(57)【要約】チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別を行うためのオリゴヌクレオチドを提供する。チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数は、本発明のオリゴヌクレオチドの対象のゲノムDNAへのハイブリダイゼーションに基づいて特定することができる。このため、チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型をタンデムリピートの数に基づいて特定することができる。この遺伝子型は抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関連がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)(i)チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートを構成する3つのリピートユニットのうち中央のリピートユニット、および
(ii)該中央のリピートユニットの下流に位置するリピートユニット、
からなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ
(b)高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)の領域にハイブリダイズする、
単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートを構成する2つのリピートユニットの3'末端リピートユニットに、(b)よりもストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が配列番号：2のヌクレオチド配列を含む、請求項2記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
(a)(i)チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートを構成する3つのリピートユニットのうち中央のリピートユニット、および
(ii)該中央のリピートユニットの下流に位置するリピートユニット、
からなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ
(b)(a)の領域にハイブリダイズする、
というオリゴヌクレオチドの5'側に隣接した領域にハイブリダイズする、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、請求項4記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定する方法であって、以下を含む方法：
(a)チミジル酸シンターゼ遺伝子の少なくともプロモーター領域内のタンデムリピートを含むゲノムDNAを増幅する段階、
(b)請求項1記載のオリゴヌクレオチドを、段階(a)の増幅されたゲノムDNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる段階、
(c)該オリゴヌクレオチドと該ゲノムDNAとのハイブリダイゼーションを検出する段階、および
(d)ハイブリダイゼーションが検出されない場合にはタンデムリピートの数を「2」として特定し、ハイブリダイゼーションが検出された場合にはタンデムリピートの数を「3」として特定する段階。
【請求項７】
以下をさらに含む、請求項6記載の方法：
(e)本発明のオリゴヌクレオチドの、段階(a)の増幅されたゲノムDNAへの、(b)よりもストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション、
(f)該オリゴヌクレオチドと該ゲノムDNAとのハイブリダイゼーションを検出する段階、および
(g)ハイブリダイゼーションが(c)では検出されないが(f)では検出された場合、タンデムリピートの数を「2」として特定する段階。
【請求項８】
ハイブリダイゼーションが融解曲線分析によって検出される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
(i)3'末端が蛍光色素によって標識されている請求項4記載のオリゴヌクレオチド、および(ii)蛍光共鳴エネルギーを(i)のオリゴヌクレオチドの3'末端にある蛍光色素に転移させる異なる蛍光色素によって、5'末端が標識されている請求項1記載のオリゴヌクレオチドを用いて、蛍光共鳴エネルギー転移を検出する段階を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
(ii)のオリゴヌクレオチドが配列番号：2のヌクレオチド配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
(i)のオリゴヌクレオチドが配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
(i)のオリゴヌクレオチドを標識する蛍光色素がFITCであり、かつ(ii)のオリゴヌクレオチドを標識する蛍光色素がRED640またはRED705である、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
対象のチミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別を行う方法であって、以下を含む方法：
(a)請求項6記載の方法によって、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定する段階、および
(b)タンデムリピートの数が2のみと特定された場合には対象のチミジル酸シンターゼの遺伝子型が「ホモ接合型2R／2R」、タンデムリピートの数が3のみと特定された場合には「ホモ接合型3R／3R」、またはタンデムリピートの数が「2」と「3」の両方であると特定された場合には「ヘテロ結合型2R／3R」であると決定する段階。
【請求項１４】
チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性を予測する方法であって、以下を含む方法：
(a)請求項13記載の方法によって、対象のチミジル酸シンターゼの遺伝子型を決定する段階、および
(b)チミジル酸シンターゼの遺伝子型を、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関連付ける段階。
【請求項１５】
癌患者を治療するために、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤の投与量および／または種類を決定する方法であって、以下を含む方法：
(a)請求項13記載の方法によって、患者のチミジル酸シンターゼの遺伝子型を決定する段階、および
(b)「ホモ接合型2R／2R」患者に対しては(i)通常用いられる投与量よりも少ない投与量で抗腫瘍剤を投与するか、または(ii)異なる標的を有する抗腫瘍剤を用いるかということを判定する段階。
【請求項１６】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定するためのキットであって、以下を含むキット：
(i)請求項4記載のオリゴヌクレオチド、および
(ii)請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
(i)のオリゴヌクレオチドの3'末端がFITCで標識されていて、かつ(ii)のオリゴヌクレオチドの5'末端が蛍光色素RED640またはRED705で標識されている、請求項16記載のキット。
【請求項１８】
以下を含む、請求項16記載のキット：
(a)配列番号：1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(b)配列番号：2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別（genotyping）に関する。本発明はまた、チミジル酸シンターゼの遺伝子型に基づく、抗腫瘍剤に対する対象（subject）の応答性の予測にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
5-フルオロウラシル（5-FU）は、長期にわたって抗腫瘍剤として利用されてきた化合物である（Heidelberger C, Chaudhuri NK, Danenberg PV, Mooren Dら(1957) Fluorinated pyrimidines: a new class of tumor inhibitory compounds. Nature 179: 663.666）。種々の腫瘍に対する5-FUの抗腫瘍効果が報告されている。
【０００３】
5-FUの細胞毒性効果は細胞におけるDNA合成の阻害に基づく。5-FUは腫瘍組織においてのみならず、非腫瘍組織においてもDNA合成を阻害する。しかし、腫瘍組織では非腫瘍組織と比べてはるかに活発なDNA合成が通常起こっているため、5-FUを介した抑制作用の明らかな影響は腫瘍組織の方が比較的大きいと考えられる。5-FUが腫瘍組織に対して抑制作用を発揮するのはこの機序による。
【０００４】
一方、細胞毒性薬である5-FUの投与には、無視できない有害作用がしばしば伴う。5-FUの細胞毒性効果は腫瘍組織だけでなく非腫瘍組織の働きも失わせる。5-FUを投与された患者における5-FU感受性は、この薬剤の有害作用の規模と密接に関連すると考えられる。
【０００５】
5-FUはチミジル酸シンターゼを標的とするDNA合成阻害剤である。チミジル酸シンターゼは、デオキシウリジル酸のデオキシチミジル酸への細胞内における変換を触媒する。デオキシチミジル酸は、DNA合成のための必須前駆物質であるチミジル酸の唯一のデノボ供給源である（Danenberg PV (1997) Thymidylate synthase. a target enzyme in cancer. Biochim Biophys Acta 473: 73.92）。
【０００６】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーターは多型であることが示されている（Nobuyuki H, Masahiko C, Ryushi N, Keiichi T (1993) Characterization of the regulatory sequences and nuclear factors that function in cooperation with the promoter of the human thymidylate synthase gene. Biochim Biophys Acta 1216: 409.416）。さらに、チミジル酸シンターゼ遺伝子プロモーターの多型が、5-FUに対する対象の応答と関連付けられることが示されている。ヒトチミジル酸シンターゼ遺伝子はその調節領域に28bp配列のタンデムリピートを2つまたは3つ含む多型を有する。3つのタンデムリピートのホモ接合型であるチミジル酸シンターゼ遺伝子の発現レベルは、2つのタンデムリピートのホモ接合型であるチミジル酸シンターゼ遺伝子の発現レベルの3.6倍である。その結果、3つのタンデムリピートを有する対象の方が有害作用が有意に少ない（Pullarkat, ST, Stoehlmacher J, Ghaderi V, Xiong Yら (2001) Thymidylate synthase gene polymorphism determines clinical outcome of patients with colorectal cancer treated with fluoropyrimidine chemotherapy. Pharmacogenomics J 1: 65.70）。
【０００７】
チミジル酸シンターゼは、5-FUだけでなく他の抗腫瘍剤の重要な標的でもある。例えば、5-FUの経口プロドラッグとして開発されたカペシタビンもチミジル酸シンターゼを標的とする。このことから、ヒトチミジル酸シンターゼ遺伝子の調節領域における多型は、抗腫瘍剤に対する対象の応答性を決定するための有用なマーカーとなることが示唆された。
【発明の開示】
【０００８】
発明の開示
本発明の1つの目的は、チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別を行う方法を提供することである。特に、チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別に適したオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のもう1つの目的は、チミジル酸シンターゼの遺伝子型に基づいて、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性を予測する方法を提供することである。
【０００９】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域におけるタンデムリピートの多型は、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関係していることが知られている。したがって、この多型を分析することにより、抗腫瘍剤の有効性または有害作用の度合いを予測することができる。多型は一般に、ゲノムDNAを増幅して、アンプリコンのサイズを分析することによって決定される。PCRによって増幅されたアンプリコンのサイズはゲル電気泳動によって分析される。しかし、ゲル電気泳動は手間も時間もかかる分析技法である。チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤は癌の化学療法において重要な薬剤である。このため、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性に関する情報がより簡便に得られる方法が求められている。
【００１０】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定する方法に関して、広範囲にわたる研究が本発明者らによって実施された。その結果、本発明者らは、特定のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、その中のミスマッチを検出することによって、ゲノムDNA中のタンデムリピートの数を特定しうることを見いだした。さらに、本発明者らは、以上のようにして明らかになったタンデムリピートの数に基づいて対象の遺伝子型を決定しうることを確かめた。さらに、本発明者らは、本発明によって決定されたチミジル酸シンターゼの遺伝子型を、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関連付けることにより、患者における癌を治療するための戦略を計画することが可能であることを見いだした。
【００１１】
すなわち、本発明は、
(a)(i)チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートを構成する3つのリピートユニットのうち中央のリピートユニット、および
(ii)前記中央のリピートユニットの下流に位置するリピートユニット、
からなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、ならびに
(b)高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)の領域とハイブリダイズする、
単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
前述の通り、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートは多型である。すなわち、2つのリピートユニットからなるタンデムリピートと3つのリピートユニットからなるタンデムリピートの2種類のタンデムリピートの存在が明らかにされている。本明細書で言及する「タンデムリピート（tandem repeat）」とは、類似のヌクレオチド配列が2以上繰り返して連続的している領域のことを指す。反復性の類似のヌクレオチド配列はリピートユニットと呼ばれる。一般に、繰り返しの数は2以上である。本発明において、特定すべき繰り返しの数は2および3である。本明細書では以下、3つのリピートユニットがタンデムリピートを構成する多型形態を3Rと記載する。さらに、2つのリピートユニットがタンデムリピートを構成する多型形態を2Rと記載する。これらの多型形態のヌクレオチド配列はDNAデータベース中で見つけることができる（3R：GenBankアクセッション番号AF279906、2R：GenBankアクセッション番号AF279907）。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの多型形態のうち3Rの中央のリピートユニットと中央のリピートユニットの下流に位置するリピートユニットの2つのユニットを含む領域を構成するヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する。より詳細には、GenBankアクセッション番号AF279906に開示されたヌクレオチド配列の132〜193が、上記の(a)で示した領域である。本発明において、相補的ヌクレオチド配列とは、具体的には以下の2種類のヌクレオチド配列を含む： 
(1)あるヌクレオチド配列に対してワトソン-クリックの法則に従って相補的であることが決定されたヌクレオチド配列、または
(2)(1)のヌクレオチド配列に対して80％またはそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列。
【００１３】
(2)は、好ましくは(1)のヌクレオチド配列に対して90％以上、より好ましくは95％以上、さらにより好ましくは97％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのアルゴリズムは公知である。例えば、ヌクレオチド配列の相同性をBLASTを用いて計算するためのアルゴリズムが実用化されている。これらのプログラムはインターネットを介して利用することができる。
【００１４】
本発明者らは、このようなヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを同一条件下でゲノムDNAとハイブリダイズさせたときにこの2種類の多型形態を識別しうることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、このオリゴヌクレオチドは、同一条件下で3Rタンデムリピートとは結合するが2Rとはハイブリダイズしない。
【００１５】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこの領域とハイブリダイズする。本発明において、「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、以下の(1)および(2)の条件を同時に満たすことによって達成される。なお、「実質的にハイブリダイズしない」とは、下記の(1)と同じ条件下でハイブリダイゼーションが検出されないことを意味する：
(1)あるオリゴヌクレオチドが(a)の領域にハイブリダイズし、かつ
(2)そのオリゴヌクレオチドは、その遺伝子のもう1つの多型形態である、2つのリピートユニットからなるタンデムリピートとは実質的にハイブリダイズしない。
【００１６】
本発明において、好ましいオリゴヌクレオチドは、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートを構成する2つのリピートユニットの3'末端リピートユニットに、(b)よりもストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。このオリゴヌクレオチドは本発明の融解曲線分析のために有用である。
【００１７】
上記の条件を満たすオリゴヌクレオチドは本発明において変異プローブと記載することがある。チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーターを構成する複数のリピートユニットは完全に同一ではない。チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域におけるタンデムリピートを構成する3つのリピートユニットのそれぞれのヌクレオチド配列を以下に示す。
5'-ccgcgccacttggcctgcctccgtcccg
ccgcgccacttcgcctgcctccgtcccg
ccgcgccacttcgcctgcctccgtcccccgcccg-3'
【００１８】
したがって、特定のリピートユニットにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが他のリピートユニットにハイブリダイズしない場合もありうる。本発明のオリゴヌクレオチドはこのような現象を利用してデザインされた。好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。関心対象のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者に周知である。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定するために用いることができる。すなわち、本発明は、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定する方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
(a)チミジル酸シンターゼ遺伝子の少なくともプロモーター領域内のタンデムリピートを含むゲノムDNAを増幅する段階、
(b)本発明のオリゴヌクレオチドを、段階(a)の増幅されたゲノムDNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる段階、
(c)前記オリゴヌクレオチドと前記ゲノムDNAとのハイブリダイゼーションを検出する段階、および
(d)ハイブリダイゼーションが検出されない場合にはタンデムリピートの数を「2」として特定し、ハイブリダイゼーションが検出された場合にはタンデムリピートの数を「3」として特定する段階。
【００２０】
好ましくは、本発明の方法はさらに以下を含む：
(e)本発明のオリゴヌクレオチドの、段階(a)の増幅されたゲノムDNAへの、(b)よりもストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション、
(f)前記オリゴヌクレオチドと前記ゲノムDNAとのハイブリダイゼーションを検出する段階、および
(g)ハイブリダイゼーションが(c)では検出されないが(f)では検出された場合に、タンデムリピートの数を「2」として特定する段階。
【００２１】
本発明において、ゲノムDNAは、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定しようとする対象由来の生物試料から入手することができる。例えば、対象から採取した血液細胞からゲノムDNAを得るための方法は公知である。DNAをヌクレオチド配列特異的な様式で増幅することができる任意の方法を、ゲノムDNAの増幅に用いることができる。一般に、ゲノムDNAの増幅にはPCR法が用いられる。DNAの増幅においては、チミジル酸シンターゼ遺伝子の少なくともプロモーター領域内のタンデムリピートを含む任意の領域が増幅されればよい。より詳細には、タンデムリピートを含む少なくとも90bpのゲノムDNAを増幅すべき領域として選択することができる。例えば、後に述べるLightCyclerを用いて融解曲線分析によってハイブリダイゼーションを検出する場合、増幅すべきDNAの長さは、通常700bp以下である。
【００２２】
チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定するための本発明の方法は、変異プローブを増幅されたゲノムDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる段階を含む。変異プローブは、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域における多型形態のうち3Rには結合するが2Rには結合しない。したがって、変異プローブのハイブリダイゼーションを指標として用いることで、タンデムリピートの数を決定することができる。変異プローブのハイブリダイゼーションを検出するためには、DNAのハイブリダイゼーションを検出するための任意の方法を利用することができる。
【００２３】
本発明においては、融解曲線分析が、DNAのハイブリダイゼーションを利用してヌクレオチド配列の違いを検出するための好ましい方法である。あるオリゴヌクレオチドが、相補配列を有するポリヌクレオチドに結合する。DNAハイブリダイゼーションは配列特異的であるが、極めて類似性の高いヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションを完全に除外することは困難である。融解曲線分析は、ハイブリダイゼーションの変化を融解温度（Tm）の変化に基づいて検出する方法である。互いに相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖DNA（dsDNA）は、温度が上昇すると徐々に解離して一本鎖DNA（ss DNA）となる。ds DNAからss DNAへの変化と温度変化との関係をグラフ上にプロットすると、ss DNAへの変化は直線的ではなく、特定の温度で急激に起こる。ss DNAへのこの急激な変化が起こる温度がTmである。Tmは、ヌクレオチド配列およびそのDNAが存在する溶液の組成といった種々の要因に応じて変化する。しかし、特定の条件下では、ヌクレオチド配列に違いがある場合、Tmはヌクレオチド配列に依存して明らかに変化する。このため、あるオリゴヌクレオチドの標的配列に対するTmの違いは、標的配列の違いがたとえわずかであっても容易に検出することができる。融解曲線分析は、以上のようにして検出されるTmの違いに基づいて、ヌクレオチド配列のわずかな違いの高感度検出を容易にする方法である。
【００２４】
融解曲線分析に基づいて本発明の方法を実施するために、3Rおよび2Rに対する変異プローブのTmの違いを検出してもよい。融解曲線分析では、標的配列に対する変異プローブのハイブリダイゼーションを観察する必要がある。ハイブリダイゼーションを観察するための方法に制限はない。本発明において、ハイブリダイゼーションを観察するための好ましい方法には、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）法の適用が含まれる。FRETは、標的配列上で隣接した領域にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションによって互いに近接するという事実を利用してハイブリダイゼーションを検出するための方法である。2つの隣接したオリゴヌクレオチドの末端は、ドナーまたはアクセプターとして機能する異なるフルオロフォア（fluorophore）によって標識されている。この2つがハイブリダイゼーションのために近接すると、フルオロフォア間のエネルギー転移に起因する特徴的な蛍光発光を検出することができる。
【００２５】
FRETを本発明の方法に対して適用するためには、変異プローブのハイブリダイゼーションを検出するために変異プローブに隣接した領域にハイブリダイズする、第2のオリゴヌクレオチドが必要である。本発明者らは、前記の特性(a)および(b)を有するオリゴヌクレオチドを変異プローブとして用いる場合、その5'側にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが第2のオリゴヌクレオチドとして有用であることを見いだした。より詳細には、本発明は
(a)(i)チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートを構成する3つのリピートユニットのうち中央のリピートユニット、および
(ii)前記中央のリピートユニットの下流に位置するリピートユニット、
からなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、ならびに
(b)(a)の領域とハイブリダイズする、
というオリゴヌクレオチドの5'側に隣接した領域にハイブリダイズする、単離されたオリゴヌクレオチドに関する。
【００２６】
本発明において、「オリゴヌクレオチドの5'側に隣接した領域」とは、標的ヌクレオチド上においてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の5'側の領域のことを指す。「に隣接した」とは、オリゴヌクレオチドの末端と第2のオリゴヌクレオチドが、0〜10塩基、好ましくは0〜5塩基離れて隣接している場合を含む。本発明において、FRETのための第2のオリゴヌクレオチドを用いる場合、アンカープローブと呼ぶことがある。アンカープローブのTmは3Rタンデムリピートに対する変異プローブのTmと同等、またはそれ以上であることが好ましい。ゲノムDNAと各プローブとの関係を図1に示した。
【００２７】
変異プローブのハイブリダイゼーションは、PCRを行いながらFRETによって観察することができる。すなわち、ゲノムDNAを増幅しながら変異プローブのハイブリダイゼーションを検出することができる。PCRの最中に変異プローブのハイブリダイゼーションを検出するためには、変異プローブおよびアンカープローブのTmをアンプリコンに対するハイブリダイゼーションがPCRのアニーリング段階で起こるようにデザインすることが好ましい。Tmを適切な範囲に調整するために、変異プローブおよびアンカープローブのヌクレオチド配列にミスマッチ塩基を導入することができる。さらに、DNAポリメラーゼによるプローブの伸長を防止するために、各プローブの3'末端を修飾することが好ましい。例えば、5'末端がフルオロフォアで標識されているオリゴヌクレオチドを、リン酸化によってその3'末端を修飾してもよい。
【００２８】
PCR中の変異プローブのハイブリダイゼーションを検出するためにFRETを用いる装置が市販されている。例えば、LightCycler（商標）には、FRETによってPCRアンプリコンを分析するために必要なメカニズムおよびソフトウエアが備わっている。このような装置を用いて本発明を実施することができる。以下に、本発明の方法を、変異プローブおよびアンカープローブを用いてLightCycler（商標）によって本発明の方法を実施するための具体的なプロトコールを述べる。
【００２９】
チミジル酸シンターゼ遺伝子の少なくともプロモーター領域内のタンデムリピートを含むゲノムDNAを、特異的プライマーを用いてヒトゲノムDNAから増幅する。変異プローブおよびアンカープローブをハイブリダイゼーションプローブの特異的な対として用いてこのアンプリコンを蛍光によって検出する。ハイブリダイゼーションプローブは、PCRサイクルのアニーリング段階の際に増幅断片の内部配列にハイブリダイズする異なる2つの短いオリゴヌクレオチドからなる。一方のプローブ（変異プローブ）は5'末端がLightCycler-Red 640で標識されており、その3'末端は伸長を防止するためにリン酸化によって修飾される。第2のプローブ（アンカープローブ）は3'末端をフルオレセインで標識されている。この2つのプローブはテンプレートDNAに対するハイブリダイゼーションによって初めて近接し、その結果、2つのフルオロフォアの間で蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が起こる。FRETの過程では、ドナーフルオロフォアであるフルオレセインがLightCycler装置の光源によって励起され、励起エネルギーの一部がアクセプターフルオロフォアであるLightCycler-Red 640へと転移する。続いて、発せられたLightCycler-Red 640の蛍光をLightCycler装置によって測定する。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、増幅サイクルが完了してアンプリコンが形成された後に融解曲線分析を行うことによって遺伝子型を決定するためにも用いられる。
【００３１】
フルオレセイン標識された本発明のオリゴヌクレオチドは、変異していない標的配列の部分にハイブリダイズし、アンカープローブとして機能する。
【００３２】
Light Cycler-Red640で標識されたもう一方のオリゴヌクレオチドはリピートユニットにかかる(span)（変異プローブ）。この後者のプローブはアンカープローブよりも融解温度（Tm）が低く、そのために融解曲線分析の際に生じた蛍光シグナルを変異プローブのみによって確実に決定することができる。Tmは、変異プローブおよびテンプレートDNAの長さおよびG＋C含有量だけでなく、変異プローブとテンプレートDNAとの相同性の程度にも依存する。2R型タンデムリピートが存在する場合には、変異プローブと標的とのミスマッチによってそのハイブリッドが不安定化する。3R型タンデムリピートの場合にはミスマッチが起こらず、ハイブリッドのTmはより高くなる。温度を緩徐に上昇させ、変異プローブが融解解離すると、2つの蛍光色素は近接状態ではなくなり、蛍光が減少する。変異した遺伝子型の場合には、これが野生型の遺伝子型よりも低い温度で起こると考えられる。
【００３３】
チミジル酸シンターゼの5R型タンデムリピートが最近報告されている（Luo HR, Lu XM, Yao YG, Horie N, Takeishi K, Jorde LB, Zhang YP. (2002) Length polymorphism of thymidylate synthase regulatory region in hinese populations and evolution of the novel alleles. Biochem Genet 40(1-2): 41-51）。本発明の変異プローブは3R型のものに加えて5R型タンデムリピートともハイブリダイズすると考えられる。しかし、このプローブが3R型と5R型を識別できるか否かは重大な違いを生まない。本発明における遺伝子型判別および応答性の予測は、このプローブが応答性の高い2R型を他の多型タイプと識別しうる限り実施することができる。
【００３４】
上記の通りに、本発明により決定されたタンデムリピートの数に基づいてチミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型を明らかにする。より詳細には、本発明は、対象のチミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別を行う方法であって、以下を含む方法を提供する：
(a)本発明の方法によって、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定する段階、および
(b)タンデムリピートの数が2のみと特定された場合には対象のチミジル酸シンターゼの遺伝子型が「ホモ接合型2R／2R」、タンデムリピートの数が3のみと特定された場合には「ホモ接合型3R／3R」、またはタンデムリピートの数が「2」と「3」の両方であると特定された場合には「ヘテロ結合型2R／3R」であると決定する段階。
【００３５】
LightCyclerを他の遺伝子の遺伝子型判別のために用いた報告がある（Nicolas Von Ahsenら、Clinical Chemistry 46: 12, 1939-1945 (2000)、DNA base bulge vs unmatched end formation in probe-based diagnostic insertion/deletion genotyping: Genotyping the UGT1A1 (TA)n polymorphism by real-time fluorescence PCR）。しかし、本発明より以前に、LightCyclerはチミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別のために用いられていない。
【００３６】
明らかにされたチミジル酸シンターゼの遺伝子型に基づいて、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性を予測することができる。より詳細には、本発明は、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性を予測する方法であって、以下を含む方法を提供する：
(a)本発明の方法によって、対象のチミジル酸シンターゼの遺伝子型を決定する段階、および
(b)チミジル酸シンターゼの遺伝子型を、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関連付ける段階。
【００３７】
本発明において、「チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性を予測する」とは、ある特定の患者および／または患者から採取された腫瘍組織に対する、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤の細胞毒性活性の程度の予測を指す。前述の通り、チミジル酸シンターゼの遺伝子型は、チミジル酸シンターゼの発現レベルを決定する大きな要因の一つである。さらに、チミジル酸シンターゼの発現レベルは、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関連付けられている。すなわち、チミジル酸シンターゼの発現レベルはこの応答性と逆相関する。したがって、遺伝子型と応答性を相関付けることができる。具体的には、本発明によれば、チミジル酸シンターゼの遺伝子型がホモ接合型2R／2Rであると決定された対象は応答性が高いと予想される。すなわち、この対象では、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤の細胞毒性活性が高いことが予想される。一方、その遺伝子型が2R／3Rヘテロ接合型または3R／3Rホモ接合型であると決定された対象は、応答性が正常であると予想される。すなわち、この対象では、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤の細胞毒性活性が正常であることが予想される。「正常な細胞毒性活性」とは、薬剤を通常の投与プロトコールに従って投与した場合に重篤な薬物有害作用の可能性が高くない状態のことを指す。または、これは、投与量が通常の投与プロトコールに準じた投与量でなければ、薬剤の腫瘍組織に対する抑制作用が期待できない状態のことを指す。
【００３８】
本発明において、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤には、チミジル酸シンターゼの活性を直接的または間接的に調節する作用を有する抗腫瘍剤が含まれる。5-FU系抗腫瘍剤の作用機序の一つは、その代謝産物であるFdUMPによってチミジル酸シンターゼの活性を阻害することである。チミジル酸シンターゼは5-FU系抗腫瘍剤の直接的な標的酵素である。一方、白血病などの処置のために用いられるメトトレキサートに対する応答性もチミジル酸シンターゼの遺伝子型と関連があると考えられている（The Lancet Vol.359, 1033-1034, March 23, 2002）。メトトレキサートはジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤である。これに対して、チミジル酸シンターゼによって触媒される反応はジヒドロ葉酸の還元を要求する。すなわち、メトトレキサートは、チミジル酸シンターゼを間接的に阻害する抗腫瘍剤である。本発明の方法は、チミジル酸シンターゼに対して間接的な阻害作用を有するこのような抗腫瘍剤に対する応答性を予測することができる。本発明の方法によって応答性を予測しうる抗腫瘍剤の例として、5-FU、カルモフール、テガフール、UFT、S-1、ドキシフルリジン、カペシタビン、フルダラビン、メトトレキサート、ロイコボリンおよびレボホリナートがある。
【００３９】
このようにして決定された応答性に基づいて、癌に対する癌化学療法をデザインすることができる。より詳細には、本発明は、癌患者を処置するために、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤の投与量および／または種類を決定する方法であって、以下を含む方法を提供する：
(a)本発明の方法によって、患者のチミジル酸シンターゼの遺伝子型を決定する段階、および
(b)「ホモ接合型2R／2R」患者に対しては(i)通常用いられる投与量よりも少ない投与量で抗腫瘍剤を投与するか、または(ii)異なる標的を有する抗腫瘍剤を用いるかということを判定する段階。
【００４０】
チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する応答性が高いことが予測された患者に対しては、抗腫瘍剤の投与量を減したり、または異なる標的を有する抗腫瘍剤を選択することが推奨される。その結果として、患者を薬物有害作用に曝す危険性を減らすことができる。
【００４１】
さらに、本発明は、チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数を特定するためのキットであって、以下を含むキットも提供する：
(a)配列番号：1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(b)配列番号：2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００４２】
前述の通り、本発明のキットを構成するオリゴヌクレオチドは、FRETのためのフルオロフォアで標識することができる。さらに、付加的な要素を本発明のキットと組み合わせることもできる。付加的な要素の例としては以下のものがある：
ハイブリダイゼーションバッファー、
2Rおよび／または3Rの結果が得られる対照試料、ならびに
PCR用のDNAポリメラーゼおよび物質。
【００４３】
本明細書中に引用した特許、特許出願および刊行物はいずれも参照として組み入れられる。
【００４４】
発明を実施するための最良の態様
1）DNAの抽出 
ゲノムDNAをヒト全血100μlから精製した。精製のためにはGFX（商標）Genomic Blood DNA Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech）を用いた。
【００４５】
2）PCRプライマーFW、PCRプライマーREV、ハイブリダイゼーションプローブ（アンカー）およびハイブリダイゼーションプローブ（変異）の配列：
PCRフォワードプライマーの配列  5'-GTG GCT CCT GCG TTT CCC C-3'
PCRリバースプライマーの配列  5'-TCC GAG CCG GCC ACA GGC AT-3'
ハイブリダイゼーションプローブ（アンカー）の配列  5'-CGC GGA AGG GGT CCT GCC ACC GCG CCA CTT GGC CTG CCT CGG TCC CGC CG-FITC-3'
ハイブリダイゼーションプローブ（変異）の配列  5'-LCRed640-CTT GGC CTG CCT CCG TCC CGC CGC GCC-リン酸化-3'
【００４６】
プライマーは株式会社サワディー・テクノロジーにより合成され、プローブは株式会社日本遺伝子研究所により合成された。
【００４７】
3）PCR混合物の調製
LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit（Roche Diagnostics）を用いた。PCR混合物は以下の組成物から調製した。
2006500943.tif 000002
【００４８】
4）LightCyclerを用いたPCR
LightCyclerを用いるPCRのための実験プロトコール
実験プロトコール
2006500943.tif 000003
【００４９】
5）LightCyclerを用いた融解曲線分析
分析はLightCyclerの融解曲線プログラムを用いることによって実施した。蛍光はF2／F1に設定した。「ステップ1：融解ピーク」の「計算方法」は「バックグラウンド補正付きの直線」に設定した。ベースラインの調整のために、低温側にあるカーソル（緑色）を62℃前後に設定し、高温側にあるカーソルを83℃前後に設定した。融解ピーク面積の計算のために「ステップ2：ピーク面積」を選択し、各試料に関してTm値、ピーク面積および標準偏差を得るためにピークの数を選択した。
【００５０】
6）決定
ピークTm値が68〜70℃のみであった配列を2R／2Rホモ接合型と決定し、ピークTm値が76〜79℃のみであった配列を3R／3Rホモ接合型と決定した。両方のTm値が得られた配列は2R／3Rヘテロ接合型と決定した。
【００５１】
産業上の利用可能性
チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別を行うためのオリゴヌクレオチドを提供する。チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域内のタンデムリピートの数は、オリゴヌクレオチドのゲノムDNAへのハイブリダイゼーションに基づいて特定することができる。ハイブリダイゼーションに基づく特定はゲル電気泳動に比べて簡単で、かつ迅速である。本発明のオリゴヌクレオチドを用いると、ミスマッチを指標として容易にタンデムリピートの数を特定しうる。
【００５２】
したがって、チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型をタンデムリピートの数に基づいて決定することができる。この遺伝子型は、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する対象の応答性と関連がある。このため、本発明に基づき、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する応答性を予測することが可能である。さらに、本発明に従って予測された応答性に基づいて、癌に対する化学療法をデザインすることができる。より詳細には、チミジル酸シンターゼを標的とする抗腫瘍剤に対する応答性が高いことが予測された患者に対しては、抗腫瘍剤の投与量を減らすこと、または異なる標的を有する抗腫瘍剤を選択することが推奨される。その結果として、患者を薬物有害作用に曝す危険性を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】2Rおよび3Rのタンデムリピートと、そのタンデムリピートとハイブリダイズする2つのプローブとの関係を示している。図中のヌクレオチド配列は、アンカープローブ（上）、ゲノムDNAのタンデムリピート（中）および変異プローブ（下）を示している。リピートユニットの配列はイタリック体になっている。各リピートユニットはスペースで区切られている。配列の検証が容易となるように、すべての配列はセンス鎖の配列として示している。実際には、ゲノムDNAおよび各プローブのいずれか一方はアンチセンス配列である。
【図１】
2006500943.tif 000004
【配列表】
2006500943000001.app
【国際調査報告】
2006500943.tif 000005
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