(57)【要約】本発明は、動物における受胎を調節するための組成物および方法に関する。より具体的には、該組成物は、配偶子形成および初期発生においてmRNAの分解を調節する。さらに本発明は、過剰増殖性疾患のような生殖器官の疾患を調節するための医薬組成物および方法に関する。
2006502738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、および配列番号11からなる群より選ばれる核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド配列であって、該タンパク質が、
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12をコードするポリヌクレオチド配列、
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12との一致度が少なくとも60％であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、
(c)0.02M〜約0.15MのNaClで約50℃〜約70℃の温度のハイブリダイゼーション条件下、(a)のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
(d)(a)、(b)または(c)に相補的な単離されたポリヌクレオチド配列
からなる群より選ばれる、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
プロモーター配列に作動的に連結された請求項1または2のポリヌクレオチド配列を含む発現カセット。
【請求項４】
請求項3の発現カセットを含むベクター。
【請求項５】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド配列。
【請求項６】
請求項1または2のポリヌクレオチド配列によりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項７】
該ポリペプチドがOASL活性を有する、請求項5または6の単離されたポリペプチド配列。
【請求項８】
請求項1または2のポリヌクレオチド配列の有効量を含む、OASL活性を調節するための組成物。
【請求項９】
請求項5または6のポリペプチド配列の有効量を含む、OASL活性を調節するための組成物。
【請求項１０】
請求項5のポリペプチドに免疫学的に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項6のポリペプチドに免疫学的に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項5のポリペプチドに免疫学的に結合するポリクローナル抗血清抗体。
【請求項１３】
請求項6のポリペプチドに免疫学的に結合するポリクローナル抗血清抗体。
【請求項１４】
請求項5のポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１５】
請求項6のポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１６】
請求項10、11、12または13の抗体を含む組成物。
【請求項１７】
請求項3の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項１８】
該細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項17の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項1または2のポリヌクレオチド配列を含むトランスジェニック動物。
【請求項２０】
該動物がげっ歯動物、マウスまたはラットである、トランスジェニック動物。
【請求項２１】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列を含むトランスジェニック動物。
【請求項２２】
請求項1のポリヌクレオチドまたはその機能的等価物の相補物を含むアンチセンス分子。
【請求項２３】
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群より選ばれるOASLポリヌクレオチドであって、該OASLポリヌクレオチドが配列番号23、配列番号25または配列番号27のアンタゴニストである、OASLポリヌクレオチド。
【請求項２４】
該OASLポリヌクレオチドが配列番号24、配列番号26または配列番号28のアンタゴニストである、請求項23のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項4の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２６】
ポリペプチドを生産するための方法であって、
該ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項17または25に記載の宿主細胞を培養する工程、および
該宿主細胞培養物から該ポリペプチドを回収する工程
を含む方法。
【請求項２７】
薬学的に許容される担体中に分散されたOASL発現のモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項２８】
該モジュレーターがOasl6遺伝子の転写を抑制する、請求項27の組成物。
【請求項２９】
該モジュレーターがOasl6遺伝子の転写を促進する、請求項27の組成物。
【請求項３０】
該モジュレーターがOasl7遺伝子の転写を抑制する、請求項27の組成物。
【請求項３１】
該モジュレーターがOasl7遺伝子の転写を促進する、請求項27の組成物。
【請求項３２】
該モジュレーターがOasl8遺伝子の転写を抑制する、請求項27の組成物。
【請求項３３】
該モジュレーターがOasl8遺伝子の転写を促進する、請求項27の組成物。
【請求項３４】
該モジュレーターがOasl9遺伝子の転写を抑制する、請求項27の組成物。
【請求項３５】
該モジュレーターがOasl9遺伝子の転写を促進する、請求項27の組成物。
【請求項３６】
該モジュレーターがOasl10遺伝子の転写を抑制する、請求項27の組成物。
【請求項３７】
該モジュレーターがOasl10遺伝子の転写を促進する、請求項27の組成物。
【請求項３８】
該モジュレーターがOasl11遺伝子の転写を抑制する、請求項27の組成物。
【請求項３９】
該モジュレーターがOasl11遺伝子の転写を促進する、請求項27の組成物。
【請求項４０】
該モジュレーターがポリペプチドである、請求項27の組成物。
【請求項４１】
該モジュレーターが小分子である、請求項27の組成物。
【請求項４２】
該モジュレーターがポリヌクレオチド配列である、請求項27の組成物。
【請求項４３】
該ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである、請求項27の組成物。
【請求項４４】
発現ベクターをさらに含み、該発現ベクターが、作動的に連結されたプロモーターおよびポリヌクレオチド配列を含む、請求項43の組成物。
【請求項４５】
薬学的に許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項４６】
該組成物はOASL活性を阻害する、請求項45の組成物。
【請求項４７】
該組成物はOASL活性を刺激する、請求項45の組成物。
【請求項４８】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項45の組成物。
【請求項４９】
OASLの活性を調節する化合物を同定または識別する方法であって、
単離されたOASLポリペプチドまたはその機能的等価物を得る工程、
該OASLポリペプチドまたはその機能的等価物を候補化合物と混合する工程、および
OASLの活性に対する該候補化合物の効果を測定する工程
を含む、方法。
【請求項５０】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項49の方法。
【請求項５１】
該効果はmRNA分解の減少である、請求項49の方法。
【請求項５２】
該効果はmRNA分解の増加である、請求項49の方法。
【請求項５３】
OASLの活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法であって、
(a)OASLまたはそのOASL結合断片を候補化合物に暴露すること、
(b)OASLまたはそのOASL結合断片に該化合物が結合するかどうかを決定すること、および
(c)OASL活性またはOASLとその結合パートナーとの相互作用を該化合物が調節するかどうかをさらに決定すること
を含む、方法。
【請求項５４】
OASLタンパク質と結合する相互作用タンパク質についてスクリーニングする方法であって、
(a)OASLタンパク質またはそのOASL断片を候補化合物に暴露すること、および
(b)該化合物がOASLタンパク質に結合するかどうかを決定すること（ここで、該候補化合物のOASLタンパク質への結合は、相互作用タンパク質であることを意味する）
を含む、方法。
【請求項５５】
OASL活性をもたらす化合物を同定または識別する方法であって、
(a)OASLタンパク質をコードする一つ以上の調節可能な遺伝子、OASLタンパク質をコードする一つ以上の遺伝子のノックアウト、またはOASLタンパク質をコードする一つ以上の遺伝子のノックインを有するトランスジェニック動物を用意する工程、
(b)工程(a)のトランスジェニック動物に対する対照動物を用意する工程、
(c)該トランスジェニック動物の群および対照動物の群をOASL調節候補化合物に暴露する工程、および
(d)該トランスジェニック動物および該対照動物を比較し、該トランスジェニック動物における不妊または妊性に関係する一つ以上のOASLタンパク質への該化合物の効果を、該対照動物と比較して決定する工程
を含む、方法。
【請求項５６】
ペプチド結合対の第一のペプチドおよび第二のペプチドの結合相互作用を検出する方法であって、
(i)選択された表現型を検出するのに適した条件下で少なくとも一種の真核細胞を培養する工程（ここで、該細胞は、(a)転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合される該第一のペプチドまたはそのセグメントを含む第一の異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、(b)転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合される該第二のペプチドまたはそのセグメントを含む第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ここで、該第一のペプチドまたはそのセグメントと該第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合によって転写活性化タンパク質が再構成される）、および(c)該再構成される転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるレポーター要素（ここで、該レポーター要素の発現は、選択された表現型をもたらす）を含む）、および
(ii)該選択された表現型をもたらす該レポーター要素の発現のレベルを測定することにより、該ペプチド結合対の結合相互作用を検出する工程を含み、
ここで、該第一または第二のペプチドはOASLペプチドであり、その他方のペプチドは試験ペプチド、好ましくは、卵巣に存在する選択されたペプチド／タンパク質である、方法。
【請求項５７】
ペプチド結合対の第一のペプチドおよび第二のペプチドの結合相互作用を検出するためのレスキュースクリーニングであって、
(i)選択された表現型を検出するためまたはそのような表現型の不在を検出するための条件下で少なくとも一種の真核細胞を培養すること(ここで、該細胞は、(a)転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合される該第一のペプチドまたはそのセグメントを含む第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、(b)転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合される該第二のペプチドまたはそのセグメントを含む第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ここで、該第一のペプチドまたはそのセグメントと該第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合によって転写活性化タンパク質が再構成される）、および(c)該再構成される転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるレポーター要素（ここで、該レポーター要素の発現は、選択された表現型の発現を妨げる）を含む)、および
(ii)該選択された表現型の発現を妨げる該レポーター要素の発現に、試験ペプチドが影響するかどうかを決定することにより、該試験ペプチドのOASLと相互作用する能力を検出する工程を含み、
ここで、該第一または第二のペプチドはOASLペプチドであり、その他方のペプチドは試験ペプチド、好ましくは、卵巣に存在する選択されたペプチド／タンパク質である、方法。
【請求項５８】
OASLに対する結合パートナーを同定または識別する方法であって、
(a)該タンパク質を結合パートナー候補に暴露する工程、および
(b)該結合パートナー候補がOASLに結合するかどうかを決定する工程
を含む方法。
【請求項５９】
OASL活性のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって、
OASLポリペプチドを発現させる細胞を用意する工程、
該細胞を候補モジュレーターと接触させる工程、
OASLの発現を測定する工程、および
該候補モジュレーターの存在下における該OASLの発現を、該候補モジュレーターの不在下におけるOASL発現の発現と比較する工程を含み、
ここで、該候補モジュレーターの不在下におけるOASLの発現に対して該候補モジュレーターの存在下におけるOASLの発現が異なれば、該候補モジュレーターがOASL発現のモジュレーターであることが確認される、方法。
【請求項６０】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項59の方法。
【請求項６１】
OASL活性のモジュレーターを生産する方法であって、
OASLポリペプチドを発現させる細胞を用意する工程、
該細胞を候補モジュレーターと接触させる工程、
OASLの発現を測定する工程、
該候補モジュレーターの存在下における該OASLの発現を、該候補モジュレーターの不在下におけるOASL発現の発現と比較する工程（ここで、該候補モジュレーターの不在下におけるOASLの発現に対して該候補モジュレーターの存在下におけるOASLの発現が異なれば、該候補モジュレーターがOASL発現のモジュレーターであることが確認される）、および
該モジュレーターを生産する工程
を含む、方法。
【請求項６２】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項61の方法。
【請求項６３】
動物の生殖細胞または初期胚におけるmRNAの分解を調節する方法であって、OASL活性の阻害剤を該動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項６４】
該生殖細胞が卵母細胞または卵である、請求項63の方法。
【請求項６５】
該生殖細胞が精細胞または精子である、請求項63の方法。
【請求項６６】
該阻害剤がOasl6遺伝子の転写を抑制する、請求項63の方法。
【請求項６７】
該阻害剤がOasl7遺伝子の転写を抑制する、請求項63の方法。
【請求項６８】
該阻害剤がOasl8遺伝子の転写を抑制する、請求項63の方法。
【請求項６９】
該阻害剤がOasl9遺伝子の転写を抑制する、請求項63の方法。
【請求項７０】
該阻害剤がOasl10遺伝子の転写を抑制する、請求項63の方法。
【請求項７１】
該阻害剤がOasl11遺伝子の転写を抑制する、請求項63の方法。
【請求項７２】
該阻害剤がポリペプチドである、請求項63の方法。
【請求項７３】
該阻害剤がポリヌクレオチド配列である、請求項63の方法。
【請求項７４】
該ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである、請求項73の方法。
【請求項７５】
発現ベクターをさらに含み、該発現ベクターが、作動的に連結されたプロモーターおよびポリヌクレオチド配列を含む、請求項73の方法。
【請求項７６】
該ベクターが細菌ベクター、ウイルスベクターまたは哺乳動物ベクターである、請求項75の方法。
【請求項７７】
該RNAがアンチセンスOaslRNAである、請求項74の方法。
【請求項７８】
該RNAがOaslRNAの干渉RNAである、請求項74の方法。
【請求項７９】
薬理学上許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、該量が受胎を低減させることができるものである、避妊の方法。
【請求項８０】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10、およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項79の方法。
【請求項８１】
該OASLはOASL6である、請求項80の方法。
【請求項８２】
該動物は雌である、請求項79の方法。
【請求項８３】
該動物は雄である、請求項79の方法。
【請求項８４】
動物の生殖細胞または初期胚におけるmRNAの分解を調節する方法であって、OASL活性の刺激剤を該動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項８５】
該生殖細胞が卵母細胞または卵である、請求項84の方法。
【請求項８６】
該生殖細胞が精細胞または精子である、請求項84の方法。
【請求項８７】
該刺激剤がOasl6遺伝子の転写を促進する、請求項84の方法。
【請求項８８】
該刺激剤がOasl7遺伝子の転写を促進する、請求項84の方法。
【請求項８９】
該刺激剤がOasl8遺伝子の転写を促進する、請求項84の方法。
【請求項９０】
該刺激剤がOasl9遺伝子の転写を促進する、請求項84の方法。
【請求項９１】
該刺激剤がOasl10遺伝子の転写を促進する、請求項84の方法。
【請求項９２】
該刺激剤がOasl11遺伝子の転写を促進する、請求項84の方法。
【請求項９３】
該刺激剤がポリペプチドである、請求項84の方法。
【請求項９４】
該刺激剤がポリヌクレオチド配列である、請求項84の方法。
【請求項９５】
該ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである、請求項94の方法。
【請求項９６】
発現ベクターをさらに含み、該発現ベクターが、作動的に連結されたプロモーターおよびポリヌクレオチド配列を含む、請求項94の方法。
【請求項９７】
該ベクターが細菌ベクター、ウイルスベクターまたは哺乳動物ベクターである、請求項96の方法。
【請求項９８】
薬理学上許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、該量が受胎を低減させることができるものである、妊性を増強する方法。
【請求項９９】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10、およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項79の方法。
【請求項１００】
該OASLはOASL6である、請求項80の方法。
【請求項１０１】
該動物は雄である、請求項98の方法。
【請求項１０２】
該動物は雌である、請求項98の方法。
【請求項１０３】
OASLポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける突然変異を確認することを含む、不妊を診断する方法。
【請求項１０４】
薬理学上許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含む、過剰増殖性疾患を調節する方法。
【請求項１０５】
該OASLがOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10およびOASL11からなる群より選ばれる、請求項104の方法。
【請求項１０６】
該動物が雄である、請求項104の方法。
【請求項１０７】
該動物が雌である、請求項104の方法。
【請求項１０８】
該過剰増殖性疾患がさらに癌であると定義される、請求項104の方法。
【請求項１０９】
該癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝細胞癌、網膜芽腫、星状細胞腫、グリア芽腫、白血病、神経芽腫、扁平上皮細胞癌、頭部癌、頸部癌、歯肉部癌、舌癌、乳癌、すい臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳腫瘍、大腸癌、および膀胱癌からなる群より選ばれる、請求項104の方法。
【請求項１１０】
該過剰増殖性疾患は、良性前立腺肥大（BPH）、慢性関節リウマチ、炎症性の腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、前新生物性の病変、上皮内癌、口腔毛髪状白斑、および乾癬からなる群より選ばれる、請求項104の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第60/381,408号（2003年5月17日出願）に基づく優先権を主張するものであり、その内容は、この引用により本明細書に記載されたものとする。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（National Institute of Health）により認められたNIH認可番号HD42500の下、政府の援助によってなされたものである。米国政府は本発明において所定の権利を有しうる。
【０００３】
本発明は、医薬の分野に関する。とりわけ本発明は、動物において受胎を調節するための医薬組成物および方法に関する。さらに本発明は、生殖器官の疾患、たとえば過剰増殖性の疾患を調節するための医薬組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ウイルス感染とインターフェロンは、2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ（OAS）の発現を誘発する（Rebouillat他、1999）。これらOASタンパク質類は、ヒトおよびマウスにおいて「普遍的に」発現される。報告によれば、ヒトにおいて、三つのOAS遺伝子（小：OAS1、中：OAS2、大：OAS3）及び一つのOAS様遺伝子（OASL）があり、それらは、ヒト第１２染色体上でつながっている。遺伝子重複から生じたものであり、「小さな」OASタンパク質をコードする二つのマウスOAS遺伝子（Oas1AおよびOas1B）があり、さらに、OAS様遺伝子（Oasl5）がある。OASL5タンパク質はマウスOAS1Aおよび1Bと60％一致する（Shibata他、2001）が、ヒトOASLとは全く異なる。三つのヒトOASタンパク質とマウスOASタンパク質（OASLまたはOASL5を除く）とは、二本鎖（ds）RNAの存在下、ATPをアデノシンの2',5'-結合オリゴマー（2-5A）に変換する能力を有する点で共通している。GTPもまたOASの基質として作用し得るが、これのインビボでの重要性はわかっていない。2-5AオリゴマーはRNアーゼLに結合してそれを活性化し、ウイルスおよび細胞のRNAの分解をもたらし、それによりタンパク質産生をダウンレギュレーションする。しかし、ウイルスの感染と関係のない細胞のプロセス（例えば、受精後の卵母細胞mRNA種の分解）において、OASまたはOAS様タンパク質がRNアーゼLに依存しない抗ウイルス活性または機能を有するかどうかはわかっていない。
【０００５】
そこで、本発明者らは、OASが関連するファミリーメンバーを同定し、オリゴアデニレートシンテターゼ様タンパク質が配偶子形成および初期胚発生において機能することを最初に明らかにした。そのタンパク質の調節は、避妊、妊性、細胞増殖性疾患、例えばガンや他の増殖性疾患において役割を果たすと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規なポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの変形物に関する。本発明の組成物は、配偶子形成または初期胚発生に関係する。新規なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、配偶子形成または初期胚発生に重要なmRNA分解経路を媒介すると考えられる。さらに、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、細胞増殖に役割を果たすmRNA分解経路を媒介し得る。
【０００７】
本発明は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、および配列番号11のポリヌクレオチド配列、それらがコードするタンパク質産物、それらの断片、ホモログおよび誘導体、ならびにそれらのタンパク質産物と免疫反応する抗体を提供する。
【０００８】
特定の一態様において、本発明は核酸分子を提供する。これら特定の核酸は、天然由来のcDNA、ゲノムDNA、RNAもしくはこれらの核酸の一つの断片であってもよく、または、天然由来でない核酸分子であってもよい。好ましい態様において、該核酸分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、または配列番号12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。他の態様において、該核酸分子は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、および配列番号11の核酸配列を含む。核酸分子には、性腺の特定のタンパク質をコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズする配列または性腺の特定のタンパク質をコードする核酸分子に配列が実質的に類似する配列も含まれ、あるいは、性腺の特定の核酸に選択的にハイブリダイズする核酸または性腺の特定の核酸に配列が実質的に類似する核酸も含まれ、さらには、性腺の特定のタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子変異体および性腺の特定の核酸の対立遺伝子変異体も含まれる。
【０００９】
また意図するところでは、本発明のポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列に作動的に連結された本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットとすることができる。さらに、該発現カセットはベクター中に構成することができる。
【００１０】
本発明の他の態様は、薬学的に許容される担体中に分散されたOASL発現のモジュレーターを含む医薬組成物である。該モジュレーターは、Oasl遺伝子、たとえば、Oasl6、Oasl7、Oasl8、Oasl9、Oasl10、またはOasl11の転写を抑制および／または促進する。具体的に、該モジュレーターは、ポリペプチド、小分子、ポリヌクレオチド配列（例えばDNAまたはRNA）および／またはポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターでありうる。
【００１１】
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。該モジュレーターは、OASLの活性、たとえば、OASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10、およびOASL11を阻害または刺激する構成物または組成物である。
【００１２】
他の態様は、OASLの活性を調節する化合物を同定または識別する方法であり、その方法は、単離されたOASLポリペプチドまたはその機能的等価物を得る工程、該OASLポリペプチドまたはその機能的等価物を候補化合物と混合する工程、およびOASLの活性に対する該候補化合物の効果を測定する工程を含む。OASLは、OASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10、およびOASL11からなる群より選ばれる。該効果は、mRNA分解の減少および／またはmRNA分解の増加である。
【００１３】
さらなる態様は、OASLの活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法であり、その方法は、OASLまたはそのOASL結合断片を候補化合物に暴露すること、および該化合物がOASLまたはそのOASL結合断片に結合するかどうかを決定することを含み、さらに、該化合物がOASL活性またはOASLとその結合パートナーとの相互作用を調節するかどうかを決定することを含む。
【００１４】
さらに他の態様は、OASLタンパク質と結合する相互作用タンパク質についてスクリーニングする方法であり、その方法は、OASLタンパク質またはそのOASL断片を候補化合物に暴露すること、および該化合物がOASLタンパク質に結合するかどうかを決定することを含み、ここで、該候補化合物のOASLタンパク質への結合は、相互作用タンパク質であることを意味する。
【００１５】
さらなる態様は、OASL活性をもたらす化合物を同定または識別する方法であり、その方法は、OASLタンパク質をコードする一つ以上の調節可能な遺伝子、OASLタンパク質をコードする一つ以上の遺伝子のノックアウト、またはOASLタンパク質をコードする一つ以上の遺伝子のノックイン、を有するトランスジェニック動物を用意する工程、該トランスジェニック動物に対して対照動物を用意し、該トランスジェニック動物の群および対照動物の群をOASL調節候補化合物に暴露する工程、および該トランスジェニック動物と該対照動物とを比較して、該トラスジェニツク動物における不妊または妊性に関係する一つ以上のOASLタンパク質に対する該化合物の効果を該対照動物と比較して決定することを含む。
【００１６】
ある特定の態様は、ペプチド結合対の第一のペプチドと第二のペプチドの結合相互作用を検出する方法であり、その方法は、選択された表現型を検出するのに適した条件下で少なくとも一種の真核細胞を培養する工程（ここで、該細胞は、転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合される該第一のペプチドまたはそのセグメントを含む第一の異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合される該第二のペプチドまたはそのセグメントを含む第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ここで、該第一のペプチドまたはそのセグメントと該第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が再構成される）と、該再構成される転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるレポーター要素（ここで、該レポーター要素の発現が、選択された表現型をもたらす）とを含む）、選択された表現型をもたらす該レポーター要素の発現のレベルを測定することによって該ペプチド結合対の結合相互作用を検出する工程を含み、ここで、該第一または第二のペプチドがOASLペプチドであり、その他方が試験ペプチド、好ましくは卵巣に存在する選択されたペプチド／タンパク質である。
【００１７】
さらなる態様は、ペプチド結合対の第一のペプチドと第二のペプチドの結合相互作用を検出するためのレスキュースクリーニングであり、そのスクリーニングは、選択された表現型を検出するためまたはそのような表現型の不在を検出するための条件下で少なくとも一種の真核細胞を培養すること（ここで、該細胞は、転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合される該第一のペプチドまたはそのセグメントを含む第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合される該第二のペプチドまたはそのセグメントを含む第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ここで、該第一のペプチドまたはそのセグメントと該第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が再構成される）と、該再構成される転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるレポーター要素（ここで、該レポーター要素の発現が、選択された表現型の発現を妨げる）とを含む）、該選択された表現型の発現を妨げる該レポータ要素の発現に試験ペプチドが影響するかどうかを決定することによって該試験ペプチドのOASLと相互作用する能力を検出すること、を含み、ここで、該第一または第二のペプチドがOASLペプチドであり、その他方が試験ペプチド、好ましくは卵巣に存在する選択されたペプチド／タンパク質である。
【００１８】
他の態様は、OASLに対する結合パートナーを同定または識別する方法であり、その方法は、該タンパク質を結合パートナー候補に暴露する工程、および該結合パートナー候補がOASLに結合するかどうかを決定する工程を含む。
【００１９】
さらに他の態様は、OASL活性のモジュレーターについてスクリーニングする方法であり、その方法は、OASLポリペプチドを発現させる細胞を用意する工程、該細胞を候補モジュレーターと接触させる工程、OASLの発現を測定する工程、および該候補モジュレーターの存在下におけるOASLの発現と該候補モジュレーターの不在下におけるOASL発現の発現とを比較する工程を含み、ここで、該候補モジュレーターの不在下におけるOASLの発現に対して該候補モジュレーターの存在下におけるOASLの発現が異なれば、該候補モジュレーターをOASL発現のモジュレーターであることが確認される。該OASLは、OASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10およびOASL11からなる群より選ばれる。
【００２０】
さらなる態様は、OASL活性のモジュレーターを生産する方法であり、その方法は、OASLポリペプチドを発現させる細胞を用意する工程、該細胞を候補モジュレーターと接触させる工程、OASLの発現を測定する工程、該候補モジュレーターの存在下におけるOASLの発現と該候補モジュレーターの不在下におけるOASLの発現とを比較する工程（ここで、該候補モジュレーターの不在下におけるOASLの発現に対して該候補モジュレーターの存在下におけるOASLの発現が異なれば、該候補モジュレーターをOASL発現のモジュレーターであることが確認される）、および該モジュレーターを生産する工程を含む。
【００２１】
さらに他の方法は、動物の生殖細胞または初期胚におけるmRNAの分解を調節する方法であり、その方法は、OASL活性の阻害剤を該動物に投与する工程を含む。該生殖細胞は、卵母細胞もしくは卵および／または精細胞もしくは精子である。該阻害剤は、Oasl6、Oasl7、Oasl8、Oasl9、Oasl10、またはOasl11遺伝子の転写を抑制する。該阻害剤はポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列である。該ポリヌクレオチド配列はDNAまたはRNAである。該RNAはアンチセンスOaslRNAまたはOaslRNAの干渉RNAである。
【００２２】
他の態様は、避妊の方法であり、その方法は、薬理学上許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、ここで、該量は、受胎を低減することが可能なものである。該OASLは、OASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10、およびOASL11からなる群より選ばれる。該動物は雌または雄である。
【００２３】
さらに他の態様は、動物の生殖細胞または初期胚におけるmRNAの分解を調節する方法であり、その方法は、OASL活性の刺激剤を該動物に投与する工程を含む。該生殖細胞は、卵母細胞もしくは卵および／または精細胞もしくは精子である。該刺激剤は、Oasl6、Oasl7、Oasl8、Oasl9、Oasl10、またはOasl11遺伝子の転写を促進する。
【００２４】
ある具体的態様は、妊性を増強する方法であり、その方法は、薬理学上許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、ここで、該量は、受胎を低減することが可能なものである。
【００２５】
他の態様は、不妊を診断する方法であり、その方法は、OASLポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける突然変異を確認することを含む。
【００２６】
さらに他の態様は、過剰増殖性疾患を調節する方法であり、その方法は、薬理学上許容される担体中に分散されたOASL活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含む。過剰増殖性疾患はさらに癌として定義される。癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝細胞癌、網膜芽腫、星状細胞腫、グリア芽腫、白血病、神経芽腫、扁平上皮細胞癌、頭部癌、頸部癌、歯肉部癌、舌癌、乳癌、すい臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳腫瘍、大腸癌、および膀胱癌からなる群より選ばれる。さらなる態様において、過剰増殖性疾患は、良性前立腺肥大（BPH）、慢性関節リウマチ、炎症性の腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム（性動脈）硬化（症）、前新生物性の病変、上皮内癌、口腔毛髪状白斑、および乾癬からなる群より選ばれる。
【００２７】
上記の説明は、以下に述べる本発明の詳細な説明がより良く理解されるように、本発明の特徴および技術上の利点をかなり大まかに概説したものである。本発明のさらなる特徴および利点は、以下に記載され、それらは、本願特許請求の範囲の主題を構成する。当業者に明らかなことであるが、本明細書に開示する概念および特定の態様は、同じ本発明の目的を果たすため、他の構造を変更または設計する際の基礎としてすぐに利用できる。また当業者に明らかなことであるが、そのような等価な構築物は本願特許請求の範囲に記載する本発明の精神および範囲から逸脱しない。その構成と実施法の両方に関して本発明に特有であると考えられる新規な特徴は、さらなる目的および利点と共に、以下の説明を添付の図面と一緒に考慮することにより、より良く理解されるだろう。ただし、当然のことながら、各図面は本発明を例示し説明するためだけにあるのであって、各図面は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
本発明のより十分な理解のため、添付の図面を参照しながら、以下に説明をおこなっていく。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
当業者に明白なことであるが、本願に開示する発明には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、さまざまな態様および変更が可能である。
【００３０】
ここで使用される単語「a」または「an」は、用語「を含む（comprising）」とともに特許請求の範囲および／または明細書で使用されるとき、「一つの」を意味しうるが、それはまた、「一つ以上」、「少なくとも一つ」および「一つまたは複数の」の意味とも一致する。
【００３１】
ここで使用する用語「動物」は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ゾウ、ネコ、イヌ、ラットまたはマウスなどの哺乳動物を指す。特定の態様において、動物はヒトである。
【００３２】
ここで使用する用語「抗体」は、例えばIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEなどの任意の免疫学的結合因子を、広く指すものとする。一般的にはIgGおよび／またはIgMが好ましい。なぜなら、これらは、生理学的状況でもっとも一般的な抗体であり、研究室でも最も容易に作製することができるからである。従って、当業者に明らかなように、「抗体」という用語は、抗原結合領域を持つ任意の抗体様分子を指し、例えばFab'、Fab、F（ab'）2、単一ドメイン抗体（DAB）、Fv、scFv（単鎖Fv）などの抗体断片を包含する。抗体に基づくさまざまなコンストラクト（構築物）および断片を製造し使用するための技術は、当該技術分野においてよく知られている（例えばAntibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（コールドスプリングハーバー研究所）, 1988を参照されたい）。
【００３３】
ここで使用する用語「結合タンパク質」は、特定のリガンドに対して結合親和性を示すタンパク質を指す。結合タンパク質は、別々の相異なる遺伝子から産生されうる。所定のリガンドに関して、特定の遺伝子から産生される結合タンパク質は、受容体のリガンド結合ドメインまたはその可溶性受容体とは異なる。
【００３４】
ここで使用する用語「結合パートナー」または「相互作用タンパク質」は、たとえば抗原と抗原特異的抗体、あるいは酵素とその阻害剤のように、特異性を有する他の分子に結合することが可能な分子を指す。たとえば、結合パートナーには、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、IgGとプロテインA、受容体−リガンドの組みあわせ、タンパク質−タンパク質相互作用、および相補的ポリヌクレオチド鎖類が含まれうる。用語「結合パートナー」はまた、細胞においてOASL類に結合するポリペプチド類、脂質類、小分子類、または核酸類を指すこともできる。タンパク質と結合パートナーとの間の相互作用の変化は、相互作用が起こる確率の増加または減少として、あるいは、細胞−結合パートナー複合体におけるOASLの濃度の増加または減少として現われ得る。
【００３５】
ここで使用する用語「OASL結合断片」は、結合パートナーまたは相互作用タンパク質、たとえばポリペプチド、脂質、小分子、または核酸、に結合することが可能なOASLの核酸断片および／またはアミノ酸断片をそれぞれ指す。
【００３６】
ここで使用する用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養(物)」は、相互に交換可能に使用できる。これらすべての用語はまた、それらの子孫をも含み、子孫は任意かつすべての後代である。当然のことながら、すべての子孫は、意図したまたは意図しない変異のため、同じでないことがありうる。異種核酸配列を発現させる文脈において、用語「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞（例えば、大腸菌のような細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥細胞、両生動物細胞、植物細胞、魚細胞、および昆虫細胞）をさし、インビトロにあろうと、インビボにあろうとかまわない。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中にあってもよい。宿主細胞は、ベクターの受容体として用いることができ、また、ベクターを複製することができ、かつ／またはベクターによってコードされる異種核酸を発現させることができる任意の形質転換可能な生物体を含みうる。
【００３７】
ここで使用する用語「受胎」は、雄の精子と雌の卵子の合体、受精を意味する。
【００３８】
ここで使用する用語「避妊」は、受胎の防止または妨害を指す。したがって避妊手段は、受胎を防止する任意のプロセス、器具、または方法を指す。よく知られている避妊手段の種類には、ステロイド、化学的障壁、物理的障壁、化学的障壁と物理的障壁の併用、関心のある生殖抗原に対する抗体を投与するかまたは投与された生殖抗原に対して自然の免疫応答を発生させることによる免疫避妊方法の使用、禁欲および永久的な外科手術などがある。避妊手段は雄または雌のいずれにも適用することができる。
【００３９】
ここで使用する用語「相補的」は、互いにハイブリダイズ（対合）することができるヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。たとえば、DNAに関し、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００４０】
ここで使用する用語「cDNA」は、あるmRNA鋳型に相補的でかつそれに由来するDNAを指す。cDNAは、一本鎖であってもよいし、たとえば、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて、二本鎖の形態に変換してもよい。
【００４１】
ここで使用する用語「DNA」はデオキシリボ核酸と定義される。
【００４２】
ここで使用する用語「DNAセグメント」は、ある特定種の全ゲノムDNAから分離されているDNA分子を指す。「DNAセグメント」という用語には、DNAセグメントおよびそのようなセグメントのより小さい断片が包含され、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターも包含される。
【００４３】
ここで使用する「発現コンストラクト（発現構築物）」または「導入遺伝子」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物と定義され、ここで、その核酸コード配列の一部または全部が転写を受けることが可能であり、ベクターに挿入することができる。転写産物はタンパク質に翻訳されるが、その必要はない。ある態様では、遺伝子の転写とmRNAの遺伝子産物への翻訳との両方が、発現に含まれる。別の態様では、関心のある核酸コード遺伝子の転写だけが、発現に含まれる。本発明では、発現コンストラクトまたは導入遺伝子を指すために「治療用コンストラクト」という用語を使用する場合もある。当業者に明らかなように、本発明は、不妊を治療するための治療法として発現コンストラクトまたは導入遺伝子を利用する。さらに本発明は、発現コンストラクトまたは導入遺伝子を、避妊のための「予防用コンストラクト」として利用する。したがって該「予防用コンストラクト」は避妊手段である。
【００４４】
ここで使用する用語「発現ベクター」は、ある遺伝子産物の少なくとも一部をコードし、転写されうる核酸配列を含むベクターを指す。ある場合、RNA分子がさらにタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。また、他の場合、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生産の場合、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターはさまざまな制御配列を含むことができる。制御配列とは、特定の宿主生物内で作動的に連結されたコード配列の転写に必要な、そして場合によっては翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列のほかに、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たす後述の核酸配列も含むことができる。
【００４５】
ここで使用する用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位を簡潔に示すために用いられる。この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および突然変異体を発現させるか、またはそれらを発現させるように改造することができる、ゲノム配列、cDNA配列および操作されたセグメントを包含する。当業者にわかるとおり、例えば、「本来の（元の）遺伝子」という用語は、自分自身の調節配列を持つ自然界に見いだされるままの遺伝子を指し、「キメラ遺伝子」という用語は、自然界では一緒には見いだされない調節配列とコード配列とを含む本来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列とコード配列、または同じ供給源に由来するが自然界に見いだされる態様とは異なる態様で配置されている調節配列とコード配列を含みうる。
【００４６】
ここで使用する用語「妊性」は、生殖能力を持つまたは受胎能力を持つという性質を指す。妊性は雄性動物にも雌性動物にもあてはまる。
【００４７】
ここで使用する用語「一致度（identity）」または「類似度（similarity）」は、当該技術において知られるとおり、二以上のポリペプチド配列間の、または二以上のポリヌクレオチド配列間の、配列を比較することにより決定される関係を指す。当該技術において、一致度はまた、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味し、それは、場合に応じて、そのような配列の並びの一致によって決定される。一致度および類似度はともに、以下に記載される公知の方法によって容易に計算することができる。Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994;ならびにSequence Analysis Primer, Gribskov, M.およびDevereux, J. 編, M Stockton Press, New York, 1991。配列間の一致度または類似度を決定するため一般に使用される方法には、Carillo, H.およびLipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)に開示されるものがあるが、これに限定されるものではない。一致度および類似度を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。二つの配列間の一致度および類似度を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、GCG program package（GCGプログラムパッケージ）, Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA Atschul, S. F.ら, J Molec. Biol., 215, 403 (1990)があるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
ここで使用する用語「相同（の）（相同的）」は、二つのポリマー（すなわち、二つのポリペプチド分子または二つの核酸分子）間の配列類似度を指す。ここでとりあげる相同率（百分率）の図は、二つのポリマー間の可能な最高の相同性を表わしており、すなわち、一致する（相同の）位置の数が最も多くなるよう二つのポリマーを整合させたときのパーセントホモロジーを表わしている。
【００４９】
ここで使用する用語「パーセントホモロジー」は、ポリペプチド間のアミノ酸配列が一致する程度を指す。任意の二つのポリペプチド間のホモロジーは、いずれかの配列の所定の位置において一致するアミノ酸の総数と直接的な関係にあり、たとえば、いずれかの配列においてアミノ酸総数の半分が同じであれば、二つの配列は５０％のホモロジー（相同性）を示すという。
【００５０】
本発明のポリペプチド（例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12）に言及するとき、用語「断片」、「類似体」および「誘導体」は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しうるポリペプチドを指す。したがって、類似体は、前駆タンパク質部分の切断により活性化され得て活性な成熟ポリペプチドを生成させることができる前駆タンパク質を含む。本発明のポリペプチド（配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12）の断片、類似体または誘導体は、一つ以上のアミノ酸が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基で置換されおり、かつそのようなアミノ酸残基が遺伝コードでコードされていてもよいし、いなくともよいもの、一つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、該ポリペプチドがその半減期をのばすためポリエチレングリコールのような化合物と融合されているもの、あるいは、さらなるアミノ酸が、ポリペプチド、たとえばシグナルペプチド、あるいは、ポリペプチドまたは前駆タンパク質の精製のため使用されるポリヒスチジン標識のような配列に融合されたもの、であってもよい。そのような断片、類似体または誘導体は、本発明の技術範囲内であると判断される。
【００５１】
ここで使用する用語「機能的等価物」は、異なる配列を含むよう作られると同時に、野生型または対照タンパク質の関心のある生物学的機能を発揮する能力を保持しているポリヌクレオチドとして規定される。したがって、ここで使用する用語「機能的等価物」は、OASL類（例えば配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12）のトランケーション物、欠失物、挿入物、または置換物を含み、それは、妊性および胚の発生において役割を果たすその機能を保持するものである。これはまた、遺伝コードの縮重、すなわち、同じアミノ酸をコードする複数のコドンの存在に対して、成立しうる。一例において、当業者の望むところにより、あるポリヌクレオチドのタンパク質をコードする能力を妨げずに、そのポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入することができる。他の例において、ポリヌクレオチドは、より顕著な変化を有する機能的等価物とすることができ（かつ機能的等価物をコードすることができ）る。たとえば抗体の抗原−結合領域、基質分子上の結合部位、受容体などのような構造による相互作用的な結合能力を顕著に減損させることなく、あるタンパク質構造において、ある特定のアミノ酸で他のアミノ酸を置換することができる。いわゆる「保守的」変化は、タンパク質の生物学的活性を破壊しない。というのも、その構造的変化は、タンパク質の設計された機能を発揮する能力を阻害するものでないからである。したがって、本発明者の意図するところにより、本発明の目的をなお果たしつつ、ここに開示する遺伝子およびタンパク質の配列をさまざまに変化させることができる。
【００５２】
ここで使用する用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖によって起こる疾患と定義される。過剰増殖性疾患はさらに癌と定義される。細胞の過剰増殖は、無秩序な成長、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移をもたらす。代表的な過剰増殖性疾患には、例えば癌または自己免疫疾患などが含まれるが、それらに限定されることはない。他の過剰増殖性疾患には、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、良性前立腺肥大症（BPH）または炎症性腸疾患を含めることができる。
【００５３】
ここで使用する用語「不妊」は、子孫を妊娠または産出する能力が無いことまたは減少していることを指す。不妊は、雄または雌のいずれにもありうる。本発明において、不妊を強化するか妊性を低下させるため組成物を投与することは可逆的（取消し可能）なことである。不妊の例には、無精子症、精子形成不全を伴う遺伝子疾患（例えば、クラインフェルター症候群および生殖器発育不全）、精子過少症、精索静脈瘤、ならびに低精子数、精子運動性および精子形態に関する他の精子異常、ならびに排卵の機能不全（例えば、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）または慢性無排卵）があるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ここで使用する用語「阻害剤」は、OASLまたはOASの活性を低下させる化合物または組成物を指す。例えば、阻害剤は、OASL遺伝子またはタンパク質の活性を低下させることができ、あるいは、OAS遺伝子またはタンパク質の活性を低下させることができる。阻害剤はポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または小分子であってもよい。
【００５５】
ここで使用する用語「調節（する）」は、機能の抑制、増強（促進）、または誘導を指す。たとえば、遺伝子発現の「調節」または「制御」は、遺伝子の活性の変更を指す。発現の調節には、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制があるが、これらに限定されるものではない。「調節（する）」または「制御（する）」はまた、タンパク質、酵素、阻害物質、シグナルトランスデューサー、受容体、転写アクチベーター、コファクターなどの生物学的活性を増加または減少させる方法、条件または因子もしくは薬剤をさしていう。この活性の変化は、mRNAの翻訳、DNAの転写、および／またはmRNAもしくはタンパク質の分解の増加または減少であり得、それは、結果として生物学的活性の増加または減少に対応しうる。そのような増強または阻害は、特定の事象の発生、たとえばシグナルトランスダクション経路の活性化、に左右されうることもあり、かつ／または特定の細胞型のみに現れることもありうる。
【００５６】
ここで使用する用語「調節された活性」は、タンパク質の生物学的に活性な形によって調節される任意の活性、状態、疾患、または表現型を指す。調節は、生物学的に活性なタンパク質の濃度に作用を及ぼすことにより、影響されてもよく、たとえば、発現または劣化（分解）を制御することにより、あるいは、たとえば、基質の阻害、活性化、結合、または放出を介する、化学的または構造的な変更または修飾としての直接的な作動的または拮抗的作用により、あるいは、さらなる因子を伴いうる直接的または間接的な相互作用により、調節に影響を及ぼすことができる。
【００５７】
ここで使用する用語「モジュレーター」は、特定の活性の発現、たとえば、OASまたはOASL類の活性または発現、を変化させる任意の組成物および／または化合物を指す。モジュレーターは、意図するところによれば、任意の組成物または化合物、たとえば、抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質からなる。
【００５８】
用語「小分子」は、合成または天然の化合物をさし、たとえば、必要に応じて誘導体化してもよいペプチドまたはオリゴヌクレオチド、天然物またはその他の低分子量（典型的に約５キロダルトン未満）の有機化合物、無機生物学的化合物または無機化合物で天然物または合成物のいずれかの起源のものを指す。そのような小分子は、治療上送達（デリバリー）可能な物質であってもよいし、送達促進のためさらに誘導体としてもよい。
【００５９】
用語「作動的に連結された」は、一つの核酸断片上での二以上の核酸断片の結合で、一方の機能が他方に影響（作用）されるような結合を指す。たとえば、プロモーターがそのコード配列の発現に作用することができるとき（すなわち、該コード配列が、該プロモーターの転写制御下にあるとき）、プロモーターはコード配列に作動的に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンスの配向で制御配列に作動的に連結されうる。ここで使用する用語「ペプチド結合対」は、既知の結合親和性を持ち、そのDNA配列がわかっているまたは推定することができる、任意のペプチド対を指す。ペプチド結合対のペプチドは、改変細胞の他のどの成分に対しても、互いに選択的な結合を示さなければならない。
【００６０】
ここで使用する用語「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング類、抗菌剤、抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質へのそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術ではよく知られている。通常の媒質または薬剤は、それが本発明のベクターまたは細胞と適合しない場合を除き、治療用および／または予防用組成物への使用が意図される。組成物には補助活性成分も組み込むことができる。
【００６１】
ここで使用する用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」は、DNAおよびRNAにおける一連のヌクレオチド塩基（ヌクレオチドとも呼ぶ）を指し、二つ以上のヌクレオチドからなる任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチドは、キメラの混合物もしくは誘導体、それらの修飾物、一本鎖、または二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、たとえば、分子安定性の向上、そのハイブリダイゼーションパラメータの向上等のために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンにおいて、修飾または変更されてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾塩基部分を含んでもよい。そのような修飾塩基部分は、限定されることなく、たとえば、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2-メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6-アデニン、7−メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、および2,6-ジアミノプリンよりなる群から選択される。ヌクレオチド配列は、典型的に、遺伝情報を保持し、それは、細胞機構によりタンパク質および酵素を生成させるのに使用される情報を含む。これらの用語は、二本鎖または一本鎖のゲノムおよびcDNA、RNA、任意の合成されたまたは遺伝子操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これは、一本鎖および二本鎖の分子、すなわち、DNA-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリッドを含むとともに、さらに、アミノ酸バックボーンに接合する塩基によって形成される「タンパク質核酸」（PNA）をも含む。これはさらに、修飾塩基、たとえば、チオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシル、を含む核酸、または炭水化物もしくは脂質を含む核酸を含む。
【００６２】
ここで使用する用語「ポリペプチド」は、通常、所定の配列を有するアミノ酸残基の鎖と定義される。ここで使用する用語ポリペプチドは、用語「ペプチド」および「タンパク質」と可換である。
【００６３】
ここで使用する用語「プロモーター」は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列であって、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なDNA配列と定義される。
【００６４】
ここで使用する用語「精製されたタンパク質またはペプチド」は、他の成分から分離することができる組成物を指すものとし、タンパク質またはペプチドは、その天然に得られる状態と比較して、任意の程度に精製される。したがって精製されたタンパク質またはペプチドは、それが天然に存在しうる環境から解放されたタンパク質またはペプチドも指す。
【００６５】
ここで使用する用語「刺激剤」は、OASLまたはOASの活性を増強（促進）する化合物または組成物として定義される。増強される活性は、OASL遺伝子の活性、OASLタンパク質の活性、OAS遺伝子の活性、またはOASタンパク質の活性でありうる。刺激剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または小分子でありうる。
【００６６】
ここで使用する「メッセンジャーRNA（mRNA）」は、イントロンがなく、細胞によってポリペプチドに翻訳できるRNAを指す。
【００６７】
ここで使用する用語「RNA」はリボ核酸と定義される。
【００６８】
ここで使用する用語「RNA干渉」または「iRNA」は、関心のある特定の遺伝子を阻害するために用いられるRNA分子である。
【００６９】
ここで使用する用語「転写制御下」または「作動的に連結」は、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するための核酸に対して、プロモーターが正しい位置および配向にあることと定義される。
【００７０】
ここで使用する用語「制御配列（調節配列）」は、コード配列の上流（5'非コード配列）、中、または下流（3'非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは、転写、RNAプロセッシングもしくは安定性、または連結されたコード配列の翻訳に影響するものである。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含みうる。
【００７１】
ここで使用する用語「センス」は、コードmRNA核酸配列と同じ配向にある核酸の配列を指す。「センス配向」でプロモーターに結合されたDNA配列は、mRNAと同じ配列を含むRNA分子が転写されるように結合されている。生成したRNA分子は、しかし、機能的なタンパク質に転写される必要はない。
【００７２】
ここで使用する、特定のポリヌクレオチドの「アンチセンス」複製物という用語は、ポリヌクレオチドに水素結合することが可能であり、したがって、ポリヌクレオチドの発現を調節することが可能な、相補的配列を指す。それらは、DNA、RNAまたはそれらの類似体であり、上述したような改変したバックボーンを有する類似体を含む。アンチセンス複製物が結合するポリヌクレオチドは、一本鎖の形態でも、二本鎖の形態でもよい。「アンチセンス配向」でプロモーターに結合したDNA配列は、目的とする遺伝子のコードmRNAに相補的なRNA分子が生成されるように、プロモーターに結合され得る。
【００７３】
ここで使用する用語「センス」鎖および「アンチセンス」鎖は、同じ文脈で使用されるとき、互いに相補的な一本鎖ポリヌクレオチドを指す。それらは、二本鎖ポリヌクレオチドの対向する鎖同士であってもよいし、また、一方の鎖は、一般的に受け入れられている塩基対合則に従って、他方の鎖から予測することができる。他の態様で明記または定義しないかぎり、任意に、一方の鎖を「センス」とし、他方の鎖を「アンチセンス」とすることができる。
【００７４】
I.OASLタンパク質
OASL類に対するタンパク質の配列は、次の配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12において提供される。
【００７５】
本願において、用語「OASL遺伝子産物」または「OAS遺伝子産物」は、本来のOASL類またはOAS、例えばOASL6、OASL7、OASL8、OASL9、OASL10またはOASL11のアミノ酸配列（またはRNA、適用可能であれば）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質およびポリペプチドを指し、あるいは、内因性のOASLまたはOASに類似する機能的活性を発揮することが可能な点もしくはOASLおよび／またはOASに対して生じた抗−OASL抗体または抗−OAS抗体と交差反応することが可能な点で生物学的に活性なアミノ酸配列を有するタンパク質およびポリペプチドを指す。
【００７６】
用語「OASL遺伝子産物」および／または「OAS遺伝子産物」はまた、それらの本来の相当物と同じような生物学的活性を少なくともいくらか示すそれぞれの分子の類似体をも含む。そのような類似体には、端を切り取った（短小化した）ポリペプチドおよび元のポリペプチドよりアミノ酸の数が少ないポリペプチドがあるが、それらに限定されることはない。
【００７７】
本発明は、完全なOASL分子だけでなく、後述する機能を保っていても保っていなくてもよい、それらポリペプチドの断片にも関係する。分子のN末端を含む断片は、遺伝子操作でコード領域内に翻訳停止部位を作ることによって作製することができる。あるいは、OASLを、プロテアーゼとして知られるタンパク質分解酵素で処理することによって、さまざまなN末端断片、C末端断片および内部断片を製造することもできる。たとえば、断片は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12の連続する6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、200個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む長さのものである。これらの断片は、公知の方法、たとえば沈殿（例えば硫酸アンモニウム）、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（免疫アフィニティークロマトグラフィーを含む）または種々のサイズ分離法（遠心沈降、ゲル電気泳動、ゲルろ過）によって精製することができる。
【００７８】
また、意図するところによれば、他のOASおよび／またはOASLタンパク質配列、たとえば、OASla：配列番号13、OASlｂ：配列番号14、OASlc：配列番号15、OASL4：配列番号16、OASL5：配列番号17、OAS1：配列番号24、OAS2：配列番号26、およびOAS3：配列番号28を、本発明において使用することができる。
【００７９】
ここで使用する「実質的に純粋」という用語は、他のタンパク質、脂質、糖質、または天然に付随している他の物質を実質的に含まないOASL類および／またはOASを指す。当業者は標準的なタンパク質精製法を使ってOASL類および／またはOASを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲルで単一の主要バンドを与える。OASLおよび／またはOASポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列分析によって決定することもできる。OASLおよび／またはOASポリペプチドには、それらポリペプチドの機能的断片も、それらの活性が残っている限り包含される。OASLおよび／またはOASの生物学的活性を持つさらに小さいペプチドも、本発明に使用できる。
【００８０】
A.OASL類の変異体
OASLポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換変異体、挿入変異体または欠失変異体であり得る。これらの変異は、保存的でもよいし、非保存的でもよい。欠失変異体は、機能または免疫原活性に必要でない一つ以上の本来のタンパク質の残基が欠けているものであり、たとえば、上述したトランスメンブラン（膜貫通）配列の欠けた変異体がその例である。他の一般的なタイプの欠失変異体は、分泌シグナル配列またはタンパク質を細胞の特定の部分に結合させるよう誘導するシグナル配列が欠けたものである。挿入変異体は、典型的に、ポリペプチド中の末端でない箇所に材料の付加を伴うものである。これは、免疫反応性のエピトープの挿入、あるいは、単なる一残基の挿入を含み得る。末端付加（融合タンパク質と呼ばれる）は、後に解説する。
【００８１】
置換変異体は、典型的に、タンパク質内の一つ以上の部位においてあるアミノ酸が他のアミノ酸に変わったものを含む。ポリペプチドの一つ以上の特性、たとえばタンパク質分解切断に対する安定性を、他の機能または特性を失わせることなく調節するため、置換変異体を設計してもよい。この種の置換は、保存的であることが好ましく、すなわち、あるアミノ酸を、類似の形態および電荷の他のアミノ酸で置換することが好ましい。保存的置換は、当該技術でよく知られており、たとえば、アラニンからセリン、アルギニンからリジン、アルパラギンからグルタミンまたはヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グルタミンからアスパラギン、グルタミン酸からアスパラギン酸、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアルパラギンまたはグルタミン、イソロイシンからロイシンまたはバリン、ロイシンからバリンまたはイソロイシン、リジンからアルギニン、メチオニンからロイシンまたはイソロイシン、フェニルアラニンからチロシン、ロイシンからメチオニン、セリンからトレオニン、トレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン、およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変換がある。
【００８２】
以下の解説は、等価物を作るため、あるいは、さらに改良された第二世代分子を作るため、タンパク質のアミノ酸を変えることに基づくものである。タンパク質構造において、たとえば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造と相互作用する結合能力を顕著に失わせることなく、たとえば、ある特定のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。そのタンパク質の生物学的機能活性を決めるのは、タンパク質の相互作用の能力と性質であるため、タンパク質の配列において、そして、その基礎をなすDNAコード配列において、アミノ酸のある置換を行うことができ、それでもなお、同様の特性を有するタンパク質をもたらすことができる。したがって、本発明者らの意図するところにより、様々な変更を、遺伝子のDNA配列において、その生物学的有用性または活性を顕著に失わせることなく、行うことができる。
【００８３】
そのような変更を行うとき、アミノ酸のハイドロパシック・インデックス（hydropathic index）を考慮することができる。タンパク質上に相互作用の生物学的機能を与える際、アミノ酸のハイドロパシック・インデックスが重要であることは、当該技術において一般的にわかっている（KyteおよびDoolittle、1982）。認められているところによれば、アミノ酸の相対的なハイドロパシック特性（疎水親水特性）は、結果生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それは結果的にタンパク質の他の分子（たとえば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原など）との相互作用を特徴づける。
【００８４】
各アミノ酸は、その疎水性度と電荷特性に基づいて、ハイドロパシック・インデックスを割り当てられてきた（KyteおよびDoolittle、1982）。それらは以下のとおりである。イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、 システイン／シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(-0.4)、トレオニン(-0.7)、セリン(-0.8)、トリプトファン(-0.9)、チロシン(-1.3)、プロリン(-1.6)、ヒスチジン(-3.2)、グルタミン酸(-3.5)、グルタミン(-3.5)、アスパラギン酸(-3.5)、アスパラギン(-3.5)、リジン(-3.9)、およびアルギニン(-4.5)。
【００８５】
当該技術において知られているとおり、あるアミノ酸を、それに近いハイドロパシック・インデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それにより、類似の生物学的活性をなお有するタンパク質、すなわち、生物学的機能においてなお等価なタンパク質を得ることができる。そのような変更を行うに際し、ハイドロパシック・インデックスが、±2以内にあるアミノ酸同士の置換が好ましく、±1以内にあるアミノ酸同士の置換が特に好ましく、±0.5以内にあるアミノ酸同士の置換がより特に好ましい。
【００８６】
また当該技術において明らかなとおり、類似アミノ酸同士の置換は、親水性度に基づいて効果的に行うこともできる。米国特許第4,554,101号（この引用により本明細書中にその内容が記載されたものとする）の記載によれば、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性度（その付近のアミノ酸の親水性度に左右される）は、そのタンパク質の生物学的特性と相関する。米国特許第4,554,101号に詳しく記載されるとおり、次の親水性度の値が、アミノ酸残基に割り当てられてきた。アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、アルパラギン酸(+3.0 ± 1)、グルタミン酸(+3.0 ± 1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(-0.4)、プロリン(-0.5 ± 1)、アラニン(-0.5)、ヒスチジン(-0.5)、システイン(-1.0)、メチオニン(-1.3)、バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、チロシン(-2.3)、フェニルアラニン(-2.5)、トリプトファン(-3.4)。
【００８７】
勿論、アミノ酸を親水性度の値の近い別のアミノ酸と置換することができ、それでもなお、生物学的に等価で免疫学的に等価なタンパク質を得ることができる。そのような変更において、親水性度の値が、±2以内にあるアミノ酸同士の置換が好ましく、±1以内にあるアミノ酸同士の置換が特に好ましく、±0.5以内にあるアミノ酸同士の置換がより特に好ましい。
【００８８】
概説したとおり、アミノ酸の置換は、一般に、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、たとえば、それらの疎水性度、親水性度、電荷、サイズなどに基づいている。上記特性のいくつかを考慮した置換の典型例は、当業者によく知られており、たとえば、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、バリンとロイシンとイソロイシンがある。
【００８９】
また、同じ考え方を用いて、対抗する性質、すなわち拮抗的性質を有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを作ることができる。このことも本発明に関連し、そこにおいて、非保存的な置換、挿入および／または欠失を用いてOASL変異体または類似体を生成させることができる。例えば、OASL活性に重要な残基を特定するため、OASL変異体を生成させ、OASL活性について試験することができる。ヒトの個体群で生じ、癌の発生に関連するOASL変異体を反映させるため、OASL6変異体を合成してもよい。また、OASL変異体を、妊性を阻害または増強するためのアンタゴニストとして使用してもよい。従って、OASL変異体は、可能性のある避妊組成物および／または妊性増強組成物として使用することができる。
【００９０】
B.ドメインスイッチング
また、本発明は、ネズミおよびヒトのOASLタンパク質を同定した。興味ある一連の突然変異体を、種々のタンパク質の相同領域を置換することによって作ることができる。これは、ある特定の状況において、「ドメインスイッチング」として知られている。
【００９１】
ドメインスイッチングは、異なるが、しかしこの場合、関連するポリペプチドを用いたキメラ分子の生成を必要とする。種々のOASLタンパク質を比較することにより、これら分子の機能的に重要な領域について予測することができる。そして、これらの分子の関連するドメイン類を交換して、それら領域のOASL機能に対する重要性を決定しようとすることが可能である。これらの分子は、これらが本来の分子と異なる「キメラ」である点で、付加価値を有し得る一方、しばしば同じ機能をもたらし得る。
【００９２】
C.融合タンパク質
挿入変異体に特有のものは、融合タンパク質である。この分子は、通常、元の分子のすべてまたは実質的な部分を有し、それは、N末端またはC末端において、第二のポリペプチドのすべてまたは一部に結合されている。融合は、典型的に、他の種からのリーダー配列を用いて、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にする。たとえば、本発明の融合タンパク質は、付加されたタンパク質形質導入ドメイン（たとえば、アンテナペディア（Antennapedia）形質導入ドメイン（ANTP）、HSV1(VP22)およびHIV-1(Tat)があるが、これらに限定されることはない）を含むことができる。タンパク質形質導入ドメイン（PTD）を含む融合タンパク質は、生物膜を効率よく横断することができ、したがって、関心のあるタンパク質（OAS、OASLまたはそれらの変異体、たとえば賦活物質または阻害物質）を細胞中に送達できる（Tremblay、2001、Forman他、2003）。
【００９３】
さらに、融合体の接合部またはその近くに開裂部位を含めると、精製後、非本質的なポリペプチドの除去を容易にすることができる。その他の有用な融合には、機能的ドメインの結合、たとえば、酵素からの活性部位の結合、グリコシル化ドメインの結合、その他の細胞ターゲッティングシグナルの結合、またはトランスメンブラン（膜貫通）領域の結合がある。
【００９４】
D.タンパク質の精製
本発明の特定の態様において、OASL類またはその変異体を精製することが望ましい。タンパク質精製の技法は当業者によく知られている。それらの技法は、あるレベルにおいて、細胞環境からポリペプチド画分および非ポリペプチド画分への粗い分画をともなう。他のタンパク質からポリペプチドを分離したら、クロマトグラフィーまたは電気泳動の手法を用いて関心のあるポリペプチドをさらに精製することができ、部分的または完全な精製（または均質になるまでの精製）を達成することができる。純粋なペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、またはHPLCである。
【００９５】
E.合成ペプチド
本発明はまた、本発明の様々な態様において使用するためのより小さなOASL関連ペプチドを提供する。それらが相対的に小さなサイズであるため、本発明のペプチド類は、常法に従って、溶液中または固相支持体上で合成することもできる。種々の自動合成機が、市販されており、公知のプロトコルに従って用いることができる。たとえば、StewartおよびYoung(1984)、Tam他(1983)、Merrifield(1986)、ならびにBaranyおよびMerrifield(1979)を参照（この引用により、これらの内容は本明細書に記載されたものとする）。短いペプチド配列類、または部分的に重なるペプチド類のライブラリー（通常、約６から最高約３５〜５０アミノ酸のペプチドで、ここに記載する選択された領域に相当するもの）を、容易に合成することができ、次いで、反応性ペプチドを識別するために設計されたスクリーニングアッセイにおいて、スクリーニングすることができる。その代わりに組換えDNA技術を採用することができ、そこにおいて、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主について形質転換または形質移入し、そして、発現に適する条件下で培養する。
【００９６】
F.抗原組成物
本発明はまた、抗体の産生に関係する動物の免疫化のため、OASLタンパク質またはペプチドを抗原として使用する用途を提供する。OASLまたはその部分を、リンカー、ポリリンカーまたは誘導体化アミノ酸を介して、一つ以上の薬剤または因子に、連結、結合、接合、抱合、または化学結合させることが考えられる。このことは、二重特異的なまたは多価の組成物（構成物）またはワクチンを生成させるように、行うことができる。また、それらの組成物の調製に使用される方法は、当業者によく知られており、動物への投与に適している、すなわち、薬学的に許容されることがわかる。好ましい薬剤または担体は、スカシ貝ヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)（KLH）またはウシ血清アルブミン（BSA）である。
【００９７】
1．抗体の産生
所定の態様において、本発明は、ここに提供されるOASLポリペプチドに高い特異性で結合する抗体を提供する。したがって、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12のポリペプチドに結合する抗体が提供される。完全長のタンパク質に対して生成される抗体に加えて、エピトープのコア領域、たとえば、野生型のエピトープおよび突然変異エピトープ、からなるより小さいコンストラクトに対しても、抗体を生成させることができる。
【００９８】
モノクローナル抗体（MAb）は、たとえば、再現性および大規模生産について、所定の利点を有することが認められ、その使用は一般に好ましい。したがって、本発明は、ヒト、ネズミ、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、さらにはニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。調製の容易さおよび試薬入手の容易さから、ネズミモノクローナル抗体がしばしば好ましい。
【００９９】
しかし、ヒト化抗体もまた意図され、同様に、マウス、ラットまたは他の種からのキメラ抗体でヒトの定常領域および／または可変部ドメインを有するもの、二重特異性抗体、組換えおよび遺伝子操作抗体ならびにそれらの断片も意図される。患者の病気に対して「特注の（custom-tailored）」抗体を形成するための方法は、同様に知られており、そのような特注の抗体もまた意図するところである。
【０１００】
本発明による免疫原性OASL組成物で動物を免疫し、そして、免疫した動物から抗血清を採集することにより、ポリクローナル抗体が調製される。
【０１０１】
抗血清の産生には広範囲にわたる種の動物を用いることができる。抗血清の産生に使用される動物は、典型的に、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギは相対的に血液の容量が大きいため、ポリクローナル抗体の産生には、ウサギを選択することが好ましい。
【０１０２】
当該技術においてよく知られているように、所定の組成物の免疫原性にはばらつきがあり得る。したがって、しばしば、宿主免疫系をブーストする必要があり、それは、ペプチドまたはポリペプチドの免疫原を担体に結合させることにより行うことができる。具体的な好ましい担体は、スカシ貝ヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。他のアルブミン、たとえば、卵アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンを担体として使用してもよい。ポリペプチドを担体タンパク質に接合させる手段は、当該技術においてよく知られており、グルタルアルデヒド、m−マレイミドベンゾイル−N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾ化（biazotized）ベンジジンを含む。
【０１０３】
当該技術においてよく知られているとおり、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激剤の使用により増強することができる。適当なアジュバントには、サイトカイン類、トキシン類、または合成組成物などのあらゆる可能な免疫刺激性化合物が含まれる。
【０１０４】
使用可能なアジュバントには、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ−インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、MDP化合物（例えばthur-MDPおよびnor-MDP）、CGP（MTP-PE）、リピドA、およびモノホスホリルリピドA（MPL）がある。RIBI（細菌から抽出された三つの成分を含む）、MPL、トレハロースジミコレート（TDM）および2％スクアレン／トゥイーン80エマルション中の細胞壁スケルトン（CWS）もまた使用できる。MHC抗原もまた使用できる。典型的に、しばしば好まれるアジュバントには、完全フロイントアジュバント（結核死菌を含む免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントがある。
【０１０５】
アジュバントに加えて、生物応答修飾因子（バイオロジック・レスポンス・モディファイヤー（BRM））を共に投与することが望ましい場合もある。該修飾因子は、T細胞免疫をアップレギュレーションするか、サプレッサー細胞活性をダウンレギュレーションすることが知られている。そのようなBRMには、たとえば、シメチジン（CIM、1200mg/d）（Smith/Kline、ペンシルバニア州）、低用量シクロホスファミド（CYP、300mg/m2）（Johnson/Mead、ニュージャージー州）、サイトカイン類、例えばγ−インターフェロン、IL-2またはIL-12、またはB-7のような免疫ヘルパー機能に必要なタンパク質をコードする遺伝子がある。
【０１０６】
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫化に使用される動物とともに、免疫原の性質によってかわってくる。種々の経路を、免疫原の投与に使用することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫処置後、種々の時点で免疫した動物の血液をサンプリングすることによりモニターすることができる。
【０１０７】
第二のブースター（追加免疫）注射を行ってもよい。追加免疫および力価測定のプロセスを、適当な力価が得られるまで繰り返す。必要なレベルの免疫原性が得られたとき、免疫した動物から採血することができ、血清を分離し、貯蔵することができ、かつ／または動物をMAbを生成させるため用いることができる。
【０１０８】
モノクローナル抗体（MAb）を生成させるための方法は、通常、ポリクローナル抗体の調製のためのものと同じ系統で始める。げっ歯類、例えばマウスおよびラットは好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、またはカエル細胞の使用も可能である。ラットの使用で所定の利点がもたらされ得る（Goding、1986）が、マウスが好ましく、BALB/cマウスが最も好ましい。というのも、これは最も日常的に使用され、一般により高い割合で安定な融合をもたらすからである。
【０１０９】
上述したように、一般的には、動物に抗原を注射する。必要であれば、スカシ貝ヘモシアニンのような担体分子に抗原を結合してもよい。抗原は、典型的に、アジュバント、たとえば、フロイント完全または不完全アジュバントと混合される。同じ抗原を用いる追加免疫注射は、約２週間おきに行うことができる。
【０１１０】
免疫化の後、抗体、特にBリンパ球（B細胞）を産生する可能性のある体細胞を、MAb生成プロトコルに使用するため選択する。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃またはリンパ節から、あるいは、末梢血サンプルから得ることができる。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。というのも、前者は、分裂する形質芽球の段階にある抗体生産細胞の豊富な源であり、後者は、末梢血が用意に採取できるからである。
【０１１１】
しばしば、一群の動物が免疫され、抗体力価が最も高い動物の脾臓が取り出され、脾臓をシリンジでホモジナイズすることにより脾臓リンパ球が得られる。典型的に、免疫されたマウスからの脾臓は、約5×107〜2×108のリンパ球を含む。
【０１１２】
次いで、免疫された動物からの抗体生産Bリンパ球は、不死化ミエローマ細胞（通常、免疫された動物と同じ種の一つ）と融合される。ハイブリドーマ産生融合法での使用に適するミエローマ細胞株は、好ましくは、抗体非生産性であり、高い融合効率を有し、かつ所定の選択培地で成長できなくなる酵素欠損（それは、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支える）を有するものである。
【０１１３】
当業者に知られているとおり、多くのミエローマ細胞の中から任意のものを用いるこ
とができる（Goding, 1986; Campbell, 1984）。たとえば、免疫される動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/l.Ag 4 1、Sp210-Agl4、FO、NSO/U、MPC-ll、MPCll-X45-GTG 1.7およびS194/5XX0 Bulを用いることができ、ラットの場合、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210を用いることができ、そして、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6は、ヒト細胞融合に関してすべて有用である。
【０１１４】
一つの好ましいネズミミエローマ細胞は、NS-1ミエローマ細胞株（P3-NS-1-Ag4-1とも呼ばれる）であり、それは、細胞株保管番号GM3573を請求することにより、NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repositoryから容易に入手できる。他の使用できるマウスミエローマ細胞株は、8-アザグアニン耐性マウスのネズミミエローマSP2/0非プロデューサー細胞株である。
【０１１５】
抗体産生性の脾臓細胞またはリンパ節細胞とミエローマ細胞とのハイブリッドを生成させるための方法は、通常、体細胞とミエローマ細胞とを2:1の割合で混合することを含む。しかし、この割合は、細胞膜の融合を促進する一つ以上の作用因子（化学物質または電気的因子）の存在下、約20:1から約1:1まで変わり得る。センダイウイルスを用いる融合方法は、KohlerおよびMilstein (1975; 1976)によって報告されており、また、ポリエチレングリコール（PEG）（例えば、37％（v/v）PEG）を用いるものはGefterら(1977)により報告されている。電気的に誘発させる融合方法の使用もまた適当である（Goding, 1986）。
【０１１６】
融合法は、通常、生存能力のあるハイブリッドを、低い頻度、約1×10-6〜1×10-8で生産する。しかし、このことは、問題とならない。というのも、生存能力のある融合されたハイブリッドは、親の融合されていない細胞（特に、通常、いつまでも分裂を続ける融合されていないミエローマ細胞）と、選択培地での培養により、区別されるからである。選択培地は、一般に、組織培養培地においてヌクレオチドのデノボ（新規）合成を遮断する薬剤を含むものである。具体的な好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンとピリミジンの両方のデノボ合成を遮断する一方、アザセリンは、プリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキセートを使用する場合、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンで培地を補足する（HAT培地）。アザセリンを使用する場合、ヒポキサンチンで培地を補足する。
【０１１７】
好ましい選択培地はHATである。ヌクレオチドサルベージ（再利用）経路を作用させることができる細胞のみが、HAT培地において生き延びることができる。ミエローマ細胞は、このサルベージ経路の鍵酵素、たとえば、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（HPRT）を欠くため、生き延びることができない。B細胞は、この経路を作用させることができるが、培養において寿命が限られており、一般に約2週間以内に死ぬ。したがって、選択培地で生き延びることのできる唯一の細胞は、ミエローマ細胞とB細胞から形成されるハイブリッドである。
【０１１８】
この培養により、ハイブリドーマの個体群が得られ、それから、特定のハイブリドーマを選択する。典型的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートでの単一クローン希釈によって、細胞を培養し、次いで、個々のクローンの上清（約２〜３週間後）を所望の反応性について試験することにより、行われる。このアッセイは、感度がよく、簡単で迅速であるべきであり、たとえば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ（dot immnobinding assay）などがある。
【０１１９】
次いで、選択されたハイブリドーマを連続希釈し、個々の抗体生産細胞株にクローン化することができる。次いで、MAbを得るため、そのクローンを無期限に増殖させることができる。MAb産生のため、二つの基本的な方法において、細胞株を活用することができる。第一に、元の融合のため体細胞およびミエローマ細胞を提供するのに用いた種類の組織適合動物（すなわち、同系マウス）に、ハイブリドーマのサンプルを（しばしば腹腔内に）注射することができる。必要に応じて、注射に先立ち、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のようなオイルで動物を刺激する。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生させる。次いで、高濃度のMAbを得るため、該動物の体液、たとえば、血清または腹水液を採取することができる。第二に、個々の細胞株をインビトロで培養することができ、そこにおいて、MAbが培養培地に自然に分泌され、そこから、MAbを高濃度で容易に得ることができる。
【０１２０】
いずれの方法で生成させたMAbも、必要であれば、ろ過、遠心分離、および、HPLCのような種々のクロマトグラフィー法またはアフィニティークロマトグラフィーを用いて、さらに精製することができる。本発明のモノクローナル抗体の断片は、酵素（例えばペプシンまたはパパイン）による消化を含む方法により、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の開裂により、生成したモノクローナル抗体から得ることができる。その代わりに、本発明に含まれるモノクローナル抗体の断片は、自動化されたペプチド合成機を用いて合成することもできる。
【０１２１】
さらに意図するところによれば、分子クローニング法を用いてモノクローナル物を生成させてもよい。このため、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを、免疫した動物の脾臓から分離したRNAより調製し、そして、適当な抗体を発現するファージミドを、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞を用いるパンニング（選別）法により選択する。通常のハイブリドーマ法に対するこの方法の利点は、一回で約104倍多い抗体を生産しスクリーニングできることと、H鎖とL鎖の組み合わせにより、新たな特異性が生成されること（それは、さらに適当な抗体を見出す可能性を増やす）である。
【０１２２】
一方、本発明に包含されるモノクローナル抗体の断片を、自動化されたペプチド合成機を用いて合成することができ、あるいは、大腸菌において、完全長の遺伝子または遺伝子の断片を発現させることにより合成することができる。
【０１２３】
2．抗体接合体
本発明はさらに、一般にモノクローナル型のOASLに対する抗体であって、一つ以上の他の薬剤または作用因子に結合されて抗体接合体を形成するものを提供する。十分な選択性、特異性および親和性を有する任意の抗体を、抗体接合体用の基材として用いることができる。そのような特性は、当業者に知られた通常の免疫学的スクリーニング法を用いて評価することができる。
【０１２４】
抗体接合体の具体例は、抗体が検出可能な標識（ラベル）に結合されたものである。「検出可能な標識」は、その特有の機能的特性または化学的特性により検出することができる化合物または要素（成分）であり、その使用により、それが付いた抗体を検出することが可能になり、さらに必要であれば定量することが可能になるものである。他の具体例は、細胞障害性（細胞毒性）因子または抗細胞因子に結合された抗体からなる接合体の形成である。そのような因子は、「免疫毒素（イムノトキシン）」と呼ぶことができる（米国特許第5,686,072、5,578,706、4,792,447、5,045,451、4,664,911および5,767,072号に記載され、この引用により、それぞれの内容は本明細書に記載されたものとする）。
【０１２５】
かくして、抗体接合体は、診断薬としての使用のため好ましい。抗体診断薬は、一般に二種類に分けられる。すなわち、インビトロ診断薬用のもの、たとえば種々のイムノアッセイに使用されるもの、そして、インビボ診断のプロトコル（一般に抗体特異的イメージング（画像診断）（antibody-directed imaging）として知られる）用のものである。一方、抗体特異的イメージングは、本発明とともに使用するにはそれほど好ましくない。
【０１２６】
多くの適当なイメージング剤（画像診断薬）が当該技術において知られており、それを抗体に取り付けるための方法も同様である（例えば、米国特許第5,021,236および4,472,509号を参照、この引用により、両者の内容は本明細書に記載されたものとする）。所定の取り付け方法は、たとえば、抗体に取り付けられるDTPA（米国特許第4,472,509号）のような有機キレート剤を用いる金属キレート複合体の使用を伴う。モノクローナル抗体はまた、カップリング剤、たとえばグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸の存在下、酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーを有する接合体は、これらのカップリング剤の存在下、またはイソチオシアナートとの反応により、調製される。
【０１２７】
常磁性体イオンの場合、イオンの例には、たとえば、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、およびエルビウム（III）があり、ガドリニウムが特に好ましい。他の状況、たとえばX線イメージングにおいて有用なイオンには、例えば、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、および特にビスマス（III）があるが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
治療用途および／または診断用途のための放射性同位体には、211アスタチン、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、67銅、152Eu、67ガリウム、3水素、123ヨウ素、125ヨウ素、131ヨウ素、111インジウム、59鉄、32リン、186レニウム、188レニウム、75セレン、35硫黄、および99mテクニシウムがある。125Iは所定の態様においてしばしば好ましく用いられるものである。99mテクニシウムおよび111インジウムもまた、その低いエネルギーと長期検出に対する適性のため、しばしば、好ましいものである。
【０１２９】
本発明の放射性標識されたモノクローナル抗体は、当該技術においてよく知られた方法により製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムおよび化学酸化剤（例えば次亜塩素酸ナトリウム）または酵素酸化剤（例えばラクトペルオキシダーゼ）との接触によりヨード化することができる。本発明によるモノクローナル抗体は、99mテクニシウムで標識してもよく、それは、リガンド交換プロセス、たとえば、ペルテクネート（pertechnate）を第一スズ溶液で還元し、還元したテクニシウムをSephadexカラム上でキレート化し、該カラムに抗体を与えることにより行うことができ、あるいは、直接標識法、すなわち、ペルテクネート、SNCL2のような還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液のような緩衝溶液、および抗体をインキュベートすることにより行うことができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合するためよく用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）である。さらに使用できると考えられるのは、蛍光標識であり、ローダミン、フルオレセインイソチオシアナートおよびレノグラフィンを含む。
【０１３０】
本発明のより好ましい抗体接合体は、主としてインビトロ用のものであり、そこにおいて、抗体は、発色性の基質に接触すれば着色物を生成させる二次結合リガンドまたは酵素（酵素標識）に結合されている。適当な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼがある。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は当業者によく知られており、例えば、米国特許第3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、および4,366,241号に記載される。この引用により、その内容は本明細書に記載されたものとする。
【０１３１】
II.Oasl核酸
本発明の重要な局面は、OASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単離されたDNAセグメントおよび組換えベクター、ならびに、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、または配列番号11およびそれらの生物学的機能的等価物の配列を用いて野生型、多形性、または突然変異型のOASLを発現させるDNA技術を応用した組換え宿主細胞の創出および使用に関する。
【０１３２】
さらに意図するところによれば、他のOASおよび／またはOASL核酸配列を本発明において使用することもでき、それらは、たとえば、OASla：配列番号18、OASlｂ：配列番号19、OASlc：配列番号20、OASL4：配列番号21、OASL5：配列番号22、OAS1：配列番号23、OAS2：配列番号25、およびOAS3：配列番号27であるが、これらに限定されることはない。
【０１３３】
本発明は、哺乳動物細胞たとえばマウス、ラットまたはヒトの細胞から単離可能なDNAセグメントに関し、それは、全ゲノムDNAから離れたものであり、かつタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現させることが可能なものである。従って、OaslをコードするDNAセグメントは、野生型、多形性または突然変異型Oaslコード配列を含み、しかも哺乳動物の全ゲノムDNAから離され単離さているかまたは離され精製されているDNAセグメントを指す。
【０１３４】
同様に、単離または精製されたOasl遺伝子を含むDNAセグメントは、OASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード配列をコードし、ある局面では、さらに調節配列をコードし、他の天然の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に分離されているDNAセグメントを指す。当業者に明らかなように、この機能的用語の遺伝子は、Oaslコード配列のタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および突然変異体を発現させるまたは発現させるように適合しうるゲノム配列、cDNA配列および遺伝子操作セグメントのいずれも含む。
【０１３５】
「他のコード配列から実質的に分離されている」ことは、関心のある遺伝子、この場合Oasl遺伝子が、DNAセグメントのコード領域の重要な部分を形成し、しかもDNAセグメントは天然のコードDNAの大きな部分、例えば大きな染色体断片または他の機能的遺伝子もしくはcDNAコード領域を含まないことを意味する。もちろん、これは、もともと単離されたDNAセグメントを指すが、人工的に後からセグメントに加えた遺伝子またはコード領域を排除するものではない。
【０１３６】
A.変異体
所定の態様において、本発明は、OASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列を組み込む単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。該OASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、そのアミノ酸配列内に、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12に従うまたは実質的に示される連続したアミノ酸配列を含み、そして、その配列は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12の一部に実質的に相当し、かつ配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12のアミノ酸と同一ではない相対的に少ないアミノ酸を有するものであるか、または、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12のアミノ酸の生物学的機能的等価物である相対的に少ないアミノ酸を有するものである。
【０１３７】
従って、特定の態様において、OASLタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたはその生物学的機能的等価物の生物学的活性は、例えば、mRNA分解に関与する。さらに、OASLは2-5A合成能を欠くと考えられる。
【０１３８】
所定の態様において、本発明は、その配列内に配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11に実質的に示される核酸配列を含む単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。「配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11に実質的に示される」とは、上述と同様の意味で用いられ、その核酸配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11の一部に相当し、かつ配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11のコドンに対し、同一ではないか機能的に等価である相対的に少ないコドンを有することを意味する。
【０１３９】
機能的に等価なコドンは、同じアミノ酸をコードするコドン、例えば、アルギニンおよびセリンに対する6個のコドンであり、また、それは、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンも指す。種々の生物体または細胞小器官に対するコドンの用法は、当該技術においてよく知られており、従って、本開示を用いて、当業者は、種々の生物体において発現のためのコドンの用法を最適化できる。意図するところによれば、当業者が知りうる好ましいコドンの用法に基づき、コドンの用法は必要な動物に対し最適化できるほか、他の生物体、例えば原核生物（例えばユーバクテリア、古細菌）、真核生物（例えば原生生物、植物、カビ、動物）、ウイルスなどに対しても最適化でき、また、核酸を含む細胞小器官、たとえばミトコンドリアまたはクロロプラストに対しても最適化できる。
【０１４０】
勿論、アミノ酸配列発現が関与する生物学的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの活性の維持を含む上述した基準が配列によって満たされるかぎり、アミノ酸および核酸の配列は、さらなる残基、例えば、さらなるN-もしくはC-末端アミノ酸または5'もしくは3'配列を含んでもよく、それでもなお、ここに開示する配列の一つに示されるものと実質的に同じである。例えば、コード領域の5'または3'部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含みうる核酸配列、あるいは、種々の内部配列、すなわちイントロン（遺伝子内に生じることが知られる）を含みうる核酸配列に対し、末端配列の付加が特にあてはまる。
【０１４１】
また、同じ考え方を用いて、対抗する性質、すなわち拮抗的性質を有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを作ることができる。このことも本発明に関連し、そこにおいて、非保存的な置換、挿入および／または欠失を用いてOASL変異体または類似体を生成させることができる。OASL変異体を、妊性を阻害または増強するためのアンタゴニストとして使用してもよい。従って、OASL変異体は、可能性のある避妊組成物および／または妊性増強組成物として使用することができる。
【０１４２】
A.相補的核酸
また、本発明は、OASLおよび／またはOAS核酸に相補的な核酸を包含する。特定の態様において、本発明は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11に示される配列に相補的な核酸または核酸セグメントを包含する。ある核酸が、標準ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合相補性則に従って、他の核酸と塩基対合することが可能であるとき、その核酸は、他の核酸に対し、「相補物」であるかまたは「相補的」である。ここで使用する用語「他の核酸」は、別の分子または同じ分子の空間的に離れた配列を指し得る。
【０１４３】
ここで使用する用語「相補的」または「相補物」は、たとえ、すべての核酸塩基が対応する核酸塩基と対合するわけではない場合でも、他の核酸の鎖または二重鎖とハイブリダイズすることができる連続的な核酸塩基または半連続的な核酸塩基の配列（例えば、一つ以上の核酸塩基部分が該分子に存在しない）からなる核酸を指していう。ある特定の態様において、「相補的」核酸は、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%の、約100%までの、あるいは、そこから導き出せる任意の範囲の、核酸塩基配列が、ハイブリダイゼーションにおいて、一本鎖または二本鎖の核酸分子と塩基対合することが可能な配列からなる。ある特定の態様において、用語「相補的」は、当業者に明らかなように、ストリンジェントな条件において、他の核酸の鎖または二重鎖にハイブリダイズできる核酸を指していう。
【０１４４】
ある特定の態様において、「部分的に相補的な」核酸は、低いストリンジェンシーの条件において一本鎖または二本鎖の核酸とハイブリダイズできる配列からなるか、あるいは、約７０％未満の核酸塩基配列が、ハイブリダイゼーションにおいて、一本鎖または二本鎖の核酸分子と塩基対合することができる配列を含む。
【０１４５】
B.核酸のハイブリダイゼーション
また、ここに開示する核酸配列は、種々の用途を有し、例えば、核酸ハイブリダイゼーションの態様においてプローブまたはプライマーとしての用途を有する。
【０１４６】
ここで使用する用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズすることが可能な（ハイブリダイズすることができる）」は、二本鎖または三本鎖分子を形成すること、または、部分的な二本鎖または三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると解される。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズすることが可能な（ハイブリダイズすることができる）」は、用語「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー」および用語「低いストリンジェンシー」または「低いストリンジェンシーの条件」に及ぶ。
【０１４７】
ここで使用する用語「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー」は、相補的配列を含む一つ以上の核酸鎖間または核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にする（しかし、ランダム配列のハイブリダイゼーションを排除する）条件である。ストリンジェントな条件は、もしあっても、核酸と目的とする鎖との間のミスマッチをほとんど許容しない。そのような条件は、当業者によく知られており、高い選択性を必要とする用途に好ましい。非限定的な用途には、核酸、たとえば、遺伝子またはその核酸セグメントの単離、または、少なくとも一つの特定のmRNA転写産物またはその核酸セグメントの検出などがある。
【０１４８】
ストリンジェントな条件は、低塩および／または高温の条件、たとえば、約0.02M〜約0.15MのNaClによって約50℃〜約70℃の温度で与えられるような条件を含み得る。明らかなとおり、必要なストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、一部、特定の一つ以上の核酸の長さ、目的とする一つ以上の配列の長さおよび核酸塩基含量、該核酸の電荷構成によって決まり、また、ハイブリダイゼーション混合物におけるホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはその他の一つ以上の溶媒の存在または濃度に対して決まってくる。
【０１４９】
さらに明らかなとおり、ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単に非限定的な例として述べるものであり、そして、特定のハイブリダイゼーション反応に必要なストリンジェンシーは、しばしば、一つ以上の陽性または陰性の対照との比較による経験に基づいて決定される。想定される用途に応じて、種々のハイブリダイゼーション条件を用い、目的とする配列に対し核酸の選択性の程度をいろいろ変えることが好ましい。非限定的な例において、ストリンジェントな条件下である核酸にハイブリダイズしない関係のあるターゲット核酸の同定または分離は、低い温度および／または高いイオン強度でのハイブリダイゼーションによって達成し得る。例えば、中程度のストリンジェンシー条件は、約0.1〜0.25MのNaClにより約37℃〜約55℃の温度でもたらすことができる。これらの条件下では、プローブおよび目的とする鎖が完全には相補的でなく、一つ以上の箇所でミスマッチが生じても、ハイブリダイゼーションが起こり得る。他の例では、低いストリンジェンシー条件は、約0.15M〜約0.9Mの塩により約20℃〜約55℃の範囲の温度でもたらすことができる。もちろん、特定の用途に合うよう、上記低いまたは高いストリンジェンシー条件をさらに改変することは、当業者の能力の範囲内のことである。たとえば、他の態様において、ハイブリダイゼーションは、50mMのトリス-HCl(pH 8.3)、75mMのKC1、3mMのMgCl2、1.0mMのジチオトレイトール、約20℃〜約37℃の温度の条件下で達成することができる。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、約10mMのトリス-HCl(pH 8.3)、50mMのKC1、1.5mMのMgCl2、約40℃〜約72℃の範囲の温度を含むことができる。
【０１５０】
従って、本開示のヌクレオチド配列は、遺伝子またはRNAの相補的鎖と二重鎖分子を選択的に形成できるその能力を生かすように使用することができ、あるいは、組織からのDNAまたはRNAを増幅するためのプライマーを提供するため、使用することができる。想定される用途に応じて、種々のハイブリダイゼーション条件を用い、目的とする配列に対しプローブの選択性の程度をいろいろ変えることが好ましい。
【０１５１】
本発明の核酸セグメントは、コード配列自身の長さにかかわらず、他のDNA配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメント等と結合させてもよく、そのため、それらの全長はかなり変わりうる。従って、意図するところによれば、ほとんどあらゆる長さの核酸断片を使用することができ、その全長は、好ましくは、調製の容易さおよび意図する組換えDNAプロトコルでの用途によって制限される。
【０１５２】
所定の態様において、核酸セグメントはプローブまたはプライマーとすることができる。ここで使用する「プローブ」は、通常、検出方法または検出組成物に用いられる核酸を指す。ここで使用する「プライマー」は、通常、伸長または増幅の方法または組成物に用いられる核酸を指す。
【０１５３】
17〜100ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、あるいは、本発明のある局面において、1〜2Kbまでかそれ以上の長さのハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、安定でかつ選択的な二重鎖分子の形成が可能になる。ハイブリッドの安定性および選択性を高めるため、そして、得られる特定のハイブリッド分子の質および程度を向上させるため、20塩基よりも長い範囲にわたって相補的配列を有する分子が一般に好ましい。一般に20〜30ヌクレオチドの伸長物（必要であれば、さらに長い伸長物）を有する核酸分子を設計することが好ましい。そのような断片は、例えば、化学的手段により直接、断片を合成することにより、あるいは、選択した配列を組換えベクターに導入して組換え物を生成させることにより、容易に調製できる。
【０１５４】
概して、意図するところによれば、ここに記載されるハイブリダイゼーションプローブは、固相を用いる態様と同様に、溶液ハイブリダイゼーションにおける試薬として、そして、PCRTM（商標）における試薬として、ともに、対応する遺伝子の発現の検出のため有用である。固相を用いる態様において、試験DNA（またはRNA）は、選択した母材（マトリックス）または表面に吸着させられるか、さもなくば付着させられる。次に、この固定された一本鎖核酸は、必要な条件下、選択したプローブとのハイブリダイゼーションに供される。選択される条件は、必要とされる特定の基準に基づく特定の状況によって変わる（例えば、G+C含量、目的とする核酸のタイプ、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどによって変わる）。非特異的に結合されるプローブ分子を除去するためにハイブリダイズした表面を洗浄し、その後、標識によってハイブリダイゼーションを検出し、あるいは、さらに定量する。
【０１５５】
C.核酸の増幅
増幅用の鋳型として用いる核酸を、標準的な方法（Sambrook他、1989）により、生物試料に含まれる細胞から単離する。この核酸は、ゲノムDNAでもよいし、分画または全細胞RNAでもよい。RNAを使用する場合、RNAを相補的DNAに転換することが望ましい。ある態様において、RNAは全細胞RNAであり、増幅のための鋳型として直接使用される。
【０１５６】
Oasl遺伝子に相当する核酸に選択的にハイブリダイズするプライマーペアーを、選択的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、分離された核酸に接触させる。ここで定義する用語「プライマー」は、鋳型依存プロセスにおいて新生核酸の合成を開始させることができるあらゆる核酸を包含すべきである。典型的に、プライマーは、10〜20または30塩基対の長さのオリゴヌクレオチドであるが、これよりも長い配列を用いることもできる。プライマーは、二本鎖または一本鎖の形態で用意できるが、一本鎖の形態が好ましい。
【０１５７】
ハイブリダイゼーションを行った後、核酸：プライマー複合体を、鋳型依存核酸合成を促進する一つ以上の酵素と接触させる。増幅を複数回の繰返すこと（「サイクル」とも呼ばれる）を十分な量の増幅生成物が得られるまで行う。
【０１５８】
次に増幅生成物を検出する。ある応用例では、検出を視覚による手段によって行うことができる。一方、検出は、組み込まれた放射性標識または蛍光標識の化学ルミネセンス、放射性シンチグラフィーを介する、あるいは、電気的または熱的インパルス信号を用いるシステムをも介する、生成物の間接的識別法を用いるものでもよい。
【０１５９】
所定の鋳型試料に存在するマーカー配列を増幅するため、多数の鋳型依存プロセスを利用できる。最もよく知られた増幅方法の一つとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCRTM（商標）と呼ぶ）がある。これは米国特許番号第4,683,195、4,683,202および4,800,159号に詳細に記載されている。この引用によりそれらの内容全体が本明細書に記載されたものとする。
【０１６０】
簡単に言えば、PCRTM（商標）では、マーカー配列の対向する相補鎖上の領域に相補的な、２つのプライマー配列が準備される。過剰なデオキシヌクレオシド三リン酸を、DNAポリメラーゼ（例えばTaqポリメラーゼ）とともに反応混液に添加する。試料中にマーカー配列が存在するならば、プライマーはマーカーに結合し、ポリメラーゼは、ヌクレオチドの付加により、プライマーをマーカー配列に沿って伸張させる。反応混液の温度を上下させると、伸張したプライマーはマーカーから解離して反応生成物をもたらす。過剰のプライマーは、マーカーと反応生成物に結合し、このプロセスが繰返される。
【０１６１】
増幅されたmRNAの量を定量するために、逆転写酵素PCR増幅法を実施してもよい。RNAをcDNAに逆転写する方法は周知であり、Sambrook他、1989に記載されている。逆転写の別の方法では、熱安定性の、RNA依存性DNAポリメラーゼを利用する。これらの方法は、1990年12月21日に提出されたWO 90/07641に記載されており、その内容は、この引用により本明細書に記載されたものとする。ポリメラーゼ連鎖反応法は、当該技術分野において周知である。
【０１６２】
他の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（LCR）であり、EPA No.320 308に開示される。その内容はこの引用により本明細書に記載されたものとする。LCRでは、二つの相補的プローブ対が調製され、ターゲット配列の存在下、各対は、隣接するよう、ターゲットの対向する相補鎖に結合する。リガーゼの存在下、二つのプローブ対は結合して単一の単位となる。PCRTM（商標）と同様に温度を周期的に変化させると、結合した連結単位は、ターゲットから解離し、そして、過剰なプローブ対の連結のための「ターゲット配列」として働く。米国特許第4,883,750号は、プローブ対をターゲット配列に結合するための、LCRに類似する方法を記載する。
【０１６３】
Qbetaレプリカーゼ（PCT出願番号第PCT/US87/00880号（この引用によりその内容が本明細書に記載されたものとする）に記載される）も、本発明のもう１つの増幅方法として使用できる。この方法では、ターゲットの配列に相補的な領域を持つ、RNAの複製配列を、RNAポリメラーゼの存在下、試料に添加する。このポリメラーゼによって複製配列がコピーされると、その配列が検出できるようになる。
【０１６４】
等温増幅法も、本発明における核酸の増幅に有用である。この方法では、制限エンドヌクレアーゼとリガーゼを用いて、制限部位の一方の鎖にあるヌクレオチド5'-[α-チオ]-三リン酸を含むターゲット分子の増幅を実現する。
【０１６５】
鎖置換増幅（SDA）は、核酸の等温増幅を行う別の方法であり、それは、複数回の鎖置換および合成、すなわち、ニックトランスレーションを含む。修復連鎖反応（Repair Chain Reaction、RCR）とよばれる類似の方法は、増幅の標的となる領域全体で数個のプローブのアニーリングを行うものであり、その後、４種の塩基のうち２種だけを存在させて、修復反応を行う。残りの２種の塩基は、検出が容易になるように、ビオチン化誘導体として添加することができる。類似の方法がSDAで使用される。ターゲット特異的配列はまた、サイクリックプローブ反応（cyclic probe reaction、CPR）を用いて検出できる。CPRでは、非特異的DNAの3'および5'配列と特異的RNAの中間配列とを有するプローブが、試料に存在するDNAにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに際し、反応物はRNアーゼHで処理され、プローブの生成物は、消化後に放出される特徴的な生成物として識別される。元の鋳型は、他のサイクリングプローブにアニールされ、反応が繰り返される。
【０１６６】
英国出願番号第2,202,328号およびPCT出願番号第PCT/US89/01025号（この引用によりこれら内容は本明細書に記載されたものとする）に記載された他の増幅方法も、本発明に従って使用できる。前者の出願では、「修飾された」プライマーが、PCRTM（商標）に類似する鋳型および酵素依存性の合成に用いられる。このプライマーは、捕捉部分（ビオチンなど）および/または検出部分（酵素など）で標識することにより修飾できる。後者の出願では、過剰の標識プローブを試料に添加する。ターゲット配列の存在下、プローブは結合し、触媒作用的に切断される。切断後、ターゲット配列は無傷で放出され、過剰のプローブによって結合される。標識プローブの切断によって、ターゲット配列の存在が知らされる。
【０１６７】
他の核酸増幅法には、転写に基づく増幅系（transcription-based amlification system、TAS）（核酸配列に基づく増幅系（nudeic acid sequence based amplification、NASBA）および３SRを含む）がある（Gmgerasら、PCT出願番号第WO 88/10315号（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする））。NASBAにおいて、増幅用の核酸は、標準的なフェノール/クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、DNAおよびRNAの分離のための、溶解緩衝液およびミニスピンカラムを用いた処理、あるいは、RNAの塩化グアニジウム抽出により調製できる。これらの増幅技法には、ターゲット特異的配列を持つプライマーのアニーリングが含まれる。重合の後、DNA/RNAハイブリッドをRNアーゼHで消化し、一方、二本鎖DNA分子を再び熱変性させる。いずれの場合でも、第二のターゲット特異的プライマーを加えることにより、一本鎖DNAを完全な二本鎖とし、その後に重合を行う。次いで、二本鎖DNA分子を、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼにより多重転写する。等温サイクル反応において、RNAを一本鎖DNAに逆転写し、そして、これを二本鎖DNAに転換する。その後、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼによって再び転写する。得られた生成物は、切り詰められているか、完全であるかにかかわらず、ターゲット特異的配列を示す。
【０１６８】
Davey他のEP 329,822(この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする)は、一本鎖RNA(ssRNA)、ssDNA、および二本鎖DNA(dsDNA)を周期的に合成することを含む核酸増幅プロセスを開示する。該プロセスを本発明に従って使用することができる。ssRNAは、第一のプライマーオリゴヌクレオチドの鋳型であり、該プライマーは逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、得られたDNA：RNA二重鎖から、リボヌクレアーゼＨ(RNアーゼH、DNAまたはRNAのいずれかとの二重鎖においてRNAに特異的なRNアーゼ)の作用によって、RNAを除去する。得られたssDNAは、第二のプライマーの鋳型である。このプライマーはさらに、鋳型に対するその相同性に対して5'にRNAポリメラーゼ（例えばT7 RNAポリメラーゼ）プロモーターの配列を含む。そして、このプライマーはDNAポリメラーゼ（例えば大腸菌DNAポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」フラグメント）によって伸長され、プライマー間に元のRNAの配列に等しい配列を有し、さらに、一端にプロモータ配列を有する二本鎖DNA（dsDNA）分子をもたらす。このプロモータ配列を用いて、適当なRNAポリメラーゼにより、DNAの多数のRNAコピーを作ることができる。その後、これらのコピーは、非常に速い増幅をもたらすサイクルに再び入る。酵素を正しく選べば、この増幅は、サイクルごとに酵素を加えなくても等温的に行える。このプロセスは周期的であるため、開始配列は、DNAまたはRNAのいずれかの形態を選択できる。
【０１６９】
MillerらのPCT出願番号第WO 89/06700号（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする）に開示される核酸配列の増幅スキームは、プロモータ／プライマー配列のターゲット一本鎖DNA（ssDNA）へのハイブリダイゼーションと、その後の、配列の多数のRNA複製物の転写に基づいている。このスキームは周期的でない。すなわち、生じたRNA転写物から新しい鋳型は生じない。別の増幅方法は、「RACE」および「片側PCR」を含む(Frohman、1990)（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする）。
【０１７０】
生じた「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で二つ（または三つ以上）のオリゴヌクレオチドを連結し、それによりジオリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法もまた、本発明の増幅工程に用いることができる。
【０１７１】
D.核酸の検出
所定の態様において、本発明の核酸配列は、適当な手段、例えばハイブリダイゼーションを確認するための標識と組み合わせて用いることが有利である。当該技術において、多くの適当な標識手段が知られており、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、あるいはアビジン／ビオチンのような他のリガンド類があり、それらは検出可能である。好ましい態様において、放射性試薬またはその他の環境に有害な試薬の代わりに、所望により、蛍光標識または酵素標識、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを用いることができる。酵素標識の場合、公知の比色標識基質を使用することができ、それにより、ヒトの目でまたは分光測光的に見ることができる検出手段を与え、相補的核酸を含む試料との特異的なハイブリダイゼーションを確認することができる。
【０１７２】
核酸を増幅する態様において、特定の増幅が起こったかどうかを決めるため、鋳型および過剰のプライマーから増幅生成物を分離するのが望ましい。ある態様において、増幅生成物は、標準的な方法を用いてアガロース、アガロース−アクリルアミド、または、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される(Sambrook他、1989)。
【０１７３】
一方、分離を行うために、クロマトグラフィー法を用いてもよい。吸着、分配、イオン交換、および分子ふるい、そして、それらを用いる多くの具体的方法、例えばカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーなど、多くの種類のクロマトグラフィーを本発明において用いることができる。
【０１７４】
増幅生成物は、マーカー配列の増幅を確認するために、視覚化する必要がある。ある代表的な視覚化の方法は、臭化エチジウムによるゲルの着色と、UV光による可視化を用いる。一方、増幅生成物が、放射性標識されたまたは蛍光測定可能に標識されたヌクレオチドで一体的に標識されている場合、この増幅生成物を、分離後、Ｘ線フィルムに曝露するか、適当な刺激スペクトルのもとで視覚化することができる。
【０１７５】
ある態様において、視覚化は間接的に行われる。増幅生成物の分離後、標識された核酸プローブを増幅したマーカー配列に接触させる。このプローブは発色団に接合させることが好ましいが、放射性標識を行ってもよい。他の態様において、プローブを一つの結合パートナー、例えば抗体またはビオチン、に接合させ、結合パートナーの他方は検出可能な部分を保持する。
【０１７６】
ある態様において、サザンブロット分析と標識プローブを用いたハイブリダイゼーション分析により検出を行う。サザンブロット分析に必要な技術は、当業者に周知であり、分子プロトコルに関する多くの標準的な書物に見出すことができる(Sambrook他、1989参照)。簡単に言えば、増幅生成物を、ゲル電気泳動により分離する。次にゲルをニトロセルロースなどの膜に接触させると、核酸の転移および非共有結合が可能となる。続いてこの膜を、目的とする増幅生成物とハイブリダイズできる発色団接合プローブとともにインキュベートする。検出は、この膜をＸ線フィルムに暴露することにより、あるいは、イオン放射検出装置により行う。
【０１７７】
上記の一例が、米国特許番号第5,279,721号に記載されている。この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする。これは、核酸の自動化された電気泳動および転移のための装置および方法を開示する。この装置は、ゲルの外部操作を行わずに電気泳動とブロッティングを行うことが可能で、本発明による方法を実施するのに非常に適している。
【０１７８】
III.発現コンストラクトの作製
所定の態様において、本発明は、Oasl遺伝子をコードする発現コンストラクトを作製するために、遺伝物質の操作を用いる。このような方法には、例えば関心のある遺伝子をコードする異種DNAとその発現のための手段を含有する発現コンストラクトの生成、適当なヘルパー細胞でそのベクターを複製すること、そこから生産されるウイルス粒子を得ること、および細胞をその組換えウイルス粒子に感染させることが含まれる。
【０１７９】
その遺伝子は、本明細書で解説する正常のOasl遺伝子とすることができる。遺伝子治療に関し、その遺伝子は異種DNAとすることができ、ベクターの骨格となるウイルスゲノム以外の供給源に由来するDNAを含むものとする。遺伝子は細菌、ウイルス、酵母、寄生虫、植物または動物などの原核もしくは真核供給源に由来しうる。異種DNAは二つ以上の供給源に由来してもよい（すなわち多重遺伝子コンストラクトまたは融合タンパク質）。異種DNAは、１つの供給源に由来しうる調節配列と、異なる供給源からの遺伝子とを含んでもよい。
【０１８０】
さらに本発明は、キメラのポリヌクレオチド配列を構築することを含んでもよい。そのような配列は、細胞でタンパク質を過剰発現させるのに使用できる。キメラの導入遺伝子またはキメラのコンストラクトは、所望の組織において所望の発生段階でポリヌクレオチド配列の発現を誘導できるプロモーターを用いることにより、生成させることができる。これらのキメラコンストラクトは、同じポリヌクレオチド配列に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含むことができる。さらに、転写終結シグナルをコードする3'非コードポリヌクレオチド配列を含めることができる。さらに意図するところによれば、ポリヌクレオチド配列の発現を促進するため、キメラのコンストラクトは一つ以上のイントロンも含むことができる。
【０１８１】
A.選択可能なマーカー
本発明の所定の態様において、本発明の治療用発現コンストラクト及び／又は予防用コンストラクトは、核酸コンストラクトを含み、そのコンストラクトの発現は、その発現コンストラクトにマーカーを含ませることにより、インビトロまたはインビボで確認される。そのようなマーカーは、細胞に確認可能な変化をもたらすことができ、発現コンストラクトを含む細胞の容易な識別を可能にする。通常、薬剤選択マーカーを含ませることは、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。たとえば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに耐性を与える遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。その代わりに、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tK)のような酵素が用いられる。免疫原性のマーカーも用いることができる。採用される選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能であるかぎり、それほど重要ではないと考えられる。選択可能なマーカーのさらなる例は、当業者によく知られており、レポーター類、たとえば、EGFP、βgal、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）を含む。
【０１８２】
B.制御領域
1.プロモーター
関心のあるポリヌクレオチド配列の発現を制御するのに使用される特定のプロモーターは、目的とする細胞において該ポリヌクレオチドの発現を誘導することができるかぎり、それほど重要でないと考えられる。したがって、ヒト細胞を目的とする場合、ポリヌクレオチド配列のコード領域を、ヒト細胞において発現が可能なプロモーターの近傍でその制御下にあるよう、配置することが好ましい。概して、そのようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスのプロモーターのいずれかを含み得る。
【０１８３】
種々の態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、β−アクチン、ラットインシュリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを、関心のあるコード配列の高レベル発現を得るのに使用することができる。発現レベルが所定の目的に対し十分であるならば、関心のあるコード配列の発現を達成するため当該技術においてよく知られている他のウイルスプロモーター、哺乳動細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も、同様に考えられる。よく知られた特性を有するプロモーターを採用することにより、トランスフェクションまたはトランスフォーメーション後の関心のあるタンパク質の発現レベルおよびパターンを最適化することができる。
【０１８４】
特定の生理的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターを選択すれば、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にすることができる。たとえば、一つの導入遺伝子または複数の導入遺伝子（マルチシストロンベクターを用いるとき）の発現が、ベクターを産する細胞に毒性である場合、該導入遺伝子の一つ以上の発現を妨げるか低減させることが望ましい。プロデューサー細胞株に毒性の導入遺伝子の例は、プロアポトーシス遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導可能なプロモーター系を、導入遺伝子産物が毒性である場合、ウイルスベクターの生産に利用できる。
【０１８５】
エクダイソン系（Invitrogen, Carlsbad, カリホルニア州）は、そのような系の一つである。この系は、哺乳動物細胞において、関心のある遺伝子の制御された発現を可能にするよう設計されている。それは、導入遺伝子の発現基底レベルが実質的にゼロであることを可能にする一方、200倍を越える誘導能が可能である厳密に制御された発現機構からなる。この系は、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクダイソン受容体に基づいており、エクダイソンまたはmuristerone Aのような類似体が受容体に結合するとき、該受容体がプロモーターを活性化して下流の導入遺伝子の発現を生じさせ、高レベルのmRNA転写産物がもたらされる。この系において、ヘテロ二量体受容体の両モノマーは、一方のベクターから構造的に発現され、これに対し、関心のある遺伝子の発現を駆動するエクダイソン−応答性プロモーターは、他のプラスミド上にある。関心のある遺伝子導入ベクターへこのタイプの系を組み込むことは、従って有用である。そして、関心のある遺伝子と受容体モノマー類とを含むプラスミド類をプロデューサー細胞株に同時形質移入することは、毒性の可能性のある導入遺伝子の発現なく、遺伝子導入ベクターの生産を可能にし得る。適当な時期に、導入遺伝子の発現をエクダイソンまたはmuristeron Aによって活性化することができる。
【０１８６】
有用となり得る他の誘導可能な系は、最初GossenおよびBujard(GossenおよびBujard、1992; Gossen他、1995)により開発されたTet-OffTM（商標）またはTet-OnTM（商標）系（Clontech, Palo Alto, カリホルニア州）である。この系もまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体、たとえばドキシサイクリンに応答して、高レベルの遺伝子発現を制御可能にする。Tet-OnTM（商標）系において、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下で生じる一方、Tet-OffTM（商標）系において、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの不在下で生じる。これらの系は、大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンに由来する二つの制御因子に基づいている。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。関心のある遺伝子を、プロモーターの後ろでプラスミドにクローニングする。プロモータは、その中に存在するテトラサイクリン−応答性因子を有するものである。第二のプラスミドは、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターと呼ばれる制御因子を含み、それは、Tet-OffTM（商標）系において、単純ヘルペスウイルスからのVP16ドメインと野生型テトラサイクリンリプレッサーとから構成される。かくして、ドキシサイクリンの不在下、転写が構造的に生じる。Tet-OnTM（商標）系では、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下、転写を活性化する。遺伝子治療ベクター生産のため、Tet-OffTM（商標）系が好ましいであろう。というのも、プロデューサー細胞は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で増殖することができ、そして毒性の可能性のある導入遺伝子の発現を防止することができるからである。一方、ベクターが患者に導入されるとき、遺伝子発現は、構造的に生じ得る。
【０１８７】
さらに、他の制御可能な系はRU486（Pierson他、2000）である。この系はリガンドにより誘導可能な系である。RU486またはミフェプリストンの存在下、転写が活性化される。GeneSwitch系は、キメラの制御因子（GLVP）を含み、それは、結合してRU486により活性化される突然変異プロゲステロン受容体リガンド結合ドメインから構成される。
【０１８８】
ある状況では、遺伝子治療ベクターにおいて導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、種々の活性強度を有する異なるウイルスプロモーターが、発現の必要なレベルに応じて利用される。哺乳動物細胞において、CMV最初期プロモーターが、強い転写活性化をもたらすべく、しばしば使用される。導入遺伝子の発現レベルを低くしたい場合、効力の低い改変されたCMVプロモーターもまた使用されてきた。造血細胞において導入遺伝子の発現が必要な場合、レトロウイルスプロモーター、たとえば、MLVまたはMMTVからのLTRがしばしば用いられる。必要な作用に応じて使用される他のウイルスプロモーターには、SV40、RSV LTR、HIV-1およびHIV-2 LTR、アデノウイルスプロモーター、たとえばE1A、E2AまたはMLP領域、AAV LTR、HSV-TK、およびトリ肉腫ウイルスからのものがある。
【０１８９】
目的としない組織への可能性のある毒性または望ましくない作用を減らすよう、特定の組織または細胞において転写をもたらすため、同様に、組織特異的プロモーターが用いられる。たとえば、雌の生殖細胞特異的プロモーターには、Zp3（透明帯プロテイン3）（Lira他、1990）、ZP2（透明帯プロテイン2）、ZP1（透明帯プロテイン1）、kit、GDF-9、Oct-4、Fig-アルファプロモーター、などがあるが、これらに限定されるものではない。雄の生殖細胞プロモーターには、PGK2プロモーター（Zhang他、1999)、プロタミン（Protamine）プロモーター（Peschon他、1987）、fig-アルファ、シスタチンTおよびINSL6があるが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
ある兆候においては、遺伝子治療ベクターの投与の後、特定の時期に転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインで調節可能なプロモーター等を用いて行われる。使用することができる、サイトカインおよび炎症タンパク質応答性プロモーターには、KおよびTキニノーゲン（Kageyama他、1987）、c-fos、TNF-アルファ、C-反応性タンパク質（Arcone他、1988）、ハプトグロビン（Oliviero他、1987）、血清アミロイドA2、C/EBPアルファ、IL-1、IL-6（PoliおよびCortese、1989）、補体C3（Wilson他、1990）、IL-8、アルファ-1酸グリコプロテイン（ProwseおよびBaumann、1988）、alpha-1 antitypsin（抗トリプシン）、リポタンパク質リパーゼ（Zechner他、1988）、アンギオテンシノーゲン（Ron他、1991）、フィブリノーゲン、c-jun（ホルボールエステル類、TNF−アルファ、UV照射、レチノイン酸、および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステル類およびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイドで誘導可能）、ストロメリシン（ホルボールエステル、インターロイキン-1およびEGFにより誘導可能）、アルファ-2マクログロブリン、およびアルファ-1抗キモトリプシンがある。
【０１９１】
必要な作用に応じて、本発明により、上記プロモーターの任意のものを単独で、または他のものと組み合わせて、活用することができる。また、上記プロモーターのリストは、すべてを網羅するものあるいは限定的なものとして解釈すべきでなく、ここに開示するプロモーターおよび方法に関連して使用される他のプロモーターは、当業者の知るところである。
【０１９２】
2．エンハンサー
エンハンサーは、DNAの同じ分子上で離れた位置にあるプロモーターからの転写を増加させる遺伝子要素である。エンハンサーはプロモーターのように有機的に構成されている。すなわち、エンハンサーは、多くの個々の要素からなり、その各々は、一つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な違いは、操作可能である。エンハンサー領域は、全体として、ある距離をおいて、転写を刺激することが可能になる必要がある。このことは、プロモーター領域またはその構成要素の場合には、必要がない。一方、プロモーターは、RNAの合成の開始を特定の部位で特定の配向に誘導する一つ以上の要素を有する必要がある。これに対し、エンハンサーは、これらの特異性に欠けている。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば、部分的に重なり、かつ隣接し、しばしば、非常に類似するモジュールの構成を有するようにみえる。
【０１９３】
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核プロモーターデータベース（Eukaryotic Promoter Data Base）（EPDB）より）を用いて遺伝子の発現を駆動することができる。もし、適当な細菌ポリメラーゼが、送達（デリバリー）複合体の一部またはさらなる遺伝子発現コンストラクトのいずれかとして与えられるならば、真核細胞は、所定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支えることができる。
【０１９４】
3．ポリアデニル化シグナル
cDNA挿入物が用いられる場合、典型的に、遺伝子転写産物の適当なポリアデニル化をもたらすため、ポリアデニル化シグナルを含めることが必要になってくる。ポリアデニル化シグナルの性質が、本発明をうまく実施するために特に重要であるとは考えられず、任意の配列、たとえば、ヒトまたはウシ成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルが使用される。発現カセットの要素としてさらに考えられるのは、ターミネーターである。これらの要素は、メッセージレベルを高め、かつカセットから他の配列へのリードスルー（読み過ごし）を最小にするよう、機能しうる。
【０１９５】
4．組込み（インテグレーション）配列
発現ベクターが細胞内で自己複製することが有利な場合、ベクターに存在する組込み配列、すなわち、レトロウイルス長末端反復配列（LTR）、アデノ随伴ウイルスITR配列により、ベクターは細胞のゲノムに組込んでもよく、また、その代わりに、ベクターそれ自身が、DNA複製の起点と、細胞においてベクターの複製を促進する他の配列とを含むことができ、そして該ベクターはエピソームの形態を維持する。例えば、発現ベクターは、必要に応じてDNA複製のエプスタイン−バールウイルス（EBV）起点と、ベクターが導入される細胞においてベクターのエピソーム複製を促進させるためEBVのEBNA-1タンパク質をコードする配列とを含むことができる。例えば、EBV起点と、核抗原EBNA-1コードとを有するDNAコンストラクトは、哺乳動物細胞において、高い複製数で複製が可能であり、かつ、例えばInvitrogen（San Diego、カリホルニア州）から市販されている。
【０１９６】
留意すべき重要なことは、本発明において、適当なタンパク質発現のために、発現ベクターを細胞のゲノムに組込ませる必要はないことである。むしろ、発現ベクターは、必要な細胞中において、エピソーム分子の形態で存在することもできる。例えば、所定の細胞タイプにおいて、必要なタンパク質を発現させるために発現ベクターが自己複製する必要はない。これらの細胞は、正常に複製しないが、遺伝子を十分に発現することができるものである。発現ベクターは、非分裂細胞に導入され、そして、発現ベクターの複製なしに、それによってコードされるタンパク質を発現させる。
【０１９７】
C.遺伝子導入の方法
細胞において導入遺伝子発現の効果を発揮させるため、本発明の発現コンストラクトを細胞に導入することが必要になる。そのような導入は、遺伝子導入のウイルスによる方法またはウイルスによらない方法を用いうる。この章は、遺伝子導入の方法および組成物について解説を行う。
【０１９８】
1．非ウイルス性導入
発現コンストラクトを細胞に導入するためのいくつかの非ウイルス法が、本発明により意図される。これらは、リン酸カルシウム沈降（GrahamおよびVan Der Eb、1973; ChenおよびOkayama、1987; Rippe他、1990）、DEAE−デキストラン（Gopal、1985）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspa他、1986; Potter他、1984）、直接マイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub、1985）、DNA充填リポソーム（NicolauおよびSene、1982; Fraley他、1979）、細胞音波処理（Fechheimer他、1987）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子ボンバード（Yang他、1990）、および受容体媒介トランスフェクション（WuおよびWu、1987; WuおよびWu、1988）を含む。
【０１９９】
本発明の特定の態様において、発現コンストラクトは、カチオンポリマーに複合化される。水溶性の複合体であるカチオンポリマーは、当該技術においてよく知られており、DNAプラスミド用の送達系として利用されてきた。この戦略は、可溶性の系を用いるものであり、それは、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを介してDNAを細胞内に運ぶ（Wu & Wu 1988）。当業者に認められるとおり、カチオンポリマーとの複合核酸は、核酸の負電荷を中和するのを助け、エンドサイトーシスによる取り込みを増加させる。
【０２００】
本発明の特定の態様において、発現コンストラクトはリポソーム中に封じ込められる。リポソームは、小胞構造物であり、リン脂質二重層膜と内部の水性媒質とを特徴とする。多重ラメラリポソームは、水性媒質によって分離される多重脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁するとき、自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造物が形成される前に、自己再配列をうけ、そして、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を封じ込める（GhoshおよびBachhawat、1991）。DNAをカチオン性リポソームに加えると、リポソームから光学的に複屈折の液晶性凝集小滴へのトポロジカルな転移が起こる（Radler他、1997）。これらDNA−脂質複合体は、可能性のある遺伝子治療用非ウイルス性ベクターである。
【０２０１】
リポソーム媒介核酸送達およびインビトロでの外来DNAの発現は、大変うまくいっている。β−ラクタマーゼ遺伝子を用いて、Wong他（1980）は、リポソーム媒介送達ならびに培養ニワトリ胚、HeLaおよび肝がん細胞における外来DNAの発現の実行可能性を明らかにした。Nicolau他（1987）は、静脈注射の後、ラットにおいてリポソーム媒介遺伝子導入に成功した。さらに含まれるのは、「リポフェクション」技術を用いる種々の市販されているアプローチである。
【０２０２】
本発明の所定の態様において、リポソームは、赤血球凝集ウイルス（HVJ）と複合化される。これは、細胞膜との融合を促進し、かつリポソームによりカプセル化されたDNAの細胞取り込みを推進することが明らかにされてきた（Kaneda他、1989）。他の態様において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）とともに複合化または使用される（Kato他、1991）。さらに他の態様において、リポソームは、HVJとHMG-1の両方とともに複合化または使用される。そのような発現コンストラクトが、インビトロおよびインビボでの核酸の導入および発現にうまく利用されてきたことから、それらは、本発明に適用できる。
【０２０３】
他の態様において、送達媒体は、リガンドおよびリポソームからなり得る。例えば、Nicolau他(1987)は、ラクトシル−セラミド、ガラクトース−末端アシアロガングリオシドを使用して、リポソームに組み込み、肝細胞によるインスリン遺伝子取込みの増加を観察した。従って、リポソームを用いてまたは用いずに、任意の数の受容体−リガンド系により、治療遺伝子をコードする核酸を、前立腺、上皮または腫瘍細胞のような細胞型に特異的に送達することが可能である。例えば、ヒト前立腺特異的抗原（Watt他、1986）は、前立腺組織における核酸の媒介送達用受容体として用いられる。
【０２０４】
本発明の他の態様において、発現コンストラクトは、単に裸の組換えDNAまたはプラスミドからなってもよい。このコンストラクトの導入は、物理的または化学的に細胞膜を透過性にする上記方法のいずれかにより行う。これは、インビトロの導入に特に適用できるが、同様にインビボにも適用される。Dubensky他(1984)は、CaPO4沈殿物の形態で、ポリオーマウイルスDNAを成体および新生児マウスの肝臓および脾臓にうまく注入し、活発なウイルス複製および急性の感染を明らかにした。また、BenvenistyおよびNeshif(1986)は、CaPO4沈殿プラスミドの直接的な腹腔内注入が、形質移入遺伝子の発現をもたらすことを明らかにした。CAMをコードするDNAをインビボで同様に導入し、CAMを発現させることが考えられる。
【０２０５】
裸のDNA発現コンストラクトを細胞に導入するための本発明の他の態様は、粒子ボンバード（粒子銃）を含み得る。この方法は、DNA被覆マイクロプロジェクタイルを高速に加速して、細胞を殺さずに細胞膜に穴をあけ、それを細胞に入れることができる能力によるものである（Klein他、1987）。小さな粒子を加速するための装置がいくつか開発されている。そのような装置の一つは、高電圧荷電によって電流を生じさせ、その結果、推進力をもたらすものである（Yang他、1990）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、生物学的に不活性な物質、たとえば、タングステンまたは金ビーズからなる。
【０２０６】
B．ウイルスベクターにより媒介される導入
所定の態様において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子導入を媒介するウイルス粒子に取込まれる。典型的に、該ウイルスは、単純に、生理学的条件下、適当な宿主細胞にさらされ、該ウイルスの取込みを可能にする。本方法は、以下に解説するとおり、種々のウイルスベクターを用いて、有利に利用される。
【０２０７】
1.アデノウイルス
アデノウイルスは、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。というのも、そのDNAゲノムのサイズは中位であり、操作が簡単であり、力価が高く、標的細胞の範囲が広く、感染力が高いからである。おおよそ36kBのウイルスゲノムは、100〜200塩基対（bp）の逆方向末端反復（ITR）によって境界をつけられる。そこには、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシス作用因子が含まれる。異なる転写単位を含むゲノムの初期（E）領域および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始により分割される。
【０２０８】
E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよびわずかな細胞遺伝子の転写制御をつかさどるタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質はDNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Renan、1990）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む、後期遺伝子（L1、L2、L3、L4およびL5）の産物は、メジャー後期プロモーター（MLP）によって産出される単一の一次転写物の効果的プロセッシングの後にのみ、発現される。MLP（16.8地図単位に位置する）は、感染の後期において特に有効である。このプロモーターから産出されるすべてのmRNAは、5'三部分リーダー（TL）配列を保有し、その配列は、それらを翻訳のための好ましいmRNAにする。
【０２０９】
アデノウイルスを遺伝子治療用として最適化するためには、大きいDNAセグメントを含めることができるよう保持能力を最大にする必要がある。所定のアデノウイルス産物に付随する毒性および免疫反応を減らすことも非常に望ましい。この二つの目標は、アデノウイルス遺伝子の排除が両方の目的にかなうという点で、ある程度共通している。本発明の実施により、治療用コンストラクトを比較的簡単に操作する能力を維持しながら、これら両方の目標を達成することができる。
【０２１０】
DNAの大きな置換は可能である。というのも、ウイルスDNAの複製すべてに必要なシス因子は、線状ウイルスゲノムのいずれかの末端において、逆方向末端反復配列（ITR）（100〜200bp）に局在化されているからである。ITR'sを含むプラスミドは、非欠損アデノウイルスの存在下で複製できる（Hay他、1984）。したがって、これらの要素をアデノウイルスベクターに含めることは、複製を可能にする。
【０２１１】
さらに、ウイルスカプセル化のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノム左端において、194〜385bp（0.5〜1.1地図単位）の間に位置する（Hearing他、1987）。このシグナルは、バクテリオファージλDNAのタンパク質認識部位によく似ており、そこにおいて、左端に近いが付着末端配列の外にある特定の配列は、頭部構造へのDNAの挿入に必要なタンパク質への結合を媒介する。AdのE1置換ベクターが明らかにしたところによれば、ウイルスゲノムの左端にある450bp（0〜1.25地図単位）断片は、293細胞においてパッケージングを誘導することができた（Levrero他、1991）。
【０２１２】
すでに明らかなところによれば、アデノウイルスゲノムの所定の領域は、哺乳動物細胞のゲノムの組み込むことができ、それによりコードされる遺伝子を発現させることができる。これらの細胞株は、該細胞株にコードされるアデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を援助することができる。また、「介助」ベクター、たとえば野生型ウイルスまたは条件に応じて欠陥のある突然変異体、により複製不全アデノウイルスベクターを補足する報告もある。
【０２１３】
複製不全アデノウイルスベクターは、トランスで、ヘルパーウイルスにより補足することができる。しかし、この所見のみでは、複製不全ベクターの単離は可能にならない。というのも、複製機能を付与するのに必要なヘルパーウイルスの存在は、あらゆる調製物を汚す可能性があるからである。従って、複製不全ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加できるさらなる要素が必要であった。その要素は、本発明において付与されるように、アデノウイルスのパッケージ機能から由来する。
【０２１４】
明らかにされているところによれば、アデノウイルスのためのパッケージングシグナルは、通常のアデノウイルス地図の左端に存在する（Tibbetts、1977）。後の研究で明らかになったことによれば、ゲノムのE1A（194〜358bp）領域に欠失がある突然変異体は、初期（E1A）機能を補足した細胞株においてさえも、うまく増殖しなかった（HearingおよびShenk、1983）。補足アデノウイルスDNA（0〜353bp）を、該変異体の右端に組み換えたところ、ウイルスは正常にパッケージされた。さらに突然変異解析を行ったところ、Ad5ゲノムの左端に短い反復された位置依存性の要素が特定された。この反復の一複製物は、ゲノムのいずれかの末端に存在すれば、有効なパッケージングに十分であり、Ad5DNA分子の内部に移動すると十分ではなくなることが明らかになった（Hearing他、1987）。
【０２１５】
パッケージングシグナルの突然変異物を用いることにより、種々の効率でパッケージされるヘルパーウイルスを作ることができる。典型的に、突然変異は、点突然変異または欠失である。パッケージング効率の低いヘルパーウイルスをヘルパー細胞において増殖させると、野生型ウイルスに比べて低い率ではあるが、ウイルスはパッケージされ、それにより、ヘルパーの増殖が可能になる。しかし、野生型のパッケージングシグナルを含むウイルスとともに、細胞においてこれらのヘルパーウイルスを増殖させると、突然変異物に優先して、野生型パッケージングシグナルが認められる。パッケージングファクター量が制限されているならば、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーに対して選択的にパッケージされる。この選択性が十分に大きいならば、均質に近いストックが得られるはずである。
【０２１６】
2.レトロウイルス
レトロウイルス類は、一本鎖RNAウイルスの一群で、逆転写のプロセスにより、感染細胞において、そのRNAを二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする（Coffin、1990）。次いで、生成されたDNAは、安定してプロウイルスとして細胞の染色体に組込み、ウイルスタンパク質の合成を誘導する。この組込みにより、受容細胞においてウイルス遺伝子配列は保持され、その子孫がもたらされる。レトロウイルスゲノムは、三種の遺伝子、gag、polおよびenvを含み、これらは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする。gag遺伝子の上流にある配列（Ψと呼ばれる）は、ゲノムをウイルス粒子にパッケージングするためのシグナルとして機能する。二つの長末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムでの組込みにも必要である（Coffin、1990）。
【０２１７】
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、所定のウイルス配列の位置において、ウイルスゲノムに挿入し、複製不全のウイルスを生産する。ウイルス粒子を生産するために、gag、polおよびenv遺伝子を含む一方、LTRおよびΨ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Mann他、1983）。ヒトcDNAとともにレトロウイルスLTRおよびΨ配列を含む組換えプラスミドがこの細胞株に導入されると（例えば、リン酸カルシウム沈降により）、Ψ配列は、組換えプラスミドのRNA転写産物をウイルス粒子にパッケージ可能にし、そして、ウイルス粒子は、培養培地に分泌される（NicolasおよびRubenstein、1988; Temin、1986; Mann他、1983）。組換えレトロウイルスを含む培地を集め、必要に応じて濃縮し、そして、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターが感染できる細胞のタイプは、広範囲にわたる。しかし、多くのタイプのレトロウイルスにとって、組込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Paskind他、1975）。
【０２１８】
レトロウイルスベクターの特異的なターゲッティングを可能にするよう設計された手法が最近開発された。それは、ウイルスエンベロープにガラクトース残基を化学的に付加することにより、レトロウイルスを化学修飾することに基づく。必要に応じて、この修飾は、アシアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞のような、細胞の特異的感染を可能にしうる。
【０２１９】
組換えレトロウイルスのターゲッティングに対し異なる手法が設計され、そこでは、レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用された。これらの抗体は、ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン成分を介して結合された（Roux他、1989）。主要組織適合性複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を使用し、それらの表面抗原を保持した種々のヒト細胞の感染が、インビトロでエコトロピックウイルスを用いて明らかにされた（Roux他、1989）。
【０２２０】
3.アデノ随伴ウイルス
AAVは、約4700塩基対の線状一本鎖DNAを利用する。逆方向末端反復はゲノムに隣接する。ゲノム内には二つの遺伝子が存在し、相当数の異なる遺伝子産物をもたらす。第一に、cap遺伝子は、三つの異なるウイルス粒子タンパク質（VP）（VP-1、VP-1およびVP-3と呼ばれる）を産生させる。第二に、rep遺伝子は、四つの非構造的タンパク質（NS）をコードする。これらのrep遺伝子産物の一つ以上は、トランス活性化AAV転写をつかさどる。
【０２２１】
AAV中の三つのプロモーターは、その位置、地図単位、ゲノムで表わされる。それらは、左から右に、p5、p19およびp40である。転写は、六つの転写産物をもたらし、二つは、三つのプロモーターのそれぞれから開始され、各ペアの一方はスプライスされる。スプライス部位は、地図単位42〜46に由来し、各転写産物について同じである。四つの非構造的タンパク質は、明らかに、転写産物のより長いものに由来し、三つのウイルス粒子タンパク質はすべて、より小さな転写産物から生じる。
【０２２２】
AAVは、ヒトにおいて、病理学的状態を伴わない。おもしろいことに、効率的な複製のため、AAVは、ウイルス、たとえば単純ヘルペスウイルスIおよびII、サイトメガロウイルス、偽狂犬病ウイルス、そして、もちろんアデノウイルスからの「介助」機能を必要とする。この介助者の最も特性がわかっているものは、アデノウイルスであり、このウイルスの多くの「初期」機能が、AAVの複製を援助することがわかっている。AAV repタンパク質の発現レベルが低いと、AAV構造の発現が抑制されることが考えられ、そして、ヘルパーウイルス感染により、この抑制が除かれると考えられる。
【０２２３】
AAVベクターの末端反復は、AAVまたはプラスミド、たとえばp201（これは改変AAVゲノムを含む（Samulski他、1987））の制限エンドヌクレアーゼ消化により得ることができ、あるいは、当業者に知られる他の方法（AAVの公表されている配列に基づく末端反復の化学的または酵素的合成を含むが、これに限定されることはない）により得ることができる。当業者は、よく知られた方法、たとえば、欠失分析により、機能（すなわち安定した部位特異的組込み）を可能にするのに必要なAAVのITR類の最小配列または部分を決定することができる。また、当業者は、安定した部位特異的組込みを誘導する末端反復の能力を保持しながら、どのような配列のマイナー改変が許容され得るか、決定することができる。
【０２２４】
AAV系ベクターは、インビトロで安全かつ効果的な遺伝子送達用媒体であることが証明されている。これらのベクターは、前臨床段階および臨床段階において、可能性のある遺伝子治療の広範囲な応用のため、エキソビボおよびインビボの両方で、開発、試験中である（CarterおよびFlotte、1995; Chatterjee他、1995; Ferrari他、1996; Fisher他、1996; Flotte他、1993; Goodman他、1994; Kaplitt他、1994; 1996、Koeberl他、1997）。
【０２２５】
肺におけるAAV媒介による有効な遺伝子導入および発現は、のう胞性繊維症の治療について臨床試験に至っている（CarterおよびFlotte、1995; Flotte他、1993）。同様に、ジストロフィン遺伝子の骨格筋へのAAV媒介遺伝子送達による筋ジストロフィーの治療、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の治療、肝臓へのファクターIX遺伝子送達による血友病Bの治療、および心臓への血管内皮成長因子遺伝子送達による心筋梗塞の可能性のある治療は、期待がもてそうである。というのも、AAVに媒介される導入遺伝子のそれら臓器における発現は、高度に有効であることが最近わかってきているからである（Fisher他、1996; Flotte他、1993; Kaplitt他、1994; 1996; Koeberl他、1997; McCown他、1996; Ping他、1996; Xiao他、1996）。
【０２２６】
4.その他のウイルスベクター
本発明において、その他のウイルスベクターが発現コンストラクトとして用いられる。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988; BaichwalおよびSugden、1986; Coupar他、1988）、カナリアポックスウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターが用いられる。これらのウイルスは、遺伝子導入の用途において、種々の哺乳動物細胞に、いくつかの特徴を与える。
【０２２７】
一旦、コンストラクトが細胞内に送達されると、導入遺伝子をコードする核酸は、適当な位置に置かれ、異なる部位で発現される。所定の態様において、導入遺伝子をコードする核酸は、安定に細胞のゲノムに組込まれる。この組込みは、相同的組換え（遺伝子置換）を介して同族体の位置および配向にあるか、あるいは、それは、ランダムで非特異的な位置に組込まれる（遺伝子増強）。さらなる態様において、核酸は、安定して細胞内にDNAの別個のエピソームセグメントとして保持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルから独立してまたはそれと同期して保持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトをどのように細胞に送達するか、そして、核酸を細胞のどこに維持させるかは、使用する発現コンストラクトのタイプに依存する。
【０２２８】
V.突然変異誘発、ペプチドミメティクスおよび合理的薬剤設計
勿論、本発明は、本発明の特定の核酸配列およびアミノ酸配列に限定されるものではない。従って、組換えベクター類および単離されたDNAセグメント類は、様々な態様でこれらのコード領域自体を含むことができ、基本的なコード領域内に選択された変更または修飾を有するコード領域を含むことができる。あるいは、それらは、そのようなコード領域をなお含むより大きなポリペプチドをコードしてもよく、また、変異したアミノ酸配列を有する生物学的機能的に等価なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしてもよい。変異アミノ酸配列を有するそれらのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、拮抗性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとして機能する類似体または変異体をも含みうる。
【０２２９】
本発明のDNAセグメントは、生物学的機能的に等価なOASLタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを包含する。そのような配列は、核酸配列内、従ってコードされるタンパク質組成物内において自然に生じることが知られているコドンの縮退および機能的等価の結果として生じうる。一方、機能的に等価なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、組換えDNA技術の適用を通じて作り出すことができ、そこにおいて、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの構造変化は、交換されるアミノ酸の特性を考慮して、設計することができる。変化は、例えば、以下に述べる部位特異的突然変異誘発の適用を通じて、導入することができ、タンパク質組成物の抗原性に改良を加えるため、あるいは、OASL6活性を分子レベルで検査するためテスト変異体に改良を加えるため、変化を導入することができる。
【０２３０】
一方、拮抗的OASLタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを包含するDNAセグメントは、非保存的な挿入、欠失および／または置換を用いて生成させてもよい。DNAセグメントにおけるこれらの非保存的変化は、拮抗的特性、例えば、OASL機能の阻害、を示すタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをもたらす。
【０２３１】
部位特異的変異誘発は、個々のペプチド、アンタゴニスト、または生物学的機能的に等価なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを、元のDNAの特異的な変異誘発を通じて調製するのに有用な技法である。また、この技法によれば、上述した考察の一つ以上を取り入れて、一つ以上のヌクレオチド配列変化をDNAに導入することにより、迅速に、配列変異体を調製し試験することができる。部位特異的変異誘発は、必要な変異のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列を使用し、さらに、横切られる欠失接合部の両側に安定な二重鎖を形成するため、十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を与えるよう、十分な数の隣接ヌクレオチドを使用することにより、突然変異体の生産を可能にする。典型的に、約17〜25ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の接合部の両側にある約5〜10の残基が変更される。
【０２３２】
概して、部位特異的突然変異誘発の技法は当該技術においてよく知られている。承知のとおり、この技法は、一般的に、一本鎖および二本鎖の両方の形態で存在するバクテリオファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発に有用である代表的なベクターにはM13ファージのようなベクターがある。これらのファージベクターは市販されており、その使用は一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、部位特異的変異誘発に日常的に使用されており、これは、関心のある遺伝子をファージからプラスミドに移す工程を必要としない。
【０２３３】
部位特異的変異誘発は、まず、一本鎖ベクターを得る工程または二本鎖ベクターの二つの鎖を融解させる工程により実行され、該ベクターは、その配列内に、必要なタンパク質分子をコードするDNA配列を含むものである。必要な変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは合成により調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖DNA調製物とアニーリングされ、そして、変異を保有する鎖の合成を完了させるため、ＤＮＡ重合酵素（例えば大腸菌ポリメラーゼIクレノウフラグメント）に供される。かくしてヘテロ二重鎖が形成されるが、ここで一方の鎖は、元の非変異配列をコードし、もう一方（第二）の鎖は必要な変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを用いて適当な細胞（例えば大腸菌細胞）を形質転換し、変異配列が配置された組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０２３４】
部位特異的変異誘発を用いた選択遺伝子の配列変異体の調製は、潜在的に有用な種を生産する一手段として提供されるものであり、これに限定されるものではない。他にも、遺伝子の配列変異体を得ることができる方法がある。例えば、配列変異体を得るため、必要な遺伝子をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミンのような変異誘発剤で処理することができる。
【０２３５】
ここに記載するOASLペプチジル化合物に加えて、意図するところによれば、ペプチド構造の重要な部分を模倣するため、その他の立体的に類似する化合物を作ることができる。そのような化合物（ペプチドミメティックスと呼んでもよい）は、本発明のペプチドとして同様に用いることができ、従って、機能的等価物でもある。
【０２３６】
タンパク質分子の二次構造の要素を模倣する所定のミメティックスは、Johnsonほか（1993）に記載されている。「タンパク質分子のペプチド骨格は、多くの場合、抗体および抗原のように、分子相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向させて存在する」ということがペプチドミメティックス利用の背後にある基本的原理である。従って、ペプチドミメティックは、分子相互作用が本来の分子に類似するように設計される。
【０２３７】
ペプチドミメティックスの考え方がうまくいっている応用例は、タンパク質分子内のβターン（高度に抗原性であることが知られている）のミメティックに集中している。ポリペプチド内の有望なβターン構造は、コンピュータに基づくアルゴリズムにより、ここに述べるように予測できる。一旦、ターンの構成アミノ酸が決まれば、アミノ酸側鎖の必須要素が類似する空間的配向となるように、ミメティックを構築することができる。
【０２３８】
さらなる構造的等価物またはミメティックの生成は、当業者に知られるモデリングおよび化学デザインの技法により達成することができる。受容体モデリングの技術は現在よく知られており、そのような方法によって、OASLに結合する化学物質を設計し、そして合成することができる。勿論、そのように立体的に設計された構築物もすべて本発明の技術範囲に入る。
【０２３９】
ある局面において、2',5'オリゴアデニレートシンテターゼ活性のモジュレーターとして機能するよう、合理的な薬剤設計により化合物を設計することができる。これらのモジュレーターは、アゴニスト（作動薬）またはアンタゴニスト（拮抗薬）となり得る。合理的な薬剤設計の目標は、生物学的に活性な化合物の構造類似体を製造することである。そのような類似体を作ることにより、元の分子よりもより活性であるかまたはより安定な薬剤を作ることができ、それらは、改変に対して異なる感受性を有し、あるいは、種々の他の分子の機能に影響を与え得る。一手法において、本発明のOASLタンパク質またはその断片について三次元構造を生成させることができる。このことは、X線結晶構造解析、コンピュータモデリング、または両手法の組み合わせにより、達成することができる。他の一手法は、OASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを通じて官能基をランダムに置換し、生じる機能への作用を確認することを含む。
【０２４０】
OASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに特異的な抗体を機能的なアッセイにより選択し、単離し、そして、その結晶構造を解明することができる。原則として、この手法は、続いて行う薬剤設計の基礎となりうるファーマコア（pharmacore）をもたらす。機能的で薬理学的に活性な抗体に対して抗イディオタイプ抗体を生成させることにより、概して、タンパク質結晶構造解析を回避することができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、元の抗原の類似体であると予測できる。そして、抗イディオタイプは、化学的または生物学的に生産したペプチド類の貯え（バンク）からペプチドを識別し分離するのに、使用することができる。そして、選択したペプチドは、ファーマコアとして役に立ちうる。抗イディオタイプは、ここに記載した抗体を製造するための方法を用い、抗体を抗原として用いて、生成させることができる。
【０２４１】
かくして、もともとのOASLタンパク質配列に対し、増強されかつ改良された生物学的活性、例えば、2',5'オリゴアデニレートシンテターゼ活性、避妊、増強された妊性、細胞増殖活性を有する薬剤を設計することができる。さらに、2',5'オリゴアデニレートシンテターゼ活性をもたない薬剤を設計することもでき、あるいは、2',5'オリゴアデニレートシンテターゼ活性を化学的手段により調節することもできる。組換え技術によって十分な量のOASLタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを生産することができるので、突然変異誘発および化学的模倣に最も適当な部位を決定するため、結晶構造解析を行うことができる。さらに、それらの化合物の化学的特徴に関する情報は、コンピュータを用いた構造−機能の関係の予測を可能にする。種々のポリペプチドまたはペプチド構造のコンピュータモデルはまた、文献またはコンピュータデータベースにおいて利用可能である。非限定的な一例として、当業者は、突然変異誘発のためのターゲット配列および領域を特定するため、Entrezデータベースを利用することができる。
【０２４２】
VI.モジュレーターをスクリーニングするための方法
本発明では、OASL活性を刺激するか、OASLの欠如を克服するか、OASL分子の作用を遮断または阻害する活性を持つ化合物のスクリーニングに、OASLおよび活性断片、ならびにそれらをコードする核酸を使用することも考えられる。これらのアッセイは、多種多様なフォーマットを利用して行うことができ、そのスクリーニングが目的としている「活性」の種類によって変わりうる。
【０２４３】
A.インビトロアッセイ
ある態様において、OASLポリペプチドまたはその断片に結合する化合物のスクリーニングに、本発明を応用する。ポリペプチドまたは断片は、溶液中で遊離しているものでもよいし、支持体に固定されているものでもよいし、細胞中または細胞の表面上に発現されているものでもよい。ポリぺプチド側または化合物側を標識して、結合を検出できるようにすることができる。
【０２４４】
もう一つの態様において、アッセイでは、天然または人工の基質または結合パートナーに対するOASLの結合の阻害を測定することができる。薬剤（作用因子）の一つ（OASL、結合パートナーまたは化合物）が標識された競合結合アッセイを行うことができる。通常はポリペプチドが標識種になる。遊離している標識の量を、結合している標識の量と対比して測定することにより、結合または結合の阻害を決定することができる。
【０２４５】
化合物のハイスループットスクリーニングを行うためのもう一つの技術は、WO84／03564に記載されている。多数の小ペプチド試験化合物をプラスチックピンなどの固体基材または他の何らかの表面上で合成する。ぺプチド試験化合物をOASLと反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドをさまざまな方法で検出する。
【０２４６】
精製されたOASLは、上述の薬物スクリーニング法において使用するため、プレート上に直接コーティングすることができる。しかし、ポリペプチドに対する非中和抗体を使って、固相にポリペプチドを固定化することもできる。また、反応性領域（好ましくは末端領域）を含む融合タンパク質を使って、OASL活性領域を固相に連結してもよい。
【０２４７】
Oasl遺伝子中に自然突然変異もしくは人工突然変異または野生型を含むさまざまな細胞株を使って、OASLのさまざまな機能的特性を研究し、候補化合物がこれらの特性にどのように影響を及ぼすかを研究することができる。突然変異を人工的に作る方法は、本明細書の他の項で説明する。また、Oasl中に生じて不妊につながる、不妊の一因となる、かつ／または、さもなくば不妊を引き起こす自然発生突然変異も、本明細書の他の項で説明する。アッセイでは、化合物の生化学的性質を考慮して、化合物を適切に調製し、標的細胞と接触させる。アッセイによっては培養が必要な場合もある。次に、多種多様な生理学的アッセイに基づいて細胞を検査することができる。あるいは、OASLの機能または関連する経路を探ることができるような分子解析を行ってもよい。
【０２４８】
一つの具体的態様として、当該技術で標準的な手段により、本発明のポリペプチド、すなわちOASLを用いて、酵母ツーハイブリッド解析を行う。ツーハイブリッドスクリーニングは、あるタンパク質の機能を、それと相互作用する他のタンパク質を同定することによって、明らかにするために、あるいは、特徴づけるために使用される。機能がわかっていないタンパク質（ここではこれを「ベイト（bait）」という）を、GAL4のDNA結合ドメインをさらに含むキメラタンパク質として製造する。このキメラタンパク質を発現させるヌクレオチド配列を含むプラスミドで酵母細胞を形質転換する。この酵母細胞はまた、ライブラリーからの典型的プラスミドを含むものであり、該ライブラリーは、可能性のある複数の異なるターゲットタンパク質をコードする複数の異なるヌクレオチド配列に融合されたGAL4活性化ドメインを含んでいる。ベイトタンパク質がターゲットタンパク質と物理的に相互作用するのであれば、GAL4活性化ドメインとGAL4  DNA結合ドメインとがつながれ、その結果、レポーター遺伝子の転写を促進するよう、連携して作用できるようになる。ある特定の細胞において、ベイトタンパク質と可能性のあるターゲットタンパク質との間に相互作用が起こらない場合、GA14成分は離れたままであり、レポーター遺伝子の転写を単独では促進することができない。当業者に明らかなように、β−ガラクトシダーゼ、HIS3、ADE2またはuRA3を含む、複数種のレポーター遺伝子を利用できる。また、GAL4成分の相互作用（したがって特定のベイトとターゲットタンパク質との相互作用）を示すため、複数のレポーター配列を、それぞれ異なる誘導可能なプロモーターの制御下に置いて、同じ細胞内で利用することもできる。当業者に知られているとおり、複数のレポーター配列を使用すれば偽陽性候補を得る可能性が下がる。また、LexAなどの代わりのDNA結合ドメイン／活性化ドメイン成分を使用することもできる。当業者に明らかなように、レポーター遺伝子のトランス活性化をもたらすことができる限り、任意の活性化ドメインを任意のDNA結合ドメインと組み合わせることができる。さらに、当業者に明らかなとおり、LexAシステムの場合と同様、2つの成分のどちらか一方は、他方の成分が存在してそれらが共同してレポーター遺伝子のトランス活性化を可能にする限り、原核生物由来であってもよい。
【０２４９】
ツーハイブリッド実験の試薬類および設計は、このシステムの最新の改良版（Fashena他、2000）を含めて、当業者によく知られている（P. L. BartelおよびS. Fieids編「The Yeast Two−Hybrid System」オックスフォード大学出版局、1997）。当業者に知られるとおり、Clontech（カリフォルニア州パロアルト）製のMatchmaker（商標）システムやHybriZAP（登録商標）2.1ツーハイブリッドシステム（Stratagene；フォルニア州ラホーヤ）などの市販のベクターがあり、あるいは、研究コミュニティを通じて入手できるベクター（Yang他、1995；James他、1996）がある。これに代わる態様として、哺乳類（Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）の哺乳類ツーハイブリッドアッセイキット）または大腸菌（Hu他、2000）などの、酵母以外の生物がツーハイブリッド解析に使用される。
【０２５０】
ある代わりの態様において、細胞質ベースのアッセイでタンパク質−タンパク質相互作用を検出するツーハイブリッド系が利用される。この態様では、タンパク質を細胞質で発現させることにより、翻訳後修飾が起こるようにし、また転写活性化因子および転写阻害因子をベイトとしてスクリーニングに使用することができるようにする。そのような系の一例は、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）のCytoTrap（登録商標）ツーハイブリッドシステムであり、このシステムでは、hSos（グアニルヌクレオチド交換因子）の酵母ホモログであるcdc25遺伝子に温度感受性突然変異を持つ酵母の細胞膜にターゲットタンパク質が固定されることになる。ベイトタンパク質がターゲットに結合すると、hSosが膜に局在化し、GDP／GTP交換を促進することによるRASの活性化が可能になる。次にRASは、突然変異型酵母cdc25Hの37℃での生育を可能にするシグナリングカスケードを活性化する。この系のためのベクター（pMyrおよびpSosなど）およびこの系に関する他の実験詳細は、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）を通じて当業者に利用可能である（例えば、米国特許第5,776,689号参照（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする））。
【０２５１】
従って、本発明のある態様によれば、OASLと相互作用するペプチドについてスクリーニングする方法が提供され、この方法は、試験ペプチド（この試験ペプチドはDNA結合ドメインに融合される）をコードするDNAセグメントを含む第一の核酸と、OASL6の少なくとも一部（このOASLの少なくとも一部はDNA活性化ドメインに融合される）をコードするDNAセグメントを含む第二の核酸とを、それぞれ、細胞に導入することを含む。次に、DNA結合ドメインとDNA活性化ドメインとの相互作用をアッセイすることによって、試験ペプチドとOASLポリペプチドまたはその断片との相互作用に関するアッセイを行う。例えば、DNA結合ドメインと活性化ドメインとの相互作用のアッセイは、β−ガラクトシダーゼ発現の活性化とすることができる。
【０２５２】
他の方法は、組換えOaslによるλgt11、λLZAP（Stratagene）または等価なcDNA発現ライブラリーのスクリーニングである。組換えOaslまたはその断片は、FLAG、HSVまたはGSTなどの小さいペプチド標識に融合される。これらのペプチド標識は、キナーゼ（心筋クレアチンキナーゼなど）に対する便利なリン酸化部位を有することができ、あるいはビオチン化することができる。組換えOaslは、32［P］でリン酸化するか、または標識せずに使用して、ストレプトアビジンまたは標識に対する抗体により検出することができる。λgt11 cDNA発現ライブラリーを関心のある細胞から作り、組換えOaslと共にインキュベートし、洗浄し、そしてOaslと相互作用するcDNAクローンを単離する。当業者はこのような方法を日常的に使用している。例えば、Sambrook（上述）を参照。
【０２５３】
もう一つの方法は、哺乳動物発現ライブラリーのスクリーニングであり、そこにおいて、cDNAをベクター中の哺乳動物プロモーターとポリアデニル化部位の間にクローニングし、それを細胞に一過性にトランスフェク卜する。48時間後に、固定し洗浄した細胞を標識Oaslと共にインキュベートすることによって、結合タンパク質を検出する。このようにして、目的の結合タンパク質をコードするcDNAを含むcDNAのプールを選択することができ、そして、各プールをさらに細分し、次いで一過性トランスフェクション、結合およびオートラジオグラフィーのサイクルを繰り返すことによって、目的のcDNAを単離することができる。あるいは、cDNAライブラリー全体を哺乳動物細胞にトランスフェクトし、それらの細胞を、プレートに結合させたOaslを含むディッシュ上でパンニング（選別）することにより、目的のcDNAを単離することもできる。洗浄後に付着している細胞を溶解し、プラスミドDNAを単離し、細菌内で増幅し、トランスフェクションとパンニングのサイクルを、単一のcDNAクローンが得られるまで繰り返す。Seed他（1987）およびAruffo他（1987）を参照されたい（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする）。結合タンパク質が分泌される場合、一過性形質導入細胞から得られる上清をアッセイするための結合アッセイまたは中和アッセイがいったん確立されれば、同様のプール戦略によって、そのcDNAを得ることができる。上清をスクリーニングするための一般的方法はWong他（1985）に開示されている。
【０２５４】
もう一つの代替法は、OASLと相互作用するタンパク質を細胞から直接単離することである。OASLとGSTまたは小ペプチド標識との融合タンパク質を作製し、ビーズに固定化する。関心のある細胞から、生合成的に標識されたタンパク質または標識されていないタンパク質の抽出物を調製し、該ビーズと共にインキュベートし、緩衝液で洗浄する。OASLと相互作用するタンパク質をビーズから特異的に溶離させ、SDS-PAGEで分析する。結合パートナー一次アミノ酸配列データをマイクロシークエンシングによって得る。必要に応じて、細胞タンパク質のチロシンリン酸化のような機能的応答を誘発する薬剤で細胞を処理することもできる。そのような薬剤の一例は、成長因子またはインターロイキン2などのサイトカインであろう。
【０２５５】
他の代替法は免疫アフィニティー精製である。組換えOASLを標識細胞抽出物または非標識細胞抽出物と共にインキュベートし、抗OASL抗体で免疫沈降させる。免疫沈降物をプロテインA−セファロースを用いて回収し、SDS−PAGEで分析する。非標識タンパク質はビオチン化によって標識され、ストレプトアピジンを使ってSDSゲル上で検出される。結合パートナータンパク質をマイクロシークエンシングによって解析する。さらに、マイクロシークエンシングに先立って、当業者に知られている標準的な生化学的精製工程を使用してもよい。
【０２５６】
さらに他の代替法は、結合パートーナーに関するペプチドライブラリーのスクリーニングである。タグ付きのまたは標識した組換えOASLを用いて、ペプチドライブラリーまたはホスホペプチドライブラリーから、OASLと相互作用するペプチドを選択する。ペプチドのシークエンシングは、相互作用するタンパク質に見いだされうるコンセンサスペプチド配列の同定につながる。また、OASL機能を遮断するペプチドを選択してもよい。
【０２５７】
B.インビトロアッセイ
本発明はさまざまな動物モデルの使用も包含する。例えば、ヒトOASLと他の動物OASLの間に認められる一致はいずれも、それが正常に発現される丸ごとの動物系でのOASLの機能を調べる格好の機会になる。正常なOASLを発現させることができない突然変異型細胞株を開発または単離することにより、卵形成および胚発生におけるOASLの機序およびその役割の研究を可能にするモデルマウスを作ることができる。
【０２５８】
試験化合物による動物の処置には、化合物を適当な形態で動物に投与することが含まれうる。投与は、例えば経口、鼻腔、口腔、直腸、膣内または局所経路など、臨床目的または非臨床目的に利用することができる任意の経路で行われる。あるいは、投与は、気管内点滴、気管支点滴、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内、あるいは、卵巣嚢内または精巣内の注射によって行うこともできる。特に、全身的静脈内注射、血液供給またはリンパ供給を介した局所投与および腫瘍内注射が考えられる。
【０２５９】
ある化合物のインビボでの有効性の決定には多種多様な基準が含まれうる。そのような基準には、例えば妊性の増加、妊性の減少または避妊が含まれる。
【０２６０】
本発明の一態様において、機能的OASLポリペプチドまたはその変異体をコードする機能的導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が作出される。OASL導入遺伝子を発現させるトランスジェニック動物、そのような動物に由来する組換え細胞株、およびトランスジェニック胚は、OASLの機能を誘導または抑制する薬剤をスクリーニングする方法および、そのような薬剤を同定する方法に役立ちうる。本発明のトランスジェニック動物は、症状を研究するためのモデルとして使用することもできる。
【０２６１】
本発明の一態様において、Oasl導入遺伝子を非ヒト宿主に導入して、OASLを発現させるトランスジェニック動物を生産する。このトランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする態様でゲノムに導入遺伝子を組み込むことによって作られる。トランスジェニック動物の生産方法は、WagnerおよびHoppe（米国特許第4,873,191号（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする））、Brinster他、1985（この引用によりその内容はすべて本明細書に記載されたものとする）ならびにHogan, Beddington, CostantimiおよびLong編「Manipulating the Mouse Embryo；A Laboratory Manual」第2版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994（この引用によりその内容はすべて本明細書に記載されたものとする）に概説されている。
【０２６２】
導入遺伝子と内在性遺伝子との相同組換えによって内在性Oasl遺伝子またはその遺伝子の一部を置き換えることが望ましい場合もある。あるいは、「ノックアウト」動物を調製する場合のように、欠失によって内在性遺伝子を排除することもできる。典型的には、関心のある遺伝子の一部と選択マーカーとを含むターゲティングベクターを作製し、胚幹（ES）細胞にトランスフェク卜する。これらのターゲティングベクターは、hprt陰性ES細胞株にエレクトロポレーションされ、HATおよびFIAUにおいて選択される。ES細胞は、使用される選択可能なマーカー遺伝子に応じて、HAT、G418または任意の他の選択方法により選択することができる。正しい突然変異を持つES細胞を胚盤胞に注入して、突然変異型Oasl遺伝子に関し、キメラを生成させ、最終的にはヘテロ接合体およびホモ接合体を生成させる。従って「ノックアウト」マウスにはOaslが存在しないことを利用して、OASLタンパク質の喪失がインビボで細胞に及ぼす影響を研究することができる。
【０２６３】
上述のように、トランスジェニック動物および組織ならびにそのような動物に由来する細胞および細胞株は、ある種の検証実験に役立ちうる。これに関し、野生型または突然変異型Oaslを発現させることができるトランスジェニック動物および細胞株、または機能的OASL遺伝子を欠くトランスジェニック動物または細胞株を、試験物質に暴露することができる。野生型Oasl発現および／または機能を強化する能力または突然変異型Oaslの発現または機能を損なう能力に関して、これらの試験物質をスクリーニングすることができる。
【０２６４】
VII.OASLのモジュレーター
所定の態様において、OASLのモジュレーターを動物に投与して、OASLの活性および／または発現を増強または抑制する。OASLは、配偶子形成または初期胚発生または細胞増殖に重要なmRNA分解経路に関与していると考えられる。
【０２６５】
本発明のモジュレーターには、OASLの活性および／または発現のいずれかを調節することができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、小分子または他の組成物があるが、これらに限定されるものではない。
【０２６６】
A.転写因子および核結合部位
転写因子は、特定のDNA配列（例えばプロモーターおよびエンハンサー）に結合し、コードDNA領域の転写を調節する調節タンパク質である。典型的に、転写因子は、DNAに結合する結合ドメイン（DNA結合ドメイン）と、転写を制御する調節ドメインとからなる。調節ドメインが転写を活性化する場合、その調節ドメインは活性化ドメインと呼ばれる。その調節ドメインが転写を阻害する場合、その調節ドメインは抑制ドメインと呼ばれる。
【０２６７】
活性化ドメイン、そしてより最近、抑制ドメインは、転写因子の独立したモジュール構成要素として機能することが明らかになった。活性化ドメインは、単一のコンセンサス配列に類型化されず、その代わりに、いくつかの異なる種類に分類される。例えば、GAL4（Ma他、1987)、GCN4（Hope他、1987）、VP16（Sadowski他、1988）およびGATA-1（Martin他、1990)における酸性ドメイン、Spl（Courey他、1988)およびOct-2/OTF2（Muller-Immergluck他、1990; Gerster他、1990)におけるグルタミンの豊富な鎖、CTF/NF-1（Mermod他、1989)におけるプロリンの豊富な配列、ならびにPit-l/GH-F-1(Theill他、1989)におけるセリン／トレオニンの豊富な領域があり、それらはすべて転写を活性化するよう機能する。fosおよびjunの活性化ドメインは、酸性残基およびプロリン残基の両方が豊富である（Abate他、1991; Bohmann他、1989）。CCAAT／エンハンサー結合プロテインC／EBP（Friedman他、1990)のような他のアクチベーター（活性化因子）については、はっきりした配列モチーフが明らかになっていない。
【０２６８】
本発明において、意図するところによれば、転写因子は、Oasl遺伝子の発現を阻害するため使用することができる。そのようなものの一例はFIGアルファである。FIGアルファ（Soyal他、2000）は、生殖細胞特異的な、基本的へリックス−ループ−へリックス因子である。FIGアルファは、卵巣発生の調節に関与していることが示唆されている。
【０２６９】
B.アンチセンスおよびリボザイム
翻訳または転写の開始部位またはスプライス接合点に結合するアンチセンス分子は、理想的なモジュレーターである。アンチセンス分子、リボザイム分子および二本鎖RNA分子は、ある特定の配列をねらって、特定のポリペプチド、例えばOASLまたはOASLの調節に関与している他のタンパク質の低減または排除を達成する。かくして、意図するところによれば、アンチセンス分子、リボザイム分子、二本鎖RNA分子、および干渉RNA分子を構築し、Oasl発現を調節するために使用する。
【０２７０】
1．アンチセンス分子
アンチセンス法は、核酸が容易に相補的配列と対合することを利用する。「相補的」は、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリック相補性則に従って塩基対合できるものであることを意味する。すなわち、大きなプリンがより小さなピリミジンと塩基対合して、DNAの場合、グアニンがシトシンに対合した組み合わせ（G：C）およびアデニンがチミンと対合した組み合わせ（A：T）を形成し、RNAの場合、アデニンがウラシルと対合した組み合わせ（A：U）を形成する。ハイブリダイズする配列において、あまり一般的でな塩基、例えば、イノシン、5−メチルシトシン、6−メチルアデニン、ヒポキサンチンなどが入ることは、対合を妨害しない。
【０２７１】
ポリヌクレオチドで二本鎖（ds）DNAを狙えば、三重らせんの形成がもたらされ、RNAを狙えば、二重らせんの形成がもたらされる。ターゲット細胞に導入されたとき、アンチセンスポリヌクレオチドは、その標的とするポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨げる。アンチセンスRNAコンストラクト（構築物）またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAを用い、宿主細胞内、インビトロまたはインビボにおいて、例えばヒトの対象を含む宿主動物内において、転写もしくは翻訳またはその両方を阻害する。
【０２７２】
プロモーターおよび他の制御領域、エキソン、イントロン、または遺伝子のエキソン−イントロンの境界に結合するよう、アンチセンスコンストラクトを設計する。意図するところによれば、最も効果的なアンチセンスコンストラクトは、イントロン／エキソンスプライス接合点に相補的な領域を含みうる。例えば、イントロン−エキソンスプライス接合点の50〜200塩基範囲内の領域に対して相補性を有するアンチセンスコンストラクトを使用する。その標的選択性に深刻な影響を与えることなく、コンストラクトになんらかのエキソン配列を含ませられることがわかっている。含ませるエキソン材料の量は、使用される特定のエキソンおよびイントロン配列に応じて変わってくる。含ませるエキソンDNAが多すぎるかどうかは容易に試験することができ、それは、単にインビトロでコンストラクトを試験して、正常な細胞の機能が影響を受けているかどうか、あるいは、相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けているかどうかを決定することにより、行うことができる。
【０２７３】
特異的なコンストラクトを生成させるため、ゲノムDNAの部分をcDNAまたは合成配列と結合することは、有利なことである。例えば、イントロンが最終的なコンストラクトに必要な場合、ゲノムのクローンを用いることが必要になる。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、コンストラクトの他の部分により都合のよい制限部位をもたらすことができるため、該配列の残りの部分に使用することができる。
【０２７４】
2．リボザイム
リボザイムは、部位特異的な態様で核酸を切断するRNA−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインをもつ（KimおよびCech、1987；ForsterおよびSymons、1987）。たとえば、多くのリボザイムは、高度の特異性をもってホスホエステルトランスファー反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質において、数個のホスホエステルのうちのただ１つを切断する（Cech他、1981;MichelおよびWestof、1990；Reinhold-HurekおよびShub、1992）。この特異性は、基質が化学反応に先だって、特異的塩基対相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（IGS）に結合する必要があるという要件に起因している。
【０２７５】
最初、リボザイムの触媒作用は、核酸に関係する配列特異的切断／ライゲーション反応の一部として観察された（Joyce、1989；Cech他、1981）。たとえば、米国特許第5,354,855号の報告によれば、あるリボザイムは、公知のリボヌクレアーゼよりも高い配列特異性をもつエンドヌクレアーゼとして作用することができ、DNA制限酵素の配列特異性に似ている。したがって、配列特異的リボザイムが媒介する遺伝子発現の阻害は、特に治療用途に適している（Scanlon他、1991；Sarver他、1990；Sioud他、1992）。この研究のほとんどは、特定のリボザイムによって切断される特定の変異体コドンに基づいて、目的とするmRNAの改変を必要とした。ここにある情報および当業者の知識によれば、所定の遺伝子を特異的に狙うさらなるリボザイムの調製および使用は、現在では簡単なことである。
【０２７６】
他の適当なリボザイムには、RNA切断活性を有するRNアーゼPからの配列（Yuan他、1992；YuanおよびAltman、1994）、ヘアピンリボザイム構造物（Berzal-Herranz他、1992；Chowrira他、1993）および肝炎δウイルス由来のリボザイム（PerrottaおよびBeen、1992）がある。ＲＮＡ切断活性を誘導するリボザイムの一般的なデザインおよび最適化は、詳細に解説されている（HaseloffおよびGerlach、1988；Symons、1992；Chowrira他、1994；およびThompson他、1995）。
【０２７７】
リボザイムの設計上他に変わりうることは、所定のターゲットRNA上の切断部位の選択である。リボザイムは、相補的塩基対の相互作用による部位へのアニーリングによって所定の配列にねらいを定める。この狙い撃ちには、相同性を有する二つの鎖が必要である。これら相同配列の鎖は、上述したリボザイムの触媒構造に隣接する。相同な配列の各鎖は、7〜15ヌクレオチドの長さで変わりうる。それらの相同配列を決める唯一の要件は、ターゲットRNA上において、切断部位である特定の配列によってそれらが分離されるということである。ハンマーヘッドリボザイムにとって、切断部位は、ターゲットRNA上のジヌクレオチド配列であり、それは、ウラシル（U）とそれに続くアデニン、シトシンまたはウラシルのいずれかである（A、CまたはU；Perriman他、1992；Thompson他、1995）。任意の所与のRNAにおいて、このジヌクレオチドが生じる頻度は、統計的に16中3である。
【０２７８】
目的とするRNAの効率的な切断のため、リボザイムを設計および試験することは、当業者によく知られたプロセスである。リボザイムを設計および試験するための科学的手法の例は、Chowrira他（1994）ならびにLieberおよびStrauss(1995)に記載されている。それらの内容は、この引用により本明細書に記載されたものとする。OASLを標的とするリボザイムの有効で好ましい配列の特定は、所定の配列を単に調製して試験するだけのことであり、当業者にとって知られた日常的に行われるスクリーニング法にすぎない。
【０２７９】
3．RNA干渉
さらに本発明において意図するところによれば、二本鎖RNAが干渉分子として用いられる。すなわち、RNA干渉（iRNA）である。
【０２８０】
RNA干渉は、二本鎖RNA分子を関心のある生物体に単に注射、入浴または食餌によって与えることにより、関心のある特定の遺伝子を「ノックアウト」または阻害するために、使用される。この手法は、トランスフェクションまたは組換え法を必要とすることなく、遺伝子機能を選択的に「ノックアウト」する（Giet、2001; Hammond、2001）。
【０２８１】
かくして、所定の態様において、ここに記載する標準的な分子的手法を用いて、二本鎖OaslRNAを合成または生産する。さらなる態様において、Oaslを阻害しうる他の構成の二本鎖RNAもまた考えられ、ここで使用され、例えば、OASLの活性を増強しうる組成物である。
【０２８２】
VIII.不妊の診断
Oasl遺伝子は、概して、不妊の診断または予後の指標として用いることができる。より具体的には、点変異、欠失、挿入、または調節の乱れを確認することができる。さらに本発明は、Oasl発現のレベルの変化を検出する不妊の診断を意図する。
【０２８３】
A.遺伝子診断
本発明の一態様は、Oaslの発現における変動を検出するための方法を包含する。これは、発現されるOaslのレベルを測定すること、または発現される生産物における特定の変化を測定することを含み得る。具体的態様において、Oasl6の発現の変化を検出する。
【０２８４】
生物学的試料は、任意の組織または体液であり得る。種々の実施態様は、精巣および卵巣からの細胞を含む。他の態様は、膣液または精液のような液体試料を含む。
【０２８５】
使用される核酸は、標準的な方法論（Sambrook他、1989）に従って、生物学的試料に含まれる細胞から単離される。核酸は、ゲノムDNAまたは分画された細胞RNAもしくは全細胞RNAであり得る。RNAを使用する場合、このRNAを相補的DNA（cDNA）に変換することが望ましい場合もある。ある態様において、RNAは、全細胞RNAであり、別の態様では、ポリ−A RNAである。通常、核酸を増幅する。
【０２８６】
様式に応じて、関心のある特定の核酸は、増幅を用いて直接的に試料において識別されるか、あるいは、増幅の後、第二の既知の核酸を用いて、識別される。次に、識別された生成物は検出される。ある応用例において、この検出は可視的な手段（例えば、ゲルの臭化エチジウム染色）によって行うことができる。あるいは、この検出は、化学発光、放射性標識または蛍光標識の放射性シンチグラフィーを介する、あるいは、さらに電気的または熱的なインパルスシグナルを使用するシステム（Affymax Technology；Bellus、1994）を介する、生成物の間接的な識別を利用することができる。
【０２８７】
検出の後、所定の患者において見られる結果を、正常な患者および不妊と診断された患者の統計的に有意な対照群と、比較することができる。
【０２８８】
意図するところによれば、Oasl遺伝子における他の変異は、本発明に従って、特定の核酸のヌクレオチド変化を検出することにより同定（確認）することができる（米国特許第4,988,617号、その内容はこの引用により本明細書に記載されたものとする）。これに関し、多種多様のアッセイが考えられ、例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH、米国特許第5,633,365号、米国特許第5,665,549号、その内容はこの引用により本明細書に記載されたものとする）、直接DNAシークエンス法、PFGE分析、サザンまたはノーザンブロッティング、一本鎖コンフォメーション解析（SSCA）、RNアーゼプロテクションアッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO、例えば、米国特許第5,639,611号）、ドットブロット分析、変性勾配ゲル電気泳動（例えば、米国特許第5,190,856号、その内容はこの引用により本明細書に記載されたものとする）、RFLP（例えば、米国特許第5,324,631号、その内容はこの引用により本明細書に記載されたものとする）、およびPCRTM（商標）-SSCPが挙げられる。例えば、生物学的液体中の遺伝子配列、例えば突然変異遺伝子および発ガン遺伝子を検出および定量するための方法は、米国特許第5,496,699号に記載されている（その内容は、この引用により本明細書に記載されたものとする）。
【０２８９】
さらに意図するところによれば、チップを用いたDNA技術、例えばHacia他（1996）およびShoemaker他（1996）に記載される技術を、不妊の診断に用いることができる。簡単に言えば、これらの技術は、非常に多くの遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的な方法を含む。オリゴヌクレオチドで遺伝子を標識するか、または固定したプローブアレイを用いれば、チップ技術を利用して、高密度のアレイとして目的とする分子を分離し、ハイブリダイゼーションに基づいてそれらの分子をスクリーニングすることができる（さらにPease他（1994）、Fodor他（1991）参照）。
【０２９０】
B.免疫診断
ELISAおよびウエスタンブロッティングなどの技術によってOASL含量を特徴づけるのに抗体を使用することができる。これは出生前スクリーニングまたは子供を欲しいと思っている人々のカウンセリングに役立っだろう。
【０２９１】
他にもさまざまな有用な免疫検出方法の工程が、例えばNakamura他（1987）などの科学文献に記載されている。免疫アッセイは、その最も簡単かつ直接的な意味において、結合アッセイである。ある好ましい免疫アッセイは、さまざまなタイプのラジオイムノアッセイ（RIA）および免疫ビーズ捕捉アッセイである。組織切片を使用する免疫組織化学的検出も、とりわけ有用である。しかし、検出はそれらの技術に限定されるわけではなく、本発明に関し、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、FACS解析なども使用しうることは、容易に理解できることである。
【０２９２】
本発明の抗体組成物は、イムノブロットまたはウエスタンブロット解析に大いに役立ちうる。固体の支持母材、例えばニトロセルロース、ナイロンまたはそれらの組み合わせ上に固定されたタンパク質を同定するための高アフィニティ一次試薬として抗体を使用することができる。免疫沈降法（ゲル電気泳動がその後行われる）と組み合わせて、それらの抗体を、抗原（それ対し、その検出において二次試薬を使用すると不都合なバックグラウンドが生じる）を検出するためのシングルステップ試薬として使用することができる。ウエスタンブロッティングと組み合わせて使用するための免疫学に基づく検出方法は、毒素成分に対する、酵素標識、放射性標識または蛍光標識された二次抗体を含み、これに関し、特に役立つと考えられる。そのような標識の利用に関する米国特許には、第3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、および4,366,241号があり、それらの内容はこの引用により本明細書に記載されたものとする。勿論、当該技術において知られているように、二次結合リガンド、例えば、第二の抗体またはビオチン／アビジンリガンド結合アレンジメントを利用することにより、さらに都合のよいこともありうる。
【０２９３】
IX.治療のための方法
A.妊性および避妊
本発明は、動物の避妊または妊性のいずれかを増強するため、OASLのモジュレーターを使用することを意図する。治療する動物は、例えば、哺乳動物または鳥であるが、これらに限定されない。例えば、マウス、ラットまたはサルは、実験動物モデルとして利用される。特定の態様において、本発明はヒトを治療するのに使用される。また、意図するところによれば、愛玩動物を不妊のため処置することができ、あるいは、予防組成物を避妊薬として用いることができる。愛玩動物には、イヌ、ネコ、ウマ、または鳥があるが、これらに限定されるものではない。
【０２９４】
本発明は、避妊または妊性をもたらす量で組成物を動物に投与する方法を含む。例えば、避妊は、受胎を減らすような有効量での化合物の投与を含む。本発明では、受胎のいかなる調節または低減も避妊とみなす。さらに、妊性の増加をもたらす化合物量を、有効量とみなす。
【０２９５】
本発明の所定の態様において、mRNAの分解を減らすことにより避妊を増強するため、OASLのモジュレーターの有効量を動物に投与する。特定の転写物のmRNA分解を阻害すれば、不妊がもたらされると考えられる。意図するところによれば、卵母細胞の成熟においてmRNA分解が減少すると、MosおよびPlatのような転写物の増加がもたらされる。通常は成熟時に分解される転写物が増えると、成熟した卵における突然変異の増加がもたらされる。
【０２９６】
本発明の所定の態様において、OASLのモジュレーターの有効量が、避妊を増強するため、動物に投与される。OASLは、OAS経路に関与しうると考えられる。OASLの増加は、OAS活性を阻害しうるか、またはOAS活性を増強しうると考えられる。一方、OASLの減少は、OAS活性を阻害または増強しうる。
【０２９７】
さらなる態様において、OASLのモジュレーターの有効量を、妊性を増強するために動物に投与する。OASLの増加または減少は、妊性を高めうると考えられる。妊性は、不妊または避妊の反対である。もし、OASLが特定の転写物のmRNA分解をつかさどっているのであれば、OASLの増加は妊性の増加をもたらしうる。
【０２９８】
具体的態様において、意図するところによれば、OASLポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはそれらの断片は、OASのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと相互作用しうる。OASLポリヌクレオチドはOASのアンタゴニストであると考えられる。例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11からなる群より選ばれるOASLポリヌクレオチドは、配列番号23、配列番号25または配列番号27のアンタゴニストである。さらに、OASLポリヌクレオチドは、配列番号24、配列番号26または配列番号28のアンタゴニストとなりうる。従って、OASLポリヌクレオチド、ポリペプチド、それらの変異体または断片は、OASポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合し得、OAS活性を調節しうる（例えば、転写を遮断し得、翻訳を遮断し得、他のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドとの相互作用を遮断し得る）。さらに、OASLは、OASの転写、翻訳等を増加または促進することにより、OAS活性を調節し得る。
【０２９９】
1．遺伝子に基づく治療
特に、本発明は、細胞に対してOASLを増強または減少させることができる発現コンストラクトを該細胞に与えることを意図する。ヒトOASL関連タンパク質と他のOASL関連タンパク質との間の配列相同性ゆえに、これらの核酸のいずれもがヒトの治療に使用でき、同様に、同じまたは生物学的に等価なポリペプチドをコードし得る上記の遺伝子配列変異体のいずれをも使用することができる。発現ベクターの詳細な解説とそこで使用される遺伝子エレメントは、引用によって本節に記載されたものとする。特に好ましい発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスベクターである。また、リポソームにカプセル化された発現ベクターも好ましい。
【０３００】
当業者は、インビボおよびエキソビボでの状況に対し遺伝子送達を如何にして適用するかについてよくわかっている。ウイルスベクターについては、一般にウイルスベクターストックを調製する。ウイルスの種類とその達成できる力価に応じて、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011または1×1012の感染性粒子を患者に配達する。相対的取り込み効率を比較することにより、同様の値をリポソーム製剤または他の非ウイルス製剤について予測することができる。薬学的に許容される組成物としての製剤は、以下に記載する。
【０３０１】
2．タンパク質治療
他の治療手法は、OASLポリペプチド、それの活性断片、それの合成ペプチド、それのミメティック、またはそれの他の類似体の、対象への供給である。タンパク質は、組換え発現手段によって生産することができる。剤型は、投与経路および目的に基づいて選択することができ、例えば、リポソーム製剤および古典的な医薬調製物がある。
【０３０２】
さらなるタンパク質治療は、免疫避妊法を含む。免疫避妊は、関心のある生殖抗原に対する抗体を投与すること、または、投与した生殖抗原に対して自然の免疫応答を発生させることを含む。
【０３０３】
B.過剰増殖性疾患
所定の態様において、OASL活性のモジュレーターの有効量を対象に投与することにより、過剰増殖性疾患を治療することができる。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０３０４】
本発明において、過剰増殖性疾患はさらに癌として定義される。さらに具体的には、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、白血病、肝細胞癌、網膜芽腫、星状細胞腫、グリア芽腫、歯肉部癌、舌癌、神経芽腫、頭部癌、頸部癌、乳癌、すい臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳腫瘍、大腸癌、肉腫または膀胱癌である。
【０３０５】
癌は、腫瘍細胞からなる腫瘍を含みうる。例えば、腫瘍細胞は、メラノーマ細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳癌細胞、卵巣癌細胞、リンパ癌細胞、皮膚癌細胞、脳癌細胞、骨癌細胞、または軟組織癌細胞を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【０３０６】
他の態様において、過剰増殖性疾患は、良性前立腺肥大、神経線維腫症、慢性関節リウマチ、ヴァーグナー肉芽腫症、川崎病、ループスエリテマトーデス、正中肉芽腫、炎症性の腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫（アデノーマ）、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム（性動脈）硬化（症）、前新生物性の病変、上皮内癌、口腔毛髪状白斑、乾癬、前白血病、過剰な芽細胞を伴う貧血、および骨髄異形成症候群である。
【０３０７】
本発明の組成物の有効性を高めるため、過剰増殖性疾患の治療に有効な他の薬剤、例えば抗癌剤、または手術を、本発明の組成物と組み合わせることが望ましい場合がある。「抗癌」剤は、対象において、癌に負に作用することができ、例えば、そのような作用は、癌細胞を殺す、癌細胞においてアポトーシスを誘発する、癌細胞の増殖速度を低下させる、転移の出現率または数を減らす、腫瘍のサイズを小さくする、腫瘍の成長を阻害する、腫瘍または癌細胞への血液の供給を減らす、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進する、癌の進行を阻止または阻害する、あるいは、癌を有する対象の寿命を延ばすことによるものである。抗癌剤は、生物学的薬剤（生物学的療法）、化学療法剤、および放射線療法剤を含む。より一般的に、これらの他の組成物は、細胞の増殖を止めるか阻害するのに効果的な組み合わせの量で供給することができる。このプロセスは、OASLモジュレーターおよび一つ以上の薬剤または複数の因子を同時に細胞に接触させることを含みうる。これは、両剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤を細胞に接触させることにより、あるいは、異なる二種の組成物または製剤（一方の組成物はOASLモジュレーターを含み、他方は第二の薬剤（類）を含む）を同時に細胞に接触させることにより達成することができる。
【０３０８】
あるいは、本発明のOASLモジュレーターを、数分間〜数週間の期間をおいて、他の抗癌剤による治療の前または後に用いることができる。他の抗癌剤およびOASLモジュレーターが別々に細胞に適用される態様では、一般に、各送達の間で顕著な時間が過ぎることなく、該薬剤とOASLモジュレーターとが、依然として有利に複合的効果を細胞に確実に及ぼすことができるようにする。そのような場合、意図するところによれば、両モダリティーに対してそれぞれ細胞を12〜24時間以内に、より好ましくは約6〜12時間以内に接触させることができる。しかし、治療のための期間を顕著に引き延ばすことが望ましい場合もあり得、その場合、それぞれの投与の間に数日（2、3、4、5、6または7）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）が経過する。
【０３０９】
X.患者に投与するための製剤および経路
臨床的用途が考えられる場合、意図する用途に適した形態の医薬組成物（発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体および薬物）を調製する必要がある。一般に、これには、発熱物質およびヒトまたは動物に対して有害であるかもしれない他の不純物を実質的に含まない組成物の調製が必要である。
【０３１０】
一般的には、送達ベクターを安定化し、ターゲット細胞による取り込みを可能にするために、適当な塩類および緩衝液を使用することが望まれる。緩衝液は、組換え細胞を患者に導入する場合にも使用される。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒質に溶解または分散された有効量の細胞向けベクターを含む。そのような組成物は接種材料とも呼ばれる。「薬学的にまたは薬理学上許容される」という表現は、動物またはヒトに投与したとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質へのそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術においてよく知られている。通常の媒質または薬剤は、それが本発明のベクターまたは細胞と適合しない場合を除き、治療用組成物への使用が考えられる。組成物には補助活性成分も組み込むことができる。
【０３１１】
本発明の活性組成物は、古典的医薬調製物を含みうる。これら本発明による組成物の投与には、どの一般的経路であっても、その経路で目的とする組織に到達することができる限り、使用することができる。これには経口、鼻腔、口腔、直腸、膣内および局所経路が含まれる。あるいは、投与は、同所性、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うこともできる。そのような組成物は、通常は上述の薬学的に許容される組成物として投与することができる。
【０３１２】
活性化合物は、非経口投与または腹腔内投与することもできる。遊離塩基または薬理学上許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。分散液をグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中、ならびに油中に調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件では、これらの調製物は微生物の成長を防止するために保存剤を含む。
【０３１３】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。いずれの場合も、剤形は滅菌されていなければならず、容易に注射器を通過する程度に流動性でなければならない。また、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物、および植物油などを含む溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、浸透圧調節剤、例えば糖または塩化ナトリウムなどを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを組成物中に使用することによって達成することができる。
【０３１４】
滅菌した注射用溶液は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒中で、上に列挙した他のさまざまな成分と混合した後、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒と上に列挙したものから選択される他の必要な成分とを含む滅菌した媒質にさまざまな滅菌した活性成分を混合することによって調製される。滅菌した注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分＋先に滅菌ろ過したその溶液に由来する所望の追加成分の粉末が得られる。
【０３１５】
ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質へのそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術ではよく知られている。通常の媒質または薬剤は、それが活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物への使用が考えられる。組成物には補助活性成分も組み込むことができる。
【０３１６】
経口投与のため、本発明のポリペプチドを賦形剤と混合し、非摂食性の洗口剤および歯磨剤の形で使用してもよい。洗口剤は、必要量の活性成分を適当な溶媒、例えばホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などに混合することによって製造することができる。あるいは、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む防腐洗浄剤に活性成分を組み込むこともできる。活性成分は、ゲル剤、ペースト剤、粉末剤およびスラリー剤を含む歯磨剤に分散させてもよい。水、結合剤、研磨材、着香剤、起泡剤および湿潤剤を含みうる練り歯磨き剤に、治療上有効量の活性成分を加えることができる。
【０３１７】
本発明の組成物は、中性または塩の形で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基を用いて形成されるもの）が含まれ、酸付加塩は、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【０３１８】
製剤化が終わったら、溶液剤は、その剤形に適した態様で、治療上有効であるような量で投与することができる。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどのさまざまな剤形で、容易に投与される。例えば、水溶液として非経口投与する場合、溶液は必要に応じて適切に緩衝化されているべきであり、希釈液をまず十分量の生理食塩水またはグルコースで等張性になるようにする。これらの特定の水溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとりわけ適している。これに関して、使用することができる滅菌水性媒質は、本開示から、当業者には明らかである。例えば、1回の用量を1mlの等張性NaCl溶液に溶解し、それを1000mlの皮下注入液に加えるか、注入しようとする部位に注射する（例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照）。治療対象の症状に応じて用量には必然的にある程度の変動が生じる。いずれにせよ、投薬責任者は個々の対象に適した用量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、FDA生物製剤局の基準が要求する滅菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。
【実施例】
【０３１９】
XI.実施例
本発明の好ましい態様を例示するために、以下に実施例を記載する。当業者に明らかなとおり、以下の実施例に開示する技術は、本発明者が見出した本発明の実施に際しうまく機能する技術を表し、従って、その実施の好ましい形態を構成するとみなすことができる。しかし、ここに開示する具体例には数多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく、よく似たまたは同類の結果が得られることは、本明細書の開示に照らして、当業者には明らかなことである。
【０３２０】
＜実施例１＞
サブトラクティブハイブリダイゼーション（Subtractive hybridization）
物理的サブトラクティブハイブリダイゼーション法を用いて、RNA分解を誘発する2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ（OAS）と相同性を有する新規なタンパク質をクローニングした。それらのタンパク質には、OASL6（配列番号2）、OASL7（配列番号4）、OASL8（配列番号6）、OASL9（配列番号8）、OASL10（配列番号10）、およびOASL11（配列番号12）が含まれる。
【０３２１】
簡単に言えば、サブトラクティブハイブリダイゼーションライブラリーを作製した。該ライブラリーは、野生型マウスからの卵巣に比べて、成長分化因子-9（Gdf9）ノックアウトマウスの卵巣からの配列をより多く含むものだった。Gdf9ノックアウトの卵巣は、一層の一次卵胞期に障害を有するため、それら卵巣における十分に成長した卵母細胞の数が対照に比べて相対的に増えていた。配列を解析して、それらが公的なデータベースにあるかどうか、そして、卵巣特有のものであるかどうか、決定した。
【０３２２】
＜実施例２＞
配列解析
マウスOasl6（配列番号1）、Oasl7（配列番号3）、Oasl8（配列番号5）、Oasl9（配列番号7）、Oasl10（配列番号9）、およびOasl11（配列番号11）の配列を、いくつかのデータベースを用いて解析した。PAM250残基重量表を用いるClustal法により、配列の特徴を調べ、それにより配列を既知のタンパク質配列と比較し、機能的ドメインを予測した。図1はOASおよびOASLタンパク質のマルチプルアラインメント（multiple alignment）解析を示す。図2はOAS1a-c、OASL4-7およびOASL11タンパク質のマルチプルアラインメント解析を示す。図3はOAS1a-cおよびOASL8-10タンパク質のマルチプルアラインメント解析を示す。保存されている残基は影をつけている。図4はOAS1a-c、OASL4-7およびOASL11タンパク質の系統発生解析を示す。図5はOAS1a-cおよびOASL8-10タンパク質の系統発生解析を示す。
【０３２３】
図6は、マウス染色体上の11の2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ様遺伝子の染色体位置を示す模式図である。配列解析から、データによって、完全長Oasl6のcDNAは362アミノ酸のタンパク質をコードすることが明らかになり、それは、マウス2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ（OAS1）との一致度が59％であり、OAS様タンパク質OASL5との一致度が72％であった。Oasl６遺伝子は6つのエキソンを有し、第５染色体上に位置した。それは、ヒト第１２染色体（ヒトOAS族遺伝子クラスターを含む領域）とシンテニック（相同）である。従って、データは、マウスおよびヒトにおいてOASL5およびOASL6をコードする遺伝子は物理的に連結されていることを示唆した。
【０３２４】
＜実施例３＞
mRNA組織発現
Oasl5-11のmRNA発現の半定量的RT-PCR解析を、複数種のマウス組織を用いて行った。プライマー類は、それらがすべて少なくとも一つのイントロンを包含し、かつOasl相同体間で交差増幅がないように、設計した。マウスHprtをcDNAの等しい投入量をモニターする対照として用いた。これらのOasl転写物の発現を最大に引き出すため、40サイクルのPCRを行った。マウスHprtを20サイクル増幅し、PCRが指数関数的段階にあることを確認した。図7は、複数種の組織におけるmRNA発現の解析を示し、それは、心臓（He）,肝臓（Li）、脾臓（Sp）、腎臓（Ki）、脳（Br）、胃（St）、小腸（In）、精巣（Te）、卵巣（OV）、および子宮（Ut）を含んだ。図7に示すとおり、Oasl6、Oasl7およびOasl8は卵巣で発現され、Oasl5およびOasl10は卵巣でわずかに発現された。
【０３２５】
＜実施例４＞
Oasl6のmRNA発現
当該技術においてよく知られ用いられる標準法を用いてノーザンブロット解析を行った。RNAを以下の組織から分離した。卵巣、脳、肺、心臓、胃、脾臓、肝臓、小腸、腎臓、精巣、および子宮。製造者の説明書に従いRNA STAT-60（Leedo Medical Laboratories, Inc., Houston, テキサス州）を用いてRNAを調製した。標準法（Sambrook他、1989）により、RNAのアガロースゲル電気泳動、ナイロン膜への転移、およびその後のハイブリダイゼーションを行った。RNAをまた、GDF9-/-マウスの卵巣から分離した。
【０３２６】
図８に示すように、Oasl6はもっぱら卵巣のみにおいて発現された。従って、Oasl6は卵巣特異的遺伝子である。
【０３２７】
＜実施例５＞
Oas1およびOasl6のmRNA組織発現
Oasl6がもっぱら卵巣でのみ発現されるのを確認するために、Oas1およびOasl6のmRNA発現の半定量的RT-PCR解析を行った。（Yan W他、2002）に記載されるように逆転写およびPCR反応を行った。Oasl6の増幅に使用したプライマーは、配列番号29の5'-CTTTTCAGCAGTGCATGTGG-3'、配列番号30の5'-TTCAATGCGTTTTGCTTTAATTT-3'である。Oasl用プライマーは配列番号31の5'-CGTCTTGGAACTGGTCATCA-3'、配列番号32の5'-GGCACCTGCTGTGGTTTATT-3'である。マウスHprtをcDNAの等しい投入量をモニターする対照として用いた。これらのOasl転写物の発現を最大に引き出すため、Oasl6については35サイクル、Oaslについては30サイクル、Hprtについては20サイクル行った（94C変性15分、その後、94C30秒、59C30秒、および72C１分のサイクルを繰り返し、最終伸長72C10分間）。
【０３２８】
図9に示すように、Oaslは、複数種のマウス組織で普遍的に発現された。一方、Oasl6はもっぱら卵巣のみで発現された。従って、Oasl6は卵巣特異的遺伝子である。
【０３２９】
＜実施例６＞
Oaslの誘導可能性
OaslmRNA発現の誘導可能性を、ポリ[I：C]処理により複数種のマウス組織において確認した。ポリ[I：C]は、インターフェロン誘導物質として作用することが知られている合成dsRNAである。
【０３３０】
簡単に言えば、マウスにi.p.で250μgのポリ[I：C]を注射した。24時間後、組織を採集した。対照マウスにはビヒクル（PBS）を注射した。ポリ[I：C]処理したマウス（+）および対照マウス（−）の複数の組織におけるOaslmRNAレベルについてノーザンブロット解析を行った（図10A）。データは、卵巣においてdsRNAが存在することによりOasl7およびOasl10が誘導されることを明らかにした。
【０３３１】
次いで、OaslmRNA発現の半定量的RT-PCR解析を、ポリ[I：C]処理したマウスおよび対照マウスの複数の組織において行った（図10B）。マウスHprtをcDNAの等しい投入量をモニターする対照として用いた。プライマー類は、それらがすべて少なくとも一つのイントロンを包含し、かつOasl相同体間で交差増幅がないように、設計した。これらのOasl転写物の発現を最大に引き出すため、40サイクルのPCRを行った。マウスHprtを20サイクル増幅し、PCRが指数関数的段階にあることを確認した。データは、卵巣においてポリ[I:C]の存在下および不在下、Oasl5、Oasl7が発現されることを明らかにし、卵巣においてdsRNAが存在することによりOasl10の発現が誘導されることを明らかにした。
【０３３２】
＜実施例７＞
前立腺組織におけるmRNA発現
前立腺におけるOaslmRNAのRT-PCR解析を行った。マウスをi.p.注射にて250μgのポリ[I:C]で処理した。24時間後、前立腺を採取した。対照マウスにはビヒクル（PBS）を注射した。酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Leedo Medical Laboratories, Houston, テキサス州）を用いて全RNAを分離した。全RNAの2μgアリコートを逆転写し、次いで、得られたcDNAをPCR増幅に用いた。45サイクルのPCRを行った（図11A）。図11Aは、Oasl1が、ポリ[I:C]の存在下および不在下で、前立腺で発現されたことを示すとともに、Oasl10の発現がポリ[I:C]の存在下で誘導されたことを示している。
【０３３３】
図11Bは、ポリ[I：C]処理したマウス（+）または対照マウス（−）の全前立腺（WP）、腹側前立腺（VP）、外側前立腺（LP）、背側前立腺（DP）、および凝固腺（GC）から分離された全RNAを示す。マウスHprtを増幅し、cDNAの等しい投入量をモニターするための対照として用いた。
【０３３４】
知られているところによれば、OASタンパク質はATPを2-5Aオリゴマーに変換し、
それが、RNアーゼLを活性化し、タンパク質の減成をもたらす。さらに知られているところによれば、活性の低下をもたらすRNアーゼL遺伝子の突然変異、例えば生殖細胞系の突然変異は、前立腺癌に関連しうる（Carpten他、2002）。従って、データは、OASLタンパク質が、RNA分解経路において負の制御因子として作用しうることを示唆した。
【０３３５】
＜実施例８＞
ポリ[I：C]によるOaslおよびOasl6 mRNAの調節
OaslmRNA発現のノーザンブロット解析を、ポリ[I：C]処理マウスおよび対照マウスの複数の組織において行った。
【０３３６】
成熟した（3〜4ヶ月）C57/S129SvEv(ハイブリッド)マウス（オス3匹およびメス3匹）に、0.9％NaClに溶解したポリ[I：C]40μgをi.p.注射した（+）。対照マウスには0.9％NaClのみを与えた（−）。血液精巣隔壁および血液脳関門のため、我々はさらに直接10μgを精巣（Te、+*）または脳（Br、+*）に注射した。対照マウスにはビヒクル（PBS）を注射した。24時間後、組織（心臓（He）,肝臓（Li）、脾臓（Sp）、腎臓（Ki）、脳（Br）、胃（St）、小腸（In）、精巣（Te）、卵巣（OV）、および子宮（Ut））を採取した。製造者の説明書に従いRNA STAT-60（Leedo Medical Laboratories, Inc., Houston, テキサス州）を用いてRNAを調製した。全RNA（10μg）を1.2％ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で分画し、Hybon-Nナイロン膜（Amersham, Arlington Heights, イリノイ州）に移した。Oasl6の3'-UTRからの421bpのPCRフラグメント（n.t.1123-1543に相当）を、Strip-EZキット（Ambion, Inc, Austin, テキサス州）を用いて[α-32P]dATPで標識した。ブロットを取り、ローディング対照用18S rRNA cDNAとハイブリダイズさせた。
【０３３７】
その結果、Oasl6は、卵巣において、発現され、ポリ[I：C]により誘導されることが明らかになり、また、Oaslは検査したすべての組織でポリ[I：C]により誘導されることが明らかになった。OAS1（ポリ[I：C]により誘導可能であった）と異なり、OASL6は二本鎖RNAの刺激に応答しない（図12）。
【０３３８】
＜実施例９＞
ウエスタンブロット解析
組換えタンパク質（10ng）を載せ、前免疫血清（A）および特異的抗血清（B）を用いて検出した。タンパク質は、複数の組織（腸（In）、脾臓（Sp）、肺（lu）、子宮（Ut）、胃（St）、肝臓（Li）、卵巣（Ov）を含む）から分離され、分画され、ナイロン膜に移され、特定の抗OAS抗体または抗OASL抗体を用いて検出された。
【０３３９】
図13は、OAS1およびOASL6タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。
【０３４０】
＜実施例１０＞
Oasl6のインサイチューハイブリダイゼーション
インサイチューハイブリダイゼーションを行った（Yan W他、2001 Oncogene, 20:1343-1356）。Oasl6の3'-UTRからの421bpのPCRフラグメント（n.t.1123-1543に相当）をpGEM-Tベクター（Promega, Madison, ウィスコンシン州）にサブクローニングし、Riboprobe Labeling System (Promega)を用いてセンスおよびアンチセンスのリボプローブ（n.t.1123-1543に対応）を調製した。
【０３４１】
図14に示すとおり、すべての成長卵胞においてOasl6は卵母細胞に局在した。従って、Oasl6は卵母細胞特異的遺伝子である。
【０３４２】
＜実施例１１＞
免疫組織化学的位置特定
完全長マウスOASLおよびOAS遺伝子を、pET系ベクター（Novagen）に挿入し、N末端T7標識およびC末端Hig標識をともに含む組換えタンパク質を生成させた。T7標識に対する抗体を用いて組換えOASおよびOASを同定した。His標識を用いて、ニッケルアフィニティカラム上で均質になるまでOASを精製した。抗体を産生させるため、組換えOASおよびOASタンパク質をヤギに注射した。
【０３４３】
PBS中4％パラホルムアルデヒドにおいて2時間、卵巣を固定し、加工し、パラフィン中に包埋し、5μm厚の切片にした。ヤギ抗OASLポリクローナル抗血清をCommon Antibody Dilute (BioGenex)において1：2000に希釈した。同じヤギからの前免疫ヤギ血清を対照として用いた。すべての切片をUniversal Blocking Reagent (BioGenex)において10分間ブロックし、一次抗体とともに1時間室温でインキュベートした。OASLおよびOASの検出は、抗ヤギビオチン化二次抗体、ストレプトアビジン接合アルカリホスファターゼ標識およびNew Fuschin基質（BioGenex, Laboratories, Inc., San Ramon, カリフォルニア州）を用いて行った。
【０３４４】
1〜8細胞胚および胚盤胞を、96ウェル丸底プレートにおいて、PBS中4％パラホルムアルデヒドで2時間固定し、0.85％生理食塩水で洗浄し、1.5％アガロースの数滴中に埋め込んだ。アガロース含有胚を、脱水し、パラフィン中に包埋し、上述したように分析した。
【０３４５】
OASL6免疫反応性は、成熟した卵巣におけるすべての成長卵胞の卵母細胞の細胞質（図15A）、および、Gdf9-/-卵巣における一次卵胞の卵母細胞の細胞質（図15B）でのみ検出された。OAS1免疫反応性は、成熟した卵巣（図15C）およびGdf9-/-卵巣（図15D）の卵母細胞、顆粒膜細胞、および黄体細胞のいずれの細胞質にも存在した。前免疫血清で染色された切片は、免疫反応性を示さない（図15Eおよび図15F）。
【０３４６】
＜実施例１２＞
Oasl6の免疫蛍光分析
（Yan W他、2002）に記載されるとおり、卵母細胞および初期胚について、免疫蛍光分析を行った。
【０３４７】
図16に示すように、OASL6は、GV期および中期II段階の卵母細胞において発現され、同様に、2〜8細胞期の初期胚においても発現された。従って、データは、OASL6が受精および／または初期胚形成においていずれの段階でも機能しうることを示唆した。
【０３４８】
＜実施例１３＞
ポリ[I：C]によるOaslおよびOasl6の調節
本来の（N1およびN2）または完全に変性した（D）組換えOAS1またはOASL6のアリコートをポリ[I：C]−アガロースとともにインキュベートした。インキュベーションの後、混合物を遠心分離し、アガロースビーズを洗浄した。次に、結合タンパク質をSDS-PAGEに付与し、抗His抗体（Invitrogen, Carlsbad, カリフォルニア州）とのインキュベーションによる免疫ブロッティングおよび解析を行った。各反応からの同じアリコートをSDS-PAGEに供し、次いで、ポリ[I：C]-アガロースとともにインキュベートし、ローディング対照として使用した。結合アッセイを上述したように行った（SarkarおよびSen, 1998 Methods: A Companion to Methods in Enzymology 15:233-242）。
【０３４９】
図17Aに示すように、完全に変性した（D）OAS1およびOASL6は、ポリ[I：C]に結合しなかった。その結果、OAS1と同様、OASL6は二本鎖RNAに結合する能力を有することが明らかになった。
【０３５０】
タンパク質のアリコート（結合アッセイに用いた量と同じ）をブロットし、結合アッセイにおいてタンパク質の投入量が同じであることをモニターした（図17B）。
【０３５１】
＜実施例１４＞
2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性アッセイ
OASL5（これは「いたるところで」発現される）は、2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性を有しない（Shibata他、2001）。構造−機能の研究が明らかにしたところによれば、触媒活性には、OAS1タンパク質のP-ループ、D-ボックス、およびKR−リッチ領域が必要である（Kon他、1996；Yamamoto他、2000）。2',5'-オリゴアデニレートへの変換のため、P−ループはdsRNAに結合し、D-ボックスはMg++に結合し、KR-リッチドメインはATPに結合する。特に、OAS1AにおいてK67、D76、D78、およびK200の変異は、OAS酵素活性を失わせる（Yamamoto他、2000）。マウスOASL5、マウスOASL類およびヒトOASL類の解析により、これら4つの残基は保存されていないことがわかる。このことは、マウスOASL5およびヒトOASLにOAS活性がないことをかなり裏付けている。
【０３５２】
簡単に説明すると、2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ酵素活性は、OAS1またはOASL6（5μg）を、20mMのTris-HCl（pH7.4）、20mMの酢酸マグネシウム、2.5mMのDTT、5mMのATP、5uCiの[α−32P]ATP（800Ci/mmol）および50μg／mlのポリ[I：C]とともに、20μlの反応容量において37℃で12時間インキュベートすることによりアッセイした。反応は、95℃での加熱により停止させた。薄層クロマトグラフィーにより生成物を分析した。
【０３５３】
図18は、再折りたたみの前（B）、完全に変性したOAS1は2',5'-オリゴAを生成させず、一方、再折りたたみの後（A）2',5'-オリゴAが認められたことを示す。再折りたたみの前でも後でも、OASL6において2',5'-オリゴアデニレートは検出されなかった（図18）。従って、組換えOASL6は正しく折りたたまれていた。
【０３５４】
＜実施例１５＞
OASL6の2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性アッセイ
数時間にわたって[γ-32P]ATPを放射性標識pp[pA]nに変換する能力（Shibata他、2001）について組換えマウスOASおよびマウスOASL6を検査した。
【０３５５】
実施例14に記載されるように（SarkarおよびSen, 1998 Methods: A Companion to Methods in Enzymology 15:233-242）、2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性アッセイを行った。簡単に言えば、ポリ[I：C]−アガロース結合組換えタンパク質を、20mMのHEPES-KOH、50mMのKCl、25mMのMg(Oac)2、7mMの2−メルカプトエタノール、5mMのATPを含む反応緩衝液中で、[γ-32P]ATP(20μCi)とともに33℃で図に示される時間インキュベートした。反応混液を遠心分離し、上清を7Mの尿素を含む20％ポリアクリルアミドゲル上で分画した。ゲルを乾燥させ、その後オートラジオグラフィーを行った。
【０３５６】
図19に示すように、OASL6には2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性を有しない。
【０３５７】
＜実施例１６＞
Oasl6ヌルアレル（無効対立遺伝子）の生成およびOasl6ノックアウトマウスの生産
Oasl6の破壊および不活性化を、Pgkプロモーターの制御下、エキソン1および2（転写の開始、開始ATGコドン、およびOASL6の157コドンを含む）をHprtミニ遺伝子で置換することにより、行った（図20）。HPRTを正の選択マーカーとして使用した。MCIプロモーターの制御下、負の選択マーカーである単純ヘルペスチミジンキナーゼ（TK）ミニ遺伝子を、3'アームの下流に配置した。ターゲティングを、Hprt欠損であるAB2.1 ES細胞株において行った。正および負の選択の後、標的化ES細胞を5'プローブおよび3'プローブの両方を用いるサザンブロット解析により確認した。マウスES細胞において相同組換えを介するエキソン1および2のPgk/Hprtミニ遺伝子での置換により、Oasl6の転写が完全になくなった。
【０３５８】
次に、正しく標的化されたES細胞を、C57BL/6胚盤胞に注入し、（Badley, A. 1987）に記載されるように、偽妊娠させた受容体に移した。キメラをC57BL/6マウスと交雑させ、実験用のF1ハイブリッド変異マウスを生産した。
【０３５９】
ヘテロ接合交配対（Oasl6+/-×Oasl6+/-）からの８匹のマウスの同腹子の3'プローブを用いたサザンブロット解析。尾部DNAを分離しBglIIで消化した。次いで、消化したDNAを0.7％アガロースゲル上で分画し、その後、GeneScreen Plus膜（PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, マサチューセッツ州）に移した。膜をUV架橋し、Rediprime II Random Prime Labeling System (Amersham Biosciences UK limited, Little Chalfont Buckinghamshire, 英国)を用い、[α-32P]-dCTPで標識した3'プローブを用いてハイブリダイズした。Kodak X-OMAT ARフィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, ニューヨーク州）を用いてオートラジオグラフィーを行った。図21に示すように、サザンブロット解析により、変異体および野生型の動物の遺伝子型が正確に分類された。
【０３６０】
＜実施例１７＞
Oasl6ノックアウトマウスの生殖能力の分析
ヘテロ接合マウスを交雑させた。ヘテロ接合交雑体からの子孫の遺伝子型を3週齢で分類し、その結果、1:2:1のメンデル比が明らかになった。ホモ接合変異体マウスは、生存能力があり、その対照同腹子と区別がつかなかった。表1は、ヘテロ接合変異体マウスがメンデルの法則どおりに繁殖し、Oasl6のホモ接合変異が生存能力に影響しなかったことを示している。
【０３６１】
【表１】
2006502738.tif 000003
【０３６２】
Oasl6ヌル雌の妊性の状態を調べるため、ホモ接合変異体の雌を野生型の雄と交配させ（-/-×+/+）、そして、ヘテロ接合生殖対（+/-×+/-）を対照として用いた。Oasl6ヌル雌は、一腹子数が減っているようである（8.3対5.1）（表2参照）。かくして、ホモ接合雌（Oasl6-/-）と野生型雄との交配の結果、ヘテロ接合交配の対照と比べて一腹子数が約38.5％減ったことが明らかになった。
【０３６３】
【表２】
2006502738.tif 000004
【０３６４】
Oasl6-/-卵巣の組織学的解析を行い、薬理学的な過剰排卵に対してOasl6-/-卵母細胞が放出される能力を調べ、Oasl6-/-卵の受精能力を測定し、そして、培養においてOasl6-/-卵からの初期胚の発生を調べることにより、妊性遮断の性質／時期を決定する。
【０３６５】
もしOasl6が、突然変異により誘発されるユニークなRNA分解経路に関わっているのであれば、母系転写物の残留は、初期胚開裂の異常をもたらしうる。これらの状況の下、初期胚のRNアーゼプロテクションアッセイを用いて、RNA分解の関与を明らかにする。かくして、卵母細胞成熟においてmRNA分解系に機能障害があれば、通常は分解される転写物が、MosおよびPlatのように、変異体成熟卵において対照よりも高レベルになる。
【０３６６】
参照文献
本明細書に記載するすべての特許および刊行物は、本発明に関し、当業者の技術水準を示すものである。本明細書で個々に引用した特定の特許および刊行物はすべて、その引用によってその内容が本明細書に記載されたものとする。
Arcone, 他, (1988) Nucl. Acids Res., 16(8):3195-3207.
Aruffo 他(1987) EMBO J. 6:3313.
Baichwal および Sugden, In: Gene Transfer, pp. 117-148, 1986.
Barany および Merrifield, (1979) The Peptides, pp. 1-284.
Bartel, P. L. および S. Fields In: THE YEAST TWO-HYBRID SYSTEM. Oxford University Press, 1997.
Benvenisty および Neshif, (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 83:9551-9555.
Berzal-Herranz 他, (1992) Genes Dev. 6(1):129-34.
Bohmann 他, (1989) Cell. Nov 17;59(4):709-17.
Bradley, A. (1987) in Production and analysis of chimeric mice, Robinson, E. J.編(Oxford:IRL, London), pp. 113-151
Brinster 他, (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:4438-4442.
Capecchi 他, Sci Am (1994) 270:52-9.
Campbell, In: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burden および Von Knippenberg編. pp. 75-83, Amsterdam, Elseview, 1984.
Carpten 他, (2002), Nature Genetics 30:181-184.
Carter および Flotte, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci, 770:79-90.
Cech 他, (1981) Cell Dec;27(3 Pt 2):487-96.
Chatterjee, 他, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770:79-90.
Chen および Okayama (1987) Mol. Cell Biol, 7:2745-2752.
Chowrira 他, (1994) J Biol Chem. 269(41):25856-64.
Chowrira 他, (1993) J Biol Chem. 268(26):19458-62.
Coffin, (1990) In: Virology編, New York: Raven Press, pp. 1437-1500.
Coupar 他, (1988) Gene, 68:1-10.
Courey 他, (1988) Cell 55(5):887-98.
Davey他, EPO No. 329822.
Dubensky 他, (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7529-7533.
Fashena 他, (2000) Methods Enzymol. 328:14-26.
Fechheimer 他, (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467.
Ferrari 他, (1996) J. Virol., 70:3227-3234.
Fisher 他, (1996) J. Virol., 70:520-532.
Flotte 他, (1993) PROC. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:10613-10617.
Fodor 他, (1991) Science, 251:767-773.
Forster および Symons, (1987) Cell, 49:211-220.
Fraley 他., (1979) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352.
Friedman 他, (1990) Genes Dev. Aug;4(8):1416-26.
Gefter 他, (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-236.
Gerster 他, (1990) EMBO J. (5):1635-43.
Ghosh および Bachhawat, (1991) In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands. Wu 他, pp. 87-104.
Gist 他, (2001) J Cell Biol. 152(4):669-82.
Gingeras 他, PCT Application WO 88/10315.
Goding, (1986) In: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 71-74.
Goodman 他, (1994) Blood, 84:1492-1500.
Gopal, (1985) Mol. Cell Biol., 5:1188-1190.
Gossen 他, (1995) Science, 268:1766-1769.
Gossen および Bujard (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:5547-5551.
Graham および van der Eb, (1973) Virology, 52:456-467.
Hacia 他, (1996) Nature Genetics, 14:441-447.
Hammond 他, (2001) Nat Rev Genet. 2(2):110-9.
Harland および Weintraub, (1985) J. Cell Biol., 101:1094-1099.
Haseloff および Gerlach (1988) Nature. 334(6183):585-91.
Hay (1984) J. Mol. Biol., 175:493-510.
Hearing および Shenk, (1983) J. Mol. Biol. 167:809-822.
Hearing 他, (1987) J. Virol, 67:2555-2558.
Hope 他, (1987) EMBO J. Sep;6(9):2781-4.
Hu 他, (2000) Methods. 20(l):80-94.
James 他, (1996) Genetics. 144(4):1425-36.
Johnson 他, (1993) "Peptide Turn Mimetics" In: Biotechnology And Pharmacy.
Joyce Nature, (1989) 338:217-244.
Kageyama 他, (1987) J. Biol. Chem., 262(5):2345-2351.
Kaneda 他, (1989) Science, 243:375-378.
Kaplitt 他, (1994) Nat'l Genet., 8:148-153.
Kato 他, (1991) J. Biol. Chem., 266:3361-3364.
Kim および Cook, (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8788-8792.
Klein 他, (1987) Nature, 327:70-73.
Koeberl 他, (1997) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94:1426-1431.
Kohler および Milstein, (1976) Eur. J. Immunol., 6:511-519,
Kon, N. 他, (1996) J. Biol Chem 271, 19983-90.
Legrain, P. 他, (2001) Trends Genet. 17, 346-52.
Levrero 他, (1991) Gene, 101:195-202.
Lieber 他, (1995) Mol Cell Biol. 15(1):540-51.
Lira SA 他, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1990) Sep;87(18):7215-9.
Ma 他, (1987) 50:137-42.
Mann 他, (1983) Cell, 33:153-159.
Martin 他, (1990) Genes Dev. (ll):1886-98.
McCown 他, (1996) Brain Res., 713:99-107.
Mermod 他, (1989) Cell. 58(4):741-53.
Merrifield, (1986) Science, 232:341-347.
Michel および Westhof (1990) J.Mol.Biol, 216:585-610.
Miller 他, PCT出願番号第WO89/06700号.
Muller-Immergluck 他, (1990) EMBO J. 9(5):1625-34.
Nakamura 他, (1987) In: Handbook of Experimental Immunology (第四版).
Nicolau および Sene (1982) Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190.
Nicolau 他, (1987) Methods Enzymol., 149:157-176.
Oliviero (1987) 他., EMBO J., 6(7):1905-1912.
Paskind 他, (1975) Virology, 67:242-248.
Pease 他,(1994) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 91:5022-5026.
Perriman 他, (1992) Gene. 113(2):157-63.
Perrotta および Been (1992) Biochemistry. 31(1):16-21.
Peschon JJ 他, Proc. Nat'l Acad Sci. USA (1987) Aug;84(15):5316-9.
Pierson 他, (2000) Molecular Endocrinology 14:1075-1085.
Ping 他, (1996) Microcirculation, 3:225-228.
Poli および Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:8202-8206.
Potter 他, (1984) Proa Nat'lAcad. Sci. USA, 81:7161-7165.
Prowse および Baumann (1988) Mol Cell Biol, 8(1):42-51.
Radler 他, (1997) Science, 275:810-814.
Rebouillat, D. 他, (1999) J. Interferon Cytokine Res 19, 295-308.
Reinhold-Hurek および Shub, (1992) Nature, 357:173-176.
Renan (1990) Radiother. Oncol., 19:197-218.
Ridgeway, (1988) In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, pp. 467-492.
Rippe 他, (1990) Mol. Cell Biol., 10:689-695.
Ron, 他, (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895.
Roux 他, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:9079-9083.
Sadowski 他, (1988) Nature. 335(6190):563-4.
Sambrook 他, (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Samulski 他, (1987) J. Virol., 61(10):3096-3101.
Sarver 他,(l990) Science, 247:1222-1225.
Scanlon 他, (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88:10591-10595.
Seed 他, (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:3365.
Shibata, S. 他, (2001) Gene 271, 261-71.
Shoemaker 他, (1996) Nature Genetics 14:450-456.
Sioud 他, (1992) J Mol Biol. 223(4):831-5.
Soyal, 他, (2000) Development 127:4645-4654.
Stewart および Young, (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 第二版, Pierce Chemical Co.
Tam 他, (1983) J. Am. Chem. Soc., 105:6442.
Temin, (1986) In: Gene Transfer, Kucherlapati編, New York: Plenum Press, pp. 149-188.
Thompson 他, (1995) Nucleic Acids Res. 23(12):2259-68.
Tibbetts (1977) Cell, 12:243-249.
Tur-Kaspa 他, (1986) Mol. Cell Biol., 6:716-718.
Watt 他, (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci., 83(2):3166-3170.
Wilson 他, (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191.
Wong 他., (1980) Gene, 10:87-94.
Wong 他, (1985) Science, 228:810-815.
Wu および Wu, (1987) J. Biol. Chem., 262:4429-4432.
Wu および Wu, (1988) Biochem., 27:887-892.
Wu, L.C., 他, (1996) Nat Genet 14, 430-40.
Xiao 他, (1996) J. Virol., 70:8098-8108.
Yamamoto, Y. 他, (2000) J. Interferon Cytokine Res 20, 337-44.
Yan W., 他, 2002 Mol. Endo., 16:1168-1184
Yang 他, (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87:9568-9572.
Yuan および Altman (1994) Science. 263(5151):1269-73.
Yuan 他, (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89(17):8006-10.
Zechner 他, (1988) Mol. Cell. Biol., 2394-2401.
Zhang LP 他, Biol Reprod. (1999) Jun;60(6):1329-37.
本発明およびその利点を詳細に説明してきたが、勿論、本願特許請求の範囲に規定する本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更、置換、および改変を施すことができる。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載した特定の態様のプロセス、装置、製品、組成物、手段、方法および工程に限定されるものではない。本発明の開示から当業者には明らかなように、本明細書に記載した対応する態様と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果をもたらす、既存のまたは将来開発されるプロセス、装置、製品、組成物、手段、方法または工程を、本発明に従って用いることができる。従って、そのようなプロセス、装置、製品、組成物、手段、方法または工程もまた、本願特許請求の範囲に包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１Ａ．１Ｂ．１Ｃ】すべてのネズミOASおよびOASLタンパク質の多重整列解析を示す。保存残基は影付けされている。
【図２Ａ．２Ｂ】ネズミのOASla-c、OASL4-7、およびOASL11タンパク質の多重整列解析を示す。保存残基は影付けされている。
【図３Ａ．３Ｂ】ネズミのOASla-c、OASL8-10タンパク質の多重整列解析を示す。保存残基は影付けされている。
【図４】ネズミのOASla-c、OASL4-7、およびOASL11タンパク質の系統発生解析を示す。
【図５】ネズミのOASla-c、およびOASL8-10タンパク質の系統発生解析を示す。
【図６】マウス第５染色体上の11の2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ様遺伝子の染色体位置を示す模式図である。矢印は遺伝子の転写配向を示す。下欄にある数字は、Oasl遺伝子間の距離を表す。
【図７】複数種のマウス組織におけるOasl5-11のmRNA発現の半定量的RT-PCR分析を示す。組織には、心臓（He）、肝臓（Li）、脾臓（Sp）、腎臓（Ki）、脳（Br）、胃（St）、小腸（In）、精巣（Te）、卵巣（OV）および子宮（Ut）が含まれる。
【図８】ノーザンブロット解析によって測定された複数種のマウス組織におけるOasl6のmRNA発現を示す。組織には、心臓（He）、肝臓（Li）、脾臓（Sp）、腎臓（Ki）、脳（Br）、胃（St）、小腸（In）、精巣（Te）、卵巣（OV）および子宮（Ut）が含まれる。
【図９】複数種の組織におけるOasl6およびOasl mRNA発現のRT-PCR分析を示す。組織には、心臓（He）、肝臓（Li）、脾臓（Sp）、腎臓（Ki）、脳（Br）、胃（St）、小腸（In）、精巣（Te）、卵巣（OV）および子宮（Ut）が含まれる。
【図１０Ａ．１０Ｂ】ポリ[I:C]（Poly[I:C]）処理による複数種のマウス組織におけるOasl mRNA発現の誘導可能性を示す。図10Aは、ポリ[I:C]処理されたマウス(+)および対照マウス（-）の複数種の組織におけるOasl mRNAレベルのノーザンブロット解析を示す。図10Bは、ポリ[I:C]処理されたマウスおよび対照マウスの複数種の組織におけるOasl mRNA発現の半定量的PCR分析を示す。
【図１１Ａ．１１Ｂ】前立腺におけるOasl mRNAのRT-PCR分析を示す。図11Aは、逆転写されて得られたcDNAがPCR増幅に使用された全RNAを示す。図11Bは、ポリ[I:C]処理されたマウス(+)または対照マウス(-)の全前立腺（WP）、腹側前立腺（VP）、外側前立腺（LP）、背側前立腺（DP）、および凝固腺（GC）から分離された全RNAを示す。
【図１２】ポリ[I:C]処理されたマウスおよび対照マウスの複数種の組織におけるOaslおよびOasl6mRNA発現のノーザンブロット解析を示す。
【図１３】OAS1およびOASL6タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。組換えタンパク質を載せ、前免疫（pre-immune）血清（A）および特異的抗血清（B）で検出した。タンパク質が分離された複数種の組織には、腸（In）、脾臓（Sp）、肺（lu）、子宮（Ut）、胃（St）、肝臓（Li）および卵巣（Ov）が含まれる。
【図１４Ａ．１４Ｂ】卵巣におけるOasl6 mRNA局在化のインサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーションを示す。
【図１５Ａ．１５Ｂ．１５Ｃ．１５Ｄ．１５Ｅ】マウス卵巣におけるOASLおよびOASL6タンパク質の免疫組織化学的位置測定を示す。図15Aは成熟した卵巣を示し、図15BはGdf9ヌル卵巣またはノックアウト卵巣における一次卵胞の卵母細胞を示す。図15Cは成熟した卵巣の卵母細胞、顆粒膜細胞、および黄体細胞を示し、図15DはGdf9ヌル卵巣またはノックアウト卵巣の卵母細胞、顆粒膜細胞、および黄体細胞を示す。前免疫血清で染色された切片を図15Eおよび図15Fに示す。
【図１６Ａ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｉ．Ｊ】卵母細胞および初期胚におけるOASL6発現の免疫蛍光分析を示す。図16Cおよび図16DはGV卵母細胞におけるOASL6およびOASlの発現を示す。図16Eおよび図16FはMII卵母細胞におけるOASL6およびOASlの発現を示す。図16Gおよび図16Hは2細胞胚におけるOASL6およびOASlの発現を示す。図16Iおよび図16Jは8細胞胚におけるOASL6およびOASlの発現を示す。前免疫血清で染色された切片を図16Aおよび図16Bに示す。
【図１７Ａ．１７Ｂ】ポリ[I:C]結合アッセイを示す。図17AはOASlおよびOASL6の結合アッセイを示す。図17Bは結合アッセイにおいて使用されるタンパク質の量を示す。
【図１８】2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性アッセイを示す。二つの別個の実験を示している（上および下の欄）。リフォールディング（再折りたたみ）前（B）とリフォールディング後（A）である。
【図１９】OAS1およびOASL6に対する2',5'-オリゴアデニレートシンテターゼ活性アッセイを示す。
【図２０】Oasl6ゲノム遺伝子座、Oasl6無効対立遺伝子（ヌルアルレ）を生成させるターゲティングベクターを示す。
【図２１】3'プローブを用いたヘテロ接合交配対（Oasl6+/-×Oasl6+/-）からのマウスの同腹子のサザンブロット解析を示す。
【配列表】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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