(57)【要約】ケモカイン関連性またはケモカイン受容体関連性病変を治療または予防するための組成物および方法が提供される。１つの態様では、該病変は癌である。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、特にＴＮ１４００３などのＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストが宿主における腫瘍転移を阻害または減少させることが見いだされた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ４媒介性病変を治療または予防する方法であって、
ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを宿主へ、ＣＸＣＲ４受容体もしくはそのホモログを発現する細胞内でのＣＸＣＲ４シグナル伝達を阻害するために十分な量で投与することを含み、該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストが抗体もしくはそのフラグメントではない、
ＣＸＣＲ４媒介性病変を治療または予防する方法。
【請求項２】
該ＣＸＣＲ４媒介性病変が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該癌が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外腫瘍、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肝臓癌、骨芽細胞腫、神経芽細胞腫、脳腫瘍一般、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫一般、天幕上原始神経外胚葉・松果体腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、ウィルムス腫瘍、急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、毛様細胞性白血病、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＴＮ１４００３もしくはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＴＣ１４０１２、およびＴＥ１４０１１、またはその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体もしくはそのホモログへのリガンド結合を妨害することによってシグナル伝達を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体へ特異的に結合し、それによりＳＤＦ−１α結合を防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌を治療する方法であって、
腫瘍阻害量のＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト、その医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを、そのような治療を必要とする宿主へ投与することを含み、該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストが抗体もしくは抗体フラグメントではない
癌を治療する方法。
【請求項９】
該癌が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外腫瘍、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肝臓癌、骨芽細胞腫、神経芽細胞腫、脳腫瘍一般、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫一般、天幕上原始神経外胚葉・松果体腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、ウィルムス腫瘍、急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、毛様細胞性白血病、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ペプチドアンタゴニストがＴＮ１４００３もしくはその誘導体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該ペプチドアンタゴニストがＴ１４０、Ｔ２２、ＴＣ１４０１２、ＴＥ１４０１１、またはその組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストが腫瘍転移を阻害する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体へ特異的に結合し、それによりＳＤＦ−１α結合を防止する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物における腫瘍転移を防止する方法であって、転移阻害量のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、その医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを投与することを含む方法。
【請求項１５】
該腫瘍が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外腫瘍、ホジキン病、肝臓癌、骨芽細胞腫、神経芽細胞腫、脳腫瘍一般、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫一般、天幕上原始神経外胚葉・松果体腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、ウィルムス腫瘍、急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、食道癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＴＮ１４００３もしくはその誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
該ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＴＣ１４０１２およびＴＥ１４０１１またはその組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
該ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体もしくはそのホモログへのリガンド結合を妨害することによって腫瘍転移を阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
該ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体へ特異的に結合し、それによりＳＤＦ−１α結合を防止する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物における腫瘍転移を予防する方法であって、
転移阻害量のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、その医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを第２治療薬と組み合わせて投与することを含み、該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストが抗体ではない
哺乳動物における腫瘍転移を予防する方法。
【請求項２１】
該腫瘍が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹部神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外腫瘍、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肝臓癌、骨芽細胞腫、神経芽細胞腫、概して脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、概して軟組織肉腫、天幕上原始神経外胚葉・松果体腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、ウィルムス腫瘍、急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、毛様細胞性白血病、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、および小細胞肺癌からなる群から選択される癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該ペプチドアンタゴニストがＴＮ１４００３もしくはその誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該ペプチドアンタゴニストがＴＣ１４０１２およびＴＥ１４０１１またはその組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体もしくはそのホモログへのリガンド結合を妨害することによってシグナル伝達を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体へ特異的に結合し、それによりＳＤＦ−１α結合を防止する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法であって、
（ａ）細胞サンプルを、検出可能な標識を含むＣＸＣＲ４アンタゴニストと接触させることと、
（ｂ）該検出可能な標識を検出することと、
（ｃ）該検出可能な標識の量を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、
を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法。
【請求項２７】
該ＣＸＣＲ４アンタゴニストが抗体もしくは抗体フラグメント以外のペプチドアンタゴニストである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＴＮ１４００３である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストがＴＣ１４０１２およびＴＥ１４０１１からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法であって、
（ａ）細胞サンプルを蛍光標識ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストと接触させることと、
（ｂ）該蛍光標識ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを含む該細胞サンプルを励起量の電磁放射線で照射することと、
（ｃ）該蛍光標識ＣＸＣＲ４の発光を検出することと、
（ｄ）該検出可能な蛍光を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、
を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法。
【請求項３１】
癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法であって、
（ａ）細胞サンプルをビオチン化ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストと接触させることと、
（ｂ）該ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストを含む該細胞サンプルをストレプトアビジン結合検出可能標識と接触させることと、
（ｃ）該検出可能標識を検出することと、
（ｄ）該検出可能標識を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、
を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法。
【請求項３２】
該検出可能標識が蛍光体または放射性同位体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌転移を阻害する方法であって、そのような治療を必要とする宿主へ転移阻害量のＣＸＣＲ４ポリヌクレオチドアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項３４】
該ＣＸＣＲ４ポリヌクレオチドアンタゴニストがＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの領域に対して特異的なｓｉＲＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの第２の領域に対して特異的な第２のｓｉＲＮＡをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする宿主へＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡもしくはそのフラグメントに対して特異的な１種以上のｓｉＲＮＡの治療量を投与することを含む方法。
【請求項３７】
腫瘍または癌細胞転移を阻害するために十分な量でＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡに対して特異的なｓｉＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項３８】
該ｓｉＲＮＡがＵＡＡＡＡＵＣＵＵＣＣＵＧＣＣＣＡＣＣｄＴｄＴ（配列番号１５）を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
該ｓｉＲＮＡがＧＧＡＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＵＧＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号１６）を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含み、各ｓｉＲＮＡがＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの異なる領域を標的とする、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
該少なくとも２つのｓｉＲＮＡがＵＡＡＡＡＵＣＵＵＣＣＵＧＣＣＣＡＣＣｄＴｄＴ（配列番号１５）およびＧＧＡＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＵＧＡＡＡＡｄＴｄＴ（配列番号１６）を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
腫瘍転移を阻害する方法であって、
それを必要とする宿主へ裸のｓｉＲＮＡのプールを投与することを含み、該裸のｓｉＲＮＡのプールがＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの異なる領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含む
腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項４３】
該ｓｉＲＮＡがターゲティング物質に結合している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該ターゲティング物質が葉酸塩もしくはその誘導体を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの領域に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、葉酸塩に結合したｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡが腫瘍転移を阻害するｓｉＲＮＡ。
【請求項４６】
ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡに対して特異的な１つ以上のｓｉＲＮＡ、その医薬上許容される塩もしくはプロドラッグ、および
制御放出または遅延放出のための手段
を含む持続放出性医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に関する相互参照）
本出願は、２００３年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／４５８，２１７号の利益および優先権を主張するものであり、前記特許はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
（連邦政府によって後援された研究または開発に関する陳述）
本明細書に記載した研究の側面は、補助金番号第ＤＥ１３７０１の下に国立口腔・頭蓋顔面研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって部分的に後援された。このため、米国政府は本明細書に開示した主題に一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、一般にケモカイン受容体、詳細にはＣＸＣＲ４受容体、のアンタゴニスト、ならびに例えば癌の治療、予防または診断におけるそれらの使用方法に向けられる。
【背景技術】
【０００４】
米国癌学会によると、２００３年にはおよそ１３０万人の米国人が侵襲癌と診断されると推定されている。米国立癌研究所は、２００３年にはおよそ８９０万人の米国人が癌の病歴を有していたと推定しており、そして２００３年には１日当たりおよそ１，５００例の癌関連死が予測されている。これらの驚くべき数の癌関連死および新規症例のために、新規の医薬品および治療方法が必要とされている。近年の進歩によって癌を引き起こすメカニズムの一部に関する我々の理解は深まってきたが、依然として癌の効果的な治療方法が高度に必要とされている。
【０００５】
癌は致死性疾患である可能性があるが、部分的には、これは癌が生体全体に広がる、または転移することがあるためである。転移は、乳癌の発病およびそれによる死亡において重要な役割を果たしている（Ｆｏｒｄ  Ｋ．ら、「乳癌のスクリーニング、診断、および治療（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、  Ｄｉｓ．  Ｍｏｎ．，  ４５：３３３−４０５，  １９９９）。乳癌は型にはまったパターンで転移し、結果としてリンパ節、肺、肝臓、および骨髄において見いだされる病変を生じる。一般に、癌細胞は分化特性、適正な組織区画化、細胞−細胞付着を消失し、ならびに変化した細胞基質接着、変化した細胞骨格組織化、細胞移動運動、および遠隔部位で生存する能力を獲得する。
【０００６】
乳癌などの侵襲癌に対する治療法には、歴史的には手術、放射線、抗ホルモン療法、および化学療法が含まれる。各療法はある程度の成功率を有するが、患者のおよそ７０％における治癒達成の失敗は、検出されなかった、もしくは検出された転移への治療効果のそもそもの欠如および治療中に獲得された薬物およびホルモン耐性に起因する（Ｂｌａｎｄ  Ｋ．Ｉ．，  Ｃｏｐｅｌａｎｄ  Ｅ．Ｍ．編集：「Ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ、  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＷＥ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  １９９１年、第３９５頁に記載のＦｉｄｌｅｒ  Ｉ．  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｓｏｎ  Ｇ．Ｌ．、「乳癌転移のコンセプトおよび機序（Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）」を参照）。
【０００７】
知られている治療法には、ＣＸＣＲ４によって媒介される疾患を治療するためのナフトエ酸誘導体を含む米国特許第６，６９３，１３４号に記載された治療法が含まれる。
【０００８】
米国特許出願第２００３２２０４８２号は、ＨＩＶ−１ウイルスが共受容体ＣＸＣＲ４と相互作用することを妨害し、それによりその細胞のウイルス感染を防止するｖＭＩＰ−ＩＩのペプチドフラグメントを開示している。
【０００９】
カナダ国特許出願第２２４５２２４号は、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）のＮ−末端９残基に対応し、ＳＤＦ−１活性を有するペプチドを開示している。さらに、この特許出願は、ＳＤＦ−１、１−８、１−９、１−９ダイマーおよび１−１７がＴリンパ球およびＣＥＭ細胞内で細胞内カルシウムおよび化学走性を誘導し、さらにＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）へ結合したと報告している。
【００１０】
カナダ国特許出願第２４０８３１９号は、細胞の増殖、自己再生、増殖または拡大の速度を促進するように、前駆細胞もしくは幹細胞などの造血細胞を処理するために使用されるＣＸＣＲ４アンタゴニストについて開示している。この特許出願は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは造血性幹細胞／前駆細胞の増殖／自己再生を刺激するように治療的に使用できることをさらに開示している。
【００１１】
カナダ国特許出願第２３０５７８７号は、癌などのヒト疾患において造血細胞の増倍、特に前駆細胞もしくは幹細胞の増倍を刺激するために治療的に使用されるＣＸＣＲ４アンタゴニストについて開示している。
【００１２】
ＷＯ第０００９１５２号は、Ｔ細胞によるインターフェロンγを減少させる、自己免疫疾患の治療、多発性硬化症の治療、癌の治療、および血管新生の阻害のための、ＳＤＦ−１に対応する、またはＳＤＦ−１の部分配列を含むＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを開示している。
【００１３】
ＷＯ第９９４７１５８号は、Ｔ細胞によるインターフェロンγを減少させる、自己免疫疾患の治療、多発性硬化症の治療、癌の治療、および血管新生の阻害のための、ＳＤＦ−１の実質的に精製されたペプチドフラグメント、修飾されたフラグメント、アナログまたは医薬上容認される塩を含むペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストを開示している。
【００１４】
ＣＸＣＲ４媒介性病変に対する現行療法が存在するにもかかわらず、癌を含むがそれに限定されないＣＸＣＲ４関連性病変に対する新規の効果的治療方法に対する必要が依然として存在する。
【特許文献１】カナダ国特許出願第２４０８３１９号
【特許文献２】カナダ国特許出願第２３０５７８７号
【特許文献３】ＷＯ第０００９１５２号
【特許文献４】ＷＯ第９９４７１５８号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ケモカイン関連性またはケモカイン受容体関連性病変を治療または予防するための組成物および方法を提供する。１つの態様では、病変は癌である。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、特にＴＮ１４００３、ＴＣ１４０１２、およびＴＥ１４０１１などのＴ１４０の誘導体が宿主における腫瘍転移を阻害または減少させることが見いだされた。
【００１６】
本開示のまた別の態様は、ＣＸＣＲ４ポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。本明細書に開示したＣＸＣＲ４ポリヌクレオチドアンタゴニストには、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれるが、それらに限定されない。該ポリヌクレオチドアンタゴニストは、宿主へ「裸で」投与されてもよく、またバイオアベイラビリティ（生体内利用率）および細胞取り込みを促進するために、パッケージングすることもできる。さらにまた別の実施形態では、該ポリヌクレオチドアンタゴニストは葉酸塩などのターゲティング物質へ結合させられる。
【００１７】
本開示のさらにまた別の態様は、癌細胞および／または癌細胞転移を検出、定量、または同定するための診断用組成物および方法を提供する。これらの診断薬には、標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストが含まれるが、それらに限定されない。
【００１８】
さらにまた別の態様は、治療量のＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを含有する癌治療のための医薬組成物を提供する。１つの態様では、該ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストは抗体もしくは抗体フラグメントではない。
【００１９】
本発明の他の組成物、方法、特徴、および長所は、以下の図面および詳細な説明を精査することにより当業者には明白になるであろう。すべてのそのような追加の組成物、方法、特徴、および長所は本明細書の中に、本開示の範囲内に含まれ、そして添付の特許請求の範囲によって保護されることが企図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本開示は、以下の詳細な説明およびその中に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解することができる。
【００２１】
本発明の化合物、組成物および方法を開示および記載する前に、本開示は特定の医薬担体、または特定の医薬調製物もしくは投与計画は当然ながら変動する可能性があるので、本開示がそれらに限定されないことが理解されるべきである。さらにまた、本明細書で使用する用語は特定実施形態を説明するためのみを目的とし、限定することを企図してはいないことが理解されなければならない。
１．用語の定義
用語「生物」は、少なくとも１つの細胞から構成されるあらゆる生命体を意味する。生きている生物は例えば、単一真核細胞のように単純なものでもあり得、またはヒトを含む哺乳動物のように複雑でもあり得る。
【００２２】
用語「ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」は、リガンドの受容体への結合を含むがそれに限定されないＣＸＣＲ４受容体の生物学的活性を妨害または阻害するポリペプチド、ポリヌクレオチド、阻害性ポリヌクレオチド、もしくはｓｉＲＮＡを含むがそれらに限定されない物質を意味する。代表的ＣＸＣＲ４アンタゴニストにはＴＮ１４００３、ＴＣ１４０１２、およびＴＥ１４０１１、ならびにＣＸＣＲ４受容体に向けられたｓｉＲＮＡが含まれるが、それらに限定されない。
【００２３】
用語「ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト」は、ＣＸＣＲ４へ特異的に結合するポリペプチド、特に抗体ではないポリペプチドを意味する。代表的なＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストには、Ｔ１４０およびＴ１４０の誘導体が含まれる。Ｔ１４０の代表的誘導体には、ＴＮ１４００３、ＴＣ１４０１２、およびＴＥ１４０１１、ならびにＴａｍａｍｕｒａ  Ｈ．ら、「Ｔ１４０誘導体に基づく低い細胞毒性および向上した生体安定性を有する強力なＣＸＣＲ４阻害剤の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ＣＸＣＲ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｌｏｗ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔ１４０  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １：３６５６−３６６２，  ２００３（参照して全体として本明細書に組み込まれる）の中に見いだされる誘導体が含まれるが、それらに限定されない。
【００２４】
本明細書で使用される用語「治療有効量」は、治療される病気の１つ以上の症状をある程度まで緩和するであろう投与される化合物の量を意味する。癌または制御されていない細胞分裂に関連する病変を参照していえば、治療有効量は、（１）腫瘍のサイズを減少させる、（２）異常な細胞分裂、例えば癌細胞分裂を阻害する（すなわち、ある程度まで緩徐化させる、好ましくは停止させる）、（３）癌細胞の転移を防止する、または減少させる、および／または（４）一部には例えば癌を含む制御されていないもしくは異常な細胞分裂または血管新生に関連する、またはそれによって引き起こされる病変と関連する１つ以上の症状をある程度まで緩和する（または、好ましくは除去する）作用を有する量を意味する。
【００２５】
「医薬上許容される塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および特性を維持しており、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸などの無機酸もしくは有機酸との反応によって得られる塩を意味する。
【００２６】
「医薬組成物」は、他の化学的成分（例えば生理学的に許容される担体および賦形剤など）を含む、本明細書に記載した１つ以上の化合物の混合物、またはその医薬上許容される塩を意味する。医薬組成物の１つの目的は、生物への化合物の投与を促進することである。
【００２７】
本明細書で使用する「医薬上許容される担体」は、生物に対する有意な刺激を引き起こさない、そして投与される化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を意味する。
【００２８】
「賦形剤」は、化合物の投与をいっそう促進するために医薬組成物へ添加される不活性物質を意味する。賦形剤の例には、制限なく、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングルコールが含まれる。
【００２９】
疾患を「治療する」または疾患の「治療」にはその疾患に対する素因を有するがまだその疾患の症状を経験または呈示していない動物において疾患が発生するのを予防すること（予防療法）、その疾患を阻害すること（その進行を緩徐化または停止させる）、その疾患の症状または副作用の緩和を提供する（緩和療法を含む）、および疾患を取り除く（疾患の退行を引き起こす）ことが含まれる。癌に関しては、これらの用語は単純に、癌に罹患した個体の余命が増加すること、またはその疾患の症状の１つ以上が減少するであろうことを意味する。
【００３０】
用語「プロドラッグ」は、インビボで生物学的活性形に転換される、核酸およびポリペプチドを含む物質を意味する。プロドラッグは、状況によっては親化合物より容易に投与できることがあるので、有用なことが多い。例えば、プロドラッグは経口投与によって生物学的に利用可能であるが、他方親化合物はそうではないことがありうる。プロドラッグはさらにまた親薬物と比べて医薬組成物中の溶解度を向上しうる。プロドラッグは、酵素プロセスおよび代謝性加水分解を含む様々な機序によって親薬物に転換することができる。Ｊｕｃｋｅｒ編集による「薬物研究における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、４：２２１−２９４の中のＨａｒｐｅｒ  Ｎ．Ｊ．（１９６２）、「薬物潜在化（Ｄｒｕｇ  Ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」；Ｅ．Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ編集による「プロドラッグおよびアナログを通しての生物薬剤学的特性の設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ）」，  ＡＰｈＡ；Ａｃａｄ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．の中のＭｏｒｏｚｏｗｉｃｈら（１９７７）、「プロドラッグデザインへの物理的有機的原理の適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）」；Ｅ．Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ編集（１９７７）、「薬物の設計、理論および適用における薬物中の生体内可逆性担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、  ＡＰｈＡ；Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，  編集（１９８５）、「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｗａｎｇら（１９９９）、「改良されたペプチド薬送達にとってのプロドラッグアプローチ（Ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ）、  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓｉｇｎ．  ５（４）：２６５−２８７；Ｐａｕｌｅｔｔｉら（１９９７）、「ペプチド生体内利用率の改善：ペプチドミメティックおよびプロドラッグ戦略（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ２７：２３５−２５６；Ｍｉｚｅｎら（１９９８）、「β−ラクタム抗体を経口送達するためのプロドラッグとしてのエステルの使用（Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  β−Ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １１：３４５−３６５；Ｇａｉｇｎａｕｌｔら（１９９６）、「プロドラッグおよび生体内前駆物質Ｉ担体プロドラッグを設計する（Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  Ｉ．  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、Ｐｒａｃｔ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ６７１−６９６；Ｇ．Ｌ．  Ａｍｉｄｏｎ，  Ｐ．��．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｅ．Ｍ．  Ｔｏｐｐ編集による「医薬システムにおける輸送プロセス（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒの第１８５−２１８頁の中のＭ．  Ａｓｇｈａｒｎｅｊａｄ（２０００）、「プロドラッグを介しての経口薬輸送の改善（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｖｉａ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」；Ｂａｌａｎｔら（１９９０）、「様々な投与経路を介しての薬物吸収を改善するためのプロドラッグ（Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，  １５（２）：１４３−５３；Ｂａｌｉｍａｎｅ  ａｎｄ  Ｓｉｎｋｏ（１９９９）、「ヌクレオシドアナログの経口吸収における複数のトランスポータの改善（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ３９（１−３）：１８３−２０９；Ｂｒｏｗｎｅ（１９９７）、「フォスフェニトイン（セレビックス）（Ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ（Ｃｅｒｅｂｙｘ））」、Ｃｌｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０（１）：１−１２；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ（１９７９）、「薬物の生体内可逆性誘導体化−薬物の治療作用を改善するための原理および適用（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ）」、Ａｒｃｈ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｃｈｅｍｉ．  ８６（１）：１−３９；Ｈ．  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編集（１９８５）、「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｆｌｅｉｓｈｅｒら（１９９６）、「経口薬送達の改善：プロドラッグすることにより克服された溶解度の限界（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ  １９（２）：１１５−１３０；Ｆｌｅｉｓｈｅｒら（１９８５）、「腸内酵素ターゲティングによる消化管吸収改善のためのプロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １１２：３６０−８１；Ｆａｒｑｕｈａｒ  Ｄら（１９８３）、「生物学的可逆性リン酸塩保護基（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ）」、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ７２（３）：３２４−３２５；Ｈａｎ  Ｈ．Ｋ．ら（２０００）、「薬物送達を最適化するための標的化プロドラッグデザイン（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、ＡＡＰＳ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，  ２（１）：Ｅ６；Ｓａｄｚｕｋａ  Ｙ．（２０００）、「効果的なプロドラッグリポソームおよび活性代謝産物への変換（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）」、Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．，  １（１）：３１−４８；Ｄ．Ｍ．  Ｌａｍｂｅｒｔ（２０００）、「プロドラッグ担体としての脂質の合理性および用途（Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｓ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ）」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  １１  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１５−２７；Ｗａｎｇ  Ｗ．ら（１９９９）、「ペプチド薬送達を改良するためのプロドラッグアプローチ（Ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇｓ）」、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．，  ５（４）：２６５−８７を参照されたい。
【００３１】
本明細書で使用する用語「局所的に活性な物質」は、宿主への適用（接触）部位で薬理学的反応を誘導する本開示の組成物を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「局所的に」は、皮膚の表面ならびに粘膜細胞および組織への本開示の組成物の適用を意味する。
【００３３】
用語「核酸」は、少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組み合わせからなる列を意味する技術用語である。裸のＤＮＡ送達のためには、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドから区別しなければならないために１２０を超えるモノマー単位を含有している。しかし、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡ、ＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡを送達するために、ポリヌクレオチドは２つ以上のモノマー単位を含有している。ヌクレオチドは、核酸ポリマーのモノマー単位である。この用語には、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンス、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの部分またはウイルス由来の遺伝物質の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれる。アンチセンスは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの機能を妨害するポリヌクレオチドである。天然核酸はリン酸塩バックボーンを有しており、人工核酸は他のタイプのバックボーンを含有していることがあるが、同一塩基を含有する。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムの形態であってよい。この用語は、さらにまたＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、およびその他の天然核酸のリン酸塩バックボーンの変異体を含んでいる。
【００３４】
用語「ｓｉＲＮＡ」は低分子阻害性リボ核酸を意味する。ｓｉＲＮＡは、典型的には長さが３０ヌクレオチド未満であり、一本鎖または二本鎖であってよい。リボヌクレオチドは天然または人工であってよく、そして化学修飾されてよい。長鎖ｓｉＲＮＡｓは、酵素的または化学的に開裂して３０ヌクレオチド未満、典型的には２１から２３ヌクレオチドの長さを有するｓｉＲＮＡを生成できる開裂部位を含むことができる。ｓｉＲＮＡは対応する標的ｍＲＮＡと配列相同性を共有する。配列相同性は１００パーセント以下であってよいが、ｓｉＲＮＡと標的化ｍＲＮＡとの間に配列特異的関連があれば結果にとって十分である。
【００３５】
用語「阻害性核酸」は、ｍＲＮＡの翻訳を妨害または中断させるＲＮＡ、ＤＮＡまたはその組み合わせを意味する。阻害性核酸は一本鎖または二本鎖であってよい。該阻害性核酸のヌクレオチドは化学修飾、天然または人工であってよい。
【００３６】
用語「予防有効量」は、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ−１活性の調節などの所望の予防的結果を達成するために必要な用量および期間において有効な量を意味する。予防有効量は、本明細書で有効量について記載したように決定することができる。典型的には、予防用量は被験者において疾患が発生する前または初期段階に使用されるので、予防有効量は治療有効量より少ないであろう。
【００３７】
使用した略語は次のとおりである：ＣＸＣＲ４、ＣＸＣケモカイン受容体４；ＳＤＦ−１、ストローマ由来因子１；ＦＡＣＳ、蛍光活性化セルソーター；ＶＥＧＦ、血管内皮成長因子；ＭＴＴ、メチルチアゾールテトラゾリウム；ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ＭＡｂ、モノクローナル抗体；ＰＥ、Ｒ−フィコエリトリン；ＳＣＩＤ、重症複合免疫不全；ＣＣ50、５０％細胞毒性濃度；ＥＣ50、５０％有効濃度；ＳＩ、選択指数（ＣＣ50／ＥＣ50）；ＤＣＩＳ、非湿潤性乳管癌；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリンおよびエオシン；ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ；ＨＰＲＴ、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ。
２．  代表的な実施形態
一般に、本開示は、治療量、例えばＣＸＣＲ４受容体もしくはそのホモログを発現する細胞内でのＣＸＣＲ４シグナル伝達を阻害するために十分な量で、宿主へＣＸＣＲ４アンタゴニストを投与することでＣＸＣＲ４媒介性病変を治療または予防するための組成物および方法を提供する。また別の実施形態は、癌を含むがそれに限定されないＣＸＣＲ４媒介性病変を治療するための医薬品を製造するためのＣＸＣＲ４アンタゴニストの使用を提供する。さらにまた別の実施形態は哺乳動物における腫瘍転移を防止するための医薬品を製造するためのＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストの使用を提供する。
【００３８】
本明細書に記載したＣＸＣＲ４アンタゴニスト組成物は、癌、特に生物の体内での癌の広がり、を治療または予防するために使用できる。癌は異常な細胞が制御されずに分裂する疾患に対する一般的用語である。癌細胞は隣接する組織を侵害する可能性があり、血流およびリンパ系を通して身体の他の部分へ広がることができる。ＣＸＣＲ４アンタゴニストの宿主、例えば哺乳動物、への投与が腫瘍細胞、特に乳癌および前立腺癌、の転移を阻害または減少させることが見いだされた。
【００３９】
数種の主要なタイプの癌があるが、本明細書に開示した組成物はあらゆるタイプの癌の治療に用いることができる。例えば、癌腫は皮内または内臓を内張りする、もしくは被覆する組織内で始まる癌である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、またはその他の結合組織もしくは支持組織内で始まる癌である。白血病は、骨髄などの造血組織で始まり、大量の異常な血球を産生して血流内へ進入させる癌である。リンパ腫は、免疫系の細胞内で始まる癌である。
【００４０】
正常細胞が規定され、制御され、そして調整された単位として挙動する能力を失うと、腫瘍が形成される。充実性腫瘍は、通常は嚢胞または液状領域を含有していない組織の異常な塊である。単一の腫瘍は、消え失せた様々なプロセスによってその中に様々な細胞集団を有していることさえある。充実性腫瘍は、良性（非癌性）であることも、または悪性（癌性）であることもある。様々なタイプの充実性腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプで名称が付けられている。充実性腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。白血病（血液の癌）は、一般に充実性腫瘍を形成しない。本明細書に記載する組成物は、腫瘍細胞の増殖を減少させる、阻害する、または縮小させ、それによって腫瘍のサイズを減少させるのを助けるために用いることができる。
【００４１】
本明細書に開示した組成物および方法を用いて治療できる代表的な癌には、特に膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外腫瘍、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肝臓癌、骨芽細胞腫、神経芽細胞腫、脳腫瘍一般、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫一般、天幕上原始神経外胚葉・松果体腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、ウィルムス腫瘍、急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、毛様細胞性白血病、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵癌、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、小細胞肺癌が含まれるが、それらに限定されない。
【００４２】
腫瘍は悪性または良性に分類できる。どちらの例においても、細胞の異常な凝集および増殖が生じる。悪性腫瘍の場合は、これらの細胞はより攻撃的に挙動し、上昇した侵襲性の特性を獲得する。最終的には、腫瘍細胞はそれらの元々の微視的環境から関係を絶ち、（本来であればそれらが増殖できない極めて多様な環境を有する）身体の他の領域へ広がり、そしてこの新しい場所での急速な増殖および分裂を継続する能力を獲得さえできる。これは転移と呼ばれている。悪性腫瘍がいったん転移すると、治癒を達成するのはより困難である。ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストは、本明細書では癌細胞の転移を調節することが示されている。
【００４３】
良性腫瘍は侵襲する傾向が少なく、転移する可能性がより小さい。とはいえ、それらは制御されない方法で分裂する。所在場所に依存して、それらは悪性病変とまさに同様に生命を脅かす可能性がある。この例は、頭蓋内で増殖して空間を占拠し、脳への圧力上昇を引き起こすことのある脳内の良性腫瘍であろう。本明細書で提供する組成物は、良性または悪性腫瘍を治療するのに用いることができる。
２．１  ＣＸＣＲ４受容体およびＣＸＣＲ４受容体アンタゴニスト
ＣＸＣＲ４は、最初はＨＩＶが侵入するための主要な共受容体として注目されたＧ結合ヘプタヘリカル受容体である。ＳＤＦ−１によるＣＸＣＲ４の活性化は、ＭＡＰＫ、Ｐ１３Ｋ、およびカルシウム動員を含む多数の下流経路の活性化を生じさせる（Ｂｌｅｕｌ  Ｃ．Ｃ．ら、「リンパ球化学誘引物質であるＳＤＦ−１はＬＥＳＴＲ／フューシンに対するリガンドであり、ＨＩＶ−１侵入を遮断する（Ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ＳＤＦ−１  ｉｓ  ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＬＥＳＴＲ／ｆｕｓｉｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋｓ  ＨＩＶ−１  ｅｎｔｒｙ）」、Ｎａｔｕｒｅ，  ３８２：８２９−８３３，  １９９６；Ｄｅｎｇ  Ｈ．Ｋ．、「サルおよびヒト免疫不全ウイルスによって使用される新規受容体の発現クローニング（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｓｉｍｉａｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ，  ３５５：２９６−３００，  １９９７；Ｖｌａｈａｋｉｓ  Ｓ．Ｒ．ら、「Ｇタンパク質結合ケモカイン受容体は生存およびアポトーシスシグナル経路をどちらも含んでいる（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｂｏｔｈ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ）」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６９：５５４６−５５５４，  ２００２；Ｓｏｔｓｉｏｓ  Ｙ．ら、「ＣＸＣケモカインストローマ細胞由来因子はＴリンパ球中のＧｉ結合ホスホイノシチド−３−キナーゼを活性化する（Ｔｈｅ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａ  Ｇｉ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６３：５９５４−５９６３，  １９９９；Ｋｉｊｏｗｓｋｉ  Ｊ．ら、「ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４軸はＶＥＧＦ発現分泌を刺激してインテグリンを活性化するが、リンパ造血細胞内での増殖および生存には影響を及ぼさない（Ｔｈｅ  ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４  ａｘｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ＶＥＧＦ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  １９：４５３−４６６，  ２００１；Ｒｏｚｍｙｓｌｏｗｉｃｚ  Ｔ．ら、「ヒト免疫不全症ウイルスによる細胞感染性を試験するためのＴリンパ球細胞系（Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，６７：１４２−１５１，  ２００１；Ｍａｊｋａ  Ｍ．、「正常ヒト巨核芽球によるケモカイン受容体発現の生物学的有意性（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ���ｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｓ）」、Ｆｏｌｉａ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．，  ３９：２３５−２４４，  ２００１；Ｍａｊｋａ  Ｍ．ら、「正常ヒト巨核芽球内でのストローマ由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）からＣＸＣケモカイン受容体への結合はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼｐ４２／４４（ＭＡＰＫ）、ＥＬＫ−１転写調節因子およびセリン／トレオニンキナーゼＡＫＴのリン酸化を誘導するが血小板中では誘導しない（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１  ａｌｐｈａ（ＳＤＦ−１  ａｌｐｈａ）  ｔｏ  ＣＸＣＲ４  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐ４２／４４（ＭＡＰＫ），  ＥＬＫ−１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｌｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＡＫＴ）」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，  ６４：１６４−１７２，  ２０００）。造血性幹細胞活性化のために、ＣＸＣＲ４は骨髄への移動を引き起こし（Ｗｒｉｇｈｔ  Ｄ．Ｅ．ら、「造血幹細胞はケモカインに対するそれらの移動反応において比類なく選択的である（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）」、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９５．１１４５−１１５４，  ２００２；Ｖｏｅｒｍａｎｓ  Ｃ．ら、「急性骨髄性白血病患者由来の白血球の移動性挙動（Ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，  １６：６５０−６５７，  ２００２；Ｃａｓｈｍａｎ  Ｊ．ら、「ストローマ由来因子−１は極めて初期のヒト造血細胞のサイクリングをインビトロおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて阻害する（Ｓｔｒｏｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ）」、Ｂｌｏｏｄ，  ９９：７９２−７９９，  ２００２；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ａ．ら、「Ｇ−ＣＳＦ動員正常ドナー由来の骨髄ホーミング造血幹細胞の計数および同種臓器移植後の移植片に及ぼす影響（Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｈｏｍｉｎｇ  ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｇ−ＣＳＦ−ｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｄｏｎｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２８：１０１９−１０２２，  ２００１；Ｖａｉｎｃｈｅｎｋｅｒ  Ｗ．「造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｔｈｅｒａｐｉｅ，  ５６：３７９−３８１，  ２００１；Ｌｉｅｓｖｅｌｄ  Ｊ．Ｌ．ら、「ＣＸＣ、ＣＣ、およびＣＸ３Ｃケモカインに対するヒトＣＤ３４＋細胞の反応：細胞移動および活性化についての意味（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＣＸＣ，  ＣＣ，  ａｎｄ  ＣＸ３Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  １０：６４３−６５５，  ２００１；Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｔ．、「ヒト幹細胞移動ならびにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよびＢ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの再生のメカニズム。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用の役割（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ａｎｄ  Ｂ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，９３８：８３−９５，  ２００１；Ｋｏｌｌｅｔ  Ｏ．Ｔ．ら、「ヒトＣＤ３４（＋）ＣＤ３８（−／低）ＣＸＣＲ４（＋）幹細胞および前駆細胞からＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍ（ｎｕｌｌ）マウスの骨髄および脾臓への迅速かつ効率的なホーミング（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）  ＣＤ３８（−／ｌｏｗ）  ＣＸＣＲ４（＋）  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ  ｏｆ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ａｎｄ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍ（ｎｕｌｌ）  ｍｉｃｅ）」、Ｂｌｏｏｄ，  ９７：３２８３−３２９１，  ２００１）、そして末梢血球をリンパ節および脾臓内へ方向付ける（Ｂｌａｄｅｓ  Ｍ．Ｃ．ら、「ストローマ細胞由来因子−１（ＣＸＣＬ１２）はＳＣＩＤマウスに移植されたヒトリンパ節内へのヒト細胞の移動を誘導する（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＣＸＣＬ１２）  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ）」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６８：４３０８−４３１７，  ２００２）。まとめると、これらの結果はＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４が、様々な標的器官へ細胞を方向付けるための「鍵と鍵穴」の機能を果たす可能性があることを示している。ＣＸＣＲ４はＴ指向性ＨＩＶ感染症にとって重要な共受容体であるので、感染を予防するためにＣＸＣＲ４を標的とする様々な化合物が開発されてきた。
２．１．１  ペプチドアンタゴニスト
様々な実施形態で、本開示に記載された化合物は、ＣＸＣＲ４媒介性病変を治療するための調製物または医薬品において治療的に使用できる化合物の代表である。１つの実施形態は、ケモカイン媒介性病変、またはケモカインの受容体によって媒介される病変を治療を必要とする哺乳動物において、該哺乳動物に有効量のケモカイン受容体ペプチドアンタゴニスト、またはその医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを投与することによって治療する方法を提供する。また別の実施形態では、該ケモカインはＣＸＣＲ４受容体に結合するケモカインである。代表的なケモカイン媒介性病変またはケモカインの受容体によって媒介される病変は、癌を含むがそれに限定されない。好ましい実施形態では、該ケモカイン受容体アンタゴニストは、Ｔ１４０などのＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストまたはＴＮ１４００３などのＴ１４０の誘導体である。Ｔ１４０の配列は、Ｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＤＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｃｉｔ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＯＨ（配列番号１）であり、このときＣｉｔはＬ−シトルリン、ＮａｌはＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、そしてジスルフィド結合は２つのＣｙｓ残基を結合する。ＴＮ１４００３の配列は、Ｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｉｔ−Ｌｙｓ−ＤＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｃｉｔ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ2（配列番号２）であり、このときＣｉｔはＬ−シトルリン、ＮａｌはＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、そしてジスルフィド結合は２つのＣｙｓ残基を結合する。２つ以上のペプチドアンタゴニストを順にまたは組み合わせて用いることができることは理解されるであろう。
【００４４】
代表的なＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストには、ＴＮ１４００３、ＴＣ１４０１２、ＴＥ１４０１１、Ｔ１４０、Ｔ２２、およびその誘導体、医薬上許容される塩またはプロドラッグ、ならびにＴａｍａｍｕｒａ  Ｈ．ら、「Ｔ１４０誘導体に基づく低細胞毒性および向上した生体安定性を有する強力なＣＸＣＲ４阻害剤の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ＣＸＣＲ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｌｏｗ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔ１４０  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １：３６５６−３６６２，  ２００３（全体が参照により本明細書に組み込まれる）の中に見いだされる誘導体が含まれるが、それらに限定されない。ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストは当技術分野において知られている。例えば、Ｔａｍａｍｕｒａら（Ｔａｍａｍｕｒａ  Ｅ．Ｌ．ら、「特異的ＣＸＣＲ４阻害剤であるＴ１４０の薬理作用団の同定は極めて高度の選択性指数を備える効果的抗ＨＩＶ薬の開発をもたらす（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＸＣＲ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｔ１４０，  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘｅｓ）」、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １０：２６３３−２６３７，  ２０００；Ｔａｍａｍｕｒａ  Ｈ．ら、「強力な抗ＨＩＶ活性と関連する内因性薬理作用団の密接な近接性を開示している高度に特異的なＣＸＣＲ４阻害剤であるＴ１４０のコンフォメーショナル試験（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＸＣＲ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｔ１４０，  ｄｉｓｃｌｏｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｏｓｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ，  １１：３５９−３６２，  ２００１）は、ＳＤＦ−１を模倣することによって、ＣＸＣＲ４（Ｔａｍａｍｕｒａ  Ｅ．Ｌ．ら、「特異的ＣＸＣＲ４阻害剤であるＴ１４０の薬理作用団の同定は極めて高度の選択性指数を備える効果的抗ＨＩＶ薬の開発をもたらす」、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １０：２６３３−２６３７，  ２０００；Ｔａｍａｍｕｒａ  Ｈ．ら、「強力な抗ＨＩＶ活性と関連する内因性薬理作用団の密接な近接性を開示している高度に特異的なＣＸＣＲ４阻害剤であるＴ１４０のコンフォメーショナル試験」、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ，  １１：３５９−３６２，  ２００１；Ｔａｍａｍｕｒａ  Ｈ．ら、「ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対する低分子量阻害剤：強力な抗ＨＩＶペプチドであるＴ１４０（Ａ  ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＸＣＲ４：ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔ１４０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５３：８７７−８８２，  １９９８）の全アンタゴニストの中でも高レベルの抗ＨＩＶ活性およびＴ細胞系指向性ＨＩＶ−１侵入の拮抗作用を有した１４−残基ペプチドである特異的ＣＸＣＲ４阻害剤であるＴ１４０の同定について報告している。該化合物におけるいっそうの改良は、Ｔ−１４０のＣ末端をアミド化し、そして塩基性残基を非塩基性極性アミノ酸で置換することによってこの分子の総正電荷を減少させることによって達成された。これはＴ１４０に比較して血清中ではるかに低細胞毒性かつ高安定性である特性を有する化合物（ＴＮ１４００３）の生成を生じさせた（Ｔａｍａｍｕｒａ  Ｈ．「抗ＨＩＶペプチドであるＴ１４０に基づいて高度の選択指数ならびに血清中での完全安定性を有する特異的ＣＸＣＲ４阻害剤の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＸＣＲ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘｅｓ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔ１４０）」、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ，  ｌ１：１８９７−１９０２，  ２００１）。ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ誘導性細胞病原性の５０％の保護（ＥＣ50）のために必要なＴ１４０およびＴＮ１４００３の濃度は、各々３．３ｎＭおよび０．６ｎＭである。ＭＴ−４細胞の生存率の５０％減少（ＣＣ50）を誘導するＴ１４０およびＴＮ１４００３の濃度は、各々５９μＭおよび４１０μＭである。これらの結果は、Ｔ１４０に比して優れたＴＮ１４００３の改良された治療指数を反映している（ＳＩTN14003＝６８０，０００；ＳｉT140＝１７，８７９；ＳＩ＝ＣＣ50／ＥＣ50）。Ｔ２２の配列はＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号３）である。
【００４５】
さらにまた別の実施形態は、治療を必要とする哺乳動物などの宿主へ腫瘍阻害量のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えばペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニスト、その医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを投与することによって癌を治療する方法を提供する。
【００４６】
さらにまた別の実施形態は、転移阻害量のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えばペプチドアンタゴニスト、その医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを投与することによって、哺乳動物における腫瘍細胞転移を防止する方法を提供する。転移を阻害することは、癌の腫瘍起源部位から生物内の第２部位への広がりを防止する、または減少させることを意味する。
【００４７】
さらにまた別の実施形態は、抗転移量のＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えばペプチドアンタゴニスト、を治療を必要とする哺乳動物などの宿主へ投与することによって非造血性癌または腫瘍の転移を治療または予防するための方法を提供する。
【００４８】
１つの実施形態では、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＣＸＣＲ４タンパク質のＳＤＦ−１結合部位へ結合するＴＮ１４００３である。本明細書に提供するように、１０分間にわたりＳＤＦ−１αを用いて前処理した細胞上でビオチン標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストを用いてＣＸＣＲ４を蛍光染色し、その後に低温アセトン固定を行うと、ＴＮ１４００３がＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１結合部位に結合することが示される。ＳＤＦ−１αを用いた細胞の前処理は、ＣＸＣＲ４受容体のエンドサイトーシスを誘導するであろう。細胞は短時間にわたりＳＤＦ−１αを用いて処理されただけなので、一部のＣＸＣＲ４タンパク質はエンドサイトーシスのプロセス中にあるが、他のタンパク質は細胞表面上にまだとどまっているはずである。ビオチン標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストの免疫蛍光は１０分間にわたりＳＤＦ−１αを用いて前処理された細胞では膜および細胞質のどちらにおいても陰性であった（図１Ａの右）。このため、本明細書に提供したデータは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＣＸＣＲ４タンパク質のＳＤＦ−１結合部位へ結合することを示している。
【００４９】
インビトロ侵襲アッセイは、ＣＸＣＲ４陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞はマトリゲルを通して侵襲できないが、ＣＸＣＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＳＤＦ−ｌαの存在下でボトムチャンバで侵襲することを示した（図２）。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞はボトムチャンバで１％  ＦＢＳの存在下でさえマトリゲルを通して侵襲できなかったが、他方ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は侵襲した（データは示していない）。これらの結果は、インビトロマトリゲル侵襲のためにＣＸＣＲ４発現が必要であることを示している。動物モデルにおいて転移を形成する確率を増加させるために、１７β−エストラジオール（６０日間放出性ピル）が与えられた雌性ＳＣＩＤマウスへ２×１０6ｃｅｌｌｓの腫瘍細胞を２回（第０日および第６日）静脈内投与した。５５日間にわたって週２回、コントロールペプチドを用いて処理された全動物は肺転移を発生した。他方、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理動物は目に見える肺転移を形成しなかった。半定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理群の７匹中４匹が微小肺転移を含有していることが明らかになった（図３）。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理動物における肺転移の減少は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストが１０ｎＭの濃度でさえ細胞増殖に影響を及ぼさなかったことからして、アンタゴニストの細胞毒性が原因ではなかった（図４）。さらに、ＣＸＣＲ４アンタゴニストで処理されたマウスからの肝臓および腎臓組織のＨ＆Ｅ染色は肝臓における中心ネクローシスまたは腎臓における尿細管ネクローシスを示さなかった。ＣＸＣＲ４アンタゴニストが造血性前駆細胞コロニー形成に及ぼす毒性について評価したが、試験した最高濃度の１０ｎＭにおいて、造血性前駆細胞コロニー形成への認識できる作用は認められなかった。このため、本明細書に記載したＣＸＣＲ４アンタゴニストは乳癌転移を阻害するための優れた治療薬として使用できる。
【００５０】
本明細書に提供したデータは、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用が乳癌転移にとって主要な要件の１つであることを示している。原発性腫瘍において上昇したＣＸＣＲ４のレベルは腫瘍の転移能力と相関している。ＣＸＣＲ４の過剰発現は、脳腫瘍（Ｒｅｍｐｅｌ  Ｓ．Ａ．ら、「サイトカインＳＤＦ１およびその受容体、ＣＸＣケモカイン受容体４の同定およびヒト神経膠芽細胞腫におけるネクローシスおよび血管新生の領域への局在化（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＳＤＦ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４，  ｔｏ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）」、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６：１０２−１１１，  ２０００；Ｓｅｈｇａｌ  Ａ．ら、「ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ４は神経膠芽細胞腫腫瘍細胞の増殖において必要とされ、過剰発現する（ＣＸＣＲ−４，  ａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ．  Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，  ６９：９９−１０４，  １９９８；Ｓｅｈｇａｌ  Ａ．ら、「ＣＸＣＲ−４の分子的特性解析：潜在的脳腫瘍関連遺伝子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ−４：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）」、Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ６９：２３９−２４８，  １９９８）、膵癌（Ｋｏｓｈｉｂａ  Ｔ．ら、「膵臓癌におけるストローマ細胞由来因子１およびＣＸＣＲ４リガンド受容体系の発現：腫瘍進行にとって考えられる役割（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｎｄ  ＣＸＣＲ４  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６：３５３０−３５３５，  ２０００）、卵巣上皮腫瘍（Ｓｃｏｔｔｏｎ  Ｃ．Ｊ．ら、「上皮癌細胞の移動：ケモカイン受容体にとっての役割であるか？（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ：ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ？）、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１：４９６１−４９６５，  ２００１）、前立腺癌（Ｔａｉｃｈｍａｎ  Ｒ．Ｓ．、「前立腺癌の骨転移におけるストローマ細胞由来因子１／ＣＸＣＲ４経路の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１／ＣＸＣＲ４  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：１８３２−１８３７，  ２００２）、腎臓癌（Ｓｃｈｒａｄｅｒ  Ａ．Ｊ．ら、「腎臓癌におけるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２の発現およびシグナリング（ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１  ２  ｅｘｐｒ���ｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）」、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ８６：１２５０−１２５６，  ２００２）、および非小細胞肺癌（Ｔａｋａｎａｍｉ  Ｉ．、「非小細胞肺癌におけるＣＣＲ７  ｍＲＮＡの過剰発現。リンパ節転移との相関（Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＣＲ７  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｎｏｎｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １０５：１８６−１８９，  ２００３）などの乳癌以外の腫瘍において見いだされている。
【００５１】
したがって、本開示の実施形態には、乳癌、脳腫瘍、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、および非小細胞肺癌を治療する方法が含まれる。詳細には、乳癌、脳腫瘍、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、および非小細胞肺癌の転移は、そのような治療を必要とする宿主へＴＮ１４００３などのＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを抗転移有効量で投与することによって減少または阻害することができる。
【００５２】
ＣＸＣＲ４抗体を用いてＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１活性化を無力化すると乳癌転移の動物モデルにおいてリンパ節および肺への乳癌転移を損傷させ（Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ．、「乳癌転移におけるケモカイン受容体の関与（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ，  ４１０：５０−５６，  ２００１）、そして同様の結果は前立腺癌骨転移において観察されている。本明細書で示したように、合成１４−ｍｅｒペプチドはＣＸＣＲ４受容体がそのリガンドＳＤＦ−１へ結合するのを遮断し、抗ＣＸＣＲ４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）より高い特異性でインビトロでのＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１媒介性侵襲およびインビボでの転移を阻害した。このペプチドの抗侵襲および抗転移活性は、ＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１α結合に及ぼすそれらの阻害活性と極めて明確に相関していた。このアンタゴニストは、増殖アッセイ、動物組織学検査、および造血性前駆細胞コロニー形成によって安全であることが証明されている。そこで、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＴＮ１４００３は、有効な乳癌転移の治療薬ならびにＴ指向性ＨＩＶ感染症の阻害剤である。
【００５３】
抗ＣＸＣＲ４抗体は高濃度（５０ｍｇ／ｋｇ）でインビボ乳癌転移を減少させることができる（Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ．、「乳癌転移におけるケモカイン受容体の関与」、Ｎａｔｕｒｅ，  ４１０：５０−５６，  ２００１）。しかし、抗体療法は：（ｉ）商業規模での生産の困難さまたは費用；（ｉｉ）大きな質量を原因とする送達の問題および緩徐な拡散；および（ｉｉ）血液／脳関門のような区画からのモノクローナル抗体の除外によって制限される（Ｃｈｏ  Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎ  Ｒ．、「高分子治療薬対低分子治療薬：新薬の発見、開発および臨床的考察（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １４：１５３−１５８，  １９９６）。例えば、緻密な腫瘍塊では、１５０ｋＤａの分子量を備える抗体などの大きな分子は充実性腫瘍の内側の細胞間では容易に拡散できないことが理論付けられている。このため、抗体は腫瘍塊内の深部にある細胞を標的とするためには非効率な分子である可能性がある。特に、ＣＸＣＲ４陽性腫瘍を検出するポジトロンエミッション断層撮影法（ＰＥＴ）またはシングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のためのイメージングプローブとしての抗体（１５０ｋＤａ）または抗体フラグメント（Ｆ（ａｂ’）2、３０ｋＤａ）の使用は実際的ではない。これは、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ核種の寿命は短いが（２０〜１０９分間）、抗体もしくは抗体フラグメントが標的部位（腫瘍）に到達して血液および組織から排出されるには長い時間（少なくとも２４時間）を要するためである。
２．１．２  小分子アンタゴニスト
他の実施形態では、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは非ペプチド化合物である。代表的低分子アンタゴニストにはＫＲＨ−１６３６、Ｎ−｛（Ｓ）−４−グアニジノ−１−［（Ｓ）−１−ナフタレン−１−イル−エチルカルバモイル］ブチル｝−４−｛［（ピリジン−２−イル−メチル）アミノ］メチル｝ベンズアミドが含まれるが、それには限定されない。（Ｉｃｈｉｙａｍａ  Ｋ．ら、「十二指腸で吸収可能なＣＸＣケモカイン受容体４アンタゴニストであるＫＲＨ−１６３６は強力かつ選択的な抗ＨＩＶ−１活性を示す（Ａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｌｙ  ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，  ＫＲＨ−１６３６，  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、２００３，  ＰＮＡＳ  １００（７）：４１８５−４１９０）
１，１’−［１，４−フェニレンビス（メチレン）］−ビス−１，４，８，１１−テトラアザシドテトラデカンオクタヒドロクロリド二水和物としても知られるＡＭＤ３１００は非ペプチドＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストであり、そしてヒト免疫不全ウイルス細胞侵入の強力な遮断薬である。ＡＭＤ３１００は比較的剛性のフェニレンビスメチレンリンカーによって接続された２つの同一の１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）成分からなる対称性バイサイクラムである（Ｇｅｒｌａｃｈ  Ｌ．Ｏ．ら、「サイクラムおよびバイサイクラムの非ペプチドアンタゴニストとＣＸＣＲ４ケモカイン受容体との分子的相互作用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌａｍ  ａｎｄ  ｂｉｃｙｃｌａｍ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＣＸＣＲ４  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１  Ａｐｒ  ２７；２７６（１７）：１４１５３−６０）。また別のＣＸＣＲ４アンタゴニストにはＴ１３４が含まれる（Ａｒａｋａｋｉ  Ｒ．、「小分子ＣＸＣＲ４阻害剤であるＴ１３４は、相違する構造を備えるＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００との薬物交差耐性を有していない（Ｔ１３４，  ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＣＸＣＲ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｈａｓ  ｎｏ  ｃｒｏｓｓ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＡＭＤ３１００，  ａ  ＣＸＣＲ４  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９９，  ｐ．１７１９−１７２３，  Ｖｏｌ．７３，  Ｎｏ．２）。
２．２  ポリヌクレオチドアンタゴニスト
また別の実施形態は、細胞内でのＣＸＣＲ４ポリペプチドの発現を阻害する、減少させる、または防止するポリヌクレオチドＣＸＣＲ４アンタゴニストを提供する。特に、ＣＸＣＲ４に向けられたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主生物、例えば哺乳動物における癌の転移を防止することが見いだされている。
【００５４】
また別の実施形態は、癌などのケモカイン関連性またはケモカイン受容体関連性病変を治療するための、そのような治療を必要とする宿主へ治療量の（ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡもしくはそのフラグメントなどの）ＣＸＣＲ４ポリヌクレオチドに対して特異的な１つ以上のｓｉＲＮＡを投与することによる方法を提供する。
【００５５】
本開示のある実施形態の阻害性核酸は、ＣＲＣＸ４シグナル伝達経路に関係するタンパク質の発現を阻害または妨害することに向けられる。本明細書に開示した阻害性核酸には、典型的には長さが３０ヌクレオチド未満、より典型的には長さが１９〜２１または１９〜２３ヌクレオチドであり、一本鎖または二本鎖であってよい低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。二本鎖ｓｉＲＮＡのうちの１本の鎖は少なくとも、例えばＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡなどの標的ｍＲＮＡに対して相補的な部分配列を含んでいる。ｓｉＲＮＡのリボヌクレオチドは天然または人工であってよく、例えば酵素による変性に抵抗するため、または溶解性もしくは生体内利用率を調節するために化学修飾することができる。より長いｓｉＲＮＡｓは、３０ヌクレオチド未満の長さを有するｓｉＲＮＡを生成する酵素的または化学的に開裂できる開裂部位を含むことができる。ｓｉＲＮＡのリン酸塩バックボーンは、酵素的変性に抵抗するように化学修飾することができる。配列相同性は１００パーセント以下、典型的には約１００〜９０パーセントであってよいが、ｓｉＲＮＡと標的化ｍＲＮＡとの間に配列特異的関連があれば結果にとって十分である。
【００５６】
癌細胞は、それらが原発性部位を離れて高ＳＤＦ−１レベルを有する器官に向けて移動する前にＣＸＣＲ４過剰発現を獲得する。（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてｍＲＮＡレベルで）ＣＸＣＲ４発現を遮断するとマトリゲル侵襲アッセイにおいて乳癌細胞の侵襲を阻害し、動物モデルにおいて乳癌転移を阻害することが見いだされている。さらに、裸のｓｉＲＮＡ二本鎖のプールを直接注射するとインビボ腫瘍形成を防止できることが見いだされている。
【００５７】
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡが対応する細胞遺伝子のサイレンシングを誘発する細胞メカニズムである（Ｆｉｒｅ  Ａ．ら、「Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおける二本鎖ＲＮＡによる強力かつ特異的な遺伝的干渉（Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ８０６−１１，  １９９８；Ｓｈａｒｐ  Ｐ．Ａ．、「ＲＮＡ干渉−２００１（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−２００１）」、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，  ４８５−９０，  ２００１；Ｐｌａｓｔｅｒ  Ｒ．Ｈ．、「ＲＮＡサイレンシング：ゲノムの免疫系（ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ’ｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，  １２６３−５，  ２００２）。細胞内の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる低分子のおよそ２１−２２ヌクレオチドｄｓＲＮＡｓへ処理される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．ら、「キイロショウジョウバエ胚溶解液中での効率的ＲＮＡｉを媒介するためのｓｉＲＮＡの機能解剖学（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｅｍｂｒｙｏｌｙｓａｔｅ）」、Ｅｍｂｏ  Ｊ２０，  ６８７７−８８，  ２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ａ．Ｊ．  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  Ｂ．Ｃ．、「植物における転写後遺伝子サイレンシングにおける１つの低分子アンチセンスＲＮＡの種（Ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，  ９５０−２，  １９９９）。哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉テクノロジーの用途における主要な発展は哺乳動物細胞における標的遺伝子をサイレンシングさせるための２１〜２２ヌクレオチド合成ｓｉＲＮＡの開発から発生した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ．，  Ｗｅｂｅｒ  Ｋ．  ＆  Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．、「低分子干渉ＲＮＡを用いた哺乳動物体細胞内の遺伝子機能の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６，  １９９−２１３，  ２００２；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．ら、「２１−ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖は培養哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する（Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，  ４９４−８，  ２００１）。近年、二本鎖ｓｉＲＮＡは尾静脈注射によっていずれの種類の担体も使用せずに標的細胞内へ効果的に送達できることが証明されている（Ｌｅｗｉｓ  Ｄ．Ｌ．ら、「出生後マウスにおける遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの効率的送達（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ）」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２，  １０７−８，  ２００２；Ｓｏｎｇ  Ｅ．ら、「Ｆａｓを標的とするＲＮＡ干渉はマウスを劇症性肝炎から保護する（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｆａｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，  ３４７−５１，  ２００３）。Ｓｏｒｅｎｓｅｎらはさらにまた、その同起源ｓｉＲＮＡとともに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドのカチオン性リポソームを基剤とする静脈内注射が様々な器官においてＧＦＰ遺伝子発現を阻害することを示した（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｄ．Ｒ．ら、「成体マウスにおける合成ｓｉＲＮＡの全身性送達による遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ）」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２７，  ７６１−６，  ２００３）。
【００５８】
ＲＮＡ干渉の現行モデルは、阻害のプロセスを広く「開始」および「エフェクター」段階に分けている。開始ステップでは、導入されたｄｓＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」とも呼ばれている２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化される。証拠は、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲｎａｓｅ  ＩＩＩファミリーのメンバーである酵素ＤｉｃｅｒがＡＴＰ依存性の進行的方法でｄｓＲＮＡを進行的に開裂するとｓｉＲＮＡが産生することを指示している。それに続く開裂事象は、ＲＮＡを各々２−ヌクレオチド３’が突出している１９〜２１ｂｐ（塩基対）の二本鎖（ｓｉＲＮＡ）へ変性させる。本開示の阻害性核酸は、例えばインビボで酵素的に開裂させて、１０から約３０ヌクレオチド、典型的には約１９から約２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを生成することができる。
【００５９】
エフェクターステップでは、ｓｉＲＮＡ二本鎖はヌクレアーゼ複合体へ結合してＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体、もしくはＲＩＳＣとして知られる複合体を形成する。ＲＩＳＣの活性化のためにはｓｉＲＮＡ二本鎖のＡＴＰ依存性巻き戻しが必要とされる。活性ＲＩＳＣは次に塩基対合相互作用によって相同転写産物を標的とし、ｓｉＲＮＡの３’末端からｍＲＮＡの〜１２ヌクレオチドを開裂する。開裂のメカニズムは現時点では不明であるが、研究は各ＲＩＳＣが一本鎖ｓｉＲＮＡおよびＤｉｃｅｒとは別個であると思われるＲｎａｓｅを含有することを示している。一部の生物におけるＲＮＡｉの顕著な効力のために、ＲＮＡｉ経路内での増幅ステップもまた提案されてきた。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを生成するであろう導入されたｄｓＲＮＡのコピーによって、またはｓｉＲＮＡ自体の複製によって発生させることができるであろう。あるいは、または追加して、増幅はＲＩＳＣの複数のターンオーバー事象によって実行できよう。１つの実施形態は、本明細書に開示したｓｉＲＮＡのインビボ増幅を含んでいる。さらに、本明細書に記載したｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを酵素的に開裂するために追加のタンパク質および／またはコファクターを用いて複合体を形成することができる。
【００６０】
また別の実施形態は、転移阻害量の、１つ以上、典型的には少なくとも２つのＣＸＣＲ４に特異的なｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を、それを必要とする宿主へ投与することによって癌を治療する方法を提供する。ＣＸＣＲ４に対して特異的なｓｉＲＮＡの１つもしくは組み合わせを使用するとＣＸＣＲ４発現を効果的に抑制し腫瘍形成を予防することが見いだされている。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡはＣＸＣＲ４の以下のｃＤＮＡ配列セグメント：197ＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣ217（配列番号４）および／または529ＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡ549（配列番号５）またはその相補的もしくはアンチセンス配列に対して特異的である、および／またはそのような配列を含んでいる。ＲＮＡ配列ではＵにＴを置き換えられることは理解されるであろう。一部の実施形態では、本明細書に開示したｓｉＲＮＡ二本鎖は３’突出ヌクレオチド、例えばウリジンダイマーを含んでいる。
【００６１】
ｓｉＲＮＡ二本鎖生成のための他のＣＸＣＲ４  ｃＤＮＡ標的配列には：ＴＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧ（配列番号６）；ＴＣＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴ（配列番号７）；ＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＴＧＡ（配列番号８）；ＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴ（配列番号９）；ＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＣ（配列番号１０）；ＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴ（配列番号１１）；ＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴ（配列番号１２）；ＧＣＡＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴ（配列番号１３）；ＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＴ（配列番号１４）またはその相補的もしくはアンチセンス配列が含まれるがそれらに限定されない。
【００６２】
また別の実施形態は、以下の配列197ＵＡＡＡＵＣＵＵＣＣＵＧＣＣＣＡＣＣｄＴｄＴ217（配列番号１５）または529ＧＧＡＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＵＧＡＡＡＡｄＴｄＴ549（配列番号１６）を含有するｓｉＲＮＡを含む医薬組成物、その組み合わせ、医薬上許容される塩もしくはプロドラッグを、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために十分な量でそのような治療を必要とする宿主へ投与することによって、ケモカイン関連性もしくはケモカイン受容体関連性病変、例えば癌を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ組成物は「裸」で、すなわちタンパク質、脂質、発現ベクターもしくはリポソームなどのベクターまたはパッケージングビヒクルを使用せずに送達される。
【００６３】
さらにまた別の実施形態は、標的成分に結合したｓｉＲＮＡ組成物を提供する。標的成分には、特異的標的へのｓｉＲＮＡの送達を促進する物質が含まれるが、それらには限定されない。代表的標的成分には、葉酸塩、葉酸塩の誘導体もしくは葉酸塩受容体、プルランなどの多糖類、ガラクトースなどの糖類、表面タンパク質もしくはポリペプチドに対して特異的な抗体、または細胞表面受容体の小分子リガンドが含まれるが、それらに限定されない。
２．３  併用療法
本明細書に開示した組成物は、病変（例えば癌もしくはその他のケモカイン関連性病変などの増殖性病変）を治療するために、独立して、または相互に組み合わせで、もしくは１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて使用できる。代表的治療薬には、抗生物質、抗炎症薬、抗酸化物質、鎮痛薬、放射性同位体、ナスコピン（ｎａｓｃｏｐｉｎｅ）、パクリタキセル、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄ）、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア（ｈｙｄｒｅａ）、イダルビシン、イフォスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、ベルバン（ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ジェムザール（ｇｅｍｚａｒ））、ハーセプチン、イリノテカン、（ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン（ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、リツキサン、ＳＴＩ−５７１、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、トポテカン（ハイカムチン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ（ｈｙｃａｍｔｉｎ））、ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）（カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ））、ゼベリン（ｚｅｖｅｌｉｎ）などの化学療法薬、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【００６４】
本開示の化合物は、例えば癌などの病変を治療するために、放射線療法または外科的手技と組み合わせて使用できることは理解されるであろう。
２．４  診断薬
また別の実施形態は、癌および癌転移を含むがそれらに限定されないケモカインもしくはケモカイン受容体媒介性病変を検出および診断するための組成物および方法を提供する。例えば、ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト（例えばＴＮ１４００３）は、検出可能な標識で標識できる。検出可能な標識は、放射性同位体、酵素を産生する基質もしくは酵素のための基質、金属、ビーズ、金属粒子、蛍光体、リン、ビオチン、色素、または検出可能なシグナルを生成できる、もしくは既知の技術を用いて検出できる他の成分であってよい。代表的な標識はフッ素１８である。１つ以上の検出可能な標識を使用して、例えば蛍光共鳴エネルギー移動系（ＦＲＥＴ）を生成してもよい。ペプチドの化学修飾は当技術分野において知られている（例えば、ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍを参照されたい）。使用できる代表的蛍光体はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）の中に見いだされる。
【００６５】
また別の実施形態は、細胞サンプルを、検出可能な標識を含むＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばＴＮ１４００３を含むがそれに限定されないＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト）と接触させることと、検出可能な標識を検出することと、検出可能な標識の量を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法を提供する。
【００６６】
また別の実施形態は、細胞サンプルを蛍光標識されたＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト（例えばＴＮ１４００３）と接触させることと、該蛍光標識ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを含む該細胞サンプルを励起量の電磁放射線で照射することと、該蛍光標識ＣＸＣＲ４の放射を検出することと、および該検出可能な蛍光を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法を提供する。
【００６７】
さらにまた別の実施形態は、細胞サンプルを蛍光標識されたＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト（例えばＴＮ１４００３）と接触させることと、該蛍光標識ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを含む該細胞サンプルを励起量の電磁放射線で照射することと、該蛍光標識ＣＸＣＲ４の放射を検出することと、および該検出可能な蛍光を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法を提供する。
【００６８】
様々な実施形態における細胞サンプルは、癌または転移を示す第２決定因子を検出するための試薬と接触させることもできることは理解されるであろう。転移を示す代表的な第２決定因子には、Ｈｅｒ−２タンパク質もしくはそのフラグメントが含まれるが、それに限定されない。したがって、Ｈｅｒ−２に対して特異的である抗体は癌または癌細胞転移を検出するための本明細書に開示した方法においても使用できる。癌または転移を示す他のマーカーにはＢＣＲ−ａｂｌ、ＡＬＬ１、ＡＭＬ１、ＣＢＦ−β遺伝子、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ｐ５３、ＣＤ２０、ＩＬ−２受容体α、チミジル酸シンターゼ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ｒａｓ、ＰＧＹ１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、血小板由来成長因子受容体、ＪＡＫキナーゼ、線維芽細胞成長因子受容体、およびホスファチジルイノシトール−３’キナーゼが含まれるが、それらに限定されない。
【００６９】
さらにまた別の実施形態は、細胞サンプルを、第１標識を含むＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばＴＮ１４００３などのペプチドアンタゴニスト）と接触させることと、第１標識を有するＣＸＣＲ４アンタゴニストを第２標識と接触させることと、第２標識を検出することと、および第２標識の量を癌細胞または癌細胞転移の存在と関連付けることと、を含む癌細胞または癌細胞転移を検出するための方法を提供する。第１標識はビオチンであってよく、そして第２標識は蛍光体などの検出可能な標識と連結したストレプトアビジンであってよい。ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストが培養および臨床サンプル中でＣＸＣＲ４受容体陽性腫瘍を同定するための定量的診断ツールとして有用な可能性があることが見いだされている（図１）。
【００７０】
ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストが免疫蛍光法およびフローサイトメトリーの使用を通して乳癌患者の培養癌細胞およびパラフィン処理組織からＣＸＣＲ４受容体を検出するための強力な試薬であることは見いだされている。ＣＸＣＲ４アンタゴニストと他の知られている転移マーカー（例、Ｈｅｒ−２）の抗体との併用は、癌および乳癌転移を含むがそれに限定されない癌転移を検出するために使用できる。
２．５  医薬組成物
本開示の医薬組成物および剤形は、ＣＸＣＲ４のアンタゴニストの化合物の医薬上許容される塩またはその医薬上許容される多形体、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水形、もしくは非晶質形を含んでいる。ＣＸＣＲ４のアンタゴニストの具体的な塩類には、そのナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、および水和物が含まれるが、それらに限定されない。
【００７１】
本開示の医薬組成物および単位投薬形態は、典型的にはさらに１つ以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤を含んでいる。上昇した溶解性および／または増強した流動性、純度、または安定性（例、吸湿性）の特徴などを含むがそれらに限定されない本開示の特定化合物によって提供される長所は、先行技術に比較してそれらを医薬調製物および／または患者への投与のためにより適したものにすることができる。
【００７２】
本開示の化合物の薬学的単位剤形は、患者への経口、経粘膜（例、経鼻、舌下、経膣、経口腔、もしくは経直腸）、非経口（例、筋肉内、経皮、静脈内、動脈内、もしくはボーラス注射）、局所的、または経皮的投与のために適している。剤形の例には、錠剤；カプレット剤；硬質ゼラチンカプセルおよび軟質弾性ゼラチンカプセルなどのカプセル；カシェ；トローチ；ロゼンジ；分散体；坐薬；軟膏；パップ剤（湿布剤）；ペースト；粉末；ドレッシング類；クリーム；膏薬；溶液；パッチ；エーロゾル（例、鼻腔スプレーもしくは吸入剤）；ジェル；懸濁液（例、水性もしくは非水性液状懸濁剤、水中油型エマルジョン、もしくは油中水型液状エマルジョン）、溶液、およびエリキシルなどの患者への経口もしくは粘膜投与に適する液状剤形；患者へ非経口投与するために適合する液状剤形；および患者への非経口投与のために適した液状剤形を提供するために再構成できる無菌固体（例、結晶質もしくは非晶質固体）が含まれるが、それらに限定されない。
【００７３】
本開示の組成物の剤形の組成、形状、およびタイプは、典型的にはそれらの使用に依存して変動するであろう。例えば、疾患もしくは障害の急性期治療に使用される剤形は、同一の疾患もしくは障害の長期的治療に使用される剤形より大量の有効成分（例えばＣＸＣＲ４アンタゴニストもしくはその組み合わせ）を含有しうる。同様に、非経口剤形は同一の疾患もしくは障害を治療するために使用される経口剤形より少量の有効成分を含有していてよい。本開示によって含まれる具体的剤形が相互に相違するであろうこれらおよびその他の方法は当業者には容易に明白になるであろう。例えば、レミントンの製薬科学第１８版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ペンシルベニア州イーストン（１９９０）を参照されたい。
【００７４】
典型的な医薬組成物および剤形は１つ以上の賦形剤を含んでいる。適切な賦形剤は調剤学または製薬学の当業者にはよく知られており、適切な賦形剤の非限定的例は本明細書において与えられている。特定の賦形剤が医薬組成物または剤形に組み込むために適しているかどうかは、その剤形が患者に投与される方法を含むがそれらに限定されない当技術分野においてよく知られている様々な因子に左右される。例えば、錠剤またはカプセル剤などの経口剤形は非経口剤形における使用に適さない賦形剤を含有していてよい。特定の賦形剤の適合性は、さらにまたその剤形内の特異的有効成分にも左右される可能性がある。例えば、一部の有効成分の分解は、乳糖などの一部の賦形剤によって、または水への曝露によって促進されうる。第１級もしくは第２級アミンを含む有効成分は、そのような促進された分解に対して特に感受性である。
【００７５】
本開示はさらにまた、有効成分の分解速度を低下させる１つ以上の化合物を含む医薬組成物および剤形を含んでいる。本明細書では「安定剤」と呼ぶそのような化合物には、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨバッファー、または塩バッファーが含まれるが、それらに限定されない。さらに、本開示の医薬組成物または剤形は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムもしくはカリウムまたは有機酸などの１つ以上の溶解性調節因子を含むことができる。具体的溶解性調節因子の一つは酒石酸である。
【００７６】
賦形剤の量およびタイプと同様に、剤形中の有効成分の量および具体的タイプは、それが患者に投与される経路などの因子を含むがそれらに限定されない因子に依存して相違しうる。しかし、本開示の化合物の典型的剤形はＣＸＣＲ４のアンタゴニストの医薬上許容される塩、または医薬上許容される多形体、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、それらの無水形もしくは非晶質形を約１０ｍｇから約１０００ｍｇの量で、好ましくは約２５ｍｇから約７５０ｍｇの量で、およびより好ましくは５０ｍｇから５００ｍｇの量で含んでいる。
２．５．１  経口剤形
経口投与に適する本開示の医薬組成物は、錠剤（制限なく分割錠もしくはコーティング錠を含む）、ピル、カプレット、カプセル、チュアブル錠、散剤分包、カシェ、トローチ、ウエハー、エーロゾルスプレー、または水溶液、非水溶液、水中油型エマルジョン、もしくは油中水型エマルジョン中のシロップ、エリキシル、水溶液もしくは懸濁液などを含むがそれらに限定されない液体、などを含むがそれらに限定されない個別剤形として提示できる。そのような組成物は規定量のＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩を含有しており、そして当業者によく知られている調剤方法によって調製できる。一般に、レミントンの製薬科学第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州イーストン）（１９９０）を参照されたい。
【００７７】
本開示の組成物の典型的な経口剤形は、従来型の製薬学的調剤技術によってＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩を少なくとも１つの賦形剤とよく混合することによって調製される。賦形剤は、投与のために望ましい組成物の形態に依存する極めて広範囲の形態を取ることができる。例えば、内服液もしくはエーロゾル剤形で使用するのに適した賦形剤の例には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、および着色剤が含まれるが、それらに限定されない。経口固形剤形（例、散剤、錠剤、カプセル、およびカプレット）に使用するのに適合した賦形剤の例には、デンプン、糖類、微結晶セルロース、カオリン、希釈剤、顆粒形成剤、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤が含まれるが、それらに限定されない。
【００７８】
投与の容易さのために、錠剤およびカプセルは最も有益な固形経口剤形を代表しており、その場合には固形賦形剤が使用される。所望であれば、錠剤は標準の水性または非水性技術によってコーティングできる。これらの剤形は、任意の調剤方法によって調製できる。一般に、医薬組成物および剤形は均一および均質に１つ以上の有効成分を液状担体、微粉化した固体担体、またはその両方と混合し、次に必要であれば所望の形態に製品を成形することによって調製される。
【００７９】
例えば、錠剤は圧縮または成形によって調製できる。圧縮錠剤は、場合により１つ以上の賦形剤と混合された（粉末または顆粒などの）自由流動状態にある１つ以上の有効成分を適切な機械で圧縮することによって調製できる。成形錠剤は、不活性液状希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作製できる。
【００８０】
本開示の経口剤形に使用できる賦形剤の実施例には、結合剤、充填剤、崩壊剤、および潤滑剤が含まれるが、それらに限定されない。医薬組成物および剤形中で使用するために適切な結合剤には、コーンスターチ、バレイショデンプン、もしくはその他のデンプン、ゼラチン、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、その他のアルギン酸塩、粉末状トラガカント、グアールガムなどの天然および合成ガム、セルロースおよびその誘導体（例、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、前ゼラチン化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例、第２２０８番、第２９０６番、第２９１０番）、微結晶セルロース、ならびにそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。
【００８１】
微結晶セルロースの適切な形状には、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１、およびＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｉｓｃｏｓｅ事業部Ａｖｉｃｅｌ  Ｓａｌｅｓ部門（米国ペンシルベニア州マーカスフック）から入手できる）として販売されている物質、およそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。代表的な適切な結合剤は、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１として販売されている微結晶セルロースとカルボキシメチルセルロースナトリウムの混合物である。適切な無水もしくは低含水量賦形剤もしくは添加物にはＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３（登録商標）およびデンプン１５００ＬＭが含まれる。
【００８２】
本開示の医薬組成物および剤形に使用するために適切な充填剤の例には、タルク、炭酸カルシウム（例、顆粒もしくは粉末）、微結晶セルロース、粉末状セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、前ゼラチン化デンプンおよびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。本開示の医薬組成物中の結合剤または充填剤は、典型的には医薬組成物または剤形の約５０から約９９重量％で存在する。
【００８３】
崩壊剤は、水性環境に曝露させると崩壊する錠剤を提供するために本開示の組成物中に使用される。崩壊剤を過剰に含有する錠剤は保存中に湿潤したり、亀裂を生じたり、崩壊したりすることがあり、他方崩壊剤の含量が少なすぎる錠剤は崩壊を発生させるには不十分なことがあるので、したがって剤形からの１つ以上の有効成分の放出の速度および程度を変化させる可能性がある。そこで、本開示の固形経口剤形を形成するためには、１つ以上の有効成分の放出を有害に変化させるほど少なすぎも多すぎもしない十分な量の崩壊剤を使用すべきである。使用される崩壊剤の量は調製物のタイプおよび投与様式に依存して変動するが、当業者であれば容易に認識できる。典型的な医薬組成物は、約０．５から約１５重量％の崩壊剤、好ましくは約１から約５重量％の崩壊剤を含んでいる。
【００８４】
本開示の医薬組成物および剤形を形成するために使用できる崩壊剤には、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリンカリウム、グリコール酸デンプンナトリウム、バレイショデンプンもしくはタピオカデンプン、その他のデンプン、前ゼラチン化デンプン、粘土、その他のアルギン類、その他のセルロース類、ガム類、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。
【００８５】
本開示の医薬組成物および剤形を形成するために使用できる潤滑剤には、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、その他のグリコール類、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水素化植物油（例、落花生油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリル酸エチル、寒天、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。追加の潤滑剤には、例えばｓｙｌｏｉｄシリカゲル（ＡＥＲＯＳＩＬ  ２００、メリーランド州バルチモア所在のＷ．Ｒ．  Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．製）、合成シリカの凝固エーロゾル（テキサス州プラノ所在のＤｅｇｕｓｓａ  Ｃｏ．製）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（マサチューセッツ州ボストン所在のＣａｂｏｔ  Ｃｏ．が販売している発熱性二酸化ケイ素）、およびそれらの混合物が含まれるがそれらに限られない。使用される場合は、潤滑剤は典型的にはそれらが組み込まれる医薬組成物または剤形の約１重量％未満の量で使用される。
【００８６】
本開示は乳糖を含有しない医薬組成物および剤形をさらに含むが、このときそのような組成物は好ましくは乳糖または他の単糖類もしくは二糖類をたとえ含んでもわずかしか含有していない。本明細書で使用する用語「乳糖を含まない」は、存在する乳糖の量が、たとえ存在しても、有効成分の分解速度を実質的に増加させるには不十分であることを意味する。
【００８７】
本開示の乳糖を含まない組成物は、当技術分野においてよく知られており、参照により本明細書に取り込まれるＵＳＰ（米国薬局方）（ＸＸＩ）／ＮＦ（国民医薬品集）（ＸＶＩ）に列挙されている賦形剤を含むことができる。一般に、乳糖を含まない組成物は、医薬上適合し医薬上許容できる量でＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩、結合剤／充填剤、および潤滑剤を含んでいる。好ましい乳糖を含まない剤形は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩、微結晶セルロース、前ゼラチン化デンプン、およびステアリン酸マグネシウムを含んでいる。
【００８８】
本開示は、有効成分を含む無水医薬組成物および剤形をさらに含むが、それは水が一部の化合物の分解を促進することがあるためである。例えば、水（例、５％）の添加は、経時的な保管寿命または調製物の安定性などの特性を決定するために長期保存をシミュレートする手段として製薬分野において広く受け入れられている。例えば、Ｊｅｎｓ  Ｔ．  Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ、「薬物の安定性：原理および実践（Ｄｒｕｇ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、３７９−８０（第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９５）を参照されたい。水および熱は一部の化合物の分解を促進する。そこで、水が調製物に及ぼす作用は極めて重大であるが、それは調製物の製造、取扱い、包装、保管、輸送、および使用中には通常、水分および／または湿気に遭遇するためである。
【００８９】
本開示の無水医薬組成物および剤形は、無水もしくは低含水量成分および低水分もしくは低湿度条件を用いて調製できる。乳糖ならびに第１級もしくは第２級アミンを含む少なくとも１つの活性成分を含む医薬組成物および剤形は、製造、包装、および／または保管中の水分および／または湿度との実質的接触が予想される場合は、好ましくは無水である。
【００９０】
無水医薬組成物は、その無水の性質が維持されるように調製かつ保存されなければならない。したがって、無水組成物は、好ましくは適切な処方用キットに含めることができるように水への曝露を防止することが知られている物質を用いて包装される。適切な包装の例には、密封されるホイル、プラスチック、乾燥剤を含むもしくは含まない単位用量容器（例、バイアル）、ブリスターパック、およびストリップパックが含まれるが、それらに限定されない。
２．５．２  制御放出性および遅延放出性剤形
ＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩は制御放出性または遅延放出性手段によって投与できる。制御放出性製剤は、それらの非制御放出性対応物によって達成されるものに比して薬剤療法を改良するという共通の目標を有している。理想的には、薬物療法における最適に設計された制御放出性調製物の使用は、最少の医薬物質が最少量の時間でその状態を治癒または制御するために使用されることを特徴とする。制御放出性調製物の長所には１）薬物の活性の延長；２）投与頻度の減少；３）患者のコンプライアンスの上昇；４）薬物の総使用量の減少；５）局所的または全身性副作用の減少；６）薬物蓄積量の最少化；７）血中レベル変動の減少；８）治療の有効性の改善；９）増強作用の減少または薬物活性の消失；および１０）疾患もしくは状態の制御速度の改善、が含まれる。Ｋｉｍ  Ｃｈｅｒｎｇ−ｊｕ、「制御放出性剤形の設計２（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ２）」、（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州ランカスター、２０００）を参照されたい。
【００９１】
従来型剤形は、一般に該調製物からの速いまたは中程度の薬物放出を提供する。薬物の薬理学および薬物動態に依存して、従来型剤形の使用は患者の血液およびその他の組織中での薬物濃度における広範囲の変動を引き起こす可能性がある。これらの変動は、例えば投与頻度、作用開始、有効性の持続、治療薬血中レベルの維持、毒性、副作用などの多数のパラメータに大きな影響を及ぼすことがある。有益にも、制御放出性調製物を使用すると、薬物の作用開始、作用持続、治療窓内での血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。詳細には、制御放出性または持続放出性剤形もしくは調製物を使用すると、過少投与（すなわち、最小治療レベル未満になる）ならびにその薬物にとっての毒性レベルを超すことの両方から生じる可能性がある潜在的な有害作用および安全性問題を最小限に抑えながら薬物の最高有効性を達成することを確かにできる。
【００９２】
ほとんどの制御放出性調製物は、最初に所望の治療作用を迅速に引き起こす量の薬物（有効成分）を放出し、そして長期間にわたってこのレベルの治療的もしくは予防的作用を維持するための、上とは異なる量の薬物を徐々にかつ持続的に放出するように設計されている。身体内での薬物のこの一定レベルを維持するためには、薬物は身体から代謝かつ排出される薬物の量を置き換える速度で剤形から放出されなければならない。有効成分の制御性放出は、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水分、およびその他の生理的条件もしくは化合物を含むがそれらに限定されない様々な条件によって刺激することができる。
【００９３】
様々な既知の制御放出性または持続放出性剤形、調製物およびデバイスは、本開示のＣＸＣＲ４アンタゴニスト塩類および組成物と一緒に使用するために適合させることができる。その例には、その各々が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第４，００８，７１９号；第５，６７４，５３３号；第５，０５９，５９５号；第５，５９１，７６７号；第５，１２０，５４８号；第５，０７３，５４３号；第５，６３９，４７６号；第５，３５４，５５６号；第５，７３３，５６６号；および第６，３６５，１８５Ｂ１号に記載されたものが含まれるが、それらに限定されない。これらの剤形は、様々な比率の目的とする放出プロフィールを提供するために、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系（例えば、ＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはミクロスフェアまたはそれらの組み合わせを用いて、１つ以上の有効成分の緩徐放出または制御放出を達成するために用いることができる。さらに、イオン交換物質を使用するとＣＸＣＲ４アンタゴニストの固定化吸着塩を調製し、したがってその薬物の制御された送達を実行することができる。特定のアニオン交換体の例には、Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ５６８およびＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）ＡＰ１４３（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ、米国ペンシルベニア州スプリングハウス）が含まれるが、それには限定されない。
【００９４】
本開示の１つの実施形態は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩（例、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム塩）、またはその多形体、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水形もしくは非晶質形、および１つ以上の医薬上許容される賦形剤もしくは希釈剤を含む単位投与形態を含んでいるが、このとき該医薬組成物もしくは剤形は制御放出のために調製される。特定の剤形は浸透圧薬物送達系を利用する。
【００９５】
特定のよく知られている浸透圧薬物送達系はＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）と呼ばれている。この技術は、本開示の化合物および組成物の送達に容易に適合させることができる。この技術の様々な態様は、各々が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第６，３７５，９７８Ｂ１号；第６，３６８，６２６Ｂ１号；第６，３４２，２４９Ｂ１号；第６，３３３，０５０Ｂ２号；第６，２８７，２９５Ｂ１号；第６，２８３，９５３Ｂ１号；第６，２７０，７８７Ｂ１号；第６，２４５，３５７Ｂ１号；および第６，１３２，４２０号に記載されている。本開示の化合物および組成物を投与するために使用できるＯＲＯＳ（登録商標）の特定の適応物には、全て周知であるＯＲＯＳ（登録商標）Ｐｕｓｈ−Ｐｕｌｌ（登録商標）、遅延性Ｐｕｓｈ−Ｐｕｌｌ（登録商標）、多層Ｐｕｓｈ−Ｐｕｌｌ（登録商標）、およびＰｕｓｈ−Ｓｔｉｃｋ（登録商標）系が含まれるが、それらに限定されない。例えば、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅウエブサイトａｌｚａ．ｃｏｍを参照されたい。本開示の化合物および組成物の経口制御送達に使用できるさらなるＯＲＯＳＯ（登録商標）システムにはＯＲＯＳ（登録商標）−ＣＴおよびＬ−ＯＲＯＳ（登録商標）が含まれる；例えば、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｉｍｅｓ，  ｖｏｌ．１１，  ｉｓｓｕｅ  ＩＩ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を参照されたい。
【００９６】
従来型のＯＲＯＳ（登録商標）経口剤形は、薬物粉末（例、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト塩）を硬質錠剤に圧縮することと、その錠剤をセルロース誘導体でコーティングして半透膜を形成することと、および次にそのコーティングに（例えば、レーザーを用いて）開口部を穿孔することとによって作製される。Ｋｉｍ  Ｃｈｅｍｇ−ｊｕ、「制御放出性剤形の設計（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ  Ｄｅｓｉｇｎ）」、２３１−２３８（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州ランカスター、２０００）を参照）。そのような剤形の長所は、薬物の送達速度が生理的もしくは実験条件によって影響を受けないことにある。ｐＨ依存性溶解度を備える薬物でさえ、その送達媒体のｐＨとは無関係の一定速度で送達することができる。しかしこれらの長所は投与後の剤形内での浸透圧の形成によって提供されるので、従来型のＯＲＯＳ（登録商標）薬物送達系は水溶性の低い薬物を効果的に送達するために使用できない。本開示のＣＸＣＲ４アンタゴニスト塩および複合体（例、ＣＸＣＲ４アンタゴニストナトリウム）はＣＸＣＲ４アンタゴニスト自体よりはるかに高度に水溶性であるので、それらは患者への浸透圧に基づく送達により適している。しかし、本開示は、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ならびにその非塩異性体および異性体混合物をＯＲＯＳ（登録商標）剤形内に組み込むことを含んでいる。
【００９７】
本開示の組成物の特定の剤形は：腔を規定する壁であって、その中に形成されたもしくは形成可能な出口を有し、その壁の少なくとも一部分が半透性である壁と；その出口から離れている腔内に位置してその壁の半透性部分と液体連絡している膨張性の層と；出口に隣接する腔内に位置し、該膨張性の層と直接的もしくは間接的接触関係にある、乾燥したもしくは実質的に乾燥状態にある薬物層と；および壁の内面と腔内に位置する薬物層の少なくとも外面との間に差し挟まれた流動促進層とを含み、このとき該薬物層はＣＸＣＲ４アンタゴニストの塩、またはその多形体、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水形もしくは非晶質形を含んでいる。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３６８，６２６号を参照されたい。
【００９８】
本開示のまた別の剤形は：腔を規定する壁であって、その中に形成されたもしくは形成可能な出口を有し、その壁の少なくとも一部分は半透性である壁と；その出口から離れている腔内に位置して壁の半透性部分と液体連絡している膨張性層と；出口に隣接して腔内に位置しており、膨張性層と直接的もしくは間接的接触関係にある薬物層とを含んでおり；薬物層は多孔性粒子内に吸収された液状活性薬物調製物を含み、多孔性粒子は液状の活性薬調製物の重大な浸出を伴わずに密な薬物層を形成するために十分な圧縮力に抵抗するように適合しており、その剤形は場合によって出口と薬物層の間にプラセボ層を有しており、このとき該活性薬調製物がＣＸＣＲ４アンタゴニストの塩、またはその多形体、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水形もしくは非晶質形を含んでいる。例えば、全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第６，３４２，２４９号を参照されたい。
２．５．３  非経口剤形
非経口剤形は、皮下、静脈内（ボーラス注射を含む）、筋肉内、および動脈内を含むがそれらに限定されない様々な経路によって患者に投与できる。非経口剤形の投与は典型的には汚染物質に対する患者の自然防衛を迂回するので、非経口剤形は好ましくは無菌であるか、または患者に投与する前に滅菌可能である。非経口剤形の例には、注射用溶液、注射用の医薬上許容されるビヒクル内に溶解もしくは懸濁させることのできる乾燥製品、注射用懸濁剤、およびエマルジョンが含まれるが、それらに限定されない。さらに、制御放出性非経口剤形は、ＤＵＲＯＳ（登録商標）タイプの剤形の投与および用量ダンピングを含むがそれらに限定されない患者への投与のために調製できる。
【００９９】
本開示の非経口剤形を提供するために使用できる適切なビヒクルは当業者にはよく知られている。その例には、制限なく、滅菌水；ＵＳＰ注射用水；生理食塩水；ブドウ糖溶液；塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、および乳酸リンガー注射液などを含むがそれらに限定されない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどを含むがそれらに限定されない水混和性ビヒクル；ならびにコーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどを含むがそれらに限定されない非水性ビヒクルが含まれる。
【０１００】
本明細書に開示したＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩の溶解度を変化させる、または修飾する化合物もまた、従来型および制御放出性非経口剤形を含む本開示の非経口剤形の中に組み込むことができる。
２．５．４  局所的、経皮的および経粘膜剤形
本開示の局所的剤形には、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン、および当業者に知られている他の形態が含まれるがそれらに限定されない。例えば、レミントンの製薬科学第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州イーストン）（１９９０）；および医薬剤形概論第４版（（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．）、Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）（１９８５）を参照されたい。スプレーできない局所的剤形のためには、典型的には局所塗布のために適合し好ましくは水より大きな力学的粘度を有する担体又は１つ以上の賦形剤を含む粘性から半固形もしくは固形剤形が使用される。適切な調製物には、制限なく、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント、膏薬などを含むが、それらは所望であれば、滅菌されたり、例えば浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすために補助剤（例、保存剤、安定剤、湿潤剤、バッファー、もしくは塩）と混合される。その他の適切な局所的剤形にはスプレー可能なエーロゾル調製物が含まれるが、このとき有効成分は（好ましくは固形または液状不活性担体と組み合わせて）加圧揮発性物質（例、フレオンなどの気体状噴射剤）との混合物中に、またはスクイーズボトル内に包装される。所望であれば、医薬組成物および剤形に保湿剤または保水剤を添加することもできる。そのような追加の成分の例は当技術分野においてよく知られている。例えば、レミントンの製薬科学第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州イーストン）（１９９０）を参照されたい。
【０１０１】
本開示の組成物の経皮的および経粘膜剤形には、眼科用液剤、パッチ、スプレー、エアロゾル、クリーム、ローション、坐剤、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液または当業者に知られている他の剤形が含まれるがそれらに限定されない。例えば、レミントンの製薬科学第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルベニア州イーストン）（１９９０）；および医薬剤形概論第４版（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ、ペンシルベニア州フィラデルフィア）（１９８５）を参照されたい。口腔内の粘膜組織を治療するために適合する剤形は、口腔洗浄剤、経口ジェル、または口腔パッチとして調製できる。さらなる経皮的剤形には、皮膚に適用して所望量の有効成分の浸透を許容するために特定期間にわたり装着できる「リザーバータイプ」または「マトリックスタイプ」のパッチが含まれる。
【０１０２】
本開示の１つ以上の有効成分を投与するために使用できる経皮的剤形および投与方法の例には、各々全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第４，６２４，６６５号；第４，６５５，７６７号；第４，６８７，４８１号；第４，７９７，２８４号；第４，８１０，４９９号；第４，８３４，９７８号；第４，８７７，６１８号；第４，８８０，６３３号；第４，９１７，８９５号；第４，９２７，６８７号；第４，９５６，１７１号；第５，０３５，８９４号；第５，０９１，１８６号；第５，１６３，８９９号；第５，２３２，７０２号；第５，２３４，６９０号；第５，２７３，７５５号；第５，２７３，７５６号；第５，３０８，６２５号；第５，３５６，６３２号；第５，３５８，７１５号；第５，３７２，５７９号；第５，４２１，８１６号；第５，４６６，４６５号；第５，４９４，６８０号；第５，５０５，９５８号；第５，５５４，３８１号；第５，５６０，９２２号；第５，５８５，１１１号；第５，６５６，２８５号；第５，６６７，７９８号；第５，６９８，２１７号；第５，７４１，５１１号；第５，７４７，７８３号；第５，７７０，２１９号；第５，８１４，５９９号；第５，８１７，３３２号；第５，８３３，６４７号；第５，８７９，３２２号；および第５，９０６，８３０号が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０３】
本開示によって含まれる経皮的および経粘膜剤形を提供するために使用できる適切な賦形剤（例、担体および希釈剤）およびその他の物質は製薬分野の当業者にはよく知られており、所定の医薬組成物または剤形が適用される特定組織または器官に左右される。その事実を考慮に入れて、典型的賦形剤には、非毒性であって医薬上許容される剤形を形成するために、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０４】
治療される特定組織に依存して、本開示のＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩を用いた治療の前に、一緒に、または後に追加の成分を使用できる。例えば、その組織へ、またはその組織を越えて有効成分を送達するのを補助する浸透増強剤を使用できる。適切な浸透増強剤には、アセトン；エタノール、オレイル、テトラヒドロフリルなどの様々なアルコール；ジメチルスルホキシドなどのアルキルスルホキシド；ジメチルアセトアミド；ジメチルホルムアミド；ポリエチレングリコール；ポリビニルピロリドンなどのピロリドン類；Ｋｏｌｌｉｄｏｎグレード（ポビドン、ポリビドン）；尿素；ならびにＴＷＥＥＮ  ８０（ポリソルベート８０）およびＳＰＡＮ  ６０（モノステアリンソルビタン）などの様々な水溶性または非水溶性糖エステルが含まれるが、それらに限定されない。
【０１０５】
医薬組成物もしくは剤形のｐＨ、または該医薬組成物または剤形が適用される組織のｐＨは、該有効成分の送達を改善するために調整することができる。同様に、溶媒担体の極性、そのイオン強度、または張性は送達を改善するために調整できる。送達を改善するために１つ以上の有効成分の親水性もしくは親油性を有益に変化させるために、ステアリン酸塩などの化合物を医薬組成物または剤形に添加することができる。この点で、ステアリン酸塩は調製物のための脂質ビヒクルとして、乳化剤もしくは界面活性剤として、そして送達増強剤もしくは浸透増強剤として機能することができる。結果として生じる組成物の特性をさらに調整するために、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩の様々な水和物、脱水物、共結晶、溶媒和物、多形体、無水形もしくは非晶質形を使用できる。
２．６  キット
典型的には、本開示の医薬組成物の有効成分は好ましくは、同時にまたは同一投与経路によっては、患者に投与されない。このため本開示は、医療従事者が使用する場合は、患者への適切な量の有効成分の投与を単純化できるキットを含んでいる。
【０１０６】
典型的なキットは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩の単位投与形態と、抗増殖剤もしくは抗癌剤などの第２の医薬上活性な化合物の単位投与形態とを含んでいる。
【０１０７】
詳細には、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの医薬上許容される塩は、そのナトリウム塩、リチウム塩、もしくはカリウム塩、または多形体、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水形もしくは非晶質形である。キットは、さらにまた該有効成分を投与するために使用できるデバイスを含むことができる。そのようなデバイスの例には、シリンジ、点滴用バッグ、パッチ、および吸入器が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０８】
本開示のキットは、１つ以上の有効成分を投与するために使用できる医薬上許容されるビヒクルをさらにまた含むことができる。例えば、有効成分が非経口投与のために再構成されなければならない固体形で提供される場合は、キットは粒子状物質を含まない非経口投与のために適切な無菌溶液を形成するために有効成分をその中に溶解させることのできる適切なビヒクルの密封容器を含むことができる。医薬上許容されるビヒクルの例には、ＵＳＰ注射用水；塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、および乳酸リンガー注射液などを含むがそれらに限定されない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどを含むがそれらに限定されない水混和性ビヒクル；ならびにコーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどを含むがそれらに限定されない非水性ビヒクル、などを含むがそれらに限定されない。
【０１０９】
別のキットは、癌細胞または癌細胞転移を検出または定量するための試薬を含んでおり、そして例えば標識ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストを含んでいる。代表的な標識ＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストは、ビオチン化ＴＮ１４００３である。このキットは、蛍光体などの検出可能な標識と結合したストレプトアビジンをさらに含むことができる。ｐＨ、浸透圧濃度、および標識アンタゴニストをサンプルへ結合させるための条件を維持するためのバッファーを含むことができることは理解されるであろう。場合によって、例えばマイクロタイタープレートおよびカバースリップなどの追加の試薬材料をキット内に含めることができる。
３．  方法および材料
細胞培養。ヒト乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（バルチモア）のＺ．  Ｂｈｕｊｗａｌｌａからの贈呈）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（アトランタ）のＬｉｌｙ  Ｙａｎｇからの贈呈）を、５％  ＣＯ2、３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ社）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）が補給されたＲＰＭＩ−１６００（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）中で培養した。ヒト一次線維芽細胞２０９１（ＡＴＣＣ）を、１０％  ＦＢＳおよび抗生物質が補給されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）中で培養した。
【０１１０】
アンタゴニストおよびコントロールペプチドの合成ならびにビオチン標識化。ＣＸＣＲ４アンタゴニストはＥｍｏｒｙ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって合成された。コントロールペプチドは、アンタゴニスト（ＮＨ2−ＫＹ−Ｎａｌ−ＹＲ−DＫ−Ｃｉｔ−ＲＣＲＲＰ−Ｃｉｔ−Ｃ−ａｍｉｄｅ）のＵタイプ構造を維持するためにジスルフィド結合を維持しながらＣＸＣＲ４アンタゴニストのアミノ酸配列を無作為にスクランブルすることによって作製した。このコントロールペプチドはＣＸＣＲ４タンパク質には結合しない（データは示していない）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン化した。脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用して未結合ビオチンおよび塩を除去した。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト当たりの平均ビオチン数は２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸（ＨＡＢＡ）試験によって決定した。ビオチン対ＣＸＣＲ４アンタゴニストの比率を決定するために、１ｍＬのアビジン−ＨＡＢＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）をキュベット内に添加し、アビジン−ＨＡＢＡ試薬の吸光度を５００ｎｍで測定した。
【０１１１】
腫瘍細胞侵襲アッセイ。転移についてのインビトロモデル系のために、ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ社（カリフォルニア州サンホセ）製のマトリゲル侵襲チャンバを用いるマトリゲル侵襲アッセイを使用した。マトリゲルを通してのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲を誘導するためにボトムチャンバへＳＤＦ−ｌα（４００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を添加した。細胞をトップチャンバへ播種する前にＣＸＣＲ４アンタゴニスト（４ｎｇ／ｍＬ）または抗ＣＸＣＲ４抗体（ＭＡＢ  １７３、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）（２５ｎｇ／ｍＬ）を細胞に添加した。加湿組織培養インキュベータ内でマトリゲル侵襲チャンバを２２時間にわたりインキュベートした。最初に、綿棒を用いてマトリゲルの上部から非侵襲性細胞を取り除いた。マトリゲルの底部にある侵襲性細胞をメタノール中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。侵襲速度はＨ＆Ｅ染色細胞を計数することによって決定した。
【０１１２】
細胞毒性。細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用してインビトロでＣＸＣＲ４アンタゴニストの細胞毒性を決定した。細胞増殖はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。細胞を様々な濃度のＣＸＣＲ４アンタゴニストと一緒に９６ウエル透明プレート内に播種した（溶媒１００μＬ中に１ウエル当たり３０００ｃｅｌｌｓ）。２日後、２０μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６ＡＱ試薬を各ウエル内に添加し、さらに２時間インキュベートし、そして４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１３】
インビトロ造血性前駆細胞コロニー形成。ＣＸＣＲ４アンタゴニストを造血性前駆細胞コロニー形成への毒性について評価した。Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの治験審査委員会によって承認されたプロトコール下で、ヒト骨髄細胞を健常成人志願者から腸骨稜穿刺および保存料を含有しないヘパリン中への吸引によって入手した。単核球をＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（比重、１．０７７）上での密度分離によって単離した。１０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、および１μＭのヒドロコルチゾン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＩＭＤＭ中で各１時間にわたる３７℃でのプラスチック付着を２回実施した後、非付着性細胞を回収した。ＣＤ３４＋骨髄細胞を低密度非付着性細胞分画からの陽性免疫選択によって単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、カリフォルニア州オーバーン）。その後、１．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８および２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ社）の存在下または不在下で、３０％  ＰＣＳ、１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０-4β−ＭＥ、５Ｕ／ｍＬヒトエリスロポエチン（ｈＥｐｏ；Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ社）、および２％脾臓細胞馴化培地（ＳＣＣＭ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を補給したアルファ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中の０．８％メチルセルロースの１．１ｍＬ混合液を充填した３５ｍｍペトリ皿（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で細胞を培養した。コロニーは、インキュベーション第１４日に顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）から誘導された、または赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅｓ）から誘導されたものとして調べられた。コロニーの同定は、コロニーのサイトスピン標本のライト・ギムザ（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）染色によって確認した。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは第０日での初回投与後に１／２用量で毎日添加した。この薬物は少なくとも３６時間にわたり安定であり、ＣＯ2組織培養インキュベータ内の１０％ＦＢＳを備えるＲＰＭＩ培地中で２０時間の半減期で減少する（データは示していない）。
【０１１４】
ＦＡＣＳ分析。６０ｍｍシャーレ上で増殖させたＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を氷上で２０分間にわたり０．５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストと一緒にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を収集し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。ストレプトアビジン結合フィコエリトリン（ＰＥ）またはＦＩＴＣを１：１００の希釈率で細胞へ適用した。これらの細胞を室温の暗所で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳを用いて３回洗浄した。細胞を６００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、３０μｍ孔径フィルター（ＶＷＲ社、オハイオ州ウィラード）を通して濾過し、そしてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエアを装備したＢｅｃｉｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを用いて分析した。ＰＥまたはＦＩＴＣ蛍光は、ＦＬ２チャンネル（励起４８８ｎｍ／発光５７５ｎｍ）またはＦＬ１チャンネル（励起４８８ｎｍ／発光５３０ｎｍ）内で各々検出した。
【０１１５】
動物実験。動物実験は、１群当たり７匹を含む６〜８週齢のＣＢ−１７  ＳＣＩＤ雌性マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社、ニューヨーク州ジャーマンタウン）で実施した。１７β−エストラジオール（６０日放出性、０．７２ｍｇ；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、フロリダ州サラソータ）は、腫瘍細胞注射の１日前に全動物へ皮下挿入した。全動物には、６日間離して（第０日および第６日）、尾静脈を通して送達されるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞（２×１０6）を２回注射した。治療のためには、動物には第０日の腫瘍細胞の第１回注射直前からＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはそのコントロールペプチド（これはＣＸＣＲ４を認識しない）を週２回（１００ｎｇ／ｇ（体重））静脈内注射した。マウスは腫瘍細胞注射から５５日後に致死させた。転移の存在について調べるために、主要臓器を最適切削温度（ＯＣＴ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ジョージア州スワニー）化合物中で採取して液体窒素中で冷凍した。収集した組織切片はヒトＣＸＣＲ４のＨ＆Ｅ組織染色、ＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを受けさせた。
【０１１６】
インビボ毒性試験のためには、マウスへ４５日間にわたり週２回１００ｎｇ／ｇ（体重）でＣＸＣＲ４アンタゴニストを注射した。コントロールマウスは同一プロトコールによってビヒクルを用いて処理した。４５日間の処理後、マウスを致死させた。それらの肝臓および腎臓切片はＨ＆Ｅ染色によって毒性の評価を受けさせた。動物実験の全プロトコールは、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって精査かつ承認された。
【０１１７】
免疫染色および免疫蛍光。動物の臓器は液体窒素中のＯＣＴ中で急速冷凍し、切片作製し、氷温アセトン中で固定し、−８０℃で維持した。組織は腫瘍の存在／不在を評価するためにＨ＆Ｅ染色した。ＣＸＣＲ４の免疫蛍光検出のために、切片を水およびＰＢＳで洗浄し、非特異的結合を排除するためにブロッキングした（アビジンおよびビオチンブロッキング溶液、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州サンフランシスコ）。これらのスライドを引き続いて０．０５ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストと一緒に室温（ＲＴ）で４５分間インキュベートした。これらのスライドはＰＢＳを用いて３回洗浄し、室温で３０分間にわたりストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（希釈率１：１５０）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ペンシルベニア州ウエストグローブ）中でインキュベートした。最後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、抗退色封入液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン）中に入れた。
【０１１８】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を５８℃で３０分間加熱した。これらの試料をキシレンで各５分間ずつ３回洗浄し、次に１００％、９５％、および７５％エタノールで洗浄し、そしてＰＢＳでリンスした。非特異的結合をブロッキングするために、これらのサンプルをアビジンブロッキング液およびビオチンブロッキング液中で順番にインキュベートした。ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（０．０５μｇ／ｍＬ）を組織切片へ適用し、これらのサンプルを室温の加湿チャンバ内でさらに４５分間インキュベートした。これらのスライドはＰＢＳを用いて３回洗浄し、室温で３０分間にわたりストレプトアビジン−ローダミン（希釈率１：１５０）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中でインキュベートした。抗退色封入液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）中で洗浄かつ封入した後、これらのサンプルをＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００顕微鏡上で分析した。ヒト組織試験の全プロトコールは、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの所内審査委員会（１ＫＢ）によって精査かつ承認された。
【０１１９】
ノーザンおよびウェスタンブロット分析。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡ（１５μｇ）はＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて製造業者の取扱説明書に従い調製し、１．４％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上に装填した。ニトロセルロースへ移した後、32Ｐ標識ＣＸＣＲ４フラグメント（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＩ９２０９４６）を用いてブロットをプローブ付けし、その後に室温で３０分間にわたり２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌに０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを加えたものである）−０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で１回、そして５０℃で３０分間にわたり０．２×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳ中で３回洗浄した。ウェスタンブロット分析のためには、同等濃度の全細胞タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１０％ゲル）によって分離し、そしてポリクローナルウサギ抗ＣＸＣＲ４抗体（Ａｂ−２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）およびモノクローナルマウス抗３−アクチン（Ｓｉｇｍａ社）を用いて免疫ブロット分析にかけた。
【０１２０】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。ＲＴ−ＰＣＲのためには、ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて製造業者の取扱説明書に従い動物の器官由来の冷凍組織３切片から調製した。１４９塩基対に対するヒトＣＸＣＲ４特異的プライマーは、５’−ＧＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡ（配列番号１７）および５’−ＣＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＡ（配列番号１８）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３４６７）であり、そしてβ−アクチンに対するプライマーは５’−ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴ（配列番号１９）および３’−ＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ（配列番号２０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ００３５１）である。第１鎖ｃＤＮＡ合成はＧｅｎｅＡｍｐ  Ｇｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて実施した。２０μＬの容量は、１×ＲＴバッファー中に０．５μｇのＲＮＡ、２００μＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、８ＵのＲＮａｓｅ阻害剤、３０Ｕの逆転写酵素、および１．２５μＭのランダムヘキサマーを含有していた。この反応は、４２℃で３０分間、次に２５℃で１０分間にわたり実施した。サンプルを１０分間にわたり９５℃へ加熱することによって反応を停止させた。ＲＴ反応液を使用時まで−２０℃で保管した、またはＰＣＲのためのテンプレートとして直ちに使用した。ｃＤＮＡ  ＰＣＲの反応は、２μＬの１０×バッファー、０．２μＭ濃度のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、３ｍＭのＭｇＣｌ2、２００Ｍの各ｄＮＴＰ、ならびに２μＬのｃＤＮＡを含有する２０μＬ反応容量中において、９５℃で３分間、次に（９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、そして７０度で１分間）を３５サイクル実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。定量的ＰＣＲ分析のために、多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を装備したｉＣｙｃｌｅｒ中でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ定量的ＰＣＲ増幅を実施した。これらの反応は、７．５μＬの２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスティーシティ）、０．２μＭの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに上記に記載したＲＴ反応液からの１μＬのｃＤＮＡを含有する１５μＬ反応容量中で実施した。リアルタイムＰＣＲのための熱プロフィールは９５℃で１０分間であり、次に（９５℃で３０秒間、５４℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間）の４０サイクルが続いた。各ランにおいて、ＣＸＣＲ４遺伝子およびｐ−アクチン遺伝子に対する標準物質の一連の希釈を肺組織の未知のサンプルと一緒に実施した。ＰＣＲ増幅後にｉＣｙｃｌｅｒプログラムを用いて、自動データ獲得および引き続いてのデータ分析を実施した。ＣＸＣＲ４遺伝子の平均コピー数は全ＲＮＡの１μｇ当たりで計算した。
【０１２１】
ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｉＲＮＡ実験のためには、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて全ＲＮＡを動物の肺の冷凍組織切片から調製した。ヒトＨＰＲＴ特異的プライマー対は以前の報告書からであり12、１４９塩基対に対するヒトＣＸＣＲ４特異的プライマーは、５’−ＧＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡ（配列番号１７）および５’−ＣＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＡ（配列番号１８）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３４６７）であり、そしてβ−アクチンに対するプライマーは５’−ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴ（配列番号１９）および３’−ＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ（配列番号２０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ００３５１）である。第１鎖ｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡの増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｇｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を製造業者の取扱説明書によって用いて実施した。リアルタイム定量的ＰＣＲ分析のために、多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を装備したｉＣｙｃｌｅｒ中でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ定量的ＰＣＲ増幅を実施した。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡの構築およびトランスフェクション。２つの相違するｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した（全体が参照により本明細書に取り込まれるＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３４６７）。ｃＤＮＡ標的領域およびｓｉＲＮＡ二本鎖の配列は次のとおりである：ｓｉＲＮＡ１については197−ＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣ−217（配列番号４）、ｓｉＲＮＡ２については529ＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡ−549（配列番号５）。非特異的コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＣＸＣＲ４  ｓｉＲＮＡ（４２％、Ｄ００１２０６−１０）と同一ＧＣ含量でＤｈａｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．から購入した。ｓｉＲＮＡｓはインビトロでｌｉｐｏｆｅｃｔｉａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＭＤ  Ａ−ＭＢ−２３１細胞内へトランスフェクトした。ヒト乳癌細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（バルチモア）のＺ．  Ｂｈｕｊｗａｌｌａからの贈呈）を、５％  ＣＯ2、３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ社）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）が補給されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）中で培養した。
【０１２３】
ｓｉＲＮＡ有効性の検出。ｓｉＲＮＡの有効性を決定するために、トランスフェクション４８時間後に、細胞を収集して全ＲＮＡおよび細胞溶解液を作製し、トランスフェクトした細胞からＣＸＣＲ４のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを各々測定した。同一時点に、細胞をさらに免疫蛍光のためのビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストによって免疫染色し、ＣＸＣＲ４タンパク質レベルを測定した。例えば、全体が参照により取り込まれるＬｉａｎｇ，  Ｚ．ら、「ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体に対する選択的合成ポリペプチドによる乳癌転移の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＸＣＲ４  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４（２００３）を参照されたい。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、Ｅｍｏｒｙ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって合成され、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を製造業者の取扱説明書に従って用いてビオチン化した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて調製し、１５ｊａｇの全ＲＮＡを１．４％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上に装填した。ニトロセルロースへ移した後、
32Ｐ標識ＣＸＣＲ４フラグメント（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ａｌ９２０９４６）を用いてブロットをプローブ付けした。ウェスタンブロット分析のために、我々は以前のプロトコール20にしたがった。手短には、同等量の全細胞タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１２％ゲル）によって分離し、そしてポリクローナルウサギ抗ＣＸＣＲ４抗体（Ａｂ−２、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびモノクローナルマウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ社）を用いて免疫ブロット分析にかけた。
【０１２４】
腫瘍細胞侵襲アッセイ。ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ社からのマトリゲル侵襲チャンバをマトリゲル侵襲アッセイのために使用した。細胞はトランスフェクション４８時間後にトップチャンバへ添加した。マトリゲルへのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲を誘導するためにボトムチャンバへＳＤＦ−ｌａ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した。加湿組織培養インキュベータ内でマトリゲル侵襲チャンバを２２時間にわたりインキュベートした後、綿棒を用いてマトリゲルの上部から非侵襲性細胞を除去し、マトリゲルの底部にある侵襲性細胞をメタノール中で固定してヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。侵襲速度はＨ＆Ｅ染色細胞を計数することによって決定した。
【０１２５】
細胞毒性。細胞増殖はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＡＱ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。このアッセイは、細胞乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性に基づくＭＴＴアッセイと類似であった。ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡと一緒のトランスフェクション４８時間後の細胞を９６ウエル透明プレート内に播種した（１００ｐｉの培地中で１ウエル当たり３０００ｃｅｌｌｓ）。２４時間後、２０μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６ＡＱ試薬を各ウエル内に添加し、プレートをさらに２時間インキュベートした。そして次に４９０ｎｍでの吸光度を測定して相対細胞数を決定した。
【０１２６】
ＳｉＲＮＡ動物実験。動物実験は、１群当たり６匹を含む６から８週齢のＣＢ−１７  ＳＣＩＤ雌性マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社、ニューヨーク州ジャーマンタウン）上で実施した。１７（３−エストラジオール（製品番号ＳＥ−１２１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）は、腫瘍細胞注射の１日前に全動物へ皮下挿入した。処理群中の全動物には注射４８時間前にＣＸＣＲ４  ｓｉＲＮＡ１＋２をトランスフェクトした２×１０6のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を尾静脈を介して静脈内注射し、その後は週２回ＣＸＣＲ４  ｓｉＲＮＡ１＋２（０．５μｇ／ｇ（体重））を注射した。コントロール群の全動物に対しては、非特異的コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖を備える２×１０6のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を注射し、そしてその後はコントロール二本鎖を週２回注射した。マウスは腫瘍細胞注射から４５日後に致死させた。主要臓器組織を最適切削温度化合物（ＯＣＴ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で採取して液体窒素中で冷凍した。冷凍組織切片にＨ＆Ｅ組織染色およびヒトハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴおよびＣＸＣＲ４のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを受けさせた。動物実験の全プロトコールは、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって精査かつ承認された。
【０１２７】
統計学的分析。全統計学的有意性はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって判定した。
実施例
【実施例１】
【０１２８】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストの特異性
最初に、ＣＸＣＲ４アンタゴニストがＣＸＣＲ４受容体上の予想ＳＤＦ−１結合部位へ結合することを確かめるために実験を実施した。これらの試験のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を最初は２μｇ／ｍＬのＳＤＦ−１αの存在下および不在下で１０分間にわたりインキュベートし、次に氷温アセトン中で固定した。細胞はビオチン標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびストレプトアビジン結合ローダミンを用いて免疫染色した。ビオチン標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストの免疫蛍光は１０分間にわたりＳＤＦ−１αを用いて前処理した細胞では膜および細胞質のどちらにおいても陰性であった（図１Ａの右）。乳癌患者由来のパラフィン包埋組織および培養した乳癌細胞の免疫蛍光染色と結合したＣＸＣＲ４のプローブとしてのビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストの有用性についてさらに調査した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ノーザンブロットおよびウェスタンブロットで示されたように、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５と比較してＣＸＣＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質を高レベルに有していた（図１Ｂ）。ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストを使用して２つの細胞タイプを染色すると、高度に発現しているＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞は明るく染色されたが（図１Ｃの左）、これはＣＸＣＲ４の高いタンパク質レベルと一致していた。他方、ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＭＤＡ−ＭＢ４３５への結合は劇的に小さくなり（図１Ｃの右）、これはこれらの細胞内での低い表面ＣＸＣＲ４発現と一致していた。フローサイトメトリーを使用してこれらの結果を確認したところ、予想されたとおり、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１についての結果（図１Ｄの下方）とは対照的に、ＭＤＡ−ＭＤ−４３５細胞ではビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストの結合は限定されていた（図１Ｄの上方）。
【０１２９】
癌患者のパラフィン包埋組織切片上でのビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストを用いた免疫蛍光染色は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを使用すると保管されたパラフィン包埋組織切片から腫瘍細胞のＣＸＣＲ４受容体を検出できることを示した（図１Ｅ）。図１Ｅは、ＣＸＣＲ４発現レベルが正常組織中では低いが（赤色ローダミン染色が見られない）、他方同一患者由来の原発性腫瘍およびリンパ節転移は上昇したＣＸＣＲ４タンパク質レベルを示したことを示している。重要なことに、乳管内癌（ＤＣＩＳ）の診断を受けている多くのサンプルが既にＣＸＣＲ４過剰発現を獲得していた（図１Ｅ）。
【実施例２】
【０１３０】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストによるインビトロでの乳癌細胞侵襲の阻害
転移についてのインビトロモデル系のために、マトリゲル侵襲チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ニュージャージー州フランクリンレークス）を使用した。ＣＸＣＲ４陽性乳癌細胞がマトリゲルを通して移動するのを引き起こすために、ＳＤＦ−１αを下方チャンバへ添加した。ＳＤＦ−１の不在下では、侵襲速度は極めて低かった。ボトムチャンバ内に４００ｎｇ／ｍＬのＳＤＦ−ｌαを用いると、極めて多数のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が化学走性誘引物質へ応答し、ボトムチャンバ内へ移動した。このＳＤＦ−１媒介性侵襲は、ＣＸＣＲ４受容体（ＭＡＳ  １７３、Ｒ＆Ｄ社）に対して向けられた２５μｇ／ｍＬの抗体の添加によって抑制された（図２）。ＣＸＣＲ４抗体と同様に、ＣＸＣＲ４アンタゴニストもまた腫瘍細胞の侵襲をインビトロで阻害したが、４ｎｇ／ｍＬ（２μＭ）の濃度では、より効果的であった。他方、ＣＸＣＲ４陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ボトムチャンバ内にＳＤＦ−１αを用いた場合でさえマトリゲルを通って侵襲することができなかった（図２の右側）。
【実施例３】
【０１３１】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストは動物モデルにおいて乳癌転移を阻止した。
【０１３２】
我々のインビトロ所見を拡大するために、乳癌転移の実験的転移動物モデルを確立した。１７β−エストラジオールを補給した雌性ＳＣＩＤマウスへ、コントロールペプチドまたはＣＸＣＲ４アンタゴニストと結び付けたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２回、静脈内投与した。ＣＸＣＲ４アンタゴニストまたはコントロールペプチド処理を５５日間にわたって週２回のペースで継続した。コントロールペプチドを用いて処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射したコントロール群の全７匹のマウスが肺転移を発生した。図３Ａにおける肺の３枚の代表的写真は、コントロール群における気泡状に見える肺微小転移巣を示している（上方パネル）。他方、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの週２回静注によって処理したマウス７匹中３匹は転移を形成できなかったが、４匹の動物はコントロールペプチド処理群より有意に小さな転移を発生した。図３Ａにおける肺の代表的な３枚の写真は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを用いて処理した群内の目に見える肺転移を示していない（下方パネル）。これらの動物の肺由来の組織をＨ＆Ｅ染色のために処理した。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理動物由来の肺組織は正常肺組織の形態を維持していたが、コントロール群由来の肺組織は大きな核を備える腫瘍細胞で充填されていた。これらの結果は、さらにヒトＣＸＣＲ４に対して特異的なＣＸＣＲ４プライマーを用いる半定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確証された（図３Ｂ）。これらの結果は、コントロールペプチドで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射された動物の転移浸潤性肺においてヒトＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡの有意な発現が発生したことを示した（図３Ｂ）。これとは対照的に、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＭＤＡ  ＩＢ−２３１細胞が注射されたＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理ＳＣＩＤマウスの肺中での転移は有意に少ないことを確証した。これらの結果は、肺組織のＨ＆Ｅ染色と良好に一致していた（図３Ａ）。その後の分析によって、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理動物の肺の全ＲＮＡの１μｇ当たりのヒトＣＸＣＲ４の平均ｍＲＮＡコピー数がコントロールペプチド処理肺におけるコピー数の１０．６％であることが明らかになった。これらの所見と一致するのは、コントロールペプチド処理動物と比較してアンタゴニスト処理動物では平均体重が多いという観察所見であった（図３Ｃ）。肺重量は動物の全身腫瘍組織負荷を反映していた（図３Ｄ）。
【実施例４】
【０１３３】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストの細胞毒性
ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理動物における肺への転移の減少は、転移が出来ないことまたは治療の細胞毒性に帰することができよう。ＣＸＣＲ４アンタゴニストの細胞毒性を決定するために、様々な濃度のアンタゴニストを用いてＣＸＣＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を処理し、増殖に及ぼす作用を決定した。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは１０ｎＭの濃度でさえ細胞増殖に影響を及ぼさなかった（図４Ａ）。そこで、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理動物がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のＣＸＣＲ４アンタゴニストの細胞毒性作用のために大きな肺転移を形成できなかったということはありそうもない。
【実施例５】
【０１３４】
全身性毒性
ＣＸＣＲ４アンタゴニストの全身性毒性に対する可能性を評価するために、数種の器官を顕微鏡下で試験した。図４Ｂは、ＰＢＳ注射またはＣＸＣＲ４アンタゴニストのどちらかを用いて処理されたマウス由来の肝臓および腎臓組織の代表的Ｈ＆Ｅ染色を示している。詳細には、肝臓内の中心ネクローシスおよび腎臓内の管ネクローシスは観察されなかった。Ｈ＆Ｅ染色の結果は、各群の代表的マウスの肝臓および腎臓において損傷が生じなかったことを示している。ＣＸＣＲ４アンタゴニストを造血性前駆細胞コロニーに及ぼす毒性について評価した。ＣＤ３４＋細胞からのコロニー形成を決定し、赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅｓ）または顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）として調べた。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは第０日での初回投与後に１／２装填量で毎日添加した。これらの試験のために、試験した最高濃度の１０ｎＭでは、造血性前駆細胞コロニー形成への認識できる作用は所見されなかった（図４Ｃ）。１ウエル当たりのコロニー数は、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅへの処理によっては有意には相違していなかった。ＣＸＣＲ４アンタゴニストの添加によってコロニーの総数も変化しなかった。ヒトＣＸＣＲ４陰性２０９１ヒト一次線維芽細胞についても類似の実験を実施した。この場合も、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは１００μＭ（その有効濃度の５０，０００倍）でさえ、２０９１細胞の細胞増殖速度に影響を及ぼさなかった（図４Ｄ）。
【実施例６】
【０１３５】
ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡによってトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＣＸＣＲ４発現
ビオチン化ＣＸＣＲ４ペプチドおよびストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ）を用いて、ＳｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を検出した。赤色：ＣＸＣＲ４  ＰＥ染色；青色：核対比染色。ＳｉＲＮＡ１はＣＸＣＲ４発現を低下させることにｓｉＲＮＡ２より効果的であり、そしてｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２の組み合わせ（ｓｉＲＮＡ１＋２）はＣＸＣＲ４レベルを低下させることにいずれかの単独より効果的であった（図５Ａ）。図１Ｂでは、抗ＣＸＣＲ４抗体Ａｂ２（１：１０００）を用いたｓｉＲＮＡトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のウェスタンブロットの結果はＳｉＲＮＡ１＋２がＣＸＣＲ４タンパク質の発現をほとんど完全に阻止することを示している。β−アクチン（Ｓｉｇｍａ社、１：２５００）を装填コントロールとして使用した。図１Ｃでは、ｓｉＲＮＡトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＣＸＣＲ４のＲＴ−ＰＣＴ分析はｓｉＲＮＡ１＋２がＣＸＣＲ４の発現を効果的に遮断したことを示している。
【０１３６】
ＣＸＣＲ４の２つのｓｉＲＮＡの組み合わせは、トランスフェクション４８時間後にｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内でのＣＸＣＲ４発現のほぼ完全な抑制を達成した。ｓｉＲＮＡ１はＣＸＣＲ４発現を低下させることに関してｓｉＲＮＡ２より効果的であった。ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２の組み合わせ（ｓｉＲＮＡ１＋２）はＣＸＣＲ４を抑制することについていずれかの単独に比較してより効果的であった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡがＣＸＣＲ４遺伝子およびタンパク質発現を阻害することに効率的であることを示した。
【実施例７】
【０１３７】
ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲率
ＣＸＣＲ４阻害が侵襲に及ぼす作用をマトリゲル侵襲アッセイによって決定した。ＣＸＣＲ４の細胞表面発現はＳＤＦ−１に対する反応を可能にし、移動および侵襲性の上昇を生じさせた。ＣＸＣＲ４陽性乳癌細胞がマトリゲルを通して移動するのを引き起こすために、ＣＸＣＲ４リガンドであるＳＤＦ−１（１００ｎｇ／ｍＬ）を下方チャンバへ添加した。コントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（非特異的コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖をトランスフェクトした）とＣＸＣＲ４トランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｓｉＲＮＡの侵襲についてトランスフェクション４８時間後に比較した。ｓｉＲＮＡ１を用いて細胞をトランスフェクトした場合の侵襲率はコントロール細胞の３９％へ低下し、ｓｉＲＮＡ２を用いた場合は５１％へ低下したが、ｓｉＲＮＡ１＋２を用いた場合はたった１６％へ低下した（図６）。データは、２種の相違するｓｉＲＮＡの組み合わせを用いるとタンパク質もしくはｍＲＮＡ発現レベルでだけではなく、機能的レベルでも遺伝子サイレンシングが増強することを示した。コントロールに比較してｓｉＲＮＡ１＋２、ｓｉＲＮＡ１、およびｓｉＲＮＡ２をトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲率は、各々６．９％（Ｐ＝０．０００２８）、３５．６％（Ｐ＝０．００１４０）、および５１．５％（Ｐ＝０．００２５５）である。
【実施例８】
【０１３８】
動物モデルにおける乳癌転移においてＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡが及ぼす作用
図７Ａは、処理群マウスからの肺は正常であるが、対照群マウスからの肺はヒト腫瘍細胞で満たされていることを示している、各群３匹のマウスの全部の肺およびこれらの肺組織のＨ＆Ｅ染色の写真である。図７Ｂは、各群における全動物からの肺サンプルのｈＨＰＲＴのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果を示している。数字１〜６はｓｉＲＮＡ処理群の動物６匹からの肺組織サンプルであり、数字７〜１２はコントロール群のマウス６匹からの肺組織サンプルである。ｈＨＰＲＴ発現レベルのパーセンテージは、コントロール群からの校正用サンプル番号１に比較したパーセンテージである。ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡ処理群マウスからの肺６片中２片だけが検出可能なｈＨＰＲＴを発現した。
【０１３９】
ＣＸＣＲ４のＳｉＲＮＡ１＋２をトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１７β−エストラジオールを補給した雌性ＳＣＩＤマウスへ１回静脈内投与した。１７β−エストラジオールは動物におけるホルモン依存性および非依存性細胞系のどちらにおいても腫瘍形成の効率を上昇させる。ヒト細胞における合成ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉は一過性であり、細胞は単回処理から４から６日間で回復した。このため、ＣＸＣＲ４遺伝子のサイレンシング作用を維持するために、サイレンシングｓｉＲＮＡを定期的に導入した。処理したマウスは、４５日間でそれらの肺における極めて少数の転移しか形成しなかった。コントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が注射されたコントロール群は肺転移を発生した。図７Ａの代表的な肺の写真は、コントロール群における気泡状の肺微小転移巣を示している肺を示している。他方、肺の３枚の代表的写真は、ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡで処理した群においては目に見える肺転移を示していない（図７Ａ）。ｓｉＲＮＡ処理動物由来の肺組織のＨ＆Ｅ染色は正常な肺の形態を示したが、コントロール群由来の肺組織のＨ＆Ｅ染色は侵襲性腫瘍細胞を示している（図７Ａ）。これらの結果は、さらにヒトハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴプライマーを用いる半定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図７Ｂ）。肺転移は、そのマウス対応物と交差反応しないヒトハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴのＨ＆Ｅ染色およびＲＴ−ＰＣＲによって検出した。ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を検出するためにｈＨＰＲＴを使用したのは、これらの細胞中でのＣＸＣＲ４レベルが肺内での転移の存在を表すことができなかったためであった。
【０１４０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、コントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が注射されたＳＣＩＤマウスの転移浸潤性肺中でヒトＨＰＲＴ  ｍＲＮＡの高発現が生じることを確証した。これとは対照的に、ｓｉＲＮＡ処理ＳＣＩＤマウスの肺ではほんの少数の転移しか見られなかった。この群ではマウス６匹中２匹でのみｈＨＰＲＴ遺伝子の弱い発現が観察された（図７Ｂ）。これらの肺組織のヒト特異的ＣＸＣＲ４についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、コントロール群マウスでは高いＣＸＣＲ４発現が観察されるが、他方処理群マウスの肺では極めて低いＣＸＣＲ４発現が観察されることを示した（コントロール群の２．３±２．２％）。これらの結果は、低下したＣＸＣＲ４レベルを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が動物モデルにおいて転移を形成しないことを示した。ＣＸＣＲ４  ｓｉＲＮＡ処理動物における肺への転移の減少は、転移が出来ないことまたはＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡの細胞毒性に帰することができよう。ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡの潜在的細胞毒性は、非特異的コントロールｓｉＲＮＡまたはＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡのどちらかをトランスフェクトした再播種した細胞上でのＭＴＴアッセイと類似するＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＡＱ９６アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてトランスフェクション４８時間後に測定した。ＳｉＲＮＡ１＋２トランスフェクトした細胞の増殖率は２４時間にわたってコントロール細胞に比して８５．９±１５．７％（ｐ＝０．１３９）であったが、これは細胞増殖にｓｉＲＮＡ処理が及ぼす作用が比較的小さいことを示していた。処理動物がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡの細胞毒性作用に起因して肺転移を形成しなかったことはありそうもない。細胞毒性の欠如は、正常細胞への全身性作用が限定されていることも意味している。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】ビオチン標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびストレプトアビジン結合ローダミンを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の免疫蛍光顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＣＸＣＲ４のｍＲＮＡおよびタンパク質を高レベルに有するが、ＭＤＡ−４３５細胞は有していないことを示しているノーザンブロットおよびウェスタンブロットを示した図である。
【図１Ｃ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞より高レベルのＣＸＣＲ４を有することを示しているビオチン標識ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびストレプトアビジン結合ローダミンを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の免疫蛍光顕微鏡写真である。したがって、ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、細胞表面上のＣＸＣＲ４タンパク質を定量的に検出できる。
【図１Ｄ】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞においてビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストの結合が限定されていることを示しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のフローサイトメトリーデータのグラフである。ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＦＡＣＳ分析によりＣＸＣＲ４タンパク質を定量的に検出するために用いることができる。
【図１Ｅ】ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストを使用した組織切片の免疫蛍光顕微鏡写真のパネルである。
【図２】Ｒ＆Ｄ  ｃｏｍｐａｎｙからの抗ＣＸＣＲ４抗体と比較したＣＸＣＲ４アンタゴニストで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のマトリゲル侵襲データの棒グラフである。
【図３Ａ】ＣＸＣＲ４アンタゴニスト処理群内において目に見える肺転移がないことを示している写真のパネルである。
【図３Ｂ】ＣＸＣＲ４アンタゴニストを用いて処理した動物の肺の、ヒトＣＸＣＲ４に対して特異的なプライマーを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの棒グラフである。コントロールペプチド処理群動物は肺転移のために体重を増加させることができなかった。
【図３Ｃ】平均体重がコントロールペプチド処理動物よりアンタゴニスト処理動物における方が高かったことを示している棒グラフである。
【図３Ｄ】肺重量が動物の全身腫瘍負荷を反映することを示した棒グラフである。
【図４Ａ】ＣＸＣＲ４アンタゴニストが１０ｎＭの濃度においてさえ細胞増殖率に影響を及ぼさなかったことを示した棒グラフである。
【図４Ｂ】ＰＢＳ注射またはＣＸＣＲ４アンタゴニストのどちらかを用いて処理されたマウスからの肝臓および腎臓組織のＨ＆Ｅ染色を示している顕微鏡写真である。
【図４Ｃ】造血性前駆細胞コロニー形成にＣＸＣＲ４アンタゴニストが及ぼす認識可能な作用がないことを示している線グラフである。
【図４Ｄ】ＣＸＣＲ４アンタゴニストが１００マイクロモル濃度でさえ正常ヒト線維芽２０９１細胞の細胞増殖率に影響を及ぼさなかったことを示している折れ線グラフである。
【図５Ａ】ビオチン化ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ）を用いて検出した、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の免疫蛍光顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】ｓｉＲＮＡ１＋２がＣＸＣＲ４の発現を効果的に遮断したことを示している、ｓｉＲＮＡトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＣＸＣＲ４のＲＴ−ＰＣＴ分析である。
【図５Ｃ】抗ＣＸＣＲ４抗体Ａｂ２（１：１０００）を用いたｓｉＲＮＡトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のウェスタンブロットである。これもまた、ｓｉＲＮＡ１＋２がＣＸＣＲ４発現を効果的に遮断することを確認している。
【図６Ａ】ＣＸＣＲ４  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした侵襲性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＨ＆Ｅ染色を示している顕微鏡写真である。ｓｉＲＮＡ１＋２をトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲率は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲率よりはるかに小さかった。
【図６Ｂ】ｓｉＲＮＡ１＋２、ｓｉＲＮＡ１、およびｓｉＲＮＡ２をトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の侵襲率が各々、コントロールに比較して６．９％（Ｐ＝０．０００２８）、３５．６％（Ｐ＝０．００１４０）、および５１．５％（Ｐ＝０．００２５５）であることを示している棒グラフである。
【図７Ａ】処理群マウスからの肺は正常であるが、コントロール群マウスからの肺はヒト腫瘍細胞で満たされていることを示している、各群３匹のマウスの全部の肺およびこれらの肺組織のＨ＆Ｅ染色の写真である。
【図７Ｂ】各群における全動物からの肺サンプルのｈＨＰＲＴのＲＴ−ＰＣＲ結果を示した棒グラフである。ＣＸＣＲ４のｓｉＲＮＡ処理群マウスからの肺組織６片中２片のみが極めて低レベルの検出可能なｈＨＰＲＴを発現した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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