(57)【要約】本発明は、患者の血液等の対象物を分析するための分析装置、特に分光分析装置と、対応の分析方法とに関する。励起系（ｅｘｓ）が、ターゲット領域を励起するための励起ビーム（ｅｘｂ）を発し、ビーム分離ユニット（ｈｍ）が、ターゲット領域において励起ビーム（ｅｘｂ）により発生させられた散乱放射について、弾性散乱放射の少なくとも一部を、非弾性散乱放射から分離する。モニタリング系（ｌｓｏ）は、弾性散乱放射または非弾性散乱放射を用いて、ターゲット領域の画像を生成し、その画像内における関心領域を画定する。ラマンスペクトルの記録効率を高めるため、ターゲット領域の画定された関心領域が励起されるように励起系（ｅｘｓ）を制御し、かつ／または、画定された関心領域からの信号のみが検出されるように検出系（ｄｓｙ）を制御する制御ユニット（ｃｔｒｌ）が設けられ、さらに、励起ビームによって発生させられた、画定された関心領域からの散乱放射を検出する検出系（ｄｓｙ）が設けられている。好ましくは、画定された関心領域上に亘ってレーザーの励起パワーを分散させることにより、画定された関心領域からの信号が平均される。
2006512575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を分析するための分析装置、特に分光分析装置であって、
−  ターゲット領域を励起するための励起ビームを発する励起系と、
−  前記ターゲット領域において前記励起ビームにより発生させられた散乱放射について、弾性散乱放射の少なくとも一部を、非弾性散乱放射から分離するビーム分離ユニットと、
−  前記弾性散乱放射または前記非弾性散乱放射を用いて、前記ターゲット領域の画像を生成し、該画像内における関心領域を画定するためのモニタリング系と、
−  前記励起ビームによって発生させられた、前記画定された関心領域からの散乱放射を検出する検出系と、
−  前記ターゲット領域の前記画定された関心領域が励起されるように、前記励起系を制御し、かつ／または、前記画定された関心領域からの信号のみが検出されるように、前記検出系を制御する制御ユニットとを含むことを特徴とする分析装置。
【請求項２】
前記モニタリング系が、前記画像内のコントラスト情報を用いて、異なる画像部分を区別するようにされていることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項３】
前記モニタリング系が、検出された前記散乱放射中のスペクトル情報を用いて、異なる画像部分を区別するようにされていることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項４】
前記検出系が、ラマン信号中の高周波スペクトル部分、特に蛋白質および水からの寄与を含む部分を、低周波スペクトル部分、特に指紋スペクトル領域から分離するための、フィルタを含んでいることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項５】
前記モニタリング系が、前記ターゲット領域を撮像するためのモニタリングビームを発するようにされていることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項６】
出力ビームを発する放射源と、
前記モニタリングビームおよび前記励起ビームを、前記出力ビームから分離する光分離系とをさらに含むことを特徴とする請求項５記載の分析装置。
【請求項７】
前記モニタリング系が、共焦点走査レーザー顕微鏡を含み、
前記検出系が、該共焦点走査レーザー顕微鏡と、共焦点関係を有することを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項８】
前記モニタリング系が、直交偏光スペクトル撮像構成を含んでいることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項９】
前記制御系が、前記画定された関心領域上に亘ってレーザーパワーを分散させるよう、前記励起系を制御するようにされていることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項１０】
前記制御系が、前記画定された関心領域の一部からの不要な信号をブロックし、前記画定された関心領域からの所望の信号のみを検出するよう、前記検出系を制御するようにされていることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項１１】
対象物を分析するための分析方法、特に分光分析方法であって、
−  ターゲット領域を励起するための励起ビームを発する工程と、
−  前記ターゲット領域において前記励起ビームにより発生させられた散乱放射について、弾性散乱放射の少なくとも一部を、非弾性散乱放射から分離する工程と、
−  前記弾性散乱放射または前記非弾性散乱放射を用いて、前記ターゲット領域の画像を生成する工程と、
−  前記画像内における関心領域を画定する工程と、
−  前記ターゲット領域の前記画定された関心領域が励起されるように、励起系を制御し、かつ／または、前記ターゲット領域の前記画定された関心領域からの信号が検出されるように、検出系を制御する工程と、
−  前記励起ビームによって発生させられた、前記画定された関心領域からの散乱放射を検出する工程とを含むことを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の血液等の対象物を分析するための分析装置、特に分光分析装置と、対応の分析方法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、分光分析装置等の分析装置は、検査対象物の組成を調べるために用いられる。とりわけ、分析装置は、対象物の物質の、可視光、赤外放射、または紫外放射といった入射電磁放射との相互作用に基づく、スペクトル分解等の分析を用いている。
【０００３】
励起系とモニタリング系とを備えた１つの分光分析装置が、国際公開公報ＷＯ０２／０５７７５９Ａ２号より知られている。この特許文献の内容は、参照により本明細書に含まれているものとする。励起系は、励起期間中において、ターゲット領域を励起するための励起ビームを発する。モニタリング系は、モニタリング期間中において、ターゲット領域を撮像するためのモニタリングビームを発する。励起期間とモニタリング期間とは、実質的な重複を有する。そのため、ターゲット領域は、励起と共に撮像され、ターゲット領域と励起領域との両方を表示する画像が形成される。この画像に基づいて、励起ビームを極めて精確にターゲット領域に向けることができる。
【０００４】
国際公開公報ＷＯ９６／２９５７１Ａ１号は、キャピラリー（毛細管）の内容物のラマン散乱信号を利用することにより、蛍光検出の用途のため、キャピラリーと励起レーザービームとの光学的なアラインメントを取るシステムおよび方法を開示している。たとえば、キャピラリー電気泳動系におけるアラインメントのため、電気泳動分離基材によるラマン散乱を利用することが可能である。蛍光材料が存在していてもよいし、アラインメントの目的のために使用されてもよいが、かかる蛍光材料は必須ではない。この発明は、開口を有する放物面状の反射器を用いている。キャピラリーとレーザービームとは、この開口を通って、互いに交わるように（好ましくは、反射器の焦点において直交するように）案内される。キャピラリー内の材料のラマン散乱信号が、一連のフィルタを介して収集され、この情報が、ラマン散乱信号が最大となるように、必要であれば、励起ビームを反射器およびキャピラリー内へと向かわせる集光レンズを再配置するために用いられる。最大のラマン散乱信号は、キャピラリーと励起ビームとの適当なアラインメントが取れたことを示す。その後、試料からの蛍光放射等の他の信号が収集されてもよい。キャピラリーの内容物の分析中に亘ってキャピラリーとビームとのアラインメントが維持されるように、集光レンズの調整が自動化されてもよい。励起ビームに対するキャピラリーのアレイの順次アラインメントも開示されている。
【０００５】
局所的な組成の分光分析と撮像とを同時に行う、国際公開公報ＷＯ０２／０５７７５９Ａ２号より知られている分析方法は、共焦点のビデオ撮像およびラマン励起のための、別個のレーザーにより実行される。非侵襲性の血液分析への応用の場合、レーザーは、特定の血管に向けられる。欠点は、別個の共焦点ビデオ顕微鏡とラマン系とのために、２つの別個のレーザーを使用する点である。さらに、血管のトラッキングを行うために、画像処理ソフトウェア手段が必要である。単一のレーザーを用いることにより、統合された撮像およびラマン分析を行う実施形態も開示されている。しかしながら、撮像時間とラマンスペクトル分析時間との実質的な重複内において、画像中の血管を探索し、かつ高い信号対雑音比でその血管のラマンスペクトルを記録することの問題は、いまだ解決されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の１つの目的は、高い信号対雑音比を有するラマンスペクトルおよび分析を与え、かつ撮像とラマン励起との両方のために単一のレーザーの使用を許容する、対象物の撮像および分光分析のための最適化された分析装置、および対応の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、上記の目的は、請求項１に記載されているような、
−  ターゲット領域を励起するための励起ビームを発する励起系と、
−  ターゲット領域において励起ビームにより発生させられた散乱照射について、弾性散乱放射の少なくとも一部を、非弾性散乱放射から分離するビーム分離ユニットと、
−  上記の弾性散乱放射または非弾性散乱放射を用いて、ターゲット領域の画像を生成し、その画像内における関心領域を画定するためのモニタリング系と、
−  ターゲット領域の上記の画定された関心領域が励起されるように、上記の励起系を制御し、かつ／または、画定された関心領域からの信号のみが検出されるように、検出系（ｄｓｙ）を制御する制御ユニットと、
−  励起ビームによって発生させられた、画定された関心領域からの散乱放射を検出する検出系とを含むことを特徴とする分析装置によって達成される。
【０００８】
上記の目的はまた、請求項１０に記載されているような対応の分析方法によっても達成される。
【０００９】
本発明は、励起系を使用してターゲット領域の画像を生成するという思想に基づいている。励起ビームに応答してターゲット領域において発生させられた弾性散乱光または非弾性散乱光が、画像（たとえば、血管を伴う患者の皮膚の画像）を提供するために用いられる。画像情報に基づいて、特定の血管へと関心領域をズームすることができ、その関心領域内の各画素からのラマンスペクトルを記録することができる。ここでの発想は、関心領域が、血管部分を完全にまたはほぼ完全にカバーしているという発想である。
【００１０】
また、ターゲット領域の画像全体中の各画素のラマンスペクトルを検出することも可能である。その後、スペクトル情報に基づいて、血管を伴う最良の関心領域が選択され、さらに、より高速のラマン信号取得時間のための、関心領域のズームが実行される。
【００１１】
本発明は、撮像とラマンスペクトル検出との両方に、単一のレーザーを使用することができるという利点を有する。すなわち、ラマン励起ビームが、ターゲット領域の励起と、撮像との両方に用いられる。また、固定点記録と比べて、血液についての大きな積分ラマン信号を得ることができる。さらに、ラマンスペクトル情報は、別個の画像処理手段を用いた血管のターゲットトラッキングにも用いることができる。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態は、各従属請求項において規定されている。モニタリング系の異なる実施形態が、請求項２および３において規定されている。異なる画像部分を区別するため（たとえば、画像内の血液と皮膚とを含む画素を区別するため）、画像内のコントラスト情報、または検出された散乱放射中のスペクトル情報を用いることが可能である。
【００１３】
画像分析においてコントラスト情報を用いる場合、ラマン信号を分析する必要はない。画像内の血管は、強度コントラスト、または強度変動のコントラストによって同定可能である。このことの利点は、画像フレームレートが、通常、ラマン信号取得時間よりもずっと高い点である。このことは、必要な画像処理を犠牲にする分、画像分析が、スペクトル分析よりも高速であることを意味する。スペクトル分析を用いる場合には、血液または皮膚は、特徴が異なるスペクトル特性を有するために同定が可能である。その利点は正確な局所的分子の同定であるが、スペクトル分析は、画像分析に比べて低速である。
【００１４】
血液と皮膚との区別は、関心領域（ＲＯＩ）内において、蛋白質の信号寄与分に対する水の信号寄与分の比をモニタリングすることにより、実行することができる。血液中における水／蛋白質比（ＷＰＲ）は、血管周辺の皮膚における水／蛋白質比よりも、かなり高い。これは、コラーゲンが相当の含有率で存在するためである。水／蛋白質比を特定するために、フィルタを用いて、ラマン信号中の高周波スペクトル部分、特に蛋白質および水からの寄与を含む部分を、低周波スペクトル部分、特に指紋スペクトル領域から分離することが可能である。
【００１５】
本発明に係る分析装置は、２レーザー型の装置であってもよいし、単一レーザー型の装置であってもよい。２レーザー型の装置では、１つのレーザーが励起ビームを生成するために用いられる一方、別の１つのレーザーがモニタリングビームを発するために用いられる。たとえば、励起ビームは、単一のスポットを分析するための静止ビームであっても、走査ビームであってもよく、一方、モニタリングビームは、好ましくは画像を形成するための走査ビームである。単一レーザー型の実施形態では、好ましくは、放射源（すなわちレーザー）によって発生させられた元の出力ビームが、適当な光分離手段によって、モニタリングビームと励起ビームとに分割される。
【００１６】
他の好ましい実施形態によれば、モニタリング系は、共焦点ビデオ顕微鏡を含んでいてもよく、その場合、検出系は、共焦点ビデオ顕微鏡と共焦点関係を有する。あるいは、モニタリング系は、直交偏光スペクトル撮像構成を含んでいてもよい。かかるモニタリング系の詳細は、上記の国際公開公報ＷＯ０２／０５７７５９Ａ１号に開示されている。
【００１７】
画定された関心領域上に亘って励起レーザーのレーザーパワーを分散させることにより、画定された関心領域からの信号を平均すると、さらに有利である。このことは、最大入射パワーの制限に関連しても重要なことである。
【００１８】
制御系の種々の実施形態には、画定された関心領域上に亘ってレーザーパワーを分散させるが、全関心領域（当初の関心領域）に亘ってはレーザーパワーを分散させないよう、上記の励起系を制御するようにされた実施形態が含まれる。制御系の別の１つの実施形態は、画定された関心領域の一部からの不要な信号（たとえば周囲の皮膚）をブロックし、画定された関心領域からの所望の信号（たとえば血液）のみを検出するよう、上記の検出系を制御するようにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００２０】
図１は、本発明に従う１つの分析システムを示した図である。この分析システムは、検査対象物（ｏｂｊ）の光学的画像を形成するための、光学撮像系（ｌｓｏ）を含んでいる。この光学撮像系（ｌｓｏ）は、共焦点ビデオ顕微鏡を形成している。この例では、対象物は、検査されるべき患者の前腕部の皮膚片である。分析システムはさらに、対象物（ｏｂｊ）内において多光子光学過程または非線形光学過程により発生させられた光の分光分析のため、多光子型、非線形型、または弾性散乱型もしくは非弾性散乱型の光検出系（ｏｄｓ）を含んでいる。図１に示した例は、特に、ラマン分光装置の形態の、非弾性ラマン散乱検出系（ｄｓｙ）を用いている。光学（的）および光との語は、可視光のみではなく、紫外放射および赤外放射（特に近赤外放射）も包含する。
【００２１】
光源（ｌｓ）は、たとえば、８５０ｎｍ赤外ビームの形態の励起ビーム（ｅｘｂ）を生成する、アルゴンイオン／チタンサファイアレーザーによって形成される。チタンサファイアレーザーは、たとえば、アルゴンイオンレーザーにより光ポンピングされる。レーザーの赤外励起ビーム（ｅｘｂ）は、光学撮像系により、出射側焦点において、対象物（ｏｂｊ）内または対象物（ｏｂｊ）上の焦点面内に合焦させられる。光学撮像系は、偏光ビームスプリッタ（ｐｂｓ）、回転反射多面体（ｐｇｎ）、レンズ（ｌ１、ｌ２）、走査ミラー（ｓｍ）、および顕微鏡対物レンズ（ｍｏ）を含んでいる。反射多面体（ｐｇｎ）を回転させ、かつ走査ミラー（ｓｍ）を移動させることにより、合焦させられた励起ビーム（ｅｘｂ）が、焦点面上を横切って移動させられる。半導体レーザー（ｌｓ）の出射面は、入射側焦点にある。半導体レーザー（ｌｓ）はまた、入射側焦点において、入射ピンホールに光を当てることもできる。この光学撮像系は、焦点面から反射された光を、戻りビームとして、偏光ビームスプリッタ（ｐｂｓ）を介して、アバランシェフォトダイオード（ａｐｄ）へと伝達する。さらに、戻りビームの偏光が励起ビームの偏光に対して垂直となるように、顕微鏡対物レンズ（ｍｏ）の前段に、λ／４板が配されている。このようにして、偏光ビームスプリッタ（ｐｂｓ）は、戻りビームを励起ビームから分離する。
【００２２】
光学表示ユニット（ｏｐｄ）は、アバランシェフォトダイオード（ａｐｄ）の出力信号を用いて、検査対象物内または検査対象物上の焦点面の画像（ｉｍｇ）を形成する。この画像（ｉｍｇ）は、モニタ上に表示される。実際には、光学表示ユニットはワークステーションであり、ワークステーションのプロセッサを用いて、アバランシェフォトダイオード（ａｐｄ）の出力信号から電子ビデオ信号を導出することにより、画像が実現される。この画像は、分光検査をモニタリングするため、特に、励起領域がターゲット領域上に入るようにしてターゲット領域を励起させ、ターゲット領域からの散乱放射を受光するために用いられる。
【００２３】
ラマン分光装置（ｏｄｓ）は、励起系（ｅｘｓ）として、撮像系（ｌｓｏ）で使用されるレーザーと同一のレーザー（ｌｓ）を含んでいる。ラマン散乱は、走査ミラー（ｓｍ）、レンズ（ｌ１、ｌ２）、および回転多面体（ｐｇｎ）によって、励起ビームと同一の光路に沿って反射される。反射された散乱光の方向に見て、回転多面体の後段の光路内には、反射光ビーム内の弾性散乱光から、ラマン散乱光（すなわち励起ビームとは異なる波長を有する非弾性散乱光）を分離するための、ホットミラー（ｈｍ）が配されている。
【００２４】
ラマン散乱光は、別の１つのミラー（ｍ）によってファイバー（ｆｂｒ）の入射端へと向けられ、さらに、ファイバー入射端（ｆｂｒ−ｉ）の前段に配されたノッチフィルタ（ｎｆ）およびレンズ（ｌ３）によって、検出ピンホール内のファイバー入射端に合焦させられる。ファイバー入射端自体が、検出ピンホールとして作用する。光学撮像系（ｌｓｏ）は、半導体レーザー（ｌｓ）が存在する入射側焦点と、検査対象物（ｏｂｊ）の詳細部分の領域にある出射側焦点と、ファイバー入射端にある検出焦点との間に、共焦点関係を確立する。ファイバー（ｆｂｒ）は、ＣＣＤ検出器（ＣＣＤ）を伴う分光計（ｓｐｍ）の入力部に接続されている。ＣＣＤ検出器を伴う分光計は、約１０５０ｎｍ未満の波長についてラマンスペクトルを記録する、検出系（ｄｓｙ）内に組み込まれている。ＣＣＤ検出器を伴う分光計の出力信号は、ラマン散乱された赤外光のラマンスペクトルを表す。実際には、このラマンスペクトルは、励起波長に応じて、８６０ｎｍを超える波長範囲内において生じる。ＣＣＤ検出器の信号出力部は、スペクトル表示ユニット（ｓｐｄ）に接続されている。このスペクトル表示ユニット（ｓｐｄ）は、たとえば、記録されたラマンスペクトル（ｓｐｃｔ）をモニタ上に表示するワークステーションである。
【００２５】
実際には、光学表示ユニットとスペクトル表示ユニットとの機能は、同一のワークステーションによって実行することが可能である。たとえば、モニタの表示面の別個の部分（ウインドウ）が、光学的画像とラマンスペクトルとの同時表示に用いられてもよい。一般的な分析装置およびその機能のさらなる詳細については、上記の国際公開公報ＷＯ０２／０５７７５９Ａ１号を参照されたい。
【００２６】
本発明に従い、対象物（ｏｂｊ）のターゲット領域の、特定の画定された関心領域のみが励起されるように励起系（ｅｘｓ）を制御し、かつ／または、画定された関心領域の一部からの不要な信号（たとえば周囲の皮膚）をブロックし、画定された関心領域からの所望の信号（たとえば血液）のみを検出するように検出系（ｄｓｙ）を制御する、制御ユニットが設けられる。
【００２７】
これにより、検出系（ｏｄｓ）から受け取った、検出された散乱放射中のスペクトル情報またはコントラスト情報を用いて、画定された領域が、モニタリング系（ｏｐｄ）によって生成される。すなわち、本発明によれば、この特定の実施形態では励起ビームの弾性散乱光を用いることにより、図２ａおよび２ｂに示すように、全撮像野（ＦＯＶ）が撮像される。その後、画像内において、より小さな視野を有する関心領域（ＲＯＩ）が画定される。この関心領域（ＲＯＩ）は、図２ａおよび２ｂに示すように、たとえば血管Ｖを含む。これにより、関心領域は、図２ｂに示すように対象物（Ｖ）のサイズおよび形状に適合化されてもよいし、図２ａに示すように長方形とされてもよい。
【００２８】
その後、制御ユニット（ｃｔｒｌ）を用いて、励起ビームの走査が、限られたサイズの関心領域に合わせて設定され、この関心領域からの散乱放射のみが収集される。この特定の実施形態では、非弾性散乱放射のみが、ラマン検出系（ｄｓｙ）によって検出される。したがって、関心領域（ＲＯＩ）内のすべての画素について、血液からのラマン信号が収集され、その結果、既知の分析方法に比べて大きなラマン信号が得られる。
【００２９】
図２ａに示すような血管または血管部分をほぼ完全にカバーするため、ＲＯＩをズームする場合の意図は、血液と皮膚とを区別し、血液の領域からの信号のみを検出することである。すなわち、ＲＯＩ内の血液でない画素においては、励起または検出のいずれかがブロックされる。血液と皮膚との区別は、ＲＯＩ内における、蛋白質の信号寄与分に対する水の信号寄与分の比をモニタリングすることにより、実行することができる。血液中における水／蛋白質比（ＷＰＲ）は、血管周辺の皮膚における水／蛋白質比よりもかなり高い。これは、コラーゲンが相当の含有率で存在するためである。
【００３０】
通常、組織または血液の特徴は、指紋スペクトル領域（０−２０００ｃｍ−１）より特定される。高周波スペクトル領域（２０００−４０００ｃｍ−１）は、蛋白質の帯域と水の帯域との両方を含んでいる。これらの帯域におけるラマン強度は、容易に特定することができ、それにより、ＲＯＩ内の各画素においてモニタリングが実行される。
【００３１】
指紋スペクトル領域と水／蛋白質スペクトル領域とを生成するため、低周波スペクトル領域と高周波スペクトル領域とを分離するフィルタを用いることができる。蛋白質の帯域内の信号および水の帯域内の信号を積分して、２つの信号を与えることにより、ＷＰＲを特定することができる。このことは、図３に示すように、高周波スペクトル部分を低周波スペクトル部分から分離するフィルタを用いることにより、またはＣＣＤカメラより対応の画素を読み出すことにより、実行可能である。
【００３２】
本発明に従う分析方法の１つの実施形態の、主要なステップを示したブロック図が、図４に示されている。画像分析を利用する場合には、皮膚内における血管の探索は、たとえば直交偏光スペクトル撮像（ＯＰＳＩ）における画素強度のコントラストの選択、または共焦点走査レーザー顕微鏡法（ＣＳＬＭ）における画素強度の変動の選択によって実行される。スペクトル分析を利用する場合には、血液のスペクトル特性の選択により、血管が探索される。ラマン測定のための最良のターゲット血管の位置を特定し選択する（ステップＳ１）ためには、上記のいずれの方法を用いてもよいし、それらの組合せを用いてもよい。
【００３３】
血管の選択の後、図２ａおよび２ｂに示すような、血管（または血管部分）を伴うより小さなＦＯＶを選択するために、ズームが実行される（Ｓ２）。このズームは、以下の種々の方法により実行可能である。
【００３４】
２個のレーザーを用いて：画像走査ビーム（モニタリングビーム、ｉｒｂ）が、画定されたＲＯＩへとズームされ、固定された静止ラマンビーム（励起ビーム、ｅｘｂ）が、血管内の固定点にズームされる（Ｓ２）。
【００３５】
２個のレーザーを用いて：画像走査ビーム（ｉｒｂ）とラマン励起走査ビーム（ｅｘｂ）との両方が、画定されたＲＯＩ領域へとズームされる。ラマン励起レーザーパワーは、固定点のみに向けられるのではなく、ＲＯＩ領域上に亘って分散されるので、ラマン信号は、収集され、ＲＯＩ内の全画素に亘って平均されることとなる。低周波領域および高周波領域について、フィルタが使用される（Ｓ３）。フィルタリング（Ｓ４）を用いて、高周波領域からＷＰＲが特定され、モニタリングされる（Ｓ５）。このＷＰＲより、皮膚または血液の画素を検出することができる（Ｓ６）。ＷＰＲのモニタリングを用いて皮膚の画素と血液の画素とのいずれがターゲットとされているかを検出する場合には、血液の画素のみからラマン信号を収集し、皮膚の画素については励起または検出をブロックすることにより、皮膚対血液比を改善することができる。
【００３６】
１個のレーザーを用いて：ラマン励起ビーム（ｅｘｂ）が、画定されたＲＯＩへとズームされる。励起ビームの一部は、画定されたＲＯＩの画像分析のための弾性光散乱を発生させ、皮膚および血液を検出するために用いられ、別の一部は、画定されたＲＯＩからの非弾性光散乱（ラマン信号）のために用いられる。この方法では、励起がブロックされると、画像または信号を分析するための入力がもはや存在しなくなる。したがって、検出がブロックされる。ラマン励起レーザーパワーは、固定点に向けられるのではなく、画定されたＲＯＩ領域上に亘って分散されるため、ラマン信号は、収集され、画定されたＲＯＩ内のすべての血液の画素に関して平均される。
【００３７】
１個のレーザーを用いて：ラマン励起ビームが、画定されたＲＯＩへとズームされる。励起ビームの一部は、画定されたＲＯＩの画像分析のための弾性光散乱を発生させ、皮膚および血液を検出するために用いられ、別の一部は、画定されたＲＯＩからの非弾性光散乱（ラマン信号）のために用いられる。低周波領域および高周波領域について、フィルタリングがなされる（Ｓ３）。フィルタリング（Ｓ４）を用いて、高周波領域からＷＰＲが特定され、モニタリングされる（Ｓ５）。このＷＰＲより、皮膚または血液の画素を検出し（Ｓ６）、検出を開始させることができる。ラマン励起レーザーパワーは、固定点に向けられるのではなく、画定されたＲＯＩ領域上に亘って分散されるので、ラマン信号は、収集され、ＲＯＩ内のすべての血液の画素に亘って平均される。
【００３８】
ＷＰＲの特定は、対応のＣＣＤの画素の読出し、またはスペクトルのフィルタリングによって行うことができる（Ｓ３）。さらに、低周波領域（いわゆる指紋領域）から、ＰＬＳ分析を行うことも可能である（Ｓ７）。このＰＬＳ分析は、画定されたＲＯＩ内における血液含有率の特定（Ｓ８）を可能とする。
【００３９】
図５は、光分離系を含む、本発明に係る分析システムの１つの実施形態を、概略的に示した図である。λ１のレーザーが、共焦点撮像に使用され、同時にラマン励起にも使用される放射源を形成する。ビームは、たとえば２０−８０％のビームスプリッタ（ＢＳ１）によって形成された光分離系（ｓｅｐ）により、２つに分割される。一部が共焦点撮像に使用され、他方の一部がラマン励起に使用される。モニタリングビーム（ｉｒｂ）は、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）によって直線偏光させられている。画像を形成するため、共焦点ビデオ顕微鏡内の走査ビーム経路は、Θ−Φミラーによって、ｘ−ｙ平面内において方向変換させられている。レンズＬ１およびＬ２がビーム拡大のために用いられており、Ｌ２は、Θ−Φミラーの中心部分の像を、顕微鏡対物レンズ（ｍｏ）の入射瞳上に形成するために用いられている。このようにして、Θ−Φミラーから反射されたレーザー光は、Θ−Φミラーの実際のΘ−Φ位置によらず、常に同一位置において対物レンズに入射する。
【００４０】
直線偏光させられたモニタリングビーム（λ１；ｉｒｂ）は、１／４波長版λ／４によって、円偏光に変換される。ラマン励起ビームは、高域通過フィルタ（ＨＰＦ）において反射され、ミラー（Ｍ１、Ｍ２）および反射ビームスプリッタ（ＢＳ２）を通って、対物レンズへと向けられる。戻り経路において、対象物からの反射光は、再び直線偏光に変換されるが、ここでは、入射ビームの偏光方向に対して、９０°シフトされた偏光方向となる。反射ビームスプリッタ（ＢＳ２）を透過した光（一部はモニタリングビームであり、一部は弾性散乱されたラマン光である）は、その後、画像および画像内のラマンスポットを形成するため、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）により、ＡＰＤ検出器へ向けて方向変換される。対象物からの、弾性散乱および非弾性散乱されたラマン光は、ＢＳ２において反射される。非弾性散乱されたラマン光（λＲ）は、高域通過フィルタ（ＨＰＦ）を透過し、ラマン検出光路へと向けられる。ビームスプリッタ（ＢＳ２）は、スポット反射器に置き換えられてもよい。
【００４１】
図１に示す第１の実施形態に関連して上記に説明したように、撮像系（ｏｐｄ）から受け取った情報に基づいて、上記に説明したようなやり方で、励起系（ｅｘｓ）および／または検出系（ｄｓｙ）を制御する制御ユニット（ｃｔｒｌ）が設けられる。
【００４２】
図６は、モニタリング系が直交偏光スペクトル撮像構成とされた、本発明にかかる分析装置のさらに別の実施形態を、概略的に示した図である。この実施形態は、ＯＰＳＩによる撮像と、ラマン分光とを組み合わせたものである。直交偏光スペクトル撮像（ＯＰＳＩ）のために、特定の波長帯の光源（ｌｓ）が使用される。この実現のため、白色光源が、帯域通過フィルタ（λ−Ｆｔｒ）によってフィルタリングされる。この光が、偏光子（Ｐ）によって直線偏光させられ、その後、対物レンズ（Ｏｂｊ）によって対象物内に合焦させられる。反射された光は、直交する偏光方向で、アナライザを介して検出される。このことは、濁りを有する（ｔｕｒｂｉｄ）対象物（組織）深部からの多重散乱された（乱反射された）光に由来する、偏光解除された光のみが検出されることを意味する。これらの光子の後方散乱は、ＣＣＤ検出器（ＣＣＤ）における像に大なり小なり均一な輝度を与える、一種の「バックライト照明」を生成する。浅部の対象物（たとえば皮膚中の毛細管）内における吸収に（部分的に）対応する波長を適当に選択することにより（λ−Ｆｔｒ）、これらの対象物は、明るい背景上に、（吸収を介して）逆に暗く現れる。フィルタその他のビーム組合せユニットを用いた共焦点撮像における手法と類似の手法により、ラマン励起ビームが、ＯＰＳＩ画像内にカップリングされ得る。ＯＰＳＩの利点は、とりわけ、そのコンパクトさおよび低いコストにある。
【００４３】
ここでも、図１に示す第１の実施形態に関連して上記に説明したように、撮像系（ｏｐｄ）から受け取った情報に基づいて、上記に説明したようなやり方で、この実施形態ではモニタリングビーム（ｉｒｂ）を発生させるための光源（ｌｓ）と別個のものとされた励起系（ｅｘｓ）を制御し、かつ／または検出系（ｄｓｙ）を制御するための、制御ユニット（ｃｔｒｌ）が設けられる。
【００４４】
本発明は、画像内における血管の探索と、高ＳＮＲでのその血管のラマンスペクトルの記録とを可能とする。本発明の可能な適用分野としては、材料のチップ遠隔分析における組成のような組成の局所的分析、非侵襲性の血液分析、または製造環境中における高速オンライン分析処理が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明に係る分析システムの第１の実施形態を示した図
【図２ａ】撮像野と、画像内のある関心領域とを示した図
【図２ｂ】撮像野と、画像内の別の関心領域とを示した図
【図３】組織の高周波成分のラマン信号強度を示したグラフ
【図４】本発明に係る方法のブロック図
【図５】本発明に係る分析システムの第２の実施形態を示した図
【図６】本発明に係る分析システムの第３の実施形態を示した図
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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