(57)【要約】インビトロでの家畜由来または霊長類由来のGV卵母細胞の核および細胞質での成熟の同期化のための方法は、ホスホジエステラーゼ3型阻害剤を卵母細胞の収集後の培地に添加して、その後に、前記ホスホジエステラーゼ3型阻害剤を除去して核成熟を進行することができるならば、改善することができる。
2006502717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、家畜由来または霊長類由来のGV卵母細胞の核および細胞質の成熟のインビトロでの同期化のための方法：
a.家畜由来もしくはヒト由来の1つもしくは複数のGV卵母細胞またはMI卵母細胞を、第1の培地中で培養することであって、前記培地は、PDE3INHを含み、前記培養は、細胞質の成熟を進行させるために、またはIVF／ICSI法の間に正常な作用時間を可能にするために十分な時間行うことと;
b.PDE3INHを除去するか、またはこれらの量を減少させるために、工程（a）の卵母細胞を洗浄することと;
c.第2の培地中において、工程（b）の洗浄した卵母細胞を、核成熟を所望の頻度に中期IIまで完了させるために十分な時間培養すること。
【請求項２】
ヒト卵母細胞が使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
第1の培地中で培養するために使用する卵母細胞が、PDE3INHを含むCO2非依存的な培地である卵母細胞収集培地中に貯蔵されている卵母細胞である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４】
卵母細胞が、前記卵母細胞を女性から除去した後に4時間よりも後、好ましくは2時間以下、さらに好ましくは1時間以下、およびさらに好ましくは1/2時間以下まで前記卵母細胞収集培地中に置かれている、前述の請求項に記載の方法。
【請求項５】
工程（a）に従った培養が、細胞質の成熟を改善させるために十分な時間行われる、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
工程（a）に従った培養が、細胞質の成熟を完了させるために十分な時間行われる、前述の請求項に記載の方法。
【請求項７】
工程（a）において培養される卵母細胞が、GV卵母細胞である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
第1の培地が、EGF、GH、性腺刺激ホルモンの組み合わせ、グルタチオン合成のプロモーター、減数分裂を活性化する化合物、アクチビンおよびインヒビンの組み合わせ、前述のものの類似体、または上述した化合物の組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
PDE3INHが、EP350,990の請求項1によって包含される化合物、好ましくはDDMPである、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（a）の培養時間が少なくとも約4時間である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
培養時間が少なくとも約8時間である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
培養時間が少なくとも約12時間である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
培養する時間が少なくとも約24時間である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
培養する時間が少なくとも約48時間である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
培養する時間が少なくとも約72時間である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（a）に使用する卵母細胞が、濾胞形成および／または卵形成のいずれかを生じさせることができる何らかのホルモンで処理する前に、動物／ヒト（循環する動物／ヒトまたは循環しないもの）から吸引された小胞から収集される、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
卵母細胞の起源となる女性のホルモン治療が、ステロイド、性腺刺激ホルモン、GnRH類似体、クエン酸クロミフェン、タモキシフェン、インスリン感作物質（たとえば、メトホルミン）、アロマターゼ阻害薬、または前述の薬物のいずれか単独もしくは組み合わせによって行われる、前述の請求項に記載の方法。
【請求項１８】
卵母細胞が、濾胞形成および／または卵形成に対して効果を生じる何らかのホルモンまたは薬物の処理後に動物から吸引された小胞から収集される、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
ホルモンまたは薬物療法が、性腺刺激ホルモン、GnRH類似体、クエン酸クロミフェン、タモキシフェン、LH、hCG、ステロイドまたはステロイド様物質、LHRH類似体、アロマターゼ阻害薬、インスリン増感剤、およびこれらのいずれかの類似体または組み合わせによって行われる、前述の請求項に記載の方法。
【請求項２０】
使用するホルモンが、hCG、LH、または同様の効果を誘導するであろう何らかの化合物である、前述の2つの請求項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（a）からの卵母細胞の洗浄は、第2の培地中のPDE3INHの洗浄後のPDE3INH濃度が、第1の培地中のPDE3INHの濃度の約10%未満、好ましくは約5%未満、より好ましくは約1%未満であるように行われる、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
第1の培地は、油相と水相の間の比率が、2：10（体積／体積）よりも少なく、より好ましくは1：10（体積／体積）よりも少なくなるように油の薄層によって最小限に被覆される、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
卵母細胞収集培地が油によって被覆されている、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（a）において、卵丘細胞が卵母細胞周辺にある、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（b）において、PDE3INHを除去するか、またはこれらの量を減少させるための工程（a）の卵母細胞の洗浄は、PDE3INHの残量が、あるとしても、卵母細胞の停止に対して実質的に効果を有さないように行われる、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（c）において、卵丘細胞が卵母細胞周辺に存在しないか、または実質的に存在しない、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（c）において、核成熟が、HCGおよび／またはEGFおよび／またはMAS化合物を第2の培地に添加することによって刺激される、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
工程（c）において、所望の頻度は、少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約50%、さらに好ましくは少なくとも約70%、および好ましくは少なくとも90%である、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
工程（c）の後に、卵母細胞が、好ましくはICSIを使用して精液で受胎されている、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
本明細書に記載されている特徴の何らかの新規の特徴または組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家畜由来または霊長類由来の胚胞（以下、GVと称する）卵母細胞の核および細胞質のインビトロでの成熟の同期化のための方法に関する。より詳しくは、本発明は、上記の請求項において定義される側面に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景  
減数分裂は、有性生殖に基づく生殖細胞の独特かつ究極的なイベントである。減数分裂には、2つの減数分裂を含む。第一の分裂の間には、染色体の一対が2つの娘細胞に分離される前に、母系と父系の遺伝子の間に交換が起こる。これらは、半数（1n）の染色体および2cDNAのみを含む。第二の減数分裂は、DNA合成を伴わずに進行する。従って、この分裂により、1cDNAのみを有する半数体の生殖細胞の形成を生じる。
【０００３】
減数分裂のイベントは、雌雄の生殖細胞で同じであるが、卵子に、および精子に至る時間スケジュールおよび分化プロセスは、非常に異なる。全ての雌の生殖細胞は、たいてい出生前の若い頃に第1減数分裂の前期に入るが、全てが春機発動期後の排卵まで、前期（網糸期状態）の後半の卵母細胞として停止される。したがって、若い頃から、雌は、卵母細胞のストックを有し、ストックが使い果たされるまで利用される。雌の減数分裂は、受精後まで完了されず、生殖細胞につき1つの卵子および2つの発育不全の極体のみを生じる。対照的に、いくつかの雄性生殖細胞のみが、春機発動期から減数分裂に入り、生涯にわたって生殖細胞の幹集団のままとなる。雄性細胞の減数分裂は、一旦開始されると、有意に遅れることなく進行し、4つの精子を産生する。
【０００４】
インビボでの濾胞増殖期の間の卵母細胞の発生は、黄体形成ホルモン（以下、LHと称する）が排卵前期に急増するまで、前期Iで長期間停止することによって特徴づけられる。この卵母細胞発生期の間に、RNAの合成および貯蔵、並びにタンパク質の翻訳に関連した細胞質内の変化を生じる。これらのプロセスは、卵母細胞の減数分裂、受精、およびその後の初期胚の発生を可能にするために必須である。卵母細胞が発生的に受容能力をもつのは、卵胞がその最大体積に達するときだけである。LHの上昇は、減数分裂の停止を解除し、卵母細胞は、最初の減数分裂を再開する。
【０００５】
哺乳類卵母細胞における前期Iの停止は、発生の異なった時間において異なる機構によって維持される。生長する卵母細胞は、初期の胞状濾胞までの始原的なものに囲まれており、前期Iで停止されて、機能が不十分なことを原因として胚胞崩壊（以下、GVBDと称する）する能力がない。この時点まで、卵母細胞は、減数分裂の進行のために必須の細胞周期調節分子を十分な量で合成しておらず、および／またはこれらの分子は、まだ卵母細胞内に正しく配置されない。対照的に、胞状濾胞および排卵前期濾胞に囲まれたGVBDコンピテントの卵母細胞における前期I停止は、体細胞との相互作用によって持続され、ギャップ結合を経て卵母細胞に対して適正レベルのcAMPを提供する。あるいは、体細胞コンパートメントは、阻止因子を卵母細胞へ移動させる。インビボで、性腺刺激ホルモンは、顆粒膜細胞に対する効果を経て間接的に卵成熟（主にcAMP経を経て媒介されるプロセス）を促進する。濾胞のcAMPの上昇は、LHの作用を媒介して卵成熟を誘導し、また卵母細胞内cAMPは、該プロセスを阻害する。この明らかな矛盾は、卵母細胞内cAMPレベルがホスホジエステラーゼの作用を介してその後に減少し、減数分裂の再開を生じるという事実によって説明することができる。減数分裂の再開は、ギャップ結合の妨害によって卵母細胞内のcAMPが低下することによって引き起こされることが示唆されていたが、GVBDは、これらの細胞間で何らかの検出可能なイオン性または代謝性のアンカップリングの前に生じるという証拠がある。その他にも、細胞内cAMPのレベルが減数分裂の再開の間に減退しないことが示されている。cAMPの減数分裂再開の役割に対しては、なおもいくつかの論議が存在するが、二次メッセンジャーcAMPが、種々の種において減数分裂停止での重要な役割を果たしているという概念は、広く受け入れられている。
【０００６】
高いcAMPを維持する化合物で培地を補うことにより、自然成熟を防止することができる。これは、いくつかの化合物：ジブチリルcAMPなどのcAMP類似体（以下、dbcAMPと称する）、アデニル酸シクラーゼ（フォルスコリン）を介してcAMP生産を刺激する薬物、および3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）などのcAMP分解アイソザイムのホスホジエステラーゼ（以下、PDEと称する）の阻害剤によって達成することができる。
【０００７】
哺乳類において、減数分裂の再開は、GVBDコンピテント卵母細胞がインビトロでこれらの卵胞から解放されるときに、自発的に生じる。しかし、自然のサイクルでは、LHは、排卵が生じる前に卵胞の卵成熟（GVBD）を誘導する。さらに、齧歯類では、洞性濾胞および排卵前期の卵胞において、約4mMのPDE阻害剤（ヒポキサンチン）が恒常的に存在することが既知である。ヒトでは、インビボでの自然のサイクルにおける排卵のときまで、優性の洞性濾胞は、約14日間成長し、約22mmの直径に達した。いくつかの研究では、種に特異的な最小の直径に到達していない卵胞から吸引した卵母細胞が、核成熟を受ける能力がないことを証明した。
【０００８】
いくつかのホスホジエステラーゼ（以下、PDEと称する）は、cAMPの分解の原因となり、その細胞内レベル減少に至る。PDEは、少なくとも11個の異なるファミリーが特徴づけられたタンパク質の大規模な群からなる。これらのファミリーの例は、タイプ3ホスホジエステラーゼ、およびタイプ4ホスホジエステラーゼ（以下、それぞれPDE3およびPDE4と称する）である。減数分裂の再開におけるcAMPの役割を理解するために、非選択的なPDE阻害剤を使用した。種々の特異的PDE阻害剤を用いてcAMP異化反応を抑制すると、これらの化学物質が減数分裂の抑止作用を示した。PDE4は、顆粒膜細胞において、主にcAMPの代謝に関与する。PDE3は、体細胞の細胞機能を妨害することなく卵母細胞に直接作用することを証明した。ラットにおいて、PDE3の発現は、卵母細胞に特異的であった。以下の記載は、Developmental Biology 178 （1996）, 393 et seq.: “In isolated oocytes, spontaneous GVBD was blocked by two inhibitors of type 3 PDE”の要約に見出すことができる。本刊行物から明らかなように、この記載は、ラットにあてはまる。J. Clin. Invest. 102 （1998）, 532 et seq.の要約では、「ホスホジエステラーゼ3の阻害剤を使用して、齧歯類の排卵する卵母細胞の減数分裂を遮断した。」ことが述べられている。このストラテジーによって、本発明者ら[すなわち、本論文の著者]は、受精および妊娠を防止できることを証明した。
【０００９】
上記から明らかなように、cAMPの情報伝達は、哺乳類および両生類の卵成熟の間の鍵となる因子である。哺乳類において、未成熟の胞状濾胞から除去した胚胞期（以下、GVと称する）の卵母細胞は、インビトロで自発的に減数分裂を再開するが、この過程は、インビボおよびインビトロで増大される卵母細胞内cAMPレベルを維持する特定の化合物によって遮断することができる。
【００１０】
本発明の1つの目的は、ヒト不妊性を治療することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、ヒト卵母細胞の成熟を改善することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、核、細胞質内、および／または膜の卵成熟の同調性を改善することである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、卵母細胞の生殖力を改善することである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、ヒトの体外成熟および受精によって卵母細胞の移植率を改善することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、染色体異常（異数性）をもつヒト・プレ胚（preembryo）の発病率を減少させることである。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、ヒト・プレ胚の卵割速度を改善することである。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、ヒト・プレ胚の質を改善することである。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、IVMのために細胞質内および核の成熟をより同調させるための方法を提供することである。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、IVM研究室で、1日の正常な労働時間内に操作することを可能にする方法を提供することである。
【００２０】
本発明の更なる目的は、卵母細胞の卵丘複合体（以下、OCCと称する）の収集の時間に非依存的なIVMを行うことによってIVMの実施の見通しを増大する方法を見いだすことである。（すなわち、収集時間は、減数分裂の進行およびその後の受精工程とは連関され得ない）。
【００２１】
定義  
MIは、中期Iである。EGFは、上皮細胞成長因子である。GHは、成長ホルモンである。IVMは、体外成熟である。IVFは、体外受精である。
【発明の開示】
【００２２】
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の説明  
驚くべきことに、PDE3INHs（これは、以下に定義してある）の阻害効果は、PDE3INHsを外へ洗い出すことによって逆転することができること、および減数分裂の正常な再開（減数分裂の進行の正常な時間枠および卵母細胞の細胞小器官の形態学的な側面）ができることが判明した。正常な子孫が、正常なIVFと同等の割合で生じることが証明された。
【００２４】
たとえば、第1の培地（これは、下記に定義してある）中で長期間の生体外培養期間と同時に核成熟の停止を誘導することによって、都合のよい結果が得られることが分かっている。細胞質の成熟が改善されたときに、第2の培地（これは、下記に定義してある）によって核成熟が促進される。
【００２５】
さらに、OCCをより小さな卵胞（＜約12mm）から回収することによって（これは、従来の処理（現在、別々の一連のSOP（すなわち、標準作業手順書）および時間予定表でIVMに使用されている）では、通常回収されないが、本発明を使用して回収することができる）、正常なIVF／ICSIの収率を増大することがでた。
【００２６】
驚くべきことに、PDE3INHを除去したときに、大部分の卵母細胞において正常な減数分裂が進行すると考えられる。たとえば、約8〜約12mmの直径を有する卵胞に由来する胚胞（GV）は、培養の間に正常なクロマチンの再造形を受ける（核小体または核球が囲まれる）。インビトロにおける長期間の前期停止により、細胞質の変化を生じるであろうが、明らかな核変化は生じない。
【００２７】
PDE3INHを使用することにより、卵母細胞経路、より詳しくは体細胞cAMP依存的な経路の上流の機構に対する妨害を回避することができる。卵母細胞内cAMPの増大により、I型アイソザイム・プロテインキナーゼA（以下、PKAと称する）の活性化、およびその後の、核成熟に対して抑制性の特異的なタンパク質のリン酸化）の増大を生じる。
【００２８】
上記したように、本発明は、上記の請求の範囲に記載のとおり、GV卵母細胞の核および細胞質の成熟のインビトロでの同期化のための方法に関する。本方法は、3工程の方法である。工程（a）と称される第1の工程では、卵母細胞を、とりわけ、PDE3INHおよび細胞質の成熟を促進する物質または共培養系を含む第1の培地中で培養する。工程（b）と称される第2の工程では、実質的にPDE3INHの一部または全体を卵母細胞から除去する。工程（c）と称される第3の工程では、これらを所望の頻度に中期IIまでの完了状態になるように、卵母細胞を第2の培地または共培養中で培養する。
【００２９】
好ましくは、工程（a）に使用する卵母細胞は、あまり小さくない卵胞から収集される。通常、小さな卵胞からの小さな卵母細胞は、より大きな卵胞からの卵母細胞よりも長く（工程（a）において）培養される。好ましくは、使用する卵母細胞は、その種の卵母細胞の完全に発達したサイズの、少なくとも約70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましいくは少なくとも約90%のサイズを有する。ヒトに対しては、約4mm〜約20mmの直径を有する卵胞、好ましくは約6mm〜約12mmの直径を有する卵胞を使用することが好ましい。
【００３０】
COCsは、インビボでLH活性に曝露する前後のサイクルの卵胞期の未成熟の胞状濾胞から回収することができる。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、工程（a）に使用される卵母細胞は、濾胞形成および／または卵形成のいずれかに作用し得るいずれかのホルモンを処理する前に動物／ヒト（サイクリングする動物／ヒトまたはしないもの）から吸引された卵胞から収集する。本発明のもう一つの好ましい態様において、卵母細胞の起源となる女性のホルモン治療は、ステロイド、性腺刺激ホルモン、GnRH類似体、クエン酸クロミフェン、タモキシフェン、インスリン感作物質（たとえば、メトホルミン）、アロマターゼ阻害薬、もしくは前述の薬物のいずれかを単独で、または組み合わせて行った。本発明のもう一つの好ましい態様において、卵母細胞は、濾胞形成および／または卵形成に対して効果を及ぼす何らかのホルモンまたは薬物療法の後に動物から吸引された卵胞から収集される。本発明のもう一つの好ましい態様において、ホルモンまたは薬物療法は、性腺刺激ホルモン、GnRH類似体、クエン酸クロミフェン、タモキシフェン、LH、HCG、ステロイドもしくはステロイド物質、LHRH類似体、アロマターゼ阻害薬、インスリン増感剤、およびこれらのいずれかの類似体または組み合わせによって行われる。本発明のもう一つの好ましい態様において、使用するホルモンは、hCG、LH、または同様の効果を誘導するかもしれない任意の化合物である。
【００３２】
卵母細胞を培養するために使用する培地は、必要な栄養成分を含む任意の培地であり、前記卵母細胞の培養において有害な影響を有する化合物の実質的な量を含まない。このような培地は、当業者に既知である。さらにまた、当業者は、温度、モル浸透圧濃度、湿度、時間などのうまく培養する状態に精通している。
【００３３】
都合のよいことには、第1の培地は、炭酸緩衝系（CO２インキュベーター内でのインキュベーションによって、約7.4のpH値にできる）を基礎として含み、約285mOsm/キログラム水のモル浸透圧濃度を有する。培養は、種に対して十分な温度（ヒトについては約37℃）で、約10%の湿度で行う。ヒト血清アルブミン（選択的に、遺伝子工学によって調製される）がタンパク源として添加されているいくつかの商業的に入手可能な定義された培地または組織培養培地を使用することができる。使用に適した培地の例は、とりわけインスリン（たとえば、1ng／ml）、トランスフェリン（たとえば、5マイクロgr/ml）、セレン（たとえば、5ng／ml）、0.1%のヒト血清アルブミン、ピルベート、たとえば23マイクロモル濃度、グルタミン、たとえば2mM、および／または17β-エストラジオール（以下、β-E2と称する）を補ったDMEMまたはTC-199である。
【００３４】
好ましい態様において、第1の培地中のPDE3INHの含量は、約0.1〜約100マイクロモルの範囲であり、もちろん、使用する特定のPDE3INHの能力によって変更することができる。
【００３５】
都合のよいことには、1つまたは複数の細胞質の促進因子を第1の培地に添加する。細胞質の促進因子の具体例は、EGF（ Fertil. Steril 55 （1991）, 1000-1004; and Zygote 5 （1995）, 345を参照）、GH（Reprod. Dev. 45 （1996）, 372-377を参照）、性腺刺激ホルモンの組み合わせ（Fertil. Steril. 52 （1989）, 319-324; and Mol. Reprod. Dev. 45 （1996）, 218-224を参照）、グルタチオン合成（Theriogenology 53 （2000）, 761-771を参照）、減数分裂活性化ステロール（Biol. Reprod. 58 （1998）, 1297-1302を参）、アクチビンおよびインヒビン（それぞれを単独で、または組み合わせて）（Biol. Reprod. 58 （1998）, 558-565; and Biol. Reprod. 56 （1997）, 1559-1564を参照）、前述の類似体、上述した化合物のいずれか単独で、または組み合わせである。
【００３６】
工程（a）において、卵母細胞は、都合よく培養容器においてインキュベートされ、都合よく培地の量と比較して最小の油の量で被覆される。
【００３７】
工程（a）において、卵母細胞は、進歩にしばらく細胞質の成熟が進行するために、またはIVF法の間に正常な作用時間が可能にするために十分な期間培養される。
【００３８】
時間が十分かどうかを判断する一つの方法は、その後の卵母細胞の受精および胚培養工程の結果を評価することである。その後の卵母細胞の受精工程の結果は、たとえば2つの細胞の数、核、細胞質内および／または膜の卵成熟の同調性、卵母細胞の生殖力、ヒト体外成熟および受精による卵母細胞の移植の割合、染色体異常（異数性）をもつヒト・プレ胚の発症率、ヒト・プレ胚の切断率、およびヒト・プレ胚の質により、いずれの当業者にでても判断することができる。受精の結果は、通常2つの細胞/精液が注入された卵母細胞のパーセントによってチェックされる。胚培養の結果は、割球（規則性または断片化）の形態、切断の時間間隔、胚盤胞の形態、および孵化能力によって判断される。
【００３９】
時間が細胞質の成熟が進行するために十分かどうかを判断するもう一つの方法は、卵丘細胞によって発現される選択マーカーの非存在または存在を評価（access）するために、確証された分子生物学的方法（カスタム・マイクロアレイ技術）を使用する。
【００４０】
本明細書において、PDE3INHsの用語は、PDE3を阻害することが可能な化合物に適用される。PDE3sは、2つのアイソフォームに存在する特異的な酵素である：心筋の平滑筋に、および卵母細胞にPDE3A、並びに細胞の脂肪分解およびグリコーゲン新生のホルモン制御において機能するPDE3B（J. Biol. Chem. 272 （1997）, 6823-6826を参照）。PDE3Aは、卵母細胞に存在し、減数分裂を調節するPDE3のアイソタイプである。タイプ3B（すなわちPDE3B）は、その他の細胞（脂肪細胞）に存在し、脂質分解および新生グリコーゲン生成を調節する。
【００４１】
cAMP特異的なホスホジエステラーゼ（=cAMPPDE：タイプ4）の最初のクローニングでは、哺乳類の少なくとも25個の異なるPDE形態の同定を伴った。ホスホジエステラーゼは、これらの速度論的性質、基質特異性、および調節に基づいて7つの異なったファミリー（タイプ）に分類された。分類は、Mol. Pharmacol. 46 （1994）, 399-405によって提案された。この発行物の表は、Endocr. Rev. 16 （1995）, 370-389に示してある。
【００４２】
ホスホジエステラーゼに対する詳細な情報は、Current Opinion in Cell Biol. 4 （1992）, 233-240）, Endocr. Rev. 16 （1995）, 370-389, J. Biol. Chem. 268 （1993）, 12925-12932, and Proc. Natl. Acad Sci. USA 97 （2000）, 12891-12895に見いだすことができる。
【００４３】
ヒトPDE3AおよびPDE3B遺伝子は、クローン化されており、これらの発現パターンを理解するために広範な研究が行われてきた（J. Biol. Chem. 272 （1997）, 6823-6826を参照）。
【００４４】
PDE3Bは、脂肪分解および新生グリコーゲン生成の調節において機能するが、PDE3A型は、心筋および平滑筋収縮の調節に関与している（J. Biol. Chem. 272 （1997）, 6823-6826を参照）。また、PDE3Aアイソフォームは、ラットおよびマウス卵母細胞に発現されている。
【００４５】
特異的な化合物がPDE3INHであるかどうかの決定は、PDE3に問題の化合物を添加して、PDE3が不活性化されるかどうかを決定することによって行うことができる。たとえば、PDE3が阻害される場合、卵母細胞のcAMPの濃度は上昇する。より詳細には、これは、たとえば試験化合物を添加した場合に、卵母細胞中のcAMPの濃度が上がるかどうかを決定することによって行うことができる。その場合、卵成熟は妨げられる（すなわち、減数分裂コンピテントな卵母細胞のGVブロックが維持される）が、体細胞に対しては効果がない（すなわち、cAMP依存的なステロイド増産の増大はない）。このような実験（すなわち、PDE4ではなく、PDE3の阻害剤が、特異的および用量依存的な減数分裂の自発的な成熟を遮断する能力を確認するためのもの）の例は、Human Reproduction 17 （2002）, 2019-2084に記載されていた。
【００４６】
特異的なPDE3INHsの例は、ミルリノン、シロスタミド（cilostamide）、フェノキシモン（fenoximone）、および欧州特許出願公開番号0350990（以下、EP350,990と称する）に述べられた一般式Iの化合物であり、たとえば4,5-ジヒドロ-6-（5,6-ジメトキシベンゾ[b]チエン-2-イル）-5-メチル-3（2H）-ピリダジノンまたは4,5-ジヒドロ-6-（5,6-ジメトキシベンゾ[b]チオフェン-2-イル）-5-メチル-3（2H）-ピリダジノン（以下、DDMPと称し（代わりにORG9935と称し））、および以下の式を有する：
【化１】
2006502717.tif 000003
第1の培地中のDDMPの濃度は、都合のよいことには約1μM〜約100μMの範囲である。
【００４７】
家畜の例は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒツジである。霊長類の例は、サルおよびヒト、好ましくはヒトである。
【００４８】
本発明の好ましい態様において、第1の培地中で培養するために使用する卵母細胞は、PDE3INHを含むCO2非依存的な培地である卵母細胞収集培地中に貯蔵された卵母細胞である。
【００４９】
本発明の好ましい態様において、卵母細胞は、前記卵母細胞が女性から除去された後、4時間以内に、好ましくは2時間以内に、より好ましくは1時間以内に、さらに好ましくは30分以内に前記卵母細胞収集培地に配置される。
【００５０】
本発明の好ましい態様において、工程（a）に従った培養は、細胞質成熟が改善されるのに十分な時間行われる。本発明のもう一つの好ましい態様において、工程（a）に従った培養は、細胞質の成熟が完了するのに十分な時間行われる。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、工程（a）において培養される卵母細胞は、GV卵母細胞である。
【００５２】
本発明の好ましい態様において、第1の培地は、EGF、GH、性腺刺激ホルモンの組み合わせ、グルタチオン合成のプロモーター、減数分裂を活性化する化合物、アクチビンおよびインヒビンの組み合わせ、前述の類似体、または上述した化合物の組み合わせを含む。
【００５３】
本発明の好ましい態様において、PDE3INHは、EP350,990の請求項1に包含される化合物、好ましくはDDMPである。
【００５４】
本発明の好ましい態様において、工程（a）の培養時間は、少なくとも約4時間、好ましくは少なくとも8時間、より好ましくは少なくとも約12時間、より好ましくは少なくとも約24時間、さらに好ましくは少なくとも約48時間、およびさらに好ましくは少なくとも約72時間である。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、第1の培地は、油性相および水相間の比率が2：10（体積／体積）未満、好ましくは1：10（体積／体積）未満であるように油の薄層によって最小限に被覆されている。本発明のもう一つの好ましい態様において、卵母細胞収集培地は、油によって被覆されている。
【００５６】
本発明の好ましい態様において、卵丘細胞は、工程（a）において使用する卵母細胞周辺にある。
【００５７】
都合のよいことには、第2の培地は、第1の培地（上記のものを参照）と同じ基礎成分を含み、これにはHCG、LH、またはMAS、これらの化合物の類似体の単独またはいずれかの組み合わせが添加されている。
【００５８】
本発明の好ましい態様において、工程（a）の卵母細胞は、存在するいずれのPDE3INHも卵母細胞の抑止に対して実質的な効果を有さないように、PDE3INHを除去するか、またはこれらの量を減少させるために洗浄される。
【００５９】
本発明の好ましい態様において、工程（a）から卵母細胞の洗浄は、第2の培地中のPDE3INHの洗浄後のPDE3INH濃度が、第1の培地中のPDE3INHの濃度の約10%未満、好ましくは約5%未満、より多好ましくは約1%未満であるように行われる。
【００６０】
第3の工程において、第2の培地中で培養した卵母細胞を油の量によって被覆することができる。
【００６１】
本発明の好ましい態様において、工程（c）の卵母細胞周辺に卵丘細胞がないか、または実質的にない。
【００６２】
本発明の好ましい態様において、核成熟は、HCGおよび／またはEGFおよび／またはMAS化合物を工程（c）の第2の培地に添加することによって刺激される。卵丘細胞周辺に卵母細胞が存在しない場合（長期間の培養後の大部分の時点で、卵丘は、卵母細胞を減少する）、HCGまたはEGFは、卵母細胞に対して作用することができない。しかし、MAS化合物は、このような場合にも作用することができる。
【００６３】
本発明の好ましい態様において、中期IIまでに核成熟が完了させるための工程（c）の所望の頻度は、少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約70%、および好ましくは少なくとも90%である。
【００６４】
本発明の好ましい態様において、工程（c）の後に、卵母細胞は、精液によって、好ましくはICSIを使用して受胎される。
【００６５】
本発明により、週末に、または夕方もしくは夜に働かずに操作することが可能になる。
【００６６】
第一極体の突出があるときに、核成熟は完了状態であった。これは、たとえば顕微鏡観察によって決定することができる。
【００６７】
中期IIは、第一極体が囲卵腔に存在する段階である。
【００６８】
本発明の好ましい態様において、工程（a）に使用する卵母細胞は、都合のよいことには、PDE3INHを含むCO2非依存的な培地である卵母細胞収集培地中に貯蔵された。たとえば、それは、HEPES緩衝化培地またはPhoSphate培地（たとえばLeibovits培地）であることができる。卵母細胞は、これらが卵胞から出てくるとすぐに、この卵母細胞収集培地中で貯蔵される。その理由は、さもなければ、卵母細胞が遠い場所（サテライト収集センターおよび現場、次いでIVF／ICSI研究室へ運搬される）で収集されるかもしれないからである。後者の場合、時間がすぎると、十分な卵成熟の阻害が示されないかもしれない。このような卵母細胞の収集培地の使用により、特にこれらが卵丘細胞から裸出されたタイプである場合に、卵母細胞が減数分裂の再開を開始するのが回避される。
【００６９】
本明細書における参照の言及は、これらが従来技術を構成することを認めるものではない。
【００７０】
本明細書において、「含む」の語は、広く「含む」、「含有する」、または「包含する」を意味するものと解釈される（たとえば、EPO指針C4.13を参照されたい）。
【００７１】
本明細書において言及した全ての論文は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００７２】
本発明は、以下の実験においてさらに例証されるが、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。
【００７３】
前述の明細書において、および以下において開示される特徴は、別々に、およびこれらのいずれかを組み合わせにて、本発明をこれらの多様な形態で理解するための材料である。
【実施例１】
【００７４】
材料および方法  
未成熟卵母細胞の収集  
この研究に関与する患者は、不妊治療を受けており、種々の用量の性腺刺激ホルモンでプライムされているが、血清ホルモンおよび膣の超音波モニタリングを使用して慎重にモニターしている（Human Reproduction 7 （1992）, 49以下参照）。種々の卵胞サイズからの卵母細胞卵丘複合体（COCs）の収集は、以下の通りに行った：1°）腹腔鏡手術の間、2°）子宮内の授精の前に卵胞減少を受けている刺激された卵巣患者から吸引したもの（複数の排卵による複数の妊娠を回避するために）（Albano et al、2001）、または3°）IVF治療が予定される大きな卵胞（＞15mm）を吸引した後に卵子を拾い上げる間（Human Reproduction 7 （1992）, 49以下参照）。基本的に、これらの吸引により、2つのタイプのCOCを得た：LH活性（プレhCG）にこれまで曝露されていない第1の群およびhCG（注入された）または内因性LH（自発的なLHピーク）に対する曝露の36h後の卵胞の第2の群。可能な場合、卵胞直径を膣の超音波測定によって記録した。この研究に使用するCOCsは、6〜14mmの間の直径を有する卵胞から回収した。
【００７５】
ヒト卵母細胞の吸引は、局所麻酔薬で子宮頚管傍浸潤の後に、単一の内腔針（Cook, K-OPS-1230-VUB, Switzerland AG）を使用する超音波ガイド経腟卵胞吸引によって行った。使用した吸引圧は、通常の成熟した卵母細胞の回収のための100mmHgから60mmHgに減少した。卵胞は、HEPES緩衝化アール培地を使用して少なくとも3回洗浄した。
【００７６】
卵丘卵母細胞複合体（COCs）の分類法  
COCsは、吸引の直後に、および24時間および48時間の培養後に評価し、以下の通りに分類した：タイプ（I）（顆粒膜細胞の3〜5層の緻密な集団）;タイプ（II）（顆粒膜細胞（卵丘）の広がった遠位の層であるが、緻密な近位の顆粒膜細胞層）;タイプ（III）（顆粒膜細胞の広がった遠位の層（卵丘）および近位の層（コロナ細胞））;およびタイプ（IV）、広がった顆粒膜細胞によって部分的に裸出された卵母細胞。
【００７７】
COCsの培養  
卵母細胞の回収時に、IまたはIIと分類されたCOCsのみを培養液中に置いた。
【００７８】
24時間後に、卵母細胞の段階を記録し、明白な極体の突出を示す卵母細胞を培養から除いた。48時間後に、全ての卵母細胞を評価し、GV、GVBD、および極体が突出されたものを記録した。
【００７９】
卵母細胞培養に使用する基本培地は、10mIU／mlのFSH（Gonal-F（登録商標）, kindly donated by Ares Serono, Geneva, Switzerland）、100ng／mlのIGF-I（R＆D, UK）、5ng／mlのインスリン、5ng／mlのセレン、5g/mlのトランスフェリン（Life technologies, Merelbeke, Belgium）、および0.1%のヒト血清アルブミン（CAF-DCF、Brussels、Belgium）を補った2mMのGlutamax-IおよびNaHCO3 （2g/L）を有するD-MEM（D-5280、LifeTechnologies、Merelbeke、Belgium）であった。17β-E2（Sigma、Bornem、Belgium）をエタノール中に希釈して、1μg/mlの終濃度に到達するように10μl以下の培地液滴に油を添加した（この濃度は、特異的な放射免疫アッセイを使用して測定した）。10μlの培地の微小液滴を2mlの油でおおった。5μlの条件培地の回復を24時間毎に行った。全ての培養は、空気中に5%のCO2でガスを供給したインキュベーター内の加湿された雰囲気において37℃で行った。
【００８０】
研究の模式図は、図1に示してある。
【００８１】
卵母細胞の阻害および減数分裂の逆転
DDMPを10μMの終濃度（0.1%のDMSO）で添加した。直接吸引した後、単一のCOCsを洗浄用培地（HEPESを有するD-最小必須培地）で洗浄し、油下の10μlの液滴に入れた。COCsは、2つの培養条件：DDMP有および無で無作為化した。DDMPと共に24時間、48時間、および72時間培養した卵母細胞で、阻害剤を洗浄することによる減数分裂停止の逆転について研究した。PDE3阻害の逆転を残りの体細胞の機械的な裸出によって行い、さらに24〜30時間条件培地中に卵母細胞を置いた。
【００８２】
電子顕微鏡法（以下に、EMと称する）のための卵母細胞の調製  
24時間および48時間の培養における評価の間に、DDMPを伴い、および伴わない卵母細胞の一部をEM解析のために固定した。
【００８３】
合計48個の卵母細胞（回収時の4個、培養の24時間後の21個、48時間後の20個、および72時間後の3個）を、0時間、24時間、および48時間の成熟時に、2.5%のグルタルアルデヒドのpH7.3のカコジラート緩衝液中で4℃において少なくとも2時間固定した。全ての卵母細胞を個々に封埋した。その後、これらを1%のOsO4のH2O溶液中に30分間添加し、2%の酢酸ウラニルのベロナール緩衝液中で60分間染色し、段階的にアルコールで脱水して、SPURRに包埋し（Taab; Bodson, Liege, Belgium）、70℃で一晩放置して重合させた。
【００８４】
0.5μmの半薄切片および75nmの超薄切片を約30レベル（15〜35の範囲）で作製した。半薄切片をガラススライドにマウントし、光顕微鏡の誘導のためにトルイジンブルーで染色した。超薄切片を広い単一スロットの銅格子（Agar Scientific LTD, Stansted, UK）上に移して、（ポリビニルホルマールフィルム（Formvar、Laborimpex、Brussels、Belgium）でおおい、クエン酸鉛で染色して、ツァイス透過型電子顕微鏡タイプEM9S2を使用して検査した。
【００８５】
共焦点レーザー顕微鏡のための卵母細胞の調製  
微小繊維の局在化については、39個の極体が突出した卵母細胞（対照培地中で48時間成熟後の25個の卵母細胞および阻害剤除去後の14個の卵母細胞）を2.5%のグルタルアルデヒドのカコジラート緩衝液中で少なくとも2時間固定し、PBS／1%のBSAで洗浄し、5分間0.1%のトリトンX-100に入れて、再びPBSでリンスした。その後、卵母細胞を、f-アクチンのために1：40にPBS希釈したf-アクチンを染色するテキサスレッドでラベルしたファロイジン中に、およびDNA染色のために1：2000にPBS希釈したおよびピコ・グリーン中に入れた。
【００８６】
統計解析  
卵胞治療、成熟の再開、GVBDの動態、および極体の突出に関連した培養中の卵丘の形態学的膨張の評価は、対称群とDDMP処理群の間を比較するための、χ2試験およびフィッシャーの完全試験を使用して解析した。P＜0.05ときに、統計的有意差があるとみなした。
【００８７】
結果  
種々の群の卵母細胞の回収率  
合計139個の卵胞をいずれかのhCGの投与前に30人の患者から吸引した。6〜12mmの間の卵胞（45.3%）では、80.9%の卵母細胞回収率を得た（患者あたりの卵母細胞の平均±SD：3.2±2.2;範囲1-9）。12mmよりも大きな吸引された卵胞（54.7%）では、35.5%の卵母細胞回収率を得た（患者あたりの卵母細胞の平均±SD：1.7±0.9;範囲1-4）。
【００８８】
6〜12mmの間の合計128個の卵胞をhCG投与の36時間後に27人の患者から吸引した。これらは、50.0%の卵母細胞回復を得た（患者あたりの卵母細胞の平均±SD：2.4±1.5;範囲1-6）。13〜15mmの間の合計54個の卵胞を卵胞吸引の1日前に内因性LHピークをもつ9人の患者から吸引した。これらでは、37.0%の卵母細胞回復を得た（患者あたりの卵母細胞の平均±SD：2.2±0.8;範囲2-4）。
【００８９】
COCSの形態学的性質  
検索時および対照の培養の間の卵丘細胞膨張（図2）  
hCG投与前に回収したCOC  
回収時、緻密な卵丘形態（I型）を有するかなりの割合（83.8%）のCOCsがあった。24時間後に、対照では、タイプIのCOCsの比率は、10.8%に減少した。この時に、51.4%および29.7%のCOCsがそれぞれタイプIIおよびタイプIIIとして分類された。48時間の培養時に40%の卵母細胞では、卵丘細胞とこれらの結合がなくなった（タイプIV）。
【００９０】
hCG投与後に回収したCOC  
この群は、hCGを36時間投与した患者（通常のIVF／ICSI法）、および内因性LHサージを有した患者を含む。hCG後の患者から回収したCOCsは、hCG前の患者と比較して、有意に低い比率のタイプI型COCsを示した（45.0%）（p＜0.01）。24時間後に、ほとんどすべてのCOCsは、広がった卵丘（42.5%のタイプIIおよび35.0%のタイプIII）を示し、20.0%は、細胞-卵母細胞の結合がすでになくなっていた。最後に48時間の培養では、hCG前の群から培養したものと比較して、有意に高い比率の卵母細胞が、細胞とこれらの結合がなくなっていた（66.7%）（p＜0.05）。
【００９１】
DDMPの存在下における卵丘細胞の膨張（図3）  
プレhCG投与から回収したCOC  
プレhCG患者から回収したCOCでは、74.4%がタイプIに分類された。24時間後に、タイプIの比率は、25.6%に減少した。この時に、56.4%および15.4%のCOCsが、それぞれタイプIIおよびIIIに分類された。最後に、48時間の培養において、22.2%の卵母細胞では、卵丘細胞とこれらの結合がなくなった。
【００９２】
hCG投与後に回収したCOC  
hCG後の患者から回収したタイプIのCOCsの比率は、プレhCG患者から回収したものと比較して有意に低かった（48.8%）（p＜0.05）。24時間後には、hCG後の卵丘の4.7%のみがタイプIのままであった。これは、hCG前の卵丘よりも有意に低い比率を構成する（p＜0.05）。57.1%のタイプIIおよび30.9%のタイプIII卵丘があった（前hCGと有意差があるとは言えない）。24時間後に、プレhCG群の卵母細胞で同様の比率が、卵丘細胞（7.1%）との結合がなくなった。最後に、48時間の培養において、62.1%の卵母細胞では、体細胞との結合がなくなり、これは、プレhCG群から回収したCOCsよりも高い（p＜0.05）。
【００９３】
培養の前と間のCOCの膨張および粘液分泌期パターンは、培地中にPDE3が存在することによっては修飾されなかった。
【００９４】
培養におけるDDMPの存在：核成熟の時限解析  
24時間の培養での評価  
hCG投与前に回収したCOC（図4）  
GV段階の合計39のCOCsをDDMPの存在下で、および37のCOCsを伴わずに培養した（=対照）。24時間の培養後、培地にDDMPが存在するときには、全ての卵母細胞が、GV段階のままであり、対照培地の24.3%のみとは対照的であった（p＜0.001）。対照では、4つの卵母細胞（10.8%）が極体の突出を有した。かなりの卵母細胞（64.9%）は、明白な囲卵腔内の極体の存在を示さなかった（図において図示せず）。
【００９５】
hCG投与後に回収したCOCs（図5）  
合計42の未成熟のCOCsをDDMPの存在下において、および40のCOCsを対照下で培養した。外因性（hCG）および内因性（自然発生的な）のLHピークのものから回収したCOCsは、同じ表および図にグループ化した。24時間の培養後、92.9%の卵母細胞は、DDMP培地中でGV段階のままであったが、対照では22.5%だけであった（p＜0.001）。DDMPにもかかわらずGV段階で停止をしなかったこれらの卵母細胞のうち、2.4%のみが目に見える極体（PB）を突出した（グラフに図示せず）。対照では、10.0%が極体（PB）を突出した。核を視覚化して、PBの存在下で確認することが不可能であった卵母細胞の比率は、対照において67.5%であった。
【００９６】
48時間の培養での評価  
hCG投与後に回収したCOCs（図4）  
核段階が明らかに視覚化されなかったCOCsを機械的に裸出させた。EM解析のために固定したものは、これらが成熟段階を有したことをその後に決定した（半薄切片上で）。DDMPの存在下で培養した卵母細胞は、対照の19.3%のみとは対照的に、88.9%がGV段階の間のまであった（p<0.001）。DDMPの存在下において、5.5%の卵母細胞のみがGVBDであり、2.8%は、PBであり、および2.8%では、段階を決定することができなかった。対照では、12.9%がGVBDであり、有意に多くの卵母細胞（64.5%）が突出したPBを有し（p<0.001）、3.2%は決定できる段階がなかった。記録された卵胞直径と培養後の突出した卵母細胞の極体の数との関係を表2に示してある。
【００９７】
表2。対照培地でのインビトロ培養において、24または48時間後に正常な極体突出達する卵母細胞の数。データは、回収時の卵胞サイズおよびhCGによる処理の有無によって分類した。
【表２】
2006502717.tif 000004
hCG投与後に回収したCOCs（図5）  
DDMPの存在下で培養したCOCsは、対照（6.0%）と比較して有意に多くの比率（83.3%）でGV段階の卵母細胞を示した（p＜0.001）。DDMPでは、8.3%の卵母細胞がGVBDであり、5.6%のみがPBであり、および2.8%は段階が決定されなかった。対照では、12.1%がGVBDであり、有意に多くの比率（81.8%）の卵母細胞が突出したPBを有した（p＜0.001）。極体が突出した卵母細胞と卵胞直径との関係を表2に示してある。また、hCG後の患者（51.2%）からの回収時にタイプIIとして分類されたCOCsでは、これらの77.6%が、48時間の培養の間にGV段階に停止したままであり得ることが観察された（卵丘タイピング-核進行の関連から）。これは、阻害剤が卵母細胞回収時よりも広がった卵丘形態を有する卵母細胞に対してさえも有効であったことを示す。
【００９８】
72時間の培養時の評価  
DDMPの存在下で72時間後に、hCG前の患者からの19のうちの16の卵母細胞（84.2%）およびhCG後の患者からの15のうちの10（66.6%）は、なおもGV段階で停止していた。
【００９９】
48または72時間の停止後の可逆性  
DDMP中で48時間の培養後、合計22のGV段階の卵母細胞を卵丘細胞から機械的に裸出させた。阻害剤を洗い流し（hCG前の群から11およびhCG後の群から11）、卵母細胞を対照培地中でさらに24〜30時間培養した。hCG前の患者群では、4つがGVBDに進行したが、これらのうちの1つは、この段階で停止し、3つは24〜30時間で極体を突出した。hCG後の患者群では、11の卵母細胞が、GVBDに進行したが、5つがこの段階で停止し、6つが極体を突出した（表3）。
【０１００】
表3．成熟培地からDDMPを除去して24〜30時間後に観察される減数分裂の進行（GV、GVBD、PB）の種々の段階での卵母細胞数。データは、DDMPを補った培地中での培養期間によって、および患者治療（hCG）のタイプによってグループ化した。
【表３】
2006502717.tif 000005
aおよびbは、フィッシャー完全試験による有意差を意味する（p＜0.01）。  
cおよびdは、χ2試験による有意差を意味する（p＜0.05）。
【０１０１】
DDMPの存在下において72時間後に、hCG前の患者からの13の卵母細胞およびhCG後の患者からの10の卵母細胞を裸出させて、阻害剤を洗い流した。条件培地中で24時間〜30時間の培養後、hCG前の患者群では、7つがGVBDに進行したが、1つはこの段階に停止して、5つがPBを突出した。hCG後の患者群では、10の卵母細胞が、阻害剤除去の24〜30時間後にPB突出に達し（表3）、これは、hCG前の群と比較して有意に高かった（p＜0.05）。また、hCG後の群から阻害剤を除去した後にPB突出を有する卵母細胞の比率は、卵母細胞をDDMP培養で72時間培養したときに、48時間と比較して有意に高かった（p＜0.05）。
【０１０２】
光および電子顕微鏡法  
核および細胞質組織に対するPDE3阻害の効果を解析するために、DDMPによって停止されたか、またはされていない卵母細胞において、超微細構造的な観察を種々の培養時間で行った。解析した卵母細胞は、8〜12mmの間の直径を有する卵胞に由来した。EMによって解析した卵母細胞の数および状態は、表1に一覧を示してある。
【０１０３】
表1。回収時および培養の24、48および72時間後における種々の成熟段階（GV、GVBD、PB）でEMによって解析した卵母細胞の数。解析した卵母細胞は、患者の治療および培養条件のタイプによってグループ化してある。
【表１】
2006502717.tif 000006
回収時−0時間での卵母細胞の形態  
半薄および超薄切片により、これらの卵母細胞のGVが中央に位置する（3つの卵母細胞）か、または原形質膜（1つの卵母細胞）の近くにあることが明らかとなった。核は、核小体周辺のクロマチン間の顆粒状複合体および外核小体クロマトイド小体と結合した1つの密度の高いコンパクトな核小体を含む、2つの膜の層によって形成されるエンベロープからなっていた（Sathananthan、1985）。核小体は、規則正しく円形または卵型に均質に成形され、原繊維の顆粒によって形成される。解析した全ての卵母細胞において、核小体に結合した染色質の形成は、通常は8mm以上の胞状濾胞から得られる卵母細胞に存在する連続的な集団（核球）として観察された（Tesariketal、1983）。核球は、囲まれた核小体（SN）とも呼ばれ、核内において偏心性の位置を占め、核小体に接触してゆるくパックされた原繊維（fibrills）からなる（図6b）。核球の存在は、卵母細胞内の核の位置とは独立している（1つの卵母細胞のみにおいて、核が末梢にあった）。
【０１０４】
細胞質の組織のレベルでは、回収時に解析した全ての卵母細胞の特徴は、皮質および中間細胞質において細胞小器官を欠いた領域が存在した。トコンドリア凝集塊が細胞質の全体にわたって分布されていることが見いだされた（図6a、c）。ミトコンドリアのGV凝集体の周囲では、種々の直径の小胞が入り混ざっていた。表層粒が細胞質の全体にわたって分散しているのが見いだされ、少数しか卵母細胞の卵細胞膜（oolemma）下に単層を形成することが観察されなかった。
【０１０５】
微絨毛は、透明帯（ZP）の内側皮質を通って原形質膜から延長しているのに気がついた。多数の細胞突起が卵細胞膜に対して透明帯を貫通した。顆粒膜細胞（GC）は、ZPと並べて配置された卵型または円形の細胞として現れ、ZPを横断して卵細胞膜に達する多くの細胞突起を伴う。細胞は、コンパクトな配置を示し、ギャップ結合に似た密接に並んで配置された原形質膜によって、互いにしっかりと付着されていた（図6d）。細胞の核は、偏心性に位置している。COCの顆粒膜細胞は、核濃縮の徴候を示さなかった。
【０１０６】
阻害剤を伴わずに24時間培養した後のCOCsの形態  
対照培地中で培養した卵母細胞の電子顕微鏡観察解析では、インビトロでの成熟がミトコンドリアおよび滑面小胞体（SER）の再編成に関与しており、細胞質内に円形の小胞として現れることを示す。この再編成は、hCG刺激の前または後に回収した卵母細胞において差異はなかった。ミトコンドリアは、球形または卵形であり、細胞質の全体にわたって、またはSERの凝集体周辺に分散している。これらの凝集体は、成熟ヒト卵母細胞の周辺ミトコンドリアと特徴的な複合体を形成し（Ann. NY Acad Sci. 442 （1986）, 251以下参照、および Prog. Clin. Biol. Res. 296 （1989）, 273以下参照を参照）、および主にPB突出したものに存在した。
【０１０７】
表層粒（CG）は、GVBD卵母細胞の表面上に不連続な分布を示し、PBを突出した卵母細胞の皮質の1〜2層に現れた。
【０１０８】
対照培地中で24時間後にGV段階のままであった卵母細胞は、回収時に固定して解析したGVと同じタイプの核（核球の存在と共に）および細胞小器官分布を有した（図7b）。
【０１０９】
24時間の培養後、卵丘細胞はさらに伸長し、透明帯から後退し、部分的に卵母細胞から離れた。細胞の核は、伸長の反対側で細胞の周辺に移動した（図7a、c）。
【０１１０】
阻害剤と共に24時間の培養後のCOCの形態  
卵母細胞のGVは中央に位置し、全ての卵母細胞の核小体周辺に核球の存在を伴った。全ての卵母細胞の核膜は、完全なままであった（図8b）。
【０１１１】
全ての卵母細胞は、回収時に固定したものと同様の未成熟の細胞質の徴候を示した。主に、ミトコンドリアは、細胞質の全体にわたって凝集塊中に分布されていることが見いだされた（図8c）。GVの周囲では、ミトコンドリアの凝集体には、種々の直径の小胞が入り混ざっていた。少数の表層粒が細胞質の全体にわたって分散し、卵母細胞の卵細胞膜（oolemma）下に単層を形成することが見いだされなかった。単一のGV段階の卵母細胞（9mmのポストhCG卵胞吸引から回収された）には、核内に核球が存在することはなく、細胞質内の細胞小器官は、より均一な分布であった。解析したGVBD卵母細胞の細胞質は、細胞小器官の分布の阻害を示し、GV段階の卵母細胞の細胞質に凝集した。PB突出を受けた卵母細胞は、対照と同じ細胞質内の形態を有した。
【０１１２】
卵丘細胞は、拡大して卵母細胞とゆるく接触し始めた。卵丘細胞は、これらの伸長を始めたが、いくつかの細胞は、なおも円形または卵形であった。これらの細胞の核は、まだ末梢に移動していなかった（図8a）。
【０１１３】
阻害剤を伴わずに48時間の培養後のCOCの形態
対照中で48時間培養後に解析したPBが突出した卵母細胞は、卵細胞膜に対して垂直に減数分裂スピンドルを形成した（図9a）。細胞小器官、ミトコンドリア、およびSERは、小胞として、または筒状エレメントの凝集体として卵細胞質の全体にわたって広がった。CGは、卵細胞膜下に1〜3層を形成し、1つの成熟した卵母細胞（hCG前）では、多数のCGが、減数分裂スピンドルの場所で卵細胞膜下に凝集した。いくつかの腫大したSER小胞が、おそらく卵母細胞の老化の徴候として観察された（Sathananthan、1982）（図9b）。全ての卵母細胞において、わずかなCGを細胞質の全体にわたって観察することができる。小胞化の増加は、これらの卵母細胞のいずれにおいても観察されなかった。
【０１１４】
大部分の卵母細胞は、これらを取り囲む細胞をよく分散させたか、または、完全に帯（zona）から分離し、トランス帯状のプロセスが卵丘細胞からZPに現れた。
【０１１５】
阻害剤を伴って48時間および72時間の培養後のCOCの形態  
阻害剤の存在下において48時間および72時間の培養後に固定して、解析したGV段階の卵母細胞は、中央に位置する核を示し、ほとんどすべての卵母細胞の核小体周辺に核球が存在した（図10a）。48時間の1つのGV段階の卵母細胞（1つの8mmのhCG前の卵胞の吸引から回収した）は、核内に核球が存在せず、より均一な細胞質内の細胞小器官の分布であった。全ての卵母細胞の核膜は、完全なままであった。細胞小器官は、なおも凝集性であったが、いくつかの卵母細胞では、ミトコンドリアがこれらの凝集体から分離し始めた。わずかな表層粒が、細胞質の全体にわたって分散し、卵母細胞の卵細胞膜下に単層を形成することが見いだされた（図10b）。卵丘細胞は、完全にZPを介したトランス帯状でないプロセスで帯からさらに分散し、または分離した。成熟を受けた卵母細胞（GVBDおよびPB）は、対照と同じ細胞質内の形態を有した。
【０１１６】
72時間後に、卵母細胞は、SERの膨張によって生じる卵細胞質内の液胞化の徴候を示した（図11a、b）。微絨毛は、あまり明らかではなく、帯は、卵丘細胞からトランス帯状のプロセスを伴わずにより均一であり、卵母細胞（図11b）との結合の完全な減少を示す。
【０１１７】
微小繊維および染色体分析のための共焦点のレーザー顕微鏡観察  
対照培地中で48時間培養後に染色した合計20の卵母細胞（8つのhCG前のうちの7つ;および17のhCG後のうちの13）は、中期II（MII）プレートを示し、その80.0%は、適切に整列された染色体を有し卵細胞膜に対して垂直に配置された。1つの卵母細胞は、MIIプレートから移行した染色体を示した（図12）。4つの卵母細胞が、おそらく老化の徴候として、中期プレートの場所で染色体の凝集塊を形成する核を有した。微小繊維は、一般的なパターンとして記載されている第一極体の突出部位の近くの光学切片においてより顕著な染色を有する走査されるレベルの卵母細胞において観察された （Terada et al, 1995）。極体突出の部位では、アクチンと重なる微小繊維が観察されず、このレベルで均質な染色を示した。
【０１１８】
12の卵母細胞は、阻害剤除去の24〜30時間後にMIIプレートを示し（3つのhCG前のうちの3つおよび11のhCG後のうちの9つ）、その中の83.3%は、適切に整列された染色体を有し卵細胞膜に対して垂直に配置された（図13）。2つの卵母細胞は、中期プレートの場所で染色体の凝集塊を形成する核を有した。また、微小繊維の一般的な側面をこれらの卵母細胞において観察し、極体の突出部位レベルで均質な顕著な染色を有した（図13）。
【０１１９】
上記のデータからの結論  
DDMPの使用により、PDE3は、ヒト卵成熟の調節に有意に関与していることが証明された。10μMの用量のDDMPの使用により、少なくとも48時間の培養の間に、胞状濾胞から抽出したCOCsにおいて、超微細構造的な卵母細胞の変性の形態学的な徴候を伴わずに、インビトロでの減数分裂の再開が一貫して妨害された。核停止は、72時間の培養まで保持することができる。阻害剤の除去後、停止した卵母細胞は、正常な期間内に減数分裂を再開することができた。
【０１２０】
本発明者らは、選択的なDDMPを使用することにより、GVの減数分裂の停止を少なくとも48時間効率的に維持することができることを経験して知った。また、この無血清培地において、卵丘細胞は、24時間後に卵母細胞に対してゆるく結合し始めることが観察された。hCGの前処理の後に収集した卵母細胞では、結合の破壊がより迅速に生じ、トランス帯のプロセスを最大で約48時間の期間だけ維持することができる。DDMP自体は、この体細胞と卵母細胞との間の結合の進行性の減少に対して影響を有さなかった。これは、核成熟を停止させるために体細胞依存的なcAMP生成の必要を回避して、卵母細胞内のPDE3Aを経て卵母細胞cAMP代謝に直接作用する選択的な阻害剤を使用することの利点を強調する。
【０１２１】
卵母細胞内のcAMP分解を遮断するために選択的なDDMPを使用すると、72時間の間、GV卵母細胞の核停滞の正常な形態学的な徴候を生じた。核膜は、無傷で開かれたままであり、周囲の核クロマチン配置（SNまたは核球）は、停止の間持続し、胚胞は、多くの場合中心に位置した。核球形成は、排卵のために調製される卵母細胞核の状態を反映し、転写プロセスの消衰を伴うことが報告されている。核球は、これらがなおもコンパクトな卵丘細胞集団によって囲まれているときに、卵母細胞の核において検出可能であった。卵母細胞でのいくつかのトランス帯状のプロセスは、不均一な帯と共に観察され、微絨毛は、なおも存在し、かつ豊富であった。
【０１２２】
本発明者らのインビトロ成熟培地内のDDMPによる核停止の延長は、GV段階の卵母細胞の細胞小器官の遊走に影響を及ぼすようであった。細胞小器官は、GVが完全な卵母細胞においてさえ、DDMP培養の48時間後に凝集体から分離し始める。DDMPで停止された卵母細胞では、表層粒が特徴単層を形成し、その一方で、対照的に、対照では、これらの表層粒が凝集したままであった。
【０１２３】
卵母細胞に対するDDMPの使用に関する安全性の研究を齧歯類で行い;阻害効果は、単離した卵母細胞において完全に可逆的であることが確認された。48または72時間のヒト卵母細胞の薬理学的な停止の後、減数分裂のサイクルは、DDMPを洗浄することによって再会させることができる。卵胞処理前の状態（HCG刺激単独で、または高移動度タンパク質刺激と組み合わせて）に応じて、46%〜100%の卵母細胞は、通常染色体分離の忠実度で中期IIプレートの形成を伴った減数分裂を介して進行することができる。
【実施例２】
【０１２４】
特異的な化合物がPDE3INHであるかどうかの評価は、たとえば以下の試験を使用して行うことができる：
このような実験の（すなわち、減数分裂の自然成熟を遮断するための阻害剤の、PDE4ではなくPDE3の特異性および用量依存的な能力を証明するための）例は、Human Reproduction 17 （2002）, 2019-2084.によって記載されたものを参照されたい。
【実施例３】
【０１２５】
本明細書において、MAS化合物の用語は、卵母細胞の減数分裂を媒介する化合物を示す。より詳細には、MAS化合物は、この実施例の下記に記載されている試験において、対照よりも有意に高い割合の胚胞崩壊（以下、GVBと称する）を有する化合物である。好ましいMAS化合物は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%の割合のGVBを有するようなものである。
【０１２６】
MAS化合物の例は、WO96/00235、96/27658、97/00884、98/28323、98/54965、および98/55498に、より詳細にはこれらの請求項1において言及されている。
【０１２７】
特異的な化合物がMAS化合物であるかどうかの評価は、たとえば以下の試験を使用して行うことができる：
卵母細胞は、制御された温度（20〜22℃）、光（06.00-18.00の光）および相対湿度（50〜70%の）下で保たれた13〜16グラムの重さの幼若雌マウス（C57BL/6J x DBA/2J F1, Bomholtgaard, Denmark）から得た。マウスには、20IUのFSHを含む0.2mlの性腺刺激ホルモン（Gonal-F, Serono）の腹腔内注射を受けさせ、48時間後に動物を頚椎脱臼によって屠殺した。卵巣を切り出して、卵母細胞を、立体顕微鏡下で一対の27ゲージ針を使用して卵胞を手の断裂することによってHx-培地中に単離した（下記を参照されたい）。完全な胚胞（以下、GVと称する）を示す球状卵母細胞を、卵丘に囲まれた卵母細胞（以下、CEOと称する）および裸の卵母細胞（以下、NOと称する）に分けて、3mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA, Sigma Cat. No. A-7030）、5mg/mlのヒト血清アルブミン（HSA, Statens Seruminstitut, Denmark）、0.23mMのピルベート（Sigma, Cat. No S-8636）、2mMのグルタミン（Flow Cat. No. 16-801）、100IU／mlのペニシリンおよび100g/mlストレプトマイシン（Flow, Cat No. 16-700）を補ったα-最小必須培地（リボヌクレオシドを伴わないα-MEM, Gibco BRL, Cat. No. 22561）に置いた。この培地に、3mMのヒポキサンチン（Sigma Cat. No. H-9377）および指定されたHx-培地を補った。卵母細胞をHx-培地で3回リンスして、均一サイズの卵母細胞をCEOおよびNOの群に分けた。CEOおよびNOは、それぞれのウェルには0.4mlのHx-培地および10Mの濃度の試験化合物を含む4ウェルのマルチディッシュ（Nunclon, Denmark）内で培養した。1つの対照ウェル（すなわち、試験化合物を添加せずに、同一の培地中で培養される35〜45の卵母細胞）を常に3つの試験ウェル（試験化合物を補ったウェルにつき35〜45の卵母細胞）と同時に培養した。卵母細胞を37℃で24時間、5%のCO2の加湿された雰囲気の空気中で培養した。培養期間の終わりに、GV、GVB、および極体（以下、PBと称する）を有する卵母細胞の数を、実体顕微鏡を使用してそれぞれ計数した（Wildt, Leica MZ 12）。そのウェル内の卵母細胞の総数あたりのGVBを受けている卵母細胞の割合として定義されるGVBの割合を以下のとおりに算出した：
%GVB=（（GVBの数+PBの数）／卵母細胞の総数）X100。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】研究の模式図
【図２】0時間、続く対照中での24および48時間における、hCG処理の前後の患者に由来する卵丘-コロナ細胞の増殖の程度を図示する。それぞれのカラムに対して、異なるCOCタイプの比率を表示する。
【０１２９】
*は、hCG後からのタイプIおよびIIのCOCについての違いを意味する（p＜0.001）。
【０１３０】
**は、hCG後からのタイプIIおよびIVのCOCについての違いを意味する（p＜0.05）。
【図３】0時間、続く対照中での24および48時間における、hCG処理の前後の患者に由来する卵丘-コロナ細胞の増殖の程度を図示する。それぞれのカラムに対して、異なるCOCタイプの比率を表示する。
【０１３１】
*は、hCG後からのタイプIおよびIIのCOCについての違いを意味する（p＜0.05）。
【０１３２】
**は、hCG後からのタイプIのCOCについての違いを意味する（p＜0.01）。
【０１３３】
***は、hCG後からのタイプIIおよびIVのCOCについての違いを意味する（p＜0.05）。
【図４】hCG前に治療された患者から収集したCOCsの0、24、および48時間の培養時の核成熟段階のパーセントの（Percentual）比率。N/A=解析していない卵母細胞。
【０１３４】
*は、χ2試験によって対照との有意差を意味する（p＜0.001）。
【図５】hCG前に治療された患者から収集したCOCsの0、24、および48時間の培養時の核成熟段階のパーセントの（Percentual）比率。N/A=解析していない卵母細胞。
【０１３５】
*は、χ2試験によって対照との有意差を意味する（p＜0.001）。
【図６】回収の直後に固定したCOC。（a）回収時のCOCの光学顕微鏡観察。卵母細胞を囲んでいる円形の卵丘細胞に留意されたい。（×400）。（b）完全な核膜を有する卵母細胞核の一部。暗いコンパクト核小体を囲んでいる核球の存在に留意されたい。核を囲んでいる細胞質は、ミトコンドリアの凝集体およびSERの小胞でおおわれている。（×3000）。（c）Serと凝集体を形成するミトコンドリアの凝集塊を有する卵母細胞の皮質（矢印）。細胞小器官を欠いた領域に留意されたい。微絨毛は、卵細胞膜からZP（*）の内側皮質に突出される。表層粒（CG）は、細胞質の全体にわたって分散し、卵細胞膜下に単層形成の始まりがある（矢印）。（×3000）。（d）ギャップ結合によって結合された卵丘細胞間の付着（矢印）。（×12000）。N=核小体;K=核球;SER=滑面小胞体;MT=ミトコンドリア;
【図７】COCは、インビトロで阻害剤を伴わずに24時間で成熟した。（a）多数の細長い卵丘細胞を伴う光学顕微鏡切片。細胞小器官は、細胞質の全体にわたって分散したことに留意されたい。（×400）。（b）細胞質の全体にわたって細胞小器官の分散を伴って、極体が突出した卵母細胞の皮質。周辺ミトコンドリア（*）とSERの複合体に留意されたい。（×3000）CGは、卵細胞膜下に1〜2層形成する（矢印）。（c）卵丘細胞は、伸張し、透明帯から退縮される。細胞の核は、細胞質の伸長の反対側の末梢に配置される。時々変性している核に留意されたい（矢印）。（×1100）。mc=微絨毛。
【図８】DDMPによって24時間インビトロで停止されたCOC。（a）卵丘細胞の核ではなく帯から退縮し始めている卵丘細胞を有する光学顕微鏡切片は、細胞においてより中心に集まっている。未成熟卵母細胞（GV示していない）の凝集塊に分布された細胞小器官に留意されたい。（×400）。（b）核は、完全な、滑らかな核膜（矢印）によって含まれる中央に位置する。核膜の近くにある核小体は、核球によって囲まれている。ミトコンドリアは、小胞と入り混ざってGVを囲んでいる。（×1100）。（c）および（d）卵母細胞の皮質には、細胞小器官がなく、ミトコンドリアは、SERと共に凝集塊を形成して分布されている。（d）卵丘細胞は、帯から収縮する。脂質液滴が観察される（矢印）。（c=×3000;d=×1100）。GV=胚卵胞;N=核小体;K=核球;MT=ミトコンドリア;ZP=透明帯。
【図９】阻害剤を伴わずにインビトロで48時間成熟したCOC。（a）第一極体は、膨張した囲卵腔に存在する卵母細胞から分離される。卵母細胞染色体は、密度の高いクロマチンの凝集塊として現れ、中期スピンドル（矢印）の赤道上に位置する。ミトコンドリアおよびSERは、卵細胞質の全体にわたって分散し、CGの1つの層は、卵細胞膜の下にある（矢印）。（×3000）。（b）2-3層のCGを有するPB突出した卵母細胞の皮質および一部がふくんだ（*）SERのいくつかの小胞。（×7000）。PVS=囲卵腔;PB=極体。
【図１０】DDMPの存在下においてインビトロで48時間停止したCOC。（a）核小体のまわりの核球の存在を伴って中央に位置する核を有する卵母細胞。なおも完全な核膜に留意されたい（矢印）。細胞小器官は、SERの小胞と入り混ざり、主に核周辺に局在化されるが、これらの凝集体から分離し始める。（×3000）。（b）GV段階の卵母細胞は、細胞質においてより均一な細胞小器官の分布を有する。卵細胞膜の下の表層粒は、単一の層（矢印）を形成する。（×1100）。GV=胚卵胞;N=核小体;K=核球。
【図１１】変性した側面を示すDDMPの存在下においてインビトロで72時間停止したCOC。（a）GV周辺の多くのSERの小胞化の増大を示す光学顕微鏡切片。（×1000）。（b）SERおよびミトコンドリアの小胞化（vesicuolisation）の増大を伴う退縮の徴候を有する卵母細胞も変性される（矢印）。卵母細胞皮質（矢印）およびより均質な帯（ZP）の上に微絨毛がないことに留意されたい。（×7000）。SER=滑面小胞体。N=核小体;K=核球。
【図１２】阻害剤を伴わずにインビトロで48時間成熟したCOC。MII卵母細胞の微小繊維（アクチン）を表す共焦点イメージの一つの切片。（a）および（b）において、左および右は、染色体混乱を伴ったMIIプレートの種々のレベルでの同じ卵母細胞である。
【図１３】72時間のインビトロでの停止後い30時間培養したCOC。MII卵母細胞の微小繊維（アクチン）を表す共焦点イメージの一つの切片。（a）および（b）において、左および右は、異なるレベルでの同じ卵母細胞である。第一極体F-アクチンのレベルは、中期板のレベルよりも優性な赤い染色を示す。
【図１】
2006502717.tif 000007
【図２】
2006502717.tif 000008
【図３】
2006502717.tif 000009
【図４】
2006502717.tif 000010
【図５】
2006502717.tif 000011
【図６】
2006502717.tif 000012
【図７】
2006502717.tif 000013
【図８】
2006502717.tif 000014
【図９】
2006502717.tif 000015
【図１０】
2006502717.tif 000016
【図１１】
2006502717.tif 000017
【図１２】
2006502717.tif 000018
【図１３】
2006502717.tif 000019
【国際調査報告】
2006502717.tif 000020
2006502717.tif 000021
2006502717.tif 000022
2006502717.tif 000023
2006502717.tif 000024
2006502717.tif 000025