(57)【要約】本発明は、被験体における肺疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする被験体にＳＰ−Ｃ治療薬を含む治療的有効量の処方物を投与することを包含する方法を提供する。好ましくはＳＰ−Ｃ治療薬は、単離ＳＰ−Ｃタンパク質、ＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子、受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体、または医薬上許容可能なそれらの組成物からなる群から選択される作用物質である。本発明は、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊を有するマウスの産生方法も提供する。本発明は、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊により産生されるトランスジェニックマウスも提供する．本発明はさらに、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊により産生されるトランスジェニックマウスからの細胞または細胞系統を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、該哺乳類が、内因性サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子のコード配列中に標的化破壊を保有し、そして哺乳類の表現型が家族性ＳＰ−Ｃ欠損を有するヒトにおける変化と一致する肺障害症状により特徴付けされるよう、前記標的化破壊が野生型サーファクタントタンパク質Ｃの産生を抑制する哺乳類。
【請求項２】
間質性肺炎と一致する組織学的特徴を有する重症進行性肺障害を発症する請求項１に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３】
該哺乳類の表現型が、気腫、単球浸潤物、繊維症、上皮細胞形成異常、ならびにＩＩ型上皮細胞および肺胞マクロファージにおける細胞内脂質の非定型蓄積からなる群から選択される少なくとも１つの表現型を含む請求項２に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項４】
肺障害症状が家族性ＳＰ−Ｃ欠損を有するヒトにおける変化と一致する請求項３に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項５】
サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子における破壊に関してヘテロ接合性である請求項４に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項６】
サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子における標的化破壊に関してホモ接合性である請求項４に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項７】
前記表現型が肺組織に対する損傷を包含する請求項４に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項８】
マウスである請求項４に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項９】
１２９／Ｓｖマウス系統から得られる請求項８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０】
前記破壊がエクソン２の挿入破壊により作製される請求項８記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１１】
前記標的化破壊が前記野生型サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子のエクソン２におけるＡｐａＬ１部位に少なくともヌクレオチド位置１６６７を包含する請求項８記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２】
前記標的化破壊が前記サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子のコード配列の少なくとも５０連続ヌクレオチドの欠失により作製される請求項４記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類。
【請求項１３】
内因性サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子のコード配列における標的化破壊を含有するトランスジェニックマウスからの細胞または細胞系統。
【請求項１４】
前記マウスが１２９／Ｓｖマウス系統から得られる請求項１３に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１５】
前記破壊がエクソン２の挿入破壊により作製される請求項１３に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１６】
前記破壊が前記野生型サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子のエクソン２におけるＡｐａＬ１部位に少なくともヌクレオチド位置１６６７を包含する請求項１５に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１７】
前記標的化破壊がサーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子のコード配列の少なくとも５０連続ヌクレオチドの欠失により作製される請求項１３に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１８】
未分化細胞である請求項１３記載の細胞または細胞系統。
【請求項１９】
未分化細胞が幹細胞、胚幹細胞、卵母細胞および胚細胞からなる群から選択される請求項１４に記載の細胞または細胞系統。
【請求項２０】
サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊を有するマウスの産生方法であって、以下の：
ａ．マーカーに置き換えられた前記ＳＰ−Ｃ遺伝子の内部部分を有するＳＰ−Ｃ遺伝子の部分を含むノックアウト構築物を作製する過程であって、ＳＰ−Ｃ遺伝子コード配列の少なくとも５０連続ヌクレオチドが欠失されている、過程と、
ｂ．前記ノックアウト構築物を胚幹細胞の集団にトランスフェクトし、かつ前記マーカーを発現するトランスフェクト化ＥＳ細胞を選択する過程と、
ｃ．前記トランスフェクト化ＥＳ細胞を前記マウスの先祖の胚中にトランスフェクト化ＥＳ細胞を導入する過程と、
ｄ．前記胚を、その生殖系列中にノックアウト構築物を有するキメラマウスを産生する時期まで発生させる過程と、
ｅ．前記キメラ哺乳類を繁殖させる過程であって、それにより、ＳＰ−Ｃ遺伝子における標的化破壊を有するヘテロ接合性マウスを産生する、繁殖させる過程と
を包含する方法。
【請求項２１】
サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子の一部を含むサーファクタントタンパク質Ｃノックアウト構築物であって、前記ＳＰ−Ｃ遺伝子の内部部分が選択可能マーカーにより置き換えられて、そしてＳＰ−Ｃ遺伝子コード配列の少なくとも５０連続ヌクレオチドが欠失された構築物。
【請求項２２】
前記選択可能マーカーがチミジンキナーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である請求項２１に記載のＳＰ−Ｃノックアウト構築物。
【請求項２３】
前記マーカーがネオマイシン耐性遺伝子である請求項２１に記載のＳＰ−Ｃノックアウト構築物。
【請求項２４】
肺症状に対する有効性に関する作用物質の試験方法であって、以下の：
ａ．サーファクタントタンパク質Ｃヌル対立遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニックマウスを生成することであって、前記トランスジェニックマウスは気腫、単球浸潤物、繊維症、上皮細胞形成異常、ならびにＩＩ型上皮細胞および肺胞マクロファージにおける細胞内脂質の非定型蓄積からなる群から選択される表現型を示す、こと
ｂ．前記作用物質を前記トランスジェニック動物に投与することであって、前記表現型を改善する作用物質は前記症状に対する有効性を有する作用物質として選択される、こと
を包含する方法。
【請求項２５】
前記マウスの先祖が１２９／Ｓｖマウス系統である請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
マウスが１２９／Ｓｖマウス系統から得られる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記サーファクタントタンパク質Ｃヌル対立遺伝子が内因性サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子のコード配列における標的化破壊により作製される請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記サーファクタントタンパク質Ｃヌル対立遺伝子がエクソン２の挿入的破壊により作製される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記破壊が野生型サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子のエクソン２におけるＡｐａＬ１部位に少なくともヌクレオチド位置１６６７を包含する請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記サーファクタントタンパク質Ｃヌル対立遺伝子が前記サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子のコード配列の少なくとも５０連続ヌクレオチドの欠失により作製される請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類がＳＰ−Ｃノックアウトマウスである請求項４に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３２】
前記哺乳類がｐｒｏＳＰ−Ｃノックアウトマウスである請求項３１記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
ＳＰ−Ｃを発現しない請求項４記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３４】
活性ＳＰ−Ｃを発現しない請求項４に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３５】
前記マウスがＳＰ−Ｃノックアウトマウスである請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記マウスがｐｒｏＳＰ−Ｃノックアウトマウスである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記マウスがＳＰ−Ｃを発現しない請求項２４記載の方法。
【請求項３８】
前記マウスが活性ＳＰ−Ｃを発現しない請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
被験体における肺疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする被験体へのＳＰ−Ｃ治療薬を含む治療的有効量の処方物の投与を包含する方法。
【請求項４０】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が、単離ＳＰ−Ｃタンパク質、ＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子、受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体、または医薬上許容可能なそれらの組成物からなる群から選択される作用物質である請求項１記載の方法。
【請求項４１】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬がＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子であり、該核酸分子が転写制御配列に操作可能に連結される請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸分子が被験体の気道細胞中で発現される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＰ−Ｃポリペプチド、断片、相同体または実質的相同性を有する変異体をコードする核酸がＳＰ−Ｃ機能を供給する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸分子が染色体ＤＮＡに組み込まれるようになって、被験体の気道細胞のゲノムを作り上げる請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸分子が染色体外位置から被験体の気道細胞により発現される請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸分子が少なくとも５０ヌクレオチドを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸分子が少なくとも２００ヌクレオチドを含む請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
前記気道細胞が平滑筋細胞および上皮細胞からなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記単離核酸分子がリポソーム送達ビヒクルと複合されて前記哺乳類に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記単離核酸分子がウイルスベクター送達ビヒクル中で哺乳類に投与される請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルスベクター送達ビヒクルがアデノウイルスからである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記単離核酸分子が、前記哺乳類の肺に投与される場合、前記哺乳類の細胞中で発現される請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患が好酸球性炎症に関連した気道の慢性閉塞性肺疾患である請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、気道閉塞、アレルギー、喘息、急性炎症性肺疾患、慢性炎症性肺疾患、慢性閉塞性肺形成異常、気腫、肺気腫、慢性閉塞性気腫、成人呼吸窮迫症候群、気管支炎、慢性気管支炎、慢性喘息性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および間質性肺疾患からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が哺乳類における肺炎症を低減する請求項４０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が約０．１μｇ／哺乳類の体重１ｋｇ〜約１０ｍｇ／哺乳類の体重１ｋｇの量で投与される請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が医薬上許容可能な賦形剤中で投与される請求項４０に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳類がヒトである請求項４０に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が鼻および吸入経路からなる群から選択される少なくとも１つの経路により投与される請求項１記載の方法。
【請求項６２】
肺疾患が、喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、過敏性肺臓炎、職業性喘息、気道過敏症症候群、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎および寄生虫性肺疾患からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項６３】
哺乳類における炎症反応を包含する呼吸器疾患に関連した気道過敏性および／または気道狭窄のための治療の処方方法であって、以下の：ａ．受容体単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体；ならびにＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、該核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）からなる群から選択されるＳＰ−Ｃ治療薬を哺乳類の肺に投与すること；ｂ．該哺乳類における惹起作用物質に対する応答における肺機能の変化を測定することであって、それにより、前記ＳＰ−Ｃ治療薬が気道過敏性を変調するか否かを確定する、；およびｃ．肺機能の変化に基づいて炎症を低減するのに有効なＳＰ−Ｃ治療薬を前記哺乳類に投与することを包含する薬理学的療法を処方することを包含する方法。
【請求項６４】
炎症を包含する呼吸器疾患に関連した気道過敏性、気道狭窄および／または気道繊維症から哺乳類を防御するための処方物であって、好酸球性炎症を低減するのに有効な抗炎症薬、ならびに受容体単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体；およびＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、該核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）からなる群から選択されるＳＰ−Ｃ治療薬を含む処方物。
【請求項６５】
医薬上許容可能な賦形剤を含む請求項６４に記載の処方物。
【請求項６６】
生体適合性ポリマー、その他の高分子マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微小粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、脂質球、ウイルスベクターおよび経皮送達系からなる群から選択される制御放出ビヒクルを含む請求項６４に記載の処方物。
【請求項６７】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質である請求項６４に記載の処方物。
【請求項６８】
ＳＰ−Ｃ治療薬がＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、該核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）である請求項６４に記載の処方物。
【請求項６９】
前記単離核酸分子がリポソーム送達ビヒクルと複合される請求項６８に記載の処方物。
【請求項７０】
前記単離核酸分子がウイルスベクター送達ビヒクルである請求項６８に記載の処方物。
【請求項７１】
ウイルスベクター送達ビヒクルがアデノウイルス由来である請求項７０に記載の処方物。
【請求項７２】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体である請求項６４に記載の処方物。
【請求項７３】
前記ＳＰ−Ｃ治療薬が、単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質ならびにＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、該核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）からなる群から選択される請求項６４に記載の処方物。
【請求項７４】
前記抗炎症薬が、抗ＩｇＥ、免疫調節薬、ロイコトリエン合成阻害剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、グルココルチコステロイド、ステロイド化学的誘導体、抗シクロオキシゲナーゼ薬、β−アドレナリン作動薬、メチルキサンチン、クロモン、抗ＣＤ４試薬、抗ＩＬ−５試薬、界面活性剤、サイトキシンおよびヘパリンからなる群から選択される請求項６４に記載の処方物。
【請求項７５】
前記抗炎症薬が、ロイコトリエン合成阻害剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、グルココルチコステロイド、β−アドレナリン作動薬、メチルキサンチンおよびクロモンからなる群から選択される請求項６４に記載の処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／４３１，９４９号（２００２年１２月９日出願）（この出願の記載内容は、参照されて本明細書中の一部とする）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により授与された補助金ＨＬ５６３８７およびＨＬ５００４６下での政府支援により成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、１つまたは複数の肺サーファクタントタンパク質遺伝子の発現が抑制された哺乳類を提供する。特に本発明は、内因性遺伝子の発現低減または完全抑制を示すノックアウト非ヒト哺乳類を産生するためのサーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子の不活性化欠失に関する。本発明は、このようなノックアウト哺乳類の調製方法、ならびに肺サーファクタントタンパク質経路における混乱（perturbation）に関連した疾患または障害を治療するための治療薬およびレジメンの有効性を評価するためのノックアウト哺乳類の使用方法を提供する。
【０００４】
ＳＰ−Ｃは、肺の肺胞中のＩＩ型上皮細胞中で選択的に発現される３４〜３５アミノ酸ペプチドである［再検討のためには１、２］。単一ＳＰ−Ｃ遺伝子は、第１４染色体上に位置するマウスにおけるものに対してシンテニー(syntenic)であるヒト第８染色体上に位置する。ＳＰ−Ｃ遺伝子は、パルミトイル化され、タンパク質分解的にプロセシングされ、そして粗面小胞体および多小胞体を通って、層状体に送られ、そこで界面活性剤が貯蔵される１９７または１９１アミノ酸のプロタンパク質（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）をコードする。ＳＰ−Ｃペプチドは空隙に分泌され、そこで、それはリン脂質の安定性および拡張を増強する。ＳＰ−Ｃペプチドは、高疎水性であり、ＮＨ２末端ドメインに２つのシステイン残基も含有する。これらのシステインはパルミトイル化され、２３残基のうち１９がバリン、ロイシンまたはイソロイシンである延長疎水性ドメイン近くに置かれる。この疎水性領域は、脂質二分子層にまたがるαらせん構造を形成する［３］。αらせんドメインおよびシステイン結合パルミトイル基はともに、リン脂質に密に会合される。ＳＰ−Ｃはリン脂質アシル鎖パッキングを破壊して、空気−液体界面で単一層および多重層へのリン脂質の動員を増強する［４、５］。これらの特徴は、多重層皮膜間のリン脂質の動きを促進する場合のＳＰ−Ｃに関する構造的役割を示唆する。精製ＳＰ−Ｃまたは合成ＳＰ−Ｃペプチドの生物学的機能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで非常に活性であり、脂質の界面活性剤特性を増強し、そして界面活性剤欠損動物における肺機能を回復させる［６、７］。これらの結果は、ＳＰ−Ｃが肺胞におけるリン脂質皮膜の拡張および安定化において重要な役割を果たす、ということを示す。
【０００５】
ＳＰ−Ｃ遺伝子における突然変異がヒトにおける特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）に関連するということを実証する近年の研究により、肺恒常性におけるＳＰ−Ｃの予期せぬ役割が提示された［８、９］。これらの患者における肺疾患は、常染色体優性形質として受け継がれた。間質性肺炎は、種々の肺障害、例えば剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ならびに特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）と広義に呼ばれているその他の障害を包含する［１０］。これらの障害を有する個体は、通常は、運動制限、頻呼吸および呼吸不足に関連した進行性肺疾患を呈する。ＳＰ−Ｃプロタンパク質における突然変異は、十分にプロセシングされない異常プロＳＰ−Ｃペプチドの産生を生じたため、ＳＰ−Ｃそれ自体の欠如あるいはプロＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｃのミスフォールディングがこれらの患者におけるＩＩＰの病因に関与したか否かは明らかになっていない［５］。概して、種々の形態のＩＩＰは、肺胞炎症、単球マクロファージによる肺浸潤、肺構造の進行性損失および肺繊維症に関連する［１０］。十分に認識された組織学的および臨床的症状発現にもかかわらず、ＩＩＰの病因に関与する分子メカニズムは分かりにくい。
【０００６】
遺伝子操作ゲノムを有する動物には２つの基本型が存在する。伝統的トランスジェニック哺乳類はそのゲノムに導入された修飾遺伝子を有し、そして修飾遺伝子は外因性または内因性起源のものであり得る。「ノックアウト」哺乳類は、遺伝子操作により内因性遺伝子の発現の抑制を特徴とする特定型のトランスジェニック哺乳類である。特定内因性遺伝子の破壊は、遺伝子のある部分を欠失することにより、またはそれを他の配列で置き換えて、ヌル対立遺伝子を生成することにより成し遂げられ得る。ヌル対立遺伝子を有する異種交配哺乳類は、遺伝子の活性コピーを欠くホモ接合性哺乳類を生じる。
【０００７】
多数のこのような哺乳類が開発されてきたが、医学的発達に非常に役立つ。例えば米国特許第６，２４５，９６３号明細書は、脊髄性筋萎縮症のノックアウト−トランスジェニックマウスモデルを詳述し、そして米国特許第６，４１４，２１９号明細書は、オステオポンチンノックアウトマウスを詳述する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＳＰ−Ｃ媒介性肺疾患のトランスジェニック動物モデルは、肺疾患を治療または予防し得る医薬的作用物質を同定するために非常に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［発明の説明］
類似遺伝子系統１２９ＪＳＶ中のＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの生成は、ＳＰ−Ｃの遺伝的切除が、進行性重症繊維症、誘導気道におけるムチン遺伝子ＭＵＣ５の発現、誘導気道における上皮細胞形成異常、気腫、肺胞血管リモデリングおよび右心肥大を引き起こす、という意外な知見を生じた。意外にも、界面活性剤濃度における関連異常の非存在下で発症される重症肺病態、ならびにＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺から単離される肺界面活性剤の表面特性における最少変化が観察された。これらの知見は、ＳＰ−Ｃ／プロＳＰ−Ｃそれ自体の特異的欠如が重症肺疾患を引き起こす、ということを実証する。
【００１０】
ＳＰ−Ｃにおける優性遺伝性遺伝子突然変異（ミスフォールディングされたプロタンパク質の産生、ならびに正常タンパク質の発現破壊を引き起こす）を保有するヒトにおいて、プロＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｃそれ自体の欠損はまた、肺疾患を引き起こす。肺疾患の病態としては、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ならびに他の形態の間質性肺疾患が挙げられる。
【００１１】
本発明は、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、質量分光分析およびタンパク質シーケンシングを用いた組織または洗浄肺物質中のＳＰ−ＣまたはプロＳＰ−Ｃの非存在に基づいた診断的スクリーニングの使用を提供する。
【００１２】
本発明は、遺伝子移入により、正常対立遺伝子を発現するためのベクターが、これらの肺障害の治療のために有益であるか、または精製ＳＰ−Ｃ、プロＳＰ−Ｃまたは組換えＳＰ−Ｃまたは組換えプロＳＰ−ＣあるいはＳＰ−ＣまたはプロＳＰ−Ｃ類似体によるタンパク質置換が有益であるかにかかわらず、プロＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｃの置換も提供する。ＳＰ−Ｃは、界面活性剤様リン脂質、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリンを含有する医薬上有用な調製物のエーロゾルまたは吸入により投与され得る。
【００１３】
本発明は、間質性肺疾患のための療法を試験するための、ならびにＳＰ−Ｃ（−／−）マウスに認められる重症肺疾患に関与するかまたは該疾患を引き起こす活性化されたまたは抑制された分子経路を確定するためのモデルを提供するＳＰ−Ｃ（−／−）マウスも提供する。
【００１４】
本発明は、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊を有するマウスの産生方法を提供する。本発明は、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊により産生されるトランスジェニックマウスも提供する。本発明はさらに、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子における標的化破壊により産生されるトランスジェニックマウスからの細胞または細胞系統を提供する。本発明はさらに、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子の一部を含むサーファクタントタンパク質Ｃノックアウト構築物であって、上記ＳＰ−Ｃ遺伝子の内部部分が選択可能マーカーにより置換され、そしてＳＰ−Ｃ遺伝子コード配列の少なくとも５０連続ヌクレオチドが欠失された構築物を提供する。好ましくはＳＰ−Ｃ欠損ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスは、間質性肺炎と一致する組織学的特徴を有する重症進行性肺障害を発症する。
【００１５】
ＳＰ−Ｃ欠損マウスは、誘導および末梢気道における気胸、びまん性肺胞繊維症、単球浸潤物および上皮細胞形成異常に関連した重症進行性肺疾患を発症した。マウスにおけるプロＳＰ−Ｃの標的化欠失は、ヒトにおける間質性肺炎と類似した症候を引き起こす。
【００１６】
一態様において、本発明は、肺障害の治療に有用な薬剤またはその他の治療レジメンのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングおよび評価に用いるためのトランスジェニック非ヒト生物および細胞系統を提供する。一実施形態では、本発明は、肺界面活性剤遺伝子における標的化破壊を有するトランスジェニック動物である。特に遺伝子は、ＳＰ−Ｃ遺伝子である。動物は、破壊遺伝子に関してキメラ、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。ホモ接合性ノックアウトＳＰ−Ｃ哺乳類は、肺症状、例えば気腫、単球浸潤、繊維症、上皮細胞形成異常、ならびにＩＩ型上皮細胞および肺胞マクロファージ中の細胞内脂質の非定型蓄積（atypical accumulation）を発症する強い傾向を有する。標的化破壊は、遺伝子中のどこでも、それが機能性ＳＰ−Ｃタンパク質の産生を抑制するという要件のみに左右される。
【００１７】
マウスサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子のＤＮＡ配列（GenBank寄託番号Ｍ３８３１４）は、配列番号１で示される。マウスＳＰ−Ｃ遺伝子のエクソンＤＮＡ配列（GenBank寄託番号Ｍ３８３１４）は、配列番号２で示される。マウスサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）のポリペプチド配列（GenBank寄託番号ＡＡＡ４００１０）は、配列番号３で示される。ヒトサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子のＤＮＡ配列（GenBank寄託番号Ｊ０３８９０）は、配列番号４で示される。ヒトサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）のポリペプチド配列（GenBank寄託番号ＡＡＣ３２０２２）は、配列番号５で示される。ヒトサーファクタントタンパク質Ｃ１（ＳＰ−Ｃ１）のＤＮＡ配列（GenBank寄託番号ＡＡＣ３２０２３）は、配列番号６で示される。
【００１８】
好ましい実施形態では、破壊は、野生型遺伝子のエクソン２内で起きる。さらに好ましい実施形態では、破壊は、野生型遺伝子のエクソン２におけるＡｐａＬ１部位でのヌクレオチド１６６７の少なくとも１つの破壊を含む。トランスジェニック動物は任意の種（ヒトを除く）のものであり得るが、好ましくは哺乳類である。好ましい実施形態では、非ヒト動物はサーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子における標的化破壊を含み、この場合、標的化破壊に関してホモ接合性である非ヒト動物の表現型が肺障害症状により特徴付けされるよう、上記標的化破壊は野生型サーファクタントタンパク質Ｃの産生を抑制する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子における標的化破壊を含有する細胞または細胞系統を特徴とする。好ましい実施形態では、細胞または細胞系統は、未分化細胞、例えば幹細胞、胚幹細胞、卵母細胞または胚細胞である。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、サーファクタントタンパク質遺伝子における標的化破壊を有する非ヒト哺乳類の産生方法を特徴とする。例えばＳＰ−Ｃノックアウト構築物は、マーカーに置き換えられた上記ＳＰ−Ｃ遺伝子の内部部分を有するＳＰ−Ｃ遺伝子の部分を含むＳＰ−Ｃノックアウト構築物が作製され得る。ノックアウト構築物は次に、胚幹細胞（ＥＳ）の集団にトランスフェクトされ得る。トランスフェクト細胞は、マーカーを発現するときに選択され得る。次にトランスフェクト化ＥＳ細胞は、上記哺乳類の先祖の胚中に導入され得る。胚は、その生殖系列中にノックアウト構築物を有するキメラ哺乳類を産生する時期まで発生させられ得る。上記キメラ哺乳類を繁殖させて、ＳＰ−Ｃ遺伝子における標的化破壊を有するヘテロ接合性哺乳類を産生する。ホモ接合体は、ヘテロ接合体を交雑することにより生成され得る。
【００２１】
別の態様では、本発明は、上記の動物を生成するために用いられ得るＳＰ−Ｃノックアウト構築物を特徴とする。一実施形態では、ＳＰ−Ｃ構築物はサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）遺伝子の一部を含み、この場合、遺伝子の内部部分は選択可能マーカーに置き換えられる。好ましくはマーカーはネオマイシン耐性遺伝子であり、ＳＰ−Ｃ遺伝子の部分は少なくとも２．５ｋｂ長、あるいは７．０または９．５ｋｂ長である（置換部分および任意のＳＰ−Ｃフランキング配列を含む）。内部部分は、好ましくはエクソンの少なくとも一部におよび、最も好ましくはそれは野生型遺伝子のエクソン２におけるＡｐａＬ１部位での少なくともヌクレオチド１６６７である。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、肺症状を治療および／または予防する場合の有効性に関して作用物質を試験するための方法を特徴とする。一実施形態では、方法は、上記のようなトランスジェニック動物または細胞系統を用い得る。例えば試験作用物質はトランスジェニック動物に投与され、そして肺症状を改善する作用物質の能力が、上記肺症状に対する有効性を有するとして採点され得る。界面活性剤構成成分による任意の肺症状は、これらの哺乳類を用いて試験され得るが、特に、ＳＰ−Ｃタンパク質の欠如により特徴付けされる症状が試験される。該方法は、ＳＰ−Ｃ肺タンパク質およびそれらの下流構成成分を置換するのに有効である作用物質を試験するためにも用いられ得る。
【００２３】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと類似のまたは等価の方法および材料が本発明の実施または試験に用いられ得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書中に記述された出版物、特許出願、特許およびその他の参考文献は全て、具体的にこれらの記載内容が参照されて本明細書中の一部とする。不一致の場合、定義を含め、本明細書が統制する。さらに、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、本発明を限定するよう意図されない。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
［発明の詳細な説明］
【００２５】
以下の説明において、組換えＤＮＡ技術に用いられる複数の用語が専ら利用される。このような用語を与えるべき範囲を含めて、明細書および特許請求の範囲の明白な且つ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提示する。
【００２６】
「アゴニスト」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＳＰ−Ｃ生物活性を模倣するかまたは上方調節する（例えば効力を高めるかまたは補足する）作用物質を指すことを意味する。ＳＰ−Ｃアゴニストは、野生型ＳＰ−Ｃタンパク質または野生型ＳＰ−Ｃの少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体であり得る。ＳＰ−Ｃ治療薬も、ＳＰ−Ｃ遺伝子の発現を上流調節するか、あるいはＳＰ−Ｃタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大する化合物であり得る。アゴニストは、任意のクラスの分子、好ましくは小分子、例えば核酸、タンパク質、炭水化物、脂質またはそれらの組合せであり得る。
【００２７】
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書中で用いる場合、少なくとも１つのＳＰ−Ｃ生物活性を下方調節する（例えば抑制するかまたは阻害する）作用物質を指すことを意味する。アンタゴニストは、ＳＰ−Ｃ座遺伝子の発現を下方調節するか、あるいは存在するＳＰ−Ｃタンパク質の量を低減する化合物であり得る。ＳＰ−Ｃアンタゴニストは、ＳＰ−Ｃ  ＲＮＡと特異的に相互作用し得るＳＰ−Ｃアンチセンス核酸またはリボザイムでもあり得る。さらにその他のＳＰ−Ｃアンタゴニストは、ＳＰ−Ｃポリペプチドと結合し、そしてその作用を阻害する分子である。このような分子としては、ペプチドが挙げられる。さらにその他のＳＰ−Ｃアンタゴニストとしては、結合がＳＰ−Ｃ遺伝子座ポリペプチドの生物学的機能を阻害するよう、ＳＰ−Ｃ分子のエピトープと特異的に相互作用する抗体が挙げられる。
【００２８】
「対立遺伝子」という用語は、「対立遺伝子変異体」と本明細書中で互換的に用いられ、代替的形態の遺伝子またはその一部を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同一遺伝子座または位置を占める。被験体が遺伝子の２つの同一対立遺伝子を有する場合、被験体はその遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合性であるといわれる。被験体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、被験体はその遺伝子または対立遺伝子に関してヘテロ接合性であるといわれる。特定遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチド中でまたはいくつかのヌクレオチド中で互いに異なり得るし、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。しばしば起こる配列変異としては、トランジション変異（即ちプリン→プリン置換およびピリミジン→ピリミジン置換、例えばＡ→ＧまたはＣ→Ｔ）、トランスバーション変異（即ちプリン→ピリミジンおよびピリミジン→プリン置換、例えばＡ→ＴまたはＣ→Ｇ）、ならびに反復ＤＮＡ配列における変化（例えばトリヌクレオチド反復およびその他のタンデム反復配列の伸長および収縮）が挙げられる。遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含有する遺伝子の形態でもある。「ＳＰ−Ｃ遺伝子の多型領域の対立遺伝子変異体」という用語は、他の個体におけるその遺伝子の領域に見出される１つまたは数個のヌクレオチド配列差を有するＳＰ−Ｃ座遺伝子の領域を指す。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「肺疾患」という用語は、原因または病因とは関係なく、気腫、単球浸潤物、繊維症、上皮細胞形成異常、ならびにＩＩ型上皮細胞および肺胞マクロファージにおける細胞内脂質の非定型蓄積により特徴付けされる肺疾患の集合体に関連があると当業者に一般に認識される障害および症状を指す。これらの例としては、気腫および間質性肺炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的機能」という用語は、本明細書中での目的のために互換的に用いられ、ＳＰ−Ｃポリペプチドにより（ネイティブ立体配座であれ、変性立体配座であれ）、あるいはその任意のサブ配列により、直接または間接的に実施される機能を意味する。ＳＰ−Ｃ生物活性は、ＳＰ−Ｃポリペプチドに直接的に影響を及ぼすことにより、変調され得る。あるいはＳＰ−Ｃ生物活性は、ＳＰ−Ｃポリペプチドのレベルを変調することにより、例えばＳＰ−Ｃ遺伝子の発現を変調することにより、変調され得る。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「ＳＰ−Ｃポリペプチドの生物活性断片」という用語は、全長ＳＰ−Ｃポリペプチドの断片を指すが、この場合、断片は野生型ＳＰ−Ｃポリペプチドの活性を特異的に模倣するかまたは拮抗する。
【００３２】
「異所性活性」という用語は、ポリペプチド、例えばＳＰ−Ｃの活性に適用される場合、野生型またはネイティブポリペプチドの活性とは異なる、あるいは健常被験体におけるポリペプチドの活性とは異なる活性を指す。ポリペプチドの活性は、それがそのネイティブ同等物の活性より強いため、異所性であり得る。あるいは、活性は、それがそのネイティブ同等物の活性と比較して弱いかまたは存在しないため、異所性であり得る。異所性活性は活性における変化でもあり得る。細胞は、ＳＰ−Ｃ遺伝子座ポリペプチドをコードするＳＰ−Ｃ座遺伝子の過剰発現または低発現のため、異所性ＳＰ−Ｃ活性を有し得る。
【００３３】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる用語である。このような用語は、特定の被験体細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫も指す、と理解される。突然変異または環境的影響のため後に続く世代において或る種の修飾が起こり得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一でありえないが、依然として本明細書中で用いられるような用語の範囲内に含まれる。
【００３４】
「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、被験体ＳＰ−Ｃ遺伝子座ポリペプチドのうちの１つをコードする第一のアミノ酸配列と、ＳＰ−Ｃポリペプチドの任意のドメインにとって異物であり、実質的に相同でないドメイン（例えばポリペプチド部分）を限定する第二のアミノ酸配列との融合体である。キメラポリペプチドは、第一のポリペプチドも発現する生物体中に見出される（異なるポリペプチド中ではあるが）外来ドメインを提示し得るし、あるいはそれは、異なる種類の生物により発現されるポリペプチド構造の「種間」、「遺伝子間」融合体等であり得る。概して、融合ポリペプチドは一般式Ｘ−ＳＰ−Ｃ−Ｙ（式中、ＳＰ−ＣはＳＰ−Ｃポリペプチドに由来するポリペプチドの部分を表し、そしてＸおよびＹは独立して、存在しないかまたは生物体中のＳＰ−Ｃ配列に関連しないアミノ酸配列、例えば自然発生突然変異体を表す）により表され得る。
【００３５】
「配列番号ｘで記述されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列」という語句は、配列番号ｘを有する核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列を指す。「相補鎖」という用語は、本明細書中では、「相補体」という用語と互換的に用いられる。核酸鎖の相補体は、コード配列の相補体または非コード配列の相補体であり得る。二本鎖核酸に言及する場合、配列番号ｘを有する核酸の相補体は、配列番号ｘを有する鎖の相補鎖を指すか、あるいは配列番号ｘの相補鎖のヌクレオチド配列を有する任意の核酸を指す。配列番号ｘのヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸に言及する場合、この核酸の相補体は、配列番号ｘのものと相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸である。ヌクレオチド配列およびその相補的配列は、常に５’から３’方向に示される。
【００３６】
既知のように、遺伝子は、個体のゲノム内に単一または多重コピーで存在し得る。このような重複遺伝子は、同一であり得るし、あるいは或る種の修飾、例えばヌクレオチド置換、付加または欠失を有し得るが、これらは全て、同一活性を実質的に有するポリペプチドを依然としてコードする。したがって「ＳＰ−ＣポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」という用語は、特定個体内の１つまたは複数の遺伝子を指し得る。さらにヌクレオチド配列中の或る種の差は、個々の生物間に存在し、これが対立遺伝子と呼ばれる。このような対立遺伝子差は、依然として同一生物学的活性を有するポリペプチドをコードするコードポリペプチドのアミノ酸配列の差を生じることもあり得る。
【００３７】
「遺伝子の破壊」および「標的化破壊」という語句、あるいは任意の類似の語句は、遺伝子の野生型コピーと比較した場合の、細胞中のその遺伝子の発現を防止するためのネイティブＤＮＡ配列の部位特異的遮断を指す。遮断は、遺伝子に対する欠失、挿入または修飾、あるいはそれらの任意の組合せにより引き起こされ得る。
【００３８】
「ハプロタイプ」という用語は、（連鎖不平衡で存在する）一群として一緒に遺伝される一組の対立遺伝子を指す。本明細書中で用いる場合、ハプロタイプは、統計学的に有意のレベル（ｐ＜０．０５）で生じるハプロタイプを含むと定義される。本明細書中で用いる場合、「ＳＰ−Ｃハプロタイプ」という語句は、ＳＰ−Ｃ遺伝子座におけるハプロタイプを指す。
【００３９】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間の、または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のために一列に並べられ得る各配列中の位置を比較することにより確定され得る。比較配列中の位置が同一塩基またはアミノ酸により占められる場合には、分子はその位置で同一である。核酸配列間の相同性または類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一または適合ヌクレオチドの数の一関数である。アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列により共有される位置での同一アミノ酸の数の一関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、アミノ酸配列により共有される位置でのアミノ酸、即ち構造的に関連したアミノ酸の数の一関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本発明のＳＰ−Ｃ遺伝子座配列のうちの１つと４０％未満の同一性を、しかし好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【００４０】
「相互作用する」という用語は、本明細書中で用いる場合、分子間の検出可能な関係または関連（例えば生化学的相互作用）、例えば事実上、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、およびタンパク質−小分子または核酸−小分子の間の相互作用を含むことを意味する。
【００４１】
「ＳＰ−Ｃ関連」という用語は、本明細書中で用いる場合、ヒト第８染色体上のヒトＳＰ−Ｃ座遺伝子に関連した全てのマウスおよびヒト遺伝子を含むことを意味する。
【００４２】
「ＳＰ−Ｃ」という用語が、遺伝子産物またはポリペプチドに対する参照において用いられる場合、それは、ヒト第８染色体上のサーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子座によりコードされる全ての遺伝子産物およびそれらに対応するマウス相同体を指すことを意味する。
【００４３】
「ＳＰ−Ｃ治療薬」という用語は、種々の形態のＳＰ−Ｃポリペプチド、ならびに天然ＳＰ−Ｃポリペプチドの作用を模倣するか、または増強する（作動する）か、または阻害する（拮抗する）ことにより、ＳＰ−Ｃポリペプチドの少なくとも１つの活性を変調し得るペプチド模倣物、核酸または小分子を指す。野生型ＳＰ−Ｃポリペプチドの活性を模倣するかまたは増強するＳＰ−Ｃ治療薬は、「ＳＰ−Ｃアゴニスト」である。逆に、野生型ＳＰ−Ｃポリペプチドの活性を阻害するＳＰ−Ｃ治療薬は、「ＳＰ−Ｃアンタゴニスト」である。
【００４４】
「単離された」という用語は、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書中で用いる場合、高分子の天然供給源中に存在するそれぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。例えば被験体のＳＰ−Ｃポリペプチドのうちの１つをコードする単離核酸は、好ましくは、天然ではゲノムＤＮＡ中のＳＰ−Ｃ遺伝子に直に隣接する５キロベース（ｋｂ）以下の核酸配列を、さらに好ましくは１０ｋｂ以下のこのような天然フランキング配列を、最も好ましくは５ｋｂ未満のこのような天然フランキング配列を含む。単離されたという用語は、本明細書中で用いる場合、組換えＤＮＡ技術により産生される場合には細胞物質、ウイルス物質または培地を、あるいは化学的に合成される場合には化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含有しない核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語は、他の細胞タンパク質から単離されるポリペプチドを指すためにも本明細書中で用いられ、そして精製および組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
【００４５】
「ノックアウト」という用語は、内因性遺伝子の発現の部分的または完全抑制を指す。これは一般に、遺伝子の一部を欠失することにより、または一部を二次配列で置き換えることにより成し遂げられるが、遺伝子に対する他の修飾、例えば停止コドンの導入、重大なアミノ酸の突然変異、イントロン連結部の除去等によっても引き起こされ得る。
【００４６】
「ノックアウト構築物」という用語は、細胞中の内因性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を低減するかまたは抑制するために用いられ得る核酸配列を指す。簡単な例では、ノックアウト構築物は、活性タンパク質がそれから発現され得ないよう、遺伝子の重大部分に欠失を有する遺伝子、例えばＳＰ−Ｃ遺伝子からなる。あるいは複数の終結コドンがネイティブ遺伝子に付加されて、タンパク質の早期終結を引き起こし、またはイントロン連結部が不活性化され得る。典型的ノックアウト構築物では、遺伝子が以下のように表され得るよう、遺伝子のいくつかの部分は選択可能マーカー（例えばｎｅｏ遺伝子）で置換される：ＳＰ−Ｃ５’／ｎｅｏ／ＳＰ−Ｃ３’（ここで、ＳＰ−Ｃ５’およびＳＰ−Ｃ３’は、それぞれＳＰ−Ｃ遺伝子の部分に比して上流および下流に存在するゲノムまたはｃＤＮＡ配列を示し、ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を指す）。別のノックアウト構築物では、遺伝子が以下のように表され得るよう、二次選択可能マーカーがフランキング位置に付加される：ＳＰ−Ｃ／ｎｅｏ／ＳＰ−Ｃ／ＴＫ（ここで、ＴＫは、先行構築物のＳＰ−Ｃ５’またはＳＰ−Ｃ３’配列に付加され得る、そしてさらに適切な培地に対して選択され得る（即ち陰性選択可能マーカー）チミジンキナーゼ遺伝子である）。この２つのマーカー構築物は、通常はＴＫ配列を保持する非相同組換え事象から、フランキングＴＫマーカーを除去する相同組換え事象の選択を可能にする。遺伝子欠失および／または置換は、エクソン、イントロン、特にイントロン連結部、および／または調節領域、例えばプロモーターからであり得る。
【００４７】
「ノックアウト哺乳類」等という用語は、所定の遺伝子がノックアウト構築物との組換えにより抑制されたトランスジェニック哺乳類を指す。本用語はすべての子孫世代を含むよう意図される、と強調されるべきである。したがって創始者動物およびすべてのＦ１、Ｆ２、Ｆ３等のその子孫が含まれる。
【００４８】
「キメラ」、「モザイク」、「キメラ哺乳類」等という用語は、そのゲノム含有細胞のいくつかにおいてノックアウト構築物を有するトランスジェニック哺乳類を指す。
【００４９】
「ヘテロ接合体」、「ヘテロ接合性哺乳類」等という用語は、そのゲノム含有細胞の全てにおいて染色体対の一方の上にノックアウト構築物を有するトランスジェニック哺乳類を指す。
【００５０】
「ホモ接合体」、「ホモ接合性哺乳類」等という用語は、そのゲノム含有細胞の全てにおいて染色体対の両成員上にノックアウト構築物を有するトランスジェニック哺乳類を指す。
【００５１】
「連鎖不平衡」という用語は、所定の対照集団における各対立遺伝子の別個の発生頻度から予測されるものより大きい頻度での２つの対立遺伝子の同時遺伝を指す。独立して遺伝される２つの対立遺伝子の発生の予測頻度は、第一対立遺伝子の頻度に第二対立遺伝子の頻度を掛けた値である。予測頻度で同時発生する対立遺伝子は、「連鎖平衡」と呼ばれる。
【００５２】
「マーカー」または「マーカー配列」という用語あるいは同様の語句は、選択可能遺伝子型、または好ましくは選択可能表現型を生じる任意の遺伝子を意味する。それは、ｎｅｏ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ＴＫ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等のような例を含む。マーカー配列は、これらの目的に役立つ当業者に既知の任意の配列であり得るが、通常マーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子のような選択可能形質を付与するタンパク質をコードする配列、あるいは検出可能であり、通常は細胞中に見出されない酵素である。マーカー配列は、そのタンパク質の発現を調節するプロモーターまたはエンハンサーのような調節領域も含み得る。しかしながら内因性調節配列を用いて、マーカーを転写することも可能である。本発明の一実施形態では、マーカーは、蛍光活性化細胞分類により、例えば蛍光標識化抗体の使用またはＧＦＰのような蛍光タンパク質の発現により、非トランスフェクト細胞からのトランスフェクト細胞の分離を促す。マーカー遺伝子の発現を促す他のＤＮＡ配列も、本発明のＤＮＡ構築物中に組入れられ得る。これらの配列としては、少数の例を挙げると、転写開始および終結シグナル、翻訳シグナル、翻訳後修飾シグナル、イントロンスプライシング連結部、リボソーム結合部位およびポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。マーカー配列は、標的遺伝子に配列を付加するためにも用いられ得る。例えばそれは、ＳＰ−Ｃ翻訳を打ち切るために停止コドンを付加するために用いられ得る。
【００５３】
選択可能マーカーの使用は当該技術分野で既知であり、本明細書中で詳述される必要はない。「変調」という用語は、本明細書中で用いる場合、上方調節（即ち活性化または刺激（例えば作動するかまたは増強することにより））および下方調節（即ち阻害または抑制（例えば拮抗し、低減しまたは阻害することにより））の両方を指す。
【００５４】
「突然変異遺伝子」という用語は、突然変異遺伝子を有さない被験体と比較して、突然変異遺伝子を有する被験体の表現型を変更し得る対立遺伝子形態の遺伝子を指す。被験体が変更表現型を有するためにこの突然変異に関してホモ接合性でなければならない場合、突然変異は劣性と言われる。突然変異遺伝子の１つのコピーで被験体の遺伝子型を変更するのに十分である場合、突然変異は優性と言われる。被験体が突然変異遺伝子の１つのコピーを有し、そしてホモ接合性の被験体のものとヘテロ接合性の被験体のものとの間の中間体（その遺伝子に関して）である表現型を有する場合、突然変異は共優性であると言われる。
【００５５】
本発明の「非ヒト動物」は、哺乳類、例えば齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。好ましい非ヒト動物は、齧歯類ファミリー、例えばラットおよびマウスから、最も好ましくはマウスから選択されるが、トランスジェニック両生類、例えばツメガエル属の成員(member)、ならびにトランスジェニックニワトリも、例えば胚発生および組織形成に影響を及ぼし得る作用物質を理解し、同定するための重要なツールを提供し得る。「キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が見出されるか、あるいは組換え遺伝子がいくつかでは発現されるが、動物の全ての細胞で発現されるわけではない動物を指すために、本明細書中で用いられる。「組織特異的キメラ動物」という用語は、組換えＳＰ−Ｃ遺伝子のうちの１つが、ある組織において存在しかつ／または発現されまたは破壊されるが、他の組織ではそうではないことを示す。「非ヒト哺乳類」という用語は、ヒト以外の哺乳類クラスの任意の成員を指す。
【００５６】
本明細書中で用いられる場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、適切な場合は、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。本用語はさらにまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、そして記載されている実施形態に適用可能であるような、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００５７】
「多型性」（polymorphism)という用語は、１つより多い形態の遺伝子またはその部分（例えば対立遺伝子変異体）の共存を指す。少なくとも２つの異なる形態、即ち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部分は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は単一ヌクレオチドであり得り、その同一性は、異なる対立遺伝子においては異なる。多型領域は、数ヌクレオチド長でもあり得る。
【００５８】
「多型遺伝子」という用語は、少なくとも１つの多型領域を有する遺伝子を指す。
【００５９】
本明細書中で用いる場合、「プロモーター」という用語は、プロモーターと操作可能に連結された選定ＤＮＡ配列の発現を調節し、そして細胞中の選定ＤＮＡ配列の発現を実行するＤＮＡ配列を意味する。本用語は、「組織特異的」プロモーター、即ち特定細胞（例えば特定組織の細胞）中でのみ選定ＤＮＡ配列の発現を実行するプロモーターを包含する。本用語は、主としてある組織中での選定ＤＮＡの発現を調節するが、同様に他の組織中での発現を引き起こすいわゆる「漏出性」プロモーターも網羅する。本用語は、非組織特異的プロモーター、ならびに構成的に発現するが、誘導性である（即ち発現レベルが制御され得る）プロモーターも包含する。
【００６０】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物に言及する場合、本明細書中で互換的に用いられる。
【００６１】
「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術により産生される本発明のポリペプチドを指すが、この場合、一般にＳＰ−ＣポリペプチドをコードするＤＮＡが適切な発現ベクター中に挿入され、次にこれを用いて、宿主細胞を形質転換して非相同タンパク質を産生する。さらに「〜に由来する」という語句は、組換えＳＰ−Ｃ遺伝子に関して、ネイティブＳＰ−Ｃポリペプチドのアミノ酸配列、あるいは天然形態のポリペプチドの置換および欠失（切頭化（truncation）を含む）を含めた突然変異により生成されるそれに類似するアミノ酸配列を有するタンパク質である「組換えタンパク質」の意味内に含むことを意味する。
【００６２】
「小分子」という用語は、本明細書中で用いる場合、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指すことを意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質またはその他の有機（炭素含有）または無機分子であり得る。多数の製薬会社は、ＳＰ−Ｃ生物活性を変調する化合物を同定するための本発明の検定のいずれかを用いてスクリーニングされ得る化学的および／または生物学的混合物、しばしば真菌、細菌または藻類抽出物の大きなライブラリを有する。
【００６３】
本明細書中で用いる場合、「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」という用語は、脊椎動物の少なくとも約６、１２、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、３５０、４００または４２５連続ヌクレオチド、好ましくはＳＰ−Ｃ遺伝子とハイブリダイズする本発明の核酸分子の能力を指す。
【００６４】
「転写調節配列」という用語は、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導するかまたは制御するＤＮＡ配列、例えば開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターを指すために本明細書を通して用いられる遺伝子用語である。好ましい実施形態では、ＳＰ−Ｃ遺伝子のうちの１つの転写は、発現が意図される細胞型中の組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（またはその他の転写調節配列）の制御下にある。さらにまた組換え遺伝子は、天然形態のＳＰ−Ｃポリペプチドの転写を制御する配列と同一であるかまたは異なる転写調節配列の制御下にあり得る、と理解される。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介性遺伝子移入によるレシピエント細胞中への、例えば発現ベクターを介した、核酸の導入を意味する。当該技術分野で既知である形質転換のための方法としては、任意の電気的、磁気的、物理的、生物学的または化学的手段が挙げられる。本明細書中で用いる場合、「トランスフェクション」は、電気穿孔、磁気穿孔（magnetoporation）、Ｃａ＋＋処理、注入、照射（bombardment）、レトロウイルス感染およびリポフェクション等を含む。「形質転換」とは、本明細書中で用いる場合、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取り込みの結果として、細胞の遺伝子型が変更される過程を指し、例えば形質転換細胞は、組換え形態のＳＰ−Ｃポリペプチドを発現し、あるいはトランスフェクト遺伝子からのアンチセンス発現の場合、天然形態のＳＰ−Ｃポリペプチドの発現が破壊される。
【００６６】
本明細書中で用いる場合、「導入遺伝子」という用語は、細胞中に導入された核酸配列（例えばＳＰ−Ｃポリペプチドのうちの１つ、またはそれに対するアンチセンス転写体をコードする）を意味する。導入遺伝子は、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して部分的にまたは完全に非相同性、即ち異質であり得るし、あるいはそれが導入されるが、それが挿入される細胞のゲノムを変更するような方法で動物のゲノム中に挿入されるべきであると意図されるかまたは挿入される（例えばそれは、天然遺伝子のものとは異なる位置に挿入されるか、あるいはその挿入がノックアウトを生じる）トランスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子に対して相同である。導入遺伝子は、エピソームの形態でも細胞中に存在し得る。導入遺伝子は、１つまたは複数の転写調節配列、ならびに選定核酸の最適発現のために必要であり得る任意のその他の核酸、例えばイントロンを含み得る。
【００６７】
「トランスジェニック動物」とは、動物の１つまたは複数の細胞が、ヒトの介入により、例えば当該技術分野で既知のトランスジェニック技法により導入される非相同核酸を含有する任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類または両生類を指す。核酸は、意図的な遺伝子操作により、例えばマイクロインジェクションにより、または組換えウイルスを用いた感染により、細胞の前駆体中への導入によって、直接または間接的に細胞中に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的交雑またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は染色体内に組み込まれるか、あるいはそれは染色体外複製ＤＮＡであり得る。本明細書中に記載された一般的なトランスジェニック動物では、導入遺伝子は細胞にＳＰ−Ｃポリペプチドの１つの組換え形態を、例えばアゴニストまたはアンタゴニスト形態を発現させる。しかしながら組換えＳＰ−Ｃ遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も、例えば下記のようなＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性構築物として、意図される。さらに「トランスジェニック動物」は、１つまたは複数のＳＰ−Ｃ遺伝子の遺伝子破壊がヒトの介入により、例えば組換えおよびアンチセンス技術により引き起こされる組換え動物も含む。
【００６８】
「治療する」という用語は、本明細書中で用いる場合、症状または疾患の少なくとも１つの症候を治癒し、ならびに改善することを包含するよう意図される。
【００６９】
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を運搬し得る核酸分子を指す。好ましいベクターの一型は、エピソーム、すなわち染色体外複製をし得る核酸である。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製および／または発現を可能にするものである。それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を指図し得るベクターは、「発現ベクター」として本明細書中で言及される。概して、組換えＤＮＡ技術において有用性を有する発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態であって、これは、一般にそれらのベクター形態では、染色体に結合されない環状二本鎖ＤＮＡを指す。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に用いられる。しかしながら本発明は、等価機能として役立ち、そしてこの点に関してその後当該技術分野で既知になるこのようなその他の形態の発現ベクターを含むよう意図される。
【００７０】
「野生型対立遺伝子」という用語は、被験体中に２コピーで存在する場合、野生型表現型を生じる遺伝子の対立遺伝子を指す。遺伝子における或る種のヌクレオチド変化はヌクレオチド変化を伴う遺伝子の２コピーを有する被験体の表現型に影響を及ぼし得ないため、特定遺伝子のいくつかの異なる野生型対立遺伝子が存在し得る。
【００７１】
本発明は、被験体における肺疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする被験体に治療的有効量のＳＰ−Ｃ治療薬を含む処方物を投与することを包含する方法を提供する。好ましくはＳＰ−Ｃ治療薬は、単離ＳＰ−Ｃタンパク質、ＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子、受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体、あるいはその医薬上許容可能な組成物からなる群から選択される作用物質である。
【００７２】
本発明は、ＳＰ−Ｃ治療薬が受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体であるか、あるいは単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質であるＳＰ−Ｃ治療薬の使用を提供する。
【００７３】
一実施形態では、ＳＰ−Ｃ治療薬はＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子であり、この場合、核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される。好ましくは核酸分子は、被験体の気道細胞中で発現される。さらに好ましくは核酸は、ＳＰ−Ｃポリペプチド、断片、相同体または実質的相同性を有する変異体をコードし、ＳＰ−Ｃ機能を供給する。
【００７４】
一実施形態では、核酸分子は染色体ＤＮＡに組み込まれるようになり、被験体の気道細胞のゲノムを作り上げる。別の実施形態では、核酸分子は、染色体外位置から被験体の気道細胞により発現される。一般に、核酸分子は少なくとも５０ヌクレオチドを含む。好ましくは核酸分子は、少なくとも２００ヌクレオチドを含む。気道細胞は一般に、平滑筋細胞および上皮細胞である。
【００７５】
一実施形態では、単離核酸分子はリポソーム送達ビヒクルと複合されて哺乳類に投与される。あるいは単離核酸分子は、ウイルスベクター送達ビヒクル中で哺乳類に投与される。好ましくは、ウイルスベクター送達ビヒクルは、アデノウイルス由来である。
【００７６】
一実施形態では、単離核酸分子は、哺乳類の肺に投与される場合、哺乳類の細胞中で発現される。好ましくは疾患は、好酸球性炎症に関連した気道の慢性閉塞性肺疾患である。
【００７７】
別の実施形態では、疾患は、気道閉塞、アレルギー、喘息、急性炎症性肺疾患、慢性炎症性肺疾患、慢性閉塞性肺形成異常、気腫、肺気腫、慢性閉塞性気腫、成人呼吸窮迫症候群、気管支炎、慢性気管支炎、慢性喘息性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および間質性肺疾患からなる群から選択される。
【００７８】
好ましくはＳＰ−Ｃ治療薬は、哺乳類における肺炎症を低減する。ＳＰ−Ｃ治療薬は、約０．１μｇ／哺乳類の体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量で、好ましくは約０．１μｇ／哺乳類の体重１ｋｇ〜約１０ｍｇ／哺乳類の体重１ｋｇの量で投与される。一実施形態では、ＳＰ−Ｃ治療薬は医薬上許容可能な賦形剤中で投与される。
【００７９】
ＳＰ−Ｃ治療薬は、鼻および吸入経路からなる群から選択される少なくとも１つの経路により投与され得る。
【００８０】
別の実施形態では、肺疾患は、喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、過敏性肺臓炎、職業性喘息、気道過敏症症候群、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎および寄生虫性肺疾患からなる群から選択される。
【００８１】
本発明は、哺乳類における炎症反応を包含する呼吸器疾患に関連した気道過敏性および／または気道狭窄のための治療の処方方法であって、以下の：ａ．受容体単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体；ならびにＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）からなる群から選択されるＳＰ−Ｃ治療薬を哺乳類の肺に投与し；ｂ．哺乳類における惹起作用物質に対する応答における肺機能の変化を測定して、ＳＰ−Ｃ治療薬が気道過敏性を変調するか否かを確定し；そしてｃ．肺機能の変化に基づいて炎症を低減するのに有効なＳＰ−Ｃ治療薬を哺乳類に投与することを包含する薬理学的療法を処方することを包含する方法も提供する。
【００８２】
本発明は、炎症を包含する呼吸器疾患に関連した気道過敏性、気道狭窄および／または気道繊維症から哺乳類を保護するための処方物であって、好酸球性炎症を低減するのに有効な抗炎症薬、ならびに受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体；単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質；ならびにＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）からなる群から選択されるＳＰ−Ｃ治療薬を含む処方物も提供する。一般に、処方物は、医薬上許容可能な賦形剤を含む。
【００８３】
好ましくは、処方物は、生体適合性ポリマー、その他の高分子マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微小粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、脂質球、ウイルスベクターおよび経皮送達系からなる群から選択される制御放出ビヒクルを含む。
【００８４】
一実施形態では、ＳＰ−Ｃ治療薬は単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質である。別の実施形態では、ＳＰ−Ｃ治療薬は、ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子であって、この場合、核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される。一実施形態では、単離核酸分子はリポソーム送達ビヒクルと複合される。別の実施形態では、単離核酸分子はウイルスベクター送達ビヒクルに提供される。好ましくは、ウイルスベクター送達ビヒクルはアデノウイルス由来である。
【００８５】
別の実施形態では、ＳＰ−Ｃ治療薬は受容体の活性を刺激するＳＰ−Ｃ受容体特異的抗体である。別の実施形態では、ＳＰ−Ｃ治療薬は、単離ＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質、ならびにＳＰ−Ｃタンパク質またはプロＳＰ−Ｃタンパク質をコードする単離核酸分子（この場合、核酸分子は転写制御配列に操作可能に連結される）からなる群から選択される。
【００８６】
別の実施形態では、処方物は、抗ＩｇＥ、免疫調節薬、ロイコトリエン合成阻害剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、グルココルチコステロイド、ステロイド化学的誘導体、抗シクロオキシゲナーゼ薬、β−アドレナリン作動薬、メチルキサンチン、クロモン、抗ＣＤ４試薬、抗ＩＬ−５試薬、界面活性剤、サイトキシンおよびヘパリンからなる群から選択される抗炎症薬を含有し得る。好ましくは抗炎症薬は、ロイコトリエン合成阻害剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、グルココルチコステロイド、β−アドレナリン作動薬、メチルキサンチンおよびクロモンからなる群から選択される。
【００８７】
概して本発明は、１つまたは複数のＳＰ−Ｃ関連遺伝子がトランスジェニッククローニング手法により修飾されたトランスジェニック動物を提供する。これらのＳＰ−Ｃトランスジェニック動物は、ＳＰ−Ｃ媒介性肺過程を包含する種々の疾患のための動物モデルとして有用である。上記の肺疾患および症状のほとんどが複合性および多因性病因を有すると思われるが、それらは全て、結局ＳＰ−Ｃ媒介性肺過程を包含すると思われる。本発明は、これらのＳＰ−Ｃ媒介性肺過程を妨害し、それによりこれらの他の点で異なる疾患の進行を遮断し得る医薬化合物の発見のための試薬および方法も提供する。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明は、８ｐ，８の位置でマウス第１４染色体上に保有されるマウスＳＰ−Ｃ（サーファクタントタンパク質Ｃ）遺伝子が、ＳＰ−Ｃ遺伝子の発現を低減するかまたは排除するために破壊されるかまたは欠失されるトランスジェニック「ノックアウト」マウス系統を特徴とする。
【００８９】
内因性ＳＰ−Ｃタンパク質分子の損失のため、ＳＰ−Ｃノックアウトマウス系統は、ＳＰ−Ｃ媒介性肺障害過程の強化を特徴とする。さらなる実施形態では、本発明は、ＳＰ−Ｃ遺伝子と、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−ＢまたはＳＰ−Ｄの少なくとも１つの遺伝子の両方の発現低減を特徴とする「二重」ノックアウトマウス系統を提供する。
【００９０】
トランスジェニック「ノックアウト」マウス系統は、ＳＰ−Ｃ媒介性肺疾患および症状を試験するために用いられ得るヘテロ接合性およびホモ接合性ＳＰ−Ｃ遺伝子ノックアウトマウスの両方を生成するために有用である。例えばサーファクタントタンパク質Ｃタンパク質の損失は、ＳＰ−Ｃ媒介性肺障害の増大をもたらし、そしてこれは、複数の疾患および症状、例えば気腫、単球浸潤物、繊維症、上皮細胞形成異常、ならびにＩＩ型上皮細胞および肺胞マクロファージにおける細胞内脂質の非定型蓄積の病因の一因となる。
【００９１】
慢性および急性形態のこのような肺疾患および症状は、適切なＳＰ−Ｃノックアウト動物または動物系統において再生され得る。例えばＳＰ−Ｃノックアウト構築物に対してヘテロ接合性である動物は、サーファクタントタンパク質Ｃを産生する能力を減少しており、したがってＳＰ−Ｃ媒介性肺過程の対応する強調を示す。ヘテロ接合性マウス系統はしたがって、慢性肺疾患および症状の環境を再生する。さらにこれらのヘテロ接合性動物または細胞系統は、内因性サーファクタントタンパク質Ｃの減少されたプールの発現または活性を強調するよう作用する治療薬を見出すのに良好に適している。このような受容体アンタゴニスト「アゴニスト」は、例えばＳＰ−Ｃ遺伝子の残存コピーの発現を増大する。それに反して、ホモ接合性ＳＰ−Ｃ「ノックアウト」動物および系統は、ＳＰ−Ｃ遺伝子産物を産生する能力を有さず、それゆえＳＰ−Ｃ媒介性過程の対応的に大きい増強を示す。したがってホモ接合性動物および細胞系統は、急性肺疾患において起こる異所性肺機能を再生し得る。さらにこれらのホモ接合性動物および系統は、例えばサーファクタントタンパク質Ｃの分子模倣物として機能する治療薬を見つけ出すために特によく適している。
【００９２】
本発明はさらに、ＳＰ−Ｃ「ノックアウト」およびＳＰ−Ｃ「ノックイン」トランスジェニックマウス細胞系統およびトランスジェニックマウスを作製するために有用な種々の核酸構築物を提供する。
【００９３】
例えばＳＰ−Ｃ破壊構築物は、遺伝子の染色体コピー中にレポーターまたはマーカー遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはグリーン蛍光タンパク質）を組入れ、それによりその結果生じるキメラレポーター遺伝子を、その発現のための内因性ＳＰ−Ｃ遺伝子プロモーター依存性にする。このような「ノックイン」構築物を組入れるトランスジェニック細胞系統および動物は、サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子の転写を増大することにより、ＳＰ−Ｃ依存性肺過程を抑制するそれらの能力に関する化合物のスクリーニングに特によく適している。別の例では、サーファクタントタンパク質Ｃ発現が調節可能プロモーターによりここで制御されるよう、非相同性調節可能プロモーターは、ＳＰ−Ｃ遺伝子座に「ノックイン」され得る。調節可能プロモーターは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターまたは発生的調節プロモーターであり得る。この場合のプロモーターの選択は、特定の試験に合わせていつでも使えるようにし得る。例えば抑制性プロモーター系は、正常増殖および発生後の何らかの時点まで、ＳＰ−Ｃ遺伝子が発現されるマウス系統の産生を促す。次にＳＰ−Ｃ遺伝子の機能は、ＳＰ−Ｃ遺伝子の転写的活動停止を生じる適切なリガンド（例えばテトラサイクリン）の投与により、急に停止され得る。この誘導性サーファクタントタンパク質Ｃ欠損はそれにより、そうでなければ正常に発達する動物におけるＳＰ−Ｃ媒介性肺症状を誘発する。したがって医薬スクリーンは、サーファクタントタンパク質Ｃ欠損誘導性肺応答を遮断し得る化合物のために考案され得る。
【００９４】
したがって本発明のＳＰ−Ｃトランスジェニック動物および細胞系統は、このようなＳＰ−Ｃ媒介性疾患および症状を治療するかまたは予防するために有用である医薬的作用物質の開発のために用いられ得る。
【００９５】
ノックアウトされるべき遺伝子は、ＳＰ−Ｃ経路に関与する任意の遺伝子であり得るが、但し、破壊されるべきＤＮＡに関する少なくともいくつかの配列またはマッピング情報は、ノックアウト構築物およびスクリーニングプローブの両方の調製に用いるために利用可能である。本発明の好ましい実施形態では、８ｐ，８の位置で第１４染色体上のマウスＳＰ−Ｃ遺伝子は、破壊のために標的化される。ネズミＳＰ−Ｃ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１で示される。これらの標的遺伝子構築物としては、本発明の種々の実施形態の各々に特定的に適合されるＳＰ−Ｃ標的遺伝子ノックアウトおよびノックイン構築物が挙げられる。
【００９６】
本発明の重要な態様は、一般にマウス（GenBank寄託番号Ｍ３８３１４；配列番号１）またはヒト（GenBank寄託番号Ｊ０３８９０；配列番号４）ＳＰ−Ｃ遺伝子の配列、あるいはその機能的等価物を有する１つまたは複数のＳＰ−Ｃポリペプチドを発現する遺伝子の破壊に関する。「遺伝子」とは、ＳＰ−Ｃ遺伝子コード配列、そして或る種の態様では、他の天然遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離された調節配列のいずれかを含むＤＮＡセグメントを指す。この点で、「遺伝子」という用語は、機能性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード単位に言及するのを簡単にするために用いられる。当業者に理解されるように、この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチドまたは融合タンパク質を発現するかまたは発現するために適合され得るゲノム配列、ｃＤＮＡ配列およびより小さい工学処理遺伝子セグメントをともに含む。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明は、それぞれマウス（GenBank寄託番号ＡＡＡ４００１０；配列番号３）またはヒト（GenBank寄託番号ＡＡＣ３２０２２；配列番号５およびＡＡＣ３２０２３；配列番号６）ＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｃ１ポリペプチド、あるいはその機能的等価物の連続アミノ酸配列をそのアミノ酸配列内に含むＳＰ−ＣポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００９８】
当然、ＤＮＡセグメントがＳＰ−Ｃポリペプチドをコードし、あるいはＳＰ−Ｃポリペプチドの発現に際して用いると意図される場合、最も好ましい配列は本質的に、配列番号１、配列番号２または配列番号４の連続配列で記述されるようなもの、そしてＳＰ−Ｃ生物学的活性を保持するタンパク質をコードするものである。ＳＰ−Ｃポリペプチドの配列は、配列番号３、配列番号５または配列暗号６で示されるものの連続部分に実質的に対応し、そして配列番号３、配列番号５または配列暗号６で示されるアミノ酸と同一でない相対的に少数のアミノ酸、または生物学的機能的等価物を有する。「生物学的機能的等価物」という用語は、当該技術分野で十分に理解されており、本明細書中でさらに詳細に定義される。
【００９９】
したがって配列番号３、配列番号５または配列番号６のアミノ酸と同一であるかまたは機能的に等価である約７０％〜約８０％、さらに好ましくは約８１％〜約９０％、さらに好ましくは約９１％〜約９９％のアミノ酸を有する配列は、「配列番号３、配列番号５または配列暗号６で記述されるものと本質的に同じである」配列である。
【０１００】
或る種の他の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号４で示される連続核酸配列をそれらの配列内に含む単離ＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。この定義は、上記と同一の意味で用いられ、そして核酸配列が配列番号１、配列番号２または配列番号４で示されるものの連続部分に実質的に対応し、ならびに配列番号１、配列番号２または配列番号４のコドンと同一でない相対的に少数のコドンまたは機能的等価物を有する、ということを意味する。「機能的等価コドン」という用語は、同一アミノ酸をコードするコドンに言及するために、そして生物学的等価アミノ酸をコードするコドンに言及するためにも、本明細書中で用いられる。
【０１０１】
イントロン領域またはフランキング領域を除いて、そして遺伝暗号の縮重を考慮して、配列番号１、配列番号２または配列暗号４の配列で示されるヌクレオチドと同一である約７０％〜約７９％、さらに好ましくは約８０％〜約８９％、さらに好ましくは約９０％〜約９９％のヌクレオチドを有する配列は、「配列番号１、配列番号２または配列暗号４で記述されるものと本質的に同じである」配列である。配列番号１、配列番号２または配列番号４３で記述されるものと本質的に同一である配列はまた、相対的ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号２または配列番号４の相補体を含有する核酸セグメントとハイブリダイズし得る配列として機能的に定義され得る。適切な相対的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知である。
【０１０２】
当然、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号４で記述される配列と相補的であるかまたは本質的に相補的であるＤＮＡセグメントも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準ワトソン・クリック相補性規則に従って塩基対合し得るものである。本明細書中で用いる場合、「相補的配列」という用語は、上記と同一のヌクレオチド比較により評価され得るように、または相対的ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号３の核酸セグメントとハイブリダイズし得るものと定義されるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【０１０３】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の特定の核酸およびアミノ酸配列に限定されない、ということも理解される。したがってＤＮＡセグメントは、ＳＰ−Ｃコード領域自体、塩基コード領域における選定変化または修飾を保有するコード領域を種々に含み得るし、あるいはそれらセグメントはそれにもかかわらずＳＰ−Ｃコード領域を含むより大きいポリペプチドをコードし得るし、あるいは変異体アミノ酸配列を有する生物学的機能的等価タンパク質またはペプチドをコードし得る。
【０１０４】
本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的機能的等価ＳＰ−Ｃタンパク質およびペプチドを包含する。このような配列は、核酸配列内で、したがってコードされたタンパク質内で天然に生じることが既知であるコドン重複および機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは機能的等価タンパク質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用により作製され得るが、この場合、交換されているアミノ酸の特性の考察に基づいてタンパク質構造の変化が工学処理され得る。変化は、部位特異的突然変異誘発技術の適用により、例えばタンパク質の抗原性に対する改善を導入するため、あるいは分子レベルでのアデノシンデアミナーゼ活性を検査するためにＳＰ−Ｃ突然変異体を試験するため、導入され得る。
【０１０５】
修飾および変更は本発明のＳＰ−Ｃ遺伝子およびタンパク質の構造中になされ、そして同様のまたはそうでなければ望ましい特質を有する分子を依然として生成するので、このような生物学的機能的等価物も、本発明内に包含される。
【０１０６】
例えば或る種のアミノ酸は例えば抗体の抗原結合領域、基質分子または受容体上の結合部位、ＤＮＡ結合部位等のような構造との相互作用性結合能力の感知可能な損失を伴わずに、タンパク質構造中の他のアミノ酸に置換され得る。それは、そのタンパク質の生物学的機能活性を定めるタンパク質の相互作用能力および性質であるため、或る種のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列（またはもちろんその基礎を成すＤＮＡコード配列）中で成され、それにもかかわらず、同様の（アゴニスト）特性を有するタンパク質を生成する。したがって、種々の変更は、それらの生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴わずに、ＳＰ−Ｃタンパク質またはポリペプチド、あるいは基礎を成すＤＮＡの配列中で成され得る、ということが本発明人等により意図される。
【０１０７】
機能的等価に関しては、「生物学的機能的等価タンパク質またはペプチドまたは遺伝子」の定義に付随するのは、分子の限定部分内で成され、そして依然として許容可能レベルの等価生物学的活性を有する分子を生じ得る変更の数に対する制限が存在する、という概念である、ということは当業者により十分に理解される。したがって生物学的機能的等価ペプチドは、本明細書中では、ほとんどまたは全てではないが或る種のアミノ酸が置換され得るペプチドとして定義される。
【０１０８】
特により短い長さのペプチドが関係している場合、より少ないアミノ酸置換が所定のペプチド内で成されるべきである、と意図される。より長いドメインは、中間数の変更を有し得る。全長タンパク質は、より多数の変更に対するほとんどの耐性を有する。もちろん、異なる置換を有する複数の別個のタンパク質／ペプチドは容易に作成され、本発明に従って用いられ得る。
【０１０９】
アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づいている。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および型の分析は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは全て正荷電残基であり、アラニン、グリシンおよびセリンは全て同様のサイズであり、そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは全て一般的に同様の形状を有する、ということを明示する。したがってこれらの考察に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書中では、生物学的機能的等価物と定義される。
【０１１０】
一実施形態では、ノックアウト構築物を産生するのに用いられるべきクローンは、マーカー遺伝子が遺伝子中のその位置で挿入され得るよう、位置（単数または複数）で切断するよう選択される制限酵素で消化される。別の実施形態では、ＤＮＡ配列は、遺伝子中の単一制限酵素切断での無作為ヌクレアーゼを用いた部分的消化により除去され得る。
【０１１１】
マーカー遺伝子挿入のための適正位置は、ネイティブ遺伝子の発現を防止するのに役立つ位置である。この位置は、種々の因子、例えば配列（エクソン、イントロンまたはプロモーター）が標的化されるべきものである（即ちプロモーター機能を阻害するためにまたはネイティブエクソンの合成を阻害するために必要な挿入の精確な位置）因子、ならびに配列内の便利な制限部位の利用可能性によるであろう。いくつかの場合には、マーカー遺伝子がノックアウト構築物中に挿入されるべきである場合、オリジナルゲノム配列と適合性のノックアウト構築物の長さを維持するために、遺伝子の大部分を除去することが望ましい。
【０１１２】
マーカー遺伝子は、当業者に既知の、そして検出可能(detectable)および／または検定可能(assayable)である任意の核酸配列であり得る。通常は、抗生物質耐性遺伝子が、あるいはゲノム中のその発現または存在が容易に検出され得る任意のその他の遺伝子が用いられる。マーカー遺伝子は通常は、それが挿入される細胞中で活性であるかまたは容易に活性化され得る任意の供給源からのプロモーターに操作可能に連結される。しかしながらマーカー遺伝子は、それが標的化遺伝子のプロモーターを用いて転写され得る場合、それ自体のプロモーターを有する必要はない。さらにマーカー遺伝子は普通は、遺伝子の転写終結のために遺伝子の３’末端に結合されるポリＡ配列を有する。好ましいマーカー遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはノックアウト技法におけるマーカーとして有用であることが既知の任意の抗生物質耐性遺伝子である。
【０１１３】
線状ノックアウト構築物は胚幹細胞（下記）中に直接トランスフェクトされ得るし、あるいはそのノックアウト構築物は挿入前に先ず増幅のための適切なベクター中に入れられる。適切なベクターは、当業者に既知である。
【０１１４】
本発明はさらに、種々の目的のための、例えばＳＰ−Ｃ媒介性肺障害のための治療薬を同定するために用いられ得るトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物は、例えばＳＰ−Ｃ遺伝子発現を変調することにより、例えばＳＰ−Ｃの産生を変調する薬剤を同定するために有用であり得る。ＳＰ−Ｃ遺伝子プロモーターは、例えばＳＰ−ＣｃＤＮＡ断片を用いたゲノムライブラリーのスクリーニングにより単離され、そして当該技術分野で既知の方法に従って特徴付けされ得る。本発明の好ましい実施形態では、上記のＳＰ−Ｃレポーター遺伝子を含有するトランスジェニック動物を用いて、ＳＰ−Ｃ発現を変調するそれらの能力に関してステロイドホルモンとして既知の或るクラスの生物活性分子をスクリーニングする。本発明のさらに好ましい実施形態では、内因性ＳＰ−Ｃ遺伝子の発現が突然変異化されたかまたは「ノックアウト」された非ヒト動物が産生される。「ノックアウト」動物は、特定遺伝子（単数または複数）のホモ接合性またはヘテロ接合性欠失を保有するものである。これらの動物は、ＳＰ−Ｃの非存在が特定表現型を生じるか否か、特にこれらのマウスが特定の疾患、例えば気腫に対する高罹患率を有するかまたは発症すると思われるかを確定するために有用である。さらにこれらの動物は、下記のようなＳＰ−Ｃ遺伝子の突然変異に起因する疾患症状を軽減するかまたは弱める薬剤に関するスクリーンに有用である。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、その染色体の両方の上に突然変異化ＳＰ−Ｃ遺伝子座を保有するトランスジェニックＳＰ−Ｃノックアウトマウスは、ＳＰ−Ｃ発現の損失に起因する症状のトランスジェニックまたは薬剤治療のためのモデル系として用いられる。
【０１１５】
トランスジェニックおよびノックアウト非ヒト動物の生成方法は、当該技術分野で既知である。一般的態様では、トランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする方法でのゲノム中への所定の導入遺伝子の組込みにより、あるいは野生型遺伝子を破壊して、野生型遺伝子のノックアウトを引き起こすことにより、産生される。米国特許第５，６１６，４９１号明細書（この出願の記載内容は、参照されて本明細書の一部とする）は、一般に、ノックアウトマウスの調製に関与する技法を記載する。
【０１１６】
トランスジェニック動物の産生方法は、一般に米国特許第４，７３６，８６６号、第４，８７３，１９１号、第５，１７５，３８３号、第５，８２４，８３７号、第６，４３７，２１６号、第６，４３７，２１５号、第６，３７４，１３０号の各明細書（これらの出願の記載内容が、参照されて本明細書の一部とする）に記載されている。トランスジェニックブタ、ウサギ、マウスおよびラット産生に関して教示する米国特許第５，６３９，４５７号、第５，１７５，３８４号、第５，１７５，３８５号、第５，５３０，１７９号、第５，６２５，１２５号、第５，６１２，４８６号および第５，５６５，１８６号の各明細書も、これらの出願の記載内容が参照されて本明細書の一部とする。
【０１１７】
ノックアウトマウスは、ノックアウトされるべき遺伝子をコードするマウス胚幹細胞染色体中への「ノックアウト」構築物の相同組込みにより生成される。一実施形態では、動物のゲノムを修飾するために相同組換えを用いる一方法である遺伝子ターゲッティングを用いて、培養胚幹細胞中に変更を導入し得る。ＥＳ細胞中で当該ＳＰ−Ｃ遺伝子をターゲッティングすることにより、これらの変更が動物の生殖系列に導入されて、キメラを生成し得る。遺伝子ターゲッティング手法は、標的ＳＰ−Ｃ遺伝子座と相同のセグメントを含み、かつＳＰ−Ｃゲノム配列に対する意図された配列修飾（例えば挿入、欠失、点突然変異）も含むＤＮＡターゲッティング構築物を組織培養細胞中に導入することにより、成し遂げられる。処理細胞は次に、適正に標的化されたものを同定し、かつ単離するための精確なターゲッティングに関してスクリーニングされる。
【０１１８】
胚幹細胞における遺伝子ターゲッティングは、実際、１つまたは複数のＳＰ−Ｃゲノム配列を用いた相同組換えを受けるよう設計されたターゲッティング導入遺伝子構築物の使用によりＳＰ−Ｃ遺伝子機能を破壊するための一手段として本発明により意図される一企画である。ターゲッティング構築物は、ＳＰ−Ｃ遺伝子の要素を用いた組換え時に、陽性選択マーカーが遺伝子のコード配列中に挿入される（または置換する）よう、整列され得る。挿入配列はＳＰ−Ｃ遺伝子を機能的に破壊するが、一方、陽性選択形質も提供する。例示的ＳＰ−Ｃターゲッティング構築物は、以下でさらに詳細に記載される。
【０１１９】
一般に、ノックアウト動物を産生するために用いられる胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、生成されるべきノックアウト動物と同一種のものである。したがって、例えばマウス胚幹細胞は通常は、ノックアウトマウスの生成のために用いられる。
【０１２０】
胚幹細胞は、Doetschman et al. (1985) J. Embryol. Exp. Mol. Biol. 87: 27-45に記載されたもののような当業者に既知の方法を用いて、生成され、かつ保持される。ＥＳ細胞の任意の系統が用いられ得るが、選択される系統は、ノックアウト構築物の生殖系列伝達を作製するため、通常は発生中の胚の生殖系列に組み込む細胞の能力に関して選択されて、その生殖系列の一部となる。したがってこの能力を有すると考えられる任意のＥＳ細胞系統は、本明細書中で用いるのに適している。ＥＳ細胞の産生のために好ましい一マウス系統は、１２９／Ｓｖ系統である。細胞は培養され、当業者に既知の方法を用いて、ノックアウト構築物挿入用に調製される。
【０１２１】
典型的ノックアウト構築物は、突然変異化されるべき遺伝子をコードするゲノム座位の５’および３’末端の両方から約０．５ｋｂ以上または約１０．０ｋｂ以下の核酸断片を含有する。これら２つの断片は、陽性選択可能マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）をコードする核酸の介在断片により分離される。その結果生じる核酸断片（陽性選択可能マーカーをコードする核酸に連結されたゲノム座位の超(extreme)５’末端からの核酸からなり、これは次に当該ゲノム座位の超(extreme)３’末端からの核酸に連結される）は、ＳＰ−Ｃまたはノックアウトされるべき他の当該遺伝子に関するコード配列のほとんどを省く。その結果生じる構築物がこの遺伝子座で染色体と相同的に組み換わる場合、それはゲノム座位からの、そうでなければ構造遺伝子として既知の、省略されたコード配列の損失を生じる。このようなまれな相同組換え事象が起きた幹細胞は、陽性選択可能マーカーをコードする遺伝子の核酸のゲノム中への安定組込みにより選択され、その後、適切な薬剤（この例ではネオマイシン）の存在下でこのマーカー遺伝子を発現する細胞に関して選択され得る。
【０１２２】
この基本的技法に関する変法も存在し、当該技術分野で既知である。例えば「ノックイン」構築物は、陽性選択可能マーカーをコードする核酸に連結された５’ゲノム座位断片をコードする核酸の同一の基本的配置を指し、これは次に３’ゲノム座位断片をコードする核酸に連結されるが、コード配列で省略されるものはなく、したがって用いられる５’および３’ゲノム断片は最初は連続していたが、その後、陽性選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸の導入により破壊された、という点で異なる。したがってこの「ノックイン」型の構築物は、単一エクソンのような突然変異化されるべき遺伝子のゲノム座位の限定領域のみがクローニングおよび遺伝子操作のために利用可能である場合、突然変異体トランスジェニック動物の構築のために非常に有用である。あるいは「ノックイン」構築物は、標的化遺伝子の単一機能ドメインを特異的に排除して、コードされたポリペプチドの他のドメインの機能を保持しながら、一機能を欠損する標的化遺伝子のポリペプチドを発現するトランスジェニック動物を生じる。ノックイン技法の変法では、マーカー遺伝子の発現が標的化遺伝子の転写調節要素の制御下になるよう、マーカー遺伝子は当該ゲノム座位で組み込まれる。マーカー遺伝子は、その活性が検出される酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ）をコードするものであり、酵素基質が適切な条件下で細胞に付加され、そして酵素活性が分析され得る。当業者は、他の有用なマーカーおよび所定の細胞中のそれらの存在を検出するための手段を熟知している。例えばこのような一代替マーカーは、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰマーカーは、個々の生存細胞中の遺伝子発現の検査のために特に有用である。したがってＧＦＰおよび関連マーカーは、「ノックイン」遺伝子の発現のレベルのｉｎ  ｓｉｔｕ分析のために特に有用である。このようなマーカーは全て、本発明の教示の範囲内に含まれるものであるとして意図される。
【０１２３】
非相同組換え事象は、いずれかの末端での陰性選択可能マーカーに隣接されるよう、上記のノックアウトおよびノックイン構築物を修飾することにより選択されることができる（特に、そのポリペプチド産物が当該技術分野で既知の適切な組織培地、即ち、５−ブロモデオキシウリジンのような薬剤を含有する培地中で細胞系統を発現する場合に選択され得るチミジンキナーゼ遺伝子の２つの対立遺伝子変異体の使用により）。したがって本発明のこのようなノックアウトまたはノックイン構築物の好ましい実施形態は、陽性選択可能マーカーの核酸に連結されたゲノム座位の５’末端をコードする核酸（これは次に同一ゲノム座位の３’末端をコードする核酸に連結され、次にこれは陰性選択可能マーカーをコードする第二核酸に連結される）に連結された陰性選択可能マーカーをコードする核酸からなる。その結果生じるノックアウト構築物とゲノムとの間の非相同組換えは通常は、これらの陰性選択可能マーカー遺伝子の一方または両方の安定組込みを生じ、それゆえ非相同組換えを受けた細胞が、適切な選択培地（例えば５−ブロモデオキシウリジンのような薬剤を含有する培地）中での増殖により選択され得る。陽性選択可能マーカーに関するならびに陰性選択可能マーカーに対する同時選択は、ノックアウト構築物が突然変異化されるよう意図された遺伝子の座位で相同的に組換わったクローンに関する極度の濃厚化(vast enrichment)を生じる。結果的に生じるノックアウト幹細胞系統における標的化遺伝子座での予測染色体変化の存在は、当業者に既知であるサザンブロット分析技法により確証され得る。あるいはＰＣＲが用いられ得る。
【０１２４】
細胞中に挿入されるべき各ノックアウト構築物は先ず、線状形態でなければならない。したがってノックアウト構築物がベクター中に挿入された場合（下記）、線状化は、ベクター配列内でのみ切断し、ノックアウト構築物配列内では切断しないよう選択される適切な制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを消化することにより、成し遂げられる。
【０１２５】
挿入のために、ノックアウト構築物は、当業者に既知であるように、選択される挿入方法のために適切な条件下でＥＳ細胞に付加される。例えばＥＳ細胞が電気穿孔されるべきものである場合、ＥＳ細胞およびノックアウト構築物ＤＮＡは、電気穿孔機を用いて、使用のためのメーカーのガイドラインに従って、電気パルスに曝露される。電気穿孔後、ＥＳ細胞は通常は適切なインキュベーション条件下で回収される。次に細胞は、上記のようなノックアウト構築物の存在に関してスクリーニングされる。１つより多い構築物がＥＳ細胞中に導入されるべきである場合、各ノックアウト構築物は、同時に、または１度に１つ、導入され得る。
【０１２６】
適正な位置にノックアウト構築物を含有する適切なＥＳ細胞が上記の選択技法により同定された後、細胞は胚に導入され得る。挿入は、当業者に既知の種々の方法により成し遂げられ得るが、好ましい方法は、マイクロインジェクションによる。マイクロインジェクションに関して、約１０〜３０個の細胞をマイクロピペット中に収集し、発生の適正段階にある胚に注入して、発生中の胚中へのノックアウト構築物を含有する外来ＥＳ細胞の組込みを可能にする。例えば形質転換化ＥＳ細胞は、胚細胞中にマイクロインジェクションされ得る。
【０１２７】
発生の適当な段階の任意の胚は使用に適しているが、好ましい胚は雄である。マウスでは、好ましい胚は、ＥＳ細胞遺伝子によりコードされる毛色とは異なる毛色に関してコードする遺伝子も有する。このようにして、モザイク毛色（ＥＳ細胞が発生中の胚に組入れられたことを示す）を調べることにより、ノックアウト構築物の存在に関して子孫は容易にスクリーニングされ得る。したがって、例えばＥＳ細胞系統が白色被毛に関する遺伝子を保有する場合、選択される胚は、黒色または褐色被毛に関する遺伝子を保有する。
【０１２８】
ＥＳ細胞が胚に導入された後、胚は、妊娠のために偽妊娠仮親の子宮に移植され得る。任意の仮親が用いられ得るが、仮親は通常、良好に繁殖して仔を産む能力に関して、そして仔を世話する能力に関して選択される。このような仮親は、通常は同一種の精管切除雄との交配により調製される。偽妊娠仮親の段階は移植を成功させるためには重要であり、それは種依存性である。マウスに関しては、この段階は偽妊娠の約２〜３日目である。
【０１２９】
仮親に出産される子孫は、最初にモザイク毛色に関してスクリーニングされ得るが、この場合、毛色選択戦略（上記のような、そして添付の実施例における）が用いられた。さらに、あるいは代替物として、子孫の尾組織からのＤＮＡが、上記のようにサザンブロットおよび／またはＰＣＲを用いて、ノックアウト構築物の存在に関してスクリーニングされ得る。モザイクであると思われる子孫は、次に、それらがノックアウト構築物をそれらの生殖系列中に保有すると考えられる場合、ホモ接合性ノックアウト動物を生成するために、互いに交配され得る。ホモ接合体は、この交配の産物であるマウスならびに既知のヘテロ接合体であるマウスおよび野生型マウスからの等量のゲノムＤＮＡのサザンブロッティングにより、同定され得る。
【０１３０】
ノックアウト子孫を同定し、特徴付けするその他の手段が利用可能である。例えばノーザンブロットを用いて、ノックアウトされた遺伝子、マーカー遺伝子またはその両方をコードする転写体の存在または非存在に関して、ｍＲＮＡをプローブし得る。さらにウエスタンブロットを用いて、特定ＳＰ−Ｃタンパク質に対する抗体、またはマーカー遺伝子産物（ここで、この遺伝子は発現される）に対する抗体を用いてウエスタンブロットをプローブすることにより、子孫の種々の組織中のノックアウトされたＳＰ−Ｃ遺伝子の発現のレベルを評価し得る。最後に、子孫からの種々の細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ分析（例えば細胞を固定し、そして抗体で標識する）および／またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）分析は、ノックアウト構築物遺伝子産物の存在または非存在を調べるために適切な抗体を用いて実行され得る。
【０１３１】
リコンビナーゼ依存性ノックアウトも、ＳＰ−Ｃ遺伝子の不活性化の組織特異的および／または時間的制御がリコンビナーゼ配列により制御され得るよう、例えば相同組換えにより生成され、標的配列を挿入し得る。
【０１３２】
１つより多いノックアウト構築物および／または１つより多い導入遺伝子発現構築物を含有する動物は、いくつかの方法のいずれかで調製される。調製の好ましい方法は、所望の導入遺伝子表現型のうちの１つを各々含有する一連の哺乳類を生成することである。このような動物は、一連の交配、戻し交配および選択により一緒に掛け合わされて、最終的に全ての所望のノックアウト構築物および／または発現構築物を含有する単一動物を生成するが、この場合、ノックアウト構築物（単数または複数）および／または導入遺伝子（単数または複数）の存在を除いて、動物はそうでなければ野生型と類遺伝子性（遺伝子的に同一）である。
【０１３３】
本発明のトランスジェニック動物は全て、複数のそれらの細胞内に、本発明の導入遺伝子を含み、この導入遺伝子は、細胞増殖、死および／または分化の調節に関して、「宿主細胞」の表現型を変える。本明細書中に記載された１つまたは複数の導入遺伝子構築物を利用して本発明のトランスジェニック生物を産生し得るため、外因性遺伝物質について一般的に言及することにより、トランスジェニック生物の産生についての一般的説明が示される。この一般的説明は、下記の方法および材料を利用して生物体中に特定の導入遺伝子配列を組み入れるために、当業者により適合され得る。
【０１３４】
例示的な実施形態では、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系または出芽酵母のＦＬＰリコンビナーゼ系を用いて、当該技術分野で既知のようにｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的遺伝子組換え系を生成し得る。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列間に位置する介在性標的配列の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼが結合し、そしてＣｒｅリコンビナーゼ媒介性遺伝子組換えに必要とされる３４塩基対ヌクレオチド反復配列である。ｌｏｘＰ配列の配向は、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する場合、介在標的配列が切断されるかまたは逆にされるかを確定する；ｌｏｘＰ配列が定方向反復として配向される場合に、標的配列の切断を触媒し、そしてｌｏｘＰ配列が逆方向反復として配向される場合、標的配列の逆位を触媒する。
【０１３５】
したがって標的配列の遺伝子組換えは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によって決まる。リコンビナーゼの発現は、外部付加作用物質による調節制御、例えば組織特異的、発生段階特異的、誘導性または抑制性調節制御を受けるプロモーター要素により調節可能であり得る。この調節制御は、リコンビナーゼ発現がプロモーター要素により媒介される細胞中でのみ、標的配列の遺伝子組換えを生じる。したがって組換えＳＰ−Ｃタンパク質の活性化発現は、リコンビナーゼ発現の制御により調節され得る。
【０１３６】
組換えＳＰ−Ｃタンパク質の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の使用は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび本発明のタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物の構築を要する。Ｃｒｅリコンビナーゼおよび組換えＳＰ−Ｃ遺伝子の両方を含有する動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築により提供され得る。このような動物を提供するための便利な方法は、各々、導入遺伝子、例えばＳＰ−Ｃ遺伝子およびリコンビナーゼ遺伝子を含有する２つのトランスジェニック動物を交配することである。
【０１３７】
例示的な実施形態では、非ヒト動物の生殖系列中への導入遺伝子の導入は、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」を産生する。種々の発生段階での胚性標的細胞は、導入遺伝子を導入するために用いられ得る。胚性標的細胞の発生の段階によって、異なる方法が用いられる。本発明を実行するために用いられる任意の動物の特定の系統（単数または複数）は、全身が良好な健康状態、良好な胚収量、胚における良好な前核可視度、ならびに良好な生殖適応度に関して選択される。さらにハプロタイプは重大な因子である。例えばトランスジェニックマウスが産生されるべきである場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＦＶＢ系統のような系統がしばしば用いられる（Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.）。好ましい系統は、Ｈ−２ｂ、Ｈ−２ｄまたはＨ−２ｑハプロタイプを有するもの、例えばＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１である。本発明を実行するために用いられる系統（単数または複数）は、それ自体トランスジェニックであるか、および／またはノックアウトであり得る（即ち部分的にまたは完全に抑制された１つまたは複数の遺伝子を有する動物から得られる）。
【０１３８】
一実施形態では、トランスジェニック構築物は単一段階胚中に導入される。接合体(zygote)は、マイクロインジェクションのための最良の標的である。マウスでは、雄性前核は直径約２０μｍのサイズに達し、これは１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再生可能な注入を可能にする。遺伝子移入のための標的としての接合体の使用は、ほとんどの場合、注入ＤＮＡが一次切断前に宿主遺伝子中に組入れられるという点で大きな利点を有する（Brinster et al., (1985) PNAS 82: 4438-4442）。結果として、トランスジェニック動物の全ての細胞は組入れられた導入遺伝子を保有する。これは、概して、生殖細胞の５０％が導入遺伝子を保有するため、創始者の子孫への導入遺伝子の効率的伝達にも反映される。
【０１３９】
普通は、受精胚は、前核が出現するまで、適切な培地中でインキュベートされる。ほぼこの時期に、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が下記のように雌または雄性前核中に導入される。いくつかの種、例えばマウスでは、雄性前核が好ましい。外因性遺伝物質が接合体の雄ＤＮＡ相補体に付加された後、その生命体が卵核または接合体雌性前核により処理される、というのが最も好ましい。卵核または雌性前核は、おそらくは雄ＤＮＡのプロタミンをヒストンで置換することにより、雄ＤＮＡ相補体に影響を及ぼす分子を放出し、それにより雌および雄ＤＮＡ相補体の組合せを促して、二倍体接合体を形成する、と考えられる。
【０１４０】
したがって、外因性遺伝物質がＤＮＡの雄相補体またはＤＮＡの任意のその他の相補体に付加された後、その生命体が雌性前核により影響を及ぼされる、というのが好ましい。例えば外因性遺伝物質は、雄性前核の形成後できるだけ直ぐに初期雄性前核に付加されるが、これは、雄および雌性前核が良好に分離され、そして両方が細胞膜近くに位置する場合である。あるいは外因性遺伝物質は、脱凝縮を受けるよう誘導された後、精子の核に付加され得る。次に外因性遺伝物質を含有する精子は卵子に付加されるか、あるいは脱凝縮精子は卵子に付加され、導入遺伝子構築物がその後できるだけ直ぐに付加される。
【０１４１】
胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入は、当該技術分野で既知の任意の手段により、例えばマイクロインジェクション、電気穿孔またはリポフェクションにより成し遂げられ得る。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入後、胚は、種々の長さの時間の間ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートされるか、または代理宿主中に再移植されるか、またはその両方であり得る。成熟までのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションは、本発明の範囲内である。一般的な一方法は、種によって、胚を約１〜７日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートし、そして次に代理宿主中にそれらを再移植することである。
【０１４２】
本発明の目的として、接合体は本質的には、完全生物体に発達し得る二倍体細胞の形成である。一般に、接合体は、単数または複数の配偶子からの２つの半数体核の融合により、天然にまたは人工的に生成された核を含有する卵子を含む。したがって配偶子核は、天然適合性であるもの、即ち機能する生物体への分化および発達を受け得る生育可能接合体を生じるものでなければならない。一般に、正倍数性接合体が好ましい。異数性接合体が生成される場合には、染色体の数は、いずれかの配偶子が生じた生物体の正倍数体数に関して１より大きく変わるべきでない。
【０１４３】
同様の生物学的考察のほかに、物理学的考察も、接合体の核に、または接合体核の一部を形成する遺伝物質に付加され得る外因性遺伝物質の量（例えば容積）を支配する。遺伝物質が除去されない場合には、付加され得る外因性遺伝物質の量は、物理的に破壊されることなく吸収される量により限定される。一般に、挿入される外因性遺伝物質の容積は、約１０ピコリットルを超えない。付加の物理的作用は、接合体の生育可能性を物理的に破壊するほど大きくてはならない。結果として生じる接合体の外因性遺伝物質を含めた遺伝物質は、機能的生物への接合体の分化および発達を開始しかつ保持することが生物学的に可能でなければならないため、ＤＮＡ配列の数および変異の生物学的限度は、特定の接合体および外因性遺伝物質の機能によって変わり、この生物学的限度は当業者に容易に理解されよう。
【０１４４】
接合体に付加される導入遺伝子構築物のコピーの数は、付加される外因性遺伝物質の総量によって決まり、遺伝子形質転換を起こさせる量になる。理論的には、１つのコピーのみが必要であるが、一般的には、１つのコピーが機能性であることを保証するために、導入遺伝子構築物の多数のコピー、例えば１，０００〜２０，０００個のコピーが利用される。本発明に関しては、外因性ＤＮＡ配列の表現型発現を増強するために、挿入外因性ＤＮＡ配列の各々の１つより多い機能性コピーを有することがしばしば有益である。
【０１４５】
核遺伝物質中への外因性遺伝物質の付加を可能にする任意の技法は、それが細胞、核膜またはその他の既存の細胞または遺伝子構造に対して破壊的でない限り、利用され得る。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションにより核遺伝物質中に優先的に挿入される。細胞および細胞構造物のマイクロインジェクションは当該技術分野で既知であり、用いられる。
【０１４６】
再移植は、標準方法を用いて成し遂げられる。通常は、代理宿主が麻酔され、そして胚が卵管に挿入される。特定の宿主中に移植される胚の数は種によって変わるが、通常はその種が天然に産生する子孫の数に匹敵する。
【０１４７】
代理宿主のトランスジェニック子孫は、任意の適切な方法により、導入遺伝子の存在および／または発現に関してスクリーニングされ得る。スクリーニングはしばしば、導入遺伝子の少なくとも一部分と相補的であるプローブを用いて、サザンブロットまたはノーザンブロット分析により成し遂げられる。導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロット分析は、導入遺伝子産物の存在に関してスクリーニングするための代替的または付加的方法として用いられ得る。通常は、ＤＮＡは尾組織から調製され、導入遺伝子に関するサザン分析またはＰＣＲにより分析される。あるいは最も高いレベルで導入遺伝子を発現すると考えられる組織または細胞は、サザン分析またはＰＣＲを用いて導入遺伝子の存在および発現に関して試験されるが、任意の組織または細胞型がこの分析に用いられ得る。
【０１４８】
導入遺伝子の存在を評価するための代替的または付加的方法としては、適切な生化学的検定、例えば酵素および／または免疫学的検定、特定マーカーまたは酵素活性に関する組織染色、フローサイトメトリー分析等が挙げられるが、これらに限定されない。血液の分析も、血中の導入遺伝子産物の存在を検出するために、ならびに種々の型の血球およびその他の血液構成成分のレベルに及ぼす導入遺伝子の作用を評価するために有用であり得る。
【０１４９】
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適切な相手と交配することにより、あるいはトランスジェニック動物から得られた卵子および／または精子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精により、得られる。相手との交配が実施されるべきである場合、その相手はトランスジェニックおよび／またはノックアウトであり得るし、そうでない場合もある。その相手がトランスジェニックである場合、それは同一のまたは異なる導入遺伝子を、あるいは両方を含有し得る。あるいは相手は、親系列であり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精が用いられる場合、受精胚は代理宿主中に移植され得るし、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートされ、あるいはその両方であり得る。いずれかの方法を用いて、子孫は、上記の方法または他の適切な方法を用いて、導入遺伝子の存在に関して評価され得る。
【０１５０】
本発明に従って産生されるトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を含む。上記のように、外因性遺伝物質は、或る種の実施形態では、ＤＮＡ配列であり、これはＳＰ−Ｃタンパク質（アゴニスト性またはアンタゴニスト性）およびアンチセンス転写体またはＳＰ−Ｃ突然変異体を生じる。さらにこのような実施形態では、配列は転写制御要素、例えばプロモーターに結合され、これが、好ましくは特定型の細胞中での導入遺伝子産物の発現を可能にする。
【０１５１】
レトロウイルス感染も、非ヒト動物中に導入遺伝子を導入するために用いられ得る。発生中の非ヒト胚は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞段階に培養され得る。この期間中、卵割球はレトロウイルス感染のための標的であり得る（Jaenich, R. (1976) PNAS 73: 1260-1264）。卵割球の効率的感染は、透明帯を除去するための酵素処理により得られる（Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor), 1986）。導入遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は、通常は導入遺伝子を保有する複製欠損レトロウイルスである（Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148-6152）。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単一層上で卵割球を培養することにより、容易に且つ効率的に得られる（Van der Putten、上記；Stewart et al. (1987) EMBO J. 6: 383-388）。あるいは感染は、さらに後期段階で実施され得る。ウイルスまたはウイルス産生細胞は、胞胚腔中に注入され得る（Jahner et al. (1982) Nature 298: 623-628）。組み入れはトランスジェニック非ヒト動物を構成した細胞のサブセット中でのみ起こるため、創始者(founder)のほとんどが導入遺伝子に関してモザイクである。さらに創始者は、一般に子孫においては分離するゲノム中の異なる位置に導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含有し得る。さらに、中期妊娠胚の子宮内レトロウイルス感染により、生殖系列中に導入遺伝子を導入することも可能である（Jahner et al. (1982)上記）。
【０１５２】
導入遺伝子導入のための標的細胞の第三の型は、胚幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された予備移植胚から得られ、胚と融合される。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションにより、またはレトロウイルス媒介性形質導入により、ＥＳ細胞中に効率的に導入され得る。このような形質転換化ＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と併合され得る。ＥＳ細胞はその後、胚をコロニー化して、その結果生じるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【０１５３】
医薬スクリーン
本発明は、医薬スクリーンが実行されて、ＳＰ−Ｃ媒介性肺プロセスに影響を及ぼし得る化合物を同定する種々のトランスジェニック細胞系統および生物体を提供する。上記のように、トランスジェニック細胞系列および生物体は、内因性ＳＰ−Ｃ遺伝子活性を欠損するよう工学処理される。内因性ＳＰ−Ｃ活性の結果的損失は一般に、「急性期反応」をもたらす。急性期反応はさらに、肺過程、例えば上記の種々の肺疾患および症状に特有のものを開始する。
【０１５４】
ＳＰ−Ｃ媒介性肺過程を防止するために有用であるとして上で同定された化合物は、例えば核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子またはその誘導体であり得る。好ましい化合物は、ＳＰ−Ｃ遺伝子またはタンパク質と結合し、その転写、翻訳、プロセシングまたは活性を調節し得る。例としては、アンチセンス、リボザイムまたは三重らせん核酸、小分子リガンド、抗体または抗体様結合断片が挙げられる。
【０１５５】
このような化合物の毒性および治療効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を確定するために、細胞培養または実験動物において、標準医薬的手法により確定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が用いられ得る場合、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それにより副作用を低減するために、影響を受ける組織の部位に対してこのような化合物を標的とする送達系を設計するよう注意すべきである。
【０１５６】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに用いるための一連の投与量を処方するに際して用いられ得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む一連の循環(circulating)濃度内である。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。本発明の方法に用いられる任意の化合物に関して、治療的有効用量は、細胞培養アッセイから最初に概算され得る。用量は、細胞培養中で確定した場合、ＩＣ５０（即ち症候の半最大(half-maximal)抑制を達成する試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度範囲に達するよう、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより精確に確定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１５７】
本発明に従って用いるための医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いて、慣用的方法で処方され得る。したがって化合物およびそれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒和物は、例えば注射、吸入または吹送（口または鼻を通して）による投与のために、あるいは経口、口腔、非経口または直腸投与のために処方され得る。
【０１５８】
このような療法のために、本発明の化合物は、種々の負荷量の投与、例えば全身および局所または限局性投与のために処方され得る。全身投与のためには、注射、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下注射が好ましい。注射のためには、本発明の化合物は液体溶液中に、好ましくは生理学的相溶性緩衝液、例えばハンクス溶液またはリンガー溶液中に処方され得る。さらに化合物は、固体形態で処方され、そして使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も含まれる。
【０１５９】
経口投与に関しては、医薬組成物は、例えば医薬上許容可能な賦形剤、例えば結合剤（例えば予め糊化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）、または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を用いて、慣用的手段により調製される錠剤またはカプセルの形態をとり得る。錠剤は、当該技術分野で既知の方法により被覆され得る。経口投与のための液体製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとり得るし、あるいはそれらは使用前に水またはその他の適切なビヒクルを用いる組成のための乾燥産物として提示され得る。このような液体製剤は、医薬上許容可能な添加剤、例えば沈殿防止剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）、非水性ビヒクル（例えばationd油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画(fractionated)植物油）、および防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて、慣用的手段により調製され得る。本製剤は、適切な場合には、緩衝塩、風味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
【０１６０】
経口投与のための製剤は、活性化合物の制御放出を生じるよう、適切に処方され得る。口腔投与のためには、組成物は、慣用的方法で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。吸入による投与のためには、本発明に従って用いるための化合物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾル噴霧呈示の形態で送達されることが便利である。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は、定量（metered amount）を送達するよう弁を提供することにより確定され得る。吸入器または吹送器で用いるための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンを含有して処方され得る。
【０１６１】
化合物は、注射により、例えばボーラス注射または連続注入により、非経口投与のために処方され得る。注射用処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中または多用量容器中で、付加防腐剤を伴って呈示され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとり、そして処方剤、例えば沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。あるいは活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えばパイロジェンフリー(pyrogen-free)水による組成のため、粉末形態であり得る。
【０１６２】
化合物はまた、直腸組成物中で、例えば慣用的座薬基剤、例えばココアバターまたはその他のグリセリドを含有する座薬または停留浣腸中で処方され得る。
【０１６３】
上記の処方物のほかに、化合物は、デポー(depot)製剤としても処方され得る。このような長期作用処方物は、移殖により（例えば皮下または筋肉内に）、あるいは筋肉内注射により投与され得る。したがって例えば化合物は、適切な高分子または疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルションとして）あるいはイオン交換樹脂とともに、あるいは貧可溶性(sparingly soluble)誘導体として、例えば貧可溶性塩として処方され得る。その他の適切な送達系としては、長期間の薬剤の局所的非侵襲性送達の可能性を提供する微小球が挙げられる。この技法は、例えば炎症または虚血を引き起こすことなく、心臓または他の器官の任意の選定部分に冠動脈カテーテルを介して注入され得る前毛細血管のサイズの微小球を利用する。投与治療薬は、これらの微小球から徐々に放出され、周囲組織細胞（例えば内皮細胞）により取り込まれる。
【０１６４】
全身投与は、経粘膜または経皮的手段によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与のためには、浸透されるべきバリヤーに対して適した浸透剤が、処方物中に用いられる。このような浸透剤は一般的に当該技術分野で既知であり、例としては、例えば経粘膜投与のための胆汁塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに界面活性剤を用いて、浸透を促し得る。経粘膜投与は、鼻噴霧によるかまたは座薬を用いるものであり得る。局所投与のために、本発明のオリゴマーは、当該技術分野で一般的に既知であるような軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に処方される。洗浄溶液を局所的に用いて、損傷または炎症を治療して、治癒を促進し得る。
【０１６５】
治療薬が遺伝子である情況では、遺伝子送達系は、その各々が当該技術分野で既知の多数の方法のいずれかにより、患者に導入され得る。例えば遺伝子送達系の医薬調製物は、例えば静脈内注射により全身的に導入され得るし、ならびに標的細胞中のタンパク質の特異的形質導入は、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列のために、遺伝子送達ビヒクル、細胞型または組織型発現あるいはそれらの組合せにより提供されるトランスフェクションの特異性から主として起こる。他の実施形態では、組換え遺伝子の初期送達はより限定され、動物への導入は全く限局される。例えば遺伝子送達ビヒクルは、カテーテルにより、または定位注射により導入され得る。治療用遺伝子、例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする遺伝子は、当該技術分野で既知の技法を用いて、電気穿孔により遺伝子療法構築物中で送達され得る。
【０１６６】
遺伝子療法調製物は、本質的に許容可能な希釈剤中の遺伝子送達系からなり、あるいは遺伝子送達ビヒクルまたは化合物が包埋される徐放性基剤を含み得る。あるいは、完全遺伝子送達系が組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから無傷で産生され得る場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含み得る。
【０１６７】
組成物は、所望により、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサー装置中に呈示され得る。パックは、例えば金属またはプラスチック箔、例えばブリスター包装を含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書を添付される。
【０１６８】
本発明はさらに、以下の実施例により例証されるが、これらはいかなる点でも本発明を限定するよう意図されるべきでない。全ての引用された参考文献（例えば本出願全体で引用されるような参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願）の記載内容は、参照されて本明細書の一部とする。本発明の実施は、別記しない限り、当業者の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的技法を用いる。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば以下を参照されたい：Molecular Cloning : A Laboratory Manual、 2nd Ed., ed. By Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); 米国特許第4,683,195号明細書（Mullis等）; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., 1986)。
【実施例】
【０１６９】
材料と方法
動物
上記のように標的化遺伝子不活性化により、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスを生成した［１１］。一般に、１２９／Ｊマウスゲノムライブラリーをスクリーニングして、１２９由来ＥＳ細胞と相同であるＳＰ−Ｃ遺伝子のゲノムクローンを同定した。ＳＰ−Ｃ遺伝子のエクソン２〜６を含有する２．１ｋｂＢａｍＨＩ断片を、遺伝子の修飾のために用いた。１．６ｋｂのｐＧＫｎｅｏ遺伝子カセットを用いた挿入突然変異誘発により、ＳＰ−Ｃペプチドの疎水性ポリバリンドメインをコードする配列を遮断した。この挿入は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８中での増殖による標的化細胞に関する陽性選択を提供した。ＳＰ−Ｃポリバリンドメイン中に位置する独特のＡｐａＬＩ部位を切断するＡｐａＬＩで、２．１ｋｂＳＰ−Ｃプラスミドを消化した。ＡｐａＬＩリンカーｐＧＫｎｅｏＢＰＡカセットを、ＳＰ−Ｃ  ＡｐａＬＩ部位に結繋した。エクソン１および５’フランキングＤＮＡにまたがる１．３ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を、２．１ｋｂのＢａｍ−ｐＧＫｎｅｏＢＰＡ断片の５’ＢａｍＨＩ部位に結繋した。５’ＳｐｈＩ部位に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子をクローニングして、構築物の非相同組込みに対するガンシクロビル選択を提供することにより、ターゲッティング構築物をさらに修飾した。
【０１７０】
精製ＳＰ−Ｃターゲッティング構築物ＤＮＡを用いてＥＳ細胞のＤ３Ｒ系統を電気穿孔し、上記のように選択した（１５）。ＥＳ細胞ＤＮＡをＢｓｕ３６Ｉで消化し、ターゲッティング構築物配列の外側のプローブで分析した。プローブは、ターゲッティング構築物の５’末端に隣接する４５７ｂｐ  ＳｐｈＩ−ＰｓｔＩ断片であった。多重制限酵素消化のゲノムサザンブロットにより、陽性クローンを確証した。
【０１７１】
標的化ＳＰ−Ｃ対立遺伝子を保有するＥＳ細胞クローンをＣ５７／Ｂ１６胚盤胞中でマイクロインジェクトして、宿主マウスに移植した。モザイクアグーチ毛色によりキメラ子孫を同定し、NIH  Swissブラック（Taconic FarmsからのＴａｃ：Ｎ：ＮＩＨＳＢＣｆＢｒ）雌と掛け合わせた。ＢｇｌＩＩ−およびＳｐｈＩ−消化した尾ＤＮＡのゲノムサザンブロット分析により、標的化ＳＰ−Ｃ対立遺伝子の生殖系列伝達に関して、アグーチ子孫をスクリーニングした。４５７ｂｐ５’Ｓｐｈ−Ｐｓｔ断片を、プローブとして用いた。ＳＰ−Ｃ突然変異（＋／−）に関してヘテロ接合性であるＦ１子孫を交配させて、ＳＰ−Ｃ（＋／＋）、ＳＰ−Ｃ（＋／−）およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウスのコロニーを確立した。濾過した空気、水およびオートクレーブ処理した食餌を有する無病原体バリヤー拘束設備中に、全マウスを保持した。
【０１７２】
キメラ創始者マウスを１２９／Ｓｖマウス、Taconic （Germantown, NY）と掛け合わせた。ゲノムサザンブロット分析により、標的化ＳＰ−Ｃ対立遺伝子の伝達に関して、子孫をスクリーニングした。標的化対立遺伝子に関して陽性の動物を掛け合わせて、標的化ＳＰ−Ｃ対立遺伝子に関してホモ接合性である１２９／Ｓｖマウスを確立した。バリヤー拘束設備中に、マウスを保持した。全動物を無菌条件下で取扱い、濾過空気、水およびオートクレーブ処理食餌を有する無菌ユニット中に閉じ込めた。この部屋からのセンチネルマウスは、一般的ウイルス、細菌または寄生性病原体に関して陰性であった。１２月齢で、ＳＰ−Ｃ（−／−）および野生型同腹仔から無菌条件下で調製した肺ホモジネートは、細菌または真菌を含有しなかった。２３マウスウイルス病原体に関する血清学知見は、陰性であった。
【０１７３】
形態学的分析
ケタミン、キシラジンおよびアセプロマジンの混合物の腹腔内注射により、マウスを屠殺した。２５ｃｍＨ２Ｏの圧での４％パラホルムアルデヒドの気管内点滴注入により、肺を膨張させた。一晩固定後、慣用的パラフィン包埋により組織を処理した。６ミクロン組織切片をヘマトキシリン−エオシン、メーソン三重染色、またはオルセイン染色により染色した。前に記載された方法［１３］を用いて、ビオチニル化一次または二次抗体、およびアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ（Vector Elite ABCキット、Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）あるいはストレプタビジン（Zymed Laboratories Burlingame, CA）を用いて、ＭＡＣ−３、ＭＵＣ５Ａ／Ｃ、ＣＣＳＰ、ＳＰ−Ｂ、ＴＴＦ−１およびα−ＳＭＡに関して免疫組織化学染色を実施した。前に記載されたように［１４］、グルタルアルデヒド中での固定後、９月齢ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスおよび齢適合対照から得た肺組織に関して、電子顕微鏡検査を実施した。
【０１７４】
リン脂質およびサーファクタントタンパク質
１５月齢マウス（ｎ＝５／群）をペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔して、放血により屠殺した。気管にカニューレを挿管し、０．９％ＮａＣｌの１ｍｌアリコートを５回、肺中にどっと流して、各アリコートに関して３回、注射器で回収した。洗浄肺組織を取り出し、２ｍｌの０．９％ＮａＣｌ中に均質化した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および肺組織の脂質抽出物中の飽和ホスファチジルコリン（Ｓａｔ  ＰＣ）を、前記［１１］と同様に、四酸化オスミウムで単離し［１５］、その後リン測定［１６］した。リン脂質組成物分析に関しては、ＢＡＬ後の肺組織の抽出脂質を、二次元薄層クロマトグラフィーに用いた［１７］。スポットをヨウ素蒸気で可視化し、掻き取って、リン含量に関して検定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウエスタンブロットにより、ＢＡＬＦ中のサーファクタントタンパク質を分析した［１１、１８］。
【０１７５】
サイトカイン測定
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１３およびＩＬ−６の濃度を、ＢＡＬＦ中および洗浄後全肺ホモジネート中で測定した。各遺伝子型の動物５匹を評価した。メーカーの使用説明書（R and D Systems, Minneapolis, MN）に従って、ＥＬＩＳＡキットを用いた。
【０１７６】
ＭＭＰ活性
前に記載されたように［１９］、１２月齢ＳＰ−Ｃ（−／−）またはＳＰ−Ｃ（＋／＋）１２９／Ｓｖマウスから採取したマクロファージ調整培地中で、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）活性を測定した。１ｍｌのＰＢＳを用いた連続肺洗浄により、マクロファージを単離した。洗浄液をプールし、１％Nutriodoma（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）および１％抗生物質を補足した無血清ＲＰＭＩ培地中で２４時間、２４ウエル組織培養皿のウエル当たり５×１０５細胞で培養中に入れた。４℃で３時間、１５μｌのゼラチン−セファロース４−Ｂビーズ（Amersham Pharmacia, Arlington Heights, IL）を含有する１００μｌ培地のインキュベーションにより、調整培地からのプロテイナーゼを濃縮した。静かに遠心分離してビーズをペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、そして３７℃で１時間、ＢＭＥを含有しないレムリー試料緩衝液中でのビーズのインキュベーションにより、プロテイナーゼを溶離した。１０％ザイモグラムゼラチンゲル（NOVEX, San Diego, CA）への、非還元条件下での電気泳動により、試料を直接分析した。ゲルを２．５％トリトンＸ−１００で２回洗浄し（各々１５分）、展開緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中で１６時間インキュベートした。次にゲルを、５０％メタノール、１０％酢酸中の０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）クーマシーブルー中で染色し、その後、部分脱染して、プロテアーゼ活性の明瞭な帯域を明示した。
【０１７７】
肺機構
１５月齢の野生型およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウス（ｎ＝５／群）の気道および／または肺実質組織において、耐性および弾力を測定した。４０ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび２ｍｇ／ｍｌのキシラジンを含有する混合物（ｉｐ）を０．１ｍｌ／体重１０ｇで用いて、マウスを麻酔した。マウスを気管切除して、コンピューター化フレキシベント（SCIREQ, Montreal, Canada）により送達される強制振動技法（０．２５〜２０Ｈｚ）を用いて、呼吸インピーダンスを測定した［２０］。各インピーダンススペクトルにモデルを適合させることにより、２ｃｍ  Ｈ２Ｏ  ＰＥＥＰでのマウスに関する概算総肺コンプライアンス、気道耐性、気道エラスタンス、組織ダンピングおよび組織エラスタンスを得た。組織ダンピング対組織エラスタンスの比として、hysteresivityを算定した。この系を用いて、較正手法は、設備および気管内チューブのインピーダンスを除去した。
【０１７８】
１０〜１２月齢野生型およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウス（ｎ＝５／群）で、圧力−容積関係を試験した。マウスをペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔し、１００％Ｏ２を含入する箱に入れて、Ｏ２吸収による肺胞の完全虚脱を保証した。放血によりマウスを屠殺後、圧力センサー（Mouse Pulmonary Testing System, TSS, Cincinnati, OH）に接続したカニューレを気管に挿入し、膨張および収縮中に５ｃｍＨ２Ｏの間隔で、体重１ｋｇ当たりの肺容積を確定した［２１］。
【０１７９】
結果
ＳＰ−Ｃ（−／−）１２９／Ｓｖコンジェニックマウス
１２９／Ｓｖ胚幹細胞から生じたＳＰ−Ｃ（＋／−）キメラ創始者を、１２９／Ｓｖマウスと掛け合わせた。ＥＳ細胞由来精子のみがキメラオス創始者からのＳＰ−Ｃ突然変異を運ぶため、専ら１２９／Ｓｖ生殖細胞からＳＰ−Ｃ（−／−）子孫を産生した。したがってＳＰ−Ｃ（−／−）子孫は、近交系を表す。２月齢までのＳＰ−Ｃ（−／−）マウスに、健康不良および生殖能力低減が認められた。６月齢より上の動物により生まれた同腹子は少数であった。毛づくろい不良および結膜炎が、６月齢を超えた全てのＳＰ−Ｃ（−／−）１２９／Ｓｖ動物で認められた。被毛状態の劣化が、２月齢後のほとんどのＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで観察された。１２〜１３月齢ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの平均体重は、対照と比較して２４％低減した（２５．７ｇ±３．２、ｎ＝７対３３．５ｇ±３．０、ｎ＝７）。これらの高齢ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスでは、心臓／体重比で確定した場合、相対心臓重量が増大した。比は３０％増大し、右心室は左心室より拡大した（０．００５６５±０．０００２６、ｍ±ＳＤ、ｎ＝１０（ＳＰ−Ｃ  −／−）対０．００４３１±０．０００３３、ｍ±ＳＤ、ｎ＝７（ＳＰ−Ｃ  ＋／＋）、ｐ＜０．００７）。
【０１８０】
ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺の形態学的変化
ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺構造は出生時は正常であった（データは示されていない）が、気腫の発症と一致して、２月齢までにおよびその後に、肺胞の拡張が観察された（図１）。肺胞中隔形成は不規則で、肺実質組織全体に肺胞中隔先端部の非存在または短縮化が観察された。一般に肺胞マクロファージおよびその他の単核球からなる多病巣性細胞浸潤物が検出された（図１Ｂ）。６月齢マウスからの肺では、統合化実質組織浸潤が一般的に観察された。ＩＩ型細胞過形成および間質肥厚の広範な領域が、肺実質組織中に観察された。実質組織異常および細胞浸潤物の程度および重症度は齢とともに増大し、１２月齢でいくつかの肺胞間隙の完全閉塞をしばしば生じた。上皮細胞過形成、間質肥厚および繊維症を伴う領域が、肺胞および気道で観察された。広範な血管周囲および細気管支周囲単球浸潤物が、最も重度に罹患した動物で検出された（図１Ｆ）。
【０１８１】
肺胞リモデリング
三重染色は、肺実質組織、胸膜表面における、そして血管周囲および細気管支周囲部位での繊維症の領域を実証した（図２）。いくつかの領域では、肺実質組織全体に広がったクモの巣様形状で、コラーゲン沈着が分布した。筋繊維芽細胞形質転換を示す広範なα−ＳＭＡ染色が、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺胞全体に観察された。α−ＳＭＡ染色の強度および程度は、概して、齢に伴って増大したが、肺切片内および同腹仔間では可変性であった（図２）。オルセイン染色により検出される肺胞エラスチン繊維の網状構造の損失が、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺胞崩壊領域で観察された（図２）。オルセイン染色低減を示す領域は三重染色増大の部位と共局在したが、これは、肺胞リモデリングの重症度がＳＰ−Ｃ欠損マウスにおける肺繊維症と相関する、という概念を支持した。
【０１８２】
電子顕微鏡知見
電子顕微鏡レベルでは、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺胞はしばしば肥厚し、過形成性ＩＩ型上皮細胞に裏打ちされた（図３Ａ）。立方細胞の数の増大が裏打ち肺胞表面で観察され、そしてＩＩ型細胞は過剰数の層状体を含有した。毛細血管壁は、周囲ストロマおよびコラーゲンにより肥厚されるか、または消失された。気管支および細気管支は、高異型円柱上皮に裏打ちされた。誘導気道は、多数の非定型高電子密度細胞小器官を含有する非繊毛円柱上皮細胞に裏打ちされたが、これは、クララ細胞の非定型ミトコンドリア特性と一致する［２２］。ＩＩ型細胞は肥厚性で、数が増大した層状体および脂質封入体を含有した。肺胞においては、基底膜が肥厚し、多数のコラーゲン繊維を含有した。多数の毛管管腔が消失され、繊維症の領域が容易に識別された。大型血管の基底膜および内皮表面は崩壊した。異常肺胞マクロファージは界面活性剤様物質の大蓄積を含有し、管状ミエリンおよび層状体の構造的特徴を有した（図３）。
【０１８３】
マクロファージ形態および異常脂質蓄積
ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺胞間隙中の単核球の小集団(subset)は、肺胞マクロファージ細胞マーカーであるＭＡＣ３抗体に強く染色した（図４Ｂ）。異常細胞内脂質封入体が、肺胞マクロファージ中で観察された（図４Ｄ）。同様に、脂質蓄積も、残留肺胞を裏打ちする過形成ＩＩ型上皮細胞で認められた（図４Ｄ）。微細構造レベルでは、異型肺胞マクロファージは豊富な界面活性剤化合物、例えば層状体および管状ミエリン、細胞外形態の肺界面活性剤を含有した（図３）。他のマクロファージは、多数の細胞質結晶を含有したが、これは哺乳類レクチンであるＹｍｌにより生成されるものと一致する［２３］。質量分光分析は、ＢＡＬＦ中の増大Ｙｍｌの存在を確証した（データは示されていない）。細胞内結晶および脂質の蓄積は、このバリア設備内に保持された対照１２９／Ｓｖからの肺胞マクロファージ中に検出されなかった。６月齢ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからのＢＡＬＦでは、肺胞マクロファージの数は、４．４倍増大された（それぞれＳＰ−Ｃ（−／−）対ＳＰ−Ｄ（＋／＋）で９０２１±１０１７対２０３９±４９７（ｎ＝５））。リンパ球のパーセンテージは変わらなかった。多形核細胞および好酸球における変化は観察されなかった。
【０１８４】
上皮細胞形成異常
誘導気道上皮細胞形態における顕著な変化が、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで観察された（図５）。上皮細胞形成異常は６〜１２月齢で容易に明らかになり、誘導気道は過形成性多列円柱上皮により裏打ちされた（図１Ｆ、５Ｂ）。ＭＵＣ５Ａ／Ｃ染色細胞は野生型マウスにおいて稀に観察されたが、ＭＵＣ５Ａ／Ｃ陽性細胞は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの誘導気道のほとんどを裏打ちした（図５Ｄ）。誘導気道のＭＵＣ５Ａ／Ｃ染色は一般に広範囲であったが、染色パターンの不均一が生じた。クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）およびプロＳＰ−Ｂに関する免疫染色が検出されたが、染色の程度および強度は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける重症罹患誘導気道では低減し、これはまた、上皮細胞形成異常と一致した（データは示されていない）。肺胞では、中隔肥厚および高密度単球浸潤が広範な上皮過形成域で認められた。しかしながら重症空隙リモデリングを示すいくつかの領域では、ＩＩ型細胞を欠く肺胞もあった。それらの病変部では、扁平上皮細胞のクモの巣様紐が、毛管を欠く肺胞を構成した。
【０１８５】
肺機構
圧力−容積曲線の収縮部における高圧では、肺容積は、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｃ（−／−）で有意に増大し（図６）、これは組織学的に観察された気腫（図１）と一致した。低圧では、肺容積は正常であり、残留肺容積は０圧で保持されたが、これは正常界面活性剤機能と一致した。同様に、７ｍｌ／ｋｇの通気容積で得られる動的肺コンプライアンスにおいては、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスおよび対照マウス間に有意差は認められなかった（表ＩＩ）。気道および組織エラスタンスは変化しなかったが、気道耐性および組織ダンピングはともに、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで有意に増大された（ｐ＜０．０５）。Hysteresivityは、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいて有意に増大された（ｐ＜０．０１）。これらの知見は、観察された気腫と、界面活性剤機能の保持と一致する。界面活性剤組成組織および総界面活性剤リン脂質プールサイズは、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスでは約２倍増大した（図７）。ＢＡＬ後の肺組織中の脂質の組成は、変化しなかった（表１）。ＢＡＬＦのウエスタンブロット分析により、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｄを概算した。サーファクタントタンパク質Ｂレベルは変わらなかったが、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−ＤはＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいて有意に増大した。
【０１８６】
【表１】
2006519588.tif 000002
【０１８７】
【表２】
2006519588.tif 000003
【０１８８】
サイトカインおよびメタロプロテイナーゼ発現
６月齢マウスからのＢＡＬＦおよび肺ホモジネートで、炎症性サイトカインの濃度を確定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＩＰ−２およびＩＬ−１３は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいては変化しなかった。１年齢でのＳＤＳ／ＰＡＧＥザイモグラフィーにより、ＭＭＰ活性に関して、ＳＰ−Ｃ（−／−）および（＋／＋）からの培養肺胞マクロファージの上清を試験した。ゲラチナーゼ活性はＳＰ−Ｃ（−／−）マクロファージからの調整培地中では容易に検出可能であったが、対照マクロファージ（ＳＰ−Ｄ＋／＋）からの培地中では検出できなかった。プロテイナーゼのバンドは、約７２ｋＤａおよび９２ｋＤａに移動したが、これはＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９とそれぞれ一致する（データは示されていない）。さらにＭＭＰ−１２  ｍＲＮＡは、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからの肺ＲＮＡ中では３．５８倍増大した。ＭＭＰ活性の発現増大は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで観察される肺胞リモデリングの一因となり得る。
【０１８９】
考察
ＳＰ−Ｃ（−／−）１２９／Ｓｖマウスの類遺伝子系統におけるＳＰ−Ｃ遺伝子の標的化欠失により、気腫、上皮細胞形成異常、単球浸潤、肺繊維症および異常脂質蓄積により特徴付けされる重症肺障害を引き起こした。異種肺病変は、１）α−平滑筋アクチンに関して染色した肥厚化繊維性肺胞壁、２）広範な単球浸潤物およびメタロプロテイナーゼの発現増大、３）中隔肉細化および肺毛細血管変性を伴う重症気腫の領域、４）誘導気道における上皮細胞形成異常およびＭＵＣ５Ａ／Ｃ発現、ならびに５）種々の細胞型における細胞内脂質の蓄積を含有した。ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける病理学的知見は、特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）と呼ばれる種々の症状を有する患者からの肺で観察されたものと一致したが、同一ではなかった。したがってＳＰ−ＣまたはプロＳＰ−Ｃの欠如は、マウスにおける間質性肺疾患の病因に直接結びつけ得る。
【０１９０】
ＳＰ−Ｃ遺伝子における突然変異は最近、常染色体優性疾患として受け継がれた家族性間質性肺炎と関連づけられた［８、９］。突然変異ｃ４６０＋１Ｇ→Ａを有し、プロＳＰ−Ｃペプチドのエクソン４欠失（ＩＩ型上皮細胞内に蓄積されるミスプロセシング化プロＳＰ−Ｃ）を生じる同胞群では、組織および肺洗浄物質は活性ＳＰ−Ｃペプチドを欠いた［８］。同様に、単一塩基対置換（Ｌ１８８Ｑ）は、ＩＩＰを有する広範な家族におけるプロＳＰ−Ｃの細胞内局在性を変えた［９］。したがってこれらの患者における重症肺疾患がＳＰ−Ｃの欠如に起因するか、あるいはミスフォールディング化突然変異体ＳＰ−ＣまたはプロＳＰ−Ｃタンパク質の異常蓄積に起因するのかは不明である。本試験は、ＳＰ−Ｃそれ自体の欠如が種々の形態の成人および小児期間質性肺炎と一致する病理学的知見の多くを反復し得る、ということを実証する。
【０１９１】
プロＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ｃの非存在はマウスにおける重症肺疾患を引き起こしたが、この障害の分子的病因は、依然として不明である。光学顕微鏡レベルでは、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺構造は、Ｅ１９．５および生後１日目では正常であった（データは示されていない）。肺構造において見られる異常は、齢の進行に伴って増大したが、このことは、気腫およびリモデリングが肺形態形成における異常から生じないが、進行中の損傷および修復過程から生じる、ということを示唆する。前に気腫および炎症と関連づけられた種々の炎症性サイトカインの発現は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいては変わらなかった。好中球数の変化は認められず、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおけるウイルスまたは細菌感染の証拠は観察されなかった。これらの知見は、リモデリングおよび炎症が肺に内在する細胞異常により引き起こされ、そしてＳＰ−Ｃの機能に、あるいはおそらくは病因に対する感受性というよりむしろマクロファージにより生産されるＭＭＰによる細胞外マトリックスの選択的分解の結果によっている、ということを示唆する。肺胞マクロファージによるＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２産生、ならびにＭＭＰ−１２ｍＲＮＡレベルは増大され、したがってＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける肺疾患の病因に一役を果たし得る。ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１２発現増大は、前に、ＳＰ−Ｄ遺伝子標的化マウスにおける気腫と関連づけられた［２４］。
【０１９２】
炎症性サイトカインはＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺では増大しなかったが、肺は、多数の脂質封入体およびＹｍｌ結晶を含有する異型肺胞マクロファージで浸潤された［２３］。異常マクロファージの数は、対照と比較して４〜５倍増大した。細胞浸潤は、肺胞肥厚および繊維症と関連づけられた。微細構造レベルで観察された筋繊維芽細胞形質転換およびコラーゲン沈着は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺胞壁全体で観察されたα−ＳＭＡ染色増大と一致した。逆説的に、プロＳＰ−Ｃは野生型マウスにおいてはこれらの細胞中では発現されない、という事実にもかかわらず、顕著な上皮細胞形成異常はＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの誘導気道で観察された。さらにＭＵＣ５Ａ／Ｃの高レベルの発現が、ＳＰ−Ｃ  ｍＲＮＡおよびタンパク質が普通は発現されない部位で誘導気道において観察された。ＭＵＣ５Ａ／Ｃは、普通はマウスの誘導気道中で低レベルで発現されるが、炎症または炎症性サイトカインにより容易に誘導され、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびアレルゲンにより増大される［再検討のためには２５］。これら後者の知見は、ＳＰ−Ｃの欠如が肺胞の外側の遺伝子発現に影響を及ぼし得る、ということを示唆し、ＳＰ−Ｃが誘導気道において、直接または間接的に一役を果たすことを意味する。しかしながら、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの誘導気道における細胞異常がＳＰ−Ｃ依存性シグナル伝達事象により直接的に媒介されるか、あるいは表面力のＳＰ−Ｃ依存性変調またはＳＰ−Ｃの非存在下での粘膜毛様体クリアランスの変化に関連づけられ得るかは、不明である。
【０１９３】
重症肺疾患が優性遺伝突然変異体プロＳＰ−Ｃタンパク質の発現またはＳＰ−Ｃ遺伝子の欠失により引き起こされ得る、という知見は、ＳＰ−ＣがＩＩＰの病因の一因であり得るいくつかの考え得るメカニズムを示唆する。Nogee等およびThomas等［８、９］により記載されたＩＩＰ患者では、突然変異体プロＳＰ−Ｃタンパク質は、ＩＩ型細胞内に蓄積し、おそらくは、前駆体タンパク質のミスフォールディングまたはミスプロセシングに関連した細胞損傷を作り出す。この考えを支持して、Conkright等は近年、ＳＰ−Ｃ突然変異体タンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｖｏで致死性肺機能不全を引き起こす、ということを実証した［２６］。しかしながら活性ＳＰ−Ｃペプチドは、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいては、ならびにこの優性遺伝ＳＰ−Ｃ突然変異により引き起こされるＩＰＦを有する患者においては存在しなかった［８］。したがってＳＰ−Ｃそれ自体の欠如は、ＩＩＰの病因に関与し得る。Amin等は近年、ＳＰ−Ｃのコード領域における突然変異を見出すことができなかったにもかかわらず、３個体がＩＩＰに重度に罹患し、その各々が肺胞洗浄液中のプロＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｃの検出可能発現を欠いた同胞群を記載した［２７］。プロＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｃの選択的欠如がこれらの患者における障害を直接引き起こしたか否かは不明である。
【０１９４】
界面活性剤機能における異常はＩＩＰの一因であるか？
本知見は、ＳＰ−Ｃそれ自体の欠如がマウスにおける間質性肺炎の特徴を有する症候を引き起こす、ということを実証する。ＳＰ−Ｃは空隙中のリン脂質の表面特性を増強するため、ＳＰ−Ｃの欠如がやがて界面活性剤機能を変えて、間質性肺炎をもたらす可能性がある。しかしながら肺リン脂質含量は、Swissブラック系統のＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいては変化せず［１１］、１２９／ＳｖバックグラウンドにおけるＳＰ−Ｃ（−／−）マウスでは２倍増大した。界面活性剤リン脂質組成、層状体および管状ミエリンの構造は一般に、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの両系統で保存された。８週齢Swissブラック系統ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの先の試験において示された肺機構および肺組織学における変化は、本発明の試験とは異なった。ＳＰ−Ｃ（−／−）Swissブラックマウスでは、炎症または気腫の証拠は認められなかった。hysteresivityは、組織エラスタンスおよび抵抗が変わらない間は低減し、界面活性剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表面活性の控えめな異常と一致する知見である。これに反して、本発明の試験におけるＳＰ−Ｃ（−／−）マウスは、気道耐性、組織ダンピングおよびhysteresivityにおける重度の異常を示し、広範な気腫と一致して有意に増大した［２８］。さらにＳＰ−Ｂおよび界面活性剤リン脂質プールサイズは、界面活性剤機能の観察された保存と一致して、正常であるかまたは増大した。ＳＰ−Ｃ（−／−）１２９／ＳｖマウスにおけるＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄのレベルの穏当な増大は、慢性肺炎症に関連した変化を反映し得る。したがって、界面活性剤欠乏がＳＰ−Ｃ（−／−）１２９／Ｓｖマウスにおける慢性肺疾患の主な原因であるという証拠は目下認められないが、本発明の試験において識別不可能である剪断力の微妙な差は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける肺構造および肺機能の崩壊の一因であり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、種々の成長因子、サイトカインおよび剪断応力が肺繊維芽細胞の筋繊維芽細胞形質転換を引き起こし得る、ということを実証する。マウスにおいて本発明の試験で観察されたα−ＳＭＡ染色増大と一致して、広範な繊維症および筋繊維芽細胞形質転換はしばしば、ＩＩＰを有するヒトにおいて観察される［１０］。コラーゲン沈着および繊維芽細胞の数の増大も、ＩＩＰを有するヒト患者において観察されるのと同様に、肺胞壁内で容易に観察される。ＳＰ−Ｃの欠如が肺疾患の病因の一因である場合、外因性ＳＰ−Ｃが投与される療法は、ＩＩＰ患者のために考慮され得る。他方で、障害がＳＰ−Ｃまたは突然変異体ＳＰ−Ｃのミスルーティングおよび異常蓄積により引き起こされる場合、正常ＳＰ−Ｃの付加または発現増大は、実際に障害の一員であり得る。
【０１９５】
ＳＰ−Ｃ欠乏は脂質蓄積症を引き起こすか？
非定型マクロファージ中に蓄積される界面活性剤脂質、層状体および管状ミエリン、ならびに顕著な脂質小滴が、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの肺中のＩＩ型細胞の下にある豊富な繊維芽細胞で観察された。これらの病理学的知見は、ＳＰ−Ｃの非存在が、界面活性剤またはその他の細胞構成成分の異化作用を変え、貯蔵障害を生じる、ということを示唆する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ＳＰ−ＣがＩＩ型上皮細胞による界面活性剤脂質取り込みを増強し、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｂとは別個の方法で機能する、ということを示したが、後者は上皮表面と関連した大型界面活性剤集合体を保持するのに役立つ［２９］。したがってＳＰ−Ｃは、界面活性剤恒常性における細胞内および細胞外の両方の役割を有し得る。
【０１９６】
系統はＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける病理学的知見に影響を及ぼす
１２９／Ｓｖ系統におけるＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで観察される重症肺疾患は、非近交系Swissブラックバックグラウンド中に保持される場合、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで観察されるより軽度の異常と明確に対照を成す。ＳＰ−Ｃ（−／−）／Swissブラックマウスは肺構造中に明白な異常を有さないが、これらのマウスは、高酸素症およびサーファクタントタンパク質Ｂの低減におかれた場合、肺機能不全を受け易い［１２］。重症度、時間および場所で変わるＳＰ−Ｃ（−／−）表現型および肺病変の不均一性に及ぼす強力な系統依存性影響は、ＳＰ−Ｃ遺伝子における突然変異により引き起こされる家族性特発性繊維症患者における知見と一致する［３０］。これらの症候群は、α１−アンチトリプシン欠損と関連した気腫とは臨床的におよび病理学的に異なる。ＩＩＰでは、臨床的および病理学的知見は、これらの同胞群において大いに変わり、多面的組織病理学的診断が、同一ファミリー内で成されてきた。ＳＰ−Ｃ突然変異の性質は障害に影響を及ぼし得るが、重症度の顕著な不均質性、呈示の齢、ならびに肺疾患の進行時間はこれらの障害を特徴付けし、このことは、環境因子またはその他の遺伝子がその病因に強く影響を及ぼすことを示唆する。ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおけるＳＰ−Ｃ欠損により引き起こされる肺疾患の重症度における観察された系統差は、ＳＰ−Ｃ欠損またはＳＰ−Ｃ突然変異に関連した表現型が遺伝的因子により強く影響を及ぼされ得る、ということを示唆する。感染が本発明の試験の解釈を複雑にしたという証拠はないが、ＩＩＰ患者における肺機能不全は感染により悪化される。
【０１９７】
診断および治療に関する含意
本発明の試験および近年のヒト試験［８、３０］は、おそらくは、遺伝子突然変異と特発性間質性肺疾患との間の最初の関連を提供する。ＳＰ−Ｃの非存在はＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける重症肺疾患を引き起こしたため、ＳＰ−Ｃの欠損は、遺伝的であろうが、損傷に派生しようが、急性および慢性肺疾患の一因であり得る、という可能性もある。ＳＰ−Ｃにおける突然変異とヒトにおけるＩＩＰとの関連は、疾患の危険に関する遺伝子試験を実行可能にする。同様に、ＳＰ−Ｃ遺伝子における突然変異により引き起こされる種々の病理の組織学的診断は、免疫組織化学によりなされ得る。突然変異体ＳＰ−Ｃ遺伝子の検出あるいはＢＡＬＦからのＳＰ−Ｃの存在または非存在は、複雑な肺疾患を有する患者におけるＳＰ−Ｃの役割に診断的洞察を提供し得る。最後に、ヒトＩＩＰが１）ＳＰ−ＣおよびプロＳＰ−Ｃの非存在、２）ＳＰ−Ｃプロタンパク質または活性ＳＰ−Ｃペプチドのミスフォールディングおよびミスルーティング、あるいは３）その恒常性がプロＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ｃによっている他の細胞構成成分のルーティング、プロセシングまたは分解の変化により引き起こされるか否かは、不明である。ＩＩ型またはその他の肺細胞におけるタンパク質ミスフォールディングが肺疾患の病因の一因である場合、ＳＰ−Ｃ以外のタンパク質のミスフォールディングは、間質性肺疾患の病因において考慮され得る。ＳＰ−Ｃの異常に関連した間質性肺疾患を引き起こす細胞および分子メカニズムの解明は、ＩＩＰのための新規の療法の開発に概念的基礎を提供し得る。
［参考文献］
【０１９８】
【表３】
2006519588.tif 000004
【０１９９】
【表４】
2006519588.tif 000005
【０２００】
【表５】
2006519588.tif 000006
【０２０１】
【表６】
2006519588.tif 000007
【０２０２】
その他の実施形態
本発明を、その詳細な説明とともに記載してきたが、上記の説明は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲により限定される。その他の態様、利点および修正は、特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける肺組織病理学の進行。肺は、野生型同腹仔（Ａ、Ｃ、Ｅ）またはＳＰ−Ｃ（−／−）（Ｂ、Ｄ、Ｆ）マウスから得た。肺を２０ｃｍＨ２Ｏの圧力で膨張固定し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。空隙拡張、可変性支質肥厚および単球浸潤が、２月齢（Ｂ）、６月齢（Ｄ）および１２月齢（Ｆ）で認められた。誘導気道における脈管周囲および細気管支周囲単核浸潤物および上皮細胞形成異常を、パネルＦに示す。顕微鏡写真（倍率６２５倍）は、同月齢の少なくとも３〜５匹の動物の代表的なものである。
【図２】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける気腫。対照（パネルＡ）およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウス（パネルＢ）における肺組織学は、１歳での肺胞サイズの顕著な増大を実証する。マクロファージ浸潤がパネルＢの中央および下方領域に観察される。
【図３】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからの肺におけるリモデリング(remodeling)および増大三重染色。６月月齢の野生型（Ａ、Ｃ、Ｅ）、およびＳＰ−Ｃ（−／−）（Ｂ、Ｄ、Ｆ）同腹仔からの、メーソン三色（Ａ、Ｂ）、オルセイン（Ｃ、Ｄ）およびα−平滑筋アクチン免疫染色（Ｅ、Ｆ）を示す。単球浸潤および高密度青色染色による空隙リモデリングを観察した（矢印）。オルセイン染色は、エラスチン繊維がリモデル化空隙の多くに存在しないことを実証した（Ｄ）。α−平滑筋アクチン染色は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける肺実質の肺胞領域で観察された（矢印）が、野生型マウスでは観察されなかった。
【図４】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける微細構造異常。９月齢でのＳＰ−Ｃ（−／−）マウスに関して、電子顕微鏡観察を実施した。ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからの肺胞壁において、顕著な異常を観察した（Ａ）。ＩＩ型細胞は過形成性で、多数の層状体様封入体を含有し、コラーゲン沈着が肺胞壁内に認められた。肺胞毛管は、肥厚上皮下支質により取り囲まれた。誘導気道は、非定型形態を有する形成異常性上皮細胞により裏打ちされた（Ｂ）。同様に非定型ミトコンドリアを表す多数の細胞変性高密度細胞小器官が、非繊毛円柱上皮細胞で観察された。肺胞マクロファージは過形成性であり、いくつかは、高密度結晶を含有した（上方細胞、Ｃ）。層状体および管状ミエリン形状を含めた過剰量の界面活性剤脂質を含有する他のものが観察された。肺血管異常が、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける小血管で観察された。血管は、多数の肺胞において閉塞されるかまたは存在しなかった。異常膜小胞形成が、異常血管内膜に沿って頻発的に観察された（Ｄ）。
【図５】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける肺胞マクロファージ浸潤物。ＭＡＣ−３免疫染色を、６月齢の野生型（Ａ）およびＳＰ−Ｃ（−／−）（Ｂ）マウスで評価した。ＭＡＣ−３染色細胞による広大な浸潤が、重症気腫と関連して認められた（Ｂ）。顕微鏡写真（倍率６２５倍）は、少なくとも５匹のＳＰ−Ｃ（−／−）マウスおよび対照の代表的なものである。野生型（Ｃ）およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの半薄切片を、トルイジンブルーで染色し、肺胞および肺胞マクロファージ異常を実証した。脂質封入体が、肺胞を裏打ちする過形成性ＩＩ型細胞で、ならびに空隙中に蓄積する多数の肺胞マクロファージで認められた。
【図６】２月齢のＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの誘導気道における上皮細胞形成異常およびＭＵＣ５Ａ／Ｃ染色。野生型（Ａ、Ｃ）またはＳＰ−Ｃ（−／−）（Ｂ、Ｄ）からの誘導気道が、Ｈ＆Ｅ染色（Ａ、Ｂ）またはＭＵＣ５Ａ／Ｃ免疫組織化学（Ｃ、Ｄ）後に観察された。上皮細胞形成異常は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスの大および小誘導気道で観察された。異常上皮細胞は過形成性であり、多列上皮の異常病巣を伴った。ＭＵＣ５Ａ／Ｃ染色細胞は野生型マウスにおいてはほとんど観察されなかった（Ｃ）が、ＭＵＣ５Ａ／Ｃに関する広大な染色が気管支および細気管支全体を通して観察され（Ｄ）、時折、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける末梢肺実質で観察された（示されていない）。パネルＡ、Ｂ：倍率６２５倍；パネルＣ、Ｄ：倍率１２５０倍。
【図７】圧力−容積分析は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおける肺容積増大を実証する。１０〜１２月齢の気管切開野生型およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウス（ｎ＝５／群）で、圧力−容積曲線を完成した。高圧での肺容積の有意の増大が、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで観察された。＊ｐ＜０．０１。
【図８】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおけるリン脂質（ＳａｔＰＣ）およびサーファクタントタンパク質。Ａ：ＢＡＬＦ、ＢＡＬ後の肺組織ならびにＢＡＬＦおよび組織分画の和（合計）における野生型およびＳＰ−Ｃ（−／−）マウスにおいて、ＳａｔＰＣプールサイズを確定した。ＳａｔＰＣは、１５月齢で野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスではＢＡＬＦで６０％、そして組織および合計では２倍、増大された。Ｂ：ＳａｔＰＣの量と比較して、ウエスタンブロットにより、ＢＡＬＦ中のサーファクタントタンパク質の量を概算した。野生型マウスに関する値を値１に標準化した。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで増大された。Ｃ：ＢＡＬＦ中のＳＰ−Ａ、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｄに関するプールサイズ／体重を、野生型マウスに関する値１に対して標準化した。ＳＰ−Ｂレベルは変化しなかったが、一方、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−ＤはＳＰ−Ｃ（−／−）マウスで増大された。平均±ＳＥ。＊ｐ＜０．０５。
【図９】ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからのマクロファージにより生成されるメタロプロテイナーゼ活性増大。ＳＰ−Ｃ（−／−）マウス、レーン１およびＳＰ−Ｃ（＋／＋）マウス、レーン２からの肺胞マクロファージからの調整培地のザイモグラフィーにより、ＭＭＰ活性を評価した。プロテアーゼ活性７２ｋｄ（ＭＭＰ−２）および１０５ｋｄ（ＭＭＰ−９）は、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからの培地中で増大された（矢印）。ＭＭＰ−１２のサイズと一致する５５ｋｄのかすかなバンドも、ＳＰ−Ｃ（−／−）マウスからの調整培地中で増大された（矢頭）。ゲルは、４つの別個の実験からの観察と一致した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
2006519588.tif 000031
2006519588.tif 000032
2006519588.tif 000033