(57)【要約】遺伝子サイレンシングに使用するｓｉハイブリッドが本明細書において開示される。ｓｉハイブリッドとは、互いにアニーリングし、各３’末端に２塩基の張出しを有する、１本のＤＮＡ鎖および１本のＲＮＡ鎖からなる短い二本鎖分子である。これは、ＤＮＡおよびＲＮＡに加えて、ＰＮＡや他の核酸アナログを含むこともできる。ｓｉハイブリッドでは、ｓｉＲＮＡより高い程度かつ長い持続時間の遺伝子サイレンシングが可能であり、ｓｉＲＮＡでは不可能な細菌遺伝子のサイレンシングも可能である。ｓｉハイブリッドは、過剰発現した遺伝子または癌遺伝子によって生じる疾患を治療するための薬剤および治療薬の理想的な候補である。これは、生死に関わる独特の細菌遺伝子に標的を定めたとき抗生剤として使用することもできる。ｓｉハイブリッドは、抗ウイルス剤、防カビ剤、除草剤または農薬として使用することができる。いずれの有機体のいずれの細胞中のいずれの遺伝子もサイレンシングされるように、適切なｓｉハイブリッドを設計することができる。
2006512902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ハイブリダイズした相補的部分と、（２）少なくとも１つの張出した３’末端部分とを含むｓｉハイブリッドであって、核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列とハイブリダイズした核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を有し、第２の一本鎖が第１の一本鎖配列と異なるタイプの核酸または核酸アナログからなるところのｓｉハイブリッドを含む組成物。
【請求項２】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物のハイブリダイズした相補的部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物のハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｉハイブリッドが、２つの張出した３’末端を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記２つの張出した３’末端がそれぞれ２塩基の長さを有しており、前記組成物のハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
（１）１９〜２１塩基対の長さを有するハイブリダイズした相補的部分と、（２）２〜３塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端とを含むｓｉハイブリッドであって、核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列とハイブリダイズした核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を有し、第２の一本鎖が第１の一本鎖配列と異なるタイプの核酸または核酸アナログからなるところのｓｉハイブリッドを含む組成物。
【請求項９】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
（１）２１塩基対の長さを有するハイブリダイズした相補的部分と、（２）２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端とを含むｓｉハイブリッドであって、核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列とハイブリダイズした核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を有し、第２の一本鎖が第１の一本鎖配列と異なるタイプの核酸または核酸アナログからなるところのｓｉハイブリッドを含む組成物。
【請求項１１】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を提供する工程と、
前記第１の一本鎖配列と異なるタイプの核酸または核酸アナログからなる、核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列を提供する工程と、
前記第１の一本鎖配列と前記第２の一本鎖配列とをハイブリダイズさせて、（１）ハイブリダイズした相補的部分と（２）少なくとも１つの張出した３’末端とを有するｓｉハイブリッドを作成する工程と
を含む方法。
【請求項１３】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｉハイブリッドが、２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端を有し、ｓｉハイブリッドの前記ハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｓｉハイブリッドを、直接にまたはトランスフェクト用の作用因子を用いて基質と接触させて、少なくとも１つの遺伝子をサイレンシングする工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｓｉハイブリッドが、２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端を有し、ｓｉハイブリッドの前記ハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記基質が有機体または細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、または真菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列とハイブリダイズした核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を有し、前記第２の一本鎖配列が第１の一本鎖配列と異なるタイプの核酸または核酸アナログからなるｓｉハイブリッドであって、（１）ハイブリダイズした相補的部分と（２）少なくとも１つの張出した３’末端とを有するところのｓｉハイブリッドを提供する工程と、
前記ｓｉハイブリッドを、直接にまたはトランスフェクト用の作用因子を用いて基質と接触させて、少なくとも１つの遺伝子をサイレンシングする工程と
を含む方法。
【請求項２６】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｓｉハイブリッドが、２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端を有し、ｓｉハイブリッドの前記ハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記基質が有機体または細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、または真菌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
複数の遺伝子に共通する、核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を提供する工程と、
前記第１の一本鎖配列とは異なるタイプの核酸または核酸アナログからなる、核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列を提供する工程と、
前記第１の一本鎖配列を前記第２の一本鎖配列とハイブリダイズさせて、（１）ハイブリダイズした相補的部分と（２）少なくとも１つの張出した３’末端とを有するｓｉハイブリッドを作成する工程と
を含む方法。
【請求項３４】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｓｉハイブリッドを、直接にまたはトランスフェクト用の作用因子を用いて基質と接触させて、前記複数の遺伝子をサイレンシングする工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした相補的部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、前記ハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｓｉハイブリッドが、２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端を有し、ｓｉハイブリッドの前記ハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
基質が有機体または細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、または真菌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
それぞれ異なる配列を有する複数のｓｉハイブリッドであって、それぞれが、核酸または核酸アナログの第２の一本鎖配列とハイブリダイズした核酸または核酸アナログの第１の一本鎖配列を含み、第２の一本鎖配列が第１の一本鎖配列と異なるタイプの核酸または核酸アナログであり、それぞれが（１）ハイブリダイズした相補的部分と（２）少なくとも１つの張出した３’末端とを有するところの複数のｓｉハイブリッドを提供する工程と、
前記複数のｓｉハイブリッドを、直接にまたはトランスフェクト用の作用因子を用いて基質と接触させて、少なくとも１つの遺伝子をサイレンシングする工程と
を含む方法。
【請求項４２】
第１の一本鎖配列および第２の一本鎖配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｓｉハイブリッドが、２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端を有し、ｓｉハイブリッドの前記ハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
基質が有機体または細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、または真菌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
それぞれ異なる配列を有する、核酸または核酸アナログの第１の複数の一本鎖配列を提供する工程と、
核酸または核酸アナログの第２の複数の一本鎖配列を提供する工程であって、前記第２の複数の一本鎖が前記第１の複数の一本鎖と異なるタイプの核酸または核酸アナログであるところの工程と、
前記第１の複数の一本鎖を前記第２の複数の一本鎖とハイブリダイズさせて、それぞれが（１）ハイブリダイズした相補的部分と（２）少なくとも１つの張出した３’末端部分とを有する複数のｓｉハイブリッドを作成する工程と
を含む方法。
【請求項５０】
前記複数のｓｉハイブリッドを、直接にまたはトランスフェクト用の作用因子を用いて基質と接触させて、少なくとも１つの遺伝子をサイレンシングする工程をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした相補的部分が、１０〜１００塩基対の長さを有している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記張出した３’末端が、２〜３塩基の長さを有している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ハイブリダイズした相補的部分が、１９〜２１塩基対の長さを有している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
各ｓｉハイブリッドが、２塩基の長さをそれぞれ有する２つの張出した３’末端を有し、前記複数のｓｉハイブリッドのハイブリダイズした部分が、２１塩基対の長さを有している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
基質が有機体または細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、または真菌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
標的遺伝子と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＤＮＡを提供する工程と、
前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側の最初の２１塩基の前記配列と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＲＮＡを提供する工程と、
前記一本鎖ＤＮＡを前記一本鎖ＲＮＡとハイブリダイズさせて、（１）２１塩基対のハイブリダイズした部分と（２）２塩基張出した各３’末端部分とを有するｓｉハイブリッドを形成する工程と
を含む方法。
【請求項５８】
前記ｓｉハイブリッドを細胞または有機体と接触させる工程であって、前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、および真菌からなる群から選択される工程をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
標的遺伝子と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＤＮＡを、前記一本鎖ＤＮＡの５’末端側の最初の２１塩基の前記配列と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＲＮＡとハイブリダイズさせて、（１）２１塩基対のハイブリダイズした部分と（２）２塩基張出した各３’末端部分とを有するｓｉハイブリッドを形成する工程と、
前記ｓｉハイブリッドを基質と接触させる工程と
を含む方法。
【請求項６０】
前記基質が細胞または有機体であり、前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、および真菌からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
標的遺伝子と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＲＮＡを提供する工程と、
前記一本鎖ＲＮＡの５’末端側の最初の２１塩基の前記配列と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＤＮＡを提供する工程と、
前記一本鎖ＲＮＡを前記一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズさせて、（１）２１塩基対のハイブリダイズした部分と（２）２塩基張出した各３’末端部分とを有するｓｉハイブリッドを形成する工程と
を含む方法。
【請求項６２】
前記ｓｉハイブリッドを細胞または有機体と接触させる工程であって、前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、および真菌からなる群から選択される工程をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
標的遺伝子と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＲＮＡを、前記一本鎖ＲＮＡの５’末端側の最初の２１塩基の前記配列と相補的な、５’末端側の最初の２１塩基の配列を含む２３塩基を有する一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズさせて、（１）２１塩基対のハイブリダイズした部分と（２）２塩基張出した各３’末端部分とを有するｓｉハイブリッドを形成する工程と、
前記ｓｉハイブリッドを基質と接触させる工程と
を含む方法。
【請求項６４】
前記基質が細胞または有機体であり、前記有機体が、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、および真菌からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短い干渉核酸ハイブリッドおよびその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国政府は、ローレンス−リバーモア国立研究所の事業に対する米国エネルギー省とカリフォルニア大学との契約Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−４８号に従って本発明における権利を有する。
【０００３】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００２年９月９日出願の「ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの短い干渉分子を用いた遺伝子サイレンシング（Gene Silencing Using DNA:RNA-Hybrid Short, Interfering Molecules）」という名称の米国仮出願第６０／４０９６８０号の特典を請求するものであり、これを参照により本明細書に組み込む。
【０００４】
近年、配列特異的な遺伝子サイレンシング作用を示す短い干渉ＲＮＡ分子（「ｓｉＲＮＡ」）がＲＮＡ干渉を媒介することが受け入れられてきている。ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの詳細な機序は完全には分かっていないが、標的遺伝子と相同性があるｓｉＲＮＡ分子を導入して細胞ｍＲＮＡを分解することによって、遺伝子をサイレンシングするまたは無力化することができる。
【０００５】
アンチセンス分子の使用を含む以前の実験研究によって、アンチセンス治療が優れた抗ウイルス感染物質（infectant）であることが示されたが、アンチセンス分子の半減期が極めて短いことによってその有用性は打ち消されていた。また、アンチセンス治療は、ウイルスｍＲＮＡの翻訳を単に阻止するだけであるという点で受動的な方法であるが、ＲＮＡｉは実際にｍＲＮＡを分解する。ｓｉＲＮＡを産生するプラスミドの細胞へのトランスフェクションに関係する類似の研究は、突然変異誘発の研究には有効であるが、このような能動的方法は、微生物感染などの遺伝的過程からの長期的保護には有用でない可能性がある。
【０００６】
以下の参考文献は、遺伝子サイレンシング技術に関するものである。その全体を参照により本明細書に組み込む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規組成物、ならびに原核生物であれ真核生物であれ任意の有機体または細胞中でin vivoおよびin vitroで遺伝子機能を抑制するためにその組成物を使用する方法を提供する。遺伝子の機能または供給源に関わらず特有の配列を同定することができるいずれの遺伝子の機能をも標的としてそれを抑制するために、本発明の核酸または核酸アナログの短い干渉ハイブリッドを使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の一本鎖とハイブリダイズして、ハイブリダイズした部分および少なくとも１つの３’側の張出し（overhang）を有するｓｉハイブリッドを形成する、核酸または核酸アナログの一本鎖がハイブリダイズした相補的な部分から構成される組成物を提供する。ｓｉハイブリッドのハイブリダイズした部分は、それが適用される遺伝子、ならびに有機体または細胞に応じて、１０〜１００塩基対の長さとすることができる。
【０００９】
本発明はまた、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の一本鎖とハイブリダイズして、長さ１９〜２１塩基対のハイブリダイズした部分および長さ２〜３塩基の２つの３’側の張出しを有するｓｉハイブリッドを形成する、核酸または核酸アナログの一本鎖のハイブリダイズした相補的な部分から構成される組成物をも提供する。
【００１０】
さらに本発明は、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の一本鎖とハイブリダイズして、長さ２１塩基対のハイブリダイズした部分および長さ２塩基の２つの３’側の張出しを有するｓｉハイブリッドを形成する、核酸または核酸アナログの一本鎖のハイブリダイズした相補的な部分から構成される組成物をも提供する。
【００１１】
本発明はまた、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の一本鎖とハイブリダイズして、ハイブリダイズした部分および少なくとも１つの３’側の張出しを有するｓｉハイブリッドを形成する核酸および核酸アナログの一本鎖を提供することにより、ｓｉハイブリッド組成物を作成する方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の一本鎖とハイブリダイズして、長さ１９〜２１塩基対のハイブリダイズした部分および長さ２〜３塩基の２つの３’側の張出しを有するｓｉハイブリッドを形成する核酸および核酸アナログの一本鎖を提供することにより、ｓｉハイブリッド組成物を作成する方法を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の一本鎖とハイブリダイズして、長さ２１塩基対のハイブリダイズした部分および長さ２塩基の２つの３’側の張出しを有するｓｉハイブリッドを形成する核酸および核酸アナログの一本鎖を提供することにより、ｓｉハイブリッド組成物を作成する方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の複数の一本鎖とハイブリダイズして、長さ１９〜２１塩基対のハイブリダイズした部分および長さ２〜３塩基の少なくとも１つの３’側の張出しを有する複数のｓｉハイブリッドを形成する核酸および核酸アナログの複数の一本鎖を提供することにより、複数のｓｉハイブリッド組成物を作成する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、異なるタイプの核酸または核酸アナログの他の複数の一本鎖とハイブリダイズして、長さ２１塩基対のハイブリダイズした部分および長さ２塩基の２つの３’側の張出しを有する複数のｓｉハイブリッドを形成する核酸および核酸アナログの複数の一本鎖を提供することにより、複数のｓｉハイブリッド組成物を作成する方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、ｓｉハイブリッドを直接にまたはトランスフェクト用の作用因子を用いて基質に適用して１つまたは複数の遺伝子をサイレンシングする方法である。ここで、基質とは、ウイルス、原核生物、細菌、真核生物、真核細胞、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、ヒト、ヒト細胞、植物、昆虫、または真菌である細胞あるいは有機体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ｓｉＲＮＡの３つの最大の弱点は、その効果が短期間であること、細菌には無効であること、および細胞への支援送達が必要であることである。トランスフェクションとは、真核細胞に遺伝子および他の核酸を送達する戦略である。生化学的方法、物理的方法およびウイルスを介する方法という３種類のトランスフェクション技術がある。細胞に対するトランスフェクションの負荷およびその方法の効率によって、使用するトランスフェクション技術を決定する。生化学的手法には、リン酸カルシウムを媒介とするもの、ＤＥＡＥデキストランを媒介とするもの、およびリポトランスフェクションがある。物理的方法には、エレクトロポレーションおよび微粒子銃がある。細菌では、核酸の取り込みを形質転換と呼ぶ。細胞が外来の核酸を取り込むのに「適格」となるように、細菌の細胞膜を処理しなければならない。形質転換技術は熱ショックおよびエレクトロポレーションの２つがある。
【００１８】
持続時間が短いことが、ｓｉＲＮＡの特徴であり、それによってどんな有意義な臨床的利用も妨げられる。癌治療、抗ウイルス剤、および特定の遺伝性疾患の治療を含めた潜在的適用にはすべて、送達および有効性を促進させる長期に働く過程が必要である。例えば抗細菌薬として有効期間がより短い治療にとって代わる使用法は、ｓｉＲＮＡが細菌には無効であるので排除される。本明細書において開示するｓｉハイブリッドの構築は、これらの問題のどちらも解決するものである。
【００１９】
ｓｉＲＮＡに類似した機能を有するが、それよりはるかに遺伝子サイレンシングに有効であるｓｉハイブリッド分子が本明細書において開示される。ｓｉハイブリッド分子は、二本鎖ＲＮＡ分子の代わりに、核酸、例えばＲＮＡの一本鎖が、その第１鎖と異なるタイプの核酸、例えばＤＮＡである核酸の第２鎖とハイブリダイズしたものを含む。２本の異なるタイプの核酸をハイブリダイズさせることによって作り出されるｓｉハイブリッドは、ハイブリダイズした相補的な部分と、少なくとも１つの張出した３’末端とを有する。核酸アナログは、核酸の代わりに使用することができる。「核酸アナログ」という用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など改変されたまたは天然に存在しないヌクレオチドまたは主鎖構造物を示す。
【００２０】
ｓｉハイブリッドの独特の機能は、分子の安定性に関係している可能性がある。二本鎖ＲＮＡ分子は、本質的に不安定であり、哺乳動物細胞中では速やかに分解され、細菌中ではほとんど即座に分解される。これとは違って、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、天然物質由来のもので可能な最も安定した種類の核酸分子であり、この構築物は、細菌または哺乳動物の細胞中で分解されない。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドがｓｉＲＮＡより強力な遺伝子サイレンシング用の作用因子であることが実験結果から示唆されている。論理的には、分子が安定であるほど、その分子は強力な遺伝子サイレンシング用の作用因子となり得る。したがって、ＰＮＡ、または新規に合成された核酸アナログでできている分子の少なくとも１つを含むｓｉハイブリッドは、この合成ｓｉハイブリッドがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドより安定である場合、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと同じく有効であり、またはそれより強力であるはずである。
【００２１】
図１を参照すると、最も有効なｓｉハイブリッドは、長さ１９〜２１塩基対のハイブリダイズした相補的部分（２）および長さが少なくとも２塩基の少なくとも１つの張出した３’末端（４）を有する。この分子のハイブリダイズした相補的部分は、１００塩基対までとすることができる。一般に、長さが短いほど、その特異性は低くなる。ｓｉハイブリッドが１０より少ない塩基対を含む場合、そのハイブリッドは遺伝子をサイレンシングするための特異性を失うことになる。一方、長い分子は、細胞に侵入するのが困難となり、したがって遺伝子をサイレンシングすることができない。したがって、１００を超える塩基対を含むｓｉハイブリッドは細胞に侵入するのが困難となる。
【００２２】
複数の遺伝子に共通の配列を有するｓｉハイブリッドを使用して複数の遺伝子を同時にサイレンシングすることができる。また、複数のｓｉハイブリッドを使用して複数の遺伝子をサイレンシングすることもできる。複数の遺伝子を同時にサイレンシングすることにより、遺伝子を１つだけサイレンシングするよりも選択的にかつ効率よく細菌を死滅させることができる可能性があるので、複数の遺伝子サイレンシングは、抗生剤の目的に特に有用である。複数の遺伝子サイレンシングは、ヒトの治療の目的にも有用である。例えば、腫瘍増殖の原因である複数の遺伝子を抑制することによって、遺伝子を１つだけ抑制することでは達成することができない効率のよい腫瘍増殖の抑制を達成することができる。
【００２３】
ｓｉハイブリッドは、万能に近い潜在的可能性を有する。それを使用してどんな有機体の細胞（群）中の遺伝子をもサイレンシングすることができる。これは、治療のまたは研究の目的に使用することができる。これは抗生剤、抗ウイルス剤、および癌治療薬として使用することができ、またこれを使用して遺伝子の好ましくない過剰発現によって起こる様々な遺伝性疾患を治療することもできる。さらに、植物の疾患を治療し、収穫量、色、環境耐性、品質などの植物の形質を改良するためにこれを植物に使用することができる。遺伝子（群）を選択的にサイレンシングすることによって、ｓｉハイブリッドを除草剤、殺虫剤、農薬および防カビ剤として使用することができる。
【００２４】
ｓｉハイブリッドを使用して細胞のウイルス感染を防止することができる。タンパク分解酵素遺伝子、逆転写酵素遺伝子などウイルス感染に特有であり不可欠である遺伝子を見つけ出し、これらに対応するｓｉハイブリッドを構築し、これらのｓｉハイブリッドを細胞に適用することによって、ウイルスを死滅させることができ、遺伝子をサイレンシングすることによってウイルス感染症を治療することができる。さらに、細菌株の不可欠な遺伝子経路をサイレンシングすることによって、ｓｉハイブリッドを抗生剤として使用することができる。このような経路のサイレンシングは細菌細胞を死滅させる手段をもたらす。
【００２５】
さらに、ｓｉハイブリッドを使用して、遺伝子の過剰発現または疾患を引き起こす遺伝子から生じるヒトまたは動物の疾患を治療することができる。このような疾患には、それだけに限らないが、自己免疫疾患、腫瘍、炎症性疾患および高血圧が含まれ得る。またｓｉハイブリッドを使用して治療の目的で、正常に発現された遺伝子を抑制することもできる。例えば、臓器移植の成功を可能にするために、拒絶免疫応答に関係する遺伝子を抑制することができる。
【００２６】
製剤および投与経路
ｓｉハイブリッドは薬剤として許容されるどんな剤形にも製剤することができる。例えば、剤形をヒトにおける静脈内投与に適したものとすることができる。剤形は、当技術分野で知られている、薬剤として許容される添加剤、担体、緩衝液、ならびに浸透圧調節剤およびその類似物を含むことができる。製剤は、併用療法のために他の薬剤活性成分を含むことができる。また、特定の使用のために、粉末、固体、液体または気体の形で製剤を設計することもできる。ｓｉハイブリッドを、経口的に、皮下に、静脈内に、脳内に、筋内に、髄内に、非経口的に、経皮的に、経鼻的に、または経直腸的に投与することができる。投与するｓｉハイブリッドの剤形は、これらが投与される経路に少なくとも部分的に依存する。
【実施例】
【００２７】
下記の諸節で概略を記載するように、哺乳動物細胞および細菌細胞で実験を行った。哺乳動物細胞の実験に用いたｓｉハイブリッドの濃度は、終濃度で細胞１×１０６個当たり１０〜２５μｇであった。細菌細胞の実験に用いたｓｉハイブリッドの濃度は、終濃度で１ミリリットル当たり０．２５〜４μｇであった。これらの実験からその範囲が遺伝子をサイレンシングするのに有効であることが実証されたが、実際の最も低い有効濃度は、細胞１×１０６個当たり１０μｇまたは１ミリリットル当たり０．２５μｇよりはるかに低い可能性があった。
【００２８】
哺乳動物細胞の概要
様々な癌遺伝子および癌抑制遺伝子に対するｓｉハイブリッドの作用を試験するための方法を開発した。その目標は、特定の遺伝子を長期間遮断し、その作用を観察する方法を開発することである。ヒトおよびハムスター由来の正常細胞および癌細胞中でグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）をサイレンシングするのにｓｉハイブリッドを使用した。その結果、Ｇ６ＰＤ遺伝子発現の抑制において、その程度および持続の点でｓｉハイブリッドはｓｉＲＮＡおよびｓｉＤＮＡより強力であることが判明した。またｓｉハイブリッドの強さは、ＤＮＡ：ＲＮＡの位置に依存しないこともその結果から明らかとなった。ｓｉＲＮＡおよびｓｉハイブリッドの遺伝子サイレンシング実験ではリポトランスフェクションのみを使用した。リポトランスフェクションは、核酸分子と結合する陽イオン性脂質で、細胞中へ送達しようとする核酸を被覆する工程を含む。この人工膜を、やはり脂質でできているが負に帯電している細胞膜と融合させる。支援なしの送達を行う実験では構築物を培地に直接添加した。トランスフェクション用の培地または薬剤は不要であり、単にｓｉハイブリッドを培地に添加するだけで十分であった。図２は、ｓｉＲＮＡおよびｓｉハイブリッド分子を支援なしで送達することによってＧ６ＰＤの遺伝子サイレンシングが生じたことを示している。
【００２９】
別の実験では、ｓｉハイブリッドを分裂中の細胞に添加し、次いでこの細胞を少なくとも８日間増殖させた。その８日の間に様々な間隔でＧ６ＰＤ遺伝子を誘導する試みを行ったが、遺伝子発現が４０％より少ないことが観察された。対照細胞は正常なＧ６ＰＤ活性を示した。従来のｓｉＲＮＡを添加した細胞では、正常なＧ６ＰＤ活性が、２日以内に遺伝子発現が１００％になるまでに回復することが判明した。これらの観察結果は、ｓｉハイブリッドを使用して哺乳動物細胞中のほとんどすべての遺伝子をサイレンシングすることができることを示唆するものである。この機能を使用して遺伝子の過剰発現を生じているどんな疾患をも抑止することができ、それによって疾患に対する有効な治療がもたらされる。
【００３０】
細菌細胞の概要
哺乳動物細胞にｓｉハイブリッドを使用すると遺伝子サイレンシングにおいて著しい有効性を示したことから、哺乳動物細胞中でこのｓｉハイブリッドが著しい長寿命を示したので、細菌中でもこれが同様に働くことが可能であるはずであるという論理的前提に立って、これを細菌細胞に使用することが示唆された。最初の標的は単純であり、細菌を形質転換するプラスミド上に位置する抗生物質耐性遺伝子であった。抗生物質を含む培地中で増殖させるとき、これらのプラスミド上に含まれる遺伝子が活性であってはじめて細胞は生存することができる。容易に入手することができ、使用するのに安全であるので、E.coliをすべての細菌の試験に使用した。細菌がｓｉＲＮＡを分解する機構はすべての細菌に共通であると考えられているので、この試験例は妥当であると想定される。一連の実験では、アンピシリンおよびクロラムフェニコールという２種の一般的な抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子がサイレンシングされた。すべての場合において、抗生物質を含む培地で容易に増殖することができた細菌は、抗生物質耐性遺伝子に対するｓｉハイブリッドを培地に添加したとき死滅した。形質転換する工程も、トランスフェクション用の培地または薬剤も不要であり、単にｓｉハイブリッドを培地に添加するだけで十分であった。また、発現した遺伝子を標的としないｓｉハイブリッドを培地に添加したとき、作用は認められず、細菌は何も添加されなかった場合とまったく同様に増殖した。このことから、観察されたのが対象を定めた作用であり、細胞が無差別に非特異的に死滅したのではないことが実証された。
【００３１】
細菌における遺伝子サイレンシング作用を確認するために、ＤＨＦＲタンパクを産生し細菌中でプリンを合成する手段をもたらすｆｏｌＡ遺伝子を標的とした。プリンを補充した「豊富な」培地中では、この遺伝子産物は不要である。ＤＨＦＲサイレンシング用のｓｉハイブリッドを豊富な培地中で増殖している細菌に添加したとき、作用は認められなかった。しかし、プリンまたはピリミジンが供給されない最小培地中では、ＤＨＦＲタンパクは細胞の生存に必要である。このタンパクは、細胞がチミジンやアデニンなど他の分子からプリンを合成することを可能にする。最小培地では、ｆｏｌＡ遺伝子が機能しない場合、細胞は、ＤＮＡを合成することができず、それによって静止状態となり増殖しなくなる。アデニンやチミジンなどのプリンまたはピリミジン（ヌクレオシド）を培地に添加した後では、プリン合成にＤＨＦＲタンパクをもはや必要としないので、細胞は再び増殖し始める。この実験で、ｓｉハイブリッドのｆｏｌＡアンタゴニストを培地中に添加し、次いでアンピシリンを添加した。ｓｉハイブリッドを取り込んだすべての細胞は分裂を停止した。これらは、分裂細胞のみ死滅させるアンピシリンによって死滅しなかった。この細胞を遠心してアンピシリンを含む培地を除き、ｓｉハイブリッド、アンピシリン、ヌクレオシドのいずれも含まない最小培地で再懸濁させた。プリンを培地に添加した直後に、細胞は正常の速度で増殖し始めた。また、必須でないまたは発現していない遺伝子を標的とするｓｉハイブリッドを添加しても、作用は認められなかった。またｓｉハイブリッドと同じ配列のｓｉＲＮＡ分子を添加しても、作用は認められなかった。これらの結果は、遺伝子サイレンシングが特異的かつ非致死的であり、従来のｓｉＲＮＡによる処理では不可能であることを示すものである。この実験について記載された結果は、特定の細菌について細菌の生存に必要な独特の遺伝子を選択することにより、ｓｉハイブリッドが、遺伝子をサイレンシングすることによってこれらの特定の細菌に対する抗生剤として働くことができることを示すものである。
【００３２】
この実験の結果から、細菌は細胞壁および細胞膜を有するが、哺乳動物細胞は細胞膜しか有さずｓｉハイブリッドが侵入するのがより容易であり、ｓｉハイブリッドはｓｉＲＮＡより比較的安定であるため、ｓｉハイブリッドはトランスフェクションの手段を用いるのではなく直接に哺乳動物細胞に適用されて遺伝子サイレンシング作用を発揮させることができることが示唆される。したがって、リポソーム、タンパク、核酸配列などトランスフェクションの手段を介してｓｉハイブリッドを細胞に送達する以外に、ｓｉハイブリッドをトランスフェクション用の薬剤なしで疾患の治療に直接使用することもできる。
【００３３】
哺乳動物細胞
ｓｉＲＮＡを媒介とするＲＮＡｉの能力を調べるために、培養された哺乳動物細胞中で誘導可能な内在遺伝子を転写後にサイレンシングし、この作用の持続時間を決定するように実験を設計した。ＣＨＯ  ＡＡ８細胞系統中でグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）遺伝子という哺乳動物細胞中で認められる誘導可能な内在遺伝子をサイレンシングするためにｓｉＲＮＡを使用した。Ｇ６ＰＤは、ニコチン酸アミドジヌクレオチド三リン酸の還元型であるＮＡＤＰＨ、およびヌクレオチド生成に用いられるリボース５リン酸を生成する動物組織中のペントースリン酸経路において重要な役割を果たしている（Carson, P.E.およびFrischer, H. (1966) Glucose-6-Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. Am J Med. 41, 744-764. を参照のこと）。グルコース６リン酸は、この経路に入り、Ｇ６ＰＤにより酸化されて、ＮＡＤＰＨおよびグルコノ−δ−ラクトン６リン酸が生じる（Carson, P.E.およびFrischer, H. (1966) Glucose-6-Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. Am J Med. 41, 744-764. を参照のこと）。この反応の酸化還元特性を、テトラゾリウムを基質とする組織化学染色法と組み合わせて使用することができる。この染色法を比色分析法でグルコース６リン酸にさらされた細胞に使用して、Ｇ６ＰＤ遺伝子サイレンシングの程度を表す細胞中のＧ６ＰＤ酵素活性レベルとして定量化することができる。
【００３４】
短い干渉分子の核酸組成を変えた、ｓｉＲＮＡを媒介とする遺伝子サイレンシングの分析を用いてこの遺伝子サイレンシングモードの影響を受けるパラメーターに対するその作用を試験する。これらのファクターには、遺伝子サイレンシング作用の程度および持続、ならびに回復した遺伝子の発現量が含まれる。哺乳動物Ｇ６ＰＤ遺伝子を用いたとき、これらのパラメーターは、細胞がさらされる短い干渉分子の核酸組成に応じた影響を受ける。これらの知見が哺乳動物細胞の間で普遍的であることを実証するために、ヒト細胞とハムスター細胞との間の比較分析を行った。
【００３５】
材料および方法
短い干渉分子の調製。Ｇ６ＰＤ遺伝子配列から２１ｂｐの配列をランダムに選択した。ハムスターおよびヒトの両方のＧ６ＰＤ遺伝子の配列との相同性を有する２番目の領域を、ハムスターとヒトとの比較検討に使用した。ジョンスホプキンス大学のDNA Synthesis Core Facilityで、３’側に２ヌクレオチド分のウリジンの張出しを持つセンス鎖およびアンチセンス鎖を構築した。ｓｉＤＮＡ配列は、３’側に２ヌクレオチド分のチミジンの張出しを含んでいた。ｓｉＲＮＡ配列は精製を行わず、ｓｉＤＮＡ配列はＲＰカートリッジで精製を行った。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の存在下で、９４℃で５分間変性させることにより、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖とを互いにアニーリングし、５３℃で３時間再度アニーリングし、次いでゆっくりと室温まで冷却した。
【００３６】
細胞培養およびトランスフェクション：チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）（ＣＨＯ）ＡＡ８細胞を、１０％ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、ならびに１％の抗生物質および抗真菌薬を補充したＦ−１２栄養混合ハム培地（Nutrient Mixture Ham）（米国ニューヨーク州、Life Technologies）中で３７℃で増殖させた。ヒトＭＣＦ−７細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、ならびに２％ＢＭＥアミノ酸溶液を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Life Technologies）中で増殖させた。ヌクレアーゼ活性を除去するために、５６℃で３０分間熱処理してＦＢＳを非働化した。指数関数的な増殖を維持するために、細胞を１週間につき３回継代した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、１×ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理し、３５ｍｍ組織培養ディッシュ内で抗生物質を含まない増殖培地２ｍｌ中に１プレート当たり細胞１×１０６個で播き、３７℃でインキュベートした。短い干渉分子のトランスフェクションを、リポフェクタミン試薬（Lipofectamine Reagent）（米国ニューヨーク州、Life Technologies）を使用して、付着細胞に核酸１０μｇを用いる製造者のプロトコールに従って実施した。細胞をトランスフェクション複合体とともに５時間インキュベートした。細胞毒性を防止するために、複合体を吸引し、細胞を、完全増殖培地で２回洗浄し、Ｇ６ＰＤ酵素活性のアッセイに使用できるようになるまで抗生物質を含む増殖培地中で３７℃でインキュベートした。
【００３７】
Ｇ６ＰＤ比色アッセイおよび酵素活性の定量化：Stamatoらの記載の通りに（Stamato, T.D., Mackenzie, L., Pagani, J.M., and Weinstein, R. 1982 Mutagen treatment of single Chinese Hamster Ovary cells produce colonies mosaic for Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. Somatic Cell Genetics. 8, 643-651を参照のこと）Ｇ６ＰＤ酵素活性をモニターした。手短に言えば、単層の細胞を、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１２％  Triton-X 100溶液２ｍｌで洗浄し、ｐＨ６．５の２．５ｍｇ／ｍｌグルコース６リン酸二ナトリウム塩、０．１７ｍｇ／ｍｌフェナジンメトサルフェート、０．３３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．１７ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤＰおよび０．０１２％のTriton-X 100を含む溶液２ｍｌ中で３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１０％酢酸緩衝ホルマリン２ｍｌで１５分間固定し、洗浄し、窒素で乾燥した。酵素活性を定量化するために、Ｇ６ＰＤ活性レベルに関係する細胞中の着色の程度を表す細胞の平均的な画素強度を求めた。Zeiss Axiophot上で明視野光を用いて２０倍で細胞を観察した。単層の細胞が存在する領域中のプレートの画像を取得した。個々の細胞と、バックグラウンドを表す、細胞を含まない領域との平均的な画素強度の差を得た。Smart Capture VPソフトウェアを用いて画像分析を行った。
【００３８】
ドットブロット：短い干渉分子をトランスフェクトしたＣＨＯ  ＡＡ８細胞を、トランスフェクションの０時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後および２４時間後の時点で、１×ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシンとともに５分間インキュベートすることにより取り出した。細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、１×ＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液（細胞約１０５個）を９５℃で１０分間沸騰させて細胞ライセートを得た。GibcoのBlugene Nonradioactive Nucleic Acid Detection Systemに記載された通りにハイブリダイゼーション手順を実施して、ライセート中の短い干渉分子の存在を検出した。使用したプローブは、ビオチン化されたアンチセンスＧ６ＰＤ  ＤＮＡ配列であった。
【００３９】
統計：ＣＨＯ  ＡＡ８に対してｓｉＲＮＡおよびｓｉＤＮＡを用いた経時実験において示された値は、実験を５回繰り返した平均値を表し、ハイブリッドのデータは実験を３回繰り返した平均値を表す。ハムスターとヒトとを比較した経時実験で示された値は、実験を２回繰り返した平均値を表す。陽性対照条件の平均値を１００％として、実験条件の平均値を陽性対照の平均値で除して相対値を得た。エラーバーは、標準偏差を表す。
【００４０】
実験結果
陽イオン性リポソームを用いて短い干渉分子のトランスフェクションを行うと、矛盾したことに、細胞毒性が起こりトランスフェクションの効率が低くなる。陽イオン性リポソームを用いて、ＣＨＯ  ＡＡ８細胞およびヒトＭＣＦ−７細胞に短い干渉分子をトランスフェクトした。細胞の生死をカウントすると、使用したトランスフェクション試薬に関わらず、トランスフェクション複合体にさらされ死滅した細胞は５０％を超えることが判明した。細胞毒性および細胞の死亡率を最小限にするために、異なる陽イオン性リポソームトランスフェクション試薬５種類を試したが、リポフェクタミン（Life Technologies）で最も低いレベルの細胞死が生じた。トランスフェクション後に健常に見える細胞のみでＧ６ＰＤ活性のアッセイを行った。
【００４１】
Ｇ６ＰＤ酵素活性のアッセイを行ったときの細胞の着色に基づくと、３５ｍｍプレート中でトランスフェクトした細胞の約４０〜５０％で短い干渉分子がトランスフェクトされていると思われた。単層培養物中のトランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされなかった細胞は、細胞の着色で示されるように、別々の斑状領域中に生じる傾向があった。トランスフェクトされた領域中の細胞のみで、遺伝子サイレンシングを分析した。Ｇ６ＰＤ活性が抑制されない対照のプレートでは、細胞の着色強度が異なるこれらの領域は存在せず、Ｇ６ＰＤアッセイがこの効果をもたらしているのではないことが示唆された。
【００４２】
比色アッセイは、個々の細胞中でのＧ６ＰＤ遺伝子サイレンシングの存在を検出する効率のよい方法を提供する：Ｇ６ＰＤ遺伝子は、ｓｉＲＮＡを媒介とする遺伝子サイレンシングを調べるのに有利な選択肢であったことが判明した。ｓｉＲＮＡの検討からトランスフェクションの効率を取り除くためには、集団の平均を得るのではなく個々の細胞のアッセイを行うことが重要である。これを行うために、Stamatoらによって開発された比色アッセイ（２２）を用いてＧ６ＰＤタンパクの酵素活性のアッセイを行った。ｓｉＲＮＡを用いて培養哺乳動物細胞中で遺伝子をサイレンシングするElbashirらによる以前の研究（２０）でも、結果のアッセイに蛍光染色およびルシフェラーゼ活性の比色技術が使用された。トランスフェクション後、グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）およびニコチン酸アミドジヌクレオチド三リン酸（ＮＡＤＰ）を含むテトラゾリウムを基質とする組織化学染色液とともに細胞をインキュベートした。細胞にＧ６Ｐを添加すると、Ｇ６ＰＤ遺伝子の転写およびタンパク合成が活性化する。Ｇ６ＰＤの酵素活性が、Ｇ６Ｐが酸化されることおよびＮＡＤＰが還元されてＮＡＤＰＨとなることとあいまって、細胞の色の白から紫への変化をもたらす。Ｇ６ＰＤ遺伝子配列と相同性を有する配列を含むｓｉＲＮＡを添加することによってＣＨＯ  ＡＡ８細胞中で転写後遺伝子サイレンシングが誘導された場合、Ｇ６ＰＤタンパクの合成量が不十分となり、その結果、Ｇ６ＰＤ酵素活性が欠如し、色が変化する反応が抑制されるはずである。
【００４３】
ｓｉＲＮＡ分子にさらされたチャイニーズハムスター細胞中で誘導性Ｇ６ＰＤ酵素活性の低下が認められる：細胞の色の強度を、やはり組織化学染色液とともにインキュベートしたトランスフェクトしなかった細胞と比較することによって、ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞中でのＧ６ＰＤ活性の相対変化を測定した。転写後遺伝子サイレンシングがｓｉＲＮＡの特異的な作用であることを確認するために、非相同性のヌクレオチド配列であるＴ７プライマーをトランスフェクトしたＣＨＯ  ＡＡ８細胞、ならびにベクターを含まない陽イオン性リポソームにさらされた細胞中の酵素活性も測定した。Ｇ６Ｐ不在下で組織化学染色液とともにインキュベートしたＣＨＯ  ＡＡ８細胞をこのアッセイの陰性対照として使用した。インキュベーション後に細胞の画像を取得し、個々の細胞の色に基づいた画素強度を測定してＧ６ＰＤ活性の相対変化を決定した。
【００４４】
Ｇ６ＰＤによるグルコース６リン酸の酸化およびＮＡＤＰの還元を、テトラゾリウムを基質とする組織化学染色と組み合わせて、哺乳動物細胞中でＧ６ＰＤ活性を検出することができた。
【００４５】
Ｇ６ＰＤの遺伝子サイレンシングを誘導したｓｉＲＮＡの動態：ｓｉＲＮＡによるＧ６ＰＤの転写後遺伝子サイレンシングの動態を決定するために、トランスフェクションの５時間後から９６時間後の期間にわたって特定の時点で比色アッセイを行って、Ｇ６ＰＤ酵素活性の存在を測定した。ｓｉＲＮＡを媒介とする遺伝子サイレンシングでは、トランスフェクション後最初の２４時間でＧ６ＰＤ活性が約６０％低下した。細胞では４８時間目でＧ６ＰＤ遺伝子の発現が再び回復し始め、トランスフェクションの９６時間後までに細胞は完全な発現を示した。
【００４６】
図３を参照すると、（Ａ）はｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトしたＣＨＯ  ＡＡ８細胞、（Ｂ）はｓｉＤＮＡ分子にさらされた細胞、（Ｃ）はＤＮＡｓ：ＲＮＡａの短い干渉ハイブリッド分子を導入した細胞、（Ｄ）はＲＮＡｓ：ＤＮＡａの分子を導入した細胞の場合である。対照反応は、Ｔ７ファージプロモーターのプライマーの配列を有するｓｉ分子（ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡのいずれか）をトランスフェクトすること（Ｔ）、またはベクターを含まない陽イオン性リポソーム複合体にさらすこと（Ｂ）からなるものであった。対照試験を行ったすべての細胞で、遺伝子発現および酵素活性が１００％を示した。ｓｉＤＮＡ分子をトランスフェクトした細胞では最も低い程度の遺伝子サイレンシング作用を示したが、ｓｉＲＮＡ分子の細胞では、遺伝子発現がより強く抑制された。ｓｉＲＮＡまたはｓｉＤＮＡ分子をトランスフェクトした細胞では、サイレンシングが約２４時間持続した。ＤＮＡｓ：ＲＮＡａおよびＲＮＡｓ：ＤＮＡａのどちらの構造の短い干渉ハイブリッド分子も、最も高い程度の内在遺伝子発現抑制およびその最も長い持続を示した。作用は９６時間を通じて持続し続けた。グラフＡおよびＢは、５回繰り返した実験によるデータを表し、グラフＣおよびＤのデータは、３回繰り返した実験によるデータを表す。
【００４７】
細胞は、核酸組成の異なる短い干渉分子にさらしたとき、Ｇ６ＰＤ遺伝子サイレンシングにおいて異なる反応を示す：ｓｉＲＮＡを媒介とするＲＮＡｉの機構は明らかでないので、転写後遺伝子サイレンシングがＲＮＡから作られる短い干渉配列に特異的な作用であるのかどうか、あるいはその核酸組成が変わったｓｉＲＮＡ分子が遺伝子サイレンシング作用をもたらすことができるのかどうかは疑問であった。このことを試験するために、使用したｓｉＲＮＡベクターと配列が同じである、ｓｉＤＮＡ配列とＲＮＡおよびＤＮＡから構成される短い干渉ハイブリッド分子とをＣＨＯ  ＡＡ８細胞中へトランスフェクトし、トランスフェクションの９６時間後までの期間にわたって指定した時点でＧ６ＰＤ酵素活性のアッセイを再度行った。どちらの核酸がセンス鎖およびアンチセンス鎖を構成するのかが異なる２種の異なったハイブリッド分子を構築した。細胞の分析から、使用した異なる短い干渉分子の間でＧ６ＰＤサイレンシングの反応の違いが存在することが示唆された。ｓｉＤＮＡ分子をトランスフェクトした細胞は、最も低い程度の遺伝子サイレンシングを示し、トランスフェクションの１２時間後に初めて最大の発現抑制が認められた。これとは違って、ｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトした細胞は、早くもトランスフェクションの０時間後に発現の低下を示し、そのサイレンシングの程度はｓｉＤＮＡ分子によってもたらされたものと比べて高かった。ｓｉＤＮＡおよびｓｉＲＮＡ分子の作用は両方とも約２４時間続き、９６時間までに正常の発現レベルに達した。
【００４８】
ＤＮＡｓ：ＲＮＡａおよびＲＮＡｓ：ＤＮＡａのどちらの短い干渉ハイブリッド分子をトランスフェクトしたＣＨＯ  ＡＡ８細胞でも、Ｇ６ＰＤ酵素活性が最も高い低下を示し、その活性低下の持続も最も長かった。ＤＮＡｓ：ＲＮＡａをトランスフェクトした細胞は、早くもトランスフェクションの０時間後にＧ６ＰＤの低下を示し、その％相対活性は約２０％であった。この作用は、その実験の時間経過を通じて持続し、活性量が約２０％以下のままであった。これと同様の作用がＲＮＡｓ：ＤＮＡａ分子をトランスフェクトした細胞でも見られた。図３を参照すると、％酵素活性は、その実験を通じて約２０％以下のままであった。短い干渉ハイブリッド分子の存在を検出するためにドットブロットを行った。何も検出されず、このことからは、これらの分子の細胞内濃度が低すぎてそれらを検出することができなかったことが実証されるだけである。
【００４９】
ハイブリッド構築物の作用がどれだけの間続くかを決定するために、トランスフェクションの１２０〜１９２時間後の間で２４時間毎にハイブリッド分子にさらされた細胞中のＧ６ＰＤ活性の存在についてアッセイを行った。Ｇ６ＰＤ活性の存在は、１２０時間目までに約４０％に増大したが、１９２時間を通じてこのレベルのままであった。短い干渉ハイブリッド分子の存在を検出するためにドットブロットを行った。何も検出されず、このことからは、これらの分子の細胞内濃度が低すぎてそれらを検出することができなかったことが実証されるだけである。
【００５０】
すべての哺乳動物細胞中で、ｓｉＲＮＡの核酸組成が変わると、それを媒介とする遺伝子サイレンシングにおいて異なる反応が認められる可能性がある。この異なる反応がハムスター細胞の特異的な作用でないことを示すために、核酸組成を変えた短い干渉分子の持続の時間経過の比較研究をヒトおよびハムスター細胞について行った。この実験では、短い干渉分子が相同性を有する遺伝子配列を変えることによる作用も検討した。これらの分子は、ハムスターおよびヒトのどちらのＧ６ＰＤコード領域の配列とも同一のものであった。図４は、ヒトＭＣＦ−７細胞中でも異なる反応が認められたことを示しており、このことから、すべての培養哺乳動物細胞にこれが普遍的に適用される可能性があることが示唆される。ｓｉＤＮＡ分子をトランスフェクトした細胞は、最も低い程度の遺伝子サイレンシングを示し、一方、ｓｉＲＮＡ分子は、より高い程度の遺伝子発現抑制をもたらした。ｓｉＲＮＡおよびｓｉＤＮＡのどちらのサイレンシング作用もトランスフェクションの約２４時間後までに低下を示し、９６時間目までに完全な発現が回復した。ヒト細胞およびハムスター細胞のどちらのハイブリッド分子も、遺伝子サイレンシングにおいて内在遺伝子発現の最も大きい低下をもたらし、その遺伝子発現を長期間抑制した。ハムスター細胞のみに関する以前の実験ではどちらのハイブリッド分子で得られた結果も類似していたので、ＲＮＡセンス鎖およびＤＮＡアンチセンス鎖から構成されるハイブリッド分子のみを使用した。
【００５１】
図４を参照すると、（Ａ）はｓｉＲＮＡ分子を、（Ｂ）はｓｉＤＮＡ分子を、（Ｃ）はＲＮＡｓ：ＤＮＡａという組成の短い干渉ハイブリッド分子をトランスフェクトしたＣＨＯ  ＡＡ８細胞およびヒトＭＣＦ−７細胞の場合である。ここで用いた配列は、ＣＨＯ  ＡＡ８細胞における最初の一連の実験に用いたものとは異なる配列であるので、これらの結果から、異なる反応が細胞特異的な作用ではなく、配列特異的な作用でもないことが実証される。ｓｉＤＮＡ分子を導入すると、最も低い遺伝子発現抑制が生じたが、ｓｉＲＮＡ分子はより高い程度の遺伝子サイレンシングをもたらした。どちらの細胞系統中でのどちらの作用も、トランスフェクションの約２４時間後までの間続いた。短い干渉ハイブリッド分子は、最も高い程度のＧ６ＰＤ遺伝子発現抑制およびその最も長い持続を示し、その抑制は、この実験の間中続いた。３つのグラフすべてのデータは、２回繰り返した実験のデータを表す。
【００５２】
この適用例の哺乳動物細胞における潜在的使用が示されることに加えて、これらの実験から、短い干渉分子が相同性を有するコード領域の配列の如何に関わらず異なる反応が生じることが実証される。ハムスター細胞中で核酸組成の作用を試験した最初の実験では、ヒトとハムスターとの比較実験とは異なる短い干渉配列を使用し、どちらの配列もコード鎖の区別されない領域と相同性を有していた。それでも、どちらからも遺伝子サイレンシングが生じ、ハイブリッド分子によって異なる反応および長期の抑制がもたらされた。
【００５３】
細菌細胞
ｓｉハイブリッドの支援なしの送達のみを使用した。支援なしの送達では、ｓｉハイブリッドを細菌培養物の培地に直接添加する。
【００５４】
１．  ｃａｔ  ｓｉハイブリッドの有効量：UltraMAX DH5α-FT Competent E. coli cells（米国カリフォルニア州、Carlsbad、Invitrogen）を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性タンパクをコードする（ｃａｔ遺伝子）ｐＢＣ  ＳＫ＋プラスミド（米国ウィスコンシン州、Madison、Promega）で熱ショックによって形質転換した。形質転換物を、ｃａｔ  ｓｉハイブリッド構築物の存在下で抗生物質クロラムフェニコール（米国ミズーリ州、St. Louis、Sigma）２５μｇ／ｍｌを含むLuria-Bertani（ＬＢ）培地２ｍｌ中で培養した。ｃａｔ  ｓｉハイブリッドの有効量を決定するため、この構築物０．１２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、および８．０μｇ／ｍｌの存在下で細胞を増殖させた。ｓｉハイブリッドは、長さ２１塩基対であり、ｐＢＣ  ＳＫ＋プラスミドのｃａｔ遺伝子コード領域内の特定の配列と相同性を有するものであった。構築物は、Tuschlらの指針（ウェブアドレスmpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/sirna.htmlにある「ｓｉＲＮＡユーザーガイド」（The siRNA user guide）を参照のこと）に従って設計した。センス鎖は、配列が５’ＣＧＧＵＧＧＵＡＵＡＵＣＣＡＧＵＧＡＵＵＵＵＵ ３’（米国コロラド州、Lafayette、Dharmacon）のＲＮＡから構成されるものであり、アンチセンス鎖は、配列が５’ＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＴ３’（米国テキサス州、The Woodlands、Sigma Genosys）のＤＮＡから構成されるものであった。対照条件として陽性対照を使用し、これはＬＢクロラムフェニコール培地中で増殖させた細胞、ｃａｔ  ｓｉハイブリッドと配列が同一のｓｉＲＮＡ  ４μｇ／ｍｌの存在下でＬＢクロラムフェニコール培地中で増殖させた培養物を含んでいた。ｓｉハイブリッドの作用が配列特異的であることを示すために、E.coliゲノムのどの領域とも相同性を有さない（ＮＨ）ｓｉハイブリッド構築物も使用した。この非相同性構築物のセンス鎖は、配列が５’ＣＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＵＵＵＵ３’（Dharmacon）のＲＮＡから構成されるものであった。アンチセンス鎖は、配列が５’ＡＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴ３’（Sigma Genosys）のＤＮＡから構成されるものであった。培養物を、２５０ｒｐｍの振盪器上で３７℃で１晩インキュベートした。インキュベーション後、培養物をＬＢ培地で１：１０００に希釈し、希釈物のうち１０μｌを、抗生物質クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを補充したＬＢ／寒天プレートに播いた。プレート上で均一なコロニーを得るために、直径５ｍｍのソーダ石灰ガラスビーズ（米国ペンシルバニア州、Westchester、VWR）をプレートに入れ、手で振盪した。プレートを逆さまにして３７℃で１晩インキュベートした。ｓｉハイブリッドによる遺伝子サイレンシングの発生率または遺伝子サイレンシング活性を定量化するため、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を以下の方程式を用いて算出した：［（播いた１０μｌ当たりのコロニー数）×（希釈倍率）×（２０００μｌ）］。
【００５５】
図５を参照すると、ｃａｔ  ｓｉハイブリッド活性を測定し、１０７コロニー形成単位で表した。対照、非相同性ｓｉハイブリッド、およびｓｉＲＮＡの棒グラフはすべて３６．０〜４３．０×１０７ＣＦＵの範囲内の類似した増殖を示した。この結果は、コロニー増殖がｃａｔ  ｓｉハイブリッドの濃度に反比例することを示唆するものである。ｃａｔ  ｓｉハイブリッドの濃度が２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、および８．０μｇ／ｍｌのものはすべて対照と比べてコロニー形成で７２．２％の低下を示した。ｃａｔ  ｓｉハイブリッドの各添加量についてコロニー増殖が平均２３．６％低下した。％誤差はここで使用したすべての実験技術で約５％と算出された。
【００５６】
２．  ｓｉハイブリッドを用いたｆｏｌＡ遺伝子のサイレンシング：ＭＧ１６５５  E.coli細胞の培養を、そのタンパク産物がジヒドロ葉酸レダクターゼであるｆｏｌＡ遺伝子のコード領域配列と相同性を有するｓｉハイブリッド４μｇ／ｍｌの存在下でＭ９最小培地２ｍｌ中で開始した。センス鎖は、配列が５’ＵＣＵＣＧＣＣＵＧＧＵＵＵＡＡＡＣＧＣＡＡＵＵ３’（米国メリーランド州ボルチモア、Johns Hopkins Synthesis Facility）のＲＮＡから構成されるものであった。アンチセンス鎖は、配列が５’ＴＴＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＴＴ３’（Johns Hopkins Synthesis Facility）のＤＮＡから構成されるものであった。ｆｏｌＡ遺伝子のサイレンシングを行うと、E.coli細胞がプリンおよびピリミジンを合成することができなくなるため、この細胞の最小培地中での増殖が妨げられる。実験条件には６つあり、それには、最小培地中の細胞を含む陽性対照、ｆｏｌＡ  ｓｉハイブリッド構築物４μｇ／ｍｌを含む最小培地中の細胞、ｆｏｌＡ  ｓｉＲＮＡ（ｆｏｌＡ  ｓｉハイブリッドと配列が同一である）構築物４μｇ／ｍｌを含む最小培地中の細胞、非相同性ｓｉハイブリッド構築物４μｇ／ｍｌを含む最小培地中の細胞、ｆｏｌＡ  ｓｉハイブリッド構築物４μｇ／ｍｌを含み、２０ｍＭのチミジン、シチジン、アデノシン、およびグアノシン（Sigma）を補充した最小培地で増殖させた細胞があった。ジヒドロ葉酸レダクターゼの作用を特異的に阻害する抗生物質であるトリメトプリム（Sigma）５０μｇ／ｍｌを補充した最小培地中でも細胞を増殖させ、これを薬理学的対照として使用した。これらの培養物を３７℃で１晩増殖させ、２５０ｒｐｍで振盪した。培養物を１：１０００および１：１００，０００で希釈し、翌日に播いた。コロニーをカウントし、ＣＦＵを各実験条件について算出した。
【００５７】
図６を参照すると、陽性対照（最小培地のみで増殖させた細胞）について得られたＣＦＵ値を１００％とし、他の条件のものはすべてその値と比較して表した。ｆｏｌＡ  ｓｉハイブリッドの存在下で増殖させた培養物では、ＣＦＵ形成が、８０％を超える有意な低下を示した。陽性対照、ｆｏｌＡ  ｓｉＲＮＡの存在下で増殖させた培養物、および非相同性ｓｉハイブリッドの存在下で増殖させた培養物中で形成されたＣＦＵ量の間で有意差は存在しなかった。ｆｏｌＡ  ｓｉハイブリッド、ならびにプリンおよびピリミジンの存在下で増殖させた培養物（ｓｉハイブリッド／救済）は１００％を超えるＣＦＵ形成を示した。その原因は、この救済培養物の増殖速度が陽性対照のそれより有意に速いことであることが実験的に決定された（データは示さない）。救済培養物中の細胞は自身のプリンおよびピリミジンを合成する必要がなかったためにその増殖速度がより速く、そのために、より速い速度で分裂が起こる可能性があったと仮説が立てられる。
【００５８】
上記明細書中で挙げた刊行物および特許のすべてを、参照により本明細書に組み込む。ここに記載した本発明の方法およびシステムの、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない様々な変更形態および変形形態は、当業者に明らかになるであろう。特定の実施形態に関して本発明を記載したが、特許請求の範囲に記載する本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、分子生物学またはその関連分野の技術者にとって自明である、ここに記載した本発明の実施形態の様々な変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ｓｉハイブリッド分子を示す図である。
【図２】哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡおよびｓｉハイブリッド分子の支援なしの送達によるＧ６ＰＤ遺伝子サイレンシングを示す図である。
【図３】短い干渉分子の核酸構造によって哺乳動物細胞中でのｓｉＲＮＡを媒介とする遺伝子サイレンシング作用の程度および持続性が変化することを示すグラフである。
【図４】２種の哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシング作用の程度および長さに対する応答を示すグラフである。
【図５】抗生物質耐性遺伝子サイレンシング中の細菌細胞におけるＣＦＵ形成を示す図である。
【図６】ｆｏｌＡ遺伝子サイレンシング中の細菌細胞におけるＣＦＵ形成を示す図である。
【配列表】
2006512902.tif 000003
2006512902.tif 000004
【図１】
2006512902.tif 000005
【図２】
2006512902.tif 000006
【図３】
2006512902.tif 000007
【図４】
2006512902.tif 000008
【図５】
2006512902.tif 000009
【図６】
2006512902.tif 000010