(57)【要約】本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いて、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体（ＭｃＡ）ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１から得られる一価及び二価（二重特異性抗体）の単鎖Ｆｖ型（ｓｃＦｖ）抗体断片に関する。前述のＭｃＡはＣＥＡに対する高い親和性を有しており、ヒトにおける結腸直腸腫瘍の診断及びモニターリングに使用されている。元のＭｃＡと同様に、二重特異性抗体及び一価ｓｃＦｖ断片はヒトＣＥＡに対する高い親和性、及び炭水化物の保存に依存的なエピトープ認識を示す。二重特異性抗体及び一価ｓｃＦｖ断片はそれぞれ（５．０±０．４）×１０９Ｌ  ｍｏｌ−１及び（２．８±０．３）×１０１０Ｌ  ｍｏｌ−１のＣＥＡに対する親和定数を有する。前述の２つの断片は、ＣＥＡがしばしば存在する正常な結腸粘膜を除いては、正常なヒト組織及び細胞と交差反応性を示さない。前記断片は、ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１  ＭｃＡによって産生されるハイブリドーマから得られうる可変領域をコードしている核酸配列のクローニングから、組換え微生物中で発現させることによって産生できる。元のＭｃＡと同様に、二重特異性抗体及び一価ｓｃＦｖは、腫瘍の形成を増殖するヒトＣＥＡ産生細胞をラット内でｉｎ  ｖｉｖｏで同定する能力を有している。一価ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体はＦｃドメインを有さず、前記一価ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の分子量はラットＭｃＡよりもそれぞれ５倍及び２．５倍小さい。その結果、前述の一価ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体はｉｎ  ｖｉｖｏで組織により良好に浸透することができ、且つヒトにおいて免疫原性がより低い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を産生するハイブリドーマから抽出したＲＮＡから得た単量体ｓｃＦｖ型の抗体断片であって、可溶性の形態であるか、固体表面上に吸着されているか、又は細胞中に存在するヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的であり、並びに、（５．０±０．４）×１０９Ｌ  ｍｏｌ−１のＣＥＡに対する親和定数、及びそのグリコシル化の保存に依存的なこのような抗原の認識を示す、抗体断片。
【請求項２】
アミノ酸配列が配列番号１６に示すものである、請求項１記載の単量体ｓｃＦｖ型の抗体断片。
【請求項３】
Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を産生するハイブリドーマから抽出したＲＮＡから得た二価（二重特異性抗体）ｓｃＦｖ型の抗体断片であって、可溶性の形態であるか、固体表面上に吸着されているか、又は細胞中に存在するヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的であり、並びに、（２．８±０．３）×１０１０Ｌ  ｍｏｌ−１のＣＥＡに対する親和定数、及びそのグリコシル化の保存に依存的なこのような抗原の認識を示す、抗体断片。
【請求項４】
アミノ酸配列が配列番号１７に示すものである、請求項３記載の二価（二重特異性抗体）ｓｃＦｖ型の抗体断片。
【請求項５】
ヒトＣＥＡを発現する腫瘍細胞の同定に使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項６】
Ｆａｂ断片及び他のｓｃＦｖ変異体、二重特異的抗体の形態で人為的に連結されているか、又は生物学的若しくは生化学的に活性のあるドメインと融合している、配列番号１６及び配列番号１７に報告されている可変ドメインＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＣＥＡに特異的な組換え又は合成組換え抗体。
【請求項７】
組換え細菌又は酵母、昆虫若しくは哺乳動物の形質移入細胞、又は遺伝子改変した生物中で産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項８】
放射性若しくは他の方法で検出可能な標識、又は抗腫瘍の潜在性を有する化学的若しくは生物学的物質を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、ＣＥＡを発現するヒト腫瘍を治療するための、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、画像化技術を使用してＣＥＡを発現するヒト腫瘍をイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で放射性により位置決定するための、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、細胞に連結している又は連結していないヒトＣＥＡを検出するための、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）診断用の試薬。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を発現する細胞であって、組換えＤＮＡによる遺伝子操作によって得られ、及び、細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である、細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を発現する多細胞生物であって、組換えＤＮＡによる遺伝子操作によって得られ、及び、生物は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物である、多細胞生物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片をコードしているベクターであって、組換えＤＮＡの遺伝子操作によって得られ、及び、ベクターは、プラスミド、又は宿主細胞内に組み込まれることが可能な配列である、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関し、具体的には、本発明はヒト癌胎児性抗原に特異的な、臨床的有効性が証明されているマウスモノクローナル抗体から出発して組換えＤＮＡ技術によって得られた一価及び二価（二重特異性抗体）の形態の単鎖Ｆｖ型の抗体断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）とは、好ましくはヒト胃腸管系の腫瘍及び他の癌腫の細胞によって分泌される１８０ｋＤａの糖タンパク質であるが、結腸粘膜などの一部の悪性でない組織でも検出されることがある。その生理的な役割は完全に解明されておらず、また、何らかの形で細胞接着プロセスに関連していると現在までは考えられている（Ｇｏｌｄ  Ｐ、Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＳＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２２：４６７；１９６５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｗ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：２９６０−２９６４；１９８７；Ｐａｘｔｏｎ  ＲＪ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：９２０−９２４、１９８７；Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  Ｎ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．７：３２２１−３２３０、１９８７；Ｇｏｌｄ  Ｐ、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＮＡ．ＭＪＭ  ３：４６−６６、１９９７）。
【０００３】
ＣＥＡは、反復ドメインを特徴とするその構造のため、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（Ｏｉｋａｗａ  Ｓ他、ＢＢＲＣ  １４４：６３４−６４２、１９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｗ．Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：６３−８３、１９８８；Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６７−８１、１９９９）。ＣＥＡは、ＮＣＡ、胎便抗原、妊娠に特異的なＡ型及びＢ型胆汁糖タンパク質などのこのスーパーファミリーの他の分子に対して高い相同性を有している（ｖｏｎ  Ｋｌｅｉｓｔ  Ｓ、Ｂｕｒｔｉｎ  Ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．３２２−３４１、１９７９；Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ．Ｆ．他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３；６４３−６４９、１９８４；Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｙ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：２０１２−２０１８、１９８２；Ｓｖｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １７：５８８−５９６、１９７６）。
【０００４】
循環ＣＥＡレベルの上昇は、この抗原を発現する原発性結腸腫瘍の手術を受ける患者において、再発及び／又は転移の可能性の最良の指標の１つとして何年も前から検討されている（Ｇｏｌｄ  Ｐ、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＮＡ．ＭＪＭ  ３：４６−６６、１９９７）。循環ＣＥＡの測定は、この腫瘍マーカーの有意な手術前レベルが実証された場合に、他のヒトの癌（乳房、肺）の経過観察を行う方法としても拡張されている（Ｇｏｌｄ  Ｐ、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＮＡ．ＭＪＭ．３：４６−６６、１９９７）。
【０００５】
モノクローナル抗体を産生する技術が発見されて以来（Ｍａｂ；Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：５２−５３、１９７５）、循環ＣＥＡを測定するための免疫アッセイは特異性が向上し、またその使用は広く拡張されている。
【０００６】
ＣＥＡはまた、何年も前からｉｎ  ｖｉｖｏ診断学（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ  Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ  ７；１８３−１８８、１９９２）及びｉｎ  ｓｉｔｕ放射線療法（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７；６５９−６６４、１９９１）において放射性同位体を特異的に方向づけるための、可能性のある「細胞標的」としても研究されている。またその使用は、腫瘍細胞を毒素、薬物、及び他の生物活性生成物の標的とすることが予測されていた（Ｂａｇｓｈａｗｅ  ＫＤ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．３４：２２０−２３０、１９９５）。
【０００７】
抗ＣＥＡ抗体はこのような目的のために使用する主要なベヒクルであり、ポリクローナル抗体の調製から出発し、続いてマウスＭａｂ、そのＦａｂ断片、マウスＭａｂから遺伝子操作することによって得られた抗体断片、及びより最近では、繊維状ファージで提示されるネズミ及びヒト抗体のライブラリーから出発している（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９、４８５２−４８５８、１９８９；Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１：５４８−５５７、１９９９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２、１９９３；７２５−７３４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３  ３２４５−３２６０、１９９４；国際公開公報ＷＯ９３／１１２３６号；Ｃｈｅｓｔｅｒ  Ｋ他  １９９５、国際公開公報ＷＯ９５／１５３４１号；Ａｌｌｅｎ  ＤＪ他、１９９６、ＵＳ５８７２２１５号）。
【０００８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞中、及び他の微生物中での抗体及び抗体断片の発現は当分野で十分に確立されている（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１、１９９１；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ、Ｌａｒｒｉｃ  ＪＷ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１３２、１３４−１３６、２０００）。培養中の上位真核細胞中での抗体及び抗体断片の発現も当業者に知られている（Ｒｅｆｆ  ＭＥ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６、１９９３；Ｔｒｉｌｌ  ＪＪ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０、１９９５）。
【０００９】
ＣＢ−ＣＥＡ．１又はｉｏｒ−ＣＥＡ．１（以降ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１と呼ぶ）としてあいまいに命名されているマウスＭａｂは、現況技術で知られている。このＭａｂはヒトＣＥＡに対する高い特異性を有しており、ＮＣＡなどの分子と望ましくない交差反応を示さず、また、ＣＥＡが一般に分極して見つかる正常な結腸上皮の細胞を除いては、正常な組織を認識しない（Ｔｏｒｍｏ  Ｂ他、ＡＰＭＩＳ  ９７：１０７３−１０８０、１９８９）。このＭａｂはＣＥＡに対する非常に高い親和性を有している（Ｐｅｒｅｚ  Ｌ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４：７９−８２、１９９６）。９９ｍＴｃで標識したこのＭａｂの、ヒト結腸直腸腫瘍の診断及び経過観察における使用が成功している。放射免疫検出の臨床研究により、これが９１．３％の感度、７７．１％の特異性、及び８２．８％の陽性予測値を有することが示されている（Ｏｌｉｖａ  ＪＰ他、Ｒｅｖ  Ｅｓｐ  Ｍｅｄ  Ｎｕｃｌ．  １３：４−１０、１９９４）。このことから、これが、このような目的のために現在世界で臨床的に使用されている唯一の他の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ（米国ニュージャージー州Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ）のＣＥＡ−Ｓｃａｎ（９９ｍＴｃ−Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）よりも優れていることとなる。
【００１０】
Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を産生するハイブリドーマから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得た単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片の開発が１９９２年に報告されている（Ａｙａｌａ  Ｍ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２）。その後の実験戦略では、ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１の可変ドメインの増幅は、両方の可変ドメインのフレームワーク領域の縮重オリゴヌクレオチドを用いて行われた。ｓｃＦｖは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生され、これはＥＬＩＳＡ及び細胞化学の研究においてＣＥＡの認識を示したが、固定した抗原に対する親和性は天然の方法で得たＦａｂよりも２００倍低かった（ＰｅｒｅｚＬ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：７９−８２、１９９６）。この同じｓｃＦｖ断片をピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中にクローニングし、発現させ、産生させたが（Ｆｒｅｙｒｅ  ＦＭ他、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：１５７−１６３、２０００）、ヒトＣＥＡに対する親和性は向上せず、放射標識した断片を用いて実験動物で実施した研究では異常な体内分布が示され（Ｐｉｍｅｎｔｅｌ  ＧＪ他、Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．２２：１０８９−９４、２００１）、これにより、これを更に開発し続けないことが促された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１から出発してＤＮＡ組換え技術によって得られた、一価及び二価（二重特異性抗体）の形態の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片に関する（Ｔｏｒｍｏ  Ｂ他、ＡＰＭＩＳ  ９７：１０７３−１０８０、１９８９）。このＭａｂはＣＥＡに対する非常に高い親和性を有しており（Ｐｅｒｅｚ  Ｌ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：７９−８２、１９９６）、ヒト結腸直腸腫瘍の診断及び経過観察における使用が成功している（Ｏｌｉｖａ  ＪＰ他、Ｒｅｖ  Ｅｓｐ  Ｍｅｄ  Ｎｕｃｌ．１３：４−１０、１９９４）。本発明中で報告するｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片は、細菌及び酵母などの組換え微生物中でそれを発現させることによって産生することができる。元のＭａｂと同様に、ｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片は、炭水化物の保存に依存的なヒトＣＥＡのエピトープに対する特異性を有しており、またこの抗原に対して高い親和性を示す。ｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片は、元のＭａｂに類似した、ヒトの正常及び腫瘍細胞並びに組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ認識パターンを有しており、したがって、放射標識した後は、先天性胸腺欠損マウス中で増殖しているヒトＣＥＡを発現する腫瘍細胞を同定する能力を有する。ｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片はＦｃドメインを有さず、分子量がマウスＭａｂよりも小さいので、診断又は治療目的のためにヒトに施用した場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織により良好に浸透し、且つ免疫原性がより低いという潜在性が与えられる。
【００１２】
本発明で報告するｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片は、同じＭａｂから以前に開発されている他のｓｃＦｖに対して重鎖（ＶＨ、及び軽鎖（ＶＬ）可変ドメイン中のアミノ酸に重要な差異を有しており、ＣＥＡに対する親和性、細胞及び組織の認識における性能、並びにマウス内にｉｎ  ｖｉｖｏで増殖しているヒトＣＥＡを産生する腫瘍の位置決定における有効性について、より優れている。
【００１３】
本発明で報告する組換えｓｃＦｖ一価及び二重特異性抗体断片は、ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１ハイブリドーマから抽出したＲＮＡから出発して、ＰＣＲ並びに組換え微生物中におけるクローニング及び発現技術を使用して開発された。ＭａｂのＶＨ及びＶＬドメインをコードしている塩基配列の増幅及び単離には、以前に報告されているｓｃＦｖを得るために使用したオリゴヌクレオチドの組（Ａｙａｌａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２）とは異なるものを使用した。本発明では、新しい一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖは、以前に得られたｓｃＦｖに対してＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列中に重要な差異を有しており、この差異は、ＶＨドメイン中のフレームワーク１（ＦＲ１）及び３（ＦＲ３）並びに相補的決定領域２（ＣＤＲ２）で以前に得られたｓｃＦｖと１６個のアミノ酸が異なっており、ＶＬドメインのＦＲ１及びＦＲ３間では３個のアミノ酸が以前に得られたｓｃＦｖと異なっている。これは、これらのドメインがＡｙａｌａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２に報告されたものに対して異なるクローニング起点を有していることを示している。二重特異性抗体の場合、これは、ｓｃＦｖ型分子の作製で使用した結合セグメント（リンカー）の大きさ及びアミノ酸組成においても、以前に得られたｓｃＦｖと異なる。
【００１４】
驚くべきことに、この変更は、新しい断片の生化学的及び生物学的特性に反映されており、これらにＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１に非常に類似しており以前に報告されたｓｃＦｖよりもはるかに優れた挙動を与える。以前に報告されたｓｃＦｖと同一のリンカーを有するが（Ａｙａｌａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２）、前述の可変ドメイン中にアミノ酸の変更を有する新しい一価ｓｃＦｖ断片は、以前に報告されたｓｃＦｖよりもはるかに高いヒトＣＥＡに対する親和定数を有する。また、二重特異性抗体は、ヒトＣＥＡに対するその親和定数に関してどちらの一価ｓｃＦｖの形態よりも優れている。２つの新しいｓｃＦｖ一価及び二重特異性抗体断片は、ＣＥＡの認識、腫瘍細胞及び組織の同定、ＮＣＡとの交差反応性が存在しないこと、並びにヒトＣＥＡを産生するマウスに移植した腫瘍を選択的に蓄積する能力に関して元のＭａｂの特異性の特性を保存しており、これらは全て以前に得られたｓｃＦｖよりもはるかに優れた性能である。
【００１５】
２つの新しい一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖは、元のＭａｂよりも分子量がそれぞれ少なくとも５及び２．５倍小さく、これにより、組織により良好に浸透し、且つ人間に対してより免疫原性が低いという潜在性がこれらに与えられ、これらは全て、ヒトＣＥＡを発現する腫瘍を放射性同位元素、薬物、毒素、及び他の生理活性要素の対象とさせるのにこれらを元のＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１  Ｍａｂよりも魅力的且つ恐らくは優位にする。
【００１６】
本発明では、シグナルペプチド並びに定常ドメインＣＨ１及びＣｋをコードしている塩基配列にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドを使用した、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１のＶＨ及びＶＬドメインのＰＣＲによる増幅がどのように可能かを示す。また、増幅したＶＨ及びＶＬドメインをこの順序で、ＰＣＲを使用してアセンブリ形成し、ドメインを連結するリンカーの大きさを操作してｓｃＦｖ断片の様々な形態を得る可能性も示す。１４個のアミノ酸を使用して一価のｓｃＦｖ形態がもたらされ、この数字を５に減らすと二重特異性抗体のｓｃＦｖ型の形態がもたらされる。
【００１７】
本発明では、細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で一価及び二価のｓｃＦｖ断片を発現させることが可能であり、またこれらの断片がｉｎ  ｖｉｔｒｏで、特定の様式で腫瘍細胞に連結している又はしていないヒトＣＥＡを同定することが実証されている。本発明では、放射標識した一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖが、ヒトＣＥＡを発現しマウス内で腫瘍として増殖する腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで同定し、またＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１に非常に類似した挙動を示し、以前に得られたｓｃＦｖよりもはるかに優れた性能を示すことも実証されている。本発明では、新しいｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片を精製且つ特徴づける方法も示す。
【００１８】
本発明中に記述する抗体断片は、これらが臨床的有効性が証明されたＭａｂに由来すること、その大きさがより小さいこと及びＦｃドメインが存在しないことのいずれもからより良好な組織浸透が可能になること、また、ヒト抗マウス免疫グロブリン応答の誘発能がより低いことで反復処置に使用できることが利点であり、癌の診断及び治療への応用に有用である（ＨＡＭＡ；Ｓｃｈｒｏｆｆ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５：８７９−８８５、１９８５；ＤｅＪａｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９：３７７、１９８８）。ＨＡＭＡ応答は、投与した抗体の生物学的効果が中和され結果的に投与量が低下すること、またこれらがアレルギー応答、「血清」病、及び腎臓障害を引き起こす可能性があることから、処置に不都合である。
【００１９】
用語
抗体及びその特異的断片
これらの用語は、天然又は部分的に若しくは完全に合成によって生成した、抗原特異性を有する免疫グロブリン又はその一部を説明している。これらの用語はまた、抗体の結合部位又はその相同体である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質にもわたる。これらは天然の方法によって、又は部分的に若しくは完全に合成によって生成することができる。抗体の例は、免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラス、並びにＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及び二重特異性抗体などの、１つ又は複数の抗原結合部位を含むこれらの断片である。
【００２０】
抗体及び抗体断片には、天然又は完全に若しくは部分的に合成によって生成した免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチド、及び他のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン若しくはその等価物を含むキメラ分子が含まれる。
【００２１】
完全な抗体の断片は、抗原と結合する機能を実行することができることが示されている。このような結合断片の例は、（ｉ）免疫グロブリンのＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含むＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）所定の抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）所定の抗体のＶＨ及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーで結合されたｓｃＦｖ断片（Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、１９８８）、（ｖ）ｓｃＦｖと類似の方法で構築するが、リンカーが小さいことにより同一ｓｃＦｖ分子のＶＨ及びＶＬドメインがその間で会合できず、また抗原結合部位が２つ以上あるｓｃＦｖの会合によって形成される多価又は多重特異的断片である「二重特異性抗体」（国際公開公報ＷＯ９４／１３８０４号；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８、１９９３）、（ｖｉ）ｄＡｂ（Ｗａｒｄ  ＳＥ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、１９８９）、単離ＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２断片及び二重特異性ｓｃＦｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６−４４９、１９９３；ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｈ他、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．３１：５−３１、１９９８）などの他の断片である。
【００２２】
二重特異性抗体及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを用いてＦｃ領域なしで構築することができ、これにより、ヒトに投与した際の抗アイソタイプ反応の有効性が潜在的に低減される。また、これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び組換え酵母中で産生されるので特に有用である。その大きさが完全な免疫グロブリンよりも小さいので、組織への浸透性の潜在性が増す。
【００２３】
抗原結合部位
この用語は、全ての抗原又はその一部と特異的に相互作用する区域を含む抗体部分を説明している。抗原が大きい場合は、抗体はエピトープと呼ばれる抗原の特定の部分としか結合することができない。抗体結合部位は、１つ又は複数の抗体可変ドメインで与えることができる。好ましくは、抗原結合部位は抗体の軽鎖（ＶＬ）の可変領域（又はドメイン）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域（又はドメイン）を含む。
【００２４】
特異性
抗体又はその断片が、その特異的結合対とは異なる他の分子と有意な結合を提示しない状態を言う。また、この用語は、抗原結合部位がいくつかの関連又は非関連抗原中に表れる特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、結合部位はこのエピトープを保有するいくつかの抗原と結合することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明を通して特異的ポリペプチド分子が得られ、これはヒトＣＥＡに特異的なマウスＭａｂ由来の１つ又は複数の抗原結合部位によって形成されている。抗原結合部位は、ポリペプチド分子を構築する方法に応じて、一価、二価、及び他の形態の抗体断片の形態でアセンブリ形成される。
【００２６】
ヒトＣＥＡに特異的な一価ｓｃＦｖ断片の形態のポリペプチド分子は、この抗原に対する親和定数（５．０±０．４）×１０９Ｌ  ｍｏｌ−１を示し、１４個のアミノ酸の結合セグメント（リンカー）によって連結されているＶＨ及びＶＬドメインをこの順序で含み、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する。
【００２７】
ヒトＣＥＡに特異的な二価ｓｃＦｖ断片（二重特異性抗体）の形態のポリペプチド分子は、この抗原に対する親和定数（２．８±０．３）×１０１０Ｌ  ｍｏｌ−１を示し、それぞれが５個のアミノ酸の結合セグメント（リンカー）によって連結されているＶＨ及びＶＬドメインによってこの順序で形成される２つの同一の分子の対合を含み、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明の別の態様では、一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片は、正常組織、又は以下の正常組織、すなわち肝臓、腎臓、肺、精巣、血液、脾臓、及び膵臓由来の細胞と結合しない、又は有意でない様式で結合する。結腸粘膜の場合、一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片は管腔分泌の産物及び尖端域又は一部の腺中で独占的に反応する。一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片が正常なリンパ球及び好中球と反応性を持たないことは、ＮＣＡ抗原との交差反応性が重要なレベルでないことの指標である（ｖｏｎ  Ｋｌｅｉｓｔ  Ｓ、Ｂｕｒｔｉｎ  Ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．３２２−３４１、１９７９；Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ，Ｆ．他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３；６４３−６４９、１９８４）。
【００２９】
一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片は、可溶性ＣＥＡ、固体表面に吸着させたＣＥＡ、又はそれを産生する細胞に結合しているＣＥＡ、及び腫瘍組織、とりわけヒトの結腸直腸、乳房、肺、膵臓及び胃の腺癌に結合することができる。一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片並びにＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１は、ヒトＣＥＡのグリコシル化の保存に依存的な形態で可溶性ＣＥＡ及び固体表面に結合したＣＥＡに結合し、これにより、この抗原の炭水化物が認識に関与していることが示唆される。
【００３０】
本発明中で報告する、ＣＥＡと結合する能力、その報告された親和性、特異的なエピトープ認識、並びに本発明中に記載した断片と類似及び等価な生物学的及び生化学的性能を有する一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片由来のポリペプチド分子は、等価な変形形態であるとみなされ、本発明に含まれる。このようなポリペプチド分子は、ＶＬドメインがＶＨに先行するｓｃＦｖ、又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆａｂｂ、三量体及び四量体ｓｃＦｖ等（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９、１９９１；国際公開公報ＷＯ９４／１３８０４号；ｄｅ  Ｈａａｒｄ．Ｈ他、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．３１：５−３１、１９９８）などの他の組換え抗体断片の形態をとることができ、また、現況技術で知られている他の結合セグメント（リンカー）が使用される。これらはまた、一部分がＣＥＡに対する特異性を保存しており、他の部分が異なる特異性を有する二重特異性抗体分子の形態をとることもできる。
【００３１】
本発明には、先の段落に記載した特徴に従っており、可変ドメイン中に存在するＢ細胞及びＴ細胞のエピトープが、抗原認識は変化しないが生じる分子のヒトにおける免疫原性が低減されているように改変されている、いわゆる「免疫原性の低減によるヒト化」による一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片の変形形態、例えばＣａｒｒ  ＦＪ他、２０００、ＥＰ９８３３０３Ａ１号及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐｅｒｅｚ  Ｒ他、ＵＳ５７１２１２０−Ａ号に示されるものも同様に含まれる。第１の抗体のＣＤＲ配列をその抗体由来でない配列のフレーム内に配置する、いわゆる「ＣＤＲ移植」によって、例えばＥＰ−Ｂ−０２３９４００号、ＥＰ−Ａ−１８４１８７号、ＧＢ２１８８６３８Ａ又はＥＰ−Ａ−２３９４００号に示されるように産生し、且つ同様の親和性でＣＥＡと結合する能力、競合能力、特定のエピトープ認識、並びに本発明中に記載した一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片に類似及び等価な生物学的及び生化学的性能を有するものも、本発明中に含まれる、等価とみなされる変形形態である。
【００３２】
抗体配列以外にも本発明に含まれるポリペプチド分子は、ペプチド若しくはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、又はＣＥＡ抗原と結合することとは異なる機能的特徴を分子に付加する他のアミノ酸、例えば精製若しくは同定用のタグ、酵素若しくはその断片、生体応答調整物質、毒素又は薬物などを含むことができる。
【００３３】
本発明に従って、一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片を単離又は精製した形態で投与することができる。
【００３４】
本発明は、ＣＥＡを発現するヒトの癌形態、例えば結腸、肺、乳房又は他の腺癌などの診断試薬としての、上述のポリペプチド分子の一部の使用を予測している。
【００３５】
上述のＣＥＡに特異的なポリペプチド分子を放射標識し、ヒトにおいてＣＥＡを発現する腫瘍の存在及び位置を特異的な様式で実証する画像を得るための試薬として使用することができる。本発明は、ＣＥＡを発現する細胞又は腫瘍の存在を決定する方法を提供し、この方法では、細胞を記載したポリペプチド分子と接触させ、これらの細胞との結合を決定する。この方法はｉｎ  ｖｉｖｏで、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで身体から取り出した細胞試料で開発することができる。
【００３６】
本発明は、前述したものなどのポリペプチド分子をヒトＣＥＡに結合させる方法を提供する。この結合はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで起こることができる。結合がｉｎ  ｖｉｖｏである場合、本方法は、ポリペプチド分子を１個又は複数の個体である哺乳動物に投与することを含むことができる。ｔを本明細書中で実験的に実証するように、本発明の一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片は、マウスに移植した後に腫瘍として増殖する形質移入させたマウス腫瘍細胞によって発現されたヒトＣＥＡに結合するので、特異的な結合を有する分子及びその特性の研究、調査、並びに開発に有用な実験モデルを提供する。
【００３７】
細胞試料上の抗体の反応性は、任意の適切な手段によって検出することができる。このような可能性の１つは、個別のレポーター分子で標識することである。レポーター分子は、直接的又は間接的に検出され得る、好ましくは測定されるシグナルを生じることができる。レポーター分子のカップリングは直接又は間接の、共有又は非共有カップリングであることができる。ペプチド結合による結合は抗体とレポーター分子とをカップリングする遺伝子融合の組換え発現によりもたらすことができる。カップリング方法を決定する形態は本発明の特徴ではなく、当業者はその選好及び一般知識に従って適切なモデルを選択する能力を有するであろう。
【００３８】
１２５Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９ｍＴｃなどの放射性核種を使用して一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片並びにその等価形を標識する場合は、これらが好ましくは腫瘍中に存在し、正常組織中に存在しなければ、腫瘍組織中の放射性標識の存在はγカメラを用いて検出及び定量することができる。得られた画像の質はシグナル：バックグラウンドに直接関連する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ．Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ．１９９２、７；１８３−１８８）。１２５Ｉの実験的な使用を本文中に例示する。
【００３９】
本発明はまた、前述の一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片及びその等価な変形形態を、例えば、これらが治療能力を有する分子にカップリング、コンジュゲート若しくは結合している場合、又は組換え融合タンパク質として作製される場合に、治療試薬として使用できるような要素も提供する。本発明による一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片及びその等価な変形形態を使用して、ＣＥＡを発現する腫瘍を毒素、放射活性体、Ｔ及びＮＫ細胞、若しくは他の分子の対象とさせる、又は生物中で所望の治療効果を導くことができる抗イディオタイプ応答を発生させることができる。これと一致して、本発明の他の態様は、一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片又はその等価な変形形態を医薬品又は薬剤組成物として投与することを含む処置方法の要素を提供する。
【００４０】
本発明に従って、この組成物を個体に、好ましくは少なくとも１つの症状を改善するという点で患者への利点を実証するのに十分な「治療上有効量」で投与することができる。投与する量、投与の頻度及び間隔に関する詳細は処置する疾病の性質及び重篤度に依存し、これらの決定は専門家及び他の医師の責任である。抗体の適切な用量は当分野で周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．他、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４、１９９１；Ｂａｇｓｈａｗｅ  ＫＤ他、Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２、１９９１）。
【００４１】
組成物は、処置する疾病に応じて、単独で又は他の処置と同時に若しくは連続的に組み合わせて投与することができる。
【００４２】
本発明に従い、また本発明に従って使用すべき薬剤組成物は、活性成分以外に、賦形剤、緩衝剤、安定剤若しくは許容される薬剤担体、又は当業者に周知の他の物質を含むことができる。これらの物質は無毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害しないべきであり、またその詳細な性質は経口であろうと、例えば静脈内などの注入であろうと投与経路に依存する可能性がある。
【００４３】
本発明に従うｓｃＦｖの一価及び二重特異性抗体の断片及びその等価な変形形態は、それをコードしている核酸の発現によって作製することができる。前述のこれらポリペプチド分子の任意のものをコードしている核酸は本発明の一部であり、このような核酸の発現方法も同様である。異なる実施形態では、核酸は配列番号１６及び１７に示すアミノ酸配列をコードしていることができる。
【００４４】
一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ及びその等価な変形形態の組換え発現には、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化、マーカー遺伝子、及び他の関連配列を含めた十分な制御配列を有する適切なベクターを選択又は構築することができる。ベクターはプラスミドであることができる。核酸を操作するための多くの既知のプロトコル及び技術、例えば核酸構築体の調製、ポリメラーゼ連鎖反応、突然変異誘発、配列決定、細胞及び遺伝子発現におけるＤＮＡの導入、タンパク質分析、並びに他のものは、分子クローニング：実験室手引き：第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９又は分子生物学の手短なプロトコル、第２版（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２又はＥｒｌｉｃｈ  ＨＡ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９などのいくつかの参考文献に詳細に記載されている。これらの参考文献に示される開示は、参考として本文書に組み込まれている。
【００４５】
本発明の別の態様は、外来核酸を含む宿主細胞及びこのような核酸を宿主細胞中に導入する方法を提供する。導入には、このような目的のために存在する技術のうち任意のものを使用することができる。細菌細胞及び酵母細胞では、この技術はエレクトロポレーションであることができる。導入後、例えば遺伝子の発現に望ましい条件下で宿主細胞を増殖させることで核酸の発現を誘発させるか又は許容することができる。一実施形態では、本発明の核酸は宿主細胞に取り込まれる。
【００４６】
産生された後、一価及び二重特異性抗体のｓｃＦｖ断片及びその等価な変形形態は、上記で述べたように、特異的結合メンバー以外にメンバーと細胞又はメンバーと細胞に連結していないＣＥＡとの結合を決定するための１つ又は複数の試薬を含む一組の試薬など、薬剤としての組成物又は診断用製品の形成等において、本明細書中に示す任意の形態で使用することができる。
【００４７】
本発明の他の更なる態様及びその実現は、当業者には明らかであろう。本発明の完全な理解のために実施例を提供するが、本発明の拡張及び範囲を限定するものではない。以下の図を参照する。
【００４８】
本明細書中で言及する全ての文献は参照により組み込まれている。
【００４９】
（実施例）
１．Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１の可変ドメインのＰＣＲによる増幅、クローニング、及び配列決定。
２．ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体のアセンブリ形成、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現、及びそれらのヒトＣＥＡの認識の実証。
３．ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中でのｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の発現、並びにそれらのヒトＣＥＡの認識の実証。
４．細菌中で産生されたｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の精製。
５．タンパク質分解性消化及び質量分析による二重特異性抗体の特性決定。
６．脱グリコシル化したＣＥＡの認識の研究。
７．正常及び腫瘍組織における免疫細胞化学的及び組織化学的調査。
８．親和定数の決定。
９．Ｂ１６−ＣＥＡ１３細胞を接種することによって誘発させた腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける、１２５Ｉで標識した断片及び抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的認識の決定。
【実施例１】
【００５０】
Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１の可変ドメインのＰＣＲによる増幅、クローニング、及び配列決定
手順（ａ）ＲＮＡの精製及び可変領域の増幅
マウスハイブリドーマＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１の１０６個の細胞由来の全ＲＮＡ（Ｔｏｒｍｏ  Ｂ．他、ＡＰＭＩＳ．９７：１０７３−１０８０、１９８９）を、ＴｒｉＰｕｒｅ（商標）試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で抽出した。オリゴｄＴをプライマーとして使用して、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。重鎖及び軽鎖可変ドメインの遺伝子の特異的増幅にはポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ）を用いた。使用した合成プライマーは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．他（米国保健社会福祉省、ＮＩＨ、１９９１）が報告したマウスＩｇＧ及びκ鎖のコンセンサス配列に基づいて設計され、実験方法は以前に本研究室によって開発されている（Ｃｏｌｏｍａ、ＭＪ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：１５２−１５６、１９９１）。ＰＣＲで用いたオリゴヌクレオチドの配列を表Ｉに示す。
【００５１】
【表１】
2006500913.tif 000002
【００５２】
ＰＣＲには、ＰＣＲ  Ｃｏｒｅキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用した。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９４℃で変性、１分間、５５℃でアニーリング、１分間、７２℃で伸張、１分間、２５サイクル、及び最終サイクルで既に記載した温度で更に５分間の伸張。これらは全てＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒ装置で行った。各反応の最終体積は１００μＬであった。全てのオリゴヌクレオチドを最終濃度１μＭで使用した。
【００５３】
予想される大きさが約３２０〜５３０ｂｐであるＤＮＡ増幅断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ，ＧｍｂＨ）を用いて低集合点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）で精製し、ＤＮＡ断片の「平滑末端」クローニング用に設計されたｐＭＯＳベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中にそれぞれ独立にクローニングした。
【００５４】
手順（ｂ）．可変ドメインのヌクレオチド配列
ベクターｐＭＯＳ中にクローニングした軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列を決定するために、製造元が推奨するオリゴヌクレオチドを使用した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。塩基の配列はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩ装置及び「Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ５  Ｃｙ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット」を用いた自動化方法によって作製した。プラスミドｐＶＬ２及びｐＶＨ５がそれぞれＶＬ及びＶＨの配列の代表として選択された。
【実施例２】
【００５５】
ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体のアセンブリ形成、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現、及びそのヒトＣＥＡの認識の実証
手順（ａ）．可変ドメインの再増幅並びにｓｃＦｖ及び二重特異性抗体のアセンブリ形成
プラスミドｐＶＨ５及びｐＶＬ２中に含まれるＶＨ及びＶＬドメインのｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の形態のアセンブリ形成にＰＣＲを使用した。
【００５６】
合成オリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＶＨ５及びｐＶＬ２中のＶＨ及びＶＬの配列に基づいて設計した。これらには、ベクターｐＪＧ−１ｍ中へのクローニングのための制限部位が含まれ、また単量体ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体のアセンブリ形成のための１４個及び５個のアミノ酸のリンカーセグメントが組み込まれていた（表ＩＩ及びＩＩＩ）。
【００５７】
表ＩＩ．ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体断片の構築に使用した結合セグメント（リンカー）のアミノ酸配列
ＳｃＦｖ．−リンカーＬ１：ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号５）
二重特異性抗体．−リンカーＬ２：ＧＧＧＧＳ（配列番号６）
【００５８】
【表２】
2006500913.tif 000003
【００５９】
断片のアセンブリ形成には、以下を増幅するために第１ステップでそれぞれ独立したＰＣＲを行った：
１．一価ｓｃＦｖに複製起点を与えるドメイン。反応１：プラスミドｐＶＨ５を鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド５及び６（表ＩＩＩ）を用いる。反応２：プラスミドｐＶＬ２を使用し、オリゴヌクレオチド７及び８（表ＩＩＩ）を用いる。
２．二重特異性抗体に複製起点を与えるドメイン。反応３：プラスミドｐＶＨ５を使用し、オリゴヌクレオチド５及び９（表ＩＩＩ）を用いる。反応４：プラスミドｐＶＬ２を鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド８及び１０（表ＩＩＩ）を用いる。
【００６０】
ＰＣＲで使用した条件及び試薬は既に上に記載してある。全てのオリゴヌクレオチドは最終濃度１μＭで使用した。
【００６１】
ｓｃＦｖのアセンブリ形成には、４μＬの反応物１及び２を、最終濃度１μＭのオリゴヌクレオチド５及び８（表ＩＩＩ）と、並びに最終濃度０．０１μＭのオリゴヌクレオチド６及び７（表ＩＩＩ）と混合して、新たなＰＣＲを行った。
【００６２】
二重特異性抗体のアセンブリ形成には、４μＬの反応物３及び４を、最終濃度１μＭのオリゴヌクレオチド５及び８（表ＩＩＩ）と、並びに最終濃度０．０１μＭのオリゴヌクレオチド６及び７（表ＩＩＩ）と混合して、新たなＰＣＲを行った。
【００６３】
増幅したＤＮＡ断片は約７００ｂｐの主要なバンドとして検出され、これを既に記載のように低融点アガロースゲルで単離した。
【００６４】
手順（ｂ）．ｐＪＧ−１ｍベクターへのクローニング
ベクターｐＪＧ−１ｍとは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム中での抗体断片の発現のために設計されたプラスミドである（図１）。主要素として、これは、ＬａｃＺプロモーター、シグナルペプチド、遺伝子断片を挿入するための制限部位ＡｐａＬ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉ、ｃ−ｍｙｃペプチド及び６個のヒスチジンをコードしている配列を有する。この最後の要素は、固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによる発現産物の精製用のタグとして使用する（ＩＭＡＣ；Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．  ３：２６３−２８１、１９９２）。当該のｓｃＦｖをベクター内にクローニングするためのクローニング用制限部位の塩基配列、及びｓｃＦｖに付加されるＣ末端アミノ酸の配列を図１に示す（配列番号１３）。
【００６５】
ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体に対応するＤＮＡ断片並びにｐＪＧ−１ｍベクターをＡｐａＬＩ及びＮｏｔ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）制限酵素で消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してバンド及びベクターをそれぞれ独立にライゲートさせた。ライゲート反応の産物を、エレクトロポレーションによるコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に使用し（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ｓｔｒａｉｎ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、形質転換された細胞を固体選択培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天）中で、３７℃で１６時間増殖させた。用いた方法は分子クローニングの実験室手引き、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  １９８９に記載されている。
【００６６】
いくつかのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製した後に組換えプラスミドを選択し（ＱＩＡＧＥＮ  ＭｉｎｉＰｒｅｐキット）、既に記載した制限酵素で消化することによって予想されるライゲート産物が対応するかどうかの確認を行った。制限分析では、線状化したベクターに対応する約３．５ｋｂのバンド、並びにｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の断片をコードしている遺伝子の約７００ｂｐのバンドが得られた。
【００６７】
ベクターｐＪＧ−１ｍのクローニング領域の外部にハイブリダイズする特異的に設計したプライマーを用いて（表ＩＶ）、既に記載した手順によって各構築体について５つのクローンの配列決定を行った。
【００６８】
表ＩＶ．ＰＣＲでアセンブリ形成し、ベクターｐＪＧ−１ｍ中にクローニングしたｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の塩基配列を決定するための合成オリゴヌクレオチド
オリゴ１１．（配列番号１４）
５’．．．ＧＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣ．．．３’
オリゴ１２．（配列番号１５）
５’．．．ＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣ．．．３’
【００６９】
一価ｓｃＦｖ（クローンｐＪＧ１ｍ−２５）及び二重特異性抗体（クローンｐＪＧ１ｍ−１８）について得られた塩基配列から導いたアミノ酸配列を図２に示す（配列番号１６及び配列番号１７）。以前に開発されたｓｃＦｖに対して（Ａｙａｌａ  Ｍ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２）、新しい一価ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体について今回得られたＶＨ及びＶＬ配列は、ＶＨのＦＲ１、ＣＤＲ２及びＦＲ３ドメイン内で１６個のアミノ酸が異なっており、ＶＬのＦＲ１及びＦＲ３ドメインで３個のアミノ酸が異なっている。
【００７０】
これらの結果は、新しい一価ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体を構築するためにハイブリドーマＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１から増幅及びクローニングした可変ドメインは、以前に報告されたｓｃＦｖをクローニングするための増幅で使用したものとは異なるＲＮＡ由来であることができることを示している。
【００７１】
新しい一価ｓｃＦｖのリンカーセグメントは以前に報告されているｓｃＦｖのリンカーセグメントと同一である。新しい二価ｓｃＦｖ（二重特異性抗体）の結合セグメントは５個のアミノ酸しか含まないので、以前に得られたｓｃＦｖの結合セグメントとは異なる。これらの実験では、リンカーセグメントＬ１及びＬ２の配列も確認され、これらを表ＩＩに示す。
【００７２】
手順（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の発現の確認
コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ＴＧ１を、どちらの抗体断片の情報も含むプラスミドｐＪＧ１ｍ−２５及びｐＪＧ１ｍ−１８でそれぞれ独立して形質転換させた。この株では、異種タンパク質のペリプラズムにおける発現、又は培地へのその分泌が可能になる。
【００７３】
形質転換させた細菌を固体選択培地に播種し、３７℃で１６時間増殖させた。２つの構築体のそれぞれの代表コロニーを、ＯＤ５３０ｎｍ＝１となるまで液体培地で増殖させ、培地に１ｍＭのＩＰＴＧを加えて１２時間誘発させた。１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中の電気泳動で評価するために、細胞を遠心分離し、ペリプラズム内容物を浸透圧衝撃及び短い超音波処理（数秒間）によって単離した。この試験により、どちらの場合にも予想された分子量（約２７ｋＤａ）のタンパク質が発現されたことが明らかとなり、その後これを、このタンパク質が含むｃ−ｍｙｃ由来のペプチドに対して特異的なＭａｂ（９Ｅ１０）（１μｇ／ｍＬ）を一次抗体として使用して、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートしたウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体を使用して、ウエスタンブロットによって評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＨｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａニトロセルロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へのタンパク質の移動は半乾燥移動装置（ＢｉｏＲａｄ）中で行った。展開にはＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ）不溶性基質を使用した。
【００７４】
２つの構築体で、Ｍａｂ９Ｅ１０を用いて言及した大きさの組換えタンパク質を同定した。
【００７５】
手順（ｄ）ＥＬＩＳＡによる、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体によるヒトＣＥＡの特異的認識
ＥＬＩＳＡ試験は、ポリビニル製プレート（Ｃｏｓｔａｒ、９６ウェルのビニル製アッセイプレート）をヒトＣＥＡ（Ｃａｌｂｏｃｈｅｍ  ２１９３６９）で、１μｇ／ｍＬの濃度でコーティングすることによって作製した。プレートを脱脂乳でブロッキングした後、２つの構築体に対応する細菌ペリプラズム試料をＰＢＳ−２％脱脂乳中の１：５、１：１０、及び１：２０の希釈率で加え、室温で２時間インキュベートした。
【００７６】
断片のＣＥＡとの結合の検出には、Ｍａｂ９Ｅ１０（１μｇ／ｍＬ）を使用し、次いでＳｉｇｍａの西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウス抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。数回洗浄した後、反応を展開させるためにＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）及びＨ２Ｏ２を色素原及び基質として使用し、反応物の定量的評価はＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＳで４９２ｎｍの読取を行った。
【００７７】
この試験では、陽性対照としてＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を使用した。挿入物を有さないベクターｐＪＧ−１ｍで形質転換させた細胞ＴＧ１に対応するペリプラズム分画、及び非関連のＭａｂを陰性対照として使用した。また、以下の関連性のない抗原でプレートをコーティングした：１０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍＬの卵白アルブミン、１０μｇ／ｍＬのリゾチーム、１０μｇ／ｍＬのキーホールリンペットヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ）。全てのプレートに、抗原を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみを入れたウェル（ブランク）を含めた。陰性対照で生じるよりも少なくとも４倍高い吸光値が陽性であるとみなされた。
【００７８】
これらの実験では、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の構築体のペリプラズム試料は、ポリビニル製プレートに吸着させたヒトＣＥＡの認識能力に関して陽性の結果となった。これらの同じ試料が、関連性のない抗原の全てで陰性であった。
【００７９】
手順（ｅ）ＥＬＩＳＡ及び間接免疫蛍光法における、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体による細胞に会合しているヒトＣＥＡの認識
全て培養中にＣＥＡを発現するヒト腫瘍細胞系ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２９）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８２）、及びＬＳ  １７４Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１８８）を９６ウェルのポリスチレン製プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。コンフルエントな状態に達した後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、排水し、空気乾燥させた。その後、冷アセトン−メタノールの１：１（ｖ：ｖ）混合物を３分間用いることによって細胞をプラスチックに固定した。残渣を排除するために蒸留水で数回洗浄した後、プレートを、２つの構築体に対応する細菌ペリプラズム試料をＰＢＳ−２％脱脂乳中の１：２、１：８、及び１：１６の希釈率で加えて室温で２時間インキュベートするＥＬＩＳＡにおける固相として使用した。数回洗浄した後、断片のＣＥＡとの結合を検出するために、Ｍａｂ  ９Ｅ１０（１μｇ／ｍＬ）を使用し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。数回洗浄した後、反応を展開させるために色素原ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）及び基質としてＨ２Ｏ２を使用し、４９２ｎｍで反応物の定量的評価を行うためにＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＳ読取器を使用した。読取ステップでは上清を新しいプレートに移した。アッセイではＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を陽性対照として使用した。挿入物を有さないベクターｐＪＧ−１ｍで形質転換させた細胞ＴＧ１に対応するペリプラズム分画、及び非関連のＭａｂを陰性対照として使用した。ＣＥＡを発現しないヒト細胞ＨＥＫ  ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を含むプレートも陰性対照として使用した。陽性の判定基準は前の手順で記載したＥＬＩＳＡで用いたものと類似していた。
【００８０】
この実験では、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の構築体のペリプラズム試料はＬｏＶｏ、ＡｓＰＣ−１及びＬＳ  １７４Ｔ細胞しか認識しなかった。すべての陰性対照は陰性であった。このようにして、ポリスチレン製プレート上に固定したこの抗原を発現するヒト腫瘍細胞上のヒトＣＥＡを細胞−ＥＬＩＳＡによって同定するｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の能力を実証した。
【００８１】
別の実験では、ＬｏＶｏ、ＡｓＰＣ−１及びＬＳ  １７４Ｔ細胞を直径３５ｍｍのポリスチレン製プレート（ＣＯＳＴＡＲ）に播種し、コンフルエントな状態に達するまで培養した。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、排水し、空気乾燥させ、冷アセトン−メタノールの１：１（ｖ：ｖ）混合物を使用して細胞をプラスチックに固定した。残渣を排除するために蒸留水で数回洗浄した後、プレートを間接免疫蛍光試験の固相として使用した。このために、固定細胞を含む表面で円形区域を定義し、この中で、ＰＢＳ−３％ＢＳＡ中の１：２、１：４及び１：８の希釈率の２つの構築体に対応する細菌ペリプラズム試料をそれぞれ独立にインキュベートした。細胞−ＥＬＩＳＡで使用したものと同じ陽性対照及び陰性対照を使用した。
【００８２】
インキュベーションは湿ったチャンバ内で、室温（ＲＴ）で１時間行い、次いで冷ＰＢＳ−３％ＢＳＡで数回洗浄し、やはり湿ったチャンバ内でＭａｂ  ９Ｅ１０（１０μｇ／ｍＬ）を全ての単層にＲＴで１時間加えた。冷ＰＢＳ−３％ＢＳＡで数回洗浄した後、単層を、ＰＢＳ−３％ＢＳＡで１：６４に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体と共に３０分間、暗い湿ったチャンバ内でインキュベートし、その後、ＰＢＳ−３％ＢＳＡで５回洗浄し、ＰＢＳで更に１回洗浄し、最後にＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ溶液で数分間染色した。
【００８３】
単層をＰＢＳ−１０％グリセロールで覆い、カバーガラスで密閉し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨＴ顕微鏡上に設置した蛍光灯アクセサリーＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ２−ＲＦＬで観察した。ＨＥＫ  ２９３ヒト細胞を含むプレートも陰性対照として使用した。膜及び細胞質に青リンゴ色の蛍光が存在すれば、陰性対照試料やＣＥＡに陰性であるヒト細胞中にも存在しない限りは、陽性の結果の判定基準として確立した。
【００８４】
この実験では、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体構築体のペリプラズム単純物はＬｏＶｏ、ＡｓＰＣ−１及びＬＳ  １７４Ｔ細胞しか認識しなかった。陰性対照は陰性であった。このようにして、ポリスチレン製プレート上に固定したこの抗原を発現するヒト腫瘍細胞上のヒトＣＥＡを間接免疫蛍光法によって同定するｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の能力を実証した。結果の一例を図３に示す。
【実施例３】
【００８５】
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中でのｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の発現、並びにそのヒトＣＥＡの認識の実証
手順（ａ）ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の再増幅及びベクターｐＰＳ７中でのクローニング
構築体ｐＪＧ１−２５及びｐＪＧ１−１８をそれぞれ鋳型として使用し、またピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＳ７中にクローニングすることを目的として遺伝子の５’及び３’末端にＮｃｏＩを付加するように設計されたオリゴヌクレオチド（オリゴ１３及び１４；表Ｖ）を使用して、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体をコードしている遺伝子をＰＣＲで増幅した。増幅手順は既に記載した手順に類似している。プラスミドｐＰＳ７とは、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ．１）酵素のプロモーターに対応する１．１５Ｋｂの断片、次いでサッカラマイセスセレビセイ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のスクロースインベルターゼ（ｓｕｃＩＩ）の分泌シグナルをコードしている遺伝子、唯一のＮｃｏＩクローニング部位、転写の完了を保証するための酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｔ）の９６０ｂｐの断片、及び選択マーカーとしてサッカラマイセスセレビセイ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＨＩＳ３遺伝子を含む、組込みベクターである。更に、このベクターはＡＯＸ．１遺伝子の３’配列に対応する２．１ｋｂの断片も含む。これらの要素すべてがベクターｐＵＣ１８中に挿入される（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＬＳ他、ＥＰ０４３８２００Ａ１号）。
【００８６】
【表３】
2006500913.tif 000004
【００８７】
ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体に対応する増幅したバンドをＮｃｏＩで消化した後（Ｐｒｏｍｅｇａ）、同じ酵素で事前に消化したベクターｐＰＳ７にそれぞれ独立にライゲートさせ、ライゲート産物を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株をそれぞれ独立に形質転換させた。それぞれの組換えベクターを用いた株の形質転換体に対応する単離したコロニーを、プロモーターにハイブリダイズするプライマー（オリゴ１５、表Ｖ）及びＶＬの３’末端にハイブリダイズするプライマー（オリゴ８、表ＩＩＩ）を用いたコロニーＰＣＲで分析した。正しい方向の挿入物を含むコロニーを選択した。クローニングした遺伝子の配列決定は、オリゴ１５（表Ｖ）を用いて既に記載した手順に従って行った（実施例１手順ｂ）。組換えプラスミドｓｐＰＳＭ２（ｓｃＦｖ）及びｐＰＳＭ３（二重特異性抗体）のＶＨ及びＶＬドメインについて得られた配列は、配列番号１６及び配列番号１７で既に述べたものと一致していた。
【００８８】
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の組換え株は、これら２つのプラスミドを用いて事前に制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した言及したプラスミドの両方でＭＰ３６  ｈｉｓ  ３野生株をエレクトロポレーションし（Ｙｏｎｇ  Ｖ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌｉｃ．  ９：５５−６１、１９９２）、ヒスチジン欠乏最少培地で選択することによって得られた。組換えプラスミドのピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のゲノム中の特異的部位との様々な組換え機構の結果、それぞれの構築体について２つの異なる型の分泌株の表現型を単離することが可能であった：（ａ）組換え事象の間にＡＯＸ．１遺伝子が影響を受けず、したがってメタノールを含む培地中で増殖し、野生株に類似の増殖を示した株（Ｍｕｔ＋）、並びに（ｂ）ＡＯＸ．１遺伝子が発現カセットで置き換えられており、メタノールの存在下で遅い増殖を示した株（Ｍｕｔ  ｓ）。
【００８９】
手順（ｂ）発現の研究
抗体断片の発現の研究は、選択的ＭＤ培地（窒素酵母ベース、ビオチン、デキストロース）を含むプレート中で増殖させた原栄養コロニーＨｉｓ＋から出発して行った。選択したコロニーを５０ｍＬチューブ中の１０ｍＬの富化ＢＭＧＹ緩衝培地（酵母抽出物、ペプトン、リン酸カリウム、窒素酵母ベース、ビオチン、及びグリセロール）に接種し、１５０ｒｐｍで回転しながら２８℃の場所に置いた。培養物をＳＰＥＣＴＲＯＮＩＣ  ＧＥＮＥＳＩＳ２装置で測定して２単位のＯＤ６００ｎｍに達したら、これを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、グリセロールの代わりにメタノールを唯一の炭素原として含む１０ｍＬの富化培地（ＢＭＭＹ）に懸濁させた。この時点以降９６時間の間に目的のタンパク質が誘発され、毎日純粋なメタノールを培養物中の最終濃度が１％になるまで加えた。陰性対照としては、挿入物を有さないベクターで形質転換させたＭＰ３６ｈｉｓ３株を使用した。
【００９０】
培養期間の終了後、細胞を遠心分離し、誘導期に代謝された培地を回収し、最終クリーンアップ（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のために再び遠心分離し、ｓｃＦｖ又は二重特異性抗体の検出はＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の１５％ゲル中での電気泳動によって行った。この試験により、どちらの場合にも予想された分子量（約２７ｋＤａ）のタンパク質が発現されたことが明らかとなり、その後これを、Ｍａｂ  ９Ｅ１０を一次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として使用して、ウエスタンブロットによって評価した。上述のように移動を行った。展開では、ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ）を不溶性の基質として使用した。２つの構築体では、組換えタンパク質はＭａｂ９Ｅ１０を用いて同定した。
【００９１】
手順（ｃ）ＥＬＩＳＡにおけるｓｃＦｖ及び二重特異性抗体によるヒトＣＥＡの認識
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の材料について既に記載した試験と非常に類似したＥＬＩＳＡ試験を、類似の固相、試薬及びコーティング、インキュベート、展開、並びに陽性対照の条件を用いて行った。誘発された組換え株の代謝培養物の試料をＰＢＳ−１％のミルクで希釈し、１ウェル当たり１００μＬの割合で加え、室温で２時間インキュベートした。陰性対照として、ＭＰ３６ｈｉｓ３株に対応する代謝培地、及び非関連のＭａｂを使用した。吸光度が陰性対照で生じるよりも少なくとも４倍高い場合に値が陽性であるとみなされた。
【００９２】
この実験では、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現されたｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の構築体の誘導期に代謝された培地の試料は、ポリビニル製プレートに吸着させたヒトＣＥＡの認識能力に関して陽性の結果となった。
【００９３】
手順（ｄ）細胞−ＥＬＩＳＡ及び間接免疫吸光法による、細胞と会合しているヒトＣＥＡの認識
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の材料について既に記載した試験と非常に類似したＥＬＩＳＡ試験を、類似の固相、試薬及びコーティング、インキュベート、展開、並びに陽性対照の条件を用いて行った。誘発された組換え株の代謝培養物の試料をＰＢＳ−２％のミルクで希釈し、固定したＬｏＶｏ、ＡｓＰＣ−１、及びＬＳ  １７４Ｔ細胞を含むプレートに加え、穏やかに攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。この試験では、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を陽性対照として使用した。挿入物を有さないベクターｐＰＳ７で形質転換させた株ＭＰ３６ｈｉｓの代謝された誘導期の培養物、及び非関連のＭａｂを陰性対照として使用した。また、陰性対照として、ヒトＨＥＫ２９３細胞を含むプレートも使用した。
【００９４】
この実験では、ポリスチレン支持体上に固定されたヒト腫瘍細胞上のヒトＣＥＡをＥＬＩＳＡによって特異的に同定するｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の能力が実証された。
【００９５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の材料について既に記載した試験と非常に類似した間接免疫蛍光試験を、類似の培養細胞、及び固定、試薬、インキュベート、展開、装着、顕微鏡観察及び陽性判定基準の条件を用いて使用した。固定したＬｏＶｏ、ＡｓＰＣ−１及びＬＳ  １７４Ｔ細胞を含むプレートで独立した区域を定義し、これにＰＢＳ−３％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウムで希釈した２つの構築体に対応する組換えストックの誘発させた培養物の試料及び陰性試料を施用した。
【００９６】
室温（ＲＴ）で１時間、湿ったチャンバ内でインキュベートし、次いで冷ＰＢＳ−ＢＳＡ−アジ化ナトリウムで数回洗浄し、やはり湿ったチャンバ内でＭａｂ９Ｅ１０を全ての単層にＲＴで１時間加えた。冷ＰＢＳ−３％ＢＳＡで数回洗浄した後、単層をＰＢＳ−３％ＢＳＡで１：６４に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ抗体と共に暗い湿ったチャンバ内で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ  ３％ＢＳＡで５回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、最後にＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ溶液で数分間染色した。ＰＢＳ−１０％グリセロールで覆った単層にカバーガラスを装着し、紫外光顕微鏡で観察した。
【００９７】
このアッセイでは、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を陽性対照として使用した。陰性対照として、挿入物を有さないｐＰＳ７で形質転換させたＭＰ３６ｈｉｓ３の誘発させた培地、及び非関連のＭａｂを使用した。また、ＨＥＫ２９３細胞を含むスライドも陰性対照として使用した。この実験では、組換えｓｃＦｖ及び二重特異性抗体を分泌した誘発させた培養物の試料は、ＬｏＶｏ、ＡｓＰＣ−１及びＬＳ  １７４Ｔ細胞のみを認識した。陰性対照は陰性であった。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で産生されたｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の、ポリスチレン製プレート上に固定したこの抗原を発現するヒト腫瘍細胞上のヒトＣＥＡを間接免疫蛍光によって同定する能力が実証された。
【実施例４】
【００９８】
細菌中で産生されたｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の精製
手順（ａ）固定イオン金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びイオン交換を用いた、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体断片の精製
組換えタンパク質中にベクターｐＪＧ−１ｍから供与される６個のヒスチジンのドメインが存在することを精製に使用した。これらの配列はタンパク質に、様々なクロマトグラフィー用支持体にキレート化されることができる金属イオン（例えばＺｎ＋２、Ｃｕ＋２、Ｎｉ＋２）に対する非常に高い親和性を与え、これにより簡単且つ再現性のある精製が可能となる。
【００９９】
前述のように得た組換え細菌を遠心分離し、ペリプラズム内容物を浸透圧衝撃及び短い超音波処理（数秒間）によって単離し、その後、カップリング緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）中で７２時間透析した。ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体を含む細菌ペリプラズム調製物を直接且つそれぞれ独立にＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ＩＤＡ−Ｃｕ＋２マトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に施用した。タンパク質がカップリングされた後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）汚染タンパク質を排除するためにゲルをまず１０倍体積のカップリング緩衝剤で洗浄し、次いで同様に洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）で洗浄した。ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の溶出は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて行った。目的タンパク質の存在を確認するために、溶出ピークの試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体を含む溶出分画をＵｌｔｒａＦｒｅｅ１５（Ａｍｉｃｏｎ）装置で濃縮し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．７を含む緩衝溶液中で透析し、イオン交換を使用した第２の精製ステップに供した。これには、試料をＭｏｎｏ  Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に施用し、直線ＮａＣｌ勾配（０〜１Ｍ）によって溶出させた。回収したピークの試料を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。予想された大きさ（約２７ｋＤａ）のｓｃＦｖ及び二重特異性抗体が確認された。２つの分子で達成されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色で推定した最終純度は非常に類似しており、９５％近くであった。純粋なｓｃＦｖ及び二重特異性抗体のピークをＵｌｔｒａＦｒｅｅ１５（Ａｍｉｃｏｎ）装置で２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。本発明中で既に記載した手順に類似の手順に従って、精製した調製物の生物学的活性をＥＬＩＳＡで確認した。全ての試料を４℃で保存した。
【０１００】
手順（ｂ）ゲル濾過によるｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の分析
以前の手順に記載したように精製したｓｃＦｖ及び二重特異性抗体を、試料の均一性及び多量体の存在を決定するために分子篩クロマトグラフィーを用いて調査した。これにはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びＨＰＬＣ装置中の従来のゲル濾過プロセスを使用した。ｓｃＦｖが単量体と一致する約２７ｋＤａの主要なピーク中に濃縮されていることが決定された。二重特異性抗体は主に約４５ｋＤａの大きさで表れ、これは二量体と一致している。
【実施例５】
【０１０１】
タンパク質分解性消化及び質量分析による二重特異性抗体の特徴づけ
精製した二重特異性抗体を終夜４℃で、２ｍｏｌ／Ｌの濃度の尿素を含み１％ＮＨ４ＨＣＯ３を含むｐＨ＝８．３の緩衝溶液に対して透析した。透析したタンパク質を酵素：基質比１：５０の配列決定グレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で４時間消化した。等体積の１％トリフルオロ酢酸水溶液で酸性にすることによってタンパク質分解性消化を停止させ、質量分析装置に連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）で分析するまで−２０℃で保存した。
【０１０２】
トリプシン消化物を液体クロマトグラフィーＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の逆相クロマトグラフィーで、０％〜８０％の溶液Ｂの直線勾配を１００分間で使用して、分離した。勾配を生じさせるのに使用した溶液は、Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  ０．０５％及びＢ：アセトニトリル／ＴＦＡ  ０．０５％であった。
【０１０３】
タンパク質分解性消化の間に得られた分画を、クロマトグラフィーシステムに直交配置のＱＴＯＦ−２（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｌｔｄ．）を備えたＬＣ−ＭＳハイブリッド質量分析装置をオンラインで連結させた、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いた質量分析によって分析した。ＬＣ−ＭＳの測定の間、各走査間に０．０２秒を使用して、０．９８秒間に３５０〜１８００の質量分析スペクトルが得られた。質量分析装置はナトリウムとヨウ化セシウムの混合物からなる生理食塩水で較正した。コーン及びキャピラリーで使用した電圧はそれぞれ５０及び３０００ボルトであった。スペクトルはプログラムパッケージＭａｓｓＬｉｎｘ  ｖ３．５（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｌｔｄ）を使用して処理した。
【０１０４】
図４及び付属の表では、二重特異性抗体のトリプシン消化のクロマトグラフィープロファイル、及び二重特異性抗体をトリプシンで消化したペプチドの割当を見ることができる。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、それぞれシステイン２２と９５及び１４７と２１２の間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）によって連結されているペプチド（２０Ｐｈｅ−Ａｒｇ３１）−Ｓ−Ｓ−（８７Ｓｅｒ−Ａｒｇ９７）及び（１４３Ｖａｌ−Ｌｙｓ１４８）−Ｓ−Ｓ−（１８６Ｉｌｅ−Ｌｙｓ２２８）を含む図４に付属の表の分画８及び１２の要約から明らかなように、誤って連結されたシステインを示すシグナルは検出されなかった。
【０１０５】
ＥＳＩ−ＭＳで分析したペプチドから、二重特異性抗体の配列の９２％を１回のタンパク質分解性消化から得ることができる（図５）。この配列では、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を産生するハイブリドーマの全ＲＮＡから開始するＰＣＲによって増幅した、５−アミノ酸リンカーセグメント（配列番号１０）のＶＨ及びＶＬドメインの塩基配列から推論したアミノ酸配列（配列番号１６及び１７）、並びにベクターｐＪＧ−１ｍに提供されるｃ−ｍｙｃペプチドの配列のＣ末端部分及び最後の６個のヒスチジン（図２）が完全に一致している。
【実施例６】
【０１０６】
脱グリコシル化したＣＥＡの認識の調査
ヒトＣＥＡ（Ｃａｌｂｏｃｈｅｍ）をＮ−グリコシル化に特異的なエンドグリコシダーゼＰＮＧａｓａ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で酵素的に脱グリコシル化した。ＣＥＡを２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．８に溶かし、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを用いて１００℃、５分間で変性させた。その後、ＮＰ−４０及び１μＬのＰＮＧａｓａ  Ｆを３７℃で２時間加えた。対照及び脱グリコシル化した試料をクマシーブルー染色でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果、エンドグリコシダーゼで消化した後に分子量が顕著に減少していた（５０％近く）。（ａ）Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１、（ｂ）精製した二価ｓｃＦｖ（二重特異性抗体）又は（ｃ）マウスで得られた抗ヒトＣＥＡ抗清を一次抗体として使用し、次いで（ａ）及び（ｂ）には西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１のＦａｂに対するポリクローナル抗体、（ｃ）には西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体を使用して、ウエスタンブロットを行った。移動及び展開は、本発明中でウエスタンブロットについて既に言及したものと類似していた。Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１及び二重特異性抗体は脱グリコシル化されていない抗原しか認識しなかった。ポリクローナル抗血清は脱グリコシル化の前及び後のＣＥＡを認識した。
【０１０７】
特異的レクチンを認識するためのドットブロットシステムによってネイティブヒトＣＥＡの試料を分析した。使用したレクチンは、それぞれα２，６及びα２，３で連結された末端シアル酸に特異的なセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）凝集素（ＳＮＡ）及びイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）凝集素（ＭＡＡ）であった。これらの実験で使用したレクチンはジゴキシゲニンとコンジュゲートされており、アルカリホスファターゼで標識した抗ジゴキシゲニン抗体によって同定した。レクチン−オリゴ糖の相互作用に陽性である試料は、ホスファターゼに特異的な基質との反応によって開発した（塩化４−ニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸の混合物）。この実験ではどちらのレクチンの陽性対照としてもフェツインを使用した。ネイティブＣＥＡはＳＮＡによって認識されたがＭＡＡによっては認識されず、このことは、α２，６で連結された末端シアル酸が非常に多く存在することを示している。
【０１０８】
その後、ヒトＣＥＡを酵素ＮＡＮＡｓａ  ＩＩ及び末端のα２，６シアル酸を加水分解することができるエキソグリコシダーゼ（シアリダーゼ）で消化した。消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、それらの認識の調査は、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１及びマウスで得られた抗ヒトＣＥＡ抗血清を一次抗体として使用したウエスタンブロットによって行った。結果により、ネイティブＣＥＡ対照はどちらの試料にも認識されたが、マウス抗ＣＥＡ抗血清のみがＮＡＮＡｓａ  ＩＩで消化したＣＥＡを認識したことが示された。
【実施例７】
【０１０９】
ヒトの正常及び腫瘍組織における免疫細胞化学的及び組織化学的調査
組織の調査は検屍材料由来の正常及び腫瘍組織アーカイブから選択した試料で行った。Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１について以前に記載されている認識を確認するために（Ｔｏｒｍｏ  Ｂ他、ＡＰＭＩＳ  ９７：１０７３−１０８０、１９８９）組織の最小限のパネルを使用した。試料には、肺、皮膚、乳房、子宮頚部、食道及び腎臓の癌腫、結腸、前立腺、膵臓、胆嚢、小腸及び胃の腺癌、神経、造血及び肉腫起源の腫瘍、正常な結腸粘膜、並びに肝臓、腎臓、肺、精巣、脾臓及び膵臓などの正常な組織や血液細胞も含まれていた。
【０１１０】
この調査は、以前に報告されている手順（Ｔｏｒｍｏ  Ｂ他、ＡＰＭＩＳ  ９７：１０７３−１０８０、１９８９）にいくつかの変形を加えたものに従って行った。定法に従って組織試料を１０％の緩衝ホルマリンで固定し、脱水し、清浄にし（ｃｌｅａｒ）、パラフィンに包埋した。組織病理学は、ヘマトキシリン−エオシンで染色した切片で評価した。組織病理学によって評価したブロックの連続した切片を免疫ペルオキシダーゼ技法に使用した。
【０１１１】
パラフィンを含まない再水和した切片を、内在ペルオキシダーゼを遮断するために３％のＨ２Ｏ２で３０分間処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ−１％ウシ血清アルブミン（希釈緩衝液）で希釈した試料と共に１時間インキュベートした。その後、スライドをＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１のＦａｂを用いた免疫化によって得られた、ビオチン標識したポリクローナルＩｇＧウサギ抗体の１：１００希釈液と共に３０分間、最後に同様の時間の間ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の１：５００希釈液と共にインキュベートした。
【０１１２】
検査した単純物は、以下の通りである。
（ａ）２０μｇ／ｍＬの濃度のＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１（陽性対照）
（ｂ）５０μｇ／ｍＬの濃度の、実施例４、手順（ａ）に記載した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の精製したｓｃＦｖ
（ｃ）５０μｇ／ｍＬの濃度の、実施例４、手順（ａ）に記載した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の精製した二重特異性抗体
（ｄ）５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度の、これらの実施例中で「Ｆ３」と呼ぶ以前に得られた精製したｓｃＦｖ（Ａｙａｌａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２；Ｐｅｒｅｚ  Ｌ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４：７９−８２、１９９６）。
【０１１３】
全ての希釈は希釈緩衝液で行い、インキュベートは室温で湿ったチャンバ内で行った。各ステップ間に、希釈緩衝液又はＰＢＳでそれぞれ１分間の洗浄を３回行った。免疫ペルオキシダーゼ反応は、３ｍｇのジアミノベンシジン、５ｍＬのＰＢＳ及び５ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２を含む溶液と共に５〜１０分間インキュベートすることによって展開させた。スライドをマイヤーヘマトキシリンで対比染色した。特徴的な茶色の反応物を強度が増大していく３つのレベル（１＋、２＋、３＋）で陰性又は陽性として登録した。各スライドで目的試料を用いて標識を行い、陰性対照として隣接区域を希釈緩衝液で標識した。
【０１１４】
血液細胞での調査には、赤血球を最初に除去し、残った白血球をゼラチンでコーティングしたガラス製スライドに施用し、アセトン：メタノール１：１（ｖ：ｖ）で固定した。技法の続きは、基本的に上述したように展開した。
【０１１５】
調査した組織に関して得られた結果を表ＶＩに要約する。調査した正常組織（肝臓、腎臓、肺、精巣、血液、脾臓、膵臓）はこの断片にもＭａｂにも同定されなかった。結腸粘膜の場合、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１について以前に得られたものと一致して、Ｆ３  ｓｃＦｖ並びに新しいｓｃＦｖ及び二重特異性抗体が管腔分泌産物及び一部の腺の尖端域で独占的に反応した。Ｆ３  ｓｃＦｖの場合、反応の強度はより低く、これは後にいくつかの腫瘍でも見られた。血液細胞の場合、Ｍａｂ、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体は正常なリンパ球及び好中球と反応を示さず、これは、ＮＣＡ抗原との重要な交差反応が存在しないことを示している。対照的に、Ｆ３  ｓｃＦｖはこれらの細胞の微量な認識をある程度示した。
【０１１６】
Ｍａｂ、ｓｃＦｖ、及び二重特異性抗体は胃腸管系起源のほとんどの腫瘍と反応し、腫瘍細胞の尖端表面及び細胞質のどちらの場合にもほとんどの事例で強力な標識化が観察された。これらの試料はどれも、管状乳癌及び肺大細胞癌を除いては、造血及び肉腫起源の腫瘍又は上皮由来の他の腫瘍の標識化を行わなかった。よく分化した結腸腺癌では、細胞質の尖端域及び管腔分泌産物で標識化が強く、中程度及び不十分に分化した腺癌では、全ての細胞質で標識化が観察された。非常に僅かな試料を除いては、これら３つの分子で染色強度は非常に類似していた。
【０１１７】
Ｆ３の場合、一部の場合でｓｃＦｖ及び二重特異性抗体で使用した濃度よりも２倍高い濃度を使用したにもかかわらず、染色強度の全般的な低下が見られる。染色の強度がより低かったことで、他の抗体によって同定された一部の試料がＦ３に認識されなかったのかもしれない。
【０１１８】
【表４】
2006500913.tif 000005
注記：表中の数字は、陽性染色の事例／調査した全事例の数を表す。括弧がない場合は、陽性の染色強度は２＋〜３＋であった。Ｃａ：癌腫、ＡＤＣ：腺癌、ＨＤＧ：ホジキン、ＢＤ：良好に分化、ＭＤ：中程度に分化、ＰＤ：不十分に分化。（＊）：標識化が管腔分泌産物及び一部の腺の尖端域に制限されていると考えられる；（ａ）：陽性の事例は１＋と分類できる染色を示した、（ｂ）１＋と分類できる強度のリンパ球及び好酸球の認識、（ｃ）６つの陽性事例のうち２つが１＋と分類できる強度の染色を示した。
【実施例８】
【０１１９】
親和定数の決定
親和定数の決定では、質量作用の法則に基づいた非競合的ＥＬＩＳＡ法（Ｂｅａｔｔｙ  ＪＤ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．  １００：１７３−１８４、１９８７）を用いた。親和定数Ｋａｆｆは［ＡｇＡｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］に等しく、ここで、ＡｇＡｂは抗原−抗体複合体のＬ／ｍｏｌ（Ｍ−１）であり、［Ａｇ］は遊離抗原の濃度であり（ｍｏｌ）、［Ａｂ］は遊離抗体の濃度である（ｍｏｌ）。
【０１２０】
ヒトＣＥＡ（Ｃａｌｂｏｃｈｅｍ）の４つの２倍段階希釈液を、ポリビニル製ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のコーティングに使用した。ＰＢＳ−脱脂乳１％を使用してプレートを遮断した。試料（全て精製したｓｃＦｖ  Ｆ３、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１）を様々な濃度でプレートに施用した。洗浄後、３つの最初の試料に対応するウェルをＭａｂ９Ｅ１０（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１に対応するウェルでは遮断溶液を使用した。次のステップでは、ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ抗体を１：２５００の希釈率で、３７℃で１時間加えた。使用した基質はＯＰＤであり、反応を１５分間展開させた。吸光度の読取はＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＳ装置で４９２ｎｍで行った。
【０１２１】
それぞれの事例の吸光（ＯＤ）値を縦軸（ｙ）にプロットし、濃度をｎｇ／ｍＬで横軸（ｘ）に、ｌｏｇ１０の対数スケールでプロットした。ＯＤ１００はシグナルが最大に維持されたものとした。それぞれの曲線で、ＯＤ１００の半分（ＯＤ５０）を計算した。各試料のＯＤ５０の濃度値をそれぞれの曲線で決定し、以下の式を用いて親和性の計算を行った：Ｋａｆｆ＝（ｎ−１）／２（ｎ）、ただし、ｎ＝［Ａｂ’］ｔ／［Ａｂ］ｔである。［Ａｂ’］ｔは比較する最も高い抗原濃度のＯＤ５０値に対応する試料の濃度値であり、［Ａｂ］ｔは比較する最も低い抗原濃度のＯＤ５０値に対応する単純物の濃度値である。４つの得られた曲線で可能な親和性を６回決定し、これらの平均を最終的なＫａｆｆと概算した。
【０１２２】
表ＶＩＩは、アッセイした変異体のそれぞれについて計算したＫａｆｆ値を反映している。ｓｃＦｖは（５．０±０．４）×１０９Ｌ  ｍｏｌ−１のＫａｆｆを有しており、これは、Ｆ３で得られたものより（Ｋａｆｆ＝（９．２±０．８）×１０７Ｌ  ｍｏｌ−１）１桁半大きい。この最後の値は基本的に異なった手順（Ｐｅｒｅｚ  Ｌ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４：７９−８２、１９９６）で行った測定でＦ３について計算された値に対応している。二重特異性抗体は（２．８±０．３）×１０１０Ｌ  ｍｏｌ−１のＫａｆｆを有しており、Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１のＫａｆｆ値は（６．１±０．５）×１０１０Ｌ  ｍｏｌ−１であった。
【０１２３】
【表５】
2006500913.tif 000006
【実施例９】
【０１２４】
Ｂ１６−ＣＥＡ１３細胞を接種することによって誘発させた腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける、１２５Ｉで標識した断片及び抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的認識の決定
抗体断片のｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的認識を決定するために、ロドゲン（ｌｏｄｏｇｅｎ）法を使用して（Ｆｒａｋｅｒ  ＰＪ、Ｓｐｅｃｋ  ＪＣ  Ｊｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ８０：８４９−８５７、１９７８）、以下の分子を１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）で標識した：
（ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製したｓｃＦｖ、（特異的活性１．１ＭＢｑ／５μｇ）
（ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した二重特異性抗体、（特異的活性：１．２ＭＢｑ／５μｇ）
（ｃ）Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１、（特異的活性：１．８ＭＢｑ／５μｇ）
（ｄ）精製したＳｃＦｖ  Ｆ３（Ａｙａｌａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：７９０−７９９、１９９２；Ｐｅｒｅｚ  Ｌ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：７９−８２、１９９６）（特異的活性：１．０ＭＢｑ／５μｇ）
【０１２５】
タンパク質への取り込みを決定するために放射標識した産物を薄層クロマトグラフィーで分析し、９５〜９８％の放射活性値が見つかった。放射標識した産物のＣＥＡを検出する能力は、ポリスチレン製チューブをＣＥＡ（５μｇ／ｍＬ；Ｃａｌｂｏｃｈｅｍ）でコーティングし、遮断し、この固相によって捕捉され得る抗体の量に調節した放射標識した産物の試料を加えるシステムでアッセイした。インキュベート及び洗浄の後、上述の試料（ａ）〜（ｄ）についてそれぞれ８０、７９、８３、及び８１％の放射活性が固相に捕捉されたことが決定され、放射標識化手順が抗体の生物活性に目立って影響を与えなかったことが実証された。
【０１２６】
体内分布を調査するために、それぞれが１２匹のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ＣＥＮＰＡＬＡＢ、キューバ）からなる４つの動物グループを形成した。腋窩内経路を使用して動物に１匹当たり１×１０６個のＢ１６−ＣＥＡ１３細胞を接種した。腫瘍は７日後に目視及び触知可能であり（約０．３〜０．５ｇ）、その後、マウスに放射標識した目的の産物を尾部の静脈内により注入し、１２、２４及び４８時間後に屠殺し、腫瘍並びに以下の正常組織、すなわち脾臓、肝臓、腎臓、腸管、筋肉、骨髄、及び血液を外科的に切除した。放射活性の蓄積は、組織１グラム当たりの注射した用量に対する割合として表した。較正は、注入した用量の標準試料によって行った。放射活性はγシンチレーションカウンターを用いて決定した。
【０１２７】
これらの実験で使用したＢ１６−ＣＥＡ１３細胞は、ｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）ベクター（カタログ番号Ｖ６６０−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングされた、ヒトＣＥＡの細胞外ドメインをコードしている遺伝子の形質移入によって得られた。この遺伝子は、公開されているヒトＣＥＡの配列を変化させて設計したオリゴヌクレオチドを用いて、ＣＲＬ−１６８２細胞から抽出したＲＮＡのＰＣＲによって得られた。組換えプラスミドｐＤｉｓｐｌａｙ−ＣＥＡを精製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰＬＵＳ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、１回の形質転換当たり５μｇのＤＮＡを用いてＣ５７Ｂｌ／６マウスのＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５）に形質移入させた。安定な形質移入体の選択は、４．０ｍｇ／ｍＬの硫酸ジェネティシン（Ｇ４１８；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて１４日間で行い、その後、生存している培養細胞を限界希釈によってクローニングし、表面にヒトＣＥＡを発現したクローンを、一次抗体としてＭａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を使用し、展開にＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ抗体を使用して間接免疫蛍光法によって同定した。クローンの７３％が８０％を超える細胞が特異的膜蛍光を示すことを表していることが判明し、これは、ヒトＣＥＡが正しいフォールディングを提示し且つ表面がグリコシル化されたことを示している。
【０１２８】
Ｂ１６−Ｆ１０に形質移入されていない細胞を対照として使用した。間接免疫蛍光法によって陽性として選択されたクローンの複製物を増やし、１匹当たり１×１０６個の細胞で、腋窩内経路を用いてそれぞれ独立にＣ５７Ｂｌ／６マウスに注入した。腫瘍を生じる１０個のクローンのうち、Ｂ１６−ＣＥＡ１３と呼ばれるより速く且つ進行的な増殖特徴を有するものを、本明細書で報告した実験用に選択した。
【０１２９】
図６は、様々な時間における調査した組織当たり（注入した全量に対する）回収された放射活性の割合、及び腫瘍中の放射活性：血液中の放射活性の比を示す。表ＶＩＩＩに含めた結果は、２４〜４８時間の間では、腫瘍中の放射活性腫瘍：血液中の放射活性の比が二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、及びＭａｂで高く維持され、後者で値が最も高く、次いで二量体分子であることが実証された。以前に得られたＦ３  ｓｃＦｖは非常に低い値を示し、ＣＥＡに対するその親和性が減少することに関連づけることができる、不十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの挙動を有する。
【０１３０】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における一価ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の発現に使用したｐＪＧ−１ｍベクターを表す図である。幅広の水平バーで記したベクター区域に対応して、クローニング部位断片、ｃ−ｍｙｃペプチド、６−ヒチジンドメイン、並びに一部のドメイン間及びドメイン後領域の塩基配列を示す（配列番号１３）。
【図２】（１）一価ｓｃＦｖ断片（配列番号１６）、及び（２）二価断片（二重特異性抗体）（配列番号１７）について、ヌクレオチド配列から推論したアミノ酸配列のアラインメントを表す（一文字コードで示す）図である。いずれの構築体でも、ドメインの順番はＶＨ−リンカーセグメント−ＶＬである。２つの分子のそれぞれで使用したリンカーセグメントのアミノ酸を太字で示した。
【図３】培養腫瘍細胞ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８２）中で発現されたＣＥＡに関して、（Ａ）Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１、（Ｂ）一価ｓｃＦｖ、及び（Ｃ）二重特異性抗体の、間接免疫蛍光技術による認識を示す図である。Ａ、Ｂ、及びＣで、膜及び近傍細胞質の特徴的な蛍光が見られる。拡大率は２００×である。
【図４】二重特異性抗体のタンパク質分解性消化のクロマトグラフィープロファイル及び質量分析で得た、トリプシンで消化したペプチドの割当を表す図である。上：二重特異性抗体のトリプシン消化のクロマトグラフィープロファイル。下：二重特異性抗体のトリプシンで消化したペプチドの割当を要約した表。Ｍ／ｚ  ｅｘｐ：実験質量、理論ｍ／ｚ：理論質量、Ｚ：電荷。得られたスペクトルでは、正しくないリンカーシステインに対応するシグナルは検出されなかった。
【図５】二重特異性抗体（配列番号２１）のアミノ酸配列の確認のまとめである図である。質量分析によって確認したタンパク質配列の領域を太字で示し、トリプシン消化の後に回収されなかった配列の区域をイタリックで示す。太字の区域は、二重特異性抗体の塩基配列から推論したアミノ酸配列と全体で一致する。ｐＪＧ−１ｍベクター（図１）により提供されるｃ−ｍｙｃペプチド及び最後の６個のヒスチジンの配列もＣ末端部分に見られる。
【図６】１２５Ｉで放射標識した以下の分子、すなわち左から右に、４つの２つ組バーの群で、（ａ）二重特異性抗体、（ｂ）ｓｃＦｖ、（ｃ）Ｆ３、及び（ｄ）Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を、ヒトＣＥＡを発現する腫瘍を有するマウスに接種した２４時間（斜線バー）及び４８時間（非斜線バー）の、組織１グラム当たりにおける注入した用量に対する割合を表す図である。それぞれのバーは１２匹のマウスから得られた組織から回収されたカウントの平均を表す。結果から、２４〜４８時間の間では、腫瘍中の放射活性：血液中の放射活性の比が二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、及びＭａｂで高い値に維持され（後者で値が高い）、次いで二量体分子であることが実証された。Ｆ３は非常に低い値を示し、ＣＥＡに対するその親和性が減少することに関連づけることができる、不十分なｉｎ  ｖｉｖｏでの挙動を有する。
【配列表】
2006500913.tif 000008
2006500913.tif 000009
2006500913.tif 000010
2006500913.tif 000011
2006500913.tif 000012
2006500913.tif 000013
2006500913.tif 000014
【図１】
2006500913.tif 000015
【図２】
2006500913.tif 000016
【図３】
2006500913.tif 000017
【図５】
2006500913.tif 000018
【図６】
2006500913.tif 000019
【図４】
2006500913.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月22日(2004.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を産生するハイブリドーマから抽出したＲＮＡから得た単量体ｓｃＦｖ型の抗体断片であって、可溶性の形態であるか、固体表面上に吸着されているか、又は細胞中に存在するヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的であり、並びに、（５．０±０．４）×１０９Ｌ  ｍｏｌ−１のＣＥＡに対する親和定数、及びそのグリコシル化の保存に依存的なこのような抗原の認識を示す、抗体断片。
【請求項２】
アミノ酸配列が配列番号１６に示すものである、請求項１記載の単量体ｓｃＦｖ型の抗体断片。
【請求項３】
Ｍａｂ  ＣＢ／ｉｏｒ−ＣＥＡ．１を産生するハイブリドーマから抽出したＲＮＡから得た二価（二重特異性抗体）ｓｃＦｖ型の抗体断片であって、可溶性の形態であるか、固体表面上に吸着されているか、又は細胞中に存在するヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的であり、並びに、（２．８±０．３）×１０１０Ｌ  ｍｏｌ−１のＣＥＡに対する親和定数、及びそのグリコシル化の保存に依存的なこのような抗原の認識を示す、抗体断片。
【請求項４】
アミノ酸配列が配列番号１７に示すものである、請求項３記載の二価（二重特異性抗体）ｓｃＦｖ型の抗体断片。
【請求項５】
ヒトＣＥＡを発現する腫瘍細胞の同定に使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項６】
Ｆａｂ断片及び他のｓｃＦｖ変異体、二重特異的抗体の形態で人為的に連結されているか、又は生物学的若しくは生化学的に活性のあるドメインと融合している、配列番号１６及び配列番号１７に報告されている可変ドメインＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＣＥＡに特異的な組換え又は合成組換え抗体。
【請求項７】
組換え細菌又は酵母、昆虫若しくは哺乳動物の形質移入細胞、又は遺伝子改変した生物中で産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項８】
放射性若しくは他の方法で検出可能な標識、又は抗腫瘍の潜在性を有する化学的若しくは生物学的物質を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、ＣＥＡを発現するヒト腫瘍を治療するための、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、画像化技術を使用してＣＥＡを発現するヒト腫瘍をイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で放射性により位置決定するための、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、細胞に連結している又は連結していないヒトＣＥＡを検出するための、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）診断用の試薬。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を発現する細胞であって、組換えＤＮＡによる遺伝子操作によって得られ、及び、細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である、細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片を発現する多細胞生物であって、組換えＤＮＡによる遺伝子操作によって得られ、及び、生物は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物である、多細胞生物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体断片をコードしているベクターであって、組換えＤＮＡの遺伝子操作によって得られ、及び、ベクターは、プラスミド、又は宿主細胞内に組み込まれることが可能な配列である、ベクター。
【国際調査報告】
2006500913.tif 000021
2006500913.tif 000022