(57)【要約】本発明はまた、バイオマーカーおよびガンの予測および予後のためのバイオマーカーの使用ならびにガン処置の効力をモニタリングするためのバイオマーカーの使用に関する。具体的には本発明はＲａｆキナーゼインヒビターのバイオマーカーとしてアドレノメジュリンの使用に関する。
2006518031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ガン剤を投与することによりガンを処置している患者の応答を監視する方法であって：
（ａ）抗ガン剤で処置する前に患者から採取した第１の生物学的サンプル中の１以上のバイオマーカーの発現レベルを測定し；
（ｂ）抗ガン剤での初期の処置後に患者から採取した少なくとも１つの第２の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを測定し；そして
（ｃ）第２の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを第１の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現レベルと比較する、
工程を含んでなり、第１の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現レベルと比較した第２の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現レベルの変化が、抗ガン剤による処置の効力の指標となる上記方法。
【請求項２】
ガンが乳ガン、気道のガン、脳のガン、生殖器官のガン、消化管のガン、尿路のガン、目のガン、肝臓ガン、皮膚ガン、頭および首のガン、甲状腺ガン、副甲状腺ガン、リンパ腫、肉腫および白血病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記抗ガン剤がＲａｆキナーゼインヒビターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記バイオマーカーがアドレノメジュリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記生物学的サンプルが血液、尿、骨髄および生検サンプルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ガンの処置に有用な化合物の同定法であって：
（ａ）化合物での処置前に、細胞または組織サンプル中の１以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルを分析し；
（ｂ）化合物での処置後に、細胞または組織サンプル中の１以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルを分析する、
工程を含んでなり、遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルにおける変動が薬剤効力の指標となる上記方法。
【請求項７】
遺伝子または遺伝子産物がアドレノメジュリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ガンの処置に有用な化合物を同定する方法であって：
（ａ）化合物での処置前に、細胞または組織サンプル中の１以上のポリペプチドの発現レベルを分析し；
（ｂ）化合物での処置後に、細胞または組織サンプル中の１以上のポリペプチドの発現レベルを分析する、
工程を含んでなり、ポリペプチドの発現レベルにおける変動が薬剤効力の指標となる上記方法。
【請求項９】
ポリペプチドがアドレノメジュリンである請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１５個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸プローブを含んでなる、細胞または組織サンプル中の化合物の効力を監視するためのキット。
【請求項１１】
細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能な標識、ハイブリダイゼーション溶液、細胞を溶解するための溶液、および／または核酸精製のための溶液をさらに含んでなる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
核酸プローブが配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
タンパク質に特異的な抗体を含んでなる、細胞または組織サンプル中の化合物の効力を監視するためのキット。
【請求項１４】
細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能な標識、ポリペプチドを抗体に結合し易くさせる溶液、細胞を溶解するための溶液、および／またはポリペプチド精製のための溶液をさらに含んでなる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
抗体がアドレノメジュリンに特異的である、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年９月３０日に出願された特許文献１の利益を主張し、この内容は全部、引用により本明細書に編入する。
発明の分野
本発明は、バイオマーカーおよびガンの予測および予後のためのバイオマーカーの使用、ならびにガン処置の効力を監視するためのバイオマーカーの使用に関する。具体的には、本発明はＲａｆキナーゼインヒビターのバイオマーカーとしてのアドレノメジュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの疾患状態は、遺伝子ＤＮＡのコピー数の変化、または特定の遺伝子の転写レベルの変化のいずれかを介する（例えばイニシェーションの制御、ＲＮＡ前駆体の供給、ＲＮＡプロセッシング等を介して）種々の遺伝子の発現レベルにおける差異が特徴である。例えば遺伝物質の損失および獲得は、悪性の形質転換および進行に重要な役割を果たす。これらの獲得および損失は少なくとも２種類の遺伝子、ガン遺伝子および腫瘍抑制遺伝子により駆動されていると考えられている。ガン遺伝子は腫瘍形成の正のレギュレーターであるが、腫瘍抑制遺伝子は腫瘍形成の負のレギュレーターである（非特許文献１；非特許文献２）。したがって制御されていない増殖を活性化する１つのメカニズムは、ガン遺伝子タンパク質をコードする遺伝子数を増すこと、またはこれらのガン遺伝子の発現レベルを増すことであり（例えば細胞または環境的変化に応答して）、そして別のメカニズムは腫瘍サプレッサーをコードする遺伝物質を失うこと、または遺伝子の発現レベルを下げることである。このモデルは神経膠腫の進行に関連する遺伝物質の損失および獲得により支持される（非特許文献３）。すなわち特定の遺伝子（例えばガン遺伝子または腫瘍サプレッサー）の発現（転写）レべルの変化は、種々のガンの存在および進行の手掛かりとして役立つ。
【０００３】
ＲａｆキナーゼはＲａｓシグナル伝達経路に関与するタンパク質である。ＲａｓはＲａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋカスケードおよびｒａｃおよびｒｈｏ経路を含め、細胞の形質転換を相乗的に誘導する幾つかの経路を調節する。特にＲａｓは最初にＲａｆを形質膜に局在化させることによりＲａｆ／Ｍｅｋ経路を活性化し、ここでＲａｆは有糸分裂的キナーゼカスケードを開始する（非特許文献４）。活性化されたＲａｆはＭｅｋ（既知の下流の基質）をリン酸化し、そして活性化し、これは次いでＥｒｋをリン酸化し、そして活性化する。次いで活性化されたＥｒｋは細胞質から核へと場所を換え、そして転写因子のリン酸化を介して遺伝子発現をモジュレートする。このようにＲａｓの活性化を介するＲａｆキナーゼの活性化は、ガンが発生する重要なメカニズムであると考えられている。
【０００４】
多数の実験で、Ｒａｆキナーゼの阻害がガン治療の重要な標的になることが示唆された。例えばＲａｆ、ＭｅｋまたはＥｒｋ活性のドミナントネガティブ変異体は、齧歯類の繊維芽細胞のバックグラウンドにおいて変異体Ｒａｓの形質転換能力を有意に下げる。さらにドミナントネガティブＭｅｋを発現しているヒト腫瘍細胞株は、親の細胞株と比べた時、組織培養ならびに足場非依存性増殖アッセイの両方で増殖する能力を欠いていた。またそのような変異体はインビボでヒト腫瘍異種移植の１次および転移性増殖の両方を阻害した。さらにＲａｆキナーゼを標的とすることの支持は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた研究から来ている。ｃ−Ｒａｆを標的にするように設計されたホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ５１３２は、インビボでＡ５４９ヒト肺異種移植片の増殖を阻害することが見いだされた（非特許文献５）。これらのデータを合わせると、Ｒａｆキナーゼタンパク質が活性化されたｒａｓシグナル伝達により駆動される悪性の表現型の重要な誘因であることが示唆される。さらにまたこのデータは、Ｒａｆキナーゼ活性の低分子インヒビターがガンの処置において重要な治療的メカニズムであることも示唆している。
【０００５】
これらの種々の疾患（例えばガン）を処置するための治療薬として使用される化合物は、これら遺伝子発現の変化の幾つか、またはすべてを恐らく逆行させる。したがってこれら遺伝子の少なくとも幾つかの発現の変化は、そのような治療薬の効力を監視し、またはさらに予測する方法として使用できる。結果としてこれらの遺伝子発現の変化の幾つか、またはすべてはバイオマーカーと考ることができ、そして利用できる。拡大して遺伝子産物もバイオマーカーとして使用できる。治療薬の効力を監視し、または予測するために使用する外に、バイオマーカーは治療薬の投与に正に応答することが予測される患者、および応答無しの状態へ逆戻りしたかもしれない患者を同定するためにも使用することができる。これらの発現の変化の分析は、目的とする標的組織（例えば腫瘍）または幾つかの代理細胞群（例えば末梢血白血球）で行うことができる。後者の場合、遺伝子発現の変化と効力（例えば腫瘍の収縮または非増殖）との相関は、効力のマーカーとして使用される発現の変化のパターンに関して特に強いはずである。
【０００６】
アドレノメジュリンは、多くのヒト腫瘍型（例えば肺（非小細胞および小細胞）、甲状腺、脳、皮膚、卵巣および子宮）、およびヒト腫瘍細胞株（非特許文献６；非特許文献７）により分泌されることが示された分泌型の生存または増殖因子である。アドレノメジュリンは正常および悪性細胞型に有糸分裂活性を有し、抗アポトーシスおよび脈管形成能を現し（非特許文献８）、そしてその発現は低酸素条件でアップレギュレートされる（非特許文献９）。  
【０００７】
本発明は、アドレノメジュリンとＲａｆキナーゼとの間の関連を初めて記載する。すなわち、ヒトの異種移植腫瘍モデルでアドレノメジュリンの発現がＲａｆキナーゼインヒビターにより調節されることが示された（図１および２）。アドレノメジュリン発現のモジュレーションは、Ｒａｆキナーゼインヒビターの効力およびその薬物動態学と相関する。したがってアドレノメジュリンは腫瘍の進行および分化の価値あるバイオマーカーとして、そして特にＲａｆキナーゼインヒビターでの処置の効力を監視するためのバイオマーカーとして役立つことができる。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／４１５，１９４号明細書
【非特許文献１】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｅｌｌ  ６４：３１３−３２６，１９９１
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１１３８−１１４６，１９９１
【非特許文献３】Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：３−８，１９９１
【非特許文献４】Ｈａｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１４１３−１４１４，１９９４
【非特許文献５】Ｍｏｎｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４８１−１５４８４，１９９６
【非特許文献６】Ｐｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２：１７１９−１７２９，２００１
【非特許文献７】Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３３４５−２３３５１，１９９６
【非特許文献８】Ｋａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２６１５−２６２０，１９９７
【非特許文献９】Ｇａｒａｙｏａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：８４８−８６２，２０００
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、バイオマーカーおよびガンの予測および予後に関するバイオマーカーの使用、ならびにガン処置の効力を監視するためのバイオマーカーの使用に関する。特に本発明はＲａｆキナーゼインヒビターのバイオマーカーとしてアドレノメジュリンの使用に関する。
【０００９】
加えて、本発明の目的はガンの予測、診断、予後および治療のための方法および試薬を提供することである。
【００１０】
本発明の１つの態様では、バイオマーカーは薬剤への暴露後に改変された発現を示す１以上の遺伝子および／または遺伝子産物を含んでなる。さらなる態様では、薬剤はＲａｆキナーゼインヒビターであり、そして別の態様ではバイオマーカーはアドレノメジュリンである。
【００１１】
本発明の別の態様は、１以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルを分析する工程を含んでなる、組織または細胞サンプルに及ぼす薬剤の効果をスクリーニングする方法であり、ここで組織または細胞サンプル中の遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルが薬剤への暴露前および後に分析され、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変動が薬剤効果の指標となるか、または患者の診断を提供するか、または処置に対する患者の応答を予測する。さらなる態様では、薬剤はＲａｆキナーゼインヒビターである。別の態様では、遺伝子または遺伝子産物はアドレノメジュリンである。
【００１２】
本発明の別の観点は、１以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルを分析する工程を含んでなる新規薬剤の探査法であり、ここで細胞の遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルが薬剤への暴露前および後に分析され、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変動が薬剤効力の指標となる。さらなる観点では、遺伝子または遺伝子産物はアドレノメジュリンである。
【００１３】
さらに本発明は、ガン患者に試験化合物を投与し、そしてポリペプチドの活性を測定することを含んでなるガンの処置に有用な化合物の同定法を提供し、ここでポリペプチド活性の変化は試験化合物がガンの処置に有用であることの指標となる。さらなる態様では、ポリペプチドはアドレノメジュリンであり、そして別の態様では化合物はＲａｆキナーゼインヒビターである。
【００１４】
このように本発明は、例えばアゴニストおよびアンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、アクチベーター、コアクチベーターおよびインヒビターのようなレギュレーターまたはモジュレーターとして作用し得る化合物を同定するために使用することができる方法を提供する。したがって本発明はガンに関連するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する試薬および方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現、安定性もしくは量、またはポリペプチドの活性をモジュレートする試薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模造物、核酸、核酸類似体（例えばペプチド核酸、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸）、または低分子であることができる。
【００１５】
また本発明は、１以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルを分析する工程を含んでなる診断を患者に提供する方法を提供し、ここで正常および患者サンプルの遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルを分析し、そして患者サンプル中の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変動は疾患の診断である。患者サンプルには限定するわけではないが、血液、羊水、血漿、精液、骨髄および組織生検を含む。さらなる態様では、遺伝子または遺伝子産物はアドレノメジュリンである。
【００１６】
さらに本発明はガンを有すると推定される個体のポリペプチドの活性を測定することを含んでなる個体のガンの診断法も提供し、ここでガンを有するとは推定されない個体のポリペプチドの活性と比べてポリペプチドの活性において差異があれば、個体はガンを有すると診断される。さらなる態様では、ポリペプチドはアドレノメジュリンである。
【００１７】
別の態様では、本発明は患者サンプル中にガンを検出する方法を提供し、ここで患者サンプル中のタンパク質と反応させるために、タンパク質に対する抗体が使用される。さらなる態様では、抗体はアドレノメジュリンに対して特異的である。
【００１８】
本発明の別の観点は、１以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルを分析する工程を含んでなる正常と疾患状態との間を識別するための方法であり、ここで正常および疾患組織の遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルが分析され、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変動が疾患状態の指標となる。さらなる観点では、遺伝子または遺伝子産物はアドレノメジュリンである。
【００１９】
別の態様では、本発明は正常細胞に対して少なくとも１つの遺伝子の差次的発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を検出することを含んでなる細胞の表現型の測定法に関し、ここで遺伝子は少なくとも２の因子、少なくとも５の因子、少なくとも２０の因子または少なくとも５０の因子により差別的に発現される。さらなる態様では、遺伝子はアドレノメジュリンをコードする。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は正常細胞に対して少なくとも１つのポリペプチドの差次的発現を検出することを含んでなる細胞の表現型の測定法に関し、ここでタンパク質は少なくとも２の因子、少なくとも５の因子、少なくとも２０の因子、少なくとも最高５０の因子により差別的に発現される。さらなる態様では、ポリペプチドはアドレノメジュリンである。
【００２１】
別の態様では本発明は、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸プローブを準備し、患者から細胞サンプルを得、場合により実質的に全部が非ガン性である第２の細胞サンプルを準備し、核酸プローブをストリンジェントな条件下で該各第１および第２の細胞サンプルのｍＲＮＡと接触させ、そして（ａ）プローブと第１の細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）プローブと第２の細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較することによる患者に由来する細胞の表現型を測定する方法に関し、ここで第２の細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比べた第１の細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量において、少なくとも２の因子、少なくとも５の因子、少なくとも２０の因子、または少なくとも５０の因子の差異は第１細胞サンプル中の細胞の表現型の指標となる。さらなる態様では、核酸プローブはアドレノメジュリンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２２】
別の態様では、本発明は患者から単離した細胞のサンプル中の核酸レベルを測定するためのプローブ／プライマーを含んでなる、ガン細胞または組織の存在を同定するための試験キットを提供する。特定の態様では、このキットはさらにキットを使用するための使用説明書、細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグもしくは標識、核酸をハイブリダイゼーションし易くする溶液、細胞溶解用の溶液、または核酸精製用の溶液を含むことができる。さらなる態様では、プローブ／プライマーはアドレノメジュリンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２３】
１つの態様では、本発明はタンパク質に特異的な抗体を含んでなる、ガン細胞または組織の存在を同定するための試験キットを提供する。特定の態様では、このキットはさらにキットを使用するための使用説明書を含む。特定の態様では、このキットはさらに細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグもしくは標識、ポリペプチドを抗体に結合し易くする溶液、細胞溶解用の溶液、またはポリペプチド精製用の溶液を含むことができる。さらなる態様では、抗体はアドレノメジュリンに特異的である。
【００２４】
別の態様では、本発明は患者から単離した細胞サンプル中の核酸レベルを測定するためのプローブ／プライマーを含んでなる、ガン細胞または組織中の化合物または治療薬の効力を監視するための試験キットを提供する。特定の態様では、このキットはさらにキットを使用するための使用説明書、細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグもしくは標識、核酸をハイブリダイゼーションし易くする溶液、細胞溶解用の溶液、または核酸精製用の溶液を含むことができる。さらなる態様では、プローブ／プライマーはアドレノメジュリンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２５】
１つの態様では、本発明はタンパク質に特異的な抗体を含んでなる、ガン細胞または組織中の化合物または治療薬の効力を監視するための試験キットを提供する。特定の態様では、このキットはさらにキットを使用するための使用説明書を含む。特定の態様では、このキットはさらに細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグもしくは標識、ポリペプチドを抗体に結合し易くする溶液、細胞溶解用の溶液、またはポリペプチド精製用の溶液を含むことができる。さらなる態様では、抗体はアドレノメジュリンに特異的である。
発明の詳細な説明
本発明は記載する特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、構築物および試薬に限定されず、そしてそれ自体が変動できると理解される。また本明細書で使用する技術は特定の態様を説明することを目的とするのみであり、そして添付する特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないと理解される。
【００２６】
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用するように、単数形“ａ”、“ａｎｄ”、および“ｔｈｅ”には内容が明確に他を規定しない限り、複数表示も含むことに注意しなければならない。すなわち例えば「遺伝子（ａ  ｇｅｎｅ）」に関して、これは１以上の遺伝子を指し、そして当業者に既知のその均等物等を含む。
【００２７】
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似または均等な任意の方法、デバイスおよび材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法、デバイスおよび材料をこれから記載する。
【００２８】
本明細書に挙げたすべての刊行物および特許明細書は、例えば今、記載する本発明と関連して使用することができる刊行物に記載されている構築物および方法論を説明し、そして開示する目的で、引用により本明細書に編入する。上で、そして本明細書を通して検討する刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示を単に提供するだけである。ここで本発明者に、先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えないと認めるものではないと解釈される。
定義
便宜的に、明細書、実施例および添付する特許請求の範囲で使用する特定の用語および句の意味をこれから提供する。
【００２９】
アレイ（ａｒｒａｙ）（例えばマイクロアレイ）上の「アドレス（ａｄｒｅｓｓ）」は、要素、例えばオリゴヌクレオチドがアレイの固体表面に結合している位置を指す。
【００３０】
本明細書で使用する用語「アゴニスト」は、タンパク質の生物活性を模倣またはアップレギュレート（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）する（例えば強化または補足する）作用物質を指すことを意味する。アゴニストは野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体であることができる。またアゴニストは、遺伝子の発現をアップレギュレートするか、またはタンパク質の少なくとも１つの生物生物を増加する化合物であることができる。またアゴニストはポリペプチドと別の分子、例えば標的ペプチドまたは核酸との相互作用を上昇させる化合物であることもできる。
【００３１】
本明細書で使用する「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの生産に関する。例えば増幅は当該技術分野で周知なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して行うことができる。（例えばＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲプライマー、ア ラボラトリーマニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー出版、プレインビュー、ニューヨーク州を参照にされたい）。
【００３２】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」は、タンパク質の少なくとも１つの生物活性をダウンレギュレート（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）する（例えば抑制または阻害する）作用物質を指すことを意味する。例えばＲａｆキナーゼインヒビターはそのようなアンタゴニストの例である。アンタゴニストはタンパク質と別の分子、例えば標的ペプチドまたは酵素基質との間の相互作用を阻害または減少させる化合物であることもできる。またアンタゴニストは、遺伝子の発現のダウンレギュレートするか、または存在する発現されたタンパク質の量を減少させる化合物であることもできる。
【００３３】
本明細書で使用する用語「抗体」は、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の全抗体を含むことを意図し、そして脊椎動物（例えば哺乳動物）のタンパク質と特異的に反応性でもあるそれらの断片を含む。抗体は通例の技術を使用して断片化することができ、そして断片は全抗体について上に記載した様式と同じ様式で用途についてスクリーニングすることができる。すなわちこの用語には、特定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解的に切断された、または組換え的に調製された部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質溶解的および／または組換え断片の非限定的例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖおよびペプチドリンカーにより連結されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ’ｓは共有的または非共有的に連結して、２以上の結合部位を有する抗体を形成することができる。本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、または抗体の他の精製された調製物および組換え抗体を含む。
【００３４】
用語「アレイ」または「マトリックス」はアドレス可能な位置の配置、またはデバイス上の「アドレス」を指す。位置は２次元アレイ、３次元アレイまたは他のマトリックス形式に配置することができる。位置の数は数個から少なくとも数十万の範囲であることができる。最も重要なことは、各位置が全く独立した反応部位を表すことである。「核酸アレイ」は、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子のより大きな部分のような核酸プローブを含有するアレイを指す。アレイ上の核酸は好ましくは単鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」と呼ぶ。「マイクロアレイ」も本明細書では「バイオチップ」を指し、または「生物学的チップ」は少なくとも約１００／ｃｍ２、そして好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の個別領域の密度を有する領域のアレイである。マイクロアレイ中の領域は典型的な寸法、例えば約１０〜２５０μｍの範囲の直径を有し、そしておよそ同じ距離によりアレイ中の他の領域から分かれている。
【００３５】
互換的に使用される「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的機能」は、本明細書ではポリペプチド（その天然または変性した構造でも）により、またはその任意のサブ配列により直接的または間接的に行われるエフェクターまたは抗原性機能を意味する。生物学的活性にはポリペプチドへの結合、他のタンパク質または分子への結合、ＤＮＡ結合タンパク質としての、転写レギュレーターとしての活性、損傷したＤＮＡに結合する能力等を含む。生物活性は本ポリペプチドに直接的に影響を及ぼすことによりモジュレートされ得る。あるいは生物活性は対応する遺伝子の発現をモジュレートすることによるように、ポリペプチドのレベルをモジュレートすることにより改変することができる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「生物学的サンプル」は、生物から、または生物の成分（例えば細胞）から得たサンプルを指す。サンプルは任意の生物学的組織または流体でよい。サンプルは患者に由来するサンプルでよい。そのようなサンプルには限定するわけではないが、唾液、血液、血液細胞（例えば白血球）、組織または生検サンプル（例えば腫瘍生検材料）、尿、腹腔液および胸膜液、またはそれらに由来する細胞を含む。生物学的サンプルは、組織学的目的に採取された凍結切片のような組織の切片も含むことができる。
【００３７】
用語「バイオマーカー」または「マーカー」は、広い範囲の細胞内または細胞外の出来事、ならびに全生物的な生理学的変化を包含する。バイオマーカーは細胞機能の任意の観点、例えば限定するわけではないがシグナル発信分子、転写因子、代謝産物、遺伝子転写産物ならびにタンパク質の翻訳後修飾の生産レベルまたは速度を本質的に表すことができる。バイオマーカーは転写レベルの全ゲノム分析またはタンパク質レベルおよび／または修飾の全プロテオーム分析を含むことができる。
【００３８】
またバイオマーカーは、未処置の病んだ細胞と比べて、疾患を有する個体の化合物で処置した病んだ細胞中で、アップまたはダウンレギュレートされる遺伝子または遺伝子産物を指すことができる。すなわち遺伝子または遺伝子産物は処置した細胞に十分に特異的であるので、場合により他の遺伝子または遺伝子産物と共に使用されて低分子の効力を同定、予測または検出することができる。すなわちバイオマーカーは、病んだ細胞中の化合物の効力または化合物による処置に対する病んだ細胞の応答に特徴的な遺伝子または遺伝子産物である。
【００３９】
ヌクレオチド配列は、２つの配列の各塩基が対合する場合、すなわちワトソン−クリック塩基対を形成することができる場合、もう１つのヌクレオチド配列に対して「相補的」である。用語「相補的鎖」は、本明細書では用語「相補鎖」と互換的に使用する。核酸鎖の相補鎖は、コード鎖の相補鎖または非コード鎖の相補鎖であることができる。
【００４０】
遺伝子の「検出剤」とは、遺伝子またはそれに関連する他の生物学的分子、例えば遺伝子から転写されたＲＮＡまたは遺伝子によりコードされるポリペプチドを特異的に検出するために使用できる作用物質を指す。例示的な検出剤は、遺伝子に対応する核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、および抗体である。
【００４１】
用語「ガン」には限定するわけではないが、胸部、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、目、肝臓、皮膚、頭および首、甲状腺、副甲状腺のガンのような充実性腫瘍、およびそれらの遠位転移を含む。またこの用語は、リンパ腫、肉腫および白血病も含む。
【００４２】
胸部ガンの例には限定するわけではないが、侵襲性腺管ガン、侵襲性小葉ガン、腺管ガンｉｎ ｓｉｔｕおよび小葉ガンｉｎ ｓｉｔｕを含む。
【００４３】
気道のガンの例には限定するわけではないが、小細胞および非小細胞肺癌腫、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫を含む。
【００４４】
脳のガンの例には限定するわけではないが、脳幹および下垂体神経膠腫、小脳および大脳星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、ならびに神経外胚葉および松果体腫を含む。
【００４５】
男性の生殖器の腫瘍には限定するわけではないが、前立腺および精巣ガンを含む。女性の生殖器の腫瘍には限定するわけではないが、子宮内膜、頚部、卵巣、膣および外陰部のガン、ならびに子宮の肉腫を含む。
【００４６】
消化管の腫瘍には限定するわけではないが、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺ガンを含む。
【００４７】
尿路の腫瘍には限定するわけではないが、膀胱、陰茎、腎臓、腎盤、尿管および尿道ガンを含む。
【００４８】
目のガンには限定するわけではないが、眼内メラノーマおよび網膜芽腫を含む。
【００４９】
肝臓ガンの例には限定するわけではないが、肝細胞ガン（繊維層板肝細胞ガンバリアントを含むか、または含まない肝細胞ガン）、胆管ガン（肝臓内胆汁管ガン）、および混合型肝細胞胆管ガンを含む。
【００５０】
皮膚ガンには限定するわけではないが、扁平上皮ガン、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚ガン、および非メラノーマ皮膚ガンを含む。
【００５１】
頭および首のガンには限定するわけではないが、咽頭／下咽頭／鼻咽頭／口腔咽頭ガン、および唇および口腔ガンを含む。
【００５２】
リンパ腫には限定するわけではないが、ＡＩＤＳ関連リンパ、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫を含む。
【００５３】
肉腫には限定するわけではないが、柔軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫を含む。
【００５４】
白血病には限定するわけではないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリーセル白血病を含む。
【００５５】
「ガンの病んだ細胞」とは、ガンを有する患者に存在する細胞を指す。すなわち正常な細胞の修飾された形態であり、そしてガンではない個体には存在しない細胞であるか、あるいはガンではない個体と比べて、ガンを有する個体に有意に高い、または低い数で存在する細胞である。
【００５６】
用語「均等な」とは、機能的に均等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。均等なヌクレオチド配列には、対立遺伝子バリアントのような１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を含むことができる。
【００５７】
本明細書において「遺伝子発現プロファイル」および細胞の「フィンガープリント」と互換的に使用する用語「発現プロファイル」とは、細胞中の１以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す１組の値を指す。発現プロファイルは好ましくは少なくとも約１０個の遺伝子、好ましくは少なくとも約５０、１００、２００個以上の遺伝子の発現レベルを表す値を含んでなる。また発現プロファイルは多数の細胞および条件（例えばＧＡＰＤＨのようなハウスキーピング遺伝子）で類似レベルで発現され遺伝子のｍＲＮＡレベルを含んでなることができる。例えばガンの病んだ細胞の発現プロファイルとは、病んだ細胞中に１０個以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す１組の値を指す。
【００５８】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の生産に必要な制御およびコード配列を含んでなる核酸配列を指す。ポリペプチドは完全長のコード配列により、またはコード配列の任意の部分によりコードされ得る。遺伝子は全体または一部が、植物、真菌、動物、細菌ゲノムもしくはエピソーム、真核生物、核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡを含む当該技術分野で知られている任意の起源に由来することができる。遺伝子は、発現産物の生物学的活性または化学的構造、発現の速度、または発現制御の様式に影響を及ぼすことができる１以上の修飾を、コードまたは非翻訳領域のいずれかに含むことができる。そのような修飾には限定するわけではないが、１以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換を含む。遺伝子は非切断コード配列を構成することができ、または遺伝子は適切なスプライス部位により結合した１以上のイントロンを含むことができる。
【００５９】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。例えば２つの一本鎖核酸は、それらが二本鎖デュプレックスを形成する時、ハイブリダイズする。二本鎖の領域は、単鎖核酸の１つまたは両方の完全長を、あるいは１つの一本鎖核酸のすべておよびもう１つの一本鎖核酸のサブ配列を含むことができ、あるいは二本鎖の領域は、各核酸のサブ配列を含むことができる。またハイブリダイゼーションは、２つの鎖が二本鎖ヘリックスを形成するならば、特定の誤対合を含むデュプレックスの形成も含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションを生じるハイブリダイゼーション条件を指す。
【００６０】
ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関連して本明細書で使用する用語「単離された」とは、高分子の天然の起源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。本明細書で使用する用語「単離された」とは、細胞性物質、ウイルス性物質、組換えＤＮＡ技術により生産された時の培養基、または化学的に合成された時の化学的前駆体または他の化学品を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに「単離された核酸」は、自然には断片として存在せず、そして天然の状態では見いだされない核酸断片を含むことができる。また本明細書で使用する用語「単離された」は、他の細胞性タンパク質から分離されたポリペプチドを指すためにも使用し、そして精製または組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
【００６１】
本明細書で使用する用語「標識」および「検出可能な標識」とは、限定するわけではないが放射性同位体、フルオロフォア、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、色素、金属イオン、リガンド（例えばビオチンまたはハプテン）等を含む検出することができる分子を指す。用語「蛍光剤」は、検出可能な範囲に蛍光を現すことができる物質またはその部分を指す。本発明に使用することができる標識の特別な例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、アンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、アルファ−、ベータ−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。
【００６２】
本明細書で使用する用語「発現のレベル」とは、所定の核酸の測定可能な発現レベルを指す。核酸の発現のレベルは、当該技術分野で周知な方法により測定される。用語「差別的に発現される」または「差次的発現」は、所定の核酸の測定可能な発現レベルの増加または減少を指す。本明細書で使用するように、「差別的に発現される」または「差次的発現」は、比較に使用する２つのサンプル（両方が同じ正常な標準サンプルに対して比べられる）において、核酸の発現レベルの差異が少なくとも１．４倍以上であることを意味する。また本発明に従い「差別的に発現される」または「差次的発現」は、比較に使用する２つのサンプル中の核酸の発現レベルにおいて、１．４倍以上から２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍以上までの差異を意味する。また核酸は、検出可能に発現される核酸が＋／−少なくとも１．４倍であれば、２つのサンプルのうちの１つが所定の核酸に検出できる発現を含まない場合でも２つのサンプルで「差別的に発現される」と言う。核酸配列の差次的発現は、比較に使用する２以上のサンプル中の核酸の発現レベルの差異が、もはや少なくとも１．４倍の差ではないように改変されたならば「阻害」されている。核酸の発現レベルの絶対的定量は、既知の濃度（１つまたは複数）の１以上の対照核酸種を含め、対照核酸の量に基づき標準曲線を作成し、そして未知のハイブリダイゼーション強度から「未知」の核酸種の発現レベルを標準曲線に関して外挿することにより達成することができる。
【００６３】
本明細書で使用する用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適切ならばリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指す。またこの用語は、均等物としてヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類似体も含むと理解され、そして一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドとして記載する態様に応用可能である。染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびＥＳＴは、核酸と呼ぶことができる分子の代表例である。
【００６４】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば約１０〜約１０００ヌクレオチドを含んでなる核酸分子を指す。本発明に使用するオリゴヌクレオチドは、好ましくは約１５〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５０〜約１０００のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは自然に存在するオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドでよい。オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−６２，１９８１）により、あるいはトリエステル法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１）により、あるいは当該技術分野で知られている他の化学的方法により調製することができる。
【００６５】
本明細書で使用する用語「患者」または「個体」には、哺乳動物（例えばヒトおよび動物）を含む。
【００６６】
本明細書で使用するように、アレイに結合した核酸または他の分子は、「プローブ」または「捕捉プローブ」と呼ぶ。アレイが１つの遺伝子に対応する数個のプローブを含む時、これらのプローブを「遺伝子プローブセット」と呼ぶ。遺伝子プローブセットは、例えば約２〜約２０個のプローブ、好ましくは約２〜約１０個のプローブ、そして最も好ましくは約５個のプローブを含んでなることができる。
【００６７】
細胞の生物学的状態の「プロファイル」とは、薬剤処置および細胞の生物学的状態の他の混乱に応答して変化することが知られている細胞の種々の構成要素のレベルを指す。細胞の構成要素には、例えばＲＮＡのレベル、タンパク質量のレベル、またはタンパク質活性レベルを含む。
【００６８】
用語「タンパク質」は本明細書では「ペプチド」および「ポリペプチド」と互換的に使用する。
【００６９】
２つのプロファイルにおける遺伝子の発現レベルが十分に類似する時、１つの細胞における発現プロファイルはもう１つの細胞の発現プロファイルに「類似」し、この類似性は共通する特性、例えば細胞が同じ型である指標となる。したがって第１の細胞で発現される遺伝子の少なくとも７５％が、第１の細胞に比べて２の因子内のレベルで第２細胞内で発現される時、第１の細胞および第２の細胞の発現プロファイルは類似する。
【００７０】
本明細書で使用する「低分子」は、約５ｋＤ未満、そして最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を持つ組成物を指す。低分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模造物、炭水化物、脂質または他の有機もしくは無機分子であることができる。多くの製薬会社は化学物質および／または生物学的混合物、しばしば真菌、細菌、または藻類抽出物の徹底的なライブラリーを有し、これらを本発明の任意のアッセイでスクリーニングして、生物活性をモジュレートする化合物を同定することができる。
【００７１】
鋳型核酸の標的部位に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルが明らかに翻訳され得るように、標的に主に対するプローブのハイブリダイゼーションを指す。さらに本明細書に記載するように、そのような条件は、相同的な領域の長さ、領域のＧＣ含量およびハイブリッドの融解温度（”Ｔｍ”）に依存して変動する特異的なハイブリダイゼーションをもたらす。すなわちハイブリダイゼーション条件は、塩含量、酸性度およびハイブリダイゼーション溶液の温度および洗浄で変動し得る。
【００７２】
ポリペプチドの「バリアント」は、１以上のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。バリアントは「保存的」変化を有してよく、ここで置換されたアミノ酸は類似の構造または化学的特性を有する（例えばロイシンのイソロイシンへの置換）。またバリアントは「非保存的」変化（例えばグリシンのトリプトファンへの置換）を有してもよい。類似のわずかな変動には、アミノ酸の欠失または挿入、またはその両方を含むことができる。生物学的または免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させることができるかを決める指針は、当該技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して同定することができる。
【００７３】
用語「バリアント」は、ポリヌクレオチド配列と関連して使用する時、特定の遺伝子またはそのコード配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含することができる。またこの定義には、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」または「多型」バリアントを含むことができる。スプライスバリアントは参照分子に対して有意な同一性を有することができるが、一般にはｍＲＮＡプロセッシング中にエキソンの選択的スプライシングにより、より多くの、またはより少ない数のポリヌクレオチドを有するだろう。対応するポリペプチドはさらなる機能的ドメインを有することができ、またはドメインが無い。種のバリアントは種毎に変動するポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは一般に、互いに関連する有意なアミノ酸同一性を有する。多型バリアントは、所定の種の個体間における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変動である。また多型バリアントにはポリヌクレオチド配列が１塩基毎に変動する「単一ヌクレオチド多形」（ＳＮＰ）も包含することができる。ＳＮＰの存在は、例えば特定の集団、疾患状態または疾患状態の傾向の指標となることができる。
【００７４】
本発明の観点は、異常な増殖を特徴とする細胞の分化および増殖をモジュレートすることができる作用物質の同定を対象とする。より具体的には、本発明は核酸配列の差次的発現を調節する能力について、候補化合物または物質をスクリーニングする方法に関する。すなわち核酸配列がガン細胞中で過剰発現される場合、候補化合物の発現を下げるそれらの能力についてスクリーニングし、そして核酸配列がガン細胞中で不十分に発現される（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）場合、試験化合物の発現を上げるその能力についてスクリーニングする。さらに本発明は本明細書に記載する差別的に発現される配列によりコードされる１以上のポリペプチドの活性をモジュレートする試験化合物もしくは物質を同定するスクリーニングアッセイに関する。これに関して、本発明はマーカー核酸の発現をモジュレートし、かつ／またはコードされるポリペプチドの生物活性を改変する化合物を測定するアッセイを提供する。
差次的発現のモジュレーションに関するスクリーニング
薬剤スクリーニングは、試験化合物（例えばＲａｆキナーゼインヒビター）を細胞のサンプルに加え、そして効果を監視することにより行われる。試験化合物を受けていない平行サンプルも対照として監視する。次いで処置および未処置細胞は、限定するわけではないが顕微鏡分析、生存試験、複製能力、組織学的調査、細胞に付随する特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞ライセートにより発現される酵素活性のレベル、および他の細胞もしくは化合物と相互作用する細胞の能力を含む任意の適切な表現型基準により比較される。処置と未処置細胞との間の差異が、試験化合物に起因する効果を示す。
【００７５】
試験化合物の望ましい効果には、ガンに関連するマーカー核酸配列により付与される任意の表現型に及ぼす効果を含む。例にはｍＲＮＡの過多を制限し、コードされるタンパク質の生産を制限し、またはタンパク質の機能的効果を制限する試験化合物を含む。試験化合物の効果は、処置と未処置細胞との間の結果を比較する時、明らかとなるだろう。
【００７６】
このように本発明は、インビトロで核酸マーカーの発現を抑制または強化する作用物質（例えばＲａｆキナーゼインヒビター）をスクリーニングする方法も包含し、この方法は作用物質がｍＲＮＡの生産を抑制または強化することができるかどうかを測定するために、マーカー核酸のｍＲＮＡ（例えばアドレノメジュリン）が培養した細胞中で検出可能である細胞または組織を作用物質に暴露し；そして暴露した細胞または組織中のｍＲＮＡのレベルを測定することを含んでなり、ここで作用物質に対して細胞株を暴露した後のｍＲＮＡレベルの減少はマーカー核酸ｍＲＮＡ生産の抑制の指標であり、そしてｍＲＮＡレベルの上昇はマーカーｍＲＮＡ生産の強化の指標となる。
【００７７】
あるいはスクリーニング法にはマーカータンパク質が培養した細胞中で検出可能である、マーカータンパク質の生産を抑制または強化すると思われる作用物質に対して細胞または組織のインビトロスクリーニングを含んでもよく；そして細胞または組織中のマーカータンパク質のレベルを測定し、ここで作用物質に対して細胞または組織を暴露した後のマーカータンパク質レベルの減少はマーカータンパク質生産の抑制の指標であり、そしてマーカータンパク質レベルの上昇はマーカータンパク質生産の強化の指標となる。
【００７８】
また本発明はマーカー核酸の発現を抑制または強化する作用物質をスクリーニングするインビボ方法を包含し、この方法はマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞を有する個体を、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の生産を抑制または強化すると思われる作用物質に暴露し；そして暴露した哺乳動物の腫瘍細胞中のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することを含んでなる。作用物質に対する個体の暴露後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少は、マーカー核酸発現の抑制の指標であり、そしてマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの上昇はマーカー核酸発現の強化の指標となる。
【００７９】
したがって本発明は、マーカー核酸を発現する細胞を試験化合物とインキュベーションし、そしてｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することを含んでなる方法を提供する。さらに本発明は、細胞群中のマーカー核酸の発現レベルを定量的に測定する方法、および作用物質が細胞群中のマーカー核酸の発現レベルを増加または減少できるかどうかを測定する方法を提供する。作用物質が細胞群中のマーカー核酸の発現レベルを増加または減少できるかどうかを測定する方法は、（ａ）対照および作用物質で処置した細胞群から細胞抽出物を調製し、（ｂ）細胞抽出物からマーカーポリペプチドを単離し、そして（ｃ）マーカーポリペプチドと該ポリペプチドに特異的な抗体との間に形成される免疫複合体の量を定量（例えば平行して）する工程を含んでなる。本発明のマーカーポリペプチドは、その生物活性をアッセイすることにより定量することもできる。マーカー核酸発現の上昇を誘導する作用物質は、対照細胞中で形成される免疫複合体の量に比べて、処置細胞中に形成される免疫複合体の量を増加させるそれらの能力により同定することができる。同様の様式で、マーカー核酸の発現を減少させる作用物質は、対照細胞に比べて、処置細胞抽出物中に形成される免疫複合体の量を減少させるそれらの能力により同定することができる。
【００８０】
本発明はガンで差別的に調節される単離された核酸配列、およびそのような配列の同定法を提供する。本発明はガンを有する個体で差別的に調節されるヌクレオチド配列の同定法を提供し、この方法は：個体から得たＲＮＡに対応する核酸サンプルを、同一性が既知の１以上の核酸分子を含んでなる核酸サンプルとハイブリダイズさせ；そして核酸サンプルの同一性が既知の１以上の核酸分子へのハイブリダイゼーションを測定することを含んでなり、ここでガンではない個体から得た核酸サンプルに比べて、同一性が既知の１以上の核酸分子への核酸サンプルのハイブリダイゼーションにおける２倍の差異は、ガンを有する個体中のヌクレオチド配列の差次的発現の指標となる。
【００８１】
一般に本発明はガンを有する個体で差別的に調節される核酸配列を同定する方法を提供し、この方法は個体からメッセンジャーＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡサンプルからｃＲＮＡを生成し、ｃＲＮＡをアレイ上の別個の位置に安定に結合した複数の核酸分子を含んでなるマイクロアレイにハイブリダイズさせ、そしてアレイに対するｃＲＮＡのハイブリダイゼーションのパターンを同定することを含んでなる。本発明に従い、アレイ上の所定の位置にハイブリダイズする核酸分子は、ハイブリダイゼーションシグナルがガンではない個体から得た核酸サンプルとハイブリダイズした同一のアレイ上の同じ位置でのハイブリダイゼーションシグナルよりも少なくとも２倍高いか、または低い場合、差別的に調節されていると言う。
遺伝子の発現レベルを測定するためのマイクロアレイ
遺伝子発現レベルの測定は、マイクロアレイを使用して行うことができる。一般に以下の工程を含むことができる：（ａ）個体からｍＲＮＡサンプルを得、そしてそれらから標識された核酸を調製し（「標的核酸」または「標的」）；（ｂ）標的核酸をアレイと、標的核酸がアレイ上の対応するプローブに結合するために十分な条件下、例えばハイブリダイゼーションまたは特異的結合により接触させ；（ｃ）任意にアレイから非結合標的を除去し；（ｄ）結合した標的を検出し、そして（ｅ）例えばコンピューターに基づく分析法を使用して結果を分析する。本明細書で使用する「核酸プローブ」または「プローブ」はアレイに結合した核酸であり、一方、「標的核酸」はアレイにハイブリダイズする核酸である。
【００８２】
核酸検体は試験される個体から「侵襲的」または「非侵襲的」サンプリング手段のいずれかを使用して得ることができる。サンプリング手段は、動物（マウス、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌまたはネコ動物を含む）の皮膚または臓器中からの核酸の回収が関与する場合、侵襲的と言う。侵襲的方法の例には、例えば採血、精液回収、針生検、胸膜吸引、臍帯生検を含む。そのような方法の例は、Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ.６６：３８７９−３８８２，１９９２）；Ｂｉｓｗａｓ，ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５９０：５８２−５８３，１９９０）およびＢｉｓｗａｓ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２２８−２２３３，１９９１）により検討されている。
【００８３】
対照的に「非侵襲的」サンプリング手段は、核酸分子が動物の内または外表面から回収される手段である。そのような「非侵襲的」サンプリング手段には、例えば涙、唾液、尿、糞便材料、汗または発汗を綿棒で集めること、および毛髪を含む。
【００８４】
本発明の１つの態様では、試験する個体に由来する１以上の細胞が得られ、そして細胞からＲＮＡが分離される。好適な態様では、末梢血白血球（ＰＢＬ）細胞のサンプルが個体から得られる。個体から細胞サンプルを得、そして次いでサンプルを所望の細胞型に濃縮することも可能である。例えば細胞は、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いた単離のような種々の技術を使用して、他の細胞から単離することができる。所望する細胞が固い組織中にある場合、特定の細胞を例えばミクロ切開により、またはレーザー捕捉ミクロ切開（ＬＣＭ）により切開することができる（例えばＢｏｎｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４８１，１９９７；Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９８，１９９６；Ｆｅｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５４：６１，１９９９；およびＭｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５８：１３４６，２０００を参照にされたい）。
【００８５】
ＲＮＡは組織または細胞サンプルから種々の方法、例えばチオシアン酸グアニジン溶解、続いてＣｓＣｌ遠心により抽出することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−５２９９，１９７９）。単一細胞からのＲＮＡは、単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法に記載されているように得ることができる（例えばＤｕｌａｃ，Ｃｕｒｒ，Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６：２４５，１９９８；Ｊｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９０：１９９，１９９６を参照にされたい）。
【００８６】
ＲＮＡサンプルは特定種についてさらに濃縮することができる。１つの態様では、例えばｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＲＮＡサンプルから単離することができる。別の態様では、ＲＮＡ群は、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成により、またはｃＤＮＡ合成に基づく多数回の直線増幅および鋳型方向のインビトロ転写により目的の配列について濃縮することができる（例えばＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９７１７，１９８９；Ｄｕｌａｃ，ｅｔ  ａｌ．、同上；Ｊｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．、同上を参照にされたい）。さらに特定の種または配列について濃縮された、または濃縮されていないＲＮＡ群は、例えばＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＷｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７，１９８８を参照にされたい）；自己−持続型配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＳＳＲ）（例えばＧｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４，１９９０を参照にされたい）；核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写増幅（例えばＫｗｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３，１９８９を参照にされたい）を含む種々の増幅法によりさらに増幅させることができる。ＰＣＲ技術に関する方法は当該技術分野では周知である（例えばＰＣＲ技法：ＤＮＡ増幅のための原理および応用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編集、フリーマン出版、ニューヨーク、ニューヨーク州，１９９２を参照にされたい）；ＰＣＲプロトコール：方法および応用へのガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．編集、アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４９６７，１９９１；Ｅｃｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．編集、ＩＲＬ出版、オックスフォード）；および米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照にされたい）。増幅法は、例えばＯｈｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｅｓ  ２９：５３０．２０００）；Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１１７，１９９９）；Ｈｅｇｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｅｓ  ２９：５４８，２０００）；Ｋａｃｈａｒｍｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：３，１９９９）；Ｌｉｖｅｓｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：３０１，２０００）；Ｓｐｉｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：３１０８，１９９９）；およびＳａｋａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８７：３２，２０００��参照にされたい）により記載されている。ＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ合成は、細胞のその場で行うこともできる（例えばＥｂｅｒｗｉｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３０１０，１９９２を参照にされたい）。
【００８７】
核酸分子は、核酸分子のマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの検出を可能とするように標識することができる。すなわちプローブはシグナル生成系の員を含んでなることができるので、直接的に、またはシグナル生成系の１以上のさらなる員と組み合わせた作用を介していずれかで検出可能となる。例えば核酸は蛍光的に標識したｄＮＴＰ（例えばＫｒｉｃｋａ，１９９２，非同位体ＤＮＡプローブ技術（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州を参照にされたい）、ビオチン化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰ、続いて標識されたストレプトアビジン、化学発光標識または同位体の付加で標識することができる。別の標識の例にはＴｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３，１９９６）に記載された「分子ビーコン」を含む。ハイブリダイゼーションは例えばプラスモン共鳴により測定することもできる（例えばＴｈｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４９４８，１９９７）。
【００８８】
１つの態様では、複数（例えば２、３、４、５以上）組の標的核酸を標識し、そして１回のハイブリダイゼーション反応に使用する（「複合分析」）。例えば１組の核酸は１つの細胞に由来するＲＮＡに対応することができ、そして別の組の核酸は別の細胞に由来するＲＮＡに対応することができる。複数組の核酸を種々の標識、例えば異なる発光スペクトルを有するので識別することができる種々の蛍光標識（例えばフルオルセインおよびローダミン）で標識することができる。次いでこの組を混合し、そして１つのミクロアレイに同時にハイブリダイズさせることができる（例えばＳｈｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０，１９９５）。
【００８９】
本発明に従い使用するためのマイクロアレイには、低分子の効力に特徴的な遺伝子の１以上のプローブを含む。好適な態様では、マイクロアレイはガンでアップレギュレートされる遺伝子およびガンでダウンレギュレートされる遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子に対応するプローブを含んでなる。マイクロアレイは低分子の効力に特徴的な少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも１０００個の遺伝子に対応するプローブを含んでなることができる。
【００９０】
マイクロアレイ上には各遺伝子に対応する１プローブ以上が存在してよい。例えばマイクロアレイは１つの遺伝子に対応する２〜２０個のプローブ、そして好ましくは約５〜１０個のプローブを含むことができる。プローブは低分子の効力に特徴的な遺伝子の完全長のＲＮＡ配列またはその相補鎖に対応することができ、またはプローブはその一部に対応することができ、この一部は特異的ハイブリダイゼーションを可能にするために十分な長さである。そのようなプローブは約５０ヌクレオチド〜約１００、２００、５００または１０００ヌクレオチド、または１０００ヌクレオチドより多くを含んでなることができる。本明細書にさらに記載するように、マイクロアレイは約１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、そしてより好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。プローブは好ましくは単鎖であり、そして所望するレベルの配列特異的ハイブリダイゼーションを提供するために、その標的に対して十分な相補性を有する。
【００９１】
典型的には本発明で使用するアレイは、ｃｍ２あたり１００種より高いプローブの部位密度を有する。好ましくはアレイは５００／ｃｍ２より高い部位密度、より好ましくは約１０００／ｃｍ２より高く、そして最も好ましくは約１０，０００／ｃｍ２より高い部位密度を有する。好ましくはアレイは１つの支持層上に１００種より多いプローブ、より好ましくは約１０００種より多いプローブ、さらに一層好ましくは約１０，０００種より多いプローブ、そして最も好ましくは１つの支持層上に１００，０００種よりも多いプローブを有する。
【００９２】
多くの異なるマイクロアレイ形状およびそれらの生産法が当業者には知られており、そして米国特許第５，２４２，９７４号；同第５，３８４，２６１号；第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；同第５，４２４，１８６号；第５，４２９，８０７号；同第５，４３６，３２７号；同第５，４４５，９３４号；同第５，５５６，７５２号；第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；第５，４２４，１８６号；同第５，４２９，８０７号；第５，４３６，３２７号；同第５，４７２，６７２号；同第５，５２７，６８１号；第５，５２９，７５６号；同第５，５４５，５３１号；同第５，５５４，５０１号；同第５，５６１，０７１号；第５，５７１，６３９号；同第５，５９３，８３９号；同第５，６２４，７１１号；同第５，７００，６３７号；同第５，７４４，３０５号；第５，７７０，４５６号；同第５，７７０，７２２号；第５，８３７，８３２号；同第５，８５６，１０１号；第５，８７４，２１９号；同第５，８８５，８３７号；同第５，９１９，５２３号；第６，０２２，９６３号；同第６，０７７，６７４号；および同第６，１５６，５０１号明細書；Ｓｈｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｂｔｅｃｈ  １６：３０１，１９９８；Ｄｕｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０，１９９９；Ｂｏｗｔｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５，１９９９；Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，２１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２０−２４，１９９９；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，１１  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，６８７−９０，１９９６；Ｍａｓｋｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，２１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４６６３−６９，１９９３；Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．（２００１）１９：３４２に開示されている；これらの内容は引用により本明細書に編入する。種々の応用におけるアレイの使用法を記載する特許には：米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，２８８，６４４号；第５，３２４，６３３号；同第５，４３２，０４９号；同第５，４７０，７１０号；第５，４９２，８０６号；同第５，５０３，９８０号；同第５，５１０，２７０号；同第５，５２５，４６４号；第５，５４７，８３９号；同第５，５８０，７３２号；同第５，６６１，０２８号；第５，８４８，６５９号；および同第５，８７４，２１９号明細書を含み、これらの開示は引用により本明細書に編入する。
【００９３】
アレイは好ましくは制御および参照核酸を含む。対照の核酸には例えば、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣおよびｂｉｏＤのような原核遺伝子、Ｐ１バクテリオファージに由来するｃｒｅまたはｄａｐ、ｌｙｓ、ｐｈｅ、ｔｈｒおよびｔｒｐのようなポリＡ制御を含む。参照核酸は１つの実験からの結果を別の結果に対して標準化させ、そして多数の実験を定量的レベルで比較できるようにする。参照核酸の例には既知の発現レベルのハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ、ヘキソキナーゼおよびアクチンを含む。
【００９４】
１つの態様では、オリゴヌクレオチドのアレイを固体支持体上に合成することができる。例示的な固体支持体にはガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、有機物質等を含む。チップマスキング技術および光保護化学を使用して、核酸プローブの規則正しいアレイを作成することが可能である。例えば“ＤＮＡチップ”または大変大規模の固定化ポリマーアレイ（“ＶＬＳＩＰＳ（商標）”アレイ）として知られているこれらのアレイは、約１ｃｍ２〜数ｃｍ２の面積を有する支持層上に数百万の特定したプローブ領域を含むことができ、これにより数個から数百万のプローブを包含する（例えば米国特許第５，６３１，７３４号明細書を参照にされたい）。
【００９５】
発現レベルを比較するために、標識した核酸はアレイと、標的核酸とアレイ上のプローブとの間の結合に十分な条件下で接触させることができる。好適な態様では、所望のレベルのハイブリダイゼーションの特異性を提供するために、ハイブリダイゼーション条件；すなわち標識した核酸とマイクロアレイ上のプローブとの間でハイブリダイゼーションが起こるために十分な条件を選択することができる。
【００９６】
ハイブリダイゼーションは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションを可能とする条件下で行うことができる。核酸の長さおよびＧＣ含量が熱融点、すなわち標的核酸に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションを得るために必要なハイブリダイゼーション条件を決定するだろう。これらの因子は当業者には周知であり、そしてアッセイで試験することもできる。核酸のハイブリダイゼーションに関する徹底的なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（生物化学および分子生物学におけるラボラトリーテクニック（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２４巻：核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｐ、Ｔｉｊｓｓｅｎ編集、エルセビア、ニューヨーク州（１９９３））に見いだすことができる。
【００９７】
上に記載した方法は、アレイ表面上に標識された標的核酸のハイブリダイゼーションパターンの生成をもたらす。標識した核酸の生成しじたハイブリダイゼーションパターンは、標的核酸の特定の標識に基づき選択した特定の検出様式を用いて、種々の方法で視覚化または検出することができる。代表的な検出手段には、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、比色測定、発光測定、光散乱等を含む。
【００９８】
１つのそのような検出法は、市販されている（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃｓ）、サンタクララ、カリフォルニア州）アレイスキャナー、例えば４１７（商標）アレイヤー、４１８（商標）Ａｒｒａｙスキャナー、またはアギレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）のＧｅｎｅＡｒｒａｙ（商標）スキャナーを利用する。このスキャナーはインターフェイスおよび容易に使用できるソフトウェアツールを用いてシステムスンピューターから制御される。出力は種々のソフトウェアアプリケーションにより直接インポートされるか、または直接読まれる。好適なスキャンニングデバイスは、例えば米国特許第５，１４３，８５４号および同第５，４２４，１８６号明細書に記載されている。
【００９９】
蛍光標識化プローブに関して、転写アレイの各部位での発蛍光は、好ましくはスキャンニング共焦点レーザー顕微鏡により検出することができる。あるいは２つのフルオロホアに特異的な波長での同時検体発光を可能にするレーザーを使用することができ、そして２つのフルオロホアからの発光を同時に分析することができる（例えばＳｈａｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：６３９−６４５，１９９６を参照にされたい）。好適な態様では、アレイはコンピューター制御Ｘ−Ｙステージおよび対物顕微鏡を用いたレーザー蛍光スキャナーでスキャンすることができる。蛍光レーザースキャンニングデバイスは、Ｓｈａｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．、同上に記載されている。
【０１００】
遺伝子発現データー、例えば比較を行う種類の分析に、種々のアルゴリズムを利用することができる。特定の態様では、同時に調節される遺伝子をまとめることが望ましい。これにより多数のプロファイルの比較が可能となる。そのような遺伝子群を同定するために好適な態様には、クラスタリングアルゴリズム（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｕｍ）を含む（クラスタリングアルゴリズムに関する総説に関しては、例えばＦｕｋｕｎａｇａ，１９９０、統計的パターン認識（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｉｎｉｔｉｏｎ）、第２版、アカデミック出版、サンディエゴ；Ｅｖｅｒｉｔｔ，１９７４，クラスター分析（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）、ロンドン：ヘインマン教育書（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｅｄｕｃ．Ｂｏｏｋｓ）；Ｈａｒｔｉｇａｎ，１９７５、クラスタリングアルゴリズム（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｕｍ）、ニューヨーク：ウィリー；Ｓｎｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，１９７３，数値的分類学（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ）、フリーマン；Ａｎｄｅｒｂｅｒｇ，１９７３，応用に関するクラスター分析（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、アカデミック出版：ニューヨーク）を含む。
バイオマーカー探査
発現パターンを使用して患者における薬剤処置の効力を予測するために使用できるバイオマーカーのパネルを引き出すことができる。バイオマーカーは生物学的サンプルから単離したＲＮＡ、腫瘍生検の凍結サンプルから単離したＲＮＡに関するマイクロアレイ実験に由来する遺伝子発現レベル、または質量分析から引き出される血清中のタンパク質の質量からなることができる。
【０１０１】
データ分析に関する精密なメカニズムはデータの厳密な性質に依存するが、バイオマーカーのパネルを開発する典型的な手順は以下の通りである。データ（遺伝子発現レベルまたは質量スペクトル）を、処置前の各患者について集める。実験が進行した時、患者は薬剤処置に対する彼らの応答；効力があるか、無いかに従い分類される。多くの効力レベルをデータモデルに適応させることができるが、特に患者群が数百に満たない場合は二値比較が最適であると考えられる。各クラスに十分な患者数を割り当てることにより、タンパク質および／または遺伝子発現データは当該技術分野で知られている多数の技術により分析することができる。この技術の多くは従来の統計学から、ならびに機械学習の分野にも由来する。これらの技術は２つの目的に役立つ：
１．データの次元の縮小−質量分析または遺伝子発現マイクロアレイの場合、データは数千の個体データ点から約３〜１０に減らされる。この減少は集合として取った時のデータ点の予測力に基づく。
２．訓練−これら３〜１０のデータ点は次に、多数の機械学習アルゴリズムを訓練するために使用され、これは次いで、この場合、効力がない薬剤処置から効力がある薬剤処置を識別するタンパク質質量または遺伝子発現のパターンを認識することを「学習」する。すべての患者サンプルを、このアルゴリズムを訓練するために使用することができる。
【０１０２】
生成された訓練されたアルゴリズムは、次いでそれらの予測力を測定するために試験される。典型的には数百未満の訓練例が利用可能である時、幾つかの交差検定の形式が行われる。具体的に説明するために、１０倍の交差検定を考える。この場合、患者サンプルは１０個のビンの１つに無作為に割り当てられる。最初の検定で、９個のビン中のサンプルを訓練に使用し、そして１０番目の残るサンプルはアルゴリズムを試験するために使用する。これをさらに９回繰り返し、各回で試験のために異なるビン中のサンプルを残す。１０回すべてからの結果（正しい予測および誤り）を合わせ、そして次に予測力を評価する。この試験に関して異なるアルゴリズムならびに異なるパネルを比較することができる。次いで「最高」のアルゴリズム／パネルの組み合わせを選択する。次いでこの「スマート」アルゴリズムを将来の実験で使用して、処置に最も応答する見込みの患者を選択することができる。
【０１０３】
多くのアルゴリズムが、患者について集めたさらなる情報から利益を得る。例えば性別または年齢は予測力を改善するために使用できる。また標準化および平滑化のようなデーター変換もノイズを減らすために使用することができる。この理由から、結果を至適化するために、多数のアルゴリズムが多くの異なるパラメーターを使用して訓練され得る。予測パターンがデータ中に存在する場合、最適またはほぼ最適な「スマート」アルゴリズムを開発することができるだろう。より多くの患者サンプルが利用できるようになれば、アルゴリズムを再訓練して新たなデータを利用することができる。
【０１０４】
質量分析を使用する例として、血漿（１μｌ）を疎水性ＳＥＬＤＩ−標的にのせ、水中で徹底的に洗浄し、そして質量分析計のＳＥＬＤＩ−Ｔにより分析することができる。これを１００以上の患者サンプルについて繰り返すことができる。各サンプルで約１６，０００ｍ／ｚ値の強度から生じるタンパク質プロファイルは、薬剤効力の予測である特異的ｍ／ｚ値の組を同定するために統計的に分析される。イオン交換またはＩＭＡＣ表面のような他のＳＥＬＤＩ−標的を使用した同一の実験を行うこともできる。これらは血漿中に存在するタンパク質の異なるサブセットを捕捉するだろう。さらに血漿を変性し、そしてＳＥＬＤＩ標的に適用する前に予備分画することができる。
診断および予後アッセイ
本発明は、バイオマーカー（例えばアドレノメジュリン）、すなわちガンに関する核酸および／またはポリペプチドマーカーを検出することにより、個体が望ましくない細胞の増殖を特徴とする疾患または状態を発症する危険にあるかどうかを測定するための方法を提供する。
【０１０５】
臨床的応用では、ヒトの組織サンプルを本明細書で同定するバイオマーカーの存在および／または不存在についてスクリーニングすることができる。そのようなサンプルは針生検コア、外科的切除サンプル、リンパ節組織または血清からなることができる。例えばこれらの方法には、生検材料を得ることを含み、これは場合により低温槽切開により分画して、腫瘍細胞を全細胞群の約８０％にまで濃縮する。特定の態様では、これらのサンプルから抽出した核酸を当該技術分野で周知な技術を使用して増幅することができる。検出される選択マーカーのレベルは、統計的に検定された転移性、非転移性悪性、良性または正常組織サンプルの群と比較される。
【０１０６】
１つの態様では、診断法は個体がバイオマーカー（例えばアドレノメジュリン）の異常なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを有するかどうかを、ノーザンブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロットハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学によるように測定することを含んでなる。この方法に従い細胞を個体から得、そしてバイオマーカー、タンパク質のレベル、またはｍＲＮＡレベルを測定し、そして健康な個体中のこれらのマーカーのレベルと比較することができる。バイオマーカーポリペプチドの異常なレベルまたはｍＲＮＡレべルは、ガンの指標となるだろう。
【０１０７】
したがって１つの観点では本発明は、本明細書に開示する独自の核酸マーカーに特異的なプローブおよびプライマーを提供する。したがって核酸プローブはマーカーの核酸配列のコード配列の一部に相補的な少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列、およびコード配列のすべてまたはほぼすべてまでを含んでなる。
【０１０８】
１つの態様では、この方法は患者に由来する組織中のガン性細胞の存在を測定するために、核酸プローブを使用することを含んでなる。具体的にはこの方法は：
１．核酸配列のコード配列の一部に相補的な少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列、およびコード配列のすべてまたはほぼすべてまでを含んでなり、そして腫瘍細胞中で差別的に発現される核酸プローブを準備し；
２．患者からガン性細胞を含んでなる可能性が高い組織サンプルを得；
３．実質的にすべてが非ガン性である細胞を含有する第２の組織サンプルを準備し；
４．核酸プローブをストリンジェントな条件下で、各該第１および第２の組織サンプル中のＲＮＡと接触させ（例えばノーザンブロットまたはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで）；そして
５．（ａ）プローブと第１の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）プローブと第２の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較することを含んでなり；ここで第２の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量に比べて、第１の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量における統計的に有意な差異は、第１の組織サンプル中にガン性細胞が存在することの指標となる。
【０１０９】
１つの観点では、この方法は所定のマーカー核酸配列（例えばアドレノメジュリン）に由来するプローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含んでなる。この方法は標識したハイブリダイゼーションプローブを、ガン性または前ガン性細胞ならびに正常細胞を含有する可能性がある所定の組織型のサンプルと接触させ、そしてプローブが所定の組織型の幾つかの細胞を標識する程度が、プローブが同じ組織型の他の細胞を標識する程度よりも有意に異なるかどうか（例えば少なくとも２の因子、または少なくとも５の因子、または少なくとも２０の因子、または少なくとも５０の因子）を測定することを含んでなる。
【０１１０】
また本発明内にあるのは、試験細胞のｍＲＮＡを、核酸配列のコード配列の一部に相補的な少なくとも１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、および配列のすべてまたはほぼすべてであり、そして所定の組織型の正常細胞と比べて腫瘍細胞中で差別的に発現される核酸プローブと接触させ；そしてｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションのおよその量を測定することにより、所定のヒト組織に由来する試験細胞の表現型、例えば細胞が（ａ）正常、（ｂ）ガン性または前ガン性であるかどうかを測定する方法であり、正常細胞のｍＲＮＡで見られるハイブリダイゼーションの量より多いか、または少ないその組織型で現れるハイブリダイゼーションの量は、試験細胞がガン性または前ガン性であることの指標となる。
【０１１１】
あるいは上記診断アッセイは、マーカー核酸配列によりコードされるタンパク質産物（例えばアドレノメジュリン）を検出するための抗体を使用して行うことができる。したがって１つの態様では、アッセイは試験細胞のタンパク質を核酸の遺伝子産物に特異的な抗体と接触させ、マーカー核酸は試験細胞と同じ組織型の正常な細胞中で所定の制御レベルで発現されるものであり、そして抗体および試験細胞のタンパク質により形成された免疫複合体のおよその量を測定することを含んでなり、ここで同じ組織型の正常な細胞に比べて試験細胞中のタンパク質と形成された免疫複合体の量における統計的に有意な差異は、試験細胞がガン性または前ガン性であることの指標となる。好ましくは抗体はアドレノメジュリンに対して特異的である。
【０１１２】
本発明に有用なポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を生産する方法は当業者に知られており、そして例えばＤｙｍｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４８１５，１９９２）；Ｂｏｅｒｓｍａ  ＆  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３１７，１９９４）；Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｅｌｌ  ２８：４７７，１９８２）；およびＡｒｎｈｅｉｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２７８，１９８１）に見いだすことができる。
【０１１３】
別のそのような方法には：マーカー核酸配列の遺伝子産物に特異的な抗体を準備し、この遺伝子産物は同じ組織型の非ガン性組織中の遺伝子産物のレベルよりも多いレベルまたは少ないレベルで所定の組織型のガン性組織中に存在し；患者から所定の組織型の第１の組織サンプルを得、このサンプルはガン性細胞を含む可能性があり；同じ組織型の第２の組織サンプルを準備し（これは同じ患者に由来するか、または正常な対照、例えば別の個体または培養した細胞に由来するものでよい）、第２のサンプルは正常細胞を含有し、そして本質的には非ガン性細胞であり；抗体を第１および第２のサンプルのタンパク質（これは部分的に精製され、溶解されているが、分画されていない細胞、またはｉｎ ｓｉｔｕでよい）と、抗体とサンプル中に存在するマーカー核酸配列産物との間で免疫複合体の形成ができるような条件下で接触させ；そして（ａ）第１のサンプル中での免疫複合体形成の量を、（ｂ）第２のサンプル中での免疫複合体形成の量と比較する工程を含み、ここで第２サンプル中での免疫複合体形成の量に比べて、少ない第１のサンプル中での免疫複合体形成の量における統計的に有意な差異は、組織の第１のサンプル中にガン性細胞が存在する指標となる。
【０１１４】
さらに本発明は個体から得た細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを測定する方法を提供し、これは（ａ）個体から細胞サンプルを得、（ｂ）そのように得られたサンプル中のマーカーポリペプチドの量を定量的に測定し、そして（ｃ）個体から得た細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定するために、そのように測定したマーカーポリペプチドの量を既知の標準と比較することを含んでなる。そのようなマーカーポリペプチドは免疫組織化学アッセイ、ドット−ブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出することができる。
【０１１５】
免疫アッセイは通常、細胞サンプル中のタンパク質レベルを定量するために使用され、そして多くの他のイムノアッセイ技術が当該技術分野で知られている。本発明は特定のアッセイ手順に制限されず、したがって均一および不均一な手順の両方を含む。本発明に従い行うことができる例示的なイムノアッセイには、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む。指示部分または標識群は主題の抗体に結合され、そしてアッセイ装置の利用性および適用可能なイムノアッセイ法によりしばしば決められる様々な方法の用途の必要性に合うように選択される。上に記載した種々のイムノアッセイを行うために使用される一般技術は当業者には周知である。
【０１１６】
別の態様では、患者の生物学的流体（例えば血液または尿）中のコードされた産物のレベルあるいはポリペプチドのレベルは、患者の細胞中のマーカー核酸配列の発現レベルを監視する方法として測定することができる。そのような方法には、患者から生物学的流体のサンプルを得、サンプル（またはサンプル由来のタンパク質）を、コードされるマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、そして抗体による免疫複合体形成の量を測定する工程を含み、免疫複合体形成の量がサンプル中でコードされるマーカーのレベルの指標となる。この測定は、正常個体から採取した対照サンプル中または同じ人から事前に、またはその後に得た１以上のサンプル中の同じ抗体による免疫複合体形成の量と比べた時、特に有益である。
【０１１７】
別の態様では、この方法は細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を測定するために使用することができ、これを次に高増殖性障害の進行と相関させることができる。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞のサンプルが形質転換した細胞であるか、または形質転換した細胞になる傾向がある細胞を含むかどうかを評価するために予測的に使用することができる。さらに本方法は形質転換したことが分かる細胞の表現型を評価するために使用することができ、表現型決定の結果は特定の治療法の計画に有用である。例えばサンプル細胞中の大変高レベルのマーカーポリペプチドは、ガンの有力な診断および予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察は、例えばより積極的な治療の使用に関する決定に利用することができる。
【０１１８】
上で説明したように本発明の１つの観点は、患者から単離した細胞の内容において、マーカーポリペプチドレベルがサンプル細胞中で有意に減少しているかどうかを決定するための診断アッセイに関する。用語「有意に減少している」とは、細胞が同じ組織起源の正常細胞に比べて減少したマーカーポリペプチドの細胞量を有する細胞の表現型を指す。例えば細胞は正常な対照細胞に比べて、約５０％、２５％、１０％または５％未満のマーカーポリペプチドを有することができる。特にこのアッセイは試験細胞中のマーカーポリペプチドレベルを評価し、そして好ましくは測定したレベルを少なくとも１つの対照細胞、例えば正常細胞および／または既知の表現型の形質転換した細胞中で検出されるマーカーポリペプチドで測定したレベルと比較する。
【０１１９】
本発明で特に重要であるのは、正常または異常なマーカーポリペプチドレベルに関連する細胞数により測定されるマーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。特定のマーカーポリペプチドの表現型を持つ細胞数は、次いで患者の予後と相関させることができる。本発明の１つの態様において、損傷のマーカーポリペプチドの表現型は、マーカーポリペプチドが異常に高い／低いレベルを有すると見いだされた生検材料中の細胞の割合として測定される。そのような発現は免疫組織化学アッセイ、ドット−ブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出することができる。
【０１２０】
組織サンプルを使用する場合、免疫組織化学的染色を使用してマーカーポリペプチドの表現型を有する細胞数を測定することができる。そのような染色には、マルチブロックの組織を生検材料または他の組織サンプルから採取し、そしてプロテアーゼＫまたはペプシンのような作用物質を使用するタンパク質分解的加水分解にかけることができる。特定の態様では、サンプル細胞から核画分を単離し、そして核画分中のマーカーポリペプチドのレベルを検出することが望ましいかもしれない。
【０１２１】
組織サンプルはホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等のような試薬で処理することにより固定される。次いでサンプルを抗体、好ましくはマーカーポリペプチドに結合特異性を有するモノクローナル抗体とインキュベーションする。この抗体は後に結合を検出するために標識に結合させることができる。サンプルは免疫複合体の形成に十分な時間、インキュベーションされる。次いで抗体の結合が抗体に結合した標識により検出される。抗体が非標識である場合、例えば抗−マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに特異的な第２の標識抗体を使用することができる。使用できる標識の例には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素等を含む。
【０１２２】
酵素を使用する場合、酵素の基質をサンプルに加えて発色または蛍光産物を提供することができる。結合物に使用するために適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ等を含む。市販されていない場合、そのような抗体−酵素結合物は当業者に知られている技術により容易に生成される。
【０１２３】
１つの態様では、アッセイはドットブロットアッセイにより行われる。ドットブロットアッセイは、予め定めた数の細胞から生産される無細胞抽出物中のマーカーポリペプチドの量と相関させることにより、１つの細胞に付随するマーカーポリペプチドの平均量の測定を可能とすることができるので、組織サンプルが使用される場合に特定の応用が見いだされる。
【０１２４】
ガンに関する文献では、同型の腫瘍細胞（例えば胸部および／または結腸腫瘍細胞）は、個々のガン遺伝子の均一に増加した発現、または個々の腫瘍抑制遺伝子の均一に減少した発現を示すことができないことが十分に確立している。所定の型のガンの細胞間でも所定のマーカー遺伝子の発現レベルが変動するかもしれないので、単一の試験よりもむしろ一群の試験に頼る必要性がさらに強調される。したがって１つの観点では、診断試験の信頼性および／または精度を向上するために、本発明は本発明の多数のプローブを使用する一群の試験を提供する。
【０１２５】
１つの態様では、本発明は核酸プローブが整列したアレイ中のＤＮＡチップ上に固定化されている方法も提供する。オリゴヌクレオチドはリトグラフィーを含む種々の手法により固体支持体上に結合させることができる。例えばチップは２５０，０００ものオリゴヌクレオチドを保持することができる。これらの核酸プローブは、マーカー核酸配列のコード配列の一部に相補的であり、そして腫瘍細胞中で差別的に発現される配列の少なくとも約１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、およびすべてまたはほぼすべての配列を含んでなる。本発明は１つのチップ上に核酸マーカーのアレイを提供することにより試験の信頼性が上がるので、種々なガンに関して利用可能な試験に優る有意な利点を提供する。
【０１２６】
この方法は、全細胞群の約８０％に腫瘍細胞を濃縮するために低温槽切開により場合によっては分画される生検材料を得ることを含んでなる。次いでＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、増幅し、そしてＤＮＡチップを用いてマーカー核酸配列の存在または不存在を測定する。
【０１２７】
１つの態様では、核酸プローブを支持体上で２次元マトリックスまたはアレイにスポットする。核酸のサンプルは標識することができ、そして次いでプローブとハイブリダイズする。プローブ核酸に結合した標識されたサンプル核酸を含んでなる２重鎖核酸は、いったんサンプルの非結合部分を洗い出せば検出することができる。
【０１２８】
プローブ核酸は、ガラス、ニトロセルロース等を含む支持体上にスポットすることができる。次いでプローブは、共有結合または疎水性相互作用のような非特異的相互作用によるいずれかで支持体に結合することができる。サンプル核酸は放射性標識、フルオロホア、クロモホア等を使用して標識することができる。
【０１２９】
アレイを構築する技術およびこれらのアレイを使用する方法は、例えば欧州特許第０７９９８９７号明細書；国際公開第９７／２９２  １２号；同第９７１２７３１７号パンフレット；欧州特許第０７８５２８０号明細書；国際公開第９７／０２３５７号パンフレット；米国特許第５，５９３，８３９号；同第５，５７８，８３２号明細書；欧州特許第０７２８５２０号明細書；米国特許第５，５９９，６９５号明細書；欧州特許第０７２１０１６号明細書；米国特許第５，５５６，７５２号明細書；国際公開第９５／２２０５８パンフレット；および米国特許第５，６３１，７３４号明細書に記載されている。
【０１３０】
さらにアレイは遺伝子の差次的発現を調査するために使用することができ、そして遺伝子の機能を測定するために使用することができる。例えば核酸配列のアレイは核酸配列が正常細胞とガン細胞との間で差別的に発現されるかどうかを測定するために使用できる。対応する正常細胞で観察されないガン細胞中の特定のメッセージの上昇した発現は、ガンに特異的なタンパク質を示すかもしれない。
【０１３１】
１つの態様では核酸分子は、並べた核酸分子が正常細胞または組織とガン性細胞または組織との間で核酸が差別的に発現されるのかどうかを測定するために使用できるように、固体表面（例えば膜）上にマイクロアレイを作成するために使用することができる。１つの態様では本発明の核酸分子はｃＤＮＡでよく、または続いてＰＣＲにより増幅され、そしてナイロン膜上にスポットされるｃＤＮＡ分子を生成するために使用することができる。次いで膜を、ガン性および正常組織または細胞の同等サンプルから得た放射標識された標的核酸分子と反応させることができる。ｃＤＮＡの作成およびマイクロアレイの調製法は当業者には知られており、そして例えばＢｅｒｔｕｃｃｉ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８：２１２９，１９９９）；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９：２０７，１９９５）；Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｇｅｎｅ  １５６：２０７）；Ｇｒｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ３：６０９，１９９２）；Ｚｈｕｍａｂａｙｅｖａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：１５８，２００１）；およびＬｅｎｎｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：３１４，１９９１）に見いだすことができる。
【０１３２】
さらに別の態様では、本発明は本発明のマーカーポリペプチドに対して生成される抗体のパネルを使用することを企図する。好ましくは抗体はアドレノメジュリンに対して生成される。そのような抗体のパネルは、ガンに関する信頼性のある診断用プローブとして使用することができる。本発明のアッセイは、細胞、例えば肺細胞を含有する生検サンプルを、１以上のコードされる産物に対する抗体のパネルと接触させてマーカーポリペプチドの存在または不存在を測定することを含んでなる。
【０１３３】
本発明の診断法は、処置の追跡としても使用することができ、例えばマーカーポリペプチドレベルの定量は、現在または過去に使用したガン治療の効力ならびに患者の予後に及ぼすこれら治療の効果の指標となることができる。
【０１３４】
加えてマーカー核酸またはマーカーポリペプチドは、初期の検出、追跡スクリーニング、再発の検出および化学療法または外科的処置について処置後を監視するために、診断パネルの一部として利用することができる。
【０１３５】
したがって本発明は、例えば細胞の腫瘍形成性形質転換から生じる増殖性障害の診断および表現型の決定を援助するために、細胞に由来するマーカーポリペプチドの獲得および／または損失を検出するために診断アッセイおよび試薬を利用できるようにする。
【０１３６】
上記の診断アッセイは予後アッセイとしても使用できるように適合させることができる。そのような応用は、腫瘍の進行の特徴的な段階で起こる出来事に対する本発明のアッセイの感度を利用する。例えば所定のマーカー遺伝子は大変早い段階、恐らく細胞が悪性に進化することを不可逆的に定められる（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前に、アップまたはダウンレギュレートされることができるが、別のマーカー遺伝子はもっと遅い段階でのみ特徴的にアップまたはダウンレギュレートされ得る。そのような方法には、試験細胞のｍＲＮＡを、腫瘍進行の種々の段階でガン性または前ガン性細胞中で異なる特徴的なレベルで発現される所定のマーカー核酸に由来する核酸プローブと接触させ、そして細胞のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションのおよその量を測定する工程を含み、そのような量は細胞中の遺伝子発現レベルの指標となり、すなわち細胞の腫瘍の進行段階の指標となり；あるいはアッセイは所定のマーカー核酸の遺伝子産物に特異的な抗体を用いて行うことができ、試験細胞中のタンパク質と接触させる。そのような一群の試験は腫瘍の存在および場所を開示するだけでなく、医師が腫瘍に最も適切な処置の様式を選択できるようにし、そしてまたその処置が成功する見込みを予測できるようにする。
【０１３７】
また本発明の方法は、腫瘍の臨床経過を追跡するためにも使用することができる。例えば本発明のアッセイは患者に由来する組織サンプルに適用し；ガンについて患者を処置した後に、別の組織サンプルを採取し、そして試験を繰り返す。成功裏の処置はガン性または前ガン性細胞に特徴的な差次的発現を示すすべての細胞の除去、あるいはこれら細胞中での遺伝子の発現に恐らく正常レベルに近づくか、または超える実質的な上昇のいずれかをもたらす。
【０１３８】
さらに別の態様では本発明は、個体がポリペプチド、好ましくはアドレノメジュリンの異常な活性を伴うガン発症の傾向のような疾患を発症する危険性があるどうかを測定する方法を提供し、ここでポリペプチドの異常な活性は（ａ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす改変、または（ｂ）コード核酸の誤発現の少なくとも１つを特徴とする遺伝子損傷の存在または不存在を検出することにより特徴つけられる。具体的に説明すると、そのような遺伝的損傷は、（ｉ）核酸配列から１以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）核酸配列への１以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）核酸配列の１以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）核酸配列の全体的な（ｇｒｏｓｓ）染色体再編成、（ｖ）核酸配列のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルにおける全体的改変、（ｖｉ）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような核酸配列の異常な修飾、（ｖｉｉ）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）マーカーポリペプチドの非野生型レベル、（ｉｘ）遺伝子の対立遺伝子損失および／または（ｘ）マーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つの存在を確認することにより検出することができる。
【０１３９】
本発明はコード核酸配列中の損傷を検出するためのアッセイ技術を提供する。これらの方法には限定するわけではないが、配列分析、サザンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングが関与する方法、および分析すべき核酸とプローブとの間のヌクレオチド対合の不存在の検出が関与する方法を含む。
【０１４０】
特異的な疾患または障害、例えば遺伝的疾患または障害は、特定遺伝子の多型領域の特異的な対立遺伝子バリアントが関係し、これは突然変異したタンパク質を必ずしもコードしない。すなわち個体の遺伝子の多型領域の特異的な対立遺伝子バリアントの存在により、その個体は特異的な疾患または障害を発症し易くなるかもしれない。遺伝子の多型領域は、個体群で遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより同定することができる。多型領域が同定されれば、特定疾患との関連は特別な個体群、例えばガンのような特異的な疾患を発症した個体を研究することにより測定できる。多型領域は遺伝子の任意の領域、例えばエキソン、エキソンのコードもしくは非コード領域、イントロンおよびプロモーター領域に位置し得る。
【０１４１】
例示的態様では、遺伝子のセンスもしくはアンチセンス配列、または自然に存在するその変異体、または５’もしくは３’フランキング配列、または主題の遺伝子に自然に付随するイントロン配列、または自然に存在するその変異体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の領域を含む核酸プローブを含んでなる核酸組成物を提供する。細胞の核酸をハイブリダイゼーションし易くし、プローブをサンプルの核酸と接触させ、そしてプローブのサンプル核酸へのハイブリダイゼーションを検出する。そのような技術を使用して、欠失、置換等を含むゲノムまたはｍＲＮＡレベルのいずれかで損傷または対立遺伝子バリアントを検出し、ならびにｍＲＮＡ転写レベルを測定することができる。
【０１４２】
好適な検出法は、突然変異または多型部位が重複し、そして突然変異または多型領域周辺の約５、１０、２０、２５または３０ヌクレオチドを有するプローブを使用した対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好適な態様では、対立遺伝子バリアントに特異的にハイブリダイズすることができる幾つかのプローブを固相支持体、例えば「チップ」に結合させる。「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれるオリゴヌクレオチドを含んでなるこれらのチップを使用した突然変異検出分析は、例えばＣｒｏｎｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４，１９９６）に記載されている。１つの態様ではチップは遺伝子の少なくとも１つの多型領域のすべての対立遺伝子バリアントを含んでなることができる。次いで固相支持体を試験核酸と接触させ、そして特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを検出する。したがって１以上の遺伝子の多数の対立遺伝子バリアントの同一性を、単純なハイブリダイゼーション実験で同定することができる。
【０１４３】
特定の態様では、損傷の検出にはアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０，１９８８；Ｎａｋａｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４，１９９４を参照にされたい）のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号明細書を参照されたい）で、プローブ／プライマーを利用することを含んでなり、後者は遺伝子の点突然変異を検出するために特に有用となり得る（例えばＡｂｒａｖａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２３：６７５−６８５，１９９５を参照にされたい）。説明的な態様では、この方法には（ｉ）患者から細胞サンプルを集め、（ｉｉ）細胞サンプルから核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、（ｉｉｉ）核酸サンプルを、核酸配列に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと、核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が（存在する場合には）起こる条件下で接触させ、そして（ｉｖ）増幅産物の存在または不存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照サンプルに対して長さを比較する工程を含んでなる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載する突然変異を検出するために使用する任意の技術と一緒に予備増幅工程として使用することが望ましいかもしれないと予想する。
【０１４４】
代替的な増幅法には：自己持続型配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８，１９９０）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７，１９８９）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７，１９８８）、または他の核酸増幅法、続いて増幅した分子の当業者に周知な技術の使用による検出が含まれる。これらの検出スキームは、核酸分子が大変少数で存在する場合にそのような分子の検出に特に有用である。
予測アッセイ
所定の抗ガン剤からの臨床的利益を予測することができる研究室基準のアッセイは、ガン患者の臨床的管理を大きく強化するだろう。この効果を評価するために、処置の前、最中および後に抗ガン剤に関連するバイオマーカーを生物学的サンプル中（例えば腫瘍サンプル、血漿）で分析することができる。
【０１４５】
例えばアドレノメジュリンのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、異種移植したヒト腫瘍を持つ実験動物でＲａｆキナーゼインヒビターを用いた処置により改変される。賦形剤での処置群に比べて、アドレノメジュリンｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、Ｒａｆキナーゼインヒビター処置群で最初に上昇した。Ｒａｆキナーゼインヒビターの血漿濃度が上昇すると、アドレノメジュリンの発現は減少した。アドレノメジュリンの発現は血漿Ｒａｆキナーゼインヒビターレベルが下降すると回復した。アドレノメジュリンは全身の循環に分泌され、そして血漿および尿で検出することができる。すなわちＲａｆキナーゼインヒビターで処置した後のアドレノメジュリンの血漿および尿濃度の変化を、ガン患者で監視することができる。加えて、アドレノメジュリンのタンパク質レベルは、パラフィンで包埋した腫瘍生検材料を使用した定量的免疫組織化学により監視することができる。
【０１４６】
処置を監視する別の取り組みは、血清のプロテオームスペクトルの評価である。具体的には血清サンプルを質量分光器（例えば表面−強化レーザー脱着およびイオン化）にかけることができ、そしてプロテオームスペクトルを各患者について作成することができる。処置前および最中の患者に由来する血漿の分析から引き出された１組のスペクトルは、反復サーチアルゴリズムにより分析することができ、これは未処置サンプルから処置サンプルを完全に区別するプロテオームパターンを同定することができる。次いで生成したパターンを、処置後の臨床的利益を予測するために使用することができる。
【０１４７】
生物学的サンプル（例えば腫瘍生検サンプル、血液サンプル）の包括的遺伝子発現プロファイリングおよびバイオインフォマティックスから引き出されたパターン同定は、臨床的利益および感度ならびに抗ガン剤に対する耐性の発生を予測するために利用することができる。例えば処置前および最中の患者からの全血に由来する細胞から単離されたＲＮＡは、アフィメトリックスのＧｅｎｅＣｈｉｐ技術およびアルゴリズムを使用して、血液細胞の遺伝子発現プロファイルを作成するために使用することができる。次いでこれらの遺伝子発現プロファイルは、特定の抗ガン剤を用いた処置からの臨床的利益を予測することができる。
【０１４８】
１Ｄ１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴）による尿の生化学的組成の分析も、予測アッセイとして利用することができる。パターン認識技術を使用して抗ガン剤での処置に対する代謝的応答を評価し、そしてこの応答と臨床的終点とを相関させることができる。尿に排出される生化学的または内因性代謝産物は、正常個体についてプロトンＮＭＲにより十分に特徴付けられて来た（Ｚｕｐｐｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２６５：８５−９７，１９９７）。これらの代謝産物（約３０〜４０）は、クエン酸および尿素サイクルのような主要な代謝経路の副産物を表す。薬剤−、疾患−および遺伝的−刺激は、ベースラインの尿プロファイルに、刺激に対する代謝的応答のタイムラインおよび規模の指標となる代謝特異的な変化を生じることが示された。これらの分析は多変量（ｍｕｌｔｉ−ｖａｒｉａｎｔ）であり、したがってパターン認識技術を使用してデータの解釈を改善する。尿の代謝的プロファイルは臨床的終点と相関させて、臨床的利益を決定することができる。
〔実施例〕
本明細書に記載する構造、材料、組成物および方法は本発明の代表例であることを意図しており、そして本発明の範囲は実施例の範囲により制限されないと理解される。当業者は本発明が開示した構造、材料、組成物および方法に変更を実施できると認識し、そしてそのような変更は本発明の範囲内と見なす。
【実施例１】
【０１４９】
腫瘍の異種移植遺伝子発現プロファイリングプロトコール
Ａ．腫瘍移植および摘出
１１〜１９週齢で、約１８〜２５グラムの平均体重のメスのヌードマウスをこの実験に使用した。別にヒト膵臓癌腫（ＭｉａＰａＣａ）および肺（ＷＣＩ−Ｈ４６０）ガン細胞株を組織培養で約７０％の集密度まで成長させた。細胞を移植の日に回収し（５×１０６細胞／マウス）、そしてハンクスバランス塩溶液に回収時から移植時まで懸濁し、移植の時点で各マウスは適切な細胞接種の細胞懸濁液の０．２ｍｌ注射を受けた。細胞は各マウスの右脇腹の皮下に注射され、そして腫瘍の成長を監視した。ステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）（投与）の時期は、腫瘍が７５〜１２５ｍｇｓのサイズに達した時に決めた（移植から５日〜９日）。Ｒａｆキナーゼインヒビターに使用する賦形剤は、１２．５％エタノール、１２．５％Ｃｒｅｍａｆｏｒ  ＥＬおよび水であった。ＭｉａＰａＣａおよびＷＣＩ−Ｈ４６０異種移植の両方について、経口投与は９日間、１日１回の８０ｍｇ／ｋｇであった。９日の投与から１、４、７、２４時間後にマウスを安楽死させ、そして３種の薬剤処置および３種の賦形剤処置腫瘍を回収し、そして素早く凍結した。
Ｂ．ＲＮＡ抽出およびｃＲＮＡ調製
全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州）を使用して、ＲＮｅａｓｙプロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州）を利用する改良した販売元のプロトコールに従い、腫瘍のエクスプラントから抽出した。ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）のＰｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１０／３５（ブリンクマン、スイス）で均一化し、そしてクロロホルムで相分離した後、サンプルをＲＮｅａｓｙカラムにのせた。ＲＮＡサンプルはＲｎａｓｅを含まないＤＮａｓｅセット（キアゲン、カリフォルニア州）を使用してＤＮａｓｅＩで処理した。
【０１５０】
溶出し、そしてＵＶ分光計により定量した後、各サンプルはＲＴ−ＰＣＲ用のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩチョイスシステムを使用して、販売元のプロトコール（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州）に従い二本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。
【０１５１】
サンプルは有機的に抽出し、そしてエタノール沈殿した。次いで約１μｇのｃＤＮＡをインビトロ転写反応に使用して、ＲＮＡラベリングキット（エンゾ  ダイアグノスティックス（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ニューヨーク州）を使用してビオチン化ヌクレオチドを包含させた。生成したｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙクリーン−アッププロトコールで処理し、次いでＵＶ分光計を使用して定量した。ｃＲＮＡ（１５μｇ）をＭｇＯＡｃおよびＫＯＡｃの存在下、９４℃で断片化した。断片化したＲＮＡ（１０μｇ）を、アレイあたり１ｃＲＮＡサンプルで各アレイにのせた。アレイは４５℃で１６時間、６０ｒｐｍで回転させながらアフィメトリックスのＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン６４０中でハイブリダイズさせた。
Ｃ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０分析
ハイブリダイゼーション後、アレイはフィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）−結合ストレプトアビジンで染色し、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）のＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーに置き、次いで４８８ｎｍのレーザーに暴露し、フィコエリスリンの励起を引き起こした。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０ソフトウェアは、アレイにより放出される光の強度を遺伝子発現のレべルの数値的指標にデジタルで転換する。各アレイは１つの動物サンプルを表すので、処置した動物を賦形剤の動物と比較し、そして遺伝子の相対的変化倍率（ｈｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を得た。少なくとも２倍数の変化まで上昇または減少した遺伝子を有意であると考え、そしてさらなる分析に使用した。
Ｄ．ＴａｑＭａｎ分析用のｃＤＮＡ調製
各ＲＮＡサンプルは、ＲＴ−ＰＣＲ用のＧｉｂｃｏＢＲＬ  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ第１鎖合成系を販売元のプロトコール（ライフテクノロジーズ、メリーランド州）に従い使用して逆転写した。反応混合物中の最終ＲＮＡ濃度は５０ｎｇ／μＬであった。逆転写は５０ｎｇのランダムヘキサマーを使用して行った。
Ｅ．蛍光プローブを使用したＴａｑＭａｎ定量分析
アドレノメジュリン（配列番号１および７）に特異的なプライマーおよびプローブは、ＰＥアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の推薦に従い設計し、そして以下に列挙する：
フォワードプライマー：５’−（ＧＴＧＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＧＧＴＧＴＡＡ）−３’（配列番号：２）
リバースプライマー：５’−（ＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＴＣ）−３’（配列番号：３）
プローブ：５’−（ＦＡＭ）−ＴＴＣＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号：４）
ここでＦＡＭ＝６−カルボキシ−フルオレセインおよびＴＡＭＲＡ＝６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン。
【０１５２】
定量的実験は各サンプルから逆転写した２５ｎｇのＲＮＡで行った。対照として１８ＳリボゾームＲＮＡは、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（ＰＤＡＲ）（ＰＥアプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州）を使用して測定した。アッセイの反応混合物は以下の通りである：
最終濃度
ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（２ｘ）         １ｘ
（ＰＥアプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州）
ＰＤＡＲ対照−１８Ｓ  ＲＮＡ（２０ｘ）                         １ｘ
フォワードプライマー                                        ３００ｎＭ
リバースプライマー                                          ３００ｎＭ
プローブ                                                    ２００ｎＭ
ｃＤＮＡ                                                      ２５ｎｇ
水                                                          加えて２５μＬ
Ｆ．ＳＹＢＲグリーンを使用したＴａｑＭａｎ定量分析
アドレノメジュリンに特異的なプライマーおよびプローブは、ＰＥアプライドバイオシステムズのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムの推薦に従い設計し、そして以下に列挙する：
フォワードプライマー：５’−（ＧＴＧＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＧＧＴＧＴＡＡ）−３’（配列番号：５）
リバースプライマー：５’−（ＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＴＣ）−３’（配列番号：６）
プローブ：ＳＹＢＲグリーン
定量的実験は各サンプルから逆転写した２５ｎｇのＲＮＡで行った。対照として１８ＳリボゾームＲＮＡは、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（ＰＤＡＲ）（ＰＥアプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州）を使用して測定した。アッセイの反応混合物は以下の通りである：
最終濃度
ＴａｑＭａｎＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（２ｘ）     １ｘ
（ＰＥアプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州）
フォワードプライマー                                        ３００ｎＭ
リバースプライマー                                          ３００ｎＭ
ｃＤＮＡ                                                      ２５ｎｇ
水                                                          加えて２５μＬ
Ｇ．ＰＣＲ条件
１回：              ５０℃で２分  
９５℃で１０分
４０サイクル：      ９５℃で１５秒
６０℃で１分
実験はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出器（ＰＥアプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州）で行った。実験の終わりに、ＰＣＲ中に得た蛍光データは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００ユーザーマニュアルに記載されているように処理した。変化倍率はデルタ−デルタＣＴ法を使用して計算し、１８Ｓ値に対して標準化した。表１および図１および２は、Ｒａｆキナーゼインヒビターに対する暴露に応答したアドレノメジュリン遺伝子の発現の変化を表す。Ｙ軸は賦形剤で処理した腫瘍を持つ動物に対して、化合物で処置した腫瘍を持つ動物におけるアドレノメジュリン発現の変化倍率を表す。Ｘ軸は腫瘍サンプルを取った処置後９日の時間を時間（ｈｏｕｒｓ）で表す。Ｒａｆ２はこの特定実験に関するコード名であり、そしてＦＣは変化倍率を表す。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘおよびＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析法の両方に関するデータをプロットした。
【０１５３】
【表１】
2006518031.tif 000003
【実施例２】
【０１５４】
ガンを処置した患者の応答の監視
血液サンプル（１０ｍｌ）は、スクリーニング（試験薬を開始する７日前）、サイクル１の１５日、サイクル２、４、６等の１日および最終来院時に集める。血液サンプルは静脈穿刺またはポルタ−カテーテルを介して、カリウムＥＤＴＡを含有するバキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に引き抜き、そして数回、穏やかに上下して抗凝固剤と混合した。採血から１０〜１５分後以内に、血液サンプルを冷蔵（４℃）遠心機で１０分間遠心して血漿を分離した。血漿サンプルを質量分析に供し、そしてプロテオミックスペクトルを各タイムコースについて作成する。スペクトルはプロテオームパターンを同定し、そして作成する反復サーチアルゴリズムにより分析する。次いでプロテオームパターンを分析して処置の効力をモニタリングする。
【実施例３】
【０１５５】
腫瘍生検サンプルを対象とした処置の応答の監視
軽く凍結した腫瘍サンプルをＲＮＡ単離およびアフィメトリックスのＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ遺伝子発現分析に使用する。パラフィンで包埋した腫瘍サンプルは、定量的な免疫組織化学を使用してアドレノメジュリンタンパク質レべルについて分析する。腫瘍の生検サンプルは処置を始める前のベースライン、およびさらにサイクル２中のサンプルについて集める。両サンプルは同じ腫瘍部位から集める。
軽い凍結サンプル
滅菌条件下で、生きている悪性組織を細い針による吸引により、またはパンチ、コアもしくは切除生検により得る。腫瘍組織の一部を即座に軽く凍結する。ＲＮＡをサンプルから単離し、そして次いで実施例１に記載した方法により遺伝子発現プロファイルを作成するために使用する。次いで遺伝子発現プロファイルを分析して、処置効力を監視する。
パラフィン包埋サンプル
生検材料の別の部分（少なくとも０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）を、パラフィンブロックに固定する。サンプルは採取から３０分以内に中性緩衝化ホルマリン中に固定する。サンプルは少なくとも２時間固定する。次いでサンプルをホルマリンから取り出し、そして処理前に流水ですすぐ。組織の多段階処理は以下の通りである：
工程１              ７０％エタノール                        １５分
工程２              ８０％エタノール                        １５分
工程３              ９５％エタノール                        １５分
工程４              １００％エタノール                      １５分
工程５              １００％エタノール                      １５分
工程６              １００％エタノール                      １５分
工程７              ５０％キシレン／１００％エタノール      １５分
工程８              全部キシレン                            １５分
工程９              全部キシレン                            １５分
工程１０            パラフィン                    ６０℃で３０分間
工程１１            パラフィン                    ６０℃で３０分間
工程１２            パラフィン                    ６０℃で３０分間
工程１３            パラフィン                    ６０℃で３０分間
次いで各サンプルをパラフィンに埋め、そして固体化した。次いでサンプルは定量的な免疫組織化学を使用してアドレノメジュリンタンパク質レべルについて分析する。
【実施例４】
【０１５６】
尿サンプルを対象とした処置の応答の監視
尿サンプルは、スクリーニング（試験薬を開始する７日前）、サイクル１の１５日、サイクル２、４、６等の１日および最終来院時に集める。回収から１５分後以内に、５〜１０ｍＬの尿サンプルを１５ｍＬのポリプロピレン試験管に移し、そして−７０℃にて直立で凍結する。サンプルの生化学的組成を１Ｄ１Ｈ  ＮＭＲにより分析し、そして尿の代謝プロファイルを処置の応答に関して評価する。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】Ｒａｆキナーゼインヒビターに対する暴露に応答するアドレノメジュリン遺伝子の発現の変化を、アフィメトリックスの遺伝子発現分析法を使用して表す。Ｙ軸は賦形剤で処理した腫瘍を持つ動物に対して、化合物で処置した腫瘍を持つ動物におけるアドレノメジュリン発現の変化倍率を表す。Ｘ軸は腫瘍サンプルを取った処置後９日の時間を時間（ｈｏｕｒｓ）で表す。
【図２】Ｒａｆキナーゼインヒビターに対する暴露に応答するアドレノメジュリン遺伝子の発現の変化を、ＴａｑＭａｎの遺伝子発現分析法を使用して表す。Ｙ軸は賦形剤で処理した腫瘍を持つ動物に対して、化合物で処置した腫瘍を持つ動物におけるアドレノメジュリン発現の変化倍率を表す。Ｘ軸は腫瘍サンプルを取った処置後９日の時間を時間（ｈｏｕｒｓ）で表す。
【配列表】
2006518031.tif 000004
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2006518031.tif 000006
【図１】
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【図２】
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