(57)【要約】【課題】農薬、または医薬品としての活性を有する化合物の同定または開発に有用なポリペプチドをエンコードするポリペプチド及びヌクレオチドの配列の提供。【解決手段】ヘミプテランミオシン軽鎖キナーゼをエンコードする新規な核酸配列及び単離されたヘミプテランミオシン軽鎖キナーゼ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド配列をエンコードする核酸配列、及び少なくとも１０のヌクレオチドを有するそのフラグメントからなる群から選ばれる核酸配列を有することを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または少なくとも１０ヌクレオチドを有するそのフラグメントからなる請求項１の核酸分子。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなる請求項２の核酸分子。
【請求項４】
少なくとも１０ヌクレオチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のフラグメントからなる請求項１の核酸分子。
【請求項５】
１２−１５０ヌクレオチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のフラグメントからなる請求項１の核酸分子。
【請求項６】
１５−５０ヌクレオチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のフラグメントからなる請求項１の核酸分子。
【請求項７】
請求項１の核酸分子を含むことを特徴とする組み換えベクター。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または少なくとも１０アミノ酸を有するそのフラグメントからなることを特徴とする単離されたポリペプチド分子。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる請求項８のポリペプチド分子。
【請求項１０】
少なくとも１０アミノ酸を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のフラグメントからなる請求項８のポリペプチド分子。
【請求項１１】
１２−１５０アミノ酸を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のフラグメントからなる請求項８のポリペプチド分子。
【請求項１２】
１５−５０アミノ酸を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のフラグメントからなる請求項８のポリペプチド分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農薬、獣医薬または医薬の領域で有用な組成物に関する。特に、本発明は、殺虫剤または医薬品としての活性を有する化合物の同定または開発に有用なポリペプチドをエンコードするポリペプチド及びヌクレオチドの配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）は、筋肉活性を調節するのに重要な役割を果たしていると考えられる。すなわち、ＭＬＣＫによるミオシン軽鎖（ＭＬＣ）の燐酸化が心筋の収縮を含む筋肉の収縮の開始に必要であると予想される（非特許文献１−４）。従って、ＭＬＣのＭＬＣＫ燐酸化の切断または阻害は、種々の生物学的効果を生ずる（非特許文献１−４）。そのため、殺虫剤を含む生物学的に活性な化合物を同定する手段としてこの酵素を目標とする方法を開発することが望まれている。
【０００３】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｕｎｃ−２２突然変異体から由来するツウィチン（ｔｗｉｔｃｈｉｎ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから由来するプロジェクチン（ｐｒｏｊｅｃｔｉｎ）及びチチン（ｔｉｔｉｎ）は、周知のＭＬＣＫである（非特許文献５及び６）。ツウィチン様及びプロジェクチン様のＭＬＣＫは、また細菌例えばＥ．ｃｏｌｉ、軟体動物例えばＡｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ並びに昆虫例えばＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ及びＬｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから発現かつクローンされている（非特許文献２−４及び７）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｋａｓｔｕｒｉら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．（１９９３），Ｖｏｌ．２６８，Ｎｏ．１１，ｐｐ．７９５８−７９６４
【非特許文献２】Ｌｅｉら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．（１９９４），Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．３３，ｐｐ．２１０７８−２１０８５
【非特許文献３】Ｈｅｉｅｒｈｏｒｓｔら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．（１９９４），Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．３３，ｐｐ．２１０８６−２１０９３
【非特許文献４】Ｗｅｉｔｋａｍｐら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．３１，ｐｐ．１９８０２−１９８０８
【非特許文献５】Ｄａｌｅｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９９８），２７９，ｐｐ．２０１−２１０
【非特許文献６】Ｈａｒｄｉｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｋｓ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ（１９９５），ｐｐ．１６１−１６５
【非特許文献７】ＮＣＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  ＡＦ４６５６００，ＡＦ４６５６００１，ＡＦ４６５６００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、殺虫剤または医薬品としての活性を有する化合物の同定または開発に有用なポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、殺虫剤または医薬品としての活性を有する化合物の同定または開発に有用なポリペプチドをエンコードするポリペプチド配列に関する。これらのヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、また本明細書において、それぞれ「本発明のヌクレオチド配列」及び「本発明のポリペプチド配列」とよばれるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の核酸は、本明細書では、包括的に「本発明の核酸」とよばれるだろう。また、以下の本発明のさらなる記述の内容において適切ならば、用語「本発明のヌクレオチド配列」及び「本発明の核酸」は、本質的に等しくそして本質的に交換可能である。
【０００７】
また、本発明の目的のために、核酸は、それと通常結合している少なくとも１つの他の核酸分子及び配列から分離しているとき、例えばその天然の生物学的源からの「本質的に単離された（形）」であると考えられる。同様に、ポリペプチドは、それと通常結合している他のポリペプチド分子例えばその天然の生物学的源から有効に分離されているとき、「本質的に単離された（形）」であると考えられる。特に、核酸またはポリペプチドは、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍そして１０００倍までまたはそれ以上精製されたとき、「本質的に単離された」と考えられる。
【０００８】
本発明は、核酸好ましくは本質的に単離された形の核酸に関し、その核酸は、本発明のヌクレオチド配列そして特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含む。本発明は、また、本発明のポリペプチド配列そして特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド配列に関する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列は、以下の実験の部でさらに記述される方法で、Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ生物から由来するかまたは単離された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する核酸によりエンコードされる。
【０００９】
一般に、核酸の形のときの本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、そして一本鎖または二本鎖である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡであり、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）から入手できるＯｌｉｇｏ−４並びにＦｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒからオンラインで利用できるＨｅｎｉｋｏｆｆら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，７０，１６２８−１６３５，１９９８）によるＣｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＯＤＥＨＯＰ）のような好適なコンピュータプログラムを使用して例えばデザインできる、目的とする宿主細胞または宿主生物の発現に特に適合されたコドンを使用するＤＮＡである。従って、本発明のヌクレオチド配列は、イントロン配列を含むことができ、そしてまた一般に異なるスプライス変異型を含む。
【００１０】
他の態様は、本発明のヌクレオチド配列に関係する二本鎖ＲＮＡ分子に関する（その一本鎖は、通常本発明のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むだろう）。本発明は、また、（例えば、宿主細胞または宿主生物、または例えばＥ．ｃｏｌｉのような細菌菌株における好適な発現により）これらの二本鎖ＲＮＡ分子を生成するのに使用できる遺伝的構造物に関する。これらの構造物については、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を参照。
【００１１】
広い意味で、用語「本発明のヌクレオチド配列」は、また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の一部またはフラグメント；以下に詳述されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の（天然または合成）突然変異体、変異型、対立遺伝子、アナログ、オルソログ（本明細書では以下まとめて「突然変異体」とよぶ）；これら（天然または合成）突然変異体の一部またはフラグメント；少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列とのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列（またはその一部またはフラグメント）のヌクレオチド融合；少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列との（天然または合成）突然変異体（またはその一部またはフラグメント）のヌクレオチド融合を含む。この場合、これら突然変異体、一部、フラグメントまたは融合は、好ましくは以下に詳述される。
【００１２】
本発明は、また上記のヌクレオチド配列の異なるスプライス変異型を含む。
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも５００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチドの長さを有し、そして多くて３５００ヌクレオチド、好ましくは多くて３０００ヌクレオチド、さらに好ましくは多くて２６００ヌクレオチドまでの長さを有するだろう。
【００１３】
広い意味で、用語「本発明のポリペプチド配列」は、また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド配列の一部またはフラグメント；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド配列の（天然または合成）突然変異体、変異型、対立遺伝子、アナログ、オルソログ（本明細書では以下まとめて「突然変異体」とよぶ）；これら（天然または合成）突然変異体の一部またはフラグメント；少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列とのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチド配列（またはその一部またはフラグメント）のペプチド融合；少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列との（天然または合成）突然変異体（またはその一部またはフラグメント）のペプチド融合を含む。
【００１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の一部またはフラグメントまたはその（天然または合成）突然変異体の一部またはフラグメントの例は、５´または３´切断ヌクレオチド配列または導入されたイン・フレーム開始コドンまたは停止コドンを有する配列を含むが、これらに限定されない。また、本発明の１つ以上のヌクレオチド配列の２つ以上のこれらの一部またはフラグメントは、本発明のさらなるヌクレオチド配列をもたらすために好適に組み合わされる（例えば連結されたイン・フレーム）。
【００１５】
好ましくは、任意のこれらの一部またはフラグメントは、それらがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド、より好ましくは１００より多いヌクレオチドの少なくとも１つの連続する線状物からなる。
【００１６】
また、本明細書の記述に基づいて、当業者が、（他の個体の）同じ種（例えば突然変異体の株またはラインを含むがこれらに限定されない異なる株またはラインの個体からのもの）からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の天然の「突然変異体」（上記のもの）を同定、誘導または単離できることが予想される。本明細書の記述に基づいて、当業者が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の合成の突然変異体（上記で定義したもの）を提供または誘導できることも予想される。本明細書の記述に基づいて、当業者が、蛋白発現によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の（上記で定義した）ポリペプチド配列を有するポリペプチドを提供または誘導できることも予想される。１つの特定の態様では、突然変異体は、それがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列またはその一部またはフラグメントをエンコードするようなものである。
【００１７】
好ましくは、本明細書で記述された任意の突然変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列について以下に述べられる構造上の特徴または保存された特性の１つ以上そして好ましくはすべてを有するだろう。
【００１８】
また、本明細書で記述された任意の突然変異体、その一部またはフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列について、好ましくは、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％そして特に９０％より多くそして９５％以内またはそれ以上のヌクレオチドのレベルで或る程度の「配列同一性」を有するだろう。
【００１９】
この目的のために、所定のヌクレオチド配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」の％は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列の対応する位置でヌクレオチドに等しい所定のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数を、所定のヌクレオチド配列中の全ヌクレオチドの数により除しそして１００をかけることにより計算でき、その場合、ヌクレオチドの欠失、挿入、置換または付加は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列に比べて、単一のヌクレオチドの位置の相違と考えられる。
【００２０】
別の場合、配列の同一性を決定するコンピュータプログラムは、一般に利用可能である。配列の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ  ｖ２．５（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ）のプログラムであり、それは、ＦＡＳＴＡに類似のプログレッシブ・アラインメント・プロシージャ（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用する。好ましくは、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓプログラムにより使用されるパラメータは、以下の通りである。コスト対オープンギャップ（ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）＝５０、レンスンギャップ（ｌｅｎｇｔｈｅｎ  ｇａｐ）＝１００、最小対角長さ（ｄｉａｇｏｎａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）＝４、最大対角オフセット＝１２５。２つの配列間の同一性を決定する他のコンピュータプログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））．ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）及びＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ（ｂｌａｓｔ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）及び他の源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）），Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．Ｎｏｒｔｈ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから利用可能なＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６から一般に利用可能である。
【００２１】
また、好ましい構成では、本明細書で記述された任意の突然変異体、その一部またはフラグメントは、すなわち、上記のアッセイにより測定して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％そして９０％まで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：の配列について上述された生物学的活性に本質的に類似した生物学的活性を有する蛋白またはポリペプチドをエンコードするだろう。
【００２２】
本明細書で記述された任意の突然変異体、その一部またはフラグメントは、好ましくは、すなわち「中程度の緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」の条件下そして好ましくは「高度の緊縮」の条件下で、それらがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列とハイブリッド形成できるようなものである。これらの条件は、例えば標準的な書籍例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌら、並びにヨーロッパ特許０９６７２８４、ヨーロッパ特許１０８５０８９またはＷＯ  ００／５５３１８から当業者にとり明らかであろう。
【００２３】
１つ以上のコーディング配列または調節配列を含むこれらに限定されない１つ以上のさらなるヌクレオチド配列と本発明のヌクレオチド配列（上述した）との融合を使用することも本発明の範囲内である。好ましくは、これらの融合において、１つ以上のさらなるヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列に実行可能に（下記のように）接続する（例えば、さらなるヌクレオチド配列がコーディング配列の場合、ヌクレオチド融合は下記のように蛋白融合をエンコードするように接続する）。
【００２４】
他の態様では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子に関する。
好ましくは（本質的に）単離された形の核酸は、アミノ酸配列例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列をエンコードまたは発現するのに使用できる。
【００２５】
上述に基づいて、そして本発明は任意の特定の説明またはメカニズムに特に制限されないが、本発明のいくつかの態様のヌクレオチド配列は、ミオシン軽鎖キナーゼとしての（生物学的）活性を有する蛋白をエンコードする。特に、本発明は、突き刺し及び吸引するのに適合した口器を有するアリマキ、ヨコバイ、コナジラミ、カイガラムシ及び半翅類であるＨｅｍｉｐｔｅｒａ目の昆虫からのミオシン軽鎖キナーゼとしての活性を示す。
【００２６】
当業者では周知のように、この種類の生物学的活性は、例えば結合部位に対するラベルされた周知のリガンドとの競合により、キナーゼへのグアノシン５´−［γ−３５Ｓ］−トリホスフェート結合により、蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光または蛍光測定または比色定量レポータアッセイのような蛋白相互反応に基づく蛍光アッセイにより、またはＭＬＣＫ蛋白をアッセイするのに好適な任意の技術（Ｋａｓｔｕｒｉら；Ｌｅｉら；及びＨｅｉｅｒｈｏｒｓｔら参照）により、標準のアッセイ技術を使用して測定できる。
【００２７】
本発明の他の態様は、中程度の緊縮の条件下好ましくは高度の緊縮の条件下そして特に緊縮条件下（すべて上述されている）、本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる核酸プローブに関する。これらのヌクレオチドプローブは、例えば、本発明のヌクレオチド配列を検出または単離するのに使用されるか、または本発明のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーとして使用され、そしてすべてはそれ自体周知の技術を使用するものであり、それらについては上記の一般的なハンドブック例えばＳａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらを再び参照。
【００２８】
好ましくは、本発明の他のヌクレオチド配列を検出または単離するのに使用されるとき、このヌクレオチドプローブは、通常、１５−１００ヌクレオチドそして好ましくは２０−８０ヌクレオチドの長さを有するだろう。増幅のためのプライマーとして使用されるとき、このヌクレオチドプローブは、２５−７５ヌクレオチドそして好ましくは２０−４０ヌクレオチドの長さを有するだろう。
【００２９】
一般に、これらのプローブは、所望により好適なコンピュータ計算手法を使用して、本発明のヌクレオチド配列そして特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列から出発して当業者によりデザインできる。また、当業者に明らかなように、これらのプローブは、縮重プローブであろう。
【００３０】
他の構成では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列の突然変異体及び遺伝的構造物を製造する方法に関する。
本発明のヌクレオチド配列の天然の突然変異体は、実験の部に記述された方法と本質的に類似している方法で得ることができる。または別に、
適切な発現ベクター系における関係のある種からのＤＮＡライブラリーの構築次に突然変異体の配列の直接的発現；
発現ベクター系における関係のある種からのＤＮＡライブラリーの構築次に本発明のプローブ（以下に記述される）によるかまたは本発明のヌクレオチド配列による該ライブラリーのスクリーニング；
【００３１】
関係のある種からの突然変異体の配列をエンコードするｍＲＮＡの単離次に逆転写酵素を使用するｃＤＮＡ合成
により、またはそれら自体周知の任意の他の１つ以上の方法または１つ以上の技術（それらについては、例えば、標準的ハンドブック例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２ｎｄ．ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照）により得ることができる。
【００３２】
本発明のヌクレオチド配列のこれら合成配列を得る技術は、当業者では明らかであり、そして例えば自動化ＤＮＡ合成；
部位指向突然変異誘発；
１つ以上の天然の配列の２つ以上の部分の組み合わせ、切断された発現生成物の発現を導く突然変異の導入；
１つ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して容易に消化されるかまたは連結できるカセットまたは領域を生ずる）そして１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入
【００３３】
を含むが、これらに限定されない。これら及び他の技術については、当業者では周知であり、そして上記の標準的ハンドブック例えばＳａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらを参照。
本発明は、以下の本発明を制限しない実験の部（すなわち実施例）によりさらに説明されるだろう。
【００３４】
実施例１  −ミオシン軽鎖キナーゼ配列の同定
材料及び方法
１．ポリ（Ａ＋）ＲＮＡの単離
ワタアリマキは、ワタ植物から採集されそして使用前に清浄されそして１８０℃で６時間加熱した氷冷のガラス製遠心分離管に入れた。ワタアリマキの一部約０．３ｇをポリ（Ａ＋）ＲＮＡの単離に使用し、そして残りを将来使用するために−７０℃で貯蔵した。
【００３５】
一般に、ＲＮＡを製造者の指示に従ってＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して単離した。具体的にいえば、ワタアリマキからその０．３ｇをとり、１．５ｍＬの冷却した抽出緩衝液（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔに同梱されている）を加えた。添加完了後、均一な懸濁物が形成されるまで、混合物をＢｒａｕｎホモゲナイザーで均質にした。均質化後、３．０ｍＬの溶離緩衝液（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔに同梱されている）を加えた。得られた混合物をＢｒａｕｎホモゲナイザーで短く均質化し、次に１０分間約１２０００×ｇで周囲温度を遠心分離した。得られた上清を採集し、オリゴ（ｄＴ）セルロース紡糸カラム（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔに同梱されている）の樹脂にかけ、そして高濃度の塩（ｈｉｇｈ  ｓａｌｔ）及び低濃度の塩（ｌｏｗ  ｓａｌｔ）の緩衝液（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔに同梱されている）により洗った。結合したポリ（Ａ＋）ＲＮＡを、予め６５℃に加温した溶離緩衝液で０．２５ｍＬずつ３回溶離した。０．５ｍＬの溶離液に、５０ｍＬの酢酸カリウム水溶液、１０ｍＬのグリコーゲン溶液及び１ｍＬの９５％エタノールを加えた。得られた混合物を１時間−２０℃で貯蔵し、次に最大速度で遠心分離した。得られた沈澱したポリ（Ａ＋）ＲＮＡを採集し、そして次に５０ｍＬの０．１％ＤＥＰＣ水溶液に溶解した。得られた溶液を使用まで−８０℃で貯蔵した。
【００３６】
２．プライマーのデザイン
Ｏｌｉｇｏ（バージョン６．０）ソフトウエアを使用して、ＦＭＣが専有するＡｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔａｇ（“ＥＳＴ”）ライブラリーからの配列の情報に基づいてプライマーをデザインした。バイオインホマティックスの実験によれば、ライブラリー中の２つの配列が、目標遺伝子の部分的な転写物でありそして関係のある領域に隣接しそしてＭＬＣＫの触媒的ドメインを含んだ。プライマーの２つの対は選択されそしてそれらの配列は以下にリストされる。
【００３７】
センスプライマー  Ｆ１：ＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
アンチセンスプライマー  Ｒ１：ＧＴＴＡＣＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
センスプライマー  Ｆ２：ＧＡＡＴＴＴＡＧＡＧＴＧＴＡＣＧＣＴＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
アンチセンスプライマー  Ｒ２：ＴＡＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＴＣＧＴＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
【００３８】
３．逆転写及びＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）
一般に、ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して行われた。具体的にいえば、２０μＬ容の反応容器に、０．３μｇのワタアリマキポリ（Ａ＋）ＲＮＡ、１μＬのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素、１μＬのランダムヘキサマー（５０ｎｇ／ｕＬ）、４μＬの５×ｃＤＮＡ合成緩衝液、１μＬのＲｎａｓｅＯＵＴ（商標）、１μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ（すべてＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステムに含まれる）及び適切な量のＤＥＰＣ処理水を加えて最終の体積を２０μＬにした。添加完了後、逆転写反応物をＧｅｎｅａｍｐ（商標）９６００サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）にいれ、そして１０分間２５℃に保持した。次に、反応物を５０℃に加熱し、その温度で５０分間保持した。次いで、逆転写反応物を５分間８５℃でインキュベートして反応を終了させた。反応物を−２０℃で貯蔵するかまたはＰＣＲ反応のために直ぐに使用した。ＰＣＲ反応を行うために、２μＬのテンプレート溶液（逆転写反応物または始めのＰＣＲからの得られた溶液）を５０μＬ容の反応容器に移し、そして５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、１．５μＬの５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ、０．４μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）（すべてＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステムに含まれる）、１μＬの１０μＭセンスプライマー、１μＬの１０μＭアンチセンスプライマー及び３８．１μＬのＤＥＰＣ処理水を加えた。反応物をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩから入手可能）にいれ、そしてＰＣＲ増幅をそれぞれのプライマー対に応じて適切なサイクリング条件を使用して行った。
【００３９】
テンプレートとして逆転写反応物を使用しそしてプライマー対としてＦ１及びＲ１を使用するＰＣＲの第一回目は、以下の条件を使用して行われた。反応物を先ず５分間９４℃で加熱し次に３０サイクルのＰＣＲ反応を行い、４５秒間９４℃で変性し、４５秒間５４．３℃でアニーリングし、そして３分間７２℃で拡張した。サイクリングの完了は、１０分間で７２℃でのインキュベーションであった。得られたＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によって確認された。このとき、どんなＰＣＲ生成物のバンドも観察されず、曖昧なＰＣＲ生成物のバンドのみが観察された。
【００４０】
ＰＣＲ生成物を増やすために、二次的な「繰り込まれた（ｎｅｓｔｅｄ）」増幅が、２μＬのテンプレートとしての上記のＰＣＲ反応物並びにプライマー対としてのＦ２及びＲ２を使用して行われた。ＰＣＲの条件は、第一回目のそれと同じであるが、但しアニーリングは５２．３℃である。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動により確認された。約２．５ｋｂのＰＣＲフラグメントがゲルから切り出されそしてＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、２８１５９  Ａｖｅｎｕｅ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、そして得られたＤＮＡを下記のようにクローニングベクター中に連結した。
【００４１】
４．ＲＴ−ＰＣＲ生成物のサブクローニング及び配列決定
ＰＣＲ生成物を製造者の指示に従ってｐＣＲ  ＩＩ  ＴＯＰＯベクター中に連結した。得られたプラスミドを、配列決定プライマーとしてＴ７またはＳＰ６を使用して配列決定した。
【配列表】
2006500067.tif 000002
2006500067.tif 000003
2006500067.tif 000004
2006500067.tif 000005
2006500067.tif 000006
2006500067.tif 000007
【国際調査報告】
2006500067.tif 000008