(57)【要約】本発明は、コヌカグサＡＳＲ−３６８植物および種子を提供する。また、ＤＮＡ配列に基づき、コヌカグサＡＳＲ−３６８の存在を検出するアッセイおよびＤＮＡ検出方法における分子マーカーとしてのこのＤＮＡ配列の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４８１６下で寄託されているコヌカグサ植物の代表的な種子を有するＡＳＲ−３６８と命名されたコヌカグサ植物の種子。
【請求項２】
請求項１記載の種子を生育することによって生産されるコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８またはその部分。
【請求項３】
花粉、胚珠、種子、根、または葉を含む請求項２記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８またはその部分。
【請求項４】
さらに、その子孫を含む請求項２記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項５】
該コヌカグサ植物またはその子孫のゲノムが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４よりなる群から選択されるＤＮＡ分子を含む請求項４記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項６】
該コヌカグサ植物が、グリフォセートに対して耐性がある請求項５記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項７】
該ＤＮＡ分子が、コヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８のゲノムから単離された請求項５記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項８】
芝スタンドを含む請求項６記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項９】
該芝がゴルフコースとして使用される請求項８記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項１０】
該ゴルフコースがグリーン、ティー、またはフェアウェイを含む請求項９記載のコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８。
【請求項１１】
コヌカグサ植物または種子であって、そのゲノムが、該コヌカグサ植物または種子から抽出されたＤＮＡからアンプリコンを生産するＤＮＡ増幅方法でテストされる時に、コヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生じ、ここに、該アンプリコンが配列番号：１または配列番号：２を含むことを特徴とする該コヌカグサ植物または種子。
【請求項１２】
アンプリコンが、配列番号：１１および配列番号：１２、および配列番号：１３および配列番号：１４よりなる群から選択されるＤＮＡプライマー対で生産される請求項１１記載のコヌカグサ植物または種子。
【請求項１３】
配列番号：３または配列番号：４の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドの単離されたＤＮＡプライマー分子、またはその相補体を含み、ここに、コヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８ゲノムＤＮＡを有するＤＮＡ増幅方法において使用される時に、該ＤＮＡプライマー分子が配列番号：１または配列番号：２を含むアンプリコンを生産することを特徴とする、試料中のコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８またはその子孫ゲノムＤＮＡの検出に特異的なＤＮＡ検出キット。
【請求項１４】
配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４よりなる群から選択される単離されたＤＮＡプライマー分子を含む請求項１３記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１５】
キットが、染色、遺伝子ビット分析（genetic bit analysis）、パイロ配列決定（pyrosequencing）、蛍光偏光、Taqman、および分子beaconよりなる群から選択されるＤＮＡ増幅検出方法を含む請求項１３記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１６】
試料中のコヌカグサＡＳＲ−３６８ＤＮＡに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって：
（ａ）コヌカグサＡＳＲ−３６８植物または植物部分からＤＮＡ試料を抽出し；次いで
（ｂ）ＤＮＡ試料をＤＮＡプライマー対と接触させ；次いで
（ｃ）核酸増幅反応を行い、それによりアンプリコンを生産し；次いで
（ｄ）アンプリコンを検出することを含み、
ここに該アンプリコンは配列番号：１または配列番号：２を含むことを特徴とする該方法。
【請求項１７】
試料中のコヌカグサＡＳＲ−３６８ＤＮＡに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって：
（ａ）コヌカグサＡＳＲ−３６８植物または植物部分からＤＮＡ試料を抽出し；次いで
（ｂ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８からのゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で対照コヌカグサ植物ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしないプローブと接触させ、ここに該プローブは配列番号：１または配列番号：２に相同的または相補的であり；次いで
（ｃ）試料およびプローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件に付し、次いで
（ｄ）プローブのＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする該方法。
【請求項１８】
（ａ）第１のグリフォセート耐性コヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８とグリフォセート除草剤に対する耐性を欠乏している第２の親コヌカグサ植物とを有性的に交配させ、それにより複数の第１の子孫植物を生産し；次いで
（ｂ）グリフォセートの適用に耐性のある第１の子孫植物を選択し；次いで
（ｃ）該第１の子孫植物を自家受粉させ、それにより複数の第２の子孫植物を生産し；次いで
（ｄ）該第２の子孫植物から、グリフォセート耐性植物を選択することを特徴とする、グリフォセート除草剤の適用に耐える植物を生産する方法。
【請求項１９】
さらに、グリフォセート耐性の第１の子孫植物またはグリフォセート耐性の第２の子孫植物を、第２の親植物または第３の親植物に戻し交配させ、それによりグリフォセートの適用に耐える植物を生産する工程を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
マーカーポリ核酸が、配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択されるマーカーポリ核酸の相補体に遺伝的に連鎖しているグリフォセート耐性特徴を含むコヌカグサ植物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明はグリフォセート耐性コヌカグサ植物事象ＡＳＲ−３６８および植物試料およびその組成物において、コヌカグサ植物事象ＡＳＲ−３６８の存在を検出するためのアッセイおよび方法に関する。
【０００２】
発明の背景
コヌカグサ（Agrostis stolonifera）は、世界の多くの地域において、重要な芝生種である。バイオテクノロジーの方法が、農業特性の改良のためにコヌカグサに適用されてきた。１つのそのような農業特性は、除草剤耐性であり、特に、グリフォセート除草剤に対する耐性である。コヌカグサにおける雑草の制御は、特に問題である。ゴルフグリーン上で使用されるコヌカグサは、他の芝またはゴルフコースの他の領域で通常使用される多くの除草剤に対して、特に感受性である。ヒシバ、狗尾草、シマスズメノヒエ、およびオヒシバのような一年草は、特異的な割合、環境的状況、および季節にて、効果的であるために、専門の塗布する人によって、投与されるベンスリド、ジチオピル、オキサジアゾン、フェノキサプロップおよびプロジアミンを含む多種多様な除草剤の使用によって、制御されなければならない。一年生および多年生広葉草は、２，４−Ｄ、ＭＣＰＰ、ジカンバ、およびこれらの混合物を含む除草剤の適用によって、コヌカグサ芝生において制御することができる。多くの草および広葉除草剤は、コヌカグサへの被害のため、あるいはそれらはコヌカグサに対する使用について登録されていないため、コヌカグサゴルフグリーン上で使用することができない。これらの除草剤の使用を置き換え、グリフォセート除草剤が適用された時にコヌカグサ芝生における効果的な草および広葉草制御のための方法を提供するために、グリフォセート耐性コヌカグサの必要性が存在する。
【０００３】
グリフォセートとも知られるＮ−ホスホノメチルグリシンは、広範囲の植物種に対して活性を有するよく知られた除草剤である。グリフォセートは、環境において望ましくは半減期が短い安全な除草剤であるRoundup（登録商標）（Monsanto Co.）の活性成分である。植物表面に適用されると、グリフォセートは、植物を通して全身的に移動する。グリフォセートは、芳香族アミノ酸の合成のための前駆体を供するシキミ酸経路の阻害のため、植物に有害である。グリフォセートは、植物中で見受けられる酵素５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。また、グリフォセート耐性は、グリフォセートに対して低い親和性を有し、従って、グリフォセートの存在下で触媒作用を保持する細菌性ＥＰＳＰＳ変種および植物ＥＰＳＰＳ変種の発現によって達成することが可能である（米国特許第５，６３３，４３５号；同第５，０９４，９４５号、同第４，５３５，０６０号、および同第６，０４０，４９７号）。
【０００４】
植物における外来種の発現は、恐らく、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）または統合部位に近い転写調節成分（例えば、エンハンサー）の近接性のため、それらの染色体の位置によって影響されることが分かっている（Weisingら, Ann. Rev. Genet 22: 421-477, 1988)。このため、多数の事象をスクリーンして、関心のある導入された遺伝子の最適な発現によって特徴付けられる事象を同定することが、しばしば必要になる。例えば、植物および他の生物において、事象の間に導入されたトランスジーンの発現のレベルにおいて広範な変動があり得ることが観察されている。また、例えば、導入された遺伝子構築体に存在する転写調節成分から予測されるパターンに対応しないかもしれない、種々の植物組織におけるトランスジーンの相関的発現における差異といったような、発現の空間的または時間的パターンにおいて差異が存在し得る。このため、何百ないし何千もの異なる事象を生成し、それらの事象を、商業的目的のために、所望のトランスジーン発現レベルおよびパターンを有する単一の事象につきスクリーンすることが一般的である。トランスジーン発現の所望のレベルまたはパターンを有する事象は、慣用的な育種方法を用いて、有性的交配によって、トランスジーンを他の遺伝的背景に遺伝子移入するのに有用である。そのような交配の子孫は、元の形質転換体のトランスジーン発現特徴を維持する。この戦略を用いて、地域の成長状況および市場の要求に上手く適合した多くの種において、確実な遺伝子発現を確証する。
【０００５】
有性的交配の子孫が関心のあるトランスジーンを有するか否かを決定するために、特定の事象の存在を検出することが可能であることが有利であろう。加えて、特定の事象を検出する方法は、例えば、市販前承認および組換え作物植物から由来する食物の表示を必要とする規則に従うために有用であろう。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸プローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションのようないずれかのよく知られた核酸検出方法によって、トランスジーンの存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般的に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子等のような、頻繁に使用される遺伝要素に焦点を合わせている。結果として、そのような方法は、挿入されたＤＮＡ（「フランキングＤＮＡ」）に隣接する染色体のＤＮＡの配列が知られていない限り、異なる事象、特に、同じＤＮＡ構築体を用いて生成されたものの間を区別するのに有用ではないだろう。事象特異的ＰＣＲアッセイは、例えば、挿入およびフランキングＤＮＡの間の接合部におよぶプライマー組、具体的にはフランキングＤＮＡからの配列を含んだ挿入および第２のプライマーからの配列を含んだ１つのプライマーを用いるＰＣＲによって、グリフォセート耐性大豆事象４０−３−２を同定したWindelsら（Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b: 459-462, 1999）によって論議されている。グリフォセート耐性トウモロコシ事象の事象特異的ＤＮＡ検出方法もまた記載されている（本明細書中にその全文において援用される米国２００２００１３９６０  Ａ１）。
【０００６】
本発明は、グリフォセート除草剤耐性コヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８およびＡＳＲ−３６８のゲノムに含有されるトランスジーン／ゲノム接合領域を含むＤＮＡ組成物およびコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８およびその子孫におけるトランスジーン／ゲノム接合の検出方法に関する。
【０００７】
発明の概要
本発明は、受託番号ＰＴＡ−４８１６で、American Type Culture Collection（ATCC)に寄託された種子を有するＡＳＲ−３６８と命名されたコヌカグサトランスジェニック事象である。本発明のもう１つの態様は、コヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８の子孫植物、または種子、あるいは植物および種子の再生可能な部分である。また、本発明は、花粉、胚珠、花、芽、根、および葉を含むがこれらに限定されるものではないコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８の植物部分を含む。
【０００８】
本発明の１つの態様は、コヌカグサ植物事象ＡＳＲ−３６８からのトランスジーン／ゲノム接合領域の存在を検出するための組成物および方法を供する。配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択される少なくとも１つのトランスジーン／ゲノム接合ＤＮＡ分子、およびその相補体を含むＤＮＡ分子が提供され、ここに、接合分子は、コヌカグサゲノムに挿入された異種ＤＮＡおよびコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８における挿入部位に近接するコヌカグサ細胞からのゲノムＤＮＡを含む挿入部位にわたる。これらの分子を含むコヌカグサ植物ＡＳＲ−３６８および種子は、本発明の１態様である。
【０００９】
トランスジーン／ゲノム接合ゲノム領域配列番号：３またはその相補体である新規ＤＮＡ分子が提供され、ここにこのＤＮＡ分子は、コヌカグサ植物事象ＡＳＲ−３６８において新規である。ゲノムにおいて配列番号：３を含むコヌカグサ植物および種子は、本発明の１態様である。
【００１０】
本発明のもう１つの態様によると、ＤＮＡ分子は、トランスジーン／ゲノム領域配列番号：４であるＤＮＡ分子、またはその相補体が提供され、ここにこのＤＮＡ分子は、コヌカグサ植物事象ＡＳＲ−３６８において新規である。ゲノムにおける配列番号：４を含むコヌカグサ植物および種子は、本発明の１態様である。
【００１１】
本発明のもう１つの態様によって、２つのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ検出方法における使用のために提供され、ここに第１のＤＮＡ分子は、配列番号：３のＤＮＡ分子のトランスジーン領域のいずれかの部分の少なくとも１１またはそれを超える連続的なポリヌクレオチドおよび配列番号：３の５’フランキングコヌカグサゲノムＤＮＡ領域のいずれかの部分の同様の長さのＤＮＡ分子を含み、ここにこれらのＤＮＡ分子は、一緒に使用すると、アンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法においてこれらのＤＮＡプライマーを使用して生成されたアンプリコンは、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的である。配列番号：３のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーによって生成された配列番号：１を含むいずれかのアンプリコンは、本発明の１態様である。
【００１２】
本発明のもう１つの態様によって、２つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡ検出方法における使用のために提供され、ここに第１のＤＮＡ分子は、配列番号：４のＤＮＡ分子のトランスジーン領域のいずれかの部分の少なくとも１１またはそれを超える連続的なポリヌクレオチドおよび配列番号：４の３’フランキングコヌカグサゲノムＤＮＡのいずれかの部分の同様の長さのＤＮＡ分子を含み、ここにこれらのＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法においてこれらのＤＮＡプライマーを用いて生産されたアンプリコンは、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的である。配列番号：４のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーによって生成された配列番号：２を含むいずれかのアンプリコンは、本発明の１態様である。
【００１３】
本発明のもう１つの態様によって、試料中のコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８ＤＮＡに特異的に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。そのような方法は：（ａ）ＤＮＡを含む試料を、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において使用すると、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的であるアンプリコンを生成するプライマー組と接触させ（ｂ）核酸増幅反応を行い、それによりアンプリコンを生成し；次いで（ｃ）アンプリコンを検出することを特徴とする。
【００１４】
本発明のもう１つの態様によって、試料中のコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に特異的に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。そのような方法は：（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８からのゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、対照コヌカグサ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないプローブと接触させ；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件に付し；次いで（ｃ）プローブのＡＳＲ−３６８ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする。
【００１５】
本発明のもう１つの態様によって、（ａ）グリフォセートの適用に対する耐性を授与する本発明の発現カセットを含む第１の親コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８、およびグリフォセート耐性を欠く第２の親コヌカグサ植物を、有性的に交配させ、それにより複数の子孫植物を生産し；次いで（ｂ）グリフォセートの適用に耐える子孫植物を選択する工程を含むグリフォセートの適用に耐えるコヌカグサ植物の生産方法が提供される。そのような方法は、所望により、子孫植物を第２の親コヌカグサ植物に戻し交雑し、グリフォセート耐性子孫につき選択して、グリフォセートの適用に耐える真の品種改良コヌカグサ種を生産するさらなる工程を含んでもよい。
【００１６】
コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８を含む草の芝スタンドが提供される。グリフォセート耐性のあるコヌカグサＡＳＲ−３６８の芝スタンドは、ゴルフコースに特に有用であり、これらの芝スタンドは本発明の１態様である。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、芝スタンドに、除草剤処方を含有するグリフォセートを適用する工程を含む、コヌカグサＡＳＲ−３６８の芝スタンドにおいて雑草を制御する方法である。
【００１８】
本発明の前述および他の態様は、次の詳細な記載および添付の図面から、より明白になるだろう。
【００１９】
好ましい具体例の詳細な記載
本発明をより良く定義し、当業者を本発明の実施において指導するために、次の定義および方法が提供される。特記しない限り、用語は、関連分野の当業者によって、慣用的な使用に従い、理解されるべきである。また、分子生物学における一般的な用語の定義は、Riegerら, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 第５版, Springer-Verlag: New York, 1991; およびLewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994で見受けられるだろう。３７ＣＦＲ  §１．８２２記載のＤＮＡ塩基のための命名法が使用される。
【００２０】
本明細書において使用されるように、用語「コヌカグサ」は、Agrostis stoloniferaを意味し、コヌカグサＡＳＲ−３６８と育種することができる全植物種を含む。
【００２１】
本明細書において使用されるように、用語「含む」は、「含むが制限されるわけではない」を意味する。
【００２２】
「グリフォセート」は、Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩を指し、グリフォセートは、Roundup（登録商標）除草剤（Monsanto Co.)の活性成分である。「グリフォセート除草剤」による処理は、Roundup（登録商標）、Roundup Ultra（登録商標）、Roundup Pro（登録商標）除草剤またはグリフォセートを含有するいずれかの他の除草剤処方による処理を指す。グリフォセートの商業的処方の例は、制限なしに、ROUNDUP（登録商標）、ROUNDUP（登録商標）ULTRA、ROUNDUP（登録商標）ULTRAMAX、ROUNDUP（登録商標）CT、ROUNDUP（登録商標）EXTRA、ROUNDUP（登録商標）BIOACTIVE、ROUNDUP（登録商標）BIOFORCE、RODEO（登録商標）、POLARIS（登録商標）、SPARK（登録商標）およびACCORD（登録商標）除草剤として、Monsanto Companyによって販売されているもの（これらの全てはそのイソプロピルアンモニウム塩としてグリフォセートを含有する）；ROUNDUP（登録商標）DRY、およびRIVAL（登録商標）除草剤としてMonsanto Companyによって販売されているもの（これらの全てはそのアンモニウム塩としてグリフォセートを含有する）；ROUNDUP（登録商標）GEOFORCEとしてMonsanto Companyによって販売されているもの（これはそのナトリウム塩としてグリフォセートを含有する）；およびTOUCHDOWN（登録商標）除草剤として、Zeneca Limitedによって販売されているもの（これはそのトリメチルスルホニウム塩としてグリフォセートを含有する）を含む。
【００２３】
トランスジェニック「事象」は、異種ＤＮＡ、つまり、関心のあるトランスジーンを含む核酸構築体による植物細胞の形質転換、植物のゲノムへのトランスジーンの挿入から得られる植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる特定の植物の選択によって生じる。用語「事象」は、異種ＤＮＡを含む元の形質転換体および形質転換体の子孫を指す。また、用語「事象」は、形質転換体および異種ＤＮＡを含むもう１つの事象の間の有性的外部交配によって生産される子孫を指す。反復親への戻し交雑を繰り返した後でさえ、形質転換された親からの挿入されたＤＮＡおよびフランキングゲノムＤＮＡは、同じ染色体の位置にて、交配の子孫中に存在する。また、用語「事象」は、挿入されたＤＮＡおよび挿入されたＤＮＡに直接隣接したフランキングゲノム配列を含む元の形質転換体からのＤＮＡを指し、これは、挿入されたＤＮＡを含む１つの親系統（例えば、元の形質転換体および自家受粉から得られる子孫）および挿入されたＤＮＡを含有しない親系統の有性的交配の結果として、関心のあるトランスジーンを含む挿入されたＤＮＡを受け取る子孫に導入されることが予測されるだろう。グリフォセート耐性コヌカグサ植物は、まず形質転換から由来するトランスジェニックコヌカグサ植物から成長したコヌカグサ植物よりなる、グリフォセート除草剤の適用に耐えるｐＭＯＮ２５４９６（図１）中に含有される植物発現カセットを持つ第１の親コヌカグサ植物、およびグリフォセート除草剤に対する耐性を欠く第２の親コヌカグサ植物を有性的に交配させ、それにより複数の第１の子孫植物を生産し；次いで、グリフォセート除草剤の適用に対して耐性のある第１の子孫植物を選択し；第１の子孫植物を自家受粉させ、それにより複数の第２の子孫植物を生産し；次いで第２の子孫植物から、グリフォセート除草剤耐性植物を選択することによって、育種することができる。これらの工程は、さらに、第１のグリフォセート耐性子孫植物または第２のグリフォセート耐性子孫植物の第２の親コヌカグサ植物または第３の親植物への戻し交雑を含んで、それによりグリフォセート除草剤の適用に耐えるコヌカグサ植物を生産することを含むことができる。本発明において、トランスジェニックコヌカグサ事象は、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８としても定義され、本明細書において、ＡＳＲ−３６８または事象ＡＳＲ−３６８として呼ぶことがある。
【００２４】
また、２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて、２つの独立した分離添加された、外因性遺伝子を含有する子孫を生産することもできることができることは、理解されるべきである。適当な子孫を自家受粉させて、添加された、外因性の両方の遺伝子に対して、同一である植物を生産することができる。また、親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配は、栄養繁殖のように考慮される。異なる特徴につき一般的に使用される他の育種方法および作物の記載は、いくつかの引用文献のうちの１つ、例えばFehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)で見つけることができる。
【００２５】
「プローブ」は、例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素といった慣用的な検出可能標識またはレポーター分子が結合している単離された核酸である。そのようなプローブは、標的核酸のストランドに相補的であり、本発明の場合、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８植物からであろうと、または事象からのＤＮＡを含む試料からであろうと、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８からのゲノムＤＮＡのストランドに相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ポリアミドおよび標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する他のプローブ物質も含み、これらを使用して、該標的ＤＮＡ配列の存在を検出することができる。
【００２６】
「プライマー」は、プライマーおよび標的ＤＮＡストランドの間のハイブリッドを形成する核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的標的ＤＮＡストランドにアニールされ、次いで例えばＤＮＡポリメラーゼといったポリメラーゼによって、標的ＤＮＡストランドに沿って延びる単離された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の慣用的核酸増幅方法によって、標的核酸配列の増幅のための使用を指す。
【００２７】
プローブおよびプライマーは、一般的に、長さが１１ポリヌクレオチドまたはそれ以上、しばしば１８ポリヌクレオチドまたはそれ以上、２４ポリヌクレオチドまたはそれ以上、または３０ポリヌクレオチドまたはそれ以上である。そのようなプローブおよびプライマーは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さであるように選択される。好ましくは、標的配列にハイブリダイズする能力を保持する標的配列と異なるプローブは、慣用的方法によって設計できるが、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有する。
【００２８】
プローブおよびプライマーを調製し使用する方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, vol.1-3, ed. Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (以下、「Sambrookら, 1989」)；Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的にアップデートがある）(以下、「Ausubelら, 1992」)；およびInnisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990に記載されている。ＰＣＲ―プライマー対は、例えば、Primer(Version 0.5,(Copyright) 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)のような該目的用のコンピュータープログラムを用いることによって、既知の配列から得ることができる。
【００２９】
本明細書中で開示するフランキングゲノムＤＮＡおよび挿入配列に基づくプライマーおよびプローブを使用して、慣用的方法によって、例えば、種子が受託番号ＰＴＡ−４８１６を有するＡＴＣＣで寄託されているコヌカグサＡＳＲ−３６８から単離されたそのようなＤＮＡ分子を、再度クローニングして配列決定することによって、開示されたＤＮＡ配列を確認（そして、必要に応じて、修正）することができる。
【００３０】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェント状況下で、標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズする。いずれかの慣用的核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を使用して、試料中のトランスジェニック事象からＤＮＡの存在を同定することができる。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で、他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることが可能である。本明細書中で使用されるように、２つの核酸分子は、もし該２つの分子が、逆平行、二本鎖核酸構造を形成することが可能であれば、もう一方に特異的にハイブリダイズすることが可能であると考えられている。核酸分子は、もしそれらが完全な相補性を呈すれば、もう１つの核酸分子の「相補体」であると考えられている。本明細書中で使用されるように、分子は、該分子のうちの１つの各ヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である時、「完全な相補性」を呈すると考えられている。２つの分子は、もしそれらが、少なくとも慣用的な「低ストリンジェンシー」状況下で、十分な安定性をもって、もう一方にハイブリダイズして、もう一方にアニールされたままであることを可能にすることができれば、「最小限、相補的」であると考えられている。同様に、分子は、もしそれらが十分な安定性をもって、もう一方にハイブリダイズして、慣用的な「高ストリンジェンシー」状況下で、もう一方にアニールされたままであることを可能にすることが出来れば、「相補的」であると考えられている。慣用的なストリンジェンシー状況は、Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985),において、Sambrookら, 1989, およびHaymesらによって記載されている。従って、逸脱が、二本鎖構造を形成するための分子の能力を完全に妨げない限り、完全な相補性からの逸脱は許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして働くためには、使用される特定の溶媒および塩濃度下で、安定した二本鎖構造を形成することが可能であるように、配列が十分に相補的であればよい。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、実質的に相同的な配列は、高ストリンジェンシー状況下で比較される核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。例えば、約４５℃での６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、引き続いての５０℃での２．０ｘＳＳＣの洗浄といったＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させる適切なストリンジェンシー状況は、当業者に知られているか、あるいはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6で見つけることができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での約２．０ｘＳＳＣの低ストリンジェンシーないし５０℃での０．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー状況から約６５℃の高ストリンジェンシー状況まで上昇させることができる。温度および塩の両方は変動してもよく、あるいは、温度または塩濃度のいずれかは、一定に維持される一方で、他の変数は変化してもよい。好ましい具体例において、本発明の核酸は、例えば、約２．０ｘＳＳＣおよび約６５℃といった適度にストリンジェントな状況下で、配列番号：１、２、３、または４記載の１またはそれを超える核酸分子、その相補体またはいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするだろう。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー状況下で、配列番号：１から配列番号：４記載の１またはそれを超える核酸分子、またはいずれかの相補体または断片に特異的にハイブリダイズするだろう。本発明の１つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１から配列番号：４記載の核酸配列またはその相補体またはいずれかの断片を有する。本発明のもう１つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１から配列番号：４記載の核酸配列組またはその相補体またはいずれかの断片と、８０％および１００％または９０％および１００％の間の配列同一性を共有する。本発明のさらなる態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１から配列番号：４記載の配列組またはその相補体またはいずれかの断片と、９５％および１００％の間の配列同一性を共有する。配列番号：１から配列番号：４は、植物育種方法においてマーカーとして使用して、その全ては、その全文おいて、本明細書中に援用される"ＤＮＡ markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173-185, Creganら, eds., Wiley-Liss NYにおいて、単純な配列反復ＤＮＡマーカー分析に関して記載される方法と同様の遺伝子交配の子孫を同定することができる。プローブの標的ＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションは、当業者に知られたいくつもの方法によって検出可能であり、これらは、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および蛍光発光タグを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
特定の増幅プライマー対を用いる（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェント条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが結合する標的核酸配列にのみハイブリダイズし、好ましくは、ＤＮＡ熱増幅反応において、独特の増幅生成物、アンプリコンを生成することを可能にする条件である。
【００３３】
用語「（標的配列）に対して特異的」は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプライマーが、標的配列を含む試料において、標的配列にのみハイブリダイズすることを示す。
【００３４】
本明細書において使用されるように「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、ポリ核酸鋳型の一部である標的ポリ核酸分子のポリ核酸増幅の生成物を指す。例えば、有性交配から得られたコヌカグサ植物が本発明のコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８植物からのトランスジェニック事象ゲノムＤＮＡを含有するか否かを決定するために、コヌカグサ植物組織試料から抽出されるＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡ（トランスジェニックＤＮＡ）の挿入部位に隣接したＡＳＲ−３６８植物のゲノムにおけるフランキングＤＮＡから由来するプライマー、および挿入された異種ＤＮＡから由来する第２のプライマーを含むプライマー対を用いるポリ核酸増幅方法に付して、ＡＳＲ−３６８事象ＤＮＡの存在に対して診断的なアンプリコンを生成することができる。アンプリコンは、事象に対してやはり診断的な長さのものであって、そのようなポリヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、プライマー対の組み合わされた長さから、プラス１ヌクレオチド塩基対、好ましくはプラス約５０ヌクレオチド塩基対、より好ましくはプラス約２５０ヌクレオチド塩基対、およびさらにより好ましくは約４５０ヌクレオチド塩基対またはそれ以上の長さの範囲とすることができる。別法として、プライマー対は、挿入された異種ＤＮＡの両側のフランキングゲノム配列から由来して、全インサートポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号：３からの正ゲノムプライマーおよびコヌカグサへと形質転換されたｐＭＯＮ２５４９６  ＤＮＡ断片のＨｉｎｄＩＩＩ発現カセットを含む挿入されたＤＮＡ分子を増幅する配列番号：４からの逆ゲノムプライマー、約６６８１ヌクレオチド塩基対、図１）を含むアンプリコンを生成してもよい。ＡＳＲ−３６８の植物ゲノム配列から由来したプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ分子から離れて位置していてもよく、この距離は、１ヌクレオチド塩基対ないし約２０，０００ヌクレオチド塩基対の範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、特異的に、ＤＮＡ熱増幅反応において形成され得るプライマー二量体を除く。
【００３５】
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当該分野で知られる種々のポリ核酸増幅方法のいずれかによって達成することができる。増幅方法の事象は、当該分野で知られており、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびにPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innisら, Academic Press, San Diego, 1990に、記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大２２ｋｂのゲノムＤＮＡおよび最大４２ｋｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するまで発展している(Chengら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994)。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の分野において知られる他の方法を、本発明の実施において使用してもよい。コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８からの異種ＤＮＡインサートまたはフランキングゲノムＤＮＡの配列は、本明細書中で提供される配列から由来するプライマーを用いて、事象からそのようなＤＮＡ分子を増幅し、引き続いて、ＰＣＲアンプリコンまたはクローンされたＤＮＡの標準ＤＮＡ配列決定することによって、確証（必要に応じて、修正）することができる。ＤＮＡ増幅方法に基づくＤＮＡ検出キットは、診断的なアンプリコンを特異的に増幅するＤＮＡプライマーを含有する。キットは、アガロースゲルベースの検出方法または当該分野で知られるアンプリコンを検出するいくつもの方法を提供し得る。
【００３６】
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技術によって検出することができる。１つのそのような方法は、遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis)（Nikiforovら, Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)であり、ここにＤＮＡオリゴヌクレオチドは、隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の両方と重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、マイクロタイタープレートのウェル中で固定化される。（挿入された配列において１つのプライマーおよび隣接するフランキングゲノム配列における１つのプライマーを用いる）関心のある領域のＰＣＲに引き続いて、一本鎖ＰＣＲ生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に対して特異的な標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を用いる単一の塩基延長反応用の鋳型として働かせることができる。読み取りは、蛍光ベースまたはＥＬＩＳＡベースであってもよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および単一の塩基延長によるインサート／フランキング配列の存在を示す。
【００３７】
もう１つの方法は、Winge(Innoc. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)によって記載されるような、パイロ配列決定（Pyrosequencing)技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入ＤＮＡ接合部と重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、関心のある領域からの一本鎖ＰＣＲ生成物（挿入された配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＴＰ）は、個々に添加され、取込みは、測定される光シグナルを招く。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および単一または複数の塩基延長によるトランスジーンインサート／フランキング配列の存在を示す。
【００３８】
Chenら(Genome Res. 9:492-498, 1999)によって記載される、蛍光偏光は、本発明のアンプリコンを検出するのに使用することができる方法である。この方法を用いて、オリゴヌクレオチドは、ゲノムフランキングおよび挿入されたＤＮＡ接合部と重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、関心のある領域からの一本鎖ＰＣＲ生成物（挿入されたＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列における１つ）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基延長は、ｄｄＮＴＰの取込みを招く。取込みは、蛍光光度計を用いて、偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および単一の塩基延長によるトランスジーンインサート／フランキング配列の存在を示す。
【００３９】
Taqman（登録商標）(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)は、ＤＮＡ配列の存在を検出し定量化する方法として記載され、製造者によって提供される取扱説明書において完全に理解される。簡潔に述べれば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、ゲノムフランキングおよびインサートＤＮＡ接合部と重複するように設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入されたＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）は、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分からの蛍光部分の分裂および放出を招く。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによるフランキング／トランスジーンインサート配列の存在を示す。
【００４０】
分子Beacon(Molecular Beacon)は、Tyangiら(Nature Biotech. 14:303-308, 1996)に記載されるように、配列検出における使用のために記載されている。簡潔に述べると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、フランキングゲノムおよびインサートＤＮＡ接合部と重複するように設計される。ＦＲＥＴプローブの独特の構造によって、近接した蛍光およびクエンチング部分を維持する二次構造を含有することになる。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入されたＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つ）は、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。成功したＰＣＲ増幅に引き続いて、ＦＲＥＴプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションによって、プローブ二次構造の除去および蛍光およびクエンチング部分の空間的分離が起こる。蛍光シグナルが得られる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによるフランキング／トランスジーンインサート配列の存在を示す。
【００４１】
コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８は、グリフォセート除草剤に対して耐性があり、芝スタンドとして有用である。芝スタンドは、私有および公有領域において栽培される。優れた芝スタンド、またはグリーンは、美および有用性の両方を兼ね備えている；ゴルフ、テニス、野球、フットボール、および他のスポーツ分野のためのその維持は、高価で特殊な手順である。コヌカグサＡＳＲ−３６８事象は、ゴルフコース上に植えられた芝スタンドとして特に有用である。ゴルフコースは、ホールを作り上げる種々の芝スタンド芝構成要素を持つ。これらの構成要素は、ティー、フェアウェイ、ラフおよびグリーンを含む。芝として使用される時、事象ＡＳＲ−３６８は、除草剤を含有するグリフォセートの適用による雑草制御に対して効果的に管理することができる芝スタンドを提供する。コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８を含む芝スタンドは、本発明の１態様である一方、ＡＳＲ−３６８芝スタンドは、ゴルフコースの１構成要素であり、すなわち、その構成要素は本発明の１態様である。本発明の芝スタンドは、好ましくは、５０パーセントまたはそれを超える構成要素、より好ましくは７５％の構成要素、およびさらにより好ましくは９０％を超える構成要素として、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８を含む。
【００４２】
次の例は、本発明の特定の好ましい具体例の例を示すために含まれる。続く例に開示される技術は、発明者らが本発明の実施において上手く機能すると考えたアプローチを示し、すなわちその実施について好ましいモードの例を構成すると考えられ得ると、当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、多くの変更を開示される特異的な具体例において行い、それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様または似た結果を得ることが可能であることを理解するはずである。
【実施例】
【００４３】
実施例１
トランスジェニックコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８を、本発明のトランスジーンインサートを含むｐＭＯＮ２５４９６（図１）から由来する線状ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を用いて、コヌカグサ系統Ｂ９９０６１Ｒ／９９００２８のマイクロプロジェクタイル衝撃によって創生させた。このＤＮＡ断片は、コヌカグサＡＳＲ−３６８植物に、グリフォセートに対する耐性を集団的に授与する２つのトランスジーン発現カセットを含有する。第１のカセットは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＥＰＳＰＳ葉緑体トランジットペプチド（ＴＳ−Ａｔ．ＥＰＳＰＳ：ＣＴＰ２，ｃｔｐ２とも呼ばれる、Kleeら, Mol. Gen. Genet. 210:47-442, 1987)に操作可能に結合され、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株  ＣＰ４（ＡＧＲＴＵ．ａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ，ｃｐ４とも呼ばれる、米国特許第５，６３３，４３５号）からのグリフォセート耐性５−エノール−ピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）に操作可能に結合され、ノパリンシンターゼ転写ターミネーター（Ｔｎｏｓ，  ＮＯＳ  ３’とも呼ばれる、Fraleyら. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807, 1983)に操作可能に結合されたライス・アクチン１プロモーターおよびイントロン（Ｐ−ｒａｃｔとも呼ばれるＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１、およびｒａｃｔイントロンとも呼ばれるイントロンＩ−Ｏｓ．Ａｃｔ１、米国特許第５，６４１，８７６号）よりなる。第２のトランスジーン発現カセットは、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｈｓｐ７０イントロン（ＺｍＨＳＰ７０イントロンとも呼ばれるＩ−Ｚｍ．Ｈｓｐ７０，米国特許第５，３６２，８６５号）に操作可能に結合され、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＥＰＳＰＳ葉緑体トランジットペプチド（ＴＳ−Ａｔ．ＥＰＳＰＳ：ＣＴＰ２）に操作可能に結合され、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株ＣＰ４（ＡＧＲＴＵ．ａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ）からのグリフォセート耐性の５−エノール−ピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）に操作可能に結合され、ノパリンシンターゼ転写ターミネーター（T-nos, Fraley ら. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807, 1983）に操作可能に結合された、エンハンサー領域の直列重複（Ｐ−ｅ３５Ｓとも呼ばれるＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ, Kayら. Science 236:1299-1302, 1987; 米国特許第５，１６４，３１６号）を含有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターよりなる。ＤＮＡ構築体ｐＭＯＮ２５４９６は、トランスジェニックトウモロコシ（米国２００２００１３９６０  Ａ１）において、グリフォセート耐性を授与することを示している。照射後のグリフォセート耐性のトランスジェニックｃａｌｌｉを３ｍＭグリフォセートを含有する培地上で選択し、引き続いて、植物を再生させた。トランスジェニック事象が生成され、事象ＡＳＲ−３６８を、グリフォセート耐性、農学的性能、および単一トランスジェニック挿入を含む特徴の優れた組合せに基づき、この集団から選択した。ＡＳＲ−３６８において起こるトランスジーン挿入を図２に示す。
【００４４】
実施例２
グリフォセート耐性のコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８を、グリフォセート成長損傷に対する耐性につきテストした。グリフォセート耐性のコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８は、手回し噴霧機で噴霧された５%Roundup（登録商標）Pro（グリフォセート含有除草剤処方）または１２８オンスのRoundup（登録商標）Pro／エーカーへの同等の量に対して損傷を全く見せなかった。標準の推奨される割合は、１．２５ないし２．５%Roundup（登録商標）Proまたは３２ないし６４オンスのRoundup（登録商標）Pro／エーカーに同等の量である。成長期、初夏、盛夏および秋口の間のグリフォセート含有除草剤処方の３回の適用を使用して、事象ＡＳＲ−３６８の芝スタンドにおけるグリフォセート耐性につきテストした。コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８は、３つのテスト位置のグリフォセートの全適用に対して、グリフォセート耐性を示した。事象ＡＳＲ−３６８に関しては、成長損傷は観察されなかったが、ｐＭＯＮ２５４９６を含有しないコヌカグサ植物は、全て、グリフォセート含有除草剤処方処理によって、ひどく損傷したか、あるいは枯れた。芝スタンドの芝構成要素であるコヌカグサＡＳＲ−３６８のグリフォセート含有除草剤処理は、芝スタンドにおける雑草および他の不要な植物を制御するのに有用な方法である。
【００４５】
実施例３
トランスジーンインサートに隣接した５’および３’ゲノム領域のＤＮＡ配列は、Clontech's Universal Genome WalkerTMキットおよびＲＡＧＥ方法（ゲノムＤＮＡ末端の高速増幅）を用いるＤＮＡ分子の単離によって決定される。５’トランスジーン／ゲノムＤＮＡ（図３）を、コヌカグサＡＳＲ−３６８ゲノムＤＮＡから、ＨｉｎｄＩＩＩによる３７℃での一晩の消化、およびＸｂａＩによる３７℃での３時間のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳプラスミド（Stratagene, La Jolla CA）の消化によって単離する。４つのヌクレオチド塩基突出を、２つのヌクレオチドで満たして、結合に適合させる。ゲノムＤＮＡを、適当な条件下で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるインキュベーションによって、ＸｂａＩ消化／２ヌクレオチド塩基で満たしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  プラスミドと結合させる。結合反応の後、５μｌの結合ミックスを、２μｌの１０μＭ  Ｍ１３順方向プライマー（配列番号：５）、２μｌ  １０μＭ  ＡＳＲ−３６８トランスジーン−特異的オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：６）、１．７５μｌ  １０ｍＭデオキシリボヌクレオチド、Expand Long Template PCR System（Roche）および水を５０μｌへのＤＮＡ増幅方法において使用する。一次反応を、次の回転条件でサーモサイクラーで実施する：２分間の９４℃の３０サイクル；各々１０秒間９４℃；３０秒間５６℃、３分間６８℃；および最後に１０分間６８℃。一次反応の１μlを、５０μｌまでの２μｌの１０μＭ  Ｔ７プライマー（配列番号：７）、２μｌのＡＳＲ−３６８特異的プライマー（配列番号：８）、１．７５μｌ  １０ｍＭ  デオキシリボヌクレオチド、Expand Long Template PCR System（Roche）および水を含む二次反応において増幅し、サーモサイクラー条件は、一次反応に対して使用されたのと同じである。
【００４６】
コヌカグサ試料中のトランスジーン／ゲノムＤＮＡの存在は、ＰＣＲによって確証される。５’トランスジーン／ゲノム接合領域アンプリコンは、挿入されたトランスジーンＤＮＡのライス・アクチン１プロモーター中の第２のプライマー（配列番号：１２）と対合したインサートの５’末端に近接したゲノムＤＮＡ配列に対して設計された１つのプライマー（配列番号：１１）を用いて生成される。５’接合部アンプリコンは、５０μｌ反応容量における鋳型としての約５０ｎｇの葉ゲノムＤＮＡ（１μｌ）、１５ｐｍｏｌの各プライマー（各々１．５μｌ）、およびExpand High Fidelity PCRシステムから生成される。反応の増幅は、次のサイクリング条件下で行われた： ２分間９４℃で１サイクル；１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、１分間７２℃で１０サイクル；１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、１分間７２℃＋さらに５秒間／サイクルで２５サイクル；７分間７２℃で１サイクル。
【００４７】
もう１つの方法において、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８からの対応するトランスジーン／ゲノムＤＮＡ分子の単離をGenome WalkerTMキット（カタログ番号K1807-1, CloneTech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA）に記載のように、連結アダプターおよびネステッドＰＣＲを用いて達成することもできる。まず、ＡＳＲ−３６８事象からのゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢ精製方法（Rogersら, Plant Mol. Biol. 5:69-76, 1985）によって単離する。増幅用のゲノムＤＮＡライブラリーを、製造者ら指示（Genome WalkerTM, CloneTech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA）に従い調製する。別の反応において、ゲノムＤＮＡを、平滑末端制限エンドヌクレアーゼ（CloneTech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA）によって、３７℃で一晩消化させる。反応混合物をフェノール:クロロホルムで抽出し、ＤＮＡを、水性相へのエタノールの添加によって沈殿させ、遠心分離によってペレット化し、次いで、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−．ＨＣｌ，  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁する。精製された平滑末端ゲノムＤＮＡ断片を、製造者のプロトコルに従い、Genome WalkerTMアダプターに連結させる。連結後、各反応を熱処理（５分間７０℃）して、反応を終了させ、次いでトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中で１０倍希釈する。次いで、各それぞれの連結の１μlを、それぞれのアダプター−リゲートライブラリーの1μｌ、１０μＭ Genome WalkerTMアダプタープライマーＡＰ１（配列番号：９、製造者によって供給された）の１μl、１０μＭ事象ＡＳＲ−３６８トランスジーン-特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：１２）の１μl、１μl １０ｍＭデオキシリボヌクレオチド、２．５μｌ硫酸ジメチル、ＭｇＣｌ２を含有する１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液の５μｌ、Ａｍｐｌｉｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）の０．５μｌ（２．５ユニット）、および５０μｌまでのＨ２Ｏを含んだ５０μｌ反応において増幅させる。反応を、計算された温度調節および次のサイクリング条件を用いて、サーモサイクラーにおいて実施する：９分間９５℃の１サイクル；２秒間９４℃、３分間７０℃の７サイクル；  ２秒間９４℃、３分間６５℃の３６サイクル；４分間６５℃の１サイクル。各一次反応の１μlを、水で５０倍希釈し、二次反応（それぞれの希釈された一次反応の１μｌ，  １０μＭ  Genome WalkerTMネステッドアダプタープライマーＡＰ２の１μl（配列番号：１０,  製造者に供給された）、１０μＭ事象ＡＳＲ−３６８トランスジーン-特異的ネステッドオリゴヌクレオチド（配列番号：１２）の１μｌ、１μｌ  １０ｍＭデオキシリボヌクレオチド、２．５μｌ硫酸ジメチル、ＭｇＣｌ２を含有する１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液の５μｌ、Ａｍｐｌｉｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）の０．５μl（２．５ユニット）および５０μｌまでのＨ２Ｏ）において、次のサイクリング条件を用いて増幅させる：９分間９５℃の１サイクル；２秒間９４℃、３分間７０℃の５サイクル；  ２秒間９４℃、３分間６５℃の２４サイクル；  ４分間６５℃の１サイクル。
【００４８】
コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８トランスジェニックインサートおよび隣接するフランキングコヌカグサゲノムＤＮＡ配列の間の接合部にわたる５’領域を表すＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動法によって精製し、引き続いて、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（カタログ番号28704, Qiagen Inc., Valencia, CA）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（カタログ番号A1360, Promega, Madison, +WI）への直接的クローニングを用いて、アガロースマトリックスから単離する。クローンされたＰＣＲ生成物の同一性およびコヌカグサＡＳＲ−３６８を生成するのに使用されたｐＭＯＮ２５４９６のＨｉｎｄＩＩＩ断片への関係を、ＤＮＡ配列分析（ABI PrismTM 377, PE Biosystems, Foster City, CA and DNASTAR配列分析ソフトウェア, DNASTAR Inc., Madison, WI）によって確認する。５’ゲノム/トランスジーン領域ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、図３に示される。さらに、図３は、コヌカグサゲノムＤＮＡ部分を、下線を引いたＤＮＡ配列として示すことによって同定し、二重線を引いたＤＮＡ配列は、配列番号：３を含有するコヌカグサゲノムの同定に有用なＰＣＲプライマー分子に相同的または相補的なＤＮＡ配列である。
【００４９】
同様に、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８  ３’フランキングゲノムＤＮＡ配列（図４）は、トランスジーンインサートの３’末端に近接するゲノムＤＮＡ配列に対して設計された１つのプライマー（配列番号：１４）およびｐＭＯＮ２５４９６に含有されたＴ−ｎｏｓ  ３’転写終了領域に位置する第２のプライマー（配列番号：１３）を用いて増幅する。ＰＣＲを、鋳型として約２１１ｎｇの葉ゲノムＤＮＡ（１μｌ）、１ｐｍｏｌの各プライマー（各１．５μｌ）、およびExpand Long Template PCRシステム（Roche）を用いて、５０μｌ反応容量において実施する。反応の増幅を、次のサイクリング条件下で実施する：２分間９４℃で１サイクル；１０秒間９４℃、３０秒間６０℃，３０秒間６８℃で３５サイクル；１０分間６８℃で１サイクル。
【００５０】
トランスジェニック挿入の両側に近接するコヌカグサゲノムＤＮＡ配列を、Genome WalkerTM-由来の増幅生成物を配列決定し、既知のトランスジーン配列に対して整列させることによって、事象ＡＳＲ−３６８に対して決定した。トランスジーン挿入部位の５’領域を配列決定し、この領域は、挿入接合部周辺の８９６ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）（配列番号：３）のトランスジーン／ゲノムＤＮＡ配列を含む。このＤＮＡ配列は、図３に示されるように、６３７ｂｐのフランキングコヌカグサゲノム配列（配列番号：３のヌクレオチド１−６３７）、およびＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１（配列番号：３のヌクレオチド６３８−８９６）の５’末端からの２５９ｂｐの配列よりなる。
【００５１】
表４に示されるように、ＤＮＡ配列を、セグメントの５’末端から、２４８ｂｐのＴ−ｎｏｓ転写ターミネーター（配列番号：４のヌクレオチド１−２４８）、および組込部位に近接するコヌカグサゲノムＤＮＡ配列（配列番号：４の塩基２４９−４７４に対応する）よりなる残りの配列を有する、３’挿入接合部あたりの４７４ｂｐセグメント（配列番号：４）につき決定した。二重線を引いたＤＮＡ配列は、配列番号：４を含有するコヌカグサゲノムの同定において有用なＰＣＲプライマー分子に相同的または相補的なＤＮＡ配列である。
【００５２】
接合配列、配列番号：１および配列番号：２（図５）は、事象ＡＳＲ−３６８からの新規ＤＮＡ配列であり、コヌカグサ植物事象ＡＳＲ−３６８およびその子孫に対して診断的である。配列番号：１および配列番号：２における接合配列は、トランスジーン配列断片およびコヌカグサゲノムＤＮＡの挿入部位の各側にポリヌクレオチドを含む。接合配列の配列番号：１は、配列番号：３のヌクレオチド位置６２６−６４９、トランスジーン挿入部位の５’領域にて見受けられる。接合配列の配列番号：２は、配列番号：４のヌクレオチド位置２３６−２５９、トランスジーン挿入部位の３’領域に位置する。いずれの接合配列も、ＤＮＡプローブまたはプライマーとして使用して、事象ＡＳＲ−３６８のゲノムＤＮＡを特異的に同定することができる。
【００５３】
実施例４
ＤＮＡ事象プライマー対を使用して、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成する。ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンは、少なくとも１つの接合部配列、配列番号：１または配列番号：２を含む。コヌカグサＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成するＡＳＲ−３６８事象プライマー対は、５’アンプリコンＤＮＡ分子を提供する事象プライマー１（配列番号：１１）および事象プライマー２（配列番号：１２）を含むプライマー対、および表１に略述されたプロトコルにおけるプライマー１および２に代えて置換する時に３’アンプリコンＤＮＡ分子を生成するプライマー対、配列番号：１３および配列番号：１４を含むが、これらに限定されるものではない。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応においてコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成する配列番号：３または配列番号：４から由来するいずれのプライマー対も本発明の態様である。配列番号：３の少なくとも１１の連続したヌクレオチド、またはＤＮＡ増幅方法において、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成するのに有用なその相補体を含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。配列番号：４の少なくとも１１の連続したヌクレオチド、またはコヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成するのに有用なその相補体を含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。この分析のための増幅条件を、表１および表２において説明するが、ＤＮＡプライマーを使用して、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成するこれらの方法のいずれの修飾も当業者の範囲内である。診断的なアンプリコンは、少なくとも１つのトランスジーン／ゲノム接合部ＤＮＡ（配列番号：１または配列番号：２）を含む。
【００５４】
事象ＡＳＲ−３６８植物組織試料に対する分析は、事象ＡＳＲ−３６８からの陽性組織対照、事象ＡＳＲ−３６８でないコヌカグサ植物からの陰性対照、およびコヌカグサＤＮＡを含有しない陰性対照を含むべきである。さらなるプライマー配列は、ＤＮＡ増幅方法の分野の当業者が配列番号：３および配列番号：４から選択することができ、アンプリコンの生成につき選択された条件は表１および表２に示された方法であってよく、あるいは異なるが、事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンをもたらす。表１および表２の方法に修飾を加えたこれらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲内である。ＡＳＲ−３６８に対して診断的な配列番号：３または配列番号：４から由来する少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列によって生成されるアンプリコンは、本発明の態様である。
【００５５】
ＤＮＡ増幅方法において使用される時に、コヌカグサＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成する配列番号：３または配列番号：４から由来する少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含有するＤＮＡ検出キットは、本発明の態様である。ＡＳＲ−３６８に対して診断的なｐＭＯＮ２５４９６の遺伝子要素のいずれかから由来する少なくとも１つのプライマー配列によって生成されるアンプリコンは、本発明の態様である。ゲノムが、ＤＮＡ増幅方法においてテストされて、該コヌカグサ植物または種子から抽出されたＤＮＡからのＤＮＡ分子を増幅させる時に、コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８に対して診断的なアンプリコンを生成するコヌカグサ植物または種子は、本発明の態様である。表２に示されるように、ＡＳＲ−３６８アンプリコン用のアッセイは、Stratagene Robocycler、MJ Engine, Perkin-Elmer 9700、またはEppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラーを用いて、あるいは当業者に知られる方法および装置によって、実施することができる。
【００５６】
表１  コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８  ５’トランスジーンインサート／ゲノム接合領域の同定のためのＰＣＲ手順および反応混合物条件
【００５７】
【表１】
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【００５８】
表２  異なるサーモサイクラーに対して提案されるＰＣＲパラメーター
緩やかに混合し、必要に応じて（サーモサイクラーに熱頂部無し）、各反応の頂部に１−２滴の鉱油を落とす。次のサイクリングパラメーターを用いて、Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700、またはEppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラーにおいて、ＰＣＲを進める。
記：  MJ EngineまたはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーは、計算されたモードで実行するべきである。Perkin-Elmer9700サーモサイクラーを最大に設定されたランプ速度で実行する。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
【表３】
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【００６１】
上記開示および請求の範囲において列挙されたMonsanto Companyの、コヌカグサ種子ＡＳＲ−３６８の寄託は、ブダペスト条約下にて、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110になされた。ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−４８１６である。寄託は、３０年、または最後の請求から５年、あるいは特許の有効期限の間のいずれか長い方の期間、保管場所で維持され、その期間の間、必要ならば、置き換えられるだろう。
【００６２】
本発明の原理を示し記載したところで、そのような原理から逸脱することなしに、本発明を整然かつ詳細に修飾することができることは、当業者に明白であるはずである。我々は、付属の請求の範囲の精神および範囲内である全修飾を主張する。
【００６３】
本明細書中で引用された全公報および公開された特許文献は、各個々の公報または特許出願が、具体的かつ個々に援用されると示されていたのと同じように、本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ｐＭＯＮ２５４９６のプラスミドマップ
【図２】コヌカグサ事象ＡＳＲ−３６８におけるインサートのゲノム組織化
【図３】ＡＳＲ−３６８  ５’トランスジーン／ゲノムＤＮＡ配列（配列番号：３）
【図４】ＡＳＲ−３６８  ３’トランスジーン／ゲノムＤＮＡ配列（配列番号：４）
【図５】ＡＳＲ−３６８  ５’トランスジーン／ゲノム接合領域（配列番号：１）および３’トランスジーン／ゲノム接合領域（配列番号：２）
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月25日(2005.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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