(57)【要約】本発明は、阻害性ＲＮＡに関連する方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローニングの準備ができている阻害剤配列集団を生成する方法であって：
ａ）固定プライマー配列；
ランダムオリゴヌクレオチド配列；および
固定ステム−ループ構造
を含んでなるランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を、ポリメラーゼ伸長反応を介して伸長させて、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を産生し；
ｂ）前記全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を変性させて、変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を産生し；
ｃ）前記変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を、ポリメラーゼ伸長反応を介して伸長させて、二本鎖直鎖産物を生成し、そして
ｄ）前記二本鎖産物からプライマー配列を除去する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記産物を発現ベクターに挿入することをさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記発現ベクターを細胞に導入することをさらに含んでなる、請求項２の方法。
【請求項４】
前記細胞を表現型に関して評価する、請求項３の方法。
【請求項５】
前記表現型が機能表現型喪失である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記表現型が機能表現型の部分的喪失である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記表現型が、受容体遺伝子機能喪失のためである、請求項４の方法。
【請求項８】
前記表現型が、受容体遺伝子機能の部分的喪失のためである、請求項４の方法。
【請求項９】
クローニングの準備ができている配列集団が、長さ１５〜５０塩基の変性ランダムオリゴヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１０】
クローニングの準備ができている配列集団が、長さ２０〜３０塩基の変性ランダムオリゴヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１１】
クローニングの準備ができている配列集団が、長さ２１〜２３塩基の変性ランダムオリゴヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、阻害性ＲＮＡに関連する方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの複雑な生物由来の完全ゲノム配列および多数の予測される遺伝子配列が、現在、入手可能である。現在、これらの遺伝子すべての機能およびこれらが互いにどう相互作用するかを理解するには、これらの生物の逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）遺伝学的解析が必要であろう。すべての製薬会社のＲ＆Ｄ業務の主要な目的の１つは、これらの供給源を十分に利用し、そして薬剤を発見する目的で、標的同定および検証を加速するであろう、ゲノミクスに基づく技術を開発しそして実行することである。
【０００３】
引用文献
【０００４】
【化１】
2006500023.tif 000002
【０００５】
【化２】
2006500023.tif 000003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明は、固定プライマー配列、ランダムオリゴヌクレオチド配列および固定ステム−ループ構造を含んでなる、ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を提供する。本発明の好ましい態様は、ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ１５〜５０塩基である、ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を含んでなる。特に好ましいのは、ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２０〜３０塩基である、ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団である。さらにより好ましいのは、ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２１〜２３塩基である、ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団である。
【０００７】
本発明は、二本鎖固定プライマー配列、二本鎖ランダムオリゴヌクレオチド配列；および固定ステム−ループ構造を含んでなる、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団をさらに提供する。本発明の好ましい態様は、ランダムオリゴヌクレオチド配列が１５〜５０塩基対である、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を含んでなる。特に好ましいのは、ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２０〜３０塩基対である、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団である。さらにより好ましいのは、ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２１〜２３塩基対である、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団である。
【０００８】
本発明は、変性固定プライマー配列、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列および変性ステム−ループ構造を含んでなる、変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団をさらに提供する。本発明の好ましい態様は、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ１５〜５０塩基である、変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を含んでなる。特に好ましいのは、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２０〜３０塩基である、変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団である。さらにより好ましいのは、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２１〜２３塩基である、変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団である。
【０００９】
本発明は、二本鎖ランダムオリゴヌクレオチド配列；および二本鎖固定ステム−ループ構造を含んでなる、クローニングの準備ができている阻害剤配列集団をさらに提供する。本発明の好ましい態様は、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ１５〜５０塩基である、クローニングの準備ができている阻害剤配列集団を含んでなる。特に好ましいのは、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２０〜３０塩基である、クローニングの準備ができている阻害剤配列集団である。さらにより好ましいのは、変性ランダムオリゴヌクレオチド配列が長さ２１〜２３塩基である、クローニングの準備ができている阻害剤配列集団である。本発明は、クローニングの準備ができている阻害剤配列集団を含んでなるベクター集団をさらに含んでなる。
【００１０】
本発明は、クローニングの準備ができている阻害剤配列集団を生成する方法であって、ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を、ポリメラーゼ伸長反応を介して伸長させて、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を産生し、前記全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を変性させて、変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を産生し、前記変性全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を、ポリメラーゼ伸長反応を介して伸長させて、二本鎖直鎖産物を生成し、そして前記二本鎖産物からプライマー配列を除去することを含んでなる、前記方法をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の詳細な説明
条件付きでそして標的化された遺伝子ノックアウト技術は、強力な逆方向遺伝学的ツールであるが、高価であり、そして好ましい哺乳動物モデル生物、ハツカネズミで達成するには比較的時間がかかる（ＢａｂｉｎｅｔおよびＣｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ（２００１））。遺伝子不活性化につながるいくつかのショートカットが試みられている。これらには、新規レコンビナーゼ（Ｋｏｌｂ（２００２））、４倍体胚凝集（Ｍｉｓｒａら（２００１）；Ｅｇｇａｎら（２００２）；Ｅｇｇａｎら（２００１））および誘導性発現系（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ（２００１））の使用を含む、標的化された破壊を生じる新規技術が含まれる。同様に、ＥＮＵまたはトラップベクターを用いた、全ゲノム突然変異誘発のような順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）遺伝学的ツール（Ｈｒａｂｅ  ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓら（２０００）；Ｈｒａｂｅ  ｄｅ  ＡｎｇｅｌｉｓおよびＳｔｒｉｖｅｎｓ（２００１））またはＥＭＳを用いたＥＳ細胞の突然変異誘発が含まれるが、これらは強力であるが、労働集約型で、比較的時間がかかり、そして高価である。
【００１２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術の出現は、これらのモデル生物においてのみでなく、以前は遺伝子解析には向かないと見なされていた生物においても、遺伝子機能を研究し、そして「薬剤化可能（ｄｒｕｇａｂｌｅ）」標的を同定し、そして検証するための、大きなブレイクスルーとして歓迎されてきた。
【００１３】
ＲＮＡｉは、脊椎動物細胞または完全な生物において、遺伝子機能を除去するか、または有意に減少させる、逆方向遺伝学的技術の武器庫の強力なツールである。ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシングの非常に保存された機構であり、該機構においては、目的の遺伝子または遺伝子コード領域に対応する二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを生物に導入して、対応するｍＲＮＡの分解を生じる（Ｆｉｒｅ（１９９９）；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（２０００）；Ｂａｓｓ（２００１）；Ｓｈａｒｐ（２００１）；Ｈａｎｎｏｎ（２００２））。アンチセンス技術とは異なり、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）において、遺伝子発現が回復するまでに、ＲＮＡｉ現象は数回の細胞分裂の間（以下に記載）、存続する（Ｆｉｒｅ（１９９８））。ＲＮＡ干渉は、植物界および動物界両方に見られる古くからの系であり（Ｃｏｇｏｎｉおよびｍａｃｉｎｏ（２０００））、そしてウイルスであって、そのいくつかが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ゲノムを有する、前記ウイルスに対する進化的に保存された防御（ＬｉおよびＤｉｎｇ（２００１））であるとともに、トランスポゾン活性の調節（ＫａｓｓｃｈａｕおよびＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ（１９９８）；Ｌｌａｖｅら（２０００）；Ｔａｂａｒａら（１９９９）；Ｋｅｔｔｉｎｇら（１９９９））および遺伝子発現制御（ＬｉｎおよびＡｖｅｒｙ（１９９９）；Ｒｕｖｋｕｎ（２００１））を行うことが提唱されてきている。この現象は、動物においてはＲＮＡｉ、トランスジェニック植物においては転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、ウイルス感染植物においてはＶＩＧＳ（Ｚａｍｏｒｅ（２００１））そして真菌においては「鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）」（ＲｏｍａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ（１９９２））として記載されている。
【００１４】
ＰＴＧＳ現象は１０年以上前から知られていたが、ＲＮＡｉの機構は、現在、理解され始めたばかりである。現在のモデルは、感受性細胞に導入された後、ｄｓＲＮＡが認識されて、そしてＡＴＰ依存性反応において、ダイサーと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ様エンドヌクレアーゼによって、２１〜２５ｎｔの断片に切断されるというものである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（２００１）；ＫｎｉｇｈｔおよびＢａｓｓ（２００１））。二重鎖ｓｉＲＮＡ上に形成されるタンパク質複合体は、「ｓｉＲＮＰ」と称され、ＲＮＡ標的を切断可能な、完全に活性である「ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体」（ＲＩＳＣ）とは区別される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（２００１））。これらのｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡとアニーリングし、そして２つの方式で破壊を引き起こすことが可能である。第一に、複合体がＲＮアーゼＩＩＩ様酵素、ヘリカーゼなどに認識され、そしてｍＲＮＡが、大まかにｓｉＲＮＡの中心に対応する点で切断される。あるいは、線虫においては、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡとアニーリングした後、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって伸長される。次いで、エンドヌクレアーゼ、ダイサーがｓｉＲＮＡの新規周期を生成し、ここで、自己永続的プロセスにおいて、さらなるｍＲＮＡを標的とし続ける。したがって、線虫において、ＲＮＡｉの現象は、分解ＰＣＲと適切に描写され、これはｓｉＲＮＡにプライミングされる、このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応が、少量の「トリガー」ｄｓＲＮＡによって引き起こされる干渉を増幅するためである（Ｌｉｐａｒｄｉら（２００１）；Ｓｉｊｅｎら（２００１））。
【００１５】
哺乳動物系におけるＲＮＡｉの最初の記述は、２０００年初期に、ＷｉａｎｎｙおよびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚによって公表された。その一方で、いくつかの刊行物がこの結果を追認し、そして干渉の力学的性質に関して、さらに展開してきた。哺乳動物細胞においては、ｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡへとプロセシングされるが、ｄｓＲＮＡを伴うＲＮＡｉは、大部分の細胞種では特に成功してきておらず、これは３０ｎｔより長いｄｓＲＮＡ分子によって非特異的反応が誘発されるためであり、この非特異的反応はＰＫＲ経路の活性化のためである可能性が最も高い。より最近、合成２１ｎｔ  ｓｉＲＮＡ二重鎖を哺乳動物細胞にトランスフェクションすると、非常に配列特異的な方式で、内因性標的遺伝子発現が有効に阻害されることが報告された（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）；Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２））。この後、多様な細胞種において、標的遺伝子をノックダウンするため、哺乳動物発現ベクターが仲介するｓｉＲＮＡの合成が有効であることを立証する多くの報告が続いた（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）；Ｓｕｉら（２００２）；Ｐａｕｌら（２００２）；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ＆Ｔａｉｒａ（２００２）；Ｌｅｅら（２００２））。また、多数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子が最近発見され、これによって、哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡ阻害の細胞機構を、遺伝子制御の正常プロセスに結びつけることも可能である見込みがあると提起されている（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら（２００１）；Ｌａｕら（２００１）；ＬｅｅおよびＡｍｂｒｏｓ（２００１）；Ａｍｂｒｏｓ（２００１））。
【００１６】
多くの学術的実験室および産業実験室が、特定の遺伝子の機能またはゲノムの全相補体（線虫に関して：Ｆｒａｓｅｒら（２０００）；Ｂａｒｇｍａｎｎ（２００１）；Ｍａｅｄａら（２００１））の機能でさえ解明するために、逆方向遺伝学的ツールとして、ＲＮＡｉを用いているが、ＲＮＡｉの順方向遺伝学的適用の包括的なプロトコルを提唱するかまたは記載する報告または概説はない。最近の概説に関しては、Ｈａｎｎｏｎ  ２００２を参照されたい。こうした適用は、適切な発現系におけるランダムｓｉＲＮＡ分子ライブラリーの生成を必要とする。ランダムｓｉＲＮＡは、典型的には、ランダム組成（複数のＮ）の二本鎖ＲＮＡ配列からなり、これによって、二本鎖が可変数の塩基対のループ領域を介して連結される（点線ループとして示される）。酵素「ダイサー」が、ループ領域を切り落とすことによって、この分子をさらにプロセシングすると考えられる（図１）。
【００１７】
ここで、ＰＣＲに基づくアプローチに基づいて、ランダムｓｉＲＮＡライブラリーの迅速なクローニングを可能にするであろう方法を記載する（図２〜４）。
「ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体」は、以下の特徴：ａ）以下に記載するポリメラーゼ伸長反応に適した条件下で、プライマーとして作用するのに十分な長さおよび適切な配列組成の固定プライマー配列を取り込んで合成される。所望により、固定プライマー配列は、配列内の、または配列の３’の制限部位（点線）、長さ１５〜５０塩基の間の、好ましくは長さ２１〜２３塩基の間のランダムオリゴヌクレオチド配列のストレッチ（複数のＮ）および固定ステム−ループ構造（黒い実線）を取り込むことも可能である。ステムは、ＧＣ含量が豊富であってもよい（「ＧＣクランプ」）。ステム−ループの３’端は、次の工程の開始点として働くであろう。「ランダムオリゴヌクレオチド配列」によって、特定の長さのヌクレオチド配列のプールが、その長さのありうる配列すべてのコレクションからランダムな方式（すなわちブラインドで無作為の選択）で選択されるヌクレオチド配列のプールから、有意に逸脱しないことを意味する。しかし、ランダムオリゴヌクレオチドの配列は、数学的な意味で完全にランダムでない可能性もあることが認識される。化学的に合成されたランダムオリゴヌクレオチドは、合成法の物理的効率および化学的効率が許す度合いにランダムであろう。
【００１８】
「鎖伸長」は、核酸テンプレート上のプライマーの伸長プロセスを指す。適切な緩衝剤、ｐＨ、塩およびヌクレオシド三リン酸を用いて、ＤＮＡポリメラーゼなどのテンプレート依存性ポリメラーゼは、テンプレートにアニーリングするプライマーの３’端上で、テンプレート鎖に相補的なヌクレオチドを取り込む。ポリメラーゼは、こうして、テンプレートの忠実な相補コピーを合成するであろう。この目的に適したポリメラーゼには、限定されるわけではないが、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎｓ）逆転写酵素、および熱安定性酵素（すなわち変性を引き起こすのに十分に高い温度にさらされた後、プライマー伸長を行う酵素、例えばＴａｑポリメラーゼ）を含む他の酵素が含まれる。適切な酵素は、適切な方式で、ヌクレオチドの組み合わせを促進して、各突然変異体ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するであろう。
【００１９】
「全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体」は、以下の処理にさらされる：ａ）すべての塩基対形成を破壊する変性、しばしば熱変性（図３、上部パネル）、ｂ）「二本鎖直鎖産物」を産生する、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングおよび「鎖伸長」後のポリメラーゼ伸長（図３、中央パネル）。プライマー配列の除去は、制限酵素（単数または複数）またはヌクレアーゼでの消化によって達成されて（図３、下部パネル）、「クローニングの準備ができている配列」を産生する。
【００２０】
適切な細胞種に導入された後、ｓｉＲＮＡコード配列の恒常性発現または誘導性発現を可能にするベクターに、先行する方法の産物（「クローニングの準備ができている阻害剤配列」）をクローニングする（図４）。当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される、細胞にＤＮＡを導入する方法には、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核インジェクション、またはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞、およびプロトプラストなどのキャリアーとの融合が含まれる。本発明の発現系には、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物、脊椎動物、および哺乳動物の細胞系が含まれる。
【００２１】
ＲＮＡｉチップまたは他の固体支持体物質−ｓｉＲＮＡアレイであって、多くの種類の培養細胞が該アレイ上で増殖し、そして１つずつ、ゲノムにおけるすべての遺伝子の発現を抑制する効果に関してスコア付けすることが可能な、前記ｓｉＲＮＡアレイを製造することも可能である。上述のランダムＲＮＡｉライブラリーを用いて、ＲＮＡｉ技術はさらに１ステップ進んで、そして生物医学研究において特に興味深い、細胞性機能喪失／低形質（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）表現型に関する順方向遺伝学的スクリーニングに取り込まれることも可能である。
【００２２】
適切な細胞種にランダムＲＮＡｉライブラリーを搬送した後、いかなる数の細胞性表現型をスクリーニングすることも可能であることが想定される。特に想定されるいくつかの表現型には、限定されるわけではないが：アポトーシス誘導、形質転換表現型の誘導、分化、化学療法剤酸化ストレス、ＥＲストレスおよび血管形成（胚様体）に対する耐性が含まれる。ＡｒｒａｙＳｃａｎまたはＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎセットアップなどのプラットホームもまた、特定の曝露での生存以外の表現型に関する高処理スクリーニングに使用することも可能である。
【００２３】
望ましい表現型（例えばＴＮＦαまたは血清枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性）を示す細胞クローンが同定されたら、表現型に関与するｓｉＲＮＡをＰＣＲ増幅し、そして配列決定することも可能である。相当するゲノム配列に対して、得られた配列をＢＬＡＳＴ検索すると、そのノックダウンが細胞性表現型を生じる標的ｍＲＮＡが同定されるはずである。
【００２４】
以下の実施例１は、ＴＮＦα曝露後の「生存者」を特徴付ける胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｋａｗａｓａｋｉら（２００２））を用いた表現型スクリーニングを概説する。
【実施例】
【００２５】
実施例１
ＴＮＦαが誘導する細胞死に関与する遺伝子の同一性を決定する。以下の工程が想定される：
まず、ＥＳ細胞トランスフェクション（または目的の他の初代細胞株または不死化細胞株）に好ましいベクターを決定する。次いで、選択した細胞をエレクトロポレーションして／感染させて、そして二重選択（抗生物質耐性マーカーおよび目的の生存者表現型（例えばＴＮＦアルファが誘導するアポトーシスに対する耐性））する。次いで、耐性クローンのゲノム由来のｓｉＲＮＡ配列をＰＣＲで増幅する。所望により、多数の周期のスクリーニングを行ってもよい。適切なゲノムのＢＬＡＳＴ検索を行って、標的ｍＲＮＡを同定する。所望により、標的ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドまたはＢＡＣを用いて、表現型救出を試みてもよい（例えばこの例では、ＴＮＦアルファへの感受性を回復する）。所望により、ヒト・オルソログが同定されたら、次いで、同定された転写物の機能をさらに調べて、例えばヒト疾患（癌など）における転写物の潜在的な役割を決定してもよい。
【００２６】
前述の説明および実施例に特に記載されるのとは別の方式で、本発明を実施することも可能であることが明らかであろう。
上記解説を考慮して、本発明の多くの修飾および変型が可能であり、そしてしたがって、本発明の範囲内である。
【００２７】
本明細書に引用するすべての刊行物の完全な開示が、本明細書の開示と不一致でない度合いまで、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ｎ量体のランダムＲＮＡｉライブラリーの構造特徴。
【図２】ポリメラーゼ伸長反応を介してランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体集団を伸長させて、全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を産生することを示す図。
【図３】全長ヘアピン・ランダムオリゴヌクレオチドＲＮＡｉ前駆体を変性させて、二本鎖直鎖産物を生成し、そして続いて固定プライマー配列を実質的に除去して、クローニングの準備ができている阻害剤配列を生成することを示す図。
【図４】クローニングの準備ができている阻害剤配列のクローニングを示す図。
【図１】
2006500023.tif 000004
【図２】
2006500023.tif 000005
【図３】
2006500023.tif 000006
【図４】
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【国際調査報告】
2006500023.tif 000008
2006500023.tif 000009