出されてきている。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化も可能にする。Ｆｃ領域は、天然存在Ｆｃ領域であることも可能であるし、また療法特質や循環時間などの特定の特質を改善し、凝集を減少させるように改変することなども可能である。
【００９０】
ＩＦＮγポリペプチド誘導体は、本発明の範囲内に含まれる。こうした誘導体は、ＩＦＮγポリペプチドがポリマーに連結された、化学的に修飾されたＩＦＮγポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは、付着するタンパク質が、生理学的環境などの水性環境において沈殿しないように、典型的には、水溶性である。ポリマーは、いかなる分子量のものであることも可能であるし、そして分枝していてもまたは分枝していなくてもよい。ＩＦＮγポリペプチドポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマー混合物である。好ましくは、最終産物調製物を療法的に使用するため、ポリマーは薬学的に許容しうるものであろう。
【００９１】
水溶性ポリマーまたはその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤの低分子量デキストランなど）、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール・ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）およびポリビニルアルコールであることも可能である。
【００９２】
好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。本明細書において、ポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するのに用いられてきたＰＥＧのいかなる型も、例えばモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールも含むよう意図される。本発明にやはり含まれるのは、共有結合ＩＦＮγ多量体を調製するのに使用可能な二官能性ＰＥＧ架橋分子である。
【００９３】
化学的に誘導体化されたＩＦＮγポリペプチドを調製する方法が当該技術分野に知られる。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓら，  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ  ０  １５４  ３１６；およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４に記載される方法を用いて、ＰＥＧでのＩＦＮγポリペプチドの誘導体化を行うことも可能である。好ましい態様において、ＩＦＮγポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のＰＥＧ部分を有するであろう；本明細書に援用される米国特許第５，９８５，２６５号を参照されたい。
【００９４】
本明細書に開示するＩＦＮγポリペプチド誘導体は、非修飾ポリペプチドに比較して、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性の増進または減少を示すことも可能であるし、あるいは増加したまたは減少した半減期または安定性を示すことも可能である。
【００９５】
ＩＦＮγ選択的結合剤
ＩＦＮγポリペプチド、およびその断片、変異体および誘導体を用いて、ＩＦＮγの選択的結合剤を同定することも可能である。上に定義するように、ＩＦＮγの選択的結合剤は、タンパク質性結合剤および非タンパク質性結合剤を両方含み、そして本発明の１つの好ましい態様において、選択的結合剤はタンパク質性である。さらに別の好ましい態様において、選択的結合剤は、ＩＦＮγ、好ましくはヒトＩＦＮγに結合する抗体またはその断片である。本発明の抗体は、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性のレベルを増進するアゴニスト抗体；またはＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性のレベルを減少させるアンタゴニスト抗体であることも可能である。ＩＦＮγのアンタゴニスト抗体を、ＩＦＮγの阻害性抗体または中和抗体と呼ぶこともまた可能である。こうした抗体は本発明の好ましい態様であるが、ＩＦＮγ活性のアゴニストまたはアンタゴニストである他のタンパク質性選択的結合剤もまた、本発明に含まれることが理解される。
【００９６】
以下の実施例に記載するように、ＩＦＮγの少なくとも１つの活性を阻害する抗ＩＦＮγ抗体および抗原結合ドメインが同定されてきている。本発明の態様には、図３〜１３のいずれかに示すような重鎖Ｆａｂ配列を含み、そしてカッパ軽鎖配列またはラムダ軽鎖配列をさらに含む抗体が含まれる。軽鎖Ｆａｂ配列は、図１４〜２４に示すとおりであってもよい。例えば、「ＢＳ−Ａ」抗体は、それぞれ、図１４および図３の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＢＳ−Ｂ」抗体は、それぞれ、図１５および図４の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＲＤ−Ｂ１」抗体は、それぞれ、図１６および図５の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＲＤ−Ａ２」抗体は、それぞれ、図１７および図６の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「５８Ｃ」抗体は、それぞれ、図１８および図７の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＧＰ−Ａ」抗体は、それぞれ、図１９および図８の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「５７Ｄ」抗体は、それぞれ、図２０および図９の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「５７Ｅ」抗体は、それぞれ、図２１および図１０の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「ＩＦＮ−Ａ」抗体は、それぞれ、図２２および図１１の軽鎖配列および重鎖配列を有し；「６７Ｃ」抗体は、それぞれ、図２３および図１２の軽鎖配列および重鎖配列を有し；そして「５９−Ａ２」抗体は、それぞれ、図２４および図１３の軽鎖配列および重鎖配列を有する。本発明の抗体は、アイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤいずれか由来のヒトＦｃ領域をさらに含む。好ましくは、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来である。
【００９７】
本発明はまた、本明細書に開示するＦａｂ配列の断片、変異体、または誘導体を含む抗体または抗原結合ドメインも提供する。断片には、軽鎖または重鎖のＦａｂ配列いずれかの可変ドメインが含まれ、これらは、典型的には軽鎖または重鎖の定常ドメインに連結されている。変異体には、図１４〜２４のいずれか１つのＦａｂ配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一または類似である軽鎖Ｆａｂ配列、または対応する可変ドメインを含む抗体、あるいは図３〜１３のいずれか１つのＦａｂ配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一または類似である重鎖Ｆａｂ配列、または対応する可変ドメインを含む抗体が含まれる。抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖の定常領域と会合して、全長抗体を形成することも可能である。
【００９８】
本発明の抗体および抗原結合ドメイン、並びにその断片、変異体および誘導体は、ＩＦＮγポリペプチド、好ましくはヒトＩＦＮγポリペプチドに選択的に結合する能力を保持するであろう。１つの態様において、抗体は、約１ｎＭ以下、あるいは０．１ｎＭ以下、あるいは１０ｐＭ以下、あるいは１０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でＩＦＮγポリペプチドに結合するであろう。
【００９９】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、単一特異性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体および／または二重特異性抗体が含まれる。抗体断片には、ＩＦＮγポリペプチド上のエピトープに結合する抗ＩＦＮγ抗体の部分が含まれる。こうした断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、およびｓＦｖ断片が含まれる。抗体は、全長抗体の酵素切断によって、または組換えＤＮＡ技術によって、例えば抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現などによって、生成可能である。
【０１００】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。抗原は、抗体に結合されることが可能であり、さらに、動物が、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生するよう誘導可能である、分子または分子の部分である。抗原は、１以上のエピトープを有することも可能である。上述の特異的反応は、抗原が、非常に選択的な方式で、対応する抗体と反応し、そして他の抗原に誘発されうる多数の他の抗体とは反応しないであろうことを示すよう意味する。
【０１０１】
ＩＦＮγポリペプチドに対して向けられるポリクローナル抗体は、一般的に、ＩＦＮγおよびアジュバントの多数回の皮下注射または腹腔内注射によって、動物（例えばウサギまたはマウス）において作成される。本発明にしたがって、ＩＦＮγポリペプチド、あるいはその変異体、断片、または誘導体を、免疫しようとする種において免疫原性であるキャリアータンパク質、例えばキーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシ・チログロブリン、またはダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）・トリプシン阻害剤にコンジュゲート化することが有用である可能性もある。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて、免疫応答を増進する。免疫後、動物から出血させ、そして抗ＩＦＮγ抗体力価に関して、血清をアッセイする。
【０１０２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含有し、この集団は、実質的に類似のエピトープ結合部位を含有する。こうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスいずれかを含む、免疫グロブリンクラスいずれのものであることも可能である。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養することも可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕでの高力価の産生が好ましい産生法である。ＩＦＮγに対して向けられるモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する方法いずれかを用いて産生される。モノクローナル抗体を調製するのに適した方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、並びにヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，．  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  ，  ニューヨーク，  １９８７）；並びにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）が含まれ；これら参考文献の内容は、本明細書に完全に援用される。
【０１０３】
好ましい抗ＩＦＮγ選択的結合剤には、ヒトＩＦＮγのその同族受容体、ｈＩＦＮγ−Ｒへの結合を、部分的にまたは完全に阻害するであろうモノクローナル抗体、あるいは実質的に同一の特異的結合特性を有する抗体とともに、その断片および領域が含まれる。競合的阻害によって、モノクローナル抗体特異性および親和性を決定するのに好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら監修，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  （１９９２，  １９９３）；およびＭｕｌｌｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ９２：５８９−６０１（１９８３）に見出されることも可能である。これらの参考文献は、本明細書に援用される。本発明にやはり提供するのは、ＩＦＮγポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。
【０１０４】
キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えばネズミ・モノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものがある。キメラ抗体は、主に、適用中の免疫原性を減少させ、そして産生中の収率を増加させるように用いられ、例えば、ネズミ・モノクローナル抗体が、ハイブリドーマからはより高い収率で得られるが、ヒトにおいてより免疫原性である場合、ヒト／ネズミ・キメラモノクローナル抗体を用いる。
【０１０５】
キメラ抗体およびその産生法が当該技術分野に知られる。Ｃａｂｉｌｌｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｌｉｕら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；並びにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）。これらの参考文献は、本明細書に援用される。
【０１０６】
例えば、本発明のキメラモノクローナル抗体を療法剤として用いることも可能である。こうしたキメラ抗体では、望ましい生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、または１つの特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（単数または複数）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体とともにこうした抗体の断片の対応する配列と同一であるかまたは相同である；例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。
【０１０７】
本明細書において、用語「キメラ抗体」には、一価、二価または多価免疫グロブリンが含まれる。一価キメラ抗体は、キメラＬ鎖とのジスルフィド架橋を通じて会合するキメラＨ鎖によって形成される二量体（ＨＬ）である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を通じて会合する２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価キメラ抗体もまた、例えば凝集するＣＨ領域（例えばＩｇＭ  Ｈ鎖、またはμ鎖由来のもの）を使用することによって産生可能である。
【０１０８】
本発明のネズミ抗体およびキメラ抗体、断片および領域は、個々の重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）免疫グロブリン鎖を含むことも可能である。キメラＨ鎖は、ＩＦＮγに特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の抗原結合領域を含み、これがヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の少なくとも部分、例えばＣＨ１またはＣＨ２に連結される。
【０１０９】
本発明記載のキメラＬ鎖は、ヒトＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）の少なくとも部分に連結された、ＩＦＮγに特異的な非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結合領域を含む。
既知の方法工程にしたがって、個々のポリペプチド鎖を適切に会合させることによって、選択的結合剤、例えば同一のまたは異なる可変領域結合特異性を持つキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する抗体、断片、または誘導体もまた調製可能である；例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら監修  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク（１９９３）およびＨａｒｌｏｗら，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。これらの参考文献の内容は、本明細書に完全に援用される。このアプローチを用いて、キメラＨ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主を、キメラＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主と別個に培養し、そして免疫グロブリン鎖を別個に回収して、そして次いで会合させる。あるいは、宿主を同時培養して、そして鎖を培地中で自発的に会合可能にし、その後、組み立てられた免疫グロブリン、断片または誘導体を回収することも可能である。
【０１１０】
例として、本発明の選択的結合剤（例えばキメラ抗体）の抗原結合領域は、好ましくは、ヒトＩＦＮγに特異的な非ヒト抗体由来である。こうした非ヒト抗体をコードするＤＮＡの好ましい供給源には、抗体を産生する細胞株、例えば一般的にハイブリドーマとして知られるハイブリッド細胞株が含まれる。
【０１１１】
本発明はまた、抗ＩＦＮγ抗体の断片、変異体および誘導体も提供し、ここで用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「融合体」は、本明細書に定義される。本発明は、非修飾抗ＩＦＮγ抗体に機能的に類似である、すなわち非修飾抗体の活性を少なくとも１つ保持する、抗ＩＦＮγ抗体の断片、変異体、誘導体、および融合体を含む。上述の修飾に加えて、植物毒素および細菌毒素などの細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加も含まれる。抗ＩＦＮγ抗体の断片、変異体、誘導体および融合体を、本発明の宿主のいずれから産生することも可能である。
【０１１２】
適切な断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖが含まれる。これらの断片は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に一掃され、そして損なわれていない抗体よりも非特異性組織結合がより少なくなりうる；Ｗａｈｌら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，  ２４：３１６−３２５（１９８３）。これらの断片は、当該技術分野に周知の方法を用いて、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する）などの酵素でのタンパク質分解切断によって、損なわれていない抗体から産生される。これらの抗原結合領域および／または本発明のモノクローナル抗体に認識されるエピトープを同定すると、本出願の態様と同等である、類似の結合特性および療法的有用性または診断有用性を持つさらなるモノクローナル抗体を生成するのに必要な情報が提供される。
【０１１３】
選択的結合剤の変異体もまた提供する。１つの態様において、抗体および抗原結合ドメインの変異体は、軽鎖および／または重鎖アミノ酸配列中に変化を含み、これらの変化は天然存在であるか、または組換えＤＮＡ技術を用いた天然配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作によって導入されている。天然存在変異体には、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原に対する抗体応答の生成中、対応する生殖系列ヌクレオチド配列において、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成される「体細胞」変異体が含まれる。配列において、本発明の典型的なＦａｂを生成する、生殖系列可変軽鎖および重鎖配列中の体細胞突然変異にコードされる変異体は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」に関しては図３３および図４１に、Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」に関しては図３４および図４１に、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」に関しては図３５および図４２に、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」に関しては図３５および図４２に、Ｆａｂ「ＲＤ−Ａ２」に関しては図３３および図４３に、Ｆａｂ「５８Ｃ」に関しては図３６および図４４に、Ｆａｂ「ＧＰ−Ａ」に関しては図３７および図４５に、Ｆａｂ「５７Ｄ」に関しては図３８および図４６に、Ｆａｂ「５７Ｅ」に関しては図３９および図４１に、Ｆａｂ「ＩＦＮ−Ａ」に関しては図３３および図４３に、Ｆａｂ「６７Ｃ」に関しては図４０および図４３に、そしてＦａｂ「５９−Ａ２」に関しては図３４および図４１に示される。
【０１１４】
抗ＩＦＮγ抗体および抗原結合ドメインの変異体はまた、当該技術分野に知られる突然変異誘発技術によっても調製可能である。１つの例において、抗体コード領域全体で、無作為にアミノ酸変化を導入することも可能であり、そして望ましい活性、例えばＩＦＮγに対する結合親和性に関して、生じた変異体をスクリーニングすることも可能である。あるいは、ＩＦＮγ抗体の選択される領域に、例えば軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ、およびフレームワーク領域に、アミノ酸変化を導入することも可能であり、そしてＩＦＮγへの結合または他の何らかの活性に関して、生じた抗体をスクリーニングすることも可能である。アミノ酸変化は、単一アミノ酸相違から、既定のＣＤＲ、例えばＣＤＲ３内のアミノ酸のありうるすべての順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の範囲で、ＣＤＲ中に１以上のアミノ酸置換を含む。別の方法において、ＣＤＲ内の少なくとも１つの残基をアラニンで置換することによって、ＣＤＲ内の各残基のＩＦＮγ結合への寄与を評価することも可能である；Ｌｅｗｉｓら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３２：１０６５−１０７２（１９９５）。次いで、より最適な配列を決定するため、ＩＦＮγへの結合に最適でない残基を変化させることも可能である。アミノ酸を挿入して、ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３のサイズを増加させることによって生成される変異体もまた、含まれる。例えば、大部分の軽鎖ＣＤＲ３配列は、長さ９アミノ酸である。９残基より短い、抗体中の軽鎖ＣＤＲ３配列は、適切なアミノ酸を挿入して、ＣＤＲの長さを増加させることによって、ＩＦＮγへの結合に関して最適化されることも可能である。
【０１１５】
１つの態様において、抗体または抗原結合ドメイン変異体は、１以上の重鎖または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３に、そして所望によって１以上の重鎖または軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２またはＦＲ３に、１以上のアミノ酸変化を含む。アミノ酸変化は、アミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入を含む。典型的な変異体には、配列ＧＹＹＷＳ（配列番号３４）；ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４４）；またはＧＲＡＲＮＷＲＳＲＦＤＹ（配列番号５４）に１以上のアミノ酸変化を持つ「ＢＳ−Ａ」重鎖可変領域変異体、あるいは配列ＴＧＳＳＧＳＩＡＳＨＹＶＱ（配列番号０１）；ＥＤＫＥＲＰＳ（配列番号１２）；またはＱＳＹＤＳＳＮＱＷＶ（配列番号２３）に１以上のアミノ酸変化を持つ「ＢＳ−Ａ」軽鎖可変領域変異体が含まれる。前述の「ＢＳ−Ａ」重鎖および軽鎖可変領域変異体は、フレームワーク領域に１以上のアミノ酸変化をさらに含むことも可能である。
【０１１６】
１つの例において、１以上のアミノ酸変化を導入して、体細胞突然変異フレームワーク残基を、その位の生殖系列残基で置換することも可能である。前述のアミノ酸変化が置換である場合、変化は保存的置換でもまた非保存的置換でもよい。変異体を、軽鎖または重鎖いずれかの「鎖シャフリング」によって調製することもまた可能である；Ｍａｒｋｓら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：７７９−７８３（１９９２）。典型的には、単一の軽鎖（または重鎖）を、重鎖（または軽鎖）のレパートリーを有するライブラリーと組み合わせて、そして生じた集団を、ＩＦＮγへの結合などの望ましい活性に関してスクリーニングする。この技術は、重鎖および軽鎖両方のレパートリーを含むライブラリーで可能であるよりも、単一の軽鎖（または重鎖）と組み合わされた異なる重鎖（または軽鎖）のより多数の試料をスクリーニングすることを可能にする。
【０１１７】
本発明の選択的結合剤は、二重特異性であることも可能である。本発明の二重特異性選択的結合剤は、いくつかの立体配置のものであることも可能である。例えば、二重特異性抗体は、一本鎖抗体（または抗体断片）に似ているが、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を有する。二重特異性抗体は、化学的技術によって；例えば、Ｋｒａｎｚら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７８：５８０７（１９８１）を参照されたい；「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」技術によって；米国特許第４，４７４，８９３号；または組換えＤＮＡ技術によって、産生可能である。
【０１１８】
本発明の選択的結合剤はまた、異種抗体であることも可能である。異種抗体は、ともに連結された、各々異なる特異性を有する、２以上の抗体、または抗体結合断片（Ｆａｂ）である。
【０１１９】
本発明はまた、「ヒト化」抗体にも関する。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野に周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト抗体に導入された１以上のアミノ酸残基を有する。一般的に、非ヒト残基は、ＣＤＲに存在するであろう。ヒト化は、当該技術分野に知られる方法にしたがって、げっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域に対して置換することによって、実行可能である；Ｊｏｎｅｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）。
【０１２０】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体を含む、本発明の選択的結合剤は、当該技術分野に知られる組換え法によっても産生可能である。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、そして本明細書に記載し、そして当該技術分野に知られる、材料および方法を用いて発現させる。好ましい態様において、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、抗体を産生する。宿主細胞にトランスフェクションした組換えＤＮＡの発現によって、または上述のようなハイブリドーマ細胞における発現によって、完全ヒト抗体を産生することも可能である。
【０１２１】
モノクローナル抗体の生成を回避して、抗体分子の抗原結合領域の組換えＤＮＡ型を生成する技術が本発明の実施内に含まれる。これを行うため、免疫動物から採取した免疫系細胞から、抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を抽出し、そして相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写する。次いで、ｃＤＮＡを細菌発現系にクローニングする。本発明を実施するのに適した技術の一例は、発現されたＦａｂタンパク質を細胞膜周辺腔（細菌細胞膜および細胞壁の間）に移動させるか、または分泌させる、リーダー配列を有する、繊維状バクテリオファージＭ１３由来ファージミド・ベクター系を用いる。抗原に結合するものに関して、非常に多数の機能するＦａｂ断片を迅速に生成し、そしてスクリーニングすることも可能である。こうしたＩＦＮγ選択的結合剤（ＩＦＮγポリペプチドに対して特異性を持つＦａｂ断片）は、本明細書に定義され、議論され、そして請求される際、用語「抗体」に明確に含まれる。
【０１２２】
やはり本発明の範囲内にあるのは、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性、例えばヒト補体を活性化し、そしてＡＤＣＣを仲介する能力を持つヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによって、キメラ抗体を産生するために開発された技術である；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８１：６８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１２：６０４（１９８４）。１つの例は、Ｆｃ領域の、異なるアイソタイプのＦｃ領域との交換である。この技術によって産生される抗体などの選択的結合剤は、本発明の範囲内である。
【０１２３】
本発明の好ましい態様において、抗ＩＦＮγ抗体は、完全ヒト抗体である。したがって、ＩＦＮγポリペプチドに結合し、そしてヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列、並びにその断片、合成変異体、誘導体および融合体の天然存在体細胞変異体である核酸配列にコードされる抗体が本発明に含まれる。こうした抗体は、当該技術分野に知られる方法いずれによって産生してもよい。典型的な方法には、内因性免疫グロブリン産生を伴わずに、ヒト抗体レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を、ＩＦＮγ抗原（免疫応答を誘発することが可能であり、そして所望によってキャリアーにコンジュゲート化されているＩＦＮγポリペプチドいずれか）で免疫することが含まれる；例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７：３３（１９９３）を参照されたい。
【０１２４】
あるいは、ファージ・ディスプレー抗体ライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを通じて、ヒト抗体を生成することも可能である；例えば、本明細書に援用される、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１（１９９１)を参照されたい。多様な抗体含有ファージ・ディスプレー・ライブラリーが記載されており、そして当業者によって容易に調製可能である。ライブラリーは、適切な標的に対してスクリーニング可能な、多様なヒト抗体配列、例えばヒトＦａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片を含有することも可能である。実施例２は、ＩＦＮγに選択的に結合する分子を同定するための、ＩＦＮγに対するＦａｂファージ・ライブラリーのスクリーニングを記載する。ファージ・ディスプレー・ライブラリーが、ＩＦＮγの選択的結合剤を同定するためにスクリーニングすることが可能な抗体以外のペプチドまたはタンパク質を含んでもよいことが認識されるであろう。
【０１２５】
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、一般的に抗体の抗原結合部位と会合するユニークな決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄを調製しようとするモノクローナル抗体で、該モノクローナル抗体の供給源と同一種および同一遺伝子型（例えばマウス系統）の動物を免疫することによって、調製可能である。免疫された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そして応答するであろう；例えば本明細書に完全に援用される米国特許第４，６９９，８８０号を参照されたい。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する、「免疫原」としても使用可能である。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元来のモノクローナル抗体と、エピトープが同一であることも可能である。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【０１２６】
ＩＦＮγの選択的結合剤の産生
調製しようとするＩＦＮγの選択的結合剤が、タンパク質性選択的結合剤、例えば抗体または抗原結合ドメインである場合、前記剤を産生するため、多様な生物学的方法または化学的方法が利用可能である。
【０１２７】
療法使用のために十分な量の選択的結合剤を産生するには、生物学的方法が好ましい。本発明の抗体および抗原結合ドメインの産生には、標準的組換えＤＮＡ技術が特に有用である。発現産物の回収のための典型的な発現ベクター、宿主細胞および方法を以下に記載する。
【０１２８】
標準的連結技術を用いて、ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子を適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、典型的には、使用する特定の宿主細胞で機能するように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こりうるように、宿主細胞機構と適合する）。抗ＩＦＮγ抗体をコードする核酸分子を、原核宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞で増幅／発現することも可能である。宿主細胞の選択は、部分的に、抗ＩＦＮγ抗体を翻訳後に（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾（例えばグリコシル化および／またはリン酸化）しようとしているかどうかに応じるであろう。修飾するのであれば、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの概説に関しては、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  Ｖ．  １８５，  Ｄ．Ｖ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ監修  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）を参照されたい。
【０１２９】
典型的には、いかなる宿主細胞で用いられる発現ベクターも、以下の構成要素の１以上を含有するであろう：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプターのスプライス部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとするポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素。これらの配列は各々、以下により詳細に論じられる。
【０１３０】
ベクター構成要素は、相同配列（すなわち宿主細胞と同一種および／または同一系統由来）、異種配列（すなわち宿主細胞種以外の種または系統由来）、ハイブリッド（すなわち１より多い供給源由来の異なる配列の組み合わせ）、合成配列、または通常、免疫グロブリン発現を制御するように機能する天然配列であることも可能である。こうしたものとして、ベクター構成要素の供給源は、宿主細胞機構において機能し、そして該機構によって活性化可能である限り、いかなる原核生物または真核生物、いかなる脊椎動物または無脊椎動物、またはいかなる植物であることも可能である。
【０１３１】
複製起点は、発現に用いられる宿主細胞の種類に基づいて選択される。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、一方、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはパピローマウイルス（ＨＰＶまたはＢＰＶなど）由来の多様な起点は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点構成要素は哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点がしばしば用いられるが、これはただ初期プロモーターを含有するからである）。
【０１３２】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の３’端に位置し、そして転写を終結させるように働く。通常、原核細胞中の転写終結配列には、Ｇ−Ｃリッチ断片に続いてポリＴ配列がある。配列を、ライブラリーから容易にクローニングするか、またはベクターの一部として商業的に購入してもよいが、上述のものなどの核酸合成法を用いて、容易に合成することも可能である。
【０１３３】
選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば原核宿主細胞ではアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求不全を補足するタンパク質；または（ｃ）複合培地から入手可能でない非常に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。原核宿主細胞および真核宿主細胞において、ネオマイシン耐性遺伝子もまた使用可能である。
【０１３４】
他の選択遺伝子を用いて、発現しようとする遺伝子を増幅することも可能である。増幅は、増殖に決定的に重要なタンパク質の産生に対する要求がより高い遺伝子が、組換え細胞の代々の世代の染色体内で、タンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、ベクターに存在するマーカーのため、形質転換体のみがユニークに適応して生存する選択圧下に置く。培地中の選択剤の濃度を連続的に変化させて、それによって選択遺伝子および抗ＩＦＮγ抗体をコードするＤＮＡ両方の増幅が導かれる条件下で、形質転換細胞を培養することによって、選択圧を課す。その結果、増幅されたＤＮＡから、増加した量の抗体が合成される。
【０１３５】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。これら要素は、典型的には、発現しようとするポリペプチドのプロモーターの３’で、そしてコード配列の５’に位置する。シャイン・ダルガノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン・ダルガノ配列が同定されてきており、各々、上述の方法を用いて、容易に合成可能であり、そして原核ベクターで使用可能である。
【０１３６】
リーダー配列またはシグナル配列は、ポリペプチドの分泌を指示するのに用いられる。シグナル配列はポリペプチドコード領域内にまたはその５’端に直接配置されることも可能である。多くのシグナル配列が同定されてきており、そして発現に用いる宿主細胞に基づいて選択可能である。本発明において、シグナル配列は、抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸配列に相同である（天然存在である）か、またはこれら配列に対して異種であることも可能である。選択される異種シグナル配列は、シグナルペプチダーゼにより、宿主細胞によって、認識され、そしてプロセシングされる、すなわち切断されるものであるべきである。天然免疫グロブリンシグナル配列を認識せず、そしてプロセシングしない原核宿主細胞では、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性内毒素ＩＩのリーダーの群から選択される原核シグナル配列によって置換する。酵母分泌のため、天然免疫グロブリンシグナル配列を、酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸ホスファターゼのリーダーによって置換することも可能である。哺乳動物細胞発現では、天然シグナル配列で十分だが、他の哺乳動物シグナル配列が適切である可能性もある。
【０１３７】
大部分の場合、宿主細胞から抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインが分泌される結果、抗体からシグナルペプチドが除去されるであろう。したがって、成熟抗体は、いかなるリーダー配列またはシグナル配列も欠くであろう。
【０１３８】
真核宿主細胞発現系におけるグリコシル化が望ましいなどのいくつかの場合、グリコシル化または収率を改善するため、多様なプレ配列を操作することも可能である。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変することも可能であるし、またはグリコシル化に影響を及ぼすことも可能なプロ配列を付加することも可能である。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に比較して）に、完全には除去されなかった可能性もある、発現によって生じる１以上のさらなるアミノ酸を有することも可能である。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に付着して、ペプチダーゼ切断部位に見られる１つまたは２つのアミノ酸を有することも可能である。あるいは、いくつかの酵素切断部位を用いることによって、望ましいＩＦＮγポリペプチドのわずかに一部切除された型を生じることも可能であり、これは酵素が成熟ポリペプチド内のこうした領域を切断する場合である。
【０１３９】
本発明の発現ベクターは、典型的には、宿主生物に認識され、そして抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子に機能可能であるように連結されているプロモーターを含有するであろう。発現に用いる宿主細胞および望ましいタンパク質収率に応じて、天然プロモーターまたは異種プロモーターを使用することも可能である。
【０１４０】
原核宿主で用いるのに適したプロモーターには、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。他の既知の細菌プロモーターもまた、適している。これらの配列は公表されており、それによって、当業者が、必要に応じて、必要な制限部位いずれかを供給するリンカーまたはアダプターを用いて、これらプロモーターを望ましいＤＮＡ配列（単数または複数）に連結することが可能になる。
【０１４１】
酵母宿主で用いるのに適したプロモーターもまた、当該技術分野に周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに、好適に用いられる。哺乳動物宿主細胞で用いるのに適したプロモーターが周知であり、そしてポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ・パピローマウイルス、鳥・肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサル・ウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチン・プロモーターが含まれる。
【０１４２】
本発明の選択的結合剤を発現するのに使用可能なさらなるプロモーターには、限定されるわけではないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域；ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０：３０４−３１０（１９８１）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に含有されるプロモーター；Ｙａｍａｍｏｔｏら，  Ｃｅｌｌ，  ２２：７８７−７９７（１９８０）、ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター；Ｗａｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７８：１４４−１４４５（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９６：３９−４２（１９８２）、ベータ−ラクタマーゼ・プロモーターなどの原核生物発現ベクター；Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７５：３７２７−３７３１（１９７８）、またはｔａｃプロモーター；ＤｅＢｏｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８０：２１−２５（１９８３）が含まれる。
【０１４３】
やはり重要なのは、組織特異性を有し、そしてトランスジェニック動物において利用されてきている、以下の動物転写調節領域である：膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域；Ｓｗｉｆｔら，  Ｃｅｌｌ，  ３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ７：４２５−５１５（１９８７）、膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子調節領域；Ｈａｎａｈａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１５：１１５−１２２（１９８５）、リンパ球で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域；Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，  Ｃｅｌｌ，  ３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：１４３６−１４４４（１９８７）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ球およびマスト細胞で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域；Ｌｅｄｅｒら，  Ｃｅｌｌ，  ４５：４８５−４９５（１９８６）、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子調節領域；Ｐｉｎｋｅｒｔら，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，  １：２６８−２７６（１９８７）、肝臓で活性であるアルファ・フェトプロテイン遺伝子調節領域；Ｋｒｕｍｌａｕｆら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３５：５３−５８（１９８７）、肝臓で活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域；Ｋｅｌｓｅｙら，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，  １：１６１−１７１（１９８７）；骨髄細胞で活性であるベータ−グロビン遺伝子調節領域；Ｍｏｇｒａｍら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら，  Ｃｅｌｌ，  ４６：８９−９４（１９８６）、脳のオリゴデンドロサイトで活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域；Ｒｅａｄｈｅａｄら，  Ｃｅｌｌ，  ４８：７０３−７１２（１９８７）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域；Ｓａｎｉ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：２８３−２８６（１９８５）、および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域；Ｍａｓｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３４：１３７２−１３７８（１９８６）。
【０１４４】
エンハンサー配列をベクターに挿入して、真核宿主細胞において転写を増加させることも可能である。哺乳動物遺伝子で利用可能ないくつかのエンハンサー配列が知られる（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェト−プロテインおよびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター・エンハンサー、ポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーは、真核プロモーター活性化のための典型的な増進要素である。エンハンサーは、ポリペプチドコード領域の５’または３’の位で、ベクターにスプライシングすることも可能であるが、典型的には、プロモーターの５’の部位に位置する。
【０１４５】
本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合するものである。こうしたベクターには、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラホヤ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＲ公報第ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）が含まれる。
【０１４６】
さらなる可能なベクターには、限定されるわけではないが、コスミド、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるが、ベクター系は、選択した宿主細胞に適合しなければならない。こうしたベクターには、限定されるわけではないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（ＣｏｌＥ１に基づく高コピー数ファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホヤ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯＴＭ  ＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、および哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）が含まれる。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、または他の既知の技術を介して、宿主細胞に導入可能である。
【０１４７】
本発明の宿主細胞は、原核宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ））または真核宿主細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であることも可能である。宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、本発明の抗体または抗原結合ドメインを発現し、これを続いて培地から収集する（宿主細胞がこれらを培地に分泌する場合）か、またはこれらを産生する宿主細胞から直接収集する（これらが分泌されない場合）ことも可能である。適切な宿主細胞の選択は、望ましい発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化、および生物学的活性分子にフォールディングするのが容易であることなどの多様な要因に応じるであろう。
【０１４８】
いくつかの適切な宿主細胞が当該技術分野に知られ、そして多くがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能である。例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞；Ｕｒｌａｕｂら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７：４２１６−４２２０（１９８０）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）などの哺乳動物細胞が含まれる。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、並びに産物産生および産物精製に適した哺乳動物宿主細胞および方法の選択は当該技術分野に知られる。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらなる典型的な哺乳動物宿主細胞には、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が含まれ、形質転換細胞株が含まれる。正常な二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から得られる細胞株とともに、初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子の遺伝子型が不完全であることも可能であるし、また優性に作用する選択遺伝子を含有することも可能である。他の適切な哺乳動物細胞株には、限定されるわけではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓマウス、Ｂａｌｂ−ｃマウスまたはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３細胞株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が含まれ、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）から入手可能である。これら細胞株は各々、タンパク質発現の技術分野の当業者に知られ、そして入手可能である。
【０１４９】
本発明に適した宿主細胞として、同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、大腸菌の多様な株（例えばＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））は、バイオテクノロジーの分野で、宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、他のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種等の多様な株もまた、この方法で使用可能である。
【０１５０】
当業者に知られる酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として、入手可能である。好ましい酵母細胞には、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）が含まれる。
【０１５１】
さらに、望ましい場合、本発明の方法には、昆虫細胞系が利用可能である。こうした系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １４：８１０−８１７（１９９３）、Ｌｕｃｋｌｏｗ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４：５６４−５７２（１９９３）およびＬｕｃｋｌｏｗら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）である。
【０１５２】
抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子の、選択した宿主細胞への形質転換またはトランスフェクションは、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法またはＤＥＡＥデキストラン法などの方法を含む、周知の方法によって達成可能である。選択される方法は、部分的に、用いる宿主細胞の種類と相関関係にあるであろう。これらの方法および他の適切な方法が当業者に周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に示される。
【０１５３】
トランスジェニック動物を使用して、グリコシル化選択的結合剤、例えば抗体および抗原結合ドメインを発現することも可能である。例えば、ミルクを産生するトランスジェニック動物（例えばウシまたはヤギ）を用いて、そして動物のミルク中にグリコシル化された結合剤を得ることも可能である。あるいは、植物を用いて、グリコシル化された選択的結合剤を産生することも可能である。
【０１５４】
当業者に周知の標準的培地を用いて、ＩＦＮγの選択的結合剤をコードする発現ベクターを含む（すなわち形質転換されたかまたはトランスフェクションされた）宿主細胞を培養してもよい。培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含有するであろう。大腸菌細胞を培養するのに適した培地は、例えば、ルリア・ブロス（ＬＢ）および／またはテリフィック・ブロス（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに適した培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらすべてには、培養中の特定の細胞株に必要とされるような血清および／または増殖因子を補うことも可能である。昆虫培養に適した培地は、必要に応じて、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解物、および／またはウシ胎児血清を補ったグレース培地である。
【０１５５】
典型的には、トランスフェクション細胞および形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地の補充剤として添加される。使用すべき化合物は、宿主細胞を形質転換するプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって、決定されるであろう。例えば、選択可能マーカー要素が、カナマイシン耐性である場合、培地に添加される化合物はカナマイシンであろう。選択的増殖のための他の化合物には、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが含まれる。
【０１５６】
当該技術分野に知られる標準法を用いて、宿主細胞に産生される抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインの量を評価することも可能である。こうした方法には、限定なしに、ウェスタンブロット解析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／または活性アッセイが含まれる。
【０１５７】
細胞培地に分泌されている抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインの精製は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、分取用ゲル電気泳動または等電点電気泳動、クロマトフォーカシング、および高圧液体クロマトグラフィーを含む、多様な技術を用いて、達成可能である。例えば、Ｆｃ領域に選択的に結合するプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｆｃ領域を含む抗体を好適に精製することも可能である。カルボキシル末端またはアミノ末端いずれかの、ヘキサヒスチジン、あるいはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの他の小ペプチドなどのアフィニティータグを用いて、抗体または抗原結合ドメインの修飾型を調製し、そして一工程アフィニティーカラムによって精製することも可能である。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性でニッケルに結合し、したがってニッケルのアフィニティーカラム（例えばＱｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）を、ポリヒスチジンでタグ化した選択的結合剤の精製に用いることも可能である；例えばＡｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  セクション１０．１１．８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク（１９９３）を参照されたい。いくつかの例では、１より多い精製工程が必要である可能性もある。
【０１５８】
原核宿主細胞で発現される本発明の選択的結合剤は、細胞膜周辺腔または細胞質いずれかで、可溶性型で、あるいは細胞内封入体の一部として、不溶性型で、存在することも可能である。選択的結合剤は、当業者に知られる標準的技術いずれかを用いて、宿主細胞から抽出することも可能である。例えば、フレンチプレス、ホモジナイズ、および／または超音波処理の後、遠心分離することによって、宿主細胞を溶解して、周辺質／細胞質の内容物を放出させることも可能である。
【０１５９】
当該技術分野に知られる方法を用いて、細胞質に存在するか、または細胞膜周辺腔から放出されるか、いずれかの抗ＩＦＮγ抗体または抗原結合ドメインの可溶性型をさらに精製することも可能であり、例えば浸透圧ショック技術によって、細菌細胞膜周辺腔からＦａｂ断片を放出させる。抗体または抗原結合ドメインが、封入体を形成した場合、これらはしばしば、内部細胞膜および／または外部細胞膜に結合することも可能であり、そしてしたがって、遠心分離後、主にペレット成分中に見られるであろう。次いで、ペレット成分を、アルカリｐＨではジチオスレイトールなどの還元剤の存在下で、または酸ｐＨではＴｒｉｓカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で、極端なｐＨで処理するか、あるいは界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体などのカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、粉々にし、そして可溶化することも可能である。次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて、可溶性選択的結合剤を解析することも可能である。可溶化抗体または抗原結合ドメインを単離することが望ましい場合、以下に示す方法およびＭａｒｓｔｏｎら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  １８２：２６４−２７５（１９９０）に示される方法などの標準法を用いて、単離を達成することも可能である。
【０１６０】
いくつかの場合、抗体または抗原結合ドメインは、単離の際には、生物学的に活性でなくてもよい。ポリペプチドを三次構造に「再フォールディング」するか、または変換して、そしてジスルフィド連結を生成するための、多様な方法を用いて、生物学的活性を回復することも可能である。こうした方法には、可溶化ポリペプチドを、通常７を超えるｐＨに、そして特定の濃度のカオトロープの存在下で、曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と非常に類似であるが、通常、カオトロープは、より低い濃度で用いられ、そして可溶化に用いるカオトロープと必ずしも同一ではない。大部分の場合、再フォールディング／酸化溶液はまた、還元剤を含有するか、または還元剤に加えて特定の比で酸化型を含有して、特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィド・シャフリングを可能にして、タンパク質のシステイン架橋（単数または複数）の形成を生じる。通常用いられるレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの場合、共溶媒（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔ）を用いることも可能であるし、また再フォールディングの効率を増加させるのに共溶媒が必要とされる可能性もあり、そしてこの目的に用いられる、より一般的な試薬には、グリセロール、多様な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン等が含まれる。
【０１６１】
本発明の抗体および抗原結合ドメインはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：５１３２（１９８５）、並びにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  イリノイ州ロックフォード（１９８４）に示されるものなどの当該技術分野に知られる技術を用いた化学合成法（例えば固相ペプチド合成）によっても調製可能である。こうしたポリペプチドを、アミノ末端にメチオニンを含み、または含まずに合成することも可能である。これらの参考文献に示される方法を用いて、化学的に合成された抗体および抗原結合ドメインを酸化して、ジスルフィド架橋を形成することも可能である。こうして調製された抗体は、天然のまたは組換えによって産生された抗ｏｐｇｂｐ抗体または抗原結合ドメインと関連する生物学的活性を少なくとも１つ保持するであろう。
【０１６２】
ＩＦＮγの選択的結合剤に関するアッセイ
ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性を部分的にまたは完全に阻害する選択的結合剤を同定するためのスクリーニング法を本発明に提供する。ＩＦＮγの生物学的活性の阻害には、限定されるわけではないが、ＩＦＮγのその同族受容体、ＩＦＮγ−Ｒへの結合の阻害、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡ５４９に対するＩＦＮγの抗増殖活性の阻害、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＦＮγによる単球の活性化の阻害が含まれる。本発明の選択的結合剤には、抗ＩＦＮγ抗体、並びにその断片、変異体、誘導体および融合体、ペプチド、ペプチド模倣体化合物または有機模倣体（ｏｒｇａｎｏ−ｍｉｍｅｔｉｃ）化合物が含まれる。ＩＦＮγの生物学的活性を部分的にまたは完全に阻害可能な選択的結合剤を同定するためのスクリーニング法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが含まれることも可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイには、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を検出するものが含まれ、そしてこうしたアッセイを用いて、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合の速度または度合いを増加させるかまたは減少させる能力に関して、ＩＦＮγの選択的結合剤をスクリーニングすることも可能である。１つの種類のアッセイでは、ＩＦＮγポリペプチド、好ましくは細胞外ドメインなどのＩＦＮγの可溶性型を固体支持体（例えばアガロースまたはアクリルビーズ）に固定し、そしてＩＦＮγ−Ｒポリペプチドを、ＩＦＮγの選択的結合剤の存在下または非存在下いずれかで添加する。選択的結合剤の存在下または非存在下でＩＦＮγおよびＩＦＮγ−Ｒの結合の度合いを測定する。例えば放射標識、蛍光標識または酵素反応によって、結合を検出することも可能である。
【０１６３】
あるいは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などの表面プラズモン共鳴検出装置系を用いて、結合反応を行うことも可能である。結合反応は、製造者のプロトコルにしたがって、実行可能である。
【０１６４】
上述のものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを好適に用いて、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合に対する影響に関して、迅速に多数の選択的結合剤をスクリーニングすることも可能である。アッセイを自動化して、ファージ・ディスプレー・ライブラリー、合成ペプチドライブラリーおよび化学合成ライブラリーで生成される化合物をスクリーニングすることも可能である。
【０１６５】
ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を増加させるかまたは減少させる選択的結合剤を、どちらかのポリペプチドを発現する細胞および細胞株を用いて、細胞培養中でスクリーニングすることもまた可能である。細胞および細胞株は、いかなる哺乳動物から得ることも可能であるが、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類、イヌまたはげっ歯類供給源由来であろう。例えば、選択的結合剤の存在下または非存在下で、表面にＩＦＮγ−Ｒを発現している細胞に対するＩＦＮγの結合を評価して、そして例えばＩＦＮγに対するビオチン化抗体を用いたフローサイトメトリーによって、結合の度合いを測定することも可能である。
【０１６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイを用いて、ＩＦＮγ活性を阻害する選択的結合剤を同定することもまた可能である。アッセイの例には、Ａ５４９細胞増殖アッセイおよびＴＨＰ−１  ＨＬＡ−ＤＲ発現アッセイが含まれる。
【０１６７】
選択的結合剤が、ＮＺＢｘＮＺＷ  Ｆ１マウスモデルにおいて、タンパク尿の発生を遅延させ、そして生存時間を増加させることが可能であるかどうかを決定するため、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイもまた利用可能である。
【０１６８】
診断適用のため、特定の態様において、ＩＦＮγの選択的結合剤、例えば抗体およびその抗原結合ドメインを、典型的には、検出可能部分で標識する。検出可能部分は、直接または間接的に、検出可能シグナルを産生可能なものいずれであってもよい。例えば、検出可能部分は、放射性同位体、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ、蛍光化合物または化学発光化合物、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン；あるいは酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼであってもよい；Ｂａｙｅｒら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  １８４：１３８−１６３（１９９０）。
【０１６９】
本発明の選択的結合剤は、いかなる既知のアッセイ法で使用することも可能であり、こうした方法には、例えばＩＦＮγポリペプチドを検出し、そして定量化するための、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫沈降アッセイがある（Ｓｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７））。抗体は、使用中のアッセイ法に適した親和性で、ＩＦＮγポリペプチドに結合するであろう。
【０１７０】
本発明の選択的結合剤はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化にも有用であり、ここで、例えば検出可能部分で標識した選択的結合剤を、動物の好ましくは血流中に投与し、そして宿主中の標識抗体の存在および位置をアッセイする。剤を、核磁気共鳴によってであれ、放射線によってであれ、または当該技術分野に知られる他の手段によってであれ、動物中で検出可能ないずれの部分で標識することも可能である。
【０１７１】
本発明はまた、抗体または抗原結合ドメインなどのＩＦＮγの選択的結合剤、および生物学的試料中のＩＦＮγレベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットにも関する。こうした試薬には、二次活性、検出可能標識、ブロッキング血清、陽性対照試料および陰性対照試料、および検出試薬が含まれることも可能である。
【０１７２】
ＩＦＮγ選択的結合剤の療法使用
本発明の選択的結合剤は、療法剤として使用可能である。療法選択的結合剤は、ＩＦＮγアゴニストまたはアンタゴニストであることも可能であり、そして１つの態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＩＦＮγポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを阻害する抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体である。例えば、ＩＦＮγのアンタゴニストは、ＩＦＮγのＩＦＮγ−Ｒへの結合を阻害するであろう。あるいは、ＩＦＮγアンタゴニストは、実施例１に記載するものなどのＡ５４９細胞増殖アッセイにおいて、測定可能なＮＤ５０（５０％増殖を生じる濃度）によって示されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト肺癌の増殖を刺激するであろう。
【０１７３】
ＩＦＮγアンタゴニスト、例えば抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを用いて、限定されるわけではないが、以下の：急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；ＡＩＤＳ誘導悪疫質を含む悪疫質／摂食障害；喘息および他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；慢性疲労症候群；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）関連下痢を含むクロストリジウム属関連疾病；うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連するもの）、および冠状動脈バイパス移植を含む冠状動脈状態および徴候；癌、例えば多発性骨髄腫、並びに骨髄性白血病（例えばＡＭＬおよびＣＭＬ）および他の白血病とともに腫瘍転位；発熱；糸球体腎炎；移植片対宿主病／移植拒絶；出血性ショック；例えば角膜移植に関与することもありうるような、炎症性眼疾患；脳虚血（例えば、各々神経変性につながりうる、外傷、癲癇、出血または脳卒中などの結果の脳傷害）を含む虚血；学習障害；多発性硬化症；筋障害（例えば筋タンパク質代謝、特に敗血症におけるもの）；神経毒性（例えばＨＩＶに誘導されるようなもの）；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；神経毒性；早期陣痛；乾癬；再灌流傷害；敗血症ショック；放射療法の副作用；顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；または挫傷（ｓｔｒａｉｎ）、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形手術、感染もしくは他の疾患過程から生じる炎症状態；若年発症１型糖尿病およびインスリン耐性糖尿病（例えば肥満に関連するようなもの）を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎、および関連状態；線維筋痛症または痛覚脱失症；痛覚過敏；クローン病を含む炎症性腸疾患；肺疾患（例えば成人呼吸困難症候群、および肺線維症）；神経炎症性疾患；眼変性およびブドウ膜炎を含む、眼疾患および状態；毛孔性紅色粃糠疹（ＰＲＰ）；前立腺炎（細菌性または非細菌性）および関連状態；乾癬および関連状態；肺線維症；再灌流傷害；骨関節炎、関節リウマチ、若年性（リウマチ様）関節炎、血清陰性多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）誘導（「敗血症」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎およびリウマチ性多発性筋痛および巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症状態およびリウマチ疾患；敗血症ショック；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）腎炎；放射療法による副作用；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植、または挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、および整形手術から生じる炎症状態を含む、自己免疫疾患および炎症状態を防止するかまたは治療することも可能である。
【０１７４】
より具体的には、ＩＦＮγアンタゴニスト、例えば抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを用いて、関節炎（特に関節リウマチ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、多発性硬化症および糖尿病を防止するかまたは治療することも可能である。
【０１７５】
アンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを含む、本発明のＩＦＮγアンタゴニストを、単独で、または抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインなどの他の療法剤ＩＦＮγアンタゴニストと組み合わせて投与して、これらを用いて、多様な炎症状態、自己免疫状態、および骨損失につながる他の状態を防止するかまたは治療することも可能である。状態および望ましい治療レベルに応じて、２、３、またはそれより多い剤を投与することも可能である。同一処方に含むか、または治療キットに含むことによって、これらの剤をともに提供することも可能であり、あるいは別個に提供することも可能である。遺伝子治療によって投与する際、タンパク質剤をコードする遺伝子を、所望によって同一プロモーター領域の制御下で同一ベクターに含めてもよいし、または別個のベクターに含めてもよい。前述の種類の特に好ましい分子は以下のとおりである。
・ＩＬ−１阻害剤：ＩＬ−１ｒａタンパク質および可溶性ＩＬ−１受容体。最も好ましいＩＬ−１阻害剤はアナキンラである。
・ＴＮＦ−α阻害剤：可溶性腫瘍壊死因子Ｉ型受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ；−ＲＩはまた、ｐ５５受容体とも呼ばれる）；可溶性腫瘍壊死因子ＩＩ型受容体（ｐ７５受容体とも呼ばれる）；およびＴＮＦ受容体に結合するモノクローナル抗体。最も好ましいのは、ＷＯ  ９８／２４４６３に記載されるようなｓＴＮＦ−ＲＩ、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））、およびアバカイン（登録商標）である。典型的なＴＮＦ−α阻害剤は、ＥＰ  ４２２  ３３９、ＥＰ  ３０８  ３７８、ＥＰ  ３９３  ４３８、ＥＰ  ３９８  ３２７、およびＥＰ  ４１８  ０１４に記載される。
・セリンプロテアーゼ阻害剤：ＳＬＰＩ、ＡＬＰ、ＭＰＩ、ＨＵＳＩ−Ｉ、ＢＭＩ、およびＣＵＳＩ。ＳＬＰＩがＬＰＳ反応を阻害することが示されたように、これらの阻害剤を、典型的なＬＰＳ調節因子として見ることもまた可能である。Ｊｉｎら（１９９７），  Ｃｅｌｌ  ８８（３）：４１７−２６（本明細書に援用される）。
【０１７６】
薬剤組成物
ＩＦＮγ選択的結合剤の薬剤組成物は、本発明の範囲内にある。こうした組成物は、療法的または予防的に有効な量のＩＦＮγ選択的結合剤、例えば抗体、あるいはその断片、変異体、誘導体または融合体を、薬学的に許容しうる剤と混合して含む。好ましい態様において、薬剤組成物は、ＩＦＮγの少なくとも１つの生物学的活性を部分的にまたは完全に阻害する抗ＩＦＮγアンタゴニスト抗体を、薬学的に許容しうる剤と混合して含む。典型的には、抗体は、動物への投与のため、十分に精製されているであろう。
【０１７７】
本発明の組成物に使用するための薬学的に許容しうる剤には、当該技術分野に周知であるような、キャリアー、賦形剤、希釈剤、酸化防止剤、保存剤、着色剤、フレーバー剤および希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、緩衝剤、搬送ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝化剤、抗菌剤および界面活性剤が含まれる。
【０１７８】
中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水が、典型的な適切なキャリアーである。組成物にやはり含まれるのは、アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノースまたはデキストリン類を含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック類またはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤である。やはり例として、適切な等張化増進剤には、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトール等が含まれる。適切な保存剤には、限定されるわけではないが、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチル・アルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸等が含まれる。過酸化水素もまた、保存剤として使用可能である。
【０１７９】
適切な共溶媒は、例えばグリセリン、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールである。適切な錯化剤は、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンである。適切な界面活性剤または湿潤剤には、ソルビタンエステル類、ポリソルベート８０などのポリソルベート類、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）等が含まれる。緩衝剤は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、リン酸、炭酸水素、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌなどの慣用的緩衝剤であることも可能である。酢酸緩衝液はｐＨ４．０〜５．５程度であることも可能であり、そしてＴｒｉｓ緩衝液はｐＨ７．０〜８．５程度であることも可能である。さらなる薬学的剤が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１８版，  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ監修，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１９９０に示されており、該文献の相当する部分は、本明細書に援用される。
【０１８０】
組成物は、液体型であっても、あるいは凍結乾燥型またはフリーズドライ型であってもよい。凍結乾燥型には、スクロースなどの賦形剤が含まれうる。本発明の組成物は、非経口投与に適している。好ましい態様において、組成物は、当業者に利用可能ないずれかの経路によって、例えば皮下経路、静脈内経路、筋内経路、腹腔内経路、大脳内（実質内）経路、脳室内経路、筋内経路、眼内経路、動脈内経路、または病変内経路によって、動物に注射するかまたは注入するのに適している。非経口処方は、典型的には、無菌、病原体不含の等張化水性溶液であり、所望によって薬学的に許容しうる保存剤を含有するであろう。
【０１８１】
最適な薬剤処方は、意図される投与経路、搬送形式および望ましい投薬量に応じて、当業者が容易に決定可能である。
他の処方もまた本発明に意図される。薬剤組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子性調製物、またはリポソームへのＩＦＮγ選択的結合剤（抗体など）の導入も含むことも可能である。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、そしてこの酸は、循環中にある期間の持続を促進する効果も有しうる。薬剤組成物は、ＩＦＮγ選択的結合剤（例えば抗体）と、注射可能微小球体、生体侵食性粒子またはビーズ、あるいはリポソームとの処方もまた含み、こうした処方は、選択的結合剤の制御放出または徐放を提供し、こうした処方を、次いで、蓄積注射として搬送してもよい。他の適切な搬送手段には、移植可能搬送装置が含まれる。
【０１８２】
ＩＦＮγ選択的結合剤（抗体など）を含む薬剤組成物は、吸入用の乾燥粉末としても処方可能である。こうした吸入溶液はまた、エアロゾル搬送用の液化噴霧剤中にも処方可能である。さらに別の処方において、溶液を噴霧することも可能である。ＩＦＮγ選択的結合剤を含有する特定の処方を経口投与してもよいこともまた意図される。この方式で投与される処方を、錠剤およびカプセルなどの固形投薬型の配合に習慣的に用いられるキャリアーを伴い、または伴わずに、処方することも可能である。例えば、生物学的利用能が最大となりそして前全身分解が最小となる胃腸管で、処方の活性部分が放出されるように、カプセルを設計することも可能である。選択的結合剤の吸収を促進する、さらなる剤を含むことも可能である。希釈剤、フレーバー剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた、使用可能である。
【０１８３】
別の調製は、有効量のＩＦＮγ選択的結合剤を、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合して含むことも可能である。錠剤を滅菌水、または別の適切なビヒクルに溶解することによって、単位用量型の溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム（ａｃａｃｉａ）；あるいは滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクが含まれる。
【０１８４】
さらなる処方が当業者には明らかであり、こうした処方には、ＩＦＮγ選択的結合剤を、１以上の他の療法剤と組み合わせて含む処方が含まれる。多様な他の徐放または制御搬送手段、例えばリポソームキャリアー、生体侵食性微小粒子または多孔ビーズおよび蓄積注射を処方するための技術もまた、当業者に知られる。例えば、その開示が本明細書に援用される、Ｓｕｐｅｒｓａｘｏら、薬剤組成物搬送用の制御放出多孔ポリマー微小粒子の説明（ＷＯ  ９３／１５７２２（ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９）を参照されたい）を参照されたい。
【０１８５】
投与方式に関わらず、体重、体表面積または臓器サイズにしたがって、特定の用量を計算することも可能である。上述の処方各々を伴う治療の適切な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、そして当業者が日常的に行う仕事の範囲内である。適切な用量−反応データの使用を通じて、適切な投薬量を確認することも可能である。
【０１８６】
さらに、肺投与によって、本発明の薬剤組成物を投与することも可能であり、例えば化学的に修飾されたタンパク質の肺搬送を開示し、本明細書に援用される、ＰＣＴ  ＷＯ９４／２００６９を参照されたい。肺搬送のため、粒子サイズは、遠位肺への搬送に適したものでなければならない。例えば、粒子サイズは１μｍ〜５μｍであることも可能であるが、例えば各粒子がかなり多孔性であれば、より大きい粒子も使用可能である。
【０１８７】
あるいはまたはさらに、ＩＦＮγ選択的結合剤が吸収されているか、または被包されている、膜、スポンジ、または他の適切な材料を、罹患領域に移植することを介して、組成物を局所投与することも可能である。移植装置を用いる場合、適切な組織または臓器いずれかに装置を移植し、そしてＩＦＮγ選択的結合剤の搬送は、多量（ｂｏｌｕｓ）投与を介して、または連続投与を介して、または連続注入を用い、カテーテルを介して、装置から直接なされることも可能である。
【０１８８】
本発明の薬剤組成物は、徐放処方または徐放調製物中でもまた投与可能である。徐放調製物の適切な例には、成形物品の形の半透性ポリマーマトリックス、例えばフィルム、または微小カプセルが含まれる。徐放マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（例えば米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  １５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．，  １２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。徐放組成物にはまた、当該技術分野に知られるいくつかの方法のいずれかによって調製可能なリポソームが含まれることも可能である。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；およびＥＰ  １４３，９４９を参照されたい。
【０１８９】
いくつかの例では、ＩＦＮγ選択的結合剤組成物を含む薬剤組成物を、ｅｘ  ｖｉｖｏ方式で使用することが望ましい可能性もある。この場合、患者から取り除いた細胞、組織または臓器を、ＩＦＮγ選択的結合剤を含む薬剤組成物に曝露し、その後、続いて、細胞、組織および／または臓器を患者に移植しなおす。
【０１９０】
他の場合では、本明細書に記載するものなどの方法を用いて、遺伝子操作した特定の細胞を患者に移植して、ポリペプチド、選択的結合剤、断片、変異体、または誘導体を発現させ分泌させることによって、ＩＦＮγ選択的結合剤を含む組成物を搬送することも可能である。こうした細胞は、動物細胞またはヒト細胞であってもよく、そして患者自身の組織あるいはヒトまたは非ヒトいずれかの別の供給源由来であってもよい。所望によって、細胞を不死化してもよい。しかし、免疫応答の可能性を減少させるため、細胞を被包して、周囲組織への浸潤を回避することが好ましい。被包材料は、典型的には、タンパク質産物（単数または複数）の放出を許すが、患者の免疫系による、または周囲組織由来の他の有害因子による分解を防止する、生体適合性の半透性ポリマー被包体（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）または膜である。
【０１９１】
細胞の膜被包に用いられる方法は当業者に周知であり、そして被包細胞の調製および該細胞の患者への移植は、過度の実験を伴わずに達成可能である。例えば米国特許第４，８９２，５３８号、第５，０１１，４７２号、および第５，１０６，６２７号を参照されたい。生存細胞を被包する系がＰＣＴ  ＷＯ  ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。他の多様な徐放または制御搬送手段、例えばリポソームキャリアー、生体侵食性粒子またはビーズを処方するための技術もまた、当該技術分野に知られ、そして記載されている。細胞を被包し、また被包せずに、患者の適切な体組織または臓器に移植してもよい。
【０１９２】
ＩＦＮγ選択的結合剤（例えば抗ＩＦＮγ抗体、あるいはその断片、変異体、誘導体、および融合体）を含む薬剤組成物の療法的または予防的に有効な量は、例えば該組成物を用いる徴候などの療法目的、投与経路、および被験者の状態に応じるであろう。本発明のＩＦＮγアンタゴニスト抗体または抗原結合ドメインは、自己免疫および／または炎症状態を防止し、そして／または治療するため、療法的または予防的に有効な量で投与される。
【０１９３】
以下の実施例は、本発明をさらに十分に例示するために提供され、そして本発明の範囲を限定するとは解釈されない。
【０１９４】
（実施例１）
試薬およびアッセイ
これらの研究に用いるスクリーニング標的を：１）ＥＰ  ０４２３８４５またはＰＣＴ公報ＷＯ  ８３／０４０５３に記載されるような、ｈＩＦＮγをコードするｃＤＮＡの大腸菌における発現；または２）以下のような、ｈＩＦＮγをコードするｃＤＮＡのＣＨＯ宿主細胞における発現から調製した：ＰＣＲ（標準的条件）を用いて、テンプレートとしてヒト脾臓Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用い、ヒトＩＮＦγをコードする全長配列を増幅した。発現プラスミドに配列をサブクローニングし、そしてＤＨ１０Ｂ細胞（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＮＡで形質転換し、ＤＮＡを調製し、そしてリン酸カルシウム法（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｍｅｄｉａ，  Ｉｎｃ．）によって、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。高発現細胞株クローンを用いて、血清不含馴化培地を生成した。
【０１９５】
ｈＩＮＦγを含有するＣＨＯ細胞馴化培地を濃縮し、透析し、そして次いで、いくつかのクロマトグラフィー工程を通じて精製した。最初の工程は、非グリコシル化ｈＩＦＮγ型に対して高グリコシル化型を分離する、標準的ＮａＣｌ勾配を用いたＱ−ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーであった。コムギ（ｗｈｅａｔ）胚芽凝集素クロマトグラフィー（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を通して、Ｑ−ＨＰプールをさらに精製した。精製物質は、クーマシー−ブルーおよび銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ両方によって判断すると、９５％より純粋であった。物質は、ゲル凝固法（カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解物）によってアッセイした際、内毒素が低レベルであった。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのヤギ（ｇｏａｔ）抗ｈＩＦＮγ中和抗体（カタログ番号ＡＦ−２８５−ＮＡ、ロット番号ＺＷ０１９０１１）を用いて、ウェスタンブロットによって、ｈＩＮＦγの同一性を確認した。吸光係数法（０．６６）を用いて、最終タンパク質濃度を決定した。物質２ロットをそれぞれ生成した。収率は４０ｍｇ／ｌであった。最終物質をＰＢＳ中に配合した。
【０１９６】
ＣＨＯ細胞におけるヒトＩＦＮγＲ１−Ｆｃタンパク質の発現
これらの研究において、標的からファージ抗体を溶出するのに用いたヒトＩＦＮγＲ１−Ｆｃタンパク質を以下のように調製した：ＰＣＲ（標準的条件）を用いて、テンプレートとしてヒトリンパ球Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより購入）を用い、ヒトＩＦＮγＲ１をコードする全長配列を増幅した。ＰＣＲ（標準的条件）を用いて、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をコードする配列を増幅した。重複ＰＣＲを用いて、ＩＦＮγＲ１−Ｆｃ融合構築物をコードする配列（ＩＦＮγＲ１のアミノ酸１〜Ｓｅｒ２４６）を生成して、そして発現プラスミドに該配列をサブクローニングした。ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＮＡで形質転換し、ＤＮＡを調製し、そしてリン酸カルシウム法（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｍｅｄｉａ，  Ｉｎｃ．）によって、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。高発現細胞株クローンを用いて、血清不含馴化培地を生成した。
【０１９７】
標準的プロテインＧ  Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して、ｈＩＮＦγＲ１−Ｆｃを含有するＣＨＯ細胞馴化培地を濃縮し、そして精製した。吸光係数として１．４４を用いて、Ａ２８０によって最終濃度を決定した。Ｎ末端配列決定解析を通じて、精製試料の同一性を確認した。この物質をＰＢＳ中に配合した。
【０１９８】
抗体
モノクローナル抗ｈＩＦＮγ抗体、クローン２５７８．１１１をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（カタログ番号ＭＡＢ２８５、ロット番号ＫＷ０７）。モノクローナル抗ｈＩＦＮγ抗体、クローンＭＭＨＧ−１をＢｉｏｓｏｕｒｃｅから購入した（カタログ番号ＡＨＣ４８３４、ロット番号１０８０３−０１５）。組換えヒトＩＦＮγ受容体１（ｒｈＩＦＮγ  Ｒ１）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（カタログ番号６７３−ＩＲ）。ｒｈＩＦＮγ  Ｒ１の計算上の分子量は２５，０００ダルトンである。グリコシル化の結果、組換えタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、４０〜５０ｋＤａタンパク質として移動する。
【０１９９】
Ａ５４９細胞増殖アッセイ
ＩＦＮγの抗体中和を評価するために用いたＡ５４９細胞増殖アッセイは、９６ウェルアッセイであり、そして一般的に以下のように記載される：第１日、１）アッセイ培地（Ｆ１２Ｋ、５％ＦＢＳ、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ  Ｌ−グルタミン）中の最高濃度からＡｂを１：２で連続希釈する。アッセイにおいて望ましい濃度の４倍で、全部で１０回の希釈を行う。２つ組のため、各希釈物は少なくとも最終２００μｌが必要である；２）用量反応曲線中の有効用量の９０％に基づいて、スパイク用にＩＦＮγを適切な濃度に希釈する。アッセイにおいて望ましい濃度の４倍で、ＩＦＮγスパイクを作成する；３）Ｔｉｔｅｒｔｅｋ試験管中で、各４ｘＡｂ希釈物１５０μｌを、４ｘＩＮＦγスパイク１５０μｌと合わせる。ピペッティングによって混合する。ふたをして、室温で１時間インキュベーションする。（注：ＡｂおよびＩＦＮγの濃度は、ここで、アッセイ濃度の２倍である）；４）（所望による）ＡｂおよびＩＦＮγをインキュベーションしている間、力価決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）曲線用にＩＦＮγを希釈する。４０００ｎｇ／ｍｌから始めて、１：３希釈を１２回行う。アッセイにおいて、３つ組には３００μｌが必要であるため、希釈終了時に必要な体積は少なくとも４００μｌであるはずである。必要となるまで、４℃で保存する；５）インキュベーションが完了する前に、５ｍｌトリプシン中で、Ａ５４９細胞をトリプシン処理する。フラスコに２０ｍｌのアッセイ培地を添加し、そして５０ｍｌコニカルに移して、そしてＩＥＣ中、室温で１／２〜３／４の速度で遠心分離する；６）細胞を吸引する。７．５ｍｌのアッセイ培地に再懸濁する。トリパンブルー中、１：１で計数する；７）アッセイ培地中、細胞を２．５ｘ１０４細胞／ｍｌに希釈する。各試料について、２．５ｘ１０３細胞／ウェルを、９６ウェルＦａｌｃｏｎに０．１ｍｌで植え付ける；８）１時間後、２つ組の２つのウェル各々に、１００μｌ  Ａｂ／ＩＦＮγ混合物を添加する；そして９）３７℃、５％ＣＯ２および高湿度で５日間インキュベーションする。第５日：１）ウェルあたり２０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを添加する。３７℃、５％ＣＯ２および高湿度で３〜４時間インキュベーションする；２）ＦＬ５００蛍光プレート読取装置のスイッチを入れる。プレートからふたを取り除き、そしてふたなしで１０分間振盪する；そして３）ＦＬ５００を読み取る。設定：中程度に３秒間振盪、励起５３０／２５、発光５９０／３５、感度３４。
【０２００】
（実施例２）
ヒトＦａｂライブラリーのスクリーニング
スクリーニング法
ヒトＦａｂライブラリーを構築し、そしてスクリーニングする、一般的な方法は、ｄｅ  Ｈａａｒｄら（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ３１：５−３１（１９９８）；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４：１８２１８−１８２３０（１９９９））に記載された。以下の方法によって、ｈＩＦＮγに結合するＦａｂ断片をスクリーニングした。
【０２０１】
Ｎｕｎｃイムノチューブを、０．１Ｍ炭酸Ｎａ、ｐＨ９．６中、０．３９μｇ／ｍｌのｈＩＦＮγ  ４ｍｌで、Ｎｕｔａｔｏｒ上、室温で２時間コーティングした。Ｔａｒｇｅｔ  Ｑｕｅｓｔ、ＮＶ（オランダ・アムステルダム）凍結ファージライブラリーストック（試験管あたり７５０μｌ中、４ｘ１０１２ｐｆｕ）のアリコットを融解後、１／５体積（１５０μｌ）のＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコール８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、オートクレーブ）を添加し、そして試験管を氷上に１時間放置してファージを沈殿させることによって、グリセロール（１５％）を取り除いた。沈殿したファージ粒子を４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心してペレットとし、次いで５００μｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁した。ＩＦＮγでコーティングしたイムノチューブを４ｍｌ  ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＮｕｔａｔｏｒ上、４ｍｌの２％ＭＰＢＳを用いて、室温で１時間ブロッキングした。同時に、５００μｌの４％ＭＰＢＳをファージ懸濁物に添加し、そして室温で３０分間〜１時間インキュベーションして、ファージ粒子のプレ・ブロッキングを可能にした。ブロッキングしたイムノチューブをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。プレ・ブロッキングしたファージ混合物を、３ｍｌの２％ＭＰＢＳを含有する、洗浄したイムノチューブに添加した。回転装置上で３０分間インキュベーションし、その後、室温で１．５時間、静置インキュベーションした後、ファージ混合物を廃棄した。試験管をまずＰＢＳＴで２０回、次いでＰＢＳで２０回洗浄した。回転装置上、０．４％ＭＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１μＭの特異的溶出試薬（それぞれｈＩＦＮγ、ＧＰＮＡ、ＲＤＭＡ、ＢＳＭＡ、またはｒｈＩＦＮγ  Ｒ１）１ｍｌとインキュベーションすることによって、結合したファージ粒子を溶出した。溶出したファージ粒子を無菌５０ｍｌコニカル・ポリプロピレン試験管に移し、そして氷上で保存した。各ファージ溶出物、約２０μｌを、力価決定のため、取り置いた。増幅のため、残った溶出ファージ粒子を、５ｍｌのＴＧ１培養物（ＯＤ５９０約０．５）および４ｍｌの２ｘＹＴを含有する５０ｍｌコニカル試験管に添加した。ＩＦＮ感染（ＩＦＮｅｃｔｉｏｎ）混合物を振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、３５００ｒｐｍで２０分間回転させた。細胞ペレットを１５００μｌの２ｘＹＴ−ＡＧブロスに懸濁し、そして５つのＳＯＢＣＧプレート上、３００μｌ／プレートで蒔いた。プレートを３０℃で一晩インキュベーションした。２０時間インキュベーションした後、プレートから細胞スクレーパーで細胞を回収し、これにプレートあたり４ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧを添加した。この工程を３回反復した。回収細胞のごく一部をファージ救出に用いた（以下を参照されたい）。残った細胞懸濁物を３５００ｒｐｍで２０分間回転させた。細胞ペレットをペレットサイズの１／２体積の５０％グリセロールに再懸濁して、グリセロールストックを作成し、そして−８０℃で保存した。
【０２０２】
増幅細胞懸濁物からのファージ救出を以下のように行った。蒔いて増幅させた約０．５ｍｌの回収細胞懸濁物を用いて、約０．３のＯＤ５９０になるように５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧに接種した。振盪装置上、ＯＤ５９０が０．５になるまで培養物を３７℃でインキュベーションした。Ｍ．Ｏ．Ｉ．２０のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、カタログ番号１８３１１−０１９、１．１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）１ｍｌで、１０ｍｌの培養物をＩＦＮ感染させて、そして３７℃で３０分間、インキュベーター中でインキュベーションした。ＩＦＮ感染した細胞を４０００ｒｐｍで２０分間回転させて落とした。細胞ペレットを５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＫに再懸濁し、２５０ｍｌフラスコに移して、そして２７０ｒｐｍで２０時間、振盪しながら３０℃でインキュベーションした。一晩培養物を４０００ｒｐｍで２０分間回転させて、細胞破片を取り除いた。上清を再び遠心分離して、細胞破片が除去されることを確実にした。ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）約１／５体積を上清に添加して、ファージ粒子を沈殿させた。混合物を氷上で少なくとも１時間インキュベーションし、次いで４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿したファージ粒子を収集した。ファージペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして微量遠心分離試験管に移した。ファージ懸濁物を氷上で１時間放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を可能にし、次いで、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させて、残った細胞破片を取り除いた。ファージ沈殿工程を反復した。最終ファージペレットを１．１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、そして延長した期間、氷上に放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を確実にした。ファージ懸濁物を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、残った細胞破片を取り除いた。５００μｌの救出したファージ懸濁物を用いて、２５０μｌの５０％グリセロールを添加することによって、グリセロールストックを作成した。１００μｌの救出ファージ懸濁物をファージプールＥＬＩＳＡ（以下を参照されたい）用に取り置いた。残った５００μｌの救出ファージを次の周期のパニングに用いた。
【０２０３】
ファージプールＥＬＩＳＡ
ファージプールＥＬＩＳＡを以下のように行った：大腸菌で発現したｈＩＦＮγを、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂ  Ｉｍｍｕｎｏプレートにおいて、０．１Ｍ炭酸Ｎａ、ｐＨ９．６中、０．３９μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで、穏やかに振動させながら、室温で２時間プレーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、振動装置上、室温で１時間、２％ＭＰＢＳ  ３００μｌ／ウェルを用いてブロッキングした。陰性対照として、抗原でコーティングされていない別のＮｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏプレートもまた、２％ＭＰＢＳでブロッキングした。その間に、１２０μｌの救出された各ファージプールを、９６ウェルＣｏｓｔａｒ  ３７９０プレート中、１２０μｌの０．８％ＭＴＢＳでプレ・ブロッキングし、そして使用準備が整うまで、室温で放置した。ブロッキングしたプレートをどちらも、０．１％ＴＢＳＴ（ＴＢＳ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．１％）で５回洗浄した。プレ・ブロッキングしたファージ希釈物を、抗原でコーティングしたプレートおよび陰性対照プレート両方に分配し（１００μｌ／ウェル）、そして振動装置上、室温で１時間インキュベーションした。記載するようにプレートを洗浄した後、０．４％ＭＴＢＳ中、１：１０００倍希釈したＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル・コンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−９４２１−０１）１００μｌ／ウェルを分配し、そして振動装置上、室温で１時間インキュベーションした。記載するようにプレートを洗浄した。基質、１−ＳｔｅｐＴＭ  ＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３７６１５）１００μｌ／ウェルを添加した後、プレートを１時間インキュベーションした。シグナル検出のため、ＯＤ４０５を測定した。さらなる解析のため、個々のクローンの供給源として、ＥＬＩＳＡ陽性ファージプールを用いた。
【０２０４】
（実施例３）
ＩＦＮγに結合するＦａｂファージクローンの同定
ＤＮＡフィンガープリンティング
ＥＬＩＳＡ陽性ファージプール由来の重鎖および軽鎖両方を含有する全長クローンを同定するため、９６ウェルＴｈｅｒｍｏｗｅｌｌプレート中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。典型的には、各ウェルは、２５μｌのＰＣＲ反応混合物（２．５μｌ  １０ｘＰＣＲ緩衝液、２１．６２５μｌの水、２５ｍＭの０．２５μｌ  ｄＮＴＰ類、１０ｐｍｏｌ／μｌの０．２５μｌプライマー８７０−０２（以下を参照されたい）、１０ｐｍｏｌ／μｌの０．２５μｌプライマー２１８２−８３（以下を参照されたい）、５単位／μｌの０．１２５μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ）を含有する。
【０２０５】
【化７】
2006502739.tif 000010
【０２０６】
個々のコロニーを摘み取り、そしてまずＰＣＲプレート中のウェルに再懸濁し、次いで３００μｌ／ウェルの２ｘＹＴ−ＡＧブロス（２ｘＹＴブロス：１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する、水１ｌあたり、１０ｇ酵母エキス、１６ｇバクト−トリプトン、５ｇ  ＮａＣｌ）を満たした９６ウェル深底ウェルブロックの対応するウェルに再懸濁する。ＰＣＲ反応条件は、９４℃５分間の変性周期１回、４０周期の９４℃４５秒間、５５℃４５秒間、７２℃１．５分間、その後、７２℃１０分間の伸長周期１回であった。ＰＣＲ反応が完了した後、３μｌ／ウェルのＰＣＲ反応混合物を、０．５μｌ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する、余分に長い４ｘ（２４＋２）の１％ＴＡＥゲル（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ、カタログ番号ＧＥ−３８２０）上で、１２０ボルトで１時間泳動した。１ｋｂ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、カタログ番号１０７８７−０１８）に比較することによって、１．６ｋｂより大きい挿入物を持つクローンを全長クローンと同定した。
【０２０７】
ユニークな全長クローンの同定を以下のように行った：同定された全長クローンのＰＣＲ増幅した挿入物に対して、ＢｓｔＮＩ消化を行った。９６ウェルＴｈｅｒｍｏｗｅｌｌプレート中の試料あたり１６μｌのＰＣＲ反応混合物に、３μｌ  １０ｘ緩衝液２（ＮＥＢＬ）、１０ｍｇ／ｍｌの０．３μｌ  ＢＳＡ、１０μｌの水および０．７μｌのＢｓｔＮＩ（ＮＥＢＬ）を含有する１４μｌのＢｓｔＮＩ消化マスター溶液を添加した。プレートを６０℃で３時間インキュベーションした。消化した試料の各々１３μｌを、０．５μｌ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する、余分に長い２ｘ（２４＋２）の４％ＴＡＥゲル（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ、カタログ番号ＧＥ−３８１７）上で、１００ボルトで３時間泳動した。ＢｓｔＮＩ断片パターンの相違に基づいて、ユニークなクローンを同定した。
【０２０８】
クローンファージＥＬＩＳＡ
同定されたユニークな全長クローンのＦａｂファージを９６ウェル形式で救出した。９６ウェルの２ｍｌ深底ウェルブロックにおいて、４８０μｌ／ウェル  ２ｘＹＴＡＧブロスに、選択したユニークな全長クローンの一晩培養物２０μｌを接種し、次いで、３００ｒｐｍ、３７℃で３時間インキュベーションした。細胞をＩＦＮ感染させるため、各ウェルに、１００μｌの１：１０希釈したＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ希釈物を添加した。ブロックを振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、１５０ｒｐｍでさらに３０分間、穏やかに振盪した。ブロックを３６００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、ＩＦＮ感染させた細胞をペレットにした。各ウェルの細胞ペレットを４８０μｌの２ｘＹＴＡＫ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ｘＹＴブロス）に懸濁し、次いで約２０時間に渡って、３０℃で一晩インキュベーションした。３６００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、細胞破片を分離した。救出したファージ上清を注意深く別の無菌９６ウェルブロックに移した。救出したファージを用いて、実施例２のファージプールＥＬＩＳＡに記載したのと正確に同じように、クローンファージＥＬＩＳＡを行った。０．２以上の純ＯＤ４０５を生じるクローンをＩＦＮγ結合候補と見なした。
【０２０９】
大規模ファージ救出ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡにおいて、ＦａｂファージがＩＦＮγに濃度依存的に結合することを立証することによって、同定したユニークなＦａｂファージクローンが特異的にＩＦＮγに結合することを確認した。大規模救出によってＦａｂファージを得た。
【０２１０】
個々のクローンの大規模救出を、以下のように行った：同定したユニークなＩＦＮγ結合クローンのＦａｂファージを大規模に救出した。２５０ｍｌの無菌フラスコ中で、５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧブロスに、選択したＩＦＮγ結合クローンの一晩培養物２００μｌを接種し、そして培養物のＯＤ５９０が０．５に達するまで、３７℃、２７００ｒｐｍでインキュベーションした。５ｍｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、カタログ番号１８３１１−０１９、１．１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）をＭ．Ｏ．Ｉ．２０で添加して、細胞を感染させた。細胞／ヘルパーファージ混合物を振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、感染細胞をペレットにした。細胞ペレットを５０ｍｌの２ｘＹＴＡＫブロス（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ｘＹＴブロス）に懸濁し、次いで２７０ｒｐｍで振盪しながら、約２０時間に渡って、３０℃で一晩インキュベーションした。一晩培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、細胞破片を取り除いた。上清を再び遠心分離して、細胞破片が除去されていることを確実にした。上清に、１０ｍｌ（１／５体積）のＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加して、ファージ粒子を沈殿させた。混合物を氷上で少なくとも１時間インキュベーションし、そして４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿したファージ粒子を収集した。ファージペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、そして微量遠心分離試験管に移した。ファージ懸濁物を氷上で１時間放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を可能にし、次いで、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させて、残った細胞破片を取り除いた。ファージ沈殿工程を反復した。最終ファージペレットを１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、そして延長した期間、氷上に放置して、ファージ粒子の完全な懸濁を確実にした。ファージ懸濁物を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、残った細胞破片を取り除いた。最終ファージ懸濁物を４℃で保存した。実施例２のファージプールＥＬＩＳＡに記載するように、ファージＥＬＩＳＡを行った。典型的には１ｘ１０９ｐｆｕ／ウェル〜１ｘ１０１１ｐｆｕ／ウェルの、少なくとも６つの異なる濃度の大規模救出ファージを、対応するウェルに添加した。
【０２１１】
総数１１のＦａｂクローンを同定した。大腸菌ｈＩＦＮ−γ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、および「５７Ｄ」を同定した。ＧＰＮＡ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＧＰ−Ａ」および「５８Ｃ」を同定した。ＲＤＭＡ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ」および「５９−Ａ２」を同定した。ＢＳＭＡ溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「ＢＳ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」を同定した。ｈＩＦＮ−γ  Ｒ１溶出を用いて、ファージプールからＦａｂクローン「６７Ｃ」を同定した。大規模救出ファージ調製物に対して、９つのユニークなクローンの濃度依存的クローンファージＥＬＩＳＡを行って、そしてこれを図１および図２に例示した。これらのＦａｂファージは、ＥＬＩＳＡプロフィールに基づいて、３つのグループに分けることも可能である。グループＡには、Ｆａｂクローン「ＧＰ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」が含まれる。これらの２つのＦａｂファージは強い結合剤であり、ＥＬＩＳＡシグナルは５Ｅ９  ｐｆｕ／ウェルで飽和に到達する。グループＢには、Ｆａｂクローン「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＩＮＦ−Ａ」および「５７Ｅ」が含まれる。これらは強い結合剤から穏やかな結合剤であり、優れた濃度依存性結合曲線を示す。グループＣには、Ｆａｂクローン「５７Ｄ」、「５８Ｃ」、「ＲＤ−Ｂ」および「６７Ｃ」が含まれる。これらは弱いが特異的であり、そして濃度依存性のＩＦＮγ結合剤である。
【０２１２】
Ｆａｂクローンの配列解析
ユニークなＩＦＮγ結合Ｆａｂファージクローンの確認を以下のように行った：ＱＩＡｆｉｌｔｅｒＴＭプラスミド・ミディ・キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２２４５）を用いて、ユニークなＦａｂ  ＢｓｔＮＩ消化パターン各々の代表のプラスミドＤＮＡを調製し、そして配列決定に送った。Ｆａｂ  ＢｓｔＮＩパターンすべての配列がユニークであることが確認され、そして個々の重鎖配列および軽鎖配列が明らかになった（図３〜２４を参照されたい）。
【０２１３】
Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＲＤ−Ａ２」、「５８Ｃ」、「ＧＰ−Ａ」、「５７Ｄ」、「５７Ｅ」、「ＩＦＮ−Ａ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の重鎖のＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号６５〜８６）を、それぞれ図３〜１３に示した。Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＲＤ−Ａ２」、「５８Ｃ」、「ＧＰ−Ａ」、「５７Ｄ」、「５７Ｅ」、「ＩＦＮ−Ａ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の軽鎖のＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号８７〜１０８）を、それぞれ図１４〜２４に示した。図３１に示すように、１１のＦａｂすべての重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を比較した。ＧＣＧの「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを用いて、Ｆａｂ各対間の同一性および類似性のパーセンテージを得た。重鎖中の最も密接なマッチは、「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」および「ＩＦＮ−Ａ」中である。「ＢＳ−Ａ」および「ＲＤ−Ａ２」の重鎖配列は、同一のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。これらはＣＤＲ３のみが異なり、そして９２．６％の同一性および９３．４％の類似性を有する。最初のアミノ酸を例外として、「ＢＳ−Ａ」および「ＩＦＮ−Ａ」の重鎖配列は、同一のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有し、そして異なるＣＤＲ３を有する。これらは９３．５％の同一性および９５．１％の類似性を共有する。同じことが「ＩＦＮ−Ａ」および「ＲＤ−Ａ２」の重鎖配列にも当てはまり、これらは９０．５％の同一性および９２．１％の類似性を持つ。Ｆａｂ「５７Ｅ」の重鎖のアミノ酸配列は、「ＢＳ−Ａ」の重鎖配列に８８．１％の同一性および８９．０％の類似性を示し、「ＲＤ−Ａ２」の重鎖配列に８８．８％の同一性および９０．０％の類似性を示し、そしてＩＦＮ−Ａの重鎖配列に８９．０％の同一性および９０．７％の類似性を示す。Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」の重鎖のアミノ酸配列は、「５７Ｄ」の重鎖配列に８８．６％の同一性および９０．４％の類似性を示し、「ＧＰ−Ａ」の重鎖配列に８１．７％の同一性および８３．３％の類似性を示し、そして５８Ｃの重鎖配列に８３．９％の同一性および８４．７％の類似性を示す。軽鎖中の最も密接なマッチは、「５９−Ａ２」および「ＢＳ−Ａ」間の９０．８％の同一性および９１．７％の類似性、「ＢＳ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」間の８９．０％の同一性および９０．９％の類似性、「５７Ｅ」および「ＢＳ−Ａ」間の８８．２％の同一性および９０．９％の類似性、「５７Ｅ」および「ＢＳ−Ｂ」間の８９．７％の同一性および９１．５％の類似性、そして「５９−Ａ２」および「ＢＳ−Ｂ」間の８８．２％の同一性および８８．２％の類似性である。Ｆａｂの３対、「５９−Ａ２」／「ＢＳ−Ｂ」、「５７Ｅ」／「ＢＳ−Ａ」および「ＩＦＮ−Ａ」／「ＲＤ−Ａ２」のみが、重鎖および軽鎖両方で密接にマッチしている。
【０２１４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列の比較を図２５に示す。１１の抗ＩＦＮγ  Ｆａｂの重鎖ＣＤＲ３は、類似性をほとんど共有しない。図３２に示すように、重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲのいずれの類似性にしたがって、Ｆａｂをグループ分けすることも可能である。クローン「ＢＳ−Ａ」、「ＩＦＮ−Ａ」および「ＲＤ−Ａ２」は、同一の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。しかし、最後の３つの残基が同一である（ＦＤＹ）ことを除いて、これらの重鎖ＣＤＲ３は、非常に異なる。興味深いことに、ＩＦＮ−ＡおよびＲＤ−Ａ２はまた、緊密にマッチする軽鎖ＣＤＲ１（１１／１６の同一残基）、ＣＤＲ２（５／７の同一残基）、およびＣＤＲ３（８／９の同一残基）も共有する。クローン「ＢＳ−Ｂ」、「５９−Ａ２」、「ＧＰ−Ａ」、および「５７Ｄ」は、類似の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有する。クローン「ＢＳ−Ｂ」および「５９−Ａ２」は、同一の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有するが、非常に異なる重鎖ＣＤＲ３を有する。クローン「５９−Ａ２」、「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」および「５７Ｅ」の３つの軽鎖ＣＤＲはすべて、非常に類似である。
【０２１５】
（実施例４）
可溶性Ｆａｂの発現および精製
大腸菌株ＨＢ２１５１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ユニークな結合剤のプラスミドＤＮＡで形質転換した。形質転換ＨＢ２１５１の一晩培養物を２ｘＹＴ−ＡＧブロス中、３０℃で増殖させた。１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを含有する７５０ｍｌの２ｘＹＴに、一晩培養物７．５ｍｌを接種し、そして３７℃で約２時間、振盪しながら（２７０ｒｐｍ）インキュベーションした。ＯＤ５９０が０．８〜１．０に到達したら、誘導のため、ＩＰＴＧを１ｍＭ添加した。培養物を振盪しながら３０℃で４時間増殖させ続けた。培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。浸透圧ショックアプローチを用いて、Ｆａｂの周辺腔放出を達成した。８ｍｌの氷冷ＴＥＳ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１７．１％スクロース、ｐＨ８．０）に細胞を懸濁し、そしてときどき穏やかに振盪しながら氷上で５〜１０分間インキュベーションした。空の試験管を８．８ｍｌのＴＥＳ／Ｈ２Ｏ（１：３）でリンスし、これを細胞懸濁物にプールした。
【０２１６】
細胞懸濁物を氷上でさらに２０分間インキュベーションし、そして４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を注意深く別の試験管に移し、そして８０００ｒｐｍで２０分間、再度遠心分離した。生じた上清は、ＴＥＳ放出周辺腔分画であった。細胞ペレットを１０ｍｌ  ＴＥＳ／１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベーションし、次いで上述のように２回遠心分離した。最後の上清は、Ｍｇ放出周辺腔分画であり、そしてＴＥＳ放出周辺腔分画にともにプールした。
【０２１７】
周辺腔分画に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにキャリアーおよび安定化剤としてＢＳＡを添加した。プロテアーゼ阻害剤を加えた、２ｌの超音波処理緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に対して、１回交換しつつ、周辺腔分画を透析した。１／１０体積のあらかじめ平衡化したＴＡＬＯＮ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に周辺腔分画を添加し、そして穏やかに振動させながら４℃で１時間インキュベーションした。樹脂混合物を１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、そして上清をできるだけ多く取り除いた。樹脂を１０体積の超音波処理緩衝液で洗浄し、次いで１３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を廃棄した。洗浄した樹脂を１ベッド体積の超音波処理緩衝液に懸濁し、そしてカラムに充填し、これを３ベッド体積の超音波処理緩衝液で洗浄した。２ベッド体積の２００ｍＭイミダゾールを用いて、Ｆａｂを溶出させた。精製したＦａｂをＰＢＳ、ｐＨ７．４に透析した。
【０２１８】
（実施例５）
全長ヒトＩＦＮγ抗体のクローニングおよび発現
以下の方法によって、ＦＡｂクローンを全長抗体に変換した。
【０２１９】
ｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１  ＣＨの構築
プラスミドｐＤＳＲα１９：抗ヒトＯＰＧＬ  ＩｇＧ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｍＢＩで消化して、抗ヒトＯＰＧＬ可変領域のコード領域を除去した。１．０ｋｂｐヒトＩｇＧ１定常領域ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含有する直鎖プラスミドｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１  ＣＨをゲル単離し、そしてＦＡｂ由来抗ＩＦＮ−ガンマ可変領域を受け入れさせるのに用いた。
【０２２０】
ｐＤＳＲα１９：抗ＩＦＮガンマＢＳ−Ａ重鎖の構築
抗ＩＦＮ−ガンマＦＡｂ重鎖ｃＤＮＡをｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１  ＣＨにクローニングして、ＦＡｂを全長ＩｇＧに変換した。「ＢＳ−Ａ」重鎖をコードするプラスミドの構築を本明細書に記載する。類似の方法を用いて、他のＦＡｂ重鎖をクローニングした。シグナル配列を持つＦＡｂを生成するため、３工程ＰＣＲを行った。まず、ＦＡｂ  ｃＤＮＡテンプレートとともにプライマー２４８５−５１（以下に示す）および２４６５−６８（以下に示す）を用いた。条件は：Ｐｆｕポリメラーゼ、並びに適切な緩衝液およびヌクレオチドを用いて、９４℃１分間、（９４℃２０秒間、４８℃３０秒間、７４℃３０秒間）を４周期、（９４℃２０秒間、６６℃３０秒間、７４℃３０秒間）を２５周期、および７４℃５分間であった。次いで、プライマー２１４８−９８（以下に示す）および２４６５−６８（以下に示す）を用いてＰＣＲ産物を増幅し、その後、プライマー２４８９−３６（以下に示す）および２４６５−６８（以下に示す）を用いて増幅した。最終ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｍＢＩで切断し、そしてＱｉａｇｅｎで精製した。５’コザック（翻訳開始）部位および哺乳動物発現のための以下のシグナル配列：
【０２２１】
【化８】
2006502739.tif 000011
【０２２２】
とともにＦＡｂを含有するこの断片を、ｐＤＳＲα１９：ｈＩｇＧ１  ＣＨに連結した。
【０２２３】
【化９】
2006502739.tif 000012
【０２２４】
ｐＤＳＲα１９：抗ＩＦＮガンマＢＳ−Ａ重鎖の構築
ＦＡｂ軽鎖ｃＤＮＡをｐＤＳＲα１９にクローニングして、ＦＡｂを全長抗体に変換した。「ＢＳ−Ａ」軽鎖をコードするプラスミドの構築を本明細書に記載する。類似の方法を用いて、他のＦＡｂをクローニングした。シグナル配列を持つＦＡｂ「ＢＳ−Ａ」を生成するため、３工程ＰＣＲを行った。まず、ＦＡｂ  ｃＤＮＡテンプレートとともにプライマー２５２５−４３（以下に示す）および２５７８−２７（以下に示す）を用いた。ＰＣＲ条件は：ｐｆｕポリメラーゼ、並びに適切な緩衝液およびヌクレオチドを用いて、９４℃１分間、（９４℃２０秒間、４８℃３０秒間、７４℃３０秒間）を４周期、（９４℃２０秒間、６６℃３０秒間、７４℃３０秒間）を２５周期、および７４℃５分間であった。次いで、ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして次いで、プライマー２１４８−９８（以下に示す）および２５７８−２７（以下に示す）で増幅した。次に、再び、ＦＡｂ  ｃＤＮＡテンプレートとともに、プライマー２５７８−２６（以下に示す）および２４６９−６７（以下に示す）を用いた。ＰＣＲ条件は：Ｐｆｕポリメラーゼ、並びに適切な緩衝液およびヌクレオチドを用いて、９４℃１分間、（９４℃２０秒間、４８℃３０秒間、７４℃３０秒間）を４周期、（９４℃２０秒間、６６℃３０秒間、７４℃３０秒間）を２５周期、および７４℃５分間であった。ＰＣＲ産物をゲル単離し、そして同じ条件を用いて再増幅した。最後にゲル単離したＰＣＲ産物をプライマー２４８９−３６（以下に示す）および２４６９−６７（以下に示す）と混合し、そして増幅した。最終ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎで精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断し、そしてＱｉａｇｅｎで精製した。５’コザック（翻訳開始）部位および哺乳動物発現のための以下のシグナル配列：
【０２２５】
【化１０】
2006502739.tif 000013
【０２２６】
とともにＦＡｂを含有するこの断片を、ｐＤＳＲα１９に連結した。
【０２２７】
【化１１】
2006502739.tif 000014
【０２２８】
抗体調製
重鎖および軽鎖全長抗体をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、そして重鎖および軽鎖の発現、並びに細胞培地への分泌を可能にする条件下で培養した。０．４５μｍの酢酸セルロース・フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、マサチューセッツ州アクトン）を通して馴化培地をろ過し、そして塩化カルシウム不含で、そして塩化マグネシウム不含である、ＰＢＳ−ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）で平衡化しておいたプロテインＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）カラムに適用した。試料を適用した後、２８０ｎｍの吸光度がベースラインに達するまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５を用いて、タンパク質の溶出を達成した。分画を収集し、そして１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２を添加することによって、直ちに中和した。クーマシー染色によってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを視覚化することによって抗体を検出した。
【０２２９】
抗体を含有する分画をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０（Ａｍｉｃｏｎ）または体積がより多い場合は、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０（Ａｍｉｃｏｎ）いずれかを用いて、濃縮し、そしてＰＢＳ中に透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）した。
【０２３０】
単離抗体を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上のゲルろ過によって性質決定し、そして該抗体は、単量体ＩｇＧとして移動することが示された。
【０２３１】
（実施例６）
ＦａｂおよびＩｇＧの親和性測定
表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって、結合定数（Ｋｄ）、結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を決定した。Ｆａｂおよび抗体のＢＩＡｃｏｒｅ解析を以下のように行った：ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ．）を室温で用いて、実験を行った。ＣＨＯが発現したｈＩＦＮγをＣＭ５チップに固定した。多様な濃度のＦａｂまたはＦａｂ  ＩｇＧをｈｕ−ＩＦＮγ表面に注入した。ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ  ３．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ，  Ｉｎｃ．）を用いてデータを解析した。結果を図３０に示す。
【０２３２】
（実施例７）
ＦａｂおよびＩｇＧの活性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ中和アッセイ
ＩｇＧに変換されたＦａｂの中和活性をＢＩＡｃｏｒｅ上で試験した（実施例６を参照されたい）。結果を図２９に示す。ＢＳ−Ｂ  ＩｇＧに関して、９ｎＭのＩＣ５０で、ＩＦＮγ−Ｒ１へのｈｕ  ＩＦＮγ結合の濃度依存性阻害が観察された。
【０２３３】
Ａ５４９細胞増殖アッセイ
Ａ５４９増殖アッセイ（実施例１に記載）において、ＦａｂおよびＩｇＧの中和活性測定を以下のように行った：Ａ５４９細胞を、標的化されたＦａｂまたはＩｇＧ（多様な濃度）およびＣＨＯに発現されたｈＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）の混合物で処理した。Ｆａｂ濃度は、０．３〜１５０μｇ／ｍｌの範囲であった。ＩｇＧ濃度は０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲であった。陽性対照Ａｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｂ２７）濃度は、０．０１〜５μｇ／ｍｌの範囲であった。処理５日後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅで細胞を染色し、そして染色４時間後、ＦＬ５００プレート読取装置上で解析した。ＢＳ−Ａ  Ｆａｂ、ＢＳ−Ｂ  ＦａｂおよびＧＰ−Ａ  Ｆａｂに関しては図２６に、そしてＢＳ−Ａ  ＩｇＧおよびＢＳ−Ｂ  ＩｇＧに関しては図２７に結果を示す。図２６のＢＳ−Ａ  ＦａｂおよびＢＳ−Ｂ  Ｆａｂ、並びに図２７のＢＳ−Ａ  ＩｇＧおよびＢＳ−Ｂ  ＩｇＧは、増殖活性として測定した際、高濃度で、陽性対照よりも約２桁高い中和活性を有することが示された。
【０２３４】
本発明は、好ましい態様に関して記載されてきているが、当業者には多様な変型および修飾が思い浮かぶであろうことが理解された。したがって、付随する請求項が、請求された際に本発明の範囲内に属するであろう、こうした同等の変型をすべて含むと意図された。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、主なファージＦａｂクローンのｈＩＦＮγに対する反応性に関するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。２％ＭＰＢＳであらかじめブロッキングしたファージ懸濁物を、ウェルあたり最大１００μｌ用いて、ファージ希釈を行い、ＥＬＩＳＡにおいて典型的な１０９〜１０１１ファージ／ウェルの範囲とした。実施例３に記載するように、ＥＬＩＳＡ用のファージストックを調製した。値は、単一点測定によるものであり、そしてシグナル検出のため、ＯＤ４０５を測定した。
【図２】図２は、主なＦａｂ「ＧＰ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」クローンのｈＩＦＮγに対する反応性に関する、用量依存性クローンファージＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。２％ＭＰＢＳであらかじめブロッキングしたファージ懸濁物を、ウェルあたり最大１００μｌ用いて、ファージ希釈を行い、ＥＬＩＳＡにおいて典型的な１０９〜１０１１ファージ／ウェルの範囲とした。実施例３に記載するように、ＥＬＩＳＡ用のファージストックを調製した。値は、単一点測定によるものであり、そしてシグナル検出のため、ＯＤ４０５を測定した。
【図３】図３は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ａ２」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、Ｆａｂ「５８Ｃ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、Ｆａｂ「ＧＰ−Ａ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、Ｆａｂ「５７Ｄ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、Ｆａｂ「５７Ｅ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、Ｆａｂ「ＩＦＮ−Ａ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、Ｆａｂ「６７Ｃ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、Ｆａｂ「５９−Ａ２」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ｂ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１６は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ｂ１」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は、Ｆａｂ「ＲＤ−Ａ２」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、Ｆａｂ「５８Ｃ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９は、Ｆａｂ「ＧＰ−Ａ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２０】図２０は、Ｆａｂ「５７Ｄ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２１】図２１は、Ｆａｂ「５７Ｅ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２２】図２２は、Ｆａｂ「ＩＦＮ−Ａ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、Ｆａｂ「６７Ｃ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２４】図２４は、Ｆａｂ「５９−Ａ２」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２５】図２５は、Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８−Ｃ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２６】図２６は、Ａ５４９細胞アッセイで測定した際のＦａｂ「ＢＳ−Ａ」および「ＢＳ−Ｂ」の中和活性を示すグラフである。実施例４に記載するようにＦａｂを精製し、そして０．３〜１５０μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度範囲で添加した。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｂ２７  Ａｂ（０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲）を陽性対照として用いた。処理５日後、細胞をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅで染色し、そしてＦＬ５００プレート読取装置上で、染色４時間後に解析した。
【図２７】図２７は、Ａ５４９細胞アッセイで測定した際の「ＢＳ−Ａ」ＩｇＧおよび「ＢＳ−Ｂ」ＩｇＧの中和活性を示すグラフである。実施例４に記載するようにＩｇＧを精製し、そして０．１〜１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度範囲で添加した。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｂ２７  Ａｂ（０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲）を陽性対照として用いた。ｈＩＦＮγと反応しない無関係なＡｂ、ＡＴ−ＩｇＧ（０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度範囲）を陰性対照として用いた。処理５日後、細胞をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅで染色し、そしてＦＬ５００プレート読取装置上で、染色４時間後に解析した。
【図２８】図２８は、ＢｉａＣｏｒｅによって、そしてＡ５４９細胞アッセイにおいて測定した際の、「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８Ｃ」および「６７Ｃ」ＩｇＧの親和性および中和活性の比較を提供する表である。ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮを用いて、ＢＩＡＣＯＲＥデータを解析した。
【図２９】図２９は、ＢＩＡＣｏｒｅで測定した際の「ＢＳ−Ａ」ＩｇＧおよび「ＢＳ−Ｂ」ＩｇＧの中和活性を示すグラフである。相対結合反応（％）を、試料濃度（ｎＭ）に対してプロットしている。
【図３０】図３０は、ＢＩＡＣｏｒｅによって測定した際の、抗ＩＦＮγ  Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＩＦＮ−Ａ」および「ＧＰ−Ａ」、並びに対応するＩｇＧの親和性の比較を提供する表である。
【図３１】図３１は、図３〜２４に示すＦａｂアミノ酸配列の比較を示す。重鎖および軽鎖Ｆａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８−Ｃ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」の予測されるアミノ酸配列を、同一性および類似性に関して比較した。ＧＣＧの「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを用いて、Ｆａｂの各対間の同一性および類似性パーセントを得た。
【図３２】図３２は、重鎖および軽鎖「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＲＤ−Ｂ１」、「ＩＦＮ−Ａ」、「５７Ｅ」、「５７Ｄ」、「ＧＰ−Ａ」、「５８−Ｃ」、「６７Ｃ」および「５９−Ａ２」Ｆａｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）の並列を示す。
【図３３】図３３は、予測されるＦａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」および「ＩＦＮ−Ａ」重鎖アミノ酸配列（それぞれ、図３、６および１１の両端を含む残基１〜１２０、１〜１２７および１〜１２６）と、ＶＨ４ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列４−３４、Ｄ領域配列１−１、３−３または３−１６、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は、３つのフレームワーク領域を指定し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、３つの相補性決定領域を指定し、そしてＨ１、Ｈ２およびＨ３は、フレームワーク領域およびＣＤＲの間の対応する接合部配列を指定する。「ＢＳ−Ａ」、「ＲＤ−Ａ２」、「ＩＦＮ−Ａ」および生殖系列Ｖ、Ｄ、またはＪ配列の間の相違を太字で示す。図３３〜４６の生殖系列アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  米国保健社会福祉省，  第４版（１９９１）に記載されるとおりである。
【図３４】図３４は、予測されるＦａｂ「ＢＳ−Ｂ」、および「５９−Ａ２」重鎖アミノ酸配列（それぞれ、図４および１３の両端を含む残基１〜１２１および１〜１２０）と、ＶＨ１ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列１−１８、Ｄ領域配列６−１３、１−１または１−７、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。
【図３５】図３５は、予測されるＦａｂ「ＲＤ−Ｂ１」重鎖アミノ酸配列（図５の両端を含む残基１〜１１９）と、ＶＨ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列２−２６、Ｄ領域配列３−２２、およびＪ領域配列ＪＨ５を含む。
【図３６】図３６は、予測されるＦａｂ「５８Ｃ」重鎖アミノ酸配列（図７の両端を含む残基１〜１１９）と、ＶＨ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３−２１、未知のＤ領域配列、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。
【図３７】図３７は、予測されるＦａｂ「ＧＰ−Ａ」重鎖アミノ酸配列（図８の両端を含む残基１〜１２４）と、ＶＨ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３−３０．３、Ｄ領域配列３−１０、およびＪ領域配列ＪＨ３を含む。
【図３８】図３８は、予測されるＦａｂ「５７Ｄ」重鎖アミノ酸配列（図９の両端を含む残基１〜１１７）と、ＶＨ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３−５３、Ｄ領域配列３−１６、および未知のＪ領域配列を含む。
【図３９】図３９は、予測されるＦａｂ「５７Ｅ」重鎖アミノ酸配列（図１０の両端を含む残基１〜１１８）と、ＶＨ４ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列４−６１、Ｄ領域配列７−２７、およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。
【図４０】図４０は、予測されるＦａｂ「６７Ｃ」重鎖アミノ酸配列（図１２の両端を含む残基１〜１１９）と、ＶＨ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列２−０５、Ｄ領域配列５−１８、およびＪ領域配列ＪＨ６を含む。
【図４１】図４１は、予測されるＦａｂ「ＢＳ−Ａ」、「ＢＳ−Ｂ」、「５７Ｅ」および「５９−Ａ２」軽鎖アミノ酸配列（それぞれ、図１４、１５、２１および２４の両端を含む残基１〜１１１、１〜１１０、１〜１１２および１〜１１０）と、Ｖλ６ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列６ａおよび未知のＪ領域配列あるいはＪＬ２またはＪＬ３を含む。
【図４２】図４２は、予測されるＦａｂ「ＲＤ−Ｂ１」軽鎖アミノ酸配列（図１６の両端を含む残基１〜１１２）と、Ｖκ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列Ａ２３およびＪ領域配列ＪＫ２を含む。
【図４３】図４３は、予測されるＦａｂ「ＲＤ−Ａ２」、「ＩＦＮ−Ａ」および「６７Ｃ」軽鎖アミノ酸配列（それぞれ、図１７、２２および２３の両端を含む残基１〜１１２、１〜１１０、１〜１１２および１〜１１０）と、Ｖκ２ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列Ａ１９、並びにそれぞれＪ領域配列ＪＫ３、ＪＫ２およびＪＫ２を含む。
【図４４】図４４は、予測されるＦａｂ「５８Ｃ」軽鎖アミノ酸配列（図１８の両端を含む残基１〜１０８）と、Ｖλ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３ｈおよび未知のＪ領域配列を含む。
【図４５】図４５は、予測されるＦａｂ「ＧＰ−Ａ」軽鎖アミノ酸配列（図１９の両端を含む残基１〜１０６）と、Ｖλ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列２−１９およびＪ領域配列ＪＬ２またはＪＬ３を含む。
【図４６】図４６は、予測されるＦａｂ「５７Ｄ」軽鎖アミノ酸配列（図２０の両端を含む残基１〜１０８）と、Ｖκ３ファミリー由来の生殖系列配列の比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列Ａ２７およびＪ領域配列ＪＫ５を含む。
【図４７】図４７は、Ｆａｂクラスの比較を示す。多配列比較解析用のＧＣＧ（遺伝学コンピュータグループ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１１）ＰｉｌｅＵｐプログラムを用いて、Ｆａｂクラス比較を行った。記号（＊＊）は、既知の生殖系列配列には関連していたが、最も密接なマッチング多様性（Ｄ）領域または連結領域（Ｊ）が決定不能であったことを示す。記号（＊）は、同定された連結領域に比較して、１、２または３残基の変異が起きたことを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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