(57)【要約】細胞溶解組成物、この組成物を使用して宿主細胞からタンパク質およびペプチドを抽出および単離するための方法、宿主細胞からタンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離するためならびにタンパク質またはペプチドの存在について検出するためのキットならびに装置。この組成物は、機械的破壊を必要とせず、かつ細胞培地から細胞を単離してもしなくても、宿主細胞からタンパク質およびペプチドを抽出および単離することを可能にする。この組成物は、約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および
（ｂ）少なくとも１種の細胞膜改変化合物
を含んでなる組成物。
【請求項２】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記界面活性剤が、前記組成物の約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で該組成物中に存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤がエトキシ化アルキルフェノールを含んでなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記エトキシ化アルキルフェノールが、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カチオン性界面活性剤が、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤がエトキシ化アミンを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤が、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−５、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５、Ｒｈｏｄａｍｅｅｎ（Ｒ）ＶＰ５３２／ＳＰＢ、Ｔｒｙｍｅｅｎ（Ｒ）６６０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｒ）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞膜改変化合物が、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁において孔形成を引き起こすのに有効な量で前記組成物中に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞膜改変化合物が、リン脂質感受性のＣａ＋２依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞膜改変化合物が、膜の透過性を変化させるかまたは膜を破壊する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞膜改変化合物が抗生物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞膜改変化合物が、硫酸ポリミキシンＢまたはバンコマイシンを含んでなる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシンＢ１とポリミキシンＢ２との混合物を含んでなる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞膜改変化合物が、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドを含んでなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞膜改変化合物がオクチルチオグルコシドを含んでなる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記オクチルチオグルコシドが、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）かつ１％（ｗ／ｖ）未満の終濃度で存在する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記オクチルチオグルコシドが、０．４％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）の終濃度で存在する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
緩衝塩をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記緩衝塩が、約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量で存在する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
消泡剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
リゾチームをさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が水溶液の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記溶液が濃縮物である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量の緩衝塩をさらに含んでなる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に２％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および６％のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；ならびに
細胞を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の組成物と接触させる工程
からなる方法。
【請求項３１】
放出されたタンパク質またはペプチドを分離する工程からさらになる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質またはペプチドを結合する基材と接触させる工程からさらになる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記基材が磁性または非磁性の樹脂からなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物がリゾチームをさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が原核細胞または真核細胞からなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、細胞培養物またはペレットの形態である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記界面活性剤が、前記組成物の約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記非イオン性界面活性剤がエトキシ化アルキルフェノールを含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記エトキシ化アルキルフェノールが、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記カチオン性界面活性剤が、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記界面活性剤がエトキシ化アミンを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記界面活性剤が、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−５、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、Ｒｈｏｄａｍｅｅｎ  ＶＰ５３２／ＳＰＢ、Ｔｒｙｍｅｅｎ  ６６０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群より選択される１種または複数の化合物を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞膜改変化合物が、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁において孔形成を引き起こすのに有効な量で存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞膜改変化合物が、リン脂質感受性のＣａ＋２依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞膜改変化合物が抗生物質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞膜改変化合物が、硫酸ポリミキシンＢまたはバンコマイシンを含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシンＢ１とポリミキシンＢ２との混合物を含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞膜改変化合物が、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドを含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞膜改変化合物がオクチルチオグルコシドを含んでなる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記オクチルチオグルコシドが、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）かつ１％（ｗ／ｖ）未満の終濃度で存在する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記オクチルチオグルコシドが、０．４％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）の終濃度で存在する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が緩衝塩をさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項５６】
前記緩衝塩が、約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量で存在する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物が消泡剤をさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤をさらに含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物がリゾチームをさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物が、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物が、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に２％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および６％のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項６２】
宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
該タンパク質またはペプチドを結合するための基材を提供する工程；
該細胞を、該細胞の溶解および該タンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の該組成物と接触させる工程；
該放出されたタンパク質またはペプチドを、放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で該基材と接触させる工程；
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを洗浄する工程；ならびに
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを回収する工程
からなる方法。
【請求項６３】
タンパク質またはペプチドを抽出および単離するための装置であって、
タンパク質またはペプチドを有する１つまたは複数のサンプルを入れるためのハウジング；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物；ならびに
該タンパク質またはペプチドを結合する基材
からなる装置。
【請求項６４】
前記ハウジングが、容器、カラムまたはマルチ・ウェル・プレートからなる、請求項６３に記載の装置。
【請求項６５】
前記基材が、クロマトグラフィー樹脂またはメンブレンからなる、請求項６３に記載の装置。
【請求項６６】
前記クロマトグラフィー樹脂が磁性である、請求項６５に記載の装置。
【請求項６７】
請求項６３に記載の装置を備えてなる、タンパク質またはペプチドを単離するためのキット。
【請求項６８】
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；
少なくとも１種の細胞膜改変化合物；ならびに
キットを使用するための指示書
からなるキット。
【請求項６９】
前記界面活性剤および細胞膜改変化合物が１つの組成物中に存在する、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
前記組成物が水を含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記水性組成物が濃縮物の形態である、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
バッファーをさらに備えてなる、請求項６８に記載のキット。
【請求項７３】
リゾチームをさらに備えてなる、請求項６８に記載のキット。
【請求項７４】
１種または複数の洗浄用バッファーをさらに備えてなる、請求項６８に記載のキット。
【請求項７５】
１種または複数の溶出用バッファーをさらに備えてなる、請求項６８に記載のキット。
【請求項７６】
タンパク質またはペプチドを結合するための基材をさらに備えてなる、請求項６８に記載のキット。
【請求項７７】
前記基材が磁性または非磁性のクロマトグラフィー樹脂からなる、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するため、標的タンパク質または標的ペプチドが存在するか否かを検出するため、あるいは細胞抽出物を調製するために使用される、請求項６８に記載のキット。
【請求項７９】
サンプル中に存在するタンパク質またはペプチドを検出あるいは定量するための手段をさらに備えてなる、請求項６８に記載のキット。
【請求項８０】
宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する１つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；ならびに
細胞の各供給源を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の該組成物と接触させる工程
からなる方法。
【請求項８１】
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを分離する工程からさらになる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記工程が、放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質またはペプチドの一部または全てに結合する基材と接触させることによって実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記基材が磁性または非磁性の樹脂からなる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する、１つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
該タンパク質またはペプチドを結合するための１種または複数の基材を提供する工程；
細胞の各供給源を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の該組成物と個別に接触させる工程；
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質の一部または全てが基材と結合するのに有効な条件下で該基材と接触させる工程；
該基材に結合した該タンパク質を洗浄する工程；ならびに
該基材に結合した該タンパク質を回収する工程
からなる方法。
【請求項８６】
前記基材が磁性または非磁性の樹脂からなる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
宿主細胞の各供給源が有するベクターによってコードされるタンパク質またはペプチドを構成メンバーとする、宿主細胞の供給源由来のライブラリーをスクリーニングするための高スループットの方法であって、
ライブラリーを構成するタンパク質またはペプチドをコードするベクターを有する宿主細胞の供給源から、タンパク質またはペプチドのライブラリーを提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
該タンパク質またはペプチドを結合するための１種または複数の基材を提供する工程；
細胞の各供給源を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の組成物と接触させる工程；
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質またはペプチドの一部または全てが該基材と結合するのに有効な条件下で該基材と接触させる工程；
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを洗浄する工程；ならびに
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを回収する工程
からなる方法。
【請求項８９】
前記タンパク質またはペプチドが、目的の特定のタンパク質またはペプチドの変異体である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記タンパク質またはペプチドの活性または結合特性を測定する工程からさらになる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記組成物が、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項８０、８５または８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記組成物が、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に２％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および６％のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項８０、８５または８８に記載の方法。
【請求項９３】
培養培地から細胞を収集する工程を伴わずに、培養された細胞から細胞抽出物を作製するための方法であって、該方法は、該細胞培地を、該細胞を溶解させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなり、該組成物は、
（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および
（ｂ）少なくとも１種の細胞膜改変化合物
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項９４】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
前記界面活性剤が、前記組成物の約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で該組成物中に存在する、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記非イオン性界面活性剤がエトキシ化アルキルフェノールを含んでなる、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９７】
前記エトキシ化アルキルフェノールが、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含んでなる、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
前記カチオン性界面活性剤が、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９９】
前記界面活性剤がエトキシ化アミンを含んでなる、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１００】
前記界面活性剤が、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−５、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、Ｒｈｏｄａｍｅｅｎ  ＶＰ５３２／ＳＰＢ、Ｔｒｙｍｅｅｎ  ６６０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群より選択される、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記細胞膜改変化合物が、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁において孔形成を引き起こすのに有効な量で前記組成物中に存在する、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記細胞膜改変化合物が、リン脂質感受性のＣａ＋２依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃する、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記細胞膜改変化合物が、膜の透過性を変化させるかまたは膜を破壊する、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）を含んでなる、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞膜改変化合物が抗生物質である、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記細胞膜改変化合物が、硫酸ポリミキシンＢまたはバンコマイシンを含んでなる、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシンＢ１とポリミキシンＢ２との混合物を含んでなる、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記細胞膜改変化合物が、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドを含んでなる、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記細胞膜改変化合物がオクチルチオグルコシドを含んでなる、請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記オクチルチオグルコシドが、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）かつ１％（ｗ／ｖ）未満の終濃度で存在する、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記オクチルチオグルコシドが、０．４％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）の終濃度で存在する、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
緩衝塩をさらに含んでなる、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記緩衝塩が、約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量で存在する、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
消泡剤をさらに含んでなる、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１１５】
親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤をさらに含んでなる
、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１１６】
リゾチームをさらに含んでなる、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記組成物が水溶液の形態である、請求項９３に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記溶液が濃縮物である、請求項１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量の前記緩衝塩をさらに含んでなる、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１２０】
Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項１１９に記載の組成物。
【請求項１２１】
５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に２％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および６％のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項９３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞溶解組成物、タンパク質を抽出および精製するための方法、細胞培地および細胞ペレットを含む宿主細胞から標的タンパク質を抽出するための装置ならびにキットに関する。特に本発明は、機械的破壊を必要とせずに宿主細胞からタンパク質を抽出するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、参照によりその全体が援用される米国仮出願第６０／４２２，９３１号（２００２年１１月１日出願）の利益を主張する。
組換えＤＮＡ技術は、大量の所望の真核生物タンパク質（例えば、哺乳動物のホルモン、インターフェロンおよび酵素）を合成する価値ある手段を提供している。所望のタンパク質を産生するために生物を容易に操作することができるが、この宿主生物は通常、タンパク質産物を培養培地中に分泌しない。従って、生物（例えば、細菌）の溶解とその後の所望のタンパク質の単離とが通常必要である。
【０００３】
一般に、天然のタンパク質および組換えタンパク質の精製における第１の工程は、これらのタンパク質を産生する細胞の溶解を伴い、細胞成分を遊離させる。細胞溶解のための古典的な物理的方法には、超音波処理およびフレンチプレス細胞破砕機（French Pressure Cell）の使用などが挙げられるが、溶解において補助的に化学薬剤または酵素剤と組み合わされることが多い。物理的方法で溶解すると、膜の断片および染色体ＤＮＡの剪断によって生じる小分子ＤＮＡが生じるが、これらはいずれもその後の所望のタンパク質の分離および／または分析を妨害する可能性がある。これらの混入物を除去するには、ＤＮＡ消化などの、費用および時間のかかるさらなる精製工程を必要とする。
【０００４】
古典的なタンパク質精製方法には、沈殿（例えば、ＰＥＩ、ＰＥＧおよび硫酸アンモニウム）、濾過、分取電気泳動などが含まれる。これらの方法は、細菌溶解物または部分的に精製されたタンパク質調製物に対して実施されることが多い。クロマトグラフィーを用いるさらなる方法には、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。これらの方法のいずれかおよび全てが、適切な収量を確実にするためには有効な溶解手法に依存する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞の溶解のための方法は当該分野に存在するが、穏やかな細胞溶解を使用しかつ機械的破壊を回避する迅速な方法、混入する細胞破片（ＤＮＡ断片および膜の断片を含む）からの目的のタンパク質およびペプチドの分離、ならびに手順が１回または数回となる別の精製方法が、当該分野において必要とされている。本発明は、このような組成物、方法およびキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、概して、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する際に使用するための組成物、方法およびキットに関する。より具体的には、本発明は、溶解および１つまたは複数のさらなる単離手順を介した、宿主細胞（例えば、細菌細胞、動物細胞、真菌細胞、酵母細胞または植物細胞）からのタンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において有用な、このような組成物、方法およびキットに関する。特に、本発明は、細胞を溶解して細胞からタンパク質を放出させるための細胞溶解組成物ならびにタン
パク質分子およびペプチド分子を結合するための基材を使用して、１回または数回の手順で所望のタンパク質分子およびペプチド分子が宿主細胞から抽出および単離される、組成物、方法およびキットに関する。
【０００７】
本発明は、宿主細胞を溶解するための組成物を提供する。この組成物は、（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および（ｂ）少なくとも１種の細胞膜を変化させる化合物（以降、細胞膜改変化合物とする）を含んでなる。この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択可能であり、組成物の約０．００１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）の範囲の量で組成物中に存在する。この細胞膜改変化合物は、硫酸ポリミキシンＢもしくはバンコマイシン、またはポリミキシンＢ１とポリミキシンＢ２との混合物などの抗生物質であり得る。本発明の組成物は、組成物のｐＨを約６．５〜約９．０の範囲に維持するのに充分な量で緩衝液を含んでもよい。所望の場合、組成物は、消泡剤またはリゾチームなどの他の成分を含んでいてもよい。組成物は、水で再構成するための固体形態でも、水溶液でも、水性濃縮物でもよい。
【０００８】
本発明はまた、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞）からタンパク質を回収するための方法を提供する。この方法は、所望のタンパク質を有する細胞の供給源を提供する工程；約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；ならびにこの細胞を、細胞を溶解しその後タンパク質を放出させるのに充分な量の組成物と接触させる工程からなる。この細胞は、細胞培養物またはペレットの形態であり得る。本発明の１態様において、この方法は、放出されたタンパク質を分離する工程からさらになる。放出されたタンパク質は、同タンパク質を結合する基材と接触させることによって分離され得る。基材の代表的な例には、磁性または非磁性の樹脂などの任意の適切なクロマトグラフィー媒体が含まれる。
【０００９】
本発明はまた、精製された形態でタンパク質を単離するための方法を提供する。この方法は、所望のタンパク質を有する細胞の供給源を提供する工程；約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；タンパク質を結合するための基材を提供する工程；細胞を、細胞を溶解させてタンパク質を放出させるのに充分な量の組成物と接触させる工程；放出されたタンパク質を、この放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程；基材に結合したタンパク質を洗浄する工程；ならびに基材に結合したタンパク質を回収する工程からなる。
【００１０】
本発明はまた、タンパク質を抽出および単離するための装置を提供する。この装置は、抽出および単離しようとするタンパク質またはペプチドを有するサンプルを入れることができるハウジング；約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物；ならびにこのタンパク質を結合する基材からなる。適切なハウジングには、容器、カラムまたはマルチ・ウェル・プレートが含まれる。基材には、クロマトグラフィー樹脂またはメンブレンが含まれる。本発明の１態様において、この装置はタンパク質を単離するためのキット中に含まれる。
【００１１】
本発明はまた、宿主細胞からタンパク質を回収するためのキット、サンプル中のタンパク質の存在を検出するためのキット、および細胞溶解物を調製するためのキットを提供する。このキットは、約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；少なくとも１種の細胞膜改変化合物；ならびにこのキットを使用するための指示書からなる。このキットは、約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バ
ランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を含み得る。所望の場合、この組成物は水溶液である。この溶液は、濃縮物の形態であってもよい。このキットは任意選択で緩衝塩およびリゾチームなどの他の成分を含み得るが、該成分は組成物の一部として含まれてもよいし、組成物とは別に含まれてもよい。キットは、１種または複数の洗浄用バッファー、溶出用バッファー、タンパク質を結合するための基材もまた含み得る。
【００１２】
本発明の１実施形態において、
（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および
（ｂ）少なくとも１種の細胞膜改変化合物、
を含んでなる組成物が提供される。
【００１３】
本発明のこの実施形態の１態様において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される。界面活性剤は、組成物の約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で組成物中に存在することが好ましい。非イオン性界面活性剤は、エトキシ化アルキルフェノール（例えば、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を含んでなる。カチオン性界面活性剤は、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる。界面活性剤は、エトキシ化アミンを含んでなるものでもよい。本発明の好ましい実施形態において、界面活性剤は、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−５、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５、Ｒｈｏｄａｍｅｅｎ（Ｒ）ＶＰ５３２／ＳＰＢ、Ｔｒｙｍｅｅｎ（Ｒ）６６０７およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｒ）からなる群より選択される。
【００１４】
本発明のこの実施形態の別の態様において、細胞膜改変化合物は、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁に孔を生じさせるのに有効な量で組成物中に存在する。細胞膜改変化合物は、リン脂質感受性のＣａ＋２依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃し、膜の透過性を変化させ、もしくは膜を破壊し得る。細胞膜改変化合物は、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン（magainin）、メリチン（melittin）、ホスホリパーゼＡ２またはホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）を含んでなる。あるいは、細胞膜改変化合物は、硫酸ポリミキシンＢもしくはバンコマイシン、またはポリミキシンＢ１とポリミキシンＢ２との混合物などの抗生物質である。好ましくは、細胞膜改変化合物は、アルキルグリコシドまたはオクチルチオグルコシドなどのアルキルチオグリコシドを含んでなる。オクチルチオグルコシドは、終濃度が少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）かつ１％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）で存在し得る。
【００１５】
本発明のこの実施形態の別の態様において、組成物は緩衝塩をさらに含んでなる。緩衝塩は、約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量で存在し得る。
本発明のこの実施形態の別の態様において、組成物は、消泡剤、親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤、またはリゾチームなどの他の物質をさらに含んでなる。
【００１６】
本発明のこの実施形態の別の態様において、組成物は、水溶液の形態、好ましくは濃縮物の形態である。組成物は、好ましくは、約６．５〜約９．０のｐＨ範囲を維持するのに充分な量で緩衝塩を含む。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、組成物は、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｒ）およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなり、最も好ましくは５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に２％のＴｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｒ）および６％のオクチルβチオグルコピラノシド含んでなる。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；ならびに
細胞を、細胞を溶解させてその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなる。
【００１９】
本発明の１実施形態において、細胞は、原核細胞または真核細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞）からなる。これらの細胞は培養培地中に存在していてもよく、組成物は、培地から細胞を収集する工程なしに同培地に添加される。あるいは、細胞がペレットの形態で培地から収集されてもよく、細胞溶解組成物がこのペレットに添加される。
【００２０】
本発明のこの実施形態の別の態様において、この方法は、好ましくは、放出されたタンパク質またはペプチドを、同タンパク質またはペプチドを結合する基材と接触させることによって分離する工程からさらになる。好ましくは、この基材は、磁性または非磁性の樹脂からなる。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
タンパク質またはペプチドを結合するための基材を提供する工程；
細胞を、細胞を溶解してタンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程；
放出されたタンパク質またはペプチドを、この放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程；
基材に結合したタンパク質またはペプチドを洗浄する工程；ならびに
基材に結合したタンパク質またはペプチドを回収する工程からなる。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、タンパク質またはペプチドを抽出および単離するための装置が提供され、この装置は、
タンパク質またはペプチドを有する１つまたは複数のサンプルを入れるためのハウジング；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物；ならびに
このタンパク質またはペプチドを結合する基材からなる。
【００２３】
本発明のこの実施形態の１態様において、ハウジングは、容器、カラムまたはマルチ・ウェル・プレートからなる。
本発明のこの実施形態の別の態様において、基材は、クロマトグラフィー樹脂またはメ
ンブレンからなる。クロマトグラフィー樹脂は、磁性であることが好ましい。
【００２４】
本発明のこの実施形態の別の態様において、タンパク質またはペプチドを単離するための装置を備えてなるキットが提供される。
本発明の別の実施形態において、
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；
少なくとも１種の細胞膜改変化合物；ならびに
キットを使用するための指示書、
からなるキットが提供される。
【００２５】
本発明のこの実施形態の１態様において、界面活性剤および細胞膜改変化合物は、組成物中に含まれる。好ましくは、この組成物は濃縮物などの水性組成物であり得る。
本発明のこの実施形態の別の態様において、キットは、１または複数の以下の成分、すなわち：緩衝剤、リゾチーム、１または複数の洗浄用バッファー、１または複数の溶出用バッファー、およびタンパク質またはペプチドを結合するための基材、をさらに含み得る。基材は、磁性または非磁性のクロマトグラフィー樹脂からなるものでよい。このキットは、サンプル中に存在するタンパク質またはペプチドを検出あるいは定量するための手段をさらに含み得る。キットは、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するため、標的タンパク質または標的ペプチドが存在するか否かについて検出するため、あるいは細胞抽出物を調製するために有用である。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質またはペプチドを有する、１つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；ならびに
細胞の各供給源を、細胞を溶解してその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなる。
【００２７】
本発明のこの実施形態の１態様において、この方法は、細胞の各供給源由来の放出されたタンパク質またはペプチドを分離する工程からさらになる。この工程は、放出されたタンパク質またはペプチドを、同タンパク質またはペプチドの一部または全てに結合する基材と接触させることによって実施され得る。基材は、磁性または非磁性の樹脂からなり得る。
【００２８】
本発明のこの実施形態の別の態様において、この方法は、放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる。
本発明の別の実施形態において、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質またはペプチドを有する、１つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
タンパク質またはペプチドを結合するための１種または複数の基材を提供する工程；
細胞の各供給源を、細胞を溶解してその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と個別に接触させる工程；
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、この放出されたタンパク
質の一部または全てが基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程；
基材に結合したタンパク質を洗浄する工程；ならびに
基材に結合したタンパク質を回収する工程からなる。
【００２９】
本発明のこの実施形態の１態様において、基材は磁性または非磁性の樹脂からなる。
本発明のこの実施形態の別の態様において、この方法は、放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、宿主細胞の各供給源が有するベクターによってコードされるタンパク質またはペプチドを構成メンバーとする、宿主細胞の供給源由来のライブラリーをスクリーニングするための高スループットの方法が提供され、この方法は、
ライブラリーを構成するタンパク質またはペプチドをコードするベクターを有する宿主細胞の供給源から、タンパク質またはペプチドのライブラリーを提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
タンパク質またはペプチドを結合するための１または複数の基材を提供する工程；
細胞の各供給源を、細胞を溶解させてその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程；
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、この放出されたタンパク質またはペプチドの一部または全てが基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程；
基材に結合したタンパク質またはペプチドを洗浄する工程；ならびに
基材に結合したタンパク質またはペプチドを回収する工程からなる。
【００３１】
本発明のこの実施形態の１態様において、これらのタンパク質またはペプチドは、目的の特定のタンパク質またはペプチドの変異体である。
本発明のこの実施形態の別の態様において、この方法は、タンパク質またはペプチドの活性または結合特性を測定する工程からさらになる。
【００３２】
本発明のこの実施形態の別の態様において、この組成物は、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｒ）およびオクチルβチオグルコピラノシドからなり、好ましくは５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に２％のＴｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｒ）および６％のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、培養培地から細胞を収集する工程を伴わずに、培養された細胞から細胞抽出物を作製するための方法が提供され、この方法は、細胞培地を、細胞を溶解させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなり、この組成物は、
（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤；および
（ｂ）少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる。
【００３４】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明に照らして明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、タンパク質および／またはペプチドを含む細胞から、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する際に使用可能な、組成物、方法およびキットを提供する。本発明によれば、任意の細胞、組織、器官、細胞集団などがタンパク質およびペプチ
ドの供給源として使用され得ることが、当業者には容易に理解されよう。
【００３６】
Ａ．定義
以下の説明において、分子生物学、生化学およびタンパク質化学の分野で使用される多数の用語が広範に利用される。このような用語が用いられる範囲を含む明細書および特許請求の範囲が明確かつ矛盾なく理解されるように、以下の定義が提供される。
【００３７】
本明細書中で定義するように、用語「宿主細胞」（「宿主」と互換的に使用される）は、本明細書中で使用される場合、目的のタンパク質および／またはペプチドを産生する任意の原核細胞または真核細胞をいう。このような宿主の例については、マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第二版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）［米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在］（１９８２）を参照のこと。好ましい原核生物宿主には、エシェリキア（Escherichia ）属の細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、バチルス（Bacillus）属の細菌、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属の細菌、アグロバクター（Agrobacter）属の細菌（例えば、アグロバクター・ツメファシエンス（A.tumefaciens ））、ストレプトマイセス（Streptomyces）属の細菌、シュードモナス（Pseudomonas ）属の細菌、サルモネラ（Salmonella）属の細菌、セラチア（Serratia）属の細菌、カリオファノン（Caryophanon ）属の細菌などが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌（E.coli）である。本発明において特に注目した細菌宿主には、大腸菌株Ｋ１２、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓが含まれる。好ましい真核生物宿主には、真菌細胞、魚類細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい動物細胞は、ドロソフィラ（Drosophila）細胞、スポドプテラ（Spodoptera）のＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞およびトリコプルサ（Trichoplusa ）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（ＴＭ）細胞などの昆虫細胞；線虫（C. elegans）細胞などのネマトーダ細胞；ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞およびヒト細胞などの哺乳動物細胞である。本発明によれば、宿主または宿主細胞は、単離しようとする所望のタンパク質分子および／またはペプチド分子のための細胞性供給源として働き得る。
【００３８】
用語「天然のコンホメーション」は、本明細書中で使用する場合、そのタンパク質またはペプチドが介入なしに自然に翻訳される生物学的宿主中に存在することがわかっている場合の、該アミノ酸鎖の３次構造もしくは４次構造（または３次構造もしくは４次構造の範囲）として定義される。当該分野においては、天然のコンホメーションの状態にあるタンパク質またはペプチドは天然の全ての機能および活性をも保有すると一般に考えられている。天然のコンホメーションに混乱が生じると、必ずというわけではないが、多くの場合天然の機能または活性に混乱が生じるが、そのようなタンパク質およびペプチドは、変性タンパク質または変性ペプチドとも称することができる。本願の目的に関しては、タンパク質またはペプチドの構造は、これらの天然の構造が有意な操作（例えば、再構築技術）なしには回復され得ない場合に混乱が生じているとみなされる。天然のコンホメーションを実質的に維持しているタンパク質およびペプチドは、その天然の機能および活性を実質的に全て有している。
【００３９】
用語「可溶性タンパク質」は、本明細書中で定義する場合、非特異的様式（例えば、沈殿、フロキュレーションなど）で他のタンパク質分子との巨大な凝集体を形成することのないように、その一般に知られているコンホメーションが溶媒分子によって適切に取り囲まれるタンパク質分子として定義される。対称的な用語は不溶性タンパク質ということになるが、不溶性タンパク質には膜貫通タンパク質、変性タンパク質および封入体を形成するタンパク質が挙げられる。１つの溶媒（例えば、水性溶媒）中で不溶性であり得る（封
入体を形成し得る）タンパク質またはペプチドが、異なるバッファー系（例えば、６Ｍ尿素）中で可溶性であることもある。
【００４０】
用語「単離された」（「単離されたタンパク質分子」または「単離されたペプチド分子」でのような）は、単離された材料、成分または組成物が、単離された同材料、成分または組成物の一部ではない他の材料、混入物などから離されて少なくとも部分的に精製されたことを意味する。例えば、「単離されたタンパク質分子」は、このタンパク質分子が細胞、組織、器官または生物体中で結合し得る混入物（例えば、膜の断片または核酸）の少なくとも一部を除去するような方法で処理されたタンパク質分子である。しかし、当業者であれば十分認識しているように、単離されたタンパク質分子および／またはペプチド分子を含んでなる溶液は、１または複数の緩衝塩、溶媒（例えば水）ならびに／または他のタンパク質分子およびペプチド分子を含むことが可能であり、その場合も所望のタンパク質分子およびペプチド分子はなお、その出発材料に関して「単離された」タンパク質分子およびペプチド分子とみなすことができる。
【００４１】
用語「細胞溶解組成物または試薬」とは、本明細書中で使用する場合、単離しようとするタンパク質分子およびペプチド分子の供給源として使用される細胞、組織または生物体の溶解、破裂または孔形成をもたらし、その結果、その細胞、組織または生物体の供給源中に含まれている可溶性のタンパク質分子およびペプチド分子（またはそれらの一部分）をこの細胞、組織または生物体から放出させる組成物をいう。本発明によれば、これらの細胞、組織または生物体が、完全に溶解され／破壊され／透過性とされる必要はなく、この供給源の細胞、組織または生物体中に含まれる全てのタンパク質分子およびペプチド分子が、この細胞、組織または生物体から放出される必要もない。細胞破壊用組成物または細胞溶解組成物は、細胞、組織または生物体中に含まれる目的の（可溶性および不溶性の）タンパク質分子またはペプチド分子全体の少なくとも５０％以上を放出することが好ましいであろう。
【００４２】
用語「細胞膜改変化合物」とは、本明細書中で使用する場合、細胞性供給源から所望のタンパク質の一部または全てを放出させるための任意の機構によって、タンパク質分子およびペプチド分子の細胞性供給源の細胞膜の透過性を変化させるか、あるいは同供給源の膜および／または細胞壁の完全性を破壊する（すなわち、膜および／もしくは細胞壁を溶解するか、または膜および／もしくは細胞壁に孔を形成させる）任意の化合物または化合物の組合せをいう。一般に、細胞膜改変化合物には、ポリミキシンＢ（例えば、ポリミキシンＢ１およびポリミキシンＢ２）およびポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）などの抗生物質；アルキルグルコシドもしくはアルキルチオグルコシド（オクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシドなど）（本明細書中でその全体が参考として援用される米国特許第６，１７４，７０４号を参照のこと）；カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）などのベタイン界面活性剤；臭化トリメチルオクタデシルアンモニウム（ＴＭＡ−１８）などの第４級アンモニウム塩；プロタミン；トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびトリエタノールアミン（ＴｅｏｌＡ）などのアミン；ならびに孔形成性の（抗菌性の）ポリリジンペプチド（例えば、ランチビオティックであるナイシン）などのリジンポリマー；ならびにマガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２およびホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）などの神経毒など、種々の薬剤が含まれるが、これらは細胞膜に孔を形成し、かつ／または細胞膜の既存の孔を広げる。本明細書中で全体が参考として援用される、モルブ（Morbe ）ら、マイクロバイオロジカル・リサーチ誌（Microbiol.Res.）、１９９７年、第１５２巻、３８５〜３９４ページを参照のこと。
【００４３】
用語「疎水性−親油性バランス値」または（ＨＬＢ）は、本明細書中で使用する場合、水中での界面活性剤の挙動および溶解性に関する界面活性剤の分類をいう。ＨＬＢ値は、非イオン性界面活性剤について計算することが可能であり、他の界面活性剤について実験
的に決定することも可能である。ＨＬＢ値の規模は、１〜４０である。ＨＬＢが増大するにつれて、その界面活性剤中の親水性基が増え、その界面活性剤はより水溶性となる。一般に、３〜６のＨＬＢは油中水乳化剤を示し、７〜９のＨＬＢは湿潤剤を示し、８〜１８のＨＬＢは水中油乳化剤を示し、１３〜１５のＨＬＢは界面活性剤を示し、１５〜２２のＨＬＢは可溶化剤を示す。以下の参考文献は、ＨＬＢについてのさらなる情報を提供している：グリフィン，ダブリューシー（Griffin, WC ）、「非イオン性界面活性剤のＨＬＢ価の算出（Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants）」、ジャーナル・オブ・ザ・ソサイエティ・オブ・コスメティック・ケミスツ誌（Journal of the Society of Cosmetic Chemists ）、第５巻（１９５４年）、２４９〜２５６ページ；グリフィン，ダブリューシー（Griffin, WC ）、「ＨＬＢによる界面活性剤の分類（Classification of Surface-Active Agents by 'HLB'）」、ジャーナル・オブ・ザ・ソサイエティ・オブ・コスメティック・ケミスツ誌、第１巻（１９４９年）、３１１〜３２６ページ；「アトラスのＨＬＢシステム（The Atlas HLB System）」、第４刷、アトラスケミカルインダストリーズ社（Atlas Chemical Industries ）［米国デラウエア州ウィルミントン（Wilmington）所在］、１９６３年；「エマルジョン（Emulsions ）」、ウルマン工業化学百科事典（Ullmans's Encyclopedia of Industrial Chemistry）、第５版、１９８７年；フォックス，シー．（Fox, C. ）、「乳化剤選択の論拠（Rationale for the Selection of Emulsifying Agents ）」、コスメティクス・アンド・トイレタリーズ誌（Cosmetics & Toiletries）、第１０１．１１巻（１９８６年）、２５〜４４ページ；ガルシア，エイ．（Garcia, A.）、ジェイ．ラシェーズ（J. Lachaise ）およびジー．マリオン（G. Marion ）、「乳化剤に求められる親水‐親油バランスの研究（A Study of the Required Hydrophile-Lipophile Balance for Emulsification ）」、ラングミュア誌（Langmuir）、第５巻（１９８９年）、１２１５〜１３１８ページ；ならびにグリフィン，ダブリュー．シー．（Griffin, W.C. ）「エマルジョン（Emulsions ）」、カーク・オスマー化学大辞典（Kirk
Othmer Encyclopedia of Chemical Technology ）、第３版、１９７９年。
【００４４】
本明細書中で使用されているような、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、分子生物学および細胞生物学の分野において使用されるその他の用語は、適用可能な分野の当業者には一般的に理解されよう。
【００４５】
Ｂ．タンパク質およびペプチドの供給源
本発明の方法、組成物およびキットは、任意の細胞性供給源（種々の細胞、組織、器官または生物体を含む）由来のタンパク質分子およびペプチド分子の単離に適切であり、細胞性供給源は、天然のものでもよいし、または様々な市販の供給源（米国メリーランド州ロックビル所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection: ATCC）；米国メイン州バーハーバー（Bar Harbor）所在のジャクソンラボラトリーズ社（Jackson Laboratories）；米国ワシントン州カークランド（Kirkland）所在のセルシステムズインコーポレーテッド社（Cell Systems,Inc. ）；米国カリフォルニア州ラホヤ（La Jolla）所在のアドバンストティシューサイエンシズ社（Advanced Tissue Sciences）など）を介して入手してもよい。細胞性のタンパク質およびペプチドの供給源として使用され得る細胞は、原核生物（エシェリキア属のメンバー（特に大腸菌）、セラチア属のメンバー、サルモネラ属のメンバー、スタフィロコッカス属のメンバー、ストレプトコッカス（Streptococcus ）属のメンバー、クロストリジウム（Clostridium ）属のメンバー、クラミジア（Chlamydia ）属のメンバー、ナイセリア（Neisseria ）属のメンバー、トレポネマ（Treponema ）属のメンバー、マイコプラズマ（Mycoplasma）属のメンバー、ボレリア（Borrelia）属のメンバー、ボルデテラ（Bordetella）属のメンバー、レジオネラ（Legionella）属のメンバー、シュードモナス（Pseudomonas ）属のメンバー、マイコバクテリウム（Mycobacterium ）属のメンバー、ヘリコバクター（Helicobacter）属のメンバー、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属のメンバー、コレクトトリチューム（Collectotrichum ）属のメンバー、リゾビウム（Rhizobium ）属のメンバーおよびス
トレプトマイセス（Streptomyces）属のメンバーを含む細菌）または真核生物（真菌もしくは酵母、植物、原生生物および他の寄生生物、ならびにヒトおよび他の哺乳動物を含む動物など）であり得る。哺乳動物の組織もしくは細胞（例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環系、リンパ系、胃腸および（例えば、内胚葉起源または外胚葉起源の）結合組織供給源由来の組織もしくは細胞、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）の胚または胎仔由来の組織もしくは細胞）もまた、タンパク質分子およびペプチド分子の供給源として使用するのに適切である。タンパク質およびペプチドの適切な供給源はまた、所望のタンパク質およびペプチドを発現し得るプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス、ファージまたは他のＤＮＡ分子を保有する上記の任意の細胞でもよい。これらの細胞、組織および器官は、正常な細胞株、初代細胞株、形質転換細胞株もしくは樹立された細胞株でもよいし、あるいは（細菌、真菌もしくは酵母、ＡＩＤＳを含むウイルスによって引き起こされる）感染性疾患もしくは寄生生物、遺伝的もしくは生化学的な病変（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、精神分裂病、筋ジストロフィーまたは多発性硬化症）、または癌および癌性プロセスに関与するものなど病理学的な細胞、組織および器官でもよい。本発明の方法、組成物およびキットは、小さい可溶性のタンパク質およびペプチド（例えば、１０００ｋＤ以下、好ましくは約１〜１００ｋＤ、最も好ましくは約１〜５０ｋＤのタンパク質またはペプチド）の単離に充分適している。より大きい分子量のタンパク質（例えば、１０００ｋＤより大きいタンパク質）については、これらのタンパク質の放出を補助するための添加物としてリゾチームが使用されてもよい。本発明の方法は、生物学的宿主において発現され、封入体を形成するタンパク質分子またはペプチド分子の単離のために特に充分適している。封入体からタンパク質分子またはペプチド分子を放出するために、尿素またはグアニジン−ＨＣｌなどの試薬が、封入体と関連するタンパク質分子およびペプチド分子の放出を補助するための補助剤として使用されてもよい。
【００４６】
特に好ましい態様において、本発明の方法は、組換えタンパク質および組換えペプチドを発現し得る宿主中に取り込まれたＤＮＡから発現される組換えタンパク質分子および組換えペプチド分子の単離において有用である。特に好ましいタンパク質分子およびペプチド分子は、タンパク質ライブラリーまたはペプチド・ライブラリーの一部である。このようなライブラリーには、ランダムなポリヌクレオチド配列によってコードされる完全に新規のアミノ酸配列の集団が含まれるがこれに限定されず、またはこのようなライブラリーは、ランダムに生成された変異タンパク質および変異ペプチドのライブラリーもしくは集団でもよい。当業者ならよく知っていようその他の細胞、組織、ウイルス、器官および生物体も、本発明に従って単離されるタンパク質分子およびペプチド分子の抽出および調製のためのタンパク質分子およびペプチド分子の供給源として使用され得る。
【００４７】
ｂ．細胞溶解組成物
本発明は、１つまたは複数の細胞を破壊または溶解する細胞溶解組成物に関する。これらの細胞は、細胞培地中に存在していてもよいし、または凍結ペレットもしくは非凍結ペレットとして存在してもよい。本発明の１実施形態において、この細胞溶解組成物は、（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する、少なくとも１種の界面活性剤；および（ｂ）少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる。この組成物は、水溶液でもよいし、または使用前に水もしくは緩衝溶液中に再構成される固体の形態でもよい。細胞溶解組成物の好ましい形態は、１×溶液または濃縮溶液（例えば、（特に好ましくは）１０×）などの水溶液である。１×溶液が細胞ペレットに直接添加されてもよいし、濃縮物が細胞培地に直接添加されてもよい。１０×濃縮溶液が使用される場合、１容量の１０×溶液が９容量の細胞培地と混合されて、該細胞混合物中の細胞溶解試薬濃度を最終的に１×とすることが好ましい。
【００４８】
界面活性剤は、細胞溶解組成物の約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範
囲、好ましくは約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲、最も好ましくは約１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で、同組成物中に存在する。１０×濃縮物の形態の細胞溶解試薬を、本明細書中に記載される特定の適用において細胞培地に添加する場合、界面活性剤の好ましい終濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）の範囲である。界面活性剤は、約１１〜約１６の範囲の疎水性−親油性バランス値を有する非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択され得る。このような界面活性剤の商業的供給源は、これもまた本明細書中で参考として援用される、「マカッチャンの乳化剤と界面活性剤（McCutcheon's EMULSIFIERS AND DETERGENTS ）」、北米版、２００２年、エムシーパブリッシングカンパニー社マカッチャン部門（McCutcheon Division、MC Publishing Company ）中に見出され得る。非イオン性界
面活性剤の適切な例（限定するものではない）には、アルキルアルコールエトキシレート、アルキルエステルエトキシレート、ポリプロピレンオキシド、ソルビトールアルキルエステル、グリセロールアルキルエステル、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー；ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル（例えば、米国デラウエア州ウィルミントン（Wilmington）所在のアイシーアイアメリカズ社（ICI Americas）から入手可能な商品名Ｂｒｉｊとして販売されているもの）、商品名Ｔｗｅｅｎ（米国デラウエア州ウィルミントン所在のアイシーアイアメリカズ社）として販売されているポリ（オキシエチレン）ソルビタンエステルが挙げられる。好ましい非イオン性界面活性剤には、商品名Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｒ）ＮＰ（米国コネチカット州ダンバリー（Danbury ）所在のユニオンカーバイド社（Union Carbide ））として販売されているエトキシ化ノニルフェノールまたは商品名Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア所在のロームアンドハース社（Rohm & Haas ））として販売されているオクチルフェノキシポリエトキシエタノールなどの、エトキシ化アルキルフェノールが挙げられる。
【００４９】
カチオン性界面活性剤の適切な例（限定するものではない）には、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物が含まれる。好ましいカチオン性界面活性剤には、米国オハイオ州シンシナティ（Cincinnati）所在のヘンケルコーポレーション社（Henkel Corp.）から商品名Ｔｒｙｍｅｅｎのもとで販売されているエトキシ化アミン、および米国ウィスコンシン州ミルトン（Milton）所在のトマープロダクツインコーポレイテッド社（Tomah Products, Inc.）から入手可能なＴｏｍａｈ  Ｅシリーズとして販売されているエトキシ化アミンが挙げられる。
【００５０】
本発明における使用のために適切ないくつかの界面活性剤（限定するものではない）は、米国ニュージャージー州クランベリー（Cranberry ）所在のロディア社（Rhodia）から入手可能な商品名Ｒｈｏｄａｍｅｅｎ（Ｒ）ＶＰとして販売されているエトキシ化脂肪アミンなど、非イオン性の特性およびカチオン性の特性の両方を有するものと特徴付けられる。
【００５１】
細胞膜改変化合物の適切な例（限定するものではない）には、抗生物質、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第４級アンモニウム塩、アミン、短鎖リン脂質（１，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＨＰＣ）など）および孔形成性ペプチドが含まれる。代表的な抗生物質には、硫酸ポリミキシンＢまたはバンコマイシンが含まれるが、限定するものではない。好ましい抗生物質は、一般にポリミキシンＢと称される、ポリミキシンＢ１とポリミキシンＢ２との混合物である。所望のタンパク質またはペプチドの一部または全てを放出するために、宿主の細胞膜または細胞壁を溶解させるか、あるいは宿主の細胞膜または細胞壁に孔を形成させるのに充分な任意の適切な量の細胞膜改変化合物が、細胞溶解組成物中で使用され得る。好ましい細胞膜改変化合物であるポリミキシンＢが細胞溶解組成物中で使用される場合、ポリミキシンＢの存在量は一般に、約０．０２５％（ｗ／ｖ）〜約０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００５２】
別の好ましい細胞膜改変化合物は、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドである。代表的なアルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドには、オクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（またはオクチルチオグルコシド）が含まれる（限定ではない）。米国特許第６，１７４，７０４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、宿主細胞から組換えタンパク質を調製および抽出する方法を提供している。この方法は、細胞を溶解させると同時に他の宿主細胞由来のタンパク質から目的のタンパク質を抽出するために、本質的に１％のオクチルチオグルコシド（ＯＴＧ）を含んでなる試薬溶液を使用している。本発明では、充分に細胞を溶解することと満足のいくタンパク質純度を得ることをいずれも達成するために、ＯＴＧに加えて少なくとも１種の界面活性剤が必要であることが、思いがけず発見された。さらに、より高い濃度のＯＴＧ（例えば、米国特許第６，１７４，７０４号で使用された１％（ｗ／ｖ））を用いれば溶解性がより高まるにもかかわらず、そのような高濃度のＯＴＧを含む細胞溶解組成物は、ある種のタンパク質を不活化する傾向も強いことが、思いがけず発見された。従って、細胞の充分な溶解とタンパク質の活性との間の注意深いバランスが非常に重要である。本発明の１実施形態において、ＯＴＧは、細胞培地に直接添加される１０×細胞溶解組成物中の細胞膜改変化合物として使用され、このときＯＴＧの望ましい濃度は、少なくとも４％（ｗ／ｖ）かつ１０％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは４％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）である。従って、１×細胞溶解組成物におけるＯＴＧの実用上の最適な終濃度は、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）かつ１％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）である。しかし、タンパク質またはペプチドが天然の構造または活性を有する必要のない場合、溶解／破壊用の試薬についての制限は必要ない。細胞溶解組成物は、細胞培地または懸濁物（細胞ペレットが細胞溶解組成物中に懸濁される場合）において、ｐＨを約６．５〜９．０、好ましくは約７．０〜約８．０の範囲に維持するのに有効な量の緩衝塩を含む。適切な緩衝剤（限定するものではない）には、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、トリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）およびＭＯＰＳが含まれる。
【００５３】
その後いずれの精製手順が使用されるかに依存して、任意の成分が、細胞溶解組成物の一部として、または別個に添加されるべき補助剤として含まれ得る。任意の成分には、濃度約１％の消泡剤；リゾチーム、リティカーゼ、ザイモリアーゼ、ノイラミニダーゼ、ストレプトリシン、セルリシン（ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｎ）、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）、キチナーゼ、グルカラーゼ（ｇｌｕｃａｌａｓｅ）またはリソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）などの酵素（約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度）；約１ｍＭ〜５Ｍの濃度の、１種または複数の無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化リチウムまたは塩化プラセオジミウム）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル、トリプシン阻害剤、アプロチニン、ペプスタチンＡ）、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元剤（例えば、２−メルカプトエタノールおよびジチオトレイトール）；キレート剤（例えば、最も好ましくは約１ｍＭ以下の濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎａ２ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ）；１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの範囲の濃度の１種または複数のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ａ、Ｔ１、Ｔ２など）、または上記の任意の組み合わせが含まれる。ＤＮａｓｅＩ濃度は、１単位〜１００単位（１０，０００単位／ｍｇ）の範囲であり得る。
【００５４】
ｃ．方法
本発明はまた、宿主細胞からタンパク質を単離するための方法に関する。本発明のこの態様に従う方法は、細胞を本明細書中に記載されるような細胞溶解組成物と接触させて、細胞を溶解させた後に所望のタンパク質の全てまたは一部分を放出させる工程からなる。放出されたタンパク質を、溶解物からさらに分離することも可能である。本発明の１実施形態において、宿主細胞からタンパク質を回収するための方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質を有する細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；ならびに
細胞を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質の放出をもたらすのに充分な量の組成物と接触させる工程からなる。
【００５５】
本発明の実施において、細胞膜／細胞壁の完全性を破壊することによって細胞を溶解させ、続いて細胞性供給源から所望のタンパク質の全部または一部を放出させるのに有効な任意の適切な量の組成物を使用すればよい。本発明の実施において、この組成物は、所望のタンパク質およびペプチドの天然のコンホメーションまたは機能を実質的に乱すことなく、細胞膜または細胞壁の完全性を破壊し、その結果、天然のコンホメーションまたは実質的に天然のコンホメーションを有するタンパク質またはペプチドが収集され得る。しかし、タンパク質またはペプチドの天然の構造が必要でなければ、溶解／破壊用の試薬についての制限は必要ない。一般に、細胞混合物中の界面活性剤の濃度は、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲、通常は約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）の範囲である。本発明の別の実施形態において、宿主細胞からタンパク質を回収するための方法が提供され、この方法は、溶解物から放出された所望のタンパク質を分離する工程をさらに含む。この方法は、
所望のタンパク質を有する細胞の供給源を提供する工程；
約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程；
タンパク質を結合するための基材を提供する工程；
細胞を、該細胞を溶解させてタンパク質を放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程；
放出されたタンパク質を、この放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程；
基材に結合したタンパク質を洗浄する工程；ならびに
基材に結合したタンパク質を回収する工程からなる。
【００５６】
放出されたタンパク質の分離は、当該分野で公知の任意の適切な方法（タンパク質精製技術または該タンパク質に結合する基材（例えば、磁性または非磁性の樹脂）を使用するクロマトグラフィー技術など）によって達成され得る。本発明の実施において、所望のタンパク質は分離され、親和性クロマトグラフィー（例えば、ニッケル樹脂またはＧＳＴ樹脂）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、沈殿（例えば、ＰＥＩ、ＰＥＧまたは硫酸アンモニウムを用いる）などを使用してさらに精製され得る。適切なクロマトグラフィー樹脂は、例えば、その全体が本明細書中で参考として援用される米国特許出願第６０／４１９，６１４号（２００２年１０月１８日出願）、表題「分子を分離する組成物及び方法（Compositions and Methods of Separating Molecules）」（代理人事件番号Ｂ０１７４８９３）において記載されている。単離されたタンパク質は、意図された目的のために充分な純度である場合もあれば、またはさらなる精製手順（例えば、樹脂、抗体など）に供される場合もある。このような追加の精製により、望ましくない混入物、例えば、核酸、他のタンパク質およびペプチド、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質分子およびペプチド分子の活性を阻害ししたりさらなる操作（例えば、標識、タンパク質分解による切断、酵素活性の検出および定量など）を阻害したりする可能性のある化合物もしくは組成物の除去が容易となる。いかなる場合においても、このようなさらなる精製が行なわれる必要はなく、従って、本発明の方法によって得られるタンパク質は、標準的な生化学の技法およびタンパク質化学の技法によって直接操作され得る。
【００５７】
本発明の好ましい態様において、１または複数の追加の精製用組成物（例えば、イオン交換樹脂、親和性樹脂、磁性ビーズまたは磁性樹脂、抗体、ニッケル樹脂、ＧＳＴ樹脂など）が、本発明に従って分離マトリックスと合わせて利用される。このような追加の精製は、別個の手順で達成されてもよいが、好ましい態様においては、追加の精製は本発明の分離方法と同時に、または本発明の分離方法と合わせて達成される。１態様において、１または複数の分離マトリックスならびに１または複数のタンパク質およびペプチド精製用組成物は、流体チャネルにおいて連続的に連結され、その結果、所望のタンパク質分子およびペプチド分子を含むサンプルは、１つのマトリックスから別のマトリックスへと通過し得る。
【００５８】
放出されたタンパク質は、任意の適切な形式（例えば、ミニ・カラムを含むカラム形式、チューブ形式、ウェル形式、マルチ・ウェル・プレート形式など）で分離および／または精製され得る。本発明の１態様では、細胞の溶解および分離が同じ容器内で実施されることになる。１つの特に好ましい実施形態は、本明細書中に記載されるような高スループットの精製形式での、宿主細胞からのタンパク質またはペプチドの抽出および精製を含む。例えば、基材が、ウェルに入った細胞溶解物に添加されてもよい。次いでこの基材は、放出されたタンパク質を基材に結合させるための一定の時間、この細胞溶解物と共にインキュベートされる。その後、溶解物が除去され、基材に結合したタンパク質が洗浄用バッファーまたは洗浄溶液で１回または複数回洗浄されればよい。次いで、基材に結合したタンパク質は、溶出用バッファーまたは溶出溶液で１回または複数回基材を洗浄することによって、回収され得る。本発明の別の態様において、細胞溶解物は、ミニ・カラム中に含まれる基材を介して濾過され得る。タンパク質を基材に結合させるための所定の時間の後、この基材が任意の適切な洗浄用バッファーまたは洗浄溶液で１回または複数回洗浄され、かつ結合したタンパク質が任意の適切な溶出用バッファーまたは溶出溶液で１回または複数回基材を洗浄することによって基材から溶出され得る。望ましくない物質、例えば、脂質、核酸、溶解組成物の成分、またはタンパク質分子およびペプチド分子のさらなる操作もしくは分析を阻害し得る任意の他の物質は、所望のタンパク質分子およびペプチド分子を精製用の固定化組成物上に保持させる任意の適切な洗浄用バッファーまたは洗浄溶液を用いて除去され得る。所望のタンパク質分子およびペプチド分子を精製用の固定化組成物から除去するための任意の適切な溶出用バッファーまたは溶出溶液が、精製されたタンパク質分子およびペプチド分子を単離するために使用され得る。これらの手順のいずれかは、例えば９６ウェルのプレートを使用して１種類または多種類のタンパク質またはペプチドを精製するための高スループットの精製形式に変形され得る。宿主細胞がウェル中に個々に添加されて、本発明の細胞溶解試薬を用いて溶解されればよい。次いで、各ウェル由来の溶解された混合物は、基材（例えば、タンパク質またはペプチドに結合するクロマトグラフィー樹脂）を有する別個のウェル中にピペッティングされ得る。望ましくない材料をすべて除去するために洗浄用バッファーで１回または複数回基材を洗浄した後、溶出用バッファーで１回または複数回この基材を洗浄することによって、タンパク質が基材から溶出され得る。
【００５９】
本発明の別の実施形態において、高スループット形式でタンパク質分子のライブラリーをスクリーニングするための方法が提供される。例えば、ランダムなポリヌクレオチド配列または変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーが、記載の本発明を使用して、９６ウェル・プレートにおいて酵素活性または結合特性についてスクリーニングされてもよい。各々がライブラリーの１つのメンバーをコードするプラスミドを含む細菌のコロニーが、タンパク質合成の誘導後に溶解組成物を用いて溶解されてもよく、その結果放出されたタンパク質は、このタンパク質に結合する基材を使用して分離される。望ましくない物質をすべて除去するために基材が洗浄された後、緩衝水溶液および／または遠心分離を使用して基材からタンパク質分子が溶出され９６ウェル・プレートのウェル中に収集されうる。
所望のリガンドまたは基材を含む試薬が９６ウェル・プレートの各ウェルに添加され、次いで活性または結合の存在が、所望の活性または結合特性について適切であると考えられる任意の方法によって測定され得る。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、目的の特定のタンパク質またはペプチドについてランダムに生成された変異体または合成により生成された変異体のライブラリーをスクリーニングするための方法が提供される。変異体のライブラリーは、溶解用の９６ウェル・プレートを使用して、相対的酵素活性について効率よくスクリーニングされ得る。さらに、スクリーニングは、足場（例えば、マルチ・ウェル・プレート、チップ、スライド、ウエハ、フィルタ、シート、チューブなど）上に本発明のタンパク質またはペプチドを固定することによって達成され得る。固定された本発明のタンパク質またはペプチドを含むこれらの足場は、タンパク質分子もしくはペプチド分子に結合する組成物（例えば、抗体）、タンパク質分子もしくはペプチド分子によって結合される組成物（例えば、リガンド）、または測定可能なパラメータ（例えば、ルミネセンス、色の変化、蛍光、化学ルミネセンスなど）の変化を引き起こす組成物のいずれかと接触させることが可能である。
【００６１】
ｄ．装置およびキット
本発明はまた、タンパク質を抽出および単離する際に使用するための装置に関する。従って、本発明の１実施形態において、この装置は、
（ａ）試験しようとするサンプルを入れることができるハウジング；
（ｂ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物；ならびに
（ｃ）タンパク質を結合する少なくとも１種の基材からなる。
【００６２】
ハウジングの適切な例（限定するものではない）には、ボックス、カートン、チューブ、マイクロスピン用チューブ、微量遠心分離チューブ、スピン・カートリッジ、マルチ・ウェル・プレート、バイアル、アンプル、バッグなどのような容器が含まれる。
【００６３】
タンパク質を結合する基材の代表的な例（限定するものではない）には、タンパク質またはペプチドを結合するクロマトグラフィー用の樹脂または非樹脂が含まれる。タンパク質またはペプチドを結合するクロマトグラフィー樹脂の例には、イオン交換樹脂、親和性樹脂、磁性ビーズもしくは磁性樹脂、抗体、ニッケル樹脂、ＧＳＴ樹脂などが含まれる。これらの樹脂には、抗体、タンパク質リガンド、タンパク質またはペプチドにそれ自体が共有結合し得る組成物などがさらに結合していてもよい。適切なクロマトグラフィー樹脂は、例えば、その全体が本明細書中で参考として援用される米国特許出願第６０／４１９，６１４号（２００２年１０月１８日出願）、表題「分子を分離する組成物及び方法（Compositions and Methods of Separating Molecules）」（代理人事件番号Ｂ０１７４８９３）において記載されている。本発明の別の実施形態において、この装置は、サンプル中のタンパク質を検出するかまたはサンプル中のタンパク質の量を定量するための手段、例えば該タンパク質またはペプチドに結合する抗体；該タンパク質またはペプチドの基質；該タンパク質またはペプチドに対するリガンド；該タンパク質の補因子；該タンパク質またはペプチドを修飾する酵素；および該タンパク質またはペプチドを修飾する組成物など、からさらになる。
【００６４】
本発明はまた、タンパク質分子およびペプチド分子を単離する際に使用するためのキットに関する。本発明のこのようなキットは、ボックス、カートン、チューブ、マイクロスピン・チューブ、微量遠心分離チューブ、スピン・カートリッジ、マルチ・ウェル・プレート、バイアル、アンプル、バッグなどのような１つまたは複数の容器中に含まれ得る、または前記１つまたは複数の容器を含み得る１種または複数の構成要素からなり得る。１実施形態において、本発明のキットは、
（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物；ならびに
（ｂ）キットを使用するための指示書からなる。
【００６５】
このキットにおいて使用される組成物は、固体の形態でもよいし、濃縮された水溶液もしくは使用準備のできた希釈状態の水溶液の形態でもよい。
本発明の別の実施形態において、サンプル中のタンパク質の存在について検出するための診断キットが提供される。このキットは、
（ａ）約１１〜約１６の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも１種の界面活性剤および少なくとも１種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物；
（ｂ）サンプル中に存在するタンパク質を検出または定量するための手段；ならびに
（ｃ）キットを使用するための指示書からなる。
【００６６】
本発明のキットはさらに、タンパク質および／またはペプチド精製用のさらなる組成物、洗浄用バッファー、溶出用バッファー；本発明に従って単離または精製されるタンパク質分子およびペプチド分子をさらにタンパク質プロセシング、分析または使用するのに有用であり得る１種または複数の追加の構成要素または試薬（例えば、タンパク質およびペプチドの精製、標識または検出において有用な構成要素または試薬）からなり得る。このような試薬または構成要素には、例えば、精製において補助するためにアミノ酸配列を結合する１もしくは複数の基材（例えば、ニッケル樹脂およびＧＳＴ結合樹脂）、または当業者によく知られる他の試薬が含まれ得る。タンパク質の検出および／または定量、ならびにタンパク質純度のレベルの確認は、当該分野で公知の任意の従来の手段によって実施され得る。例えば、タンパク質またはペプチドの検出および／または定量は、イムノアッセイなど任意の方法でタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定することによって、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって実施され得る。例えば、アール．ケイ．スコープス（R.K. Scopes ）、「タンパク質精製：原理と実践（Protein Purification: Principles and Practice ）」、第３版、シュプリンガー・フェアラーク社（Springer-Verlag ）、１９９４年を参照のこと。
【実施例１】
【００６７】
（細胞溶解試薬の調製）
この実施例では、幾つかの代表的な細胞溶解試薬について説明する。細胞ペレット用に、１×濃度の水性配合物の細胞溶解試薬を使用することが好ましい。細胞培地用には、１０×濃度の細胞溶解試薬が好ましい。
【００６８】
（ａ）１×濃度の細胞溶解試薬：
この１×水性配合物は、細胞ペレット（凍結または非凍結）からタンパク質またはペプチドを抽出するのに有用である。ペレットに加える配合物の量は一般に、細胞の光学密度に基づく。例えば、２００ｕｌの１×配合物を、ＯＤ６００が１．８／１ｍｌの細胞を溶解するのに使用する。この配合物は、以下の成分を含む：
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ（Sigma ）、カタログ番号Ｔ−９２８４）
１％ＭａｚｕＤＦ２０４（消泡剤、米国イリノイ州グルニー（Gurnee）所在のピーピージーインダストリーズ（PPG Industries）、カタログ番号２１３３０６−２）
０．４％Ｔｏｍａｈ（精製ＴｏｍａｈＥ−１８−１５、米国イリノイ州ロスコー（Roscoe）所在のバイオアフィニティシステムズ（Bioaffinity systems ）、カタログ番号０１６４８３）
１０ｍＭイミダゾール（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ；カタログ番号Ｉ−２３９９）
３８０Ｕ硫酸ポリミキシンＢ（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ；カタログ番号Ｐ−１００４、ロット２２Ｋ２５１７）
（ｂ）リゾチームを含む１×細胞溶解試薬
この１×水性配合物は、細胞ペレット（凍結または非凍結）から比較的大きなタンパク質またはペプチド（＞４００ｋＤ）の抽出を改善するのに有用である。ペレットに加える配合物の量は一般に、細胞の光学密度に基づく。例えば、２００ｕｌの１×配合物を、ＯＤ６００が１．８／１ｍｌの細胞を溶解するのに使用する。この配合物は、以下の成分を含む：
１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ、カタログ番号Ｔ−９２８４）
１％  ＭａｚｕＤＦ２０４（消泡剤、米国イリノイ州グルニー所在のピーピージーインダストリーズ、カタログ番号２１３３０６−２）
０．４％Ｔｏｍａｈ（精製ＴｏｍａｈＥ−１８−１５、米国イリノイ州ロスコー所在のバイオアフィニティシステムズ、カタログ番号０１６４８３）
１０ｍＭイミダゾール（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ；カタログ番号Ｉ−２３９９）
３８０Ｕ硫酸ポリミキシンＢ（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ；カタログ番号Ｐ−１００４、ロット２２Ｋ２５１７）
任意選択で、リゾチーム（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ）を加えることが可能である。
【実施例２】
【００６９】
（大腸菌からのウミシイタケ（Renilla ）ルシフェラーゼの放出）
界面活性剤およびポリミキシンＢを含む溶液で細胞を処理すると、酵素（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ）によって測定される細胞質タンパク質が、大腸菌細胞から放出される。驚くべきことに、この酵素の放出には、処理中の培養物の光学密度の観察によって測定されるような通常の細胞溶解を伴わない。
【００７０】
Ｈｉｓタグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現する大腸菌細菌を、ルリア（Luria ）ブロス［Ｌブロス］＋１０ｎｇ／ｍｌテトラサイクリン［Ｔｅｔ］［２５０ｍｌフラスコ中に培地５０ｍｌ］中で、２００ＲＰＭで回転する振とう培養器中で一晩３７℃において増殖させた。この大腸菌株は、ヒスチジン・タグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて、大腸菌を形質転換することによって作製した。このベクターは、従来の方法によって構築した。マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社（Cold Spring Harbor Laboratory ）、１９８２年を参照のこと。一晩培養した後、細菌細胞を新鮮なＬブロス＋Ｔｅｔで１：１００に希釈し、振とう培養器で３７℃において、６００ｎｍで０．６の密度まで増殖させた［ＯＤ６００  ０．６］。ウミシイタケの発現は、濾過滅菌した１Ｍ溶液のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭまで加えることによって誘導した。この培養物を、使用前に振とう培養器で３７℃においてさらに４時間増殖させた。
【００７１】
リゾチーム［Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、シグマ  Ｌ６８７６、ロット５１Ｋ７０２８］の１０ｍｇ／ｍｌ溶液は、固体状の酵素を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．３）に溶解することによって調製した。
【００７２】
１０×細胞溶解試薬［ＣＬＲ配合物Ａ］配合物は、２５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、５ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ１００［米国ミズーリ州セントルイス所在
のシグマＴ９２８４、ロット１１８Ｈ０２９７］、２ｍｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５［米国ウィスコンシン州トマー所在トマーケミカルカンパニー（Tomah Chemical Company）により供給されたもの］、２５ｍｇのポリミキシンＢ［シグマＰ−１００４、ロット２２Ｋ２５１７］を混合し、濾過処理したｎａｎｏｐｕｒｅ（Ｒ）水を加えて溶液を５０ｍｌに調整することによって作製した。
【００７３】
ウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現している大腸菌培養物１ｍｌを、１〜１２にラベル付けした１２本のチューブそれぞれに加えた：チューブ１〜３、さらなる添加なし；チューブ４〜６、１０ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム；チューブ７〜１２、１００ｕｌのＣＬＲ配合物Ａ、；チューブ１０〜１２、１００ｕｌのＣＬＲ配合物Ａおよび１０ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム。これらのチューブを１０回上下反転して混合し、次いで濁度のレベルを肉眼によって調べた：チューブ１〜３、溶液が非常に濁っている；チューブ４〜６、溶液が非常に濁っている；チューブ７〜９、溶液の濁りがわずかに少ない；チューブ１０〜１２、溶液はあまり濁っていない。
【００７４】
９００ｕｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）および１００ｕｌの上記溶液を、１２個の使い捨てプラスチック・キュベットそれぞれに加えた。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）を用いて６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）について機器のバックグラウンド値をゼロに設定した後、溶液の光学密度を測定した。以下の読み取り値が記録された：
チューブ番号      ＯＤ６００
チューブ１        ０．３１９３
チューブ２        ０．３２６６
チューブ３        ０．３２６６
チューブ４        ０．３２６４
チューブ５        ０．３２６１
チューブ６        ０．３０３３
チューブ７        ０．１７７９
チューブ８        ０．１７８９
チューブ９        ０．１７７９
チューブ１０      ０．００２０
チューブ１１      ０．００１２
チューブ１２      ０．００１３
これらのデータは、培養物について実施した希釈に関して吸光度測定値を調整した後、図１Ａにグラフとして表されている。
【００７５】
チューブ１０〜１２中の溶液の光学密度の劇的な低下は、細胞が完全に溶解したことを充分に示すものである。チューブ７〜９中では溶液の光学密度の測定可能な低下がみられたが、その光学密度の低下は、チューブ１０〜１２中で見られたものほど劇的ではなかった。これらのデータを図１Ａにグラフによって表す。
【００７６】
チューブ１〜１２中の残りの溶液を、微量遠心分離機において４℃で１０分間、全速で遠心し、上清をラベル付けした新たなチューブに移した（注：チューブ１０〜１２にはペレットはほとんど見られなかった。少量［約２０ｕｌ］の上清を上記チューブに残し、偶発的にペレットが乱れるのを防いだ）。１ｍｌのＣＬＲ配合物Ａ、９ｍｌのｎａｎｏｐｕｒｅ（Ｒ）水、および１００ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームから構成される８００ｕ１の溶液中に、ペレットを再懸濁させた。
【００７７】
３ｍｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用バッファー［米国ウィスコンシン州マディソン（Madison ）所在のプロメガ  コーポレイション（Promega Corp）、Ｅ２９
０Ａ、ロット１３３２７８０１］を、３０ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用基質［プロメガ  コーポレイション、Ｅ２８９Ａ、１３３５８３０１］と混合して、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬を作製し、その試薬の１００ｕｌサンプルを２４本の発光測定装置用チューブのそれぞれの中に入れた。次いで、取っておいた上清２マイクロリットルのサンプル、および再懸濁ペレットから２マイクロリットルを、そのそれぞれのチューブに加えた。３秒間渦流混合（vortex）することによってチューブを混合し、Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ２０／２０発光測定装置（米国カリフォルニア州サニーベール（Sunnyvale ）所在のターナーデザインズ（Turner Designs）を使用して、発光を測定した。以下の相対光度単位（ＲＬＵ）の測定値を観察した：
【００７８】
【表１】
2006507818.tif 000002
予想されたように、ほぼ全てのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が、チューブ１〜３のペレット・サンプル中に見出された。同じく予想どおり、ほぼ全てのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が、チューブ４〜６のペレット・サンプル中に見出された。なぜなら、これらの溶液中では光学密度の低下はほとんど観察されず、リゾチームだけで大腸菌細胞が溶解されるとは予想されないからである。さらに予想どおり、ほぼ全てのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が、チューブ１０〜１２の上清サンプル中に見出されたが、このことは、光学密度が劇的に低下し、これらの細胞が完全に溶解されて細胞の細胞質タンパク質であるウミシイタケ・ルシフェラーゼが培地中に放出されたであろうことが示唆されたからである。驚くべきことに、チューブ７〜９中の溶液は光学密度の低下がごくわずかであった（細胞がほぼ完全な状態であったことが示唆される）が、ほぼ全てのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が上清サンプルに見出されており、これらの細胞に与えられた処理によって酵素が培地中に放出されたことが示唆される。このデータを図１Ｂにグラフによって表す。
【実施例３】
【００７９】
（大腸菌から培地中へ酵素を失活させずに放出させる能力に関する、界面活性剤のスクリーニング）
この実施例では、幾つかの界面活性剤について、単独およびポリミキシンＢと組み合わ
せて、大腸菌細胞から細胞質タンパク質を放出させる能力に関して試験した。
【００８０】
以下の界面活性剤溶液ストックを調製した：
２グラムのデオキシコール酸、ナトリウム塩［シグマ  Ｄ６７５０、１０２Ｈ０８１１］を脱イオン水に溶かして、４％（ｖ／ｖ）のＤＯＣ溶液を作製した。
【００８１】
２グラムのラウリル硫酸、ナトリウム塩［シグマ  Ｌ４３９０、７３Ｈ００５７］を脱イオン水に溶かして、４％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ溶液を作製した。
２グラムのＴｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１４−５［トマーケミカルカンパニー、ロット７１００２−１］を脱イオン水に溶かして、４％（ｖ／ｖ）のＴｏｍａｈ  Ｅ−１４−５溶液を作製した。
【００８２】
２グラムのＴｏｍａｈ  Ｅ−１４−２［トマーケミカルカンパニー、ロット７０２２４−１］を脱イオン水に溶かして、４％（ｖ／ｖ）のＴｏｍａｈ  Ｅ−１４−２溶液を作製した。
【００８３】
２グラムのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５［トマーケミカルカンパニー、ロット６０９１１−１］を脱イオン水に溶かして、４％（ｖ／ｖ）のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５溶液を作製した。
【００８４】
２グラムのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５［トマーケミカルカンパニー、ロット６０９１１−１］を脱イオン水に溶かして、４％（ｖ／ｖ）のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５溶液を作製した。
【００８５】
２ミリリットルのＲｈｏｄａｍｅｅｎ（Ｒ）ＰＮ−４３０［ロディア、ノースアメリカンケミカルズ（Rhodia、North American Chemicals ）、ロットＳＰ８Ｂ０１７０４９］
を脱イオン水と混合して、４％（ｖ／ｖ）のＲｈｏｄａｍｅｅｎＰＮ溶液を作製した。
【００８６】
２ミリリットルのＲｈｏｄａｍｅｅｎ  ＶＰ５３２／ＳＰＢ［ロディア、ノースアメリカンケミカルズ、ロットＳＰ８Ｂ０１７０４９］を脱イオン水と混合して、４％（ｖ／ｖ）のＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ溶液を作製した。
【００８７】
２ミリリットルのＴｒｙｍｅｅｎ（Ｒ）６６０７［クラフトケミカルカンパニー（Kraft Chemical Company）、ロット８Ａ０１２０］を脱イオン水と混合して、４％（ｖ／ｖ）のＴｒｙｍｅｅｎ６６０７溶液を作製した。
【００８８】
２ミリリットルのＴｒｉｔｏｎＷ−３０［シグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical
Company）、Ｗ−３０、ロット１８Ｆ０７６６］を脱イオン水と混合して、４％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＷ−３０溶液を作製した。
【００８９】
１０ミリリットルのＴｗｅｅｎ２０（Ｒ）［シグマケミカルカンパニー、Ｐ７９４９、ロット１５Ｈ０９２９３］を脱イオン水と混合して、２０％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０溶液を作製した。
【００９０】
１０ミリリットルのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｒ）［シグマケミカルカンパニー、Ｔ９２８４、ロット１１８Ｈ０２９７］を脱イオン水と混合して、２０％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を作製した。
【００９１】
１０ミリリットルのＴｅｒｇｉｔｏｌ（Ｒ）ＮＰ−９［シグマケミカルカンパニー、ＮＰ−９、ロット４１ＫＯ１５６］を脱イオン水と混合して、２０％（ｖ／ｖ）のＴｅｒｇ
ｉｔｏｌＮＰ−９溶液を作製した。
【００９２】
１０ミリリットルのＴｗｅｅｎ８０（Ｒ）［シグマケミカルカンパニー、Ｐ１７５４、ロット４４Ｈ０１２１］を脱イオン水と混合して、２０％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０溶液を作製した。
【００９３】
１０ミリリットルのＢＲＩＪ（Ｒ）３５［シグマケミカルカンパニー、Ｐ１２５４、ロット３０Ｋ０１９８］を脱イオン水と混合して、２０％（ｖ／ｖ）のＢＲＩＪ３５溶液を作製した。
【００９４】
ポリミキシンＢ、５０ｍｇ、［シグマ  Ｐ−１００４、ロット２２Ｈ２５１７］を水に溶かして、４０ｍｌのポリミキシンＢ溶液（１０，０００Ｕ／ｍｌ）を作製した。
ｈｉｓ−タグ付きウミシイタケ・ルシフェラーゼ融合タンパク質プラスミドを含む大腸菌細胞の一晩培養物１ｍｌを、テトラサイクリンを含む新鮮なＬブロス５０ｍｌに加えた。この新しい培養物を振とう培養器において３７℃で４時間インキュベートした時点で、１ＭのＩＰＴＧを同培養物に加えて終濃度１ｍＭとした。この培養物をさらに２．５時間振とう培養器でインキュベートした時点で、培養物を溶解実験で使用した。
【００９５】
１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに、Ａ〜Ｕ、およびＢ１とラベル付けした。以下の細胞溶解溶液を調製し、一部をラベル付けしたチューブに分注した：
Ａ  ５００ｕｌの４％ＴｒｉｔｏｎＷ３０溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ（Ｒ）水
Ｂ  ５００ｕｌの４％ＤＯＣ溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｃ  ５００ｕｌの４％ドデシル硫酸ナトリウム溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｄ  ５００ｕｌの４％ＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ−５３２／ＳＰＢ溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｅ  ５００ｕｌの４％ＲｈｏｄａｍｅｅｎＰＮ−４３０溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｆ  ５００ｕｌの４％Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１４−５溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｇ  ５００ｕｌの４％Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｈ  ５００ｕｌの４％Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１４−２溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｉ  ５００ｕｌの４％Ｔｒｙｍｅｅｎ６６０７溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｊ  １００ｕｌの２０％Ｔｗｅｅｎ２０溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、６５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｋ  １００ｕｌのポリミキシンＢ溶液（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｌ  Ａと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｍ  Ｂと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｎ  Ｃと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｏ  Ｄと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｐ  Ｅと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｑ  Ｆと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｒ  Ｇと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｓ  Ｈと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｔ  Ｉと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｕ  Ｊと同じ。ただし、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌの１０，０００Ｕ／ｍｌポリミキシンＢに置き換えた
Ｂ１  ２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
チューブを閉じ、５分間渦流混合した。実証的観察によれば、チューブＣおよびＮの溶液は、混合後濁っていたようであり、チューブＨ、ＬおよびＳの溶液は、混合後わずかに乳濁していたようであった。
【００９６】
新たな０．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブにＡ〜ＵおよびＢ１とラベル付けし、上記の対応する１．５ｍｌチューブ中の溶液５０ｕｌを、対応する０．５ｍｌチューブに移した。この０．５ｍｌ微量遠心分離チューブに上述の細菌培養物２００マイクロリットルを加え、３秒間渦流混合することによって混合した。次いでこの０．５ｍｌチューブを微量遠心分離機で１２，０００ＲＰＭとして室温で５分間回転させた。上清をラベル付けした新しいチューブに移し、ペレットは−２０℃のフリーザー中に入れた。
【００９７】
ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬を実施例２と同様に作製し、その試薬１００ｕｌを発光測定装置用チューブに入れた。１０マイクロリットルの上清を、実施例２と同様に調製した２４０ｕｌの１０×細胞溶解試薬配合物Ａと混合した。希釈した上清の２連の５ｕｌサンプルを発光測定装置用チューブに加え、同チューブを２秒間渦流混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置（米国カリフォルニア州サニーベール所在のターナーデザインズ）を使用して発光を測定した。
【００９８】
−２０℃で約３０分間凍結させた後、実施例２で調製した１０×細胞溶解試薬配合物Ａ２５０ｕｌを、細胞ペレットそれぞれに加えた。次いで細胞ペレットを、約５秒間の渦流混合処理によって再懸濁させた。２連の５マイクロリットルの再懸濁ペレットを、１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬を含む発光測定装置用チューブに加え、溶液を２秒間混合し、該溶液によって発生した光を、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して測定した。以下の相対光度単位の読み取り値を記録した：
【００９９】
【表２】
2006507818.tif 000003
これらの結果は、ポリミキシンＢとともに、あるいはポリミキシンＢを含めずにＳＤＳを使用する配合物［溶液ＣおよびＮ］などの、幾つかの界面活性剤配合物は、界面活性剤を含まない対照［溶液Ｂ１］またはバッファー中にポリミキシンＢのみを含む溶液［溶液Ｋ］と比較して、酵素活性測定値の合計が非常に低いことを示している。ポリミキシンＢを含む、あるいは含まないＴｗｅｅｎ２０含有溶液［溶液ＪおよびＵ］などの他の溶液は、相当な酵素活性を保持しているが、その活性の大部分は細胞ペレット画分中にある。しかしながら、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５［溶液Ｒ］など、選択した幾つかの界面活性剤は、ポリミキシンＢの存在下で細胞から相当量の酵素を放出させ、かつ測定される総酵素活性を大幅に低下させることもない。しかしながら、これらの界面活性剤の幾つかは、ポリミキシンＢの不在下では［Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５溶液Ｇにより例示されるように］それほど多くの酵素は放出させない。Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５単独［溶液Ｇ］あるいはポリミキシンＢ単独［溶液Ｋ］ではいずれも細胞から実質的活性を有する酵素を放出しないので、これらを組み合わせて得られる溶液［溶液Ｒ］が細胞から相当量の酵素を放出させ、かつ培地中の酵素の活性を保持することが可能であることは驚きである。
【実施例４】
【０１００】
（その他の界面活性剤の試験）
この実施例では、他の界面活性剤について、実施例３で使用した実験条件と同様の条件下で、活性を有するＨｉｓ−タグ付きウミシイタケ・ルシフェラーゼを大腸菌から放出させる能力に関して試験する。
【０１０１】
実施例３で使用した培養物を作製するために使用した一晩培養物（約３６時間齢）５００マイクロリットルを使用して、５０ｍｌのＬブロス＋Ｔｅｔに接種し、この培養物を、振とう培養器で３０分間振とうしながら３７℃で増殖させた時点で、１Ｍのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）５０ｕｌを培養物に加え、この培養物をさらに２．５時間増殖させてから以下の実験に使用した。以下の溶液を作製した。ストック溶液とは、実施例３で調製したストック溶液を指すことに留意されたい。
【０１０２】
溶液      組成
Ａ        ５００ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｂ        ５００ｕｌのＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ−５３２／ＳＢＰストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｃ        ５００ｕｌのＴｒｙｍｅｅｎ６６０７ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｄ        １００ｕｌのＴｗｅｅｎ２０ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｅ        １００ｕｌのＢＲＩＪ３５ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｆ        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｇ        １００ｕｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｈ        １００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｉ        ５００ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５ストック溶液、２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｃｏｎ    ２５０ｕｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ａ’      Ａと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
【０１０３】
Ｂ’      Ｂと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
Ｃ’      Ｃと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
【０１０４】
Ｄ’      Ｄと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
Ｅ’      Ｅと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
【０１０５】
Ｆ’      Ｆと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
Ｇ’      Ｇと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌの
ポリミキシンＢストック溶液を加えた。
【０１０６】
Ｉ’      Ｉと同じ。ただし、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を１００ｕｌ減らし、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液を加えた。
３６本の１．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブに１〜３６とラベル付けし、１００ｕｌの溶液Ａをチューブ１および２に加え、１００ｕｌの溶液Ｂを３および４に加えるなどして、最後に１００ｕｌのＩ’をチューブ３５および３６に加えた。次いで、４００マイクロリットルの培養物をチューブ１〜３６に加え、チューブを５回上下反転して混合し、次いでチューブを微量遠心分離機で室温において１２，０００ＲＰＭで４分間回転させた。チューブ内の上清１０ｕｌを、２９０ｕｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に加え、混合した。この希釈した上清５マイクロリットルを、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬［実施例２参照］に加え、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を測定した。以下の測定値が記録された：
【０１０７】
【表３】
2006507818.tif 000004
前述のデータから示唆されるように、幾つかの界面活性剤配合物は、ポリミキシンＢを含まない培地で処理した大腸菌細胞から、他の界面活性剤配合物に比べて多量の細胞質タンパク質を放出させることが可能である。さらに、多くの界面活性剤は、ポリミキシンＢと組み合わせた場合に多くの細胞質タンパク質を培地に放出させる。例えば、Ｔｏｍａｈ
Ｅ−１８−５、ＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ５３２／ＳＰＢ、Ｔｒｙｍｅｅｎ６６０７、およびＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５［上記の表においてそれぞれチューブ１７と１８、３と４、５と６、および１と２で試験したもの］は、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリミキシンＢおよびバッファーを含む配合物、またはバッファーのみの配合物［それぞれチューブ７と８、１５と１６、および１９と２０で試験したもの］に比べて大腸菌の細胞質物質を非常に多く放出させる（Ｈｉｓウミシイタケ・ルシフェラーゼの放出により測定）。しかしながら、前述のように、一部の界面活性剤にポリミキシンＢを加えることによって、界面活性剤のみあるいはポリミキシンＢのみを使用するよりも効率よく活性タンパク質が放出される。例えば、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−５のみ（チューブ１７および１８）およびポリミキシンＢのみ（チューブ１５および１６）と、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−５およびポリミキシンＢ（それぞれチューブ３５および３６）との相対光度単位を比較されたい。イオン性界面活
性剤（Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５など）および非イオン性界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ１００など）のいずれも、ポリミキシンＢなどの細胞膜改変化合物と組み合わせると、大腸菌から培地へとタンパク質を放出させる際に有効である可能性があることも、前述のデータから明らかである。このデータは、図２Ａおよび図２Ｂにグラフによって表す。
【実施例５】
【０１０８】
（大腸菌からのＨｉｓ−ＰＰＥルシフェラーゼの放出のＨＬＢ試験）
この実施例では、よく知られているＨＬＢ指標を有するさまざまな界面活性剤溶液について、ポリミキシンＢと組み合わせて、大腸菌細胞から耐熱性ホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質を放出させる能力に関して試験する。ヒスチジン・タグ付きの耐熱性ホタル・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、大腸菌株を作製した。このベクターは従来の方法によって構築した。マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning:  Laboratory Manual ）」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９８２年を参照のこと。ＨＬＢ指標は、表面活性剤および界面活性剤を使用する分野の当業者によって用いられている尺度であり、マカッチャン（McCutcheon）の１９９６年第１巻「乳化剤と界面活性剤（Emulsifiers and Detergents）」（米国ニュージャージー州グレンロック（Glen Rock ）ロックロード（Rock Road ）１７５所在のマカッチャンパブリッシングカンパニー社マカッチャン部門（McCutcheon's division Mc Publishing Co. ））などの、よく知られている教本に界面活性剤およびそのＨＬＢ値のリストが載っている。前述の実施例３および４から、ポリミキシンＢの存在下でタンパク質を放出させる際に有効であった界面活性剤のＨＬＢ値を調べると、これらの界面活性剤は１１〜１６のＨＬＢ値を有しており、一方タンパク質の放出に無効であったか、あるいはタンパク質を不活性化させた可能性がある界面活性剤は、１１未満または１６を超える値を有していたことが分かった。この試験では特に、米国コネチカット州ダンベリー（Danbury ）所在のユニオン・カーバイド（Union Carbide ）から入手可能なＴｅｒｇｉｔｏｌとして知られている一連の界面活性剤を使用して、有効なＨＬＢ範囲を決定した。なぜならこれらの界面活性剤は、広範囲のＨＬＢ指標を有しているからである。この一連の界面活性剤を使用して、これらの物質がタンパク質の放出に関して、他の界面活性剤で見られたのと同じＨＬＢ指標依存性を示すかどうかを決定することができた。タンパク質の放出に関するＨＬＢ指標依存性は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌシリーズの界面活性剤を使用することによって確認可能であると考えられた。なぜならこのシリーズの界面活性剤は、ほぼ同じ化学構造を有するからである。言い換えれば、１１〜１６のＨＬＢ値を有する界面活性剤から作製したＴｅｒｇｉｔｏｌ溶液がポリミキシンＢとの組み合わせでタンパク質を効果的に放出させ、１１〜１６の範囲外の溶液ではタンパク質を効果的に放出しないことを実証することができれば、その結果によって、ＨＬＢが１１〜１６の範囲内の界面活性剤は、活性を有するタンパク質またはペプチドを細胞から効果的に放出させるであろうことが証明されると思われる。
【０１０９】
５０ｍｌのＬブロス＋Ｔｅｔに、Ｈｉｓ−ＰＰＥ−ルシフェラーゼを発現する大腸菌株を接種し、振とう培養器において３７℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、０．５ｍｌの培養物を２５０ｍｌフラスコ中の５０ｍｌの新鮮なＬブロス＋Ｔｅｔに入れて希釈し、密度がＯＤ６００で０．６に達するまで振とうしながら３７℃で増殖させた。その時点で、１ＭのＩＰＴＧを加えて終濃度１ｍＭとし、培養物をさらに６時間インキュベートしてから以下の実験で使用した。
【０１１０】
以下のストック溶液を調製した：
３ｍｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４（シグマケミカルカンパニー  ＮＰ−４  ロット５２Ｋ１２８６）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
【０１１１】
３ｍｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−７（シグマケミカルカンパニー  ＮＰ−７  ロット７９Ｈ０１０９）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
３ｍｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９（シグマケミカルカンパニー  ＮＰ−９  ロット４１Ｋ０１５６）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
【０１１２】
３ｍｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−１０（シグマケミカルカンパニー  ＮＰ−１０  ロット７８Ｈ１０９１）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
３グラムのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４０（シグマケミカルカンパニー  ＮＰ−４０  ロット１１０Ｋ０２２５）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
【０１１３】
３ｍｌのＴｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−５（シグマケミカルカンパニー  １５−Ｓ−５  ロット６１Ｋ００４０）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
３ｍｌのＴｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−１２（シグマケミカルカンパニー  １５−Ｓ−１２  ロット８１Ｋ０２９２）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
【０１１４】
３グラムのＴｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−３０（シグマケミカルカンパニー  １５−Ｓ−３０  ロット２０Ｈ０１２３）を、脱イオン水に溶かして３０ｍｌにした。
以下の溶液を作製した：
溶液        組成
Ｔ１        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ２        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−７ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ３        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ４        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−１０ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ５        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４０ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ６        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−５ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ７        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−１２ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
Ｔ８        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−３０ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水  ＴＰ１      Ｔ１と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
【０１１５】
ＴＰ２      Ｔ２と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
ＴＰ３      Ｔ３と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
【０１１６】
ＴＰ４      Ｔ４と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
ＴＰ５      Ｔ５と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
【０１１７】
ＴＰ６      Ｔ６と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
ＴＰ７      Ｔ７と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
【０１１８】
ＴＰ８      Ｔ８と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
Ｔｃｏｎ    ５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
ＴＯ−１    ２５０ｕｌの実施例３のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水
ＴＯＰ−１  ＴＯ−１と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
【０１１９】
ＴＯ−２    ２５０ｕｌの実施例３のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５ストック溶液、５００ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水。
ＴＯＰ−２  ＴＯ−２と同じ。ただし、実施例３のポリミキシンＢストック溶液１００ｕｌを、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水の代わりとする。
【０１２０】
４２本の１．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブに１〜４２の番号を付け、前述の溶液２００ｕｌを、以下に示すようにチューブに加えた。
【０１２１】
【表４】
2006507818.tif 000005
８００マイクロリットルの細菌培養物をチューブに加えて得られた溶液を混合した。チューブを室温で４分間１２，０００ＲＰＭで回転させ、上清を新たなチューブに移した。ペレットは、０．２％［ｖ／ｖ］ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２％Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５および２００Ｕ／ｍｌのポリミキシンＢを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液に再懸濁させた［使用したＴｒｉｔｏｎ、ＴｏｍａｈおよびポリミキシンＢストック溶液は、実施例３に記載されている；ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）は１Ｍストックから希釈した］。上清サンプルと再懸濁させた細胞ペレットの両方を、サンプル１部に対して１９部の割合で１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に希釈し、この溶液を混合して得られた溶液４ｕｌを、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのルシフェラーゼ・アッセイ用試薬（ＬＡＲ：プロメガ社（Promega Corp. ）のルシフェラーゼ・アッセイ用基質Ｅ１５１Ａを製造業者の説明どおりにプロメガ社のルシフェラーゼ・アッセイ用バッファーＥ１５２Ａに溶解することによって作製）に加えた。添加の直後に、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、チューブを直ちに読み取った。以下の測定値が得られた。
【０１２２】
【表５】
2006507818.tif 000006
これらの結果から示唆されるように、試験したＴｅｒｇｉｔｏｌ溶液はいずれも、単独では大部分のＨｉｓ−ＰＰＥ−ルシフェラーゼを放出することはできなかったが、幾つかのＴｅｒｇｉｔｏｌ溶液は、ポリミキシンＢと組み合わせると大部分の酵素を放出する（例えば、ポリミキシンＢを含まないＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−７［チューブ３および４］と、ポリミキシンＢを含むチューブ２３および２４を比較されたい。また、測定された酵素活性の約９５％が細胞上清中に存在するチューブ３７および３８も参照されたい）。一方他のＴｅｒｇｉｔｏｌ溶液は、ポリミキシンＢの存在下でも、酵素に放出には無効である（例えば、ポリミキシンＢを含まないＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４０［チューブ１５および１６］と、ポリミキシンＢを含むチューブ３５および３６を比較されたい）。
【０１２３】
前述のマカッチャンの参照文献が示すように、これらの界面活性剤は以下のＨＬＢ指標を有する：Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−３０、８．０；ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４、８．９；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−５、１０．５；ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−７、１１．７；ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９、１２．９；ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−１０、１３．６；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ−１２、１４．５；ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−４０、１７．８。
【０１２４】
この情報を前述の結果と組み合わせると、前述のように作製し試験した、１１未満または１６を超えるＨＬＢ指標を有するＴｅｒｇｉｔｏｌ溶液は、大腸菌細胞から培地にタンパク質を放出させる際に無効であるが、一方１１〜１６のＨＬＢ指標を有するＴｅｒｇｉｔｏｌ溶液は、培地にタンパク質を放出させる際に有効であることがわかる。したがってこれらの結果は、ＨＬＢ  １１〜１６のＨＬＢ値を有する界面活性剤は、前述のようにポリミキシンＢと配合すると、前述のように増殖させた大腸菌細胞から培地へとタンパク質を放出させると予想されることを示す。これらの結果は、図３にグラフで表す。
【実施例６】
【０１２５】
（界面活性剤／ポリミキシンＢ溶液を含む培地で処理した大腸菌からの、β−ガラクトシダーゼの放出の測定を経時的に追跡する）
この実施例では、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（タンパク質テトラマーであり活性テトラマーに関して約４６０，０００ダルトンのみかけの分子量を有する）の放出を経時的に追跡する。
【０１２６】
大腸菌株Ｗ３１１０（エール大学（Yale University ）の大腸菌ストックセンター（E.coli Genetic Stock Center: CGSC ）から入手）の一晩培養物を、振とう培養器内でＬブロス中において３７℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、培養物を新鮮なＬブロスで１：１００に希釈し、培養物の密度がＯＤ６００で０．６に達するまで３７℃で増殖させ、次いで１ＭのＩＰＴＧを加えて終濃度１ｍＭとし、培養物をさらに４時間増殖させてから以下の試験で使用した。
【０１２７】
１０×細胞溶解試薬と呼ぶことにする以下の溶液を、２５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；５ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ１００（シグマケミカルコーポレーション  Ｔ９２８４、ロット１１８Ｈ０２９７）；２ｍｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５（トマーケミカルカンパニー）；２５ｍｇのポリミキシンＢ（シグマケミカルコーポレーション  Ｐ−１００４、２２Ｋ２５１７）を混合し、ｎａｎｏｐｕｒｅ水を用いて該溶液を５０ｍｌに希釈することによって作製した。
【０１２８】
１００ｕｌの１０×細胞溶解試薬を、１、３、５、７、および９とラベル付けした５本の１．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブに加え、１００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を０とラベル付けした６番目のチューブに加えた。９００ｕｌのＷ３１１０培養物をチューブ０、１、３、５、７、および９に加えた。チューブ０と１を上下反転することによって混合し、直ちに４℃において２分間１４，０００ＲＰＭの遠心分離にかけた。残りのチューブを上下反転することによって混合し、タイマーを始動させた。チューブ３は前述と同様に５分間遠心分離し；チューブ５は混合後１５分間；チューブ７は混合後２５分間、チューブ９は混合後３０分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、ペレットがあれば、１ｍｌの１×細胞溶解試薬［１０×細胞溶解試薬１部とｎａｎｏｐｕｒｅ水９部とで希釈することによって作製］に再懸濁させた。
【０１２９】
５０マイクロリットルの上清および再懸濁させた細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）９５０ｕｌで希釈して、希釈サンプルを生成させた。
５ｍｌのアッセイ用２×バッファー（プロメガ社のキットＥ２０００  Ｂ）を５ｍｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水で希釈し、２００ｕｌを透明なマイクロタイター・プレートのウェル中に入れた。希釈サンプル５マイクロリットルを、マイクロタイター・プレートの２つの個別ウェルに加え、タイマーを始動させた。肉眼による観察で幾つかのウェルが黄色を示し始めたときに、４２０ｎｍにおける溶液の吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーで読み取った。記録した値は以下の通りであった：
【０１３０】
【表６】
2006507818.tif 000007
このデータが示すように、上記の条件下では、少量のβ−ガラクトシダーゼタンパク質が培地に放出された。このタンパク質は大きさが非常に大きく、約１１５，０００ダルトンのサブユニットのテトラマーであり、活性タンパク質の大きさは４６０，０００ダルトンである。
【０１３１】
培地に放出されるβ−ガラクトシダーゼタンパク質の量を増大させるために、実施例１（ｃ）のリゾチームを含む１×細胞溶解試薬を使用した。
ｈｉｓ−タグ付のタンパク質である、リボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（Ｒ）、ＲＮａｓｅＨＩ、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、耐熱性ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、を別々に発現することが可能な大腸菌細胞（大腸菌ＪＭ１０９または大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ菌株、それぞれ米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ  コーポレイションのＬ２００１およびＬ１１９１）を、Ｌブロス＋適切な抗生物質中で一晩インキュベートした。５マイクロリットルの一晩培養物を、５０ｍｌのＬブロスおよび適切な抗生物質の入った２５０ｍｌフラスコに移し、細菌細胞をＯＤ６００が０．４〜０．８になるまで増殖させ、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧによってタンパク質の発現を誘導した。細胞培養物を、誘導後一晩２５℃で増殖させた。この二晩目のインキュベーションの後、細菌培養物のＯＤは１．８〜３．４に達していた。それぞれの培養物１ミリリットルを、縦６列の深型ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。各縦列に１種類ずつの細菌培養物を分配した；縦列１にはｈｉｓ−ＲＮａｓｅＨＩを含む細胞、縦列２にはｈｉｓ−ヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼを含む細胞、縦列３にはｈｉｓ−ＲＮａｓｉｎを含む細胞、縦列４にはｈｉｓ−耐熱性ホタル・ルシフェラーゼを含む細胞、縦列５にはｈｉｓ−ＭＧＨを含む細胞、そして縦列６にはｈｉｓ−β−ガラクトシダーゼを含む細胞を入れた。プレートを遠心分離にかけ、上清を除去した。横列Ａのサンプルには２００ｕｌの細胞溶解試薬を加えて対照ウェルとし、横列Ｂのサンプルには２００ｕｌの細胞溶解試薬および１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム
を加えた。タンパク質精製は、Ｍａｇｎｅ−Ｈｉｓ（商標）タンパク質精製システム（カタログ番号Ｖ８５００、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ  コーポレイション）を使用して、ＢｉｏＭｅｋ（Ｒ）２０００で実施した。
【０１３２】
ＢｉｏＭｅｋ２０００でタンパク質を精製した後、各精製タンパク質サンプル２０ｕｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して目に見える状態にした。図１２中に見られるように、ゲルの上部のレーン名は、Ｍ＝分子量マーカー、１＝ｈｉｓ−ＲＮａｓｅＨＩ、２＝ｈｉｓ−ヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、３＝ｈｉｓ−ＲＮａｓｉｎ、４＝ｈｉｓ−耐熱性ホタル・ルシフェラーゼ、５＝ｈｉｓ−メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、および６＝ｈｉｓ−β−ガラクトシダーゼに対応する。図１２は、リゾチームを含まない陰性対照ゲル（−ｌｙｓｏｚｙｍｅ）と比較すると、リゾチームを細胞溶解試薬に加えることによって、試験したうちの最も大きなタンパク質であるｈｉｓ−β−ガラクトシダーゼについて、捕捉および精製されるタンパク質の量が増大したことを実証している。
【実施例７】
【０１３３】
（界面活性剤／ポリミキシンＢ溶液を含む培地で処理した大腸菌からのＧＳＴ−ホタル・ルシフェラーゼの放出に関する反応時間の試験）
この実施例では、大腸菌細胞からの約９０，０００ダルトンのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質（ＧＳＴ−ＰＰＥ−Ｌｕｃ）の放出を経時的に追跡する。ＧＳＴタグ付きのホタル・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、この大腸菌株を作製した。このベクターは従来の方法によって構築した。マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９８２年を参照のこと。細胞は実施例６と同様に増殖させた。ただし、ＧＳＴとＰＰＥルシフェラーゼの融合体を発現する大腸菌の菌株を増殖させ、Ｌブロス＋Ｔｅｔを増殖培地として使用した。
【０１３４】
実施例６と同様に、チューブにラベル付けし、操作した。各々のチューブの上清および細胞ペレット由来のサンプルを、実施例５と同様にＬＡＲに加えた。ただしこの実験では、読み取り値は１つだけとした。以下の値が記録された：
【０１３５】
【表７】
2006507818.tif 000008
前述の表（および他の実施例）に示した「活性（％）」は、測定された全体のＲＬＵ（上清およびペレット）に対する上清中に測定されたＲＬＵの割合を指す。前述のデータは、大きさ約９０，０００ダルトンのこのタンパク質は、上記の反応条件下で本発明の細胞溶解試薬を適用することによって、相当量が細胞から培地に放出されることを示す。
【実施例８】
【０１３６】
（界面活性剤／ポリミキシンＢ溶液を含む培地で処理した大腸菌からの、ＧＳＴ‐ウミシイタケ・ルシフェラーゼの放出を経時的に測定する）
この実施例では、約６０，０００ダルトンのタンパク質（ＧＳＴ−ウミシイタケ・ルシフェラーゼ）の大腸菌細胞からの放出を経時的に追跡する。ＧＳＴタグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、大腸菌株を調製した。このベクターは従来の方法によって構築した。マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９８２年を参照のこと。
【０１３７】
細胞は実施例６と同様に増殖させた。ただし、ＧＳＴとウミシイタケ・ルシフェラーゼとの融合体を発現する大腸菌の菌株を増殖させ、Ｌブロス＋Ｔｅｔを増殖培地として使用した。
【０１３８】
実施例６と同様に、チューブをラベル付けし、操作した。培地およびペレットのサンプルを採取し、そのサンプルをＬＡＲに加えた［実施例５に記載のとおり］。ただし、この実験では、読み取り値は１つだけとした。以下の値が記録された：
【０１３９】
【表８】
2006507818.tif 000009
前述のデータは、大きさ約６０，０００ダルトンのこのタンパク質は、上記の反応条件下で本発明の細胞溶解試薬を適用することによって、細胞から培地へと実質的に放出されることを示す。
【実施例９】
【０１４０】
（さまざまな濃度における界面活性剤の有効性）
この実施例では、ポリミキシンＢの存在下で大腸菌細胞からＨｉｓタグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・タンパク質を放出させる、さまざまな界面活性剤の能力を、さまざまな界面活性剤濃度で測定する。大腸菌培養物は、実施例４に記載したのと同様に増殖させた。
【０１４１】
以下の溶液を作製した。ストック溶液とは、実施例３で調製したストック溶液を指すことに留意されたい：
溶液        組成
ＡＨ        １００ｕｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、５５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＡＭ        １０ｕｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＡＬ        １ｕｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４９ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＢＨ        １００ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、５５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＢＭ        １０ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＢＬ        １ｕｌのＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４９ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＣＨ        ５００ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、１５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＣＭ        ５０ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＣＬ        ５ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４５ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＤＨ        ５００ｕｌのＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ−５２３／ＳＰＢストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、１５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＤＭ        ５０ｕｌのＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ−５２３／ＳＰＢストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＤＬ        ５ｕｌのＲｈｏｄａｍｅｅｎＶＰ−５２３／ＳＰＢストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４５ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＥＨ        ５００ｕｌのＴｒｙｍｅｅｎ６６０７ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、１５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＥＭ        ５０ｕｌのＴｒｙｍｅｅｎ６６０７ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＥＬ        ５ｕｌのＴｒｙｍｅｅｎ６６０７ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４５ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＦＨ        ５００ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、［実施例３で調製した］１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、１５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＦＭ        ５０ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６００ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水；
ＦＬ        ５ｕｌのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５ストック溶液、２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液、６４５ｕｌのｎａｎｏｐ
ｕｒｅ水；
Ｃｏｎ１    ２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、６５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水、１００ｕｌのポリミキシンＢストック溶液；
Ｃｏｎ２    ２５０ｕｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５０ｕｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水。
【０１４２】
前述の溶液それぞれ１００ｕｌを、２０本の１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに分注し、次いで４００ｕｌの細菌培養物を加えた。チューブを閉じ、５回の上下反転によって混合し、室温で４分間１３，０００ＲＰＭで回転させた。上清を取り出して新たなチューブに移し、それぞれの上清の１０ｕｌサンプルを、２９０ｕｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に加えて希釈し、希釈サンプル５ｕｌを、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬［実施例２で調製したストック溶液由来］に加え、渦流混合処理によって混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、すぐに発光を測定した。測定された相対光度単位の値は、以下の通りであった：
【０１４３】
【表９】
2006507818.tif 000010
表にみられるように、幾つかの界面活性剤は、ポリミキシンＢとの組み合わせで、前の実施例で使用した濃度よりはるかに低い濃度でも、大腸菌から培地に多量のタンパク質を放出させることが可能である。例えば、配合物ＣＨ中のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５は、前の実施例で使用した濃度と同等の濃度であり、上記の条件下で７４２．２ＲＬＵの活性を放出した。配合物ＣＬ中の同じ界面活性剤は、配合物ＣＨ中で使用された濃度のわずか１％の濃度でしか存在しなくても、ほぼ同等の量の活性［５１４．２ＲＬＵ］を放出した。このデータを、図４にもグラフ形式で表す。したがって、幾つかの界面活性剤は、非常に低い濃度であっても、酵素を放出させる際に有効である。
【０１４４】
幾つかの界面活性剤は、ポリミキシンＢを補うと非常に低い濃度でタンパク質を放出する際に一層有効であることを確認するために、別の１．５ｍｌチューブ２０本を、１〜２０に番号付けした。チューブ１〜３には１００ｕｌのＡＬ；チューブ４〜６には１００ｕｌのＢＬ；チューブ７〜９には１００ｕｌのＣＬ；チューブ１０〜１２には１００ｕｌのＤＬ；チューブ１３〜１５には１００ｕｌのＥＬ；チューブ１６〜１８には１００ｕｌのＦＬ、チューブ１９には１００ｕｌのＣｏｎ１、チューブ２０には１００ｕｌのＣｏｎ２を入れた。このチューブ１〜２０に４００マイクロリットルの前述の培養物を加え、チュ
ーブにキャップをし、５回の上下反転によって混合し、室温で５分間１２，０００ＲＰＭで回転させ、上清を取り出して新たなチューブに移した。ペレット・サンプルは、実施例２で調製した１×細胞溶解試薬に再懸濁させた。チューブ１６〜１８中にはペレットが見られなかったので、これらのチューブには１×細胞溶解試薬を加えず、したがって、これらのチューブからは細胞のペレット・サンプルは得られなかった。上清サンプルおよび再懸濁した細胞ペレット・サンプルを、１×細胞溶解試薬で１：３０に希釈し、渦流混合処理によって混合し、この物質５ｕｌを発光測定装置用チューブ中の１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した。以下の相対光度単位の読み取り値が記録された：
【０１４５】
【表１０】
2006507818.tif 000011
これらの結果から、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５およびＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−５などの幾つかの物質は、大腸菌から培地にタンパク質を放出させる際に、ポリミキシンＢと組み合わせると非常に低い濃度で驚くほど有効であることは明らかである。
【実施例１０】
【０１４６】
（さまざまな形式を使用する、培地に放出されたタンパク質の精製）
この実施例では、２つの界面活性剤によって培養培地に放出されたタンパク質の精製を親和性樹脂で試みる。これらの結果は、さまざまな界面活性剤によって、培地にタンパク質を放出させることが可能であるが、すべての界面活性剤が下流の用途について等しく有利であるとは限らないかもしれないことを示す。
【０１４７】
Ｈｉｓタグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現する大腸菌培養物を、実施例３に示したのと同様に増殖させた。ただし、この試験で使用した培養物は、ＩＰＴＧ誘導の３時間後のものとした。増殖後、培養物を３〜５０ｍｌのプラスチック製チューブに分けたが；１０ｍｌはＣＯＮとラベル付けしたチューブに入れ；２０ｍｌはＴＲＡ−１５とラベル付けしたチューブに入れ、２０ｍｌはＴＲＡ−５とラベル付けしたチューブに入れた。以下の溶液を作製した：
溶液Ｔ−５
５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｕｌのポリミキシンＢ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）［実施例３で調製したもの］、０．５ｍｌの４％ＴｏｍａｈＥ−１８−５溶液［実施例３で調製したもの］、および３．５ｍｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を合わせて混合した。
【０１４８】
溶液Ｔ−１５
Ｔ−５と同様に作製した。ただし、０．５ｍｌの４％ＴｏｍａｈＥ−１８−１５溶液［実施例３で調製したもの］を、ＴｏｍａｈＥ−１８−５の代わりに使用した。
【０１４９】
５００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）バッファー２．５ｍｌをＣＯＮチューブに加え、５ｍｌのＴ−５をＴＲＡ−５チューブに、５ｍｌのＴ−１５をＴＲＡ−１５チューブに加えた。チューブにキャップをし、室温で２分間攪拌した。３本のチューブの２連の１ｍｌサンプルを、１．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブに移し、これらのチューブを室温で４分間、１２，０００ＲＰＭで遠心した。遠心したチューブおよび遠心していないチューブの上清１０マイクロリットルを、実施例２で調製した１×細胞溶解試薬１９０ｕｌで希釈した。１秒間渦流混合した後、５ｕｌのそれぞれのサンプルを、１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を測定した。以下の読み取り値が記録された：
【０１５０】
【表１１】
2006507818.tif 000012
１．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブ６本に、Ｔ−１５Ａ〜ＣおよびＴ−５Ａ〜Ｃとラベル付けした。ＴＲＡ−１５とラベル付けしたチューブ中の溶液の１ｍｌサンプルを、Ｔ−１５Ａ〜Ｃに入れ、ＴＲＡ−５とラベル付けしたチューブ中の溶液の１ｍｌサンプルは、Ｔ−５Ａ〜Ｃ中に入れた。ニッケルが固定化された磁性シリカ樹脂の１０％（ｗ／ｖ）懸濁液（その全容を本願明細書に援用する、米国特許出願第６０／４１９，６１４号（２００２年１０月１８日出願）、表題「分子を分離する組成物及び方法（Compositions and Methods of Separating Molecules）」（代理人事件番号Ｂ０１７４８９３）に従い調製したもの）３０マイクロリットルを、Ｔ−１５ＢおよびＴ−５Ｂに加え、同樹脂１００ｕｌをＴ−１５ＣおよびＴ−５Ｃに加えた。約３０秒毎に上下反転させることによって、これらの溶液を混合した。樹脂添加後５、１０、１５、および２０分に、樹脂
を磁力でペレット状にし、上清の１０ｕｌサンプルを、１９０ｕｌの１×細胞溶解試薬で希釈し、次いでチューブを再度密封し、２０分後に最終サンプルを得るまで約３０秒毎に上下反転させることによって混合した。
【０１５１】
それぞれの時点で得た１０マイクロリットルの希釈サンプルを、発光測定装置用チューブ中の１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、１秒間渦流混合処理することによってチューブを混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した。以下の結果を得た：
【０１５２】
【表１２】
2006507818.tif 000013
このデータによって、（１）培地中に放出されるタンパク質の酵素活性は、本発明の細胞溶解試薬を用いてタンパク質を抽出し、親和性樹脂を用いてこれらのタンパク質を単離する場合には保存され得ること、および（２）酵素を捕捉するために使用する樹脂の量を増大させると、樹脂によって捕捉されるタンパク質の量も増大することが確認される。
【０１５３】
２０分の時点で測定値を得た後、５Ｂ、５Ｃ、１５Ｂおよび１５Ｃの上清を取り出して「非結合」とラベル付けした新たなチューブに移し、後のアッセイ用に保存した。樹脂ペレットを１ｍｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に再懸濁させ、次いで磁力によって再度ペレット状にした。これらの上清を、「洗浄１」とラベル付けしたチューブに移し、後のアッセイ用に保存した。別の１ｍｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を使用して、「洗浄１」の後の各樹脂ペレットを再懸濁させ、サンプルを再度ペレット状にした。各チューブの上清を、「洗浄２」とした新たなチューブに移し、後のアッセイ用に保存した。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした５００ｍＭイミダゾール５００マイクロリットルを使用して、「洗浄２」の後の樹脂粒子を再懸濁させ、粒子を含んだ状態で溶液を室温で２分間放置した。次いで樹脂を磁力によってペレット状にし、上清を取り出して「溶出タンパク質」とラベル付けした新たなチューブに入れた。これらの操作中に得られたさまざまなサンプルの分割試料１０マイクロリットルを、１９０ｕｌの１×細胞溶解試薬で希釈し、この希釈物５ｕｌを、発光測定装置用チューブ中の１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、１秒間渦流混合処理することによってチューブを混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して発光を測定した。これらのサンプルから、以下の読み取り値が記録された：
【０１５４】
【表１３】
2006507818.tif 000014
このデータは、樹脂上で捕捉された活性タンパク質は、洗浄の際は大部分が樹脂上に残っていることを示す。しかしながら、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５処理した培養物由来の活性タンパク質が樹脂から容易に溶出されうる（１５４４および２２７０の相対光度単位が生じている）が、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−５処理した培養物に関して放出されたタンパク質は上記の溶出条件下では樹脂から容易には溶出されない（Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５処理した培養物と同様の方法でアッセイすると、５．９および１６．５の相対光度単位が生じている）。
【実施例１１】
【０１５５】
（種々のＨＬＢ値の界面活性剤を用いて作製した界面活性剤／ポリミキシンＢ溶液を使用する、放出されたタンパク質の高スループット精製）
この実施例では、一定範囲のＨＬＢ指標を有する界面活性剤溶液から放出されたＨｉｓタグ付きＰＰＥホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質の精製を実証する。使用した物質は、実施例５に詳細に記載している。この実験は、実施例５に記載した界面活性剤とポリミキシンＢの組合せから単離した上清サンプルを使用することから始める。
【０１５６】
実施例５においてＴＰ２、ＴＰ３、ＴＰ４、ＴＰ７、ＴＯＰ−１およびＴＯＰ−２として示した細胞溶解試薬由来の上清の、２００ｕｌの分割試料２つを、個々のラベル付きチューブ：ＴＰ２、ＴＰ３、ＴＰ４、ＴＰ７、ＴＯＰ−１およびＴＯＰ−２中に入れた。ニッケルがキレートされた５０ｕｌの磁性シリカ樹脂［実施例１０に示したのと同様のもの］（１０％ｗ／ｖ）を、それぞれのチューブに加え、上下反転させることによってチューブを混合した。これらのチューブを、時折上下反転させながら３０分間室温でインキュベートし、次いで樹脂を磁力によってペレット状にし、上清を除去した。１５０マイクロリットルの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を使用して樹脂を再懸濁させ、再懸濁物を、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）９６ウェル・プレート［フィンランド国ヘルシンキ（Helsinki）オーイ（Oy）所在のサーモラボシステムズ（Thermo Labsystems ）、カタログ番号９７００２０８０、ロット２１３５００］の横列Ａに移した。このプレートの下記の横列には以下を添加した：横列Ｂ、１５０ｕｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；横列Ｃ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶解した１００ｍＭのＮａＣｌ；横列ＤおよびＥ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶解した５００ｍＭイミダゾール、１５０ｕｌ。次いでこのプレートを、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）磁気粒子処理装置［フィンランド国ヘルシンキ所在のサーモラボシステムズ、製品番号５４０００００］で、製造者が推奨する使い捨て器具を使用して処理した。自動装置のプログラムに従って、最初のウェル中の液体が数秒間混合された。次いで磁性樹脂が回収されて隣の横列のウェルに移されて、粒子が横列ＡからＢ、Ｃ、Ｄ、そして最後にＥへと進められ、次いで粒子がＥから取り出され、自動装置により引き続き粒子が残りのウェルへと移動された。プレートを処理した後、磁性シリカを入れた元の上清のチューブに入っている１０ｕｌの非結合試料を１９０ｕｌの１×細胞溶解試薬で希釈した。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒプレートの
横列Ｄのサンプルを、１×細胞溶解試薬を用いて１：１０に連続的に希釈した。希釈後、４ｕｌの希釈サンプルを、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、チューブを渦流混合し、Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して発光を測定した。以下の読み取り値が得られた。
【０１５７】
【表１４】
2006507818.tif 000015
非結合サンプルおよび第１の溶出サンプルの中の何％の活性酵素が第１の溶出サンプル中に存在するかを決定するために計算を行なった。これらの結果は、図６にグラフによって表す。
【０１５８】
これらの結果は、選択した範囲のＨＬＢ値を有する上記のさまざまな界面活性剤を使用して、酵素を培地中に放出させ、次いで親和性樹脂に捕捉させて放出させることが可能であることを示している。これらの結果は、本発明の溶解試薬を、タンパク質精製に有用な自動システムと組み合わせて使用することが可能であることも示している。
【実施例１２】
【０１５９】
（非磁性の固体支持体による、大腸菌から放出されたタンパク質の精製）
この実施例では、本願の根本となる物質のさまざまな異なる性質を実証する：同物質をカラム形式で樹脂と共に使用可能であること、およびさらなる実施時間が与えられれば、該タンパク質放出試薬によって、古い、保存培養物からタンパク質を放出させることが可能であることを実証する。
【０１６０】
（ａ）細胞溶解物の調製
約８００ミリリットルの大腸菌培養物を、ほぼ実施例５に記載したように増殖させた。ただし、一晩培養物の希釈を、非常に大量のＬブロス＋Ｔｅｔ［成分の割合は一定に保った］において行なった点が変更されている。ＩＰＴＧ添加後に６時間増殖させた後、培養物を４℃に１８時間置いてから使用した。
【０１６１】
５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍｌの２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液［実施例３で調製したもの］、および４６ｍｌのｎａｎｏｐｕｒｅ水を混合することによって、希釈用試薬を調製した。
【０１６２】
４℃で保存した後、フラスコを攪拌することによって細胞を培地に再懸濁させ、培養物を室温まで暖めた。室温に達した後、２本の１．５ｍｌのチューブに「処理」および「非処理」とラベル付けした。再懸濁した培養物１ｍｌを、「未処理」チューブ中に入れた。
【０１６３】
４ｇのＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、４ｇのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ  Ｔ９２８４、ロット１１８ｈ０２９７０）、および４７．６ｇのＨＥＰＥＳ（シグマケミカルカンパニー  Ｈ４０３４、ロット１０８Ｈ５４１０２）をビーカー内で混合し、約１６０ｍｌまで水を加えることによって、１０×細胞溶解試薬を調製した。この溶液を攪拌し、次いで固体ＮａＯＨ（フィッシャー（Fisher）Ｓ３１８−１、ロット９７５００６）をゆっくりと加えることによってｐＨ７．５に調整した。ｐＨ７．５に達した後、４９ｍｇの硫酸ポリミキシンＢ（シグマ  Ｐ１００４、２２Ｋ２５１７、固体１ｍｇあたり８１４０Ｕ）を該溶液中に溶かし、体積を２００ｍｌに調整した。
【０１６４】
１００マイクロリットルの１０×細胞溶解試薬を、９００ｕｌの細菌培養物とともに、「処理」とラベル付けしたチューブに入れた。上下反転させることによってチューブを混合し、「処理」および「非処理」チューブを、室温において４分間１２，０００ＲＰＭで遠心分離した。上清を新たなラベル付きチューブに移し、ペレットは１ｍｌの希釈用試薬に再懸濁させた。１０マイクロリットルの上清および再懸濁細胞を、１９０ｕｌの希釈用試薬で希釈し、この希釈物１０ｕｌを、発光測定装置用チューブに入った１９０ｕｌのルシフェラーゼ・アッセイ用試薬（ＬＡＲ）［プロメガ  コーポレイション、Ｅ１４８３、１５５１７３０１］に加え、チューブを１秒間渦流混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して発光を測定した。以下の値が記録された：
【０１６５】
【表１５】
2006507818.tif 000016
これらの読み取り値について注目すべき２つの要因が存在する。第１に、本発明の細胞溶解試薬で細胞培養物を処理すると、ルシフェラーゼ活性が明らかに増大する。具体的には、測定可能な相対光度単位の合計（上清＋ペレット）は、処理サンプルおよび非処理サンプルに関してそれぞれ１５８８．１および１２３．４６７であった。このことは、本発明の細胞溶解試薬を加えることにより、測定可能な酵素活性が約１２倍に増大することを示している。いかなる理論にも縛られるものではないが、この現象は、細胞膜に孔を形成することおよび／または細胞膜の孔を広げることによって、酵素が基質と接触しやすくなるということに起因するものかもしれない。
【０１６６】
第２に、処理サンプルおよび非処理サンプルの上清中に見出される活性の割合のみを見ると、放出されるタンパク質の割合が細胞溶解試薬を加えることによって低下したという不適切な結論に至る可能性がある。このような異常な状態は、非処理サンプルの細胞ペレット中の酵素活性を効率よく測定し得ないことによるものである。細胞ペレット中の酵素
活性を効率よく測定するというこの問題を克服するために、ペレットを１×細胞溶解試薬中に再懸濁させることが可能である。
【０１６７】
（ｂ）界面活性剤との反応時間を延長した場合の酵素放出の測定
多くの研究者は細胞培養物を長時間保存すると思われるので、さらなる試験を行なって、古い細胞培養物（言い換えれば、細胞培養物は少なくとも１８時間置いたものとした）から、細胞溶解試薬による処理時間を増大させることによって、追加の酵素が放出され得るかどうかを測定した。９１ミリリットルの前述の細胞培養物（ここでは約３６時間置いたもの）をビーカーに入れ、１ｍｌを取り出して「Ｐｒｅ」とラベル付けした１．５ｍｌチューブに移し、１０ｍｌの１０×細胞溶解試薬をビーカーに加え、ビーカーを約１分間攪拌し、次いで１ｍｌのサンプルを取り出して「ＩＮＩＴ」とラベル付けした１．５ｍｌのプラスチック製微量遠心分離チューブ中に入れた。ＰｒｅおよびＩＮＩＴチューブを、室温で４分間１２，０００ＲＰＭにて回転させ、上清を取り出して新たにラベル付けしたチューブに移した。ペレットは、１ｍｌの希釈用試薬中に再懸濁させた。培養物と細胞溶解試薬との混合物を、細胞溶解試薬の添加後５、１０、２０、および１２０分の時点でサンプリングしたが、１ｍｌのサンプルを取り出し、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブ中に入れ、室温において４分間１２，０００ＲＰＭでチューブを回転させ、上清を取り出してラベル付けした新しいチューブに移し、ペレットを１ｍｌの希釈用試薬中に再懸濁させることによって行った。１０マイクロリットルの上清および再懸濁細胞ペレットを、１９０ｕｌの希釈用試薬で希釈し、１秒間渦流混合処理することによって溶液を混合し、次いで、得られた混合物の１０ｕｌサンプルを発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのＬＡＲに加え、１秒間渦流混合処理することによってチューブを混合し、Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を直ちに読み取った。以下の読み取り値が記録された：
【０１６８】
【表１６】
2006507818.tif 000017
これらの結果は、本発明の細胞溶解試薬を一定時間培養物と共にインキュベートすることが可能であれば、時間を置いた培養物中で発現されたルシフェラーゼ活性のほぼ全てを放出させることが可能であることを示している。
【０１６９】
（ｃ）カラム系システムを使用する、活性酵素の捕捉および溶出
この項では、細胞溶解試薬溶液を樹脂カラムに直接注入して得られたタンパク質溶液は、酵素の可逆的結合および溶出用に使用可能であるという実証を示す。
【０１７０】
活性酵素の精製は一般に、該酵素を含むタンパク質の溶液を、目的の該酵素と可逆的に結合し溶出させる樹脂を含むカラムに、その樹脂と結合し溶出される他のタンパク質がほ
とんどない条件下で注入することによって行なう。しかしながら一般には、注入されるタンパク質溶解物は、培養培地から細胞を単離し、これらの細胞を（しばしばフレンチプレスの使用などの物理的手段によって）溶解し、細胞残屑を除去し、次いでタンパク質溶液を樹脂カラムにかけることによって生成する。
【０１７１】
その全容を本願明細書に援用する米国特許出願第６０／４１９，６１４号（２００２年１０月１８日出願）、表題「分子を分離する組成物及び方法（Compositions and Methods
of Separating Molecules）」（代理人事件番号Ｂ０１７４８９３）に従い調製した、ニッケルが固定化された２．５ｍｌのシリカ樹脂をカラムに入れ、別の樹脂２．５ｍｌを５０ｍｌの密封可能なチューブに入れた。Ｈｉｓ−ＰＰＥ−ルシフェラーゼ細菌培養物／細胞溶解試薬の混合物の１．５ｍｌサンプル８つを注入し、画分を回収した。８回目にサンプルを注入しているとき、カラム中の液体の流れが大幅に低下したことが示された。被験サンプル中の樹脂を再懸濁させると、カラム中の流速は元に戻った。次いでこのカラムを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした１０ｍＭイミダゾール４ｍｌで洗浄し、１ｍｌ画分を回収した。次いでカラムを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした５００ｍＭイミダゾールを１ｍｌサンプルずつ用いて複数回溶出し、１ｍｌ画分を回収した。培養物−細胞溶解試薬の混合物を注入したときに回収した画分は、希釈用試薬に１：２５に希釈し、洗浄および溶出中に回収した画分は、１：２０に希釈した。細胞溶解試薬の混合物を注入したときに回収した画分の希釈物および洗浄画分のサンプル１０マイクロリットルを、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのＬＡＲに加え、１秒間の渦流混合によってチューブを混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した；溶出中に回収した画分の希釈物の２ｕｌサンプルを、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのＬＡＲに加え、１秒間の渦流混合によってチューブを混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した。以下の読み取り値が記録された：
【０１７２】
【表１７】
2006507818.tif 000018
これらの結果は、本発明の試薬および方法を使用することによって、活性酵素が高度に捕捉され、かつ樹脂から溶出したことを示している。実際、前に記載した上清の実験において見られた活性に基づいてみると、本発明の方法を使用することによって、元の培養物中の潜在的酵素が高い割合で捕捉され溶出された。
【０１７３】
（ｄ）目的の酵素を単離するための、培地に放出されたタンパク質の一括捕捉
前項（ｃ）に示したように、細胞溶解試薬溶液を樹脂に直接適用して目的の酵素を単離することが可能である。しかしながら、この方法は、細胞および細胞残屑でカラムを詰まらせる危険があり、樹脂粒子をカラム内で再懸濁させてカラムの流れを元に戻すことが必要である。目的の酵素が樹脂と結合し、かつ細胞および細胞残屑は樹脂から移し取られる条件下において、細胞溶解試薬の混合物を樹脂に直接加えることが可能であれば、上記の閉塞の影響は回避し得る。さらに、樹脂をまとめて洗浄してからカラム内に入れることが可能であれば、目的の酵素を精製するための非常に迅速な方法、すなわち、細胞溶解試薬の混合物を形成することと、目的の酵素は樹脂と結合するが大部分の他のタンパク質は非結合状態である条件下において、この混合物に樹脂粒子を直接適用することと、任意選択で、樹脂粒子間の溶液中に存在する微量の非結合タンパク質を除去するために樹脂を洗浄することと、樹脂からタンパク質を溶出させることと、を想定することが可能である。この項では、このような精製法を記載する。
【０１７４】
２０ミリリットルの細胞溶解試薬の混合物を、５０ｍｌのプラスチック製のキャップ付
きチューブ中に入れたが、このチューブは、米国特許出願第６０／４１９，６１４号（２００２年１０月１８日出願）、表題「分子を分離する組成物及び方法（Compositions and
Methods of Separating Molecules）」（代理人事件番号Ｂ０１７４８９３）に従い調製した２．５ｍｌのニッケルでキレート化されたシリカ樹脂を含んでいた。樹脂添加の直後、５０ｍｌのプラスチック製チューブから樹脂粒子が取り出されないように注意しながら、１０ｕｌの溶液を取り出して別のチューブに入れた。チューブを閉じ、ゆっくり上下反転させることによって混合し、さらに１０ｕｌずつのサンプルを、樹脂添加の２、４、６、８、１０、２０および３０分後に採取した。樹脂を沈殿させ、上清を捨て、樹脂を２回洗浄したが、樹脂の洗浄は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールを２分割したものに樹脂を再懸濁させ、５分間ゆっくり上下反転させることによって内容物を混合し、上清を捨てることによって実施した。
【０１７５】
５ｍｌの１０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に樹脂を再懸濁（３回目）させ、次いでカラムに移し、液体のレベルがカラム中の樹脂のレベルにちょうど達するまで、液体をこのカラムに移された樹脂から排出させた。この間に溶出した液体は、後のアッセイ用に保存した。次いで、１０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）５ｍｌサンプル（×２）をカラムに加え、溶出した液体を後に使用するために回収した。５００ｍＭのイミダゾールを１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした溶出溶液をカラムに注入し、溶出した液体サンプル１ｍｌずつを回収した。
【０１７６】
溶出溶液の注入の際に幾つかの画分を回収した後、この種々の画分の１０ｕｌサンプルを、１９０ｕｌの希釈用試薬で希釈した。この希釈サンプルを１０分割した試料を、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのＬＡＲに加え、１秒間渦流混合することによってチューブを混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して発光を測定した。希釈していない溶出画分の２ｕｌ分割試料も同様に、発光測定装置用チューブに入った１００ｕｌのＬＡＲに加え、１秒間渦流混合することによってチューブを混合し、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して発光を測定した。以下の読み取り値が記録された：
【０１７７】
【表１８】
2006507818.tif 000019
【０１７８】
【表１９】
2006507818.tif 000020
【０１７９】
【表２０】
2006507818.tif 000021
これらのデータは、上述の細胞溶解試薬を使用することによって大腸菌培養物中に放出された酵素を同溶液中で直接捕捉することが可能であり、樹脂を洗浄した後に酵素を放出させることができることを実証するものである。
【実施例１３】
【０１８０】
（高スループット機能アッセイ）
この実施例では、終濃度が１×未満の本発明の細胞溶解試薬でも、細菌培養物のいかなる機械的な予備処理も必要とせずに、細胞を溶解することが可能であることを実証するための実験を行なった。この実施例は、終濃度が１×未満の本発明の細胞溶解試薬を使用して、組換えタンパク質を細菌培養物から放出させ、高スループットの機能アッセイにおいて分析することが可能であることを実証する。
【０１８１】
ラット肝臓ｃＤＮＡ由来のリボヌクレアーゼインヒビター遺伝子（米国メリーランド州ロックビル所在のオリジーンテクノロジーズ社（OriGene Technologies, Inc.））を、ＰＣＲによって増幅させ、従来の方法に従ってベクターにクローニングした。マニアティスら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９８２年を参照のこと。このベクターで大腸菌株ＪＭ１０９およびＣＡ７を形質転換し、形質転換反応物の２００ｕｌ分割試料を、９６ウェル・プレート（ファルコン（Falcon）９６ウェルＭｉｃｒｏＴｅｓｔ（商標）ＩＩＩ、蓋付き組織培養プレート；カタログ番号３０７５）に分注した。形質転換した細菌細胞を１２℃で一晩増殖させて、クローニングしたリボヌクレアーゼインヒビター遺伝子を発現できるようにした。その後、実施例１に記載した１０ｕｌの１×細胞溶解試薬を、ウェルに入っている各２００ｕｌ培養物に加え、プレートを、サーモライン（Thermolyne）Ｍａｘｉ−Ｍｉｘ
ＩＩＩ（商品名）、タイプ６５８００（米国アイオワ州ドゥビューク（Dubuque ）所在のサーモライン社、モデル番号Ｍ６５８２５）を使用して室温で２０分間軽く振とうさせた。細胞残屑は、スイング・バケット遠心分離装置（ベックマン（Beckman ）ＧＳ−６Ｒ遠心分離装置、米国カリフォルニア州フラールトン（Fullerton ）所在のベックマン・コールター（Beckman coulter ））中で、３０００ｒｐｍで１５分間、９６ウェル・プレートを遠心分離することによってウェルから除去し、それぞれのウェルからの上清の１０ｕｌ分割試料について、ＲＮＡｓｅ検出アッセイを使用してＲＮＡｓｅ阻害活性を分析した。
【０１８２】
ＲＮＡｓｅ検出アッセイは、既存の寒天プレートを用いるアッセイ（プロメガ  コーポ
レイション（Promega Corp. ）、パーツ番号ＡＢ１５０）の変法である。簡単に述べると、ＲＮＡがＲＮＡｓｅによって加水分解されるにつれて溶液のｐＨが変化し、このｐＨがＡ６５０における吸光度の変化によって検出される。活性は、吸光度の変化の総量として測定される。この検出アッセイにおいては、リボヌクレアーゼ阻害活性は、ＲＮＡｓｅが不活性であること、または吸光度の変化がないことによって測定される。サンプル（純化したクローンまたは溶解物など）を、添加した量のＲＮＡｓｅを阻害することが可能な量の野生型リボヌクレアーゼインヒビターの陽性対照、およびインヒビターを含まないＲＮＡｓｅの陰性対照サンプル（阻害が無いという意味で陰性である）と比較する。測定した吸光度の変化を、相対的活性に関して対照と比較する。
【０１８３】
材料：
トルイジンブルーＯ［シグマ  Ｔ−３２６０］
酵母菌の全ＲＮＡ［ベーリンガー・マンハイム／ロシュ（Boehringer-Mannheim/Roche ）１０９−２２３］
２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．３［プロメガ  ＬＳＳ１４７２］
２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０［プロメガ  ＬＳＳ４２２７］
８０％グリセロール［プロメガ  ＬＳＳ６２０８］
ＲＮＡｓｅＡ［シグマ  Ｒ−４６４２］
９６ウェルのマイクロタイター・プレート、Ｉｍｍｕｌｏｎ（Ｒ）、平底、ポリスチレン、［ダイネックス（Dynex ）、３４５５］
アッセイ用溶液：
２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、２ｍｇ／ｍＬの酵母菌  全ＲＮＡ、終濃度０．００７５％（ｖ／ｖ）のトルイジンブルーＯ（０．５％（ｗ／ｖ）のストックをｎａｎｏｐｕｒｅ水で作製し、１．５％（ｖ／ｖ）を溶液に加える）。溶液は４℃で保存した。
【０１８４】
手順：
サンプルを９６ウェルのマイクロタイター・プレートのウェルに等分し、サンプル・ウェルあたり１００ｕｌのアッセイ用溶液を加えた。溶液とサンプルとを混合し、時間＝０におけるサンプルの吸光度をＡ６５０で測定した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、時間＝３０におけるサンプルの吸光度をＡ６５０で測定した。６５０ｎｍで吸光度を測定することが可能な測光フィルタを備えた、Ｌｕｃｙ１マイクロプレート発光測定装置（オーストリア国バルツ／ザルツブルグ（Wals/Salzburg ）所在のアントスラボテクインスツルメンツ（Anthos Labtec Instruments ）、モデル番号１６−８００）によって、吸光度を測定した。時間＝０と時間＝３０との間の全体的な吸光度の変化を計算しプロットした。対照の吸光度の変化と実験サンプルの吸光度の変化を比較することによって、あるいはリボヌクレアーゼインヒビターサンプルの吸光度の変化：ＲＮＡｓｅＡサンプルの吸光度の変化の比と、実験サンプルの吸光度の変化：ＲＮＡｓｅＡサンプルの吸光度の変化の比とを比較することによって、データを分析することが可能である。
【０１８５】
ＲＮＡｓｅ検出アッセイのための、対照実験を行なった。阻害活性の陽性対照として、１０ｕｌのＲＮＡｓｅ希釈用バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５％グリセロール）とＲＮＡｓｅＡを組み合わせて終濃度１ｎｇ／ｕｌとした。１０ｕｌ（約２０Ｕ）の精製ラット・リボヌクレアーゼインヒビターを反応に加え、約１〜２分間反応させた。阻害の陰性対照は、陽性対照と同じプロトコルに従い、ラット・リボヌクレアーゼインヒビターを加えないものとした。さらに、酵素を含まないバッファーのみの陰性対照を使用した。全てのサンプルに関して、吸光度を測定した。図１０および１１を参照のこと。これらの結果は、遠心分離なしで細菌細胞を直接溶解するために本発明の細胞溶解試薬を使用することが可能であることを実証している。この手法は、以下の高スループットのタンパク質機能アッセイを試験するのに有用である。
【実施例１４】
【０１８６】
（異なる組換えタンパク質の高スループット精製）
この実施例では、本明細書に記載の発明の細胞溶解バッファーを、幾つかの異なるポリヒスチジン‐タグ付きのタンパク質；リボヌクレアーゼインヒビター、ＲＮａｓｅＨＩ、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、熱安定性ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＭＧＨ、およびヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼの高スループット精製に使用した。これらのＨｉｓ‐タグ付きタンパク質の細菌細胞からの精製は、ヒスチジン‐タグ付きタンパク質のアフィニティ精製用のキットを使用して行なった。ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）タンパク質精製システム（プロメガ  コーポレイション、カタログ番号Ｖ８５００）。このキットは、ニッケル結合磁気粒子、結合／洗浄用バッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのイミダゾール）、溶出用バッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）および５００ｍＭのイミダゾール）、および実施例１に記載した本発明の細菌細胞溶解試薬を含む。
【０１８７】
さまざまなｈｉｓ‐タグ付きタンパク質を発現することが可能な細菌細胞を、ＯＤ６００  ０．４〜０．６まで増殖させ、終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを加えることによって、タンパク質の発現を誘導した。細胞をさらに３時間増殖させ、１ｍｌのそれぞれの培養物を、９６ウェルのプレートに等分した。遠心分離によって細胞をペレット状にし、培養培地を除去した。その後、２００ｕｌの細胞溶解試薬をそれぞれのペレットに加え、ペレットを再懸濁させ、混合物を１０分間振とうさせながらインキュベートし、さらに精製するためにプレートをベックマン（Beckman ）Ｂｉｏｍｅｋ（Ｒ）２０００に配置した。得られた溶解物を１００ｕｌ分割試料としてＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）粒子（３０ｕｌ）に直接加えた。次に、タンパク質が結合した粒子を、洗浄／結合用バッファーで処理した。続いて、０．５Ｍのイミダゾールを含むバッファーを用いてタンパク質を溶出させた。次いで、溶出サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１８８】
これらの結果は図７に示し、図の上部のレーン番号は、それぞれのレーン中に矢印によって示した精製Ｈｉｓタグ付きタンパク質に対応する；Ｍ＝分子量マーカー、１＝Ｈｉｓ−ＲＮａｓｅＨＩ、２＝Ｈｉｓ−ヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、３＝Ｈｉｓ−ＲＮａｓｉｎ、４＝Ｈｉｓ−熱安定性ホタル・ルシフェラーゼ、５＝Ｈｉｓ−ＭＧＨ、および６＝Ｈｉｓ−β−ガラクトシダーゼ。これらの結果は、自動システム（robotics platform ）で多数のＨｉｓタグ付きタンパク質を精製する際に、本発明の細胞溶解試薬が適用可能であることを示す。
【実施例１５】
【０１８９】
（遠心分離を伴わない溶解細胞からのタンパク質の精製）
この実施例では、ｈｉｓ‐メチオニルｔＲＮＡ合成酵素を発現することができる大腸菌ＪＭ１０９細胞を使用した。実施例１４に記載したようにして細胞を増殖させ誘導した。誘導後、１ｍｌの細胞を２本の異なるチューブそれぞれに等分し、サンプルを遠心分離にかけ、細胞ペレットを回収した。細胞溶解試薬の２００ｕｌ分割試料をそれぞれのペレットに加え、この混合物を室温で１０分間インキュベートした。溶解後、サンプルの１つを遠心分離にかけて、細胞残屑および他の混入物を除去した。このチューブには「遠心分離サンプル」とラベル付けした。もう１つのサンプルは、全く遠心分離せずに処理した。このサンプルには「非遠心分離サンプル」とラベル付けした。
【０１９０】
ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）精製粒子（３０ｕｌ）（ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）タンパク質精製システム（プロメガ  コーポレイション、カタログ番号Ｖ８５００）を両方のサンプルに直接加え、混合物を完全に混合させた。粒子を結合用バッファーで洗浄し、０．５Ｍのイミダゾールを含む結合用バッファーを用いて、タンパク質を溶出させた。次いで、
これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。これらの結果を図８に示す。レーン番号１〜４は実験サンプル；１）遠心分離した粗溶解物５ｕｌ、２）遠心分離した溶解物由来の精製タンパク質２０ｕｌ、３）遠心分離していない粗溶解物の５ｕｌサンプル、４）遠心分離していない溶解物由来の精製タンパク質２０ｕｌ、に対応する。レーン５は分子量マーカーを含む。
【０１９１】
これらの結果は、（１）本発明の細胞溶解試薬は、さまざまな自動システムで組換えタンパク質を精製するために使用可能であり、（２）本明細書に記載の本発明の方法を使用して、９６ウェル・プレートのそれぞれのウェルからタンパク質を均一に精製することが可能であることを示している。
【実施例１６】
【０１９２】
（複数のシステムにおける、溶解細胞からのタンパク質の自動精製）
この実施例では、細菌細胞培養物中で発現された組換えタンパク質を、本発明の方法を使用した高スループットのタンパク質精製のためのマルチ−ウェル形式で精製した。３つの自動システム、すなわちＢｅｃｋｍａｎ  ＦＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ（Ｒ）２０００、およびＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ（Ｒ）ＲＳＰについて、高スループットのタンパク質精製に関して評価した。
【０１９３】
実施例５に記載したのと同様に調製した、ｈｉｓタグ付きの熱安定性ホタル・ルシフェラーゼを発現可能な細菌細胞を、ＯＤ６００  ０．４〜０．６まで増殖させ、終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを加えることによって、タンパク質の発現を誘導した。細胞をさらに３時間増殖させ、１ｍｌの培養物を９６ウェルのプレートのすべてのウェルに等分した。遠心分離によって細胞をペレット状にし、培養培地は除去した。その後、実施例１に記載した１×細胞溶解試薬２００ｕｌを、深型９６ウェル・プレートのそれぞれのウェルに等分した。ペレット／試薬を、それぞれのウェルを１０回のピペット操作によって混合させ、オービタル・シェーカーで５分間プレートを攪拌した。この溶解物の分割試料１００ｕｌを各ウェルから取り出し、３０ｕｌのＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）精製粒子の入った第２のプレートに移した。溶解物と粒子とを最初にピペットによって混合し、さらにオービタル・シェーカーで１分間混合した。このプレートをＭａｇｎａＢｏｔ（Ｒ）磁気デバイス［プロメガ  コーポレイション、パーツ番号Ｖ８１５１］上に１分間置いた。
【０１９４】
素通りした液体（廃物）を、３つの各自動システムについて予め定義したコンピュータ・プログラムを使用して、自動操作によって除去した。さらに１００ｕｌの溶解物を各ウェルに加えた。溶解物と粒子をピペット操作によって混合し、さらにオービタル・シェーカー上で１分間混合した。このプレートを再度、ＭａｇｎａＢｏｔ（登録商標）磁気デバイス上に１分間置いた。素通りした液体を除去し、１００ｕｌの洗浄／結合用バッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭのイミダゾール）を使用して、粒子を洗浄した。粒子を３分間振とうさせ、プレートをＭａｇｎａＢｏｔ（登録商標）デバイス上に１分間置いた。洗浄／結合用バッファーを除去した。１００ｕｌの洗浄／結合用バッファーを加え、この工程をさらに２回繰り返した。次いで、ピペット操作および１分間の振とうによって、粒子とバッファーを再懸濁させた。
【０１９５】
サンプル操作の後、９６ウェル・プレートを、ＭａｇｎａＢｏｔ（登録商標）磁気デバイス上に１分間置き、２００ｕｌの溶出バッファー［１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾール］を加えた。溶出したタンパク質は、分析用に別のプレートに移した。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図９参照）。
【０１９６】
これらの結果は、（１）本発明の細胞溶解試薬は、さまざまな自動システムで組換えタンパク質を精製するために使用可能であり、（２）本明細書に記載の本発明の方法を使用
して、９６ウェル・プレートのそれぞれのウェルから、タンパク質を均一に精製することが可能であることを示している。
【実施例１７】
【０１９７】
（細胞を透過性にする第２の物質オクチル‐β‐チオグルコピラノシドを使用する、大腸菌細胞からのタンパク質の放出）
この実施例では、さまざまな試薬配合物について、大腸菌細胞からタンパク質を放出させる能力に関して比較する。これらの配合物は、２つの異なる化学試薬、ポリミキシンＢまたはオクチル‐β‐チオグルコピラノシドを使用するが、これらの試薬は単独で、互いに組み合わせて、タンパク質の活性を安定化させることが可能な界面活性剤［ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびＴｏｍａｎ  Ｅ−１８−１５］と組み合わせて、大腸菌細胞を透過性にすることが知られている。
【０１９８】
以下の溶液を作製した。
ＰＲＳ＃１  ２％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、１００Ｕ／ｍｌのポリミキシンＢ、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）
ＰＲＳ＃２  ＰＲＳ＃１と同じ。ただし、６％（ｗ／ｖ）のオクチル‐β‐チオグルコピラノシドも含む
ＰＲＳ＃３  １０％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、３％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、１００ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、６％のオクチル‐β‐チオグルコピラノシド
ＰＲＳ＃４  ＰＲＳ＃３と同じ。ただし、Ｔｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５は含まない
ＰＲＳ＃５  ２％のＴｏｍａｈ  Ｅ−１８−１５、２％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのイミダゾール、６％（ｗ／ｖ）のオクチル‐β‐チオグルコピラノシド
ＰＲＳ＃６  ＰＲＳ＃５と同じ。ただし、６％（ｗ／ｖ）オクチル−β−チオグルコピラノシドは含まない
実施例５に記載したのと同様に調製した、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ由来のｈｉｓタグ付き熱安定性ルシフェラーゼを発現する培養物を、振とうさせながら３７℃で一晩、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンも含むルリアブロス中で増殖させた。１ｍｌの種菌ストックを調製し、−７０℃で保存した。実験の日に、１ｍｌの種菌ストックを使用して、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのルリアブロスに接種し、この培養物を０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで振とうさせながら２５℃で増殖させた。この時点で、１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド、プロメガカタログ番号Ｖ３９５１）を、終濃度１ｍＭで培養物に加え、振とうさせながら室温で一晩、培養物を増殖させる。
【０１９９】
翌日、ＰＲＳ＃１〜＃６の２連の１００ｕｌサンプルを、ラベル付けした１．５ｍｌのチューブに入れた。次いで９００マイクロリットルずつの一晩培養物をこの１．５ｍｌチューブに加え、室温で１０分間上下反転させることによって、チューブを混合させた。
【０２００】
１０分間の上下反転操作の後、このチューブの２００ｕｌサンプルを別のチューブ中で４℃にて微量遠心分離機において全速で１５分間回転させ、無傷の細胞および細胞残屑をペレット状にした。回転させた後、上清を注意深く取り出してラベル付けした新たなチューブに移した。
【０２０１】
回転処理していない残りの細胞サンプルおよび上清サンプル１０マイクロリットルを、９９０ｕｌの１×細胞溶解試薬（２５ｍＭのＴｒｉｓ−リン酸ｐＨ７．８、２ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭの１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸、１０％グリセロール、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血
清アルブミン）を含めたもの）に希釈し、希釈した溶液は氷上で保存した。ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬（ＬＡＲ）（１．０７ｍＭの炭酸マグネシウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２．６７ｍＭの硫酸マグネシウム、３３．３ｍＭのジチオスレイトール、０．２７ｍＭのコエンザイムＡ、０．５３ｍＭのＡＴＰおよび０．４７ｍＭのルシフェリン）の１００ｕｌサンプルを、Ｔｕｒｎｅｒ発光測定装置用チューブに入れた。５マイクロリットルの希釈サンプルを、ＬＡＲの入った発光測定装置用チューブの１つに加え、このチューブを１〜２秒間混合させ、次いで、反応によって生成した光を、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して読み取った。以下の値が記録された：
【０２０２】
【表２１】
2006507818.tif 000022
これらのデータは、タンパク質を安定化する界面活性剤を細胞に透過性をもたらす種々の試薬と共に使用して、タンパク質を大腸菌細胞から培地中に効果的に放出させることが可能な溶液を作製することができることを示している。タンパク質の放出は、上清および全溶解物のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって確認された。
【実施例１８】
【０２０３】
（タンパク質を安定化する界面活性剤をオクチルβチオグルコピラノシドの溶液に加えることによって、安定化をもたらす該化学物質を含まない溶液に比べてタンパク質の活性を損ねない溶液を作製することが可能である。
【０２０４】
この実施例では、タンパク質を安定化する界面活性剤の存在下または不在下において、オクチルβチオグルコピラノシドの溶液を、ホタル・ルシフェラーゼと共にインキュベートする。安定化をもたらす界面活性剤を含む溶液は、該界面活性剤を含まないオクチルβチオグルコピラノシドの溶液よりも、酵素活性を有意に高く保持することが示されるであろう。
【０２０５】
以下の溶液を作製した：
試験溶液＃１  ６％のオクチルβチオグルコピラノシドを、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした溶液
試験溶液＃２  試験溶液＃１と同じ。ただし、１０％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ１００も含む
試験溶液＃３  前述の実施例１７中のＰＲＳ＃３と同じ
試験溶液＃４  ６％のオクチルβチオグルコピラノシド、２％のＴｒｉｔｏｎＸ１００（ｖ／ｖ）、２％のＴＯＭＡＨ  Ｅ−１８−１５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に溶かした溶液
前述の試験溶液４０マイクロリットルを、２連のチューブ中に３６０ｕｌの脱イオン水を用いて１：１０に希釈した。１×細胞溶解試薬（２５ｍＭのＴｒｉｓ−リン酸ｐＨ７．８、２ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭの１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸、１０％グリセロール、１％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００を含む１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、プロメガカタログ番号Ｗ３８４１））（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡも含む）の入った１つの最終組のチューブを、２連のチューブ中に置いた。１組のチューブを氷上に置き、もう一方は室温に保つ。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来の野生型ルシフェラーゼを含む溶液（４ｕｌの２５ｍＭトリス酢酸ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２Ｍ硫酸アンモニウム、１５％のグリセロール、３０％のエチレングリコール、１４．６ｕｇ／ｕｌのルシフェラーゼ；溶液は使用時まで−７０℃で保存）を全チューブに加え、氷上あるいは室温で２０分間インキュベートした。２０分間のインキュベーションの後、全ての溶液を１×細胞溶解試薬（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡも含む）で１／１００に希釈した。
【０２０６】
実施例１６に記載したルシフェラーゼ・アッセイ用試薬の１００マイクロリットルのサンプルを、Ｔｕｒｎｅｒ発光測定装置用チューブに入れた。ＢＳＡを含むＣＣＬＲに希釈した酵素ストックの１０マイクロリットルのサンプルを加え、チューブを混合させ、ＴｕｒｎｅｒＴＤ２０／２０発光測定装置を使用して光を読み取った。各サンプルについて２連で光を読み取った。以下の値が得られた。
【０２０７】
【表２２】
2006507818.tif 000023
これらのデータは、タンパク質を安定化する試薬を加えることによって、オクチルβチオグルコピラノシドの存在下における、ルシフェラーゼ酵素の安定性が大幅に改善されたことを実証する。これらの物質を加えることによって、細胞タンパク質放出試薬による大腸菌細胞からのタンパク質の放出が妨げられることはないことを実証した前述の実施例１７のデータと組み合わせると、これらのデータは、これらの試薬を組み合わせることによって、タンパク質放出試薬を単独で使用するよりも改善されたタンパク質放出物質がもたらされることを実証する。なぜなら、組み合わせることによって、放出試薬による害を受ける可能性があるタンパク質活性の保持の助けとなるからである。
【０２０８】
本発明をある程度具体的に記載し例示してきたが、当業者であれば、本発明の思想から逸脱せずに、本明細書で開示してきたものについて、変形、追加および省略を含めたさまざまな変更形態を作製可能であることを理解するであろう。したがって、これらの変更形態も本発明に含まれるものであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲について法律上従うことが可能な最も広い解釈によってのみ制限されるものと考えられる。本願明細書に引用した全ての参照文献は、それらの全容を本願明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１ａ】実施例２に記載のように種々の配合物で処理した細菌溶液の見かけの細胞培養物密度を示す棒グラフ。
【図１ｂ】実施例２に記載のように種々の溶液で大腸菌培養物を処理した際の、培地および細胞ペレットにおける酵素の相対的酵素レベルを示す棒グラフ。
【図２ａ】実施例４に記載のような、種々の界面活性剤を使用した、酵素の培地中への放出を示す棒グラフ。
【図２ｂ】実施例４に記載のような、種々の界面活性剤をポリミキシンＢと組み合わせて使用した、酵素の培地中への放出を示す棒グラフ。
【図３】実施例５に記載のような、ポリミキシンＢと組み合わせた種々のＴｅｒｇｉｔｏｌ（Ｒ）界面活性剤溶液による酵素の放出を示す棒グラフ。
【図４】実施例１１に記載のような、種々の界面活性剤濃度における、大腸菌からのタンパク質の培地中への放出を示す棒グラフ。
【図５】実施例１０に記載のような、Ｔｏｍａｈ（Ｒ）Ｅ−１８−１５界面活性剤を含む細胞溶解試薬を使用して大腸菌から放出された培地中のタンパク質の捕捉および溶出を相対的に示す棒グラフ。
【図６】実施例１１に記載のような、大腸菌細胞から培地中への酵素の放出後に、親和性樹脂に結合して溶出された活性酵素の割合（％）を示す棒グラフ。
【図７】実施例１４に記載のように、細胞溶解試薬を使用してロボットを用いて複数のタンパク質の精製について相対的な精製度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真。（細胞溶解用バッファーを使用した、自動システムにおける複数のタンパク質の精製。）矢印は対応するタンパク質を示す。レーン１：Ｈｉｓ−ＲＮａｓｅＨＩ；レーン２：Ｈｉｓ−ヒト化ウミシイタケ（Renilla ）ルシフェラーゼ；レーン３：Ｈｉｓ−ＲＮａｓｉｎ；レーン４：Ｈｉｓ−熱安定性ホタル・ルシフェラーゼ；レーン５：Ｈｉｓ−ＭＧＨ；レーン６：Ｈｉｓ−βガラクトシダーゼ；Ｍ：分子量マーカー。
【図８】実施例１５に記載のような、遠心分離した細胞に対して遠心分離していない細胞のタンパク質純度を相対的に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真。（遠心分離した細胞と遠心分離していない細胞の比較。）レーン１：遠心分離した溶解物、サンプル５μｌ；レーン２：遠心分離した溶解物から精製したタンパク質、サンプル２０μｌ；レーン３：遠心分離していない溶解物、サンプル５μｌ；レーン４：遠心分離していない溶解物から精製したタンパク質、サンプル２０μｌ；レーン５：分子量マーカー。
【図９】実施例１６に記載のように、異なるロボット・プラットホームにおいて１×細胞溶解試薬を使用してタンパク質を高スループット精製した場合のタンパク質純度を相対的に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真。（異なる自動システムにおいて１×細胞溶解試薬を使用したタンパク質の高スループット精製。Ａ１‐Ｈ８は、９６ウェル・プレートのウェルに相当する。）
【図１０】実施例１３に記載のような高スループット・アッセイにおけるＪＭ１０９細胞の溶解を実証する棒グラフ。
【図１１】実施例１３に記載のような高スループット・アッセイにおけるＣＡ７細胞の溶解を実証する棒グラフ。
【図１２Ａ】リゾチームの非存在下（−ｌｙｓｏｚｙｍｅ）におけるタンパク質の放出を実証する図。レーン１：Ｈｉｇｈ−ＲｎａｓｅＨＩ；レーン２：Ｈｉｓ−ヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ；レーン３：Ｈｉｓ−ＲＮａｓｉｎ；レーン４：Ｈｉｓ−熱安定性ホタル・ルシフェラーゼ；レーン５：Ｈｉｓ−メチオニルｔＲＮＡ合成酵素；およびレーン６：Ｈｉｓ−β−ガラクトシダーゼ。
【図１２Ｂ】リゾチーム（lysozyme）の存在下（＋Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）におけるタンパク質の放出を実証する図。レーン１：Ｈｉｇｈ−ＲｎａｓｅＨＩ；レーン２：Ｈｉｓ−ヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ；レーン３：Ｈｉｓ−ＲＮａｓｉｎ；レーン４：Ｈｉｓ−熱安定性ホタル・ルシフェラーゼ；レーン５：Ｈｉｓ−メチオニルｔＲＮＡ合成酵素；およびレーン６：Ｈｉｓ−β−ガラクトシダーゼ。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
2006507818.tif 000025
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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