(57)【要約】ポリヌクレオチド分子ならびにポリペプチド分子であるＡ３４およびＡ３３様３について記載し、さらにポリペプチド分子Ａ３４およびＡ３３様３に対する抗体を記載する。さらにまた、これらのポリペプチドを発現する癌を検出する方法、前記癌を診断する方法およびキット、ならびに患者における癌の作用を阻害する方法についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ３４抗原に特異的に結合する実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項２】
前記分子が、抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ｓｃＦｖｓフラグメント、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、または多量体抗体を含む請求項１記載の分子。
【請求項３】
前記分子が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥを含む請求項１記載の分子。
【請求項４】
前記分子が、Ａ３４に対して５０ｎＭを超える親和性を有する請求項１記載の分子。
【請求項５】
前記分子が、Ａ３４に対して５ｎＭを超える親和性を有する請求項１記載の分子。
【請求項６】
治療有効量の請求項１記載の分子および少なくとも１種の医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項７】
抗癌剤に抱合したＡ３４に結合する治療有効量の免疫グロブリン産物および少なくとも１種の医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項８】
Ａ３４抗原を発現する癌の患者における作用を低減させる方法であって、前記患者にＡ３４タンパク質に結合する治療有効量の免疫グロブリン分子を投与するステップを含む方法。
【請求項９】
Ａ３４抗原を発現する癌の患者における作用を低減させる方法であって、前記患者に抗癌剤と抱合させたＡ３４タンパク質に結合する治療有効量の免疫グロブリン産物を投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
Ａ３４タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド分子が少なくとも１種のプロモーターと機能的に関連して位置している、請求項１０記載の単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の単離ポリヌクレオチド分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１４】
Ａ３４、または前記Ａ３４の抗原性フラグメントを含む単離ポリペプチド分子。
【請求項１５】
前記単離ポリペプチドが、配列番号１または配列番号６を含む請求項１４記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１０の単離ポリヌクレオチド分子の組換え発現によって産生したポリペプチド。
【請求項１７】
癌細胞におけるＡ３４抗原の存在によって特徴付けられる癌を診断する方法であって：
対象の細胞サンプルを入手するステップと；
前記サンプルとＡ３４抗原に特異的に結合する物質とを、Ａ３４／物質複合体が形成されるように接触させるステップと；
前記複合体の存在または不在を検出するステップであって、前記複合体の存在が癌陽性の診断を示すステップと、を含む方法。
【請求項１８】
前記物質が抗体、またはその免疫学的に活性なフラグメントであり、前記抗体またはフラグメントが、Ａ３４タンパク質に対して特異的である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記物質が核酸分子であり、前記サンプルとＡ３４の核酸分子の全部または一部にハイブリダイズする核酸分子とを接触させるステップを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が、卵巣癌、胃癌、または食道癌である請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
癌性状態の退行、進行、または発症を決定する方法であって：
対象サンプルを入手するステップと；
前記サンプルとＡ３４抗原に特異的に結合する少なくとも１種の物質とを、Ａ３４／物質複合体が形成されるように接触させるステップと；
前記複合体の存在、不在または変化を検出するステップであって、前記複合体の存在、不在または発現レベルの変化が癌の進行、退行または発症の診断を示すステップと、を含むＡ３４抗原の存在、不在、または発現レベルの変化について前記癌性状態を備える患者からのサンプルを監視するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の物質が抗体、またはその免疫学的に活性なフラグメントであり、前記抗体またはフラグメントが、Ａ３４ポリペプチドに対して特異的である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記物質が核酸分子であり、前記サンプルとＡ３４の核酸分子の全部または一部にハイブリダイズする核酸分子とを接触させるステップを含む請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、卵巣癌、胃癌、または食道癌である請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫グロブリン分子が、ヒト化されてある請求項１から４のいずれか一項記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２６】
前記免疫グロブリン分子が、完全ヒトである請求項１から４のいずれか一項記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２７】
前記免疫グロブリン分子が、組換えである請求項１から４のいずれか一項記載の免疫グロブリン分子。
【請求項２８】
少なくとも１種の抗癌剤に抱合したＡ３４に結合する免疫グロブリン分子。
【請求項２９】
前記抗癌剤が、放射性同位体、化学療法剤および細胞毒性剤からなる群から選択される請求項２８記載の免疫グロブリン分子。
【請求項３０】
前記物質が、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、９０Ｙ、および１１１Ｉｎからなる群から選択される放射性同位体である請求項２９記載の免疫グロブリン分子。
【請求項３１】
前記物質が、ＱＦＡ、葉酸代謝拮抗剤、ＢＣＮＵ（カルムスチン）、メルカプトプリン、メトトレキサート、ドセタキセル、アドリアマイシン、カリケアミシン細胞毒素、細菌毒素、シュードモナス外毒素、リシン、およびジフテリア毒素からなる群から選択される化学療法剤または細胞毒性剤を含む請求項２８記載の免疫グロブリン分子。
【請求項３２】
前記物質が、少なくとも１つの毒素全体または毒素の特定ドメインを含む請求項２９記載の免疫グロブリン分子。
【請求項３３】
Ａ３４を発現する癌細胞がサンプル中に存在するかどうかを決定する方法であって：
対象サンプルとＡ３４をコードする核酸分子へ特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子とを接触させるステップであって、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子の核酸分子へのハイブリダイゼーションが前記サンプルにおけるＡ３４を発現する癌細胞の指標であるステップと；
そのようなハイブリダイゼーションの存在または不在を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーションの存在がＡ３４を発現する癌細胞の存在を示すステップと、を含む方法。
【請求項３４】
Ａ３４のアンチセンス配列であるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項３５】
該免疫グロブリン分子が、Ａ３４の細胞外部分に結合する請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項３６】
少なくとも１つの可変領域を含み、前記可変領域が配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４６、または配列番号４９からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項３７】
少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３７、配列番号４３、または配列番号４９からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項３８】
少なくとも１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３７、配列番号４３、または配列番号４９からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ３配列を含み；および前記軽鎖可変領域が配列番号３４、配列番号４０、または配列番号４６から選択される少なくとも１つのＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項３９】
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９からなる群から選択される３つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４０】
配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される３つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４１】
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９からなる群から選択される３つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域と、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される３つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４２】
配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域と、を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４３】
配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域と、を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４４】
配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域と、を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４５】
配列番号２３、配列番号２７、および配列番号３１から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４６】
配列番号２１、配列番号２５、および配列番号２９から選択される少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【請求項４７】
配列番号２３、配列番号２７、および配列番号３１から選択される少なくとも１つの重鎖可変領域と、および配列番号２１、配列番号２５、および配列番号２９から選択される１つの軽鎖可変領域と、を含む、請求項１記載の実質的に純粋な免疫グロブリン分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ３４およびＡ３３様３ポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびそれらのヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント、ならびにそれらのアンチセンス配列に関する。本発明はさらにまた、Ａ３４抗原および／またはＡ３３様３抗原に特異的に結合する免疫グロブリン産物、ならびにそれらのＣＤＲおよび可変領域に関する。本発明はさらにまた、そのような免疫グロブリン産物を用いて患者における癌を阻害する方法、およびそのような免疫グロブリン産物を含む組成物、ならびに癌を検出するキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の医学は、疾患に対する伝統的な治療法に分子生物学の進歩が交わることによって疑う余地なく質的に向上してきた。詳細には、免疫学は明確に特徴付けられた特異的抗体の提供によって、様々な疾患、特に腫瘍性疾患の治療にとって新たな希望を提供してきた。抗体は、特異的作用部位を標的にできるために治療薬として重要になっている。例えば、癌細胞は、特定抗体に対する結合部位または抗原である「マーカー」タンパク質を有していることがある。
【０００３】
従来、抗体は、実験動物に長期にわたって対象抗原を注入することによって実験動物（通常はマウスまたはウサギ）中で産生されていた。（免疫グロブリンの構造および生合成に関する一般的考察については、ダブリュ・イー・ポール（Ｗ．Ｅ．  Ｐａｕｌ）、「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９３年またはジェーンウェイ（Ｊａｎｅｗａｙ）ら，「免疫生物学：健康および疾患における免疫系（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００１年などの標準的な免疫学の教科書を参照されたい。）外来抗原は免疫応答を生じさせた；次に、結果として生じる抗体を血液から精製することができた。しかし、このアプローチには限界がある。様々な種由来の抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用は、潜在的な致死的応答を誘導することがある（例えば、マウス抗体をヒトに注入するとヒト抗マウス抗体応答−「ＨＡＭＡ」反応を引き起こすことがある。例えば、シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５：８７９−８８５（１９８５年）を参照）。さらに、非ヒト抗体はヒト補体または細胞性毒性を刺激するには有効性が低いであろう。
【０００４】
分子生物学は、さらにこれらの問題に対する解答も提供し始めている。現在
では、これらの問題に対処するためにキメラ抗体および組換え抗体が使用されている。キメラ抗体は、様々な種由来の抗体の部分を結合することによって免疫グロブリン産物の成分の性質を活用する。例えば、マウス由来の可変領域をヒト由来の定常領域と結び付けることができる。その後に組換えＤＮＡ技術を使用して様々な成分を切断およびスプライシングすると、機能的免疫グロブリン産物が形成される。抗体の有用性を免疫グロブリン産物へ拡大するためのまた別のアプローチは、「ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ」として知られる技術である。この方法では、相補性決定領域「ＣＤＲ」だけがヒト抗体フレームワーク内に挿入される。さらにこのアプローチは、ヒト可変領域内の重要なマウス抗体残基を置換することによって微調整することさえできる。その標的抗原への抗体の結合は、その重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を通して媒介されるが、重鎖のＣＤＲ３の役割が特に重要である（シウ（Ｘｕ）およびデイヴィス（Ｄａｖｉｓ），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：３７−４５，２０００年）。そのようなヒト化抗体の使用および産生についての研究は今も続けられているが、これらの技術は一般には現在使用段階にある。米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；および第５，８５９，２０５号は、そのような技術の例を記載している。
【０００５】
非ヒトタンパク質配列に対して起こり得る免疫原性応答の問題を回避するためのまた別のアプローチでは、完全ヒト抗体が使用されている。完全ヒト抗体を調製する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、完全ヒト抗体はマウス免疫グロブリンではなくヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスを免役することによって調製できる。そのようなマウスにおける抗体応答は、直接的に完全ヒト抗体を産生する。そのようなマウスの例には、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標））（アブジェニクス（Ａｂｇｅｎｉｘ）社）およびＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ＠（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ）社）が含まれる。さらに米国特許第６，２０７，４１８号、第６，１５０，５８４号、第６，１１１，１６６号、第６，０７５，１８１号、第５，９２２，５４５号、第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号も参照されたい。抗体は、次に例えば標準ハイブリドーマ技術などの標準技術、またはファージディスプレイ法（下記を参照）によって調製できる。その場合、これらの抗体は完全ヒトアミノ酸配列しか含有していない。
【０００６】
完全ヒト抗体を含むモノクローナル抗体は、ファージディスプレイライブラリーから生産および単離することもできる。ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング法は当技術分野においてよく知られているが、例えばマークス（Ｍａｒｋｓ）ら，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２（３）：５８１−５９７（１９９１年）；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２２７（２）：３８１−３８８（１９９２年）；ならびに米国特許第５，８８５，７９３号および第５，９６９，１０８号を参照されたい。
【０００７】
次の参考文献は、そのような完全ヒト抗体およびファージディスプレイ法に関する例である：マークス（Ｍａｒｋｓ）ら，「免疫の迂回。ファージ上でディスプレイされたＶ−遺伝子ライブラリー由来ヒト抗体（Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｐｈａｇｅ）」，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２（３）：５８１−５９７（１９９１年）；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら，「免疫の迂回。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再編成された生殖細胞系ＶＨ遺伝子セグメントの合成レパートリー由来ヒト抗体（Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２７（２）：３８１−３８８（１９９２年）。
【０００８】
治療用モノクローナル抗体の有効性を改善するために、例えばそれらのｉｎ  ｖｉｖｏエフェクター機能の強化、それらと細胞毒性物質または放射性核種との直接的結合、および前標的化プロドラッグでの、そのような結合物質の活性化、並びにモノクローナル抗体療法と従来型の化学療法措置との併用などの新規のストラテジーが導入されてきた。これらの第二世代モノクローナル抗体を使用する大規模臨床試験は現在進行中であるが、一部は癌治療のためのＦＤＡ承認を獲得しており、中でも最も注目に値するのは、乳癌治療のための抗ｃ−ｅｒｂＢ−２／Ｈｅｒ２ｎｅｕ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ））、非ホジキンリンパ腫治療のための抗ＣＤ２０（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））、およびＢ細胞慢性リンパ性白血病治療のための抗ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
新しい、治療上重要な細胞表面標的分子の発見は、モノクローナル抗体技術における急速な進歩に遅れを取っており、これに関して進んでいるのはほんの少数の抗原標的だけである。これは、ヒトゲノム、トランスクリプトーム、およびプロテオームの解析から生じる遺伝子発見における極めて重大な進歩を考えると特に当てはまる。これとは対照的に、活性特異的癌免疫療法、すなわち癌ワクチンのための細胞内標的の同定は最近１０年間に広く行われてきた。そこで、新規の細胞表面抗原に対するヒトトランスクリプトームの発掘は高度に正当化されている。これに関連して、本発明の一部は、組織限定細胞表面タンパク質をコードする新規転写産物に対するヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの探索から生じたのであるが、それはこれらがモノクローナル抗体に基づく治療法にとって新規標的となる可能性があるためである。
【００１０】
Ａ３３／ＪＡＭ遺伝子ファミリーには、以前から知られている少なくとも７種のタンパク質（Ａ３３、ＣＡＲ、ＨＣＴＸ、ＥＬＡＭ、ＪＡＭ１、ＪＡＭ２、およびＪＡＭ３）が含まれている。これらのタンパク質は、一般に２つの膜貫通ドメイン（単一シグナル配列を含む）および２つのＩｇ様ドメインによって識別される。メンバーの１つであるＡ３３は、結腸癌と関連することが知られている。Ａ３３分子の単離および特徴解析は、米国特許第５，７１２，３６９号に記載されている。Ａ３３に対するヒト化抗体は、米国特許第５，９５８，４１２号；第６，３０７，０２６号、およびレーダー（Ｒａｄｅｒ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５（１８）：１３６６８−７６（２０００年）に記載されている。Ａ３３抗体を使用する方法は、米国特許第６，３４６，２４９  Ｂ１号および米国特許第６，３４２，５８７号に記載されている。これらすべての参考文献は、特に参照として本明細書に組み込まれる。
【００１１】
Ａ３３に対するマウスおよびヒト化抗体を用いて、ヒトを対象とする臨床試験が実施されてきた。肝転移を伴う結腸癌患者では、１３１Ｉ−ｍＡｂ  Ａ３３の生体内分布および画像特性が研究されてきた。これらの研究は、ｍＡｂ  Ａ３３局在が抗原特異的であり、癌：肝比が非特異的抗体に比して特異的抗体については２．３から４５倍高いことを証明した。例えば、ウェルト（Ｗｅｌｔ）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  ８：１８９４−１９０６（１９９０年）を参照。その後の１３１Ｉ−ｍＡｂ  Ａ３３による放射線免疫療法の第Ｉ／ＩＩ相試験は、１３１Ｉ−ｍＡｂ  Ａ３３が、重度の前治療を受けていたが化学療法に対してもはや応答しない患者において穏当な抗癌作用を及ぼすことを証明した。例えば、ウェルト（Ｗｅｌｔ）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １２：１５６１−１５７１（１９９４年）を参照されたい。
【００１２】
Ａ３３  ｍＡｂｓについての他の臨床試験およびその結果は、例えばウェルト（Ｗｅｌｔ）ら，「ヒト転移性結腸癌における抗体局在化の定量解析：モノクローナル抗体Ａ３３の第Ｉ相試験（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａ３３）」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８（１１）：１８９４−９０６（１９９０年）；およびウェルト（Ｗｅｌｔ）ら，「進行性結腸癌患者におけるヨウ素１３１標識モノクローナル抗体Ａ３３の第Ｉ／ＩＩ相試験（Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｏｄｉｎｅ  １３１−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａ３３  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １２（８）：１５６１−７１（１９９４年）に記載されている。
【００１３】
しかし、Ａ３３は主として結腸癌に限定されるマーカーである。本明細書では、Ａ３３／ＪＡＭファミリーの２つの新規メンバーについて記載する。１つの新規タンパク質／遺伝子は「Ａ３４」と称する。このファミリーのもう１つの新規メンバーについても記載するが、これは「Ａ３３様３」と称する。
【００１４】
「分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｔｈｅｍ）」と題するジェイコブズ（Ｊａｃｏｂｓ）らの米国特許第６，３１２，９２１号は、Ａ３４と一部重複するタンパク質およびポリヌクレオチドを開示している。しかし、これらの配列はＡ３４またはＡ３３様３とは同一ではない；そして本発明に開示した方法とは対照的に、ジェイコブ（Ｊａｃｏｂ）が開示した使用は非特異的である。すなわち生物学的活性が特定されておらず、研究での使用、および栄養食品での使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、Ａ３３タンパク質と同一のタンパク質ファミリー由来の新規タンパク質、そしてこれらの新規タンパク質を認識する、およびそれらに結合する免疫グロブリン産物に関する。Ａ３３タンパク質ファミリーの２つの追加のメンバー、すなわちＡ３４およびＡ３３様３タンパク質を同定し、本明細書に記載した。これら３つは、それらのアミノ酸配列および発現プロファイルによって示されるように、Ａ３３／ＪＡＭファミリーのメンバーである。Ａ３４に対する抗体は、食道癌、卵巣癌、および胃癌を治療する際に特に重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（用語の定義）
二重特異性抗体：二重特異性抗体は、好ましくはヒトまたはヒト化された、少なくとも２種の抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。本出願の場合、１つの結合特異性はＡ３４またはＡ３３様３に対してであり、もう１つの結合特異性はいずれか他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質もしくは受容体もしくは受容体サブユニットに対してである。
【００１７】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において知られている。従来的には、二重特異性抗体の組換え産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、このとき２本の重鎖は相違する特異性を有する［ミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）およびクエロ（Ｃｕｅｌｌｏ），Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３年）］。組換えＤＮＡ技術を使用して二重特異性抗体または二重特異性抗体フラグメントを生成する方法もまた当技術分野においてよく知られている［クリアンクム（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ）ら，Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２００１  Ｓｅｐ；１８（２）：３１−４０］。
【００１８】
癌：制御できない細胞成長および／又は増殖を特徴とする多数の疾患のいずれか１種。その例は、新生物、腺癌、上皮性癌、腫瘍、白血病などである。
【００１９】
ＣＤＲ：免疫グロブリン分子の部分である相補性決定領域。各重鎖および軽鎖において存在する、典型的には各々３つのＣＤＲが存在する。
【００２０】
エピトープ：免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の一部分（一般には１つのタンパク質であるが、いずれの成分であってもよい）。
【００２１】
フラグメント：当技術分野において、免疫グロブリンまたは抗体の様々なフラグメント、すなわちＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ｓｃＦｖｓなどが知られている。Ｆａｂフラグメントは、一緒に共有結合して１種の抗原に特異的に結合できる、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性部分から構成される多量体タンパク質である。Ｆａｂフラグメントは、無傷免疫グロブリン分子のタンパク質分解性開裂（例えば、パパインを用いて）を介して生産される。Ｆａｂ２フラグメントは、２つの連結したＦａｂフラグメントを含んでいる。これら２つのフラグメントが免疫グロブリンヒンジ領域によって連結されると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生じる。Ｆｖフラグメントは、一緒に共有結合して１種の抗原に特異的に結合できる、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性部分から構成される多量体タンパク質である。フラグメントは、軽鎖可変領域を１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、もしくは関連する重鎖成分を含まずに軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント、または重鎖可変領域を１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、もしくは関連する軽鎖成分を含まずに重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体であってよく、これは例えば米国特許第６，２４８，５１６号に記載されている。Ｆｖフラグメントまたは単一領域（ドメイン）フラグメントは、典型的には関連する同定された領域の宿主細胞系内での発現によって生成される。これらやその他の免疫グロブリンまたは抗体フラグメントは本発明の範囲内に含まれており、ポール（Ｐａｕｌ）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙまたはジェーンウェイ（Ｊａｎｅｗａｙ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（上記で言及した）などの免疫学の標準的な教科書に記載されている。分子生物学を利用すると、現在ではこれらのフラグメントの直接的合成（細胞内での発現または化学的）ならびにそれらの組み合わせの合成が可能である。抗体または免疫グロブリンのフラグメントはさらにまた、上記に記載した二重特異性機能を有することができる。
【００２２】
免疫グロブリン分子（Ｉｇ）：１クラスのタンパク質分子は、１つ以上の免疫グロブリンドメインを有する体液（例、血漿、初乳、および涙）中に存在する。典型的には、単量体免疫グロブリン分子は４本のポリペプチド鎖を含む。これら４本の鎖は２本の同一重鎖および２本の同一軽鎖であり、ジスルフィド結合によって連結されてＹ字形単量体抗体分子を形成している。
【００２３】
免疫グロブリンスーパーファミリー分子：免疫グロブリンまたは免疫グロブリンドメインに高度に類似するドメインサイズおよびアミノ酸配列を有する分子。この類似度の有意性は、コンピュータプログラム（例えば、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９１：５２４−５４５（１９８３年）によって記載されたプログラムであるＡｌｉｇｎ）によって決定される。Ａｌｉｇｎコンピュータプログラムのスコアが３未満である場合は、その分子が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示している。その例には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ、軽鎖κおよびλ、主要組織適合性抗原など由来の免疫グロブリン重鎖が含まれる。
【００２４】
多量体タンパク質：相互に結び付いて特定のタンパク質ユニットを生成する１以上の別個のポリペプチドまたはタンパク質鎖を含有するタンパク質。これらの単位は同一であっても相違していてもよい。すなわちホモダイマーおよびヘテロダイマーのどちらも包含される。
【００２５】
ポリペプチドおよびペプチド：隣接アミノ酸のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって共有結合したアミノ酸の直鎖系。
【００２６】
タンパク質：前記アミノ酸が隣接アミノ酸のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって共有結合している約５０アミノ酸より長い直鎖系。
【００２７】
治療有効量：治療の経過においてそれを必要とする患者に投与される組成物の量。有効成分の量および濃度は医学および生物医学分野の当業者の技術の範囲内に含まれ、治療を必要とする患者の年齢、健康、体重、身長、総合的健康状態、疾患状態、または他に摂取している薬剤が考慮に入れられる。
【００２８】
療法または治療：患者における疾患の作用の全部または一部を阻害する、低減させる、緩和する、および／または改善する方法。治療には、現在は症状を経験していないが、その疾患のリスク状態にある、またはその可能性がある患者における疾患発生の予防が含まれる。
【００２９】
本発明は、単離Ａ３４およびＡ３３様３タンパク質および／またはポリペプチド分子、並びにこれらのタンパク質および／またはポリペプチド分子をコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む。本発明は、さらにこれらのタンパク質および／またはそのエピトープ、に結合する単離免疫グロブリン産物ならびに可変領域および／またはＣＤＲを含むそれらの様々なフラグメントも含む。
【００３０】
本発明によるタンパク質および／または免疫グロブリン産物は、天然起源から単離できる、または宿主細胞中で組換え産生することができる。当業者に知られている保存的置換、すなわち実質的に類似の配列を生じさせる置換は、本発明の範囲内に含まれる。保存的置換は、置換前の分子に比較して分子の特性を重大には変化させないそれらのアミノ酸または核酸の置換である。本発明の実質的に類似の核酸フラグメントは、さらにまた当業者によって一般的に使用されるアルゴリズムによって決定されるような、本明細書に開示したアミノ酸配列に対するそれらがコードするアミノ酸配列の同一性率によって特性付けることができる。
【００３１】
本明細書で使用する用語「保存的置換」は、他の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。したがって、本発明の状況では、保存的置換は当技術分野において１つのアミノ酸の類似の特性を有する他のアミノ酸に対する置換であると認識されていると理解されたい。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基と他の残基との置換、あるいはアルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンなどの１つの極性残基と他の残基との置換が含まれる。相互に置換できる天然親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが含まれる。用語「保存的置換」にはさらにまた、未置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用が含まれる。
【００３２】
代表的な保存的置換は、国際特許出願第９７／０９４３３号からの下記の表１に記載されている。
【００３３】
【表１】
2006512910.tif 000002
【００３４】
あるいは、保存的アミノ酸は下記の表２に記載されているように、レーニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第二版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社，  ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５年）、第７１−７７頁に記載されているように分類できる。
【００３５】
【表２】
2006512910.tif 000003
【００３６】
代表的な保存的置換は、下記の表３に記載されている。
【００３７】
【表３】
2006512910.tif 000004
【００３８】
所望であれば、本発明のペプチドは、本発明のポリペプチドの、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、もしくはリン酸化によって、酸付加塩、アミド、エステル、特にはＣ末端エステル、の作製によって、およびＮ−アシル誘導体によって修飾できる。ペプチドは、さらにまた他の成分との共有または非共有複合体を形成することによってペプチド誘導体を作製するために修飾できる。共有結合複合体は、ペプチドを含むアミノ酸の側鎖上の官能基へ、またはＮ末端もしくはＣ末端で化学成分を連結させることによって調製できる。
【００３９】
詳細には、上記のペプチドは、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素（例えば、比色もしくは蛍光反応を触媒する酵素）、基質、固体マトリックス、または担体（例、ビオチンまたはアビジン）を含むがそれらに限定されないレポーター基へ結合できることが予想されている。
【００４０】
適切な核酸フラグメント（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、本明細書で報告したアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書で報告したアミノ酸配列に対して約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書で報告したアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本明細書で報告したアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントである。適切な核酸フラグメントは、上記の同一性を有するだけではなく、典型的には少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにいっそうより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。さらに本発明には、本発明の単離ポリヌクレオチドのアンチセンス配列が含まれる。
【００４１】
配列アライメントおよび同一性率の計算は、例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して実施できる。配列マルチプルアライメントは、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いて、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９年）、ＣＡＢＩＯＳ．  ５：１５１−１５３）を使用して実施できる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアライメントのデフォルトパラメータは、例えばＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。
【００４２】
本明細書に示したマルチプル配列アライメントに対しては、ギャップオープンペナルティ（ＧＡＰ  ＯＰＥＮ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０およびギャップ伸長ペナルティ（ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝０．０５に基づくＣｌｕｓｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／で見いだされる）デフォルト設定を利用した。本明細書に示したペアワイズアライメントのためには、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１１およびＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１に基づく、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）で見いだされる）のためのデフォルト設定を使用した。
【００４３】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が含むタンパク質または遺伝子の推定同一性を得るために十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列を含んでいる。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、当業者によって手作業で、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（基本的局所アライメント検索ツール）；アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９３年）；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照）などのアルゴリズムを使用するコンピュータによる配列比較および同定ツールを使用することによって評価できる。
【００４４】
一般に、ポリペプチドもしくは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定同定するためには、１０個以上の連続アミノ酸または３０個以上の連続ヌクレオチドの配列が必要である。さらにその上、ヌクレオチド配列に関して、３０個以上の連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定（例、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュー・ハイブリダイゼーション）の配列依存方法において使用できる。さらに、１２個以上のヌクレオチドを含む短いオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして、そのプライマーを含む特定核酸フラグメントを入手するために使用できる。
【００４５】
したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、その配列を含む核酸フラグメントの特異的同定および／または単離を生じるヌクレオチド配列を含む。本明細書は、Ａ３４およびＡ３３様３を含むポリペプチドをコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告した配列を利用できる当業者は、当業者に知られている目的に本明細書に開示された配列の全部または実質的部分を使用することができる。したがって、本発明は添付の図面および配列表に報告した完全配列、並びに上記に定義したそれらの配列の実質的部分、およびそれらのアンチセンス配列を含む。
【００４６】
「コドンの縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変化を許容する遺伝子コードにおける相違を意味する。したがって、本発明には本明細書に記載したアミノ酸配列の全部または実質的部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸フラグメントが含まれる。当業者は、所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用における特異的宿主細胞によって示される「コドン偏位（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ）」をよく知っている。このため、宿主細胞中での発現を向上させるために核酸フラグメントを合成する場合には、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように核酸フラグメントを設計するのが望ましい。
【００４７】
免疫グロブリン分子は、抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖｓフラグメント、一本鎖抗体、多量体抗体、またはそれらの組み合わせであってよい。免疫グロブリン分子は、レポーターもしくは化学療法剤分子へ連結させられてよい、または追加のフラグメントへ結合させられてよい、そして単量体もしくは多量体産物であってよい。免疫グロブリン分子は、さらにまた可変領域および／またはＣＤＲの全部または一部を含むように組換え生産することもできる。
【００４８】
本発明の１種以上のタンパク質／１種以上の抗体は、Ａ３４および／またはＡ３３様３ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド分子を検出して、これらのタンパク質のいずれかを発現する癌の存在についての正確な診断を患者に提供することを可能にする。本発明による検出方法およびキットは、当技術分野において知られているいずれかの方法でＡ３４およびＡ３３様３分子を検出することができる。例えば、Ａ３４およびＡ３３様３の発現は、直接的に、例えばＰＣＲに基づく技術によってｍＲＮＡもしくはアンチセンステクノロジーを介して検出できる、または発現したタンパク質に結合する物質は、例えば前記Ａ３４およびＡ３３様３分子に結合して複合体を生成する抗体もしくはポリペプチドフラグメントを用いて直接的に検出できる。複合体を形成できる抗体もしくはポリペプチドフラグメントは、複合体の検出を容易にするために標識と連結させることができる。そのような標識は当技術分野においてよく知られており、例えば放射能標識および蛍光標識が含まれる。
【００４９】
結合した複合体は、Ａ３４タンパク質に対する親和性を備える免疫グロブリン分子を含んでいる。この親和性は、例えば表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））またはその他のバイオセンサーシステムによって測定されるように、約５０ｎＭ、または好ましくは約５ｎＭより大きい可能性がある。
【００５０】
本発明は、癌細胞中のＡ３４抗原の存在を特徴とする癌を診断する方法を含んでおり、この方法は対象細胞のサンプルを入手するステップと；前記サンプルとＡ３４抗原に特異的に結合する物質とをＡ３４／物質複合体が形成されるように接触させるステップと；および前記複合体の存在または不在を検出するステップであって、前記複合体の存在が癌陽性の診断を示すステップと、を含む。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、癌性状態の退行、進行、または発症を決定するための方法を含んでおり、この方法は対象サンプルを入手するステップと；前記サンプルとＡ３４抗原に特異的に結合する少なくとも１種の物質とをＡ３４／物質複合体が形成されるように接触させるステップと；および前記複合体の存在、不在または変化を検出するステップであって、前記複合体の存在、不在または発現レベルの変化が癌の進行、退行または発症の診断を示すステップと、を含むＡ３４抗原の存在、不在、または発現レベルの変化について前記癌性状態を備える患者からのサンプルをモニターするステップを含む。
【００５２】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、Ａ３４を発現する癌細胞がサンプル中に存在するかどうかを決定するための方法を含むが、この方法は対象サンプルとＡ３４をコードする核酸分子へ特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子とを接触させるステップであって、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子の核酸分子へのハイブリダイゼーションが前記サンプル中でのＡ３４を発現する癌細胞の指標であるステップと；およびそのようなハイブリダイゼーションの存在または不在を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーションの存在がＡ３４を発現する癌細胞の存在を示すステップと、を含む。
【００５３】
本発明によるキットは、一般に少なくとも１つのＡ３４およびＡ３３様３分子と複合体を形成する適切な物質（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子のどちらか）および対象サンプル中で複合体を形成かつ検出する方法についての取扱説明書を含む。
【００５４】
一般に、患者は哺乳動物である；好ましくは、患者はヒトである。
【００５５】
本発明による免疫グロブリン産物のまた別の利点は、Ａ３４および／またはＡ３３様３タンパク質を発現する癌または新生物の治療方法にある。これらの癌を検出することに加えて、本発明の免疫グロブリンを使用すると、本発明の免疫グロブリン産物を単独で、または医薬上許容される担体と一緒に、または別の抗癌剤と併用して投与することにより、前記癌および新生物を治療するため、または前記癌および新生物の作用を低下させるために使用できる。本発明の免疫グロブリン産物が追加の抗癌剤と併用して投与されると、その複合体は癌細胞を特異的に標的とするので、したがって健常組織の損傷を最小限に抑えながら抗癌剤の治療能力を最大限に発揮する。
【００５６】
（図面の簡単な説明）
以下では、添付の図面に示した代表的実施形態を参照しながら、本発明についてより詳細に記載する。
【００５７】
図１は、２４種の正常組織中のＡ３４  ｍＲＮＡのエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ発現を示した図である。
【００５８】
図２は、リアルタイムＰＣＲを使用して正常組織および悪性組織でのＡ３４発現の解析を示した図である。
【００５９】
図３は、全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）およびＡ３４とＡ３３（配列番号２）とのアミノ酸配列比較を示した図である。
【００６０】
図４は、最初に入手したＡ３４のポリヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示した図である。
【００６１】
図５は、追加のＡ３４クローンポリヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示した図である。
【００６２】
図６は、Ａ３３様３のポリヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示した図である。
【００６３】
図７は、追加のＡ３３様３（配列番号９）およびＡ３３（配列番号１０）のアミノ酸配列比較を示した図である。
【００６４】
図８は、ｍＡｂ  ３４２を用いた正常結腸粘膜および正常胃粘膜のウェスタンブロットを示した図である。
【００６５】
図９は、正常精巣でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００６６】
図１０は、正常精巣でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００６７】
図１１は、正常胃粘膜／表面上皮でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００６８】
図１２は、正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００６９】
図１３は、正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７０】
図１４は、正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７１】
図１５は、正常膵臓でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７２】
図１６は、正常膵臓でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。  
【００７３】
図１７は、胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７４】
図１８は、胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７５】
図１９は、胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７６】
図２０は、胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図である。
【００７７】
図２１は、２０９−９７０と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図である。ＣＤＲは影付き囲みの中に下線付きで表示した。
【００７８】
図２２は、２０９−５６４と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図である。ＣＤＲは影付き囲みおよび下線付きで表示した。
【００７９】
図２３は、２０９−３４２と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図である。
【００８０】
図２４は、３つのＡ３４抗体クローンについてのＣＤＲ領域のアミノ酸配列（配列番号３２−４９）を示した図である。
【００８１】
図２５は、全長Ａ３４ヌクレオチド配列（配列番号５０）を示した図である。
【００８２】
図２５は、全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）を示した図である。
【００８３】
（発明の概要）
本発明は、Ａ３３タンパク質と同一のタンパク質ファミリー由来の新規タンパク質、そしてこれらの新規タンパク質を認識する、およびそれらに結合する免疫グロブリン産物に関する。Ａ３３タンパク質ファミリーの２つの追加のメンバー、すなわちＡ３４およびＡ３３様３タンパク質を同定し、本明細書に記載した。これら３つは、それらのアミノ酸配列および発現プロファイルによって示されるように、Ａ３３／ＪＡＭファミリーのメンバーである。Ａ３４に対する抗体は、食道癌、卵巣癌、および胃癌を治療する際に特に重要である。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
逆転写およびＰＣＲのための一般的な材料および方法
【００８５】
腫瘍組織は、Ｃｏｒｎｅｌｌ大学Ｗｅｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ癌センターおよび日本の名古屋市立愛知がんセンター、研究センターから入手した。正常組織ＲＮＡ調製物はクローンテック  ラボラトリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（カリフォルニア州パロアルト）およびＡｍｂｉｏｎ社（テキサス州オースティン）から購入した。腫瘍組織からのトータルＲＮＡはグアニジンチオシアネート法によって調製した。
【００８６】
様々な正常組織由来の規準化ｃＤＮＡ調製物は、クローンテック  ラボラトリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。その他のｃＤＮＡ調製物（腫瘍組織および正常組織）は、インビトロジェン  ライフ  テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（カリフォルニア州カールズバッド）製のスーパースクリプトファーストストランド合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ）を使用して、製造業者の取扱説明書にしたがって４０ｍＬ反応液中で５μｇのトータルＲＮＡを使用して調製した。正常組織ｃＤＮＡは、オリジーン  テクノロジー（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（メリーランド州ロックビル）からも購入した。これは、図１に示したエンドポイントＲＴ−ＰＣＲデータに使用した２４種の組織についてのｃＤＮＡパネルの入手源である。
【００８７】
正常組織中のＡ３３、Ａ３４およびＡ３３様３  ｍＲＮＡ転写物の濃度は、リアルタイムＰＣＲによって、６種のハウスキーピング遺伝子（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）に対して規準化されている１６種の正常組織ｃＤＮＡ調製物（卵巣、白血球、前立腺、脾臓、精巣、胸腺、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤、骨格筋、膵臓、小腸および結腸）を使用して測定した。遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲプライマーは、プライマー発現ソフトウエア（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して設計した。それらの配列は以下に提供する。
【００８８】
マルチプレックスＰＣＲ反応は、１．２５μＬのＶｉｃ標識ヒトβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）内因性コントロールプローブ／プライマーミックス（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の専売色素）、２００ｎＭの６−カルボキシ−フルオレセイン標識遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ、ならびに濃度９００ｎＭの遺伝子特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマー（３００−９００ｎＭ）を補充したＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中で希釈した２．５μＬのｃＤＮＡを使用して調製した。各ｃＤＮＡサンプルについてトリプリケートＰＣＲ（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ  ＰＣＲ）反応液を調製した。ＰＣＲは、９５℃での変性（１５秒間）および６０℃でのアニーリング／伸長（６０秒間）の４０サイクルから構成した。
【００８９】
熱サイクリングおよび蛍光モニタリングはＡＢＩ  ７７００型配列解析装置（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を使用して実施した。サイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ）と呼ばれる固定閾値（ｆｉｘｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の上方でＰＣＲ産物が最初に検出される点を各サンプルについて測定した。正常組織中の遺伝子特異的転写物の存在度は、例えばＡ３３、Ａ３４および／またはＡ３３様３をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートの既知の濃度のＣｔ値から作成した標準曲線との比較によって決定した。
【００９０】
様々な癌標本および追加の正常組織（乳房、胃、食道、子宮頚部、副腎）に存在する対象の特異的転写物（すなわち、Ａ３４、Ａ３３様３など）の量は、同様に調製した正常精巣ｃＤＮＡ標本と比較して計算した。これらの実験では、結果として生じるＣｔ値は、ＧＵＳ内因性コントロールから入手したＣｔ値を差し引くことによって最初に規準化した（ＤＣｔ＝Ｃｔ  ＦＡＭ−Ｃｔ  ＶＩＣ）。
【００９１】
様々な癌標本および追加の正常組織（実験サンプル）中の対象ｍＲＮＡ（すなわち、Ａ３４、Ａ３３様３など）の濃度は、実験サンプルを用いて入手した規準化Ｃｔ値から正常組織を用いて入手した規準化Ｃｔ値を差し引く（Ａ３４については、正常精巣を用いて入手した規準化Ｃｔ値を差し引く）ことによって正常精巣と比較して計算し（ＤＤＣｔ＝実験サンプルのＤＣｔ−正常組織のＤＣ）、そして相対濃度を決定した（相対濃度＝２−ＤＤＣｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によって導き出され、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２，  １２／１１／９７に公表された式）。
【００９２】
次に標準物質として規準化精巣ｃＤＮＡ調製物（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）を使用して、実験サンプル中の相対濃度をｃＤＮＡ出発物質（ｆｇ）に関してブロットした。例えば、Ａ３４  ｍＲＮＡは胃癌標本＃５中では精巣で検出されたレベルの０．３８７倍のレベルで発現し、規準化した正常精巣標本中のＡ３４の発現レベルは３．３８ｆｇのｃＤＮＡ出発物質と等価であった。標準物質として正常精巣中の発現レベルを使用すると、胃癌標本＃５は１．３１ｆｇのｃＤＮＡ出発物質と等価のレベルで発現した（０．３８７×３．３８）。
【００９３】
（実施例２）
Ａ３４遺伝子およびそのマウスオルソログ
【００９４】
ヒトゲノムデータベースの解析によってＡ３４遺伝子は染色体Ｘｑ２２．１−２２．３へマッピングされたが、高類似度の配列は判明せず、これはＡ３４がさらなる追加のファミリーメンバーを有していない単一コピー遺伝子であることを示唆していた。Ａ３４遺伝子は長さがおよそ３４Ｋｂであり、染色体Ｘゲノム連続配列ＮＴ  ０１１７６５の塩基対１１７２０３−１５１２８３と等価である。Ａ３４遺伝子は７エクソンに及び、それによりエクソン１は５’非翻訳領域およびシグナル配列の大部分をコードし、エクソン２および３は可変（Ｖ）免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインをコードし、エクソン４および５は定常型２（Ｃ２）Ｉｇ様ドメインをコードし、エクソン６は膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの大部分をコードし、そしてエクソン７は細胞質ドメインの残りおよび３’非翻訳領域をコードする。このイントロン／エクソン構造は、Ａ３３遺伝子のイントロン／エクソン構造に極めて類似している。
【００９５】
Ａ３４の推定マウスオルソログは、ヌクレオチド類似度、相同ＥＳＴの組織分布、タンパク質類似度、染色体局在、および遺伝子構造に基づいて同定した。ヒトＡ３４ヌクレオチド配列とマウスＥＳＴデータベースとの比較は、マウスＵｎｉｇｅｎｅクラスターＭｍ．６６８９３に属するＥＳＴ配列との８３％を超えるヌクレオチド同一性を示した。現在、Ｕｎｉｇｅｎｅクラスター内には、正常精巣由来の２３ＥＳＴ、正常胃由来の６ＥＳＴおよび正常盲腸由来の２ＥＳＴを含む３１配列が存在する。この組織分布は、ヒトＡ３４  ＥＳＴ配列の組織分布に極めて類似している。
【００９６】
全長マウスＥＳＴクローンであるＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ４９３０４０５Ｊ２４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ ０３０１８１）は、このマウス遺伝子にとって基準ｃＤＮＡ配列である。この転写物は２１８２ヌクレオチドから構成されており、ヒトＡ３４と７３％同一であり（３３０アミノ酸が重複する）、ヒトＡ３４ドメイン構造、すなわち細胞外Ｖ型およびＣ２型Ｉｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを維持している４０７アミノ酸のタンパク質をコードする。細胞外システイン残基はヒトおよびマウスタンパク質間で保存されており、そしてヒトＡ３４と同様に、６つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位がある。細胞内ドメインはタンパク質の最少保存部分であるが、ヒトＡ３４と同様に、ＥＰ反復配列が推定マウスタンパク質の細胞内ドメインのカルボキシル末端残基内で見いだされる。マウスＡ３４遺伝子はマウス染色体Ｘゲノム連続配列ＮＴ０３９７１６の塩基対５５３４８６８−５５６６２０６と等価で長さがおよそ３１Ｋｂであり、そして上記に記載したヒトＡ３４の７エクソンと同一タンパク質ドメインをコードする７エクソンに及ぶ。
【００９７】
（実施例３）
以下のプライマーを使用して、正常組織でのＡ３４  ｍＲＮＡ発現を実施例１の実験方法にしたがってＲＴ−ＰＣＲによる最初の実験で調査した：
ＡＣＴＧＴＴＧＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＣＡＣ  Ａ３３Ｌ２Ｆ、塩基対２２２（配列番号１１）
ＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧ  Ａ３３Ｌ２Ｒ、塩基対５４３（配列番号１２）
【００９８】
これらの結果は、Ａ３４が精巣および胃では発現することを証明したが、試験した他の２２種の正常組織のいずれにおいても有意な発現は見いだされなかった。図１を参照（２４種の正常組織についてのＯｒｉｇｅｎｅ  ｃＤＮＡパネルを使用した）。
【００９９】
引き続いて、３４８アミノ酸（配列番号６）をコードする１０４５塩基対のＡ３４クローン（配列番号５）を入手した。入手したタンパク質は一部分であったが、その配列はアミノ末端最多４８アミノ酸（細胞外ドメインの一部である）およびカルボキシル末端最多４８アミノ酸（細胞内ドメインの一部である）を除く全部を含んでいる。
【０１００】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用した正常組織および腫瘍組織に対する詳細な発現分析には、次のプライマー：
Ｌ２ｆ＝ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴ（配列番号１３）
Ｌ２ｒ＝ＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＴＧＣＣ（配列番号１４）
を利用し、さらに次のＴａｑｍａｎプローブも使用した：
６ＦＡＭ−ＣＴＴＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＴＣ−ＴＡＭＡＲＡ（配列番号１５）。実験は、実施例１に記載した実験方法と同様に実施した。実施例２では、レポーター色素としてのＶＩＣまたはＦＡＭとともに、ＴＡＭＡＲＡをクエンチャー色素として使用したが、当業者に知られているあらゆるクエンチャー／レポーターシステムもまた使用できる。
【０１０１】
この実験は精巣および胃での有意なＡ３４発現を示したが、他の１９種の標本は低から微量レベルのＡ３４発現を示した。これらの結果は図２にグラフ表示した。Ａ３４はさらに、表４に示したように、胃癌６例中２例、食道癌１６例中９例、および卵巣癌１７例中４例において高レベルで発現した。この差次的発現は、抗体などの免疫グロブリン分子、および／または抗体−薬剤複合物もしくは抗体―放射性核種複合物などの抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）免疫グロブリン分子を用いてターゲッティングすることによって治療または診断のために活用できる。差次的発現は、さらにまたＡ３４核酸発現を測定する際にＰＣＲなどの技術を使用することによって診断のために活用することもできる。
【０１０２】
【表４】
2006512910.tif 000005
【０１０３】
Ａ３４  ｍＲＮＡ転写物の発現プロファイル
【０１０４】
Ａ３４ｍＲＮＡの発現パターンを調査するために、２１種の正常成体組織および種々の悪性組織由来の規準化ｃＤＮＡパネルを使用して、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。図２に示したように、Ａ３４  ｍＲＮＡは精巣（３．４ｆｇ）および胃（７．４ｆｇ）では高レベルで、正常膵臓（０．０７ｆｇ）中では低レベルで発現した。他の１３種の正常組織（脾臓、ＰＢＬ、胸腺、脳、心臓、肝臓、肺、胎盤、小腸、乳房、食道、副腎、子宮頚部（ｃｅｒｖｉｘ））では微量レベル（０．０３−０．００１ｆｇ）のｍＲＮＡしか検出されなかった。残り５種の正常組織（卵巣、前立腺、結腸、腎臓、および骨格筋）中では、Ａ３４  ｍＲＮＡは検出されなかった。様々な悪性組織由来の規準化ｃＤＮＡパネル中でもＡ３４  ｍＲＮＡ発現について試験した。図２に示したように、胃癌標本６例中２例、食道癌標本１６例中８例、および卵巣癌標本１７例中４例では高レベルＡ３４  ｍＲＮＡ発現（０．５ｆｇ以上）が検出された。Ａ３４  ｍＲＮＡは、肺癌（０／９標本）、結腸癌（０／５標本）、または乳癌（０／１３標本）では検出されなかった。そこで、試験したｃＤＮＡパネルでは、Ａ３４  ｍＲＮＡの発現は主として正常精巣および胃、並びに卵巣癌、胃癌および食道癌に限定された。
【０１０５】
（実施例４）
Ａ３４ｍＲＮＡ転写物の同定
【０１０６】
ヒトの癌に対するモノクローナル抗体に基づく治療法の新規標的として役立つであろうＡ３３結腸癌抗原のパラログを同定するために、アミノ酸配列糖タンパク質Ａ３３を翻訳非冗長ヌクレオチドデータベース：（ｔｂｌａｓｔｎ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）と比較した。
【０１０７】
Ａ３４と称する新規転写物が同定されたが、これは仮説的翻訳を行うと推定シグナル配列、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインおよび、細胞表面タンパク質をコードすることを示唆する膜貫通ドメインの限定された保存を含んでＡ３３との３１％のアミノ酸同一性を示した。Ａ３４転写物は、全長精巣由来ｃＤＮＡクローン、ＭＧＣ：４４２８７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０４３２１６）、並びに主に正常精巣（７ＥＳＴ）由来、およびさらに正常胃（２ＥＳＴ）、正常大動脈（１ＥＳＴ）、子宮癌（２ＥＳＴ）、膵臓癌（１ＥＳＴ）、およびプール組織（２ＥＳＴ）由来の他の１５種の相同発現配列タグ（ＥＳＴ）を含有するＵｎｉｇｅｎｅクラスターＨｓ．１７７１６４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）によって示めされた。限定された相同ＥＳＴの分布は、Ａ３４転写物が差次的に発現することを示唆した。
【０１０８】
ヒトゲノムデータベースの分析（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ）はＡ３４をコードする遺伝子を染色体Ｘｑ２２．１へマッピングした。そこで、Ａ３４は、その発現が配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｉｃ）組織および癌に限定され、そして治療用癌ワクチンにとっての標的分子と見なされる免疫原性タンパク質のグループである癌／精巣（ＣＴ）抗原ファミリーのメンバーと精巣由来ＥＳＴの有病率および染色体Ｘへのマッピングなどの一定の特徴を共有している。このため、Ａ３３結腸癌抗原との類似度、相同ＥＳＴの限定された組織分布、およびＣＴ抗原との類似度に基づいて、Ａ３４遺伝子産物は癌で発現する新規の細胞表面分子に関する本発明者らの研究の焦点となった。
【０１０９】
精巣由来ｃＤＮＡクローンであるＭＧＣ：４４２８７によって示めされる全長Ａ３４転写物は、３２Ｐ標識Ａ３４  ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした精巣ｍＲＮＡのノーザンブロットで検出された３．１Ｋｂの単一ハイブリダイゼーションシグナルと一致する長さである３０１７ヌクレオチドから構成される（図２５を参照）。ＭＧＣ：４４２８７によって表されるようなＡ３４転写物は、１２２塩基対の５’非翻訳配列および１７３１塩基対の３’非翻訳配列を含有している。Ａ３４ヌクレオチド配列は、追加の全長Ａ３４  ＥＳＴクローン、ＩＭＡＧＥ：５２６６７７１、ならびにヒト精巣ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって生成したＡ３４の全タンパク質コーディング領域を含む４種の独立ｃＤＮＡクローンをシーケンシングすることにより検証した。どちらのストラテジーもタンパク質コーディング領域においてＭＧＣ：４４２８７と同一であるｃＤＮＡ配列を産生したが、ＩＭＡＧＥ：５２６６７７１はＭＧＣ：４４２８７のヌクレオチド１７０２−２４１３に対応する３’非翻訳領域において７１２塩基対欠失を含有していた。
【０１１０】
Ａ３４タンパク質
【０１１１】
初期の実験は、Ａ３４（配列番号３）が３８７アミノ酸のタンパク質（配列番号４）をコードすることを証明した。引き続いて上記で詳述したＡ３４転写物のクローニングは、完全タンパク質およびＤＮＡを解明した（配列番号１および５０を参照）。
【０１１２】
予想ＡＴＧ開始部位は、タンパク質翻訳の開始のためのＫｏｚａｋコンセンサス配列に適合するクローンＭＧＣ：４４２８７の塩基対１２３で現れ、そして最長の可能性がある１１６１塩基対のオープンリーディングフレームが続く。Ａ３４タンパク質は、３つの構造ドメイン：２３３アミノ酸の細胞外ドメイン、２３アミノ酸の膜貫通ドメイン、および１３１アミノ酸の細胞内ドメインを含む３８７アミノ酸（Ｍｒ．４１，８１６）から構成された（図３）。最初のメチオニン残基に続いて、Ｎ末端最多２１アミノ酸は残基２１と２２との間の切断可能部位を含む推定疎水性シグナル配列を形成した。アミノ酸残基３３−１２３は、ジスルフィド結合を形成することが予測される２つのシステイン残基（Ｃ４３、Ｃ１１６）を含有するＮ末端、Ｖ型Ｉｇ様ドメインを含んでいた。３１アミノ酸のセグメントは、２つのシステイン残基（Ｃ１６ｌ、Ｃ２１１）を含有する残基１５４−２１８に存在するＣ２型の第２のＩｇ様ドメインからＶ型Ｉｇ様ドメインを分離した。
【０１１３】
Ａ３４の細胞外ドメインは６つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する。オリゴ糖鎖の平均サイズがおよそ２．５ｋＤａであることを前提にすると、Ａ３４の糖部分は潜在的におよそ１５ｋＤａの質量に寄与し、従って天然Ａ３４タンパク質の予想サイズ（２．３ｋＤａのシグナルペプチドより小さい）は５４．４ｋＤａである。疎水性プロットおよび膜貫通ドメイン予測ソフトウエア：
ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌおよび
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）は膜貫通ドメインを、その後に残基２５７−３８７を包含するＣ末端細胞内ドメインが続く残基２３４−２５６に位置つけた。Ａ３４細胞内ドメインは、７つの潜在的セリン／トレオニンリン酸化部位（カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位）、および１つのＧＳＫ３リン酸化部位を含有していた。２つのＴＲＡＦ２−結合コンセンサスモチーフは、アミノ酸３１４−３１７および３２４−３２７に存在する。さらに、Ａ３４のカルボキシル末端ではグルタミン酸／プロリン反復配列（ＥＰ）の独特のパターンが見いだされる。このパターンは、造血系細胞特異的タンパク質（ＨＳ１）およびｓｒｃ基質タンパク質ｐ８５／コータクチンの他の既知ヒトタンパク質でのみ見いだされる。
【０１１４】
Ａ３４のドメイン組織およびアミノ酸配列はそれをジャンクション接着分子（ＪＡＭ）ファミリー内に置いた。ＪＡＭファミリーには、細胞−細胞接着を媒介し、上皮細胞および内皮細胞のタイトジャンクションに局在すると考えられるＧＰＡ３３、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＸＡＤＲ）、皮質性胸腺細胞受容体様タンパク質（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＴＸＬ）、ＪＡＭ１／Ｆ１１受容体、ＪＡＭ２、およびＪＡＭ３／Ｍａｃ−１受容体などの分子が含まれる。メンバーは、２つの細胞外Ｉｇ様ドメイン（Ｖ型およびＣ２型）、細胞外ドメイン内の保存されたシステイン残基、および単一膜貫通ドメインによって特徴付けられる。Ａ３４ドメイン構造は類似の組織を有する。Ａ３４およびＡ３３のアライメントは図３に提供されている。Ａ３４アミノ酸配列は、細胞外ドメインにおける少なくとも４／６システイン残基の保存を伴って、ＣＴＸＬ（２４４アミノ酸の重複）、Ａ３３（２６２アミノ酸の重複）、ＪＡＭ２（２３２アミノ酸の重複）、ＣＸＡＤＲ（２５９アミノ酸の重複）、ＪＡＭ１（２７０アミノ酸の重複）、およびＪＡＭ３（１１３アミノ酸の重複）と各々３５％、３２％、２８％、２６％、２５％、および２７％同一である。
【０１１５】
Ａ３４は４１．８ｋＤａの予想分子量を有するが、これはＡ３３とは３２％同一およびＡ３３と４９％類似である。他のＡ３３／ＪＡＭファミリータンパク質との比較については表５を参照（類似度率はＢＬＡＳＴによって入手した）。
【０１１６】
Ａ３４は、染色体Ｘｑ２２．１−２２．３上のｕｎｉｇｅｎｅクラスターＨｓ．  １７７１６４内に位置づけられた。Ａ３４アミノ酸配列は、親水性シグナル（リーダー配列）残基２−２１、２つのＩｇ様ドメイン（残基３３−１２３、および１５４−２１８）、ならびに単一の膜貫通ドメイン（残基２３４−２５６）を含有している。
【０１１７】
【表５】
2006512910.tif 000006
【０１１８】
Ａ３４を含むＪＡＭファミリーの細胞内ドメインの保存は不良である。例えば、Ａ３４の細胞内ドメインは１３１アミノ酸から構成されるが、Ａ３３の細胞内ドメインは６０アミノ酸から構成され、２つの細胞内ドメイン間で組成における有意な類似度は見られない（図３）。
【０１１９】
Ａ３４抗体：
【０１２０】
Ａ３４タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査するために、Ａ３４の細胞外ドメイン（アミノ酸３５−２３１）に対してマウスモノクローナル抗体を生成した。Ａ３４の細胞外ドメイン由来の２０９アミノ酸（２３ｋＤａ）を含む組換えＨＩＳタグ組換えポリペプチドを産生した。マウスをこの組換えポリペプチドで免役し、３種のＩｇＧ１モノクローナル抗体を単離し（３４２、５６４、および９７０であると同定した）、そしてミリグラム量で精製した。
【０１２１】
３種のＩｇＧ１モノクローナル抗体に対応するハイブリドーマから標準ＲＮＡ単離技術（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８７  １６２：１５６−１５９）によってトータルＲＮＡを抽出した。１本鎖ｃＤＮＡは１本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用して調製し、重鎖および軽鎖のどちらに対してもｄ（Ｔ）１８を用いてプライミングした（レンナー（Ｒｅｎｎｅｒ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９８年  ２４（５）：７２０−２）。マウス重鎖および軽鎖に対する標準プライマーの組み合わせを使用してこのｃＤＮＡをＰＣＲにかけた。重鎖および軽鎖可変領域に対するＰＣＲ産物は、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カリフォルニア州カールスバッド）を使用してクローニングし、引き続いて標準方法を用いてシーケンシングした。３種のマウス抗体の可変領域およびＣＤＲ領域の配列は図２１−２４に示した。
【０１２２】
図８に示したように、モノクローナル抗体３４２はウェスタンブロットにおいてヒト胃粘膜から調製した５１ｋＤａタンパク質を認識した。このタンパク質は、ヒト結腸粘膜から調製した類似の可溶化液中には存在していなかった。ウェスタンブロットによって検出されたＡ３４タンパク質の５１ｋＤａサイズは、Ａ３４  ｃＤＮＡの仮定翻訳および予想糖寄与により決定された５４．４ｋＤＡの予想サイズと一致している。
【０１２３】
Ａ３４の予備免疫組織化学的分析を下記の通りにホルマリン固定パラフィン包埋組織について実施した。
【０１２４】
最初は、ＥＬＩＳＡによって陽性であった４つの抗体クローンを免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によって分析した。最初に既知のＡ３４ｍＲＮＡ発現を示した冷凍組織について反応性を試験し、新しく生成したハイブリドーマ上清の様々な希釈液について試験した。これらの組織は、ＯＣＴ（最適切断温度）化合物中に包埋した急速冷凍標本であった。５ｍｍ切片を低温アセトン中で１０分間固定し、３％  Ｈ２Ｏ２を使用して内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害を実施した。予備抗体インキュベーションを５℃で一晩実施した。一次抗体はビオチン化ウマ抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ，  Ｌａｂｓ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）二次抗体、その後にアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）システムによって検出した。３，３’−ジアミノベンジジン（Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ，  ＢｉｏＧｅｎｅｘ社、カリフォルニア州サンラモン）を色素原として機能させ、ヘマトキシリンを対比染色色素として使用した。
【０１２５】
次に反応性クローンを精製し、組織標本上でのＩＨＣ滴定によって最適作業濃度を確立した。４種中３種（３４２、９７０、５６４）のハイブリドーマクローンは冷凍胃および精巣組織で反応性を示し、希釈率はこれら全３種のクローンについて１：２０であった。これらのクローンを精製し、再び滴定すると、１．０μｇ／ｍＬで良好な染色が明らかになった。
【０１２６】
第２ステップでは、スチーマーおよび種々の抗原回収溶液から構成される抗原回収技術を使用して冷凍組織での３種の陽性クローンをホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロック上で試験した。一次抗体のインキュベーションおよび検出は、冷凍組織を用いた場合と同様に実施した。１パネルの正常組織ならびに胃癌を分析した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織では、最高の染色は、Ｔｒｉｓ酢酸塩（ＴＡ）緩衝液（ｐＨ  ８．０、ｌｍＭ）中において９３℃で３０分間スライドを加熱するステップを使用する抗原回収技術を使用して達成した。全３種のクローンは類似の染色を示し、その後の分析のためには３４２を選択した。
【０１２７】
結果
【０１２８】
正常組織では、免疫反応性は主として胃および精巣に存在した。胃では、粘膜で強度の染色が観察された。ほとんどは表面上皮から分化した腺（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｇｌａｎｄ）の底部にまで達する全上皮細胞成分の膜性およびさらに細胞質の染色であった（図１１−１４）。精巣では、全ての細管（ｔｕｂｕｌｅ）に存在した生殖細胞の細胞質染色を観察することができた（図９−１０）。膵臓では、管上皮の限局的な染色がときどき見られた（図１５−１６）。結腸、食道、小腸、肺、肝臓、皮膚および腎臓などの他の正常組織中では染色は存在しなかった。
【０１２９】
２０種の正常組織のパネルでは、Ａ３４は胃粘膜（図１１−１４）、精巣（図９−１０）で観察できたが、膵臓（図１５−１６）でははるかに小さな程度で観察された。胃では、上皮細胞が粘膜全体で染色された。他の組織成分は染色されなかった。粘膜細胞は、典型的な膜性染色パターンを示した。類似の染色パターンが膵臓の管上皮細胞で観察されたが、しかし、膵臓では限局的な細胞だけが免疫陽性であった。
【０１３０】
精巣では、完全に生殖細胞から構成される反応性染色パターンが観察された。精巣間質組織では染色は観察されなかった。
【０１３１】
胃癌、卵巣癌および食道癌の限定されたグループでは、Ａ３４は腫瘍細胞のほとんどが不均一な標識化またはときどきは均一な標識化を示した。正常組織と同様に、免疫反応性パターンは膜性であった。
【０１３２】
下記の表は、Ａ３４クローン３４２を用いて胃癌細胞、卵巣癌細胞、および食道癌細胞について実施した免疫組織化学的分析の結果を表形式で表したものである。“Ｎｅｇ”は陰性反応、＋記号は染色された腫瘍細胞のパーセンテージを示している。限局性：〜＜５％（極めて少数の細胞に対して）；＋：＞５−２５％；＋＋＞２５−５０％；＋＋＋＞５０−７５％；および＋＋＋＋＞７５％。この等級付けは再現性であり、文献で見られる標準方法に適合している。
【０１３３】
【表６】
2006512910.tif 000007
【０１３４】
【表７】
2006512910.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2006512910.tif 000009
【０１３６】
表９は、Ａ３４抗体クローン３４２によって検出されるような正常組織でのＡ３４タンパク質発現についての免疫組織化学的分析を示している。試験した組織の大半は陰性であった。胃および精巣は陽性であった。
【０１３７】
【表９】
2006512910.tif 000010
【０１３８】
（実施例５）
ヒトおよびマウス両方のＡ３４転写物の胃／精巣関連発現プロファイルは、これらの２種のオルソログの発現がそれらの対応するプロモーターにおける類似の調節配列の制御下にあることを示した。ヒトおよびマウスＡ３４開始部位の上流に位置するＤＮＡ配列の比較は、推定開始部位の１から６００位でのオルソログ遺伝子間で６４％ヌクレオチド同一性を解明した（１から３００の推定開始部位の８０％同一性）。これらの領域はＡ３４プロモーター領域を構成する可能性がある。
【０１３９】
ヒトおよびマウスＡ３３遺伝子と同様に、これらの推定Ａ３４プロモーターは開始部位の２５−３０塩基対内でＴＡＴＡ  ｂｏｘが欠如しており、これはｍＲＮＡ転写がＴＡＴＡ配列からは独立しているが、ヒトおよびマウスＡＴＧ開始部位の上流６７位および７０位に位置するＣＡＡＴ  ｂｏｘを含んでいることを示している。３種の組織特異的転写因子に対する結合部位は、腸特異的ホメオボックス転写因子ＣＤＸ１、ならびに２種の精巣関連転写因子ＳＲＹおよびＳＯＸ−５を含むヒトおよびマウスＡ３４オルソログ間で高度に保存されている。Ａ３３オルソログにおいても見いだされるＣＤＸ１結合部位は、ヒトおよびマウスＡＴＧ開始部位、各々の上流の２３６および２３３各々で存在する。２種の精巣関連転写因子に対する結合部位ＳＲＹおよびＳＯＸ−５は相互に重複し、各々ヒトおよびマウスＡＴＧ開始部位の上流２９４および２８８位で見いだされている。推定Ａ３４プロモーターにおけるこれら３種の転写因子に対する結合部位の存在は、Ａ３４の胃／精巣関連ｍＲＮＡ発現プロファイルと一致している。
【０１４０】
ヒトＡ３４プロモーター領域
【０１４１】
GGTAGTGACAACTGCCAGTGTTTCAAAAAAGAGTAACATATCC
AGAGTTTGTTCACACAGAAATGAATGCTTTTTAGCTTCATAACCCCTGT
GCCCTTCCCGTGAGCCCCATCTCCCCAGGAAACGATATAGTACCAATTT
ACTAACTTAATTTGTAAAAGGAGGTTAGTGAATCAATTCTGTAAGACTC
ATGGAAATATTTGAAATTAATTAGCCTTGTCAGCTTTTATTTGCATAGG
CTCTCTTCCAACCATATCCCCCAGCCCAAGTACAACGTTTTAGTAAGAT
TGATTTTAAACAATGAGACTTAGAGAATCTGTGTACAAGGAGCTTGAAT
AATTTAAATGCGTGGGTTTATTATTAACACAGTAGCAAATATATCAAGG
AAACACGCCCCATGAAAAGTGTTTCAAAGAAACACAAATCTGTACTGAA
AAAAGTCTATACGCAATAAGTAAGCCCAAAGAGGCATGTTTGCTTGGC
GATGCCCAGCAGATAAGCCAGGCAAACCTCGGTGTGATCGAAGAAGCC
AATTTGAGACTCAGCCTAGTCCAGGCAAGCTACTGGCACCTGCTGCTCT
CAACTAACCTCCACACAATG（配列番号：１６）
【０１４２】
マウスＡ３４プロモーター領域
【０１４３】
GGATTTGCTGACAGTCCAATCACTGGAAAGTGTTACTGGAAAT
GCCTTATTAGAGTTGAGATTTTTAGCCTGGGACTGGTACAAATTATTAC
ATAGGATGAAGGAGAAAGAAACCCAGGAGACCATTCAGGAAGCTGTTG
CTTTAGGCTAACGTAATATCTAGAACAAAATGGAAGCAGCAGGTTGGA
GATGGGACAAATCTACCATTCACTTTAGAAGCAGCAGGACCAAGATAT
CTTATGGGAAGAACTGGAGGAGGCCCTCCAAGTACAACTTTCTTTTTTT
AAAAAGGGTTGATTTTAAACAATGTAACCTAAGAGAATCTGTGTACAAA
GAACTGAAAGGATTTAAGTGCGTGGTTTATTATTAACACAGTAGCAAAT
ATATCAAGGGGACACACCCCGGGGGAAAAGGGTTTCAAATAAACACAG
ATTTGTTCAGAGAGAACTCAGTGCCCAATAAGCAAGCGTAAGGAGGCC
TATTTGCTTGGTGATGCCCAGCCGATAAGCCAGGCTGTGACTGAAGAA
GCCAATTTGAAACTCAGCCTAGTTCAGGCAGCCTTCGGACTGGCACCT
GCTGCTCCAAGCGACTTTCAGCATG（配列番号：１７）
【０１４４】
ＡＴＧ開始コドンは、マウスおよびヒト配列中で下線が付けられている。
【０１４５】
（実施例６）
Ａ３３様３（配列番号７）は、ヒト染色体１上の＞ｇｉ｜１８５４７６０５｜ｒｅｆ｜ＸＭ＿０８９０９６．１｜に位置し、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体様タンパク質との類似度を有している。Ａ３３様３ポリペプチド分子（配列番号８）の重量はおよそ４０，０８５Ｄａ（およそ３７０アミノ酸）であり、これはＡ３３と２７％同一で、Ａ３３と４０％類似である（アルゴリズム、すなわちＢＬＡＳＴもしくは類似プログラムを使用するコンピュータによる配列比較および同定ツールを使用して）。
【０１４６】
Ａ３３様３タンパク質はアミノ酸４−２６に伸びる１つの膜貫通ドメインを有し、そしてアミノ酸３７−１２８および１６０−２４１へ伸びる２つのＩｇ様ドメインを有している。表１０は、Ａ３３様３と新規ポリペプチドＡ３４を含む他のファミリーメンバーとの比較を示している。
【０１４７】
【表１０】
2006512910.tif 000011
【０１４８】
正常組織中でのＡ３３様ｍＲＮＡ発現は、以下のプライマーを使用して実施例１の実験方法によってＲＴ−ＰＣＲによる最初の実験で調査した：
ＴＧＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧ、
Ａ３３Ｌ３Ｆ、７３３塩基対（配列番号１８）
ＣＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＴＧＣ、
Ａ３３Ｌ３Ｒ、１０２５塩基対（配列番号１９）
【０１４９】
（実施例７）
組換えタンパク質Ａ３４およびＡ３３様３、またはそのフラグメントは適切な単離ｃＤＮＡ配列から産生する。マウス、ウサギ、または他の適切な哺乳動物を少なくとも１種の組換えもしくは単離Ａ３４タンパク質（全体または適切な抗原性フラグメントのどちらか）で免役し、抗体を産生し、そして以前に言及した参考文献に詳述されていて当業者に知られている標準技術によって精製する。
【０１５０】
（実施例８）
Ａ３４および／またはＡ３３様３抗原を標的とする抗体は、診断および治療の両方の目的に使用される。治療目的では、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答を刺激して腫瘍に対する免疫反応を引き出すことによって、裸の（非結合）抗体自体を治療薬として使用される。治療および／または診断の両方の目的では、Ａ３４および／またはＡ３３様３特異的抗体は放射性同位体または化学療法剤もしくは細胞毒性剤と結合させられる。放射性同位体は、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、９０Ｙおよび１１１Ｉｎまたはいずれか他のγ、αもしくはβ放射体である。当業者であれば、抗体と放射性同位体とを結合させるためには、例えば米国特許第５，１６０，７２３号および第５，８５１，５２６号に記載されているような多数の方法が適切であることを理解できる。
【０１５１】
Ａ３４および／またはＡ３３様３抗原に結合する抗体は任意で少なくとも１種の化学療法剤と、または少なくとも１種の細胞毒性剤と結合させることができる、あるいはそのような物質と併用することができる。例えば、抗体はＱＦＡ（葉酸代謝拮抗薬）、ＢＣＮＵ、メルカプトプリン、メトトレキセート、ドセタキセル、アドリアマイシンまたはカリケアミシンと結合することができる、またはそれらと一緒に併用療法で使用することができる。これらはすべてよく知られている化学療法剤または細胞毒性剤であり、これらと抗体を含むタンパク質との結合ならびに併用は例えばヘルストローム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６６：３−１６（２００１年）；シーヴァース（Ｓｉｅｖｅｒｓ）ら，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １３（６）：５２２−７（２００１）；ワイナー（Ｗｉｎｅｒ）ら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１  Ｓｕｐｐｌ．  ２：５０−７（２００１年）に記載されている。
【０１５２】
抗体、またはそれらのフラグメントもまたいずれかの細胞毒素、細菌またはその他、例えばシュードモナス外毒素、リシン、もしくはジフテリア毒素などに結合させられてよい、または組換え融合させられてよい。使用される毒素の部分は毒素全体であってよい、またはその毒素のいずれか特定のドメインであってもよい。そのような抗体−毒素分子はこれまで様々な種類の癌を標的として治療のために使用され、良好な成果が得られている。例えばパスタン（Ｐａｓｔａｎ），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３３３（２）：Ｃ１−６（１９９７年１０月２４日）；クライトマン（Ｋｒｅｉｔｍａｎ）ら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３４５（４）：２４１−２４７（２００１年）；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４（１）：１２９−３５（２０００）およびゲティ（Ｇｈｅｔｉｅ）ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８（３）：２５１−６８（２００１年）を参照されたい。
【０１５３】
例えばＡＤＥＰＴアプローチのように、酵素、およびプロドラッグなどのその他の結合パートナーを本発明において使用される抗体に結合させることもできる。例えばシウ（Ｘｕ）ら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７（１１）：３３１４−２４（２００１年）を参照されたい。本発明において有用な複合物を生成するためには、抗体複合物を調製するために当技術分野において知られている方法を使用することができる。細胞毒性剤もしくは化学療法剤と抱合したＡ３４もしくはＡ３３様３特異的抗体は、それを必要とする患者に、非抱合形態のＡ３４もしくはＡ３３様３特異的抗体の投与前、投与後、または同時に投与することができる。
【０１５４】
薬物複合物などについて記載している例は、下記の参考文献の中に見いだされる：ヘルストローム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ら，「ＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合物の発生および活性（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲ９６−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １６６：３−１６（２００１年）；シーヴァース（Ｓｉｅｖｅｒｓ）ら，「Ｍｙｌｏｔａｒｇ：抗体を標的とする化学療法の成熟（Ｍｙｌｏｔａｒｇ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ）」，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １３（６）：５２２−７（２００１年）；ワイナー（Ｗｉｎｅｒ）ら，「転移性乳癌におけるハーセプチンの新しい組み合わせ（Ｎｅｗ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１  Ｓｕｐｐｌ．  ２：５０−７（２００１年）；パスタン・アイ（Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．），「組換え免疫毒素を用いた癌のターゲティング療法（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ）」，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １３３３（２）：Ｃ１−６（１９９７年）；クライトマン（Ｋｒｅｉｔｍａｎ）ら，「化学療法耐性毛様細胞性白血病における抗ＣＤ２２組換え免疫毒素ＢＬ２２の有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＣＤ２２  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ＢＬ２２  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈａｉｒｙ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）」，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３４５（４）：２４１−７（２００１年）；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）ら，「抗ＣＤ２５リシンＡ鎖免疫毒素を用いた難治性ホジキンリンパ腫患者の治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ２５  ｒｉｃｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）」，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４（１）：１２９−３５（２０００年）；ゲティ（Ｇｈｅｔｉｅ）ら，「免疫毒素の化学構造（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ）」，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８（３）：２５１−６８（２００１年）；シウ（Ｘｕ）ら，「酵素／プロドラッグ抗癌療法のための戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ／ｐｒｏｄｒｕｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７（１１）：３３１４−２４（２００１年）；ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）ら，「癌の診断および療法のための組換え抗体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．  １（５）：８４５−５５（２００１年）。
【０１５５】
（実施例９）
Ａ３４および／またはＡ３３様３に結合するヒト化抗体、完全ヒト抗体、および／またはキメラ抗体および／または免疫グロブリン産物は、他の抗癌療法と併用するターゲティング剤として使用される。それを必要とする患者に、抗体、フラグメント、またはその他の免疫グロブリン産物を追加の抗癌剤と連結させ、生成した治療有効量の複合物が投与される。あるいは、その物質は検出用の標識と結合させられる。標識の例には、放射性同位体および蛍光マーカーが含まれる。その結合は、本質的に共有結合またはイオン結合であってよい。
【０１５６】
（実施例１０）
さらにヒト化抗体を作製するために、当技術分野において知られている分子生物学技術によってＡ３４および／またはＡ３３様３に結合するこれらの抗体、またはそれらの抗原活性フラグメントは操作される。これらの抗体は完全ヒトまたは部分ヒトであってよい。
【０１５７】
（実施例１１）
Ａ３４および／またはＡ３３様３に結合するヒト化抗体、完全ヒト抗体、および／またはキメラ抗体および／または免疫グロブリン産物、あるいはＡ３４および／またはＡ３３様３の少なくとも１つに結合する適切な抗原性フラグメントは、放射性同位体、化学療法剤、サイトカイン、細胞毒性剤、または他の免疫グロブリン産物などの他の物質と組み合わせられる、または結合される。この結合はイオン結合または共役結合であってよく、当技術分野において知られている方法によって形成する（上記に挙げた参考文献を参照）。
【０１５８】
（実施例１２）
少なくとも１種の免疫グロブリン産物の組成物（抗体、フラグメント、若しくは他の物質に結合した免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせのいずれか）は、治療有効量の前記免疫グロブリン産物と医薬上許容される担体とを組み合わせることによって形成されるが、このとき前記少なくとも１種の免疫グロブリン産物はＡ３４および／またはＡ３３様３の少なくとも１つと結合する。この組成物は次にそれを必要とする患者（すなわち、ヒトまたは他の哺乳動物）に投与される。
【０１５９】
そのような患者は、免疫グロブリン産物が結合する抗原（すなわち、Ａ３４またはＡ３３様３）を発現する腫瘍疾患などの疾患を患っている。
【０１６０】
少なくとも１種の免疫グロブリン産物（抗体、フラグメント、もしくは他の物質に結合した免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせのいずれか）を備える組成物、または治療措置は、治療有効量の前記免疫グロブリン産物と化学療法剤とを組み合わせることによって形成されるが、このとき前記少なくとも１種の免疫グロブリン産物はＡ３４および／またはＡ３３様３の少なくとも１つと結合する。化学療法剤は、Ａ３４および／またはＡ３３様３特異的免疫グロブリン産物が患者に投与される前に、同時に、あるいは投与された後に投与することができる。そのような組み合わせに使用できる化学療法剤の例は、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、カルムスチン、ビンクリスチン、ロイコボリン、ストレプトゾシン、Ｏｒｚｅｌ（商標）およびフルオロピリミジン系、例えば５−フルオロウラシル、フトラフルール、カペシタビン、ゲムシタビン、フロキシウリジンおよびフルオリチン、ならびに他のヌクレオシドアナログ、およびビンブラスチン、ナベルビン、およびビンゾリジンを含むがそれらに限定されないビンカアルカロイドアナログ、トポテカンおよびカンプトテシンを含むがそれらに限定されないトポイソメラーゼＩ阻害剤、ならびにシスプラチンおよびカルボプラチンを含むがそれらに限定されない他の白金アナログである、がそれらに限定されない。
【０１６１】
少なくとも１種の免疫グロブリン産物を備える組成物、または治療措置（抗体、フラグメント、もしくは他の物質に結合した免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせのいずれか）は、前記免疫グロブリン産物とＡ３４および／またはＡ３３様３抗原に対して特異的ではない他の免疫グロブリンとを組み合わせることによって形成されるが、このとき前記少なくとも１種の免疫グロブリン産物はＡ３４および／またはＡ３３様３の少なくとも１つと結合する。そのような他の免疫グロブリンの例はセツキシマブ（エルビタックス：Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、イムクローン  システムズ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社）およびトラスツズマブ（ハープセプチン：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社）のような、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーの受容体を標的とする抗体である。
【０１６２】
少なくとも１種の免疫グロブリン産物を備える組成物、または治療措置（抗体、フラグメント、もしくは他の物質に結合した免疫グロブリン、またはそれらの組み合わせのいずれか）は、前記免疫グロブリン産物と小分子シグナル伝達阻害剤とを組み合わせることによって形成されるが、このとき前記少なくとも１種の免疫グロブリン産物はＡ３４および／またはＡ３３様３の少なくとも１つと結合する。そのような小分子シグナル伝達阻害剤の例は、メシル酸イマチニブ（グリベック：Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）社）およびゲフィニチブ（イレッサ：Ｉｒｅｓｓａ（商標）、アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）社）である。
【０１６３】
上記の説明および例は単に本発明を例示するために記載したものであり、限定することは意図していない。本発明の精神および本質を組み込んでいる本明細書に記載した実施形態の修飾は当業者であれば思い付くことであるので、本発明は添付の請求項およびその同等物の範囲内に含まれるすべての変形を含むと広く解釈されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】２４種の正常組織中のＡ３４  ｍＲＮＡのエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ発現を示した図
【図２】リアルタイムＰＣＲを使用して正常組織および悪性組織でのＡ３４発現の解析を示した図
【図３】全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）およびＡ３４とＡ３３（配列番号２）とのアミノ酸配列比較を示した図
【図４】最初に入手したＡ３４のポリヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示した図
【図５】追加のＡ３４クローンポリヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示した図
【図６】Ａ３３様３のポリヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示した図
【図７】追加のＡ３３様３（配列番号９）およびＡ３３（配列番号１０）のアミノ酸配列比較を示した図
【図８】ｍＡｂ  ３４２を用いた正常結腸粘膜および正常胃粘膜のウェスタンブロットを示した図
【図９】正常精巣でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１０】正常精巣でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１１】正常胃粘膜／j面上皮でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１２】正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１３】正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１４】正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１５】正常膵臓でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１６】正常膵臓でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１７】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１８】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１９】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図２０】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図２１】２０９−９７０と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図であり、ＣＤＲは影付き囲みの中に下線付きで表示した図
【図２２】２０９−５６４と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図であり、ＣＤＲは影付き囲みおよび下線付きで表示した図
【図２３】２０９−３４２と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図
【図２４】３つのＡ３４抗体クローンについてのＣＤＲ領域のアミノ酸配列（配列番号３２−４９）を示した図
【図２５】全長Ａ３４ヌクレオチド配列（配列番号５０）を示した図
【図２５】全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）を示した図
【配列表】
2006512910.tif 000012
2006512910.tif 000013
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【図１】
2006512910.tif 000037
【図２】
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【図３】
2006512910.tif 000039
【図４】
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【図５】
2006512910.tif 000041
【図６】
2006512910.tif 000042
【図７】
2006512910.tif 000043
【図８】
2006512910.tif 000044
【図９】
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【図１０】
2006512910.tif 000046
【図１１】
2006512910.tif 000047
【図１２】
2006512910.tif 000048
【図１３】
2006512910.tif 000049
【図１４】
2006512910.tif 000050
【図１５】
2006512910.tif 000051
【図１６】
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【図１７】
2006512910.tif 000053
【図１８】
2006512910.tif 000054
【図１９】
2006512910.tif 000055
【図２０】
2006512910.tif 000056
【図２１】
2006512910.tif 000057
【図２２】
2006512910.tif 000058
【図２３】
2006512910.tif 000059
【図２４】
2006512910.tif 000060
【図２５】
2006512910.tif 000061
【図２６】
2006512910.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月16日(2005.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
前記単離ポリペプチドが、配列番号１または配列番号６を含む請求項１４記載の単離ポリペプチド分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
図２６は、全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）を示した図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
【図１】２４種の正常組織中のＡ３４  ｍＲＮＡのエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ発現を示した図
【図２】リアルタイムＰＣＲを使用して正常組織および悪性組織でのＡ３４発現の解析を示した図
【図３】全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）およびＡ３４とＡ３３（配列番号２）とのアミノ酸配列比較を示した図
【図４】最初に入手したＡ３４のポリヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示した図
【図５】追加のＡ３４クローンポリヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示した図
【図６】Ａ３３様３のポリヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示した図
【図７】追加のＡ３３様３（配列番号９）およびＡ３３（配列番号１０）のアミノ酸配列比較を示した図
【図８】ｍＡｂ  ３４２を用いた正常結腸粘膜および正常胃粘膜のウェスタンブロットを示した図
【図９】正常精巣でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１０】正常精巣でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１１】正常胃粘膜／表面上皮でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１２】正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１３】正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１４】正常胃粘膜／胃底腺でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１５】正常膵臓でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１６】正常膵臓でのＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１７】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１８】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図１９】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図２０】胃癌におけるＡ３４発現の免疫組織化学的分析を示した図
【図２１】２０９−９７０と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図であり、ＣＤＲは影付き囲みの中に下線付きで表示した図
【図２２】２０９−５６４と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図であり、ＣＤＲは影付き囲みおよび下線付きで表示した図
【図２３】２０９−３４２と名づけられたマウスＡ３４可変領域軽鎖クローンおよび重鎖クローンのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図
【図２４】３つのＡ３４抗体クローンについてのＣＤＲ領域のアミノ酸配列（配列番号３２−４９）を示した図
【図２５】全長Ａ３４ヌクレオチド配列（配列番号５０）を示した図
【図２６】全長Ａ３４アミノ酸配列（配列番号１）を示した図
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
2006512910.tif 000063
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2006512910.tif 000064
【国際調査報告】
2006512910.tif 000065
2006512910.tif 000066