(57)【要約】本発明は、薬剤の徐放のための高分子微粒子およびその製造方法に関する。水溶性高分子の微小凝集現象を用いた高分子微粒子の製造のための本発明の方法により、薬剤の封入量が向上するだけでなく、薬剤の初期バーストをが最小限に抑制され得るだけでなく、これにより、薬剤の徐放と持続的放出を可能にする高分子微粒子が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1) 生分解性高分子および疎水性界面活性剤を含む1次有機溶媒に、2次有機溶媒を添加して高分子溶液を製造する段階；(2)水溶性高分子および親水性界面活性剤を含む水溶液に薬剤を溶解および／又は分散させた後、この溶液を段階(1)で製造された高分子溶液に添加して1次乳剤(油中水型 (W/O))を製造する段階であり、ここで1次乳剤の内部水相の脱水により水溶性高分子の微小凝集粒子が形成され、微小凝集粒子内に薬剤が封入される段階；および(3)外部連続相に1次乳剤を分散させて高分子微粒子を固形化させる段階を含む高分子微粒子の製造方法。
【請求項２】
生分解性高分子がポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、乳酸-グリコール酸共重合体(PLGA)およびポリカプロラクトン(PCL)からなる群より選択される少なくとも1つであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
生分解性高分子が高分子溶液中の有機溶媒に対する濃度が10〜60%(w/v)になるように添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
段階(1)で結晶性高分子がさらに添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
結晶性高分子がポリエチレングリコールまたはポリL-乳酸であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
結晶性高分子と生分解性高分子の質量比が0.1：99.9〜20：80であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
疎水性界面活性剤が脂肪酸、オレフィン、アルキルカーボン、シリコン、硫酸エステル、脂肪アルコールスルフェート、硫酸化脂肪および油、スルホン酸塩、脂肪族スルホネート、アルキルアリールスルホネート、リグミンスルホネート(ligminsulfonate)、リン酸エステル、ポリオキシエチレン、ポリグリセロール、ポリオール、イミダゾリン、アルカノールアミン、ヘタミン、スルホメタミン、リン脂質およびソルビタン脂肪酸エステルからなる群より選択される少なくとも1つであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
疎水性界面活性剤がソルビタントリオレエートであることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
疎水性界面活性剤が、高分子溶液中の有機溶媒に対する濃度が0.1〜30%(v/v)になるように添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
1次有機溶媒がジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサンおよび酢酸エチルより選択される少なくとも一つであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
2次有機溶媒が、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランおよびジオキサンより選択される少なくとも1つであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
1次有機溶媒と2次有機溶媒の体積比が95：5〜50：50であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
水溶性高分子が、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、貯蔵炭水化物である澱粉、キトサン、キサンタンガム、アルギン酸、プルラン、カードラン、デキストラン、レバン、ヒアルロン酸、グルカン、コラーゲンおよびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1つであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
水溶性高分子が、ヒアルロン酸又はその塩であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
水溶性高分子の脱水前の水溶液中の粘度が300〜50,000cpであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
親水性界面活性剤が、蛋白質界面活性剤、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック共重合体(polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer)およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルからなる群より選択される少なくとも1つであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
親水性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
親水性界面活性剤が、水に対する濃度が0.1〜30%(w/w)になるように添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
薬剤がビスフォスフォネートであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
外部連続相が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、メチルセルロース(MC)、ゼラチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートまたはポリビニルアルコール(PVA)の水溶液であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 
【請求項２１】
段階(3)に従来の濾過および洗浄の段階がさらに追加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
請求項1〜請求項21のいずれか一項に記載の製造方法により得られる高分子微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬剤の徐放のための高分子微粒子、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子を用いた薬剤送達用微粒子の製造方法としては、主に溶媒蒸発法(N. Wakiyama et al., Chem. Pharm. Bull., 30(7), 2621-2628, 1982)、溶媒抽出法(J. M. Ruiz et al., Int. J. Pharm., 49, 69-77, 1989)、相分離法(N. Nihant et al., J. Controlled Release, 35, 117-125, 1995)、コアセルベーション法(J. C. Leroux et al., Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., Controlled Release Society, Inc., 21 #1118, 1994)、塩析法(B. Gander et al., J. Microencapsulation, 12(1), 83-97, 1995)、および噴霧乾燥法(R. Arshady et al., Polym. Eng. Sci., 30(15), 915-924, 1990)を挙げることができる。粒子の大きさ、薬剤の封入（loading）率、および薬剤の放出特性のような微粒子の最終特性は製造方法によって大きな影響を受けるため、高分子と薬剤の性質だけでなく微粒子の所望の物性を考慮して適切な方法が選択されなければならない。
【０００３】
上記方法のうち、多重乳剤を用いた溶媒蒸発方法および溶媒抽出方法が集中的に研究されており、これはポリエステル高分子を用いた微粒子を製造するための一般的な方法として知られている。このような多重乳剤方法を用いた高分子微粒子の製造方法は、簡単に微粒子を得ることができるという長所がある。しかし、水溶性薬剤を用いる場合は、微粒子の製造過程中に外部連続相へ薬剤が拡散されて出るため、薬剤の封入効率が非常に低下し、またこれにより薬剤の微粒子表面の分布量が高くなり薬剤の初期バーストが起こる。
【０００４】
一方、韓国特許公開第2002-0005215号(Korean Patent Laid-open No.2002-0005215)ではジクロロメタンと酢酸エチルの混合溶媒内で蛋白質薬剤の可逆的な微小凝集現象を利用してポリエステル高分子微粒子内部に蛋白質薬剤を封入させる方法が開示されている。該方法により、蛋白質薬剤の持続的放出が誘導され、薬剤の初期バーストが阻害されている。しかし、これは蛋白質薬剤の固有の特性を用いた特別な場合に該当するだけで、蛋白質薬剤を除いた他の薬剤については薬剤の封入効率低下および薬剤の初期バーストなどの問題点が依然として残っていた。
【０００５】
さらに、韓国特許公開第1997-069033号では多重乳剤方法であって、高分子には溶解しないが水と混和できる酢酸エチルを外部連続相に予め添加し、短時間内に高分子微粒子を固形化させる方法を用いた微粒子の製造方法を記載している。該方法により、微粒子の製造時間が短縮されて薬剤の封入効率が高くなる。しかし該方法は、水に対する薬剤の溶解度が少なくとも500mg/mlの低分子量の薬剤の場合にのみ適用することができ、それにより薬剤の封入量を上昇させたが、薬剤放出初期バーストに60%超が放出されるという問題点がさらに明らかになった。さらに、塩の形態であったり、または親水性である薬剤であっても水に対する薬剤の溶解度が約10mg/mlと非常に低い場合は、W/O型1次乳剤の製造時の内部水相の体積が制限されているため、導入される薬剤の量もまた制限されなければならない。よって、微粒子から放出される薬剤の量が非常に低い可能性があるため、治療効果をもたらすためには不十分であると考えられる。内部水相に飽和濃度以上の量の薬剤を用いる場合は、多重乳剤方法による高分子微粒子の製造自体が不可能になる。
【０００６】
米国特許第6,419,961号、同第5,585,460号および同第4,652,441号では、多重乳剤方法を用いてリュープロレリンアセテート等のペプチド系薬剤を含有する乳酸-グリコール酸共重合体微粒子を製造する方法が開示されている。特に、米国特許第4,652,441号の場合、内部水相にゼラチン、アルブミン、ペクチン、寒天等の水溶性高分子を薬剤と共に導入することにより内部水相の粘度が高くなり、結果としてゼラチンと乳酸-グリコール酸共重合体の二重封入が誘導されて持続性放出用の注射剤を得ることができた。しかし、内部水相の粘度を上昇させるためにゼラチンを用いる場合、1次乳剤内で薬剤を均一に分布させるために80℃という温度が必要であり、1次乳剤を外部連続相に再分散させる際に、20℃〜30℃まで冷却する必要があるため、製造工程が複雑だという問題点を持っている。さらに該製造方法は、熱安定性を有している薬剤にのみ適用することができるという制限がある。
【０００７】
本発明者らは従来の多重乳剤工程を用いた高分子微粒子の製造時に発生する問題、つまり、低い薬剤封入率、および薬物の初期バーストを解決しようとした。
【０００８】
本発明の目的は、薬剤の徐放が可能な高分子微粒子およびその製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は薬剤の徐放のための高分子微粒子およびその製造方法に関する。
【００１０】
本発明の高分子微粒子は、(1)生分解性高分子、および疎水性界面活性剤を含む1次有機溶媒に2次有機溶媒を添加し、高分子溶液を製造する段階；(2)水溶性高分子および親水性界面活性剤を含む水溶液に薬剤を溶解し、かつ/または分散させた後、これを該段階(1)で製造された高分子溶液に添加し、1次乳剤(油中水型 (W/O))を製造する段階であって、ここで1次乳剤の内部水相が脱水されて水溶性高分子の微小凝集粒子が形成され、これにより該微小凝集粒子に薬剤が封入される段階；および(3)外部連続相に該1次乳剤を分散させて高分子微粒子を固形化させる段階を含む製造方法により製造される。または、該高分子微粒子は、段階(3)において従来のろ過および洗浄の過程をさらに行うことによって得ることができる。
【００１１】
以下、本発明の高分子微粒子を製造する方法を段階別に分けて詳細に説明する。
【００１２】
段階1：高分子溶液の製造
先ず、生分解性高分子および疎水性界面活性剤を含む1次有機溶媒内に2次有機溶媒を添加して高分子溶液を製造する。
【００１３】
生分解性高分子として、ポリエステル高分子を用いることができ、好ましくはポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、乳酸-グリコール酸共重合体(PLGA)およびポリカプロラクトン(PCL)からなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。該高分子は、体内の通常の代謝過程の1つであるクエン酸回路を通して人体に無害な化学物質、すなわち水と二酸化炭素に分解されるため、生体適合性および生体分解性が優れた高分子として知られている(S. J. Holland et al., J. Controlled Release, 4, 155-180, 1986)。生分解性高分子は、特に限定されるものではないが、分子量が5,000〜210,000の範囲のものを用いることが好ましい。また、生分解性高分子は、高分子溶液中の有機溶媒に対する濃度が10〜60%(w/v)になるように添加できる。  
【００１４】
さらに、本発明では該段階(1)で結晶性高分子をさらに添加して高分子微粒子を製造する方法を提供する。結晶性高分子は、薬剤の放出調節物質としての役割をする。結晶性高分子として任意の注射可能な生体適合性材料を、特に制限なく用いることができるが、さらに好ましくはポリエチレングリコール(PEG)又はポリ乳酸、さらに好ましくはポリエチレングリコールを用いる。低分子量のPEGは、臨床で関節内の注射用に用いられる生体適合性高分子として知られている。好ましいPEGの分子量は、200〜5,000である。PEGの分子量が200未満の場合は、PEGは結晶を形成しないため薬剤の放出調節物質として作用しないが、分子量が5000を超える場合は腎臓を通した排出が不可能であった(K. K. Huang, T. W. Chang and T. W. Tzeng, Int. J. Pharm., 156, 9-15, 1997)。結晶性高分子と生分解性高分子の質量比は0.1：99.9〜20：80であり、好ましくは1：99〜10：90である。
【００１５】
特に、該生分解性高分子がポリ乳酸とポリグリコール酸のモル分率が50:50である低分子量共重合体の場合、ゴム状である無定形高分子であるため、微粒子に封入された薬剤の主な放出経路である細孔および水チャネル(water channel)の形成が阻害されるので、薬剤の全体的な放出速度があまりにも遅い傾向が見られる。このような場合、ポリエチレングリコールを薬剤の放出調節物質として無定形高分子と物理的に混合して用いる場合、ゴム状の無定形高分子微粒子内部に結晶領域を形成することにより、細孔と水チャネル形成を容易にし、これにより薬剤放出を簡単に調節する。
【００１６】
一方、該疎水性界面活性剤としては、脂肪酸、オレフィン、アルキルカーボン、シリコン、硫酸エステル、脂肪アルコールスルファート、硫酸化脂肪および油、スルホン酸塩、脂肪族スルホネート、アルキルアリールスルホネート、リグミンスルホネート(ligminsulfonate)、リン酸エステル、ポリオキシエチレン、ポリグリセロール、ポリオール、イミダゾリン、アルカノールアミン(alkanolamine)、ヘタミン(hetamine)、スルホメタミン(sulfomethamine)、リン脂質およびソルビタン脂肪酸エステルからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができ、好ましくはソルビタン脂肪酸エステル、さらに好ましくはソルビタントリオレエートを用いることができる。該疎水性界面活性剤は、高分子溶液中の有機溶媒に対する濃度が0.1〜30%(v/v)、好ましくは5〜20%(v/v)になるように添加することができる。
【００１７】
該1次有機溶媒は、生分解性高分子および疎水性界面活性剤との混和性が必要とされ、かつ水とは相分離が起こることが必要とされる。該1次有機溶媒は、上記の要件を満たす場合であれば特に制限はされないが、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサンおよび酢酸エチルより選択される少なくとも一つを用いることができる。
【００１８】
該2次有機溶媒は、1次有機溶媒と、その溶媒に含まれる生分解性高分子および疎水性界面活性剤と混和性がなければならなく、また水とも混和性があることも必要とされる。該2次有機溶媒は上記の要件を満たす場合であれば特に制限はされないが、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランおよびジオキサンより選択される少なくとも1つを用いることができる。
【００１９】
本発明において、生分解性高分子および疎水性界面活性剤を含んだ1次有機溶媒と水との混和性を満たす2次有機溶媒との混合溶媒を用いることが好ましい。ジクロロメタンとアセトンの混合溶媒がさらに好ましい。1次有機溶媒と2次有機溶媒の体積比は95：5〜50：50、好ましくは75：25〜55：45である。1次有機溶媒と2次有機溶媒の全体積は、外部連続相(例えば、ポリビニルアルコール水溶液)の体積に対して1/500〜1/100、好ましくは1/400〜1/200である。
【００２０】
段階2：1次乳剤の製造および水溶性高分子の微小凝集粒子形成による薬剤の1次封入
水溶性高分子と親水性界面活性剤を含む水溶液に飽和濃度を超える量の薬剤を溶解させ、分散させた後、これを段階1で製造された高分子溶液に添加し、激しく攪拌し、1次乳剤(油中水型 (W/O))を製造した。この際、生分解性高分子および疎水性界面活性剤を含む混合溶媒中の2次有機溶媒と水との混和性により内部水相が急速に脱水される。これにより水溶性高分子の溶解度が急激に落ちて微細な大きさの粒子が形成され、このような過程において薬剤が水混和性高分子の非常に小さいサイズの該微細粒子に1次封入される。よってこの段階で製造される1次乳剤の内部水相は、薬剤が封入された水溶性高分子の微細粒子が分散された状態で存在する。
【００２１】
本発明で使用される水溶性高分子は、生体適合性が優れた物質であり、人体に無害であり、水に溶解されると高い粘性を示す。該水溶性高分子はセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、貯蔵炭水化物である澱粉、キトサン、キサンタンガム、アルギン酸、プルラン、カードラン、デキストラン、レバン、ヒアルロン酸、グルカン、コラーゲンおよびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1つを用いることができ、このうちヒアルロン酸またはその塩を用いることが好ましい。該水溶性高分子の脱水前の水溶液中の粘度は、300〜50,000cp(センチポアズ)、好ましくは500〜30,000cpである。
【００２２】
さらに、本発明では該段階(2)で水溶性高分子の水に対する溶解度を高めるために、他の成分をさらに添加して高分子微粒子を製造することができる。上記水溶性高分子がキトサンである場合は、ギ酸、クエン酸、酢酸、および乳酸等の有機酸ならびに塩酸等の無機酸の水溶液にキトサンを溶解させて反応することが好ましい。この際、水に対する酸の濃度は0.5〜3.0%(w/v)であることが好ましい。
【００２３】
親水性界面活性剤は、飽和濃度を超える量の薬剤粒子を均一に分散させるために用いられる。親水性界面活性剤の例としては、ウシ血清アルブミン(BSA)またはカルボポール(carbopol)のような蛋白質界面活性剤、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック共重合体(polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer)およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(ツィーン（Tween）系列)からなる群より選択される少なくとも1つを用いられ、好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系の界面活性剤が用いられ、さらに好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(商品名：ツィーン 80)を用いられる。親水性界面活性剤は、水に対する濃度が0.1〜30%(w/w)、好ましくは1〜20%(w/w)になるように添加する。
【００２４】
本発明で適用可能な薬剤の例は、特に制限されない。例えば、ビスフォスフォネート薬剤として、エチドロネート、クロドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、ゾレンドロネート、チルドロネート、YH 529、インカドロネート、オルパドロネート(olpadronate)、ネリドロネート(neridronate)、EB-1053、およびそれらの塩を用いることができる。該薬剤は水に対する溶解度が0.1μg/ml〜1000mg/ml、好ましくは10mg/ml〜500mg/mlであることが好ましい。
【００２５】
一方、内部水相と有機相の体積比は1：5〜1：30、好ましくは1：10〜1：20である。
【００２６】
段階3：外部連続相に1次乳剤を分散させて固形化させることによる高分子微粒子を製造する段階
1次乳剤を分散させるための外部連続相としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、メチルセルロース(MC)、ゼラチン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート又はポリビニルアルコール(VA)水溶液を用いることができ、好ましくはポリビニルアルコール水溶液を用いることができる。ポリビニルアルコール溶液を用いる場合、ポリビニルアルコールの濃度は0.1〜5%(w/v)、好ましくは0.3〜2%(w/v)である。ポリビニルアルコールの分子量は10,000〜100,000、好ましくは13,000〜23,000であり、加水分解度は75〜95%、好ましくは83〜89%である。さらに、該連続相に多重乳剤の製造時に通常的に添加される他の成分、例えば酢酸エチル等を添加することができる。このような場合、酢酸エチルはPVA水溶液に対して1〜20%(v/v)、好ましくは5〜10%(v/v)添加する。
【００２７】
本発明により製造された高分子微粒子は、平均粒子径が0.1〜200μm、好ましくは10〜100μmであり、注射針を通して静脈、皮下、または筋肉の経路で投与が可能であるという特徴を有している。さらに、該微粒子は、内部に多くの細孔および水チャネルが形成されている円形の粒子であり、同質量のフィルム状又は円筒形状の製剤に比べて表面積が大きいため、薬剤の徐放が可能だという特徴を有している。
【００２８】
本発明によって製造された高分子微粒子内部に存在する細孔には、水溶性高分子微小凝集粒子が分布され、その結果このような水溶性高分子微小凝集粒子内に薬剤が封入されている。その結果、薬剤が水溶性高分子内と生分解性高分子内に二重に封入される効果を有する。このような二重封入により微粒子の製造過程中に、外部連続相への薬剤の損失を最小化することができ、薬剤の初期バーストもまた最小化することができるという特徴を有するようになる。
【００２９】
本発明において製造された微粒子は、薬剤の徐放のために注射可能な製剤またはインプラントペレット(implant pellet)として用いることができる。具体的な注射方法としては皮下注射、および筋肉注射等を挙げることができる。さらにその適用可能な製剤の例としては、注射液およびすぐに使用できる注射液製造用粉末等の注射用製剤、インプラントペレット等のインプラント製剤等がある。よって本発明の組成物は、製剤を製造する際に通常用いられる賦形剤、安定化剤、pH調節剤、および等張化剤等をさらに含むことができる。
【００３０】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好ましい実施例、実験例および製剤例を提示する。しかし、次の具体例は本発明をより理解し易くするためのものであって、本発明がこれらの具体例により限定されるものではない。
【００３１】
実施例1
内部水相は水に対する濃度が0.75%(w/v)であるヒアルロン酸ナトリウム、および水に対する20%(w/v)であるポリエチレングリコールソルビタンモノオレートを含む水溶液500μlにアレンドロン酸ナトリウム100mgを分散させることによって得た。有機相の高分子溶液は、ジクロロメタンとアセトン（9対1の体積比）からなる混合溶媒100重量部に、ポリ乳酸(分子量100,000)10重量部およびソルビタントリオレエート5重量部を溶解させることによって得た。外部連続相は（ポリビニルアルコール0.5重量部を蒸留水100重量部に溶解することによって作製した）水溶液99重量部に対して酢酸エチル1重量部を溶解させることによって得た。
【００３２】
内部水相と有機相を1対10の体積比にし、激しく攪拌してW/O型乳剤を製造した。外部連続相をホモジナイザーにて5,000rpmで均一に分散させながら、上記で製造したW/O型1次乳剤を外部連続相に対して1対200の体積比でそれにゆっくり添加し、5分間ホモジナイザーで分散させてW/O/W型多重乳剤を製造した。その後30分間おだやかに攪拌した後、ろ過して有機溶媒を除去し、真空オーブンに入れて24時間乾燥させて微粒子を得た。
【００３３】
実施例1-1
有機相を形成する有機溶媒として、ジクロロメタンとアセトン（8対2の比率）の混合溶媒を用いたことを除いては、実施例1と同様の方法で微粒子を製造した。
【００３４】
実施例1-2
有機相を形成する有機溶媒として、ジクロロメタンとアセトン（7対3の比率）の混合溶媒を用いたことを除いては、実施例1と同様の方法で微粒子を製造した。
【００３５】
実施例1-3
有機相を形成する有機溶媒として、ジクロロメタンとアセトン（6対4の比率）の混合溶媒を用いたことを除いては、実施例1と同様の方法で微粒子を製造した。
【００３６】
比較例1
有機相を形成する有機溶媒として、ジクロロメタンのみを用いたことを除いては、実施例1と同様の方法で微粒子を製造した。
【００３７】
実施例2
内部水相は水に対する濃度が0.75%(w/v)であるヒアルロン酸ナトリウム、および水に対する濃度が20%(w/v)であるポリエチレングリコールソルビタンモノオレートが溶解されている水溶液500μlにアレンドロン酸ナトリウム100mgを分散させることによって得た。有機相である高分子溶液は、ジクロロメタンとアセトン（7対3の比率）からなる混合溶媒100重量部に、乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)を30重量部、およびソルビタントリオレエート5重量部を溶解させることによって得た。外部連続相はポリビニルアルコール0.5重量部を蒸留水100重量部に溶解させて製造した水溶液99重量部に対し酢酸エチル1重量部を溶解させることによって得た。
【００３８】
内部水相と有機相（1対10の体積比）を、激しく攪拌してW/O型乳剤を製造した。外部連続相をホモジナイザーにて5,000rpmで均一に分散させながら、上記で製造したW/O型1次乳剤を外部連続相に対して1対200の体積比でそれにゆっくり添加し、5分間ホモジナイザーで分散させてW/O/W型多重乳剤を製造した。その後、約30分間おだやかに攪拌した後、ろ過して有機溶媒を除去し、真空オーブンに入れて24時間を超える時間乾燥させて微粒子を得た。
【００３９】
実施例2-1
乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)30重量部の代わりにに、乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)を29.3重量部、およびポリエチレングリコール(分子量3,350)0.7重量部を用いたことを除いては、実施例2と同様の方法で高分子微粒子を製造した。
【００４０】
実施例2-2
乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)30重量部の代わりにに、乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)を28.5重量部、およびポリエチレングリコール(分子量3,350)1.5重量部を用いたことを除いては、実施例2と同様の方法で高分子微粒子を製造した。
【００４１】
実施例2-3
乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)30重量部の代わりにに、乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)を27.0重量部、およびポリエチレングリコール(分子量3,350)3.0重量部を用いたことを除いては、実施例2と同様の方法で高分子微粒子を製造した。
【００４２】
比較例2
有機相を形成する有機溶媒としてジクロロメタンのみを用いたことを除いては、実施例2と同様の方法で微粒子を製造した。
【００４３】
実施例3
内部水相は、水に対する濃度が1.5%(w/v)である乳酸、水に対する濃度が0.75%であるキトサン、および水に対する濃度が10%であるポリエチレングリコールソルビタンモノオレートが含まれる水溶液500μlにアレンドロン酸ナトリウム100mgを分散させることによって得た。有機相の高分子溶液は、ジクロロメタンとアセトン（8対2の比率）の混合溶媒100重量部に、乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)30重量部、およびソルビタントリオレエート5重量部を溶解させることによって得た。外部連続相は、ポリビニルアルコール0.5重量部を蒸留水100重量部に溶解さることにより製造した水溶液99重量部に対して酢酸エチル1重量部を溶解させることによって得た。
【００４４】
内部水相と有機相（1対10の体積比）を激しく攪拌し、W/O型乳剤を製造した。外部連続相をホモジナイザーで5,000rpmで均一に分散させながら、上記で製造したW/O型1次乳剤を、外部連続相に対して1対200の体積比でそれにゆっくり添加して5分間ホモジナイザーで分散させてW/O/W型多重乳剤を製造した。その後、約30分間おだやかに攪拌した後、ろ過して有機溶媒を除去し、真空オーブンに入れて24時間乾燥させて微粒子を得た。
【００４５】
実施例3-1
有機相を形成する有機溶媒として、ジクロロメタンとアセトン（6対4の比率）の混合溶媒を用いたことを除いては、実施例3と同様の方法で微粒子を製造した。
【００４６】
比較例3
有機相を形成する有機溶媒として、ジクロロメタンのみを用いたことを除いては、実施例3と同様の方法で微粒子を製造した。
【００４７】
比較例4
内部水相は、水に対する濃度が5%(w/v)であるゼラチンの水溶液500μlにアレンドロン酸ナトリウム200mgを分散させることによって得、80℃の温度を維持させた。有機相である高分子溶液は、ジクロロメタン100重量部に乳酸-グリコール酸共重合体(乳酸：グリコール酸のモル比＝50：50、分子量54,000)10重量部を溶解させることによって得た。外部連続相は、ポリビニルアルコール0.5重量部を蒸留水100重量部に溶解さることにより製造した水溶液99重量部に対し、酢酸エチル1重量部を溶解させることによって得た。
【００４８】
内部水相と有機相（1対10の体積比）を25℃で激しく攪拌し、W/O型乳剤を製造した。外部連続相をホモジナイザーにて5,000rpmで均一に分散させながら、上記で製造したW/O型1次乳剤を外部連続相に対して1対200の容積比でそれにゆっくり添加し、5分間ホモジナイザーで分散させてW/O/W型多重乳剤を製造した。その際の外部連続相温度は、25℃を維持しなければならない。その後、約30分間おだやかに攪拌した後、ろ過によって有機溶媒を除去し、残った生成物を真空オーブンに入れて24時間乾燥させて微粒子を得た。
【００４９】
実験例1.薬剤の封入率（％）測定実験
上記実施例で製造された高分子微粒子30mgを正確に秤量して蓋付き試験管に入れ、5mlのクロロホルムに十分に溶解した後、20mlの蒸留水と混合し30分間激しく攪拌した。その後、この溶液を5000rpmで5分間遠心分離し、一定量の上清を取りHPLCで分析し、薬剤の濃度を測定し、これを元に微粒子内の薬剤の量を計算し、次の式により高分子微粒子内に封入されている薬剤の封入率を計算した。この実験結果を表1に表した。
薬剤封入率(%)＝(微粒子内の薬剤の重量／採取した微粒子の重量)×100
薬剤の封入効率(%)＝(薬剤の封入率(%)／理論的薬剤封入率(%))×100
【００５０】
本発明では、理論的薬剤封入率(%)とは、微粒子製造時に用いられた薬剤の総重量／(微粒子製造時に用いられた薬剤の総重量＋微粒子製造時に用いられた他の物質の総重量)を指し、微粒子製造時に用いられた薬剤が微粒子製造過程中に外部連続相へ損失せず、100%完全に封入されたという仮定に基づいて、得られた薬剤の封入率を意味するものである。さらに、微粒子製造時に用いられた他の物質は、ポリエステル高分子および疎水性界面活性剤等の有機相を構成する物質の総重量と、水溶性高分子および親水性界面活性剤等の内部水相を構成する物質の総重量の合計を指す。
【００５１】
（表１）アレンドロン酸ナトリウムの封入率（％）および封入効率
2006508959.tif 000002
【００５２】
上記の表1で確認できるように、ヒアルロン酸ナトリウムの微小凝集が生じないように、比較例1と比較例2のように混合溶媒を用いる代わりに、有機溶媒としてジクロロメタンのみを用いた場合、薬剤封入効率はわずか20％であった。これに対して、1次有機溶媒と2次有機溶媒を混合して用いることによってヒアルロン酸ナトリウムの微小凝集粒子化現象が誘導された微粒子の場合では、薬剤の封入量が著しく増加することが確認された。特に、実施例1-1、実施例1-2、および実施例1-3の結果から混合溶媒内のアセトン含量が増加する程、薬剤の封入率が増加することが分かった。これはヒアルロン酸ナトリウム水溶液の脱水の増加のため、ヒアルロン酸ナトリウム微粒子自体の薬剤を保持するための物理的な力が増加するため、製造過程中の薬剤の損失を最小化する傾向があることを示している。
【００５３】
一方、製造された高分子微粒子の断面を微分走査型電子顕微鏡（differential scanning electron microscope）で撮影したものを図1aおよび図1bに示した。図1aは、比較例1によって製造された高分子微粒子の断面の微分走査型電子顕微鏡写真である。微粒子内部で観察される不連続相の内部細孔は、薬剤の封入率および薬剤の放出速度に影響を及ぼすが、写真で見られるように微粒子の製造過程中、ヒアルロン酸ナトリウムの微小凝集粒子が形成されなかった。その結果、十分量の薬剤が微粒子の製造過程中に外部水相へ損失したものと推測された。図1bは、実施例1-3により製造された高分子微粒子の断面の微分走査型電子顕微鏡写真である。写真で見られるように、高分子微粒子の不連続な内部細孔の内部がヒアルロン酸ナトリウム微小凝集粒子で埋まっている。これにより薬剤がヒアルロン酸ナトリウム凝集粒子内に最初に封入され、これにより微粒子の製造過程中にも外部水相への薬剤損失が最小化されたということが確認できた。このような現象は、比較例1、比較例2のように微粒子製造過程中にジクロロメタンのみを用いた場合を除いては、全実施例でこのような現象が観察された。
【００５４】
実施例2、実施例2-1、実施例2-2、および実施例2-3は、ポリエチレングリコールの含量増加による薬剤の封入率および封入効率を示し、この場合には、薬剤放出速度調節物質としてポリエチレングリコールをポリエステル高分子に添加した。表1から分かるように、水溶性および結晶性の特性を有しているポリエチレングリコールの添加は、微粒子の製造過程中に微粒子内の外部水相の流入および流出を自由にし、その結果、薬剤の封入率および封入効率を減少させる。
【００５５】
実施例3、実施例3-1、および比較例3は、水溶性高分子を含有する内部水相として、ヒアルロン酸ナトリウムの代わりにキトサンを用いた場合、混合溶媒内のアセトン含量の増加に依存する薬剤の封入率および封入効率をあらわす。キトサンの場合は、ジクロロメタンのみを用いた場合よりジクロロメタン／アセトンの混合溶媒を用いてキトサンの微小凝集粒子化現象を誘導した際に、薬剤の封入量が増大されることが確認できた。しかしキトサンの場合は、ヒアルロン酸ナトリウムの場合とは違い、混合溶媒内のアセトン含量と薬剤の封入効率と比例関係はないことが確認された。
【００５６】
実験例2. 薬剤の試験管内放出実験
製造された高分子微粒子から親水性および疎水性薬剤が持続的に放出制御されるか確認するために、次の試験管内条件で薬剤放出実験を行った。即ち、製造された高分子微粒子100mgを正確に秤量してメンブレンチューブ(分子量カットオフ：3,500)に入れて両端を密封させた後、pH7.4のホスフェート緩衝溶液30mlが充填されている試験管に入れて蓋を閉め、37℃で分当り60回の速度の振盪型ウォーターバスに入れて少なくとも28日薬剤の徐放を可能にした。15mlずつ採取し、放出薬剤の濃度を実験例1のようにHPLC分析によって測定し、試験管に新しいホスフェート緩衝溶液15mlを添加した。
【００５７】
図2および図3は、それぞれポリ乳酸（図2）または乳酸-グリコール酸共重合体（図3）、および疎水性界面活性剤を含む有機溶媒中、ジクロロメタンとアセトンの混合比率に依存する薬剤の放出速度を示す。上記結果から混合溶媒内のアセトンの含量が増加する程、薬剤の初期放出が著しく減っていることが確認できた。アセトンを添加することにより高分子微粒子を製造する場合、薬剤がヒアルロン酸ナトリウム微小凝集粒子とポリ乳酸微粒子に二重に封入されているため、薬剤の初期放出が減少する傾向があることを意味する。即ち、混合溶媒内のアセトンの含量が増加する程、内部水相であるヒアルロン酸ナトリウム水溶液の脱水が増し、これにより微小凝集粒子の凝集力が増加され、このような凝集力が薬剤放出において一次的な調節因子の役割をする。
【００５８】
図4は高分子微粒子の製造において、低分子量の乳酸-グリコール酸共重合体（モル分率50：50）とポリエチレングリコールの混合比率に依存する薬剤の放出速度を示す。上記の結果からポリエチレングリコールの含量が増加する程、薬剤の放出速度が増加することが分かった。上記のように、ポリ乳酸とポリグリコール酸のモル分率が50：50の低分子量共重合体の場合、その物性が無定形のゴム状であるため、微粒子に封入された薬剤の主な放出経路である細孔および水チャネルの形成が阻害され、これにより薬剤の全体的な放出速度が遅くなる。従って、ポリエチレングリコールを薬剤放出調節物質として無定形高分子と混合する場合、細孔と水チャネル形成を容易にし、薬剤放出速度を調節するように、無定形高分子微粒子内部に結晶領域が形成される。
【００５９】
図5は、水溶性高分子としてキトサンを用いた場合、薬剤の初期放出速度の変化を示す。上記のようにキトサンを用いた場合(実施例3および実施例3-1)、ヒアルロン酸ナトリウムの場合とは異なり、混合溶媒内のアセトンの含量と薬剤の封入効率が比例関係ではないことが分かった。さらに、ジクロロメタンのみを用いた場合(比較例3)より、ジクロロメタン／アセトンの混合溶媒を用いてキトサンの微小凝集粒子化現象を誘導した場合、アセトンの含量増加に比例して薬剤の初期放出速度が減少したことが確認される。
【００６０】
図6は、粘度を有する内部水相の変更による薬剤の初期放出速度の変化を示す。上記のようにヒアルロン酸ナトリウム(実施例2)又はキトサン(実施例3)の微小凝集粒子化現象を誘導した場合に比べてゼラチン(比較例4)自体のゲル化による薬剤の初期バーストに対する抑制効果が殆どないことが確認される。即ち、ゼラチンのゲル化による薬剤の初期バーストの抑制効果は、蛋白質又はペプチド薬剤等の限定された場合にのみ生じ、アレンドロン酸ナトリウム等の低分子量薬剤の放出調節に有意な効果を示さず、その技術が汎用的ではないことが分かる。
【００６１】
製剤例1. 注射剤
注射溶媒は、注射用蒸留水に塩化ナトリウム、およびツィーン20を含むカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を用いた。注射部位の痛みを和らげるために塩化ナトリウムを添加し等張液とし、ミクロスフェアを効果的に懸濁させ、注射する間均一な懸濁液として維持させた。注射部位でミクロスフェア粒子が留まるようにするために、200〜400cps粘度を維持するために増粘剤としてカルボキシメチルセルロースナトリウムを用いた。注射溶媒は、滅菌して用いた。
【００６２】
下記の成分を注射剤の従来の方法により、1.0mlの容量のアンプルに充填し、滅菌し、注射剤を製造した。投与時、無菌条件下で製造された微粒子組成物50.0mgと下記の注射剤溶媒組成物を混合することによって投与することができる。
注射剤溶媒組成物
塩化ナトリウム                         9.0 mg
カルボキシメチルセルロースナトリウム  30.0mg
ツィーン 20                            1.0 mg
注射用蒸留水               1.0mlになるよう添加
【００６３】
産業上の利用可能性
本発明のW/O/W型多重乳剤方法により、1次乳剤の製造時に形成される水溶性高分子の微小凝集粒子内に薬剤を1次封入し、これをポリエステル高分子に2次封入することによって、2次乳剤化過程での薬剤の損失の最小化により、薬剤の封入量を向上させる。さらに、水溶性高分子およびポリエステル高分子に二重に封入されている薬剤は、初期バーストが最小限に抑制されることができ、これにより究極的に徐放的にかつ長期的に薬剤が放出される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図1aは、比較例1において製造された高分子微粒子の断面に対する電子顕微鏡写真である。図1bは、実施例1〜3により製造された高分子微粒子の断面に対する電子顕微鏡写真である。
【図２】ポリ乳酸と疎水性界面活性剤を含む有機溶媒中、ジクロロメタンとアセトンの混合比率依存するた薬剤の放出プロファイルを示したものである(比較例1：△、実施例1：●, 実施例1-1：▲, 実施例1-2：◆, 実施例1-3：■)。
【図３】乳酸-グリコール酸共重合体と疎水性界面活性剤を含む有機溶媒中のジクロロメタンとアセトンの混合比率に依存する薬剤の放出プロファイルを示したものである(比較例2：▲, 実施例2：●)。
【図４】乳酸-グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールの混合比率に依存する薬剤の放出プロファイルを示したものである(実施例2：◆, 実施例2-1：■, 実施例2-2：▲, 実施例2-3：●)。
【図５】水溶性高分子としてヒアルロン酸ナトリウムの代わりにキトサンを用いた場合、有機溶媒中のジクロロメタンとアセトンの混合比率に依存する薬剤の放出プロファイルを示したものである(比較例3：●, 実施例3：▲, 実施例3-1：■)。
【図６】様々な粘度を有する内部水相に依存する薬剤の放出プロファイルを示したものである(実施例2：■, 実施例3：▲, 比較例4：●)。
【図１ａ】
2006508959.tif 000003
【図１ｂ】
2006508959.tif 000004
【図２】
2006508959.tif 000005
【図３】
2006508959.tif 000006
【図４】
2006508959.tif 000007
【図５】
2006508959.tif 000008
【図６】
2006508959.tif 000009
【国際調査報告】
2006508959.tif 000010
2006508959.tif 000011