(57)【要約】本発明は、単離されたＣＤ１４＋抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）ならびにその単離および濃縮された集団を提供する。本発明はまた、単離および濃縮のための方法を提供する。また、Ｔ細胞応答をインビボ、インビトロ、およびエキソビボで調節するためにこのＣＤ１４＋抗原提示細胞を使用するための方法が、本発明により提供される。さらに、本発明は、ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋を発現する、抗原提示細胞の単離された集団を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋を発現する、抗原提示細胞の単離された集団。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋抗原提示細胞の単離された集団であって、該抗原提示細胞は、樹状細胞である、集団。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された細胞集団であって、該集団は、前記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞について濃縮されている、集団。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された樹状細胞集団であって、該樹状細胞集団は、成熟樹状細胞について実質的に濃縮されている、集団。
【請求項５】
請求項２に記載の単離された樹状細胞集団であって、該樹状細胞集団は、未成熟樹状細胞について実質的に濃縮されている、集団。
【請求項６】
請求項２に記載の単離された樹状細胞集団であって、所定の抗原をさらに含む、集団。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記所定の抗原は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である、集団。
【請求項８】
請求項７に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記腫瘍関連抗原は、前立腺関連抗原である、集団。
【請求項９】
請求項８に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記前立腺関連抗原は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、または前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）である、集団。
【請求項１０】
請求項６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記所定の抗原は、自己抗原である、集団。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された樹状細胞集団であって、少なくとも１種のサイトカインをさらに含む、集団。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記少なくとも１種のサイトカインは、炎症性サイトカインである、集団。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、またはＣＤ４０リガンドである、集団。
【請求項１４】
請求項１１に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記少なくとも１種のサイトカインは、抗炎症性サイトカインである、集団。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、またはＰＧＥ２である、集団。
【請求項１６】
請求項２に記載の単離された樹状細胞集団であって、Ｔ細胞の濃縮された集団またはＮＫ細胞の濃縮された集団をさらに含む、集団。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記Ｔ細胞の濃縮された集団は、単離されたＴ細胞を含む細胞集団である、集団。
【請求項１８】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記Ｔ細胞の単離された集団は、Ｔ細胞について実質的に濃縮されている、集団。
【請求項１９】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記樹状細胞集団および前記Ｔ細胞集団は、自己由来であるか、同系であるか、または同種異系である、集団。
【請求項２０】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されている、集団。
【請求項２１】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されている、集団。
【請求項２２】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合集団から構成されている、集団。
【請求項２３】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記ＮＫ細胞の濃縮された集団は、単離されたＮＫ細胞を含む細胞集団である、集団。
【請求項２４】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記ＮＫ細胞の濃縮された集団は、ＮＫ細胞について実質的に濃縮されている細胞集団である、集団。
【請求項２５】
請求項１６に記載の単離された樹状細胞集団であって、前記樹状細胞集団および前記ＮＫ細胞集団は、自己由来であるか、同系であるか、または同種異系である、集団。
【請求項２６】
ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団と、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）とを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物であって、Ｔ細胞の単離された集団またはＮＫ細胞の単離された集団をさらに含む、組成物。
【請求項２８】
ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の集団を単離するための方法であって、
樹状細胞前駆体の集団を得る工程；
該前駆体を、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞へと分化させる工程；および
該未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞から、ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の集団を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記樹状細胞前駆体の集団は、単球樹状細胞前駆体接着基材を白血球の集団と接触させることによって得られる、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記樹状細胞前駆体から未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞への分化は、該前駆体を少なくとも１種のサイトカインとともに培養する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記少なくとも１種のサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン４、インターロイキン１３、またはインターロイキン１５である、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記樹状細胞前駆体から未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞への分化は、血漿の存在下で該前駆体を培養して前記ＣＤ１４＋樹状細胞の分化を促進する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記樹状細胞前駆体から未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞への分化は、該前駆体を所定の抗原とともに培養する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項２８に記載の方法であって、前記未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞からのＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離は、
前記樹状細胞前駆体の集団を、前記ＣＤ１４発現樹状細胞との複合体の形成をもたらす条件下でＣＤ１４特異的プローブと混合する工程；
該ＣＤ１４特異的プローブと複合体形成したＣＤ１４発現細胞を検出する工程；および
該ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記ＣＤ１４特異的プローブは、ＣＤ１４特異的抗体である、方法。
【請求項３６】
請求項２８に記載の方法であって、前記未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞からのＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の選択は、基材に結合しているＣＤ１４特異的プローブを用いる前記ＣＤ１４＋樹状細胞の親和性選択を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記ＣＤ１４特異的プローブは、抗ＣＤ１４抗体である、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、前記ＣＤ１４特異的プローブに結合している基材は、磁気ビーズである、方法。
【請求項３９】
請求項２８に記載の方法であって、前記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞を培養して、成熟樹状細胞について実質的に濃縮された単離された集団を得る工程をさらに包含する、方法。
【請求項４０】
所定の抗原に対するＴ細胞応答を調節するための方法であって、
ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団を得る工程；
該ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団を、所定の抗原と接触させる工程；および
該ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団を、Ｔ細胞と接触させて、該所定の抗原に対するＴ細胞応答を調節する工程；
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞は、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、末梢血、または臍帯血から得られた、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、前記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞および前記Ｔ細胞は、自己由来であるか、同系であるか、または同種異系である、方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、前記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞が、インビトロまたはエキソビボで前記Ｔ細胞と接触される、方法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法であって、前記所定の抗原は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、自己抗原、またはウイルス抗原である、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原は、前立腺癌関連抗原である、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記前立腺癌関連抗原は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、または前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）である、方法。
【請求項４７】
請求項４０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されているＴ細胞の単離された集団である、方法。
【請求項４８】
請求項４０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されているＴ細胞の単離された集団である、方法。
【請求項４９】
請求項４０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合集団を含むＴ細胞の単離された集団である、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、未成熟系調節において中心的役割を果たす。先天性マン駅における重要な役割に加えて、ＤＣは、Ｔ細胞媒介性適応性免疫応答のための定量的かつ定性的な枠組みを提供する（例えば、ＭｅｌｌｍａｎおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｃｅｌｌ  １０６：２５５〜５８（２００１）；ＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａおよびＳａｌｌｕｓｔｒｏ，Ｃｅｌｌ  １０６：２６３〜２６６（２００１）参照）。ＤＣは、抗原のプロセシングおよび提示において非常に有効であり、多様な抗原群を取り込んでそれをＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方に結合されたペプチドとして提示することが可能である。さらに、ＤＣは、有効な細胞媒介性免疫応答のために必要とされるＴ細胞の状態の誘導および調節のために必要な他のシグナル（一般的には、例えば、細胞表面分子およびサイトカインに関与する）を提供する。他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と比較して、ＤＣは、未刺激Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞を刺激することに、より巧みである。また、ＳＣは、未刺激Ｔ細胞から種々の種類のエフェクター（例えば、ＴＨ１分化細胞およびＴＨ２文化細胞）への分化を駆動することによって、Ｔ細胞応答の質を制御する。従って、ＤＣは、免疫応答を促進するＴ細胞を生成するだけではなく、活性化Ｔ細胞を抑制する調節Ｔ細胞も生成する。（ＭｅｌｌｍａｎおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（前出））。最後に、特定のＤＣは、自己抗原に対するＴ細胞寛容を誘導可能であると考えられる（Ｌｉｕ，Ｃｅｌｌ  １０６：２５９〜６２（２００１））。結果的に、ＤＣの細胞機能は、感染および腫瘍に対する抵抗性のために重要であるだけではなく、自己免疫および移植片拒絶においても同様に重要である。
【０００２】
免疫調節におけるＤＣの多様な機能は、部分的には、そのＤＣサブクラスおよびＤＣ系統の多様性に依存する。複数のＤＣサブクラスが、存在する（Ｌｉｕ（前出）参照）。第一に、ＤＣは、未成熟または成熟（２種類の機能的かつ表現型的に異なる状態）のいずれかとして分類され得る。未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）は、エンドサイトーシスが巧みであり、比較的低いレベルの表面ＭＨＣクラスＩ分子および表面ＭＨＣクラスＩＩ分子および副刺激分子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）を発現する。従って、ｉｍＤＣは、自己抗原をＴ細胞に対して提示することによって、その免疫系において寛容生成機能を果たす。（Ｌｉｕ（前出）；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：４１１〜４１６（２０００））。これに関して、ｉｍＤＣは、未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞および未刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＬ−１０生成Ｔ調節／サプレッサー細胞へと分化するのを促進し得ることが、考えられる。（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１２１３〜１２２２（２０００）；Ｄｈｏｐａｄｋａｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：２３３〜２３８（２００１））。
【０００３】
ｉｍＤＣは、骨髄において造血幹細胞から継続的に生成されると考えられる。ＣＤ３４＋幹細胞に由来するＣＤ３４＋骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、ＣＤ３４＋ＣＬＡ＋集団とＣＤ３４＋ＣＬＡ−集団へと分化し、これらは、それぞれ、その後、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ａ＋  ｉｍＤＣおよびＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ａ−  ｉｍＤＣに分化すると考えられる。（Ｌｉｕ（前出）；Ｓｔｒｕｎｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１３１〜１１３６（１９９７））。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ａ＋  ｉｍＤＣは、皮膚表皮へと移動してランゲルハンス細胞になり、一方、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ａ−  ｉｍＤＣは、皮膚真皮および他の組織へと移動して、間質性ｉｍＤＣになる（Ｌｉｕ（前出）；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２９６１〜２９６９（２００１））。上記ランゲルハンス細胞および間質性ｉｍＤＣはまた、種々の機能的特性を示す。例えば、間質性ｉｍＤＣは、マンノースレセプターにより大量の抗原を取り込んでＩＬ−１０を生成可能であり、ＣＤ４０およびＩＬ−２の存在かでのみ刺激Ｂ細胞活性化およびＩｇＭ生成に寄与するが、ランゲルハンス細胞はそうではない。（Ｌｉｕ（前出））。
【０００４】
（例えば、微生物感染または移植による）インビボでの免疫原性チャレンジの後、ｉｍＤＣは、免疫原性形態への迅速な抗原依存性成熟を行う。成熟しているＤＣは、エンドサイトーシス活性を迅速に失い、ＭＨＣクラスＩペプチド複合体およびＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の表面発現および安定性を増加し、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３）を分泌し、接着表面分子および副刺激表面分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）の発現をアップレギュレートする。成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、ｉｍＤＣと比較して抗原を取り込むことがそれほどできないが、これらの細胞は、抗原と提示すること、およびＴ細胞を刺激することにおいて非常に有効である（ＭｅｌｌｍａｎおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（前出））。さらに、ｍＤＣ細胞は、成熟シグナルの型に依存して、異なる型のＴ細胞免疫応答（例えば、ＴＨ１対ＴＨ２）を誘導し得る（Ｌｉｕ（前出））。
【０００５】
種々のＤＣサブクラスの機能的多様性は、その単離、特徴付け、および免疫調節における使用（インビボおよびエキソビボの両方）において、かなりの関心を生じた（例えば、米国特許第５，９９４，１２６号；同第６，２７４，３７８号；Ｓｈｕｒｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：１５８〜６４（１９９６）参照）。樹状細胞集団は、例えば、末梢血から得られる樹状細胞前駆体を、種々の分化因子および成熟因子とともに培養することによって、単離された（一般的には、例えば、米国特許第６，２７４，３７８号参照）。代表的には、ｉｍＤＣは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、樹状細胞前駆体を培養することによって、得られ得る。（例えば、ＭｅｌｌｍａｎおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｃｅｌｌ  １０６：２５５〜５８（２００１））ＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａおよびＳａｌｌｕｓｔｒｏ，Ｃｅｌｌ  １０６：２６３〜２６６（２００１）参照）。また、ｉｍＤＣからｍＤＣへの成熟は、微生物病原体もしくはウイルス病原体の生成物（例えば、ＬＰＳ）によって、または炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）によって、誘発され得る。（ＭｅｌｌｍａｎおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（前出））。
【０００６】
これらの単離されたＤＣ集団は、例えば、細胞表面分子の発現、およびそれが抗原を取り込んで提示する能力に基づいて、特徴付けられた。これに関して、ＣＤ１４（ＬＰＳレセプター）は、末梢血単球の大集団において豊富に発現され、一方、単球性ＤＣ前駆体から生成されるｉｍＤＣおよびｍＤＣの両方は、代表的には、高ＣＤ１４発現を欠くと特徴付けられる。（例えば、米国特許第５，９９４，１２６号；Ｃｚｅｍｉｅｘｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３８２３〜３７（１９９７）；ＳａｌｌｕｓｔｏおよびＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９〜１１１８（１９９４）；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０〜６８５２（１９９３ａ）；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８２１〜８３４（１９９３ｂ）参照）。従って、表面ＣＤ１４を欠くことは、ＤＣ表現型についてのマーカーとして見なされている。（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６（１９９１）；米国特許第５，９９４，１２６号；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｊｉら（前出）；ＳａｌｌｕｓｔｏおよびＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（前出）；Ｔｈｏｍａｓ（前出）（１９９３ａ）；Ｔｈｏｍａｓ（前出）（１９９３ｂ）参照）。結果として、抗原提示細胞（すなわち、ＤＣ）の特徴を示すＣＤ１４発現細胞集団は、認識されることはなく、免疫調節においてそれを使用するための方法も開発されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＣの多様な機能は、樹状細胞サブクラスおよび樹状細胞系統の多様性に依存するので、特定のＤＣサブセットの同定および単離は、免疫応答を調節するための特定の細胞組成物を提供し得る。従って、インビボおよびエキソビボでの免疫調節能力を示すさらなる単離されたＤＣサブセット集団について、当該分野において必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の簡潔な要旨）
本発明は、抗原提示細胞の実質的に単離された集団を提供し、この集団は、その集団の成分として、細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１４＋を発現する一群の抗原提示細胞を含む。このＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞は、実質的に濃縮され得る。
【０００９】
本発明の一実施形態において、上記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞集団は、未成熟樹状細胞または樹状細胞のいずれかについて実施的に濃縮されている細胞集団を含む。上記実施的に濃縮されている未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞の集団は、所定の抗原をさらに含み得る。本発明の文脈において、上記所定の抗原は、樹状細胞により提示され得るエピトープを含む任意の型であり得る。これらの抗原としては、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原などが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記抗原は、上記樹状細胞集団に対して、細胞全体として、溶解物として、膜調製物として、部分精製調製物として、実質的に精製された調製物として、組換え発現タンパク質もしくはその一部として、ペプチドとして、提供され得るか、または組換え細胞、リポソーム、もしくは他の任意の手段の表面上に発現され得る。
【００１０】
特定の実施形態において、上記実質的に単離されたＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞集団は、前立腺癌に関連する腫瘍抗原をさらに含む。具体的には、上記腫瘍関連抗原は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、または前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）などである。
【００１１】
本発明のなお別の実施形態において、上記単離されたＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞集団は、少なくとも１種のサイトカインをさらに含む。特に、上記サイトカインは、炎症性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインである。具体的には、上記炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９とも呼ばれる））であり得る。上記抗炎症性サイトカインは、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子β（ＴＧＦ−β）、またはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）であり得る。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団を含み、Ｔ細胞の集団をさらに含む。代表的には、上記Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞を含む任意の細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞について濃縮されている細胞集団、または実質的に単離されたＴ細胞の集団）であり得る。上記細胞は、上記樹状細胞に対して、自己由来、同系、または同種異系のいずれかであり得る。本発明の特定の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されており得るか、またはＣＤ８＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されており得る。
【００１３】
本発明のなお別の実施形態において、ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団を含む組成物が提供される。この組成物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団をさらに含む。代表的には、上記ＮＫ細胞の集団は、ＮＫ細胞を含む任意の細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞について濃縮されている細胞集団、または実質的に単離されたＮＫ細胞の集団であるが、これらに限定されない）であり得る。上記ＮＫ細胞は、上記樹状細胞に対して、自己由来、同系、または同種異系のいずれかであり得る。
【００１４】
本発明の一実施形態において、ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の集団を単離するための方法が提供される。この方法は、樹状細胞前駆体の集団を得る工程；上記前駆体を、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞へと分化させる工程；およびＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の集団を選択する工程；を包含する。上記樹状細胞前駆体の集団は、単球樹状細胞前駆体接着基材を白血球の集団と接触させることによって得られ得る。本発明において有用な基材としては、ガラスおよびガラスでカバーしたプラスチック、スチレン、またはポリスチレンなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に、上記基材は、ガラスでカバーされたポリスチレンまたはスチレンマイクロキャリアビーズを包含する。
【００１５】
上記樹状細胞の分化は、上記細胞を少なくとも１種のサイトカインと接触させることによって達成され得る。上記サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）などであり得る。上記樹状細胞前駆細胞をサイトカインと接触させることに加えて、血漿もまた、上記ＣＤ１４＋樹状細胞の分化を促進するために含められ得る。
【００１６】
本発明のなお別の実施形態において、上記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の集団を単離するための方法は、上記樹状細胞前駆細胞または未成熟樹状細胞を、所定の抗原を用いて分化させる工程を包含する。上記所定の抗原は、抗原提示細胞により提示され得る任意の抗原であり得る。本発明の特定の実施形態において、上記抗原は、前立腺癌に関連し、その抗原としては、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、またはＰＡＰなどが挙げられ得る。
【００１７】
本発明のＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞は、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞を含む細胞集団から選択され得る。一実施形態において、上記ＣＤ１４＋樹状細胞は、上記樹状細胞前駆体の集団を、ＣＤ１４発現樹状細胞との複合体の形成をもたらす条件下でＣＤ１４特異的プローブと混合する工程；上記ＣＤ１４特異的プローブと複合体形成したＣＤ１４発現細胞を検出する工程；および上記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞を選択する工程によって、選択される。上記ＣＤ１４特異的プローブは、ＣＤ１４特異的抗体（特に、モノクローナル抗体）であり得る。上記ＣＤ１４に特異的な抗体は、固体基材（例えば、マイクロタイタープレート、カラムクロマトグラフィーの媒体、または磁気ビーズなど）に結合され得る。ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞前駆体を選択した後、上記細胞は、上記樹状細胞前駆体の成熟をもたらす条件下で培養され得る。
【００１８】
本発明のなお別の実施形態において、所定の抗原に対するＴ細胞応答を調節するための方法が、提供される。この方法は、ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞（代表的には、未成熟樹状細胞または樹状細胞前駆体）の単離された集団を得る工程；上記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団を、所定の抗原と、その樹状細胞がその抗原をプロセシングするために充分な時間接触させる工程；およびプロセシングされた抗原を提示する上記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞を含む単離された細胞集団を、Ｔ細胞集団と接触させて、その所定の抗原に対するＴ細胞応答を調節する工程；を包含する。上記ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４＋樹状細胞は、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、末梢血、または臍帯血から得られ得る。上記Ｔ細胞は、上記樹状細胞に対して自己由来、同系、または同種異系であり得、そしてインビトロまたはエキソビボで接触され得る。
【００１９】
本発明の特定の実施形態において、上記所定の抗原は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、自己抗原、またはウイルス抗原である。より具体的には、上記腫瘍関連抗原は、前立腺癌に関連し得、本発明の特定の実施形態において、上記前立腺抗原は、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、またはＰＡＰなどであり得る。
【００２０】
本発明のＴ細胞は、代表的には、白血球の混合集団（例えば、ＰＢＭＣ）にて提供される。しかし、本発明の特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されているＴ細胞の単離された集団、またはＣＤ８＋Ｔ細胞について実質的に濃縮されているＴ細胞の単離された集団であるか、あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合集団を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（単離されたＣＤ１４＋樹状細胞）
本発明は、ＣＤ１４＋である細胞について濃縮されている単離された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ））、ならびにＣＤ１４＋抗原提示細胞の単離された集団を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「単離された集団」とは、その天然環境から取り出された細胞集団を意味する。「ＣＤ１４＋」とは、表面ＣＤ１４の発現レベルが、ＰＢＭＣ由来単球上での表面ＣＤ１４の発現レベルと実質的に等しいことを意味する。そのような決定は、例えば、蛍光結合体化抗ＣＤ１４抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってなされ得、そこでは、「高」染色についてゲートは、ＰＢＭＣ由来単球における抗ＣＤ１４染色に対する参照によって決定される。さらに、ＣＤ１４＋／ｈｉｇｈＤＣは、ＣＤ１４ｌｏｗまたはＣＤ１４ｄｉｍであるＤＣ集団と区別可能であり、ここで、「ＣＤ１４ｌｏｗ」または「ＣＤ１４ｄｉｍ」とは、無関係の抗体で見出されるものと比較してわずかに陽性であるがＰＢＭＣ由来単球において見出されるものよりは有意に低い、蛍光結合体化抗ＣＤ１４抗体による低レベルのＣＤ１４染色を指す。
【００２２】
用語「樹状細胞」または「ＤＣ」とは、抗原を取り込んでＭＨＣ結合ペプチドとして提示することが可能である、種々のリンパ系組織および非リンパ系組織において見出される当該分野で特徴付けられた多様な種類の形態学的には類似する細胞型を指す。（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６（１９９１）参照）。従って、樹状細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋である。さらに、ＤＣは、一般的には、他の白血球表面マーカー（例えば、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、およびＣＤ５６／５７（ＮＫ細胞））が存在しないことに基づいて、当該分野で分類される。（同書参照）。樹状細胞サブタイプまたは樹状細胞の成熟状態に依存して、ＤＣはまた、そのＤＣ表現型に特徴的であると認識される他の表面マーカーを発現する。（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６（１９９１）；Ｌｉｕ、Ｃｅｌｌ  １０６：２５９〜６２（２００１）；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０〜６８５２（１９９３ａ）；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８２１〜８３４（１９９３ｂ）参照）。従って、用語「樹状細胞」または「ＤＣ」は、当該分野におけるこの用語の使用と一致するが、但し、本明細書中で使用される場合、「樹状細胞」は、上記のようにＣＤ１４もまた発現する。このような細胞としては、例えば、単球樹状細胞前駆体の培養物に由来するＤＣ、ならびに組織（例えば、末梢血、臍帯血、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、およびリンパ節）中に存在する内因性ＤＣが挙げられ得る。
【００２３】
代表的な実施形態において、ＣＤ１４＋樹状細胞の単離された集団が、濃縮または実質的に濃縮され得る。本明細書中で使用される場合、用語「濃縮されている」とは、その単離された細胞集団が、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％均質であることを意味する。用語「実質的に濃縮されている」とは、その細胞集団が、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％均質であることを意味する。
【００２４】
上記ＣＤ１４＋ＤＣは、未成熟であっても、成熟であってもよい。成熟樹状細胞と未成熟樹状細胞とを区別する特徴は、当該分野において記載されている。（例えば、Ｌｉｕ（前出）；ＭｅｌｌｍａｎおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（前出）参照）。一般的には、例えば、「未成熟樹状細胞」または「ｉｍＤＣ」は、中程度のＣＤ８０発現、ＣＤ８６発現、およびＭＨＣ発現を有し、ＣＤ８３の低発現を有するかまたはＣＤ８３の発現がなく、抗原の効率的な取込みが可能であり、そして抗原提示について低い能力〜中程度の能力を示す。比較すると、「成熟樹状細胞」または「ｍＤＣ」は、アップレギュレートされたＣＤ８０発現、ＣＤ８６発現、ＭＨＣ発現、およびＣＤ８３発現を有し、抗原取込みについて実質的に減少した能力を示し、そして抗原提示について高い能力を示す。特定の実施形態において、上記ＣＤ１４＋ＤＣの単離された集団は、ｍＤＣまたはｉｍＤＣのいずれかについて実質的に濃縮されたものであり得る。
【００２５】
（ＣＤ１４＋樹状細胞の単離および免疫調節のための方法）
ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４＋ＤＣが実質的に濃縮された細胞集団は、本発明によってまた提供される方法により単離され得る。これらの方法としては、概して、ＤＣ前駆体を含む細胞の集団の取得、ＤＣ前駆体の未熟ＤＣまたは成熟ＤＣへの分化が挙げられ、分化した、未熟ＤＣまたは成熟ＤＣの集団からＣＤ１４＋ＤＣを単離することもまた挙げられる。
【００２６】
ＤＣ前駆細胞は、当該分野で公知の方法によって取得され得る。樹状細胞の前駆体は、例えば、密度勾配分離法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、免疫細胞分離技術（例えば、パニング法）、補体溶解法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ）、ロゼット法（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）、磁気細胞分離技術、ナイロンウール分離法、およびこのような方法の組合せによって単離され得る（例えば、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０６７−７６（１９９３）；ＹｏｕｎｇおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３１５−３２（１９９０）；Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７６９８−７０２（１９９０）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７：２８５−８９（１９８９）；ＭａｒｋｏｗｉｃｚおよびＥｎｇｌｅｍａｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−６１（１９９０）（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。樹状細胞を免疫的選択するための方法としては、例えば、樹状細胞前駆体に関連する細胞表面マーカー（例えば、基材に結合した、抗ＣＤ３４抗体および／または抗ＣＤ１４抗体）を使用することが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１０９９−１１０４，１９９５  ；  Ｃａｕｘら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８−６１，１９９２（これらの各々は、本明細書中で参考として援用され得る）。
【００２７】
ＤＣ前駆体の濃縮された集団もまた、取得され得る。このような濃縮された集団を取得する方法は、当該分野で公知である。例えば、ＤＣ前駆体の濃縮された集団は、基材に対して接着する細胞を選択的に取り出すことによって、組織供給源から単離され得る（例えば、米国特許番号５，９９４，１２６（これは、本明細書中で参考として援用される）。組織供給源（例えば、骨髄または末梢血）を使用して、接着性単球が、市販のプラスチック基材（例えば、ビーズまたは磁気ビーズ）を使用して細胞集団から取り出されて、非接着性ＤＣ前駆体について濃縮された集団が取得され得る（前掲を参照のこと）。
【００２８】
単球ＤＣ前駆体はまた、ＤＣ前駆対接着基材を使用することによって、組織供給源から取得され得る。例えば、白血球フェレーシスによって単離された末梢血の白血球は、高い表面積体積比を有する接着性単球性ＤＣ前駆体接着基材と接触して、その接着性単球性ＤＣ前駆体は分離される。さらなる実施形態において、結合した基材は、高い表面積体積比（例えば、２０Ｍ２／Ｌ〜約８０／Ｌ）を有する球状または繊維状の基材（例えば、マイクロビーズ、マイクロキャリアビーズ、ペレット、顆粒、粉末、キャピラリーチューブ、微小絨毛膜（ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、など）であり得る。さらに、球状または繊維状の基材は、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、ガラス被覆ポリスチレンマイクロビーズなどであり得る。
【００２９】
これらのＤＣ前駆体もまた、分化および／または増殖のために、インビトロで培養され得る。ＤＣ前駆体の分化／増殖のための方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許番号５，９９４，１２６）。概して、増殖は、ＤＣの分化／増殖を誘導する少なくとも１つのサイトカインの存在下でそれらの前駆体を培養することによって達成され得る。代表的には、これらのサイトカインは、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。さらに、他の因子が、その培養物中における非ＤＣ細胞型の増殖および／または成熟を阻害するために使用され得る。それによって、ＤＣ前駆体の集団をさらに濃縮する。代表的には、このような因子は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−５など）が挙げられる（例えば、前掲を参照のこと）。
【００３０】
（樹状細胞前駆細胞の分化およびＣＤ１４＋表現型の促進）
単離されたＤＣ前駆細胞の集団を培養し、そして分化させて、未熟ＤＣまたは成熟ＤＣを得る。適切な組織培養培地としては、例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組織培養培地は、代表的に、アミノ酸、ビタミン、二価の陽イオン、およびサイトカインを補充されて、これらの前駆細胞の、ＤＣ表現型への分化を促進する。代表的に、分化を促進するサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４である。代表的なサイトカインの組み合わせは、約１，０００〜約５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＳＣＦおよびＩＬ−４である。
【００３１】
さらに、ＤＣ表現型への増殖、分化、および成熟の間の、ＤＣ前駆細胞の培養物は、ＣＤ１４＋  ＤＣの発生を促進するために、血漿を含有し得る。代表的な血漿濃度は、約５％である。さらに、例えば、ＤＣ前駆細胞が基材への接着によって単離される場合、血漿は、この培養倍地中に、接着工程の間に含められて、培養の初期のＣＤ１４＋表現型を促進し得る。接着の間の代表的な血漿濃度は、約１％以上である。
【００３２】
単球樹状細胞前駆細胞は、任意の適切な時間にわたって培養され得る。特定の実施形態において、前駆細胞の、未熟樹状細胞への分化のために適切な培養時間は、約４日〜約７日間であり得る。ただし、ＣＤ１４は、ＤＣ表現型の欠損を示さない。これらの前駆細胞からの未熟樹状細胞の分化は、当業者に公知である方法によって（例えば、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８３ｌｏｗ、ＣＤ８６−／ｌｏｗ、ＨＬＡ−ＤＲ＋）の存在または非存在によって）モニタリングされ得る。未熟樹状細胞はまた、適切な組織培養倍地中で培養されて、これらの未熟樹状細胞を、さらなる分化または抗原の取り込み、プロセシングおよび提示のための状態に維持し得る。例えば、未熟樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下に維持され得る。
【００３３】
（分化した樹状細胞前駆細胞からのＣＤ１４＋樹状細胞の単離）
ＤＣ前駆細胞からの分化に続いて、ＣＤ１４＋細胞は、単離されて、ＣＤ１４＋  ＤＣの単離された集団を与え得る。代表的に、ＣＤ１４＋  ＤＣが、濃縮されたかまたは実質的に濃縮されたＤＣ（上記のような分化をモニタリングすることによって決定される）から成熟する前に単離される場合、この単離された集団は、未熟ＣＤ１４＋  ＤＣについて濃縮されるか、またな実質的に濃縮される。一般に、ＣＤ１４＋  ＤＣの単離は、ＣＤ１４＋細胞が単離される細胞集団を、ＣＤ１４特異的プローブと接触させる工程を包含する。１つの例示的な実施形態において、ＣＤ１４発現細胞は、ＦＡＣＳによって、蛍光性分子（例えば、ＦＩＴＣもしくはＰＥ）と直接結合体化されているか、またはＣＤ１４に特異的な非標識の抗体およびこの第一の抗体に特異的な標識された第二の抗体と結合体化されているかのいずれかの、ＣＤ１４特異的プローブを使用して、検出される。ＣＤ１４＋細胞はまた、ＣＤ１４ｌｏｗおよびＣＤ１４−細胞から、ＦＡＣＳ選別によって分離され得る。ＣＤ１４ｈｉｇｈを正にゲーティングすることは、例えば、ＰＢＭＣ由来の単球に対するＣＤ１４染色を参照して決定され得る。代表的に、ＣＤ１４特異的結合因子は、例えば、抗ＣＤ１４抗体（例えば、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント）である。本発明において使用するために適切な、多数の抗ＣＤ１４抗体が、当業者に周知であり、そして多くが、市場で購入され得る。
【００３４】
別の実施形態において、ＣＤ１４特異的プローブは、基材に結合され、そしてＣＤ１４＋細胞は、アフィニティー選択によって単離される。ＣＤ１４＋細胞を含む細胞の集団は、この結合された基材に曝露され、そしてＣＤ１４＋細胞は、特異的に接着される。次いで、接着していないＣＤ１４−細胞が、この基材から洗い流され、次いで、接着細胞が溶出されて、ＣＤ１４＋  ＤＣがかなり濃縮された、単離された細胞集団が得られる。このＣＤ１４特異的プローブは、例えば、抗ＣＤ１４抗体であり得る。この基材は、例えば、市販の組織培養プレートまたはビーズ（例えば、ガラスまたは磁気ビーズ）であり得る。基材に結合した表面マーカー特異抗体を使用する、細胞集団の親和性単離のための方法は、一般に公知である（例えば、Ｂｅｒｎｇａｒｄら、前出；Ｃａｕｘら、前出を参照のこと）。
【００３５】
（未熟樹状細胞の抗原との接触および樹状細胞の成熟）
培養の間、未熟樹状細胞（ＣＤ１４＋  ｉｍＣＤの単離された集団、または単離前の全ｉｍＤＣのいずれか）は、必要に応じて、所定の抗原に曝露され得る。適切な所定の抗原としては、Ｔ細胞調節が望ましい任意の抗原が挙げられ得る。１つの実施形態において、未熟樹状細胞は、癌の免疫療法および／または腫瘍増殖阻害のために、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の存在下で培養される。他の抗原としては、例えば、細菌細胞、ウイルス、部分的に精製されたかまたは精製された細菌抗原またはウイルス抗原、腫瘍細胞、腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞溶解物、腫瘍細胞膜調製物、腫瘍から単離された抗原、融合タンパク質、リポソームなど）、表面で抗原を発現する組換え細胞、自己抗原、および他の任意の抗原が挙げられる。これらの抗原のいずれかはまた、ペプチドまたはその組換え産生タンパク質もしくはその一部として提示され得る。抗原との接触の後に、これらの細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングを可能にするために適切な任意の時間にわたって培養され、抗原特異的樹状細胞などの集団を増殖させ得る（以下を参照のこと）。
【００３６】
例えば、１つの実施形態において、未熟ＤＣは、抗原取り込みの後に培養されて、ｉｍＤＣの、ＭＨＣ分子に関する抗原を提示する成熟ＤＣへの変異を促進し得る。ＤＣの成熟のための方法は、公知である（例えば、米国特許第６，２７４，３７８号を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）。このような成熟は、例えば、既知の成熟因子（例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、またはＣＤ４０リガンド）、細菌産物（例えば、ＬＰＳまたはＢＣＧ）など）の存在下で培養することによって、実施され得る。ｉｍＤＣからｍＤＣへの成熟は、当該分野において公知の方法によって（例えば、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ８３分子、ＣＤ８６分子、およびＭＨＣ分子のアップレギュレーション）の存在または非存在を測定すること、あるいは成熟樹状細胞特異的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を、例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用して試験することによって）モニタリングされ得る。
【００３７】
必要に応じて、ｉｍＤＣは、細胞集団を増殖するため、および／またはｉｍＤＣをさらなる分化もしくは抗原取り込みのための状態に維持するために適切な組織培養培地中で培養され得る。例えば、ｉｍＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、維持および／または増殖され得る。また、ｉｍＤＣは、抗炎症性分子（例えば、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β））の存在下で培養されて、ｉｍＤＣの成熟を阻害し得る。
【００３８】
別の局面において、ＣＤ１４＋  ＤＣの単離された集団は、成熟ＤＣを濃縮される。この単離されたＣＤ１４＋  ｍＤＣの集団は、単離されたＣＤ１４＋  ｉｍＤＣの集団を、上記のような成熟因子（例えば、細菌産物、および／または炎症誘発性サイトカイン）の存在下で培養し、これによって変異を誘導することによって、得られ得る。必要に応じて、ＣＤ１４＋  ｉｍＤＣとＣＤ１４−  ｉｍＤＣ（ＤＣ前駆細胞から分化された）との混合された集団が培養されて、変異を誘導し得、この変異段階は、上記のようにモニタリングされ、そしてｍＤＣ濃縮の適切な段階において、ＣＤ１４＋細胞が、上記のように分離され、ＣＤ１４＋  ｍＤＣを濃縮されたかまたはかなり濃縮された、単離された集団を与える。
【００３９】
本発明のなお別の局面によれば、ＤＣは、例えば、前立腺癌抗原への曝露前、または前立腺癌抗原への曝露後のいずれかに、例えば、凍結保存によって保存され得る。使用され得る凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドンポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、モノ酢酸グリセロール、および無機塩が挙げられるが、これらに限定されない。制御されたゆっくりとした冷却速度が、重要であり得る。異なる凍結保護物質および異なる細胞型は、代表的に、異なる最適冷却速度を有する。水が氷に変わる溶解相の熱は、代表的に、最小であるべきである。この冷却手順は、例えば、プログラム可能な冷凍デバイスまたはメタノール浴手順の使用によって、実施され得る。プログラムされた冷凍装置は、最適冷却速度の決定を可能にし、そして標準的な再現可能な冷却を容易にする。プログラム可能な制御された速度のフリーザー（例えば、ＣｒｙｏｍｅｄまたはＰｌａｎａｒ）は、所望の冷却速度曲線への冷凍レジメンの調整を可能にする。
【００４０】
完全に凍結させた後に、ＤＣを、長期間の低温保存容器に迅速に移し得る。代表的な実施形態において、サンプルは、液体窒素（−１９６℃）またはその蒸気（−１６５℃）中で、低温保存され得る。造血幹細胞（特に、骨髄または末梢血由来のもの）の操作、凍結保存、および長期保存のための問題および手順は、本発明のＤＣに大いに適用可能である。このような議論は、例えば、以下の参考文献に見出され得、これらの文献は、本明細書中に参考として援用される：Ｔａｙｌｏｒら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：２６９−７８（１９９０）；Ｇｏｒｉｎ，Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １５：１９−４８（１９８６）；Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  Ｐａｎｅ．  Ｍｏｓｃｏｗ，Ｊｕｌ．２２−２６，１９８６，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ，Ｖｉｅｎｎａ，ｐｐ．１０７−１８６。
【００４１】
冷凍された細胞は、好ましくは、迅速に（例えば、３７℃〜４１℃に維持された水浴中で）解凍され、そして解凍したらすぐに冷却される。これらの細胞を、解凍の際の細胞の凝集を防止するために処理することが、望ましくあり得る。凝集を防止するために、種々の手順が使用され得、これらの手順としては、凍結の前および／または後のＤｎａｓｅの添加（Ｓｐｉｔｚｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  ４５：３０７５−８５）、低分子量のデキストランおよびクエン酸塩の添加、ヒドロキシエチルデンプンの添加（Ｓｔｉｆｆら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１７−２４（１９８３））などが挙げられるが、これらに限定されない。この凍結保護物質は、ヒトにおいて毒性である場合、解凍されたＤＣの治療的使用の前に除去されるべきである。この凍結保護物質を除去するための１つの様式は、有意でない濃度への希釈による。一旦、冷凍されたＤＣが解凍および回収されると、これらのＤＣは、冷凍されていないＤＣに関して本明細書中で記載されるように、Ｔ細胞を活性化させるために使用され得る。
【００４２】
（ＣＤ１４＋樹状細胞を使用するＴ細胞応答の調節）
別の局面によれば、ＣＤ１４＋  ＤＣは、Ｔ細胞応答を調節するために使用され得る。Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットは、反応者細胞として使用するために、種々のリンパ系組織から得られ得る。このような組織としては、脾臓、リンパ節、および末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ１４＋  ＤＣは、Ｔ細胞に対して自己由来、同系、または同種であり得る。
【００４３】
例えば、ＣＤ１４＋  ＤＣは、インビトロでの抗原非依存性Ｔ細胞共刺激のために使用され得る（図４を参照のこと、ＤＣ効力／共刺激アッセイにおける、ＣＤ１４＋  ＤＣでのＴ細胞の刺激を示す）。刺激されるＴ細胞は、ＣＤ１４＋  ＤＣの単離された集団と一緒に共生培養される。細胞の活性化は、Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）の係合によって（例えば、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントの接触によって）か、または最適より低濃度で、Ｔ細胞を活性化させるために充分な刺激シグナルを、ＣＤ１４＋  ＤＣによって提供される共刺激シグナルと組み合わせて提供する他の任意の抗原（例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などのような植物レクチン、もしくはホルボールミリステート酢酸（ＰＭＡ）などのような非植物起源のマイトジェン）によって、誘導される。Ｔ細胞活性化のレベルは、公知の方法によってモニタリングされ得る。例えば、活性化は、Ｔ細胞増殖の増加（例えば、３Ｈ−チミジン取り込みによって）；Ｔ細胞活性化マーカーの変化（例えば、ＦＡＣＳによって）；またはサイトカイン産生の変化（例えば、ＥＬＩＳＡもしくはアレイによって）によって、モニタリングされ得る。
【００４４】
また、別の実施形態において、所定の抗原に曝露されたＣＤ１４＋  ＤＣは、インビトロまたはエキソビボで、抗原に対してＴ細胞を活性化させるために使用され得る。ＣＤ１４＋は、Ｔ細胞を刺激するために、抗原への曝露の直後に使用され得る。あるいは、ＤＣは、抗原およびＴ細胞への曝露の前に、サイトカインの組み合わせ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）の存在下で維持され得る。特定の実施形態において、ヒトＣＤ１４＋  ＤＣが、ヒトＴ細胞を刺激するために使用される。
【００４５】
Ｔ細胞はまた、所定の抗原に曝露されたＣＤ１４＋  ＤＣと一緒に、混合されたＴ細胞集団としてか、または精製されたＴ細胞サブセットとして、共生培養され得る。例えば、精製されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗原に曝露されたＣＤ１４＋  ＤＣと一緒に共生培養されて、抗原特異的ＣＴＬを惹起し得る。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を初期に排除することによって、ＣＤ８＋  Ｔ細胞とＣＤ４＋  Ｔ細胞との両方の混合された培養物における、ＣＤ４＋細胞の過剰増殖を防止し得る。Ｔ細胞の精製は、ポジティブ選択および／またはネガティブ選択によって達成され得、この選択としては、ＣＤ２に対する抗体、ＣＤ３に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体、および／またはＣＤ８に対する抗体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞との混合された集団は、ＣＤ１４＋  ＤＣと共生培養されて、細胞傷害性応答とＴヘルパー（ＴＨ）免疫応答との両方を含む抗原に特異的な応答を誘発し得る。
【００４６】
さらに、インビトロまたはエキソビボで所定の抗原と接触されたＣＤ１４＋樹状細胞は、インビボでの抗原に対する免疫応答を調節するために使用され得る。例えば、上記のような抗原との接触および成熟に引き続いて、成熟した抗原提示ＣＤ１４＋  ＤＣは、ヒト被験体に投与されて、抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答を刺激し得る。さらに、所定の抗原と接触されたＣＤ１４＋  ＤＣへの曝露による、インビトロまたはエキソビボでのＴ細胞の活性化の後に、活性化されたＴ細胞はまた、ヒト被験体に投与されて、この抗原に対する免疫応答を刺激し得る。
【００４７】
以下の実施例は、本発明の種々の局面の例示として単に提供され、そして本発明をいかなる様式でも限定するとは解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４８】
（実施例１：血漿を用いるＣＤ１４＋樹状細胞表現型の促進）
本実施例において、血漿（樹状細胞（ＤＣ）上でのＣＤ１ａ発現を阻害することが公知である）を、未熟ＤＣを培養するために使用される培養培地を補充するために使用される場合に血漿がＣＤ１４＋表現型の発生を促進する能力について試験した。
【００４９】
手短に言えば、予め冷凍されたＰＢＭＣおよび正常な健常なドナー由来の自己由来血漿を利用した。白血球フェレーシス材料を、２つの異なる時点（本明細書中で、「Ｔ１」および「Ｔ２」であり、約１年離れている）でヒトドナー（ドナー０１６）から得られた血液から調製した。Ｔ２白血球フェレーシスは、大きいＣＤ１４＋  ＤＣ集団を生じ、一方で、より早期のＴ１白血球フェレーシスは、「正常な」（または低い）百分率の集団を生じた。各時点からのＰＢＭＣを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）において、５％血漿と一緒に培養し、そして各細胞集団におけるＣＤ１４＋の百分率に対する効果を分析した。その結果を、表１に示す。
【００５０】
【表１】
2006517108.tif 000002
これらの結果は、血漿が、ＣＤ１４＋集団の発生を促進する因子を含有することを示唆した；さらに、同様に関与した細胞成分（例えば、おそらく血漿由来の因子に対するレセプター）が存在した。従って、培養物からの血漿の省略が、（「良好な」（抗原提示）ＤＣの発生をなお支持しながら）より低い百分率のＣＤ１４＋細胞をもたらし得るか否かを試験した。
【００５１】
標準的なＤＣ培養手順後のＣＤ１４＋細胞の発生は、血漿成分および細胞成分に起因して明らかであるので、５％血漿ありまたはなしでの他の２つの培地（ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）およびＬＧＭ３（ＸＶＩＶＯ−１５（登録商標）としてもまた公知））の、ＤＣ培養に対する効果を試験した。培養培地を、ドナー０１６のＴ１  ＰＢＭＣおよびＴ２  ＰＢＭＣ（上記を参照のこと）、ならびにＴ２血漿（すなわち、高い百分率のＣＤ１４＋細胞を以前に生じた白血球フェレーシス由来の血漿）を用いた６日間のＣＤ培養について、比較した。ＤＣ表面表現型を、ＦＡＣＳによって分析した。その結果を、以下の表２に示す。
【００５２】
【表２】
2006517108.tif 000003
これらのデータは、ＣＤ１４＋の誘導が、培養培地中の血漿の存在に関連したことを確信させる。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞およびＣＤ８３発現細胞の百分率は、血漿の非存在下で速く５０％低下し、一方で、ＣＤ１ａ＋細胞の百分率は、増強された。引き続く試験は、ＬＧＭ−３（Ｘ−ＶＩＶＯ−１５（登録商標））のみを標準培地（ＯｐｔｉＭｅｍ（登録商標）＋５％自己由来血漿）と比較した。なぜなら、ＨＬＡ−ＤＲ発現は、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）単独において培養されたＤＣに対してさらに不十分であるからであり、そしてまた、ＬＧＭ−３は、ＤＣ培養のために良好な培地であることが公知であったからである。
【００５３】
細胞培養に対する血漿の初期の効果：
ＰＢＭＣによるＣＤ１４＋細胞の接着に対する血漿の効果をまた試験した。１時間の接着工程により、細胞は、固相に強く接着したままであった（細胞は、冷ＰＢＳ採取によって外れなかった）ので、患者１１８から単離したＤＣを、接着の２４時間後に採取し、そして細胞表面マーカーの存在についてアッセイした。培養培地は、自己由来の血漿を含有した。ＰＢＭＣの接着を、１％の血漿中で実施し、引き続いて、解放されたＤＣを、５％結晶中で培養した。その結果を、以下の表３に示す。
【００５４】
【表３】
2006517108.tif 000004
これらのデータは、ＣＤ１４＋集団の調節における血漿の効果が、培養の間の初期に起こることを示した。血漿によるＣＤ１４の調節を実証するこのような結果は、共通であったが、絶対的ではなかった。
【００５５】
（実施例２：ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４−細胞、ならびに選別されていない樹状細胞およびＰＢＭＣ由来の単球の免疫表現型決定）
成熟ＤＣから単離されたＣＤ１４＋細胞集団およびＣＤ１４−細胞集団（実施例１において上で記載されたように得られた）を、種々の細胞表面分子の発現について試験した。実施例１において上に記載されたように得られたＰＢＭＣ由来の単球もまた試験した。細胞を、ＰＥ結合体化抗体またはＦＩＴＣ結合体化抗体で、種々の細胞表面マーカーについて染色し、そしてＦＡＣＳ分析に供して、表面分子発現を評価した。試験された抗体は、ＣＤ５４特異的抗体、ＣＤ８３特異的抗体、ＣＤ８０特異的抗体、ＣＤ８６特異的抗体、ＣＤ４０特異的抗体、ＣＤ１１ｃ特異的抗体、ＣＤ１４特異的抗体、ＣＤ５６特異的抗体、ならびにＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体、ＤＰ特異的抗体、およびＤＱ特異的抗体であった。一致するアイソタイプのコントロール抗体をまた使用して、バックグラウンド染色を得た。
【００５６】
選別されていないＤＣについての免疫表現型分析の、選別されていないＰＢＭＣ由来単球と比較した結果を、図１に示す。この場合において、２つのロットのＤＣ（ＤＣＶａｘ前立腺標準細胞、組換え発現されたヒトＰＳＭＡ（ｒＰＳＭＡ）に曝露されたＤＣ）を分析した。これらの結果は、産生されるＤＣが、同じ細胞表面分子の発現の相対レベルの観点で、血液単球とは非常に異なることを実証した。血液単球と比較すると、ＤＣは、より高レベルのＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０ならびにＨＬＡ−ＤＲ、Ｄ、およびＤＱを発現した。ＣＤ１１ｃの発現は、ＤＣと単球との間で有意には異ならなかった。
【００５７】
分化したＤＣ前駆細胞から選別され、引き続いてｒＰＳＭＡおよびＢＧＣと接触されたＣＤ１４＋細胞集団およびＣＤ１４−細胞集団についての免疫表現型分析の結果を、図２Ａおよび２Ｂに示す。ＣＤ１４＋細胞は、試験した全ての表面分子に関して、ＣＤ１４−細胞と同一の染色パターンを有する。試験した全てのマーカーは、成熟ＤＣ上で代表的に発現されるものであった。従って、免疫表現型に基づいて、ＣＤ１４＋とＣＤ１４−との両方が、ＤＣである。
【００５８】
血液単球から選別されたＣＤ１４＋細胞およびＣＤ１４−細胞の免疫表現型分析の結果をまた、図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａおよび２Ｂに示される、血液単球上でのマーカー発現の、ＤＣにおける発現との比較は、血液単球が、細胞表面マーカー発現の観点で、ＣＤ１４＋  ＤＣとは有意に異なることを実証し、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、およびＤＱのより低いレベルを示す。
【００５９】
（実施例３：Ｔ細胞の抗原非依存性共刺激）
ＣＤ１４＋  ＤＣを、これらが抗原非依存性共刺激（ＡＰＣ効力）アッセイにおいてＴ細胞を活性化させる能力を試験した。
【００６０】
ヒト被験体由来のＰＢＭＣを、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）溶液の上に、緩衝化生理食塩水で希釈した白血球フェレーシスした血液を重ね、２０００ｒｐｍで２０分間スピンし、そして界面の白血球を単離することによって、調製した。
【００６１】
樹状細胞調製物を、単離されたＰＢＭＣから、以下のように作製した：各被験体由来の単球ＤＣ前駆細胞を、上記手順によって単離した。ＤＣ前駆細胞を、５００Ｕ／ｍｌまたは１，０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を補充したＸ−ＶＩＶＯ１５（登録商標）中で７日間培養した。次いで、これらのＤＣを、ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ１４抗体を使用して、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１４＋集団およびＣＤ１４−集団に選別し、ＣＤ１４発現を検出した。
【００６２】
Ｔ細胞の濃縮された集団を、ＰＢＭＣから、磁気ビーズと結合体化した抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とのインキュベーションによって調製した。３０分間のインキュベーションに続いて、これらのビーズに結合した細胞を、磁石を使用して除去した。ＨＬＡ−ＤＲが枯渇した細胞は、かなり濃縮されたＴ細胞集団を含む。
【００６３】
増殖アッセイを、以下のような２つの実験で実施した：１×１０４個のＣＤ１４＋、ＣＤ１４−、または選別されていないＤＣもしくはＰＢＭＣ由来の単球を、９６ウェル培養プレートの各ウェルに添加し、そして０．００５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と接触させた。次いで、１×１０５個の濃縮Ｔ細胞を添加し、１ウェルあたり０．２ｍｌの最終体積を得た。このプレートを約２６時間インキュベートし、次いで、３Ｈ−チミジンでパルスした。このプレートを、約１８時間さらにインキュベートし、その後、採取し、そして取り込まれた標識を決定した。
【００６４】
細胞増殖（１分間あたりの計数のデルタ（Δｃｐｍ））を、抗ＣＤ３抗体の存在下でＤＣのサンプルまたはＰＢＭＣ由来の単球調製物で刺激されたＴ細胞による３Ｈ−チミジン取り込みから、ＤＣ調製物単独のサンプルで刺激されたＴ細胞による３Ｈ−チミジン取り込みを減算した差として測定される。各樹状細胞調製物についての平均Δｃｐｍを、三連のサンプルの平均として計算した。
【００６５】
この実施例において、ＣＤ１４−  ＡＰＣ（ＤＣ）は、平均６０，０００のΔｃｐｍの効力を保有することが見出された。ＰＢＭＣ由来のＣＤ１４＋単球が、ＡＰＣに漸増割合で添加された場合、効力Δｃｐｍ値は、次第に減少した。図３Ａに示されるように、単球単独の効力は無視でき、このことは、これらの細胞が、ＣＤ１４−ＡＰＣ（ＤＣ）と比較して、乏しい抗原提示細胞であるという事実の証拠となる。図３Ｂに例示される実験において、樹状細胞を、ＣＤ１４−  ＤＣおよびＣＤ１４ＬＯＷ／＋  ＤＣに分離（選別）した。次いで、ＤＣ型を、効力バイオアッセイにおいて試験した。示されるように、これらの２つの群のＤＣの間には、抗原非依存性効力の観点では、有意な差がなかった。このことは、ＣＤ１４ｌｏｗ／＋−ＤＣが、これらが抗原を提示する能力において、ＣＤ１４−  ＤＣと等価であることを示した。図３Ｃは、ＣＤ１４−  ＤＣおよびＣＤ１４ｌｏｗ／＋  ＤＣが、これらのＤＣの混合物がまたＴ細胞の活性化のための抗原提示細胞の良好な集団を構築するか否かを評価するための効力アッセイにおいて、単独でかまたは組み合わせて試験された実験を図示する。試験されたＡＰＣの種々の群の効力は、およそ等しかった。このことは、任意の混合割合のＣＤ１４−  ＤＣおよびＣＤ１４ｌｏｗ／＋  ＤＣを含有するＡＰＣ産物が、ＣＤ１４−  ＤＣと効力が等価であることを示した。
【００６６】
上記知見は、図４に図示される結果によって確認された。手短に言えば、１８バッチのＡＰＣを、ＣＤ１４−  ＤＣおよびＣＤ１４＋  ＤＣの集団について試験した。種々のバッチを、サンプル中のＣＤ１４＋  ＤＣの割合に基づいて、各々９個のサンプルの２つの群にグループ分けした。ある群が０．３８％と１７．９７％との間（平均６．３６％）のＣＤ１４＋  ＤＣを有する場合、この群は、低い割合のＣＤ１４＋  ＤＣを含有するとみなされ、一方で、ある群が２０．７１％と５１．９０％との間（平均３０．９８％）のＣＤ１４＋  ＤＣを有する場合、この群は、「高い」割合のＣＤ１４＋  ＤＣを含有するとみなされた。これらの２つの群におけるＡＰＣの効力は、互いに無関係であった（図４）。このことは、ＣＤ１４−  ＤＣとの混合物としてのＣＤ１４ｌｏｗ／＋  ＤＣの存在が、ＣＤ１４−  ＤＣの効力を低下させないこと、およびＣＤ１４＋  ＤＣと混合されたＣＤ１４ｌｏｗ／＋  ＤＣの集団が、Ｔ細胞を刺激するための等価なＡＰＣ調製物として使用され得ることを示した。
【００６７】
（実施例４：ＣＤ１ａ発現、ＣＤ８０発現およびＨＬＡ−ＤＲ発現の決定）
単球を、ＧＭ−ＣＳＦ単独（５００Ｕ／ｍｌ）単独を補充したか、ＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を補充したか、またはＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｇ）単独を補充した、ＸＶＩＶＯ−１５（登録商標）＋２％ヒト血清アルブミン（ＳＨＡ）中で５日間培養した。得られたＤＣを、ＣＤ１４発現（図５Ａおよび５Ｂ）ならびにＨＬＡ−ＤＲ発現、ＣＤ８０発現およびＣＤ１ａ発現（図５Ｃ）について表現型決定した。ＧＭ−ＣＳＦ単独において培養されたＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で生成されるＤＣと比較して、低レベルのＣＤ１４を発現する、より高い百分率の細胞を有した。しかし、ＣＤ１４発現のレベルは、ＧＭ−ＣＳＦを含まない（ＩＬ−１５のみの）倍地中で同じ時間にわたって培養された単球において見られるよりも、ずっと低かった。ＣＤ１４が低いＤＣまたはＣＤ１４ネガティブなＤＣを、ＣＤ１４ｈｉｇｈ単球集団（ＧＭ−ＣＳＦ培養物なし）と、クラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）発現、ＣＤ８０発現、およびＣＤ１ａ発現について比較した。ＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養された単球のみが、ＣＤ１ａおよびＣＤ８０（樹状細胞を示す２つのマーカー）を発現することが見出された（図５Ｃ）。クラスＩＩ発現は、３つ全ての培養条件由来の細胞に存在した。
【００６８】
（実施例５：ＣＤ１４ｌｏｗ樹状細胞およびＣＤ１４−樹状細胞からの、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生）
ＧＭ−ＣＳＦ単独を補充されたか（ＣＤ１４ｌｏｗ）、またはＩＬ−４と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦを補充された（ＣＤ１４−）ＸＶＩＶＯ−１５（登録商標）＋２％ＨＳＡ中で産生されたＤＣを、不活性化されたＢＣＧ（１：４００希釈物）およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）と一緒に一晩成熟させた。上清を、各ウェルから収集し、そしてＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡアッセイおよびＩＬ−１２ｐ７０  ＥＬＩＳＡアッセイで泳動した（図６Ａおよび６Ｂ）。両方のＤＣ集団が、それらの細胞表面上で発現されるＣＤ１４のレベルにかかわらず、類似の量のＩＬ−１０およびＩＬ−１２を産生した。
【００６９】
（実施例６：ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の刺激）
この実施例において、ＢＣＧおよびＩＦＮγの存在下で成熟されたＣＤ１４ｌｏｗ  ＤＣおよびＣＤ１４−  ＤＣが、Ｖβ１７＋，ＣＤ８＋  Ｔ細胞の発現を刺激する能力。
【００７０】
次いで、抗原特異的Ｔ細胞を、ＣＤ１４ｌｏｗ  ＤＣおよびＣＤ１４−  ＤＣと共生培養した。手短に言えば、これらのＤＣを、培養フラスコから採取し、そして遠心分離によって濃縮した。直接の負荷のために、細胞を、等体積のＸ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）倍地およびＰＢＳ中のＨＬＡＡ．Ａ２．１制限エピトープを含むインフルエンザＭＩ−Ａ４  ４０マーペプチドＧｌｙＩｌｅＬｙｓＧｌｙＰｈｅＴｈｒＬｅｕ（配列番号１）中に再懸濁させ、そして３７℃で１時間インキュベートした。これらの細胞を、３７℃で２時間インキュベートして、抗原プロセシングを可能にした。
【００７１】
Ｍ１−Ａ４  ４０マーを負荷したＤＣを成熟させ、そして自己由来のＰＢＭＣ（１：１０  ＤＣ：ＰＢＭＣ比）と一緒に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を補充したＡＩＭ−Ｖ（登録商標）＋５％ヒトＡＢ血清中で８日間共生培養した。得られた細胞株を、各株におけるＶβ１７＋；ＣＤ８  Ｔ細胞（インフルエンザＡ特異的細胞）の百分率について、フローサイトメトリーによって分析した（図７Ａ）。絶対的な細胞数を、この百分率に、各株において見出される全細胞および図７Ｂに示される結果を除算することによって、計算した。これらのデータは、ＣＤ１４＋  ＣＤおよびＣＤ１４−  ＤＣが、かなりの抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を完全に刺激し得ること、ならびに樹状細胞の表面上におけるＣＤ１４抗原の欠乏が、抗原提示と結びつく表現型の特徴ではないことを、実証した。
【００７２】
先の実施例は、特許請求される発明の範囲を説明するために提供されるのであり、この範囲を限定するために提供されるのではない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に明らかになり、そして添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献はまた、これらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、未選別のＤＣ由来単球およびＰＢＭＣ由来単球の集団上で発現される表面分子の代表的提示を示す。新鮮な血液単球を、白血球フェレーシス生成物から単離し、５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４とともに６日間培養した。その後、細胞を、種々の細胞表面マーカーに対するＰＥ結合体化抗体またはＦＩＴＣ結合体化抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳ分析に供して、表面分子発現を評価した。この図は、２人の異なるドナー由来するＤＣ（実線および破線）ならびに血液単球（黒塗りのヒストグラム）についての蛍光強度ヒストグラムを示し、ＣＤ５４に対する抗体、ＣＤ８３に対する抗体、ＣＤ８０に対する抗体、ＣＤ８６に対する抗体、ＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ１１ｃに対する抗体、ＣＤ１４に対する抗体、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、ＨＬＡ−ＤＰに対する抗体およびＨＬＡ−ＤＱに対する抗体で染色した。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣ上での表面分子発現のレベルを、その前駆体であるＰＢＭＣ由来単球と対照して示す。ＤＣを、５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４との培養によりこれらのヒト単球性ＤＣ前駆体から生成し、ＣＤ１４に特異的なＦＩＴＣ結合体化抗体と種々の細胞表面マーカーに対するＰＥ結合体化抗体とで二重染色し、ＦＡＣＳ分析に供して、表面分子発現を評価した。図２Ａは、ＣＤ５４に対する抗体、ＣＤ８６に対する抗体、ＣＤ１１ｃに対する抗体、およびＣＤ５６に対する抗体で染色した（実線）か、またはアイソタイプコントロール抗体（黒塗りヒストグラム）で染色した、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの両方についての蛍光強度ヒストグラムを示す。図２Ｂは、ＣＤ８３に対する抗体、ＣＤ８０に対する抗体、ＣＤ４０に対する抗体、ならびにＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、ＨＬＡ−ＤＰに対する抗体、およびＨＬＡ−ＤＱに対する抗体で染色した、これらの細胞についての蛍光強度ヒストグラムを示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣ上での表面分子発現のレベルを、その前駆体であるＰＢＭＣ由来単球と対照して示す。ＤＣを、５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４との培養によりこれらのヒト単球性ＤＣ前駆体から生成し、ＣＤ１４に特異的なＦＩＴＣ結合体化抗体と種々の細胞表面マーカーに対するＰＥ結合体化抗体とで二重染色し、ＦＡＣＳ分析に供して、表面分子発現を評価した。図２Ａは、ＣＤ５４に対する抗体、ＣＤ８６に対する抗体、ＣＤ１１ｃに対する抗体、およびＣＤ５６に対する抗体で染色した（実線）か、またはアイソタイプコントロール抗体（黒塗りヒストグラム）で染色した、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの両方についての蛍光強度ヒストグラムを示す。図２Ｂは、ＣＤ８３に対する抗体、ＣＤ８０に対する抗体、ＣＤ４０に対する抗体、ならびにＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、ＨＬＡ−ＤＰに対する抗体、およびＨＬＡ−ＤＱに対する抗体で染色した、これらの細胞についての蛍光強度ヒストグラムを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、種々の濃度のＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力の例を示す。図３Ａは、ＣＤ１４＋単球を添加した場合のＣＤ１４−ＤＣの効力に対する影響を測定するバイオアッセイの結果を示す。簡単に述べると、刺激細胞（ＤＣまたは単球）を、９６ウェル培養プレート上にプレーティングし、最適に満たない量の抗ＣＤ３抗体（０．００５ｎｇ／ｍｌ）および濃縮されたＴ細胞を、添加した。細胞を、３Ｈ−チミジンでパルスし、さらにインキュベートし、そして収集した。その後、Ｔ細胞増殖を、取り込まれた標識（Δｃｐｍ）を測定することによって決定した。図３Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力を示す。樹状細胞を、ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４ｌｏｗ／＋ＤＣとに分離（分別）した。その後、各細胞群を、その抗原非依存性効力のバイオアッセイにおいて試験した。図３Ｃは、ＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力を、単独でかまたはＣＤ１４ｌｏｗ／＋ＤＣと組み合わせて示し、これらのＤＣの混合物もまた抗原提示細胞の良好な集団を構成するか否かを評価する。試験した種々のＡＰＣ（抗原提示細胞）群の効力は、ほぼ等しかった。このことは、ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４＋ＤＣとの任意の混合集団を含むＡＰＣ生成物は、ＣＤ１４−ＤＣに対する効力が等しかったことを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃは、種々の濃度のＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力の例を示す。図３Ａは、ＣＤ１４＋単球を添加した場合のＣＤ１４−ＤＣの効力に対する影響を測定するバイオアッセイの結果を示す。簡単に述べると、刺激細胞（ＤＣまたは単球）を、９６ウェル培養プレート上にプレーティングし、最適に満たない量の抗ＣＤ３抗体（０．００５ｎｇ／ｍｌ）および濃縮されたＴ細胞を、添加した。細胞を、３Ｈ−チミジンでパルスし、さらにインキュベートし、そして収集した。その後、Ｔ細胞増殖を、取り込まれた標識（Δｃｐｍ）を測定することによって決定した。図３Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力を示す。樹状細胞を、ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４ｌｏｗ／＋ＤＣとに分離（分別）した。その後、各細胞群を、その抗原非依存性効力のバイオアッセイにおいて試験した。図３Ｃは、ＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力を、単独でかまたはＣＤ１４ｌｏｗ／＋ＤＣと組み合わせて示し、これらのＤＣの混合物もまた抗原提示細胞の良好な集団を構成するか否かを評価する。試験した種々のＡＰＣ（抗原提示細胞）群の効力は、ほぼ等しかった。このことは、ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４＋ＤＣとの任意の混合集団を含むＡＰＣ生成物は、ＣＤ１４−ＤＣに対する効力が等しかったことを示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、種々の濃度のＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力の例を示す。図３Ａは、ＣＤ１４＋単球を添加した場合のＣＤ１４−ＤＣの効力に対する影響を測定するバイオアッセイの結果を示す。簡単に述べると、刺激細胞（ＤＣまたは単球）を、９６ウェル培養プレート上にプレーティングし、最適に満たない量の抗ＣＤ３抗体（０．００５ｎｇ／ｍｌ）および濃縮されたＴ細胞を、添加した。細胞を、３Ｈ−チミジンでパルスし、さらにインキュベートし、そして収集した。その後、Ｔ細胞増殖を、取り込まれた標識（Δｃｐｍ）を測定することによって決定した。図３Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力を示す。樹状細胞を、ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４ｌｏｗ／＋ＤＣとに分離（分別）した。その後、各細胞群を、その抗原非依存性効力のバイオアッセイにおいて試験した。図３Ｃは、ＣＤ１４−ＤＣの抗原非依存性効力を、単独でかまたはＣＤ１４ｌｏｗ／＋ＤＣと組み合わせて示し、これらのＤＣの混合物もまた抗原提示細胞の良好な集団を構成するか否かを評価する。試験した種々のＡＰＣ（抗原提示細胞）群の効力は、ほぼ等しかった。このことは、ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４＋ＤＣとの任意の混合集団を含むＡＰＣ生成物は、ＣＤ１４−ＤＣに対する効力が等しかったことを示す。
【図４】図４は、１８個の抗原提示細胞バッチの抗原非依存性効力の比較を示す。これらのバッチを、その細胞集団内のＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１４＋ＤＣとの比率について試験した。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ単独、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４、またはＩＬ−５単独の存在下で培養したＤＣの表現型を示し、この表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ８０、およびＣＤ１ａの細胞表面発現により決定した。図５Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ単独の存在下で５日間培養した後にＣＤ１４を発現する細胞の割合を示す。図５Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で５日間培養した後にＣＤ１４を発現する細胞の割合を示す。図５Ｃは、ＣＤ１４ｈｉｇｈであることが決定された細胞（単球）と比較した場合の、ＣＤ１４ｌｏｗＤＣまたはＣＤ１４−ＤＣにおける、ＣＤ８０について陽性である細胞、ＣＤ１ａについて陽性である細胞、およびＨＬＡ−ＤＲについて陽性である細胞の割合を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ単独、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４、またはＩＬ−５単独の存在下で培養したＤＣの表現型を示し、この表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ８０、およびＣＤ１ａの細胞表面発現により決定した。図５Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ単独の存在下で５日間培養した後にＣＤ１４を発現する細胞の割合を示す。図５Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で５日間培養した後にＣＤ１４を発現する細胞の割合を示す。図５Ｃは、ＣＤ１４ｈｉｇｈであることが決定された細胞（単球）と比較した場合の、ＣＤ１４ｌｏｗＤＣまたはＣＤ１４−ＤＣにおける、ＣＤ８０について陽性である細胞、ＣＤ１ａについて陽性である細胞、およびＨＬＡ−ＤＲについて陽性である細胞の割合を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ単独、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４、またはＩＬ−５単独の存在下で培養したＤＣの表現型を示し、この表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ８０、およびＣＤ１ａの細胞表面発現により決定した。図５Ａは、ＧＭ−ＣＳＦ単独の存在下で５日間培養した後にＣＤ１４を発現する細胞の割合を示す。図５Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で５日間培養した後にＣＤ１４を発現する細胞の割合を示す。図５Ｃは、ＣＤ１４ｈｉｇｈであることが決定された細胞（単球）と比較した場合の、ＣＤ１４ｌｏｗＤＣまたはＣＤ１４−ＤＣにおける、ＣＤ８０について陽性である細胞、ＣＤ１ａについて陽性である細胞、およびＨＬＡ−ＤＲについて陽性である細胞の割合を示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＤ１４＋成熟樹状細胞およびＣＤ１４−成熟樹状細胞およびＣＤ１４＋未成熟樹状細胞およびＣＤ１４−未成熟樹状細胞によって分離される、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０の量を示す。図６Ａは、ＩＬ−１２のｐ７０サブユニットの存在によって測定したＩＬ−１２の分泌を示す。図６Ｂは、ＩＬ−１０の発現を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＤ１４＋成熟樹状細胞およびＣＤ１４−成熟樹状細胞およびＣＤ１４＋未成熟樹状細胞およびＣＤ１４−未成熟樹状細胞によって分離される、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０の量を示す。図６Ａは、ＩＬ−１２のｐ７０サブユニットの存在によって測定したＩＬ−１２の分泌を示す。図６Ｂは、ＩＬ−１０の発現を示す。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣと接触したＴ細胞集団におけるインフルエンザＡ抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在を示すＶβ１７細胞表面マーカーを発現する、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（図７Ａ）および総数（図７Ｂ）を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＤ１４＋ＤＣおよびＣＤ１４−ＤＣと接触したＴ細胞集団におけるインフルエンザＡ抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在を示すＶβ１７細胞表面マーカーを発現する、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（図７Ａ）および総数（図７Ｂ）を示す。
【図１】
2006517108.tif 000005
【図２Ａ】
2006517108.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2006517108.tif 000010
【図４】
2006517108.tif 000011
【図５Ａ】
2006517108.tif 000012
【図５Ｂ】
2006517108.tif 000013
【図５Ｃ】
2006517108.tif 000014
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2006517108.tif 000017
【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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