(57)【要約】本発明は、診断目的に関連して腫瘍に対する標的指向剤として用いられ、ファージディスプレイ法によって得られるＬＬＧペプチド誘導体に関する。また本発明は、腫瘍および感染部位または炎症部位に対して標的指向し、画像化する方法に関する。さらに本発明は、上記ペプチド誘導体を包含する診断用組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチドまたはその誘導体を含む、腫瘍および感染部位からなる群より選ばれる少なくとも１種の標的に対する標的指向剤。
【請求項２】
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチドまたはその誘導体の、診断目的に関連する用途。
【請求項３】
下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチドまたはその誘導体を含む、腫瘍および感染部位に対する標的指向剤。
【請求項４】
下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチドまたはその誘導体の、診断目的に関連する用途。
【請求項５】
該ペプチドが、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質またはルミネセンス物質に結合され、画像化剤として用いられることを特徴とする、請求項２または４に記載の用途。
【請求項６】
該ペプチドまたはその誘導体が、細胞傷害性薬剤または細胞増殖阻害薬剤の標的指向に用いられることを特徴とする、請求項１または３に記載の標的指向剤。
【請求項７】
該ペプチドまたはその誘導体がＰＥＧ分子によって修飾されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の標的指向剤または診断目的に関連する用途。
【請求項８】
該ペプチドまたはその誘導体がリポソームに結合されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の標的指向剤または診断目的に関連する用途。
【請求項９】
患者の腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位を画像化する方法にして、
（ａ）下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドに、検出可能な標識物質を結合させ、
（ｂ）得られた混合物を患者に投与し、そして
（ｃ）該混合物の標識を検出する
ことを包含する方法。
【請求項１０】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質およびルミネセンス物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位に対して標的指向し、画像化する方法にして、
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチド、
検出可能な標識物質、
および所望により、
化学療法薬または抗炎症剤
を含んでなる組成物を、腫瘍または感染症の疑いのある患者に投与し、そして
所望により、該検出可能な標識を検出する
ことを包含する方法。
【請求項１２】
以下の成分を包含する、患者の腫瘍細胞の画像化用キット。
− 下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチド、および
− 検出可能な標識物質。
【請求項１３】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質およびルミネセンス物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の画像化用キット。
【請求項１４】
以下の成分を包含する、診断用組成物。
− 下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含む少なくとも１種のペプチドまたはその誘導体、
および所望により、
− 診断において許容される担体、
− 賦形剤、および
− 補助剤。
【請求項１５】
該ペプチドが、下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
またはその誘導体、
を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の標的指向剤（"targeting agent"の訳語であって、以下屡々「ターゲッティング剤」ともいう）および診断目的に関連して画像化剤（imaging agent）として用いられ、ファージディスプレイ法によって得られるＬＬＧペプチド誘導体に関する。また本発明は、腫瘍あるいは感染部位または炎症部位に対して標的指向（"targeting"の訳語であって、以下屡々「ターゲッティング」ともいう）し、画像化する方法に関する。さらに本発明は、上記ペプチド誘導体を包含する診断用組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療には重要な利点があるにも関らず、この病気の患者の大多数が死亡している。ＡＭＬの小児患者のおよそ半分が治癒するのに対し、成人患者の長期生存率にめざましい向上はみられていない。細胞傷害性薬剤の大量投与や同種間の幹細胞移植などを含むＡＭＬの治療は困難なものであるが、それでも多くの成人患者はＡＭＬを再発する。ここ数年の間に、非修飾抗体免疫療法や細胞免疫療法（unmodified antibody or cell based immunotherapies）など、ＡＭＬの治療を進歩させる新たな方法が生まれている。しかし治療の成果がまだ乏しいＡＭＬのような病気は、可能な限り臨床試験に基づいた治療を行う必要がある。
【０００３】
インテグリンＣＤ１１とＡＭＬの予後不良との間には相関性があるといわれている。このほどファージディスプレイ法によって得られた生物活性を有するペプチドは、白血球β2インテグリンの特異的リガンドである。精製したαMβ2インテグリン（ＣＤ１１／ＣＤ１８）を用いた選別により、新規なノナペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（以下屡々「ＬＬＧ」と称す）を単離したが、このペプチドはそのペプチド鎖を拘束する２つのジスルフィド結合に依存する（ＷＯ０２／０７２６１８を参照；  この言及によりこの文献は本明細書中に組み込まれたものとする）。
【０００４】
現在、in vivoでの治療方法や診断方法に用いる様々なペプチドに基づく放射性リガンドの開発が行われている。これらの治療方法や診断方法では、例えばボンベシン、ガストリン、コレシストキニンやニューロテンシンなど、一般のガン細胞上に発現するレセプターが利用され、また新生血管表面に発現するレセプターに結合するため様々な一般のガンに対するターゲッティングが可能なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ型ペプチドなどが利用される。
【０００５】
炎症は防御機構の一種であり、そのしくみは以下の通りである。前炎症メディエーターが放出され、白血球が炎症部位近傍の血管内皮細胞にセレクチンを介して接着する。そして、特定の白血球インテグリンが活性化され、インテグリンと細胞間接着分子（intercellular adhesion molecules）（ＩＣＡＭｓ）との相互作用により、さらに強固に接着し、白血球が血管外遊走する。
【０００６】
インテグリンは細胞間情報伝達に係わる幅広い働きに関与し、βサブユニットの特徴によってサブファミリーに分類される。なお白血球上に発現するインテグリンはβ2インテグリンのみであり、β2インテグリンファミリーに属するインテグリンは、αLβ2（またはＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、αMβ2（またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８もしくはＭａｃ−１）、αXβ2（またはＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）、およびαDβ2（またはＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８）の４種類である。細胞間接着分子（ＩＣＡＭｓ）はβ2インテグリンファミリーに対する主なリガンドであり、標識となるＬＬＧという共通のアミノ酸配列を有し、αMβ2インテグリンはこのアミノ酸配列への親和性が高い。αMβ2インテグリンは、ｉＣ３ｂに被覆された赤血球に結合したり、骨髄性細胞の接着や食作用を媒介したり、ＮＫ細胞の活性を高めるなどして免疫反応に関与する。αMβ2インテグリンはまた、マクロファージと微生物の間の相互作用にも関与するとともに、骨髄性細胞への細胞接着作用も媒介する。なおαMβ2インテグリンには第１０因子やフィブリノゲンなど、ＩＣＡＭｓ以外のリガンドも存在する。
【０００７】
上記のように、このほどファージディスプレイ法によって得られた生物活性を有するペプチドは、白血球β2インテグリンの特異的リガンドである。精製したαMβ2インテグリン（ＣＤ１１／ＣＤ１８）を用いた選別により、新規なノナペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（ＬＬＧ）を単離したが、このペプチドはそのペプチド鎖を拘束する２つのジスルフィド結合に依存する。種々の環状構造を有するペプチド（differentially cyclized peptides）を調べたところ、ある特定のジスルフィド結合形態を有するペプチドは他の形のペプチドよりも高い活性を有することがわかった。本発明において好ましく用いられるペプチドは、２つのジスルフィド結合のうちの１つがＣ１システインとＣ８システインとの間にあり、もう１つがＣ３システインとＣ９システインとの間にあるペプチドである。このペプチドはαMβ2インテグリンによる白血球細胞接着を阻害し、インテグリンａサブユニットの陽イオン感受性Ｉドメインに結合する。２つのＬＬＧ異性体の構造をＮＭＲ測定によって決定したところ、活性のより高い異性体の方が、抗炎症剤や白血病細胞ターゲッティング用化合物の開発のための手がかりとなることがわかった。本明細書においては、ＬＬＧペプチドを炎症部位および腫瘍へのターゲッティング剤および画像化剤として用いる可能性について詳述する。ＬＬＧペプチドはまた、治療効果を高めるためＰＥＧ化（pegylate）することもできる。また、Ｉドメインを有する複合体を用いてＬＬＧペプチドを結晶化し、また、該ペプチドの有機アナログ（organic analogue）を設計する予定である。また、その有機アナログの潜在能力を、本明細書に記載の動物実験によって評価する。該ＬＬＧペプチドをリポソーム表面に結合させると、治療薬としても機能する。リポソームを用いることにより、該ペプチドの薬物動態やダイナミクスを改変することができる。
【０００８】
本発明においては、ＬＬＧまたはＬＬＧ−ＰＥＧを診断目的に関連して画像化剤として用いる方法を開示する。また、ターゲット療法にも活用可能な方法であり、ペプチドを利用した方法を用いてＡＭＬ細胞に対するターゲッティングを行なう新たな手法も開示する。
【０００９】
発明の概要 
本発明においては、ＬＬＧペプチド誘導体の、腫瘍および感染部位に対するターゲッティング特性を実証する。また、ＬＬＧの生体内における運動特性（biokinetic properties）を高めるためのＰＥＧ化も行う。本発明では、腫瘍によるＬＬＧ取込量の経時変化を調べるため、異種移植片を有する麻酔のかかった動物を画像化した。腫瘍や炎症した病変部位を持つ動物におけるＬＬＧの生体内分布を調べた。
【００１０】
即ち本発明は、アミノ酸配列：ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含むペプチドまたはその誘導体を含む、腫瘍および炎症部位に対する標的指向剤に関する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記標的指向剤を用いた方法、即ち該標的指向剤を用いて、患者の腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位を画像化する方法および腫瘍細胞に対して細胞傷害性薬剤または細胞増殖阻害薬剤を標的指向（ターゲッティング）する方法、を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸配列：ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含む少なくとも１種のペプチドまたはその誘導体を包含する診断用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の好ましい態様においては、本発明のペプチドはアミノ酸配列：ＣＰＣＰＬＬＧＣＣを含むペプチドまたはその誘導体である。
【００１４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療法においては、治療を必要とする患者に対して、以下の成分を含む医薬組成物を有効量投与する：ａ）好ましくはアントラサイクリンなどの治療薬、ｂ）下記アミノ酸配列：ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）を含むペプチドまたはその誘導体、および所望により、ｃ）薬学的に許容される公知の担体、賦形剤および補助剤。
【００１５】
発明の詳細な説明 
本願で使用する略語 
ＡＭＬ              急性骨髄性白血病
ｃＤＴＰＡ          環状ジエチレントリアミン五酢酸
ＥＤＣ−ＮＨＳ      エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド−Ｎ−ヒドロキシ
サクシニミジル
ＨＰＬＣ            高圧液体クロマトグラフィー
ＨＹＮＩＣ          ６−ヒドラゾピリジン−３−カルボン酸
ＬＬＧ              ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
ＬＬＧ−ＰＥＧ      ＰＥＧ化ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
ＭＲＩ              磁気共鳴映像法
ＮＭＲ              核磁気共鳴
ＰＥＧ              ポリエチレングリコール
ＰＥＧ−ＮＨＳ      ポリエチレングリコール−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
【００１６】
まず、ＬＬＧペプチドのＹＡＤＧＡ誘導体のＵ９３７細胞系における腫瘍ターゲッティングについて研究した。このペプチドに対し、Ｉｎ−１１１−標識、直接ヨウ素化、およびｃＤＴＰＡによるラベリングを行った。腫瘍ターゲッティングに成功したので、さらなる画像化特性決定（imaging characterization）用の誘導体を作製した。新たな誘導体においては、Ｔｃ９９ｍ−標識やその他のキレート化剤、例えばＨＹＮＩＣなどを用いた。このペプチドをＰＥＧ−ＮＨＳに結合させたものもまた画像化に成功した。
【００１７】
本発明者らは、白血病の動物モデルにおいて、ＬＬＧはそのままでも腫瘍に対するターゲッティング剤として用いることが可能であること、さらにＬＬＧはＰＥＧ分子で修飾することも可能であることを知見した。ＬＬＧはヒトに対して無害であると考えられ、実験や製造が容易であるため、この知見はたいへん重要である。本発明はまた、リポソームに封入した細胞傷害性薬剤または細胞増殖阻害薬剤のターゲッティング剤としてＬＬＧを用いる方法も開示する。ＬＬＧはさらに、細胞毒素の効果を制御し副作用を抑えるという面でも有用である。このことを、ＡＭＬの場合について白血病の動物モデルを用いて評価した。このようなタイプの白血病に関する既存の治療法の成果は十分でなく、新たな治療法が求められている。
【００１８】
ＬＬＧは白血球インテグリンに結合するペプチドである（J Biol Chem 2001; 153:905-15）。さらなる画像化特性決定を行うための誘導体ＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣを作製した。Ｉｎ−１１１−標識誘導体およびＩ−１２５−標識誘導体のための放射性ラベリング法を開発した。また、ＬＬＧペプチドをＰＥＧ−ＮＨＳにカップリングさせた。そしてさらなる放射性核種による修飾法を開発し、それにより、リン脂質を結合したＰＥＧを付加したリポソームの構築物を作成した。
【００１９】
In vivoでの本発明のペプチドの腫瘍への取込の経時変化を調べるため、放射性標識を付したペプチド誘導体を、時間の間隔を空けてガンマ線カメラで画像化した。最後の画像化が終わった後、腫瘍細胞を摘出して放射能を測定した。定量オートラジオグラフィーによって微小分布を詳しく調べた。ＹＡＤＧＡ−ＬＬＧペプチド誘導体を用いたヒト骨髄単球性白血病Ｕ９３７細胞系についての腫瘍ターゲッティングを調べた。ペプチドに対し、Ｉｎ−１１１−標識、直接ヨウ素化、およびｃＤＴＰＡによるラベリングを行った。
【００２０】
さらに、治療に用いるペプチドリポソームも画像化することが可能である。リポソームは、超音波検査用の気泡、ＭＲＩ用の常磁性化合物や蛍光イメージングのためのフルオロセイン標識、および化学ルミネセンスイメージングのためのルシフェラーゼ酵素系などを封入して用いてもよい。
【００２１】
今後、現在最も効果的なＡＭＬ治療薬だが中毒作用もある「イダルビシン」というアントラサイクリン系薬剤を治療用薬剤として含み、ＬＬＧをターゲッティング剤として含むリポソーム構築物を作製する予定である。ＬＬＧをリポソーム表面に結合させると、治療薬としても機能する。このような標識したリポソームを使うことによりイダルビシンの薬物動態やダイナミクスを調べることができる。
【００２２】
ＬＬＧ構築物の動物実験によって、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療法を臨床開発するための基盤知識が得られる。白血病マウスモデル体内におけるＬＬＧ構築物の細胞薬理学、細胞動態学および薬物動態を理解できれば、適切な投与間隔や投与量依存性がわかる。
【００２３】
ＰＥＧ化ＬＬＧペプチド、およびＬＬＧペプチドを担持するリポソーム 
通常ペプチドはＰＥＧ化すると血清中での安定性が増し、より効力が増す。この簡単かつ短時間でできるペプチド修飾を行うとペプチドの血清中での安定性が増し、治療薬や画像化剤として用いることができるようになる。標識を行うため、またＬＬＧペプチドがＰＥＧ分子と結合できるようにするため、ＬＬＧペプチドのＮ末端にＹＡＤＧＡで表されるアミノ酸配列を付加する。次にこのペプチドを、分子量の異なる複数のＰＥＧ−ＮＨＳにＥＤＣ−ＮＨＳ反応によりカップリングさせる。そうして得られた構築物を細胞培養物上で調べて最適な分子を検出し、異種移植片を有するマウスを用いて生体内分布を評価する。
【００２４】
チオグリコレートのインキュベーション 
まず、チオグリコレートを動物へ腹腔内注入し、チオグリコレートのインキュベーション実験を行う。チオグリコレート注入から１０分後に実験動物における生体内分布を調べる。腹腔液を採取し細胞を染色してインテグリンを表出させる。最もチオグリコレート取込量の多い細胞を使ってさらに研究を行う。炎症部位への好中球の集まり方を特徴付けるため、細胞試料を採取する。
【００２５】
チオグリコレートのインキュベーション後のＬＬＧペプチドのターゲッティング 
チオグリコレートによる炎症を起すためのインキュベーション時間中の所定時点において、標識済みのＬＬＧペプチド構築物の生体内分布を詳しく調べた。ペプチド注入から５分後、３０分後、３時間後、１８時間後において取込量を調べた。腹腔液の採取は細心の注意を払って行った。炎症部位への好中球の集まり方を評価するため、細胞試料を採取した。
【００２６】
ＬＰＳのインキュベーション 
まず、動物体内におけるＬＰＳのインキュベーション実験を行う。インキュベーション時間はＬＰＳ注入から７２時間、２４時間および３時間とした。３時間後に実験動物における生体内分布を調べた。インキュベーション時間が２４時間の時の最もＬＰＳ取込量の多い細胞を使ってさらに研究を行った。
【００２７】
ＬＰＳのインキュベーション後のＬＬＧペプチドのターゲッティング 
ＬＰＳによる炎症を起すためのインキュベーション時間中の所定時点において、標識済みのＬＬＧペプチド構築物の生体内分布を詳しく調べた。炎症部位への好中球の集まり方を評価するため、組織試料を採取した。ヨウ素化ペプチドを用いた場合の通常の生体内分布データを図４に示す。
【００２８】
結果 
Ｕ９３７細胞系における腫瘍ターゲッティングを行うため、ＹＡＤＧＡ−ＬＬＧペプチドについて研究した。ペプチドは、Ｉｎ−１１１−標識、直接ヨウ素化、およびｃＤＴＰＡによるラベリングを行った。図１に、Ｉｎ−１１１−ＹＡＤＧＡ−ＬＬＧの静脈注入から３時間後に腫瘍ターゲッティングを行なった様子がはっきりと示されている。ここで用いたモデルについては、２４時間の時点での腫瘍／血液絶対比（absolute tumor-to-blood ratio）は４．７であった。
【００２９】
本発明者らは、ＬＬＧとＰＥＧ化ＬＬＧの放射性ハロゲン化を行った。ハロゲン化は、放射性核種として、ガンマ線イメージングにも用いられるＩ−１２３や、陽電子放射断層撮影法に用いられるＩ−１２４、Ｉ−１２５（オージェ治療、ガンマ線プローブ、各種の手術技法に用いられる）、Ｉ−１３１（ガンマ線イメージ、放射性核種治療、ベータ線放射に用いられる）などの放射性同位体を同様の方法で用いて行うことができる。またその他の放射性核種として有用なものは、Ｂｒ−７６、Ｂｒ−７７、Ａｔ−２１１である。臭素は陽電子放射元素であり、アスタチンはアルファ放射体（放射性核種治療に用いられる）である。Ｉｎ−１１１は遷移金属である。様々な放射性金属核種を用いた放射性標識も同様の方法で行うことができる。
【００３０】
ｃＤＴＰＡをキレート結合させて用いる金属の放射性核種としてはＩｎ−１１１が公知であり、その他にもＩｎ−１１０（ＰＥＴ、即ち陽電子放射断層撮影法に用いられる）、Ｉｎ−１１４ｍ（オージェ治療、ガンマ線に用いられる）などが挙げられる。その他用いることのできるものは、Ｙ−９０やその他の核種、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎなどが有り、基本的には全ての遷移金属とその放射性核種である。Ｇｄは常磁性の造影剤として用いられる金属であり、ｃＤＴＰＡキレートとカップリングすることができる。ランタニドの大半は常磁性体による画像化にとって有用な特徴を備えており、ｃＤＴＰＡをキレート結合させることもできる。
【００３１】
本発明者らはまた、ペプチドリポソームを用いた画像化も行った。リポソームには、超音波検査用の気泡、ＭＲＩ用の常磁性化合物や蛍光イメージングのためのフルオロセイン標識、および化学ルミネセンスイメージングのためのルシフェラーゼ酵素系などを封入して用いてもよい。
【００３２】
以下の実験において、放射性ラベリングを行う場合は、長いペプチド構築物（ＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣ）、短いペプチド構築物（ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ）または融合タンパク質であるＧＳＴ−ＬＬＧを、ラベリング法別に使い分けた。
【実施例】
【００３３】
膿瘍に対するＬＬＧのターゲッティング 
本実験においては、ウィスターラットとニュージーランドシロウサギの左大腿筋中に、およそ１×１０9コロニー形成ユニットのStaphylococcus aureus または Escherichia coli を用いて膿瘍を誘導し、炎症部位へのＬＬＧのターゲッティングを行った。実験中、動物は麻酔で眠らせておいた。上記細菌の注入から２４時間後、筋肉の腫れが明らかに認められた時、Ｉｎ−１１１放射性標識ＣＰＣＦＬＬＧＣＣペプチドを静脈注入し、ガンマ線カメラで画像化してペプチドの蓄積する様子を追った。このペプチド実験は、各動物種につき３匹を用いて行った。
【００３４】
方法を最適化せずに行なった実験であるが、ウサギ体内のE. coli膿瘍をＬＬＧを用いて（ガンマ線カメラで）画像化したことによって、大腿筋における特異的ターゲッティングが実証され、これは１時間以内に明確に可視化した（図５（Ａ）〜（Ｅ）参照）。実験動物の観察は４時間に渡って行った。実験中の後期に得た画像には動物の排尿による乱れがあるが、シグナル／バックグラウンド比（signal-to-background ratio）は高いままであった。膿瘍以外のターゲットは検知できなかった。仮に画像化実験の前にウサギにカテーテルを導入していれば（または膀胱を空の状態にしていれば）、画像化は更にうまくいったはずである。このペプチドは親水性が高いが標識しやすく、腎臓を通して速やかに排出された。
【００３５】
一方ラットのアッセイでは、実験動物の観察はペプチド注入後２時間に渡って行った。ここでもまた、ラット体内のS. aureus膿瘍をＬＬＧを用いてガンマ線カメラで画像化したことによって、特異的ターゲッティングが実証された（図６（Ａ）〜（Ｃ））。しかし、実験中の後期に得た画像には動物の排尿による乱れがある。ウサギの場合と同様、仮に画像化実験前にラットの膀胱を空の状態にしていれば、画像化は更にうまくいったはずである。しかし、シグナル／バックグラウンド比は高いままであり、ウサギの場合と同様、膿瘍以外のターゲットは検知できなかった。
【００３６】
画像化工程が済んだ後、動物を解剖して様々な組織を採取してその中の放射能蓄積量をガンマ線カウンターを使って測定した。図７Ａに、ウサギの各組織におけるペプチドの蓄積量（ペプチド注入量／測定した組織の重量のパーセンテージ、％ＩＤ／ｇとして）（３匹の平均値）を示す。膿瘍以外の組織（データ記載の無い腎臓を除く）は全て膿瘍よりも低い蓄積値を示した。膿瘍のペプチド蓄積量は、筋肉の２１．７倍、血液の２．３倍であった。図７Ｂに、同様に測定したラット組織中のペプチド蓄積量を示す。ラットの場合、膿瘍のペプチド蓄積量は、筋肉の４．５倍、血液の２．０倍であった。これらの実験から、放射性標識したＬＬＧは感染部位を画像化するのに有効な手段であることが明確になったが、このペプチドはすぐに排出されてしまうため、尿路における感染部位の検知には使えない。
【００３７】
炎症部位（耳）へのＬＬＧのターゲッティング 
本実験では、Balb/cマウス６匹に対し、左耳の部分にE. coli ＬＰＳを１０μｇ注入した。２４時間かけて炎症を起した後、２０μｇ（７５ｋＢｑ）の放射性標識したＧＳＴ−ＬＬＧをマウスの尻尾の静脈に注入した。ペプチド注入から３時間後、マウスを解剖して左耳（感染部位）と右耳（対照）を採取して放射能蓄積量を測定した。その結果を組織１．０ｇ当たりのペプチド注入量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す（図８）。全ての値は平均値±マウス３匹の標準偏差で示す。
【００３８】
ＬＬＧが誘発する阻害 
本発明者らの以前の研究（supra）では、マウスにＬＬＧ−ＧＳＴ融合タンパク質を静脈注入すると、チオグリコレートによる炎症を起こした腹腔中への好中球の遊走が阻害されることを示した。このとき遊走した好中球の数は対照に比べ４０％にまで減少した。この効果は時間の経過に依存するものであり、注入から１時間後および２時間後では可視であったが、時間の経過と共に減退し、４時間以上経過後は不可視であった。
【００３９】
上記と同様の研究を以下のように行った。
炎症の誘発は次のようにして行った。ペプチド投与グループと対照動物グループのそれぞれを３匹ずつのメスのBalb/cマウスで構成し、各マウスの腹腔に３％のチオグリコレートブロス（Thioglycolate Broth)（ＴＧ）を１ｍｌ注入した。対照グループには、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に入れた、ペプチドの入っていない空のベヒクルを静脈注入した。ペプチド投与グループには１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に入れたＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣ１ｍｇ／ｋｇを静脈注入した。ペプチド投与から６０分後または１２０分後、動物を解剖した。腹腔細胞を５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む５ｍｌのＰＢＳで洗浄して採取し、血球計で数を数えた。
【００４０】
ＴＧの局所注入は、腹腔内への有意な顆粒球の遊走を起こさせるために行ったものである。この実験では、細胞集団の種類は区別しなかった。しかし、やはり今度の場合もペプチドＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣを投与したグループでは、in vivoにおける実験的炎症部位への顆粒球の蓄積量はペプチド投与から６０分後で７８％、１２０分後で５２％減少した（図９）。
【００４１】
ＬＬＧの安定性 
ＬＬＧペプチド（ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ）の最も安定な形状を見出すため、このペプチドをＩ−１２５標識した。精製したペプチドをＰＥＧ(10000)またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ(3400)にカップリングした。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ(3400)-ＬＬＧは水溶液中でミセルを形成するが、このようなミセルを市販のステルスリポソームに封入した。Ｉ−１２５−標識ＬＬＧ（ＬＬＧ）、ＰＥＧ化ＬＬＧ（Ｐｅｇ−ＬＬＧ）、ミセル型ＬＬＧ（Ｍ−ＬＬＧ）およびリポソーム型ＬＬＧ（Ｌ−ＬＬＧ）をBalb/cマウスの尻尾の静脈中に注入した。ペプチド注入から３時間後にマウスを解剖し、血液試料を採取して放射能を測定した。その結果を血液１．０ｇ当たりのペプチド注入量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す。全ての値は平均値±マウス５匹の標準偏差で示す。
【００４２】
図１０に示したように、より高分子量の分子またはステルスリポソームにペプチドをカップリングすると、循環系におけるペプチドの安定性は最高７倍まで高められる。
【００４３】
ＬＬＧの生体内分布 
ＬＬＧ（ＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣ）をＩ−１２５で標識し、精製した１００μｌのペプチド（４０μｇ、〜５００ｋＢｑ）をマウスの尻尾の静脈中に注入した。ペプチド投与から３０分後と１８０分後にマウスを解剖し、血液と組織を採取して放射能を測定した。その結果を組織１．０ｇ当たりのペプチド注入量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す（図１１）。全ての値は平均値±マウス３匹の標準偏差で示す。
【００４４】
図１１に示したように、このペプチドはいずれの組織にも蓄積せず、腎臓から速やかに排出されたことがわかる。
【００４５】
ＬＬＧの親和性 
本発明者らは、ＢＩＡＣＯＲＥを用いてインテグリンに対するＬＬＧの親和性を調べた。この方法では、精製したインテグリンＩドメインを、カルボキシメチル基を導入したデキストランを金薄膜上に結合させた構造のセンサーチップ上に固定化した。固定化は成功し、様々なチャネルで2000〜4000のレゾナンスユニット（ＲＵ）が得られた。濃度を様々に変えた（３．３ｎＭ〜３３μＭ）ＬＬＧ−ＧＳＴまたはＧＳＴについて、インテグリンＩドメインへの結合能力を調べた。反応バッファーとしては、１ｍＭのＭｇＣｌ2を含むか含まない１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と１５０ｍＭのＮａＣｌを用いた。あいにくＬＬＧの特異的結合は検出されなかったが、それはＧＳＴタンパク質が非常に強いバックグラウンドの結合（a very high background binding）を示したためである。０．０５％のＰ２０洗浄液を添加しても、そのようなバックグラウンドの結合を減らすことはできなかった。
【００４６】
別な実験では、普通のＬＬＧペプチドを使って親和性を調べた。実験に用いたペプチド試料の濃度は１３４ｎＭ〜１３４μＭである。前記の実験と同様の条件では、ペプチドの大きさが小さすぎて特異的結合は検出されなかった。ＢＩＡＣＯＲＥを用いる方法は今のところまだ開発段階であり、本発明者らは今後も、より高分子量かつ不活性な分子担体にカップリングさせたペプチドを使って特異的親和性を調べるつもりである。
【００４７】
図１２に、ＹＬＬＧの、ＴＨＰ−１細胞系へのＬＬＧ−ＧＦＰの結合の阻害能を示す。ＹＬＬＧ濃度が５０μＭのとき、ＬＬＧ−ＧＦＰの結合は９５％阻害された。濃度が２０μＭに低下した場合でも、７０％が阻害された。図１２から、ＩＣ50はナノモルレベルであることが明らかである。しかし、容器のプラスチック壁面にペプチドが非特異的に結合するため、またナノモルレベルのシグナルを発生させるために必要とされるＬＬＧ−ＧＦＰの濃度が比較的高濃度であるため、最適化されていない現状では、この実験を行うことは不可能である。これらの実験から結合定数を直接導き出すことはできないが、実際は、生物系での実験でペプチドが示した結合能力から判断することができるものであり、その結合能力がin vivo系ではより重要である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】マウスモデルにおけるヒト骨髄性単球性白血病の腫瘍に対するターゲッティングを示す。例えばＩｎ−１１１による金属キレートを使用した。
【図２】ＬＬＧペプチドのＩ−１２５−ＹＡＤＧＡ誘導体を静脈注入してから２４時間経過後の腫瘍ターゲッティング、即ちハロゲン化非ＰＥＧ化ＬＬＧペプチド誘導体による腫瘍ターゲッティングを示す。Ｉ−１２５−標識を用いた、ヒト骨髄性単球性白血病のマウスモデルによる腫瘍ターゲッティングのガンマ線イメージング平面画像。放射性物質で標識したペプチドを注入したマウスに麻酔をし、ガンマ線カメラ（ピンホールコリメーターを装着したPicker SX-300ガンマ線カメラ）で撮影した。
【図３】ＰＥＧ化ＬＬＧペプチドのＩ−１２５−ＹＡＤＧＡ誘導体を静脈注入してから２４時間経過後の腫瘍ターゲッティング、即ちハロゲン化ＰＥＧ化ＬＬＧペプチド誘導体による腫瘍ターゲッティングを示す。Ｉ−１２５標識を用いた、ヒト骨髄性単球性白血病のマウスモデルによる腫瘍ターゲッティングのガンマ線イメージング平面画像。放射性物質で標識したペプチドを注入したマウスに麻酔をし、ガンマ線カメラ（ピンホールコリメーターを装着したPicker SX-300ガンマ線カメラ）で撮影した。
【図４】ＬＬＧペプチドのＩ−１２５−ＹＡＤＧＡ誘導体の生体内分布の調査結果。125Ｉで標識したぺプチドをＮＭＲＩヌードマウスに注入後、間隔を空けて３回、in vivoにおける生体内分布を評価した。投与から２時間後、６時間後および２４時間後に測定したマウス体内における125Ｉで標識したぺプチドの生体内分布を重量で補正し、得られた結果を、組織０．１ｇ当たりのペプチド投与量のパーセンテージ（%ID/0.1g）で示す。全ての値は、５匹のマウスの平均値±標準偏差で示した。
【図５−１】（Ａ）および（Ｂ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ニュージーランドシロウサギの左大腿筋におけるE. coli膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図５−２】（Ｃ）および（Ｄ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ニュージーランドシロウサギの左大腿筋におけるE. coli膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図５−３】（Ｅ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ニュージーランドシロウサギの左大腿筋におけるE. coli膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図６−１】（Ａ）および（Ｂ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ウィスターラットの左大腿筋におけるS. aureus膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図６−２】（Ｃ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ウィスターラットの左大腿筋におけるS. aureus膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図７Ａ】ラビットのある組織におけるＩｎ−１１１−ｃＤＴＰＡ−ＣＰＣＦＬＬＧＣＣの生体内分布を重量で補正したもの。
【図７Ｂ】ラットのある組織におけるＩｎ−１１１−ｃＴＰＡ−ＣＰＣＦＬＬＧＣＣの生体内分布を重量で補正したもの。
【図８】マウスの耳の感染部位におけるＩ−１２５−ＧＳＴ−ＬＬＧペプチド誘導体の蓄積の様子。
【図９】炎症部位におけるＬＬＧペプチドによる白血球遊走の阻害の様子。
【図１０】投与から３時間後の血液中のＩ−１２５−ＬＬＧ接合体の安定性を示す。
【図１１】マウス体内のＬＬＧペプチドの生体内分布を示す。
【図１２】ＹＬＬＧの、ＴＨＰ−１細胞系へのＬＬＧ−ＧＦＰの結合の阻害能を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
配列番号１    ファージディスプレイ法によって得られるペプチド、Ｘａａは任意のアミノ酸
配列番号２    ファージディスプレイ法によって得られるペプチド
【図１】
2006525289.tif 000002
【図２】
2006525289.tif 000003
【図３】
2006525289.tif 000004
【図４】
2006525289.tif 000005
【図５−１】
2006525289.tif 000006
【図５−２】
2006525289.tif 000007
【図５−３】
2006525289.tif 000008
【図６−１】
2006525289.tif 000009
【図６−２】
2006525289.tif 000010
【図７Ａ】
2006525289.tif 000011
【図７Ｂ】
2006525289.tif 000012
【図８】
2006525289.tif 000013
【図９】
2006525289.tif 000014
【図１０】
2006525289.tif 000015
【図１１】
2006525289.tif 000016
【図１２】
2006525289.tif 000017
【配列表】
2006525289000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月1日(2005.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチドを含む、腫瘍および感染部位からなる群より選ばれる少なくとも１種の標的に対する標的指向剤。
【請求項２】
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチドを含み、該ペプチドは、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質またはルミネセンス物質に結合されて画像化剤として用いられることを特徴とする診断剤。
【請求項３】
下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチドを含む、腫瘍および感染部位に対する標的指向剤。
【請求項４】
下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチドを含み、該ペプチドは、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質またはルミネセンス物質に結合されて画像化剤として用いられることを特徴とする診断剤。
【請求項５】
該ペプチドが、細胞傷害性薬剤または細胞増殖阻害薬剤の標的指向に用いられることを特徴とする、請求項１または３に記載の標的指向剤。
【請求項６】
該ペプチドがＰＥＧ分子によって修飾されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の標的指向剤または診断剤。
【請求項７】
該ペプチドがリポソームに結合されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の標的指向剤または診断剤。
【請求項８】
患者の腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位を画像化する方法にして、
（ａ）下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドに、検出可能な標識物質を結合させ、
（ｂ）得られた混合物を患者に投与し、そして
（ｃ）該混合物の標識を検出する
ことを包含する方法。
【請求項９】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質およびルミネセンス物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位に対して標的指向し、画像化する方法にして、
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチド、
検出可能な標識物質、
および所望により、
化学療法薬または抗炎症剤
を含んでなる組成物を、腫瘍または感染症の疑いのある患者に投与し、そして
所望により、該検出可能な標識を検出する
ことを包含する方法。
【請求項１１】
以下の成分を包含する、患者の腫瘍細胞の画像化用キット。
− 下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチド、および
− 検出可能な標識物質。
【請求項１２】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質およびルミネセンス物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の画像化用キット。
【請求項１３】
以下の成分を包含する、診断用組成物。
− 下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含む少なくとも１種のペプチドまたはその誘導体、
および所望により、
− 診断において許容される担体、
− 賦形剤、および
− 補助剤。
【請求項１４】
該ペプチドが、下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の診断用組成物。


【手続補正書】
【提出日】平成18年2月1日(2006.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチドを含む、腫瘍および感染部位からなる群より選ばれる少なくとも１種の標的に対する標的指向剤。
【請求項２】
下記アミノ酸配列：
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
を含むペプチドを含み、該ペプチドは、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質またはルミネセンス物質に結合されて画像化剤として用いられることを特徴とする診断剤。
【請求項３】
下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチドを含む、腫瘍および感染部位に対する標的指向剤。
【請求項４】
下記アミノ酸配列：
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチドを含み、該ペプチドは、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質またはルミネセンス物質に結合されて画像化剤として用いられることを特徴とする診断剤。
【請求項５】
該ペプチドが、細胞傷害性薬剤または細胞増殖阻害薬剤の標的指向に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の標的指向剤。
【請求項６】
該ペプチドがＰＥＧ分子によって修飾されていることを特徴とする、請求項１または５に記載の標的指向剤。  
【請求項７】
該ペプチドがリポソームに結合されていることを特徴とする、請求項１、５および６のいずれかに記載の標的指向剤。  
【請求項８】
該ペプチドがＰＥＧ分子によって修飾されていることを特徴とする、請求項２に記載の診断剤。
【請求項９】
該ペプチドがリポソームに結合されていることを特徴とする、請求項２または８に記載の診断剤。
【請求項１０】
該ペプチドが、細胞傷害性薬剤または細胞増殖阻害薬剤の標的指向に用いられることを特徴とする、請求項３に記載の標的指向剤。
【請求項１１】
該ペプチドがＰＥＧ分子によって修飾されていることを特徴とする、請求項３または１０に記載の標的指向剤。
【請求項１２】
該ペプチドがリポソームに結合されていることを特徴とする、請求項３、１０及び１１のいずれかに記載の標的指向剤。
【請求項１３】
該ペプチドがＰＥＧ分子によって修飾されていることを特徴とする、請求項４に記載の診断剤。
【請求項１４】
該ペプチドがリポソームに結合されていることを特徴とする、請求項４または１３に記載の診断剤。
【請求項１５】
患者の腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位を画像化する方法にして、 
（ａ）下記アミノ酸配列： 
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ 
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。） 
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドに、検出可能な標識物質を結合させ、 
（ｂ）得られた混合物を患者に投与し、そして 
（ｃ）該混合物の標識を検出する 
ことを包含する方法。
【請求項１６】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質およびルミネセンス物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞あるいは感染部位または炎症部位に対して標的指向し、画像化する方法にして、 
下記アミノ酸配列： 
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ 
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。） 
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチド、 
検出可能な標識物質、 
および所望により、 
化学療法薬または抗炎症剤 
を含んでなる組成物を、腫瘍または感染症の疑いのある患者に投与し、そして 
所望により、該検出可能な標識を検出する 
ことを包含する方法。
【請求項１８】
以下の成分を包含する、患者の腫瘍細胞の画像化用キット。 
− 下記アミノ酸配列： 
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ 
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。） 
を含むペプチド類からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチド、および 
− 検出可能な標識物質。
【請求項１９】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、アフィニティラベル、磁気粒子、蛍光性物質およびルミネセンス物質からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載の画像化用キット。
【請求項２０】
以下の成分を包含する、診断用組成物。 
− 下記アミノ酸配列： 
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ 
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。） 
を含む少なくとも１種のペプチド、 
および所望により、 
− 診断において許容される担体、 
− 賦形剤、および 
− 補助剤。
【請求項２１】
該ペプチドが、下記アミノ酸配列： 
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ 
を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の診断用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
インテグリンＣＤ１１とＡＭＬの予後不良との間には相関性があるといわれている。このほどファージディスプレイ法によって得られた生物活性を有するペプチドは、白血球β2インテグリンの特異的リガンドである。精製したαMβ2インテグリン（ＣＤ１１／ＣＤ１８）を用いたパニング（panning）により、新規なノナペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（以下屡々「ＬＬＧ」と称す）を単離したが、このペプチドはそのペプチド鎖を拘束する２つのジスルフィド結合に依存する（ＷＯ０２／０７２６１８を参照；  この言及によりこの文献は本明細書中に組み込まれたものとする）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
上記のように、このほどファージディスプレイ法によって得られた生物活性を有するペプチドは、白血球β2インテグリンの特異的リガンドである。精製したαMβ2インテグリン（ＣＤ１１／ＣＤ１８）を用いたパニングにより、新規なノナペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（ＬＬＧ）を単離したが、このペプチドはそのペプチド鎖を拘束する２つのジスルフィド結合に依存する。種々の環状構造を有するペプチド（differentially cyclized peptides）を調べたところ、ある特定のジスルフィド結合形態を有するペプチドは他の形のペプチドよりも高い活性を有することがわかった。本発明において好ましく用いられるペプチドは、２つのジスルフィド結合のうちの１つがＣ１システインとＣ８システインとの間にあり、もう１つがＣ３システインとＣ９システインとの間にあるペプチドである。このペプチドはαMβ2インテグリンによる白血球細胞接着を阻害し、インテグリンαサブユニットの陽イオン感受性Ｉドメインに結合する。２つのＬＬＧ異性体の構造をＮＭＲ測定によって決定したところ、活性のより高い異性体の方が、抗炎症剤や白血病細胞ターゲッティング用化合物の開発のための手がかりとなることがわかった。本明細書においては、ＬＬＧペプチドを炎症部位および腫瘍へのターゲッティング剤および画像化剤として用いる可能性について詳述する。ＬＬＧペプチドはまた、治療効果を高めるためＰＥＧ化（pegylate）することもできる。また、Ｉドメインを有する複合体を用いてＬＬＧペプチドを結晶化し、また、該ペプチドの有機アナログ（organic analogue）を設計する予定である。また、その有機アナログの潜在能力を、本明細書に記載の動物実験によって評価する。該ＬＬＧペプチドをリポソーム表面に結合させると、治療薬としても機能する。リポソームを用いることにより、該ペプチドの薬物動態やダイナミクスを改変することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の好ましい態様においては、本発明のペプチドはアミノ酸配列：ＣＰＣＦＬＬＧＣＣを含むペプチドまたはその誘導体である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
図１２に、ＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ＴＨＰ−１細胞系へのＬＬＧ−ＧＦＰの結合の阻害能を示す。ＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣ濃度が５０μＭのとき、ＬＬＧ−ＧＦＰの結合は９５％阻害された。濃度が２０μＭに低下した場合でも、７０％が阻害された。図１２から、ＩＣ50はナノモルレベルであることが明らかである。しかし、容器のプラスチック壁面にペプチドが非特異的に結合するため、またナノモルレベルのシグナルを発生させるために必要とされるＬＬＧ−ＧＦＰの濃度が比較的高濃度であるため、最適化されていない現状では、この実験を行うことは不可能である。これらの実験から結合定数を直接導き出すことはできないが、実際は、生物系での実験でペプチドが示した結合能力から判断することができるものであり、その結合能力がin vivo系ではより重要である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
【図１】マウスモデルにおけるヒト骨髄性単球性白血病の腫瘍に対するターゲッティングを示す。例えばＩｎ−１１１による金属キレートを使用した。
【図２】ＬＬＧペプチドのＩ−１２５−ＹＡＤＧＡ誘導体を静脈注入してから２４時間経過後の腫瘍ターゲッティング、即ちハロゲン化非ＰＥＧ化ＬＬＧペプチド誘導体による腫瘍ターゲッティングを示す。Ｉ−１２５−標識を用いた、ヒト骨髄性単球性白血病のマウスモデルによる腫瘍ターゲッティングのガンマ線イメージング平面画像。放射性物質で標識したペプチドを注入したマウスに麻酔をし、ガンマ線カメラ（ピンホールコリメーターを装着したPicker SX-300ガンマ線カメラ）で撮影した。
【図３】ＰＥＧ化ＬＬＧペプチドのＩ−１２５−ＹＡＤＧＡ誘導体を静脈注入してから２４時間経過後の腫瘍ターゲッティング、即ちハロゲン化ＰＥＧ化ＬＬＧペプチド誘導体による腫瘍ターゲッティングを示す。Ｉ−１２５標識を用いた、ヒト骨髄性単球性白血病のマウスモデルによる腫瘍ターゲッティングのガンマ線イメージング平面画像。放射性物質で標識したペプチドを注入したマウスに麻酔をし、ガンマ線カメラ（ピンホールコリメーターを装着したPicker SX-300ガンマ線カメラ）で撮影した。
【図４】ＬＬＧペプチドのＩ−１２５−ＹＡＤＧＡ誘導体の生体内分布の調査結果。125Ｉで標識したぺプチドをＮＭＲＩヌードマウスに注入後、間隔を空けて３回、in vivoにおける生体内分布を評価した。投与から２時間後、６時間後および２４時間後に測定したマウス体内における125Ｉで標識したぺプチドの生体内分布を重量で補正し、得られた結果を、組織０．１ｇ当たりのペプチド投与量のパーセンテージ（%ID/0.1g）で示す。全ての値は、５匹のマウスの平均値±標準偏差で示した。
【図５−１】（Ａ）および（Ｂ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ニュージーランドシロウサギの左大腿筋におけるE. coli膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図５−２】（Ｃ）および（Ｄ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ニュージーランドシロウサギの左大腿筋におけるE. coli膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図５−３】（Ｅ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ニュージーランドシロウサギの左大腿筋におけるE. coli膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図６−１】（Ａ）および（Ｂ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ウィスターラットの左大腿筋におけるS. aureus膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図６−２】（Ｃ）は、Ｉｎ−１１１−放射性標識ペプチドであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ウィスターラットの左大腿筋におけるS. aureus膿瘍への蓄積の様子を示す。
【図７Ａ】ラビットのある組織におけるＩｎ−１１１−ｃＤＴＰＡ−ＣＰＣＦＬＬＧＣＣの生体内分布を重量で補正したもの。
【図７Ｂ】ラットのある組織におけるＩｎ−１１１−ｃＴＰＡ−ＣＰＣＦＬＬＧＣＣの生体内分布を重量で補正したもの。
【図８】マウスの耳の感染部位におけるＩ−１２５−ＧＳＴ−ＬＬＧペプチド誘導体の蓄積の様子。
【図９】炎症部位におけるＬＬＧペプチドによる白血球遊走の阻害の様子。
【図１０】投与から３時間後の血液中のＩ−１２５−ＬＬＧ接合体の安定性を示す。
【図１１】マウス体内のＬＬＧペプチドの生体内分布を示す。
【図１２】ＹＡＤＧＡＣＰＣＦＬＬＧＣＣの、ＴＨＰ−１細胞系へのＬＬＧ−ＧＦＰの結合の阻害能を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2006525289.tif 000018
【国際調査報告】
2006525289.tif 000019
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