(57)【要約】抗血管形成特性を有するタンパク質、そのフラグメント、および血管形成を抑制または促進するためにこれらのタンパク質およびフラグメントを用いる方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
Ｒ１Ｘ１ＬＦＸ２ＮＶＮＸ３ＶＸ４ＮＦＲ２（配列番号４５）
の単離ペプチドであって、
ここで、式中、Ｒ１は水素または１〜１７アミノ酸のぺプチジル鎖であり、Ｒ２は水素または１〜１２アミノ酸のペプチジル鎖であり、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３は個々にアミノ酸であり、および、ここで前記ペプチドが腫瘍の増殖を抑制する、前記単離ペプチド。
【請求項２】
Ｘ１が塩基性側鎖を有するアミノ酸または芳香族側鎖を有するアミノ酸である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
Ｘ１がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンである、請求項２に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がリジンまたはフェニルアラニンである、請求項３に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が独立して親水性側鎖を有するアミノ酸または塩基性側鎖を有するアミノ酸である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンである、請求項５に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
Ｘ２およびＸ４が独立してシステイン、セリンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３がシステインまたはアスパラギン酸である、請求項６に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
Ｘ１がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、そしてＸ２、Ｘ３およびＸ４が独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンである、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項９】
Ｒ１が１個のアミノ酸または２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のペプチジル鎖である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
Ｒ１で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖が下記：
（ａ）Ｐ；
（ｂ）ＭＰ；
（ｃ）ＴＭＰ；
（ｄ）ＴＴＭＰ（配列番号４６）；
（ｅ）ＦＴＴＭＰ（配列番号４７）；
（ｆ）ＲＦＴＴＭＰ（配列番号４８）；
（ｇ）ＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号４９）；
（ｈ）ＬＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５０）；
（ｉ）ＫＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５１）；および、
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかの保存的変異体、
からなる群より選択される、請求項９に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
Ｒ２が１個のアミノ酸または２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基のペプチジル鎖である、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
Ｒ２で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖が下記：
（ａ）Ａ；
（ｂ）ＡＳ；
（ｃ）ＡＳＲ；
（ｄ）ＡＳＲＮ（配列番号５２）；
（ｅ）ＡＳＲＮＤ（配列番号５３）；
（ｆ）ＡＳＲＮＤＹ（配列番号５４）；
（ｇ）ＡＳＲＮＤＹＳ（配列番号５５）；
（ｈ）ＡＳＲＮＤＹＳＹ（配列番号５６）；
（ｉ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷ（配列番号５７）；
（ｊ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷＬ（配列番号５８）；および、
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のいずれかの保存的変異体、
からなる群より選択される、請求項１１に記載の単離ペプチド。
【請求項１３】
ペプチドが還元される、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１４】
ペプチドがアルキル化される、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１５】
ペプチドが酸化される、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１６】
下記式：
Ｒ１Ｘ１ＬＦＸ２ＮＶＮＸ３ＶＸ４ＮＦＲ２（配列番号４５）
の単離ペプチドであって、
ここで、式中、Ｒ１は水素または１〜１７アミノ酸のぺプチジル鎖であり、Ｒ２は水素または１〜１２アミノ酸のペプチジル鎖であり、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３は個々にアミノ酸であり、および、ここで前記ペプチドが哺乳類組織において血管形成活性を抑制する、前記単離ペプチド。
【請求項１７】
Ｘ１が塩基性側鎖を有するアミノ酸または芳香族側鎖を有するアミノ酸である、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項１８】
Ｘ１がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンである、請求項１７に記載の単離ペプチド。
【請求項１９】
Ｘ１がリジンまたはフェニルアラニンである、請求項１８に記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が独立して親水性側鎖を有するアミノ酸または塩基性側鎖を有するアミノ酸である、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンである、請求項２０に記載の単離ペプチド。
【請求項２２】
Ｘ２およびＸ４が独立してシステイン、セリンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３がシステインまたはアスパラギン酸である、請求項２１に記載の単離ペプチド。
【請求項２３】
Ｘ１がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、そしてＸ２、Ｘ３およびＸ４が独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンである、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項２４】
Ｒ１が１個のアミノ酸または２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のペプチジル鎖である、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項２５】
Ｒ１で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖が下記：
（ａ）Ｐ；
（ｂ）ＭＰ；
（ｃ）ＴＭＰ；
（ｄ）ＴＴＭＰ（配列番号４６）；
（ｅ）ＦＴＴＭＰ（配列番号４７）；
（ｆ）ＲＦＴＴＭＰ（配列番号４８）；
（ｇ）ＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号４９）；
（ｈ）ＬＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５０）；
（ｉ）ＫＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５１）；および、
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかの保存的変異体、
からなる群より選択される、請求項２４に記載の単離ペプチド。
【請求項２６】
Ｒ２が１個のアミノ酸または２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基のペプチジル鎖である、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項２７】
Ｒ２で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖が下記：
（ａ）Ａ；
（ｂ）ＡＳ；
（ｃ）ＡＳＲ；
（ｄ）ＡＳＲＮ（配列番号５２）；
（ｅ）ＡＳＲＮＤ（配列番号５３）；
（ｆ）ＡＳＲＮＤＹ（配列番号５４）；
（ｇ）ＡＳＲＮＤＹＳ（配列番号５５）；
（ｈ）ＡＳＲＮＤＹＳＹ（配列番号５６）；
（ｉ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷ（配列番号５７）；
（ｊ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷＬ（配列番号５８）；および、
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のいずれかの保存的変異体、
からなる群より選択される、請求項２６に記載の単離ペプチド。
【請求項２８】
ペプチドが還元される、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項２９】
ペプチドがアルキル化される、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項３０】
ペプチドが酸化される、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項３１】
下記式：
Ｒ１Ｘ１ＬＦＸ２ＮＶＮＸ３ＶＸ４ＮＦＲ２（配列番号４５）
の単離ペプチドであって、
ここで、式中、Ｒ１は水素または１〜１７アミノ酸のぺプチジル鎖であり、Ｒ２は水素または１〜１２アミノ酸のペプチジル鎖であり、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３は個々にアミノ酸であり、および、ここで前記ペプチドが内皮細胞においてタンパク質合成を抑制する、前記単離ペプチド。
【請求項３２】
Ｘ１が塩基性側鎖を有するアミノ酸または芳香族側鎖を有するアミノ酸である、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項３３】
Ｘ１がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンである、請求項３２に記載の単離ペプチド。
【請求項３４】
Ｘ１がリジンまたはフェニルアラニンである、請求項３３に記載の単離ペプチド。
【請求項３５】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が独立して親水性側鎖を有するアミノ酸または塩基性側鎖を有するアミノ酸である、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項３６】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンである、請求項３５に記載の単離ペプチド。
【請求項３７】
Ｘ２およびＸ４が独立してシステイン、セリンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３がシステインまたはアスパラギン酸である、請求項３６に記載の単離ペプチド。
【請求項３８】
Ｘ１がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、そしてＸ２、Ｘ３およびＸ４が独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンである、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項３９】
Ｒ１が１個のアミノ酸または２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のペプチジル鎖である、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項４０】
Ｒ１で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖が下記：
（ａ）Ｐ；
（ｂ）ＭＰ；
（ｃ）ＴＭＰ；
（ｄ）ＴＴＭＰ（配列番号４６）；
（ｅ）ＦＴＴＭＰ（配列番号４７）；
（ｆ）ＲＦＴＴＭＰ（配列番号４８）；
（ｇ）ＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号４９）；
（ｈ）ＬＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５０）；
（ｉ）ＫＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５１）；および、
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかの保存的変異体、
からなる群より選択される、請求項３９に記載の単離ペプチド。
【請求項４１】
Ｒ２が１個のアミノ酸または２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基のペプチジル鎖である、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項４２】
Ｒ２で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖が下記：
（ａ）Ａ；
（ｂ）ＡＳ；
（ｃ）ＡＳＲ；
（ｄ）ＡＳＲＮ（配列番号５２）；
（ｅ）ＡＳＲＮＤ（配列番号５３）；
（ｆ）ＡＳＲＮＤＹ（配列番号５４）；
（ｇ）ＡＳＲＮＤＹＳ（配列番号５５）；
（ｈ）ＡＳＲＮＤＹＳＹ（配列番号５６）；
（ｉ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷ（配列番号５７）；
（ｊ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷＬ（配列番号５８）；および、
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のいずれかの保存的変異体、
からなる群より選択される、請求項４１に記載の単離ペプチド。
【請求項４３】
ペプチドが還元される、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項４４】
ペプチドがアルキル化される、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項４５】
ペプチドが酸化される、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項４６】
哺乳類組織において腫瘍の増殖を抑制するための方法であって、請求項１に記載の単離ペプチドを含む組成物に組織を接触させることを包含する、前記方法。
【請求項４７】
哺乳類組織において血管形成活性を抑制するための方法であって、請求項１６の単離ペプチドを含む組成物に組織を接触させることを包含する、前記方法。
【請求項４８】
１以上の哺乳類細胞においてタンパク質合成を抑制するための方法であって、前記方法が請求項３１の単離ペプチドを含む組成物に１以上の細胞を接触させることを包含する、前記方法。
【請求項４９】
製薬上許容しうる担体と組み合わせられた、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項５０】
製薬上許容しうる担体と組み合わせられた、請求項１６に記載の単離ペプチド。
【請求項５１】
製薬上許容しうる担体と組み合わせられた、請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項５２】
腫瘍の増殖を抑制する能力を有する、配列番号１０の単離フラグメント。
【請求項５３】
フラグメントが配列番号３７である、請求項５２に記載の単離フラグメント。
【請求項５４】
フラグメントが還元される、請求項５２に記載の単離フラグメント。
【請求項５５】
フラグメントがアルキル化される、請求項５２に記載の単離フラグメント。
【請求項５６】
フラグメントが酸化される、請求項５２に記載の単離フラグメント。
【請求項５７】
配列番号１０の単離突然変異フラグメントであって、１個以上で５個以下のアミノ酸が置換されており、そして突然変異フラグメントが腫瘍の増殖を抑制する能力を有する、前記フラグメント。
【請求項５８】
フラグメントが還元される、請求項５７に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項５９】
フラグメントがアルキル化される、請求項５７に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項６０】
フラグメントが酸化される、請求項５７に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項６１】
フラグメントが配列番号３８である、請求項５７に記載の単離フラグメント。
【請求項６２】
フラグメントが配列番号３９である、請求項５７に記載の単離フラグメント。
【請求項６３】
フラグメントが配列番号４０である、請求項５７に記載の単離フラグメント。
【請求項６４】
フラグメントが配列番号４１である、請求項５７に記載の単離フラグメント。
【請求項６５】
フラグメントが配列番号４２である、請求項５７に記載の単離フラグメント。
【請求項６６】
血管形成を抑制する能力を有する、配列番号１０の単離フラグメント。
【請求項６７】
フラグメントが配列番号３７である、請求項６６に記載の単離フラグメント。
【請求項６８】
フラグメントが還元される、請求項６６に記載の単離フラグメント。
【請求項６９】
フラグメントがアルキル化される、請求項６６に記載の単離フラグメント。
【請求項７０】
フラグメントが酸化される、請求項６６に記載の単離フラグメント。
【請求項７１】
配列番号１０の単離突然変異フラグメントであって、１個以上で５個以下のアミノ酸が置換されており、そして突然変異フラグメントが血管形成活性を抑制する能力を有する、前記フラグメント。
【請求項７２】
フラグメントが還元される、請求項７１に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項７３】
フラグメントがアルキル化される、請求項７１に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項７４】
フラグメントが酸化される、請求項７１に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項７５】
フラグメントが配列番号３８である、請求項７１に記載の単離フラグメント。
【請求項７６】
フラグメントが配列番号３９である、請求項７１に記載の単離フラグメント。
【請求項７７】
フラグメントが配列番号４０である、請求項７１に記載の単離フラグメント。
【請求項７８】
フラグメントが配列番号４１である、請求項７１に記載の単離フラグメント。
【請求項７９】
フラグメントが配列番号４２である、請求項７１に記載の単離フラグメント。
【請求項８０】
内皮細胞においてタンパク質合成を抑制する能力を有する、配列番号１０の単離フラグメント。
【請求項８１】
フラグメントが配列番号３７である、請求項８０に記載の単離フラグメント。
【請求項８２】
フラグメントが還元される、請求項８０に記載の単離フラグメント。
【請求項８３】
フラグメントがアルキル化される、請求項８０に記載の単離フラグメント。
【請求項８４】
フラグメントが酸化される、請求項８０に記載の単離フラグメント。
【請求項８５】
配列番号１０の単離突然変異フラグメントであって、１個以上で５個以下のアミノ酸が置換されており、そして突然変異フラグメントが内皮細胞においてタンパク質合成を抑制する能力を有する、前記フラグメント。
【請求項８６】
フラグメントが還元される、請求項８５に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項８７】
フラグメントがアルキル化される、請求項８５に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項８８】
フラグメントが酸化される、請求項８５に記載の単離突然変異フラグメント。
【請求項８９】
フラグメントが配列番号３８である、請求項８５に記載の単離フラグメント。
【請求項９０】
フラグメントが配列番号３９である、請求項８５に記載の単離フラグメント。
【請求項９１】
フラグメントが配列番号４０である、請求項８５に記載の単離フラグメント。
【請求項９２】
フラグメントが配列番号４１である、請求項８５に記載の単離フラグメント。
【請求項９３】
フラグメントが配列番号４２である、請求項８５に記載の単離フラグメント。
【請求項９４】
哺乳類組織において腫瘍の増殖を抑制するための方法であって、前記方法が下記：
（ａ）配列番号１０；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１〜アミノ酸１２４；
（ｃ）配列番号２０；
（ｄ）配列番号２１；
（ｅ）配列番号２２；
（ｆ）配列番号２３；
（ｇ）配列番号２５；
（ｈ）配列番号２６；
（ｉ）配列番号２９；
（ｊ）配列番号３０；
（ｋ）配列番号３３；
（ｌ）配列番号３４；
（ｍ）配列番号３７；
（ｎ）配列番号３８；
（ｏ）配列番号３９；
（ｐ）配列番号４０；
（ｑ）配列番号４１；および、
（ｒ）配列番号４２、
からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に組織を接触させることを包含する、上記方法。
【請求項９５】
フラグメントが還元される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
フラグメントがアルキル化される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
フラグメントが酸化される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
１個以上のシステイン残基が別のアミノ酸の代わりに置換されている、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
哺乳類組織において血管形成活性を抑制するための方法であって、前記方法が下記：
（ａ）配列番号１０；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１〜アミノ酸１２４；
（ｃ）配列番号２０；
（ｄ）配列番号２１；
（ｅ）配列番号２２；
（ｆ）配列番号２３
（ｇ）配列番号２５；
（ｈ）配列番号２６；
（ｉ）配列番号２９；
（ｊ）配列番号３０；
（ｋ）配列番号３３；
（ｌ）配列番号３４；
（ｍ）配列番号３７；
（ｎ）配列番号３８；
（ｏ）配列番号３９；
（ｐ）配列番号４０；
（ｑ）配列番号４１；および、
（ｒ）配列番号４２、
からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に組織を接触させることを包含する、前記方法。
【請求項１００】
１以上の哺乳類細胞においてタンパク質合成を抑制するための方法であって、前記方法が下記：
（ａ）配列番号１０；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１〜アミノ酸１２４；
（ｃ）配列番号２０；
（ｄ）配列番号２１；
（ｅ）配列番号２２；
（ｆ）配列番号２３；
（ｇ）配列番号２５；
（ｈ）配列番号２６；
（ｉ）配列番号２９；
（ｊ）配列番号３０；
（ｋ）配列番号３３；
（ｌ）配列番号３４；
（ｍ）配列番号３７；
（ｎ）配列番号３８；
（ｏ）配列番号３９；
（ｐ）配列番号４０；
（ｑ）配列番号４１；および、
（ｒ）配列番号４２、
からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に１以上の細胞を接触させることを包含する、前記方法。
【請求項１０１】
１以上の哺乳類細胞においてタンパク質合成を抑制するための方法であって、前記方法が下記：
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号６；および、
（ｃ）配列番号１０、
からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に１以上の細胞を接触させることを包含する、前記方法。
【請求項１０２】
タンパク質合成がｃａｐ依存性タンパク質合成である、請求項８０に記載の単離フラグメント。
【請求項１０３】
タンパク質合成がｃａｐ依存性タンパク質合成である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
タンパク質合成がｃａｐ依存性タンパク質合成である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
内皮細胞がαｖβ３インテグリンを発現する、請求項８０に記載の単離フラグメント。
【請求項１０６】
哺乳類細胞がαｖβ３インテグリンを発現する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
哺乳類細胞がαｖβ３インテグリンを発現する、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府による支援）
本発明は全体または部分において、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成番号ＤＫ−５１７１１、ＤＫ−５５００１により支援金を受けている。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
基底膜は上皮および内皮細胞を担持して成育させる支持構造を与え、そして、筋肉または脂肪を包囲する特殊化された細胞外マトリックスの薄層である（Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．，  １９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：９３−１２７）。基底膜は常時細胞と会合しており、そして、基底膜は機械的支持を与えるのみならず分化や増殖のような細胞の挙動にも影響することが明らかにされている。血管基底膜はコラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、フィブロネクチンおよびエンタクチンのような巨大分子からなる（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：６１８−２４）。機能的には、コラーゲンは細胞の接着、遊走、分化および増殖を促進し（Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：９３−１２７）、そして、これらの機能を介して、既存の血管から新しい血管を形成する過程である血管形成の間の内皮細胞の増殖と挙動において重要な役割を演じていると推測されている（Ｍａｄｒｉ，Ｊ．Ａ．ら，１９８６，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３４：８５−９１；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９７２，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１７５：４０９−１６）。血管形成は複雑な過程であり、そして、内皮細胞の新芽形成および遊走、これらの細胞の増殖、および管様構造へのその分化、および形成中の血管の周囲の基底膜マトリックスの生成を必要とする。更にまた、血管形成は創傷の修復および子宮内膜のリモデリングのような正常な生理学的事象にとっても重要な過程である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．ら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−３４）。数ｍｍ３を超えて固形腫瘍が転移および増殖する際に血管形成が必要であることが現在明らかになっている（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．１９７２，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１７５：４０９−１６；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１）。腫瘍の大きさの拡大は腫瘍を通過する血液の灌流によるのみならず、新しい毛細血管内皮細胞により産生されるいくつかの増殖因子およびマトリックスタンパク質による腫瘍細胞のパラクリン刺激によっても起こる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１）。最近、多くの血管形成阻害因子が同定されており、すなわち、アンジオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−２８）、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−８５）、レスチン（Ｒａｍｃｈａｎｄｒａｎ，Ｒ．ら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：７３５−９）および色素上皮細胞由来因子（ＰＥＤＦ）（Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：２４５−８）が挙げられる。
【０００３】
ＩＶ型コラーゲンは６種の異なるα鎖、α１〜α６として発現され（Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．ら，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４０３−３４）、そして、三重らせんに組み立てられる。これは更にネットワークを形成し、基底膜中の他の巨大分子のための足場となる。これらのα鎖は３つのドメイン、即ち、Ｎ末端７Ｓドメイン、中央三重らせんドメイン、およびＣ末端球状非コラーゲン性（ＮＣ１）ドメインからなる（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．ら，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：２０３−１１）。いくつかの研究によれば、コラーゲン代謝の阻害因子は抗血管形成特性を有し、このことは基底膜のコラーゲンの合成と沈着が血管形成と生存のために重要であるという考え方を裏付けている（Ｍａｒａｇｏｕｄａｋｉｓ，Ｍ．Ｅ．ら，１９９４，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４３：１４７−５０；Ｈａｒａｌａｂｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｃ．ら，１９９４，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：５７５−８２）。しかしながら、基底膜の組織化および血管形成におけるコラーゲンの厳密な役割はいまだ十分には解明されていない。
【０００４】
インテグリンは、多くの化合物のための接着分子として機能する重要な細胞表面接着受容体のファミリーである。それらは細胞−細胞または細胞−細胞外マトリックスの相互作用に関与し、共に細胞外マトリックスとの細胞の相互作用を媒介し、細胞をそれに結合させる。インテグリンは、２種の非共有結合膜貫通糖タンパク質サブユニット、即ちαサブユニットおよびβサブユニットからなるαβヘテロ２量体である。すべてのαサブユニットは、すべてのβサブユニットと同様、相互に相同性を共有している。現在同定されている１６種のαサブユニット（α１〜α９、αＤ、αＬ、αＭ、αｖ、αＸ、αＩＩｂおよびαＩＥＬｂ）、および８種のβサブユニット（β１〜β８）があり、これらは２２種の異なる既知の組み合わせを形成する（β１とα１〜α９；β１とαｖ；β２とαＤ、αＬ、αＭおよびαＸ；β３とαｖおよびαＸ；β４とα６；β５とαｖ；β６とαｖ；β７とα４およびαＩＥＬｂ；β８とαｖ）。使用可能なインテグリンサブユニットのプールは、インテグリンサブユニットのうちのいくつかについてのｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングにより更に増大することができる。
【０００５】
インテグリンは一般的に、細胞表面の特定のスポットにおいてインテグリンの濃度が一定の最低閾値を超えている場合にそのリガンドに結合し、接触点（ｆｏｃａｌ  ｃｏｎｔａｃｔ）または半接着斑（ｈｅｍｉｄｅｓｍｏｓｏｍｅ）を形成する。この低結合親和性と局所接着部の形成との組み合わせにより、インテグリンは、インテグリン分子の濃度に応じて、強弱双方の結合が可能となるのである。
【０００６】
発明の概要
本発明は、抗血管形成性タンパク質およびその生物学的に活性なフラグメントに関する。本明細書に記載するフラグメントは、抗血管形成性タンパク質が別々の活性、例えば抗血管形成活性および抗腫瘍細胞活性を有する領域に細分でき、そしてこれらの別々の活性がより大きいタンパク質分子の細分の際にのみ顕在化することを示す。ＩＶ型コラーゲンのα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの場合は、このような活性はまた、グッドパスチャー・エピトープの領域外でもある。
【０００７】
本明細書に記載するとおり、これらの活性フラグメントは内皮細胞、特にαｖβ３インテグリンを発現する内皮細胞に対して高い特異性を有し、そして、これらのフラグメントはこのような細胞におけるタンパク質合成を阻害する。内皮細胞上のαｖβ３インテグリンへの活性フラグメントの結合はマイナス信号を誘導し、これがこれらの細胞におけるタンパク質合成の阻害をもたらす。このことは内皮細胞のみならずすべての細胞型におけるタンパク質合成に影響するラパマイシンにより生じるタンパク質合成の阻害とは異なることが分かっている。このような特異性は、タンパク質合成が望まれない、例えば、本明細書に記載のタンパク質およびペプチドを免疫抑制剤として使用できるような状況において、タンパク質合成を阻害する際に有用であると考えられる。
【０００８】
特に、本発明は腫瘍増殖を抑制する能力を有する配列番号１０の単離フラグメントに関する。フラグメントは、Ｔ７（配列番号３７）、Ｔ７突然変異体（配列番号３８）、Ｔ８（配列番号３９）、Ｔ８−３（配列番号４０）、ＴＰ３（配列番号４１）またはＰ２（配列番号４２）でありうる。このようなフラグメントは還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。
【０００９】
本発明はまた、アミノ酸１〜５個が置換されており、突然変異フラグメントが腫瘍増殖を抑制する能力を有する、配列番号１０の単離突然変異フラグメントに関する。フラグメントはＴ７突然変異体（配列番号３８）、Ｔ８（配列番号３９）、Ｔ８−３（配列番号４０）、ＴＰ３（配列番号４１）またはＰ２（配列番号４２）であるうる。このようなフラグメントはまた、還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。
【００１０】
本発明はさらに、血管形成を抑制する能力を有する配列番号１０の単離フラグメントに関する。フラグメントは、Ｔ７（配列番号３７）、Ｔ７突然変異体（配列番号３８）、Ｔ８（配列番号３９）、Ｔ８−３（配列番号４０）、ＴＰ３（配列番号４１）またはＰ２（配列番号４２）でありうる。このようなフラグメントは還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。
【００１１】
本発明はまた、アミノ酸１〜５個が置換されており、突然変異フラグメントが血管形成を抑制する能力を有する、配列番号１０の単離突然変異フラグメントに関する。フラグメントは、Ｔ７突然変異体（配列番号３８）、Ｔ８（配列番号３９）、Ｔ８−３（配列番号４０）、ＴＰ３（配列番号４１）またはＰ２（配列番号４２）でありうる。このようなフラグメントはまた、還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。
【００１２】
本発明はさらに、内皮細胞におけるタンパク質合成を阻害する能力を有する、配列番号１０の単離フラグメントに関する。フラグメントは、Ｔ７（配列番号３７）、Ｔ７突然変異体（配列番号３８）、Ｔ８（配列番号３９）、Ｔ８−３（配列番号４０）、ＴＰ３（配列番号４１）またはＰ２（配列番号４２）でありうる。このようなフラグメントは還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。タンパク質合成はｃａｐ依存性タンパク質合成でありうる。細胞はαｖβ３インテグリンを発現することができる。
【００１３】
本発明はまた、アミノ酸１〜５個が置換されており、突然変異フラグメントが内皮細胞におけるタンパク質合成を阻害する能力を有する、配列番号１０の単離突然変異フラグメントに関する。フラグメントは、Ｔ７突然変異体（配列番号３８）、Ｔ８（配列番号３９）、Ｔ８−３（配列番号４０）、ＴＰ３（配列番号４１）またはＰ２（配列番号４２）でありうる。このようなフラグメントはまた、還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。タンパク質合成はｃａｐ依存性タンパク質合成でありうる。細胞はαｖβ３インテグリンを発現することができる。
【００１４】
別の側面において、本発明は、哺乳類組織における血管形成活性を抑制するための方法に関し、この方法は、（ａ）配列番号１０；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１〜１２４；（ｃ）配列番号２０；（ｄ）配列番号２１；（ｅ）配列番号２２；（ｆ）配列番号２３；（ｇ）配列番号２５；（ｈ）配列番号２６；（ｉ）配列番号２９；（ｊ）配列番号３０；（ｋ）配列番号３３；（ｌ）配列番号３４；（ｍ）配列番号３７；（ｎ）配列番号３８；（ｏ）配列番号３９；（ｐ）配列番号４０；（ｑ）配列番号４１および／または（ｒ）配列番号４２からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に組織を接触させることを包含する。このようなフラグメントはまた、還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。
【００１５】
別の側面において、本発明は、哺乳類組織における腫瘍増殖を抑制するための方法に関し、この方法は、（ａ）配列番号１０；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１〜１２４；（ｃ）配列番号２０；（ｄ）配列番号２１；（ｅ）配列番号２２；（ｆ）配列番号２３；（ｇ）配列番号２５；（ｈ）配列番号２６；（ｉ）配列番号２９；（ｊ）配列番号３０；（ｋ）配列番号３３；（ｌ）配列番号３４；（ｍ）配列番号３７；（ｎ）配列番号３８；（ｏ）配列番号３９；（ｐ）配列番号４０；（ｑ）配列番号４１および／または（ｒ）配列番号４２からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に組織を接触させることを包含する。このようなフラグメントはまた、還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、１以上の哺乳類細胞におけるタンパク質合成を阻害するための方法に関し、この方法は、（ａ）配列番号１０；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸１〜１２４；（ｃ）配列番号２０；（ｄ）配列番号２１；（ｅ）配列番号２２；（ｆ）配列番号２３；（ｇ）配列番号２５；（ｈ）配列番号２６；（ｉ）配列番号２９；（ｊ）配列番号３０；（ｋ）配列番号３３；（ｌ）配列番号３４；（ｍ）配列番号３７；（ｎ）配列番号３８；（ｏ）配列番号３９；（ｐ）配列番号４０；（ｑ）配列番号４１および／または（ｒ）配列番号４２からなる群より選択される単離フラグメントを含む組成物に細胞を接触させることを包含する。このようなフラグメントはまた、還元、アルキル化または酸化されることができる。このようなフラグメントはまた、別のアミノ酸の代わりに１個以上のシステイン残基を有する。タンパク質合成はｃａｐ依存性タンパク質合成でありうる。細胞は内皮細胞でありうる。細胞はαｖβ３インテグリンを発現することができる。
【００１７】
別の側面において、本発明は、１以上の哺乳類細胞におけるタンパク質合成、腫瘍増殖、および／または哺乳類組織における血管形成を抑制するための方法を特徴としており、その方法は、（ａ）配列番号２；（ｂ）配列番号６または（ｃ）配列番号１０のような単離フラグメントを含む組成物に１以上の細胞を接触させることを包含する。タンパク質合成はｃａｐ依存性タンパク質合成でありうる。哺乳類細胞はαｖβ３インテグリンを発現することができる。
【００１８】
本発明はまた下記式の単離ペプチドを特徴とする：
Ｒ１Ｘ１ＬＦＸ２ＮＶＮＸ３ＶＸ４ＮＦＲ２（配列番号４５）、
ここで式中、Ｒ１は水素または１〜１７アミノ酸のペプチジル鎖であり、Ｒ２は水素または１〜１２アミノ酸のペプチジル鎖であり、そして、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は個々にアミノ酸であって、前記ペプチドは腫瘍の増殖を抑制する。Ｘ１は、塩基性側鎖を有するアミノ酸または芳香族側鎖を有するアミノ酸でありうる。Ｘ１は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンでありうる。Ｘ１はまた、リジンまたはフェニルアラニンでありうる。Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、独立して親水性側鎖を有するアミノ酸または塩基性側鎖を有するアミノ酸でありうる。Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンでありうる。Ｘ２およびＸ４は、独立してシステイン、セリンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３はシステインまたはアスパラギン酸でありうる。Ｘ１は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであることができ、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、独立してシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸またはグルタミンでありうる。Ｒ１は１個のアミノ酸またはアミノ酸残基２、３、４、５、６、７または８個のペプチジル鎖でありうる。Ｒ１で示される前記アミノ酸またはペプチジル鎖は、（ａ）Ｐ、（ｂ）ＭＰ、（ｃ）ＴＭＰ、（ｄ）ＴＴＭＰ（配列番号４６）、（ｅ）ＦＴＴＭＰ（配列番号４７）、（ｆ）ＲＦＴＴＭＰ（配列番号４８）、（ｇ）ＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号４９）、（ｈ）ＬＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５０）、（ｉ）ＫＱＲＦＴＴＭＰ（配列番号５１）および（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかの保存的変異体からなる群より選択することができる。Ｒ２は１個のアミノ酸またはアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８または９個のペプチジル鎖でありうる。Ｒ２で示されるアミノ酸またはペプチジル鎖は、（ａ）Ａ、（ｂ）ＡＳ、（ｃ）ＡＳＲ、（ｄ）ＡＳＲＮ（配列番号５２）、（ｅ）ＡＳＲＮＤ（配列番号５３）、（ｆ）ＡＳＲＮＤＹ（配列番号５４）、（ｇ）ＡＳＲＮＤＹＳ（配列番号５５）、（ｈ）ＡＳＲＮＤＹＳＹ（配列番号５６）、（ｉ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷ（配列番号５７）、（ｊ）ＡＳＲＮＤＹＳＹＷＬ（配列番号５８）および（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のいずれかの保存的変異体からなる群より選択することができる。このような単離ペプチドは還元、アルキル化または酸化されることができる。このような単離ペプチドは、１以上の哺乳類細胞におけるタンパク質合成、腫瘍増殖、および／または、哺乳類組織における血管形成を抑制するための方法において使用でき、その方法は単離ペプチドを含む組成物に組織を接触させることを包含する。単離ペプチドは製薬上許容しうる担体と組み合わせることができる。
【００１９】
本発明はまた、以下の特徴、即ち（ａ）αｖβ３インテグリンに結合する能力；（ｂ）内皮細胞の増殖を抑制する能力；および（ｃ）内皮細胞のアポトーシスを引き起こす能力、の１以上を有する、α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの抗血管形成性の単離された非グッドパスチャー・フラグメントに関する。単離された非グッドパスチャー・フラグメントは、本明細書に記載するとおり、ＲＧＤ非依存的な機序によりαｖβ３インテグリンに結合する。このようなＩＶ型コラーゲンのα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの単離フラグメントを本明細書において記載し、そして、「ツムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）」と称する。本明細書における用語「ツムスタチン」とは、配列番号１０を含む。更に、本明細書において「Ｔｕｍ−１」または「ツムスタチンＮ５３」（配列番号２２）と称する別の単離された非グッドパスチャー・フラグメントは、完全長ツムスタチン（配列番号１０）のアミノ酸残基５４〜アミノ酸２４４のアミノ酸配列からなる。本明細書に記載する別の単離フラグメントには、「Ｔｕｍ−２」（配列番号２３）、「Ｔｕｍ−３」（配列番号２４）、「Ｔｕｍ−４」（配列番号２５）および「Ｔｕｍ−５」（配列番号２６）が含まれ、これらはそれぞれ、完全長ツムスタチン（配列番号１０）の残基１〜１３２（Ｔｕｍ−２）、残基１３３〜２４４（Ｔｕｍ−３）、残基１８１〜２４４（Ｔｕｍ−４）および残基５４〜１３２（Ｔｕｍ−５）のアミノ酸配列からなる。ペプチドフラグメントもまた本明細書に開示され、これには「Ｔ１」（配列番号２７）、「Ｔ２」（配列番号２８）、「Ｔ３」（配列番号２９）、「Ｔ４」（配列番号３０）、「Ｔ５」（配列番号３１）、「Ｔ６」（配列番号３２）および「Ｔ７」（配列番号３７）が包含され、これらはそれぞれ、完全長ツムスタチン（配列番号１０）の残基１〜１９（Ｔ１）、残基５３〜７２（Ｔ２）、残基６８〜８７（Ｔ３）、残基８３〜１０２（Ｔ４）、残基９８〜１１６（Ｔ５）、残基１１３〜１３１（Ｔ６）および残基７３〜９７（Ｔ７）からなる。本明細書においては、完全長ツムスタチンの更に別のペプチドフラグメントを「ツムスタチン−４５−１３２」（配列番号３３）と称し、そして、完全長ツムスタチン（配列番号１０）のアミノ酸残基４５〜１３２からなる。本明細書においては、完全長ツムスタチンの別のフラグメントを「Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ」（配列番号３４）と称し、そして、これは、１２５位（完全長ツムスタチンの）におけるシステインが部位指向性突然変異誘発を介してアラニンに突然変異しているツムスタチン−４５−１３２からなる。還元、例えばアルカリ還元されているツムスタチンのフラグメントもまた、本明細書においては抗血管形成特性を有するものとして記載する。２種の他のフラグメントは「ツムスタチン３３３」（配列番号２０）および「ツムスタチン３３４（配列番号２１）であり、これらは完全長ツムスタチン（配列番号１０）の残基１〜１２４（ツムスタチン３３３）および残基１２５〜２４４からなる。ツムスタチンの他のフラグメントには、Ｔ７−突然変異体（配列番号３８、メチオニンが完全長ツムスタチン分子の７７位のロイシン残基と置換、そして、イソロイシンが８１位のバリンと置換、そして、アスパラギンが８３位のアスパラギン酸と置換している）、Ｔ８（配列番号３９、リジンが完全長ツムスタチン分子の６８位のロイシン残基と置換している）、Ｔ８−３（配列番号４０、リジンが完全長ツムスタチン分子の６８位のロイシン残基と置換、そして、７９位および８５位においてセリンがシステイン残基と置換している）、ＴＰ３（配列番号４１、リジンが完全長ツムスタチン分子の７６位においてフェニルアラニン残基と置換、そしてシステインが８３位においてアスパラギン酸と置換している）およびＰ２（配列番号４２、リジンが完全長ツムスタチン分子の６８位においてロイシン残基と置換、そして、アスパラギン酸が７９位および８５位においてシステイン残基と置換している）が包含される。
【００２０】
本発明はまた、以下の特徴（ａ）αｖβ３インテグリンに結合する能力、（ｂ）内皮細胞に結合する能力、（ｃ）腫瘍細胞の増殖を抑制する能力、および、（ｄ）内皮細胞の増殖を抑制する能力がないこと、の１以上を有する、α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの抗腫瘍細胞、単離非グッドパスチャー・フラグメントを特徴とする。単離非グッドパスチャー・フラグメントは、本明細書に記載するように、ＲＧＤ非依存性の機序によりαｖβ３インテグリンに結合することができる。１つの単離された非グッドパスチャー・フラグメントは、完全長ツムスタチン（配列番号１０）のアミノ酸残基１８５〜アミノ酸２０３のアミノ酸配列を含む。完全長ツムスタチンの別のペプチドフラグメントは、本明細書においては「Ｔ３」と称し、そして、完全長ツムスタチン（配列番号１０）のアミノ酸残基６８〜８７からなる。完全長ツムスタチンの更に別のペプチドフラグメントは、本明細書において「ツムスタチン４５−１３２」と称し、そして、完全長ツムスタチン（配列番号１０）のアミノ酸残基４５〜１３２からなる。本明細書においては、完全長ツムスタチンの別のフラグメントを「Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ」（配列番号３４）と称し、そしてこれは、１２５位（完全長ツムスタチンの）におけるシステインが部位指向性突然変異誘発を介してアラニンに突然変異しているツムスタチン−４５−１３２（配列番号３３）からなる。還元、例えばアルカリ還元されているツムスタチンのフラグメントもまた、本明細書においては抗血管形成特性を有するものとして記載する。ツムスタチンの他のフラグメントは、Ｔ７−突然変異体、Ｔ８、Ｔ８−３、ＴＰ３およびＰ２を包含する。
【００２１】
本発明はまた、例えば抗血管形成性のタンパク質およびペプチドと相互作用（例えば結合）して、それにより抗血管形成性のタンパク質、ペプチドおよび化合物を評価するための標的を提供する、受容体、結合タンパク質に関する。受容体およびそのサブユニットは、血管形成、腫瘍の増殖および転移、および、内皮細胞の増殖および遊走、および内皮細胞管腔形成を媒介する。これらの受容体はまた、細胞のアポトーシスも媒介する。
【００２２】
特に本発明は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖であるアレステンに結合することが分かっているインテグリンサブユニットα１、α２、α３、αｖ、β１およびβ３、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα２鎖であるカンスタチンに結合することが分かっているインテグリンサブユニットα１、α２およびβ１、そして、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα３鎖であるツムスタチンに結合することが分かっているインテグリンサブユニットα５、α６、αｖ、β１およびβ３に関する。インテグリン結合により媒介される内皮細胞の血管形成および増殖は、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンを投与することによるか、または、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの受容体として機能する上記のインテグリンサブユニットに結合する別のタンパク質、ペプチドまたは化合物を投与することによるか、のどちらかにより抑制される。インテグリン結合により媒介される内皮細胞のアポトーシスもまた、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンを投与すること、または、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの受容体として機能する上記のインテグリンサブユニットに結合する別のタンパク質、ペプチドまたは化合物を投与すること、のどちらかにより抑制される。このような化合物は、抗体、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのフラグメントまたは部分、または、上記のインテグリンサブユニットに結合するアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの領域を含むタンパク質またはペプチドを包むことができる。
【００２３】
本発明はまた、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンに対する受容体として機能するインテグリンサブユニットを模倣するタンパク質、ペプチドまたは化合物を投与することにより血管形成および細胞増殖を増強、促進または誘導する方法に関する。このようなタンパク質、ペプチドまたは化合物は、使用可能なアレステン、カンスタチンまたはツムスタチン、および、その生物学的に活性（例えば抗血管形成性）のフラグメント、突然変異体、類似体、相同体および誘導体、並びに、その多量体（例えば２量体）および融合タンパク質（本明細書においてはキメラタンパク質とも称する）と相互作用（例えば結合）する機能を有する、選択されたサブユニットからなるインテグリンタンパク質を包含する。このようなタンパク質、ペプチドまたは化合物はまた、８．５×１０−１１ＭのＫｄ１値および細胞当たり３×１０６部位のＢ  ｍａｘ１を有するアレステンに結合するヘパラン硫酸プロテオグリカンを包含する。本明細書においては、「使用可能な（ａｖａｉｌａｂｌｅ）」とは、インテグリンまたはそのサブユニットまたはフラグメントと接触または相互作用（例えば結合）できる可溶性または循環性のタンパク質を意味する。血管形成および細胞増殖はまた、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチン、またはその生物学的に活性（例えば抗血管形成性）のフラグメント、突然変異体、類似体、相同体および誘導体、並びに、その多量体（例えば２量体）および融合タンパク質（本明細書においてはキメラタンパク質とも称する）に対する抗体を投与することにより増強することができる。このような抗体はこれらの分子に結合し、これによりそれらがそのそれぞれのインテグリン受容体と相互作用して血管形成活性を抑制することを防止する。
【００２４】
本発明はまた、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンおよびその抗血管形成性変異体およびフラグメントと同様の態様で血管形成を抑制する抗血管形成性のタンパク質、ペプチドおよび化合物を同定するためのキットを含む。このようなキットは、インテグリンの適切な（例えばα１、α２、β３等）サブユニット、および後述する実施例において説明する試験の１つを実施するために必要な他の成分を含む。このようなキットを用いて行う例外的な試験には、後に実施例１２および２８において記載する細胞接着試験および後に実施例２６において記載する競合増殖試験を含む。
【００２５】
本発明はまた、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインの１以上のα鎖（例えばα１〜α６）に組織を接触させ、そして、血管形成、腫瘍増殖または腫瘍転移が１以上のインテグリンまたはインテグリンサブユニットにより媒介されるような、組織（例えば哺乳類またはヒトの組織）における血管形成、腫瘍増殖または腫瘍転移を抑制する方法に関する。
【００２６】
より詳しくは、本発明は、血管形成が１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα１β１、α２β１、α３β１、αｖβ３）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα１、α２、α３、αｖ、β１、β３）により媒介されるような、組織における血管形成を抑制する方法を特徴とする。この方法は、アレステンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。血管形成は、以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより抑制できる。
【００２７】
本発明はまた、腫瘍の増殖または転移が１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα１β１、α２β１、α３β１、αｖβ３）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα１、α２、α３、αｖ、β１、β３）により媒介されるような、組織における腫瘍の増殖または転移を抑制する方法を特徴とし；この方法は、アレステンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。腫瘍の増殖は、以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより抑制できる。
【００２８】
更に、本発明は、内皮細胞のアポトーシスが１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα１β１、α２β１、α３β１、αｖβ３）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα１、α２、α３、αｖ、β１、β３）により媒介されるような、組織における内皮細胞のアポトーシスを促進または誘導する方法を特徴とし；この方法は、アレステンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。アポトーシスは以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより促進または誘導できる。
【００２９】
本発明はまた、血管形成が１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα１β１、α２β１）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα１、α２、β１）により媒介されるような、組織における血管形成を抑制する方法を特徴とし；この方法は、カンスタチンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。血管形成は以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより抑制できる。
【００３０】
本発明はまた、腫瘍の増殖または転移が１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα１β１、α２β１）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα１、α２、β１）により媒介されるような、組織における腫瘍の増殖または転移を抑制する方法を特徴とし；この方法は、カンスタチンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。腫瘍の増殖は以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより抑制できる。
【００３１】
更に本発明は、内皮細胞のアポトーシスが１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα１β１、α２β１）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα１、α２、β１）により媒介されるような、組織における内皮細胞のアポトーシスを促進または誘導する方法を特徴とし；この方法は、カンスタチンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。アポトーシスは以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより促進または誘導できる。
【００３２】
本発明は、血管形成が１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα５β３、α６β１、αｖβ３）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα５、α６、αｖ、β１、β３）により媒介されるような、組織における血管形成を抑制する方法を特徴とし；この方法は、ツムスタチンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。血管形成は、以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより抑制できる。
【００３３】
本発明はまた、腫瘍の増殖または転移が１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα５β３、α６β１、αｖβ３）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα５、α６、αｖ、β１、β３）により媒介されるような、組織における腫瘍の増殖または転移を抑制する方法を特徴とし；この方法は、ツムスタチンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。腫瘍の増殖は、以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより抑制できる。
【００３４】
更に本発明は、内皮細胞のアポトーシスが１以上の内皮細胞インテグリン（例えばα５β３、α６β１、αｖβ３）または１以上の内皮細胞インテグリンサブユニット（例えばα５、α６、αｖ、β１、β３）により媒介されるような、組織における内皮細胞のアポトーシスを促進または誘導する方法を特徴とし；この方法は、ツムスタチンまたはそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体に内皮細胞を接触させることを包含する。アポトーシスは、以下の項目、即ち：内皮細胞の増殖、内皮細胞の遊走、または内皮細胞の管腔形成の１以上を抑制することにより促進または誘導できる。
【００３５】
本発明は更に、以下のもの、即ち：インテグリンのα１サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；インテグリンのα２サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；インテグリンのα３サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；インテグリンのα５サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；インテグリンのα６サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；インテグリンのαｖサブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；インテグリンのβ１サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド；または、インテグリンのβ３サブユニットに特異的に結合する抗体またはペプチド、の１以上に組織を接触させることを包含する、組織における血管形成または細胞増殖を抑制する方法を特徴とする。この方法は血管形成または細胞増殖を特徴とする症状を治療するために使用してよい。
【００３６】
更に本発明は、インテグリンのα１サブユニット；インテグリンのα２サブユニット；インテグリンのα３サブユニット；インテグリンのα５サブユニット；インテグリンのα６サブユニット；インテグリンのαｖサブユニット；インテグリンのβ１サブユニット；または、インテグリンのβ３サブユニット、の１以上に組織を接触させることを包含する、組織における血管形成または細胞増殖を促進または誘導する方法を特徴とする。１以上のインテグリンサブユニットは可溶性の形態であることができ、そしてそれらは単量体、２量体、３量体、４量体、または多量体であることもできる。
【００３７】
本発明はまた、アレステンに対する受容体（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α３β１インテグリン、αｖβ３インテグリン）により媒介される血管形成が疾患の特徴である、脊椎動物における増殖性疾患を抑制する方法を特徴とし；この方法は、アレステン受容体媒介血管形成を抑制し、これにより増殖性疾患を抑制することを包含する。アレステン受容体媒介血管形成の抑制により、腫瘍の増殖、転移の抑制、または、樹立された腫瘍の退縮がもたらされる。アレステン受容体媒介血管形成の抑制は、アレステン受容体媒介血管形成を抑制する分子、例えば、アレステン受容体に特異的に結合する抗体（例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体）、抗体フラグメントまたはペプチドに、増殖細胞を接触させることにより達成できる。
【００３８】
本発明は更に、アレステンに結合する１以上の可溶性受容体を含む組成物に組織を接触させることを包含する、組織における血管形成を促進する方法を特徴とする。
【００３９】
別の側面において、本発明は、カンスタチンに対する受容体（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン）により媒介される血管形成が疾患の特徴である、脊椎動物における増殖性疾患を抑制する方法を特徴とし；この方法は、カンスタチン受容体媒介血管形成を抑制し、これにより増殖性疾患を抑制することを包含する。カンスタチン受容体媒介血管形成の抑制により、腫瘍の増殖、転移の抑制、または、樹立された腫瘍の退縮がもたらされる。カンスタチン受容体媒介血管形成の抑制は、カンスタチン受容体媒介血管形成を抑制する分子、例えば、カンスタチン受容体に特異的に結合する抗体（例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体）、抗体フラグメントまたはペプチドに、増殖細胞を接触させることにより達成できる。
【００４０】
本発明は更に、カンスタチンに結合する１以上の可溶性受容体を含む組成物に組織を接触させることを包含する、組織における血管形成を促進する方法を特徴とする。
【００４１】
別の側面において、本発明は、ツムスタチンに対する受容体（例えばα５β１インテグリン、α６β１インテグリン、αｖβ３インテグリン）により媒介される血管形成が疾患の特徴である、脊椎動物における増殖性疾患を抑制する方法を特徴とし；この方法は、ツムスタチン受容体媒介血管形成を抑制し、これにより増殖性疾患を抑制することを包含する。ツムスタチン受容体媒介血管形成の抑制により、腫瘍の増殖、転移の抑制、または、樹立された腫瘍の退縮がもたらされる。ツムスタチン受容体媒介血管形成の抑制は、ツムスタチン受容体媒介血管形成を抑制する分子、例えば、ツムスタチン受容体に特異的に結合する抗体（例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体）、抗体フラグメントまたはペプチドに、増殖細胞を接触させることにより達成できる。
【００４２】
本発明は更に、ツムスタチンに結合する１以上の可溶性受容体を含む組成物に組織を接触させることを包含する、組織における血管形成を促進する方法を特徴とする。
【００４３】
別の側面において、本発明は、組織におけるＦＬＩＰ濃度を低下させる分子に組織を接触させることを包含する、組織における血管形成を抑制する方法を特徴とする。
【００４４】
本発明はまた、１以上のアレステン受容体またはアレステン受容体サブユニット（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α３β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α２インテグリンサブユニット、α３インテグリンサブユニット、αｖインテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット、β３インテグリンサブユニット）に特異的に結合する１以上の分子（例えば抗体、抗体フラグメント、ペプチド）を生物学的活性成分として含有する組成物を特徴とする。組成物は場合により製薬上許容しうる担体を含んでよい。組成物は血管形成活性を特徴とする疾患を抑制する方法において使用でき、この方法は疾患を有する患者に組成物を投与することを包含する。疾患は血管形成活性を特徴とし、組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と併用して患者に投与することができる。
【００４５】
別の側面において、本発明は、１以上のアレステン受容体またはアレステン受容体サブユニット（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α３β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α２インテグリンサブユニット、α３インテグリンサブユニット、αｖインテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット、β３インテグリンサブユニット）を生物学的活性成分として含有する組成物を特徴とする。組成物は場合により製薬上許容しうる担体を含んでよい。組成物は血管形成を促進または誘導するための方法において使用でき、この方法は疾患を有する患者に組成物を投与することを包含する。疾患は血管形成活性を特徴とし、組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と併用して患者に投与することができる。
【００４６】
本発明はまた、１以上のカンスタチン受容体またはカンスタチン受容体サブユニット（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α２インテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット）に特異的に結合する１以上の分子（例えば抗体、抗体フラグメント、ペプチド）を生物学的活性成分として含有する組成物を特徴とする。組成物は場合により製薬上許容しうる担体を含んでよい。組成物は血管形成活性を特徴とする疾患を抑制する方法において使用でき、この方法は疾患を有する患者に組成物を投与することを包含する。疾患は血管形成活性を特徴とし、組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と併用して患者に投与することができる。
【００４７】
別の側面において、本発明は、１以上のカンスタチン受容体またはカンスタチン受容体サブユニット（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α２インテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット）を生物学的活性成分として含有する組成物を特徴とする。組成物は場合により製薬上許容しうる担体を含んでよい。組成物は血管形成を促進または誘導するための方法において使用でき、この方法は疾患を有する患者に組成物を投与することを包含する。疾患は血管形成活性を特徴とし、組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と併用して患者に投与することができる。
【００４８】
本発明はまた、１以上のツムスタチン受容体またはツムスタチン受容体サブユニット（例えばα５β１インテグリン、α６β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、α５インテグリンサブユニット、α６インテグリンサブユニット、αｖインテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット、β３インテグリンサブユニット）に特異的に結合する１以上の分子（例えば抗体、抗体フラグメント、ペプチド）を生物学的活性成分として含有する組成物を特徴とする。組成物は場合により製薬上許容しうる担体を含んでよい。組成物は血管形成活性を特徴とする疾患を抑制する方法において使用でき、この方法は疾患を有する患者に組成物を投与することを包含する。疾患は血管形成活性を特徴とし、組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と併用して患者に投与することができる。
【００４９】
別の側面において、本発明は、１以上のツムスタチン受容体またはツムスタチン受容体サブユニット（例えばα５β１インテグリン、α６β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、α５インテグリンサブユニット、α６インテグリンサブユニット、αｖインテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット、β３インテグリンサブユニット）を生物学的活性成分として含有する組成物を特徴とする。組成物は場合により製薬上許容しうる担体を含んでよい。組成物は血管形成を促進または誘導するための方法において使用でき、この方法は疾患を有する患者に組成物を投与することを包含する。疾患は血管形成活性を特徴とし、組成物は放射線療法、化学療法または免疫療法と併用して患者に投与することができる。
【００５０】
更に別の側面において、本発明は、細胞（例えば癌細胞）がアレステンの作用に対して感受性であるかどうかを測定する方法を特徴とし、それは、以下の工程、即ち：（ａ）細胞を含有する試料（例えば、哺乳動物から）を準備すること、（ｂ）試料を、１以上の抗体（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α３β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α２インテグリンサブユニット、α３インテグリンサブユニット、αｖインテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット、β３インテグリンサブユニットに対する抗体）と、１以上の抗体の細胞への結合のために十分な時間、そして１以上の抗体の細胞への結合に適する条件下で、反応させること；そして、細胞がアレステンの作用に感受性であれば、細胞−抗体複合体を形成すること；そして、次に（ｃ）細胞−抗体複合体の存在を検出すること；これにより、試料中の細胞−抗体複合体の存在がアレステンの作用に対する細胞の感受性を示すようにすること、を包含する。前記哺乳動物は望ましくない血管形成を少なくとも部分的に特徴とする症状を有してよい。
【００５１】
更に別の側面において、本発明は、細胞（例えば癌細胞）がカンスタチンの作用に対して感受性であるかどうかを測定する方法を特徴とし、それは、以下の工程、即ち：（ａ）細胞を含有する試料（例えば、哺乳動物から）を準備すること、（ｂ）試料を、１以上の抗体（例えばα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α２インテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニットに対する抗体）と、１以上の抗体の細胞への結合のために十分な時間、そして１以上の抗体の細胞への結合に適する条件下で、反応させること；そして、細胞がカンスタチンの作用に感受性であれば、細胞−抗体複合体を形成すること；そして、次に（ｃ）細胞−抗体複合体の存在を検出すること；これにより、試料中の細胞−抗体複合体の存在がカンスタチンの作用に対する細胞の感受性を示すようにすること、を包含する。前記哺乳動物は望ましくない血管形成を少なくとも部分的に特徴とする症状を有してよい。
【００５２】
更に別の側面において、本発明は、細胞（例えば癌細胞）がツムスタチンの作用に対して感受性であるかどうかを測定する方法を特徴とし、それは、以下の工程、即ち：（ａ）細胞を含有する試料（例えば、哺乳動物から）を準備すること、（ｂ）試料を、１以上の抗体（例えばα５β１インテグリン、α６β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、α１インテグリンサブユニット、α５インテグリンサブユニット、α６インテグリンサブユニット、αｖインテグリンサブユニット、β１インテグリンサブユニット、β３インテグリンサブユニットに対する抗体）と、１以上の抗体の細胞への結合のために十分な時間、そして１以上の抗体の細胞への結合に適する条件下で、反応させること；そして、細胞がツムスタチンの作用に感受性であれば、細胞−抗体複合体を形成すること；そして、次に（ｃ）細胞−抗体複合体の存在を検出すること；これにより、試料中の細胞−抗体複合体の存在がツムスタチンの作用に対する細胞の感受性を示すようにすること、を包含する。前記哺乳動物は望ましくない血管形成を少なくとも部分的に特徴とする症状を有してよい。
【００５３】
本発明はまた、抗血管形成特性を有するＩＶ型コラーゲンのアルファ鎖のＮＣ１ドメインを含むタンパク質に関する。特に本発明は、新規のタンパク質であるアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンに関するものであり、そして生物学的に活性な（例えば抗血管形成性の）そのフラグメント、突然変異体、類似体、相同体および誘導体、並びにその多量体（例えば２量体）および融合タンパク質（本明細書においてはキメラタンパク質とも称する）に関する。これらのタンパク質はすべてＩＶ型コラーゲンのＮＣ１（非コラーゲン性１）ドメインのＣ末端フラグメントを含む。より詳細には、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンは各々が、それぞれ、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖、α２鎖およびα３鎖のＮＣ１ドメインのＣ末端フラグメントである。特にアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンは単量体タンパク質である。３つすべてがインビボで腫瘍の増殖を停止させ、そしてまた、内皮細胞管腔試験を含むいくつかのインビトロのモデルにおいて毛細管の形成も抑制している。
【００５４】
本発明は、内皮細胞におけるアレステンの受容体としてのインテグリンまたはインテグリンサブユニット（例えばα１β１、α１β２およびα２β１インテグリン）を包含し、これらの細胞において内皮細胞のアポトーシスを含む抗血管形成活性を媒介する。アレステンはまた、特異的に結合してマトリックス・メタロプロテイナーゼ２、３および９の基底膜分解活性を阻害し；このような分解活性は血管形成の不可欠な部分である。
【００５５】
本発明はまた、抗血管形成活性を有するＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメイン、単離アレステンの抗血管形成性フラグメント、単離アレステンおよび抗血管形成性フラグメントの多量体、およびこれらの抗血管形成性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離および組換え製造されたアレステンもまた含む。また、単離アレステン、その抗血管形成性フラグメントまたは双方を生物学的活性成分として含む組成物もまた包含される。別の実施形態においては、本発明は、疾患が血管形成活性を特徴とする、哺乳動物における癌のような増殖性疾患の治療方法を特徴とし、この方法は抗血管形成性アレステンまたはそのフラグメントを含有する組成物を哺乳動物に投与することを包含する。抗血管形成性アレステンおよびそのフラグメントはまた、細胞の遊走または内皮細胞の増殖を防止するために使用することができる。また、単離抗血管形成性アレステンおよびそのフラグメントに対する抗体も特徴とする。
【００５６】
本発明はまた、内皮細胞におけるカンスタチンに対する細胞接着受容体としてのインテグリンまたはインテグリンサブユニット（例えばα１β１およびα１β２インテグリン）も包含し、これらの細胞における内皮細胞のアポトーシスを含む抗血管形成活性を媒介する。
【００５７】
本発明はまた、抗血管形成活性を有するＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメイン、単離カンスタチンの抗血管形成性フラグメント、単離カンスタチンおよび抗血管形成性フラグメントの多量体、およびこれらの抗血管形成性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離および組換え製造されたカンスタチンを包含する。また、単離カンスタチン、その抗血管形成性フラグメントまたは双方を生物学的活性成分として含む組成物も包含される。別の実施形態においては、本発明は、疾患が血管形成活性を特徴とする、哺乳動物における癌のような増殖性疾患の治療方法を特徴とし、この方法は抗血管形成性カンスタチンまたはそのフラグメントを含有する組成物を哺乳動物に投与することを包含する。抗血管形成性カンスタチンおよびそのフラグメントはまた、細胞の遊走または内皮細胞の増殖を防止するために使用することができる。また、単離抗血管形成性カンスタチンおよびそのフラグメントに対する抗体も特徴とする。
【００５８】
本発明はまた、内皮細胞におけるツムスタチンの受容体としてのインテグリンおよびインテグリンサブユニット（例えばα５β１、α６β１およびαｖβ３インテグリン）を包含し、これらの細胞における内皮細胞のアポトーシスを含む抗血管形成活性を媒介する。
【００５９】
本発明はまた同様に、抗血管形成活性を有するＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン、単離ツムスタチンの抗血管形成性フラグメント、単離ツムスタチンおよび抗血管形成性フラグメントの多量体、および、これらの抗血管形成性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離および組換え製造されたツムスタチンを包含する。また、単離ツムスタチン、その抗血管形成性フラグメントまたは双方を生物学的活性成分として含む組成物も包含される。別の実施形態においては、本発明は、疾患が血管形成活性を特徴とする、哺乳動物における癌のような増殖性疾患の治療方法を特徴とし、この方法は抗血管形成性ツムスタチンまたはそのフラグメントを含有する組成物を哺乳動物に投与することを包含する。抗血管形成性ツムスタチンおよびそのフラグメントはまた、細胞の遊走または内皮細胞の増殖を防止するために使用することができる。また、単離抗血管形成性ツムスタチンおよびそのフラグメントに対する抗体も特徴とする。
【００６０】
詳細な説明
広範の種々の疾患は、望ましくない血管形成の結果である。言い換えれば、ある条件下で、特定の時に、または特定の組織において毛細血管の生育と伸長を停止させることが可能であれば、多くの疾患および望ましくない症状を防止または緩和することができる。基底膜組織化は、ＩＶ型コラーゲンのＣ末端球状非コラーゲン性（ＮＣ１）ドメインを介して起こると考えられているＩＶ型コラーゲンネットワークの組み立てに依存している（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：６１８−２４；Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．ら，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：２０３−１１）。ＩＶ型コラーゲンは６種の異なる遺伝子産物、即ち、α１〜α６からなる（Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．ら，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４０３−３４）。α１およびα２のアイソフォームは、ヒト基底膜中に偏在的に存在している（Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：９３−１２７）が、一方、他の４種のアイソフォームは限定された分布を示す（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０−８）。
【００６１】
既存の血管からの新しい毛細血管の形成、即ち血管形成は、腫瘍の増殖および転移の過程において必須である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−４；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ら，１９９６，Ｃｅｌｌ  ８６：３５３−６４）。ヒトおよび動物の腫瘍は最初は血管新生しないが、しかしながら、腫瘍が数ｍｍ３を超えて増殖するためには、それは血管新生しなければならない（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ら，１９９６，Ｃｅｌｌ  ８６：３５３−６４）。血管形成表現型への切り替えには、血管新生刺激物質のアップレギュレーションおよび血管新生抑制物質のダウンレギュレーションの両方が必要である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７−３１）。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、腫瘍において最も一般的に発現されている血管形成因子である。血管新生した腫瘍は、腫瘍増殖を相乗作用的に促進しうる１以上のこれらの血管形成因子を過剰発現する。ＶＥＧＦのような単一の血管形成因子を受容体拮抗剤を用いて抑制することは、腫瘍の増殖を停止させるのに十分ではない。多くの血管形成阻害因子が最近同定されており、ＩＦＮ−ａ、血小板第4因子のような特定の因子（Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．Ｅ．ら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：７７−９）およびＰＥＸ（Ｂｒｏｏｃｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９２：３９１−４００）は内因的には腫瘍細胞と関連していないのに対し、アンジオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−２８）およびエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−８５）は腫瘍組織そのものから生じる腫瘍関連血管形成阻害因子である。腫瘍の増殖および転移をこれらの内因性血管形成阻害因子を用いて治療することは極めて効果的であり魅力的な考えであるが、抗血管形成療法に関連するいくつかの潜在的な問題を考慮しなければならない。長期にわたる抗血管形成療法により誘導される遅延毒性、並びに治療中に起こる創傷治癒障害および再生的血管形成の障害の可能性を重大視しなければならない。
【００６２】
インテグリンは、一般的に細胞の細胞骨格に受容体を連結させる短いＣ末端細胞質ドメインおよびリガンドに結合するための長いＮ末端細胞外ドメインを有している。αおよびβサブユニットの両方がリガンド結合に関与しており、広範囲に並んだ潜在的リガンドが存在している。いくつかの一般的なリガンドには、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよび種々の型のコラーゲンが含まれる。これらの一部（例えばフィブロネクチンおよびラミニン）は複数のインテグリンにより結合される。コラーゲンＩはインテグリンα１β１、α２β１およびα３β１により結合され、コラーゲンＩＶはインテグリンα１β１およびα２β１により結合されることが知られている。上皮細胞はインテグリンα２β１、α６β１、αｖβ３およびα６β４により結合される。サイトカイン活性化内皮細胞は、α４β１およびαＬβ２により結合され、そして血管内皮はαＭβ２インテグリンにより結合される。
【００６３】
本発明においては、血管形成性のタンパク質およびペプチドと相互作用、例えば特異的に結合する細胞表面受容体、特に、抗血管形成性タンパク質アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンに結合するインテグリンおよびインテグリンサブユニットを開示する。これらのインテグリンは、新しい抗血管形成性のタンパク質、ペプチドおよび化合物、または、現在知られている抗血管形成性のタンパク質、ペプチドおよび化合物のより強力な変異体およびフラグメント、特にアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンのより強力な変異体およびフラグメントを評価するための標的を提供する。特に、本発明は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖であるアレステンに結合することが分かっているインテグリンサブユニットα１、α２、α３、αｖ、β１およびβ３に関する。本発明はまた、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα２鎖であるカンスタチンに結合することが分かっているインテグリンサブユニットα１、α２およびβ１に関する。更に本発明は、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα３鎖であるツムスタチンに結合することが分かっているインテグリンサブユニットα５、α６、αｖ、β１およびβ３に関する。他のインテグリンまたはインテグリンサブユニットもまた、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンに結合する場合があり、これらは本明細書に記載する方法を用いて同定されうる（例えば下記の実施例１２、２６および２８参照）。
【００６４】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンを投与するか、またはアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンに対する受容体として作用する上記のインテグリンサブユニットに結合する別のタンパク質、ペプチドまたは化合物を投与するか、のどちらかにより、血管形成および内皮細胞の増殖が抑制され、または、内皮細胞のアポトーシスが促進または誘導される。このようなタンパク質、ペプチドおよび化合物は、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの抗体、フラグメントまたは部分、または、上記のインテグリンサブユニットに特異的に結合するアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの領域を含むタンパク質またはペプチドを包含する。「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」とは、特定の結合タンパク質（例えば抗体または受容体）へのリガンド（例えば抗原）の高い結合活性および／または高い親和性による結合を有することを意味する。例えば、この特異的抗原のそのエピトープに結合する抗体は、いかなる他のエピトープへの、特に対象となる特定の抗原として関連して分子中に存在しているかまたは同じ試料中に存在するものへの、同じ抗体の結合よりも強力である。対象となる分子に特異的に結合する抗体は、弱いがなお検出可能な水準（例えば対象となる分子で観察される結合の１０％以下）で他の分子に結合することができる場合がある。このような弱い結合、即ちバックグラウンド結合は、例えば適切な対照群を用いることにより、対象となる分子への特異的抗体結合から容易に識別することができる。
【００６５】
特定のペプチドに対する抗体は一般的に作成されており、所定のタンパク質に対する抗体の製造方法は当業者のよく知るとおりである（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８７，ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  １９９９）の第１１章、特に１１．４．２−１１．１１．５のページ、（“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”），１１．１２．１−１１．１３．４（“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ”）およびとりわけ１１．１４．１−１１．１５．４のページ（“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）を参照のこと）。オーダーメイドの抗体はまた、多くの入手元、例えばＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから購入することもできる。インテグリンおよびインテグリンサブユニットに対する抗体の製造方法もまたよく知られており、このような抗体の製造方法はＧａｌｌａｔｉｎ，Ｗ．Ｍ．ら，（米国特許第５，８１７，５１５号）およびＫｉｍ，Ｋ．Ｊ．ら，（米国特許第５，６５２，１１０号；５，６５２，１０９号；５，５７８，７０４号）に記載されており、その内容はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本明細書に記載するインテグリンおよびインテグリンサブユニットは、組換えにより、そして可溶性形態で製造することができる。可溶性の受容体およびタンパク質の製造方法は当該技術分野においてよく知られており、可溶性形態のインテグリンおよびインテグリン受容体の製造方法はＢｒｉｅｓｅｗｉｔｚ，Ｒ．ら，（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８９−９６），Ｋｅｒｎ，Ａ．ら，（１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２２８１１−６）、そしてまたＧａｌｌａｔｉｎ，Ｗ．Ｍ．ら，（米国特許第５，７２８，５３３および５，８３１，０２９号）およびＤｕｏｎｇ，Ｌ．Ｔ．ら，（米国特許第５，８９５，７５４号）に記載されており、その内容はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
本発明はまた、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの受容体として機能するインテグリンサブユニットを模倣するタンパク質、ペプチドまたは化合物を投与することによる、血管形成および細胞増殖の増強または細胞アポトーシスの抑制のための方法に関する。このようなタンパク質、ペプチドまたは化合物には、使用可能なアレステン、カンスタチンまたはツムスタチン、および、その生物学的に活性（例えば抗血管形成性）のフラグメント、突然変異体、類似体、相同体および誘導体、並びに、その多量体（例えば２量体）および融合タンパク質（本明細書においてはキメラタンパク質とも称する）に結合し、これによりそれらがそれらのそれぞれのインテグリン受容体と相互作用して血管形成活性を抑制するのを防止する、選択されたサブユニットからなるインテグリンタンパク質を包含する。アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンおよびその変異体およびフラグメントに結合するタンパク質、ペプチドまたは化合物はまた、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンに対する、またはその変異体またはフラグメントに対する抗体も包含する。このような抗体はこれらの分子に結合し、これにより、それらがそれらのそれぞれのインテグリン受容体と相互作用して血管形成活性を抑制することを防止する。
【００６８】
本発明においては、アレステン、カンスタチンおよび／またはツムスタチンまたはそのフラグメントまたは突然変異体は、単独でまたは組み合わせて、組織における血管形成、内皮細胞増殖、内皮細胞遊走または内皮細胞管腔形成を抑制するために、または、組織中のアポトーシスを誘導または促進するために使用してよく、例えば、アレステンおよびカンスタチンを医薬組成物内で組み合わせ、Ｔｕｍ−４およびＴ７を組成物内で組み合わせるなどすることができる。アレステン、カンスタチンおよび／またはツムスタチンの組み合わせは、他のコラーゲンドメインまたはＮＣ１鎖、または他の形態の治療、例えば放射線療法、化学療法、免疫療法、または他の活性分子、例えばエンドスタチン、アンジオスタチン、レスチンとさらに組み合わせることもできる。このような分子は、抗アポトーシス性タンパク質、ＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質、即ちＦＡＤＤ様インターロイキン−１ベータ変換酵素阻害タンパク質）の濃度を低下させる。従って血管形成は、ＦＬＩＰの濃度を低下させる分子により抑制され、これによりカスパーゼ活性を誘発し、末端アポトーシスシグナルを伝達する。
【００６９】
本明細書に記載したアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンに対する受容体は（例えばα１β１、α２β１、α３β１、α５β１、α６β１およびαｖβ３インテグリン）および／またはそのサブユニット（例えばα１、α２、α３、α５、α６、αｖ、β１、β３）は血管形成の促進または誘導のために組み合わせて使用することができる。アレステン、カンスタチンおよび／またはツムスタチンに対する抗体はまた、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンに対する受容体およびそれらの受容体サブユニットに対する抗体の場合と同様に、単一の治療方法に組み込むこともできる。
【００７０】
本発明はまた、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチン、およびその抗血管形成性変異体およびフラグメントと同様な態様で血管形成を抑制する抗血管形成性タンパク質、ペプチドおよび化合物を同定するためのキットも包含する。このようなキットは、適切な（例えばα１、α２、β３等）インテグリンサブユニットおよび後述する実施例に記載する試験の１つを実施するために必要な他の成分を含む。このようなキットを用いて実施される例外的な試験は、後述する実施例１２および２８に記載する細胞接着試験、および後述する実施例２６に記載する競合増殖試験を含む。例えば、ツムスタチンと同様の態様で挙動するタンパク質、ペプチドまたは化合物を同定するためのキットは、インテグリンサブユニットα６、β１、αｖ、β３およびＩｇＧ（対照群として機能）に対する抗体のような、実施例２８の細胞接着試験を実施するために必要な成分および試薬を包含する。キットは場合により、被験化合物および対照群、例えばＩＶ型コラーゲンまたはラミニン−１でコーティングされる９６穴のプレートを含むことができる（またはプレートは場合により予備コーティングされうる）。キットはまた場合により、ＢＳＡまたは他のブロッキング剤、および接着用の細胞（例えばＨＵＶＥＣ細胞）、並びに細胞を増殖させ、トリプシン処理し、再懸濁し、そして染色するための試薬を含むことができる。
【００７１】
ひとたび潜在的に抗血管形成性の化合物が同定されると、別のキットを用いて、一回目に化合物を同定するために使用したものと同じインテグリンサブユニットとの競合により、抗血管形成活性の消失を明らかにすることができる。このようなキットは後述する実施例２６に記載する競合増殖試験においてモデル化される。キットは増殖試験（後述する実施例に記載）において有用な細胞、および、タンパク質形態の適切なインテグリンサブユニットを含む。キットはまた場合により、被験化合物の抗増殖活性への介入におけるインテグリンサブユニットタンパク質の作用を調べるために必要または有用な染色剤および他の試薬を含むことができる。
【００７２】
本発明においては、抗血管形成性を有するタンパク質およびそのフラグメント、類似体、誘導体、相同体および突然変異体を、血管形成媒介増殖性疾患を抑制するためにこのようなタンパク質、類似体、誘導体、相同体および突然変異体を使用する方法に加えて説明する。タンパク質はＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣ１ドメインまたはドメインの部分を含み、特に、ＩＶ型コラーゲンのα１、α２およびα３鎖のＮＣ１ドメインのモノマーを含む。これらのタンパク質は、特に単量体形態にある場合に、癌のインビボのモデルにおける腫瘍の増殖を停止させ、そしてまた、内皮細胞管腔試験を含むいくつかのインビトロのモデルにおいて毛細管の形成を抑制する。
【００７３】
これらのタンパク質はまた、ＮＣ１ドメインの接合領域を含んでよい。α１、α２またはα３鎖が好ましいが、その理由はα４、α５およびα６鎖は低減あるいは非検出可能な抗血管形成活性を有していることを示唆する証拠があるためである。一般的に、タンパク質の単量体形態が好ましいが、その理由は６量体の形態では活性は殆ど無いか、または低減されていることを示唆する証拠があるためである。
【００７４】
より詳しくは、本発明は「アレステン（Ａｒｒｅｓｔｅｎ）」と命名されたタンパク質を説明するものであり、これは、ヒトＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖のＮ末端におけるアミノ酸に相当する約２３０アミノ酸長のタンパク質である（Ｈｏｓｔｉｋｋａ，Ｓ．Ｌ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９４８８−９３）。
【００７５】
本明細書に開示するとおり、ヒトアレステンはペリプラズムの輸送が可能であり、これにより可溶性タンパク質を結果として生じるｐＥＴ２２ｂのような、細菌発現プラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生することができる。タンパク質は、Ｃ末端の６ヒスチジンタグを有する２９ｋＤａの融合タンパク質として発現する。更に３ｋＤａ（２６ｋＤａを超える）がポリリンカーおよびヒスチジンタグ配列から生じる。アレステンはまた、ｐｃＤＮＡ３．１の真核細胞用ベクターを用いて２９３腎細胞中において分泌可溶性タンパク質として産生された。この２９３産生タンパク質はまた、精製または検出のタグを有していない。
【００７６】
アレステンは、処置後２時間もの早期に内皮細胞アポトーシスを誘発し、そしてこの作用は内皮細胞に特異的であり、高用量のアレステンで処置された腫瘍細胞において有意な細胞死は観察されていない。代表的なＣＤ−３１染色パターンは、対照のマウスと比較して投与マウスの血管系の減少を示した。腫瘍の切片をＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）、フィブロネクチンおよびＩＶ型コラーゲンについて染色したところ、腫瘍細胞の増殖または、腫瘍細胞を包囲するＩＶ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの含量や構造には差は無かった。
【００７７】
大腸菌産生アレステンは、用量依存性の態様でｂＦＧＦ刺激内皮細胞の増殖を抑制し、そのＥＤ５０は０．２５μｇ／ｍｌであった。腎癌細胞（７８６−Ｏ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）またはヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）の増殖に対しては有意な作用は観察されなかった。エンドスタチンは、アレステンより３倍高値のＥＤ５００．７５μｇ／ｍｌでＣ−ＰＡＥ細胞の増殖を抑制し、Ａ−４９８癌細胞を抑制しなかった。
【００７８】
内皮細胞の増殖および遊走の特異的抑制は、本明細書に記載するとおり、アレステンが細胞表面のタンパク質または受容体を介して機能することを示している。マトリックス・メタロプロテイナーゼ、即ちＭＭＰの抑制は、バチマスタット（ＢＢ−９４）およびマリマスタット（ＢＢ−２５１６）と同様に、腫瘍の増殖および転移におけるアレステンの直接の役割を示唆している。
【００７９】
最近の研究によれば、α１β１、α１β１およびα２β１インテグリンがＥＨＳ肉腫腫瘍から単離されたＩＶ型コラーゲンに結合することが予測されている（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３６１２−７）。アレステンは、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のフラグメントであるため、それがα１β１／α２β１インテグリンを介した内皮細胞結合を媒介する能力について評価されている。インテグリンα１およびβ１サブユニットに対する抗体を機能的にブロックし、そして、アレステン・コーティング培養ウェルへのＨＵＶＥＣ細胞の結合を著しく低減することが示された（図１０Ａ）。アレステン・コーティングしたプレートへの内皮細胞の接着は、α１抗体で６０％、そしてβ１インテグリン抗体で７０％抑制された。これらの結果は１２５Ｉ標識アレステンを用いた結合試験の結果と合致している。アレステンは、８．５×１０−１１の高親和性のＫｄ１値および４．６×１０−８の低親和性のＫｄ２値で内皮細胞に結合する。プレートをＩＶ型コラーゲンでコーティングした場合、中等度の抑制が、α１への中和抗体では３０％、β１抗体では４０％、そしてαｖβ３抗体では１５％観察された（図１０Ｂ）。アレステンとコラーゲンＩＶコーティングプレートとの間の細胞接着の差は、全体のコラーゲンＩＶ分子上の潜在的な別のインテグリン結合部位が原因であると考えられるが、アレステンはα１β１インテグリンに対して単一の特異的結合部位を与える（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【００８０】
アレステンの腫瘍抑制活性はインテグリン、特にα１β１により媒介されうる。α１β１へのアレステンの結合は、以前に別途報告されたとおり、α１β１インテグリンへのＶＥＧＦの依存性により示唆されるように、内皮細胞のＶＥＧＦ誘導増殖および遊走をダウンレギュレートする（Ｂｌｏｃｈ，Ｗ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：２６５−７８）。これらの結果を総括すると、アレステンは血管形成カスケード中の種々の段階でその作用を発揮することが示される。α１およびα２インテグリンサブユニットに対する抗体はインビボで血管形成を抑制することができることがわかっている（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら，ＷＯ９９／１６４６５）。アレステンは、ＶＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦのいずれかの活性を直接抑制することにより機能する。ラットにおけるアレステンの半減期３６時間は、臨床使用のために必要とされる用量がエンドスタチンおよびアンジオスタチンのような他のタンパク質阻害因子よりもはるかに低値であることを示唆している（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−８５）。
【００８１】
本発明においては、カンスタチン、即ちＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインを用いて血管形成を抑制し、これは、内皮細胞の増殖および遊走の抑制により、並びに内皮細胞管腔形成の抑制により試験された。カンスタチンは内皮細胞の増殖を抑制し、そしてこれらの細胞のアポトーシスを誘導したが、非内皮細胞の増殖の抑制またはアポトーシスはなかった。カンスタチン誘導アポトーシスは、抗アポトーシスタンパク質ＦＬＩＰのダウンレギュレーションにより媒介される。ＣＤ−３１組織学的染色によれば、対照のマウスと比較して投与群の血管系が減少していた。カンスタチンによる内皮細胞の増殖および遊走の特異的な抑制はまた、その抗血管形成活性を、そして、細胞表面のタンパク質／受容体を介してそれが機能していることを示している。インテグリンは、その細胞外マトリックス結合能力、および遊走や増殖のような細胞の挙動を調節する能力に基づいた潜在的な候補分子である。特に、αｖβ３インテグリンは、血管形成の間のその誘導およびその乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）結合能力により、カンスタチンの受容体である可能性がある。
【００８２】
本発明においては、ツムスタチン、即ちＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン（Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．ら，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：２０３−１１；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．ら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：５９２−６０１）を用いて、インビトロおよびインビボの血管形成および腫瘍増殖のモデルを使用する、血管内皮細胞の増殖および血管形成を調節した。ツムスタチンは腫瘍の血管形成の過程における種々の段階においてその作用を発揮する。ツムスタチンによる内皮細胞の特異的な抑制は、それが細胞表面のタンパク質または受容体を介して機能していることを強力に示唆している。最近、ツムスタチンのＣ末端部分に相当する１９アミノ酸長の合成ペプチドがαｖβ３インテグリンに結合することが報告されている（Ｓｈａｈａｎ，Ｔ．Ａ．ら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４５８４−９０）。下記の実施例において記載される細胞接着試験の結果は、ツムスタチンが内皮細胞でαｖβ３およびα６β１インテグリンに結合することを示している。ツムスタチンを、あとで内皮細胞と結合することになるαｖβ３インテグリンへのその結合を抑制するためにαｖβ３インテグリンタンパク質と共に予備インキュベートすると、ツムスタチンの抗増殖作用が著しく低減した（図２２）。このことは、ツムスタチンの抗増殖作用が、少なくとも部分的には増殖内皮細胞の細胞表面上のαｖβ３インテグリンへの結合を介して媒介されていることを示している。血管形成はαｖβ３インテグリンにより媒介される特定の内皮細胞接着事象に依存している（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：１１５７−６４；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｓ．ら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：５６９−７１）ため、ツムスタチンは、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのようなマトリックス成分との増殖内皮細胞の相互作用を妨害することにより抗血管形成作用を発揮している。ビトロネクチンおよびフィブロネクチンとの増殖内皮細胞の正常な相互作用は、重要な抗アポトーシスシグナルであると考えられている（Ｉｓｉｋ，Ｆ．Ｆ．ら，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７５：１４９−５５）。ツムスタチンは増殖刺激された内皮細胞におけるアポトーシスを誘導し、この作用は、ツムスタチンをサブコンフルエントの単層に添加した場合に、即ち細胞が指数関数的に増殖している場合に、最も顕著となる。ツムスタチンは、内皮細胞が活性化される腫瘍血管系に対して選択的である。
【００８３】
「α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメイン」のフラグメントとは、哺乳類ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインのアミノ酸配列のフラグメントまたは部分を意味する。このようなフラグメントの例は、配列番号１０のアミノ酸配列のフラグメントである。
【００８４】
α３（ＩＶ）鎖（ツムスタチン）の分布は、特定の基底膜、例えばＧＢＭ、蝸牛のいくつかの基底膜、例えば水晶体前嚢のような眼の基底膜、デスメー膜、卵巣および精巣の基底膜（Ｆｒｏｊｄｍａｎ，Ｋ．ら，１９９８，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８３：１２５−３０）および肺胞毛細管基底膜（Ｋａｓｈｔａｎ，Ｃ．Ｅ．，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：１７３６−５０）に限定されている。しかしながら、この鎖は、腎糸球体間質、皮膚の血管基底膜および表皮基底膜、および、肝の血管基底膜には存在しない（Ｋａｓｈｔａｎ，Ｃ．Ｅ．、上記）。創傷治癒の過程において、α３およびα４鎖以外のＩＶ型コラーゲンのα鎖が組み立てられて新しい毛細管を形成するが、その理由は、これらの２種の鎖が「既存の（ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ）」基底膜の成分、即ち皮膚の血管系ではないためである。α３（ＩＶ）鎖は正常なヒトの皮膚の本来の成分ではないため、創傷治癒についての損傷におけるコラーゲンの組み立ておよび血管形成の過程はツムスタチンを用いた治療により改変されない。
【００８５】
α３（ＩＶ）鎖は、ヒト腎血管基底膜並びにＧＢＭにおいて発現する（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０−８）。これらの「既存の」血管は、腎細胞癌のような原発性腎腫瘍の進行に関与していると考えられている。ツムスタチンは、α３（ＩＶ）鎖と他のα鎖との組み立てにより媒介される新血管形成を妨害することにより、原発性腎腫瘍の治療において効果的でありえる。腎細胞癌と診断された患者の数は１９９６年では米国で約３０，０００人であり（Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｐ．ら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５１８９−９５）、そして、転移症例の予後は極めて不良である。放射線療法および化学療法の進歩にもかかわらず、治療された患者の長期の生存はいまだ顕著には改善されていない（Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｐ．ら，上記）。腎細胞癌についての明らかな治療選択肢の欠如は新しい治療方法の開発の重要性を強調するものである。この事実に鑑み、固形腫瘍の新血管形成を標的とすることは、現在、いくつかの動物モデルにおいて有望な結果を示している（Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｃ．Ｔ．ら，１９９５，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：２５７−６７；Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｆ．Ｊ．ら，１９９４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６４：１５５−７４；Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．ら，１９９５，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３６：２３７−５１）。インビボの腎細胞癌増殖の抑制におけるツムスタチンの作用は、この種の腫瘍に対する効果的な抗血管形成性療法としてのこの分子の潜在力を示している。
【００８６】
本発明においては、ツムスタチンは、用量依存的な態様でインビトロのウシ肺動脈細胞の血清刺激増殖を特異的に抑制し、インビトロの腫瘍細胞系統ＰＣ−３および７８６−Ｏの増殖に対しては影響を及ぼさなかった。ツムスタチンは内皮細胞の遊走を抑制しなかったが、インビトロでマウス大動脈内皮細胞の管腔形成を著しく抑制し、また内皮細胞のアポトーシスも誘導した。ツムスタチンは、マトリゲルプラグ試験（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ）において、インビボで新血管形成を６７％抑制し、そして、６ｍｇ／ｋｇにおいては、マウス異種移植片モデルにおいてヒト腎細胞癌（７８６−Ｏ）細胞および前立腺癌（ＰＣ−３）の腫瘍増殖を抑制した。これらの結果を合わせれば、ツムスタチンは、血管形成過程における種々の工程を抑制することにより新しい血管の形成を抑制することが分かる。
【００８７】
インビボの研究において、ツムスタチンはマトリゲルプラグ試験において血管形成を抑制し、そして、マウス異種移植片モデルにおいてＰＣ−３腫瘍および７８６−Ｏ腫瘍の増殖を抑制した。ツムスタチンが大型の腫瘍の増殖を抑制したという事実は、特に臨床状況における腫瘍の治療を考慮すれば、有望なものである。
【００８８】
ツムスタチンはグッドパスチャー症候群、即ち肺出血および急速に進行する糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患についての病原性エピトープを有しているため（Ｂｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８７４−７７；Ｓａｕｓ，Ｊ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３３７４−８０；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４０１８−２４）、ツムスタチンの短期または長期の投与はこの自己免疫疾患を誘導する可能性がある。いくつかのグループがα３（ＩＶ）ＮＣ１上のグッドパスチャー自己エピトープの位置をマッピングまたは予測する試みを行っており、Ｎ末端部分、中央部分およびＣ末端部分がエピトープを有すると報告されている（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：１１７８−８５；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８；Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｂ．ら，１９９７，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：１６９８−１７０５；Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，Ｓ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９７８０−４；Ｋｅｆａｌｉｄｅｓ，Ｎ．Ａ．ら，１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４３：９４−１００；Ｎｅｔｚｅｒ，Ｋ．Ｏ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１２６７−７４）。近年、自己抗体の反応性はα３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端に対してのみであり、腎生存率に相関していることが報告された。これは、組換えキメラコンストラクトを用いて行われた（Ｈｅｌｌｍａｒｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５：９３６−４４）。疾患関連エピトープもまた、Ｎ末端部分の最初の４０アミノ酸について同定された。従って、グッドパスチャー症候群に関するエピトープを除去するために、Ｎ末端５３アミノ酸残基を欠いたトランケーションされたツムスタチンが合成され、そしてこの分子は、マウス異種移植片モデルにおいて７８６−Ｏ腫瘍の増殖に対し抑制作用を示した。更に、この分子はグッドパスチャー症候群の重度の患者に由来する自己抗体には結合しなかった。ツムスタチンＮ−５３（本明細書においては「Ｔｕｍ−１」とも称する）もまた、内皮細胞の生存性を強力に低減した。意外にも、この作用は完全長の分子においてよりもツムスタチンＮ−５３（Ｔｕｍ−１）において、より高値であった。これらの結果によれば、ツムスタチンの抗血管形成性の領域は、Ｎ末端５３アミノ酸が除去された場合においてさえも保存されていることを示している。
【００８９】
Ｔｕｍ−１以外にも、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４を含む他のツムスタチン欠失突然変異体もまた作成されている。これらもまた、後述する実施例３５に記載する。上記の通り、Ｔｕｍ−１はＣ末端１９１アミノ酸を含み、Ｎ末端５３アミノ酸を欠損している。「ツムスタチン３３３」はツムスタチンのＮ末端アミノ酸１〜１２４を含む。Ｔｕｍ−３はＣ末端の１１２アミノ酸を含む。Ｔｕｍ−４はＣ末端の６４アミノ酸を含み、これはアミノ酸１８５〜２０３を含む（Ｈａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３９５−４０１）。完全長ツムスタチンのアミノ酸５４〜１３２の領域はＴｕｍ−５と称した。本明細書において「ツムスタチン−４５−１３２」と称するＴｕｍ−５の拡張型は、Ｔｕｍ−５の発現と溶解性を増大させるために作成した。ツムスタチン−４５−１３２は、更に９個のアミノ酸のＮ末端における伸長部を有するＴｕｍ−５からなる。更に、ツムスタチン−４５−１３２の突然変異体が作成され、本明細書においては「Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ」と称した。この突然変異体は、（完全長ツムスタチンの）１２５位のシステインが部位指向性突然変異誘発によりアラニンに突然変異した、ツムスタチン−４５−１３２からなる。Ｔ１および部分重複するペプチドのセット（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６）からなる更に別の欠失突然変異体をＴｕｍ−５から作成した。
【００９０】
これらの突然変異体を以下の表１に示す。
【表１】
2006508015.tif 000002
2006508015.tif 000003
１  Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａにおいて、完全長ツムスタチン分子の１２５位のシステイン残基に代わってアラニンに置換されている。  
２  Ｔ７突然変異体において、完全長ツムスタチン分子の７７位のロイシン残基に代わってメチオニンに置換されており、そして８１位のバリンに代わってイソロイシンに置換されており、そして８３位のアスパラギン酸に代わってアスパラギンに置換されている。  
３  Ｔ８においては、完全長ツムスタチン分子の６８位のロイシン残基に代わってリジンに置換されている。  
４  Ｔ８−３において、完全長ツムスタチン分子の６８位のロイシン残基に代わってリジンに置換されており、そして７９位および８５位のシステイン残基に代わってセリンに置換されている。  
５  ＴＰ３において、完全長ツムスタチン分子の７６位のフェニルアラニン残基に代わってリジンに置換されており、そして８３位のアスパラギン酸に代わってシステインに置換されている。  
６  Ｐ２において、完全長ツムスタチン分子の６８位のロイシン残基に代わってリジンに置換されており、そして７９位および８５位のシステイン残基に代わってアスパラギン酸に置換されている。
【００９１】
Ｔｕｍ−４は、本明細書に記載するとおり黒色腫細胞の増殖（ＷＭ−１６４細胞）を抑制し、αｖβ３受容体に結合するが、この領域はツムスタチンの抗血管形成活性をもたらす部分ではない。これとは対照的に、ツムスタチンのＮ末端半分を含むツムスタチン欠失突然変異体Ｔｕｍ−２は、抗血管形成特性は示したが抗腫瘍細胞活性は示さなかった。従って、ある実験条件下においては、これらの２種の活性は切り離すことができると考えられる。
【００９２】
図３４Ａおよび３５Ａに示すとおり、完全長ツムスタチンおよび欠失突然変異体Ｔｕｍ−１は双方とも等価な抗血管形成活性を示すという事実は、残基１〜５３の領域がこの活性のために必要ではないことを示している。完全長ツムスタチンを超えたＴｕｍ−１の増大した抗血管形成活性は、より大きい完全長の分子とは対照的に、突然変異タンパク質のマイクログラム当たりの活性分子の増大数により合理的に説明できる。
【００９３】
完全長ツムスタチンおよび欠失突然変異体Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２がすべて抗血管形成活性を示す（即ち、内皮細胞増殖を抑制しそのアポトーシスを誘発する）がＴｕｍ−３およびＴｕｍ−４は示さないという事実は、ツムスタチンの抗血管形成特性は残基５４〜１３２の領域に主に位置していることを示唆している。活性はまた残基１３２を超えて一部の残基にまで伸長しているが、Ｔｕｍ−３が抗血管形成特性を示すのに十分な抗血管形成の領域を含んでいないことは明らかである。
【００９４】
しかしながら、Ｔｕｍ−４はＷＭ−１６４黒色腫細胞の増殖を抑制しており（図３３Ｂに示すとおり）、一方Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２は抑制しておらず、このことはツムスタチンの抗腫瘍細胞活性は残基１８１〜２４４内に存在していることを示している。Ｓｈａｈａｎら（１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４５８４−９０）の結果を考慮すると、抗腫瘍細胞活性は残基１８５〜２０３内に位置する可能性がより高い。ツムスタチンの抗血管形成活性と抗腫瘍細胞活性の分離は、抗血管形成の分野の大部分の研究がその血液供給の制限により腫瘍を抑制することを指向していることからすれば、意外である。
【００９５】
興味深いことに、欠失突然変異体Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２の抗血管形成活性はツムスタチンのものと同等であったため、残基５４〜１３２の領域の抗血管形成活性はまた、完全長の折りたたみツムスタチン分子内にそれが含まれる場合にも有効である。これとは対照的に、Ｔｕｍ−４は抗腫瘍細胞活性を有していたのに対し、Ｔｕｍ−３（Ｔｕｍ−４と同様に残基１８５〜２０３を含む）は有していなかった。従って、領域１８５〜２０３の抗腫瘍細胞活性は、この領域が完全長折りたたみツムスタチンの部分として存在する場合、または、より大きいツムスタチンフラグメント内（例えばＴｕｍ−３内）に存在する場合でさえも、使用可能とはならない。この活性は、この領域が分子のトランケーション（後述する実施例に示す）によるか、またはＨａｎら（１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３９５−４０１）が行ったように代表的ペプチドの合成によるか、のどちらかより曝露される場合にのみ認識されるものとなる。
【００９６】
完全長ツムスタチンの他のフラグメントおよび突然変異体もまた、抗血管形成活性を有している。ツムスタチン−４５−１３２は、非内皮細胞に対しては有意な作用を示すことなく、内皮細胞の増殖を特異的に抑制しアポトーシスを誘発する。これは、親タンパク質から６４％トランケーションされているにもかかわらず、２４４アミノ酸の完全長分子と同様に活性である。ツムスタチン−４５−１３２の抗血管形成作用は、マトリゲルプラグ試験を用いてインビボでさらに確認されている。１μｇ／ｍｌのツムスタチン−４５−１３２は、マウス異種移植片においてＰＣ−３腫瘍を抑制し、そして新血管形成および微細血管密度を低減することがわかった。内皮細胞表面へのビオチニル化ツムスタチン−４５−１３２の結合が免疫細胞化学により確認されている。免疫沈降実験によれば、ツムスタチン−４５−１３２は競合増殖試験で測定した場合、内皮細胞表面上のαｖβ３およびβ１インテグリンに結合することが分かった。
【００９７】
更に、アルカリ還元ツムスタチン−４５−１３２は未還元のツムスタチン−４５−１３２と同様に有効であることが分かった。アルカリ還元は、折りたたみタンパク質分子のコンフォメーション構造を維持する役割を果たしている、システイン残基間のジスルフィド結合を破壊する。未還元の分子と比較した場合にアルカリ還元ツムスタチン−４５−１３２で活性の低下がないことは、ツムスタチン−４５−１３２のシステイン結合媒介コンフォメーション特性がその抗血管形成活性に必須ではないことを示している。従って、「突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）」という用語はまた、還元されているか、または１以上のシステイン残基が別のアミノ酸に突然変異しているか若しくは完全に欠失している、ツムスタチン分子の全体または部分をも意味することができる。
【００９８】
ツムスタチン−４５−１３２の突然変異体であるＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａは、（完全長分子の）残基１２５番のシステインがアラニンに突然変異しているように作成した。この突然変異により、増強されたタンパク質の発現が認められ、そしてこの分子は、この突然変異体が実際はツムスタチン−４５−１３２よりも強力に腫瘍増殖を抑制した、マウス異種移植片の研究における腫瘍増殖の抑制を除き、ツムスタチン−４５−１３２と同等の抗血管形成特性を有している。
【００９９】
これらの活性は更に、合成ペプチドＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ７−突然変異体、Ｔ８、Ｔ８−３、ＴＰ３およびＰ２の研究によっても明らかにされた。合成ペプチドのうちＴ３は、インビボで新血管形成を抑制した。一方、完全長ツムスタチンの２０Ｎ末端アミノ酸、従ってＲＧＤ配列を含むＴ１ペプチドは、内皮細胞増殖を抑制しなかった。Ｔ３は増殖内皮細胞のＧ１停止を誘発することが分かっており、この作用は、Ｔ３ペプチドへの曝露前に細胞をαｖβ３インテグリンタンパク質と共に予備インキュベートしたところ低減した。Ｔ３ペプチドは、その中に含まれる２個のシステインがジスルフィド結合により連結されているか否かに関わらず内皮細胞増殖を抑制した。これは、ツムスタチン−４５−１３２と同様、Ｔ３ペプチドの抗血管形成活性がそのコンフォメーション特性とは無関係であることを示している。Ｔ３ペプチドの活性は、ツムスタチンまたはツムスタチン−４５−１３２と比較してモル単位で２〜５倍低い。Ｔ４ペプチドはＴ３と重複しており、そして、Ｔ４は内皮細胞増殖を抑制しなかったが、これはこれらの細胞におけるαｖβ３インテグリンに対する弱い結合を示した。従って、Ｔ３配列はＴ４ペプチドの最初の９残基により伸長され、そして新しいペプチド配列を「Ｔ７」と称した。
【０１００】
Ｔ７ペプチドは、等モル濃度において、Ｔ３よりも高く、そしてツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２と同等の水準の活性を示した。ツムスタチン、ツムスタチン−４５−１３２およびＴ７ペプチドは１μＭのＥＤ５０で抗増殖作用を示したが、Ｔ３ペプチドは２．５μＭのＥＤ５０を有していた。これらの結果は、Ｔ４ペプチドの最初の９アミノ酸はそれ自体抗血管形成活性を示さないが、それにもかかわらず、それらがαｖβ３インテグリンに対するツムスタチンの結合に寄与しており、おそらくはこれらの分子間のより良好な相互作用を促進し、最大の抗血管形成活性の達成を助長することを示している。
【０１０１】
興味深いことに、Ｔ７配列のアミノ酸８〜２９はまた、腫瘍細胞抑制活性を示す領域であるアミノ酸１８７〜２０７のＣ末端領域に対してある程度の相同性（５０％同一性）を示す。
【０１０２】
多くの別のペプチドおよび突然変異体を合成し、癌のインビボ動物モデルにおけるその活性について試験した。これらのペプチドは上記表１に示すとおりであり、そのツムスタチン配列とのアラインメントは以下に示すとおりである。ツムスタチン配列と異なるアミノ酸残基は小文字で示す。
【化１】
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【０１０３】
ツムスタチンペプチドＴ７は完全長ツムスタチンのフラグメントであり、配列内に改変箇所はない。ペプチドＴ７突然変異体はＴ７配列に基づいているが、ツムスタチンの残基７７、８１および８３におけるロイシン、バリンおよびアスパラギン酸の代わりに、それぞれメチオニン、イソロイシンおよびアスパラギンを有している。ペプチドＴ８はツムスタチンの６８位のロイシンの代わりにリジンを有している。ペプチドＴ８−３は２つの別の置換を有しており、ツムスタチンの７９位および８５位のシステイン残基の各々に代わってセリンに置換されている。ペプチドＴＰ３は７６位のフェニルアラニン残基に対して置換しているリジンを有し、システインは８３位のアスパラギン酸に対して置換している。ペプチドＰ２もまたＴ８−３ペプチドと同様であり、ツムスタチンの６８位のロイシンに対して置換しているリジンを有するが、７９位と８５位のシステインはアスパラギン酸で置換されている。
【０１０４】
インビボのマウス腫瘍モデルにおいて、ペプチドＴ８は毒性を示さず、そしてＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌の同位異種移植片において腫瘍の増殖を抑制した。抑制は体重１ｋｇ当たり１ｍｇの１日用量で２８％を超えており、２．５ｍｇ／ｋｇではほぼ４９％であった。興味深いことに、５ｍｇ／ｋｇの１日用量では抑制は僅か３１％であったが、同じ用量（５ｍｇ／ｋｇ）を１週間に２回投与した場合、抑制は４１％を超えていた。同じ腫瘍モデルにおいて、ペプチドＴＰ３は、１ｍｇ／ｋｇを毎日投与した場合は３０％超の抑制、１ｍｇ／ｋｇを毎日投与した場合は５０％の抑制であった。別の実験において、Ｔ８およびＴ８−３は、５ｍｇ／ｋｇで投与した場合にそれぞれ５０．５％および４１．９％で腫瘍の増殖を抑制し、そしてＴ８−３は１ｍｇ／ｋｇでは有効ではなかった。ペプチドＰ２は、１ｍｇ／ｋｇの場合に２６．４％、そして５ｍｇ／ｋｇの場合に１５．９％で、この癌モデルにおける腫瘍増殖を抑制した。
【０１０５】
ＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおいて、ペプチドＴ７、Ｔ８、ＴＰ３並びに対照のスクランブルペプチドＳＰ１およびＳＰ２を毎日投与したところ、Ｔ８、Ｔ７およびＴＰ３は５ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ４５％、６６．８％および５３．２％でＰＣ３腫瘍の増殖を抑制した。ＳＰ１およびＳＰ２は３１．７および１８．７％で増殖を抑制した。週１回５ｍｇ／ｋｇで投与した場合、Ｔ８は３９．５％で腫瘍増殖を抑制したが、週２回投与した場合は僅か８．１％であり、これはＭＤＡＭＢ−４３５モデルにおける結果を反映している。別の実験において、Ｔ８およびＴ８−３ペプチドは両方とも５ｍｇ／ｋｇの用量で３５．４％腫瘍増殖を抑制し、７９位および８５位のシステインがこの生物学的活性にとって必要な二次構造を与えないことを示している。Ｐ２はＰＣ３モデル並びにＭＤＡＭＢ−４３５モデルにおいてより低い用量でより効果的であることが分かり、１および５ｍｇ／ｋｇでそれぞれ３１．６％および僅か１５．９％の腫瘍増殖抑制が見られた。
【０１０６】
本明細書に記載するとおり、ツムスタチンペプチド誘導アポトーシスは、ｃａｐ依存性のタンパク質翻訳の調節に関与する酵素であるカスパーゼ−３の増加と関連している（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３７４５−５０；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１９５９−６８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１５２４０−８；Ｂｕｓｈｅｌｌ，Ｍ．ら，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５１：３３２−３３６）。インテグリンβ３欠損マウス由来の細胞を用いたところ、本明細書に記載する結果（例えば実施例５２〜５５参照）は、種々のツムスタチンペプチドのタンパク質合成に対する抑制作用が内皮細胞上に発現されるαｖβ３インテグリンにより媒介されることが示されている。そのαｖβ３インテグリンとの相互作用を介して、ツムスタチンペプチドはＦＡＫ、ＰＩ−３キナーゼ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲの活性化を抑制し、そしてｅＩＦ４Ｅ／４Ｅ−ＢＰ１複合体の解離を防止し、ラパマイシンと同様、内皮細胞におけるｃａｐ依存性のタンパク質翻訳を抑制する結果となるが、このような作用は別のマトリックス誘導血管形成阻害因子であるエンドスタチンでは観察されていない。このことは、ｃａｐ依存性のタンパク質合成の細胞特異的抑制の媒介におけるインテグリンの新しい役割を証明している。従って、ツムスタチンおよび関連ペプチドは、αｖβ３インテグリン依存性の、ｃａｐ依存性タンパク質合成の内皮細胞特異的阻害因子である。
【０１０７】
ペプチドおよびタンパク質の３次構造またはコンフォメーションに対する活性の依存性がないことは、医薬品目的のこれらのペプチドおよびタンパク質の設計を容易にするはずである。例えば、Ｔ３ペプチドの折りたたみ型と非折りたたみ型、または還元されアルキル化されたツムスタチン−４５−１３２と未還元未アルキル化型の活性に差がないため、所定の発現系においてより高いレベルで発現される、患者における副作用がより少ないほうの型のタンパク質またはペプチドを、あるいは、より可溶性であるほうを使用できる。更に、活性配列の大きさが小さいことは、発現、溶解性、副作用等を操作するためのフランキング配列の付加を可能とする。
【０１０８】
従って、本発明のタンパク質およびペプチドはまた、種々の薬学的特性を改善または改変するために修飾してよく、例えば、別のアミノ酸配列を全体のペプチドまたはタンパク質の配列に組み込むことにより、分子に望ましい性質を付与したり、または望ましくない性質を除去したりすることができる。例えば、ペプチドの短い配列は重量単位でその有効性を増大させるが、その有効半減期も低下させる場合がある。例えば修飾によりペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期（例えば血清中半減期）を増大させることが望ましい場合がある。タンパク質の半減期を増大させるための種々の方法が当該分野で知られており、例えば、タンパク質のポリエチレングリコール部分への結合、即ちＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ（例えば米国特許第４，１７９，３３７号；５，１６６，３２２号；５，２０６，３４４号；Ｎｕｃｃｉら，１９９１，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４：１３３−５１を参照）およびタンパク質のデキストランへの結合（Ｍａｋｓｉｍｅｎｋｏ，１９８６，Ｂｕｌｌ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｒｕｓｓｉａｎ）５２：５６７−９）が含まれる。
【０１０９】
抗血管形成活性および抗腫瘍細胞活性は両方とも、グッドパスチャー・エピトープ領域外に存在する。α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの「非グッドパスチャーフラグメント」とは、哺乳類ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインのアミノ酸配列のフラグメント（例えばタンパク質、ペプチド若しくはポリペプチド）または部分を意味し、ここでフラグメントはグッドパスチャー自己エピトープを含まない。最近、自己抗体が単独でα３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端と反応することが報告された。
【０１１０】
抗血管形成領域と抗腫瘍細胞領域のいずれも、古典的な「ＲＧＤ」（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）結合部位を含まず、従って、両領域ともＲＧＤ非依存性の機序でそのリガンドに結合する。インテグリンまたはインテグリンサブユニットに結合するフラグメント（例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）の能力が「ＲＧＤ非依存性」であるとは、フラグメントがペプチド配列「ＲＧＤ」（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含まなかったとしてもインテグリンまたはインテグリンサブユニットに結合できることを意味する。いずれもＲＧＤ配列を含まないにもかかわらず、抗血管形成領域および抗腫瘍細胞領域の双方がなおαｖβ３インテグリンに結合し、共に内皮細胞に結合する。フラグメント（例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）が「αｖβ３インテグリンに結合する能力」を有するとは、フラグメントがこのインテグリンまたはそのサブユニット（即ちαｖおよび／またはβ３）に結合できること、あるいは、このインテグリンまたはそのサブユニットに対する抗体で前処理することでこのインテグリンおよび／またはそのサブユニットへのフラグメントの結合が抑制される結果となる（例えば後述する実施例１２または２８において示す方法により明らかにされる）ことを意味する。
【０１１１】
これらの類似性を鑑みると、（１）抗血管形成領域は内皮細胞の増殖を抑制するが、抗腫瘍細胞領域は抑制しないこと、および、（２）抗血管形成領域は腫瘍細胞を抑制できないが、抗腫瘍細胞領域はこのような細胞を抑制する、ということは意外である。
【０１１２】
フラグメント（例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）が「腫瘍細胞の増殖を抑制することの不可能性」を有する、または「腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を欠く」とは、フラグメントが腫瘍細胞（例えば培養した黒色腫細胞、例えばＷＭ−１６４細胞）の増殖を防止しないことを意味する。試験方法は後述する実施例、例えば実施例３６、３７および３８に記載する。同様に、フラグメント（例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）が「腫瘍細胞の増殖を抑制する能力」を有するとは、フラグメントが腫瘍細胞（例えば培養した黒色腫細胞、例えばＷＭ−１６４細胞）の増殖を防止することを意味する。このような能力の試験方法は後述する実施例、例えば実施例３６、３７および３８に記載する。
【０１１３】
フラグメント（例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）が「内皮細胞の増殖を抑制することの不可能性」を有する、または「内皮細胞の増殖を抑制する能力を欠く」とは、フラグメントが内皮細胞（例えば培養Ｃ−ＰＡＥ細胞）の増殖を防止しないことを意味する。このような不可能性を試験する方法は後述する実施例、例えば実施例５，６，７，２６，３４、３６、３８等に記載する。
【０１１４】
フラグメント（例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）が「内皮細胞に結合する能力」を有するとは、フラグメントが内皮細胞（例えばＣ−ＰＡＥ細胞）に結合することを意味する。このような能力を試験する方法はまた、後述する実施例、例えば実施例２６，２８，３７に記載する。
【０１１５】
後述する実施例に記載した方法を用いて抗血管形成活性または抗腫瘍細胞活性のいずれかに必要である厳密な最小限の長さを更に明確化するために別の欠失突然変異体を作成することは、困難でも厄介でもない。このような取組みは、所望の活性をなお示す最も小さい可能な分子が所望の活性のためには不必要なアミノ酸を含むより大きい分子よりも重量当たりではより強力であるため、極めて好都合である。
【０１１６】
ツムスタチンによる内皮細胞の増殖の特異的抑制は、それが細胞表面タンパク質／受容体を介して機能することを強力に示唆している。血管形成はまた、インテグリンαｖβ３により媒介される特異的内皮細胞接着事象にも依存している（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：１１５７−６４）。細胞接着試験によれば、ツムスタチンはαｖβ３インテグリンおよびα６β１インテグリンを介して内皮細胞に結合することが分かった。ツムスタチンの抗増殖作用は部分的に、可溶性αｖβ３インテグリンタンパク質により回復された。ツムスタチンは、マトリックス成分に対する増殖内皮細胞の相互作用を妨害し、これにより内皮細胞をアポトーシスさせる（Ｒｅ，Ｆ．ら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：５３７−４６）。マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍における新しい血管の形成を調節する重要な酵素として関係している（Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．７：２０６２−７２）。最近、ＭＭＰ−２の阻害剤（ＰＥＸ）が血管形成を抑制することにより腫瘍の増殖を抑制できることが明らかにされた（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ  ９２：３９１−４００）。ツムスタチンはＭＭＰの活性を阻害することを介して機能する。
【０１１７】
Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃら（２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：８０５１−６１）は、α３（ＩＶ）ＮＣ１がαｖβ３インテグリンを介して内皮細胞に結合することを示しているが、この結合はα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのＮ末端に存在するＲＧＤ配列を介していると推測している。しかしながら、このＲＧＤ配列はＮＣ１ドメインの部分ではなく、三重らせん領域に由来するものであり、Ｎｅｉｌｓｏｎら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５）により説明された元のクローン内に含まれる。Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃらは、このクローンを用いて２９３胚性腎細胞においてα３（ＩＶ）ＮＣ１を組換えにより発現させた。この配列を部位指向性突然変異誘発により除去すると、αｖβ３結合部位が保存され、ＲＧＤ非依存性の結合機序が示された。
【０１１８】
Ｓｈａｈａｎら（１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４５８４−９０）は、αｖβ３インテグリンに対するリガンドとして残基１８５〜２０３を同定し、この相互作用が関連する抗腫瘍細胞特性にとって重要であることを推測している。このペプチドドメインは、ＨＴ−１４４黒色腫細胞のＲＧＤ認識部位とは異なるβ３インテグリンサブユニットに結合することが更に特定された（Ｐａｓｃｏ，Ｓ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３２９９９−３００７）。後述する実施例３７および３８は、ツムスタチンの５４〜１３２残基領域内における別の異なるＲＧＤ非依存性αｖβ３（αｖβ５またはβ１ではない）インテグリン結合部位を示している。この第２の部位は腫瘍細胞増殖の抑制のためには必要ではないが、抗血管形成活性のためには必要である。Ｔｕｍ−２は内皮細胞および黒色腫細胞の両方に結合するが、内皮細胞の増殖のみを抑制し、腫瘍細胞の増殖に対しては効果を示さない。残基１８５〜２０３を含むＴｕｍ−４は内皮細胞および黒色腫細胞の両方に結合するが、黒色腫細胞の増殖のみを抑制する。両方のインテグリン結合部位について、可溶性αｖβ３タンパク質を用いた競合試験は抗増殖活性を逆転させるために十分である。このことは、ツムスタチン上の２つの異なるＲＧＤ非依存性αｖβ３結合部位が２種の個別の抗腫瘍活性を、おそらくは異なるαｖβ３インテグリン媒介機序を介して媒介していることを示唆している。本明細書に記載した結果によれば、αｖβ３およびα６β１インテグリンがツムスタチンに結合し、そしてαｖβ３の結合はＲＧＤ非依存性である。
【０１１９】
欠失突然変異体を用いてインテグリン結合部位を検出するための細胞接着試験を行った。ツムスタチンのＮ末端部分には、三重らせん非コラーゲン性部分に由来するＲＧＤ配列（アミノ酸残基７〜９）が存在する。ＲＧＤはαｖβ３受容体に対する結合部位である。しかしながら、この配列を欠いているＴｕｍ−１はなおαｖβ３インテグリンに結合する。従って、この結合部位は１８５〜２０３領域について示されたとおり、ＲＧＤ非依存性である。αｖβ３結合部位に部分的に結合することが示されたこの領域に対する抗体（例えば抗Ｔｕｍ−４抗体）はＴｕｍ−１のαｖβ３受容体への結合を妨害せず、そしてＴｕｍ−１の抗増殖作用もまた影響を受けない。更に、Ｃ末端αｖβ３結合部位（残基１８５〜２０３）を含まないＴｕｍ−２（残基１〜１３２）は、実施例３８において、細胞接着試験でαｖβ３に結合し、そして内皮細胞の増殖を抑制することが示されている。ツムスタチンまたはＴｕｍ−２をαｖβ３タンパク質と共にインキュベートすることにより内皮細胞膜上のαｖβ３受容体を飽和させたところ、ツムスタチンの抗増殖作用は著しく低下した（４３〜７４％）。このことは、ツムスタチンに対する可溶性αｖβ３受容体の親和性が膜結合αｖβ３と比較してはるかに弱く非効率であることを考慮すると、意外である。本明細書に記載した結果によれば、αｖβ３結合部位はアミノ酸５４〜１３２内に位置すると考えられる。
【０１２０】
ツムスタチンの抗血管形成活性がαｖβ３により媒介されるということは、ＶＥＧＦが内皮細胞上のαｖβ３の発現をアップレギュレートするという見解と合致している（Ｓｅｎｇｅｒら，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：２９３−３０５；Ｓｕｚｕｍｅら，１９９８，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：１０２８−３５）。血管形成はαｖβ３インテグリンにより媒介される特異的な内皮細胞接着事象に依存しているため（Ｂｒｏｏｋｓら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：５６９−７１；Ｂｒｏｏｋｓら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：１１５７−８３）、ツムスタチンの抗血管形成作用は、重要な抗アポトーシスシグナルと考えられる、ビトロネクチンやフィブロネクチンのようなマトリックス成分に対する増殖内皮細胞の相互作用を妨害することにより媒介される。
【０１２１】
第２のＲＧＤ非依存性部位は、共に内皮細胞および黒色腫細胞上のαｖβ３インテグリンに結合するものの、アミノ酸レベルでの１８５〜２０３部位との有意な相同性は示さない。αｖβ３インテグリンは残基１８５〜２０３に結合するが、内皮細胞の増殖の抑制は観察されなかった。
【０１２２】
ツムスタチンはインビトロおよびインビボで血管形成を抑制し、その結果、腫瘍の進行を抑制している。この方法を患者に適用するためには、全身投与によるその潜在的毒性または副作用もまた考慮しなければならない。ツムスタチンの分布が限定され、皮膚基底膜には殆ど存在しないという事実は、ツムスタチン処置による副作用の可能性が低いことを示唆している。また、腎臓のような限定された臓器の血管基底膜におけるツムスタチンの存在は、限定された臓器において生じる腫瘍のターゲティングにおけるその潜在的で独特の利点を示唆している。究極的には、遺伝子転移法を用いて腫瘍の血管系においてインビボでツムスタチン遺伝子を発現するための代替法を開発することが望ましい（Ｋａｓｈｉｈａｒａ，Ｎ．ら，１９９７，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．５：１２６−３１；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：２２１９−２９；  Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｔ．ら，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２５８９−９７）。
【０１２３】
α３（ＩＶ）鎖の分布は選択された臓器の基底膜に限定されており、従ってツムスタチンは、α鎖の組み立ての抑制によるこの分子の考えうる機序を考慮すれば有害性はより低いと考えられる。更に、α３（ＩＶ）鎖は腎臓の血管基底膜において観察されており（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０−８）、そしてこれらの血管は腎細胞癌のような原発腎腫瘍の進行に関与していると考えられている。従って、ツムスタチンは他のα鎖とのα３（ＩＶ）鎖の集合体を破壊することを通じてこのような腫瘍の治療において有効である。
【０１２４】
本明細書においては、「血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」という用語は、組織または臓器内への新しい血管の発生を意味し、内皮細胞の増殖を含む。正常な生理学的条件下では、ヒトおよび動物は極めて特異的な限定された状況においてのみ血管形成を起こす。例えば、血管形成は通常、創傷治癒、胎児および胚の発生、および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。「内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」という用語は、漿液腔、リンパ管および血管の内張りとなる平坦な内皮細胞の薄層を意味する。従って、「抗血管形成活性（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、血管の生育を抑制する組成物の能力を指す。血管の生育は複雑な一連の事象であり、個々の内皮細胞の下にある基底膜の局所的破壊、これらの細胞の増殖、将来の血管の位置への細胞の遊走、新しい血管膜を形成する細胞の再組織化、内皮細胞増殖の停止、および、新しい血管壁を支持する血管周皮細胞と他の細胞との取り込みを含む。従って「抗血管形成活性」とは本明細書においては、これらの段階のいずれかまたはすべての中断であり、最終結果として新しい血管の形成が抑制されることであるものを包含する。
【０１２５】
抗血管形成活性は内皮細胞抑制活性を含み、これは、一般的には血管形成を抑制する、そして例えば線維芽細胞増殖因子、血管形成関連因子、または他の知られた増殖因子の存在下で培養されているウシ毛細管内皮細胞の増殖または遊走を抑制する組成物の能力を指す。「増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」とは、細胞の増殖、再生または合成活性を刺激する組成物である。「血管形成関連因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）」とは、血管形成を抑制または促進する因子である。血管形成関連因子の一例は、血管形成プロモーターである塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような血管形成性の増殖因子である。血管形成関連因子の別の例は、例えばアンジオスタチン（例えば米国特許第５，８０１，０１２号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７７６，７０４号、米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７９２，８４５号、ＷＯ９６／３５７７４、ＷＯ９５／２９２４２、ＷＯ９６／４１１９４、ＷＯ９７／２３５００参照）またはエンドスタチン（例えば米国特許第５，８５４，２０５号；米国特許第６，１７４，８６１号；ＷＯ９７／１５６６６参照）のような血管形成抑制因子である。
【０１２６】
「実質的に同じ生物学的活性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「実質的に同じかより優れた生物学的活性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｏｒ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、組成物が抗血管形成活性を有し、そして、標準的な試験で測定されるように、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンと同様に挙動することを意味する。「標準的な試験（ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｓｓａｙｓ）」とは、抗血管形成活性、細胞周期の停止、およびアポトーシスを評価するために分子生物学分野で使用されているプロトコルを含むが、これらに限定されない。このような試験は、内皮細胞増殖、内皮細胞遊走、細胞周期分析、および内皮細胞管腔形成についての試験、例えばアポトーシス細胞の形態またはアネキシンＶ−ＦＩＴＣ試験によるアポトーシスの検出、漿尿膜（ＣＡＭ）試験、およびヌードマウスにおける腎癌腫増殖の抑制を包含するが、これらに限定されない。このような試験は後述する実施例において示す。
【０１２７】
「アレステン（Ａｒｒｅｓｔｅｎ）」とは本明細書においては「アレスチン（Ａｒｒｅｓｔｉｎ）」とも称し、アレステン配列のアミノ酸配列のフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体、並びに他の哺乳類に由来するアレステン、およびそのアレステンアミノ酸配列のフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【０１２８】
「カンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）」とは本明細書においては、カンスタチン配列のアミノ酸配列のフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体、並びに他の哺乳類に由来するカンスタチン、およびそのカンスタチンアミノ酸配列のフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【０１２９】
「ツムスタチン（Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）」とは本明細書においては、ツムスタチン配列のアミノ酸配列のフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体、並びに他の哺乳類に由来するツムスタチン、およびそのツムスタチンアミノ酸配列のフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【０１３０】
本発明が、内皮抑制活性（例えば、一般的には血管形成を抑制する、そして、例えば線維芽細胞増殖因子、血管形成関連因子、または他の知られた増殖因子の存在下で培養されているウシ毛細管内皮細胞の増殖または遊走を抑制する、組成物の能力）を有するアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのいずれかの誘導体を包含することを意図するものであることを理解されたい。本発明は、完全なアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのタンパク質、それらのタンパク質の誘導体、およびそれらのタンパク質の生物学的に活性なフラグメントを包含する。これらには、アミノ酸の置換を有するか、またはアミノ酸官能基に結合した糖または他の分子を有するアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの活性を有するタンパク質が包含される。
【０１３１】
本発明はまた、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンのフラグメント、突然変異体、相同体および類似体について記載する。アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのポリペプチドの少なくとも２５連続アミノ酸を含む、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの分子より短いいずれかのアミノ酸配列である。このような分子はまた、クローニングの過程から誘導された別のアミノ酸、例えば完全または部分的リンカー配列に相当するアミノ酸残基またはアミノ酸配列を含んでいてもいなくてもよい。本発明の範囲に包含されるためには、このような別のアミノ酸残基を有するまたは有さないこのような突然変異体は、参照ポリペプチドの天然または完全長の型と実質的に同じ生物学的活性を有さなければならない。
【０１３２】
タンパク質の「フラグメント」とは、完全長ポリペプチドの１２以上の連続アミノ酸を含む、そのタンパク質よりも短いいずれかのアミノ酸配列である。このようなフラグメントはあるいは、完全長ポリペプチドの連続アミノ酸１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個を含んでよい。フラグメントは、完全長ポリペプチドの連続アミノ酸５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５個を含んでよい。そのような分子はまた、クローニングの過程から誘導された別のアミノ酸、例えば完全または部分的リンカー配列に相当するアミノ酸残基またはアミノ酸配列を含んでいてもいなくてもよい。
【０１３３】
このようなフラグメントはまた、ツムスタチン配列に基づいて一般的な活性ペプチドを製造するための以下の式に基づくものであることもできる。アミノ酸６０〜１００のツムスタチン配列を以下に示し、活性ツムスタチンペプチドとアラインした。配列全体にわたって共通する残基は大文字で示す。
【化２】
2006508015.tif 000005
【０１３４】
従って、この式に基づいてペプチドを作成し、抗血管形成特性について本明細書に記載したとおりそれらを試験することができる。例えばアミノ酸ＦまたはＫ、次いでＬＦ、次いでＣまたはＳまたはＤ、次いでＮＶＮ、次いでＤまたはＣ、次にＶ、次にＣまたはＳまたはＤ、そして最後にＮＦとなる配列のペプチドを作成できる。合計で僅か３６種、即ち、本明細書に記載する試験法により容易に試験できる数量の、異なるペプチドがこの式で作成できる。
【０１３５】
他のフラグメントもまた作成できる。「ツムスタチンＮ−５３」と称する１つのツムスタチンフラグメントは、標準的な試験法による測定によれば完全長のツムスタチンと同等の抗血管形成活性を有していることが分かった。ツムスタチンＮ−５３は、Ｎ末端の５３アミノ酸が欠失しているツムスタチン分子を含む。本明細書に記載する他の突然変異フラグメントは、本明細書に記載した試験法で示されるとおり、極めて高い水準の抗血管形成活性を有していることが分かった。これらのフラグメント「ツムスタチン３３３」、「ツムスタチン３３４」、「１２ｋＤａアレステンフラグメント」、「８ｋＤａアレステンフラグメント」および「１０ｋＤａカンスタチンフラグメント」はそれぞれ、７５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌおよび８０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０値を有している。一方、完全長のアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンは、それぞれ４００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌおよび５５０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０値を有していることが分かった。ツムスタチン３３３は配列番号１０のアミノ酸１〜１２４を含み、そしてツムスタチン３３４は配列番号１０のアミノ酸１２５〜２４４を含む。
【０１３６】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの「突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、等価な参照アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのポリペプチドのアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列においていずれかの変化を含むポリペプチドを意味する。このような変化は自発的に、または人間による操作により、化学エネルギー（例えばＸ線）により、または化学的突然変異の他の形態により、または遺伝子操作により、または交配または遺伝子情報の交換の他の形態の結果として生じうる。突然変異には、例えば塩基の変化、欠失、挿入、逆位、転座または重複が包含される。アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの突然変異体は、等価な参照アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのポリヌクレオチドと比較して増大した、または低減された抗血管形成活性を示してよく、このような突然変異体はまた、クローニングの過程から誘導された別のアミノ酸、例えば完全または部分的リンカー配列に相当するアミノ酸残基またはアミノ酸配列を含んでいてもいなくてもよい。
【０１３７】
本発明の抗血管形成性タンパク質の突然変異体／フラグメントは、ＰＣＲクローニングにより生成できる。「ツムスタチン３３３」および「ツムスタチン３３４」と命名されたフラグメントはこの方法で生成されており、後述する実施例２３に記載するとおり、そして図３０および３１に示すとおり、完全長ツムスタチンよりも優れた抗血管形成活性を有している。このようなフラグメントを作成するためには、ＰＣＲプライマーは、プライマーの各セットが全体のタンパク質から既知の配列を増幅するように、既知の配列から設計する。次にこれらの配列をｐＥＴ２２ｂベクターのような適切な発現ベクター内にクローニングし、発現されたタンパク質は、抗血管形成活性について後述する試験法に説明するとおり試験する。
【０１３８】
本発明の抗血管形成性タンパク質の突然変異体／フラグメントはまた、Ｍａｒｉｙａｍａ，Ｍ．ら，（１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２５３−８）および後述する実施例３３に記載するとおり、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のエラスターゼ消化により生成することもできる。この方法を用いて１２ｋＤａおよび８ｋＤａのアレステン突然変異体および１０ｋＤａのカンスタチン突然変異体を作成し、これら３つすべては元の完全長タンパク質よりも高い水準の抗血管形成活性を有していた。
【０１３９】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの「類似体（ａｎａｌｏｇ）」とは、全体のアレステン、カンスタチンまたはツムスタチン分子またはそのフラグメントまたは対立遺伝子変異体と実質的に同じであり、そして、同じかまたはより優れた生物学的活性を有する非天然の分子を意味する。このような類似体は、生物学的に活性なアレステン、カンスタチンまたはツムスタチン、並びにそのフラグメント、突然変異体、相同体および対立遺伝子変異体の誘導体（例えば上記の化学的誘導体）を包含するものとし、そのような誘導体は未修飾のアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのポリペプチド、フラグメント、突然変異体、相同体または対立遺伝子変異体と定性的に同様のアゴニストまたは拮抗剤の作用を示す。
【０１４０】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」とは、参照アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンポリペプチドのポリペプチド配列と比較して天然の配列変異を含むポリペプチド配列を意味する。アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの「対立遺伝子」とは、参照アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列と比較して配列変異を含むポリヌクレオチドを意味し、ここで、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子はアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのポリペプチドの対立遺伝子型をコードしている。
【０１４１】
所定のポリペプチドは、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのフラグメント、突然変異体、類似体または対立遺伝子変異体のいずれかであることができ、あるいは、それはこれらの２以上のものであってもよく、例えば、ポリペプチドは、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンポリペプチドの類似体および突然変異体の双方であってよい。例えばアレステン、カンスタチンまたはツムスタチン分子の短小化された型（例えばアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのフラグメント）を実験室で作製してよい。次にそのフラグメントを当該分野で知られた手段により突然変異させる場合には、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンのフラグメントおよび突然変異体の双方である分子が作製される。別の例においては、突然変異体は、ある哺乳類個体におけるアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンの対立遺伝子型として存在することが後になって分かるものとして、作製されてよい。従って、このような突然変異体のアレステン、カンスタチンまたはツムスタチン分子は、突然変異体および対立遺伝子変異体の双方となる。フラグメント、突然変異体、対立遺伝子変異体および類似体のこのような組み合わせは、本発明に包含されるものとする。
【０１４２】
例えば、後述する実施例２３に記載する大腸菌発現クローニング法により作成されたツムスタチンは単量体である。大腸菌発現クローニング法は、発現されたタンパク質に天然のタンパク質には存在しないポリリンカー配列およびヒスチジンタグを付加するため、それはまた、融合タンパク質またはキメラタンパク質でもある。実施例２３にも記載するツムスタチンフラグメント「ツムスタチンＮ−５３」は、完全長ツムスタチンタンパク質のフラグメントおよび欠失突然変異体であり、同じ大腸菌発現クローニング法で作成される場合には、それに付加された別の配列も有し、従って、完全長ツムスタチンタンパク質の融合突然変異フラグメントまたはキメラ突然変異フラグメントである。ツムスタチンＮ−５３のサブユニットが一緒になって、例えば２量体、３量体等となる場合には、ツムスタチンタンパク質の多量体の融合突然変異フラグメントまたはキメラ突然変異フラグメントが生成する。
【０１４３】
本発明には、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンと実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質、またはアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンをコードするポリヌクレオチドと実質的に同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドが包含される。「実質的に同じ配列（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、参照配列と少なくとも約７０％の配列同一性を示す核酸またはポリペプチドを意味し、例えば参照配列と典型的には少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性を有する別の核酸またはポリペプチドである。配列について比較した長さは、一般的には少なくとも３６ヌクレオチド塩基または１２アミノ酸、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド塩基または少なくとも２５アミノ酸、更により好ましくは１５０ヌクレオチド塩基または５０アミノ酸、そして、最も好ましくは２４３〜２６４ヌクレオチド塩基または８１〜８８アミノ酸である。「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは本明細書においては、アミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義に包含される。この用語はまた、発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等に付されているポリペプチドも包含するものとする。
【０１４４】
「配列の同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは本明細書においては、２つの重合体分子、例えば２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間のサブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方におけるあるサブユニットの位置が同じ単量体サブユニットで占められている場合、例えば、２つのペプチドの各々におけるある位置がセリンにより占められている場合、それらはその位置において同一である。２つの配列の間の同一性は、一致するまたは同一な位置の数の直接関数であり、例えば、２つのペプチドまたは化合物の配列の半分（例えば長さ１０サブユニットの重合体における５つの位置）が同一である場合、２つの配列は５０％同一であり；位置の９０％、例えば１０のうち９が一致する場合、２つの配列は９０％の配列同一性を共有している。例えば、アミノ酸配列Ｒ２Ｒ５Ｒ７Ｒ１０Ｒ６Ｒ３およびＲ９Ｒ８Ｒ１Ｒ１０Ｒ６Ｒ３は６つの位置のうち３つの位置が共通であり、従って５０％の配列同一性を有するが、一方、配列Ｒ２Ｒ５Ｒ７Ｒ１０Ｒ６Ｒ３およびＲ８Ｒ１Ｒ１０Ｒ６Ｒ３は５つの位置のうち３つの位置が共通であり、従って６０％の配列同一性を有する。２つの配列の間の同一性は、一致するまたは同一な位置の数の直接関数である。したがって、参照配列の一部が特定のペプチドにおいて欠失している場合、その欠失した部分は配列の同一性を計算する目的のためには数に入れられず、例えば、Ｒ２Ｒ５Ｒ７Ｒ１０Ｒ６Ｒ３およびＲ２Ｒ５Ｒ７Ｒ１０Ｒ３は６つの位置のうち５つの位置を共有しており、従って８３．３％の配列同一性を有する。
【０１４５】
同一性は、配列分析ソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰ（米国政府（“．ｇｏｖ”）の米国国立衛生研究所（“．ｎｉｈ”）の米国国立生命工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（“．ｎｃｂｉ”）に関するワールドワイドウェブサイト（“ｗｗｗ”）において“／ＢＬＡＳＴ／”ディレクトリ内で入手可能）を用いて測定される場合が多い。ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列について）により２つの配列を比較する（例えば２つの配列を相互に「ブラスティング（“Ｂｌａｓｔ”−ｉｎｇ）」する）ためのデフォルトパラメーターは、一致に対するリワード＝１、ミスマッチに対するペナルティー＝−２、オープンギャップ＝５、エクステンションギャップ＝２である。タンパク質配列についてＢＬＡＳＴＰを使用する場合は、デフォルトパラメーターは、一致に対するリワード＝０、ミスマッチに対するペナルティー＝０、オープンギャップ＝１１、エクステンションギャップ＝１である。
【０１４６】
２つの配列が「配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」を共有する場合、これは、その２つの配列が保存的な置換によってのみ相互に異なっており、そして相互の「保存された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ）」であることを意味する。ポリペプチド配列の場合、このような保存的置換は、配列内の所定の位置における１つのアミノ酸の、同じクラスの別のアミノ酸（例えば疎水性、電荷、ｐＫまたは他のコンフォメーションまたは化学的性質の特性を共有するアミノ酸、例えばロイシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン）との置換からなるか、または、ポリペプチドの生物学的活性が破壊されない程度までポリペプチドのコンフォメーションまたは折りたたみ状態を改変しない配列の位置に存在する、１以上の非保存的なアミノ酸置換、欠失または挿入によるものである。「保存的な置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基の１つのもう１つとの置換；アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、トレオニンとセリンとの間のような極性（親水性）残基の１つのもう１つとの置換；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような塩基性残基の１つのもう１つとの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような酸性残基の１つのもう１つとの置換；または非誘導残基の代替としての化学的に誘導された残基の使用が包含され；ただしこの場合、ポリペプチドは必要な生物学的活性を示す。配列相同性を共有する２つの配列は「配列相同体（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ）」と称してよい。
【０１４７】
本発明は、突然変異がタンパク質またはペプチドの活性を実質的に変化させない、即ち、突然変異が効果的に「サイレントな（ｓｉｌｅｎｔ）」突然変異であるような、本明細書に記載するタンパク質およびペプチドの突然変異体を意図している。このような突然変異体の１つであるＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａを本明細書に記載するが、これにおいては、（完全長ツムスタチン分子のうちの）１２５番目の残基におけるシステインがシステインからアラニンに突然変異している。この突然変異は、その残基においてジスルフィド結合が形成されるのを防止しているが、なおＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａはその親分子のツムスタチン−４５−１３２の完全な活性を保持している。
【０１４８】
ポリペプチドに関する相同性は、典型的には、配列分析ソフトウエアを用いて測定される（例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７０５の配列分析ソフトウエアパッケージ）。タンパク質分析ソフトウエアは、種々の置換、欠失および他の修飾に相同性の程度を対応させることにより、同様の配列を一致させる。保存的な置換は典型的には、以下のグループ内、即ち、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの置換を含む。
【０１４９】
本発明は更に、アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンの化学的誘導体を包含する。「化学的誘導体（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」とは、官能基の側鎖基の反応により化学的に誘導された１以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。このような誘導残基は例えば、遊離のアミノ基が誘導されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するような分子を包含する。遊離のカルボキシル基は誘導されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の種のエステルまたはヒドラジドを形成してよい。遊離のヒドロキシル基は誘導されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成してよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導されてＮ−イムベンジルヒスチジン（Ｎ−ｉｍｂｅｎｚｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を形成してよい。また、化学的誘導体として、２０種の標準アミノ酸の１以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンと置換してよく；５−ヒドロキシリジンがリジンと置換してよく；３−メチルヒスチジンがヒスチジンと置換してよく；ホモセリンがセリンと置換してよく；そして、オルニチンがリジンと置換してよい。
【０１５０】
本発明はまた、抗血管形成性タンパク質、そのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体、および対立遺伝子変異体、例えばツムスタチンおよびカンスタチン、またはＴ１およびＴ４等を含む、融合タンパク質およびキメラタンパク質を包含する。融合タンパク質またはキメラタンパク質は、組換え発現およびクローニング工程の結果として製造することができ、例えば完全および部分的リンカー配列に相当する別のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むタンパク質を製造してよく、例えば本発明のアレステンは、大腸菌中で製造する場合（後述する実施例２参照）、ヒスチジンタグを含む、タンパク質に付加された別のベクター配列を含む。本明細書においては、「融合タンパク質またはキメラタンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、この型から元のタンパク質の配列への変更も含むものとする。同様の変更をカンスタチンおよびツムスタチンタンパク質に対して行った（それぞれ実施例１４および２３）。融合タンパク質またはキメラタンパク質は、単一のタンパク質の多量体、例えば抗血管形成性タンパク質の反復からなることができ、または、融合タンパク質またはキメラタンパク質は数種のタンパク質、例えば数種の抗血管形成性タンパク質から組み立てることができる。融合タンパク質またはキメラタンパク質は、２以上の既知の抗血管形成性タンパク質の組み合わせ（例えばアンジオスタチンとエンドスタチン、またはアンジオスタチンとエンドスタチンの生物学的に活性なフラグメント）、またはターゲティング剤と組み合わせた抗血管形成性タンパク質（例えばエンドスタチンと表皮増殖因子（ＥＧＦ）またはＲＧＤペプチド）、または免疫グロブリン分子と組み合わせた抗血管形成性タンパク質（例えばエンドスタチンとＩｇＧ、特にＦｃ部分を除去したもの）を含むことができる。融合タンパク質およびキメラタンパク質はまた、抗血管形成性タンパク質、そのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体、および他の抗血管形成性タンパク質、例えばエンドスタチンまたはアンジオスタチンを含むことができる。他の抗血管形成性タンパク質は、レスチンおよびアポミグレン（ａｐｏｍｉｇｒｅｎ）（ＷＯ９９／２９８５６、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、およびエンドスタチンのフラグメント（ＷＯ９９／２９８５５、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を包含することができる。「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「キメラタンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は本明細書においては、例えば化学療法剤を送達するための別の成分を含むことができ、ここで、化学療法剤をコードするポリヌクレオチドは、抗血管形成性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結させる。融合タンパク質またはキメラタンパク質はまた、抗血管形成性タンパク質の多量体、例えば２量体または３量体を含むことができる。このような融合タンパク質またはキメラタンパク質は、翻訳後修飾を介して互いに連結（例えば化学的に連結）するか、または全体の融合タンパク質を組換えにより製造してよい。
【０１５１】
アレステン、カンスタチン、ツムスタチン、そのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体を含む多量体タンパク質もまた、本発明に包含されるものとする。「多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）」とは、サブユニットタンパク質の２以上のコピーを含むタンパク質を意味する。サブユニットタンパク質は本発明のタンパク質の１つであってよく、例えばアレステンが２回以上反復されたもの、またはフラグメント、突然変異体、相同体、類似体または対立遺伝子変異体、例えばツムスタチン突然変異体またはフラグメント、例えばツムスタチン３３３が２回以上反復されたものであってよい。このような多量体はまた、融合タンパク質またはキメラタンパク質であってもよく、例えば反復されたツムスタチン突然変異体は、ポリリンカー配列および／または１以上の抗血管形成性ペプチドと組み合わせられてよく、これは単一のコピーとして存在してよく、または直列型に反復してもよく、例えばタンパク質は全体のタンパク質内に２以上の多量体を含んでよい。
【０１５２】
本発明はまた、アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンをコードする１以上の単離されたポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、並びにアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンおよびそのフラグメント、突然変異体、相同体、類似体および対立遺伝子変異体の製造方法を包含する。「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は本明細書においては、核酸断片を挿入またはクローニングする担体を意味し、その担体は宿主細胞に核酸断片を転移させるように機能する。このようなベクターはまた、転移された核酸断片の複製および／または発現をもたらしうる。ベクターの例には、例えばプラスミド、バクテリオファージまたは哺乳類、植物または昆虫ウイルスに由来する核酸分子、または非ウイルス性のベクター、例えばリガンド−核酸コンジュゲート、リポソームまたは脂質−核酸複合体を包含する。転移された核酸分子は発現制御配列に作動可能に連結され、転移された核酸の発現が可能な発現ベクターを形成することが望ましい。このような核酸の転移は一般的に「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」と称され、また、挿入に使用する方法とは無関係に、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば、直接の取り込み、形質導入、または、ｆ交配が包含される。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持してよく、あるいは、宿主ゲノム内に組み込んでも良い。「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、記載した成分がその意図する態様で機能できるような関係にある状況を指し、例えば、コード配列に「作動可能に連結した」対照配列は、コード配列の発現が対照配列と適合した条件下で行われるような態様で結合される。「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、適切な調節配列の制御下にある（例えば作動可能に連結した）場合にｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。このような境界は天然に存在し、または当該分野で知られた方法によりポリヌクレオチド配列に導入するか付加することができる。コード配列には、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列が包含されるが、これらに限定されない。
【０１５３】
クローニングされたポリヌクレオチドがクローニングされるベクターは、それが原核生物において機能することから選択してよいか、または、それが真核生物において機能することから選択される。アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローニングおよびポリヌクレオチドからのこれらのタンパク質の発現の双方を可能にするベクターの２つの例は、ｐＥＴ２２ｂおよびｐＥＴ２８（ａ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）および修飾ｐＰＩＣＺαＡベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であり、これらはそれぞれ細菌および酵母のタンパク質の発現を可能にする。例えば、ＷＯ９９／２９８７８およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／５８９，４８３が参照でき、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
一旦ポリヌクレオチドを適当なベクターにクローニングした後、これを適切な宿主細胞内に形質転換することができる。「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」とは、ベクターを用いることにより転移された核酸のレシピエントとして使用された、または使用できる細胞を意味する。宿主細胞は原核生物または真核生物、哺乳類、植物または昆虫のものであることができ、そして単細胞として、または集合物として、例えば培養物として、または組織培養中、または組織または臓器中に存在することができる。宿主細胞はまた、多細胞生物、例えば哺乳類の正常または疾患を有する組織に由来することができる。宿主細胞は、本明細書においては、核酸で形質転換された元の細胞のみならず、核酸をなお含んでいる細胞の子孫も包含する。
【０１５５】
１つの実施形態において、抗血管形成性タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは更に、ペプチドをコードするポリヌクレオチドリンカーを含む。このようなリンカーは当業者にとって既知であり、そして、例えばリンカーは少なくとも１つの別のアミノ酸をコードする少なくとも１つの別のコドンを含むことができる。典型的には、リンカーは１〜約２０個または３０個のアミノ酸を含む。ポリヌクレオチドリンカーは、抗血管形成性タンパク質をコードするポリヌクレオチドと同様に翻訳され、抗血管形成性タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端において少なくとも１つの別のアミノ酸残基を有する抗血管形成性タンパク質の発現をもたらす。重要な点は、この別のアミノ酸は抗血管形成性タンパク質の活性を損なわないことである。
【０１５６】
ベクターへの選択されたポリヌクレオチドの挿入の後、ベクターを適切な原核生物株に形質転換し、そして、株を生物学的に活性な抗血管形成性タンパク質の産生に適する培養条件下で培養（例えば維持）することにより、生物学的に活性な抗血管形成性タンパク質またはその突然変異体、誘導体、フラグメントまたは誘導タンパク質を生成する。１つの実施形態においては、本発明は、後に細菌内に形質転換されるベクターｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ１７ｂまたはｐＥＴ２８ａへの抗血管形成性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローニングを含む。次に細菌宿主株が抗血管形成性タンパク質を発現する。典型的には、抗血管形成性タンパク質は培養液のリットル当たり約１０〜２０ミリグラム以上の量で産生される。
【０１５７】
本発明の別の実施形態においては、真核生物のベクターは修飾された酵母ベクターを包含する。１つの方法は、プラスミドがマルチクローニングサイトを含むｐＰＩＣｚαプラスミドを使用することである。マルチクローニングサイトはＨｉｓ．Ｔａｇモチーフをマルチクローニングサイトに挿入している。更に、ベクターはＮｄｅＩ部位または他の適当な制限部位を付加するように修飾されることができる。このような部位は、当業者によく知られているものである。この実施形態により生成された抗血管形成性タンパク質は、１以上のヒスチジン、典型的には約５〜２０のヒスチジンを含むヒスチジンタグモチーフ（Ｈｉｓ．ｔａｇ）を含む。
【０１５８】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンを生成する１つの方法は、例えば、配列番号１、配列番号５または配列番号９のポリヌクレオチドをそれぞれ増幅し、これを発現ベクター、例えばｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ２８（ａ）、ｐＰＩＣＺαＡまたは他の何らかの発現ベクター内にクローニングし、ポリヌクレオチドを含むベクターを、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現することができる宿主細胞内に形質転換し、形質転換された宿主細胞をタンパク質の発現に適する培養条件下で培養し、そして次に、培養物からタンパク質を抽出および精製することである。一般的に抗血管形成性タンパク質、特にアレステン、カンスタチンおよびツムスタチンを生成する方法の例は、後述する実施例に示すとおりである。アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンタンパク質はまた、トランスジェニックな動物の産物として、例えば、トランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタの乳汁の成分として、または、例えばトウモロコシ内の澱粉の分子と組み合わせられるか連結されたトランスジェニック植物の産物として発現させても良い。これらの方法はまた、配列番号１、配列番号５または配列番号９のサブ配列と共に使用することができ、これにより配列番号２、配列番号６または配列番号１０のタンパク質の部分が生成される。これらの方法は、例えば、フラグメントであるツムスタチン−３３３、ツムスタチン−３３４、ツムスタチン−Ｎ５３、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、Ｔｕｍ−４、ツムスタチン−４５−１３２、およびペプチドＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６の生成のためにも使用した。
【０１５９】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンはまた、従来の知られた化学合成により産生しても良い。合成手段により本発明のタンパク質を構築するための方法は当該分野で知られている。合成により構築されたアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンタンパク質配列は、例えば組換えにより産生されたアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンと、一次、二次または三次構造および／またはコンフォメーションの特性を共有しているため、それらに共通の生物学的特性、例えば生物学的活性を有しうる。したがって、合成により構築されたアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンタンパク質配列は、例えば組換えにより産生されたアレステン、カンスタチンまたはツムスタチンタンパク質の、生物学的に活性な、または免疫学的な代替品として、治療化合物のスクリーニングにおいて、および抗体の開発の免疫学的工程において、使用してよい。
【０１６０】
アレステン、カンスタチンおよびツムスタチンタンパク質は、標準的な試験法で測定されるように、そして後述する実施例において示されるとおり、血管形成の抑制において有用である。アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンは他の細胞型、例えば非内皮細胞の増殖を抑制しない。
【０１６１】
アレステン、カンスタチンまたはツムスタチンをコードするポリヌクレオチドは、単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリからクローニングすることができる。本明細書において「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とする核酸およびポリペプチドは、更にプロセシングされていてもよい、それらが得られた生物学的原料（例えば核酸の混合物中に、または細胞中に存在する状態）の物質を実質的に含まない（即ち、それらから分離されている）核酸またはポリペプチドである。「単離された」核酸またはポリペプチドには，本明細書に記載した方法、同様の方法または他の適当な方法により得られた核酸またはポリペプチド、例えば本質的に純粋な核酸またはポリペプチド、化学合成により、化学的および生物学的方法の組み合わせにより製造された核酸またはポリペプチド、および組換えにより製造された核酸またはポリペプチドであって単離されたものが包含される。従って単離されたポリペプチドとは、それが通常会合している他のタンパク質、炭水化物，脂質および他の細胞成分を比較的含まないものを意味する。単離された核酸は、核酸がそれに由来する生物の天然に存在するゲノム中で隣接する核酸の両方と隣接する（即ち共有結合する）ことはない。従って、この用語には、例えば、ベクター（例えば自律的に複製するウイルスまたはプラスミド）に取り込まれた核酸、または化学的手段または制限エンドヌクレアーゼ処理により生成した核酸フラグメントのような他の核酸とは無関係な別個の分子として存在する核酸が包含される。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質はまた、他の抗血管形成性タンパク質を単離するためのプローブを設計するためにも使用できる。例外的な方法はＪａｃｏｂｓらによる米国特許第５，８３７，４９０号において提供されており、その内容は参照によりすべて本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、好ましくは以下のパラメーター、即ち（ａ）それは、曖昧な塩基がある場合には、その数が最小（「Ｎ」）となる配列の領域となるように設計されなければならず、そして（ｂ）約８０℃のＴｍを有するように設計されなければならない（各ＡまたはＴにつき２℃、そして各ＧまたはＣにつき４℃を想定）、というパラメーターに従わなければならない。
【０１６３】
オリゴヌクレオチドは、好ましくはオリゴヌクレオチドを標識するために一般的に用いられる手法を用いて、ｇ−３２Ｐ−ＡＴＰ（比放射能６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識しなければならない。他の標識方法もまた使用することができる。未取込の標識は、好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーまたは他の確立された方法により除去しなければならない。プローブに取り込まれた放射能の量はシンチレーションカウンターにおける計測により定量しなければならない。好ましくは、得られるプローブの比放射能は約４×１０６ｄｐｍ／ｐｍｏｌでなければならない。完全長クローンのプールを含む細菌培養物は、好ましくは解凍し、そして保存溶液１００μｌを用いてアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する滅菌Ｌ−ブロス２５ｍｌの入った滅菌培養フラスコに接種した。培養は好ましくは３７℃において飽和状態となるまで増殖させ、そして飽和した培養物は好ましくは新しいＬ−ブロスで希釈しなければならない。これらの希釈物を小分けにしたものを好ましくはプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた場合に１５０ｍｍのペトリ皿中にアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび寒天１．５％を含有するＬ−ブロスの入った固体細菌用培地上で約５０００個の個別の十分分離したコロニーが形成されるような希釈度と容量を求めなければならない。個別の十分分離したコロニーを得るための他の知られた方法もまた使用できる。
【０１６４】
次に、標準的なコロニーハイブリダイゼーション操作法を用いてニトロセルロースフィルターにコロニーを移し、溶解させ、変性させ、焼成する。高度にストリンジェントな条件は、例えば１×ＳＳＣを６５℃で、または１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを４２℃で使用する程度に少なくともストリンジェントなものである。中等度のストリンジェント条件は４×ＳＳＣを６５℃で、または４×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを４２℃で使用する程度に少なくともストリンジェントなものである。低ストリンジェント条件は４×ＳＳＣを５０℃で、または６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを４０℃で使用する程度に少なくともストリンジェントなものである。
【０１６５】
次にフィルターを好ましくは、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する６×ＳＳＣ（２０×保存溶液は１７５．３ｇＮａＣｌ／リットル、８８．２ｇクエン酸ナトリウム／リットル、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節）中で穏やかに攪拌しながら１時間６５℃でインキュベートする（１５０ｍｍフィルター当たり約１０ｍｌ）。好ましくは、次にプローブを１×１０６ｄｐｍ／ｍｌ以上の濃度でハイブリダイゼーション混合物に添加する。次にフィルターを一晩穏やかに攪拌しながら６５℃でインキュベートする。次にフィルターを好ましくは攪拌することなく室温で２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ  ５００ｍｌ、好ましくはその後、１５分間穏やかに振とうしながら室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ  ５００ｍｌ中で洗浄する。３０分〜１時間６５℃において０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳを用いた３回目の洗浄は任意である。次にフィルターを好ましくは乾燥し、十分な時間オートラジオグラフィーに付し、Ｘ線フィルム上にポジ像を可視化する。他の知られたハイブリダイゼーション法もまた使用できる。次に陽性コロニーを選び、培地中に増殖させ、プラスミドＤＮＡを標準的な操作法を用いて単離する。次にクローンを制限分析、ハイブリダイゼーション分析またはＤＮＡ配列決定により評価することができる。
【０１６６】
ハイブリダイゼーションのストリンジェント条件は、第１核酸配列の第２核酸配列へのハイブリダイゼーションを可能とする温度と緩衝液組成の条件を指し、その際、その条件が相互にハイブリダイズする配列の間の同一性の程度を決定する。従って、「高ストリンジェント条件（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、相互に極めて類似の核酸配列のみがハイブリダイズする条件である。配列は、それらが中ストリンジェント条件下でハイブリダイズする場合は、相互の類似性はより低い。低ストリンジェント条件下で２つの配列がハイブリダイズするためには、さらに低い類似性が必要である。ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェント水準から最初にハイブリダイゼーションが観察される水準にまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列がそれに最も類似である配列とハイブリダイズする条件を決定することができる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェントを決定する厳密な条件は、イオン強度、温度およびホルムアミドのような脱安定化剤の濃度のみならず、核酸配列の長さ、その塩基組成、２配列間のミスマッチ塩基対のパーセント、および他の非同一配列内の配列のサブセット（例えば反復配列の小範囲）の発生頻度のような要因も含む。洗浄は、相互にハイブリダイズする配列の間の類似性の最小水準を決定するように条件が設定される工程である。一般的に、相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から、２配列間の１％ミスマッチは、所定の選択されたＳＳＣ濃度に対して融点（Ｔｍ）の１℃低下をもたらす。一般的に、ＳＳＣの濃度を倍にするとＴｍが約１７℃上昇する。このような指針を用いながら、意図するミスマッチの水準に応じて、洗浄温度を実験的に決定することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５，補遺有り）の２．１０．１〜２．１０．１６および６．３．１〜６．３．６ページに説明されている。
【０１６７】
高ストリンジェント条件は、（１）１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ３−クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨを  ７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（２）１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２×ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１３４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４×７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ３ＰＯ４、リットル当たり）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（１００×＝１０ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに調製）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、のいずれかにおけるハイブリダイゼーションを採用することができ、高ストリンジェント洗浄は、（１）０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃または（２）１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃とする。上記の条件は５０塩基対以上の長さのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して使用することを意図している。ハイブリッドが１８塩基対よりも短いと思われる場合は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度はハイブリッドについての計算されたＴｍ値よりも５〜１０℃低温とし、ここでＴｍ（℃）＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数）である。約１８〜約４９塩基対と考えられるハイブリッドの場合は、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）となり、ここで「Ｍ」は１価のカチオン（例えばＮａ＋）のモル数であり、そして、「Ｌ」は塩基対で表したハイブリッドの長さである。
【０１６８】
中ストリンジェント条件は、（１）４×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ３−クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（２）４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２×ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１３４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４×７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ３ＰＯ４、リットル当たり）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（１００×＝１０ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ），水で５００ｍｌ）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、のいずれかにおけるハイブリダイゼーションを採用することができ、中ストリンジェント洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃とする。上記の条件は５０塩基対以上の長さのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して使用することを意図している。ハイブリッドが１８塩基対よりも短いと思われる場合は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度はハイブリッドの計算されたＴｍ値よりも５〜１０℃低温とし、ここでＴｍ（℃）＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数）である。約１８〜約４９塩基対と考えられるハイブリッドの場合は、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）となり、ここで「Ｍ」は１価のカチオン（例えばＮａ＋）のモル数であり、そして、「Ｌ」は塩基対で表したハイブリッドの長さである。
【０１６９】
低ストリンジェント条件は（１）４×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ３−クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０℃、（２）６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２×ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１３４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４×７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ３ＰＯ４、リットル当たり）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（１００×＝１０ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ），水で５００ｍｌ）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０℃、（５）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０℃、のいずれかにおけるハイブリダイゼーションを採用することができ、低ストリンジェント洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、または（２）０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳとする。上記の条件は５０塩基対以上の長さのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して使用することを意図している。ハイブリッドが１８塩基対よりも短いと思われる場合は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度はハイブリッドの計算されたＴｍ値よりも５〜１０℃低温とし、ここでＴｍ（℃）＝（２×ＡおよびＴ塩基の数）＋（４×ＧおよびＣ塩基の数）である。約１８〜約４９塩基対と考えられるハイブリッドの場合は、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）となり、ここで「Ｍ」は１価のカチオン（例えばＮａ＋）のモル数であり、そして、「Ｌ」は塩基対で表したハイブリッドの長さである。
【０１７０】
本発明は、アレステン、カンスタチン、ツムスタチンまたはその生物学的に活性なフラグメント、類似体、相同体、誘導体または突然変異体を用いた哺乳類組織における血管形成を抑制する方法を包含する。特に本発明は、１以上の抗血管形成性タンパク質、または１以上の生物学的に活性なそのフラグメント、または抗血管形成活性を有するフラグメントまたはアゴニストおよび拮抗剤の複合物の有効量を用いて血管形成媒介疾患を治療する方法を含む。抗血管形成性タンパク質の有効量とは、疾患または症状をもたらす血管形成を抑制し、これにより完全にまたは部分的に、疾患または症状を緩解するのに十分な量である。血管形成媒介疾患の緩解は、疾患の症状の緩解、例えば腫瘍の大きさの縮小、または停止した腫瘍の増殖を観察することにより判断できる。本明細書においては、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、意味のある患者の利益、即ち該当する医学的状態の治療、治癒、予防または緩解、またはそのような症状の治療、治癒、予防または緩解の速度の増大を示すのに十分な組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。複合剤に適用する場合は、この用語は、複合投与が逐次的であるか同時であるかに関わらず、治療効果をもたらす活性成分の複合量を指す。血管形成媒介疾患には、例えば、癌、固形腫瘍、血液由来の腫瘍（例えば白血病）、腫瘍転移、良性腫瘍（例えば血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、臓器線維症、トラコーマおよび化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼部血管形成性疾患（例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス）、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病性関節症、血管線維種および創傷顆粒化が包含されるが、これらに限定されない。抗血管形成性タンパク質は内皮細胞の過剰または異常な刺激の疾患の治療に有用である。これらの疾患には、腸管癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、硬皮症、線維症および肥厚性瘢痕（即ちケロイド）が包含されるが、これらに限定されない。抗血管形成性タンパク質は胚の着床に必要な血管化を防止することにより避妊薬として使用することができる。抗血管形成性タンパク質は引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のような病理学的帰結として血管形成を有する疾患の治療に有用である。抗血管形成性タンパク質はまた、例えば脂肪組織における毛細管の形成を抑制してその拡大を予防することにより、透析移植片血管接触狭窄（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｇｒａｆｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｃｅｓｓ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）および肥満を予防するために使用できる。抗血管形成性タンパク質はまた、局在化した（例えば非転移性の）疾患の治療に使用できる。「癌（ｃａｎｃｅｒ）」とは、新生物の増殖、過形成または増殖性の生育または異常な細胞の発達の病的状態を意味し、固形腫瘍、非固形腫瘍およびいずれかの異常な細胞の増殖、例えば白血病で見られるものを包含する。本明細書においては、「癌」とは血管形成依存性の癌および腫瘍、即ち、その増殖（容量および／ま��は質量の拡大）のためにそれらに血液を供給する血管の数量と密度の増大を必要とする腫瘍も意味する。「退縮（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、当該分野でよく知られた方法を用いて測定した場合の腫瘍の質量および大きさの低減を指す。
【０１７１】
あるいは、血管形成の増大が必要な場合、例えば創傷治癒の場合、または心筋梗塞後の心臓組織においては、抗血管形成性タンパク質に対する抗体または抗血清を用いて、局在化した天然の抗血管形成性のタンパク質と過程をブロックし、これにより組織の萎縮を抑制すべく新血管の形成を増大することができる。
【０１７２】
抗血管形成性タンパク質は、それら自体または疾患の治療のための組成物および操作法との組み合わせにおいて使用してよく、例えばアレステンおよびカンスタチンを医薬組成物内において組み合わせることができ、Ｔｕｍ−４およびＴ７を組成物中で組み合わせることができ、または抗血管形成性タンパク質と組み合わせた手術、放射線療法、化学療法または免疫療法を用いて腫瘍を従来どおり治療してよく、そしてその後、抗血管形成性タンパク質を患者に投与して微小転移の休止期を延長し、残存する原発腫瘍がある場合はそれを安定化させ、増殖を抑制してよい。抗血管形成性タンパク質またはそのフラグメント、抗血清、受容体アゴニストまたは受容体拮抗剤またはそれらの組み合わせはまた、他の抗血管形成性の化合物、または他の抗血管形成性タンパク質のタンパク質、フラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、受容体拮抗剤（例えばアンジオスタチン、エンドスタチン）と組み合わせることもできる。更にまた、抗血管形成性タンパク質またはそのフラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、受容体拮抗剤またはそれらの組み合わせは、製薬上許容しうる賦形剤、そして、場合により除放性のマトリックス、例えば生体分解性重合体と組み合わせて治療用組成物を形成してよい。本発明の組成物はまた、他の抗血管形成性タンパク質または化学物質、例えばエンドスタチンまたはアンジオスタチンおよびその突然変異体、フラグメントおよび類似体も含有してよい。組成物は更に、タンパク質の活性を増強するか、または治療におけるその活性または用途を補う他の物質を含有してよい。このような付加的な因子および／または物質を組成物に含有させることにより、本発明のタンパク質との相乗作用をもたらしたり、または副作用を最小限にしたりすることができる。更にまた、本発明の組成物の投与は他の治療と同時に行ってよく、例えば化学療法または放射線療法と組み合わせて投与してよい。
【０１７３】
本発明は、本発明のタンパク質を含有する組成物に哺乳類（例えばヒト）組織を接触させることによる組織中の血管形成を抑制する方法を包含する。「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、局所的適用のみならず、組織中にまたは組織の細胞中に組成物を導入する送達による方法も包含する。
【０１７４】
時期を調節した遊離、すなわち除放性のデリバリーシステムもまた、本発明に包含される。このようなシステムは、外科的処置が困難であるか不可能である状況、例えば患者が年齢または疾患の過程そのものにより衰弱している場合、または、危険−利益の分析から治癒より管理が意図される状況において強く望まれる。
【０１７５】
除放性マトリックスは、本明細書においては、酵素的または酸／塩基加水分解により、または溶解によって分解されるマトリックス、通常は重合体から製造されるマトリックスである。一旦体内に挿入されると、マトリックスは酵素および体液の作用に付される。除放性マトリックスは望ましくは、生体適合性の材料、例えばリポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）、ポリラクチド  コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシンのようなアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレンン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンから選択される。好ましい生体分解性のマトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはポリラクチド  コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のいずれか１つのマトリックスである。
【０１７６】
本発明の血管形成調節組成物は、固体、液体またはエアロゾルであってよく、そしていずれかの知られた投与経路で投与してよい。固体の組成物の例は、丸薬、クリーム剤および移植可能な投与単位である。丸薬は経口投与してよく、治療用クリームは局所投与してよい。移植可能な投与単位は局所的に、例えば腫瘍部位に投与してよく、または血管形成調節組成物の全身放出を意図して例えば皮下に移植してもよい。液体組成物の例は皮下、静脈内、動脈内注射用の製剤、並びに局所および眼内投与用の製剤を含む。エアロゾル製剤の例は、肺への投与のための吸入用製剤を包含する。
【０１７７】
上記の抗血管形成活性を有するタンパク質およびタンパク質フラグメントは、当業者に知られた製剤方法を用いて、製薬上許容しうる製剤中の単離され、実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供することができる。このような製剤は標準的な経路で投与できる。一般的に、複合物は局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、大脳内、膣内、子宮内、経口、直腸または非経口（例えば静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）の経路で投与してよい。更に、抗血管形成性タンパク質は、化合物の除放性をもたらす生体分解性の重合体内に取り込ませ、重合体を薬剤のデリバリーが望まれる箇所の近傍、例えば腫瘍部位に移植するか、または抗血管形成性タンパク質が緩徐に全身放出されるように移植する。浸透圧ミニポンプもまた、目的部位に、例えば転移増殖箇所に、またはその腫瘍への血管供給箇所内に直接、カニューレを通じて抗血管形成性タンパク質の高濃度の制御デリバリーを行うために使用してよい。生体分解性重合体およびその使用は例えばＢｒｅｍら，（１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１−６）に詳細に説明されている。
【０１７８】
本発明のポリペプチドを含有する組成物は、例えば単位用量の注射によるなどして、静脈内に投与することができる。「単位用量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）」とは、本発明の治療用組成物に関して使用する場合は、対象に対する単一の用量として適する物理的に個別の単位を指し、各単位は液体希釈剤、即ち担体またはベヒクルと組み合わせて所望の治療効果をもたらすために計算された活性物質の所定量を含有する。
【０１７９】
本発明の組成物の投与様式には、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および動脈内の注射および注入を包含する。非経口注射用の医薬組成物は、製薬上許容しうる滅菌された水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳液、並びに使用直前に希釈再調製して滅菌された注射用の溶液または分散液とするための滅菌粉末を包含する。適当な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒またはベヒクルには、水、エタノール、ポリオール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、カルボキシメチルセルロースおよびその適当な混合物、植物油（例えばオリーブ油）および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが包含される。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要な粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持してよい。これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助剤を含有してよい。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等のような種々の抗菌剤および抗カビ剤を含有させることにより確保してよい。糖類、塩化ナトリウム等のような等張化剤を含有させることも望ましい。注射用剤型の遅延吸収は、吸収を遅延させるモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような薬剤の含有により行うことができる。注射用デポ剤型は、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）のような生体分解性重合体中の薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより製造する。重合体に対する薬剤の比および使用する特定の重合体の性質に応じて、薬剤の放出速度を制御できる。デポ注射製剤はまた、身体組織に適合するリポソームまたはミクロエマルジョン中に薬剤を閉じこめることにより調製される。注射用製剤は、例えば細菌保持フィルターを通して濾過することにより、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用溶媒中に溶解または分散できる滅菌固体組成物の形態で滅菌薬を配合することにより、滅菌してよい。
【０１８０】
本発明の治療用組成物は、例えば無機または有機の酸から誘導しうる、その成分の製薬上許容しうる塩を含むことができる。「製薬上許容しうる塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｓａｌｔ）」とは、信頼できる医療上の判断の範囲内において、不必要な毒性、刺激性、アレルギー応答等を伴うことなく、ヒトおよびより下位の動物の組織と接触させて使用するのに適し、そして合理的な利益／危険の比を確保している塩を意味する。製薬上許容しうる塩は当該分野でよく知られている。例えばＳ．Ｍ．ＢｅｒｇｅらはＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）６６：１〜において製薬上許容しうる塩を記載しており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。製薬上許容しうる塩には、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と共に形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基で形成）を包含する。遊離のカルボキシル基で形成された塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄の水酸化物のような無機の塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機の塩基から誘導できる。塩は、本発明の化合物の最終単離および精製の間にインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で、または適当な有機酸と遊離の塩基官能基を反応させることにより個別に調製してよい。酸付加塩の代表例は、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシメタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩を包含する。また、塩基性の窒素含有基を低級アルキルハライド、例えばメチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；ジアルキル硫酸塩、例えばジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルの硫酸塩；長鎖ハロゲン化物、例えばデシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；アリールアルキルハライド、例えばベンジルおよびフェネチルの臭化物等で、四級化することもできる。水溶性または油溶性または水分散性または油分散性の生成物をこれにより得ることができる。製薬上許容しうる酸付加塩を形成するために使用しうる酸の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸、並びに有機酸、例えばシュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸を包含する。
【０１８１】
本明細書においては、「製薬上許容しうる（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」、「生理学的に許容しうる（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｔｏｌｅｒａｂｌｅ）」およびその文法上の変形体が組成物、担体、希釈剤および試薬を指して用いられる場合は互換的に使用されるものとし、そして、悪心、めまい、むかつき等のような望ましくない生理学的作用を最小限にしながら哺乳類に投与することのできる物質を指す。活性成分を溶解または分散させて含有する医薬組成物の調製は、当該分野でよく知られており、製剤に関して限定するものではない。典型的にはこのような組成物は液体の溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能に調製されるが、しかしながら、使用前に液体中の溶液または懸濁液とするのに適する固体剤型も調製することができる。製剤は乳化されていることもできる。
【０１８２】
活性成分は、製薬上許容される活性成分と適合性がある賦形剤と、本明細書に記載した治療方法において用いるのに適する量で混合することができる。適当な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびこれらの組み合わせを含む。更に、所望により、組成物は活性成分の有効性を増強する少量の補助的物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等を含有できる。
【０１８３】
本発明の抗血管形成性タンパク質はまた、プロドラッグを含む組成物中に含有させることができる。本明細書においては、「プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）」という用語は、例えば血中の酵素的加水分解によりインビボで急速に変換されて親化合物となる化合物を指す。詳しい説明はＴ．Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｏｌ．１４，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、およびＥｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍａｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書においては、「製薬上許容しうるプロドラッグ（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ）」とは、（１）信頼できる医療上の判断の範囲内において、不必要な毒性、刺激性、アレルギー応答等を伴うことなくヒトおよびより下位の動物の組織と接触させて使用するのに適し、そして合理的な利益／危険の比を確保しており、その意図する使用のために有効である本発明の化合物のプロドラッグ、および（２）可能な場合は親化合物の両性イオン形態を指す。
【０１８４】
本発明の抗血管形成性タンパク質の用量は、治療される疾患の状態または症状、および他の臨床要因、例えばヒトまたは動物の体重および健康状態、および化合物の投与経路により異なる。ヒトまたは動物を治療するためには、約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重のタンパク質を投与することができる。複合療法の場合、例えば本発明のタンパク質を放射線療法、化学療法または免疫療法と組み合わせる場合は、用量を例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．２ｍｇ／ｋｇ体重にまで低減することができる。特定の動物またはヒトにおける抗血管形成性タンパク質の半減期に応じて、抗血管形成性タンパク質は一日当たり数回ないしは一週間に１回の頻度で投与することができる。本発明は、ヒトおよび獣医科用の両方の用途を有する。本発明の方法は、単回投与並びに同時または長期間にわたる多数回投与を意図している。更にまた、抗血管形成性タンパク質は他の形態の治療、例えば化学療法、放射線療法または免疫療法と組み合わせて投与することもできる。
【０１８５】
抗血管形成性タンパク質の製剤は、経口、直腸、眼内（例えば硝子体内または房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ））、鼻内、局所（例えば口内または舌下）、子宮内、膣内または非経口（例えば皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内および硬膜外）の投与に適したものを包含する。抗血管形成性タンパク質製剤は、好都合には単位用量型で提供され、そして従来の製薬手法により調製される。このような手法には、活性成分および製薬用担体または賦形剤を会合させる工程が包含される。一般的に製剤は、活性成分を液体担体または微細分割固体担体または両方と均一緊密に会合させ、その後必要に応じて生成物を成型することにより調製する。
【０１８６】
非経口投与に適する製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を投与対象の血液と等張とするための溶質を含有しうる水性または非水性の滅菌注射用溶液；および、懸濁剤および濃化剤を含有しうる水性および非水性の滅菌懸濁液を包含する。製剤は、単位用量または多用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に提供してよく、そして、使用直前に例えば注射用水のような滅菌液体担体を添加するのみでよい凍結乾燥された状態で保存してよい。用時調製の注射溶液および懸濁液は前述した滅菌粉末、顆粒および錠剤から調整してよい。
【０１８７】
本発明のタンパク質の有効量を経口投与する場合、本発明の抗血管形成性タンパク質は錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態とする。錠剤形態で投与する場合は、本発明の医薬組成物は更にゼラチンまたはアジュバントのような固体担体を含有してよい。錠剤、カプセルおよび粉末は、本発明のタンパク質を約５〜９５％、好ましくは本発明のタンパク質を約２５〜９０％含有する。液体形態で投与する場合は、液体担体、例えば水、石油、動物性および植物性の油脂、例えばピーナツ油、鉱物油、大豆油またはゴマ油、または、合成の油を添加してよい。医薬組成物の液体形態は更に、生理食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液、またはグリコール類、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含有してよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は本発明のタンパク質を約０．５〜９０重量％、好ましくは本発明のタンパク質を約１〜５０重量％含有する。
【０１８８】
本発明のタンパク質の有効量を静脈内、経皮または皮下注射により投与する場合は、本発明のタンパク質は発熱物質非含有の非経口的に許容される水溶液の形態とする。このようなｐＨ、等張性、安定性等に関して非経口的に許容されるタンパク質の溶液の調製は当業者の知るとおりである。静脈内、経皮または皮下注射のための好ましい医薬組成物は本発明のタンパク質のほかに、等張性のベヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸添加リンゲル注射液、または当該分野で知られた他のベヒクルを含有しなければならない。本発明の医薬組成物は、安定剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤、または当該分野で知られた他の添加剤も含有してよい。
【０１８９】
本発明の医薬組成物中の本発明のタンパク質の量は、治療すべき症状の性質および重症度、および患者が受けた以前の治療の性質により異なる。究極的には、個々の患者の治療に用いる本発明のタンパク質の量は担当医が決定する。最初、担当医は本発明のタンパク質を低用量で投与し、患者の応答を観察する。本発明のタンパク質の漸増用量を至適治療効果が患者に得られるまで投与し、その段階で用量はさらに増加されない。
【０１９０】
本発明の医薬組成物を用いた静脈内治療の期間は、治療すべき疾患の重症度および各患者の状態および潜在的な特有の応答により変動する。本発明のタンパク質のそれぞれの適用期間は、連続静脈内投与の１２〜２４時間の範囲である。究極的には、本発明の医薬組成物を用いた静脈内治療の適切な期間については担当医が決定する。
【０１９１】
好ましい単位用量製剤は、投与される成分の一日当たりの用量または単位、一日当たりのサブ用量、またはその適切な細分量を含有するものである。上記の特定の成分に加えて、本発明の製剤は該当する製剤の形態に応じた当該分野で従来使用されている他の物質も含有してよい。場合により、細胞毒性の薬剤を配合するか、その他の様式で抗血管形成性タンパク質または生物学的に機能性のそのタンパク質フラグメントと組み合わせることにより、二剤併用療法を患者に行ってよい。
【０１９２】
治療用組成物はまた、獣医科用途においても現在価値あるものである。特に家畜および血統馬がヒト以外では本発明のタンパク質による治療に望ましい対象である。
【０１９３】
リシンのような細胞毒性剤を抗血管形成性タンパク質およびそのフラグメントと連結し、これにより抗血管形成性タンパク質に結合する細胞を破壊するための道具を得ることができる。このような細胞は、多くの箇所、例えば微小転移および原発腫瘍に見られるが、これらに限定されない。細胞毒製剤と連結したタンパク質を、所望の箇所へのデリバリーを最大限とするように設計された態様で注入する。例えばリシン連結高親和性フラグメントを標的部位への供給血管内に、または標的部位に直接、カニューレを通じて送達する。このような薬剤はまた、注入カニューレに結合した浸透圧ポンプを介して制御された態様で送達される。拮抗剤と抗血管形成性タンパク質の組み合わせを血管形成の刺激と共に同時適用することにより、組織の血管形成を増強してよい。この治療法は転移癌を破壊するための効果的な手段を与える。
【０１９４】
他の治療法には、細胞毒性剤に連結した抗血管形成性タンパク質、そのフラグメント、類似体、抗血清または受容体のアゴニストおよび拮抗剤の投与が包含される。抗血管形成性タンパク質はヒトまたは動物起源のものでありうる。抗血管形成性タンパク質はまた、化学反応による合成で、または発現系を用いた組換え法により製造することもできる。抗血管形成性タンパク質はまた、単離されたＩＶ型コラーゲンを酵素的に切断して抗血管形成活性を有するタンパク質を精製することにより製造することもできる。例えば、血管基底膜、例えばＩＶ型コラーゲンをプロテアーゼ、例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、エラスターゼによるタンパク質分解に付することにより、本発明のタンパク質およびペプチドを得ることができる。抗血管形成性タンパク質はまた、ＩＶ型コラーゲンを分解して抗血管形成性タンパク質とする内因性酵素の作用を模倣した化合物により製造することもできる。抗血管形成性タンパク質の製造はまた、開裂酵素の活性に影響する化合物により調節してもよい。
【０１９５】
本発明はまた、抗血管形成性タンパク質、インテグリン、インテグリンサブユニットまたはその突然変異体、フラグメントまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者内に導入して調節する遺伝子療法を包含する。遺伝子産物タンパク質の発現のために細胞にＤＮＡを転移またはデリバリーする種々の方法、別称遺伝子療法はＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｎ．Ｙａｎｇ（１９９２），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２（４）：３３５−５６に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子療法はエクスビボまたはインビボ療法に使用するために、体細胞または生殖細胞系統にＤＮＡ配列を取り込ませることを包含する。遺伝子療法は遺伝子を交換し、正常または異常な遺伝子機能を増強し、そして感染性疾患または他の病態に対抗する機能を有する。
【０１９６】
遺伝子療法によるこれらの医療上の問題を治療するための手法には、欠損遺伝子を同定し、次いで欠損遺伝子の機能を代替するか、または僅かに機能する遺伝子を増強するために機能的遺伝子を加える治療手法；または症状を治療するかまたは組織または臓器を治療方法に対してより感受性とするような生成タンパク質についての遺伝子を加える等の予防的手法が包含される。予防的手法の一例として、１以上の抗血管形成性タンパク質をコードする遺伝子を患者体内に入れ、これにより血管形成の発生を防止するか；または、腫瘍細胞を放射線により感受性とする遺伝子を挿入し、次いで腫瘍の放射線照射により腫瘍細胞の増強された殺傷がもたらされる。
【０１９７】
抗血管形成性タンパク質のＤＮＡまたは調節配列を転移させる多くのプロトコルが、本発明において意図される。抗血管形成性タンパク質と特に関連して通常存在するもの以外のプロモーター配列または抗血管形成性タンパク質の生成を増大させる他の配列のトランスフェクションもまた、遺伝子療法の方法として意図される。この手法の一例は、細胞におけるエリトロポエチンの遺伝子のスイッチを入れる「遺伝子スイッチ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｗｉｔｃｈ）」を挿入する相同組換えを用いた、Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．，にみとめられる。Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，Ａｐｒ．１５，１９９４を参照のこと。このような「遺伝子スイッチ」は、これらのタンパク質（または受容体）を通常発現しない細胞中の抗血管形成性タンパク質（またはその受容体）を活性化するために使用される。
【０１９８】
遺伝子療法の遺伝子転移法には、３種の大きく分けたカテゴリー、即ち、物理的（例えばエレクトロポレーション、直接遺伝子転移、および粒子衝突）、化学的（例えば液体系担体または他の非ウイルスベクター）および生物学的（例えばウイルス由来ベクターおよび受容体の取込）方法に分類される。例えば、非ウイルスベクターは、ＤＮＡでコーティングされたリポソームであるものを使用してよい。このようなリポソーム／ＤＮＡ複合体は患者に直接静脈内注射してよい。リポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓内で高濃度化し、そこでマクロファージおよびクプファー細胞にＤＮＡをデリバリーすると考えられている。このような細胞は長期間生存し、従ってデリバリーされたＤＮＡの長期間の発現をもたらす。更に、治療用ＤＮＡのターゲティングデリバリーのために、ベクターまたは遺伝子の「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡを直接、所望の臓器、組織または腫瘍内に注射してよい。
【０１９９】
遺伝子療法の方法論はまた、デリバリー部位によって論じることもできる。遺伝子をデリバリーする基礎的な方法は、エクスビボの遺伝子転移、インビボの遺伝子転移、およびインビトロの遺伝子転移を含む。エクスビボの遺伝子転移の場合は、細胞を患者から取り出し、細胞培養物中で増殖させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞の数を増大させ、次に患者に再移植する。インビトロの遺伝子転移の場合は、形質転換された細胞は培養物中で増殖する細胞、例えば組織培養細胞であり、特定の患者から得た特定の細胞ではない。これらの「実験細胞（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）」をトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞は選択され、患者に移植するかその他の用途のいずれかに用いられる。
【０２００】
インビボの遺伝子転移には、細胞が患者体内にある場合は、ＤＮＡを患者の細胞内に導入することが含まれる。方法には、非感染性のウイルスを使用したウイルス媒介遺伝子転移を用いて、患者体内に遺伝子をデリバリーするか、またはネイキッドのＤＮＡを患者の部位内に注射することが含まれ、そしてＤＮＡは、遺伝子産物タンパク質が発現している細胞の比率で回収される。更に、本明細書において記載する他の方法、例えば「遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）」の使用は、抗血管形成性タンパク質の生成を制御するＤＮＡまたは調節配列のインビトロ挿入に使用してよい。
【０２０１】
遺伝子療法の化学的方法には、必ずしもリポソームである必要はない脂質系の化合物を用いてＤＮＡを細胞膜を通過して転移させることが含まれる。リポフェクチンまたはサイトフェクチン、負荷電ＤＮＡに結合する脂質系陽イオンは、細胞膜を通過できる複合体を形成し、ＤＮＡを細胞の内部に提供する。別の化学的方法では、受容体系エンドサイトーシスを用い、この場合、特異的リガンドを細胞表面の受容体に結合させ、それを封入して、細胞膜を通過して輸送する。リガンドはＤＮＡに結合し、全体の複合体が細胞内に輸送される。リガンド遺伝子複合体を血流中に注射し、次に受容体を有する標的細胞がリガンドに特異的に結合し、リガンドＤＮＡ複合体を細胞に輸送する。
【０２０２】
多くの遺伝子療法の方法論が細胞に遺伝子を挿入するためにウイルスベクターを使用している。例えば、改変されたレトロウイルスベクターをエクスビボの方法で用いることにより遺伝子を末梢および腫瘍浸潤のリンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞または他の体細胞内に導入している。これらの改変された細胞を次に患者に導入することにより、挿入されたＤＮＡからの遺伝子産物を提供する。
【０２０３】
ウイルスベクターはまた、インビボのプロトコルを使用して細胞に遺伝子を挿入するために使用されている。外来遺伝子の組織特異的発現を指向するためには、組織特異的であることが分かっているシス作用する調節エレメントまたはプロモーターを用いることができる。あるいは、これはインビボの特定の解剖学的部位へのＤＮＡまたはウイルスベクターのインサイチュ・デリバリーを用いて行うこともできる。例えば、インビボの血管への遺伝子転移は、動脈壁上の選択された部位に形質導入内皮細胞をインビトロ移植することにより達成している。ウイルスは遺伝子産物を発現していた周囲の細胞にも感染した。ウイルスベクターは、例えばカテーテルによりインビボの部位に直接デリバリーでき、これにより特定の領域のみをウイルスにより感染させ、長期間の部位特異的遺伝子発現を行うことができる。レトロウイルスを用いたインビボの遺伝子転移はまた、臓器に連絡する血管内への改変ウイルスの注射により乳房組織および肝組織においても明らかにされている。
【０２０４】
遺伝子療法プロトコルのために用いられているウイルスベクターは、例えばレトロウイルス、他のＲＮＡウイルス、例えばポリオウイルスまたはＳｉｎｄｂｉｓウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアおよび他のＤＮＡウイルスを包含するが、これらに限定されない。修復欠損ネズミレトロウイルスベクターは最も広範に使用されている遺伝子転移ベクターである。ネズミ白血病レトロウイルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）に入れられ、宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）により包囲された、核のコアタンパク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素に複合した１本鎖ＲＮＡからなる。レトロウイルスのゲノム構造は５’および３’の長末端反復（ＬＴＲ）により囲まれたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイルスベクター系は、５’および３’のＬＴＲおよびパッケージング・シグナルを含む最小ベクターが、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞系統内にトランスで供給される限り、ベクターのパッケージング、感染および標的細胞への組み込みを可能にするのに十分であるという事実を利用している。遺伝子転移のためのレトロウイルスベクターの基礎的な利点は、大部分の細胞型における効率的な感染および遺伝子発現、標的細胞の染色体ＤＮＡへの厳密な１コピーベクター組み込み、およびレトロウイルスゲノムの操作の容易性を包含する。
【０２０５】
アデノウイルスは、コアタンパク質と複合化し、カプシドタンパク質で包囲されている直線状の２本鎖ＤＮＡである。分子ウイルス学の進歩は、インビボで標的細胞内に新しい遺伝子配列を導入することのできるベクターを作成するためにこれらの生物の生物学的特性を利用する能力をもたらした。アデノウイルス系ベクターは高濃度で遺伝子産物タンパク質を発現する。アデノウイルスベクターは低ウイルス力価においてさえも高い効率の感染性を有する。更にまた、ウイルスは無細胞のビリオンとして完全な感染性を有するため、産生細胞系統の注入を必要としない。アデノウイルスベクターの別の潜在的な利点はインビボの異種遺伝子の長期発現が達成できる能力である。
【０２０６】
ＤＮＡデリバリーの機械的方法は、融合誘発性脂質嚢胞、例えばリポソームまたは他の膜融合のための嚢胞、ＤＮＡ配合カチオン性脂質の脂質粒子、例えばリポフェクチン、ＤＮＡのポリリジン媒介転移、ＤＮＡの直接注射、例えば生殖細胞または体細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクション、空気力学的にデリバリーされたＤＮＡコーティング粒子、例えば「遺伝子銃」において用いられる金粒子、および、無機化学的方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクションを包含する。粒子媒介遺伝子転移法は植物組織の形質転換において最初に使用された。粒子衝突装置または「遺伝子銃」を用いて、駆動力を発生させてＤＮＡコーティング高密度粒子（例えば金またはタングステン）を、標的となる臓器、組織または細胞の貫通を可能とする高速にまで加速する。粒子衝突は細胞、インビトロの系において、あるいは組織または臓器にＤＮＡを導入するためのエクスビボまたはインビボの手法を用いて使用できる。別の方法であるリガンド媒介遺伝子療法では、ＤＮＡを特定のリガンドと複合体化してリガンド−ＤＮＡコンジュゲートを形成し、ＤＮＡを特定の細胞または組織に指向させる。
【０２０７】
プラスミドＤＮＡを筋肉細胞内に注射すると、トランスフェクトされマーカー遺伝子の持続性の発現を示す細胞が高い比率で得られることが分かっている。プラスミドのＤＮＡは細胞のゲノム内に組み込まれても組み込まれなくてもよい。トランスフェクトされたＤＮＡの非組み込みは、細胞またはミトコンドリアのゲノム内の相互の挿入、欠失または改変のおそれを伴うことなく、トランスフェクションを可能とし、長期間にわたり最終的に分化した非増殖性の組織内に遺伝子産物タンパク質の発現を可能とする。長期間であるが必ずしも永久ではない治療用遺伝子の特定の細胞への転移は、遺伝子疾患のため、または予防的使用のための治療を可能とする。ＤＮＡは周期的に注射することにより、レシピエントの細胞のゲノム内に突然変異を起こすことなく遺伝子産物の濃度を維持することができる。外因性ＤＮＡの非組み込みは、１つの細胞内に数種の外因性ＤＮＡコンストラクトが存在し、そのコンストラクトのすべてが種々の遺伝子産物を発現することを可能にする。
【０２０８】
遺伝子の転移のためのエレクトロポレーションは、細胞または組織をエレクトロポレーション媒介の媒介遺伝子転移に感受性とするために電流を使用する。所定の電場強度の短い電気インパルスを用いて、ＤＮＡ分子が細胞内に貫通できるように膜の透過性を増大させる。この手法はインビトロの系において、または細胞、組織または臓器にＤＮＡを導入するためのエクスビボまたはインビボの手法と共に用いることができる。
【０２０９】
担体媒介のインビボの遺伝子転移は、外来性ＤＮＡを細胞にトランスフェクトするために使用することができる。担体−ＤＮＡ複合体を好都合に体液または血流中に導入し、次に体内の標的臓器または組織に部位特異的に指向させる。リポソームおよびポリカチオンの両方、例えばポリリジン、リポフェクチンまたはサイトフェクチンを使用できる。細胞特異的または臓器特異的であるようなリポソームを開発し、これによりリポソームにより担持される外来性ＤＮＡを標的細胞に取り込ませる。特定の細胞上の特異的受容体にターゲティングされたイムノリポソームの注射は、受容体を有する細胞へのＤＮＡの挿入の好都合な方法として使用できる。使用されている別の担体系は、インビボの遺伝子転移のために肝細胞にＤＮＡを運搬するためのアシアロ糖タンパク質／ポリリジンコンジュゲート系である。
【０２１０】
トランスフェクトされたＤＮＡはまた、ＤＮＡがレシピエント細胞に運搬され、そして原形質内または核質内に残存できるように、他の種の担体と複合体化してもよい。ＤＮＡは特別に操作された嚢胞複合体中の担体核タンパク質とカップリングし、核内に直接運搬することができる。
【０２１１】
抗血管形成性タンパク質の遺伝子調節は、抗血管形成性タンパク質の１つをコードする遺伝子またはその遺伝子に関連している制御領域、またはその相当するＲＮＡ転写物に結合する化合物を投与して転写または翻訳の速度を変更することにより行ってよい。更にまた、抗血管形成性タンパク質をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトした細胞を患者に投与することにより、そのタンパク質のインビボ供給源を提供しうる。例えば、抗血管形成性タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで細胞をトランスフェクトしてよい。トランスフェクトされた細胞は、患者の正常組織、患者の疾患組織に由来するものであってよく、または非患者の細胞であってよい。
【０２１２】
例えば、患者から摘出した腫瘍細胞を本発明のタンパク質を発現できるベクターでトランスフェクトし、患者に再導入する。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、腫瘍の増殖を抑制するタンパク質の濃度を患者体内においてもたらす。患者はヒトまたは非ヒト動物であってよい。細胞はまた、非ベクターにより、または当該分野で知られた物理的または化学的方法、例えばエレクトロポレーション、イオノポレーションにより、または「遺伝子銃」によりトランスフェクトしてもよい。更にまた、ＤＮＡは担体の助けを借りることなく直接患者に注射してもよい。特に、ＤＮＡは皮膚、筋肉または血液中に注射してよい。
【０２１３】
患者に抗血管形成性タンパク質をトランスフェクトするための遺伝子療法プロトコルは、抗血管形成性タンパク質ＤＮＡの細胞のゲノム内、微小染色体内への組み込みを介するか、または、細胞の原形質または核質内の別個の複製または非複製ＤＮＡコンストラクトとして行ってよい。抗血管形成性タンパク質の発現は長時間継続してよく、または周期的に再注射することにより細胞、組織または臓器内のタンパク質の所望の濃度または所定の血中濃度を維持してよい。
【０２１４】
更にまた、本発明は、新しい抗血管形成性タンパク質を試験するために使用でき、そして、血管形成活性またはその欠如を特徴とするか、あるいはそれに関連する疾患および症状の診断、予後または治療において使用できる抗体および抗血清を包含する。そのような抗体および抗血清は、所望の場合は、例えば心筋梗塞後の心臓組織において、血管形成をアップレギュレートするために使用でき、本発明のタンパク質に対する抗体または抗血清は、局在化する天然の抗血管形成性のタンパク質および過程をブロックして新血管の形成を増大させ、心臓組織の萎縮を抑制するために使用できる。
【０２１５】
このような抗体および抗血清は、製薬上許容しうる組成物および担体と組み合わせて、診断、予後または治療用の組成物を形成できる。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指す。
【０２１６】
抗血管形成性タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた受動的抗体治療を用いて、再生、発達および創傷治癒と組織修復のような血管形成依存性の過程を調節することができる。更に、抗血管形成性タンパク質の抗体のＦａｂ領域に指向させた抗血清を投与することにより、タンパク質に対する内因性抗血清のタンパク質に結合する能力をブロックすることができる。
【０２１７】
本発明の抗血管形成性タンパク質はまた、阻害剤および受容体に特異的な抗体を生成するために使用できる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであることもできる。抗血管形成性タンパク質またはその受容体に特異的に結合するこれらの抗体は、体液または組織中の抗血管形成性タンパク質またはその受容体の量を検出するための当該分野でよく知られた診断方法およびキットにおいて使用することができる。これらの試験の結果を用いて、癌および他の血管形成媒介疾患の診断または再発予測を行うことができる。
【０２１８】
本発明はまた、抗血管形成活性を特徴とする疾患の診断または予後における抗血管形成性タンパク質、これらのタンパク質に対する抗体およびこれらのタンパク質および／またはその抗体を含有する組成物の使用を包含する。本明細書においては、「予後方法（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）」という用語は、疾患、特に血管形成依存性の疾患を診断されたヒトまたは動物の疾患の進行に関する予測を可能とする方法を意味する。本明細書においては「診断方法（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）」という用語は、ヒトまたは動物における、またはこれらに対する、血管形成依存性の疾患の存在または種類の判定を可能にする方法を意味する。
【０２１９】
抗血管形成性タンパク質は、タンパク質に結合できる抗体を検出し定量化するための診断方法およびキットにおいて使用できる。このようなキットは、インサイチュの原発腫瘍により分泌される抗血管形成性タンパク質の存在下における微小転移の拡大を示す抗血管形成性タンパク質に対する循環抗体の検出を可能とする。そのような循環抗タンパク質抗体を有する患者は、複数の腫瘍および癌を有する可能性がより高く、治療または緩解期後に癌の再発を起こす可能性がより高い。これらの抗タンパク質抗体のＦａｂフラグメントを抗原として使用することにより、抗タンパク質抗体を中和するために使用できる抗タンパク質Ｆａｂフラグメント抗血清を生成してよい。このような方法は、抗タンパク質抗体による循環タンパク質の除去を低減し、これにより抗血管形成性タンパク質の循環濃度を効果的に上昇させることができる。
【０２２０】
本発明はまた、抗血管形成性タンパク質に特異的な受容体の単離を包含する。組織に高親和性結合を示すタンパク質フラグメントを用いて、アフィニティーカラム上で抗血管形成性タンパク質の受容体を単離することができる。受容体の単離および精製は、抗血管形成性タンパク質の作用機序を解明するための基礎的な工程である。受容体の単離およびアゴニストおよび拮抗剤の同定は、生物活性への最終経路である受容体の活性を調節する薬剤の開発を促進する。受容体の単離により、インサイチュおよび溶液のハイブリダイゼーション手法を用いて受容体の位置および合成をモニタリングするためのヌクレオチドプローブの構築が可能となる。更にまた、受容体に対する遺伝子を単離し、発現ベクターに取り込み、患者の腫瘍細胞のような細胞にトランスフェクトすることにより、細胞型、組織および腫瘍が抗血管形成性タンパク質に結合して局所的血管形成を抑制する能力を増大させることができる。
【０２２１】
抗血管形成性タンパク質は、培養腫瘍細胞からの抗血管形成性タンパク質に対する受容体の単離のためのアフィニティーカラムの開発のために使用される。受容体の単離および精製の後にアミノ酸の配列決定を行う。この情報を用いて、受容体をコードする遺伝子を同定し単離することができる。次に、クローニングされた核酸配列を開発して受容体を発現できるベクターに挿入する。これらの手法は当該分野でよく知られている。腫瘍細胞への受容体をコードする核酸配列のトランスフェクションおよびトランスフェクトされた腫瘍細胞による受容体の発現により、内因性および外因性の抗血管形成性タンパク質へのこれらの細胞の応答性が増強され、これにより転移性の増殖の速度が低減される。
【０２２２】
本発明の血管形成抑制タンパク質は、標準的な微小化学設備において合成でき、純度はＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析により確認できる。タンパク質合成、ＨＰＬＣ精製および質量スペクトル分析の方法は当該分野で知られている。抗血管形成性タンパク質およびその受容体タンパク質はまた、組換え大腸菌または酵母の発現系において製造され、そしてカラムクロマトグラフィーで精製される。
【０２２３】
未損傷の抗血管形成性タンパク質の種々のタンパク質フラグメントは、いくつかの用途において使用するために合成でき、例えば特異的抗血清の開発のための抗原として、抗血管形成性タンパク質の結合部位において活性なアゴニストおよび拮抗剤として、抗血管形成性タンパク質に結合するタンパク質のターゲティング殺傷のための細胞毒製剤に連結するかまたはこれと組み合わせて使用されるタンパク質としての用途が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
抗血管形成性タンパク質の合成タンパク質フラグメントは種々の用途を有する。高い親和性と結合性で抗血管形成性タンパク質の受容体に結合するタンパク質を放射標識し、オートラジオグラフおよび膜結合手法を用いて結合部位の可視化と定量のために用いる。この用途は重要な診断および研究用の道具となる。受容体の結合特性を知れば、受容体に関連する形質導入構造の検討が容易になる。
【０２２５】
抗血管形成性タンパク質およびそれらより誘導されるタンパク質は、標準的な方法を用いて他の分子にカップリングすることができる。抗血管形成性タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端は、ともにチロシンおよびリジン残基を含んでおり、種々の方法により同位体または非同位体標識、例えば従来の手法を用いて放射標識される（チロシン残基−クロラミンＴ法、ヨードゲン法、ラクトペルオキシダーゼ法；リジン残基−ボルトンハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬）。これらのカップリング方法は当該分野でよく知られている。あるいは、チロシンおよびリジンをこれらの残基を有さないフラグメントに付加することにより、そのタンパク質上の反応性のアミノ基およびヒドロキシル基の標識を容易にする。カップリングの手法は、アミノ酸上の使用可能な官能基、例えばアミノ、スルフィドリル、カルボキシル、アミド、フェノールおよびイミダゾールに基づいて選択する。これらのカップリングを行うために使用される種々の試薬には、特に、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミドおよびｐ−ベンゾキノンが包含される。
【０２２６】
抗血管形成性タンパク質は、同位体、酵素、担体タンパク質、細胞毒製剤、蛍光分子、化学ルミネセント、生物ルミネセントおよび種々の用途のための他の化合物に化学的にカップリングされる。カップリング反応の効率は、特定の反応に適切な種々の手法を用いて測定される。例えば１２５Ｉによる本発明のタンパク質の放射標識は、高い比放射能を有するクロラミンＴおよびＮａ１２５Ｉを用いて行われる。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムを用いて停止され、混合物は使い捨てカラム上で脱塩される。標識されたタンパク質をカラムから溶離し、画分を収集する。少量づつを各画分から採取し放射能をガンマカウンターで測定する。この方法において未反応のＮａ１２５Ｉは標識タンパク質から分離される。最も高い比放射能を有する画分を保存して、その後の抗血管形成性タンパク質の抗血清に結合する能力の分析に付す。
【０２２７】
更にまた、半減期の短い同位体による抗血管形成性タンパク質の標識により、陽電子放射断層撮影またはタンパク質の結合部位を有する腫瘍の位置決めのための他の近代的な放射能分析手法を用いたインビボの受容体結合部位の可視化が可能となる。
【０２２８】
これらの合成タンパク質内のアミノ酸の全体的置換により、受容体への結合を増強または低減する抗血管形成性タンパク質の受容体に対する高親和性のタンパク質アゴニストおよび拮抗剤が得られる。このようなアゴニストを用いて、微小転移の増殖を抑制し、癌の蔓延を制限することができる。抗血管形成性タンパク質の拮抗剤は、不十分な血管形成の状況において、抗血管形成性タンパク質の抑制作用をブロックし、血管形成を促進するために適用される。例えば、この治療法は糖尿病における創傷治癒を促進するための治療効果を有する。
【０２２９】
本発明は更に以下の実施例により説明されるが、これらは本発明の範囲を制限する意図を全く有さない。他の実施形態、変更およびその等価なものが可能であり、それらは本明細書を参照すれば本発明の範囲を逸脱しないことは当業者には明らかである。
【０２３０】
実施例
実施例１：天然のアレステンの単離
アレステンは、ヒト胎盤および羊膜の組織からミリグラム量で発生させることができる。これおよび同様のタンパク質を単離するためのプロトコルは文献に報告されている（例えばＬａｎｇｅｖｅｌｄ，Ｊ．Ｐ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０４８１−８；Ｓａｕｓ，Ｊ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３３７４−８０；Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：５４６６−９；Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４；Ｋａｈｓａｉ，Ｔ．Ｚ．ら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７０２３−３２参照）。アレステンの組換え型の製造はＮｅｉｌｓｏｎら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−６）に記載されている。タンパク質はまた、２９３腎細胞において発現させることもできる（例えば、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．ら，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：１６５６−６４中に記載の方法等）。アレステンはまたＰｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ，Ｔ．ら（１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：７６８１−７）の方法に従って単離することもできる。
【０２３１】
ヌクレオチド（配列番号１）およびＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖のアミノ酸（配列番号２）配列は図１に示す通りであり、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号Ｍ１１３１５に相当する（Ｂｒｉｎｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，１９９４）。アレステンは一般的にＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインを含み、そしておそらくは、ＮＣ１ドメインの直前の１２アミノ酸である接合部も含む。
【０２３２】
天然のアレステンはヒト胎盤から、細菌性のコラゲナーゼ、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４；Ｗｅｂｅｒ，Ｓ．ら，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：４０１−１０）。ヒト胎盤から単離したＩＶ型コラーゲン単量体は、Ｃ１８疎水性カラムを用いてＨＰＬＣ精製した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）。構成成分のタンパク質をアセトニトリル勾配（３２％〜３９％）を用いて分割した。主ピーク、小さい二重ピークが観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、第１のピーク内に２バンドがあり、第２のピーク内には検出可能なタンパク質はなかった。免疫ブロッティングにおいても第２のピーク中に免疫検出可能なタンパク質はなく、主ピークはアレステンであると同定された。
【０２３３】
実施例２：大腸菌中のアレステンの組換え生成
アレステンをコードする配列をα１ＮＣ１（ＩＶ）／ｐＤＳベクターからＰＣＲにより増幅（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５）し、その際、フォワードプライマーとして５’−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＴＴＣ−３’（配列番号３）およびリバースプライマーとして５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＧＡＣ−３’（配列番号４）を用いた。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、予備消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションした（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）。このコンストラクトを図２に示す。これはアレステンをｐｅｌＢリーダー配列の下流に、そしてそれとインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）に位置させ、これにより可溶性タンパク質の原形質周囲の局在化および発現が可能となった。別のベクター配列をアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号１３）をコードするタンパク質に付加した。配列の３’末端をポリヒスチジンタグ配列にインフレームにライゲーションした。ｃＤＮＡの３’末端およびｈｉｓ−ｔａｇの間の別のベクター配列は、アミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号１４）をコードしていた。陽性クローンを両鎖について配列決定した。
【０２３４】
アレステンをコードするプラスミドコンストラクトを、まず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に形質転換し、次に発現のためにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に形質転換した。一晩培養した細菌培養物を用いてＬＢ培地５００ｍｌ培養物に接種した。この培養物を、細胞のＯＤ６００が０．６に達するまで約４時間増殖させた。次に終濃度１〜２ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。２時間の誘導の後、５０００×ｇで遠心分離することにより細胞を採取し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、３０分間１２，０００×ｇで遠心分離した。上澄み画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４〜６回、２ｍｌ／分の速度で通過させた。非特異的結合タンパク質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭおよび２０ｍＭのイミダゾールで洗浄することにより除去した。アレステンタンパク質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の漸増濃度のイミダゾール（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）を用いてカラムから溶離させた。溶離したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析の間、総タンパク質のうちの少量が析出した。透析したタンパク質を収集し、約３５００×ｇで遠心分離し、ペレットと上澄みの画分に分離した。各画分のタンパク質濃度をＢＣＡ試験（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。ペレット中の総タンパク質の画分は約２２％であり、残りの７８％は可溶性タンパク質として回収された。タンパク質の総収率は約１０ｍｇ／リットルであった。
【０２３５】
大腸菌発現タンパク質は主に可溶性タンパク質として単離され、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば２９ｋＤａにおける単量体バンドであった。別の３ｋＤａがポリリンカーおよびヒスチジンタグから生じ、アレステンおよび６−ヒスチジンタグ抗体の両方により免疫検出された。
【０２３６】
実施例３：２９３胚性腎細胞におけるアレステンの発現
α１（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミドを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）内にインフレームにリーダーシグナル配列が付加されるような方法でアレステンを増幅した。完全長α１（ＩＶ）の５’末端からのリーダー配列をＮＣ１ドメインにクローニングすることにより、培地中へのタンパク質の分泌を可能とした。アレステン含有組換えベクターはフランキングプライマーを用いて配列決定した。エラーなしのｃＤＮＡクローンを更に精製し、タンパク質の発現を確認するためのインビトロの翻訳試験に用いた。アレステン含有プラスミドおよび対照のプラスミドを用いて、塩化カルシウム法により２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされたクローンをゲネチシン抗生物質処理により選択した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）。細胞死が観察されなくなるまで抗生物質の存在下、３週間細胞を継代した。次にクローンをＴ−２２５フラスコに植え替え、コンフルエントになるまで増殖させた。次に上澄みを収集し、アミコンの濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて濃縮した。濃縮した上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよびＥＬＩＳＡで分析してアレステンの発現を調べた。上澄みにおける強力な結合がＥＬＩＳＡにより検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、約３０ｋＤａにおいて単一の主バンドがみとめられた。アレステン含有上澄みは、アレステン特異的抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーに付した（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４）。主ピークが検出され、アレステン抗体に対して免疫反応性である約３０ｋＤａの単量体を含有していた。組換えアレステン約１〜２ｍｇを培養液リットル当たり製造した。
【０２３７】
実施例４：アレステンは内皮細胞の増殖を抑制する
Ｃ−ＰＡＥ細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ中でコンフルエントとなるまで増殖させ、４８時間接触抑制させ続けた。対照細胞として７８６−Ｏ（腎癌）細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞およびＡ−４９８（腎癌）細胞を用いた。５分間３７℃でトリプシン処理（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）することにより細胞を回収した。１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１２，５００個の懸濁液を、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした２４穴のプレートの各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ２および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去し、０．５％ＦＣＳおよび３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭと交換した。未刺激の対照にはｂＦＧＦを添加しなかった。細胞を０．０１〜５０μｇ／ｍｌの範囲のアレステンまたはエンドスタチンの濃度で処理した。全ウェルに対し、投与時に３Ｈ−チミジン  １μキュリーを添加した。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。細胞を１Ｎ  ＮａＯＨで抽出し、ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）を４ｍｌ含有するシンチレーションバイアルに添加した。チミジンの取り込みはシンチレーションカウンターを用いて測定した。結果は図３Ａおよび３Ｂに示すとおりであり、これらは種々の量のアレステン（図３Ａ）またはエンドスタチン（図３Ｂ）を投与したＣ−ＰＡＥ細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みを示す一組のグラフである。アレステンはエンドスタチンと同様、Ｃ−ＰＡＥにおけるチミジン取り込みの抑制を示した。アレステンおよびエンドスタチンを投与した対照細胞の挙動もまた、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに示すが、アレステンは７８６−Ｏ細胞（図４Ａ）、ＰＣ−３細胞（図４Ｂ）、またはＨＰＥＣ細胞（図４Ｃ）に対しては殆ど作用を示さなかった。エンドスタチンはＡ−４９８細胞に対して殆ど作用を示さなかった（図４Ｄ）。図３および４における全群とも３組の試料の結果である。
【０２３８】
実施例５：アレステンは内皮細胞においてアポトーシスを誘導する
５０，０００個のＣ−ＰＡＥ細胞を１２時間、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを用いて、６穴の組織培養プレートの各ウェルに添加した。新鮮培地および５μｇ／ｍｌアレステンまたは４０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦα（陽性対照）を２、４および６時間の時点で添加した。対照ウェルには等容量のＰＢＳを添加した。脱着した細胞および接着した細胞をあわせ、１５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞を結合緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で洗浄し、アポトーシスの指標であるホスファチジル−セリン（ＰＳ）外在化をＦＩＴＣ標識アネキシンＶで標識することにより、製造元の指示に従って測定した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。アネキシン−ＦＩＴＣ標識細胞をＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｔｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて計数した。各投与につき、１０，０００個の細胞を計数し、保存した。次にこのデータを標準Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて分析した。対照群と比較して、陽性対照のＴＮＦαではアネキシンＶ染色（アポトーシス）細胞の比率は２時間で約２７％、４時間および６時間で約２０％増大していた。アレステン投与細胞では、アポトーシス細胞の比率は２時間で約１８％、そして４時間および６時間では約２３％であった。内皮細胞の形態の変化もまた実験の間に観察され、対照群の細胞は有意な変化を示さなかったのに対し、アレステン投与および非接着細胞はアポトーシスを示す細胞形態の変化を示していた。
【０２３９】
実施例６：アレステンは内皮細胞の遊走を抑制する
ＦＢＳ誘導化学走性に対するアレステンおよびエンドスタチンの抑制作用をヒト臍帯内皮細胞（ＥＣＶ−３０４細胞、ＡＴＣＣ  １９９８−ＣＲＬ，ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡ））に対し、ボイデンチャンバー試験（Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ａｓｓａｙ）（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて試験した。ＥＣＶ−３０４細胞を一晩、１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ  ＤｉｌＣ１８（３）リビング蛍光染色（ＤｉｌＣ１８（３）  ｌｉｖｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｔａｉｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を含有するＭ１９９培地中に増殖させた。トリプシン処理、洗浄および０．５％ＦＢＳ含有Ｍ１９９中に細胞を希釈した後、６０，０００個の細胞を、アレステンまたはエンドスタチン（２〜４０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下にて、上側のチャンバーのウェルに播種した。２％ＦＢＳを含有するＭ１９９培地を化学走性物質として下側のチャンバーに入れた。細胞含有コンパートメントは、孔径８μｍのポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて化学走性物質から分離した。チャンバーを３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で４．５時間インキュベートした。非遊走細胞を廃棄し、上側のウェルをＰＢＳで洗浄した後、フィルターをプラスチック刃で掻き取り、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定し、そしてスライドガラス上においた。蛍光高倍率視野を用いて、画像処理ソフトウエアＰＭＩＳ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）により操作されたデジタルＳｅｎＳｙｓＴＭカメラにより、数種の独立した均質な画像を記録した。代表的な写真は図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示すとおりであり、これらは２０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと同様に効果的な２μｇ／ｍｌにおけるアレステンを示している。細胞は、ＯＰＴＩＭＡＳ  ６．０ソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて計数し、結果は図６に示すとおりであり、これは顕微鏡写真で観察された結果をグラフ型にしたものである。
【０２４０】
実施例７：アレステンは内皮管腔形成を抑制する
内皮細胞の形成の抑制を測定するために、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）３２０μｌを２４穴プレートの各ウェルに添加し、重合体化させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。抗生物質を含有しないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中の２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞の懸濁液は、マトリゲルコーティングした各ウェルに移した。細胞に漸増濃度のアレステン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳまたは７Ｓドメインを投与した。全試験とも３組で行った。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（３．３対眼、１０×対物）で観察した。次に細胞を４００ＤＫコーティングＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）で撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で染色し、再度撮影した。１０の視野を観察し、管腔を計数し、平均した。結果は図７に示すとおりであり、これによればアレステン（■）は対照と比較して管腔形成を抑制している（滅菌ＰＢＳ、◆；ＢＳＡ、△；７Ｓドメイン、−Ｘ−）。十分形成された管腔の代表例は図８Ａに示すとおりであり、これは７Ｓドメインを投与された細胞を示している（１００×倍率）。一方、図８Ｂは０．８μｇ／ｍｌのアレステンを投与されたＭＡＥ細胞における管腔形成が乏しいかまたは全くないことを示している（１００×倍率）。
【０２４１】
インビボのＣ５７／ＢＬ６マウスについてもマトリゲル試験を行った。マトリゲルは４℃で一晩解凍した。次に、これを２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）および１μｇ／ｍｌのアレステンまたは１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンのいずれかと混合した。マトリゲル混合物を２１ｇ針で皮下注射した。対照には、血管形成阻害因子を添加しないほかは、同じ混合物を投与した。１４日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグをはずした。マトリゲルプラグを室温で４時間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中に固定し、その後２４時間ＰＢＳに切り替えた。プラグをパラフィン包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。切片を光学顕微鏡で観察し、１０高倍率視野から血管数を計数し、平均した。
【０２４２】
マトリゲルをｂＦＧＦの存在下、漸増濃度のアレステンの存在下または非存在下においた場合、血管数の５０％低下が、１μｇ／ｍｌアレステンおよび１０μｇ／ｍｌエンドスタチンにおいて観察された。これらの結果は、アレステンが血管形成過程の種々の工程を抑制することにより新血管形成に影響することを示している。結果はまた、１μｇ／ｍｌのアレステンがインビボの新血管形成の抑制において１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと同様に効果的であることを示している。
【０２４３】
実施例８：アレステンはインビボで腫瘍転移を抑制する
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに１００万個のＭＣ３８／ＭＵＣ１（Ｇｏｎｇ，Ｊ．ら，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：５５８−６１）を静脈注射した。２６日間１日おきに５匹の対照マウスに滅菌ＰＢＳ  １０ｍＭを注射し、６匹の実験群マウスには４ｍｇ／ｍｌのアレステンを投与した。投与２６日の後、肺腫瘍の結節を各マウスにつき計数し、２群について平均した。各群で２匹の死亡が記録された。アレステンは、肺結節の平均数を対照マウスの３００から２００にまで著しく低減した。
【０２４４】
実施例９：アレステンはインビボで腫瘍増殖を抑制する
２００万個の７８６−Ｏ細胞を７〜９週齢の雄性無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。６匹のマウスからなる第１の群においては、腫瘍は約７００ｍｍ３まで増殖した。６匹のマウスからなる第２の群においては、腫瘍は１００ｍｍ３まで増殖した。滅菌ＰＢＳ中のアレステンを腹腔内に毎日１０日間、７００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスには２０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスには１０ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。対照のマウスにはＢＳＡまたはＰＢＳベヒクルのいずれかを投与した。結果は図９Ａおよび９Ｂに示すとおりである。図９Ａは１０ｍｇ／ｋｇのアレステン投与（□）、ＢＳＡ投与（＋）および対照マウス（●）について、７００ｍｍ３から増量した腫瘍容量を示すプロットである。アレステン投与マウスの腫瘍は７００から５００ｍｍ３に収縮したのに対し、ＢＳＡ投与および対照のマウスの腫瘍は１０日間で約１２００ｍｍ３に拡大した。図９Ｂは１００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスにおいて、アレステン（□）はやはり約８０ｍｍ３までの腫瘍の収縮をもたらしたのに対し、ＢＳＡ投与腫瘍（＋）は１０日間でほぼ５００ｍｍ３の大きさにまで増大した。
【０２４５】
約５００万個のＰＣ−３細胞（ヒト前立腺癌細胞）を採取し、７〜９週齢の雄性無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍は１０日間増殖させ、次にバーニヤカリパス（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて測定した。腫瘍容量を標準的な式（幅２×長さ×０．５２（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−８５；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−２８）を用いて計算した。動物を５〜６匹の群に分割した。実験群には、腹腔内に毎日アレステン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはエンドスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を添加した。対照には毎日ＰＢＳを投与した。結果は図９Ｃに示すとおりであり、これによれば、アレステン（□）はエンドスタチン（▲）または対照（●）と同等かそれより僅かに良好に腫瘍の増殖を抑制した。実験は反復したが、アレステンの用量は４ｍｇ／ｋｇ／日とした。結果は図９Ｄに示すとおりである（アレステン、□；対照群、●）。投与は８日後（矢印）に停止したが、有意な抑制は、更にアレステンを投与しなくても更に１２日間継続した。無投与１２日の後、腫瘍はアレステンの抑制性の影響を回避し始めた。
【０２４６】
実施例１０：アレステンの免疫組織化学
腫瘍試験に用いたマウスを投与１０〜２０日の後に屠殺した。腫瘍を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に固定した。組織をパラフィン包埋し、３μｍの切片を切り出し、スライドガラス上に搭載した。切片を脱パラフィンし、再水和し、そして３００ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＸＸＩＶ（ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を３７℃で５分間投与した。１００％エタノールを添加して消化を停止し、切片を風乾して１０％ウサギ血清でブロッキングした。次にスライドを１：５０希釈度のラット抗マウスＣＤ−３１モノクローナル抗体（ＰａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）と共に一晩４℃でインキュベートし、その後、１：５０希釈度のウサギ抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）およびラットＡＰＡＡＰ（ＤＡＫＯ）中、３７℃で連続２回の３０分間インキュベートを行った。着色反応は新しいフクシンを用いて行い、切片はヘマトキシリンで対比染色した。ＣＤ−３１染色パターンによれば、対照マウスと比較した場合に投与群の血管形成が低減していた。
【０２４７】
ＰＣＮＡ染色については、組織切片を１：２００希釈度の抗ＰＣＮＡ抗体（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）と共に室温で６０分間インキュベートした。検出は、ＵＳＡセイヨウワサビペルオキシダーゼ系（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて製造元の推奨に従って行った。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。フィブロネクチンおよびＩＶ型コラーゲンによる染色は、１：５００の希釈度のポリクローナル抗フィブロネクチン（ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）および１：１００の希釈度の抗ＩＶ型コラーゲン（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行った。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、製造元の推奨に従って検出を行った。細胞外マトリックスのＰＣＮＡ、フィブロネクチンおよびＩＶ型コラーゲンの染色によれば、腫瘍増殖および腫瘍細胞を包囲するＩＶ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの含量や構造に差はなかった。
【０２４８】
実施例１１：アレステンの循環半減期
ヒト胎盤から単離した天然のアレステンを２００ｇのラットに静脈内注射した。各ラットにはヒトのアレステン５ｍｇを投与した。抗アレステン抗体の使用することにより、循環アレステンの存在について、血清を直接ＥＬＩＳＡによって種々の時点で分析した。対照として、血清アルブミンも各時点で評価し、同一量の血清が分析に用いられるようにした。アレステンは約３６時間の半減期で血清中を循環していることが分かった。
【０２４９】
ラットの別の群に２００μｇのヒトアレステンを腹腔内および／または皮下注射し、肺、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、脳、精巣、卵巣等における疾患の発生の兆候について調べた。直接ＥＬＩＳＡを行い、アレステン抗体をこれらのラットの血清中に検出し、一部の内因性ＩｇＧの付着が、以前に報告されている通り腎糸球体基底膜上に検出された（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６２０１−５）。腎内の抗体の付着は、炎症や腎機能の悪化の兆候は伴っていなかった。これらの実験は、アレステンが非病原性であることを示唆していた。
【０２５０】
実施例１２：細胞接着に対するアレステンの作用
９６穴プレートをヒトアレステンまたはヒトＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）のいずれかで、３７℃一晩、１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。残存するタンパク質結合部位を３７℃で２時間、ＰＢＳ中の１０％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）でブロッキングした。ＨＵＶＥＣ細胞をＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中、サブコンフルエント（７０〜８０％）となるまで増殖させた。細胞を穏やかにトリプシン処理し、血清非含有の培地中に再懸濁した（５×１０４個／ｍｌ）。次に細胞を１０μｇ／ｍｌの抗体と混合し、室温で穏やかに振とうしながら１５分間インキュベートした。次に細胞懸濁液１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２の下３７℃で４５分間インキュベートした。血清非含有の培地で洗浄することにより未結合の細胞を除去し、結合細胞を計数した。対照のマウスＩｇＧおよびヒトβ１インテグリンサブユニットに対するマウスモノクローナル抗体（クローンＰ４Ｃ１０）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から購入した。モノクローナル抗体α１インテグリンサブユニットおよびαｖβ３（それぞれクローンＣＤ４９ａおよびＬＭ６０９）はＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２５１】
結果は図１０Ａおよび１０Ｂに示すとおりであり、これらはコーティングされたプレート上の接着ＨＵＶＥＣ細胞（ｙ軸）の比率を示すヒストグラム２種であり、ここでは、細胞はマウスＩｇＧ（ｃ、対照）またはα１またはβ１インテグリンサブユニットに対する抗体、またはαｖβ３インテグリンに対する抗体と混合した。図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれアレステン・コーティングおよびＩＶ型コラーゲンコーティングのプレート上の付着細胞の比率を示す。アレステン・コーティングプレート（図１０Ａ）では、細胞接着はα１サブユニットについて６０％の抑制が、β１サブユニットについては７０％抑制が観察されたのに対し、ＩＶ型コラーゲンコーティングプレート（図１０Ｂ）ではα１で３０％、β１で４０％、そしてαｖβ３中和抗体で１５％の、より中等度の抑制が観察された。
【０２５２】
実施例１３：アレステンによるマトリックス・メタロプロテイナーゼの結合および抑制
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびこれらの酵素に対する抗体はＯｎｃｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．より購入した。直接ＥＬＩＳＡは、前述の通り、ヒト胎盤から単離した天然のアレステンを用いて行った（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６２０１−５）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は共に特異的にアレステンに結合した。これらは７Ｓドメインには結合しなかった。この結合は、それぞれＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１の結合とは非依存性であった。
【０２５３】
アレステンが基底膜を分解する能力を評価するために、マトリゲルを穏やかに振とうしながら３７℃で６時間、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と共にインキュベートした。上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖に対する抗体を用いてイムノブロッティングした。分解試験の開始時には、アレステンは漸増濃度で添加し、ＭＭＰ−２活性の阻害を観察した。ＮＣ１ドメインはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分割されて２６ｋＤａの単量体と５６ｋＤａの２量体となり、ＩＶ型コラーゲン抗体を用いたウエスタンブロットにより可視化することができた。漸増濃度のアレステンはＭＭＰ−２による基底膜の分解を抑制し、アレステンがＭＭＰ−２に結合でき、そしてその基底膜コラーゲン分解を防止することが示された。同様の結果がＭＭＰ−９についても得られた。
【０２５４】
実施例１４：大腸菌におけるカンスタチンの組換え生成
ヒトカンスタチンは、細菌発現プラスミドｐＥＴ２２ｂを用いて、Ｃ−末端ヒスチジンタグとの融合タンパク質として大腸菌中で生成した。
【０２５５】
ＩＶ型コラーゲンのα２  ＮＣ１ドメインに関するヌクレオチド（配列番号５）およびアミノ酸（配列番号６）の配列をそれぞれ図１１Ａおよび１１Ｂに示す。カンスタチンをコードする配列は、フォワードプライマー５’−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＣＴＣ−３’（配列番号７）およびリバースプライマー５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＣＡＣ−３’（配列番号８）を用いて、α２  ＮＣＩ（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ  Ｅ．Ｇ．ら，（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２４７６６（Ｋｉｌｌｅｎ，Ｐ．Ｄ．ら，１９９４））からＰＣＲにより増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、予備消化したｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）内にライゲーションした。コンストラクトを図１２に示す。このライゲーションにより、カンスタチンをｐｅｌＢリーダー配列の下流に、そしてそれとインフレームに位置させ、これにより可溶性タンパク質の原形質周囲の局在化および発現が可能となった。別のベクター配列をアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号１３）をコードするタンパク質に付加した。配列の３’末端をポリヒスチジンタグ配列にインフレームにライゲーションした。ｃＤＮＡの３’末端およびｈｉｓ−ｔａｇの間の別のベクター配列は、アミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号１４）をコードしていた。陽性クローンを両鎖について配列決定した。
【０２５６】
カンスタチンをコードするプラスミドコンストラクトを、まず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に形質転換し、次に発現のためにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に形質転換した。一晩培養した細菌培養物を用いて、ＬＢ培地５００ｍｌ培養物に接種した。この培養物を、細胞のＯＤ６００が０．６に達するまで約４時間増殖させた。次に終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。２時間の誘導の後、５０００×ｇで遠心分離することにより細胞を採取し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、３０分間１２，０００×ｇで遠心分離した。上澄み画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４〜６回、２ｍｌ／分の速度で通過させた。非特異的結合タンパク質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭのイミダゾールそれぞれ１５ｍｌで洗浄することにより除去した。カンスタチンタンパク質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の漸増濃度のイミダゾール（１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）を用いてカラムから溶離させた。溶離したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析の間、総タンパク質のうちの少量が析出した。透析したタンパク質を収集し、約３５００×ｇで遠心分離し、ペレットと上澄みの画分に分離した。各画分のタンパク質濃度をＢＣＡ試験（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、単量体バンドは約２６〜３２ｋＤａ、最も高頻度には２７ｋＤａにあり、そのうち３ｋＤａはポリリンカーおよびヒスチジンタグの配列から生じたものであった。カンスタチンを含有する溶出液をあわせ、ＰＢＳに対して透析し、次の試験に付した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析されたカンスタチンタンパク質は、ポリヒスチジンタグ抗体により検出された。カンスタチン抗体はまた、細菌発現された組換えカンスタチンタンパク質も検出した。
【０２５７】
大腸菌発現タンパク質は、主に可溶性タンパク質として単離された。ペレット中の総タンパク質の画分は約４０％であり、残りの６０％は可溶性タンパク質として回収された。タンパク質の総収量は約１５ｍｇ／リットルであった。
【０２５８】
実施例１５：２９３胚性腎細胞におけるカンスタチンの発現
ヒトカンスタチンはまた、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞ベクターを用いて２９３胚性腎細胞中の分泌可溶性タンパク質として産生し、アフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した（精製または検出タグを用いなかった）。
【０２５９】
α２（ＩＶ）ＮＣ１（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５）を含有するｐＤＳプラスミドを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）内にインフレームにリーダーシグナル配列が付加されるような方法で、カンスタチンをＰＣＲ増幅した。完全長α２（ＩＶ）の５’末端からのリーダー配列をＮＣ１ドメインにクローニングすることにより、培地中へのタンパク質の分泌を可能とした。カンスタチン含有組換えベクターは、フランキングプライマーを用いて配列決定した。エラーなしのｃＤＮＡクローンを更に精製し、タンパク質の発現を確認するためのインビトロの翻訳試験に用いた。カンスタチン含有プラスミドおよび対照のプラスミドを用いて、塩化カルシウム法により２９３細胞をトランスフェクトした（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，１９９６，“Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ”，ｐｐ．９．１．４−９．１．７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）。トランスフェクトされたクローンをゲネチシン抗生物質処理により選択した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）。細胞死が観察されなくなるまで、抗生物質の存在下、３週間細胞を継代した。次にクローンをＴ−２２５フラスコに植え替え、コンフルエントになるまで増殖させた。次に上澄みを収集し、アミコンの濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて濃縮した。濃縮した上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよびＥＬＩＳＡで分析して、カンスタチンの発現を調べた。上澄みにおける強力な結合がＥＬＩＳＡにより検出された。カンスタチン含有上澄みは、カンスタチン特異的抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーに付した（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４）。主ピークが検出され、カンスタチン抗体に対して免疫反応性である約２４ｋＤａの純粋な単量体を含有していた（抗α２ＮＣ１抗体、１：２００希釈度）。
【０２６０】
実施例１６：カンスタチンは内皮細胞の増殖を抑制する
ウシ大動脈内皮（Ｃ−ＰＡＥ）細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ中コンフルエントとなるまで増殖させ、４８時間接触抑制させ続けた。５分間３７℃でトリプシン処理（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）することにより細胞を回収した。０．５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１２，５００個の細胞の懸濁液を、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした２４穴のプレートの各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ２および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去し、０．５％ＦＣＳ（未刺激）または１０％ＦＣＳ（刺激および処置細胞）を含有するＤＭＥＭと交換した。対照細胞として７８６−Ｏ、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３細胞を用い、同様にコンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理し、プレーティングした。細胞を０．０２５〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲のカンスタチンまたはエンドスタチンの濃度で処理した。チミジン取り込み実験においては、全ウェルに対し、処置時に３Ｈ−チミジン１ｍキュリーを添加した。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。放射能を１Ｎ  ＮａＯＨで抽出し、ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ  ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）を４ｍｌ含有するシンチレーションバイアルに添加した。チミジンの取り込みは、シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０２６１】
結果は図１３Ａおよび１３Ｂに示すとおりである。図１３Ａは、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖に対するカンスタチンの種々の量の作用を示すヒストグラムである。カウント／分で示したチミジンの取り込みはｙ軸に示す。ｘ軸の「０．５％」は０．５％ＦＣＳ（未刺激）対照であり、「１０％」は１０％ＦＣＳ（刺激）対照である。漸増濃度のカンスタチン処理によりチミジンの取り込みが安定して低下した。図１３Ｂは、非内皮細胞の７８６−Ｏ（斑点棒）、ＰＣ−３（直行斜線棒）およびＨＥＫ２９３（白色棒）におけるチミジンの取り込みに対するカンスタチンの漸増量の作用を示すヒストグラムである。カウント／分で示したチミジンの取り込みはｙ軸に示し、ｘ軸は３種の細胞系統の各々につき、０．５％ＦＣＳ（未刺激）および１０％ＦＣＳ（刺激）対照、次いで漸増濃度のカンスタチンを示す。全群とも３組の試料の結果であり、棒は平均のカウント／分±平均の標準誤差を示す。
【０２６２】
メチレンブルー染色試験も実施した。３，１００個の細胞を各ウェルに添加し、上述の通り処理し、次に細胞をＯｌｉｖｅｒら（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９２：５１３−８）の方法を用いて計数した。全ウェルとも１００ｍｌの１×ＰＢＳで１回洗浄し、室温で３０分間中性緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）中１０％ホルマリン１００ｍｌを添加することにより細胞を固定した。ホルマリンを除去した後、細胞を室温で３０分間０．０１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）中１％メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）の溶液を用いて染色した。染色溶液除去後、ウェルを０．０１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）１００ｍｌで５回洗浄した。室温で１時間０．１Ｎ  ＨＣｌ／エタノール（１：１混合物）１００ｍｌを用いて細胞からメチレンブルーを抽出した。メチレンブルー染色の量は、６５５ｎｍ波長における吸光度を用いて、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上で測定した。
【０２６３】
結果を図１３Ｃおよび１３Ｄに示す。図１３Ｃは、Ｃ−ＰＡＥ細胞の染料取り込みに対するカンスタチンの漸増量の作用を示すヒストグラムである。ＯＤ６５５における吸光度はｙ軸に示す。「０．１％」は０．１％ＦＣＳ処置（未刺激）対照を示し、「１０％」は１０％ＦＣＳ（刺激）対照である。残りの棒は漸増濃度のカンスタチンの投与を示す。Ｃ−ＰＡＥ細胞において、染料の取り込みは約０．６２５〜１．２５μｇ／ｍｌのカンスタチン処置濃度において、未刺激の細胞で観察された水準まで低下した。図１３Ｄは、非内皮細胞ＨＥＫ２９３（白色棒）およびＰＣ−３（直行斜線棒）に対するカンスタチンの種々の濃度の作用を示すヒストグラムである。ＯＤ６５５における吸光度はｙ軸に示す。「０．１％」は０．１％ＦＣＳ処置（未刺激）対照を示し、「１０％」は１０％ＦＣＳ（刺激）対照である。棒は６５５ｎｍにおける相対吸光度の平均±処置濃度当たり８ウェルの標準誤差を示す。
【０２６４】
１０％血清刺激内皮細胞の用量依存的抑制が、約０．５μｇ／ｍｌのＥＤ５０で検出された（図１３Ａおよび１３Ｃ）。カンスタチン用量４０ｍｇ／ｍｌまででは、腎癌細胞（７８６−Ｏ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）またはヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）の増殖に対しては有意な作用は観察されなかった（図１３Ｂおよび１３Ｄ）。この内皮細胞の特異性は、カンスタチンが特に効果的な抗血管形成剤であることを示している。
【０２６５】
実施例１７：カンスタチンは内皮細胞の遊走を抑制する
血管形成の過程において、内皮細胞は増殖するだけではなく遊走する。従って、内皮細胞の遊走に対するカンスタチンの作用を評価した。ＦＢＳ誘導化学走性に対するカンスタチンおよびエンドスタチンの抑制作用は、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対し、ボイデンチャンバー試験（Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ａｓｓａｙ）（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて試験した。ＨＵＶＥＣ細胞を一晩、１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌＤｉｌＣ１８（３）リビング蛍光染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を含有するＭ１９９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｏｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｅｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）培地中に増殖させた。トリプシン処理、洗浄および０．５％ＦＢＳ含有Ｍ１９９中に細胞を希釈した後、カンスタチン（０．０１または１．００ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、６０，０００個の細胞を上側のチャンバーのウェルに播種した。２％ＦＢＳを含有するＭ１９９培地を化学走性物質として下側のチャンバーに入れた。細胞含有コンパートメントは、孔径８μｍのポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて化学走性物質から分離した。チャンバーを３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で４．５時間インキュベートした。非遊走細胞を廃棄し、上側のウェルをＰＢＳで洗浄した後、フィルターをプラスチック刃で掻き取り、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定し、そしてスライドガラス上においた。蛍光高倍率視野を用いて、画像処理ソフトウエアＰＭＩＳ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）により操作されたデジタルＳｅｎＳｙｓＴＭカメラにより、数種の独立した均質な画像を記録した細胞を、ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ６．０ソフトウエアプログラム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて計数した（Ｋｌｅｍｋｅ，Ｒ．Ｌ．ら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：８５９−６６）。
【０２６６】
結果は図１４に示すとおりであり、これはＶＥＧＦなし（ＶＥＧＦまたは血清なし）、およびＶＥＧＦ（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ）細胞の処置について、そして、０．０１カンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌカンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌカンスタチン）の処置について、一視野当たりの遊走内皮細胞数（ｙ軸）を示す棒グラフである。
【０２６７】
カンスタチンはＨＵＶＥＣの遊走を抑制し、１０ｎｇ／ｍｌにおいて有意な作用が観察された。内皮細胞の増殖および遊走の双方を抑制するカンスタチンの能力は、それが血管形成の１より多くの工程において作用していることを示唆している。あるいは、カンスタチンは、増殖および遊走の両方に影響を及ぼしうる刺激内皮細胞に対するアポトーシスシグナルとして機能している可能性がある。アポトーシスの誘導は、アンジオスタチンおよび他の抗血管形成分子において報告されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−２８；Ｌｕｃａｓ，Ｒ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９２：４７３０−４１）。
【０２６８】
実施例１８：カンスタチンは内皮管腔形成を抑制する
カンスタチンの抗血管形成能力の第１の試験として、肉腫腫瘍から誘導したマウス基底膜タンパク質の固体ゲルであるマトリゲルにおける、内皮細胞による管腔形成を妨害する能力について評価した。マウス大動脈内皮細胞をマトリゲル上で増殖させると、それらは急速に整列し、中空の管様の構造を形成する（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。
【０２６９】
マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）（３２０ｍｌ）を２４穴プレートの各ウェルに添加し、重合体化させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，上記）。抗生物質を含有しないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中の２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）の懸濁液をマトリゲルコーティングした各ウェルに移した。細胞は、漸増濃度のカンスタチン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳまたはα５−ＮＣ１で処置した。全試験とも３組で行った。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（３．３対眼、１０×対物）で観察した。次に細胞を４００ＤＫコーティングＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）で撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ  固定剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で染色し、再度撮影した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。視野を観察し、管腔を計数して平均した。
【０２７０】
結果は図１５に示すとおりであり、これは、ＢＳＡ（□）、カンスタチン（■）およびα５ＮＣ１（○）の種々の処置の下での対照（ＰＢＳ処置ウェル）の管腔形成のパーセントとして、管腔形成の量（ｙ軸）を示すグラフである。垂直の棒は平均の標準誤差を示す。この結果によれば、カンスタチンは対照と比較して内皮管腔形成を大きく低減した。
【０２７１】
２９３細胞内に生成したカンスタチンは、用量依存的な態様で内皮管腔形成を選択的に抑制し、カンスタチンタンパク質の１ｍｇ添加によりほぼ完全な管形成抑制が観察された（図１５）。対照タンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＩＶ型コラーゲンα５鎖のＮＣ１ドメインのいずれも内皮管腔形成に対する作用を有さず、この試験におけるカンスタチンの抑制作用はカンスタチンに特有であり、添加したタンパク質含量によるものではないことを示している。これらの結果は、カンスタチンが抗血管形成剤であることを示している。
【０２７２】
実施例１９：ＥＲＫ活性化に対するカンスタチンの作用
カンスタチンの抗増殖および抗遊走活性に関与する分子機序を更に理解するために、２０％ウシ胎児血清および内皮有糸分裂促進物質により誘導されたＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）活性化に対するカンスタチンの作用を調べた。ＨＵＶＥＣ細胞を２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌヘパリンおよび５０μｇ／ｍｌ内皮有糸分裂促進物質（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を添加したマッコイ培地中で一晩培養した。翌日細胞を洗浄し、低血清培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌヘパリンおよび５％ＦＢＳを添加したマッコイ培地）中で４時間増殖させた。４時間後、培地を２０μｇ／ｍｌカンスタチン添加または無添加の新しい低血清培地と交換した。１時間後、血清濃度を２０％に調節し、内皮有糸分裂促進物質を終濃度５０μｇ／ｍｌで添加した。０、５、１０、２５および４０分の時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、受動的細胞溶解ミックス（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｍｉｘ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）＋ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ＮａＦ、Ｎａ３ＶＯ４、β−グリセロホスフェートおよびピロリン酸ナトリウムを用いて細胞溶解した。溶解物のタンパク質濃度を定量化し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。リン酸化ＥＲＫのウエスタンブロットは、血清処置および血清＋カンスタチン処置のＨＵＶＥＣについて、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＨＵＶＥＣにおけるＥＲＫリン酸化は、増殖因子刺激後５分以内に顕著になった。カンスタチン２０μｇ／ｍｌの処置によりＥＲＫの早期活性化は変化しなかった。ＥＲＫリン酸化の低下がより遅い時点で観察され、これは数種の有糸分裂促進物質について観察された結果と合致した特徴であった（Ｇｕｐｔａ，Ｋ．ら，１９９９，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２４７：４９５−５０４；Ｐｅｄｒａｍ，Ａ．ら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６７２２−８）。これらの観察結果は、カンスタチンがＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ受容体により活性化される近傍の事象を抑制することにより主に機能するわけではないことを示している。
【０２７３】
実施例２０：カンスタチンは内皮細胞においてアポトーシスを誘導する
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識。カンスタチンの作用の潜在的様式としてアポトーシスを確立するために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて、外在化したホスファチジルセリン（ＰＳ）を標識し、アポトーシス細胞を調べた。０．５×１０６個のＣ−ＰＡＥ細胞、ＰＣ−３、７８６−ＯおよびＨＥＫ２９３細胞を一晩、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）中で６穴の組織培養プレートの各ウェルに添加した。翌日、新鮮培地を４０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦα（陽性対照）または１５μｇ／ｍｌカンスタチンと共に全ウェルに添加した。対照ウェルには等容量のＰＢＳを添加した。２４時間投与の後、脱着した細胞を含む培地を収集し、接着細胞をトリプシン処理し、脱着細胞とあわせ、３０００×ｇで遠心分離した。細胞を洗浄し、そしてホスファチジルセリン外在化（早期のアポトーシスの指標）を、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて製造元の指示通り標識することにより測定した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識細胞をＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｔｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて計数した。各処置につき１５，０００個の細胞を計数し、リストモード（ｌｉｓｔｍｏｄｅ）で保存した。次に、このデータを標準Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０２７４】
カンスタチンは内皮細胞のアポトーシスを特異的に誘導することが分かり、ＰＣ−３、７８６−ＯまたはＨＥＫ２９３細胞系統に有意な作用は観察されなかった。
【０２７５】
ＦＬＩＰタンパク質濃度。ＨＵＶＥＣ細胞を上記のＥＲＫ試験の場合と同様に処理し、０、１、３、６および２４時間の時点で採取した。血清処置ＨＵＶＥＣ細胞および血清＋カンスタチン処置ＨＵＶＥＣ細胞におけるＦＬＩＰタンパク質濃度を、抗−ＦＬＩＰ抗体（Ｓａｔａ，Ｍ．ら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３３１０３−６）を用いて定量し、そしてビンキュリンの濃度を用いてタンパク質の担持量について規格化し、そして０時間の時点のパーセントとしてプロットした。
【０２７６】
結果は図１６に示すとおりであり、これは、経時的（ｘ軸）にｔ＝０において存在したタンパク質のパーセントとしてのビンキュリン濃度の関数としてのＦＬＩＰタンパク質濃度（ｙ軸）のグラフである。カンスタチン処置後１時間においてＦＬＩＰタンパク質濃度の低減が認められ、血清刺激後２４時間まで持続し、カンスタチンのアポトーシス作用がＦａｓ活性化アポトーシス阻害因子ＦＬＩＰにより媒介されている可能性があることを示していた。内皮細胞はＦａｓおよびＦａｓＬの両方を構成的に発現するため（Ｓａｔａ，Ｍ．ら，上記）、ＦＬＩＰのこの低下がカスパーゼ活性化を誘発し、末端アポトーシスシグナルを供給すると考えられる。
【０２７７】
実施例２１：カンスタチンはインビボで腫瘍増殖を抑制する
ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）を培養物から採取し、滅菌ＰＢＳ中２００万個の細胞を７〜９週齢の雄性ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍を約４週間増殖させた後、動物を４匹の群に分割した。実験群には、ＰＢＳ  ０．１ｍｌの総容量中１０ｍｇ／ｍｌの用量でカンスタチンを毎日腹腔内注射した。対照には毎日等容量のＰＢＳを投与した。投与開始時（第０日）に、腫瘍の大きさは対照マウスで８８ｍｍ３〜１３５ｍｍ３であり、カンスタチン処置マウスで１０８ｍｍ３〜１４９ｍｍ３であった。各群はマウス５匹とした。所定日における計算された腫瘍容量を処置第１日の容量で割り、分数値の腫瘍容量（Ｖ／Ｖ０）を求めた。結果は図１７Ａに示すとおりであり、これは投与日（ｘ軸）にわたりプロットした分数値腫瘍容量（ｙ軸）±標準誤差を示すグラフである。カンスタチン処置（■）腫瘍は、対照（□）と比較して僅かにのみ増大した。
【０２７８】
第２のＰＣ−３実験においては、ＰＣ−３細胞を培養物から採取し、３００万個の細胞を７〜９週齢の無胸腺ヌードマウスに注射し、そして腫瘍を約２週間増殖させた後、動物を４匹の群に分割した。実験群（４匹）には、ＰＢＳ  ０．２ｍｌの総容量中３ｍｇ／ｍｌの用量でカンスタチン、または同じ容量のＰＢＳ中８ｍｇ／ｍｌの用量でエンドスタチンを毎日腹腔内注射した。対照（４匹）には毎日等容量のＰＢＳを投与した。腫瘍の長さおよび幅をバーニヤカリパス（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて測定し、腫瘍容量を標準的な式：長さ×幅２×０．５２を用いて計算した。腫瘍の容量は２６ｍｍ３〜７３ｍｍ３であり、所定日における計算された腫瘍容量を処置第１日の容量で割り、分数値の腫瘍容量（Ｖ／Ｖ０）を上記と同様に求めた。結果は図１７Ｂに示すとおりであり、これは、投与日（ｘ軸）にわたりプロットした分数値腫瘍容量（ｙ軸）±標準誤差を示すグラフである。対照（□）と比較して、カンスタチン投与（■）腫瘍は僅かにのみ増大し、結果はエンドスタチン（○）で得られたものと同等であった。
【０２７９】
腎細胞癌の細胞モデルについては、２００万個の７８６−Ｏ細胞を７〜９週齢の無胸腺ヌードマウスに注射した。腫瘍を約１００ｍｍ３または約７００ｍｍ３となるまで増殖させた。各群６匹とした。対照には同じ容量のＰＢＳを与えた。結果は図１７Ｃ（１００ｍｍ３腫瘍）および１７Ｄ（７００ｍｍ３腫瘍）に示す。両方の群において、カンスタチン投与（■）腫瘍は対照（□）と比較して実際に収縮していた。
【０２８０】
大腸菌中に生成したカンスタチンは、プラセボ処置マウスと比較して、小型（１００ｍｍ３、図１７Ｃ）および大型（７００ｍｍ３、図１７Ｄ）の腎細胞癌（７８６−Ｏ）の腫瘍の増殖を、それぞれ４倍および３倍抑制した。重症免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて樹立されたヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍について、１０ｍｇ／ｋｇのカンスタチンは、ベヒクルのみ注射したマウスの５５％（１．８倍低値）までに分数値腫瘍容量を維持した。無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおいては、処置腫瘍は、プラセボ処置マウスより２．４倍低値であった。腫瘍の大きさの低下はＣＤ−３１陽性血管形成における低下と合致していた（後述する実施例２９参照）。無胸腺マウスにおいては、カンスタチンおよびエンドスタチンの両方ともより低用量を用いたが、カンスタチン３ｍｇ／ｋｇはエンドスタチン８ｍｇ／ｋｇと同じ抑制作用を有し、エンドスタチン５ｍｇ／ｋｇの用量は腫瘍の増殖を抑制できなかった。すべてのインビボの試験において、マウスは外見上は健康であり、消耗の兆候はなく、処置中に死亡したマウスもなかった。
【０２８１】
実施例２２：カンスタチン処置マウスに対するＣＤ３１免疫組織化学
インビボの腫瘍の大きさの減少は、これらの腫瘍の血管形成に対する抑制的作用を示唆している。異種移植片腫瘍試験の終了時に、マウスを屠殺し、腫瘍を摘出した。腫瘍血管を検出するために、抗ＣＤ３１抗体アルカリホスファターゼコンジュゲート免疫細胞化学実験をパラフィン包埋腫瘍切片について行った。摘出した腫瘍をメスで切開して約３〜４ｍｍの厚みの数片に分け、次に２４時間４％パラホルムアルデヒド中に固定した。次に組織をＰＢＳに移して２４時間保持し、その後脱水し、パラフィン包埋した。パラフィン包埋の後、３ｍｍの組織切片を切り出して搭載した。切片を脱パラフィンし、再水和し、そして３００ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を３７℃で５分間、予備処置した。１００％エタノールを添加して消化を停止した。切片を風乾し、再水和し、そして１０％ウサギ血清でブロッキングした。次に、スライドを１：５０希釈度のラット抗マウスＣＤ−３１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）と共に一晩４℃でインキュベートし、その後、各々１：５０希釈度のウサギ抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）およびラットＡＰＡＡＰ（ＤＡＫＯ）中、３７℃で３０分間連続２回のインキュベートを行った。着色反応は新しいフクシンを用いて行った。切片はヘマトキシリンで対比染色した。
【０２８２】
カンスタチン処置腫瘍の腫瘍の大きさの低下は、ＣＤ３１陽性血管形成の低下と合致していることが分かった。
【０２８３】
実施例２３：大腸菌におけるツムスタチンおよびツムスタチン突然変異体の組換え生成
ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα３鎖に関するヌクレオチド（配列番号９）およびアミノ酸（配列番号１０）の配列を、図１８Ａおよび１８Ｂにそれぞれ示す。ツムスタチンをコードする配列をα３ＮＣ１（ＩＶ）／ｐＤＳベクターからＰＣＲにより増幅（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９２９９３（Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，Ｓ．ら，１９９４），Ｍ８１３７９（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．ら，１９９４）およびＸ８００３１（Ｌｅｉｏｎｉｎ，Ａ．Ｋ．およびＭａｒｉｙａｍａ，Ｍ．ら，１９９８））し、その際、フォワードプライマーとして５’−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＣＧＴ−３’（配列番号１１）およびリバースプライマーとして５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＴ−３’（配列番号１２）を用いた。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、予備消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションした（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）。このコンストラクトを図１９に示す。このライゲーションは、ツムスタチンをｐｅｌＢリーダー配列の下流に、そしてそれとインフレームに位置させ、これにより可溶性タンパク質の原形質周囲の局在化および発現が可能となった。別のベクター配列をアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号１３）をコードするタンパク質に付加した。配列の３’末端をポリヒスチジンタグ配列にインフレームにライゲーションした。ｃＤＮＡの３’末端およびｈｉｓ−ｔａｇの間の別のベクター配列は、アミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号１４）をコードしていた。陽性クローンを両鎖について配列決定した。ツムスタチンをコードするプラスミドコンストラクトを、まず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に形質転換し、次に発現のためにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に形質転換した。一晩培養した細菌培養物を用いて、ＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）５００ｍｌ培養物に接種した。この培養物を、細胞のＯＤ６００が０．６に達するまで約４時間増殖させた。次に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。２時間の誘導の後、５０００×ｇで遠心分離することにより細胞を採取し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、３０分間１２，０００×ｇで遠心分離した。上澄み画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に４〜６回、２ｍｌ／分の速度で通過させた。非特異的結合タンパク質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１０ｍＭおよび２０ｍＭのイミダゾールで洗浄することにより除去した。ツムスタチンタンパク質を８Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の漸増濃度のイミダゾール（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）を用いてカラムから溶離させた。溶離したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析の間、総タンパク質のうちの一部が析出した。透析したタンパク質を収集し、約３５００×ｇで遠心分離し、不溶性（ペレット）および可溶性（上澄み）の画分に分離した。
【０２８４】
大腸菌発現ツムスタチンは主に可溶性タンパク質として単離され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば３１ｋＤａにおける単量体バンドであった。別の３ｋＤａがポリリンカーおよびヒスチジンタグから生じていた。このバンドを含む溶離した画分を後の実験に用いた。各画分のタンパク質濃度はＢＣＡ試験（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、走査密度計を用いて測定した。還元条件下、非還元条件下においてツムスタチンの２量体を示していた約６０ｋＤａのバンドは、３１ｋＤａの単一のバンドに分解された。タンパク質の総収量はリットル当たり約５ｍｇであった。
【０２８５】
５３Ｎ末端アミノ酸を欠失した組換えトランケーションされたツムスタチン（ツムスタチン−Ｎ５３）を大腸菌中で生成し、前述したとおり精製して別の突然変異体を得た（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）。この突然変異体は図２０に示すとおりであり、これは、α３（ＩＶ）ＮＣ１単量体内のトランケーションされたアミノ酸の位置を示す複合的ダイアグラムである。黒丸は、「ツムスタチン−Ｎ５３」を生成するためにツムスタチンから欠失させたＮ末端アミノ酸残基に相当する（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）。短い棒でマークしたジスルフィド結合が、α１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１中に存在するとおり配列している（Ｓｉｅｂｏｌｄ，Ｂ．ら，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：６１７−２４）。明確化するために、２つの可能なジスルフィド配置のうちの一方のみを示す。
【０２８６】
ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１に対して作成したウサギ抗体は、以前に報告されている通り調製した（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０−８）。モノクローナルラット抗マウスＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子、ＰＥＣＡＭ−１）抗体を（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２８７】
上記の通り得られた濃縮上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、以前に報告されている通り（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）、ツムスタチン発現に関してイムノブロッティングした。一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１２％分離ゲルおよび不連続緩衝系を用いて実施した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、室温で３０分間２％ＢＳＡでブロッキングした。残存する結合部位をブロッキングした後、膜を洗浄緩衝液で十分洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中１：１０００の希釈度で一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションは振とう器で一晩、室温で行った。次にブロットを洗浄緩衝液で十分洗浄し、振とう器を用いて室温で３時間、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートした。ブロットを再度十分洗浄し、そして基質（０．０１％塩化コバルトおよびニッケルアンモニウムを含有する０．０５Ｍリン酸塩緩衝液中のジアミノベンジジン）を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、基質溶液を注ぎ出し、過酸化水素を含有する基質緩衝液を添加した。バンドを展開した後、蒸留水で反応を停止し、ブロットを乾燥させた。３１ｋＤａの単一のバンドが観察された。
【０２８８】
実施例２４：２９３胚性腎細胞におけるツムスタチンの発現
ヒトツムスタチンもまた、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞ベクターを用いて、２９３胚性腎細胞中の分泌可溶性タンパク質として生成した。この組換えタンパク質（精製または検出のタグを有さない）はアフィニティークロマトグラフィーで単離し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析により、主ピークとして純粋な単量体型が検出された。
【０２８９】
α３（ＩＶ）ＮＣ１（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４０２−５）を含有するｐＤＳプラスミドを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）内にインフレームにリーダーシグナル配列が付加されるような方法で、ツムスタチンをＰＣＲ増幅した。完全長α３（ＩＶ）の５’末端からのリーダー配列をＮＣ１ドメインにクローニングすることにより、培地中へのタンパク質の分泌を可能とした。ツムスタチン含有組換えベクターは、フランキングプライマーを用いて両方の鎖に対し配列決定した。エラーなしのｃＤＮＡクローンを更に精製し、タンパク質の発現を確認するためのインビトロの翻訳試験に用いた。ツムスタチン含有プラスミドおよび対照のプラスミドを用いて、塩化カルシウム法により２９３細胞をトランスフェクトした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，ｐｐｓ．１６．３２−１６．４０）。トランスフェクトされたクローンをゲネチシン抗生物質処理により選択した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）。細胞死が観察されなくなるまで、抗生物質の存在下、３週間細胞を継代した。次にクローンをＴ−２２５フラスコに植え替え、コンフルエントになるまで増殖させた。次に上澄みを収集し、アミコンの濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて濃縮した。濃縮した上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよびＥＬＩＳＡで分析してツムスタチンの発現を調べた。上澄みにおける強力な結合がＥＬＩＳＡにより検出された。
【０２９０】
ツムスタチン含有上澄みをアフィニティークロマトグラフィーに付し、抗ツムスタチンおよび抗−６−ヒスチジンタグ抗体の双方を用いて免疫検出した（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，  １９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５３１８−２４）。ツムスタチン抗体に対して免疫反応性の約３１ｋＤａの単量体を含む主ピークが同定された。
【０２９１】
実施例２５：ツムスタチンは内皮細胞の増殖を抑制する
Ｃ−ＰＡＥ細胞に対するツムスタチンの抗増殖作用を大腸菌産生可溶性タンパク質を用いた３Ｈ−チミジン取り込みにより調べた。
【０２９２】
細胞系統および培養。７８６−Ｏ（腎明細胞癌系統）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌細胞系統）、Ｃ−ＰＡＥ（ウシ肺動脈内皮細胞系統）、ＨＰＥ（ヒト一次前立腺内皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＭＡＥ（マウス大動脈内皮細胞系統）をすべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。７８６−ＯおよびＣ−ＰＡＥの細胞系統は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）中に、ＨＰＥ細胞は、ウシ下垂体抽出液および組換えヒトＥＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を添加したケラチノサイト−ＳＦＭに、そしてＨＵＶＥＣおよびＭＡＥ細胞は、ＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中に維持した。
【０２９３】
増殖試験。  Ｃ−ＰＡＥ細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中でコンフルエントとなるまで増殖させ、４８時間接触抑制させ続けた。Ｃ−ＰＡＥ細胞は第２および第４継代の間で使用した。７８６−ＯおよびＰＣ−３細胞は、本実験では非内皮細胞対照として使用した。５分間、３７℃でトリプシン処理（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）することにより細胞を回収した。０．１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１２，５００個の細胞の懸濁液を、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした２４穴のプレートの各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ２および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を除去し、２０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭと交換した。未刺激の対照は０．１％ＦＣＳと共にインキュベートした。細胞を０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度のツムスタチンで処理した。全ウェルに対し、投与開始１２時間後に３Ｈ−チミジン１μキュリーを添加した。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。細胞を１Ｎ  ＮａＯＨで抽出し、ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ  ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）溶液を４ｍｌ含有するシンチレーションバイアルに添加した。チミジンの取り込みはシンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０２９４】
メチレンブルー染色試験においては、７０００個の細胞を９６穴プレートの各ウェルに入れ、上記の通り処置した。次に細胞をＯｌｉｖｅｒら（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９２：５１３−８）の方法を用いて計数した。４８時間後、全ウェルとも１００μｌのＰＢＳで洗浄し、細胞を中性緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）中１０％ホルマリンで固定した。次に細胞を０．０１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．５中１％メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。ウェルを０．０１Ｍホウ酸塩緩衝液で洗浄し、メチレンブルーを０．１Ｎ  ＨＣｌ／エタノールで細胞から抽出し、そして６５５ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて吸光度を測定した。終濃度５μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を用いてエンドトキシンを不活性化した（Ｌｉｕ，Ｓ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：４５５−６３）。
【０２９５】
結果は図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃに示すとおりであり、これらは、種々のツムスタチン（ｘ軸）を投与した場合のＣ−ＰＡＥ細胞（図２１Ａ）、ＰＣ−３細胞（図２１Ｂ）および７８６−Ｏ細胞（図２１Ｃ）に関する３Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示すヒストグラムである。全群とも３組の試料の結果である。ツムスタチンは、用量依存的な態様で２０％ＦＣＳ刺激３Ｈ−チミジン取り込みを著しく抑制し、ＥＤ５０は約０．０１ｍｇ／ｍｌであった（図２１Ａ）。また、２０ｍｇ／ｍｌまでのツムスタチン用量においてさえも、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）または腎癌細胞（７８６−Ｏ）では有意な抗増殖作用は観察されなかった（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。ツムスタチン処置（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）群および対照における３Ｈ−チミジン取り込みの平均値の間の差は有意であった（ｐ＜０．０５）。ＰＣ−３細胞または７８６−Ｏ細胞をツムスタチンで処置した場合、抑制作用は観察されなかった（図２１Ｂ、２１Ｃ）。それぞれの棒は３組のウェルの平均±ＳＥを示す。この実験は３回反復した。アスタリスクを付した棒は、片側スチューデントｔ検定においてｐ＜０．０５であり、有意なものであった。
【０２９６】
実施例２６：競合増殖試験
Ｃ−ＰＡＥ細胞は、内皮細胞増殖試験に関して上記の通り、９６穴プレート内にプレーティングした。終濃度０．１μｇ／ｍｌのツムスタチンを室温で３０分間、ヒトαｖβ３タンパク質（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の種々の濃度（０、０．００８、０．０８、０．８、１．６および２．４μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。次にこの混合物をウェルに添加し、４８時間インキュベートした。次に内皮細胞増殖試験に関して上記の通り、メチレンブルー染色試験を用いて増殖試験を行った。
【０２９７】
結果は図２２に示すとおりであり、これは、Ｃ−ＰＡＥ細胞による染料の取り込みに対する漸増量のαｖβ３と組み合わせた０．１μｇ／ｍｌのツムスタチンの作用をｘ軸に示すヒストグラムである。ＯＤ６５５の吸光度はｙ軸に示す。「０．１％ＦＣＳ」は０．１％ＦＣＳ処置（未刺激）対照を、そして「２０％ＦＣＳ」は２０％ＦＣＳ処置（刺激）対照を示す。残りの棒は、αｖβ３単独の対照、およびツムスタチン＋漸増量のαｖβ３の処置を示す。各棒は、３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。実験は３回反復した。アスタリスクは片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５を示す。
【０２９８】
上記の通り、ツムスタチンは通常は用量依存性の態様で細胞の増殖を抑制する。しかしながら、αｖβ３インテグリンタンパク質を添加すると、ツムスタチンの抗増殖作用はαｖβ３タンパク質の漸増濃度に用量依存的な態様で逆転し、内皮細胞増殖を抑制するために使用可能なツムスタチンをαｖβ３インテグリンタンパク質が効果的に「飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）」させていることが示された。２．４μｇ／ｍｌ（３倍モル過剰）のαｖβ３は４３．１％までツムスタチン誘導抗増殖作用を著しく逆転させた。αｖβ３単独の処置では内皮細胞増殖の抑制は起こらなかった。
【０２９９】
実施例２７：ツムスタチンは内皮細胞のアポトーシスを誘導する
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ試験。アポトーシスの早期の段階においては、細胞膜の内表面から外部への膜リン脂質ＰＳの転移が観察される（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌａｎｄ，Ｍ．ら，１９９８，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３１：  １−９；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．ら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：５２５−３１；Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｇ．ら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４１５−２０）。外在化したＰＳは、ＰＳに対する天然の高い結合親和性を有するアネキシンＶのＦＩＴＣコンジュゲートによる染色により検出することができる（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌａｎｄ、上記）。従って、ツムスタチン処置による内皮細胞のアポトーシスは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識を用いて評価した。
【０３００】
Ｃ−ＰＡＥ細胞（ウェル当たり０．５×１０６）を１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中６穴プレートに播種した。翌日、１０％ＦＣＳを含有する新しい培地を８０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陽性対照）または０．０２〜２０μｇ／ｍｌの範囲のツムスタチンと共に添加した。対照ウェルには等容量のＰＢＳを添加した。１８時間投与の後、浮遊した細胞を含む培地を収集し、接着細胞をトリプシン処理し、浮遊細胞とあわせて３０００×ｇで遠心分離した。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、そして結合緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中に再懸濁した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を終濃度１５０ｎｇ／ｍｌで添加し、細胞を１０分間暗所でインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で再度洗浄し、結合緩衝液中に再懸濁した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識細胞をＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｔｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて計数した。各処置につき、１５，０００個の細胞を計数し、リストモードで保存した。次にこのデータを標準Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０３０１】
２０μｇ／ｍｌのツムスタチンは、１８時間後にアネキシン蛍光ピークの顕著なシフトを示した。蛍光強度のシフトは、２０μｇ／ｍｌのツムスタチンと陽性対照ＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ）で同様であった。２μｇ／ｍｌのツムスタチンはまた、アネキシン蛍光強度の穏やかなシフトを示したが、０．２μｇ／ｍｌ未満の濃度はアネキシンＶ陽性を示さなかった。このピーク強度のシフトは、非内皮細胞（ＰＣ−３）を使用した場合には観察されなかった。
【０３０２】
ツムスタチンはまた、位相差顕微鏡によりモニタリングしたところ、Ｃ−ＰＡＥ細胞の細胞形態を改変した。フィブロネクチンコーティングプレート上で２４時間、１０％ＦＣＳの存在下、ツムスタチン２０μｇ／ｍｌを細胞に投与した後、アポトーシス細胞の典型的な形態学的特徴である、膜の泡状化、原形質の萎縮および染色質の凝縮が観察された。対照ウェルにおいては、細胞は未損傷の形態を示していた。
【０３０３】
カスパーゼ−３試験。カスパーゼ−３（ＣＰＰ３２）は、アポトーシスの早期の段階で活性化される細胞内プロテアーゼであり、構造およびＤＮＡ修復のタンパク質を分解することにより細胞の崩壊を開始させる（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．ら，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１９５７−６４；Ｓａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ９１：４４３−６）。カスパーゼ−３のプロテアーゼ活性は、標識された基質から分離した発色団（ｐ−ニトロアニリド）の検出により分光光度計を用いて測定した（ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）。
【０３０４】
Ｃ−ＰＡＥまたはＰＣ−３細胞（ウェル当たり０．５×１０６）を１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中、フィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）で予備コーティングした６穴プレートに入れ、一晩インキュベートした。翌日、２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭと交換し、３７℃で一晩インキュベートした。次に細胞を、２％ＦＣＳを添加してＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ、陽性対照）またはツムスタチン（１０μｇ／ｍｌ）をも含有するＤＭＥＭ中のｂＦＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、そして２４時間インキュベートした。対照細胞はＰＢＳ緩衝液で処置した。２４時間後、上澄みの細胞を収集し、接着細胞をトリプシン処理し、上澄み細胞と合わせた。細胞を計数し、細胞溶解緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中に４×１０７個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。プロトコルのその他の部分は製造元の指示に従った（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。カスパーゼ−３の特異的阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）を用いて、試験の特異性を確認した。吸光度は、４０５ｎｍにおいてマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて測定した。試験は各細胞型につき３回反復した。
【０３０５】
結果は図２３Ａおよび２３Ｂに示すとおりであり、これは種々の処置（ｘ軸）の下でのＣ−ＰＡＥ細胞（図２３Ａ）およびＰＣ−３細胞（図２３Ｂ）に関するＯＤ４０５における吸光度の関数としてのカスパーゼ３活性の量（ｙ軸）を示す一組のヒストグラムである。それぞれの棒は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。
【０３０６】
２０μｇ／ｍｌのツムスタチンで処置したＣ−ＰＡＥ細胞はカスパーゼ−３活性の１．６倍増強を示したのに対し、陽性対照のＴＮＦ−αは対照と比較して同等（１．７倍）の増強をもたらした。カスパーゼ−３の特異的阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋはプロテアーゼ活性を基線まで低下させ、測定された活性の増強はカスパーゼ−３に特異的であったことを示していた。非内皮細胞ＰＣ−３においては、対照とツムスタチン処置細胞との間にはカスパーゼ−３の活性に差はなかった。
【０３０７】
実施例２８：細胞接着試験
インテグリンサブユニットα１〜α６、β１およびαｖβ３インテグリンのブロッキング抗体の存在下における、ツムスタチンコーティングプレートへのＨＵＶＥＣの接着を試験した。本試験は、Ｓｅｎｇｅｒら（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３６１２−７）の方法に従って、僅かな変更を加えながら行った。９６穴プレートを３７℃で一晩、１０μｇ／ｍｌの濃度のヒトツムスタチン、マウスラミニン−１、またはヒトＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）のいずれかでコーティングした。次に０．５μｇ／ｍｌの濃度のビトロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いてプレートをコーティングした。残りのタンパク質結合部位は、２時間ＰＢＳ中ＢＳＡ１００μｇ／ｍｌでブロッキングした（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）。ＨＵＶＥＣ細胞をＥＧＭ−２培地中サブコンフルエント（７０〜８０％）となるまで増殖させ、穏やかにトリプシン処理し、血清非含有の培地中に再懸濁した（１．５×１０5個細胞／ｍｌ）。細胞を１０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１（対照）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｏｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｅｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）または抗体（ヒトβ１インテグリンへのマウスモノクローナル抗体（クローンＰ４Ｃ１０）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｏｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｅｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）；ヒトインテグリンα１〜α６に対するモノクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）；αｖβ３インテグリン（クローンＬＭ６０９）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のいずれかと混合し、室温で穏やかに振とうしながら１５分インキュベートした。次に１００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。未結合の細胞を洗浄除去し、メチレンブルー染色の後に結合細胞数を計数した。Ｃ−ＰＡＥ細胞は，上記の操作の後に分離実験に用いた。
【０３０８】
結果を図２４Ａ〜２４Ｄおよび図２５に示す。図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄは、インテグリンサブユニットα１〜α６、β１またはαｖβ３インテグリンブロッキング抗体の存在下におけるツムスタチン（図２４Ａ）、または対照であるＩＶ型コラーゲン（図２４Ｂ）、ビトロネクチン（図２４Ｃ）およびラミニン−１（図２４Ｄ）でコーティングされたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の結合を示す４種のヒストグラムのセットである。図２５は、ツムスタチンコーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合を示すヒストグラムである。プレートのコーティングは各グラフの上部に記載し、インキュベートに使用した抗体は各グラフのｘ軸に示す。ＢＳＡコーティングプレートを陰性対照として使用した。
【０３０９】
ツムスタチンコーティングＨＵＶＥＣ細胞の結合は、ＩｇＧコーティング対照プレートと比較して、抗−α６、抗−β１または抗−αβ３抗体により著しくブロックされた。細胞の結合は抗−β１と抗−αｖβ３抗体を共に使用した場合に更に抑制された。αｖβ３抗体は８０％細胞の結合を抑制し、α６またはβ１抗体は対照のＩｇＧ処置と比較して５４％ブロックした。α５抗体は僅かな抑制（２０％）しか示さなかったが、サブユニットα１〜α４に対する抗体は細胞の結合をブロックしなかった。抗−αｖβ３抗体とβ１抗体を共に使用した場合に、細胞の結合は９１％ブロックされた。
【０３１０】
ＨＵＶＥＣ細胞の代わりにツムスタチンコーティングプレート上でＣ−ＰＡＥ細胞を用いた場合にも、同等の抑制が観察された。ＩＶ型コラーゲン、ビトロネクチンおよびラミニン−１でコーティングされたプレートも対照として使用した。α１β１およびα２β１インテグリンはコラーゲンに結合する（Ｅｌｉｃｅｓ，Ｍ．Ｊ．ら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９９０６−１０；Ｉｇｎａｔｉｕｓ，Ｍ．Ｊ．ら，１９９０，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：７０９−２０）。ＩＶ型コラーゲンコーティングプレートへの細胞の結合は、対照ＩｇＧと共にインキュベートした細胞と比較して、抗体α１（２０％）、α２（２７％）およびβ１（５３％）に対する抗体により部分的に抑制された。αｖβ３インテグリンはビトロネクチンの受容体である（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ  ６９：１１−２５）。ビトロネクチンコーティングプレートへの細胞の結合はαｖβ３抗体により６１％抑制された。α５β１およびα６β１インテグリンはラミニンに結合する（Ｗａｙｎｅｒ，Ｅ．Ａ．ら，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：１８８１−９１；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ａ．ら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：４８７−９）。抗−α５および抗−α６抗体は、それぞれ５０％および８９％、ラミニン−１コーティングプレートへの内皮細胞の結合をブロックした。ツムスタチンコーティングプレートへの細胞の結合（図２５）は、ＩｇＧ処置対照と比較して抗−β１抗体または抗−αｖβ３抗体により著しく抑制された。抗−β１抗体と抗−αｖβ３抗体を共に使用した場合は、細胞の結合は更に抑制された。
【０３１１】
実施例２９：ツムスタチンは内皮管腔形成を抑制する
マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）（３２０ｍｌ）を２４穴プレートの各ウェルに添加し、重合体化させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。抗生物質を含有しないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中の２５，０００個のＭＡＥ細胞の懸濁液をマトリゲルコーティングした各ウェルに移した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。細胞を漸増濃度のツムスタチン、ＢＳＡ、または７Ｓドメインのいずれかで処置した。対照の細胞は滅菌ＰＢＳと共にインキュベートした。全試験とも３組で行った。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（倍率３．３対眼、１０×対物）で観察した。次に細胞を４００ＤＫコーティングＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）で撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で染色し、再度撮影した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。１０個の視野を観察し、実験プロトコルを知らない検査者２人により管の数を計数し、平均した。
【０３１２】
結果は図２６に示すとおりである。マウス大動脈内皮細胞をマウス基底膜タンパク質の固体ゲルであるマトリゲル上で培養した場合、これらは急速に整列し、中空の管様の構造を形成する（Ｈａｒａｌａｂｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｃ．ら．，１９９４、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：５７５−８２）。２９３細胞内で産生されたツムスタチンは、ＢＳＡ対照と比較して用量依存的な態様でＭＡＥ細胞の内皮管腔形成を著しく抑制した（図２６）。タンパク質１ｍｇ／ｍｌの処置後の管腔形成のパーセントは、ＢＳＡ  ９８．０±４．０、ツムスタチン  １４．０±４．０であった。同様の結果が大腸菌産生ツムスタチンを用いた場合にも得られた。ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（Ｎ末端非コラーゲン性ドメイン）は内皮管腔形成に対する作用を有さなかった。ツムスタチンによる最大抑制は、８００〜１０００ｎｇ／ｍｌで得られた。ツムスタチン処置（●、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）および対照（ＢＳＡ（□）、７Ｓドメイン（○））の平均のパーセント値の間の差は有意であった（ｐ＜０．０５）。各点は３組のウェルの平均±ＳＥを示す。この実験は３回反復した。アスタリスクを付したデータポイントは、片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５の有意差を示す。十分に形成された管腔が７Ｓドメイン処置において観察された。０．８ｍｇ／ｍｌツムスタチンで処置したＭＡＥ細胞は、管腔形成の低下を示していた。
【０３１３】
新しい毛細管の形成に対するツムスタチンのインビボの作用を評価するために、マトリゲルプラグ試験を行った（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ，Ａ．ら，１９９２，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−２９）。５〜６週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を入手した。マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を４℃で一晩解凍した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに注射する前に、２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）および１ｍｇ／ｍｌのツムスタチンと混合した。対照は、血管形成阻害因子で処置しなかった。マトリゲル混合物を２１ゲージ針で皮下注射した。１４日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグをはずした。マトリゲルプラグを室温で４時間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）中に固定し、その後２４時間ＰＢＳに切り替えた。プラグをパラフィン包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。切片を光学顕微鏡で観察し、１０高倍率視野から血管数を計数し、平均した。全切片ともコード化し、試験プロトコルを知らない病理学者により観察された。
【０３１４】
マトリックスをｂＦＧＦおよびヘパリンリンの存在下にて、大腸菌産生ツムスタチンの存在下または非存在下においた場合、血管数の６７％低下が１ｍｇ／ｍｌツムスタチン処置で観察された。高倍率視野当たりの血管数は、ツムスタチンで２．２５±１．３２、対照で７．５０±２．１７であった。それぞれの棒は、1群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを示す。ツムスタチン（１ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳ処置した対照と比較してインビボの新血管形成を著しく抑制した。ツムスタチン処置動物と対照動物の平均パーセント値の間の差は有意であった（ｐ＜０．０５）。ツムスタチン処置は、片側スチューデントｔ検定によればｐ＜０．０５で有意であった。
【０３１５】
実施例３０：ツムスタチンおよびツムスタチン突然変異体はインビボで腫瘍増殖を抑制する
５００万個のＰＣ−３細胞を収集し、７〜９週齢の雄性無胸腺ヌードマウスの背部に皮下注射した。腫瘍はバーニヤカリパス（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて測定し、腫瘍容量を標準的な式：幅２×長さ×０．５２を用いて計算した。腫瘍を約１００ｍｍ３まで増殖させ、次に動物を５または６匹の群に分割した。ツムスタチンまたはマウスエンドスタチンは、その該当する実験群に対し、滅菌ＰＢＳ中１０日間毎日（２０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内注射した。対照にはベヒクルを注射した（ＢＳＡまたはＰＢＳ）。腫瘍容量は、１０日間にわたり２または３日おきに計算した。結果は図２７Ａに示すとおりであり、これは、ＰＢＳ対照（□）、２０ｍｇ／ｋｇツムスタチン（●）および２０ｍｇ／ｋｇエンドスタチン（○）について、処置日数（ｘ軸）に対するｍｍ３単位の腫瘍容量（ｙ軸）を示すグラフである。大腸菌中で産生されたツムスタチンは、ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖を著しく抑制した（図２７Ａ）。２０ｍｇ／ｋｇのツムスタチンは、２０ｍｇ／ｋｇのエンドスタチンと同様に腫瘍増殖を抑制した（図２７Ａ）。腫瘍の増殖に対する有意な抑制作用は第１０日に観察された（対照２０２．８±５０．０ｍｍ３、ツムスタチン８２．９±２５．２ｍｍ３、エンドスタチン６８．９±１６．７ｍｍ３）。ツムスタチンまたはエンドスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較した場合、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）腫瘍の増殖を抑制した。本実験は腫瘍容量が１００ｍｍ３未満である場合に開始した。
【０３１６】
マウスにおける別の樹立された原発腫瘍に対するツムスタチンの作用も試験した。２００万個の７８６−Ｏ腎癌細胞を７〜９週齢の雄性無胸腺ヌードマウスの背部に皮下注射した。腫瘍を約６００〜約７００ｍｍ３まで増殖させ、次に動物を６匹の群に分割した。ツムスタチンは、滅菌ＰＢＳ中１０日間毎日（６ｍｇ／ｋｇ）腹腔内注射した。対照にはＢＳＡを注射した。結果は図２７Ｂに示すとおりであり、これは、ＰＢＳ対照（□）および６ｍｇ／ｋｇツムスタチン（●）について、処置日数（ｘ軸）に対するｍｍ３単位の腫瘍容量（ｙ軸）を示すグラフである。大腸菌産生ツムスタチンは、ＢＳＡ対照と比較して、７８６−Ｏヒト腎細胞癌の腫瘍増殖を６ｍｇ／ｋｇにおいて抑制した（図２７Ｂ）。腫瘍の増殖に対する有意な抑制作用は第１０日に観察された（対照１０９６±１７９．７ｍｍ３、ツムスタチン６１９±１２０．７ｍｍ３）。ツムスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較した場合、ヒト腎細胞癌（７８６−Ｏ）の腫瘍増殖を抑制した。本実験は腫瘍容量が６００〜７００ｍｍ３である場合に開始した。各時点は群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを示す。アスタリスクを付したデータポイントは、片側スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０５で有意であった。
【０３１７】
ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン（α３（ＩＶ）ＮＣ１）の部分は、グッドパスチャー症候群の病原性エピトープである（Ｂｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８７４−７７；Ｓａｕｓ，Ｊ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３３７４−８０；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４０１８−２４）。グッドパスチャー症候群は、肺出血および／または急速に進行する糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患である（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．＆Ｆ．Ｄｉｘｏｎ，１９８６，Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ．ｐｐｓ．８００−８９；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｂ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６０３３−６）。これらの症状は、α３（ＩＶ）ＮＣ１に対する自己抗体の結合を介した糸球体および肺胞の基底膜の破壊により起こる（Ｗｉｌｓｏｎ，１９８６，上記；Ｈｕｄｓｏｎ，１９９３，上記）。数グループが、α３（ＩＶ）ＮＣ１上のグッドパスチャー自己抗原の位置をマッピングまたは予測する試みを行っており（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：１１７８−８５；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８；Ｌｅｖｙ，  Ｊ．Ｂ．ら，１９９７，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：１６９８−１７０５；Ｋｅｆａｌｉｄｅｓ，Ｎ．Ａ．ら，１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４３：９４−１００；Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，Ｓ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９７８０−４（正誤表、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７３５８）；Ｂｅｔｚｅｒ，Ｋ．Ｏ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１２６７−７４）、Ｎ末端、Ｃ末端および中間部分の残基がエピトープ位置として報告されている。近年、最も可能性の高い疾患関連の病原性エピトープがＮ末端部分の最初の４０アミノ酸内に同定され（Ｈｅｌｌｍａｒｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５：９３６−４４）、そしてＮ末端４０アミノ酸に更に限定された。病原性グッドパスチャー自己エピトープに相当する、Ｎ末端５３アミノ酸を欠失したトランケーションされたツムスタチンを設計した（ツムスタチン−Ｎ５３）。この突然変異タンパク質を以下の実験において使用した。
【０３１８】
２００万個の７８６−Ｏ腎癌細胞を７〜９週齢の雄性無胸腺ヌードマウスの背部に皮下注射した。腫瘍を約１００〜約１５０ｍｍ３まで増殖させた。次にマウスを５匹の群に分割し、１０日間、５３Ｎ末端アミノ酸を欠失した大腸菌産生トランケーションツムスタチン２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）。対照にはＰＢＳを注射した。結果は図２８に示すとおりであり、これは、対照マウス（□）およびツムスタチン突然変異体Ｎ５３処置マウス（●）について、処置日数（ｘ軸）に対する腫瘍容量の増大（ｙ軸）を示すグラフである。６ｍｇ／ｋｇの大腸菌産生ツムスタチンＮ−５３は、対照と比較して、第４日〜第１０日にわたり７８６−Ｏヒト腎腫瘍の増殖を抑制した（第１０日：ツムスタチンＮ５３は１１０．０±２９．０ｍｍ３、対照は３４５．０±２４．０ｍｍ３）（図２８）。各点は５〜６匹／群のマウスの平均±ＳＥを示す。アスタリスクを付したデータポイントは、片側スチューデントｔ検定により、ｐ＜０．０５で有意であった。
【０３１９】
実施例３１：α３（ＩＶ）ＮＣ１およびＣＤ３１についての免疫組織化学的染色
７週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスから採取した腎および皮膚の組織を、免疫蛍光顕微鏡分析による評価を行うために処理した。組織試料を液体窒素中に凍結し、４ｍｍ厚の切片を使用した。組織は以前に報告されている間接的免疫蛍光法により処理した（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８）。凍結した切片を一次抗体、ポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：１００希釈）またはポリクローナル抗α３（ＩＶ）ＮＣ１抗体（１：５０希釈）、次いで二次抗体、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ラットＩｇＧ抗体またはＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。免疫蛍光は、オリンパス蛍光顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の下で観察した。陰性対照は、非関連性の前免疫血清で一次抗体を置き換えることにより実施した。
【０３２０】
マウス腎において、α３（ＩＶ）ＮＣ１の発現はＧＢＭおよび血管基底膜において観察された。ＣＤ３１、ＰＥＣＡＭ−１の発現は糸球体内皮および血管内皮において観察された。マウス皮膚においては、α３（ＩＶ）ＮＣ１は表皮基底膜および血管基底膜には存在していなかった。ＣＤ３１の発現は皮膚の血管内皮において観察された。ＣＤ３１の発現はマウス腎の糸球体および小血管の内皮において観察された。α３（ＩＶ）ＮＣ１の発現は糸球体基底膜および糸球体外の血管基底膜において観察された。ＣＤ３１の発現はマウス皮膚の皮膚小血管の内皮において観察された。α３（ＩＶ）ＮＣ１の発現は表皮基底膜には存在せず、皮膚小血管の基底膜中にも殆ど観察されなかった。これらの結果は、ツムスタチンの限定された分布の例を示している。
【０３２１】
実施例３２：ツムスタチンＮ−５３は内皮細胞におけるアポトーシスを誘発する
ツムスタチンＮ−５３の前アポトーシス活性をＣ−ＰＡＥ細胞において検討した。細胞の生存性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）試験により調べた（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．ら，１９９８，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５４：１１８８−９６）。本試験は、活動性ミトコンドリア中でテトラゾリウム環を開裂する生存細胞の能力に基づいた、細胞の生存に関する定量的比色分析である。Ｃ−ＰＡＥ細胞（ウェル当たり７０００個）を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中、９６穴プレートにプレーティングした。翌日、ＴＮＦ−α（陽性対照、８０ｎｇ／ｍｌ）または種々の濃度のツムスタチンまたはツムスタチンＮ−５３をウェルに添加し、２４時間インキュベートした。次にＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ；ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を１０μｌ／ウェルの比率でウェルに添加し、４時間３７℃でインキュベートした。酸−イソプロパノールを添加し、十分混合した。吸光度は、５９０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【０３２２】
結果は図２９に示すとおりであり、これは、ツムスタチンおよびツムスタチンＮ−５３の漸増濃度（ｘ軸）における細胞の生存性（ＯＤ５９０の関数として、ｙ軸）を示すグラフである。各点は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。アスタリスクは、片側スチューデントｔ検定においてｐ＜０．０５を示す。
【０３２３】
ツムスタチンＮ−５３は、用量依存的態様で細胞の生存性を低減した。５μｇ／ｍｌにおいては、ツムスタチンＮ−５３は対照と比較して４９．４％細胞の生存性を低減し、この作用は陽性対照として使用したＴＮＦ−α  ８０ｎｇ／ｍｌと同等であった。別の実験において、完全長ツムスタチンは５μｇ／ｍｌで僅か２２．５％、そして１０μｇ／ｍｌで６０％細胞の生存性を低減したのに対し、５μｇ／ｍｌのツムスタチンＮ−５３では４９．４％であった。意外にも、５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのツムスタチンＮ−５３は、完全長のツムスタチンよりも内皮細胞のアポトーシスをより誘導している。
【０３２４】
実施例３３：抗血管形成性タンパク質の突然変異体およびフラグメント
アレステンおよびカンスタチンのフラグメントおよび突然変異体もまた、Ｍａｒｉｙａｍａら（１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２５３−８）のシュードモナスのエラスターゼ消化に従って作成した。消化物はゲル濾過ＨＰＬＣにより分離し、得られたフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、上記の内皮管腔試験において評価した。これらのフラグメントには、アレステンの１２ｋＤａフラグメント、アレステンの８ｋＤａフラグメント、およびカンスタチンの１０ｋＤａフラグメントが包含されていた。更に、ツムスタチンの２つのフラグメント（「３３３」および「３３４」）は、ＰＣＲクローニングにより生成した。
【０３２５】
図３０に示すとおり、上記の通り実施した内皮管腔試験では、２種のアレステンフラグメント（１２ｋＤａ（■）および８ｋＤａ（□））およびカンスタチンフラグメント（１９ｋＤａ（▲））は、アレステン（●）およびカンスタチン（○）よりも大きく内皮管腔形成を抑制した。図３１は、ツムスタチンフラグメント「３３３」（●）および「３３４」（○）が同様にツムスタチン（▲）を超えた性能を示したことを示しており、ここではＢＳＡ（■）およびα６鎖（□）を対照として用いた。
【０３２６】
実施例３４：内皮細胞およびＷＭ−１６４細胞の増殖に対するツムスタチンの作用
内皮細胞増殖は、実施例２５において上述されたように、３Ｈ−チミジン取り込みまたはメチレンブルー染色により調べた。Ｃ−ＰＡＥ細胞（２〜４継代）をコンフルエントにまで増殖させ、４８時間接触抑制させ続けた。７８６−Ｏ、ＰＣ−３およびＷＭ−１６４を非内皮細胞対照として用い、上記実施例２５に記載の通り培養した。ＨＰＥ（ヒト一次前立腺上皮細胞）をウシ下垂体および組換えヒトＥＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を添加したケラチノサイト−ＳＦＭ中で培養した。黒色腫細胞系統ＷＭ−１６４は、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）のＤｒ．Ｍｅｅｎｈａｒｄ  Ｈｅｒｌｙｎから入手し、Ｈｅｒｌｙｎら（１９９０，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：２１３−３４）に記載の通り、７８％ＭＣＤＢ−１５３培地、１０％Ｌ−１５培地、１０％トリプトースリン酸ブロス、２％ＦＢＳおよび５０単位／ｍｌインスリン中で培養した。
【０３２７】
Ｃ−ＰＡＥ、ＰＣ−３および７８６−Ｏ細胞における３Ｈ−チミジン取り込みの結果は、図２１Ａ−Ｃおよび上記実施例２５に記載したとおりである。ＨＰＥ、Ｃ−ＰＡＥおよびＷＭ−１６４細胞のメチレンブルー染色は、図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃに示すとおりであり、これらは、ＨＰＥ（図３２Ａ）、Ｃ−ＰＡＥ（図３２Ｂ）およびＷＭ−１６４（図３２Ｃ）細胞の増殖（ｙ軸）に対するツムスタチン漸増濃度の作用（ｘ軸）を示す、３種のヒストグラムのセットである。結果によれば、ツムスタチンは用量依存的な態様でＣ−ＰＡＥ細胞のＦＣＳ刺激増殖を抑制する（図２１Ａ）。ツムスタチン処置（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）および対照細胞における３Ｈ−チミジン取り込みの平均値の間の差は有意であった（ｐ＜０．０５）。ＰＣ−３（図２１Ｂ）、７８６−Ｏ（図２１Ｃ）、ＨＰＥ（図３２Ａ）およびＷＭ−１６４（図３２Ｃ）は、ツムスタチンによる抑制作用を示さなかった。ポリミキシンＢ（５μｇ／ｍｌ）を添加してエンドトキシンを活性化した場合、ツムスタチンの抑制作用は変化しなかった（図３２Ｂ）。
【０３２８】
興味深いことに、完全長ツムスタチンは、α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのアミノ酸１８５〜２０３によるこれらの細胞の抑制が報告されている（Ｈａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３９５−４０１）にも関わらず、ＷＭ−１６４細胞の増殖に対して作用を有さなかった。このことは、領域１８５〜２０３の抗腫瘍細胞活性が、完全長の折りたたみツムスタチンの部分として存在する場合には利用できないことを示唆している。
【０３２９】
実施例３５：ツムスタチンの突然変異体、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４の組換え生成
α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインは黒色腫およびその他の表皮腫瘍細胞系統にインビトロで結合し増殖を抑制することが分かっている（Ｈａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０３９５−４０１）。Ｈａｎらは、α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのアミノ酸１８５〜２０３に対する黒色腫細胞のための結合部位を特定した。この部位に対して作成したモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、黒色腫細胞の接着および増殖の抑制をブロックする（Ｈａｎら、上記）。Ｈａｎらはまた、黒色腫細胞の接着および増殖の抑制の両方に、アミノ酸１８９〜１９１内に位置する特定の配列「ＳＮＳ」が必要であることを同定した（Ｈａｎら、上記）。これらの試験において、１８５〜２０３  α３（ＩＶ）ＮＣ１合成ペプチドは、内皮細胞を含む他の細胞型に対して試験されていない。更に、Ｈａｎらは、単離したヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインを使用しなかった。
【０３３０】
上述の実施例２３およびＫａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８に記載の通り、４種の組換え欠失突然変異体を作成し精製した。ツムスタチンＮ５３としても知られるＴｕｍ−１は、配列番号１０のＣ末端１９１アミノ酸からなり、Ｎ末端５３アミノ酸を欠失している。Ｔｕｍ−１はまた、上記実施例２３においても説明されている。ツムスタチン３３３は、ツムスタチン（配列番号１０）のＮ末端アミノ酸２〜１２５からなる。Ｔｕｍ−３は、Ｃ末端１１２アミノ酸からなる。Ｔｕｍ−４は、アミノ酸１８５〜２０３を含むＣ末端６４アミノ酸である（Ｈａｎら、上記）。これらの欠失突然変異体は、上記実施例２３に記載の通り、ｐＥＴ２２ｂまたはｐＥＴ２８ａ（＋）発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いて大腸菌中で発現した。これらの突然変異体は上記表１に示すとおりである。
【０３３１】
実施例３６：内皮細胞およびＷＭ−１６４細胞の増殖およびアポトーシスに対するツムスタチン突然変異体の作用
内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ細胞）およびＷＭ−１６４黒色種細胞の増殖は、上記実施例２５および３４に記載するとおり、メチレンブルー染色により試験した。結果は図３３Ａおよび３３Ｂに示すとおりであり、これは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３３Ａ）およびＷＭ−１６４細胞（図３３Ｂ）の相対数（ｙ軸）に対するツムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４の漸増濃度（ｘ軸）の作用を示す一組のグラフである。図３３Ａは、ツムスタチン、Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２がＣ−ＰＡＥ細胞の増殖を用量依存的態様で抑制したことを示している。図３３Ｂは、ＷＭ−１６４即ち黒色腫細胞系統がＴｕｍ−１またはＴｕｍ−２のいずれによっても影響されなかったことを示している。しかしながらＴｕｍ−４は、この細胞系統に対して抗増殖活性を有していた。以下の表２に示すとおり、１５μｇ／ｍｌのツムスタチンは７８．５％Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖を抑制した。Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２は、それぞれ６５．６および７３．３％、Ｃ−ＰＡＥ細胞を抑制した。一方、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４はＣ−ＰＡＥ細胞を抑制しなかった。Ｔｕｍ−４のみがＷＭ−１６４黒色腫細胞を抑制した。５０μｇ／ｍｌのＴｕｍ−４は、これらの細胞を４６．１％抑制したが、Ｃ−ＰＡＥ細胞は抑制できなかった。
【表２】
2006508015.tif 000006
【０３３２】
組換えツムスタチンおよび欠失突然変異体を、ｐＥＴ２２ｂまたはｐＥＴ２８ａ（＋）発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いて大腸菌中で発現した。７０００個の細胞を９６穴プレートの各ウェルに入れ、１５μｇ／ｍｌ（Ｃ−ＰＡＥの場合）または５０μｇ／ｍｌ（ＷＭ−１６４の場合）の組換えタンパク質の存在下または非存在下において、２０％ＦＣＳ（Ｃ−ＰＡＥ細胞）または３％ＦＣＳ（ＷＭ−１６４細胞）で刺激した。相対細胞数は上記の通りメチレンブルー染色により測定した。データは３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。Ｎ．Ｄ．＝測定せず。＊＝タンパク質非存在下と比較してｐ＜０．０５（「なし」）。
【０３３３】
ＭＴＴ試験を用いて、ツムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４による処置後のＣ−ＰＡＥ内皮細胞およびＷＭ−１６４黒色腫細胞の細胞生存性を評価した。結果は図３４Ａおよび３４Ｂに示すとおりであり、これは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３４Ａ）およびＷＭ−１６４細胞（図３４Ｂ）の細胞生存性（ｙ軸）に対する漸増濃度のツムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４（ｘ軸）の作用を示す一組のグラフである。各点は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。図３４Ａは、Ｔｕｍ−１が用量依存的な態様で細胞生存性を低減したことを示している。１および５μｇ／ｍｌの用量において、Ｔｕｍ−１は細胞生存性の低減についてツムスタチンよりも著しくより効果的であった。Ｔｕｍ−４は、ＷＭ−１６４黒色腫細胞の生存性を低減した唯一の欠失突然変異体であった（図３４Ｂ）。
【０３３４】
アポトーシスは、上記実施例２７に記載したとおり、カスパーゼ−３活性を測定することによっても評価した。結果は図３５に示すとおりであり、これは、５μｇ／ｍｌのＴｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、Ｔｕｍ−４、または８０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αまたはＰＢＳ緩衝液（対照）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞（ｘ軸）のＯＤ４０５における吸光度（ｙ軸）の測定値としてのカスパーゼ−３活性を示すヒストグラムである。Ｔｕｍ−１およびＴｕｍ−２はＣ−ＰＡＥ細胞におけるカスパーゼ−３の活性を増大させたが、Ｔｕｍ−３およびＴｕｍ−４は増大させなかった。
【０３３５】
実施例３７：内皮細胞上のαｖβ３インテグリンに対するツムスタチン突然変異体の結合
ツムスタチン欠失突然変異体でコーティングしたプレートに対するＣ−ＰＡＥ細胞の結合を測定するために、上記の通り細胞接着試験を実施した（例えば実施例２８参照）。Ｔｕｍ−４に対して作成されるウサギ抗体は、以前に記載されている通り調製した（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２４７０−８）。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より購入した。結果は図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃに示すとおりであり、これらは、対照ＩｇＧ、αｖβ３、αｖβ５およびＢＳＡの存在下におけるＴｕｍ−１（図３６Ａ）、Ｔｕｍ−２（図３６Ｂ）およびＴｕｍ−４（図３６Ｃ）でコーティングしたプレートに対するＣ−ＰＡＥ細胞の％結合（ｙ軸）を示す、３種のヒストグラムのセットである。Ｔｕｍ−１でコーティングしたプレート（図３６Ａ）はまた、抗Ｔｕｍ−４抗体（１：２００希釈度）で処置することにより、以前に報告されている（Ｓｈａｈａｎら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４５８４−９０）αｖβ３結合部位並びにαｖβ５結合部位をブロックした。
【０３３６】
αｖβ３抗体は、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２またはＴｕｍ−４へのＣ−ＰＡＥ細胞の結合をそれぞれ５５．９％、６９．８％および６２．６％抑制した。Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２またはＴｕｍ−４でコーティングしたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合は、αｖβ５抗体では抑制されなかった。抗Ｔｕｍ−４抗体（アミノ酸２０９〜２４４に結合する）を添加した場合、αｖβ３抗体はなおＴｕｍ−１へのＣ−ＰＡＥ細胞の結合を抑制した（図３６Ａ）。
【０３３７】
ツムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２およびＴｕｍ−４はまた、図３７に示すとおりＷＭ−１６４細胞に結合し、この図は、ＰＢＳ、ツムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−４またはＢＳＡでコーティングしたプレートに結合したＷＭ−１６４細胞（ｘ軸）に関するＯＤ６５５における吸光度によるメチレンブルー染色の程度（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ツムスタチンおよび欠失突然変異体の全３種とも、プレートへのＷＭ−１６４黒色腫細胞の結合を増強した。
【０３３８】
実施例３８：ツムスタチン欠失突然変異体の活性の逆転
Ｔｕｍ−１の内皮細胞増殖抑制が抗Ｔｕｍ−４抗体により無効になるかどうかを調べるために、上記実施例２６に記載の通り競合増殖試験を実施した。αｖβ３インテグリン結合部位を少なくとも部分的にブロックする目的で、Ｔｕｍ−１を抗Ｔｕｍ−４抗体と共に予備インキュベートした。次にこれを内皮細胞増殖試験に用いた。
【０３３９】
結果は図３８Ａおよび３８Ｂに示すとおりであり、これらは、抗Ｔｕｍ−４抗体（１：１００、１：２００、１：５００希釈）（ｘ軸）と共に予備インキュベートされている１．５μｇ／ｍｌのＴｕｍ−１（図３８Ａ）またはＴｕｍ−２（図３８Ｂ）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞の増殖（ｙ軸）を示すヒストグラムである。それぞれの棒は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。実験は３回反復した。アスタリスクは、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５を示す。
【０３４０】
Ｔｕｍ−１の抗増殖作用は、これを抗Ｔｕｍ−４抗体または対照ウサギＩｇＧと共に予備インキュベートした場合でも変化しなかった（図３８Ａ）。同様に、Ｔｕｍ−２の抗増殖作用も抗Ｔｕｍ−４抗体または対照ウサギＩｇＧの予備インキュベーションによる影響を受けなかった（図３８Ｂ）。
【０３４１】
次にツムスタチンおよびＴｕｍ−２の抗増殖作用を逆転させる能力についてインテグリンαｖβ３を調べた。ツムスタチンおよびＴｕｍ−２を３０分間αｖβ３タンパク質と共にインキュベートし、Ｃ−ＰＡＥ細胞に添加し、これを９６穴プレートにプレーティングし、増殖培地と共に一晩インキュベートした。４８時間インキュベートした後、細胞数をメチレンブルー染色により測定した。図２２に示すとおり、そして実施例２６に記載したとおり、ツムスタチンの抗増殖作用はαｖβ３可溶性タンパク質の漸増用量に応じて用量依存的に逆転し、そして２．４μｇ／ｍｌ（ツムスタチンと比較して３倍モル過剰）では、αｖβ３はツムスタチンの抗増殖作用を著しく逆転させた（４３．１％）。αｖβ３タンパク質のみでの処置では、内皮細胞増殖は抑制されなかった。図３８Ｃに示す通り、Ｔｕｍ−２の抗増殖作用は、αｖβ３可溶性タンパク質の漸増用量により用量依存的態様で逆転し、そしてＴｕｍ−２の抗増殖作用は、２μｇ／ｍｌのαｖβ３タンパク質では７４．１％著しく逆転した。
【０３４２】
次に黒色腫細胞のＴｕｍ−４の抗増殖作用を無効にするαｖβ３の能力を試験した。ツムスタチンおよびＴｕｍ−４をαｖβ３インテグリンタンパク質と共に室温で３０分間予備インキュベートし、次に９６穴プレート中に増殖しているＷＭ−１６４細胞に添加した。４８時間のインキュベーションの後、細胞数の増加をメチレンブルー染色により測定した。結果を図３８Ｄおよび３８Ｅに示す。ツムスタチンは、ＷＭ−１６４細胞に対し作用を有していなかった。Ｔｕｍ−４の抗増殖作用は、αｖβ３可溶性タンパク質の漸増用量に応じて用量依存的態様で逆転した。２μｇ／ｍｌのαｖβ３タンパク質は、Ｔｕｍ−４誘導抗増殖作用を７６．７％まで著しく逆転させた。αｖβ３タンパク質のみでの処置は、黒色腫細胞増殖を抑制しなかった。
【０３４３】
ツムスタチンの増殖作用をエンドスタチンおよび抗αｖβ３抗体の作用と比較した。等モル量のツムスタチンおよび抗αｖβ３インテグリン抗体をＣ−ＰＡＥ細胞に添加した。結果は図３９に示すとおりであり、これは、ｙ軸上の相対細胞数に対するｘ軸上のツムスタチン、エンドスタチン、抗αｖβ３抗体およびＩｇＧ（対照）の濃度を示すグラフである。各点は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。実験は３回反復した。アスタリスクは、片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５を示す。漸増量の抗αｖβ３抗体は内皮細胞の増殖を抑制しなかったのに対し、ツムスタチンおよびエンドスタチンは内皮細胞の増殖について用量依存性の抑制を示した。
【０３４４】
実施例３９：カンスタチンの欠失突然変異体
カンスタチンの欠失突然変異体を、実施例２３および３５において上述したとおり構築した。Ｃａｎ−１は完全長カンスタチン（配列番号６）のＮ末端１１４アミノ酸からなり、Ｃａｎ−２はＣ末端１１３アミノ酸からなる。これらの２種の突然変異体をそれぞれｐＥＴ２２ｂおよびｐＥＴ２８ａにクローニングし、ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に導入してタンパク質の発現に付した。タンパク質は発現クローンから容易に産生され、ベクターに組み込んだポリヒスチジンタグを用いてＮｉ−ＴＡカラムで精製した。タンパク質を漸増濃度のイミダゾールを用いてカラムから溶離させ、次にＰＢＳに対して透析した。透析の間に溶液から生じるタンパク質はすべて不溶性とし、溶液中にとどまるものは可溶性画分とした。可溶性画分を濃縮し、滅菌濾過し、−２０℃で保存した。不溶性タンパク質はＰＢＳ中に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０３４５】
増殖試験のために、カンスタチン、Ｃａｎ−１およびＣａｎ−２可溶性タンパク質（０．１〜２０．０μｇ／ｍｌ）を、増殖中のＣ−ＰＡＥ細胞の増殖培地に添加し、これを５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦに加えてＤＭＥＭ中の１０％ＦＢＳで刺激した。結果は図４０に示すとおりであり、これは、Ｃ−ＰＡＥ細胞の相対細胞数（ｙ軸）に対するカンスタチン（◆）、Ｃａｎ−１（■）およびＣａｎ−２（▲）の漸増濃度の作用（ｘ軸）を示すグラフである。各タンパク質の各濃度は４組で試験した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照の処置として用いた。ポリミキシンＢは、エンドトキシン干渉をコントロールするために使用し、そして、培地に添加するポリミキシンＢを用いた場合と用いない場合の試験の間に差はなかった。細胞を４８時間増殖させ、次に固定し、染色し、密度をＢｉｏ−Ｒａｄプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で読み取った。カンスタチンおよびＣａｎ−１は、共に％細胞数の用量依存的減少をもたらし、ともに５μｇ／ｍｌ以上の濃度で８０％細胞数を低下させた。Ｃａｎ−２は、１０μｇ／ｍｌより高濃度で％細胞数の僅かな低下を示し、最高濃度（２０μｇ／ｍｌ）においては、Ｃａｎ−２は３３％増殖を抑制した。
【０３４６】
アポトーシスは、ＡｐｏＡｌｅｒｔキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ試験により調べた。ヨウ化プロピジウムを用いて、アポトーシス以外の態様で死滅した細胞の核を染色した。カンスタチン、Ｃａｎ−１およびＣａｎ−２はすべて、１μｇ／ｍｌより高濃度で内皮細胞のアポトーシスを誘導した。１μｇ／ｍｌ未満の濃度では、Ｃａｎ−１はアポトーシスの誘導において最も強力であった。
【０３４７】
抗血管形成活性はインビボのマトリゲルプラグ試験で測定し、その際２μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌの不溶性タンパク質、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有するマトリゲル０．５ｍｌをＣ５７／ＢＬ６マウスの両側腹に同時に注射した。プラグは１４日間マウス内に保持してマウスを屠殺し、プラグを切開して固定した。プラグを包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。試料を盲検化し、血管を定量した。タンパク質の２種の濃度の間には血管数に差はなかったため、６検体すべてのカウントを平均しプロットした。
【０３４８】
結果は図４１に示すとおりであり、これは、ＰＢＳ（対照）、カンスタチン、Ｃａｎ−１およびＣａｎ−２での処置に関するプラグ当たりの血管の平均数（ｙ軸）を示すヒストグラムである。カンスタチンまたはＣａｎ−１で処置したプラグは、ＰＢＳまたはＣａｎ−２で処置したプラグと比較して著しく少ない血管を示した。
【０３４９】
実施例４０：ツムスタチンの合成フラグメントの活性
ツムスタチンのペプチドフラグメント：ツムスタチンのアミノ酸５４〜１３２の領域をＴｕｍ−５と称した。ペプチドＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６を合成した。Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６は部分的に重複しており、Ｔｕｍ−５内に位置する。ツムスタチン内のこれらのペプチドの位置を図４２および以下の表３に示す。
【表３】
2006508015.tif 000007
【０３５０】
抗増殖活性：ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６の内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ細胞）に対する抗増殖活性を調べた。結果は図４３Ａに示すとおりであり、これは、１０μｇ／ｍｌのＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６（ｘ軸）による内皮細胞増殖の抑制（ｙ軸）を示すヒストグラムである。対照は、未刺激の細胞および２０％ＦＣＳ刺激細胞とする。ペプチドＴ３は内皮細胞の増殖を有意（ｐ＜０．０５）に抑制することが分かり、そして、抑制は図４３Ｂに示すとおり、用量依存的であった。図４３Ｂは０．１、１．０および１０μｇ／ｍｌのペプチドＴ３（ｘ軸）で処置した場合のＣ−ＰＡＥ細胞の増殖の抑制（ｙ軸）を示すヒストグラムである。この抑制は他のペプチドを用いた場合には観察されず、また、Ｃ−ＰＡＥ細胞をＷＭ−１６４細胞に置き換えた場合にも観察されなかった。
【０３５１】
インテグリンαｖβ３がペプチドＴ３の抗増殖作用を逆転させる能力について調べた。Ｔ３ペプチドを室温で３０分間、０、０．００１、０．０１、０．１、０．５および１．０μｇ／ｍｌのαｖβ３インテグリンタンパク質（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）と共にインキュベートし、次に終濃度２０μｇ／ｍｌで、増殖培地中９６穴プレート中に増殖させておいたＣ−ＰＡＥ細胞に添加した。更に４８時間インキュベートした後、細胞数をメチレンブルー試験により測定した。結果は図４３Ｃに示すとおりであり、これは、αｖβ３インテグリンの種々の濃度（ｘ軸）と共に予備インキュベートしておいたＴ３ペプチドで処置した場合のＣ−ＰＡＥ細胞の細胞増殖（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ペプチドＴ３の抗増殖作用は、αｖβ３インテグリンタンパク質と共に予備インキュベートすることにより著しく低下した。αｖβ３インテグリンそのものは増殖を抑制しなかった（対照）。
【０３５２】
内皮細胞の増殖に対するＴ３ペプチドの機序を更に評価するために、細胞周期の進行に対するＴ３ペプチドの作用を分析した。増殖停止および接触抑制された細胞（０時）において、４．１％の細胞がＳ期にあった。細胞をｂＦＧＦで２４時間刺激した場合、Ｓ期の細胞のパーセントは５．４倍、２２．１％まで増大した。最高用量５０μｇ／ｍｌにおけるＴ３ペプチドでの処置は、Ｓ期の細胞のパーセントを１３．８％にまで低下させた。これとは対照的に、Ｔ１またはＴ６ペプチドでの処置は、Ｓ期の細胞の有意な低下は示さず、Ｔ１およびＴ６による処置では、それぞれＳ期の細胞は２２．３％および２１．２％であった。これは最大用量１００μｇ／ｍｌでも同様であった。しかしながら、Ｔ３ペプチドの作用は用量依存的であり、Ｓ期の細胞のパーセントは、１０μｇ／ｍｌで２１．４％、２５μｇ／ｍｌで２０．５％であった。Ｇ０／Ｇ１期の細胞のパーセントは、０時で８８．３％、ｂＦＧＦ対照で５３．４％、およびＴ１、Ｔ６およびＴ３ペプチドではそれぞれ５７．６％、５７．６％および７１．０％であった。Ｇ０／Ｇ１期の細胞のパーセントは、ｂＦＧＦ対照で最低であり、そしてＴ３処置では上昇し、これは、Ｔ３で内皮細胞を処置することで増殖中の内皮細胞のＧ１停止が起こることを示している。
【０３５３】
アポトーシス活性：ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６（１０μｇ／ｍｌ濃度）を、上記の実施例３２および３６に記載したＭＴＴ試験を用いて、Ｃ−ＰＡＥ細胞の生存性に対するその作用について試験した。結果は図４３Ｄに示すとおりであり、これは、ＯＤ５９５で測定した細胞の生存性（ｙ軸）および合成ペプチドでの処置（ｘ軸）を示すヒストグラムである。ペプチドＴ３は、Ｔｕｍ−５から誘導した他のペプチドと比較して細胞の生存性を著しく低下させたことが分かる。内皮細胞アポトーシスを誘導する際の陽性対照としてＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いた。
【０３５４】
細胞接着活性。内皮細胞を用いた細胞接着を上記の通り行った。ＨＵＶＥＣまたはＣ−ＰＡＥ細胞をモノクローナル抗ヒトインテグリン抗体、対照マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）または合成ペプチドと共にインキュベートし、予備コーティングした９６穴プレート上にプレーティングし、プレートに接着した細胞の数をＯＤ６５５におけるメチレンブルー染色の測定を用いて調べた。図４４Ａは、ＢＳＡ（対照）、抗体なし（対照）、マウスＩｇＧ（対照）およびαｖβ３インテグリン抗体の存在下のＴｕｍ−５ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の結合を示している。細胞接着は抗αｖβ３インテグリン抗体により著しく抑制された。対照マウスＩｇＧは、細胞接着の抑制を示さなかった。図４４Ｂは、組換えＴｕｍ−５ペプチド１０μｇ／ｍｌでコーティングした９６穴プレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の接着を示すヒストグラムである。これらのプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の接着は、ＲＧＤペプチドと共にインキュベートしても抑制されず、Ｔｕｍ−５への内皮細胞の結合がＲＧＤ非依存的であることを示していた。ＣＮＧＲＣペプチドを対照として用いた。
【０３５５】
次に、Ｔｕｍ−５コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の接着に対する合成ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６の作用を調べた。結果は図４４Ｃに示すとおりであり、これは、Ｔｕｍ−５でコーティングして２．５μｇ／ｍｌのＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６で処置した９６穴プレート（ｘ軸）、またはＴ３処置したＴｕｍ−４コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ＰＢＳでの処置を対照とした。Ｔｕｍ−５コーティングプレートへの細胞接着はＴ３ペプチドにより著しく抑制され、Ｔｕｍ−５との内皮細胞の相互作用においてＴ３が関与していることを示している。他の合成ペプチドはこの作用を示さず、Ｔ３はＴｕｍ−４ペプチドでコーティングしたプレートへの内皮細胞の接着を抑制できなかった。図４４Ｄは、種々の濃度のＴ３ペプチド（ｘ軸）のＴｕｍ−５コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合に対する作用（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ＰＢＳでの処置を対照とした。Ｔ３ペプチドは用量依存的な態様でＴｕｍ−５コーティングプレートへの内皮細胞の接着を抑制することが分かった。
【０３５６】
ペプチドコーティングプレートへの内皮細胞の接着は、図４４Ｅに示す通り、Ｔ３ペプチドについては、αｖβ３インテグリンによって抑制されるのみであり、これは、内皮細胞とペプチドＴ３の相互作用がαｖβ３インテグリンにより媒介されていることを示している。図４４Ｆは、抗β３インテグリン抗体と共に予備インキュベートすることによりＴ３ペプチドコーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の接着が抑制されることを示している。しかしながら、抗αｖまたは抗β１インテグリン抗体はＴ３コーティングプレートへの細胞接着を抑制せず、これは、β１インテグリンが潜在的には内皮細胞へのＴ３の結合およびＴ３媒介抗血管形成活性の両方において主要な役割を果たしていないことを示唆している。β１インテグリン結合部位は、他の非抗血管形成性ペプチド中に存在する可能性がある。
【０３５７】
図４４Ｇは、２．５μｇ／ｍｌビトロネクチンでコーティングしたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合がＴ３ペプチドと共にインキュベートすることにより抑制されなかったことを示しており、これは、ビトロネクチン結合に使用されないαｖβ３インテグリン上の異なるドメインにＴ３が結合することを示している。Ｔ６ペプチドと細胞をインキュベートしても、やはり接着は抑制されなかった。
【０３５８】
実施例４１：ツムスタチンの欠失突然変異体の活性
ツムスタチンの欠失フラグメントを細菌発現ベクターにクローニングし、発現し、ニッケルクロマトグラフィーを用いて精製し、次にインビトロの抗血管形成活性および関連する活性について分析した。タンパク質調製品から混在エンドトキシンを確実に除去するために特別な作業を要した。完全長ツムスタチン、ツムスタチン−Ｎ５３および２種の更に別の欠失突然変異体（Ｔｕｍ−２ＣおよびＴｕｍ−ＫＥ）を作成して試験した。欠失突然変異体は、内皮細胞増殖、細胞周期の進行、アポトーシスおよび内皮管腔形成について試験した。分子の内皮細胞特異性を明らかにするために、非内皮細胞に対する活性ツムスタチンフラグメントの作用もまた分析した。これらの活性を以下の表４に総括する。
【表４】
2006508015.tif 000008
「コンストラクト」の欄の１〜１２は、アミノ酸位置３４、６７、７９、８５、１２２、１２５、１４４、１７８、１９０、１９６、２３６、２３９において完全長ツムスタチン内に位置する１２個のシステイン残基を示す。  
ジスルフィド結合は、システイン１および６；システイン２および５；システイン３および４；システイン７および１２；システイン８および１１；およびシステイン９および１０に存在する。  
Ｇ１：細胞周期停止試験。  
Ａｐｏ：アネキシンＶ−ＦＩＴＣ試験。  
Ｔｕｂｅ：内皮管腔形成試験。  
ＥＵ：ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ試薬により測定したエンドトキシン濃度。
【０３５９】
ツムスタチン−Ｎ５３は、これらの試験において最も活性が高いことが分かった。インビトロでツムスタチン−Ｎ５３は内皮細胞アポトーシスを誘導し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で内皮細胞の細胞周期の進行を抑制した。ＩＣ５０は両方の活性に関して約５μｇ／ｍｌであり、エンドスタチンは２０μｇ／ｍｌを超える濃度で同じ試験において活性を示さなかった。
【０３６０】
ツムスタチン−Ｎ５３はまた、細胞接着試験においても使用した。ツムスタチン−Ｎ５３（１０μｇ／ｍｌ）は、９６穴プレートにコーティングされた場合、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の接着を支持した。αｖβ３インテグリンおよびβ１インテグリンに対する抗体は、図４５に示すとおり、ＨＵＶＥＣとともに予備インキュベートした場合にこの接着を抑制したが、α６に対する抗体は抑制しなかった。従って、ツムスタチン−Ｎ５３はαｖβ３インテグリンおよびβ１インテグリンを介してその抗血管形成作用を発揮すると考えられる。このことは、上記実施例２８に記載した完全長ツムスタチンで観察された結果と合致していた。
【０３６１】
ツムスタチン−Ｎ５３はまた、新血管形成に関するマトリゲルプラグ試験において血管形成を抑制する。ツムスタチン−Ｎ５３はまた、ＰＣ３前立腺異種移植片モデルおよびＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌同所移植モデルの両方において実質的な抗腫瘍活性を示す。ツムスタチン−Ｎ５３（キログラム当たり５ｍｇまたは２０ｍｇ）を１日２回投与した。これらの後者２種の試験結果は図４６および４７に示すとおりである。図４６は、ベヒクル（対照、○）、ツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり５ｍｇ／ｋｇ（□）またはツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ（◇）で処置した腫瘍に関する、１５日間にわたる（ｘ軸）ＰＣ３前立腺腫瘍のｍｍ３単位の平均腫瘍容量（ｙ軸）を示すグラフである。図４７は、ベヒクル（対照、○）、ツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ（□）、またはツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり５ｍｇ／ｋｇ（◇）で処置した腫瘍に関する、２２日間にわたる（ｘ軸）ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌腫瘍のｍｍ３単位の平均腫瘍容量（ｙ軸）を示すグラフである。1日当たり５および２０ｍｇ／ｋｇの用量は同等の抗腫瘍活性を示したため、より低い用量を用いてなお有意な抗腫瘍活性を達成することができる。
【０３６２】
第２のグッドパスチャー・エピトープであるＧＰＢは、最近ツムスタチン−Ｎ５３内の領域にマッピングされた（完全長ツムスタチンのアミノ酸１４０〜１５３内）。従って、この領域を除去しながら別の欠失突然変異体を作成した。残基５４〜１３２の抗血管形成ドメインに加えてＮ末端の９個のアミノ酸を含む、完全長ツムスタチンのアミノ酸４５〜１３２からなる突然変異体のツムスタチン−４５−１３２を作成した。ツムスタチン−４５−１３２は高い濃度の発現を示し、ツムスタチン−Ｎ５３よりも低用量で細胞周期の進行を抑制する。このことは図４８において示されており、これは、ＰＢＳ（対照）、緩衝液（対照）、２０μｇ／ｍｌツムスタチン−Ｎ５３、１０μｇ／ｍｌツムスタチン−４５−１３２および５μｇ／ｍｌツムスタチン−４５−１３２（ｘ軸）で処置した場合の、Ｓ期のＣ−ＰＡＥ細胞のパーセント（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ツムスタチン−４５−１３２もまた、ＨＵＶＥＣ細胞接着を支持し、αｖβ３およびβ１インテグリンに対する抗体により抑制された。このことは図４９に示されており、これは、ＰＢＳ（対照）、αｖβ３インテグリン抗体、β１インテグリン抗体、α６インテグリン抗体、およびＢＳＡ（対照）の存在下における、ツムスタチン−４５−１３２コーティング（２０μｇ／ｍｌ）プレートへのＨＵＶＥＣ細胞（ｙ軸）の接着（ＯＤ５９５、ｙ軸）を示すヒストグラムである。従って、ツムスタチンの抗血管形成活性はアミノ酸４５〜１３２の領域内にあると考えられる。これらのフラグメントの別の欠失突然変異体、例えば（完全長ツムスタチンの）６番目のシステイン残基が欠失しているツムスタチン−４５−１３２のフラグメントもまた、これらの方法に従って作成した。
【０３６３】
実施例４２：ツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａの発現および精製
完全長ツムスタチンのアミノ酸４５〜１３２からなるツムスタチン−４５−１３２を、Ｃ末端６ヒスチジンタグとの融合タンパク質として、発現プラスミドｐＥＴ２８ａを用いて大腸菌中に発現させた。大腸菌発現タンパク質を、再折りたたみおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後に、１２ｋＤａの可溶性タンパク質として主に単離した。ツムスタチン−４５−１３２は、抗ポリヒスチジンタグ抗体により免疫検出可能であった。Ｔｕｍ−５上に更に別の９アミノ酸（完全長ツムスタチンの残基４５〜５４）を付加することにより、タンパク質発現の効率および可溶性を増大させた。低エンドトキシン濃度（５０ＥＵ／ｍｇ未満）の可溶性タンパク質のみをその後の実験に用いた。
【０３６４】
組換えツムスタチン−４５−１３２もまた、上記の通り、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現させた。ベクターｐＰＩＣＺαＡを用いて、タンパク質がＣ末端の６ヒスチジンタグに融合するようにツムスタチン−４５−１３２をサブクローニングした。
【０３６５】
Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ（配列番号３４）は、ツムスタチン−４５−１３２の分泌を増強するために、システインからアラニンへの（完全長ツムスタチンの）残基１２５の部位指向性突然変異により作成した。これを大腸菌中で発現させ、抗ポリヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより、同じ分子量サイズで検出した。
【０３６６】
グッドパスチャー症候群は、肺出血および／または急速に進行する糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患であり、α３（ＩＶ）ＮＣ１に対する自己抗体活性に関わる免疫傷害を介した糸球体および肺胞の基底膜の破壊により起こる。最近、最も可能性の高い疾患関連の病原性エピトープがＮ末端タンパク質中に同定されており（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８；Ｈｅｌｌｍａｒｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５：９５３−４４）、そしてその後Ｎ末端の４０アミノ酸内に限定された（Ｈｅｌｌｍａｒｋ，Ｔ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５８６２−８；Ｎｅｔｚｅｒ，Ｋ．Ｏ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２６７−７４）。Ｎ末端ツムスタチン−４５−１３２は、グッドパスチャー自己エピトープ外のツムスタチンの残基４５〜１３２からなる。ツムスタチン−４５−１３２がグッドパスチャー自己抗体により検出されないことを更に確認するために、グッドパスチャーを有する患者の抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。この抗血清は高い感度で２９３細胞発現完全長ツムスタチンを検出したが、大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２およびＰｉｃｈｉａ発現Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａは検出できなかった。このことは、ツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａがグッドパスチャー自己エピトープを含んでおらず、これらの組換えタンパク質がヒトへの投与によりこの自己免疫疾患を誘導する可能性が排除される。
【０３６７】
実施例４３：ツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａの活性
ツムスタチン−４５−１３２の内皮細胞増殖、細胞周期（Ｇ１／Ｓ）停止および細胞生存性に対する作用を調べた。
【０３６８】
Ｃ−ＰＡＥ細胞に対するツムスタチン−４５−１３２の抗増殖作用を、ＢｒｄＵ取り込み試験により調べた。この試験は、チミジン類似体として［３Ｈ］−チミジンの代わりにブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を使用する。ＢｒｄＵは活動的に増殖している細胞において新規に合成されるＤＮＡ鎖に取り込まれる。試験は、ＢｒｄＵ増殖試験キット（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて製造元の指示に従い、若干の変更を加えながら行った。Ｃ−ＰＡＥ細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中９６穴プレートに播種した。翌日、培地を大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２または２９３細胞中に発現された完全長ツムスタチンを含有するまたは含有しない２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭと交換した。次に、プレートを４６時間インキュベートし、次に細胞を１０ｎＭ  ＢｒｄＵで２時間パルス処理した。次に、細胞およびＤＮＡをウェルに固定し、抗ＢｒｄＵ一次および二次抗体と反応させ、次にキットに付属の比色反応を用いて発色させた。次にプレートをプレートリーダー上でＯＤ４５０において読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。
【０３６９】
細胞周期に対するツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａの作用を、上記実施例４と同様にして試験した。慨すれば、Ｃ−ＰＡＥ細胞を４８時間接触抑制により増殖停止させた。次に１０５個細胞／ウェルで細胞を収集し、５％ＦＣＳ中のフィブロネクチンならびに組換えツムスタチン−４５−１３２またはＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａのいずれかでコーティングされた、１２穴プレートにプレーティングした。２１時間後、細胞を収集し、７０％氷冷エタノール中に固定した。固定した細胞を２％ＦＣＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で３０分間室温で再水和し、遠心分離し，そして同じ緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁した。ＲＮａｓｅ（５μｇ／ｍｌ）消化を２時間３７℃で行い、その後ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）で染色した。次に細胞をＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて計数した。
【０３７０】
細胞の生存性は上記の通り、ＭＴＴ試験により測定した。
【０３７１】
一部の実験においては、完全長ツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２を更に還元しアルキル化した。慨すれば、６Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の２．５ｍｇ／ｍｌのツムスタチンまたはツムスタチン−４５−１３２を１０ｍＭ  ＤＴＴ中５０℃で１時間インキュベートした。次に反応混合物を室温に戻し、ヨードアセトアミドを終濃度２５ｍＭで添加した。溶液を室温で１時間インキュベートし、５ｍＭ  ＨＣｌ（各５時間ごとに２回交換）、そして次に１ｍＭ  ＨＣｌに対して透析した。最終生成物中に遊離のチオール基が存在しないことは、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いて確認した。非還元ツムスタチン−４５−１３２は、単量体、２量体および他のオリゴマーとして存在することができるが、還元およびアルキル化されたツムスタチン−４５−１３２は、分子量１２ｋＤの単量体タンパク質に相当する単一のバンドで移行する。
【０３７２】
図５０〜５２に示すとおり、ツムスタチン−４５−１３２は特異的に内皮細胞の増殖を抑制し（図５０Ａおよび５０Ｂ）、細胞周期の停止を誘導し（図５１）、そして細胞の生存性を低下させた（図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃおよび５２Ｄ）。
【０３７３】
図５０Ａは、０、０．１２５、０．２５、０．５、１．０または２．０μＭの濃度（ｘ軸）の大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２（黒色棒）または２９３細胞発現完全長ツムスタチン（白色棒）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞を用いたＢｒｄＵ試験により、ＯＤ４５０で測定した細胞の増殖（ｙ軸）を示す。ツムスタチン−４５−１３２および完全長ツムスタチンの両方とも、用量依存性の態様でＣ−ＰＡＥ細胞におけるＢｒｄＵの取り込みを低下させた。図５０Ｂは０、０．１、１．０、５．０および１０．０μｇ／ｍｌの濃度（ｘ軸）におけるＰｉｃｈｉａ発現ツムスタチン−４５−１３２で処置したＣ−ＰＡＥ細胞を用いたメチレンブルー染色により、ＯＤ６５５において測定した細胞増殖（ｙ軸）を示すヒストグラムである。未刺激のＣ−ＰＡＥ細胞を対照とした。ツムスタチン−４５−１３２は用量依存的態様で、２０％ＦＣＳで刺激されたＣ−ＰＡＥを抑制し、ＥＤ５０は５μｇ／ｍｌであった。対照（０μｇ／ｍｌ）およびツムスタチン−４５−１３２（５および１０μｇ／ｍｌ）処置の間の差は有意であった（片側スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５）。対照のヒト黒色腫細胞（ＷＭ−１６４細胞）を使用した場合、ツムスタチン−４５−１３２の抗増殖作用は観察されなかった。
【０３７４】
図５１は、増殖中の内皮細胞のＧ１停止を示すヒストグラムである。増殖停止、接触抑制細胞において、細胞の５．８％が０時においてＳ期であった。細胞を２１時間５％ＦＣＳで刺激すると、Ｓ期の細胞のパーセントは２１．５％まで３．７倍増大した。ツムスタチン−４５−１３２での処置により、Ｓ期細胞のパーセントは６．０％まで低下した。この作用は用量依存的であり、Ｓ期の細胞のパーセントは１μｇ／ｍｌのツムスタチン−４５−１３２で１９．３％、１０μｇ／ｍｌのツムスタチン−４５−１３２で１１．３％であった。別の実験において、Ｇ０／Ｇ1期の細胞のパーセントは５％ＦＣＳ処置対照で最低であり、ツムスタチン−４５−１３２での処置により上昇した。これらの結果は、ツムスタチン−４５−１３２での処置が増殖内皮細胞において細胞周期の停止を誘導することを示している。Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａでの処置はツムスタチン−４５−１３２の処置と同等の結果を示した。
【０３７５】
図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃおよび５２Ｄは、細胞の生存性に対するツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａの作用を示す４種のヒストグラムのセットである。図５２Ａは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２（黒色棒）およびアルキル化および還元されているツムスタチン−４５−１３２（白色棒）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。ツムスタチン−４５−１３２は用量依存的な態様で細胞の生存性を著しく低下させ、ＥＤ５０は１２μｇ／ｍｌであった。還元およびアルキル化されたツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２は、Ｃ−ＰＡＥ細胞の細胞生存性の低下においては、未処置のツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２と同様の作用を示した。従って、ツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２の抗血管形成作用は、システイン残基の間のジスルフィド結合から誘導されるそのコンフォメーションには依存していない。
【０３７６】
Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａは、図５２Ｂに示すとおり、ツムスタチン−４５−１３２と同様の細胞生存性に対する作用を示した。図５２Ｂは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａで処置したＣ−ＰＡＥ細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。
【０３７７】
ツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−ＡのＣ−ＰＡＥ細胞の細胞生存性に対する作用は、図５２Ｃおよび５２Ｄに示すとおり、対照のＰＣ−３およびＤＵ−１４５細胞では観察されなかった。図５２Ｃは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２で処置したＰＣ−３細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。図５２Ｄは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２で処置したＤＵ−１４５細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。従って、ツムスタチン−４５−１３２の活性は、内皮細胞に特異的なものである。
【０３７８】
実施例４４：内皮細胞に対するツムスタチン−４５−１３２の作用
ツムスタチン−４５−１３２は、以下の試験において示されるとおり、内皮細胞のアポトーシスを誘導し、内皮管腔形成を抑制することが分かった。
【０３７９】
ツムスタチン−４５−１３２は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ試験により明らかにされるとおり、内皮細胞のアポトーシスを誘導することが分かった。試験は、１８時間ツムスタチン−４５−１３２でＣ−ＰＡＥ細胞を処置することにより、上記の通り行った。対照はＰＢＳで処置した。ツムスタチン−４５−１３２は５μｇ／ｍｌにおいて、対照のＴＮＦ−αと比較して蛍光強度ピークの顕著なシフトを誘導した。
【０３８０】
カスパーゼ−３活性もまた上記の通り試験した。ツムスタチン−４５−１３２の特異性を示すために、特異的カスパーゼ−３阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋを内部対照として使用した。ＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。実験は３回反復した。
【０３８１】
結果は図５３に示すとおりであり、これは、（ｘ軸）対照、対照＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ツムスタチン−４５−１３２（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）およびツムスタチン−４５−１３２（１０μｇ／ｍｌ）＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋのカスパーゼ−３活性（ＯＤ４０５で測定、ｙ軸）を示すヒストグラムである。１０μｇ／ｍｌの大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２でＣ−ＰＡＥ細胞を処置することにより、カスパーゼ−３活性の４．５倍上昇が観察された。陽性対照であるＴＮＦ−αもまた４．５倍の上昇をもたらした。特異的カスパーゼ−３阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋは、基線レベルのタンパク質活性低下をもたらし、測定された活性の上昇はカスパーゼ−３に特異的であることが示された。この上昇した活性は、ツムスタチン−４５−１３２でＰＣ−３細胞を処置することによっては観察されなかった。
【０３８２】
ツムスタチン−４５−１３２はまた、マトリゲル試験で示されるとおり、内皮管腔形成を抑制することがわかっている。マトリゲル試験を上記実施例に記載したとおり行った。慨すれば、ＨＵＶＥＣを５μｇ／ｍｌの大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２の存在下または非存在下においてインキュベートしたマトリゲルコーティングプレート上に管形成させた。ＢＳＡ処置細胞および酵母発現ヒトエンドスタチン（５および２０μｇ／ｍｌ）を対照として使用した。ツムスタチン−４５−１３２は対照と比較して、用量依存的な態様で内皮管腔形成を著しく抑制した。処置後の平均の％管腔分枝形成は、ＢＳＡ処置で２２．７±３．１、ツムスタチン−４５−１３２処置で２．１±２．０であったのに対し、５μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのエンドスタチンはそれぞれ平均で１９．４±３．０および７．５±６．０であった。対照と比較して、ツムスタチン−４５−１３２は５μｇ／ｍｌで内皮管腔形成を著しく低減した。ヒトエンドスタチンは２０μｇ／ｍｌでもツムスタチン−４５−１３２の５μｇ／ｍｌより低い阻害剤作用を示した。
【０３８３】
実施例４５：ツムスタチン−４５−１３２の結合活性
ツムスタチン−４５−１３２が内皮細胞上のαｖβ３およびβ１インテグリンに結合すること、および、結合が「ＲＧＤ」ペプチド配列には非依存性であることを示す、細胞接着試験を実施した。
【０３８４】
細胞接着試験は上記の通り実施した。慨すれば、１０μｇ／ｍｌのツムスタチン−４５−１３２または０．５〜２．５μｇ／ｍｌのビトロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓｋ，ＵＳＡ）のいずれかで一晩、９６穴プレートをコーティングした。プレートをＢＳＡでブロッキングし、ＨＵＶＥＣまたはＣ−ＰＡＥ細胞を１０μｇ／ｍｌの抗体または合成ペプチド（合成ペプチド  ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３５））または合成対照ペプチド  ＣＮＧＲＣ（配列番号３６）のいずれかと共に１５分間インキュベートした。細胞をプレートに添加し、４５分間３７℃でインキュベートした。次にプレートを洗浄し、結合細胞数をメチレンブルー染色により測定した。
【０３８５】
大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２でコーティングしたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の接着は、αｖβ３およびβ１インテグリンに対する抗体により著しく抑制された。αｖβ３インテグリン抗体およびβ１インテグリン抗体はそれぞれ、対照として用いたマウスＩｇＧと比較して４７．１％および４７．５％細胞接着を抑制した。Ｃ−ＰＡＥ細胞は同等の抑制を示した。
【０３８６】
合成ペプチド  ＣＤＣＲＧＤＣＦＣは５μｇ／ｍｌにおいて、ビトロネクチンコーティングプレートへの内皮細胞の接着を抑制した。対照ペプチド  ＣＮＧＲＣはこのような抑制を示さなかった。しかしながら、細胞を１．０または１０．０μｇ／ｍｌのＣＤＣＲＧＤＣＦＣペプチドと共にインキュベートした場合、大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の接着は抑制されず、ツムスタチン−４５−１３２が内皮細胞上のαｖβ３インテグリン受容体上の異なる部位、即ち、以前に報告されているＲＧＤ結合部位（Ａｒａｐ，Ｗ．ら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−８０）とは異なる部位に結合することが示唆された。
【０３８７】
可溶性αｖβ３インテグリンタンパク質は、ツムスタチン−４５−１３２の抗増殖作用を復帰させた。このことは実施例２６において上記の競合増殖試験により示された。ビトロネクチンコーティングプレートをαｖβ３可溶性タンパク質と共にインキュベートし、次に細胞接着試験を実施した。可溶性αｖβ３タンパク質は１および２μｇ／ｍｌでコーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の接着を著しく抑制した。次に大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２を３０分間、αｖβ３インテグリンタンパク質と共にインキュベートし、次に２０％ＦＣＳと共にＣ−ＰＡＥ細胞に添加した。４８時間後、細胞増殖をメチレンブルー染色により測定した。ツムスタチン−４５−１３２の抗増殖作用は、漸増濃度のαｖβ３可溶性タンパク質に対して用量依存的に逆転した。１μｇ／ｍｌにおいては、αｖβ３タンパク質は６５．９％までツムスタチン−４５−１３２誘導抗増殖作用を著しく逆転させた。ツムスタチン−４５−１３２を用いることなくαｖβ３タンパク質のみで処置した場合には、内皮細胞の増殖は抑制されず、ツムスタチン−４５−１３２の抗血管形成活性が内皮細胞表面上のαｖβ３インテグリンへの結合により媒介されていることが更に確認された。
【０３８８】
内皮細胞表面へのツムスタチン−４５−１３２の結合を更に示すために、ビオチニル化ツムスタチン−４５−１３２を細胞表面標識のために使用した。組換え大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２は、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を用いてビオチニル化した。１０％ＤＭＳＯおよび５％Ｄ−マンニトールを含有する緩衝液中のツムスタチン−４５−１３２を４℃で一晩、１２Ｍ過剰量のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと共にインキュベートした。ビオチニル化ツムスタチン−４５−１３２は、このインキュベートの間に析出した。沈殿を蒸留水で２回洗浄し、ＤＭＳＯ中に再懸濁し、次に蒸留水と１：１混合し、約４ｍｇ／ｍｌの終濃度を得た。ビオチニル化ツムスタチン−４５−１３２は４℃で保存した。
【０３８９】
細胞表面標識のために、サブコンフルエントのＨＵＶＥＣ細胞を、穏やかなトリプシン処理によりＥＤＴＡを用いてフラスコから取り出し、次に２％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭで２回洗浄した。次に細胞をＤＭＥＭ／ＢＳＡ中に再懸濁し、ビオチン標識ツムスタチン−４５−１３２またはツムスタチン−４５−１３２を用いない擬似的ビオチン反応産物のいずれかと共に４℃で１時間インキュベートした。次に細胞をＤＭＥＭ／ＢＳＡで２回洗浄し、次に４℃で３０分間、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（“Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ”，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。次に試料をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００蛍光顕微鏡で観察し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０３９０】
ツムスタチン−４５−１３２に間接的に結合したＦＩＴＣは、懸濁液中のＨＵＶＥＣ細胞の表面上にて検出され、そして、蛍光は接着後の細胞表面上でより小さい斑点パターンで広範に分布していた。ビオチニル化ツムスタチン−４５−１３２の代わりに遊離のビオチンと共に細胞をインキュベートした場合、細胞表面に有意な蛍光は検出されなかった。ＦＩＴＣ−陽性、即ちツムスタチン−４５−１３２結合の細胞の数は、ビオチニル化ツムスタチン−４５−１３２の漸増濃度と共に用量依存的に増大し、これは、ツムスタチン−４５−１３２が内皮細胞の表面に結合することを示していた。
【０３９１】
実施例４６：血管形成および腫瘍増殖に対するツムスタチン−４５−１３２の作用
新毛細管の形成に対するツムスタチン−４５−１３２のインビボの作用を評価するために、マトリゲルプラグ試験を行った。処置の６日後、形成した新血管の数は、ＰＢＳ処置対照と比較して、５μｇ／ｍｌの大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２での処置により９１％低減した。完全長ツムスタチンのＮ末端５３アミノ酸を欠失したＴｕｍ−１もまた試験したところ、新血管形成を９５％低減した。血管の平均数（３〜４を超えるマトリゲルプラグ）は、Ｔｕｍ−１処置プラグで０．４７±０．１６、ツムスタチン−４５−１３２処置プラグで０．８０±０．１６、そしてＰＢＳ処置対照で８．８１±０．３５であった。
【０３９２】
ツムスタチン−４５−１３２はまた、腫瘍の増殖を抑制する能力についても試験した。５〜６週齢の約２５ｇの雄性無胸腺ヌードＮＣＲＮＵマウスに約２×１０６個のＰＣ−３（前立腺癌）細胞を背部の皮下に移植した。腫瘍は、バーニヤカリパス（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて計測し、腫瘍の容量を標準的な式（幅２×長さ×０．５２）を用いて計算した。腫瘍を約５０ｍｍ３まで増殖させ、次に動物を６匹のマウスの群に振り分けた。タンパク質またはベヒクル（ＰＢＳ、対照）の初期用量をペアマッチングの日（第１日）に与えた。滅菌ＰＢＳ中のツムスタチン−４５−１３２、Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａまたはヒトエンドスタチンを２０日間、１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）毎日腹腔内注射した。対照動物にはＰＢＳベヒクルを注射した。１つの処置では、外科的に移植したＡｌｚｅｔミニポンプを用いてツムスタチン−４５−１３２の連続皮下デリバリーを行った。マウスは毎週２回計量し、腫瘍の計測は第１日より開始した。予測される平均腫瘍容量を計算し、第２１日にマウスを計量し、屠殺し、その腫瘍を切開し、光学顕微鏡およびＣＤ３１免疫染色により調べた。平均の処置腫瘍重量を平均の対照腫瘍重量で割って１から差し引き、パーセントとして表示することにより、各群に関する腫瘍増殖の抑制とした。
【０３９３】
結果は図５４に示すとおりであり、これは、ベヒクル（対照、□）、１ｍｇ／ｋｇのツムスタチン−４５−１３２（◆）、１ｍｇ／ｋｇのＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ（●）、２０ｍｇ／ｋｇのエンドスタチン（○）およびミニポンプ処置ツムスタチン−４５−１３２（１ｍｇ／ｋｇ、△）を用いた処置の、０、５、１０、１５および２０日（ｘ軸）におけるＶ／Ｖ０（平均腫瘍容量／初期腫瘍容量）による分数値の腫瘍容量（ｙ軸）を示す線グラフである。タンパク質処置の毒性は、体重変化で判断したところ観察されなかった。ツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａは共に、ＰＣ−３細胞の増殖を著しく抑制した。ベヒクル注射の対照と比較して、ヒトツムスタチン−４５−１３２は１ｍｇ／ｋｇで７４．１％（ｐ＝０．０２）の腫瘍増殖抑制を示し、そしてＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａは９２．０％（ｐ＝０．００１）の腫瘍増殖抑制を示した。Ａｌｚｅｔミニポンプを用いたツムスタチン−４５−１３２（１ｍｇ／ｋｇ、２４時間）の連続デリバリーもまた、７０．１％（ｐ＝０．０３）の有意な腫瘍増殖抑制を示した。２０ｍｇ／ｋｇの用量でデリバリーしたエンドスタチン（１日２回、ボーラスインジェクション（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））は、ベヒクル処置対照と比較して有意な腫瘍増殖抑制を示さなかった。
【０３９４】
標準的なストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ検出系（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）と共にラット抗マウスＶＤ３１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ）を用いて、ＰＣ−３腫瘍異種移植片の凍結組織切片中の腫瘍内微小血管密度（ＭＶＤ）を測定するためにＣＤ３１免疫染色を用いた。内因性ペルオキシダーゼ活性を１％Ｈ２Ｏ２／メタノールで３０分間ブロッキングし、次に室温で３０分間プロテアーゼＫと共にインキュベートすることによりスライドを抗原回復処理に付した。抗マウスＣＤ３１抗体を０．１％ＴＷＥＥＮ−２０含有ＰＢＳ中１：２０に希釈し、５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ−２０で切片をブロッキングした後、２時間インキュベートした。正常ラットＩｇＧを陰性対照として用いた。免疫ペルオキシダーゼ染色は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ試薬キットを用いて行った。切片はメチルグリーンで対比染色した。ＭＶＤは、低倍率の倍率で腫瘍を走査し、次に個別の微小血管の最大数を含んでいる腫瘍の周囲の３領域を同定し、そして４０×の視野で個々の微小血管を計数することにより評価した。平均の微小血管密度を処置群間で比較し、スチューデントのｔ検定を用いて分析した。
【０３９５】
ツムスタチン−４５−１３２の腹腔内注射は、ベヒクル注射の対照と比較してＰＣ−３異種移植片中の微小血管密度を著しく抑制した。低倍率（４０×）視野当たりのＣＤ３１陽性血管数は、ツムスタチン−４５−１３２処置で６．３３±０．５４であったのに対し、対照では９．４４±１．０５であった（ｐ＝０．０４７）。Ｔｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａまたはミニポンプ処置ツムスタチン−４５−１３２処置群は、平均血管密度の同様の低下を示した。
【０３９６】
実施例４７：ツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２はＴ３ペプチド配列を介して内皮細胞に結合する
２９３ヒト胚性腎細胞中に生成したツムスタチンを用いて、組織培養プレートをコーティングした。１０μｇ／ｍｌのＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６およびＴｕｍ−４の存在下において、Ｃ−ＰＡＥ細胞のツムスタチンコーティングプレートへの接着を行った。結果は図５５Ａおよび５５Ｂに示すとおりであり、これらは、ツムスタチンの種々のペプチドサブユニットの存在下における、２９３産生ツムスタチンでコーティングされた組織培養プレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合を示す一組のヒストグラムである。ＰＢＳおよびＢＳＡをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。図５５Ａは、１０μｇ／ｍｌのペプチドＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔｕｍ−４の存在下の細胞結合を示す。Ｔ３ペプチドは４６．４％までツムスタチンコーティングプレートへの細胞接着を抑制した。図５５Ｂは、０．１、２．０または１０．０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチドの存在下の細胞結合を示す。細胞接着の抑制は用量依存性であった。他のペプチドは細胞接着を抑制しなかった。
【０３９７】
これらの結果、並びに実施例４０の結果（図４４Ｃおよび４４Ｄ）は、内皮細胞が完全長ツムスタチンのツムスタチン−４５−１３２ドメイン内のＴ３配列に特異的に結合すること、および、この結合がこれらの分子の抗血管形成特性の原因であると考えられることを示している。ツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２は他の内皮細胞結合部位を有しており、このことは、Ｔ３がαｖβ３インテグリン結合を介してのみ抑制するため、Ｔ３ペプチドによる内皮細胞の結合の完全な抑制が無かったことを説明している（上記の実施例４０、図４４Ｅおよび４４Ｆ参照）。
【０３９８】
実施例４８：Ｔ３ペプチドはカスパーゼ−３の活性を増強する
Ｔ３ペプチドで処置した細胞におけるカスパーゼ−３のプロテアーゼ活性は、標識基質（ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）から開裂した発色団（ｐ−ニトロアニリド）の検出によりスペクトル分析により測定した。５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチドで処置したＣ−ＰＡＥ細胞はカスパーゼ−３活性について３．６倍上昇を示したのに対し、陽性対照ＴＮＦ−α（８０ｎｇ／ｍｌ）は陰性対照と同等の上昇（４．５倍）をもたらした。１０ｍｇ／ｍｌのＴ３ペプチドは１．６倍の僅かなカスパーゼ−３活性増大をもたらし、用量依存的作用を示唆していた。カスパーゼ−３の特異的阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋは基線までプロテアーゼ活性を低下させ、測定された活性の上昇がカスパーゼ−３に特異的であることを示していた。ＰＣ−３非内皮細胞においては、対照とＴ３ペプチド処置細胞との間にカスパーゼ−３活性の差はなかった。
【０３９９】
実施例４９：Ｔ３折りたたみペプチドの合成および活性ならびにＳ−Ｓ架橋の形成
Ｔ３ペプチドは２個のシステイン残基を含んでいる。Ｔ３ペプチドの２個のシステイン残基の間のＳ−Ｓ架橋の形成は以下の通り酸化により行った。Ｔ３ペプチドを１０ｍｌの５０％アセトニトリルおよび１０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．３）に０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解した。１０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．３）中に溶解した酸化剤である２ｍｇ／ｍｌのフェリシアン化カリウムの３０μｌ分液を、５分間間隔で室温で５回添加し、その際、各添加の後に短時間攪拌し、その後２時間室温でインキュベートした。最終生成物中に遊離のチオール基が存在しないことは、Ｅｌｌｍａｎ試薬（ＤＴＮＢ、ジチオニトロ安息香酸）を用いることにより確認し、そしてペプチドの２量体およびより高次のオリゴマーが存在しないことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１６．５％）および銀染色により確認した。ＨＰＬＣをＴ３ペプチドの最終精製として使用した。アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配（３０分間、２０〜６０％緩衝液Ｂ）を用い、Ｃ−１８  ３００Ａ  Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）にＴ３ペプチドを適用し、精製した。緩衝液Ａは０．１％トリフルオロ酢酸、そして緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸である。純粋な単量体ピークが各試料で観察されたが、溶出時間が異なっており、ペプチドの疎水性に差があることが示唆された。Ｔ３折りたたみペプチドのピーク画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により確認した。
【０４００】
結果は図５６に示すとおりであり、これは、０、１、１０および２０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（黒色棒）およびＴ３折りたたみペプチド（白色棒）で処置した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖（０．１％ＦＣＳで処置した未刺激の対照細胞のパーセントとして）を示すヒストグラムである。Ｔ３非折りたたみペプチドの抗増殖作用はＴ３折りたたみペプチドのものと異なっておらず、ツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２を用いた場合と同様、ジスルフィド結合および二次構造はＴ３活性に必要でないことが示された。
【０４０１】
実施例５０：ツムスタチンおよび欠失突然変異体の抗血管形成活性の比較
内皮細胞増殖試験を用いて、ツムスタチンおよびいくつかの欠失突然変異体の活性を比較した。組換えツムスタチン（２８ｋＤａ）、ツムスタチン−４５−１３２（１２ｋＤａ）およびＴ３ペプチドを等モル濃度においてメチレンブルー増殖試験で使用した。１μＭ、２．５μＭおよび５μＭの濃度において、ツムスタチン、ツムスタチン−４５−１３２およびＴ３ペプチドは抗増殖活性を示した。しかしながら、Ｔ３ペプチド（折りたたみ型または非折りたたみ型のいずれか、上記実施例４９参照）は、等モル濃度においてツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２と比較して２．５倍低活性であった。
【０４０２】
二次構造はＴ３ペプチドのより低い活性を説明するものではなく、この活性のためには別の配列が必要である可能性がある。Ｔ２ペプチドはツムスタチンへのαｖβ３インテグリンの結合を抑制せず、また内皮細胞の増殖も抑制せず、そしてこの領域はＴ３ペプチドの活性の増強においては重要ではないと考えられる。一方、Ｔ４ペプチド配列は内皮細胞の増殖に対して抑制活性を示さなかったが、αｖβ３インテグリンに対しては弱い結合を示した。従って、Ｔ４ペプチドから９個の別のアミノ酸を伸長した新しいペプチドを作成した。この９個の残基はＴ５ペプチドには含まれない。この新しいペプチド（ＴＭＰＦＬＦＣＮＶＮＤＶＣＮＦＡＳＲＮＤＹＳＹＷＬ：配列番号３７）を「Ｔ７」と称し、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖に対するその作用について試験した。
【０４０３】
結果は図５７に示すとおりであり、これは、完全長ツムスタチン（黒色棒）、ツムスタチン−４５−１３２（白色棒）、Ｔ７ペプチド（交差線棒）およびＴ３ペプチド（斑点棒）で処置した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖（０．１％ＦＣＳで処置した未刺激の対照細胞のパーセントとして）を示すヒストグラムである。図５７のそれぞれの棒は３組のウェルの平均±ＳＥＭを示す。ツムスタチンは５μＭの濃度では試験しなかった。
【０４０４】
Ｔ７ペプチドは、等モル濃度でツムスタチンおよびツムスタチン−４５−１３２と同様の活性の水準を示した。ツムスタチン、ツムスタチン−４５−１３２およびＴ７ペプチドは１μＭのＥＤ５０で抗増殖活性を示したが、Ｔ３ペプチドは２．５μＭのＥＤ５０を有していた。これらの結果は、Ｔ４ペプチドの最初の９アミノ酸は抗血管形成活性を示さないが、それらはαｖβ３インテグリンへのツムスタチンの任意の結合にとって重要であり、おそらくはこれらの分子の間の良好な相互作用を促進し、最大の抗血管形成活性を獲得しやすくしていると考えられる。
【０４０５】
実施例５１：合成ペプチドのインビボの抗血管形成活性
新毛細管の形成に対するＴ３のインビボの作用を調べるために、マトリゲルプラグ試験をツムスタチン−Ｎ５３（５μｇ／ｍｌ）、Ｔ１およびＴ３ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を用いて行った。４〜７倍の高倍率視野から血管の数を計数し、平均した。ツムスタチン−Ｎ５３処置後の高倍率視野当たりの血管の平均数は０．４７±０．１６であり、Ｔ１ペプチドでは７．４１±０．５４、そしてＴ３ペプチドでは０．３３±０．１６であった。対照では平均で視野当たり８．８１±０．３５血管であった。ツムスタチン−Ｎ５３およびＴ３は、未処置対照と比較してそれぞれ９５％および９６％新血管形成を抑制したのに対し、Ｔ１ペプチドは血管数の有意な低減をもたらさなかった。
【０４０６】
実施例５２：ツムスタチンペプチドは内皮細胞の全タンパク質合成を抑制する
タンパク質合成の調節は、細胞の増殖およびプログラムされた細胞死、即ちアポトーシスにとって重要である（ＭｃＢｒａｔｎｅｙ，Ｓ．ら，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：９６１−５；Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．ら，１９９６，Ｃｅｅ  ８６：５１７−５２０；Ｔａｎ，Ｓ．Ｌ．ら，１９９９，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｒｅｓ．１９：５４３−５４；Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．Ｃ．ら，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：８０７−８２６）。ツムスタチン、基底膜由来α３ＩＶ型コラーゲンペプチドフラグメントは、抗血管形成活性を有する内皮細胞特異的な前アポトーシス因子であることが分かっている（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３７４５−５０；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１５２４０−８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１９５９−６８）。ツムスタチン誘導アポトーシスは、カスパーゼ−３、即ちｃａｐ依存性のタンパク質翻訳の調節に関与しているとされる酵素に関わっている（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３７４５−５０；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１５２４０−８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１９５９−６８；Ｂｕｓｈｅｌｌ，Ｍ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５１：３３２−３３６）。
【０４０７】
従って、ツムスタチンが複数の内皮細胞においてタンパク質合成を抑制する潜在的能力を検討した。ツムスタチンおよびその活性サブフラグメントであるツムスタチン−４５−１３２、Ｔ３およびＴ７ペプチドを使用した。ツムスタチンのアミノ酸４５−１３２は、上記のとおり、大腸菌において組換えツムスタチン−４５−１３２として発現させた（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１５２４０−８）。ヒトエンドスタチンは文献に従って酵母内で産生した（Ｄｈａｎａｂａｌら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１８９−９７）。低エンドトキシン濃度（５０ＥＵ／ｍｇ未満）の可溶性タンパク質のみを使用した。ツムスタチンの残基６８〜８７および７３〜９７からそれぞれなるＴ３ペプチド、Ｔ７ペプチド、およびＴ７−突然変異ペプチド（ＴＭＰＦＭＦＣＮＩＮＮＶＣＮＦＡＳＲＮＤＹＳＹＷＬ；配列番号３８）を、文献記載の通り合成した（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１３４０−８８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１９５９−６８）。
【０４０８】
一次ヒト腎内皮細胞（ＨＲＥ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）より購入し、ＲＥＧＭ中に維持した（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。他の細胞系統は上記の通り入手して維持した。細胞を２４時間血清枯渇させ（０．５％ＦＣＳ）、Ｔ３ペプチド、ツムスタチン−４５−１３２、エンドスタチンまたはラパマイシンの存在下において１２〜２４時間、１０％ＦＣＳで刺激した。１時間メチオニン非含有倍地中で細胞を前インキュベートした後、１時間３５Ｓ−メチオニンで細胞を標識し、トリクロロ酢酸沈殿物中への放射能の取り込みを分析した（Ｓｕｄｈａｋａｒ，Ａ．ら，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１２９２９−３８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，１９９６，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｔｏｌ．７：２２１９−２９）。片側スチューデントｔ検定を用いたＡＮＯＶＡを用い、この試験の多重比較における有意差を調べた。ｐ＜０．０５の水準を統計学的に有意とみなした。
【０４０９】
結果は図５８Ａ〜５８Ｈに示すとおりであり、これは、種々の処置（ｘ軸）の下での細胞における３５Ｓメチオニン取り込み（ｙ軸）を示す８種のヒストグラムのシリーズである。実験は３回反復し、代表的なデータを示した。それぞれの棒は３組の平均±ＳＥＭからなる。図５８Ａにおいては、Ｃ−ＰＡＥ細胞をＴ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で、１２時間（黒色棒）または２４時間（斜線棒）処置した。ＨＵＶＥＣもまた、２４時間（図５８Ｂ）Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した。図５８Ｃにおいては、Ｃ−ＰＡＥを１２〜２４時間血清枯渇させ、次に０μＭ（対照、黒色棒）、４．５μＭ（水平平行線棒）または２２．７μＭ（斜線棒）のＴ３ペプチドの存在下で２４時間、１０％ＦＣＳを含有する培地を用いてインキュベートした。図５８Ｄ〜Ｈにおいては、ＰＣ−３細胞（図５８Ｄ）、７８６−Ｏ細胞（図５８Ｅ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（図５８Ｆ）、ＨＲＥ細胞（図５８Ｇ）およびＷＭ−１６４細胞（図５８Ｈ）を２４時間、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した。
【０４１０】
等モル濃度（４．５μＭ）において、全ツムスタチンペプチドとも、３５Ｓ−メチオニン取り込みにより測定した場合、ウシおよびヒトの内皮細胞の血清刺激の２４時間後に、２５〜３０％タンパク質合成を抑制した（図５８Ａおよび５８Ｂ）。用量感受性試験においては、ツムスタチンペプチドＴ３は、２２．７μＭの濃度で約４５％の最大抑制を達成した（図５８Ｃ）。これらの実験のすべてにおいて、陽性対照であるラパマイシン（汎特異的ｍＴＯＲ／タンパク質合成阻害因子（Ｂｅｒｅｔｔａら，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６５８−６４））はタンパク質合成を抑制したのに対し、エンドスタチン、即ち別のマトリックス由来内皮細胞特異的プロアポトーシス因子（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−８５；Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．ら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：８０８−１２；Ｄｈａｎａｂａｌ，Ｍ．ら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８：３４５−３５２）はタンパク質合成を抑制しなかった（図５８Ａおよび５８Ｂ）。ツムスタチンペプチドは、ＰＣ−３前立腺癌細胞、７６８−Ｏ腎癌腫細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞、一時ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥ）またはＷＭ−１６４ヒト黒色腫細胞のような非内皮細胞においては、タンパク質合成を抑制しなかった（図５８Ｄ〜５８Ｈ）。一方、ラパマイシンは、試験したすべての細胞においてタンパク質合成を抑制した（図５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｄ〜５８Ｈ）。
【０４１１】
実施例５３：ツムスタチンペプチドは内皮細胞においてｃａｐ依存性タンパク質翻訳を抑制する
ツムスタチンによるタンパク質合成の抑制がｃａｐ依存性であることを明確にするために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下においてジシストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡを発現し、そしてポリオウイルスの未翻訳領域に由来する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＬＵＣ／ｐｏｌ／ＣＡＴ）で内皮細胞をトランスフェクトした（Ｂｅｒｅｔｔａ，Ｌ．ら，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６５８−６４；Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）。このプラスミドの構築は、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）の翻訳がｃａｐ依存性であるがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の翻訳がｃａｐ非依存性であるように行う（Ｂｅｒｅｔｔａ，Ｌ．ら，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６５８−６４；Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）。慨すれば、細胞を２４時間血清枯渇させ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、１．５μｇのｐＣＤＮＡ３−ＬＵＣ−ｐｏｌ−ＣＡＴ（Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）で一過性にトランスフェクトした（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２５８９−９７）。３時間後、細胞を今度は１０％ＦＣＳの存在下、２１時間、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ７ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下（対照）または存在下に処理した。細胞溶解物を調製し、デュアル‐ルシフェラーゼレポーター定量システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＣＡＴ活性は、１４Ｃ−クロラムフェニコールと共にＣＡＴ酵素アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いて測定した。液体シンチレーション計数法を用いて、ｎ−ブチリルクロラムフェニコールの濃度を測定した。
【０４１２】
結果は図５９Ａおよび５９Ｂに示すとおりであり、これは、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ７ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）による処置の下での、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ；ｃａｐ依存性翻訳；黒色棒）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；ｃａｐ非依存性翻訳；交差線棒）の翻訳に関するレポーター活性（ｙ軸）を示す一組のヒストグラムである。対照と比較した場合のルシフェラーゼおよびＣＡＴ活性を示す。これらの実験は３回反復し、代表的データを示した。それぞれの棒は３組の平均±ＳＥＭからなる。
【０４１３】
ツムスタチンペプチドは、ウシ内皮細胞において３７〜３９％ＬＵＣのｃａｐ依存性翻訳を低減し、ラパマイシンと同等であった（図５９Ａ）。ここでもまたエンドスタチンはｃａｐ依存性翻訳に影響を及ぼさなかった（図５９Ｂ）。初期に観察されたとおり、ツムスタチンペプチドは非内皮細胞におけるｃａｐ依存性翻訳は抑制しなかったが、ラパマイシンは抑制した（図５９Ｂ）。ｃａｐ非依存性の翻訳（ＣＡＴ活性）はツムスタチンペプチドにより改変されなかった。
【０４１４】
ラパマイシンは内皮細胞におけるｃａｐ非依存性の翻訳を誘導した（図５９Ａ）が、このことは、ＩＲＥＳ含有ｍＲＮＡ（ポリオウイルス）の翻訳をラパマイシンが刺激することを示唆している以前の報告と合致している（Ｂｅｒｅｔｔａ，Ｌ．ら，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６５８−６４；Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．Ｃ．ら，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：８０７−８２６）。興味深いことに、ｃａｐ非依存性の翻訳はＮＩＨ３Ｔ３細胞においてはラパマイシンによって低減したが、このこともまた、この傾向を示唆していた以前の報告と合致している（Ｂｅｒｅｔｔａ，Ｌ．ら，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６５８−６４）。別の実験において、処置および未処置の内皮細胞におけるＲＮＡ濃度はノーザンブロットによる試験では不変であり、これは、ＲＮＡ濃度に対してではなくタンパク質翻訳に対するツムスタチンペプチドの特異的作用を示唆している。
【０４１５】
実施例５４：ｃａｐ依存性翻訳およびタンパク質合成に対するツムスタチンペプチドの内皮細胞特異的抑制作用はαｖβ３インテグリンにより媒介される
以前の研究は、ツムスタチンによる内皮細胞のアポトーシスが内皮細胞上のαｖβ３インテグリンへのその結合に依存していることを示唆している（Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１３４０−８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１５２４０−８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１９５９−６８）。従って、ｃａｐ依存性および非依存性の翻訳に対するツムスタチンペプチドの作用を評価するために、αｖβ３インテグリンの発現が欠損している１２週齢のマウス（即ち、β３インテグリン欠損マウス）およびその野生型対照の肺から内皮細胞を単離した（Ｈｏｄｉｖａｌａ−Ｄｉｌｋｅ，Ｋ．Ｍ．ら，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：２２９−３８）。慨すれば、ＩＣＡＭ−２発現ＭＬＥＣは、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０，Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）にコンジュゲートしたラット抗マウスＩＣＡＭ−２（＃０１８００Ｄ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて増量した。ＭＬＥＣは、４０％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、４０％ＤＭＥ−低グルコース、ヘパリンを添加した２０％ＦＢＳ、内皮有糸分裂促進物質（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン中に維持した。野生型およびβ３インテグリン欠損マウスの胚性線維芽細胞を調製した（Ｈｏｄｉｖａｌａ−Ｄｉｌｋｅ，Ｋ．Ｍ．ら，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：２２９−３８）。ＭＥＦは１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中に維持した。ＭＬＥＣは、形態学的分析により、および内皮特異的マーカーに関する免疫蛍光染色により、均質性について特徴付けられた。３継代〜６継代の細胞を実験に使用した。
【０４１６】
結果は図６０Ａ〜６０Ｈに示すとおりであり、これは、８種のヒストグラムのセットである。図６０Ａ〜６０Ｄは、３５Ｓメチオニン取り込みとしての総タンパク質合成（ｙ軸）を、内皮細胞について（ＭＬＥＣ）（図６０Ａおよび６０Ｂ）および野生型（図６０Ａおよび６０Ｃ）およびβ３インテグリンノックアウト（図６０Ｂおよび６０Ｄ）の同腹仔マウスの胚腺維芽細胞について（ＭＥＦ）（図６０Ｃおよび６０Ｄ）示したものであり、ここで、細胞は、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ７（４．５μＭ）、Ｔ７突然変異ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した（ｘ軸）。図６０Ｅ〜６０Ｇは、対照のパーセントとしてのルシフェラーゼ（Ｌｕｃ；黒色棒）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；交差線棒）のレポーター活性を、内皮細胞について（ＭＬＥＣ）（図６０Ｅおよび６０Ｆ）および野生型（図６０Ｅおよび６０Ｇ）およびβ３インテグリンノックアウト（図６０Ｆおよび６０Ｈ）の同腹仔マウスの胚腺維芽細胞について（ＭＥＦ）（図６０Ｇおよび６０Ｈ）示したものであり、ここで、細胞は、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ７（４．５μＭ）、Ｔ７突然変異ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した（ｘ軸）。これらの実験は３回反復し、代表的データを示した。それぞれの棒は３組の平均±ＳＥＭからなる。
【０４１７】
野生型およびβ３インテグリン欠損ＭＬＥＣは共に、内皮特異的マーカーであるＶＥ−カドヘリンの発現について細胞接合部および接触点において共に陽性であった。両細胞系統はまた、ｄｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬの取込が可能であった。ツムスタチンは、対照細胞（β３＋／＋細胞）においてタンパク質合成を抑制したが、αｖβ３インテグリンの発現が欠損しているマウス内皮細胞（β３−／−）におけるｃａｐ依存性タンパク質合成については作用を有さなかった（図６０Ａおよび６０Ｂ、６０Ｅおよび６０Ｆ）。ラパマイシンは、対照およびαｖβ３インテグリン欠損マウス内皮細胞の両方においてｃａｐ依存性タンパク質合成を抑制し、そして同様の実験条件下においてエンドスタチンはこの性質を示さなかった（図６０Ａおよび６０Ｂ、６０Ｅおよび６０Ｆ）。αｖβ３インテグリンを発現する内皮細胞に対するツムスタチンの特異性を明確にするために、αｖβ３インテグリンを発現するマウス胚性線維芽細胞（Ｈｏｄｉｖａｌａ−Ｄｉｌｋａ，Ｋ．Ｍ．ら，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：２２９−３８）もタンパク質合成実験において使用した。ツムスタチンペプチドは、αｖβ３インテグリンの発現とは非依存的にこれらの細胞におけるタンパク質の合成を抑制しなかったのに対し、ラパマイシンはこれらの細胞におけるタンパク質合成およびｃａｐ依存性翻訳を抑制した。（図６０Ｃ、６０Ｄ、６０Ｇおよび６０Ｈ）。
【０４１８】
実施例５５：４Ｅ−ＢＰ１の低下したリン酸化をもたらすＰＩ３−ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナリングをツムスタチンペプチドはダウンレギュレートする
タンパク質合成の抑制に関与するシグナリング経路に対するツムスタチンの役割を解明するために実験を行った。内皮細胞を含む種々の細胞型において、インテグリンに結合するリガンドは、種々のシグナリング分子の活性化をもたらす焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化を誘導する（Ｖｕｏｒｉ，Ｋ．，１９９８，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６５：１９１−９；Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，１９９９，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７６：１−２０）。リン酸化ＦＡＫは、ホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）およびＡｋｔ（ＰＩ３−キナーゼの下流）と相互作用してこれを活性化し、細胞の生存をもたらす（Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｃ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０１４８−５２；Ｖｕｏｒｉ，Ｋ．，１９９８，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６５：１９１−９）。以前の報告によれば、内皮細胞におけるＰＩ３−Ｋの抑制はタンパク質合成の抑制をもたらす（Ｖｉｎａｌｓ，Ｆ．ら，１９９９，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６７７６−８２）。
【０４１９】
Ｃ−ＰＡＥを３０分間血清枯渇させ、トリプシン処理した。懸濁液中の細胞を１５分間Ｔ３ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、次に３０〜６０分間血清非含有条件下においてビトロネクチン予備コーティング皿に接着させた。総細胞抽出液を調製し、抗ＦＡＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；ヤギＩｇＧ）および抗リン酸化ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；ウサギＩｇＧ）抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを行った（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９０６２−８；Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３７４５−５０；Ｓｕｄｈａｋａｒ，Ａ．ら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１５３９８−４０５；Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２７１９−２４）。同じ実験は、ＷＭ−１６４黒色腫細胞を用いても行った。  
結果は図６１Ａに示すとおりであり、これは、ビトロネクチンコーティングプレートへの結合時間無しでＴ３ペプチドの非存在下（「０−」棒）、３０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「３０−」棒）、３０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「３０＋」棒）、６０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「６０−」棒）および６０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「６０＋」棒）での処置の下における（ｘ軸）、ｐＦＡＫ／ＦＡＫの相対密度（ｙ軸）を示す。
【０４２０】
ＰＩ３−キナーゼ活性は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のインビトロでのリン酸化により測定した（Ｕｅｋｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１４３７−４５）。Ｃ−ＰＡＥを３０分間血清枯渇させ（０．５％ＦＣＳ）、トリプシン処理し、１５分間Ｔ３ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）と共に予備インキュベートした。次に細胞を３０〜６０分間ビトロネクチンコーティング皿に接着させ、細胞溶解物は、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫沈降に付した（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）。連続して洗浄した後、免疫沈降物を０．１ｍｇ／ｍｌのＰＩ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）を含有するＰＩ３Ｋ反応緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）５０μＬ中に再懸濁した。ＰＩ３キナーゼの反応は、５μＣｉのγ−３２Ｐ−ＡＴＰを含有する２００μＭ  ＡＴＰ  ５μＬを添加することにより開始した。２５℃で２０分間の後、反応を停止し、試料を遠心分離し、有機層を除去し、シリカゲル６０プレートにスポットし、クロロホルム−メタノール−２８％水酸化アンモニウム−水（４３：３８：５：７）で展開した。リン酸化脂質はオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０４２１】
結果は図６１Ｂに示すとおりであり、これは、ビトロネクチンコーティングプレートへの結合時間無しでＴ３ペプチドの非存在下（「０−」棒）、３０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「３０−」棒）、３０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「３０＋」棒）、６０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「６０−」棒）および６０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「６０＋」棒）での処置の下における（ｘ軸）、ＰＩ３キナーゼ活性（ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【０４２２】
次にＣ−ＰＡＥおよびＷＭ−１６４細胞を用いて、図６１Ａに示すとおり、抗Ａｋｔおよび抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ；ウサギＩｇＧ）によるウエスタンブロッティングを行った。結果は図６１Ｃに示すとおりであり、これは、図６１Ａと同じ処置（ｘ軸）の下でのｐＦＡＫ／ＦＡＫの相対密度（ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【０４２３】
ｍＴＯＲキナーゼ試験は以前に記載されている通り実施した（Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）。Ｃ−ＰＡＥおよびＷＭ−１６４を血清枯渇させ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、ＨＡ−ｍＴＯＲ  ｃＤＮＡ（Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）で一過性にトランスフェクトし、そして２４時間、Ｔ３ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）またはツムスタチン−４５−１３２で処置した。細胞溶解物（１５０μｇ）を抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）による免疫沈降に付した。ビーズを２０分間３０℃で、３０μＭの冷ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＫＣｌおよび２．５ｍＭ酢酸マグネシウム）中１０μＣｉのγ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下において、組換えＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１融合タンパク質（Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）と共にインキュベートした。反応を停止し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、オートラジオグラフィーで分析した。
【０４２４】
結果は図６１Ｄに示すとおりであり、これは、ｍＴＯＲトランスフェクション無しでペプチド処理無し（「−−」棒）、ｍＴＯＲトランスフェクション有りでペプチド処理無し（「＋−」棒）、ｍＴＯＲトランスフェクション有りでツムスタチン−４５−１３２処理有り（「＋Ｔｕｍ−５」棒）およびｍＴＯＲトランスフェクション有りでペプチドＴ３処理あり（「＋Ｔ３」棒）での処置の下の（ｘ軸）、ｍＴＯＲキナーゼ活性（ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【０４２５】
血清枯渇の後、Ｃ−ＰＡＥまたはＷＭ−１６４は、２４時間１０％ＦＣＳの存在下、Ｔ３ペプチド、ツムスタチン−４５−１３２、ラパマイシンまたはエンドスタチンで処置した。細胞溶解物を調製し、７−メチル−ＧＴＰ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）の５０％スラリー３０μｌを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。樹脂を２回洗浄（洗浄緩衝液：１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）した後、結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、結合ｅＩＦ４Ｅおよび４Ｅ−ＢＰ１の濃度をイムノブロッティングにより検出した（Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７７９−８７）。
【０４２６】
結果は図６１Ｅに示すとおりであり、これは、ＦＢＳなし、Ｔ３、ツムスタチン−４５−１３２、ラパマイシン、エンドスタチンまたはＦＢＳで処置した（ｘ軸）後の、Ｃ−ＰＡＥ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ結合４Ｅ−ＢＰＩの密度（ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【０４２７】
ＰＩ３−キナーゼおよびＡｋｔの活性化に対するツムスタチンペプチドの作用を調べるために、構成性で活性なＡｋｔ（ＣＡＡｋｔ、野生型ＡｋｔのＮ末端に融合したＧａｇタンパク質）のｃＤＮＡを構築した（Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｍ．ら，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：５９９−６０２）。組換えアデノウイルスは、文献記載の通り、親ウイルスゲノムと発現コスミドカセットまたはシャトルベクターとの間の相同組換えにより構築した（Ｕｅｋｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１４３７−４５）。アデノウイルスは、１×１０８プラーク形成単位／ｍＬの濃度で適用し、ｌａｃＺ遺伝子を有する同じ親ゲノムのアデノウイルスを対照として使用した。組換えアデノウイルスでＣ−ＰＡＥ細胞を２４時間感染させた後、細胞を２４時間血清枯渇させ、ｐｃＤＮＡ−ＬＵＣ−ｐｏｌ−ＣＡＴでトランスフェクトした。１０％ＦＣＳ含有培地の存在下において２１時間、Ｔ３ペプチドで細胞を処置した後、細胞溶解物を取得し、ルシフェラーゼ試験およびＣＡＴ試験を実施した。
【０４２８】
ＣＡＴ活性に対するルシフェラーゼ活性の結果は図６１Ｆに示す通りであり、これは、対照のｌａｃＺ（陰をつけた棒）、構成性で活性なＡｋｔ（交差線棒）のｃＤＮＡを含むアデノウイルスで感染させた、または全く感染していない（黒色棒）のいずれかであるＣ−ＰＡＥについて、ＣＡＴ活性に対するパーセントルシフェラーゼ活性を示すヒストグラムである。次に細胞を血清枯渇させ、ｐｃＤＮＡ−ＬＵＣ−ｐｏｌ−ＣＡＴでトランスフェクトし、１０％ＦＣＳ含有培地存在下においてＴ３ペプチドで処置した。
【０４２９】
ツムスタチンペプチドは、ビトロネクチンへの結合により誘導された内皮細胞におけるＦＡＫのリン酸化を抑制する（図６１Ａ）。ＰＩ３−キナーゼおよびＡｋｔの活性化はまた、ツムスタチンペプチドでの処置により抑制された（図６１Ｂおよび６１Ｃ）。Ａｋｔの下流にあるＦＬＡＰ／ｍＴＯＲとしても知られているラパマイシン／ＦＫＢＰ−標的１（ＲＡＦＴ１）は、真核細胞開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）−結合タンパク質（４ＥＢＰ１）を直接リン酸化する（Ｂｒｕｎｎ，Ｇ．Ｊ．ら，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９９−１０１；Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．Ｃ．ら，１９９８，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：５０２−１３）。未リン酸化４Ｅ−ＢＰ１は、ｅＩＦ４Ｅと相互作用してｃａｐ依存性翻訳を抑制する（Ｐａｕｓｅ，Ａ．ら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７６２−７）。増殖因子または血清による細胞の刺激は４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化を誘導し、その結果、ｅＩＦ４Ｅからのその解離が起こり、翻訳の抑制が軽減される（Ｐａｕｓｅ，Ａ．ら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７６２−７；Ｇｉｎｇｒａｓ，Ａ．Ｃ．ら，１９９８，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：５０２−１３）。ツムスタチンペプチドはｍＴＯＲキナーゼ活性を不活性化し、従って４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化を抑制する（図６１Ｄ）。４Ｅ−ＢＰ１リン酸化の抑制はｅＩＦ−４Ｅへの４Ｅ−ＢＰ１の結合を増強し（図６１Ｅ）、ｃａｐ依存性翻訳の抑制をもたらす。αｖβ３インテグリンを発現する非内皮ＷＭ−１６４黒色腫細胞をこれらの実験に使用した場合、ツムスタチンペプチドによる抑制作用は観察されなかった（図６１Ａおよび６１Ｃ〜６１Ｅ）。内皮細胞におけるｃａｐ依存性翻訳の抑制においてこの経路が重要であることを確認するために、構成性で活性なＡｋｔは、組換えアデノウイルスを用いて内皮細胞内で過剰発現させた。ツムスタチンペプチドによるｃａｐ依存性翻訳の抑制は、構成的に活性なＡｋｔの過剰発現により克服された（図６１Ｆ）。
【０４３０】
これらのデータは更に、αｖβ３インテグリン−ＦＡＫ−ＰＩ３−ＫＡｋｔ−ｍＴＯＲシグナリングのネガティブな調節を介した内皮細胞のタンパク質合成の抑制におけるツムスタチンペプチドの関与を示唆している。ツムスタチン／αｖβ３インテグリン誘導のネガティブシグナルは、これらの２種の経路の間のクロストークを介して、増殖因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等）の発する細胞生存シグナルに逆作用すると考えられる。
【０４３１】
ツムスタチンペプチドによるタンパク質合成の調節におけるＭＡＰキナーゼ経路の役割も調べた。ビトロネクチン結合またはＶＥＧＦ刺激の際の細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）１／２のリン酸化は、Ｃ−ＰＡＥにおいてはツムスタチンペプチドにより改変されなかった。総括すると、これらの結果は、ｃａｐ依存性タンパク質合成の内皮細胞特異的阻害因子としてのツムスタチンペプチドがαｖβ３インテグリンの関与する「アウトサイド−イン（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ）」のシグナリングを介して作用すること、および、ツムスタチンの以前に報告されている抗血管形成活性がタンパク質のｃａｐ依存性翻訳のαｖβ３インテグリン媒介抑制を介して作用できることを確立するものである。
【０４３２】
実施例５６：ＭＤＡＭＢ−４３５腫瘍異種移植片モデルにおけるＴ８合成ペプチドの活性
ヌードマウスにおけるＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルに対する合成ペプチドＴ８の活性を検討した。
【０４３３】
Ｔ８（ＫＱＲＦＴＴＭＰＦＬＦＣＮＶＮＤＶＣＮＦＡＳＲＮＤＹＳ：配列番号３９）を合成し、ＨＰＬＣにより９０％超の純度まで精製した（＜２０ＥＵ／ｍｇ）。５０ｍＭグリシン、５ｍＭアルギニン、９％Ｄ−マンニトール（ｐＨ８．０）の２×緩衝液１：１（ｖ：ｖ）を用いて、注射前にペプチドを中和した。
【０４３４】
体重約２０グラムの５〜６週齢の雌性ＮＣＲＮＵヌードマウスに、腋窩下乳房脂肪組織パッド中の２×１０６個のＭＤＡＭＢ−４３５細胞を移植した。腫瘍が１００ｍｍ３となった時点で、動物を処置群および対照群に振り分けた。各群は７匹の腫瘍マウスを含み、その各々に耳タグを付し、実験期間中を通じて個体別に観察した。Ｔ８ペプチドまたは対照ベヒクルの初回用量をペアマッチング日（第０日）に与え、ｋｇ動物体重当たり、１ｍｇおよび２．５ｍｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスは週２回計量し、腫瘍の計測は第１日より週２回カリパスを用いて行った。これらの腫瘍計測値はよく知られた数式であるＶ＝Ｗ２×Ｌ／２を用いて腫瘍容量に変換し、平均の腫瘍容量を時間に対してプロットした。マウスは処置期間終了時に安楽死させた。終了時にマウスを計量し、屠殺し、その腫瘍を摘出した。群当たりの平均腫瘍重量を計算し、（平均の処置腫瘍重量／平均の対照腫瘍重量×１００）の値を１００％から差し引くことにより、各群の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）を求めた。
【０４３５】
処置は腫瘍容量が１００ｍｍ３に達した時点で開始した。全群とも２６日間１日２回腹腔内注射した。結果は以下の表５に示す。
【表５】
2006508015.tif 000009
【０４３６】
結果はまた図６２に示すとおりであり、これは対照のベヒクル処置（○）、および１ｍｇ／ｋｇ（□）または２．５ｍｇ／ｋｇ（◇）のＴ８での処置の後の種々の日数後の平均腫瘍容量（ｍｍ３；ｙ軸）を示すグラフである。体重変化により判断して、いずれの群にも毒性は観察されなかった。２６日の処置の後、本発明者らの結果では、２７量体のペプチドＴ８は、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回処置した場合に４７．９１％腫瘍増殖を著しく抑制した（ｐ＜０．００１）。１．０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回処置したＴ８は腫瘍増殖を著しく抑制しなかった。結論として、ツムスタチン配列に由来する小型の合成ペプチドであるＴ８は、ＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルにおける腫瘍の増殖の抑制において有効であった。
【０４３７】
実施例５７：ＭＤＡＭＢ−４３５腫瘍異種移植片モデルに対するＴ８およびＴＰ３合成ペプチドの活性
Ｔｕｍ５合成ペプチドＴ８およびＴＰ３の抗腫瘍活性を、ヌードマウスにおいてＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルに対して評価した。Ｔ８の投与計画もまた変更した。
【０４３８】
天然のツムスタチン配列の突然変異体である合成ペプチドＴ８およびＴＰ３（ＫＬＦＣＮＶＮＣＶＣＮＦＡＳＲＮＤＹＳ；配列番号４１）を合成し、ＨＰＬＣで９０％超の純度まで精製した（＜２０ＥＵ／ｍｇ）。５０ｍＭグリシン、５ｍＭアルギニン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％Ｄ−マンニトール（ｐＨ８．２）の２×緩衝液１：１（ｖ：ｖ）を用いて、注射前にペプチドを中和した。
【０４３９】
体重約２０グラムの５〜６週齢の雌性ＮＣＲＮＵヌードマウスに腋窩下乳房脂肪組織パッド中の２×１０６個のＭＤＡＭＢ−４３５細胞を移植した。腫瘍が１００ｍｍ３となった時点で、動物を処置群および対照群に振り分けた。各群は６〜７匹の腫瘍マウスを含み、その各々に耳タグを付し、実験期間中を通じて個体別に観察した。Ｔ８またはＴＰ３ペプチドまたはベヒクル対照の初回用量をペアマッチング日（第０日）に与え、記載した用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスは週２回計量し、腫瘍の計測は第１日より週２回カリパスを用いて行った。これらの腫瘍計測値はよく知られた数式（Ｖ＝Ｗ２×Ｌ／２）を用いて腫瘍容量に変換し、そして平均の腫瘍容量並びに腫瘍比（Ｖ／Ｖ０）を時間に対してプロットした。マウスは処置期間終了時に安楽死させた。終了時にマウスを計量し、屠殺し、その腫瘍を摘出した。群当たりの平均腫瘍重量を計算し、（処置腫瘍比／平均の対照腫瘍比×１００）の値を１００％から差し引くことにより各群の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）を求めた。
【０４４０】
処置は腫瘍容量が８０ｍｍ３に達した時点で開始した。週当たり２回処置した１つのＴ８処置群を除き、全群とも毎日腹腔内注射した。結果は以下の表６に示す。
【表６】
2006508015.tif 000010
【０４４１】
結果はまた図６３に示すとおりであり、これは、対照の処置（○）、および、毎日ＴＰ３を１ｍｇ／ｋｇ（◇）、毎日ＴＰ３を５ｍｇ／ｋｇ（×）、毎日Ｔ８を５ｍｇ／ｋｇ（□）、または、1週間に２回Ｔ８を５ｍｇ／ｋｇ（＋）で処置した場合の処置開始後種々の日数（ｘ軸）における腫瘍容量の比（Ｖ／Ｖｏ；ｙ軸）を示すグラフである。
【０４４２】
体重変化により判断して、いずれの群にも毒性は観察されなかった。４週間の処置の後、結果によれば２７量体のペプチドＴ８は、５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回処置した場合に、それぞれ３１．０％（ｐ＝０．０７）および４１．４％（ｐ＝０．０２）腫瘍増殖を抑制した。更に、１８量体トランケーションペプチドＴＰ３は、１ｍｇ／ｋｇの用量で３０．６％（ｐ＝０．１４）および５ｍｇ／ｋｇの用量で５０．０％（ｐ＜０．０１）腫瘍増殖を抑制した。従って、ツムスタチン配列に由来する小型の合成ペプチドは、ＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルにおける腫瘍の増殖の抑制において有効であった。
【０４４３】
実施例５８：ＰＣ３腫瘍異種移植片モデルにおけるＴ７、Ｔ８、ＴＰ３、ＳＰ１およびＳＰ２合成ペプチドの活性
合成ペプチドＴ７、Ｔ８、ＴＰ３、ＳＰ１およびＳＰ２の抗腫瘍活性を、ヌードマウスにおいＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルに対して評価した。
【０４４４】
ペプチドＴ７、Ｔ８、ＴＰ３および対照のスクランブルドペプチドＳＰ１（ＡＮＭＳＲＮＶＦＦＤＣＴＳＦＰＶＣＱＫＦＬＮＤＴＲＮＹ；配列番号４３）およびＳＰ２（ＴＦＮＣＶＫＮＹＱＲＬＤＦＴＳＲＦＶＭＤＳＣＡＮＦＰＮ；配列番号４４）を合成し、ＨＰＬＣで９０％超の純度まで精製した（＜２０ＥＵ／ｍｇ）。５０ｍＭグリシン、５ｍＭアルギニン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％Ｄ−マンニトール（ｐＨ８．２）の２×緩衝液１：１（ｖ：ｖ）を用いて、注射前にペプチドを中和した。ペプチドＴ７およびＴ８は、異なる保存ベヒクル中に保存した（Ｔ７は２５％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ、そしてＴ８は２ｍＭ  ＨＣｌ）ため、異なる保存ベヒクル自体も対照として用いた。
【０４４５】
体重約２５グラムの５〜６週齢の雄性ＮＣＲＮＵヌードマウスの背部皮下に２×１０６個のＰＣ３細胞を移植した。腫瘍が６０ｍｍ３となった時点で、動物を処置群および対照群に振り分けた。各群は６〜７匹の腫瘍マウスを含み、その各々に耳タグを付し、実験期間中を通じて個体別に観察した。ペプチドまたはベヒクル対照の初回用量をペアマッチング日（第０日）に与え、記載した用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスは毎週計量し、腫瘍の計測は毎週カリパスを用いて行った。これらの腫瘍計測値はよく知られた数式（Ｖ＝Ｗ２×Ｌ／２）を用いて腫瘍容量に変換し、そして平均の腫瘍容量を時間に対してプロットした。マウスは処置期間終了時に安楽死させた。終了時にマウスを計量し、屠殺し、その腫瘍を摘出した。群当たりの平均腫瘍重量を計算し、平均の処置腫瘍容量または容量比／平均の対照腫瘍容量または容量比×１００の値を１００％から差し引くことにより、各群の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）を求めた。
【０４４６】
週当たり２回および週1回それぞれ処置した２つのＴ８処置群を除き、全群とも毎日腹腔内注射した。結果は以下の表７に示す。
【表７】
2006508015.tif 000011
【０４４７】
結果はまた図６４Ａおよび６４Ｂに示すとおりであり、これは、種々の処置に関する処置後の種々の日数（ｘ軸）における平均腫瘍容量の比（ｍｍ３；ｙ軸）を示す一組のグラフである。図６４Ａにおいては、処置は、Ｔ７用保存ベヒクル（○）、Ｔ７（□）、Ｔ８用保存ベヒクル（◇）、Ｔ８毎日（×）、ＴＰ３毎日（＋）、ＳＰ１毎日（△）およびＳＰ２毎日（●）とした。図６４Ｂにおいては、処置は、Ｔ８用保存ベヒクル（○）、Ｔ８毎日（□）、Ｔ８週２回（◇）およびＴ８週1回（×）とした。
【０４４８】
体重変化により判断して、いずれの群にも毒性は観察されなかった（体重減少１０％未満）。３週間のペプチドの腹腔内投与の後、結果によれば、２７量体のペプチドＴ８は５ｍｇ／ｋｇの用量で４５％腫瘍増殖を抑制した。Ｔ７は同用量で６６．８％腫瘍増殖を抑制し、そしてＴＰ３は同用量で５３．２％腫瘍増殖を抑制した。すべての場合において、腫瘍増殖の抑制は、スチューデントのｔ検定によればそれほど有意ではなかった。スクランブルドペプチドＳＰ１およびＳＰ２は、より低い程度において腫瘍増殖を抑制し（それぞれ３１．７％および１８．７％）、これは有意ではなかった。
【０４４９】
異なる投与計画も検討した。Ｔ８は、１週間に２回または１回、５．０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、腫瘍増殖を著しく抑制しなかった（それぞれ８．１％および３９．５％）。従って、ペプチドＴＰ３はＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおいてＴ７およびＴ８の両方と同様の腫瘍増殖抑制活性を示すと考えられる。
【０４５０】
実施例５９：ＭＤＡＭＢ−４３５腫瘍異種移植片およびＰＣ３腫瘍異種移植片モデルにおけるＴ８、Ｔ８−３、Ｐ２およびＳＰ２合成ペプチドの活性
合成ペプチドＴ８、Ｔ８−３、Ｐ２およびＳＰ２の抗腫瘍活性を、ヌードマウスにおいてＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルおよびＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルに対して評価した。
【０４５１】
ペプチドＴ８を合成し、そして、セリンが各システインと置換している以外はＴ８と同様の配列を有するＴ８−３（ＫＱＲＦＴＴＭＰＦＬＦＳＮＶＮＤＶＳＮＦＡＳＲＮＤＹＳ；配列番号４０）、およびアスパラギン酸が各システインと置換しているＰ２（ＫＱＲＦＴＴＭＰＦＬＦＤＮＶＮＤＶＤＮＦＡＳＲＮＤＹＳ；配列番号４２）も合成した。スクランブルド対照ペプチドであるＳＰ２もまた合成した。すべてＨＰＬＣで９０％超の純度まで精製した（＜２０ＥＵ／ｍｇ）。５０ｍＭグリシン、５ｍＭアルギニン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％Ｄ−マンニトール（ｐＨ８．２）の２×緩衝液１：１（ｖ：ｖ）を用いて、注射前にペプチドを中和した。
【０４５２】
ＭＤＡＭＢ−４３５モデルを伴う試験については、体重約２０グラムの５〜６週齢の雌性ＮＣＲＮＵヌードマウスに、腋窩下乳房脂肪組織パッド中の２×１０６個のＭＤＡＭＢ−４３５細胞を移植した。ＰＣ３モデルを伴う試験については、体重約２５グラムの５〜６週齢の雄性ＮＣＲＮＵヌードマウスの背部皮下に２×１０６個のＰＣ３細胞を移植した。腫瘍が１００ｍｍ３（ＭＤＡＭＢ−４３５モデルの場合）および６０ｍｍ３（ＰＣ３モデルの場合）となった時点で、動物を処置群および対照群に振り分けた。
【０４５３】
各群は６〜７匹の腫瘍マウスを含み、その各々に耳タグを付し、実験期間中を通じて個体別に観察した。ペプチドまたはベヒクル対照の初回用量をペアマッチング日（第０日）に与え、記載した用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスは毎週計量し、腫瘍の計測は毎週カリパスを用いて第０日より行った。これらの腫瘍計測値はよく知られた数式（Ｖ＝Ｗ２×Ｌ／２）を用いて腫瘍容量に変換し、そして平均の腫瘍容量を時間に対してプロットした。マウスは処置期間終了時に安楽死させた。終了時にマウスを計量し、屠殺し、その腫瘍を摘出した。群当たりの平均腫瘍重量を計算し、平均の処置腫瘍容量／対照腫瘍容量×１００を１００％から差し引くことにより、各群の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）を求めた。
【０４５４】
ＭＤＡＭＢ−４３５およびＰＣ３モデルの結果を以下の表８および９にそれぞれ示す。
【表８】
2006508015.tif 000012
【表９】
2006508015.tif 000013
【０４５５】
結果は図６５Ａおよび６５Ｂに示すとおりであり、これは、対照処置（○）、Ｔ８ペプチド５ｍｇ／ｋｇで毎日処置（□）、ＳＰ２を５ｍｇ／ｋｇ（◇）、Ｔ８−３を１ｍｇ／ｋｇ（×）または５ｍｇ／ｋｇ（＋）、またはＰ２を１ｍｇ／ｋｇ（△）または５ｍｇ／ｋｇ（●）について、処置開始後種々の日数（ｘ軸）の平均腫瘍容量（ｍｍ３；ｙ軸）を示す一組のグラフである。図６５Ａおよび６５Ｂは、それぞれＭＤＡＭＢ−４３５およびＰＣ３異種移植片モデルに関する結果を示す。体重変化により判断して、いずれの群にも毒性は観察されなかった（体重減少１０％未満）。
【０４５６】
３週間のペプチドでの毎日腹腔内投与の処置の後、結果によれば、ヌードマウスにおけるＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルでは、２７量体のペプチドＴ８は５ｍｇ／ｋｇの用量で５０．５％腫瘍増殖を抑制した（ｐ＝０．００２）。更に、Ｔ８−３ペプチドは５ｍｇ／ｋｇの用量で４１．９％腫瘍増殖を著しく抑制した（ｐ＝０．００８）が、１ｍｇ／ｋｇのより低用量では有効ではなかった。Ｐ２ペプチドは１ｍｇ／ｋｇの用量で２６．４％腫瘍増殖を抑制した（それほど有意ではない。ｐ＝０．５５）が、５ｍｇ／ｋｇでは有意な抑制は観察されなかった。更に、スクランブルド対照ペプチドＳＰ２は、５ｍｇ／ｋｇの用量では有意な腫瘍増殖抑制を示さなかった。結論として、セリン置換Ｔ８変異体であるＴ８−３は、ＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデルにおける腫瘍増殖の抑制においてはＴ８と同様の活性を有している。
【０４５７】
ヌードマウスにおけるＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルでは、３週間のペプチドでの毎日腹腔内投与の処置の後、２７量体のペプチドＴ８は５ｍｇ／ｋｇの用量で３５．４％腫瘍増殖を抑制した（ｐ＝０．０３６）。更に、Ｔ８−３ペプチドは５ｍｇ／ｋｇの用量で３５．４％腫瘍増殖を抑制したが、抑制はそれほど有意ではなかった（ｐ＝０．０６５）。Ｐ２ペプチドもまた腫瘍増殖抑制を示したが、この場合、より低用量のほうが更に効果的であり、１ｍｇ／ｋｇで、ＴＧＩ＝３１．６％、ｐ＝０．５４であったのに対し、５ｍｇ／ｋｇでは、ＴＧＩ＝１５．９％、ｐ＝０．２６５であった。更に、スクランブルド対照ペプチドＳＰ２は、５ｍｇ／ｋｇの用量では有意な腫瘍増殖抑制を示さなかった。結論として、セリン置換Ｔ８変異体であるＴ８−３およびアスパラギン酸置換Ｔ８変異体であるＰ２は共に、ＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおいてある程度の腫瘍増殖抑制活性を示した。それほど有意ではないものの、Ｔ８−３はその薬効においてはＴ８と近似していると考えられる。
【０４５８】
すべての参考文献、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明はその好ましい実施形態を参照しながら特に示し説明したが、当業者の知るとおり、添付の請求項に含まれる本発明の範囲を外れることなく、形態や詳細において種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０４５９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα１鎖のヌクレオチド（図１Ａ、配列番号１）およびアミノ酸（図１Ｂ、配列番号２）の配列を示すダイアグラムである。ｐＥＴ２２ｂ（＋）フォワード（配列番号３）およびリバース（配列番号４）プライマーの位置は二重下線で示されており、ｐＰＩＣＺαＡフォワード（配列番号１５）およびリバース（配列番号１６）プライマーの位置は一重下線で示されている。
【図２】図２は、アレステンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す模式的ダイアグラムである。フォワード（配列番号３）およびリバース（配列番号４）プライマーおよびアレステンがクローニングされた部位を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ）増殖の指標としての、３Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステン（図３Ａ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ｘ軸）およびエンドスタチン（図３Ｂ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ｘ軸）の作用を示す一組の線グラフである。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての３Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの作用を示す、４種の棒グラフチャートである。図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、それぞれ７８６−Ｏ、ＰＣ−３およびＨＰＥＣ細胞に対するアレステン（０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（図４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（図４Ｃ））の作用を示す。図４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンの作用を示す。
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ヒト臍帯内皮細胞（ＥＣＶ−３０４）におけるＦＢＳ−誘導化学走性を介した内皮細胞遊走に対するアレステン（２μｇ／ｍｌ、図５Ｂ）およびエンドスタチン（２０μｇ／ｍｌ、図５Ｃ）の作用を示す４種の顕微鏡写真のセットである。図５Ａは未処置の対照細胞を示す。
【図６】図６は、図５の結果から得られたグラフを示す棒グラフである。図６は、ＥＣＶ−３０４内皮細胞の遊走に対するアレステン（２μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）およびエンドスタチン（２．５μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）の各々の作用を示す。
【図７】図７は、内皮細胞管腔形成に対するアレステンの作用を示す線グラフである。％管腔形成はｙ軸に示し、阻害因子濃度はｘ軸に示す。処置は：無処置（対照、◆）、ＢＳＡ（対照、△）、７Ｓドメイン（対照、×）およびアレステン（■）とした。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、対照（図８Ａ）と比較した場合の、内皮細胞管腔形成に対するアレステン（０．８μｇ／ｍｌ、図８Ｂ）の作用を示す一組の顕微鏡写真である。
【図９】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、インビボでの腫瘍増殖に対するアレステンおよびエンドスタチンの作用を示す４種の線グラフのセットである。図９Ａは、１０ｍｇ／ｋｇアレステン処置（□）、ＢＳＡ処置（＋）および対照マウス（●）について、７００ｍｍ３からの腫瘍容量の増大を示すプロットである。図９Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇアレステン処置（□）およびＢＳＡ処置（＋）の腫瘍について、１００ｍｍ３からの腫瘍容量の増大を示している。図９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇアレステン処置（□）、エンドスタチン処置（▲）および対照マウス（●）について、１００ｍｍ３からの腫瘍容量の増大を示している。図９Ｄは、アレステン処置（□）に対する対照（●）の２００ｍｍ３の腫瘍についての増大を示している。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、種々の処置（ｘ軸）の下でのＣ−ＰＡＥ細胞（図１０Ａ）およびＰＣ−３細胞（図１０Ｂ）に関するＯＤ４０５における吸光度（ｙ軸）の関数としてのカスパーゼ−３活性の量を示す一組のヒストグラムである。それぞれの棒は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα２鎖のヌクレオチド（図１１Ａ、配列番号５）およびアミノ酸（図１１Ｂ、配列番号６）の配列を示すダイアグラムである。ｐＥＴ２２ｂ（＋）フォワード（配列番号７）およびリバース（配列番号８）プライマーの位置は二重下線で示されており、ｐＰＩＣＺαＡフォワード（配列番号１７）およびリバース（配列番号１８）プライマーの位置は一重下線で示されている。
【図１２】図１２は、カンスタチンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す模式的ダイアグラムである。フォワード（配列番号７）およびリバース（配列番号８）プライマーおよびカンスタチンがクローニングされた部位を示す。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ）（図１３Ａおよび１３Ｃ）および非内皮細胞（７８６−Ｏ、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３）（図１３Ｂおよび１３Ｄ）の増殖に対する種々の濃度のカンスタチン（ｘ軸）の作用を示すヒストグラムである。増殖は、３Ｈ−チミジンの取り込み（図１３Ａおよび１３Ｂ）およびメチレンブルー染色（図１３Ｃおよび１３Ｄ）の関数として測定した。
【図１４】図１４は、ＶＥＧＦなし（ＶＥＧＦまたは血清なし）、およびＶＥＧＦ（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ）細胞の処置に関する、ならびに０．０１カンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌカンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌカンスタチン）処置に関する、視野当たりの遊走内皮細胞数（ｙ軸）を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、ＢＳＡ（□）、カンスタチン（■）およびα５ＮＣ１（○）の種々の処置の下での対照（ＰＢＳ処置ウェル）の管腔形成の％としての、内皮細胞管腔形成の量（ｙ軸）を示す線グラフである。垂直の棒は平均の標準誤差を示す。
【図１６】図１６は、経時的（ｘ軸）にみた、ｔ＝０において存在するタンパク質のパーセントとしてのビンキュリンの濃度の関数としてのＦＬＩＰ（ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質、即ちＦＡＤＤ様インターロイキン‐１ベータ変換酵素阻害タンパク質）の濃度（ｙ軸）のグラフである。
【図１７】図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃおよび１７Ｄは、処置日数（ｘ軸）に対してプロットした、分数値の腫瘍容量（ｙ軸、図１７Ａおよび１７Ｂ）またはｍｍ３単位の腫瘍容量（ｙ軸、図１７Ｃおよび１７Ｄ）に関するカンスタチン（■）、エンドスタチン（○）および対照（□）のＰＣ−３細胞（図１７Ａおよび１８Ｂ）および７８６−Ｏ細胞（図１７Ｃおよび１７Ｄ）に対する作用を示す線グラフである。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα３鎖のヌクレオチド（図１８Ａ、配列番号９）およびアミノ酸（図１８Ｂ、配列番号１０）の配列を示すダイアグラムである。ｐＥＴ２２ｂ（＋）フォワード（配列番号１１）およびリバース（配列番号１２）プライマーの位置は二重下線で示されている。「ツムスタチン３３３」（配列番号２０）および「ツムスタチン３３４」（配列番号２１）のフラグメントの開始および終了もまた示されている（「＊」＝ツムスタチン３３３；「＋」＝ツムスタチン３３４）。
【図１９】図１９は、ツムスタチンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す模式的ダイアグラムである。フォワード（配列番号１１）およびリバース（配列番号１２）プライマーおよびツムスタチンがクローニングされた部位を示す。
【図２０】図２０は、ツムスタチン突然変異体ツムスタチンＮ−５３（Ｔｕｍ−１）におけるα３（ＩＶ）ＮＣ１単量体内のトランケーションされたアミノ酸の位置を示す模式的ダイアグラムである。黒丸はこの突然変異体を発生させるためにツムスタチンから欠失させたＮ末端５３アミノ酸残基に相当する。短い棒によって印をつけたジスルフィド結合は、それらがα１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１内に存在するとおりに配置している。
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、ツムスタチンの種々の濃度（ｘ軸）で処置した場合のＣ−ＰＡＥ細胞（図２１Ａ）、ＰＣ−３細胞（図２１Ｂ）および７８６−Ｏ細胞（図２１Ｃ）に関する３Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示す３種のヒストグラムのセットである。全群とも３組の試料を示す。
【図２２】図２２は、Ｃ−ＰＡＥ細胞による染料の取り込みに対する漸増量のαｖβ３と組み合わせた０．１μｇ／ｍｌツムスタチンの作用をｘ軸上に示したヒストグラムである。ＯＤ６５５における吸光度をｙ軸に示す。「０．１％ＦＣＳ」は０．１％ＦＣＳ処置（未刺激）対照を、そして「２０％ＦＣＳ」は２０％ＦＣＳ処置（刺激）対照を示す。残りの棒は、αｖβ３単独の対照、およびツムスタチン＋漸増量のαｖβ３での処置を示す。各棒は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。実験は３回反復した。アスタリスクは片側スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）におけるｐ＜０．０５を示す。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、種々の処置（ｘ軸）の下でのＣ−ＰＡＥ細胞（図２３Ａ）およびＰＣ−３細胞（図２３Ｂ）に関するＯＤ４０５における吸光度の関数としてのカスパーゼ３活性の量（ｙ軸）を示す一組のヒストグラムである。それぞれの棒は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。
【図２４】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄは、インテグリンサブユニットα１〜α６、β１またはαｖβ３インテグリンブロッキング抗体の存在下におけるツムスタチン（図２４Ａ）、または対照であるＩＶ型コラーゲン（図２４Ｂ）、ビトロネクチン（図２４Ｃ）またはラミニン−１（図２４Ａ）でコーティングされたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の結合を示す４種のヒストグラムのセットである。プレートのコーティングは各グラフの上部に記載し、インキュベートに使用した抗体は各グラフのｘ軸に示す。ＢＳＡコーティングプレートを陰性対照として使用した。
【図２５】図２５は、ツムスタチンコーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合を示すヒストグラムである。ＢＳＡコーティングプレートを陰性対照として使用した。
【図２６】図２６は、ツムスタチン（●）、ＢＳＡ（対照、□）および７Ｓドメイン（対照、○）の種々の量（ｘ軸）の内皮細胞管腔形成（ｙ軸）に対する作用を示す線グラフである。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、対照（□）と比較した場合のツムスタチン（●）およびエンドスタチン（○）の処置日数（ｘ軸）に対する腫瘍容量（ｍｍ３、ｙ軸）への作用を示す一組の線グラフである。アスタリスクを付したデータポイントは片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５の有意差を示す。
【図２８】図２８は、対照マウス（□）およびツムスタチン突然変異体Ｎ−５３で処置したマウス（●）に関する処置日数（ｘ軸）に対する腫瘍容量の増大（ｙ軸）を示すグラフである。アスタリスクを付したデータポイントは片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５の有意差を示す。
【図２９】図２９は、ツムスタチンおよびツムスタチンＮ−５３の漸増濃度（ｘ軸）における細胞の生存性（ＯＤ５９０の関数として、ｙ軸）を示すグラフである、各点は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。アスタリスクを付したデータポイントは片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５を示す。
【図３０】図３０は、アレステン（●）、カンスタチン（○）、１２ｋＤａアレステンフラグメント（■）、８ｋＤａアレステンフラグメント（□）および１０ｋＤａカンスタチンフラグメント（▲）の種々の濃度（ｘ軸）による内皮細胞管腔形成の抑制（ｙ軸）を示す線グラフである。
【図３１】図３１は、ツムスタチンフラグメント３３３（●）、ツムスタチンフラグメント３３４（○）、ＢＳＡ（対照、■）、α６（対照、□）およびツムスタチン（▲）の種々の濃度（ｘ軸）による内皮細胞管腔形成の抑制（ｙ軸）を示す線グラフである。
【図３２】図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃは、ＨＰＥ（図３２Ａ）、Ｃ−ＰＡＥ（図３２Ｂ）およびＷＭ−１６４（図３２Ｃ）細胞の増殖（ｙ軸）に対するツムスタチン漸増濃度（ｘ軸）の作用を示す３種のヒストグラムのセットである。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３３Ａ）およびＷＭ−１６４細胞（図３３Ｂ）の相対数（ｙ軸）に対するツムスタチン（◆）、Ｔｕｍ−１（□）、Ｔｕｍ−２（●）、Ｔｕｍ−３（◇）およびＴｕｍ−４（▲）の漸増濃度（ｘ軸）の作用を示す一組のグラフである。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、Ｃ−ＰＡＥ細胞（図３４Ａ）およびＷＭ−１６４細胞（図３４Ｂ）の細胞生存性（ｙ軸）に対するツムスタチン（◆）、Ｔｕｍ−１（□）、Ｔｕｍ−２（●）、Ｔｕｍ−３（◇）およびＴｕｍ−４（▲）の漸増濃度（ｘ軸）の作用を示す一組のグラフである。各点は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。
【図３５】図３５は、５μｇ／ｍｌのＴｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−３、Ｔｕｍ−４または８０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αまたはＰＢＳ緩衝液（対照）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞（ｘ軸）のＯＤ４０５における吸光度（ｙ軸）の測定値としてのカスパーゼ−３活性を示すヒストグラムである。
【図３６】図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃは、３種のヒストグラムのセットである。図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃは、対照ＩｇＧ、αｖβ３、αｖβ５およびＢＳＡの存在下におけるＴｕｍ−１（図３６Ａ）、Ｔｕｍ−２（図３６Ｂ）およびＴｕｍ−４（図３６Ｃ）でコーティングしたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の％結合（ｙ軸）を示す。
【図３７】図３７は、ＰＢＳ、ツムスタチン、Ｔｕｍ−１、Ｔｕｍ−２、Ｔｕｍ−４またはＢＳＡでコーティングしたプレートに結合したＷＭ−１６４細胞（ｘ軸）に関するＯＤ６５５における吸光度によるメチレンブルー染色の程度（ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【図３８】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄおよび３８Ｅは、抗Ｔｕｍ−４抗体（１：１００、１：２００、１：５００希釈）（ｘ軸）と共に予備インキュベートされている１．５μｇ／ｍｌのＴｕｍ−１（図３８Ａ）もしくはＴｕｍ−２（図３８Ｂ）、あるいはαｖβ３タンパク質（図３８Ｃ）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞、またはツムスタチン（図３８Ｄ）またはＴｕｍ−４（図３８Ｅ）で処置したＷＭ−１６４細胞の増殖（ｙ軸）を示す５種のヒストグラムのセットである。
【図３９】図３９は、ｙ軸上の相対細胞数に対するｘ軸上のツムスタチン（●）、エンドスタチン（△）、抗αｖβ３（□）抗体およびＩｇＧ（◆）（対照）の濃度を示すグラフである。各点は３組のウェルの平均±平均の標準誤差を示す。実験は３回反復した。アスタリスクは片側スチューデントｔ検定におけるｐ＜０．０５を示す。
【図４０】図４０は、Ｃ−ＰＡＥ細胞の相対細胞数（ｙ軸）に対する、漸増濃度のカンスタチン（◆）、Ｃａｎ−１（■）およびＣａｎ−２（▲）（ｘ軸）の作用を示すグラフである。各タンパク質の各濃度は４組で試験した。
【図４１】図４１は、ＰＢＳ（対照）、カンスタチン、Ｃａｎ−１およびＣａｎ−２での処置に関するプラグ当たりの血管の平均数（ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【図４２】図４２は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６ペプチドの位置を記載したツムスタチンのタンパク質の配列のダイアグラムである。ＧＰ−Ａ＝第１のグッドパスチャー・エピトープ。ＧＰ−Ｂ＝第２のグッドパスチャー・エピトープ。
【図４３】図４３Ａ、図４３Ｂ、４３Ｃおよび４３Ｄは、Ｔ３ペプチドによる内皮細胞の増殖の抑制（図４３Ａ，４３Ｂおよび４３Ｃ）および内皮細胞アポトーシスの誘導（図４３Ｄ）を示す４種のヒストグラムである。図４３Ａは、１０μｇ／ｍｌのペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６（ｘ軸）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞の増殖（ｙ軸）を示す。図４３Ｂは、０．１、１．０および１０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチドで処置したＣ−ＰＡＥ細胞の増殖（ｙ軸）を示す。図４３Ｃは、種々の濃度のαｖβ３インテグリン（ｘ軸）と共に予備インキュベートしておいたＴ３ペプチドで処置した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の細胞増殖（ｙ軸）を示す。図４３Ｄは、１０μｇ／ｍｌのペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６での細胞の処置後のＭＴＴ試験により測定したＣ−ＰＡＥ細胞の細胞生存性（ｙ軸）を示す。すべての棒は、３組のウェルの平均±ＳＥＭを示す。
【図４４】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、４４Ｅ、４４Ｆおよび４４Ｇは、抗ヒトインテグリン抗体、マウスＩｇＧ（対照）またはペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５およびＴ６で処置した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の接着を示す７種のヒストグラムのセットである。図４４Ａは、ＢＳＡ（対照）、抗体なし（対照）、マウスＩｇＧ（対照）およびαｖβ３インテグリン抗体（ｘ軸）の存在下における、Ｔｕｍ−５ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートへのＨＵＶＥＣ細胞の結合（ｙ軸）を示す。図４４Ｂは、１０μｇ／ｍｌの組換えＴｕｍ−５ペプチド（ｘ軸）でコーティングした９６穴プレートへのＣ−ＰＥＡ細胞の接着（ｙ軸）を示すヒストグラムである。図４４Ｃは、Ｔｕｍ−５でコーティングし２．５μｇ／ｍｌのペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６で処置した９６穴プレート（ｘ軸）、またはＴ３で処置したＴｕｍ−４コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示すヒストグラムである。ＰＢＳ処置を対照とした。図４４Ｄは、種々の濃度のＴ３ペプチド（ｘ軸）のＴｕｍ−５コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合に対する作用（ｙ軸）を示す。ＰＢＳ処置を対照とした。図４４Ｅは、ＰＢＳ（対照）、ＩｇＧ（対照）またはαｖβ３インテグリン抗体の存在下のＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５またはＴ６コーティングプレート（ｘ軸）へのＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示す。図４４Ｆは、ＰＢＳ（対照）、ＩｇＧ（対照）またはαｖインテグリン抗体、β１インテグリン抗体、β３インテグリン抗体、αｖβ５インテグリン抗体またはＢＳＡ（対照）（ｘ軸）と共にインキュベートした場合の、Ｔ３コーティングプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示す。図４４Ｇは、ＰＢＳ（対照）、ＢＳＡ（対照）または種々の濃度（０．１、１．０、１０．０μｇ／ｍｌ）のＴ３ペプチド、または種々の濃度（０．１、１．０、１０．０μｇ／ｍｌ）の濃度のＴ６ペプチド（ｘ軸）と共にインキュベートした場合の、ビトロネクチン（２．５μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合（ｙ軸）を示す。それぞれの棒は３組のウェルの平均±ＳＥＭを示す。実験は３回反復した。＊ｐ＜０．０５はスチューデントのｔ検定による。
【図４５】図４５は、ＰＢＳ（対照）、αｖβ３インテグリン抗体、β１インテグリン抗体、α６インテグリン抗体、またはＢＳＡ（対照）の存在下における、ツムスタチン−Ｎ５３−コーティング（２０μｇ／ｍｌ）プレートへのＨＵＶＥＣ細胞の接着を示すヒストグラムである。
【図４６】図４６は、ベヒクル（対照、○）、ツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり５ｍｇ／ｋｇ（□）、またはツムスタチンＮ−５３を１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ（◇）で処置した腫瘍に関する、１５日間にわたる（ｘ軸）ＰＣ３前立腺腫瘍（ＰＣ３前立腺異種移植片モデル）についてのｍｍ３単位の平均腫瘍容量（ｙ軸）を示すグラフである。
【図４７】図４７は、ベヒクル（対照、○）、ツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ（□）、またはツムスタチン−Ｎ５３を１日当たり５ｍｇ／ｋｇ（◇）で処置した腫瘍に関する、２２日間にわたる（ｘ軸）ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌腫瘍のｍｍ３単位の平均腫瘍容量（ｙ軸）を示すグラフである。
【図４８】図４８は、ＰＢＳ（対照）、緩衝液（対照）、２０μｇ／ｍｌツムスタチン−Ｎ５３、１０μｇ／ｍｌツムスタチン−４５−１３２および５μｇ／ｍｌツムスタチン−４５−１３２（ｘ軸）で処置した場合の、Ｓ期のＣ−ＰＡＥ細胞のパーセント（ｙ軸）を示すヒストグラムである。細胞周期試験は１０％ＦＢＳの存在下に実施した。
【図４９】図４９は、ＰＢＳ（対照）、αｖβ３インテグリン抗体、β１インテグリン抗体、α６インテグリン抗体、またはＢＳＡ（対照）の存在下における、ツムスタチン−４５−１３２−コーティング（２０μｇ／ｍｌ）プレートへのＨＵＶＥＣ細胞（ｙ軸）の接着（ＯＤ５９５値、ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【図５０】図５０Ａおよび５０Ｂは、細胞の増殖に対するツムスタチン−４５−１３２の作用を示す２種のヒストグラムのセットである。図５０Ａは、０、０．１２５、０．２５０、０．５００、１．０または２．０μＭの濃度（ｘ軸）の大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２（黒色棒）または２９３細胞発現完全長ツムスタチン（白色棒）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞を用いたＢｒｄＵ試験により測定した細胞の増殖（ＯＤ４５０における、ｙ軸）を示す。図５０Ｂは、０、０．１、１．０、５．０および１０．０μｇ／ｍｌの濃度（ｘ軸）におけるＰｉｃｈｉａ発現ツムスタチン−４５−１３２で処置したＣ−ＰＡＥ細胞を用いたメチレンブルー染色により測定した細胞増殖（ＯＤ６５５における）を示す。未刺激のＣ−ＰＡＥ細胞を対照とした。
【図５１】図５１は、細胞周期の進行に対する大腸菌発現ツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａの作用を示すヒストグラムである。Ｓ期のＣ−ＰＡＥ細胞のパーセント（ｙ軸）を、０時（対照）および０、１、１０および２０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２（黒色棒）またはＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ（白色棒）での処置後について示す。実験は３回反復した。
【図５２】図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃおよび５２Ｄは、細胞の生存性に対するツムスタチン−４５−１３２およびＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａの作用を示す４種のヒストグラムのセットである。図５２Ａは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２（黒色棒）、ならびにアルキル化および還元されているツムスタチン−４５−１３２（白色棒）で処置したＣ−ＰＡＥ細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。図５２Ｂは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａで処置したＣ−ＰＡＥ細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。図５２Ｃは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２で処置したＰＣ−３細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。図５２Ｄは、０、３、６、１２、２５および５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）のツムスタチン−４５−１３２で処置したＤＵ−１４５細胞について、ＭＴＴ試験においてＯＤ５６２で測定した細胞生存性（ｙ軸）を示す。
【図５３】図５３は、（ｘ軸）対照、対照＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、ツムスタチン−４５−１３２（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）およびツムスタチン−４５−１３２（１０μｇ／ｍｌ）＋ＤＥＶＤ−ｆｍｋのカスパーゼ−３活性（ＯＤ４０５で測定、ｙ軸）を示すヒストグラムである。
【図５４】図５４は、ベヒクル（対照、□）、１ｍｇ／ｋｇツムスタチン−４５−１３２（◆）、１ｍｇ／ｋｇのＴｕｍ−５−１２５−Ｃ−Ａ（●）、２０ｍｇ／ｋｇエンドスタチン（○）およびミニポンプ処置ツムスタチン−４５−１３２（１ｍｇ／ｋｇ、△）での処置の、０、５、１０、１５および２０日（ｘ軸）におけるＶ／Ｖ０（平均腫瘍容量／初期腫瘍容量）による分数値の腫瘍容量（ｙ軸）を示す線グラフである。
【図５５】図５５Ａおよび５５Ｂは、ツムスタチンの種々のペプチドサブユニットの存在下における、２９３産生ツムスタチンでコーティングされた組織培養プレートへのＣ−ＰＡＥ細胞の結合を示す一組のヒストグラムである。ＰＢＳおよびＢＳＡをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。図５５Ａは、１０μｇ／ｍｌのペプチドＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔｕｍ−４の存在下の細胞結合を示し、そして図５５Ｂは、０．１、２．０または１０．０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチドの存在下の細胞結合を示す。
【図５６】図５６は、０、１、１０および２０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（黒色棒）およびＴ３折りたたみペプチド（白色棒）で処置した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖（０．１％ＦＣＳで処置した未刺激の対照細胞のパーセントとして）を示すヒストグラムである。
【図５７】図５７は、完全長ツムスタチン（黒色棒）、ツムスタチン−４５−１３２（白色棒）、Ｔ７ペプチド（交差線棒）およびＴ３ペプチド（斑点棒）で処置した場合の、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖（０．１％ＦＣＳで処置した未刺激の対照細胞のパーセントとして）を示すヒストグラムである。それぞれの棒は３組のウェルの平均±ＳＥＭを示す。ツムスタチンは５μＭの濃度では試験しなかった。
【図５８】図５８Ａ〜５８Ｈは、種々の処置（ｘ軸）の下での細胞における３５Ｓ-メチオニン取り込み（ｙ軸）を示す８種のヒストグラムのシリーズである。実験は３回反復し、代表的なデータを示した。それぞれの棒は３組の平均±ＳＥＭからなる。図５８Ａにおいては、Ｃ−ＰＡＥ細胞は、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で１２時間（黒色棒）または２４時間（斜線棒）処置した。図５８Ｂにおいては、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間、ＨＵＶＥＣを処置した。図５８Ｃにおいては、Ｃ−ＰＡＥは、１２または２４時間血清枯渇させ、次に０μＭ（対照、黒色棒）、４．５μＭ（水平平行線棒）または２２．７μＭ（斜線棒）のＴ３ペプチドの存在下で２４時間、１０％ＦＣＳを含有する培地を用いてインキュベートした。図５８Ｄ〜Ｈにおいては、ＰＣ−３細胞（図５８Ｄ）、７８６−Ｏ細胞（図５８Ｅ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（図５８Ｆ）、ＨＲＥ細胞（図５８Ｇ）およびＷＭ−１６４細胞（図５８Ｈ）を２４時間、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ７ペプチド（図５８Ｄ、図５８Ｅ、図５８Ｈ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した。
【図５９】図５９Ａおよび５９Ｂは、Ｔ３ペプチド（４．５μＭ）、ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ７ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）での処置の下における、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ；ｃａｐ依存性翻訳；黒色棒）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；ｃａｐ非依存性翻訳；交差線棒）の翻訳に関するレポーター活性（ｙ軸）を示す一組のヒストグラムである。対照と比較した場合のルシフェラーゼおよびＣＡＴ活性を示す。これらの実験は３回反復し、代表的データを示した。それぞれの棒は３組の平均±ＳＥＭからなる。
【図６０】図６０Ａ〜６０Ｈは、８種のヒストグラムのセットである。図６０Ａ〜６０Ｄは、３５Ｓ‐メチオニン取り込みによる総タンパク質合成（ｙ軸）を、内皮細胞（ＭＬＥＣ）（図６０Ａおよび６０Ｂ）について、ならびに野生型（図６０Ａおよび６０Ｃ）およびβ３インテグリンノックアウト（図６０Ｂおよび６０Ｄ）の同腹仔マウスの胚腺維芽細胞について（ＭＥＦ）（図６０Ｃおよび６０Ｄ）示したものであり、ここで細胞は、（ｘ軸）ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ３（４．５μＭ）、Ｔ７（４．５μＭ）、Ｔ７突然変異ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した。図６０Ｅ〜６０Ｇは、対照のパーセントとしてのルシフェラーゼ（Ｌｕｃ；黒色棒）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；交差線棒）のレポーター活性を、内皮細胞（ＭＬＥＣ）（図６０Ｅおよび６０Ｆ）について、ならびに野生型（図６０Ｅおよび６０Ｇ）およびβ３インテグリンノックアウト（図６０Ｆおよび６０Ｈ）の同腹仔マウスの胚腺維芽細胞について（ＭＥＦ）（図６０Ｇおよび６０Ｈ）示したものであり、ここで、細胞は、（ｘ軸）ツムスタチン−４５−１３２（４．５μＭ）、Ｔ３（４．５μＭ）、Ｔ７（４．５μＭ）、Ｔ７突然変異ペプチド（４．５μＭ）、エンドスタチン（４．５μＭ）またはラパマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した。これらの実験は３回反復し、代表的データを示した。それぞれの棒は３組の平均±ＳＥＭからなる。
【図６１】図６１Ａ〜６１Ｆは、８種のヒストグラムのシリーズである。図６１Ａは、（ｘ軸）ビトロネクチンコーティングプレートへの結合時間無しでＴ３ペプチドの非存在下（「０−」棒）、３０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「３０−」棒）、３０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「３０＋」棒）、６０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「６０−」棒）および６０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「６０＋」棒）の処置の下における、ｐＦＡＫ／ＦＡＫの相対密度（ｙ軸）を示す。図６１Ｂは、（ｘ軸）ビトロネクチンコーティングプレートへの結合時間無しでＴ３ペプチドの非存在下（「０−」棒）、３０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「３０−」棒）、３０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「３０＋」棒）、６０分の結合時間とＴ３ペプチド非存在下（「６０−」棒）および６０分の結合時間と５０μｇ／ｍｌのＴ３ペプチド（「６０＋」棒）の処置の下における、ＰＩ３キナーゼ活性（ｙ軸）を示す。図６１Ｃは、図６１Ａと同じ処置（ｘ軸）の下でのｐＦＡＫ／ＦＡＫの相対密度（ｙ軸）を示す。図６１Ｄは、（ｘ軸）ｍＴＯＲトランスフェクション無しでペプチド処置無し（「−−」棒）、ｍＴＯＲトランスフェクション有りでペプチド処置無し（「＋−」棒）、ｍＴＯＲトランスフェクション有りでツムスタチン−４５−１３２処置有り（「＋Ｔｕｍ−５」棒）およびｍＴＯＲトランスフェクション有りでペプチドＴ３処置あり（「＋Ｔ３」棒）の処置の下における、ｍＴＯＲキナーゼ活性（ｙ軸）を示す。図６１Ｅは、ＦＢＳなし、Ｔ３、ツムスタチン−４５−１３２、ラパマイシン、エンドスタチンまたはＦＢＳで処置した（ｘ軸）後の、Ｃ−ＰＡＥ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ結合４Ｅ−ＢＰ１の密度（ｙ軸）を示す。図６１Ｆは、対照のｌａｃＺ（陰をつけた棒）、構成性で活性なＡｋｔ（交差線棒）のｃＤＮＡを含むアデノウイルスベクターで感染させた、または、全く感染していない（黒色棒）、のいずれかであるＣ−ＰＡＥについてのＣＡＴ活性に対して相対的なパーセントルシフェラーゼ活性を示す。次に細胞を血清枯渇させ、ｐｃＤＮＡ−ＬＵＣ−ｐｏｌ−ＣＡＴでトランスフェクトし、１０％ＦＣＳ含有培地存在下においてＴ３ペプチドで処置した。
【図６２】図６２は、対照のベヒクル処置（○）、および１ｍｇ／ｋｇ（□）または２．５ｍｇ／ｋｇ（◇）のＴ８での処置の後の種々の日数（ｘ軸）の平均腫瘍容量（ｍｍ３；ｙ軸）を示すグラフである。
【図６３】図６３は、対照の処置（○）、および、毎日ＴＰ３を１ｍｇ／ｋｇ（◇）、毎日ＴＰ３を５ｍｇ／ｋｇ（×）、毎日Ｔ８を５ｍｇ／ｋｇ（□）、または１週間に２回Ｔ８を５ｍｇ／ｋｇ（＋）投与での処置について、処置開始後種々の日数（ｘ軸）における腫瘍容量の比（Ｖ／Ｖｏ；ｙ軸）を示すグラフである。
【図６４】図６４Ａおよび６４Ｂは、種々の処置についての処置開始後の種々の日数（ｘ軸）における平均腫瘍容量の比（ｍｍ３；ｙ軸）を示す一組のグラフである。図６４Ａにおいては、処置は：Ｔ７用保存ベヒクル（○）、Ｔ７毎日（□）、Ｔ８用保存ベヒクル（◇）、Ｔ８毎日（×）、ＴＰ３毎日（＋）、ＳＰ１毎日（△）およびＳＰ２毎日（●）とした。図６４Ｂにおいては、処置は：Ｔ８用保存ベヒクル（○）、Ｔ８毎日（□）、Ｔ８週２回（◇）およびＴ８週１回（×）とした。
【図６５】図６５Ａおよび６５Ｂは、対照処置（○）、Ｔ８ペプチド５ｍｇ／ｋｇで毎日処置（□）、ＳＰ２を５ｍｇ／ｋｇ（◇）、Ｔ８−３を１ｍｇ／ｋｇ（×）または５ｍｇ／ｋｇ（＋）、またはＰ２を１ｍｇ／ｋｇ（△）または５ｍｇ／ｋｇ（●）について、処置開始後種々の日数（ｘ軸）の、ヌードマウスのＭＤＡＭＢ−４３５ヒト乳癌同所移植モデル（図６５Ａ）およびヌードマウスのＰＣ３ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデル（図６５Ｂ）における平均腫瘍容量（ｍｍ３；ｙ軸）を示す一組のグラフである。図６５Ａおよび６５Ｂは、それぞれＭＤＡＭＢ−４３５およびＰＣ３異種移植片モデルに関する結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ．Ｂ】
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【図４Ａ．Ｂ】
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【図４Ｃ．Ｄ】
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【図５Ａ．Ｂ．Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図１０Ａ．Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ．Ｂ．Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ．Ｂ】
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【図２４Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ．Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ．Ｂ．Ｃ】
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【図３３Ａ．Ｂ】
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【図３４Ａ．Ｂ】
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【図３５】
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【図３６Ａ．Ｂ．Ｃ】
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【図３７】
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【図３８Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図４４Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図４４Ｅ．Ｆ．Ｇ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ．Ｂ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図５８Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ】
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【図５９Ａ．Ｂ】
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【図６０Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ】
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【図６０Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ】
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【図６１Ａ．Ｂ．Ｃ】
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【図６１Ｄ．Ｅ．Ｆ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ．Ｂ】
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【図６５Ａ．Ｂ】
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