(57)【要約】抗増殖剤による幹細胞の死滅を低減させるために、β-カテニンの細胞外活性化をブロックする試薬を用いて、正常幹細胞の静止状態を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常幹細胞の静止状態を誘導する方法であり、以下の段階を含む方法:
該正常幹細胞と、該正常幹細胞のwnt経路の細胞外活性化をブロックする有効量の保護剤を接触させる段階であり、該正常幹細胞が静止状態になる、段階。
【請求項２】
幹細胞が造血幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
保護剤が患者にインビボで投与される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
患者が癌に罹患しており、保護剤の投与と同時にまたは保護剤の投与の後に抗増殖剤を該患者に投与する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
抗増殖剤が、複製中の細胞に選択的である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
抗増殖剤が代謝拮抗剤である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
代謝拮抗剤が、ピリミジン(例えば、シタラビン(CYTOSAR-U)、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル(5-FU)、もしくはフロクスウリジン(FUdR));プリン(例えば、チオグアニン(6-チオグアニン)、メルカプトプリン(6-MP)、ペントスタチン、もしくはフルオロウラシル(5-FU));または葉酸類似体(例えば、メトトレキセート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザフォレート(PDDF、CB3717)、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸(DDATHF)、もしくはロイコボリン)から選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
抗増殖剤がトポイソメラーゼ阻害剤である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
トポイソメラーゼ阻害剤がイリノテカン、ドキソルビシン、またはカルボプラチンから選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
抗増殖剤の後に、幹細胞増殖を回復させるのに有効な量のwntタンパク質またはwntミメティックを投与する段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
保護剤が細胞外wntに結合し、該細胞外wntと幹細胞表面上に存在するfrizzledとの結合を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
保護剤がfrizzledポリペプチドの少なくとも一部を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
保護剤が、血漿タンパク質に融合したfrizzled CRDを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
血漿タンパク質が免疫グロブリン定常領域である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
保護剤が可溶性frizzled関連ポリペプチドを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
保護剤が、wntまたはfrizzledに特異的な免疫グロブリンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
化学療法剤を投与しようとする患者の幹細胞の生存を高める方法であり、以下の段階を含む方法：
細胞外wntと幹細胞表面上に存在するfrizzledとの結合を検出可能に阻害するのに有効な量の、細胞外wntシグナル伝達をブロックする少なくとも1種類の保護剤を該患者に投与する段階であり、該保護剤は該化学療法剤の前または該化学療法剤と同時に投与される、段階。
【請求項１８】
細胞外wntと幹細胞表面上に存在するfrizzledとの結合を検出可能に阻害するのに有効な量の、細胞外wntシグナル伝達をブロックする少なくとも1種類の活性保護剤;化学療法に有効な用量の化学療法剤;および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
保護剤が、可溶性FZD CRD;FZDに対する抗体;分泌型frizzled関連タンパク質(sFRP);Wntに対する抗体;LRP5/6抗体;Kremenに対する抗体;Dkkタンパク質、Soggyタンパク質、Wise;前記のいずれかを含む融合タンパク質;前記のいずれかの誘導体;前記のいずれかのバリアント;および前記のいずれかの生物学的に活性な断片から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
保護剤が、FZD8 CRD、FZD CRD-IgG融合タンパク質、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-3、SFRP-4、SFRP-5、Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4、Soggy、Wise、wnt3Aに対する抗体、wnt2Bに対する抗体;wnt10Bに対する抗体、およびwnt5Aに対する抗体から選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
細胞外wntシグナル伝達をブロックする保護剤、および細胞外wntと幹細胞表面上に存在するfrizzledとの結合を検出可能に阻害するのに有効な量の該保護剤を治療剤として患者に投与するための説明書を含む、キット。
【請求項２２】
保護剤と混合するための、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項21記載のキット。
【請求項２３】
保護剤を患者に送達するための手段をさらに含む、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
化学療法剤、および治療レジメにおいて保護剤と共に該化学療法剤を患者に投与するための説明書をさらに含む、請求項21記載のキット。
【請求項２５】
wntポリペプチドまたはwntミメティック、および治療レジメにおいて保護剤を競合的にブロックし、正常幹細胞の増殖を回復させるのに有効な量の該wntポリペプチドまたは該wntミメティックを患者に投与するための説明書をさらに含む、請求項21記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
化学療法および放射線療法を含む癌治療に用いられる細胞傷害剤は、腫瘍および正常組織両方の細胞に傷害を与え、死滅させることが知られている。癌を治療するために化学療法を用いて成功するには、正常組織への副作用と比較して癌細胞が特異的に死滅することに左右される。非常に大きな副作用の中に、腸上皮細胞および骨髄細胞の死滅がある。骨髄細胞が破壊されると様々な血球が欠乏して、例えば、好中球減少症、無顆粒球症、血小板減少症、汎血球減少症、または再生不良性貧血となることがある。従って、急性および慢性の骨髄毒性が癌治療における主な制限因子であり、好中球減少が用量増加における一般的な制限因子である。繰り返して、または高用量で行われる化学療法サイクルは重篤な幹細胞枯渇の原因となり、これが重大な長期の造血性続発症および骨髄消耗につながることがある。
【０００２】
骨髄機能の維持に極めて重要な細胞が造血幹細胞であり、この細胞は造血系列の全てを生じることができる。正常な成人では造血幹細胞は静止状態にあることが多いが、化学療法間に成熟血球が著しく枯渇すると、多数のHSCが細胞周期に入り、分化することがある。G-CSFまたはGM-CSFなどの薬剤の投与がHSCを末梢血に動員することが分かっているが、このように動員されたCD34+細胞の大部分は静止状態にはない。逆説的に、この細胞周期活性の増大は、患者の長期の利害に反する可能性がある。なぜなら、細胞傷害剤は主に増殖細胞に有効であるからである。静止細胞は、細胞周期に入っている細胞と比較してある程度の薬物非感受性を示し、化学療法の終了時に残存している可能性があるが、細胞周期に入っているHSCは、細胞傷害剤に対する感受性が静止細胞より高い。
【０００３】
特に、代謝拮抗物質およびDNAトポイソメラーゼII阻害剤は静止細胞に対して比較的効果がない。これらの薬物として、広範囲に用いられている11型トポイソメラーゼ阻害剤であるドキソルビシンおよびカルボプラチン(carboplatinum)が挙げられる。代謝拮抗剤として、ピリミジン類似体、プリン類似体、および葉酸類似体を挙げることができる。例えば、メトトレキセートは、免疫抑制剤として、ならびに過剰増殖疾患の治療に広範囲に用いられている。
【０００４】
細胞傷害剤の副作用からの阻止または保護は癌患者にとって大きな利益であろう。これらの副作用を減らす多くの以前の取り組みは大部分が不首尾に終わってきた。命にかかわる副作用の場合、取り組みは、化学療法剤の用量および計画を変更して副作用を減らすことに集中してきた。化学療法を開始する前に様々な組織の正常細胞の数を増やす取り組み(例えば、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、または上皮細胞増殖因子(EGF)のような因子の使用)は、化学療法後の細胞生存の増大に結び付かない場合がある。
【０００５】
化学療法分野の進展にもかかわらず、先行技術の方法は、化学療法により誘導される造血幹細胞および血球の枯渇を最小限にすることへの有用性が限れていることが分かっている。従って、化学療法後の幹細胞の生存を高めるための改善された治療方法および薬学的組成物が必要とされている。
【０００６】
関連刊行物
Wntタンパク質は、数種類の生物において発生を調節し、調節不全になると癌の一因となる細胞間シグナル伝達分子である。Wnt活性の消失は非常に大きな発生欠陥につながることがあるのに対して、Wntシグナル伝達の過剰活性化には強力な発癌作用があることがある。Wntは、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)と共に、Frizzled受容体ファミリー(Bhanot et al.(1996)Nature 382:225-30)に結合することによって作用する。Wntシグナルの非存在下では、セリン/スレオニンキナーゼであるGSK-3βがβ-カテニンをリン酸化して、ユビキチン結合およびプロテオソームによる分解の標的とする。Wntタンパク質がその受容体に結合すると、β-カテニンが安定化し、サイトゾルに蓄積する(Willert&Nusse(1998)Curr Opin in Gen Dev 8:95-102)。次に、β-カテニンは核に移動することができ、そこで、LEF-1/TCF転写因子ファミリーのメンバーに結合し、標的遺伝子の誘導を引き起こす(Eastman&Grosschedl(1999)Curr Opin Cell Biol 11:233-40)。
【０００７】
幹細胞の増殖にβ-カテニンを使用することが米国特許第6,465,249号で議論されている。造血幹細胞を刺激するたにwntを使用することが米国特許第5,851,984号で提案されている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
細胞傷害剤、特に、増殖細胞を標的とする細胞傷害剤(例えば、化学療法剤)から幹細胞を保護するための方法および組成物が提供される。保護は、細胞外シグナル伝達を介した幹細胞のβ-カテニンの活性化をブロックするのに有効な量の保護剤を投与することによって達成される。この保護剤は存在している間、正常な(すなわち、腫瘍でない)幹細胞の複製を阻止するのに対して、もはや存在しなくなった時には増殖を回復させる。正常幹細胞として、造血幹細胞(HSC)、腸表皮幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。幹細胞は増殖するために細胞外wntシグナル伝達を必要とし、従って、細胞外wntシグナル伝達をブロックする薬剤を投与することによって静止状態になることが本明細書で示される。
【０００９】
関心対象の保護剤は、可溶性細胞外wntタンパク質と、幹細胞表面上に存在するfrizzled受容体との相互作用を妨害する。このような薬剤として、wnt結合ドメインを含む可溶性frizzledポリペプチド;可溶性frizzled関連ポリペプチド;wnt特異的抗体;frizzled特異的抗体;および細胞外wntシグナル伝達をブロックすることができる他の分子が挙げられるが、これに限定されない。
【００１０】
本発明の1つの態様において、保護剤は、幹細胞(特に、造血幹細胞)と相互作用するwntタンパク質に対する特異性を有する。本発明の別の態様において、保護剤は、幹細胞表面上に発現する(特に、造血幹細胞によって発現される)frizzledタンパク質に対する特異性を有する。wntタンパク質の特異性とfrizzled受容体の特異性は重複し、本発明の一部の態様では、保護剤は複数の種類のwntタンパク質と広範囲に相互作用する。保護剤としての有効性について薬剤をインビボおよびインビトロでスクリーニングする方法が提供される。
【００１１】
本発明の1つの態様において、細胞外シグナル伝達によるβ-カテニン活性化は、保護剤の投与によって一過的にブロックされる。この投与は、増殖細胞を標的とする細胞傷害剤を投与する前または間に行われる。増殖細胞を標的とする細胞傷害剤として、癌治療に用いられる化学療法薬が挙げられる。1つの局面において、細胞傷害剤は、例えば、トポイソメラーゼ、ポリメラーゼなどの、DNA合成に関与する酵素の阻害剤である。別の局面において、細胞傷害剤は、代謝産物の類似体(例えば、プリン、ピリミジン、または葉酸の類似体)である。本発明の別の局面において、細胞傷害剤は免疫抑制剤である。別の局面において、細胞傷害剤は抗菌剤である。
【００１２】
本発明の別の局面において、細胞外シグナル伝達によるβ-カテニン活性化は、保護剤の投与によって一過的にブロックされる。この投与は、増殖細胞を標的とする細胞傷害剤を投与する前または間に行われ、化学療法の終了時に、幹細胞増殖の一時ブロックに打ち勝つのに有効な量のwntタンパク質が投与される。
【００１３】
態様の詳細な説明
細胞外wnt経路シグナル伝達を介したβ-カテニン活性化をブロックする保護剤を投与することによって、増殖細胞を標的とする細胞傷害剤から正常幹細胞を保護するための方法および組成物が提供される。正常幹細胞として、造血幹細胞(HSC)、腸表皮幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。特に、HSCの保護が関心対象である。
【００１４】
幹細胞は増殖するためにwntシグナル伝達を必要とし、逆に言うと、細胞外wntシグナル伝達をブロックすることによって幹細胞の増殖を阻止できることが本明細書で示される。HSCを含む幹細胞は、wnt受容体であり、細胞内β-カテニンを活性化するfrizzledタンパク質を表面上に発現する。Wntシグナル伝達は、β-カテニンの安定性を調節することによって多くの発生段階において多様な役割を果たしている。活性化シグナルの非存在下では、細胞質β-カテニンは、数種類のタンパク質(Axin、APC、およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ-3(GSK3)を含む)を含有する多タンパク質β-カテニン破壊複合体に結合し、N末端にあるSer残基およびThr残基のクラスターでGSK3によって構成的にリン酸化される。リン酸化されたβ-カテニンは、SCFβTrCPユビキチン-タンパク質リガーゼ複合体の一成分であるβ-TrCPによって認識され、ユビキチン-プロテアソーム経路によって分解される。Wntシグナル伝達はβ-カテニン破壊複合体を分解し、β-カテニンのリン酸化およびその後のユビキチン結合を妨げ、従って、β-カテニンはプロテアソーム機構から逃れる。次いで、蓄積したβ-カテニンは核に入り、LEF/TCFファミリー転写因子に結合し、β-カテニン標的遺伝子を活性化する。
【００１５】
正常細胞とは異なり、多くの一般的な腫瘍細胞は増殖のために細胞外wntシグナル伝達を必要としない。β-カテニンの活性化変異またはAPCもしくはAxinの不活化変異の結果であり得る異常なwntシグナル伝達経路活性化が、多種多様なヒト悪性腫瘍(例えば、結腸直腸腫瘍、肝細胞腫瘍、卵巣子宮内膜腫瘍、類腱腫、白血病(CML)、および膵臓腫瘍)と関連付けられている。例えば、APCは結腸直腸癌の大部分において変異しており、野生型APCを有する結腸直腸癌は変異β-カテニンを含むことが多い。従って、異常なWntシグナル伝達活性化は結腸直腸腫瘍の開始または進行に必須である。
【００１６】
関心対象の保護剤は、可溶性細胞外wntタンパク質と、幹細胞表面上のfrizzledタンパク質との相互作用を妨害する。このような薬剤として、wnt結合ドメインを含む可溶性frizzledポリペプチド;可溶性frizzled関連タンパク質;wnt特異的抗体およびその生物学的に活性な断片;frizzled特異的抗体およびその生物学的に活性な断片;ならびに細胞外wntシグナル伝達をブロックすることができる他の分子が挙げられるが、これに限定されない。これらの薬剤は腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼさず、従って、腫瘍細胞は抗増殖剤に感受性のままである。
【００１７】
細胞外シグナル伝達によるβ-カテニン活性化は、増殖細胞を標的とする細胞傷害剤を投与する前または間に保護剤を投与することによって一過的にブロックされてもよい。本発明の方法はまた、反復したまたは高用量の化学療法を必要とする患者に特に適している。一部の癌患者では、造血毒性によって化学療法の用量増大の機会が頻繁に制限される。繰り返して、または高用量で行われる化学療法サイクルは重篤な幹細胞枯渇の原因となり、これが重大な長期の造血性続発症および骨髄消耗につながることがある。本発明の方法は、化学療法と共に用いられた時に死亡率および血球数の改善をもたらす。
【００１８】
本発明の方法、キット、および薬学的組成物は、化学療法後の幹細胞生存を高めることによって、臨床化学療法治療に現在利用可能な治療の有用性を著しく高める。
【００１９】
定義
本発明は、説明される特定の方法、プロトコール、細胞株、動物の種または属、および試薬に限定されず、これらは変更してもよいことを理解すべきである。本明細書で使用する用語は特定の態様のみを説明することを目的とし、本発明の範囲を限定することを目的とせず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。
【００２０】
本明細書で使用する単数形「a」、「an」、および「the」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含む。従って、例えば、「細胞」についての言及は複数のこのような細胞を含み、「培養物」についての言及は、1つまたはそれ以上の培養物および当業者に周知のその等価物についての言及などを含む。特別の明確な定めのない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２１】
Frizzledポリペプチドおよび可溶性frizzledポリペプチド
「frizzled」(Fz)遺伝子ファミリーのメンバーは、Wntシグナル伝達タンパク質の受容体である7回膜貫通ドメインタンパク質をコードする。ヒトFzd遺伝子ファミリーの中には、FZD1〜10がある。特に、FZD1、3、4、6、7、および8が関心対象である。造血幹細胞は、とりわけ、FZD4を発現することが報告されている(Natalia et aL(2002)Science 298(5593):601-604を参照のこと)。frizzledタンパク質の中には、システインリッチドメイン(CRD)がwnt結合決定因子を含み、wnt結合をトランスフェクト細胞に付与するのに必要かつ十分である。可溶性FZD CRDは、細胞外wntシグナル伝達の阻害剤として用いられ、特に、FZD8のCRDは広範囲のwntタンパク質と相互作用する。FZDタンパク質はまた、阻止抗体を産生するための免疫原としても用いられる。
【００２２】
推定647アミノ酸のFZD1タンパク質は、シグナルペプチド、N末端細胞外領域にあるシステインリッチドメイン、7回膜貫通ドメイン、およびC末端にあるPDZドメイン結合モチーフを含む。FZD1は、FZD2と77％のタンパク質配列同一性、FZD7と74％のタンパク質配列同一性を有する。FZD1はGenBankアクセッション番号AB017363を有する(Sagara et al.(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.252(1),117-122)。FZD2はGenBankアクセッション番号AB017364を有する(Sagara et al.前記)。
【００２３】
666アミノ酸のFZD3タンパク質はマウスFzd3と98％同一であり、N末端CRD、7回膜貫通ドメイン、2番目および3番目の細胞外ループにある2個のシステイン残基、ならびに3個のN結合グリコシル化部位を含む。ノザンブロット分析によって、14.0kb、9.0kb、4.0kb、および1.8kbのFZD3転写物が主に中枢神経系(CNS)組織、成人膵臓、および多くの癌細胞株において発現することが明らかになった。FZD3はGenBankアクセッション番号AJ272427を有する(Kirikoshi et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.264(3),955-961)。
【００２４】
FZD4は推定537アミノ酸のタンパク質をコードし、N末端細胞外領域にあるシステインリッチドメイン、2番目および3番目の細胞外ループにある2個のシステイン残基、2個のN結合グリコシル化細胞外部位、ならびにC末端にあるS/T-X-Vモチーフを有する。ノザンブロット分析によって、7.7kb転写物が成人心臓、骨格筋、卵巣、および胎児腎臓において大量に、成人肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、および胎児肺において中程度の量で、ならびに胎盤、成人肺、前立腺、精巣、結腸、胎児の脳および肝臓において少量で発現することが分かっている。FZD4はGenBankアクセッション番号AB032417を有する(Kirikoshi et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.264(3),955-961)。
【００２５】
FZD5は585アミノ酸のポリペプチドをコードし、Wnt5Aの受容体であることが報告されている。FZD5はGenBankアクセッション番号AB043702を有する。
【００２６】
推定706アミノ酸のFZD6タンパク質は、シグナルペプチド、N末端細胞外領域にあるシステインリッチドメイン、および7回膜貫通ドメインを含む。しかしながら、他の多くのFzファミリーメンバーとは異なり、FDZ6は、C末端PDZドメイン結合モチーフを含まない。FZD6はGenBankアクセッション番号AB012911を有する(Tokuhara et al.(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.243(2),622-627)。
【００２７】
推定574アミノ酸のFZD7タンパク質は、N末端シグナル配列、Fzdファミリーメンバーのシステインリッチ細胞外ドメインの典型である10個のシステイン残基、7回推定膜貫通ドメイン、およびPDZドメイン結合モチーフを有する細胞内C末端テールを含む。FZD7はGenBankアクセッション番号AB017365を有する(Sagara et al.(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.252(1),117-122)。
【００２８】
FZD8は、FZD5と69％同一の、マウスFzd8と95％同一の694アミノ酸タンパク質であり、N末端シグナルペプチド、CRD、7回膜貫通ドメイン、3個のN結合グリコシル化部位、およびC末端ser/thr-X-valモチーフ(複数のPDZドメインを有する足場タンパク質の結合部位)を含む。4.0kbのFZD8転写物が胎児腎臓において最も豊富にあり、これに胎児脳、および胎児肺が続く。成人組織では、FZD8は腎臓、心臓、膵臓、および骨格筋において発現している。FZD8はGenBankアクセッション番号AB043703を有する(Saitoh et al.(2001)Int.J.Oncol.18(5)、991-996)。FZD9はGenBankアクセッション番号BC026333を有する(Strausberg et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903)。
【００２９】
FZD10は、FZD9と66％同一の581アミノ酸タンパク質であり、N末端CRD;2番目および3番目の細胞外ループに2個のシステイン残基を有する7回膜貫通ドメイン;2個のN結合グリコシル化部位;ならびにC末端ser/thr-Xxx-valモチーフ(複数のPDZドメインを有する足場タンパク質結合部位)を含む。FZD10は広範囲に発現しており、胎盤および胎児腎臓において最高レベルで発現し、これに胎児肺および脳が続く。成人脳の中では、発現は小脳において比較的高く、これに大脳皮質、延髄、および脊髄が続いた。FZD10はGenBankアクセッション番号AB027464を有する(Koike et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.262(1)、39-43.)。
【００３０】
それぞれのfrizzledタンパク質は、保存された細胞外システインリッチドメイン(約120個のアミノ酸に及び、10個の不変システインを含む)をアミノ末端に含み、これに7回膜貫通ドメインが続く。本発明の方法における使用のために、可溶型CRDが関心対象である。このようなドメインは、frizzled分子のwnt結合能を維持していることを特徴とし、一般的に不変システイン残基を含むが、膜貫通ドメインを欠く。CRD構築物の例は、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Hsieh et al.(1999)PNAS 96:3546-3551で見られる。
【００３１】
Frizzled関連タンパク質
分泌型frizzled関連タンパク質(sFRP)はサイズが約30kDaであり、それぞれのsFRPは、推定シグナル配列、約110残基のシステインリッチドメイン(FZタンパク質の推定リガンド結合ドメインと30〜40％同一であるが、FZタンパク質を原形質膜に固定する7回膜貫通モチーフを欠く)、および保存されている親水性カルンボキシ末端ドメインを含む。FRPは分泌されるが、wntと同様に、細胞に関わり続ける傾向がある。様々なwntファミリーメンバーと同時発現されると、FRPはwnt依存性活性を打ち消し、ドミナントネガティブ受容体のようにふるまう。従って、FRPタンパク質はwntの阻害剤であり、可溶性wntに結合し、それにより膜結合frizzledタンパク質による活性化をブロックするように働く。
【００３２】
ヒトSFRP1は314個のアミノ酸を含む。この配列はGenBankアクセッション番号AF001900で見られ、Finch et al.(1997)P.N.A.S.94(13):6770-6775に記載されている。
【００３３】
SFRP2は、数種類のヒト組織において2.2kbおよび1.3kb転写物として発現し、最高レベルは結腸および小腸で見られる。この配列はGenBankアクセッション番号AY359001で見られ、Clark et al.(2003)Genome Res.13(10)、2265-2270に記載されている。
【００３４】
SFRP3は、25アミノ酸のシグナルペプチド、N末端N-グリコシル化部位、24アミノ酸の推定膜貫通セグメント、複数の可能性のあるser/thrリン酸化部位を有する領域、およびセリンリッチC末端ドメインを含む。この配列はGenBankアクセッション番号U24163;Hoang et al.(1996)J.Biol.Chem.271(42)、26131-26137で見られる。
【００３５】
346アミノ酸のSFRP4タンパク質はN末端シグナルペプチドを含み、膜貫通ドメインおよび親水性C末端を含まない。インサイチューハイブリダイゼーション分析から、間質細胞および子宮筋層細胞(特に、子宮内膜および乳房)に限定した発現が証明された。この配列はGenBankアクセッション番号AF026692で見られる。
【００３６】
SFRP5は、網膜色素上皮(RPE)で高度に発現している。他のSFRPと同様に、SFRP5は、N末端シグナルペプチドに続いて、frizzledシステインリッチドメイン(CRD)に相同な領域を含む。この配列はGenBankアクセッション番号AF117758で見られ、Chang et al.(1999)Hum.Mol.Genetに記載されている。
【００３７】
Wntポリペプチド
本明細書で使用する用語「Wnt」または「Wnt遺伝子産物」または「Wntポリペプチド」はWnt遺伝子ファミリーのメンバーを意味する。この名称にはヒトWntポリペプチドが含まれる。ヒトwntタンパク質として以下が挙げられる:Wnt1、GenBank参照番号NP 005421.1;Wnt2、GenBank参照番号NP_003382.1(これは脳、視床、胎児および成人の肺、ならびに胎盤において発現している);2種類のWnt2Bアイソフォーム、GenBank参照番号NP 004176.2およびNP 078613.1。アイソフォーム1は、成人の心臓、脳、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、および結腸において発現している。成人脳において、これは主に尾状核、視床下核、および視床で見られる。胎児の脳、肺、および腎臓でも検出される。アイソフォーム2は、胎児脳、胎児肺、胎児腎臓、尾状核、精巣、および癌細胞株において発現している。Wnt3およびWnt3Aは、発生中の神経管の形態形成間の細胞間シグナル伝達において独特の役割を果たし、GenBank参照番号NP 110380.1およびX56842を有する。Wnt3Aは骨髄において発現している。Wnt4はGenBank参照番号NP 110388.2を有する。Wnt5AおよびWnt5BはGenBank参照番号NP 003383.1およびAK013218を有する。Wnt6はGenBank参照番号NP 006513.1を有する。Wnt7Aは、胎盤、腎臓、精巣、子宮、胎児肺、ならびに胎児および成人の脳において発現し、GenBank参照番号NP 004616.2を有する。Wnt7Bは胎児脳において中程度に発現し、胎児の肺および腎臓において弱く発現し、成人の脳、肺、および前立腺においてかすかに発現し、GenBank参照番号NP 478679.1を有する。Wnt 8Aには、2種類の選択的転写物(GenBank参照番号NP 114139.1およびNP 490645.1)がある。Wnt8Bは前脳において発現し、GenBank参照番号NP 003384.1を有する。Wnt10AはGenBank参照番号NP 079492.2を有する。Wnt10Bは大部分の成人組織において検出され、最高レベルは心臓および骨格筋で見られる。これはGenBank参照番号NP 003385.2を有する。Wnt11は、胎児の肺、腎臓、成人心臓、肝臓、骨格筋、および膵臓において発現し、GenBank参照番号NP 004617.2を有する。Wnt14はGenBank参照番号NP 003386.1を有する。Wnt15は胎児腎臓および成人腎臓において中程度に発現し、脳にも見られる。これはGenBank参照番号NP 003387.1を有する。Wnt16には、選択的スプライシングによって生じる2種類のアイソフォームWnt-16aおよびWnt-16bがある。アイソフォームWnt-16Bは末梢リンパ器官(例えば、脾臓、虫垂、およびリンパ節)、腎臓において発現しているが、骨髄では発現しない。アイソフォームWnt-16aは膵臓でしか有意な量で発現しない。GenBank参照番号は、NP 057171.2およびNP 476509.1である。
【００３８】
インビボ治療法は、一般的に、ネイティブなまたは天然のWntポリペプチドに向けられるが、インビトロスクリーニング目的の場合、Wntポリペプチドバリアント、Wntポリペプチド断片、およびキメラWntポリペプチドが用いられてもよい。「ネイティブ配列」ポリペプチドは、天然から得られるWntポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ヒトWntポリペプチドのネイティブ配列は、プロセシングされていない形で約348〜約389アミノ酸長に及んでいることがあり(これは、保存性の低いアミノ末端およびいくつかの内部部位にばらつきがあることを反映している)、21個の保存システインを含み、分泌型タンパク質の特徴を有する。Wntポリペプチドの分子量は、通常、約38〜42kDである。
【００３９】
Wnt阻害剤
本発明の目的で、wnt阻害剤は、細胞外wntタンパク質と、幹細胞上のコグネイトfrizzled受容体との相互作用をブロックする薬剤であり、本発明の方法における幹細胞保護剤として用いられる。関心対象の薬剤は、ある特定のwnt、ある特定のwntセット、または広くwntタンパク質と直接反応してもよい。他の関心対象の薬剤は、ある特定のfrizzled、ある特定のfrizzledタンパク質セット、または広くfrizzledタンパク質と直接反応してもよい。関心対象の薬剤として、阻止抗体;またはその生物学的に活性な断片(例えば、Fv断片、FAb断片など)が挙げられる。他の関心対象の薬剤は、wnt関連タンパク質(例えば、Wnt補助受容体LRP5/6および膜貫通タンパク質Kremen)と相互作用する。
【００４０】
関心対象の薬剤は、frizzled、および/または幹細胞(特に、造血幹細胞)と相互作用するwntタンパク質を妨害する。このような細胞は、FZD4およびwnt10Aを発現することが報告されている(Natalia et al.(2002)前記)。HSCはまた、wnt3A反応性であることも本明細書で示される。HSCに対して活性のある因子を産生する骨髄のストローマ細胞は、Wnt2B、Wnt10B、およびWnt5Aを発現することが報告されている。
【００４１】
多数のwnt阻害剤が述べられており、当技術分野において周知である。周知のwnt阻害剤の中には、Dickkopf(Dkk)遺伝子ファミリーのメンバーがある(Krupnik et al.(1999)Gene 238(2):301-13を参照のこと)。ヒトDkk(「hDkk」)遺伝子ファミリーのメンバーとして、Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、およびDkk-4、およびDkk-3関連タンパク質Soggy(Sgy)が挙げられる。hDkk1-4は2個の異なるシステインリッチドメインを含み、この中にある10個のシステイン残基の位置はファミリーメンバー間で高度に保存されている。ヒトDkk遺伝子およびタンパク質の例示的な配列は公的に入手することができる(例えば、GenBankアクセッション番号NM 014419(soggy-1);NM 014420(DKK4);AF177394(DKK-1);AF177395(DKK-2);NM 015881(DKK3);およびNM 014421(DKK2))。
【００４２】
他のwnt阻害剤として、分泌タンパク質であるWise(Itasaki et al.(2003)Development 130(18):4295-30)が挙げられる。Wiseタンパク質は、Wnt補助受容体であるリポタンパク質受容体関連タンパク質6(LRP6)と物理的に相互作用し、LRP6への結合においてWnt8と競合することができる。Axinは、β-カテニンのダウンレギュレーションによってWntシグナル伝達を調節する(Lyu et al.(2003)J Biol Chem.278(15):13487-95を参照のこと)。
【００４３】
Frizzledの可溶型リガンド結合ドメイン(CRD)はwntを阻害し、同様に、前記の可溶性Frizzled関連タンパク質もwntを阻害する(Krypta et al,J Cell Sci 2003 Jul 1;116(Pt 13):2627-34)。Frizzled-CRDドメインは、Wntがfrizzled受容体に結合するのを阻害することによってWnt経路を阻害することが示されている。(Hsieh et al.(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96:3546-51;およびCadigan et al.(1998)Cell 93:767-77)。
【００４４】
FZD8 CRDが、wntタンパク質への広い結合範囲のために阻害剤として用いられてきたが、他のCRDも使用される。CRDは、さらなる機能を加えるために(例えば、インビボ安定性を高めるために)別のポリペプチドと融合されてもよい。一般的に、このような融合パートナーは、融合として存在すると、CRDのインビボ血漿内半減期を延ばすことができる安定血漿タンパク質である。特に、このような安定血漿タンパク質は免疫グロブリン定常ドメインである。
【００４５】
通常、同じまたは異なるポリペプチド鎖がジスルフィド結合および/または非共有結合して集合多鎖ポリペプチドを形成する多量体の形(例えば、免疫グロブリンまたはリポタンパク質)で、安定血漿タンパク質が見出されるほとんどの場合において、CRDを含む本明細書の融合も、安定血漿タンパク質前駆体と実質的に同じ構造を有する多量体として生成および使用される。これらの多量体は、多量体が含むCRDに関して均一であるか、1種類を超えるCRDを含んでもよい。
【００４６】
安定血漿タンパク質は、一般的に約30〜2,000個の残基を有し、天然の環境において長い循環内半減期(すなわち、約20時間より長い循環内半減期)を示すタンパク質である。適切な安定血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンである。CRDは、一般的に、CRDの半減期を長くすることができる血漿タンパク質またはその断片のN末端で、血漿タンパク質に融合される。CRDの血漿内半減期の約100％を超える増加が十分である。
【００４７】
通常、CRDのC末端が、免疫グロブリンの可変領域の代わりに免疫グロブリンの定常領域のN末端に融合される。しかしながら、N末端融合が用いられてもよい。好ましくは、融合の前に、frizzledタンパク質の膜貫通領域または脂質もしくはリン脂質アンカー認識配列が欠失される。
【００４８】
一般的に、このような融合は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能活性のあるヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを維持する。このような重鎖として、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、およびIgD、通常、IgGクラスのタンパク質の1つまたは組み合わせを挙げることができる。融合はまた、定常ドメインのFc部分のC末端にも、または重鎖のCH1もしくは軽鎖の対応する領域のすぐN末端側にも作成される。これは、通常、適切なDNA配列を構築し、組換え細胞培養において発現させることによって達成される。または、ポリペプチドは既知の方法に従って合成されてもよい。
【００４９】
融合が作成される正確な部位は重要でない。CRDの生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために、特定の部位が周知であり、選択することができる。最適な部位は日常的な実験によって決定される。
【００５０】
ある態様において、ハイブリッド免疫グロブリンは、単量体として、またはヘテロ多量体もしくはホモ多量体として(特に、二量体もしくは四量体として)集合される。一般的に、これらの集合した免疫グロブリンは既知の単位構造を有する。基本4本鎖構造単位が、IgG、IgD、およびIgEが存在する形である。さらに高分子量の免疫グロブリンでは、4本鎖単位が繰り返される。IgMは、一般的に、ジスルフィド結合でまとめられた基本4本鎖単位の五量体として存在する。IgA免疫グロブリン、時として、IgG免疫グロブリンも血清中に多量体で存在することがある。多量体の場合、それぞれの4本鎖単位は同じでもよく、異なってもよい。
【００５１】
本発明において有用な阻害剤として、天然に生じる阻害剤、抗体などの誘導体、バリアント、および生物学的に活性な断片も挙げられる。「バリアント」ポリペプチドは、ネイティブ配列ポリペプチドと100％未満の配列同一性を有する、以下で定義される生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このようなバリアントとして、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基がネイティブ配列のN末端もしくはC末端またはネイティブ配列の内部で付加されたポリペプチド;約1〜40個のアミノ酸残基が欠失された(選択的に、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基で置換された)ポリペプチド;および結果として生じる生成物が非天然アミノ酸を有するようにアミノ酸残基が共有結合により改変された前記のポリペプチドの誘導体が挙げられる。通常、生物学的に活性なバリアントは、ネイティブ配列ポリペプチドと少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００５２】
「キメラ」ポリペプチドは、異種ポリペプチドに融合または結合したポリペプチドまたはその一部(例えば、1つもしくはそれ以上のドメイン)を含むポリペプチドである。キメラfrizzledタンパク質は、例えば、ネイティブ配列のfrizzledポリペプチドと少なくとも1つの生物学的特性を共有する。キメラポリペプチドの例として、前記のイムノアドヘシン(frizzledポリペプチドの一部と免疫グロブリン配列の組み合わせを含む)、およびエピトープタグ化ポリペプチド(frizzledポリペプチドまたはその一部と「タグポリペプチド」との融合)が挙げられる。タグポリペプチドは、作成される抗体のエピトープとなるのに十分な残基を有するが、frizzledポリペプチドの生物学的活性を妨害しないくらい短い。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、通常、約6〜60個のアミノ酸残基を有する。
【００５３】
ネイティブ配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、ネイティブ配列ポリペプチドと定性的な生物学的特性を共有する化合物である。「機能的誘導体」として、ネイティブ配列の断片ならびにネイティブ配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体(但し、これらが、対応するネイティブ配列ポリペプチドと生物学的活性を共有する)が挙げられるが、これに限定されない。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントおよびポリペプチドの共有結合改変体の両方を含む。
【００５４】
適切なwnt阻害剤は、化合物スクリーニングによって、薬剤がwntの生物学的活性に影響を及ぼす能力を検出することによって同定することができる。候補阻害剤の効力の第1のスクリーニングとしてインビトロアッセイが行われてもよく、通常、この生物学的アッセイを確認するためにインビボアッセイが行われる。望ましい阻害剤は、wntシグナル伝達の一過的なブロック、および同時に生じる幹細胞増殖の一過的なブロックに有効であるが、ブロック期間に幹細胞を死滅させない。望ましい阻害剤は、(例えば、生物学的分解のために)天然では一過的である。または、阻害剤を「ウォッシュアウト」するために、阻害剤の後にwntタンパク質が投与されてもよい。
【００５５】
wnt生物学的活性のインビトロアッセイとして、例えば、β-カテニン安定化、幹細胞増殖の促進などが挙げられる。wnt生物学的活性のアッセイとしてβ-カテニン安定化が挙げられる(β-カテニン安定化は、例えば、Wnt組成物の連続希釈によって測定することができる)。例示的なWnt生物学的活性のアッセイでは、候補阻害剤または活性化剤の存在下でWnt組成物と細胞(例えば、マウスL細胞)が接触される。細胞は、β-カテニンを安定化するのに十分な期間(通常、少なくとも約1時間)培養され、溶解される。細胞溶解産物はSDS-PAGEによって分離され、ニトロセルロースに転写され、β-カテニン特異的抗体でプローブされる。
【００５６】
様々な濃度に対する特異的な反応を得るために、複数のアッセイが様々な濃度を用いて並行して行うことができる。当技術分野において周知なように、薬剤の有効濃度の決定は、一般的に、1:10希釈または他の対数スケールの希釈による濃度範囲を使用する。これらの濃度は、必要であれば、第2の希釈シリーズを用いてさらに正確することができる。一般的に、これらの濃度の1つが負の対照となる(すなわち、0濃度もしくは薬剤の検出水準より低い濃度、または検出可能な結合変化を生じない薬剤濃度もしくはその濃度より低い濃度)。
【００５７】
スクリーニング用の関心対象の化合物として、非常に多くの化学クラスの生物学的に活性な薬剤(主に、有機分子であるが、場合によっては、無機分子、有機金属分子、免疫グロブリン、キメラfrizzledタンパク質、frizzled関連タンパク質、遺伝子配列なども含む)が挙げられる。有機低分子も関心対象であり、タンパク質との構造的相互作用(特に、水素結合)に必要な官能基を含み、一般的に、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、しばしば、これらの化学官能基の少なくとも2つを含む。候補薬剤は、多くの場合、前記の官能基の1つまたはそれ以上で置換された、環式炭素構造もしくは複素環式構造および/または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはその組み合わせを含む生体分子の中に見出される。
【００５８】
化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、生体分子を含む多種多様な有機化合物のランダム合成および管理された合成のために、ランダムなオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む非常に多くの手段を利用することができる。または、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形をした天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然のまたは合成により生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段、および生化学的手段によって容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを作成するのに用いられてもよい。構造類似体を生成するために、既知の薬理学的薬剤が、管理されたまたはランダムな化学修飾(例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化(amidification)など)にかけられてもよい。
【００５９】
wnt阻害剤として関心対象の分子として、特異的結合メンバー(例えば、wnt、frizzled、wnt補助受容体などに結合する特異的結合メンバー)が挙げられる。本明細書で使用する用語「特異的結合メンバー」または「結合メンバー」は、特異的結合対(すなわち、一方の分子(すなわち、第1の特異的結合メンバー)が化学的手段または物理的手段によって他方の分子(すなわち、第2の特異的結合メンバー)に特異的に結合する2つの分子、通常、2つの異なる分子)のメンバーを意味する。本発明の方法において有用な阻害剤として、元々の特異的結合メンバーの類似体、誘導体、および断片が挙げられる。
【００６０】
好ましい態様において、特異的結合メンバーは抗体である。用語「抗体」または「抗体部分」はエピトープに適合し、エピトープを認識する特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことが意図され、この場合、1つまたはそれ以上の非共有結合相互作用が分子構造とエピトープとの複合体を安定化する。本発明において用いられる抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。なぜなら、モノクローナル抗体は細胞培養または組換えによって再生することができ、抗原性を低下させるように改変できるからである。
【００６１】
ポリクローナル抗体は、標準的なプロトコールによって、産生動物に抗原組成物を注射することによって産生することができる。例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照のこと。タンパク質全体またはタンパク質の大きな部分を使用する場合、抗体は、産生動物をタンパク質および適切なアジュバント(例えば、フロイントアジュバント、フロイント完全アジュバント、水中油型エマルジョンなど)で免疫することによって産生されてもよい。小さなペプチドが用いられる場合、ペプチドを大きな分子と結合させて免疫刺激性結合体を作成するのが有利である。このような用途のために市販されている一般的に用いられる結合タンパク質として、ウシ血清アルブミン(BSA)およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)が挙げられる。特定のエピトープに対する抗体を産生するために、全配列に由来するペプチドが用いられることがある。または、脳腫瘍タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を作成するために、ポリペプチドを、オボアルブミン、BSA、またはKLHなどの担体タンパク質に結合すれば、優れた免疫応答が誘発されることがある。または、モノクローナル抗体の場合、刺激された免疫細胞(例えば、接種された動物の脾臓細胞)を単離することによって、ハイブリドーマを形成することができる。次いで、これらの細胞を、細胞培養において無限に複製することができる不死化細胞(例えば、ミエローマ細胞または形質転換細胞)と融合させ、それにより不死の免疫グロブリン産生細胞株を得る。さらに、抗体または抗原結合断片は遺伝子工学によって作成することができる。ヒトに投与された時に生じる免疫応答が少ないヒト化抗体、キメラ抗体、または異種ヒト抗体が本発明における使用に好ましい。
【００６２】
免疫グロブリン全体(またはその組換え対応物)に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片(例えば、Fab'、F(ab')2、または他の断片)が本発明における抗体部分として有用である。このような抗体断片は、フィシン、ペプシン、パパイン、または他のプロテアーゼ切断によって免疫グロブリン全体から作成することができる。「断片」または最小免疫グロブリンは組換え免疫グロブリン法を用いて設計されてもよい。例えば、本発明において使用するための「Fv」免疫グロブリンは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域をペプチドリンカー(例えば、ポリグリシンまたはαへリックスもしくはβシートモチーフを形成しない別の配列)によって連結することによって作成することができる。
【００６３】
本発明の1つの態様において、保護剤、または保護剤を含む薬学的組成物は、細胞外wntと、幹細胞表面上に存在するfrizzledとの結合を検出可能に阻害するのに有効な量で提供される。1つの態様において、保護剤は、以下:可溶性FZD CRD;FZDに対する抗体;分泌型frizzled関連タンパク質(sFRP);Wntに対する抗体;抗体LRP5/6;Kremenに対する抗体;Dkkタンパク質、Soggyタンパク質、Wise;前記のいずれかを含む融合タンパク質;前記のいずれかの誘導体;前記のいずれかのバリアント;ならびに前記のいずれかの生物学的に活性な断片から選択される。別の態様において、保護剤は、FZD8 CRD、FZD CRD-IgG融合タンパク質、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-3、SFRP-4、SFRP-5、Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4、Soggy、Wise、wnt3Aに対する抗体、wnt2Bに対する抗体、wnt10Bに対する抗体、およびwnt5Aに対する抗体から選択される。
【００６４】
抗増殖剤:細胞増殖を低減するように作用する薬剤は当技術分野において周知であり、広く用いられている。このような薬剤として、アルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)など);およびニトロソ尿素(例えば、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)、ストレプトゾシン、クロロゾトシンなど)が挙げられる。このような薬剤は癌の治療に用いられるだけでなく、免疫抑制剤および抗炎症剤でもある。
【００６５】
他の天然生成物として、アザチオプリン;ブレキナル(brequinar);アルカロイドおよびその合成誘導体または半合成誘導体(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンなど);ポドフィロトキシン(例えば、エトポシド、テニポシドなど);抗生物質(例えば、アントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン(ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン)、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびモルフォリノ誘導体など);フェノキシゾンビスシクロペプチド(phenoxizone biscyclopeptide)(例えば、ダクチノマイシン);塩基性糖ペプチド(例えば、ブレオマイシン);アントラキノン配糖体(例えば、プリカマイシン(ミスルマイシン(mithrmycin));アントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン);アジリノピロロインドールジオン(azirinopyrrolo indoledione)(例えば、マイトマイシン);大環状免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン、FK-506(タクロリムス、プログラフ)、ラパマイシンなど)などが挙げられる。
【００６６】
他の化学療法剤として、金属錯体(例えば、シスプラチン(cis-DDP)、カルボプラチンなど);尿素(例えば、ヒドロキシウレア);およびヒドラジン(例えば、N-メチルヒドラジン)が挙げられる。他の関心対象の抗増殖剤として、免疫抑制剤(例えば、ミコフェノール酸、サリドマイド、デスオキシスペルグアリン(desoxyspergualin)、アザスポリン(azasporine)、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン(azaspirane)(SKF105685)など)、タキソール(例えば、パクリタキセルなど)が挙げられる。
【００６７】
レチノイド(例えば、ビタミンA、13-cis-レチノイン酸、trans-レチノイン酸、イソトレチノインなど);カロテノイド(例えば、β-カロテン、ビタミンDなど)。レチノイドは上皮細胞の分化および増殖を調節し、上皮過剰増殖疾患の治療および予防に用いられる。
【００６８】
特に、代謝拮抗物質およびDNAトポイソメラーゼ阻害剤は静止細胞に対して比較的効果がない。イリノテカン(CPT-11)はトポイソメラーゼI阻害剤である。CPT-11は、例えば、固形腫瘍(結腸癌、肉腫、非小細胞肺癌、卵巣癌および子宮内膜癌、腺癌、中皮腫など)の治療において、治療剤として用いられる。他の関心対象のトポイソメラーゼ阻害剤として、II型トポイソメラーゼを阻害するドキソルビシンおよびカルボプラチンが挙げられる。
【００６９】
代謝拮抗剤として、ピリミジン(例えば、シタラビン(CYTOSAR-U)、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル(5-FU)、フロクスウリジン(FUdR)など);プリン(例えば、チオグアニン(6-チオグアニン)、メルカプトプリン(6-MP)、ペントスタチン、フルオロウラシル(5-FU)など);および葉酸類似体(例えば、メトトレキセート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザフォレート(PDDF、CB3717)、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸(DDATHF)、ロイコボリンなど)が挙げられる。メトトレキセートは、免疫抑制剤として(特に、同種臓器移植と共に)、ならびに他の過剰増殖疾患の治療において広く用いられる。ロイコボリンは抗感染薬として有用である。
【００７０】
薬学的処方物:wnt阻害剤および抗増殖剤は、治療投与のための様々な処方物に組み込むことができる。wnt阻害剤および抗増殖剤は、同時に、または短い期間の中で、同じ経路または異なる経路によって送達することができる。本発明の1つの態様において、2種類の成分が1種類の懸濁液の中で混合された併用製剤(co-formulation)が用いられる。別の態様において、2種類の成分は別々に処方される。抗増殖剤を用いた治療の後に、阻害剤を追い出すために用いられる、wntの処方物または阻害剤を特異的にブロックする他の薬剤の処方物も含まれる。
【００７１】
活性薬剤は、経口、非経口、吸入噴霧、直腸、または局所を含む任意の適切な経路によって、従来の薬学的に許容される担体、佐剤、およびビヒクルを含む投与単位処方物で投与することができる。本明細書で使用する用語「非経口」は、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、注入法、または腹腔内を含む。
【００７２】
wnt阻害剤は、治療投与のための様々な処方物に組み込まれる。1つの局面において、薬剤は、薬学的に許容される適切な担体または希釈剤と組み合わせることによって薬学的組成物に処方され、固体、半固体、液体、または気体の形をした製剤(例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェア、およびエアロゾル)に処方される。従って、投与は様々なやり方で(通常、経口投与によって)行うことができる。薬剤は投与後、全身にあってもよく、処方物の力で、もしくは移植部位で有効量を維持するように働く移植片を使用することで局所にあってもよい。
【００７３】
薬学的剤形において、wnt阻害剤および/または他の化合物は、その薬学的に許容される塩の形で投与されてもよく、単独で、または他の薬学的に活性な薬剤と適切に共同して、ならびに他の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて用いられてもよい。薬剤は、活性のカクテルをもたらすように組み合わされてもよい。以下の方法および賦形剤は例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。
【００７４】
経口製剤の場合、薬剤は、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤、もしくはカプセルを製造するための適切な添加物と組み合わせて(従来の添加物(例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、またはバレイショデンプン)と共に;結合剤(例えば、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン)と共に;崩壊剤(コーンスターチ、バレイショデンプン、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース)と共に;潤滑剤(例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム)と共に;所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、および着香剤と共に)使用することができる。
【００７５】
処方物は、一般的に、単位剤形で提供される。ここで、用語「単位剤形」は、ヒト被験者への単位投与として適切な物理的に別個の単位を意味し、それぞれの単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共同して所望の効果を生じるのに十分な計算された量で所定量のグルテナーゼ(glutenase)を含む。本発明の単位剤形の仕様は、使用される特定の複合体および達成される効果、ならびに宿主におけるそれぞれの複合体に関連する薬動力学に左右される。
【００７６】
ビヒクル、佐剤、担体、または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は市販されている。さらに、pH調節剤および緩衝剤、張性調節剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質が市販されている。本発明の方法および組成物において有用な任意の化合物を、薬学的に許容される塩基添加塩として提供することができる。「薬学的に許容される塩基添加塩」は、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にもその他の点でも望ましくないものは無い、塩を意味する。これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に添加することによって調製される。無機塩基から得られる塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩などが挙げられるが、これに限定されない。好ましい無機塩は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。有機塩基から得られる塩として、一級アミン、二級アミン、および三級アミン、置換アミン(天然置換アミンを含む)、環式アミン、および塩基性イオン交換樹脂(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂など)が挙げられるが、これに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。
【００７７】
当業者は、投与量は、特定の酵素、症状の重篤度および副作用に対する被験体の感受性の関数として変化することがあることを容易に理解するだろう。薬剤の中には、他の薬剤より強力なものもある。ある特定の薬剤に好ましい投与量は様々な手段によって当業者によって容易に決定することができる。好ましい手段は、ある特定の化合物の生理学的効力の測定である。
【００７８】
治療方法
化学療法後の幹細胞の生存を高める投与計画は、傷害の種類、個体の年齢、性別、医学的状態、状態の重篤度、投与経路、および使用される特定の化合物を含む様々な要因に基づいている。従って、投与計画は大きく異なる場合があるが、標準的な方法を用いて医師によって日常的に決定することができる。0.1ng/kg〜10mg/kg体重の活性薬剤/体重のオーダーの投与量が本明細書に開示される全ての使用方法に有用である。
【００７９】
前記の方法は、抗増殖剤が投与される状況であり、前記方法がなければ抗増殖剤によって死滅する正常幹細胞を残すことが望ましい状況で用いられる。患者は、一般的に、哺乳動物であり、ヒトを含む霊長類でもよく、獣医学的な目的で(例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、などに)用いられてもよく、疾患動物モデル(例えば、ラットおよびマウスを含むネズミ、ウサギなど)に用いられてもよい。抗増殖剤によって治療される状況として、自己免疫疾患の治療;抗菌治療(特に、寄生生物および他の真核微生物の治療);特に、癌の治療が挙げられる。抗増殖剤を用いた癌の治療は当技術分野において周知であり、本明細書で繰り返し説明する必要はない。特に関心があるのは、結腸癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、白血病、およびリンパ腫の治療である。
【００８０】
本発明の方法において、有効量のwnt阻害剤は、幹細胞(例えば、造血幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、神経幹細胞、腸幹細胞など）の生存を恒久的に損なうことなく、幹細胞を、ある期間、静止状態にする。一般的に、用量は、少なくとも、抗増殖剤が投与されている期間(通常、少なくとも約12時間、さらに通常には少なくとも約1日、しばしば、約2日、約3日、またはそれ以上)有効であり、通常、約2週間を過ぎて、さらに通常には約7日を過ぎて有効でない。治療剤は、下記で説明するように投与日に1〜6回投与される。これらの態様の全てにおいて、本発明の保護化合物は、化学療法暴露の前に、化学療法暴露と同時に、または化学療法暴露の後に投与することができる。例えば、化合物は、化学療法の約3日前、2日前、または1日前に投与されてもよい。
【００８１】
選択的に、抗増殖剤の作用が有効な期間の後、wnt阻害剤を競合阻害して正常幹細胞増殖を回復させる用量のwntポリペプチドまたはwntミメティックが患者に投与される。この方法は、当技術分野において用いられる様々な支持療法(例えば、、通常、幹細胞の増殖が回復した後の、エリスロポエチン、GM-CSF、G-CSFなどの投与;幹細胞および前駆細胞、赤血球などを含む血球の導入)と併用されてもよい。
【００８２】
本発明の別の態様において、被験体は本発明の方法に従う治療サイクルを繰り返し受ける。好ましくは、本発明の化合物の投与が終了し、被験体の血球数(例えば、白血球数)が治療的に許容される水準に回復して、化学療法を繰り返し行うことが可能になった後でしか、次の治療サイクルは開始しない。
【００８３】
化学療法後の幹細胞生存を高めるキットが提供される。ここで、キットは、化学療法後の幹細胞生存を高めるのに有効な量の保護剤、および有効量の活性薬剤を治療剤として使用するための説明書を含む。選択的に、キットは、化学療法の終わりに保護剤を追い出すために投与するのに適したwntまたは他の消滅分子(quenching molecule)を組成物の中にさらに含む。消滅分子は、競合的または非競合的に保護剤を特異的に不活化する任意の薬剤である。
【００８４】
好ましい態様において、キットは、前記の佐剤などの薬学的に許容される担体をさらに含む。別の好ましい態様において、キットは、活性薬剤を患者に送達するための手段をさらに含む。このような装置として、注射器、マトリックス溶液(matrical solution)またはミセル溶液、包帯、創傷用包帯、エアロゾルスプレー、脂質発泡体、経皮パッチ、局所投与剤、ポリエチレングリコールポリマー、カルボキシメチルセルロース製剤、クリスタロイド製剤(例えば、食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝食塩水など)、粘弾性物質、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールが挙げられるが、これに限定されない。送達手段は有効量の活性薬剤を含んでもよく、または化合物とは別個のものでもよく、使用時に化合物は送達手段に適用される。
【００８５】
保護剤は抗増殖剤と共に処方されてもよい。抗増殖剤として、シクロホスファミド、タキソール、5-フルオロウラシル、アドリアマイシン、シスプラチン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、マイトマイシンC、プレドニゾン、ビンデシン、カルバプラチン(carbaplatinum)、およびビンクリスチンが挙げられるが、これに限定されない。細胞傷害剤はまた、増殖細胞を破壊することができる抗ウイルス化合物でもよい。
【００８６】
1つの態様において、キットは、細胞外wntシグナル伝達をブロックする保護剤、および細胞外wntと幹細胞表面上に存在するfrizzledとの結合を検出可能に阻害するのに有効な量の保護剤を治療剤として患者に投与するための説明書を含む。キットは、保護剤を混合するための薬学的に許容される担体をさらに含んでもよく、保護剤を患者に送達するための手段を含んでもよい。キットは、化学療法剤、および治療レジメにおいて保護剤と共に化学療法剤を患者に投与するための説明書をさらに含んでもよい。キットは、wntポリペプチドまたはwntミメティック、および保護剤を競合的にブロックし、治療レジメにおいて正常幹細胞増殖を回復させるのに有効な量のwntポリペプチドまたはwntミメティックを患者に投与するための説明書をさらに含んでもよい。
【００８７】
実験
実施例1
Wntシグナル伝達への幹細胞の依存性の評価
正常な微小環境にあるHSCはLEF-1/TCFレポーターを活性化する。これはHSCがインビボでWntシグナル伝達に反応することを示している。HSCが増殖するために、この経路が生理学的に重要であることを証明するために、axinまたはfrizzledリガンド結合ドメイン(両方ともWntシグナル伝達経路の阻害剤である)を異所的に発現させることによって、インビトロでHSCの増殖が阻害され、インビボで再構築が低下したことが本明細書で示される。さらに、HSCのWntシグナル伝達を活性化すると、HSCの自己複製に関与することが以前に示されている遺伝子であるHoxB4およびNotch1の発現の増大が誘導される。Wntシグナル伝達経路はインビトロおよびインビボでの正常なHSCホメオスタシスに不可欠であると結論付けることができる。
【００８８】
β-カテニンの発現はインビトロでのHSCの自己複製につながる。最初に、本発明者らは、HSCの機能に及ぼすWnt経路下流成分の活性化の影響を確かめた。本発明者らは、構成的に活性なβ-カテニンをレトロウイルスによって形質導入することによって、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって選別されたHSC(c-Kit+Thy-1.1loLin-/loSca-1+(KTLS)細胞)のWntシグナル伝達を活性化した。レトロウイルスによるHSC形質導入の成功には、インビトロでの幹細胞の分化を促進することができる複数の種類の増殖因子を用いて細胞周期移行を誘導することが必要とされる。関心対象の実験の前に感染中にHSCが遭遇する分化促進刺激を最小限にするために、本発明者らは、SLF(steel factor)のみの存在下で増殖する、H2K-BCL-2トランスジェニックマウスに由来するHSCを使用した。選別されたBCL-2トランスジェニックHSCに、β-カテニン-IRES-GFP(β-カテニン、内部リボソーム進入部位、および緑色蛍光タンパク質)をコードするレトロウイルスまたはIRES-GFPのみをコードするレトロウイルスを感染させ、GFP発現をHSCの45〜55％で検出した。GFP発現は、インビトロ培養期間全体にわたって持続した。インビトロでの増殖キネティクスおよびインビボで免疫系を再構築する能力を確かめるために、GFP陽性(GFP+)HSCを選別した。
【００８９】
β-カテニンまたは対照ベクターを発現するHSCの短期増殖特性を細胞周期分析によって確かめた。図1Aにおいて、対照ベクターに感染したHSCの34％が細胞周期のS/G2/M期にあったのに対して、活性化β-カテニンを発現するHSCの58％が細胞周期の同じ期にあった。Wntシグナル伝達の活性化が長期増殖を増大させたのかどうか確かめるために、β-カテニンを発現するHSCを、インビトロで、増殖因子の存在下または非存在下で無血清培地において増殖させた。限界量のSLFを含む培地を使用すると、β-カテニンが形質導入されたHSCは少なくとも8週間一貫して増殖した(図1b)。この期間の間、GFP+細胞は、投入細胞の数を少なくとも100倍にするのに8〜9回の集団倍加(population doubling)を受けた。対照的に、対照ベクターに感染したHSCは、2週間を過ぎてもわずかな増殖しか示さなかった。長期培養間にSLFを完全に除去しても、β-カテニンに感染したHSCは少なくとも4週間増殖し、一部の実験では、1〜2ヶ月も維持および継代することができた。対照的に、対照形質導入HSCは48時間を過ぎて生存しなかった。
【００９０】
活性化β-カテニンに反応した増殖が分化を伴うかどうか確かめるために、これらの細胞の形態学的特徴を、2週間の期間の終わりに分析した。対照ベクターが形質導入されたHSCの寿命が限られていたので、対照形質導入HSCの分化状態とβ-カテニン形質導入HSCの分化状態の違いを比較できるようにするために、この時点を選択した。対照ベクターに感染した細胞は骨髄単球の外観を有することが見出された。対照的に、β-カテニン形質導入HSCの65〜75％は高い核対細胞質比を有した(図1C)。これと一致して、対照ベクターに感染したHSCの大部分(75〜80％)がlineageマーカー陽性であったが(図1D)、β-カテニンに感染した細胞の5〜10％しか高レベルのlineageマーカー(主に、胎児HSCおよび再生HSCで発現するインテグリンであるMac-1)を発現していなかった。実際には、β-カテニンに感染したHSCの60％がlineage陰性であり、高レベルのc-KitおよびSca-1を発現し、これらのほぼ半分が低レベルのThy-1.1も発現していた。従って、β-カテニン形質導入培養における細胞の少なくとも30％がHSCの表現型を維持していた(すなわち、c-Kit+Thy1.1loLin-Sca-1+ (KTLS細胞)であった)。このことから、活性化β-カテニンの発現によって、造血幹細胞は未熟な状態に維持すると同時に増殖することができ、従って、生成された細胞の総数に基づいてHSCプールを20〜48倍に増殖することが分かった。
【００９１】
理論に拘束されるつもりはないが、本発明者らは、活性化β-カテニンによるHSCの増殖が上流Wntシグナルを反映していると考えている。BCL-2トランスジェニックHSCおよび野生型HSCの両方において、精製Wnt3aが自己複製を引き起こすことが証明された(図5〜6)。詳細に述べると、個々にプレートされたHSCは、対照条件と比較してWnt3aの存在下で6倍以上の数の子孫を生じる。これらの娘細胞は未熟な表現型を維持するだけでなく、インビトロでの増殖後の単一HSCの子孫の移植分析により確かめられたように5〜50倍のHSC機能拡大も示す。
【００９２】
β-カテニン感染の後に播種された細胞の数(10,000)および8週間の期間にわたる数の増加(960,000)に基づいて、HSCにおける活性化β-カテニンの発現は、一般的に、幹細胞表現型を有する細胞を少なくとも20〜48倍に増加させた(960,000の30％=288,000、10,000個の初期細胞の少なくとも一部は恐らく生存も反応もしないので、これは過小評価である)。
【００９３】
限界希釈移植を用いたデータから、本発明者らは、β-カテニンの存在下でHSCの機能は著しく拡大すると結論付けることができた。125個のβ-カテニン形質導入HSCを移植した全てのマウスが首尾よく再構築されたので、本発明者らは、移植効率に基づいて(10％のKTLS細胞が骨髄を再構築することができる)、それぞれの移植片は少なくとも10 HSC/125細胞(約10％)を含んでいたはずであり、観察された再構築が高レベルであったので、それよりかなり多い細胞を含んでいた能性が高いと見積もっている。1週間行われた代表的な実験において、本発明者らは、プレートされた6,000個のHSCから48,000個の細胞が生じることを観察した。この増殖した集団の10％(4,800個)がHSC活性を保持し、プレートされたHSCの10％(600個)が機能的に出力したことに基づくと、これは、活性化β-カテニンの存在下で、HSCの機能が少なくとも8倍から80倍(100％の培養細胞がHSC活性を保持した場合)まで拡大したことを示唆している。しかしながら、最初に細胞死がかなりあること、ならびに細胞周期に入っている細胞がインビボでの移植にはかなり非効率であることに基づくと(約1/50すなわち2％の細胞が機能的に出力する)、8倍という低い方の見積もりは、まず間違いなく、実際に起こった拡大の過小評価である。さらに長期間行われた培養において観察された増殖(2ヶ月、図1)に基づいて、本発明者らは、長期培養においてHSCの機能が96〜960倍に拡大したと見積もっている。
【００９４】
Wnt3Aはインビトロで野生型HSCの増殖を誘導する
精製Wntタンパク質は、BCL-2トランスジェニックHSCにおいてβ-カテニンと同じようにHSC自己複製を調節することができる。この反応がBCL-2過剰発現に依存しないことを確実なものとするために、本発明者らは、野生型HSCも精製Wnt3Aに同じように反応するかどうか詳細に試験した。ある期間にわたって、1〜20細胞/ウェルでプレートされたHSCは、対照条件とは対照的にWnt3Aに極めて強く反応した(例えば、5細胞/ウェルでプレートされた時、184細胞対0)(図5)。3回の独立した実験にわたってWnt3Aに反応した細胞の平均頻度は、10細胞/ウェルでプレートされた時、対照条件(限界量のSLF)に対する増殖より17倍高かった。これらのデータは、様々な数の投入細胞(1〜20細胞/ウェル)を用いた9回の独立した実験を代表するものである。さらに、精製または非精製Wnt3Aで処理されたHSCの表現型特徴は著しく異なった。培養の7日後に、精製Wnt3Aで処理されたHSCの大部分はlineageマーカー陰性であったのに対して(実線)、非精製Wnt3Aで処理されたHSCの大部分はlineageマーカーを強くアップレギュレートした(破線) (C)。さらに、lineage陰性集団のかなりの割合が、HSC表現型と一致するc-KitおよびSca-1を発現した(D)。
【００９５】
精製Wnt3Aで処理された細胞が機能的に自己複製するかどうか試験するために、精製HSCを1個の細胞または10個の細胞としてプレートし、Wnt3Aで処理した。それぞれのウェルは増殖細胞を含み、これを、300,000個のSca-1-骨髄細胞と共に、致死線量を照射したレシピエントマウスに個々に移植した(A)。それぞれの移植マウスからの末梢血(PB)の分析によって、HSCの出力を示す多系列再構築が明らかになった(B)。休止HSCの経験的に観察された再構築頻度は約10％であり、細胞周期に入っているHSCの再構築頻度は約2％であるので、プレートされた1個の細胞の100％の観察された再構築頻度は、Wnt3Aが10〜50倍のHSC活性増加を誘導することと一致し、これはBCL-2トランスジェニックHSCで見られた範囲とほぼ同じ範囲である。さらに、独立した実験において、10個の細胞がプレートされたウェルならびに5個の細胞がプレートされたウェルも100％の再構築効率を示し、これは細胞周期に入っているHSCの自己複製がWnt3Aに反応して増加したことと一致する。HSCがインビトロでWnt3Aに反応して増殖したこと、幹細胞表現型特徴の維持の増大、および自己複製における機能増大が、BCL-2トランスジェニックおよび野生型マウスの両方において生じたことは、BCL-2の異所発現がWnt3Aに対するHSCの反応に必須ではないことを証明している。
【００９６】
通常、HSCはインビボでLEF-1/TCFエレメントを介してシグナル伝達を行う
Wntシグナル伝達経路がHSCに生理学的に関連しているかどうか確かめるために、本発明者らは、HSCがインビボでWnt/β-カテニン経路に関連したシグナルを使用するかどうか試験した。HSCに、不安定化GFPの発現を駆動するLEF-1/TCFレポーター(TOP-dGFP)または変異LEF-1/TCF結合部位を有する対照レポーター(FOP-dGFP)を感染させ、次いで、致死線量を照射したマウスに移植した。ドナーHSCがレポーター活性を示すかどうか確かめるために、レシピエントの骨髄を14週間後に調べた。示した例では、TOP-dGFPに感染させたドナー由来HSCは細胞の28％においてGFPを発現したのに対して(図2;観察された範囲4〜28％,平均11.8％)、レシピエントマウスに由来するHSCはGFP陰性であった(観察された範囲2.3〜3.2％,平均2.7％)。さらに、対照レポーターが形質導入されたHSCはGFPを有意に発現しなかった。これは、HSCのGFP発現には機能的なLEF-1/TCF結合部位が必要であったことを証明している(図2C)。全ての場合において、非HSC骨髄前駆細胞画分ではレポーター活性は観察されなかった(図2、細い線)。
【００９７】
対照として、本発明者らはまた、インビトロでHSCにおいてTOP-dGFPレポーターが、Wnt3aを介したシグナル伝達に反応してオンになるかどうかも試験した。従って、TOP-dGFPまたはFOP-dGFPのいずれかが形質導入されたHSCをWnt3aで刺激し、GFP発現の程度をモニタリングした。図2Eに示したように、Wnt3aで処理されたHSCは著しいレポーター活性を示した。これは、レポーターがWnt刺激に反応してオンになるが、対照条件ではオンにならないことを証明している。非不安定化GFPを駆動するレポーター構築物が用いられた時、レポーター活性の増大が観察された。これらのデータは、自己複製および/または細胞周期に入る刺激の間に、正常な微小環境にあるHSCが内因性Wntシグナル伝達に反応することを証明しており、また、自己複製を増大させたWnt3a刺激が正規のWnt経路を介してシグナル伝達を行うという解釈を裏付けている。
【００９８】
HSCはインタクトなWntシグナル伝達を必要とする
Wntシグナル伝達が正常なHSC増殖に必要かどうか試験するために、本発明者らは、Wntタンパク質とfrizzled受容体との結合を阻害する可溶型frizzledシステインリッチドメイン(CRD)を使用した(図6)。IgG-CRDドメイン融合タンパク質または対照IgGの存在下で野生型HSCを増殖因子と共にインキュベートし、細胞増殖をモニタリングした。CRDドメインが存在すると、HSCの増殖は対照条件と比較して1/4に阻害された(図3A)。可溶性CRDは、frizzled分子を結合するWntのレベルで作用するので、この阻害からHSCの生存および増殖を調節するWntシグナルの直接的な証拠が得られる。HSCしか存在しなかったので、Wntシグナルは、恐らく、培養物中のHSCの一部または全てに由来し、複数の他の増殖因子が存在するのにもかかわらず必要とされる。これらの結果は、たとえ一次シグナルがWntでなくても、全てのHSC有糸分裂はWntシグナル伝達の結果であることを意味すると解釈することができる。
【００９９】
本発明者らはまた、HSCにおいてaxinを異所的に発現させることによって独立した阻害剤でWntシグナル伝達を阻害した。Axinはβ-カテニン分解を増大させ、Wntシグナル伝達の細胞内阻害剤として作用する。生きているaxin感染野生型HSCを感染の48時間後に再度選別し、増殖因子の組み合わせに反応した増殖をアッセイするために限界数でプレートした。対照感染細胞は60時間にわたって2.3倍に増殖したが、axin感染細胞は増殖反応全体で1/7に減少した(図3b)。Axinは、BCL-2トランスジェニックHSCの増殖にも阻害作用を有した。これは、BCL-2の発現がWntシグナル伝達の喪失から細胞を保護できないことを示唆している。axin発現が細胞生存に影響を及ぼすかどうか調べるために、ヨウ化プロピジウム排除を用いて、GFP+細胞を感染期間の終わりに分析した。対照感染細胞の80％がヨウ化プロピジウム陰性であったのに対して、axin感染HSCの38％しかヨウ化プロピジウム陰性でなかった。これは、axin発現がβ-カテニン機能をブロックすることで細胞生存に重大な影響を及ぼすことを示している。
【０１００】
Wntシグナル伝達がインビボでの造血幹細胞反応に必要であるかどうか確かめるために、本発明者らは、生きているaxin形質導入HSCまたは対照形質導入HSCを、致死線量を照射したマウスに注射し、10週間後の再構築レベルを分析した。対照感染HSCが移植されたマウスは、axin感染HSCが移植されたマウス(再構築範囲0〜1.8％)より平均して7倍大きなキメラ化(再構築範囲5〜11.6％)を示した(図3E)。移植マウスにおけるaxin感染HSCまたはベクター感染HSCによる寄与の代表例を図3dに示す。これらのデータはWnt経路の阻害が再構築を低下させることを示し、Wntシグナル伝達がインビボでのHSCの正常発生に必要であることを示唆している。この発見と、HSCがインビボでWntシグナル伝達に反応するという発見(図2)から、Wnt/β-カテニンシグナル伝達はHSC由来造血の重要な生理学的メディエーターでることが分かる。
【０１０１】
β-カテニンはHSCにおいてHoxB4およびNotch1をアップレギュレートする
本発明者らは、Wntシグナル伝達が、HSCの自己複製に関与することが以前に示されている遺伝子をアップレギュレートすることによってHSCの自己複製を調節している可能性があるかどうかを確かめたいと考えた。このために、本発明者らは、HoxB4およびNotch1のアップレギュレーションを試験した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析を、β-カテニンまたは対照ベクターのいずれかに感染したHSCに使用することによって、本発明者らは、HoxB4が平均3.5倍アップレギュレートされ、Notch1が2.5倍アップレギュレートされたことを発見した(図4a)。対照的に、GADPH発現はβ-カテニン発現の結果として特異的に調節されず、対照として用いられた(図5b)。これらのデータから、HSC自己複製の調節因子としてこれまでに同定された遺伝子が関連している可能性があり、恐らく、分子階層(molecular hierarchy)において作用することが分かる。
【０１０２】
前記のデータは、Wntシグナル伝達経路の成分が精製KTLS骨髄HSCの増殖を誘導しながら、その分化を著しく阻害し、それによって機能的な自己複製をもたらすことができることを示している。HSCにおいてβ-カテニンが発現すると、少なくとも何週間にもわたってインビトロで増殖が増大し、分化が著しく低下する。β-カテニンが形質導入されたHSCは、限界数で移植された時にインビボで骨髄系列およびリンパ系列を持続的に再構築する。axinの過剰発現によってインビトロおよびインビボの両方で幹細胞増殖が低下するので、Wntシグナル伝達は他のサイトカインに対する正常HSCの増殖反応に必要とされる。さらに、frizzled-CRDによってHSCの増殖が阻害されることと、Wnt3aがHSCの増殖を引き起こすという発見は、β-カテニンおよびaxinの影響は上流Wnt活性を反映しているという解釈を裏付けている。最後に、LEF-1/TCFレポーターを含むHSCを用いた研究から、HSCはインビボで内因性Wnt刺激に反応することが分かる。骨髄における多数のWntタンパク質と、骨髄由来前駆細胞およびHSCにおけるfrizzled受容体の発現は、この可能性を裏付けている。
【０１０３】
培養においてHSCに作用する大部分の増殖因子は増殖を誘導しないか、もしくはあまり増殖を誘導しないか、または分化を阻止することができない。従って、本発明者らの研究の最も注目すべき発見の1つは、Wntシグナル伝達経路による増殖の誘導およびHSC分化の阻止である。HSCの増殖を増大させる他のシグナルとして、Notchおよびsonic hedgehogが挙げられる。さらに、サイクリン依存性キナーゼインヒビターp21Cip1/Waf1および転写因子HoxB4がHSCの自己複製の調節に関与することが示されている。特に、Wntシグナル伝達は、様々な生物において、これらの経路の多くと相互作用することが示されており、前記のデータは、HoxB4およびNotch1がHSCにおいてWntシグナル伝達に反応してアップレギュレートされることを示している。
【０１０４】
これらの発見はヒト造血細胞移植のために重要な意味を有する。可溶性Wnt3aタンパク質は、他の増殖因子が全く無い状態で、高度に精製されたヒト骨髄HSCの増殖を誘導する。Wntシグナル伝達によってHSCの増殖が誘導されると、患者自身のHSCまたは同種ドナーのHSCをインビトロで増やすことができる可能性があり、将来の移植のための細胞供給源を増やすことができるかもしれない。逆に、Wntシグナル伝達を阻害することによって、HSCを静止状態で止めることができる。
【０１０５】
材料および方法
マウス
C57Bl/Ka Ly5.1,Thy-1.1(野生型およびBCL-2)、C57Bl/Ka Ly5.2,Thy-1.1、およびAKR/Jマウスを6〜10週齢で使用した。マウスを、Stanford and Duke University Medical Centersの動物飼育施設において酸性水を与えて飼育および維持した。
【０１０６】
HSC単離
本発明者らはマウス骨髄からHSCを選別した。全ての細胞選別およびFACS分析は、Stanford共同FACS施設およびDuke Cancer Center FACS施設にあるFACSVantage(ベクトンディキンソン(Becton Dickinson))で行った。細胞を、c-Kit、Sca-1、低レベルのThy-1.1、および低レベルから陰性レベルのlineageマーカー(Lin)の発現に基づいて選別および再分析した。
【０１０７】
細胞周期分析
レトロウイルスによって形質導入されたHSCを培養物から集め、ヘキスト(Hoechst)培地中でヘキスト3342(モレキュラープローブス(Molecular Probes))で37℃で45分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、GFP+細胞の細胞周期プロファイルを確かめるためにフローサイトメトリーで分析した。
【０１０８】
ウイルス産生および感染
293T細胞を、マウス幹細胞ウイルス構築物とgag-polおよび水疱性口内炎ウイルスG糖タンパク質構築物で3回トランスフェクトすることによって、ウイルスを産生した。ウイルス上清を3日間集め、50,000gの超遠心分離によって100倍に濃縮した。ウイルス感染のために、10,000個のHSCを96ウェルプレートのウェルに選別し、BCL-2トランスジェニックHSCの場合、SLF(30ng ml-1)の存在下で、または野生型HSCの場合、SLF(30ng ml-1)+TPO(30ng ml-1)の存在下で一晩培養した。12時間後、濃縮したレトロウイルス上清を細胞に1:1の比で添加した。次いで、細胞を32℃で12時間、37℃で36時間インキュベートした後に、GFP+細胞をインビトロアッセイおよびインビボアッセイのために選別した。使用したレンチウイルスは前記のように産生した。簡単に述べると、293T細胞を、導入ベクタープラスミド、VSV-GエンベロープコードプラスミドpMD.G、およびパッケージングプラスミドCMVΔR8.74でトランスフェクトした。上清を超遠心分離によって収集および濃縮した。全てのサイトカインはアールアンドディーシステムズ(R&D systems)から購入した。
【０１０９】
インビトロHSC増殖アッセイ
新たに精製されたHSCまたはウイルスにより形質導入されたHSCを、テラサキ(Terasaki)プレートに1〜20細胞/ウェルでプレートした。細胞を、5×10-5M 2-メルカプトエタノールおよび指定の増殖因子を添加した無血清培地(X-vivo15, BioWhittaker)を含むウェルに選別した。増殖は、特定の間隔で各ウェルの細胞数を計数することによってモニタリングした。長期培養の場合、形質導入されたHSCを、SLF(1ng ml-1)の非存在下または存在下で96ウェルプレートにプレートし、生じた細胞の数を特定の間隔で細胞を計数することによってモニタリングした。CRDまたはaxinによる増殖阻害の場合、細胞を、分裂促進因子(SLF(30ng ml-1)、Flt-3L(30ng ml-1)、インターロイキン-6(10ng ml-1))の存在下で培養した。
【０１１０】
HSC機能のインビボ分析
ウイルスにより形質導入されたHSCをインビトロで培養し、300,000個のレスキュー宿主全骨髄細胞またはSca-1枯渇骨髄細胞と共に、200-kV X線機械を用いて9.5Gyを照射した4〜6匹のコンジェニックレシピエントマウス群の眼窩後方に注射した。照射後に、宿主マウスに抗生物質水溶液を与えた。ドナー細胞によってもたらされた造血区画の割合を求めるために、移植されたマウスを定期的に採血した。ドナー細胞および宿主細胞は、CD45(Ly5)の対立遺伝子発現またはBCL-2トランスジーンの発現によって区別した。
【０１１１】
レンチウイルスレポーターアッセイ
強化GFP(eGFP)またはd2-eGFP遺伝子(不安定化、半減期2時間;クロンテック(Clontech))を、LEF-1/TCF反応性プロモーター(3つのLEF-1/TCF結合モチーフおよびTATAボックスを含む)の下流にクローニングした。次いで、このカセットを自己不活化レンチウイルスベクタープラスミドにクローニングし、ウイルスを前記のように産生した。
【０１１２】
インビボアッセイの場合、HSCにレポーターレンチウイルスを形質導入し、グルタミン酸、5×10-5M 2-メルカプトエタノール、およびサイトカインカクテル(10ng ml-1インターロイキン-11、10ng ml-1 TPO、50ng ml-1 SCF、50ng ml-1 Flt-3Lを含む)X-vivo15において培養した。細胞を6時間一晩37℃でインキュベートし、致死線量を照射したコンジェニックレシピエントに移植した。致死線量を照射したマウスには、500個の形質導入HSCとレスキュー骨髄を与えた。分析のために、移植の14〜24週間後に、造血前駆細胞のレポーター活性化を分析した。
【０１１３】
インビトロアッセイの場合、精製HSCを培地(IMDM/10％FBS+インターロイキン-11、TPO、SCF、およびFlt-3L、前記)に直接選別し、96ウェルプレートに500〜1,000細胞/ウェルでプレートした。個々の細胞に、適切なレンチウイルスレポーターを形質導入し、精製Wnt3a(約100ng ml-1)で刺激するか、または刺激しなかった。5日後に、細胞を集め、死細胞を排除するためにヨウ化プロピジウムで染色し、GFP発現について分析した。
【０１１４】
リアルタイムPCR分析
X-Vivo15、5×10-5M 2-メルカプトエタノール、および100ng ml-1SLFを含む96ウェルプレートで培養した合計75,000個のHSCに、β-カテニンレンチウイルスまたは対照レンチウイルスを感染させた。培養の2日後に、形質導入細胞をGFP発現に基づいて単離した。RNAをTrizol(インビトロゲン(Invitrogen))を用いて調製し、改良エベルワイン(Eberwine)合成を用いてリニア増幅した。それぞれの増幅RNAを第一鎖に変換し、リアルタイムPCRによって特異的な遺伝子発現について分析した。相補DNAを、ファーストスタートマスターSYBRグリーン(FastStart Master SYBR Green)ポリメラーゼミックス(ロシュ(Roche))、プライマーと混合し、リアルタイムPCRを、ライトサイクラー(LightCycler)(ロシュ)を用いて行った。
【０１１５】
実施例2
動物モデルにおけるヒト幹細胞生存の分析
SCID-hu動物モデルをヒト骨髄用に準備した。ヒトHSCを、静止状態の誘導後の非増殖細胞の存在について、および静止期間後の正常造血の回復について試験した。次いで、増殖細胞を標的とする抗増殖剤による死滅に対する耐性について、細胞を試験した。
【０１１６】
Scid-hu骨髄モデル
造血が活発なことが知られている妊娠期間17〜22週(g.w.)のヒト胎児の大腿骨および脛骨(1〜2cm)を、骨皮質ならびに髄内領域が暴露されるように縦軸に沿って切断した。次いで、これらの断片を、SCIDマウスの皮下に外科的に移植した。ホモ接合性CB-17 scid/scidマウスを飼育し、記載のように(McCune et al.,Science(1988)241:1632)抗生物質で処置し、6〜8週齢の時に使用した。全ての手術処置の間に、メトキシフルランで麻酔をかけた。移植の2週間後および8週間後に、ヘマトキシリン-エオシン染色組織切片を骨移植片から作成した。組織を20％ホルマリンで固定し、EDTA(1.7mM)を含むHCl溶液でカルシウム除去し、パラフィン包埋し、4μm切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。移植後、様々な間隔で移植片を取り出し、ヒト造血活性の存在について分析した。
【０１１７】
移植された骨髄組織または正常な骨髄組織から細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解するために0.83％塩化アンモニウムで室温で5〜10分間処理し、PBSで洗浄した。細胞を、ビオチン化-MEM-43抗体、ビオチン化-Ly5.1抗体、またはビオチン化対照抗体のいずれかと氷上で45分間インキュベートし、胎仔ウシ血清(FBS)クッションを介して洗浄し、次いで、フルオレセイン結合(FITC-)アビジン(カルタグラボラトリーズ(Caltag Laboratories Inc.))で45分間染色した。フローサイトメトリーの前に、死細胞をゲートアウト(gate out)するために、ヨウ化プロピジウム(PI)を最終濃度10μg/mlで添加した。シングルレーザーFACScan(ベクトンディキンソンイムノサイトメトリーシステムズ(Becton Dickinson Immunocytometry Systems))を用いた4パラメータフローサイトメトリーによって、MEM-43陽性細胞の前方散乱光パターンおよび側方散乱光パターンを得た。
【０１１８】
4〜5週間で、移植された骨の中の多くの部位で活発な造血が観察された。6〜8週間で、移植片の大部分が、高度の細胞性でリンパ球形成、骨髄球形成、赤血球形成、および巨核球形成に関連する正常ヒト胎児骨髄と同じように見えた。移植4〜16週間後の移植片からの細胞の収率は投入量の約10％である。サイトスピン(cytospin)で調製されたこれらの細胞のライトギムザ(Wright-Giemsa)染色によっても、様々な成熟段階にあるリンパ系細胞、骨髄系細胞、または赤血球系細胞の代表的な形態が明らかになった。これらの活発な造血の兆候は骨移植片の90％を超えて観察され、移植の16週間後まで続く。
【０１１９】
移植片内の造血細胞のヒト起源は、MEM-43(ヒト細胞の共通抗原に特異的な抗体)またはLy5.1(マウス汎白血球(pan-leukocyte)抗原と反応する)のいずれかを用いたフローサイトメトリーによって確かめた。ヒト骨髄とマウス造血細胞との交換は、20週間以上、インビボでインキュベートされた移植片の一部において観察された。
【０１２０】
骨髄における造血細胞集団の特徴は、フローサイトメトリーを用いた光散乱プロファイルによって分析した。正常胎児骨髄における4種類の特徴的な造血細胞クラスター(すなわち、リンパ球集団(Rl)、芽球様細胞集団(R2)、骨髄球集団(R3)、および成熟顆粒球集団(R4))が前方散乱光および側方散乱光の分布によって明らかにされた。移植後、様々な時点で骨移植片から回収されたMEM-43陽性ヒト細胞を用いて同様の分析が行った。移植の2週間後に回収された細胞は明らかなクラスター形成を示さない。このことから、これらの細胞は非造血由来であることが分かる。これに対して、4週間を超えてインキュベートされた移植片からのヒト細胞は正常胎児骨髄細胞と同様の散乱プロファイルを示した。従って、散乱分析によって検出された移植骨にヒト造血細胞が出現するキネティクスは、組織学的観察と一致することが分かった。
【０１２１】
移植片における有核造血細胞の細胞表面表現型は、ヒトlineageマーカーに特異的な様々な抗体を用いてさらに分析することができる。リンパ球(Rl)領域にある細胞の約80％はB細胞であり、CD10およびCD19の両方に陽性である。表面免疫グロブリンが染色されると、約20％がIgMを発現し、約4％がIgDも発現する。κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかを有する細胞の比は正常骨髄における比とほぼ同じであり、このことは、これらのB細胞がモノクローナル増殖の産物ではないことを示唆している。CD7抗体により検出される少数(<5％)のヒトT系列細胞がこの領域に見出される。骨髄球(R3)領域にある細胞の約60％は、骨髄単球に特異的なCD15抗原を発現することが見出された。このことから、この領域にある細胞の主な集団は未熟型の骨髄単球であったことが分かる。R4領域にある細胞も80％を超えてこのマーカーに陽性であり、光散乱プロファイルから、これらが成熟型の顆粒球であることが分かった。芽球様細胞(R2)領域にある細胞集団は、CD10+CD19+細胞、CD15+細胞、およびこれらのマーカーを欠く集団の混合集団である。さらに、正常胎児骨髄で観察されたように、R1領域およびR2領域にあるかなりの数(5〜10％)の細胞が骨髄前駆細胞マーカーであるCD34を発現する。まとめると、移植されたヒト骨髄の各クラスターにおける細胞組成は正常胎児骨髄とほぼ同じであることが分かった。
【０１２２】
ヒト赤血球形成活性のレベルを、ヒトグリコホリンA(GPA)特異的抗体を用いて分析した。移植片からの骨髄細胞におけるヒトグリコホリンA(GPA)発現のフローサイトメトリー分析を行った。塩化アンモニウム処理をせずに、細胞懸濁液を移植片から調製した。細胞をビオチン化抗ヒトGPA抗体で染色し、その後に、前記で述べたようにFITC-アビジン結合を行った。PBSによる最後の洗浄の後、細胞を、PBSに溶解した2.5％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、核DNAを染色するために最終濃度1μg/mlのPIとインキュベートした。
【０１２３】
ヒト骨移植片がSCIDマウスに移植された時、自己複製能および多系列能を有するヒト前駆細胞は機能的に維持される。培養コロニー形成アッセイによる前駆細胞活性のキネティクスを調べた。
【０１２４】
移植片1個あたりのコロニーの総数を、コロニー数および回収された総細胞数に基づく計算によって得た。様々な胎児ドナーの骨移植片がこの実験に用いられた。以前に述べられた方法に従って、CFU-GMおよびBFU-Eをメチルセルロース培養によってアッセイした。簡単に述べると、骨髄細胞を、培養液0.25mlの中に1〜5×104/mlの濃度で24ウェルプレートにプレートした。この培養液には、イスコブ(Iscove's)改変ダルベッコ培地(ギブコラボラトリーズ(Gibco Laboratories))(20％FBS、0.05mM 2-メルカプトエタノール、200mM L-グルタミン、0.8％lept-アルブミン、0.08％NaHCO3、および2u/ml濃度のヒト組換えエリスロポエチン(アムジェンバイオロジカルズ(Amgen Biologicals))、および10％Mo条件培地を含む)に1％メチルセルロースが含まれた。メチルセルロース培養物を、7％CO2を含む空気の中で37℃でインキュベートし、ウェル1個あたりのコロニー数を求めるために12日後に計数した。CFU-Cは50個を超える細胞を有することを特徴とし、主に、顆粒球および/もしくはマクロファージ(CFU-GM)または赤血球系細胞の複数のクラスター(BFU-E)からなった。
【０１２５】
最後に、骨移植片を有するSCID-huマウスの末梢循環にヒト細胞が存在するかどうかを、FITC-HLe1抗体(共通ヒト白血球抗原,CD45)およびPE-W6/32抗体(MHC-クラスIの単一性決定因子)の組み合わせを用いたFACS分析によって調べた。ヒト細胞は、移植の9週間後に調べられたSCID-huマウスの末梢血にかなりの頻度で検出された。
【０１２６】
骨髄のヒト前駆細胞に及ぼすwnt阻害剤の影響を確かめるために、8週〜10週前の様々な長骨に由来するヒト胎児骨が移植されたCB-17scid/scidマウスを、実施例1に記載のように、様々な用量レベルのCRD-Ig分子で処置した。動物を初回量のCRD-Igで処置し、2日後に細胞を移植骨から回収した。増殖幹細胞の数を、ヒトCD34+,Thy-1+細胞の染色、ならびにKi67(細胞周期のG1後期、S期、M期、およびG2期の増殖細胞で発現するが、G0(静止)期には発現しない核タンパク質)の染色によって計算した。活発に増殖している幹細胞の数を、対照動物と比較して標準化した。
【０１２７】
幹細胞が正常な増殖を再開する能力を試験するために、CRD-Ig投与の3日後に、動物を様々な用量のWnt3Aタンパク質で処置した。wntタンパク質は阻害剤をウォッシュアウトするように作用し、正常なシグナル伝達を回復させる。2日後、幹細胞を再び回収し、前記のように増殖細胞が存在するかどうか試験した。
【０１２８】
抗増殖剤からの幹細胞の保護を確かめるために、増殖をブロックするのに十分であるが、wntウォッシュアウト後の増殖回復を妨げない用量のCRD-Igを動物に投与した。12時間後、動物を、HSCのLD50と等量の単回量のメトトレキセートで処置した。対照動物は、保護CRD-Igの非存在下でメトトレキセートで処置した。24時間後、前記のコロニーアッセイにおいて、保護剤の非存在下または存在下での幹細胞生存率を計算した。
【０１２９】
実施例3
動物宿主におけるヒト白血病細胞の増殖および転移
SCID-hu動物モデルをヒト骨髄用に準備し、ヒト白血病細胞を投与することによってさらに試験した。ヒトHSCを、静止状態の誘導後の非増殖細胞の存在について、および静止期間後の正常造血の回復について試験した。次いで、増殖白血病細胞を標的とする抗増殖剤による死滅に対する耐性について、細胞を試験した。
【０１３０】
患者試料
骨髄性白血病患者(急性骨髄性白血病および骨髄急性転化期にある慢性骨髄性白血病を含む)からの骨髄(BM)試料を、インフォームドコンセントを得て入手した。単核細胞を、フィコールパーク(Ficoll-Paque)(ファルマシア(Pharmacia))密度沈殿によって単離し、次いで、10％DMSOおよび10％胎仔ウシ血清(FBS)を含むRPMI-1640(ギブコ(GIBCO))に溶解して凍結保存した。解凍後、細胞を、10％FBSを含むRPMI-1640で洗浄し、フローサイトメトリー分析および移植に使用した。
【０１３１】
SCID-huマウス
ホモ接合性C.B-17scid/scid(SCID)マウスを飼育し、抗生物質で処置し、6〜8週齢の時に使用した。妊娠19〜23週のヒト胎児の大腿骨および脛骨を切断して断片にし、マウスの皮下に移植した。個々の胎児ドナーの胸腺から調製した細胞懸濁液をHLAアロタイプについて分析した。
【０１３２】
白血病細胞の注射
解凍後、白血病患者の骨髄細胞(0.4〜2.0×106生細胞)を、10％FBSを含むRPMI-1640 20mlに再懸濁し、マイクロシリンジ(ハミルトン(Hamilton Co.))を用いてヒト胎児骨移植片に直接注射した。骨移植片は、白血病細胞注射の6〜8週間前に皮下に移植された。ヒト骨移植片の細胞の起源が後で追跡できるように、骨ドナーと白血病ドナーの組み合わせは、一般的に分布しているHLAアロタイプが異なるように選択した。
【０１３３】
抗体
MHCクラスI抗原に対するマウスモノクローナル抗体を、直接、FITCまたはPEに結合した。FITC抗LeuM1(CD15)、PE抗LeuM9(CD33)、PE抗Leu12(CD19)、FITC抗CALLA(CD10)、およびFITC抗HLe1(CD45)を購入した。
【０１３４】
フローサイトメトリー
10％FBSを含む冷RPMI-1640の中で組織をはさみで切り刻むことによって、単一細胞懸濁液をヒト骨および/または腫瘍から調製した。次いで、赤血球を溶解するために、細胞を塩化アンモニウムで処理し、指定のマーカー細胞の免疫蛍光によって染色した。マウス末梢血および骨髄に由来する細胞も調べた。分析の前に、死細胞を選択的にゲートアウトするために、ヨウ化プロピジウムを最終濃度10μg/mlで添加した。FACScanシステムを用いて、マルチパラメーターフローサイトメトリーを行った。白血病細胞のパーセントは、個々の試料中の全てのヒト細胞あたりの患者HLAアロタイプ陽性細胞のパーセントとして計算した。各実験において、アイソタイプが一致する抗体を負の対照として含めた。
【０１３５】
組織学
細胞遠心スライド(cytocentrifuge slide)を作成し、ライトギムザ染色で染色した。
【０１３６】
SCID-Huマウスへのヒト骨髄性白血病細胞の移植
白血病患者からの凍結保存BM細胞をSCID-huマウスのヒト胎児骨断片に直接注射した。注射されたヒトBMならびにマウスBMにおけるヒト白血病細胞の増殖を、注射の4〜56週間後にフローサイトメトリーで分析した。
【０１３７】
抗増殖剤からの幹細胞の保護を確かめるために、増殖をブロックするのに十分であるが、wntウォッシュアウト後の増殖回復を妨げない用量のCRD-Igを動物に投与した。12時間後、動物を、HSCのLD50と等量の単回量のCPT-11で処置した。対照動物は、保護CRD-Igの非存在下でCPT-11で処置した。24時間後、前記のコロニーアッセイにおいて、保護剤の非存在下または存在下での幹細胞生存率を計算した。生きている腫瘍細胞の数も同様に計算した。
【０１３８】
実施例4
ヒト肺癌細胞株の細胞を、免疫不全SCIDマウスの静脈内に導入した。免疫不全SCIDマウスには、接種前に、ヒト胎児肺およびヒト胎児骨髄の断片を移植した。
【０１３９】
マウスおよび組織
ホモ接合性CB-17scid/scidマウスを6〜8週齡で使用した。妊娠18〜22週のヒト胎児肺を切断して約1mm3の断片にし、マウス乳房脂肪パッドの中に、および腎被膜の下に外科的に移植した。同じ妊娠期間のヒト胎児の大腿骨および脛骨を縦方向に切断し、SCIDマウスの皮下に移植した。結果として得られたSCID-hu動物を、移植の4〜8週間後に実験に使用した。
【０１４０】
細胞株
小細胞肺癌(SCLC)細胞株の変異サブタイプのN417およびH82は米国立衛生研究所の米国立癌研究所から入手した。肺腺癌細胞株A427はATCCから入手した。細胞株は、10％胎仔ウシ血清を添加した増殖培地RPMI1640(N417およびH82)またはDMEM(A427)で維持した。
【０１４１】
腫瘍細胞を、側方尾静脈を介してSCID-huマウスに静脈内注射した。または、細胞を、マウス皮下に移植されたヒト胎児組織に直接注射した。マウスを腫瘍増殖について週に2回調べ、腫瘍体積が5cm3に達した時に、または腫瘍体積が5cm3に達する前に屠殺した。ヒト肺移植片、マウス肺、ならびに他の内部器官および腫瘍を組織学的に調べた。無菌的に取り出され、切り刻まれた腫瘍をジスパーゼ(dispase)およびDNアーゼの存在下で37℃で1時間インキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を洗浄し、静脈内注射に使用するか、細胞株を再樹立するためにインビトロで増殖させた。
【０１４２】
抗増殖剤からの幹細胞の保護を確かめるために、増殖をブロックするのに十分であるが、wntウォッシュアウト後の増殖回復を妨げない用量のCRD-Igを動物に投与した。12時間後、動物を、HSCのLD50と等量の単回量のCPT-11で処置した。対照動物は、保護CRD-Igの非存在下でCPT-11で処置した。24時間後、前記のコロニーアッセイにおいて、保護剤の非存在下または存在下での幹細胞生存率を計算した。生きている腫瘍細胞の数も同様に計算した。
【０１４３】
本明細書で述べられた全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照として組み入れられるように詳細かつ個々に示されたのと同じ程度で参照として本明細書に組み入れられる。
【０１４４】
今や本発明は完全に説明されたが、添付の特許請求書の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正を本発明に加えることができることは当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】活性化β-カテニンはインビトロにおいてHSCの増殖を促進し、長期培養においてHSCの未熟表現型を維持する。HSCに、活性化β-カテニン-IRES-GFPレトロウイルスまたは対照GFPレトロウイルスを感染させ、60時間後に細胞周期分析を行った。a,β-カテニン感染培養物は、対照と比較して芽細胞 (右の囲み、S/G2/M)の数が増加している。b,長期増殖試験のために、10,000個の感染HSCを1ng ml-1 SLFにプレートし、60日間にわたってモニタリングした。結果は、5回の実験のうちの1回からの結果である。c,ギムザ染色から、対照細胞は骨髄球の特徴を示し、β-カテニン感染細胞はHSCの形態(高い核:細胞質比)を示すことが分かる。d,対照細胞(灰色の線)は大部分がlineage陽性であるが、大部分のβ-カテニン感染細胞(黒色の線)はlineage陰性(Lin-)であるか、または低レベルである(左パネル)。β-カテニン感染Lin-細胞はHSCの特徴(低いThy-1.1(中央パネル)ならびに高いc-KitおよびSca-1(右パネル)を含む)を有する。
【図２】HSCは、ネイティブな骨髄微小環境においてWntシグナル伝達に応答する。HSCに、不安定化GFPに結合したLEF-1/TCF結合部位を含むレンチウイルスレポーター(TOP-dGFP)または不安定化GFPに結合した変異LEF-1/TCF結合部位を含むレンチウイルスレポーター(FOP-dGFP)に感染させた。感染HSCを、致死線量を照射した3匹のレシピエントマウスに移植し、14週間後に分析した。示したデータは2回の独立した実験を示す。a,b,GFP発現がドナー由来HSC(a)または宿主由来HSC(b)で示される。c,d,変異LEF-1/TCFレポーターを有するドナー由来HSC(c)ならびにレシピエントマウスHSC(d)はGFP陰性である。ドナー由来Lin- c-Kit+ Sca-1-細胞(非HSC)のGFP発現を細い線で示す(a〜d)。e,TOP-dGFPまたはTOP-GFP(非不安定化GFP)に感染させたHSCを、対照培地または100ng ml-1 Wnt3aでインビトロで刺激し、GFP発現の程度を測定した。
【図３】Wntシグナル伝達が阻害されると、インビトロでのHSC増殖は低下し、インビボでの再構築は阻害される。a,HSC(20細胞/ウェル)を、分裂促進因子と、IgG-CRDまたは対照IgGのいずれかを含む培地中で60時間培養した。b,HSCに、axin-IRES-GFPをコードするウイルスまたはGFPのみをコードするウイルスに感染させた。分裂促進因子の存在下での感染HSCの増殖を60時間にわたってモニタリングした。生細胞の数をヨウ化プロピジウム染色によって求めた。d,e,インビボでのHSCの発生を、マウス一匹あたり1,000個の対照細胞またはaxin感染細胞と300,000個の競合同系骨髄細胞を、致死線量を照射した4匹の対立遺伝子標識(Ly5.2)宿主マウス群に注射することによって確かめた。細胞を末梢血から単離し、10週間を超えて過ぎた後でフローサイトメトリーによって分析した。ドナー由来(Ly5.1+)細胞が宿主の末梢血中にモニタリングされた。代表的なレシピエントからの分析および平均的な再構築を示す。
【図４】β-カテニンを発現するHSCはHoxB4およびNotch1をアップレギュレートする。a,精製野生型HSCに、活性化β-カテニン-IRES-GFPまたは対照ベクター-IRES-GFPを感染させ、感染細胞を、48時間でのGFP発現に基づいて選別した。これらの細胞から単離されたRNAを逆転写し、HoxB4およびNotch1の発現をリアルタイムPCR分析によって分析した。結果は、5回の独立したPCR反応の平均である。b,c,リアルタイムPCR分析の代表的なグラフ。β-カテニン形質導入HSC(実線)および対照形質導入HSC(破線)から、GADPH(b)生成物の量は等しく、HoxB4(c)生成物の量は異なることが分かる。RFU,相対蛍光単位。
【図５】野生型HSCは精製Wnt3Aに反応して増殖する。精製野生型マウス骨髄HSCをFACSで選別し、60ウェルテラサキプレートに5細胞/ウェルまたは10細胞/ウェルでプレートした。精製Wnt3A(約100ng/ml)+SLF(10ng/ml)の存在下でまたは対照としてSLF(10ng/ml)しか存在せずに、X-vivo15(Bio Whittaker)、10％FBS、5×10-5M 2-メルカプトエタノール、および1×10-4Mランダムメチル化β-シクロデキストリン(CTD,Inc.)の中で、細胞をインキュベートした(必要なSLF用量は、使用するマウス系統に応じて7.5ng/ml〜100ng/mlであった)。細胞増殖を7〜9日の培養期間にわたってモニタリングし、9回以上の独立した実験を代表する総細胞反応(A)および反応ウェルの平均頻度(B)として示した。表現型特徴を確かめるために、細胞を96ウェルプレートに大量(3500個の細胞)にプレートし、精製Wnt3Aまたは非精製Wnt3Aの存在下でインキュベートした。7日間の培養の後、精製Wnt3A(100ng/ml)で処理された細胞の大部分はlineageマーカー陰性であったのに対して(実線)、非精製Wnt3A(培地中200ng/mlであると計算された)で処理された細胞の大部分は、Lineageマーカーを強くアップレギュレートした(破線)(C)。精製Wnt3A処理細胞のFACS分析から、lineage陰性集団がc-Kit+Sca-1+HSCおよびc-Kit+Sca-1-骨髄球前駆細胞に分布していることが証明された(D)。
【図６】IgG-CRDは、Wntを介したβ-カテニン安定化を阻害する。50,000個のL細胞を24ウェルプレートにプレートし、Wnt3Aのみ、またはWnt3AとIgG-CRD(1:1)もしくはWnt3Aと対照IgG(1:1)で処理した。刺激して12時間後に、細胞を採取し、氷上で15分間溶解した(0.5％NP-40 + 20mM Tris-pH8.0 + 170mM NaCl, 1mM EDTA-pH8.0 + 1mM DTT + 0.2mM Na3VO4 + プロテアーゼインヒビター)。可溶性タンパク質溶解産物をSDS-PAGEで分離し、PVDFに転写した。ウェスタンブロットを抗β-カテニン抗体(BDトランスダクションラボラトリーズ(BD Transduction Laboratories))および抗アクチン抗体(シグマ(Sigma))でプローブした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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