(57)【要約】（ａ）ＣＨ２ドメインに１以上のアミノ酸変異を有するＩｇＧ由来のヒトヒンジ定常領域、（ｂ）２つのｓｃＦｖ、および（ｃ）２つのＦｖを含む変異二重特異性抗体が構築されている。この種の抗体はクリアランスの増強を示し、それはプレターゲッティング法に関して特に有用であることが分かっっている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＩｇＧ由来のヒトヒンジ定常領域、
（ｂ）２つのｓｃＦｖ、および
（ｃ）２つのＦｖ
を少なくとも含んでなり、該定常領域がＣＨ２ドメインに１以上のアミノ酸変異を含む、変異二重特異性抗体。
【請求項２】
前記ｓｃＦｖおよびＦｖが、ＣＤＲグラフト化マウスｓｃＦｖおよびＦｖである、請求項１に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項３】
前記ｓｃＦｖおよびＦｖが、ヒト化されたものまたはヒト由来のものである、請求項１に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項４】
前記ヒンジ定常領域が、２５３番目のイソロイシンがアラニンで置換されているか、またはそのアミノ酸置換がアラニン置換と同等もしくはそれを超えて血液クリアランスを促進する、ロイシン以外のアミノ酸で置換されている変異を含む、請求項１に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項５】
前記ＦｖがｈＭＮ１４−ＩｇＧに由来するものであり、前記ｓｃＦｖが７３４ｓｃＦｖである、請求項４に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが一価の標的化可能な構築物と結合する、請求項１に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖが二価の標的化可能な構築物と結合する、請求項１に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項８】
前記Ｆｖが標的細胞上のエピトープと結合する、請求項１に記載の変異二重特異性抗体。
【請求項９】
疾病または疾病に至る可能性のある症状を、治療もしくは診断、または治療および診断する方法であって、
（Ａ）Ｆｖが前記疾病または前記症状に関連するマーカー物質に向けられている請求項１に記載の変異二重特異性抗体を被験体に投与する工程、
（Ｂ）所望により、被験体にクリアランス組成物を投与し、該組成物に非局在抗体または抗体フラグメントを循環系から除去させる工程、および
（Ｃ）二価ハプテンを含む標的化可能な構築物であって、両ハプテン部分が請求項１に記載の変異二重特異性の単一分子上の２つのｓｃＦｖと結合するものであり、診断もしくは治療用カチオンおよび／または１以上のキレート化もしくは化学結合した治療剤もしくは診断剤をさらに含んでなる前記構築物を被験体に投与する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記変異二重特異性抗体が、前記疾病または症状の治療に用いられる少なくとも１つの治療剤を投与する前、投与中、または投与した後に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的化可能な構築物が酵素を含んでなるものであり、
ａ）プロドラッグ（前記酵素が標的部位で該プロドラッグを薬物へと変換することができる場合）、
ｂ）被験体内で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物（前記酵素が解毒された前記中間体を毒性型へと再変換し、これにより、標的部位で薬物の毒性を増強することができる場合）、または
ｃ）被験体内で自然のプロセスを経て活性化され、毒性の低い中間体へと変換されることにより解毒されるプロドラッグ（前記酵素が解毒された前記中間体を毒性型へと再変換し、これにより、標的部位で薬物の毒性を増強することができる場合）
を被験体に投与する工程をさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロドラッグが、エピルビシングルクロニド、ＣＰＴ−１１、エトポシドグルクロニド、ダウノマイシングルクロニドおよびドキソルビシングルクロニドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記診断剤が２５〜４，０００ｋｅＶのγ粒子および／または陽電子を放射するものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記診断剤が、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記放射性同位元素を用いて陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的化可能な構築物が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いる１以上の造影剤を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記造影剤が、Ｍｎ、ＦｅおよびＧｄからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的化可能な構築物が、超音波イメージングで用いる１以上の造影剤を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的化可能な構築物が、リポソーム脂質膜の外面に二価ＤＴＰＡ−ペプチドが共有結合したリポソームである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リポソームがガス充填されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的化可能な構築物が、罹患組織を死滅させるのに有用な１種以上の放射性同位元素を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記放射性同位元素のエネルギー範囲が６０〜７００ｋｅＶである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記放射性同位元素が、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的化可能な構築物が１０Ｂ原子を含んでなるものであり、罹患組織に局在した前記ホウ素原子を照射し、それにより罹患組織のＢＮＣＴを果たす工程をさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療剤が、薬物、毒素、ホルモン、酵素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬、色素、または放射性同位元素である、請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的化可能な構築物が１種以上の毒素を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記毒素が、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的化可能な構築物が１種以上の薬物を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬物が、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、ドキソルビシンおよびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的化可能な構築物が光線力学的療法のための１種以上の薬剤を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項３１】
光線力学的療法のための前記薬剤が感光剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記感光剤が、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）およびルテチウムタキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的組織が腫瘍である、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的組織が腫瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍が、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｔａｇ−７２、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＨＣＧ−β、ＰＬＡＰ、ＰＡＰ、ヒストン、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、Ｓ１００、ＥＧＦＲ、インスリン様成長因子、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、臓器向性ホルモン、癌遺伝子産物、およびサイトケラチンからなる群から選択される抗原を産生するか、またはこれに関連するものである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
変異二重特異性抗体が、クラスIII抗ＣＥＡ抗体のＦｖを組み込んでいる、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項３７】
変異二重特異性抗体が、Ｍａｂ ６７９のｓｃＦｖを組み込んでいる、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾病が、免疫調節障害、自己免疫疾患、臓器移植拒絶症、循環器病、神経疾患または移植片対宿主病である、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項３９】
前記自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、溶血性連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑らい、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、類肉腫症、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェジナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、および繊維性肺胞炎からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が、真菌、ウイルス、寄生虫または細菌により引き起こされるものであり、かつ、変異二重特異性のＦｖが、真菌、ウイルス、寄生虫または細菌を標的とするものである、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水疱−帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細菌が、炭疽菌(Anthrax bacillus)、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、レジュネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸菌(Escherichia coli)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎双球菌(Pneumococcus)、Ｂ型インフルエンザ菌(Hemophilis influenzae B）、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ライム病スピロヘータ、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、らい菌(Mycobacterium leprae)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)および破傷風毒素からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記病原体が原生動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記原生動物が、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、ランゲリ・トリパノソーマ(Trypanosoma rangeli)、クルーズ・トリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ローデシア・トリパノソーマ(Trypanosoma rhodesiensei)、ブルセイ・トリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、マンソン住血吸虫(Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ)、日本住血吸虫(Schistosoma japanicum）、ウシバベシア(Babesia bovis)、エルメリア・テネラ(Elmeria tenella)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、熱帯リーシュマニア(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、タイレリア・パルバ(Theileria parva)、胞状条虫(Taenia hydatigena)、テニア・オビス(Taenia ovis)、カギナシサナダ(Taenia saginata)、単胞条虫(Echinococcus granulosus)およびメソセストイデス・コルチ(Mesocestoides corti)からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記寄生虫が蠕虫またはマラリア原虫である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌がマイコプラズマである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記マイコプラズマが、マイコプラズマ・アルスリティディス(Mycoplasma arthritidis)、Ｍ．ヒオリニス(M. hyorhinis)、Ｍ．オーラル(M. orale)、Ｍ．アルギニニ(M. arginini)、アコレプラスマ・ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)、Ｍ．サリバルム(M. salivarum)、および肺炎マイコプラズマ(M. pneumoniae)からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記真菌が、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、およびカンジダ種(Candida)からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
組織が正常な異所組織である、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項５０】
前記正常組織が、卵巣、胸腺、副甲状腺、骨髄、または脾臓に由来する組織である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が哺乳類である、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳類被験体がヒトまたは霊長類である、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳類被験体が、齧歯類、ウサギ類、ウシ類、ヒツジ類、ヤギ類、ブタ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、家禽類、有蹄類、およびクマ類からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
罹患組織を同定するための術中診断のための、請求項９に記載の方法。
【請求項５５】
罹患組織を同定するための内視鏡診断のための、請求項９に記載の方法。
【請求項５６】
所定の診断または治療の前、同時または後に第二の治療剤が投与される、請求項９〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
第二の治療剤が、薬物、裸の抗体、免疫調節剤、または薬物、放射性同位元素、免疫調節剤もしくは毒素を担持する抗体複合体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
被験体において罹患組織を治療または同定するのに有用なキットであって、
（Ａ）請求項９に記載の変異二重特異性抗体、
（Ｂ）所望により、請求項９に記載のクリアランス剤、および
（Ｃ）請求項１１に記載の標的化可能な構築物
を含んでなる、キット。
【請求項５９】
被験体において罹患組織を治療または同定するのに有用なキットであって、
（Ａ）請求項１１に記載の変異二重特異性抗体、
（Ｂ）所望により、請求項１１に記載のクリアランス剤、
（Ｃ）請求項１１に記載の標的化可能な構築物、および
（Ｄ）請求項１１に記載のプロドラッグ
を含んでなる、キット。
【請求項６０】
前記免疫調節剤が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項６１】
前記リンホトキシンが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記造血系因子がインターロイキン（ＩＬ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記コロニー刺激因子が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記インターフェロンが、インターフェロン−α、−βまたは−γである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記幹細胞増殖因子がＳ１因子である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記免疫調節剤が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αまたはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の方法。
【請求項６７】
前記神経疾患がアルツハイマー病である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対応する親二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）よりも迅速に患者の身体から除去される変異二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）に関する。特に、本発明は、ＩｇＧ由来の１つのヒトヒンジ定常領域、２つのｓｃＦｖおよび２つのＦｖを含む変異ｂｓＡｂに関し、該ヒンジ定常領域はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸変異を含む。
【０００２】
関連技術
標的部位の検出は、検出剤のシグナル対バックグラウンド比が高いと有利である。治療は、標的部位で治療剤ができる限り多く確実に付着すること、および取り込みおよび結合の持続時間が適度に長いことが有利となる。ターゲッティング率および標的部位への薬剤送達量を向上させるためには、選択的局在性のためにターゲッティング部分と結合した診断剤または治療剤を含んでなるターゲッティングベクターの使用が長く知られている。
【０００３】
ターゲッティングベクターの例としては、抗体または抗体フラグメント、細胞または組織特異的ペプチド、ならびにホルモンおよびその他の受容体結合分子などのターゲッティング部分の診断剤または治療剤複合体が挙げられる。例えば、病理細胞および正常細胞に関連する、ならびに病原体微生物に関連する種々の決定基に対する抗体が、多種多様な病状または病変の検出および治療に用いられている。これらの方法では、例えば、Hansen et al., 米国特許第３，９２７，１９３号明細書およびGoldenberg, 米国特許第４，３３１，６４７号明細書、同第４，３４８，３７６号明細書、同第４，３６１，５４４号明細書、同第４，４６８，４５７号明細書、同第４，４４４，７４４号明細書、同第４，４６０，４５９号明細書、同第４，４６０，５６１号明細書、同第４，６２４，８４６号明細書および同第４，８１８，７０９号明細書（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のように、ターゲッティング抗体を直接適当な検出剤または治療剤と結合させる。
【０００４】
ダイレクトターゲッティング法、すなわち、診断剤または治療剤(「有効な薬剤」)がターゲッティング部分と直接結合される方法で遭遇する問題は、複合体の比較的小さな部分は標的部位と結合するが、複合体の大部分は循環系中に残ったままであり、何らかの方法で標的複合体の機能を損なうことである。診断複合体の場合には、例えば、ラジオイムノシンチグラフィーまたは磁気共鳴イメージング複合体、循環系中に残る非標的化複合体が、バックグラウンドを増加させて解像度を低下させることがある。抗体などの長期間循環するターゲッティング部分に付着した毒性の高い治療剤、例えば放射性同位元素、薬物または毒素を有する治療用複合体の場合、循環する複合体は骨髄毒性または全身性副作用などの宿主に許容されない毒性となり得る。
【０００５】
プレターゲッティング法は、検出剤または治療剤の標的:バックグラウンド比を増加させるために開発されてきた。プレターゲッティングおよびビオチン/アビジンアプローチの例は、例えば、Goodwin et al., 米国特許第４，８６３，７１３号明細書；Goodwin et al., J. Nucl. Med. 29:226, 1988; Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr et al., J. Nucl. Med. 29:728, 1988; Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter et al., Int. J. Cancer 48:167, 1991; Paganelli et al., Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12:211, 1991;米国特許第５，２５６，３９５号明細書； Stickney et al., Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan et al., Cancer Res. 51:3119, 1991;米国特許第６，０７７，４９９号明細書；米国出願番号０９／５９７，５８０；同１０／３６１，０２６；同０９／３３７，７５６；同０９／８２３，７４６；同１０／１１６，１１６；同０９／３８２，１８６；同１０／１５０，６５４；米国特許第６，０９０，３８１号明細書；同第６，４７２，５１１号明細書；米国出願番号１０／１１４，３１５；米国仮出願番号６０／３８６，４１１；同６０／３４５，６４１；同６０／３３２８，８３５；同６０／４２６，３７９；米国出願番号０９／８２３，７４６；同０９／３３７，７５６；および米国仮出願番号６０／３４２，１０３に記載されている。なお、これらは総て引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【０００６】
プレターゲッティング法では、一次ターゲッティング種(診断剤または治療剤と結合していないもの)を投与する。一次ターゲッティング種は、標的部位と結合するターゲッティング部分、および標的化可能な構築物の結合部位と結合可能な結合部分を含む。一次ターゲッティング種が十分に付着すれば、標的化可能な構築物を投与する。標的化可能な構築物は、一次ターゲッティング種の利用可能な結合部位を認識する結合部位および診断剤または治療剤を含む。
【０００７】
プレターゲッティングは、ダイレクトターゲッティング法の使用にある一定の利点を与える手法である。例えば、治療、例えば放射線免疫治療のための標的部位への放射性核種のin vivo送達にプレターゲッティング法を用いると、放射免疫複合体の長期循環により生じる骨髄毒性が減少する。これは、放射性同位元素が、多くの場合に長期間循環する種である第一のターゲッティング分子と直接結合するよりも迅速にクリアランスされる、分子量の低いキレートとして送達されるためである。
【０００８】
プレターゲッティング法で遭遇する問題は、循環している一次ターゲッティング種(標的部位と結合していない一次ターゲッティング種)が、標的化可能な複合体の、(一次ターゲッティング種の結合部分を介して)標的部位と結合しているターゲッティング種との結合を妨害することである。従って、循環している一次ターゲッティング種の量を最小限に抑える方法が必要とされる。
【０００９】
循環している一次ターゲッティング種の量を最小限に抑える試みはいくつかなされてきた。この目標を達成する一つの方法は、身体からのクリアランス速度の速い一次ターゲッティング種を調製することである。例えば、Ward et al.(米国特許第６，１６５，７４５号明細書)はマウス由来の変異ＩｇＧ１を合成し、Hornick et al.「The Journal of Nuclear Medicine 11 355-362 (2000)」は変異キメラＴＮＴ−３抗体を合成した。これらの変異抗体は、本発明による変異ｂｓＡｂとは異なる。違いの一つは、本発明による変異ｂｓＡｂは二重特異性抗体であるのに対し、Hornick et al.およびWard et al.の抗体は単一特異性抗体である点である。二重特異性抗体は単一特異性抗体に比べて異なる特性を有することから、この違いは有意である。本変異ｂｓＡｂとWard et al.のマウス抗体とのもう一つの違いは、Ward et al.のマウス抗体にはエフェクター機能がないことである。従って、Ward et al.の抗体は、本変異ｂｓＡｂのように補体を固定することまたは効果的なＡＤＣＣ(抗体依存性細胞傷害)を果たすことができない。
【発明の概要】
【００１０】
ＩｇＧ由来の１つのヒトヒンジ定常領域、２つのｓｃＦｖおよび２つのＦｖを含む変異ｂｓＡｂを提供することが本発明の目的であり、該ヒンジ定常領域はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様においては、ＦｖおよびｓｃＦｖはＣＤＲグラフト化マウスまたはヒト化成分である。別の実施態様では、ＦｖおよびｓｃＦｖはヒトまたはヒト化成分である。いくつかの実施態様において、ヒンジ定常領域はイソロイシン２５３のアラニンへの変異を含む。本発明はまた、ＦｖがｈＭＮ１４−ＩｇＧ、ヒト化クラスＩＩＩ、抗−ＣＥＡ ｍＡｂに由来し（米国特許第５，８７４，５４０号明細書参照）、ｓｃＦｖは７３４ｓｃＦｖであり、ヒンジ定常領域で２５３番目のイソロイシンがアラニンへ変異している変異ｂｓＡｂを提供する。
【発明の具体的説明】
【００１１】
特に断りのない限り、可算名詞("a"または"an")は１つ以上のものを意味する。
【００１２】
Ｉ．概要
本発明は、ＩｇＧ由来の１つのヒトヒンジ定常領域、２つのｓｃＦｖおよび２つのＦｖを含む変異ｂｓＡｂに関し、該ヒンジ定常領域はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸変異を含む。本発明による変異ｂｓＡｂは、対応する親ｂｓＡｂよりも迅速に患者の身体から除去される。二重特異性抗体は、１９９９年６月２２日出願の米国出願番号０９／３３７，７５６に開示されている。プレターゲッティング法に用いると、循環している一次ターゲッティング種（標的部位と結合していない変異ｂｓＡｂ）の量が最小限度に抑えられる。さらに、血中で捕捉される標的化可能な構築物の量も最小限度に抑えられる。
【００１３】
ヒトヒンジ定常領域はエフェクター機能を含み得る。抗体分子のＦｃ部分は、細胞溶解を引き起こす作用をするようメカニズムを設定する補体結合反応およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などのエフェクター機能を提供する。しかし、治療機能のためにはこのＦｃ部分は必要でなく、アポトーシスなどの他のメカニズムが機能を果たす可能性がある。従って、生得的なＡＤＣＣ、アポトーシス誘発および補体活性化／溶解が達成され得る。
【００１４】
ｓｃＦｖは標的化可能な構築物の結合部位に対して特異的である。標的化可能な構築物は担体部分および少なくとも１ユニットの認識可能なハプテンから成る。認識可能なハプテンの例としては、限定されるものではないが、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）、ＤＴＰＡおよびフルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。標的化可能な構築物は、罹患組織の治療または同定に有用な種々の薬剤と結合してもよい。結合される薬剤の例としては、限定されるものではないが、キレート剤、金属キレート錯体、薬物、毒素（例えば、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素）およびその他のエフェクター分子が挙げられる。結合に好適な薬物としては、ドキソルビシン類似体、ＳＮ−３８、エトポシド、メトトレキサート、６−メルカプトプリンまたはリン酸エトポシド、カリチェアマイシン(calicheamicin)、パクリタキセル、２−ピロリノドキソルビシン、ＣＣ−１０６７、およびアドゼレシンまたはその組み合わせが挙げられる。薬物の例としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、ドキソルビシン、およびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、プロドラッグの活性化または薬物の標的特異的傷害性の増加に有用な酵素を標的化可能な構築物と結合させることもできる。よって、標的化可能な構築物に対して反応性のあるｓｃＦｖを含む変異ｂｓＡｂの使用によって、各適用ごとに新規なｂｓＡｂを産生させることなく、種々の治療および診断適用を実施することが可能となった。
【００１５】
さらに、本発明は、哺乳類における標的細胞、組織または病原体の検出または治療のための方法を包含し、ＩｇＧ由来のヒトヒンジ定常領域、２つのＦｖおよび２つのｓｃＦｖを含み、ヒンジ定常領域はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸変異を含む、有効量の変異ｂｓＡｂを投与することを含んでなる。本明細書において「病原体」とは、限定されるものではないが、菌類（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシジオイデス・イミティスおよびカンジダ種）、ウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水疱−帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルス）、寄生虫、微生物（例えば、リケッチア）および細菌（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチエ、レジュネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎双球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、緑膿菌、ウシ流産菌、結核菌、炭疽菌の胞子および破傷風毒素)をさす。米国特許第５，３３２，５６７号明細書を参照されたい。
【００１６】
本明細書において「抗体」とは、全長（すなわち、天然に存在する、または正常免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換え法により形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分をさす。抗体という語は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化（ヒト化）抗体、および完全なヒト抗体を包含する。「ＩｇＧ」という語は、抗原に対して産生され、抗原と特異的に結合することができる抗体、すなわち免疫グロブリンＧを意味する。抗体はＡｂと省略される。モノクローナル抗体はｍＡｂと省略される。
【００１７】
「ヒト抗体」は、抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するように「操作された」トランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒトＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子座のエレメントが、内在性Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子座が標的化破壊されている胚幹細胞株由来のマウス系統に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレー技術によって構築でき、これらは全て当技術分野で公知である。例えば、未免疫のドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体およびそのフラグメントのin vitro作製に関してはMcCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)を参照。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子がフレーム内で糸状バクテリオファージの主要または微量コートタンパク質遺伝子にクローニングされ、ファージ粒子表面上に機能的抗体フラグメントとして提示される。この糸状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレー法は多様な形式で行うことが可能であり、総説としては、例えば、Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology  3:5564-571 (1993)を参照されたい。
【００１８】
ヒト抗体はまた、in vitro活性化Ｂ細胞でも産生し得る。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５明細書を参照されたい。
【００１９】
抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体フラグメントは無傷の抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＥＡモノクローナル抗体フラグメントはＣＥＡのエピトープと結合する。
【００２０】
「抗体フラグメント」という語は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまう合成または遺伝子組み換えタンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントには、Ｌ鎖可変領域からなる単離フラグメント、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組み換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域に類似したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが含まれる。
【００２１】
キメラ抗体は、齧歯類抗体などの第１の種由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含む組み換えタンパク質であり、抗体分子のＨ鎖およびＬ鎖定常領域はヒト抗体などの第２の種に由来する。
【００２２】
ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンなどの第１の種の免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖可変領域からヒトＨ鎖およびＬ鎖可変ドメイン中に移されている組み換えタンパク質であり、抗体分子のＨ鎖およびＬ鎖定常領域はヒト抗体に由来する。ヒト化抗体はまたＣＤＲグラフト化抗体と呼ばれる。 
【００２３】
本明細書において、「二重特異性抗体」とは、２つの異なる部分、すなわち標的組織および標的化可能な構築物と結合可能な抗体をさす。
【００２４】
本明細書において、治療剤は、特定の投与計画に従って本発明による抗体と組み合わせて被験体へ投与される、または抗体部分と結合して治療に有用な複合体を形成する分子または原子である。治療剤の例としては、薬物、毒素、ホルモン、酵素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬または色素、および放射性同位元素が挙げられる。免疫調節剤の例は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。特に有用なものは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−βまたは−γなどのインターフェロン、ならびに「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子である。より具体的には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αまたはそれらの組み合わせなどの免疫調節剤が本発明において有用である。「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組み換え単鎖ポリペプチド分子を意味する。 
【００２５】
「Ｆｖ」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなるフラグメントを意味する。
【００２６】
「組み換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む任意の原核細胞または真核細胞であってよい。この語はまた、それらの原核細胞または真核細胞、ならびに宿主細胞または宿主細胞の細胞の染色体またはゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝子組み換えされたトランスジェニック動物も含む。好適な哺乳類宿主細胞には、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ０細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株および抗体発現に有用な他の哺乳類宿主細胞を含む。また、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用なものはＷＯ ００６３４０３ Ａ２に開示されたヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６であり、従来の哺乳類細胞株ＣＨＯ、ＣＯＳ、 Ｖｅｒｏ、 ＨｅＬａ、 ＢＨＫおよびＳＰ２細胞系統に比べて２〜２００倍の組換えタンパク質を産生する。修飾された免疫機構を有する特別なトランスジェニック動物は完全なヒト抗体を作製するために特に有用である。
【００２７】
抗原はいずれの抗原であってもよい。抗原の例は、細胞表面または腫瘍関連抗原、あるいは微生物または寄生虫に関連する抗原、あるいは罹患組織または自己免疫疾患に関与するＢまたはＴ細胞などの疾病を導く細胞種、あるいは心疾患または神経疾患の標的抗原 (例えば、前の場合にはアテローム斑または塞栓、および後の場合にはアルツハイマー病に関連するものなどのアミロイド)がある。本明細書において「組織」とは、当業者がそれを意味すると理解するであろう組織を意味する。本発明において提案されるように、組織は、体組織または体液（例えば血液細胞）の個々の細胞もしくは細胞群、または細胞培養物も意味する。さらに、組織は被験体内にあっても、生検組織であっても、または被験者から摘出した組織であってもよい。この組織はまた、身体の器官の全てまたは一部であってもよい。さらに、この組織は、切除と本発明による方法との間に保存工程を含まずに被験体から取り出されたばかりの組織であるという点で「新鮮」であると言える。組織はまた、本発明による方法の適用前に、限定されるものではないが、凍結、急速凍結、パラフィン包埋および組織固定をはじめとする標準の組織調製技術によって保存してもよい。
【００２８】
「標的組織」とは、標的化可能な複合体が送達されうる系、器官、組織、細胞、受容体または細胞小器官である。本発明の治療的態様では、標的組織は、感染しているか、機能障害性であるか、置換されているか、または異所的である（例えば、感染細胞、癌細胞、子宮内膜症など）。骨髄など正常な組織もまた、治療的介入が必要であれば、これらの方法で切除してもよい。本発明の診断的態様では、標的組織を検出することが望ましい。
【００２９】
本明細書において「被験体」とは、限定されるものではないが、ヒトおよびその他の霊長類、齧歯類（例えばマウス、ラット、およびモルモット）、ウサギ類（lagamorphs）（例えばウサギ）、ウシ類（例えばウシ）、ヒツジ類（例えばヒツジ）、ヤギ類（例えばヤギ）、ブタ類（例えばブタ）、ウマ類（例えばウマ）、イヌ類（例えばイヌ）、ネコ類（例えばネコ）、家禽類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、その他のキジ類の鳥など）をはじめとするいずれの動物（すなわち、脊椎動物および無脊椎動物）、ならびに、限定されるものではないが、有蹄類（例えばシカ）、クマ類、魚類、ウサギ類、齧歯類、鳥類などの野生動物もさす。この語は特定の齢または性別に限定するものではない。よって、成体および新生児(仔)被験体、ならびに胎児(仔)は、雌雄にかかわらず、この語に包含される。
【００３０】
本明細書において「親ｂｓＡｂ」という語は、親ｂｓＡｂのヒンジ定常領域がＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域で１以上のアミノ酸変異を含まないことを除いて、あらゆる点で変異ｂｓＡｂに類似したｂｓＡｂを意味するのに使用する。
【００３１】
本明細書において「ヒンジ定常領域」は、ＩｇＧのＣｌ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。Ｈ鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むが、Ｌ鎖定常領域はＣｌ領域を含む。
【００３２】
ＩＩ．変異二重特異性抗体
変異ｂｓＡｂのＦｖは抗体に由来し、標的組織と特異的に結合する。Ｆｖの例は、「Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods Of Use」と題された、代理人整理番号１８７３３／１０７３、米国仮出願番号６０／３５６，１３２、同６０／４１６，２３２および代理人整理番号１８７３３／１１５５（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のものなどの抗ＣＤ２０抗体；クラスＩＩＩ抗癌胎児性抗原抗体（抗ＣＥＡ抗体）である、米国出願番号５，８７４，５４０（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に開示のものなどのｈＭＮ−１４抗体；米国出願番号１０／１１６，１１６（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のものなどのＭｕ−９抗体；米国仮出願番号６０／３６０，２５９（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のものなどのＬＬ１抗体；米国仮出願番号６０／３９９，７０７（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のものなどのＡＦＰ抗体；「Monoclonal Antibody cPAM4」と題された、代理人整理番号１８７３３／１１０２の米国仮出願（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のものなどのＰＡＭ４抗体；米国仮出願番号６０／３６０，２２９（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載のものなどのＲＳ７抗体；ならびに米国特許第５，７８９，５５４号明細書および同第６，１８７，２８７号明細書ならびに米国出願番号０９／７４１，８４３および同０９／９８８，０１３（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に開示のものなどのＣＤ２２抗体由来のものである。造血器腫瘍および固形腫瘍のその他の多くの腫瘍関連抗原が当業者に公知であり、引用出願にも含められているように、（限定されるものではないが）ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、Ｉｉ、Ｉａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＰＡＭ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、インスリン成長因子受容体、Ｓ１００、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、胎盤アルカリ性ホスファターゼ、壊死産物、癌遺伝子産物などが挙げられる。ｈＭＮ−１４のＨ鎖ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１に示し、ｈＭＮ−１４のＬ鎖ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を図２に示す。
【００３３】
ＦｖをコードするｃＤＮＡは、ヒンジ定常領域をコードするベクターへ挿入してもよい。発現ベクターの例として、ＩｇＧ１のヒンジ定常領域のアミノ酸をコードするｐｄＨＬ２がGillies S.D., Lo KM, and Wesolowski, J. J. Immunol Methods 125 191-202 (1989)およびLosman, M.J. et al. Cancer Supplement 80 2660-2666 (1997)によって報告されており、本発明による変異二重特異性抗体の構築に用いてよい。
【００３４】
Ｆｖはマウス抗体、ＣＤＲグラフト化（ヒト化）抗体、またはヒト抗体由来であってよい。Ｆｖはヒトモノクローナル抗体、ヒトＦｖライブラリーを含むトランスジェニックマウス、またはファージ／リボソームヒトＩｇＧライブラリーから得ることができる。
【００３５】
ＦｖがＣＤＲグラフト化抗体に由来する場合、適当な可変領域枠組み構造配列を、抗原結合領域がそれに由来するドナー抗体のクラスまたは種類を考慮して用いてよい。用いるヒト枠組み構造の種類がドナー抗体と同じまたは類似のクラスまたは種類であることが好ましい。枠組み構造は、ドナー抗体配列との相同性を、特にＣＤＲに空間的に近接または隣接する位置で最大化または最適化するように選択すると有利である。ＣＤＲグラフト化抗体を構築するために用いてよいヒト枠組み構造の例として、ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩおよびＥＵ（Kabat et al, 1987）がある。ＫＯＬおよびＮＥＷＭはＨ鎖構築に好適である。ＲＥＩはＬ鎖構築に好適であり、ＥＵはＨ鎖およびＬ鎖双方の構築に好適である。
【００３６】
ＣＤＲグラフト化抗体のＬ鎖またはＨ鎖可変領域は、必要に応じてヒトＬ鎖またはＨ鎖定常ドメインと融合させてもよい（本明細書において「Ｈ鎖定常ドメイン」とは、特に指定のない限り、ヒンジ領域を含むものと理解される）。ＣＤＲグラフト化抗体のヒト定常ドメインは、それが存在する場合は、抗体の予定される機能、特に、必要とされうるエフェクター機能を考慮して選択してもよい。例えば、ＣＤＲグラフト化抗体が治療目的を意図し、抗体のエフェクター機能を必要とする場合には、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソ型ドメインを用いてよい。あるいは、ＣＤＲグラフト化抗体が抗体エフェクター機能を必要としない目的を意図する場合、例えばイメージング、診断または細胞毒性の標的化目的である場合は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４イソ型ドメインを用いてよい。Ｌ鎖可変領域と融合してよいＬ鎖ヒト定常ドメインとしては、ヒトλまたは、特に、ヒトκ鎖が挙げられる。
【００３７】
二重特異性変異抗体のヒンジ定常領域は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸変異を含む。言い換えれば、二重特異性変異抗体のヒトヒンジ定常領域を二重特異性親抗体のヒトヒンジ定常領域と比較すると、その領域は１以上のアミノ酸が異なっている。
【００３８】
変異は、例えば置換アミノ酸が電荷または大きさなど類似の構造または化学特性を有する「保存的」変化を包含する（例えばロイシンのイソロイシンによる置換）。変異はまた、例えば「非保存的」変化（例えばグリシンのトリプトファンによる置換）も包含する。
【００３９】
好ましい実施態様では、２５３番目の位置のアミノ酸（Ｅｄｅｌｍａｎの付番方式に従う）が変異している。この位置での変異の例としては、イソロイシンのアラニンによる置換がある。いくつかの実施態様では、２５３番目のアミノ酸が、変異ｂｓＡｂのクリアランスの薬物動態が２５３番目の位置のアミノ酸がアラニンへ変化している場合に認められるものと同等となるアミノ酸へ変異している。
【００４０】
一つの実施態様では、二重特異性変異抗体のヒンジ定常領域はヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を含んでなる。Ｈ鎖のＣｌ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするアミノ酸は、図１のアミノ酸番号１３９〜４６８として示され、Ｃｌ鎖をコードするアミノ酸は図２のアミノ酸番号１２８〜２３２として示される。イソロイシン２５３を特定するために用いた番号体系は、Edelman et al.がＥｕ Ｈ鎖およびＬ鎖の開示中で用いた番号体系の開示に一致することに留意されたい（Edelman et al. Biochemistry 63, 78-85 (1969)）。
【００４１】
二重特異性変異抗体のｓｃＦｖ成分は、標的化可能な構築物と特異的に結合する。いずれのｓｃＦｖ成分の使用も本発明で意図される。好ましいｓｃＦｖ成分は６７９ｓｃＦｖ（マウス抗ＨＳＧ由来）および７３４ｓｃＦｖ（マウス抗−ｄｉＤＴＰＡ由来）である。ｓｃＦｖはマウス、ＣＤＲグラフト化（ヒト化）またはヒトであってよい。
【００４２】
ｓｃＦｖがＣＤＲグラフト化抗体に由来する場合、適当な可変領域枠組み構造配列を、抗原結合領域がそれに由来するドナー抗体のクラスまたは種を考慮して用いてよい。用いるヒト枠組み構造の種類がドナー抗体と同じまたは類似のクラスまたは種類であることが好ましい。枠組み構造は、ドナー抗体配列との相同性を、特にＣＤＲに空間的に近接または隣接する位置で最大化または最適化するように選択すると有利である。ＣＤＲグラフト化抗体を構築するために用いてよいヒト枠組み構造の例としては、ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩおよびＥＵ（Kabat et al, 1987）がある。ＫＯＬおよびＮＥＷＭはＨ鎖構築に好適である。ＲＥＩはＬ鎖構築に好適であり、ＥＵはＨ鎖およびＬ鎖双方の構築に好適である。
【００４３】
ＣＤＲグラフト化抗体のＬ鎖またはＨ鎖可変領域は、必要に応じてヒトＬ鎖またはＨ鎖定常ドメインと融合させてもよい（本明細書において「Ｈ鎖定常ドメイン」とは、特に断りのない限り、ヒンジ領域を含むものと理解される）。ＣＤＲグラフト化抗体のヒト定常ドメインは、それが存在する場合は、抗体の予定される機能、特に、必要とされうるエフェクター機能を考慮して選択してもよい。例えば、ＣＤＲグラフト化抗体が治療目的を意図し、抗体のエフェクター機能が必要とされる場合には、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソ型ドメインを用いてよい。あるいは、ＣＤＲグラフト化抗体が抗体エフェクター機能が必要とされない目的を意図する場合、例えばイメージング、診断または細胞毒性の標的化目的には、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４イソ型ドメインを用いてよい。Ｌ鎖可変領域と融合してよいＬ鎖ヒト定常ドメインには、ヒトλまたは、特に、ヒトκ鎖が挙げられる。
【００４４】
好ましい変異ｂｓＡｂはｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２である。この変異ｂｓＡｂでは、ＦｖはｈＭＮ−１４ＩｇＧに由来し、ｓｃＦｖは７３４ｓｃＦＶ（マウス抗ｄｉＤＴＰＡ由来）であり、ヒンジ定常領域はヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明の一つの実施態様では、変異ｂｓＡｂと標的化可能な構築物との間に一対一結合の相互作用が得られる。例えば、本発明による変異ｂｓＡｂが、２つのＤＴＰＡ部位を含む二価の標的化可能な構築物ＩＭＰ１９２と相互作用する場合、１つのｂｓＡｂが１つのＩＭＰ１９２と結合する。この相互作用は実施例３で説明する。
【００４６】
ＩＩＩ．変異ｂｓＡｂを標的化可能な構築物
いくつかの実施態様では、本発明による変異ｂｓＡｂは標的化可能な構築物と結合する。変異ｂｓＡｂのｓｃＦｖが標的化可能な構築物と結合するのが好ましい。標的化可能な構築物は多様な構造であり得るが、十分な免疫応答を誘起することだけでなく、急速なin vivoクリアランスに関しても選択される。本発明における使用のための標的化可能な構築物の例としては、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる１９９９年６月２２日出願の米国出願番号０９／３３７，７５６、および２００１年４月３日出願の米国出願番号０９／８２３，７４６に記載されている。
【００４７】
疎水性薬剤は強い免疫応答を誘起するのに最良であるのに対して、親水性の薬剤は急速なin vivoクリアランスに好ましく、従って、必要な疎水性と親水性とのバランスを確立するべきである。これは、多くの有機体部分の固有の疎水性を相殺するため親水性のキレート剤の使用に頼ることによって一部達成されている。また、反対の溶液特性、例えばそのうちの一部は疎水性で一部は親水性であるアミノ酸を含むペプチドを有する標的化可能な構築物のサブユニットを選択してもよい。ペプチドの他に、炭水化物を用いてもよい。
【００４８】
わずか２アミノ酸残基しかないペプチドを用いてもよく、キレート剤などのその他の部分と共役するならば、２〜１０残基が好ましい。リンカーは分子量の低い複合体であるべきであり、分子量は５０，０００ダルトン未満であることが好ましく、約２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトンまたは５，０００ダルトン未満が有利であり、キレート中に金属イオンを含む。例えば、公知のペプチドＤＴＰＡ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＯＨ（式中、ＤＴＰＡはジエチレントリアミン五酢酸である）を用いて、この分子のインジウム−ＤＴＰＡ部分に対する抗体が産生されている。しかし、インジウム非含有分子を用いることによって、また適当なスクリーニング工程によって、チロシル−リシンジペプチドに対する新規なＡｂを作出することができる。通常、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２［式中、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧは式：
【化１】
2006502091.tif 000002
のヒスタミンスクシニルグリシル群である］、などの抗原性ペプチドは４以上の残基を有する。
【００４９】
金属非含有ペプチドを免疫原として用い、結果として生じるＡｂをＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ主鎖に対する反応性をスクリーニングしてもよい。
【００５０】
本発明はまた、最終のｂｓＡｂ／リンカー系とともに用いた場合、リンカー部分を認識するｓｃＦｖ成分が完全に特異的であることを確実にするため、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸の主鎖構造への組み込みも意図する。本発明はさらに、非天然アミノ酸およびペプチドから構築されたものなどのその他の主鎖構造も意図する。
【００５１】
免疫原として用いられるペプチドは、固相支持体ならびに反復直交性の脱保護およびカップリングの標準技術を用いて自動ペプチド合成装置で便宜に合成される。ペプチド中の遊離アミノ基は、後にキレート錯体に用いられるが、アセチル基などの標準の保護基を用いてブロッキングするのが有利である。このような保護基は当業者に公知であろう。Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N.Y.)を参照されたい。ペプチドを後の変異ｂｓＡｂの使用のために準備する場合、in vivo カルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、樹脂から切り取って対応するＣ末端アミドを生成すると有利である。
【００５２】
免疫原のハプテンは、免疫原性の認識部分、例えば化学ハプテンを含んでなる。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧまたはＤＴＰＡハプテンの使用により、抗体に対するリンカーの高い特異性が発揮される。これは、ＨＳＧまたはＤＴＰＡハプテンに対して作製された抗体が公知であり、この抗体のｓｃＦｖ部分が変異ｂｓＡｂへ容易に組み込まれるために生じる。よって、リンカーと、付着したハプテンとの結合はｓｃＦｖ成分に対して特異性が高いと思われる。
【００５３】
標的化可能な構築物は一価または二価であってよく、二価のペプチドが好ましいペプチドである。標的化可能な構築物の一例はＩＭＰ１９２（Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（ＴｓｃＧ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２）である。ＩＭＰ１９２は診断用にはＴｃ−９９ｍとＩｎ−１１１の双方と結合し、治療用にはＲｅ−１８８とＲｅ−１８６の双方と結合する。ＩＭＰ１９２もまた、チロシンを含む二価のＤＴＰＡ−ペプチドである。
【００５４】
本発明による方法において、標的化可能な構築物は、罹患組織の検出に有用な１以上の放射性同位元素を含んでよい。特に有用な診断用放射性核種としては、限定されるものではないが、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、またはその他のγ-、β-、または陽電子放射体が挙げられ、エネルギー範囲は２０〜４，０００ｋｅＶであることが好ましく、２５〜４，０００ｋｅＶがより好ましく、２０〜１，０００ｋｅＶがさらに好ましく、７０〜７００ｋｅＶがなお一層好ましい。
【００５５】
本発明による方法において、標的化可能な構築物は、罹患組織の検出に有用な１以上の放射性同位元素を含んでよい。特に有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃが挙げられる。治療用の放射性核種はエネルギー範囲が６０〜７００ｋｅＶであることが好ましい。
【００５６】
本発明による方法において、標的化可能な構築物は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いる１以上の造影剤を含んでよい。限定されるものではないが、標的化可能な化合物は、例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、およびＧｄなどの１以上の常磁性イオンを含む。
【００５７】
本発明による方法において、標的化可能な構築物は、超音波イメージングに用いる１以上の造影剤を含んでよい。限定されるものではないが、標的化可能な構築物は、例えば、１以上の超音波イメージング剤を含む。このような一つの実施態様では、標的化可能な構築物は、リポソーム脂質膜の外面に二価ＤＴＰＡ−ペプチドが共有結合したリポソームである。所望により、該リポソームはガス充填されてよい。
【００５８】
ＩＶ．キレート部分
リンカー部分に親水性のキレート部分が存在することにより急速なin vivoクリアランスが確実となる。親水性に加え、キレート剤はその金属結合特性で選択され、自由に変えられる。というのも、少なくともそのｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部分であるか、または非キレート化学ハプテンであるリンカーには、金属−キレート錯体の認識はもはや問題ではないからである。
【００５９】
特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられ、放射性イメージングおよびＲＡＩＴに４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２２５Ａｃとともに用いられる。同じキレート剤は、Ｍｎ、Ｆｅ、およびＧｄなどの非放射性金属とキレート化した場合、本発明による変異ｂｓＡｂとともに用いるとＭＲＩに使用できる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環状キレート剤は種々の金属および放射性金属とともに使用され、最も特にそれぞれＧａ、ＹおよびＣｕの放射性核種とともに使用される。
【００６０】
ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ系キレート剤は、リガンドにカルボン酸塩またはアミン基など硬い塩基のキレート性官能基が含まれる場合に、硬い酸のカチオン、特にＩＩａ族およびＩＩＩａ族の金属カチオンをキレート化するのに最も効果的である。このような金属−キレート錯体は、環の大きさを目的の金属に調製することによって非常に安定させることができる。大環状ポリエーテルなどその他の環状キレート剤は、ＲＡＩＴで２２３Ｒａなどの核種の安定した結合のために注目される。ポルフィリンキレート剤を多数の放射性金属とともに用いてもよく、ｂｓＡｂに導かれる免疫光線療法のためのある種の非放射性金属錯体としても有用である。１種類以上のキレート剤を担体と結合させて複数の金属イオン、例えば、非放射性イオン、診断用放射性核種および／または治療用放射性核種と結合させてよい。特に有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃが挙げられる。特に有用な診断用放射性核種としては、限定されるものではないが、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄおよび１７５Ｌｕが挙げられる。
【００６１】
米国特許第５，７５３，２０６号明細書に開示のものなどのキレート剤、特にチオセミ−カルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニル−アセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤は、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｂｉおよびその他の遷移金属の軟らかい酸のカチオン類、ランタニド類、ならびに軟らかい塩基のリガンド、特に硫黄またはリンを含むリガンドと緊密に結合するアクチニド類との結合に用いると有利である。１種類以上のキレート剤を、ペプチド、例えばＤＴＰＡまたは類似のキレート剤、例えばＩｎ（ＩＩＩ）カチオンのキレート剤、およびチオールを含むキレート剤、例えばＴｃカチオンのＴｓｃｇ−Ｃｙｓと結合させると有用である。ｄｉ−ＤＴＰＡハプテンの抗体は公知であり（Barbet‘395、前掲）、ターゲッティング抗体と容易に結合してｂｓＡｂを形成するため、放射性同位元素をターゲッティングするためのプレターゲッティングプロトコールで、ペプチドハプテンを非放射性ｄｉＤＴＰＡキレート剤および別のキレート剤を放射性同位元素との結合に使用することができる。このようなペプチドの一例はＡｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２である。このペプチドはＩｎ（ＩＩＩ）を予め付加し、その後９９ｍ−Ｔｃカチオンで標識することができ、Ｉｎ（ＩＩＩ）イオンはＤＴＰＡに選択的にキレート化され、Ｔｃカチオンはチオールを含むＴｓｃｇ−Ｃｙｓと選択的に結合する。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどのその他の硬い酸のキレート剤は、ＤＴＰＡ基と置換することができ、抗ｄｉ−ＤＴＰＡ  Ｍａｂの産生に用いるものと類似の技術を用いてそれらに特異的なＭａｂを作製することができる。
【００６２】
当然のことながら、２種類の異なる硬い酸または軟らかい酸のキレート剤を、例えば異なるキレート環サイズのリンカーへ組み込んで、異なるカチオンサイズ、キレート環の幾何学、およびカチオンの好ましい複合イオン構造のため、２種類の異なる硬い酸または軟らかい酸のカチオンと選択的に結合させることができる。これによって、その一方または双方が放射性であるかまたはＭＲＩ増強に有用である２種類の異なる金属を、プレターゲッティングされたｂｓＡｂよる最終捕捉のためのリンカーへ組み込むことが可能となる。
【００６３】
好ましいキレート剤としては、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴｓｃｇならびにその組み合わせが挙げられる。このようなキレート剤は、次の構造：
（ａ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｂ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
（ｃ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２；
【化２】
2006502091.tif 000003
に例示されるようなキレート剤−ペプチド複合体モチーフへ組み込まれている。
【００６４】
上記キレート剤−ペプチド複合体（ｄ）および（ｅ）は、６８Ｇａと結合することが示されており、従って陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）への適用に有用である。
【００６５】
キレート剤は、下記の実施例でより詳細に考察される標準の化学反応を用いてリンカー部分と結合される。要するに、ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２の合成は、ペプチドシンセサイザーのＲｉｎｋアミド樹脂へＡｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨが最初に付着することによって達成される。本明細書で用いられる保護基の省略形「Ａｌｏｃ」および「Ｆｍｏｃ」はアリールオキシカルボニルおよびフルオレニルメチルオキシカルボニルの基をさす。次にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＴｓｃＧを標準のＦｍｏｃ自動合成プロトコールを用いてリシンの側鎖へ加えて次のペプチド：Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ｒｉｎｋ樹脂を形成した。次にＡｌｏｃ基を取り除いた。次にペプチド合成をシンセサイザーで継続して次のペプチド：（Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−）−ｒｉｎｋ樹脂を形成した。その後Ｎ末端をアシル化し、Ａｌｏｃ保護基の側鎖を取り除いた。生じたペプチドを次に、カイザー試験を用いて樹脂がアミンに検査陰性となるまで活性化Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨで処理した。Karacay et al. Bioconjugate Chem. 11:842-854 (2000)参照。Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２の合成、ならびにＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；およびＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２の合成はより詳細に下に記載されている。
【００６６】
Ｖ．金属キレート調製のための一般法
キレート剤−ペプチド複合体は固形物と同じく長期間保存し得る。それらは計量して金属結合反応のための単位用量とし、固体、水溶液または半水溶液、冷凍溶液あるいは凍結乾燥調製物の単位用量として保存してよい。それらを周知の手順によって標識してもよい。一般的に、硬い酸のカチオンを便宜な塩の溶液として導入し、それを硬い酸のキレート剤、およびあるいは軟らかい酸のキレート剤にとる。しかし、軟らかい酸のカチオンを後で添加すると軟らかい酸のキレート剤がそれと結合し、そこでキレート化する可能性のある硬い酸のカチオンをどれも置換してしまう。例えば、たとえ過剰な量の非放射性１１１ＩｎＣｌ３の存在下でも、９９ｍ−Ｔｃ（Ｖ）グルコヘプトネートまたはin situで塩化第一錫およびＮａ９９ｍ−ＴｃＯ４を用いて生成したＴｃカチオンでの標識は、軟らかい酸のキレート剤上で量的に進行する。その他の１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１３Ｂｉなどの軟らかい酸のカチオン、ならびにＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ａｕ、Ｆｅ、Ａｇ（一価）、ＺｎおよびＨｇ、特に６４Ｃｕおよび６７Ｃｕなどの二価または三価のカチオンは、放射免疫診断または放射免疫治療に有用なものもいくつかあるが、類似の方法によってリンカーペプチド上に付加することができる。Ｒｅカチオンもin situでペルレナートおよび錫イオンから生成でき、または予め還元されたレニウムグルコヘプトネートまたはその他のトランスキレート剤を用いることもできる。ペルレナートの還元にはＴｃの還元に必要とされるよりも多い錫イオン（一般的に終濃度２００ｍｇ／ｍＬ超）が必要であるので、ジスルフィド−環化ペプチド中に存在するものなどの感受性の高いジスルフィド結合を高レベルの錫イオンが還元しないことを確実にするため特別な注意が必要である。レニウムでの放射性標識の際は、Ｔｃ−９９ｍで用いるのと類似の手順が用いられる。Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−リガンドのＲｅＯ金属錯体の好ましい調製方法は、ペプチドをＲｅＯＣｌ３（Ｐ（Ｐｈ３）２と反応させることによるが、ＲｅＯ（エチレンジアミン）２などのその他の還元種を用いることも可能である。
【００６７】
ＶＩ．抗体の作製方法
ペプチド主鎖に対する抗体は周知のＡｂ産生法によって作製する。例えば、フロイント完全アジュバントでの（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（式中、ＫＬＨはキーホルリンペットヘモシアニンであり、ｎは１〜３０である）などの免疫原の注射の後、フロイントの不完全アジュバント中に懸濁した同じ免疫原を免疫反応性のある動物へ２回注射し、静脈からの抗原の追加免疫３日後に脾臓細胞を回収する。回収した脾臓細胞を次にＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させ、生じたクローンの培養上清を直接結合ＥＬＩＳＡ法を用いて抗ペプチド反応性について分析した。生成したＡｂの優れた選択性は当初の免疫原のペプチドフラグメントを用いて分析できる。これらのフラグメントは自動ペプチドシンセサイザーを用いて容易に調製できる。Ａｂの産生のため、酵素の欠乏したハイブリドーマを単離して融合した細胞株の選択を可能にする。この技術はまた、１以上のリンカーを含むキレート、例えばＩｎ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡキレートに対する抗体を作製するのに用いることができる。Ｉｎ（ＩＩＩ）−ｄｉ−ＤＴＰＡのモノクローナルマウス抗体が公知である（Barbet‘395, 前掲）。
【００６８】
本発明で用いられる変異二重特異性抗体は、マーカー物質のように種々の細胞表面または細胞内の腫瘍関連抗原に特異的である。このようなマーカーは、腫瘍により産生された物質、もしくは細胞質中、核中であろうと種々の細胞小器官あるいは細胞の下部構造中であろうと、腫瘍部位、腫瘍細胞表面上または腫瘍細胞内に集積する物質であってよい。このような腫瘍関連マーカーのの中には、Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cancer", page 347 (American Association of Clinical Chemists, 1979) および米国特許第４，１５０，１４９号明細書；同第４，３６１，５４４号明細書；および４，４４４，７４４号明細書に開示されているものがある。
【００６９】
腫瘍関連マーカーは、Herberman（前掲）によって、腫瘍胎児抗原、胎盤の抗原、発癌または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモンおよび正常な抗原またはその変異形態をはじめとするいくつかのカテゴリーに分類されている。時折、腫瘍関連マーカーのサブユニットを用いて腫瘍特異性の高い抗体、例えば、米国特許第４，３６１，６４４号明細書および同第４，４４４，７４４号明細書に開示のように非腫瘍物質に対する交差反応性が非常に低減された抗体の産生を刺激するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のβサブユニットまたは癌胎児抗原（ＣＥＡ）のγ領域を作製することが有利である。
【００７０】
注目されるもう一つのマーカーは、トランスメンブランアクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用子（ＴＡＣＩ）である。Yu et al. Nat. Immunol. 1:252-256 (2000)参照。要するに、ＴＡＣＩはＢ細胞の悪性腫瘍（例えばリンパ腫）のマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子ホモログである増殖誘発リガンド（ＡＰＲＩＬ）によって結合することが知られている。ＡＰＲＩＬは、一次Ｂ細胞およびＴ細胞のin vitroでの増殖を刺激し、Ｂ細胞のin vivoでの集積により脾臓重量を増加させる。ＡＰＲＩＬはまた、受容体結合に関してＴＡＬＬ−Ｉ（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）と競合する。可溶性ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩは、ＡＰＲＩＬの結合を特異的に阻止し、ＡＰＲＩＬに刺激される一次Ｂ細胞の増殖を阻害する。ＢＣＭＡ−Ｆｃはまた、マウスにおいてキーホルリンペットヘモシアニンおよびニューモバックスに対する抗体の産生を阻害し、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介するＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−Ｉのシグナル伝達が、液性免疫の生成に必要なことを示している。よって、２リガンド−２受容体経路からのＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−ＩおよびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩは、Ｂ細胞およびＴ細胞機能の刺激に関与する。
【００７１】
免疫原に対する最初の抗体を作製した後、抗体を配列決定し、その後組換え技術によって生産すればよい。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体はマウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖可変領域からヒト可変ドメインへ移すことによって作出し、その後、マウス対応物の枠組み構造領域中の ヒト残基を置換する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を未然に防ぐ。マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングの一般的技術は、例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるOrlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)の刊行物に記載されている。ヒト化Ｍａｂを作出する技術は、例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるJones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), and Singer et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)に記載されている。
【００７２】
あるいは、完全なヒト抗体は、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); 米国特許第５，６３３，４２５号明細書を参照されたい。例えば、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収できる。このマウス体液性免疫機構は、内在性免疫グロブリン遺伝子を不活性化して、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化されている。このヒト免疫グロブリン遺伝子座は非常に複雑で、あわせてヒトゲノムのほぼ０．２％を占める多数の不連続セグメントを含んでなる。トランスジェニックマウスの適当な抗体レパートリー産生を確実するために、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座の大部分をマウスゲノムへ導入しなければならない。これは、生殖細胞系構成における、ヒトＨ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から始まる段階的なプロセスで達成される。各々の挿入体はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築物は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。２つのＹＡＣは、１つがＨ鎖遺伝子座を含み、１つがＬ鎖遺伝子座を含み、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラスト（spheroblast）マウス胚幹細胞を融合させて個別にマウスへ導入される。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞に微量注入する。その結果得られたキメラ雄動物の生殖細胞系統を介するＹＡＣ伝達能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスを繁殖させた。一種はヒトＨ鎖の遺伝子座を含み、もう一種はヒトＬ鎖遺伝子座を含む二種のトランスジェニック系統のマウスを繁殖させることによって、免疫化に反応してヒト抗体を産生する子孫をつくる。
【００７３】
再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子もまた、微小核体媒介性染色体移入法（ＭＭＣＴ）によってマウス胚幹細胞へ導入できる。例えば、Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)を参照されたい。この方法論ではヒト染色体を含む微小核体をマウス胚幹細胞と融合させる。移入された染色体は安定して保持され、成体キメラは適当な組織特異的発現を示す。
【００７４】
あるいは、本発明による抗体または抗体フラグメントは、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離したヒト抗体フラグメントに由来するものであってもよい。例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるBarbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119 (1991),およびWinter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)を参照されたい。Ｂ細胞を不死化させてモノクローナル抗体を産生することに関連する困難の多くは、ファージディスプレーを用いて抗体フラグメントを操作し大腸菌に発現させることによって克服できる。高親和性の回復を確実にするために、モノクローナル抗体コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーは大きなレパートリーを含まなければならない。一般的戦略では、免疫マウスのリンパ球または脾臓細胞から得たｍＲＮＡを利用して、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子をＰＣＲによって個別に増幅し、ファージクローニングベクターに連結する。一方はＨ鎖遺伝子を含み、他方はＬ鎖遺伝子を含む二種類の異なるライブラリーを作製する。ファージＤＮＡを各ライブラリーから単離し、Ｈ鎖およびＬ鎖配列を連結し、パッケージングしてコンビナトリアルライブラリーを形成する。各々のファージはＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡの無作為の組み合わせを含み、大腸菌に感染させた際に感染細胞中で抗体鎖の発現を指示する。注目される抗原を認識する抗体を同定するため、ファージライブラリーをプレーティングし、プラーク中に存在する抗体分子を膜へ移す。この膜を放射性標識した抗原でインキュベートし、次に洗浄して過剰な非結合リガンドを取り除く。オートラジオグラムの放射性スポットが抗原と結合している抗体を含むプラークを識別する。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーの作出に有用なクローニングおよび発現ベクターを、例えば、STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA)から得ることができる。
【００７５】
類似の手法を用いて高親和性ｓｃＦｖが得られる。例えば、Vaughn et al., Nat. Biotechnol., 14: 309-314 (1996)を参照されたい。広いレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーは、全て公知のＶＨ、ＶｋおよびＶλ遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを用いて非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子を単離することにより構築できる。増幅の後、ＶｋおよびＶλプールを合わせて一つのプールとする。これらのフラグメントをファージミドベクターへ連結する。ｓｃＦｖリンカー、（Ｇｌｙ４、Ｓｅｒ）３をその後、ＶＬフラグメントのファージミド上流へ連結する。ＶＨおよびリンカー−ＶＬフラグメントを増幅させ、ＪＨ領域に構築する。結果として生じるＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントをファージミドベクターへ連結する。ファージミドライブラリーを、上記のようにフィルターか、またはイムノチューブ(Nunc; Maxisorp)を用いて選別する。類似の結果は、免疫ウサギのリンパ球または脾臓細胞由来のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築し、ピキア・パストリス(P. pastoris)でｓｃＦｖ構築物を発現させることによって達成することができる。例えば、Ridder et al., Biotechnology, 13: 255-260 (1995)を参照されたい。さらに、適当なｓｃＦｖを単離した後、結合親和性が高くおよび解離率の低い抗体フラグメントが、ＣＤＲ３変異誘発および鎖のシャッフリングなどの親和性成熟プロセスによって得られる。例えば、Jackson et al., Br. J. Cancer, 78: 181-188 (1998); Osbourn et al., Immunotechnology, 2: 181-196 (1996)を参照されたい。  
【００７６】
種々の組換え法を用いて二重特異性抗体および抗体フラグメントを作出できる。例えば、二重特異性抗体および抗体フラグメントをトランスジェニック家畜の乳汁中で産生できる。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63: 141-147, 1998;米国特許第５，８２７，６９０号明細書を参照されたい。対をなす免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む二つのＤＮＡ構築物を調製する。このフラグメントを、哺乳類上皮細胞中で優先的に発現されるプロモーター配列を含む発現ベクターへクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入されたフラグメントの３’部位に哺乳類特異的遺伝子由来の同族のゲノム配列が隣接する。これによりポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。この発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に同時注入し、次いでレシピエント雌の子宮に着床させて妊娠させる。出産後、双方のトランス遺伝子の存在についてサザン分析でその後代をスクリーニングする。抗体が存在するためには、Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子双方が同時に同じ細胞中で発現されなければならない。トランスジェニック雌動物から得た乳汁を当技術分野で公知の標準的免疫学的方法により、該抗体または抗体フラグメントの存在と機能性を分析する。この抗体は当技術分野で公知の標準的方法により、乳汁から精製することができる。
【００７７】
キメラＡｂは、マウスＬ鎖可変およびＨ鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントをヒト抗体由来Ｃドメインをコードするフラグメントに連結することによって構築される。Ｃドメインは抗原結合を導かないため、キメラ抗体は元のマウスＡｂと同じ抗原特異性を保持するが、配列でヒト抗体により近くなる。キメラＡｂはなおマウス配列を一部含み、また一方、依然として免疫原性である可能性がある。ヒト化Ａｂは、抗体を認識するのに必要なマウスアミノ酸のみを含む。この産物はヒト抗体枠組み構造中へマウス相補性決定領域由来のアミノ酸を形成することによって構築される。
【００７８】
ＶＩＩ．変異二重特異性抗体の設計および発現のための一般法
種々の変異誘発技術を用いて本発明による変異ｂｓＡｂを構築してよい。当業者であればこのような技術に精通しているであろう。例えば、変異ｂｓＡｂの発現ベクターは、変異したＨＣフラグメントを構築し、このフラグメントを、親ｂｓＡｂの発現ベクターへサブクローニングして対応する野生型フラグメントを置換し、宿主細胞にベクターをトランスフェクトして得てもよい。
【００７９】
親ｂｓＡｂの発現ベクターを得るために、当業者は容易に利用できる技術を用いることができる。このような技術のうちのいくつかが、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる１９９９年６月２２日出願の米国出願番号０９／３３７，７５６に開示されている。要するに、ｈＭＮ１４ＩｇＧ−（７３４  ｓｃＦｖ）２などの親ｂｓＡｂの発現ベクターを構築するため、単鎖７３４Ｆｖ（７３４ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子セグメントを構築すればよい。この７３４ｓｃＦｖセグメントは、短く柔軟なリンカー（ｓＬ）(Coloma & Morrison 1997 p.787/id)をコードするＤＮＡフラグメントを介してヒトγ鎖遺伝子の３’末端と結合してよく、その結果ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｓＬ−７３４ｓｃＦｖ（ＣＨ−ｓｃＦｖ）の融合遺伝子配列となる。このＣＨ−ｓｃＦｖ融合遺伝子セグメントは、次に同じくｈＭＮ−１４ Ｌ鎖遺伝子セグメントを含む発現ベクターｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２中で、ｈＭＮ−１４ ＶＨの配列、ならびにトランスフェクタントの選択のため、またその結果生じたトランスフェクトされた配列の増幅のためのｄｈｆｒ遺伝子と結合させることができる(Dorai & Moore 1987 p. 815/id and Gillies, Lo et al. 1989 p. 131/id)。ｈＭＮ１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２（ｂｓＡｂ２ｐｄＨＬ２）をコードするベクターは、融合ｂｓＡｂの発現のためのＳｐ２／０骨髄腫細胞へトランスフェクトすればよい。ｂｓＡｂ、ｈＭＮ１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２は、アフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。親または変異ｂｓＡｂ内の異なる結合部分の免疫反応性を評価するため、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行ってもよい。
【００８０】
その他の特異性および個別の変異ｂｓＡｂを有するＩｇＧ−ｓｃＦｖのｂｓＡｂは、ＩｇＧおよび／またはｓｃＦｖの可変領域配列だけを、その他のＡｂのもので置換することによって作製することができる。ＣＤＲグラフト化変異ｂｓＡｂは、ＩｇＧまたはｓｃＦｖの可変領域配列だけをＣＤＲグラフト化Ａｂで置換することによって作出することができる。一般に、この「ＣＤＲグラフト化」技術は、マウスＣＤＲ、ヒト可変領域枠組み構造およびヒト定常領域からなる組換え、医薬抗体の作製に適用されてきた（例えばRiechmann, L. et al, (1988) Nature, 332, 323-327)。このような「再構成」または「ヒト化」抗体はキメラ抗体よりもマウスの含有部分が少なく、ヒトＦｃ依存性エフェクター機能の刺激に必要なヒト定常領域を保持する。その結果、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトへ投与した時にキメラ抗体よりもＨＡＭＡ反応を惹起する可能性は低く、循環系中のそれらの半減期はヒト自然抗体のものに近づくはずであり、それらの診断および治療価値は向上する。
【００８１】
実際には、元のマウス抗体の特異性を保持している有効なヒト化抗体を作製するためには、単にＣＤＲを置換するだけでは十分でないことが普通である。さらに、少数の重要なマウス抗体残基をヒト可変領域中へ組み込む必要がある。このような残基の同定は、元のマウス抗体およびアクセプターであるヒト抗体の双方の構造に依存する。英国特許出願番号９０１９８１２．８（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）は、有効な抗原結合を促進するのに十分な外来残基の置換の最低数を同定する方法を開示している。本発明の一つの実施態様では、変異融合タンパク質のＦｖおよびｓｃＦｖはＣＤＲグラフト化マウスＦｖおよびｓｃＦｖである。本発明の別の実施態様では、変異融合タンパク質のＦｖおよびｓｃＦｖはヒト化されている。一つの実施態様では、Ｆｖは７３４ｓｃＦｖに由来するものであり、ｓｃＦｖは７３４ｓｃＦｖである。本発明の好ましい実施態様では、変異融合タンパク質はｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２である。
【００８２】
ＶＩＩＩ．変異ｂｓＡｂの投与方法
本発明は、米国特許第６，１２６，９１６号明細書；同第６，０７７，４９９号明細書；同第６，０１０，６８０号明細書；同第５，７７６，０９５号明細書；同第５，７７６，０９４号明細書；同第５，７７６，０９３号明細書；同第５，７７２，９８１号明細書；同第５，７５３，２０６号明細書；同第５，７４６，９９６号明細書；同第５，６９７，９０２号明細書；同第５，３２８，６７９号明細書；同第５，１２８，１１９号明細書；同第５，１０１，８２７号明細書；および同第４，７３５，２１０号明細書に記載の方法を用いて、正常組織および器官の処置および／またはイメージングにおける、本発明による二重特異性抗体および標的化可能な構築物の使用を意図する。さらなる方法は１９９９年６月２２日出願の米国出願番号０９／３３７，７５６、および２００１年４月３日出願の米国出願番号０９／８２３，７４６に記載されている。本明細書において「組織」とは、限定されるものではないが、卵巣、胸腺、副甲状腺または脾臓由来の組織をはじめとする組織をさす。本発明による変異ｂｓＡｂで治療可能な疾患および状態の例としては、免疫調節障害、自己免疫疾患、臓器移植拒絶症または移植片対宿主病が挙げられる。Ｂ細胞を標的化する抗体を用いる自己免疫疾患の免疫療法はＷＯ００／７４７１８ｍに記載されており、このクレームは米国仮出願番号６０／１３８，２８４号に優先するものである（引用することによりその全内容を本明細書の一部とする）。自己免疫疾患の例としては、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、溶血性連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑らい、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、類肉腫症、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェジナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、および繊維性肺胞炎がある。
【００８３】
本発明による変異ｂｓＡｂは、一次ターゲッティング種としてプレターゲッティング法に使用してもよい。プレターゲッティング法では、変異ｂｓＡｂを投与する。一次ターゲッティング種が十分に付着したら、標的化可能な構築物を投与する。標的化可能な構築物は、一次ターゲッティング種および診断剤または治療剤の利用可能な結合部位を認識する結合部位を含んでなる。標的化可能な構築物の例は上述したとおりである。試薬の用量およびタイミングは、当業者には容易に決定できるものであり、用いる試薬の特有の性質に依存する。プレターゲッティング法はクリアランス剤を用いて行っても、用いずに行ってもよい。
【００８４】
ｂｓＡｂが罹患組織に対して標的化するのに十分な時間が経過したら、診断剤を投与する。診断剤の投与の後、イメージングを行うことができる。腫瘍は、適当な波長光が送達される種々の構造を直接または間接に調べることによって体腔中の腫瘍を検出することができ、その後回収できる。体のどの部位の病巣であっても、非電離放射線が送達され、それらの構造から再捕捉される限り、調べることができる。例えば、高解像度、非侵襲性のイメージング技術であるＰＥＴをヒト疾病の視覚化のために本発明による抗体とともに使用できる。ＰＥＴでは、Ｆ−１８を陽電子放射体として用いる場合、陽電子崩壊減衰中に生じる５１１ｋｅＶのγ光子が検出される。
【００８５】
本発明は、一般に２５〜６００ｋｅＶのγ粒子および／または陽電子を放射する診断剤の使用を意図する。このような薬剤の例としては、限定されるものではないが、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４〜１５８Ｇｄおよび１７５Ｌｕが挙げられる。
【００８６】
術中／内視鏡プローブを用いる検出も、本発明による変異ｂｓＡｂおよびＩ−１２５標識されたペプチドである標的化可能な構築物を利用する方法において意図される。このような方法は、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第５，７１６，５９５号明細書および同第６，０９６，２８９号明細書に開示されている。
【００８７】
本変異ｂｓＡｂは、米国特許第６，０９６，２８９号明細書；同第４，３３１，６４７号明細書；同第４，８１８，７０９号明細書；同第４，３４８，３７６号明細書；同第４，３６１，５４４号明細書；同第４，４４４，７４４号明細書；同第５，８５１，５２７号明細書に論じられている光線力学療法（ＰＤＴ）に用いることができる。
【００８８】
ＰＤＴでは、感光剤、例えばジヘマトポルフィリンエーテルなどのヘマトポルフィリン誘導体を被験体へ投与する。抗腫瘍活性は、例えば６３０ｎｍの光を用いて惹起する。膜が日光によって増感しない、長い波長に有用なものをはじめとする代わりの感光剤が利用できる。このような感光剤の例としては、限定されるものではないが、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）およびルテチウムタキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）が挙げられる。
【００８９】
さらに、ＰＤＴでは、診断剤を例えば全身に注射し、レーザー誘起蛍光を用いて内視鏡により光活性化剤の付着している癌の部位を検出する。例えば、これは初期肺腫瘍の蛍光気管支鏡検査に適用されている。Doiron et al. Chest 76:32 (1979)。別の例では、抗体および抗体フラグメントを単光子放出に用いることができる。例えば、Ｔｃ−９９ｍ標識した診断剤を、本発明による抗体または抗体フラグメントの投与の後に被験体へ投与してよい。その後被験体を、単光子放出コンピュータ断層撮影画像を生じるγ線カメラでスキャンし、病巣または腫瘍部位を決定する。
【００９０】
治療上有用な免疫複合体は、光活性薬または色素を抗体複合体と結合させることにより得ることができる。蛍光またはその他の色素体、あるいはポルフィリンなどの色素は可視光に感受性であり、好適な光線を病巣に向けることにより病巣の検出および治療に用いられてきた。治療では、これは光照射、光療法、または光線力学療法と呼ばれている(Jori et al. (eds.), Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986))。さらに、光療法を達するためには、モノクローナル抗体を光活性色素と結合させる（Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983); idem., Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986); idem., Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991)）。しかし、これらの初期の研究には、内視鏡での治療、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントを用いるものの使用は含まれていない。従って、本発明は、光活性薬または色素を含んでなる免疫複合体の使用を意図する。
【００９１】
リンカー部分はまた、標的部位のプロドラッグを活性化できる、または身体の解毒経路を制御することにより通常の治療の効果を改善することのできる酵素と結合させてもよい。ｂｓＡｂの投与に続いて、リンカー部分と結合した酵素、ｂｓＡｂの２番目のアーム（ｓｃＦｖ成分）に認識される分子量の低いハプテンを投与する。酵素を標的部位へプレターゲッティングした後、標的部位で作用することが知られている細胞傷害性の薬物を注入する。この薬物は哺乳類の通常の解毒プロセスにより解毒されるものであればよい。例えば、この薬物は、肝臓毒性の低いグルクロニドに変換され得る。解毒された中間体は、次に、標的部位でプレターゲッティングされた酵素によってより有毒な形態へ再変換することができる。あるいは、投与されたプロドラッグを、プレターゲッティングされた酵素により有効な薬物へと変換することもできる。プレターゲッティングされた酵素は、解毒された薬物を再利用することにより治療の効果を向上させる。この手法は、いずれの酵素−薬物対を用いる場合にも適用することができる。
【００９２】
抗癌治療に有用なある種の細胞傷害性薬物は、比較的血清に不溶性である。結合されない形態では非常に有毒なものも中にはあるが、プロドラッグへ変換することによりその毒性は相当に低減される。難溶性の薬物をより可溶性の複合体、例えばグルクロニド、親水性酸とのエステルまたは親水性アミンとのアミドへ変換すると、その薬物の血清の水性相での可溶性、ならびに静脈、動脈、または細胞壁毛細官を通過し、腫瘍を浸している間質液まで到達する能力が改善される。プロドラッグの開裂により、可溶性の低い薬物が標的部位に置かれる。このようなプロドラッグから薬物への変換の多くの例が、Ｈａｎｓｅｎ米国特許第５，８５１，５２７号明細書に開示されている。
【００９３】
肝臓で芳香族または脂環式アルコール、チオール、フェノールおよびアミンなどのある種の有毒物質がグルクロニドへ変換されることは、それらを解毒し、より尿中に排泄しやすくする身体の手段である。このような物質へ変換できるある種の抗腫瘍薬は、エピルビシン、ドキソルビシンの４−エピマー（アドリアマイシン）であり、これはアントラサイクリン配糖体でヒトβ−Ｄ−グルクロニダーゼの基質であることが示されている。例えば、Arcamone Cancer Res. 45:5995 (1985)を参照されたい。極性基のより少ないその他の類似体は、より脂肪親和性であると考えられ、このような手法に大いに有望である。芳香族または脂環式アルコール、チオールまたはアミン基を含むその他の薬物または毒素は、このような複合体形成のための候補である。このような薬物、またはその他のそのプロドラッグ形態は、本発明による部位特異的増強法に好適な候補である。
【００９４】
プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）はin vivoでカルボキシルエステラーゼによって活性代謝物ＳＮ−３８に変換される。従って、本発明の一つの適用例は、腫瘍およびハプテン（例えばｄｉ−ＤＴＰＡ）に対して標的化したｂｓＡｂを用い、その後にｄｉ−ＤＴＰＡ−カルボキシルエステラーゼ複合体を注射することである。好適な腫瘍対バックグラウンド局在比に達したならば、ＣＰＴ−１１を投与する。腫瘍局在性カルボキシルエステラーゼは、腫瘍でＣＰＴ−１１をＳＮ−３８へ変換するのに役立つ。可溶性が低いために、活性のあるＳＮ−３８は腫瘍近傍に残ったままとなり、その結果、標的とされる抗原について陰性の隣接する腫瘍細胞へ効果を発揮する。これは本方法のさらなる利点である。カルボキシルエステラーゼの変更形態は既に文献に記載されており、本発明の範囲内にある。例えば、Potter et al., Cancer Res. 58:2646-2651 (1998)およびPotter et al., Cancer Res. 58:3627-3632 (1998)を参照されたい。
【００９５】
エトポシドは、そのグルクロニド形成によって大部分が解毒される、広く用いられる制癌剤であり、本発明の範囲内にある。例えば、Hande et al. Cancer Res. 48:1829-1834 (1988)を参照されたい。グルクロニド複合体は、細胞傷害性薬物から製造でき、ｍＡｂ−グルクロニダーゼ複合体を用いてプレターゲッティングした腫瘍の治療時に注入できる。例えば、Wang et al. Cancer Res. 52:4484-4491 (1992)を参照されたい。従って、このような複合体も本明細書に記載のプレターゲッティング手法とともに使用できる。同様に、ダウノマイシンおよびドキソルビシンの誘導体に基づいて設計されたプロドラッグは、カルボキシルエステラーゼおよびグルクロニダーゼとの併用について記載されている。例えば、Bakina et al. J. Med Chem. 40:4013-4018 (1997)を参照されたい。本発明の範囲内で使用できるプロドラッグ／酵素対のその他の例としては、限定されるものではないが、フェノールマスタードおよびβ−グルクロニダーゼのヒドロキシ誘導体のグルクロニドプロドラッグ；フェノールマスタードまたはＣＰＴ−１１およびカルボキシペプチダーゼ；メトトレキサート置換α−アミノ酸およびカルボキシペプチダーゼＡ；６−メルカプトプリンおよびドキソルビシンなどの薬物のペニシリンまたはセファロスポリン複合体およびβ−ラクタマーゼ；リン酸エトポシドおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。
【００９６】
あるいは、標的部位でプロドラッグを活性化させるか、または身体の解毒経路を制御することにより通常の治療の効力を向上させる能力のある酵素は、ハプテンと結合させてもよい。プレターゲッティングｂｓＡｂの投与の後に酵素−ハプテン複合体を被験体へ投与し、標的部位に向ける。酵素が標的部位に局在した後、標的部位で作用することが知られている細胞傷害性薬物、またはin situでプレターゲッティングされた酵素によって薬物へ変換されるそのプロドラッグ形態を注射する。上記で論じたように、この薬物は、哺乳類の通常の解毒プロセスを用いて、解毒されて毒性の低い中間体、最も一般的にはグルクロニドを形成する。解毒された中間体、例えばグルクロニドは、プレターゲッティングされた酵素によってそのより有毒な形態へ再変換され、従って標的部位での細胞傷害性が高くなる。この結果、薬物が再利用される。同様に、投与したプロドラッグを通常の生物学的プロセスによって有効な薬物へ変換できる。プレターゲッティングされた酵素は、解毒された薬物を再利用することにより治療の効力を高める。このアプローチは、どの酵素−薬物対を用いる場合にも適用できる。
【００９７】
本発明はさらに、ホウ素中性子捕捉療法(Boron Neutron Capture Therapy, BNCT)プロトコールに照らした、本発明によるｂｓＡｂおよび診断剤の使用を意図する。ＢＮＣＴは、腫瘍に局在する１０Ｂ原子の中性子照射によって電離放射線を腫瘍細胞へ送達するように設計された二元システムである。ＢＮＣＴは、安定したイソ型である同位体標識１０Ｂ（自然界には１９．８％の割合で存在）が熱中性子照射されてα粒子および７Ｌｉ原子核を生じる際に起こる核反応に基づく。これらの粒子の飛程は約１細胞径であり、結果として線形の高エネルギー転移を生じる。この核反応で生じる飛程の短い１．７ＭｅＶのα粒子がほんのわずかあれば、細胞核を標的とし、それを破壊するのに十分である。ＢＮＣＴで癌治療を成功させるには高濃度の１０Ｂを腫瘍部位に局在させるが、標的でない器官は基本的にホウ素を含まないままにしておく方法が必要である。ＢＮＣＴのためのプレターゲッティングｂｓＡｂを用いて被験体内で腫瘍を治療する組成物および方法は、同時係属の特許出願第０９／２０５，２４３号に記載され、本発明の目的のために容易に修正できる。
【００９８】
本発明による変異ｂｓＡｂのｓｃＦｖ成分もまた、酵素に特異的なものとすることができる点に留意すべきである。
【００９９】
変異ｂｓＡｂの投与と標的化可能な構築物の投与との間で加えるクリアランス剤を用いてもよい。本発明者らは新規な機構作用を有するクリアランス剤、つまりｂｓＡｂの疾病ターゲッティングアームに標的化されたグリコシル化抗イディオタイプのＦａｂ’フラグメントを本発明に用い得ることを見出した。抗−ＣＥＡ（ＭＮ１４Ａｂ）ｘ抗−ペプチドｂｓＡｂを得、疾病標的に最大限まで付着させる。残余ｂｓＡｂを除去するため、ＷＩ２と称する、ＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂを、好ましくはグリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして得る。クリアランス剤は一価の様式でｂｓＡｂと結合するが、それに付属するグリコシル残基は全複合体を急速な代謝が起こる肝臓へ向ける。その後、リンカー部分に関連する治療が患者に対して行われる。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２ Ａｂは高親和性で、クリアランス機構はその他の開示される機構とは異なる（Goodwin et al．同上参照）。それは、ＷＩ２−Ｆａｂ’が一価の部分であるため、架橋を伴わないからである。
【０１００】
本変異ｂｓＡｂはまた、超音波イメージング法でも使用できる。造影剤などの超音波増強剤は、二価のＤＴＰＡペプチドなどの標的化可能な構築物と結合してもよい。限定されるものではないが、リポソーム、好ましくはガス充填したリポソームなどの増強剤を用いてよい。この方法では、変異ｂｓＡｂが最初に投与され、その後リポソーム−標的化可能な構築物複合体が投与される。Maresca, G. et al., Eur J. Radiol. Suppl. 2 S171-178 (1998); Demos, Sm. Et al. J. Drug Target 5 507-518 (1998);およびUnger, E. et al., Am J. Cardiol. 81 58G-61G (1998)を参照されたい。
【０１０１】
変異二重特異性抗体は、多成分治療法の一成分として投与してよい。変異二重特異性抗体は、疾病または症状を治療するために用いられる少なくとも１種類の治療剤の投与前、投与中、または投与後に投与してよい。
【０１０２】
プレターゲッティング法における変異ｂｓＡｂの使用例は、プレターゲッティング法における親ｂｓＡｂの使用との比較において、実施例２に説明されている。このデータにより、親ｂｓＡｂと比較した、本発明による変異ｂｓＡｂのクリアランス速度の上昇が説明される。さらに、該データにより、変異ｂｓＡｂが用いられる場合と比較して、親ｂｓＡｂが用いられる場合に、より大量の標的化可能な構築物が血中で捕捉されることが説明される。
【０１０３】
図５および６は、親ｂｓＡｂ、１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２に関するプレターゲッティング法のデータを示す。図７は、変異ｂｓＡｂ、１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２に関するプレターゲッティング法のデータを示す。１２５Ｉ標識によって、身体の異なる領域に存在するｂｓＡｂの量を決定することができる。図５および７のデータ比較は、変異ｂｓＡｂが親ｂｓＡｂよりも速く身体から消失することを示す。例えば、親ｂｓＡｂで４日間のプレターゲッティング後（図５）、およびＩＭＰ−１９２の注射後３時間の、腫瘍および血液の％ＩＤ／ｇは、それぞれ１９．２１±７．３１８および３．７３±０．７５であった。これに対して、変異ｂｓＡｂで４日間のプレターゲッティング後（図５）、およびＩＭＰ−１９２の注射後３時間の、腫瘍および血液の％ＩＤ／ｇは、それぞれ２．４２±０．７８および０．０７±０．０１であった。
【０１０４】
図５および７の１２５Ｉの腫瘍対血液比の比較（図５および７の「血液」の欄参照）によれば、変異ｂｓＡｂに関して高いシグナル対バックグラウンド比が達成されたことが実証される。親ｂｓＡｂでのプレターゲッティングの６日後でさえ（図４参照）、腫瘍対血液比は、変異ｂｓＡｂでのプレターゲッティングの４日後よりもはるかに低い。
【０１０５】
９９ｍＴｃ標識によって、身体の異なる領域に存在する標的化可能な構築物の量を決定することができる。ＩＭＰ−１９２（９９ｍＴｃ標識した標的化可能な構築物）の％ＩＤ／ｇの比較は、腫瘍対血液比が変異ｂｓＡｂを用いるプレターゲッティング法に関してはるかに高いことを示す。この結果は、変異ｂｓＡｂに関するプレターゲッティング法において血中で捕捉された標的化可能な構築物のほうが少ないことを説明する。親ｂｓＡｂを用いた場合（図５および６参照）、９９ｍＴｃ標識した標的化可能な構築物は、腫瘍部位に現れるよりもむしろ血中で捕捉される。したがって、低い腫瘍対血液比が認められる。例えば、９９ｍＴｃ標識した標的化可能な構築物の腫瘍対血液比は、図５（親ｂｓＡｂ）の左側、「血液」の欄に示される。注射後３時間の腫瘍対血液比は０．２４±０．０５である。それに対して、図５（変異ｂｓＡｂ）では注射後３時間の腫瘍対血液比は３．５２±１．４５である。
【０１０６】
ＩＸ．その他の適用例
本発明は、米国特許第５，７１６，５９５号明細書および同第６，０９６，２８９号明細書に記載されているように、上記に論じた変異ｂｓＡｂおよびリンカー部分と結合した治療剤の手術中、血管内での使用、ならびに内視鏡による腫瘍および病巣の検出、生検および治療を包含する。
【０１０７】
本発明による変異ｂｓＡｂは、治療またはイメージング目的だけでなく、in vitroで研究を行う際の補助としても用いることができる。例えば、本発明によるｂｓＡｂをin vitroで用いることにより、標的化可能な構築物が１以上のｂｓＡｂを含む安定した複合体を形成できるかどうかを確かめることができる。このようなアッセイは、ｂｓＡｂを含む安定した複合体を形成する標的化可能な構築物の同定の際に当業者の助けとなる。これによって、次に当業者は治療剤および／またはイメージング剤として優れていると思われる標的化可能な構築物を同定することができる。
【０１０８】
アッセイは、当該の標的化可能な構築物と少なくとも２モル当量の変異ｂｓＡｂとを組み合わせて行うのが有利である。インキュベーションの後、混合物をサイズ排除ＨＰＬＣで分析して該構築物がｂｓＡｂと結合しているかどうかを判断する。あるいは、種々のｂｓＡｂ溶液を標準的な９６ウェルプレートへ置くという、標準的なコンビナトリアル（組み合わせ）法を用いてアッセイを行う。各ウェルには、標的化可能な構築物の溶液を加える。インキュベーションおよび分析を受けて、どの構築物がどのｂｓＡｂと最も良く結合するかが容易に判断できる。
【０１０９】
当然のことながら、変異ｂｓＡｂの標的化可能な構築物への添加順序は重要ではない。つまり、変異ｂｓＡｂを構築物へ加えてよく、逆もまた同じである。同様に、変異ｂｓＡｂも構築物も溶液中にある必要はない。つまり、それらは溶液中で加えてもそのまま加えてもよく、そのうち最も便宜なものであってよい。最後に、結合が確立さえすれば、結合の分析方法は重大ではない。よって、限定されるものではないが、ＦＡＢＭＳ、高磁界ＮＭＲ、またはサイズ排除ＨＰＬＣと併せた、またはその代わりとなるその他の適当な方法をはじめとする標準的分析法を用いて結合を分析してよい。
【実施例】
【０１１０】
材料および方法
７３４ｓｃＦｖの設計および構築
７３４ｓｃＦｖを、ｓＬ−Ｖλ−Ｌ−ＶＨの配置を有するよう設計した。式中、ｓＬは短く柔軟なリンカー、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ(Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15:159-163 (1997))であり、ｈＭＮ−１４ＩｇＧ  Ｈ鎖と７３４ｓｃＦｖとの間の結合の役割を果たし、Ｌは３反復のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ(Huston, Levinson, et al. PNAS 85:5879-5883 (1988))からなる７３４のＶλおよびＶＨとの間の長いリンカーである。プライマー対７３４ＶＬｓｃＦｖ５’（Ｃｙｓ）／７３４ＶＬｓｃＦｖ３’および７３４ＶＨｓｃＦｖ５’／７３４ＶＨｓｃＦｖ３’（ＳａｃＩ）を用いて７３４のそれぞれのＶλおよびＶＨ配列を増幅した。得られたＤＮＡ産物を、制限酵素消化および連結によって７３４ｓｃＦｖ遺伝子へと組み立て、ＤＮＡシーケンシングによって配列を確認した。
734VLscFv5’(Cys)：5’-TT CTC TCT GCA GAG CCC AAA TCT TGT GGT GGC GGT TCA CAG  CTG GTT GTG ACT CAG-3’；
734VLscFv3’：5’-A GCC TCC GCC TCC TGA TCC GCC ACC TCC TAA GAT CTT CAG TTT GGT TCC-3’；
734VHscFv5’：5’-CC GGA GGC GGT GGG AGT GAG GTG AAA CTG CAG GAG-3’；
734VHscFv3’(SacI)：5’-AA CCT TGA GCT CGG CCG TCG CAC TCA TGA GGA GAC GGT GAC CG-3’。
【０１１１】
ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２の発現ベクターの構築
７３４ｓｃＦｖをヒトＨ鎖定常領域（ＨＣ）のＣ末端へ結合させるため、新規なプライマー対、７３４ｓｃＦｖ２−５’および７３４ｓｃＦｖ−３’を合成し、７３４ｓｃＦｖをコードするＤＮＡの増幅に用いた。プライマー７３４ｓｃＦｖ２−５’は、７３４ｓｃＦｖとヒトＨＣのＣ末端とのフレーム内結合のための正確な配列をもたらした。得られたＤＮＡフラグメントをヒトＨＣ配列と連結し、ＨＣ−７３４ｓｃＦｖをコードする構築物を形成した。次にｈＭＮ−１４の発現ベクター、ｈＭＮ−１４ｐｄＨＬ２中の正常ヒトＨＣをコードするＤＮＡフラグメントを、ＨＣ−７３４ｓｃＦｖフラグメントで置換し、その結果、融合構築体の発現ベクターｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２ｐｄＨＬ２を得た。
734scFv2-5’：5’-TCC CCG GGT AAA GGT GGC GGT TCA CAG CTG-3’；
734scFv-3’：5’-GAG CTC GGC CGT CGC AC-3’。
【０１１２】
変異融合ｂｓＡｂ、ｈＭＮ−１４ＩｇＧ（Ｉ２５３Ａ）−（７３４ｓｃＦｖ）２の構築
イソロイシン２５３をヒトＨＣ鎖のＣＨ２ドメインに置いた。Ｉ２５３Ａ変異をｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２に導入するため、ＣＨ１および部分的にＣＨ２ドメインをコードする挿入ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドベクターＣＨ１ｋｂｐＫＳを、オリゴヌクレオチドに誘導される部位特異的変異誘発に用いた。オリゴヌクレオチドＩ２５３ＡＣＨ２は、ＣＨ２中の野生型配列ＫＤＴＬＭ２５３ＩＳＲＴＰＥをＫＤＴＬＭ２５３ＡＳＲＴＰＥへ変換するが、変異誘発プライマーとして設計および合成されている。変異誘発は、Ｓｃｕｌｐｔｏｒ  ＩＶＭ  ｓｙｓｔｅｍ(Amersham, Arlington Heights, IL)を製造業者の仕様書に従って用いることにより達成された。ジデオキシＤＮＡシーケンシングによって配列が検証された後、変異したＨＣフラグメントをｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２ｐｄＨＬ２へサブクローニングして対応する野生型フラグメントを置換し、その結果、変異融合ｂｓＡｂの発現ベクター、ｈＭＮ−１４ＩｇＧ（Ｉ２５３Ａ）−（７３４ｓｃＦｖ）２ｐｄＨＬ２を得た。
I253ACH2：5’-AAG GAC ACC CTC ATG GCT AGC CGG ACC CCT GAG-3’。
【０１１３】
ｂｓＡｂの発現および産生
発現ベクターを、〜３０μｇのＳａｌＩで線状化したＤＮＡを用いて２〜５×１０６個の細胞がトランスフェクトされるエレクトロポレーションによってＳｐ２／０細胞へトランスフェクトし、９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングした。２日後、最終濃度０．０２５〜０．０７５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）をトランスフェクタントの選択のため細胞培養培地に加えた。ＭＴＸ耐性コロニーが２〜３週で出現し、これをＥＬＩＳＡでヒトＩｇＧの分泌についてスクリーニングした。要するに、残存コロニー由来の細胞培養上清を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２特異的抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのマイクロウェル中で１時間インキュベートした。次にペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント特異的抗体を加え、ウェル中で１時間インキュベートした。上清中のヒトＩｇＧの存在は、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩０．４ｍｇ／ｍｌおよびＨ２Ｏ２  ０．０１２５％を含む基質溶液を添加することにより明らかにした。陽性クローンから最もＡｂを産生するものを決定し、選択し、さらに拡張した。ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２およびｈＭＮ−１４ＩｇＧ（Ｉ２５３Ａ）−（７３４ｓｃＦｖ）２を、タンパク質ＡまたはＤＴＰＡカラムのいずれかでのアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。
【０１１４】
Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（ＴｓｃＧ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ２  （ＩＭＰ１９２）の合成：
第一のアミノ酸、Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをペプチドシンセサイザー上でＲｉｎｋアミド樹脂０．２１ｍｍｏｌへ付着させ、その後、標準のＦｍｏｃ自動合成プロトコールを用いてＴｃ−９９ｍリガンド結合残基Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＴｓｃＧをリシンの側鎖へ添加して次のペプチド：Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（ＴｓｃＧ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ｒｉｎｋ樹脂を形成した。次に、ＣＨ２Ｃｌ２  １０ｍＬ、氷酢酸０．７５ｍＬおよびジイソプロピルエチルアミン２．５ｍｌ中に溶解したＰｄ［Ｐ（Ｐｈ）３］４    １００ｍｇを含む溶液８ｍＬで樹脂を処理してＡｌｏｃ基を取り除いた。次に樹脂混合物をトリブチルスズヒドリド０．８ｍｌで処理し、６０分間ボルテックスで混合した。次にペプチド合成をシンセサイザーで継続して次のペプチド：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｌｙｓ（ＴｓｃＧ−Ｃｙｓ−）−ｒｉｎｋ樹脂を製造した。樹脂をＤＭＦ  １０ｍＬ、無水酢酸３ｍＬ、およびジイソプロピルエチルアミン６ｍＬを含む溶液８ｍＬで６０分間ボルテックスで混合することによりＮ末端をアセチル化した。次にＡｌｏｃ保護基の側鎖を上記の通り除去し、標準のＦｍｏｃ脱保護プロトコールを用いて樹脂をピペリジンで処理して樹脂に残っている可能性のある酢酸を除去した。活性化ＤＴＰＡおよびＤＴＰＡの添加：ＤＴＰＡ５ｇをメタノール中１．０Ｍテトラブチル水酸化アンモニウム４０ｍＬに溶解した。このメタノールを高圧下で除去して粘性の油状物質を得た。この油状物質をＤＭＦ５０ｍＬに溶解し、揮発性の溶媒をロータリーエバポレーターで高圧下で除去した。ＤＭＦによる処理をさらに２回繰り返した。次に粘性の油状物質をＤＭＦ５０ｍｌに溶解し、ＨＢＴＵ５ｇと混合した。次に活性化ＤＴＰＡ溶液のアリコート８ｍｌを１４時間ボルテックスで混合した樹脂に加えた。このＤＴＰＡによる処理は、カイザー試験を用いて樹脂がアミンに検査陰性となるまで繰り返した。
【０１１５】
切断および精製：次にペプチドを、ＴＦＡ３０ｍｌ、トリイソプロピルシラン１ｍｌ、およびエタンジチオール１ｍｌからなる溶液８ｍｌで６０分間（mm→min？）処理することによって樹脂から切断した。粗切断ペプチドをエーテル３０ｍｌを注入して沈殿させ、遠心分離により回収した。次にこのペプチドを４×３０ｃｍ  Ｗａｔｅｒｓ分取Ｃ−１８  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム（１５μｍ、１００Å）を用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ画分を回収し、凍結乾燥させてＥＳＭＳ（ＭＨ±１５９０）により所望の産物を含む画分を得た。
【０１１６】
キットの作成：このペプチドをペプチド７８μｇ、非放射性ＩｎＣｌ３  ０．９２ｍｇ、塩化第一錫１００μｇ、ゲンチシン酸３ｍｇ、およびＨＰＣＤ（再構成時の１０％)を含む凍結乾燥キットを構築した。
【０１１７】
放射性ラベリング
抗体タンパク質６０μｇをクロラミン−Ｔ法(Greenwood, Hunter, et al., Biochem. J. 89 11-123 (1963))を用いてＩ−１２５で標識し、ＮＡＰ−５脱塩カラム(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いて精製した。
【０１１８】
Ｔｃ−９９ｍ標識したＩＭＰ−１９２を準備するため、ＩＭＰ−１９２  ５０μｇを含むキットを２０ｍＣｉ過酸化テクネチウムを含む生理食塩水１．５ｍｌで再構成した。再構成したキットを室温で１０分間インキュベートし、次に沸騰水浴中で１５分間加熱した。
【０１１９】
実施例１：ヒト結腸腫瘍を有するマウスでの１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２および１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２の体内分布
実験の手順
１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２および１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２の簡単な体内分布パターンを評価した。ＧＷ３９ヒト結腸癌異種移植片を有する雌ヌードマウス群へ、２０μｇ（５μＣｉ）／マウスの１２５Ｉ標識した親または変異ｂｓＡｂを静脈注射により投与した。マウスを注射後の計画した時点で安楽死させた、その器官を取り出し、重さを測り、Ｉ−１２５放射能を計数した。
【０１２０】
ＧＷ−３９ヒト結腸腫瘍細胞株を、他で記載のように(Tu, et al. Tumour Biology 9:212-220 (1988))ヌードマウス中で連続的な皮下異種移植片として増殖させた。
【０１２１】
結果
１２５Ｉ標識したｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２およびｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ（７３４ｓｃＦｖ）２変異体の腫瘍組織および正常組織での体内分布を、注射後１、２、３および４日のヒト結腸腫瘍を有するマウスで検査した。結果を図３および４に示す。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表される。
【０１２２】
ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ（７３４ｓｃＦｖ）２の腫瘍への取り込みは、ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２よりも有意に低かった。ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ（７３４ｓｃＦｖ）２のクリアランス速度の増加は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃、小腸、大腸および血液などの正常な組織でも見られた。図３および４参照。ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ（７３４ｓｃＦｖ）２のクリアランスの加速は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃、小腸、大腸および血液などの多くの正常組織の腫瘍対器官比を高くした。さらに、ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ（７３４ｓｃＦｖ）２  変異体の注射後１〜４日の腫瘍対血液比は、ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２の腫瘍対血液比と比較して速い速度で増加した。
【０１２３】
実施例２：ヒト結腸腫瘍を有するマウスでの１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２および１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２のプレターゲッティング
実験の手順
変異および親ｂｓＡｂのプレターゲッティングの体内分布パターンを評価した。ＧＷ３９ヒト結腸癌異種移植片を有する雌ヌードマウス群へ、２０μｇ（５μＣｉ）／マウスの１２５Ｉ標識した変異または親ｂｓＡｂを静脈注射により投与した。変異または親ｂｓＡｂの注射の後、予め定めたクリアランス時間の間、ｂｓＡｂが腫瘍部位に局在し、循環から取り除かれるのを待った。９９ｍＴｃ標識した二価のＤＴＰＡペプチド、ＩＭＰ−１９２を次に静脈注射した。このマウスを、ペプチド注射後の種々の時点で屠殺し、器官を取り出し、重さを測り、Ｉ−１２５およびＴｃ−９９ｍ双方の放射能を計数した。
【０１２４】
ＧＷ−３９ヒト結腸腫瘍細胞株を、他で記載のように(Tu, et al. Tumour Biology 9:212-220 (1988))ヌードマウス中で連続的な皮下異種移植片として増殖させた。
【０１２５】
結果
１２５Ｉ標識したｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２および１２５Ｉ標識したｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２の腫瘍組織および正常組織での体内分布を、９ｍＴｃ標識した二価のＤＴＰＡペプチド、ＩＭＰ−１９２の注射後３、６、および２４時間のヒト結腸腫瘍を有するマウスで検査した。ＩＭＰ−１９２の注射の前に、変異または親ｂｓＡｂでのプレターゲッティングを４日間行なった。１２５Ｉ標識した変異および親ｂｓＡｂの腫瘍組織および組織での体内分布を図５〜７に示す。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表される。さらに、ＩＭＰ−１９２（９９ｍＴｃ標識した二価のＤＴＰＡペプチド）の腫瘍組織および組織での体内分布を図５〜７に示す。変異ｂｓＡｂのクリアランスの加速が認められる。さらに、親ｂｓＡｂでのプレターゲッティングと比較して、変異ｂｓＡｂでプレターゲッティングの後により高い腫瘍対血液比が認められる。変異融合タンパク質でのプレターゲッティング後よりも親融合タンパク質でのプレターゲッティング後により多くのDTPA-ペプチドが血中に捕捉されたことが注目される。
【０１２６】
当業者には、本発明による組成物および方法に対して種々の改変および変更をなしうることが明らかである。よって、本発明は、添付のクレームおよびそれらの均等物の範囲内に入る限り、このような改変および変更を含むものとする。
【０１２７】
上記に引用した全ての文献の開示は、各々が個別に引用することにより本明細書の一部とされるのと同程度に、引用することにより明白にその全開示内容を本明細書の一部とする。
【０１２８】
実施例３：Ｉｎ−ＤＴＰＡ含有ペプチドとｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２との結合
Ｉｎ−ＤＴＰＡペプチドと抗Ｉｎ−ＤＴＰＡ抗体ｈＭＮ−１４ＩｇＧ（１２５３Ａ）−（７３４ｓｃＦｖ）２との結合を、サイズ排除ＨＰＬＣおよびＢｉａｃｏｒｅ  Ｘを用いるアフィニティー遮断研究によって調査した。
【０１２９】
ＨＰＬＣを用いる結合分析
ＩＭＰ１９２キットをＴｃ−９９ｍ  ２０．９ｍＣｉで標識した。このキットからのアリコートを希釈し、次のモル比（ペプチド／ａｂ）１：５、１：１、および２０：１でｈＭＮ−１４ＩｇＧ（１２５３Ａ）−（７３４ｓｃＦｖ）２と混合した。このペプチド／抗体混合物、ペプチド単独および抗体単独を、０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８を用いて１ｍＬ／分で溶出するＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＨＰＬＣカラムで試験した。ＨＰＬＣの痕跡（図８〜１２）は本質的にただ１種類のペプチド／抗体複合体が形成されていることを示す。ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２  の既知の基準は約９．４１分でカラムから溶出する（図８）。Ｔｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の既知の基準は約１４．８５分でカラムから溶出する（図９）。ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２対Ｔｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の１：１混合物をカラムに適用した場合、約９．５６分に１回だけピークが認められた（図１０）。それに対して、ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２対Ｔｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の１：５混合物をカラムに適用した場合、２回の大きなピークが認められ、１回は約９．５６分（ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２）そしてもう１回は約１４．８０分（Ｔｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２）であった（図１１）。ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２対Ｔｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の２０：１混合物をカラムに適用した場合、９．５６分で１回だけピークが認められた（図１２）。
【０１３０】
実施例４：臨床試験
実施例４Ａ．  結腸ポリープ患者のポリープを除去すると、それが悪性であると分かった。ＣＡＴスキャンは腫瘍を明示できなかったが、３ヵ月後、患者の血中のＣＥＡレベルが上昇。この患者に１０ｍｇのｈＭＮ１４−ＩｇＧ［７３４−ｓｃＦｖ］２を静脈点滴により投与する。３日後、患者に４０ｍＣｉのＴｃ−９９ｍで標識した二価のペプチドＩＭＰ１９２を投与する。翌日、この患者に放射性シンチグラフィーを行い、ポリープの切除部位に近接する結節にただ一箇所つの活性部位が認められる。この結節を切除し、この患者はその後１０年間罹患しなかった。
【０１３１】
実施例４Ｂ．  結腸癌患者の一次腫瘍を切除した。２年後、この患者は血中のＣＥＡレベルの上昇を示し、ＣＡＴスキャンによって肝臓に切除不可能な複数の小さな転移が示される。患者に１００ｍｇのｈＭＮ１４−ＩｇＧ［７３４−ｓｃＦｖ］２を静脈点滴により投与する。３日後、患者に１６０ｍＣｉのＩ−１３１で標識した二価のＤＴＰＡペプチド、ＩＭＰ１５６を静脈点滴により投与する。ＣＥＡの血中レベルは徐々に正常範囲まで降下した。ＣＡＴスキャンによって転移のいくつかが消散したことが示され、残りの病巣は９ヶ月間増殖しなかった。
【０１３２】
当業者には、本発明による組成物および方法に対して種々の改変および変更をなしうることが明らかである。よって、本発明は、添付のクレームおよびそれらの均等物の範囲内に入る限り、このような改変および変更を含むものとする。
【０１３３】
上記に引用した全ての文献、特許、および特許出願の開示は、各々が個別に引用することにより本明細書の一部とされるのと同程度に、引用することにより明白にその全開示内容を本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ｈＭＮ−１４のＨ鎖ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域が示されている。２７４番のアミノ酸のイソロイシンは、Edelman, et al.のナンバリング方法によればイソロイシン２５３に相当する。Edelman et al. Biochemistry 63, 78-85 (1969)を参照されたい。
【図２】ｈＭＮ−１４のＬ鎖ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。ＶｋおよびＣＫ領域が示されている。
【図３】ヒト結腸腫瘍を有するマウスでの、注射後１、２、３および４日のｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２の体内分布を示す。「Ｉ２５３Ａ」とは２５３番目のイソロイシンがアラニンへ変わっていることをさす。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示した。
【図４】ヒト結腸腫瘍を有するマウスでの、注射後１、２、３および４日のｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２の体内分布を示す。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示した。
【図５】１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２に関するプレターゲッティング実験から得た体内分布データを示す。標的化可能な構築物は、Ｔｃ−９９ｍ標識された二価のＤＴＰＡ、ＩＭＰ−１９２であった。ヒト結腸腫瘍を有するマウスを、標的化可能な複合体の注入後４日間、１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２でプレターゲッティングした。標的化可能な複合体の注入後３、６および２４時間のデータを得た。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す。腫瘍対血液の比は「血液」の欄に示されている。表の左側は１２５Ｉ標識されたｂｓＡｂのデータを示し、表の右側は９９ｍＴｃ−標識された標的化可能な構築物のデータを示す。
【図６】１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２に関するプレターゲッティング実験から得た体内分布データを示す。標的化可能な構築物は、Ｔｃ−９９ｍ標識されたｄｉＤＴＰＡ、ＩＭＰ−１９２であった。ヒト結腸腫瘍を有するマウスを、標的化可能な複合体の注入後６日間、１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧ−（７３４ｓｃＦｖ）２でプレターゲッティングした。標的化可能な複合体の注入後３、６および２４時間のデータを得た。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す。腫瘍対血液の比は「血液」の欄に示されている。表の左側は１２５Ｉ標識されたｂｓＡｂのデータを示し、表の右側は９９ｍＴｃ−標識された標的化可能な構築物のデータを示す。
【図７】１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２に関するプレターゲッティング実験から得た体内分布データを示す。標的化可能な構築物は、Ｔｃ−９９ｍ標識されたｄｉＤＴＰＡ、ＩＭＰ−１９２であった。ヒト結腸腫瘍を有するマウスを、標的化可能な複合体の注入後４日間、１２５Ｉ−ｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２でプレターゲッティングした。標的化可能な複合体の注入後３、６および２４時間のデータを得た。データはグラムあたりの注射量の中央値のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）で示す。腫瘍対血液の比は「血液」の欄に示されている。表の左側は１２５Ｉ標識されたｂｓＡｂのデータを示し、表の右側は９９ｍＴｃ標識された標的化可能な構築物のデータを示す。
【図８】０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８を用いて１ｍＬ／分で溶出するＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＨＰＬＣカラムでのｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２の既知の標準溶出プロフィールを示す。
【図９】０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８を用いて１ｍＬ／分で溶出するＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＨＰＬＣカラムでのＴｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の既知の標準溶出プロフィールを示す。
【図１０】０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８を用いて１ｍＬ／分で溶出するＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＨＰＬＣカラムでのｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２とＴｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の１：１混合物の既知の標準溶出プロフィールを示す。
【図１１】０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８を用いて１ｍＬ／分で溶出するＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＨＰＬＣカラムでのｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２とＴｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の１：５混合物の既知の標準溶出プロフィールを示す。
【図１２】０．２Ｍリン酸バッファーｐＨ６．８を用いて１ｍＬ／分で溶出するＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ  ２５０  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＨＰＬＣカラムでのｈＭＮ−１４ＩｇＧＩ２５３Ａ−（７３４ｓｃＦｖ）２とＴｃ−９９ｍ  ＩＭＰ１９２の２０：１混合物の既知の標準溶出プロフィールを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006502091.tif 000017
2006502091.tif 000018
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