(57)【要約】本発明は、細胞内でのサイトカイン、とりわけＴｈ２細胞サイトカインの発現および／または機能を調節する、そして、サイトカイン調節を介して、細胞をアポトーシスに感作するために、前記細胞内で、抗−アポトーシスタンパク質のダウン−レギュレーションを引き起こす、サイトカインアンタゴニストの利用を言及する。とりわけ、サイトカインアンタゴニストで処理可能である細胞は、アポトーシスをうけることが出来ない、薬物耐性がん細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の細胞死阻止タンパク質のダウン−レギュレーションのための、細胞内のサイトカインの発現および／または機能を調節する、サイトカインアンタゴニストの使用。
【請求項２】
前記細胞が、細胞死に関して感作されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記細胞ががん細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびこれらの組み合わせからなる群より選択され、好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記細胞死が、アポトーシスによるものであり、前記細胞死阻止タンパク質が、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、ｃＦＬＩＰ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＢＯＯ、ＮＲ−１３、セントリン、ＴＯＳＯ、ＣＰＡＮ、ＰＥＤ、ＤＦＦ４５、ＮＡＩＰ、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＫＩＡＰ、ＢＩＲＣ５、ＴＩＡＰ、Ａｐｏｌｌｏｎおよびホルチリンからなる群より選択され、好ましくはＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、ＰＥＤ、ｃＦＬＩＰおよびこれらの組み合わせからなる群より選択され、もっとも好ましくはＢｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ｘLである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
サイトカインアンタゴニストが、サイトカイン／サイトカインレセプター遺伝子の転写レギュレーター、サイトカイン／サイトカインレセプター遺伝子の領域に相補的なアンチセンス核酸分子、サイトカイン／サイトカインレセプターｍＲＮＡに相補的なｄｓＲＮＡ分子、サイトカイン／サイトカインレセプターｍＲＮＡを開裂するリボザイム、サイトカイン／サイトカインレセプターｍＲＮＡの転写レギュレーター、サイトカインおよび／またはサイトカインレセプターに結合し、サイトカインとそのレセプター間の相互作用を防止するか、または混乱させる、アプタマー、サイトカイン／サイトカインレセプターに結合する抗体、サイトカインのレセプター、その断片または誘導体、好ましくはＣＤ１２４、ＣＤ１３２、ＩＬ−１３Ｒα−２およびＩＬ−１０Ｒα、サイトカイントラップおよびサイトカイン突然変異タンパク質からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記サイトカインアンタゴニストが、サイトカイン／サイトカインレセプターに結合する抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体が、ＩＬ−４、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３に結合する抗体か、またはそれらの組み合わせである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記サイトカインアンタゴニストが、標的細胞の近くに、または該細胞内に伝達される、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記サイトカインアンタゴニストが、レトロウイルスベクターを介して伝達される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
細胞内での細胞死阻止タンパク質のダウン−レギュレーションする方法であって、
（ａ）対象より組織または細胞の試料を得ること、
（ｂ）前記細胞または試料を、請求項６〜８のいずれかに記載のサイトカインアンタゴニストと接触させることを含む方法。
【請求項１２】
前記細胞が癌細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
がんの処置用の医薬品の製造のための、放射線治療と組み合わせてもよい、サイトカインアンタゴニストの使用。
【請求項１４】
がんの処置のための医薬品の製造のための少なくとも１つの活性化合物と組み合わせてもよい、サイトカインアンタゴニストの使用。
【請求項１５】
前記活性化合物が、代謝拮抗物質、好ましくは、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウイリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレアまたはメトトレキサート；ＤＮＡ−断片化試薬、好ましくはブレオマイシン、ＤＮＡ架橋剤、好ましくはクロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、またはナイトロジェン  マスタード；挿入剤、好ましくはアドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトクサトロン；タンパク質合成阻害剤、好ましくはＬ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、プロマイシンまたはジフテリア毒素；トポイソメラーゼＩ毒、好ましくはカンプトセシンまたはトポテカン；トポイソメラーゼＩＩ毒、好ましくはエトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシド；微小管指向薬剤、好ましくはコルセミド、コルチシン、パクリタキセル、ビンブラスチンまたはビンクリスチン；キナーゼ阻害剤、好ましくはフラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ  ５７１４８Ｂ）またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；種々の治療薬、好ましくはＰＳ−３４１、フェニルブチレート、ＥＴ−１８−ＯＣＨ3、またはファルネシル  トランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９、Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール類、好ましくはクエルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、没食子酸エピガロカテシン、セアフラビン類、フラバノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸；ホルモン類、好ましくは、グルココルチコイド類またはフェンレチニド、ホルモンアンタゴニスト、好ましくは、タモキシフェン、フィナステリドまたはＬＨＲＨアンタゴニスト；（Ｖｉｓｃｕｍおよび誘導体からの）植物由来細胞増殖抑制剤；アルカロイド類、好ましくはビンデシン；ポドフィロトキシン類、好ましくはビノレルビン；アルキラント類、好ましくはニムステリン、カルムステリン、ロムスチン、エストラムステリン、メルファラム、イホスファミド、トロホスファミド、ベンダムスチン、デカルバジン、ブスルファン、プロカルバジン、トレオスルファン、トレモゾラミド、チオテパ；細胞傷害性抗生物質、好ましくはアクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン；葉酸類似体のような代謝拮抗薬、好ましくはメトトレキサート、プリン類似体、好ましくはクラドリビン、メルカプトプリン、チオグアニンおよびピリジン類似体、好ましくはシタラビン、フルオロウラシル、ドセタキセル；他の抗腫瘍薬、白金化合物、好ましくはチオプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン；アマサクリン、イリノテカン、インターフェロン−α、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ミルテホシン、ペントスタチン、アルデスロキン；器官から由来する抗腫瘍薬化合物、たとえばモノクローナル抗体、好ましくは、トランスズマブ、リツキシマブまたは酵素由来の抗腫瘍薬、好ましくはペガスパラガーゼ；ホルモンに属するエンドクリン効果抗腫瘍薬、たとえばエストロゲン類、好ましくはポリエストラジオール、ホスフェストリオール、エチニルエストラジオール、ゲスターゲン類、好ましくはメドロキシプロゲステロン、ガストノロンカプロアート、メゲストロール、ノレチステロン、リネストレノール、視床下部ホルモン類、好ましくはトリプトレリン、ロイプロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、他のホルモン類、好ましくはテストラクトン、テストステロン；ホルモンアンタゴニストに属するエンドクリン影響抗腫瘍化合物、たとえば抗エストロゲン類、好ましくはトレミフィン；抗アンドロゲン類、好ましくはフルタミド、ビカルタミドおよびシプロテラン；酵素阻害剤に属するエンドクリン影響抗腫瘍薬化合物、好ましくはアナステロール、エキセメスタン、レトロゾール、ホルメスタン、アミノグルテチミドからなる群れから選択され、これらの全てが、いわゆる保護剤、好ましくはカルシウン
ホリナット、アミホスチン、レノグラスチン、モルグロモスチン、フィルグラスチン、メスナ、またはいわゆる添加物、好ましくは、レチノールパルミテート、視床下部Ｄ９、アミロマーと共に投与してもよい、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記活性化合物が、パクリタキセル、シスプラチンおよびドコルビシンからなる群より選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記活性化合物が、死受容体アゴニストである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記死受容体アゴニストが、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＭＰリガンド、ＤＲ６リガンドおよびその断片および誘導体からなる群より選択される、死受容体リガンドである請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記死受容体アゴニストが、抗−ＣＤ９５抗体、抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体、抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、抗−ＤＲ６抗体、抗−ＴＮＦ−Ｒ１抗体および抗−ＴＲＡＭＰ抗体からなる群より選択される、死受容体に対する抗体、その誘導体または断片である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記活性化合物が、抗−アポトーシスタンパク質の陰性レギュレーター、好ましくはＩＡＰである、請求項１４に記載の使用。
【請求項２１】
処置されるべきがんが、神経芽細胞腫、腸がん、好ましくは結腸がん、大腸がん、家族性腺腫様ポリープカルシノーマ、遺伝性非ポリープ大腸がん、食道がん、陰唇がん、喉頭がん、下咽頭がん、舌がん、唾液腺がん、胃癌、アデノカルシノーマ、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、未分化甲状腺がん、腎臓がん、腎実質がん、卵巣がん、頸部がん、子宮体がん、子宮内膜がん、絨毛膜がん、膵臓がん、前立腺がん、睾丸がん、乳がん、尿路がん、メラノーマ、脳腫瘍、好ましくは膠芽細胞腫、星状細胞種、髄膜腫髄芽細胞種、および末梢神経外胚葉腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ−細胞白血病リンパ腫、肝細胞がん、胆嚢がん、気管支がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、多発性骨髄腫、
基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜ミエローマ、セミノーマ、胎児型性横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および形質細胞腫からなる群より選択される、請求項１３〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
処置されるべきがんが、甲状腺がん、乳がん、肺がん、前立腺がんおよび大腸がんからなる群より選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
処置されるべきがんが甲状腺がんである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
がんの処置のための医薬品であって、サイトカインアンタゴニストを含み少なくとも１つの活性化合物および医薬的に許容可能な担体とを組み合わせてもよい、医薬品。
【請求項２５】
対象のがん疾患を診断するため、およびモニタするための、サイトカインアンタゴニストの使用であって、
（ａ）体液試料、または対象の腫瘍からの、組織または細胞の試料を得ること、
（ｂ）サイトカイン核酸に結合する標識プローブおよび／またはサイトカインに結合する抗体に試料を接触させること、
（ｃ）組織または細胞内のサイトカインの発現レベルを測定し、健康な対照細胞での発現レベルと比較すること、および、
（ｄ）健康な対照細胞での発現レベルと比較した場合に、サイトカイン発現が低い比である対象によりよい診断を相関させることを含む、使用。
【請求項２６】
少なくとも１つのサイトカインアンタゴニストを含み、適した緩衝液、酵素および他の化合物とを組み合わせてもよい、診断キット。
【請求項２７】
前記細胞が、非リンパ球、および非リンパがん細胞である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
前記サイトカインが、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記サイトカインが、リンパまたは骨髄細胞によって産出されない、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記サイトカインが、非リンパおよび非骨髄がん細胞によってオートクライン的に産出される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記細胞死阻止タンパク質が、ｃＦＬＩＰおよび／またはＢｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ｘLである、請求項２７〜３０のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
前記サイトカインアンタゴニストが、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３に結合する抗体である、請求項２７〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前記がんが、非リンパおよび非骨髄がんである、請求項１３〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
前記サイトカインが、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記サイトカインが、非リンパおよび非骨髄がんによって、オートクライン的に産出される、請求項３３または３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記がんが、甲状腺がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がんおよび大腸がんからなる群より選択される、請求項３３〜３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記がんが甲状腺がんである、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
サイトカインをオートクライン的に産出する非リンパおよび／または非脊髄がんの処置のための医薬品であって、少なくとも１つの活性化合物および医薬的に許容可能な担体との組み合わせてもよい請求項６〜８のいずれかに定義されたサイトカインアンタゴニストを含む、医薬品。
【請求項３９】
サイトカイン、好ましくはインターロイキンをオートクライン的に産出する非リンパおよび／または非脊髄がんにおける、抗アポトーシスタンパク質のダウンレギュレーションのための方法であって、請求項６〜８のいずれかに記載のサイトカインアンタゴニストと、標的細胞または試料とを接触させることを含む、方法。
【請求項４０】
前記サイトカインアンタゴニストが、標的細胞の近くに、または細胞内に伝達される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サイトカインアンタゴニストが、レトロウイルスベクターを介して伝達される、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン、とりわけインターロイキン類を選択的にブロックする化合物を用いることによって、アポトーシスに対する細胞を感作する方法、およびがんおよび自己免疫疾患の処置のための前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞生存と細胞死との間のバランスを制御している分子機序は、多数の生理学及び病理学的過程で、鍵となる役割を果たしている。高い特異性と効率で、規定数以上の、誤ったまたは傷害を受けた細胞の死を誘導する細胞能力にとって重大なことは、いわゆる「アポトーシス」または「プログラムされた細胞死」と呼ばれる機序である。
【０００３】
アポトーシスが関与した病気および状態は、２つのカテゴリー、つまり細胞生存が増加するもの（すなわち、アポトーシスが減少するもの）および細胞死が過度であるもの（すなわちアポトーシスが増加するもの）に分けられる。細胞生存が増加することによって、過剰な細胞の集積が存在する疾患として、がん、自己免疫疾患およびウイルス感染が挙げられる。これらおよびアポトーシスの不全が関与すると信じられている他の疾患に関しては、アポトーシスの促進が望まれる。これは、たとえば、細胞性アポトーシスを促進することによって、または内因性または外因性アポトーシス刺激、たとえば細胞シグナル伝達分子または他のサイトカイン類、細胞傷害性薬剤または放射線に対する細胞の感受性を増加させることによって達成される。アポトーシスの促進または感作は、化学治療剤または放射線にがん細胞を感作する際、臨床的関連性があると信じられる。
【０００４】
第２のカテゴリーにおいて、ＡＩＤＳおよびアルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性疾患が、アポトーシスの促進による（または望まれていないアポトーシスによる）過剰な細胞死が関与する可能性の高い疾患の代表である。筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性（症）、およびてんかんも、アポトーシスが関与した他の神経疾患である。アポトーシスが、たとえば心筋梗塞および脳梗塞のような虚血によって特徴づけられる状態で発生することが報告されている。これらおよび望まないアポトーシスが関与すると信じられている疾患および状態に関しては、アポトーシスの阻害が望まれる。
【０００５】
現在、がん性腫瘍に対する主要な処置は、組織、器官または腺の病変部の外科的除去である。しかしながら、高い再発率が、がん性細胞の完全な撲滅に対する主要な障害である。悪性腫瘍内のがん細胞は外科的に除去可能であるけれども、周辺の組織またはリンパ節に浸入したがん性細胞が、しばしば腫瘍の再発を引き起こすと信じられている。腫瘍の再発がしばしば起こる理由の１つは、原発がんが進行している間に、外科的手段によって全てのがん細胞を完全に除去をすることが非常に難しいからである。放射線照射、化学治療および適切なホルモン治療はすべて、腫瘍細胞内で、ある程度までアポトーシスを誘発するけれども、がん細胞の増殖を抑制するためには、より高い用量の薬物または放射線が要求され、これによって患者は重篤な副作用を引き起こす可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の根底にある問題は、記述された有害な副作用を引き起こすことなしに、アポトーシス過程における異なる段階を特異的に調節する化合物の同定に関する。
【０００７】
がんを患っている患者の効果的なケアは、多くの腫瘍細胞が、化学治療のために使用さ
れる抗がん薬物に対する抵抗性を発達させるので、しばしば難しい。記述した表現型には抗がん剤の細胞増殖抑制効果を逃れるために、腫瘍細胞が使用する種々の戦略が含まれる。薬物耐性機序には、解毒およびＤＮＡ回復経路の改変、薬物腐骨化の細胞部位の変化、薬物−標的親和性減少、細胞内での特定の薬物阻害剤の合成、および薬物の除去または分泌の加速が含まれる。さらに、がん細胞は共通して、アポトーシスを受けない。したがって、アポトーシス欠損が、現在の処置プロトコールに対して耐性を多くの腫瘍に与え、腫瘍進行を導くので、これががん治療における主要な問題であるようにみられる。
【０００８】
アポトーシス経路には、多様な分子群が関与する。アポトーシスに関与するメディエーターの１つの組は、カスパーゼと呼ばれるものであり、アスパラギン酸残基において特異的にその基質を開裂するシステインプロテアーゼである。カスパーゼは、後に他の細胞標的を分解し、最終的に細胞破壊を起こす、他のカスパーゼを開裂し活性化するカスパーゼで、タンパク質分解カスケードにおけるアポトーシスシグナルを伝達する。カスパーゼ活性化それ自身は、死受容体と呼ばれる、当業者に公知の、特定の自己表面レセプターに栄養を与える外部刺激によって、またはミトコンドリアタンパク質の放出まで導くミトコンドリアを介した細胞内ストレス応答によって、誘発されうる。アポトーシスを仲介している公知の死受容体には、たとえばＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）またはＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導リガンド）レセプター１および２のような、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタースーパーファミリーのメンバーが含まれる。アポトーシス−誘導基質による死受容体の刺激は、なによりも、カスパーゼ８の活性化を導き、これが続いて、他の下流−活性カスパーゼを活性化する。
【０００９】
アポトーシスの誘導または阻害は、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーによって部分的に制御される。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLを含む多数のそのような遺伝子が、ミトコンドリア膜完全性を保存し、細胞質中でのシトクロームｃ放出を防止することによって、アポトーシスを中和する。反対に、ＢａｘおよびＢａｄのようなプロ−アポトーシスのメンバーは、ヘテロダイマー形成およびシトクロームｃ放出でのミトコンドリア膜透過性上昇を含む、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLの機能を拮抗する。
【００１０】
ヒトがんにおいて、Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスのメンバーの高発現が、腫瘍細胞発現および化学治療剤の治療的活性に対する耐性の両方に共通してみられ、関与する。Ｂｃｌ−２の過剰発現は、細胞にアポトーシスに対する耐性を与え得、それによって、悪性増殖が支持される。さらに、多くの化学治療剤が、アポトーシスを誘導することによって腫瘍がんを殺すので、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘLの過剰発現は、多薬剤耐性表現型を導きうる。
【００１１】
Ｂｌｃ−２ファミリーのメンバーを含む、異なる標的細胞の生存または死に関与する、多数の遺伝子の発現が、いわゆるサイトカイン類によってレギュレートされる。たとえばインターフェロン、インターロイキンなどのサイトカイン類は、種々の免疫系の細胞型で分泌される可溶性、非抗体タンパク質の多様な群に属し、特定の細胞表面レセプターとの相互作用によって、個々の細胞の機能活性を調節する。当業者間では、サイトカイン産出に基づき特性化された、Ｔ−ヘルパー細胞と呼ばれる、機能的に異なる２つのサブセットが知られている。１つのサブセット、Ｔｈ１細胞は、炎症および細胞仲介免疫応答と関連した、ＩＦＮ−γおよび他のサイトカインを分泌し、一方Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を放出するホルモン応答を促進する。
【００１２】
リンパ球由来（およびおそらく骨髄由来）のがん型は、オートクライン的に、ＩＬ−１およびＩＬ−６のようなサイトカイン類を産出すること、およびたとえばＩＬ−４は、アポトーシスを阻害することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）におけるＢ細胞の生存を促進することが業界で知られている（たとえば、Ｌｕ  Ｚｈａ
ｏ  Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｏｌｄ，１９９５，Ｖｏｌ．８６、ページ３１２３−３１３１、Ｍａｉｎｏｕ−Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１９９６，Ｖｏｌ．２１、３６９−３７７頁）。一方、腫瘍、たとえば甲状腺がんの周辺の、ＴまたはＢリンパ球によって産出されたサイトカイン類は、前記腫瘍の生存および／または増殖を促進する（Ｓｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，Ｖｏｌ．２，１９５−２０４頁）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の根底にある問題を解決すること、すなわち、異なるアポトーシス段階を特異的に調節する化合物の同定に関して、本発明者らは、驚くべきことに、甲状腺がん細胞が、通常の細胞組織と比較して、オートクライン的に高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０を産出し、一方ＩＮＦ−γは、それらのがん細胞ではほとんど検出されなかったことを発見した。甲状腺がんは、もっとも一般的な内分泌性悪性腫瘍であり、内分泌性がんの影響による死亡の約６０％に関与する。３つの主要な型の悪性腫瘍が、甲状腺上皮から発生する。より分化した乳頭（ＰＴＣ）および甲状腺濾胞腺（ＦＴＣ）甲状腺カルシノーマが、大多数の悪性腫瘍でみられ、一方、分化していない再生不良性カルシノーマ（ＵＴＣ）は非常にまれである。甲状腺がん細胞における高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０は、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２の過剰発現と相関関係があり、これが、化学治療薬剤の細胞障害性効果に対して甲状腺がん細胞を保護し、このことにより、薬物誘導細胞毒性からの、甲状腺がん耐性におけるこれらの抗アポトーシスタンパク質の潜在的な役割を示唆している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
当業者には、甲状腺がん細胞が、リンパ球または骨髄がん型のいずれかとはっきり区別される上皮がんと呼ばれるものに属するという事実は承知されている。
【００１５】
したがって、本発明の第１の目的は、細胞内の細胞死防止タンパク質のダウンレギュレーションに対する、細胞内のサイトカインの発現および／または機能を調整する、サイトカインアンタゴニストの使用に関する。
【００１６】
細胞死防止タンパク質のダウンレギュレーションの結果として、細胞が、細胞死に関して感作される。本発明の説明において、語句「細胞死」とは、細胞を死亡させうる任意の機序および過程を意味する。当業者は、両方が本発明の目的内に記録される、アポトーシスおよび壊死と呼ばれる２つの過程を区別する。しかしながら、本発明によるサイトカインアンタゴニストの使用は、細胞を感作すべき死の過程が、アポトーシスである場合に特に効果的である。したがって、本発明の好ましい実施形態において、「細胞死防止」タンパク質は、「抗アポトーシス」タンパク質を意味する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、語句「細胞」は、導入部で記述したような、アポトーシスを受けることが出来ない細胞を意味する。この観点において、該細胞は、たとえば、がん細胞、免疫系の自己応答細胞が含まれる。もっとも好ましい本発明の細胞は、がん細胞である。
【００１８】
特に好ましい実施形態において、がん細胞は、非リンパ球および／または非骨髄がん細胞であり、もっとも好ましくは、上皮がんである。
【００１９】
細胞ががん細胞である場合、アポトーシスを受けることの欠損によって、細胞が抗腫瘍化合物および／または放射線治療を利用している種々の治療戦略に抵抗性になりうる。サイトカインが好ましく適用されたがん細胞は、また、必ずしも細胞死を導かないが、アポトーシスに対して、これらの細胞を感作する化合物に対して耐性であり得る。当業者間に
は、そのような化合物として、死受容体に対する、天然に存在するアゴニスト、すなわちレセプターリガンドまたは前記死受容体に対するアゴニスト抗体、ならびに化学治療薬物が含まれることが知られている。
【００２０】
本発明の「サイトカイン」は、大部分が、Ｔｈ２ヘルパー細胞より分泌されるサイトカインの群に属する。より好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択されるサイトカイン、ならびにこれらの組み合わせである。本発明のサイトカインアンタゴニストの効果的な利用のためには、サイトカインとしてＩＬ−４、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３、ならびにこれらの組み合わせである場合がもっとも好ましい。
【００２１】
本発明の範囲内で、「抗アポトーシスタンパク質」には、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、ｃＦＬＩＰ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、Ａ１／ＢＦＬ１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、ＮＲ−１３、セントリン、ＴＯＳＯ、ＣＰＡＮ、ＰＥＤ、ＤＦＦ４５などのようなＢｃｌファミリーのメンバーが含まれる。本発明の抗アポトーシスタンパク質にはまた、「アポトーシスタンパク質の阻害剤」（ＩＡＰｓ）と呼ばれるものも含まれる。ＩＡＰは、早期活性カスパーゼに結合し、それによって、アポトーシス過程の開始を防止する。これらは、多くの腫瘍中で高レベルで発現し、カスパーゼを阻害することによって、アポトーシス誘導に対するがんの耐性に寄与する。ＩＡＰの例として、ＮＡＩＰ、ＸＩＡＰ（ｈＩＬＰ）、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２、ＭＬ−ＩＡＰ（リビン）、ＫＩＡＰ、ＢＩＲＣ５（サービビン）、ＴＩＡＰおよびＡｐｏｌｌｏｎが挙げられる。最後に、抗アポトーシスタンパク質は、ホルチリンなどのような他のものであり得る。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、抗アポトーシスタンパク質には、ＰＥＤ、ｃＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘL、およびこれらの組み合わせが含まれる。もっとも好ましいサイトカインアンタゴニストによってダウンレギュレートされた抗アポトーシスタンパク質は、Ｂｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ｘLである。
【００２３】
語句「サイトカインアンタゴニスト」は、サイトカインの発現および／または機能を直接調整可能な、抗アポトーシスタンパク質のダウンレギュレーションを導くことが可能な任意の化合物である。さらに、サイトカインアンタゴニストは、サイトカインの発現および／または機能を間接的に調節する、すなわち、それぞれのサイトカインレセプターの発現および／または機能に影響を与えることによって調節する任意の化合物もさらに含まれる。サイトカインレセプターのダウンレギュレーションが、サイトカインそれ自身の機能を直接干渉することは、当業者にとって明らかである。したがって、サイトカインの発現および／または機能を調節する、以下に記述される機序および分子はそれぞれ、サイトカインレセプターに対して推定されうる。この観点において、語句「サイトカイン」はまた、他に示唆しない限り、サイトカインレセプターも含む。
【００２４】
本発明の説明において、以下で「調節」と言う、本発明にしたがったサイトカインアンタゴニストの利用によるサイトカイン／サイトカインレセプターの発現および／または機能の調節は、タンパク質上および／または核酸レベル上で起こりうる。
【００２５】
該調節が、核酸レベル上で起こる場合、本発明にしたがったサイトカインアンタゴニストは、サイトカインのコード領域の上流および／または下流制御配列に結合することによって、サイトカイン遺伝子の転写をレギュレートするペプチドまたは核酸でありうる。そのような制御配列は、当業者に公知であり、プロモーター、オペレーター、エンハンサーまたはサイレンサー領域と呼ばれるものが含まれる。たとえば、サイトカインアンタゴニストは、ＲＮＡポリメラーゼ結合領域に直接結合することによって、ポリメラーゼそれ自身に結合することによって、または効果的なＲＮＡポリメラーゼ結合および機能に必要な
、他の因子、たとえば転写因子に結合することによってのいずれかで、サイトカインの遺伝子のプロモーター領域に対するＲＮＡポリメラーゼの結合を干渉しうる。さらに、サイトカインアンタゴニストが、オペレーター領域に結合し、いわゆるサイトカイン遺伝子発現のレプレッサーとして働いてもよい。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態において、核酸レベル上での調節は、サイトカインのコード配列にハイブリッド形成する、したがって相補的な核酸分子の使用によって起こりうる。これらの核酸分子は、たとえば、サイトカイン遺伝子レギュレーションで有用な、サイトカイン遺伝子アンチセンス分子としてコードしてもよく、分子として働いてもよい。サイトカイン遺伝子レギュレーションに関して、そのような技術は、たとえば、がん細胞の表現系および転移可能性を調節するために利用可能である。阻害剤としてのアンチセンス分子の使用は、遺伝的に治療アプローチに依存して、特異的である。本発明は、以上で述べたサイトカインの１つをコードしている遺伝子またはｃＤＮＡに対するアンチセンスである、少なくとも６つのヌクレオチドの核酸の、治療的および予防的利用を提供する。
【００２７】
同様に、核酸レベル上でサイトカインの発現および／または機能を調整する、本発明のサイトカインアンタゴニストは、サイトカインｍＲＮＡに相補的なｓｄＲＮＡ分子であり得る。そのような分子は、当該技術分野で、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としても知られている。特定のｍＲＮＡの発現を阻害する本技術は、当業者にはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている。本発明のサイトカインのｍＲＮＡに相補的なｄｓＲＮＡ分子は、１９から２５の間の塩基対を持つのが好ましい。ｓｉＲＮＡであるサイトカインアンタゴニストは、当業者に公知の任意の方法によって標的細胞に伝達する。たとえば、カチオン性リポソーム試薬を用いることによる伝達が適用可能である。サイトカインｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを、それをコードしているＤＮＡグリコシラーゼを用いて得ることも考えられる。この場合、所望のサイトカインコード領域の１９〜２５ヌクレオチドのストレッチと、ヘアピンループを形成可能な適したリンカーによって、センスストレッチから分離されているアンチセンスストレッチ双方が、ベクター内に挿入される。ベクターは、当業者によく知られている方法によって、標的細胞内に導入可能である。そのような構築物の設計は、さらに、たとえばＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  Ｖｏｌ．２９６，ページ５５０〜５５３）にて記載されている。
【００２８】
さらに、本発明は、サイトカインアンタゴニストとして、リボザイムと呼ばれるものを含む。リボザイムは、いかなる疾患をも引きおこすｍＲＮＡ配列、この場合はサイトカインｍＲＮＡを認識し、結合し、消化するために、ヒト治療剤として設計可能な、天然に存在するＲＮＡ断片である。リボザイムは、相補的塩基対ハイブリッド形成を介して、サイトカインｍＲＮＡを標的とするように設計する。標的に結合した後、リボザイムの酵素活性が、サイトカインｍＲＮＡを開裂し、したがって、タンパク質への翻訳を防止する。サイトカインｍＲＮＡリボザイムは、化学的に合成可能で、サイトカイン産出を選択的に阻害する。さらに、リボザイムは、そのリボザイムをより安定および活性にするように、化学的に改変してもよい。リボザイムには他の型の化学反応を触媒可能なリボザイムの可能性を提起する、サイトカイン特異的ＲＮＡ分子を開裂するだけでなく、共有様式で炭素−炭素結合を形成するものも含まれる。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態において、サイトカイン遺伝子の翻訳を、サイトカインｍＲＮＡ転写物の５’−ＵＴＲ内で、ＲＮＡ−結合タンパク質を、１つまたはそれ以上のオペレーター配列に結合することによって、減少または削除可能である。結合ＲＮＡ−結合タンパク質は、おそらくリボザイムアッセンブリを防止するか、または５’から３’への転写にそって、リボザイムの移動をブロックすることによって、翻訳に干渉する。そのようなＲＮＡ−結合タンパク質は、特定のＲＮＡ−結合タンパク質の多重体、たとえば２量体でもよい。また、本発明の範囲内で、サイトカインアンタゴニストが、サイトカインｍＲ
ＮＡ分解を促進するか、または少なくとも関与することによって、サイトカイン発現を阻害できる。
【００３０】
調節がタンパク質レベルで起こる場合、本発明には、サイトカイン遺伝子産物の１つまたはそれ異常のエピトープ、サイトカイン遺伝子産物の保存バリアントのエピトープ、変異体サイトカイン遺伝子産物のエピトープ、またはサイトカイン遺伝子産物のペプチドンペンを特異的に認識可能な、抗体またはその断片が含まれる。そのような抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産出される断片、抗イデオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および任意の上記のエピトープ−結合断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。以上記述した抗体であるサイトカインアンタゴニストは、薬物耐性がん細胞で過剰発現している、過剰な量のサイトカインを捕獲し、中和するために使用可能である。抗体が、上記で言及したサイトカインの複数を認識する場合、本発明のために望ましい可能性がある。複数の過剰発現したサイトカインを捕獲し、中和するために、本発明のサイトカインアンタゴニストとして使用する抗体は、複数の特異性を持ちうる、すなわち、たとえば２重特異性、３重特異性または多重特異性である。
【００３１】
抗体を産出するために有用なエピトープおよび抗原性領域は、当業者に利用可能な手順によって、サイトカインアミノ酸配列（たとえば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ番号、ＩＬ−４に関してＰ０５１１２、ＩＬ−１０に関してＰ２２３０１、またはＩＬ−１３に関してＰ３５２２５）内で見ることができる。たとえば、短い、固有のペプチド配列を、公知のアミノ酸配列に対して、相同性をほとんどもたないか、または全く持たない、アミノ酸配列内で同定可能である。ペプチドエピトープまたは抗原として働くように選択したタンパク質の領域は、全体として疎水性ではないのが好ましく、これらの領域が、本タンパク質およびポリペプチドの内部領域以外の表面エピトープを構築する可能性が高いので、親水性領域が好ましい。これらの表面エピトープは、本タンパク質およびポリペプチドの存在に関して試験した、試料中でより簡単に検出される。
【００３２】
たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳または化学合成手順を用いることによって、当業者に公知の任意の手順によってペプチドを作製できる。抗原性エピトープを提供するが、それ自身では、小さすぎて、免疫応答を誘導できない短いペプチドを、適した担体に共役してよい。適した担体および結合の方法は、当該技術分野でよく知られている。適した担体は、通常タンパク質、ポリサッカライドおよび高分子アミノ酸のような、巨大分子である。たとえば、血清アルブミン、キーホール  リンポット  へモシアニン、オバルブミン、ポリリシンなどが挙げられる。当業者は、所望のペプチドエピトープを、そのような担体に連結する利用可能な手順および結合試薬を利用可能である。たとえば、結合試薬を、担体から対象のペプチドへのジスルフィド結合またはチオエーテル結合を形成するために使用可能である。ペプチドがジスルフィド基を欠く場合、サイトカイン残基の添加によって提供しうる。あるいは、カップリングは、カルボキシル基の活性化によっても達成しうる。
【００３３】
抗原特異的抗体を得るために有用なペプチドの最小サイズは、非常に広い。該最小サイズは、タンパク質またはポリペプチドに特異的である、抗原性エピトープを提供するのに十分でなければならない。最大サイズは、１つの特定のエピトープに対する抗体を得ることが望ましい場合を除いて、重要ではない。たとえば、大きなポリペプチドは、多重エピトープを含み、１つのエピトープが特に有用であり、第２エピトープが免疫優勢である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、サイトカインアンタゴニストは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１３に対する抗体、ならびにその組み合わせである。より好ましいサイトカインアンタゴニストは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およ
び／またはＩＬ−１３に対する抗体、ならびにその組み合わせである。もっとも好ましいサイトカインアンタゴニストは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０に対する抗体、およびその組み合わせである。サイトカインアンタゴニストとして利用される抗体は、以上に記述したように、複数の特異性を持ち、すなわち、言及したＩＬの複数に対し、たとえば、ＩＬ−４およびＩＬ−１０に対する２重特異性抗体である。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態において、サイトカインの発現および／または機能を調整するサイトカインアンタゴニストは、いわゆるアプタマーであり得、ペプチドに基づくアプタマーまたはオリゴヌクレオチドに基づくアプタマーでありうる。ペプチドアプタマーは、足場タンパク質の表面上に発現した拘束コンビナトリアルペプチドライブラリーからなる、タンパク質に基づく認識薬剤として定義される。ペプチドアプタマーは、それらをコードしているＤＮＡを変異させることなく、遺伝子産物と相互作用し、不活性化するように、ｉｎ  ｔｒａｎｓで機能する。原理的に、ペプチドアプタマーのコンビナトリアルライブラリーは、任意の遺伝子産物と相互作用するアプタマーを含むべきであり、したがって、ペプチドアプタマーが有機体全体のプロテオームに対して産出可能になる。本発明にしたがったサイトカインアンタゴニストとして使用されるオリゴヌクレオチドに基づくアプタマーには、ＤＮＡならびにＲＮＡアプタマーが含まれる。この観点において、本発明には、鏡像Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡアプタマー、スピエゲルマーと呼ばれるものも含まれる。
【００３６】
本発明のためのサイトカインアンタゴニストとして有用なアプタマーには、特異的なタンパク質と相互作用し、したがって、サイトカインとそのレセプターの特異的タンパク質相互作用を防止するか、または攪乱するものが含まれる。これらは、サイトカインそれ自身と、好ましくはレセプター結合に関与するサイトカインの領域と、相互作用する。アプタマーはまた、レセプターへの結合によってサイトカインとレセプターとの間の相互作用を防止／攪乱することができ、サイトカイン結合に関与するレセプターの領域との相互作用を防止／攪乱できるのが好ましい。アプタマーが、サイトカイン／レセプター相互作用の成功のために必要な他の因子／タンパク質に結合することも可能である。
【００３７】
記述したアプタマーの説明において、サイトカインアンタゴニストは、アプタマーと同様の特性を示しうる、すなわち、サイトカインまたはサイトカインレセプターのいずれかに結合し、それによって、その適切な相互作用、したがって機能を阻害する、小分子阻害剤と呼ばれるものを含むことも実現可能である。小分子阻害剤は、ペプチドまたは小さな化合物であり得、たとえば化合物ライブラリのスクリーニングとの組み合わせでのコンピュータコンビナトリアル化学によって、当業者に公知の方法によって同定されてきた。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態において、サイトカインの発現および／または機能を調節するサイトカインアンタゴニストには、本発明に含まれる任意のサイトカインの、少なくとも１つのレセプター、その誘導体または断片が含まれる。サイトカインアンタゴニストとして抗体を使用するため、提案され、記述された効果と同様に、サイトカインレセプター、その断片または誘導体を、薬物耐性がん細胞中で過剰発現している、過剰量のサイトカインを捕獲し、中和するために使用可能である。適したレセプターおよびレセプターサブユニットに関する例としてそれぞれ、ＩＬ−４およびＩＬ−１３両方に結合するＣＤ１２４（データベース受け入れ番号Ｐ２４３９４）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−１５レセプターに共有された、共通のガンマサブユニット（データベース受け入れ番号Ｐ３１７８５）、ＩＬ−１３レセプターアルファ−２鎖（データベース受け入れ番号Ｑ１４６２７）およびＩＬ−１０レセプターアルファ鎖（データベース受け入れ番号Ｑ１３６５１）が挙げられる。
【００３９】
本発明の説明において、語句、サイトカインレセプターの「誘導体または断片」は、レ
セプターの機能、すなわちサイトカインの結合が、減少または削除されないという条件で、その長さおよび／またはそのアミノ酸組成が、本来の開示されたアミノ酸配列とは異なりうるペプチドを言う。したがって、語句「誘導体または断片」には、アミノまたはカルボキシル末端が伸びたあるいは短くなった、または内部に欠損または挿入を含むペプチドが含まれる。さらに、語句「誘導体または断片」は、本来の開示された配列とは異なる、１つまたはそれ以上のアミノ酸を持つペプチドを含む。本発明においてとりわけ有利な点は、特にレセプターを治療で使用する場合、膜貫通領域を欠く可溶性レセプターである。この場合、レセプターには、任意に直接、またはスペーサーを介して、提案された細胞内ドメインへ、または抗体のＦｃ部分へ連結している提案された細胞外結合ドメイン、その断片または誘導が含まれる。
【００４０】
レセプター、その誘導体または断片に関して、本発明はまた、サイトカインによって誘因されるシグナル伝達カスケードが、第１サブユニットへのサイトカイン結合によって開始され、前記結合が、第２サブユニットの補充を導き、それによって、両方のサブユニット鎖に結合したサイトカインの複合体のみが、続くカスケードを開始する、サイトカイントラップと呼ばれるものを含む。Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００３，Ｖｏｌ．９，２０〜２２頁および４７〜５２頁に記述されたように、サイトカイントラップは、免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分（補体結合ドメイン）との融合によって、一緒に結合する、２つの関連レセプターサブユニットからなる。したがって、本発明のサイトカインアンタゴニストは、ＩｇＧ１の重鎖定常領域ＣＨ２およびＣＨ３と、ヒンジ領域からなる「ヘテロ２量体トラップ」と呼ばれるものであり得、それによって、この構造が、ヒンジ領域間のジスルフィド結合を介して対になる。本発明のサイトカインアンタゴニストはまた、「インライン  トラップ」と呼ばれるものでありえ、２つのレセプター細胞外ドメインが、インラインで融合し、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃが続く。たとえば、サイトカインＩＬ−４に対するサイトカインアンタゴニストは、記述した様式でＩｇＧ１に連結した、上記で特定したＣＤ１２４の細胞外ドメイン、および上記で特定したＣＤ１３２からなりうる。
【００４１】
さらに、サイトカインの調節は、サイトカインの変異体と呼ばれるものを使用して達成できる。変異体は、そのアミノ酸組成が、人工的に改変された、生物学的に活性なタンパク質の誘導体である。本発明の変異体はまた、その予想される細胞表面レセプターに結合可能であるが、抗アポトーシスタンパク質のアップ−レギュレーションを誘導しうる内部シグナルカスケードは誘発出来ない。この観点において、変異体は、予想されるレセプター上の結合部位に対して、内因的に発現したサイトカインと競合する。変異体は、オリゴヌクレオチド指定変異導入によって、親タンパク質の遺伝子から合成された、変異体をコードしている変異体遺伝子の、細菌発現を介して作製可能である。
【００４２】
以上の開示に沿って、本発明は、さらに、細胞内の細胞死阻止タンパク質をダウン−レギュレーションする方法に関し、該方法は、
（ａ）対象から組織または細胞の試料を得ること、
（ｂ）細胞または試料を、サイトカインアンタゴニストと接触させること、
を含む。本発明の特に好ましい実施形態において、開示された方法が適用されるべき細胞は、がん細胞である。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、高レベルのサイトカイン、好ましくはインターロイキンをオートクライン的に産出する、非リンパ性および／または非骨髄性がん標的細胞における、抗アポトーシスをダウン−レギュレーションする方法、上で定義したようなサイトカインアンタゴニストと、標的細胞または試料を接触させることを含む方法について言及する。
【００４４】
サイトカインアンタゴニストとして適切に働くため、そして記述した方法を実施するた
めに、サイトカインアンタゴニストを、活性部位、すなわち、細胞の近くへ、および／または細胞内へ伝達することが望ましい。当業者は、開示されたサイトカインアンタゴニストを、標的細胞内、または標的細胞の近くへ伝達するための種々の方法を知っている。一般的に、適切な方法は、サイトカインアンタゴニストが核酸またはペプチドであるかどうかに依る。さらに、サイトカインアンタゴニストがペプチドの場合、それをコードしている核酸を、標的細胞それ自身、またはペプチドを産出するのに適した他の細胞へ導入することによって、標的細胞内またはその近くに伝達可能である。ペプチド産出のために、原核および真核宿主細胞が意図される。
【００４５】
核酸をアミノ酸に導入する周知の方法がいくつか存在し、そのどれも本発明で使用してもよいが、宿主に依存する。代表的な宿主には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツなどの哺乳動物種などが含まれる。最も簡単には、核酸を、標的細胞／標的組織内に直接注入でき、または、核内へいわゆるマイクロインジェクションによっても注入できる。他の方法として、核酸を含む細菌プロトプラストでの、レシピエント細胞の融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン脂質またはリポソームのような組成物の使用、または、レセプター−仲介エンドサイトーシス、バイオリスティック粒子照射（「ジーン  ガン」法）、ウイルスベクターでの感染、エレクトロポレーションなどが挙げられる。
【００４６】
サイトカインアンタゴニスト、それをそれぞれコードしている核酸の、細胞内への導入およびその発現のために、核酸が、発現ベクターに統合されている場合に、利点がある。発現ベクターとは、好ましくは真核生物発現ベクター、またはレトロウイルスベクター、プラスミド、バクテリオファージ、または生物技術領域で通常使用される他のベクターである。必要ならば、または望むならば、サイトカインアンタゴニストをコードしている核酸は、原核または真核細胞での、翻訳可能なｍＲＮＡの転写および合成を指向するレギュレーション要素に、動作可能に連結可能である。そのようなレギュレーション要素は、プロモーター、エンハンサーまたは転写終止シグナルであるが、しかしまた、イントロンまたは同様の要素、たとえば、ベクターの安定性および増幅、ゲノムの望む場所で、成功した宿主のゲノムへの伝達および／または統合を促進するか寄与する要素、ゲノム内の望む場所での相同組換えを促進する領域のようなものも含まれうる。
【００４７】
サイトカインアンタゴニストが、標的細胞内に直接導入されるペプチドである場合、ペプチドの細胞取り込みを仲介する担体ペプチドに融合可能である。適切な担体は、当業者に公知であり、ＴＡＴ、繊維芽細胞増殖因子、グラパラン（トランスポータン）、ポリ−アルギニンおよびＰｅｐ−１、任意の前記担体の機能的断片および誘導体が含まれる。さらに、サイトカインは、細胞表面レセプター、またはその機能的部分に対するリガンドに融合されてもよく、したがって、レセプター仲介エンドサイトーシスによって内在化されてもよい。
【００４８】
本発明で開示したようなサイトカインアンタゴニストは、任意に、少なくとも１つの活性化合物との組み合わせで、がんの治療のために、医薬的に使用可能である。これは、本発明のさらなる実施形態である。語句「活性化合物」は、細胞死、好ましくはアポトーシスを誘導するか感作することが可能であるか、または細胞増殖を阻害するサイトカインアンタゴニスト以外の化合物である。細胞死、好ましくはアポトーシスを誘導するかまたは感作可能な活性化合物は、当業者に公知である。
【００４９】
まず、語句「活性化合物」では、腫瘍の処置において、電気磁気または微粒子放射の使用について言及する。放射線治療は、標的領域へ伝達された高用量放射線が、がんおよび正常組織内の再生細胞の死となるという原理に基づいている。放射用量投与計画は、一般的に放射吸収用量（ｒａｄ）、時間および分画に関して定義され、がん専門家によって注
意深く定義されなければならない。患者が受ける放射線の量は、種々の考慮に依存するが、２つの最も重要な考慮は、体の他の重要な構造または器官に関する腫瘍の局在および腫瘍が広がっている程度である。放射線治療薬の例は、放射治療においてを提供されており、当該技術分野で公知である（Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ，ｉｎＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２４８７５（Ｄａｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，４ｔｈ  ｅｄ．，ｖｌ，１９９３）が、これらに限定されるものではない。放射線治療における最近の進展には、３次元共焦点外部ビーム放射、強度調節放射線治療（ＩＭＲＴ）、定位的放射線治療および近接照射療法（間質放射線治療）、埋め込み「種」として、腫瘍内への直接放射線の供給源の配置が挙げられる。これらのより新しい処置は、腫瘍への、より大きな用量の放射線の伝達を改変し、標準の外部ビーム放射線治療と比較した時に、その効果が増加する。ベータ放射放射性核種が、イオン化粒子（エレクトロン）の穏やかな直線エネルギー伝達（ＬＥＴ）、およびその中間範囲（通常、組織中数ミリメートル）のために、放射線治療適用にもっとも有用であると考えられる。ガンマ線は、より長い距離で、低レベルにて、用量を伝達する。アルファ粒子は、他の極端なものであり、非常に高いＬＥＴ用量を伝達するが、極端に範囲が制限され、したがって、処置すべき組織の細胞と密に接触しなければならない。さらに、アルファ放射物は、一般的に重金属であり、可能性のある化学反応を制限し、処置すべき領域からの放射性核種の漏出からの必要以上の危険が提示される。処置すべき腫瘍に依り、本発明の範囲内で全ての種類の放射物が想定しうる。
【００５０】
一般的に、放射線治療は、処置の結果を改善するために、以下に列記した、他の活性化合物と、時間的に組み合わせることが可能である。他の活性化合物と一緒に、放射線治療を適用する、時間的な関係を記述する種々の語句が存在し、以下の例は、好ましい処置投与計画であり、一般的に当業者によって公知であり、例示のためのみであり、他の組み合わせの使用を制限する意図はない。他の活性化合物との放射性治療の投与としては、「連続的」、すなわち、分離投与を可能にするために時間的に分離する、「同日に投与することを意味する「同時」、および最後に他の活性化合物を投与しない日に放射線治療を実施することを意味する「交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）」投与ができる。
【００５１】
活性化合物の他のクラスは、細胞増殖抑制または抗腫瘍効果のある化合物（「細胞増殖抑制化合物」）である。本発明に含まれる細胞増殖抑制化合物として、（ｉ）シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、ゲンシタビン、ヒドロキシウレアまたはメトトレキサートのような代謝拮抗物質、（ｉｉ）ブレオマイシンのようなＤＮＡ−断片化剤、（ｉｉｉ）クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミドまたはナイトロジェンマスタードのようなＤＮＡ−架橋剤、（ｉｖ）アドリアマイシン（ドキソルビシン）またはミトキサントロンのような挿入剤、（ｖ）Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、プロマイシンまたはジフテリア毒素のようなタンパク質合成阻害剤、（ｖｉ）カンプトテシンまたはトポテカンのようなトポイソメラーゼＩ毒、（ｖｉｉ）エトポシド（ＶＰ−１６）またはテニポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ毒、（ｖｉｉｉ）コレセミド、コルチシン、パクリタキセル、ビンブラスチンまたはビンクリスチンのような微小管指向剤、（ｉｘ）フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）またはＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）のようなキナーゼ阻害剤、（ｘ）チオプラチン、ＰＳ−３４１、フェニルブチレート、ＥＴ−１８−ＯＣＨ3、またはフェルネシル  トランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３０７４９、Ｌ−７４４８３２）のような種々の治験剤、クエルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、エピガロカテキン、ガレート、セアフラビン類、フラボノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸およびその誘導体のようなポリフェノール類、（ｘｉ）グルココルチコイド類またはフェンレチニドのようなホルモン類、（ｘｉｉ）タモキシフェン、フィナステリドまたはＬＨＲＨアンタゴニストのようなホルモンアンタゴニスト類が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。
【００５２】
他の細胞増殖抑制化合物には、（ビスカムおよび誘導体からの）植物由来の細胞増殖抑制剤；ビンデシンのようなアルカロイド類、ビネオレルビンのようなポドフィロトキシン類；ニムステリン、カルムストリン、ロムスチン、エストラムステリン、メルファラム、イホスファミド、トロホスファミド、ベンダムスチン、ダカルバジン、ブスルファン、プロカルバジン、トレオスルファン、トレモゾルアミド、チオテパのようなアルキラント類；アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ダクチノマイシンのような細胞増殖抑制抗生物質；メトトレキサートのような葉酸類似体、クラドリビン、メルカプトプリン、チオグアニンのようなプリン類似体およびシタラビン、フルオロウラシル、ドセタキセルのようなピリミジン誘導体などの代謝拮抗物；カルボプラチン、オキサリプラチンのようなプラチナ化合物；アムサクリン、イリノテカン、インターフェロン−アルファ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ミルテホシン、ペントスタチン、アルデスロイキン；例えば、トラスツズマブ、リツキシマブなどのモノクローナル抗体のような有機体から由来する、またはペガスパラガーゼのような酵素から由来する抗腫瘍化合物；たとえばポリエストラジオール、ホスフェストリオール、エチニルエストラジオールのようなエストロゲン類、メドロキシプロゲステロン、ゲストノロンカプロート、メゲストロール、ノレシステロン、リネストレノールのようなゲスタゲン類、トリプトレリン、ロイプロレリン、ブセレリン、ゴセレリンのような視床下部ホルモン類、テストラクトン、テストステロンのような他のホルモン類などのホルモン類に属する内分泌影響抗腫瘍化合物；トレミフェンのような抗エストロゲン類、フルタミド、ビカルタミド、シプロテランのような抗アンドロゲン類などのホルモンアンタゴニストに属する内分泌効果抗腫瘍化合物；アナストロール、エキセメスタン、レトロゾール、ホルメスタン、アミノグルテチミドのような酵素阻害剤に属する内分泌効果抗腫瘍化合物が含まれ、これらのすべてが、カルシムホリナット、アミホスチン、レノグラスチン、モルグロモスチン、フィルグラスチン、メスナのようないわゆる保護物、またはレチノールパルミテート、甲状腺Ｄ９、アミロマーのようないわゆる添加物と共に投与可能である場合もある。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、細胞増殖抑制効果のある活性化合物は、シスプラチン、ドキソルビシンおよびパクリタキセル（タキソール）からなる群より選択される。
【００５４】
本発明で使用可能な他のクラスの活性化合物は、死受容体に結合することによって、アポトーシスに関して感作するか、または誘導することが可能なもの（「死受容体アゴニストである。死受容体のアゴニストには、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β、リンホトキシン−α）、ＬＴ−β（リンホトキシン−β）、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ、ＤＲ４リガンド）、ＣＤ９５（Ｆａｓ、ＡＰＯ−１）リガンド、ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３、Ａｐｏ−３）リガンド、ＤＲ６リガンド、ならびに任意の前記リガンドの断片および誘導体のような、死受容体リガンドが含まれる。さらに、死受容体アゴニストには、抗−ＣＤ９５抗体、抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）抗体、抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）抗体、抗−ＤＲ６抗体、抗ＴＮＦ−Ｒ１（ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ）抗体および抗−ＴＲＡＭＰ（ＤＲ３）抗体、ならびに任意の前記抗体の断片および誘導体のような、死受容体に対するアゴニスト活性抗体が含まれる。好ましくは、アゴニスト活性抗体としては、抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体、抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体および任意の該抗体の断片および誘導からなる群より選択される。
【００５５】
サイトカインアンタゴニストとの組み合わせで使用可能な活性化合物の他のクラスは、上述した抗アポトーシスタンパク質を陰性に制御するか、または阻害する、ペプチド、タンパク質または小分子である。陰性にレギュレートするペプチドの例には、上述したＩＡＰｓを特に阻害する、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、ＮＲＡＧＥおよびＴＡＫ１、それらの断片が含まれる。これらのペプチドは、細胞取り込みによって、腫瘍細胞内に迅速に内在化
可能である方法で、改変しうる。この改変は、以上で開示されたような、細胞取り込みを仲介する担体ペプチドを、活性化合物に接着させることによって実施可能である。
【００５６】
サイトカインアンタゴニストは、単独で、または１つまたはそれ以上の活性化合物との組み合わせて投与可能である。後者は、サイトカインアンタゴニストの投与前後または同時に投与可能である。サイトカインアンタゴニストまたは活性化合物いずれかの用量、ならびにインキュベーションの期間および温度は、変更可能であり、処置すべき標的に依存する。
【００５７】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つの任意の活性化合物と、医薬的に許容可能な担体、すなわち１つまたはそれ以上の医薬的に許容しうる担体基質および／または添加物との組み合わせであって、有効量の少なくとも１つのサイトカインアンタゴニストを含む医薬製剤である。
【００５８】
本発明にしたがった医薬製品は、経口で、たとえば、ピル、錠剤、漆塗り錠剤、糖衣錠、顆粒、堅および軟ゼラチンカプセル、水性、アルコール性または油性溶液、シロップ、エマルションまたは懸濁液の形態で、または経直腸で、たとえば座薬の形態で、投与可能である。投与は、注射または注入用溶液の形態、たとえば皮下、筋肉内または静脈内のような非経口でも実施可能でもある。他の適した投与形態は、たとえば、軟膏、チンキ剤、スプレーまたはエアゾル混合液の形態で、またはたとえばマイクロカプセル、インプラントまたはロッドの形態で、たとえば経皮または局所投与である。好ましい投与形態は、たとえば、処置すべき疾患およびその重症度に依存する。
【００５９】
医薬組成物の調製は、それ自体公知の様式で実施可能である。この目的のために、１つまたはそれ以上の固体または液体医薬的担体基質および／または添加物（または補助基質）と共に、所望により、治療的または予防的活性を持つ他の医薬的に活性な化合物と組み合わせて、サイトカインアンタゴニストおよび／または活性化合物を、ヒトまたは動物医薬品内の医薬製品として利用可能である好適な投与形態または用量形態にする。
【００６０】
ピル、錠剤、糖衣錠および堅ゼラチンカプセルを作るため、たとえば、ラクトース、デンプン、たとえばトウモロコシデンプン、またはデンプン誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを利用することが可能である。軟ゼラチンカプセルおよび座薬のための担体は、たとえば、脂肪、蝋、半固体および液体ポリオール、天然または固化油などである。たとえば注射用溶液、またはエマルジョンまたはシロップの溶液の調製のために適した担体は、たとえば、水、生理学的塩化ナトリウム溶液、エタノールのようなアルコール類、グリセロール、ポリオール類、ショ糖、不活性糖、グルコース、マンニトール、植物油などである。サイトカインアンタゴニストおよび／または活性化合物を凍結乾燥すること、およびたとえば注射または注入用調製剤を調製するために、得られた凍結乾燥品を使用することも可能である。マイクロカプセル、インプラントまたはロッド用に適した担体は、たとえばグリコール酸および乳酸のコポリマーである。
【００６１】
医薬製剤はまた、添加物、たとえば充填剤、錠剤分解物質、結合剤、潤滑油、湿潤剤、安定剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味料、色素、甘味料、芳香剤、増粘剤、希釈液、緩衝基質、溶媒、可溶化剤、デポット効果を達成するための薬剤、浸透圧を変化させるための塩、コーティング薬剤または抗酸化剤も含みうる。
【００６２】
投与すべき１つまたはそれ以上の活性化合物との組み合わせでの、サイトカインアンタゴニストの用量は、個々の場合に依存し、慣例的であるように、最適な効果を達成するために、個々の環境に適合しうる。したがって、処置すべき疾病の性質および重症度に依存し、処置すべきヒトまたは動物の性、年齢、体重および個々の応答性に、使用した化合物
の活性の効果および期間に、治療が急性であるか、慢性であるか、または予防的であるか、他の活性化合物を、サイトカインアンタゴニストに加えて投与されるかどうかに依存する。
【００６３】
本発明にしたがったサイトカインアンタゴニスト、それぞれ後者を含む医薬品は、抗アポトーシスタンパク質の発現により、アポトーシスに抵抗性である、すべてのがんの型の処置に使用可能である。そのようながん型の例には、神経芽細胞腫、回腸がん、大腸がん、家族性アデノマトスポリープがん、および世襲非ポリープ大腸がんのような腸がん、食道がん、唇がん、喉頭がん、下咽頭がん、舌がん、唾液腺がん、胃がん、アデノカルシノーマ、脊髄甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、未分化甲状腺がん、腎臓がん、腎実質がん、卵巣がん、頸部がん、子宮体がん、子宮内膜がん、絨毛がん、膵臓がん、前立腺がん、睾丸がん、乳がん、泌尿器がん、メラノーマ、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫および末梢神経外胚葉腫瘍のような脳腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ−細胞白血病リンパ腫、肝細胞がん、胆嚢がん、気管支がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、セミノーマ、胎児性横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および形質細胞腫が含まれる。
【００６４】
特に好ましい実施形態において、本発明にしたがったサイトカインアンタゴニスト、それぞれ後者を含む医薬品を、非リンパ性および非骨髄性、好ましくは上皮がんの処置のために使用可能である。
【００６５】
本発明にしたがったサイトカインアンタゴニスト、それぞれ後者を含む医薬品の使用が、とりわけ有利であるがんの型の例には、甲状腺がんの全ての形態（延髄骨髄がん、甲状腺乳頭がん、濾胞性甲状腺がん、未分化甲状腺がん）、乳がん、肺がん、前立腺がんおよび大腸がんが含まれる。もっとも好ましくは、サイトカインアンタゴニストは、甲状腺がんの処置のために有用である。
【００６６】
本発明にしたがったサイトカインアンタゴニスト、それぞれ後者を含む医薬品はまた、抗アポトーシスタンパク質の発現によって、アポトーシスに抵抗性である全ての自己免疫疾患の処置のためにも使用可能である。そのような自己免疫疾患の例には、関節リウマチ、エリテマトーデス狼瘡、シャープ症候群、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー病、食道運動障害、毛細血管拡張症）、皮膚筋炎、脈管炎（ボルバス  ワーグナー）およびシューグレン症候群のような膠原病、グッドパスチュア症候群、迅速進行糸球体腎炎およびＩＩ型膜増殖性主糸球体腎炎のような腎臓病、Ｉ型糖尿病、自己免疫疾患多重内分泌障害−カンジダ症−外胚葉性形成異常（ＡＰＥＣＥＤ）、自己免疫副甲状腺、悪性貧血、生殖腺不全、突発性モルバスアディソン、ハイパースレオシス、橋本甲状腺炎および原発性ミキセデミアのような内分泌疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、ヘルペス  ガスタチオニス、表皮水疱症、主要多形性紅斑のような皮膚疾患、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性胆管炎、１型自己免疫性肝炎、２型自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎のような肝臓疾患、多発性硬化症、筋無力性結腸炎、筋無力性ランバート−イートン症候群、獲得性神経筋緊張、ギラン・バレー症候群（ミューラー−フィッシャー症候群）、スティッフ−マン症候群、小脳変性症、運動失調、オプソクロヌス、感覚ネフロパシーおよびアカラシアのような神経疾患、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（モルバス  ワールホット）のような血液疾患、ＡＩＤＳ、マラリアおよびチャガス疾患のような、関連した自己免疫応答を伴う感染疾患が含まれる。
【００６７】
本発明のさらなる目的は、薬物耐性腫瘍細胞に存在するサイトカインの発現レベルを検
出および定量するための診断ツールとして、サイトカインまたはそれをコードしている核酸にハイブリッド形成するかまたは結合するサイトカインアンタゴニストの利用である。漿液流出物（血液）、精液、膣分泌液、唾液、脳脊髄液、胸膜および心膜液、腹膜炎、滑液および羊水のような、任意の可能性のある患者の体液を解析することによって、サイトカインの発現レベルを検出および定量し、したがってがんに対する罹患性を検出および定量することも可能である。
【００６８】
すなわち、本発明は、対象のがん疾患を診断およびモニタするための、サイトカインアンタゴニストの使用であって、該使用が
（ａ）対象の体液試料、または非リンパ性および／または非骨髄性腫瘍からの組織または細胞の試料を得ることと、
（ｂ）前記試料を、サイトカイン核酸に結合する標識化プローブ、および／またはサイトカインに結合する抗体に接触させることと、
（ｃ）組織または細胞内のサイトカインの発現レベルを測定し、健康な対照細胞での発現レベルと比較することと、および
（ｄ）健康な対照細胞での発現レベルと比較した場合に、サイトカイン発現が低い比である対象に対して、よりよい診断を相関させることと、
を含むサイトカインアンタゴニストの使用についてを言及している。
【００６９】
したがって、サイトカインアンタゴニストは、ある型のがんを患っている患者が、ある治療に対して感受性であるかどうか、および処置戦略を変更する必要があるかどうかを予測するために有用であり得る。結合およびハイブリッド形成アッセイを利用して、腫瘍細胞または体液中のサイトカインの過剰発現に関連した（状態および疾病を含む）疾患を検出、予知、診断またはモニタ可能である。これは、サイトカインをコードしている核酸の検出およびサイトカインタンパク質の検出を必要とする。
【００７０】
サイトカイン核酸は、当業者によく知られている多数の方法の任意のもので、本明細書によって検出および定量される。適切な検出方法には、分光光度計、ラジオグラフィー、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高分散クロマトグラフィーなどのような生化学的方法、および流体またはゲル沈殿反応、免疫核酸、免疫電気泳動、放射免疫アッセイ（ＲＩＡｓ）、酵素結合免疫沈着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、組織アレイなどのような免疫学的方法が含まれる。
【００７１】
ハイブリッド形成技術は、しばしば核酸の検出のために利用されており、本発明は、サザン、ノザンおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成技術、ドットブロット解析、ｃＤＮＡアレイを含む、全ての利用可能なハイブリッド形成技術を意図している。サイトカインｍＲＮＡｓの発現は、たとえば、ノザン解析によって、またはＰＣＲによる逆転写および増幅によって検出してもよい。たとえば、放射活性標識化ヌクレオチドの組み込みによって、核酸プローブに共役しているシグナル部位を利用する、核酸検出および定量方法も意図される。試料中の核酸は、固体支持体上に固定化し、そのようなプローブにハイブリッド形成可能である。シグナル部位は、たとえば蛍光によって、直接検出可能である。あるいは、シグナル部位は、たとえばＥＬＩＳＡまたは他の比色アッセイにおいて、その酵素活性により、間接的に検出してもよい。
【００７２】
ハイブリッド技術は、通常、組織または細胞の試料を得ること、該試料を、前記核酸分子に結合した識化プローブと接触させること、および前記核酸分子に結合したプローブの存在または量を検出することで、それによって、前記試料中の前記核酸分子の存在または量を検出すること、によって実施される。
【００７３】
該試料中のサイトカインタンパク質の存在および量を定量するための方法は、当業者によく知られている。簡単に記すと、試料を得、前記試料を、該サイトカインに免疫特異的に結合する抗体と接触させ、前記サイトカインに結合した抗体の存在または量を測定し、それによって、前記試料中のサイトカインの存在または量を決定する。ポリペプチドの量および存在を測定する方法として、数ある中で、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡが挙げられる。検出のために抗体を使用する場合、検出可能であるか、または検出に寄与する分子へ共役することが有利である。適した分子には、ビオチン、ワサビ  ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、フルオレセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン  イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ジアミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）およびフィコエリスリンが含まれる。
【００７４】
したがって、本発明は最終的に、任意に、好適な緩衝液、酵素および、薬物耐性腫瘍細胞内、または漿液流出物（血液）、精液、膣分泌液、唾液、脳脊髄液、胸膜および心膜液、腹膜炎、滑液および羊水のような体液内でのサイトカインの検出および定量を促進する他の化合物との組み合わせで、核酸またはペプチド／タンパク質である少なくとも１つのサイトカインアンタゴニストを含む、診断キットを包含する。
【００７５】
本発明を、さらに以下の実施例にて説明する。
【実施例１】
【００７６】
甲状腺がん細胞は化学治療誘導細胞死に対して抵抗性である。
【００７７】
単剤でのまたは化学治療薬の組み合わせでの臨床試験によってまれであり、限定的な陽性の反応が得られてきているが、それは、疾患の自然の歴史と比較して、中間及び平均生存時間が増加せず、いくつかの化合物が、部分的な応答率、および転移性腫瘍拡大に関して、２，３の有益な効果を示した。
【００７８】
甲状腺上皮がんの異なる組織学的変異体の、従来の化学治療薬に対する感度を調査するために、シスプラチン（３００ｎｇ／ｍｌ）、ドキソルビシン（５μＭ）およびタキソール（５μＭ）へ曝露した、新たに精製した正常、および腫瘍甲状腺細胞の生存力を、がん処置の間に観察された、ｉｎ  ｖｉｖｏレベルと同じ用量を用いて、測定した。臨床試験で報告された、適度な臨床効果と一致して、すべて甲状腺上皮がんの組織学的変異体から由来した、初代腫瘍細胞が、正常の甲状腺細胞と比較して、化学治療薬に対して相当な耐性を示した（図１）。そのような抵抗性は、数日間継続し、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養８〜１０日後になくなった（結果は示さず）。
【実施例２】
【００７９】
甲状腺がん細胞は、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLを発現する。
【００８０】
甲状腺がん細胞の化学治療の難治性は、抗アポトーシス遺伝子の阻害活性の結果であり得る。したがって、潜在的に化学治療薬の細胞傷害性活性から、甲状腺がん細胞を保護可能な、相当する抗アポトーシスタンパク質の発現を評価した。ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣパラフィン包埋切片の免疫組織化的解析によって、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLが、甲状腺がん細胞内で、相当アップレギュレートされたことが示された（図２ａおよびｂ）。より正確に、正常甲状腺細胞と異常な甲状腺細胞間の差を測定するために、新たに精製した、対象および腫瘍甲状腺細胞を溶解し、免疫ブロットによって解析した。図２ｃおよびｄで示すように、Ｂｃｌ−ｘLは、正常細胞では弱く発現したが、全ての組織学的にがんの変異体において、４〜５倍アップレギュレートされ、一方Ｂｃｌ−２は、正常甲状腺細胞と比較して、ＦＴＣ細胞内で約３倍、ＰＴＣとＵＴＣ細胞内で２倍高いことがわかっ
た。Ｂｃｌ−ｘLとＢｃｌ−２トランスジェニックマウスからの心臓を陽性対照として使用した。Ｂｃｌ−ｘLとＢｃｌ−２過剰発現の、化学治療薬の細胞傷害性効果に対するいくつかの細胞型を保護する能力が、薬物誘導細胞傷害性からの、甲状腺がん抵抗性における、これらの抗アポトーシスタンパク質の潜在的な役割を示唆している。
【実施例３】
【００８１】
外因性Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLは化学治療剤によって誘導される細胞死から甲状腺細胞を保護する。
【００８２】
Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２のアップ−レギュレーションが、化学治療薬によって誘導されるアポトーシスから甲状腺細胞を保護し、甲状腺がん細胞の生存に関与しうることを証明するために、正常の甲状腺細胞に、レポーター遺伝子として、グリーン  フルオレセイン  タンパク質（ＧＦＰ）を持つ、レトロウイルスベクター（ＰＩＮＣＯ）で変換した。感染の後、空ベクター、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２で変換した甲状腺細胞を、フローサイトメトリーによってソートし、シスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールに対して曝露して、化学治療誘導アポトーシスの程度を評価した。感染を、免疫ブロット解析によってモニタし、遺伝子伝達の効率を確認した（図３ａ）。Ｂｃｌ−ｘLまたはＢｃｌ−２のいずれかを変換した甲状腺細胞は、殆ど完全に、化学治療薬の細胞障害性効果より保護され（図３ｂおよびｃ）、このことは、任意の２つの遺伝子の過剰発現が、甲状腺がん細胞を破壊を防止するのに十分であったことを示している。したがって、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｘｌ−２は、化学治療に対する甲状腺がん細胞の難治性を中和するための可能性のある候補を示している。
【実施例４】
【００８３】
甲状腺がん細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０のオートクライン産出 
腫瘍微小環境が、甲状腺がん細胞表現系および機能に影響を与えうるかどうかを調査するために、アポトーシスに感受性の甲状腺細胞を調節することで、先に発見されたサイトカインの存在を次に評価した。腫瘍甲状腺中でのＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの存在を、甲状腺がんのパラフィン包埋切片上での免疫組織化学によって、および新たに単離した甲状腺がん細胞上での免疫組織化学および免疫ブロット解析によって調査した。免疫組織化学によって解析したすべての組織学的変異体は、正常組織と比較して、ＩＬ−４およびＩＬ−１０に対する高い応答性を示し、一方で、ＩＮＦ−γはほとんど検出されなかった（図４ａ）。興味深いことに、Ｔｈ２サイトカインに対する応答性は、甲状腺小胞に局在しており、これは腫瘍甲状腺細胞がＩＬ−４およびＩＬ−１０両方に関する産出の供給源であったことを示している（図４ａ）。これらのサイトカインが、Ｔ細胞を浸透させることによって放出された可能性を除外するために、新たに精製した甲状腺がん細胞を、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの発現に関して、免疫細胞化学および免疫ブロットによって解析した。免疫組織化学実験において観察されたように、精製した甲状腺がん細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０両方に対する強い応答性を示したが、一方で、ＩＦＮ−γの発現は検出されなかった（図４ｂおよびｃ）。組換え体ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ、２０ｎｇを、免疫ブロット解析のための陽性対照として使用した。陽性対照とがん試料との間の比較によって、悪性甲状腺細胞が、甲状腺小胞細胞上で抗アポトーシス活性を示した、大量のＴｈ２サイトカインを産出することが示唆された。
【実施例５】
【００８４】
ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、化学治療剤によって誘導される細胞死から甲状腺細胞を保護する。
【００８５】
次にＩＬ−４およびＩＬ−１０が、化学治療−誘導アポトーシスに対する感度、および甲状腺細胞中の抗アポトーシスタンパク質の発現を仲介できるかどうかを調査した。興味
深いことに、ＩＬ−４およびＩＬ−１０両方が、シスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールに曝露した正常な甲状腺細胞の死を、劇的に防止し（図５ａ）、これは、甲状腺がん細胞内でのこれらのサイトカインのオートクライン産出が、化学治療に対する難治性に関与することを示唆している。さらに、ＩＬ−４およびＩＬ−１０両方が、培養４８時間後に、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｌｃ−２をアップレギュレートしたが、一方でＩＮＦ−γは影響を与えなかった。したがって、抗アポトーシスタンパク質の発現と結果としての化学治療からの腫瘍細胞の保護は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のオートクライン放出によって仲介される可能性がある。
【実施例６】
【００８６】
オートクラインＩＬ−４およびＩＬ−１０活性を阻害することにより、化学治療仲介破壊に対して甲状腺がん細胞を準備する。
【００８７】
甲状腺腫瘍によるオートクラインＩＬ−４および／またはＩＬ−１０放出が、抗アポトーシスタンパク質のアップレギュレーションに関与するかどうかを試験するために、腫瘍細胞を、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１０に対して特異的な中和Ａｂｓで２日間処理し、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２発現を測定した。図６ａで示すように、両方のタンパク質のレベルが、ＩＬ−４およびＩＬ−１０に対する中和Ａｂｓに曝露した甲状腺腫瘍細胞内で劇的に減少し、一方で、単独のサイトカインの阻止では、非常に限られた効果だけだった。Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２レベルにおけるサイトカイン仲介増加が、化学治療に対する甲状腺腫瘍細胞抵抗性に関与したかどうかを試験するために、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣ細胞を、中和抗−ＩＬ−４および抗−ＩＬ−１０  Ａｂｓで２日間処理し、生存および化学治療薬に対する感受性に関して解析した。すべての組織学的変異体からの有意な割合の甲状腺腫瘍細胞が、抗−ＩＬ−４および抗−ＩＬ−１０  Ａｂｓへの曝露４８時間後に、自発的アポトーシスを起こし（図６ａ）、これは、これらのサイトカインが実際に、甲状腺がん細胞に対する生存因子として働くことを示唆している。さらに、これらの細胞は、化学治療誘導細胞障害性に対する感受性を獲得し、シスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールでの処置２４時間後に、大規模な死を示した（図６ｂ）。したがって、甲状腺がん細胞によって放出されたＩＬ−４およびＩＬ−１０の中和によって、化学治療薬の使用を介し、これらの破壊が可能になる。
【実施例７】
【００８８】
抗アポトーシスタンパク質のダウンレギュレーションは、細胞をＴＲＡＩＬ−誘導細胞死に対して感作する。
【００８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスの可能性を決定するために、正常および甲状腺がん細胞中のＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲ）発現を記録した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４の存在を決定するために、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣによって影響を受けた患者からのパラフィン包埋甲状腺組織切片の、免疫組織化学的染色を実施し、甲状腺がん患者のがん性葉から対極の、正常甲状腺葉からの切片と比較した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ＴＲ４が、解析した乳頭腫瘍のすべてで強力に発現しており、小胞および未分化腫瘍では完全に存在しなかったことがわかった（データは示さず）。オートクラインＩＬ−４およびＩＬ−１０放出が、試験したすべての形態学的甲状腺がん変異体で、ＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシス抵抗性に関与するかどうかを試験するために、細胞を、ＩＬ−４−およびＩＬ−１０−中和抗体で２日間処理し、ついでＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対する腫瘍細胞抵抗性を測定した。有意な割合の腫瘍細胞が、抗−ＩＬ−４および抗−ＩＬ−１０  Ａｂｓへの４８時間の曝露の後、アポトーシス性となり、このことは、これらのサイトカインが、これらの細胞に関して、生存因子として働くことを示唆している（データは示さず）。したがって、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２のような抗アポトーシスタンパク質のダウンレギュレ
ーションは、Ｔｈ２サイトカインの阻害を通して、これらの細胞を、ＴＲＡＩＬ−誘導細胞死に対して感作する。
【実施例８】
【００９０】
ＩＬ−４は、膀胱がん細胞における化学治療−およびＣＤ９５−誘導アポトーシスを阻害する。
【００９１】
広く種々のヒトがんにおいて、Ｔｈ１／Ｔｈ２比の減少が観察され、悪性のステージおよび程度と相関することが提案されてきた。腫瘍関連Ｔｈ２リンパ球から放出されたＩＬ−４は、マウスにおける肺転移がんの増殖を促進することが示されてきており、これは、腫瘍細胞生存に影響を与えることにおける、このサイトカインと特別な役割を示唆している。したがって、ＩＬ−４の、異なるヒト固形がんから由来した細胞のアポトーシス感受性を調節する能力を調査した。
【００９２】
細胞傷害性薬物を用いる抗がん処置は、細胞内アポトーシスプログラムを活性化することによって、細胞死を仲介する。ＩＬ−４が化学治療薬剤によって誘導されたアポトーシスを阻害可能であったかどうかを決定するために、膀胱腫瘍細胞（ＲＴ１１２）を、異なる濃度のＩＬ−４で２日間前処理し、続いて、カンプトテシンまたはエトポシドに曝露した。多数の腫瘍細胞（〜６０％）が、化学治療剤に対する応答でアポトーシスを受けた一方で、ＩＬ−４で前処理した細胞は、薬物誘導死から有意に保護されており（図７Ａ）、このことは、ＩＬ−４が、腫瘍細胞内の抗がん剤によって活性化されたアポトーシスプログラムを干渉することを示している。ＩＬ−４の保護効果はすでに、前処理の２４時間後に一貫しており、ＩＬ−４を培養培地から除去しない限り、処置の２日目から安定のままである（図７Ｂおよびデータは示さず）。
【００９３】
ＩＬ−４で処置した腫瘍細胞が、化学治療薬剤に対する感受性の減少を示したという観察によって、我々は、このサイトカインが、アポトーシスレギュレーション遺伝子の発現に影響を与えるかどうかを調査した。アポトーシス関連タンパク質のウエスタンブロット解析を、未処理またはＩＬ−２処理細胞と比較して、ＩＬ−４で４８時間処理したがん細胞株で実施した。試験したタンパク質のうち、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１のレベルが、ＩＬ−４で処理した腫瘍細胞で増加し、一方でカスパーゼおよび他のプロ−および抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーのメンバーのレベルは、変化しないままであったことがわかった（図７Ｃ〜Ｄおよびデータは示さず）。ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の発現の増加によって、我々は、ＩＬ−４が、死受容体刺激から腫瘍細胞を保護することができるかどうかという調査に進んだ。ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）は、細胞傷害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の主要な効果器分子の１つである。ＣＤ９５経路は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける主要クリアランスに関与していることが示されてきた。ＣＤ９５変異またはダウンモジュレーションが、多くの腫瘍で発見されており、ＣＤ−９５誘導細胞死に対する抵抗性の発達が、悪性細胞の免疫回避に関与することが示唆されてきた。図７Ｅで示すように、ＩＬ−４処置が、膀胱がん細胞におけるＣＤ９５−誘導アポトーシスを有意に阻害可能であり、このことは、ＩＬ−４が、腫瘍に対する免疫応答に陰性に影響を与えうることを示唆している。
【実施例９】
【００９４】
ＩＬ−４は、前立腺および乳癌細胞における化学治療−およびＣＤ−９５誘導アポトーシスを阻害する。
【００９５】
化学治療および抗−ＣＤ９５−誘導アポトーシスから、膀胱がん細胞を保護するＩＬ−４の能力はまた、前立腺および乳癌のような、ＩＬ−４の存在によって特徴づけられる他の腫瘍によっても提示されうることが仮定された。したがって、前立腺（ＬＮＣａＰ）お
よび乳（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）がんから由来した腫瘍細胞株を、ＩＬ−４で２日間前処理し、続いて、各細胞株に対して、もっとも高い細胞傷害性活性を示した、抗腫瘍薬剤に曝露した。培地中で培養したのみ、またはＩＬ−２で前処理した前立腺および乳腫瘍細胞の多くの割合が、化学治療剤に対する応答においてアポトーシスを受けた一方で、ＩＬ−４で前培養した細胞は、薬物誘導死から有意に保護された（図８Ａ〜Ｂ）。同様に、ＩＬ−４は、抗−ＣＤ９５−誘導アポトーシスを大きく減少させ（図８Ｃ）、このことは、腫瘍浸潤物におけるＩＬ−４の存在が、がん細胞を、細胞傷害性治療および免疫応答から保護しうることを示唆している。反対に、ＩＬ−２での細胞の前処理は、なんの保護効果も達成せず、このことは、がん細胞におけるＣＤ９５によって開始されたアポトーシスの阻害における、ＩＬ−４−仲介シグナルの特異性を示唆している。明らかに、ＩＬ−４で前処理した細胞は、細胞傷害性薬剤およびＣＤ９５刺激に対する生存の増加を示唆しただけでなく、細胞傷害性刺激を除去した時に、完全な増殖活性を取り戻した（データは示さず）。したがって、ＩＬ−４が、化学治療処置を生き抜いた細胞のより迅速な拡大を含む腫瘍細胞の生存および増殖において、有意な効果を達成可能であることが明らかである。
【実施例１０】
【００９６】
ＩＬ−４は、前立腺がんおよび乳癌細胞における抗−アポトーシスタンパク質の発現をアップレギュレートする。
【００９７】
ＩＬ−４で処理した前立腺および乳腫瘍細胞が、ＣＤ−９５および化学治療薬剤によって誘導された死に対して、減少した感受性を示した観察によって、我々は、このサイトカインがアポトーシスレギュレーション遺伝子の発現に影響を与えうるかどうかを調査することにした。膀胱腫瘍細胞と同様に、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１のレベルが、ＬＮＣａｐ前立腺がん細胞でのＩＬ−４処置に続いて、相当アップレギュレートされ（図９Ａ）、したがって、化学治療およびＣＤ９５レセプターによって開始されたアポトーシス現象からの、ＩＬ−４仲介保護に対する可能性ある説明が提供される。別に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にて、ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１では、適度な増加しか観察されず、そこで、Ｂｃｌ−ｘLが、アポトーシスからのＩＬ−４仲介保護の第１効果器を表す（図９Ｂ）。したがって、膀胱、前立腺および乳癌細胞でのＩＬ−４−仲介の生存の増加は、抗アポトーシスタンパク質のアップレギュレートに関連している。
【実施例１１】
【００９８】
Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現は、薬物誘導アポトーシスから腫瘍細胞を保護する。
【００９９】
抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーのメンバーは、ミトコンドリアからのシトクロームｃの放出を調節し、化学治療薬剤に曝露された腫瘍細胞のアポトーシスレギュレーションに関係してきた。ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の発現の増加が、悪性細胞のＣＤ９５−依存アポトーシスを阻害することが報告されてきており、したがって、結果として、ｉｎ
ｖｉｖｏでのＴ細胞免疫からの腫瘍の回避となる。これらの２つの抗アポトーシス効果器の発現の増加が、化学治療薬剤によって誘導されたアポトーシスから、腫瘍細胞を保護可能であったかどうかを決定するために、ＲＴ１１２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＬＮＣａＰ細胞に、Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１に対するｃＤＮＡ、およびレポーター遺伝子としてＧＦＰを含むレトロウイルスベクターを変換した。ウイルス上清を滴定し、感染サイクス数を調整することによって、免疫ブロット解析およびデンシトメトリー変換によって示したように、ＩＬ−４−処置細胞のものと同程度の、細胞におけるＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１のレベルを得ることが可能であった（図９Ｃ〜Ｅ）。ついで細胞を、化学治療薬剤に曝露し、外因性Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１によって達成されたアポトーシスからの保護を、ＩＬ−４、または対照サイトカインＩＬ−２で前処理した非変換細胞との関連で評価した。対照細胞が、効
果的に細胞傷害性薬剤によって殺された一方で、Ｂｃｌ−ｘLの外因性発現は、ＩＬ−４によって産出されたものと同様のレベルで、薬物誘導アポトーシスから、腫瘍細胞を保護した。薬物誘導死の部分的な阻害がまた、ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１を過剰発現している細胞で観察され（図１０）、おそらく、ＮＦ−ｋＢを介した抗アポトーシスシグナルを活性化させる、ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の能力を反映しているか、あるいは、化学治療誘導アポトーシスにおける、死受容体仲介事象の関与を示唆している。
【実施例１２】
【０１００】
Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現は、ＣＤ９５−誘導アポトーシスから腫瘍細胞を保護する。
【０１０１】
Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１は両方とも、異なる機序ではあるが、ＣＤ９５レセプターにて開始されたアポトーシスシグナルを干渉することが示されてきた。ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１は、カスパーゼ−８の活性化を阻害することによって、ＣＤ９５  ＤＩＳＣを不活性化し、一方で、Ｂｃｌ−ｘLの過剰発現は、ミトコンドリアアポトーシス経路を阻害し、これは、死受容体シグナル伝達の遂行に寄与する。Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の、腫瘍細胞のＣＤ９５−誘導アポトーシスを阻害する能力を決定するために、安定にＢｃｌ−ｘLを過剰発現しているＲＴ１１２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＬＮＣａＰ細胞、およびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１を過剰発現しているＲＴ１１２およびＬＮＣａＰ細胞を、抗−ＣＤ９５アゴニスト抗体で刺激した。Ｂｃｌ−ｘLは、これらの細胞株の、ＣＤ−９５仲介死からの有意な保護を誘導可能であって、このことは、これらの細胞のＣＤ−９５−仲介アポトーシスにおけるミトコンドリア事象の重要な役割を示唆しており（図１０Ａ〜Ｃ）、一方、ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１は、ＩＬ−４処置で得たものと同程度のレベルで、ＣＤ−９５−誘導アポトーシスから、ＬＮＣａＰおよびＲＴ１１２細胞を効果的に保護した（図１０ＡおよびＢ）。これらの結果は、ＩＬ−４によって誘導されたＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１のアップレギュレーションが、化学治療薬物によって、および免疫系作用によって仲介されたアポトーシスに対する腫瘍の抵抗性の増加に寄与しうるという仮説を支持する。
【実施例１３】
【０１０２】
ＩＬ−４のｉｎ  ｖｉｖｏ産出は、膀胱および前立腺がんにおけるＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１のアップレギュレーションと関連する。
【０１０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、腫瘍細胞保護でのＩＬ−４の役割を決定するために、膀胱、前立腺および乳癌標本を、ＩＬ−４の存在およびＩＬ−４誘導抗アポトーシスタンパク質の発現を検出するために、免疫組織化学によって解析した。文献データと一致して、正常および腫瘍組織は、試験したすべての異なる型のがんで、ＩＬ−４の存在を一貫して示したが、正常組織は十分陰性であった（図１２Ａ〜Ｃ）。連続切片解析によって、ＩＬ−４反応性が、ＣＤ４５+免疫浸潤物の存在と関連したことを示しており、これは、異なる腫瘍におけるＩＬ−４産出の主な供給源を表す（図１２Ａ〜Ｃ）。アポトーシス関連タンパク質の解析によって、膀胱、前立腺および乳腫瘍が、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１両方に対する高い反応性を提示し、正常組織でのその発現は、非常に低いか、検出不可能であった（図１３Ａ）。予想したように、３つの型の腫瘍は、ＩＬ−４レセプターを発現し、このレセプターは、正常組織にも存在した（図１３Ａ）。さらに、ｉｎ
ｖｉｖｏで観察されたＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１のレベルを、そのＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現が化学治療薬物および抗−ＣＤ９５からの保護を与える細胞株のものと比較した。Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１両方の発現は同様であるか、外因性遺伝子を持つ相当する細胞株と比較して、膀胱および前立腺がんでより高く（図１３ＢおよびＣ）、一方で、乳癌でのＢｃｌ−ｘLのｉｎ  ｖｉｖｏ発現は、変換ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で見られたものよりもわずか
に低かった（図１３Ｄ）。したがって、膀胱および前立腺がんにおけるＩＬ−４のｉｎ  ｖｉｖｏ産出は、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の抗発現と関連し、化学治療およびＣＤ−９５−仲介アポトーシスからがん細胞を保護する。
【実施例１４】
【０１０４】
ＩＬ−４のｉｎ  ｖｉｖｏ産出は、化学治療から、乳がん細胞を保護する。
【０１０５】
Ｂｃｌ−ｘLのＩＬ−４誘導アップレギュレーションが、上皮乳細胞を、アポトーシスから保護可能であることを確認するために、新たに単離した正常乳上皮細胞を、ＩＬ−４に曝露し、Ｂｃｌ−ｘL発現、および通常乳がんを処置するために使用される化学治療薬剤のパネルに対する感受性を解析した。正常乳上皮細胞のＩＬ−４処置は、Ｂｃｌ−ｘLの発現を相当増加させ、新たに単離した腫瘍細胞において観察されたものよりも、わずかに低いレベルに達した（図１４Ａ）。ＩＬ−４へのｉｎ  ｖｉｖｏ曝露が、乳がんにおける高いＢｃｌ−ｘL発現および化学治療に対する抵抗性に関与することを確認するために、Ｂｃｌ−ｘL発現および、ＩＬ−４が存在する場合、しない場合で培養した初代乳がん細胞のアポトーシスに対する感受性を測定した。新たに単離した乳がん細胞は、高いレベルのＢｃｌ−ｘLを発現し、化学治療薬物に対してほとんど感受性ではなかった（図１４ＣおよびＤ）。しかしながら、ＩＬ−４の存在しない場合で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養の６日後、乳がん細胞が、Ｂｃｌ−ｘLをダウンレギュレートし、化学治療誘導アポトーシスへ感受性となり、一方で、ＩＬ−４が存在する場合、高レベルのＢｃｌ−ｘLを維持し、化学治療薬物に対しては感度は低かった（図１４ＣおよびＤ）。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−４産出によって、乳がん細胞の生存が促進される。
【０１０６】
材料と方法（実施例１〜７および図１〜６に関して）
標本：  ８人のＰＴＣ（２８±５歳）、８人のＦＴＣ（４４±３歳）および４人のＵＴＣ（６５±４．５歳）によって影響を受けた甲状腺組織を、チロイデクトミーの時点で得た。正常な甲状腺標本を、腫瘍に関与していない甲状腺の反対の葉から得た。組織学的診断は、乳頭要素の同定、がん細胞の挙動特性（血管および皮膜浸潤）および核異型（形態およびクロマチンパターン）に依存した。Ｇ．Ｌ．Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ、Ｔｈｏｍａｓｂ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから提供された、ヒトＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLを発現しているトランスジェニックマウス心臓を、陽性対照として使用した。
【０１０７】
甲状腺細胞精製および培養：  正常、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣからの甲状腺組織を、ＤＭＥＭ中のコラゲナーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）およびヒアルロニダーゼ（２０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｕｉｓｅ，ＭＯ）によって、２時間消化した。甲状腺細胞を、抗−ＣＤ４５−共役ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｗｉｒｒａｌ  Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ，Ｕ．Ｋ．）および１２時間のフラスコ接着での造血性細胞枯渇によって精製し、これによって、他の細胞が除去された。さらに１２時間培養した後、甲状腺細胞を、免疫細胞化学のために単層で増殖させたか、または機能およびタンパク質解析のために、トリプトン＋ＥＤＲＡと、それに続くサイトカインまたは化学治療剤への曝露によって脱離させた。甲状腺細胞を、ヒト組換え体ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（４０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＦＮ−γ（１０００ＩＵ／ｍｌ）（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、Ｐａｉｇｎｔｏｎ，ＵＫ）およびシスプラチン（３００ｎｇ／ｍｌ）、ドキソルビシン（５μＭ）およびタキソール（５μＭ）（Ｓｉｇｍａ）またはＴＲＡＩＬ（Ａｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）の存在する場合、またはしない場合で、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ，ＵＫ）を含む標準のＤＭＥＭ中で培養した。ＩＬ−４およびＩＬ−１０中和のために、甲状腺がん細胞を、抗−ヒトＩＬ−４およびＩＬ−１０中和抗体（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ，ＵＳＡ）で、４
８時間前処理した。
【０１０８】
細胞死定量：  腫瘍甲状腺のアポトーシス現象を、ＤＮＡ染色およびフローサイトメトリー解析によって評価した。甲状腺細胞ペレットを、０．１％クエン酸ナトリウムおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）を含む低張蛍光色素溶液中に再懸濁させた。低２倍体核を、先に記述したように評価した。あるいは、新たに精製した甲状腺細胞を、３重で、９６−底プレート中に、１５，０００細胞／ウェルでプレートして、培養した。生細胞の数を、２０μｌの溶液試薬を直接培養ウェルに加え、３７℃にて１時間培養し、４９０ｎｍで吸収を記録することによって、セルタイター  アクエアス  アッセイ  キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって検出した。
【０１０９】
免疫染色手順：  免疫組織化学的染色を、厚さ５μｍのパラフィン包埋甲状腺切片上で実施した。脱パラフィン化切片を、室温にて１０分間、３％過酸化水素にて前処理して、内因性ペルオキシダーゼを阻害した。ついで、細胞を１０分間、３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）とともに培養して、非特異的染色をブロックした。過剰な血清を除外し、続いて切片を１時間Ｂｃｌ−ｘL（Ｈ−５、マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、Ｂｃｌ−２（１２４、マウスＩｇＧ１、Ｄａｋｏ）、ＩＬ−４（Ｂ−Ｓ４マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、ＩＬ−１０（Ｂ−Ｎ１０マウスＩｇＧ２ａ、Ｃａｌｔａｇ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ２７、マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｔａｇ）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１〜Ｒ４（Ａｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）、または適切な溶出液として、アイソタイプがマッチした対照に対する特異的抗体に、曝露した。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLに関する免疫染色の前に、マイクロウェーブオーブン中で、脱ろう切片を０．１Ｍクエン酸緩衝液中１０分間処理した。ＴＢＳ中で２回洗浄した後、切片をビオチン化抗−ウサギまたは抗−マウス免疫グロブリンで処理し、ＴＢＳ中で洗浄し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ  ＬＳＡＢ  ２  Ｋｉｔ、Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ，ＵＳＡ）とともに培養した。発色基質として３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を用いて染色を検出した。組織染色の対比染色を、水性ヘマトキシリンを用いて実施した。
【０１１０】
タンパク質単離およびウエスタンブロッティング：  細胞ペレットを、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１μｇ／ｍｌ）、およびアプロチニン（１μｇ／ｍｌ）を含む氷冷ＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  ＮＰ−４０）中に再懸濁させた。各溶解物（３０μｇ）を、１％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで画分化し、ニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒ  Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）にブロットした。膜を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ中の非脂肪乾燥ミルクで１時間ブロックし、続いて、アクチン（Ａｂ−１、マウスＩｇＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｃｌ−２（１２４、マウスＩｇＧ１、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、Ｂｃｌ−ｘL（Ｈ−５、マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＩＬ−４（３００７．１１、マウスＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）、ＩＬ−１０（２３７３８．１１１、マウスＩｇＧ２ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＦＮ−γ（２５７１８．１１１、マウスＩｇＧ２ａ、Ｒ＆Ｄ  システムズ）に特異的なＡｂｓとともに、２時間培養した。洗浄後、ブロットをＨＲＰ−共役抗−マウスＡｂｓ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに１時間培養して、増強化学発光蛍光検出系（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｗｘｔｅｎｄｅｄ  ｄｕｒ
ａｔｉｏｎ  Ｓｕｓｔｒａｔｅ、Ｐｉｅｃｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を用いて視覚化した。ｒｈＩＬ−４、ｒｈＩＬ−１０およびｒｈＩＦＮ−γ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）を、陽性対照として使用した。
【０１１１】
レトロウイルス粒子の産出と、甲状腺細胞の感染：  Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘLｃＤＮＡｓを、ＰＩＮＣＯベクター中にクローン化した。両種性フェニックスパッケージング細胞株に、カルシウム−リン酸／クロロキニン法を用いて、ＰＩＮＣＯをトランスフェクトした。感染を、１ｍｌの、ウイルス粒子を含む０．４５ｍＭ濾過上清中で、５×１０5の甲状腺細胞を培養することによって実施した。ついで、細胞を、１８００ｒｐｍにて４５分間遠心し、ＣＯ2インキュベーター中に戻し２時間置いた。３回の感染サイクルを、甲状腺細胞をサプリメンタル培地中に戻す前に実施した。保存し、濃縮した陽性細胞を、細胞死の評価のために、シスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールに曝露した。
【０１１２】
材料と方法（実施例８〜１４および図７〜１４に関して）
細胞培養および試薬
ヒトＬＮＣａＰ前立腺がん細胞株、およびヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より得た。ヒトＲＴ１１２膀胱がんは、Ｍ．Ｃｉｐｐｉｔｅｌｌｉ博士（Ｒｅｇｉｎａ  Ｅｌｅｎａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）より供給していただいた。細胞を、Ｌ−グルタミン２ｍＭおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン−シトレプトマイシンを含む、１０％熱不活性化光子血清を含む、ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）内で増殖させた。細胞を、５％  ＣＯ2雰囲気中に維持し、８０〜８５％コンフルエントの場合に、繰り返し継代した。ヒト組換え体ＩＬ−２およびＩＬ−４を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）より購入した。カンプトテシン、シスプラチン、ダウノルビシン、エトポシドおよびビンクリスチンを、Ｓｉｇｎａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓａｉｎ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入し、ＤＭＳＯ（シスプラチン、カンプトテシン、およびエトポシド）中、または水（ダウノルビシンおよびビンクリスチン）中に再懸濁させた。抗ＣＤ９５アゴニスト抗体（クローンＣＨ１１）を、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ  ｂＰｌａｃｉｄ，ＮＹ）より購入した。モノクローナル抗体抗Ｂｃｌ−ｘL（Ｈ５、マウス）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）より、抗体抗ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１（ＮＦ６、マウス）は、Ｐ．Ｈ．Ｋｒａｍｍｅｒ博士（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より供給していただいた。抗体抗β−アクチン（ヤギ）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）より購入した。乳房、前立腺および膀胱からの正常およびがん組織を、ＤＭＥＭ中のコラゲナーゼ（１．８ｍｇ／ｍｌ）Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）、およびヒアルロニダーゼ（２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって３時間消化した。培養１２時間後、正常およびがん細胞を、トリプシン＋ＥＤＴＡで脱離させ、機能およびタンパク質解析のために、サイトカインまたは化学治療剤に曝露した。細胞を、ヒト組換え体サイトカインが存在する場合、またはしない場合で、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ，ＵＫ）を含む標準ＤＭＥＭ中で培養した。
【０１１３】
細胞生存率アッセイ
細胞生存率を、取扱説明書にしたがって、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱueous  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定した。アッセイは、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、不活性塩（ＭＴＳ）の、分光光度計で
測定される、着色ホルマザン産物の還元に基づいている。細胞を、９６−ウェル組織培養プレート中に蒔き、５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて一晩培養した。翌日、ＩＬ−２またはＩＬ−４を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。２日後、細胞を化学治療薬物、または抗−ＣＤ９５で、１０時間処理し、次いで２０μｌのＭＴＳを核ウェルに加えた。３７℃で３時間のＭＴＳ試薬で培養した後、プレートを、マルチラベル  カウンター（Ｖｉｃｔｏｒ  ２、Ｗａｌａｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）上で読み、色素吸収を４９０ｎｍにて測定した。
【０１１４】
免疫染色手順：  免疫組織化的解析を、７μｍ厚のパラフィン包埋切片上で実施した。脱パラフィン化切片を、１０分間、マイクロウェーブオーブン中、０．１Ｍクエン酸緩衝液中で処理した。過剰な血清を除去した後、切片を１時間Ｂｃｌ−ｘL（Ｈ−５、マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１、マウスＩｇＧ２ａ、Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＩＬ−４（Ｂ−Ｓ４マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、ｃＦＬＩＰ（ウサギポリクローナルＩｇＧ、（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、ＩＬ−４Ｒ（Ｃ−２０、ウサギポリクローナルＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、または適切な溶出液として、アイソタイプがマッチした対照に対する特異的抗体に曝露した。ＴＢＳで２回の洗浄した後、切片をビオチン化抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンで処理し、ＴＢＳ中で洗浄し、ストレプトアビジン  ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ  ＬＳＡＢ  ２  Ｋｉｔ）とともに培養した。染色を、着色基質として、３−アミノ−９−エチルカルボゾール（ＡＥＣ）を用いて検出した。細胞および組織切片の対比染色を、水性ヘマトキシリンを用いて実施した。
【０１１５】
ウエスタンブロッティング：  細胞ペレットを、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＭフェニルメチルスルホニル  フルオリド（ＰＭＳＦ）、および各２μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンの存在下で、１％のＮＰ−４０溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％ＮＰ−４０）中にで、氷上３０分間で溶解した。細胞残物を、４℃にて、１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心することによって除去した。溶解濃度は、バイオ−ラドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて決定した。３０μｇの総タンパク質を含む、細胞抽出物の一部を、１０％または１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分解し、ハイボンド−Ｃ  エクストラニトロセルロース膜（アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に写した。フィルターを、室温にて１時間、ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中に溶解した、５％非脂肪−乾燥ミルク中で、室温にて１時間ブロックし、ついで、１次抗体の希釈液（１：２００  抗Ｂｃｌ−ｘL、１：１０  抗ｃ−Ｆｌｉｐ、および１：１００００抗β−アクチン）を含む１％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で、３時間（Ｂｃｌ−ｘLおよびβ−アクチン）、または一晩（ｃＦｌｉｐ）培養した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中で洗浄した後、フィルターを、１：４０００希釈相当ペルオキシダーゼ共役第２抗体（アマシャム）を含むＴＢＳ−Ｔ中に溶解した、５％非脂肪−乾燥ミルク中で、４５分培養した。タンパク質を、増強化学発光蛍光技術（スーパーシグナル  ウエスト  デュラ  エキステンデッド  デュレーション  サストレート（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて視覚化した。
【０１１６】
レトロウイルス粒子の産出と、細胞株の感染
ｃＦｌｉｐおよびＢｃｌ−ｘL  ｃＤＮＡｓを、レポーター遺伝子（２５）として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むＰＩＮＣＯレトロウイルスベクター中にクローン化した。両種性パッケージング細胞株フェニックスに、標準カルシウム−リン酸／クロロキニン
法を用いて、ＰＩＮＣＯ−１／Ｂｃｌ−ｘL、ＰＩＮＣＯ−１／ｃＦｌｉｐプラスミドを、または空ベクターでトランスフェクトした。ウイルス粒子を含む培養上清を４８時間後に回収し、濾過し（０．４５μｍ）、６−ウェルプレート上にプレートした３×１０5細胞に加えた。１回の感染サイクルとして、細胞を１８００ｒｐｍにて４５分間３２℃で遠心し、７５分間インキュベーター内に置いた。
【０１１７】
細胞を、２連続日間、各日に２回の感染サイクルにかけ、ついで、標準培地中においた、ＧＦＰ−陽性細胞を、フローサイトメトリーによって、最後の感染サイクルの２４時間後に解析した（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。
【０１１８】
統計解析
アポトーシス細胞の割合を、ＭＴＳアッセイの値から直接計算した生細胞の割合から導いた。アポトーシスからの保護の割合を、
％保護＝１００％−Ｘ
として決定した。Ｘは式
（Ｃ１−Ｃ２）：１００＝（Ｓ１−Ｓ２）：Ｘ
（式中Ｃ１は、未処理対照細胞の生存率であり、Ｃ２は、アポトーシス刺激で処理した対象細胞の生存率であり、Ｓ１およびＳ２は、サイトカインで前処理した、または抗アポトーシス遺伝子、未処理（Ｓ１）またはアポトーシス刺激で処理された（Ｓ２）で変換した細胞の生存率である）で計算した。
【０１１９】
対応のあるｔ検定を利用して、実験結果の統計的な有意さを解析した。０．０５以下のＰ値を、有意であるとした。データは、平均値±平均の１標準偏差として示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】甲状腺がん細胞における化学治療薬物によって誘導されたアポトーシス死に対する抵抗性。シスプラチン（３００ｎｇ／ｍｌ）、ドキソルビシン（５μＭ）およびタキソール（５μＭ）に６、１２および２４時間曝露した正常な甲状腺、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣから新たに精製した甲状腺細胞中のアポトーシス細胞の割合（データは、４つの独立した実験の平均値±ｓ．ｄ．である）。
【図２】甲状腺がんでの抗アポトーシス分子発現。ＡＥＣ（赤色染色）によって明らかになった、パラフィン包埋正常甲状腺、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣ切片上の、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２の免疫組織化学的解析（ａ、ｂ）。正常、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣから新たに精製した甲状腺溶解物中のＢｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２の免疫ブロット解析（ｂ、ｃ）。Ｂｃｌ−ｘｌおよびＢｃｌ−２遺伝子組換心臓を陽性対照として使用した（＋陽性）。同膜ブロット中で、β−アクチンを検出することによって、対照のローディングを行った（４つの実験の代表的な１つを示す）。
【図３】Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２で変換した甲状腺における化学治療誘導細胞死からの保護。空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２で変換したフローサイトメトリーソート甲状腺細胞の（ａ）Ｂｃｌ−ｘLおよび（ｂ）Ｂｃｌ−２発現の免疫ブロット解析。ローディングコントロールは、β−アクチン染色によって査定した。（ｃ）（ａ）および（ｂ）と同様に変換し、その後化学治療薬物に曝露した正常甲状腺におけるアポトーシスの割合。（ｄ）エチジウム  ブロマイドで染色し、免疫蛍光顕微鏡によって観察したＧＦＰ−陽性細胞。実施した３つの内１つの代表的な実験を示す。
【図４】甲状腺がん細胞のＩＬ４およびＩＬ−１０発現。（ａ）パラフィン包埋正常甲状腺、ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣ切片におけるＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの免疫組織化学的解析（赤色染色）。（ｂ）甲状腺上皮がんの全組織学的変異体からの、精製した甲状腺細胞のＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γに対する免疫染色。（ｃ）新たに精製したがん甲状腺における、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γのウエスタン解析。ｒｈＩＬ−４、ｒｈＩＬ−１０およびｒｈＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／レーン）を、陽性対照として使用した。これらの実験は、それぞれ異なった患者標本からの培養物を用いる、３つの独立する実験からの結果の代表である。
【図５】ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、化学治療が誘導するアポトーシス細胞死から正常甲状腺細胞を救助する。（ａ）対照培地（左パネル）、ｒｈＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはｒｈＩＬ−１０（４０ｎｇ／ｍｌ）で、４８時間前処理し、ついでシスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールでさらに１２時間培養した、精製正常甲状腺細胞の、アポトーシス現象の割合。（ｂ）（ａ）と同様にＩＬ−４またはＩＬ−１０で、またはｒｈＩＦＮ−γ（１０００ＩＵ／ｍｌ）で培養した正常甲状腺の免疫ブロット解析。
【図６ａ】ＩＬ−４およびＩＬ−１０に対する中和抗体は、甲状腺がん細胞を化学治療に対して感作する。培地のみで、または抗−ＩＬ−４と、または抗−ＩＬ−１０と、または抗−ＩＬ−４＋抗−ＩＬ−１０とで培養した生細胞上の生細胞の速度論。４８時間、対照培地、抗−ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）または抗−ＩＬ−１０（１μｇ／ｍｌ）、または抗−ＩＬ−４＋抗−ＩＬ−１０で前処理し、次いでさらに２４時間、化学治療薬物と培養した生精製甲状腺がん細胞の割合（右パネル）。（４つの実験の代表的な１つを示す）
【図６ｂ】ＩＬ−４およびＩＬ−１０に対する中和抗体は、甲状腺がん細胞を化学治療に対して感作する。抗−ＩＬ−４＋抗ＩＬ−１０で４８時間前処理し、次いでシスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールで１２時間および２４時間培養した生ＰＴＣ、ＦＴＣおよびＵＴＣ細胞の割合。
【図７】ＩＬ−４は、ＲＴ１１２膀胱がん細胞を化学治療−および抗ＣＤ９６−誘導アポトーシスから保護する。（Ａ）化学治療薬物で培養している間も維持した増加用量のＩＬ−４（５、１０、２０、５０および１００ｎｇ／ｍｌ）で、２日間前処理し、７μＭエトポシドの５０ｎｇ／ｍｌカンプトテシンへ曝露した、生ＲＴ１１２膀胱がん細胞の割合。２日間、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４での処置で、化学治療誘導アポトーシスから細胞を保護できる。保護効果は、２０ｎｇ／ｍｌ以上の高濃度ＩＬ−４で維持される。細胞生存率は、材料と方法において記述したように、ＭＴＳアッセイを用いて、２４時間後に測定し、細胞死からの保護の割合を、材料と方法において記述したように計算した。示した結果は、４つの独立した実験の、平均値±ｓ．ｄ．である。（Ｂ）続いてＩＬ−４に曝露されたＲＴ１１２膀胱がん細胞は、ＩＬ−４が培養培地に維持されるまで、２日目から４日目までは時間の経過でエトポシド−誘導細胞死から保護される。ＩＬ−４またはＩＬ−２で３日まで前処理した細胞を、２日間、７μＭのエトポシドに曝露し、洗浄し、６日目まで、サイトカインなしの新鮮な培地に入れる、サイトカインを洗浄によって除去した場合、保護の割合が、ダウンモデュレートされる。（Ｃ）ＲＴ１１２におけるＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１発現レベルの免疫ブロット解析。未処理（０）または処置細胞を５、１０、２０、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４に２日間曝露した。２つの実施した実験の１つの代表を示す。（Ｄ）。未処理（０）、または１日目〜３日目にＩＬ−４で処理、洗浄し、３日目〜６日目にＩＬ−４を含まない新鮮培地中に置いた、ＲＴ１１２におけるＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１発現レベルの免疫ブロット解析。（Ｅ）ＩＬ−４は、抗ＣＤ９５−誘導アポトーシスを防止する。２日間、ＩＬ−４またはＩＬ−２で前処理し、実験を通してサイトカインの存在下で維持した生ＲＴ１１２細胞の割合。引き続いて、細胞を標準培地中の３０ｎｇ／ｍｌ  抗−ＣＤ９５アゴニスト抗体とともに培養し、対照細胞（−）は、サイトカイン前処理をせずに、抗−ＣＤ９５で刺激した。結果は、４つの独立した実験の、平均値±ｓ．ｄ．である。＊は、Ｐ＜０．０５ｖｓ対照を示し、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓＩＬ−２、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ対照またはＩＬ−２。
【図８】ＩＬ−４は、化学治療薬物によって誘導されるアポトーシスを防止する。２日間、ＩＬ−４またはＩＬ−２で前処理した、ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞（Ａ）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞（Ｂ）のアポトーシスの割合。ＬＮＣａＰ細胞を、３００ｎｇ／ｍｌ  シスプラチン（左）または１μＭ  ビンクリスチン（右）で処理し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、３００ｎｇ／ｍｌのシスプラチン（左）または５μＭ  ダウノルビシン（右）で処理した。対照細胞（−）を、サイトカイン前処理をせずに、化学治療薬物で刺激した。示した結果は、４つの独立した実験の、平均値±ｓ．ｄ．である。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１ｖｓ対照およびＩＬ−２を示す。
【０１２１】
ＩＬ−４は、がん細胞を、ＣＤ９５−誘導アポトーシスから保護する。ＩＬ−４またはＩＬ−２の存在下、３０ｎｇ／ｍｌの抗−ＣＤ９５アゴニスト抗体で培養したＬＮＣａＰ（Ｃ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｄ）細胞のアポトーシス評価。対照細胞（−）を、サイトカインで前処理せずに抗−ＣＤ９５で刺激した。示した結果は、４つの独立した実験の、平均値±ｓ．ｄ．である。
＊は、Ｐ＜０．０５ｖｓ対照を示し、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓＩＬ−２、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ対照またはＩＬ−２。
【図９】ＩＬ−４は、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１発現レベルをアップレギュレートする。ＬＮＣａＰ（Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｂ）における、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１レベルの免疫ブロット解析。４つの実施した実験の１つの代表を示す。
【０１２２】
ＩＬ−４で処理したＲＴ１１２（Ｃ）、ＬＮＣａＰ（Ｄ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｅ）における、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１発現と、レトロウイルス変換がん細胞でのＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現との比較。データは、ＩＬ−２処理細胞株と比較したＩＬ−４処理腫瘍細胞株（黒棒）と、空ベクター−変換細胞株と比較した遺伝子変換細胞株（白棒）とにおける、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の増加を示している。
【０１２３】
ＧＦＰ発現に対して１００％陽性の細胞集団を、最後の感染サイクルの後、４８時間で解析した。
【図１０】Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現が、腫瘍細胞を、化学治療アポトーシスから保護する。安定に、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１を過剰発現している細胞株を、図１および図２で記述したように化学治療薬物で処理した。ＲＴ１１２細胞を、カンプトテシン（Ａ）またはエトポシド（Ｂ）で処理し、ＬＮＣａＰ細胞は、シスプラチン（Ｃ）またはビンクリスチン（Ｄ）で処理し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、シスプラチン（Ｅ）またはダウノルビシン（Ｆ）で処置する。示した結果は、５つの独立した実験の平均値±ｓ．ｄ．である。
【図１１】Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現は、腫瘍細胞を抗−ＣＤ９５−油道アポトーシスから保護する。安定的にＢｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１を過剰発現しているＲＴ１１２（Ａ）、ＬＮＣａＰ（Ｂ）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｃ）細胞株を、抗−ＣＤ９５アゴニスト抗体で処理した。結果は、５つの独立した実験の平均値±ｓ．ｄ．である。
【図１２】ＡＥＣによって明らかになった（赤色染色）、パラフィン包埋正常および膀胱（Ａ）、前立腺（Ｂ）、および乳（Ｃ）がん切片上の、ＣＤ９５およびＩＬ−４の免疫組織化学的解析。
【図１３Ａ】正常または膀胱、前立腺、および乳がん標本のパラフィン切片における、Ｂｃｌ−ｘL、ｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１またはＩＬ−４Ｒの免疫組織化学的解析（赤色）。初代がん細胞との比較での、レトロウイルス変換がん細胞。
【図１３Ｂ】ＲＴ１１２における、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現、空ベクター（ベクター）、Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１（遺伝子）で変換したがん細胞、および初代がん細胞（がん）の免疫ブロット解析。各細胞株に関して実施した３つのうちの１つの代表実験を示している。
【図１３Ｃ】ＬＮＣａＰにおける、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現、空ベクター（ベクター）、Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１（遺伝子）で変換したがん細胞、および初代がん細胞（がん）の免疫ブロット解析。各細胞株に関して実施した３つのうちの１つの代表実験を示している。
【図１３Ｄ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、Ｂｃｌ−ｘLおよびｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１の外因性発現、空ベクター（ベクター）、Ｂｃｌ−ｘLまたはｃＦｌｉｐ／ＦＬＡＭＥ−１（遺伝子）で変換したがん細胞、および初代がん細胞（がん）の免疫ブロット解析。各細胞株に関して実施した３つのうちの１つの代表実験を示している。
【図１４】（Ａ）未処理（Ｃ）またはＩＬ−２またはＩＬ−４で処理した（Ｂ）主題がん細胞における、Ｂｃｌ−ｘL発現レベルの免疫ブロット解析。未処理およびＩＬ−４前処理細胞で、シスプラチン、ドキソルビシンまたはタキソールに曝露した細胞死の割合。対照細胞は、サイトカインの前処理なしで、化学治療薬物で刺激した。（Ｃ）ＩＬ−４がある状態またはない状態で、６日間前培養した初代がん細胞中のＢｃｌ−ｘLの免疫ブロット解析。（Ｄ）ＩＬ−４で培養し、シスプラチン、ドキソルビシンおよびタキソールに曝露した、初代腫瘍細胞における、アポトーシス細胞死の割合。
【図１】
2006519190.tif 000002
【図６ａ】
2006519190.tif 000003
【図８】
2006519190.tif 000004
【図１０】
2006519190.tif 000005
【図１１】
2006519190.tif 000006
【図２】
2006519190.tif 000007
【図３】
2006519190.tif 000008
【図４】
2006519190.tif 000009
【図５】
2006519190.tif 000010
【図６ｂ】
2006519190.tif 000011
【図７】
2006519190.tif 000012
【図９】
2006519190.tif 000013
【図１２】
2006519190.tif 000014
【図１３Ａ】
2006519190.tif 000015
【図１３Ｂ】
2006519190.tif 000016
【図１３Ｃ】
2006519190.tif 000017
【図１３Ｄ】
2006519190.tif 000018
【図１４】
2006519190.tif 000019
【国際調査報告】
2006519190.tif 000020
2006519190.tif 000021
2006519190.tif 000022
2006519190.tif 000023
2006519190.tif 000024
2006519190.tif 000025
2006519190.tif 000026
2006519190.tif 000027