(57)【要約】本発明はアミロイドベータ由来拡散性リガンド(ADDLs)、 ADDLsを含む組成物、ADDL代替物、ADDL結合性分子、および以上の化合物および組成物のうち任意のものの使用を含む。ADDLsは特定の細胞プロセスを活性化することができる可溶性、球状、非線維状、オリゴマー構造体へと集成したアミロイドβタンパク質を含む。本発明はまた、ADDL特異抗体を生成させる方法、およびADDLsの形成、存在、受容体タンパク質結合および細胞活性に関する検定にADDL特異抗体を使用する方法、そうした抗体を使用してADDLsの形成と活性を阻害する化合物を検出する方法、それにそうした化合物を識別する方法を含む。本発明はさらに、ADDL形成および/または活性の調節に、特に学習記憶障害の治療に、ADDL特異抗体を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンまたはワクチン成分である、宿主生物に免疫反応を生じさせることができるADDLsを含む医薬組成物。
【請求項２】
宿主生物に投与したときにADDL阻害免疫反応を生じさせることができる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
宿主生物に投与したときに抗ADDL抗体を生成させることができる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
宿主生物に投与したときにAD、記憶学習障害、ニューロンの変性または機能不全を予防することができる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５】
宿主生物に投与したときにAD、記憶学習障害、ニューロンの変性または機能不全を改善することができる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ADDLsを含む医薬組成物であって、該組成物を宿主生物に投与したときに、該ADDLsが抗原であるか、免疫原であるかまたは結合性分子として働くことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項７】
ADDL阻害抗体を生成させるために使用する、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ADDL阻害抗体断片、単鎖抗体または他の任意の抗体ミミックを生成させるために使用する、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ADDL阻害結合性分子を生成させるために使用する、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ADDL阻害分子を選択または識別するために使用する、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
宿主生物に投与したときにADDL阻害免疫反応を生じさせることができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１２】
宿主生物に投与したときに抗ADDL抗体を生成させることができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１３】
宿主生物に投与したときにAD、記憶学習障害、ニューロンの変性または機能不全を予防することができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１４】
宿主生物に投与したときにAD、記憶学習障害、ニューロンの変性または機能不全を改善することができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１５】
ADDL阻害抗体を生成させることができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１６】
ADDL阻害抗体断片、単鎖抗体または他の任意の抗体ミミックを生成させることができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１７】
ADDL阻害結合性分子を生成させることができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１８】
ADDL阻害分子を選択または識別することができる単数または複数のエピトープを含む組成物。
【請求項１９】
オリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミックであって、該オリゴマーは宿主生物に投与したときにADDL阻害免疫反応を生じさせうることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２０】
オリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミックであって、該オリゴマーは宿主生物に投与したときに抗ADDL抗体を生成させうることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２１】
オリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミックであって、該オリゴマーは宿主生物に投与したときにAD、記憶学習障害、ニューロンの変性または機能不全を予防しうることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２２】
オリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミックであって、該オリゴマーは宿主生物に投与したときにAD、記憶学習障害、ニューロンの変性または機能不全を改善しうることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２３】
ADDL阻害抗体を生成させるうえで有用なオリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２４】
ADDL阻害抗体断片、単鎖抗体または他の任意の抗体ミミックを生成させるうえで有用なオリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２５】
ADDL阻害および/または結合性分子を生成させるうえで有用なオリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２６】
ADDL阻害分子を選択または識別するうえで有用なオリゴマーへと集成することができるペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２７】
内部ベータシートの形成を可能にする特異的な構造要素を含むペプチドまたはペプチドミミックであって、該形成によって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるようにするオリゴマーへの集成が可能になることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２８】
内部C末端ベータシートの形成を可能にする特異的な構造要素を含むペプチドまたはペプチドミミックであって、該形成によって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるようにするオリゴマーへの集成が可能になることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項２９】
以下のモチーフ：
【化１】
2006508072.tif 000011
(式中Zはベータターンまたは他の任意のベータターンミミックを形成することができるグリシルグリシル、プロリル、または他の任意のジペプチドまたはジペプチドであり、またXは任意のアミノ酸またはアミノ酸ミミックである。)
を含むペプチドまたはペプチドミミックであって、該モチーフの存在によって該ペプチドまたはペプチドミミックの、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるようにするオリゴマーへの集成が可能になることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項３０】
抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうることを特徴とする、オリゴマーへと集成することができるジペプチド官能化ベータターンミミック。
【請求項３１】
内部C末端ベータシートの形成を可能にする特異的な構造要素を含むペプチドまたはペプチドミミックであって、該形成により1つまたは複数のエピトープを含むオリゴマーへの集成が可能になることを特徴とする前記ペプチドまたはペプチドミミック。
【請求項３２】
以下の配列：
【化２】
2006508072.tif 000012
を含むペプチドであって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるがアミロイドモノマーまたは線維状集合体に結合する抗体または他分子は生成しえないオリゴマーへと集成することができることを特徴とする前記ペプチド。
【請求項３３】
以下の配列：
【化３】
2006508072.tif 000013
を含むペプチドであって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるがアミロイドモノマーまたは線維状集合体に結合する抗体または他分子は生成しえないオリゴマーへと集成することができることを特徴とする前記ペプチド。
【請求項３４】
以下の配列：
【化４】
2006508072.tif 000014
を含むペプチドであって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるがアミロイドモノマーまたは線維状集合体に結合する抗体または他分子は生成しえないオリゴマーへと集成することができることを特徴とする前記ペプチド。
【請求項３５】
以下の配列：
【化５】
2006508072.tif 000015
を含むペプチドであって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるがアミロイドモノマーまたは線維状集合体に結合する抗体または他分子は生成しえないオリゴマーへと集成することができることを特徴とする前記ペプチド。
【請求項３６】
以下の配列：
【化６】
2006508072.tif 000016
を含むペプチドであって、抗ADDL抗体または結合性分子を生成または選択しうるがアミロイドモノマーまたは線維状集合体に結合する抗体または他分子は生成しえないオリゴマーへと集成することができることを特徴とする前記ペプチド。
【請求項３７】
アミロイドβ配列の一部分を含むペプチドまたはペプチドミミック組成物であって、該配列がN末端で切断され、かつ正荷電残基が除去されていて、宿主細胞に該組成物を投与したときに線維反応性抗体の生成が妨げられるようにしたことを特徴とする前記組成物。
【請求項３８】
アミロイドβ配列の一部分を含むペプチドまたはペプチドミミック組成物であって、該配列がC末端で修飾されていて宿主細胞に該組成物を投与したときにオリゴマーへの集成が促進されるようにしたことを特徴とする前記組成物。
【請求項３９】
オリゴマーAβを認識することはできるが、モノマーまたは線維状アミロイドに対する交差反応性を欠く結合性分子。
【請求項４０】
抗体または抗体断片である、請求項39に記載の分子。
【請求項４１】
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片である、請求項39に記載の分子。
【請求項４２】
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体または抗体断片である、請求項39に記載の分子。
【請求項４３】
オリゴマーAβを認識することはできるが、モノマーまたは線維状アミロイドを認識することはできないモノクローナル抗体3B7。
【請求項４４】
オリゴマーAβを認識することはできるが、モノマーまたは線維状アミロイドを認識することはできないモノクローナル抗体11B5。
【請求項４５】
オリゴマーAβを認識することはできるが、モノマーまたは線維状アミロイドを認識することはできないモノクローナル抗体5A9。
【請求項４６】
請求項39〜45のいずれか1項に記載の抗体を、ADDL活性を阻害する治療的免疫反応を誘導するためのワクチン免疫原として有用である抗イディオタイプ抗体を生成させるための抗原として、使用する方法。
【請求項４７】
請求項42に記載の抗体を、ADDL誘導毒性から神経細胞を保護するための治療用抗体として使用する方法。
【請求項４８】
請求項42に記載の抗体を、アルツハイマー病モデルのトランスジェニックマウスの記憶障害を回復させるための治療用抗体として使用する方法。
【請求項４９】
請求項41に記載の抗体を、アルツハイマー病モデルのトランスジェニックマウスの記憶障害を回復させるための治療用抗体として使用する方法。
【請求項５０】
請求項42に記載の抗体を、人間の記憶障害を回復させるための治療用抗体として使用する方法。
【請求項５１】
請求項42に記載の抗体を、人間のアルツハイマー病、ダウン症候群、軽度認知障害および他の記憶障害を伴う疾患を予防または治療するための治療用抗体として使用する方法。
【請求項５２】
請求項39〜42のいずれか1項に記載の分子を、血清中、脳脊髄液中または死後脳組織中のADDLsを検出するための診断試薬として使用する方法。
【請求項５３】
請求項41に記載の分子を、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を設計するための鋳型として使用する方法。
【請求項５４】
請求項42に記載の分子または請求項42に記載の分子を含む製薬上許容しうる組成物を投与するステップを含む、アルツハイマー病、ダウン症候群、軽度認知障害および他の記憶障害を伴う疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は2002年10月1日提出の米国特許出願第60/415,074号の優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府の支援を受けた研究開発に関する宣誓
本発明の実現には米国政府機関からの部分的支援があった。従って、連邦政府は本発明にある種の権利を有する可能性がある。
【０００３】
コンパクトディスクで提出した付属書類に関する説明
該当せず。
【０００４】
本発明は医薬、生物学、生化学、分子生物学および細胞生物学の各分野に関する。特に本発明は神経変性疾患に関する。なお特に本発明は神経変性疾患の診断治療に関する。さらになお特に本発明はアミロイドベータ(Aβ)由来拡散性リガンド(ADDLs)、ADDL受容体、およびADDL抗体および/またはADDL受容体抗体に関する。本発明はさらに、神経変性疾患の診断治療へのADDLs、ADDL受容体、および/またはADDLおよび/またはADDL受容体に対する抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
本発明は、現在米国特許第6,218,506号となっている米国特許出願第08/769,089号(1997年2月5日提出)の一部継続出願である米国特許出願第09/369,236号(1999年8月4日提出)の一部継続出願である米国特許出願第10/166,856号(2002年6月11日提出)で開示した発明に関連する。
【０００６】
アルツハイマー病(AD)は老人性痴呆症の最も一般的な原因である。有効な治療法はないが、相当な研究の進歩により、長いほうの形のアミロイドベータ(Aβ)ペプチドであるAβ1-42の蓄積が原因であるとの一般的な総意が形成されるに至った。厳密には、そうしたAβ1-42の蓄積がどのような機序で該疾患をもたらすかはまだ正確に説明されていないが、最も頻繁に用いられる年来の説明は、アミロイド線維の沈着とその毒性とされるものを柱とするアミロイドカスケード仮説である[Hardy, J.A. & Higgins, G.A. (1992) Science, vol.256, pp.184-185; Small, D.H. (1998) Amyloid, vol. 5, pp.301-304; Golde, T.E. (2000) Biochim. Biophys. Acta, vol.1502, pp.172-187]。中枢神経系の炎症、酸化的障害、細胞骨格異常などを含む複数の因子が絡んでいるとの主張もある[McGeer, P.L. & McGeer, E.G. (1999) J. Leukoc. Biol., vol.65, pp.409-415; Mandelkow, E.M. & Mandelkow, E. (1998) Trends Cell Biol., vol.8, pp.425-427; Spillantini, M.G. & Goedert, M. (1998) Trends Neurosci., vol.21, pp.428-433; Smith, M.A. et al. (1995) Trends Neurosci., vol.18, pp.172-176]が、これらの現象はAβ1-42蓄積の結果であり、それ自体該疾患の根本原因ではないとされてきた。
【０００７】
Aβ1-42は、広く発現する膜前駆体タンパク質の分解に由来するアミノ酸42個の両親媒性ペプチドである[Selkoe, D.J. (1994) Annu. Rev. Neurosci., vol.17, pp.489-517]。該アミロイドペプチドはモノマーとしては毒性があると立証されたことはなく、神経栄養効果があるとする研究者もいる。天然Aβ1-42の配列は次のとおりである: DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA.
【０００８】
Aβ1-42のモノマーは集成して少なくとも3種の神経毒となる: すなわち線維状アミロイド[Pike, C.J. et al. (1993) J. Neurosci. vol.13, pp.1676-1687; Lorenzo, A. & Yanker, B.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.91, pp.12243-12247]、原線維[Hartley, D.M. et al. (1999) J. Neurosci., vol.19, pp.8876-8884; Walsh, D.M. et al. (1999) J. Biol. Chem., vol.274, pp.25945-25952]およびAβ1-42由来拡散性リガンド(ADDLs)[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453]である。線維状アミロイドは不溶性であり、また線維状アミロイドの沈着物はその複屈折のためにADおよびトランスジェニックマウスではチオフラビンSなどのような色素による検出が容易である。線維状アミロイドはアルツハイマー病脳の老人斑の主要タンパク質成分である。様々な長さのAβペプチドがAβ1-40、1-42、1-43、25-35および1-28などを含めてin vitroで集成して線維となる。これらの線維はどれもin vitroではニューロンに対して有害であり広範囲の細胞プロセスを活性化すると報告されてきた。何百件もの研究報告でAβ線維の神経毒性が明らかにされているが、再現性の低さや毒性のバラツキの大きさを示す報告も多い。このバラツキは出発固体ペプチドのバッチ間差にも由来するが、そうした差は特に該ペプチドの、化学構造または組成よりもむしろ、様々な物理状態または凝集状態に関連する。原線維は、フルサイズのアミロイド線維に至る途上の中間物として初めて同定された大きな、ただし可溶性の、準安定構造体である[Walsh, D.M. et al. (1997) J. Biol. Chem., vol.272, pp.22364-22372]。
【０００９】
ADDLs[アミロイドベータ(Aβ)由来拡散性リガンド]は低分子量の可溶性Aβ1-42オリゴマーを含む。該オリゴマーはトリマーとテトラマーが主体であるが、さらに高次構造の化学種をも含む[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453; Chromy, B.A. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1284]。3つの形のAβ1-42集合体はどれもMTT色素の還元を急速に損なう[Shearman, M.S, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.91, pp.1470-1474; Walsh, D.M. et al. (1999) J. Biol. Chem., vol.274, pp.25945-25952; Oda, T. et al. (1995) Exp. Neurol., vol.136, pp.22-31]が、それはおそらく小胞輸送障害の結果であり[Liu, Y. & Schubert, D. (1997) J. Neurochem., vol. 69, pp.2285-2293]、それらは最終的にニューロンを傷害する[Longo, V.D. et al. (2000) J. Neurochem., vol.75, pp.1977-1985; Loo, D.T. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, pp.7951-7955; Hartley, D.M. et al. (1999) J. Neurosci., vol.19, pp.8876-8884]。また、3つの形はどれも超高速の電気生理学的作用を示す。アミロイドと原線維は広くニューロンの膜特性を混乱させて、膜脱分極、活動電位、およびEPSPの上昇を誘導する[Hartley, D.M. et al. (1999) J. Neurosci., vol.19, pp.8876-8884]が、ADDLsは長期増強(LTP)を選択的に阻害する[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453; Wang, H. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1787; Wang et al. (2002) Brain Research 924, 133-140]。ADDLsはまた、神経毒性に選択性を示し、脳スライス培養中では小脳ニューロンではなく海馬ニューロンを傷害する[Kim, H.-J. (2000) Doctoral Thesis, Northwestern University, pp.1-169]。線維状アミロイドと疾患進行の間の相関は低いので[Terry, R.D. (1999) in Alzheimer’s Disease (Terry, R.D. et al., Eds.) pp.187-206, Lippincott Williams & Wilkins]、線維状アミロイド沈着物はADとの関連が最も強い有害形のAβ1-42ではなさそうである。AD脳では非線維状のAβ集合体も生じており[Kuo, Y.M. et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp.4077-4081; Roher, A.E. et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp.20631-20635; Enya, M. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.154, pp.271-279; Funato, H. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.155, pp.23-28; Pitschke, M. et al. (1998) Nature Med., vol. 4, pp.832-834]、またこれらの化学種はADの重篤度に対する相関がアミロイドよりも高そうに見える[McLean, C.A． et al. (1999) Ann. Neurol., vol.46, pp.860-866; Lue, L.F. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.155, 853-862]。アミロイドプラークを生成しない多数のトランスジェニックマウス系統に見られる神経障害の原因となっているのは可溶性Aβオリゴマーであるらしい[Mucke, L. et al. (2000) J. Neurosci., vol.20, pp.4050-4058; Hsia, A.Y. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.96, pp.3228-3233; Klein, W.L. (2000) in Molecular Mechanisms of Neurodegenerative Diseases (Chesselet, M.-F., Ed.), Humana Press; Klein, W.L. (2001) Trends Neurosci., vol.24, pp.219-224]。
【００１０】
ここ3年の間に、Aβ凝集体調製物ワクチンの接種によるアルツハイマー病の新規治療戦略が浮上してきた。この戦略に沿った当初の研究では、ADモデルTg(トランスジェニック)マウスにAβ線維がワクチン接種されたが、この処置はこれらのマウスで通常見られる行動障害をある程度予防する効果があると報告された[Schenk, D. (1999) Nature, vol.400, pp.173-177; Morgan, D.G. et al. (2001) Nature, in press; Helmuth, L. (2000) Science, vol.289, p.375; Arendash, G. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1059; Yu, W. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.497]。この結果は驚きであった。血液脳関門(BBB)の脳側に有効な免疫防御をもたらしうるとは一般に認識されていなかったからである。これらのTg ADマウスへのワクチン接種研究で観測された防御効果は、神経毒性アミロイド構造体のレベルを低下させるに足る量の抗アミロイド抗体がBBBを越えて直接輸送された結果であるらしい。あるいは、血流中を循環する該抗体は脳内アミロイドレベルを低下させ有益な対症効果を生み出すに足る量のアミロイドに結合しそれを排泄させることができるとも考えられる。Tgマウスへのワクチン接種研究では、対照群の非ワクチン接種Tg ADマウスのアミロイドレベルと比較して全脳アミロイドレベルの有意の低下は見られないとの報告も何件かあり、Aβクリアランス機序説に疑いを抱かせる。
【００１１】
他の研究ではTg ADマウスの脳への抗アミロイド抗体の直接注射が脳アミロイドレベルの有意の低下をもたらすことが示された(Bard, F. et al. (2000) Nature Med., vol.6, pp.916-919)が、その方法ではBBBを越える受動輸送から期待しうるよりもずっと高レベルの抗体の送達を必要とした。
【００１２】
これらのワクチン接種Tg ADマウスでの作動機序に関係なく、行動防御に関する有望な研究結果が得られたことで、線維状AβワクチンAN1792の治験の推進に拍車がかかった[Helmuth, L. (2000) Science, vol.289, p.375]。第Ｉ相安全性試験の成功を受けてAD患者を対象とする第II相有効性試験が始まった。あいにくこれらの第II相試験は最近、治験に参加したAD患者97人中12人が脳の炎症と脳炎を伴うワクチン関連合併症を起こしたため、停止となった。これらの重大な合併症の具体的な原因は明確にはわかっていないものの、Aβ線維ワクチンの接種は脳内アミロイドプラークに対する相当の免疫反応を生成させ、その結果小グリア細胞の持続的な活性化と炎症メディエーターの産生を招き、それらがみな重篤な脳炎の一因になるのだと考えられる。実は、このグリア細胞活性化機序はこのワクチン療法の有効性を説明するために提案されている機序に他ならない[Schenk, D. (1999) Nature, vol.400, pp.173-177]。
【００１３】
これらの結果から今や明白なように、AD予防治療のための有効な免疫戦略では、ワクチン、治療用抗体のいずれを使用するにせよ、毒性構造体を直接、個別に標的とするような選択性のきわめて強いアプローチが必要になろう。従来の免疫プロトコール(たとえば前述のAN1792プロトコール)は、複数の形のAβ1-42を不明確な比率で含むAβ1-42凝集体溶液を使用している。
【００１４】
従って、これまで当該技術のネックとなってきた諸問題に対する解決策が求められている。本書で開示する発明ではAβ1-42モノマーおよび小オリゴマーからなる、低用量注射用の、既知組成のADDL調製物が使用される。本書に収めたデータによれば、Aβ1-42オリゴマーはAβモノマーよりも強力な免疫原であり、免疫ブロット法でADDLsを選択的に認識するような抗体を産生させ、細胞表面に結合したADDLsの斑点(puncta)を免疫組織化学法で検出し、また培養PC12細胞に対するADDLsの毒作用を阻害する。これらの結果は、小さな非線維状Aβ1-42毒素を標的とする治療用抗体がADの病原機構を予防的および/または治療的に診断治療するための有効な薬物になりうるとの仮説を支持する。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は一態様で、ADの予防的および/または治療的免疫戦略を提供するが、該療法は毒性構造体を直接、個別に標的とするような選択的アプローチを含む。このアプローチは線維状、モノマーいずれの形であれアミロイドの排泄とは無関係としうる。本発明は直接ADDLsを標的とし中和する免疫戦略を提供する。
【００１６】
本発明は別の態様で、ADDLsに特異的に結合しAβモノマーまたはアミロイド線維には結合しないという性質をもつように生成させ選択した種々の抗体を提供する。そうした抗体はADDLsの脳内での作用に由来する疾患の治療予防に使用することができる。
【００１７】
本発明はさらに別の態様で、血清、脳またはCSF中に測定可能量のADDLsを存在させている個人の特異的診断のための抗ADDL抗体を提供する。
【００１８】
本発明は追加の態様で、ADDLsの形成または活性を阻害する分子の検出を可能にする検定用抗ADDL抗体を提供する。
【００１９】
本発明は、アミロイド線維およびアミロイドプラークがADを引き起こすという欠陥理論に概ね依拠する先行技術の大きな問題点を克服しようと努める。従って本発明の一目的は、ADDLsの活性および/または形成を直接、間接に妨げることができる抗ADDL抗体などのような特異的ADDL結合性分子(可溶性、球状、非線維状のオリゴマーAβ1-42集合体)を含む新規組成物の産生や解析、使用である。本発明のあれこれの目的や利点およびそれ以外の発明性は以下の説明から明らかとなろう。
【００２０】
本発明はアミロイドベータ由来拡散性リガンド(ADDLs); ADDLsに結合する抗体(抗ADDL抗体); 抗ADDL治療薬の発見を目的とした抗ADDL抗体の使用; およびアルツハイマー病、学習記憶障害、神経変性疾患を含むADDL関連疾患の診断、治療および予防への抗ADDL抗体の使用に関する。本発明は特に、ADDLsに対する選択的な認識・結合能を有する一方でモノマー形アミロイドペプチドに対する結合能はずっと小さい抗体に関する。これらの特徴をもつ抗体はADDLsの神経毒作用を阻害するために有用であり、また抗体-ADDL複合体の排泄によりADDLsを脳から除去するために有用である。これらの特徴をもつ抗体はヒト血漿、脳脊髄液、脳組織などを含む生体サンプル中のADDLsの検出にも有用である。抗ADDL抗体は脳脊髄液中のADDLsの定量的測定に有用であり、ADDLsの悪影響を受けている個人の診断を可能にする。そうした悪影響は学習記憶障害、人格交替、および他の認知機能(たとえばアルツハイマー病や関連疾患で障害が及ぶことが判明している機能)の低下として現れる場合もあろう。抗ADDL抗体は検視で得られる脳組織中のADDLsの定量的検出にも有用であり、アルツハイマー病の生前診断の確認につながる。
【００２１】
本発明はさらに、ADDLsに対する選択的な認識・結合能を有する一方で線維状およびモノマー形アミロイドペプチドに対する結合能はずっと小さい抗体に関する。そうした抗体は、線維状アミロイド沈着が脳内に広く存在していてかつ線維状形のアミロイドに選択的に結合する抗体による治療では重篤な脳炎症や脳炎を招くと推測されるような患者のアルツハイマー病や他のADDL関連疾患の治療、予防に特に有用である。
【００２２】
本発明はさらに、ADDLsに結合する、ADDLsを脳から除去する、ADDL活性を阻害する、またはADDLsの形成を防止することができる抗体または他の任意のADDL結合性分子または高分子を選択または識別するためのADDLsの使用に関する。追加の発明は新規合成物、たとえば抗体または抗ADDL結合性分子を選択することができる、または動物または人間に投与したときにADDL阻害免疫反応を誘導することができる分子に関する。本発明はさらに、技術上周知の選択方法または遺伝子組換え的方法による、合成抗体、結合性分子、および他の特異的な結合性分子の創製に適用する場合の、それらの使用にも及ぶ。
【００２３】
本発明は特に、そうした抗ADDL抗体の調製、解析および使用方法に関する。本発明はまた、ADDL形成の検出への、またADDL形成を妨げる分子の検出への、抗ADDL抗体の使用に関する。本発明はさらに、そうした抗体の、アルツハイマー病や関連疾患で障害が生じている神経細胞の表面上に存在する特異的ADDL受容体へのADDLの結合を阻害する分子の検出を目的とした使用に関する。
【００２４】
ADDLsは、特定の細胞プロセスを活性化することができる可溶性、球状、非線維状、オリゴマー構造体へと集成したアミロイドベータ(Aβ)ペプチドを含む。本書で開示するのは、ADDLsに対して特異的である抗体を調製し解析する方法、ならびにADDLsの形成、存在、受容体タンパク質結合および細胞活性に関する検定方法である。またADDLsの形成または活性を阻害する化合物、およびそうした化合物を識別する方法も開示される。ADDL形成および作用はとりわけ学習記憶障害、神経細胞変性、およびアルツハイマー病の発症と進行に関連する。従って本発明によるADDL形成または活性の調節は学習記憶障害やADDLsの作用に起因する他の疾患、障害または病態の治療に使用することができる。
【００２５】
本発明は、アミロイドベータ由来拡散性リガンドまたはアミロイドベータ由来痴呆化リガンド(ADDLs)という新規合成物に関する。ADDLsは、特定の細胞プロセスを活性化することができる可溶性の非線維状オリゴマー構造体へと集成したAβペプチドからなる。本発明の好ましい態様はADDLsに対して特異的な抗体および結合性分子を、またADDLsに対して特異的な抗体および結合性分子の調製、解析および使用方法を、含む。別の好ましい実施態様は、ADDLsに結合するがAβモノマーまたは線維状凝集体には結合しない抗体または結合性分子を含む。本発明の別の態様は、ADDLsの形成、存在、受容体タンパク質結合および細胞活性に関する検定方法からなる。本発明のさらなる態様は抗ADDL抗体または抗ADDL結合性分子の、ADDLsの存在に関連するアルツハイマー病等の疾患の治療および/または予防への使用である。本発明はまた、ADDLsの形成および/または活性を調節(たとえば加減)する化合物の検定および識別方法を包含する。該化合物はADDLsの作用に起因する疾患、障害または病態の治療に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
Aβ由来オリゴマー(ADDLs)は有効な抗原として、分析に有用であり治療予防にも潜在的に有用である抗体を誘導する。その抗体はオリゴマーをモノマーから区別するし、また免疫ブロット法や免疫蛍光顕微鏡法で有効性と特異性を示す。該抗体はさらに、ADDLsの生物活性を中和する。この点が重要である。というのは、ADDLsはAβ1-42レベルが上昇すると形成される関連病原分子であることを示す証拠が出てきているからである。ADDLsは沈着アミロイドと異なり、可溶性、分散性の低分子量神経毒である。ADDLsは記憶すなわちLTPに必要とされる重要な電気生理および生化学現象を直接妨げることが証明されている。従って、これらの可溶性毒素を中和する能力はアルツハイマー病や関連疾患への治療的介入には大いに重要であると思われる。
【００２７】
ADDL調製物により誘導される抗体はオリゴマーに対して特異性を示す。抗体用量をきわめて大きくすればモノマーの検出が可能となる場合もあるが、いくつかの動物に由来する抗体(90、93または94と命名)はオリゴマーを選択的に認識し、オリゴマーに結合することが連続希釈法で証明されている(図19および20)。これらのADDL調製物は原線維または線維へと変換することがないので、そうした比較的大きな集合体が、観測された免疫反応を生じさせるということはありえない。
【００２８】
オリゴマーの抗原性をモノマーのそれよりも強くする要因はいくかつ考えられる。1つは、オリゴマーはモノマーには欠ける新規のコンホメーション依存的エピトープを提示するために、本来的に抗原性がより強いのかもしれない。またモノマーのほうも、発症期に一時的に存在量が多くなる[Enam, S.A. (1991) Ph.D. Thesis, Northwestern University]APP分子の正常な代謝に続く生理的役割のために[Selkoe, D.J. (1994) Annu. Rev. of Neurosci., vol.17, pp.489-517]、本来的に抗原性がより弱いという可能性もある。また、モノマーのほうがオリゴマーよりも効率的に排泄されるという可能性もある。
【００２９】
ADDL-抗体の結合親和性および検出効率は市販Aβモノクローナル抗体並みである(図19)。たとえば高ADDL濃度(100pmol)では、0.3μg/mlのADDL-抗体が示す結合強度は0.4〜0.5μg/mlで使用される市販モノクローナル抗体のそれに匹敵する(図19)。これらの市販モノクローナル抗体はまた、抗ADDL抗体によっては検出されなかったいくつかのAβ集合体-状態(モノマーやダイマーを含む)に共通するエピトープを認識する。代替のAβ集合体-状態が異なるエピトープを示すというのはそれらの毒性の違いと符合するが、将来の創薬に利用しうる性質かもしれない。ADDL-抗体はまた、ごく低いAβ濃度で使用した場合には少なくともモノクローナル抗体並みの効率を示す[Ida, N. et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp. 22908-22914; Potempska, A. et al. (1999) Amyloid, vol.6, pp.14-21]。IgGタンパク質終濃度0.6μg/mlでのADDL-抗体による免疫ブロットは1fmol未満のADDLsを認識することができる。
【００３０】
該抗体は有効性に加えて著しい特異性を示すため、分析試験にも有用である。Aβペプチドに対して産生される他の抗体ではそうとも限らない。たとえばAβ35-42およびAβ33-40に対するある種のモノクローナル抗体は、たとえELISAではAβに関して選択的であるとしても、免疫ブロットではCSFおよび血漿中の成分と非特異的に結合する[Ida, N. et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp. 22908-22914]。M93およびM94抗体(後述)は全ラットホモジネート中のタンパク質に対し結合性を示さなかったが、これはモノマーよりもむしろオリゴマーに対する選択性と符合する。同様に、免疫蛍光顕微鏡法では、該抗体は外因性ADDLsの不存在下で細胞表面への結合性をほとんど示さなかった。
【００３１】
免疫ブロットおよび免疫蛍光試験から2つの興味深い観測が得られる。第1に、ADDLsを脳ホモジネートと混合するとし、免疫ブロットは通常の分子量範囲のADDLsを示すが、それに加えてさらに高分子量の化学種も観測された。こうした追加の化学種が観測される根拠はわからないが、数種類のタンパク質がAβの凝集特性に影響を及ぼしうるとすでに証明されている[Klein, W.L. (2000) in Molecular Mechanisms of Neurodegenerative Diseases (Chesselet, M.-F., Ed.), Humana Press; Klein, W.L. et al (2001) Trends Neurosci., vol.24, pp.219-224]。この場合に観測される化学種のサイズ(~30〜40kDa)はAD脳で優勢な形と指摘される化学種のサイズと同じである[Guerette, P.A. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.25, p2129]。しかし、これらの追加化学種はまた、低分子量の脳タンパク質たとえばApoEに結合した強付着性ADDLsであるかもしれない。Aβ-ApoE安定複合体は前から見られた[LaDu, M.J. et al. (1997) J. Neurosci. Res., vol. 49, pp. 9-18; LaDu, M.J. et al. (1995) J. Biol. Chem., vol.270, pp.9039-9042]。第2に、ニューロン培養試験の免疫蛍光データは、 ADDLsがきわめてパターン化された形でニューロンと会合するようになることを示した。これらの「ホットスポット」の性格はADDL毒性に受容体が関与しているという可能性を示唆する(Viola, Gong, Lambert, Lin and Klein, 近刊)。
【００３２】
やや意外であり、潜在的に最も重要でもあるのは、不足当量の用量で抗体がもたらすニューロン保護効果である。保護効果の試験はPC12ニューロン様細胞を対象にMTT還元法で行った。この検定法では、酸化的代謝やエキソサイトーシス/エンドサイトーシスをモニターする[Liu, Y. & Schubert, D. (1997) J. Neurochem., vol.69, pp. 2285-2293]。ADDLsは1〜5μMの用量でMTT還元を最大限阻害する。ADDLの作用は不足当量レベルの抗体で阻害されたが、阻害効果が明白になった抗体/ADDLモル比は低く、わずか1:15である。こうした有効性は、モルモット抗体によるPC12 MTT還元法でアミロイド毒性を阻害しうるモル比は1:20であるという報告データに近い[Frenkel, D. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.97, pp.11455-11459]。本例で低相対用量の抗体が有効そうに見えるのは、その有害オリゴマーに対する選択性のためである(図19および20)。モノマーは無害である[Yanker, B.A. (1996) Neuron, vol.16, pp.921-931; Yanker, B.A. et al. (1989) Science, vol.245, pp.417-420]が、可溶性Aβ全体の45±5%を構成する(Chromy,,B.C. et al., 近刊)。このように、該抗体はADDL溶液中の毒性亜化学種を標的にし、その生体利用率を低下させるように見受けられる。
【００３３】
有害形の自己集合Aβを標的にする抗体は、多大の関心を呼ぶようになった。Aβ抗体はトランスジェニックマウスのADモデルで血液脳関門を通過し、治療効果を及ぼすという驚くべき研究結果が最近出てきたためである[Bard, F. et al. (2000) Nature Med., vol.6, pp.916-919; Schenk, D. (1999) Nature, vol.400, pp.173-177]。ワクチン接種プロトコールはアミロイド量の減少を招く[Bard, F. et al. (2000) Nature Med., vol.6, pp.916-919; Schenk, D. (1999) Nature, vol.400, pp.173-177]し、また行動障害の予防に有効である[Helmuth, L. (2000) Science, vol.289, p.375; Arendash, G. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1059; Yu, W. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.497]。これらの免疫/ワクチン接種研究報告では、その治療有効性はアミロイドプラークタンパク質を除去する活性化小グリア細胞に間接的に負うという可能性が示唆されている。しかし、他の研究報告によればファージディスプレー法で細菌および哺乳動物中に生成させた抗体は凝集Aβのin vitro解離を直接もたらすことができる[Frenkel, D. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.97, pp.11455-11459; Frenkel, D. et al. (2000) J. Neuroimmunol., vol.106, pp.23-31]。これらの抗体はEFRHエピトープすなわちAβのアミノ酸#3〜6に対して産生されるが、この部位は仮説によれば線維N末端側の調節部位である[Frenkel, D. et al. (1998) J. Neuroimmunol., vol.88, pp.85-89]。
【００３４】
これらの抗体の行動障害に対する有効性に関する別の説明は、トランスジェニックマウスADモデルおよびAD自体で病原機能を果たすと推定される可溶性ADDLsを該抗体が中和するのではないかというものである。アミロイド沈着がまったく存在しない中で行動および変性障害を示すトランスジェニックAPPマウスモデルが複数存在する[Klein, W.L. (2000) in Molecular Mechanisms of Neurodegenerative Diseases (Chesselet, M.-F., Ed.), Humana Press; Klein, W.L. (2001) Trends Neurosci., vol.24, pp.219-224]。最近、たとえば無アミロイド沈着APP-トランスジェニックマウスは、それにもかかわらず可溶性Aβ1-42種のレベルと相関する形で[Mucke, L. et al. (2000) J. Neurosci., vol.20, pp.4050-4058]、ADの認知障害の指標であるシナプトフィジン-免疫反応性末端の欠失を示すことが判明した[Terry, R.D. (1999) in Alzheimer’s Disease (Terry, R.D. et al., Eds.) pp.187-206, Lippincott Williams & Wilkins]。著者らによれば、彼らの結果はADにおけるシナプス障害の発生にはプラークとは無関係のAβ毒性が重要であるという新たな見解を支持するものである。シナプス障害と可溶性Aβの間の類似の相関がADでは観測されてきた[Lue, L.F. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.155, pp.853-862; Klein, W.L. (2000) in Molecular Mechanisms of Neurodegenerative Diseases (Chesselet, M.-F., Ed.), Humana Press; Klein, W.L. (2001) Trends Neurosci., vol.24, pp.219-224; McLean, C.A. et al. (1999) Ann. Neurol., vol.46, pp.860-866]。可溶性の有害オリゴマーはアミロイドプラークとは無関係のAβ毒性の主因であるらしい。これらの所見は、本書で示した抗体データと結び付くと、行動障害の改善もまた少なくとも部分的にはアミロイドプラークとは無関係の現象でありうることを強く示唆する。
【００３５】
ADDLsを標的とする抗体は理想的な特異性を示すかもしれない。ペプチド集合体依存的な新規ドメインを標的とする本発明の中和抗体は治療用ワクチン接種のための原型として提案される。同種抗体の使用はAD初期段階の記憶障害の治療になると予測される。抗体はADDLsに結合することで、実験的には低ADDL用量で阻害されるような神経可塑性を保護しよう[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453; Wang, H. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1787]。加えて、該抗体は準線維状の化学種を標的とすることで、アミロイドプラーク形成に必要となる中間物を除去しよう。該抗体は、その潜在的な直接効能とは無関係に、オリゴマー表面上の有害ドメインを特定し、以ってより在来色の強い治療薬を開発するための重要な分子的洞察を手に入れるうえでの強力な手段となるはずである。さらにADDL選択的抗体は、有害重合を阻害するような化合物を探し出すためのライブラリースクリーニングを目的とした単純なハイスループット検定法の土台となる。
【００３６】
すでに判明していることであるが、神経毒性アミロイドβサンプルには線維状構造体が確かに存在するだけでなく、意外にも、神経毒性を引き起こす若干の球状構造タンパク質もまた存在する。新規の方法を使用して、主にこうした可溶性の球状タンパク質集合体を含み線維状構造体をまったく含まないサンプルを本書で開示の要領で生成させた。種々の方法で調製した異種成分からなるサンプルでは、大きいほうの線維状アミロイドβを遠心で除去しても上清中のこうした可溶性球状アミロイドβ集合体は除去されない。こうした上清画分は公知条件下で凝集した非分画アミロイドβサンプルよりも著しく強い神経毒性を示す。これらの新規の、予想外な神経毒性の可溶性球状構造体を本書ではアミロイドβ由来痴呆化リガンド、アミロイドβ由来分散性リガンド(ADDLs)、アミロイドβ可溶性非線維状構造体、アミロイドβオリゴマー構造体、または単にオリゴマー構造体という。標準公知条件[たとえばPike et al. (1993) J. Neurosci., vol.13, pp. 1676-1687]下で3週間あまり「寝かせた」アミロイドβサンプルは、たとえ主に線維状構造体を含みADDLsをほとんどまたはまったく含まないとしても、神経毒性を失う。球状ADDLsが神経毒性であるというこの発見は、アミロイドβの毒性は線維状構造体に由来するというのが通説となっているだけになおさら驚きである[Lorenzo et al. (1994) Proc. Acad. Natl. Sci. USA, vol.91, pp.12243-12247; Howlett et al. (1995) Neurodegen., vol.4, pp.23-32]。
【００３７】
ADDLsはin vitroで形成させることができる。モノマーAβ1-42(または後述のような他の適当なAβ)を含む溶液(たとえばDMSO溶液)を冷組織培養培地(たとえばF12培地)で希釈し、次いで約4℃で約2〜48時間インキュベートし、4℃、14,000gで約10分間遠心すると、たとえば神経細胞および脳スライス培養で強い神経毒性を示す可溶性オリゴマー小球を含む上清画分が得られる。ADDLsはまた、Aβとある種の適当な抗原たとえばクラスタリン(ApoJともいう老人斑タンパク質)とのコインキュベーションにより、また本書で開示の他の方法により、形成させることもできる。
【００３８】
こうして、本発明は特に単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体に関する。この単離されたオリゴマー構造体は外因性の架橋剤を含まない。該オリゴマー構造体は架橋剤の不存在下で安定であるのが好ましい。
【００３９】
原子間力顕微鏡(AFM)分析は技術上周知の要領で、また本書で開示する要領で、たとえば実施例3で開示するようにDigital Instruments原子間力顕微鏡を使用して行うことができる。こうした上清画分(たとえば線維状構造体を除去した上清画分)のAFM分析により画分中に存在する多数の、粒径の異なる小球(たとえば粒径の異なるオリゴマー構造体)が明らかになる。これらの小球は約4.7〜11.0 nmの粒径範囲に収まるが、最大の画分は約4.7〜6.2nmの粒径範囲に収まる。図2および16に示すように、この粒径範囲内に収まり、かつある種の電気泳動分析により示される特定粒径のオリゴマー種に対応するような識別可能な小球種が見受けられる。ややばらつきのある表面高さは、AFM分析時の雲母表面上への特定化学種の置き方に由来する。しかしこのわずかなばらつきにもかかわらず、4.7〜6.2nmの粒径範囲内にはいくつかの支配的な粒径(たとえば約4.9〜5.4nmおよび約5.7〜6.2nm)の小球が見受けられ、それらは代表的なサンプルではオリゴマー構造体の約50%を占める。また、粒径約5.3〜5.7nmの小球種も識別可能である。約6.5〜11.0nmというもっと大きな粒径の小球はそれほど多くは見られないが、より支配的な小粒径種に似た神経毒性をもつ可能性がある。AFM粒径約4.7〜6.2nmの小球はペンタマー形またはヘキサマー形のオリゴマーAβタンパク質を含む模様である。AFM粒径が約4.2〜4.7nmの小球はAβテトラマーに対応する模様である。粒径約3.4〜4.0nmの小球はトリマーに対応する模様である。大径の小球はアミロイドモノマー13〜24個程度の範囲のオリゴマー種に対応する模様である。粒径約2.8〜3.4nmの小球はダイマーに対応する模様である[Roher et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp.20631-20635]。AβモノマーのAFM粒径範囲は約0.8nm〜1.8-2.0nmである。モノマーとダイマーのAβは神経細胞培養または脳スライスの器官培養では神経毒性を示さない。
【００４０】
こうして本発明は、単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体(すなわちADDL)を提供するが、該構造体はAβタンパク質モノマーを約3〜24個とりわけ約3〜20個特に3〜16個含むのが好ましく、Aβモノマーを約3〜12個特に約3〜6個含むのが最も好ましい。前述のように、大径の小球(非支配種)はAβモノマーを約13〜24個含むオリゴマー種に対応する模様である。従って、本発明は単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体を提供するが、該オリゴマー構造体はAβタンパク質のトリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、12マー、16マー、20マーまたは24マー凝集体を含むのが好ましい。特に本発明は単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体を提供するが、該オリゴマー構造体はAβタンパク質のトリマー、テトラマー、ペンタマーまたはヘキサマー凝集体を含むのが好ましい。本発明のオリゴマー構造体は随意に神経毒性を示す。
【００４１】
単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体(すなわちモノマーの凝集により形成されたオリゴマー構造体)のうちさらに高次の構造体は、Aβ1-42から得られるだけでなく、可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体を安定的に形成しうる任意のAβタンパク質からも得られるのが望ましい。特にAβ1-43もまた使用可能である。位置1にビオシチンを有するAβ1-42もまた使用可能である。N末端にシステインを有するAβ(たとえばAβ1-42またはAβ1-43)もまた使用可能である。同様に、N末端を切り捨てたAβ(たとえば特にAβ1-42またはAβ1-43のアミノ酸残基1〜8のうち1ないし全配列のアミノ酸残基を欠くもの)またはC末端に1個または2個の追加アミノ酸残基をもつAβも使用可能である。対照的に、Aβ1-40は有害かもしれないADDL様構造体を一時的に形成しうるが、これらの構造体は不安定であり、水溶液として単離することはできない。それはそうした高次の集合体を安定的に形成する能力の制約となる短縮形のせいかもしれない。
【００４２】
本発明の単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体は原子間力顕微鏡(AFM)で測定した粒径が約4.7〜11.0nm特に約4.7〜6.2nmである小球を含むのが望ましい。また、この単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体は原子間力顕微鏡で測定した粒径が約4.9〜5.4nmまたは5.7〜6.2nmまたは6.5〜11.0nmである小球を含むのが好ましい。特に本発明の単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体は、好ましくは該集合体の約30〜85%が、さらになお好ましくは約40〜75%が2つの支配的粒径の小球を、すなわち原子間力顕微鏡で測定した粒径が約4.9〜5.4nmおよび5.7〜6.2nmである小球を、含む。しかし、該オリゴマー構造体はAFM粒径約5.3〜5.7nmの小球を含むのも好ましい。該オリゴマー構造体はまた、AFM粒径約6.5〜11.0nmの小球を含むのも好ましい。
【００４３】
非変性ゲル電気泳動では、ADDLsに対応するバンドは26kD〜約28kDに現れ、また別個の幅広いバンドは約36kD〜約108kDのサイズを表す。変性条件下(すなわち15%SDS-PAGE)では、ADDLsは約22kD〜約24kDのバンドを含むし、また約18kD〜約19kDのバンドをさらに含む可能性もある。従って本発明は好ましくは、非変性ゲル電気泳動法で求めた分子量が約26kD〜約28kDである、単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体(すなわちADDL)を提供する。本発明はまた好ましくは、15%SDS-PAGEで求めた分子量が約22kD〜約24kDである、単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体(すなわちADDL)を提供する。本発明はさらに、15%SDS-PAGEで求めた分子量が約18kD〜約19kDである、単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体(すなわちADDL)を提供する。
【００４４】
また、16.5%トリス-トリシンSDS-PAGEシステムを使用して、追加のADDLバンドを視覚化することもできる。このゲルシステムの使用による分解能の向上からは、16.5%トリス-トリシンSDS-PAGE電気泳動法で求めた分子量が約13kD〜約116kDである単離オリゴマー構造体を本発明により得られることが確認される。追加のADDLバンドは識別可能な分子量種に対応する模様である。特にこのゲルシステムの使用により分子量約13〜14kDのトリマー、約17〜19kDのテトラマー、約22〜23kDのペンタマー、約26〜28kDのヘキサマー、約32〜33kDのヘプタマー、約36〜38kDのオクタマー、さらにはもっと大きな、モノマーを約12〜24個含む可溶性オリゴマーに対応するバンドの視覚化が可能になる。こうして、本発明は望ましくは、16.5%トリス-トリシンSDS-PAGE電気泳動法で求めた分子量が約13〜14kD、約17〜19kD、約22〜23kD、約26〜28kD、約32〜33kDおよび約36〜38kDからなる群より選択される分子量である単離オリゴマー構造体を提供する。
【００４５】
本発明はさらに、単離された可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体を調製する方法を提供する。この方法は随意に次のステップを含む:
(a)  モノマーAβタンパク質の溶液を獲得する;
(b)  該タンパク質溶液を好適な培地で希釈する;
(c)  ステップ(b)に由来する培地を約4℃でインキュベートする;
(d)  該培地を約14,000g、約4℃で遠心分離する; および
(e)  遠心分離で得られる上清を、Aβオリゴマー構造体を含むものとして回収する。
【００４６】
この方法のステップ(c)では、溶液のインキュベーション時間は約2〜48時間特に約12〜48時間であるのが好ましくは、約24〜48時間であるのが最も好ましい。この方法のステップ(d)では、遠心分離の持続時間は約5分間〜約1時間特に約5〜30分間であるのが好ましく、約10分間が最適である。しかし一般に、これは生成期の線維状または原線維状構造体を完全に除去するための予備的な対策であるため、特にADDL調製物の長期安定性が求められないときには無用かもしれない。
【００４７】
ステップ(b)ではAβタンパク質を終濃度約5nM〜約500μM特に約5〜300μMに、特に約100μMに、希釈するのが望ましい。ステップ(b)でAβタンパク質溶液の希釈に使用する「好適な培地」はADDL形成を促進はしないにせよ支援するような任意の培地であるが、本発明のこの方法に使用するなら、特にF12培地(市販品もあるし、研究室での調製も容易である)が好ましい。同様に、「代用F12培地」の使用も望ましい。代用F12培地は、市販品または研究室での調製品であるF12培地とは異なる。本発明では、代用F12培地は次の成分を含むのが好ましい: N,N-ジメチルグリシン、D-グルコース、塩化カルシウム、硫酸銅五水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよび硫酸亜鉛七水和物。
【００４８】
特に本発明の合成F12培地は随意に次の成分を含む: N,N-ジメチルグリシン(約600〜850mg/L)、D-グルコース(約1.0〜3.0g/L)、塩化カルシウム(約20〜40mg/L)、硫酸銅五水和物(約15〜40mg/L)、硫酸鉄(II)七水和物(約0.4〜1.2mg/L)、塩化カリウム(約160〜280mg/L)、塩化マグネシウム(約40〜75mg/L)、塩化ナトリウム(約6.0〜9.0g/L)、炭酸水素ナトリウム(約0.75〜1.4g/L)、リン酸水素二ナトリウム(約120〜160mg/L)および硫酸亜鉛七水和物(約0.7〜1.1mg/L)。本発明の合成F12培地は随意に次の成分を含む: N,N-ジメチルグリシン(約766mg/L)、D-グルコース(約1.802g/L)、塩化カルシウム(33mg/L)、硫酸銅五水和物(約25mg/L)、硫酸鉄(II)七水和物(約0.8mg/L)、塩化カリウム(約223mg/L)、塩化マグネシウム(約57mg/L)、塩化ナトリウム(約7.6g/L)、炭酸水素ナトリウム(約1.18 g/L)、リン酸水素二ナトリウム(約142mg/L)および硫酸亜鉛七水和物(約0.9mg/L)。さらに、該代用F12培地のpHは、たとえば0.1M水酸化ナトリウムを使用して約7.0〜8.5に調整するのが望ましく、約8.0に調整するのが好ましい。
【００４９】
さらに前記の方法は好ましくは、好適な薬物たとえばクラスタリンの存在下に緩沈殿性オリゴマー構造体を形成させることによって実行することができる。これはたとえばステップ(c)でクラスタリンを添加して、また以下の実施例に記載の要領で、行う。
【００５０】
さらに、本発明はまた実施例に記載の要領で、本発明の可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体を調製する方法を提供するが、該方法は次のステップを含む:
(a)  オリゴマー構造体を形成しうるモノマーAβタンパク質の溶液を獲得する;
(b)  該Aβモノマーをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解する;
(c)  ヘキサフルオロイソプロパノールを高速減圧留去して固体のペプチドを得る;
(d)  該固体ペプチドをDMSOに溶解してDMSOストック溶液とする;
(e)  該ストック溶液を好適な培地で希釈する;
(f)  ボルテックスする; および
(g)  約4℃で約24時間インキュベートする。
【００５１】
10%ビオチン化Aβ1-42(または他の好適なビオチン化Aβタンパク質)の混入によりADDLsを調製する場合には、該ADDLsは、たとえば蛍光色素アビジン複合体で標識する蛍光活性化セルソーター(FACS)上で神経細胞を使用して行う受容体結合検定法に使用することができる。あるいはAβタンパク質にビオチンを組み込む代りに、ADDLに結合して蛍光標識分子を結合しうるような、またすでに蛍光標識複合体の一部となっているような、別の試薬を使用してもよい。たとえば可溶性の非線維状Aβオリゴマー構造体は、該Aβタンパク質がもう1つの結合性部分を含むように、形成させることができる。「結合性部分」はここでは、蛍光標識化合物または複合体の形成のために試薬に結合させうる分子(アビジン、ストレプトアビジン、ポリリシンなど)を包含する。オリゴマー構造体の結合相手となる「蛍光試薬」はそれ自体が直接蛍光を発する必要はなく、別個の試薬との結合により蛍光発光能を獲得するだけでもよい。たとえばオリゴマー構造体に結合する蛍光試薬はAβ特異抗体(たとえば6E10)を含み、蛍光二次抗体の使用により発光させるようにしてもよい。
【００５２】
他の実験ではラットCNS B103細胞のFACScan分析をADDLとのインキュベーションの有無に応じて行った。これらや他の研究の結果は、該細胞表面への結合は飽和性であり、また短時間のトリプシン処理により特定の細胞表面タンパク質群が選択的に除去され、ADDLs結合がなくなることを追認する。短時間のトリプシン処理によりB103細胞の表面から切断しうるタンパク質はまた、B103細胞または初代培養ラット海馬ニューロンへのADDL結合を妨げる。これらの結果はみな、ADDLsが特定の細胞表面受容体を介して作用すること、ADDLsによって仲介される初期イベント(たとえば細胞傷害前のイベント)が、ADDLsの形成と活性(受容体への結合を含む)を阻害する化合物により(たとえば治療または研究のために)有利に調節しうることを裏付ける。
【００５３】
こうして本発明は、ADDLの活性(たとえば受容体への結合などのような活性)を調節(すなわち促進または阻害)する化合物を識別する方法を提供する。この方法は次のステップを含む:
(a)  試験化合物の存在下または不存在下に神経細胞の個別培養に本発明のオリゴマー構造体を接触させる;
(b)  該オリゴマー構造体に結合する蛍光試薬を添加する;
(c)  個別培養細胞をFACSで分析する; および
(d)  培養の蛍光を比較して、試験化合物の不存在下に該オリゴマー構造体に接触させた対応する培養との比較から、培養の蛍光の減少を招くものは該オリゴマー構造体の活性(すなわち細胞表面タンパク質への結合)を阻害する化合物として識別し、また培養の蛍光を増進するものは細胞表面タンパク質(すなわち受容体)への結合を促進する化合物として識別する。
【００５４】
あるいは、それ自体で自然にタンパク質複合体に結合しうる蛍光試薬を添加する代りに、蛍光試薬と結合しうる結合性部分を含むように調製したAβ1-42タンパク質(または他のAβ)からオリゴマー構造体が形成されるように該方法を実行するのが望ましい。
【００５５】
同様にして、オリゴマー構造体の形成または活性(たとえば受容体などのような細胞表面タンパク質への結合)を調節(すなわち促進または阻害)する化合物を識別するための、次のステップを含む方法も可能である:
(a)  試験化合物と混合済みの、または未混合の個別Aβサンプルを調製する;
(b)  個別サンプル中にオリゴマー構造体を形成させる;
(c)  神経細胞の個別培養に個別サンプルを接触させる;
(d)  該オリゴマー構造体に結合する蛍光試薬を添加する;
(e)  個別培養細胞をFACSで分析する; および
(f)  培養の蛍光を比較して、試験化合物の不存在下に該オリゴマー構造体に接触させた対応する培養との比較から、培養の蛍光の減少を招くものは該オリゴマー構造体の形成またはその細胞表面タンパク質への結合を阻害する化合物として識別し、また培養の蛍光を増進するものは該オリゴマー構造体の形成またはその細胞表面タンパク質への結合を促進する化合物として識別する。
【００５６】
さらに、それ自体で自然にタンパク質複合体に結合しうる蛍光試薬を添加する代りに、蛍光試薬と結合しうる結合性部分を含むように調製したAβタンパク質からオリゴマー構造体が形成されるように該方法を実行することもできる。
【００５７】
さらに、培養の蛍光は随意に、オリゴマー構造体の形成前に試験化合物を添加してまたは添加せずに処理する代りに、オリゴマー構造体の形成後に試験化合物を添加してまたは添加せずに処理する点を除けば、同じ要領で処理した培養の蛍光と比較する。この場合、該化合物をオリゴマー構造体の形成前に添加するときに限って、試験化合物の不存在下に該オリゴマー構造体に接触させた対応する培養との比較から、培養の蛍光の減少を招くものは該オリゴマー構造体の形成を阻害する化合物として識別し、また培養の蛍光を増進するものは該オリゴマー構造体の形成を促進する化合物として識別する。
【００５８】
一方、該化合物をオリゴマー構造体の形成前かまたは形成後に添加するときには、試験化合物の不存在下に該オリゴマー構造体に接触させた対応する培養との比較から、培養の蛍光の減少を招くものは該オリゴマー構造体の細胞表面タンパク質(たとえば受容体)への結合を阻害する化合物として識別し、また培養の蛍光を増進するものは該オリゴマー構造体の細胞表面タンパク質への結合を促進する化合物として識別する。
【００５９】
同様にして、本発明に従って細胞系検定法特に細胞系ELISA法を使用してADDLの結合活性を評価することもできる。この方法は特に、細胞表面タンパク質へのオリゴマー構造体の結合の検出に使用することができる。この方法は次のステップを含むのが好ましい:
(a)  Aβタンパク質からオリゴマー構造体を形成させる;
(b)  該オリゴマー構造体を培養神経細胞に接触させる;
(c)  該オリゴマー構造体に結合するような、結合性部分(たとえばビオチン、または他の好適な薬物)を含む抗体を添加する;
(d)  未結合抗体を洗浄除去する;
(e)  該オリゴマー構造体に結合した該抗体に、該結合性部分を介して酵素(西洋わさびペルオキシダーゼなど)を連結させる;
(f)  該酵素により分解されて変色するような無色の基質(ABTSなど)を添加する;
(g)  該変色を(たとえば分光光度法で)、または変色速度を、該オリゴマー構造体の細胞表面タンパク質(たとえば受容体)への結合の指標として求める。
【００６０】
前述のように、該抗体はADDLsを検出することができる任意の抗体(たとえばADDLs特異抗体またはAβの露出部位に対する抗体)でよいし、また抗体の結合性部分は検出手段を連結しうるような任意の薬物(たとえば酵素)でよい。該酵素は、検出手段(たとえば基質の分解による変色)を提供するような、またさらにオリゴマー構造体に結合した抗体に、別の部分(たとえば二次抗体)を介して結合させうるような任意の部分(たとえば場合によりタンパク質以外)でもよい。また、本発明では、細胞は検定法を行う前に固相担体(たとえば組織培養プラスチック製品)に接着させるのが好ましい。言うまでもないが、ステップ(b)は本書に記載の要領で、ADDLsが細胞に結合しうるように行うのが望ましい。同様にして、ステップ(c)は抗体をADDLsに結合させるに足る長さの時間(たとえば約10分間〜約2時間、望ましくは約30分間)にわたり、好適な条件下で(たとえばほぼ室温で、好ましくは穏やかに撹拌しながら)、行うのがよい。さらに、技術上周知の好適な阻害ステップは抗体の非特異的結合を抑制するための好適な阻害試薬を使用して行うことができる。当業者は種々のELISA法に精通しており、また技術上周知の変更を該検定法に加えることもできる。
【００６１】
該検定法は、オリゴマー構造体の形成または細胞表面への結合を調節(すなわち促進または阻害)する化合物を識別するように行えるのが望ましい。この方法では、試験化合物に関する公知検定法の場合と同様、ADDLsを細胞に接触させる前に試験化合物をADDL調製物に添加してもよい。その場合、この検定法は(前述の要領で)オリゴマー構造体の形成を調節する化合物の検出に使用することができる。さらに、試験化合物を細胞に接触させる前に(ただしADDL形成後に)ADDL調製物に添加するか、ADDLsに接触させる前に細胞に添加してもよい。この方法は(前述の要領で)、細胞表面へのADDLの結合を調節する化合物の検出に使用することができる。また、試験化合物は細胞+ADDLsの混合物に添加してもよい。この方法は(前述の要領で)、細胞表面タンパク質(たとえばADDL受容体)へのADDLの結合の下流で起こるADDL関連イベントに影響を及ぼす化合物の検出に使用することができる。ADDL関連型の下流効果に対する試験化合物の作用の特異性は、たとえばADDLsとのコインキュベーションの不存在下に単に試験化合物を添加することによって確認することができる。もちろん、いずれの検定法にも(たとえば後続の実施例で開示の、また技術上周知の)さらなる好適な調節を加えてよい。
【００６２】
同様にして、本発明は本書(たとえば実施例)で開示の方法を使用して、本発明のオリゴマー構造体の形成を阻害する化合物を識別するための、次のステップを含むのが好ましい方法を提供する:
(a)  試験化合物と混合済みの、または未混合の個別Aβサンプルを調製する;
(b)  個別サンプル中にオリゴマー構造体を形成させる;
(c)  個別サンプル中で形成されたタンパク質集合体を、電気泳動法、免疫認識法および原子間顕微鏡法からなる群より選択される方法を使用して評価する;
(d)  個別サンプル中でのタンパク質集合体の形成を比較し、その中で試験化合物の不存在下に該オリゴマー構造体を形成させるサンプルとの比較から、サンプル中のオリゴマー構造体の形成の減少を招くものを、オリゴマー構造体の形成を阻害する化合物として識別する。
【００６３】
オリゴマー構造体の(細胞表面タンパク質との結合を非限定的に含む)形成、活性または形成と活性を調節(すなわち促進または阻害)する化合物に関するこの情報は、ADDL関連の疾患、障害または病態の研究および治療に使用することができる。本発明の方法はADDLs自体の活性と神経毒性を研究するために使用することができる。たとえば長期増強(LTP)実験を実施する60〜70分前にADDL調製物20nLを成獣マウスの海馬領域に注入すると[Namgung et al. (1995) Brain Research, vol.689, pp.85-92などを参照]、実験の刺激相は対照食塩水注入の場合と同じように起こるが、記憶固定化相はその後2時間にわたり、細胞体スパイク振幅によって測定したシナプス活性の著しい継続的低下を示した。一方、対照動物では刺激相で示されたレベルに匹敵するレベルが維持された。実験後の脳スライス分析によれば細胞死は起きていなかった。これらの結果は、後続の実施例で開示する結果もまた同様に、ADDL処理がLTP反応に障害を及ぼすことを裏付ける。これはADDLsがアルツハイマー病で観察される行動記憶障害を、神経細胞死の誘導よりもむしろ神経信号伝達の妨害によって、助長することを示唆する。
【００６４】
ADDLsの(ADDL形成および/または活性を潜在的に調節する試験化合物の存在下または不存在下での)効果に関する追加情報は、本発明のさらなる検定法を用いて獲得することができる。たとえば本発明は、次のステップを含むのが好ましいADDLsの効果に関する検定方法を提供する:
(a)  オリゴマー構造体を動物の海馬に投与する;
(b)  電気刺激を加える; および
(c)  細胞体スパイク振幅を経時的に測定して長期増強反応を求める。
【００６５】
該方法は随意に、該動物の長期増強反応を、電気刺激を加える前にオリゴマー構造体ではなく食塩水を投与する以外は同じ要領で処理した別の動物の長期増強と比較するように行ってもよい。該方法はさらに、ADDLsの効果を調節(促進または抑制)する化合物の(たとえばADDLsを単独でまたは試験化合物と一緒に投与した動物のLTP反応を比較することによる)識別に使用することができる。
【００６６】
同様にして、本発明はADDLオリゴマー構造体の効果を調節する化合物を識別する方法を提供する。該方法は次のステップを含むのが好ましい:
(a)  動物の海馬に食塩水または試験化合物を投与する;
(b)  電気刺激を加える;
(c)  細胞体スパイク振幅を経時的に測定して長期増強反応を求める; および
(d)  食塩水を投与した動物の長期増強反応と試験化合物を投与した動物の長期増強反応を比較する。
【００６７】
該方法は随意に、オリゴマー構造体を海馬に、食塩水または試験化合物の投与の前・中・後のいずれかに、投与するステップを含む。
【００６８】
同様にして、本発明はADDLタンパク質集合体の細胞毒性を調節(促進または抑制)する化合物を識別する方法を提供するが、該方法は次のステップを含む:
(a)  試験化合物の存在下または不存在下に神経細胞の個別培養に本発明のオリゴマー構造体を接触させる;
(b)  各培養の生存細胞率を計測する; および
(c)  各培養の生存細胞率を比較する。
【００６９】
オリゴマー構造体の細胞毒性を阻害する化合物は、たとえば該培養の生存細胞率の(試験化合物の不存在下にオリゴマー構造体を接触させた対応培養との比較で見た)上昇を招くものとして識別する。オリゴマー構造体の細胞毒性を増進する化合物は、たとえば該培養の生存細胞率の(試験化合物の不存在下にオリゴマー構造体を接触させた対応培養との比較で見た)低下を招くものとして識別する。
【００７０】
本発明の方法はまた、(研究、診断および/または治療の一環としての)検体中のADDLsの検出に使用しうる。たとえばADDLsは血清欠乏B103細胞に急速な形態変化をもたらし、またADDL処理の30分以内に該細胞中のFynキナーゼ活性を誘導する(データ非表示)。ADDLsはまた、Fynと焦点接着キナーゼ(FAK)の間の急速な複合体形成を誘導し[Zhang et al. (1996) Neurosci. Lett., vol.211, pp.1-4]、また数種のリン酸化タンパク質およびFyn-Fak複合体のTriton不溶性画分への移行を誘導する[Berg et al. (1997) J. Neurosci. Res., vol.50, pp.979-989]。これは、Fynや他の活性化信号伝達経路がADDLsによって誘導される神経変性過程に関与することを示唆する。この点は機能性fyn遺伝子を欠く遺伝子組換えマウスに由来する脳スライスの培養実験により確認された。その実験では、ADDLsの添加は対照の基剤に比して神経毒性の増大を招かなかった。
【００７１】
従って、ADDLsに影響を及ぼすことにより1つまたは複数のFyn機能またはFyn再局在を阻害するような化合物は、アルツハイマー病に対する重要な神経保護薬となる可能性がある。同様にして、一次星状細胞の培養にADDLsを添加すると、正常細胞が活性化され、IL-1、誘導型NOS、ApoE、ApoJおよびα1-抗キモトリプシンなどを含む数種のタンパク質に対応するmRNAのレベルが上昇する。これらの現象は本発明に従って、検体中のADDLタンパク質集合体を検出する方法に利用するのが望ましい。そうした方法は随意に次のステップを含む:
(a)  検体を抗体(たとえば6E10抗体または他抗体)に接触させる; および
(b)  該抗体のオリゴマー構造体への結合を検出する。
【００７２】
同様にして、次のステップを含む方法を利用しうるようにするのが望ましい:
(a)  検体を血清欠乏神経芽細胞種細胞(たとえばB103神経芽細胞種細胞)に接触させる; および
(b)  該細胞の形態変化を、該細胞と検体と接触させていない神経芽細胞種細胞の形態を比較することにより測定する。
【００７３】
また、次のステップを含む方法を利用しうるようにするのが好ましい:
(a)  検体を脳スライス培養に接触させる; および
(b)  検体を接触させていない脳スライス培養との比較で、脳細胞死を測定する。
【００７４】
さらに、次のステップを含む方法を実行しうるようにするのが望ましい:
(a)  検体を神経芽細胞種細胞(たとえばB103神経芽細胞種細胞)に接触させる; および
(b)  fynキナーゼ活性の増大を、該細胞中のfynキナーゼ活性と検体を接触させていない神経芽細胞種細胞中のfynキナーゼ活性とを比較することにより、測定する。
【００７５】
特に、Fynキナーゼ活性は、市販キット(たとえばKit #QIA-28; Oncogene Research Products, Cambridge, MA)を使用して、またはBorowski et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo), vol.115, pp.825-829で開示されている検定法と類似する検定法を用いて、比較することができる。
【００７６】
検体中のADDLsを検出する方法のさらに別の好ましい実施態様では、該方法は次のステップを含むのが望ましい:
(a)  検体を一次培養星状細胞に接触させる; および
(b)  該星状細胞の活性化を、検体を接触させていない一次星状細胞の培養との比較で、求める。
【００７７】
この方法は変法では、随意に次のステップを含む:
(a)  検体を一次培養星状細胞に接触させる; および
(b)  該星状細胞中の、IL-1、誘導型NOS、ApoE、ApoJおよびα1-抗キモトリプシンからなる群より選択されるタンパク質に対応するmRNAレベルの上昇を、検体を接触させていない一次培養星状細胞中の対応するmRNAレベルとの比較で、測定する。
【００７８】
もちろん当業者には、他の検定法、および上文で開示した方法のさらなる変法も、特に本書の開示内容に照らして、自明であろう。
【００７９】
こうして、本発明のADDLsがin vitroで有用性をもつのは明らかである。そうしたADDLsはとりわけ、細胞内ADDL結合および相互作用の研究やADDL活性検定法に研究ツールとして使用することができる。同様にしてADDLsは、それにADDL形成、活性および調節の研究もまた、in vivoでも利用することができる。
【００８０】
特に、本発明の方法を使用して識別された化合物は、(記憶障害に由来する)認知/学習障害および/または記憶障害それ自体を招く多数の疾患、障害または病態のうちいずれか1つの治療に使用することができる。そうした治療または予防は、ADDLsの形成および/または活性を妨げる化合物の、またはADDLsの相互作用(たとえばいわゆる「下流」イベント)相手の細胞物資を調節する(すなわち、その活性を、望ましくはADLLSへの作用の結果として、増減する)化合物の、投与によって行うことができる。ADDLsに作用を及ぼす能力をもつそうした化合物は本書では「ADDL調節化合物」という。ADDL調節化合物はマイナス作用を及ぼしうるだけでなく、場合によってはADDLsの形成および/または活性を増進するためにも使用される。
【００８１】
該方法は、in vivoで使用する場合には、ADDLタンパク質集合体の作用に起因する認知、学習または記憶の低下から動物を保護するために使用しうるのが望ましい。この方法はADDLsの形成または活性を阻害する化合物を投与するステップを含む。同様にして、認知、学習および/または記憶の障害がADDL形成および/または活性に起因する限りで、そうした障害は、ADDL活性(および/または形成)がひとたび阻害されれば、逆転または復旧させることができる。こうして本発明は好ましくは、本発明のオリゴマー構造体の作用に起因する動物の認知、学習および/または記憶の低下を逆転(または復旧)させる方法を提供する。この方法はADDLsの形成または活性を阻害するステップを含むのが好ましい。本発明はまた好ましくは、本発明の可溶性の、非線維状Aβオリゴマー構造体の作用に起因する、神経細胞における長期増強の低下を逆転させる(併せて可溶性の、非線維状Aβオリゴマー構造体の作用に起因する長期増強の低下から神経細胞を保護する)方法を提供する。この方法は該細胞を、オリゴマー構造体の形成または活性を阻害する化合物に接触させるステップを含む。
【００８２】
この方法は特に、認知、学習および/または記憶の障害として現れる、ADDL形成および/または活性に起因する疾患、障害または病態特にアルツハイマー病、成人(すなわち40歳超の)ダウン症候群および老人性痴呆症からなる群より選択される疾患、障害または病態の治療または予防に適用しうるのが望ましい。
【００８３】
またこの方法は、疾患、障害または病態の発現に先立って明らかになり、かつ該疾患、障害または病態の発現の一因となる、または最終的に該疾患、障害または病態そのものとなるような細胞活性、認知、学習および記憶に対する初期の有害な影響の治療または予防に適用しうるのが望ましい。該方法は特に、ADDL形成または活性の結果として生じる可能性のある神経細胞または他脳細胞の初期異常の治療または予防に適用しうるのが好ましい。同様に、該方法は文献に記載されているような限局性記憶障害(FMD)[たとえばLinn et al. (1995) Arch. Neurol. vol.52, pp.485-490を参照]の治療または予防に、そうしたFMDがADDL形成また活性に起因する限りで、適用しうるのが望ましい。該方法はさらに、ADDL形成また活性の結果として生じるADDL誘導型の神経信号伝達異常、高次文章技能障害[たとえばSnowdon et al. (1996) JAMA, vol.275, pp.528-532を参照]または高次認知機能障害、長期増強の低下(または欠如)の治療または予防に適用しうるのが望ましい。
【００８４】
本発明によれば、「ADDL誘導型の神経信号伝達異常」は種々の手段で計測することができる。たとえば正常な神経信号伝達(および長期増強反応の観測)には、Fynキナーゼの活性化、FynキナーゼによるNMDAチャンネルのリン酸化[Miyakawa et al. (1997) Science, vol.278, pp.698-701; Grant (1996) J. Physiol. Paris, vol. 90, pp. 337-338]、およびFynの適切な細胞内局在(それは、たとえばADDLによって誘導されるある種の細胞骨格再構築で見られるように、Fyn-FAK複合体の形成によって妨げられることがある)が必要であるように見受けられる。これに基づきADDL誘導型の神経信号伝達異常(ADDLsによる細胞系路の異常活性化によって誘導される信号伝達異常)とその知見を本発明の方法に利用することができるのは、当業者には自明であろう。たとえば、ADDL誘導型の神経信号伝達異常はこれらの手段のうち任意のものを用いて、または当業者には自明であろうが、たとえばFynキナーゼの活性化(またはその修正版)、Fyn-FAK複合体の形成(またはその修正版)、細胞骨格の再構築(またはその修正版)、Fynキナーゼの細胞内局在(またはその修正版)、FynキナーゼによるNMDAチャンネルのリン酸化(またはその修正版)を用いて、(たとえば、ADDL調節活性の評価を目的とした試験化合物の存在下または不存在下にも行うことができる、神経細胞とADDLsとの接触の結果として)評価することができる。
【００８５】
さらに、本発明の方法を使用して識別された化合物を使用する代りに、特定のin vitroおよびin vivo効果を有する公知の化合物を前記の治療方法に使用してADDLに影響を及ぼすこともできる。すなわち、アミロイド形成は2段階過程としてモデル化することができる(が、必ずしもその必要はない)。第1段階では、アミロイド前駆体タンパク質たとえばアミノ酸数695のアミロイド前駆体タンパク質[Kang et al. (1987) Nature, vol.325, pp.733-736]またはアミノ酸数751のタンパク質[Ponte et al. (1988) Nature, vol.331, pp. 525-527]の産生が始まる。どちらのタンパク質もその配列中に、Glenner et al. (米国特許第4,666,829号明細書)によって同定された約4kDaのβアミロイド・コアタンパク質配列を有する。第2段階ではアミロイドのプロセッシングおよび/または沈着により、さらに高分子量の構造体(たとえばβアミロイドのモノマーよりも高分子量のβアミロイド線維または他構造体であるが、プラークやプレプラークよりもずっと小さい構造体を含む)が形成される。化合物によってはこれらの段階の一方に、または両方に影響を及ぼすと考えられる。悪影響を及ぼす化合物もあるが、そうした阻害の場がタンパク質の産生なのかアミロイドのプロセッシングおよび/または沈着なのかは不明である。
【００８６】
こうして、本発明に関係するのは該第1段階または第2段階または両段階で作用する化合物である。特に、第2段階を調節する化合物はADDLsに影響を及ぼす効果が格別であり、ADDLの調節に依存する治療方法に使い道がある。アミロイドの沈着によるさらに高分子量の構造体の形成を調節(阻害)するそうした化合物の非限定的な例は、βアミロイドモノマーのさらに高分子量の構造体特に線維への組込みを調節(特に阻害)する化合物である。従って本発明では望ましくは、βアミロイドモノマーのさらに高分子量の構造体への組込みを阻害するそうした化合物は、特に線維形成を阻害することが知られている(従ってβアミロイドモノマーのさらに高分子量の構造体への組込みを阻害することがすでに確認されている)化合物は、本発明の方法に従ってADDL形成および/または活性に対して阻害作用を及ぼすために使用することができる。もちろん、そうした使用に先立って、該調節物質のADDLに対する作用能を、たとえば本発明の方法を用いて確認するのが好ましい。本発明に使用しうるのが望ましいそうした公知の調節物質は次のとおりであるが、他の類似の調節物質もまた使用可能である。
【００８７】
第2段階で作用する化合物については、PCT国際出願第WO 96/39834号明細書およびカナダ特許出願第2222690号明細書は、アミロイドまたはアミロイド様沈着形成のためのタンパク質またはペプチド上の疎水性構造決定基と相互作用し、以ってアミロイドおよびアミロイド様沈着形成を招くタンパク質およびペプチドの異常折り畳みを阻害し構造的に阻止する新規ペプチドに関する。特に ‘834出願明細書は、約3〜15アミノ酸残基の配列を含み少なくとも3個のアミノ酸からなる疎水性クラスターを有する阻害性ペプチドに関するが、該ペプチドでは該残基のうち少なくとも1つはPro、Gly、AsnおよびHisより選択されるβシート阻止性アミノ酸残基であり、また該阻害性ペプチドはタンパク質またはペプチド上の構造決定基と会合して異常なアミロイドおよびアミロイド様沈着形成を構造的に阻止し、阻害することができる。
【００８８】
PCT国際出願第WO 95/09838号明細書は一連のペプチド作動性化合物、およびAβペプチドの異常沈着を防止するための患者への該化合物の投与に関する。
【００８９】
PCT国際出願第WO 98/08868号明細書は天然Aβペプチド凝集を調節するペプチドに関する。これらのペプチドは3〜5個のD-アミノ酸残基を含み、またD-ロイシン、D-フェニルアラニンおよびD-バリンからなる群より選択される少なくとも2個のD-アミノ酸残基を含む。
【００９０】
同様にして、PCT国際出願第WO 96/28471号明細書は、アミロイド性タンパク質またはそのペプチド断片(トランスサイレチン、プリオンタンパク質、膵島アミロイドポリペプチド、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、アミロイドA、プロカルシトニン、システインC、β2ミクログロブリン、ApoA-1、ゲルゾリン、プロカルシトニン、カルシトニン、フィブリノゲンおよびリゾチームなど)を少なくとも1つの修飾基(たとえば環式、ヘテロ環式または多環式基、cis-デカリン基、コラニル構造、コリル(cholyl)基、含ビオチン基、含フルオレセイン基など)に直接または間接にカップリングさせて含むアミロイド調節化合物に関する。該化合物は天然アミロイドタンパク質またはペプチドと接触させると該天然アミロイドタンパク質またはペプチドの凝集を調節する。
【００９１】
またPCT国際出願第WO 97/21728号明細書は、重合の実現に必要であるAβのLys-Leu-Val-Phe-Phe(KVLFF)配列を組み込むペプチドに関する。この配列を組み込むペプチドはAβに結合するし、また線維形成を阻止することができる。
【００９２】
非ペプチド剤については、PCT国際出願第WO 97/16191号明細書は、以下の式：
【化１】
2006508072.tif 000002
[式中R1とR2は水素、ハロ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシおよびアルキルチオである; R3は水素またはアルキルである; またR4はアルキレン-NR5R6であるが、ただしR5とR6は独立に水素、C1-C4アルキルであるか、またはそれらの結合相手となる窒素と共に、ピペリジルまたはピロリジニルを形成する。]
で示される9-アクリジノン化合物または製薬上許容しうるその塩を動物に投与することによりアミロイドタンパク質の凝集を阻害する薬物に関する。開示の化合物は以前には抗菌・抗腫瘍剤(米国特許第4,626,540号明細書)および抗腫瘍剤[Cholody et al. (1990) J. Med. Chem., vol.33, pp.49-52; Cholody et al. (1992) J. Med. Chem., vol.35, pp.378-382]であるとされた。
【００９３】
PCT国際出願第WO 97/16194号明細書は、以下の式：
【化２】
2006508072.tif 000003
[式中R1とR2は独立に水素、アルキル、置換アルキルまたは完全ヘテロ環式環である; R3は水素またはアルキルである; またR4、R5、R6およびR7は水素、ハロ、アルキルおよびアルコキシを非限定的に含む置換基である。]
で示されるナフチルアゾ化合物を動物に投与することによりアミロイドタンパク質の凝集を阻害する薬物に関する。
【００９４】
日本特許第9095444号明細書はアミロイドタンパク質の凝集および/または沈着を阻害する薬物に関するが、該薬物は以下の式：
【化３】
2006508072.tif 000004
[式中RはCHまたは(随意にアリール、ヘテロシクリル、COR5、CONHR6またはシアノを置換基とする)COOR4を置換基とするC1-C5アルキルである; R4はHまたはC1-C10アルキル、C3-C10アルケニル、C3-C10環式アルキルである(いずれも随意に置換基を有する); R5とR6は随意置換アリールまたはヘテロシクリルである; R1とR2はH、C1-C5アルキルまたはフェニルである; R3はH、C1-C5アルキルまたはOOR7である; R7はOR’、-R”または-N(R’’’)2である; R’、R”、R’’’はC1-C4アルキルである。]
で示されるチオナフタレン誘導体を含む。
【００９５】
日本特許第7309760号およびPCT国際出願第WO95/11248号の各明細書はアミロイドβタンパク質の凝集および/または沈着の阻害剤特にリファマイシン誘導体に関する。日本特許第7309759号明細書はアミロイドβタンパク質の凝集および/または沈着の阻害剤特にリファマイシンSV誘導体に関する。日本特許第7304675号明細書はアミロイドβタンパク質の凝集および/または沈着の阻害剤特に3-ホモピペラジニル-リファマイシン誘導体に関する。
【００９６】
日本特許第7247214号明細書はβ-アミロイド形成および/または沈着の阻害剤として使用しうるピリジン誘導体、およびその塩またはプロドラッグに関する。
【００９７】
米国特許第5,427,931号明細書は哺乳動物におけるアミロイドプラークの沈着を阻害する方法に関する。該方法はプラーク沈着阻害有効量のプロテアーゼ、ネキシン-2またはその断片または類似体を該哺乳動物に投与するステップを含む。
【００９８】
第1段階または第2段階で作用する(すなわち作用の場が不確定である)化合物については、PCT国際出願第WO96/25161号明細書はアミロイドβタンパク質の産生または分泌を阻害する製剤組成物に関する。該組成物は以下の式：
【化４】
2006508072.tif 000005
(式中、環Aは随意置換ベンゼン環である; RはOR1、
【化５】
2006508072.tif 000006
またはSR1であるが、ただしR1、R2およびR3は同じであるか、または異なり、かつ各々が水素原子と随意置換炭化水素基より選択されるか、またはR2とR3は隣接窒素原子と共に随意置換型の含窒素ヘテロ環式基を形成する; Yは随意置換アルキル基である。)
で示される化合物または製薬上許容しうるその塩を、必要に応じて製薬上許容しうる賦形剤、担体または希釈剤と共に、含む。もちろん、これらや他の公知の(たとえば第1段階または第2段階の)調節物質は本発明に従って使用するのが好ましい。ゴシポールおよびゴシポール誘導体の使用も好ましい。さらに、ADDL活性に影響を及ぼす能力をもつ調節物質の使用も見込まれる(たとえばPCT国際出願第WO93/15112号および97/26913号明細書)。
【００９９】
また、ADDLs自体を治療に使用してもよい。本書で開示するこれらの新規集合体は細胞に対する多数の予想外の作用を有しており、それは治療に適用しうると考えられる。たとえばADDLsは、血管細胞と相互作用することなどが特に知られている内皮細胞を活性化する。従って、ADDLsはたとえば創傷治癒に使用することができよう。また、たとえばA型ボツリヌス毒素(Botox)はボツリヌス菌(Clostridium botulinum)に由来する神経筋接合部遮断薬であり、その作用機序は神経伝達物質アセチルコリンの放出を遮断するというものである。Botoxは無力性筋痙攣(失調症を含む)の治療に有効であると証明されている。ADDLs自体は理論的には、神経細胞機能を支配するためか、または標的神経細胞を(たとえば中枢神経系特に脳のがんなどの場合に)破壊するために、使用することができよう。ADDLsは、細胞に対するごく早期の作用を有するので、また細胞に対するその作用が(細胞傷害作用を別にすれば)可逆的であるように見受けられるので、さらに有利であるように思われる。
【０１００】
前述のように、本発明のADDL調節化合物、アミロイドβのさらに高分子量の構造体への組込みに影響を及ぼす公知化合物、それにADDLs自体は、in vitroまたはin vivoで細胞に接触させるために使用することができる。本発明では、細胞は任意の細胞でよいが、真核細胞であるのが好ましい。真核細胞は一般に、生活環の何らかの時期に核膜で覆われた核を有する細胞である。真核細胞は(たとえば単細胞の酵母菌細胞などではなく)多細胞種の真核細胞であるのが好ましく、哺乳動物(随意にヒト)細胞であるのがなお好ましい。しかし、本発明の方法はトリ細胞などのような多様な異種細胞やげっ歯類、霊長類(チンパンジー、サル、類人猿、ゴリラ、オランウータンまたはテナガザルなど)、ネコ科、イヌ科、有蹄類(反芻動物やブタなど)、それに特にヒトの細胞を非限定的に含む哺乳動物細胞を使用して効果的に行うこともできる。好ましい細胞の種類は脳内に形成される細胞であり、神経細胞やグリア細胞を含む。本発明に従う特に好ましい細胞の種類は(正常または異常な、たとえば形質転換またはがん性)神経細胞である。組織培養に使用するときは、神経細胞は神経芽細胞腫細胞であるのが望ましい。
【０１０１】
細胞は単一体として存在してもよいし、より大きな細胞集合体の一部として存在してもよい。そうした「より大きな細胞集合体」にはたとえば(混合または純粋)細胞培養、組織(たとえば神経または他組織)、器官(たとえば脳または他器官)、器官系(たとえば神経系または他器官系)、または生物体(たとえば哺乳動物等)がある。本発明との関連で着目する器官/組織/細胞は中枢神経系のそれ(たとえば神経細胞)であるのが好ましい。
【０１０２】
また本発明では、「接触」は任意の手段によりこれらの薬物を細胞に物理的に接触させることをいう。その方法は特定の導入手段に依存するものではなく、また依存しないものとする。導入手段は技術上周知であり、また本書でも例示する。従って導入はたとえばin vitroで行うことも(たとえばex vivo型の治療方法または組織培養研究の場合)、in vivoで行うことも可能である。他の方法も利用可能であり、また技術上周知である。
【０１０３】
そうした「接触」は、ADDLsとADDL調節化合物と細胞との表面的な接触または相互接触が実現可能になる限り、任意周知の方法および本書で開示の方法により行うことができる。接触はたとえばこれらの要素を小容量の同じ溶媒中で混合することにより行うことができる。随意に、これらの要素を技術上周知の化学的手段で、または他の手段で、さらに共有結合させてもよいし、また好ましくは非共有的相互作用(イオン結合、水素結合、Van der Waals力、および/または無極性相互作用など)で結合させてもよい。その一方で、対象細胞とADDLまたはADDL調節化合物を小容量中で接触させる必要は必ずしもない。ADDLまたはADDL調節化合物を宿主に投与し、複合体が血流または他体液(脳脊髄液など)中を移動して結合対象の細胞に到達するような場合である。細胞へのADDLまたはADDL調節化合物の接触は、別の着目化合物の投与前・中・後のいずれに行われてももよい。この接触は、同時投与薬物がその作用を細胞またはADDLに対して少なくともある時間にわたり並行的に及ぼすように、行われるようにするのが望ましい。
【０１０４】
当業者には自明であろうが、本発明の薬物(たとえばADDLまたはADDL調節化合物)を動物に投与するには、治療/診断、研究または治験の目的に応じた好適な方法があり、また投与には複数の経路を使用しうるものの、他の経路に比べてより短時間に、より効果的な反応をもたらすような特定の経路が存在しうる。製薬上許容しうる賦形剤もまた当業者には公知であり、また入手も容易である。賦形剤の選定は特定の薬物投与方法にもよる。従って、多様な種類の製剤が本発明への使用に適する。以下の方法と賦形剤は単なる例示であり、限定的なものではない。
【０１０５】
好適な経口製剤には(a)有効量の化合物を希釈剤たとえば水、食塩水またはオレンジジュースなどに溶解した液剤; (b)所定量の活性成分を固形物または顆粒として含むカプセル剤、小袋または錠剤; (c)好適な懸濁剤; および(d)好適な乳剤などがある。錠剤は1つまたは複数の乳糖、マンニトール、トウモロコシでんぷん、片栗粉、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色料、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味料および薬理学的適合性のある賦形剤を含有してもよい。薬用ドロップは活性成分と香味料、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントを含み、またトローチは活性成分と不活性基剤たとえばゼラチンやグリセリン、乳液、ゲル、周知の賦形剤などを含むのが普通である。
【０１０６】
本発明の薬物は単独で、または他の好適な成分と組み合わせて、吸入投与用のエアゾール製剤に仕立ててもよい。エアゾール製剤には許容しうる加圧推進剤たとえばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などを使用することができる。また、非加圧製剤としてネブライザーまたはアトマイザーと併用してもよい。
【０１０７】
本発明では好適な非経口製剤が好ましい場合もあり、その例は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を投与対象者の血液と等張化するための溶質などを含んでもよい水性/非水性の等張滅菌注射液や懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤などを含んでもよい水性/非水性の滅菌懸濁液などである。この製剤は単位用量型または多用量型の密封容器たとえばアンプルやバイアルに包装してもよいし、また凍結乾燥条件で保存して、滅菌した液体賦形剤たとえば水を添加するだけで注射液として使えるようにしてもよい。即席注射溶液/懸濁液は前述のような滅菌粉末、顆粒または錠剤から調製してもよい。
【０１０８】
本発明との関連で動物特に人間に投与する用量は着目の薬物、使用組成物、投与方法、および治療対象の特定部位および生物体に応じて異なろう。しかし、有効量の薬物(たとえば本発明のADDLまたはADDL調節化合物)に対応する用量の使用が好ましい。「有効量」は宿主に所期の効果を生み出すに足る量であるが、そうした効果は技術上周知のいくつかのエンドポイントを使用してモニターすることができる。所期の効果の例は学習、記憶、LTP反応、神経毒性、ADDL形成、ADDL細胞表面タンパク質(たとえば受容体)結合、抗体結合、細胞形態変化、Fynキナーゼ活性、星状細胞活性化、およびインターロイキン-1、誘導型NOS、ApoE、ApoJ、α1-抗キモトリプシンなどのタンパク質に対応するmRNAレベルの変化などに対する効果を非限定的に含む。開示したこれらの方法はけっして包括的ではない。当業者には、個別の用途に適合したさらなる方法が明らかであろう。
【０１０９】
さらに、特定の(たとえばin vitroまたはin vivo)用途では、ADDLまたはADDL調節化合物の実際の用量や投与計画は、該組成物を他の製剤組成物と組み合せて投与するかどうかに応じて、あるいは薬物動態、体内動態および代謝の個体間差異に応じて、変化しうる。同様にして、in vitro用途では使用細胞の特定の種類、あるいはADDLまたはADDL調節化合物を培養物に移す際の手段または溶液に応じて、用量が変化しうる。当業者は個別事例の条件に従って必要な調節を加えることができる。
【０１１０】
ある種の化合物の使用に際しては場合によって、該化合物(たとえば薬物)を製剤組成物として脳内に直接または間接に導入するのが望ましい、または必要でさえある。直説導入法の非限定的な例は宿主脳室系への薬物送達カテーテルの挿入による血管脳関門の迂回である。間接導入法の非限定的な例は技術上周知の手法を用いて(たとえば薬物上のヒドロキシル、カルボキシルおよび第1級アミン基をブロックすることにより)親水性薬物を脂溶性薬物に変換させ、以って薬物の血管脳関門の通過を可能にするような組成物の調製である。さらに、親水性薬物の送達はたとえば血管脳関門を一時的に開放する高張液(または他の溶液)の動脈内注入によって改善することができる。
【０１１１】
以下の文献は、それらが本書で開示し特許請求する本発明と矛盾しない限りで、本書に組み込まれる:
1)  欧州特許出願第EP 01172378号明細書「ヒトβアミロイド抗体およびアルツハイマー病治療へのその使用」-「Aβアフィニティークロマトグラフィーにより含ヒトIgG体液から得られたヒト抗Aβ抗体およびアミロイド関連疾患特にアルツハイマー病、原発性および続発性アミロイド症の診断または治療へのその使用を特許請求の範囲に含める。含IgG体液のアミロイド関連疾患治療への使用および抗Aβ抗体を含む製剤組成物もまた特許請求の範囲に含める。ヒトIgGまたはヒトIgG由来の抗Aβ抗体の注入によるアルツハイマー病の治療法を開示する。神経疾患の患者4人に免疫グロブリン製剤(Octagam, Polyglobulin)を静注投与すると、CSF中のAβ量が投与前の1835ng/lから投与4週間後の1376ng/lへと減少する」
【０１１２】
2)  国際公開第WO00/071671号明細書「新規の突然変異遺伝子およびアミロイド関連神経変性疾患モデルへのその使用」-「家族性痴呆のFamilial British Dementia(FBD)とFamilial Danish Dementia(FDD)にそれぞれ関連付けられる突然変異アミロイド前駆体ポリペプチドのABriPPとADanPPおよびそのアミロイドペプチドABriとADan、およびそれらの、脳アミロイド症抑制および該痴呆の潜在治療薬のスクリーニングへの使用を特許請求の範囲に含める。該ポリペプチドおよびペプチドをコードするポリヌクレオチド、アミロイド前駆体ポリペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターおよびトランスジェニック動物もまた特許請求の範囲に含める。さらに、ABriまたはADanの変異エピトープに対する特異的免疫反応を誘導しうる特異抗体、免疫検定法およびワクチン組成物もまた特許請求の範囲に含める。この発明によって提供されるトランスジェニックマウスはアルツハイマー病などの神経変性疾患の研究に特に貴重であるとされる。FBD患者とFDD患者の軟膜および実質の沈着からアミロイド線維を単離した。核酸およびアミノ酸配列を決定し、抗体を産生させた。両疾患で沈着したアミロイドは同じアミロイド前駆体タンパク質に由来したが、異なる遺伝的欠陥を有していた」
【０１１３】
3)  国際公開第WO00/072876号明細書「アミロイド性疾患の予防治療」-「患者のアミロイド成分に対する免疫反応を誘導しうる薬物と製薬用添加剤とを含む組成物を特許請求の範囲に含める。アミロイド沈着を特徴とする疾患の治療予防への該組成物の使用、およびアミロイド疾患の治療を受けている患者の予後診断法もまた特許請求の範囲に含める。アルツハイマー病に対するAβの有効性を評価するために、アルツハイマー様神経病理を発現しやすくする突然変異を位置717に有するAPPを過剰発現するトランスジェニックマウスに、Aβ42ペプチドを投与した。該マウスにはAβ42、SAPペプチド、PBSのいずれかを投与した。マウスをモニターし、13か月目に犠牲にした。凝集Aβ42を投与したマウスは高抗体価を示した。Aβ42で処置したマウス9頭のうち7頭では脳に検出可能なアミロイドが認められなかった。これらの結果を図で表示する」
【０１１４】
4) 国際公開第WO00/072880号明細書「アミロイド性疾患の予防治療」-「特許請求の範囲に含まれるのは特に、Aの1〜10残基内のエピトープに結合するヒト・アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の抗体および随意に二次抗体を、または該抗体をコードするポリヌクレオチドを、またはAβの少なくとも1〜5残基からなるN末端断片を含むペプチドを、投与することによる、アルツハイマー病、ダウン症候群または軽度認知障害などのようなAβ沈着に関連する疾患を予防または治療する方法である。該方法はアミロイド沈着に対してFc受容体を介した貪食作用という除去反応を誘導するとされる。アミロイド沈着を検出するための、また抗原除去活性をもつ抗体を識別するための、スクリーニング方法もまた特許請求の範囲に含まれる。アルツハイマー様神経病理を発現しやすくする突然変異を位置717に有するAPPを過剰発現するトランスジェニックマウス(PDAPPマウス)にAβ1-42(AN1792)ペプチドを投与してAβのアルツハイマー病予防効果を評価した。Aβ1-42の注射は脳組織へ(から)のヒトAβの沈着防止または除去に、またその後の神経細胞性および炎症性変性の解消に、大いに有効であると判明した。PDAPPマウスでのAN1792の効果には皮質Aβレベルの72%低下、老人斑面積の著(84%)減、および星状細胞症発現の抑制などがある。合成Aβタンパク質による免疫はアミロイドプラーク中のAβにin vivoで結合する抗体を生成させることも示された」
【０１１５】
5)  国際公開第WO00/077178号明細書「アルツハイマー病治療のためのin vivo βアミロイド(β-A)レベルの免疫学的制御」-「特許請求の範囲に含まれるのはβ-A内の指定アミド結合の加水分解を触媒する抗体である。この活性を有し、かつ血液脳関門を通過することができる抗体もまた特許請求の範囲に含まれる。β-A抗原で免疫するかまたは特異抗体を投与することによる動物の血流中の遊離β-Aを捕捉する方法および脳内β-Aレベルを低下させる方法もまた特許請求の範囲に含まれる。さらに、内因性β-A由来の抗原エピトープまたは加水分解の遷移状態に類似するβ-Aを提供することにより、または抗体を投与することにより、アミロイドプラーク形成を防止し、循環β-Aレベルを低下させ、またアミロイドプラークを解離させる方法もまた特許請求の範囲に含まれる。さらに、抗体を生成させる方法も特許請求の範囲に含まれる。β-A由来の3種のペプチド抗原で免疫したマウスは異なるエピトープと全長β-Aに対して特異的な抗体を産生することがELISA法により示された。カニクイザルの免疫に使用したミョウバンベースのβ-Aペプチドワクチンもまた、該ペプチドに対する強力な免疫反応を生み出した。抗β-A遷移状態抗体が生成したが、それらは天然β-Aペプチドに遷移状態コンホメーションを強いて、潜在的に有害性の低い、より短いペプチドへの分解を可能にしうるのかもしれないとされる。抗β-A抗体は脳への送達手段としての抗トランスフェリン受容体抗体(anti-TfR)に結合させた。特異抗体は含TfRマウス細胞膜に接着し、[125I]-β-Aを結び付ける。[125I]-β-Aを生きたマウスに投与すると、脳内レベルは1〜6時間目に上昇し、24〜48時間目に低下した。脳に入りやすくするために、また有害な補体結合を避けるために、もっと小さな修飾二重特異性薬物を使用することを検討する」
【０１１６】
6)  国際公開第WO00/139796号明細書「アルツハイマー病およびアミロイド関連疾患の予防治療ワクチン」-「特許請求の範囲に含まれるのは、対象者のアミロイド関連疾患を予防または治療するための、抗原量のオールDペプチドを投与するステップを含む新規の方法である。対象者のアミロイド関連疾患を予防または治療するための、抗原量のオールDペプチドに対して産生させた(アミロイドタンパク質の少なくとも一領域と相互作用し線維形成を妨げる)抗体を含むワクチンもまた特許請求の範囲に含まれる。さらに、対象者のアミロイド関連疾患を予防または治療するための、抗原量のオールDペプチドに対して産生させた(アミロイドタンパク質の少なくとも一領域と相互作用する)抗体を含むワクチンもまた特許請求の範囲に含まれる。アミロイド関連疾患を予防または治療するためのワクチンの、アミロイド関連疾患を予防または治療するための医薬の製造へとの使用もまた特許請求の範囲に含まれる。ウサギを使用してオールDペプチド対して産生させた抗体は抗線維形成活性が抗オールLペプチド抗体の約5倍であった。これらの結果は2つの図で示す。抗KLVFFA抗体は非凝集形のAβを認識しただけであり、脳スライス中のプラークには結合しなかった」
【０１１７】
7) 国際公開第WO00/142306号明細書「アルツハイマー病に関連するアミロイドβペプチドに対する免疫に有用である免疫原性キメラペプチドおよび抗体」-「特許請求の範囲に含まれるのは、天然型の前駆体または成熟タンパク質内部ペプチド分解産物に由来する末端特異的B細胞エピトープを、異なるヘルパーT細胞エピトープに、スペーサー残基を介してまたは介さずに、融合させた遊離NまたはC末端として有するキメラペプチドである。該ヘルパーT細胞エピトープは破傷風毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、麻疹ウイルスFタンパク質、B型肝炎ウイルス表面抗原、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatis)主要外膜タンパク質、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)スポロゾイト周囲タンパク質、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イソメラーゼまたはE. coli TraTに由来してもよい。内部自己ペプチド分解産物の遊離N末端または遊離C末端に対する免疫のための免疫組成物および方法もまた特許請求の範囲に含まれる。該内部自己ペプチド分解産物はアミロイドβペプチドでもよい。さらに、該キメラペプチドに対して特異的な抗体の抗原結合部分および該部分の受動免疫法への使用もまた特許請求の範囲に含まれる。該抗体はβアミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の分解に由来するアミロイドβペプチドに対して産生させてもよい。βAPPとセクレターゼによる切断の産物の略図を示す。アミロイドβペプチドの由来であるβAPPの部分アミノ酸配列を示す。生物学的オリジナルデータは他には提示されていない」
【０１１８】
8) 国際公開第WO00/153457号明細書「神経変性疾患に対するワクチン」-「特許請求の範囲に含まれるのは、神経変性疾患に関連する、βアミロイドではない抗原分子を含む製剤組成物である。該組成物が特許請求の範囲に含まれるのは特に、該抗原分子がオリゴマーAβ複合体、ApoE4-Aβ複合体、αシヌクレイン、変異アミロイド前駆体、プレセニリン、またはプリオンタンパク質であり、かつ該組成物がアジュバントたとえば免疫賦活分子または微粒子状アジュバントをさらに含む場合である。抗原分子、運搬体タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換えヒト細胞を含む神経変性疾患の治療または予防用の製剤組成物もまた特許請求の範囲に含まれる。さらに、抗原分子および第2抗原分子によりin vitroで感作した抗原提示細胞の組成物を投与することにより抗原に対する免疫反応を誘導する方法もまた特許請求の範囲に含まれる。種々のタンパク質が神経変性疾患に関連する抗原分子のもとになるとされる。たとえばアポリポタンパク質E4、アミロイド前駆体タンパク質、タウタンパク質およびプリオンタンパク質などである。抗原の組換え産生および修飾のための種々の方法が開示されており、また神経変性疾患の治療予防へとの潜在的使用も検討されている。適応免疫療法やマクロファージおよび抗原提示細胞の抗原感作との組合せを含む治療方法、および抗原ワクチンの調製方法、免疫原性や効果を評価するための検定方法もまた開示されている」
【０１１９】
9) 国際公開第WO00/162284号明細書「アルツハイマー病治療ワクチン」-「特許請求の範囲に含まれるのは、個体へのアミロイド性ポリペプチドに対するワクチンの接種に使用しうるタンパク質である。B細胞エピトープまたはT細胞エピトープを含むアミロイド性ポリペプチドで免疫すると、アミロイドタンパク質のダウンレギュレーションを実現することができるとされる。修飾分子を抗原提示細胞へと誘導するような修飾も特許請求の範囲に含まれる。ワクチンとして使用されるポリペプチドは、パルミトイル基またはファルネシル基へのカップリングにより、またはアミド結合による多糖へのカップリングにより、修飾することができるとされる。該多糖にはポリペプチドワクチンとT細胞エピトープを別個に結合させることができる。アミロイドタンパク質の減少とアルツハイマー病の効果的な治療を目的とした使用では、少なくとも年12回の投与が求められる。APPタンパク質の様々な部分をB細胞エピトープおよびT細胞エピトープP30およびP2と共に含む35コンストラクト。そうしたポリペプチドコンストラクトの1つをE. coli中で発現させ、封入体から精製し、リフォールドさせた。ヒトAPPを含むトランスジェニックマウスをAβ42の残基673-714を含む合成ペプチドまたは35コンストラクトのうちの1つに由来するタンパク質で免疫する。高抗体力価がAβ42タンパク質で4回免疫後に見られた。AβペプチドだけでなくP2およびP30ペプチドをも含むAβペプチドコポリマーワクチンの合成もまた開示されている」
【０１２０】
10) 国際公開第WO00/162801号明細書「Aβペプチドを除去するヒト化抗体」-「特許請求の範囲に含まれるのは、Aβの13〜28位内に含まれるエピトープに特異的に結合して、Aβをその血中の結合・循環形から分離し、また中枢神経系および血漿中の可溶・結合形Aβのクリアランスを改善するようなヒト化抗体である。該抗体およびその断片の組換え産生のための核酸、発現ベクターおよびそれらを導入した細胞もまた特許請求の範囲に含まれる。該ヒト化抗体の投与はアミロイドプラークの形成または有害な可溶性Aβの人間への作用を抑制または阻害する効果があり、それはアルツハイマー病、ダウン症候群および脳アミロイド血管症の治療に有用であるとされる。ヒトCSF中ではMab266とMab4G8に限ってAβペプチドを除去しうることが示された。さらにAβの固定化(sequestration)は抗ApoE抗体の影響を受けなかった。Aβペプチドのin vivo固定化は、該ペプチドが血流中のMab266の存在により脳実質からCSF中に排出されることを示した」
【０１２１】
11) 国際公開第WO00/190182号明細書「Aβおよびアミロイド沈着に対する免疫反応を誘導するための、Aβに類似する合成免疫原性・非アミロイド性ペプチド」-「特許請求の範囲に含まれるのは、単離ペプチド、および該ペプチドを広い特異性の(promiscuous)ヘルパーT細胞エピトープなどのようなポリマー分子と架橋結合させた複合体である。該単離ペプチドまたは複合体と製薬上許容しうる担体とを含む免疫組成物もまた特許請求の範囲に含まれる。さらに、該ペプチドに対して生成させた抗体たとえばモノクローナル、キメラまたはヒト化抗体の抗原結合部分を含む分子、および該分子と製薬上許容しうる担体とを含む製剤組成物も特許請求の範囲に含まれる。アミロイド線維および沈着の形成を抑えるための、該分子の投与を含む方法もまた特許請求の範囲に含まれる。プロトタイプのペプチドK6Abeta1-30-NH2は少なくとも15日間は線維を形成しないことが示された。K6Abeta1-30-NH2は2日後にはヒト神経芽細胞腫細胞に影響を及ぼさず、また6日後にはやや栄養作用的であった。K6Abeta1-30-NH2をワクチン接種したマウスは皮質および海馬のアミロイドプラーク面積を対照に比してそれぞれ81%、89%減少させた。配列表が開示されている」
【０１２２】
12) 国際公開第WO00/200245号明細書「神経毒オリゴマー、およびアルツハイマー病等の疾患治療面でのその潜在的価値」-「特許請求の範囲に含まれるのは、チロシン架橋の酸化的損傷および形成に関連するタンパク質の病的凝集および集積を特徴とする疾患の予防、治療または改善のための、免疫有効量の1つまたは複数のチロシン架橋化合物の使用である。該疾患はアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、パーキンソン病、クロイツフェルト=ヤコブ病、レビー小体形成を伴う痴呆症、多系統萎縮症、ハレルフォルデン=スパッツ病、またはびまん性レビー小体病などであろう。該化合物は、それ自体が免疫原性である運搬体タンパク質とカップリングしてもよい。これらの疾患への抗体および抗体断片の使用、それに患者由来の体液サンプルに関するチロシン架橋を含む分子の有無の検定に基づく診断方法もまた特許請求の範囲に含まれる。ジチロシン架橋の誘導方法および架橋結合で形成されるポリペプチドの構造は、抗体によるジチロシンの認識にとって大いに重要であることが示された。トランスジェニックマウスのアミロイドベータ沈着に対するジチロシンによる免疫効果の評価方法が開示され、またマウスでのジチロシン抗体による治療の効果が検討されている」
【０１２３】
13) 国際公開第WO00/221141号明細書「アミロイド沈着関連疾患の治療のための方法および組成物」-「特許請求の範囲に含まれるのは、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質と、トランスフェリン部分または断片を含む少なくとも1つまたは複数のフラグメントとを含む、血管脳関門を通過することができる組成物である。該融合タンパク質を産生させるための分子コンストラクトおよび発現ベクターもまた特許請求の範囲に含まれる。該融合タンパク質は人間のアミロイド沈着を改善することができるという。少なくとも1つの修飾ペプチドすなわちパルミトイル化ベータアミロイド1-16ペプチド、その断片または部分をリポソーム中に固定して含むさらなる組成物も特許請求の範囲に含まれる。マウスから採取した血液にELISA法を適用して抗ベータアミロイド抗体の生成を調べたが、5000倍希釈した血清ではOD45は対照の10倍であった。ワクチン接種NOBRAマウスに由来する膵臓のチオフラビン染色スライスの組織学的研究から、ワクチン接種はベータアミロイドプラークを分解させるか、プラーク沈着を逆転させることが判明した。各染色スライスの平均蛍光強度の定量評価では、ワクチン接種NOBRAマウスに由来する膵臓スライスの蛍光強度は対照(非ワクチン接種)マウスの高蛍光強度の<25%であった」
【０１２４】
14) 国際公開第WO02/060481号明細書「毒素または感染性病原体に関連する疾患の低用量抗体療法」-「特許請求の範囲に含まれるのは、毒素または感染性病原体の存在に関連する疾患を、該毒素または病原体に対して特異的な抗体を日用量0.1mg未満投与することにより治療する方法である。該抗体はモノクローナル抗体でもよいし、また投与方法は経口法、飲薬法、舌下法、注射法のいずれでもよい。該疾患はがん、肺感染症、アルツハイマー病、糖尿病、クローン病または関節リウマチのいずれでもよい。製剤組成物もまた特許請求の範囲に含まれる。低用量の注意欠陥症候群および多発性硬化症の治療および肺炎桿菌特異抗体による若年性関節リウマチの治療について、実施例を示す。アルツハイマー病および老衰犬への抗アミロイドベータ抗体の使用も開示する」
【０１２５】
15) 国際公開第WO96/25435号明細書「ベータA4ペプチド特異的モノクローナル抗体」-「特許請求の範囲に含まれるのは、アミロイド前駆体タンパク質由来のベータA4ペプチドに結合する新規モノクローナル抗体である。本発明はアルツハイマー病の診断治療に潜在的に有用であるとされる。公知技術は結合の特異性があまり高くなかった。ベータA4ペプチドの放出はアルツハイマー病の兆候であり、アルツハイマー病患者の脳部位には大量のベータアミロイドプラークが見られる。該モノクローナル抗体はベータA4ペプチド(ベータA4 ‘1-42’)の遊離C末端に対して特異的である。該抗体は拡散性および線維状アミロイド、神経原線維変化および血管アミロイドに結合する。該モノクローナル抗体の投与はベータA4ペプチドの凝集を防ぎ、以って疾患を抑えるとされる。ベータA4ペプチドを異種発現させ、Balb/cでモノクローナル抗体を生成させた。最良の細胞株を選択し、該抗体がアミロイドプラークコアや他アミロイド沈着との結合で高親和性、高特異性を示すことを証明した。このベータA4 1-42ペプチド抗体は効果的に結合するが、ベータA4 1-43ペプチド抗体はそうではないことが示された」
【０１２６】
16) 国際公開第WO98/05350号明細書「プラーク形成疾患治療の材料と方法」-「特許請求の範囲に含まれるのは、アミロイドおよび動脈プラーク形成に関連する疾患の症状を緩和する方法および組成物である。該組成物はアミロイドタンパク質および/またはチメロサールを含み、アルツハイマー病、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症、高血圧、ヘルペスおよび慢性疲労症候群に使用される。チメロサールは市販インフルエンザウイルスワクチンに使用されている防腐剤である。日量10〜4mgのアミロイドベータタンパク質の舌下投与を3〜4か月にわたり継続したアルツハイマー病患者6人は、治療期間中のミニ精神状態試験で得点を伸ばした。アミロイドタンパク質+チメロサールを投与したアテローム性動脈硬化症患者5人は血圧低下を示した。チメロサールだけを慢性疲労症候群患者16人を対象とする二重盲検試験で評価すると、重篤度の有意の改善という結果が得られた。チメロサールの抗ヘルペス活性を±インフルエンザワクチン条件下、in vitro実験と患者7人で確認した。開示の組成物はアミロイドベータタンパク質10-10〜10-2 mgおよび/またはチメロサール0.05〜500 mugを含み、患者あたり0.05 ml用量を舌下投与するものであり、特にこの使用に関して特許請求の範囲に含まれる」
【０１２７】
17) 国際公開第WO98/44955号明細書「ベータアミロイド末端に対して特異的な組換え抗体、該抗体をコードするDNA、およびそれらの使用方法」-「特許請求の範囲に含まれるのは、アルツハイマー病の進行を防止または阻害する方法である。この方法はベータアミロイドペプチドのCまたはN末端に対して特異的な抗体をコードする核酸配列の投与を含む。この抗体コード化配列は中枢神経系内での発現のための好適なプロモーターに連結されている。この技術はベータアミロイドペプチドの集積を防止し、以って脳内アミロイド沈着を招く凝集を防止するよう工夫されている。標準ハイブリドーマ法により、ウシ血清アルブミンを結合した末端ペプチド配列を使用してベータアミロイドペプチド末端特異的なモノクローナル抗体を産生させる。精製抗体はin vitroでベータアミロイドペプチドの凝集およびマウス脳細胞内でのベータアミロイドペプチド誘導神経毒性を防ぐ効果のあることが示された。免疫グロブリン可変領域のクローニングおよびFv領域の脳内発現のための組換えアデノ随伴ウイルスベクターの構築もまた開示されている」
【０１２８】
18) 国際公開第WO99/27944号明細書「アミロイド性疾患の予防治療」-「特許請求の範囲に含まれるのは、アミロイド性疾患の予防または治療方法およびこの方法に使用する製剤組成物である。該方法はアミロイドタンパク質特に凝集ベータアミロイド(Aβ)に対する免疫反応を誘導する薬物の投与を含む。該組成物はAβ、その活性断片、または該タンパク質をコードする核酸を含むとされる。Aβ1-42のアルツハイマー病治療効果を評価するための検定を脳アミロイドプラークのあるPDAPPマウスで行った。皮質アミロイドプラーク面積は対照に比して15か月後に96%、18か月後に98%減少した。種々のアジュバントの効果もまた例示されている」
【０１２９】
19) 国際公開第WO99/58564号明細書「アルツハイマー病とダウン症候群の予防に使用するベータアミロイド前駆体タンパク質およびユビキチンBタンパク質の変異ペプチド」-「特許請求の範囲に含まれるのは、ベータアミロイド前駆体タンパク質およびユビキチンBタンパク質の新規変異ペプチド、該ペプチドを含む製剤組成物、該ペプチドをコードするDNA配列、およびそうしたDNA配列を含むプラスミドまたはベクターである。これらのペプチドは前記タンパク質のフレームシフト型変異を含み、またアルツハイマー病まてはダウン症候群の治療に、または予防ワクチンとして、使用するとされる。特許請求の範囲に含まれるワクチン接種方法は、該変異ペプチドを、それに対してT細胞特異免疫が生じるまで、投与することからなる。該ペプチドの投与方法が、免疫系の反応を改善するための他のサイトカインや成長因子たとえばIL-2、IL-12、GM-CSFなどの使用を含めて、開示されているが、生物学的データの提示はない。該ペプチドは連続フロー式固相ペプチド合成法を用いて合成された。ペンタフルオロエステルとしてのカップリングのためにFmoc-アミノ酸を活性化した。次いで20%ピペリジン/DMF溶液を使用して、カップリング後のFmocを選択除去した。ペプチドを精製し、逆相HPLCで分析し、エレクトロスプレー質量分析法でペプチドの同定を確認した。5〜28アミノ酸の10種のペプチドが、特定化合物のAsn-Val-Pro-Gly-His-Glu-Arg-Met-Gly-Arg-Gly-Arg-Thr-Ser-Ser-Lys-Glu-Leu-Alaを含めて、特に特許請求の範囲に含まれる。」
【０１３０】
以上(および以下)の開示と引用は例示にすぎない。当業者には本発明の方法および構成要素の他の実施態様も自明であろう。そこで以下の実施例をもって本発明をさらに説明するが、それらは本発明の特許請求の範囲をいかなる意味でも限定するものではない。
【実施例】
【０１３１】
実施例１
アミロイドβオリゴマーの調製
本発明に従って、1mgの固体アミロイドβ1-42[たとえばLambert et al. (1994) J. Neurosci. Res., vol.39, pp.377-395に記載の要領で合成]を44μLの無水DMSOに溶解してADDLsを調製した。この5mM溶液を次に冷(4℃)F12培地(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Md.)で希釈して合計容量を2.2mLとし(50倍希釈)、約30秒間ボルテックスした。混合物を約0〜8℃で約24時間インキュベートし、次いで14,000g 、4℃で約10分間遠心分離した。上清を特定の既知組成培地で10倍〜10,000倍希釈した後、脳スライス培養、細胞培養または結合性タンパク質調製物と共にインキュベートした。しかし一般には、Aβ濃度100μMでADDLsを形成させた。一般に、実験に使用した最高濃度は10μMであり、場合によってはADDLs(当初Aβ濃度で測定)を(たとえば細胞培地で)1nMまで希釈した。原子間力顕微鏡(AFM)分析では、100倍希釈液20μLを生成したての雲母劈開面上に塗布して分析した。他の操作は下文のとおりであるか、または周知のとおりである。
【０１３２】
あるいはADDLを前記と同様にして、ただしF12培地の代りに次の成分を含む緩衝液(F12培地代用物)を使用して形成させた: N,N-ジメチルグリシン(766mg/L)、D-グルコース(1.802g/L)、塩化カルシウム(33mg/L)、硫酸銅五水和物(25mg/L)、硫酸鉄(II)七水和物(0.8mg/L)、塩化カリウム(223mg/L)、塩化マグネシウム(57mg/L)、塩化ナトリウム(7.6g/L)、炭酸水素ナトリウム(1.18g/L)、リン酸水素二ナトリウム(142mg/L)および硫酸亜鉛七水和物(0.9mg/L)。緩衝液は0.1M水酸化ナトリウムを使用してpHを8.0に調整した。
【０１３３】
実施例２
アミロイドβオリゴマーの架橋
グルタルアルデヒドは多様な生化学分析システムにうまく使用されてきた。グルタルアルデヒドは、高濃度タンパク質との非特異的反応とは対照的に、直接接触しているタンパク質を架橋結合する性質がある。この実施例ではアミロイドβのグルタルアルデヒド架橋を調べた。
【０１３４】
オリゴマーはF12培地代用物を使用して実施例1の要領で調製した。遠心(および場合によっては分画)で得られた上清を0.22mLの25%グルタルアルデヒド水溶液(Aldrich, St. Louis, MO)で、次いで0.67mLの0.175M水素化ホウ素ナトリウム/0.1M NaOHで、順次処理した(Levine, Neurobiology of Aging, 1995の方法による)。混合物を4℃で15分間撹拌し、20%ショ糖水溶液1.67mLの添加によりクエンチした。混合物をSpeedVacにより5倍に濃縮し、1kD未満の小さな成分を透析除去したた後、SDS-PAGEで分析した。ゲルろ過クロマトグラフィーを次の要領で実施した: Superose 75PC 3.2/3.0カラム (Pharmacia, Upsala, Sweden)をろ過、脱気処理した0.15%炭酸水素アンモニウム緩衝液(pH=7.8)により流量0.02mL/分、室温で18時間にわたり平衡化した。流量を0.04mL/分に変えて、20mLの溶媒を溶出した。反応溶液50μLをカラムに添加し、流量0.04mL/分で溶出を再開した。化合物の溶出を220nmでのUV検出によりモニターし、0.5-1.0mL画分を回収した。UV吸光度の第3ピークに対応する画分No.3を単離し、4.9±0.8nm(幅分析による値)の小球を含むことをAFM分析により示した。この画分は脳スライスニューロンに接触させてみると、以下の実施例で示すように高神経毒性であった。
【０１３５】
実施例３
ADDLsのサイズ解析
この実施例では実施例1の要領で形成させたADDLsについて種々の方法(たとえば天然ゲル電気泳動、SDS-PAGE、AFM、フィールドフロー分画、免疫認識など)でサイズ解析する。
【０１３６】
AFMは基本的に公知の要領[たとえばStine et al. (1996) J. Protein Chem., vol.15, pp.193-203]で行った。すなわち、Digital Instruments (Santa Barbara, CA) Nanoscope III aマルチモード原子間顕微鏡を使用して、xyレンジ150μのJ-スキャナーにより画像を得た。どの画像でもタッピングモードを採用し、エッチングしたシリコンTESP Nanoprobes (Digital Instruments)を使用した。AFMデータはNanoscope III aソフトウェアとIGOR Pro(商標)波形解析ソフトウェアを使用して分析した。AFM分析では、4μスキャン(すなわち4μm角の評価)を行った。ここに記載の寸法は断面分析で得たが、幅分析を採用した場合には幅分析で得られた値であることを明記している。断面分析と幅分析はNanoscope III aソフトウェアでは別個の分析モジュールである。一般にADDL分析では、断面分析で得られるサイズと幅分析で得られるサイズの間に系統偏差が存在する。すなわち、4μスキャンの場合、断面分析では高さが通常0.5nmほど過大に出るため、小球サイズの値に約0.5nmの偏差が生じる結果となる。
【０１３７】
ゲル電気泳動法による分析は15%ポリアクリルアミドゲルを使用して行い、Coomassieブルー染色で視覚化した。ADDLsの非変性条件下の分解は4-20%トリス-グリシンゲル(Novex)上で行った。電気泳動は20mAで約1.5時間続けた。タンパク質のSDS-PAGEによる分解はZhang et al. (1994) J. Biol. Chem., vol.269, pp.25247-25250に開示の要領で行った。次いでタンパク質を銀染色により視覚化した[たとえばSherchenko et al. (1996) Anal. Chem., vol.68, pp.850-858を参照]。天然、SDS両ゲルに由来するゲルタンパク質は前記Zhang et al. (1994) J. Biol. Chem., vol.269, pp.25247-25250の要領でニトロセルロース膜に転写した。免疫ブロットは1:5000のビオチン化6E10抗体(Senetak, Inc., St. Louis, MO)を使用して行い、ECL(Amersham)を使用して視覚化した。一般にゲルのスキャニングには濃度計を使用した。これによりゲルの(たとえばゲル自体の写真とは異なる)コンピューター生成画像が得られた。
【０１３８】
AFM断片分析[たとえばStine et al. (1996) J. Protein Chem., vol.15, pp.193-203]または幅分析(Nanoscope III ソフトウェア)によるADDLsのサイズ解析によれば、支配的な種はz軸方向が約4.7nm〜約6.2nmの小球であった。小さな球状タンパク質(Aβ1-40モノマー、アプロチニン、bFGF、炭酸脱水酵素)との比較から、ADDLsの質量は17〜42kDらしいと判明した。識別可能にみえる種は認識可能である。これらはサイズが約4.9〜5.4nm、約5.4〜5.7nm、および約5.7〜6.2nmの小球に対応する模様である。サイズが約4.9〜5.4nmと約5.7〜6.2nmの小球は小球全体の約50%を占める模様である。
【０１３９】
AFM分析とも調和するが、ADDLsのSDS-PAGE免疫ブロットでは約17〜22kDのAβオリゴマーと、その分解産物と思われる豊富な4kDモノマーとが識別された。この解釈とも合致するが、ADDLsの非変性ポリアクリルアミドゲル分析では乏しいモノマー、30kD付近の主要バンド、もっと弱い〜17kDのバンド、線維または凝集体の形跡ゼロなどが明らかとなった。銀染色天然ゲルおよびCoomassie染色SDS-ポリアクリルアミドゲルのコンピューター生成画像を図1、図2にそれぞれ示す。SDSゲルと非変性ゲルの間の一致は、小サイズオリゴマーのADDLsが変成作用に起因しないことを裏付ける。ADDL調製物中のオリゴマーはクラスタリン(Mr 80kD、変性ゲル中で40kD)よりも小さかったが、使用クラスタリン濃度の低さ(Aβの1/40。これは1:1のAβ-クラスタリン複合体としてのAβの会合を不可能にする)から予想されたことであった。
【０１４０】
本発明のADDL調製物をSuperdex 75カラム(Pharmacia, Superose 75PC 3.2/3.0カラム)で分画した。ADDLsを含む画分はUV吸光度の第3ピーク画分であり、AFMとSDS-PAGEで分析した。画分3の代表的なAFM分析を図3に示す。分画によりADDLsの均質性が高まり、サイズ約4.9〜5.4nmの小球が大半を占める結果となった。該画分のSDS-PAGE電気泳動でモノマー/ダイマー形Aβに対応する重い、より低いバンドが明らかになった。非分画ADDLs調製物でも観測されたように、これはADDLsの分解産物であると思われる。該画分の添加量を増やすと大きなサイズの広いバンド(おそらくダブレット)が明らかとなった。これもまた、非線維状オリゴマーAβ構造体の対SDS安定性を裏付ける。
【０１４１】
実施例４
アミロイドβのクラスタリン処理
線維状構造体は毒性形のAβにあたるとの説が提唱されてきたものの[Lorenzo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.91,pp 12243-12247; Howlett et al. (1995) Neurodegen., vol.4, pp.23-32]、Aβ1-42を低濃度クラスタリン(別名ApoJ)と共にインキュベートすると、沈降性線維としての挙動を示さない新規の神経毒素が形成されよう[Oda et al. (1995) Exper. Neurol., vol. 136, pp.22-31; Oda et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.204, pp. 1131-1136]。これらの緩沈降性毒素が小さな、または発生期の線維をなお含むかどうかを試験するために、クラスタリン処理したAβ調製物をAFMで調べた。
【０１４２】
クラスタリン処理はOda et al. (1995) Exper. Neurol., vol. 136, pp.22-31に開示の要領で、基本的には実施例1に記載のインキュベーションにクラスタリンを加えることにより、実施した。あるいは出発物質のAβ1-42をDMSOではなく0.1N HClに溶解してもよいし、またこの出発物質のAβ1-42が当初から線維状構造体を有していてもよい。しかし、クラスタリンとのインキュベーションを24時間、37℃で行うと、緩沈降性の、線維をほとんど含まない調製物が得られる。これは、クラスタリン添加量の増加に応じて線維形成が抑えられることを示す実験で裏付けられた。
【０１４３】
クラスタリン処理に由来する調製物はもっぱら小さな球状構造体を含んだ。そのサイズは、Superdex 75ゲルカラムで分画したADDLsのAFM分析で測定しておよそ5〜6nmであった。通常の電子顕微鏡でも同等の結果が得られた。それに対して、クラスタリン不存在の標準条件下[Snyder et al. (1994) Biophys. J., vol.67, pp. 1216-1228]で自己会合していたAβ1-42は、主として大きな、非拡散性の線維状化学種を示した。さらに、得られたADDL調製物をCentricon 10kDカットオフ膜に通し、SDS-PAGEグラジエントゲル上で分析した。図4で明らかなように、Centricon 10フィルターを通過したのはモノマーだけであり、ADDLsはフィルター上に留まった。分離後に見付かったモノマーは、フィルター上に留まった比較的高分子量の種からしか形成されえなかった。
【０１４４】
これらの結果は、毒性ADDL調製物が小さなAβ1-42無線維オリゴマーを含むこと、およびADDLsはアミロイドβの適切なクラスタリン処理により得られることを裏付ける。
【０１４５】
実施例５
生理的なADDLs形成
実施例4中の毒性部分はオリゴマーAβとクラスタリンとを含む希な構造体をなす。Oda et al. [Exper. Neurol., vol. 136, pp.22-31(1995)]の報告ではクラスタリンはAβ1-42溶液の毒性を強める結果となったが、化学量論的レベルのクラスタリンはAβ1-40毒性を防ぐとの結果を得ている[Boggs et al. (1997) J. Neurochem., vol. 67, pp. 1324-1327]。そこで、この実施例ではクラスタリン不存在下でのADDL形成をさらに解析した。
【０１４６】
モノマーAβ1-42溶液を適当な培地中で低温に維持すると、沈降性Aβ線維の形成がほぼ完全に阻止された。しかし、Aβはこれらの低温溶液中で自己会合し、クラスタリンをシャペロンとするものと本質的に区別しがたいADDLsを形成した。最後に、モノマーAβ1-42溶液を脳スライス培地中37℃で、ただしごく低濃度(50nM)で、インキュベートしてもADDLsは形成された。これは生理的形成の可能性を示唆する。ADDL調製物はどれも比較的安定であり、24時間の組織培養実験中に線維への転換を示したものはなかった。
これらの結果は、生理的条件下でADDLsが形成され、また安定であることを裏付けるし、またin vivoでも同様に形成され、安定でありうることを示唆する。
【０１４７】
実施例６
ADDLs: 拡散性のきわめて強力なCNS神経毒素
ADDLsを誘導するものがクラスタリン、低温度、低Aβ濃度のいずれであれ、形成される安定オリゴマーは強力な神経毒素である。その毒性を器官型マウス脳スライス培養(生理学的に関連する成熟CNSモデル)で調べた。脳組織をフィルターによって大気-培地界面に支持し、対照並みの高生存能を維持するようにした。
【０１４８】
これらの実験では、B6 129 F2およびJR 2385系統マウス(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)から脳スライスを獲得し、公知の要領[Stoppini et al. (1991) J. Neurosci. Meth., vol.37, pp. 173-182]+改良に従って培養した。すなわち、二酸化炭素を吸入させて成獣マウスを犠牲にし、すばやく断頭した。頭部を低温の、滅菌した解剖用緩衝液[Geyの平衡塩溶液(pH7.2) 94mLに0.5M MgCl2、25%ブドウ糖および1.0M Hepes各2mLを添加)に浸した後、脳を取り出し、Sylgardコート滅菌プレート上に載せた。小脳を除去し、正中切断により大脳半球に分けた。各半球を別個にスライスした。半球を、正中切断面を下に向けて置き、背面から30度のスライスを作成して、該半球を定位するようにした。半球を、Campdenティッシュチョッパーのプラスチックステージ上に切断面を下にして接着剤で固定し、氷冷滅菌緩衝液に浸した。200μm厚のスライスを横→内側方向に作成し、海馬が見えるスライスを回収した。
【０１４９】
滅菌ピペットの末口を使用して各スライスを10%ウシ胎仔血清+ 2%S/P/F[ストレプトマイシン、ペニシリン、ファンギゾン; Life Technologies(Gibco, BRL), Gaithersburg, MD]添加ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)を入れた小ペトリ皿に移し、顕微鏡で観察して海馬の存在を確認した後、ディープウェル組織培養ディッシュ(Flacon、6穴ディッシュ)内のMillicell-CMインサート(Millipore)上に置いた。各ウェルは1.0mLの増殖培地を含み、通常、各インサート上に2個のスライスを置いた。スライスを培養器(CO2 6%、湿度100%)に一晩入れた。増殖培地を除去し、ウェルを温ハンクスBSS (Gibco, BRL, Life Technologies)1.0mLで洗った。アミロイドβオリゴマー±阻害剤を含む既知組成培地[DMEM、N2補給剤、SPF; たとえばBottenstein et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., vol.76, pp.514-517で開示のもの]を各ウェルに加え、培養を24時間続けた。
【０１５０】
LIVE/DEAD(登録商標)アッセイキット(Molecular Probes, Eugene, OR)を使用して死細胞を計測した。これは二重標識蛍光アッセイであり、生細胞はカルセイン-AMを緑色蛍光性カルセインへと分解するエステラーゼの存在により検出される。死細胞は、DNAにインターカレートし赤色蛍光を示すエチジウムホモダイマーを取り込む。アッセイはキットメーカーの指示に従って2μMのエチジウムホモダイマーと4μMのカルセインで行った。画像は落射蛍光装置(epifluorescence)付きのNikon Diaphot顕微鏡を使用すると30分以内に得られた。緑色または赤色蛍光を示す細胞の数および/または面積の定量にはMetaMorph画像解析システム(Universal Imaging Corporation, Philadelphia, PA)を用いた。
【０１５１】
これらの実験ではADDLsを24時間存在させたが、全Aβ濃度は5μMを上限とした(すなわちどのADDL実験でも全Aβ濃度が5μMを超えることはなかった)。細胞死は「黄色の擬似染色」で示すが、錐体細胞層(CA 3-4)と歯状回(DG)にほぼ完全に限定されており、ADDL誘導毒性の標的が海馬の主要なニューロン(それぞれ錐体細胞、顆粒細胞)であることを示唆する。さらに、24時間のADDL処理はトリパンブルー分染法やMTT法による計測によれば(Finch et al. 未刊)、グリア細胞の生死には影響しない。歯状回(DG)およびCA3領域は特に敏感であり、P20(離乳子)〜P84(若い成獣)の動物に由来するいずれの培養でもADDL誘導型の細胞死を示した。ADDLsへの長期接触後、この領域内では最高40%の細胞死が見られた。ニューロン死のパターンは、ニューロンがDGとCA1では死ぬがCA3では生き残るというNMDAの場合とは異なった。
【０１５２】
20日齢(P20)超の動物の海馬DGおよびCA3領域に由来する若干の培養を通常の線維状Aβ調製物で処理した。線維の非拡散性とも整合するが、20μMの場合でさえも細胞死(黄色染色)は明白ではなかった。この培養中の生細胞に対応する染色パターンから、海馬CA3/DG領域を調べていることが確認された。通常のAβ(すなわち線維状Aβ)による処理後に観測された細胞死の度合いは、培養に培地または培地+クラスタリンを添加した陰性対照の場合と識別不能であった。代表的な対照では細胞死は5%未満であった。実際、対照での高生存率は代表的な実験期間を7日間も超えて維持された培養でもなお見られたが、それは細胞の生存率が標準培養条件によって悪影響を受けはしなかったことを裏付ける。
【０１５３】
細胞死を誘導するADDLsの効能を計測するために用量-反応実験を行った。DG/CA3領域を含む観察野内の死細胞および生細胞染色の定量には画像解析を用いた。図5は死細胞率とADDL濃度[当初のAβ1-42濃度(nM)として計測]の関係を示す。脳スライスは定量が困難であるため、これらの結果はEC50を厳密に求めうるほど詳細ではない。しかし、図5から明らかなように、1000倍希釈後(〜5 nM Aβ)でさえ、ADDL誘導細胞死は20%超であった。0.3nM ADDLsでもなお毒性が認められた。これは普通に寝かせたAβで得られる結果とは対照的である(そうしたAβは約20〜50nMの濃度で培養ニューロンに対する毒性を示す)。これらのデータは、ADDLsが線維状Aβ実験で使用される用量の約1,000分の1または１万分の1の用量でも有効であることを示す。
【０１５４】
こうして、海馬スライスに由来するこれらのデータはADDLsの超毒性を裏付ける。さらにADDLsは細胞死を招くには培養支持フィルター(インサート)を透過しなければならなかったのだから、その拡散性(これは小オリゴマーサイズとも整合する)もまた結果から確認される。また、ここで示した方法はADDLを介した細胞活性の変化を調べる検定法にも使用可能である。特に、該検定法はADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。
【０１５５】
実施例７
MTT酸化ストレス毒性検定 - PC12細胞
この実施例では、Aβオリゴマーへの反応としての初期毒性変化を検出するために使用しうる検定法を示す。
【０１５６】
これらの実験では、PC12細胞を96穴培養プレートにより4×104細胞/ウェルで継代し、DMEM+10%ウシ胎仔血清+1%S/P/F(ストレプトマイシン、ペニシリン、ファンギゾン)中で24時間増殖させた。プレートを200μg/mLポリ-1-リシンで2時間処理して細胞の接着を強めるようにしてから、細胞をプレーティングした。1セット6ウェルは未処理のまま新鮮培地を加え、また別の1セット6ウェルは対照の基剤(室温で一晩寝かせた10% 0.01N HCl添加PBS)で処理した。陽性対照はトリトン(1%)+アジ化ナトリウム(0.1%)を添加した通常の増殖培地で処理した。実施例1の要領で阻害化合物の存在下または不存在下に調製した(またはクラスタリンとのコインキュベーションで得た)Aβオリゴマーを細胞に加え24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション後、MTT(0.5mg/mL)を細胞に加えて2.5時間インキュベートした(PBSで可溶化した0.5mg/mLストック11μLを100μLの培地に添加)。正常細胞はMTTを還元して青色のホルマザン産物とする。MTTとのインキュベーション後、培地を吸引除去し、100% DMSOを100μL加えて細胞を溶解させ、また青色結晶を溶解させた。プレートを15分間、室温でインキュベートし、プレートリーダー(ELISA)にかけて550nmで測定した。
【０１５７】
図6はこうした実験の結果を示す。図から明らかなように、ADDLsと接触させなかった対照細胞(“Cont.”)、クラスタリンとだけ接触させた細胞(“ApoJ”)およびモノマーAβと接触させた細胞(“Aβ”)は細胞毒性を示さない。一方、クラスタリンと共凝集させ1日寝かせたAβ(“Aβ:ApoJ”)はMTT還元能の低下を示し、初期毒性変化を裏付けている。この最後のアミロイド調製物はアミロイド線維を欠くことがAFMにより確認された。
こうして、この実験の結果はクラスタリンとの共凝集から得られたADDL調製物が毒性を強めることを裏付ける。さらにPC12酸化ストレス反応はADDLsに起因する初期毒性変化を検出する検定法に利用しうることもまた結果から確認される。該検定法はADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。
【０１５８】
実施例８
MTT酸化ストレス毒性検定 - HN2細胞
この実施例では、ADDLを介した細胞変化のさらなる検定法を示す。すなわち前実施例で示したMTT酸化ストレス毒性検定は、PC12細胞の代りにHN2細胞や他の好適な細胞を使用して行うこともできる。
【０１５９】
この検定では、HN2細胞を96穴培養プレートにより4×104細胞/ウェルで継代し、DMEM+10%ウシ胎仔血清+1%S/P/F(ストレプトマイシン、ペニシリン、ファンギゾン)中で24時間増殖させた。プレートを200μg/mLポリ-1-リシンで2時間処理して細胞の接着を強めるようにしてから、細胞をプレーティングした。細胞は5μMレチノイン酸により24〜48時間分化させ、1%血清で増殖をさらに阻害した。1セットのウェルは未処理のまま新鮮培地を加え、また別のセットのウェルは対照の基剤(0.2%DMSO)で処理した。陽性対照はトリトン(1%)+アジ化ナトリウム(0.1%)で処理した。実施例1の要領で阻害化合物の存在下または不存在下に調製したAβオリゴマーを細胞に加え24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション後、MTT(0.5mg/mL)を細胞に加えて2.5時間インキュベートした(0.5mg/mLストック11μLを100μLの培地に添加)。MTTとのインキュベーション後、培地を吸引除去し、100% DMSOを100μL加えて細胞を溶解させ、また青色結晶を溶解させた。プレートを15分間、室温でインキュベートし、プレートリーダー(ELISA)にかけて550nmで測定した。
【０１６０】
この検定法も同様に、ADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。
【０１６１】
実施例９
位相差顕微鏡による細胞形態観察
この実施例ではADDLを介した細胞変化のさらに別の検定法、すなわち位相差顕微鏡による細胞形態検定法を示す。
【０１６２】
この検定では、細胞を低密度(50〜60%コンフルエンス)に培養した。実験を始める前に、細胞をF12培地中で1時間、血清欠乏状態にした。次いで細胞を、実施例1の要領で阻害化合物の存在下または不存在下に調製したAβオリゴマーと共に3時間インキュベートした。3時間後、細胞の形態学的際を調べ、または固定して免疫蛍光標識した。サンプルの分析にはMetaMorph Image AnalysisシステムおよびMRIビデオカメラ(Universal Imaging, Inc.)を使用した。
【０１６３】
こうした検定の結果は以下の実施例で示す。特にこの検定法は、ADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。
【０１６４】
実施例１０
細胞表面へのADDLsの結合に関するFACScan検定
最近、常法で調製したAβに対応する細胞表面受容体がグリア細胞で同定された[Yan et al. (1996) Nature, vol. 382, pp. 685-691; El Khoury et al. (1996) Nature, vol.382, pp. 716-719]ため、また低用量のADDLによるニューロン死には信号伝達機構が関与しているという可能性が示唆されたため、ADDLに対応する特異的な細胞表面結合部位がニューロン上に存在するかどうかを実験で調べた。
【０１６５】
フローサイトメトリーでは、細胞を0.1%トリプシンで解離させ、組織培養プラスチック上に低密度にプレーティングして少なくとも一晩おいた。細胞を冷リン酸緩衝食塩水(PBS)/0.5mM EDTAではがし、3回洗い、終濃度が500,000細胞/mLとなるように氷冷PBS中に懸濁させた。細胞を冷PBS中で、実施例1の要領で調製したAβオリゴマー(ただしAβの10%は位置1にアスパラギン酸の代りにビオシチンを含むAβ1-42類似体である)と共にインキュベートした。オリゴマー±阻害化合物を細胞に加え、24時間インキュベートした。細胞を冷PBSで2回洗って、遊離の未結合Aβオリゴマーを除去し、アビジン+フルオレセイン複合体の1:1,000希釈液中に再懸濁させ、4℃で1時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。あるいは、アビジンの代りにAβ特異抗体と蛍光二次抗体を使用して、10%のビオチン化Aβ類似体を組み込む必要がないようにした。すなわちビオチン化6E10モノクローナル抗体1μL (Senetec, Inc., St. Louis, Missouri)を細胞懸濁液に加えて、30分間インキュベートした。細胞をペレット化し500μL PBS中に再懸濁させた後に、FITC標識ストレプトアビジン(1:500, Jackson Laboratories)と30分間インキュベートし、結合抗体を検出した。
【０１６６】
細胞の分析にはBecton-Dickenson Fluorescence Activated Cell Scanner (FACScan)を使用した。一般に10,000〜20,000イベントを収集して前方散乱(サイズ)と蛍光強度の両方を計測し、データをConsort 30ソフトウェア(Becton-Dickenson)で分析した。結合の定量では、平均蛍光に全イベント数を掛け、6E10およびFITCの存在下でのバックグラウンド細胞蛍光に対応する値を差し引いた。
【０１６７】
これらの実験では、対数期酵母細胞(大体が糖質表面)とB103 CNS神経細胞株の懸濁液中のADDL免疫反応性を比較するためにFACScan分析を行った[Schubert et al. (1974) Nature, vol. 249, pp.224-227]。B103細胞では、ADDLsの添加は細胞関連蛍光の大幅な増強をもたらした(図7)。B103細胞の1分間にわたるトリプシン処理はADDLの結合をなくした。一方、対照酵母細胞(データ非表示)ではADDL結合がまったく見られなかった。これにより細胞表面上に存在するタンパク質に対するADDLの選択性が確認された。海馬細胞(組織のトリプシン処理に続く2時間の代謝機能回復)の懸濁液でもADDLの結合は見られたが、B103細胞と比較すると結合イベント数が少ないのは標識ピークの蛍光強度の低下から明らかであった。これは図8で標識ピークの左方シフトとして現れている。
【０１６８】
これらの結果はこうして、ADDLsが特異的な細胞表面受容体への結合によりその作用を及ぼすことを示唆する。特にB103細胞のトリプシン感受性は、それらのADDL結合性部位が細胞表面タンパク質であり、その結合がこれらのタンパク質内の特定ドメイン群に対して選択的であることを示した。
【０１６９】
さらに、この検定法はADDLを介した細胞結合の検定にも用いることができる。特にこの検定法はADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。
【０１７０】
実施例１１
ゴシポールによるADDL形成阻害
この実施例ではたとえばゴシポールの使用によるADDL形成の阻害方法を示す。
これらの実験では、ADDLsを実施例1の要領で調製した。ADDLs形成のためのAβタンパク質のインキュベーション時にゴシポール(Aldrich)を100μMとなるように加えた。得られた調製物の神経毒性を、前述のようにLIVE/DEAD(登録商標)アッセイキットを使用して評価した。ゴシポール/ADDL調製物との接触の24時間後の細胞死の量は5%未満であった。これは、対応するDMSO対照調製物またはADDLsをまったく含まないゴシポール対照調製物の毒性レベル(それぞれ6%、4%)に匹敵した。
【０１７１】
これらの結果はこうして、ADDL形成の阻害にゴシポールなどのような化合物を使用しうるという裏付けとなる。
【０１７２】
実施例１２
トリプシン消化ペプチドによるADDL結合阻害
B103細胞のトリプシン処理はその後のADDL結合を阻止することが判明したため、この実施例で示すような実験を行って、細胞表面から放出されるトリプシン消化断片がADDL結合活性を抑制するかどうかを調べた。
【０１７３】
トリプシン消化ペプチドは100mmディッシュ4枚からのコンフルエントB103細胞を使用して調製した。3分間のトリプシン処理(0.025%, Life Technologies)後に培地を回収し、トリプシン-キモトリプシン阻害剤(Sigma, 0.5mg/mL-ハンクス緩衝食塩水)を加え、遠心(500 x g、5分間)で細胞を除去した。上清(〜12mL)をCentricon 3フィルター(Amicon)により約1.0mLへと濃縮し、タンパク質濃度を求めた後、凍結させた。阻害実験では、滅菌濃縮トリプシン消化ペプチド(0.25mg/mL)を器官型脳スライスに、またはFACScan検定の懸濁B103細胞に、ADDLs添加と同時に、添加した。
【０１７４】
FACScan検定では、培地中に放出されるトリプシン消化ペプチド(0.25mg/mL)はADDL結合を>90%阻害した(図9)。それに対して、BSAと接触させた対照細胞では100mg/mLの濃度でも結合阻害は見られなかった。ADDLsがすでに細胞に接着した後に添加したトリプシン消化ペプチドでは、蛍光強度を低下させる効果はそれほどなかった。これは、該ペプチドが結合済みADDLsを定量する検定法の性能を低下させなかったことを示唆する。トリプシン消化ペプチドはADDL結合を阻害するだけでなく、ADDL誘導細胞死の拮抗剤でもあった。すなわち図9に示すように、トリプシン消化ペプチドの添加は細胞死を75%減少させる結果となった(p<0.002)。
【０１７５】
これらのデータから、特定の細胞表面タンパク質はADDL結合を仲介すること、細胞表面に由来する可溶化トリプシン消化ペプチドは神経保護的なADDL中和作用を及ぼすことが裏付けられる。さらにこの検定法は、ADDL細胞結合を仲介する物質や細胞活性に対するADDLの効果に関する検定にも用いることができる。特にこの検定法はADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。さらに、ADDLs-細胞表面結合の前または後の薬物の添加を比較して、そうした結合に影響を与える薬物、または結合後に作用する薬物を識別することができる。
【０１７６】
実施例１３
ADDL細胞結合に関する用量反応曲線
この実施例では、細胞表面へのADDL結合が飽和性であるかどうかを見極めるための用量反応実験を示す。そうした飽和が見込まれるのは、ADDLsが実際に特定の細胞表面受容体と相互作用する場合である。
【０１７７】
これらの実験では、B103細胞を逓増量のADDLsともにインキュベートし、ADDL結合をFACScan分析で定量した。図10はその結果を示す。これらの結果からADDL結合は明確なプラトーに達することが確認される。ADDL結合は約250nmの相対Aβ1-42濃度(すなわちAβに対する相対ADDL濃度)で、飽和に達する。
【０１７８】
こうしてこれらの結果から、ADDL結合は飽和性であることが確認される。ADLL結合のそうした飽和性は、特にトリプシン処理実験の結果とも併せて考えると、ADDLsが特定の細胞表面受容体を解して作用することの確証となる。
【０１７９】
実施例１４
ADDL結合活性に関する細胞系ELISA
この実施例では細胞系検定法、特にADDL結合活性を評価するための細胞系酵素免疫検定法(ELISA)を示す。
【０１８０】
これらの実験では実験実施48時間前に、2.5×104 B103細胞を懸濁させた100μL DMEMを96穴マイクロタイタープレートの各検定ウェルに加え、インキュベーター中に37℃で保持した。実験実施24時間前に、ADDLsを実施例1の要領で調製した。検定を開始するために、細胞を入れたマイクロタイタープレートの各ウェルを50μLの固定液(3.7%ホルマリン/DMEM)により室温で10分間処理した。この固定液(+DMEM))を抜いて、ホルマリン単独の(DMEMを加えない)固定液50μLにより室温で15分間二次処理した。この固定液を抜いて、各ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS)100μLで2回洗った。ブロッキング液(1%BSA/PBS)200μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。100μLのPBSで2回洗った後、 PBSで10倍希釈したADDLs 50μLを、または対照としてのPBSだけを、該ウェルに加え、該ウェルを37℃で1時間インキュベートした。100μLのPBSで3回洗った後、1%PBSで1000倍希釈したビオチン化6E10(Senetek) 50μLを該ウェルに加えた。別のウェルにはPBSを対照として加えた。ローテーターに載せて室温で1時間インキュベートした後、ウェルを50μLのPBSで3回洗い、ABC試薬(Elite ABCキット、Vector Labs) 50μLを加え、ローテーターに載せて室温で30分間インキュベートした。50μLのPBSで4回洗った後、各ウェルにABTS基質溶液50μLを加え、プレートを暗所、室温でインキュベートした。プレートを分析して405nmでの吸収の増大を調べた。有意の信号が見られたのは、ADDLs、細胞および6E10が存在するときだけであった(図11)。
【０１８１】
これらの結果からはさらに、細胞系ELISAを、ADDLを介した細胞結合の検定法として使用できることが裏付けられる。特にこの検定法はADDL形成および/または活性を増減する可能性のあるADDLs薬とのコインキュベーションまたは同時投与によって行うことができる。そうしたコインキュベーションまたは同時投与によって得られた結果はADDLs単独の場合の結果と比較することができる。
【０１８２】
実施例１５
FynキナーゼのノックアウトはADDL神経毒性を防ぐ
この実施例では、ADDL毒性への信号伝達の潜在的な関与をさらに調べるために、同系fyn-/-およびfyn+/+動物に由来する脳スライスに対するADDLsの影響を比較した。Fynは多様な細胞信号および反応の中心をなすSrcファミリーのタンパク質チロシンキナーゼの一種である[Clark, E.A. & Brugge, J.S. (1995) Science, vol. 268, pp. 233-239]。fynはADニューロンでアップレギュレーションされるため、特に重要である[Shirazi et al. (1993) Neuroreport, vol. 4, pp.435-437]。Fynはまた、(後のAFM分析でADDLsを含むことが判明した)通常のAβ調製物によって活性化されるように見受けられる[Zhang et al. (1996) Neurosci. Lett., vol.211, pp.187-190]。さらに、Fynノックアウトマウスでは発達途上海馬でのアポトーシスが抑制される[Grant et al. (1992) Science, vol. 258, pp. 1903-1910]。
【０１８３】
これらの実験では、Fynノックアウトマウス[Grant et al. (1992) Science, vol. 258, pp. 1903-1910]を前の実施例で示したのと同様の要領で処置し、ADDLで24時間処理した、または処理しないマウスの脳スライスの画像を比較してDGおよびCA3領域の死細胞を計測した。4〜7スライスについての平均±SEMを表す、エラーバー付きの定量比較が得られた(図12)。
【０１８４】
野生型動物に由来する培養とは対照的に、fyn-/-動物に由来する培養はADDL誘導細胞死をほとんど示さなかった(図12)。ADDLs毒性に関しては、fyn+/+スライスでの細胞死レベルはfyn-/-培養での細胞死の5倍余りであった。fyn-/-培養ではADDLs存在下での細胞死はバックグラウンドレベルであった。この神経保護反応は選択的であり、NMDA受容体拮抗剤によって誘導される海馬細胞死[Bruce et al. (1995) Exper. Neurol. vol. 132, pp. 209-219; Vornov et al. (1991) Neurochem., vol. 56, pp. 996-1006]には影響がなかった(データ非表示)。Tukey多重比較の使用による分析(ANOVA)ではADDL fyn+/+データについて、他のすべての条件と比較してP<0.001という値が得られた。
【０１８５】
これらの結果はFynキナーゼの欠失が海馬DGおよびCA3領域のADDL誘導細胞死を防ぐことを裏付ける。これらの結果は、ADDL毒性がFynタンパク質チロシンキナーゼのノックアウトによって阻止される機構に仲介されることを実証する。これらの結果はさらに、Fynタンパク質チロシンキナーゼの活性またはFynタンパク質キナーゼをコードする遺伝子の発現を封じるような処置によって神経保護効果が得られることを示唆する。
【０１８６】
実施例１６
星状細胞活性化実験
この実施例では、ADDL毒性への信号伝達の潜在的な関与をさらに調べるために、星状細胞の活性化に対するADDLsの影響を実験によって比較した。
【０１８７】
これらの実験では、皮質星状細胞の培養をSprague-Dawleyラット新生仔(生後1〜2日齢)から、Levison and McCarthyの方法により[Levison et al. (1991) in Culturing Nerve Cells (Banker et al., Eds.), pp.309-36, MIT Press, Cambridge, MA]、公知の要領で[Hu et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp. 2543-2547]調製した。要するに、大脳皮質を切り出し、トリプシン処理し、10%ウシ胎仔血清(Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT)と抗生物質(ペニシリン100U/mL、ストレプトマイシン100mg/mL)を添加したα-MEM培地(Gibco, BRL)中で細胞を培養した。11日間の培養後、細胞をトリプシン処理し、100mmプレートに〜6×105細胞/プレートの密度で再プレーティングし、コンフルエントまで増殖させた[Hu et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp. 2543-2547]。
【０１８８】
実施例1の要領で調製したADDLsで、またはAβ17-42[Lambert et al. (1994) J. Neurosci. Res., vol.39, pp.377-384に記載の要領で合成したもの; または市販品]で、星状細胞を処理した。この処理では、星状細胞のコンフルエント培養をトリプシン処理し、細胞を次のようにプレーティングした: 60mm組織培養ディッシュ上に1×106細胞/ディッシュの密度で(RNA分析およびELISA用); 4穴チャンバースライドに5×104細胞/ウェルの密度で(免疫組織化学法用); または96穴プレートに5×104細胞/ウェルの密度で(NO検定用)。24時間のインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗って血清を除去し、N2補給剤を添加したα-MEM培地中で培養物をさらに24時間インキュベートしてから、Aβペプチドまたは対照緩衝液(すなわち希釈剤入り緩衝液)を添加した。
【０１８９】
Nikon TMS倒立顕微鏡+Javelin SmartCamカメラ、Sonyビデオモニターおよびカラービデオプリンターにより、星状細胞の形態変化を調べた。一般に各実験条件につき4つの任意選択した顕微鏡視野(倍率x20)を写真撮影した。それらの写真からNIH Imageにより4視野内の活性化細胞(「長さが少なくとも1細胞体分の突起を1つまたは複数もつ細胞」と定義される)数を計数して形態的活性化を定量した。
【０１９０】
培養物中のmRNAレベルをノーザンブロット法およびスロットブロット法で求めた。細胞はまずADDLsまたは対象緩衝液に24時間接触させた。次いで細胞をジエチルピロカーボネート(DEPC)処理PBSで2回洗い、全RNAをRNeasy精製ミニカラム(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)により、メーカー推奨の要領で単離した。一般的なRNA収量は8〜30mg-全RNA/ディッシュであった。ノーザンブロット法では、5mg-全RNA/サンプルをアガロース-ホルムアルデヒド ゲル上で分離し、毛管作用でHybond Nメンブラム(Amersham, Arlington Heights, IL)に転写し、UV架橋させた。スロットブロット法では、200ng-全RNA/サンプルをDuralon-UVメンブラン(Stratagene, La Jolla, CA)上に減圧ブロットし、UV架橋させた。RNA等量添加の確認には臭化エチジウム染色またはGAPDHプローブによるハイブリダイゼーションおよび補正を用いた。
【０１９１】
プローブはプラスミドの制限酵素消化とそれに続く然るべき断片のゲル精製により生成させた。すなわちラットの皮質星状細胞に由来する全RNAを使用してRT-PCRによりcDNA断片を調製した。RNAをSuperscript II系(Gibco/BRL)により逆転写し、PCRをPTC-100サーマルコントローラー(MJ Research Inc, Watertown, MA)により下記設定条件で35サイクル実行した:52℃40秒間; 72℃40秒間; 96℃40秒間。ラットIL-1βの447bp断片の増幅に使用したプライマー対は、フォワード: 5’ GCACCTTCTTTCCCTTCATC 3’ [SEQ ID NO:1]; リバース: 5’ TGCTGATGTACCAGTTGGGG 3’ [SEQ ID NO:2]であった。ラットGFAPの435bp断片の増幅に使用したプライマー対は、フォワード: 5’ CAGTCCTTGACCTGCGACC 3’ [SEQ ID NO:3]; リバース: 5’ GCCTCACATCACATCCTTG 3’ [SEQ ID NO:4]であった。PCR産物はInvitrogen TAクローニングキットによりpCR2.1ベクター中にクローニングし、DNA配列解析によりコンストラクトを確認した。ベクターのEcoRI消化とそれに続く然るべき断片のゲル精製によりプローブを調製した。使用プラスミドはラットiNOS cDNAプラスミドpAstNOS-4(ラットiNOS cDNA塩基3007-3943に対応)[Galea et al. (1994) J. Neurosci. Res., vol. 37, pp.406-414]およびラットGAPDH cDNAプラスミドpTRI-GAPDH (Ambion, Inc., Austin, TX)であった。
【０１９２】
Prime-a-Gene Random-Prime標識キット(Promega, Madison, WI)を用いて前記プローブ(25ng)を32P-dCTPで標識し、またプッシュカラム(Stratagene)を使用して未結合分子から分離した。ハイブリダイゼーションをストリンジェント条件下にQuikHyb液(Stratagene)を使用して、ストリンジェントハイブリダイゼーションに関する推奨条件に従って実施した。簡単に言えば、プレハイブリダイゼーションを68℃で30〜60分ほど行い、ハイブリダイゼーションを68℃で約60分間実施した。次いでブロットをストリンジェント条件下で洗浄し、オートラジオグラフィーかまたはホスホイメージングプレートに撮影した。オートラジオグラムをBioRad GS-670レーザースキャナーで走査し、バンド強度をMolecular Analyst v2.1 (BioRad, Hercule CA)画像解析ソフトウェアで定量した。ホスホイメージはStorm 840システム(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)で取り込み、バンド強度をImage Quant v1.1 (Molecular Dynamics)画像解析ソフトウェアで定量した。
【０１９３】
亜硝酸検定法によるNOの計測では、細胞をAβペプチドまたは対照緩衝液と共に48時間インキュベートし、次いでならし培地中の亜硝酸レベルを公知の要領で[Hu et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp. 2543-2547]、Griess反応により計測した。NOS阻害剤N-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-name)または不活性D-nameイソマーを使用するときは、Aβと同時に培養に添加した。
【０１９４】
図13はこれらの実験の結果である。図から明らかなように、星状細胞をADDLsと共にインキュベートするとグリア細胞の活性が増大するが、星状細胞をAβ17-42と共にインキュベートしてもそうはならない。
【０１９５】
これらの結果はADDLsがグリア細胞を活性化することを裏付ける。グリアタンパク質はたとえばアルツハイマー病に見られる神経障害の一因であるかもしれないし、またADDLsのある種の作用はグリア細胞の活性化によって実際に間接的に仲介されているかもしれない。特にグリアタンパク質はADDLsの形成または受容体結合の後で起こるADDLを介した作用を促進するかもしれない。また、クラスタリンはアルツハイマー病患者の脳内でアップグレードされること、クラスタリンの産生が昂進するのは活性化されたグリア細胞の中に限られることも判明している。とすれば非ADDL、非アミロイド刺激によるグリア細胞の活性化がクラスタリンを産生させ、それがADDLsの産生を招き、それがまたニューロンの破壊やグリア細胞のさらなる活性化を招くという可能性がある。
【０１９６】
機序はともかく、これらの結果はさらに、ADDLを介したグリア細胞の活性化を調節(加減)するような処置により神経保護効果が得られることを示唆する。さらに、これらの結果は、ニューロンへの効果の阻害とは別にグリア細胞に対するこうした効果の阻害もまた有益であることを示唆する。
【０１９７】
実施例１７
LTP検定法 - ADDLsはLTPを妨げる
長期増強(LTP)はシナプス可塑性の古典的な典型であり、また初期ADで選択的に失われる記憶および学習機能のモデルである。この実施例では、LTP特に内側貫通線維-顆粒細胞LTPに対するADDLsの作用を調べるために行った実験を示す。
【０１９８】
動物へのAβ投与: マウスをウレタンで麻酔し、脳定位固定装置に固定した。温水ジャケットパッドを使用して体温を維持した。頭蓋開口より脳表を露出させた。海馬の分子層中層に注入するためのブレグマおよびラムダ位置はブレグマ後方2mm、正中線外側1mmおよび脳表からの深さ1.2〜1.5mmである。アミロイドβオリゴマーは〜10nm径ガラスピペットによりnitrogen puff法で、20〜50nLのアミロイドβオリゴマー溶液(180nMのアミロイドβ/リン酸緩衝食塩水、PBS)として、1時間かけて投与した。対照マウスにはPBSだけを等量投与した。動物は様々な時間(一般には60分)の休息をとらせてからLTP刺激を与えた。
【０１９９】
Aβ投与動物のLTP: 実験はRouttenbergらが確立したマウスでのLTPのための枠組みに従って行う[Namgung et al. (1995) Brain Research, vol. 689, pp.85-92]。内嗅皮質からの貫通線維刺激を用い、歯状回の分子層中層と細胞体から記録をとった。電気刺激を与えたときの最大集合興奮性シナプス後電位(pop-EPSP)と集合スパイク電位(pop-spike)を観測した。連続3回の400Hz、8×0.4msパルス/回の刺激により、これらの反応としてLTPを誘導することができた[Namgung et al. (1995) Brain Research, vol. 689, pp.85-92]。刺激後(刺激を加えた時点を起点として)2〜3時間にわたり記録をとり、LTPが保持されているかどうかを調べた。次いで動物をすぐに犠牲にするか、または1、3または7日間回復させてから、同様に犠牲にした。脳を30%ショ糖で凍結防止してからマイクロトームで薄切りにした(30μm)。得られた切片はゼラチン下塗りスライド上に固定するか、または浮遊法により分析した。免疫組織化学法でGAP-43; PKC亜型; およびタウ(PHF-1)、パキシリンおよび焦点接着キナーゼ(FAK)のタンパク質リン酸化について、変化をモニターした。波形を機械により公知の要領で[Colley et al. (1990) J. Neurosci., vol. 10, pp. 3353-3360]分析した。Aβ投与群と対照群の間のスパイク振幅の比較には2-way ANOVAを用いる。
【０２００】
図14は動物個体レベルのADDLsのスパイク振幅効果を示す。この図から明らかなように、ADDLsは、内嗅皮質に対する高頻度の電気刺激によって誘導され歯状回の分子層中層における細胞体スパイク振幅として計測されるLTPの持続相を阻害する。
【０２０１】
LTP実験の後、動物を種々の時間にわたり回復させてから、ペントバルビタールナトリウム麻酔剤と4%パラホルムアルデヒド潅流の使用により犠牲にした。生死判別研究には3時間、24時間、3日間、7日間という時間を用いた。脳を30%ショ糖で凍結防止してからマイクロトームで薄切りにした(30μm)。得られた切片はゼラチン下塗りスライド上に固定し、クレシルバイオレットで染色した。細胞消失を、歯状回、CA3、CA1および内嗅皮質における細胞体を計数することによって計測し、ADDLsの用量および接触時間と相関させた。これらの実験の結果は、LTP実験の24時間後の時点では細胞死が起きていないことを裏付けた。
【０２０２】
同様にして、若い成獣ラットに由来する海馬スライスでもLTP反応を調べた。図15が示すように、ラット海馬スライスをADDLsとインキュベートすると、細胞変性のしるしが現れるずっと前にLTPが妨げられる。予め500nM ADDLsに45分間接触させた海馬スライス(n=6)はテタヌス刺激30分後には、活動電位容量が存続するにもかかわらず集合スパイクの増強をまったく示さなかった(平均振幅99%±7.6)。それに対して、基剤とインキュベートしたスライス(n=6)ではLTPが容易に誘導され、最終10分間の振幅は138%±8.1であった。この値は同齢群に関する以前の値[Trommer et al. (1995) Exper. Neurol., vol.131, pp.82-92]に匹敵する。ADDL処理スライスではLTPが起きなかったものの、その細胞は活動電位を生成する力を有しており、変性のしるしはまったく示さなかった。
【０２０３】
これらの結果は、動物個体、組織スライス両レベルでADDLs添加が1時間以内に、細胞の変性や死に先立って、LTPを著しく妨げる結果となることを実証する。こうしてこれらの実験は、ADDLsがごく初期の作用を及ぼすこと、またADDL形成および/または活性の阻害を利用すれば、疾患、障害または病態(たとえばアルツハイマー病)が細胞死段階へと進行する前に、治療効果が得られることを裏付ける。言い換えると、これらの結果は神経細胞死の前に記憶の減退が起こることを裏付ける。従って、そうした細胞死の前に前記の阻害を実現すれば記憶の減退を逆転させることができるし、回復を実現することも可能かもしれない。
【０２０４】
実施例１８
ADDLsのin vivo初期作用
この実施例ではADDLsのin vivo初期作用およびそうした初期作用を利用するための理論的な方法を示す。
【０２０５】
アルツハイマー病の主症状は学習記憶障害である。しかし、行動障害と凝集アミロイド沈着との関連は立証困難となっている。トランスジェニックマウスでは、血小板由来成長因子プロモーターの制御下での変異APPの過剰発現が大量のアミロイド沈着を招く[Games et al. (1995) Nature, vol.373, pp.523-527]。その一方で、この実験系では行動障害の報告はない。トランスジェニックマウスで研究を進めている他の研究者たち[たとえばNalbantoglu, J. et al. (1997) Nature, vol.378, pp.500-505; Holcomb, L. et al. (1998) Nat. Med., vol.4, pp.97-100]は、著しい凝集アミロイド沈着が観測されるよりもずっと前に起こる著しい行動認知障害を観察、報告している。これらの行動認知障害には長期増強障害も含まれる[前掲Nalbantoglu, J. et al.]。これらのモデルは全体として、非沈着形アミロイドが誘導ニューロン機能障害の結果として起こる初期認知行動障害の一因であることを示唆する。本書で開示する新規ADDLsが初期認知行動障害を引き起こすこの非沈着形アミロイドであるというのは、これらのモデルとも整合する。この点からみて、本発明に従うADDL調節化合物はADDL誘導ニューロン機能障害に由来するこれらの初期認知行動障害の治療および/または予防に使用することができる。
【０２０６】
同様にして、老人では第Ｉ期アルツハイマー病の疑いが強いと診断されるずっと前に認知機能低下や限局性記憶障害が起きている可能性がある[Linn et al. (1995) Arch. Neurol., vol.52, pp.485-490]。これらの限局性記憶障害は細胞死よりも誘導されたニューロン間信号伝達異常に由来する可能性がある。他の機能たとえば高次文章技能[Snowdon et al. (1996) JAMA, vol.275, pp.528-532]もまた、細胞死のずっと前に起こるニューロン機能異常の影響を受ける可能性がある。ADDLsがこれらの障害を、ADDLsによって誘導されるLTP機能の低下と同様に、誘導するというのは、これらの障害に関する知見や本書で開示したADDLs情報とも整合する。これらの点から見て、本発明に従うADDL調節化合物は、ADDL形成または活性に由来するこれらの初期認知機能低下および限局性記憶障害、さらには高次文章技能障害の治療および/または予防に使用することができる。または、そうした障害を研究するためにADDLs自体をたとえば動物モデルに使用することもできる。特にそうした研究は、当業者には周知のやり方で、たとえば処理群と対照(プラセボ)群の同年齢層の対象を比較することにより、行うことができる。
【０２０７】
実施例１９
アミロイドβオリゴマー(ADDLs)のさらなる調製法
この実施例ではたとえば実施例1および4に記載の方法に代わるADDLs調製方法を示す。
アミロイドβモノマーをヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に溶解して該モノマーのストック液とし、次いで該溶媒をスピード減圧留去する。固体ペプチドを無水DMSOに再溶解し5mMのDMSOストック液とし、またADDLsはこのDMSOストック液1μlをF12培地(無血清、無フェノールレッド) 49μlで希釈して調製する。この混合物をボルテックスし、次いで4℃で24時間インキュベートする。
【０２０８】
実施例２０
アミロイドβオリゴマーのさらなるゲル分析
この実施例ではアミロイドβオリゴマーに関するさらなるゲル分析を示す。
アミロイドβオリゴマー(たとえば前実施例の要領で調製したオリゴマー)の調製に続くゲル分析では、オリゴマー液1μlをF12培地4μlおよび電気泳動用トリス-トリシン緩衝液に加え、次いで既製16.5%トリス-トリシンゲル(Biorad)上に添加する。電気泳動を100Vで2.25時間実施する。電気泳動後、Silver Xpressキット(Novex)を使用してゲルを染色する。あるいはゲルを染色する代りに、アミロイドβ種をゲルから含SDS転写緩衝液中のHybond-ELC (Amersham)に100V、4℃で1時間転写する。ブロットは5%脱脂粉乳添加TBS-T1中に1時間、室温で浸してブロックする。TBS-T1で洗浄後、ブロットを一次抗体(26D6, 1:2000)と室温で1.5時間インキュベートする。26D6抗体はアミロイドβのアミノ末端領域を認識する。さらなる洗浄後、ブロットを二次抗体(抗マウスHRP, 1:3500)と室温で1.5時間インキュベートする。さらなる洗浄後、ブロットをWest Pico Supersignal試薬(各500μl; Pierce) +  ddH2O 3ml中で5分間インキュベートする。最後に、ブロットをフィルムに撮影し、現像する。
【０２０９】
こうしたさらなるゲル分析の結果は図16のとおりであり、この図は濃度計でスキャンした16.5%トリス-トリシンSDS-ポリアクリルアミドゲル(Biorad)のコンピューター生成画像である。一連の可溶性オリゴマーADDLs(“ADDLs”)、ダイマー(“Dimer”)、およびモノマー(“Monomer”)が確認される。こうしてこのゲルシステムは3モノマー(トリマー)〜約24モノマーを含む識別可能なADDLsの視覚化を可能にする。
【０２１０】
図16には示されていないが、凝集前後に得られるゲル/ウェスタンブロットの比較から明らかになるのは、テトラマーのバンドが凝集後に増強するのに対して、ペンタマー〜24マーのオリゴマー種は凝集後にようやく現れるという事実である。オリゴマー(特にダイマーとテトラマー)の銀染色量と免疫検出量の差は、該オリゴマーの凝集後のコンホメーションが異なる可能性のあることを示唆する。
【０２１１】
実施例２１
アミロイドβオリゴマーのさらなるAFM分析
この実施例ではアミロイドβオリゴマーに関するさらなるAFM分析を示す。
AFM分析は実施例3の要領で行ったが、ただしSuperdex 75カラムによる分画は行わず、また視野は比較的大サイズの小球を計測するように特別に選択した。この分析は技術的には実施例3のそれと同じであるが、本例では視野を特別に選択し調べることで、断面分析で計測したものより大きなサイズのオリゴマーの視覚化が可能になっている。AFM分析にはTappingMode(登録商標)(Digital Instruments, Santa Barbara, CA)使用のNanoScope(登録商標)III  MultiMode AFM (MMAFM)ワークステーションを使用した。
【０２１２】
図17はこれらの分析の結果、すなわちADDLsのAFM分析のコンピューター生成画像であり、種々のアミロイドβオリゴマーの多様なサイズの構造体を示す。接着構造体のサイズ範囲はz高さで1〜10.5nmである。この解析によれば構造体は3〜24モノマーユニットを含むが、これはトリス-トリシンSDS-PAGEで示されたバンドとも合致する。別個の実験(データ非表示)では、高さが約11nmのオリゴマー種が観測された。
【０２１３】
実施例２２
抗ADDL抗体の調製、解析および使用
材料と方法
材料: Aβ1-42はAmerican Peptideから入手した。細胞培養製品はCellGroとLife Technologiesから入手した。化学薬品と試薬は特に断らない限りSigma-Aldrichから得た。以下のキット類を使用した: Boehringer Mannheim Cell Proliferation (MTT)キット、Novex Silver XpressキットおよびPierce West Femto化学発光キット。SDS-PAGEゲルおよび緩衝液はBioRadから得た。抗体6E10、6E10Biおよび4G8はSenetekから得た。26D6はSibia Corporationからの贈与であった。複合二次抗体はJackson LabとAmershamから入手した。
【０２１４】
Aβ由来拡散性リガンド(ADDL)調製品: Aβ1-42をヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)に溶解し、マイクロ遠心チューブに分注した。凍結乾燥法でHFIPを除去し、チューブを-20℃で保存した。分取量のAβ1-42を無水DMSOに溶解して5mM溶液とした。このDMSO溶液を冷F12培地(Life Technologies)に加え100μM溶液とした。この溶液を4℃で、少なくとも24時間インキュベートし、次いで14,000 x gで10分間遠心した。その上清がADDLsであり、通常は培地で1:10または1:20希釈して使用した。
【０２１５】
MTT検定: PC12細胞を96穴プレートに30,000細胞/ウェルの密度でプレーティングし、一晩増殖させた。この培地を除去し、ADDLs(5または10μM)または基剤を新培地(F12K、1%ウマ血清、抗生物質/抗真菌剤)に加えた。37℃で4時間後、MTT(10μl)を各ウェルに加え、37℃で4時間インキュベートした。可溶化緩衝液(100μl)を加え、プレートを37℃で一晩置いた。プレートリーダーにより測定波長550または550/690 nmで測定し、データを平均+標準誤差(SEM)としてプロットした。
【０２１６】
銀染色: メーカー(Novex)概説の手順に従った。
抗体調製: ポリクローナル抗体の産生と精製はテキサス州のBethyl Laboratories, Inc.に委託した。最初の24時間材料は翌日配達便により氷冷状態で抗体会社に送った。抗体会社では、材料を受領当日に完全フロイントアジュバントで1:1希釈し、注射した。こうして+48時間と標識した抗原が注射された。ブースター注射は不完全アジュバントを使用して数週間続行した。2頭のウサギに産生させた超免疫血清を、96穴フォーマット中の原抗原溶液に対するELISAにより定量した。然るべき抗体価に達した後、動物から採血し、アフィニティーカラムを使用して抗体を回収精製した。アフィニティーカラムはAβ40溶液(50μg/ml-ゲル)をアガロースに臭化シアン法で固定化して作製した。然るべき抗体の該カラムへの結合はELISA法でモニターした。次いでカラムからポリクローナル抗体を取り出し、硫安沈殿とイオン交換クロマトグラフィーを使用して分画し、純度95%超のIgG調製物として当方に返送してきた。当方は合計3回ずつ採血した2頭のウサギに由来する抗体(M93とM94)を受領した。
【０２１７】
免疫ブロット法: 公知の手順[Zhang, C. et al. (1994) J. Biol. Chem., vol.269, pp.25247-25250]に従った。簡単に言えば、等量のタンパク質またはADDLsをサンプル緩衝液に加え、16.5% Tris-Tricineゲル上に添加した。混合サンプルでは、ADDLsをまずタンパク質に、次いでサンプル緩衝液に加えたら、すぐにゲル上に添加した。100Vでの電気泳動によるタンパク質の分離を、サンプル緩衝液がゲルの底に到達するまで、行った。次にニトロセルロースメンブランへのタンパク質の転写を100Vで1時間、冷やしながら行った。メンブランは5%脱脂粉乳/トリス緩衝食塩水+0.1%トリトンにより室温で1時間ブロッキングした。サンプルを一次抗体と室温で1.5時間インキュベートし、3回×15分間洗浄した。一次抗体は通常、2000倍希釈で使用した。これは使用抗体にもよるが0.3〜0.6 μg/mlのタンパク質濃度に相当する。メンブランは二次抗体(通常、2万倍希釈液)と室温で1.5時間インキュベートし、同様に洗浄した。タンパク質を化学発光法で視覚化した。定量にはIS440CF Image Station対応のKodak 1D Image Analysisソフトウェアを使用した。
【０２１８】
ラット海馬培養物の調製: Brewer法による胎児マウス培養[Brewer, G.J. (1997) J. Neurosci., vol.71, pp.143-155]を行った。海馬を動物から取り出し、すべての海馬を摘出し洗浄し終わるまでHibernate(商標)/B27培地に入れておいた。次いでパパインにより組織を解離させた。細胞をトリチュレーションにより分離し、再結合させ、ポリ-L-リシン(200μg/ml)とラミニン(15μg/ml)をコートしたカバーガラス上にプレーティングした。プレーティング培地は0.5mMグルタミン、5ng/ml β-FGFおよび抗生物質/抗真菌剤を添加したNeurobasal(商標)-E/B28(Life Technologies)であった。通常この手順により、長い突起を発達させたクリーンな、ニューロンを主体とする培養物および細胞が得られた。培養物を3日目までに使用しないときは、培地を新鮮培地に取り替えた。
【０２１９】
ADDLの蛍光発光分析: 細胞をコート・カバーガラス上で、公知の要領で培養した[Stevens, G.R. et al. (1996) J. Neurosci. Res., vol.46, pp.445-455]。様々な時間にわたりADDLsを無血清培地中の細胞に接触させた。遊離ADDLsは温培地で洗浄除去した。細胞を室温で1.88%ホルムアルデヒドにより10分間、固定処理し、次いで3.7%ホルムアルデヒドにより15分間、固定後処理をした。結合ADDLsはM9ポリクローナル抗体とのインキュベーションにより識別し、Oregon Green-514(Jackson Labs)-抗ウサギIgG複合体を使用して視覚化した。分析にはNikon Diaphot倒立顕微鏡+落射蛍光装置を使用した。
【０２２０】
結果
既知成分のADDL抗原で免疫するために、まず調製物が期待される構造および毒性を一貫してもたらすことを検証した。ADDL溶液はモノマーと毒性オリゴマーだけを含む必要がある[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453]。線維形成を促進するようなタネを除去するため、供給者に由来するAβ1-42をまずヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に溶解してモノマー化し、乾燥・保存する。このモノマー化Aβ1-42を毎週、8週間にわたり使用し、同濃度(0.24±0.1mg-Aβ/ml;「方法」の項を参照)のADDLsを安定供給した。ADDL溶液は線維を含まないことを原子間力顕微鏡で検証し、従来の見解[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453]を確認した。各調製物の成分をSDS-PAGEと銀染色でさらに分析すると、小さなオリゴマーとモノマー(支配的な成分、45±5%)だけからなることが判明した。図18Aは免疫に使用した調製物の組成である。時点は当初調製物と1日経過後の同じ調製物の状態を示す。組成に経時変化は見られなかった。各調製物についてPC12細胞に対する毒性も、MTT還元への影響として、調べた。調製直後または1日経過後の計測では、ADDL溶液はMTT還元阻害能を一貫して示した(図18B)。影響は5μMまでは基本的に最大であった。これらの結果は免疫原がタンパク質濃度、オリゴマー構成および毒性の点で終止一貫していることを立証した。
【０２２１】
前記の要領で調製したADDL溶液(0.23mg/ml-全タンパク質;「方法」の項を参照)を完全フロイントアジュバント1mlと混合し、ただちに2頭のウサギに注射した(0.12mg-タンパク質/動物)。ブースター注射(5回)は不完全アジュバントを使用し、10週間にわたって続けた。ウサギからは3回採血して抗血清(M93およびM94)を獲得し、それをアフィニティークロマトグラフィーで精製、分画し、純度95%超のIgG調製物を得た。
【０２２２】
種々のAβ種を識別する新抗体の能力を免疫ブロット法で評価した。結果を標準モノクローナル抗体4G8、26D6および6E10のそれと比較した。26D6(Kounnas, M.Z.、私信)および6E10[Kim, K.S. et al. (1990) Neurosci. Res. Commun., vol.7, pp.113-122]はAβの類似エピトープaa1-12および1-16をそれぞれ認識し、4G8はAβのaa17-24を認識する[Enya, M. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.154, pp.271-279]。有効性は大差ないが特異性は著しく異なることが比較で判明した。3つのモノクローナル抗体はオリゴマー種だけでなくモノマーも認識する。4G8はまた、少量のダイマーに結合する効果が特に大きい。一方、新ポリクローナル抗体はオリゴマー種に対する強い選好を示した。M94およびM93は同じADDLs調製物に、しかもモノクローナル抗体と等しい用量を加えると、トリマーとテトラマーだけを認識した(図19および20)。用量-反応データによれば、M93はモノマーに、ただし高抗体濃度でのみ、結合しうる(図20)。6E10がモノマーにも少なくともオリゴマー並みに結合する希釈濃度では、M93抗体はオリゴマーにだけ結合する。ダイマーはいずれの抗体によっても認識されない。これらのデータからは、ポリクローナル抗体は高次編成形のAβをすぐ識別するものの、モノマーはなかなか認識しないことがうかがえる。
【０２２３】
抗体とADDLsの非特異的会合の可能性を、4℃で2時間ADDLsにより抗体を予め吸収させておく方法で試験した。この事前吸収により免疫ブロット時の結合は一切排除された(図21)。抗体がADDLs以外の神経タンパク質に非特異的に結合するかどうかを見るために、ラット脳由来のホモジネートを使用して免疫ブロット法を行った。結果は、ホモジネート中のどのタンパク質ともほとんど反応しないことを示している(図22、中央レーン)。ラットのポストミトコンドリア膜ホモジネートやB103 CNS神経芽細胞種細胞ホモジネートでも同様の結果(データ非表示)が得られた。抗体が他の脳タンパク質の存在下でADDLsを検出しうるかどうかを試験するために、ADDLsをゲル分離前のホモジネートに加えて、免疫ブロット法を行った(図22、右側レーン)。トリマーとテトラマー(黒矢印)は検出されたし、また抗体はもっと高分子量の種も認識した。これらのバンドで最も目立つものを白矢印で示すが、さらに高分子量の種も微量ながら現れている。これらの高分子量の種はヒト脳ですでに発見されているような[Guerette, P.A. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.25, p.2129]比較的大きなオリゴマーであるか、またはおそらくADDLsと第2タンパク質たとえばApoEなどとの複合体であろう[LaDu, M.J. et al. (1995) J. Biol. Chem., vol.270, pp.9039-9042]。
【０２２４】
抗体は他タンパク質の存在下でADDLsを認識したので、次にそれらの抗体が培養細胞に結合したADDLsの検出するための顕微鏡法に有用かどうかを試験した。培養物をE18ラット海馬から調製し、ADDLsと37℃で90分間インキュベートした(「方法」を参照)。細胞を固定し、M94と共にインキュベートし、二次IgG+Oregon Green-514複合体で視覚化した。ADDLs不存在下ではシグナルが見られなかったが、それは免疫ブロット法で判明した特異性と呼応する。ADDLsの存在下では、M94はほぼ神経突起だけに局在する小斑点を検出した(図23)。この斑点状結合はADDLsを市販抗体で視覚化すると見られるものに類似する[Viola, K.L. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p1285]。
【０２２５】
最後の実験では、抗体が溶液中でADDLsに結合しその神経毒性を止めるかどうかを試験した。毒性はPC12細胞内のMTT還元に対するADDLsの影響から評価した[Shearman, M.S, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.91, pp.1470-1474; Liu, Y. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.13266-13271; Liu, Y. & Schubert, D. (1997) J. Neurochem., vol. 69, pp.2285-2293; Oda, T. et al. (1995) Exp. Neurol., vol.136, pp.22-31; Lambert, M.P. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol. 26, p.1285]。免疫前血清の存在下でのADDL活性の対照検定では、用量依存的なMTT還元の抑制が明らかとなった(図24、黒四角)。表示のデータはADDLsの4時間の影響に関するデータである。24時間の影響に関する試験でも同様の結果(データ非表示)が得られた。加えて、ADDLsを形成する際にクラスタリンをシャペロンとするかどうかの条件次第でも保護が見られた(データ非表示)。これらの結果は神経毒性を中和するADDL抗体の潜在能力を証明する。
【０２２６】
実施例２３
アルツハイマー病および軽度認知障害(MCI)の血清系バイオマーカーとしてのADDLs
前述のように、アルツハイマー病と軽度認知障害はADDLsに起因する可能性がある。多数の方法で認知機能を定量的に計測しうることは周知のとおりである。前述のように、ADDLsは血清から、また死後なら脳からでも、定量的に計測しうる。従って死亡直前の認知機能と死後脳内ADDL濃度の間に統計的相関を確立することは可能である。さらに、脳ADDLsと血清ADDLsの間に統計的相関が確立されれば、アルツハイマー病やMCIの臨床診断が、被験者または患者が疾患の初期段階にあっても、下せるようになる。
【０２２７】
従って、冠動脈性心疾患のバイオマーカーとしての血清コレステロール値の場合と同様に、ADDLsをこれらの疾患のバイオマーカーとして利用することができる。目下、ADにもMCIにも血清系マーカーは存在していない。
【０２２８】
ADDLsがADやMCIのバイオマーカーとして確立されれば、たとえば次のような効用が期待される:
a.  そうしたバイオマーカーの使用による、モノクローナル抗体系血清診断検定法の実現;
b.  そうしたバイオマーカーの使用による、患者の治験参加資格認定の支援。このスクリーニングバイオマーカーを欠く現行臨床プロトコールと比べた場合のSN比の向上、ひいては治験期間の短縮および/または規模の縮小による大幅なコストダウン;
c.  そうしたバイオマーカーの使用による、早期診断の実現と疾患進行速度の緩和;
d.  そうしたバイオマーカーの使用による、治療および/または予防目的の薬学的介入の効果の判定;
e.  そうしたバイオマーカーの使用による、DHEA調節成分(栄養補助食品など)の血中、脳中および脳脊髄液(CSF)中ADDLs濃度の低減効果の判定。
【０２２９】
実施例２４
ADDL結合性タンパク質(ヒト脳内のADDLsおよびADDL受容体の解析)
図25および26に示すように、高感受性のADDLs検定法によりAD脳内ADDLsの検出が可能になる。非AD脳に比べてAD脳ではADDLs濃度が70倍も上昇する。
【０２３０】
さらに、図27に示すように、ヒト脳内ADDLsは合成Aβ1-42から調製したADDLサンプル中に存在する比較的大きなオリゴマーと同じである。
【０２３１】
ADDLsは皮質および海馬に由来する神経細胞膜から単離した3つのタンパク質バンドに結合する。受容体タンパク質はラット脳とヒト脳に見られ、バンドはAD患者の皮質に由来する(図28参照)。
【０２３２】
ヒト脳から単離したADDLsまたは合成Aβ1-42から調製したADDLsは、分子量(MW)が約100kDa、約140kDaおよび約260 kDaのタンパク質への特異的結合を示す(図29)。
【０２３３】
図30に示すようにADDLsはB103細胞または脳組織に由来するp260に結合し、また架橋により分子量280〜300kDaのADDL-p260複合体を生成する。細胞表面上の特異的ADDL結合性タンパク質を識別するために、ADDLsと脳組織またはB103ニューロンから単離した膜タンパク質とのインキュベーション後に架橋試薬を加えた。次いで該タンパク質をゲル電気泳動法で分離し、ブロットし、ADDL特異抗体(M94-3)でプローブした。分子量250〜300 kDa程度のADDL依存バンドが1つ、B103とラット脳膜では見られたが、肝臓膜では見られなかった。
【０２３４】
ADDL受容体と推定されるp260は等電点(pI)約5.6の存在量の少ないタンパク質である(図31参照)。
【０２３５】
図32に示すように、ADDLsは受容体に結合して、神経細胞の突起を中心として細胞体にも分布する明確な「斑点」を形成する。海馬脳スライスをADDLsで処理すると急速なLTP阻害を招くが[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453; Wang, H.W. et al. (2002) Brain Res., vol.924, no.2, pp.133-140; Klein, W.L. (2001) Trends Neurosci., vol.24, no.4, pp.219-224]、それはADDLsが受容体または受容体様タンパク質に結合してそうした細胞応答を自動的に引き出すことを示唆する。ADDL特異抗体を使用する免疫蛍光法で検出すると、ADDL受容体は培養神経細胞上に局在している。培養し解離させたラット海馬細胞を、ラミニンをコートしたカバーガラス上にプレーティングした(1.33×103細胞/mm2)。細胞を2〜3日増殖させた。細胞を5μM ADDLs/無血清培地で1時間処理し、洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで15分間固定した。次いで細胞をPBSで洗浄し、10%NGS:PBSでブロッキングし、6E10-B(1:200)/NGS:PBSにより37℃で2時間、次いでDTAF-ステレプトアビジン(1:333)/PBSにより37℃で1時間、それぞれ免疫標識した。MetaMorph画像化ソフトウェアで細胞を調べた。斑点状のADDL結合が突起や細胞体に沿った多数の部位に見られる(図32)。
【０２３６】
さらに、図33に示すように、斑点状のADDLs-神経細胞結合はアミロイド原線維または線維の結合とは識別可能である。この検定法は前記と同様の要領で、線維状または原線維状のAbeta(Aβ)調製物を使用して行う。
【０２３７】
ADDLsはp75神経成長因子(NGF)受容体とは異なる細胞表面受容体に結合する(図34参照)。構造未知のAbetaペプチドが神経芽細胞種細胞のNGF-r(p75)に結合することはすでに示されていた[Kuner, P. et al. (1998) J. Neurosci. Res., vol.54, no.6, pp.798-804]。ADDLsがp75NGF-r、海馬神経細胞上の別のADDL受容体のいずれに結合するのかを免疫蛍光法で調べることにした。ラット海馬細胞を12日間増殖させた。細胞を1μMのADDLsにより37℃で1.5時間処理した。カバーガラスを1回洗浄し、次いでホルムアルデヒドで15分間固定した。カバーガラスを洗浄し、10%NGS/PBSに溶解した0.1% Triton X-100により1.5時間浸透化処理し、モノクローナル抗NGF-r(1:100)およびポリクローナル抗ADDL(M94-3)(1:500)により4℃で一晩標識した。次いで細胞を洗浄し、AlexaFluor 594抗マウスおよびAlexaFluor 488抗ウサギ(それぞれ1:1000)と共に室温で3時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ProLong Anti-Fade封入剤を使用して標本にし、MetaMorph画像化ソフトウェアにより視覚化した。図34に示すように、ADDL受容体複合体は海馬細胞突起上の斑点としてはっきり見える。NGF-r(p75神経成長因子受容体)は主に細胞体周辺で観察されることから、共局在はほとんど起きないことが示された。この結果はKuner et al. (1998)の研究結果とは対照的であり、ADDLsが、ヒト神経芽細胞種細胞株でAβのp75NGFRへの結合を立証した実験に使用したAβペプチドに対して区別可能な構造体であることを示唆する。
【０２３８】
ADDL受容体は、樹状突起の局在を示すMAP-2a,b染色と共局在する(図35)。MAP-2a,bの局在とADDL受容体は12日齢ラット海馬細胞で免疫蛍光法により検出することができる。ラット海馬細胞を12日間増殖させる。細胞を1μMのADDLsにより37℃で1.5時間処理する。カバーガラスを1回洗浄し、ホルムアルデヒドで15分間固定する。カバーガラスを洗浄し、10%NGS/PBSに溶解した0.1% Triton X-100により1.5時間浸透化処理し、モノクローナル抗MAP2a,b(1:250)およびポリクローナル抗ADDL(M94-3)(1:500)により4℃で一晩標識する。次いで細胞を洗浄し、AlexaFluor 594抗マウスおよびAlexaFluor 488抗ウサギ(それぞれ1:1000)と共に室温で3時間インキュベートする。細胞を洗浄し、ProLong Anti-Fade封入剤を使用して標本にし、MetaMorph画像化ソフトウェアで視覚化する。図35に示すように、ADDLは抗MAP2a,b抗体で染色された突起上でだけ検出される。これはADDLsが樹状突起に主に結合し、軸索上にはほとんど結合しないことを示す。
【０２３９】
ADDLsは成長円錐および葉状突起先端に結合する(図36)。さらに、図37に示すようにADDL受容体は樹状突起棘上にシナプス後マーカーPSD-95およびCAMキナーゼIIと共に局在し、シナプス前末端への局在はそれほど一般的ではない。二重標識した海馬ニューロンの免疫蛍光分析では、ADDL受容体複合体(緑)の主要な局在が見られるのはSDS-95の密度(赤)で識別されるシナプス後部位(下パネル)であることが判明した。ずっと軽微な共局在がSVP-38の密度(赤、上パネル)で識別されるシナプス前末端に見られる。同様の二重標識から、ADDL受容体複合体がシナプス後マーカーCAMキナーゼIIと共に樹状突起棘に局在することがわかる。
【０２４０】
ADDL受容体斑点はニューロン接着斑の構成分子としてのパキシリンおよびビンクリンと共局在する(図38)。過去の研究では、ラット神経芽細胞種細胞のADDLsによる処理はパキシリンの急速なリン酸化を引き起こしたが、ビンクリンのリン酸化には何の変化も及ぼさなかった[Berg, M.M. et al. (1997) J. Neurosci. Res., vol.50, no.6, pp.979-989]。ADDL受容体の信号伝達に関与する信号伝達過程および分子をさらに解析するためには、海馬神経細胞内でADDL受容体複合体がパキシリンおよび/またはビンクリンと共局在するかどうかを蛍光発光法により調べることができる。
【０２４１】
ラット海馬細胞を12日間増殖させる。細胞を1μMのADDLsにより37℃で1.5時間処理する。カバーガラスを1回洗浄し、ホルムアルデヒドで15分間固定する。カバーガラスを洗浄し、10%NGS/PBSに溶解した0.1% Triton X-100により1.5時間浸透化処理し、モノクローナル抗パキシリンまたは抗ビンクリン(1:100)およびポリクローナル抗ADDL(M94-3)(1:500)により4℃で一晩標識する。次いで細胞を洗浄し、AlexaFluor 594抗マウスおよびAlexaFluor 488抗ウサギ(それぞれ1:1000)と共に室温で3時間インキュベートする。細胞を洗浄し、ProLong Anti-Fade封入剤を使用して標本にし、MetaMorph画像化ソフトウェアで視覚化する。
【０２４２】
ADDL受容体結合は(通常観察されるように)海馬細胞突起上に、またときには細胞体上にも、識別可能な斑点を形成させる結果となる(図38参照)。パキシリンは突起および細胞体に見られる。ADDL受容体複合体は少数例に限ってパキシリンと共局在する模様である。ビンクリンは主として細胞突起間の連接部に、また接着斑と推定される部位に、見られ、またADDL受容体複合体はこれらのうち大多数の接着斑部位で検出することができる。これらの観測結果はADDL受容体が接着受容体ときわめて似通った性質を有することを示唆する。すなわち、両者のリガンド結合体は接着斑に局在する。
【０２４３】
パキシリンとの局在が最小限に留まることを確認するために、E18ラット胎児から調製した培養海馬神経を使用して別の検定法を行う。培養26日目にニューロンを海馬培地中で1μMのADDLsまたは等容量の対照基剤により37℃で1時間処理する。細胞を洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、PBSで3回洗浄し、次いで10%NGS/PBSで60分間ブロッキングする。カバーガラスをPBS:NGSと共に、または抗パキシリン(1:100)およびM90-2ポリクローナル抗ADDLウサギ抗体(1:250)/PBS:NGSと共に、8℃で一晩インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、次いでAlexaFluor 488(緑)抗ウサギ(1:1000)およびビオチン化抗マウス(1:250)/PBS:NGSと共に37℃で1時間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、次いでAlexaFluor 594(赤)ストレプトアビジン(1:1000)/PBS:NGSと共に37℃で1時間インキュベートする。細胞を洗浄し、ProLong Anti-Fade封入剤を使用して標本にする。細胞をNikon顕微鏡とMetaMorph画像化ソフトウェアで視覚化する(図38、下パネルを参照)。
【０２４４】
ADDL受容体結合は接着斑キナーゼ(FAK)のチロシン・リン酸化を活性化し、またADDL受容体複合体はリン酸化FAK(FAK-YP)と共に局在する(図39参照)。Aβ1-42の混合凝集体がFAKのリン酸化を誘導する可能性があるとの研究結果(Zhang et al., 1994)が出ていたので、ADDL処理とそれに続く受容体複合体の形成がFAKリン酸化を増進するかどうかを、いくつかの検定法で調べる。
【０２４５】
海馬細胞60mmディッシュに〜200万細胞/ディッシュの密度でプレーティングし、5日間増殖させる。細胞をADDLs(1μM)または基剤により1時間、またはpervanadate(終濃度: オルトバナジン酸ナトリウム0.1mM+H2O2 0.3mM/培地)かPBSにより20分間、それぞれ37℃で処理する。細胞を温PBSでざっと洗浄し、0.15mL沸騰溶解緩衝液(1%SDS、1.0mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mM  Tris pH 7.4)で溶解する。細胞をすくい取り、大きなマイクロ遠心チューブに収集し、一晩凍結させる。翌日サンプルを解凍し、5分間煮沸する。サンプルを高速で1分間遠心し、上清を新チューブに移す。Coomassie Plusキットを使用してタンパク質濃度を求める。4〜20% Tris-HClゲルにMultimarkスタンダードと10μgタンパク質を、5×Laemmli緩衝液+βメルカプトエタノール(BME)を加えた海馬細胞溶解物ごとに繰り返し添加し、ゲルを転写後に半分にカットしうるようにする。ゲルを120Vで〜1.5時間電気泳動し、100V、8℃で1.5時間Immobilon-P PVDFに転写し、1%BSA-TBSTで一晩ブロッキングし、FAK-YP抗体(クローン14)と共に1%BSA-TBST中、室温で2時間インキュベートし、次いでHRP-抗マウス二次抗体と共に1%BSA-TBST中、室温で1時間インキュベートする。SuperSignal West FemtoキットおよびKodak Image Stationを使用してバンドを視覚化し、画像を15分間隔で得る。
【０２４６】
図39に示すようにFAK-YPはすべてのサンプルで検出されており、また一般的なホスファターゼ阻害剤であるpervanadateで処理したサンプルで、予想どおり、際立っていた。1時間のADDL処理もまたFAK-YPの著増を招く。FAK-YP抗体は〜60kDa、〜85kDaおよび〜140kDaの各バンドを検出する。
【０２４７】
ADDL受容体結合を引き金とするFAK-YKの増加と局在化を計測するために、海馬細胞をADDLsで処理し免疫蛍光法で分析する(図39、上段左)。E18ラット胎児から海馬細胞を培養し、培養26日目に海馬培地中で1μMのADDLsまたは等容量の対照基剤により37℃で1時間処理する。細胞を洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、PBSで3回洗浄し、次いで10%NGS/PBSで60分間ブロッキングする。カバーガラスをPBS:NGSと共に、またはFAK-YP(1:100)およびM90-2ポリクローナル抗ADDLウサギ抗体(1:250)/PBS:NGSと共に、8℃で一晩インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、次いでAlexaFluor 488(緑)抗ウサギ(1:1000)およびビオチン化抗マウス(1:250)/PBS:NGSと共に37℃で1時間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、次いでAlexaFluor 594(赤)ストレプトアビジン(1:1000)/PBS:NGSと共に37℃で1時間インキュベートする。細胞をPBSで洗浄し、ProLong Anti-Fade封入剤を使用して標本にする。細胞をNikon顕微鏡とMetaMorph画像化ソフトウェアで画像化する。
【０２４８】
ADDL受容体結合は、1μMのADDLsで1時間処理後に免疫蛍光法で検出したFAK-YP斑点数を3倍増加させる。細胞平均の斑点数は52から148に増加し、また斑点サイズの25%増と球体容積の22%増を伴った(図39参照)。
【０２４９】
実施例２５
治療用抗体
抗体の使用によるアミロイドβペプチドモノマーの固定化または線維状アミロイドプラークの除去は多数の研究者が提案している。これらの方法はADDLsを標的とはしないが、それは今日までに同定された最も強力な神経毒性アミロイド構造体であり、該構造体は今日ではADや記憶障害の有力な原因と考えられている。抗体は、ADや関連記憶障害の有効な治療薬であるためには、Aβモノマーやアミロイド線維に対してはさほどの親和性をもたずオリゴマーに特異的に結合しなければならず、また脳内にある程度進入しうるようなヒトまたはヒト化抗体でなければならない。また、そうした最適抗体の結合はADDL毒性の阻害を招かなければならない。治療用抗体の候補が低い特異性を有する、すなわちオリゴマーだけでなくモノマーにも結合するとしたら、抗体投与量のうち非毒性のモノマーと結合する量の比率が高くなり、強い神経毒性のオリゴマー(ADDLs)と結合しその作用を阻害するために当てられる抗体の量が減るであろう。治療用抗体の候補がモノマーに結合するだけでなく線維と交差反応するとしたら、その抗体は沈着プラーク内のアミロイド線維に結合し、結果として脳からの除去が容易ではない抗体-プラーク複合体に起因するしつこい炎症反応を招くおそれがある。
【０２５０】
公知の抗体(M93-3およびM93-4)はポリクローナル・ウサギ抗体であり、ADDLsに対して選択的に結合したが、線維との交差反応性や若干のモノマーとの結合性をなお示した。これらの抗体は強力なADDL毒性阻害作用を示したが、人間用の治療薬には薬に立たないであろう。ここに、新しいモノクローナル抗体が開示される。それはオリゴマー構造体にだけ結合し、モノマーや線維には結合しないという性質を有する。
【０２５１】
ADモデルのTgマウスに線維状Aβを注射すると、プラークの除去や記憶障害の予防という効果が得られる[Bacskai, B.J. et al. (2002) J. Neurosci., vol.22, no.18, pp.7873-7878; Jantzen, P.T. et al. (2002) J. Neurosci., vol.22, no.6, pp.2246-2254; Bard, F. et al. (2000) Nat. Med., vol.6, no.8, pp.916-919; Games, D. et al. (2000) Ann. NY Acad. Sci., vol.920, pp.274-284; Masliah, E. et al. (1996) J. Neurosci., vol.16. no.18, pp.5795-5811]。しかし、この抗原を治験に使用すると、脳の炎症のため治験は中止に追い込まれた。ADDLの注射はウサギではオリゴマー選択的ポリクローナル抗体を産生させるので、小さなオリゴマー形ADDL表面にだけ見られるエピトープを標的とするようなモノクローナル抗体をマウスで産生させるのは可能であるよう見えた。低分子量のオリゴマーに対する抗体はおそらくプラークを標的にしないであろうから、一般的な炎症反応を引き起こすおそれはないと思われた。そこで、3頭のBalb/cマウスにADDLs(代表的な抗原の構造や毒性に関する品質管理については図40を参照)を3週間ごとに6か月間にわたり注射した。注射量の平均値は92μg-全Aβ/頭/回であった。
【０２５２】
図41に示す結果は6か月間の注射の後に免疫マウスが示す代表的な反応である。抗体はモノマー、トリマー、テトラマー、およびさらに高分子量の、12〜24マーに近い物質に結合するように見える。この結果は過去の未発表の実験結果、すなわち147μg-全Aβを(9回)注射したADモデルTgマウス(24頭中24頭)で免疫反応を引き起こしたという結果とも合致する。また最近の実験でも、ウサギ6頭中6頭およびニワトリ2羽中2羽が、注射されたADDLs(〜150μg-全Aβ/動物、6回の注射)に対するポリクローナル抗体を産生するという結果になった。発明者らの最初のポリクローナル抗体の特性は最近発表されている[Lambert, M.P. et al. (2001) J. Neurochem., vol. 79, no.3, pp.595-605]。
【０２５３】
マウス脾臓細胞をSP2骨髄腫細胞と融合させて得たハイブリドーマを20枚の96穴プレートにプレーティングし、次いで5pmol ADDLsへの結合能をドットプロット法で試験した。代表的な試験結果は図42の左側に示すとおりである。ハイブリドーマの増殖速度の差を考慮してスクリーニングを2回行う。2つの別個のマウス脾臓に由来するハイブリドーマ融合生成物に関するドットブロット法の結果では、各例でハイブリドーマ上清〜11%が5pmol ADDLsに強く結合する。
【０２５４】
陽性度の高いドットプロットから200余りのウェルを20pmol ADDLs/レーン使用の免疫ブロット法でスクリーニングする(図42右側)。どの免疫ブロットでもウサギ・ポリクローナル抗体の1つを陽性対照として使用する。これらのデータから、41のハイブリドーマを選び出して24穴プレートで増殖させる。
【０２５５】
免疫ブロット法から、いくつかの興味深いADDL結合プロフィールが見つかった(図43)。特に、1つのハイブリドーマ3B7は比較的低分子量の物質に対してだけ強い反応性を有するように見受けられる。他のハイブリドーマ(8C3)は12〜24マーだけを標的にするようである。5A9と11B5は低分子量と高分子量の両方の物質に結合する。ウェスタンブロット法ではまた、いくつかのハイブリドーマ液がレーン内のすべてに対し不鮮明に結合することも示される。これが非特異的結合のせいなのか、抗体の希釈によりその親和性が低下したためなのかは不明である。現在、ハイブリドーマのサブクローニングが進んでいる。
【０２５６】
ある種のモノクローナル抗体の重要な属性は免疫組織化学法での抗原識別能である。オリゴマー選択的ウサギ・ポリクローナル抗体が培養細胞表面のADDL結合部位を実際に認識することは以前の研究(Lambert, Viola)でわかっていたので、ハイブリドーマ上清もまた細胞表面のADDL結合部位を認識するかどうかを調べ、それをM94/3で視覚化したものと比較することが重要であった。そこでADDLsを21日間培養した海馬細胞とインキュベートし、3B7由来の上清を使用して結合を定位した。結果はADDLsが主に樹状突起上の小斑点内の培養海馬細胞に結合することを示す。その画像はウサギ・ポリクローナル抗体で得られたものとよく似ているが、斑点は3B7画像のほうがやや小さいようである。その結合は、基剤の画像で信号の少なさからわかるように、きわめて鮮明である。免疫組織化学法では、非反応性ハイブリドーマ(免疫ブロットの14D3)に由来する上清はやはり反応を示さなかった。
【０２５７】
実施例２６
ADDL誘発疾患の予防、治療および診断
本発明のこの態様は医薬、医学診断、分子生物学、細胞生物学および生化学の各分野に関する。特に本発明のこの態様は、変性疾患特に神経変性疾患たとえばアルツハイマー病、軽度認知障害、ダウン症候群関連痴呆および他の記憶障害型疾患の診断、予防および治療に関する。なお特に本発明のこの態様は、特にアミロイドベータ(Aβ)由来拡散性リガンド(ADDLs)に関連するワクチン、抗体、阻害剤および診断試薬ならびに方法、それにADDLsに起因するアルツハイマー病、軽度認知障害、ダウン症候群関連痴呆および炎症などを含む病態の治療、予防および/または発見に関する。
【０２５８】
老人の最も一般的な形の痴呆および認知障害はアルツハイマー病であり、その最終診断は検死で特有の老人斑と神経原線維変化を計測して初めて確認しうる。この10年間、多数の研究者が「アミロイドカスケード仮説」でADを説明しようとしてきた。この仮説ではアミロイドプラークとその成分であるアミロイド線維が神経変性を引き起こし、それがADを招くということになるが[Hardy, J.A. & Higgins, G.A. (1992) Science, vol.256, pp.184-185]、AD症状および病理の数多くの矛盾した特徴たとえばプラークと変性神経細胞の間の空間的相関の低さなどが説明できない。Aβ1-42を過剰発現するトランスジェニック動物モデルはAβ1-42関与の確認にはなるが、これらのトランスジェニックマウスにはプラークまたはアミロイド線維の沈着を伴わない深刻な記憶障害を示すものもいた。
【０２５９】
アミロイドβ由来拡散性リガンド(ADDLs)という新規の可溶性オリゴマーAβ1-42神経毒の発見[Krafft, G.A. et al. (1997) 米国特許出願第08/796,089号明細書; Krafft, G.A. et al. (2001) 米国特許第6,218,506号明細書; Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453]はAβ1-42レベルの上昇と結び付いた認知障害を、アミロイド線維またはプラークの必要または関与なしに説明してくれた。ここ1年のうちに、ADの病原分子は線維ではなくADDLsである可能性が大であると、「アミロイドカスケード仮説」を初めて唱えた本人が報告するに至った。
【０２６０】
米国特許出願第第08/796,089号明細書は、ADDLsが必須の学習記憶過程を妨げうる強力な神経毒であることを示唆するデータを収めており、またADDLの形成または活性を妨げるステップを含むADおよび認知障害の治療および予防方法を特許請求の範囲に含めている。本願では、ADおよび関連のADDL誘発疾患の治療、予防および診断方法を支持するデータを提示する。これらの方法は、ADDLsに対する特異的結合能をもつがAβモノマーに対する検出可能な結合能およびAβの線維状または原線維状凝集体に対する検出可能な結合能はもたない最近発見の分子を利用する。モノクローナル抗体分子を含むこれらの分子はその高い特異性のために、ADDL阻害能を有する大いに有効な治療/予防薬となりうるし、また(死後)脳組織および(生前)血清または脳脊髄液での特異的ADDL検出能を有する大いに有効な診断試薬となりうる。
【０２６１】
ADDLsは血清中での検出が可能であるため、認知機能と相関関係にあるバイオマーカーであると言える。こうして、特異的ADDL結合性分子は時間の関数としての血清ADDLsの定量的検出に使用することができるので、任意の治療用分子または栄養補助食品の血清ADDL濃度引下げ効果をモニターするための、またADDL濃度低下に関連する認知機能の相関的な改善を記録するための方法が得られる。この方法はAD治療薬候補を解析するためのADモデル動物に適用することができるし、ADおよび認知障害の治療薬候補の治験に適用することもできる。この方法は血中ADDL検定のための検査機関用診断製品に組み込むことができるが、そうした検定はADDLs濃度を引き下げる治療薬またはADDLsを含むAβの産生を引き下げる治療薬を医師が処方する際の参考となる。この方法はまた、血中ADDL検定のための消費者にとって使い勝手のよい診断製品に組み込むことができるが、そうした検定はADDL形成を阻害しうることが判明している天然物質を含む栄養補助食品を消費者が消費する際の参考となる。
【０２６２】
特異的なADDL結合性分子を使用する診断方法による測定で血清ADDL濃度を引き下げる効果があると判明している栄養補助食品や他の成分もまた開示され、特許請求の範囲に含まれる。
【０２６３】
これらの特異的なADDL結合性分子は、脳神経細胞の表面に結合したADDLsのin vivo検出のための造影剤としても有用である。そうした造影剤の例はポジトロンCT(PET)用、MRI用、または他の任意の画像診断法用の試薬などである。そうした画像診断法はADDLs特有の局在化やそうした局在化の(放射性または磁性造影剤などのようなレポーター分子を特異的ADDL結合性分子に付着させることによって可能となる)検出を土台とする。
【０２６４】
これらの特異的なADDL結合性分子は、ADDLsの神経毒性を仲介する神経細胞表面の特異的受容体タンパク質を発見するうえでも有用である。本願では、そうしたADDL特異的なニューロン受容体タンパク質もまた開示されるし、またこれらの受容体タンパク質に対するADDL結合を妨げる治療および予防薬を発見するための方法もまた開示される。
【０２６５】
これらの特異的なADDL結合性分子は、ADDL形成またはADDL活性を妨げる低分子量薬物を発見するうえでも有用である。ADDL形成を妨げる分子はADDLsの神経毒性の防止に有効であり、またそうしたADDL形成阻害分子の存在は特異的なADDL結合性分子を使用してADDLsがAβモノマーから形成されてはいないことを検証することにより確認することができる。
【０２６６】
実施例２７
アルツハイマー病(AD)脳: オリゴマーAβリガンドの存在は可逆性神経障害の分子的機序を与える
ADの記憶障害は進行性であり、回復不能であると考えられてきた。しかし、アミロイドβペプチド(Aβ)に対する抗体ワクチンを接種したADトランスジェニックマウスモデルで記憶機能の著しい回復が最近報告された。アミロイドプラークには影響がなかったので、このモデルは記憶障害を可溶性Aβ集合体に強く結び付ける。種々のモデルで、可溶性オリゴマーAβ集合体はシナプス情報記憶(長期増強)の急速な、非変性性阻害を含む神経への影響を伴う強力なCNS神経毒として認識されている。本書でも開示するように、そうしたオリゴマーAβはヒトの脳に存在しており、アルツハイマー病では70倍も増加する。Aβオリゴマー(ADDLsともいう)は、海馬と大脳で発現するが小脳では発現しない細胞表面タンパク質に対するリガンドとして作用するが、それは脳の認知機能領域がアルツハイマー病の影響を特に受けやすいという機序を示唆する。結果から得られる強力な証拠によれば、ADDLsはADの重要な病原因子であり、記憶機能障害を回復させる可能性のある新しい治療用薬物および抗体の有力な標的を構成する。
【０２６７】
ADは致命的な進行性痴呆であり、その最初期の症状は記憶障害である。ADは治療法がないうえに、その分子的機序も未解明である。しかし、ADは42アミノ酸残基のペプチドであるアミロイドβ(Aβ)の神経毒性集合体に関連するタンパク質障害(proteinopathy)であることを示唆する証拠も多い(1,2)。
【０２６８】
Aβは膜貫通前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解に由来する両親媒性分子である(3)。自己会合性が強く(4)、最大のAβ集合体はADプラーク中に見られる不溶性アミロイド線維を構成する(5,6)。類似のアミロイド線維はin vitroで合成ペプチドから集合する。際立った線維を含む合成調製物は神経毒性である(7,8)が、純粋のモノマー溶液は非毒性であり、これは自己集合が毒性の条件となることを示唆する。AD病原因子としてのAβ由来神経毒素の役割は、ばらばらのAD関連変異および危険因子に共通する高レベルのAβ1-42によって強く示唆される(9)。長年、毒性および病原に不可欠の構造体は不溶性アミロイド線維であると考えられていた(8)が、このアミロイド仮説に対する一見頼もしい支持にもかかわらず、ADに対するその妥当性については合意に至ってはいない。最大の障害は痴呆とアミロイドプラーク面積の間の相関の低さであり(10)、それはADモデルのhAPPトランスジェニックマウスで何度も再現された(11,12)。
【０２６９】
そのうえ、線維および関連細胞死は記憶障害の必要条件なのか疑問を投げかけるデータが最近出てきた(13)。hAPPトランスジェニックマウスでは、記憶障害はAβワクチンの接種によって予防しうるが、これはアミロイド沈着の除去を必要としない驚くべき効果である(14)。さらに目を見張るのは、抗Aβモノクローナル抗体ワクチンの接種がhAPPマウスの失われた記憶機能の回復を可能にすることである。回復は注射後1日以内に、しかも不溶性アミロイド線維への影響を何ら伴うことなく、起こる(15)。このモデルにおける記憶機能の回復は、ADはとにかく変性的で回復不能であるという通説(16)に反するが、Aβ由来毒素の構造と病原因子に関する代替仮説では回復がとうに予言されていた(12,17)。この代替仮説では、回復可能な、線維とは無関係の記憶障害の機序は可溶性Aβ集合体の神経学的性質にある。線維状アミロイドとは明確に異なり、これらの小さな球状オリゴマー[ADDLs(17)という]およびやや大きな棒状の原線維(18,19)は強力なCNS神経毒である(20,21)。該オリゴマーは証明済みのシナプス情報記憶の枠組みである長期増強を急速かつ選択的に阻害するので(17,22,23)、特に記憶機能障害に関連する。
【０２７０】
可溶性Aβ集合体はそのモデル系での影響からして、存在する場合には、ADの重要な因子であることが明らかである。本書で開示するように、可溶性Aβ集合体は実際に脳内に存在し、ADでは70倍も増加する。このAD関連分子は合成オリゴマーの構造に酷似しており、認知機能の中心領域で発現する細胞表面タンパク質に対する高アフィニティーリガンドとして機能する。AD脳へのオリゴマーAβリガンドの蓄積は病原因子に関する強力な証拠であって、痴呆とアミロイドプラーク面積の間の矛盾を説明すると推定され、またその中和は記憶障害を回復させる手段をもたらすと見られる。
【０２７１】
材料：
アミロイドベータ(Aβ1-42)ペプチドはAmersham Peptide (Sunnyvale, CA)、California Peptide Research (Napa, CA)またはRecombinant Peptide, Inc. (Athens, GA)から得た。Hams F12培地(無フェノールレッド)はBioSource International (Camarillo, CA)から得た。Hibernate(商標)はLife Technologies(Gaithersburg, MD)から得た。Neurobasal(商標)、ウマ血清およびB27培地添加物(商標)はInvitrogen(Carlsbad, CA)から得た。他の細胞培養試薬はすべてMediatech(Hemdon, VA)から得た。特に断らない限り、化学薬品と試薬はSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から得た。Cell Proliferation (MTT)キットはRoche Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN)から得た。Coomassie PlusおよびBCAタンパク質検定法キット、SuperSignal West Femto蛍光発光法キットはPierce (Rockford, IL)から得た。SDS-PAGE Tris-Glycineゲル、2-Dストリップ、および緩衝液はBioRad (Hercule, CA)から得た。HyBond(商標)ECL(商標)ニトロセルロースおよびHRP-二次抗体はAmersham Biosciences (Piscataway, NJ)から得た。オリゴマー選択的抗体(M93, M94)は以前に産生させ、解析したものである(24)。Alexa Fluor(登録商標)488-二次抗体はMolecular Probes (Eugene, OR)から得た。タイミングの合った妊娠Sprague DawleyラットはCharles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA)から得た。AD脳および年齢を合せた対照脳に由来する前頭皮質と小脳のサンプルはNorthwestern Alzheimer’s Disease Center Neuropathology Coreから入手し、用時まで-80℃で保存した。
【０２７２】
合成ADDLs：
ADDLsは公開プロトコール(24,25)に従って、また本書に記載の要領で、調製した。
【０２７３】
細胞培養：
海馬細胞の調製と維持はBrewer(26)に従いポリリシン(0.002%)をコートしたカバーガラスを使用して行った。プレーティングは B27培地添加物とL-グルタミン(2.5μM)とを添加したNeurobasal(商標)培地を使い1.8×104細胞/cm2の密度で行った。皮質および小脳細胞は公知(27)の要領で、小脳細胞培養のほうのKCl濃度を高くして(25mM)行った。細胞を5μM Ara-Cに24時間接触させ、次いで2.5μM Ara-Cに24時間接触させた。代謝活性検定では、ポリ-L-リシンでコートした24穴プレートに細胞を0.4×106細胞/ウェルの密度でプレーティングした。ADDLsを添加するときは、50nMまたは100nM合成ADDLs(小脳細胞培養の場合はプラス25mM KCl)を加えたF12培地に培地交換し、48時間後に、Cell Proliferationキットをメーカーの説明書に従って使用して、代謝活性(MTT還元)を計測した。
【０２７４】
免疫組織化学法：
培養物を培地で1回洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで固定した。カバーガラスを洗浄し、10%正常ヤギ血清/リン酸緩衝食塩水(NGS/PBS)に溶解した0.1%トリトンX-100により室温で1.5時間浸透化処理し、ポリクローナル抗M94-3抗体(1:500)により4℃で一晩標識し、次いでAlexaFluor(登録商標)抗ウサギ抗体(2μg/mL)と共に室温で〜3時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ProLong (登録商標)試薬を使用して標本にし、MetaMorph画像化ソフトウェア(Universal Imaging Corp, West Chester, PA)により視覚化した。
【０２７５】
膜画分調製物：
ヒトおよび成獣ラット脳組織の取扱はすべて4℃で行った。小脳、皮質および海馬を20容量の緩衝液A(PBS, pH 7.4、0.32Mショ糖、50mM HEPES、25mM MgCl2、0.5mMジチオスレイトール、200μg/mLペプスタチンA、4μg/mLロイペプチン、30μg/mLベンズアミジン塩酸塩)中でホモジナイズし、1,000×gで10分間遠心した。ペレットを10容量の緩衝液A中で再ホモジナイズし、再遠心した。上清を合せ、100,000×gで1時間遠心し、ペレットを全膜画分に使用した。
【０２７６】
可溶性の組織抽出物：
AD脳または対照脳に由来する前頭皮質(0.2g)を、20容量のF12+プロテアーゼ阻害剤中で(前記同様に)ホモジナイズし、100,000×gで1時間遠心した。ペレットを10容量のF12+プロテアーゼ阻害剤中で再ホモジナイズし、再遠心した。次いでCentricon(商標)-10遠心フィルターを使用して4mgのタンパク質を容量60mL以下に濃縮した。
【０２７７】
2次元ゲル電気泳動法：
可溶性の皮質組織抽出物のタンパク質を、公知の要領でBio-Lytes pH 3-10両性担体を使用して調製した(28)。1nmol-合成ADDLs/10μL-F12を皮質とまったく同様に処理し、公知の要領で銀染色した(24)。
【０２７８】
免疫検定法：
リガンドブロット法は公知手順に依拠した(29)。膜画分調製物を界面活性剤により(30)、15分間氷上で抽出し、可溶化タンパク質をSDS-PAGEにより3〜4時間、120Ｖで分離し、ニトロセルロースに転写した。ブロットを3%脱脂粉乳添加TBSTと一晩インキュベートし、冷F12培地で3回洗い、10nM ADDLsと3時間、4〜8℃でインキュベートした。未結合物をTBSTで洗い去り、結合ADDLsをM93/3(1:1000)で標識し、高感度化学発光法で視覚化した。免疫ブロット法とドットブロット法は公知の要領で行った(24,29)。
【０２７９】
集合形可溶性Aβの検定：
オリゴマーは、ヒト脳中に存在するとしても、存在量が豊富ではないかもしれないので、ウェスタンブロット法でAβをフェムトモルレベルで検出すること知られている(31)抗体を(Dr. Potempskaのご好意により)まず入手した。しかし、この抗体はモノマー選択的であることが判明した。必要な感度と選択性を得るために、Aβ1-42の完全長モノマーおよびオリゴマーをウサギにワクチン接種して抗体を産生させた(24)。図25Aは同じ溶液で試験した2つの抗体の特異性を示す。最初に現れる支配的なオリゴマーはテトラマーである。ただしインキュベーションを継続すると、24マー以下の安定した、非線維状集合体が得られる(25)。この新抗体によるドットブロット免疫検定法もまたオリゴマー選択性を示した(図25B)。Aβモノマー溶液[すなわちヘキサフルオロ-イソプロパノール(HFIP)で処理したばかり溶液]は信号を発するには1pmol濃度を必要としたが(図25Bの上段)、オリゴマーを含む溶液(すなわちHFIPでモノマー化していない溶液)は1fmolで免疫反応性を示した(全Aβ; 図25Bの下段)。この検定法は少なくとも100倍の範囲にわたり線形であったし、また高い再現性が得られた(たとえば図29Bを参照)ので、脳抽出物の比較分析に適した検定法となる。
【０２８０】
ヒト脳内の可溶性Aβ集合体: アルツハイマー病では大幅に増大
ドットブロット検定法を用いて、可溶性ヒト脳抽出物中の集合形Aβについて、5人のAD患者と同年齢の対照の前頭皮質を比較しながら試験するようにした。脳組織を無界面活性剤の(無血清)神経細胞培地中でホモジナイズし、in vivo条件を保持するように努めた。100,000×g、60分間の遠心による上清をドットブロット免疫検定用フィルターにかけた。免疫反応性はAD脳抽出物では強かったが、対照ではバックグラウンドに近かった(図26)。基本的に同じ結果が3回の検定で得られた。AD脳に関する母集団平均値は対照脳の12倍であった(表示データに関してはp<0.001)。対照群では、1サンプルの値は低値サンプルの10倍であった。最低値の3サンプルと比べて最高値の3サンプルは可溶性Aβ集合体が70倍も多かった。
【０２８１】
ドットブロット分析で検出された可溶性Aβ集合体の特性を解析するために、また線維の不存在を検証するために、脳抽出物を2次元電気泳動法および免疫ブロット法により(前と同様に四次構造感受性抗体を使用して)分析した。線維状物質は明白ではなかった。その代り、約56kDaおよびpI 5.6に顕著なオリゴマーが見られた(図27A)。一方、AD脳由来の高速ペレット(アミロイド画分)は等電点電気泳動次元の全範囲にわたり大量の免疫反応性物質を含んでいたが、そのうちサイズ分離次元(データ非表示)に入ったものはなかった。対照組織は免疫反応性物質をまったく示さなかった(図27C)。合成Aβから調製したオリゴマー(図27B)はAD脳由来の可溶性オリゴマーと特性が同じであった(推定12マー; 3被験者でMW=53±4kDa)。他の実験では、合成調製物中に24マー以下の範囲内のオリゴマーが形成されうることが判明したし、また脳組織を界面活性剤で抽出すると、含まれているこの範囲内のオリゴマー(12マーに加えて4マーと24マー; データ非表示)が放出された。サイズや等電点の対応付けおよび集合体依存的な抗体による相互認識は、合成Aβから調製したオリゴマーまたはAD脳組織由来のオリゴマーは構造的に等価であることを示唆していた。
【０２８２】
Aβオリゴマーは細胞膜ラフト中のタンパク質に対応するリガンドである
AD脳由来Aβオリゴマーはリガンド活性のための条件に合致するようなサイズと可溶性を有する(12,17)。そこで、試験済みのAβオリゴマーを、タンパク質-タンパク質相互作用の特異性を評価することができるリガンド・オーバーレイ検定法で調べてみた(29,32)。ラット脳細胞膜タンパク質をSDS-PAGEで調製し、転写し、抽出物とインキュベートした。対照脳ではないが、AD脳ではAβオリゴマーの存在がドットブロット法により検証された(図29B)。結合は前と同様に抗体で検出した。疾患性結合は明白であり、そこではADオリゴマーは3つの細胞膜関連結合性タンパク質(p100、p140およびp260; 図29A)に対応するリガンドとして機能していた。これらの結合性タンパク質は他の細胞膜タンパク質よりも存在量がずっと少なかった(Coomassieブルー染色法、データ非表示)。これは高選択性のリガンド相互作用を反映する。合成オリゴマーは同じタンパク質に対する選択結合性を示した(上段右)。粗製AD抽出物中リガンドのp100に対する結合の強さが高純度の合成調製物中には存在しないような追加タンパク質(または複合体)のせいかどうかはまだ不明である。p140とp260は信号伝達に特化した細胞膜ドメインである(33)ラフトを含む画分中に多く含まれていた(上段左)。ラフトの局在はp140およびp260のTriton X-100可溶化に対する抵抗とも符合した(データ非表示)。
【０２８３】
結合性タンパク質の性質はAβリガンドに対する脆弱性と類似
ヒトおよび合成Aβオリゴマーは構造や結合が類似するため、次に、やはりヒト・サンプルを保存している合成リガンドだけを使用して実験を行った。ラット脳中での結合性タンパク質の選択的発現を試験するために、ADで一般に損傷を受ける2つの領域(海馬と大脳)を、損傷を受けない領域(小脳)と比較した。小脳はそうでないが、海馬と大脳はp140とp260を含んでいた(図28、上段左)。p100は選択的発現を示さなかった。これらの検定では、免疫反応性は細胞膜タンパク質の追加量に比例したし(データ非表示)、また非特異抗体結合に関する対照(図28、上段中)はその免疫反応性がリガンドに依存することを明示した。
【０２８４】
ヒト脳はラット脳(図28、上段右)の場合と同じ結合性タンパク質を発現したが、それはマウス脳やブタ脳と変わらない。発現量はやはり小脳よりも皮質のほうが多かった。5つの正常老人(対照)サンプルと5つのADサンプルとを比較したときのp260およびp140結合部位の相対存在量(図28、下段左)はADサンプルのほうが低レベルになる傾向を示す(ステューデントのt検定: p260ではp<0.05、p140ではp<0.01)が、母集団間のオーバーラップは明白であった。しかし、この結果はADに際して変性を起こしやすい細胞表面の、オリゴマー結合性タンパク質の存在量とも整合した。この可能性は毒性検定によって裏付けられた。皮質培養物(および海馬、データ非表示)はオリゴマーに対する感受性を示したが、小脳培養物はそれを示さなかった(図28、下段右)。代謝と小胞輸送の両方をモニターするこの検定では、オリゴマーの有効性は50nMのときが最大であった(34,35)。皮質p140に対するリガンドの結合は、ほぼ同じ用量のときに起きた(図、下段右)。
【０２８５】
培養ニューロンとの結合のホットスポット
オーバーレイ検定の結果とも符合するが、以前のフローサイトメトリーデータは合成オリゴマーが細胞表面タンパク質に特異的に結合することを示唆した(17)。この結論は免疫蛍光顕微鏡法により確認され、拡大適用された(図32参照)。培養海馬ニューロンをオリゴマーと共に5分間インキュベートし、洗浄し、免疫標識した。オリゴマーはヒト脳抽出物に由来しようが合成Aβから調製しようが、同じ高選択性の結合パターンを示した(図32、パネルAおよびC)。結合は小斑点(径〜0.2-0.5μm)状をなし、接着斑、シナプス棘またはクラスターラフトなどのような信号伝達構造とサイズがオーバーラップしていた。対照抽出物はリガンド・オーバーレイ検定の結果と同じように、斑点をまったく示さなかった(図32、パネルB)。対照はADDLsを欠くまたは一次抗体を欠く場合も免疫反応性を示さなかった。合成オリゴマーでは、20nM(全Aβ)の低濃度でも斑点が明白であった。斑点は細胞体にも若干見られたが、樹状突起で見られものが圧倒的であった。免疫反応性は細胞浸透化処理をしなくても検出できたが、これは斑点が細胞膜にあることを示唆する。斑点は皮質ニューロン上でも観察されたが、小脳ニューロン上では観察されなかった(非表示)。これもまたオーバーレイ検定および毒性検定の結果と呼応する。
【０２８６】
ここで提示する結果は、ADの記憶障害が小さな可溶性Aβオリゴマーに起因することの証拠になる。これらのCNS神経毒素はシナプス情報記憶機構を選択的に阻害することが、以前に動物および細胞実験で示されている(17,22,23)。存在量の豊富なモノマー環境中の低レベルオリゴマーを識別することができる選択的免疫検定法により、AD脳中のモノマーAβリガンドの存在がすでに確認され、またADはこれらの毒素の大幅な増加に関連することがすでに立証されている。これらの結果はAD病因論にとってのAβの重要性を裏付け、疾患とプラークとの相関の低さという長年の問題を説明し、またこれらの可溶性毒素を特に標的とするようなAD治療薬への新しいアプローチに弾みをつけてくれる。
【０２８７】
十分に確立したモデル系での検定により、可溶性Aβ由来神経毒素の記憶障害との関係が以前から、指摘されてきた。Aβ調製物の使用によるhAPPマウスの能動免疫は記憶障害の改善がプラーク除去を伴わなくても起こりうることを示した(14)が、これは毒性のある可溶性Aβ集合体が関与している可能性を示唆する。この考え方を著しく押し広げる形で、Aβモノクローナル抗体の使用によるhAPPマウスの受動免疫は記憶機能障害を回復させることが最近示された(15)。回復は急速で、免疫後1日以内に、しかも不溶性アミロイド沈着レベルに対する影響を伴うことなく、起こる。この抗体を介した記憶回復はAβオリゴマーの役割に関する証拠であり、その記憶への影響は可逆的であると前から予言されてきた(2,12,17)。可溶性Aβ集合体は記憶障害hAPPマウスで暫定発見物中に検出されており(36)、オリゴマーまたは原線維を含む可能性があり、それらはどちらも可溶性、神経刺激性である(2,12,17)。しかし今のところ、オリゴマーだけがシナプス可塑性(LTP)(記憶過程の細胞レベルの枠組み)を阻害すると報告されている。オリゴマーは動物(2,23)または海馬組織スライス(17,22)に導入されると、数分以内にLTPを選択的に阻害するし、オリゴマーへのニューロンの接触を空間的、時間的に強めると選択的な神経細胞死を招く。目下の研究の重要な成果は、以前に実験モデルで神経破壊的であることが示されたオリゴマーと同じものがヒトAD脳にも見られるという証明である。これらのオリゴマーもヒト脳内で同様の影響を神経に及ぼすとすればプラーク存在量の多さとADの間の相関の弱さは説明がつく。
【０２８８】
AD脳におけるオリゴマーの大幅な(最大70倍の)増加は〜2-3倍の上昇に留まるモノマー濃度に対し非線形の依存関係にある(37)。この非線形性はオリゴマー化反応を反映するのかもしれない。ただし、オーバーレイ検定でも見られたように、高親和性の結合性タンパク質との複合体中にオリゴマーが蓄積するという可能性もある。興味深いことに、本発明者の以前の研究結果は、プラークが認められない個体でもオリゴマー濃度の上昇を示す場合があることを示唆している。この所見は、in vitroでは大きなアミロイド線維を欠いても安定したオリゴマーが形成しうること(17,25)と呼応するし、またオリゴマーが疾患の最初期段階で、おそらくアルツハイマー病発症前の記憶障害でも、作用し始めることを示唆する。
【０２８９】
オリゴマーがシナプス可塑性を阻害する機序は不明である。以前に提唱された一仮説では(2)、LTP阻害はFynの変位に由来する。このシナプス特異的に局在するSrcファミリータンパク質チロシンキナーゼはLTPに(38)、またAβ由来神経毒素の活性に(17)、それぞれ関与するとされているし、アルツハイマーの病因と関連付けられてもいる(39)。Fynの変位はLTPに結び付いた特定の標的たとえばERK-CREB経路のリン酸化を不可能にする可能性がある(40)。この可能性を裏付けるように、CREBの活性化は非変性用量のAβにより、オリゴマーを形成するような条件下で、開始される(41)。関連の仮説は、オリゴマーが可塑性関連の小胞輸送および重要タンパク質のシナプス膜への挿入を妨げるというものである。グルタミン酸受容体の挿入はLTPにも(LTD)の逆転にも関連するが、これらはどちらもオリゴマーによって阻害される(22)。すなわち、LTPの誘導によるシナプス膜への受容体の挿入はSrc-ファミリーに依存する(42)。Aβ毒素の小胞輸送阻害能は細胞株や線維状調製物による実験ですでに示されている(34)。
【０２９０】
オリゴマー結合性タンパク質の毒性機序に対する関係はまだ立証されてはいないが、これらの結合性タンパク質はFynと共に細胞膜ラフト中で高濃度となっている。ラフトは信号伝達および輸送に特化したドメインであり(33,43,44)、ニコチン性アセチルコリン受容体などのようなシナプス構成要素の組織化に一役買う(45)。ニコチン性受容体ファミリーのメンバーは、そのなかにはFynに関連しているものもあるが(46)、オリゴマー結合性タンパク質であるかもしれないという可能性が目下研究されている。異なる発現を示すタンパク質にオリゴマーが結合するという事実は、アルツハイマー病に対するニューロンの脆弱性が受容体に媒介されるという仮説とも符合する。この仮説にも沿うが、ADに対して脆弱な脳領域(海馬、大脳)はオリゴマーに対する反応を示し、オリゴマー結合性タンパク質を発現するが、ADに対し非感受性の領域(小脳)はオリゴマーに対して反応しないし(12)、オリゴマー結合性タンパク質を発現することもない。
【０２９１】
高選択性のリガンド活性はオリゴマーの可溶性および構造と矛盾しない。可溶性オリゴマーは、特異的なタンパク質-タンパク質相互作用を起こしうるアミノ酸配列を有する親水性表面を示すと推定される。該リガンドはホモオリゴマーであるため、これらの相互作用は、インスリンまたはBDNFなどの栄養因子(47,48)に対する、またはラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質(49)に対する複数の結合性タンパク質、類似体等に影響を与える可能性がある。オリゴマーに関する斑点状の結合パターンは、細胞表面をコートするように見える原線維に関する報告パターンとは著しく異なる(20)。従って、PFsがCSF中に存在するという形跡はあるものの(50)、抽出ヒト・リガンドおよび合成オリゴマーに関する結合パターンを見る限り、PFsからの寄与はほとんどなさそうであり、それは2次元電気泳動分析の結果とも合致する。
【０２９２】
Aβからの非線維状毒性オリゴマーの形成がアミロイド性タンパク質の一般的な性質の原型をなすことは明確になった(51)。今日ではAβ以外の種々のアミロイド性タンパク質が最初期段階の自己会合で球状の、非線維状集合体を形成すると判明しており、またAβで最初に判明したように、これらの非線維状集合体は細胞毒性を有する可能性がある。なかにはパーキンソン病関連αシヌクレインなどのように、疾患関連の集合体もある(52)。他の(たとえばプリオンなどの)場合には、オリゴマーが病因かどうかまだ定かではない。しか興味深いことに、プリオン集合体の場合のオリゴマー化はプリオン線維形成との関係ではオフ経路にある(53)。Aβのオリゴマー化もまた同様にオフ経路なのかどうかは不明である。Aβオリゴマーは線維には存在しないユニークなエピトープを示すため、人間に使用するための安全な治療用抗体の開発に使用することができる。可溶性毒素だけを標的とするような抗体はトランスジェニックマウスでの研究で示されたように記憶機能の回復につながるはずであり、しかもプラークの除去を目的として設計された最近のADワクチンの治験(54)で見られたような重篤な炎症を伴うこともないはずである。トランスジェニックマウスでの研究で示されたように、もしも記憶機能の回復が血管脳関門外での毒性オリゴマーリガンドの抗体中和に由来するとすれば、見通しはさらに明るい。
【０２９３】
参考文献
【化６】
2006508072.tif 000007
【化７】
2006508072.tif 000008
【化８】
2006508072.tif 000009
【化９】
2006508072.tif 000010
【０２９４】
実施例２８
ADDL結合性分子およびその使用
老人の最も一般的な形の痴呆および認知障害はアルツハイマー病であり、その最終診断は検死で特有の老人斑と神経原線維変化を計測して初めて確認しうる。この10年間、ADを説明しようと、しばしば「アミロイドカスケード仮説」が持ち出されてきた。この仮説ではアミロイドプラークとその成分であるアミロイド線維が神経変性を引き起こし、それがADを招くということになるが[Hardy, J.A. & Higgins, G.A. (1992) Science, vol.256, pp.184-185]、AD症状および病理の数多くの矛盾した特徴たとえばプラークと変性神経細胞の間の空間的相関の低さなどが説明できない。Aβ1-42を過剰発現するトランスジェニック動物モデルはAβ1-42関与の確認にはなるが、これらのトランスジェニックマウスにはプラークまたはアミロイド線維の沈着を伴わない深刻な記憶障害を示すものもいた。Aβ1-42は、広く発現する膜前駆体タンパク質の分解に由来するアミノ酸42個の両親媒性ペプチドである[Selkoe, D.J. (1994) Annu. Rev. Neurosci., vol.17, pp.489-517]。該アミロイドペプチドはモノマーとしては毒性があると立証されたことはなく、神経栄養効果があるとする研究者もいる。
【０２９５】
Aβ1-42のモノマーは集成して少なくとも3種の神経毒となる: すなわち線維状アミロイド[Pike, C.J. et al. (1993) J. Neurosci. vol.13, pp.1676-1687; Lorenzo, A. & Yanker, B.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.91, pp.12243-12247]、原線維[Hartley, D.M. et al. (1999) J. Neurosci., vol.19, pp.8876-8884; Walsh, D.M. et al. (1999) J. Biol. Chem., vol.274, pp.25945-25952]およびAβ1-42由来拡散性リガンド(ADDLs)[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453]である。線維状アミロイドは不溶性であり、また線維状アミロイドの沈着物はその複屈折のためにADおよびトランスジェニックマウスではチオフラビンSなどのような色素による検出が容易である。線維状アミロイドはアルツハイマー病脳の老人斑の主要タンパク質成分である。様々な長さのAβペプチドがAβ1-40、1-42、1-43、25-35および1-28などを含めてin vitroで集成して線維となる。これらの線維はどれもin vitroではニューロンに対して有害であり広範囲の細胞プロセスを活性化すると報告されてきた。何百件もの研究報告でAβ線維の神経毒性が明らかにされているが、再現性の低さや毒性のバラツキの大きさを示す報告も多い。このバラツキは出発固体ペプチドのバッチ間差にも由来するが、そうした差は特に該ペプチドの、化学構造または組成よりもむしろ、様々な物理状態または凝集状態に関連する。原線維は、フルサイズのアミロイド線維に至る途上の中間物として初めて同定された大きな、ただし可溶性の、準安定構造体である[Walsh, D.M. et al. (1997) J. Biol. Chem., vol.272, pp.22364-22372]。
【０２９６】
ADDLsは低分子量の可溶性Aβ1-42オリゴマーを含む。該オリゴマーはトリマーとテトラマーが主体であるが、さらに高次構造の化学種をも含む[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453; Chromy, B.A. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1284]。3つの形のAβ1-42集合体はどれもMTT色素の還元を急速に損なう[Shearman, M.S, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.91, pp.1470-1474; Walsh, D.M. et al. (1999) J. Biol. Chem., vol.274, pp.25945-25952; Oda, T. et al. (1995) Exp. Neurol., vol.136, pp.22-31]が、それはおそらく小胞輸送障害の結果であり[Liu, Y. & Schubert, D. (1997) J. Neurochem., vol. 69, pp.2285-2293]、それらは最終的にニューロンを傷害する[Longo, V.D. et al. (2000) J. Neurochem., vol.75, pp.1977-1985; Loo, D.T. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, pp.7951-7955; Hartley, D.M. et al. (1999) J. Neurosci., vol.19, pp.8876-8884]。また、3つの形はどれも超高速の電気生理学的作用を示す。アミロイドと原線維は広くニューロンの膜特性を混乱させて、膜脱分極、活動電位、およびEPSPの上昇を誘導する[Hartley, D.M. et al. (1999) J. Neurosci., vol.19, pp.8876-8884]が、ADDLsは長期増強(LTP)を選択的に阻害する[Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453; Wang, H. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1787; Wang et al. (2002) Brain Research 924, 133-140]。ADDLsはまた、神経毒性に選択性を示し、脳スライス培養中で海馬ニューロンを傷害するが、小脳ニューロンを傷害しない[Kim, H.-J. (2000) Doctoral Thesis, Northwestern University, pp.1-169]。線維状アミロイドと疾患進行の間の相関は低いので[Terry, R.D. (1999) in Alzheimer’s Disease (Terry, R.D. et al., Eds.) pp.187-206, Lippincott Williams & Wilkins]、線維状アミロイド沈着物はADとの関連が最も強い有害形のAβ1-42ではなさそうである。AD脳では非線維状のAβ集合体も生じており[Kuo, Y.M. et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp.4077-4081; Roher, A.E. et al. (1996) J. Biol. Chem., vol.271, pp.20631-20635; Enya, M. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.154, pp.271-279; Funato, H. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.155, pp.23-28; Pitschke, M. et al. (1998) Nature Med., vol. 4, pp.832-834]、これらの化学種はADの重篤度に対する相関がアミロイドよりも高そうに見える[McLean, C.A． et al. (1999) Ann. Neurol., vol.46, pp.860-866; Lue, L.F. et al. (1999) Am. J. Pathol., vol.155, 853-862]。アミロイドプラークを生成しない多数のトランスジェニックマウス系統に見られる神経障害の原因となっているのは可溶性Aβオリゴマーであるらしい[Mucke, L. et al. (2000) J. Neurosci., vol.20, pp.4050-4058; Hsia, A.Y. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.96, pp.3228-3233; Klein, W.L. (2000) in Molecular Mechanisms of Neurodegenerative Diseases (Chesselet, M.-F., Ed.), Humana Press; Klein, W.L. (2001) Trends Neurosci., vol.24, pp.219-224]。
【０２９７】
アミロイドβ由来拡散性リガンド(ADDLs)という新規の可溶性オリゴマーAβ1-42神経毒の発見[Krafft, G.A. et al. (1997) 米国特許出願第08/796,089号明細書; Krafft, G.A. et al. (2001) 米国特許第6,218,506号明細書; Lambert, M.P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.95, pp.6448-6453]はAβ1-42レベルの上昇と結び付いた認知障害を、アミロイド線維またはプラークの必要または関与なしに説明してくれる。驚くべきことに、「アミロイドカスケード仮説」を初めて唱えた本人であるProf. D. SelkoeがADDLsを ADの有力な病原分子として、また効果的な治療的介入の標的として挙げながら、ADDLsの神経毒性とLTP阻害能について、いくつかの刊行物の中で報告するに至った[Walsh, D.M., Selkoe, D. et al. (2000) Biochem Soc. 30; Walsh, D.M., Selkoe, D. et al. (2002) Nature 416, 434]。
【０２９８】
米国特許出願第第08/796,089号明細書は、ADDLsが必須の学習記憶過程を妨げうる強力な神経毒であることを示唆するデータを収めており、またADDLの形成または活性を妨げるステップを含むADおよび認知障害の治療および予防方法を特許請求の範囲に含めている。本願では、AD、軽度認知障害および他の記憶障害を含むADDL関連疾患の診断、監視、予防および治療方法を可能にする分子、すなわちADDLsに対する特異的結合能をもつ分子を開示しながら、これらの特許請求の範囲を拡大する。
【０２９９】
ADDL集成阻害薬は本発明者により国際出願第PCT/US98/02426号明細書(1998年2月5日提出)で初めて開示され、またさらなる実施例が米国特許出願第09/369,236号明細書(1999年8月4日提出)および米国特許出願第10/166,856号明細書(2002年6月11日提出)で開示された。ある種のイチョウ(ginko biloba)エキスはADDL集成を防止する能力があると報告されてきたし、また本書でも確認されている。ADDL免疫原に対して産生させたポリクローナル抗体もまた(おそらく集成の阻害によってではないとみられるが)ADDL毒性を阻害することが示された[Lambert, M. et al. (2001) J. Neurochem., vol.79, pp.595-605]。
【０３００】
ここ3年の間に、Aβ凝集体調製物ワクチンの接種によるアルツハイマー病の新規治療戦略が浮上してきた。この戦略に沿った当初の研究では、Aβ線維をワクチン接種したADモデルTgマウスが使用され、この処置はこれらのマウスで通常見られる行動障害をある程度予防する効果があると報告された[Schenk, D. (1999) Nature, vol.400, pp.173-177; Morgan, D.G. et al. (2001) Nature, in press; Helmuth, L. (2000) Science, vol.289, p.375; Arendash, G. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.1059; Yu, W. et al. (2000) Soc. Neurosci. Abstr., vol.26, p.497]。この結果は驚きであった。血液脳関門(BBB)の脳側に有効な免疫防御をもたらしうるとは一般に認識されていなかったからである。これらのTg ADマウスへのワクチン接種研究で観測された防御効果は、神経毒性アミロイド構造体のレベルを低下させるに足る量の抗アミロイド抗体がBBBを越えて直接輸送された結果であるらしい。あるいは、血流中を循環する該抗体は脳内アミロイドレベルを低下させ有益な対症効果を生み出すに足る量のアミロイドに結合しそれを排泄させることができるとも考えられる。Tgマウスへのワクチン接種研究では、対照群の非ワクチン接種Tg ADマウスのアミロイドレベルと比較して全脳アミロイドレベルの有意の低下は見られないとの報告も何件かあり、Aβクリアランス機序説に疑いを抱かせる。
【０３０１】
他の研究ではTg ADマウスの脳への抗アミロイド抗体の直接注射が脳アミロイドレベルの有意の低下をもたらすことが示された(Bard, F. et al. (2000) Nature Med., vol.6, pp.916-919)が、その方法ではBBBを越える受動輸送から期待しうるよりもずっと高レベルの抗体の送達を伴った。
【０３０２】
これらのワクチン接種Tg ADマウスでの作動機序に関係なく、行動防御に関する有望な研究結果が得られたことで、線維状AβワクチンAN1792の治験の推進に拍車がかかった[Helmuth, L. (2000) Science, vol.289, p.375]。第Ｉ相安全性試験の成功を受けてAD患者を対象とする第II相有効性試験が始まった。あいにくこれらの第II相試験は最近、治験に参加したAD患者97人中12人が脳の炎症と脳炎を伴うワクチン関連合併症を起こしたため、停止となった。これらの重大な合併症の具体的な原因は明確にはわかっていないものの、Aβ線維ワクチンの接種は脳内アミロイドプラークに対する有意の免疫反応を生成させ、その結果小グリア細胞の持続的な活性化と炎症メディエーターの産生を招き、それらがみな重篤な脳炎の一因になるのだと考えられる。実際、このグリア細胞活性化機序はこのワクチン療法の有効性を説明するために提案されている機序に他ならない[Schenk, D. (1999) Nature, vol.400, pp.173-177]。
【０３０３】
これらの冷厳な結果から今や明白なように、AD予防治療のための有効な免疫戦略では、ワクチン、治療用抗体のいずれを使用するにせよ、毒性構造体を直接、個別に標的とするような選択性のきわめて強いアプローチが必要になろう。
【０３０４】
公知の一代替案は、安全性がはっきりしている治療用抗体の使用という、モノマー形のAβペプチドに結合する抗体の使用を基礎とするアプローチである。これらの抗体はモノマー形Aβ1-42のADDLsへの集成を、該モノマーを固定化することによって、および/またはAβオリゴマーに至る重要な集成および折り畳み経路を立体障害的に妨げることによって、阻害すると期待されるものも多いかもしれない[Dodel, R. (2002) EP-01172378; Schenk, DB et al. (1999) US, 00322289および(2000) WO-00072880; Chain, B. (1999) US, 00169687, (2001) WO-00142306; Holtzman, DM et al. (2000) US, 00184601; Frangione, B et al. (2000) US, 00205578]。しかし、そうしたモノマー結合性抗体の投与を伴う治療戦略は、オリゴマー形成を抑えるに足るレベルまでモノマー濃度を引き下げるには相当量の抗体が必要となるため、高コストであろう。
【０３０５】
他に、Aβモノマーの断片を使用するワクチンアプローチも最近公開され、特許が付与されている。そのAβモノマーは特に免疫原性というわけではない。というのは、該モノマーは天然ヒト・タンパク質配列であり、それに対する結合能をもつ大半のT細胞は自己免疫を防ぐためにすでに除去されているからである。ヒト免疫反応をAβモノマーエピトープに向けようとする試みは、ほとんどの細胞型の表面に生じるAPP配列の中に自然に存在する同じ配列による自己免疫のリスクを招くことになろう。
【０３０６】
オリゴマーに結合しまたはオリゴマーを固定化するような分子または抗体の生成または使用は国際出願第PCT/US98/02426号明細書(1998年2月5日提出)の特許請求の範囲に入っており、またADDLsの活性を阻害するさらなる実施例が米国特許出願第09/369,236号明細書(1999年8月4日提出)で開示されている。最近のいくつかの文献でもこれと類似するアイデアたとえば免疫原としての架橋オリゴマーの使用または免疫原としてのオリゴマー自体の使用といったアイデアが開示されている[Walsh, D.M., Selkoe, D. et al. (2002) Biochem Soc. 30; Bush, A et al. US, 00214779; Srivastava (2000) US, 00489219]。
【０３０７】
本願では、ADおよび関連のADDL誘発疾患の治療、予防および診断方法を支持するデータを提示する。これらの方法は、ADDLsに特異的に結合する分子、ADDL集成を阻害する分子、および線維と交差反応しないADDL中和抗体を産生させることに免疫反応を向けることができるワクチンを使用する。これらの方法は、ADDLsに対する特異的結合能をもつがAβモノマーに対する検出可能な結合能およびAβの線維状または原線維状凝集体に対する検出可能な結合能はもたない最近発見の分子を利用する。モノクローナル抗体分子を含むこれらの分子はその高い特異性のために、ADDL阻害能を有する大いに有効な治療/予防薬となりうるし、また(死後)脳組織および(生前)血清または脳脊髄液での特異的ADDL検出能を有する大いに有効な診断試薬となりうる。
【０３０８】
本発明は、アミロイド線維およびアミロイドプラークがADを引き起こすという欠陥理論に概ね依拠する先行技術の大問題を克服しようと努める。従って本発明の一目的は、ADDLsの活性および/または形成を直接、間接に妨げることができる抗ADDL抗体などのような特異的ADDL結合性分子(可溶性、球状、非線維状のオリゴマーAβ1-42集合体)を含む新規組成物の産生や解析、使用である。本発明のあれこれの目的や利点およびそれ以外の発明性は本書の説明から明らかとなろう。
【０３０９】
本発明はアミロイドベータ由来拡散性リガンド(ADDLs); ADDLsに結合する抗体(抗ADDL抗体); 抗ADDL治療薬の発見を目的とした抗ADDL抗体の使用; およびアルツハイマー病、学習記憶障害、神経変性疾患を含むADDL関連疾患の診断、治療および予防への抗ADDL抗体の使用に関する。本発明は特に、ADDLsに対する選択的な認識・結合能を有する一方でモノマー形または線維状アミロイドペプチドに対する結合能はずっと小さい抗体に関する。これらの特徴をもつ抗体はADDLsの神経毒作用を阻害するために有用であり、また抗体-ADDL複合体の排泄によりADDLsを脳から除去するために有用である。そうした抗体はまた、支配的な線維状アミロイド沈着が脳内に存在し、しかも線維状アミロイドに選択的に結合する抗体による治療が重篤な脳炎症や脳炎を招くような患者のアルツハイマー病や他のADDL関連疾患の治療予防に特に有用である。
【０３１０】
これらの特徴をもつモノクローナル抗体はまた、ヒト血漿、脳脊髄液、脳組織などを含む生体サンプル中のADDLsの検出にも有用である。抗ADDL抗体は脳脊髄液中のADDLsの定量的測定に有用であり、ADDLsの悪影響を受けている個人の診断を可能にする。そうした悪影響は学習記憶障害、人格交替、および他の認知機能(たとえばアルツハイマー病や関連疾患で障害が及ぶことが判明している機能)の低下として現れる場合もあろう。抗ADDL抗体は検視で得られる脳組織中のADDLsの定量的検出にも有用であり、アルツハイマー病の生前診断の確認につながる。
【０３１１】
本発明はさらに、ADDLsに結合する、ADDLsを脳から除去する、ADDL活性を阻害する、またはADDLsの形成を防止することができる抗体または他の任意のADDL結合性分子または高分子を選択または識別するためのADDLsの使用に関する。追加の発明は新規合成物、たとえば抗体または抗ADDL結合性分子を選択することができる、または動物または人間に投与したときにADDL阻害免疫反応を誘導することができる分子に関する。本発明はさらに、技術上周知の選択方法または遺伝子組換え的方法による、合成抗体、結合性分子、および他の特異的な結合性分子の創製に適用した場合の、それらの使用にも及ぶ。
【０３１２】
本発明は特に、そうした抗ADDL抗体の調製、解析および使用方法に関する。本発明はまた、ADDL形成の検出への、またADDL形成を妨げる分子の検出への、抗ADDL抗体の使用に関する。本発明はさらに、そうした抗体の、アルツハイマー病や関連疾患で障害が生じている神経細胞の表面上に存在する特異的ADDL受容体へのADDLの結合を阻害する分子の検出を目的とした使用に関する。
【０３１３】
ADDLsは、特定の細胞プロセスを活性化することができる可溶性、球状、非線維状、オリゴマー構造体へと集成したアミロイドベータ(Aβ)ペプチドを含む。本書で開示するのは、ADDLsに対して特異的な抗体を調製し解析する方法、ならびにADDLsの形成、存在、受容体タンパク質結合および細胞活性に関する検定方法である。またADDLsの形成または活性を阻害する化合物、およびそうした化合物を識別する方法も開示される。ADDL形成および作用はとりわけ学習記憶障害、神経細胞変性、およびアルツハイマー病の発症と進行に関連する。従って本発明によるADDL形成または活性の調節は学習記憶障害やADDLsの作用に起因する他の疾患、障害または病態の治療に使用することができる。
【０３１４】
本発明は、アミロイドベータ由来拡散性リガンドまたはアミロイドベータ由来痴呆化リガンド(ADDLs)という新規合成物に関する。ADDLsは、特定の細胞プロセスを活性化することができる可溶性の非線維状オリゴマー構造体へと集成したAβペプチドからなる。本発明の好ましい態様はADDLsに対して特異的な抗体および結合性分子を、またADDLsに対して特異的な抗体および結合性分子の調製、解析および使用方法を、含む。別の好ましい実施態様は、ADDLsに結合するがAβモノマーまたは線維状凝集体には結合しない抗体または結合性分子を含む。本発明の別の態様は、ADDLsの形成、存在、受容体タンパク質結合および細胞活性に関する検定方法からなる。本発明のさらなる態様は抗ADDL抗体または抗ADDL結合性分子の、ADDLsの存在に関連するアルツハイマー病等の疾患の治療および/または予防への使用である。本発明はまた、ADDLsの形成および/または作用を調節(たとえば加減)する化合物の検定および識別方法を包含する。そうした化合物はADDLsの作用に起因する疾患、障害または病態の治療に使用することができる。
【０３１５】
ADDLsは血清中での検出が可能であるため、認知機能と相関関係にあるバイオマーカーであると言える。こうして、特異的ADDL結合性分子は時間の関数としての血清ADDLsの定量的検出に使用することができるので、任意の治療用分子または栄養補助食品の血清ADDL濃度引下げ効果をモニターするための、またADDL濃度低下に関連する認知機能の相関的な改善を記録するための方法が得られる。この方法はAD治療薬候補を解析するためのADモデル動物に適用することができるし、ADおよび認知障害の治療薬候補の治験に適用することもできる。この方法は血中ADDL検定のための検査機関用診断製品に組み込むことができるが、そうした検定はADDLs濃度を引き下げる治療薬またはADDLsを含むAβの産生を引き下げる治療薬を医師が処方する際の参考となる。この方法はまた、血中ADDL検定のための消費者にとって使い勝手のよい診断製品に組み込むことができるが、そうした検定はADDL形成を阻害しうることが判明している天然物質を含む栄養補助食品を消費者が消費する際の参考となる。
【０３１６】
特異的なADDL結合性分子を使用する診断方法による測定で血清ADDL濃度を引き下げる効果があると判明している栄養補助食品や他の成分もまた開示され、特許請求の範囲に含まれる。
【０３１７】
これらの特異的なADDL結合性分子は、脳神経細胞の表面に結合したADDLsのin vivo検出のための造影剤としても有用である。そうした造影剤の例はポジトロンCT(PET)用、MRI用、または他の任意の画像診断法用の試薬などである。そうした画像診断法はADDLs特有の局在化やそうした局在化の(放射性または磁性造影剤などのようなレポーター分子を特異的ADDL結合性分子に付着させることによって可能となる)検出を土台とする。
【０３１８】
これらの特異的なADDL結合性分子は、ADDLsの神経毒性を仲介する神経細胞表面の特異的受容体タンパク質を発見するうえでも有用である。本願では、そうしたADDL特異的なニューロン受容体タンパク質もまた開示されるし、またこれらの受容体タンパク質に対するADDL結合を妨げる治療および予防薬を発見するための方法もまた開示される。神経細胞上の特異的タンパク質に対するADDLsの結合を妨げるそうした分子は、ADDLsによって誘導されるLTP阻害および情報記憶阻害の防止に有用であり、従ってADDLs関連疾患たとえばアルツハイマー病、軽度認知障害およびダウン症候群における記憶および認知障害の治療に有効な分子である。
【０３１９】
これらの特異的なADDL結合性分子は、ADDL形成またはADDL活性を妨げる低分子量薬物を発見するうえでも有用である。ADDL形成を妨げる分子はADDLsの神経毒性の防止に有効であり、またそうしたADDL形成阻害分子の存在は特異的なADDL結合性分子を使用してADDLsがAβモノマーから形成されてはいないことを検証することにより確認することができる。
【０３２０】
最後に、ADDLsを特異的に中和化する抗体を免疫反応で生成させることができる新組成物が特許請求の範囲に含まれる。これらの新組成物は、急速に集成するペプチドまたはペプチドミメティクス分子から調製されるオリゴマーであり、該オリゴマーは免疫系に対してある種のエピトープを提示してADDL中和反応を誘導する。
本書で引用した特許文献および他の学術/技術文献はいずれも互いに矛盾しない範囲で、引用により本書に組み込まれる。
【０３２１】
本発明の好ましい実施態様に関する以上の開示は例示と解説が目的であり、本発明を余すところなく説明し尽くすまたは厳密に開示の形に制限するものでもない。以上の開示は本発明の原理とそうした原理の実用化を最もよく説明するように内容を選択し、当業者が本発明を他の様々な実施態様に、見込まれる具体的な用途に合せた種々の変更を加えて、利用しうるようにしている。本発明の範囲は明細書によって限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】図1は濃度計でスキャンした銀染色ポリアクリルアミドゲルのコンピューター生成画像であり、ADDLsの電気泳動パターンを示す。主バンドは約30kDに対応し、それほど豊富でないバンドは約17kDに対応する。線維または凝集体の形跡は見られない。
【図２】図2は濃度計でスキャンしたCoomassie染色SDS-ポリアクリルアミドゲルのコンピューター生成画像であり、ADDLsの電気泳動パターンを示す。主バンド(上方のダブレット)は約17〜22 kDのサイズに対応し、もう1つのバンド(下方の濃いバンド)は、おそらく分解産物と思われる豊富な4kDモノマーを示す。レーン1: 分子サイズマーカー; レーン2: ADDL調製物; レーン3: 高濃度のADDL調製物。
【図３】図3は含ADDL「画分3」(Superdex 75ゲルろ過カラムで分画)の代表的なコンピューター生成AFM分析画像である。
【図４】図4は濃度計でスキャンしたCoomassie染色SDS-ポリアクリルアミドグラジエントゲルのコンピューター生成画像であり、クラスタリン(clusterin)または冷F12培地とのコインキュベーションにより調製したADDLs(それぞれレーンA、レーンB)の、およびクラスタリンとのコインキュベーションにより調製したADDLsであってCentricon 10kDカットオフ膜を通過したもの(レーンC)またはCentricon 10kDカットオフ膜上の残ったもの(レーンD)の、電気泳動パターンを示す。MW=分子サイズマーカー。
【図５】図5はADDL調製物で処理したマウスに由来する脳スライスについての、アミロイドβ1-42濃度として測定したADDL濃度(nM)と%死細胞の関係を示すグラフである。
【０３２３】
【図６】図6はADDLsに接触させていない対照PC12細胞(Cont.)、クラスタリンだけに接触させたPC12細胞(Apo J)、モノマーAβに接触させたPC12細胞(Aβ)、クラスタリンと共凝集し1日寝かせたアミロイドβに接触させたPC12細胞(Aβ: Apo J)に関する、%MTT還元を示す棒グラフである。
【図７】図7はFACScan検出であり、ADDLsに接触させていないB103細胞(無網掛ピーク、-ADDLs)と蛍光標識ADDLsに接触させたB103細胞(網掛けピーク、+ADDLs)に関する蛍光強度(0〜170)とイベント数(0〜300)の関係を示す。
【図８】図8はFACScan検出であり、ADDLsに接触させていない海馬細胞(無網掛ピーク、-ADDLs)と蛍光標識ADDLsに接触させた海馬細胞(網掛けピーク、+ADDLs)に関する蛍光強度(0〜200)とイベント数(0〜300)の関係を示す。
【図９】図9はB103細胞のトリプシン処理により放出されたペプチドに接触させていないB103細胞(“-”)または同時接触させたB103細胞(“+”)に関するADDL結合またはADDL誘導死の%最大値を示す棒グラフである。
【図１０】図10はADDL調製物で処理したマウスに由来する脳スライスについての、相対ADDL濃度と%死細胞の関係を示すグラフである。相対濃度の決定では、初期濃度10μMのAβタンパク質を用いて最高データポイント(ポイント“16”)のADDLsを形成し、次いでこれを希釈して1/2(ポイント“8”)、1/4(ポイント“4”)などとした。
【図１１】図11は、ADDL結合ELISA検定法で得られた光学密度を示す棒グラフであり、B103細胞をADDLsおよび6E10抗体とコインキュベートした場合(cells, ADDLs, 610E)、B103細胞をADDLsとコインキュベートした場合(cells, ADDLs)、B103細胞を6E10抗体とコインキュベートした場合(cells, 610E)、B103細胞を単独でインキュベートした場合(cells)、6E10抗体を単独でインキュベートした場合(6E10)、または希釈液の光学密度を読み取った場合(blank)を示す。
【０３２４】
【図１２】図12は、ADDL処理の有無(それぞれADDLs、Medium)で分けたfyn+/+マウス(野生型、Fyn+; クロスハッチで表示)またはfyn-/-マウス(ノックアウト、Fyn-; ベタで表示)の%死細胞を示す棒グラフである。
【図１３】図13はAβ濃度(μM)と星状細胞のADDLsまたはAβ17-42とのインキュベーションにより得られた活性化グリア(個数) (それぞれベタ三角、ベタ四角)との関係を示すグラフである。
【図１４】図14はADDLsで処理していない対照マウス(ベタ三角)またはADDLsで処理したマウス(ベタ四角)に関する時間(分)と基線スパイク振幅の関係を示すグラフである。
【図１５】図15はADDLsに接触させていない対照ラット海馬スライス(ベタ三角)またはADDLsに接触させたラット海馬スライス(ベタ四角)に関する時間(分)と平均スパイク振幅の関係を示すグラフである。
【図１６】図16は濃度計でスキャンした16.5%トリス-トリシンSDS-ポリアクリルアミドゲル(Biorad)のコンピューター生成画像であり、様々な可溶性オリゴマーADDLs(ADDLsとして表示)、アミロイドβダイマー(Dimerとして表示)およびモノマー(Monomerして表示)を示す。レーン1: 銀染色Mark XII分子量標準物質(Novex, San Diego, California); レーン2: 銀染色ADDLs ; レーン3: モノクローナル抗体26D6(Sibia Neurosciences, San Diego, California)の使用によるレーン2のウェスタンブロット。
【図１７】図17はADDLsのAMF分析のコンピューター生成画像である。この平面図減算処理画像は生成したての雲母劈開面上に散らした凝集アミロイドβ分子の高倍率拡大図(2.0μm×2.0μm)である。
【図１８】図18はADDLsが4℃での保存後もそのオリゴマー分布構造と細胞傷害活性を維持することを示すデータである。A. 新鮮および1日経過後ADDL調製物の銀染色。Aβ1-42をDMSOに溶解し、次いでF12培地に溶解し(実施例22の「材料と方法」を参照)、4℃で24時間インキュベートした。遠心分離後、新鮮ADDL調製物にあたる上清を新しいチューブに移した。上清タンパク質をトリス-グリシン系SDS-PAGEで分離し、銀染色した。レーン1: 着色分子量マーカー(非銀染色); レーン2: 豊富なモノマー、わずかなダイマー、かなりのトリマーおよびテトラマーのオリゴマーを示す新鮮ADDL調製物; レーン3: 実質的に同じ分布構造を示す4℃で1日経過後のADDL調製物。この画像では、これら2レーンの均一な灰色の背景は銀染色の着色背景に由来する。B. 新鮮および1日後ADDL調製物のMTT検定。MTT検定によりPC12細胞上での4時間ADDLインキュベーションの効果を比較した(実施例22の「材料と方法」を参照)。ADDL調製物は新鮮、保存のいずれも50%以上の阻害を及ぼした。A、Bのデータから、注射に使用した48時間サンプルは構造も毒性も新鮮調製物とほぼ変わらないことがわかる。
【図１９】図19は、免疫ブロットでは抗体M94が強いオリゴマー選択性を示すことがわかるデータである。SDS-PAGEでADDLsを分離し、ニトロセルロース膜に転写し、表示の抗体でプローブした。結合の確認には西洋わさびペルオキシダーゼを結合させた二次抗体と化学発光法による視覚化を用いた。モノクローナル抗体4G8(右レーン)はモノマーからテトラマーまでの4種のAβを認識する。モノクローナルの26D6(中央レーン)および6E10(図3)はモノマー、トリマー、テトラマーを認識するが、ダイマーを認識しない。新規のポリクローナル抗血清M94(左レーン)およびM93(図20)はオリゴマーを選択的に認識する。
【図２０】図20はオリゴマー選択的M93抗体が高抗体濃度の場合に限ってAβモノマーを検出することを示すデータである。A. 免疫ブロット: SDDL免疫ブロットを逓減濃度の抗体でプローブした。ADDLsの視覚化は化学発光法によった。M93の有効性は少なくとも6E10並みであるが、6E10はオリゴマー非選択性の市販モノクローナル抗体であり参考のために(1:2000希釈で)示す。B. 化学発光バンドの定量: 各バンドの強度を画像分析で求め(「方法」)、6E10モノマーバンド(100%)で標準化した。M93抗体は高抗体濃度(<1:500希釈)の場合に限ってモノマーに結合した。これらのデータはM93がオリゴマーを選択的に認識することを示す。
【０３２５】
【図２１】図21はADDLsにオリゴマー選択的抗体を予備吸着させると免疫ブロットでの結合が見られなくなることを示すデータである。(表示のような)各抗体をADDLsと2時間、0倍、1倍、5倍または10倍のタンパク質濃度でインキュベートした。次に、この溶液を標準手法で発現させたADDL免疫ブロットに使用した。ADDLsによる予備吸着で結合は見られなくなる。この結果は抗体のADDLsとの結合には特異的な認識が必要となることを示唆する。
【図２２】図22は、オリゴマー選択的抗体が正常脳タンパク質にはまったく結合しないことを示すデータである。該抗体がADDLs以外の脳タンパク質に結合するかどうかを判定するために、ラット脳ホモジネートを調製し、SDS-PAGEにより単独で、またはADDLsの存在下に、分離した。得られた免疫ブロットをM94でプローブし、結合を化学発光法で視覚化した。脳タンパク質単体に対しては結合が生じなかった(中レーン)。ADDLs+ホモジネートのサンプル(右レーン)はテトラマーとトリマー(黒矢印)のほかにさらに高分子量の化学種も示した。これらのバンドのうち最も目立つものを白矢印で示すが、さらに高分子量でも微量ながら現れている。ADDLs単体は左レーンに示す。これらの結果は該抗体がAβオリゴマーだけを認識し、脳タンパク質は認識しないことを示唆する。
【図２３】図23は培養ラット海馬細胞中のADDL結合の局在性を示すデータである。ラット海馬細胞を培養し、ADDLsに90分間接触させ、次いで固定した。M94抗体をADDLsに結合させ、Oregon Green-514に結合させた二次IgGで視覚化した。上段パネルは免疫蛍光画像であり、下段パネルは倒立蛍光顕微鏡画像である。左: 培養細胞をADDLs(一次抗体なし)で処理; 中: 培養細胞をADDLsとM94抗体で処理; 右: 培養細胞を対照(基剤)とM94抗体で処理。当初の、または無ADDLの培養細胞では結合が見られない。ADDLsとM94の両方で処理した細胞中の標識はもっぱら神経突起上に局在する。下段左隅の棒線は25ミクロンを表す。
【図２４】図24はPC12細胞に対する毒性(MTT法で測定)がADDL選択的抗体により阻害されることを示すデータである。PC12細胞中でMTT反応を起こさせる2時間前に免疫前血清をADDLsに加えた。この添加は用量依存的なMTT還元を妨げない(白四角、下の曲線)。しかし、抗体を予めADDLsと2時間インキュベートすると、MTT還元に変化は見られない(黒四角、上の曲線)。これらのデータは該抗体がADDLsの作用を阻害することを示唆する。
【図２５】図25は集合形の可溶性Aβに関する選択的、高感度ドットブロット法のデータである。(A) M94-3はオリゴマーを識別する(右)が、一方Potempska抗体(R165)はモノマーだけを識別する(左)ことを示す免疫ブロット。(B) M94-3のモノマー単体(HFIP+)よりもオリゴマー+モノマー(HFIP-)に対する選択性を示すドットブロット。この検定法の可溶性Aβ1-42検出感度は10fmolである。(C) このドットブロット法は100倍の濃度範囲にわたって線形である。
【図２６】図26はAD脳では集合形の可溶性Aβが70倍にも増加すること示すデータである。パネルA(左): 5つのAD脳と5つの年齢対応対照脳(CTRL)に関するドットブロット(1μg/ドット)。パネルB(右): 散布図の使用による同じサンプルの定量。
【図２７】図27はAD脳中の集合形の可溶性Aβと合成Aβオリゴマーとの同一性を示すデータである。(A) AD脳由来の可溶性タンパク質の2D免疫ブロット。(B) 合成可溶性オリゴマーADDLsの2D免疫ブロット。サンプルAおよびBは、突出した55kDaタンパク質を含むが、それはAβ1-4212マーと分子量がほぼ同じであり、pIは約5.6である。(C) 対照脳由来の可溶性タンパク質の2D免疫ブロット。
【図２８】図28のデータによれば、ADDL結合性タンパク質は保存種であり、病原性ADDLsに対する脆弱性に近い親和性と発現を示す。(上段):ラットおよびヒト脳の小脳(Cb)、皮質(Cx)または海馬(Hp)に由来するタンパク質抽出物(SDS-PAGEで分離し、合成Aβオリゴマーと共にインキュベートしたもの)を使用したリガンドブロット。140kDa結合性タンパク質はラットの小脳よりも海馬および皮質に多く、またヒトの小脳よりも皮質に多い。(下段左):対照(CTRL)脳とAD脳に関するリガンドブロットでのp140およびp260結合性タンパク質の相対存在量。どちらの結合性タンパク質もAD脳では濃度が低下していた。(下段右):皮質タンパク質p140に対する可溶性Aβの結合性グラフ。半値濃度は〜10nMである。(挿入グラフ): 2つのADDL濃度(50nMと100nM)でのラット皮質(左)および小脳(右)培養のMTT毒性検定。皮質培養に限り、ADDLsの阻害を受ける。
【０３２６】
【図２９】図29は、可溶性Aβ集合体(ADDLs)が細胞膜ラフト中に見られるタンパク質に対するリガンドであることを示すデータである。(A) ラット脳の細胞膜(左側の3列、Memb)とラフト調製物(Raft)[SDS-PAGEで分離し、可用性ヒト脳抽出物(Extract)または合成ADDLs (Synth)と共にインキュベートしたもの]を使用したリガンドブロット。結合はM94-3と化学発光法で視覚化した。決まって3つの際立ったタンパク質(p260、p140、p100)が観測された。(B) ドットブロットで、ADDLsはAD脳抽出物には存在するが、対照脳抽出物には存在しないことが確認された。
【図３０】図30は、神経細胞表面上のタンパク質と架橋結合したADDLsが非架橋結合ADDLsでは検出されない分子量(MW)約280〜300kDaの一タンパク質バンドとなって現れることを示すデータである。CNS神経芽細胞腫B103株、ラット脳およびラット肝に由来する細胞膜をF12培地に懸濁させる。種々の濃度のADDLsを氷上で加え、冷所で3時間振とうする。架橋剤DTSSPを冷所で1時間にわたり加え、反応をTris-HClにより氷上で、30分間で停止させる。膜タンパク質をRIPA緩衝液で可溶化し、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ウェスタン法にかける。MWが~250〜300kDaの一ADDL依存バンドがB103およびラット脳細胞膜では検出されたが、肝細胞膜では検出されなかった。
【図３１】図31は膜タンパク質の2Dゲル電気泳動(パネルA、左; 銀染色)がADDLsとADDL特異抗体によるリガンドブロット法(パネルB、右)でp260を出現させることを示すデータである。この検定法では約150μgの皮質膜タンパク質を2D電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、10nM ADDLsと共に冷所で3時間インキュベートし、次いでADDLs−M94-3 ADDL-選択的抗体と電気化学発光法で検出した。パネルA: 銀染色。パネルB: ADDL - ファーウェスタンブロット。1回の2D電気泳動でp260が得られ、またp260はpIが5.6の、相対存在量が多くないタンパク質であることがわかる。
【図３２】図32は可溶性Aβ集合体(ADDLs)がニューロン受容体タンパク質に結合し(すなわちADDLsはニューロン細胞表面タンパク質に対するリガンドであり)、斑点状に分布することを示すデータである。ADDL(オリゴマー)の結合は抗ADDL抗体M94-3を使用して免疫蛍光顕微鏡法で視覚化する。(A) 培養海馬神経細胞に結合した可溶性のAD脳タンパク質。(B) 培養海馬神経細胞に結合した可溶性の対照脳タンパク質。(C) 培養海馬神経細胞に結合したAβ1-42から調製した合成ADDLs。ADDL分布は斑点状であり、小さい(~0.2〜0.5μm)。対照脳タンパク質は結合性を示さない。棒線=10μm。
【図３３】図33は線維および原線維結合が斑点状ADDL結合とは異なることを示すデータである。ラット海馬ニューロンを種々のAβ1-42調製物と共に1時間インキュベートし、固定し、特異的抗ADDLウサギ抗血清で免疫標識した。免疫蛍光画像は構造、細胞への結合ともに異なること示す。線維(左)は特異的細胞「結合」を示さない大きな構造として現れる。シードのAβ1-42を含む原線維(中)はもっと小さいがもっと密に分布した、突起と細胞体に付着した構造を形成し、特徴的なパターンをもたない。ADDLs(右)は0.2μm径の結合ホットスポットとして現れる。顕微鏡画像では、ADDL結合はきわめて不均一であるが、これは限られた細胞表面領域への選択的結合とも符合する。ADDL受容体の「ホットスポット」はランダムではなく、成長と可塑性の領域である神経突起上に最も豊富に存在する。
【図３４】図34はADDL斑点とp75-NGF受容体の共局在率が最小であることを示すデータである。解離ラット海馬細胞を12日間培養した後に、1μM ADDLsと共に37℃で1.5時間インキュベートした。細胞を固定し、ポリクローナル抗ADDLs抗体とモノクローナル抗p75抗体で二重標識した。抗ADDLs(赤)と抗p75 NTR(緑)のオーバーレイは両抗体の共局在(黄)が最小であることを示す。蛍光オーバーレイはMetaMorph Imagingソフトウェアで作製。倍率:×100。
【図３５】図35はADDL受容体複合体が抗MAP-2a,bで標識した突起(神経突起)上の斑点として検出されることを示すデータである。解離ラット海馬細胞を12日間培養した後に、1μM ADDLsと共に37℃で1.5時間インキュベートした。細胞を固定し、ポリクローナル抗ADDLs抗体とモノクローナル抗MAP-2a,b抗体で二重標識した。抗ADDLs(赤)と抗MAP-2a,b(緑)のオーバーレイはADDLsがMAP-2a,b標識突起に結合することを示す。蛍光オーバーレイはMetaMorph Imagingソフトウェアで作製。倍率:×100。
【図３６】図36はADDLsが細胞膜の活性部位に結合し、葉状突起の先端にあってさえ斑点として局在することを示すデータである。NT2成長円錐へのADDL結合は6E10-B抗体を使用する免疫蛍光法で検出することができる。NT2細胞はADDLs(5〜10μM)と2時間インキュベートし、次いで洗浄する。NT2細胞の高倍率免疫蛍光像は、突起や細胞体はもちろん葉状突起先端でも離散斑点に結合することを示している。
【図３７】図37はADDL受容体複合体が樹状突起棘とシナプス後部位に局在することを示すデータである。
【０３２７】
【図３８】図38はADDL受容体斑点がビンキュリンと共局在することを示すデータである。ADDL受容体のパキシリンとの共局在は、パキシリンを含む若干の接着斑を除けば、ごくわずかであった(上パネル、下段)。培養海馬細胞の突起および細胞体に沿ったビンキュリン陽性斑点へのADDLの局在が免疫蛍光法で検出される。これらの斑点にはパキシリンの局在を示すものもある。初代培養のラット海馬細胞を4日間培養した後、1μM ADDLsと共に37℃で1.5時間インキュベートする。細胞を洗浄し、固定し、ポリクローナル抗ADDLs抗体とモノクローナル抗ビンキュリンまたは抗パキシリン抗体で二重標識する。MetaMorph Imagingソフトウェアで作製した蛍光オーバーレイ(前記)は、ADDLs(赤)とビンキュリン(緑、上パネル、上段)の共局在部位(黄)が突起および体細胞に沿って多数存在することを示している。(下パネル): ADDLs受容体斑点(緑)とパキシリン(赤)のオーバーラップはほとんど見られない。
【図３９】図39はADDL受容体の結合がチロシン-リン酸化FAKの検出可能レベルを高めることを示すデータである。FAK-YPレベルはADDL処理の1時間以内に上昇することがウェスタンブロット法で明らかになった。明点(上、右)はFAK-YPの位置を示す。定量によればFAK-YPレベルは3倍になっている(下、左)。FAK-YPはADDL受容体複合体の斑点と共に局在する(下、右)。
【図４０】図40は毒性の低分子量オリゴマーを抗原として使用してモノクローナル抗体を生成させたことを示すデータである。パネルA: マウス3頭(#1、#2、#3)の免疫に使用したADDLsの免疫ブロット(ポリクローナル抗体M93/3を使用)と銀染色; パネルB: これらのADDLsの5μMでの毒性(PC12細胞で、MTT法により測定)。
【図４１】図41はマウスがADDLsに対して強い抗原反応を起こすことを示すデータである。図の免疫ブロットは〜20pmol ADDLsを対照のオリゴマー選択的ウサギ・ポリクローナル抗体(M93/3)と2種類のマウス#1由来血漿(75倍希釈と100倍希釈)で視覚化したものである。
【図４２】図42は低分子量ADDLsを標的とするハイブリドーマの選択には二重スクリーニングが有効であることを示すデータである。左パネル: ADDLsに結合するハイブリドーマ上清(すなわち3B7と3D8)の、ドットブロット(5pmol ADDLs)による選択。右パネル: 選択した分子量のオリゴマーに結合するハイブリドーマの、免疫ブロット(20pmol ADDLs)によるスクリーニング。たとえば上のブロットでは#15は3B7である。
【図４３】図43は実施例25の要領で生成させたハイブリドーマ(図40〜42も参照)が種々の分子量のオリゴマーを標的とすることを示すデータである。図の免疫ブロットは種々のハイブリドーマ上清を使用してADDLsを視覚化したものである(20pmol/レーン)。3B7は低分子量ADDLsだけを認識するのに対して、5A9と11B5は低分子量と高分子量の両オリゴマーを認識する。8C3は高分子量オリゴマーだけを認識するかもしれない。増殖ハイブリドーマをドットブロットおよび免疫ブロット法で再スクリーニングした。
【図４４】図44は抗ADDLモノクローナル抗体3B7が、海馬細胞上のポリクローナルM94/3抗体に類似するADDL結合性部位を識別することを証明するデータである。ADDLs(500nM)を21日培養海馬細胞と6時間インキュベートする。ADDLsを洗浄除去し、細胞をホルムアルデヒドで固定する。次に細胞を種々のハイブリドーマに由来する上清(1:5)またはウサギ抗ポリクローナルM94/3抗体(1:200)と1.5時間接触させた後、Alexa 488結合抗マウス二次抗体で視覚化する。左側の3B7画像とM94/3画像の中の斑点の類似性に注目。
【図４５】図45は、標準手順に従ってSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜にブロットし、3B7抗体、11B5抗体または対照抗体(6E10)とインキュベートしたADDLsを示すデータである(パネルAおよびB)。(A) 抗体3B7は種々のオリゴマーバンドを認識したが、モノマーを認識しなかった。左端は分子量マーカーである。(B) 左端がオリゴマーの推定分子量である点を除けば(A)と同じである。
【図４６】図46はAD脳組織(上)および年齢対応対照脳組織(下)の皮質スライスをADDL選択的M93抗体で染色してADDLsを視覚化したものである。細胞核の染色にはHoechst色素を使用した。すべての手順は標準プロトコールに従った。
【図４７】図47は免疫染色したAD脳組織に由来する領域の拡大図であり、ニューロン表面周辺のライトグレー染色はニューロン受容体タンパク質への結合を示す。ブルー染色は細胞核の位置を示す。すべての手順は標準プロトコールに従った。
【図４８】図48はADDL選択的抗体が血中または血漿中ADDLsのドットブロット検出に使用しうることを示すデータである。上段左側のパネル: ADトランスジェニック(Tg)マウス由来ADDLs(右端の棒)は非Tgマウス(左から2番目の棒)と比べて血漿中レベルが高いことを示す。このパネルの1番目と3番目の棒は、ADDLsがTgマウスまたは正常マウスで静脈注射後に検出しうることを示す。左側のパネルは脳組織抽出物中で検出されたADDLsの比較データである。下段のパネルはこれらの診断検定に用いる標準曲線(SC)である。すべての手順は標準プロトコールに従った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
2006508072.tif 000058
【図４３】
2006508072.tif 000059
【図４４】
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【図４５】
2006508072.tif 000061
【図４６】
2006508072.tif 000062
【図４７】
2006508072.tif 000063
【図４８】
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【国際調査報告】
2006508072.tif 000065
2006508072.tif 000066
2006508072.tif 000067