(57)【要約】炭疽ワクチンなどの免疫原性炭疽用組成物、ならびに免疫原性炭疽用組成物および／またはワクチンを哺乳動物に送達する方法。方法には、粘膜および皮膚への送達が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）免疫原性炭疽用組成物の液体製剤を霧化して霧化製剤を作製するステップと、
（ｉｉ）前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップと、
（ｉｉｉ）前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を得るステップと
を含む方法によって作製されることを特徴とする免疫原性炭疽用組成物。
【請求項２】
前記乾燥粒子は約３５μｍから約３００μｍの体積平均径を有し、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炭疽ワクチンであることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性炭疽用組成物。
【請求項４】
炭疽ワクチン吸着型（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ）（ＡＶＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項５】
組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項６】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項７】
アジュバントを含まないことを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項８】
前記乾燥粒子は約５０μｍから約３００μｍの体積平均径を有することを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項９】
前記炭疽ワクチンの前記液体製剤は、本質的に前記炭疽ワクチンおよび水からなることを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項１０】
炭疽ワクチンの液体製剤を霧化して霧化製剤を作製することによって調製され、前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成し、前記固体粒子を乾燥させて乾燥粒子を作製した後に、前記乾燥粒子は約３５μｍから約３００μｍの標準的な平均径を有し、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有するように調製されたことを特徴とする炭疽ワクチン。
【請求項１１】
約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有し、約３５μから約３００μの体積平均径を有する乾燥粒子の形態で、免疫原および少なくとも１つの製剤上許容可能な担体を含み、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は平均の約８０％以内の体積径を有することを特徴とする炭疽ワクチン。
【請求項１２】
ＡＶＡワクチンであることを特徴とする請求項１１に記載の炭疽ワクチン。
【請求項１３】
ｒＰＡワクチンであることを特徴とする請求項１１に記載の炭疽ワクチン。
【請求項１４】
（ｉ）炭疽ワクチン組成物の液体製剤を霧化して、約３５μから約３００μの標準的な平均径を有する液滴を含む霧化製剤を作製するステップと、
（ｉｉ）前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップと、
（ｉｉｉ）前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を得るステップとを含む方法によって作製されることを特徴とする請求項３に記載の炭疽ワクチン。
【請求項１５】
前記乾燥粒子は約３５μｍから約３００μｍの体積平均径を有し、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有することを特徴とする請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
（ｉ）炭疽ワクチン組成物の液体製剤を霧化して霧化製剤を作製するステップと、
（ｉｉ）前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップと、
（ｉｉｉ）前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を得るステップとを含むことを特徴とする炭疽ワクチンを調製する方法。
【請求項１７】
前記乾燥粒子は約３５μｍから約３００μｍの標準的な平均径を有し、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記乾燥粒子は約５０μｍから約３００μｍの体積平均径を有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記炭疽ワクチン組成物の前記液体製剤は、本質的に前記炭疽ワクチンおよび水からなることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
炭疽ワクチンの液体製剤を霧化して霧化製剤を作製するステップを含み、前記霧化製剤を凍結して固体粒子を形成させ、前記固体粒子を乾燥させて粉末を作製した後に、乾燥粉末は約３５μから約３００μの標準的な平均径を有する乾燥粒子を含み、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有するようにすることを特徴とする炭疽ワクチンを調製する方法。
【請求項２１】
哺乳動物に免疫原性炭疽用組成物を送達する方法であって、哺乳動物に請求項１に記載の免疫原性炭疽用組成物の有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
免疫原性組成物は炭疽ワクチンであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
炭疽ワクチンは炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
炭疽ワクチンは組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
炭疽ワクチンはアジュバントを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
炭疽ワクチンはアジュバントを含まないことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
炭疽ワクチンは鼻内投与されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
炭疽ワクチンは粘膜に投与されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
有効な結果をもたらすのに必要な炭疽ワクチンの量を減らす方法であって、請求項２に記載の炭疽ワクチンの有効量を患者に鼻内投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
患者における免疫応答を引き出す方法であって、請求項１に記載の免疫原性炭疽用組成物の有効量を前記患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記組成物は鼻内投与されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
患者に炭疽に対する予防接種を行う方法であって、請求項１に記載の免疫原性炭疽用組成物の有効量を前記患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記組成物は鼻内投与されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
炭疽ワクチンはプライムブースト法の一部として投与されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物に免疫原性炭疽用組成物を送達する方法であって、ワクチンの送達が哺乳動物の皮膚の０．０２５ｍｍから２．５ｍｍの深さで行われるように組成物を皮内投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
組成部は露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の中空針によって組成物を投与され、前記出口は０．５ｍｍから２ｍｍの深さまで皮膚に挿入されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
免疫原性炭疽用組成物は炭疽ワクチンであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
炭疽ワクチンは炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
炭疽ワクチンは組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
炭疽ワクチンはアジュバントを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
炭疽ワクチンはアジュバント４２を含まないことを特徴とする請求項３７に記載の方法。送達されたワクチンは、哺乳動物において、皮下注射または筋内注射によってワクチンの同量を送達した後の応答以上の免疫応答を誘発することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
針は約３１から５０ゲージの微小針であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
微小針は微小針アレイ中にあることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物における炭疽用組成物の免疫原性を高める方法であって、組成物の送達が哺乳動物の皮膚の０．０２５ｍｍから２．５ｍｍの深さで行われるように組成物を皮内投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
炭疽用組成物は露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の中空針によって投与され、前記出口は０．５ｍｍから２ｍｍの深さまで皮膚に挿入されることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４６】
患者における免疫応答を引き出す方法であって、免疫原性炭疽用組成物の有効量を前記患者に皮内投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
組成物は露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の中空針によって投与され、前記出口は０．５ｍｍから２ｍｍの深さまで皮膚に挿入されることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項４８】
患者に炭疽に対する予防接種を行う方法であって、露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の中空針によって炭疽ワクチンの有効量を前記患者に皮内投与するステップを含み、前記出口は０．５ｍｍから２ｍｍの深さまで皮膚に挿入されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
免疫原性炭疽用組成物を皮膚に送達する方法であって、皮膚を擦過するステップと、擦過した皮膚に炭疽用組成物を送達するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
皮膚は炭疽用組成物を送達する前に擦過されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５１】
皮膚は炭疽用組成物を送達すると同時に擦過されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５２】
炭疽用組成物は炭疽ワクチンであることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
炭疽ワクチンは炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５４】
炭疽ワクチンは組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンであることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５５】
炭疽ワクチンはアジュバントを含むことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
炭疽ワクチンはアジュバントを含まないことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
皮膚は少なくとも２回擦過されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
皮膚は交互の方向で擦過されることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項５９】
組成物は液体形態で皮膚に塗布されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
組成物は擦過装置から皮膚に塗布されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
組成物は、擦過装置の擦過表面上の粉末、ゲルまたはフィルムであることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６２】
再構成用液体は擦過前に皮膚に別個に塗布されることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６３】
再構成用液体は擦過と同時に皮膚に塗布されることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６４】
免疫原性炭疽用組成物の免疫原性を高める方法であって、皮膚を擦過するステップと、擦過した皮膚に炭疽用組成物を送達するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６５】
炭疽ワクチンの防御効力を高める方法であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６６】
患者における炭疽に対する免疫応答を引き出す方法であって、皮膚を擦過するステップと、擦過した皮膚に免疫原性炭疽用組成物を送達するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６７】
患者に炭疽に対する予防接種を行う方法であって、皮膚を擦過するステップと、擦過した皮膚に炭疽ワクチンを送達するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６８】
請求項３に記載のワクチン組成物の有効量を含むキット。
【請求項６９】
ワクチンを鼻内投与するための手段をさらに含むことを特徴とする請求項７０に記載のキット。
【請求項７０】
擦過表面を含む微小擦過器と、
有効量の炭疽ワクチンとを含むことを特徴とするキット。
【請求項７１】
炭疽ワクチンは微小擦過器の表面上に被覆されることを特徴とする請求項７２に記載のキット。
【請求項７２】
炭疽ワクチンは微小擦過器と一体化した容器中に含まれることを特徴とする請求項７２に記載のキット。
【請求項７３】
炭疽ワクチンはキット内で別個に包装されていることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項７４】
０．０２５から２．５ｍｍの深さまで物質を皮内送達する送達装置と、
有効量の炭疽ワクチンとを含むことを特徴とするキット。
【請求項７５】
前記送達装置は、０．０２５から２．５ｍｍの深さまで物質を皮内送達するように設計された少なくとも１本の中空微小針を含み、送達装置は、前記微小針がそれと連係するように、炭疽ワクチン入りの容器を含む、または容器を受容するように適合されていることを特徴とする請求項７６に記載のキット。
【請求項７６】
その投与量は、送達装置の一体化部分であるか、または送達装置に機能的に取り付けることができる容器の中に含まれることを特徴とする請求項７７に記載のキット。
【請求項７７】
中空微小針は約３１から５０ゲージであることを特徴とする請求項７７に記載のキット。
【請求項７８】
装置は微小針のアレイを含むことを特徴とする請求項７７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭疽ワクチンなどの免疫原性炭疽用組成物、および／または炭疽用組成物もしくはワクチンを送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００３年２月１３日に出願した米国仮出願第６０／４４６，９９５号、および２００３年７月１４日に出願した米国仮出願（整理番号７７６７−１９０６５３）の優先権を主張するものである。
【０００３】
２００１年９月１１日の事件、およびその後数ヶ月間の炭疽騒動からみて、軍関係者と民間人をどちらも防御する新たな生体防御ワクチンが緊急に必要であることがますます明らかとなってきている。そのような新たなワクチン開発は、候補ワクチンの効力を高め、国家的な緊急事態の際に安全かつ迅速な配備が確実に行われるために、新規送達用足場の開発と並行して進行してもよい。
【０００４】
炭疽の原因物質である炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の毒性は、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）という３つの主要なタンパク成分によって媒介される。これらのタンパクは、個々としては非毒性であるが、組み合わせると潜在的に致死性の毒素を形成する。皮膚を炭疽芽胞にさらすと、皮膚傷害が生じるが、これは通常、抗生物質治療によく反応する。しかしながら、吸入による炭疽は、はるかに恐ろしい脅威を表す。吸入による炭疽の早期診断は困難であり、この疾患は、最初に症状が現れてから２〜４日後に突然呼吸不全または循環虚脱を示すことが多い。
【０００５】
米国で現在認可されているワクチンは、炭疽ワクチン吸着型（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ）（ＡＶＡ）であり、アジュバントである水酸化アルミニウム上に吸着された、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の毒性非被胞性株の培養濾過液からなる。ヒトにおいて炭疽から保護するのに一般に有効であるが、この現在のワクチンは、１８ヶ月にわたって６回連続して投与し、その後毎年追加免疫を行うものである。したがって、例えば防御免疫の実現に必要な投与回数を減らすために、より安全かつ強力な炭疽ワクチンを作製する必要がある。
【０００６】
最近開発された候補炭疽ワクチンは、組換えにより作製したＰＡに基づいている（例えば、非特許文献１および２参照）。このワクチンは、効力が向上し、したがって追加免疫投与の必要回数が少なくなり、また安全面も向上する潜在的可能性があるため、ＡＶＡの代替としてＵＳＡＭＲＩＩＤによって検討されている。防御に最も有効な送達経路を決定し、アジュバントを潜在的に必要とする可能性をさらに解明するために、さらなる前臨床および臨床試験が必要である。アルム(alum)などのアジュバントは、しばしば皮膚反応および他の有害な事象を伴う。したがって、好ましいワクチンとは、アルム含有ワクチンの免疫原性を保持するが、副作用を伴わないものであるはずである。
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１０／２８２，２３１号明細書
【特許文献２】米国特許出願第０９／８７９，７１４号明細書
【特許文献３】米国特許出願第０９／７５８，７７６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９３５，８３５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／００５２４７５号明細書
【特許文献６】米国特許出願第１０／２９９，０１２号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／２９９，０１０号明細書
【特許文献８】米国特許第４，６０８，７６４号明細書
【特許文献９】米国特許出願第１０／０２８，９８８号明細書
【特許文献１０】米国特許出願第１０／１８５，７１７号明細書
【特許文献１１】PCT publication no. WO 02/02179 A1
【特許文献１２】PCT/US01/20782
【特許文献１３】米国特許出願第６０６，９０９号明細書
【特許文献１４】米国特許出願第４１７，６７１号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，８００，４２０号明細書
【特許文献１６】米国特許出願第０９／４０５，４８８号明細書
【特許文献１７】米国特許出願第０９／５７６，６４３号明細書
【特許文献１８】米国特許出願第０９／９７４，８２９号明細書
【特許文献１９】米国特許出願第１０／２８２，２３１号明細書
【特許文献２０】米国特許出願第１０／１９３，３１７号明細書
【非特許文献１】Ivins, B.E., Infection and Immunity, 60:662-668, 1992
【非特許文献２】Ramirez, D.M., et al., J. Industrial Microbiol. and Biotechnol. 28:232-238, 2002
【非特許文献３】Price et al., Infection and Immunity, 69:4509-4515, 2001
【非特許文献４】Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY
【非特許文献５】Ausubel, F.M. et al. (1995). Current Protocols in Molecular Biology, NY, John Wiley & Sons
【非特許文献６】Wilbur et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 726-730
【非特許文献７】Martinez (1983), Nucleic Acid Res. 11, 4629-4634
【非特許文献８】Lipman et al. (1985), Science 227,1435-1441
【非特許文献９】Altschul et al.(1986), Bull. Math. Bio. 48, 603-616, 1986
【非特許文献１０】Henikoff et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,10915-10919
【非特許文献１１】W.H.Finley, "The mechanics of inhaled pharmaceutical aerosols, an introduction", Academic Press, London, UK (2001)
【非特許文献１２】The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds., Macmillan Publishing Co., New York.
【非特許文献１３】Roitt I., (1994). Essential Immunology, Blackwell Scientific Publications, London.
【非特許文献１４】Currents Protocols in Immunology; edited by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献１５】Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of the Skin, Second Edition, L.A. Goldsmith, Ed., Oxford University Press, New York, 1991
【非特許文献１６】Pitt et al., Vaccine 19:4768-4773, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、炭疽ワクチンなどの免疫原性炭疽用組成物、およびそれを必要とする患者に炭疽用組成物またはワクチンを送達する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施形態は、微粒子型の免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）であり、これは鼻内投与に適している。このような組成物は、本明細書に記載の方法によって作製することができ、および／または本発明に記載の特性を示し、好ましくは約３５μｍから約３００μｍの体積平均径を有する粒子を含み、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有する。
【００１０】
本発明の他の実施形態には、鼻内に、皮内に（例えば、中空の微小針を用いて）、および局所擦過（ｔｏｐｉｃａｌ−ａｂｒａｓｉｏｎ）により（例えば、充実微小針を用いて）免疫原性炭疽用組成物を送達する方法がある。
【００１１】
本発明の組成物および方法は、いくつかの利点を示す。例えば、それらは、ワクチンの免疫原性および防御効力を向上させる；ワクチン製剤におけるアジュバントの必要性を低下させまたは排除できる；侵襲性が最小のワクチン投与をもたらす；および／またはワクチンの自己投与を可能にする。好ましい実施形態では、そのワクチンは生体防御ワクチンであり、より好ましくは炭疽ワクチンであり、最も好ましくは炭疽ｒＰＡワクチンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明によれば、ワクチンについて「改良する」、「改良された」および「改良」という用語は、ワクチンが、従来の製剤および／または従来のワクチン投与経路を介するより強い免疫応答を刺激する（すなわち、増大された免疫原性をもたらす）ことを意味するものとする。従来の製剤には、例えば、アルム中のｒＰＡが含まれ、従来の投与経路には、例えば、筋内［ＩＭ］または皮下［ＳＣ］送達が含まれる。この場面において「改良する」、「改良された」および「改良」という用語は、ワクチンが、従来の送達経路を介して投与される従来の製剤を介するより強い防御免疫応答を刺激すること、および／またはワクチンが、通常の経路を介して投与される通常の製剤で必要な回数より少ない、免疫応答の実現に必要な免疫付与の回数を必要とすること、および／またはワクチンが、従来の経路を介して投与される従来の製剤に必要な回数よりも少ない、防御免疫応答の実現に必要な免疫付与の回数を必要とすることも意味し得る。
【００１３】
一態様では、本発明には、鼻内から患者に送達するのに適した、微粒子型の免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチンまたは薬剤組成物）、ならびにそのような組成物を作製および使用する方法が含まれる。例えば、一実施形態は、１つまたは複数の以下のステップを含む方法によって作製された乾燥粒子の形態の免疫原性炭疽用組成物である：
（ｉ）免疫原性炭疽用組成物の液体製剤を霧化して霧化製剤を作製するステップ、
（ｉｉ）前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子（例えば、粉末）を作製するステップ。
【００１４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、免疫原性炭疽用組成物は、炭疽ワクチンであり、好ましくは炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチンであり、より好ましくは組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンである。免疫原性炭疽用組成物は、アジュバントを含んでもよく含まなくてもよい。
【００１５】
好ましい一実施形態では、乾燥粒子は、約３５μｍから約３００μｍの体積平均径を有し、乾燥粒子の少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は、約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有する。
【００１６】
他の好ましい実施形態では、免疫原性炭疽用組成物の乾燥粒子は、約５０μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約１００μｍの体積平均径を有し、および／または乾燥粒子は約２０μｍから約７０μｍの平均空気力学径を有する。
【００１７】
免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を作製するこの方法に関して、凍結は、その液体製剤の凝固点未満の温度を有する流体または媒体に霧化製剤を導入することによって行うことができ、好ましくは、その流体または媒体は、前記霧化製剤より低い沸点または昇華点を有する。その流体は、気体でも液体でもよい。粒子は、凍結乾燥によって乾燥させることができ、またはおよそ大気圧で、振動物、内蔵物、機械的撹拌物もしくはその組合せの存在下で乾燥させることもでき、場合によっては、凍結乾燥によりさらに乾燥させる。液体製剤は、粘膜付着性物質、例えばキトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチン、またはペクチンを含んでもよい。一実施形態では、炭疽用組成物の液体製剤は、本質的に前記炭疽用組成物および水からなる。
【００１８】
本発明には、免疫原性炭疽用組成物の液体製剤を霧化して霧化製剤を作製することにより、前記霧化製剤を凍結して固体粒子を形成させ、前記固体粒子を乾燥させて乾燥粒子を作製した後に、前記乾燥粒子が約３５μｍから約３００μｍの標準的な平均径を有し、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子が約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有するように調製された免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）も含まれる。
【００１９】
本発明には、約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有し、約３５μから約３００μの体積平均径を有し、少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有する乾燥粒子、および製剤上許容される担体を含む免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）も含まれる。この免疫原性炭疽用組成物は、炭疽ワクチン、例えばＡＶＡワクチンでもよく、または好ましくはｒＰＡワクチンでもよい。
【００２０】
さらに、本発明には、
（ｉ）免疫原性炭疽用組成物の液体製剤を霧化して、約３５μから約３００μの標準的な平均径を有する液滴を含む霧化製剤を作製するステップと、
（ｉｉ）前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップと、
（ｉｉｉ）前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を作製するステップとを含む方法によって作製された免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）が含まれる。
【００２１】
好ましい一実施形態では、乾燥粒子は、約３５μｍから約３００μｍの体積平均径を有する。好ましくは、乾燥粒子の少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子は、約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有する。
【００２２】
他の態様では、本発明は免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を調製する方法を提供する。本発明のこの態様の好ましい一実施形態は、
（ｉ）免疫原性炭疽用組成物の液体製剤を霧化して、霧化製剤を作製するステップと、
（ｉｉ）前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップと、
（ｉｉｉ）前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を作製するステップとを含む、免疫原性炭疽用組成物を調製する方法である。
【００２３】
特に好ましい実施形態では、乾燥粒子は、約３５μｍから約３００μｍの標準的な平均径を有する。好ましくは、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有する。より好ましくは、乾燥粒子は、約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有する。他の好ましい実施形態では、前記乾燥粒子は、約５０μｍから約３００μｍ好ましくは約５０μｍから約１００μｍの体積平均径を有し、および／または前記乾燥粒子は約２０μｍから約７０μｍの標準的な平均空気力学径を有する。
【００２４】
この方法の特定の実施形態では、凍結は、前記液体製剤の凝固点未満の温度を有する流体または媒体に前記霧化製剤を導入することによって行うことができる。好ましくは、その流体または媒体は、前記霧化製剤より低い沸点または昇華点を有する。その流体は、気体でも液体でもよい。粒子は、凍結乾燥によって乾燥させることができ、またはおよそ大気圧で、振動物、内蔵物、機械的撹拌物またはその組合せの存在下で乾燥させることもできる。乾燥は、およそ大気圧で、振動物、内蔵物、機械的撹拌物またはその組合せの存在下での乾燥と、凍結乾燥との組合せによって行うこともできる。液体製剤は、粘膜付着性物質、例えばキトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチン、またはペクチンを含んでもよい。特定の好ましい一実施形態では、免疫原性炭疽用組成物の液体製剤は、本質的に免疫原性炭疽用組成物および水からなる。
【００２５】
本発明のこの態様の他の実施形態は、免疫原性炭疽用組成物の液体製剤を霧化して、霧化製剤を作製するステップを含み、前記霧化製剤を凍結して固体粒子を形成させ、前記固体粒子を乾燥させて粉末を作製した後に、その乾燥粉末が約３５μから約３００μの標準的な平均径を有する乾燥粒子を含み、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％が平均の約８０％以内の体積径を有し、前記乾燥粒子が約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径を有するようにする、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を調製する方法である。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物に本発明の免疫原性炭疽用組成物の有効量を投与するステップを含む、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を哺乳動物に送達する方法である。好ましくは、免疫原性炭疽用組成物は、炭疽ワクチン、例えば、炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチン、または組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンである。炭疽用組成物は、さらにアジュバントを含んでもよいが、好ましくはアジュバントを含まない。免疫原性炭疽用組成物は、鼻内におよび／または粘膜に投与することができる。
【００２７】
本発明のこの態様には、それを必要とする患者に鼻内投与した後に有効な結果を得るのに必要な免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）の量を低下させる方法であって、前記患者に本発明の免疫原性炭疽用組成物の有効量を鼻内投与するステップを含む、方法が含まれる。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、患者における免疫応答を引き出す（誘発する）方法であって、本発明の免疫原性炭疽用組成物の有効量を患者に（例えば、鼻内）投与するステップを含む、方法である。特に好ましい実施形態は、患者に炭疽に対する予防接種を行う方法であって、本発明の炭疽ワクチンの有効量を患者に投与するステップを含む、方法である。一実施形態では、炭疽ワクチンは、プライムブースト法（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ）の一部として投与される。適切なプライムブースト法は、当業者によく知られており、日常的な実験によって決定することができる。
【００２９】
本発明はまた、中空微小針（ＨＭＮ）を用いた、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を哺乳動物に送達する皮内（ＩＤ）法をも提供する。したがって、本発明には、露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の中空針によって組成物を皮内投与し、前記出口が深さ０．５ｍｍから２ｍｍまで皮膚に挿入されるステップを含む、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチン、または好ましくは組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンなどの炭疽ワクチン）を哺乳動物に送達する方法が含まれる。そのように使用される免疫原性炭疽用組成物は、アジュバントを含んでもよく含まなくてもよい。
【００３０】
この皮内投与法の一実施形態では、免疫原性炭疽用組成物は、装置を用いて投与され、その装置は、
ワクチンを貯蔵する、予め装填可能な容器を取り付けられるハブ部と、
前記ハブ部によって支持され、前記ハブ部から離れて伸長している前方の先端を有する少なくとも１本の中空微小針と、
前記（複数の）微小針を包囲し、前記ハブ部から離れて前記（複数の）微小針の前方の先端に向かって伸長しているリミッタ部を含み、前記リミッタは、前記（複数の）微小針の軸に対して通常垂直な表面中で伸長している、一般に平らな皮膚結合表面を含み、ワクチンの皮内注射をする哺乳動物の皮膚に対して受容するように適合され、前記（複数の）微小針の（複数の）前方の先端は、約０．５ｍｍから２．０ｍｍの距離まで前記皮膚結合表面を越えて伸長し、前記リミッタ部は、哺乳動物の皮膚の皮層への（複数の）微小針の進入を制限するものである。この方法の実施形態では、免疫原性組成物の送達は、哺乳動物の皮膚の約０．０２５ｍｍから２．５ｍｍの深さで行われ；送達された免疫原性組成物が、哺乳動物において、皮下注射または筋内注射によって免疫原性組成物の同量を送達した後の応答以上の免疫応答を誘発し；送達された免疫原性組成物が、哺乳動物において、皮下注射または筋内注射によって免疫原性組成物のより多量を送達した後の応答以上の免疫応答を誘発する。好ましくは、その針は、約３１から５０ゲージの微小針であり、深さ０．３から１．７ｍｍまで皮膚に垂直に挿入される。この送達法の一実施形態では、炭疽ワクチンはプライムブースト法の一部として投与される。
【００３１】
さらに他の実施形態では、本発明は、少なくとも１本の中空針によって炭疽用組成物の有効量を皮内投与するステップを含む、炭疽用組成物の免疫原性を高める方法を提供する。好ましくは、その針は、露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有し、その出口は深さ０．５ｍｍから２ｍｍまで皮膚に挿入される。皮内投与のこの手段および同様の手段を用いると、炭疽ワクチンの防御効力が高まる。
【００３２】
本発明には、患者に免疫原性炭疽用組成物（または炭疽ワクチン）の有効量を皮内投与するステップを含む、患者における免疫応答を引き出す（誘発する）（または患者に炭疽の予防接種を行う）方法も含まれる。この方法の好ましい実施形態では、その組成物は、露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の中空針によって投与され、前記出口は深さ０．５ｍｍから２ｍｍまで皮膚に挿入される。
【００３３】
本発明はまた、充実微小針（ＳＭＮ）微小擦過器で皮膚を擦過するステップと、微小擦過ステップの前、その間、またはその後のいずれかに免疫原性組成物を塗布するステップを含む、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を皮膚に局所送達する方法にも関する。この送達法は、本明細書において「局所擦過」法と呼ばれることがあり、中でも特許文献１に記載されている。
【００３４】
この方法の一実施形態では、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン吸着型（ＡＶＡ）ワクチン、または好ましくは組換え防御抗原（ｒＰＡ）ワクチンなどの炭疽ワクチン）は、皮膚を予め擦過した後、炭疽用組成物を局所に塗布することによって送達される。この方法に従って送達される炭疽用組成物は、場合によってはアジュバントを含む。皮膚は、好ましくは少なくとも２回、より好ましくは少なくとも６回、さらに６から１２回以上擦過される。皮膚は、交互の方向で擦過してもよく、同じ方向で擦過してもよい。免疫原性組成物は、好ましくは液体の形態で皮膚に塗布され、被覆装置または液体用容器を含むものなどのような擦過装置に塗布することもでき、または擦過ステップの前または後のいずれかにおいて別々に塗布することもできる。一実施形態では、乾燥した免疫原性組成物は、擦過と同時に再構成される。このことは、擦過装置の擦過表面上に免疫原性組成物を粉末または他の固体として存在させ、擦過前にまたは擦過と同時に、再構成用液体が皮膚に別々に塗布されることによって行うことができる。好ましい一実施形態では、皮膚は充実微小針アレイを含む装置を用いて擦過される。
【００３５】
微小擦過法の一実施形態では、皮膚は、少なくとも１つの擦過先端を含み、その擦過表面から突き出ている円錐台状のまたは角錐台状の微小突起を含む擦過表面を含む装置で皮膚を擦過される。この方法の特定の実施形態では、微小突起は、炭疽ワクチンで少なくとも部分的に被覆され；これらの微小突起は、皮膚の角質層へと進入するのに十分な長さである。
【００３６】
本発明はまた、本発明のいかなる方法も実行するためのキットにも関する。例えば、一実施形態は、有効量の本発明の微粒子型免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）、および場合によっては免疫原性組成物を鼻内投与するための手段を含むキットである。
【００３７】
本発明の他の実施形態は、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を皮内送達するためのキットである。例えば、キットは、（ａ）０．０２５から２．５ｍｍの深さまで物質を皮内送達するように設計された少なくとも１本の中空微小針を有する送達装置であって、微小針がそれと連係するように炭疽用組成物入りの容器を含む、またはそれを受容するように適合されている送達装置と、（ｂ）有効量（投与量）の炭疽用組成物を含んでもよい。このキットの実施形態では、その投与量は、送達装置の一体化部分であり、または送達装置に機能的に取り付けることができる容器の中に含まれ；その中空微小針は約３１から５０ゲージであり；またはその装置は微小針のアレイを含む。
【００３８】
このキットの一実施形態では、装置は、（ａ）ワクチンを貯蔵する、予め装填可能な容器に取り付け可能なハブ部と、（ｂ）前記ハブ部によって支持され、前記ハブ部から離れて伸長している前方の先端を有する少なくとも１本の微小針と、（ｃ）前記微小針を包囲し、前記ハブ部から離れて前記微小針の前記前方の先端に向かって伸長しているリミッタ部を含み、前記リミッタは、前記微小針の軸に対して通常垂直な表面中で伸長している、一般に平らな皮膚結合表面を含み、炭疽用組成物の皮内注射をする哺乳動物の皮膚に対して受容するように適合され、前記微小針の前方の先端は、約０．５ｍｍから２．０ｍｍの距離まで前記皮膚結合表面を越えて伸長し、前記リミッタ部は、哺乳動物の皮膚の皮層への微小針の進入を制限する。
【００３９】
他の実施形態では、キットは（ａ）０．０２５から２．５ｍｍの深さまで炭疽用組成物を皮内送達するように設計され、その皮膚接触手段がそれと連絡するように炭疽用組成物を含む容器を受容するように適合された皮膚接触手段、および（ｂ）有効量（投与量）の炭疽用組成物を含む。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、微小擦過器の使用を含む、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を送達するためのキットである。例えば、一実施形態では、キットは、（ａ）擦過表面を含む微小擦過器であって、その擦過表面が、少なくとも１つの擦過先端を含み、前記擦過表面から突き出ている円錐台状のまたは角錐台状の微小突起を含む微小擦過器、および（ｂ）有効量の炭疽用組成物を含む。このキットの実施形態では、炭疽用組成物が微小擦過器の表面上で被覆され；炭疽用組成物が、微小擦過器と一体化した容器中に含まれ、または炭疽用組成物がキット内で別個に包装される。
【００４１】
本発明のさらに他の実施形態は、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を鼻粘膜に送達するためのキットであり、微粒子または粉末型の本発明の免疫原性炭疽用組成物、および送達のための手段を含む。適切な送達装置は、当技術分野で知られており、例えば、単回投与量の粉末形薬剤は、破ることができまたは穴を開けることができる膜が反対の端を覆っているカートリッジの中で薬剤の貯蔵を可能にする装置を使用して、鼻内に送達することができる。そのような装置は、これらの膜を破りまたはこれらの膜に機械的に穴を開け、そのカートリッジを介して流体を通過させることで薬剤を放出させることによって作動させることができる。この型の装置は、特許文献２（６／１２／０１出願）および特許文献３（１／１２／０１出願）に記載されている。
【００４２】
本発明のキットの他の任意選択の成分には、適切な緩衝液、培地成分など；容器；または包装物質が含まれる。キットの試薬は、凍結乾燥した形態または安定化させた液体のような試薬が安定である、容器の中に入れてもよい。試薬はまた、単回使用の形態、例えばワクチンとして使用するための単回投与量の形態でもよい。
【００４３】
炭疽用組成物
本発明の免疫原性炭疽用組成物は、いかなる適切な形態をとることもできる。例えば、組成物は、ＡＶＡワクチンでみられる混合物のような、複数の炭疽タンパクの混合物を含むことができ、または炭疽菌の単離または精製された個々の成分を含むこともできる。好ましくは、ワクチンは、本質的に炭疽タンパク１つだけからなり（例えば、組換えタンパク）、最も好ましくは、前記の防御抗原（ＰＡ）タンパクからなる（例えば、非特許文献１および２を参照）。これは、実施例中で例示される炭疽タンパクである。本発明はまた、ＡＶＡおよびＤＮＡプラスミドワクチン（例えば、非特許文献３を参照）のような、他の型の炭疽ワクチンにも適用できる可能性が高い。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、天然に存在するものとすることもでき、組換えによって作製することもできる。（ポリペプチドおよびタンパクという用語は、本明細書において相互に交換可能なものとして使用される。）好ましくは、炭疽菌のポリペプチド成分、例えばＰＡタンパクは、組換えによって作製する。適切な配列をクローン化し、対象とする配列が適切な発現制御配列に作動的に連結された組換えベクターを生成する方法は、日常的であり従来のものである。典型的なそのような方法（および本発明の他の態様で使用する分子生物学の方法）は、多くの他の出典の中でも、非特許文献４および５に記載されている。「発現制御配列」という語句は、機能的に（「作動的に」）連結したポリヌクレオチドにより、コードされているポリペプチドの発現を調節するポリヌクレオチド配列を意味する。発現は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで調節することができる。したがって、発現制御配列には、ｍＲＮＡ関連成分およびタンパク関連成分が含まれる。そのような成分には、プロモーター、エンハンサー（ウイルス性または細胞性）、リボソーム結合配列、転写終結配列などが含まれる。発現制御配列がそのような方式で位置して、コード配列の発現を実施または実行するとき、発現制御配列は、ヌクレオチドコード配列に作動的に連結している。例えば、プロモーターがコード配列に５’で作動的に連結しているとき、コード配列の発現は、プロモーターによって駆動される。強い構成的なまたは調節可能なプロモーターのような、適切な発現制御配列は、当業者には明らかであろう。
【００４５】
本発明は、野生型炭疽タンパクの機能的断片または機能的異型を包含する。本明細書において使用される、「機能的」断片または異型には、そのポリペプチドが免疫原性を示すことを可能にする抗原決定基の少なくとも１つを保持する条件で、天然に生じたまたは故意に生じさせたどんな種類の変化（修飾）をも含むポリペプチドが含まれる。好ましくは、その断片または異型は、炭疽感染に対する防御応答を引き出す（誘発する）能力を保持する。当業者は、本明細書で開示されているものなど従来の方法を用いて、所与の断片または異型が所望の性質を示すかどうかを容易に決定することができる。天然に存在する、タンパクの対立遺伝子異型は、本発明により包含される。
【００４６】
本発明の組成物または方法に使用するポリペプチドは、フルレングス（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）タンパクの機能的断片とすることができる。所望されるいずれのサイズ（長さ）のポリペプチドも、野生型タンパクより１アミノ酸短いものから、単一の抗原決定基および／または抗原性配列しか有さない小さなペプチド（例えば、長さ約８〜１０アミノ酸）まで、使用することができる。
【００４７】
ポリペプチドはまた、機能的異型とすることもできる。例えば、本発明の方法で使用する異型ＰＡポリペプチドは、野生型ＰＡの比較可能な部分と実質的な同一性を示すことができる。本明細書において使用する「実質的な同一性」または「実質的な類似性」という用語は、ポリペプチド（または核酸）が、少なくとも約１０から約１００以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの比較ウインドウ（window）にわたって、基準配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、またはより好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。（核酸間のまたはタンパク間の）配列同一性を決定する方法は、従来のものである。アラインメントは、いかなる有効なアルゴリズムを使用することによっても行うことができる。ＤＮＡ配列のペアワイズアラインメントでは、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎ（例えば、非特許文献６を参照）またはＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（例えば、非特許文献７を参照）により記載の方法が使用できる。１対のタンパクの配列は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（例えば、非特許文献８を参照）により、例えば、要素数ｋ（ｋ−ｔｕｐｌｅ）を２に、ギャップペナルティーを４に、ギャップ長ペナルティーを１２に設定して、アラインすることができる。例えば、ＤＮＡ  ＳｔａｒのＭｅｇＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））、ＢＣＭ（ベイラー医科大学）Ｌａｎｃｈｅｒなど、様々な営利のおよび無料のアラインメントプログラム供給源が利用可能である。パーセント配列同一性は、例えば、非特許文献９および１０に記載の他の従来の方法によって決定することもできる。
【００４８】
本発明の異型ポリペプチドには、天然に生じる（例えば、天然の変異による）または非天然に生じる（例えば、部位特異的突然変異生成など故意の修飾による）修飾、例えば、保存的または非保存的な挿入、欠失、付加および／または置換を１つまたは複数有するポリペプチドが含まれる。「保存的な置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを意味する。異型は、例えば、相同体、突然変異タンパク（ｍｕｔｅｉｎ）および擬似物を含むことができる。翻訳後修飾を含めて、多数の型のタンパク修飾が含まれる。翻訳後修飾には、天然に生じるまたは合成により作製される、例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基など他の化学的部分を有する共有結合物または凝集結合物、ならびに末端の（複数の）アミノ酸の切断などの切断がある。例えば、特許文献４で開示されている修飾を参照されたい。本発明はまた、生物活性に必須でないシステイン残基が欠失されまたは他のアミノ酸と置き換えられ、それによって誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するポリペプチド；選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から生じる、天然に存在する異型；および遺伝的多型（例えば、対立遺伝子変異）を反映する変化型などの変異型をも包含する。他の活性型異型は、天然に存在する、または、例えばリーダー配列、シグナル配列、分泌配列、標的配列、酵素配列などの非相同な付加ペプチド配列を含むことができる。さらに、ポリペプチドは、特許文献５で論じられている異型ポリペプチドにあるような、どんな種類の技術分野で認められている修飾によっても、修飾することができる。
【００４９】
鼻内（ＩＮ）送達のための組成物および方法
本発明の一態様は、直接の鼻内投与に適している微粒子型の（例えば粉末での）乾燥した薬剤組成物を調製する方法、およびこの方法によって作製された組成物に関する。そのような乾燥粒子はまた、粘膜または皮膚に送達する前に、薬剤として許容される液体（水性）の形態に再構成することもできる。
【００５０】
上記したように、本発明の一態様は、１つまたは複数の以下のステップを含む、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を調製する方法である：炭疽用組成物の液体製剤を霧化して霧化製剤を作製するステップ；前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップ；前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を作製するステップ。好ましくは、前記霧化製剤は、約３５μｍから約３００μｍの体積平均径（非特許文献１１によって定義される）を有する液滴を含む。好ましい実施形態では、その粉末は、約８μｍから約１４０μｍの平均空気力学径（上記の非特許文献１１によって定義される）を有する乾燥粒子を含む。この方法、およびこの方法によって作製される組成物は、本明細書において通常「噴霧−凍結−乾燥」（ＳＦＤ）法または組成物と呼ばれることがある。
【００５１】
上記薬剤組成物の粒子は、鼻内投与を促進するのに適したサイズ、密度および／または形態である。特定の理論に拘泥するものではないが、鼻内投与後、上記の組成物が、鼻腔を介して肺の系へと入るのではなく、例えば、鼻の被蓋（ｎａｓａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）または鼻腔の粘膜に送達され、そこに付着し、そのような粘膜への付着が治療用および予防用組成物の他の製剤の場合より高い速度での吸収を可能にすることが示唆される。本発明の組成物がワクチンであるとき、有効な抗体反応を開始させるのに必要な時間がしたがって短縮され、粘膜免疫（例えば、ＩｇＡ反応によって媒介される）が促進する。そのような発明のワクチンの鼻内投与により、全身性と鼻粘膜ＩｇＡの免疫応答がどちらも引き出される。
【００５２】
上記したように、本発明の他の態様は、１つまたは複数の以下のステップを含む、免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）を調製する方法である：炭疽用組成物の液体製剤を霧化して霧化製剤を作製するステップ；前記霧化製剤を凍結させて、固体粒子を形成するステップ；およそ大気圧で、振動物、内蔵物、機械的撹拌物またはその組合せの存在下で前記固体粒子を乾燥させて、乾燥粒子を作製する（例えば、粉末を作製する）ステップ。「およそ大気圧」とは、約１．５気圧から約５気圧の範囲の圧力を意味する。「乾燥させる」とは、固体の凍結粒子から製剤の揮発性成分を除去することを意味する。好ましくは、その粉末は、約３５μｍから約３００μｍの体積平均径を有する乾燥粒子を含み、より好ましくは約５０μｍから約３００μｍの体積平均径を有する乾燥粒子を含み、および／または乾燥粒子は、約８μｍから約１４０μｍの体積平均空気力学径を有する。好ましくは、凍結した固体粒子は、それらが乾燥中に流体化状態にある。この方法、およびこの方法によって作製される組成物は、本明細書において「噴霧−凍結−大気圧乾燥」法または組成物と呼ばれることがある。この方法によって作製される組成物の利点は、それが凝集しないことである。
【００５３】
「噴霧−凍結−乾燥」および「噴霧−凍結−大気圧乾燥」の方法および組成物についてのさらなる議論は、特許文献６および７に認めることができる。
【００５４】
本発明の組成物のさらなる利点は、その組成物が、容易にエアロゾル化され、良好な安定性、無菌性、放出型投与および生物活性の保存を提供し、吸入装置などの送達装置中にほとんど残らず、液体に再構成するのが容易であることである。その粒子は、低いタップ密度を示すことができ、このことは、例えば呼吸による送達のための粒子のエアロゾル化を促進する。その粒子は、低レベルの細粒を示すが、このことから、それを取り扱うのが容易となる。本発明の方法は、粒子サイズの分布をうまく制御することを可能にする。したがって、本発明の組成物は、うまく制御された粒子サイズ分布を含む。その粒子の形態により、それが凝集する可能性が低くなり、エアロゾル化がさらに促進される。その組成物は、冷却なしで安定であり、これによって、例えば液体製剤より便利となり、貯蔵および輸送に費用を要さなくなる。本発明の組成物は、大量の予防接種に特によく適している。本発明の一実施形態では、本発明の組成物は、呼吸による（例えば、鼻内）投与によって投与される。本発明の組成物は、鼻内投与に特によく適しているが、それは、うまく制御された粒子サイズ分布によって、鼻粘膜に正確に標的を定めることが可能であるからである。注射による（例えば、皮内または皮下）投与と比較した、呼吸による投与の利点には、患者コンプライアンスの向上、および免疫応答の促進が含まれる。呼吸による投与は、それが非侵襲性の手順であり、痛みを伴わず、行うのに容易である点でも有利である。
【００５５】
本発明の免疫原性組成物は、様々な従来の液体のどんなものを使用しても、液体製剤として最初に処方することができる。好ましくは、その液体は、例えば、水（例えば、注射可能な品質の水）または任意の様々な従来の緩衝液などの水性のものであり、その緩衝液は付加された塩を含んでもよく含まなくてもよい。緩衝液のｐＨは一般に、タンパクを安定化させるように選択され、当業者が確認することができるものである。一般に、これは生理的なｐＨの範囲内にある。したがって、最初の液体製剤の好ましいｐＨの範囲は約１から約１０であり、約３から約８が特に好ましく、約５から約７がとりわけ好ましい。当業者なら理解されるであろうが、使用することができる多数の適切な緩衝液がある。適切な緩衝液には、それだけに限らないが、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムおよび炭酸アンモニウムが含まれる。一般に、緩衝液は約１ｍＭから約２Ｍのモル濃度で使用するが、約２ｍＭから約１Ｍが好ましく、約１０ｍＭから約０．５Ｍがとりわけ好ましく、５０から２００ｍＭが著しく好ましい。一般に、塩は、液体溶液中に存在する場合、約１ｍＭから約２Ｍのモル濃度で使用するが、約２ｍＭから約１Ｍが好ましく、約１０ｍＭから約０．５Ｍが特に好ましく、５０から２００ｍＭがとりわけ好ましい。適切な塩には、それだけに限らないが、ＮａＣｌが含まれる。
【００５６】
液体製剤は、様々な形態、例えば、溶液、懸濁液、スラリー、またはコロイドのどんな形態をもとることができる。場合によっては、液体製剤は、従来の製剤上許容される賦形剤を１種または複数種含むことができる。「賦形剤」とは、一般に、活性薬剤成分（ＡＰＩ）の製剤の効力を高めるために添加する化合物または物質を言う。その例には、例えば、凍結防止剤および凍結乾燥防止剤が含まれ、これらが添加されて、噴霧−凍結乾燥プロセスまたは噴霧−凍結大気圧乾燥プロセスの間、タンパクを確実に安定させまたはタンパクの安定性を高め、その後その粉末産物の安定性および流動性を長期に確実にし、または高める。適切な防止剤は一般に、流動する微粒子固体を比較的含まず、水と接触した際に密集または重合せず、患者によって吸入されたまたは他の形で患者に導入されたときに本質的に無毒であり、生物活性を変化させる方式で治療剤とはっきりとは相互作用しない。適切な賦形剤には、それだけに限らないが、ヒトおよびウシ血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリンなどのタンパク、単糖類（ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）、二糖類（ラクトース、トレハロース、スクロースなど）、シクロデキストリン、および多糖類（ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど）を含む糖質；グルタミン酸一ナトリウム、グリシン、アラニン、アルギニンまたはヒスチジンなどのアミノ酸、および疎水性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなど）；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの賦形剤塩（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｓａｌｔ）；三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの多価アルコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；界面活性剤；ならびにそれらの組合せが含まれる。好ましい賦形剤には、例えば、トレハロース、スクロースおよびマンニトールが含まれる。他のクラスの賦形剤である粘膜付着性物質がしばしば使用されて、粘膜とＡＰＩの接触を増加させる。粘膜付着性物質の例には、例えば、キトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチン、およびペクチンが含まれる。さらに、ＡＰＩの溶解性を高める従来の共溶媒は、本明細書で開示されているＳＦＤプロセスに適した液体製剤に添加することができる。
【００５７】
一般に、粘膜付着性物質が使用されるとき、約１から９５重量％の量で使用されるが、約１から５０重量％が好ましく、約５から５０重量％が特に好ましく、約５から２０％がとりわけ好ましい。一般に、凍結防止剤は、約５重量％から約９５重量％の濃度で使用される。
【００５８】
一実施形態では、本発明の乾燥粉末は、後に充填剤または担体と組合せ、これらを使用して、患者に送達する粉末中の治療剤の濃度を低下させる；すなわち、単位投与量当たりの物質の体積は大きい方が望ましいことがある。充填剤が使用されて、分散装置内の粉末の分散性を高め、および／または粉末の取り扱い上の性質を向上させることもできる。これは、噴霧−乾燥プロセス中の充填剤または担体の使用と区別することができる。適切な充填剤は一般に（水吸収を回避する）結晶であり、適切な充填剤には、それだけに限らないが、ラクトースおよびマンニトールが含まれる。したがって、ラクトースなどの充填剤は、添加する場合に、様々な比で添加することができ、充填剤に対しての対象とする治療剤が約９９：１から約１：９９であることが好ましく、約１：５から約５：１であることがより好ましく、約１：１０から約１：２０であることが特に好ましい。
【００５９】
本発明の液体製剤は、様々な従来の手順のうちどんなものによっても、霧化することができる。例えば、その液体は、二流体ノズル、圧力ノズル、もしくは回転盤によって噴霧することができ、または超音波噴霧器もしくは振動オリフィスエアロゾル発生器（ＶＯＡＧ）で霧化することもできる。一実施形態では、液体製剤は、ＢＤ  ＡｃｃｕＳｐｒａｙ（商標）ノズルなどの圧力ノズルで霧化される。
【００６０】
好ましい実施形態では、霧化の条件は、霧化液滴（例えば、噴霧化液滴）の平均質量径が少なくとも約２０μ、好ましくは約３５μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約３００μｍ、さらにより好ましくは約５０μｍから約１００μｍとなるように最適化される。所望のサイズの液滴生成を最適化する方法は、従来のものである。変更することができる条件の中には、霧化気体流、霧化気体圧、液体流速などがある。また、ノズルの型およびサイズを変更することもできる。液滴サイズは、レーザー回折など従来技術を用いて容易に測定することができる。乾燥粒子のサイズは、例えば、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）またはレーザー回折などの従来技術によって測定することができる。
【００６１】
凍結し霧化した粒子がおよそ大気圧で乾燥される一実施形態では、本明細書の他の場所で論じているように、霧化液滴のサイズは、例えば、少なくとも約２０μｍ、好ましくは約２０μｍから約３００μｍ、より好ましくは約３５μｍから約１００μｍまたは約５０μｍから約１００μｍとすることができる。
【００６２】
液体製剤を霧化した後、液滴は急速に凍結されて、固体粒子を形成する。好ましくは、液滴は、霧化ステップの後、直ちにまたは実質的に直ちに凍結される。
【００６３】
一実施形態では、液滴は、そこから霧化液滴が形成された、液体製剤の凝固点より低い低温液体中に液滴を浸すことによって、凍結される。好ましい実施形態では、その低温の液体の温度は約−２００℃から−８０℃であり、より好ましくは約−２００℃から−１００℃であり、最も好ましくは約−２００℃（液体窒素は約−１９６℃）である。当技術分野で周知の、液体窒素、アルゴンおよびハイドロフルオロエーテル、または圧縮流体ＣＯ2、ヘリウム、プロパンもしくはエタンなどの圧縮液体、または同等な不活性液体を含めて、どんな適切な低温液体を使用することもできる。例えば、一実施形態では、炭疽用組成物の液体製剤は、例えば液体窒素などの適切な低温液体を含む容器の上部に位置する噴霧ノズルによって、霧化される。液滴は、低温液体との接触に際して瞬時に凍結する。
【００６４】
他の実施形態では、液滴は、冷却チャンバーの中で、液滴の凝固点より低い気体（例えば低温空気、窒素、ヘリウムまたはアルゴン）に通過させることによって、凍結される。好ましい実施形態では、その低温ガスは約−５℃から−６０℃であり、より好ましくは約−２０℃から−４０℃である。ガスは、冷却コイル、熱交換器または冷却コンデンサー（ｃｈｉｌｌｅｒ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）など、従来の方法で冷却することができる。気体の温度は、従来の手順で、例えば、液体窒素、固体二酸化炭素、または凝固点より低い温度を作り出す同等な低温剤で低下させることができる。
【００６５】
固体凍結粒子の処方後、その粒子は乾燥されて粉末を作製する。「乾燥させる」とは、ごく少量の液体を有すること、例えば、粒子が容易に分散して、例えば吸入装置中でエアロゾルを形成するような含水率を有することを意味する。この含水率は、一般に約１５水重量％未満であるが、約１０％未満であることが好ましく、約１％から約５％であることが特に好ましい。
【００６６】
本発明の一実施形態では、凍結液滴は、従来の凍結乾燥装置を用いて、凍結乾燥（真空下で凍結し乾燥させる）によって乾燥される。この方法は、一般に、「噴霧−凍結−乾燥」またはＳＦＤ法と呼ばれ、その方法によって作製された組成物は、「噴霧−凍結−乾燥」またはＳＦＤ組成物と呼ばれる。例えば、一実施形態では、粒子が、液体窒素を含む（Ｖｉｒｔｉｓ凍結−乾燥用フラスコなどの）容器中へと粒子を噴霧することによって凍結されたとき、次いでその容器は、従来の凍結乾燥器に取り付けられ、過剰な液体窒素を蒸発させることができる。凍結エアロゾルは、典型的には、４８時間以内に乾燥され、含水量約１重量％未満に到達させる。あるいは、低温空気中でおよそ大気圧で凍結した液滴、場合によっては（下記で論じるように）およそ大気圧で部分的に乾燥させた液滴は、次いで凍結乾燥用フラスコに入れ、凍結乾燥を施すことができる。
【００６７】
他の実施形態では、凍結液滴は、およそ大気圧での低温乾燥気体（例えば、空気、窒素またはヘリウム）流中における昇華によって、乾燥される。「およそ大気圧」とは、本明細書において約１．５気圧から約５気圧の圧を意味する。気体の温度は、任意の様々な従来の手順により、例えば、液体窒素、固体二酸化炭素、または同等な低温剤により低下させることができる。このような方式で乾燥させる本発明の粒子は、本明細書において「噴霧−凍結−大気圧乾燥」粒子と呼ばれることがある。好ましい実施形態では、霧化液滴は、同じ「噴霧−凍結−大気圧乾燥」チャンバー内で凍結し乾燥され、それによって単一ステップで凍結し乾燥させる手順を実施することが可能となる。
【００６８】
およそ大気圧で低温空気中で固体凍結粒子を乾燥させるための一装置および方法が、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒの特許文献８に開示されている。特許文献６および７の実施例も参照されたい。当業者なら理解されるであろうが、他の型の従来の装置を使用することもできる。
【００６９】
好ましい実施形態では、凍結霧化粒子は、粒子の流体化を促進する条件の存在下で、およそ大気圧で低温気体中で乾燥される。最も好ましい実施形態では、凍結霧化粒子は、乾燥プロセス中に、振動物、内蔵物、機械的撹拌物またはその組合せの存在下で乾燥される。本明細書において「内蔵物」という用語は、チャンバー（例えば、ＳＦＤチャンバー）の内側の任意の物理的障害物、または例えばブレード、プレートもしくは他の障害物などの流動層を指す。そのような処理により、粒子が流体化状態となることが可能となり、それはチャネリング（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）を防止する助けとなる。
【００７０】
他の実施形態では、上記に記載のように、凍結液滴は、およそ大気圧での低温乾燥気体（例えば、空気）流中における昇華と、凍結乾燥の組合せにより、乾燥される。例えば、およそ大気圧で部分的に乾燥させた組成物（例えば、それによって望ましくない量の液体を依然として含んでいる塊または粉末となるもの）は、凍結乾燥器へと移され、その中でその組成物はさらに乾燥される。
【００７１】
従来の方法が使用されて、乾燥組成物を収集することができる。一実施形態では、乾燥粒子はフィルター上で収集され、そこからその粒子を移して、例えば医療上の用途に使用することができる。他の実施形態では、噴霧−凍結大気圧乾燥粒子は、産物用容器中で収集される。部分的に乾燥した粒子は、結合のゆるい塊を形成することがあるが、それから、残存する水分は低温乾燥空気流中におけるさらなる大気圧昇華によって除去することもでき、場合によっては、粒子は凍結乾燥器または他の適切な装置へと移され、低圧下（大気圧未満）でさらに乾燥させることもできる。
【００７２】
上記のどんな方法によって乾燥した粒子も、実質的に同様の特性（例えば、粒子サイズ、多孔性など）を示す。
【００７３】
乾燥の手順の後、本発明の組成物は、流動しやすい粉末の形態にすることができる。この組成物の乾燥多孔粒子は、乾燥前の凍結液滴とサイズ（幾何的直径）および形状が大体同じである。
【００７４】
望ましい空気力学的特性を示す本発明の乾燥粒子は、（ＳＥＭによって示される）望ましい形態および望ましい密度を示す。さらに、その粒子は、その使用後に送達装置に残っている残存粉末が低量を示し、例えば液体インスリン製剤より高安定性を示し、液体に再構成することが容易である。
【００７５】
本発明の一態様は、それを必要とする患者を処置する方法であって、本発明の方法によって作製された免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）の有効量を患者に投与するステップを含む方法である。本明細書において「有効量」とは、所望の応答を引き出すのに有効な量を意味する。例えば、免疫原性組成物の有効量とは、検出可能な免疫応答を引き出すのに有効な量である。有効投与量は、従来の手順に従って、患者の年齢、体重および／または臨床状態、投与の方法および計画など周知のファクターを考慮して、経験的に決定することができる。本明細書で開示されている他の方法に関しては、患者は、任意の動物、好ましくは、例えば飼育動物（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）もしくは他の家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、またはラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなど、好ましくはヒトなどの哺乳動物とすることができる。
【００７６】
本発明の組成物は、呼吸による経路、好ましくは鼻内経路を含めて、当業者に知られている様々な経路のうちどんなものによっても、投与することができる。一実施形態では、組成物は、鼻道および鼻の粘膜組織などの粘膜組織に投与される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、呼吸器系を介して、それを必要とする患者に投与される。本明細書において「呼吸器系による投与」または「呼吸による投与」とは、作用剤が鼻（鼻内）に、または肺に（肺投与）投与されることを意味する。
【００７７】
従来の投与方法が使用できる。適切なアプリケータ（例えば、吸入器）は、当技術分野で知られている。典型的な送達装置には、それだけに限らないが、特許文献２（６／１２／０１出願）および特許文献３（１／１２／０１出願）で開示されている装置が含まれる。好ましい実施形態では、鼻投与に使用する装置は、「Ｓｏｌｏｖｅｎｔ」装置である。投与すべき量は、当業者に知られている従来の手順によって、決定することができる。例えば、非特許文献１２を参照されたい。考慮すべきファクターには、関与する特定の作用剤の活性、作用剤の代謝安定性および作用時間、投与の方法および時間、薬剤の組合せ、排出率、処置する動物種、ならびに治療を受ける受容者の齢数、体重、一般健康状態、性、食物、および特定の疾患状態の重症度が含まれる。有効な免疫応答を引き出すための投与量（例えば、有効な予防接種のための投与量）は、当業者に周知である。
【００７８】
本発明にはまた、本発明の免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）の有効量を含む、単位投与量容器または乾燥粉末吸入器が含まれる。
【００７９】
本発明の組成物は、液体製剤より高い治療効果を鼻内投与後に実現することができる。例えば、実施例１１を参照されたい。したがって、本発明には、それを必要とする患者に鼻内投与した後に有効な結果をもたらすのに必要な免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）の量を減らす方法が含まれ、その方法は、本発明の免疫原性炭疽用組成物の有効量を前記患者に鼻内投与するステップを含む。
【００８０】
本発明にはさらに、患者における免疫応答を引き出す（誘発する）方法が含まれ、その方法は、本発明の免疫原性炭疽用組成物（例えば、炭疽ワクチン）の有効量を患者に投与するステップを含む。本明細書において「免疫応答」という用語は、例えば、多細胞生物が、その生物の細胞または細胞外液に進入する抗原性物質に対して抗体を産生する機構を包含する。そのように産生された抗体は、イムノグロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかに属することができる。他の型の応答、例えば、細胞障害性Ｔ細胞の誘導などの細胞性免疫も含まれる。抗原に対する免疫応答はよく研究されており、広く報告されている。免疫学の調査は、例えば、非特許文献１３で与えられる。免疫学における方法は、日常的であり、従来のものである（例えば、非特許文献１４を参照）。
【００８１】
一態様では、本発明は、炭疽ワクチン（炭疽による将来の感染に対して防御がなされるように生命体の免疫系を刺激するのに使用するワクチン）に関する。すなわち、ワクチンによって、炭疽感染によって引き起こされる少なくともいくつかの症状を回復させることができる。本明細書に記載の送達用足場および送達方法はまた、炭疽ＰＡをコードする核酸を導入する遺伝子治療の方法にも適用可能であるはずである。
【００８２】
吸入による炭疽は体内に入り、鼻粘膜を介してその病態生理学的作用を及ぼす。感染に対する防御は、局所で産生された粘膜ＩｇＡで感染性因子を中和することにより、進入する最初の部位でもたらすことができる。全身性免疫応答は古典的な免疫感作経路（ＩＭ、ＩＤなど）によって引き出すことが容易であるが、粘膜応答は一般に実現することがより困難である。乾燥粉末ワクチンの鼻内（ＩＮ）送達の利点は、全身性免疫応答も粘膜免疫応答も引き出すことができるその能力にある。さらに、粘膜の粉末薬剤の取り込みが有効であるので、ＩＮ粉末ワクチン送達によって必要な投与量を減らすことができる。
【００８３】
中空微小針（ＨＭＮ）または充実微小針（ＳＭＮ）を使用する皮内（ＩＤ）送達の方法
一態様では、本発明では、「中空」と「充実」のどちらの「微小針」も使用して、炭疽ｒＰＡワクチンを皮膚に投与する。本発明によれば、「中空」の微小針は、再現性のある皮内（ＩＤ）送達を可能にする小さな微小突起である。そのような微小針構造物および適切な流体駆動（ｆｌｕｉｄ−ｄｒｉｖｉｎｇ）機構からなる装置は、当技術分野で知られている。適切な「中空」の微小針構造物および流体駆動機構は、２００１年１２月２８日出願の特許文献９、２００２年７月１日出願の特許文献１０、および特許文献１１に記載され、これらは参照により本明細書に組み込む。
【００８４】
中空微小針（ＨＭＮ）を用いる送達により、哺乳動物の皮膚内にある皮内空間への送達が可能となる。免疫原性炭疽用組成物は、例えば、露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する小さなゲージの中空針によって投与でき、前記出口は、物質の送達が深さ０．３ｍｍから２ｍｍで行われるように、深さ０．３ｍｍから２ｍｍまで皮膚に挿入することができる。本発明の方法を用いると、有効量は、筋内注射により投与して防御免疫などの免疫学的作用を実現するのに必要な量より少いことが判明している。
【００８５】
本発明の利点の１つは、免疫原性が増強されたＩＤ投与により、より少量の免疫原性組成物を使用して、同等な生物学的効果が可能となることである。このことから、製造業者およびおそらく消費者に対して、特に高価なワクチン製剤に関する直接の経済的利益が生じる。同様に、免疫原性が高いことにより、総投与量を低下させ、大量投与に伴う患者の副作用を減少させることができる。
【００８６】
解剖学的に、身体の外側表面は、外側の上皮と下にある真皮という２つの主要な組織層からなり、その２つが一緒になって皮膚を構成する（総説については、非特許文献１５を参照）。上皮は、５層（ｌａｙｅｒｓまたはｓｔｒａｔａ）にさらに分かれ、全体の厚さは７５から１５０μｍである。上皮の下に真皮があり、これは、真皮乳頭層と呼ばれる最も外側の部分と真皮網状層と呼ばれるより深い層の２つの層を含む。真皮乳頭層は、広範な微小循環血液およびリンパ管叢を含む。それに対して、真皮網状層は、比較的細胞および血管がなく、密な膠原性および弾性結合組織からなる。上皮と真皮の下には、皮下組織があり、これは下皮とも呼ばれ、結合組織と脂肪組織から構成される。筋組織は、皮下組織の下にある。
【００８７】
皮膚の厚さは、個体間でも、いずれの個体における身体上の異なる位置間でも様々であることが当業者に理解されている。したがって、投与する位置に応じてＩＤ空間に標的を定めるのに必要な送達の深さは様々となる。
【００８８】
本発明の皮内送達の対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。トレーサー試薬を含むまたは含まない、生物学的に活性のある試薬は、通常長さが約３００μｍから約５ｍｍの針またはカニューレによって、皮内空間に送達することができる。好ましくは、その針またはカニューレは、長さが約３００μｍから約１ｍｍであり、その出口は深さ１ｍｍから３ｍｍまで対象の皮膚に挿入される。好ましくは、３０から３６ゲージの、好ましくは３１から３４ゲージの小さなゲージの針またはカニューレが使用される。その針またはカニューレの出口は、好ましくは深さ０．３ｍｍ（３００μｍ）から１．５ｍｍまで挿入される。
【００８９】
免疫原性炭疽用組成物は注入することもでき、好ましくはボーラスとして投与することもできる。本明細書において、「ボーラス」という用語は、１０分未満の時間内に送達される量を意味するものとする。「注入」とは、１０分より長い時間にわたる物質の送達を意味するものとする。ボーラス投与または送達は、速度制御手段、例えばポンプを用いて、または特定の速度制御手段を用いずに、例えば使用者の自己注射で、実施することができることが理解される。
【００９０】
好ましい一実施形態では、免疫原性炭疽用組成物は、露出部の高さが０から１ｍｍである出口を有する少なくとも１本の小さなゲージの中空針によって投与され、前記出口はその組成物の送達が深さ０．３ｍｍから２ｍｍで行われるように、深さ０．３ｍｍから２ｍｍまで皮膚に挿入される。
【００９１】
本明細書において、「皮内送達」とは、皮内空間およびその近傍（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）への物質の送達を意味し、特許文献１１（優先日が２０００年６月２９日である特許文献１２）にＰｅｔｔｉｓらにより記載されている。
【００９２】
特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、熟練しているおよび熟練していない医療従事者がそれぞれ試みて皮膚の空間に到達することが可能な装置によって送達される。微小カニューレおよび微小針を基礎とする方法および装置は、２０００年６月２９日出願の特許文献１３に記載されている。標準的な鋼製カニューレは、１９９９年１０月１４日出願の特許文献１４に記載の装置および方法を使用する皮内送達に使用することもできる。これらの方法および装置には、進入の深さを制限した（典型的には１０μｍから２ｍｍの）細いゲージの（３０ゲージまたはそれより細い）「微小カニューレ」による物質の送達が含まれ、その深さは、深さを制限するハブの特徴的部分を越えて露出しているカニューレ全体の長さまたはカニューレ全体の長さによって定義される。好ましい一実施形態では、微小針は、送達装置中に構成され、この装置は微小針を皮膚表面に対して垂直に位置させる。
【００９３】
本明細書において「従来の送達」とは、筋内送達によるものと同規模またはそれより弱い免疫応答を誘発するのに考えられてきたまたは考えられている、どんな物質をも送達するためのいかなる方法をも意味する。従来の送達には、Ｇｒｏｓｓの特許文献１５に記載のものなどの、皮下の、イオン泳動による、および皮内の送達方法が含まれ得る。
【００９４】
本発明によれば、「充実」微小針（ＳＭＮ）は、角質層を擦過してワクチンを上皮組織に接触させるのに使用する小さな微小突起である。その微小突起は、「擦過表面」の一部であり、適切な土台および取手と一緒に「微小増強器（ｍｉｃｒｏｅｎｈａｎｃｅｒ）」または「微小擦過器」装置を構成する。この装置は、典型的には、皮膚への局所ワクチン送達に関して使用される。好ましくは、本発明で用いる装置は、角質層に進入するが、それを突き抜けない。本発明の方法を使用して投与する物質は、擦過の前、擦過と同時に、または擦過の後に皮膚に塗布することができる。適切な擦過表面、土台および取手からなる装置は、本明細書においてＳＭＮ装置と呼ばれる。そのような適切な装置は、当技術分野で知られており、例えば、１９９９年９月２４日出願の特許文献１６、２０００年５月２２日出願の特許文献１７、２００１年１０月１２日出願の特許文献１８、および２００２年１０月２９日出願の特許文献１９に記載されている。
【００９５】
ワクチンまたは他の物質を送達するＳＭＮ法には、患者の外側の皮膚層または図１Ｂに見られる微小擦過器２を薬剤または他の物質で被覆するステップと、微小擦過器２を患者の皮膚に対して動かして、患者の生きている上皮に物質を入れるのに十分な溝を残す擦過を行うステップが含まれる。微小擦過器２の構造上の設計のために、微小擦過器２の先端が最初に患者の皮膚を引き伸ばし、次いで微小擦過器２の最上部の表面が外側の保護皮膚層を擦過し、角質層を開き、それによって薬剤または他の物質が患者に入ることが可能となる。外側の保護皮膚層の最初の擦過の後、微小擦過器２の後縁および先端は、擦過した領域の表面をこすり、擦過した皮膚領域に薬剤または物質を入り込ませ、それによってその薬剤効果を向上させることができる。
【００９６】
図１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示すように、微小擦過器２には、土台４が含まれ、その上に擦過表面５を取り付けることができる。あるいは、擦過表面は土台と一体化され、２つの構成部品からなる単一の部分として作ってもよい。好ましくは、土台４は充実性の成型品である。一実施形態では、土台４はマッシュルーム様の王冠部４ｂで構成され、それは上方へと曲線を描き、最上部で切断されている。土台４の最上部は通常平らであり、擦過表面５がその上に取り付けられまたはそれと一体化されている。あるいは、切断されている最上部は、擦過表面５を受容するための凹部を有してもよい。すべての実施形態では、擦過表面５には、切断されている最上部の上で伸びている微小突起アレイの足場が含まれる。微小擦過器の他の実施形態では、取手、土台および擦過表面は、互いに一体化され、３つの構成部品からなる単一装置として作ってもよい。
【００９７】
微小擦過器２は、擦過表面５が対象の外側の保護的な皮膚または角質層を開くことができるのに十分な圧で、対象の皮膚に対して動かすことによって対象に適用される。土台にかかる内圧により、微小擦過器２が対象の皮膚へと押し付けられる。したがって、傾斜しているマッシュルーム様の王冠部４ｂの高さが、微小擦過器２が使用されたときに、塗布した物質が切子面（ｆａｃｅｔ）４ｃ上へと流れ出すことを防止するのに十分であることが好ましい。下記に説明するが、擦過表面５は微小突起アレイを含む。
【００９８】
取手６は、土台４に取り付けられ、または土台４と一体化してもよい。図２Ａに示すように、取手の上端６ａは、土台４の内側環状側壁４ａの間で、スナップ式に嵌め込んでもよく、摩擦により嵌め込んでもよい。あるいは、図１Ａおよび２Ａに示すように、取手６は、土台４の下側４ｃに（例えば、エポキシ樹脂で）接着してもよい。あるいは、取手と土台は、２つの構成部品からなる単一部分として一緒にして（例えば、射出成型してもよい）作ってもよい。この取手は、土台の直径より小さい直径でもよく、土台と同様の直径でもよい。土台４の下側４ｃは、マッシュルーム様の王冠部４ｂと同じ高さでもよく、マッシュルーム様の王冠部を越えて伸びていてもよい。取手６の下端６ｂは、取手６の柄６ｃより大きくてもよく、または柄と同様の直径でもよい。下端６ｂは陥凹部（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）６ｄを含んでもよく、その陥凹部６ｄは物質を投与し微小擦過器２を動かす者の親指掛けとして使用する。さらに、突起８は、取手６の外側に形成され、それを患者の皮膚に対して動かすときに使用者が取手６をしっかりと握る際の助けとなる。
【００９９】
図２Ｂ中の図１Ｂの断面に示すように、下端６ｂは円筒形でもよい。微小擦過器２は、図２Ａに示すように、透明な物質から作製してもよい。陥凹部６ｄは、円筒形の下端６ｂの両側に配置されて、微小擦過器２を使用する者がそれを握る助けとなる。すなわち、微小擦過器２の動きは、手または指によってもたらすことができる。微小擦過器の取手６、および土台４は、好ましくは樹脂などの物質から成型する。微小擦過器２は、微小擦過器および擦過表面全体が１患者のその使用後に処分できるように安価に製造することが好ましい。
【０１００】
擦過表面５は、微小擦過器２が患者の皮膚に対して動かされるときに生じた擦過が角質層に入り込むように設計される。擦過表面５は、患者の生きている上皮に送達されることが所望される薬剤または物質で被覆してもよい。
【０１０１】
所望の擦過を実現するために、微小擦過器２が患者の皮膚に対して少なくとも１回は動かされるべきである。患者の皮膚は、交互の方向で擦過してもよい。本発明による微小擦過器の構造上の設計により、薬剤または物質がより有効に吸収されることが可能となり、それによって、患者に塗布されるまたは擦過表面５を被覆する薬剤または物質を少なくすることができる。
【０１０２】
擦過表面５は、患者に送達されることが所望される物質で被覆してもよい。一実施形態では、その物質は、擦過表面５上につける粉末でもよい。他の実施形態では、送達すべき物質は、患者の皮膚に微小擦過器２を適用し動かす前に、患者の皮膚に直接塗布してもよい。
【０１０３】
図３を参照すると、本発明の微小擦過器装置１０には、実質的に平らな本体または擦過表面支持体１２が含まれ、その支持体は、その底部の表面から伸びている複数の微小突起１４を有する。その支持体は一般に、その表面を微小擦過器装置の土台に取り付けるのに十分な厚さを有し、それによって、図１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示すようにその装置の取り扱いが容易となる。あるいは、異なる取手またはグリップ装置（ｇｒｉｐｐｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）は、擦過表面支持体１２の最上部の表面に取り付けることもでき、またはそれと一体化することもできる。擦過表面支持体１２の寸法は、微小突起の長さ、所与の領域中の微小突起の数、および患者に投与すべき物質の量に応じて変えることができる。典型的には、擦過表面支持体１２は、約１から４ｃｍ2の表面領域を有する。好ましい実施形態では、擦過表面支持体１２は、約１ｃｍ2の表面領域を有する。
【０１０４】
図３、４、４Ａおよび５に示すように、微小突起１４は、擦過表面支持体１２の表面から突き出ており、擦過表面支持体１２の面に対して実質的に垂直である。図示した実施形態中の微小突起は、複数の行および列に配置され、好ましくは、均一な距離でその間隔が空いている。微小突起１４は一般に、角錐状であり、側面１６が先端１８へと伸びている。示されている側面１６は、断面でみたときに一般に凹面形状を有し、擦過表面支持体１２から先端１８まで伸びている湾曲した表面を形成する。図示した実施形態では、微小突起は、実質的に同じ形状および寸法の４つの側面１６によって形成される。図４Ａおよび５に示すように、微小突起１４の各側面１６は、近接した側面と接触している向かい合った側縁を有し、擦過表面支持体１２から外側へ伸びている、擦過縁（ｓｃｒａｐｉｎｇ  ｅｄｇｅ）２２を形成する。擦過縁２２は一般に、側面１６の形状に対応して、三角形または台形の擦過表面を定義する。さらなる実施形態では、微小突起１４は、より少ないまたは多い側面で形成することができる。
【０１０５】
微小突起１４は、好ましくはとがっていない先端１８で終結する。一般に、先端１８は、実質的に平らであり、支持体１４に平行である。先端が平らであるとき、微小突起の全長は皮膚に進入しない；したがって、微小突起の長さは、前記微小突起が前記皮膚に進入する全体の深さより大きい。先端１８は、好ましくは、側面１６と接する場所で、はっきりした鋭い縁２０を形成する。縁２０は、擦過表面支持体１２に実質的に平行に伸びており、さらなる擦過縁を定める。さらなる実施形態では、縁２０はわずかに丸くされて、側面１６から先端１８への滑らかな移行部を形成することができる。好ましくは、その微小突起は、円錐台形状または角錐台形状である。
【０１０６】
微小擦過器装置１０および微小突起は、投与する物質に無反応性の樹脂物質から作製することができる。適切な樹脂物質の非包括的リストには、例えば、当技術分野で知られているポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエステル、およびポリカーボネートが含まれる。あるいは、微小突起は、ステンレス鋼、タングステン鋼、ニッケルの合金、モリブデン、クロム、コバルト、チタン、およびそれらの合金などの金属、またはシリコン、セラミックス、およびガラスポリマーなどの他の物質から作製することもできる。金属の微小突起は、当技術分野で知られている、シリコン・ウエハーのフォトリソグラフィーによるエッチングまたはダイヤモンド付刃粉砕機を使用するマイクロマシニングと同様の様々な技術を用いて製造することができる。微小突起は、当技術分野で知られている標準的な技術を使用する、シリコン・ウエハーのフォトリソグラフィーによるエッチングによって製造することもできる。微小突起は、例えば、２００２年７月１２日出願の特許文献２０に記載の射出成型プロセスを介して、樹脂で製造することもでき、この文献は参照により本明細書に組み込む。
【０１０７】
微小突起の長さおよび厚さは、投与する特定の物質、および装置が適用される位置での角質層の厚さに基づいて選択される。好ましくは、微小突起は、実質的に角質層を突き抜けるまたは通過することなく角質層に進入する。微小突起は、最大約５００ミクロンの長さを有することができる。適切な微小突起は、約５０から５００ミクロンの長さを有する。好ましくは、微小突起は、約５０から約３００ミクロンの長さを有し、より好ましくは約１５０から２５０ミクロンの長さを有し、１８０から２２０ミクロンの長さが最も好ましい。図示した実施形態の微小突起は、一般に角錐形状を有し、この装置の面に垂直である。これらの形状は、擦過が所望の深さで行われることを保証するという特別な利点を有する。好ましい実施形態では、微小突起は充実性の部材である。代替の実施形態では、微小突起は中空のものとすることができる。
【０１０８】
図２および５に示すように、微小突起は、好ましくは、行および列の形で均一に間隔を空けて、皮膚を接触させ、擦過の間に角質層に進入させるためのアレイを形成する。微小突起の間隔は、皮膚の表面上または皮膚の組織内に投与する物質に応じて変化させることができる。典型的には、微小突起の行は、１ミリメートル（ｍｍ）当たりに約２本から約１０本の密度となるように間隔が空いている。一般に、その行または列は、微小突起の密度が１ｍｍ2当たり約４個から約１００個となるアレイにおける微小突起の間隔と実質的に同じ距離で間隔が空いている。他の実施形態では、微小突起は、円形パターンに配置することができる。他の実施形態では、微小突起を無作為パターンに配置することができる。行および列の形に配置されるとき、微小突起の中心間の距離は、好ましくは微小突起の長さの少なくとも２倍である。好ましい一実施形態では、微小突起の中心間の距離は、微小突起の長さの２倍±１０ミクロンである。最大が微小突起の長さの３倍、４倍、５倍およびそれより大きい倍数の、より広い間隔も含まれる。さらに、上記したように、微小突起の構成は、微小突起の高さが、皮膚にその突起が進入する深さより大きくできるようなものとすることができる。
【０１０９】
円錐台状または角錐台状の微小突起の平らな上部表面は、一般に１０から１００、好ましくは３０〜７０、最も好ましくは３５〜５０ミクロンの幅である。
【０１１０】
皮膚上の送達部位を用意する方法では、患者の皮膚２８に対して微小擦過器を所望の位置に置く。微小擦過器は、皮膚に対して静かに押され、次いで皮膚の上でまたはそれに対して動かされる。微小擦過器の一動作の距離は、所望される送達領域によって定められる、送達部位の所望のサイズに応じて変化させることができる。送達部位の寸法は、意図された結果が得られるように選択され、送達する物質、および物質の形態に応じて変化させることができる。例えば、送達部位は、発疹または皮膚疾患を治療するために、広い領域を包含することができる。一般に、微小擦過器は、約２から１５センチメートル（ｃｍ）動かされる。本発明のある実施形態では、微小擦過器は、約４ｃｍ2から約３００ｃｍ2の表面領域を有する擦過部位が生じるように動かされる。
【０１１１】
次いで、微小擦過器は、皮膚から持ち上げられて擦過した領域をさらし、適切な送達装置、絆創膏（ｐａｔｃｈ）または局所製剤が擦過した領域に塗布できる。あるいは、投与する物質は、擦過の前、または擦過と同時に、皮膚の表面に塗布することもできる。
【０１１２】
角質層の擦過の程度は、動かす間にかける圧、および微小擦過器による反復回数に依存する。一実施形態では、微小擦過器は最初の通過を行った後に皮膚から持ち上げられ、実質的に同じ場所および位置の開始位置上に戻される。次いで、微小擦過器は、同じ方向に同じ距離だけ２回目に動かされる。他の実施形態では、微小擦過器は、最初の通過を行った後に皮膚から持ち上げられずに、同じ部位に対して、交互の方向に反復して動かされる。一般に、２回以上の通過が微小擦過器により行われる。
【０１１３】
本明細書に記載の、微小針が媒介する方法による送達用に炭疽用組成物を製剤する方法は、従来のものである。例えば、当業者なら、鼻内投与に関して、本明細書に記載の方法を適当な方式で使用または改変する仕方を認識するであろう。
【０１１４】
生体防御ワクチンの投与についての、本発明の送達方法の有用性を調べるために、試験が動物モデルで実施された。下記の実施例は、中空および充実微小針装置、ならびに鼻内投与を用いた送達について説明するものである。実施例１〜５は、マウス動物モデルを用いた試験について説明するものであり、中空および充実微小針装置を用いた送達と、他の送達方法を比較している。実施例６〜１１は、ウサギモデルを用いた、致死量の投与誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の試験について説明するものである。これらの実施例は、鼻内（ＩＮ）および皮内（ＩＤ）送達法が、筋内（ＩＭ）注射など従来の送達方法と比べてより優れた防御をもたらすことをはっきりと示すものである。さらに、本発明の擦過／局所投与法は、従来の局所送達法と比べてより優れた防御をもたらす。
【０１１５】
前記のおよび下記の実施例において、すべての温度は訂正せずに摂氏温度で示し、特に示さない限り、すべての割合および百分率は重量で示す。
【実施例】
【０１１６】
Ｉ．マウスモデルでの試験
実施例１−中空および充実微小針装置を用いたｒＰＡ投与試験の実験設計
製剤：液体製剤のみ
アジュバント：下記の実験群を参照
免疫感作計画：ｄ０、ｄ２１およびｄ４２でマウスを免疫感作した。
【０１１７】
抗原投与量：１回の免疫感作につきマウス１匹当たりｒＰＡ１０μｇ
動物数：総計＝１０匹／群
試料収集：第０日（「ｄ０」、出血前）、ｄ２１（免疫感作２の前）、ｄ４２（免疫感作３の前）、およびｄ５６に血液を収集した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液をｄ５６で１群当たり少なくとも５匹の動物から収集した。
【０１１８】
投与誘発：なし
アッセイ：ｒＰＡ特異的な総Ｉｇについて、当技術分野の標準的な方法を用いて、ＥＬＩＳＡにより個々のマウスの血清を分析した。さらに、ｒＰＡ特異的なＩｇアイソタイプのプロファイル（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ）について、サブアイソタイピング（ｓｕｂ−ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）キットアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国テキサス州モンゴメリー）を用いて群の貯留した血清を分析した。ｒＰＡ特異的な総ＩｇおよびＩｇＡについて、個々のマウスのＢＡＬ液を分析した。予防接種した動物または対照動物の血清の希釈物を、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する、溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）とともにインキュベートした単球細胞培養物に添加することによって、炭疽の中和について測定した。このアッセイは、炭疽疾患に対する防御にｉｎ  ｖｉｔｒｏで相関するものの代表となる。細胞内ＡＴＰを測定することによって、細胞の生存率を決定した。
【０１１９】
実験群：
群１：ＩＭ−アルム*
群２：ＩＮ（液体点滴注入）−アジュバントなし
群３：ＩＮ（液体点滴注入）−ＣｐＧ**  群４：ＩＤ（ＨＭＮ）−アジュバントなし
群５：ＩＤ（ＨＭＮ）−アルム
群６：ＩＤ（ＨＭＮ）−ＣｐＧ
群７：ＳＭＮ（プロトコル１＝「擦過前」）−アジュバントなし
群８：ＳＭＮ（プロトコル１＝「擦過前」）−アルム
群９：ＳＭＮ（プロトコル１＝「擦過前」）−ＣｐＧ
群１０：ＳＭＮ（プロトコル２＝「液滴を介する擦過」）−アジュバントなし
群１１：ＳＭＮ（プロトコル２＝「液滴を介する擦過」）−アルム
群１２：ＳＭＮ（プロトコル２＝「液滴を介する擦過」）−ＣｐＧ
群１３：局所−アジュバントなし
群１４：局所−アルム
群１５：局所−ＣｐＧ
*Ａｌヒドロゲル（２％ＡＬ（ＯＨ）3；Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）
**ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；Ｐｒｏｌｉｇｏ、ＬＬＣ）、マウス１匹当たり１０μｇ
最近開発された候補炭疽ワクチンは、組換えにより作製した防御抗原（ｒＰＡ）に基づいている（非特許文献１および２）。このワクチンは、効力が向上し、したがって追加免疫投与の必要回数が少なくなり、また安全面も向上する潜在的可能性があるため、ＡＶＡの代替としてＵＳＡＭＲＩＩＤによって検討されている。防御に最も有効な送達経路を決定し、アジュバントを潜在的に必要とする可能性をさらに解明するために、さらなる前臨床および臨床試験が必要である。下記に示す実施例でこのワクチンを使用した。
【０１２０】
ＨＭＮの試験では、中空の、１ｍｍ、３４ゲージのステンレス鋼針をカテーテル管の短い部分に取り付け、それを注射器に順に取り付けた。マントー（Ｍａｎｔｏｕｘ）式の注射の形で、マウスへの注射液を皮膚表面に本質的に平行に挿入した。
【０１２１】
ＳＭＮの試験では、装置は、図１〜５に示すように、手持ち式のアプリケータ上に樹脂製の擦過表面を備え、擦過表面は、図４に示すように、高さが２００ミクロンの樹脂製の円錐台状微小突起からなっていた。図１および２に描くように、擦過表面を微小擦過器装置上に嵌め込んだ。この擦過器および類似する擦過器を作製する技術は、当業者に知られている。
【０１２２】
各適用部位で、約１．５ｃｍ2の範囲が擦過されるように、マウスの体毛をそった皮膚に合計６回通過を行った。あるＳＭＮ実験では、皮膚を擦過し、ワクチンを塗布したが（「ｐｒｅ」）、他の実験では、ワクチンを塗布し、皮膚を直ちに液滴を介して擦過した（「ａｂｒ」）。
【０１２３】
すべての実験について、特に示さない限り、５０μｌ量を２回の注射または２箇所の擦過部位に分割した。
【０１２４】
標準的な方法で、標準的な３０ゲージ針を用いて１つの部位にＩＭ注射を行った。従来のＧｉｌｓｏｎピペッター（Ｇｉｌｓｏｎ、米国ウィスコンシン州、ミドルトン）を用いて３０μｌ（各鼻孔当たり１５μｌ）を液体点滴注入することにより、鼻内投与を行った。局所投与では、体毛をそった皮膚にワクチンを塗布した。
【０１２５】
実施例２−ＰＡ特異的血清抗体反応（総Ｉｇ）
下記の表１は、免疫感作後、すなわちワクチンの単回投与後ｄ２１における個々のマウス（１群当たりｎ＝１０）についての炭疽ｒＰＡ特異的血清抗体価（１／血清希釈度）を示す。血清陽性反応は、太字で示す。
【０１２６】
【表１−１】
2006517913.tif 000002
【０１２７】
【表１−２】
2006517913.tif 000003
【０１２８】
この結果は、ＨＭＮに基づくＩＤ送達後に、血清抗体価が最も強く、総反応率が最も高く観察されたことを示すものである。現在の炭疽ワクチンは、アジュバントとしてアルムを含み、ＩＭまたはＳＣで投与する。アジュバント不在下でＩＤで免疫感作させた動物で反応率が６０％であった（群４）ことと比較すると、ＩＭ−アルム群では反応率が２０％しかなかった（群１）。ＩＤ群の反応率は、アジュバントとしてアルム（８０％；群５）またはＣｐＧ（９０％；群６）を添加することによってさらに高くなった。
【０１２９】
ＳＭＮに基づく送達により、従来のＩＭ−アルムの投与法によって誘発されたものと同規模の抗体反応および反応率（最大で３０％；群８および９）で刺激された。さらに、微小擦過装置を用いずにｒＰＡを局所投与したマウス全３０匹では、明らかに陽性反応を示したマウスは１匹のみであった（群１３〜１５）ので、ＳＭＮ装置による局所送達は可能であった。
【０１３０】
ＩＮ送達では、ワクチンの単回投与後に陽性抗体反応は生じなかった。
【０１３１】
全体的に、この結果から、従来のＩＭ−アルムのワクチン投与法と比較して、ＨＭＮに基づく炭疽ｒＰＡのＩＤ送達では、アジュバントの必要性が克服され、血清抗体反応レベルおよび反応率が上昇することが示唆される。さらにこの結果から、ＳＭＮに基づく皮膚への局所投与によって抗体反応が誘発され、その反応が、従来のＩＭ−アルムの投与法によって誘発されたものと少なくとも同程度強いことが示唆される。
【０１３２】
下記の表２および３は、ワクチンをそれぞれ２回および３回投与した後の炭疽ｒＰＡ特異的血清抗体価（１／血清希釈度）を示す。どんな特定の送達方法またはアジュバントにも関係しない麻酔関連の死亡がいくつかの動物で生じ、それを下記の表に示す。
【０１３３】
【表２−１】
2006517913.tif 000004
【０１３４】
【表２−２】
2006517913.tif 000005
【０１３５】
【表３−１】
2006517913.tif 000006
【０１３６】
【表３−２】
2006517913.tif 000007
【０１３７】
表２および３に示す結果から、すべての群において、ｒＰＡワクチンの第２回および第３回の投与に際してかなりの追加免疫効果があることが実証される。試験の終了時に（ｄ５６）、ＩＤ−ＨＭＮの群で全体の平均血清抗体価が最も強く観察された（群４の平均抗体価＝７８，２８０；群５の平均抗体価＝２０４，８００；群６の平均抗体価＝１３８，２８０）。すべての場合において、平均のＩＤ誘発抗体価は、ｒＰＡ＋アルムのＩＭ注射という従来の投与法を介して実現される、対応する抗体価（群１の平均抗体価＝５４，４００）より強かった。したがって、上記したように、ＨＭＮに基づくＩＤ送達で、ＩＭ−アルムの従来の投与法を介するより強い血清抗体反応が誘発され、アジュバントの必要性が低くなるまたはなくなる。
【０１３８】
さらにこの結果から、ＳＭＮにより、ＩＭ−アルムの従来の投与法を介して誘発されるものに匹敵するまたはそれを上回る規模の抗体反応が誘発されることが示唆される。ｄ５６で、ＩＭ−アルムの群（群１）の平均抗体価が５４，４００であったことと比べて、ＳＭＮ誘発平均抗体価は３０，７２０（群７）から７１，６８０（群９）であった。したがって、ＳＭＮ送達でも、アジュバントの必要性が低くなりまたはなくなり、またアジュバントの存在下では、従来の針に基づく注射を用いなくてもＩＭ注射によって誘発されるものと少なくとも同程度に強い免疫応答が誘発される。
【０１３９】
さらに、この結果から、炭疽ｒＰＡのＩＮ送達には、有意な免疫応答および１００％の血清変換を誘発するために、アジュバント、この場合ＣｐＧの使用が必要であることが示唆される。しかしながら、アジュバントを添加した際に、従来の針に基づく注射を用いなくてもＩＭ注射を介するのと同様であるがそれよりわずかに弱い抗体反応が生じる（ｄ５６での群３の平均抗体価＝３６，４８０）。
【０１４０】
実施例３−ＰＡ特異的血清抗体反応（Ｉｇアイソタイプ）
免疫応答についてさらに特徴付けるために、Ｉｇアイソタイプのプロファイルについて、上記の実施例１に示す実験群のｄ５６での血清をさらに調べた。異なるアイソタイプは、異なる免疫機能に関与する；例えば、ＩｇＧは補体を固定しＦｃ受容体と結合し、ＩｇＥはアレルギー反応に関与し、ＩｇＡは粘膜免疫応答に関与する。ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、産生する特定のサイトカインに基づいて２つのサブセットに分けることができる；「Ｔｈ１」細胞は、細胞性免疫応答に重要な炎症誘発性サイトカインのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生するが、「Ｔｈ２」細胞は、液性免疫応答に重要なＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生する。Ｔｈ１とＴｈ２のどちらのサイトカインもＩｇＧアイソタイプスイッチングに影響を及ぼす；「Ｔｈ１」サイトカインは、ＩｇＧ２ａの産生を促進するが、「Ｔｈ２」サイトカインはＩｇＧ１の産生を促進する。したがって、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比は、所与のワクチンによって誘発されたヘルパーＴ細胞応答の型を示唆するものである。図６Ａ〜６Ｆは、実施例１に示す実験群における様々なアイソタイプのｒＰＡ特異的抗体のｄ５６での血清濃度を示す。
【０１４１】
図６に示す結果は、すべての群で産生された抗体の大部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂからなっていたことを示すものである。血清中に存在するＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥアイソタイプの抗体は、非常に少量であった、または検出できなかった。したがって、本明細書に記載の新規な方法および装置により、従来のＩＭ注射を介して生じるものと組成において類似する抗体反応が誘発される。特に、本明細書に記載の新規な方法および装置は、アレルギーのＩｇＥ型反応の誘発を促進しなかった。
【０１４２】
下記の表４は、実施例１に示す実験群のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を示す。アジュバントなしで、またはアジュバントとしてアルムを用いてｒＰＡを投与した群では、ＩｇＧ反応は、ｒＰＡ＋ＣｐＧで免疫感作させた対応する群より高いＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を示した。全体的に、本明細書に記載の新規な方法および装置は、これらの型のアジュバントについて予想されるようなＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比を誘発するように思われた。しかしながら、ＩＮの群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比は、一般に他の群が示すものより低く、このことから、ＩＮ送達後のＴｈ１活性が他の経路を介して生じるより高いことが示唆される。
【０１４３】
【表４】
2006517913.tif 000008
【０１４４】
実施例４−ＢＡＬ中のＰＡ特異的抗体反応（総Ｉｇ）
ＢＡＬ中に存在する炭疽特異的抗体は、吸入形式の疾患に対する第一線の防御をもたらす。実施例１に記載の実験の終了時に、ＢＡＬ試料を１群当たり５〜１０匹のマウスから収集し、ＰＡ特異的抗体についてＥＬＩＳＡによって分析した。ＰＡ特異的抗体価（１／ＢＡＬ希釈度）を下記の表５に示す。
【０１４５】
【表５−１】
2006517913.tif 000009
【０１４６】
【表５−２】
2006517913.tif 000010
【０１４７】
表５に示す結果から、ＨＭＮおよびＳＭＮに基づく、炭疽ｒＰＡワクチンの送達により、ＢＡＬ液中にかなり高いレベルのＰＡ特異的抗体が誘発されることが示唆される。血清抗体価の場合と同様に、ＩＭ注射後の群の平均抗体価が５１であった（群１）ことと比べて、ＨＭＮに基づく送達では、ＢＡＬ中の総抗体価が最も強く、個々のマウスは１１５と高い群の平均抗体価で反応した（群５）。特に、アジュバントを添加しなくても、ＨＭＮを介して免疫感作させた動物でＢＡＬ中にかなり高い抗体価が生じた。同様に、アジュバントを添加しなくても、ＳＭＮに基づく送達により、ＢＡＬ液中にかなり高い抗体価が誘発された。さらに、ＳＭＮによって誘発された抗体価は、従来のＩＭ−アルムの投与法で生じるものと規模において同様であった。したがって、本発明の方法および装置は、ＢＡＬ液中での免疫応答の誘発において、アジュバントの必要性を克服することができる。ＢＡＬ中でのこのような免疫応答は、炭疽芽胞でのエアロゾル投与誘発に対する防御に重要である可能性が高い。
【０１４８】
ＩＮ送達は、ＢＡＬ液中でかなり高い抗体価を誘発するために、アジュバントを必要とした。しかしながら、アジュバントの存在下でも、ＩＭ注射と比べて、ＩＮで投与されるｒＰＡによって生じるＢＡＬ抗体価は同様であるがわずかに低かった。
【０１４９】
上記に示した総Ｉｇ分析に加えて、ＰＡ特異的ＩｇＡについてもＢＡＬ液を分析した。ＩｇＡは、分泌型抗体であり、粘膜表面での感染防御に関与する。ＰＡ特異的ＩｇＡは、限られた数の試料中でわずかに検出することができた；ＩＮ／ＣｐＧ群（群３）の４／９の試料、およびＩＤ／ＣｐＧ群（群６）の１／５の試料は、１：２から１：８の希釈において陽性であった。他のすべての試料は陰性であった。この結果から、ＩＮおよびＩＤ送達は、ＢＡＬ液中でＩｇＡ反応を誘発する能力において、試験した経路の中でも独特であることが示唆される。
【０１５０】
実施例５−血清中和抗体価
予防接種した動物または対照動物の血清の希釈物を、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）とともにインキュベートした単球細胞培養物に添加することによって、炭疽の中和について測定した。このアッセイは、炭疽疾患に対する防御にｉｎ  ｖｉｔｒｏで相関するものの代表となる。細胞内ＡＴＰを測定することによって、細胞の生存率を決定した。結果を図７に示す。特に、アジュバントを添加しない、ＨＭＮに基づくｒＰＡのＩＤ送達で、ＩＭ＋アルムと同様の血清Ｎａｂ価が誘発された。アジュバントとしてアルムまたはＣｐＧを添加すると、Ｎａｂ価がＩＭと比べてさらに高くなった。同様に、ＳＭＮに基づく送達でも、かなり高い血清Ｎａｂ価が誘発され、アジュバントの存在下で、それはＩＭ注射によって誘発されたものより高くなった。ＳＭＮ微小擦過器で前処置し、その後ワクチンを局所に塗布すると、皮膚表面上のワクチン液滴によって直接擦過する代替プロトコルを介して生じるものより反応がわずかに強くなった。ＩＮ送達では、アジュバントの不在下でＮａｂを誘発することができなかったが、ｒＰＡ＋ＣｐＧを３回投与した後にＮａｂを誘発した。ＢＡＬ中では、低いＮａｂ価がＳＭＮおよびＨＭＮの群で観察されたが、ＩＭおよびＩＮで処置した動物は陰性であった（データは示さず）。
【０１５１】
したがって、ＨＭＮ装置を介するＩＤ送達は、他のどんな送達経路より強い炭疽中和抗体価を誘発する。ＳＭＮは、局所送達を可能にし、ＩＭ注射を介して生じるもの以上の強さの炭疽中和抗体価を誘発する。特に、アジュバントを添加しなくても、ＨＭＮおよびＳＭＮの群において中和抗体は存在した。したがって、本発明の方法および装置は、ワクチンに対する防御免疫応答の誘発において、アジュバントを添加する必要性を克服する。ＩＮ送達も、中和抗体反応を誘発したが、それにはアジュバントを必要とした。したがって、ＩＮ送達からＩＭ注射と同様の結果が得られるが、針を用いずに非侵襲的な送達を介してそれは得られる。
【０１５２】
ＩＩ．ウサギモデルでの致死量投与誘発試験
実施例６−様々な送達経路および他のファクターの効力を比較する試験の実験設計
送達経路：
中空微小針（ＨＭＮ）に基づく皮内（ＩＤ）送達：ウサギへの注射は、カテーテル線の末端上で、３４ゲージ針を用いて、深さ１ｍｍで皮膚表面に垂直に行った。送達速度は制御しなかった。投与は、急速ボーラス注射を用いて、約２０〜３０秒にわたって手動で行った。ワクチン１００マイクロリットルを、ウサギ１匹当たり２箇所の送達部位に分けて投与した。
【０１５３】
充実微小針（ＳＭＮ）擦過に基づく送達：電気バリカンでウサギの体毛をそり、次いでＮａｉｒ（登録商標）クリームを用いて脱毛した。次いで、上記のように、ウサギをＳＭＮ装置で前処置した。次いで、ワクチン（１００μｌ量を、それぞれ面積が約１×３ｃｍの処置部位２箇所以上に分けた）を、Ｇｉｌｓｏｎピペッターを用いて、処置した皮膚に局所的に塗布した。
【０１５４】
局所送達（装置なし）：電気バリカンでウサギの体毛をそり、次いでＮａｉｒ（登録商標）クリームを用いて脱毛した。次いで、ワクチン（１００μｌ量を、それぞれ面積が約１×３ｃｍの処置部位２箇所以上に分けた）を、Ｇｉｌｓｏｎピペッターを用いて、処置した皮膚に局所的に塗布した。
【０１５５】
筋内（ＩＭ）注射：標準的な３０Ｇａ針および１ｃｃ注射器を用いて、ワクチン（１００μｌ量）を大腿四頭筋に注射した。
【０１５６】
鼻内（ＩＮ）（液体製剤）：Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ鼻噴霧器装置を用いて、ワクチン（１００μｌ量）を片方の鼻孔に噴霧した。
【０１５７】
本発明の空気力学的軽量粒子（ＡＬＰ）製剤を用いた鼻内（ＩＮ）投与：各カプセルを粉末１０ｍｇで満たした。装置を通じて空気５ｍｌを鼻孔に押し込むことにより、送達を行った。
【０１５８】
アジュバント：Ａｌヒドロゲル（２％ＡＬ（ＯＨ）3；Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；Ｐｒｏｌｉｇｏ、ＬＬＣ）、ウサギ１匹当たり５０μｇ。
【０１５９】
動物：ニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）（ＮＺＷ）雌ウサギ
免疫感作計画：ウサギを、ｄ０、ｄ２１およびｄ４２で免疫感作させた。
【０１６０】
抗原投与量：免疫感作１回当たりｒＰＡ５０μｇ
動物数：合計＝１群当たりｎ＝６またはｎ＝９。各群から６匹の動物に、致死量の投与誘発を施した。第５６日に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、鼻洗浄、または膣洗浄用に、残っている動物を屠殺した。下記の実験群を参照されたい。
【０１６１】
試料収集：第０日（「ｄ０」、出血前）、ｄ２１（免疫感作２の前）、ｄ３５（免疫感作３の前）、およびｄ５６に血液を収集した。
【０１６２】
アッセイ：アッセイは、従来のように、および／または本明細書の他箇所に記載のように行った。
【０１６３】
第２１、３５、および５６日に血清総Ｉｇ抗体価を測定した。ｒＰＡ特異的な総ｒＰＡ特異的な総Ｉｇについて、ＥＬＩＳＡにより個々のウサギの血清を分析した。第５６日にＢＡＬ総Ｉｇ抗体価を測定した。第５６日にＢＡＬ  ＩｇＡ抗体価を測定した。第５６日に鼻ＩｇＡ抗体価を測定した。第５６日に膣ＩｇＡ抗体価を測定した。第５６日に血清ＩｇＡ抗体価を測定した。上記のように、第２１、３５、および５６日に、単球細胞培養物におけるＰＡ／ＬＴ中和抗体価を決定した。
【０１６４】
以前の記載の通りに（非特許文献１６）、ＬＤ50が約１００の炭疽芽胞で致死量エアロゾル投与誘発を行った。投与誘発は、第３回のワクチン投与の６週間後に行った。
【０１６５】
【表６】
2006517913.tif 000011
【０１６６】
ＳＦＤ  ｒＰＡ粒子の調製：
この実施例で使用する乾燥粉末ＳＦＤ  ｒＰＡ試料では、特許文献６に記載のように、ＢＤ  ＡｃｃｕＳｐｒａｙノズルを用いて、ｒＰＡおよび賦形剤を含む溶液から液体粒子を作製した。このプロセスによって産生される液体粒子の体積平均径は、約５０μｍから１００μｍである。従来の凍結乾燥装置を用いて、凍結乾燥（真空下で凍結し乾燥させる）によって凍結液滴を乾燥させた。
【０１６７】
【表７】
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【０１６８】
下記の実施例では、液体窒素を含む（Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥用フラスコなどの）容器中へと粒子を噴霧することによって粒子を凍結し、次いでその容器を従来の凍結乾燥器に取り付け、過剰な液体窒素を蒸発させた。含水量が３重量％を下回るまで約４８時間以内に、凍結エアロゾルを乾燥させた。
【０１６９】
試料４では、上記のようにＢＤ  ＡｃｃｕＳｐｒａｙノズルを用いて、２０重量％のキトサンおよび８０重量％のトレハロースを含む溶液からキトサンを噴霧凍結乾燥させた。次いで、ＳＦＤ  ｒＰＡとＳＦＤキトサンを、容器内で撹拌することによって混合した。
【０１７０】
ＦＤ  ｒＰＡ粒子の調製：
この実施例で使用する乾燥粉末ＦＤ  ｒＰＡ試料では、従来の凍結乾燥装置を用いて、凍結乾燥（真空下で凍結し乾燥させる）によって凍結液滴を乾燥させた。この方法は一般に、「凍結−乾燥」またはＦＤ法と呼ばれ、この方法によって作製された組成物は、「凍結−乾燥」またはＦＤ組成物と呼ばれる。
【０１７１】
【表８】
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【０１７２】
ｒＰＡ、トレハロース、およびＣｐＧを含む溶液を、その溶液を含む容器をドライアイス槽に入れることによって凍結させた。次いで、含水量が３重量％を下回るまで、従来の凍結乾燥装置を用いて凍結溶液を含む容器を乾燥させた。試料３では、次いで乾燥粉末を、「小刻みに動く虫（ｗｉｇｇｌｅ  ｂｕｇ）」様のボールミルを使用して３０分間粉砕した。上記に記載のように調製した、乾燥させた試料ＳＦＤキトサンを添加し、「小刻みに動く虫」様のボールミルを使用して３０分間粉砕することによって、試料５を調製した。この粉砕プロセスにより、体積平均径が約５０μｍから１００μｍの試料が得られる。
【０１７３】
実施例７−第２１日、第３５日および第５６日での血清抗体価
第２１日、第３５日および第５６日での血清抗体価を表７〜９に示す。
【０１７４】
【表９−１】
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【０１７５】
【表９−２】
2006517913.tif 000015
【０１７６】
【表１０−１】
2006517913.tif 000016
【０１７７】
【表１０−２】
2006517913.tif 000017
【０１７８】
【表１１−１】
2006517913.tif 000018
【０１７９】
【表１１−２】
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【０１８０】
ワクチンを１回投与した後、ＩＤ−アルムの群で全体の血清抗体反応が最も高かったが、これは上記に示したマウスでの試験結果と一致している。ＩＭ−アルムの群で平均抗体価が３２，０００であったのと比べて、この群での算術平均抗体価は１４２，９３３であった。ＩＮ送達でも、ワクチンの単回投与後にかなり高い血清抗体価が誘発されたが、概してそれは、ＩＤまたはＩＭ注射によって生じたものより低かった。キトサンおよびＣｐＧアジュバントを含むＳＦＤ粉末製剤でＩＮにより免疫感作させたウサギで、全体のＩＮ誘発反応が最も強く、標準的な液体製剤でＩＮにより免疫感作させた群での抗体価が２０１６であったのと比べて、この群では平均血清抗体価が１０，５００であった。
【０１８１】
ワクチンを１回投与した後に、群７および１４ではかなり強い抗体反応が生じたが、局所の群（群８）のウサギでは検出可能な反応が生じなかったので、ＳＭＮ装置による、炭疽ワクチンの局所送達は可能であった。
【０１８２】
第２回のワクチン投与後、すべての群が血清抗体価のかなりの上昇を示した。第１回の投与後のように、ＨＭＮ  ＩＤ−アルムの群で全体の反応が最も強く、ｒＰＡ＋アルムでＩＭにより免疫感作させたウサギでは平均抗体価が２，３２１，０６７であったのと比べて、この群の平均抗体価は３，００３，７３３であった。
【０１８３】
第３回のワクチン投与後、すべての群が、血清中でＰＡ特異的抗体陽性であった。全体的に、ＩＤおよびＩＭで誘発される抗体価が最も高く、その次にＩＮ、ＳＭＮおよび局所が高かった。
【０１８４】
実施例９−第５６日での粘膜抗体価
表１０〜１２は、様々な組織における第５６日での抗体価を示す。表１０は、ＢＡＬ液中のＰＡ特異的ＩｇＡ抗体価を示す；表１１は、鼻洗浄液中のＰＡ特異的ＩｇＡ抗体価を示す；表１２は、膣洗浄液のＰＡ特異的ＩｇＡ抗体価を示す。表１０に示す結果は、本発明の炭疽ワクチン組成物および方法が、ＢＡＬ中で粘膜免疫応答を誘発することを明らかにするものである。表１１に示す結果は、本発明の炭疽ワクチン組成物および方法が、鼻腔内で粘膜免疫応答を誘発することを明らかにするものである。表１２に示す結果は、本発明の炭疽ワクチン組成物および方法が、ワクチン投与部位から離れた遠い粘膜組織である膣組織中で粘膜免疫応答を誘発することを明らかにするものである。
【０１８５】
【表１２】
2006517913.tif 000020
【０１８６】
【表１３】
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【０１８７】
【表１４】
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【０１８８】
実施例１０−中和抗体反応
予防接種した動物または対照動物のウサギ血清の希釈物を、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する、溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）とともにインキュベートした単球細胞培養物に添加することによって、炭疽の中和について測定した。このアッセイは、炭疽疾患に対する防御にｉｎ  ｖｉｔｒｏで相関するものの代表となる。細胞内ＡＴＰを測定することによって、細胞の生存率を決定した。結果を図８に示す。ワクチンを１回投与した後、ＩＤ−アルムの群で、全体のＮａｂ価が最も高く観察された；この群のＮａｂレベルはどんなＩＭ注射群で生じたものよりも高かった。ＩＮおよびＳＭＮに基づく送達でも、ワクチンの単回投与後にかなり高いＮａｂ価が誘発され、そのレベルは、ＩＭ注射によって誘発されるものと同様であった。第２回のワクチン投与後、Ｎａｂ価は、ＩＭ、ＨＭＮおよびＩＮの群全体で同様であった。第３回のワクチン投与の追加免疫効果は、粉末製剤のワクチンを投与したＩＮの群でのみ明らかであった。ＳＭＮ装置の不在下で局所投与した群でＮａｂ反応ははっきりと検出できなかったので、ＳＭＮ送達による、炭疽ワクチンの局所送達は可能であった。したがって、本発明のワクチン組成物および方法はＮａｂを誘発し、そのレベルは、従来のＩＭ注射で誘発されるものと少なくとも同程度に強い。
【０１８９】
実施例１１−防御免疫応答の概要：炭疽芽胞を用いたエアロゾル投与誘発後の生存率
表１３に、様々な型の投与で得られたデータの概要を示す。
【０１９０】
【表１５】
2006517913.tif 000023
【０１９１】
炭疽予防接種の現在の標準法は、アジュバントとしてアルムを含むワクチンのＩＭ注射からなる。この試験では、この標準法によって、致死量投与誘発に対する部分的な防御（８３％）がもたらされた（表１３）。それに対して、ｒＰＡ＋アルムの、またはアジュバントを含まないｒＰＡの、ＨＭＮに基づくＩＤ送達によって完全な防御（１００％）がもたらされた。一般に、ＩＭまたはＩＤの群でのアジュバントの選択は、この試験で使用したｒＰＡの投与量における防御効力を決定する際に主要な役割を果たしていないと思われた。液体製剤のＩＮ送達では６７％の防御がもたらされたが、本発明の粉末製剤のＩＮ送達では完全な防御（１００％）がもたらされた。ＳＭＮに基づく局所送達では最大５０％の防御がもたらされたが、それと比べて、装置の不在下での局所送達では１７％しかもたらされなかった。全体として、致死量投与誘発試験の結果は、本発明の方法および製剤を介して皮膚および鼻粘膜を標的とすることにより、炭疽に対する完全な防御を実現できることを実証するものである。病原体の自然なおよび兵器化された形で炭疽疾患をまさに受け入れる組織（すなわち、皮膚および呼吸器系）を標的とすることによって、防御が実証されたのはこれが初めてである。
【０１９２】
実施例１２−投与量節約の利点
上記に示したマウスおよびウサギの試験の結果は、ＨＭＮを介するＩＤ送達で、ワクチンの単回投与後にＩＭ注射より強い免疫応答がもたらされることを示すものである。したがって、ＨＭＮを介するＩＤ送達により、防御効果を引き出すのに必要な炭疽ワクチンの投与回数を減らすことができる。また、これらの結果に基づいて、ＨＭＮを介するＩＤ送達が投与量節約の利点をもたらす；すなわち、そのＩＤ送達で１回の投与あたりに少ない量のｒＰＡを使用して、ＩＭ経路を介して最大限の投与量のワクチンを使用して実現するものと同等以上のレベルの免疫応答および防御を実現することができることも予想される。
【０１９３】
前の記載から、当業者なら、本発明の基本的な特徴を容易に確認し、その趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の変化および変更を行って様々な使用および条件にそれを適合させることができる。
【０１９４】
さらに労することなく、当業者なら、前の記載を用いて、本発明をその最大限まで利用することができると思われる。したがって、前記の好ましい特定の実施形態は、単に例示的なものと解釈すべきであり、どんな形であれその開示の残りの部分を限定するものと解釈すべきでない。
【０１９５】
上記および図中で引用したすべての出願、特許および刊行物の開示全体を、参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１Ａ】好ましい実施形態の微小擦過器の取手末端の立面図である。
【図１Ｂ】好ましい実施形態の微小擦過器の側面図である。
【図２Ａ】図１Ａおよび１Ｂの微小擦過器装置の透視図である。
【図２Ｂ】図１Ｂの微小擦過器装置の横断面図である。
【図３】対象の皮膚上にある、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、および２Ｂの微小擦過器装置の擦過表面の側面図である。
【図４】図３の実施形態における擦過表面の透視図である。
【図４Ａ】擦過表面の横断側面図である。
【図５】図３の実施形態の擦過表面の底面図である。
【図６Ａ】実施例１に示す実験群における、様々なアイソタイプのｒＰＡ特異的抗体のｄ５６血清濃度を示す図である。
【図６Ｂ】実施例１に示す実験群における、様々なアイソタイプのｒＰＡ特異的抗体のｄ５６血清濃度を示す図である。
【図６Ｃ】実施例１に示す実験群における、様々なアイソタイプのｒＰＡ特異的抗体のｄ５６血清濃度を示す図である。
【図７Ａ】炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）、ならびに様々な予防接種群のマウスの希釈血清とともにインキュベートした後の単球細胞培養物の％生存率を示す図である。
【図７Ｂ】炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）、ならびに様々な予防接種群のマウスの希釈血清とともにインキュベートした後の単球細胞培養物の％生存率を示す図である。
【図７Ｃ】炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）、ならびに様々な予防接種群のマウスの希釈血清とともにインキュベートした後の単球細胞培養物の％生存率を示す図である。
【図８】炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する溶解濃度のＰＡおよび致死毒素（ＬＴ）、ならびに様々な予防接種群のウサギの希釈血清とともにインキュベートした後の単球細胞培養物の％生存率を示す図である。
【図１Ａ】
2006517913.tif 000024
【図１Ｂ】
2006517913.tif 000025
【図２Ａ】
2006517913.tif 000026
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図５】
2006517913.tif 000031
【図６Ａ】
2006517913.tif 000032
【図６Ｂ】
2006517913.tif 000033
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2006517913.tif 000036
【図７Ｃ】
2006517913.tif 000037
【図８】
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【国際調査報告】
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