(57)【要約】ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して高い親和性を持つモノクローナル抗体を開示。このモノクローナル抗体の調製は、配列番号１を持つ合成ペプチドに対しておこなわれる。モノクローナル抗体を、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの血液、血清、または血漿レベルを同定するために免疫アッセイ系で試薬として用いることができる。そのような免疫アッセイ系は、うっ血性心不全の診断および定量化に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＰＴＡ−４８４４のもとで米国菌培養収集所に寄託された、ハイブリドーマ細胞系統６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２。
【請求項２】
寄託番号ＰＴＡ−４８４４のもとで米国菌培養収集所に寄託されたハイブリドーマ細胞系統６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２から産生される、モノクローナル抗体。
【請求項３】
寄託番号ＰＴＡ−４８４５のもとで米国菌培養収集所に寄託された、ハイブリドーマ細胞系統１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９。
【請求項４】
寄託番号ＰＴＡ−４８４５のもとで米国菌培養収集所に寄託されたハイブリドーマ細胞系統１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９から産生される、モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＮ末端ｐｒｏＢＭＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）に対する特異的結合を示す単クローン抗体に関し、詳しくは６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８４４）および１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８４５）と表されたハイブリドーマ細胞ならびに該ハイブリドーマ細胞の各々によって産生される単クローン抗体に関する。本発明の単クローン抗体は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの血液、血清、または血漿レベルを測定するために用いられる。抗体は、特にうっ血性心不全を診断するための迅速診断検査に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（脳性ナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ）は、最初にボルド（Ｂｏｌｄ）他（デ・ボルド（ｄｅ  Ｂｏｌｄ）  Ａ  Ｊ、『心臓心房粒状度：  水・電解質平衡変化の効果』、実験生物医学学会会報（Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ    Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ）  １９７９；  １６１：  ５０８−５１１；  デ・ボルド  （ｄｅ  Ｂｏｌｄ）  ＡＪ、ボレステイン（Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）  ＨＢ，  ベレス（Ｖｅｒｅｓｓ）  ＡＴ  、およびソネンベルグ（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ）  Ｈ、『ラットにおける心房性心筋抽出物の静注に対する急速かつ強力なナトリウム排出増加反応』、生命科学誌（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ）  １９８１；  ２８：８９−９４）によって記載された該ペプチド（ＮＰ）のファミリーに属する。
ＮＰは、強力な利尿性、ナトリウム排泄増加性、および血管拡張性の性質を持ち、循環器病、特にニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラスＩ〜ＩＶうっ血性心不全（ＣＨＦ）の患者にとって有益な診断および予後マーカーとして報告されている（ブームスマ（Ｂｏｏｍｓｍａ）  Ｆ  およびバン・デン・メイラッカー（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｍｅｉｒａｃｋｅｒ）  Ａ  Ｈ、『血漿ＡおよびＢ型ナトリウム利尿ペプチド：生理学、方法論、および臨床用途』、循環器研究誌（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）  ２００１；  ５１：４４２−４４９）。
【０００３】
ＢＮＰ遺伝子は、１０８アミノ酸残基前駆体分子（ｐｒｏＢＮＰ）をコードする。心筋細胞による分泌に先立って、このプロホルモンが切断されることで、ＣＯＯＨ末端から生理活性ＢＮＰが生ずる。１９９５年、ハント（Ｈｕｎｔ）他（ハント（Ｈｕｎｔ）  Ｐ  Ｊ、  ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）  Ｔ  Ｇ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）Ｍ  Ｇ、リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  Ａ  Ｍ、およびエスパイナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）Ｅ  Ａ、『プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏｂｎｐ）のアミノ末端部は、ヒト血漿中を循環する』、生物物理化学研究通信誌（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ）  １９９５；  １４：１１７５−１１８３；  ハント（Ｈｕｎｔ）  Ｐ  Ｊ、リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  Ａ  Ｍ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  Ｍ  Ｇ、ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）  Ｔ  Ｇ、ドウフティ（Ｄｏｕｇｈｔｙ）  Ｒ  Ｎ、およびエスパイナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）  Ｅ  Ａ、『免疫反応性アミノ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド  （ＮＴ−ＰＲＯＢＮＰ）：  心臓機能障害の新たなマーカー』、臨床内分泌学誌（Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）  １９９７；  ４７：２８７−２９６）は、切断されたプロホルモンのＮ末端部分（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）に対応するフラグメントもまた、血漿中で循環され、ＢＮＰと同様に、潜在的に重要でおそらくよりいっそう見分けられる心室性機能障害のマーカーであることを示した。
【０００４】
多くの研究によって、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含むＮＰの血漿中濃度測定の臨床的有用性が示された。ＮＰは、心不全患者の診断および重症度分類選択のバイオマーカーとして提案された（クレリコ（Ｃｌｅｒｉｃｏ）Ａ、デル・リ（Ｄｅｌ  Ｒｙ）Ｓ  およびギアンネシ（Ｇｉａｎｎｅｓｓｉ）Ｄ、『臨床診療での心臓ナトリウム利尿ホルモンの測定（心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、および関連ペプチド）：新世代の免疫学的検定法の新世代の必要性』、米国臨床化学学会誌（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ）  ２０００；  ４６：１５２９−１５３４：  メイヤ（Ｍａｉｒ）  Ｊ、ハメレール（Ｈａｍｍｅｒｅｒ）−ラーチャー（Ｌｅｒｃｈｅｒ）Ａおよび（Ｐｕｓｃｈｅｎｄｏｒｆ）  Ｂ、『心不全の診断および処置に対する心臓ナトリウム利尿ペプチドの影響』、臨床化学臨床検査誌（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ）  ２００１；  ３９：５７１−５８８；  サグネラ（Ｓａｇｎｅｌｌａ）  Ｇ  Ａ、『血漿脳性ナトリウム利尿ペプチドおよび関連ペプチドの測定および重要性』、臨床生化学年報（Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）  ２００１；  ３８：８３−９３；  セルバイス（Ｓｅｌｖａｉｓ）  Ｐ  Ｌ、ドンキール（Ｄｏｎｃｋｉｅｒ）  Ｊ  Ｅ、ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）  Ａ、ラロウクス（Ｌａｌｏｕｘ）  Ｏ、バン・リンデン（Ｖａｎ  Ｌｉｎｄｅｎ）  Ｆ、アン（Ａｈｎ）Ｓ、ケテレルスレゲールズ（Ｋｅｔｅｌｓｌｅｇｅｒｓ）Ｊ  Ｍ  およびロウゼオウ（Ｒｏｕｓｓｅａｕ）  Ｍ  Ｆ、『心不全の診断および重症度分類のための心臓ナトリウム利尿ペプチド：心臓ホルモンの活性化に対する左室機能不全および冠動脈疾患の影響』、欧州臨床検査誌（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）１９９８；  ２８：６３６−６４２；  ＭｃＤｏｎａｇｈ  Ｔ  Ａ、カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）Ａ  Ｄ、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）Ｃ  Ｅ、  マックマレイ（ＭｃＭｕｒｒａｙ）Ｊ  Ｊ、フォード（Ｆｏｒｄ）  Ｉ、モルトン（Ｍｏｒｔｏｎ）  Ｊ  Ｊ、およびダルギー（Ｄａｒｇｉｅ）Ｈ  Ｊ、『左室機能不全、ナトリウム利尿ペプチド、および都市人口における死亡率』、心臓誌（Ｈｅａｒｔ）  ２００１；  ８６：２１−２６）。いくつかの研究は、無症状（すなわち、ＮＹＨＡクラスＩ）の患者間でさえ、左心室機能不全の患者を同定するためにＮＰ測定を用いることの有用性があることを示し、またスクリーニング・ツールとしてのＮＰ測定が、高リスク心不全群（例えば、冠動脈疾患、高血圧、糖尿病、および高齢）にあてはまって追跡評価および処置が必要となる標的患者を助けることが可能であることを示唆した。（ハンゲス（Ｈｕｇｈｅｓ）  Ｄ、タルワー（Ｔａｌｗａｒ）  Ｓ、スクアイア（Ｓｑｕｉｒｅ）  Ｉ  Ｂ、  ダビース（Ｄａｖｉｅｓ）  Ｊ  Ｅ、ウング（Ｎｇ）  Ｌ  Ｌ、『Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドの免疫蛍光測定法：左室機能不全に対する検査の開発』、臨床科学誌（Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ）  １９９９；  ９６：３７３−８０；  オムランド（Ｏｍｌａｎｄ）  Ｔ、アアクバアグ（Ａａｋｖａａｇ）  Ａ、ビクモ（Ｖｉｋ−Ｍｏ）  Ｈ、『軽度の左室機能障害患者のスクリーニング検出法としての血漿心臓ナトリウム利尿ペプチドの決定』、心臓誌（Ｈｅａｒｔ）  １９９６；  ７６：２３２−２３７；  マックドナフ（ＭｃＤｏｎａｇｈ）  Ｔ  Ａ、ロブ（Ｒｏｂｂ）  Ｓ  Ｄ、ムルドク（Ｍｕｒｄｏｃｈ）  Ｄ  Ｒ、モルトン（Ｍｏｒｔｏｎ）  Ｊ  Ｊ、フォード（Ｆｏｒｄ）  Ｉ、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）  Ｃ  Ｅ、他、『左室収縮期機能障害の生化学検出』、ランセント誌  １９９８；  ３５１：９−１３；  シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）  Ｈ、ラングビク（Ｌａｎｇｖｉｋ）  Ｔ  Ａ、ランド・サゲン（Ｌｕｎｄ  Ｓａｇｅｎ）  Ｅ、スミス（Ｓｍｉｔｈ）  Ｊ、アマディ（Ａｈｍａｄｉ）  Ｎ、およびホール（Ｈａｌｌ）  Ｃ、『ヒト血漿のＮ末端プロ脳ナトリウム利尿ペプチドに関するラジオイムノアッセイ』、臨床検査スカンジナビア学術誌（Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ）  ２００１；  ６１：３３−４２；  タルワー（Ｔａｌｗａｒ）  Ｓ、スクアイア（Ｓｑｕｉｒｅ）  Ｉ  Ｂ、  ダビース（Ｄａｖｉｅｓ）  Ｊ  Ｅ、バーネット（Ｂａｒｎｅｔｔ）  Ｄ  Ｄ、およびウング（Ｎｇ）  Ｌ  Ｌ、『血漿Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドと、ハイリスク集団で左室収縮期機能障害の評価におけるＥＣＧ』、欧州心臓病学会誌（Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ）  １９９９；  ２０：１７３６−１７４４；  ヒスタド（Ｈｙｓｔａｄ）  Ｍ  Ｅ、ゲイラン（Ｇｅｉｒａｎ）  Ｏ  Ｒ、アトラマダル（Ａｔｔｒａｍａｄａｌ）  Ｈ、スパルクランド（Ｓｐｕｒｋｌａｎｄ）  Ａ、ベージ（Ｖｅｇｅ）  Ａ、シモンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）  Ｓ、およびホール（Ｈａｌｌ）  Ｃ、『重症慢性心不全患者におけるナトリウム利尿ペプチドの局所心臓発現および濃度』、精神医学スカンジナビア学術誌（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ）  ２００１；  １７１：３９５−４０３；  ホブス（Ｈｏｂｂｓ）Ｆ  Ｄ  Ｒ、デービス（Ｄａｖｉｓ）  Ｒ  Ｃ、ロールフェ（Ｒｏａｌｆｅ）  Ａ  Ｋ、ハレ（Ｈａｒｅ）  Ｒ、ダビエス（Ｄａｖｉｅｓ）  Ｍ  Ｋ、およびケンクレ（Ｋｅｎｋｒｅ）  Ｊ  Ｅ、『  心不全の診断におけるＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド・アッセイの信頼性：  典型的かつハイ・リスクのコミュニティー集団でのコホート群研究法』、英国医学会会報（Ｂ  Ｍ  Ｊ）  ２００２；  ３２４：１４９８）。  心不全における罹患率と死亡率とに関して、ＮＰが良好な予後的価値を持つことが示された。いくつかの研究は、急性心筋梗塞後の左室機能不全および生存の予測でＮＰ測定の有用性も示した（リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  Ａ  Ｍ、  ニコルス（Ｎｉｃｏｈｏｌｌｓ）  Ｇ、ヤンドル（Ｙａｎｄｌｅ）Ｔ  Ｇ、フランプトン（Ｆｒａｍｐｔｏｎ）Ｃ、エスパイナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）Ｅ  Ａ、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）Ｊ  Ｇ、他、『血漿Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドおよびアドレノメデュリン。心筋梗塞後の左心系性能および予後の神経ホルモン予測因子』、循環器学誌（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）  １９９８；  ９７：１９２１−１９２９；  ラチナー（Ｌｕｃｈｎｅｒ）Ａ、ヘングステンベルグ（Ｈｅｎｇｓｔｅｎｂｅｒｇ）  Ｃ、ローウェル（Ｌｏｗｅｌ）  Ｈ、トランウィンスキ（Ｔｒａｗｉｎｓｋｉ）  Ｊ、ボウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）  Ｍ、ライゲール（Ｒｉｅｇｇｅｒ）  Ｇ  Ａ  Ｊ、他、『心筋梗塞後のＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド。心腎機能のマーカー』、高血圧誌（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）  ２００２；  ３９：９９−１０４；  キャンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）  Ｄ  Ｊ、ムニール（Ｍｕｎｉｒ）  Ｖ、ヘネシー（Ｈｅｎｎｅｓｓｙ）  Ｏ  Ｆ、およびデント（Ｄｅｎｔ）  Ａ  Ｗ、『急性冠動脈症候群が疑われ救急部に示されている患者の血漿アミノ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド・レベル：経過観察のために患者を選択する際の可能な役割？』、内科学誌（Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  Ｊ）  ２００１；  ３１：２１１−２１９；  ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）  Ｊ  Ｃ、グロエニング（Ｇｒｏｅｎｎｉｎｇ）  Ｂ  Ａ、ニルセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）  Ｇ、フリッツ・ハンセン（Ｆｒｉｔｚ−Ｈａｎｓｅｎ）  Ｔ、トラウインスキー（Ｔｒａｗｉｎｓｋｉ）  Ｊ、ヒルデブラント（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ）Ｐ  Ｒ、他、『急性心筋梗塞１年後の左室再構築とＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドの予測値』、米国心臓学術誌（Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ）  ２００２；  １４３：６９６−７０２）。ＮＰレベルをモニタリングすることで、個々の患者で求められる効力に合った治療をおこなう際および治療効力をモニターする際の指針も提供可能である。（リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  Ａ  Ｍ、ドウフティ（Ｄｏｕｇｈｔｙ）  Ｒ、ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  Ｇ、マックマホーン（ＭａｃＭａｈｏｎ）  Ｓ、シャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）  Ｎ、マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）  Ｊ、他、『血漿Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチドおよびアドレノメデュリン。慢性虚血性左室機能不全においてカルベディロールによって得られる利点の予後の有用性および予測』、米国循環器学会誌（ＪＡＣＣ）  ２００１；  ３７：１７８１−１７８７；  トラウフトン（Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）  Ｒ  Ｗ、フランプトン（Ｆｒａｍｐｔｏｎ）Ｃ  Ｍ、ヤンドール（Ｙａｎｄｌｅ）  Ｔ  Ｇ、エスパイナー（Ｅｓｐｉｎｅｒ）Ｅ  Ａ、  ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）  Ｎ  Ｇ、およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）  Ａ  Ｍ、『血漿アミノ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−ＢＮＰ）濃度によって導かれる心不全の治療』、ランセント誌（Ｌａｎｃｅｎｔ）  ２０００；  ３５５：１１２６−３０）。
【０００５】
（従来技術）
ホール（Ｈａｌｌ）に対するＷＯ９３／２４５３１（特許文献１）（米国特許第５，７８９，１６３号）（特許文献２）は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰを同定するための免疫学的方法とそれに用いられる複数の抗体とを開示している。これらの抗体を得るために、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの配列由来の単一合成ペプチドが用いられる。ペプチド免疫化による抗体の産生は原則として可能である。しかし、分子全体に関する親和性は、試験方法で必要感度を達するにはあまりにも低い。また、ペプチドを用いる際に、得られた抗体が、例えば該ペプチドのＣ末端を識別し、それによって上記分子全体のうちのこのフラグメントのみに結合し、分子全体に結合することができない、または限られた範囲のみしか結合することができない抗体が得られる危険がある。ＷＯ９３／２４５３１（特許文献１）では、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ由来の１つの単一ペプチドに対する抗体が作られる。産生される抗体が拮抗的試験構成で免疫化ペプチド（アミノ酸４７〜６４）に結合することが示されている。しかし、上記抗体が試料中に含まれる分子全体として天然のＮ末端ｐｒｏＢＮＰに結合することができることは示されていない。その上、試料中でのＷＯ９３／２４５３１（特許文献１）に記載されたサンドイッチ試験は、記載通りに実行することができない。なぜなら、適当な標準物質がなく、また２つの異なるエピトープに対する抗体も存在しなからである。さらに、トレーサーとしての標識形態でペプチド４７〜４６が試料または未標識ペプチド標準４７〜４６と拮抗してウサギ由来のポリクローナル抗体と結合するＰＴＯ９３／２４５３１（特許文献１）で実施された拮抗試験は、約２５０ｆｍｏｌ／ｍｌという低検出限界のみが誘導されるインキュベーションを４８時間おこなった後に、かなり穏やかな拮抗のみが達成されるという事実に見舞われる。このことは、健常な個人と心不全を患っている患者との判別に十分ではなく、また心不全の重症度の度合いに患者試料を判別して分類することにも十分ではない。また、拮抗試験での長時間に及ぶインキュベーション時間は、自動化した研究室での日常的な測定では許容されるものではない。  
【０００６】
ハント（Ｈｕｎｔ）他（臨床内分泌学誌（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）  ４７  （１９９７），  ２８７−２９６）もまた、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰを検出するための拮抗試験を記載している。このため、血漿試料の複雑な抽出が測定前に必要である。すなわち、このことは、分析物の破壊および測定誤差を導く可能性がある。使用される抗血清の生産は、ＷＯ９３／２４５３１（特許文献１）に類似したかたちで、合成ペプチドによる免疫化によっておこなった。ハント他は、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰアミノ酸１−１３による免疫化によって抗血清を生産し、アミノ酸１−２１のペプチドを標準として用いている。この試験のために、長時間にわたるインキュベーション時間も必要である。２４時間インキュベーション後、１．３ｆｍｏｌ／ｍｌの検出下限に達する。
ＷＯ  ００／４５１７６、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰの同定法、カール（Ｋａｒｌ）他は、組換えＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ免疫原を用いることで単離されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を開示している。この参考文献では、体液でＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して特異的であることから開示抗体を用いてアッセイを形成することが示唆されている。より詳細に説明されるように、このアッセイのための受信機運用特性（ＲＯＣ）のプロットの曲線下面積（ＡＵＣ）と本発明のアッセイとを比較することで、本発明が優れた診断性能を示すことが明らかである。
ＷＯ００／３５９５１（特許文献３）のナトリウム利尿ペプチド・フラグメントは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ配列の異なるエピトープに対する２種類の抗体を用いておこなうＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアッセイを目的とする。このアッセイは、免疫原としての合成ペプチド・フラグメント対して生ずるという点で、ホール（Ｈａｌｌ）（米国特許第５，７８６，１６３号）（特許文献２）の欠点と類似の欠点を持つ。
依然として求められているものは、ヒト  ＨＵＭＡＮ  ｎｔ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体であって、該抗体は、米国特許第５，５５９，０４１号（特許文献４）に開示されているような急速フォーマット手順にもとづいてうっ血性心不全の診断および定量化をおこなうために使用されうる免疫アッセイに取り込まれるための親和性および感度を呈する。
【特許文献１】ＷＯ９３／２４５３１号公報
【特許文献２】米国特許第５，７８９，１６３号
【特許文献３】ＷＯ００／３５９５１号公報
【特許文献４】米国特許第５，５５９，０４１号
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、特にそのアミノ酸１〜２５からなるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を提供することで、そのような従来技術の限界に取り組むものである。この発明の一実施形態によれば、本発明は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、特にそのアミノ酸１〜２５からなるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を提供することで、そのような従来技術の限界に対処する。この発明の一実施形態によれば、ハイブリドーマ細胞系６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２が提供される。この発明のさらなる実施形態によれば、ハイブリドーマ細胞系６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２が提供される。この発明のさらなる実施形態によれば、ハイブリドーマ細胞系１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９が提供される。これらのハイブリドーマから作り出されたモノクローナル抗体は、天然のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ分子のアミノ酸残基１〜２５内に存在するエピトープを認識する。これらのモノクローナルは、ヤギのポリクローナル抗体と対をなした状態のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  ＥＬＩＳＡで使用するために、上清から産生され、ＥＬＩＳＡアッセイおよび急速フォーマット装置は、それぞれデービイ（Ｄａｖｅｙ）他の米国特許出願第１０／３００，７３３号およびカング（Ｋａｎｇ）他の米国特許第１０／２９９，５８３号の主題であり、これらの出願は、本明細書と同日に出願されたものであり、これらの内容を本明細書中で援用する。ハイブリドーマ細胞系統６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２および１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９を、ブタベスト条約に従って、寄託番号ＰＴＡ−４８４４およびＰＴＡ−４８４５として２００２年１２月５日付けで米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（米国バージニア州マナッサス  ユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１）にそれぞれ寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８によれば、寄託者は、寄託材料公開の利用可能性に課せられた全ての制限を特許の付与によって即座に、最終的に取り除くことができる。寄託者は、さらに、生育可能な試料を寄託機関によって分配することができない場合、寄託材料を取り替えることができる。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する特異性および感受性ならびにＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する高親和性について特徴づけられているという点で、既知の抗体とは異なる。
合成ペプチドを調製する方法は周知であり、以下の参照文献に詳細に記載されている（Ｃ．Ｙ．ワング（Ｗａｎｇ）他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５４、２８５−２８８、１９９１；Ｇ．Ｗ．マクレーン（ＭａｃＬｅａｎ）他、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１３７、１４８−１５７、１９９１、またはＰ．Ｄ．ニコル（Ｎｉｃｏｌ）他、ジャーナル・オブ・ヌクレア・メジシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３４、２１４４−２１５１，１９９３）。単一のペプチド鎖は、一般に実験動物ではあまり免疫原性は高くなく、通常は該ペプチドを担体（例えばＫＬＨまたはウシ血清アルブミン）に結合させることが必要である。しかし、タンパク質結合ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を用いて産生された血清は、多くの場合、力価が低い。合成ペプチドに対して抗血清を産生するアプローチは、Ｄ．Ｎ．ポスネット（Ｐｏｓｎｅｔｔ）他（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）  ２６３、１７１９、１９８８）、Ｊ．Ｐ．タム（Ｔａｍ）（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８５、５４０９、１９８８）、およびＧ．Ｗ．マクレーン他（ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１３７、１４９、１９９１）。リジンのアルファおよびエプシロン・アミノ基は、目的とするペプチドが合成された多枝ポリリジン・コアの合成に用いた。
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図１は、マウス６０の放血Ｎｏ．１を参照する。
図２は、マウス６０の放血Ｎｏ．２を参照する。
図３は、マウス６０の放血Ｎｏ．３を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ヒトＮ末端脳ナトリウム排泄因子ＢＮＰ（１−２５）のアミノ酸配列１〜２５（配列番号１）からなるポリペプチドに対して特異的である６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２および１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９として本明細書で命名されたハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体を提供する。上記抗体は、ヒト臨床疾患単位（ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）での診断目的および汎用目的の研究で使用可能である。
モノクローナル抗体の産生
１）免疫原。Ｃ末端Ｃｙｓ付加の上記配列番号１を持つ化学合成ペプチドの合成は、アドバンスド・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社（米国４０２２８−１０７５ケンタッキー州ルイビル、ファン・バレー・ロード５６０９）でおこなった。このペプチドを、ＩＮＪＥＣＴマレイジミド試薬キット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国６１１０５イリノイ州ロックフォード、Ｎ．メリジアン・ロード３７４８７）を用いて、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。
２）免疫化。動物１匹あたり２５マイクログラムのＫＬＨペプチドをフロイント・アジュバント（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、米国ミズリー州セント・ルイス）と組み合わせて、初回抗原刺激のためにＢａｌｂ／ｃマウスに筋肉内注射した。他のアジュバントを使用してもよい。１２マイクログラムのペプチドと等価な結合体を力価増強を目的として３週間毎に同一の方法で注射した。各回の放血の４日後に力価測定をおこなうために、放血をおこなった。
３）マウスでの力価測定。各免疫化マウスから三度得た血清試料を用いて以下のように力価測定をおこなった。マイクロタイター・プレートのウエルを、５０μｌ／ウエルのペプチド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．９％ＮａＣｌ緩衝液に１μｇ／ｍｌ）で１２〜２４時間被覆した。続いて、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０含有ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ含有１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で飽和した。
マウス血清希釈をウエル（１００マイクロリットル／ウエル）に添加する。各血清を、０．１ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳ中１／１００、１／１０３、１／１０４、１／１０５、１／１０６、および１／１０７倍希釈て試験した。洗浄後、１／５０００希釈で５０マイクロリットル／ウエルの検出が結合する（ヤギ抗マウス西洋ワサビ・ペルオキシダーゼが結合）。
洗浄後、新たに調製した溶液（ＴＭＥ緩衝液と過酸化水素溶液との比が１：
【００１１】
１）を１００μｌ／ウエル用いて、色素反応を実施し、約５分間インキュベートした。各ウエルに１００マイクロリットルの２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加し、プレート・リーダーで４５０ｎｍで読み取った。
ハイブリドーマ６Ｇ１１が１Ｃ３として誘導されたマウスＮｏ．６０に関するデータを以下に示す。
放血Ｎｏ．１。力価＝４．１７５を図１で参照する。
放血Ｎｏ．２。力価＝４．７５を図２で参照する。
放血Ｎｏ．３・力価＝５．３５を図３で参照する。
４）ハイブリドーマの調製
４ａ）脾細胞の単離。動物をＣＯ２チャンバーで気絶状態にさせ、頸椎脱臼によって犠牲にし、７０％アルコールに浸す。無菌条件下で、脾臓を取り出し、１０ｍｌのダルベッコ添加培養液を含む無菌遠心管に移す。ダルベッコ培養液の入った培養皿に脾臓を移し、無菌５ｃｃシリンジ・プランジャーからなるプランジャーで穏やかに押圧し、さらに該材料を５０メッシュ細胞濾過器に通すことで、細胞の懸濁液を得る。上記手順を３回繰り返す。懸濁液を遠心して細胞ペレットを赤血球溶血緩衝液に再懸濁する。培養およびダルベッコ培養液添加の後、細胞を２回以上遠心して、細胞密度が標準的な細胞計数によって見積もられる同一の培養液に懸濁する。
４ｂ）プラズマ細胞種細胞の調製。対数増殖期半ばにあるＳＰ２／０−ＡＧ１４非スクリーニング・マウス・プラズマ細胞種細胞を、事前に増殖させた培養フラスコから収集し、細胞培養液中で３回遠心し、さらに細胞培養液に懸濁することで、既に脾臓細胞でおこなったようにして生存細胞数を得る。
４ｃ）細胞融合。脾臓細胞とプラズマ細胞種細胞とを約１：１の比率で、１５ｍｌ無菌遠心管内で混合し、１，５００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心し、上清を捨てる。融合用培地（５０％ポリエチレングリコール含む補足培地（ＦＢＳ無））を０．５ｍｌ添加し、ピペットのチップを用いて細胞ペレットを穏やかに再懸濁する。
ＦＢＳ無添加補足培地（５ｍｌ）をゆっくり加えて、ピペットのチップにより細胞懸濁液のかすかな渦巻きを形成する。最後に、２５％ウシ胎仔血清と融合細胞選択用１Ｘ  ＨＡＴ成分（１０％ヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジン）とを含むダルベッコ補足培地３．５ｍｌを３分間かけてゆっくり添加する。１００マイクロリットルの細胞懸濁液を培養プレートの９６ウエルの各々に入れて、二酸化炭素インキュベータに３７℃で保存する。
９６穴プレートを約４〜５日インキュベーションした後、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジン、さらに２０％ＦＢＳを含む補足ダルベッコ培地（ＤＭＥ  ２０％、１ＸＨＴ）を各ウエルに添加して、細胞の生育をおこなう。
細胞のクローニングは、段階希釈によって連続的に達成される。典型的なＥＬＩＳＡ結果は、マウス血清をスクリーニングするための上記技術を用いてクローン１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９および６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２のクローニングの最終フェーズで得られるものであり、該結果は以下のとおりである。
【００１２】
【表１】
2006517396.tif 000002
【００１３】
５）腹水生産。研究または臨床分析開発に適当なモノクローナル抗体量は、ハイブリドーマをマウスの腹腔または他の適当な標品に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にハイブリドーマを注射することによって、得られる。
クローン１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９および６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２によって産生された抗体を含む腹水液は、使用に先だって１０〜１５日間、マウスにプリスチンを注射することによって得た。約２〜４ｘ１０６ハイブリドーマ細胞を腹腔に注射する。注射後７ないし１０日、腹水液を無菌状態で回収する。この液体を凝固させて遠心により取り除く。ＥＤＴＡ（６０マイクロリットルの５％ＥＤＴＡ、ＰＨ７．２）を添加し、液体を３７℃で１時間インキュベートし、続いて−２０℃で凍結する。
６）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体のイソタイプ決定。モノクローナル抗体のイソタイプ決定を、マウス・タイパー（Ｍｏｕｓｅ  Ｔｙｐｅｒ）（登録商標）サブイソタイピング・キット（ＳｕｂＩｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ）（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）社）を用い、製造元の助言に従って実施した。手短に言うと、集密的（コンフルエント）なハイブリドーマ上清に含まれるモノクローナル抗体を、９６穴マイクロタイター・プレート（ＮＵＮＣ、マキソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）の表面に固定されたロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）免疫グロブリン（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を介して補足した。１ウエルあたり５０μｌの培養上清液を使用した。ＣＯ２インキュベータでの３７℃、１時間のインキュベーション後、上記プレートを０．０５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳで洗浄した。マウス・タイパー（Ｍｏｕｓｅ  Ｔｙｐｅｒ）（登録商標）サブイソタイピング・キット（ＳｕｂＩｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ）から各ウサギ抗マウス・パネル試薬を１００マイクロリットル、適当なウエルに添加し、振とうしながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、１００マイクロリットル／ウエルのペルオキシダーゼと結合したロバ抗ウサギＩｇＧ免疫グロブリン（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ））を添加し、振とうしながら室温で一時間インキュベートした。洗浄工程の後、ＴＭＢ基質溶液（モス（Ｍｏｓｓ））をプレートに添加した。暗闇で室温（ＲＴ）、５分間のインキュベーションをおこなった後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、吸光度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取った。以下の結果が得られた。
１Ｃ３−Ｅ１１−Ｈ９＝ｋ、ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３  
６Ｇ１１−Ｆ１１−Ｄ１２＝ｋ、ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３  
【００１４】
この明細書で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを示すものである。全ての特許および刊行物は、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個別に援用されるようにあたかも示されるのと同程度に、本明細書に援用される。
本発明の特定の形状が例示される一方で、本明細書に記載および示された特定の形状または配置に限定されるものではないことは、理解されることである。種々の変化が本発明の範囲から逸脱することなく、また本発明が本明細書に示し、かつ記載したものに限定されることを意図したものではないことが、当業者に容易に理解される。当業者は、本発明が目的を実施し、固有なものと同様に言及した結果および利点を得ることに十分適していることを当業者は理解する。本明細書に記載した実施形態、方法、手順、および技術は、現在好ましい実施形態を代表しており、例示を目的としたものであって範囲を制限することを意図したものではない。その中での過度な変更および他の用途は、添付した特許請求の範囲の適用範囲によって定義される。本発明が特定の好ましい実施液体に関連して記載されている一方で、特許請求の範囲でクレームされた発明がそのような特異的な実施形態に過度に制限するべきものではない。本発明が特異的な好ましい実施形態と関連して記載されるが、クレームされた発明がそのような特定の実施形態を過度に限定するものではないことを理解しなければならない。実際、当業者にとって明らかである本発明を実行するために説明された種々の態様は、以下の請求の範囲内であることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】マウス６０の放血Ｎｏ．１を参照する。
【図２】マウス６０の放血Ｎｏ．２を参照する。
【図３】マウス６０の放血Ｎｏ．３を参照する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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