(57)【要約】  本発明はグラム陽性微生物における分泌に関する。本発明はバチルス・ズブチリス分泌因子ＳｅｃＧの核酸及びアミノ酸配列を提供する。また、本発明はグラム陽性微生物において異種または同種タンパク質の分泌を増加させる手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）を含む転写物の翻訳を調節する変異シャイン・ダルガーノ配列をエンコードするグラム陽性微生物。
【請求項２】
前記グラム陽性微生物がバチルス属の１種である、請求項１のグラム陽性微生物。
【請求項３】
前記バチルスが、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項２のグラム陽性微生物。
【請求項４】
前記調節が前記ＳｅｃＧの発現の増加を含む、請求項１のグラム陽性微生物。
【請求項５】
前記調節が前記ＳｅｃＧの発現の減少を含む、請求項１のグラム陽性微生物。
【請求項６】
前記微生物が少なくとも１の異種タンパク質を発現できる、請求項１のグラム陽性微生物。
【請求項７】
前記異種タンパク質がホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される、請求項６のグラム陽性微生物。
【請求項８】
前記異種タンパク質が酵素である、請求項７のグラム陽性微生物。
【請求項９】
前記酵素がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される、請求項８のグラム陽性微生物。
【請求項１０】
分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）の発現を調節する変異ＲＮＡポリメラーゼσ因子アルファ（σＡ）配列をエンコードするグラム陽性微生物。
【請求項１１】
前記グラム陽性微生物がバチルスである、請求項１０のグラム陽性微生物。
【請求項１２】
前記バチルスが、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項１１のグラム陽性微生物。
【請求項１３】
前記調節が前記ＳｅｃＧの発現の増加を含む、請求項１０のグラム陽性微生物。
【請求項１４】
前記調節が前記ＳｅｃＧの発現の減少を含む、請求項１０のグラム陽性微生物。
【請求項１５】
前記微生物が少なくとも１の異種タンパク質を発現できる、請求項１０のグラム陽性微生物。
【請求項１６】
前記異種タンパク質がホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される、請求項１５のグラム陽性微生物。
【請求項１７】
前記異種タンパク質が酵素である、請求項１６のグラム陽性微生物。
【請求項１８】
前記酵素がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される、請求項１７のグラム陽性微生物。
【請求項１９】
グラム陽性微生物における改善されたタンパク質の分泌方法であって、ＳｅｃＧをエンコードする核酸を含むグラム陽性微生物宿主細胞を得る工程を含み、ここで前記核酸はグラム陽性微生物内でＳｅｃＧを発現できる発現シグナルにより制御され、さらに当該グラム陽性微生物宿主細胞は前記タンパク質をエンコードする核酸を含み；及びＳｅｃＧ発現及び前記タンパク質の発現及び分泌に適した条件下で前記微生物を培養する工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記グラム陽性微生物がさらに、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及びＳｅｃＡからなる群より選択される少なくとも１の他の分泌因子をエンコードする核酸を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質が前記宿主細胞と同種である、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が前記宿主細胞と異種である、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記グラム陽性微生物がバチルス属の１種である、請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記バチルスが、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記異種タンパク質がホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記異種タンパク質が酵素である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記酵素がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、ムターゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される、請求項２６の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は２０００年３月２２日に出願された米国特許出願番号第０９／４６２，８４３の一部継続出願、これに基づく優先権主張出願であり、かかる出願は１９９８年７月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／１４６４８及び１９９７年７月１５日に出願された欧州特許９７３０５２８８．５の優先権主張出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は通常、グラム陽性微生物でのタンパク質発現に関し、具体的には、グラム陽性微生物分泌因子、ＳｅｃＧに関する。本発明はさらにグラム陽性微生物内でのタンパク質生産のための発現ベクター、方法及び系を提供する。
【０００３】
発明の背景
グラム陽性微生物、例えば、バチルス属のメンバーは、ひとつには発酵産物を培地内に分泌する能力のため大規模工業用発酵に用いられてきた。グラム陽性細菌において、分泌タンパク質は細胞膜及び細胞壁を通って輸送され、続いて外部媒体内に放出されて通常、未変性立体構造が得られる。既に同定されているグラム陽性微生物由来の分泌因子はＳｅｃＡ（Ｓａｄａｉｅ  ｅｔ．ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ９８：１０１−１０５［１９９１］）、ＳｅｃＹ（Ｓｕｈ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：３０５−３１４［１９９０］、ＳｅｃＥ（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１３３−１４２［１９９３］）、ＦｔｓＹ及びＦｆＨ（ＰＣＴ／ＮＬ９６／００２７８）及びＰｒｓＡ（ＷＯ９４／１９４７１）が挙げられる。
【０００４】
一方、グラム陰性微生物、大腸菌では、タンパク質は細胞膜や細胞壁を通って培地内に入るというよりもむしろペリプラズムに輸送される。大腸菌は少なくとも２種類の分泌メカニズム構成、可溶性細胞質タンパク質及び膜関連タンパク質を有する。報告されている大腸菌分泌因子は可溶性細胞質タンパク質、ＳｅｃＢ及び熱ショックタンパク質；表在性膜関連タンパク質ＳｅｃＡ；及び内在性膜タンパク質ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＤ及びＳｅｃＦがある。原核細胞のタンパク質分泌機構の理解の進展にも関わらず、タンパク質分泌、特にバチルスなどのグラム陽性微生物でのタンパク質分泌の完全なメカニズムは依然として十分に解明する必要がある。
【０００５】
発明の概要
本発明は通常、グラム陽性微生物でのタンパク質発現に関し、具体的には、グラム陽性微生物分泌因子、ＳｅｃＧに関する。本発明はさらにグラム陽性微生物内でのタンパク質生産のための発現ベクター、方法及び系を提供する。
【０００６】
いくつかの実施態様において、本発明は分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）タンパク質をエンコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し、当該分泌因子Ｇはグラム陽性微生物内で当該分泌因子を過剰発現できる発現シグナルに制御され、当該核酸配列は配列番号１を含む。いくつかの好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。いくつかの特に好ましい実施態様において、当該バチルス属は、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。さらなる実施態様において、本発明は発現ベクターを含むグラム陽性微生物（すなわち、宿主細胞）を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。いくつかの特に好ましい実施態様において、宿主細胞はバチルス属の１種であり、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、宿主細胞はさらに少なくとも１の異種タンパク質を発現する。いくつかの好ましい実施態様において、異種タンパク質はホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される。いくつかの特に好ましい実施態様において、異種タンパク質は酵素である。さらなる実施態様において、酵素はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される。
【０００７】
また、本発明はグラム陽性微生物からタンパク質を分泌する方法を提供し、当該方法は、分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）タンパク質をエンコードする核酸配列を含むグラム陽性微生物宿主細胞を得る工程を含み、当該核酸配列が配列番号１に示す核酸配列を含み、当該核酸配列がグラム陽性微生物中でＳｅｃＧを発現できる発現信号に制御され、さらに当該グラム陽性微生物宿主細胞が分泌されるタンパク質をエンコードする核酸配列を含み；及びＳｅｃＧの発現及び当該タンパク質の発現及び分泌に適した条件下で微生物を培養する工程を含む。いくつかの実施態様において、グラム陽性微生物は少なくとも１の他の分泌因子をエンコードする核酸も含み、当該分泌因子は分泌因子Ｙ（ＳｅｃＹ）、分泌因子Ｅ（ＳｅｃＥ）、及び分泌因子Ａ（ＳｅｃＡ）からなる群より選択される。さらなる実施態様において、タンパク質は宿主細胞と同種のものである。いくつかの好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。いくつかの好ましい実施態様において、バチルス属はＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。別の好ましい実施態様において、バチルスは、ホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される少なくとも１の異種タンパク質を発現する。特に好ましい実施態様において、異種タンパク質は酵素である。さらなる実施態様において、酵素はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される。
【０００８】
本発明はさらに、配列番号２に示すアミノ酸配列を含んだ分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）タンパク質をエンコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し、ここで当該分泌因子Ｇはグラム陽性微生物内で当該分泌因子を過剰発現できる発現シグナルに制御され、当該核酸配列は配列番号１を含む。
【０００９】
また、本発明はグラム陽性微生物内でタンパク質を分泌する方法を提供し、当該方法は分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）タンパク質をエンコードする核酸配列を含むグラム陽性微生物宿主細胞を得る工程を含み、ここで当該核酸配列は配列番号１に示す核酸配列を含み、当該核酸配列はグラム陽性微生物内でＳｅｃＧを発現できる発現シグナルに制御され、さらに当該グラム陽性微生物宿主細胞はタンパク質をエンコードする核酸を含み；及びＳｅｃＧの発現及びタンパク質の発現及び分泌に適した条件下で微生物を培養する工程を含み、ここで当該タンパク質は配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明はさらに、変異シャイン・ダルガーノ配列をエンコードするグラム陽性微生物を提供し、分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）を含む転写の翻訳を調節する。いくつかの好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。いくつかの特に好ましい実施態様において、バチルス属はＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、調節とはＳｅｃＧの発現増加を含み、一方、他の実施態様において、調節とはＳｅｃＧの発現の減少を含む。さらに別の実施態様において、微生物は少なくとも１の異種タンパク質を発現できる。いくつかの実施態様において、異種タンパク質はホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される。いくつかの特に好ましい実施態様において、異種タンパク質は酵素である。いくつかの実施態様において、酵素はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される。
【００１１】
また、本発明は変異ＲＮＡポリメラーゼσ因子アルファ（σＡ）配列をエンコードするグラム陽性微生物を提供し、分泌因子Ｇ（ＳｅｃＧ）の発現を調節する。いくつかの好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。いくつかの特に好ましい実施態様において、バチルス属はＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、調節とはＳｅｃＧの発現増加を含み、一方、他の実施態様において、調節とはＳｅｃＧの発現の減少を含む。さらに別の実施態様において、グラム陽性微生物は少なくとも１の異種タンパク質を発現できる。いくつかの特に好ましい実施態様において、異種タンパク質はホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される。いくつかの特に好ましい実施態様において、異種タンパク質は酵素である。いくつかの他の好ましい実施態様において、酵素はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される。
【００１２】
本発明はさらにグラム陽性微生物内でタンパク質を分泌する方法を提供し、当該方法はＳｅｃＧをエンコードする核酸を含むグラム陽性微生物宿主細胞を得る工程を含み、ここで当該核酸はグラム陽性微生物内でＳｅｃＧを発現できる発現シグナルに制御され、さらに当該グラム陽性微生物宿主細胞はタンパク質をエンコードする核酸を含み；及びＳｅｃＧ発現及びタンパク質の発現及び分泌に適した条件下で微生物を培養する工程を含む。いくつかの実施態様において、微生物はさらに、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及びＳｅｃＡからなる群より選択される少なくとも１の他の分泌因子をエンコードする核酸を含む。いくつかの好ましい実施態様において、タンパク質は宿主細胞と同種のものであり、一方、他の好ましい実施態様において、タンパク質は宿主細胞と異種のものである。さらに好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。さらに好ましい実施態様において、バチルス属はＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。他の実施態様において、異種タンパク質はホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施態様において、異種タンパク質は酵素である。いくつかの特に好ましい実施態様において、酵素はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、ムターゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される。
【００１３】
発明の説明
本発明は通常、グラム陽性微生物でのタンパク質発現に関し、具体的には、グラム陽性微生物分泌因子、ＳｅｃＧに関する。本発明はさらにグラム陽性微生物内でのタンパク質生産のための発現ベクター、方法及び系を提供する。
【００１４】
グラム陽性微生物の分泌機構能力はタンパク質分泌の制限因子または障害となり得、及び特にタンパク質が組換え技術により導入され、宿主細胞により過剰発現した場合、分泌されるタンパク質生産の制限因子または障害となり得る。本発明は当該障害を軽減する手段を提供する。
【００１５】
本発明は、ひとつには、（大腸菌、ヘモフィルス及びマイコプラズマのＳｅｃＧに基づく）ＳｅｃＧのコンセンサス配列との相同性による、従来、非特徴的な翻訳ゲノムＤＮＡであるとされてきたＢ．ズブチリスＳｅｃＧ分泌因子（以下、ＹＶＡＬとも呼ぶ）の発見に基づき、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧが大腸菌ＳｅｃＧの機能的相同体であるという実証に基づく。本発明は、ひとつには、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧがその他のＢ．ズブチリス分泌因子と組み合わせて機能的プレタンパク質トランスロカーゼを形成するという測定にも基づく。
【００１６】
本発明はＢ．ズブチリスＳｅｃＧの単離核酸及び推定アミノ酸配列を提供する。Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧのアミノ酸配列（配列番号１）を図１に示す。Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧをエンコードする核酸配列（配列番号２）も図１に示す。
【００１７】
また、本発明はグラム陽性微生物からタンパク質を分泌するための改善された方法も提供する。従って、本発明はグラム陽性微生物内で所望のタンパク質を分泌するための改善された方法を提供し、当該方法は、ＳｅｃＧをエンコードする核酸を含むグラム陽性微生物宿主細胞を得る工程であって、当該核酸はグラム陽性微生物中でＳｅｃＧを発現できる発現シグナルに制御され、当該微生物がさらに所望のタンパク質をエンコードする核酸を含み；ＳｅｃＧの発現に適した条件下で当該微生物を培養する工程；及び最終的に、当該タンパク質を発現及び分泌する工程を含む。本発明の１の実施態様において、所望のタンパク質はグラム陽性微生物内で天然に生じるタンパク質、または相同体である。本発明の他の実施態様において、所望のタンパク質はグラム陽性微生物と異種のものである。
【００１８】
本発明の他の側面において、微生物は、酵素、成長因子またはホルモンなど所望のタンパク質を生産するように遺伝子組換えされる。いくつかの好ましい実施態様において、酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ及びリパーゼなどのカルボヒドラーゼ；ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼまたはムターゼなどのイソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、アシラーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ、レダクターゼ、及びオキシダーゼからなる群より選択される。さらなる実施態様において、ＳｅｃＧ分泌因子発現は分泌機構のその他の成分の発現と調整される。好ましくは、分泌機構のその他の成分（すなわち、トランスロカーゼ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及び／または当業者に公知のその他の分泌因子）はＳｅｃＧに対して最適比率で発現を調節される。例えば、いくつかの実施態様において、分泌機構を最適に高めるためにＳｅｃＧに加えて複数の分泌因子を過剰発現することが望ましい。１の具体的な実施態様において、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧはＢ．ズブチリスＳｅｃＹＥ及びＳｅｃＡと一緒に発現して機能的プレタンパク質トランスロカーゼを形成する。
【００１９】
本発明は相同なグラム陽性微生物ＳｅｃＧタンパク質を同定する方法も提供する。いくつかの実施態様において、本方法はＢ．ズブチリスＳｅｃＧ核酸（例えば、図１に示す；配列番号２）の一部または全部をその他の目的グラム陽性微生物由来核酸とハイブリダイズさせる工程を含む。１の実施態様において、核酸はゲノム起源であり、一方、他の実施態様において、核酸はｃＤＮＡである。本発明はさらに、本方法により同定される新規なグラム陽性微生物分泌因子を包含する。
【００２０】
また、本発明は染色体の、天然ＳｅｃＧプロモーター配列の突然変異を誘発するための方法及び組成物も提供する。いくつかの好ましい実施態様において、この突然変異誘発の結果、ＳｅｃＧ遺伝子転写の増加または減少が生じる。さらに別の実施態様において、シャイン・ダルガーノ配列（すなわち、リボソーム結合部位）及び／またはＲＮＡポリメラーゼσ因子アルファ（σＡ）を変異し、ＳｅｃＧ転写の転写／翻訳の増加または減少が生じる（例えば、Ｈｅｎｎｅｒ，ＤＮＡ  ３：１７−２１［１９８４］を参照）。従って、ＳｅｃＧ発現を調節する発現ベクターを利用する方法に加えて、本発明は染色体の、天然ＳｅｃＧプロモーターの調節に関する方法及び組成物を提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明を説明する前に、出願人は以下の定義を用いる。
【００２２】
定義
ここで用いる、バチルス属は当業界に公知の全ての種及び亜種を含み、限定されないが、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ及びＢ．チューリンゲンシスを含む。
【００２３】
本発明はグラム陽性微生物由来の新規なＳｅｃＧ分泌因子を包含する。好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス属の１種である。他の好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はＢ．ズブチリスである。ここで用いる、“Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧ分泌因子”の語は図１に示す、推定アミノ酸配列（配列番号１）をいう。本発明は図１に開示されるアミノ酸配列の変異体を包含し、その他の分泌因子と組み合わせて、または単独で分泌を調節することができる。
【００２４】
ここで用いる、“核酸”とはヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片または一部をいい、及びセンスまたはアンチセンスストランドを表す２本鎖または１本鎖であるゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。
【００２５】
ここで用いる、“アミノ酸”とは、ペプチドまたはタンパク質配列またはそれらの一部をいう。
【００２６】
ここで用いる、小文字“ｓｅｃＧ”は核酸配列を示すために用い、それに対して大文字“ＳｅｃＧ”はアミノ酸配列を示すために用いる。
【００２７】
ここで用いる“Ｂ．ズブチリスポリヌクレオチド相同体”または“ポリヌクレオチド相同体”は、図１のＳｅｃＧポリヌクレオチド（配列番号２）に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％の同一性を有する新規なポリヌクレオチドをいい、または好ましい実施態様において、少なくとも９５％の同一性を有し、または図１のポリヌクレオチド（配列番号２）に対して高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズでき、由来元のグラム陽性微生物の分泌調整できるアミノ酸配列をエンコードする配列をいう。
【００２８】
ここで用いる“目的遺伝子”の語は、細胞内での発現がトランスフェクト細胞上でさらに研究を行うために望ましいものである、発現ベクターのポリリンカー内に導入される遺伝子をいう。目的遺伝子はトランスフェクト細胞内での高レベルの発現が望ましい任意のタンパク質をエンコードできる。目的遺伝子はここに提供する例に限定されない；目的遺伝子は細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、イオンチャネル、細胞質タンパク質、核タンパク質（例えば、調節タンパク質）、ミトコンドリアタンパク質等を含む。
【００２９】
ここで用いる、“調節”とは遺伝子分泌または発現の増加または減少をいう。特に好ましい実施態様において、当該語はタンパク質の分泌パターンが変化する分泌因子の発現における変化をいう。
【００３０】
ここで用いる“単離”及び“精製”の語は、天然に結合している少なくとも１の成分から取り除かれた成分（例えば、核酸またはアミノ酸）をいう。
【００３１】
ここで用いる、“異種タンパク質”の語は、グラム陽性宿主細胞内に天然に生じないタンパク質またはポリペプチドをいう。異種タンパク質の例としては酵素を含み、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼなどのヒドロラーゼ、その他のカルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、ムターゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼなどがある。いくつかの実施態様において、異種遺伝子は治療上重要なタンパク質またはペプチドをエンコードし、例えば成長因子、サイトカイン、配位子、受容体及び阻害因子、並びにワクチン及び抗体である。いくつかの実施態様において、遺伝子は商業的に重要な工業タンパク質またはペプチドをエンコードし、例えば、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、例えばアミラーゼ及びグルコアミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ及びリパーゼである。いくつかの実施態様において、目的遺伝子は天然遺伝子であり、一方、他の実施態様において、変異遺伝子であり、さらに他の実施態様において、目的遺伝子は合成遺伝子である。
【００３２】
“相同タンパク質”の語はグラム陽性微生物内で天然または自然に生じるタンパク質またはポリペプチドをいう。本発明は組換えＤＮＡ技術により相同タンパク質を生産する宿主細胞を含む。本発明はプロテアーゼなどの天然相同タンパク質をエンコードする核酸の欠失または中断を有し、相同タンパク質または組換え体に再導入されたそれらの変異体をエンコードする核酸を有するグラム陽性宿主細胞を包含する。他の実施態様において、宿主細胞は相同タンパク質を生産する。
【００３３】
ここで用いる、“組換えタンパク質”及び“組換えポリペプチド”の語は組換えＤＮＡ分子から発現するタンパク質分子をいう。
【００３４】
“天然タンパク質”の語はベクター配列によりエンコードされたアミノ酸残基を含まないタンパク質を示すためにここで用いる（すなわち、天然タンパク質は天然に生じるタンパク質に見られるアミノ酸のみを含む）。天然タンパク質は組換え技術により生成でき、または天然源から単離できる。
【００３５】
ここで用いるタンパク質に言及する際の“一部”の語（“所定タンパク質の一部”など）はタンパク質の断片をいう。断片のサイズは４アミノ酸残基〜全体のアミノ酸配列からアミノ酸１つを除いた範囲となる。
【００３６】
ここで用いる、“融合タンパク質”の語は外来タンパク質断片に結合した目的タンパク質を含むキメラタンパク質をいう。融合パートナーは宿主細胞で発現されるタンパク質の溶解性を高めることができ、宿主細胞または培養上清液またはその両方から組換え融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティータグを提供できる。所望により、融合タンパク質は当業界に公知の種々の酵素的または化学的手段により目的タンパク質から除去できる。
【００３７】
ここで用いる、“調節”とは酵素の生物学的活性の変化または変更をいう。当該語はタンパク質活性の増加または減少、結合特性の変化、または酵素の生物学的、機能的または免疫学的特性のその他の変化を包含するものとする。
【００３８】
“野生型”の語は天然源から単離された場合、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子はある集団において最も頻繁に観察されるものであり、従って、任意に遺伝子の“標準”または“野生型”形態を設計する。一方、“修飾”または“変異”の語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、配列または機能的特性の変更を示す（すなわち、特性の変化）遺伝子または遺伝子産物をいう。自然発生の変異体も単離でき、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したときに変化した特性を有するという事実により同定されることにも留意されたい。
【００３９】
ここで用いる、“ベクター”の語は１の細胞から他の細胞にＤＮＡ断片を移動する核酸分子に関して用いられる。“媒体”は“ベクター”と交換可能に用いる場合もある。
【００４０】
ここで用いる“発現ベクター”の語は所望のコード配列及び特定の宿主生物内のコード配列に動作可能に連結した発現に必要な適した核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子をいう。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意でオペレーター配列、リボソーム結合部位及びその他の可能な配列が挙げられる。
【００４１】
“増幅”はテンプレート特異性に関する核酸複製の特別なものである。非特異的テンプレート複製はその対照をなすものである（すなわち、テンプレート依存だが特異テンプレートに依存しない複製）。テンプレート特異性は複製の厳守（すなわち、正確なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。テンプレート特異性は“標的”特異性に関して表現されることが多い。標的配列は他の核酸から選別するために探求されるという意味において“標的”である。増幅技術は主としてこの選別に関して設計されている。
【００４２】
大部分の増幅技術においてテンプレート特異性は酵素選択により達成される。増幅酵素は使用条件下で、核酸の異種混合物内で核酸の特異配列のみ処理する酵素である。例えば、ＱＢレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡはレプリカーゼの特異テンプレートである（Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：３０３８［１９７２］）。他の核酸はこの増幅酵素によっては複製しない。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素は自身のプロモーターに厳密な特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２８：２２７［１９７０］）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、当該酵素は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートの連結部分にミスマッチがある場合、２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０［１９８９］）。最終的に、Ｔａｇ及びＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する能力のため、結合配列に高い特異性を示し、従って、プライマーにより定義され；高温により、プライマーと標的配列のハイブリダイゼーションに有利だが、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じる（Ｅｒｌｉｃｈ（編集）、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＣＲ技術）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
【００４３】
ここで用いる、“増幅可能な核酸”の語は任意の増幅法により増幅できる核酸に関して用いられる。“増幅可能な核酸”は通常“サンプルテンプレート”を含むものとする。
【００４４】
ここで用いる、“サンプルテンプレート”の語は“標的”（下に定義）の存在を分析するサンプル起源の核酸をいう。それに対し、“バックグラウンドテンプレート”はサンプル内に存在する、または存在しないサンプルテンプレート以外の核酸に関して用いる。バックグラウンドテンプレートはほとんどの場合、意図せずに含まれたものであり、繰越しの結果生じたものであり、またはサンプルから精製すべき核酸汚染物の存在によるものである。例えば、検出すべき核酸以外の微生物由来の核酸は試験サンプル内でバックグラウンドとして存在し得る。
【００４５】
ここで用いる、“プライマー”の語は、精製制限消化などの天然、または合成的に生成されたオリゴヌクレオチドをいい、核酸ストランドに相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下に置いた場合、合成の開始点として作用できる（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在中、及び適当な温度、ｐＨで）。プライマーは好ましくは増幅の効率を最大にするために１本鎖であるが、あるいは２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは伸長生成物の調製に使用する前に、まずストランドの分離処理を行う。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘発剤の存在下で伸長生成物の合成を用意するために十分に長くなくてはならない。プライマーの実際の長さは、温度、プライマーの起源及び使用方法によって変わる。
【００４６】
ここで用いる“プローブ”の語は、精製制限消化などの天然、または合成的、組換え的またはＰＣＲ増幅により生成されたオリゴヌクレオチドをいい（すなわち、ヌクレオチド配列）、他の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる。プローブは１本鎖または２本鎖でもよい。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用するプローブは任意の“レポーター分子”で標識され、限定されないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び酵素ベース組織化学的分析）、蛍光、放射性、及び発光システムなどの任意の検出システムで検出可能である。本発明はいかなる特定の検出システムまたは標識にも限定されるものではない。
【００４７】
本発明のいくつかの実施態様において、図１のＳｅｃＧヌクレオチド配列由来の少なくとも約１０ヌクレオチド及び約６０ヌクレオチドまでの核酸配列、好ましくは約１２〜３０ヌクレオチド、及びより好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドはプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる。
【００４８】
ここで用いる、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いられる“標的”の語は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーが結合する核酸領域をいう。従って、“標的”はその他の核酸配列から選別すべきである。“断片”は標的配列内の核酸領域として定義される。
【００４９】
ここで用いる、“ポリメラーゼ連鎖反応”（“ＰＣＲ”）は、ここに引用する米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号の方法をいい、ゲノムＤＮＡの混合物中、クローニングまたは精製なしで標的配列の断片濃度を増加させる方法が記載されている。標的配列を増幅させるこの方法は過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下、厳格な連続熱サイクルからなる。２つのプライマーは２本鎖標的配列のそれぞれのストランドに相補的である。増幅達成のため、混合物を変性し、次にプライマーを標的分子内の相補配列にアニールする。アニーリングの後、プライマーを相補鎖の新しいペアを作るためにポリメラーゼを用いて伸長する。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長の工程は何回も繰り返すことができ（すなわち、変性、アニーリング及び伸長は１の“サイクル”を構成；多数の“サイクル”が繰り返され得る）、所望の標的配列の増幅断片を高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅断片長さはそれぞれについてのプライマーの相対位置により決定し、従って、この長さは制御可能なパラメーターである。工程の繰返しが特徴であるため、当該方法は“ポリメラーゼ連鎖反応”（以下、“ＰＣＲ”）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅断片は混合物中で主要配列（濃度に関しては）となるので、これを“ＰＣＲ増幅物”という。
【００５０】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ内の特異標的配列の１のコピーをいくつかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することが可能である（例えば、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション；ビオチニル化プライマーを組み込み、アビジン−酵素結合検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ−標識デオキシヌクレオチドトリホスフェートを増幅断片へ組み込む）。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が適当なプライマー分子セットを用いて増幅できる。特に、ＰＣＲ工程自身により作られる増幅断片はそれ自身が次のＰＣＲ増幅のテンプレートに有効である。
【００５１】
ここで用いる、“ＰＣＲ産物”“ＰＣＲ断片”及び“増幅生成物”の語は変性、アニーリング及び伸長のＰＣＲ工程サイクルを２回以上終えた後の最終的な化合物の混合物をいう。これらの語は１以上の標的配列の１以上の断片が増幅された場合を含む。
【００５２】
ここで用いる、“増幅試薬”の語はプライマー、核酸テンプレート及び増幅酵素以外の増幅に必要な試薬をいう（デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、緩衝液等）。一般的に、増幅試薬はその他の反応成分と一緒に反応容器（試験管、マイクロウェル等）内に混入される。
【００５３】
ここで用いる、“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”の語は細菌酵素をいい、いずれも特異ヌクレオチド配列で、またはその近くで２本鎖ＤＮＡを切断する。
【００５４】
ここで用いる、“ハイブリダイゼーション”の語は相補的核酸の対合に関して用いる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間のつながりの強度）は核酸間の相補度、伴う条件の厳密度（ストリンジェンシー）、形成ハイブリッドのＴｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比などの因子により影響される。
【００５５】
ここで用いる、“Ｔｍ”の語は“融点”に関して用いる。融点は２本鎖核酸分子の集団が１本鎖に半分に分離される温度である。核酸のＴｍの計算式は当業界で公知である。標準的な文献に示されるように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中にある場合、Ｔｍ値の簡単な概算は式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）により計算できる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（核酸ハイブリダイゼーション）［１９８５］の“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（定量フィルターハイブリダイゼーション）”を参照されたい）。その他の文献は、Ｔｍの計算に構造及び配列特性を考慮した、より複雑な計算を含む。
【００５６】
ここで用いる“ストリンジェンシー”の語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、及び有機溶媒などその他の化合物の存在のような条件に関して用いられる。“高ストリンジェンシー”条件では、核酸塩基対合は相補的塩基配列を高頻度で有する核酸断片間でのみ起こる。従って、“弱”または“低”ストリンジェンシー条件は相補的配列の頻度が通常は少ないので、遺伝的に多様な微生物由来の核酸を用いることが必要な場合に多い。
【００５７】
“最大ストリンジェンシー”は通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり；“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５℃〜１０℃低く；“中ストリンジェンシー”はＴｍより約１０℃〜２０℃低く；及び“低ストリンジェンシー”はＴｍより２０℃〜２５℃低い。当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いることができ、一方、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列相同体を同定または検出するために用いることができる。
【００５８】
ここで用いる、“相補的”または“相補性”の語は塩基対合ルール関係にあるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）に関して用いられる。例えば、配列“Ａ−Ｇ−Ｔ”は配列“Ｔ−Ｃ−Ａ”に相補的である。相補性は核酸塩基のいくつかのみが塩基対合ルールに従って適合するような、“部分的”であってもよい。または核酸間の相補性が“完全”または“全体”であってもよい。核酸ストランド間の相補性の度合いは核酸ストランド間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きく影響する。これは増幅反応、及び核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
【００５９】
“相同性”の語は相補性の度合いをいう。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一）がある。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、“実質的に相同”の用語を用いて言及される。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーション阻害は低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション分析（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて考察できる。実質的に相同な配列またはプローブは低ストリンジェンシー条件下での完全な相同体の標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合し、阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異結合を可能にするというわけではない。なぜなら低ストリンジェンシー条件は２つの配列のお互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることが必要だからである。非特異結合が不存在であるかは部分的な相補性さえも有さない第２の標的（例えば、約３０％より低い同一性）の使用により試験でき、すなわち非特異結合の不存在下では、プローブは第２の非相補性標的にハイブリダイズしない。
【００６０】
低ストリンジェンシー条件を含む多数の同様の条件が採用できることが当業者に公知であり、例えばプローブの長さ及び種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）及び標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中または固定化されている、等）及び塩及びその他の成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールが存在または不存在）の濃度などの因子が考えられ、上記条件と異なるが同等な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を生じるハイブリダイゼーション溶液は様々である。さらに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件は当業界に公知である（例えば、ハイブリダイゼーション温度を上げる、及び／または洗浄工程、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの使用、等）。
【００６１】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの２本鎖核酸配列に関して用いる場合、“実質的に相同”の語は、上述の通り、低ストリンジェンシー条件下で２本鎖核酸配列のいずれかまたは両方のストランドにハイブリダイズできる任意のプローブをいう。
【００６２】
ここで用いる“動作可能な組み合わせ”“動作可能な順序”及び“動作可能に連結”の語は、核酸分子が所定の遺伝子の転写を導くことができる及び／または所望のタンパク質分子の合成が生じるような核酸配列の連結をいう。また、当該語は機能性タンパク質が生じるようなアミノ酸配列の連結をいう。
【００６３】
ここで用いる“欠失”は、それぞれ１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠如しているヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化として定義される。本発明で有用な変異グラム陽性ｓｅｃＧポリヌクレオチド配列は種々のヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を含み、それぞれ、同じまたは機能的に同等なｓｅｃＧ相同体をエンコードするポリヌクレオチドを生じる。
【００６４】
ここで用いる“挿入”または“付加”は、天然グラム陽性ｓｅｃＧと比較してそれぞれ１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が追加されたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化をいう。
【００６５】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は新規なグラム陽性微生物分泌因子を提供し、及びタンパク質分泌及び分泌形態のタンパク質生産に対する障害を改善するためにグラム陽性微生物内で用いることができる方法を提供する。特に、タンパク質が組換え技術により導入され、宿主細胞により過剰発現された場合にかかる障害を改善するために用いることができる方法を提供する。特に好ましい実施態様において、本発明はＢ．ズブチリス由来分泌因子ＳｅｃＧを提供する。
【００６６】
Ｉ．  ＳｅｃＧ核酸及びアミノ酸配列
Ａ．  ＳｅｃＧ核酸配列
図１に示す配列（配列番号２）を有するＳｅｃＧポリヌクレオチドはＢ．ズブチリス分泌因子ＳｅｃＧをエンコードする。大腸菌ＳｅｃＧ配列のみを用いたＢ．ズブチリス翻訳ゲノム配列のＦＡＳＴＡサーチはＢ．ズブチリスＳｅｃＧを同定しなかった。Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧを、図２に示す大腸菌（配列番号３）、ヘモフィルス（配列番号４）及びマイコプラズマ（配列番号５）種由来の３０アミノ酸ＳｅｃＧのコンセンサス配列を用いてバチルス・ズブチリス翻訳ゲノム配列のＦＡＳＴＡサーチにより同定した。使用したコンセンサス配列は“ＬＶＧＬＩＬＬＱＱＧ  ＫＧＡＸＸＧＡＳＦＧ  ＧＧＡＳＸＴＬＦＧＳ”（配列番号６）であり、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向、ＦＡＳＴＡサーチ（リリース１．０、１９９７年６月１１日発売）パラメーターはスコアリングマトリックス；ＧｅｎＲｕｎＤａｔａ：ｂｌｏｓｕｍ５０．ｃｍｐ；変動パラメーターを用い：ギャップクリエーションペナルティ：１２；及びギャップ伸張ペナルティ：２。
【００６７】
上述の通り、本発明は、所望の異種または同種タンパク質またはポリペプチドの分泌を増加させるために、単独または、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及びＳｅｃＡなどのその他の分泌因子と一緒にグラム陽性宿主細胞中で用いることができるグラム陽性ｓｅｃＧポリヌクレオチドを提供する。
【００６８】
本発明は、１または複数のポリヌクレオチドによりエンコードされる新規なグラム陽性微生物ＳｅｃＧをエンコードするｓｅｃＧポリヌクレオチド相同体を包含し、グラム陽性微生物内の分泌を調節することで機能できるタンパク質をエンコードする相同体である限り、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧと少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。当業者に理解されるように、遺伝コードの縮退により、種々のポリヌクレオチド（すなわち、ＳｅｃＧポリヌクレオチド変異体）がＢ．ズブチリス分泌因子ＳｅｃＧをエンコードできる。本発明はそのようなポリヌクレオチドを全て含む。
【００６９】
Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧのグラム陽性ポリヌクレオチド相同体は当業者に公知の標準手順により得られ、例えば、クローンＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ“ライブラリー”）、ゲノムＤＮＡライブラリーから、同定した後化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、またはゲノムＤＮＡまたはその断片のクローニングにより、当業界に公知の方法を用いて所望の細胞から精製することにより得られる（例えば、Ｓｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング、研究所マニュアル），第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９８９］；及びＧｌｏｖｅｒ（編集）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＤＮＡクローニング：実践アプローチ），ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＩ．［１９８５］を参照）。好ましいＤＮＡ源はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様において、ゲノムＤＮＡ由来の核酸配列はコード領域に加えて調節領域を含む。供給源が何であっても、単離ｓｅｃＧ遺伝子は当該遺伝子の増殖に適したベクター内に分子的にクローンされることが考えられる。
【００７０】
ゲノムＤＮＡ由来遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡ断片を生じ、そのいくつかは所望の遺伝子をエンコードする。ＤＮＡは種々の制限酵素を用いて特定部位で切断できる。もしくは、マンガンの存在下、ＤＮＡを断片化するためにＤＮＡアーゼを用いることができ、またはＤＮＡは例えば超音波処理などにより物理的にせん断できる。それから線状ＤＮＡ断片は標準技術により大きさに従って分離でき、限定されないが、アガロース及びポリアクリルアミドゲルエレクトロフォレーシス及びカラムクロマトグラフィーなどの技術がある。
【００７１】
ＤＮＡ断片が生じると、ＳｅｃＧを含む特定ＤＮＡ断片の同定は多数の方法で達成できる。例えば、本発明のＢ．ズブチリスＳｅｃＧ遺伝子または特異ＲＮＡ、またはそれらの断片、例えばプローブまたはプライマーが単離及び標識でき、それからグラム陽性ＳｅｃＧ遺伝子を検出するためのハイブリダイゼーション分析に用いることができる（Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０［１９７７］；及びＧｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２：３９６１［１９７５］を参照）。プローブに類似した実体配列を共有するそれらのＤＮＡ断片はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００７２】
従って、本発明はＢ．ズブチリスＳｅｃＧの核酸配列の一部または全部とゲノムまたはｃＤＮＡ起源のグラム陽性微生物核酸をハイブリダイズすることを含む、グラム陽性ＳｅｃＧポリヌクレオチド相同体を検出するための方法を提供する。
【００７３】
また、本発明の範囲には、中〜最大ストリンジェンシーな条件下でＢ．ズブチリスＳｅｃＧの核酸配列にハイブリダイズできるグラム陽性微生物ポリヌクレオチド配列が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、ここに引用されるＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ［１９８７］）に教示されるように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づき、明確なストリンジェンシーを与える。
【００７４】
また、本発明の範囲には、図１のｓｅｃＧヌクレオチド配列の一部または全部に中〜最大ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる新規なグラム陽性微生物ｓｅｃＧポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００７５】
Ｂ．アミノ酸配列
図１に示すＢ．ズブチリスｓｅｃＧポリヌクレオチドはＢ．ズブチリスＳｅｃＧをエンコードする。本発明は、図１に示すアミノ酸配列の新規なグラム陽性微生物アミノ酸変異体を包含し、アミノ酸配列変異体がグラム陽性微生物中で単独または他の分泌因子と組み合わせてタンパク質分泌を調節することで機能できる限りにおいて、図１に示す配列と少なくとも８０％同一性、少なくとも９０％同一性、または少なくとも９５％同一性を有する。
【００７６】
図１に示す分泌因子ＳｅｃＧは、ＳｅｃＧのコンセンサスアミノ酸配列に対するＦＡＳＴＡ（Ｌｉｐｍａｎｎ  Ｐｅａｓｏｎ手順）アミノ酸サーチに従う。当該アミノ酸配列を図２に示す。図５に示すＢ．ズブチリスＳｅｃＧの親水性プロファイルは２つの潜在的な膜全領域を示す。
【００７７】
ＩＩ．発現系
本発明は、グラム陽性微生物における所望の異種またはタンパク質の生産及び分泌が高められた発現系を提供する。
【００７８】
Ａ．コード配列
本発明において、ベクターはグラム陽性微生物ＳｅｃＧ分泌因子をエンコードする核酸のコピーを少なくとも１含み、好ましくは複数のコピーを含む。好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルスである。他の好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス・ズブチリスである。好ましい実施態様において、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧまたはその断片、または融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドまたはＳｅｃＧのアミノ酸変異体をエンコードするポリヌクレオチド相同体配列は、グラム陽性宿主細胞中でそれぞれ、ＳｅｃＧまたはそのアミノ酸変異体の発現を目的とする組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができる。好ましい実施態様において、宿主細胞はバチルス属に属する。他の好ましい実施態様において、宿主細胞はＢ．ズブチリスである。
【００７９】
当業者に理解されるように、いくつかの実施態様において、非天然コドンを有するポリヌクレオチド配列を生成することは有利である。特定のグラム陽性宿主細胞に好ましいコドン（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ．ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：４７７−５０８［１９８９］）は例えば、発現速度を増加するように、または天然配列から生じた転写より長い半減期など所望の性質を有する組換えＲＮＡ転写を生じるように選択できる。
【００８０】
また、エンコードされたタンパク質もアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を示し、サイレント変化を生じ、機能的に同等なグラム陽性ｓｅｃＧ変異体を生じる。変異体が分泌調節能力を維持する限り、意図的なアミノ酸置換を極性、変化、溶解性、疎水性、親水性及び／または残基の両親媒性の類似性に基づいて作ることができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり；正に帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンがあり；及び類似の親水性値を有する非荷電極性頭部を含んだアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンがある。
【００８１】
本発明のｓｅｃＧポリヌクレオチドは遺伝子産物のクローニング、処理及び／または発現を修正するために設計できる。例えば、当業界に公知（例えば、部位特異的突然変異誘発法）の技術を用いて変異を誘発し、新しい制限部位の挿入、糖化パターンの変更またはコドン選択（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）の変化などができる。
【００８２】
本発明の１の実施態様において、ｓｅｃＧポリヌクレオチドは異種配列に連結して融合タンパク質をエンコードする。また、融合タンパク質はＳｅｃＧヌクレオチド配列と異種タンパク質配列間に位置した切断部位を含むよう設計でき、ＳｅｃＧタンパク質を切断して、異種部位から取り除くようにできる。
【００８３】
Ｂ．ベクター配列
グラム陽性微生物中において本発明の分泌因子の発現に用いる発現ベクターは、グラム陽性ＳｅｃＧに関する少なくとも１のプロモーターを含み、当該プロモーターは宿主細胞内で機能する。本発明の１の実施態様において、当該プロモーターは選択した分泌因子の野生型プロモーターであり、本発明の他の実施態様において、当該プロモーターは分泌因子と異種であるが依然として宿主細胞内で機能するものである。
【００８４】
所望のタンパク質またはポリペプチドをエンコードする異種核酸に関する他のプロモーターは組換えＤＮＡ技術により導入できる。本発明の１の実施態様において、宿主細胞は異種タンパク質またはポリペプチドを過剰発現でき、１以上の分泌因子をエンコードする核酸が組換え技術により導入される。本発明の好ましい実施態様において、ＳｅｃＧをエンコードする核酸は微生物ゲノム内に安定して統合される。他の実施態様において、宿主細胞を本発明の分泌因子を過剰発現するように設計し、異種タンパク質またはポリペプチドをエンコードする核酸を組換えＤＮＡ技術により導入する。実施例ＩＩＩは宿主細胞内でＢ．ズブチリスＳｅｃＧを過剰発現できることを示す。本発明は当業者に公知のその他の分泌因子を過剰発現できるグラム陽性宿主細胞を包含し、限定されないが、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥまたは当業者に公知のまたは将来同定されるその他の分泌因子を含む。実施例ＩＩで開示される１の実施態様において、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧはＢ．ズブチリス分泌因子ＳｅｃＹ、Ｅ及びＡと共に機能的プレタンパク質トランスロカーゼの形成に関与することができる。
【００８５】
好ましい実施態様において、発現ベクターは好ましくは当該ベクターに特有の少なくとも１の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む複数のクローニング部位カセットを含み、核酸操作を容易にする。好ましい実施態様において、当該ベクターは１以上の選択マーカーも含む。ここで用いる、選択マーカーの語はグラム陽性宿主において発現できる遺伝子をいい、当該ベクターを含むこれらの宿主の選択を容易にできる。そのような選択マーカーの例としては、限定されないが、抗生物質を含み、例えば、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンが挙げられる。
【００８６】
Ｃ．形質転換
本発明の１の実施態様において、１以上の本発明のグラム陽性分泌因子をエンコードする核酸を宿主細胞内で複製できる発現ベクターによりグラム陽性宿主細胞内に導入する。バチルスの適当な複製プラスミドは公知である（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ［編集］、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルスの分子生物学的方法），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照；特に、第３章［プラスミドについて（ｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）］を参照されたい。Ｂ．ズブチリスの適当な複製プラスミドの例が９２頁に記載されている）。
【００８７】
他の実施態様において、グラム陽性微生物ＳｅｃＧをエンコードする核酸を微生物ゲノム内に安定に統合させる。好ましいグラム陽性宿主細胞はバチルス属を含む。他の好ましいグラム陽性宿主細胞はＢ．ズブチリスである。当業界に公知であるように、バチルスにおけるＤＮＡの直接クローニングについていくつかの方法が文献に記載されている。例えば、プラスミドマーカーレスキュー形質転換は、部分的に相同なレジデントプラスミドを運ぶコンピテント細胞によりドナープラスミドの摂取を伴う（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ  ｅｔ．ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ  ２：５５５−５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２３：１８５−１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（３）：１０７７−１０８７［１９８３］；及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（３）：１２０５−１２１１［１９８７］）。入来ドナープラスミドは、染色体形質転換を擬態する方法においてレジデント“ヘルパー”プラスミドの相同領域と組換えする。さらに、プロトプラスト形質転換による形質転換方法が当業界に公知である（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  １６８：１１１−１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ．ａｌ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ．ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ．ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３［１９８４］；Ｂａｋｈｅｉｔ  ｅｔ．ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：５７７［１９８５］；Ｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５［１９８５］；及びＨｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７［１９８５］を参照されたい）。
【００８８】
ＩＩＩ．形質転換体の同定
マーカー遺伝子発現の存在／不存在により目的遺伝子の存在も示唆されるが、本発明の好ましい実施態様において、その存在及び発現が確認される。例えば、ＳｅｃＧをエンコードする核酸をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、当該挿入を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不存在により同定できる。もしくは、マーカー遺伝子は１のプロモーターの制御下で分泌因子をエンコードする核酸と並行して位置することができる。誘導または選択に応えたマーカー遺伝子の発現は通常、分泌因子の発現も同様に示す。
【００８９】
もしくは、分泌因子のコード配列を含み、当該タンパク質を発現する宿主細胞は当業界に公知の種々の手順により同定できる。これらの手順は限定されないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイまたは免疫測定技術を含み、核酸またはタンパク質の検出及び／または定量のための膜ベース、溶液ベースまたはチップベース技術を含む。
【００９０】
ｓｅｃＧポリヌクレオチド配列の存在はＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたはプローブ、Ｂ．ズブチリスｓｅｃＧポリヌクレオチド由来の一部または断片を用いた増幅により検出できる。
【００９１】
ＩＶ．分泌アッセイ
ここで実施例ＩＶに開示される実施態様において、ＳｅｃＧをエンコードする核酸において阻害を有するＢ．ズブチリス細胞はいくつかの細胞外タンパク質の分泌において欠陥を有するようである。
【００９２】
グラム陽性宿主細胞における異種または同種タンパク質の分泌レベルを決定する手段及び分泌タンパク質を検出する手段は、検出すべきタンパク質に特異なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いることを含む。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などがある。これら及び他の免疫測定システムは当業界に公知である（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ．ａｌ．、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ  ＭＮ［１９９０］；及びＭａｄｄｏｘ  ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５８：１２１１［１９８３］を参照されたい）。
【００９３】
種々の標識及び接合技術が当業界に公知であり、種々の核酸及びアミノ酸分析に用いることができる。さらに、標識ハイブリダイゼーションまたは特定ポリヌクレオチド配列を検出するためのＰＣＲプローブを生成する手段はオリゴ標識、ニックトランスレーション、エンドラベリングまたは標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅などが挙げられる。もしくは、ヌクレオチド配列またはその一部はｍＲＮＡプローブ作成のためのベクター内にクローンできる。当該ベクターは当業界に公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などの適当なＲＮＡポリメラーゼ及び標識ヌクレオチドを加えることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。
【００９４】
ファルマシアバイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州）、プロメガ社（Ｐｔｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）及びＵＳバイオケミカル社（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ、クリーブランド、オハイオ州）などの多数の会社がこれらの方法のための市販キット及び手順を供給している。適当なリポーター分子または標識としては、これらの放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤またはクロモジェニック試薬及び基質、共同因子、阻害剤、磁性粒子等が挙げられる。当該標識の使用を教示する特許としては、ここに引用する米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、ここに引用する米国特許第４，８１６，５６７に示されるように、組換え免疫グロブリンが生成できる。
【００９５】
Ｖ．タンパク質精製
異種または同種タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列を用いて形質転換したグラム陽性宿主細胞は、発現及びエンコードされたタンパク質を細胞培養から回収するのに適した条件下で培養できる。本発明の分泌因子を含む組換えグラム陽性宿主細胞により生産されたタンパク質は培養基内で分泌される。その他の組換え構築体は異種または同種ポリヌクレオチド配列を、可溶性タンパク質の精製を促進する、ポリペプチドドメインをエンコードするヌクレオチド配列に結合させることができる（例えば、Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ．ａｌ．、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：４４１−５３［１９９３］を参照されたい）。
【００９６】
そのような精製促進ドメインは、限定されないが、金属キレートペプチド、例えば固定化金属上で精製可能なヒスチジン−トリプトファンモジュール（Ｐｏｒａｔｈ、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．，３：２６３−２８１［１９９２］）、固定化免疫グロブリン上で精製可能なタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，シアトル、ワシントン州）で利用されるドメインを含む。精製ドメインと異種タンパク質の間に因子ＸＡまたはエンテロキナーゼ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）など切断可能なリンカー配列を含むことによっても精製を促進することができる。
【００９７】
本発明を実施する手段及び方法は以下の実施例を参照することにより当業者により十分に理解されるであろう。これらの実施例は本発明または特許請求の範囲の範囲をいかなる方法においても限定する趣旨のものではない。全ての文献及び特許文献はここにその全体を引用するものとする。
【００９８】
実験
以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施態様をさらに示し、説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【００９９】
以下の実験の開示において、以下の略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ｃＤＮＡ（コピーまたは相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ｇ（重量）；ＯＤ（光学密度）；ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−ヒドロクロリド）；クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＤＮＡポリメラーゼＩ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片）；ｒｐｍ（１分当たりの回転数）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）；ｂｌａ（β−ラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子）；エンドジェン社（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、マサチューセッツ州）；Ａｍｅｒｓｈａｍ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ、シカゴ、イリノイ州）；ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ社（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ州）；バイオ−シンセシス社（Ｂｉｏ−Ｓｙｂｔｈｅｓｉｓ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、テキサス州）；ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州）；シグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）；ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓａｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）；ネオシステム社（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス）；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄｕｒｈａｍ、ニューハンプシャー州）；ＵＳバイオケミカル（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ州）；キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）。
【０１００】
実施例１
実験に使用する物質及び方法は実施例ＩＩ−ＶＩに記載する。
【０１０１】
Ａ．細菌株及び培養基
菌株をルリア栄養（ＬＢ）培養液またはルリア寒天培地中で成長させた。必要に応じ、培地は実施例で示すように関連抗生物質を用いて補った。ベクター構築は大腸菌ＤＨ５α内で行った（ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９（Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡＩ、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）。染色体欠失及び成長実験は当業界で公知のＢ．ズブチリスＤＢ１０４（ｎｐｒＥ１８、ａｐｒＥΔ３）内で行った（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０：１５−２１［１９８４］を参照されたい）。
【０１０２】
Ｂ．プラスミド構築
適当なリボソーム結合部位を含む大腸菌ｓｅｃＧ及びＢ．ズブチリスｙｖａＬ遺伝子をＰＣＲによりそれぞれＤＨ５α及びＤＢ１０４株由来の染色体ＤＮＡからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩカセットとして増幅し、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ＋内にクローンした。使用したプライマーを表１に記載する。両オープンリーディングフレーム配列を決定し、及び関連データベースと比較した。大腸菌内で発現するため、当該遺伝子をｐＥＴ３２４内でクローンし（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｅｓ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２２：６１９−６２９［１９９６］）、ｐＥＴ３０４（大腸菌ｓｅｃＧ）及びｐＥＴ８２０（Ｂ．ズブチリスｙｖａＬ）を産出した。
【０１０３】
ベクターｐＰＲ１１１（ｐＵＢ１１０誘導体（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ  ３０：３１２−３１５［１９９３］を参照）及びｐＢＥＹ１３（Ｄｒ．Ｒ．Ｂｒｅｉｔｌｉｎから提供）は大腸菌内複製用のＣｏｌＥ１複製起点及びグラム陽性微生物内複製用のＲｅｐＲを用いるシャトルベクターである。これらのプラスミドは大腸菌のアンピシリン耐性マーカー及びＢ．ズブチリスのフレオマイシン耐性マーカーをエンコードする。ベクターｐＢＥＹ１３はＢ．ズブチリスｓｅｃＹ及びｓｅｃＥ遺伝子を構成ブドウ球菌ｓａｋプロモーターから発現する。プラスミドｐＥＴ４７０及びｐＥＴ４７１をそれぞれ大腸菌ｓｅｃＧ及びＢ．ズブチリスｙｖａＬによりｓｅｃＹＥカセットを置換して形成した。ベクターｐＡＭＰ２１は、合成リボソーム結合部位及び開始コドンと重複するＮｃｏｌ部位を有するラクトコッカス由来ｐ３２プロモーター（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｓｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：２４５２−２４５７［１９８７］を参照）を含むｐＧＫ１３（Ｋｏｋ  ｅｔ．ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４８：７２６−７３１［１９８４］）ベースの広宿主範囲ベクターである。Ｂ．アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子をＰＣＲによりＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩカセットとしてプラスミドｐＫＴＨ１０（Ｐａｌｖａ、Ｇｅｎｅ  １：８１−８７［１９８２］を参照）から単離し、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＡＭＰ２１内に連結した。得られたベクターは、ｐＥＴ４６８と称し、構成ｐ３２プロモーターの制御下でａｍｙＱ遺伝子を保持する。ベクターｐＥＴ４７２及びｐＥＴ４７３をそれぞれ大腸菌及びＢ．ズブチリスｓｅｃＧ遺伝子を連結することにより生じ、ｐブルースクリプト誘導体由来のＢａｍＨＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片をＢａｍＨＩ−ＢｓｓＨＩＩ−ＭｌｕＩ消化ｐＥＴ４６８内に含む。得られたベクターは１のｐ３２プロモーターからタンデム化オペロンとしてＢ．アミロリケファシエンスα−アミラーゼ及びｓｅｃＧまたはｙｖａＬを発現する。
【０１０４】
ｙｖａＬを阻害するベクターを以下の通り生成した。ｙｖａＬのすぐ上流及び下流領域をそれぞれＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ及びＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩカセットとしてＤＢ１０４株由来の染色体ＤＮＡから増幅し、ｐブルースクリプトＳＫ＋内にクローンした。続いて、ＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩ消化クロラムフェニコール耐性マーカーをＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩ部位間に位置し、ｐＤＥＬＧ２を生じた。このベクターは、クロラムフェニコール耐性マーカーにより置換されたｙｖａＬを含むＤＢ１０４内に存在する、染色体領域を含む。
【０１０５】
バチルス・ズブチリスｓｅｃＹ、ｓｅｃＥ及び大腸菌ｓｅｃＧの合成オペロンを含むプラスミドｐＥＴ８１２、及びｓｅｃＹ及びＢ．ズブチリスのｓｅｃＥ及びｙｖａＬを含むプラスミドｐＥＴ８２２を当業界に公知の通り、表１に記載のプライマーを用いて大腸菌内で発現するために構築した（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｅｓ  ｅｔ．ａｌ．、［１９９６］、上記を参照）。
【０１０６】
Ｂ．ズブチリスのアルカリホスフェートｐｈｏＢ（ｐｈｏＡＩＩＩ）はＰＣＲ（表１のプライマーを参照）を用いてＤＢ１０４の染色体ＤＮＡから増幅し、Ｎ末端はプラスミドｐＥＴ３０２（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｅｓ  ｅｔ．ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７：２０１−２１０［１９９８］）を用いてｈｉｓタグに融合し、ｐＥＴ４６１を作成した。この研究で用いたプラスミドの概観を表２に示す。
【表１】
2006508686.tif 000002
【０１０７】
表中、使用した制限酵素の認識部位を下線で示す。リボソーム結合部位及び開始及び停止コドンは太字で示す。
【表２】
2006508686.tif 000003
【０１０８】
Ｃ．Ｂ．ズブチリスの染色体由来ＳｅｃＧ欠失
ベクターｐＤＥＬＧ２をＰｖｕＩＩを用いて消化し、クロラムフェニコール耐性マーカーにより置換された、ｙｖａＬに隣接する領域を含む２．８ｋｂ直鎖断片を生じた。Ｂ．ズブチリスＤＢ１０４を当業界に公知の天然コンピテンスを用いて当該断片と形質転換し（Ｙｏｕｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ２１３：７７３−７７５［１９６７］を参照）、及びクロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。染色体置換の正しい位置をＰＣＲにより確認した。得られた菌株中、ＤＢ１０４ΔＧ、ｙｖａＬが、原型を保って隣接領域を離れる間、クロラムフェニコール耐性遺伝子により置換された。
【０１０９】
Ｄ．成長実験
Ｂ．ズブチリスＤＢ１０４及びＤＢ１０４ΔＧを試験用に構築した６つのプラスミドをそれぞれ用いて形質転換した（すなわち、ｐＰＲ１１１、ｐＥＴ４７０、ｐＥＴ４７１、ｐＥＴ４６８、ｐＥＴ４７２、及びｐＥＴ４７３）。形質転換後、プレートを３０℃で一晩中培養した。適当な抗菌薬を用いて選択圧力をこの時点から加えた。この段階でクロラムフェニコールは用いなかった。各形質転換体から１のコロニーを採取し、液体培地中、３０℃で一晩中培養した。次に、５μｌの一晩たった培養物をプレート上で植菌し、野生型株コロニーが直径数ミリメートルに達するまで、１５℃〜３０℃の温度範囲で培養した。プレートは毎日点検し、コロニーの発生及びサイズを記録した。
【０１１０】
大腸菌内で発現するために、プラスミドｐＥＴ８２０及びｐＥＴ３０４を前述の通り大腸菌ＫＮ３７０（ΔｓｅｃＧ：：ｋａｎ）に形質転換し（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：３２７２−３２７７［１９９４］）、及び２０℃または３７℃で、１ＰＴＧ（１ｍＭ）を用いて誘導した、または誘導しない寒天プレート上の１のコロニーの構成を分析した。
【０１１１】
Ｅ．分泌タンパク質の分析
プラスミドｐＥＴ４６８を用いて形質転換したＢ．ズブチリスＤＢ１０４を液体培地中、３０℃で一晩中成長させた。培養物を氷上で冷却し、細胞断片と培養基に遠心分離により分画した。もしくは、一晩たった培養物を新しい培養基中で１：５０に希釈し、ＯＤ６００を０．６まで成長させ、１５℃で一晩中培養させた。培養上澄液を１０％ｗ／ｖ  ＴＣＡを用いて沈殿し、冷アセトンで２回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。培養物の細胞ペレットをサンプルバッファー中で再懸濁し、超音波分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。細胞断片をさらに分析するために、プロテイナーゼＫのアクセシビリティを分析した。形質転換ＤＢ１０４及びＤＢ１０４ΔＧを３０℃で一晩中成長させ、遠心分離により集菌した。細胞ペレットをＴＮ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃ１、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）バッファーを用いて１回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む同じバッファー内で再懸濁させた。氷上、１５分間の培養後、プロテイナーゼＫを０〜２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加え、懸濁液をさらに１５分間培養した。最終的に、懸濁液をＴＣＡで沈殿させ、アセトンで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１２】
Ｆ．ｐＥＴ８１２及びｐＥＴ８２２の発現及び内側と外側（ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）ベシクルの調製
大腸菌ＳＦ１００をＢ．ズブチリスＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及び大腸菌（ｐＥＴ８１２）のＳｅｃＧまたはＢ．ズブチリス（ｐＥＴ８２２）のＹｖａＬを過剰発現させるために用いた。当該タンパク質の発現及び内側と外側（ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）ベシクルの単離を当業者に公知の通り行った（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｅｓ  ｅｔ．ａｌ．、［１９９６］、上記を参照）。
【０１１３】
Ｇ．ベシクルの大腸菌ＳｅｃＡストリッピング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転座
大腸菌ＳｅｃＡを内側と外側（ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）ベシクルから取り除くために、１００μｌのベシクル（１０ｍｇ／ｍｌ）を大腸菌ＳｅｃＡに対する５０μｌのポリクローナル抗体を用いて培養した（Ｓｃｈｉｅｂｅｌ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２２：６１９−６２９［１９９１］を参照）。１２５Ｉ標識ｈｉｓ−ｐｒｃＰｈｏＢ（Ｖａｎ  Ｗｅｌｙ  ｅｔ．ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５５：６９０−６９７［１９９８］）の内膜ベシクル内のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転座を当業者に公知の通り分析し（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｅｓ  ｅｔ．ａｌ．、［１９９６］、上記）、例外として精製Ｂ．ズブチリスＳｅｃＡ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｏｌｋ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８：３１−４２［１９９３］）を大腸菌ＳｅｃＡ（０．５μｇ）の代わりに用いた。
【０１１４】
Ｈ．Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧポリクローナル抗体の生産
チロシン残基によりＫＬＨに結合した内部YｖａＬ配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号１９）に対するペプチドポリクローナル抗体をＮｅｏｓｙｓｔｅｍから公表されている標準手順に従ってウサギ内で生産した。
【０１１５】
実施例ＩＩ
Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧは大腸菌ＳｅｃＧの機能的相同体である
この実施例はＢ．ズブチリスＳｅｃＧが大腸菌ＳｅｃＧの機能的相同体であるかどうかを測定するための実験について説明する。ｐＥＴ８１２及びｐＥＴ８２２を発現する細胞由来の膜ベシクルからＳｅｃＡに対するポリクローナル抗体を用いて固有大腸菌ＳｅｃＡを取り出し、１２５Ｉ−標識ｈｉｓ−ｐｒｅＰｈｏＢを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転座分析に供した。図８に転座結果を示す。Ｂ．ズブチリスＳｅｃＡを加えない場合、ＳｅｃＹＥＧまたはＳｅｃＹＥ及びＹＶＡＬを含む両ベシクルは背景転座をほとんど示さなかった。しかしながら、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＡをＳｅｃＹＥ及びＹＶＡＬを含むベシクルに加えた場合、１２５Ｉ−ｐｒｅＰｈｏＢの転座効率の非常に大きい増加が観測され、一方、ＳｅｃＹＥ及び大腸菌ＳｅｃＧを含むベシクルでは余分な転座は観測されなかった。これらのデータから、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＹＥはＢ．ズブチリスＹｖａｌ及びＳｅｃＡと一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏでバチルスｐｒｅＰｈｏＢタンパク質の転座を仲介する機能的プレタンパク質トランスロカーゼを形成すると結論付けることができる。
【０１１６】
実施例ＩＩＩ
大腸菌内でのバチルスタンパク質の過剰発現
この実施例はＢ．ズブチリスＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及びＳｅｃＧ（ＹＶＡＬ）タンパク質が大腸菌内で過剰発現できることを示す。ｐＥＴ８１２及びｐＥＴ８２２が大腸菌ＳＦ１００内で発現するかどうかを確証するために、内側と外側（ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）ベシクルを１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。Ｂ．ズブチリスのＳｅｃＹ及びＳｅｃＥの両方はクマシー染色ゲル上で容易に視認できた（図７Ａを参照）。Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧ及び増加した大腸菌ＳｅｃＧ量がこれらのタンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロット上で検出でき、図７Ｂ−７Ｃに示す。
【０１１７】
実施例ＩＶ
タンパク質分泌
この実施例は野生型細胞とＢ．ズブチリスＳｅｃＧ内に欠失を有する細胞のタンパク質分泌におけるタンパク質分泌機構の関連を示す。様々な温度で成長させた細胞の培養上澄中、野生型と変異細胞間で違いは見られなかった（図６Ａを参照）。細胞断片はバンドパターンにいくつかの違いを示した。この違いは主に変異体でいくつかのバンドが欠如しているというものである。これらタンパク質の局在性はリゾチームによる細胞壁の崩壊及びその後の接近可能な（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質のプロテアーゼ消化により決定した（図６Ｂ）。いくつかのタンパク質バンドは低濃度プロテイナーゼＫにより既に消化され、一方、その他のほとんどのタンパク質の崩壊はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による細胞膜崩壊後にのみ起こる。これらのタンパク質が分泌されるようである。いくつかのこれら分泌タンパク質は変異株には存在しない。従って、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧが崩壊した変異体はいくつかの細胞外タンパク質の分泌に欠陥があると考えられる。
【０１１８】
実施例Ｖ
ＳｅｃＧ欠失の効果
この実施例はＳｅｃＧ欠失の細胞成長における効果を示す。大腸菌ｓｅｃＧ遺伝子の破壊は低温感受性表現型（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：３２７２−３２７７［１９９４］を参照）における、２５℃以下の非許容状態温度での結果に示されている。染色体のＢ．ズブチリスｓｅｃＧの欠失は細胞をリッチまたは最小培地上、３７℃で成長させた場合、いかなる表現型も生じない。２０℃以下の培養は軽い低温感受性を示し、ＤＢ１０４ΔＧ株はＤＢ１０４と比較して徐々に遅くなる成長を示した。しかしながら、変異株は完全に成長停止することはなかった。野生型と比較すると、温度をさらに下げた場合、成長はさらに大幅に遅れた。細胞を再度高温に移すと、より速い速度で成長を再開した。
【０１１９】
細胞を大腸菌ＳｅｃＧまたはＢ．ズブチリスＳｅｃＧを発現するプラスミド及び制御プラスミドを用いて形質転換した。変異体成長に影響しない温度でプレ培養した後、細胞をいくつかの低温度でプレートし、培養した。コロニー成長を数日間にわたって観測した。制御プラスミドで形質転換された野生型及び変異細胞は対応する非形質転換体のように振る舞い、成長遅延を示したが、低温で完全に停止することはなかった。ｓｅｃＧ遺伝子産物を発現するｐＥＴ４７１を含む変異体の形質転換はかかる遅延を軽減することができ、変異体の表現型は極性効果によってではなくｓｅｃＧ自体の欠失により生じることを示す。驚くべきことに、変異体を大腸菌ＳｅｃＧを発現するｐＥＴ４７０を用いて形質転換した場合、温度２０℃以下で成長が完全に停止した。同じプラスミドを野生型細胞内に運んだ場合、低温で成長に支障が見られたが、２５℃では見られなかった。従って、ｓｅｃＧ遺伝子の破壊によりＢ．ズブチリスは軽い低温感受性となるが、これはＢ．ズブチリスに必須の遺伝子ではない。これらの成長実験の結果を下記の表３に示す。
【表３】
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【０１２０】
実施例ＶＩ
発現効果
この実施例は分泌タンパク質の発現効果について説明する。ｓｅｃＧのＢ．ズブチリス細胞変異体及び野生型細胞をプラスミドｐＥＴ４６８及び誘導体を用いて形質転換した。これらのプラスミドはα−アミラーゼを発現し、それにより分泌ストレスを誘発する。ｐＥＴ４７２及びｐＥＴ４７３の誘導体はそれぞれ大腸菌ＳｅｃＧまたはＢ．ズブチリスＳｅｃＧと一緒にα−アミラーゼを発現する。α−アミラーゼの発現によっては、細胞をプレ培養するために用いる温度である３０℃で欠失変異体の成長は遅延しなかった。この温度で、野生型及び欠失変異体の形質転換体によりでんぷん含有プレート上のα−アミラーゼにより形成されるハロは同じ大きさであった。欠失変異体のｐＥＴ４６８形質転換体を低温に移した場合、明確かつ完全な低温感受性を示した。既に２０℃で細胞成長が完全に停止した。細胞を許容温度の３０℃に変換して戻した場合、２０℃で培養延長後、成長は再開しなかった。従って、欠失変異体は低温であっても分泌の基準レベルを維持できるが、広温度範囲にわたって分泌タンパク質の過剰発現を操作することはできない。
【０１２１】
実施例ＶＩＩ
ＳｅｃＧタンパク質の同定
この実施例はグラム陽性微生物内のＳｅｃＧの検出について説明する。グラム陽性微生物由来ＤＮＡは当業界に公知の通り調製する（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章または３章に開示の方法に従う）。当該核酸はＳｅｃＧ由来プローブまたはプライマーを用いてハイブリダイゼーション及び／またはＰＣＲ増幅にかける。好ましいプローブは保存アミノ酸配列を含む核酸部分を含む。
【０１２２】
核酸プローブは５０ｐｍｏｌの核酸及び２５０ｍＣｉの［ガンマ３２Ｐ］アデノシントリフォスフェート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ）を混合することにより標識する。標識プローブはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５超微粉樹脂カラム（ファルマシア）を用いて精製する。それぞれ１分当たり１０７カウントを含む部分をゲノムまたはｃＤＮＡ起源の核酸サンプルの一般的な膜ベースハイブリダイゼーション分析に用いる。
【０１２３】
制限エンドヌクレアーゼ消化に供したＤＮＡサンプルは０．７パーセント・アガロースゲル上で断片化し、ナイロン膜に移す（Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間行う。非特異シグナルを取り除くため、ブロットは０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム以下で次第にストリンジェントな条件となるように室温で連続洗浄する。ブロットを数時間フィルムに曝露し、成長フィルム及びハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較し、Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧのポリヌクレオチド相同体を検出する。相同体を確証的核酸シーケンシングに供する。核酸シーケンシング方法は当業界に公知である。従来の酵素的方法はＤＮＡポリメラーゼ・クレノウ断片、ＳＥＱＹＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳバイオケミカル）またはＴａｇポリメラーゼを用い、ＤＮＡ鎖を目的のＤＮＡテンプレートにアニールされたオリゴヌクレオチドプライマーから伸長する。
【０１２４】
実施例ＶＩＩＩ
変異ＳｅｃＧプロモーターを含むＢ．ズブチリス宿主細胞の構築
上述及びここに詳細に記載するように、ｓｅｃＧプロモーターの変性後に生じるＳｅｃＧタンパク質レベルは、染色体プロモーターまたはリボソーム結合部位をＲＮＡポリメラーゼσ因子Ａ（σＡ）コンセンサス配列にさらに適合するようにまたは適合しないように変化させることにより調節して、転写に影響を与えることができ、またはコンセンサスシャイン・ダルガーノ配列にさらに適合するようにまたは適合しないように変化させることにより調節して翻訳に影響を与えることができる。
【０１２５】
以下の配列（配列番号２０）はＳｅｃＧプロモーターの核酸配列を提供し、当該配列の２００ｂｐ上流及び２００ｂｐ下流を含み、ヌクレオチド変化を標的とした配列要素。ＲＮＡポリメラーゼσ因子Ａ（σＡ）プロモーター及び下線のコンセンサスシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位を含む。
【化１】
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【０１２６】
シャイン・ダルガーノ部位の変異
ここに示すように、シャイン・ダルガーノ部位を変異させるため、当該配列は天然配列ＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号２１）をＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ（配列番号２２）に変化させてコンセンサスに正確に適合するように変異させる。以下の説明はシャイン・ダルガーノ部位の変異に適した方法を提供する。
【０１２７】
ここでＢＣ４として表す、ＰＣＲ融合配列の構築
ＢＣ４  ＰＣＲ融合は３工程で構築する：１）２つの分離断片をＢ．ズブチリス１６８染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅；２）プライマーを用いずに、ＰＣＲ型プロセスにおいて２つの精製ＰＣＲ断片を集積；及び３）ＢＣＢＳ−１及びＢＣＢＳ−８末端プライマーを用いて、ＰＣＲにより集積生成物を増幅させる。
【０１２８】
まず、染色体Ｂ．ズブチリス株１６８ＤＮＡをｓｅｃＧ遺伝子座の増幅用テンプレートとして用い、２組のプライマーを用いる。第１のプライマー対は、バチルス染色体上のｓｅｃＧの３Ｋｂ３’（下流）に位置するＢＣＢＳ−１及びＢＣＢＳ−２ｆ（５’−ＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＣＡＣＧＣＡＧＴＴＴＴＧ−３’；配列番号２３）からなる。第２のプライマー対は、ＢＣＢＳ−２ｒ（５’−ＣＡＡＡＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴＡＴ−３’；配列番号２４）、ＢＣＢＳ−２ｒの逆相補体、及びバチルス染色体上のｓｅｃＧの３Ｋｂ５’（上流）に位置するＢＣＢＳ−３からなる。両ＰＣＲ産物はｓｅｃＧのプロモーター領域中で重複している。ＢＣＢＳ−２ｆ及びＢＣＢＳ−２ｒ相補プライマーはシャイン・ダルガーノ配列中に４変異を導入するために用い、ＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＴ（配列番号２１）をＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ（配列番号２２）配列で置換した。ｒＴｔｈポリメラーゼを含んだＧｅｎｅＡｍｐ  ＸＬ  ＰＣＲキットを用いる標準ＰＣＲ反応を全てのＰＣＲの製造元取扱説明書に従って用いる。ＰＣＲ反応は１００μｌ体積中で行う。
【０１２９】
ＤＮＡ  ―  ２−５μｌ
３．３×ＸＬバッファーＩＩ  ―  ３０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰブレンド  ―  ３μｌ
２５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２  ―  ４μｌ
２５ｕＭ  ＢＣＢＳ−１プライマー（ＢＣＢＳ−３）  ―  ２μｌ
２５ｕＭ  ＢＣＢＳ−２ｆプライマー（またはＢＣＢＳ−２ｒ）  ―  ２μｌ
２Ｕ／ｕｌ  ｒＴｔｈポリメラーゼ  ―  ２μｌ
水  ―  １００μｌに調整
ＰＣＲ条件は：９５℃―３０秒、５４℃―３０秒、６８℃―３分を３０サイクルである。得られたＰＣＲ断片は、各３ｋｂであり、取扱説明書に従ってＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製キットで精製し、ＰＣＲ集積物に用いる。
【０１３０】
工程２において、精製ＰＣＲ断片の５μｌアリコートを一緒に混合し、プライマーを含まない新しいＰＣＲ混合物内に加える。ＰＣＲ混合物の全体積は上述の成分を含んで１００μｌである。ＰＣＲ集積条件は：９５℃―３０秒、５２℃―３０秒、６８℃―２分、１０サイクルである。
【０１３１】
工程３において、ＰＣＲ１０サイクル後、集積混合物をＢＣＢＳ−１及びＢＣＢＳ−３プライマーで補完し、ＰＣＲ増幅をさらに１５サイクル行う。この場合のＰＣＲ条件は：９５℃―３０秒、５２℃―３０秒、６８℃―５分である。
【０１３２】
そして、所望の６ｋｂ融合産物を単離し、ｐＪＭ１０３などの標準融合ベクター内にクローンする（Ｐｅｒｅｇｏ、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ．ａｌ．（編集）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（バチルス・ズブチリス及びその他のグラム陽性細菌）、第ＶＩ章、４２、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，［１９９３］を参照）。Ｂ．ズブチリスのＳｅｃＧ野生型株をそれから得られた組換えプラスミドを用いて形質転換し、選択し、ｐＪＭ１０３の場合、クロラムフェニコールへの耐性のため、ベクター配列により分離した、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む、６ＫＢ領域の２コピー、野生型シャイン・ダルガーノを含むｓｅｃＧを含む第１のコピー、変異配列を含む第２のコピーを運ぶ株を生じる。複数世代でクロラムフェニコール選択をしない液体培養物に形質転換体を通過させた後、複製領域及びベクター配列が欠失したクロラムフェニコール感受性株を回収し、その約半分が所望の変異体である。野生型及び変異株は当該領域のＰＣＲ増幅及び適当なプライマーを用いるｓｅｃＧ領域のＤＮＡシーケンシングにより区別できる。
【０１３３】
ＲＮＡポリメラーゼσＡプロモーター部位の変異
ここに示すように、σＡプロモーター部位を変異するために、天然配列ＧＴＧＡＣＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＴ（配列番号２５）をＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＡＡＴ（配列番号２６）に変化させて、コンセンサスに正確に適合するように当該配列を変異させる。ここで配列番号２６の最初の６ヌクレオチド（ＴＴＧＡＣＡ）はコンセンサス−３５プロモーター配列であり、配列番号２６の最後の６ヌクレオチド（ＴＡＴＡＡＴ）はコンセンサス−１０プロモーター配列である。
【０１３４】
シャイン・ダルガーノ配列の変異に関する上述の方法はσＡプロモーター部位の変異に有用である。しかしながら、プライマーＢＣＢＳ−２ｆ及びＢＣＢＳ−２ｒは以下のプライマーにより置換される：
【化２】
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【０１３５】
前述の説明及び実施例について、本発明の精神及び範囲を逸脱しない種々のその他の実施例及び修正が当該開示を読んだ当業者に明からであり、そのような全ての実施例または修正は本発明の特許請求の範囲に含まれるものとする。ここに記載の全ての文献及び特許文献はその全体を引用するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＳｅｃＧの核酸配列（配列番号１）、及びＳｅｃＧのアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図２】大腸菌（ｅｃｏｓｅｃｇ．ｐ１）（配列番号３）、ヘモフィルス（ｈａｅｉｎｓｅｃｇ．ｐ１）（配列番号４）、マイコプラズマ（ｍｙｃｌｅｐｓｅｃｇ．ｐ１）（配列番号５）、Ｂ．ズブチリス（ｂｓｕｙｖａｌ．ｐ１）（配列番号２）由来のＳｅｃＧ配列のアミノ酸配列、及びこれら４つの微生物のＳｅｃＧコンセンサス配列（配列番号６）である。
【図３】Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧ（配列番号２）と大腸菌ＳｅｃＧ（配列番号３）間のアミノ酸同一性（コンセンサス配列：配列番号７）である。
【図４】Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧ（配列番号２）とマイコプラズマＳｅｃＧ（配列番号５）間のアミノ酸同一性である。
【図５】Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧの親水性プロファイルである。
【図６Ａ】Ｂ．ズブチリスＤＢ１０４及びＤＢ１０４：ΔｙｖａＬの細胞断片のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。小文字“ｃ”は細胞の断片であり、小文字“ｍ”は媒体である。ポリペプチドバンドの位置により野生型細胞中には存在するが、欠失変異体中には存在しないことが示されている。
【図６Ｂ】細胞内タンパク質のプロテイナーゼＫ指定により得たデータである。図のように、３０ｋＤａでのポリペプチドバンドの指定はＤＢ１０４：ΔｙｖａＬ細胞には存在しない。最後のレーンはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）−１００を用いた対照であり、過剰量のプロテイナーゼＫの存在を示している。
【図７Ａ】Ｂ．ズブチリスＳｅｃＹＥ及び大腸菌ＳｅｃＧまたはＢ．ズブチリスＳｅｃＧ（ＹｖａＬ）を発現する大腸菌内膜ベシクルのクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを野生型ベシクルと比較した結果である。Ｂ．ズブチリスＳｅｃＹ及びＳｅｃＥの位置を示す。
【図７Ｂ】大腸菌ＳｅｃＧの合成ポリペプチドに対するｐＡｂによって生じる免疫ブロットである。
【図７Ｃ】Ｂ．ズブチリスＳｅｃＧの合成ポリペプチドに対するｐＡｂによって生じる免疫ブロットである。
【図８】大腸菌の内側と外側（ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）ベシクルへの１２５Ｉ−標識プレＰｈｏＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位である。ベシクルからＳｅｃＡを除去し、精製Ｂ．ズブチリスＳｅｃＡを指示通りに加えた。
【図１】
2006508686.tif 000007
【図２】
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【図３】
2006508686.tif 000009
【図４】
2006508686.tif 000010
【図５】
2006508686.tif 000011
【図６Ａ】
2006508686.tif 000012
【図６Ｂ】
2006508686.tif 000013
【図７Ａ】
2006508686.tif 000014
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2006508686.tif 000016
【図８】
2006508686.tif 000017
【国際調査報告】
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