(57)【要約】本発明は抗ウィルス拮抗薬設計の標的としてのＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子の使用に関するものであり、また該分子を用いて設計した、抗ウィルス拮抗薬に関するものであり、特にＳＡＲＳコロナウィルス及びＡＩＤＳウィルスＨＩＶ―１に対する拮抗薬である。本発明の拮抗薬としては、抗体、ポリペプチド、免疫複合体、誘導体、低分子化合物及びその他が挙げられ、これらはＳＡＲＳコロナウィルス及びＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ−１）が宿主細胞に侵入することを防ぐことができて、それによって、拮抗的抗ウィルス効果を発揮する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験により、該拮抗薬がＳＡＲＳコロナウィルス及びＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ−１）に対し阻害効果を持つこと、従って、抗ウィルス候補薬の可能性を持つことを示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２に示すアミノ酸配列から成るＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子の、抗ウィルス医薬品を設計するための標的としての使用。
【請求項２】
前記ウィルスが、宿主にＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子受容体の標的系を通して侵入するウィルスである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ウィルスがＳＡＲＳウィルスである請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ウィルスがＨＩＶ―１である請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ウィルスのＨＡＢ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体拮抗薬であるウィルス拮抗薬であって、該拮抗薬がＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子に従って設計されたことを特徴とするウィルス拮抗薬。
【請求項６】
ＨＡｂ１８抗体、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対するポリペプチド拮抗薬、並びにＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対する、他の系列相関した抗体、ポリペプチド、免疫複合体、誘導体、及び低分子化合物から成る群から選択された請求項５に記載の拮抗薬。
【請求項７】
前記ペプチド拮抗薬が、Met Thr His Asp Pro Val lle Ser Leu Pro Thr Thr（配列番号３）、Leu His Arg His Ser His Gly His Ser Tyr Lys Ser（配列番号４）、Gly His Trp His Asn His Arg His Gln Ala Pro Leu（配列番号５）、Lys Tyr Pro His Gln His Leu His Met His Asp Ser（配列番号６）、Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gln His Ser（配列番号７）、Tyr Pro Phe His His Lys His Typ His Arg Pro Asn（配列番号８）、Ala Asn Ile Val Pro Ile His Ala Asn His Phe Gln（配列番号９）、Met His Lys His Pro His Gly Ser Gln Gly Pro Thr（配列番号１０）及びTyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro（配列番号ｌｌ）から成る群から選択されるＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７ペプチド拮抗薬である請求項６に記載の拮抗薬
【請求項８】
前記拮抗薬がＳＡＲＳウィルスに対するものである請求項５〜７のいずれか一項に記載の拮抗薬。
【請求項９】
前記拮抗薬がＨＩＶ−１に対するものである請求項５〜７のいずれか一項に記載の拮抗薬。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の拮抗薬及び適切な医薬用担体から成る医薬組成物。
【請求項１１】
前記拮抗薬が配列番号３〜１１のポリペプチドから選択された１又は２以上の拮抗薬である請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子を標的とするように設計された抗ウィルス薬剤に関し、より詳細には、ＳＡＲＳコロナウィルス及びＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ−１）に対する一連の拮抗薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、世界のおよそ３３カ国／地域において、重度の急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）が蔓延している。２００３年６月３日までに、世界で全８３９８人のＳＡＲＳ患者がいて、そのうち７７２人は死亡した。中国本土では、５３２９人のＳＡＲＳ患者が２５省で報告され、うち３３４人が死亡した。
ＳＡＲＳ病原体は、ＳＡＲＳコロナウィルスと呼ばれる新型コロナウィルスである。ＳＡＲＳの特徴としては、短距離での感染、広いひろがり、急速な始まり、及び急速な悪化が挙げられる。ＳＡＲＳ患者は主に熱、空咳、肺の硬化及び呼吸不全を示す。ウィルスの複製速度が速いこと及びウィルスが同定されてから間もないこともあり、現在のところ、ＳＡＲＳに適用できるワクチン又は特別な効果のある薬剤はない。今日、ＳＡＲＳの臨床治療として、以下の方法が適用されている：１．ノイラミニダーゼ阻害剤（オセルタミヴィル）、ヴィラゾール（リバヴィリン）及びサイモシン；２．グルココルチコイド（例、デキサメサゾン）；３．連続的加圧空気流；４．ＩｇＭ；５．漢方医薬など。しかしこれらはいずれも目立った効果はない。
【０００３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は中国政府がコントロールしようと努めている重要な疾患であり、公衆衛生に関する、世界的に緊急な問題であり、重要問題である。ＨＩＶ／ＡＩＤＳに関する国連合同プログラム及び世界保健機関（ＷＨＯ）は、世界ＡＩＤＳデー２００２年１２月１日にレポートを発行し、ＡＩＤＳは世界的に更に更に蔓延していることを示している。例えば、ＨＩＶ感染は１９９５年以前に１日当たり８，０００人であったのに対し、現在は１日あたり、１５，０００人である。過去２０年間に、世界のＨＩＶ保菌者は６０００万人にのぼり、そのうち、２０００万人が死亡した。２００２年には特に、３１０万人がＡＩＤＳで死亡した。更に、ＡＩＤＳの蔓延により、南アフリカのいくつかの国では平均寿命は６０〜７０才から４０〜５０才に低下した。これらの国における国内総生産量は１０％低下した。
今日まで、ＳＡＲＳに対するモノクローナル抗体、ポリペプチド、誘導体、免疫複合体、低分子化合物のような拮抗薬についての報告は無く、またＳＡＲＳ予防薬は用意されてない。ＡＩＤＳに利用可能な効果のある受容体拮抗薬のような薬剤も、逆転写酵素阻害剤以外には無い。従って、発生率と死亡率を低下させるために、抗ＳＡＲＳウィルス薬剤及び抗ＨＩＶ薬剤を開発することが重要で、緊急事項である。
【０００４】
本発明者は、長期の肝臓癌に対する免疫標的医学研究に基づいて、肝臓癌に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体を得て、ＨＡｂ１８と名付けた（非特許文献１）。このモノクローナル抗体をリガンドとして用いて、ヒト肝臓癌細胞株（ＨＨＣＣ）の粗抽出物の膜抗原をアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、精製した天然ＨＡｂ１８Ｇ抗原を得た。次に、このモノクローナル抗体を用いて、ヒト肝臓癌組織のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、この抗原をコードする塩基配列を得た。ＧｅｎＢａｎｋ検索により、この塩基配列は白血球分化抗原ＣＤ１４７と高い相同性を有すると同定でき、この分子はＣＤ１４７ファミリーの一員であると決定し、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７と命名した（非特許文献２）。基底膜侵入実験及びゼラチンザイモグラフィー分析により、発明者はＨＡｂ１８／ＣＤ１７４分子の腫瘍、炎症及びウィルス感染への効果は相関性があることを示した（非特許文献３〜６）。
【０００５】
【非特許文献１】Monoclonal Antibodies,1990;8(1):11
【非特許文献２】Cancer Research on Prevention and Treatment,2000;27(1):7-10
【非特許文献３】Chinese Journal of Clinical Hepalology.2002;18(1):55-56
【非特許文献４】Cancer Research on Prevention and Treatment,2001,28(4):262-263
【非特許文献５】Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2001.10(3):270-272
【非特許文献６】Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology.1999.15(1):30-34
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、更に驚いたことに、ＳＡＲＳウィルス及びＨＩＶ−１がＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体の標的システムを通して宿主に侵入することを見いだした。従って、本発明において、本発明者は抗ＳＡＲＳ薬剤及び抗ＨＩＶ−１薬剤の開発を試みた。その結果、ＳＡＲＳウィルス及びＨＩＶ−１に対してある程度の阻害効果を有する幾つかの拮抗薬を得ることができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面において、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子の、抗ウィルス医薬品、特に抗ＳＡＲＳウィルス医薬品及び抗ＨＩＶ―１医薬品を設計するための標的としての使用を提供する。このＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子のアミノ酸配列は配列番号１２に示される。
本発明の他の側面として、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体を標的とするＳＡＲＳコロナウィルス及びＨＩＶ−１の標的拮抗薬を提供する。これらの拮抗薬はＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子に基づいて設計される。本発明の拮抗薬としては、ＨＡｂ１８抗体、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対するペプチド拮抗薬、並びにＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対して系列相関する抗体、ポリペプチド、免疫複合体、誘導体及び低分子化合物が挙げられる。
本発明の一態様として、抗ＳＡＲＳウィルス薬剤及び抗ＨＩＶ−１薬剤は、ＨＡｂ１８抗体である。この抗体の軽鎖の可変域の遺伝子は配列番号１の配列からなり、この抗体の重鎖の可変域の遺伝子は配列番号２の配列から成る。
【０００８】
本発明の他の態様としては、抗ＳＡＲＳ薬剤及び抗ＨＩＶ−１薬剤は以下の一群のポリペプチドから選択されるＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７ペプチド拮抗薬である：
Met Thr His Asp Pro Val lle Ser Leu Pro Thr Thr（配列番号３）；
Leu His Arg His Ser His Gly His Ser Tyr Lys Ser（配列番号４）；
Gly His Trp His Asn His Arg His Gln Ala Pro Leu（配列番号５）；
Lys Tyr Pro His Gln His Leu His Met His Asp Ser（配列番号６）；
Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gln His Ser（配列番号７）；
Tyr Pro Phe His His Lys His Typ His Arg Pro Asn（配列番号８）；
Ala Asn Ile Val Pro Ile His Ala Asn His Phe Gln（配列番号９）；
Met His Lys His Pro His Gly Ser Gln Gly Pro Thr（配列番号１０）；及び
Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro（配列番号ｌｌ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）は、サイクロフィリンＡと複合体を形成することができるという事実、及びサイクロフィリンＡはウィルスが細胞膜受容体ＣＤ１４７に結合し、細胞内に入ることを促進するという事実に基づき、またＳＡＲＳコロナウィルスは、同様にサイクロフィリンＡ―ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７システムを通して宿主細胞に入り、増殖することを考慮し、本発明者は抗体及びペプチド拮抗薬の系列、即ちＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７を標的とする抗体、ポリペプチド、複合体、誘導体及び低分子化合物、を設計し、スクリーニングをし、合成した。これら別個の薬剤分子あるいはその前駆体は、標的部位、即ち感染過程でウィルスと結合する細胞表面受容体ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７の立体構造、を保護することにより、ＳＡＲＳコロナウィルス又はＡＩＤＳウィルスと拮抗する共通の性質を持っている。
【００１０】
本発明の拮抗薬及び抗体は、ＨＡｂ１８抗体、ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対するペプチド拮抗薬、又はＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対する系列相関した抗体、ポリペプチド、免疫複合体、誘導体及び低分子化合物を含むが、それによって制限されない。本発明の好ましい拮抗薬は配列番号３〜１１に示されたペプチドであり、これらのペプチドは夫々ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１からＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−９と命名される。ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７を標的とする、配列番号３〜１１と既に記載されている、９個の高親和性ペプチド拮抗薬の物理的及び化学的性質を以下の表１に示す。
【００１１】
【表１】
2006525946.tif 000002
【００１２】
本発明によれば、拮抗薬は、宿主上のウィルス受容体部位であるＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７分子を占有することで、ＳＡＲＳコロナウィルス、ＨＩＶ−１、又は同類の宿主細胞への侵入を妨げ、従って抗ウィルス効果を持つ。後記実施例のｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で、ＳＡＲＳコロナウィルス及びＨＩＶ−１に対するこれら拮抗薬の阻害効果を示す。他のＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対する相関する抗体、ポリペプチド、免疫複合体、誘導体及び低分子化合物は、同様に本発明に属する。
【００１３】
本発明に記載された拮抗薬は、適当な製剤担体と組み合わせて用いられ、従って、本発明の拮抗薬からなる医薬組成物もまた本発明に属する。本発明の医薬組成物は、粘膜経由、皮下、筋中、腹膜中、静脈中、動脈中あるいは局所的に投与される。
ヒト細胞へのＳＡＲＳコロナウィルス及びＡＩＤＳウィルスの感染と拮抗させるために、ＳＡＲＳコロナウィルス−ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体又はＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ−１）−ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体に対する、上述の抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の遺伝子を組み換えて、ある種の組み換え抗体（即ち、キメラ抗体、ヒト化した抗体、低分子抗体、多価ミクロ抗体、二重特異性抗体、他）、組み換え抗体の融合タンパク、抗体−タンパク免疫複合体又は誘導体を作ることができる。
【００１４】
ＳＡＲＳコロナウィルス及びＡＩＤＳウィルスのヒト細胞への感染と拮抗させるために、ＳＲＡＳコロナウィルス−ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体又はＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ−１）−ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７受容体に対する系列拮抗ペプチドを再構成して、ある種のポリペプチド及びその複合体を作り出すことができる、またこれらの系列拮抗ペプチドをある種のペプチド及びその誘導体に変えることができる、またまたこれらの系列拮抗ペプチドからある種の低分子化合物又は複合体を組み立てることができる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１（ペプチド拮抗薬の合成と抗体の取得）
１．ペプチド拮抗薬の合成
ペプチド合成器を用いた固相合成法を用いて、配列番号３〜１１のアミノ酸配列をもつ９個のペプチド（ＡＰ１〜９）を合成した。各産物の純度は、ＨＰＬＣ（Waters Corporation）による分析で、>９０％であった。分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメーター（Bruker Daltonics Inc.）により分析し、結果は理論値と矛盾しなかった。ペプチドの等電点（ｐＩ）、疎水度（ＧＲＡＶＹ）及びｉｎ  ｖｉｖｏ半減期はＥｘＰＡＳｙ生物情報ソフトウェアパッケージ（表１に示す）により予測した。
【００１６】
２．抗体の取得とＨＡｂ１８Ｇに対するモノクローナル抗体の可変域の遺伝子クローニング
発明者は、新鮮な腫瘍組織から作成した細胞懸濁物で動物を免疫化し、肝臓癌に対する７個の特異的モノクローナル抗体を得た。このモノクローナル抗体の確立については、Monoclonal Antibody Communication,1989;2:33-36に記載した。これらの抗体の中で、ＨＡｂ１８モノクローナル抗体が他の株と比べよりよい特異性を持ち、また免疫組織化学的染色において７５％の陽性率であった。ＨＡｂ１８Ｇは、National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products発行のThe Outline of Preparation of Mouse Monoclonal Antibodies Used in Human and Its Quality Controlの要求を満たしている。ＨＡｂ１８ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡをグアニジンチオシアネート法により抽出し、逆転写により第１鎖のｃＤＮＡを作成した。設計したユニバーサルＲＮＡプライマーセットを用い、肝臓癌モノクローナル抗体ＨＡｂ１８Ｇ軽鎖の可変域の遺伝子及び重鎖の可変域の遺伝子を首尾良く増幅した。次ぎに、目的とする断片をＴ−ベクターにクローン化した。塩基配列解析により、これらの配列は配列番号１及び２であることが分かった。
【００１７】
実施例２
この実施例において、実施例１で得た抗ＳＡＲＳコロナウィルスペプチド拮抗薬及び抗体の有効性を示す。
１．予備実験
１）ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の２９３細胞に対する細胞毒性の測定。
２９３ヒト胎児腎臓細胞株（中国科学アカデミーの細胞銀行から入手した。）を４００，０００／ｍｌの濃度に９６ウェルプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２下、２４時間インキュベートした。次にテスト用薬剤を加えた。テスト用薬剤ＨＡＢ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９を１０００μｇ／ｍｌから１．４５μｇ／ｍｌの連続希釈を行った。陽性対照薬剤のガンシクロヴィルは６０００μｇ／ｍｌから１１．７μｇ／ｍｌまでの連続希釈を行った。各薬剤濃度に対して、細胞を３ウェルに、各ウェル当たり１００μｌ播いた、また正常細胞を対照群としてセットアップした。細胞は５％ＣＯ２下で、３７℃、６日間インキュベートした。細胞変性効果（ＣＰＥ）を倒立顕微鏡で毎日観察した。２５％以下の細胞の形態変化を"＋"と定義し、２６〜５０％を"＋＋"と定義し、５１〜７５％を"＋＋＋"と定義し、７６〜１００％を"＋＋＋＋"と定義した。薬剤の半減毒性量（ＴＤ５０）及び無毒性量（ＴＤ０）はＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法で計算した。
【００１８】
２）２９３細胞の培養におけるＮｏ．０４コロナウィルスの病原性の測定
Ｎｏ．０４コロナウィルスの単離：
ＳＡＲＳ患者及びその血清はＢｅｉｊｉｎ  Ｙｏｕａｎ病院から得た。２９３細胞をチューブ中に４００，０００／ｍｌの濃度に蒔種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。その後、培地を廃棄し、ＳＡＲＳ患者の０．２ｍｌ血清を各チューブに加え、チューブを回転ドラムの上で、５〜７日間インキュベートした。ＣＰＥが表れた時、コロナウィルスはＰＣＲで検出した。Ｎｏ．０４の試料はＰＣＲで陽性の結果を示し、コロナウィルスの単離を確認した。端点希釈法によるウィルスの２回目の希釈のＰＣＲ結果はなお陽性を示した。ＳＡＲＳ患者の血清は免疫蛍光法による二重検定を行った。ＩｇＭ陽性結果及びＩｇＧ濃度の４倍上昇により、コロナウィルスの同定を確認した。ウィルス力価をウィルスＣＰＥ法で決定した。
【００１９】
ウィルスＣＰＥ法：
２９３細胞を９６ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの濃度に蒔種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。その後、ウィルス溶液を加えた。ウィルス溶液は１０−１から１０−８迄の連続希釈により８濃度とした。各濃度に付き３ウェル用いた。１ウェル当たり１００μｌ加え、正常細胞を対照としてセットアップした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、５〜７日間インキュベートした。細胞変性効果（ＣＰＥ）を毎日倒立顕微鏡で観察し、２５％以下の細胞の形態変化を"＋"と定義し、２６〜５０％を"＋＋"と定義し、５１〜７５％を"＋＋＋"と定義し、７６〜１００％を"＋＋＋＋"と定義した。ウィルスの組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）はＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法で計算した。
【００２０】
２．実験
２９３細胞培養におけるＮｏ．０４コロナウィルスに対するＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の阻害効果
本実験の目的は、２９３細胞培養において、Ｎｏ．０４コロナウィルスに対する様々な濃度のＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の阻害効果を観察することである。本実験では、半阻害濃度（ＩＣ５０），最小阻害濃度（ＭＩＣ）及び、有効性を定める薬剤の処理指標を計算するために、ウィルス感染細胞ＣＰＥ法を用いた。
２９３細胞を９６ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの濃度に蒔種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。細胞が単層を形成した時、培地を廃棄した。その後、コロナウィルスを１００ＴＣＩＤ５０含む溶液を加え、正常細胞を対照としてセットアップした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした。ウィルス溶液を廃棄し、様々な濃度のＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９を含む溶液を加えた。薬剤は、原液濃度が無毒性量（ＴＤ０）として、１：２希釈で１０濃度（即ち、１０００μｇ／ｍｌから１．４５μｇ／ｍｌ）とし、一方陽性対照のガンシクロヴィルは、１：２希釈で１０濃度（即ち、６０００μｇ／ｍｌから１１．７μｇ／ｍｌ）とした。希釈した薬剤をウェルに加え、１濃度に付き３ウェルとした。正常細胞とウィルス感染細胞を対照としてセットアップした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で、５〜７日間インキュベートした。細胞変性効果（ＣＰＥ）は倒立顕微鏡で毎日観察した。＋＋＋から＋＋＋＋形態変化細胞がウィルス感染細胞に表れた時、実験を終了した。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いて、薬剤の半阻害濃度（ＩＣ５０）及び最小阻害濃度（ＭＩＣ）、及び有効性を決める処理指数（ＴＩ）を計算した。実験は３重（トリプリケイト）で行った。
【００２１】
３．結果
１）予備実験の結果（２９３細胞に対するＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の細胞毒性）
上述の薬剤及び陽性対照ガンシクロヴィルを２９３細胞培養に適用した。無毒性量（ＴＤ０）及び半減毒性量（ＴＤ５０）をＣＰＥ法で計算した。下表に記載した結果は３重（トリプリケート）実験の平均である。
【００２２】
（i）２９３細胞に対するＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の細胞毒性テストの結果
【表２】
2006525946.tif 000003
（ii）２９３細胞培養におけるＮｏ．０４コロナウィルスの病原性（ＴＣＩＤ５０）測定結果
Ｎｏ．０４コロナウィルス：組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）は１０−３
【００２３】
２）実験結果
２９３細胞培養系におけるＮｏ．０４コロナウィルスに対するＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の阻害効果（表は３重（トリプリケート）実験の平均である）。
【表３】
2006525946.tif 000004
上記実施例は、ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９が、ウィルスＣＰＥ法により、２９３細胞培養系で、コロナウィルスの阻害を起こすことを示す。
【００２４】
実施例３
本実施例において、実施例１で得た抗ＨＩＶペプチド拮抗薬の効果を示す。
１．ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９のＭＴ−４細胞に対する細胞毒性の測定。
ＭＴ−４リンパ球（日本から入手した。）を９６ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの濃度に蒔種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。その後、試験薬剤を加えた。試験薬剤ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９は１２０００ｎｇ／ｍｌより２４ｎｇ／ｍｌ迄の連続希釈を行った。各濃度について細胞を３ウェルに蒔種した。１ウェル当たりの容積は１００μｌであり、正常細胞を対照としてセットアップした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下６日間インキュベートした。その後、細胞増殖をＭＴＴ法により測定した。
その結果、細胞増殖は影響を受けなかった、また薬剤ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９は副作用を持たなかった。
【００２５】
２．ＭＴ−４細胞培養におけるＨＩＶに対するＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の阻害効果
ＭＴ−４  細胞培養におけるＨＩＶに対する様々の濃度の薬剤ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９の阻害効果を測定するために、ウィルスＰ２４検定を用いた。
特に、ＭＴ−４細胞を９６ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの濃度に蒔種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。細胞単層が形成された時、培地を廃棄した。その後、ＨＩＶを１００ＴＩＣＤ５０含む溶液を加え、正常細胞及びウィルス感染細胞を対照としてセットアップした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした。ウィルス溶液を廃棄し、様々な濃度のＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１、ＡＰ−６及びＡＰ−９を含む溶液を加えた。薬剤は１：２希釈で８濃度（即ち１２０００ｎｇ／ｍｌ−２４ｎｇ／ｍｌ）とした。希釈した薬剤をウェルに加え、１濃度あたり３ウェル検定した。ウィルスタンパクＰ２４検定を行う前に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で５〜７日間インキュベートした。実験を３重（トリプリケート）で行った。
【００２６】
実験の結果を表４に示す。この結果によると、ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−９はＨＩＶ−１を阻害できるが、ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−１及びＡＰ−６はＭＴ細胞培養系でのＨＩＶ−１を阻害できなかった。
ウィルスＰ２４検定を用いた上記の実験は、ＨＡｂ１８Ｇ−ＡＰ−９はＨＩＶ−１を阻害できるが、ＨＡｂ−ＡＰ−１及びＡＰ−６はＭＴ細胞培養系でのＨＩＶ−１を阻害できなかったことを示す。
【表４】
2006525946.tif 000005
【配列表】
2006525946000001.app
【国際調査報告】
2006525946.tif 000006
2006525946.tif 000007
2006525946.tif 000008
2006525946.tif 000009