(57)【要約】【課題】  溶液から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を分離する方法を提供する。  【解決手段】  本発明では、ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）を、バイモーダル高耐塩性マトリックス上での陽イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及び陰イオン交換に付す。バイモーダル高耐塩性陽イオン交換マトリックスの使用によって、細胞培養上清の精製を直接（それ以上の希釈を要しないという意味）実施することができる。バイモーダル陽イオン交換マトリックスの高い結合容量により、従来の陽イオン交換マトリックスよりもマトリックスの必要量が低減できる。従って、本発明では、体積及び作業コストの実質的な節約が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を分離する方法であって、ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）を以下のクロマトグラフィー工程に付すことを含む方法。
（ａ）バイモーダル高耐塩性マトリックスでの陽イオン交換、
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及び
（ｃ）陰イオン交換。
【請求項２】
工程（ａ）に付す際のＣＣＳの伝導率が約１０ｍＳ／ｃｍ超であり、例えば約１５ｍＳ／ｃｍ超、好ましくは約２０ｍＳ／ｃｍ超、例えば約２５〜５０ｍＳ／ｃｍである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記バイモーダル陽イオン交換マトリックスが、荷電相互作用並びに水素結合及び／又は疎水性相互作用によってｒＨＳＡと相互作用し得る、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前にＣＣＳを熱処理することを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）の前に還元剤存在下でＣＣＳを熱処理することを含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）で、フェニルリガンド、脂肪族リガンド及び／又は複素環式リガンドを含むＨＩＣマトリックスを利用する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）で用いる陽イオン交換マトリックスの量が、工程（ｂ）で用いるＨＩＣマトリックスの約半分の量である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）が、弱陰イオン交換工程である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
弱陰イオン交換体のリガンド密度が、５０μｍｏｌ／ｍｌゲル／マトリックス超、好ましくは１００μｍｏｌ／ｍｌゲル／マトリックス超、最も好ましくは約１６０μｍｏｌ／ｍｌゲル／マトリックスである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
精製ｒＨＳＡが工程（ｃ）の結合画分のみから回収される、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製、特にヒト血清アルブミンの精製の分野に関する。本発明の方法は一連のクロマトグラフィー工程を利用し、その結果大規模作業での使用に適した効率的精製が得られる。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血漿中に最も豊富に存在するタンパク質であり、その役割は浸透圧の維持に寄与するとともに、栄養物及び代謝物に結合してその輸送を可能にすることである。ＨＳＡには、例えばアルブミン欠乏又はアルブミン合成の低下、出血性ショックなどによる低アルブミン血症の治療薬として、多大な医薬及び科学的な関心がもたれている。利用可能な最古の方法では、ＨＳＡは血液から精製されている。しかし、こうした方法には、例えば血液供給が散発的であること、経済的に不利であること、並びに肝炎ウイルス及び特にＡＩＤＳウイルスのような望ましくない物質の混入を引き起こす等の問題がある。こうした問題を避けるため、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）を生産するための組換えＤＮＡ技術に基づく代替法が最近開発されている。多数の組換え方法が示唆されているが、発酵ブロスからのｒＨＳＡの精製は重要な工程であって、これを改善する必要性が依然存在していることが示されている。
【０００３】
欧州特許出願公開第０６１２７６１号には、遊離の非抗原性夾雑物を含まない高純度組換えヒト血清アルブミンの生産法が開示されている。この方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ホウ酸又はその塩を用いた処理とその後の限外濾過、及び熱処理のような他の工程と組み合わせた特定の条件下で疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を利用する。しかし、その一連の多数の工程は、複雑すぎ、工業的な大規模作業に使用するには経費がかかりすぎる。
【０００４】
欧州特許出願公開第０５７０９１６号にも、遺伝子操作によって組換えヒト血清アルブミンを生産する方法が開示されており、その精製は、培養上清を、限外濾過、熱処理、酸処理及び再度の限外濾過に付した後、陽イオン交換体、疎水性クロマトグラフィーキャリア及び陰イオン交換体で処理し、塩析に付すという多数の工程の組合せによって行われる。しかし、上記の欧州特許と同様、この精製スキームは複雑すぎ、時間がかかり、大規模作業用の効率的手順を提供するには経費がかかりすぎる。
【０００５】
欧州特許出願公開第０６９９６８７号には、ｒＨＳＡの精製法が開示されており、この方法では、培地をプロテアーゼが不活性化されるまで加熱処理した後、陽イオン交換粒子の流動層と接触させる。溶出液は、次いで限外濾過、ＨＩＣ及び陰イオン交換クロマトグラフィーに付してもよい。しかし、流動層の使用は従来の充填ベッドクロマトグラフィー工程とは異なる設備を要する。従って、培養ブロスからのｒＨＳＡの精製のためのさらに効率的で経済的に魅力のある手順が依然として必要とされている。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０６１２７６１号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０５７０９１６号
【特許文献３】欧州特許出願公開第０６９９６８７号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの目的は、大規模作業に容易に適合される組換えＨＳＡの精製法を提供することである。これは、ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）を以下の工程：
（ａ）バイモーダル高耐塩性マトリックスでの陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
に付すことを含む方法によって達成される。
【０００７】
本発明の方法に含まれるプロセス工程は、上記で引用した方法よりも少ない。さらに、工程（ａ）で用いるバイモーダル高耐塩性陽イオン交換マトリックスは、細胞培養上清を全く希釈せずに使用することができる。これは、従来法に比べると、総体積が大幅に低下し、そのためコストが大幅に低減するので、有利な特徴である。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、ｒＨＳＡの精製に用いるクロマトグラフィー工程の吸着力を向上させることである。これは、高塩リガンド（ＨＳＬ）として知られるリガンドを含む陽イオン交換体を工程（ａ）で用いる上記の方法によって達成できる。このリガンドは単離すべき物質と相互作用する２以上の部位（荷電相互作用をもたらす部位と水素結合及び／又は疎水性相互作用による相互作用をもたらす部位）を含むという意味でバイモーダルである。
【０００９】
本発明の別の目的は、最終産物の着色成分量をさらに低減すること、特に最終産物の純度をさらに向上することである。これは、弱陰イオン交換体を用いる上記の方法を用いることによって達成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第一の態様は、溶液から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を分離する方法であって、ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）を以下のクロマトグラフィー工程：
（ａ）バイモーダル高耐塩性マトリックスでの陽イオン交換、
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及び
（ｃ）陰イオン交換。
に付すことを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の特定の実施形態では、工程（ａ）に付す際のＣＣＳの伝導率は約１０ｍＳ／ｃｍ超であり、例えば約１５ｍＳ／ｃｍ超、好ましくは約２０ｍＳ／ｃｍ超、例えば約２５〜５０ｍＳ／ｃｍ、特に２５〜３０ｍＳ／ｃｍであり、これは、ここで用いる高塩リガンド（ＨＳＬ）として知られるタイプのリガンドを含む陽イオン交換体の種類によって可能となる。このように、本発明に伴う重要な利点は、本発明ではＣＣＳを希釈する必要がなく、そのため従来報告されたｒＨＳＡの精製法に比べて、陽イオン交換工程の際のサンプルの使用体積を格段に低減できることである。
【００１２】
ＣＣＳはいかなる発酵ブロスであってもよいが、好ましくは細胞を例えば遠心分離で除去したものである。従って、本発明で単離するｒＨＳＡの起源は、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、又は動物細胞株など、適当な宿主であればよい。好適な実施形態では、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。組換え宿主細胞の生産法、及び組換え宿主細胞によるｒＨＳＡのようなタンパク質の発現のための条件は周知であり、例えば、この分野の様々な特許出願については上記で引用した欧州特許０６１２７６１号を参照されたい。
【００１３】
工程（ａ）の主な目的は、負に荷電した色素のような低分子量着色物質を除去することである。従って工程（ａ）は、高塩リガンド（ＨＳＬ）として知られるタイプのリガンドを含む陽イオン交換体を利用する。これに関して、「高塩」とは、この部類のイオン交換体に特徴的な高い塩濃度に耐性をもつという上述の特性をいう。この特性は、リガンドの性状によってもたらされ、各リガンドが単離すべき物質（本発明ではｒＨＳＡ）と相互作用し得る２つの基を含むという意味でバイモーダルである。第一の結合モードは、荷電結合基、つまりイオン交換基によってもたらされ、そのためＨＳＬ型マトリックスはイオン交換体として分類される。第二の結合モードは第二の結合基によってもたらされ、この結合基は単離すべき物質との付加的な相互作用を与える。通常、第二の結合基は水素結合又は疎水性相互作用をもたらすが、以下で詳しく説明する通り、その他の相互作用も想定される。これに関して、本明細書中で用いる「バイモーダル」という用語は、２以上の結合モードが関与することを規定するものであり、２通りのみの結合モードに限定されない。本願では、ＨＳＬ型の陽イオン交換体を利用するが、かかる陽イオン交換体については既に詳細が開示されており、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ０１／０８２０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）を参照されたい。ただし、以下、これについて概説する。
【００１４】
陽イオン高塩リガンド（ＨＳＬ）に存在する荷電結合基は、スルホン酸（−ＳＯ3−／−ＳＯ3Ｈ）、硫酸（−ＯＳＯ3−／−ＯＳＯ3Ｈ）、カルボン酸（−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ）、リン酸（−ＯＰＯ32−／−ＯＰＯ3Ｈ−／−ＯＰＯ3Ｈ2及びホスホン酸（−ＰＯ32−／−ＰＯ3−Ｈ／−ＰＯ3Ｈ2）からなる群から選択し得る。ある好適な実施形態では、ＨＳＬ型陽イオン交換体は、弱陽イオン交換体、すなわち、ｐＫａが３を超える陽イオン交換体である。別の実施形態では、ｐＫａが３未満の強陽イオン交換体である。かかる弱陽イオン交換体の代表例は、カルボン酸（−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ）、リン酸（−ＯＰＯ32−／−ＯＰＯ3Ｈ−／−ＯＰＯ3Ｈ2）及びホスホン酸（−ＰＯ32−／−ＰＯ3Ｈ−／−ＰＯ3Ｈ2）である。
【００１５】
第二結合基は１以上の水素結合原子を含むもので、陽イオン交換基から１〜７原子隔てられた箇所に位置する。水素結合原子は、水素結合に関与し得る原子（水素以外のもの）である。Ｋａｒｇｅｒ他，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９７３）４２頁参照。水素結合原子はヘテロ原子からなる基から選択することができ、例えば、酸素（カルボニル酸素、エーテル酸素、エステル酸素、ヒドロキシ酸素、スルホン酸素、スルホンアミド酸素、スルホキシド酸素、芳香族環内の酸素など）、窒素（アミド窒素、芳香族環内の窒素など）、イオウ（チオエーテルイオウ、芳香族環内のイオウなど）、並びにｓｐ−及びｓｐ2−混成炭素、さらにフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードのようなハロ基（好ましくはフルオロ）がある。第二の結合基は通例、非荷電原子又はｐＨ変化で荷電し得る原子を含む。
【００１６】
工程（ａ）で用いる陽イオン交換リガンドの安定性は、概括的には、０．１又は１ＭのＮａＯＨ水溶液に４０時間以上耐えることができると規定できる。本発明の工程（ａ）で有用な陽イオン交換体の適当な化学的リガンド構造の具体例については、上述のＰＣＴ／ＥＰ０１／０８２０３を参照されたい。本発明の特定の実施形態では、工程（ａ）では、本願の図１Ａに例示したＨＳＬ陽イオン交換リガンドを用いる。
【００１７】
本発明の工程（ａ）で用いる陽イオン交換体は、機能的用語で定義すれば、
（ａ）０．３Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度で参照水溶液中での陽イオン交換によってｒＨＳＡを結合できるものであり、かつ
（ｂ）上記物質について、上記のイオン強度で、スルホプロピル基−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3−を含む参照陽イオン交換体での上記物質の破過容量の２００％以上（例えば３００％以上、５００％以上又は１０００％以上）の破過容量をもたらすことができるものである。
【００１８】
ＰＣＴ／ＥＰ０１／０８２０３には、かかる参照イオン交換体について詳細に記載されている。本発明の方法で用いる陽イオン交換体における陽イオン交換体リガンドの存在量は通常、１〜４０００μｍｏｌ／ｍｌマトリックス（例えば２〜５００μｍｏｌ／ｍｌマトリックス）の間隔で選択されるが、好ましくは５〜３００μｍｏｌ／ｍｌマトリックスである。使用可能な好ましい範囲は、特に、マトリックス、リガンドなどの性状に応じて決まる。例えば、陽イオン交換リガンドのレベルは通常、アガロース系マトリックスでは１０〜３００の範囲内である。デキストラン系マトリックスでは、この間隔は通常、１０〜６００μｍｏｌ／マトリックスｍｌである。
【００１９】
上記ＰＣＴ／ＥＰ０１／０８２０３には、ＨＳＬ型陽イオン交換体に有用なマトリックス材料についても詳細に記載されている。簡単に説明すると、かかるマトリックスは、有機又は無機材料をベースとするものでよい。マトリックスは好ましくは親水性であってポリマーの形態であり、水に不溶性で水中で幾分膨潤し得る。疎水性ポリマーを親水性となるように誘導体化したものも、この定義に包含される。適当なポリマーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランのような多糖類系のポリヒドロキシポリマー、並びにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）及びポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコールのような完全な合成ポリマー、さらには、スチレンとジビニルベンゼンをベースとしたポリマー、並びに上述のポリマーの対応モノマーの２以上を含むコポリマーも包含される。水溶性ポリマーを、例えば、吸着又は共有結合による不溶物への架橋及び結合によって誘導体化して不溶性になるようにすることもできる。疎水性ポリマー（例えば、モノビニルベンゼンとジビニルベンゼンのコポリマー）への親水基の導入は、ＯＨに変換可能な基を有するモノマーの重合、或いは最終ポリマーの親水性化（例えば、親水性ポリマーのような適当な化合物の吸着）によって行い得る。適当なマトリックスの具体例は、市販のビーズ状Ｓｅｐｈａｒｏｓｅであるが、これはアガロース系のもので、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）から市販されている。支持マトリックス用に適した無機材料は、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタルなどである。
【００２０】
上記ＰＣＴ／ＥＰ０１／０８２０３には、ＨＳＬ型陽イオン交換体の調製について詳しく開示されている。また、リガンド形成化合物を表面に固定する方法の総説が、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．及びＳｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．（編），Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ，１９９２に記載されている。
【００２１】
上述の通り、ＨＳＬ型イオン交換体の利点の一つは、上述の参照スルホプロピル陽イオン交換体のような従来の陽イオン交換体で通常実施しているイオン強度よりも高いイオン強度で、カラムへの吸着、つまりリガンドへのｒＨＳＡの結合を実施できることである。結合の際に用いるべき正確なイオン強度は、タンパク質の性状、マトリックス上のリガンドの種類と濃度に依存する。有用なイオン強度は、ＮａＣｌ濃度（純水）に換算して０．１Ｍ以上（例えば０．３Ｍ以上、さらには０．５Ｍ以上）であることが多い。脱離は、例えばイオン強度の上昇及び／又はｐＨ変化によって実施し得る。イオン強度の変化に用いられる典型的な塩は、可溶性アンモニウム塩、又はリン酸、硫酸などの金属塩から選択され、特にアルカリ金属塩及び／又はアルカリ土類金属塩から選択される。同じ塩を吸着工程で用いることもできるが、低濃度で用いられることが多い。
【００２２】
本発明の一実施形態において、工程（ａ）で用いる陽イオン交換マトリックスの量は、工程（ｂ）で用いるＨＩＣマトリックスのほぼ半分の量である。従って、本発明の利点の一つは、バイモーダル陽イオン交換マトリックスが結合容量に優れていることであり、従来の陽イオン交換体よりも体積を減らすことができ、運転コストの削減が可能となることである。伝導率約２５〜３０ｍＳ／ｃｍのような高塩濃度の存在下では、市販ＳＰ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅのｒＨＳＡ吸着量は約２〜４ｍｇ／ｍＬ充填ゲルであるが、高塩リガンドのプロトタイプ（図１Ａ）の吸着量は５０ｍｇ／ｍＬ以上であることが判明した。従って、バイモーダル高塩リガンド（ＨＳＬ）を使用すると、精製プロセスが格段に簡略化かつ改善され、大規模運転コストが削減されることは明らかである。
【００２３】
本発明の一実施形態では、工程（ａ）の前にＣＣＳを熱処理する。加熱は直接、すなわち宿主細胞が存在したまま実施してもよいし、或いは細胞を遠心分離、限外濾過その他の適当な方法で除去した後に実施してもよい。加熱は、５０〜１００℃で１分〜数時間、好ましくは６０〜７５℃で２０分〜３時間、最も好ましくは約６８℃で約３０分間実施し得る。加熱は、サーモスタットを備えた水浴で好適に実施される。一実施形態では、加熱前に、安定剤（例えばｐＨ約６．０のカプリル酸ナトリウム）を添加する。その他の安定剤、例えばアクリルトリプトファン、有機カルボン酸なども使用できる。加熱後、ＣＣＳのｐＨを好ましくは、その後の陽イオン交換体での吸着に適した低い値（例えばｐＨ４．５）に調整する。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、工程（ａ）で得られたもの、つまりＨＳＬ型マトリックス充填カラムの結合画分を、工程（ｂ）の前に熱処理する。好ましくは、システインのような還元剤を添加する。有用な還元剤のその他の例は、メルカプトエタノール、還元型グルタチオンなどである。この目的は、工程（ｂ）での着色物質の除去を容易にすることである。この加熱処理は概して上記と同様に実施されるが、さらに好ましい実施形態では、約６０℃のように若干低い温度で、幾分長時間（例えば約６０分間）実施される。
【００２５】
上述の通り、本発明の工程（ｂ）では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いる。工程（ｂ）の主な目的は、ｒＨＳＡのタンパク質分解生成物（通常約１０〜５０ｋＤａの大きさのもの）を除去することである。ＨＩＣは、クロマトグラフィー分野で周知の原理であり、表面疎水性の差に基づく様々な分離用ツールを与える。親水性と考えられる多数の生体高分子でも、クロマトグラフィーマトリックスに結合した疎水性リガンドとの相互作用が可能な十分な疎水性基が露出されていることが判明している。ｒＨＳＡの精製にＨＩＣを用いることは、例えば欧州特許０６９９６８７号にみられるように、既に示唆されている。他の周知の分離原理、すなわち逆相クロマトグラフィーと比べると、ＨＩＣではマトリックス上のリガンド密度の低いものが利用される。この特徴によって、目的タンパク質の生物学的活性を保つのに役立つ温和な溶出条件で、選択性を高めることができる。本発明に関しては、ＨＩＣ工程は、ｒＨＳＡのタンパク質分解生成物を吸着させ、完全長ｒＨＳＡを非結合画分に溶出するために用いられる。マトリックス上の固定化リガンドとｒＨＳＡとの疎水性相互作用は、使用する緩衝液のイオン強度を若干高めることによって増大する。現在、ＨＩＣ用には多数の市販分離材料があり、本発明は、いかなる特定のマトリックス及び／又はリガンドにも限定されない。従って、広義には、工程（ｂ）で用いるマトリックスは、有機材料系のものでも、無機材料系のものでもよい。有機材料の場合、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプンのような天然ポリマーであってもよいし、或いは、ジビニルベンゼン、スチレンのような合成ポリマーであってもよい。無機マトリックス材料の場合、シリカが周知であり、しかも常用されている材料である。好適な実施形態では、マトリックスは架橋アガロースであり、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のように多数の企業から市販されている。一実施形態では、工程（ｂ）で用いるＨＩＣマトリックスは、フェニル、ブチル（ｎ−ブチルなど）、オクチル（ｎ−オクチルなど）からなる群から選択される、ｒＨＳＡと相互作用し得る１つ以上の疎水性リガンドを好ましくはアガロースマトリックス上に有する。或いは、エーテル、イソプロピル又はフェニルのような疎水性リガンドが、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）のＳｏｕｒｃｅ（商標）のようなジビニル−ベンゼンマトリックス上に存在する。最も好ましい実施形態では、工程（ｂ）では架橋アガロースマトリックス上のフェニルリガンドを用いる。このマトリックスは好ましくは多孔性ビーズからなり、ビーズは約９０％を上回る水分量、好ましくは約９４％の水含量を有し得る。平均粒度は、例えば、湿性ビーズで測定して１０〜１５０μｍ、好ましくは１００未満（例えば約９０μｍ）である。マトリックス上のリガンド密度は、例えば、２０〜６０μｍｏｌ／ｍｌゲル（例えば約４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）とし得る。具体例として、使用するマトリックスは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒ��ｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである。この具体例では、マトリックスにＦａｓｔ  Ｆｌｏｗの表示が用いられており、その架橋度は、ベッド高さ１５ｃｍを通して圧力１バールでの典型的流速が３００〜４００ｃｍ／ｈとなるプロセス適応流動特性を与えるように最適化されている。ただし、かかるプロセスパラメーターを操業規模に応じて適合させることは当業者が容易になし得ることである。この工程は、ｐＨ約４〜８（例えば６．５〜７）、塩濃度約０．０１〜０．５Ｍ（例えば０．０５〜０．２Ｍ）で実施することができる。
【００２６】
上述の通り、本発明の工程（ｃ）では、工程（ｂ）の微量不純物を除去、特に不要化合物（例えば低分子量色素）を除去するため、陰イオン交換体、好ましくは弱陰イオン交換体を用いる。本発明では、最終ｒＨＳＡ生成物には望ましくない負に荷電した化合物を結合できる十分な量のリガンドが存在していれば、いかなる特定の陰イオン交換体物質の使用にも限定されない。陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、不純物除去のため、例えば、ｐＨ約５．０〜８．０、塩濃度０．０１〜０．２Ｍで実施できる。マトリックス材料に関しては、上述の通り、いかなる有機材料又は無機材料であってもよい。ある好ましい実施形態では、マトリックスは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のような架橋アガロースの多孔性ビーズからなる。これに結合したリガンドは弱陰イオン交換体であり、結合基は、例えば、第一又は第二アミンである。かかる結合基は、例えばマトリックスに近接したエーテル基を有するアルキル鎖を介して、マトリックスに結合させることができる。スペーサー、アームなどを介してマトリックスに結合基を結合させる様々な方法が文献に記載されており、上述の通り、本発明はいかなる特定の構造にも限定されない。例示的な実施形態では、式−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ＋（Ｃ2Ｈ5）2Ｈのリガンドを有するアガロースビーズ、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）が用いられる。この実施形態では、カラムの結合画分と溶出される非結合画分の双方でｒＨＳＡが得られるが、幾つかの用途では十分である。
【００２７】
ただし、最終生成物の純度が問題とされる場合には、さらに好適な別の実施形態では、エステル基を２個、好ましくはヒドロキシル基も２個含むリガンドを有するアガロースビーズを用いる。この場合の結合基は好ましくは第一アミンである。この実施形態の利点は、ｒＨＳＡがマトリックスに適度に結合した画分にのみ存在し、格段に向上した純度及び操作上の利便性が得られることである。この実施形態についての例示的な一般式を図１に示すが、構造の類似したものを工程（ｃ）に用いる方法も本発明に包含される。
【００２８】
本発明は、リガンドの一般構造が同一で、上記マトリックスに類似したマトリックスを使用することも包含する。また、図１Ａの式における「ゲル」という表現は、工程（ｂ）について上述した通り、あらゆるマトリックスを包含するものである。上述のリガンドを含むマトリックスの市販品の一例は、ＢｕｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）製）である。後記の実施例では、１６０μｍｏｌ／ｍｌのリガンド密度を用いた。従って、このマトリックスのリガンド密度を最適化すれば特に有益な結果が得られると考えられる。また、最初に記載した種類の陰イオン交換体、つまりＤＥＡＥ型のマトリックスを用いる場合には、最後に記載したＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ媒体に比べ、必要とされる体積が大きい、例えば約３倍の体積が必要とされると考えられる。従って、本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ｃ）での陰イオン交換基として第二アミンを利用し、かつ約１００μｍｏｌ／ｍｌ以上のリガンド密度を用いる。
【００２９】
特定の実施形態では、陰イオン交換体のリガンド密度は、５０〜３００μｍｏｌ／ｍｌの範囲（例えば１００〜２００μｍｏｌ／ｍｌ）であり、好ましくは約１６０μｍｏｌ／ｍｌである。その一つの利点は、ｒＨＳＡが結合画分と非結合画分の双方に存在しかねないＤＥＡＥと比較して、精製ｒＨＳＡを工程（ｃ）の結合画分のみから回収できることである。
【００３０】
図面の詳細な説明
図１Ａ〜Ｄは、本発明での使用に適したリガンド構造を示す。さらに具体的には、図１Ａは高塩リガンド（ＨＳＬ）型陽イオン交換体を示し、図１Ｂは疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス、つまりＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを示し、図１Ｃ及び図１Ｄは２種類の代替的な陰イオン交換体、すなわち市販のＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（図１Ｃはｎ＝０の場合）と改質ブチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（後述の通りリガンド密度を高めたもの）の構造を含む一般式を示す。
【００３１】
図２は、工程（ａ）の結果、すなわち図１Ａに示すリガンド構造を有する陽イオン交換マトリックスを含む２０ｍＬカラムでの未希釈細胞培養上清（ＣＣＳ）１４７ｍＬの陽イオン交換クロマトグラフィーを示す。画分１ＢにｒＨＳＡが含まれるが、画分２Ａに代表される不純物からはっきりと分離されている。
【００３２】
図３は、工程（ｂ）の結果、すなわち図１Ｂに示すＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含む４０ｍｌカラムでの図２の画分２Ｂの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を示す。画分ＡがｒＨＳＡに相当する。
【００３３】
図４は、工程（ｃ）の結果、すなわち以下の実験の項に記載する改質ブチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含む４０ｍｌカラムでの図３の画分３Ａの陰イオンクロマトグラフィーを示す。精製ｒＨＳＡは画分４Ｂにある。
【００３４】
図５は、本発明による３段階法を用いて得た主画分のネイティブＰＡＧＥ（８〜２５％）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜１５％）の分析結果を示す。銀染色した非変性ＰＡＧＥ（５Ａ）では、１スポット当たり約３．３μｇのタンパク質を添加した。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５Ｂ）では、１スポット当たり約２μｇのタンパク質を添加した。クマーシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５Ｃ）では、１スポット当たり約１０μｇのタンパク質を添加した。１はＣＣＳであり、２はＨＳＬ陽イオン交換体（Ｃａｔ．Ｅｘ．）（非結合画分）であり、３はＨＳＬ陽イオン交換体（Ｃａｔ．Ｅｘ．）（結合画分）であり、４はＰｈｅｎｙｌ（非結合画分）であり、５．Ｐｈｅｎｙｌ（結合画分）であり、６はＨｉＳｕｂ．Ｂｕｔｙｌであり、７はＨｉＳｕｂ．Ｂｕｔｙｌ（結合画分）であり、８はＨＳＡ（対照）である。矢印はｒＨＳＡの位置を示す。
【実施例】
【００３５】
実験
材料及び方法
ｒＨＳＡを含む細胞培養上清（ＣＣＳ）は、遺伝子改変Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を２週間以上発酵した後、濾過で細胞を分離して調製した。ＣＣＳは緑色であり、これを約２００ｍｌのアリコートに分けて、使用時まで−２０℃で保存した。ＣＣＳの品質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））の分析カラムでのゲル濾過で確認した。この分析で、ＣＣＳ中の高分子量（ＨＭＷ）不純物と低分子量（ＬＭＷ）不純物の相対量、並びに単量体型ｒＨＳＡの大まかな含有量を得た。
【００３６】
カプリル酸ナトリウム（オクタン酸、Ｎａ塩）及びＬ−システインは、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。ヒト血漿からクロマトグラフィー法で精製したＨＳＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）の血漿処理部門のＩ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ氏から入手した。各種サンプル中のタンパク濃度はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法として知られる）を用いて決定した。標準曲線の作成にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。紫外／可視吸光度測定は島津ＵＶ−１６０Ａ自記分光光度計（株式会社島津製作所）を用いて行った。その他使用したすべての化学物質は分析又は試薬グレードであった。
【００３７】
分析用電気泳動は、Ｐｈａｓｔｇｅｌ電気泳動システムと適当なＰｈａｓｔＧｅｌ媒体及び緩衝液Ｓｔｒｉｐｓ（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて実施した。電気泳動分析はネイティブＰＡＧＥ（８〜２５％）又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、１０〜１５％）ゲルを製造業者の推奨通り用いて実施した。１スポット当たりのサンプル添加量は以下の通りであった。非変性サンプルでは約３．３μｇ、ＳＤＳ処理サンプルでは２μｇであり、いずれもＳｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））で染色した。クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したＳＤＳ処理サンプルでは１０μｇであった。
【００３８】
質量分析（精製ｒＨＳＡ及び血漿由来ＨＳＡの質量を求めることを目的）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）のＪ．Ｆｌｅｎｓｂｕｒｇ博士がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置を用いて行った。天然ＨＳＡ及び組換えＨＳＡのトリプシン消化ペプチドマッピングもこの装置を用いて行った。後者の解析で得られた結果は、精製ＨＳＡから得たトリプシンペプチドの公知の配列と対照して、ｒＨＳＡの最も可能性の高い一次配列を得るのに用いた。
【００３９】
マトリックス及びクロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー実験は、ＵＮＩＣＯＲＮ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１）ソフトウェアで制御したＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて室温（約２３℃）で実施した。工程（ｂ）で用いた分離マトリックスは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）の定番商品であるＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）である。工程（ｃ）では、市販ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））又は改質マトリックスのいずれかを用いた。この改質マトリックスは、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を、市販品（２０〜４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）よりも高いリガンド密度（バッチ番号Ｕ２３８０２５：１６０μｍｏｌ／ｍｌ）で製造したものである。この改質マトリックスを、本明細書では「改質Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」という。さらに、工程（ａ）では、ＨＳＬ型のプロトタイプマトリックス陽イオン交換体（図１Ａ参照）を用いた。この媒体を２０％エタノール中の濃厚懸濁液としてＸＫ２６／２０ガラスカラムに充填して、４０ｍｌのベッド体積を得た。３００ｃｍ／ｈの線流速を用いた。充填カラムを約２ベッド体積の脱イオン水を用いて洗浄して、大半のエタノールを溶出し、次いでサンプル添加前に適当な緩衝液で平衡化した。各種媒体を用いたクロマトグラフィーの各工程での緩衝液の必要量を以下の表１に示す。
【００４０】
緩衝液
緩衝液Ａ：２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５
２５ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウムと４０ｍＬの１Ｍ酢酸を混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：室温（ＲＴ）で約２ｍＳ／ｃｍ。
【００４１】
緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭカプリル酸ナトリウム、ｐＨ７．０
１５５ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4と９５ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と５．８ｇのＮａＣｌと１．６６ｇのカプリル酸ナトリウムを混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：ＲＴで約１６ｍＳ／ｃｍ。
【００４２】
緩衝液Ｃ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２１２ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と３８ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4と５．８ｇのＮａＣｌを混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：ＲＴで１４ｍＳ／ｃｍ。
【００４３】
緩衝液Ｄ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２１２ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と３８ｍＬの０．２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4と１１．７ｇのＮａＣｌを混合し、脱イオン水で１Ｌに希釈。伝導率：ＲＴで２２ｍＳ／ｃｍ。
【００４４】
緩衝液Ｅ：現場洗浄（ＣＩＰ）液
３０％イソプロパノールを１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に溶解
実施例：ｒＨＳＡの精製
細胞培養上清（ＣＣＳ）の熱処理
陽イオン交換クロマトグラフィー工程の前に、まずＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの発酵時に産生したタンパク分解性酵素を不活性化すべくＣＣＳを熱処理した。これは以下の通り実施した。
【００４５】
ＣＣＳの凍結サンプルを融解し、１０ｍＭカプリル酸Ｎａを溶解した。ｐＨを６．０に調整し、水浴（サーモスタットで６８℃に維持）中で３０分間加熱した。サンプルを室温に冷却し、そのｐＨを４．５に調整した。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢのような従来の陽イオン交換媒体を工程（ａ）に用いる場合、伝導率が約５〜１０ｍＳ／ｃｍ（塩濃度約０．１Ｍ）となるように脱イオン水を用いてＣＣＳを２〜８倍（溶液の元の伝導率による）に希釈する必要がある。
【００４６】
これに対して、本発明で用いるＨＳＬ型マトリックスは高い塩濃度に格段に耐性があり、通常は、熱処理ＣＣＳを、その伝導率が約３０ｍＳ／ｃｍ未満である限り、それ以上希釈せずに工程（ａ）に用いることができる。
【００４７】
工程（ａ）の陽イオン交換工程で得られた部分精製ｒＨＳＡ（すなわち、ＨＳＬ型マトリックスに結合した画分）も、以下の通り、工程（ｂ）の前に熱処理した。サンプルのｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで６．０に調整し、還元剤として機能させるためシステインを５ｍＭ濃度となるように溶解した。この溶液を次いで６０℃に維持した水浴中で６０分間加熱した。この操作の主な目的は、ＨＩＣマトリックスによる着色物質の除去を容易にすることである。
【００４８】
工程（ａ）：陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた吸着
陽イオン交換媒体を、ＸＫ１６／２０カラム（充填ベッド体積２０ｍＬ）に充填し、平衡化のため２カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで洗浄した。熱処理ＣＣＳを、１５０ｍＬ  Ｓｕｐｅｒｌｏｏｐ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））によって流速３００ｍＬ／ｈ（１５０ｃｍ／ｈ）でカラムにかけた。ｒＨＳＡの添加量は約１ｇ（すなわち、５０ｍｇ  ｒＨＳＡ／ｍｌ充填ゲル）であった。サンプル添加後、非結合物を３ＣＶの緩衝液Ａで溶出した後、５ＣＶの緩衝液Ｂで結合ｒＨＳＡを溶出した。両画分を別々にプールし、１ＭのＮａＯＨ溶液で結合画分のｐＨを６．０に調整した。この溶液を次いで上述の通り加熱し、室温に冷却し、さらに後述の通りＨＩＣカラムで精製した。プールした各画分の１ｍＬアリコートは、分析用（すなわち、タンパク量、Ａ350／Ａ280比の測定及び電気泳動分析のため）保存した。
【００４９】
再生：カラムは、強く結合した物質を溶出させ、ゲルの機能を回復させるため２ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄した。カラムを同じ溶液中に一晩放置し、次いで４ＣＶの脱イオン水で洗浄してＮａＯＨ及びイソプロパノールの大半を溶出させた。再生カラムを、次回の吸着／脱離プロセスに用いる前に、４ＣＶの緩衝液Ａで再度平衡化した。
【００５０】
工程（ｂ）：ＨＩＣを用いた精製工程
上記工程で得たｒＨＳＡ含有画分を、１５０ｍＬのＳｕｐｅｒｌｏｏｐ（商標）に移し、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）を充填したＸＫ２６／２０カラム（充填ベッド体積４０ｍＬ）にかけた。カラムは予め３ＣＶの緩衝液Ｃで平衡化しておいた。サンプル添加後、カラムを２ＣＶの緩衝液Ｃで洗浄し、ｒＨＳＡを含む非結合物を溶出させた。結合物（主にｒＨＳＡの４５ｋＤａ分解物を含む）は２ＣＶの脱イオン水で溶出させた。
【００５１】
再生：上記と同じ手順。
【００５２】
工程（ｃ）：弱陰イオン交換体を用いた高度精製工程
前段のＨＩＣ工程で得た２つの画分をプールして各々の１ｍＬアリコートを分析用（上記参照）に保存した。カラム（ＸＫ２６／２０）にＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ又は上述の改質Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで充填して、４０ｍＬの充填ベッド体積を得た。各充填媒体を２ＣＶの脱イオン水で洗浄し、次いで約５ＣＶの緩衝液Ｃで平衡化した。ＨＩＣ工程で得られた非結合画分を１５０ｍＬのＳｕｐｅｒｌｏｏｐに移して、上記の２つのカラムのいずれかに加えた。非結合画分は６ＣＶの緩衝液Ｃで（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムから）、又は改質Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから２ＣＶで溶出した。結合画分は、ＤＥＡＥカラムでは２ＣＶの２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で、又は改質Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでは５ＣＶの緩衝液Ｄで溶出した。流速は、全体を通して９０ｃｍ／ｈに維持した。
【００５３】
再生：上記と同じ手順。
【００５４】
使用した各媒体について本発明に従って最適化した溶出プロトコールを表１にまとめた。当業者であれば、上記プロセスをパイロット又は生産規模の操作へ容易に大規模化することができる。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
結果
本３段階精製プロセスは段階的溶出に基づくものであり、大規模作業に容易に適合可能である。工程（ｃ）に高リガンドＢｕｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅを使用すると、非結合画分中に一群として溶出するＬＭＷ不純物が効率的に除去される。高リガンドＢｕｔｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅを使用すると、工程（ｃ）のためのＤＥＡＥ型マトリックスの使用よりも優れたＡ350／Ａ280比が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、本発明による陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーの各種工程での使用に適したマトリックス材料を示す。
【図２】本発明の方法の工程（ａ）による未希釈細胞培養上清（ＣＣＳ）の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。画分２ＢにｒＨＳＡが含まれる。
【図３】図２の画分２ＢのＨＩＣの結果を示す。ｒＨＳＡは画分３Ａに溶出される。
【図４】図３の画分３Ａの陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。精製ｒＨＳＡは画分４Ｂに溶出される。
【図５】本発明による３段階精製プロトコールを用いて得られた主画分の電気泳動分析を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図５】
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【国際調査報告】
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