(57)【要約】第２２染色体の２０．４２８メガベース（２２ｑ１１．２）に位置するＨＥＲＶ−Ｋファミリーの特定のメンバーが、前立腺腫瘍において優先的かつ有意にアップレギュレートされることが見出されている。本発明は、前立腺癌を診断するための方法を提供し、この方法は、ウイルスの発現産物の存在または不在を、患者サンプル中で検出する工程を包含する。このウイルスは、他のＨＥＲＶ−Ｋメンバーにおいては見られない５つの特徴を有する：（１）このウイルスが保有する特定の核酸配列、および従って、特定のアミノ酸配列；（２）タンデムな５’ＬＴＲ；（３）フラグメント化された３’ＬＴＲ；（４）ａｌｕ挿入により中断されるｅｎｖ遺伝子；および（５）独特のｇａｇ配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌、特に前立腺癌を診断する方法であって、該方法は、患者サンプルにおいて、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス（ＰＣＡＶ）の発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】
検出される前記発現産物が、ｍＲＮＡ転写物またはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍＲＮＡ転写物が、ハイブリダイゼーション、配列決定法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって検出される、請求項１および請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、以下の最初の工程：（ａ）前記患者サンプルからｍＲＮＡを抽出する工程；（ｂ）該患者サンプルから、ｍＲＮＡを除去することなくＤＮＡを除去する工程；および／または（ｃ）該患者サンプルにおいて、ＰＣＡＶ  ＤＮＡを除去または破壊するがＰＣＡＶ  ｍＲＮＡを破壊も除去もしない工程を、包含する、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記発現産物が、以下：
（ａ）第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス由来のｍＲＮＡ転写産物；
（ｂ）配列番号２３、配列番号１１９７および／または配列番号１１９８に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ｍＲＮＡ転写物；
（ｃ）配列−Ｎ１−Ｎ２−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ１が、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの、（１）最初の５’ＬＴＲから転写されたｍＲＮＡの５’末端から、（２）該最初の５’ＬＴＲから転写された該ｍＲＮＡのＵ５領域の下流の最初のスプライスドナー部位までのヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ２が、スプライスアクセプター部位のすぐ下流のヌクレオチド配列であって、該スプライスアクセプター部位が、（１）該最初のスプライスドナー部位の下流、および（２）第２のスプライスドナー部位の上流に位置し、該第２のスプライスドナー部位は該内因性レトロウイルスの第２の５’ＬＴＲの下流である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｄ）配列−Ｎ１−Ｎ２−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ１が、配列番号２６および／または配列番号１２０１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ２が、配列番号２７または配列番号２８に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｅ）配列番号２４、配列番号２５、配列番号１１９９または配列番号１２００に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｆ）配列−Ｎ３−Ｎ４−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ３が、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの３’ＬＴＲの、５’フラグメントの３’末端由来のヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ４が、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスにおけるＭＥＲ１１ａ挿入部分の５’末端由来のヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｇ）配列−Ｎ３−Ｎ４−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ３が、配列番号３０に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ４が、配列番号３１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｈ）配列番号２９に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｉ）配列−Ｎ７−Ｎ８−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ７が、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子内のａｌｕ挿入部分の前にあるヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ８が、該ａｌｕ挿入部分の５’末端で始まるヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｊ）配列−Ｎ７−Ｎ８−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ７が、配列番号３７に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ８が、配列番号３２に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｋ）配列番号３８に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｌ）配列−Ｎ９−Ｎ１０−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ９が、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子内のａｌｕ挿入部分の末端にあるヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ１０が、該ａｌｕ挿入部分のすぐ下流のヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｍ）配列−Ｎ９−Ｎ１０−を含むｍＲＮＡ転写物であって、該Ｎ９が、配列番号４１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Ｎ１０が、配列番号４０に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、ｍＲＮＡ転写産物；
（ｎ）配列番号４２に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｏ）配列番号４１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｐ）配列番号５３に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｑ）配列番号１１１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；
（ｒ）配列番号１１９１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物；および
（ｓ）配列番号９８に対し、少なくとも７０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物；
からなる群から選択されるｍＲＮＡ転写物である、方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡ転写物が、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５３、配列番号１１１および／または配列番号１１９１のうち１つ以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、以下：（ａ）前記患者サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プライマーおよび／またはプローブと接触させる工程；ならびに（ｂ）該患者サンプルにおいてハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程を、包含する、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、以下：（ａ）前記サンプル中のｍＲＮＡを、ＤＮＡと比較して富化し、ｍＲＮＡ富化サンプルを供給する工程；（ｂ）該ｍＲＮＡ富化サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プライマーおよび／またはプローブと接触させる工程；および（ｃ）該ｍＲＮＡ富化サンプルに存在するｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程を、包含する、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、以下：（ａ）前記サンプル中のｍＲＮＡのＤＮＡ複製物を調製する工程；（ｂ）該ＤＮＡ複製物を、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プライマーおよび／またはプローブと接触させる工程；および（ｃ）該ＤＮＡ複製物に対するハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程を、包含する、方法。
【請求項１０】
前記患者サンプルを、前記レトロウイルスから発現されるポリペプチドを認識する抗体と接触させる工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者サンプルが前立腺細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が成人男性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
以下：
（ａ）第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されるｍＲＮＡ転写産物の核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１０、配列番号１１９７および／または配列番号１１９８に対し、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｃ）ヌクレオチド配列−Ｎ１−Ｎ２−を含む核酸；
（ｄ）配列番号５、配列番号６、配列番号１１９９または配列番号１２００に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｅ）ヌクレオチド配列−Ｎ３−Ｎ４−を含む核酸；
（ｆ）配列番号９に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｇ）ヌクレオチド配列−Ｎ７−Ｎ８−を含む核酸；
（ｈ）配列番号３８に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｉ）ヌクレオチド配列−Ｎ９−Ｎ１０−を含む核酸；
（ｊ）配列番号４２のヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｋ）配列番号４２に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｌ）配列番号５３のヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｍ）配列番号５３に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｎ）配列番号１１１のヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｏ）配列番号１１１に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｐ）配列番号１１９１のヌクレオチド配列を含む核酸；
（ｑ）配列番号１２０〜１１８４のうち１つ以上を含む核酸；
（ｒ）ストリンジェント条件下で、請求項５に記載の（ａ）〜（ｓ）において定義されるｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る核酸；および
（ｓ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）または（ｒ）の相補核酸；
からなる群から選択される核酸であって、ここでＮ１〜Ｎ１０は請求項５において定義される、核酸。
【請求項１４】
配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号３８、配列番号４２、配列番号５３、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号３３７〜５９９、および配列番号６００〜１１８４のうち１つ以上を含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
以下：
（ａ）ＰＣＡＶ核酸標的内で配列−Ｎ１−Ｎ２−（またはその相補配列）にハイブリダイズし得るが、単独のＮ１配列またはＮ２配列（またはこれらの相補配列単独）にはハイブリダイズしないプローブ；
（ｂ）ＰＣＡＶ核酸標的内で配列−Ｎ３−Ｎ４−（またはその相補配列）にハイブリダイズし得るが、単独のＮ３配列またはＮ４配列（またはこれらの相補配列単独）にはハイブリダイズしないプローブ；
（ｃ）ＰＣＡＶ核酸標的内で配列−Ｎ７−Ｎ８−（またはその相補配列）にハイブリダイズし得るが、単独のＮ７配列またはＮ８配列（またはこれらの相補配列単独）にはハイブリダイズしないプローブ；
（ｄ）ＰＣＡＶ核酸標的内で配列−Ｎ９−Ｎ１０−（またはその相補配列）にハイブリダイズし得るが、単独のＮ９配列またはＮ１０配列（またはこれらの相補配列単独）にはハイブリダイズしないプローブ；
（ｅ）配列番号１０、配列番号１１９７もしくは配列番号１１９８のフラグメント、または配列番号１０、配列番号１１９７もしくは配列番号１１９８のフラグメントの相補鎖に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ；
（ｆ）配列番号５および／もしくは配列番号１１９９のフラグメント、または配列番号５および／もしくは配列番号１１９９のフラグメントの相補鎖に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ；
（ｇ）配列番号６および／もしくは配列番号１２００のフラグメント、または配列番号６および／もしくは配列番号１２００のフラグメントの相補鎖に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ；
（ｈ）配列番号９のフラグメント、または配列番号９のフラグメントの相補鎖に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ；
（ｉ）配列番号５３のフラグメント、または配列番号５３のフラグメントの相補鎖に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ；
（ｊ）配列番号１１９１のフラグメント、または配列番号１１９１のフラグメントの相補鎖に対し、７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ；
（ｋ）配列番号１０および／もしくは配列番号１１９８の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号１０および／もしくは配列番号１１９８の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｌ）配列番号４７の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号４７の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｍ）ヌクレオチド配列Ｂ１ａ−Ｂ２ａ（またはその相補鎖）を含むプローブであって、ここで、Ｂ１ａは配列番号２の３’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含み、Ｂ２ａは配列番号４６の５’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含む、プローブ；
（ｎ）配列番号４９の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号４９の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｏ）ヌクレオチド配列Ｂ１ｂ−Ｂ２ｂ（またはその相補鎖）を含むプローブであって、ここで、Ｂ１ｂは配列番号２の３’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含み、Ｂ２ｂは配列番号４８の５’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含むプローブ；
（ｐ）配列番号９の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号９の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｑ）ヌクレオチド配列Ｂ３−Ｂ４（またはその相補鎖）を含むプローブであって、ここで、Ｂ３は配列番号７の３’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含み、Ｂ４は配列番号８の５’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含むプローブ；
（ｒ）配列番号３８の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号３８の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｓ）ヌクレオチド配列Ｂ７−Ｂ８（またはその相補鎖）を含むプローブであって、ここで、Ｂ７は配列番号３７の３’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含み、Ｂ４は配列番号３２の５’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含むプローブ；
（ｔ）配列番号４３の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号４３の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｕ）ヌクレオチド配列Ｂ９−Ｂ１０（またはその相補鎖）を含むプローブであって、ここで、Ｂ９は配列番号３２の３’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含み、Ｂ１０は配列番号４０の５’末端由来の６つ以上のヌクレオチドを含むプローブ；
（ｖ）配列番号５３の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号５３の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｗ）配列番号１１１の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号１１１の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
（ｘ）配列番号１１２の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号１１２の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；ならびに
（ｙ）配列番号１１９１の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号１１９１の相補鎖の少なくとも１０の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ；
からなる群より選択される核酸プローブであって、ここでＮ１〜Ｎ１０は請求項５において定義され、そして「ＰＣＡＶ」は、ヒト第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置する内因性レトロウイルスである、核酸プローブ。
【請求項１６】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２（またはその相補鎖）のうち１つ以上を含む、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１７】
式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸であって、ここで：
−Ｘ−は、ｘ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
−Ｚ−は、ｚ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
−Ｙ−は、（ａ）配列番号１〜１３、配列番号２０〜５３、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６３、配列番号８１、配列番号８６、配列番号８８〜９１、配列番号９９〜１０９、配列番号１１１、もしくは配列番号１１２、または配列番号１１９１のいずれかのｙ個のヌクレオチドのフラグメント、あるいは（ｂ）（ａ）の相補鎖のいずれかからなるヌクレオチド配列であり；
該核酸５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’は、（ｉ）配列番号１〜１３、配列番号２０〜５３、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６３、配列番号８１、配列番号８６、配列番号８８〜９１、配列番号９９〜１０９、配列番号１１１、もしくは配列番号１１２、または配列番号１１９１のフラグメント、あるいは（ｉｉ）（ｉ）の相補鎖のどちらでもなく；
ｘ＋ｚの値は少なくとも１であり；そして
ｘ＋ｙ＋ｚの値は少なくとも８である、
核酸。
【請求項１８】
前記−Ｘ−部分および／または前記−Ｚ−部分がプロモーター配列（またはその相補鎖）を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
ヒト２２番染色体上の２０．４２８メガベースに位置する内因性レトロウイルス内に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットであって、該キットは第１プライマーおよび第２プライマーを含み、ここで、該第１プライマーは該テンプレート配列の一部に対して実質的に相補的である配列を含み、該第２プライマーは該テンプレート配列の相補鎖の一部に対して実質的に相補的である配列を含み、ここで、実質的な相補性を有する該プライマー内の配列が、増幅されるべき該テンプレート配列の末端を規定する、キット。
【請求項２０】
前記テンプレート配列および／またはその相補鎖に対して実質的に相補的でありかつこれらにハイブリダイズし得る、プローブをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記テンプレート配列が、２２番染色体の２０．４２８メガベースに位置するＨＥＲＶ−Ｋの転写物内に位置する、請求項１９または請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のキットであって、前記テンプレート配列が、配列番号１０もしくは配列番号２３もしくは配列番号１１９７もしくは配列番号１１９８のフラグメントであり、そして／または前記テンプレートが、配列番号５３および／もしくは配列番号１１１を含む、キット。
【請求項２３】
前記第１プライマーおよび第２プライマーが前記テンプレート配列の異なったエキソンに位置する、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記プライマーの１つが、配列番号１２０〜３３６のヌクレオチド配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のキットであって、ここで：
（ａ）前記第１プライマーが、Ｎ１の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ２の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｂ）前記第１プライマーが、Ｎ１の相補鎖の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ２の相補鎖の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｃ）前記第１プライマーが、Ｎ１の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、スプライスドナーの下流のＰＣＡＶ配列の一部と実質的に相補的である配列を含み、ここで該スプライスドナーは、それ自体が第２のＰＣＡＶ  ５’ＬＴＲの３’末端近くのスプライスアクセプターの下流にある；
（ｄ）前記第１プライマーが、Ｎ１の相補鎖の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、スプライスドナーの下流のＰＣＡＶ配列の相補鎖の一部と実質的に相補的である配列を含み、ここで該スプライスドナーは、それ自体が第２のＰＣＡＶ  ５’ＬＴＲの３’末端近くのスプライスアクセプターの下流にある；
（ｅ）前記第１プライマーが、Ｎ１−Ｎ２におけるスプライシング連結部位と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、スプライシング連結部位の上流もしくは下流のＰＣＡＶ配列の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｆ）前記第１プライマーが、Ｎ１−Ｎ２におけるスプライシング連結部位の相補鎖と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、スプライシング連結部位の上流または下流のＰＣＡＶ配列の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｇ）前記第１プライマーが、Ｎ３の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ４の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｈ）前記第１プライマーが、Ｎ３の相補鎖の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ４の相補鎖の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｉ）前記第１プライマーが、Ｎ３の一部と実質的に同一である第１配列と、Ｎ４の一部と実質的に同一である第２配列とを含み、そして前記第２プライマーが、上流または下流のＰＣＡＶ配列の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｊ）前記第１プライマーが、Ｎ３の相補鎖の一部と実質的に同一である第１配列と、Ｎ４の相補鎖の一部と実質的に同一である第２配列とを含み、そして前記第２プライマーが、上流または下流のＰＣＡＶ配列の相補鎖の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｋ）前記第１プライマーが、Ｎ３の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、ポリＡテイルの一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｌ）前記第１プライマーが、Ｎ３の相補鎖の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、ポリＡテイルの相補鎖の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｍ）前記第１プライマーが、Ｎ７の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ８の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｎ）前記第１プライマーが、Ｎ７の相補鎖の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ８の相補鎖の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｏ）前記第１プライマーが、Ｎ７の一部と実質的に同一である第１配列と、Ｎ８の一部と実質的に同一である第２配列とを含み、そして前記第２プライマーが、上流または下流のＰＣＡＶ配列の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｐ）前記第１プライマーが、Ｎ７の相補鎖の一部と実質的に同一である第１配列と、Ｎ８の相補鎖の一部と実質的に同一である第２配列とを含み、そして前記第２プライマーが、上流または下流のＰＣＡＶ配列の相補鎖の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｑ）前記第１プライマーが、Ｎ９の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ１０の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｒ）前記第１プライマーが、Ｎ９の相補鎖の一部と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、Ｎ１０の相補鎖の一部と実質的に相補的である配列を含む；
（ｓ）前記第１プライマーが、Ｎ９の一部と実質的に同一である第１配列と、Ｎ１０の一部と実質的に同一である第２配列とを含み、そして前記第２プライマーが、上流または下流のＰＣＡＶ配列の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｔ）前記第１プライマーが、Ｎ９の相補鎖の一部と実質的に同一である第１配列と、Ｎ１０の相補鎖の一部と実質的に同一である第２配列とを含み、そして前記第２プライマーが、上流または下流のＰＣＡＶ配列の相補鎖の一部に実質的に相補的である配列を含む；
（ｕ）前記第１プライマーが、配列番号１１１、配列番号１１２または配列番号５３の第１部分と実質的に同一である配列を含み、そして前記第２プライマーが、配列番号１１１、配列番号１１２または配列番号５３の第２部分と実質的に相補的である配列を含み、その結果該プライマー対は、配列番号１１１、配列番号１１２もしくは配列番号５３の内にあるテンプレート配列、配列番号１１１、配列番号１１２もしくは配列番号５３からなるテンプレート配列または配列番号１１１、配列番号１１２もしくは配列番号５３を含むテンプレート配列を規定する；
（ｖ）前記第１プライマーが、配列番号１１１、配列番号１１２または配列番号５３の相補鎖の第１部分と実質的に同一である第１配列を含み、そして前記第２プライマーが、配列番号１１１、配列番号１１２または配列番号５３の相補鎖の第２部分と実質的に相補的である配列を含み、その結果該プライマー対は、配列番号１１１、配列番号１１２もしくは配列番号５３の内にあるテンプレート配列、配列番号１１１、配列番号１１２もしくは配列番号５３からなるテンプレート配列または配列番号１１１、配列番号１１２もしくは配列番号５３を含むテンプレート配列を規定する、
ここで、Ｎ１〜Ｎ１０は請求項５において規定される通りであり、そして「ＰＣＡＶ」は、ヒト２２番染色体上の２０．４２８メガベースに位置する内因性レトロウイルスである、キット。
【請求項２６】
以下：
（ａ）２２番染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスによってコードされる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６および配列番号１１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６および配列番号１１８８のうちの１つ以上のうちの少なくとも７アミノ酸のフラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６および配列番号１１８８のうちの１つ以上に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｅ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６もしくは配列番号１１８８のＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを含む、ポリペプチド；
（ｆ）式ＮＨ２−ＸＸ−ＹＹ−ＺＺ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドであって、ここで：
ＸＸは、ｘｘ個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；
ＺＺは、ｚｚ個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；
ＹＹは、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６および配列番号１１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列のｙｙ個のアミノ酸のフラグメントを含む、ポリペプチド配列であり；
該ポリペプチドＮＨ２−ＸＸ−ＹＹ−ＺＺ−ＣＯＯＨは、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６および配列番号１１８８から選択されたポリペプチド配列のフラグメントではなく；
ｘｘ＋ｚｚは少なくとも１であり；そして
ｘｘ＋ｙｙ＋ｚｚは多くとも１００である、ポリペプチド
からなる群より選択される、ポリペプチド配列。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の抗体であって、該抗体は、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１１０、配列番号１１８６および／または配列番号１１８８の内のエピトープを認識する、抗体。
【請求項２９】
ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇタンパク質を認識する、請求項２７または請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
２２番染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス由来のｇａｇを認識するが、他のＨＥＲＶ由来のｇａｇは認識しない、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
診断における使用のための、請求項１３〜３１のいずれか１項に記載の核酸、ポリペプチドまたは抗体。
【請求項３３】
請求項１３〜３１のいずれか１項に記載の核酸、ポリペプチドまたは抗体と薬学的受容可能キャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
患者において免疫応答を引き起こす方法であって、免疫原性用量の請求項３３に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
好ましくは免疫原性組成物であり、より好ましくはワクチン組成物である薬学的組成物であって、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を生じさせるために使用され得る、薬学的組成物。
【請求項３６】
ワクチンアジュバントをさらに含有する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
癌に対して活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：試験化合物を、細胞または細胞株由来の組織サンプルに接触させる工程であって、該細胞において、２２番染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの発現がアップレギュレートされ、および該サンプル中での該レトロウイルスの発現をモニタリングする工程であって、ここで、発現の減少が、該試験化合物の抗癌効力を示す工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前立腺癌に対して活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：試験化合物を、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の核酸またはポリペプチドに接触させる工程；および該試験化合物と該核酸または該ポリペプチドとの間の結合相互作用を検出する工程であって、ここで結合相互作用は、該試験化合物の可能な抗癌効力の可能性を示す工程、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、以下の利益を主張する：国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４７８２４（２００２年６月１３日にＷＯ０２／４６４７７として英語で公開された）（２００１年１２月７日出願）；米国特許出願１０／０１６，６０４（２００１年１２月７日出願）；米国仮特許出願６０／３４０，０６４（２００１年１２月７日出願）；および米国仮特許出願６０／３８８，０４６（２００２年６月１２日出願）。
【０００２】
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、各個々の文書が参考として援用されることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、癌、特に前立腺癌の診断に関する。特に、本発明は、腫瘍、特に前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示す、第２２染色体上に位置するヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
前立腺癌は、米国の男性における最も一般的な型の癌である。良性前立腺過形成（ＢＰＨ）は、良性の前立腺細胞の異常な増殖であり、ここで、前立腺は増殖して、尿道および膀胱に圧力をかけ、尿の正常な流れをブロックする。米国における６０〜７０歳の男性の半分以上、および７０〜９０歳の９０％ほどが、ＢＰＨの徴候を有する。ＢＰＨは、ほとんど生命を脅かさないが、徴候を軽減するために処置を必要とする。
【０００５】
前立腺において始まる癌は、原発性前立腺癌（または前立腺の癌）と呼ばれる。前立腺癌は、前立腺に留まり得るか、または、近くのリンパ節に伝播し得、そしてまた、骨、膀胱、直腸および他の器官に伝播し得る。前立腺癌は、最近では、血中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）のレベルを測定することにより診断される。血中のＰＳＡレベルは、前立腺癌、ＢＰＨまたは前立腺における感染を有する男性において上昇し得る。ＰＡＰレベルは、特に、癌が前立腺を越えて伝播した場合、多くの前立腺癌患者において正常値を越えて上昇する。しかし、前立腺癌は、これらの試験単独を使用しては診断し得ない。なぜならば、上昇したＰＳＡまたはＰＡＰレベルはまた、他の非癌性の問題を示し得るからである。
【０００６】
前立腺の状態が良性であるかまたは悪性であるかを決定するのを助力するために、さらなる試験（例えば、経直腸超音波診断、静脈内腎盂Ｘ線像および膀胱鏡検査）が通常実施される。これらの試験の結果が、癌が存在し得ることを示唆する場合、この患者は、唯一の確実な診断方法である生検を受けなければならない。従って、複数の回の厄介な試験手順を受ける必要なく、前立腺癌の早期の検出および診断のための、簡単かつ直接的な試験を提供することが望ましい。前立腺癌の予防および／または処置のための組成物および方法を提供することがまた、所望されそして必要である。
【０００７】
参考文献１および２は、ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２サブグループのヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）が、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示すことを開示する。この所見は、前立腺癌のスクリーニング、診断および治療に有用であるとして開示される。特に、正常組織に対して高レベルのＨＭＬ−２発現産物が、サンプルを採取した患者が癌を有することを示すと言われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前立腺癌の診断、予防および処置に使用され得る、さらなる、そして改善された材料および方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
第２２染色体の２０．４２８メガベース（２２ｑ１１．２）に位置するＨＥＲＶ−Ｋファミリーの特定のメンバーが、前立腺腫瘍において優先的かつ有意にアップレギュレートされることが見出されている。この内因性レトロウイルス（本明細書中で「ＰＣＡＶ」と名付けられる）は、他のＨＥＲＶ−Ｋファミリーメンバーにおいては見出されないいくつかの特徴を有し、これらの特徴は、前立腺癌のスクリーニング、診断および治療（例えば、アジュバント治療）に利用され得る。
【００１０】
本発明は、癌、特に前立腺癌を診断するための方法を提供し、この方法は、第２２染色体の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの発現産物の存在または不在を、患者サンプル中で検出する工程を包含する。正常組織に対してより高いレベルの発現産物は、サンプルを採取した患者が、癌を有することを示す。
【００１１】
検出される発現産物は、好ましくは、ｍＲＮＡ転写物であるが、あるいは、このような転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。これらの発現産物は、直接的または間接的に検出され得る。直接的な試験は、患者サンプル中のＰＣＡＶ  ＲＮＡまたはポリペプチドを検出するアッセイを使用する。間接的な試験は、ＰＣＡＶからインビボで直接的に発現されない生体分子を検出するアッセイ（例えば、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを検出するアッセイ、またはＰＣＡＶポリペプチドに対する応答において上昇した抗体を検出するアッセイ）を使用する。
【００１２】
（Ａ．ヒト第２２染色体内因性レトロウイルス）
公開されたヒトゲノム配列の中の多くの領域が、内因性レトロウイルスと注釈され、配列が決定される前でさえ、ヒトゲノムは、複数のＨＥＲＶを含むことが知られていた。多くのＨＥＲＶの１つは、第２２染色体の２０．４２８メガベースに位置するＨＥＲＶ−Ｋであり、本明細書中で「ＰＣＡＶ」と称される。このＨＥＲＶの発現は、癌組織においてアップレギュレートされることが見出されている。さらに、ＰＣＡＶは、他のＨＥＲＶには見出されない５つの特異的な特徴を有する。これらの５つの特徴は、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ転写物で顕著であり、そして、スクリーニング、診断および治療に利用され得る：（１）ゲノム内に他のＨＥＲＶから区別する特異的なヌクレオチド配列を有するが、この配列は、他のＨＥＲＶと有意な同一性を共有する；（２）タンデムな５’ＬＴＲを有する；（３）フラグメント化された３’ＬＴＲを有する；（４）ｅｎｖ遺伝子がａｌｕ挿入により中断される；および（５）ｇａｇが独特の挿入を含む。
【００１３】
（Ａ．１−ヌクレオチド配列）
ＰＣＡＶは、ＨＥＲＶ−ＫサブファミリーＨＭＬ２．０のメンバーである。ヒトゲノム一倍体（ハプロイド）あたり、大まかに、３０〜５０コピーのＨＭＬ２．０ウイルスが存在する。ＨＭＬ２ウイルスは、ヒトの祖先において少なくとも２倍挿入されていたようである：３０００万年前、類人猿系統（ヒトを含む）が猿から枝分かれする前；および２０００万年前、枝分かれ後。３０００万年挿入由来のウイルスは、時々「旧型」ウイルスと称され、そして、２０００万年挿入由来のウイルスは「新型」ウイルスと称される｛３｝。旧型および新型ウイルスタンパク質は、アミノ酸配列レベルで非常に高く関連するが、いくつかの識別エピトープが存在する。ＤＮＡ配列の同一性は、ゲノムのある領域で高いが、他の領域（特にＬＴＲ）において、保存は、約７０％のみである。旧型および新型ＬＴＲ間の違いの大半は、転写開始の近くにクラスター形成され、ここで、旧型ウイルスは、新型ウイルスと比較して１つまたは２つの挿入を有する。旧型および新型ＬＴＲは、系統学分析において２つの別々の群としてクラスター形成する（図１）。相対的遺伝的年齢にと調和して、旧型ウイルスはまた、新型ウイルスよりも多い中断および欠失を含む。
【００１４】
ＰＣＡＶは、新型および旧型ウイルスの間の再配列から生じたようにみえる。このウイルスの５’領域（図２）は、新型ウイルス由来の１６２ｂｐが後続する新型ＬＴＲから開始する。新型ウイルスの残りは、失われているように見え、５５２ｂｐの非ウイルス配列がこの１６２ｂｐの後に続き、次いで、ほとんど完全な旧型ウイルスが続く。旧型ウイルスの３’ＬＴＲ（図３）は、フラグメント化され、そして、ＭＥＲ１１ａ挿入を含む。
【００１５】
配列番号１は、ＰＣＡＶの１２３６６ｂｐ配列であり、入手可能なヒト第２２染色体配列に基づき｛４｝、最初の５’ＬＴＲの開始部から、そのフラグメント化された３’ＬＴＲの最後までである。これは、二本鎖ゲノムＤＮＡのセンス鎖である。配列番号１０は、配列番号１のヌクレオチド５５９（転写開始部位の可能性がある）からポリアデニル化部位まで（配列番号１のヌクレオチド１１７３５まで）のＰＣＡＶの１１１０１ｂｐ配列であるが、より下流の転写開始部位（例えば、ヌクレオチド６３５±５）がより好ましい。
【００１６】
ＰＣＡＶの特異的な配列は、ｍＲＮＡレベルおよびアミノ酸レベルの両方で顕著であり、そして、ゲノム内で他のＨＥＲＶからＰＣＡＶを区別するのに使用され得る。
【００１７】
（Ａ．２−タンデム５’ＬＴＲ）
ＨＥＲＶ−Ｋの５’ＬＴＲの下流（ｇａｇオープンリーディングフレームの始点の前）に、保存されたスプライスドナー部位（５’ＳＳ）が存在する。このスプライスドナーは、ｅｎｖオープンリーディングフレームの始点のスプライスアクセプター部位（３’ＳＳ）に結合し得る（図４）。
【００１８】
ＨＥＲＶ−Ｋゲノムはまた、ＬＴＲの３’末端の近くに２つのスプライスアクセプター配列を含むが、これらは普通に使用されない。なぜならば、これらは、上流にウイルススプライスドナーパートナーを有さないからである。しかし、ＰＣＡＶは、５’末端に２つのＬＴＲを有する：第１のＬＴＲは、新型ＨＥＲＶ−Ｋ由来であり、第２のＬＴＲは旧型ＨＥＲＶ−Ｋ由来である。従って、旧型ＬＴＲの通常使用されないスプライスアクセプターは、新型ＬＴＲのスプライスドナーと協調し得（図２）、そして、これらのスプライスドナー／アクセプター対から生じる転写物は、ＰＣＡＶに特異的である。
【００１９】
第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位を使用して形成される転写物は、以下：（ｉ）第１の５’ＬＴＲの転写開始部位から転写され、第１の５’ＬＴＲの下流に近接するスプライスドナー部位まで続く配列を含み、この配列は、（ｉｉ）第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位の１つから転写される配列を含み、（ｉ）は（ｉｉ）に結合される。このような転写物の検出は、ＰＣＡＶが転写されていることを示す。
【００２０】
配列番号１において：第１の５’ＬＴＲの転写開始部位は、他のウイルスとの相同性によるとヌクレオチド５５９であるが、経験的にはさらに下流（例えば、約６３５±２）であるように見える；第１の５’ＬＴＲの下流の保存されたスプライスドナー部位は、ヌクレオチド１０７６〜１０８１である；第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くの２つのスプライスアクセプター部位は、ヌクレオチド２５９３〜２６１１および２６８０〜２６９９である。配列番号２は、予測される転写開始部位とスプライスドナー部位との間の配列である。配列番号３は、第１のスプライスアクセプター部位に後続する最初の１０ヌクレオチドである。配列番号４は、第２のスプライスアクセプター部位に後続する最初の１０ヌクレオチドである。配列番号５は、配列番号３と融合した配列番号２である。配列番号６は、配列番号４と融合した配列番号２である。
【００２１】
（Ａ．３−フラグメント化した３’ＬＴＲ）
ＰＣＡＶの３’ＬＴＲは、フラグメント化されており、これとしては、ＭＥＲ１１ａ反復エレメントの挿入が挙げられる（図３）。ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡは、ウイルスＬＴＲ内のシグナルを使用するよりはむしろ、ＭＥＲ１１ａ挿入内のポリアデニル化シグナルを使用して終止する。ＭＥＲ１１ａ配列が後続する３’ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲの部分コピーで終止する転写物は、ＰＣＡＶに特異的である。
【００２２】
ＰＣＡＶ由来の転写物の３’末端は、部分ＬＴＲおよび部分ＭＥＲ１１ａのコピーを含む（図３）。このような転写物の検出は、ＰＣＡＶが転写されていることを示す。
【００２３】
配列番号１において：３’ＬＴＲは、ヌクレオチド１０５２０から開始して、ヌクレオチド１０８３８まで続き、ここで、３’ＬＴＲは、ＭＥＲ１１ａ挿入により中断される；ＭＥＲ１１ａ挿入は、ヌクレオチド１０８３９から開始して、ヌクレオチド１１８３４まで続く；ヌクレオチド１１８３５〜１１９２８の後、３’ＬＴＲは、ヌクレオチド１１９２９〜１２３６６まで続く。ＭＥＲ１１ａ挿入内に、そのポリアデニル化シグナルが存在する（ヌクレオチド１１６５４〜１１６５９の間に位置する）。配列番号７は、３’ＬＴＲの最初の３１９ｎｔフラグメントの配列である。配列番号８は、ポリＡ部位までのＭＥＲ１１ａ挿入の配列である。配列番号９は、配列番号８に融合した配列番号７である。
【００２４】
（Ａ．４−ｅｎｖ内のａｌｕ）
遺伝年代に起因する変異により破壊されるのみならず、ＰＣＡＶのｅｎｖ遺伝子は、ａｌｕ配列により中断される。ｅｎｖおよびａｌｕの両方を含む転写物の検出は、ＰＣＡＶが転写されていることを示す。
【００２５】
配列番号１において、ａｌｕは、ヌクレオチド９９３８〜１０２４４である（配列番号３２）。ａｌｕ配列（９８３８〜９９３７）の直前の１００ヌクレオチドは、配列番号３７であり、その最後の１０マー（９９２８〜９９３７）は、配列番号３３である。ａｌｕ配列の直後の１００ヌクレオチドは、配列番号４０であり、その最初の１０マー（１０２４４〜１０２５３）は、配列番号３４である。ａｌｕ配列の最初の１０ヌクレオチドは、配列番号３５であり、最後の１０ヌクレオチドは、配列番号４１である。配列番号３６は、ａｌｕ／ｅｎｖ境界に架橋する２０マーであり、配列番号４５は、ａｌｕ配列の末端に架橋する２０マーである。配列番号３９は、ａｌｕ／ｅｎｖ境界に架橋する８マーであり、配列番号４４は、ａｌｕ配列の末端に架橋する８マーである。配列番号３８は、配列番号３７＋配列番号３２であり、配列番号４２は配列番号４１＋配列番号４０であり、そして、配列番号４３は配列番号３２＋配列番号４０である。
【００２６】
（Ａ．５−独特のｇａｇ配列）
ＰＣＡＶ  ｇａｇ遺伝子は、４８ヌクレオチド配列（配列番号５３）を含み、これは、他のＨＥＲＶ−Ｋにおいて見出されない。この４８マーは、１６マーの配列番号１１０をコードし、これは、新型由来のｇａｇタンパク質または他の旧型ＨＥＲＶ−Ｋにおいて見出されない。配列番号５３を含む転写物、または配列番号１１０を含むポリペプチドまたは配列番号１１０の内部かもしくは配列番号１１０を含むエピトープを認識する抗体の検出は、従って、ＰＣＡＶが転写されていることを示す。
【００２７】
ＰＣＡＶ  ｇａｇ遺伝子はまた、６９ヌクレオチド配列（配列番号１１１）を含み、これは、新型ＨＥＲＶ−Ｋにおいて見出されない。この６９マーは、２３マーの配列番号５５をコードする。配列番号１１１を含む転写物、または配列番号５５を含むポリペプチド、または配列番号５５の内部かもしくは配列番号５５を含むエピトープを認識する抗体の検出は、従って、旧型ＨＥＲＶ−Ｋ（代表的には、ＰＣＡＶ）が転写されていることを示す。
【００２８】
（Ｂ−ｍＲＮＡ発現産物の検出）
本発明の診断方法は、ｍＲＮＡ検出に基づき得る。ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡは、直接的または間接的に検出され得る。ｍＲＮＡを直接検出することが好ましく、それによってｍＲＮＡから誘導された物質（例えば、ｃＤＮＡ）を別に調製する必要性を省く。
【００２９】
（Ｂ．１−本発明のＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ転写物）
本発明に従って使用するためのｍＲＮＡ転写物は、ＰＣＡＶから転写される。転写物の３つの好ましい型は以下の通りである：（１）第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位を使用してスプライシングされる転写物；（２）３’ＬＴＲとＭＥＲ１１ａ配列との両方を含む転写物；（３）ａｌｕで中断されたｅｎｖ遺伝子を含む転写物；および（４）ＰＣＡＶ特異的なｇａｇ配列を含む転写物。
【００３０】
本発明は、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されたｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００３１】
本発明はまた、配列番号２３、または配列番号２３の５’末端から１００まで（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０または１００））のヌクレオチドを欠失するヌクレオチド配列に対してｎ％以上の同一性（例えば、配列番号１１９７または配列番号１１９８に対してｎ％以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。このヌクレオチド配列は、好ましくは、そのＲＮＡの５’末端であるが、上流配列が存在し得る。このヌクレオチド配列は、そのＲＮＡの３’末端に存在し得るが、ポリＡテイルのようなさらなる下流のエレメントが存在し得る。これらのｍＲＮＡ転写物としては、配列番号２３、配列番号１１９７および配列番号１１９７の対立遺伝子改変体、ＳＮＰ改変体、ホモログ、オーソログ、パラログ、変異体などが挙げられる。
【００３２】
本発明は、第５’ＬＴＲの３’末端の近位のスプライスアクセプター部位を含むスプライシングによって形成されるｍＲＮＡ転写物を提供する。したがって、本発明は、配列−Ｎ１−Ｎ２−を含むｍＲＮＡ転写物（例えば、配列番号２４、配列番号２５、配列番号１１９９または配列番号１２００）を提供し、ここで、Ｎ１は、（ｉ）第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの第１の５’ＬＴＲから転写された５’末端のｍＲＮＡから、（ｉｉ）その第１の５’ＬＴＲから転写されたｍＲＮＡのＵ５領域の下流の第１のスプライスドナー部位までのヌクレオチド配列（例えば、配列番号２６、配列番号１２０１）であり；そして、Ｎ２は、（ｉ）第１のスプライスドナー部位の下流および（ｉｉ）第２のスプライスドナー部位の上流に位置するスプライスアクセプター部位のすぐ下流のヌクレオチド配列（例えば、配列番号２７または配列番号２８）であり、その第２のスプライスドナー部位は、上記の内因性レトロウイルスの第２の５’ＬＴＲの下流に存在する。第１のスプラスドナー部位は、好ましくは、（配列番号１におけるヌクレオチド１０７５の後の）第１の５’ＬＴＲの下流の約１００ヌクレオチドに位置するＨＭＬ２サブファミリーにおいて保存される部位である。第２のスプラスドナー部位は、好ましくは、ＨＭＬ２サブファミリーにおいて保存される部位であり、これは、（配列番号１のヌクレオチド２７７８の後の）の第２の５’ＬＴＲの下流のほぼ１００ヌクレオチドに位置する。上記のスプライスアクセプターは、好ましくは、第２の５’ＬＴＲの下流である。
【００３３】
本発明はまた、配列−Ｎ１−Ｎ２−を含むｍＲＮＡ転写物を提供し、ここで：Ｎ１は、配列番号２６および／または配列番号１２０１に対してａ％以上の配列同一性を有するヌクレオチドであり、そして、Ｎ２は、配列番号２７または配列番号２８に対してｂ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。本発明のｍＲＮＡ転写物は、図５に例示されている。第２スプライス部位を使用する転写物（すなわち、Ｎ２は配列番号２８である）が、好ましい。
【００３４】
両方の場合において、Ｎ１は、好ましくは、そのＲＮＡの５’末端に位置するが、上流の配列が存在し得る。Ｎ２は、そのＲＮＡの３’末端に位置し得るが、通常は、下流配列が存在する。
【００３５】
本発明はまた、配列番号２４、配列番号２５、配列番号１１９９または配列番号１２００に対するｃ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００３６】
本発明は、配列−Ｎ３−Ｎ４−を含むｍＲＮＡ転写物（例えば、配列番号２９）を提供し、ここで：Ｎ３は、第２２染色体の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの３’ＬＴＲの５’フラグメントの３’末端に由来するヌクレオチド配列（例えば、配列番号３０）であり、そしてＮ４は、第２２染色体の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス内のＭＥＲ１１ａ挿入の５’末端からのヌクレオチド配列（例えば、配列番号３１）である。
【００３７】
本発明はまた、配列−Ｎ３−Ｎ４−を含むｍＲＮＡ転写物を提供し、ここで：Ｎ３は、配列番号３０に対してｄ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして、Ｎ４は、配列番号３１に対してｅ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。そのＲＮＡは、配列Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−Ｎ６−を含み、ここで：Ｎ５は、ＭＥＲ１１ａ配列のポリＡシグナルとポリＡ部位との間のヌクレオチド配列であり；そして、Ｎ６はポリＡテイルである。
【００３８】
両方の場合において、この転写物は、一般的に、Ｎ３の上流の配列を含む。この転写物は、一般的に、ポリＡテイルのようなＮ４の下流の配列を含む。
【００３９】
本発明はまた、配列番号２９に対してｆ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００４０】
本発明は、配列−Ｎ７−Ｎ８−を含むｍＲＮＡ転写物（例えば、配列番号３８）を提供し、ここで：Ｎ７は、第２２染色体の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子におけるａｌｕ挿入部分に先立つヌクレオチド配列（例えば、配列番号３７）であり、そして、Ｎ８は、そのａｌｕ挿入部の５’末端で始まるヌクレオチド配列（例えば、配列番号３２）である。
【００４１】
本発明はまた、配列−Ｎ７−Ｎ８−を含むｍＲＮＡ転写物を提供し、ここで：Ｎ７は、配列番号３７に対してｍｍ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして、Ｎ８は、配列番号３２に対してｎｎ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。
【００４２】
その転写物は、一般的に、Ｎ７の上流であってかつＮ８の下流の配列を含む。
【００４３】
本発明はまた、配列番号３８に対してｐｐ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００４４】
本発明は、配列−Ｎ９−Ｎ１０−を含むｍＲＮＡ転写物（例えば、配列番号４３）を提供し、ここで：Ｎ９は、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子中のａｌｕ挿入物の末端のヌクレオチド配列（例えば、配列番号３２）であり、そして、Ｎ１０は、上記のａｌｕ挿入物のすぐ下流のヌクレオチド配列（配列番号４０）である。
【００４５】
本発明はまた、配列−Ｎ９−Ｎ１０−を含むｍＲＮＡ転写物を提供し、ここで：Ｎ９は配列番号４１とｕｕ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり、そしてＮ１０は、配列番号４０とｖｖ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列である。
【００４６】
この転写物は、一般にＮ９の上流かつＮ１０の下流の配列を含む。
【００４７】
本発明はまた、配列番号４２とｗｗ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００４８】
本発明は、配列番号４１とｕｕ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００４９】
この転写物は、一般にＮ９の上流かつＮ１０の下流の配列を含む。
【００５０】
本発明はまた、配列番号５３とｉｉ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００５１】
本発明はまた、配列番号１１１とｉｉ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００５２】
本発明はまた、配列番号１１９１とｉｉ％以上の配列相同性を有するヌクレオチドを含むｍＲＮＡ転写物を提供する。本発明はまた、配列番号９８と少なくともｉｉ％の配列相同性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物を提供する。
【００５３】
（Ｂ．２−ｍＲＮＡの直接的検出および間接的検出）
本発明のＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ転写物は、例えば、ｍＲＮＡの配列決定によってか、またはｍＲＮＡ転写物へのハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロットによって）によって直接的に検出され得る。サンプル中の特定のＲＮＡ配列の存在または不在を検出するための種々の技術が利用可能である｛例えば、参考文献２０および２１｝。
【００５４】
ｍＲＮＡ転写物の間接的な検出がまた可能であり、そして、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ転写物由来の核酸について実施される（例えば、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの検出、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡテンプレートから増幅された核酸の検出など）。
【００５５】
ＲＮＡを検出するための好ましい方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）である｛例えば、参考文献５および１３｝。前立腺細胞由来のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、例えば、参照番号１４〜１９に報告される。ＲＴ−ＰＣＲにおいてＰＣＡＶ特異的なプローブを使用することが好ましい。
【００５６】
直接的または間接的な検出のどちらが使用されても、本発明の方法は、（ａ）ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの形態でかまたは（ｂ）ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの少なくとも一部および／もしくはＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列のコピーを含む核酸の形態でのいずれかの、一本鎖ＰＣＡＶ核酸標的または二本鎖ＰＣＡＶ核酸標的の検出に関する。
【００５７】
本発明の方法は、ＰＣＡＶゲノムＤＮＡの検出に関しない。なぜならば、これは全てのヒト細胞に存在し、従って、その存在は腫瘍の特徴ではないからである。サンプルがＰＣＡＶ  ＤＮＡを含む場合、ＲＮＡ特異的な検出技術を使用するか、またはＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ転写物には存在するが、ＰＣＡＶゲノムＤＮＡには存在しない配列（例えば、スプライスジャンクション、ポリＡテイルなど）に照準を絞ることが好ましい。従って、本発明の方法は、以下の最初の工程を包含し得る：（ａ）患者サンプル由来のｍＲＮＡを抽出する工程；（ｂ）患者サンプルから、ｍＲＮＡを除去することなくＤＮＡを除去する工程；および／または（ｃ）患者サンプルにおいて、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡは除去も破壊もせず、ＰＣＡＶ  ＤＮＡを除去するかまたは破壊する工程。代替法として、相同的なＤＮＡの存在により影響されないＲＮＡ特異的なアッセイが使用され得る。ＲＴ−ＰＣＲのために、ゲノムＤＮＡが除去されるべきである。
【００５８】
生物学的サンプルからＲＮＡを選択的に抽出する方法は、周知であり｛例えば、参考文献２０および２１｝、これらの方法としては、グアニジウム緩衝液、塩化リチウム、酸フェノール：クロロホルム抽出、ＳＤＳ／酢酸カリウムなどに基づく方法が挙げられる。全ての細胞ＲＮＡが抽出された後、例えば、オリゴ−ｄＴ技術を用いて、ｍＲＮＡが富化され得る。
【００５９】
生物学的サンプルから、ｍＲＮＡを除去することなくＤＮＡを除去するための方法は、周知であり｛例えば、参考文献２０の付録Ｃ｝、これらとしては、ＤＮａｓｅ消化が挙げられる。ＤＮａｓｅが使用される場合、新たに合成したＤＮＡの消化を妨げるために、ＤＮａｓｅは、続くＤＮＡ合成またはＤＮＡ増幅の前に、（例えば、ＥＤＴＡでのキレート化によって、加熱によってかまたはプロテイナーゼＫ処理とそれに続くフェノール／クロロホルム抽出、およびＮＨ４ＯＡｃ／ＥｔＯＨ沈殿によって）除去されるかまたは不活性化されなければならない。
【００６０】
ＰＣＡＶ  ＲＮＡを除去せずＰＣＡＶ  ＤＮＡを除去するための方法は、ＰＣＡＶ  ＤＮＡ内の配列に特異的である試薬（例えば、ＰＣＡＶゲノム内のＤＮＡ配列を認識するが、対応するＲＮＡ配列は切断しない制限酵素）を使用する。
【００６１】
サンプルからＰＣＡＶ  ｍＲＮＡを特異的に精製するための方法がまた使用され得る。このような方法の１つは、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡに結合する親和性支持体を使用する。この親和性支持体は、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡに結合するポリペプチド配列（例えば、配列特異的な様式でＨＥＲＶ−Ｋ  ｍＲＮＡのＬＴＲに結合するｃＯＲＦポリペプチド、またはＲＮＡ転写物中のＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲを認識することが示されているＨＩＶ  Ｒｅｖタンパク質｛２２｝）を含み得る。
【００６２】
ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡは、検出のためには、野生型の形態を維持する必要はない。ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡは、例えば、フラグメント化され得るが、但し、フラグメント化は、ｍＲＮＡ内のＰＣＡＶ特異的な配列を維持する。
【００６３】
（Ｂ．３−検出のためのＰＣＡＶ核酸標的）
本発明は、（ａ）第２２染色体の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されたｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列、および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号１０、配列番号１１９７および／または配列番号１１９８とｑｑ％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ＰＣＡＶは、第６染色体の４７．１メガベースに見られるＨＥＲＶ−Ｋと約８７．５％同一であり、そして、第３染色体の１０３．７５メガベースで見られるＨＥＲＶ−Ｋと約８６％同一である。
【００６４】
本発明は、（ａ）上で規定したヌクレオチド配列−Ｎ１−Ｎ２−および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号１１９９もしくは配列番号１２００とｃ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００６５】
本発明は、（ａ）上で規定したヌクレオチド配列−Ｎ３−Ｎ４−および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号９とｆ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００６６】
本発明はまた、（ａ）上で規定したヌクレオチド配列−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−Ｎ６−および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００６７】
本発明は、（ａ）上で規定したヌクレオチド配列−Ｎ７−Ｎ８−および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、（ａ）配列番号３８とａａ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００６８】
本発明は、（ａ）上で規定したヌクレオチド配列−Ｎ９−Ｎ１０−および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号４２とｈｈ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００６９】
本発明は、配列番号５３とｂｂｂ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００７０】
本発明は、配列番号１１１とｆｆｆ％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または（ｂ）（ａ）の相補体を含む核酸を提供する。
【００７１】
特異的な核酸標的としては、配列番号９９〜１０９が挙げられ、これらは、スプライス改変体のｃＤＮＡ配列であり、配列番号１の５９９に転写開始部位を仮定し、そして３’末端に４つのＡ残基を含む。より下流の転写開始部位（例えば、配列番号１のヌクレオチド６３５）を仮定すると、これらの核酸標的は、配列番号９９〜１０９の５’末端でのヌクレオチドのストレッチを含まない（例えば、これらは、５’ヌクレオチドの、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、１００またはそれ以上を含まない）。ｃＤＮＡ配列に基づく２５マー配列は、配列番号３３７〜５９９として与えられる。
【００７２】
（Ｂ．４−ｍＲＮＡの直接的または間接的な検出のための核酸材料）
本発明はＰＣＡＶ核酸標的にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００７３】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加する条件は、当該分野で広く知られ、公開されている｛例えば、参考文献２１のページ７．５２を参照のこと｝。（ストリンジェンシーを増すための）適切な条件の例は次のものを含む。：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ここでのＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝剤）の濃度の緩衝液および他の緩衝系を用いたそれらの等価物；０％、２５％、５０％および７５％の濃度のホルムアミド；５分間〜２４時間の保温時間；１、２回およびそれ以上の洗浄段階；１分間、２分間または１５分間の洗浄インキュベーション時間；および６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水による洗浄溶液。ハイブリダイゼーションの技術およびその最適化は当該分野で周知である｛例えば、参考文献２０、２１、２３、２４、２８などを参照のこと｝。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸を本発明の標的と低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。他の実施形態では、中間のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。より好ましい実施形態では、それは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の典型的な一組は５０℃および１０×ＳＳＣである。中間のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の典型的な一組は５５℃および１×ＳＳＣである。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の典型的な一組は６８℃および０．１×ＳＳＣである。
【００７５】
本発明の好ましい核酸はＰＣＡＶ核酸標的にハイブリダイズするが、他のＨＥＲＶ−Ｋからの核酸標的にはハイブリダイズしない。ＰＣＡＶ特異的なハイブリダイゼーションには、ＰＣＡＶ転写物中で見られるが、他のＨＥＲＶ−Ｋ転写産物では見られない特徴（例えば、特異的ヌクレオチド配列）、タンデムの５’ＬＴＲから生じる特徴、３’ＬＴＲにあるＭＥＲ１１ａの挿入から生じる特徴、またはｅｎｖのａｌｕ中断から生じる特徴を利用することによって与えられる。配列の整列は、他のＨＥＲＶ−Ｋゲノムと大部分異なり、ＰＣＡＶ特異的なハイブリダイゼーションが起こり得るＰＣＡＶの領域を決めるために用いられ得る。ＰＣＡＶに対する特異性は多くの細胞で見られる他の新しいＨＥＲＶ−Ｋの低レベルの天然のバックグラウンドの発現より高いそのアップレギュレーションを検出するためには好ましい。
【００７６】
本発明の好ましい核酸の１グループは、２番目の５’ＬＴＲの３’末端近辺のスプライスアクセプター部位を用いてＰＣＡＶ産物を特異的に検出し得る。上で記載したように、そのようなスプライシングがＰＣＡＶのゲノムＤＮＡにおいて並列しない、配列Ｎ１およびＮ２を一緒にする。従って、本発明はＰＣＡＶ核酸標的中の配列−Ｎ１−Ｎ２−（またはその相補体）にハイブリダイズするが、配列Ｎ１またはＮ２単独（またはその相補体単独）にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸は、Ｎ１（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第１の配列およびＮ２（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第２の配列を含む。その結果、Ｎ１およびＮ２が隣接する標的にハイブリダイズするが、スプライシングによってＮ１およびＮ２が一緒にならなかった標的にはハイブリダイズしない。そのような核酸は、Ｎ１およびＮ２の相対的な位置が異なるので、ＰＣＡＶゲノムＤＮＡの存在下で、ＰＣＡＶ転写産物を同定し得る。
【００７７】
本発明の好ましい核酸の他のグループは３’ＬＴＲおよびＭＥＲ１１ａ配列を含むｍＲＮＡを特異的に検出し得る。従って、本発明はＰＣＡＶ核酸標的中にある−Ｎ３−Ｎ４−配列（またはその相補体）にハイブリダイズするが、配列Ｎ３およびＮ４単独（またはその相補体単独）にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸はＮ３（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第１の配列およびＮ４（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第２の配列含む。その結果、その核酸は（ｉ）３’ＬＴＲおよび（ｉｉ）ＭＥＲ１１ａ配列の両方を含む標的にハイブリダイズするが、（ｉ）および（ｉｉ）の１つだけを含む標的にはハイブリダイズしない。核酸は本質的にゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る。しかし、この特性は転写産物の検出には有用でない。
【００７８】
本発明の好ましい核酸の他のグループはａｌｕに中断されたｅｎｖ遺伝子を含むｍＲＮＡを特異的に検出し得る。従って、本発明はＰＣＡＶ核酸標的にある配列−Ｎ７−Ｎ８−（またはその相補体）にハイブリダイズするが、配列Ｎ７またはＮ８単独（またはその相補体単独）にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸はＮ７（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第１の配列およびＮ８（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第２の配列含む。その結果、その核酸は（ｉ）ａｌｕの中断のすぐ前にあるｅｎｖ配列および（ｉｉ）ａｌｕの中断の両方を含む標的にハイブリダイズするが、（ｉ）および（ｉｉ）の１つだけを含む標的にはハイブリダイズしない。核酸は本質的にゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る。しかし、この特性は転写産物の検出には有用でない。
【００７９】
本発明はまた、ＰＣＡＶ核酸標的にある配列−Ｎ９−Ｎ１０−（またはその相補体）にハイブリダイズするが、配列Ｎ９またはＮ１０単独（またはその相補体単独）にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸はＮ９（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第１の配列およびＮ１０（またはその相補体）にハイブリダイズし得る第２の配列含む。そのため、その核酸は（ｉ）ｅｎｖ配列内のａｌｕの中断の３’領域および（ｉｉ）ａｌｕの中断のすぐ下流にある配列の両方を含む標的にハイブリダイズするが、（ｉ）および（ｉｉ）の１つだけを含む標的にはハイブリダイズしない。核酸は本質的にゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る。しかし、この特性は転写産物の検出には有用でない。
【００８０】
核酸のＰＣＡＶ核酸標的にハイブリダイズする能力は外因性の性質（例えば、温度、塩濃度など）に加えて、その固有の性質（例えば、標的に対する配列同一性の程度）に関連している。本発明の好ましい核酸のグループは、ＰＣＡＶ核酸標的にハイブリダイズする良好な固有の能力を持っている。
【００８１】
従って、本発明は、ＰＣＡＶ核酸標的断片またはＰＣＡＶ核酸標的断片の相補体に対してｓ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号１０の断片または配列番号１０の断片の相補体に対してｇ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号５の断片または配列番号５の断片の相補体に対してｈ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号６の断片または配列番号６の断片の相補体に対してｉ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号９の断片または配列番号９の断片の相補体に対してｊ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号５３の断片または配列番号５３の断片の相補体に対してｃｃｃ％またはそれ以上の同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号１１９１に対してｋｋｋ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号９８に対して少なくともｍｍｍ％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号１１９８とｎｎｎ％またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号１１９９と少なくともｑｑｑ％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号１２００と少なくともｒｒｒ％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【００８２】
本発明は配列番号１０または配列番号１０の相補体の少なくともｋ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸を提供する。その断片は好ましくは配列番号１１９７および／または１１９８の中に位置する。
【００８３】
本発明はまた、配列番号４７または配列番号４７の相補体の少なくともｌ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸配列を提供する。その断片は、好ましくは、ヌクレオチド配列Ｂ１ａ−Ｂ２ａ（またはその相補体）を含み、Ｂ１ａは配列番号２の３’末端からｍ個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、Ｂ２ａは配列番号４６の５’末端からｐ個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。これらの核酸は、配列Ｎ１およびＮ２を共に架橋するスプライス接合部におよび、従って、Ｂ１ａおよびＢ２ａの相対的な位置が違うので、ＰＣＡＶゲノムＤＮＡの存在下で、ＰＣＡＶ転写産物を同定し得る。Ｂ１ａ−Ｂ２ａは、好ましくは、配列番号１１（またはその相補体）（ここでｍ＝ｐ＝４である）を含み、より好ましくは、配列番号５０（またはその相補体）（ここでｍ＝ｐ＝１０である）を含む。
【００８４】
本発明はまた、配列番号４９または配列番号４９の相補体の少なくともｑ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は好ましくは、ヌクレオチド配列Ｂ１ｂ−Ｂ２ｂ（またはその相補体）を含み、その中で、Ｂ１ｂは配列番号２の３’末端からｒ個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびＢ２ｂは配列番号４８の５’末端からｔ個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は、配列Ｎ１およびＮ２を一緒にするスプライス接合部におよび、Ｂ１ｂおよびＢ２ｂの相対的な位置が違うので、ＰＣＡＶゲノムＤＮＡの存在下で、ＰＣＡＶ転写産物を同定し得る。Ｂ１ｂ−Ｂ２ｂは、好ましくは、配列番号１２（またはその相補体）（ここでｒ＝ｔ＝４である）を含み、より好ましくは、配列番号５１（またはその相補体）（ここでｒ＝ｔ＝１０である）を含む。
【００８５】
本発明はまた、配列番号９または配列番号９の相補体の少なくともｕ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は、好ましくは、ヌクレオチド配列Ｂ３−Ｂ４（またはその相補体）を含み、その中で、Ｂ３は配列番号７の３’末端からｖ個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびＢ４は配列番号８の５’末端からｗ個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は、配列Ｎ３およびＮ４の両方の一部を含む。Ｂ３−Ｂ４は、好ましくは、配列番号１３（またはその相補体）（ここでｖ＝ｗ＝４である）を含み、より好ましくは、配列番号５２（またはその相補体）（ここでｖ＝ｗ＝１０である）を含む。
【００８６】
本発明はまた、配列番号３８または配列番号３８の相補体の少なくともｒｒ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は、好ましくは、Ｂ７−Ｂ８（またはその相補体）のヌクレオチド配列を含み、その中で、Ｂ７は配列番号３７の３’末端からｓｓ個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびＢ４は配列番号３２の５’末端からｔｔ個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は配列Ｎ７およびＮ８の両方の一部を含む。Ｂ７−Ｂ８は好ましくは、配列番号３９（またはその相補体）（ここでｓｓ＝ｔｔ＝４である）を含み、より好ましくは、配列番号３６（またはその相補体）（ここでｓｓ＝ｔｔ＝１０である）を含む。
【００８７】
本発明はまた、配列番号４３または配列番号４３の相補体の少なくともｊｊ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は、好ましくは、ヌクレオチド配列Ｂ９−Ｂ１０、またはその相補体を含み、その中で、Ｂ９は配列番号３２の３’末端からｋｋ個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびＢ１０は配列番号４０の５’末端からｌｌ個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は、配列Ｎ９およびＮ１０の両方の一部を含む。Ｂ９−Ｂ１０は好ましくは、配列番号４４（またはその相補体）（ここでｋｋ＝ｌｌ＝４である）を含み、より好ましくは、配列番号４５（またはその相補体）（ここでｋｋ＝ｌｌ＝１０である）を含む。
【００８８】
本発明はまた、配列番号５３または配列番号５３の相補体の少なくともｄｄｄ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。本発明は、配列番号１１１または配列番号１１１の相補体のヌクレオチドの少なくともｇｇｇの連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号１１２または配列番号１１２の相補体の少なくともｈｈｈ個の連続する断片を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号１１９１または配列番号１１９１の相補体の少なくともｊｊｊ個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。
【００８９】
本発明は、式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸も提供する。その中で−Ｘ−はｘヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｚ−はｚヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｙ−は（ａ）配列番号１〜１３、２０〜５３、５７、５８、６３、８１、８６、８８〜９１、９９〜１０９、１１１、１１２、１１９１、１１９７または１１９８の内のいずれかのｙヌクレオチドの断片または（ｂ）（ａ）の相補体のどちらかからなるヌクレオチド配列であり；そして上記核酸５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’は、（ｉ）配列番号１〜１３、２０〜５３、５７、５８、６３、８１、８６、８８〜９１、９９〜１０９、１１１、１１２、１１９１、１１９７または１１９８、もしくは（ｉｉ）（ｉ）の相補体のどちらでもない。
【００９０】
−Ｙ−が（ａ）の場合、−Ｘ−のヌクレオチド配列は好ましくは、配列番号１〜１３、２０〜５３、５７、５８、６３、８１、８６、８８〜９１、９９〜１０９、１１１、１１２、１１９１、１１９７または１１９８における配列−Ｙ−の５’側であるｘヌクレオチドとｂｂ％より少ない配列同一性を共有し、そして／または−Ｚ−のヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１〜１３、２０〜５３、５７、５８、６３、８１、８６、８８〜９１、９９〜１０９、１１１、１１２、１１９１、１１９７または１１９８における配列−Ｚ−の３’側であるｚヌクレオチドとｃｃ％より低い配列同一性を共有する。
【００９１】
−Ｙ−が（ｂ）の場合、−Ｘ−のヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１〜１３、２０〜５３、５７、５８、６３、８１、８６、８８〜９１、９９〜１０９、１１１、１１２、１１９１、１１９７または１１９８における配列−Ｙ−の相補体の５’側であるｘヌクレオチドの相補体とｂｂ％より少ない配列同一性を共有し、そして／または−Ｚ−のヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１〜１３、２０〜５３、５７、５８、６３、８１、８６、８８〜９１、９９〜１０９、１１１、１１２、１１９１、１１９７または１１９８における配列−Ｙ−の相補体の３’側であるｚヌクレオチドの相補体とｃｃ％より低い配列同一性を共有する。
【００９２】
−Ｘ−部分および／または−Ｚ−部分は、プロモーター配列（またはその相補体）を含み得る。
【００９３】
本発明は、配列番号５３のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。この配列は、ヒトゲノム内のＰＣＡＶに特異的である。本発明はまた、配列番号１１１のヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【００９４】
本発明はまた、配列番号１１９１を含む核酸も提供する。
【００９５】
様々なＰＣＡＶ核酸が本発明により、提供される。ＰＣＡＶ配列の２５マーの断片は、配列番号１２０〜１１８４として提示される。本発明は、これらの配列を２５マーの配列として、ならびにその断片（例えば、それぞれ、２×２４マー、３×２３マー、４×２２マー．．．１９×７マー）およびこれらの２５マーを含むより長いＰＣＡＶ断片としても提供する。
【００９６】
本発明の好ましい核酸は、配列番号５３および８４２〜１１８４のうちの１つ以上を含む。
【００９７】
本発明の核酸は、プローブとして、ならびに／またはハイブリダイゼーションおよび／または増幅反応に用いるプライマーとして特に有用である。
【００９８】
本発明の１つ以上の核酸が、同じ標的にハイブリダイズし得る（例えば、１つ以上が、１本鎖ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズし得る）。
【００９９】
（Ｂ．５−核酸の増幅）
試料中の核酸は、好都合なことに、および敏感に核酸増幅技術（例えば、ＰＣＲ，ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ，Ｔ７増幅など）により検出し得る。この技術は、好ましくは指数関数的な増幅をもたらす。ＲＮＡを用いる好ましい技術はＲＴ−ＰＣＲである（例えば参考文献２０の１５章を参照のこと）。その技術は定量的および／またはリアルタイムであり得る。
【０１００】
増幅技術は、一般に、２つのプライマーの使用を含む。標的配列が１本鎖である場合、その技術は、２本鎖の標的を与えるために、相補的な１本鎖を作る準備段階を一般的に含む。２つのプライマーは、２本鎖の標的の異なる１本鎖にハイブリダイズし、次いで伸張する。伸張した産物は、ハイブリダイゼーション／伸張のさらなるラウンドについての標的として働き得る。最終的な効果は、標的内のテンプレート配列を増幅することであり、標的中の２つのプライマーの位置により、テンプレートの５’末端および３’末端が定義される。
【０１０１】
本発明は、ＰＣＡＶ核酸標的に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットを提供し、このキットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む。第１のプライマーは前記テンプレート配列の一部と実質的に相補的である配列を含み、第２のプライマーは前記テンプレート配列の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含む。実質的な相補性を有する前記プライマー中の配列は増幅されるテンプレート配列の末端を定義する。
【０１０２】
本発明のキットは、テンプレート配列および／またはその相補体に実質的に相補的であり、そしてそれらにハイブリダイズし得るプローブをさらに含み得る。このプローブをハイブリダイゼーション技術に使用して、増幅したテンプレートを検出し得る。
【０１０３】
本発明のキットは、定量的な測定を補助するために内標を作製し、検出するためのプライマーおよび／またはプローブをさらに含み得る（例えば、１５、２５）。
【０１０４】
本発明のキットは、（例えば、ネスト化した増幅についての）１組以上のプライマーを含み得、そして１つのプライマーは、１つ以上のプライマーの組に共通であり得る。キットはまた、１つ以上のプローブも含み得る。
【０１０５】
テンプレート配列は、好ましくは第２２染色体のメガベース２０．４２８に位置するＨＥＲＶ−Ｋの転写物内に位置し、そしてより好ましくは、配列番号１０（または配列番号２３）のフラグメントである。テンプレート配列は、好ましくは、少なくとも５０のヌクレオチド長（例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、３０００、またはそれより長いヌクレオチド）である。テンプレートの長さは、テンプレートが位置する標的の長さにより固有に制限される。しかし、テンプレート配列は５００ヌクレオチドより短い方（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、またはそれより短く）が好ましい。
【０１０６】
好ましいテンプレートは、配列番号５３および／または配列番号１１１を含む。
【０１０７】
本発明のキットに使用されるプライマーおよびプローブは、好ましくは、上記Ｂ．４節で記載される通りの核酸である。特に好ましいプライマーは、配列番号６００〜１１８４（またはその相補体）に基づいたプライマーである。例えば、配列番号６００〜１１８４を含むプライマー、またはｐｐｐのフラグメントまたは配列番号６００〜１１８４の内の１つ由来のさらなるヌクレオチドを含むプライマーを含む。
【０１０８】
プライマーおよびプローブのさらなる特徴は、以下のＢ．６節に記載される。
【０１０９】
キットは、プライマーの組（ｉ）および（ｉｉ）が、配列番号１０中のテンプレート配列を決定するような（ｉ）配列番号１０の一部と実質的に同一である配列を含む第１のプライマーおよび（ｉｉ）配列番号１０の一部と実質的に相補的な配列を含む第２のプライマーを含むことが、好ましい。他の好ましいキットは、プライマーの組が、配列番号１０中のテンプレート配列を決定するような（ｉ）配列番号１０の相補体の一部と実質的に同一である配列を含む第１のプライマーおよび（ｉｉ）配列番号１０の相補体の一部と実質的に相補的な配列を含む第２のプライマーを含むことが好ましい。一部の配列およびテンプレート配列は、好ましくは、配列番号１１９７または配列番号１１９８の範囲である。
【０１１０】
プライマーの１つまたは両方が、プライマーの組がＰＣＡＶに特異的であるように、ＰＣＡＶ（または、その相補体）以外の、ＨＥＲＶ−Ｋの一部と実質的に相補的ではないことが好ましい。
【０１１１】
配列番号１０は、以下の４つのエキソンに分けられ得る：（１）第１の５’ＬＴＲの下流の保存されたスプライスドナーまでの配列を含む、ヌクレオチド１〜５１７；（２）第２の５’ＬＴＲの３’末端の付近のスプライスアクセプターと保存されたスプライスドナーの間の配列を含む、ヌクレオチド２１４２〜２２０９；（３）ヌクレオチド７６０８〜７６８６；および（４）ヌクレオチド９８６６〜１１１８１（配列番号１のヌクレオチド５５９で仮定される転写開始点）。エクソン（２）は、タンデムの５’ＬＴＲのユニークなＰＣＡＶ特徴に起因して生じる。しかし、他の３つのエキソンは、他のＨＥＲＶ−Ｋに存在する。
【０１１２】
本発明の好ましいキットにおいて、第１および第２のプライマーは、異なったエキソンに位置している。このアライメントは、増幅されたテンプレート配列が、ゲノムＤＮＡから得られるものより短いことを意味する。なぜなら、それはイントロンの欠如のためである。例えば、以下：
【０１１３】
【化１】
2006508690.tif 000002
。
【０１１４】
従って、配列番号１０を参照すると、プライマーは、以下の組み合わせの間に位置する配列番号１０（またはその相補体）のフラグメントを含み得る。
【０１１５】
【化２】
2006508690.tif 000003
。
【０１１６】
配列番号１を参照すると、これらの組み合わせは以下である：
【０１１７】
【化３】
2006508690.tif 000004
。
【０１１８】
しかし、さらに下流の転写開始点で、第１のエキソンは、ヌクレオチド５５９の下流、例えばヌクレオチド６３３、６３５または６３７の周辺から始まり得る。
【０１１９】
エキソン１内の例示的なプライマーは、配列番号１２０〜２１９である。エキソン２〜４内の例示的なプライマーは、配列番号２２０〜３３６である。
【０１２０】
他の好ましいキットにおいて、第１のプライマーおよび第２のプライマーの１つまたは両方は、プライマーがスプライシング後のエキソン−エキソンの結合を結びつけるように、第１のエキソンからの第１の配列および第２のエキソンからの第２の配列を含む。例えば、プライマーは、エキソン１と２、エキソン１と３、エキソン１と４、エキソン２と３、エキソン２と４または、エキソン３と４からの配列を含み得る。これらのプライマーは、スプライシングが起こる位置で転写物にハイブリダイズする。
【０１２１】
従って、配列番号１０を参照すると、プライマーは、以下の組み合わせの３’末端からの第１の配列および以下の組み合わせ（またはその相補体）の５’末端からの第２の配列を含み得る：
【０１２２】
【化４】
2006508690.tif 000005
。
【０１２３】
しかし、さらに下流の転写開始点を取ると、第１の配列を選択するための「１〜５１７」の範囲は、「７７〜５１７」の周辺、例えば７５〜５１７、または８０〜５１７と置き換えるべきである。
【０１２４】
第２の５’ＬＴＲの３’末端近くのスプライスアクセプター部位が、使用されるＰＣＡＶ標的核酸を検出するための好ましいキットでは、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ１の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、Ｎ２の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ１の相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、Ｎ２の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。このプライマーの組は、ＰＣＡＶ特異的スプライシング部位を結びつけるテンプレート配列を定義する。スプライシング部位が使用された標的の増幅した配列は、スプライシングされない標的（図５）またはゲノムＤＮＡより短い。スプライスアクセプター部位のすぐ上流のＬＴＲにおいて（例えば、ＰＣＡＶの第２の５’ＬＴＲ、または他のＨＥＲＶの１本鎖５’ＬＴＲにおいて）転写が開始され得る標的では、増幅した配列は、より上流の５’ＬＴＲでの転写が始まるＰＣＡＶ標的より短い。
【０１２５】
第２の５’ＬＴＲの３’末端近くのスプライスアクセプター部位が使用される、ＰＣＡＶ産物を検出するための他の好ましいキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ１の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーはスプライスドナーの下流にあるＰＣＡＶ配列の一部と実質的に相補的である配列を含み、そのスプライスドナーは、それ自身、第２のＰＣＡＶ５’ＬＴＲの３’末端の近辺にあるスプライスアクセプターの下流に存在するか、または、（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ１の相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、スプライスドナーの下流にあるＰＣＡＶ配列の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含み、そのスプライスドナーは、それ自身、第２のＰＣＡＶ５’ＬＴＲの３’末端の近辺にあるスプライスアクセプターの下流に存在するかのいずれかである。プライマーは、エキソン２のいずれかのサイドに位置し、従ってエキソン２を結びつけるテンプレート配列を定義する。増幅した配列は、エキソンが存在しない標的エキソンが存在する標的の中での方が、より長くなり（図６Ａ対図６Ｂ）、そしてＰＣＡＶ標的のみが、より長い増幅産物を与え得る。全てのスプライシング産物は、エキソンを含むか否かに関わらず、スプライシングされないｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ標的より短い増幅産物を与える。
【０１２６】
第２の５’ＬＴＲの３’末端近くのスプライスアクセプター部位が使用される、ＰＣＡＶ産物を検出するための他の好ましいキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ１−Ｎ２中のスプライシング連結部位と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、スプライシング連結部位の上流または下流にあるＰＣＡＶ配列の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または、（ｉｉ）第１のプライマーはＮ１−Ｎ２中のスプライシング部位相補体と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、スプライシング連結部位の上流または下流にあるＰＣＡＶ配列の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。第１のプライマーは、Ｎ１の一部と実質的に相補的な第１の配列およびＮ２の一部と実質的に相補的であり、そしてスプライス部位が使われる標的にはハイブリダイズし得るが、スプライシング部位が使用されない標的にはハイブリダイズし得ない第２の配列を含む。このようなプライマーの組の増幅は、標的配列がスプライシング部位の使用により形成される場合でのみ起こり、スプライシングを受けない標的またはゲノムＤＮＡでは起こらない。
【０１２７】
ＰＣＡＶ産物の３’領域を検出するための好ましいキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ３の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーはＮ４の一部と実質的に同一である配列を含むか、または、（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ３の相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、Ｎ４の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。プライマーの組は、３’ＬＴＲ／ＭＥＲ１１ａの部位を結合するテンプレート配列を増殖し、そして増幅は、標的配列が、３’ＬＴＲ配列およびＭＥＲ１１ａ配列の両方を含む場合でのみ起こる（図７）。
【０１２８】
ＰＣＡＶ産物の３’領域を検出するための好ましい他のキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ３の一部と実質的に同一である第１の配列および第２の配列は、Ｎ４の一部と実質的に同一である配列を含み、第２のプライマーは、ＰＣＡＶ配列の上流または下流の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または、（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ３の相補体の一部と実質的に同一であるか、第１の配列およびＮ４の相補体の一部と実質的に同一である第２の配列を含み、そして第２のプライマーは、ＰＣＡＶ配列の上流または下流の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。標的配列が、３’ＬＴＲ配列およびＭＥＲ１１ａ配列の両方の配列を含む場合にのみ増幅が生じるように、３’ＬＴＲ配列およびＭＥＲ１１ａ配列の両方を含む標的にのみ第１のプライマーは、ハイブリダイズする（図７）。増幅産物はゲノム内のものより短いので第２のプライマーは、好ましくは、エキソン３の中に位置する。
【０１２９】
ＰＣＡＶ産物の３’領域を検出するための好ましい他のキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ３の一部と実質的に同一である配列を含み、第２のプライマーは、ポリＡテイルの一部と実質的に相補的である配列を含むか、または、（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ３の相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、第２のプライマーは、ポリＡテイルの相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。このプライマーの組により定義されるテンプレート配列は、３’ＬＴＲがＭＥＲ１１ａの挿入を含む標的中では、３’ＬＴＲがインタクトである標的（例えば、他のＨＥＲＶ）中より長い（図８）。ポリＡ特異性はゲノムＤＮＡが増幅されないことを意味する。
【０１３０】
ａｌｕ中断ｅｎｖを含むＰＣＡＶ産物を検出するための好ましいキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ７の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、Ｎ８の一部と実質的に相補的な配列を含むかまたは、（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ７の相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第２のプライマーは、Ｎ８の相補体の一部と実質的に相補的な配列を含むかのいずれかである。プライマーの組は、ｅｎｖ／ａｌｕの連結を結合するテンプレート配列を増幅し、そして増幅はｅｎｖ配列およびａｌｕ配列の両方を含む標的配列でのみ起生じる。
【０１３１】
ａｌｕ中断ｅｎｖを含むＰＣＡＶ産物を検出するための好ましい他のキットにおいて、（ｉ）第１のプライマーは、Ｎ７の一部と実質的に同一である第１の配列および、Ｎ８の一部と実質的に同一である第２の配列を含み、そして第２のプライマーは、ＰＣＡＶ配列の上流または下流の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または（ｉｉ）第１のプライマーは、Ｎ７の相補体の一部と実質的に同一である第１の配列およびＮ８の相補体の一部と実質的に同一である第２の配列を含み、そして第２のプライマーは、ＰＣＡＶ配列の上流または下流の相補体の一部と実質的に相補的な配列を含む。第１のプライマーは、増幅が、標的配列がａｌｕ配列およびｅｎｖ配列の両方を含む場合でのみ生じるように、ａｌｕ配列およびｅｎｖ配列の両方を含む標的にのみハイブリダイズする。
【０１３２】
ａｌｕ中断ｅｎｖを含むＰＣＡＶ産物を検出するためのさらなる好ましいキットにおいて、（ｉ）第１プライマーは、Ｎ９の部分と実質的に同一な配列を包含し、そして第２プライマーがＮ１０の部分と実質的に相補的である配列を包含するか、または（ｉｉ）第１プライマーがＮ９の相補体の部分と実質的に同一である配列を包含し、そして第２プライマーがＮ１０の相補的部分と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。このプライマー対は、ａｌｕ中断の末端を架橋するテンプレート配列を増幅する。
【０１３３】
ａｌｕ中断ｅｎｖを含むＰＣＡＶ産物を検出するための他の好ましいキットにおいて、（ｉ）第１プライマーは、Ｎ９の部分と実質的に同一な第１配列およびＮ１０の部分と実質的に同一の第２配列を包含し、そして第２プライマーは、上流のＰＣＡＶ配列または下流のＰＣＡＶ配列の部分と実質的に相補的である配列を包含する、あるいは（ｉｉ）第１プライマーがＮ９の相補体の部分の部分と実質的に同一である第１配列およびＮ１０の相補体と実質的に同一である第２配列を包含し、そして第２プライマーが、上流のＰＣＡＶ配列または下流のＰＣＡＶ配列の相補的位置と実質的に相補的である配列を包含する。第１プライマーは、ａｌｕ中断ｅｎｖを包含する標的とのみハイブリダイズする。
【０１３４】
別の好ましいキットは、（ｉ）配列番号１１１、１１２、または５３の第１部分と実質的に同一である配列を含む第１プライマーおよび配列番号１１１、１１２、または５３の第２部分と実質的に相補的である配列を含む第２プライマー、あるいは（ｉｉ）配列番号１１１、１１２、または５３の相補体の第１部分に実質的に同一である配列を含む第１プライマーおよび配列番号１１１、１１２または５３の相補体の第２部分と実質的に相補的な配列を含む第２プライマーのいずれかを含み、その結果プライマー対が、配列番号１１１、１１２または５３からなるまたは配列番号１１１、１１２または５３を含んで、鋳型配列を規定する。
【０１３５】
（Ｂ．６  本発明の核酸の一般的特徴）
本発明の核酸および転写産物は、好ましくは単離された形態または実質的に単離された形態（すなわち、他の核酸を実質的に含まない（例えば、天然に存在する核酸を実質的に含まない）で、一般的に少なくとも約５０％純度（重量％）で、通常は少なくとも約９０％純度で、供給される。
【０１３６】
本発明の核酸は複数の形態をとり得る。
【０１３７】
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。他に特定されない限りまたは要求されない限り、核酸を使用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を形成する各々の２つの相補的一本鎖形態の両方を使用し得る。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸のように、一般的に一本鎖である。
【０１３８】
本発明の核酸は、環状または分岐型であり得るが、一般的に線状である。
【０１３９】
本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に結合され得る。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態において、核酸は、好ましくは少なくとも７ヌクレオチド長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００ヌクレオチドまたはそれより長い）である。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態において、核酸は、好ましくは多くとも５００ヌクレオチド長（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチドまたはそれより短い）である。
【０１４２】
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションで用いる他の核酸は、好ましくは１０〜３０の間のヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド）である。
【０１４３】
本発明の核酸は、おそらく、検出可能な標識（例えば、放射活性標識または蛍光性標識）、あるいはビオチン標識を保有する。このことは、この核酸が、核酸検出技術において使用される場合（例えば、その核酸がプローブまたはプライマーである場合）に、特に有用である。
【０１４４】
本発明の核酸はＰＣＡＶ配列を含むが、その核酸はまた、非ＰＣＡＶ配列を含み得る（例えば、上記で定義されるように、５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’式の核酸における）。これは、特にプライマーにとって有益であり、このようにＰＣＡＶ核酸標的に相補的な第１配列および核酸標的に相補的でない第２配列を含み得る。プライマーにおける任意のそのような非相補的配列は、好ましくは相補的配列に対して５’である。代表的な非相補的配列は、制限部位｛２６｝またはプロモーター配列｛２７｝を含む。
【０１４５】
本発明の核酸は、多くの方法で（例えば、（少なくとも部分的に）化学合成によって）、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いてより長い核酸を消化することによって、より短い核酸（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼ）を連結することによって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからなどで調製され得る。
【０１４６】
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１つ以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、挿入ヌクレオチドの単離、増幅および複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞中の核酸配列の発現のために設計された「発現ベクター」、組み換えウイルスまたはウイルス様微粒子の産生を生じるために設計された「ウイルスベクター」または１つ以上の型のベクターの寄与を含む「シャトルベクター」であり得る。「宿主細胞」としては、外因性核酸のレシピエントであり得るかまたは外因性核酸のレシピエントであった個々の細胞または細胞培養が挙げられる。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そして子孫は（例えば、形態または総ＤＮＡ相補体において）、天然の、偶然のまたは人為的な変異および／または変化に起因して、もとの親細胞と必ずしも完全に同一ではないかもしれない。宿主細胞としては、本発明の核酸を用いて、インビボまたはインビトロでトランスフェクトされたまたは感染された細胞が挙げられる。
【０１４７】
用語「核酸」は、任意の長さの核酸重合体を包含し、一般的に任意の長さの核酸ポリマーを意味し、核酸はデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを包含する。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが挙げられる。核酸はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログ（例えば、修飾された骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または修飾塩基を含むＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ）を包含する。用語「核酸」は、特に示されない限り、核酸の長さや構造に関して制限することを意図しない。そして、次に核酸の非制限例を挙げる：遺伝子または遺伝子フラグメント、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、任意の供給源由来のＤＮＡ、任意の供給源由来のＲＮＡ，プローブ、およびプライマー。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合、その核酸は５’キャップを有し得る。
【０１４８】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列における「Ｕ」がＤＮＡにおいて「Ｔ」で置換されていることが理解される。同様に、核酸がＲＮＡの場合、ＤＮＡ配列における「Ｔ］がＲＮＡにおいて「Ｕ］で置換されていると理解される。
【０１４９】
核酸に関連して用いる場合、用語「補体」または「相補的」は、ワトソン−クリック塩基対合をいう。このように、Ｃの補体はＧであり、Ｇの補体はＣであり、Ａの補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の補体はＡである。例えば、補体プリミジンン（ＣまたはＴ）に対するＩ（プリンイノシン）のような塩基を使用することが可能である。これらの用語はまた、方向性を意味する（５’−ＡＣＡＧＴ−３’の補体は、５’−ＴＧＴＣＡ−３’ではなく５’−ＡＣＴＧＴ−３’である）。
【０１５０】
本発明の核酸は、例えば、ポリペプチドを産生するため；生物学的サンプルにおける核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして；核酸のさらなるコピーを生成するため；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため；一本鎖ＤＮＡプライマーまた一本鎖ＤＮＡプローブとして；あるいは三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして使用され得る。核酸は、好ましくはＰＣＡＶ核酸標的（例えば、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ）を検出するために使用される。
【０１５１】
２つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同定に対する言及は、整列する場合、塩基のパーセンテージは、２つの配列を比較すると同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性またはパーセンテージ配列同一性は、例えば、参考文献２８の７．７．１８節に記載されるもののような、当該分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定され得る。好ましい整列プログラムは、好ましくはデフォルトパラメーターを用いた、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）であり、そのデフォルトパラメーターを以下に示す：オープンギャップ＝３；拡張ギャップ＝１。
【０１５２】
上記で使用されたａ、ａａ、ｂ、ｂｂｂ、ｃ、ｃｃｃ、ｄ、ｅ、ｅｅｅ、ｆ、ｆｆｆ、ｇ、ｈ、ｈｈ、ｉ、ｉｉ、ｊ、ｋｋｋ、ｍｍ、ｍｍｍ、ｎ、ｎｎ、ｎｎｎ、ｐｐ、ｑｑ、ｑｑｑ、ｒｒｒ、ｓ、ｕｕ、ｖｖ、およびｗｗの％の値は、各々独立して、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、または１００であり得る。各々のａ、ａａ、ｂ、ｂｂｂ、ｃ、ｃｃｃ、ｄ、ｅ、ｅｅｅ、ｆ、ｆｆｆ、ｇ、ｈ、ｈｈ、ｉ、ｉｉ、ｊ、ｍｍ、ｎ、ｎｎ、ｐｐ、ｑｑ、ｓ、ｕｕ、ｖｖ、およびｗｗの値は、お互いに同じあるいは異なり得る。「サイレント」変化（すなわち、コドンに対するコードされるアミノ酸に影響しない）を含む核酸配列は、これら核酸の例である。
【０１５３】
上記で使用した各々ｄｄｄ、ｇｇｇ、ｈｈｈ、ｊｊ、ｊｊｊ、ｋ、ｋｋ、ｌ、ｌｌ、ｍ、ｐ、ｐｐｐ、ｑ、ｒ、ｒｒ、ｓｓ、ｔ、ｔｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｙの値は、それぞれ独立に、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、および１００またはそれ以上であり得る。各々ｄｄｄ、ｇｇｇ、ｊｊ、ｋ、ｋｋ、ｌ、ｌｌ、ｍ、ｐ、ｑ、ｒ、ｒｒ、ｓｓ、ｔ、ｔｔ、ｕ、ｖ、ｗ、およびｙの値は、お互いに同じまたは異なり得る。
【０１５４】
ｘ＋ｚの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。好ましくは、ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも８（例えば、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。好ましくは、ｘ＋ｙ＋ｚの値は、多くとも５００（例えば、多くとも４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８）である。
【０１５５】
上記で使用されたｂｂおよびｃｃの％の値は、独立して、各々好ましくは６０未満（例えば、５０、４０、３０、２０、１０）未満であるか、あるいは、０でもかまわない。ｂｂおよびｃｃの値は、お互いに同じまたは異なり得る。
【０１５６】
本発明の好ましい核酸は低複雑性をマスクするためのマスキングプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の適用後に、マスクされないままであるヌクレオチド配列を含む。
【０１５７】
核酸がポリペプチド「コードする」といわれる場合、そのポリペプチドは必ずしも翻訳されることを意味せず、その核酸は、ポリペプチドのアミノ酸をコードする一連のコドンを含む。
【０１５８】
本発明は以下の１９の核酸を含まないことが好ましい：（ｉ）参考文献１で公開されたヌクレオチド配列を含む核酸；（ｉｉ）参考文献１における配列番号１〜２２５内のヌクレオチド配列を含む核酸；（ｉｉｉ）公知の核酸；（ｉｖ）参考文献２９からの配列番号５０５、５０６、５０７、５０８、または５０９を含む核酸（ｖ）参考文献３０、３１、または３２からの配列番号４０７を含む核酸；（ｖｉ）参考文献３０、３１、または３２からの配列番号５９１を含む核酸；（ｖｉｉ）参考文献３３からの配列番号２１９２を含む核酸；（ｖｉｉｉ）参考文献３４からの診断用タンパク質  ＃１９１１５を含む核酸；（ｉｘ）参考文献３５からの配列番号３７１６９を含む核酸；（ｘ）参考文献３６からのプローブ番号１１８８２、１２３３５、１２１８１、１１７０１または２４１１４を含む核酸；（ｘｉ）参考文献３７からのプローブ番号９２３９または９６６３を含む核酸；（ｘｉｉ）参考文献３８からの配列番号１２０９４または１２５１６を含む核酸；（ｘｉｉｉ）参考文献３９からの配列番号１２３７７または１２７９５を含む核酸；（ｘｉｖ）参考文献４０からのプロ−ブ番号８５０９、８９６０または１７５４５を含む核酸；（ｘｖ）参考文献４１からのプローブ番号１２３７６、１２６８５、１２１９４、２５１５１または２５４５７を含む核酸；（ｘｖｉ）参考文献４２からの核酸４６０９を含む核酸；（ｘｖｉｉ）参考文献４３からの配列番号３６８５、１２１３５または１３６５８を含む核酸；（ｘｖｉｉｉ）２００１年１２月７日現在公知である核酸（例えば、配列が公開データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑ）において２００１年１２月７日以前に入手可能である核酸）；（ＸＩＸ）２００２年６月１０日現在公知である核酸（例えば、配列が公開データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑ）において２００２年６月１０日以前に入手可能な核酸）。
【０１５９】
（Ｃ  ポリペプチド発現産物の検出）
方法がポリペプチド検出に基づいている場合、その方法は、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ転写産物によってコードされたポリペプチドの発現の検出を包含する。この方法は、代表的に１つ以上の次のポリペプチドの検出を包含する：ｇａｇ（例えば、配列番号５７）またはＰＣＡＰ３／ｍＯＲＦ（例えば、配列番号８７）。いくつかのＰＣＡＶ  ｍＲＮＡが、これらの全てのポリペプチド（例えば、ＥＲＶＫ６｛４４｝）をコードするが、ＰＣＡＶは古いウイルスであり、そのｐｒｔ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子は、高度に断片化されている。
【０１６０】
ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする転写産物は、内在性ゲノムの全長ｍＲＮＡコピーの選択的スプライシングによって生成される｛例えば、参考文献４５の図４、参考文献５４の図１を参照のこと｝。ＰＣＡＶ  ｇａｇポリペプチドは、ゲノム内の第１長ＯＲＦ（配列番号１のヌクレオチド２８１３〜４６８３；配列番号５４）によってコードされている。全長ｇａｇポリペプチドはタンパク質分解的に切断される。ＰＣＡＶ  ｐｒｔポリペプチドは、ゲノム内の第２長ＯＲＦによってコードされ、そしてプロテアーゼを生成するためにタンパク質分解的に切断されるｇａｇ−ｐｒｔ融合ポリペプチドとして翻訳される。ＰＣＡＶ  ｐｏｌポリペプチドは、ゲノム内の第３長ＯＲＦによってコードされ、そして、３つのｐｏｌ産物（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼおよびインテグラーゼ｛４６｝）を生成するためにタンパク質分解的に切断されるｇａｇ−ｐｒｔ−ｐｏｌ融合ポリペプチドとして翻訳される。ＰＣＡＶ  ｅｎｖポリペプチドは、ゲノム内の第４の長ＯＲＦによってコードされている。翻訳されたポリペプチドは、タンパク質分解的に切断されている。ＰＣＡＶ  ｃＯＲＦポリペプチドは、ｅｎｖと同じ５’領域および開始コドンを共有するＯＲＦによってコードされているが、そこでは、スプライシング事象によってｅｎｖをコードする配列が除去され、ｅｎｖのＯＲＦに関連してリーディングフレーム＋１に変化する｛４７、４８｝。ＰＣＡＰ３ポリペプチドは、ｅｎｖと同じ５’領域および開始コドンを共有するＯＲＦによってコードされているが、そこでは、スプライシング事象によって、ｅｎｖをコードする配列が除去され、ｅｎｖのＯＲＦに関連して、リーディングフレーム＋２に変化する（第３のリーディングフレーム）。
【０１６１】
（Ｃ．１−ＨＭＬ−２ポリペプチドの直接検出）
種々の技術が、サンプル中の特定のポリペプチドの存在または非存在を検出するために利用可能である。これらは一般に、抗体とそのポリペプチド中の抗原性アミノ酸配列との間の特異的相互作用に基づく、免疫アッセイ技術である。適切な技術としては、標準的免疫組織学的方法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、免疫沈降、免疫蛍光などが挙げられる。
【０１６２】
本発明のポリペプチドはまた、機能的アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性を検出するためのアッセイ）によって検出され得る。例えば、ｃＯＲＦについての機能的アッセイは、参考文献４８〜５０に開示されており、そしてプロテアーゼについての機能的アッセイは、参考文献５１に開示されている。ＰＣＡＰ３は、初代前立腺上皮細胞においてアポトーシスを引き起こし、アポトーシスが抑制される場合、細胞をそれらの通常の老化点を超えて増大させ得ることが見出されている。
【０１６３】
本発明のポリペプチドを検出する別の方法は、標準的プロテオミクス技術を使用すること（例えば、ポリペプチドを精製または分離し、次いでペプチド配列決定を用いること）である。例えば、ポリペプチドは、２Ｄ−ＰＡＧＥを用いて分離され得、そしてポリペプチドスポットが、配列が標的ポリペプチド中に存在するか否かを同定するために（例えば、質量分析法により）配列決定され得る。
【０１６４】
技術は、検出前に標的ポリペプチドの富化を必要とし得る。しかし、免疫蛍光アッセイは、このような富化の必要性なく、細胞について容易に実施され得る。細胞は、最初に固体支持体（例えば、顕微鏡スライドまたはマイクロタイターウェル）上に固定され得る。次いで、細胞膜は、抗体の侵入を可能にするために透過処理され得る（ＮＢ：固定および透過処理は、一緒に達成され得る）。次に、この固定された細胞は、このポリペプチドに特異的な、蛍光標識された抗体に曝露され得る。この標識の存在は、標的ＰＣＡＶポリペプチドを発現する細胞を同定する。このアッセイの感度を上げるために、抗ＰＣＡＶ抗体に結合するために第２抗体を使用することが可能である（標識は、この第２抗体によって保有される）｛５２｝。
【０１６５】
（Ｃ．２−ＨＭＬ−２ポリペプチドの間接的検出）
ポリペプチドを直接的に検出するよりも、ポリペプチドに対応して身体によって生成される分子を検出すること（すなわち、ポリペプチドの間接的検出）が好適であり得る。これは代表的に、抗体の検出を含み、それゆえ、患者のサンプルは一般に、血液サンプルである。抗体は、（例えば、代表的には固定された、本発明のＰＣＡＶポリペプチドを用いた）従来の免疫アッセイ技術によって検出され得る。
【０１６６】
ＨＥＲＶ−Ｋポリペプチドに対する抗体は、ヒトにおいて（例えば、精上皮腫組織または奇形癌組織において）検出されている｛例えば、４５、５３、５４｝。
【０１６７】
（Ｃ．３−ポリペプチド物質）
本発明は、本発明の検出方法において用いられ得るポリペプチドを提供し、ここで、このポリペプチドは、第２２染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスによってコードされる。
【０１６８】
本発明は、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。配列番号５４、５５、５６、８７、９８および１１０は、この群の好ましいメンバーである。
【０１６９】
本発明はまた、以下を提供する：（ａ）配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８のうちの１以上の少なくともｄｄアミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド、ならびに（ｂ）配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８のうちの１以上に対して少なくともｅｅ％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
これらのポリペプチドは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、変異体など）を包含する。
【０１７０】
（ａ）のフラグメントは、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８のＴ細胞エピトープまたは好ましくはＢ細胞エピトープを含み得る。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ｛５５、５６｝または類似の方法を用いて）経験的に同定されてもよく、またはこれらは、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数｛５７｝、行列に基づくアプローチ｛５８｝、ＴＥＰＩＴＯＰＥ｛５９｝、神経ネットワーク｛６０｝、ＯｐｔｉＭｅｒおよびＥｐｉＭｅｒ｛６１、６２｝、ＡＤＥＰＴ｛６３｝、Ｔｓｉｔｅｓ｛６４｝、親水性｛６５｝、抗原性指数｛６６｝または参考文献６７に開示される方法などを用いて）推定されてもよい。
【０１７１】
（ａ）の好ましいフラグメントは、配列番号５５、５６および１１０であるか、または配列番号５５、５６もしくは１１０のフラグメントである。配列番号５５、５６および１１０は、ＰＣＡＶ  ｇａｇタンパク質内に見出され、そして他のＨＥＲＶ−Ｋのバックグラウンド発現よりも高いＰＣＡＶ発現を検出するために特に有用である。
【０１７２】
（ｂ）においては、これらのポリペプチドは、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８と比較して、１以上の連続したアミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸の、関連した側鎖を有する別のアミノ酸での置換）を含み得る。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわち、アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電の極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、一緒に、芳香族アミノ酸として分類される。一般に、これらのファミリー内での単一のアミノ酸の置換は、生物学的活性に対して大きな影響を有さない。
【０１７３】
本発明はまた、式ＮＨ２−ＸＸ−ＹＹ−ＺＺ−ＣＯＯＨを有するポリペプチドを提供し、ここで：ＸＸは、ｘｘアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；ＺＺは、ｚｚアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；ＹＹは、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列のｙｙアミノ酸のフラグメントからなるポリペプチド配列であり；そしてこのポリペプチドＮＨ２−ＸＸ−ＹＹ−ＺＺ−ＣＯＯＨは、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８から選択されるポリペプチド配列のフラグメントではない。
【０１７４】
−ＸＸ−の配列は、好ましくは、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８中の配列−ＹＹ−に対してＮ末端であるｘｘアミノ酸に対してｆｆ％未満の配列同一性を共有する。−ＺＺ−の配列は、好ましくは、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８中の配列−ＹＹ−に対してＣ末端であるｚｚアミノ酸に対してｇｇ％未満の配列同一性を共有する。
【０１７５】
本発明のポリペプチドは、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合体、グリコシル化、非グリコシル化、ミリストイル化、非ミリストイル化、脂質化（ｌｉｐｄａｔｅｄ）、非脂質化、モノマー、マルチマー、粒子状、変性など）で調製され得る。
【０１７６】
本発明のポリペプチドは、固体支持体に結合され得る。
【０１７７】
本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。
【０１７８】
本発明のポリペプチドは、多くの方法で、例えば、（少なくとも部分的に）化学合成により、より長いポリペプチドをプロテアーゼを用いて消化することにより、ＲＮＡから翻訳することにより、（例えば、組換え発現からの）細胞培養物からの精製により、生物自体から（例えば、前立腺組織からの単離）、細胞株供給源からなどにより、調製され得る。
【０１７９】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。このポリマーは、直鎖状であっても、または分枝状であってもよく、これは、改変されたアミノ酸を含んでもよく、そしてこれは、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然でまたは介入による改変されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にまた含まれるのは、例えば、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などが挙げられる）、ならびに当該分野で公知の他の改変を含むポリペプチドである。ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として生じ得る。本発明のポリペプチドは、天然にグリコシル化されていてもよく、または非天然にグリコシル化されていてもよい（すなわち、このポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドにおいて見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
【０１８０】
一般に、本発明のポリペプチドは、天然に存在しない環境において提供される（例えば、これらは、それらが天然に存在する環境から分離されている）。特定の実施形態では、このポリペプチドは、コントロールと比較してこのポリペプチドが富化された組成物中に存在する。従って、本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供される。すなわち、このポリペプチドは、発現された他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、ここで、実質的に含まないとは、組成物の７５（重量）％未満、好ましくは５０％未満、そしてより好ましくは１０％未満（例えば、５％）が、発現された他のポリペプチドから構成されることを意味する。
【０１８１】
変異体は、アミノ酸の置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換であっても、または（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位もしくはアセチル価部位を変更するため、または機能に必須でない１以上のシステイン残基の置換もしくは欠失による、誤った折畳みを最小にするための）非必須アミノ酸を除去する置換であってもよい。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の全体的な電荷、疎水性／親水性、および／または立体的かさ高さを保存する、置換である。改変体は、そのポリペプチドの特定領域（例えば、機能的ドメインおよび／または、このポリペプチドがポリペプチドファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関連する領域）の生物学的活性を保持するように、またはその特定領域の生物学的活性が増強されるように設計され得る。改変体の産生のためのアミノ酸改変の選択は、アミノ酸の利用可能性（内部対外部）（例えば、参考文献６８）、改変体ポリペプチドの耐熱性（例えば、参考文献６９）、所望のグリコシル化部位（例えば、参考文献７０）、所望のジスルフィド架橋（例えば、ｒｅｆｓ．７１および７２）、所望の金属結合部位（例えば、ｒｅｆｓ．７３および７４）、ならびにプロリンループ中での所望の置換（例えば、参考文献７５）に基づき得る。システイン枯渇ムテインは、参考文献７６に開示されるように産生され得る。
【０１８２】
上記で用いられるｅｅという百分率の値は、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９、または１００であり得る。
【０１８３】
上記で用いられるｆｆおよびｇｇという百分率の値は、独立して各々、好ましくは、６０未満（例えば、５０、４０、３０、２０、１０）であるか、または０でさえあり得る。ｆｆおよびｇｇという値は、互いに同じであっても異なっていてもよい。
【０１８４】
上記で用いられるｄｄ、ｘｘ、ｙｙおよびｚｚの値は、各々独立して、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００またはそれより高くであり得る。ｄｄ、ｘｘ、ｙｙおよびｚｚの各々の値は、互いに同じであっても異なっていてもよい。ｄｄの値は、２０００未満（例えば、１０００未満、５００未満、１００未満、または５０未満）であり得る。
【０１８５】
ｘｘ＋ｚｚの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ｘｘ＋ｙｙ＋ｚｚの値が少なくとも８（例えば、少なくとも、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。ｘｘ＋ｙｙ＋ｚｚの値が、多くとも５００（例えば、多くとも、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８）であることが好ましい。
【０１８６】
本発明のポリペプチドは、一般に、少なくとも７アミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００アミノ酸またはそれより長い）である。
【０１８７】
本発明の特定の実施形態については、ポリペプチドは、好ましくは、多くとも５００アミノ酸長（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５アミノ酸またはそれより短い）である。
【０１８８】
２つのアミノ酸配列の間での配列同一性の百分率に対する参照は、整列した場合に、その百分率のアミノ酸が、これら２つの配列を比較して同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２８の第７．７．１８節に記載されるソフトウェアプログラム）を用いて決定され得る。好ましい整列は、１２というギャップオープンペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）および２というギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、６２というＢＬＯＳＵＭ行列でアフィンギャップ検索を用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献７７に教示される。
【０１８９】
本発明の好ましいポリペプチドは、低複雑性をマスクするためにマスキングプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の適用後にマスクされていないままであるアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
本発明が以下を含まないことが好ましい：（ｉ）参考文献１に開示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｉ）参考文献１中の配列番号１〜２２５内のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｉｉ）参考文献３０、３０もしくは３２からの配列番号５９２を含むポリペプチド；（ｉｖ）既知のポリペプチド；（ｖ）２００１年１２月７日時点で公知のポリペプチド（例えば、配列が２００１年１２月７日よりも前に公のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑ）で入手可能であるポリペプチド）；または（ｖｉ）２００２年６月１０日時点で公知のポリペプチド（例えば、配列が２００２年６月１０日よりも前に公のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑ）で入手可能であるポリペプチド）。
【０１９１】
（Ｃ．４−抗体物質）
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明はまた、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドに結合する抗体を提供する。
【０１９２】
本発明の好ましい抗体は、配列番号５４、５５、５６、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１１０、１１８６および１１８８内のエピトープを認識する。本発明のより好ましい抗体は、配列番号５４、５５、５６または１１０内のエピトープを認識する。
【０１９３】
本発明の他の好ましい抗体は、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇタンパク質を認識する。この抗体は、以下であり得る：（ａ）ＰＣＡＶ由来のｇａｇおよびまた１以上のさらなるＨＥＲＶ−Ｋ由来のｇａｇを認識する、（ｂ）ＰＣＡＶ由来のｇａｇを認識するが、任意の他のＨＥＲＶ−Ｋ由来のｇａｇを認識しない、（ｃ）ＰＣＡＶ由来のｇａｇおよびまた１以上の古いＨＥＲＶ−Ｋ由来のｇａｇを認識するが、新しいＨＥＲＶ−Ｋ由来のｇａｇを認識しない、または（ｄ）１以上のＨＥＲＶ−Ｋ由来のｇａｇを認識するが、ＰＣＡＶ由来のｇａｇを認識しない。群（ａ）における好ましい抗体は、５Ｇ２である；群（ｃ）における好ましい抗体は、５Ａ５である。
【０１９４】
本発明の抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
【０１９５】
本発明の抗体は、任意の適切な手段（例えば、組換え発現によって、または本発明のポリペプチドを適切な動物（例えば、ウサギ、ハムスター、マウスまたは他の齧歯動物）に投与する（例えば、注射する）ことによって）産生され得る。
【０１９６】
本発明の抗体は、標識を含み得る。この標識は、直接的に検出され得る（例えば、放射性標識または蛍光標識）。あるいは、この標識は、間接的に検出され得る（例えば、産物が検出され得る酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラスクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど））。
【０１９７】
本発明の抗体は、固体支持体に結合され得る。
【０１９８】
一般に、本発明の抗体は、天然に存在しない環境において提供される（例えば、これらは、その天然に存在する環境から分離されている）。特定の実施形態では、この抗体は、コントロールと比較してこれらが富化された組成物中に存在する。従って、本発明の抗体は、好ましくは、単離された形態で、または実質的に単離された形態で、提供される（すなわち、この抗体は、他の抗体を実質的に含まない組成物中に存在する）。ここで、実質的に含まないとは、組成物の７５（重量）％未満、好ましくは５０％未満、そしてより好ましくは１０％未満（例えば、５％）が、他の抗体から作製されることを意味する。
【０１９９】
用語「抗体」は、任意の適切な天然免疫グロブリンもしくは人工免疫グロブリン、またはこれらの誘導体を含む。概して、抗体は特異的抗原結合活性を保有するＦｖ領域を含む。この抗体として以下が挙げられるが、これらに限定はされない：免疫グロブリン全体、抗原結合免疫グロブリンフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、オリゴボディ（ｏｌｉｇｏｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、表面貼り抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、など。
【０２００】
ヒト免疫系との適合性を上げるため、抗体は、キメラ抗体であってもヒト化抗体であってもよく｛例えば、参考文献７８および参考文献７９｝、または完全なヒト抗体が使用され得る。ヒト化抗体は、元の非ヒトモノクローナル抗体より、ヒトにおいてはるかに免疫原性が低いため、アナフィラキシーの危険がはるかに少なく、ヒトの処置のために使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療適用（腫瘍性疾患の処置のための放射線感作物質としての使用、または癌治療の副作用を減少させる方法における使用など）において好適であり得る。
【０２０１】
ヒト化抗体は、種々の方法により達成され得る。この方法としては、以下が挙げられる：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワークおよび定常領域の上にグラフト（「ヒト化」）する（必要に応じて非ヒト抗体由来の１つ以上のフレームワーク残基の移動を用いる）方法；（２）非ヒト可変ドメインの全体を移植するが、表面残基の置換（「表面貼り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」）により、それらをヒト様表面で「覆い隠し（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」する方法。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「表面貼り」抗体の、両方を含む｛参考文献８０〜８６｝。ＣＤＲは、一緒になって、ネイティブ免疫グロブリン結合部位のＦｖ領域の、結合親和性と特異性との両方を定義する、アミノ酸配列である｛例えば、参考文献８７および参考文献８８｝。
【０２０２】
語句「定常領域」は、エフェクター機能を与える抗体分子部分を言及する。キメラ抗体において、マウス定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプのどれかから選ばれ得る：α、δ、ε、γまたはμ。従って、抗体は任意のアイソタイプであり得る（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）。ＩｇＧが好ましく、これは、任意のサブクラスであり得る（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）。
【０２０３】
ヒト化または完全にヒトの抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用しても産生され得る。例えば、参考文献８９は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここでこの動物は、内因性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活性化のために、機能する内因性免疫グロブリンを産生しない。参考文献９０もまた、免疫原に対して免疫応答を引き起こし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで抗体は、霊長類定常領域および／または可変領域を有し、ここで内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換されているか、不活性化されている。参考文献９１は、哺乳動物において免疫グロブリン遺伝子座を改変する（例えば、定常領域または可変領域の全てまたは一部を置換し、改変抗体分子を形成する）ための、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。参考文献９２は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能するヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を、開示する。参考文献９３は、内因性重鎖を欠失し、外来性免疫グロブリン遺伝子座（１つ以上の異種定常領域を含む）を発現する、トランスジェニックマウスを作製する方法を開示する。
【０２０４】
上述のトランスジェニック動物を使用して、ＰＣＡＶポリペプチドに対する免疫応答が生じ得、そして抗体産生細胞はこの動物から取り出されて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得る。免疫プロトコール、アジュバントなどは、当該分野で公知であり、例えば、参考文献９４に記載されるトランスジェニックマウスの免疫において使用される。モノクローナル抗体は、対応するポリペプチドの生物学的活性または生理学的効果を阻害する能力または中和する能力について、試験され得る。
【０２０５】
本発明は、以下を包含しないことが好ましい：（ｉ）参考文献１において開示されるポリペプチドを認識する抗体；（ｉｉ）参考文献１の中の配列番号１〜２５５内のアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体；（ｉｉｉ）公知の抗体；（ｉｖ）２００１年１２月７日現在で公知の抗体（例えば、２００１年１２月７日よりも前に、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑなどの公のデータベースにおいて入手可能な配列のポリペプチド）；または（ｖ）２００２年６月１０日現在で公知の抗体（例えば、２００２年６月１０日よりも前に、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑなどの公のデータベースにおいて入手可能な配列のポリペプチド）。
【０２０６】
（Ｄ−患者サンプルおよび正常サンプル）
（Ｄ．１．−患者サンプル）
本発明の診断方法がｍＲＮＡ発現の検出に基づく場合、患者サンプルは、一般に細胞（例えば、前立腺細胞、とりわけ管腔上皮由来の前立腺細胞）を含む。これらは、組織サンプル（例えば、前立腺細胞）において存在し得るか、または（例えば、転移の間に）血液循環内に漏れている細胞であり得る。前立腺細胞を含む代わりに、または前立腺細胞を含むのと同じく、このサンプルは、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡを含むビリオンもまた、含み得る。
【０２０７】
本発明の診断方法がポリペプチド発現の検出に基づく場合、患者サンプルは、細胞（好ましくは、前立腺細胞）および／もしくはビリオン（ｍＲＮＡについて上述される）を含み得るか、またはＰＣＡＶポリペプチドを認識する抗体を含み得る。このような抗体は、代表的に、血液循環して存在する。
【０２０８】
従って、一般に、患者サンプルは組織サンプルであり、好ましくは、前立腺サンプル（例えば、生検）または血液サンプルである。患者サンプルの他の可能性のある供給源としては、単離された細胞、組織全体、または体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、胸水、脳脊髄液など）が挙げられる。別の好ましい患者サンプルは、精液サンプルである。
【０２０９】
患者は、一般にヒトであり、好ましくはヒト男性であり、より好ましくは成人男性である。
【０２１０】
発現産物は、患者サンプルそれ自体において検出され得るか、またはサンプル由来の物質（例えば、細胞溶解産物の上清、ＲＮＡ抽出物、ＲＮＡ抽出物から産生されたｃＤＮＡ、ＲＮＡ抽出物から翻訳されたポリペプチド、患者から抽出された細胞の培養由来の細胞、など）において検出され得る。これらは、本発明の意味の範囲内で「患者サンプル」であると考えられる。
【０２１１】
本発明の検出方法は、インビトロまたはインビボで行われ得る。
【０２１２】
（Ｄ．２−コントロール）
ＰＣＡＶ転写物は、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされる。このようなアップレギュレーションを検出するため、参照点（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｉｎｔ）（すなわち、コントロール）が代表的に必要とされる。コントロールサンプルの分析は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の標準レベルを与え、それに対して、患者サンプルが比較され得る。しかし、ＰＣＡＶ転写は、正常細胞において無視し得るほど僅かであり、そして腫瘍細胞において高度にアップレギュレートされているため、参照点は常に必要というわけではない（顕著な発現は、疾患を示す）。そうであっても、コントロールの使用は、特に標準化または定量的アッセイのために、好ましい。
【０２１３】
ネガティブコントロールは、発現のバックグラウンドレベルまたは基礎レベルを与え、これに対して、患者サンプルが比較され得る。ネガティブコントロールに対し、より高いレベルの発現産物は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。逆に、同等のレベルの発現産物は、患者がＰＣＡＶ関連癌を有さないことを示す。
【０２１４】
ネガティブコントロールは、一般に、腫瘍細胞でない細胞由来の物質を含む。ネガティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来であるが、ＰＣＡＶ発現がアップレギュレートされていない組織（例えば、非腫瘍非前立腺細胞）由来のサンプルであり得る。ネガティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来であるが、患者の人生のより早い段階で採取された前立腺細胞であり得る（例えば、癌が発達する前、またはＢＰＨ患者由来）。ネガティブコントロールは、前立腺腫瘍を有さない患者由来の細胞であり得、そしてこの細胞は前立腺細胞であってもなくてもよい。ネガティブコントロールは、適切な細胞株であり得る。代表的には、ネガティブコントロールは、試験される患者サンプルと同じ組織または同じ細胞型（例えば、前立腺細胞または血液サンプル）である。
【０２１５】
ポジティブコントロールは、患者サンプルが比較され得る発現レベルを与える。ポジティブコントロールに対して同等のレベルまたはより高いレベルの発現産物は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。逆に、より低いレベルの発現産物は、患者がＰＣＡＶ関連腫瘍を有さないことを示す。
【０２１６】
ポジティブコントロールは、一般に腫瘍細胞または腫瘍を有することが知られる患者から採取した血液サンプル由来の物質を含む。ポジティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来であるが、患者の人生のより早い段階で採取された前立腺腫瘍細胞であり得る（例えば、寛解をモニターするため）。ポジティブコントロールは、前立腺腫瘍を有する別の患者由来の細胞であり得る。ポジティブコントロールは、適切な前立腺細胞株であり得る。
【０２１７】
他の適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、当業者に明らかである。
【０２１８】
コントロールにおけるＰＣＡＶ発現は、患者サンプルにおける発現と同時に評価され得る。あるいは、コントロールにおけるＰＣＡＶ発現は、別々に評価され得る（先にまたは後で）。しかし、実際に２つのサンプルを比較するよりむしろ、コントロールは、絶対値（すなわち、（例えば、標準条件下で）前立腺腫瘍患者から採取されたサンプルから、経験的に決定された発現レベル）であり得る。前立腺腫瘍についてのこのようなネガティブコントロールの例としては、生涯のベースライン発現レベルまたは（例えば、健常者のプールにおいて観察される）発現レベルが、挙げられる。
【０２１９】
（Ｄ．３−アップレギュレーションの程度）
コントロール（１００％）に対するアップレギュレーションは、通常少なくとも１５０％（例えば、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％またはそれより上）である。２０〜４０倍のアップレギュレーションは、珍しくない。
【０２２０】
（Ｅ−診断方法および診断）
本発明は、患者サンプルにおいて、２２番染色体上の２０．４２８メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含する、前立腺癌を診断するための方法を提供する。
【０２２１】
（Ｅ．１−診断における使用のための産物）
本発明の診断方法における検出のために好ましい発現産物は、上述のセクションＢ．１、セクションＢ．３およびセクションＣ．３において記載される。
【０２２２】
本発明の診断方法における使用のために好ましい試薬は、上述のセクションＢ．４、セクションＣ．３およびセクションＣ．４において記載される。
【０２２３】
本発明の診断方法における使用のために好ましいキットは、上述のセクションＢ．５において記載される。
【０２２４】
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体を、診断における使用のために提供する。
【０２２５】
本発明はまた、診断アッセイの作製における、本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体の使用も、提供する。
【０２２６】
（Ｅ．２−本発明のｍＲＮＡベースの方法）
本発明は、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法を提供する：（ａ）患者サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸と接触させる工程；および（ｂ）患者サンプルにおいて、患者サンプル中に存在する核酸への、本発明の核酸のハイブリダイゼーションの、存在または非存在を検出する工程。工程（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。
【０２２７】
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法も提供する：（ａ）サンプル中のｍＲＮＡを、ＤＮＡと比較して富化し、ｍＲＮＡ富化サンプルを与える工程；（ｂ）ｍＲＮＡ富化サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸と接触させる工程；および（ｃ）ｍＲＮＡ増強サンプルにおいて存在するｍＲＮＡへの、本発明の核酸のハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程。工程（ｃ）におけるハイブリダイゼーションの存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。工程（ａ）における富化は、ＤＮＡの抽出を伴わないｍＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡの除去を伴わないＤＮＡ除去、またはＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの破壊を伴わないＰＣＡＶ  ＤＮＡの破壊、などの形を採り得る（上述のセクションＢ．２を参照）。
【０２２８】
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法も提供する：（ａ）サンプル中のｍＲＮＡのＤＮＡコピーを調製する工程；（ｂ）ＤＮＡコピーを、ハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸と接触させる工程；および（ｃ）このＤＮＡコピーに対する本発明の核酸のハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程。工程（ｃ）におけるハイブリダイゼーションの存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。工程（ａ）におけるＤＮＡの調製は、ＰＣＡＶに対して特異的（例えば、適切なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの使用による）または非特異（例えば、細胞性ｃＤＮＡの調製）であり得る。
【０２２９】
患者サンプルを分析する上述の方法において、サンプルと接触した本発明の核酸は、本発明のプローブであり得る。あるいは、この核酸は、本発明のプライマーを含み得、この場合、本方法の関連工程は一般に、２回以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）の増幅サイクルを含む。プライマーが使用される場合、本方法は、増幅されたＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを検出するためのプローブの使用を含み得る。
【０２３０】
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法も提供する：（ａ）サンプル中の任意のＰＣＡＶ核酸標的を増幅する工程；および（ｂ）増幅された標的の存在または非存在を検出する工程。工程（ｂ）における増幅された標的の存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。
【０２３１】
本発明のこれらの方法は、定性的、定量的または半定量的であり得る。
【０２３２】
（Ｅ．３−本発明のポリペプチドベースの方法）
本発明は、患者サンプルを、本発明のポリペプチドまたは抗体と接触させる工程を包含する、前立腺癌を診断するための免疫アッセイ法を提供する。
【０２３３】
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者の血液サンプルを分析するための方法も提供する：（ａ）血液サンプルを、本発明のポリペプチドと接触させる工程；および（ｂ）上述のサンプルにおいて、上述のポリペプチドと抗体との間の相互作用の、存在または非存在を検出する工程。工程（ｂ）における相互作用の存在は、血液サンプルが採取された患者が、抗ＰＣＡＶ抗体を惹起していること、従ってこの患者が前立腺腫瘍を有することを示す。工程（ａ）は、血液サンプルにおける抗体が富化される工程より、前であり得る。
【０２３４】
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者のサンプルを分析するための方法も提供する：（ａ）サンプルを、本発明の抗体と接触させる工程；および（ｂ）上述の抗体と上述のサンプルとの間の相互作用の、存在または非存在を検出する工程。工程（ｂ）における相互作用の存在は、サンプルが採取された患者がＰＣＡＶポリペプチドを発現すること、従ってこの患者が前立腺腫瘍を有することを示す。工程（ａ）は、サンプル中の細胞が溶解されるかまたは透過処理される工程、および／またはサンプル中のポリペプチドが富化される工程より、前であり得る。
【０２３５】
本発明のこれらの方法は、定性的、定量的、または半定量的であり得る。
【０２３６】
上述の方法は、インビボの使用に適合され得る（例えば、腫瘍細胞が存在する位置を確認または同定する）。これらの実施形態において、標的ＰＣＡＶポリペプチドに特異的な抗体が、個体に投与され得（例えば、注射によって）、そしてこの抗体は、標準的画像化技術（例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影走査法など）を使用して位置確認される。適切な標的（例えば、スピン標識など）が、使用される。これらの技術を使用して、癌細胞が、別々に標識される。
【０２３７】
他のインビボ方法は、ＰＣＡＶポリペプチドを機能的に検出し得る。例えば、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質）と操作可能に連結されるＰＣＡＶ  ＬＴＲを有する構築物は、ネイティブなＰＣＡＶポリペプチドと平行して発現される。
【０２３８】
免疫アッセイの感度を増加させるため、抗ＰＣＡＶ抗体に結合する二次抗体を使用し、その二次抗体によって標識が保持されることが可能である。
【０２３９】
（Ｅ．４−「診断」の意味）
本発明は、前立腺癌を診断する方法を提供する。本発明に記載の「診断」は、疾患の明確な臨床診断から、患者が可能となるさらなる検査を受けて明確な診断に至り得る徴候の範囲にわたり得る。例えば、本発明の方法は、スクリーニングプロセスとして使用され得、ポジティブサンプルはさらなる分析に供される。
【０２４０】
その上、診断は、既に癌を有していると分かっている患者における、癌の進行をモニターする工程を含む。癌はまた、本発明の方法により、段階付けされる。好ましくは、この癌は、前立腺癌である。
【０２４１】
関連する癌の処置レジメンの効能（セラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ））もまた、本発明の方法により、モニターされ得る（例えば、その効能の決定）。
【０２４２】
癌に対する感受性もまた、検出され得る（例えば、癌が発現する前であるが、発現のアップレギュレーションが起こった場合）。予後診断法もまた、包含される。
【０２４３】
これらの技術の全ては、本発明における「診断」の一般的な意味の中に入る。
【０２４４】
（Ｆ−薬学的組成物）
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体を含む、薬学的組成物を提供する。本発明はまた、その医薬品としての使用、および前立腺癌を標的するための医薬品の製造における使用も、提供する。本発明はまた、動物（例えば、患者）に、核酸またはポリペプチドの免疫原性用量を投与する工程を包含する、免疫応答を惹起するための方法を提供する。
【０２４５】
本発明によって包含される薬学的組成物は、活性薬剤として、本明細書中で開示される本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体を、治療有効量で含む。「有効量」は、有益な効果または望ましい結果（臨床的結果を含む）に充分な量である。有効量は、１回以上投与され得る。本発明の目的について、有効量は、前立腺癌の症状および／または進行を、緩和、改善、安定化、退行、鈍化または遅延するために充分な量である。
【０２４６】
本組成物は、癌および原発性の癌の転移を処置するために使用され得る。加えて、この薬学的組成物は、癌処置の従来技術（例えば、腫瘍の、放射能または従来の化学療法に対する感作）と組み合わせて使用され得る。用語「処置」「処置すること」「処置する」などは、本明細書中で、一般に、望ましい薬理学的効果および／または物理的効果を得ることを言及する。この効果は、疾患もしくはその兆候の、完全な予防もしくは部分的な予防の意味で、予防効果であり得、そして／あるいは疾患もしくはその兆候の、部分的な安定化もしくは治癒、または完全な安定化もしくは治癒の意味で、治療効果であり得、そして／あるいは疾患に起因する悪影響であり得る。「処置」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物（特にヒト）における疾患の任意の処置を包含し、以下を含む：（ａ）疾患または症状に対して罹患しやすくなっているが、まだ疾患を有するとは診断されていない被験体における、疾患または症状の発生の予防；（ｂ）疾患の症状の阻害（すなわち、その進行の妨害）；または（ｃ）疾患症状の軽減（すなわち、疾患また症状派における後退）。
【０２４７】
薬学的組成物が、差次的に発現される核酸によってコードされる遺伝子産物に特異的に結合する抗体を含む場合、この抗体は、処置部位への送達のために薬物に結合され得るか、または癌細胞（例えば、前立腺癌）を含む部位の画像化を容易にするために検出可能標識と結合され得る。抗体を、薬物および検出可能標識と結合させる方法は、検出可能標識を用いて画像化する方法として、当該分野において周知である。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、望ましい疾患もしくは状態を、処置するか、改善するか、もしくは予防するための治療薬剤の量、または検出可能な治療効果または予防効果を示す治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルによって検出される。治療効果はまた、身体的症状の低減を含む。被験体のための正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康状態、性質および症状の程度、ならびに投与のために選択された治療または治療の組み合わせに依存する。所定の条件についての有効量は、慣用実験によって決定され、そして臨床家の判断の範囲内である。本発明の目的のために、有効用量は、一般に、投与される個体における、本発明の組成物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０２４９】
薬学的組成物はまた、薬学的受容可能キャリアも、含み得る。用語「薬学的受容可能キャリア」は、治療薬剤（例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤）の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体はその組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与され得る、任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、大きく、ゆっくりと代謝されるマクロ分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性化ウイルス粒子など）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的受容可能キャリアとしては、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられる。例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質もまた、このような賦形剤の中に存在し得る。代表的には、治療組成物は、注射可能であるように溶液または懸濁液のいずれかとして調製され；注射前に液体賦形剤中に溶解または懸濁するのに適した固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的受容可能キャリアの定義の中に含まれる。薬学的に受容可能な塩（例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロネート、ベンゾエートなどの有機酸の塩）もまた、薬学的組成物内に存在し得る。薬学的受容可能賦形剤の一通りの議論は、参考文献９５において入手可能である。
【０２５０】
この組成物は、好ましくは、滅菌され、かつ／または発熱物質を含まない。これは、代表的には、約ｐＨ７に緩衝される。
【０２５１】
一旦処方されると、本発明によって企図されるこの組成物は、（１）被験体に直接投与され得る（例えば、核酸、ポリペプチド、低分子アゴニストまたは低分子アンタゴニストなど）；または（２）被験体由来の細胞に、（例えば、エキソビボ遺伝子治療法において）エキソビボで送達され得る。組成物の直接送達は、一般に、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内、腫瘍内、または組織の間隙空間）の注射によって達成される。投与の他の様式としては、経口または肺の投与、坐剤、および経皮投与、針、および遺伝子ガンまたはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。投薬処置は、単回投薬計画または多投薬計画であり得る。
【０２５２】
被験体へのエキソビボ送達および形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知である｛例えば、参考文献９６｝。エキソビボ投与において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞、特定の造血（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。一般に、エキソビボ投与およびインビトロ投与の両方のための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気泳動、リポソームへの核酸の封入、および核へのＤＮＡの直接微量注入などによって達成され、これらは全て当該分野で公知である。
【０２５３】
ＰＣＡＶ核酸の差次的な発現は、前立腺癌と相関することが見出されている。腫瘍は、所与の核酸、関連するポリペプチド、または他の関連分子（例えば、アンチセンス、リボザイムなど）に基づく治療薬剤の投与により、治療され得る。他の実施形態において、この障害は、低分子薬物の投与による治療に対して影響を受けやすく、この低分子薬物は、例えば、正常細胞と比較して、癌細胞において発現が増加している遺伝子の、コードされる遺伝子産物の機能のインヒビター（アンタゴニスト）として寄与するか、または癌細胞において発現の減少した遺伝子産物のアゴニストとして寄与し得る（例えば、腫瘍抑制因子として作用する遺伝子産物の活性を促進する）。
【０２５４】
発明された薬学的組成物の用量および投与の手段は、治療組成物の特別な性質、患者の症状、年齢、および体重、疾患の進行、ならびに他の関連因子に基づいて決定される。例えば、核酸治療組成物薬剤の投与は、局所的投与または全身投与（注射、経口投与、粒子ガンまたはカテーテル挿入投与、および局所投与が挙げられる）を含む。好ましくは、治療核酸組成物は、本発明の核酸に作動的に連結する、プロモーターを含む発現構築物を含有する。種々の方法が、治療組成物を、直接、体内の特定部位に投与するために、使用され得る。例えば、小さな転移病変が、位置確認され、そして治療組成物が、幾度か、腫瘍体内の幾つかの異なった位置に、注射される。あるいは、腫瘍に寄与する動脈が同定され、そして治療組成物がこのような動脈に注射され、それにより、腫瘍内に直接組成物を送達する。壊死性中心を有する腫瘍が吸引され、組成物が直接、腫瘍の穴のあいた中心に注射される。アンチセンス組成物は、腫瘍の表面に直接的に（例えば、組成物の局所投与により）投与される。Ｘ線画像法が、上述の送達方法のいずれかにおいて補助するために使用され得る。
【０２５５】
アンチセンス核酸、サブゲノム核酸、または特定の組織に対する抗体を含む治療組成物の標的化された送達もまた、使用され得る。レセプター媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えば、参考文献９７〜１０２において記載される。核酸を含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所的投与について、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコールの間に、使用され得る。作用方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルの増大または阻害）ならびに形質転換および発現の効力などの因子は、アンチセンスサブゲノム核酸の最大効能に必要な用量に影響を及ぼす。より多い発現が、組織のより大きな領域にわたって求められる場合、より多い量のアンチセンスサブゲノム核酸、もしくは引き続きの投与プロトコールにおける同量の再投与、または例えば、腫瘍部位の、隣もしくは近くの異なった組織部分への幾度かの投与が、ポジティブな治療成果を生じるために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用実験が、最適な治療効果のための特異的な範囲を決定する。
【０２５６】
本発明の治療核酸および治療ポリペプチドは、遺伝子送達媒介物を使用して、送達され得る。この遺伝子送達媒介物は、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る（一般に、参考文献１０３、１０４、１０５および１０６を参照のこと）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るかまたは制御され得る。
【０２５７】
望ましい核酸の送達および望ましい細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当業者に周知である。ウイルスベースの媒介物の代表例としては、組換え体レトロウイルス（例えば、参考文献１０７〜１１７を参照）、αウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバー熱ウイルス（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１１８〜１２３を参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。殺傷されたアデノウイルスに連結するＤＮＡの投与｛参考文献１２４｝もまた、使用され得る。
【０２５８】
非ウイルス送達の媒介物および方法もまた、使用され得、これらとしては、死滅したアデノウイルス単独に連結または非連結のポリカチオン圧縮ＤＮＡ｛例えば、参考文献１２４｝、リガンド連結ＤＮＡ｛参考文献１２５｝、真核細胞送達媒介細胞｛例えば、参考文献１２６〜１３０｝、および核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定はされない。裸のＤＮＡもまた、使用され得る。代表的な裸のＤＮＡ誘導法は、参考文献１３１および参考文献１３２において記載される。遺伝子送達媒介物として作用し得るリポソームは、参考文献１３３〜１３７に記載される。さらなるアプローチは、参考文献１３８および参考文献１３９において記載される。
【０２５９】
使用のために適切なさらなる非ウイルス送達は、参考文献１３９に記載されるアプローチのような、機械的送達系を誘導する。その上、コード配列およびその発現の産物は、光重合ヒドロゲル物質の沈殿または電離放射線を通して送達され得る｛例えば、参考文献１４０および１４１｝。コード配列の送達に使用され得る、遺伝子送達のための他の従来法としては、例えば、手のひらに乗る大きさの遺伝子転移粒子ガン｛参考文献１４２｝、または活性化転移遺伝子の電離放射線｛１４０および１４１｝の使用が挙げられる。
【０２６０】
（ワクチン組成物）
薬学的組成物は、好ましくは免疫原性組成物であり、そしてより好ましくは、ワクチン組成物である。このような組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を惹起するために使用され得る。
【０２６１】
この組成物は、さらにアジュバントを含み得る。例えば、この組成物は、１つ以上の以下のアジュバントを含み得る：（１）水中油型乳剤処方物（ムラミルペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（以下を参照）のような他の特異的免疫刺激剤または細菌細胞壁成分を含有または非含有）（例えば、（ａ）マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子にまで処方された、５％セクアリン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５  を含有の（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含有する）ＭＦ５９ＴＭ｛参考文献１４３；参考文献１４４第１０章｝、（ｂ）１０％セクアリン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％  プルロン遮断（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ）ポリマー  Ｌ１２１、およびサブミクロンの乳剤に微小液化されたか（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）またはボルテックスされてより大きな粒子の大きさの乳剤に生成したｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、および（ｃ）２％セクアリン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホルリン酸Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含有するＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）など）；（２）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）（ＩＳＣＯＭがさらなる界面活性剤を欠く場合）のようなそこから産生される粒子｛参考文献１４５｝；（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）のようなサイトカイン、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、など；（５）モノホスホリルリン酸Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−デアシル化  ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）｛例えば、参考文献１４６、１４７｝；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤との組み合わせ｛例えば、参考文献１４８、１４９、１５０｝；（７）必要に応じて５メチルシトシンをシトシンの位置に用いた、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル｛参考文献１５１｝；（９）オクトキシノールと組み合わせられたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤｛参考文献１５２｝または、少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル｛参考文献１５３｝；（１０）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン｛参考文献１５４｝；（１１）免疫��激剤および金属塩の粒子｛参考文献１５５｝；（１２）サポニンおよび水中油型乳剤｛参考文献１５６｝；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要があれば＋ステロール）｛参考文献１５７｝、（１４）アルミニウム塩（好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムだが、任意の他の適切な塩もまた使用され得る（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オキシ水酸化物、オルトリン酸塩、硫酸塩など｛参考文献１４４の第８章および９章｝）。異なったアルミニウム塩の混合物もまた、使用され得る。この塩は、任意の適切な形態を取り得る（例えば、ゲル、結晶性、非結晶性など））；（１５）キトサン；（１６）コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ不安定毒素、またはこれらの無毒化変異体｛参考文献１５８｝、（１７）ポリ（ａ−ヒドロキシ）酸（ＰＬＧなど）の微小粒子；（１８）免疫刺激剤として作用し、組成物の効能を増強する他の薬剤。アルミニウム塩および／またはＭＦ５９ＴＭが、好ましい。
【０２６２】
本発明のワクチンは、予防ワクチン（すなわち、疾患を防ぐため）または治療ワクチン（すなわち、疾患の兆候を減少させるかまたは消失させるため）であり得る。
【０２６３】
効能は、本発明の組成物投与後に、本発明の核酸および／またはポリペプチドの発現をモニターすることにより、試験され得る。
【０２６４】
（Ｇ−スクリーニング方法および薬物設計）
本発明は、以下の工程を含む、癌に対する活性を有する化合物のスクリーニングの方法を提供する：試験化合物を、ＰＣＡＶ発現がアップレギュレートされている細胞または細胞株に由来する組織サンプルと接触させる工程；およびサンプル中のＰＣＡＶ発現をモニターする工程。発現の減少は、試験化合物の抗癌効能の可能性を示す。
【０２６５】
本発明はまた、以下の工程を含む、前立腺癌に対する活性を有する化合物のスクリーニングの方法を提供する：試験化合物を本発明の核酸またはポリペプチドと接触させる工程；および試験化合物と核酸／ポリペプチドとの間の結合相互作用を検出する工程。結合相互作用は、試験化合物の抗癌効能の可能性を示す。
【０２６６】
本発明はまた、以下の工程を含む、前立腺癌に対する活性を有する化合物のスクリーニングの方法を提供する：試験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる工程；およびポリペプチドの機能をアッセイする方法。ポリペプチドの機能の阻害（例えば、プロテアーゼ活性の喪失、ＲＮＡエクスポートの喪失、逆転写酵素活性の喪失、エンドヌクレアーゼ活性の喪失、インテグラーゼ活性の喪失など）は、試験化合物の抗癌効能の可能性を示す。
【０２６７】
代表的な試験化合物としては、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、有機低分子、抗生物質、ポリアミン、ならびにこれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。有機低分子は、５０ダルトンより多く約２，５００ダルトン未満（より好ましくは、約３００ダルトン〜約８００ダルトン）の分子量を有する。物質の複合混合物（天然産物を含む抽出物など）または混合コンビナトリアル合成の産物もまた、試験され得、そして標的ＲＮＡに結合する成分は、その後の工程において、混合物から抽出され得る。
【０２６８】
試験化合物は、合成化合物または天然化合物の大ライブラリーから誘導され得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）またはＡｒｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、使用され得る。さらに、試験化合物は、個々の化合物または混合物のどちらかのコンビナトリアル化学を使用して、合成的に産生され得る。
【０２６９】
本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、任意の当該分野で公知の利用可能な技術（シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、マイトジェンアッセイ、化学走性アッセイなど）を使用してスクリーニングされ得る。アッセイ条件は、理想的には、ネイティブの活性が、インビボで示される条件（すなわち、生理学的なｐＨ、温度、およびイオン強度）と類似するべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体における毒性副作用を引き起こさない濃度で、ネイティブの活性の強い阻害または増強を示す。ネイティブなポリペプチドへの結合について競合するアゴニストまたはアンタゴニストは、ネイティブな濃度と同等以上の濃度を必要とし得る。一方、ポリペプチドに不可逆に結合し得るインヒビターが、およそネイティブの濃度で加えられ得る。
【０２７０】
このようなスクリーニングおよび実験は、ＰＣＡＶポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの同定を導き得る。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、ＰＣＡＶ発現および／またはＰＣＡＶ機能を調節するか、増強するか、または阻害するために使用され得る｛１５９｝。
【０２７１】
本発明は、本発明のポリペプチドを使用して、結合する能力またはＰＣＡＶポリペプチドの活性を調節（例えば、阻害）する能力について化合物をスクリーニングし、これにより、例えばＰＣＡＶポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る化合物を同定する方法に関する。１つのスクリーニングアッセイにおいて、ＰＣＡＶポリペプチドは、試験化合物の存在下または非存在下において、ＰＣＡＶの増殖刺激活性に感受性の細胞と共にインキュベートされる。試験化合物を改変し得るかまたは結合し得るＰＣＡＶ活性の可能性が、測定される。次いで、細胞の増殖が決定される。試験サンプルにおける細胞増殖の減少は、この試験化合物がＰＣＡＶポリペプチドに結合し、それによって不活性化するか、またはさもなくば、ＰＣＡＶポリペプチド活性を阻害することを示す。
【０２７２】
ＰＣＡＶ遺伝子を過剰発現するように形質転換されているトランスジェニック動物（例えば、げっ歯類）を使用して、ＰＣＡＶ過剰発現から生じた腫瘍の発達を阻害する能力について、インビボで化合物をスクリーニングし得るか、または一旦発達したこのような腫瘍を処置し得る。侵襲性または悪性の可能性を高められた前立腺腫瘍を有するトランスジェニック動物は、ＰＣＡＶポリペプチドの効果を阻害する能力についての化合物（抗体またはペプチドを含む）のスクリーニングに使用され得る。このような動物は、例えば、本明細書中の実施例において記載されるように、産生され得る。
【０２７３】
上述のようなスクリーニング手順は、前立腺癌処置における薬理学的介入ストラテジーにおける使用可能性についての、薬剤の同定のために、有用である。さらに、ＰＣＡＶに対応する核酸配列（ＬＴＲを含む）は、高められた遺伝子発現の阻害をアッセイするために使用され得る。
【０２７４】
ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、このポリペプチドの発現を、選択的に低減し得るか、またはこのポリペプチドの発現を与え得る。より詳細には、アンチセンス構築物、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞において、ＰＣＡＶポリペプチドの産生を阻害するために使用され得る。アンチセンスｍＲＮＡは、標的癌細胞への発現ベクターの移動によって産生され得、そして本発明のＰＣＡＶ核酸は、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ転写の方向に対してアンチセンス方向に方向付けられる。適切なベクターとしては、ウイルスベクター（レトロウイルスベクターを含む）および非ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞内に直接導入され、同じ目標を達成し得る。オリゴヌクレオチドは、最高レベルの特異性を達成し、そして、例えば、開始ＡＴＧでＰＣＡＶ−ｍＲＮＡに結合するように、選択／設計され得る。
【０２７５】
ＰＣＡＶポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、このポリペプチドの作用をブロックし、それによって癌細胞の増殖を制御するために使用され得る。これは、ＰＣＡＶポリペプチドに結合する抗体の注入により、その作用をブロックすることによって、達成され得る。
【０２７６】
本発明はまた、本発明の核酸またはポリペプチドに結合する化合物を同定するための、ハイスループットスクリーニング方法を提供する。好ましくは、このアッセイのための全ての生化学工程は、例えば試験管またはマイクロタイタープレート内で、単一の溶液中で行われ、そして、この試験化合物は、最初に単一の化合物濃度で分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のため、実験条件は、スクリーニングされた化合物全体の中から「ポジティブ」化合物として同定された試験化合物の割合を達成するように調整される。このアッセイは、好ましくは、標的に対して感知し得る親和性を有する化合物を同定するように設定される（例えば、大化合物ライブラリー由来の総試験化合物の０．１％〜１％が、所定の標的に１０μＭ以下（例えば、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ以下）のＫｉで結合することが示される場合）。
【０２７７】
（Ｈ−定義）
用語「含む」は、「含有する」および「構成する」ことを意味する（例えば、Ｘを「含む」組成物は、独占的にＸからのみ構成され得るか、または何らかの追加を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ））。
【０２７８】
用語「約」は、数値ｘに関する場合、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２７９】
用語「腫瘍性細胞」、「新形成細胞」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」（交換可能に使用される）は、比較的自立的に増殖し、従って細胞増殖制御の有意の喪失により特徴付けられる、異常な増殖発現型（すなわち、細胞分裂の無制御）を示す細胞を言及する。腫瘍性細胞は、悪性または良性であり得、前立腺癌由来組織を含む。
【０２８０】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０２８１】
（本発明を実行するための様式）
本発明の特定の局面は、以下の非限定的な実施例でより詳しく記載される。これらの実施例は、本発明を作製し使用する方法の開示および記載を、当業者に提供するために示される。これらの実施例は、本発明者らがその発明として認識する範囲を制限することを意図しないし、以下の実験が、行われる全てまたは唯一の実験であることを、表すことも意図しない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関し、正確さを確実にするための努力がなされているが、ある程度の実験的エラーおよび偏位が、考慮されるべきである。他に示されない限りは、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧かその近傍である。
【０２８２】
（ヒト前立腺細胞サンプルの供給源およびそれによって発現される核酸の単離）
癌において差次的に発現される遺伝子を表わし得る候補核酸を、公に利用可能な供給源ならびに選択した細胞株および患者組織から産生したｃＤＮＡライブラリーから得た。標準化ｃＤＮＡライブラリーを、１人の患者の腫瘍組織から調製し、マイクロアレイ上にスポットするためのクローニングした核酸を、このライブラリーから単離した。１００人の患者由来の正常組織および腫瘍組織を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写核酸を産生するために処理し、次いで、マイクロアレイにおいて発現を評価した。
【０２８３】
標準化：標準化の目的は、特定の細胞型または組織において発現される全ての転写産物が等しく表される、ｃＤＮＡライブラリーを産生することである｛参考文献１６０および１６１｝。従って、最適に標準化されたライブラリーにおける、３０，０００個ほどの少量の組換え体クローンの単離が、細胞の遺伝子発現レパートリー（１細胞あたり１０，０００個と推定される）全体を表し得る。標準化前立腺ライブラリーを産生するための供給源物質は、Ｇｌｅａｓｏｎ等級３＋３の腺癌を有する患者、および医学的サーベイランス下で危険のある被験体プールからの正常前立腺生検に由来する、凍結保存した前立腺腫瘍組織であった。前立腺上皮を、レーザー捕捉微小解剖法（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）（ＬＣＭ，Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって組織の凍結切片から直接回収し、当該分野で周知の方法（例えば、参考文献１６２）に従って行い、実質的に相同な細胞サンプルを提供した。
【０２８４】
全ＲＮＡを、ＬＣＭ回収細胞から、ＲＮｅａｓｙＴＭＰｒｏｔｅｃｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、製造者の推奨手順に従って、抽出した。ＲＮＡを、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭＲＮＡ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して、定量した。全ＲＮＡの１μｇを、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して逆転写し、ＰＣＲ増幅した。そのｃＤＮＡ産物を、アガロースゲル電気泳動法により、標準的手段（参考文献２１）を使用して、大きさにより選択した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（登録商標）ＩＩキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、抽出した。ｃＤＮＡの標準化を、以下のハイブリダイゼーション原則の動態学を使用して実行した：  ｃＤＮＡの１．０μｇを１００℃で１０分間熱変性し、次いで、４２℃で４２時間、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ．Ｎａ＋および５０％ホルムアミドの存在下で、インキュベートした。一本鎖ｃＤＮＡ（「標準化」ｃＤＮＡ）を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（＃１３０−０５２０，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により、製造者の推奨手順に従って精製し、３サイクルのＰＣＲ増幅により、増幅して、２本鎖ｃＤＮＡに転換し、そして標準的手順（参考文献２１）を用いて、プラスミドベクター内にクローン化した。標準化およびクローニング過程において使用した全てのプライマー／アダプターは、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）において、製造者によって提供される。スーパーコンピテント（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（ＸＬ−２  Ｂｌｕｅ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を標準化ｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトし、固体媒地上にプレートし、３６℃で一晩増殖させた。
【０２８５】
標準化ライブラリーの特徴づけ：ライブラリーにつき１０，０００配列の組換え体を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、キャピラリー配列決定法により分析した。ライブラリーにおける転写物の提示を決定するため、クローンの配列上でＢＬＡＳＴ分析を行い、それぞれの単離されたクローンに転写同一性を割り当てた。すなわち、単離された核酸の配列を、ＸＢＬＡＳＴマスキングプログラムを使用して、最初にマスクして、低複雑性配列を除去した（参考文献１６３、１６４および１６５）。一般に、マスキングは、比較的小さな目的配列を、それらの複雑性の低さに起因して除去すること、および多くの配列に共通の、くり返し領域（例えば、Ａｌｕリピート）の類似性に基づいて多くの「ヒット（ｈｉｔ）」を除去すること以外は、最終検索結果に影響しない。次いで、残った配列を、ＢＬＡＳＴＮ  対  ＧｅｎｅＢａｎｋの検索に使用した。これらの配列をまた、ＢＬＡＳＴＸ  対  ＮＲＰ（重複性タンパク質）データベース検索の問い合わせ配列としても使用した。
【０２８６】
自動化配列決定反応を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳを含む、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、製造業者の指示に従って行った。この反応サイクルを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００において、２０℃または３０℃で１分間アニールさせることを除いては、製造業者の指示に従って行った。配列決定反応物をエタノール沈殿させ、ペレットを８μｌの泳動緩衝液中に再懸濁し、１．５μｌを配列決定ゲル上で泳動し、そしてデータをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって集計した。
【０２８７】
ライブラリーにおいて配列が表わされる回数は、クローニングされたｃＤＮＡ配列の配列相同性分析を行い、それぞれの単離されたクローンに対する転写同一性を割り当てることにより、決定される。まず、各配列を、それがミトコンドリア、細菌またはリボソームの夾雑物でないかどうかを見るために調べた。このような配列を、その後の分析から除外した。次に、配列人工産物（例えば、ベクターおよび反復要素）をマスクし、そして／またはそれぞれの配列から取り除いた。
【０２８８】
残った配列を、ＢＬＡＳＴ｛１６６｝によってＧｅｎｅＢａｎｋおよびＥＳＴデータベースと遺伝子同定のために比較し、そして配列同士をＦａｓｔＡ｛１６７｝によって比較して、標準化ｃＤＮＡライブラリーにおけるｃＤＮＡ出現の頻度を計算した。配列を、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ＢＬＡＳＴＮ  １．３ＭＰ｛１６６｝）を用いて、ＧｅｎｅＢａｎｋヌクレオチドデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑヌクレオチドデータベースに対してもまた検索した。次に、配列を重複性タンパク質（ＮＲＰ）データベースに対して、ＢＬＡＳＴＸプログラム（ＢＬＡＳＴＸ  １．３ＭＰ｛１６６｝）を用いて分析した。このタンパク質データベースは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＰＩＲ、およびＮＣＢＩ  ＧｅｎＰｅｐｔタンパク質データベースの組み合わせである。ＢＬＡＳＴＸプログラムを、初期ＢＬＯＳＵＭ−６２置換行列を、フィルターパラメータ（ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）「ｘｎｕ＋ｓｅｇ」を用いて実行した。使用したスコア限界（ｓｃｏｒｅ  ｃｕｔｏｆｆ）は、７５である。
【０２８９】
重複クローンのコンティーグ内へのアセンブリを、プログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．）を使用して、行った。アセンブルしたコンティーグを、ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１内のプログラムを使用して分析した。
【０２９０】
（アレイを使用した、前立腺癌に付随する高められたｃＤＮＡのレベルの検出）
前立腺癌における異なった発現についてスクリーニングされる種々の候補遺伝子を表すｃＤＮＡ配列を、核酸アレイ上のハイブリダイゼーションにより、アッセイした。このｃＤＮＡ配列は、上記のような細胞株または組織から単離されたｃＤＮＡクローンを含んだ。分析されたｃＤＮＡ配列もまた、Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースの配列と重複する配列を含む核酸（種々の起源、種々の機能、および種々の特徴付けのレベルの多様な遺伝子産物をコードする）を含んだ。ｃＤＮＡを、当該分野で周知である方法に従って、スライド１枚あたり９，２１６スポットの密度で二連でスポッティングされた４６０８の配列（コントロールを含む）を表す、およそ２００ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ溶液のおよそ０．８μｌ用いて、反射スライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にスポットした。
【０２９１】
目的の遺伝子産物に対応する選択されたｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物を、５０％ＤＭＳＯ溶液中で調製した。これらのＰＣＲ産物を、Ａｍｅｒｓｈａｍアルミニウムマイクロアレイスライド上に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩスポッティングロボットを使用して、スライド１枚あたり９２１６クローンの密度でスポットした。クローンを二連でスポットし、１アレイあたり４６０８の異なる配列を得た。
【０２９２】
ｃＤＮＡプローブを、上記の患者から単離された腫瘍組織サンプルおよび正常組織サンプルのレーザー捕捉微小解剖法（ＬＣＭ，Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、得た総ＲＮＡから調製した。
【０２９３】
総ＲＮＡを、まずＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写し、第２鎖ＤＮＡ合成を続けた。ｃＤＮＡを、次いでインビトロ転写し、Ｔ７プロモーター媒介発現（例えば、参考文献１６８）を使用してアンチセンスＲＮＡを産生し、次いでこのアンチセンスＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡの第２の組を、Ｔ７プロモーターを使用して再びインビトロで転写し、アンチセンスＲＮＡを得た。次いで、このアンチセンスＲＮＡを、蛍光標識するか、またはこのＲＮＡを再びｃＤＮＡに変換し、３回目のＴ７媒介増幅を行って、より多くのアンチセンスＲＮＡを産生した。従って、この手順は、２回または３回のインビトロ転写を提供して、蛍光標識のために使用される最終ＲＮＡを産生した。プローブを、ＲＮＡ出発物質から蛍光標識ｃＤＮＡを作製することにより、標識した。腫瘍ＲＮＡサンプルから調製した蛍光標識ｃＤＮＡを、正常細胞ＲＮＡサンプルから調製した蛍光標識ｃＤＮＡと比較した。例えば、正常細胞由来のｃＤＮＡプローブを、Ｃｙ３蛍光色素（緑色）で標識し、そして腫瘍細胞から調製したｃＤＮＡプローブを、Ｃｙ５蛍光色素（赤色）で標識した。
【０２９４】
差次的発現アッセイを、同じ患者の腫瘍細胞由来のプローブと正常細胞由来のプローブとの等量の混合により、行った。アレイを、６０℃で約２時間、５×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのインキュベーションによりプレハイブリダイゼーションし、次いで、水中で３回およびイソプロパノールで２回、洗浄した。アレイのプレハイブリダイゼーション後、プローブ混合物を、高ストリンジェンシー条件下（一晩、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および０．２％ＳＤＳ中）でアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、アレイを、５５℃で３回、以下：１）第１洗浄を１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で；２）第２洗浄を０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で；そして３）第３洗浄を０．１×ＳＳＣ中で、のように洗浄した。
【０２９５】
次いでこのアレイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ二色レーザー走査機／検出機を使用して、緑色および赤色の蛍光について走査した。画像を、ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｕｔｏｇｅｎｅソフトウェアを使用して処理し、それぞれの走査の組から得たデータを標準化した。実験を繰り返し、今回、両対照色を用いた２つのプローブの標識により、両方の「色方向」におけるアッセイを行った。時々、各実験を、２枚以上のスライドを用いて繰り返した（それぞれの色方向に１枚）。各走査から得たデータを標準化し、アレイ上のそれぞれの配列についての蛍光のレベルを、４枚のアレイから得た８複製スポット／遺伝子もしくは２枚のアレイから得た４複製スポット／遺伝子または他の順列の比率の幾何平均として表わした。
【０２９６】
前立腺腫瘍組織を使用して、高められたシグナルを与えることが見出されるアレイの特徴を、配列決定し、ヒトゲノム配列にマッピングした。高められたアレイスポット特徴は、ＰＣＡＶの約９０％におよび、このような１１の配列のＰＣＡＶゲノム上の位置は、図９において、個々のアレイの特徴のコードである５桁の数で示される。
【０２９７】
１１の高められた配列のうち幾つかは、ゲノム内のＨＥＲＶ−Ｋ  ＨＭＬ２．０ファミリーの中の高度に保存された領域に由来し、従って第２２染色体中の２０．４２８メガベースにおけるウイルスに特異的ではないが、他のスポットはそうではない。
【０２９８】
（配列２７３７８）
２７３７８（配列番号１４）は、前立腺腫瘍において増大したレベルで存在する。この配列は、第２２染色体（配列番号１のヌクレオチド９７７〜１０７５および２７００〜２７７７）上のゲノムＤＮＡ配列の、２つの別個の領域に整列する：
【０２９９】
【化５】
2006508690.tif 000006
。
【０３００】
配列番号１において、ヌクレオチド１０７６〜１０７７はＧＴであり、ヌクレオチド２６９８〜２６９９はＡＧであり、これらはそれぞれ、コンセンサススプライスドナー配列およびコンセンサススプライスアクセプター配列である。従って、２７３７８へのハイブリダイゼーションは、スプライシングを確証し、ここで、第１の５’ＬＴＲが第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位に結合する（配列番号１のヌクレオチド１０７５〜ヌクレオチド２７００を結合する）。２つのエキソンにおける配列が２つの異なるウイルス（旧型および新型）を形成し、そして、これらは、他のファミリー（新型および旧型のファミリーメンバー）と有意に異なるので、２７３７８産物が、ＰＣＡＶ以外のＨＥＲＶ−Ｋから転写される見込みはない。
【０３０１】
（配列３４０５８）
スポット３４０５８（配列番号１５）は、前立腺腫瘍組織において高度に増大している。この配列は、いくつかの「旧型」ゲノムで生じ、エンベロープＡＴＧを３’ＬＴＲの近くのスプライスアクセプター部位に連結する選択的スプライシング部位をまたぐ。この配列は、第３染色体および第６染色体に見られる関連のＨＥＲＶ−Ｋよりも密接にＰＣＡＶにマッチする（２４４３での単一のミスマッチ）：
【０３０２】
【化６】
2006508690.tif 000007
2006508690.tif 000008
。
【０３０３】
（配列２６２５４）
アレイ上の配列２６２５４からのシグナルは、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において増大した。２６２５４配列（配列番号１６）は、第２２染色体コンティーグＡＰ０００３４５（配列番号１７＝ＡＰ０００３４５のヌクレオチド６３６８３〜６４３３２）およびＡＰ０００３４６（配列番号１８＝ＡＰ０００３４６のヌクレオチド２６２７１〜２６９２０）（配列番号１のヌクレオチド７０６５〜７７０１）とほぼ完全に整列される：
【０３０４】
【化７】
2006508690.tif 000009
2006508690.tif 000010
。
【０３０５】
第２２染色体配列に関する４つの点変異は、（染色体についてかまたは２６２５４についてのいずれかの）配列決定誤差を代表し得るか、あるいは、ヒトゲノム内のＳＮＰであり得る。
【０３０６】
ＰＣＡＶは、第３染色体および第６染色体に見られるＨＥＲＶ−Ｋと最も密接に関連する。２６２５４の領域での、第３染色体、第６染色体および第２２染色体のウイルスのアラインメントは、２６２５４が第３染色体または第６染色体由来でありそうもなく、そして、第２２染色体のＰＣＡＶ転写物由来である可能性が最も高いことを示す：
【０３０７】
【化８】
2006508690.tif 000011
2006508690.tif 000012
。
【０３０８】
第３染色体、第６染色体および第２２染色体上のＨＥＲＶは密接に関連するが、従って、これらは、ハイブリダイゼーションにより区別し得る。
【０３０９】
（配列３０４５３）
アレイ上の配列３０４５３からのシグナルは、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において増大した。３０４５３配列（配列番号１１３）は、第２２染色体と整列される：
【０３１０】
【化９】
2006508690.tif 000013
。
【０３１１】
（配列２６５０３）
アレイ上の配列２６５０３からのシグナルは、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において増大した。２６５０３配列（配列番号１１６）は、第２２染色体と整列される：
【０３１２】
【化１０】
2006508690.tif 000014
。
【０３１３】
（患者ライブラリー）
患者ライブラリーからクローニングしたＨＥＲＶ−Ｋ  ＨＭＬ  ２．０  ｃＤＮＡをＰＣＡＶと整列する。４人の患者由来のライブラリーからのクローンは、ＰＣＡＶと９５％より大きい同一性で整列する。
【０３１４】
配列番号１９は、前立腺腫瘍において増大したレベルで存在するｃＤＮＡ由来である。この４７０ヌクレオチドの最初の４６３は、第２２染色体のゲノムＤＮＡ配列の４つの別々の領域と整列する（配列番号１のヌクレオチド９５６〜１０７５、２７００〜２７７７、８１６６〜８２４４および１０４２４〜１０６０９）：
【０３１５】
【化１１】
2006508690.tif 000015
2006508690.tif 000016
。
【０３１６】
配列番号１の「ギャップ」の前後にあるジヌクレオチド配列は、以下の通りである：
【０３１７】
【化１２】
2006508690.tif 000017
。
【０３１８】
従って、配列番号１の「ギャップ」は、コンセンサススプライスドナー配列に始まり、コンセンサススプライスアクセプター配列に終わる。従って、ｃＤＮＡ内の配列番号１９の存在はスプライシング（ここで、第１の５’ＬＴＲが第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位に連結され（配列番号１のヌクレオチド１０７５がヌクレオチド２７００に連結される））、ならびに他のスプライシング事象を確証する。エキソン１および２の配列が２つの異なるウイルス（旧型および新型）由来であり、これらが、他のファミリー（新型および旧型のファミリーメンバー）から有意に異なるので、配列番号１９産物はＰＣＡＶ以外のＨＥＲＶ−Ｋから転写される見込みはない。
【０３１９】
配列番号１１４（０３５ＪＮ０１３．Ｆ０３−ＦＩＳ）は、入手可能な第２２染色体配列と整列する：
【０３２０】
【化１３】
2006508690.tif 000018
。
【０３２１】
配列番号１１５（０３５ＪＮ０１５．Ｈ０２−ＦＩＳ）は、入手可能な第２２染色体配列と整列する：
【０３２２】
【化１４】
2006508690.tif 000019
。
【０３２３】
配列番号１１７（０３５ＪＮ００３．Ｅ０６−ＦＩＳ）は、入手可能な第２２染色体配列と整列する：
【０３２４】
【化１５】
2006508690.tif 000020
。
【０３２５】
配列番号１１８（０３５ＪＮ０１３．Ｃ１１）は、入手可能な第２２染色体配列と整列する：
【０３２６】
【化１６】
2006508690.tif 000021
。
【０３２７】
配列番号１１９（０３５ＪＮ００１．Ｆ０６）は、入手可能な第２２染色体配列と整列する：
【０３２８】
【化１７】
2006508690.tif 000022
。
【０３２９】
（患者の腫瘍サンプル）
２人の患者からの新鮮な凍結前立腺癌組織を、１０ミクロン切片にカットし、ガラススライドにマウントし、そしてマウスモノクローナル抗体５Ｇ２で染色した。染色を、二次抗体（フルオレセイン結合ヤギ抗マウス）で可視化した。染色は、癌性組織に特異的であることを見出した。サンプルをまた、２６２５４へのハイブリダイゼーションにより分析し、シグナルは、同じ患者由来のコントロールサンプルよりも３５〜４０倍強かった。
【０３３０】
【化１８】
2006508690.tif 000023
。
【０３３１】
（ＲＴＰＣＲ）
種々の組織由来のＲＮＡ抽出物を、ＲＴ−ＰＣＲで分析した。特に、エキソン１とエキソン２との間のスプライシング事象を、図６に示すプライマーを用いて調べた。図１０に結果を示す。全てのレーンが、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＨＭＬ２．０（すなわち、新型ウイルス）のバックグラウンドレベルの発現（細い線）を示すが、前立腺組織（レーン６）は、より長い産物（太い線）を示し、これは、５’ＬＴＲとＥＮＶの開始点との間のより長い配列内のＨＥＲＶ−Ｋの発現を示唆する。他の組織において見られた長いレーン６の産物とバックグラウンド産物との間の長さの差異（約８０ｂｐ）は、図６Ｂに図示するエキソン２の長さに対応する。
【０３３２】
細胞株由来の抽出物もまた試験した（図１１）。再び、「ユビキタス」ＨＥＲＶ−Ｋ発現のバックグラウンドレベルは、ほとんどの細胞株で明らかであった。前立腺細胞株ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ（レーン７）、およびより少ない程度で、２２ＲＶ１（レーン６）は、より長いＲＴ−ＰＣＲ産物を明らかに示した。
【０３３３】
（ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ細胞株）
ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ細胞株よりＲＮＡを抽出した。スプライシングされたｍＲＮＡをクローニングして配列決定し、第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位が使用されることを確認する。これらのｍＲＮＡは、ＰＣＡＶに正確にマッチする配列を有する４つのエキソンを有する。これらは、ＬＴＲ１および２に近接するエキソンを有し、このエキソンにエンベロープＡＴＧと非常に短いオープンリーディングフレームを含むエキソンが続き、最終的に、最後の３’ＬＴＲのフラグメントで終止する。
【０３３４】
第２の５’ＬＴＲの３’末端の近くのスプライスアクセプター部位の使用はまた、私的な前立腺癌ライブラリー（ＣｈｉｒｏｎクローンＩＤ  ０３５ＪＮ０２４．Ｂ０９）に存在するｃＤＮＡにおいても見られた。
【０３３５】
ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ  ＲＮＡの３’末端を、ＲＡＣＥによりマッピングした。正方向のＰＣＲプライマーは、配列番号２１であり、これは、ＰＣＡＶおよび新型ＨＥＲＶ−Ｋにマッチする。逆方向ＰＣＲプライマーは、配列番号２２であった。逆転写のためのプライマーは、配列番号２０であった。ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ由来のｍＲＮＡ標的を用いて、１．３ｋｂに主要なバンドを得た。このバンドをクローニングして配列決定し（Ｔ７またはＳＰ６のいずれかの配列決定用プライマーを用いる）、アラインメントを以下に示す：
【０３３６】
【化１９】
2006508690.tif 000024
2006508690.tif 000025
2006508690.tif 000026
2006508690.tif 000027
2006508690.tif 000028
。
【０３３７】
これらの増幅産物の配列決定は、転写物がＭＥＲ１１ａ挿入内のポリＡシグナル（ヌクレオチド９６１で始まる列）を使用して終止することを示す。再び、これは、ＰＣＡＶに完全に合致する。
【０３３８】
（抗ｇａｇモノクローナル抗体）
ＰＣＡＶは、「旧型」ＨＥＲＶ−Ｋである。「新型」ＨＥＲＶ−Ｋの低レベルの発現がまた検出され得る。ＰＣＡＶおよび「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ由来のｇａｇオープンリーディングフレームは、主要な配列レベルで相同であるが、有意な発散を有する。ｇａｇタンパク質は、酵母において発現され、そして、ＰＣＡＶおよび「新型」ＨＥＲＶ−Ｋの両方について精製され、そして、マウスモノクローナル抗体を生じた。
【０３３９】
発現のために使用される「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ配列を、前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐから単離し、ＰＣＡＶ  ｇａｇ配列を前立腺癌細胞株ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂから単離した。これらの配列を、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３株における発現のために遺伝的に操作した。このベクターは、酵母における自律複製のための２μの配列を、選択可能なマーカーとして酵母遺伝子ｌｅｕ２ｄおよびＵＲＡ３を含む。細菌内のプラスミド複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１の複製起点ならびにａ−因子ターミネーターはまた、この発現ベクター中に存在する。組換えタンパク質の発現は、ハイブリッド型ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下である。
【０３４０】
「新型」ＨＥＲＶ−ＫおよびＰＣＡＶ  ｇａｇについてのコード配列を、それぞれ２０１２ｂｐおよび２１６８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてクローニングした。各ｇａｇを、２つの部分にサブクローニングした：
１．「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇをｐＳＰ７２にサブクローニングした。ＡＤＨ／ＧＡＰＤＨプロモーターに隣接するＨｉｎｄＩＩＩ部位からｇａｇコード配列内のＮｃｏＩ部位までの１４３ｂｐの合成オリゴヌクレオチド。ｏｒｆ−９９と称されるＬｎＣａＰ細胞から得たｃＤＮＡクローンを鋳型として使用して、ＮｃｏＩからＳａｌＩまでの「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇ配列の残存する１８６９ｂｐをＰＣＲにより誘導した。
【０３４１】
２．ＰＣＲを用いて、２Ｂ１１．１２−４４と称されるＭＤＡ  ＰＣａ  ２ｂ細胞から得たｃＤＮＡクローンを鋳型として使用して、ＰＣＡＶ  ｇａｇの１７１５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｖａ３フラグメントを作製した。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ７−Ｚにサブクローニングした。ｇａｇタンパク質の３’末端は、２Ｂ１１．１２−４４クローンにおいて欠けているので、この構築物の３’末端をコードするＡｖａ３−ＳａｌＩフラグメントを、上記の「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇクローンから単離した。
【０３４２】
配列確認の後、それぞれのフラグメントを酵母発現ベクター内でＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターに連結してｐｄ．ＬｎＣａｐ．ｇａｇ酵母発現プラスミド（「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇをコードする）およびｐｄ．ＭＤＡ．ｇａｇ酵母発現プラスミド（ハイブリッド型のＰＣＡＶ／「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇをコードする）を作製した
「新型」発現構築物は、配列番号１１８５であり、配列番号１１８６をコードする：
【０３４３】
【化２０】
2006508690.tif 000029
【０３４４】
【化２１】
2006508690.tif 000030
2006508690.tif 000031
2006508690.tif 000032
。
【０３４５】
ハイブリッド型構築物は、配列番号１１８７であり、配列番号１１８８をコードする：
【０３４６】
【化２２】
2006508690.tif 000033
2006508690.tif 000034
2006508690.tif 000035
2006508690.tif 000036
2006508690.tif 000037
。
【０３４７】
コードするタンパク質のアラインメントは、以下の通りである：
【０３４８】
【化２３】
2006508690.tif 000038
。
【０３４９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３株（ｍａｔａ、ｌｅｕ２、ｔｒｐｌ、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｐｒｃｌ−４０７、ｃｉｒ○、ｔｒｐ＋：ＤＭ１５［ＧＡＰ／ＡＤＲ］）を形質転換し、単一の形質転換体を培地中のグルコースの枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、クマシーブルー染色により全酵母抽出物において検出されるように、酵母中で高いレベルで発現した（図１５Ａ）。発現したタンパク質は、全酵母抽出物（矢印）において容易に観察された。レーン５および６は「新型」ｇａｇ、そしてレーン３および４はハイブリッド型ｇａｇである。形質転換していないコントロール細胞を、レーン２に示す。
【０３５０】
大規模発酵の後、タンパク質を精製し、モノクローナル抗体産生に使用した。８つの大量のｍＡｂを得、これらを、ウェスタンブロットにおいて両方のｇａｇタンパク質を認識する能力について試験した（図１６）。８つのｍＡｂのうち、７つが両方の組換えタンパク質を認識し、そして１つ（５Ａ５／Ｄ４）がＰＣＡＶ／ＨＥＲＶ−Ｋハイブリッド型ｇａｇタンパク質のみを認識する。抗体５Ｇ２は、旧型および新型のｇａｇ抗原の両方と交差反応する：
【０３５１】
【化２４】
2006508690.tif 000039
。
【０３５２】
ｍＡｂ  ６Ｆ８／Ｆ１を図１５Ａと同じ順序の酵母抽出物を含むゲルのウェスタンブロット（図１５Ｂ）に使用した。シグナル強度を減少させるために、ｇａｇ組換えタンパク質を含むサンプルを、組換えタンパク質を含まない酵母抽出物を使用する図１５Ａに見られるサンプルに対して５０倍希釈した。
【０３５３】
５Ｇ２抗体は、ＭＤＡ．ＰＣＡ．２ｂ細胞に結合する（図１２Ｂ）。この細胞は、抗体の不在下では蛍光を発さなかった（図１２Ａ）。前立腺細胞株ＰＣ３はまた、反応性であった（図１２Ｃ）が、ＭＤＡ．ＰＣＡ．２ｂよりも低かった。形質転換した線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）は、抗ＨＥＲＶ−Ｋ−ｇａｇ抗体と反応性でなかった（図１２Ｄ）。
【０３５４】
ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ細胞に見られるｇａｇ  ｍＲＮＡ構造は、第１の５’ＬＴＲで開始し、第２の５’ＬＴＲでスプライシングされる。このような配置は、ＲＮＡが翻訳適格性であるために必要である。なぜならば、第２の５’ＬＴＲは、多くの終止コドンを含み、これは、スプライシングされていないｍＲＮＡにおいてｇａｇ翻訳を妨げる。
（ＰＣＡＶ配列分析）
第２２染色体由来のＰＣＡＶのゲノム配列は、配列番号１として与えられる。この配列は、ゲノム中の第１の５’ＬＴＲの開始から３’ＬＴＲの最終フラグメントの末端まで伸長する。これは、合計１２３６６ｂｐである。
【０３５５】
配列番号１内で、第１の５’ＬＴＲ（新型）はヌクレオチド１〜９６８である。これは、ヌクレオチド１１２６までのＨＥＲＶ−Ｋ配列が後に続く。ヌクレオチド１１２７〜１６７８は非ウイルスであり、これは１４６４〜１４８７にＴＧ反復を含む。第２の５’ＬＴＲ（旧型）は、ヌクレオチド１６７９〜２６６８由来である。３’ＬＴＲは、ヌクレオチド１０５２０〜１０８３８および１１９２９〜１２３６６として断片化される。ＭＥＲ１１ａ挿入は、ヌクレオチド１０８３９〜１１８３４であり、そのポリＡシグナルは、１１６５４〜１１６５９の間に位置する。ポリＡ付加部位は、１１７３６と１１７３９との間に位置するが、正確にどこかを言うのは可能でない。なぜならば、これらの４つのヌクレオチドは、すでにＡであるからである。
【０３５６】
配列番号１の中の塩基性コード領域は以下：
【０３５７】
【化２５】
2006508690.tif 000040
である。
【０３５８】
スプライスドナー（５’ＳＳ）部位は、ヌクレオチド９９９〜１００４、１０７６〜１０８１、２７７８〜２７８３、８２４３〜８２４９、８３７２〜８３７８、８４２９〜８４３６、８６３４〜８６４１、８７０１〜８７０８および８７５３〜８７６０に位置する。スプライスアクセプター（３’ＳＳ）部位は、ヌクレオチド２５９３〜２６１１、２６８０〜２６９９、８１１２〜８１３１、８１４３〜８１６５および１０４０８〜１０４２３に位置する。
【０３５９】
第１の転写領域の後、ヌクレオチド２７００〜２７７７、８１６６〜８２４４および１０４２４〜１１７３９に位置する３つの主要な下流エキソンが存在する。
【０３６０】
ｇａｇ遺伝子（配列番号１のヌクレオチド２８１３〜４９６０；配列番号５７）は、７１５ａａポリペプチドをコードする（配列番号５４）。
【０３６１】
プロテアーゼ遺伝子（配列番号１のヌクレオチド４７６２〜５６８８；配列番号５８）は、３つの終止コドンにより中断される：
【０３６２】
【化２６】
2006508690.tif 000041
。
【０３６３】
終止コドンの間の４つのアミノ酸は、配列番号５９〜６２である。
【０３６４】
ｐｏｌ遺伝子（配列番号８６）はまた中断される。既知のｐｏｌ配列とのアラインメントは、アミノ酸配列の種々のフラグメントを明らかにする（配列番号９２〜９７）：
【０３６５】
【化２７】
2006508690.tif 000042
。
【０３６６】
ｅｎｖ遺伝子（配列番号１のヌクレオチド９１６５〜９８１６；配列番号６３）は、終止コドンにより中断される。最も長い中断されない配列は、アミノ酸配列（配列番号６４）をコードする。配列番号６３のリーディングフレームは、終止コドンの間にいくつかの短いアミノ酸配列（配列番号６５〜８０）を含む：
【０３６７】
【化２８】
2006508690.tif 000043
配列番号１のヌクレオチド８９１６〜９１５５（配列番号８１）はまた、中断されて、いくつかの短いアミノ酸配列（配列番号８２〜８５）を生じる：
【０３６８】
【化２９】
2006508690.tif 000044
。
【０３６９】
「ｍｏｒｆ」または「ＰＣＡＰ３」と呼ばれるポリペプチド産物（配列番号８７）は、ＨＥＲＶ−Ｋについて以前に見られた「ｃＯＲＦ」産物と大まかには等価である。そのコンティーグ配列は、配列番号１のヌクレオチド８１８３で開始し、ヌクレオチド８２４４の後にスプライシングが起こり、そして、ヌクレオチド１０４２４に連結される。スプライスジャンクションは、配列番号８８内にＡＧＴセリンコドンを形成する（図２３）：
【０３７０】
【化３０】
2006508690.tif 000045
。
【０３７１】
ＰＣＡＰ３についてのさらなる詳細を以下に示す。
【０３７２】
（ＰＣＡＶ  ｇａｇ内の独特なＤＮＡ配列）
ＰＣＡＶ  ｇａｇは、４８ヌクレオチド配列（配列番号５３）を含み、これは、第３染色体、第６染色体および第１第６染色体上の密接に関連するＨＥＲＶ−Ｋにおいては見出されない。４８マーは、１６マーの配列番号１１０をコードし、これは、新型ＨＥＲＶ−Ｋまたは他の旧型ＨＥＲＶ−Ｋにおいては見出されない。配列番号５３を含む９９マー（配列番号１からの３６１４〜３７１２）のＢＬＡＳＴ分析における上位５ヒットを示す：
【０３７３】
【化３１】
2006508690.tif 000046
2006508690.tif 000047
。
【０３７４】
（ＰＣＡＶ  ｇａｇ内のエピトープ）
種々のＨＥＲＶ−ＫのＮ末端のアラインメントを以下に示す：
【０３７５】
【化３２】
2006508690.tif 000048
2006508690.tif 000049
。
【０３７６】
２つの領域は、ＰＣＡＶ特異的な検出試薬を作製するのに特に有用である。第１の領域は、アラインメントのアミノ酸２０３〜２２５（配列番号５５；配列番号１１１によりコードされる）である。この領域は、第６染色体上の２つの他のＨＥＲＶ−Ｋに存在するが、これらの２つのウイルスは、旧型ＨＥＲＶ−Ｋ群内である。新型ＨＥＲＶ−Ｋのバックグラウンド（「ユビキタス」）発現は、多くの組織において見られる（例えば、図１０）が、旧型ＨＥＲＶ−Ｋのバックグラウンド発現は見られない。従って、配列番号５５の検出は、新型ＨＥＲＶ−Ｋのバックグラウンド発現を超えて区別され、ＰＣＡＶ発現を検出するのに使用され得る。
【０３７７】
第２の領域は、アミノ酸２８４〜３００（配列番号５６；配列番号１１２によりコードされる）から見出される。なぜなら、この配列はＰＣＡＶに独特であるからである。配列番号１１０（配列番号５３）は、配列番号５６の単一アミノ酸短縮フラグメントである。
【０３７８】
ヒトゲノム配列に対する配列番号１１０のＴＢＬＡＳＴＮ分析は、クローンＫＢ２０８Ｅ９およびＫＢ１５７２Ｇ７の、他のどこかではなく、染色体２２ｑ１１．２において１００％の合致を示す。ＢＬＡＳＴＰ分析は、任意の合致の同定をしそこなう。
【０３７９】
ヒトゲノム配列に対する配列番号５３のＢＬＡＳＴＮ分析は、ドラフト配列として働くＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの第２２染色体のヌクレオチド３１８０７６１〜３１８０８０８で１００％の合致を示し、さらにはヒットしない。
【０３８０】
非重複性のＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳデータベースに対して配列番号１１０を用いる上位５つのＢＬＡＳＴＰヒットを以下に示す：
【０３８１】
【化３３】
2006508690.tif 000050
2006508690.tif 000051
。
【０３８２】
従って、配列番号１１０はＰＣＡＶに独特である。
【０３８３】
（ｃＤＮＡ配列の予測）
スプライスドナー部位およびアクセプター部位に基づいて、配列番号９９〜１０９を構築した。配列番号１０９は、第２の５’ＬＴＲで開始する。
【０３８４】
配列番号９９〜１０８を以下ように配列番号１０と整列する：
【０３８５】
【化３４】
2006508690.tif 000052
2006508690.tif 000053
2006508690.tif 000054
2006508690.tif 000055
2006508690.tif 000056
2006508690.tif 000057
2006508690.tif 000058
2006508690.tif 000059
。
【０３８６】
（ＰＣＡＶの転写開始部位）
他のレトロウイルスとの相同性により、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ（すなわち、ＰＣＡＶゲノム内の転写開始部位）の５’末端は、配列番号１のヌクレオチド５５９の限界ＴＡＴＡ配列の３０塩基下流に落ち着くべきである。
【０３８７】
しかし、実験的な研究は、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの５’末端が、さらに下流であることを示唆する。図３３は、ＲＴ−ＰＣＲ走査アッセイの結果を示し、これを５’末端のマッピングに用いる。５’ＬＴＲのｃＤＮＡを、プロウイルスのゲノムの９９７〜９７２に広がるアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１２０２）を有する総Ｔｅｒａｌ  ＲＮＡをプライムすることにより調製した。次いで、このｃＤＮＡを分割し、そして、９６８〜９５０のアンチセンスプライマー（配列番号１２０３）を用いて、以下のような５’末端をカバーするように設計された一連のプライマーからのセンスプライマーと組み合わせて、ＰＣＲ分析を実行した：１）５７１＜配列番号１２０４＞、２）６００＜配列番号１２０５＞、３）６２６＜配列番号１２０６＞、４）６６０＜配列番号１２０７＞、５）７１２＜配列番号１２０８＞。１μｇのゲノムＨｅＬａ  ＤＮＡにおける二連のＰＣＲ反応をポジティブコントロールとして用い、これらの反応は、全てのプライマー対が有効であることを示した。ｃＤＮＡでプライムされる反応は、プライマー６００と６２６との間の顕著な差異を示し、これは、プロウイルスゲノムの位置６２６に近くに５’末端があることを示唆した。
【０３８８】
この結果を、ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて確認した（図３４）。プロウイルスゲノム中の塩基（３４Ｂ）５０９〜７３５および（３４Ｃ）６００〜７３５をカバーする標識したアンチセンスＲＮＡプローブをＴｅｒａｌ細胞由来の総ＲＮＡにハイブリダイズさせ、標準的な条件下でＲＮａｓｅで消化した。尿素含有ＰＡＧＥによる処理および検出の後、両方のプローブが１００塩基産物を生じた。これらの２つの結果は合致し、そして、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＲＮＡの５’末端がプロウイルスゲノムの塩基６３５周辺（すなわち、ＴＡＴＡ依存性遺伝子に有用な３０ｂｐ下流周辺ではなく、ＴＡＴＡシグナルの１００ｂｐ下流周辺）であることを示す。
【０３８９】
（ＰＣＡＰ３）
ＰＣＡＶのｅｎｖ領域の最終エキソン内で、リーディングフレーム１および２は、それぞれｅｎｖおよびｃＯＲＦをコードする（図２３）。配列番号８７は、ＰＣＡＰ３であり、これは、ｅｎｖとして同じ５’領域を共有するが、ここで、スプライシング事象がｅｎｖコード配列を除去し、そして、ｅｎｖのリーディングフレームに対してリーディングフレームを＋２移動させる（配列番号８８および１１９１）：
【０３９０】
【化３５】
2006508690.tif 000060
。
【０３９１】
従って、このコード配列の大部分は、スプライシングの後に、３’ＬＴＲを含むエキソン内に位置決めされる。＋２リーディングフレームは、ＨＥＲＶ−Ｋにおいて公知の機能を有さないが、前立腺癌細胞株ＭＤＡ  Ｐｃａ−２ｂから調製されたｃＤＮＡは、前立腺癌ｍＲＮＡのようなこれらの転写物を含んだ。例えば、スポット３４０５８（上記参照）は、ＰＣＡＰ３をコードし、患者サンプルの７９％において２倍以上、５３％において５倍以上アップレギュレートされた。これらの図は、ＰＣＡＰ３が多くの前立腺癌に関与するという見解を支持する。さらに、これらの図は、患者が、Ｇｌｅａｓｏｎグレードに従って分類される場合、癌とＰＣＡＰ３発現との間の全体の関係性を反映しない（グレード３の腫瘍は、ＰＣＡＰ３の高度なアップレギュレーションを示すが、より進行したグレード４の腫瘍は、ＰＣＡＰ３抑制を示すようである）。図１８は、標準化前立腺ライブラリーからの６０００のランダムＥＳＴを採用する前立腺癌のマイクロアレイ分析を示す。レーザー捕捉顕微解剖腫瘍から調製したＲＮＡレベルを、腫瘍周辺の正常組織ＲＮＡと比較する。図１８のアスタリスクでタグされた配列は、アップレギュレートされ、これらは全て第２２染色体の単一の１２ｋｂ部位由来である。これらの配列は、ＰＣＡＶの全ての部分に広がる。相対的なＰＣＡＶ発現は、グレード３の腫瘍において非常に高く、多くの患者が１０〜５０倍の範囲の腫瘍／正常比を有する。しかし、Ｇｌｅａｓｏｎグレード４以上において、この比は１に戻り、そして、いくつかの場合、ウイルス発現が抑制される。同様のパターンがｇａｇ発現で見られ（図２７）、これは、ＰＣＡＶ発現が前立腺癌の初期段階に関与することを示唆する。
【０３９２】
ＰＣＡＰ３は、ｃＯＲＦタンパク質と同じであり、この２つのＯＲＦは、開始コドンを共有するが、ＰＣＡＶの２つの小さな欠損が、フレームシフトと「旧型ウイルス」５’スプライシング部位（スプライスアクセプター）の両方を導入し、これにより、ＰＣＡＰ３特異的なスプライシング事象を可能にする。種々の整列したＨＥＲＶ−Ｋゲノムを点検すると、ＰＣＡＰ３が元々のタンパク質の変異した形態であることのさらなる証拠が得られる。従って、このタンパク質は、その元々の能力を発揮する可能性は少なく、機能性ドメインの保持を通じて発癌性活性が上昇し得る。ｅｎｖ、ｃＯＲＦおよびＰＣＡＰ３と共通するコードするエキソンは、ＲＮＡ結合ドメインを含み、これはまた核局在化シグナル（ＮＬＳ）として機能する。
【０３９３】
ＰＣＡＰ３の細胞下の局在化を研究するために、（その役割をより理解するために）、Ｖ５タグ（配列番号１１８９）を有するＰＣＡＰ３発現アデノウイルスを用いて、初代前立腺上皮細胞に感染させた。このタンパク質は比較的安定であり、抗Ｖ５により核細胞質内で標識された（図１９）。この低分子タンパク質の細胞内局在化濃度は、核内の何かと特異的に相互作用していることを示す。
【０３９４】
機能発現アッセイをまた設計した。このアッセイの第１の成分は、ＧＦＰ発現を駆動するＰＣＡＶ  ＬＴＲを有するアデノウイルスベクター（配列番号１１９０）である（図２４）。種々のヒト細胞株をこのウイルスに感染させ、蛍光顕微鏡によってかまたはＦＡＣＳによってかのいずれかで蛍光を測定した。ポジティブコントロールとして、ＧＦＰ発現がＥＦ−ａプロモーターによって駆動されるベクターを用い、このベクターは、全ての真核細胞生物において活性であるべきである。
【０３９５】
ＧＦＰ発現は、卵巣癌細胞、直腸癌細胞および肝臓癌細胞において最小であった。ＧＦＰ発現はまた、不死化腎臓細胞株である２９３細胞、および初代前立腺上皮細胞においても最小であった。ＧＦＰは、種々の前立腺癌細胞株（ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ２Ｂ  ＰＣＡ、ＤＵ１４５）において容易に検出された。代表的なデータを図２５に示す。ＧＦＰ発現パターンは患者サンプルからの遺伝的結果と正確に合致する。これらのデータは、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ  ＬＴＲから駆動される発現が、前立腺癌のマーカーであることを示す。
【０３９６】
ＬＴＲからのＧＦＰ発現が初代前立腺細胞においてサイレントであるが、前立腺癌組織において活性であるようであったため、初代前立腺細胞における発現を活性化する能力についてＰＣＡＰ３を試験した。コード配列を発現カセットに挿入し、アデノウイルスベクターに組み込んだ（図２６）。このベクターをＧＦＰベクターとともに初代前立腺上皮細胞に同時感染させ、ＰＣＡＰ３は、ＧＦＰ発現を弱く活性化した。
【０３９７】
別の実験において、高継代ＰｒＥＣ（老化にアプローチする）を旧型ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲ由来のＧＦＰを発現するアデノウイルスベクター（「ＭＤＡＬＴＲ」：配列番号１１９６）とともに同時感染させ、二次ベクターが約２０のｍｏｉでＰＣＡＰ３を発現した。３日後、蛍光強度をＦＡＣＳにより測定し、ＰＣＡＰ３による活性化が見られた。ＬＴＲ６０を用いる同じ実験において、活性化は存在しなかった。
【０３９８】
（ＰＣＡＰ３および老化）
前立腺癌は、管腔上皮層で発生すると考えられるが、正常な管腔上皮細胞は、非常に少ない細胞分裂が可能である。対照的に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＲＷＰＥ１細胞（図１１および１２を参照のこと）は不死である。ＰＣＡＶは癌の初期段階に関与するようなので、通常は迅速に老化するＰＣＡＰ３の初代前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）への影響を試験した。
【０３９９】
初代ヒト上皮細胞は、非常に制限された分裂能を有する。特定の数の分裂の後、細胞は、老化に入る。老化は、静止状態（正の増殖シグナルが取り除かれる場合または阻害シグナル（例えば細胞−細胞接触）が生じる場合、不死化細胞または前老化細胞は静止状態に入るが、増殖因子を添加することによってか、または細胞を低密度で再配置することによって、再び分裂を誘導し得る）から明らかであり、そして、増殖培地が定期的に交換される場合、老化細胞は分裂することなく数ヶ月生存し得るが、永久に分裂を停止している。
【０４００】
特定の遺伝子、特にウイルスのオンコジーン（例えば、ＳＶ４０  Ｔ抗原）は、細胞に老化シグナルを無視させる。Ｔ抗原は、細胞を刺激して、「複製危機」と呼ばれるさらなる増殖バリアまで分裂を継続させる。危機において２つのプロセスが生じる：細胞が分裂し続けるが、平行して細胞は、蓄積された遺伝的損傷から、非常に高い割合で死ぬ。細胞死が分裂を超える場合、実質的に全ての細胞が短期間に死ぬ。危機の後に増殖する稀な細胞は、不死になり、細胞株を得る。細胞株は、代表的に明白な遺伝的再配置を有する：これらは、これらは三倍体に頻繁に密接し、非相反性の染色体転座が存在し、そして、多くの染色体が欠損および多遺伝子座の増幅を有する｛１６９、１７０、１７１｝。
【０４０１】
危機をもたらす遺伝子産物は、特に興味深い。なぜならば、前立腺癌は、老化後複製により引き起こされ得る高い遺伝的不安定性を示すからである。最近の理論は、前立腺癌が、前立腺上皮内異常形成（ＰＩＮ）と名付けられた病巣から生じることを保持する｛１７２｝。ＰＩＮの遺伝的分析は、前立腺癌の特徴である遺伝的再配置の多くが、この段階ですでに生じていることを示す｛１７３｝。従って、ＰＩＮ細胞をＰＣＡＶ発現について試験し、ウイルスが前立腺癌の最初期段階で役割を果たし得るかどうかを決定した。ＰＣＡＶ  ｇａｇは、豊富に発現することが見出され（図２０）、これは、前立腺癌に関する遺伝的変化が生じる時に、ＰＣＡＶ発現が高いことを示す。ＰＣＡＰ３は前立腺癌において発現するようであるので、その役割は、老化後のＰｒＥＣにおいて細胞分裂を誘導し得るかどうかを見ることによって調べた。
【０４０２】
ＰＣＡＰ発現プラスミドを用いた形質転換後の薬物耐性ＰｒＥＣ選択の、最初の試みは失敗した。ＧＦＰまたはＰＣＡＰ３のいずれかを発現するアデノウイルスベクターでの感染後のＰｒＥＣの分析は、ＰＣＡＰ３細胞における感染４日後の大量の細胞死を明らかにした。ニックしたＤＮＡを有する核を標識する、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ末端標識（ＴＬＴＮＥＬ）の用量依存性の増加は、細胞がアポトーシスに進むことを確認した（図２１）。不均衡な増殖シグナルがアポトーシスを誘導するので、このアポトーシスは、薬物耐性ＰｒＥＣの単離の失敗を説明し得、そして、ＰＣＡＰ３による細胞分裂機構の関与に一致する。
【０４０３】
これらの結果は、ＰｒＥＣにおけるＰＣＡＰ３発現の効果が評価され得る前に、アポトーシスがブロックされなければならないことを示唆した。従って、ＰＣＡＰ３＋ネオマイシンマーカーをコードするプラスミドを、ｂｃｌ−２（抗アポトーシス）およびｌａｃＺ（マーカー）をコードする発現プラスミドと同時にトランスフェクトした。コントロールとして、細胞を、ネオマイシンおよびｌａｃＺ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ＸＬまたはＰＣＡＰ３のいずれかを発現するプラスミドでトランスフェクトした。選択下で２週間後、ｌａｃＺ、ｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ＸＬのディッシュは全て、多数の耐性細胞を有し、これは増殖してディッシュの画分を満たした。これらの細胞がスプリットする場合、これらは、さらに分裂しなかったが、生存可能であり、そして老化親細胞と類似していた。対照的に、ＰＣＡＰ３およびｂｃｌ−２を発現する細胞は、小さな細胞から形成される数コロニーを得、これは、分裂して最初のプレートを満たし、スプリットされると、分裂し続けた。
【０４０４】
上記の薬物選択と並行して、細胞の増殖能力を評価した。親ＰｒＥＣは、老化に達する前に、７世代倍加を経た。対照的に、抗アポトーシス遺伝子＋ＰＣＡＰ３で同時にトランスフェクトした薬物耐性細胞は、増殖を停止する前に、老化点までよく増殖し、１６倍加を経た。約２週間の急速な増殖の後、細胞の増殖は遅くなり、最終的に停止した。同時に、浮いている細胞および死細胞の数は増殖し、そして細胞の外観が変化した−これらの細胞は、通常の上皮細胞の「丸石」外観をもはや有さなかったが、その代わりに、いくつかの形態学を有し、そして、多くの多核細胞が存在した。２週間後、細胞は死亡し、一方で、ｌａｃＺまたはｌａｃＺ＋ｂｃｌ−２でトランスフェクトした細胞は、１ヶ月後に、まだ生存した。
【０４０５】
老化細胞または危機に近づいている細胞のいずれも、数が増えない。しかし、これらの細胞の間の１つの違いは、危機に近づいている細胞が分裂し、そして、感知できる速度で死に、従って、細胞分裂が、２つの状態の間で識別し得ることである。ブロモ−デオキシウリジンで標識した後、３０％の老化前ＰｒＥＣが標識され、これは、ＰＣＡＰ３＋ｂｃｌ−２でトランスフェクトしたＰｒＥＣの１０％であったが、老化ｌａｃＺまたはｃＯＲＦ＋ｂｃｌ−２コントロールは、標識されなかった（図２２）。
【０４０６】
これらの結果は、ＰＣＡＰ３が前立腺上皮細胞において増殖を誘導し得、この増殖が、前立腺癌の根底にある原因であり得ることを示す。
（ＰＣＲによるＰＣＡＶ検出）
プライマー対を試験して、前立腺サンプルについて期待されたＰＣＡＶ産物（Ｐ）を産生するものおよび胸部サンプルについての産物をほとんど産生しないかまたは全く産生しないもの（Ｂ）を産生するものを決定した。プライマーを図２８のＰＣＡＶの５’ＬＴＲのマップに示す。正方向のプライマーは、「９１４」（配列番号１１９２）または「９４９」（配列番号１１９３）であり；逆方向のプライマーは、「２７３６」（配列番号１１９４）または「ｃＤＮＡ」（配列番号１１９５）であった。ｃＤＮＡプライマーは、スプライスジャンクションをまたぐ。各反応を、３０サイクル、ＭＣＦ７細胞（Ｂ）またはＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ細胞（Ｐ）のいずれかから抽出した総ＲＮＡから調製したｄＴで初回刺激したｃＤＮＡで行った。
【０４０７】
結果を図２９に示す。プライマーは、前立腺細胞における優先的な増幅を明白に示し、スプライスジャンクションをつなぐこのプライマー（「ｃＤＮＡ」）は、高度に特異的である。
【０４０８】
準定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験をまた実施した。１０人の患者からのＬＣＭ由来の前立腺組織から増幅したＲＮＡを２７３６プライマーを用いて逆転写し、その後、「９１４」プライマーおよび「ｃＤＮＡ」プライマーのいずれかを用いるか（２８サイクル）、または、ヒトβ−アクチンに対する標準的なプライマーを用いて（２５サイクル）ＰＣＲ増幅を行った。結果を図３０に示す。正常（Ｎ）または癌（Ｃ）の合致するサンプルを増幅した。各対についての正常組織に対する癌組織のシグナル比を、ＰＣＡＶ  ＰＣＲ産物上で示す。
【０４０９】
プライマー「９１４」およびプライマー「ｃＤＮＡ」はまた、種々の組織からのｄＴで初回刺激したｃＤＮＡに対する定量的ＰＣＲで試験した。図３１に示す様に、４７歳の患者からの前立腺組織のみが有意なシグナルを生じた。
【０４１０】
ＲＴ−ＰＣＲをまた、種々の年齢の患者からの前立腺組織で実施した。発現レベルをｇｕｓＢ（β−グルクロニダーゼ）と比較した。結果は以下の通りであった：
【０４１１】
【化３６】
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。
【０４１２】
基準化したＰＣＡＶの図をまた、図３２に示す。
【０４１３】
本発明の好ましい実施形態の上記の説明は、明瞭および理解の目的で例示および例として示している。これは、開示される詳細な形態にまで本発明を排他的にするかまたは限定することを意図しない。本発明の教示から、多くの変化および改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に容易に明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物により規定されることが意図される。
【０４１４】
本明細書中に引用される全ての特許、刊行物および参考文献は、その全体が参考として援用される。
【０４１５】
（配列一覧索引）
【０４１６】
【化３７】
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。
【０４１７】
（参考文献（これらの内容は、全体が本明細書中に参考として援用される））
【０４１８】
【化３８】
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。
【図面の簡単な説明】
【０４１９】
【図１】図１は、種々の内因性レトロウイルスＬＴＲ間の関係を示す系統樹である。「旧型」および「新型」ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲが、強調される。
【図２】図２は、ＰＣＡＶゲノムの配置の５’端を図示する。
【図３】図３は、ＰＣＡＶゲノムの配置の３’端を図示する。
【図４】図４は、先行技術のＨＥＲＶ−Ｋ（「ＨＴＤＶ」｛参考文献４５｝）において起こるスプライシング事象（ｅｎｖおよびｃＯＲＦタンパク質を生じる）を示す。
【図５】図５は、ＰＣＡＶの５’ＬＴＲでのスプライシング事象を図示する。
【図６】図６は、並列のＰＣＡＶの５’ＬＴＲ（図６Ｂ）におけるスプライシング事象が、いかにして他のＨＥＲＶ−Ｋ（図６Ａ）におけるそれらと識別され得るかを、図示する。
【図７】図７は、特異的にＰＣＡＶ  ｍＲＮＡを使用するために、プライマーがいかにして使用され得るかを、図示する。
【図８】図８は、ＰＣＡＶの３’末端における挿入が、これを他のＨＥＲＶ−Ｋから識別するために、いかにして利用され得るかを図示する。
【図９】図９は、ＰＣＡＶゲノムに対するアレイの特徴の可能性の配置の地図を示す。
【図１０】図１０は、種々の組織におけるエキソン１〜２スプライシング事象のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。各レーンは、以下である：（１）マーカー；（２）胎盤；（３）および（４）脳；（５）精巣；（６）前立腺；（７）胸；（８）子宮；（９）甲状腺；（１０）頚；および（１１）肺。
【図１１】図１１は、細胞株におけるエキソン１〜２スプライシング事象のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。各レーンは、以下である：（１）および（１２）マーカー；（２）Ｔｅｒａｌ；（３）ｃｏｌｏ３６０；（４）ＰＣ３；（５）ＤＵ１４５；（６）２２ＲＶ１；（７）ＰＣＡ２Ｂ；（８）ＬＮＣａＰ；（９）ＲＷＰＥ１；（１０）ＲＷＰＥ２；および（１１）ＰｒＥＣ。
【図１２】図１２は、以下に対して５Ｇ２モノクローナル抗体を使用して得られた蛍光の結果を示す：（１２Ｂ）ＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ細胞；（１２Ｃ）ＰＣ３細胞；（１２Ｄ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞。図１２Ａは、５Ｇ２抗体を有さないＭＤＡ  ＰＣＡ  ２ｂ細胞を示す。
【図１３】図１３は、以下を用いた前立腺腫瘍サンプルの染色を、示す：（Ａ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｂ）ｍＡｂ  ５Ｇ２およびフルオロセイン抗マウス、または（Ｃ）フルオロセイン抗マウスのみ。
【図１４】図１４は、以下を用いた前立腺腫瘍サンプルの染色を、示す：（Ａ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｂ）ｍＡｂ  ５Ｇ２およびフルオロセイン抗マウス、または（Ｃ）フルオロセイン抗マウスのみ。
【図１５】図１５は、酵母におけるＨＥＲＶ−Ｋ  ｇａｇタンパク質の発現を示す（１５Ａはタンパク質ゲル染色、および１５Ｂはウェスタンブロット）。
【図１６】図１６は、８つのモノクローナル抗体を用いた、ｇａｇタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１７】図１７は、特定の配列番号をゲノムに対して配置した概略図である（一定比ではない）。
【図１８】図１８は、患者サンプルにおけるＰＣＡＶ発現のマイクロアレイ分析を示す。右の拡大部分において、見出しは、サンプルのＧｌｅａｓｏｎ等級を示す。赤は、癌においてアップレギュレートされる配列を同定し、緑は癌において抑制される配列を同定し、そして黒は無変化の点を示す。個々の配列は、垂直に並べられ、そして患者は水平に示される。左のパネルは、１０３人の患者由来のＲＮＡを用いてアッセイされた全ての６０００配列を示し、ほぼ一様なアップレギュレーションを示す領域は、右に拡大される。
【図１９】図１９は、免疫染色を使用したＰＣＡＰ３の非細胞局在を示す。
【図２０】図２０は、抗ｇａｇ免疫蛍光を使用した、ＰＩＮ組織染色を示す。ＰＩＮの新鮮凍結切片を使用し、そしてＰＩＮの評価は、ヘマトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）−エオシン染色連続切片において、公認病理学者によってなされた。
【図２１】図２１は、ＰＣＡＰ３をコードするアデノウイルスでトランスフェクトされた細胞（以下のｍｏｉにおいて：１００（左上）、５０（右上）、２５（左下）、またはトランスフェクトされていないコントロール（右下））についての、ＴＵＮＥＬを示す。
【図２２】図２２は、ブロモデオキシウリジン標識を使用した、細胞分裂アッセイの結果を示す。
【図２３】図２３は、ＰＣＡＶゲノム（特にｅｎｖ、ｃＯＲＦおよびＰＣＡＰ３について）内におけるスプライシングを示す。
【図２４】図２４は、ＬＴＲ活性について試験するための発現アッセイにおいて使用されるアデノウイルスベクターを示す。
【図２５】図２５は、このベクターから駆動されるＧＦＰ発現の結果を示す。
【図２６】図２６は、ＰＣＡＰ３がＰＣＡＶ  ＬＴＲを活性化する能力を試験するために使用されるベクターを示す。
【図２７】図２７は、抗ｇａｇモノクローナル抗体５Ｇ２を使用して、前立腺癌患者から採取された組織の切片を染色する免疫蛍光実験を示す。図２７Ａは正常な前立腺を示し、図２７Ｂは萎縮した組織を示し、図２７ＣはＧｌｅａｓｏｎ等級３の癌を示し、そして図２７Ｄは、Ｇｌｅａｓｏｎ等級４の癌を示す。
【図２８】図２８は、ＰＣＡＶ特異的プライマーの位置（図２の５’領域を参照）を示す。
【図２９】図２９は、これらのプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。「Ｐ」は前立腺組織であり、「Ｂ」は胸部組織である。
【図３０】図３０は、これらのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。正常（「Ｎ」）前立腺細胞または癌（「Ｃ」）前立腺細胞に適合する対を使用した。シグナル比率を、各対について与える。
【図３１】図３１は、種々の組織についての定量的ＰＣＲ結果を示す。ｙ軸は、ＨＰＲＴに対して標準化されたＰＣＡＶを示す。組織は、左から右へ、以下である：胎盤、胎児脳、胎児心臓、胎児肝臓、脳、心臓、肝臓、膵臓、胃、小腸、結腸、直腸、精巣、前立腺（４７歳男性）、卵巣、副腎、甲状腺、腎臓、膀胱、胸部、子宮、頚、骨格筋、肺、脾臓、胸腺、皮膚。
【図３２】図３２は、前立腺組織におけるＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ発現の年齢に関係した増加を示す。
【図３３】図３３は、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの５’末端をマッピングするために使用される、ＲＴ−ＰＣＲスキャニングアッセイの結果を示す。
【図３４】図３４は、ＲＮａｓｅ保護アッセイの詳細を与える。長いプローブ（2４Ｂ）および短いプローブ（2４Ｃ）の、２つのアンチセンスプローブを使用した。両プローブは、2４Ａにおいて示される領域に保護される。2４Ｂにおいて、ＴＡＴＡシグナルの位置に基づく「通常の」５’末端に基づいて予測されるバンドの位置が示され、加えて、実際のバンドも達成される。2４Ｂにおける３つのレーンは、以下である：（１）Ｔｅｒａｌ；（２）ＲＮＡなし；（３）プローブ（ＲＮＡなし）。2４Ｃの２つのレーンは、以下である：（１）Ｔｅｒａｌ；（２）プローブ（ＲＮａｓｅなし）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月22日(2005.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006508690000001.app