(57)【要約】記載したのは、興奮毒性アミノ酸トランスポーター(ＥＡＡＴ)タンパク質発現を調節する方法、病気及び病気の症状を治療する方法、ＥＡＡＴタンパク質発現を調節する化合物を同定する方法、並びにＥＡＡＴタンパク質発現の調節並びに病気及び病気の症状の治療に有用な化合物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＡＡＴ２タンパク質発現を増大させる方法であって、細胞を、少なくとも一種のＥＡＡＴ２発現促進剤と接触させるステップを含む当該方法。
【請求項２】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、下記のステップを含むスクリーニングアッセイにより同定される化合物である、請求項１に記載の方法
ａ）ｃＤＮＡ分子及びSEQ ID NO:１、２、３又は４のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はその相補性分子、又は該核酸分子を含む細胞を、試験化合物と接触させ、該核酸分子は、プロモーターレスのレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を指示することができ；そして
ｂ）該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現が調節されるかどうかを測定し、
それにより、該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を調節する化合物を、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。
【請求項３】
ＥＡＡＴ２タンパク質発現を、イン・ビボで増大させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＥＡＡＴ２タンパク質発現を、イン・ビトロで増大させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、抗生物質、抗高血圧症薬、神経伝達物質、抗菌剤、抗炎症剤、ステロイド誘導体及び防腐剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、少なくとも一つの環内硫黄原子を含むヘテロ環式化合物、第三アミン、第四アンモニウム塩、ステロイド、ポリオール、ポリケチド、グアニジン、尿素又は砒酸塩から選択する少なくとも一種の構造エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、第三アミン、第四アンモニウム塩、ポリケチド、ステロイド環系並びに１つ又は２つの環、少なくとも一つの環内硫黄原子及び０、１又は２個の環内窒素原子を有するヘテロ環式化合物から選択する少なくとも一の構造エレメントを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して２００％以上増大させる、請求項１〜７の何れか一つに記載の方法。
【請求項９】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、オキシメタゾリンヒドロクロリド、グラミン、ペリリックアシド(−)、アミトリプチリンヒドロクロリド、テトラカインヒドロクロリド、ジソピラミドホスフェート、シソミシンサルフェート、ケタミンヒドロクロリド、キシラジン、ビククリン、フルルビプロフェン、セファドロキシル、バカンピシリンヒドロクロリド、チアプリドヒドロクロリド、ノルエチンドロンアセテート、ベルガプテン、カリソプロドール、シチオロン、ピロキシカム、エリスロマイシンエチルスクシネート、フレグレレートナトリウム、アルベンダゾール、ジヒドロストレプトマイシンサルフェート、アロイン、フェノプロフェン、フルタミド、アンピシリンナトリウム、アンプロリウム、スパルテインサルフェート、メドロキシプロゲステロンアセテート、アレキシジンヒドロクロリド、クリンダマイシンヒドロクロリド、セファロチンナトリウム、ダイゼイン、メクリジンヒドロクロリド、リンデン、ブロモプリド、Ｎ−(３−トリフルオロメチルフェニル)ピペラジンヒドロクロリド(ＴＦＭＰＰ)、エノキソロン、イプラトロピウムブロミド、ブフェキサマク、グルコノラクトン、リファンピン、ヒドロキシクロロキン、コレオフォルシン、クロロキシン、オキシドーパミンヒドロクロリド、カンプトテシン、ナフシリンナトリウム、ミアンセリンヒドロクロリド、アセタルゾール、プリロカインヒドロクロリド、デフェロキサミンメシレート、ヘキサメトニウムブロミド、メテナミン、パラキサンチン、ハマロールヒドロクロリド、ピリチオン亜鉛、ヒドロコルチゾンブチレート、アセタゾラミド、アミノグルテチミド、メクロフェノキセートヒドロクロリド、２−フェンプロピルアミノ−５−ニトロ安息香酸(ＮＰＰＢ)、アミオダロンヒドロクロリド、アコニチン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、及びジオスミンよりなる群から選択する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して３００％以上増大させる、請求項１〜９の何れか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、及びオキシメタゾリンヒドロクロリドよりなる群から選択する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して４００％以上増大させる、請求項１〜１１の何れか一つに記載の方法。
【請求項１３】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド及びバンコマイシンヒドロクロリドよりなる群から選択する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して６００％以上増大させる、請求項１〜１３の何れか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド及びキナプリルよりなる群から選択する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物の細胞外グルタメート濃度を減少させる方法であって、少なくとも一種のＥＡＡＴ２発現促進剤を該哺乳動物に投与するステップを含む当該方法。
【請求項１７】
哺乳動物が、かかる治療を必要とすると同定された、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、下記のステップを含むスクリーニングアッセイにより同定される化合物である、請求項１６に記載の方法
ａ）ｃＤＮＡ分子及びSEQ ID NO:１、２、３又は４のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はその相補性分子、又は該核酸分子を含む細胞を、試験化合物と接触させ、該核酸分子は、プロモーターレスのレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を指示することができ；そして
ｂ）該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現が調節されるかどうかを測定し、
それにより、該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を調節する化合物を、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。
【請求項１９】
ＥＡＡＴ２タンパク質発現を、イン・ビボで増大させる、請求項１６〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＡＡＴ２タンパク質発現を、イン・ビトロで増大させる、請求項１６〜１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、抗生物質、抗高血圧症薬、神経伝達物質、抗菌剤、抗炎症剤、ステロイド誘導体及び防腐剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、少なくとも一つの環内硫黄原子を含むヘテロ環式化合物、第三アミン、第四アンモニウム塩、ステロイド、ポリオール、ポリケチド、グアニジン、尿素又は砒酸塩から選択する少なくとも一つの構造エレメントを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、第三アミン、第四アンモニウム塩、ポリケチド、ステロイド環系並びに少なくとも一つの環内硫黄原子及び０、１又は２個の環内窒素原子を含むヘテロ環式化合物から選択する少なくとも一つの構造エレメントを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して２００％以上増大させる、請求項１６〜２３の何れか一つに記載の方法。
【請求項２５】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、オキシメタゾリンヒドロクロリド、グラミン、ペリリックアシド(−)、アミトリプチリンヒドロクロリド、テトラカインヒドロクロリド、ジソピラミドホスフェート、シソミシンサルフェート、ケタミンヒドロクロリド、キシラジン、ビククリン、フルルビプロフェン、セファドロキシル、バカンピシリンヒドロクロリド、チアプリドヒドロクロリド、ノルエチンドロンアセテート、ベルガプテン、カリソプロドール、シチオロン、ピロキシカム、エリスロマイシンエチルスクシネート、フレグレレートナトリウム、アルベンダゾール、ジヒドロストレプトマイシンサルフェート、アロイン、フェノプロフェン、フルタミド、アンピシリンナトリウム、アンプロリウム、スパルテインサルフェート、メドロキシプロゲステロンアセテート、アレキシジンヒドロクロリド、クリンダマイシンヒドロクロリド、セファロチンナトリウム、ダイゼイン、メクリジンヒドロクロリド、リンデン、ブロモプリド、Ｎ−(３−トリフルオロメチルフェニル)ピペラジンヒドロクロリド(ＴＦＭＰＰ)、エノキソロン、イプラトロピウムブロミド、ブフェキサマク、グルコノラクトン、リファンピン、ヒドロキシクロロキン、コレオフォルシン、クロロキシン、オキシドーパミンヒドロクロリド、カンプトテシン、ナフシリンナトリウム、ミアンセリンヒドロクロリド、アセタルゾール、プリロカインヒドロクロリド、デフェロキサミンメシレート、ヘキサメトニウムブロミド、メテナミン、パラキサンチン、ハマロールヒドロクロリド、ピリチオン亜鉛、ヒドロコルチゾンブチレート、アセタゾラミド、アミノグルテチミド、メクロフェノキセートヒドロクロリド、２−フェンプロピルアミノ−５−ニトロ安息香酸(ＮＰＰＢ)、アミオダロンヒドロクロリド、アコニチン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、及びジオスミンよりなる群から選択する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して３００％以上増大させる、請求項１６〜２５の何れか一つに記載の方法。
【請求項２７】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、及びオキシメタゾリンヒドロクロリドよりなる群から選択する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して４００％以上増大させる、請求項１６〜２７の何れか一つに記載の方法。
【請求項２９】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド及びバンコマイシンヒドロクロリドよりなる群から選択する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して６００％以上増大させる、請求項１６〜２９の何れか一つに記載の方法。
【請求項３１】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド及びキナプリルよりなる群から選択する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物が、霊長類である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物が、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞外グルタメート濃度を、非調節濃度と比較して少なくとも約５０％減少させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項３５】
細胞外グルタメート濃度を、非調節濃度と比較して少なくとも約７５％減少させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項３６】
変化したグルタメート輸送と関係する病気を患った又は患い易い哺乳動物を治療する方法であって、その哺乳動物に、治療上有効な量の少なくとも一種の、ＥＡＡＴ２発現を増大させることのできるＥＡＡＴ発現促進剤を投与するステップを含む当該方法。
【請求項３７】
哺乳動物が、かかる治療を必要とすると同定された、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
変化したグルタメート輸送と関係する病気が、神経病学的疾患である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
神経病学的疾患を、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、急性神経病学的疾患、癲癇、脊髄損傷、脳外傷、緑内障、及び精神医学的疾患よりなる群から選択する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、下記のステップを含むスクリーニングアッセイにより同定される化合物である、請求項３６〜３９の何れか一つに記載の方法
ａ）ｃＤＮＡ分子及びSEQ ID NO:１、２、３又は４のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はその相補性分子、又は該核酸分子を含む細胞を、試験化合物と接触させ、該核酸分子は、プロモーターレスのレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を指示することができ；そして
ｂ）該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現が調節されるかどうかを測定し、
それにより、該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を調節する化合物を、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。
【請求項４１】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、抗生物質、抗高血圧症薬、神経伝達物質、抗菌剤、抗炎症剤、ステロイド誘導体及び防腐剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、少なくとも一つの環内硫黄原子を含むヘテロ環式化合物、第三アミン、第四アンモニウム塩、ステロイド、ポリオール、ポリケチド、グアニジン、尿素又は砒酸塩から選択する少なくとも一種の構造エレメントを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、第三アミン、第四アンモニウム塩、ポリケチド、ステロイド環系並びに１つ又は２つの環、少なくとも一つの環内硫黄原子及び０、１又は２個の環内窒素原子を有するヘテロ環式化合物から選択する少なくとも一の構造エレメントを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して２００％以上増大させる、請求項３６〜４３の何れか一つに記載の方法。
【請求項４５】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、オキシメタゾリンヒドロクロリド、グラミン、ペリリックアシド(−)、アミトリプチリンヒドロクロリド、テトラカインヒドロクロリド、ジソピラミドホスフェート、シソミシンサルフェート、ケタミンヒドロクロリド、キシラジン、ビククリン、フルルビプロフェン、セファドロキシル、バカンピシリンヒドロクロリド、チアプリドヒドロクロリド、ノルエチンドロンアセテート、ベルガプテン、カリソプロドール、シチオロン、ピロキシカム、エリスロマイシンエチルスクシネート、フレグレレートナトリウム、アルベンダゾール、ジヒドロストレプトマイシンサルフェート、アロイン、フェノプロフェン、フルタミド、アンピシリンナトリウム、アンプロリウム、スパルテインサルフェート、メドロキシプロゲステロンアセテート、アレキシジンヒドロクロリド、クリンダマイシンヒドロクロリド、セファロチンナトリウム、ダイゼイン、メクリジンヒドロクロリド、リンデン、ブロモプリド、Ｎ−(３−トリフルオロメチルフェニル)ピペラジンヒドロクロリド(ＴＦＭＰＰ)、エノキソロン、イプラトロピウムブロミド、ブフェキサマク、グルコノラクトン、リファンピン、ヒドロキシクロロキン、コレオフォルシン、クロロキシン、オキシドーパミンヒドロクロリド、カンプトテシン、ナフシリンナトリウム、ミアンセリンヒドロクロリド、アセタルゾール、プリロカインヒドロクロリド、デフェロキサミンメシレート、ヘキサメトニウムブロミド、メテナミン、パラキサンチン、ハマロールヒドロクロリド、ピリチオン亜鉛、ヒドロコルチゾンブチレート、アセタゾラミド、アミノグルテチミド、メクロフェノキセートヒドロクロリド、２−フェンプロピルアミノ−５−ニトロ安息香酸(ＮＰＰＢ)、アミオダロンヒドロクロリド、アコニチン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、及びジオスミンよりなる群から選択する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して３００％以上増大させる、請求項３６〜４５の何れか一つに記載の方法。
【請求項４７】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、及びオキシメタゾリンヒドロクロリドよりなる群から選択する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して４００％以上増大させる、請求項３６〜４７の何れか一つに記載の方法。
【請求項４９】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド及びバンコマイシンヒドロクロリドよりなる群から選択する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して６００％以上増大させる、請求項３６〜４９の何れか一つに記載の方法。
【請求項５１】
ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド及びキナプリルよりなる群から選択する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳動物が、霊長類である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物が、ヒトである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞外グルタメート濃度を、非調節濃度と比較して少なくとも約５０％減少させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
細胞外グルタメート濃度を、非調節濃度と比較して少なくとも約７５％減少させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、下記のステップを含むスクリーニングアッセイにより同定される化合物である、請求項１、１６又は３６に記載の方法
ａ）ＥＡＡＴ２を発現する細胞を試験化合物と接触させ；そして
ｂ）ＥＡＡＴ２の該細胞における発現が、試験化合物の存在下において、試験化合物の非存在下と比較して調節されるかどうかを測定し、
それにより、ＥＡＡＴ２の発現を調節する化合物を、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。
【請求項５７】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、β−ラクタム抗生物質である、請求項１、１６又は３６に記載の方法。
【請求項５８】
ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ペニシリンクラス、セファロスポリンクラス、カルバペネムクラス又はモノバクタムクラスの化合物である、請求項１、１６又は３６に記載の方法。
【請求項５９】
哺乳動物を治療して、グルタメート神経伝達を調節する方法であって、該哺乳動物に、ＥＡＡＴ２発現を増大させることのできる少なくとも一種のＥＡＡＴ発現促進剤の治療上有効な量を投与することを含む当該方法。
【請求項６０】
哺乳動物が、かかる治療を必要とすると同定された、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
哺乳動物が、学習又は記憶に関する状態の治療を必要としている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
投与が、学習、記憶の増進；又は認識の増進に利する、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
神経病学的疾患は、中枢神経系(ＣＮＳ)及び運動ニューロン単位に重大な影響を与えうる。例えば、ある種のＣＮＳの神経病学的疾患は、脳及び関連構造に悪影響を与えることが知られている。運動ニューロン単位に影響を与える神経病学的疾患は、運動ニューロン疾患と末梢神経障害とにグループ分けされてきた。一般に、Kandel, E.R.等；(1991)(Principles of Neuroscience, Appleton & Lange, Norwalk, CT)；及びRowland, L.P.(編)(1982)(Human Motor Neuron Diseases. New York. Raven Press)を参照されたい。
【０００２】
運動ニューロン疾患の実例は、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)である。ＡＬＳは、認められた症状発現を有する慢性的筋神経疾患であると報告されてきた。例えば、皮質及び脊髄／延髄運動ニューロンの変質が、この病気における鍵となる役割を演じうるということが示唆されてきた。ＡＬＳは、殆ど常に致命的である。全ＡＬＳ患者の約９５％は、散発性であり、残りの患者の多くは、常染色体優性遺伝を示す。例えば、Kuncl R.W.等 (1992) Motor Neuron Diseases In Diseases of the Nervous System, Asbury等編(Philadelphia W.B.Saunders) p.1179-1208；Brown, R.H.,(1996) Amer.Neurol. 30:145；Siddique, T.及びDeng., H.X.(1996) Hum.Mol.Genetics 5:1465)。
【０００３】
特別のＣＮＳ疾患も又、記載されてきた。特に、幾つかは、コリン作動性、ドーパミン作動性、アドレナリン作動性、セロトニン作動性の欠損症又はこれらの組合せに帰せられてきた。重篤な影響を及ぼすＣＮＳ疾患には、老化前の痴呆症(ときに、アルツハイマー病(ＡＤ)又は早期発症性アルツハイマー病とも呼ばれる)、老人性痴呆症(アルツハイマー型痴呆症)、パーキンソン病(ＰＤ)、及びハンチントン病(ＨＤ、ときに、ハンチントン舞踏病とも呼ばれる)が含まれる。かかるＣＮＳ疾患は、ヒト集団において、十分に標本が示されている。一般に、Gusella, J.F.等(1983) Nature 306: 234；Borlauer. W.及び Jprmuloewoca. P.(編)(1976)；Adv. in Parkinsonism: Biochemistry, Physiology, Treatment. Fifth International Symposium on Parkinson's Disease (Vienna) Basel: Roche；及びこれらの中で引用された参考文献を参照されたい。
【背景技術】
【０００４】
大きな注意が、運動ニューロン疾患の病因論の理解に向けられてきた。例えば、ある種の興奮毒性神経伝達物質の異常なレベルが、多くの運動ニューロン疾患に対して悪く寄与すると報告されている。特に、グルタメート媒介性の興奮毒性は、ＡＬＳにおいて臨界的役割を有すると認められている。例えば、Rothstein J.D.等(1990) Ann．Neurol．28:18.；Rothstein J.D.等(1992) N.Engl.Med. 326:1464；Rothstein J.D.等(1993) PNAS(USA) 90:6591；及びLacomblez, L.等(1996) Lancet 347:1179を参照されたい。
【０００５】
大グリア細胞のトランスポーターＧＬＡＳＴ(ＥＡＡＴ１)及びＧＬＴ−１(ＥＡＡＴ２)は、前脳のグルタメート輸送の最大パーセンテージに対して責任がある。そうして、それらは、両方とも、発現の調節のための興味をそそる標的を表しており、それにより、神経退行、発作、及び脳腫瘍の増殖を含む病気の進行を遅らせる薬剤として興味をそそる標的を表している。
【０００６】
神経系のグルタメートレベルを低下させる機構の理解に対する相当の努力がなされてきた。例えば、高親和性、ナトリウム依存性グルタメート輸送は、グルタメートを不活性化させる一つの報告された手段である。特に、星状膠細胞興奮性アミノ酸トランスポーター２(ＥＡＡＴ２)タンパク質は、該不活性化において相当の機能を有すると考えられている。例えば、Rothstein J.D.等(1994) Neuron 28: 18；Rothstein J.D.等(1995) Ann.Neurol. 38: 78.及びこれらの中で引用された参考文献を参照されたい。
【０００７】
特に、研究は、ＥＡＡＴ２が、主要なグルタメートトランスポーターであることを示唆してきた。一層詳細には、ある種のアンチセンスノックダウン研究は、ＥＡＡＴ２喪失が興奮毒性ニューロン退行及び進行性の運動障害へと導きうることを示すと報告している。ＡＬＳ及び他の神経退行性疾患の研究は、障害されたグルタメート輸送を、ＥＡＡＴ２タンパク質の喪失に関係付けてきた。特に、調べられた散発性ＡＬＳの患者の６０乃至７０％以下は、ＥＡＡＴ２タンパク質の３０〜９５％喪失を有している。例えば、Haugeto等、前出；Rothstein J.D.等(1996) Neuron 16: 675；Bristol, L.A.及びRothstein, J.D.(1996) Ann.Neurol. 39: 676を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＮＳ及び運動ニューロン単位の神経病学的疾患を治療し又は予防する試みが為されてきた。しかしながら、殆どの既存の治療は、苦しんでいる患者の病気の発達又は苦しさを常に食い止める訳ではない。例えば、Rowell, (1987) Adv.Behav.Biol. 31:191；Rinne,等、Brain Res.(1991) 54:167；Berlinerの米国特許第５，２１０，０７６号；Yurek, D.M.(1990) Ann.Rev.Neurosci. 13:415及びRowland等、前出を参照されたい。
【０００９】
従って、この分野には、神経病学的疾患を治療するための有効な治療に対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
興奮性アミノ酸トランスポーター(ＥＡＡＴ)タンパク質の発現を調節する方法、病気及び病気の症状を治療する方法、ＥＡＡＴタンパク質発現を調節する化合物を同定する方法、並びにＥＡＡＴタンパク質発現の調節並びに病気及び病気の症状の治療に有用な化合物を、ここに記載する。
【００１１】
一つの面において、この発明は、ＥＡＡＴ２タンパク質発現を増大させる方法であって、細胞を少なくとも一種のＥＡＡＴ２発現促進剤と接触させるステップを含む当該方法に関係する。他の面において、ＥＡＡＴ２発現促進剤は、下記のステップ
ａ）ｃＤＮＡ分子及びSEQ ID NO:１、２、３又は４のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補性分子又は該核酸分子を含む細胞を試験化合物と接触させ、該核酸分子は、プロモーターレスのレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を指示することができ、
ｂ）該ｍＲＮＡの発現又は該ｃＤＮＡによりコードされたポリペプチドの発現が調節されるかどうかを測定し、
それにより、該ｍＲＮＡの発現又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を調節する化合物を、神経病学的又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定することを含むスクリーニングアッセイによって同定される化合物である。この方法は、ＥＡＡＴ２タンパク質発現をイン・ビボで増大させる場合又はＥＡＡＴ２タンパク質発現をイン・ビトロで増大させる場合に可能である。
【００１２】
これらの方法の他の面は、ＥＡＡＴ２発現促進剤が抗生物質、抗高血圧剤、神経伝達物質、抗菌剤、抗炎症剤、ステロイド誘導体又は防腐剤であるもの、ＥＡＡＴ２発現促進剤が、少なくとも一つの環内硫黄原子を有するヘテロ環式化合物、第三アミン、第四アンモニウム塩、ステロイド、ポリオール、ポリケチド、グアニジン、尿素又はヒ酸塩から選択する少なくとも一つの構造エレメントを含むもの；ＥＡＡＴ２発現促進剤が、第三アミン、第四アンモニウム塩、ポリケチド、ステロイド環系及び２個以下の環、少なくとも一つの環内硫黄原子又は０、１若しくは２個の環窒素原子を有するヘテロ環式化合物から選択する少なくとも一つの構造エレメントを含むもの；ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して２００％以上増大させるもの；ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して３００％以上増大させるもの；ＥＡＡＴ２発現促進剤が、ＥＡＡＴ２産生を、非調節産生と比較して６００％以上増大させるものである。
【００１３】
他の面において、これらの方法は、ここに詳細に描写したものであって、該方法において、ＥＡＡＴ２発現促進剤は、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、オキシメタゾリンヒドロクロリド、グラミン、ペリリックアシド(−)、アミトリプチリンヒドロクロリド、テトラカインヒドロクロリド、ジソピラミドホスフェート、シソミシンサルフェート、ケタミンヒドロクロリド、キシラジン、ビククリン、フルルビプロフェン、セファドロキシル、バカンピシリンヒドロクロリド、チアプリドヒドロクロリド、ノルエチンドロンアセテート、ベルガプテン、カリソプロドール、シチオロン、ピロキシカム、エリスロマイシンエチルスクシネート、フレグレレートナトリウム、アルベンダゾール、ジヒドロストレプトマイシンサルフェート、アロイン、フェノプロフェン、フルタミド、アンピシリンナトリウム、アンプロリウム、スパルテインサルフェート、メドロキシプロゲステロンアセテート、アレキシジンヒドロクロリド、クリンダマイシンヒドロクロリド、セファロチンナトリウム、ダイゼイン、メクリジンヒドロクロリド、リンデン、ブロモプリド、Ｎ−(３−トリフルオロメチルフェニル)ピペラジンヒドロクロリド(ＴＦＭＰＰ)、エノキソロン、イプラトロピウムブロミド、ブフェキサマク、グルコノラクトン、リファンピシン、ヒドロキシクロロキン、コレオフォルシン、クロロキシン、オキシドーパミンヒドロクロリド、カンプトテシン、ナフシリンナトリウム、ミアンセリンヒドロクロリド、アセタルゾール、プリロカインヒドロクロリド、デフェロキサミンメシレート、ヘキサメトニウムブロミド、メテナミン、パラキサンチン、ハマロールヒドロクロリド、ピリチオン亜鉛、ヒドロコルチゾンブチレート、アセタゾラミド、アミノグルテチミド、メクロフェノキセートヒドロクロリド、２−フェンプロピルアミノ−５−ニトロ安息香酸(ＮＰＰＢ)、アミオダロンヒドロクロリド、アコニチン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、及びジオスミンよりなる群から選択される。
【００１４】
他の面において、これらの方法は、ここで描写した、ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、バンコマイシンヒドロクロリド、チアフェニコール、セフトリアキソンナトリウム、１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン(ＤＰＣＰＸ)、セファピリンナトリウム、アクチノスペクタシン、セフォペラゾールナトリウム、アシビシン、アセチルコリン、クロラムフェニコール、ビダラビン、アテノロール、オキシテトラサイクリン、グラフェニン、及びオキシメタゾリンヒドロクロリドよりなる群から選択するもの；ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、キナプリル、アモキシシリン、プリジノールメタンスルホネート、アクロミド、及びバンコマイシンヒドロクロリドよりなる群から選択するもの；ＥＡＡＴ２発現促進剤を、ペニシリンＶカリウム、デカリニウムクロリド、及びキナプリルよりなる群から選択するものである。
【００１５】
他の面は、哺乳動物の細胞外グルタメート濃度を減少させる方法であって、少なくとも一種のＥＡＡＴ２発現促進剤をその哺乳動物に投与するステップを含む当該方法である。この発現促進剤は、下記のステップを含むスクリーニングアッセイによって同定される化合物であってよい：
ａ）ｃＤＮＡ分子及びSEQ ID NO:１、２、３又は４のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補性分子又は該核酸分子を含む細胞を試験化合物と接触させ、該核酸分子は、プロモーターレスのレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を指示することができ；そして
ｂ）ｍＲＮＡの発現又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現が調節されるかどうかを測定し、
それにより、該ｍＲＮＡ又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を調節する化合物を、神経病学的又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。この方法は、ＥＡＡＴ２タンパク質の発現をイン・ビボで増大せるもの；又はＥＡＡＴ２タンパク質の発現をイン・ビトロで増大させるものであってよい。これらの方法において、ＥＡＡＴ２発現促進剤は、抗生物質、抗高血圧剤、神経伝達物質、及び抗菌剤、抗炎症剤、ステロイド誘導体、又は防腐剤であり；ＥＡＡＴ２発現促進剤は、少なくとも一つの環内硫黄原子を有するヘテロ環式化合物、第三アミン、第四アンモニウム塩、ステロイド、ポリオール、ポリケチド、グアニジン、尿素、又は砒酸塩から選択する少なくとも一つの構造エレメントを含み；ＥＡＡＴ２発現促進剤は、第三アミン、第四アンモニウム塩、ポリケチド、ステロイド環システム及び１又は２個の環、少なくとも一つの環内硫黄原子及び０、１若しくは２個の環内窒素原子を有するヘテロ環式化合物から選択する少なくとも一つの構造エレメントを有する。
【００１６】
他の面において、これらのここに記載の方法は、哺乳動物が霊長類であるもの；及び哺乳動物がヒトであるものである。
【００１７】
ここに記載したこれらの方法は又、細胞外グルタメート濃度が、非調節濃度と比較して少なくとも約５０％少ないものであり；又は細胞外グルタメート濃度が、非調節濃度と比較して少なくとも約７５％少ないものでもある。
【００１８】
他の面は、変化したグルタメート輸送と関係する病気を患った又は患い易い哺乳動物を治療する方法であって、その哺乳動物に、治療上有効な量の少なくとも一種の、ＥＡＡＴ２発現を増大させることのできるＥＡＡＴ発現促進剤を投与するステップを含む当該方法である。変化したグルタメート輸送と関係する病気は、神経病学的疾患(例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、急性神経病学的疾患、癲癇、脊髄損傷、脳外傷、緑内障、又は精神医学的疾患であってよい。この方法は、ＥＡＡＴ２発現促進剤が、下記のステップを含むスクリーニングアッセイによって同定されるものであってよい：
ａ）ｃＤＮＡ分子及びSEQ ID NO:１、２、３又は４のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補性分子又は該核酸分子を含む細胞を試験化合物と接触させ、該核酸分子はプロモーターレスのベクターからのｍＲＮＡ発現を指示することができ；そして
ｂ）該ｍＲＮＡの発現又は該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現が調節されるかどうかを測定し、
それにより、ｍＲＮＡの発現又はｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を調節する化合物を、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。
【００１９】
他の面において、この発明は、ＥＡＡＴ２発現促進剤が、下記のステップを含むスクリーニングアッセイにより同定される化合物である、ここに描写した方法の何れかと関係する：
ａ）ＥＡＡＴ２を発現する細胞を試験化合物と接触させ；そして
ｂ）該細胞内でのＥＡＡＴ２の発現が、試験化合物の存在下において、試験化合物の非存在下と比較して調節されるかどうかを測定し、
それにより、ＥＡＡＴ２の発現を調節する化合物を、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を治療することのできる化合物として同定する。この方法は、ＥＡＡＴ２発現促進剤がβ−ラクタム抗生物質であるもの；又はＥＡＡＴ２発現促進剤がペニシリンクラス、セファロスポリンクラス、カルバペネムクラス又はモノバクタムクラスの化合物であるものであってよい。
【００２０】
他の面は、哺乳動物を治療してグルタメート神経伝達を調節する方法であって、該哺乳動物に、ＥＡＡＴ２発現を増大させることのできる治療上有効な量の少なくとも一種のＥＡＡＴ発現促進剤を投与することを含む当該方法である。他の面において、これらの方法は、哺乳動物が、学習若しくは記憶と関連する病気の治療を必要とするもの、又は投与が学習、記憶の増進；若しくは認識増進のためであるものである。
【００２１】
ここに記載のこれらの方法は、患者(かかる治療を必要とすると同定された患者を含む)に、ここに記載した化合物又は組成物の有効量を投与して、かかる効果を生ぜしめることを含む。かかる治療を必要とする患者を同定することは、患者の判断であっても健康管理の専門家の判断であってもよく、且つ主観的なもの(例えば、意見)であっても客観的なもの(例えば、試験又は診断法により測定可能なもの)であってもよい。
【００２２】
表１は、ここに描写した方法において有用な化合物(又は、その塩又は溶媒化合物)を列挙する。
【表１】
2006524637.tif 000002
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は、SEQ ID NO:１〜４の配列表であり、これらは、ＥＡＡＴ２プロモーター配列である。
図２Ａは、試験化合物とインキュベートした脊髄培養物を示しており；２Ｂは、組織ホモジェネートからの試料のスロットブロットであり；２Ｃは、代表的なスクリーニングスロットブロットを示しており；２Ｄは、試験化合物のライブラリーのスクリーニング結果を示しており；２Ｅは、クラスにより類別された様々な化合物での処理からの発現結果の図解であり；２Ｆは、セフトリアキソンについてのＥＡＡＴ２発現の投与量応答分析を示している。
図３Ａ〜３Ｅは、マウス脳におけるＥＡＡＴ２プロモーター断片の発現を図解しており；３Ｆは、ＥＡＡＴ１プロモーターレポーターからの星状細胞を示しており、そして３Ｇは、トランスジェニックマウスにおける皮質での発現を示している。
図４Ａは、様々な試験化合物によるＥＡＡＴ２プロモーターの活性化(化合物クラスによる)を示しており；４Ｂは、投与量応答結果を図解している。
図５Ａは、ＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットであり；５Ｂは、ＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；５Ｃは、ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットであり；５Ｄは、ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果を図解している。
図６は、グルタメート輸送に対する様々な抗生物質の効果を図解している。
図７Ａは、虚血耐性に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；７Ｂは、運動神経退行に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；７Ｃは、握力に対するセフトリアキソンの効果を図解しており(イン・ビボモデル)；７Ｄは、Ｇ９３Ａマウスの生存に対するセフトリアキソンの効果を図解している。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、ＥＡＡＴ２プロモーターの配列の発見に基づいている。従って、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターを含む核酸分子、並びにＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する化合物を同定するのに有用なスクリーニングアッセイ、及び神経病学的疾患及び精神医学的疾患を治療する方法であって、ＥＡＡＴ２プロモーターモジュレーターの投与を含む当該方法を提供する。
【００２５】
酸性アミノ酸グルタメート(Ｇｌｕ)及びアスパルテートは、哺乳動物の中枢神経系(ＣＮＳ)における主要な興奮性神経伝達物質である。脳内には、これらの興奮性アミノ酸(ＥＡＡ)がミリモル濃度で存在するが、細胞外濃度は、収縮シナプス伝達を容易にしてこれらのＥＡＡの神経毒潜在性を制限するためにマイクロモルの低い範囲に維持されている。Ｎａ+依存性の高親和性トランスポーターのファミリーは、細胞外ＥＡＡの調節及びクリアランスに責任を負っている。
【００２６】
グルタメート及びアスパルテートは、アゴニストＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート(ＮＭＤＡ)、アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート(ＡＭＰＡ)及びカイネートと命名されたリガンドゲート制御されるイオンチャンネルを活性化する。これらのイオン誘起型ＥＡＡレセプターは、迅速なシナプス脱分極を媒介し、多くの他の生理的過程(シナプス可塑性及びシナプス発生を含む)に重要である。ＥＡＡは又、Ｇタンパク質を介して第２メッセンジャー系又はイオンチャンネルと共役している代謝型レセプターのファミリーをも活性化する。ＥＡＡが正常な脳機能に極めて重要であるということは十分確立されている。しかしながら、ＥＡＡの細胞外蓄積及びＥＡＡレセプターの過度の活性化は又、ＣＮＳへの急性傷害において認められる神経細胞死にも寄与するという相当の証拠がある。「興奮毒性」として知られる過程は又、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)を含む慢性の神経退行性疾患において認められる神経喪失にも寄与しうる。
【００２７】
グルタメートの細胞内濃度(５〜１０ｍＭ)及びアスパルテートの細胞内濃度(１〜５ｍＭ)は、細胞外濃度(１〜１０μＭ未満)の１０００〜１０，０００倍である。多くの他の神経伝達物質と異なって、グルタメート又はアスパルテートが、細胞外で代謝されるという証拠はない。それよりも、それらは、ニューロン及び星状細胞内への輸送によって、細胞外スペースから除去される。
【００２８】
Ｎａ+依存性グルタメートトランスポーターの幾つかのサブタイプは、薬理学的ストラテジー及びｃＤＮＡクローニングによって同定された。Ｎａ+依存性の高親和性グルタメート輸送を発現する５つの公知の別個のｃＤＮＡは、ここでは、ＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＣ１／ＥＡＡＴ３、ＧＬＡＳＴ／ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ４及びＥＡＡＴ５として言及される。選択的ｍＲＮＡスプライシングから生じるＧＬＴ−１及びＧＬＡＳＴの更なる異質性の証拠もある。
【００２９】
これらの２つのトランスポーターＧＬＴ−１及びＧＬＡＳＴの発現は、一般に、星状細胞に限られている。他の２つのトランスポーターＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４の発現は、一般に、ニューロンに限られており、そしてＥＡＡＴ５は、網膜に限られると考えられている。前脳で見出されるこれらの３種類のトランスポーター(ＧＬＴ−１、ＧＬＡＳＴ及びＥＡＡＣ１)の内で、ＧＬＴ−１が、脳組織に特異的な唯一のトランスポーターであるようであり、これは、ＧＬＴ−１発現が脳特異的な機構により制御されることを示唆している。
【００３０】
以前には、シナプス前トランスポーターが、シナプス伝達におけるＥＡＡのクリアランスにおいて主要な役割を有すると考えられていた。これは、活性が、シナプトソーム膜調製物において、ミトコンドリア又はミエリン富化画分と比較して２倍富化されるという証拠に基いていた。しかしながら、今や、これらの膜調製物は、再封緘グリア膜及び大量のＧＬＴ−１タンパク質を含むということが知られている。加えて、特定の求心性神経の障害が標的領域内のＮａ+依存性の輸送の減少を生じるということが長く知られている。例えば、線条への皮質投射の障害は、線条体シナプトソームにおける減少した取り込みを生じる。これらの種類の研究は、シナプス終末への有意の輸送があることを示唆したが、一層最近の研究は、これらの障害が、グリア輸送の発現を減少させることを示唆している。
【００３１】
幾つかの相補的なストラテジーからの証拠は、ＧＬＴ−１が、ＣＮＳにおけるＥＡＡのＮａ+依存性の輸送の大部分を媒介することを強く示唆している。例えば、ＧＬＴ−１の薬理学的特性は、ラット脳膜において認められる活性の主要な成分と近似している。ＧＬＴ−１を均質にまで精製するのに必要とされた富化に基いて、ＧＬＴ−１は、全脳タンパク質の約１％に相当すると考えられている。ＧＬＴ−１の可溶化前脳組織からの選択的免疫沈降及びリポソーム二おける残りのタンパク質の再構成は、ＧＬＴ−１が、輸送活性の９０％を媒介することを示唆している。ＧＬＴ−１のアンチセンスノックダウンは、幾つかの前脳領域においてシナプトソームトランスポーター活性の劇的な減少を生じる。遺伝子工学的にＧＬＴ−１を除去したマウスにおけるシナプトソームの取り込みは、正常の５％である。最後に、脳調製物において電流に媒介されるトランスポーターの電気生理学的記録は、ＧＬＴ−１が、幾つかの前脳領域内のシナプス伝達中のグルタメートのクリアランスに主要な役割を有することを強く示唆している。
【００３２】
ＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ２の発現は、イン・ビボ及びイン・ビトロの療法において動的に調節される。ＧＬＴ−１は、生体ＣＮＳにおける主要なトランスポーターであり、発生初期において、発現は、一層低く、ラット及びヒトの両方で、シナプス生成中に増大する。上記のように、特定の標的核に対する突起の傷害は、グリアのトランスポーターＧＬＴ−１及びＧＬＡＳＴの両方の減少した発現を生じる。これらのデータは、ニューロンの存在が、グリアのトランスポーターの発現を誘導し及び／又は維持することを示唆している。
【００３３】
幾つかの異なるグループは、脳卒中及び外傷性脳傷害を含むＣＮＳへの急性傷害の動物モデルにおいて、ＧＬＴ−１及び／又はＧＬＡＳＴの減少した発現を示した。ＧＬＴ−１発現の喪失は、ＡＬＳの患者において示されている。その上、アルツハイマー病及びハンチントン病を含む慢性の神経対抗性疾患を有するヒトにおけるこれらのトランスポーターの減少した発現の証拠がある。ＧＬＴ−１の喪失は又、致死的脳腫瘍であるグリオブラストーママルチフォーマの特徴でもある。
【００３４】
筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)は、皮質内の上位運動ニューロンと脳幹及び脊髄内の下位運動ニューロンの両方の進行性の退行がある成体の運動ニューロン疾患の最も一般的な形態である。ＡＬＳ患者の大部分(９５％)は、明らかに散発性(ＳＡＬＳ)であるが、約５％は、家族性(ＦＡＬＳ)である。Cleveland DW, Rothstein JD., Nat.Rev.Neurosci.(2001); 2:806-819；Kuncl RW, Crawford TO, Rothstein JD, Drachman DB. Motor neuron diseases. (Asbury AK等、編、Diseases of the Nervous System. 第二版、Philadelphia中)：W.B. Saunders, 1992:1179-1208. FALS cases were found to be associated with mutations in SOD-1. Andersen PM等、Genetics of amyotrophic lateral sclerosis; an overview (Brown RH, Jr., Meininger V, Swash M, 編、 Amyotrophic lateral sclerosis. London中)：Martin Dunitz, 2000:223-250；Brown RH, Jr. Amyotrophic lateral sclerosis. Insights from genetics. Arch Neurol 1997; 54:1246-1250；Cleveland DW, Rothstein JD, Nat.Rev.Neurosci. 2001; 2:806-819, the gene that encodes copper-zinc superoxide dismutase (CuZnSOD)。ＳＯＤ１変異は、全ＦＡＬＳの約１５〜２０％を説明する。ＳＯＤ１変異は、トランスジェニックマウスモデルＧ９３Ａ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８６Ｒ及びＧ８５Ｒ ＳＯＤ１を生成するために利用されてきた。これらすべては、変異タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、確実な運動ニューロンの退行を生じる。Cleveland DW, Neuron 1999; 24:515-520；Cleveland DW等、Nature 1995; 378:342-343；Cleveland DW, Rothstein JD. Nat.Rev.Neurosci. 2001; 2:806-819。変異型ＳＯＤ１毒性の「下流の」発病事象は、興奮毒性、神経炎症及びアポトーシスを含む。増加して、これらの下流事象は、病気の経過を上首尾に変える幾つかの症例において、薬物療法の標的とされてきた。多くの他の遺伝子又は染色体の配置が、他の変種の家族性ＡＬＳにおいて、同定されている。
【００３５】
家族性ＡＬＳと散発性ＡＬＳの両方に共通することは、大グリア細胞のグルタメートトランスポーターＥＡＡＴ２タンパク質の喪失である。上記のように、この大グリア細胞のトランスポーターＥＡＡＴ２は、シナプスのグルタメートのクリアランスの大部分の原因である主要タンパク質である。特に、ＥＡＡＴ２は、興奮毒性の神経退行に対して防護する。グルタメートの取扱いにおける異常の証拠は、最初、ＡＬＳ患者におけるグルタメートの脳液レベルの大幅な増加の発見から、ＡＬＳにおいて現れた(現在、散発性ＡＬＳ患者の約４０％において報告されている)。Rothstein JD等、Ann.Neurol. 1990; 28:18-25；Spreux-Varoquaux O等、J Neurol Sci. 2002; 193:73-78。ＡＬＳ組織における機能的グルタメート輸送の測定値は、冒されたＡＬＳ脳領域において、顕著な減少を示した。機能的グルタメート輸送の喪失が、大グリア細胞のグルタメートトランスポータータンパク質ＥＡＡＴ２の劇的喪失の結果であることは、ありそうなことであり、それは、最大で散発性ＡＬＳ患者の６５％でありうる。Rothstein JD等、Ann.Neurol. 1994;36:282；Rothstein JD,等、N Engl.J Med 1992; 326:1464-1468；Rothstein JD等、Ann Neurol 1995; 38:73-84。機構によらず、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＥＡＡＴ２の低下は、輸送活性の喪失は、直接、ニューロンの死滅を引き起こすことを示した。その上、少なくとも３種(Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ、Ｇ３７Ｒ)のＳＯＤ１変異体のトランスジェニックマウスにおける発現は、すべて、ＥＡＡＴ２タンパク質及びその機能の喪失へと導く。Rothstein JD等、Neuron 1996; 16:675-686；Rothstein JD等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993; 90:6591-6595。総じて、これらの及び他の研究は、ＥＡＡＴ２の機能喪失(大グリア細胞の機能不全と関係する)が、遺伝性ＡＬＳ及び散発性ＡＬＳの両方における運動ニューロンの喪失に寄与することを示唆している。最近、我々は又、この病気の新しいラットのトランスジェニックモデルにおけるＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ２タンパク質の喪失を文献に発表した。Howland DS等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002; 99:1604-1609。特に、トランスポータータンパク質の喪失は、このラットモデルにおける運動ニューロン及びそれらの軸索の現実の退行に先行する。
【００３６】
最近、２つの研究室が、ＥＡＡＴ２の治療剤としての重要性に関して、重要なデータを提供した。Glen Lin博士は、トランスジェニックマウスにおいて、ＥＡＡＴ２の２倍の過剰発現が、イン・ビトロで、神経防護へと導き、ＡＬＳマウスにおける病気の発症を遅延させるということを報告した。Guo, H.等、Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532。同様に、Margaret Sutherland博士は、ＥＡＡＴ２の５倍過剰発現が、トランスジェニックマウスにおいて、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウスの生存を少なくとも３０日(何匹かは、数カ月)増大させうることを報告した。Maguire JL等、Soc Neurosci Abstr. 2001; 27:607.9；Sutherland M.L.等、Soc Neurosci Abs. 2003。加えて、彼女の研究室は、増大したＥＡＡＴ２が、神経膠腫移植されたゲッ歯類において、発病を減衰させること並びに発病及び腫瘍成長の両方を有意に減少させることもできることを報告している。以下に示したように、我々は、ＥＡＡＴ２の過剰発現が、ＡＬＳマウスにおいて病気の発症を、新規な治療剤を用いて遅延させうることを示唆するデータをも生成した。
【００３７】
たとえＧＬＴ−１発現が、イン・ビボで極めて高くても、培養で維持された「正常な」星状細胞は、本質的に、検出可能なｍＲＮＡ又はタンパク質を発現しない。星状細胞とニューロンの同時培養は、グリア細胞のＧＬＴ−１発現を誘導し、これは、イン・ビトロでは、ニューロンがＧＬＴ−１の発現を誘導し及び／又は維持することを示唆する。ニューロンのこの効果は、少なくとも部分的に、分泌された可溶性分子によって媒介される。ｄｂｃＡＭＰ、上皮成長因子、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド、及びイムノフィリンを含む幾つかの小分子は、このニューロンの効果を真似する。これらのすべての場合において、ＧＬＴ−１タンパク質発現の増加は、ＧＬＴ−１ｍＲＮＡの増加及び星状細胞の形態変化(分化を暗示すると多くの者は考えている)を伴っている。
【００３８】
ｄｂｃＡＭＰの効果は、プロテインキナーゼＡのインヒビターによりブロックされる。ｄｂｃＡＭＰ、上皮成長因子又はニューロン調整培地により誘導されるＧＬＴ−１発現の増加は、すべて、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのインヒビター又は転写因子ＮＦ−κＢのインヒビターによってブロックされるということが示されている。他には、ＧＬＴ−１発現を実際に制御する機構に関しては、僅かのことしか知られていない。従って、ＥＡＡＴ２プロモーターの同定は、ＥＡＡＴ２調節を理解し、その合成を制御するためのアッセイを開発するための価値あるツールを提供する。
【００３９】
ここで用いる場合、用語「ＥＡＡＴ２」は、ヒトの大グリア細胞のグルタメートトランスポーター２遺伝子を指す。例えば、米国特許第５，６５８，７８２号を参照されたい。該米国特許は、ヒトＥＡＡＴ２のｃＤＮＡ配列を開示しており、その開示を本明細書中に参考として援用する。ここで用いる場合、用語「ＧＬＴ−１」は、ゲッ歯類の大グリア細胞のグルタメートトランスポーター２遺伝子を指す。
【００４０】
ここで用いる場合、用語「プロモーター」は、一般に、通常、ｍＲＮＡ転写部位の５’側に見出されるゲノムＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、ｍＲＮＡ転写のタイミング及びレベルの調節に関与し、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの細胞性タンパク質の結合部位を含む。ここでは、交換可能に用いるが、用語「ＥＡＡＴ２プロモーター」、「ＴＡＡＴ２プロモーター領域」などは、ＥＡＡＴ２ｍＲＮＡ転写開始部位の５’側に見出されるゲノムＤＮＡの領域を含む。好適具体例において、このＥＡＡＴ２プロモーターは、SEQ ID NO:１、２、３若しくは４、又はこれらの断片を含む。プロモーターレスレポーター構築物に挿入された場合には、好適なＥＡＡＴ２プロモーター断片は、このレポーター遺伝子の転写を指示することができる。
【００４１】
一具体例において、このＥＡＡＴ２プロモーターは、SEQ ID NO:１を含む(例えば、SEQ ID NO:１のヌクレオチド１〜４６９６)。他の具体例において、ＥＡＡＴ２プロモーターは、Ｐ１領域を含み、それは、SEQ ID NO:１のヌクレオチド７３３〜３４５０を含む(SEQ ID NO:２としても示してある)。他の具体例において、ＥＡＡＴ２プロモーターは、Ｐ２領域を含み、これは、SEQ ID NO:１のヌクレオチド７３３〜３１８６を含む(SEQ ID NO:３としても示してある)。更に別の具体例において、ＥＡＡＴ２プロモーターは、Ｐ３領域を含み、これは、SEQ ID NO:１のヌクレオチド２５９０〜３４５０を含む(SEQ ID NO:４としても示してある)。
【００４２】
本発明のＥＡＡＴ２プロモーター活性化分子は、神経病学的疾患及び精神医学的疾患の治療剤を提供する。ここで用いる場合、用語「神経病学的疾患」は、神経系(例えば、中枢神経形)に影響を及ぼす病気を含む。本発明によって治療することのできる神経病学的疾患は、興奮毒性と関連することが報告されてきた特定の疾患を含む。特に、含まれるのは、運動ニューロン機能に影響を及ぼす神経病学的疾患である。神経病学的疾患には、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、トリヌクレオチド反復拡張疾患(例えば、ハンチントン病(ＨＤ)、脊髄及び延髄筋萎縮症、１、２、６及び７型脊髄小脳失調症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、及びマチャド−ジョセフ病)、α−シヌクレイン症(例えば、パーキンソン病(ＰＤ)、レーヴィ小体を伴う痴呆症(ＤＬＢ)、及び多系統萎縮症(ＭＳＡ))、多発性硬化症(ＭＳ)、アルツハイマー病、脳腫瘍(例えば、神経膠芽細胞腫)、脳卒中／虚血、脳血管病、癲癇(例えば、側頭葉癲癇)、ＨＩＶ関連痴呆症、コルサコフ病、慢性的疼痛、神経性疼痛、疼痛性神経障害、頭痛(例えば、偏頭痛)、ピック病、進行性上核麻痺、クロイツフェルトーヤコプ病、ベル麻痺、睡眠異常、緑内障、及びメニエール病が含まれるが、これらに限られない。
【００４３】
加えて、本発明のＥＡＡＴ２プロモーター活性化分子は、学習及び記憶などの脳機能と関連する正常なグルタメート神経伝達の調節のための治療剤を与える。ここに記載したこれらの分子は、記憶及び学習を増進させるような治療を必要とする患者に投与することができる。
【００４４】
ここで用いる場合、用語「精神医学的疾患」は、心の病気及び障害を指し、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders  第四版(ＤＳＭ−ＩＶ)(米国精神医学会、Washington D.C.(1994)刊)に列記されている病気及び障害が含まれる。精神医学的障害には、不安障害(例えば、急性ストレス異常広所恐怖症、全身性化不安障害、強迫性障害、パニック性障害、外傷後ストレス障害、分離不安障害、社会恐怖症及び行為恐怖症)、幼児期障害(例えば、注意欠陥／多動性障害、行為障害、及び反抗性障害)、摂食障害(例えば、神経性無食欲症、双極性障害、循環病、気分変調障害、及び大鬱病)、人格異常(例えば、反社会的人格異常、回避性人格障害、境界性人格障害、依存性人格障害、演技性人格障害、自己愛性人格障害、強迫性人格障害、妄想性人格障害、分裂性人格障害及び分裂型人格障害)、精神病(例えば、短期精神障害、妄想性障害、分裂情動性障害、分裂病様障害、精神分裂病、及び共有精神病障害)、物質関連障害(例えば、アルコール依存症、アンフェタミン依存症、大麻依存症、コカイン依存症、幻覚剤依存症、吸入剤依存症、ニコチン依存症、オピオイド依存症、フェンシクリジン依存症及び鎮静剤依存症)、適応障害、自閉症、譫妄症、痴呆症、多発脳梗塞性痴呆症、学習及び記憶障害(例えば、健忘症及び加齢関連記憶喪失)、及びトゥーレット障害が含まれるが、これらに限られない。
【００４５】
記したように、特定の関心ある神経病学的及び精神医学的障害には、グルタメートなどの興奮毒性アミノ酸の異常な放出及び除去と関連するものが含まれる。幾つかのＣＮＳのニューロン型は、特にグルタメートによって悪影響を受ける。例えば、Choi, D.W.(1988) Neuron 1:623；及びその中で引用された参考文献を参照されたい。特に好適な神経病学的障害には、ＡＤ、ＨＤ、ＰＤが含まれるが、ＡＬＳが特に好適である。
【００４６】
ＩＩＩ．スクリーニングアッセイ
この発明は、モジュレーター即ち、ＥＡＡＴ２プロモーターに結合し及び／又は例えばＥＡＡＴ２プロモーター活性に対する刺激若しくは阻害効果を有する候補又は試験化合物又は薬剤(例えば、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、又は他の薬物)を同定する方法(ここでは、「スクリーニングアッセイ」とも呼ぶ)を提供する。
【００４７】
一具体例において、この発明は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性のモジュレーターである候補又は試験化合物のスクリーニングのためのアッセイを提供する。他の具体例において、この発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターに結合し又はその活性を調節する候補又は試験化合物のスクリーニングのためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、下記を含む当分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチの何れかを利用して得ることができる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な平行固相及び溶液相ライブラリー；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を利用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーに限られるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, K.S.(1997) Anticancer Drug Des. 12:45)。
【００４８】
分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、DeWitt等(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909；Erb等(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermann等(1994) J.Med.Chem. 37:2678；Cho等(1993) Science 261:1303；Carrell等(1994) Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2059；Carell等(1994) Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2061；及びGallop等(1994) J.Med.Chem. 37:1233に見出すことができる。
【００４９】
化合物のライブラリーは、溶液中に存在してよいし(例えば、Houghten(992) Biotechniques 13:412-421)、又はビーズ(Lam(1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993)Nature 364:555-556)、細菌(Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号)、胞子(Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号)、プラスミド(Cull等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)又はファージ(Scott及びSmith(1990) Science 249:386-390)上に存在してもよい；(Devlin(1990) Science 249:404-406)；(Cwirla等(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382)；(Felici(1991) J.Mol.Biol. 222:301-310)；(Ladner前出)。
【００５０】
好適具体例において、アッセイは、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその部分に機能的に結合されたレポーター遺伝子(例えば、その発現は、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその部分の制御下にある)を発現する細胞を試験化合物と接触させて、該試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する能力を測定する、細胞ベースのアッセイである。試験化合物の、ＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する能力の測定は、レポーター遺伝子の発現(例えば、レポーターｍＲＮＡ又はポリペプチド発現レベル)又は例えば活性をモニターすることにより達成されうる。ここ又は他所に記載のように、このレポーターは、任意の検出可能なレポーターであってよい。例えば、このレポーターは、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー伸張又はヌクレアーゼ防護アッセイによって発現を測定することのできる核酸配列であってよい。このレポーターは又、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイによって発現を測定することのできるポリペプチドをコードする核酸配列であってもよい。レポーター発現は又、レポーターによりコードされるポリペプチドの活性を、例えば標準的グルタメートトランスポートアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、β−ガラクトシダーゼアッセイ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)アッセイ、又は蛍光タンパク質アッセイを利用して測定することによってもモニターすることができる。
【００５１】
候補の化合物の存在下でのＥＡＡＴ２プロモーターの制御下でのレポーターの発現又は活性のレベルを、候補の化合物の非存在下でのレポーターの発現又は活性のレベルと比較する。次いで、候補の化合物を、この比較に基いて、ＥＡＡＴ２プロモーター活性のモジュレーターとして同定することができる。例えば、レポーターｍＲＮＡの発現又はタンパク質の発現若しくは活性が、候補の化合物の存在下において、非存在下よりも高い(統計的に有意に高い)ならば、その候補の化合物は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性の刺激剤として同定される。或は、レポーターｍＲＮＡ又はタンパク質の発現又は活性が、候補の化合物の存在下において、非存在下よりも低い(統計的に有意に低い)ならば、その候補の化合物は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性のインヒビターとして同定される。
【００５２】
試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーターに結合する能力及び／又はタンパク質(例えば、転写因子)のＥＡＡＴ２プロモーターへの結合を調節する能力も又、測定することができる。試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーターに結合する能力及び／又はＥＡＡＴ２プロモーターの結合タンパク質への結合を調節する能力の測定は、例えば、試験化合物、ＥＡＡＴ２プロモーター又は結合タンパク質を放射性同位元素又は酵素標識と、ＥＡＡＴ２プロモーターの試験化合物又は結合タンパク質への結合を複合体中の標識成分を検出することにより測定することができるように結合させることによって達成することができる。例えば、化合物(例えば、試験化合物、ＥＡＡＴ２プロモーター又は結合タンパク質)を、32Ｐ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は3Ｈで直接又は間接的に標識することができ、その放射性同位元素を放射の直接的計数により又はシンチレーション計数によって検出することができる。或は、化合物を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼにより酵素的に標識して、その酵素標識を、適当な基質の生成物への変換の測定により検出することができる。
【００５３】
化合物(例えば、試験化合物又はＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質)の、ＥＡＡＴ２プロモーターと相互作用する能力を、何れの反応体も標識せずに測定することも又、この発明の範囲内にある。例えば、ミクロフィジオメーターを用いて、化合物とＥＡＡＴ２プロモーターとの相互作用を、その化合物又はＥＡＡＴ２プロモーターを標識することなく検出することができる(McConnell, H.M.等(1992) Science 257:1906-1912)。ここで用いる場合、「ミクロフィジオメーター」(例えば、細胞センサー)は、細胞がその環境を酸性化する速度を、光位置付け可能な電位差センサー(ＬＡＰＳ)を利用して測定する分析用器械である。この酸性化速度の変化を、化合物とＥＡＡＴ２プロモーターの間の相互作用の指標として利用することができる。
【００５４】
他の具体例において、このアッセイは、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその部分を試験化合物と接触させて、その試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーター又はその部分の活性を調節する(例えば、刺激し又は阻止する)能力を測定する無細胞アッセイである。この試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する能力の測定は、例えば、ＥＡＡＴ２プロモーターのＥＡＡＴ２プロモーター標的分子に結合する能力を、直接結合を測定するための上記の方法の一つにより測定することによって達成することができる。ＥＡＡＴ２プロモーターの、ＥＡＡＴ２プロモーター標的分子に結合する能力の測定は又、リアルタイムバイオモレキュラーインターラクションアナリシス(ＢＩＡ)など技術を利用して達成することもできる。Sjolander, S.及び Urbaniczky, C.(1991) Anal.Chem. 63:2338-2345 及び Szabo等(1995) Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705。ここで用いる場合、「ＢＩＡ」は、生体特異的相互作用を、何れの反応体(例えば、ＢＩＡコア)も標識することなく、リアルタイムで研究するための技術である。表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)の光学現象の変化を、生物分子間のリアルタイムの反応の指示として利用することができる。
【００５５】
更に別の具体例において、この無細胞アッセイは、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその部分を、ＥＡＡＴ２プロモーターに結合する公知の化合物(例えば、基本転写装置の成分)と接触させてアッセイ混合物を形成し、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そして試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーターと相互作用する能力を測定することを含み、ここに、該試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーターと相互作用する能力の測定は、ＥＡＡＴ２プロモーターの、ＥＡＡＴ２プロモーター標的分子に優先的に結合し又は該分子の活性を調節する能力を測定することを含む。
【００５６】
本発明の上記のアッセイ法の２以上の具体例において、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその標的分子を固定化して、これらの分子の一方又は両方の未複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易にすること並びにアッセイの自動化に適応させることは好ましい。試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーターへの結合、又はＥＡＡＴ２プロモーターの基質又は標的分子との相互作用を、候補の化合物の存在下及び非存在下で、反応体を含むのに適した任意の容器中で達成することができる。かかる容器の例には、ミクロ滴定プレート、試験管、及びミクロ遠心管が含まれる。一具体例において、これらのタンパク質の一方又は両方がマトリクスに結合されることを可能にするドメインを加える融合タンパク質を与えることができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, ミズーリ、St. Louis在)又はグルタチオン誘導体化されたミクロ滴定プレート上に吸着させ、次いで、それらを試験化合物又は試験化合物及び未吸着の標的タンパク質又はＥＡＡＴ２プロモーターと合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成に導く条件下で(例えば、塩及びｐＨに関して、生理的条件で)インキュベートすることができる。インキュベーション後に、これらのビーズ又はミクロ滴定プレートを洗って、任意の未結合成分を除去し、ビーズの場合、マトリクス固定化された複合体を、例えば上記のようにして直接又は間接的に測定する。或は、これらの複合体を、マトリクスから分離して、ＥＡＡＴ２プロモーターの結合又は活性のレベルを、標準的技術を利用して測定することができる。
【００５７】
他のタンパク質又は核酸をマトリクス上に固定化する技術を、この発明のスクリーニングアッセイにおいて利用することもできる。例えば、ＥＡＡＴ２プロモーター又はＥＡＡＴ２プロモーターの基質若しくは標的分子を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化ＥＡＡＴ２プロモーター、基質又は標的分子を、当分野で公知の技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, イリノイ、Rockford在)を利用して、ビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド)から調製して、ストレプトアビジンコートした９６ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル内に固定化することができる。或は、ＥＡＡＴ２プロモーター又は標的分子と反応性であるがＥＡＡＴ２プロモーターのその標的分子への結合を邪魔しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化して、未結合の標的又はＥＡＡＴ２プロモーターをそれらのウェル内に抗体結合によってトラップすることができる。かかる複合体を検出する方法には、ＧＳＴ固定化複合体につき上記したもの以外に、ＥＡＡＴ２プロモーター又は標的分子と反応性の抗体を利用する複合体の免疫検出、並びにＥＡＡＴ２プロモーター又は標的分子と結合した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【００５８】
この発明の更に別の面において、ＥＡＡＴ２プロモーターを、ワンハイブリッドアッセイ(例えば、BD Matchmaker One-Hybrid System (1995) Clontechniques X(3):2-4；BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit (2000) Clontechniques XV(4):5-7；BD SMART technology overview (2002) Clontechniques XVII(1):22-28；Ausubel, F.M.等(1998 以下参照) Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, F.M.等編、第13.4.1−13.4.10頁参照)における「餌」として利用して、ＥＡＡＴ２プロモーターに結合し又は該プロモーターと相互作用するタンパク質(「ＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質」又は「ＥＡＡＴ２プロモーター−ｂｐ」)及びＥＡＡＴ２プロモーター活性に関与するタンパク質を同定することができる。かかるＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質が、ＥＡＡＴ２プロモーターからの転写の調節に関与するということも又、ありそうなことである。
【００５９】
他の面において、この発明は、ここに記載した２つ以上のアッセイの組合せに関係する。例えば、調節剤を、細胞ベースのアッセイ又は無細胞アッセイを利用して同定することができ、該剤の、ＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する能力を、イン・ビボで例えば動物例えば神経病学的疾患の動物モデルにおいて確認することができる。
【００６０】
この発明は、更に、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤に関係する。従って、ここに記載したようにして同定された薬剤を更に、適当な動物モデル(例えば、神経病学的疾患についての動物モデル)において利用することは、この発明の範囲内にある。例えば、ここに記載したようにして同定された薬剤(例えば、ＥＡＡＴ２プロモーター調節剤又はＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質)を、動物モデルにおいて利用して、かかる薬剤を用いる治療の効力、毒性又は副作用を測定することができる。或は、ここに記載したようにして同定された薬剤を、動物モデルにおいて利用して、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。その上、この発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の、ここに記載したような治療のための利用に関係する。
【００６１】
ここに詳述したスクリーニング法を利用して同定される薬剤を、ここに記載する。これらの化合物は、ここで同定されたような様々な化学構造を含んでおり、β−ラクタム環系を有する化合物、一層詳細には、ペニシリンクラス、セファロスポリンクラス、カルバペナムクラス及びモノバクタムクラスの化合物を含むβ−ラクタム抗生物質化合物が含まれる。
【００６２】
ＩＶ．治療方法
一具体例において、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターモジュレーターを含む医薬組成物の治療上有効な量を患者(例えば、哺乳動物例えばヒト)に投与することを含む神経病学的疾患及び精神医学的疾患を治療する方法を提供する。
【００６３】
ＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節するため、及びそれによりＥＡＡＴ２遺伝子発現を調節するために、例えば、ここに開示し又はこの発明のスクリーニングアッセイにより同定した化合物を、細胞又は患者に投与することができる。ＥＡＡＴ２プロモーターモジュレーターの哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)への投与は、ＥＡＡＴ２ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの発現を調節する(例えば、アップ又はダウンレギュレートする)ことができ、それにより、細胞へのグルタメートの輸送をアップ又はダウンレギュレートすることができる。かかる方法においては、ＥＡＡＴ２プロモーターを、公知の手順によって哺乳動物(ヒトを含む)に投与することができる。
【００６４】
この発明の好適な治療方法(予防処置を含む)は、一般に、治療上有効な量のＥＡＡＴ２プロモーターモジュレーターの、それを必要とする動物(哺乳動物特にヒトを含む)への投与を含む。かかる治療は、神経病学的疾患又は精神医学的疾患を患い、有し、有する疑いがあり又は該疾患の危険にある患者(特に、ヒト)に対して適切に施与されよう。この発明のＥＡＡＴ２プロモーターモジュレーターは又、任意の他のＥＡＡＴ２が関係しうる疾患の治療においても利用することができる。
【００６５】
治療適用のために、この発明のＥＡＡＴ２モジュレーターは、患者例えば哺乳動物(特に、ヒト)に対して、単独で又は医薬組成物(ＥＡＡＴ２モジュレーターを一種以上の許容しうるキャリアー及び適宜他の治療用成分と共に含む)の部分として適切に投与することができる。この(これらの)キャリアーは、この配合物の他の成分と相容性であり且つ受容者に対して有害でないという意味において、「許容しうる」ものでなければならない。
【００６６】
この発明の医薬組成物には、経口投与、直腸投与、鼻投与、局所投与(頬及び舌下を含む)、膣投与又は非経口投与(皮下、筋肉、静脈及び皮内投与を含む)に適したものが含まれる。これらの配合物は、便利に、単位投薬量形態例えば錠剤及び持続的放出用カプセルで、及びリポソームで与えることができ、製薬分野で周知の任意の方法によって調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, (第１７版、1985)(Mack Publishing Company, ペンシルベニア、Philadelphia在)を参照されたい。
【００６７】
かかる製造方法は、少なくとも一種の従属的成分を構成する成分(例えば、キャリアー)を、投与すべき分子と合わせるステップを含む。一般に、これらの組成物は、活性成分を液体キャリアー、リポソーム若しくは微粉固体キャリアーと又は両者と均一に且つ完全に合わせ、必要であればその後生成物を付形することによって調製される。
【００６８】
経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル、サッシェ又は錠剤などの分離したユニット(各々は、予め決めた量の活性成分を含む)として；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油液体エマルジョン又は油中水液体エマルジョンとして与え(又は、リポソームに詰め)及びボーラスなどとして与えることができる。
【００６９】
錠剤は、加圧又は型成形(適宜、一種以上の付属的成分を加える)によって製造することができる。加圧錠剤は、粉末または顆粒などの易流動性形態の活性成分を適当な機械で加圧し、適宜、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、表面活性剤又は分散剤を混合することにより製造することができる。型成形した錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤化した粉末化合物の混合物を適当な機械で型成形することにより製造することができる。これらの錠剤は、適宜、被覆し又は切れ目を入れることができ、内部の活性成分のゆっくりした又は制御された放出を与えるように配合することができる。
【００７０】
局所投与に適した組成物には、風味をつけた基剤(通常、シュークロース及びアラビアゴム又はトラガカントゴム)中に成分を含む菓子錠剤；及びゼラチン及びグリセリン又はシュークロース及びアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。
【００７１】
非経口投与に適した組成物には、水性及び非水性の無菌注射溶液(抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び意図するレシピエントの血液と等張の配合物を与える溶質を含んでよい)；及び水性及び非水性の懸濁液(沈殿防止剤及び増粘剤を含んでよい)が含まれる。これらの配合物は、単位投与又はマルチ投与コンテナ(例えば、密封されたアンプル及び小瓶)で与えることができ、凍結乾燥条件にて貯蔵することができる(注射のためには、使用直前に無菌の液体キャリアー例えば水の添加だけを必要とする)。即時的注射溶液及び懸濁液を、無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【００７２】
主題の治療剤の適用は、しばしば、関心ある部位での投与であるように、局所的であろう。注射、カテーテル、套管針、投射物、プルロニックゲル、ステント、持続的薬物放出用ポリマー又は他の内部アクセスを与える装置の利用などの様々な技術を、主題の組成物を関心ある部位に供給するために利用することができる。患者からの分離の故に、臓器又は組織に接近しやすい場合には、かかる臓器又は組織を、主題の組成物を含む媒質に浸すことができ、主題の組成物を該臓器に塗ることができ、又は任意の都合の良い方法で塗布することができる。
【００７３】
所定の治療で用いられるこの発明の所定のＥＡＡＴ２モジュレーターの実際の好適な量は、利用する特定の活性化合物、配合された特定の組成物、適用の仕方、投与する特定の部位、患者の体重、一般的健康状態、性別などにより、処置される特定の適応症などにより、及び付き添いの医師又は獣医師を含む当業者に認められている他の因子により変化するということは認められよう。投与の所定のプロトコールに最適の投与速度は、当業者が慣用の投薬量決定試験を利用することによって容易に決定することができる。
【００７４】
この発明を、下記の実施例において、更に記載する。これらの実施例は、説明目的のためのみのものであって、この発明を制限するものと解釈すべきではないということは理解されるべきである。
【実施例】
【００７５】
実施例１：ＥＡＡＴ２タンパク質発現のイン・ビトロ分析
ＥＡＡＴ２タンパク質過剰発現についてのスクリーニングアッセイ。脊髄器官培養及び大グリア細胞培養を利用して、ＥＡＡＴ２の合成及び機能を刺激することのできる薬物につきスクリーニングする。器官培養は、ニューロン−大グリア細胞相互作用の正常な構造がイン・ビトロで維持され且つそれらが出生直後の組織から誘導され、それ故、それらはイン・ビボにおける大グリア細胞応答を(胎児細胞より)一層よく反映しうるという利点を与える。従って、星状細胞に作用するか又はニューロンに星状細胞を変える因子の分泌を誘導する薬物は、薬物の動物の全身への送達の「自然な」状態を一層よく反映する。
【００７６】
バイオアッセイ法(アッセイの説明の要約は、図２を参照されたい)
脊髄器官培養。脊髄の器官培養は、過去に、我々によって詳細に記載されてきた。Rothstein JD等、N.Engl.J.Med. 1992; 326:1464-1468。簡単にいえば、ラットの腰部脊髄の３００μｍ切片(生後８〜１０日目のラット)を、ミリポアミリセルＣＭ半透膜上に置く。各ウェルは、５枚のスライスを含む(図２Ａ)。５０〜１００の培養物を、毎週、用意することができる。各薬物(１０〜１００μＭ)を、３日間、細胞培養培地／血清と共に添加した。培養物を収穫して、５〜５０μｇの組織を、過去に記載された標準的ウエスタンブロッティング／化学発光法によるＥＡＡＴ２の検出のために、スロットブロット装置に加えた。Kuncl RW等、Motor neuron diseases. (Asbury AK等編、Diseases of the Nervous System. 第二版、Philadelphia: W.B. Saunders, 1992:1179-1208中)；Rothstein JD等、Neuron 1994; 13:713-725。すべての抗ペプチド抗体は、アフィニティー精製して、トランスポーター亜種に関して高度に特異的であった。典型的なスロットブロット分析を、図２Ｂ、Ｃに示してある。この方法により、我々は、確実に、発現されるタンパク質の５０％を超える増加を検出することができる。各抗体のスロットブロットにつき、用いたホモジェネートは、以前の標準曲線に基き、抗体検出に関して直線的範囲内にあることが予想される。
【００７７】
スクリーニングライブラリーアッセイのデザイン。これらの最初の研究についての化合物のライブラリーは、NINDS Custom Collection from Microsource Discoveryであった。このライブラリーは、９６ウェル中の１０４０の化合物よりなり、それは又、トランスポーターの合成についての陽性対照(ジブチリルサイクリックＡＭＰ[ｄｂｃＡＭＰ]、ＧＤＮＦ)をも含んでいた。このライブラリーは、数百の顕著な薬物と生化学的標準の同時の評価を可能にする公知の生物活性な化合物のユニークなコレクションである。各化合物を、１０〜１００μＭの終濃度で研究した。全アッセイを、二連で行なった。典型的なスロットブロットを図２Ｃに示してある。
【００７８】
データ分析。すべてのブロットをレーザーデンシトメトリー(BioRad イメージクオント)により分析して、二連の点を平均した。１０４０の化合物からの完全な結果のデータセットを、図２Ｄに示してある。各ブロットは、陽性対照標準(例えば、ｄｂｃＡＭＰ)及び陰性対照標準(例えば、血清、ＤＭＳＯ)を含んだ。データを、数値／テキストコーディングシステムを利用して、エクセルのスプレッドシートに保存した。すべての陽性の薬物(タンパク質発現における少なくとも５０％増加として陽性を定義する)を、再評価した。
【００７９】
結果：スクリーニングした薬物は、イン・ビトロでＥＡＡＴ２を増大させることができる。１０４０の化合物をスクリーニングした後に、我々は、ＥＡＡＴ２タンパク質レベルを３．５〜７倍増大させることのできる、１０より多くの関連化合物を同定することができた(図２Ｅ参照)。全体で、我々は、ＥＡＡＴ２を２倍以上増大させることのできる、８０の化合物を最初のスクリーニングで同定した。この一覧の内で、β−ラクタム抗生物質は、過度に表され、すべての化合物で認められた最も一般的な構造モチーフであり、１５の異なるβ−ラクタム抗生物質が活性であった。図２Ｅに示したように、これらのβ−ラクタムは、すべてＥＡＡＴ２タンパク質発現を増大させることができた。追跡投与量応答分析(図２Ｆ)は、タンパク質発現についてのセフトリアキソンのＥＣ50が３．５μＭであることを示した。
【００８０】
実施例２：ＥＡＡＴ２プロモーターレポーターの活性化
ＣＯＳ７及びヒト大グリア細胞プロモーターレポーター細胞株の生成。
ＥＡＡＴ２プロモーター(Ｅ２Ｐ)の単離及びレポーターの生成。２．７ｋｂのＥＡＡＴ２プロモーター断片を、ＰＡＣクローンＲＰ４−６８３Ｌ５をＫｐｎ１及びＮｃｏ１により切断することによって得た。以前の研究は、ＥＡＡＴ２コード領域の５’側がプロモーター、モチーフを有して、イン・ビトロで活性化されうることを文書で示している。このプロモーターを、ｐＧＬ−塩基性ルシフェラーゼレポーターベクター(Promega)(ｐＥ２Ｐ−ＧＬ３と呼ぶ)中又はｐＥＧＦＰ−１プラスミド(Clontech)(ｐＥ２Ｐ−ｅＧＦＰと称する)中にクローン化した。Ｅ２Ｐは又、ｐＬｃｋ−ｅＧＦＰプラスミド(膜をｅＧＦＰタンパク質の標的とするｅＧＦＰのミリストイル化バージョン)中にもクローン化した。最後に、Ｅ２Ｐを、ｐＥ２Ｐ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−Ｌｃｋ−ｅＧＦＰプラスミド中にもクローン化した。該プラスミドは、ｐＥ２Ｐ−ＧＬ３からの断片Ｅ２Ｐ−ルシフェラーゼを有し、その後にＩＲＥＳ(内部リボソームエントリー部位)を有し、その後にＬｃｋ−ｅ−ＧＦＰを有する(ｐＥＬＩＬＥという)。この最後の構築物において、Ｅ２Ｐは、ルシフェラーゼとｅＧＦＰの両者の同時の発現を駆動する。
【００８１】
Ｅ２Ｐ−ｅＧＦＰ及びＢａｃ−ＥＡＡＴ１−ｅＧＦＰトランスジェニックマウスの生成(図３)。これらのアッセイのためのスクリーニング用細胞株を用意するために、我々は、今や、上首尾に、ＥＡＡＴ２プロモーター断片(Ｅ２Ｐ)又は完全長ＥＡＡＴ１プロモーター(Ｂａｃ−ＥＡＡＴ１)を発現する２匹のトランスジェニックマウスを生成した。図３に示したように、我々は、ＣＮＳにおけるＥＡＡＴ２プロモーターレポーターの広範な発現を示すＥ２Ｐトランスジェニックマウスを生成した。同様に、我々は、Ｂａｃ−ＥＡＡＴ１マウス及び発現細胞を生成した。最近、Heintzのグループも、我々のマウスにおいて類似のＢａｃ構築物を利用して、ＥＡＡＴ１Ｂａｃ−レポーターベースのマウスを、該構築物ベースに生成した。
【００８２】
スクリーニングアッセイ。リポフェクタミン２０００試薬を利用して、Ｃｏｓ−７及びＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトした。ヒトの皮質大グリア細胞を、我々の同僚のAvi Nath博士から得た。ＥｐＥ２Ｐ−ｅＧＦＰ、ｐＥ２Ｐ−Ｌｃｋ−ｅＧＦＰ及びｐＥＬＩＬＥは、安定な細胞株の樹立を可能にしたネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる。これらのヒト大グリア細胞に対して、ＳＶ４０を利用して、該細胞を不死化した。安定にトランスフェクトされた細胞を、２４ウェルプレートに播種して、１０μＭの化合物の溶液と共に４８時間インキュベートし、そして蛍光強度を自動化リーダー(SpectraGeminiXS)を用いて記録した。
【００８３】
結果：ＥＡＡＴ２プロモーター活性化化合物の同定(図４)。元のＮＩＮＤＳスクリーニングから、我々は、ＥＡＡＴ２プロモーターを強力に活性化することのできる多くのβラクタム化合物を同定した。図４に示したように、殆どのβ−ラクタムは、ＥＡＡＴプロモーターを、公知の陽性対照のジブチリルサイクリックＡＭＰよりも遥かに増大させることができた。すべての化合物は、１〜１０μＭの薬理学的に適当な濃度で活性であった。これは、これらの化合物が、標準的抗細菌療法(例えば、セフトリアキソン)後に、ＣＮＳ内で見出されうる濃度範囲である。
【００８４】
実施例３：ＥＡＡＴ発現／機能のイン・ビボ活性化
タンパク質発現／機能のイン・ビボ活性化は、セフトリアキソンを試験化合物として用いて、下記の実施例で詳述したように評価することができる。
【００８５】
セフトリアキソンは、脳のＧＬＴ１レベルを増大させる(図５)。フェーズ１及び２で同定された薬物が実際にイン・ビボでＥＡＡＴ発現を誘導しうるかどうかを測定するために、我々は、毎日、セフトリアキソンをラット(ｎ＝５)(及びマウス、ｎ＝３)に投与した。セフトリアキソンを、２００ｍｇ／ｋｇ ｉｐのＣＮＳレベルへと導くことが知られている投与量で投与した。５日間毎日投与した後に、動物を犠牲にして、脳組織を収穫した。図５Ａ、Ｂに示したように、セフトリアキソン療法は、脳ＧＬＴ１レベルの３倍増へと導く(並びに、その正常スプライシング産物のＧＬＴ１ｂ)。この増加は、イン・ビトロで見られたプロモーター活性化の結果に匹敵する(図４)。大グリア細胞のグルタメートトランスポーターＧＬＡＳＴ並びに２種のニューロンのグルタメートトランスポーターＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４のウエスタンブロットは、セフトリアキソン療法後に、トランスポーター発現の変化を示さなかった(図５Ｃ、Ｄ)。同様に、構成的タンパク質のアクチンは、セフトリアキソン投与によって変化しなかった(図５Ａ、Ｃ)。
【００８６】
セフトリアキソンは、脳ＧＬＴ１レベルを増大させる(図５)。フェーズ１及び２で同定された薬物が、実際に、イン・ビボでＥＡＡＴ発現を誘導しうるかどうかを測定するために、我々は、セフトリアキソンを、毎日、ラット(ｎ＝５)(及びマウス、ｎ＝３)に投与した。セフトリアキソンを、２００ｍｇ／ｋｇ ｉｐのＣＮＳレベルへと導くことが知られている投与量で投与した。５日間毎日投与した後に、動物を犠牲にして、脳組織を収穫した。図５Ａ、Ｂに示したように、セフトリアキソン療法は、脳ＧＬＴ１レベルの３倍増へと導く(並びに、その正常スプライシング産物のＧＬＴ１ｂ)。この増加は、イン・ビトロで見られたプロモーター活性化の結果に匹敵する(図４)。この効果は、トランスポーター特異的であったか？大グリア細胞のグルタメートトランスポーターＧＬＡＳＴ並びに２種のニューロンのグルタメートトランスポーターＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４のウエスタンブロットは、セフトリアキソン療法後に、トランスポーター発現の変化を示さなかった(図５Ｃ、Ｄ)。同様に、構成的タンパク質のアクチンは、セフトリアキソン投与によって変化しなかった(図５Ａ、Ｃ)。
【００８７】
実施例４：化合物の神経防護
プロモーター活性化薬物によるＥＡＡＴ２の増大した発現により与えられる潜在的神経防護を評価するために、我々は、幾つかのイン・ビトロ及びイン・ビボの実験を行なった(該実験では、グルタメート毒性が、神経死に寄与する)。神経防護は、下記の実施例で詳述したようにして、β−ラクタム抗生物質を試験化合物として利用して評価することができる。
【００８８】
虚血のイン・ビトロモデル − 酸素グルコース欠乏(図７Ａ) 酸素グルコース欠乏(ＯＧＤ)のイン・ビトロモデルは、周知であり、急性神経傷害の十分認められたモデルである。我々の虚血のイン・ビトロモデルにおいて、１時間の酸素グルコース欠乏(ＯＧＤ)は、培養ニューロンにとって致死的であり、過剰のグルタメートを含むことが知られた毒性を伴う。しかしながら、これらの培養物を、一過性のＯＧＤ(５分間)により、致死的条件の２４時間前に、予め処理しておくと、細胞死に対するニューロンの劇的且つ確固たる耐性がある。このデータは、この神経防護が、部分的に、ＧＬＴ１の増大した発現のためでありうることを示している。
【００８９】
方法。一次皮質混合神経グリア細胞培養物を、妊娠１４〜１６日のＣＤ１マウスから準備する。これらの培養物の、マウス胎児の皮質からの準備は、十分に記載されている。実験を、イン・ビトロで、１３〜１５日目に行う。実験条件にて、培養物を、酸素グルコース欠乏(ＯＧＤ)(虚血のイン・ビトロモデル)にかける。皮質細胞を、対照用処理(培地の、グルコースを含み、５％ＣＯ2、９５％Ｏ2を通気した改変アール平衡化塩溶液を、治療グループと一緒に換えるが、ＯＧＤは、行わない)又は５分間(亜致死)のＯＧＤ(グルコースを欠き、１０％Ｈ2、８５％Ｎ2及び５％を通気して酸素除去した改変アール平衡化塩溶液を使用)の何れかにかける。嫌気性条件を、３７℃の嫌気性チャンバーを利用して達成する。ＯＧＤを、培地を交換して酸素化生育用培地に戻すことによって終了する。上記の２４時間後に、皮質細胞を、何も処理しないか又は１時間のＯＧＤにかける。ニューロンの生存を、生体蛍光染料ヨウ化プロピジウム(ニューロン死の指標)及びヘキスト３３３４２(全ニューロン数の指標)で染色した後に、コンピューター補助された細胞計数によって測定して、細胞死のパーセントとして提供する。一層低い強度にあるグリア細胞の核の蛍光は、ゲートで排除される。薬物(セフトリアキソン １μＭ)を、最初の実験条件の２４時間前に加え、そうして、１時間のＯＧＤの開始の４８時間前に培養培地中にあった。１時間のＯＧＤの後に、細胞を、薬物を含まない生育用培地に戻す。
【００９０】
セフトリアキソン神経防護。培養におけるベースラインの神経細胞死は、図７Ａの未処理の柱(ＮＴ)に示したように、１４％である。データは、一つの実験における別々のウェルの平均神経細胞死として与えてある。１μＭのセフトリアキソンは(これらの培養物に４８時間にわたって加えた場合)、ベースラインの細胞死を増加させない(ＮＴ＋セフトリアキソン)。培養物を１時間のＯＧＤにかけた場合には、神経細胞死は(予想通りに)、劇的に、約５０％まで増大させる。培養物を、１時間のＯＧＤの２４時間前に５分間予備調整した場合には、細胞死のパーセントは、未処理条件に匹敵し、この条件におけるニューロンの虚血に対する耐性を示している。これは、虚血耐性の周知の現象である。重要なことに、１μＭのセフトリアキソンは(１時間のＯＧＤの４８時間前に加えた場合)、やはりニューロンを細胞死から防護して、神経細胞死のパーセンテージを５０％から２０％に減少させる(虚血耐性神経防護に類似)。従って、セフトリアキソン予備処理は、虚血耐性にて神経細胞氏を防ぐようである。
【００９１】
慢性の運動ニューロン退行のイン・ビトロモデル(図７Ｂ)。非特異的インヒビターのスレオヒドロキシアスパルテート(ＴＨＡ)又はＴＢＯＡを利用する脊髄の器官培養におけるグルタメート輸送の遮断に基づく慢性のニューロン退行のモデルを利用した。培養物のＴＨＡ(又はＴＢＯＡ)との不断のインキュベーションは、細胞外グルタメートの不断の増加及びその後の運動ニューロンのゆっくりした死(４週間にわたる)へと導く。脊髄の器官培養モデルを開発して、グルタメート媒介の毒性の面(及び治療)を研究した。それは、臨床前の薬物の同定において有用であった(唯一のＦＤＡ承認されたＡＬＳ用薬物であるリルゾール、及び一層最近のセレコキシブを含む)。グルタメートトランスポーターＧＬＴ１の遺伝子過剰発現(例えば、トランスフェクション又は導入遺伝子過剰発現)による増大した発現は、この系において、運動ニューロン死を防ぐことができ(示さない)、トランスジェニック動物においてニューロン細胞死を防ぐことができる。Guo H.等、Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532。
【００９２】
薬物がＧＬＴ１プロモーターの活性化を誘導したかどうか及びその後のＧＬＴ１タンパク質の過剰発現が神経防護的でありうるかどうかを決定するために、我々は、脊髄器官パラダイムを利用した。脊髄器官培養を、前に記載したように、８日齢のラット腰部脊髄から用意した。Rothstein JD等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993; 90:6591-6595。セフトリアキソンを培地交換と共に加えた。薬物は、培養調製後の最初の７日間は加えなかった。その後、ＴＨＡを実験用培養物に、３〜４週以内に運動ニューロン死を生じる１００μＭの濃度で加えた。様々な濃度のセフトリアキソンを示したように加えて、０〜１００μＭの終濃度を達成した。実験は、常に、対照用脊髄培養物(即ち、薬物を加えてないもの)、ＴＨＡのみのもの、セフトリアキソンのみのもの、及びセフトリアキソン＋ＴＨＡのものを用いて行った。各濃度のセフトリアキソンでの実験を、３〜５回繰り返した。示した濃度でＴＨＡ及びセフトリアキソンを含む培地を、週２回交換した。４週間後に、培養物を固定して、免疫染色して(ＳＭＩ−３２、Sternberger)、大きい前角運動ニューロンを定量した(この系において運動ニューロンの生存率を与える十分確立された方法)。
【００９３】
セフトリアキソンによる神経防護。図７Ｂに示したように、セフトリアキソン処理は、運動ニューロン喪失を投与量依存様式で防いだ。予備データフェーズ１及び２に示したように、この濃度のセフトリアキソンは、ＧＬＴ１タンパク質及び機能を、少なくとも３倍増大させる。重要なことに、これらの研究で用いた濃度は、セフトリアキソンの経口／非経口投与により達成しうる範囲ないにある(１〜４グラム／日)。特に、神経防護は、ＧＬＴ−１のないマウスから調製した培養物では見られないことである(示さない)。
【００９４】
イン・ビボでの神経防護 − Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウスにおける運動ニューロン疾患の開始及び進行に対するセフトリアキソンの効果(図７Ｃ、Ｄ)
セフトリアキソンが、グルタメートトランスポーターの変化した発現を含む疾患モデルにおいて神経退行を変えることができるかどうかを決定するために、我々は、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウスをセフトリアキソンで処理した。多くの研究が、このマウスモデルにおける過剰のグルタメートの寄与する役割及び神経防護ストラテジーにおけるグルタメートレセプター又はトランスポーターの調節の役割を記載してきた。Guo H.等、Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532。控えめな過剰発現(トランスジェニックアプローチによる)は、病気の開始及び／又は生存を変えることができる。その上、最近の研究は、薬物の遅い投与(例えば、病気の開始の時点での投与)が、治療上一層適当であることを示唆している。
【００９５】
治療パラダイム。Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウス[(Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ(ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ)１Ｇｕｒ／Ｊ、高発現体)]を、セフトリアキソン(２００ｍｇ／ｋｇ ｉｐ)で処理した(約１２週齢で開始)。薬物処理した動物(ｎ＝２０)と塩溶液を注射した対照動物(ｎ＝２０)を、前述のように、生存につき毎日モニターして、握力(Columbus Instruments)及び体重を毎週モニターした。
【００９６】
セフトリアキソンは、握力の喪失を遅延させ且つ生存を増大させる。図７Ｃに示したように、セフトリアキソン処理は、筋力の喪失を有意に遅延させた。この効果は、処理後７日以内に認められて、４週間持続した。１８週齢までに、この力の保存は失われた。同様にして、この薬物は又、これらのマウスの全体的生存をも、約７〜１０日増大させた(図７Ｄ)。この効果は比較的小さいが、この薬物は病気の開始時点で与えられたので、たとえ小さい効果でも、臨床的に有意でありうる。この研究で見られた神経防護が薬物の通常の抗生物質の特性によるものであるということはありそうにない。何故なら、顕著な筋力効果が見られたとき、マウスは、１２〜１６週齢において何ら公知の感染症を有していないからである。
【００９７】
ここで引用したすべての参考文献は、印刷物でも、電子装置でも、コンピューターで読むことのできる記録媒体又はその他の形態であっても、明白に、そっくりそのまま参考として本明細書中に援用する(抄録、論文、雑誌、刊行物、テキスト、学術論文、技術データシート、インターネットウェブサイト、データベース、特許、特許出願及び特許公開公報を含むが、これらに限られない)。
【００９８】
この発明の多くの具体例を記載してきた。それにもかかわらず、多くの改変が、この発明の精神及び範囲から離れることなく為されうるということは理解されよう。従って、他の具体例は、後記の請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】SEQ ID NO:１〜４の配列表を示した図である。
【図２】図２Ａは、試験化合物とインキュベートした脊髄培養物を示しており；２Ｂは、組織ホモジェネートからの試料のスロットブロットであり；２Ｃは、代表的なスクリーニングスロットブロットを示しており；２Ｄは、試験化合物のライブラリーのスクリーニング結果を示しており；２Ｅは、クラスにより類別された様々な化合物での処理からの発現結果の図解であり；２Ｆは、セフトリアキソンについてのＥＡＡＴ２発現の投与量応答分析を示している図である。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、マウス脳におけるＥＡＡＴ２プロモーター断片の発現を図解しており；３Ｆは、ＥＡＡＴ１プロモーターレポーターからの星状細胞を示しており、そして３Ｇは、トランスジェニックマウスにおける皮質での発現を示している図である。
【図４】図４Ａは、様々な試験化合物によるＥＡＡＴ２プロモーターの活性化(化合物クラスによる)を示しており；４Ｂは、投与量応答結果を図解している図である。
【図５】図５Ａは、ＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットであり；５Ｂは、ＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；５Ｃは、ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットであり；５Ｄは、ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果を図解している図である。
【図６】グルタメート輸送に対する様々な抗生物質の効果を図解している図である。
【図７】図７Ａは、虚血耐性に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；７Ｂは、運動神経退行に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；７Ｃは、握力に対するセフトリアキソンの効果を図解しており(イン・ビボモデル)；７Ｄは、Ｇ９３Ａマウスの生存に対するセフトリアキソンの効果を図解している図である。
【配列表】
2006524637.tif 000003
2006524637.tif 000004
2006524637.tif 000005
2006524637.tif 000006
【図２】
2006524637.tif 000007
【図３】
2006524637.tif 000008
【図４】
2006524637.tif 000009
【図５】
2006524637.tif 000010
【図６】
2006524637.tif 000011
【図７】
2006524637.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月1日(2006.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
図面の簡単な説明
図１(図１Ａ〜Ｆを含む)は、β−ラクタム抗生物質が、１０４０のＦＤＡ認可された薬物のスクリーニングに基づいて、ＥＡＡＴ２タンパク質のインデューサーであることを示す一連のイメージである。図１Ａは、試験化合物とインキュベートした脊髄培養物を示しており；図１Ｂは、組織ホモジェネートからの試料のスロットブロットであり；図１Ｃは、代表的なスクリーニングスロットブロットを示しており；図１Ｄは、試験化合物のライブラリーのスクリーニング結果を示しており；図１Ｅは、クラスにより類別された様々な化合物での処理からの発現結果の図解であり；図１Ｆは、セフトリアキソンについてのＥＡＡＴ２発現の投与量応答分析を示している。
図２(図２Ａ〜Ｇを含む)は、プロモーターレポータートランスジェニックマウスの生成を示す一連のイメージである。図２Ａ〜Ｅは、２週齢のマウスの脳におけるＥＡＡＴ２プロモーター断片の発現、及び該脳の実質組織中の星状細胞におけるレポーターの広範な発現を示している。図２Ｆは、ＥＡＡＴ１プロモーターレポーターからの星状細胞を示しており、そして図２Ｇは、トランスジェニックマウスにおけるＥＡＡＴ１Ｂａｃ−ｅＧＦＰレポーターの皮質での発現を示している。
図３(図３Ａ及び３Ｂを含む)は、β−ラクタムがＥＡＡＴ２プロモーターを活性化することを示す一連のイメージである。図３Ａは、Ｃｏｓ７細胞における様々な試験化合物によるＥＡＡＴ２プロモーターの活性化(化合物クラスによる)を示しており、そして図３Ｂは、ＥＡＡＴ２プロモーター−ｅＧＦＰレポーターをトランスフェクトされたヒト星状細胞におけるＥＡＡＴ２プロモーターの活性化(化合物クラスによる)を示している。β−ラクタム抗生物質(１０μＭ)は、ＥＡＡＴ２プロモーターを、顕著に活性化するが、グルタメートなどの対照は、効果を有しない。公知のアクチベーターのジブチリルサイクリックＡＭＰは、一貫した効果を有するが、一層小さい効果である。
図４(図４Ａ〜Ｄを含む)は、セフトリアキソンが、イン・ビボで、ＧＬＴ１及びＧＬＴ１ｂの発現を誘導するが、他のタンパク質は誘導しないことを示している。ラットに、毎日、低マイクロモルの脳内濃度を生じることが公知の投与量のセフトリアキソン(２００ｍｇ／ｋｇ)を、５日間腹腔内注射した。図４Ａは、海馬回におけるＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットであり；図４Ｂは、海馬回におけるＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果を図解しており；図４Ｃは、ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットであり；図４Ｄは、ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果を図解している。
図５は、グルタメート輸送に対する様々な抗生物質の効果を図解している。図５は、β−ラクタム抗生物質セフトリアキソン及びペニシリンの投与が、グルタメート輸送における機能増大へと導くことを示している。セフトリアキソン又はペニシリン(２００ｍｇ／ｋｇ、５日間)での毎日の処理は、3Ｈ−グルタメート輸送アッセイにより(ＧＬＴ１特異的輸送を測定するためにジヒドロカイネートの存在／非存在下で)測定して、ＧＬＴ１タンパク質のみならず、ＧＬＴ１媒介のグルタメート輸送をも増大させた。非β−ラクタム抗生物質のバンコマイシンは、グルタメート輸送活性を増大させないということが認められた。
図６(図６Ａ〜Ｄを含む)は、セフトリアキソンによる神経防護を示している。図６Ａは、虚血耐性に対するセフトリアキソンの効果を図解しており、皮質ニューロンの酸素グルコース欠乏(ＯＧＤ)は、確実な死へと導くが、短いＯＧＤでの予備調整は防護的であることが認められた。同様の防護が、セフトリアキソン(１μＭ)での予備処理により与えられた。図６Ｂは、運動神経退行に対するセフトリアキソンの効果を図解しており、セフトリアキソンが、イン・ビトロの運動ニューロンの退行を防ぐということが認められた。脊髄器官培養物の、グルタメート輸送インヒビターのスレオ−ヒドロキシアスパルテートでの絶え間ない処理は、運動ニューロンの５０％を超える喪失へと導く。セフトリアキソンによる同時処理は、この運動ニューロンの興奮毒性喪失を防いだ。図６Ｃは、握力に対するセフトリアキソンの効果を図解しており(イン・ビボモデル)；図６Ｄは、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１ ＡＬＳマウスの生存に対するセフトリアキソンの効果を図解している。セフトリアキソンでの治療(２００ｍｇ／ｋｇ日、腹腔内注射)は、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウスにおける筋力の喪失を遅延させるということが認められた。治療は、病気の開始時点において始めた(約１２週齢)。アスタリスクは、各時点における塩溶液対照からの有意の差異(Ｐ＜０．０５)を示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
バイオアッセイ法：図１は、１０４０のＦＤＡ承認された薬物のスクリーニングの結果を描写している。このスクリーニングは、β−ラクタム抗生物質が、ＥＡＡＴ２タンパク質のインデューサーとして役立つことを示した。簡単にいえば、このスクリーニングは、脊髄培養物を化合物と３日間インキュベートすることを含む(図１Ａ)。図１Ｂは、ジブチリルサイクリックＡＭＰ、ＧＤＮＦ又はニューロイムノフィリンＧＰＩ−１０４６によって起きることが公知の増大する対照と共に見られる増大したＥＡＡＴ２発現を確認する対照としての組織ホモジェネートからの試料のスロットブロットを描写している。３種類の化合物(ｄｂｃＡＭＰ、ＧＤＮＦ及びＧＰＩ−１０４６)は、すべて、培養におけるＥＡＡＴ２発現の大幅な増加を３日後に誘導した。図１Ｃは、様々な薬剤の初期スクリーニングからのＥＡＡＴ２タンパク質の典型的なスロットブロットデータを描写している。各ブロットは、対照(未処理組織)及びパネルＢからの陽性対照を含んだ。図１Ｄは、１０４０のＦＤＡ承認された化合物のＮＩＨ−ＮＩＮＤＳカスタムコレクションスクリーニングからのスクリーニング結果を描写している。バーの高さは、未処理対照と比較して増大したＥＡＡＴ２タンパク質発現を反映している。各ブロットは、少なくとも一つの未処理対照及び一つの公知の陽性対照を含んだ。図１Ｅは、β−ラクタム抗生物質が、最も強力な化合物において高度に表されたことを描写している。これらの化合物は、ＥＡＡＴ２タンパク質発現を、７日間の絶え間ない処理の後に、未処理対照培養物と比べて７倍まで増大させることができた。図１Ｆは、ＥＡＡＴ２発現についての３．５μＭのＥＣ50を示すセフトリアキソンの投与量応答分析を描写している。
脊髄器官培養。脊髄の器官培養は、過去に、我々によって詳細に記載されてきた。Rothstein JD等、N.Engl.J.Med. 1992; 326:1464-1468。簡単にいえば、ラットの腰部脊髄の３００ｕｍ切片(生後８〜１０日目のラット)を、ミリポアミリセルＣＭ半透膜上に置く。各ウェルは、５枚のスライスを含む(図１Ａ)。５０〜１００の培養物を、毎週、用意することができる。各薬物(１０〜１００μＭ)を、３日間、細胞培養培地／血清と共に添加した。培養物を収穫して、５〜５０μｇの組織を、過去に記載された標準的ウエスタンブロッティング／化学発光法によるＥＡＡＴ２の検出のために、スロットブロット装置に加えた。Kuncl RW等、Motor neuron diseases. (Asbury AK等編、Diseases of the Nervous System. 第二版、Philadelphia: W.B. Saunders, 1992:1179-1208中)；Rothstein JD等、Neuron 1994; 13:713-725。すべての抗ペプチド抗体は、アフィニティー精製して、トランスポーター亜種に関して高度に特異的であった。典型的なスロットブロット分析を、図１Ｂ、１Ｃに示してある。この方法により、我々は、確実に、発現されるタンパク質の５０％を超える増加を検出することができる。各抗体のスロットブロットにつき、用いたホモジェネートは、以前の標準曲線に基き、抗体検出に関して直線的範囲内にあることが予想される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
スクリーニングライブラリーアッセイのデザイン。これらの最初の研究についての化合物のライブラリーは、NINDS Custom Collection from Microsource Discoveryであった。このライブラリーは、９６ウェル中の１０４０の化合物よりなり、それは又、トランスポーターの合成についての陽性対照(ジブチリルサイクリックＡＭＰ[ｄｂｃＡＭＰ]、ＧＤＮＦ)をも含んでいた。このライブラリーは、数百の顕著な薬物と生化学的標準の同時の評価を可能にする公知の生物活性な化合物のユニークなコレクションである。各化合物を、１０〜１００μＭの終濃度で研究した。全アッセイを、二連で行なった。典型的なスロットブロットを図１Ｃに示してある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
データ分析。すべてのブロットをレーザーデンシトメトリー(BioRad イメージクオント)により分析して、二連の点を平均した。１０４０の化合物からの完全な結果のデータセットを、図１Ｄに示してある。各ブロットは、陽性対照標準(例えば、ｄｂｃＡＭＰ)及び陰性対照標準(例えば、血清、ＤＭＳＯ)を含んだ。データを、数値／テキストコーディングシステムを利用して、エクセルのスプレッドシートに保存した。すべての陽性の薬物(タンパク質発現における少なくとも５０％増加として陽性を定義する)を、再評価した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
結果：スクリーニングした薬物は、イン・ビトロでＥＡＡＴ２を増大させることができる。１０４０の化合物をスクリーニングした後に、我々は、ＥＡＡＴ２タンパク質レベルを３．５〜７倍増大させることのできる、１０より多くの関連化合物を同定することができた(図１Ｅ参照)。全体で、我々は、ＥＡＡＴ２を２倍以上増大させることのできる、８０の化合物を最初のスクリーニングで同定した。この一覧の内で、β−ラクタム抗生物質は、過度に表され、すべての化合物で認められた最も一般的な構造モチーフであり、１５の異なるベータラクタム抗生物質が活性であった。図１Ｅに示したように、これらのβ−ラクタムは、すべてＥＡＡＴ２タンパク質発現を増大させることができた。追跡投与量応答分析(図１Ｆ)は、タンパク質発現についてのセフトリアキソンのＥＣ50が３．５μＭであることを示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
Ｅ２Ｐ−ｅＧＦＰ及びＢａｃ−ＥＡＡＴ１−ｅＧＦＰトランスジェニックマウスの生成(図２)。これらのアッセイのためのスクリーニング用細胞株を用意するために、我々は、今や、上首尾に、ＥＡＡＴ２プロモーター断片(Ｅ２Ｐ)又は完全長ＥＡＡＴ２プロモーター(Ｂａｃ−ＥＡＡＴ１)を発現する２匹のトランスジェニックマウスを生成した。図２に示したように、我々は、ＣＮＳにおけるＥＡＡＴ２プロモーターレポーターの広範な発現を示すＥ２Ｐトランスジェニックマウスを生成した。同様に、我々は、Ｂａｃ−ＥＡＡＴ１マウス及び発現細胞を生成した。最近、Heintzのグループも、我々のマウスにおいて類似のＢａｃ構築物を利用して、ＥＡＡＴ１Ｂａｃ−レポーターベースのマウスを、該構築物ベースに生成した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
結果：ＥＡＡＴ２プロモーター活性化化合物の同定(図３)。元のＮＩＮＤＳスクリーニングから、我々は、ＥＡＡＴ２プロモーターを強力に活性化することのできる多くのβラクタム化合物を同定した。図３に示したように、殆どのβ−ラクタムは、ＥＡＡＴプロモーターを、公知の陽性対照のジブチリルサイクリックＡＭＰよりも遥かに増大させることができた。すべての化合物は、１〜１０ｕＭの薬理学的に適当な濃度で活性であった。これは、これらの化合物が、標準的抗細菌療法(例えば、セフトリアキソン)後に、ＣＮＳ内で見出されうる濃度範囲である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
セフトリアキソンは、脳のＧＬＴ１レベルを増大させる(図４)。フェーズ１及び２で同定された薬物が実際にイン・ビボでＥＡＡＴ発現を誘導しうるかどうかを測定するために、我々は、毎日、セフトリアキソンをラット(ｎ＝５)(及びマウス、ｎ＝３)に投与した。セフトリアキソンを、２００ｍｇ／ｋｇ ｉｐのＣＮＳレベルへと導くことが知られている投与量で投与した。５日間毎日投与した後に、動物を犠牲にして、脳組織を収穫した。図４Ａ、４Ｂに示したように、セフトリアキソン療法は、脳ＧＬＴ１レベルの３倍増へと導く(並びに、その正常スプライシング産物のＧＬＴ１ｂ)。この増加は、イン・ビトロで見られたプロモーター活性化の結果に匹敵する(図３)。大グリア細胞のグルタメートトランスポーターＧＬＡＳＴ並びに２種のニューロンのグルタメートトランスポーターＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４のウエスタンブロットは、セフトリアキソン療法後に、トランスポーター発現の変化を示さなかった(図４Ｃ、４Ｄ)。同様に、構成的タンパク質のアクチンは、セフトリアキソン投与によって変化しなかった(図４Ａ、４Ｃ)。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
セフトリアキソンは、脳ＧＬＴ１レベルを増大させる(図４)。フェーズ１及び２で同定された薬物が、実際に、イン・ビボでＥＡＡＴ発現を誘導しうるかどうかを測定するために、我々は、セフトリアキソンを、毎日、ラット(ｎ＝５)(及びマウス、ｎ＝３)に投与した。セフトリアキソンを、２００ｍｇ／ｋｇ ｉｐのＣＮＳレベルへと導くことが知られている投与量で投与した。５日間毎日投与した後に、動物を犠牲にして、脳組織を収穫した。図４Ａ、４Ｂに示したように、セフトリアキソン療法は、脳ＧＬＴ１レベルの３倍増へと導く(並びに、その正常スプライシング産物のＧＬＴ１ｂ)。この増加は、イン・ビトロで見られたプロモーター活性化の結果に匹敵する(図３)。この効果は、トランスポーター特異的であったか？大グリア細胞のグルタメートトランスポーターＧＬＡＳＴ並びに２種のニューロンのグルタメートトランスポーターＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４のウエスタンブロットは、セフトリアキソン療法後に、トランスポーター発現の変化を示さなかった(図４Ｃ、４Ｄ)。同様に、構成的タンパク質のアクチンは、セフトリアキソン投与によって変化しなかった(図４Ａ、４Ｃ)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
虚血のイン・ビトロモデル − 酸素グルコース欠乏(図６Ａ) 酸素グルコース欠乏(ＯＧＤ)のイン・ビトロモデルは、周知であり、急性神経傷害の十分認められたモデルである。我々の虚血のイン・ビトロモデルにおいて、１時間の酸素グルコース欠乏(ＯＧＤ)は、培養ニューロンにとって致死的であり、過剰のグルタメートを含むことが知られた毒性を伴う。しかしながら、これらの培養物を、一過性のＯＧＤ(５分間)により、致死的条件の２４時間前に、予め処理しておくと、細胞死に対するニューロンの劇的且つ確固たる耐性がある。このデータは、この神経防護が、部分的に、ＧＬＴ１の増大した発現のためでありうることを示している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
セフトリアキソン神経防護。培養におけるベースラインの神経細胞死は、図６Ａの未処理の柱(ＮＴ)に示したように、１４％である。データは、一つの実験における別々のウェルの平均神経細胞死として与えてある。１μＭのセフトリアキソンは(これらの培養物に４８時間にわたって加えた場合)、ベースラインの細胞死を増加させない(ＮＴ＋セフトリアキソン)。培養物を１時間のＯＧＤにかけた場合には、神経細胞死は(予想通りに)、劇的に、約５０％まで増大させる。培養物を、１時間のＯＧＤの２４時間前に５分間予備調整した場合には、細胞死のパーセントは、未処理条件に匹敵し、この条件におけるニューロンの虚血に対する耐性を示している。これは、虚血耐性の周知の現象である。重要なことに、１μＭのセフトリアキソンは(１時間のＯＧＤの４８時間前に加えた場合)、やはりニューロンを細胞死から防護して、神経細胞死のパーセンテージを５０％から２０％に減少させる(虚血耐性神経防護に類似)。従って、セフトリアキソン予備処理は、虚血耐性にて神経細胞氏を防ぐようである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
慢性の運動ニューロン退行のイン・ビトロモデル(図６Ｂ)。非特異的インヒビターのスレオヒドロキシアスパルテート(ＴＨＡ)又はＴＢＯＡを利用する脊髄の器官培養におけるグルタメート輸送の遮断に基づく慢性のニューロン退行のモデルを利用した。培養物のＴＨＡ(又はＴＢＯＡ)との不断のインキュベーションは、細胞外グルタメートの不断の増加及びその後の運動ニューロンのゆっくりした死(４週間にわたる)へと導く。脊髄の器官培養モデルを開発して、グルタメート媒介の毒性の面(及び治療)を研究した。それは、臨床前の薬物の同定において有用であった(唯一のＦＤＡ承認されたＡＬＳ用薬物であるリルゾール、及び一層最近のセレコキシブを含む)。グルタメートトランスポーターＧＬＴ１の遺伝子過剰発現(例えば、トランスフェクション又は導入遺伝子過剰発現)による増大した発現は、この系において、運動ニューロン死を防ぐことができ(示さない)、トランスジェニック動物においてニューロン細胞死を防ぐことができる。Guo H.等、Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
セフトリアキソンによる神経防護。図６Ｂに示したように、セフトリアキソン処理は、運動ニューロン喪失を投与量依存様式で防いだ。予備データフェーズ１及び２に示したように、この濃度のセフトリアキソンは、ＧＬＴ１タンパク質及び機能を、少なくとも３倍増大させる。重要なことに、これらの研究で用いた濃度は、セフトリアキソンの経口／非経口投与により達成しうる範囲ないにある(１〜４グラム／日)。特に、神経防護は、ＧＬＴ−１のないマウスから調製した培養物では見られないことである(示さない)。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
イン・ビボでの神経防護 − Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウスにおける運動ニューロン疾患の開始及び進行に対するセフトリアキソンの効果(図６Ｃ、６Ｄ)
セフトリアキソンが、グルタメートトランスポーターの変化した発現を含む疾患モデルにおいて神経退行を変えることができるかどうかを決定するために、我々は、Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１マウスをセフトリアキソンで処理した。多くの研究が、このマウスモデルにおける過剰のグルタメートの寄与する役割及び神経防護ストラテジーにおけるグルタメートレセプター又はトランスポーターの調節の役割を記載してきた。Guo H.等、Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532。控えめな過剰発現(トランスジェニックアプローチによる)は、病気の開始及び／又は生存を変えることができる。その上、最近の研究は、薬物の遅い投与(例えば、病気の開始の時点での投与)が、治療上一層適当であることを示唆している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
セフトリアキソンは、握力の喪失を遅延させ且つ生存を増大させる。図６Ｃに示したように、セフトリアキソン処理は、筋力の喪失を有意に遅延させた。この効果は、処理後７日以内に認められて、４週間持続した。１８週齢までに、この力の保存は失われた。同様にして、この薬物は又、これらのマウスの全体的生存をも、約７〜１０日増大させた(図６Ｄ)。この効果は比較的小さいが、この薬物は病気の開始時点で与えられたので、たとえ小さい効果でも、臨床的に有意でありうる。この研究で見られた神経防護が薬物の通常の抗生物質の特性によるものであるということはありそうにない。何故なら、顕著な筋力効果が見られたとき、マウスは、１２〜１６週齢において何ら公知の感染症を有していないからである。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【図１Ａ】試験化合物とインキュベートした脊髄培養物を示した図である。
【図１Ｂ】組織ホモジェネートからの試料のスロットブロットを示した図である。
【図１Ｃ】代表的なスクリーニングスロットブロットを示した図である。
【図１Ｄ】試験化合物のライブラリーのスクリーニング結果を示した図である。
【図１Ｅ】クラスにより類別された様々な化合物での処理からの発現結果の図解である。
【図１Ｆ】セフトリアキソンについてのＥＡＡＴ２発現の投与量応答分析を示している図である。
【図２】プロモーターレポータートランスジェニックマウスの生成を示す一連のイメージを示した図である。
【図３】β−ラクタムがＥＡＡＴ２プロモーターを活性化することを示す一連のイメージを示した図である。
【図４Ａ】海馬回におけるＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットを示した図である。
【図４Ｂ】海馬回におけるＧＬＴ−１及びＧＬＴ−１Ｂ発現に対するセフトリアキソンの効果を図解した図である。
【図４Ｃ】ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果のウエスタンブロットを示した図である。
【図４Ｄ】ＧＬＡＳＴ、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４発現に対するセフトリアキソンの効果を図解した図である。
【図５】グルタメート輸送に対する様々な抗生物質の効果を図解した図である。
【図６Ａ】虚血耐性に対するセフトリアキソンの効果を図解した図である。
【図６Ｂ】運動神経退行に対するセフトリアキソンの効果を図解した図である。
【図６Ｃ】握力に対するセフトリアキソンの効果を図解した図である。
【図６Ｄ】Ｇ９３Ａマウスの生存に対するセフトリアキソンの効果を図解した図である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2006524637.tif 000013
【図１Ｂ】
2006524637.tif 000014
【図１Ｃ】
2006524637.tif 000015
【図１Ｄ】
2006524637.tif 000016
【図１Ｅ】
2006524637.tif 000017
【図１Ｆ】
2006524637.tif 000018
【図２】
2006524637.tif 000019
【図３】
2006524637.tif 000020
【図４Ａ】
2006524637.tif 000021
【図４Ｂ】
2006524637.tif 000022
【図４Ｃ】
2006524637.tif 000023
【図４Ｄ】
2006524637.tif 000024
【図５】
2006524637.tif 000025
【図６Ａ】
2006524637.tif 000026
【図６Ｂ】
2006524637.tif 000027
【図６Ｃ】
2006524637.tif 000028
【図６Ｄ】
2006524637.tif 000029
【国際調査報告】
2006524637.tif 000030
2006524637.tif 000031
2006524637.tif 000032
2006524637.tif 000033