(57)【要約】本発明は、カスパーゼ活性部位プローブとして有用な式（Ｉ）の化合物を含む。これらのプローブは、種々の病状の動物モデルの組織内または細胞内でカスパーゼが活性化されているかどうかを判定するために使用することが可能である。さらに、競合に基づくアッセイにより、これらのカスパーゼ活性部位プローブは、活性カスパーゼが他の未標識インヒビターにより占拠されている割合を算出するために使用することが可能である。    【化１４】2006519777.tif 000025
2006519777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2006519777.tif 000019
［式中、
Ｘはハロであるか、または
Ｘは−Ｏ−Ｗ−Ｚであり、ここで、Ｗは結合、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−であり；
Ｚは、
（１）Ｈ、
（２）Ｃ１−１１アルキル、
（３）Ｃ３−１１シクロアルキルまたはそのベンゾ縮合類似体、
（４）フェニルまたはナフチル、および
（５）ＨＥＴ１（ここで、ＨＥＴ１は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜３個のヘテロ原子を含有する５〜１０員の単環式もしくは二環式の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゼン縮合類似体を表す。）
よりなる群から選ばれ、
前記の基（２）、（３）および（５）は、所望により、１〜２個のオキソ基により置換されていてもよく、
前記の基（２）〜（５）は、
（ａ）ハロ、
（ｂ）ニトロ、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）Ｃ１−４アルキル、
（ｅ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｆ）Ｃ１−４アルキルチオ、
（ｇ）Ｃ３−６シクロアルキル、
（ｈ）フェニルまたはナフチル、
（ｉ）フェノキシ、
（ｊ）ベンジル
（ｋ）ベンジルオキシ、および
（ｌ）Ｏ、ＳおよびＮよりなる群から選ばれる１〜３個のヘテロ原子を含有する５または６員の芳香族または非芳香族環
よりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により更に置換されていてもよく、
前記の基（ｄ）〜（ｇ）は、オキソにより並びに独立してハロおよびＣ１−４アルコキシから選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく、
前記の基（ｈ）〜（ｌ）は、ハロおよびＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく、
基（４）は、その最大限度までハロ基により、所望により更に置換されていてもよく；
Ｒ２は、
（１）Ｈ、
（２）ハロ、
（３）ヒドロキシ、
（４）ニトロ、
（５）シアノ、
（６）Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−１０アルキルまたは−ＮＨＣ１−１０アルキル［ここで、これらのそれぞれは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、オキソにより並びに独立してハロおよびＣ１−４アルキルから選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）。］、
（７）フェノキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２フェニル、
（８）ベンジルオキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２ベンジル、
（９）ベンゾイル、
（１０）フェニルまたはナフチル、
（１１）−Ｏ−ＨＥＴ２または−Ｓ−ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）、および
（１２）ＨＥＴ３（ここで、ＨＥＴ３は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５もしくは６員の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゾ縮合類似体であり、該ＨＥＴ３は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）
よりなる群から選ばれ、
前記の基（７）〜（１２）はそれぞれ、ハロ、シアノ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ３はフェニルまたはＣ１−１０アルキルであり、該Ｃ１−１０アルキルは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく：
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、ハロまたはＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から選ばれ、該Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、フェニル、ナフチル、Ｃ１−６アルキル（これは、所望により、ＯＲ１２および１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）およびＣ５−７シクロアルキル（これは、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。）よりなる群から選ばれ、
ここで、Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１−５アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）およびベンジル（これは、ハロ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい。）よりなる群から選ばれ、
Ｒ１３は、ＨまたはＣ１−４アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）であり；
Ｒ６はＨを表し；
あるいは、Ｒ５とＲ６とが一緒になって、４〜７員環を表し、該環は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。］
により表される化合物またはその塩、エステルもしくは水和物。
【請求項２】
Ｘがハロである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘが−Ｏ−Ｗ−Ｚである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｚが、
（１）Ｃ１−１１アルキル、
（２）Ｃ３−１１シクロアルキルまたはそのベンゾ縮合類似体、および
（３）フェニルまたはナフチル
よりなる群から選ばれ、ここで、前記の基（１）〜（３）が、
（ａ）ハロ、
（ｂ）ニトロ、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）Ｃ１−４アルキル、
（ｅ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｆ）Ｃ１−４アルキルチオ、
（ｇ）Ｃ３−６シクロアルキル、
（ｈ）フェニルまたはナフチル、
（ｉ）フェノキシ、
（ｊ）ベンジルおよび
（ｋ）ベンジルオキシ
よりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３がメチルである、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２および各Ｒ４が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５が、Ｃ１−６アルキル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
Ｘがハロまたは−Ｏ−Ｗ−Ｚであり、
Ｗが結合、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−であり、
Ｚが、
（１）１〜３個のハロ基により、所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキル、
（２）Ｃ３−１１シクロアルキルまたはそのベンゾ縮合類似体、および
（３）ハロまたはＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜３個の基により、所望により置換されていてもよいフェニルまたはナフチル
よりなる群から選ばれ、
Ｒ３がメチル、エチルまたはフェニルであり、
Ｒ２および各Ｒ４が水素であり、
Ｒ５が、Ｃ１−６アルキル、Ｃ５−７シクロアルキル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれ、
Ｒ６が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
式ＩＩ：
【化２】
2006519777.tif 000020
［式中、
Ｘはハロである；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、
（１）Ｈ、
（２）ハロ、
（３）ヒドロキシ、
（４）ニトロ、
（５）シアノ、
（６）Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−１０アルキルまたは−ＮＨＣ１−１０アルキル［ここで、これらのそれぞれは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、ハロおよびＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）。］、
（７）フェノキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２フェニル、
（８）ベンジルオキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２ベンジル、
（９）ベンゾイル、
（１０）フェニルまたはナフチル、
（１１）−Ｏ−ＨＥＴ２または−Ｓ−ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）、および
（１２）ＨＥＴ３（ここで、ＨＥＴ３は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５もしくは６員の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゾ縮合類似体であり、該ＨＥＴ３は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）
よりなる群から選ばれ、
前記の基（７）〜（１２）はそれぞれ、ハロ、シアノ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ３はＣ１−１０アルキルであり、これは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく：
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、ハロまたはＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から選ばれ、該Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、フェニル、ナフチル、Ｃ１−６アルキル（これは、所望により、ＯＲ１２および１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）およびＣ５−７シクロアルキル（これは、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。）よりなる群から選ばれ、
ここで、Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１−５アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）およびベンジル（これは、ハロ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい。）よりなる群から選ばれ、
Ｒ１３は、ＨまたはＣ１−４アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）である；
Ｒ６はＨを表し；
あるいは、Ｒ５とＲ６とが一緒になって、４〜７員環を表し、該環は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。］
により表される化合物またはその塩、エステルもしくは水和物。
【請求項１０】
Ｒ１が、
（１）ハロ、
（２）Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシ（これらはそれぞれ、所望により、オキソおよび１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）、および
（３）ＨＥＴ３（ここで、ＨＥＴ３は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５もしくは６員の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゾ縮合類似体であり、これは、独立してハロおよびＣ１−４アルキルから選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）
よりなる群から選ばれ、
Ｒ２および各Ｒ４が水素であり、
Ｒ５が、Ｃ１−６アルキル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれ、
Ｒ６が水素である、請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
ＨＥＴ３が、所望によりＣ１−４アルキルにより置換されていてもよい１，２，４−オキサジアゾールである、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
哺乳動物の細胞または組織を請求項１記載の化合物と接触させ、活性カスパーゼ３を検出することを含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するための方法。
【請求項１３】
哺乳動物の細胞または組織を請求項９記載の化合物と接触させ、活性カスパーゼ３を検出することを含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するための方法。
【請求項１４】
１）サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターを細胞損傷の動物モデルに投与すること、
２）該動物を安楽死させ、該損傷細胞を摘出すること、
３）該損傷細胞をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で請求項１記載の化合物と接触させること、
４）該化合物の量を検出して、カスパーゼ３の遊離活性部位の数を測定すること、
５）該カスパーゼ３遊離活性部位の数を活性カスパーゼの全量と比較して、カスパーゼ３活性部位占拠を測定すること
を含んでなる、細胞損傷の動物モデルにおいて、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターのカスパーゼ３活性部位占拠を測定するための方法。
【請求項１５】
１）細胞培養を、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターと接触させること、
２）該細胞培養を請求項１記載の化合物と接触させること、
３）該化合物の量を検出して、カスパーゼ３の遊離活性部位の数を測定すること、
４）該カスパーゼ３遊離活性部位の数を活性カスパーゼの全量と比較して、カスパーゼ３活性部位占拠を測定すること
を含んでなる、細胞培養内で、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターのカスパーゼ３活性部位占拠を測定するための方法。
【請求項１６】
請求項１記載の化合物を含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するためのキット。
【請求項１７】
請求項９記載の化合物を含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するためのキット。
【請求項１８】
【化３】
2006519777.tif 000021
である、請求項１記載の化合物またはその塩、エステルもしくは水和物。
【請求項１９】
以下の表：
【表１】
2006519777.tif 000022
2006519777.tif 000023
2006519777.tif 000024
から選ばれる、請求項１記載の化合物または前記のいずれかの塩、エステルもしくは水和物。
【請求項２０】
哺乳動物の細胞または組織における活性カスパーゼ３の検出に使用するための、請求項１〜１１、１８または１９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
細胞損傷の動物モデルにおける、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターのカスパーゼ３活性部位占拠の測定に使用するための、請求項１〜１１、１８または１９のいずれか１項記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アポトーシスは、組織化され秩序だった様態で細胞が分解される細胞死の一形態である。アポトーシスは、ほとんどの場合、細胞の恒常性に必要な正常な過程である。しかし、多数の病状が、過多または過少の異常細胞死を示す。したがって、薬剤でアポトーシスを調節し患者の健康の改善をもたらすことに多大な関心が持たれている。
【０００２】
アポトーシス中に見られる細胞形態学的変化の多くは、カスパーゼと称されるシステインプロテアーゼにより引き起こされる。これらの酵素は休眠形態ですべての細胞型に存在し、アポトーシスプログラムの開始後のタンパク質分解プロセシングにより活性化される。活性カスパーゼは、２つの２０ｋＤａサブユニットと２つの１０ｋＤａサブユニットとのヘテロ四量体よりなり、活性部位システインは該２０ｋＤａサブユニット上に位置する。カスパーゼは常に、短く比較的保存されたコンセンサス配列に先行するアスパラギン酸残基の後で、それらのタンパク質基質を切断する。カスパーゼの、ほとんどの薬理学的インヒビターは、アスパラギン酸を含有する短いペプチド様分子であり、細胞内でアポトーシスを阻害することが示されている。カスパーゼの阻害に基づく治療に関する重要な考慮点は、治療利益を達成するためにインヒビターにより占拠される必要のあるカスパーゼ活性部位の割合である。本発明は、活性部位システインに不可逆的に結合する標識されたカスパーゼプローブを記載する。これらのプローブは、種々の病状の動物モデルの組織内または細胞内でカスパーゼが活性化されているかどうかを判定することを可能にする。さらに、競合に基づくアッセイにより、これらのカスパーゼ活性部位プローブは、活性カスパーゼが他の未標識インヒビターにより占拠されている割合を算出するのを可能にする。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、カスパーゼ活性部位プローブとして有用な式Ｉ
【０００４】
【化４】
2006519777.tif 000003
の化合物を含む。これらのプローブは、種々の病状の動物モデルの組織内または細胞内でカスパーゼが活性化されているかどうかを判定するために使用することが可能である。さらに、競合に基づくアッセイにより、これらのカスパーゼ活性部位プローブは、活性カスパーゼが他の未標識インヒビターにより占拠されている割合を算出するために使用することが可能である。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、式Ｉ：
【０００６】
【化５】
2006519777.tif 000004
［式中、
Ｘはハロであるか、または
Ｘは−Ｏ−Ｗ−Ｚであり、ここで、Ｗは結合、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−であり；
Ｚは、
（１）Ｈ、
（２）Ｃ１−１１アルキル、
（３）Ｃ３−１１シクロアルキルまたはそのベンゾ縮合類似体、
（４）フェニルまたはナフチル、および
（５）ＨＥＴ１（ここで、ＨＥＴ１は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜３個のヘテロ原子を含有する５〜１０員の単環式もしくは二環式の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゼン縮合類似体を表す。）
よりなる群から選ばれ、
前記の基（２）、（３）および（５）は、所望により、１〜２個のオキソ基により置換されていてもよく、
前記の基（２）〜（５）は、
（ａ）ハロ、
（ｂ）ニトロ、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）Ｃ１−４アルキル、
（ｅ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｆ）Ｃ１−４アルキルチオ、
（ｇ）Ｃ３−６シクロアルキル、
（ｈ）フェニルまたはナフチル、
（ｉ）フェノキシ、
（ｊ）ベンジル
（ｋ）ベンジルオキシ、および
（ｌ）Ｏ、ＳおよびＮよりなる群から選ばれる１〜３個のヘテロ原子を含有する５または６員の芳香族または非芳香族環
よりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により更に置換されていてもよく、
前記の基（ｄ）〜（ｇ）は、オキソにより並びに独立してハロおよびＣ１−４アルコキシから選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく、
前記の基（ｈ）〜（ｌ）は、ハロおよびＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく、
基（４）は、その最大限度までハロ基により、所望により更に置換されていてもよく；
Ｒ２は、
（１）Ｈ、
（２）ハロ、
（３）ヒドロキシ、
（４）ニトロ、
（５）シアノ、
（６）Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−１０アルキルまたは−ＮＨＣ１−１０アルキル［ここで、これらのそれぞれは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、オキソにより並びに独立してハロおよびＣ１−４アルキルから選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）。］、
（７）フェノキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２フェニル、
（８）ベンジルオキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２ベンジル、
（９）ベンゾイル、
（１０）フェニルまたはナフチル、
（１１）−Ｏ−ＨＥＴ２または−Ｓ−ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）、および
（１２）ＨＥＴ３（ここで、ＨＥＴ３は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５もしくは６員の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゾ縮合類似体であり、該ＨＥＴ３は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）
よりなる群から選ばれ、
前記の基（７）〜（１２）はそれぞれ、ハロ、シアノ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ３はフェニルまたはＣ１−１０アルキルであり、該Ｃ１−１０アルキルは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい：
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、ハロまたはＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から選ばれ、該Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、フェニル、ナフチル、Ｃ１−６アルキル（これは、所望により、ＯＲ１２および１〜３個のハロ基により置換されていてもよい）およびＣ５−７シクロアルキル（これは、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。）よりなる群から選ばれ、
ここで、Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１−５アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい）およびベンジル（これは、ハロ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい）よりなる群から選ばれ、
Ｒ１３は、ＨまたはＣ１−４アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）であり；
Ｒ６はＨを表し；
あるいは、Ｒ５とＲ６とが一緒になって、４〜７員環を表し、該環は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。］
により表される化合物またはその塩、エステルもしくは水和物を含む。
【０００７】
本発明の１つの実施形態は、Ｘがハロである式Ｉの化合物を含む。
【０００８】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｘが−Ｏ−Ｗ−Ｚである式Ｉの化合物を含む。この実施形態においては、Ｚは、
（１）Ｃ１−１１アルキル、
（２）Ｃ３−１１シクロアルキルまたはそのベンゾ縮合類似体、および
（３）フェニルまたはナフチル
よりなる群から選ばれ、ここで、前記の基（１）〜（３）は、
（ａ）ハロ、
（ｂ）ニトロ、
（ｃ）ヒドロキシ、
（ｄ）Ｃ１−４アルキル、
（ｅ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｆ）Ｃ１−４アルキルチオ、
（ｇ）Ｃ３−６シクロアルキル、
（ｈ）フェニルまたはナフチル、
（ｉ）フェノキシ、
（ｊ）ベンジルおよび
（ｋ）ベンジルオキシ
よりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｒ３がメチルである式Ｉの化合物を含む。
【００１０】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｒ２および各Ｒ４が水素である式Ｉの化合物を含む。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｒ５が、Ｃ１−６アルキル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれる、式Ｉの化合物を含む。
【００１２】
本発明のもう１つの実施形態は、
Ｘがハロまたは−Ｏ−Ｗ−Ｚであり、
Ｗが結合、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−であり、
Ｚが、
（１）１〜３個のハロ基により、所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキル、
（２）Ｃ３−１１シクロアルキルまたはそのベンゾ縮合類似体、および
（３）ハロまたはＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜３個の基により、所望により置換されていてもよいフェニルまたはナフチル
よりなる群から選ばれ、
Ｒ３がメチル、エチルまたはフェニルであり、
Ｒ２および各Ｒ４が水素であり、
Ｒ５が、Ｃ１−６アルキル、Ｃ５−７シクロアルキル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれ、
Ｒ６が水素である、式Ｉの化合物を含む。
【００１３】
本発明のもう１つの実施形態は、式ＩＩ：
【００１４】
【化６】
2006519777.tif 000005
［式中、
Ｘはハロである；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、
（１）Ｈ、
（２）ハロ、
（３）ヒドロキシ、
（４）ニトロ、
（５）シアノ、
（６）Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ１−１０アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−１０アルキルまたは−ＮＨＣ１−１０アルキル［ここで、これらのそれぞれは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、ハロおよびＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）。］、
（７）フェノキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２フェニル、
（８）ベンジルオキシまたは−Ｓ（Ｏ）０−２ベンジル、
（９）ベンゾイル、
（１０）フェニルまたはナフチル、
（１１）−Ｏ−ＨＥＴ２または−Ｓ−ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）、および
（１２）ＨＥＴ３（ここで、ＨＥＴ３は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５もしくは６員の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゾ縮合類似体であり、該ＨＥＴ３は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、後記のとおりに置換されていてもよい。）
よりなる群から選ばれ、
前記の基（７）〜（１２）はそれぞれ、ハロ、シアノ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ３はＣ１−１０アルキルであり、これは、所望により、１〜２個のオキソまたはカルボキシ基により置換されていてもよく、更に、以下のものよりなる群から、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよく：
（ａ）ハロ、
（ｂ）ヒドロキシ、
（ｃ）シアノ、
（ｄ）Ｃ１−４アルコキシ、
（ｅ）−ＮＨＲ７（ここで、Ｒ７は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである）、
（ｆ）−Ｓ（Ｏ）０−２Ｃ１−４アルキルおよび
（ｇ）ＨＥＴ２（ここで、ＨＥＴ２は、Ｏ、ＳおよびＮＲ８（ここで、Ｒ８は、独立して、ＨまたはＣ１−５アルキルである。）から選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の芳香族もしくは非芳香族環を表し、該ＨＥＴ２は、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、ハロまたはＣ１−４アルキルから、独立して選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）；
各Ｒ４は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシよりなる群から選ばれ、該Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−４アルコキシは、所望により、オキソにより置換されていてもよく、更に、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、フェニル、ナフチル、Ｃ１−６アルキル（これは、所望により、ＯＲ１２および１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）およびＣ５−７シクロアルキル（これは、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。）よりなる群から選ばれ、
ここで、Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１−５アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）およびベンジル（これは、ハロ、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから、独立して選ばれる１〜３個の置換基により、所望により置換されていてもよい。）よりなる群から選ばれ、
Ｒ１３は、ＨまたはＣ１−４アルキル（これは、所望により、１〜３個のハロ基により置換されていてもよい）である；
Ｒ６はＨを表し；
あるいは、Ｒ５とＲ６とが一緒になって、４〜７員環を表し、該環は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１３から選ばれる１個のヘテロ原子を、所望により含有していてもよい。］
により表される化合物またはその塩、エステルもしくは水和物を含む。
【００１５】
本発明のもう１つの実施形態は、
Ｒ１が、
（１）ハロ、
（２）Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシ（これらはそれぞれ、所望により、オキソおよび１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）、および
（３）ＨＥＴ３（ここで、ＨＥＴ３は、Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含有する５もしくは６員の芳香族もしくは非芳香族環またはそのベンゾ縮合類似体であり、これは、独立してハロおよびＣ１−４アルキルから選ばれる１〜２個の置換基により、所望により置換されていてもよく、該Ｃ１−４アルキルは１〜３個のハロ基により置換されていてもよい。）
よりなる群から選ばれ、
Ｒ２および各Ｒ４が水素であり、
Ｒ５が、Ｃ１−６アルキル、フェニルおよびナフチルよりなる群から選ばれ、
Ｒ６が水素である、式ＩＩの化合物を含む。
【００１６】
この実施形態においては、ＨＥＴ３は、所望によりＣ１−４アルキルにより置換されていてもよい１，２，４−オキサジアゾールである。
【００１７】
本発明は、哺乳動物の細胞または組織を式Ｉの化合物と接触させ、活性カスパーゼ３を検出することを含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するための方法をも含む。
【００１８】
本発明のもう１つの実施形態は、哺乳動物の細胞または組織を式ＩＩの化合物と接触させ、活性カスパーゼ３を検出することを含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するための方法をも含む。
【００１９】
本発明のもう１つの実施形態は、
１）サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターを細胞損傷の動物モデルに投与すること、
２）該動物を安楽死させ、該損傷細胞を摘出すること、
３）該損傷細胞をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で式Ｉの化合物と接触させること、
４）式Ｉの化合物の量を検出して、カスパーゼ３の遊離活性部位の数を測定すること、
５）該カスパーゼ３遊離活性部位の数を活性カスパーゼの全量と比較して、カスパーゼ３活性部位占拠を測定することを含んでなる、細胞損傷の動物モデルにおいて、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターのカスパーゼ３活性部位占拠を測定するための方法を含む。
【００２０】
本発明のもう１つの実施形態は、
１）細胞培養を、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターと接触させること、
２）該細胞培養を式Ｉの化合物と接触させること、
３）式Ｉの化合物の量を検出して、カスパーゼ３の遊離活性部位の数を測定すること、
４）該カスパーゼ３遊離活性部位の数を活性カスパーゼの全量と比較して、カスパーゼ３活性部位占拠を測定することを含んでなる、細胞培養内で、サンプルである可逆的カスパーゼ３インヒビターのカスパーゼ３活性部位占拠を測定するための方法を含む。
【００２１】
本発明は、式Ｉの化合物を含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するためのキットをも含む。
【００２２】
本発明のもう１つの実施形態は、式ＩＩの化合物を含んでなる、哺乳動物の細胞または組織において活性カスパーゼ３を検出するためのキットをも含む。
【００２３】
本発明は、５−フルオロ−３−（｛Ｎ−［（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセチル］−Ｌ−バリル｝アミノ）−４−オキソペンタン酸またはその塩、エステルもしくは水和物である放射能標識化合物をも含む。
【００２４】
本発明は、以下の表から選ばれる放射能標識化合物またはそれらのいずれかの塩、エステルもしくは水和物をも含む。
【００２５】
【表２】
2006519777.tif 000006
2006519777.tif 000007
2006519777.tif 000008
2006519777.tif 000009
【００２６】
本明細書のこの目的においては、「細胞または組織を接触させる」なる表現は、本発明の化合物をカスパーゼ３酵素と接触させそれに結合させることを意味する。動物モデルにおいては、該表現は、本発明の化合物を、例えばｉ．ｃ．ｖ．注射により、該動物に投与することを含む。
【００２７】
「活性カスパーゼ３を検出」なる表現は、カスパーゼ３を、それに結合した標識化合物により検出することを意味する。本発明の化合物を検出するための方法は当技術分野でよく知られており、後記の方法において例示される。例えば、Ｉ１２５で標識された本発明の化合物をオートラジオグラフィーにより検出することが可能である。
【００２８】
本明細書の目的においては、アルキルは、特に示さない限り１〜２０個の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状構造体およびそれらの組合せを意味する。アルキル基の具体例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−およびｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、エイコシル、３，７−ジエチル−２，２−ジメチル−４−プロピルノニルなどが含まれる。
【００２９】
シクロアルキルは、所望により直鎖状または分枝状構造体と組合されていてもよい、特に示さない限り１〜２０個の炭素原子を含有する環状構造体を意味する。シクロアルキル基の具体例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロドデシルメチル、２−エチル−１−ビシクロ［４．４．０］デシルなどが含まれる。
【００３０】
アルコキシは、直鎖状、分枝状または環状配置の、特に示さない限り１〜１０個の炭素原子のアルコキシ基を意味する。アルコキシ基の具体例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシなどが含まれる。
【００３１】
アルキルチオは、直鎖状、分枝状または環状配置の、特に示さない限り１〜１０個の炭素原子のアルキルチオ基を意味する。アルキルチオ基の具体例には、メチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオなどが含まれる。例えば、プロピルチオ基は−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３を意味する。
【００３２】
ハロには、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩが含まれる。
【００３３】
ＨＥＴ１の具体例には、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、フラン、チオフェン、チアゾールおよびオキサゾールが含まれる。
【００３４】
ＨＥＴ２の具体例には、ブチロラクトン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、２−ピロリジノン、ピリジンおよびピリミジンが含まれる。
【００３５】
ＨＥＴ３の具体例には、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、チオフェン、ピロール、ピリジン、テトラゾール、オキサゾール、チアゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾールおよび１，３，４−トリアゾールが含まれる。
【００３６】
本明細書の目的においては、以下の略語は、以下に示す意義を有する。
ＡｃＯＨ        ＝  酢酸、
Ａｌｌｏｃ      ＝  アリルオキシカルボニル、
ＡＰＣＩ        ＝  大気圧化学イオン化、
ＢＯＣ          ＝  ｔ−ブチルオキシカルボニル、
ＣＢＺ          ＝  カルボベンゾキシ、
ＤＣＣ          ＝  １，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、
ＤＩＢＡＬ      ＝  ジイソブチルアルミニウムヒドリド、
ＤＩＥＡ        ＝  Ｎ，Ｎ−ジイソプロイルエチルアミン、
ＤＭＡＰ        ＝  ４−（ジメチルアミノ）ピリジン、
ＤＭＦ          ＝  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ＥＤＣＩ        ＝  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、
ＥＤＴＡ        ＝  エチレンジアミン四酢酸  四ナトリウム塩水和物、
ＥＳＩ          ＝  エレクトロスプレーイオン化、
ＦＡＢ          ＝  高速原子衝撃、
ＦＭＯＣ        ＝  ９−フルオレニルメトキシカルボニル、
ＨＭＰＡ        ＝  ヘキサメチルホスホルアミド、
ＨＡＴＵ        ＝  Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−ｌ−イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、
ＨＯＢｔ        ＝  ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
ＨＲＭＳ        ＝  高分解能質量分析、
ＩＣＩ          ＝  一塩化ヨウ素、
ＩＢＣＦ        ＝  イソブチルクロロホルマート、
ＫＨＭＤＳ      ＝  カリウムヘキサメチルジシラザン、
ＬＤＡ          ＝  リチウムジイソプロピルアミド、
ＭＣＰＢＡ      ＝  メタクロロ過安息香酸、
Ｍｓ            ＝  メタンスルホニル  ＝  メシル、
ＭｓＯ          ＝  メタンスルホナート  ＝  メシラート、
ＮＢＳ          ＝  Ｎ−ブロモスクシンイミド、
ＮＭＭ          ＝  ４−メチルモルホリン、
ＮＭＯ          ＝  ４−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド、
ＰＣＣ          ＝  ピリジニウムクロロクロマート、
ＰＤＣ          ＝  ピリジニウムジクロマート、
Ｐｈ            ＝  フェニル、
ＰＰＴＳ        ＝  ピリジニウム  ｐ−トルエンスルホナート、
ｐＴＳＡ        ＝  ｐ−トルエンスルホン酸、
ｒ．ｔ．        ＝  室温、
ｒａｃ．        ＝  ラセミ体、
ＴＦＡ          ＝  トリフルオロアセタート、
ＴｆＯ          ＝  トリフルオロメタンスルホナート  ＝  トリフラート、
ＴＬＣ          ＝  薄層クロマトグラフィー、
ＴＰＡＰ        ＝  テトラプロピルアンモニウム  ペルルテナート。
【００３７】
アルキル基の略語：
Ｍｅ            ＝  メチル、
Ｅｔ            ＝  エチル、
ｎ−Ｐｒ        ＝  ノルマルプロピル、
ｉ−Ｐｒ        ＝  イソプロピル、
ｎ−Ｂｕ        ＝  ノルマルブチル、
ｉ−Ｂｕ        ＝  イソブチル、
ｓ−Ｂｕ        ＝  第二級ブチル、
ｔ−Ｂｕ        ＝  第三級ブチル。
【００３８】
Ｌ−アミノ酸および略語：
【００３９】
【化７】
2006519777.tif 000010
【００４０】
本明細書に記載の化合物は、純粋な形態の塩、エナンチオマー、エステルおよび水和物ならびにそれらの混合物を包含すると意図される。また、窒素原子が存在する場合には、窒素原子の原子価を満足させるのに十分な水素原子が存在すると理解される。
【００４１】
後記においてはキラル構造が示されているが、示されているもの以外のエナンチオマーを合成スキームに代入することにより、あるいは、エナンチオマーの混合物をスキームに代入することにより、異なる異性体またはラセミ混合物を得ることが可能である。したがって、すべてのそのような異性体および混合物が本発明に含まれる。
【００４２】
記載されている化合物は、典型的には、不斉中心を含有し、したがって、ジアステレオマーおよび光学異性体が存在しうる。本発明は、そのような可能なジアステレオマーおよびそれらのラセミ体、ならびに光学分割されたエナンチオ的に純粋な形態およびそれらの医薬上許容される塩を含むと意図される。
【００４３】
本明細書に記載の化合物のいくつかはオレフィン性二重結合を含有し、特に示さない限り、ＥおよびＺ幾何異性体の両方を含むと意図される。
【００４４】
本発明の化合物を投与するために、医薬組成物を使用することが可能である。そのような医薬組成物は式Ｉまたは式ＩＩの化合物と、医薬上許容される担体、および場合によっては他の治療成分とを含む。「塩」なる語は、無機塩基および有機塩基を含む医薬上許容される塩基から製造された塩を意味する。無機塩基に由来する代表的な塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、亜マンガン酸、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩が含まれる。特に好ましいのは、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。医薬上許容される有機塩基に由来する代表的な塩には、第一級、第二級および第三級アミン、置換アミン、例えば天然に存在する置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が含まれる。
【００４５】
本発明の化合物が塩基性である場合には、塩は、無機酸および有機酸を含む医薬上許容される無毒性酸から製造されうる。そのような酸の具体例には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。特に好ましいのは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸および酒石酸である。
【００４６】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物の用量の大きさは、もちろん、試験されているモデルおよび個々の式Ｉの化合物に応じて様々となろう。本発明において使用する化合物の代表的な量は、後記の実施例において例示されている。該化合物の適当な量が用いられる。
【００４７】
本発明の化合物の投与を行うためには、任意の適当な投与経路を用いることが可能である。例えば、経口、非経口および局所経路を用いることが可能である。剤形には、錠剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、水剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤、エアゾール剤などが含まれる。
【００４８】
該組成物には、経口、非経口および眼内経路に適した組成物が含まれる。それらは、単位投与形として簡便に提供され、薬学の分野でよく知られた任意の方法により製造されうる。
【００４９】
実際の使用においては、通常の医薬調剤技術に従い、式Ｉまたは式ＩＩの化合物を有効成分として、医薬担体と密接に混合させることが可能である。該担体は、投与に望ましい製剤化の形態に応じて多種多様な形態をとりうる。経口剤形用の組成物の製造においては、例えば懸濁剤、エリキシル剤および水剤のような経口液体製剤の場合には、例えば水、アルコール、油、香味剤、保存剤、着色剤などのような通常の任意の医薬媒体を、また、例えば散剤、カプセル剤および錠剤のような経口固体製剤の場合には、デンプン、糖、微晶質セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような担体を使用することが可能であり、固体経口製剤が液体製剤より好ましい。錠剤およびカプセル剤は、それらの投与の容易さのため、最も有利な経口単位投与形を代表し、この場合には、明らかに、固体医薬担体を使用する。所望により、標準的な水性または非水性技術により錠剤をコーティングすることが可能である。
【００５０】
経口投与に適した本発明の医薬組成物は、所定量の有効成分をそれぞれが含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤のような分離した単位として、あるいは散剤または顆粒剤として、あるいは水性液体、非水性液体、水中油エマルションまたは油中水エマルション中の水剤または懸濁剤として提供されうる。そのような組成物は、任意の薬学的方法により製造することが可能であるが、すべての方法は、１以上の必要成分を構成する担体と有効成分とを接触させる工程を含む。一般には、該組成物は、液体担体または細かく分割された固体担体またはそれらの両方と有効成分とを均一かつ密接に混合し、ついで必要に応じて、該産物を、所望の外観に成型することにより製造する。例えば、錠剤は、場合によっては１以上の補助成分と共に、圧縮またはすりこみにより製造することが可能である。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合された、粉末または顆粒のような自由流動形態の有効成分を、適当な装置中で圧縮することにより製造することが可能である。すりこみ錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適当な装置中ですりこむことにより製造することが可能である。
【００５１】
合成方法
本発明の実施例１は、以下の合成スキームに従い合成することが可能である。
【００５２】
【化８】
2006519777.tif 000011
【００５３】
本発明の化合物は、前記スキームと同様の方法により当業者により製造されうる。
【００５４】
代表的な実施例
本発明を例示するのは以下の化合物である。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
５−フルオロ−３−（｛Ｎ−［（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセチル］−Ｌ−バリル｝アミノ）−４−  オキソペンタン酸（２９）：
【００５６】
【化９】
2006519777.tif 000012
【００５７】
工程１：（５−ヨード−２−メトキシフェニル）酢酸（２１）：
２０ｍｌの２：１：１  ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：水中のメチル（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセタート（０．９２ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液に水酸化リチウム（８ｍｍｏｌ）を加え、該溶液を２時間攪拌した。ついで該反応を１Ｎ  ＨＣｌ（８ｍＬの１Ｍ  水溶液、８ｍｍｏｌ）でクエンチし、ついでＥｔＯＡｃで抽出した。ついで有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。該化合物を、４０〜１００％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、０．９ｇの２１を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  １０．９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．６（ｓ，２Ｈ），６．８（ｍ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．６（ｓ，２Ｈ）。
【００５８】
工程２：Ｎ−［（１Ｓ）−１−アセチル−２−メチルプロピル］−２−（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセトアミド（２２）：
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２１（０．９ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液にＬ−バリン  ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（０．８４ｇ，４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．８６ｇ，４．５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１．６ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）を順次加え、ついで３時間攪拌した。ついで該反応を１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬの１Ｍ  水溶液、１０ｍｍｏｌ）でクエンチし、ついでＥｔＯＡｃで抽出した。ついで、合わせた抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３、ついでブラインで洗浄した。ついで有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。該化合物を、１０〜５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１．０ｇの２２を無色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ７．５（ｍ，２Ｈ），７．０（ｂｄ，１Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），４．３（ｄｄ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ＡＢ  ｑｕａｒｔｅｔ，２Ｈ），２．１（ｍ，１Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ），０．９５（ｄ，３Ｈ），０．９（ｄ，３Ｈ）。
【００５９】
工程３：Ｎ−［（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセチル］−Ｌ−バリン（２３）：
１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２２（１．０ｇ，２．２ｍｍｏｌ）に１０ｍＬのＴＦＡを加えた。該溶液を２時間攪拌し、ついで真空中で濃縮した。生成物が沈殿するまで、該粗油にエーテルを加えた。有機層をデカントし、該固体をポンプ（ｐｕｍｐｅｄ）乾燥させて、０．９ｇの２３を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ７．５（ｍ，２Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），４．５（ｄｄ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ＡＢ  ｑｕａｒｔｅｔ，２Ｈ），２．２（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｄ，３Ｈ），０．９（ｄ，３Ｈ）。
【００６０】
工程４：Ｎ１−（１−エチル−３−フルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ２−［（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセチル］−Ｌ−バリンアミド（２５）
５ｍＬのＤＭＦ中の２４（３９１ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）にｔｅｒｔ−ブチル  ３−アミノ−２，３，５−トリデオキシ−５−フルオロペントナート（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９４，３５．５２，９６９３における公知手順で製造したもの）（１７０ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３８０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１．６ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）を加え、該溶液を３時間攪拌した。水を加え、該溶液をＥｔＯＡｃで抽出した。ついで有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。該化合物を、１０〜５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２５０ｍｇの２５を４つのジアステレオマーの混合物として無色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ７．５（ｄ，２Ｈ），７．４−６．９（ｄ，１Ｈ），６．８（ｍ，１Ｈ），４．８−４．６５（ｄ，１Ｈ），４．６−４．１（ｍ，３Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ＡＢ  ｑｕａｒｔｅｔ，２Ｈ），２．７−２．４（ｍ，２Ｈ），２．１（ｍ，１Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ），０．９５（ｍ，６Ｈ）。
【００６１】
工程５：Ｎ’−（１−エチル−３−フルオロ−２−ヒドロキシプロピル）−Ｎ２−｛［２−メトキシ−５−（トリブチルスタンニル）フェニル］アセチル｝−Ｌ−バリンアミド（２６）
５ｍＬのトリエチルアミン中の２５（１１６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）の溶液にＰｄ（ＯＡｃ）２（１０ｍｇ，０．０４４ｍｍｏｌ），Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２５ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）を５０℃で加え、ヘキサブチル二スズ（０．２ｍＬ，０．４ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を１００℃に加熱し、２時間攪拌した。ついで該溶液を冷却し、セライトのパッドでエーテルと共に濾過し、真空中で濃縮した。該化合物を、１０〜５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、７０ｍｇの２５を無色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ７．５（ｄ，１Ｈ），７．３（ｍ，２Ｈ），７．０（ｍ，１Ｈ），６．８（ｍ，１Ｈ），４．７−４．６（ｄ，１Ｈ），４．５−４．１（ｍ，３Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ＡＢ  ｑｕａｒｔｅｔ，２Ｈ），２．７−２．４（ｍ，２Ｈ），２．１（ｍ，１Ｈ），１．５（ｍ，１８Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ），１．０−０．８（ｍ，９Ｈ），０．９５（ｍ，６Ｈ）。
【００６２】
工程６：Ｎｌ−（１−エチル−３−フルオロ−２−オキソプロピル）−Ｎ２−｛［２−メトキシ−５−（トリブチルスタンニル）フェニル］アセチル｝−Ｌ−バリンアミド（２７）
２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２６（１０ｍｇ）の溶液にＮＭＯ（２０ｍｇ）、ついでＴＰＡＰ結晶を加え、得られた溶液を１時間攪拌した。該溶液を真空中で濃縮し、該化合物を、５０％  酢酸エチル／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１０ｍｇの２７を無色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ７．８−７．７（ｄ，１Ｈ），７．３（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），７．０（ｍ，１Ｈ），５．３−５．０（ｍ，２Ｈ），４．８−４．７（ｍ，１Ｈ），４．２（ｍ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ＡＢ  ｑｕａｒｔｅｔ，２Ｈ），２．９−２．７（ｍ，２Ｈ），１．６−０．８（ｍ，４２Ｈ）。
【００６３】
工程７：Ｎ１−（１−エチル−３−フルオロ−２−オキソプロピル）−Ｎ２−［（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセチル］−Ｌ−バリンアミド（２８）
０．２ｍＬのＤＭＦ中の２７（２ｍｇ）にヨウ化ナトリウム（０．１ｍＬの水に溶解した５ｍＣｉ）、ついでクロラミンＴ（０．２ｍＬの１：１  ＤＭＦ：水に溶解した２ｍｇ）を加えた。得られた溶液を２時間攪拌し、ついで分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。非放射性化合物に関するデータを示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１−７．７（ｄ，１Ｈ），７．５（ｍ，２Ｈ），７．２（ｄ，１Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），５．３−５．０（ｍ，２Ｈ），４．８−４．６（ｍ，１Ｈ），４．２（ｍ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ｍ，２Ｈ），２．９−２．６（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｍ，１Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ），０．９０（ｍ，６Ｈ）。
【００６４】
工程８：５−フルオロ−３−（｛Ｎ−［（５−ヨード−２−メトキシフェニル）アセチル］−Ｌ−バリル｝アミノ）−４−オキソペンタン酸（２９）
５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２８（直前の実験からのもの）の溶液に２ｍＬのＴＦＡを加えた。該溶液を２時間攪拌し、ついで真空中で濃縮して２９を得た。非放射性化合物に関するデータを示す。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１−７．７（ｄ，１Ｈ），７．５（ｍ，２Ｈ），７．２（ｄ，１Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），５．３−５．０（ｍ，２Ｈ），４．８−４．６（ｍ，１Ｈ），４．２（ｍ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３．５（ｍ，２Ｈ），２．９−２．６（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｍ，１Ｈ），０．９０（ｍ，６Ｈ）。
【００６５】
以下の実施例は、前記の合成方法および実施例１と同様の手順に従うことにより合成することが可能である。
【００６６】
【表３】
2006519777.tif 000013
2006519777.tif 000014
2006519777.tif 000015
【００６７】
有用性
本発明の化合物は、種々のインビトロまたはインビボのアッセイまたはモデルにおけるカスパーゼ活性部位プローブとして有用である。例えば、本発明の化合物は以下のとおりに有用であろう。
【００６８】
・カスパーゼ（精製されたもの及び細胞損傷の動物モデルからの組織タンパク質抽出物からのもの）のインビトロ標識、例えば、新生児ラットにおける低酸素症−虚血、ラットおよびマウスにおける盲腸結紮および穿刺、ラット、マウスまたはウサギにおける心筋梗塞のＬＣＡＯモデルにおけるもの。
【００６９】
・インビトロでの可逆的カスパーゼインヒビターによるカスパーゼ活性部位占拠の測定。
【００７０】
・細胞および血液における、例えば胸腺細胞、ＮＴ２、Ｊｕｒｋａｔｓ、ラット白血球における活性カスパーゼの標識。
【００７１】
・細胞培養、例えば胸腺細胞、Ｊｕｒｋａｔｓ、ＮＴ２細胞における可逆的カスパーゼインヒビターによるカスパーゼ活性部位占拠の測定。
【００７２】
・細胞損傷の動物モデル、例えば新生児ラットにおける低酸素症−虚血、マウスにおける盲腸結紮および穿刺誘発性腹膜炎におけるインビボでのカスパーゼ標識。
【００７３】
・エクスビボでのカスパーゼインヒビターの動物への投与の後のカスパーゼ活性部位占拠の測定（例えば、ＣＬＰラット、胸腺細胞上で行うエクスビボ標識）。
【００７４】
方法
特に示さない限り、以下の方法において使用する本発明の化合物の比活性は２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。
【００７５】
本明細書の目的においては、Ｍ７９１なる表示は、以下の構造を有する化合物（３Ｓ）−５−（ベンジルチオ）−３−［（Ｎ−｛［２−メトキシ−５−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）フェニル］アセチル｝−Ｌ−バリル）アミノ］−４−オキソペンタン酸を意味する。
【００７６】
【化１０】
2006519777.tif 000016
この化合物の製造方法は、２００１年５月１日付けで付与された米国特許第６，２２５，２８８号に開示されている。
【００７７】
本明細書の目的においては、Ｍ８６７なる表示は、以下の構造を有する化合物（３Ｓ）−３−（｛（２Ｓ）−２−［５−ｔｅｒｔ−ブチル−３−｛［（４−メチル−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）メチル］アミノ｝−２−オキソピラジン−１（２Ｈ）−イル］ブタノイル｝アミノ）−５−［メチル（ペンチル）アミノ］−４−オキソペンタン酸を意味する。
【００７８】
【化１１】
2006519777.tif 000017
この化合物の製造方法は、２００２年９月３日付けで付与された米国特許第６，４４４，８１１号に開示されている。
【００７９】
本明細書の目的においては、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８なる表示は実施例１の放射能標識カスパーゼインヒビターを意味する。Ｍ８０８なる表示は実施例１の対応未標識カスパーゼインヒビターを意味する。
【００８０】
本明細書の目的においては、ＭＦ  Ｒ２８０は抗ヒトカスパーゼ３抗体であり、ＭＦ４６７は抗ラットカスパーゼ３抗体である。ＭＦ  Ｒ２８０はＲｏｙら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：６１３２−６１３７に記載されている。
【００８１】
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣ，アミノ−４−メチルクマリン）は以下の構造を有する。
【００８２】
【化１２】
2006519777.tif 000018
この化合物は、以下のとおりに製造されうる：ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−ＣＯ２Ｈの合成、ｉｉ）Ａｓｐ（ＯＢｎ）−７−アミノ−４−メチルクマリンとのカップリング、ｉｉｉ）ベンジル基の除去。
【００８３】
組織、細胞抽出物
組織（ラット肝臓、腎臓、脳、胸腺、マウス胸腺）をそれらの摘出の２０分以内に凍結または加工した。ラット組織および培養細胞を、５ｍＭ  ＤＴＴおよび完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）で補足された氷冷細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ−４０）中でホモジナイズした。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を注射したマウスからの胸腺を、２５μＭのＭ８０８で補足された細胞溶解バッファー中でホモジナイズした。核残渣を１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去し、可溶性画分をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により定量した。カスパーゼ３様活性を、Ｒｏｙら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６１３２−６１３７に記載されているとおりに発蛍光性基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣで測定した。
【００８４】
胸腺細胞懸濁液
ラット胸腺細胞をその摘出の２０分以内に加工した。２ｍｌの氷冷胸腺細胞単離バッファー（ＰＢＳ，２  ｍＭ  グルコース，２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１％  ＦＢＳ）を含有する５０μＭ  メディコン（Ｍｅｄｉｃｏｎ）（Ｄａｋｏ）およびメディマシン（Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ）（Ｄａｋｏ）中、２×１５秒パルスで該胸腺を破砕することにより、単個細胞懸濁液を得た。該細胞懸濁液を５０μＭ  ナイロンメッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により濾過した。細胞を３００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、１０ｍｌの低張性細胞溶解バッファー（１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５；１４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ）に懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。胸腺細胞を３００ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、ＦＢＳを含有する５〜１０ｍｌの胸腺細胞単離バッファーに懸濁させた。細胞を血球計算盤およびトリパンブルー染色により計数した。
【００８５】
細胞培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−１５２）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）で補足されたＲＰＭＩ１６４０中で維持した。カンプトテシン（Ｓｉｇｍａ；３ｇ／ｍｌ）の添加により、ＣｙｔｏＳｆ４培地（Ｋｅｍｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で３６時間飢餓させた細胞（１ｍｌ当たり１００万個の細胞）上で、アポトーシスを誘導した。ＮＴ２細胞（ＡＴＣＣ  ３８１３５５５）をＤＭＥＭ  ＋  １０％  ＦＢＳ  ＋  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質中で培養した。細胞培養内でカンプトテシン（５μｇ／ｍｌ）でアポトーシスを誘導した。
【００８６】
２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンおよび示されている濃度のカスパーゼインヒビターで補足されたＣｙｔｏＳＦ４中、ラット胸腺細胞を１０×１０６細胞／ｍｌの密度で２４時間培養した。
【００８７】
動物および手術法
雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｃ，Ｃａｎａｄａ）およびＮＤ４マウス（２０〜２５ｇのＨａｒｌａｎｅ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）を、食餌および水に自由に近づけるようにして、１２時間の明／暗周期で収容した。すべての方法は、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．の動物保護方針を遵守し適当な動物保護委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認のもとで行った。盲腸結紮および穿孔のために、動物を２．５％  イソフルランで麻酔し、温度調節加熱毛布の使用により体温を維持した。動物の腹壁に正中線切開を施し、盲腸を体外露出させた。回盲弁の近位においてナイロン（４−０）縫合により盲腸を結紮した。マウスにおいては、盲腸の遠位部分を貫通させる２３ｇ針を使用して盲腸の穿孔を行った。ラットの大腿静脈カニューレ挿入は鼡径部における小さな切開により行い、大腿静脈を単離した。ポリウレタンカテーテル（ＰＵ−Ｃ３０，３  Ｆｒｅｎｃｈ，８０ｃｍ，Ｉｎｓｔｅｃｈ  Ｓｏｌｏｍｏｎ）に接続されたシリコーン（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ）カテーテル（０．０２”×０．０３７”、Ｌｏｍｉｒ）を大静脈内に挿入し、頚部において体外露出させ、手術の間、クランプで固定した。カニューレ挿入の直後に、盲腸の結紮および穿孔を行った。これは、該体外露出盲腸の遠位部分に完全に貫通させる２０ｇカニューレ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｓｌｉｇｏ．Ｒｅｐ．ｏｆ  Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して行った。編まれた絹（サイズ０）を該カニューレに通し、腹膜内への盲腸内容物の漏出が可能となるよう適所で結紮した。模擬操作動物においては、盲腸を体外露出させたが、盲腸の結紮も穿刺も行わなかった。腹壁をＰＤＳ（４−０）で縫合し、皮膚を外科用糊（マウス）またはクリップ（ラット）で縫合した。手術直後、すべての動物に１ｃｃの０．９％  塩類液を皮下注射により投与した。ビヒクルまたは化合物（Ｍ８６７）の丸塊を静脈内カテーテルを介して投与し、この場合、それを２ｍｌ／時間／ｋｇの運搬速度のＭｅｄｆｕｓｉｏｎ  ２０１０ｉ  Ｓｙｒｉｎｇｅポンプ（Ｍｅｄｅｘ  Ｉｎｃ．Ｄｕｌｕｔｈ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）に２４時間接続した。
【００８８】
アポトーシスの検出
８０％  ＥｔＯＨ中の氷上で３０分間固定された１．５×１０６個の胸腺細胞または５００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞上のフローサイトメトリーにより、ＤＮＡの断片化を測定した。該細胞を３００ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳに懸濁させ、氷上で４５分間インキュベートした。ペレット化細胞を５００μｌのＰＩ染色溶液（ＰＢＳ／０．１％  トリトンＸ−１００／ＲＮアーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）／２５μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ））に懸濁させた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して２０，０００事象／サンプルでフローサイトメトリーを行い、その各サンプルは二重に調製した。非常に小さな細胞残渣を、前方（ｆｏｒｗａｒｄ）光散乱に基づき電気的にゲートアウト（ｇａｔｅｄ  ｏｕｔ）させた。Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を該製造業者の説明に従い使用して、ＮＴ２細胞ＤＮＡ断片化を定量した。すべてのアッセイは、凍結されていないタンパク質抽出物に対して行った。なぜなら、凍結−解凍タンパク質抽出物は反応性を改変することを、本発明者らは見出しているからである。アッセイ直線範囲内にシグナルが見出されることが保証されるよう、各サンプルについて幾つかの希釈物を調製した。
【００８９】
［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識
５ｍＭ  ＤＴＴで補足されたＩＣＥバッファーＩＩＩ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．０，０．１％  ＣＨＡＰＳ，１０％  スクロース，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、示されている量のカスパーゼインヒビター（Ｍ７９１）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）と共に精製組換えヒトカスパーゼ３を２５℃で１時間プレインキュベートすることにより、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識によるカスパーゼ活性の測定を行った。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を１．２５ｎＭの最終濃度まで加え、２５℃で５分間インキュベートした。６０〜８０μｇのライセートを［１２５Ｉ］−Ｍ８０８と共に２５℃で１５分間インキュベートすることにより、組織または細胞抽出物中の活性カスパーゼを標識した。Ｌａｅｍｌｉバッファー（２％  ＳＤＳ；０．３５Ｍ  β−メルカプトエタノール；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ６．８；１０％  グリセロール；０．０５％  ブロモフェノールブルー）の添加により及び９５℃で５分間の加熱により、標識を停止した。全細胞におけるカスパーゼ標識は以下のとおりに行った。ＮＴ２細胞を２４ウェルディッシュ内のＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中にプレーティングした（５０  ０００細胞／ウェル）。翌日、カンプトテシン（５μｇ／ｍｌ）および示されている量のカスパーゼインヒビターを含有する培地により、培地交換した。培地をインキュベーションの５時間後に除去し、１２．５ｎＭの［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を含有する１００μｌの新鮮な培地により交換した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解バッファー＋２５μＭ  Ｍ８０８中で細胞溶解させた。細胞残渣を１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去し、Ｌａｅｍｌｉバッファー中、９５℃で沸騰させた。実質的に同じ方法により、アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞およびラット胸腺細胞を［１２５Ｉ］−Ｍ８０８で標識した。簡潔に説明すると、飢餓Ｊｕｒｋａｔ細胞（５０万個）をカンプトテシン（５μＭ／ｍｌ）および示されている濃度のカスパーゼインヒビターと共にＣｙｔｏＳＦ４内で５時間プレーティングした。ついで該細胞を３５０ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、１２．５ｎＭ  ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８および示されている濃度のカスパーゼインヒビターを含有するＣｙｔｏＳＦ４培地内に該細胞ペレットを３７℃で１時間のインキュベーション時間にわたり懸濁させた。該細胞を１ｍｌのＰＢＳ＋２５μＭ  Ｍ８０８で洗浄することにより、標識を停止させた。該細胞を遠心分離によりペレット化し、記載されているとおりに細胞溶解させた。３００万細胞／アッセイを使用したこと及びＣｙｔｏＳＦ４培地内で２４時間の培養時間にわたりアポトーシスが自発的に生じたこと以外は同じ方法により、ラット胸腺細胞を処理した。１２．５ｎＭ  ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での標識を３７℃で１５分間行った。１０％  ＰＥＧ２００中の０．４３μＭ  ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８（１１２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）溶液１２５μｌの静脈内注射により、活性カスパーゼのインビボ標識を行った。１．２５ｍｌ／マウスの平均血液容量を仮定すると、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の推定初期血中濃度は４３ｎＭである。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８注射の４５分後に動物を安楽死���せた。胸腺を回収し、前記のとおりタンパク質抽出のために加工した。
【００９０】
電気泳動およびウエスタンブロット法
１×Ｌａｅｍｌｉバッファー中の変性タンパク質抽出物を、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー中、３０ｍＡで、１８％  アクリルアミド勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分離した。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８で標識されたサンプルを、染料先端がゲル末端の０．５ｃｍ上方に達するまで泳動させ、染料先端の１ｃｍ上方のアクリルアミドを切り出して、全ての遊離［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を除去しバックグラウンドを減少させる。該ゲルを４０％  メタノール−１０％  酢酸溶液中で４５分間固定し、８０℃で９０分間乾燥させた後、ＭＳ増感スクリーンを伴うＭＳ  Ｋｏｄａｋフィルムに露出させた。ウエスタンブロット法の場合には、Ｔｒｉｓ−グリシン−２０％  メタノールバッファー中の４５μｍニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にタンパク質を４０Ｖで２時間トランスファーした。ブロッキングバッファー（５％  脱脂乳／ＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で該メンブレンを１時間インキュベートすることにより、非特異的タンパク質結合を最小化した。抗カスパーゼ３（ＭＦ  Ｒ２８０およびＭＦ４６７）をブロッキングバッファー中で２０００倍希釈し、２５℃で１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中で洗浄し、ブロッキングバッファー中で５０００倍希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に４５分間インキュベートした。化学発光反応をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で行い、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に露出させた。ＢｉｏＲａｄ装置およびＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用して、デンシトメトリーを行った。ＡＮＯＶＡにより統計分析を行った。
【００９１】
タンパク質抽出物におけるカスパーゼの飽和標識（図７）
ＣＬＰ由来ラット胸腺の培養細胞（Ｊｕｒｋａｔｓ、胸腺細胞）タンパク質抽出物を低比活性［１２５Ｉ］−Ｍ８０８に長時間さらすことにより、活性カスパーゼの全量の定量を行った。簡潔に説明すると、Ｍ８６７を投与したＣＬＰ操作ラットからの８０μｇのラット胸腺タンパク質抽出物を［１２５Ｉ］−Ｍ８０８（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌで５ｎＭ）およびＭ８０８（３９５ｎＭ）と共に３時間または１８時間インキュベートした。平行して、高比活性［１２５Ｉ］−Ｍ８０８（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌで１．２５ｎＭ）の存在下で８０μｇの抽出物の短いインキュベーション（５分間）も行った。Ｌａｅｍｌｉバッファーの添加および沸騰により該標識反応を停止させ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル強度の変化は３時間の標識と１８時間の標識との間では認められなかった。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル強度とカスパーゼ３  ｐ１７バンドとの間の良好な相関性が確認され、このことは、すべての活性カスパーゼ３を定量的に標識するためには３時間で十分であることを示している。
【００９２】
結果
活性部位は大カスパーゼサブユニットと小カスパーゼサブユニットとにより共有され、活性部位システインは該大サブユニット上に位置する。ｐ１７カスパーゼサブユニット上に共有結合が形成されると予想される。
【００９３】
インビトロでのＭ８０８の特異性および感度
本発明者らは、粗タンパク質抽出物中の活性カスパーゼに対する［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の特異性を最初に試験した。等量の種々のラット組織ホモジネートを［１２５Ｉ］−Ｍ８０８と共にインキュベートするか、グランザイムＢで前処理した後でＭ８０８を加えた。平行して、グランザイムＢ処理抽出物中のカスパーゼ活性をＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断により測定した。予想どおり、精製組換えヒトカスパーゼ３のｐ１７サブユニットが［１２５Ｉ］−Ｍ８０８に共有結合した（図２Ａ  レーン１）。すべてのグランザイムＢ処理ラット組織が［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識ｐ１９バンドを含有していたが、肝臓および胸腺は、２０ｋＤａに移動する追加的なバンドを示さなかった（レーン２〜５）。カスパーゼとしての該放射能標識タンパク質の同定は幾つかの手段により確認した。グランザイムＢ処理を省略した場合には、この位置に移動する放射能標識タンパク質が観察された（データ非表示）。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の前にカスパーゼ３特異的インヒビターＭ７９１を該抽出物に加えた場合には、放射能標識（レーン６〜８）も、強く低下した標識（レーン９）も認められなかった。全ＤＥＶＤアーゼ活性とｐ１９／ｐ２０標識タンパク質のデンシトメトリーとの間に非常に良好な相関性が確認された（図２Ｂ）。アポトーシス誘導剤カンプトテシンまたは抗Ｆａｓで処理した培養細胞からの抽出物においては（図２Ｃ）、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は、１７、１９および２０ｋＤａに移動するポリペプチドを認識した。アポトーシス誘導剤を使用しなかった場合またはＭ７９１を加えた場合には、これらのバンドは存在しなかった。総合すると、これらの結果は、Ｍ８０８が複合タンパク質混合物中のカスパーゼ（カスパーゼ３を包含する）を特異的に認識することを示している。
【００９４】
精製組換えヒトカスパーゼ３を使用して、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の感度閾値が０．５ｆｍｏｌ（０．０２ｎｇ；データ非表示）であることを確認した。本発明者らは、アポトーシスが病状に関与していると考えられる疾患の動物モデルにおいて活性カスパーゼを検出するのに十分な程度に［１２５Ｉ］−Ｍ８０８が感受性であるかどうかを確認した。低酸素症−虚血（ＨＩ）新生児ラット脳、梗塞形成したラットの心臓、皮質および海馬ならびに敗血症ラット胸腺からの抽出物を［１２５Ｉ］−Ｍ８０８と共にインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（図２Ｄ）。１７ｋＤａに移動する弱い放射能標識シグナルが、ＨＩラット脳および梗塞形成ラット心臓からの虚血損傷組織においては観察されたが、非損傷対側性組織においては観察されなかった。敗血症においては強い標識が観察されたが、模擬操作ラット胸腺においては観察されなかった（Ｍ７９１競合シグナルを伴う）。虚血成体ラット皮質および海馬においては、特異的シグナルは観察されなかった（データ非表示）。このように、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は幾つかの型の損傷組織において活性カスパーゼを特異的に認識する。
【００９５】
［１２５Ｉ］−Ｍ８０８はカスパーゼ活性をインビトロで測定する
本発明者らは、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８が、アポトーシス誘導剤で処理された培養細胞または損傷組織において活性カスパーゼを認識する感受性かつ特異的なプローブであることを示した。活性部位プローブとしての［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の潜在的用途は、可逆的カスパーゼインヒビターで処理された細胞内に保有するカスパーゼ活性の量の測定である。［１２５Ｉ］−Ｍ８０８が活性カスパーゼの量を正確に測定しうることを、次第に増加する量のＭ７９１と共にプレインキュベートされた精製組換えカスパーゼ３を使用して、初めて証明した（図３）。該混合物の半分をＤＥＶＤアーゼ活性に使用し、残りの部分には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分離の５分前に［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を加えた。ＩＣ５０はＤＥＶＤ切断により０．６ｎＭおよび０．４５ｎＭであると測定された。５分間ではなく６０分間、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８と共にインキュベートすると、見掛けＩＣ５０が１ｎＭに増加した。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに伴った［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の使用は、酵素と可逆的インヒビターとの混合物中に存在する活性カスパーゼの量を反映する。該プローブを、より長時間にわたり放置すると、見掛けＩＣ５０の増加が観察されるが、これは、十中八九、可逆的Ｍ７９１の解離および不可逆的［１２５Ｉ］−Ｍ８０８によるその置換によるものであろう。
【００９６】
［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は細胞内のカスパーゼ活性部位占拠を測定する
ついで、本発明者らは、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８が全細胞内の活性カスパーゼを検出し可逆的カスパーゼインヒビターの存在下で残留カスパーゼ活性を示しうるかどうかを評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、５時間にわたり、アポトーシスを受けるよう誘導した。該インキュベーション時間の終了の１時間前に、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を培地内に加えた。細胞の放射能標識を行わなかった抗カスパーゼ３ウエスタンブロットは、全カンプトテシン処理レーンにおいて、プロセシングされたカスパーゼ３のｐ１７、ｐ１９およびｐ２０形態の種々の量の存在を示している（図４）。Ｍ７９１はｐ１９およびｐ１７へのｐ２０カスパーゼ３の自己プロセシングを妨げるが、それはｐ２０の全体的な形成を遮断しない。培地への［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の添加は全３形態のカスパーゼ３の標識をもたらした。Ｍ８６７の濃度が増加するにつれて放射能標識バンドの強度が低下したことから、活性カスパーゼ３のＭ８６７占拠は明らかであった（図４）。
【００９７】
培養内に配置されるとアポトーシスにより自発的に死亡する初代ラット胸腺細胞において、同様の実験を行った。いくつかのカスパーゼインヒビターの研究は、培養胸腺細胞および細胞損傷のインビボモデルにおける、ＤＮＡ断片化により測定したＩＣ５０とスペクトリン切断により測定したＩＣ５０との間の矛盾をあらわにした（Ｎ．Ｍｅｔｈｏｔら，印刷中）。ＤＮＡ断片化を阻害するためには、スペクトリン切断と比較して３倍多くのＭ８６７が必要である（ＩＣ５０はそれぞれ０．２７および０．０９μＭ，ｐ＜０．０１）。ＤＮＡ断片化の阻害は、Ｍ８６７によるカスパーゼ３の、より大きな部分的（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）阻害を必要とした、と本発明者らは推測している。この仮説を直接的に試験するために、培養胸腺細胞においてＭ８６７により占拠されたカスパーゼ３の割合を［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識により測定した。切断されたカスパーゼ３およびＤＮＡ断片化を、平行して評価した。既に観察されているとおり、Ｍ８６７は培養ラット胸腺細胞内でＤＮＡ断片化を０．２４μＭのＩＣ５０で阻害し（図５）、最高濃度以外ではカスパーゼ３の切断に最小限の影響を及ぼした（図５Ｂ）。Ｍ８０８の存在下の胸腺細胞のインキュベーションはＭ８６７によるカスパーゼの占拠を０．１４μＭのＩＣ５０で示した。５つの独立した実験は、Ｍ８０８で測定されたＩＣ５０がＤＮＡ断片化のＩＣ５０より有意に低いが（０．１３＋／−０．０２５μＭ  対  ０．２７＋／−０．０４５μＭ，ｐ＝０．０３）、スペクトリン切断により測定されたＩＣ５０と統計的には異なっていないことを証明した。これらの細胞においてはカスパーゼ３が標識ｐ１７カスパーゼの大部分を占めるため、本発明者らは、全細胞における［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識が活性カスパーゼ３の真の量を反映すると結論づけている。また、Ｍ８６７により占拠されたカスパーゼの実際の割合も測定した（表ＩＩＩ）。図５Ａには、カスパーゼ活性部位占拠の割合を求めるために用いた計算の説明が示されている。
【００９８】
Ｍ８０８はインビボで活性カスパーゼを検出する
つぎに、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８が活性カスパーゼをインビボで検出しうるかどうかを確認した。マウスにおける盲腸結紮および穿刺は腹膜炎を引き起こす。カスパーゼの活性化は、脾臓、胸腺および腸のような組織で見られる。カスパーゼ３は、胸腺で活性化される主要カスパーゼであり、活性のピークはＣＬＰの１６〜２４時間後に見られる（Ｎ．Ｍ．，未公開データ）。マウスにおいてＣＬＰにより腹膜炎を２３時間にわたり誘導し、安楽死の１時間前に動物に［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を静脈内注射した（図６Ａ）。胸腺タンパク質抽出物上でのウエスタンブロットは、すべてのＣＬＰ動物においてはｐ１７カスパーゼ３の存在を示すが、模擬操作動物においては示さない（図６Ｂ）。同様に、放射能標識ｐ１７タンパク質はＣＬＰにおいて認められたに過ぎず、模擬動物においては認められなかった（図６Ｃ）。したがって、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は活性カスパーゼをインビボで検出しうる。しかし、タンパク質抽出物および全細胞標識とは対照的に、該ｐ１７シグナルの強度はｐ１７カスパーゼ３の存在量に比例しなかった。このことは、等しいゲルローディングにもかかわらず、非特異的標識胸腺タンパク質にも同様に当てはまった。この矛盾は、敗血症中の損傷胸腺への該プローブの接近性のばらつきによるものであろう。なぜなら、この状態は器官の低循環を引き起こすことが知られているからである。このように、［１２５Ｉ］−Ｍ８０８が活性カスパーゼをインビボで検出するが、その有用性は、すべての動物において組織が同等に良く潅流されている系に限定される。しかし、Ｍ８６７を投与した敗血症動物からの胸腺細胞についてのエクスビボ試験はカスパーゼ活性占拠の測定を可能にするであろう（図５を参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８の構造、およびカスパーゼのサブセットに対する阻害定数（Ｋｉ）。
【図２Ａ】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８はタンパク質抽出物中の活性カスパーゼを検出する。完全にプロセシングされたカスパーゼ−３の大きなサブユニットは１７ｋＤａで泳動する（ｐ１７）。部分的にプロセシングされたカスパーゼ−３はプロドメインの一部（ｐ１９）または全部（ｐ２０）を保有するが、ｐ１７形態と同等に活性である。プロドメインの除去は自己触媒される。Ａ−予想どおり、精製された組換えヒトカスパーゼ−３のｐ１７サブユニットは［１２５Ｉ］−Ｍ８０８に共有結合した（レーン１）。すべてのグランザイムＢ処理ラット組織は［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識１９ｋＤａタンパク質を含有し、肝臓および胸腺は、２０ｋＤａで泳動する追加的なポリペプチドを示した（レーン２〜５）。標識反応中にＭ７９１を含有させると、ｐ１７標識バンドおよびｐ１９標識バンドが消失または強力に減弱する（レーン６〜９）。Ｂ−ｐ１７およびｐ１９［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質の強度は、グランザイムＢ処理組織抽出物中に存在するカスパーゼ−３様活性の全量に相関する。Ｃ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は、アポトーシスＮＴ２およびＪｕｒｋａｔ細胞においてはｐ１７、ｐ１９およびｐ２０カスパーゼサブユニットを標識するが、健常細胞においては標識しない。Ｄ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は３つの異なる細胞損傷モデルにおいてｐ１７カスパーゼサブユニットを標識する（ＨＩ：低酸素−虚血；ＭＩ：心筋梗塞；ＣＬＰ：敗血症をもたらす盲腸結紮および穿刺。同側、ＶＬＶ（腹側左室）および模擬体は非損傷対照組織である）。
【図２Ｂ】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８はタンパク質抽出物中の活性カスパーゼを検出する。完全にプロセシングされたカスパーゼ−３の大きなサブユニットは１７ｋＤａで泳動する（ｐ１７）。部分的にプロセシングされたカスパーゼ−３はプロドメインの一部（ｐ１９）または全部（ｐ２０）を保有するが、ｐ１７形態と同等に活性である。プロドメインの除去は自己触媒される。Ａ−予想どおり、精製された組換えヒトカスパーゼ−３のｐ１７サブユニットは［１２５Ｉ］−Ｍ８０８に共有結合した（レーン１）。すべてのグランザイムＢ処理ラット組織は［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識１９ｋＤａタンパク質を含有し、肝臓および胸腺は、２０ｋＤａで泳動する追加的なポリペプチドを示した（レーン２〜５）。標識反応中にＭ７９１を含有させると、ｐ１７標識バンドおよびｐ１９標識バンドが消失または強力に減弱する（レーン６〜９）。Ｂ−ｐ１７およびｐ１９［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質の強度は、グランザイムＢ処理組織抽出物中に存在するカスパーゼ−３様活性の全量に相関する。Ｃ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は、アポトーシスＮＴ２およびＪｕｒｋａｔ細胞においてはｐ１７、ｐ１９およびｐ２０カスパーゼサブユニットを標識するが、健常細胞においては標識しない。Ｄ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は３つの異なる細胞損傷モデルにおいてｐ１７カスパーゼサブユニットを標識する（ＨＩ：低酸素−虚血；ＭＩ：心筋梗塞；ＣＬＰ：敗血症をもたらす盲腸結紮および穿刺。同側、ＶＬＶ（腹側左室）および模擬体は非損傷対照組織である）。
【図２Ｃ】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８はタンパク質抽出物中の活性カスパーゼを検出する。完全にプロセシングされたカスパーゼ−３の大きなサブユニットは１７ｋＤａで泳動する（ｐ１７）。部分的にプロセシングされたカスパーゼ−３はプロドメインの一部（ｐ１９）または全部（ｐ２０）を保有するが、ｐ１７形態と同等に活性である。プロドメインの除去は自己触媒される。Ａ−予想どおり、精製された組換えヒトカスパーゼ−３のｐ１７サブユニットは［１２５Ｉ］−Ｍ８０８に共有結合した（レーン１）。すべてのグランザイムＢ処理ラット組織は［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識１９ｋＤａタンパク質を含有し、肝臓および胸腺は、２０ｋＤａで泳動する追加的なポリペプチドを示した（レーン２〜５）。標識反応中にＭ７９１を含有させると、ｐ１７標識バンドおよびｐ１９標識バンドが消失または強力に減弱する（レーン６〜９）。Ｂ−ｐ１７およびｐ１９［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質の強度は、グランザイムＢ処理組織抽出物中に存在するカスパーゼ−３様活性の全量に相関する。Ｃ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は、アポトーシスＮＴ２およびＪｕｒｋａｔ細胞においてはｐ１７、ｐ１９およびｐ２０カスパーゼサブユニットを標識するが、健常細胞においては標識しない。Ｄ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は３つの異なる細胞損傷モデルにおいてｐ１７カスパーゼサブユニットを標識する（ＨＩ：低酸素−虚血；ＭＩ：心筋梗塞；ＣＬＰ：敗血症をもたらす盲腸結紮および穿刺。同側、ＶＬＶ（腹側左室）および模擬体は非損傷対照組織である）。
【図２Ｄ】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８はタンパク質抽出物中の活性カスパーゼを検出する。完全にプロセシングされたカスパーゼ−３の大きなサブユニットは１７ｋＤａで泳動する（ｐ１７）。部分的にプロセシングされたカスパーゼ−３はプロドメインの一部（ｐ１９）または全部（ｐ２０）を保有するが、ｐ１７形態と同等に活性である。プロドメインの除去は自己触媒される。Ａ−予想どおり、精製された組換えヒトカスパーゼ−３のｐ１７サブユニットは［１２５Ｉ］−Ｍ８０８に共有結合した（レーン１）。すべてのグランザイムＢ処理ラット組織は［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識１９ｋＤａタンパク質を含有し、肝臓および胸腺は、２０ｋＤａで泳動する追加的なポリペプチドを示した（レーン２〜５）。標識反応中にＭ７９１を含有させると、ｐ１７標識バンドおよびｐ１９標識バンドが消失または強力に減弱する（レーン６〜９）。Ｂ−ｐ１７およびｐ１９［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質の強度は、グランザイムＢ処理組織抽出物中に存在するカスパーゼ−３様活性の全量に相関する。Ｃ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は、アポトーシスＮＴ２およびＪｕｒｋａｔ細胞においてはｐ１７、ｐ１９およびｐ２０カスパーゼサブユニットを標識するが、健常細胞においては標識しない。Ｄ−［１２５Ｉ］−Ｍ８０８は３つの異なる細胞損傷モデルにおいてｐ１７カスパーゼサブユニットを標識する（ＨＩ：低酸素−虚血；ＭＩ：心筋梗塞；ＣＬＰ：敗血症をもたらす盲腸結紮および穿刺。同側、ＶＬＶ（腹側左室）および模擬体は非損傷対照組織である）。
【図３Ａ】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識による及びＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断活性によるカスパーゼインヒビターの効力評価。Ａ、Ｂ−精製組換えヒトカスパーゼ３でのカスパーゼインヒビターの力価測定および［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識。Ａ−５分間の標識反応でのＭ７９１および６０分間の標識反応でのＭ７９１。Ａにおいては、示されているＩＣ５０は、カスパーゼ−３の［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識ｐ１７サブユニットの強度を５０％減少させるＭ７９１の濃度と定義された。Ｂ−示されている濃度のＭ７９１と共にインキュベートされた組換えヒトカスパーゼー３でのカスパーゼインヒビターの力価測定およびＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断活性。発蛍光アッセイ条件下、Ｋｉ＝ＩＣ５０／２。
【図３Ｂ】［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識による及びＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断活性によるカスパーゼインヒビターの効力評価。Ａ、Ｂ−精製組換えヒトカスパーゼ３でのカスパーゼインヒビターの力価測定および［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識。Ａ−５分間の標識反応でのＭ７９１および６０分間の標識反応でのＭ７９１。Ａにおいては、示されているＩＣ５０は、カスパーゼ−３の［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識ｐ１７サブユニットの強度を５０％減少させるＭ７９１の濃度と定義された。Ｂ−示されている濃度のＭ７９１と共にインキュベートされた組換えヒトカスパーゼー３でのカスパーゼインヒビターの力価測定およびＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断活性。発蛍光アッセイ条件下、Ｋｉ＝ＩＣ５０／２。
【図４Ａ】生細胞における［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での活性カスパーゼの検出。Ａ−カンプトテシン処理Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物上でのカスパーゼ３のウエスタンブロット。
【図４Ｂ】生細胞における［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での活性カスパーゼの検出。Ｂ−次第に増加する量のＭ７９１にさらされたアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞における［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識ｐ１７、ｐ１９およびｐ２０カスパーゼサブユニット。
【図４Ｃ】生細胞における［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での活性カスパーゼの検出。Ｃ−次第に増加する量のＭ７９１で処理されたアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞におけるＤＮＡ断片化活性（亜二倍体細胞集団）。
【図５Ａ】培養ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の占拠の測定。Ａ−全細胞におけるＭ８６７により占拠されたカスパーゼ３活性部位の割合を求めるための理論的計算。カスパーゼ３  ｐ１７サブユニットの全量を飽和［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識のいずれかのウエスタンブロット法でデンシトメトリーにより測定する。全細胞における活性カスパーゼの部分標識を行う（「材料および方法」を参照されたい）。Ｍ８６７（または他の可逆的カスパーゼインヒビター）の非存在下の部分［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識シグナルに対するｐ１７の量のグラフをプロットする。測定したｐ１７の量から予想される［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルをこのプロットから推定する。不可逆的インヒビターの存在下の実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル（部分標識によるもの）を測定する。予想［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルに対する実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルの比率に１００を掛け算したもの＝インヒビターにより占拠されていないカスパーゼ活性部位の割合（％）。占拠率＝１００−遊離活性部位率（％）。Ｂ−Ｃ  全ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の実際の測定。Ｂ−カスパーゼ３のウエスタンブロット。Ｃ−次第に増加する濃度のＭ８６７にさらされた全ラット胸腺細胞からの［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル。ＤＮＡ断片化阻害および［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識により測定したＭ８６７カスパーゼ阻害効力（ＩＣ５０）の比較も示す。
【図５Ｂ】培養ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の占拠の測定。Ａ−全細胞におけるＭ８６７により占拠されたカスパーゼ３活性部位の割合を求めるための理論的計算。カスパーゼ３  ｐ１７サブユニットの全量を飽和［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識のいずれかのウエスタンブロット法でデンシトメトリーにより測定する。全細胞における活性カスパーゼの部分標識を行う（「材料および方法」を参照されたい）。Ｍ８６７（または他の可逆的カスパーゼインヒビター）の非存在下の部分［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識シグナルに対するｐ１７の量のグラフをプロットする。測定したｐ１７の量から予想される［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルをこのプロットから推定する。不可逆的インヒビターの存在下の実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル（部分標識によるもの）を測定する。予想［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルに対する実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルの比率に１００を掛け算したもの＝インヒビターにより占拠されていないカスパーゼ活性部位の割合（％）。占拠率＝１００−遊離活性部位率（％）。Ｂ−Ｃ  全ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の実際の測定。Ｂ−カスパーゼ３のウエスタンブロット。Ｃ−次第に増加する濃度のＭ８６７にさらされた全ラット胸腺細胞からの［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル。ＤＮＡ断片化阻害および［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識により測定したＭ８６７カスパーゼ阻害効力（ＩＣ５０）の比較も示す。
【図５Ｃ】培養ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の占拠の測定。Ａ−全細胞におけるＭ８６７により占拠されたカスパーゼ３活性部位の割合を求めるための理論的計算。カスパーゼ３  ｐ１７サブユニットの全量を飽和［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識のいずれかのウエスタンブロット法でデンシトメトリーにより測定する。全細胞における活性カスパーゼの部分標識を行う（「材料および方法」を参照されたい）。Ｍ８６７（または他の可逆的カスパーゼインヒビター）の非存在下の部分［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識シグナルに対するｐ１７の量のグラフをプロットする。測定したｐ１７の量から予想される［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルをこのプロットから推定する。不可逆的インヒビターの存在下の実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル（部分標識によるもの）を測定する。予想［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルに対する実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルの比率に１００を掛け算したもの＝インヒビターにより占拠されていないカスパーゼ活性部位の割合（％）。占拠率＝１００−遊離活性部位率（％）。Ｂ−Ｃ  全ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の実際の測定。Ｂ−カスパーゼ３のウエスタンブロット。Ｃ−次第に増加する濃度のＭ８６７にさらされた全ラット胸腺細胞からの［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル。ＤＮＡ断片化阻害および［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識により測定したＭ８６７カスパーゼ阻害効力（ＩＣ５０）の比較も示す。
【図５Ｄ】培養ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の占拠の測定。Ａ−全細胞におけるＭ８６７により占拠されたカスパーゼ３活性部位の割合を求めるための理論的計算。カスパーゼ３  ｐ１７サブユニットの全量を飽和［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識のいずれかのウエスタンブロット法でデンシトメトリーにより測定する。全細胞における活性カスパーゼの部分標識を行う（「材料および方法」を参照されたい）。Ｍ８６７（または他の可逆的カスパーゼインヒビター）の非存在下の部分［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識シグナルに対するｐ１７の量のグラフをプロットする。測定したｐ１７の量から予想される［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルをこのプロットから推定する。不可逆的インヒビターの存在下の実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル（部分標識によるもの）を測定する。予想［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルに対する実測［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナルの比率に１００を掛け算したもの＝インヒビターにより占拠されていないカスパーゼ活性部位の割合（％）。占拠率＝１００−遊離活性部位率（％）。Ｂ−Ｃ  全ラット胸腺細胞におけるＭ８６７によるカスパーゼ活性部位の実際の測定。Ｂ−カスパーゼ３のウエスタンブロット。Ｃ−次第に増加する濃度のＭ８６７にさらされた全ラット胸腺細胞からの［１２５Ｉ］−Ｍ８０８シグナル。ＤＮＡ断片化阻害および［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識により測定したＭ８６７カスパーゼ阻害効力（ＩＣ５０）の比較も示す。
【図６Ａ】ＣＬＰ操作マウスにおける［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での活性カスパーゼのインビボ標識の概要図。マウスは、模擬手術（ｎ＝２）またはＣＬＰ手術（ｎ＝５）を受けた。２３．１５時間後に［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を静脈内注射し、手術の２４時間後に動物を安楽死させた。Ｂ−ＣＬＰおよび［１２５Ｉ］−Ｍ８０８投与の後のマウス胸腺抽出物のカスパーゼ３ウエスタンブロット。矢印は完全長プロカスパーゼ３（ｐ３２）およびプロセシングされたカスパーゼ大サブユニット（ｐ１７）を示す。Ｃ−敗血症マウスからの胸腺抽出物におけるインビボ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質。矢印は放射能標識カスパーゼ大サブユニットを示す。
【図６Ｂ】ＣＬＰ操作マウスにおける［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での活性カスパーゼのインビボ標識の概要図。マウスは、模擬手術（ｎ＝２）またはＣＬＰ手術（ｎ＝５）を受けた。２３．１５時間後に［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を静脈内注射し、手術の２４時間後に動物を安楽死させた。Ｂ−ＣＬＰおよび［１２５Ｉ］−Ｍ８０８投与の後のマウス胸腺抽出物のカスパーゼ３ウエスタンブロット。矢印は完全長プロカスパーゼ３（ｐ３２）およびプロセシングされたカスパーゼ大サブユニット（ｐ１７）を示す。Ｃ−敗血症マウスからの胸腺抽出物におけるインビボ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質。矢印は放射能標識カスパーゼ大サブユニットを示す。
【図６Ｃ】ＣＬＰ操作マウスにおける［１２５Ｉ］−Ｍ８０８での活性カスパーゼのインビボ標識の概要図。マウスは、模擬手術（ｎ＝２）またはＣＬＰ手術（ｎ＝５）を受けた。２３．１５時間後に［１２５Ｉ］−Ｍ８０８を静脈内注射し、手術の２４時間後に動物を安楽死させた。Ｂ−ＣＬＰおよび［１２５Ｉ］−Ｍ８０８投与の後のマウス胸腺抽出物のカスパーゼ３ウエスタンブロット。矢印は完全長プロカスパーゼ３（ｐ３２）およびプロセシングされたカスパーゼ大サブユニット（ｐ１７）を示す。Ｃ−敗血症マウスからの胸腺抽出物におけるインビボ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識タンパク質。矢印は放射能標識カスパーゼ大サブユニットを示す。
【図７】短い又は長いインキュベーション時間にわたり［１２５Ｉ］−Ｍ８０８で標識されたｐ１７カスパーゼの比較。敗血症ラットにビヒクルまたは示されている濃度のＭ８６７を静脈内投与した。ＣＬＰ手術の２４時間後に胸腺を集めた。切断されたｐ１７カスパーゼ３の出現を示すウエスタンブロット。高比活性プローブでの５分間の部分カスパーゼ３標識。同じ胸腺抽出物中の活性カスパーゼの、低比活性プローブでの３時間または１８時間の飽和［１２５Ｉ］−Ｍ８０８標識。その長いインキュベーション時間中、カスパーゼ３上に元々存在するＭ８６７（低い又は存在しない標識から認められる）は活性部位から解離し、不可逆的活性部位プローブ［１２５Ｉ］−Ｍ８０８により置換される。３７℃での３時間のインキュベーション時間と１８時間のインキュベーション時間との間に標識強度における変化が観察されなかったため、３時間までに置換は実質的に完了している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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