(57)【要約】ＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法を開示する。そのような方法は、ＩＲＭ化合物が少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路に影響を与えるように、ＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ８アンタゴニストをＩＲＭ応答性細胞に投与することを含む。ある場合には、本方法は、ＴＬＲ８介在細胞伝達経路を調節することによって治療可能な状態に対する予防または治療処置を提供しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲ８発現細胞内でＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法であって、以下のステップ：
ＴＬＲ８アゴニストとして同定された化合物を選択すること；および
少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路に影響を与える量の前記化合物を前記細胞に投与すること；
を含み、
ここで、前記ＴＬＲ８アゴニストが、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである、前記方法。
【請求項２】
前記細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、多形核細胞またはこれらから誘導される細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞応答が、ＮＦ−κＢの活性化、少なくとも１つのサイトカインの産生、少なくとも１つの共刺激マーカーの産生またはこれらのあらゆる組み合わせのいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＬＲ８介在細胞応答を調節することによって治療可能な状態を有する生体を治療する方法であって、以下のステップ：
ＴＬＲ８アゴニストとして同定された化合物を選択すること；および
ＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路を調節するのに有効な量の前記化合物を前記生体に投与すること；
を含み、
ここで、前記ＴＬＲ８アゴニストが、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである、前記方法。
【請求項５】
前記生体が哺乳動物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記状態が新生物形成疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記状態がＴH２介在疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記状態が、喘息、アレルギー性鼻炎またはアトピー性皮膚炎である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記状態が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、寄生虫病、原虫病またはプリオン介在疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＲＭ化合物が、ＮＦ−κＢ活性、少なくとも１つのサイトカインの産生、少なくとも１つの共刺激マーカーの産生、細胞間接着分子の産生、成熟マーカーの産生またはこれらのあらゆる組み合わせのいずれかを調節する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＬＲ８アゴニストを同定する方法であって、以下のステップ：
ａ）ＴＬＲ８陽性細胞培養を試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること；
ｂ）ＴＬＲ８陰性細胞培養を試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること；および
ｃ）前記ＴＬＲ８陽性細胞培養の細胞応答が前記ＴＬＲ８陰性細胞培養の細胞応答より大きいとき、上記試験化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記ＴＬＲ８陰性細胞培養が、ＴＬＲ８のドミナントネガティブ変異体を発現する細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＬＲ８陰性細胞培養が、ＴＬＲ８に対して産生された抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ８陽性細胞培養が、ＴＬＲ８を過剰発現する細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＬＲ８陽性細胞培養の細胞応答が前記ＴＬＲ８陰性細胞培養の細胞応答より少なくとも２０％大きいとき、上記試験化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＬＲ８陽性細胞培養の細胞応答が前記ＴＬＲ８陰性細胞培養の細胞応答より少なくとも５０％大きいとき、上記試験化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＬＲ８陽性細胞培養の細胞応答が前記ＴＬＲ８陰性細胞培養の細胞応答より少なくとも８０％大きいとき、上記試験化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＬＲ８介在細胞応答が、ＮＦ−κＢの活性化、少なくとも１つのサイトカインの産生、少なくとも１つの共刺激マーカーの産生またはこれらのあらゆる組み合わせのいずれかを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法によりＴＬＲ８アゴニストとして同定された化合物。
【請求項２１】
薬学的に受容可能な担体と組み合わされたＴＬＲ８アゴニストを含む医薬組成物。
【請求項２２】
ＴＬＲ８アンタゴニストを同定する方法であって、以下のステップ：
ａ）第１のＩＲＭ応答性細胞培養をＴＬＲ８アゴニストに曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること；
ｂ）第２のＩＲＭ応答性細胞培養をＴＬＲ８アゴニストおよび試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること；および
ｃ）前記第１の細胞培養の細胞応答が前記第２の細胞培養の細胞応答より大きいとき、上記試験化合物をＴＬＲ８アンタゴニストとして同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記ＴＬＲ８アゴニストが、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法によりＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物。
【請求項２５】
薬学的に受容可能な担体と組み合わされたＴＬＲ８アンタゴニストを含む医薬組成物。
【請求項２６】
ＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路を活性化させる化合物を同定するためのＴＬＲ８のドミナントネガティブ変異体の使用。
【請求項２７】
ＴＬＲ８の活性化を検知する分析評価法におけるＩＲＭ化合物の陽性コントロールとしての使用であって、前記ＩＲＭ化合物が、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーを含む、前記使用。
【請求項２８】
ＴＬＲ８発現細胞内でＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法であって、以下のステップ：
ＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物を選択すること；および
少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路に影響を与える量の前記化合物を前記細胞に投与すること；
を含み、
ここで、前記ＴＬＲ８アンタゴニストが、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである、前記方法。
【請求項２９】
ＴＬＲ８介在細胞応答を調節することによって治療可能な状態を有する生体を治療する方法であって、以下のステップ：
ＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物を選択すること；および
ＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路を調節するのに有効な量の前記化合物を前記生体に投与すること；
を含み、
ここで、前記ＴＬＲ８アンタゴニストが、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫系のある重要な面を刺激することによって、また、ある別の面を抑制することによって機能する新規な医薬品化合物を発見するために、近年、多大の努力が払われ、そして、かなりの成功を収めている（例えば、米国特許第６，０３９，９６９号明細書および同第６，２００，５９２号明細書を参照）。ここで免疫応答調節剤（ＩＲＭ）と称するこれらの化合物は、トル様受容体（ＴＬＲ）として知られる基本的な免疫系メカニズムを介して作用し、選択されたサイトカインの生合成を誘導するようである。それらは、様々な病気や健康状態の治療に有用である。例えば、ある種のＩＲＭｓは、ウイルス性疾患（例えば、ヒトパピローマウイルス、肺炎、疱疹）、新形成（例えば、基底細胞癌、有棘細胞癌、光線性角化症、メラノーマ）およびＴH２−介在疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症）の治療に有用であり、また、ワクチンアジュバントとしても有用である。
【０００２】
ＩＲＭ化合物の多くは、小さな有機分子であるイミダゾキノリンアミンの誘導体である（例えば、米国特許第４，６８９，３３８号明細書を参照）が、多くの他の化合物のクラスもまた知られており（例えば、米国特許第５，４４６，１５３号明細書、同第６，１９４，４２５号明細書および同第６，１１０，９２９号明細書を参照）、現在もなお発見されつつある。他のＩＲＭは、オリゴヌクレオチドのように比較的大きな分子量を有し、これにはＣｐＧが含まれる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号明細書を参照）。
【０００３】
既に重要な仕事がなされてきているのではあるが、治療へのＩＲＭの極めて大きな可能性に鑑みて、それらの使用と治療上の利益を拡大しようとする相当のニーズが存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
多くのＩＲＭ化合物は、ＴＬＲ８介在経路など、トル様受容体（ＴＬＲ）経路を介して作用することが明らかになってきた。
【０００５】
本発明は、ＴＬＲ８を発現する細胞内でＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ８アンタゴニストとして同定されている化合物を選択すること、および、その化合物を少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞内シグナル伝達経路に影響を与える量、細胞に投与することを含む。
【０００６】
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ８介在細胞応答を調節することによって治療可能な状態にある生体を治療する方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ８アンタゴニストとして同定されている化合物を選択すること、および、その化合物をＴＬＲ８介在細胞内シグナル伝達経路を調節するのに有効な量、生体に投与することを含む。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、ＴＬＲ８アゴニストを同定する方法を提供する。この方法は、ａ）ＴＬＲ８陽性細胞培養を試験化合物に曝露して、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、ｂ）ＴＬＲ８陰性細胞培養を試験化合物に曝露して、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、および、ｃ）ＴＬＲ８陽性細胞培養の細胞応答が、ＴＬＲ８陰性細胞培養の細胞応答より大きいとき、その試験化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定することを含む。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、上記方法によりＩＲＭ化合物として同定された化合物、および、上記方法によりＴＬＲ８アゴニストとして同定された化合物を、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、ＴＬＲ８アンタゴニストを同定する方法を提供する。この方法は、ａ）第１のＩＲＭ応答性細胞培養をＴＬＲ８アゴニストに曝露して、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、ｂ）第２のＩＲＭ応答性細胞培養をＴＬＲ８アゴニストと試験化合物に曝露して、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、および、ｃ）第１の細胞培養の細胞応答が、第２の細胞培養の細胞応答より大きいとき、その試験化合物をＴＬＲ８アンタゴニストとして同定することを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、上記方法により同定されたＴＬＲ８アンタゴニスト化合物、および、上記方法によりＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物を、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明の他の種々の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および添付の図面を参照すれば、容易に明らかになるであろう。本明細書中には、実施例のリストを通して手引きが示されている箇所がある。いずれの場合にも、列記されたリストは、代表的なグループとして供されているものであって、排他的なリストと解釈されるべきものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ＴＬＲ８のアゴニストとして働く化合物を検出する方法を提供する。本発明は、また、ＴＬＲ８のアンタゴニストとして働く化合物を同定する方法を提供する。
【００１３】
ＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物は、ＴＬＲ８介在細胞応答を引き出すために使用できる。したがって、本発明は、ＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法を提供する。そのような細胞応答には、例えば、サイトカイン産生、ＮＦ−κＢの活性化、および／または、共刺激マーカーの発現を変化させることが含まれる。
【００１４】
ある状態は、ＴＬＲ８介在細胞応答を変化させることによって治療が可能である。したがって、本発明は、また、ＴＬＲ８介在細胞応答を調節することにより治療可能な状態にある生体の治療方法を提供するものである。そのような状態としては、例えば新形成疾患、ＴH１介在疾患、ＴH２介在疾患および感染性疾患（例えば、ウイルス性疾患、細菌性疾患、真菌症、寄生虫病、原虫病、プリオン介在疾患など）が挙げられる。
【００１５】
本発明の目的のために、以下の用語は以下の意味を有するものとする。
【００１６】
「アゴニスト」とは、受容体（例えばＴＬＲ）と結合して細胞応答を誘発できる化合物をいう。アゴニストは受容体に直接結合するリガンドであってもよい。あるいは、アゴニストは、受容体と、例えば、（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成したり、または、（ｂ）さもなければ別の化合物を、結果的に別の化合物が受容体に直接結合するように変化させたりすることによって、間接的に結合してもよい。アゴニストは、特定のＴＬＲのアゴニスト（例えばＴＬＲ８アゴニスト）を意味することがある。
【００１７】
「細胞内シグナル伝達経路」とは、細胞応答を伴うアゴニスト−受容体の組合わせとアゴニスト−受容体結合とを生化学的に結びつける一連の生化学的活性（例えば、サイトカイン産生）をいう。
【００１８】
「ドミナントネガティブ」とは、自然蛋白質の変異体をいい、その変異体は少なくとも１つの自然活性を有するが、少なくとも１つの別の自然活性が欠損するよう変化させられたものである。一例として、ある受容体蛋白質のドミナントネガティブ変異体は、正常な結合パートナー（例えば、リガンド）と結合できるが、受容体−リガンド結合から通常は誘発される第２の活性を発現できない（例えば、細胞シグナルの中継）といった例が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
「発現する」およびその派生語は、一般に、構造遺伝子を転写する細胞の能力を表すものであり、転写によりｍＲＮＡが産生され、次いで、ｍＲＮＡが翻訳され、検知可能な生物学的機能を細胞に付与する蛋白質が生成される。
【００２０】
「抑制する」とは、生物学的活性の測定可能な低下をいう。ここで使用されているように、「抑制する」または「抑制」は、通常の活性レベルに対するパーセントとして表される。
【００２１】
「ＩＲＭアンタゴニスト」とは、ＩＲＭ応答細胞をＩＲＭ化合物に曝露したときに通常誘発される生物学的活性を抑制する化合物をいう。
【００２２】
「ＩＲＭ化合物」とは、ＩＲＭ応答細胞に投与したとき、１つまたはそれ以上の免疫調節分子、例えばサイトカインまたは共刺激マーカーのレベルを変化させる化合物をいう。代表的なＩＲＭ化合物としては、小さな有機分子、プリン誘導体、小さな複素環化合物、アミド誘導体、および、後述のオリゴヌクレオチド配列が挙げられる。
【００２３】
「ＩＲＭ応答細胞」とは、ＩＲＭ化合物に曝露されたとき細胞応答を示す細胞のいずれかをいう。
【００２４】
「ＴＬＲ８介在」とは、ＴＬＲ８の機能から生じる生物学的または生化学的活性をいう。
【００２５】
「ＴＬＲ８陰性」とは、対応するＴＬＲ８陽性細胞培養よりも弱く検出されるＴＬＲ８機能を提供するように選択された細胞培養をいう。ＴＬＲ８陰性細胞培養は通常よりも弱いＴＬＲ８機能を、例えば、一般には通常のＴＬＲ８機能を示すＴＬＲ８陽性細胞培養と比較して抑制されたＴＬＲ８機能を示す。あるいは、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、通常より強いＴＬＲ８機能を示すＴＬＲ８陽性細胞培養に比べて、一般には通常のＴＬＲ８機能を示す細胞培養のように、一般には通常のまたは通常より強いＴＬＲ８機能を示すものであってもよい。
【００２６】
「ＴＬＲ８陽性」とは、対応するＴＬＲ８陰性細胞培養よりも強く検出されるＴＬＲ８機能を提供するように選択された細胞培養をいう。ＴＬＲ８陽性細胞培養は通常よりも強いＴＬＲ８機能を、例えば、一般には通常のＴＬＲ８機能を示すＴＬＲ８−陰性細胞培養と比較して過剰に発現されたＴＬＲ８機能を示す。あるいは、ＴＬＲ８陽性細胞培養は、抑制されたＴＬＲ８機能を示すＴＬＲ８陰性細胞培養に比べて、一般には通常のＴＬＲ８機能を示す細胞培養のように、一般には通常のまたは通常より弱いＴＬＲ８機能を示すものであってもよい。
【００２７】
免疫系のある種の細胞（例えば、抗原提示細胞、すなわち「ＡＰＣ」）は、外来抗原、そのなかには宿主に対して有害の可能性を示すものもあるが、それら抗原を認識し、抗原に対する免疫応答を引き起こす。トル様受容体（ＴＬＲ）は、外来抗原が示す特定の分子パターンを免疫系細胞に認識させる、免疫系受容体の１ファミリーである。分子パターンは、一般に病原体会合分子パターン（「ＰＡＭＰ」）と呼ばれている。ＴＬＲは、ロイシンリッチドメインを含む細胞外ドメインと、インターロイキン−１受容体の細胞質ドメインに似た細胞質ドメインとを含む。
【００２８】
各種のＴＬＲを活性化すると、サイトカインおよび抗菌ペプチドの分泌を含む、一連の生物学的効果が誘導される。サイトカインは重要な免疫系調節分子であり、ＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロンおよびインターロイキンを含むが、これらに限定されるものではない。サイトカインは細胞受容体に働きかけ、細胞成長、細胞分化、細胞死、炎症性過程および細胞移動などの種々の細胞活性を調節する。
【００２９】
異なるＴＬＲの発見によって、受容体とその活性化による生物学的効果とを結びつけるシグナル伝達経路の同定がなされるようになってきた。細胞質蛋白ＭｙＤ８８は、種々のＴＬＲを含む細胞内シグナル伝達経路の１メンバーであると同定されている。ＭｙＤ８８蛋白質は、ＴＬＲの細胞質ドメインのそれと類似のＩＬ−１受容体ドメインを有している。ＴＬＲがリガンドに結合し、次に別の細胞質蛋白（例えばＩＲＡＫおよびＴＲＡＦ６）に相互作用を引き起こさせると、ＭｙＤ８８のＩＬ−１受容体ドメインと細胞質ＴＬＲドメインは相互作用する。アゴニストのＴＬＲへの結合に始まりＩＲＡＫおよびＴＲＡＦ６により中継されるシグナルカスケードは、最後にはＮＦ−κＢを活性化し、そのことによってＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２などのサイトカインをコードする遺伝子を含む、種々の遺伝子の転写が誘導される。
【００３０】
多くのＩＲＭ化合物は、多くの細胞活性を共有する。細胞活性の多くは種の間で保存されており、例えば共刺激マーカーのアップレギュレーション、単球／マクロファージ細胞における炎症誘発性サイトカインの誘導、転写調節因子ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性化などが例示される。これらの細胞活性の少なくともいくつかは、ＴＬＲ８が介在している。ＩＲＭ化合物に限定するものではないが、ＩＲＭ化合物などのＴＬＲ８アゴニストを同定することは、ＴＬＲ８を介して免疫応答を誘発することによって治療可能なある状態を予防または治療するために使用される化合物を同定することでもある。
【００３１】
表２は、広い範囲のＩＲＭ化合物がＴＬＲ８を介してＮＦ−κＢの活性化を誘導できることを示している。ヒト胎児腎臓の細胞から誘導されたＨＥＫ２９３細胞には、（１）コントロールベクター（ＨＥＫ２９３−ベクター）またはヒトＴＬＲ８（ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ８）を含むベクターコンストラクトと、（２）ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポータとを、同時導入することができる。ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポータは、導入された細胞内でのＮＦ−κＢの活性化に際して、ルシフェラーゼシグナルを発生する。こうして、ＴＬＲ８が介在するＮＦ−κＢ活性は、ベクターを導入した細胞およびＴＬＲ８コンストラクトを導入した細胞を試験化合物に曝露し、ベクター導入細胞のルシフェラーゼシグナルとＴＬＲ８コンストラクトを導入した細胞のルシフェラーゼシグナルを比較することによって、検知することができる。もし、ＴＬＲ８導入細胞で誘導されたルシフェラーゼシグナルが、ベクター導入細胞で誘導されたルシフェラーゼシグナルより大きいならば、試験化合物はＴＬＲ８アゴニストと考えられる。
【００３２】
表２は、種々のＩＲＭ化合物は、導入細胞内で、単にベクターのみを導入した細胞に比べて、ＮＦ−κＢ活性が最大で１０倍を超える種々の程度に、ＮＦ−κＢ活性を刺激することを示している。いくつかの実施形態では、１０μＭの濃度で、誘導されたＨＥＫ２９３−ＴＬＲ８細胞内のＮＦ−κＢ活性が、ビヒクルコントロールに比べて少なくとも２倍に増加しているならば、その化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定している。別の実施形態では、約３０μＭ以下の濃度で、誘導されたＨＥＫ２９３−ＴＬＲ８細胞内のＮＦ−κＢ活性が、ビヒクルコントロールに比べて少なくとも５倍に増加しているならば、その化合物をＴＬＲ８アゴニストとして同定しうる。
【００３３】
ＴＬＲ８のドミナントネガティブ変異体（ＴＬＲ８ＤＮ）は、ＴＬＲ８アゴニストの同定に使用することができる。ＴＬＲ８ＤＮは、例えばＩＲＭ化合物などのＴＬＲ８アゴニストの同定に使用することができる。ＴＬＲ８のアゴニストの同定にこの方法を用いれば、広範囲の化合物をスクリーニングすることができる。
【００３４】
ＴＬＲ８アゴニストは、また、ＴＬＲ８機能を中和するＴＬＲ８特異抗体の使用によって同定することができる。ＴＬＲ８発現細胞を、抗ＴＬＲ８抗体を加えて予備インキュベートした後、各種の刺激物質を加えてインキュベートする。もし、ＴＬＲ８発現細胞が別のＴＬＲのアゴニスト（例えばＴＬＲ４アゴニストＬＰＳ）によって刺激されたときに、細胞応答が抑制される程度よりも、試験化合物によって誘導された細胞応答がＴＬＲ８特異抗体によって抑制される程度がより大きいならば、試験化合物はＴＬＲ８アゴニストとして同定することができる。ＴＬＲ８の過剰発現もまた、ＴＬＲ８アゴニストの同定のために使用できる。強い真核プロモータから発現するＴＬＲ８をコードするベクターが導入された細胞を、試験化合物とともにインキュベートする。もし、その導入された細胞が、適当な対照細胞培養より強いＴＬＲ８介在細胞応答を示すならば、試験化合物はＴＬＲ８アゴニストと同定できる。
【００３５】
本発明は、少なくとも１つのＴＬＲ８介在経路を活性化または抑制する新規なＩＲＭ化合物を発見するために使用することができる分析評価法を提供する。下記の分析評価法は本発明を例示するための実施形態であり、本発明の限定を意図するものではない。
【００３６】
本発明は、特定の化合物がＴＬＲ８介在細胞応答を引き出すかどうかを決定することを含む、ＴＬＲ８アゴニストの同定方法を提供する。これを行う１つの方法は、細胞内のＴＬＲ８の活性を消失または低下させ、その結果少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞応答について生じたＴＬＲ８の活性の低下または消失の影響を測定するものである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＩＲＭ応答細胞にＴＬＲ８のドミナントネガティブ変異体を導入して、その細胞がＴＬＲ８アゴニストに曝露されたときにＴＬＲ８介在活性が消失または測定可能に低下するようにすることを含む。ドミナントネガティブ変異体において、低下したＴＬＲ８介在細胞活性を誘発する化合物は、ＴＬＲ８アゴニストとして同定される。
【００３８】
ＴＬＲ８のドミナントネガティブ変異体（ＴＬＲ８ＤＮ）は、種々の方法で調製できる。いくつかの実施形態においては、ＴＬＲ８ＤＮは、その蛋白質の細胞質ドメインを変化させ、それによって、ＴＬＲ８とその細胞質結合パートナーとの間の結合を切断することによって作られる。別の実施形態においては、ＴＬＲ８とＴＬＲ８アゴニストとの相互作用を破壊するために、ＴＬＲ８を変化させている。ＴＬＲ８にいかなる特定の変化が加えられようとも、ドミナントネガティブ変異体は、ＴＬＲ８アゴニストに曝露されたとき、ＴＬＲ８介在細胞シグナルを伝達することはできないであろう。
【００３９】
ＴＬＲ８ＤＮに帰結する変異は、欠失または挿入を伴う点変異であってもよい。欠失または挿入はいかなるサイズであってもよい。実施形態のいくつかでは、変異は非保存性である。別の実施形態では、変異は保存性である。さらに別の実施形態では、ＤＮＡレベルの変異により、停止コドンが形成され、その結果、欠損蛋白質が得られる。あるいは、変異は、読み枠の移動を引き起こして、そのフレームシフト変異から下流のアミノ酸配列を変える。
【００４０】
ＴＬＲ８アゴニストを同定する方法の１つは、ＴＬＲ８陽性細胞培養を試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、ＴＬＲ８陰性細胞培養を試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、および、もしＴＬＲ８陽性細胞培養の細胞応答がＴＬＲ８陰性細胞培養の細胞応答より大きいなら、その化合物をＴＬＲ８アゴニストと同定することを含む。
【００４１】
ＴＬＲ８陽性細胞培養を試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定する工程は、対照のＩＲＭ応答細胞培養（例えば、ヌルベクターを導入した細胞）を試験化合物に曝露すること、対照細胞培養のＴＬＲ８介在応答を測定すること、および、ＴＬＲ８陽性試験培養の細胞応答と対照培養の細胞応答を比較することを含むことができる。同様に、ＴＬＲ８陰性細胞培養を試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定する工程は、対照のＩＲＭ応答細胞培養を試験化合物に曝露すること、対照細胞培養のＴＬＲ８介在応答を測定すること、および、ＴＬＲ８陰性試験培養の細胞応答と対照培養の細胞応答を比較することを含むことができる。しかしながら、経験と共に、当業者であれば、本発明の方法を用いてＴＬＲ８アゴニストを同定するのに明示的なコントロールの使用を必ずしも必要としない特別な分析評価法に十分に精通することになろう。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ８陽性細胞培養は、通常のＩＲＭ介在細胞応答よりも大きな応答を示す細胞を含む。例えば、ＴＬＲ８陽性細胞培養は、ＩＲＭによって刺激されたときに通常のＩＲＭ介在応答より大きい応答を示すように、導入などによって遺伝子修飾した細胞を含むことができる。そのような遺伝子の修飾としては、導入細胞がＴＬＲ８を過剰発現するよう、ＴＬＲ８構造遺伝子のコピーを追加することが挙げられる。さらに、ＴＬＲ８の過剰発現は、１つもしくはそれ以上の強力な転写調節配列の制御の下に、ＴＬＲ８構造遺伝子をクローニングすることから生ずる。
【００４３】
ＴＬＲ８陽性細胞培養は、ＴＬＲ８過剰発現を示す導入細胞を含むことができる。ＴＬＲ８を発現もしくは過剰発現する細胞は、種々の標準的な技術（例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（２００１）を参照）により調製できる。ＴＬＲ８陽性細胞培養が、通常より大きいＴＬＲ８介在細胞応答を示す実施形態では、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、一般的に通常のレベルのＴＬＲ８介在細胞応答を示す細胞を含むことができる。あるいは、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、通常より低いＴＬＲ８介在細胞応答を示す細胞を含むことができる。
【００４４】
別の実施形態では、ＴＬＲ８陽性細胞培養は、一般的に通常のＴＬＲ８介在細胞応答を示す細胞を含むことができる。そのような実施形態では、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、通常より低いＴＬＲ８介在細胞応答を示す細胞を含むことができる。そのような実施形態では、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、ＴＬＲ８アゴニストにより刺激されたとき、通常より低いＴＬＲ８介在細胞応答を示すよう遺伝子的に改質された細胞を含むことができる。例えば、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、ドミナントネガティブＴＬＲ８変異体（ＴＬＲ８ＤＮ）をコードするベクターが導入された細胞を含むことができる。別の実施形態では、ＴＬＲ８陰性細胞培養は、少なくとも部分的にＴＬＲ８の発現を抑制するよう、ＴＬＲ８のアンチセンスコンストラクトを含むベクターが導入された細胞を含むことができる。例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（２００１）を参照されたい。
【００４５】
あるいは、ＴＬＲ８陰性細胞培養には、（１）試験化合物とＴＬＲ８との結合、または、（２）アゴニスト（すなわち試験化合物）に結合した後に細胞シグナルを伝達するＴＬＲ８の能力を阻害する、１つもしくはそれ以上の抑制成分が含まれてよい。例えば、ＴＬＲ８陰性細胞培養には、ＴＬＲ８に特異的に結合し、そのことによって少なくとも部分的にＴＬＲ８介在細胞応答を抑制する抗体（一般に、抗ＴＬＲ８抗体）が含まれてよい。当業者にとって、特定のターゲットに特異的に結合する抗体を産生することはルーチンの作業であると考えられる。このように、抗ＴＬＲ８抗体は、本発明の方法により、ＴＬＲ８陰性細胞培養を得るために使用することができる。
【００４６】
ある実施形態では、ＴＬＲ８陰性細胞培養を得るために、抗ＴＬＲ８抗体が使用される。抗ＴＬＲ８抗体を試験化合物に先立って細胞培養に加えてもよいし、試験化合物とともに加えてもよい。抗ＴＬＲ８抗体は、ポリクロナールであっても、モノクロナールであってもよい。細胞培養内の抗体の最終濃度は、ＴＬＲ８機能の所望の減少を示す濃度であればいかなる濃度であってもよい。いくつかの代表的な実施形態では、抗ＴＬＲ８抗体は、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲で存在する。細胞培養の細胞を抗ＴＬＲ８抗体の存在下で予備インキュベートする実施形態では、試験化合物を加える前に、予備インキュベーションが約０分〜約４８時間の範囲で行われる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ８介在細胞応答には、少なくとも１つのサイトカインの産生が含まれ、このサイトカインとしては、特にこれらに限定されるものではないが、ＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＮＦ−β、ＩＦＮ−ωなど）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、またはこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、ＴＬＲ８介在細胞応答にＮＦ−κＢの活性化が含まれる。さらに別の実施形態では、ＴＬＲ８介在細胞応答には、１つもしくはそれ以上の共刺激マーカー（例えば、ＣＤ４０，ＣＤ８０、ＣＤ８６など）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３など）、または、例えばＣＣＲ７などの成熟マーカーの産生が含まれる。
【００４８】
通常、ＴＬＲ８および／または発現が少なくとも部分的に抑制された細胞では、ＴＬＲ８アゴニストの投与によってＴＬＲ８介在活性（例えば、サイトカインの産生またはＮＦ−κＢの活性化）が刺激される程度は、同一の濃度の試験化合物で刺激された非導入細胞と比較して、少なくとも２０％の低下を示す。ある実施形態では、細胞は、ＴＬＲ８アゴニストの投与によってＴＬＲ８介在活性が刺激される程度が少なくとも５０％低下する。別の実施形態では、少なくとも８０％の低下が観察される。
【００４９】
ある１つの実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストの同定のために、ＴＬＲ８過剰発現細胞培養をＴＬＲ８陽性細胞培養として、非改質細胞培養をＴＬＲ８陰性細胞培養として用い、試験化合物による刺激の後に、それぞれの細胞培養におけるＴＬＲ８介在細胞応答を測定するという方法が考案されている。ＴＬＲ８アゴニストを同定する別の実施形態では、その方法は、ＴＬＲ８陽性細胞培養として非改質細胞培養を用い、ＴＬＲ８陰性細胞培養としてＴＬＲ８ＤＮ細胞培養または抗ＴＬＲ８抗体を含む細胞培養を用いている。
【００５０】
こうして、本発明はＴＬＲ８のアゴニストとして同定された化合物を提供する。特に断らない限り、化合物には、異性体（たとえばジアステレオ異性体または鏡像異性体）、塩、溶媒和化合物、多形体など、薬学的に受容可能ないかなる形態の化合物も含まれる。特に、化合物が光活性を有する場合、その化合物には、その化合物の各鏡像異性体も鏡像異性体のラセミ混合物も含まれる。
【００５１】
本発明は、また、ＴＬＲ８アゴニストを含む医薬組成物を提供するものである。医薬組成物は、例えば、薬学的に受容可能なビヒクル、１つもしくはそれ以上のアジュバント、１つもしくはそれ以上の薬学的に活性な化合物（すなわち、ＴＬＲ８アゴニストはアジュバントとして働くことができる）などの１つもしくはそれ以上の付加的成分を含むことができる。
【００５２】
本発明は、また、ＴＬＲ８アンタゴニストを同定する方法を提供する。そのような方法は、第１のＩＲＭ応答性細胞培養をＴＬＲ８アゴニストに曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、第２のＩＲＭ応答性細胞培養をＴＬＲ８アゴニストおよび試験化合物に曝露し、ＴＬＲ８介在細胞応答を測定すること、並びに、もし、第１の細胞培養の細胞応答が第２の細胞培養の細胞応答より大きいなら、その試験化合物をＴＬＲ８アンタゴニストとして同定することを含む。
【００５３】
ＴＬＲ８のアンタゴニストを同定するためには、ＩＲＭ応答性細胞培養には、ＴＬＲ８発現細胞が含まれなければならない。ある実施形態では、細胞培養は、１つもしくはそれ以上の追加のＴＬＲを自然に発現する細胞を含む。あるいは、ＩＲＭ応答性細胞培養は、上記ＴＬＲ８陽性細胞培養の多くのように、追加のＴＬＲを発現しない細胞を含む。
【００５４】
上記同定法と同じく、ＴＬＲ８アンタゴニストの同定には、第１のＩＲＭ応答性細胞培養と第２のＩＲＭ応答性細胞培養のＴＬＲ８介在細胞応答が比較されるコントロール細胞培養の使用が含まれる。しかしながら、繰り返すが、当業者であれば、分析評価毎にコントロールを使用する必要のない分析評価法に十分に精通することになろう。
【００５５】
前記方法により分析評価にかけられる試験化合物の濃度は、例えば、約０．００１μＭ〜約１００μＭの範囲であるが、いくつかの実施形態では、この範囲外の濃度の試験化合物について分析評価が行われている。細胞培養は試験化合物と共に、例えば、約１０分〜約２４時間の間インキュベートされるが、いくつかのケースでは、インキュベートの時間はこの範囲外である。試験される化合物と共にインキュベートされる細胞の密度は、例えば、約１×１０4〜約１×１０7個／ｍｌであるが、いくつかの実施形態では、この範囲外の細胞密度を有する細胞培養を使用して分析評価が行われる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ法を使用して、サイトカイン量が測定される。別の実施形態では、サイトカイン量は、例えば、抗体検出定量法（例えば、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、免疫組織化学／細胞化学法、プロテオーム配列法）やバイオアッセイ（例えば、細胞死の量がサンプル中のＴＮＦ−αの量に直接比例するＬ９２９細胞毒性法）などの技術を使用して測定される。例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（２００１）を参照されたい。
【００５７】
上記方法で使用されるＩＲＭ応答性細胞は、植物由来であっても動物由来であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＲＭ応答性細胞は、例えば、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシまたはウサギなどの哺乳動物由来のものである。このようなＩＲＭ応答性細胞としては、単球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、多形核白血球（例えば、好中球、好塩基球および／または好酸球）、Ｂリンパ球、あるいは、少なくとも前述したものの１つを含む細胞のあらゆる組み合わせが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。ＩＲＭ応答性細胞は、ＲＡＷ２６４．７（バージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能なマウスマクロファージ細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）、ＴＨＰ−１（バージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な急性単球性白血病組織から誘導されたヒト単球細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−２０２）、または、ＨＥＫ２９３（バージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な不死化したヒト胚性腎臓細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）などの確立された細胞製品ラインから入手したものであってもよい。
【００５８】
この方法で使用されるＴＬＲ８遺伝子は、種々の植物や、例えば、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシまたはウサギなどの哺乳動物といった動物のなかの任意の１つから得てもよく、また、誘導されてもよい。
【００５９】
本発明の方法で用いる細胞におけるＴＬＲ８の発現は、細胞内の自然の遺伝子発現から生じてもよい。自然にＴＬＲ８を発現する細胞としては、単球、マクロファージ、Ｂリンパ球、多形核白血球、樹状細胞が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。あるいは、ＴＬＲ８の発現は、細胞の遺伝的変異から生じてもよい。そのように変異した細胞は、自然にＴＬＲ８を発現することもあり、また、ＴＬＲ８の自然の発現を欠くこともある。例えば、非変異ＨＥＫ２９３細胞は、検知できる程度にＴＬＲ８を発現しない。本発明の方法で用いる細胞におけるＴＬＲ８発現のレベルは、特定の製品ラインの細胞におけるＴＬＲ８の通常の発現レベルより、高くても、低くても、近似していても、あるいは、等しくてもよい。
【００６０】
多くの異なるサイトカインおよび／またはマーカーを、上述した方法により分析評価することができる。適切な測定可能なサイトカインとしては、ＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、および、ＭＣＰ−１が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。適切な測定可能なマーカーとしては、共刺激マーカー（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭｓ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３など）、および、例えばＣＣＲ７などの成熟マーカーが挙げられる。
【００６１】
上記のいずれかの方法または他の方法で、ＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物は、ＴＬＲ８介在細胞応答を引き出すために用いることができる。ここで使用されているように、「引き出す」という用語には、特定の細胞応答のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが含まれる。上記方法のいずれかの方法または他の方法で、ＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ８アンタゴニストとして同定された化合物は、また、ＴＬＲ８介在細胞応答を調節（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）することによって治療可能な状態にある生体を治療するために使用することができる。
【００６２】
本発明は、また、ＴＬＲ８介在シグナル伝達経路を操作することによって、ＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法を提供する。本発明の方法により引き出される、あるＴＬＲ８介在細胞応答には、サイトカイン産生または共刺激マーカー産生の誘導が挙げられ、他の細胞応答には、あるサイトカインまたは共刺激マーカーの産生の抑制が挙げられる。
【００６３】
本発明は、ＩＲＭ応答性細胞に、少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞シグナル伝達経路に影響を及ぼすＩＲＭ化合物を投与することによって、ＩＲＭ応答性細胞内に少なくとも１つのＴＬＲ８介在細胞応答を引き出す方法を提供する。
【００６４】
ＩＲＭ化合物としては、限定はされないが抗ウイルスおよび抗ガン活性といった有効な免疫調節活性を有する化合物が挙げられる。あるＩＲＭは、サイトカインの産生と分泌を調節する。例えば、あるＩＲＭ化合物は、例えばＩ型インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１および／またはＭＣＰ−１などのサイトカインの産生と分泌を誘導する。別の例としては、あるＩＲＭ化合物は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３などのある種のＴH２サイトカインの産生と分泌を抑制することができる。さらに、あるいくつかのＩＲＭ化合物はＩＬ−１およびＴＮＦを抑制すると言われている（米国特許第６，５１８，２６５号明細書）。
【００６５】
あるＩＲＭは、小さな有機分子であり（例えば、分子量約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満であり、例えば、蛋白質、ペプチドなどの大きな生体分子とは対照的である）、例えば、米国特許第４，６８９，３３８号明細書、同第４，９２９，６２４号明細書、同第４，９８８，８１５号明細書、同第５，０３７，９８６号明細書、同第５，１７５，２９６号明細書、同第５，２３８，９４４号明細書、同第５，２６６，５７５号明細書、同第５，２６８，３７６号明細書、同第５，３４６，９０５号明細書、同第５，３５２，７８４号明細書、同第５，３６７，０７６号明細書、同第５，３８９，６４０号明細書、同第５，３９５，９３７号明細書、同第５，４４６，１５３号明細書、同第５，４８２，９３６号明細書、同第５，６９３，８１１号明細書、同５，７４１，９０８号明細書、同５，７５６，７４７号明細書、同５，９３９，０９０号明細書、同６，０３９，９６９号明細書、同第６，０８３，５０５号明細書、同第６，１１０，９２９号明細書、同第６，１９４，４２５号明細書、同第６，２４５，７７６号明細書、同第６，３３１，５３９号明細書、同第６，３７６，６６９号明細書、同第６，４５１，８１０号明細書、同第６，５２５，０６４号明細書、同第６，５４５，０１６号明細書、同第６，５４５，０１７号明細書、同第６，５５８，９５１号明細書、同第６，５７３，２７３号明細書、同第６，６５６，９３８号明細書、同第６，６６０，７３５号明細書、同第６，６６０，７４７号明細書、同第６，６６４，２６０号明細書、同第６，６６４，２６４号明細書、同第６，６６４，２６５号明細書、同第６，６６７，３１２号明細書、同第６，６７０，３７２号明細書、同第６，６７７，３４７号明細書、同第６，６７７，３４８号明細書、同６，６７７，３４９号明細書、同６，６８３，０８８号明細書、欧州特許第０３９４０２６号明細書、米国特許出願公開第２００２／００１６３３２号明細書、同第２００２／００５５５１７号明細書、同第２００２／０１１０８４０号明細書、同第２００３／０１３３９１３号明細書、同第２００３／０１９９５３８号明細書および同第２００４／００１４７７９号明細書、並びに、国際公開第０２／１０２３７７号パンフレットおよび同０３／１０３５８４号パンフレットに開示されている。
【００６６】
小さな分子のＩＲＭｓの例としては、さらに、ある種のプリン誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号明細書および同第６，０２８，０７６号明細書に記載されているものなど）、ある種のイミダゾキノリンアミド誘導体（米国特許６，０６９，１４９号明細書に記載されているものなど）、ある種のイミダゾピリジン誘導体（米国特許第６，５１８，２６５号明細書に記載されているものなど）、ある種のベンズイミダゾール誘導体（米国特許第６，３８７，９３８号明細書に記載されているものなど）、ある種の５員環窒素含有複素環に縮合した４−アミノピリミジンの誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号明細書，同第６，０２８，０７６号明細書および同第６，３２９，３８１号明細書、並びに、国際公開第０２／０８５９０５号パンフレットに記載されているアデニン誘導体など）、および、ある種の３−β−Ｄ−リボフラノシルチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体（米国特許出願公開第２００３／０１９９４６１号明細書に記載されているものなど）が挙げられる。
【００６７】
他のＩＲＭｓとしては、オリゴヌクレオチド配列などの生体分子が挙げられる。いくつかのＩＲＭオリゴヌクレオチド配列は、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含み、これらは、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号明細書、同第６，２０７，６４６号明細書、同第６，２３９，１１６号明細書、同第６，３３９，０６８号明細書および同第６，４０６，７０５号明細書に記載されている。いくつかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドには、例えば米国特許第６，４２６，３３４号明細書および同第６，４７６，０００号明細書に記載されているような合成免疫調節構造モチーフが含まれる。ＩＲＭヌクレオチド配列の他のものはＣｐＧを含有しないが、これらは、例えば、国際公開第ＷＯ００／７５３０４号パンフレットに記載されている。
【００６８】
ＴＬＲ８アゴニストとしての使用に適したＩＲＭ化合物としては、２−アミノピリジンを５員含窒素複素環と縮合させた化合物が挙げられる。そのような化合物としては、例えば、これらに限定されるものではないがアミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミンおよび６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミンといった置換イミダゾキノリンアミンなどのイミダゾキノリンアミン；これらに限定されるものではないがアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、複素環エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテルおよびチオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンなどのテトラヒドロイミダゾキノリンアミン；これらに限定されるものではないがアミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、複素環エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテルおよびチオエーテル置換イミダゾピリジンアミンなどのイミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；並びに、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーなどが挙げられる。
【００６９】
ある実施形態では、ＩＲＭ化合物は、イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである。
【００７０】
ある実施形態では、ＩＲＭ化合物は、置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン、６−、７−、８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；あるいは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである。
【００７１】
ここで使用されているように、置換イミダゾキノリンアミンは、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、あるいは、６−、７−、８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミンである。ここで使用されているように、置換イミダゾキノリンアミンからは、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンおよび４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールは明確に除外される。
【００７２】
ある１つの特定の実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアミド置換イミダゾキノリンアミンである。代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはスルホンアミド置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは尿素置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアリールエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは複素環エーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはスルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは尿素置換イミダゾキノリンエーテルである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはチオエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは６−，７−，８−もしくは９−アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミンである。
【００７３】
別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはスルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは複素環エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはスルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテルである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはチオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。
【００７４】
別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアミド置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはスルホンアミド置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは尿素置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアリールエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは複素環エーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはスルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは尿素置換イミダゾピリジンエーテルである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはチオエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。
【００７５】
別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは１，２−架橋イミダゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンである。
【００７６】
別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはイミダゾナフチリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはテトラヒドロイミダゾナフチリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはオキサゾキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはチアゾロキノリンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはオキサゾロピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはチアゾロピリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはオキサゾロナフチリジンアミンである。別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはチアゾロナフチリジンアミンである。
【００７７】
さらに別の代わりとなる実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストはピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンと縮合した１Ｈ−イミダゾダイマーである。
【００７８】
適切なＩＲＭ化合物には、また、プリン誘導体、小さな複素環化合物、アミド誘導体および上記オリゴヌクレオチド配列が含まれる。あるいは、本発明によるいくつかの方法で使用されているＩＲＭ分子には、本発明によるいくつかの方法を含む適切なＴＬＲ８アゴニスト同定法によりＴＬＲ８アゴニストとして同定された化合物が含まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ８介在細胞応答には、例えばＴＮＦ−α、Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１またはこれらのあらゆる組み合わせなどの、少なくとも１つのサイトカインの産生が含まれる。別の実施形態では、ＴＬＲ介在細胞応答には、ＮＦ−κＢの活性化が含まれる。さらに別の実施形態では、ＴＬＲ介在細胞応答には、少なくとも１つの共刺激マーカー、細胞間接着分子、成熟マーカーまたはこれらのあらゆる組み合わせの産生が含まれる。
【００８０】
ある実施形態では、ＴＬＲ８介在細胞応答は、試験管内で引き出される。例えば、ＴＬＲ８応答性細胞は、（ａ）工学的に製造されるか、または、（ｂ）被験体から収集され、試験管で培養される。ＴＬＲ８アゴニストを試験管内の細胞培養に投与することより、ＴＬＲ介在細胞応答が引き出される。あるいは、ＴＬＲ８介在細胞応答は、ＴＬＲ８アゴニストを被験体に直接投与することによって、生体内で引き出すことができる。
【００８１】
適切なＩＲＭ応答性細胞としては、単球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、多形核細胞（例えば、好中球、好塩基球または好酸球）、Ｂリンパ球およびこれらから誘導される細胞などの、自然にＴＬＲ８を発現する細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。あるいは、適切なＩＲＭ応答性細胞としては、容易に検知可能なレベルのＴＬＲ８発現を自然には有していないが、検知可能なレベルのＴＬＲ８発現を示すように遺伝子的に変異させた細胞が挙げられる。例えば、ＨＥＫ２９３細胞に、１つもしくはそれ以上の発現制御配列との操作可能な結合を有する、発現性のＴＬＲ８構造遺伝子を含むベクターを導入することができる。
【００８２】
生体のＴＬＲ８経路の活性化は、少なくとも１つのサイトカインまたは少なくとも１つの共刺激マーカーの産生の増加または減少をもたらす。サイトカインまたは共刺激マーカーの量を制御する能力は、ある状態の治療に有用であることから、本発明は、また、これらの状態を治療する方法を提供する。ある実施形態では、１つもしくはそれ以上のサイトカインまたは共刺激マーカーの産生を誘導しつつ、１つもしくはそれ以上の別のサイトカインまたは共刺激マーカーの産生が抑制されるであろう。
【００８３】
したがって、本発明は、ＴＬＲ８介在細胞応答を調節することにより、治療可能な状態にある生体を治療する方法を提供する。その方法は、ＴＬＲ８介在細胞内シグナル伝達経路を活性化するのに有効な量のＴＬＲ８アゴニストを生体に投与することを含む。ＴＬＲ８アゴニストは、上記した化合物などの、ＴＬＲ８アゴニストとして働くＩＲＭ化合物であればいかなるものであってもよい。
【００８４】
この方法は、予防処置、治療処置またはその両者を提供する。ここで使用されているように、予防処置とは、症状が観察される前および／または身体状態の原因物質（例えば、病原体または発癌物質）への曝露が疑われる前に開始される処置をいう。一般に、予防処置によって、（ａ）処置を受ける被験体の状態が進行する可能性、並びに／あるいは、（ｂ）被験体の状態が進行した場合における症状の持続期間および／または重篤度は減じられる。ここで使用されているように、治療処置とは、症状が観察された後および／または身体状態の原因物質への曝露が疑われた後に開始される処置をいう。一般に、治療処置によって、身体状態に伴う症状の重篤度および／または持続期間が減じられる。
【００８５】
病気の処置が予防であるか治療であるかにかかわらず、また、免疫への影響が自然免疫に対するものであるか獲得免疫に対するものであるかにかかわらず、ＴＬＲ８アゴニストは単独で、または、例えばワクチンアジュバントにおけるように、１つもしくはそれ以上の活性成分と組み合わされて投与される。他の成分と共に投与する場合、ＴＬＲ８アゴニストおよび他の１つまたは複数の成分は、別々に投与してもよく、溶液のように一緒ではあるが独立して投与してもよく、あるいは、一緒であって、互いに（ａ）共有結合または（ｂ）例えばコロイド懸濁液などの非共有結合で結びついた状態で投与してもよい。
【００８６】
ＴＬＲ８伝達経路の活性化は、また、サイトカインに応答する各種の障害の治療に有用である。ＴＬＲ８伝達経路を活性化する薬剤は、ＴH１免疫応答を介して治療可能な病気または状態の治療（例えば、ウイルス性疾患、ある種の細菌性疾患および腫瘍）に特に有用であると考えられる。
【００８７】
ＴＬＲ８アゴニストが治療に使用される状態としては、これらに限定されるものではないが、
（ａ）例えば、アデノウイルス、疱疹ウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、ＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、天然痘あるいは牛痘、または伝染性軟属腫などのオルソポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、鼻炎ウイルス、またはエンテロウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、およびＲＳウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、性器いぼ、尋常性ゆうぜいまたは足底いぼをひき起こすウイルスなどの乳頭腫ウイルス）、ヘパドナウイルス（Ｂ型肺炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肺炎ウイルス、デング熱ウイルス）、あるいは、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）の感染に起因する病気などのウイルス性疾患；
（ｂ）例えば、エシェリキア属、エンテロバクター属、サルモネラ属、ブドウ球菌属、志賀赤痢菌属、リステリア属、好気菌属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、シュードモナス属、連鎖球菌属、クラミジア属、マイコプラズマ属、肺炎球菌、ネイセリア属、クロストリジウム属、桿菌属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、カンピロバクター属、ビブリオ属、セラチア属、プロビデンシア属、クロモバクテリウム属、ブルセラ属、イェルシニア属、ヘモフィルス属、またはボルデテラ属などの細菌の感染に起因する病気などの細菌性疾患；
（ｃ）クラミジア、これらに限定されるものではないがカンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎などの真菌症、またはこれらに限定されるものではないがマラリア、ニューモシスティスカリーニ肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症およびトリパノソーマ感染症などの寄生虫病などの他の感染症；
（ｄ）上皮内腫瘍、子宮頚部形成異常、光線性角化症、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、腎細胞癌、カポ−ジ肉腫、メラノーマ、腎細胞癌、これらに限定されものではないが骨髄性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病などの白血病、および、他の癌などの新生物形成、並びに、
（ｅ）アトピー性皮膚炎もしくは湿疹、好酸球増加症、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、全身性紅斑性狼瘡、本態性血小板血症、多発性硬化症、オーメン症候群、円盤状狼瘡、円形脱毛症、ケロイド形成や他のタイプの瘢痕の阻害、慢性創傷などの進行性創傷治癒などの、ＴH２介在性、アトピー性および自己免疫性疾患
が挙げられる。
【００８８】
ＴＬＲ８アゴニストは、また、ワクチンアジュバントとして、体液および／または細胞介在免疫応答を亢進させる物質と共に使用するのに有用であり、そのような物質としては、例えば、生きたウイルス性、細菌性もしくは寄生虫性免疫抗原；不活性化したウイルス性、腫瘍由来、原虫性、生体由来、真菌性もしくは細菌性免疫抗原、類毒素、毒素；自己抗原；多糖類；蛋白質；糖蛋白質；ペプチド；細胞ワクチン；ＤＮＡワクチン；組み換え蛋白質；糖蛋白質；ペプチドなどがあり、例えば、ＢＣＧ、コレラ、ペスト、チフス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、パラインフルエンザ、ポリオ、狂犬病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、黄熱病、破傷風、ジフテリア、ｂ型ヘモフィルスインフルエンザ、結核、髄膜炎球菌および肺炎球菌ワクチン、アデノウイルス、ＨＩＶ、水痘、サイトメガロウイルス、デング熱、ネコの白血病、家禽ペスト、ＨＳＶ−１およびＨＶＳ−２、豚コレラ、日本脳炎、ＲＳウイルス、ロタウイルス、乳頭腫ウイルス、黄熱病、アルツハイマー病などと関連して使用する。
【００８９】
ＴＬＲ８アゴニストは、また、免疫機能が弱い個人に特に役立つ。例えば、ＴＬＲ８アゴニストは、移植患者、癌患者、ＨＩＶ患者などの細胞介在免疫が抑制された後に起こる、日和見性の感染症および腫瘍の治療に使用できる。
【００９０】
ＴＬＲ８介在細胞内シグナル伝達経路の活性化に有効なＴＬＲ８アゴニストの量は、モノサイト、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞などの１種もしくはそれ以上の細胞タイプに対して、上記の１つもしくはそれ以上のＴＬＲ８介在細胞応答のようなＴＬＲ８介在細胞応答を引き起こすのに十分な量である。そのような応答を誘導するのに必要なＴＬＲ８アゴニストの正確な量は、この分野で知られた因子によって変化するが、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであると考えられる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは、前記の小さな有機ＩＲＭ分子、すなわち、前記のプリン誘導体、小さな複素環化合物、アミド誘導体およびオリゴヌクレオチド配列などの、既に知られたＩＲＭ化合物である。あるいは、本発明のいくつかの実施形態で使用されるＴＬＲ８アゴニストとしては、いくつかの本発明による方法を含むＴＬＲ８アゴニストの適切な同定方法によってＴＬＲ８として同定された化合物が挙げられる。
【００９２】
ＴＬＲ８アゴニストは、被験体への投与に適した剤型で提供することができる。好ましい剤型のタイプは、例えば、米国特許第５，７３６，５５３号明細書、同第５，２３８，９４４号明細書、同第５，９３９，０９０号明細書、同第６，３６５，１６６号明細書、同第６，２４５，７７６号明細書、同第６，４８６，１８６号明細書、欧州特許第ＥＰ０３９４０２６号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１９９５３８号明細書に記載されている。ＴＬＲ８アゴニストは、いかなる適切な形態で提供されてもよく、そのような形態としては、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは任意の形態の剤型が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。ＴＬＲ８アゴニストは、薬学的に受容可能な賦形剤、担体またはビヒクルと共に製剤されて供給されうる。例えば、剤型は、例えば、クリーム、軟膏、エアロゾル配合、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローションなどの従来から知られる局所投与の形態で供給されうる。製剤には、さらに、１つもしくはそれ以上の添加剤が含まれてもよく、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、芳香剤、風味剤、保湿剤、増粘剤などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００９３】
１つもしくはそれ以上の成分の組み合わせを含有する製剤は、例えば、経口または非経口などの好ましい方法で投与される。ここで使用されているように、経口とは、経口摂取など、消化経路を介してなされる投与をいう。非経口とは、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、経粘膜投与（例えば、吸入による）または局所投与などのように、消化経路と異なる経路を介してなされる投与をいう。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＴＬＲ８アゴニストを、例えば、約０．０００１％〜約１０％（他に記載がなければ、ここで示す全てのパーセントは、製剤全体に対する重量／重量である）の配合で被験体に投与することを含むが、いくつかの実施形態では、この範囲外の濃度でＴＬＲ８アゴニストを与えるような配合で、ＴＬＲ８アゴニストを投与する。ある実施形態における方法は、約０．０１〜約１％のＴＬＲ８アゴニストを含有する製剤、例えば、約０．１〜約０．５％のＴＬＲ８アゴニストを含有する製剤を被験体に投与することを含む。
【００９５】
ある状態を治療するのに有効なＴＬＲ８アゴニストの量は、所望の治療または予防の効果を与えるのに十分な量である。ある状態を治療するのに有効なＴＬＲ８アゴニストの正確な量は、この分野で知られた因子により変化し、そのような因子としては、その状態、ＴＬＲ８アゴニストの物理的および化学的性質、担体の性質、予定された投与計画、被験体の免疫系の状態（例えば、抑制されている、弱い、刺激されている）、ＴＬＲ８アゴニストを投与する方法、製剤が投与される種などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。したがって、ある状態を治療するのに有効なＴＬＲ８アゴニストの量を与える製剤の量を、あらゆる可能な適用に対して、一般的に記載することは、実際的ではない。しかしながら、当業者であれば、そのような因子を十分に考慮して、適切な量を容易に決定できる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を与えるのに十分なＴＬＲ８アゴニストを被験体に投与することを含むが、いくつかの実施形態の方法では、この範囲外の濃度でＴＬＲ８アゴニストが投与される。これらの実施形態のいくつかの方法では、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの投与量、例えば、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与量を被験体に与えるのに十分なＴＬＲ８アゴニストを投与することを含む。
【００９７】
投与計画は、この分野で知られた多くの因子に少なくとも部分的に依存し、そのような因子としては、その状態、ＴＬＲ８アゴニストの物理的および化学的性質、担体の性質、アゴニスト投与量、被験体の免疫系の状態（例えば、抑制されている、弱い、刺激されている）、ＴＬＲ８アゴニストを投与する方法、製剤が投与される種などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。したがって、ある状態を治療するのに有効な投与計画を、あらゆる可能な適用に対して、一般的に記載することは、実際的ではない。しかしながら、当業者であれば、そのような因子を十分に考慮して、適切な量を容易に決定できる。
【００９８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストは、例えば、１日に１回から複数回投与されるが、いくつかの実施形態では、この範囲外の頻度でＴＬＲ８アゴニストを投与することによって本発明の方法が実施される。ある実施形態では、例えば、ＴＬＲ８アゴニストを１日に１回投与するなど、週に約１回から１日に約３回投与される。
【００９９】
ある状態を治療される生体は、植物または動物であり、特に脊椎動物である。疾患を治療される好ましい生体は、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはウシなどの哺乳動物であるが、特にこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、単に、本発明の特徴、利点および他の詳細をさらに詳しく説明するために選ばれたものである。しかしながら、これらの実施例はこの目的のために役立つもののであるが、使用されている特定の材料および量は、他の条件や詳細と同様に、本発明の範囲を過度に制限するものと解釈すべきでないことは明確に理解されなければならない。
【０１０１】
化合物
以下の実施例で使用されている化合物と各化合物の合成方法の参照を表１に示す。
【０１０２】
【表１】
2006517974.tif 000002
【表２】
2006517974.tif 000003
【表３】
2006517974.tif 000004
【表４】
2006517974.tif 000005
【０１０３】
細胞
ＨＥＫ２９３細胞−バージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な不死化したヒト肺性腎臓細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３。
【０１０４】
細胞培養培地／緩衝液
ＲＰＭＩ１６４０に、２５ｍＭのＨＥＰＥＳと、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、０．１ｍＭの非必須アミノ酸と、１ｍＭのＬ−グルタミン（ミネソタ州ミネアポリスのセロックス・ラボラトリーズ，インコーポレーティッド（Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））とを混合し、１０％の加熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ユタ州ローガンのハイクローン・ラボラトリーズ、インコーポレーティッド（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ））と１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を補足して、完全なＲＰＭＩを調製した。
【０１０５】
カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＤＰＢＳ、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））に、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）および０．０５％のアジ化合物を加えて、ＩＧＥＮ  ＰＢＳ緩衝液（ＩＧＥＮ  ＰＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）を調製した。
【０１０６】
実施例１−ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ８の発現
２ｍＭのＬグルタミンと、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するよう調製したアールの緩衝塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（メリーランド州ロックビルのインビトロゲン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を含有する９０％の最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ)（ＭＥＭ）と１０％の加熱不活性化ウシ胎児血清の中で、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。細胞は、３７℃、８％ＣＯ2でインキュベートした。
【０１０７】
導入の２４時間前に、ＨＥＫ２９３細胞を３７℃、８％ＣＯ2で、１０ｃｍ皿（コーニング４３０１６７（Ｃｏｒｎｉｎｇ４３０１６７）、ニューヨーク州コーニングのコーニング・インコーポレーティッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ））に付着させた。細胞に、（１）（ａ）非修飾（ＨＥＫ２９３−ベクター）または（ｂ）ヒトＴＬＲ８（ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ８）含有のｐＩＲＥＳ（カリフォルニア州パロアルトのビーディー・バイオサイエンス・クローンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））と、（２）ＮＦｋＢ−ｌｕｃレポーター（カリフォルニア州ラホラのストラータジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を１０：１の割合で、フジーン６（Ｆｕｇｅｎｅ  ６）導入試薬（インディアナ州インディアナポリスのロシュ・ダイアグノスティックス・コーポレーション（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））を使用し、製造者の説明書にしたがって同時導入させた。導入後、皿を２４時間インキュベートし、その後、Ｇ−４１８（４００μｇ／ｍＬ）中で２週間の選択を行った。刺激実験のために、ＴＬＲ８または空ベクターを含有するＧ−４１８耐性細胞を、Ｇ−４１８を補足したＨＥＫ２９３培地に展開した。
【０１０８】
導入細胞を、１００μＬのＨＥＫ２９３培地を入れた白色不透明の９６ウエルプレート（コスター３９１７（Ｃｏｓｔｅｒ３９１７）、ニューヨーク州コーニングのコーニング・インコーポレーティッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））で、１ウエル当たり５×１０4個の濃度で培養し、３７℃、８％ＣＯ2中で４時間インキュベートした。濃度１ｍＭのＩＲＭ化合物のＤＭＳＯ溶液（最終のＩＲＭ濃度は１０μＭ）１μＬ、または、コントロールとしてＤＭＳＯ１μＬにより細胞を刺激した。その後、３７℃、５％ＣＯ2中で、さらに１６時間、プレートをインキュベートした。ＬＭＡＸルミノメーター（カリフォルニア州サニーヴェールのモレキュラー・デバイシズ・コーポレーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））で蛍光を測定した。
【０１０９】
【表５】
2006517974.tif 000006
【０１１０】
実施例２−ＴＬＲ８アゴニストによる単球の刺激
ｐＨ８．０の０．５ＭのＥＤＴＡ（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））７５０μＬが入った６０ｍＬシリンジに全血を採取した。血液を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＤＰＢＳ、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））で１：１の希釈を行い、ヒストパクー１０７７（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を被せた。細胞を、２５℃、２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離した。軟膜層を分離し、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間、ＤＰＢＳにより３回洗浄した。
【０１１１】
ミルテニーのマイクロビーズ技術システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（カリフォルニア州オーバーンのミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））を使用して、ＰＢＭＣから単球を分離した。ＰＢＭＣを、１０7の全細胞当たり６０μｌの４℃分離緩衝液（ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ−２．５ｇｍ、２ｍＭ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。ＣＤ１４＋マイクロビーズ（カタログ番号１３０−０５０−２０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））およびＦｃＲブロッキング試薬（ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（カタログ番号１３０−０５９−９０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））を、１０7の全細胞当たりそれぞれ２０μＬ加え、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、１０8の全細胞当たり５００μＬの分離緩衝液中に再懸濁させた。その後、トップに予備分離フィルター（カタログ番号１３０−０４１−４０７、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））を備えたＬＳ＋カラム（カタログ番号１３０−０４２−４０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））に細胞を加え、分離緩衝液で３回洗浄した。陰性細胞をカラムに通過させた。カラムに保持された細胞を、５ｍＬの分離緩衝液で、無菌の１５ｍＬポリスチレンコニカルチューブに溶出した。ＣＤ１４＋細胞を、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、２×１０6細胞／ｍＬでＸ−ＶＩＶＯ２０（メリーランド州ウォーカーズビルのバイオ・フイッタッカー（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））中に再懸濁させた。
【０１１２】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、無菌細胞培養グレード、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中に溶解した化合物を、最終濃度の２倍の濃度、６０μＭで、９６ウエルの平坦底面無菌組織培養用ポリスチレンプレート（ニュージャージー州フランクリンレークスのベントン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に加え、１：３の希釈を連続的に行って、０．０２μＭにまで希釈した。その後、最終濃度の２倍の濃度（最終細胞濃度は１×１０6個／ｍＬ）で細胞を加えた。ＴＬＲ８を活性化させないものとして同定されたＩＲＭ化合物、ＩＲＭ１６、を使用した陰性コントロールを参照用に加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ2中で１６〜２４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを２５℃、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上澄みを、０．７５ｍＬ無菌ポリプロピレンマトリックスボックス（Ｍａｔｒｉｘ  ｂｏｘ）（ニューヨーク州ハドソンのマトリックス（Ｍａｔｒｉｘ，Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ））に移し、その後のサイトカインの分析のために−２０℃で保存した。
【０１１３】
ＩＧＥＮ分析法を使用して、ＩＬ−１２の分析を行った。分析を行う２時間より前に、Ｍ−２８０ストレプタビジンダイナビーズ（Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の１：２０希釈液をＩＧＥＮ緩衝液中で調製した。また、ＩＧＥＮ緩衝液中でビオチン化ＩＬ−１２抗体（カタログ番号ＡＨＣ７１２９、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））の１μｇ／ｍＬ溶液を調製した。１：２０ダイナビーズ溶液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とビオチン化抗体溶液を混合し、室温で３０分間インキュベートし、その後、分析を行うまで４℃で保存した。
【０１１４】
分析を行うために、５０μＬのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）／ビオチン化抗体溶液を、９６ウエルプレートの各ウエルに加えた。次に、１μｇ／ｍＬのオリタグでラベルしたＩＬ−１２抗体（Ｏｒｉ−ｔａｇｇｅｄ  ＩＬ−１２  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（カタログ番号８１２２、（カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））のＩＧＥＮ緩衝液溶液２５μＬを各ウエルに加えた。標準希釈体または実験試料を含有する試料２５μＬを各ウエルに加えた。
【０１１５】
プレートシール材料で覆った９６ウエルプレートをタッピングし、各ウエルの内容物を混合した後、室温で２．５時間インキュベートした。
【０１１６】
インキュベート後、２００μＬの全アッセイ容積に対して、各ウエルに１００μＬのＩＧＥＮ  ＰＢＳ緩衝液（ＩＧＥＮ  ＰＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）を加え、ｈＩＬ−１２プロトコルを使用して、ＩＧＥＮ  Ｍ−８アナライザー（ＩＧＥＮ  Ｍ−８  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（メリーランド州のガイザースバーグのＩＧＥＮ・インターナショナル・インコーポレーティッド（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））で測定した。
【０１１７】
ＴＮＦ分析を、（１）ビオチン化抗体溶液を、ＩＧＥＮ緩衝液中で、２μｇ／ｍＬのビオチン化ＴＮＦ抗体（カタログ番号ＡＨＣ３４１９、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））から調製したこと、（２）オリタグ付抗体（Ｏｒｉ‐ｔａｇｇｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）がＴＮＦ抗体（カタログ番号ＡＨＣ３７１２、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））であること、および、（３）アッセイをｈＴＮＦプロトコルを使用して、ＩＧＥＮ  Ｍ−８アナライザー（ＩＧＥＮ  Ｍ−８  Ａｎａｌｙｚｅｒ）で測定したことを除いて、ＩＬ−１２分析に用いたと同様のＩＧＥＮ分析法を使用して実施した。
【０１１８】
結果を図１および図２に示す。
【０１１９】
実施例３−ＴＬＲ８アゴニストによる単球由来樹状細胞の刺激
ｐＨ８．０の０．５ＭのＥＤＴＡ（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））７５０μＬが入った６０ｍＬシリンジに全血を採取した。血液を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＤＰＢＳ、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））で１：１希釈の行い、ヒストパクー１０７７（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を被せた。細胞を、２５℃、２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離し、軟膜層を分離し、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間、ＤＰＢＳにより３回洗浄した。
【０１２０】
ミルテニーのマイクロビーズ技術システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（カリフォルニア州オーバーンのミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））を使用して、ＰＢＭＣからモノサイトを分離した。ＰＢＭＣを、１０7の全細胞当たり６０μｌの４℃分離緩衝液（ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ−２．５ｇｍ、２ｍＭ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。ＣＤ１４＋マイクロビーズ（カタログ番号１３０−０５０−２０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ））およびＦｃＲブロッキング試薬（ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（カタログ番号１３０−０５９−９０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ））を、１０7の全細胞当たりそれぞれ２０μＬ加え、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、１０8の全細胞当たり５００μＬの分離緩衝液中に再懸濁させた。その後、トップに予備分離フィルター（カタログ番号１３０−０４１−４０７、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））を備えたＬＳ＋カラム（カタログ番号１３０−０４２−４０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））に細胞を加え、分離緩衝液で３回洗浄した。陰性細胞をカラムに通過させた。カラムに残った細胞を、５ｍＬの分離緩衝液で、無菌の１５ｍＬポリスチレンコニカルチューブに溶出した。ＣＤ１４＋細胞を、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、ミネソタ州セントポールのセロックス・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド（Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）；１０％の加熱不活性化ＦＢＳ、コロラド州フォートコリンズのアトラス（Ａｔｌａｓ，Ｆｔ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）および０．１％のゲンタミシン、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））中に再懸濁させた。ＣＤ１４＋細胞を、１×１０6個／ｍＬで、適当な容積の組織培養フラスコ（ニュージャージー州フランクリンレークスのベントン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に、ｃＲＰＭＩ、ｒＩＬ−４（バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））、ｒＧＭ−ＣＳＦ（バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））およびＴＧＦβ（ミネソタ州ミネアポリスのアール・アンド・ディー・システムズ・インコーポレーティッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））とともに入れ、３７℃、５％ＣＯ2で５〜７日間培養した。
【０１２１】
細胞をフラスコから回収し、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、２×１０6個／ｍＬでｃＲＰＭＩ中に再懸濁させた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、無菌細胞培養グレード、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中に溶解した化合物を、最終濃度の２倍の濃度、２０μＭで、９６ウエルの平坦底面無菌組織培養用ポリスチレンプレート（ニュージャージー州フランクリンレークスのベントン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に加え、１：３の希釈を連続的に行って、０．６μＭにまで希釈した。その後、最終濃度の２倍の濃度（最終細胞濃度は１×１０6個／ｍＬ）で細胞を加えた。ＴＬＲ８を活性化させないものとして同定されたＩＲＭ化合物、ＩＲＭ１６、を使用した陰性コントロールを参照用に加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ2中で１６〜２４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを、２５℃、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上澄みを、０．７５ｍＬ無菌ポリプロピレンマトリックスボックス（Ｍａｔｒｉｘ  ｂｏｘ）（ニューヨーク州ハドソンのマトリックス（Ｍａｔｒｉｘ，Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ））に移し、その後のサイトカインの分析のために−２０℃で保存した。
【０１２２】
サイトカインの分析を、実施例２で記載したように行った。結果を図３および図４に示す。
【０１２３】
実施例４−ＴＬＲ８アゴニストによるマクロファージの刺激
ｐＨ８．０の０．５ＭのＥＤＴＡ（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））７５０μＬが入った６０ｍＬシリンジに全血を採取した。血液を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＤＰＢＳ、カリフォルニア州カマリロのバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））で１：１の希釈を行い、ヒストパクー１０７７（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を被せた。細胞は、２５℃、２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離した。軟膜層を分離し、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間、ＤＰＢＳにより３回洗浄した。
【０１２４】
ミルテニーのマイクロビーズ技術システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（カリフォルニア州オーバーンのミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））を使用して、ＰＢＭＣから単球を分離した。ＰＢＭＣを、１０7の全細胞当たり６０μｌの４℃分離緩衝液（ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ−２．５ｇｍ、２ｍＭ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。ＣＤ１４＋マイクロビーズ（カタログ番号１３０−０５０−２０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ））およびＦｃＲブロッキング試薬（ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（カタログ番号１３０−０５９−９０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃ））を、１０7の全細胞当たりそれぞれ２０μＬ加え、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、１０8の全細胞当たり５００μＬの分離緩衝液中に再懸濁させた。その後、トップに予備分離フィルター（カタログ番号１３０−０４１−４０７、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ））を備えたＬＳ＋カラム（カタログ番号１３０−０４２−４０１、ミルテニー・バイオ・テック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ））に細胞を加え、分離緩衝液で３回洗浄した。陰性細胞をカラムに通過させた。カラムに残った細胞を、５ｍＬの分離緩衝液で、無菌の１５ｍＬポリスチレンコニカルチューブに溶出した。ＣＤ１４＋細胞を、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、ミネソタ州セントポールのセロックス・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド（Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）；１０％の加熱不活性化ＦＢＳ、コロラド州フォートコリンズのアトラス（Ａｔｌａｓ，Ｆｔ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）および０．１％のゲンタミシン、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））中に再懸濁させた。ＣＤ１４＋細胞は、１×１０6個／ｍＬで、適当な容積の組織培養フラスコ（ニュージャージー州フランクリンレークスのベントン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に、ｃＲＰＭＩおよびＧＭ−ＣＳＦ（アール・アンド・ディー・システムズ・インコーポレーティッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））とともに入れ、３７℃、５％ＣＯ2で５〜７日間培養した。
【０１２５】
細胞をフラスコから回収し、２５℃、１３５０ＲＰＭで１０分間遠心分離し、２×１０6個／ｍＬでｃＲＰＭＩ中に再懸濁させた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、無菌細胞培養グレード、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中に溶解した化合物を、最終濃度の２倍の濃度、２０μＭで、９６ウエルの平坦底面無菌組織培養用ポリスチレンプレート（ニュージャージー州フランクリンレークスのベントン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））に加え、１：３の希釈を連続的に行って、０．６μＭにまで希釈した。その後、最終濃度の２倍の濃度（最終細胞濃度は１×１０6個／ｍＬ）で細胞を加えた。ＴＬＲ８を活性化させないものとして同定されたＩＲＭ化合物、ＩＲＭ１６、を使用した陰性コントロールを参照用に加えた。プレートは、３７℃、５％ＣＯ2中で１６〜２４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを、２５℃、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上澄みを、０．７５ｍＬ無菌ポリプロピレンマトリックスボックス（Ｍａｔｒｉｘ  ｂｏｘ）（ニューヨーク州ハドソンのマトリックス（Ｍａｔｒｉｘ，Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ））に移し、その後のサイトカインの分析のために−２０℃で保存した。
【０１２６】
サイトカインの分析は、実施例２で記載したように行った。結果を図５および図６に示す。
【０１２７】
実施例５−ＴＬＲ８アゴニストは、ＨＥＫ２９３細胞において用量依存ＴＬＲ８介在細胞応答を誘発する
実施例１に記載したようにしてＨＥＫ２９３細胞への導入を行った。ＨＥＫ２９３培養細胞を、濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１．０μＭ、３．０μＭ、１０μＭ、３０μＭ、または、ビヒクルコントロールの、ＩＲＭ化合物または陰性コントロール化合物（１，５−ジヒドロ−１−（２−メチルプロピル）−４Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−オン、米国特許第４，６９８，３４８号明細書、実施例７１）と共にインキュベートした。培養細胞を、その他の点では実施例１に記載したようにしてインキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを、実施例１に記載したようにしてＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位）で読み取った。結果を図７〜図１１および表３に示す。
【０１２８】
【表６】
2006517974.tif 000007
【表７】
2006517974.tif 000008
【表８】
2006517974.tif 000009
【０１２９】
当業者には、本発明の範囲と精神から逸脱することなくなされる、本発明に対する種々の修正や変更が明らかとなるであろう。説明用の実施形態や実施例は、単に例としてのみ提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲は、次述する特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ＴＬＲ８アゴニストによるヒト単球内のＴＮＦ−αの誘導を示す線グラフである。
【図２】ＴＬＲ８アゴニストによるヒト単球内のＩＬ−１２の誘導を示す線グラフである。
【図３】ＴＬＲ８アゴニストによるヒト単球由来樹状細胞内のＴＮＦ−αの誘導を示す線グラフである。
【図４】ＴＬＲ８アゴニストによるヒト単球由来樹状細胞内のＩＬ−１２の誘導を示す線グラフである。
【図５】ＴＬＲ８アゴニストによるヒトマクロファージ内のＴＮＦ−αの誘導を示す線グラフである。
【図６】ＴＬＲ８アゴニストによるヒトマクロファージ内のＩＬ−１２の誘導を示す線グラフである。
【図７】ある種のＴＬＲ８アゴニストによるＨＥＫ２９３細胞内のＴＬＲ８の活性化を示す線グラフである。
【図８】ある種のＴＬＲ８アゴニストによるＨＥＫ２９３細胞内のＴＬＲ８の活性化を示す線グラフである。
【図９】ある種のＴＬＲ８アゴニストによるＨＥＫ２９３細胞内のＴＬＲ８の活性化を示す線グラフである。
【図１０】ある種のＴＬＲ８アゴニストによるＨＥＫ２９３細胞内のＴＬＲ８の活性化を示す線グラフである。
【図１１】ある種のＴＬＲ８アゴニストによるＨＥＫ２９３細胞内のＴＬＲ８の活性化を示す線グラフである。
【図１】
2006517974.tif 000010
【図２】
2006517974.tif 000011
【図３】
2006517974.tif 000012
【図４】
2006517974.tif 000013
【図５】
2006517974.tif 000014
【図６】
2006517974.tif 000015
【図７】
2006517974.tif 000016
【図８】
2006517974.tif 000017
【図９】
2006517974.tif 000018
【図１０】
2006517974.tif 000019
【図１１】
2006517974.tif 000020
【国際調査報告】
2006517974.tif 000021