(57)【要約】プレキャストスラブゲルカセットにおいて、ゲルが形成されるモノマー溶液に、100,000を超える分子量の非イオン性両親媒性ポリマーを含め、ポリマーが含まれる状態でゲルを成型することによって、タンパク質がゲルとカセット壁との間に移動して、不鮮明なバンドを形成し得る通路の形成が避けられる。非イオン性両親媒性ポリマーはまた、結果として得られたゲルが電気泳動後にカセットから取り出される場合に壁に貼り付くのを防ぐ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、スラブ電気泳動に使用するためのプレキャストポリアクリルアミドスラブゲルを製造するための方法：
(a) 互いに一定の距離で隔てられた化学的に不活性な透明プレート対により定められたゲル囲い内にゲル形成液体混合物を配置する工程であって、該ゲル形成混合物は、水溶液中に、アクリルアミドモノマー、架橋剤、バッファー、および分子量が100,000を超える非イオン性両親媒性ポリマーを含む、工程；
(b) 該ゲル形成混合物をゲルへと重合化する工程；および
(c) スラブ電気泳動に使用する前に、該ゲルを少なくとも5日間保存する工程。
【請求項２】
非イオン性両親媒性ポリマーが100,000〜8,000,000の分子量を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
非イオン性両親媒性ポリマーが100,000〜5,000,000の分子量を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
非イオン性両親媒性ポリマーが100,000〜1,000,000の分子量を有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
非イオン性両親媒性ポリマーが、ポリ(ビニルアルコール)、アガロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)/ポリ(エチレングリコール)コポリマー、および直鎖状ポリアクリルアミドからなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
非イオン性両親媒性ポリマーが水溶液の0.5重量%〜5重量%のポリ(ビニルアルコール)である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
非イオン性両親媒性ポリマーがポリ(エチレングリコール)またはポリ(エチレンオキシド)である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
非イオン性両親媒性ポリマーが水溶液の0.01重量%〜0.3重量%のポリ(エチレンオキシド)である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
プレートがガラスである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
プレートが、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー、アクリロニトリルポリマー、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリ(エチレンテレフタラートグリコラート)、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)からなる群より選択されるプラスチックである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
プラスチックがポリスチレン-アクリロニトリル混和物である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下を含む、スラブゲル電気泳動に使用するためのプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル：
化学的に不活性な透明プレート対、および
該プレート間のポリアクリルアミドゲルの鋳型であって、該ポリアクリルアミドゲルはアクリルアミドモノマーおよび架橋剤の重合化によって形成され、該重合化は、該アクリルアミドモノマー、該架橋剤、バッファー、および分子量が100,000を超える非イオン性両親媒性ポリマーを含む水溶液中で行われ、このように形成された該ゲルは、スラブゲル電気泳動に用いる前に、該プレート間に少なくとも5日間保存される、ポリアクリルアミドゲルの鋳型。
【請求項１３】
非イオン性両親媒性ポリマーが100,000〜8,000,000の分子量を有する、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１４】
非イオン性両親媒性ポリマーが100,000〜5,000,000の分子量を有する、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１５】
非イオン性両親媒性ポリマーが100,000〜1,000,000の分子量を有する、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１６】
非イオン性両親媒性ポリマーが、ポリ(ビニルアルコール)、アガロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)/ポリ(エチレングリコール)コポリマー、および直鎖状ポリアクリルアミドからなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１７】
非イオン性両親媒性ポリマーが水溶液の0.5重量%〜約5重量%のポリ(ビニルアルコール)である、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１８】
非イオン性両親媒性ポリマーがポリ(エチレングリコール)またはポリ(エチレンオキシド)である、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１９】
非イオン性両親媒性ポリマーが水溶液の0.01重量%〜約0.3重量%のポリ(エチレンオキシド)である、請求項18記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２０】
プレートがガラスである、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２１】
プレートが、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー、アクリロニトリルポリマー、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリ(エチレンテレフタラートグリコラート)、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)からなる群より選択されるプラスチックである、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２２】
プラスチックがポリスチレン-アクリロニトリル混和物である、請求項21記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、スラブゲル電気泳動において用いられるポリアクリルアミドゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
電気泳動をスラブゲルで行うと、数個の試料を同じゲルで同時に分析することができ、結果として得られた電気泳動図は、個々の成分に対応するゲル上のバンドの位置を特定することによって視覚的に観察し、読み取ることができる。ポリアクリルアミドはスラブゲルに広く用いられるゲル材料である。
【０００３】
2枚の透明な平板を典型的に備えたカセットにおいて、スラブゲルは、2枚の平板の間に保持された状態で予め成型された形で供給されることが多い。板はガラスでもプラスチックでもよく、一般的に用いられる1つのプラスチックはポリスチレン-アクリロニトリル混合物である。ある特定のプレキャストポリアクリルアミドゲルの問題点は、貯蔵中に、ゲルがカセットの板から分離するように見られることである。これによって、ゲルと板の一方または両方との間に、試料が電気泳動中に移動できる通路が生じる。この移動によって、親バンド(すなわち、電気泳動分離の直接の結果として形成されるバンド)の鮮明さおよび特定をあいまいにする不鮮明なバンドが電気泳動図に生じる。不鮮明なバンドは、冷却せずに貯蔵されたプレキャストゲルにおいて最もよく生じる。
【０００４】
ポリアクリルアミドスラブゲルにおいて生じる別の問題は、ゲルが板に貼り付こうとする、または付着しようとする傾向である。これは、分離が完了し、染色、撮影または他の観察、検出または記録のためにゲルを板から取り出さなければならない場合に問題となる。板の一方または両方に貼り付いているゲルを取り出そうとすると、ゲルが傷つき、実験が失敗する可能性がある。この問題は、低濃度のゲルおよび等電点電気泳動に用いられるゲルにとって特に深刻である。
【０００５】
溶解酸素がゲル形成液体中に、またはゲル板の近くに存在する場合に、ポリアクリルアミドを形成する重合反応は阻害される。これは、ゲル板がプラスチック(例えば、ポリスチレン-アクリロニトリル)である場合に特に当てはまる。この阻害が起こらないようにするために、板とポリアクリルアミドゲル材料を接触させる前に、ポリ塩化ビニリデンまたはポリ二塩化ビニル(PVDC)のコーティングが板に塗布されることが多い。残念なことに、これらのコーティングは、ゲルが等電点電気泳動ゲル、例えば、pHが5〜8に及ぶ等電点電気泳動ゲルである場合に貼り付きの問題を悪化させる。さらに、電気泳動像は、作成される際これらのコーティングを伴っても伴わなくても、いずれにしろ、ゲルと板との間の分離の結果であると思われるでこぼこをしばしば含む。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ポリアクリルアミドゲルとゲルカセット板との間の明らかな通路による不鮮明なバンドの出現および板へのゲルの付着の両方が、モノマーの他に高分子量の非イオン性両親媒性ポリマーを含むモノマー溶液からゲルを形成することによって妨げることができるという発見にある。ポリマーは、ゲルが成型される前に溶液に添加され、次いで、依然としてポリマーが存在する状態で成型が行われる。
【０００７】
発明の詳細な説明および好ましい態様
本発明の実施において使用することができる非イオン性両親媒性ポリマーの例は、ポリ(ビニルアルコール)、アガロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)/ポリ(エチレングリコール)コポリマー、および直鎖状ポリアクリルアミドである。これらのポリマーは、ゲル形成溶液に添加される前に完全に形成され、ゲル形成溶液に可溶性であり、架橋反応可能な部位を有さない。本発明において使用されるポリマーは、100,000を超え、好ましくは約100,000〜約8,000,000の分子量を有するポリマーであり、より好ましくは約100,000〜約5,000,000の分子量を有するポリマーであり、さらに最も好ましくは約100,000〜約1,000,000の分子量を有するポリマーである。モノマー溶液中のポリマーの重量パーセントは広範囲にわたってもよいが、分子量を小さくすると、より高い重量パーセントのポリマーと等価なまたは同様の結果が得られる傾向がある。例えば、ポリビニルアルコールの場合、好ましい濃度範囲はモノマー溶液の約0.5重量％〜約5重量％である。ポリ(エチレングリコール)またはポリ(エチレンオキシド)が用いられる場合、好ましい濃度は約0.01重量％〜約0.3重量％である。他の非イオン性両親媒性ポリマーの濃度および分子量は日常的な実験によって容易に決定され、多くの場合、当業者に容易に明らかであると思われる。
【０００８】
ゲル形成溶液は、重合して(一般的に、フリーラジカル反応によって重合して)ポリアクリルアミドを形成するモノマー混合物の水溶液である。使用されている、またはポリアクリルアミドゲルの形成に有用であると文献に記載されている任意のモノマー混合物を、本発明の実施において使用することができる。モノマー混合物は、一般的に、アクリルアミド、架橋剤、およびフリーラジカル開始剤を含む。好ましい架橋剤はビスアクリルアミドであり、特に便利な架橋剤は、N,N'-メチレン-ビスアクリルアミドである。
【０００９】
ゲル形成溶液はまた、一般的に、フリーラジカル開始剤系も含む。使用される最も一般的な系は、N,N,N',N'-テトラメチレンジアミン(TEMED)と過硫酸アンモニウムの組み合わせである。他の系は当業者に明らかであると思われる。ゲル形成溶液はまた、既知の、または様々な理由で電気泳動ゲルに用いられている追加成分を含んでもよい。一般的に、電気泳動分離は指定されたpH値で行われるので、緩衝剤が通常含まれる。グリセロールなどの密度調整剤も多くの系において(特に、分離ゲルがスタッキングゲルの下に形成される場合に)有用である。
【００１０】
電気泳動の使用および電気泳動ゲルの調製に熟練した人の中で、ポリアクリルアミドゲルは、パーセントとして表され、以下のように定義されるパラメータTおよびCによって特徴付けられる(式中、「ビス」はビスアクリルアミド架橋剤を指す)：
2006528354.tif 000002
TおよびCの値は、ポリアクリルアミドゲルの使用において一般的に変化するように本発明において変化してもよい。本発明の目的のために、好ましいT値の範囲は約3％〜約30％であり、最も好ましくは約5％〜約20％である。好ましいC値の範囲は約1％〜約10％(約10:1〜約100:1のアクリルアミド:ビスアクリルアミド重量比の範囲に相当する)であり、最も好ましくは約2％〜約4％(約25:1〜約50:1のアクリルアミド:ビスアクリルアミド重量比の範囲に相当する)である。
【００１１】
本発明は、均一濃度のゲルならびに勾配ゲルに適用することができる。均一ゲルを形成する方法および勾配ゲルを形成する方法は両方とも当技術分野において周知である。
【００１２】
ゲルカセットを形成する板は、化学的に不活性の透明な材料(ガラスもしくはプラスチックまたはその両方)である。多種多様なプラスチックを使用することができる。プラスチックは一般的に射出成型可能なプラスチックであり、その選択は、プラスチックが、ゲル形成溶液、ゲルそのもの、カセットにおいて分析しようとする試料中の溶質(典型的にタンパク質)、緩衝剤、および試料に一般的に存在する他の任意の成分に対して不活性であるという必要性によってのみ制限される。これらのプラスチックの例は、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー(SAN, NAS)、バレックス(BAREX)(登録商標)アクリロニトリルポリマー(Barex Resins, Naperville, Illinois, USA)、ポリエチレンテレフタラート(PET)、ポリエチレンテレフタラートグリコラート(PETG)、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)(PEN)である。
【００１３】
以下の実施例は例示のために示され、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００１４】
実施例1
本実施例は、本発明に沿って、分子量116,000、205,000、400,000、および438,000のポリ(エチレンオキシド)を個別の実験で高分子量非イオン性両親媒性ポリマーゲル添加物として使用することについて説明する。
【００１５】
以下の水溶液に様々なポリ(エチレンオキシド)を含ませて、勾配ゲルを形成させた(すべて重量パーセント)：
溶液A：
アクリルアミド/N,N'-メチレン-ビスアクリルアミド(T=21%, C=2.6%)
10%グリセロール
0.1% TEMED
0.022%ポリ(エチレンオキシド)
溶液B：
アクリルアミド/N,N'-メチレン-ビスアクリルアミド(T=6%, C=2.6%)
0.2% TEMED
0.022%ポリ(エチレンオキシド)
溶液C：
1.125M tris-HCl（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩）、pH8.6
0.15%過硫酸アンモニウム
【００１６】
13.4cm×8.4cm×1mm寸法のゲルスペースを定める2個のスチレン-アクリロニトリルプラスチックプレートからなるカセット中にゲルを形成させた。まず、溶液Bおよび溶液Cの混合物を、Bが2/3、Cが1/3の容積比で、カセットに底部から注入することによりポリ(エチレンオキシド)濃度0.015重量%のT=4%スタッキングゲル溶液として、各ゲルを形成させた。その後、溶液A、B、およびCの混合物を、AとBの量を変化させながら、上記4%ゲル溶液の下のカセット中に注入することにより、スタッキングゲルの下に勾配ゲルを形成させた。(A+B)の容積2対Cの容積1の比を維持しながら、AとBの容積比を変化させて、10.5%から14%に渡るT勾配を作成した。
【００１７】
ゲル上で、Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, California USA)製の、分子量範囲6,500〜200,000の9種類のタンパク質の選出（このうち5種類は典型的なTris-HClゲルにより分離可能である）からなる広範な分子量域のタンパク質標準を利用して電気泳動分離を行った。電圧200Vでトリス-グリシン-ドデシル硫酸ナトリウムを含む泳動バッファーを用い、約35℃で約55分間、分離を実施した。これらの条件下、−成型直後のゲル上において、かつ、6日間37℃で保存したゲル上においても、分離を行った。
【００１８】
ポリ(エチレンオキシド)を含まない新鮮なゲルと、様々な分子量のポリ(エチレンオキシド)を含む新鮮なゲルとを比較すると、タンパク質のバンドは分子量438,000のポリ(エチレンオキシド)を含むゲル中で最も鮮明であり、かつ、ポリ(エチレンオキシド)の分子量が増加するにつれて、タンパク質のバンドの鮮明さも増加することが明らかになった。6日目のゲル間で比較すると、ポリ(エチレンオキシド)の分子量が増加するにつれて、やはりバンドの鮮明さが増加し、同様の推移が明らかになった。
【００１９】
実施例2
本実施例は、本発明に沿ってポリ(エチレンオキシド)をゲル添加物として使用することについての別の説明であり、今度は、511,000、600,000、1,000,000、5,000,000、および8,000,000の分子量を用いる。
【００２０】
上の段落に挙げた高分子量ポリ(エチレンオキシド)を全て0.022重量%の濃度で用い、保存期間を7日間として、実施例1と同様にスラブゲルを調製した。他のすべての材料、手順、および条件は同一である。
【００２１】
ポリ(エチレンオキシド)を含まない新鮮なゲルと、様々な分子量のポリ(エチレンオキシド)を含む新鮮なゲルとを比較すると、タンパク質のバンドは分子量600,000のポリ(エチレンオキシド)を含むゲル中で最も鮮明で直線的であり、ポリ(エチレンオキシド)の分子量が600,000を超えると、バンドの鮮明さは減少し、波打ちが現れることが明らかになった。7日目のゲル間で比較すると、同様に分子量600,000が最適であることが明らかになった。このポリ(エチレンオキシド)を含む7日目のゲルは、ポリ(エチレンオキシド)を含まないゲルよりも、バンドが尾を引いている部分が短く薄かったが、尾を引いている部分は、ポリ(エチレンオキシド)の分子量が増加するにつれて濃くなった。分子量を増加させたポリ(エチレンオキシド)により、得られるバンドは外見的に波打ちが増加し、これは恐らくモノマー溶液の粘度が増加したためであろう。この粘度の増加がモノマーおよびバッファー溶液（AおよびC、またはBおよびC）の混合を妨げた可能性がある。
【００２２】
前述の説明は主に例示を目的としている。さらなる変更、代用、および変化は当業者に明らかであり、本発明の範囲に含まれると考えられる。
【国際調査報告】
2006528354.tif 000003