(57)【要約】本発明は、ポリマー構築ブロックを連続して添加することにより、ポリマー鎖を固体基板の上に合成するための自動化されたポリマー合成装置、並びに、ポリマー構築ブロックを反応基と連続して反応させることにより、ポリマーを固体基板の上に合成するための方法に関するものである。さらに、本発明は、複数の反応基を有する固体基板を一つ備え、そこに生体分子を付着させ、残りの反応基を化学的に不活性な化学種に変換する、バイオチップに関するものでもある。
2006519285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー構築ブロックを連続して添加することにより、ポリマー鎖を固体基板の上に合成するための自動化されたポリマー合成システムであって、
ａ）ポリマー構築ブロックを含む微小液滴の発生を制御するためのノズルを複数備えたインクジェット・プリント・ヘッドと、
ｂ）微小液滴を流体と共に載せた基板を処理するための処理装置と、
ｃ）基板をプリント・ヘッドに隣接するようにおよび処理装置に隣接するように輸送させるための輸送手段と、
ｄ）プリント・ヘッドに隣接した微小混合容器であって、この中でポリマー構築ブロックを活性剤と混合することで、一回の反応手順で反応させる量の構築ブロックを含むようにした、微小混合容器、
という要素からなる、システム。
【請求項２】
要素を直線状に配置していることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
要素を円形に配置していることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
複数のノズルを直線上に配置していることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載のシステム。
【請求項５】
各ノズルが個別に供給可能であることを特徴とする、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
インクジェット・ヘッドに各ノズルと接続されたタンクが一つあることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載のシステム。
【請求項７】
各構築ブロックを別個のタンクに収納することを特徴とする、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
各活性剤を別個のタンクに収納することを特徴とする、請求項６または請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
バイオチップまたは遺伝子チップの製造のための、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載のシステムの使用法。
【請求項１０】
除去可能な保護基で保護された反応基を含むポリマー構築ブロックを連続して反応させることからなる、固体基板上にポリマーを合成する方法であり、
ａ）複数の官能基を備えるポリマー表面を調製し、
ｂ）前記表面の上に、第一のポリマー構築ブロックからなる第一の微小液滴をアプライし、
ｃ）第一のポリマー構築ブロックをポリマー表面の官能基と反応させて、第一のポリマー構築ブロックをポリマー表面に付着させ、
ｄ）該付着したポリマー構築ブロックの保護基を除去し、
ｅ）前記第一の微小液滴の上に、第一のポリマー構築ブロックと同じ、あるいはそれとは異なる、第二のポリマー構築ブロックからなる第二の微小液滴をアプライし、
ｆ）前記第の二ポリマー構築ブロックを、第一のポリマー構築ブロックの脱保護した反応基と反応させ、
ｇ）必要に応じて手順ｄ）−ｆ）を連続して繰り返す、
という手順からなる方法であり、手順ｃ）の後でポリマー表面の未反応の官能基が、化学的に不活性の化学種に変換されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
第一の微小液滴の直径が、１μmと１０００μmの間であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第一の微小液滴の直径が、第二の微小液滴の直径より小さいことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化学的に不活性な化学種がリン基を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマー表面が、基板の不可分の一部であることを特徴とする、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ポリマー表面が有機ポリマーからなることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
反応基がＯＨ、ＮＲＨから選ばれ、ここでＲは、Ｈ、好適にはＣ１−Ｃ４アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基であるアルキル基、およびＳＨであってよいことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリマー構築ブロックが、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、および炭水化物から選ばれることを特徴とする、請求項１〜請求項１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
手順ｂ）の直前に、活性剤を第一のポリマー構築ブロックと微小混合容器の中で混ぜ合わせることを特徴とする、請求項１〜請求項１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１〜請求項１８のいずれか一つに記載の方法により得ることが可能なバイオチップ。
【請求項２０】
表面上に反応基を有する固体基板と、表面上の反応基の一部分に付着した生体分子とからなり、表面の残りの反応基が化学的に不活性な化学種に変換されているバイオチップ。
【請求項２１】
化学的に不活性な化学種がリン基を含むことを特徴とする、請求項２０に記載のバイオチップ。
【請求項２２】
生体分子が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、およびポリ炭水化物からなるグループから選ばれることを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載のバイオチップ。
【請求項２３】
基板が有機ポリマー物質からなることを特徴とする、請求項１〜請求項２２のいずれか一つに記載のバイオチップ。
【請求項２４】
有機ポリマー物質がポリプロピレンであることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一に、ポリマー構築ブロックを連続して添加することにより、ポリマー鎖を固体基板の上に合成するための自動化されたポリマー合成装置に関するものであり、第二に、ポリマー構築ブロックを反応基と連続して反応させることにより、ポリマーを固体基板の上に合成するための方法に関するものである。さらに、本発明は、複数の反応基を有する固体基板を一つ備え、生体分子を該反応基に付着させた、パイオチップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、ポリマー合成、特にオリゴヌクレオチドやポリペプチドのポリマー合成の分野において、有益なシステムへの需要は、増加の一途をたどっている。この目的のために、様々な合成方法が開発されてきた。中でも群を抜いて重要な二つの合成方法は、ｉ）光化学合成とｉｉ）そのようなポリマーを合成する「従来の」化学合成法である。どちらの方法にも、所望のポリマーの構築ブロックの官能基の少なくとも一つを、後に該構築ブロックを反応させることにより変換し、そのポリマーを形成するという過程がある。
【０００３】
構築ブロックの官能基（通常は末端ＯＨ基）は、複数の中間の保護基により一時的に保護され、該中間の保護基は、適切な試薬により処理すれば切断されるものである。このような保護基は通常、例えばＤＭＴ（ジメトキシトリチル）やその誘導体のような、酸に不安定な基か、例えばＮＰＰＯＣ（２−ニトロフェニル−プロピルオキシカルボニル）のような、光に不安定な基である。
【０００４】
このような保護基を多様化するために、多大な努力がなされてきた。例えば米国特許第６２２２０３０号明細書が記載しているのは、３’−５’オリゴヌクレオチドにおいて炭酸塩で保護したヒドロキシル基を用いることである。
【０００５】
どちらの合成法も、ｉｎ−ｓｉｔｕ合成またはｅｘ−ｓｉｔｕ合成で応用可能である。Ｉｎ−ｓｉｔｕ合成が望ましいことが多いのは、その方が、異なるポリマー鎖や同じポリマー鎖をそれぞれの基板の上に直接、容易に構築することができるからであり、しかも、そのような単数または複数のポリマー鎖を基板の上に後で固定する必要がないからである。
【０００６】
業界で知られている数々の合成方法のうちの圧倒的多数において用いられているのは、ポリマー鎖を構築するべき反応部位を精密に規定するための、高性能の設備である。そこに含まれるもののうち、特筆に値するのが、光化学合成方法のために複数のマスクや多数のマイクロミラーを用いているということである。
【０００７】
従来の「湿式化学」を用いる化学合成方法は、合成が行われる装置の材質を低下させることが多い強塩基を用いることによって引き起こされる問題がある。
【０００８】
上記の方法の主な欠点の一つは、反応に用いられる基板の性質である。ほとんどの場合、スライドガラスやシリカやケイ素の材料が用いられており、該材料の表面にはヒドロキシル基が含まれているが、そこに第一のポリマー構築ブロックを様々な手段で付着させることができる。（剛直性、脆弱性などの）ガラスの欠点を克服するために提案されてきたのは、官能化が可能な材料でそのガラス基板をコーティングするか、プラスチック基板を用いることである。
【０００９】
米国特許第６２５８４５４号明細書が開示するのは、（スライド）固体ガラス担体の上の、低い表面エネルギーで官能化した表面であり、それは、その表面の上に親水性の部分をもつスライドガラスを、シラン混合物を含む誘導体化組成物で処理することによるものである。最初のシランが、表面エネルギーを希望通りに減少させる一方で、第二のシランは、最初のモノマーのような目的の分子部分での官能化を可能にして、それをオリゴマーの固相合成で用いることができるようにする。
【００１０】
米国特許第６１４６８３３号明細書が開示するのは、生体高分子固定化のための試薬、それを調製するための方法、および、それらを引き続き、分析目的と診断目的のための生体高分子の固定化に用いることである。そこで開示された試薬は、ポリマー材料で作られた固体担体を含んでおり、そのポリマー材料には、ペンダントフッ化アシル官能基を備えた表面が少なくとも一つある。その固体担体に含まれ、かつその材料となっているのは、ポリマー物質であって、該ポリマー物質に含まれているのは、エチレンアクリル酸コポリマーかエチレンメタクリル酸コポリマー、および活性ポリプロピレンである。生体高分子を、そのポリマー担体の表面に直接付着させることができないのは、導入するのが厄介なリンカー基を必要とするからである。
【００１１】
業界で既知の自動合成方法において直面するさらなる問題は、高密度アレイの合成におけるブルーミングである。
【００１２】
米国特許第６１８４３４７号明細書が開示する洗浄試薬は、高密度ポリマーアレイの表面のまとめ洗いをするために用いられて、そのアレイのセルから未反応のポリマー構築ブロックを除去する一方で、それと同時に、その未反応のモノマーと反応することによって、そこで反応したモノマーが、その反応性のモノマーをアプライする表面の領域外のＨＤＡの表面にある官能基と反応するのをくい止めるものである。それゆえ、高密度ポリマーアレイの表面にアプライされた液滴がブルーミングすることは最小限に抑えられる。その反応性洗浄溶液は、メタノールであることが望ましい。
【００１３】
他に選びうるもう一つの方法は、規定の大きさの細孔内でポリマーを合成することである。米国特許第６２７７３３４号明細書が開示しているのは、化学種や分子ライブラリーを自動的に効率的に合成するための化学反応装置、材料、および方法である。オリゴマーと分子ライブラリーは、多孔質基板の細孔内で合成される。その反応が起こるのは、基板の微小細孔の中である。
【００１４】
さらに、アレイを用いてポリマーを合成するための様々な装置および方法が、業界では提案されてきている。
【００１５】
米国特許第５４７２６７２号明細書が開示しているポリマー鎖を構築するためのポリマー合成装置は、ノズルの一つ一つが液状試薬のタンクと結合されている、ノズルアレイを有するヘッドアセンブリと、反応部位のアレイを有するベースアセンブリとを含む。特定のポリマー構築ブロックに用いられる試薬を伴うノズルの真下に基板を配置するためには、様々な輸送機構が必要となる。
【００１６】
米国特許第５４７４７９６号明細書から得られるのは、特にオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドを合成するために、担体の表面の上に官能化した結合部位のアレイを作るための装置および方法である。アレイの親水性箇所は、基板の表面上の疎水性の領域で取り囲まれる。モノマーのポリマー構築ブロックを含むその溶液は、その親水性反応部位にアプライされるが、周りが疎水性であるため、隣接する反応部位とは混ざり合うことはない。
【００１７】
米国特許第５５２９７５６号明細書にはさらに、ノズルの一つ一つが液状試薬のタンクと結合されている、ノズルアレイを有するヘッドアセンブリと、反応槽のアレイを有するベースアセンブリとを含む、ポリマー鎖を構築するためのポリマー合成装置が開示されている。その基板を、選択した薬剤を含むノズルの下に配置するためには、基板の様々な輸送機構が必要となる。さらに、各ノズルが一本ずつその液状試薬のタンクに結合されるため、設備が全く複雑なものになってしまう。
【００１８】
基板の表面にアプライする液状試薬を蒸発させることで生じるさらなる問題は、米国特許第６１７７５５８号明細書によって開示されている課題である。固相合成の最中に、あるいはミクロスケールの合成において生じる液状試薬の蒸発は、反応性の化学成分で官能化される結合部位を少なくとも一つ含む、開放された固体担体の表面を設けることにより、減らされる。しっかりと制御した極めて微量の液状試薬溶液を、その担体の表面の上に載せる。その試薬溶液は、少なくとも一つの、比較的沸点が高い溶媒に含まれた反応物質を含み、該溶媒は好適には、沸点が少なくとも約１４０℃の、極性がある、非プロトン性の溶媒であり、また、ジニトリル、グリム、ジグリムなどから成るグループから選択される。
【００１９】
米国特許第６４１９８８３号明細書で提案されているのは、沸点が１５０℃以上、表面張力が３０ダイン／ｃｍ以上、そして粘性が０．０１５ｇ／ｃｍ／秒の溶媒を含む溶液の微細な液滴を用いることである。好ましい溶媒は、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、プロピレンカーボネートまたはγ−ブチロラクトンを含むものである。さらにこの米国特許が開示するのは、オリゴマーの合成中に一つ以上の基板を処理する能力がある自動化システムであって、該システムを構成するのは、基板の上に化学種を含む微小液滴を吹きつけるインクジェット・プリント・ヘッドと、そのプリント・ヘッドに隣接した基板を走査して、特定の部位にその微小液滴を選択的に載せる、走査用輸送器と、その基板を一つ以上の選ばれた流体にさらすことにより、微小液滴を載せた基板を処理するためのフロー・セルと、その基板をプリント・ヘッドとフロー・セルとの間を移動させることによりフロー・セルの中で処理を行うための処理用輸送器とであり、従って、処理用輸送器と走査用輸送器とは別個の要素である。この文献によるシステムには、極めて精巧な装置が必要である。
【００２０】
ポリマー、特に生体高分子を自動的に合成する上で直面する依然として未解決の問題があり、それは、反応が進むのは、一種のポリマー構築ブロックに活性剤を添加する場合に限るという場合が多いということである。活性剤をポリマー構築ブロックに添加した後で、その混合物を外部のタンクに収納する。しかしながら、その混合物の寿命は短くて限られたものでしかなく、数分以内にその成分の劣化が起きる。それゆえ、その混合物は、長期にわたる合成サイクルには使用できず、無駄になってしまう。使用される試薬は通常、高価なものなので、この試薬の無駄は、これらのポリマーを合成するための全般的なコストを上げることになってしまう。前もって混ぜ合わせた活性剤／構築ブロック溶液が分解しないようにするために、反応部位に載せられることになるポリマー構築ブロックからなる一種の液滴と、活性剤からなる一種の液滴とを、二つの別個のノズルから同時に吹きつけることが提案されている。これでは、様々なタイプのノズル、管、および制御装置などを付けることになって、設備が不必要に複雑なものになってしまうことになる。反応部位における反応が不完全なものになってしまうことが極めて頻繁にあるが、それは、それぞれが活性剤およびポリマー構築ブロックからなる二つの別個の液滴を混合したものを、直接に該反応部位に存在させても、完全には混じり合わないままであり、均質でもないからである。
【特許文献１】米国特許第６１７７５５８号明細書
【特許文献２】米国特許第６４１９８８３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
それゆえ、本発明の目的は、取扱の容易な設備を備え、長期にわたる保存で試薬が劣化して無駄を生じたりしないような、自動化されたポリマー合成システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この問題は、本発明によって、ポリマー構築ブロックを連続して添加することにより、ポリマー鎖を固体基板の上に合成するための自動化されたポリマー合成システムにより解決されるが、該システムを構成するのは、ポリマー構築ブロックを含む微小液滴の発生を制御するために複数のノズルを備えたインクジェット・プリント・ヘッドと、該プリント・ヘッドに隣接する位置に、さらに微小液滴を流体と共に載せた基板を処理するための処理装置に隣接する位置に、基板を動かすための輸送手段と、プリント・ヘッドに隣接し、その中でポリマー構築ブロックと活性剤を反応の直前に混合する微小混合容器とであり、それにより該微小混合容器には、一回の反応手順で反応させる分量の構築ブロックしか入らない。
【００２３】
プリント・ヘッドに隣接して配置される微小混合容器には、驚くべき長所があり、それは、反応させるためのポリマー構築ブロックの正確な分量のみを、反応の直前に活性剤と混ぜ、その反応中に完全に使い切るということである。それゆえ、ポリマー構築ブロックと混合した活性剤を含む溶液は、その反応が完了した後に無駄にならず、試薬が劣化することも避けられる。本発明のさらに特に望ましい実施態様においては、該システムには各構築ブロック一つ一つに微小混合容器が一つあり、それにより、段階的にポリマーを合成する間、各手順でそれぞれ異なる構築ブロックに必要とされる正確な分量だけの試薬を生じさせることができ、しかも、その構築ブロックを取り替える時に不純物が微量に残ることも避けられる。
【００２４】
ここで用いられている「隣接する」という用語が意味するのは、微小混合容器が空間的にインク・ジェット・プリント・ヘッドの近傍にあり、かつインク・ジェット・プリント・ヘッドと例えば管を介して連結されている、あるいは、微小混合容器が、インク・ジェット・プリント・ヘッドの一部か不可分の一部であり、かつ、固相フィルター・フリット、隔膜その他を介して該ヘッドまたはノズルから分離することが可能だということである。
【００２５】
「一回の反応手順」という用語は、ポリマー構築ブロックを少なくとも一つ、好適には活性剤との溶液の形で、単数または複数の反応部位に添加することを意味するが、そこでは、ポリマー構築ブロックを用いてそれぞれのポリマーを段階的に合成する上での、一つのステップが実行される。
【００２６】
特に望ましい実施態様においては、該システムの要素全てを直線的に（一次元に）配置し、それにより、輸送手段が基板を一方向にしか輸送できないようにしている。このことは、複雑な方向制御手段を有さずに複数の微小液滴を載せることを可能にする。
【００２７】
ポリマー構築ブロックを活性剤と混合させるのは、単に（通常は溶液の状態の）両方の成分を微小混合容器に、攪拌しつつ、あるいは攪拌なしで、添加することによって行うのが一般的である。
【００２８】
言うまでもなく、複数のインク・ジェット・プリント・ヘッドを用いることも、本発明の範囲内で可能である。
【００２９】
本発明のさらに驚くべき長所は、複数の微小液滴を基板の上のあらゆる方向に載せるために必要とされるのは、基板を動かすための一種類の輸送手段だけであるということである。
【００３０】
さらに望ましい実施態様においては、複数のノズルが、インク・ジェット・プリント・ヘッド上に直線的に配置されている。その直線的配置により、さらなる制御手段を必要とすることなく、複数の微小液滴を一直線に載せることを簡単に行うことができる。さらに、インク・ジェット・プリント・ヘッドを一方向に動かしさえすれば、同時に膨大な数の微小液滴を生じさせることができる。
【００３１】
本発明のさらに望ましい実施態様においては、インク・ジェット・プリント・ヘッドの各ノズルは選択的に供給可能である。それゆえ、それらの構築ブロックの数および性質が異なる複数のポリマーを作ることは、先行技術のシステムで行うよりもかなり容易になっている（構築ブロックは「シントン」という用語で呼んでもよい）。さらに望ましいのは、インク・ジェット・プリント・ヘッドが、複数のノズルの各ノズルと流体接続しているタンクを具備していることである。このことによりシステムの設備が単純なものになるのだが、なぜなら、先行技術においては各ノズルをタンクと接続しなければならず、したがって、さらに精巧な制御手段と設備が必要となるからである。既に前述して説明しているように、本発明による微小混合容器に入るのは、各反応手順で使用されることになる活性剤とポリマー構築ブロックとからなる液体の分量だけである。このことにより、化学反応を起こすのに必要とされる正確な量だけを用いることが可能になる。
【００３２】
好適には、ポリマー構築ブロック一つからなる各タンクを、別個のインク・ジェット・プリント・ヘッドにつないで、インク・ジェット・プリント・ヘッドが汚染されるのをふせぐようにする。
【００３３】
特に望ましい実施態様の一つにおいては、システムの要素全てを回転ドラム一つの中に配置している。このような回転式の配置に必要なのは、単数または複数の基板を一方向に移動させるということだけであり、それにより、加速も減速もしないで、単数または複数のインク・ジェット・プリント・ヘッドの下または上に配置した基板を、繰り返し、制御しやすい形で、通過させることができるようにする。さらに、このような配置により、さらなる装置（例えば、追加のインク・ジェット・プリント・ヘッド等のような、追加されたポリマー構築ブロックのためのモジュール）をいつでも望む時に簡単に追加することができるが、このことは、システムの要素を直線に配置して用いる場合にはずっと複雑になってしまうものである。
【００３４】
通常は、ポリマー、特に生体高分子の合成は、基板上の所定の不連続領域（スポット、ロケーション）のアレイで行われるものである。このような不連続領域は互いに孤立しており、エッチング、障壁の形成、マスキングなどにより、あるいは試薬を表面に載せることにより設定してよい。しかしながら、先行技術においては、いかなるシステムおよび方法も、まず、そのような不連続の孤立した領域を作らなければならず、その後で、これらの不連続領域で生体高分子を段階的にｉｎ−ｓｉｔｕ合成するための第一の反応手順を開始するようになっている。これが欠点の最たるものである、というのは、そのような不連続領域の幾何を、インク・ジェット・プリント・ヘッドにおけるノズルの配置の幾何に合わせて行わなければならず、それは、面倒で効果の薄いものであり、アレイの設計における変化が厳しく制約されることになる。
【００３５】
それゆえ、本発明のさらなる目的は、特に構造を設けていない基板の表面上でポリマーを合成するための方法で、反応部位のアレイを思いのままに作ることができ、アレイの幾何を変化させることのできる方法を提供することである。
【００３６】
このようなさらなる目的を達成するのが、複数の反応基を含むポリマー構築ブロックを連続して反応させ、但し、少なくとも一つの反応基は除去可能な保護基で保護されるようにして、反応性の表面を有する固体基板上でポリマーの合成を行うための方法であり、その方法は、
ａ）複数の官能基を備えるポリマー表面を調製し、
ｂ）前記表面の上に、第一のポリマー構築ブロックからなる第一の微小液滴をアプライし、
ｃ）第一のポリマー構築ブロックをポリマー表面の官能基と反応させて、第一のポリマー構築ブロックをポリマー表面に付着させ、
ｄ）該付着したポリマー構築ブロックの保護基を除去し、
ｅ）前記第一の微小液滴の上に、第一のポリマー構築ブロックとは異なる、あるいはそれと同じ、第二のポリマー構築ブロックからなる第二の微小液滴をアプライし、
ｆ）前記第二のポリマー構築ブロックを、第一のポリマー構築ブロックの脱保護した反応基と反応させ、
ｇ）必要に応じて手順ｄ）−ｆ）を連続して繰り返す、
という手順からなる方法であり、
手順ｃ）の後で、ポリマー表面の未反応の官能基は、化学的に不活性の化学種に変換される。
【００３７】
本発明による方法により、前記官能化された表面の上に載せた第一の微小液滴を反応させて微小スポットを形成することにより、特定の反応部位のアレイを、空間的な位置を定め、作ることができる。言い換えれば、第一の微小液滴の大きさにより、ポリマー鎖が生成される、空間的に限定された反応部位（スポット）を定めるということである。残りの反応性表面の基を化学的に不活性な化学種に変換すること（不可逆的に「表面にキャップをしてしまうこと」）により、分離した、はっきりと区別できる複数のスポットで、特定の反応部位のパターン（アレイ）を作ることができる。本発明による方法の利点の一つは、完全に構造を排除した「空の」基板表面の上でも、予め構造を設けた反応部位におけるｉｎ−ｓｉｔｕ合成を開始する前に、その表面に構造を設ける必要なく、意図的に選択可能な幾何を備えたアレイを作ることができるということである。本発明による方法で作られたスポットは、不連続の位置であり、化学的不活性で、好適には機械的にも不活性な領域で隔てられている。しかしながら、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのような所定のスポットのアレイがない、幾何的に前もって構造を設定した表面も、本発明の方法の範囲内で使用可能である。
【００３８】
「化学的不活性」という用語の意味は、化学種を、他の化学薬品、溶液に晒し、電磁波照射や熱に暴露しても、化学反応を起こさないということである。特に望ましい実施態様においては、化学的に不活性な化学種は、ひっかきなどに対して機械的にも不活性である。
【００３９】
本発明に関連した「ポリマー」や「ポリマー表面」という用語は、基板の表面を形成する有機ポリマー化学種および無機ポリマー化学種が存在するという含みがある。言う迄もなく、ガラス（ＳｉＯ２）もまた無機ポリマーという用語の指す範囲に含まれている。無機ポリマーの例をさらに挙げると、重合化した有機ケイ素化合物、ケイ素窒素化合物なども含まれる。言う迄もなく、基板はすべてポリマーでできていてもよいし、または、基板は、層やコーティングなどとして用いられるか基板の製造過程で作られるものである、基板のポリマー表面とは別の材料で作られていてもよい。
【００４０】
第二、第三などのポリマー構築ブロックからなる次の微小液滴を反応部位にアプライすると、第一の反応手順において規定された反応部位においてのみ、ブルーミングを生じる危険もなく、反応する。好適には、第一の微小液滴の直径は、１０μmから３００μmである。言う迄もなく、第二のポリマー構築ブロック（およびその後用いる全てのポリマー構築ブロック）は、同じものでも、違うものでもよい。
【００４１】
特に好適には、第一の微小液滴の直径は第二の微小液滴の直径よりも小さく、それにより、第二のポリマー構築ブロックからなる第二の微小液滴が、第一の微小液滴の中に含まれる第一のポリマー構築ブロックと完全に反応することが可能になっている。さらに好適には、連続する、即ち第三、第四、その他の液滴は、全て第二の液滴の大きさである。第一と第二以降の液滴の間でサイズの違いがあるということの利点は、反応部位における反応を不完全なものにしかねない、基板の輸送手段または単数もしくは複数のプリント・ヘッドの移動を制御する制御手段の機械的不正確さが、各反応手順の結果および収率に、全く影響しないか、少なくとも計測可能な影響を与えないということである。
【００４２】
本発明のさらに望ましい実施態様においては、適切な薬剤を未反応の表面の官能基と反応させて得られる化学的に不活性な化学種は、リンを含んでいる。特に好適には、リンを含む薬剤が、表面上の反応性官能基との反応においてリン酸基を形成する。そのようにして得られた反応生成物は、第一の微小液滴の位置によって規定される反応部位（スポット）間に、不活性な、特に化学的に不活性な表面を形成する。他のもう一つの望ましい実施態様においては、反応部位の周囲に不活性かつ疎水性の区域を生成するペルフルオロ化したリン誘導体を用いる。疎水性の有利な効果は、第二以降の液滴が、非疎水性の部分、即ち基板のスポットに集められることになるということである。また、ブルーミングも効果的に防止される。
【００４３】
好適には、ポリマー表面は基板の不可分の一部を形成するが、例えば、ポリマー薄膜が、他のポリマー、ケイ素、ドープトシリコン、窒化ケイ素などの他の素材でできた基板を覆っていることも可能である。
【００４４】
別の望ましい実施態様において、ポリマー表面は有機ポリマーでできている。ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリイミド、ポリエステルなどのような有機ポリマーは取り扱いやすく、操作しやすい。さらに、それらを、それぞれの化学的および物理的特性に応じて特定して選択し、化学的に不活性なポリマー材料を作り出すこともできる。
【００４５】
特に望ましい実施態様において、有機ポリマー表面を構成する反応基は、ヒドロキシル基、アミノ基、ＮＲＨ基、およびチオール基の中から選んだものである。これらの基は、反応基とポリマー構築ブロックとの間に、化学結合、特に共有結合を形成することにより、ポリマー構築ブロックと反応しやすくするものである。
【００４６】
好適には、ポリマー構築ブロックは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、例えば、２０個までのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド、またはアミノ酸、またはオリゴペプチド、または炭水化物の成分であることが望ましい。それゆえ、本発明による方法は、多数の様々なポリマー、特に生体高分子の合成に用いて成功をおさめることのできるものである。
【００４７】
本発明による方法において特に望ましいのは、手順ｂ）に先立ち、テトラゾール、メチルチオテトラゾールまたはエチルチオテトラゾールなどを、第一のポリマー構築ブロックと混合することである。しかしながら、本質的に当業者に知られているような活性剤なら、他のどのようなものでも使用可能である。該活性剤は、ポリマー鎖を構築するための二つのポリマー構築ブロックの間の反応を、より早く、よりよく（より完全に）行うことを可能にする。
【００４８】
本発明の根底にある問題をさらに解決するのが、ポリマー表面上に反応基を備えた固体の基板からなるバイオチップと、該反応基との間の化学結合により付着する生体分子とであり、そこで、基板の表面に残る、生体分子と反応していない反応基が、化学的に不活性な化学種に変換される。該バイオチップは、本発明の製法により得ることが可能であるが、通常は９６個のウェルがあり、それぞれにオリゴヌクレオチド鎖の付いた１２８の微小スポットからなるアレイがある。該アレイおよび該微小スポットの数は、特定の必要条件によって変化しうるものであり、上記の数は限定的なものではない。
【００４９】
特に好適には、化学的に不活性な化学種、および／または表面の反応性官能基を化学的に不活性な化学種に変換する薬剤は、リン化合物または窒素化合物を含み、該化合物は、反応において、あるいは反応後の処理（焼結、紫外線硬化等）によって、例えば、酸化リン、ペルフルオロ化したリン化合物などを材料とする化学的に不活性な表面を生成することのできるものである。窒素の場合には、好適には、窒素を含む部分が既に基板の表面に含まれており、例えばアミンからアミドなどへの変換のような化学変換だけを必要とすることが望ましい。不活性表面はまた、例えば、リン（ＩＩＩ）化合物からリン（Ｖ）化合物への酸化、アミンから不活性アミドへの変換などのような、さらなる反応により生じさせることもできる。
【００５０】
好適には、生体分子は、表面上で様々な化学反応を導き出すことができる、オリゴヌクレオチド配列またはポリペプチド配列または炭水化物配列である。
【００５１】
特に望ましい実施態様において、生体分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、およびそれらのキメラのような、オリゴヌクレオチドである。
【００５２】
さらに好適には、基板は、ＯＨ、ＮＲＨ、ＳＨなどのような活性化された基を複数含む有機ポリマーであり、それにより、様々な反応基を備えた様々なポリマー構築ブロックのための付着部位を複数提供することができ、しかもそのために特定のリンカー部分の導入を必要としない。活性化は、例えば、プラズマ処理、レーザー処理など、本質的に当業者に既知である様々な機構によって達成される。
【００５３】
特に好適には、有機ポリマーは、生物学的ポリマー分子の合成で起きる既知の化学反応の多くまたはほとんどに対して化学的耐性のある、ポリプロピレンである。
【００５４】
定義と略称
ポリマー構築ブロック：ポリマー構築ブロック（あるいは「シントン」）という用語は、最終的なポリマーの中に含まれる化学成分を指すものである。それゆえ、その化学成分には、最終的なポリマーの中に組み込まれる前の官能基が含まれることがある。本発明におけるポリマー構築ブロックとして相応しいものを、非限定的な例として列挙すると、置換されたホスホアミダイト、または非置換のホスホアミダイト、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、糖（フラノース、リボース等）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体などがある。
【００５５】
微小液滴：溶液の微小液滴は、沸点が１５０℃を上回り、好適には２２０℃を上回るものであり、そして表面張力が約２６〜４７ダイン／ｃｍ、好適には３０〜３９ダイン／ｃｍであり、粘性が３．３〜７２ｃＰで、好適には８〜２０ｃＰである、表面張力の高い溶媒を含む。各微小液滴は、それぞれが分離した不連続の単位であり、その容積は約１００から２００ｐＬであり、最も好適には５ｐＬと７０ｐＬの間である。ここで用いられる「溶液」という用語は、溶媒それ自体と、一つまたは複数の溶質も含むことは、言う迄もない。
【００５６】
微小液滴は表面に反応すると、いわゆるスポットや微小ドットを形成する。本発明により得られたポリマーのアレイを、それぞれが分離した不連続の単位であるこれらの微小ドットやスポット内に配置する。各微小ドットの直径は１０００μm より大きくてもよいが、典型的には約５μm〜８００μmの範囲であり、好適には約１０μm〜約５００μmであって、最も好適には２０〜２００μmである。
【００５７】
個々の微小ドットの間の距離は、典型的には約１μm〜約５００μmで、好適には約２０μm〜約４００μmである。一般的には、微小ドット間の距離は、好適には、隣接するスポットの使用を避けるために、微小液滴のそれぞれの部位の範囲内であるようにする。
【００５８】
微小ドットを物理的に隔てる手段は、残りの官能基を除去不能な保護基と反応させることであり、該保護基はできればリンを含んでいることが望ましい。そうすることで、これらの領域で、化学的に不活性な、非反応性の保護表面が得られる。
【００５９】
ここで用いられる「生体分子」または「生体高分子」という用語は、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体などのポリマーの形の、何らかの生物学的分子を意味するものである。ここで用いられる「ヌクレオシド」という用語は、デオキシリボヌクレオシドとリボヌクレオシドの両方を含む。「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドかリボヌクレオチドの単位を有するオリゴヌクレオチドを指す。
【００６０】
本発明によりオリゴヌクレオチドを合成するのに有益な、相応するヌクレオチドは、ホスホトリエステル基、Ｈ−ホスホネート基およびホスホアミダイト基のような、活性化されたリン含有基を含むヌクレオチドである。
【００６１】
「活性剤」という用語は通常、触媒を意味し、オリゴヌクレオチドを合成する場合には、ヌクレオシドの３’ホスホアミダイト基とそれに隣接するヌクレオシドまたはヌクレオチドのヒドロキシル基との間の反応を促進する触媒である。これは、５−メチルチオテトラゾール、テトラゾール、または５−エチルチオテトラゾール、ＤＣＩまたは塩化ピリジニウムであってよい。
【００６２】
ここで用いられる「アルキル」という用語は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等のような、１から１０個の炭素原子の、飽和した、直鎖の、分岐した、あるいは環式の、何らかの炭化水素基を指すものである。アルキルという用語はまた、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などのシクロアルキル基も含んでいる。
【００６３】
「低級アルキル」という用語は、１から４個の炭素原子のアルキル基を指し、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔブチル基を含む。
【００６４】
ここで用いられる「アリール」という用語は、一個から五個の芳香環を含む何らかの芳香族化合物を指すものであり、該芳香環は、縮合したものでも結合したものでもよく、通常はアミノ、ハロゲン、シアン化物、および低級アルキルの中から選ばれる、少なくとも一つの置換基で置換しないものでも置換したものでもよい。望ましいアリール置換基には、一個から三個の縮合した芳香環が含まれている。ここで用いられる芳香族化合物は、複素環であっても、なくてもよく、つまり、硫黄、窒素、リンなどのようなヘテロ原子を少なくとも一つ含んでもよいということである。
【００６５】
「アラルキル」という用語は、アルキル化学種とアリール化学種の両方を含む化合物で、典型的には二十個未満の炭素原子を含むものを指す。「アラルキル」という用語は、通常、アリール置換アルキル基を指すものとして用いられる。
【００６６】
「複素環」という用語は、五員もしくは六員の単環構造または八員から十一員の二環構造で、飽和あるいは不飽和のものを指す。複素環には、窒素、酸素、硫黄、リン、砒素などの中から選んだヘテロ原子が少なくとも一つ含まれている。「窒素ヘテロ原子」と「硫黄ヘテロ原子」並びに「リンヘテロ原子」という用語には、何らかの酸化された形の窒素、硫黄およびリン、並びに何らかの塩基性窒素を四級化した形のものが含まれる。「複素環化合物」の例には、ピペリジニル、モルホリニルそしてピロリジニルが含まれる。
【００６７】
「ハロゲン」という用語は、その通常の意味で用いられ、塩素原子、臭素原子、フッ素原子またはヨウ素原子を指す。
【００６８】
ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）ポリデオキシヌクレオチド、（Ｄ−リボースを含む）ポリリボヌクレオチドから、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−配糖体であるその他一切のタイプのポリヌクレオチドまで、そして、ＤＮＡやＲＮＡに見られるような塩基対合や塩基スタッキングを許容しうる配置にある核酸塩基をポリマーが含む場合は、非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマーまでをも指す。
【００６９】
ここで用いられる「保護基」という用語は、分子のセグメントが特定の化学反応を起こすことを阻害し、この反応が完了すると、該分子からの除去が可能な化学種を指すものである。
【００７０】
本発明の方法は、標準的な固相ペプチド合成方法によりペプチドを合成することにも使用可能である。
【００７１】
典型的には、固相ペプチド合成方法は、ＣからＮの方向に行われる。従って、合成形態の末端で切断を行うとＣ末端酸またはアミドが生じるようにするために、係留リンカーが必要である。望ましい実施態様においては、活性化されたカルボキシル基を含むリンカーを、本発明による担体の活性化された表面に連結することのできるアミノ基に適合させる。ポリペプチド合成化学で習慣的に用いられる、通常の「一時的な」保護基のいずれも、本発明での使用に適している。そのようなもの中から、非限定的な例を挙げると、例えばＢＯＣ（ｔ‐ブトキシカルボニル）基およびＦＭＯＣ（Ｎα９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基である。他にも相応しいアミノ保護基があり、例えば、２−（４−ビフェニル）プロピル〔２〕オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエトキシ−カルボニル（Ａｄｐｏｃ）その他があるが、それに限定されるわけではない。代表的な活性剤、あるいは、いわゆるｉｎ−ｓｉｔｕの結合を行う試薬で、本発明に用いるのに適しているものとしては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などがあるが、それに限定されるわけではない。できれば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）などのような、さらなる促進剤や添加物と共にそれらを用いるのが望ましい。
【００７２】
本発明の方法は、有利には、亜リン酸トリエステル、ホスホアミダイトの合成およびH−ホスホネート合成を含む固相ＤＮＡやＲＮＡを合成するための、幾つかの既に知られた化学的方法のいずれかによって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマー化学種（いわゆるオリゴヌクレオチド）を合成することに用いられる。
【００７３】
原則として、本発明の方法が役に立つのは、何らかの反復性の核酸合成技法を実施するために用いる場合である。本発明の特に望ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドはホスホアミダイト法により合成される。本発明によるホスホアミダイト合成を行うために、基板の表面上の反応性部位を、業界で既に知られた方法に従ったスペーサーを追加して官能化することもある。そのスペーサーを導入するのは、ポリマー鎖の生成を開始する前か、あるいは、例えば本発明による製法の手順ａ）の後で行ってもよい。そのようなスペーサーとなる基は、その反応担体の前もって選んだ部分のみにアプライしてもよい。
【００７４】
典型的には、モノマーのヌクレオチドまたはヌクレオシドポリマー構築ブロック（シントンとも呼ばれるもの）には、適切な核酸塩基または２’−Ｏ位に一時的な保護基がある。
【００７５】
固相核酸合成技法では、いわゆる一時的な、および永続的な保護基が、固相ペプチド合成と類似の仕方で用いられる。合成を行っている間、複素環式の核酸塩基の環外アミノ基を保護するためには、塩基に不安定な保護基を用いる。このタイプの保護を行うためには通常、塩化ベンゾイルや塩化イソブチリルのようなアシル化剤を用いてアシル化する。合成を行っている間、ヌクレオチドの５’ヒドロキシル基を保護するためには、酸に不安定な保護基を用いる。代表的なヒドロキシル保護基は、当業者には既知である。このようなものには、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、トリチル基および９−フェニル−キサンテン（ピクシル）基があり、しかも、それに限定されない。ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は、酸に対する不安定性が大きいということで広く使われており、それにより、大いに希釈した酸によっても効率的に除去できる。
【００７６】
ホスホアミダイト技法による反復性の鎖延長サイクルの第一歩は、反応担体を脱保護剤の溶液の中に浸すことによる、最初のモノマーの５’−Ｏ−保護基の除去（脱保護）である。この後に、すすぎ用の試薬を添加する。脱保護のための試薬として相応しいものとして、ＺｎＢｒ２、ＡｌＣｌ３、ＢＦ３、およびＴｉＣｌ４のようなルイス酸を、ジクロロメタン、ニトロメタン、テトラヒドロフランのような様々な溶媒、および混合溶媒、例えばニトロメタンと、メタノールまたはエタノールおよびそれらの混合物のような低級アルキルアルコール類との混合溶媒の中に溶かしたものがある。酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、およびトルエンスルホン酸のようなプロトン酸を、単独で、あるいは組み合わせて用いてもよい。
【００７７】
鎖は、５’−Ｏ−を保護された、活性化したモノマーのシントンを添加し、反応させることで、延長される。ホスホアミダイト技法においては、５’−ＤＭＴｒ−デオキシヌクレオシド−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエチルホスファイトを反応担体の上に載せる。数多くのヌクレオシドのホスホアミダイトが市販されている。
【００７８】
穏やかな有機触媒または活性剤、典型的には、テトラゾール、エチルチオテトラゾールまたはメチルチオテトラゾールを、反応担体の上にホスホアミダイトと共に載せる。その結合反応の後に、すすぎ用溶媒、典型的には無水アセトニトリルを添加する。
【００７９】
すすいだ後、キャップ形成試薬を、例えば基板をそのキャップ形成試薬の溶液に浸すことにより、反応担体の前もって選んだ部分の上に添加し、それにより亜リン酸塩のモノマーの反応が不完全であったために残っている、フリーのヒドロキシル化学種にキャップをする。ヌクレオチド／ヌクレオシドの反応していないヒドロキシル基の「キャップ形成」のためのキャップ形成試薬は、典型的には酸無水物の溶液であるが、それはまた、グアニンのＯ−６位が不測にもリン酸化反応をしているところがあれば、それを元に戻す機能もある。
【００８０】
しかしながら、本発明に関する限りでは、固体担体の表面上の反応していない反応基を、除去不能な化学的に不活性な化学種に変換すること（記載を容易にするために「表面キャップ形成」という用語でも呼ぶ）と、前述して説明したようなヌクレオチド／ヌクレオシド自体の反応していないヒドロキシル基のキャップ形成という変換との間には、根本的な違いがあるということに留意しなければならない。
【００８１】
得られた亜リン酸トリエステルを酸化してそれに対応するリン酸トリエステルにすることは、水にアルカリ性のヨウ素を溶かした溶液のように、適切であると業界で周知の酸化剤を添加して行ってもよい。
【００８２】
当業者は、オリゴヌクレオチドの合成が、３’−５’の方向か５’−３’の方向のどちらかで行われることは、十分に承知している。
【００８３】
本発明の方法は、天然の核酸塩基であるアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）、並びに非天然の核酸塩基も有するオリゴヌクレオチドの合成に用いてもよい。非天然の核酸塩基というのは、核酸の構成要素として、天然の核酸塩基の生物学的役割における機能を模したものとして、業界では既知の分子成分である。
【００８４】
核酸塩基、糖あるいは糖間の結合において広範で多種多様な修飾を有するオリゴヌクレオチドの化学種を、本発明の方法に従って調製することができ、それらは一般に、例えばポリ炭水化物に対するのと同様に、固相技法により合成可能な一切のオリゴマーの合成に応用可能である。
【００８５】
例えば、本発明の方法を、Ｓ−ジチオリン酸、チオリン酸などの合成に用いてもよい。
【００８６】
本発明の方法により製造されたポリマーは、（例えば、アミノ酸、ペプチド核酸、ヌクレオチド、糖類（炭水化物）などのような）複数種のモノマーのサブユニットで構成されていてもよく、そして複数種のサブユニット間の結合を有していてもよい。本発明の方法で製造されたポリマーで実例となるものとしては、ペプチド、ペプトイド（Ｎ−アルキル化グリシン）、α−ポリエステル、ポリチオアミド、Ｎ−ヒドロキシアミノ酸、β−エステル、ポリスルホンアミド、Ｎ−アルキレートポリスルホンアミド、ポリ尿素、ペプチド核酸、ヌクレオチド、多糖類、ポリカーボネート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドなど、およびそれらのポリマーの一つまたは複数が合体して単一の高分子となったものを含むキメラ分子がある。
【００８７】
モノマー化学種のライブラリーも、本発明の方法により調製することができる。これらには、ベンゾジアゼピンライブラリーが含まれ、他にも似たようなライブラリーとして血圧降下薬、抗潰瘍薬、抗真菌薬、抗生物質、抗炎症剤などがあるが、それに限定されない。
【００８８】
当業者は、本発明の範囲に含まれるのは、上記の特徴だけではなく、それら特徴を組み合わせたものも含むこと、および、本発明の範囲にはまた本文中で説明している本発明に関連している全ての特徴の一つ一つも含まれているということを、十分に承知している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
本発明を、図を参照しつつ、以下の望ましい実施態様の説明においてさらに細部にわたり説明する。
図１は、本発明のシステムの望ましい実施態様の一つを概略的に示している。
図２は、本発明のインクジェット・プリント・ヘッドを概略的に示している。
図３は、本発明のシステムの実施態様の一つをさらに概略的に示している。
図４は、本発明のシステムのさらに望ましい実施態様の一つを示している。
図５は、本発明のバイオチップの断面図を概略的に示している。
図６は、本発明のシステムの実施態様の一つをさらに概略的に示している。
図７は、本発明の方法の第一の反応手順を概略的に示している。
図８は、本発明の方法の第二の反応手順、およびその後に続く反応手順を概略的に示している。
【００９０】
図１は、本発明のシステム１００の望ましい実施態様の一つを概略的に示している。システム１００は、不活性な室１０１の内部に配置されるのであるが、その不活性な室には、アルゴン、窒素などのような不活性ガスを送りこむことができる。前記室１０１の内部で、基板１０２を移動手段１１１に取り付ける。好適には基板１０２は、その表面に、例えばヒドロキシル基、アミン基またはチオール基のような活性化させた官能基を有する、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのような有機ポリマーを材料として作られたものである。移動手段１１１により、図１に矢印で示したＸおよびＹの方向に基板１０２を動かすことができる。
【００９１】
システム１００は、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）である塩基で作られているオリゴヌクレオチドを合成するために設計されている。便宜上、そのような塩基は、ホスホアミダイト誘導体として存在させている。各塩基につき、図１に図示されていないタンクが一つ、用意されている。各タンクの中にあるのは、対応する塩基を溶媒の中に溶かした溶液である。望ましい溶媒の例を挙げると、グリム、フタル酸アルキル、セバシン酸アルキルや、アジポニトリルのようなニトリル、置換した、あるいは置換していないジアルキルエーテル、安息香酸誘導体（安息香酸塩など）、およびそれらの混合物である。望ましい溶媒は、上述したように表面張力の高い溶媒である。
【００９２】
塩基の液滴を載せる前に、各塩基と、それに対応する、例えばテトラゾール（ＴＥＴ）のような活性剤を、微小混合容器１０７、１０８、１０９、および１１０の中で混ぜ合わせる。微小混合容器の容積は、約４μｌである。容器の容積がより小さくてもより大きくても、本発明の状況で使用可能であることは、言う迄もない。その上限は、約１から５ｍｌであり、下限は約１０ｐｌである。一般的な規定として、該微小混合容器の容積は、一つの完全な手順の容積を含むものである。微小混合容器の容積との関連で「一つの完全な手順」という用語は、一つのポリマー構築ブロック（例えば上記の塩基の一つ）を、第一の反応手順で生じたすべての反応部位（「スポット」）の上にアプライすることができるということを意味する。それゆえ、該容積は、特定の必要条件、刻印すべき基板の大きさと数に従って変化することがあり得る。
【００９３】
微小液滴は、さらに小さな微小液滴のパルスからなっている。各スポットは通常、１から１００、最も好適には５０パルスにより構成されており、各パルスは１から１００、最も好適には２０ｐLの容積であり、つまり最も好適な場合、各スポットにつき１ｎｌである。規定の数のスポットが一つのアレイを構成している。数個のアレイを規則的に、あるいは不規則に、基板の上に並べてバイオチップを形成する。通常は、９６個のアレイを一つの基板の上に配するが、それより少ないあるいは多いアレイを用いるのも、本発明の趣旨の範囲内で可能である。それゆえ、それぞれの上に１２８個のスポットのある９６個のアレイからなる一つのバイオチップをプリントするための微小混合容器の容積は、≒１３μｌということになるだろう。同時に幾つかのバイオチップをプリントしなければならない場合には、その容積を調節せねばならず、さもなければ、第一のバイオチップの上に載せ終わった後で、その微小混合容器を再充填しなければならない。留意すべきことは、シントン（塩基）と活性剤の混合物の寿命は、劣化を防ぐために、１時間を越えてはならないということである。他のもう一つの望ましい実施態様においては、インクジェット・プリント・ヘッドの「デッドボリューム」は、本発明による微小混合容器を構成する。
【００９４】
活性剤と塩基とを微小混合容器１０７、１０８、１０９および１１０の中で混合した後、溶液をインクジェット・プリント・ヘッド１０３、１０４、１０５および１０６に、即ち塩基ごとのプリント・ヘッドの中に、移しかえる。プリント・ヘッド１０３、１０４、１０５および１０６は、複数の小さなノズルを直線状に配置したものである。該ノズルは、好適には、それぞれ個別に供給可能な圧電ポンプであり、それにより、複数のノズルのうちの一つのノズルだけから微小液滴を生じさせるようにする。該ノズルの数は、６４または１２８個、特に望ましい実施例では２５６個である。言う迄もなく、本発明の趣旨の範囲内で、異なる数のノズルを用いることも可能である。その場合、基板１０２を、例えばＡおよびＴＥＴの溶液が入っているインクジェット・プリント・ヘッド１０３に移動させる。基板１０２の上に生じさせる反応部位の個数によって、一本だけ、あるいは前もって選定した本数、あるいは全部のノズルを用いて、微小液滴を基板１０２の表面上に載せることになる。その反応の完了後に、続いて、基板１０２を処理室１１２に移動させるが、処理室１１２には、すすぎ装置１１３、表面の未反応官能基を不活性の化学種に変換するための装置１１４、および脱保護装置１１５が含まれる。本発明のもう一つ他の実施態様においては、基板１０２が前記処理室１１２の壁を構成する。基板上に対する室の圧力により密閉を行うが、その場合、密閉手段を使っても使わなくてもよい。図１に示されてはいないが、さらに他の装置には、ヌクレオチドの未反応のヒドロキシル基のキャップ形成を行うさらにもう一つの装置と、最終的な脱保護装置、およびヌクレオチドリンカーのリン基の酸化を行う酸化装置がある。該最終の脱保護装置が（例えばＮＨ３によって）最終的なオリゴヌクレオチドを脱保護することにより、必要なら、生物学的に活性のあるオリゴヌクレオチドを生成する。反応手順を行う、典型的、非限定的な順序は、以下のようなものである。
１．ホスホアミダイト＋活性剤の混合、基板上への噴射、洗浄、酸化、洗浄、表面の未反応官能基の化学的に不活性な化学種への変換、洗浄、脱保護、洗浄、フラッシング、および乾燥。
２．第二のホスホアミダイト＋活性剤の混合、基板上への噴射、洗浄、酸化、洗浄、キャップ形成、洗浄、脱保護、洗浄、フラッシング、および乾燥、手順２を必要な頻度で反復。
３．ＮＨ３の添加、洗浄；終了。
【００９５】
本発明のもう一つの実施態様においては、異なる塩基（すなわち対応する塩基と活性剤の混合物）を続いて、各塩基の添加手順の後に基板を処理部１１２に動かさずに、添加する。オリゴヌクレオチドの同じ位置の塩基を全て添加した後、あるいは所定の数の塩基を添加した後に初めて、基板を処理部１１２に移動させ、そこで上記に説明した通りに処理する。
【００９６】
大事なのは、第二の微小液滴の直径は、反応部位を規定する第一の微小液滴の直径よりも大きいということである。第一の微小液滴を載せた後、基板１０２の表面上の未反応のヒドロキシル反応基を薬剤と反応させる（「表面キャップ形成」）のだが、該薬剤は、好適には、リン含有の試薬であり、ポリマー鎖の合成サイクルが完了するまでの間、それを化学的に不活性な部分に変換するためのものであることが望ましい（例えば、リン酸塩、ペルフルオロアルキルまたはアリールホスフェート、Ｃ８−Ｃ２０アルキルホスフェート）。
【００９７】
図２ａは、本発明のシステムで用いられるプリント・ヘッド２００の概略図である。プリント・ヘッド２００には、金属製の外箱２０１がある。その金属製外箱２０１の底に、個別に供給可能なノズル２０７が配置されている。外箱２０１の内部には室２０５があり、そこに活性剤と混合した塩基を回収する。室２０５は、ノズル２０７と流体で接続されている。望ましい実施例においては、室２０５は、本発明の微小混合容器のことであり、そこでポリマー構築ブロックと必要なら活性剤とを混ぜ合わせる。ノズル２０７は、圧電コネクター２０４を有する圧電素子２０３を介して供給可能なので、載せるパターンを正確に規定することができる。そのプリント・ヘッド２００にはさらに、流体供給要素２０６が装備されている。
【００９８】
図２ｂは、複数のプリント・ヘッド２００のアセンブリ２０８を示す。各プリント・ヘッド２００は別のプリント・ヘッドと接続されている。ノズル２０７は、直線状に配置されていて、ノズル列２０２を形成している。ノズルの数は、用いるプリント・ヘッド２００の数によって、個別に選択可能である。好適には、ノズルは１２８個から２５６個あるのが望ましい。言う迄もなく、本発明の範囲内で、例えば６４や３２個などの、より少ないノズルも使用可能である。プリント・ヘッド２００は、各プリント・ヘッドを供給する流体供給器２０６を介して流体で接続されている。
【００９９】
図３には、本発明のシステム３００のもう一つの実施態様の概略が示されている。システム３００には、回転ドラム３０１と、それに付着した基板３１７がある。該基板は、前述して説明したものと本質的に同じものである。該ドラムの周りに、対応する塩基と活性剤ごとに、プリント・ヘッド３０４、３０５、３０６、および３０７が配置されている。インクジェット・プリント・ヘッド３０４、３０５、３０６、および３０７に隣接して、微小混合容器３０８、３０９、３１０、３１１があり、そこでは、微小液滴を生成し、そして溶液を基板の上に噴射する直前に、使用する塩基および対応する活性剤とを、前もって混合しておく。
【０１００】
処理装置には、すすぎ、脱保護、キャップ形成をする試薬のための装置３１２、３１３および３１４がある。図３に示されない装置がさらにあって、それには、複数の酸化装置および表面のキャップ形成装置が一つあるが、それだけに限定されない。
【０１０１】
さらに、乾燥器３１５がドラムの周りに配置されていて、反応完了後に基板を乾燥させる。看視器３１６は、コンピューター制御の画像看視器でもよく、それにより全ての反応段階で反応の完了を制御する。これは例えば、塩基と活性剤をあらかじめ混合したものに添加すると、ＵＶ／ＶＩＳ分光器等の当業者にとって通常の手段で視覚的に検出できるような色素を用いる等して行ってもよい。できればその色素のクラスはアズレン染料であるのが望ましい。
【０１０２】
図４は、微小混合容器を一つ有する本発明のシステムの概略的な断面図である。システム４００には二つのタンク４０１と４０２がある。タンク４０１の中には、例えばオリゴヌクレオチドを合成しなければならない場合にはホスホアミダイトである、ポリマー構築ブロックがあり（４０１）、そしてタンク４０２の中には、活性剤、または活性剤を含む溶液、例えば塩化ピリジニウム、テトラゾールなどがある。既に前述して説明したように、ポリマー構築ブロックのためのタンク４０１一つと、必要であれば活性剤のタンク４０２とだけを用いるのではなく、様々なポリマー構築ブロックと活性剤のそれぞれのための複数のタンク４０１も、本発明のさらに望ましい実施態様においては、用いられる。ポリマー構築ブロック、即ち例えばホスホアミダイトも、溶液の中に含まれていてよい。タンク４０１と４０２は両方とも、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製の管４０５を介して、微小混合容器４０３に接続されている。既に図１について説明したように、微小混合容器４０３の容積は、約４０μｌ、好適には約５−１０μｌである。微小混合容器４０３は、例えば、Ｙ字型か、二つの取り入れ口を有するその他の相応しい形のガラス管で、出口４０９での微小液滴のサイズを最小化する複数のフリット４０４を備えている。好適には、フリット４０４の材料は、例えば陶磁器などのような化学的に不活性なものである。微小混合容器４０３は、タンク４０１と４０２に管４０５を介して接続している両方の取り入れ口を、封止キャップ４０６によって封止されている。微小混合容器４０３の出口４０９は、インクジェット・ヘッド４０７に接続されている。インクジェット・ヘッド４０７から、微小液滴を、図４には示されていない基板の上にアプライする。図４には示されていない微小液滴が、基板の表面上に微小スポット４０８を形成する。
【０１０３】
図５は、本発明のバイオチップの概略的な側面図である。バイオチップ５００は、例えば、酸素基を有する官能化した表面を含む、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはそれらの混合物で構成される、基板５０１を備える。前述して説明した反応サイクルの完了後に、官能基の一つの上において、オリゴヌクレオチド配列Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａを、前記基板の表面上に付着させる。反応区域を生成するのは、前述して説明したように、第一の微小液滴である。前記反応部位の周りで、残りの官能化したヒドロキシル基を、リン含有試薬で化学的に不活性な化学種に変換し（表面キャップ形成）、該試薬をつぎに、五価のリンに酸化して、チップの表面上に化学的に不活性なリン酸塩の化学種を生成する。リンにおける置換基は、図５には示されていない。好適には、リンの置換基には、ペルフルオロ化したアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキル基などが含まれる。
【０１０４】
図６は、微小混合容器を有する本発明のシステムのさらなる概略的な断面図を示すものである。システム６００には、前述して説明したようなインクジェット・プリント・ヘッド６０１がある。言うまでもなく、該システムには、各プリント・ヘッドを異なるポリマー構築ブロックのために用いる、図６には示されていない複数のプリント・ヘッド６０１がある。
【０１０５】
各プリント・ヘッド６０１において、例えばアセトニトリルのような洗浄溶媒、または、例えばホスホアミダイトを溶解するために用いられるような他の相応しい溶媒のための、タンク６０２、さらには活性剤のためのタンク６０３、およびポリマー構築ブロック溶液の入ったタンク６０４が、微小混合容器６１０に接続されている。それらのタンクの形状や材料の選択は、それらの容積と同様に、特定の必要条件に応じて行ってよい。タンク６０２、６０３、および６０４は、好適にはＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製あるいは類似の材料製の柔軟な管を介して、微小混合容器６１０のそれに接続されている。微小混合容器６１０の材料は、例えばガラス、化学的に不活性なプラスチック材料などでよい。具体的な形状は、本来の目的に沿って許容可能なものならどのような形状でもよい。微小混合容器６１０の容積は、前述したように規定されており、その結果、ポリマー構築ブロックと活性剤の混合物である混合物６０６の正確な分量だけが、微小混合容器６１０の中に存在する。管６１１、６１２、および６１３は、バルブ６０９、６０７、６０７ｂｉｓを介して、微小混合容器６１０の中に入り込む。それに加えて、メニスカス・システム６０８を、微小混合容器６１０の頭頂部に設置してもよい。微小混合容器６１０を、封止手段６１４を介して封止し、それにより、空気の流入を防止する。微小混合容器６１０は、連結手段６１５を介してインクジェット・プリント・ヘッド６０１と連結されている。バルブ６０５は、混合液６０６のインクジェット・プリント・ヘッド６０１への流入を制御するために用いるバルブである。この特に望ましい実施態様においては、微小混合容器６１０を、例えばホスホアミダイトであるリン構築ブロックと活性剤との間の混合液を添加するために用いるだけでなく、反応の後、基板を洗浄溶媒で洗浄するためにも用いる。それゆえ、設備をさらに簡略化し、より簡単にすることができる。
【０１０６】
図７は、本発明の方法の第一の反応手順を概略的に示している。例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレンなどでできた担体７０１は、その表面上に反応性官能基ＸＨがある。Ｘは、好適にはＯまたはＮである。それらの官能基は、そのポリマー合成の最中に得られるか、レーザー処理、紫外線照射、プラズマ処理などのような、それぞれのポリマーの処理をした後に得られるものである。第一の液滴７０１にはヌクレオシドホスホアミダイトと必要なら活性剤が含まれており、それを担体７０１の表面上に、図７には示されていないインクジェット・プリント・ヘッドにより吹きつける。ヌクレオシドには、ＤＭＴのような保護基あるいは同等の保護基、好適には直交する保護基があり、該ヌクレオシドは、基板７０１の表面上で反応性官能基ＸＨと反応する。残りのＲ1は何らかの不安定基であり、例えば、本来の目的に沿ってホスホアミダイト化学で通常用いられるような、シアノエチレン基である。第二の手順において、未反応の官能化した反応性のある表面の基ＸＨが、ホスホアミダイト化学種と反応することにより、ヌクレオシドホスホアミダイトが反応を起こした反応部位の周りで、化学的に不活性な化学種に変換される。Ｒ２は不安定性のものでなく、除去不能な基であることにより、手順２で得られた反応生成物を化学的に不活性な状態にするものである。さらにそのホスホネート化学種は、例えばひっかき傷などの機械的劣化に耐性があり、反応部位７０３のスポット間に化学的安定性と機械的安定性の高い領域を発生させる。
【０１０７】
官能化した反応性のある表面の基を化学的に不活性な化学種に変換（「表面キャップ形成」）した後、直交する保護基ＤＭＴを、当業者には本質的に既知の通常の技法で除去して、そのヌクレオシドの３’または５’末端のフリーのＯＨ基を解放する。図７に関連した「ｂａｓｅ１」という用語は、塩基が、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンのような、オリゴヌクレオチド化学で用いられる保護された塩基のいずれでもよいという意味である。ここで、該ヌクレオシドのフリーのＯＨ基は、図８について下で説明しているように、本発明の方法の次の合成手順に向けた出発点である。
【０１０８】
図８は、本発明の方法の第二の反応手順を概略的に示している。図７での基板７０１に相当する基板８０１の上で、第二の塩基を含み、図７における第一の液滴（７０２）よりも直径が大きい第二の液滴８０２は、図７で用いられる塩基と同じでも異なっていてもよいが、それを、前述の第一の反応手順で規定された反応部位８０３の上にアプライする。通常はそのホスホアミダイトとしての形態で用いられる第二の塩基が反応した後で、第一のヌクレオシドの未反応のヒドロキシル基の標準的なキャップ形成を、例えば、無水酢酸での処理により行う。Ｒ３は好適には、例えば酢酸の場合のエチレンのような、アルキル基である。Ｒ１とＲ２は、図７においてと同じ意味をもっている。次の反応手順５において、図７の手順３で説明したように、ＤＭＴ保護基の脱保護を行う。所望の長さおよび性質のオリゴヌクレオチド鎖が得られるまで、一連の反応が行われる。最後の反応である手順６は、ＮＨ３水溶液で処理することによって、本発明の活性バイオチップを得ることである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明のシステムの望ましい実施例の一つを概略的に示した図。
【図２】本発明のインクジェット・プリント・ヘッドを概略的に示した図。
【図３】本発明のシステムの実施例の一つをさらに概略的に示した図。
【図４】本発明のシステムのさらに望ましい実施例の一つを示した図。
【図５】本発明のバイオチップの断面図を概略的に示した図。
【図６】本発明のシステムの実施例の一つをさらに概略的に示した図。
【図７】本発明の方法の第一の反応手順を概略的に示した図。
【図８】本発明の方法の第二の反応手順、およびその後に続く反応手順を概略的に示した図。
【符号の説明】
【０１１０】
１００、３００、４００  ポリマー合成システム
１０２、３１７  基板
１０７〜１１０、３０８〜３１１、４０３  微小混合容器
１１１  輸送手段
１１２  処理室
２００、３０４〜３０７  インクジェット・プリント・ヘッド
２０７  ノズル
４０１、４０２  タンク
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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