(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質（HSP）-ペプチド複合体もしくはα-2-マクログロブリン（α2M）-ペプチド複合体を含むワクチン組成物（本明細書中では以下、「HSP/α2Mワクチン組成物」）に対する、被験体の免疫応答を改良または持続させるための方法を提供する。ワクチン組成物のHSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPもしくはα2Mを包含する。特に、本発明は、HSPまたはα2M（単独もしくは免疫応答が誘導されることが所望される構成成分ではないペプチドとの複合体）を含む調製物（本明細書中では以下、「HSP/α2M調製物」）と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の投与を含む、被験体の免疫応答を改良あるいは持続させるための方法に向けられる。すなわち、HSP/α2M調製物は該組成物の免疫原性を示さない。特に、HSP/α2Mワクチン組成物は、HSP/α2M調製物と組み合わせて投与することで、感染性疾患もしくは癌に対する被験体の免疫応答を改良または持続させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において免疫応答を誘導する方法であって、下記のステップ：
（a）免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含有するHSP/α2Mワクチン組成物を被験体に投与するステップ；および
（b）該構成成分の免疫原性を示さず、HSP/α2Mワクチン組成物と混合して存在しない熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与するステップ；
を含み、その結果として被験体において該構成成分に対する免疫応答が生じる、上記方法。
【請求項２】
被験体においてHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答を誘導する方法であって、下記のステップ：
（a）熱ショックタンパク質調製物を被験体へ投与するステップ；および
（b）免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含有するHSP/α2Mワクチン組成物を、ステップ（a）がない場合に該構成成分に対して副免疫原性（sub-immunogenic）となる量で被験者に投与するステップ
を含み、その結果として被験体において該構成成分に対する免疫応答を誘導し、熱ショックタンパク質調製物は該構成成分の免疫原性を示さないことを特徴とする、上記方法。
【請求項３】
HSP/α2Mワクチン組成物と熱ショックタンパク質調製物とが混合して存在しない、請求項２記載の方法。
【請求項４】
被験体において感染性疾患を治療または予防する方法であって、下記のステップ：
（a）感染性疾患を引き起こす感染性病原体の抗原の抗原性を示す構成成分と複合体形成した、HSPまたはα2Mを含有するHSP/α2Mワクチン組成物を被験体に投与するステップ；および
（b）ステップ（a）と組み合わせた場合に被験体において該構成成分に対する免疫応答を誘導もしくは増強するのに効果的な量の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与すること、ここで熱ショックタンパク質調製物は該構成成分の免疫原性を示さず、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物が混合して存在しないステップ
を含む、上記方法。
【請求項５】
被験体において癌を治療または予防する方法であって、下記のステップ：
（a）腫瘍特異的もしくは癌細胞の腫瘍関連抗原の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含有するHSP/α2Mワクチン組成物を、被験体に投与するステップ；および
（b）被験体において該構成成分に対する免疫応答を誘導もしくは増強するのに効果的な量の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与するステップ、ここで熱ショックタンパク質調製物は該構成成分の免疫原性を示さず、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物が混合して存在しないステップ；
を含む、上記方法。
【請求項６】
被験体において生じる構成成分に対する免疫応答が、ステップ（b）がない場合の被験体における該構成成分に対する免疫応答に応じて増強される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
熱ショックタンパク質調製物がhsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170、カルレティキュリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される熱ショックタンパク質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
熱ショックタンパク質調製物がhsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170、カルレティキュリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される熱ショックタンパク質を含有する、請求項２記載の方法。
【請求項９】
熱ショックタンパク質調製物がhsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170、カルレティキュリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される熱ショックタンパク質を含有する、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
熱ショックタンパク質調製物がhsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170、カルレティキュリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される熱ショックタンパク質を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
熱ショックタンパク質調製物が熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
熱ショックタンパク質調製物が熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含有する、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
熱ショックタンパク質調製物が熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含有する、請求項４記載の方法。
【請求項１４】
熱ショックタンパク質調製物が熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質調製物が精製された熱ショックタンパク質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
熱ショックタンパク質調製物が精製された熱ショックタンパク質を含有する、請求項２記載の方法。
【請求項１７】
熱ショックタンパク質調製物が精製された熱ショックタンパク質を含有する、請求項４記載の方法。
【請求項１８】
熱ショックタンパク質調製物が精製された熱ショックタンパク質を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項１９】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物が哺乳動物の熱ショックタンパク質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物が哺乳動物の熱ショックタンパク質を含有する、請求項２記載の方法。
【請求項２１】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物が哺乳動物の熱ショックタンパク質を含有する、請求項４記載の方法。
【請求項２２】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物が哺乳動物の熱ショックタンパク質を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項２３】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の前に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項１、２、４または５記載の方法。
【請求項２４】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与と同時に熱ショックタンパク質調製物が投与され、熱ショックタンパク質調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物が混合して存在しない、請求項１、２、４または５記載の方法。
【請求項２５】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項１、２、４または５記載の方法。
【請求項２６】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の前に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与と同時に熱ショックタンパク質調製物が投与され、熱ショックタンパク質調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物が混合して存在しない、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の前に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与と同時に熱ショックタンパク質調製物が投与され、熱ショックタンパク質調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物が混合して投与されない、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の前に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与と同時に熱ショックタンパク質調製物が投与され、熱ショックタンパク質調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物が混合して投与されない、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
HSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に熱ショックタンパク質調製物が投与される、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
感染性疾患が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹Iウイルス、単純疱疹IIウイルス、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスI型（HIV-I）、ヒト免疫不全症ウイルスII型（HIV-II）、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レジオネラ、レーシュマニア、コクシジウム原虫（kokzidioa）、トリパノゾーマおよびクラミジアからなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項３６】
癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌腫、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、顆粒球性白血病、慢性リンパ性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病白血病、非ホジキン病白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症ならびに重鎖病からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項３７】
感染性疾患を予防する方法である、請求項４記載の方法。
【請求項３８】
癌を治療する方法である、請求項５記載の方法。
【請求項３９】
癌を予防する方法である、請求項５記載の方法。
【請求項４０】
（a）免疫応答が所望されるHSP/α2Mワクチン組成物の構成成分に対する、HSP/α2Mワクチン組成物によって誘発される免疫応答を増強するのに効果的な量の、熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物を含む第1の容器；および
（b）（a）の熱ショックタンパク質の投与前、同時または後に投与する場合に、構成成分に対する免疫応答を誘発するのに効果的な量の、HSP/α2Mワクチン組成物を含む第2の容器；
を含むキット。
【請求項４１】
第1の容器が、hsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170、カルレティキュリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される熱ショックタンパク質を含有する熱ショックタンパク質調製物を含むことを特徴とする、請求項４０記載のキット。
【請求項４２】
第1の容器が、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含有する熱ショックタンパク質調製物を含むことを特徴とする、請求項４０記載のキット。
【請求項４３】
第1の容器が、精製した熱ショックタンパク質を含有する熱ショックタンパク質調製物を含むことを特徴とする、請求項４０記載のキット。
【請求項４４】
第1の容器が、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体および精製した熱ショックタンパク質を含有する熱ショックタンパク質調製物を含むことを特徴とする、請求項４０記載のキット。
【請求項４５】
第1の容器が、哺乳動物の熱ショックタンパク質を含有する熱ショックタンパク質調製物を含むことを特徴とする、請求項４０記載のキット。
【請求項４６】
第2の容器に含まれるHSP/α2Mワクチン組成物の量が、第1の容器内の熱ショックタンパク質またはα2M調製物の投与がない場合に被験体において免疫応答を誘導するために不十分であることを特徴とする、請求項４０記載のキット。
【請求項４７】
被験体における免疫応答を誘導する方法であって、下記のステップ：
（a）免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物を被験体に投与するステップ；および
（b）該構成成分の免疫原性を示さず、HSP/α2Mワクチン組成物と混合して存在しないα2M調製物を被験体に投与するステップ；
を含み、その結果として被験体において該構成成分に対する免疫応答を生じる、上記方法。
【請求項４８】
被験体においてHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答を誘導する方法であって、下記のステップ：
（a）α2M調製物を被験体に投与するステップ；および
（b）免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物を、ステップ（a）がない場合に該構成成分に対して副免疫原性となる量で被験者に投与するステップ；
を含み、その結果として被験体において該構成成分に対する免疫応答を誘導し、α2M調製物は構成成分の免疫原性を示さない、上記方法。
【請求項４９】
被験体において感染性疾患を治療または予防する方法であって、下記のステップ：
（a）感染性疾患を引き起こす感染性病原体の抗原の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPもしくはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物を被験体に投与するステップ；および
（b）ステップ（a）と組み合わせた場合に被験体において該構成成分に対する免疫応答を誘導もしくは増強するのに効果的な量のα2M調製物を被験体に投与するステップ、ここでα2M調製物は該構成成分の免疫原性を示さず、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物が混合して存在しないステップ；
を含む、上記方法。
【請求項５０】
被験体において癌を治療または予防する方法であって、下記のステップ：
（a）腫瘍特異的もしくは癌細胞の腫瘍関連抗原の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物を被験体へ投与するステップ；および
（b）被験体における該構成成分に対する免疫応答を誘導もしくは増強するのに効果的な量のα2M調製物を被験体に投与するステップ、ここで、α2M調製物は該構成成分の免疫原性を示さず、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物が混合して存在しないステップ；
を含む、上記方法。
【請求項５１】
被験体において生じる構成成分に対する免疫応答が、ステップ（b）がない場合の被験体における構成成分に対する免疫応答に応じて増強される、請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
HSP/α2Mワクチン組成物とα2M調製物とが混合して存在しない、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
α2M調製物がα2M-ペプチド複合体を含有する、請求項４７〜５０のいずれか１項記載の方法。
【請求項５４】
α2M調製物が精製されたα2Mを含有する、請求項４７〜５０のいずれか１項記載の方法。
【請求項５５】
被験体がヒトであり、α2M調製物が哺乳動物のα2Mを含有する、請求項４７〜５０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年5月2日に出願の米国仮特許出願第60/377,484号（全文を参照として本明細書に組み込む）の利益を主張する。
【０００２】
1. 緒言
本発明は、熱ショックタンパク質（HSP）-ペプチド複合体もしくはα-2-マクログロブリン（α2M）-ペプチド複合体を含むワクチン組成物（本明細書中では以下、「HSP/α2Mワクチン組成物」）に対する、被験体の免疫応答を改良または持続させるための方法を提供する。ワクチン組成物のHSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPもしくはα2Mを包含する。本発明は、HSPまたはα2M（単独もしくは免疫応答が誘導されることが所望される構成成分ではないペプチドとの複合体）を含む調製物（本明細書中では以下、「HSP/α2M調製物」）と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の投与を含む、被験体の免疫応答を改良あるいは持続させるための方法に向けられる。特に、HSP/α2Mワクチン組成物は、HSP/α2M調製物と組み合わせて投与することで、感染性疾患または癌に対する被験体の免疫応答を改良または持続させる。
【背景技術】
【０００３】
ここに参照する引用または考察は、本発明の先行技術等の容認として解釈されるべきではない。
【０００４】
2.1. ワクチン
ワクチンは、多くの国においてポリオ、破傷風、水痘および麻疹等の一定の疾患を根絶してきた。このアプローチは、感染性疾患を阻止および予防する免疫系の能力を開発してきた。
【０００５】
ワクチン調製の伝統的な方法は、不活性化または弱毒化病原体の使用を包含する。病原微生物の適切な不活性化は、その免疫原性を損なうことなく生物学的薬剤としての無害性を与える。これらの「殺された」粒子を宿主内へ注入することで、生きた微生物が将来的に感染するのを予防できる免疫応答を誘発する。しかし、ワクチンとしての不活性化病原体の使用における主要な懸念は、全ての微生物の不活性化が不十分なことである。これが達成された場合でも、殺された病原体がそれらの宿主内で増殖しないためまたは他の未知の理由で、免疫達成は、不完全であったり、短命であったり、複数の免疫化を必要とする場合がある。最終的に、不活性化の過程は微生物の抗原を変え、その免疫原としての効果を低減させ得る。
【０００６】
弱毒化とは、実質的にその疾患発生能力を失った病原体微生物の株の産生を指す。これを達成するための１つの方法は、細胞培養において、微生物を異常な増殖条件および/または高頻度の継代にさらすことである。次に、病原性は失ったが免疫応答を誘発することの可能な変異株を選択する。弱毒化された病原体は、実際に宿主細胞内で複製し、長期持続性の免疫を誘発することでしばしば優れた免疫原を産生する。しかし、生ワクチンの使用に際してはいくつかの問題と遭遇し、最も厄介なことは、不十分な弱毒化および病原性復帰へのリスクである。
【０００７】
上記の方法に代わる方法は、サブユニットワクチンの使用である。これは、関連する免疫学的物質を含む構成成分のみに対する免疫化を包含する。新しい有望な代用法は、DNAまたはRNAをワクチンとして使用することである。そのような遺伝子ワクチンはアイディアから臨床的治験において研究される実体にまで進歩してきた（WeinerおよびKennedy, July 1999, Scientific American, pp. 50-57参照）。
【０００８】
ワクチンはしばしば種々のアジュバントとともに調剤および接種される。アジュバントは、免疫原がそれだけで投与される場合より少量の抗原またはより少ない用量の使用で、より持続性のある高レベルの免疫の達成を補助する。アジュバントの作用のメカニズムは予測不可能かつ複雑であって、完全に理解されてはいない（Suzueら, 1996, Basel: Birkhauser Verlag, 454-55参照）。
【０００９】
不活性化および弱毒化された病原体に関連するリスクのため、最小量のワクチンに対する免疫応答の増強または増幅が理想的かつ有利であろう。さらに、アジュバントのメカニズムが完全に理解されておらず、依然として予測不可能なため、現在のワクチン接種の方法による被験体の免疫応答を増強するための代用法が非常に望まれる。
【００１０】
2.2. 免疫応答
生物体の免疫系は、病原体または他の有害物質に対する２つのタイプの応答（体液性応答および細胞性応答（Alberts, Bら, 1994, Molecular Biology of the Cell. 1195-96参照））により作用する。休止B細胞が抗原により活性化されて増殖し、抗体分泌細胞に成熟した場合、それらは独自の抗体結合部位を有する抗体を産生および分泌する。この抗体分泌応答は体液性応答として知られる。一方、T細胞の多様な応答はまとめて細胞性免疫応答と呼ばれる。これには２つの主要なT細胞のクラスがあり、細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞である。細胞傷害性T細胞は、ウイルスまたは他の細胞内微生物に感染した細胞を直接的に死滅させる。対照的に、ヘルパーT細胞は他の細胞、例えば活性化したマクロファージ、樹状細胞およびB細胞の応答を刺激する（Alberts, B.ら, 1994, Molecular Biology of the Cell. 1228参照）。細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞はどちらも、標的細胞内の外来性タンパク質抗原の分解によって産生されるペプチド断片から形成される抗原を認識し、従ってどちらも（これらのペプチド断片に結合し、細胞表面に運搬してT細胞に提示する）主要組織適合複合体（MHC）分子に依存している（Alberts, B.ら, 1994, Molecular Biology of the Cell. 1228参照）。MHC分子は一般に抗原提示細胞（APC）上に多く見られる。
【００１１】
2.3. 熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（HSP）はまた、本明細書中においてストレスタンパク質としても互換的な意味を持つが、以下の基準を満たすあらゆる細胞性タンパク質の中から選択することができる。そのタンパク質は、細胞がストレス性刺激に曝露された時にその細胞内濃度が上昇し、他のタンパク質またはペプチドを結合することが可能であり、アデノシン三リン酸（ATP）または低pH存在下において結合したタンパク質もしくはペプチドを放出することが可能である。さらに、Hsp-60、Hsp-70およびHsp-90ファミリーは、ストレスタンパク質とアミノ酸配列（例えば、35％以上のアミノ酸同一性を有する）において関連するが、その発現レベルがストレス性刺激によっては変化しないようなタンパク質から構成されることが発見されてきた。従って、本明細書で用いるストレスタンパク質の定義には、他のタンパク質、突然変異体、類似体およびその変異体で、細胞における発現レベルがストレス性刺激に応答して刺激される３つのファミリーのメンバーと少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％および最も好ましくは75％〜85％のアミノ酸同一性を有するものが含まれる。
【００１２】
同定された最初のストレスタンパク質はHSPであった。それらの名称が意味するように、HSPは熱ショックに応答して細胞で合成される。現在までに、HSPの３つの主要なファミリーが分子量に基づいて同定されている。ファミリーはhsp60、hsp70およびhsp90と呼ばれており、その数字がストレスタンパク質のキロダルトンとしての推定分子量を反映している。これらファミリーの多くのメンバーは、結果的に他のストレス性刺激（栄養欠乏、代謝破壊、活性酸素および細胞内病原体の感染を含むがこれに限定されない）に応答して誘導されることが発見され（Welch, May 1993, Scientific American 56-64、Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420、Craig, 1993, Science 260:1902-1903、Gethingら, 1992, Nature 355:33-45およびLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677参照）、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。これら３つのファミリー全てに属するhsp/ストレスタンパク質は、本発明の実施に使用することができると考えられる。
【００１３】
HSPは、豊富で可溶性かつ高度に保存された細胞内分子である。細胞内シャペロンとして、HSPはストレス時および正常な細胞恒常性の間のタンパク質成熟化および機能の活性化における多くの生化学的経路に関与している。多くのストレスは、タンパク質の三次構造または折り畳み構造を破壊し得る。未修正のまま間違って折り畳まれたタンパク質は凝集体を形成し、これが最終的に細胞を死滅させ得る。HSPは、それらの損傷を受けたタンパク質に結合し、それらが適切な高次構造に再び折り畳まれるのを補助する。HSPは、正常な（ストレスを受けていない）細胞恒常性における細胞の代謝に必要とされる。HSPは新規に合成されるポリペプチドの折り畳みを補助し、従って他のタンパク質との早期の相互作用を回避する。また、HSPは細胞の種々の区画を通したタンパク質の輸送を助ける。
【００１４】
主要なHSPは、ストレスを受けた細胞中において非常に高レベルで蓄積し得るが、ストレスを受けていない細胞中においては低〜中程度のレベルで生じる。例えば、高度に誘導される哺乳動物のhsp70は、正常な温度においては検出が困難であるが、熱ショックにおいては細胞内で最も活発に合成されるタンパク質の１つとなる（Welchら, 1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211）。対照的に、hsp90およびhsp60タンパク質はほとんど（しかし全てではない）の哺乳動物の細胞中において正常な温度で豊富に存在し、熱によってさらに誘導される（Laiら, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-2810、van Bergen en Henegouwenら, 1987, Genes Dev. 1:525-531）。
【００１５】
HSPが免疫学的および抗原的特徴を有することが分かってきている。特定の腫瘍から単離されたgp96またはp84/86によるマウスの免疫化は、マウスに特定の腫瘍に対する免疫を与えるが、しかし抗原性が異なる腫瘍に対する免疫は与えない（Srivastava, P.K.ら, 1988, Immunogenetics 28:205-207、Srivastava, P.K.ら, 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109-123）。さらに、hsp70は、それが単離された腫瘍に対する免疫を誘発し、抗原性が異なる腫瘍に対しては誘発しないことが示された。しかし、ペプチドが減少したhsp70はその特異的免疫原活性を失うことが分かった（Udono, MおよびSrivastava, P.K., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396）。これらの観察は、熱ショックタンパク質それ自体が抗原性を有するのではなく、抗原性ペプチドと非共有結合複合体を形成し、その複合体が抗原性ペプチドに対する特異的な免疫を誘発し得ることを示唆した（Srivastava, P.K., 1993, Adv. Cancer Res. 62:153-177、Udono, H.ら, 1994, J. Immunol., 152:5398-5403、Suto, R.ら, 1995, Science, 269:1585-1588）。最近、hsp60およびhsp70が、単球、マクロファージまたは細胞傷害性T細胞によるTNFαおよびIL-6等の炎症誘発性サイトカインの産生を刺激することが分かってきた（Breloerら, 1999, J. Immunol. 162:3141-3147、Chenら, 1999, J. Immunol. 162:3212-3219、Ohashiら, 2000, J. Immunol. 164:558-561、Aseaら, 2000, Nature Medicine, 6:435-442、Todrykら, 1999, J. Immunol. 163:1398-1408）。Hsp70はまた未成熟な樹状細胞を標的とし、それらの抗原捕獲能を向上させることが示されてきた（Todrykら, J. Immunol. 163:1398-1408）。例えば細胞死によるhsp60およびhsp70の放出または発現の誘導が、免疫応答を引き起こし得るシグナルとして貢献し得ることが推定されてきた（Chenら, 1999, J. Immunol. 162:3212-3219、Ohashiら, 2000, J. Immunol. 164:558-561、Todrykら, 1999, J. Immunol. 163:1398-1408、Basuら Intl. Immunol. 2000 vol 12:1539-1546）。
【００１６】
癌の治療および予防のために、癌細胞から精製されたHSPとペプチドとの非共有結合複合体の使用は、米国特許第5,750,119号、5,837,251号および6,017,540号に記載されている。
【００１７】
細胞のin vitroでの養子免疫治療における使用を提供する、抗原の感作のためのHSP-ペプチド複合体の使用は、米国特許第5,985,270号および5,830,464号に記載される。
【００１８】
HSP-ペプチド複合体はまた病原体感染細胞より単離することができ、ウイルスおよび細菌、原生動物、菌類、寄生体を含む他の細胞内病原体等の病原体によって引き起こされる感染症の治療ならびに予防のために使用することができる（米国特許第5,961,979号および6,048,530号参照）。
【００１９】
免疫原性HSP-ペプチド複合体はまた、HSPおよび抗原性ペプチドのin vitroでの複合体形成によっても調製することができ、癌および感染性疾患の治療および予防のためのそのような複合体の使用は、米国特許第5,935,576号および6,030,618号に記載されている。癌および感染性疾患の治療のために、規定の抗原と組み合わせた熱ショックタンパク質の使用はまた1997年2月27日付のPCT国際公開WO97/06821に記載されている。
【００２０】
HSP-ペプチド複合体の細胞可溶化物からの精製は既に記載されている（例えば米国特許第5,750,119号および5,997,873号を参照）。
【００２１】
2.4. α-2-マクログロブリン
α-2-マクログロブリンは、構造的に関連性のあるタンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、補体成分C3、C4およびC5を含む。ヒト血漿タンパク質α-2-マクログロブリン（α2M）は720 kDaのホモ四量体タンパク質であり、初めはプロテアーゼ阻害剤ならびに血漿および炎症性体液プロテアーゼ捕捉剤分子として知られた（ChuおよびPizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792の引用文献参照）。α-2-マクログロブリンは1474アミノ酸からなる前駆体として合成され、その初めの23アミノ酸はシグナル配列として機能するもので、切断されて1451アミノ酸からなる成熟タンパク質を産生する（Kanら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:2282-2286）。
【００２２】
α2Mは、求核性のアミノ酸側鎖によりタンパク質およびペプチドと共有結合的な方法で無差別的に結合し（Chuら, 1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307）、α2M受容体（α2MR）を発現する細胞を標的とさせる（ChuおよびPizzo, 1993, J. Immnol. 150:48）。α2Mのα2MRへの結合はα2MのC末端部分によって仲介され（Holtetら, 1994, FEBS Lett. 344:242-246）、重要な残基が同定されてきている（Nielsenら, 1996, J. Biol. Chem. 271:12909-12912）。
【００２３】
プロテアーゼ活性を阻害することで一般的に知られるように、α2Mは複数の結合部位を通して種々のプロテアーゼと結合する（例えば、Hallら, 1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 100(1):8-16を参照）。α2Mと相互作用するプロテアーゼは、結果としてトランスフォーメーションと呼ばれる複合体構造の再構成を行い、これはプロテアーゼがチオエステルにより「トラップ（trapped）」された後に、α2Mの「ベイト（bait）」領域内において切断される結果である。構造的な変化は受容体結合に必要な残基を曝露し、α2M-プロテアーゼ複合体がα2MRに結合することを可能にする。メチルアミンは、プロテアーゼが誘導するような類似の構造的変化および切断を誘導し得る。α2Mの非切断型は受容体に認識されず、しばしば「スロー」型（s-α2M）のように呼ばれる。切断型は「ファスト」型（f-α2M）のように呼ばれる（Chuら, 1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307により要約される）。
【００２４】
プロテアーゼの阻害的機能に加え、α2Mが抗原と複合体形成した場合に、抗原のマクロファージ等の抗原提示細胞によって取り込まれる能力、およびin vitroにおいて2オーダーに及ぶ規模でT細胞融合細胞腫に提示される能力を強化し（ChuおよびPizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792）、T細胞の増殖を誘導し得ることが研究により示されてきた（Osadaら, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:26-31）。さらなる証拠は、α2Mとの抗原の複合体形成が、in vitroにおいて未精製の脾臓細胞による抗体産生を強化し（Osadaら, 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:883）、実験用ウサギ（Chuら, 1994, J. Immunol. 152:1538-1545）およびマウス（Mitsudaら, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:1326-1331）においてin vivoでの抗体応答を引き起こすことを示唆する。しかし、α2M-抗原複合体がin vivoにおいて細胞傷害性T細胞の応答を引き起こすことが可能であるか否かを示した研究はない。
【００２５】
α2Mは抗原と複合体を形成することができ、これはα2MRを経由して抗原提示細胞（「APC」）によって取り込まれ、またLDL（低密度リポタンパク質）受容体関連タンパク質（「LRP」）またはCD91として知られる（PCT/US01/18047参照、参照により本明細書にその全てを組み入れる）。α2Mは直接熱ショックタンパク質gp96のα2MRへの結合と競合し、このことはα2MおよびHSPがα2MR上の共通の認識部位に結合し得ることを示している（Binderら, 2000, Nature Immunology 1(2), 151-154）。さらに、抗原性分子に特異的な細胞傷害性T細胞応答を起こすために、in vitroで調製されるα2M-抗原ペプチド複合体を動物に投与することができる（Binderら, 2001, J. Immunol. 166:4968-72）。従って、HSPおよびα2Mが、ペプチドへの結合能、α2MRによる認識および取り込み、ならびに細胞傷害性T細胞応答の刺激等の多くの共通した機能的特性を有するため、α2Mを癌および感染性疾患に対する免疫療法に使用することができる。
【発明の開示】
【００２６】
本発明は、熱ショックタンパク質（HSP）-ペプチド複合体もしくはα-2-マクログロブリン（α2M）-ペプチド複合体を含有するワクチン組成物（本明細書中では以下、「HSP/α2Mワクチン組成物」）に対する、被験体の免疫応答を改良または持続させるための方法を提供する。ワクチン組成物のHSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSP(s)またはα2Mを含む。本発明は、HSPまたはα2M（単独もしくは免疫応答が誘導されることが所望される構成成分ではないペプチドとの複合体）を含有する調製物（本明細書中では以下、「HSP/α2M調製物」）と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の投与を含む、被験体の免疫応答を改良または持続させるための方法に関する。特に、HSP/α2Mワクチン組成物は、HSP/α2M調製物と組み合わせて投与することで、感染性疾患もしくは癌に対する被験体の免疫応答を改良または持続させる。
【００２７】
従って、１つの実施形態において、本発明は、癌もしくは感染性疾患の予防または治療に有効なHSPワクチン組成物に対する被験体免疫応答を改良あるいは持続させるための方法を包含し、それは、HSPのみ、あるいは感染性疾患またはあるタイプの癌の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性抗原の病原体の抗原の、いかなる抗原性も示さないペプチドと複合体形成したHSPを含むHSP調製物と組み合わせたHSPワクチン組成物の投与によって、感染性疾患またはあるタイプの癌の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性抗原の病原体の抗原の、抗原性を示すペプチドと複合体形成したHSPを含むHSP-ペプチド複合体を含む。もう１つの実施形態において、癌または感染性疾患の予防または治療に有効なHSPワクチン組成物に対する被験体の免疫応答は、α2Mのみ、あるいは感染性疾患またはあるタイプの癌の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性抗原の病原体の抗原の、いかなる抗原性も示さないペプチドと複合体形成したα2Mを含むα2M調製物と組み合わせたHSPワクチン組成物を投与することによって改良または持続される。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、癌もしくは感染性疾患の予防または治療に有効なα2Mワクチン組成物に対する被験体の免疫応答を、改良または持続させるための方法を包含し、それは、α2Mのみ、あるいは感染性疾患またはあるタイプの癌の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性抗原の病原体の抗原の、いかなる抗原性も示さないペプチドと複合体形成したα2Mを含むα2M調製物と組み合わせたα2Mワクチン組成物の投与によって、感染性疾患またはあるタイプの癌の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性抗原の病原体の抗原の、抗原性を示すペプチドと複合体形成したα2Mを含むα2M-ペプチド複合体を含む。もう１つの実施形態において、癌または感染性疾患の予防または治療に有効なα2Mワクチン組成物に対する被験体の免疫応答は、HSPのみ、あるいは感染性疾患またはあるタイプの癌の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性抗原の病原体の抗原の、いかなる抗原性も示さないペプチドと複合体形成したHSPを含むHSP調製物と組み合わせたα2Mワクチン組成物を投与することによって改良または持続される。
【００２９】
本発明の１つの実施形態において、免疫応答を誘導する方法は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、および該構成成分に対する免疫応答がHSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては誘発されないHSP調製物の被験体への投与を含む。好ましくは、HSP/α2Mワクチン組成物の投与をしなければ、該構成成分に対する免疫応答をHSP調製物のみで誘発することはできない。好ましくは、本方法は、被験体へのHSP調製物の投与をすることなく取得されるのに関連する、対象の構成成分に対する免疫応答の規模および持続時間を向上させることができる。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびHSP調製物は混合して存在しない。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、免疫応答を誘導する方法は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、および該構成成分に対する免疫応答がHSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては誘発されないα2M調製物の被験体への投与を含む。α2M調製物は該構成成分の免疫原性を示さない。好ましくは、HSP/α2Mワクチン組成物の投与をしなければ、該構成成分に対する免疫応答をα2M調製物のみで誘発することはできない。好ましくは、本方法は、被験体へのα2M調製物の投与をすることなく、取得されるのに関連する対象の構成成分に対する免疫応答の程度および持続時間を向上させることができる。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３１】
別の実施形態において、本発明はHSP/α2Mワクチン組成物の副免疫原性となる（sub-immunogenic）量による免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、HSP調製物はある量のHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答の誘導を促進し、さもなくば単独で使用した場合に免疫応答を誘導するために不十分である。特に、本方法は、（a）ある量のHSP調製物の被験体への投与および（b）ステップ（a）がない場合でも副免疫原性となる量において免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含む、HSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与というステップを含み、それによって該構成成分に対する免疫応答が被験体において誘導され、ここでHSP調製物は該構成成分の免疫原性を示さない。HSP調製物は、上記のHSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては、該構成成分に対する免疫応答を誘導しない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびHSP調製物は混合して存在しない。
【００３２】
別の実施形態において、本発明はHSP/α2Mワクチン組成物の副免疫原性となる量による免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、α2M調製物はある量のHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答の誘導を促進し、さもなくば単独で使用した場合に免疫応答を誘導するために不十分である。特に、本方法は、（a）ある量のα2M調製物の被験体への投与および（b）ステップ（a）がない場合でも副免疫原性となる量で免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含む、HSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与というステップを含み、それによって該構成成分に対する免疫応答が被験体において誘導され、α2M調製物は構成成分の免疫原性を示さない。α2M調製物は、上記のHSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては、該構成成分に対する免疫応答を誘導しない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明は、感染性疾患を引き起こす感染性病原体の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、およびHSP/α2Mワクチン組成物と組み合わせた場合に、被験体における構成成分に対する免疫応答を誘導または増強させるのに効果的な量の熱ショックタンパク質調製物の被験体への投与を含む、被験体における感染性疾患の治療または予防の方法を提供する。熱ショックタンパク質調製物は該構成成分の免疫原性を示さない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明は、感染性疾患を引き起こす感染性病原体の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、およびHSP/α2Mワクチン組成物と組み合わせた場合に、被験体における構成成分に対する免疫応答を誘導または増強させるのに効果的な量のα2M調製物の被験体への投与を含む、被験体における感染性疾患の治療または予防の方法を提供する。α2M調製物は該構成成分の免疫原性を示さない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３５】
さらに別の実施形態において、本発明は、癌細胞の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含有するHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、および熱ショックタンパク質調製物が被験体における免疫応答を誘導または増強させるのに効果的な量の熱ショックタンパク質調製物の被験体への投与を含む、被験体における癌の治療または予防の方法を提供する。ここで熱ショックタンパク質調製物は該構成成分の免疫原性を示さない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３６】
さらに別の実施形態において、本発明は、癌細胞の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、およびα2M調製物が被験体における免疫応答を誘導または増強させるのに効果的な量のα2M調製物の被験体への投与を含む、被験体における癌の治療または予防の方法を提供する。ここでα2M調製物は構成成分の免疫原性を示さない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３７】
さらに別の実施形態において、本発明は、熱ショックタンパク質調製物の被験体への投与、および免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与を含む、被験体におけるHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答の誘導方法を提供し、HSP/α2Mワクチン組成物は熱ショックタンパク質調製物非存在下で構成成分に対して副免疫原性となる量である。該熱ショックタンパク質調製物は構成成分の免疫原性を示さない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本発明は、α2M調製物の被験体への投与、および免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与を含む、被験体におけるHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答の誘導の方法を提供し、HSP/α2Mワクチン組成物はHSP/α2Mワクチン組成物非存在下で該構成成分に対して副免疫原性となる量である。該α2M調製物は構成成分の免疫原性を示さない。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００３９】
本発明におけるこれらの上記の実施形態において、HSP調製物およびα2M調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては構成成分に対する免疫応答を誘発しない。好ましくは、HSP調製物およびα2M調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物における構成成分の免疫原性を示さない。熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物の免疫原性は、5.6節に記述されるような（ただしこれらに限定されない）当技術分野で公知の任意の方法等によってin vivoまたはin vitroで試験することができる。
【００４０】
種々の実施形態において、HSP調製物またはα2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与の前に被験体に投与される。あるいはまた、HSP調製物またはα2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与と同時に被験体に投与されるが、混合物ではない。HSP調製物またはα2M調製物はまたHSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に被験体に投与することができる。好ましくは、被験体は哺乳動物、またはより限定的にはヒトである。
【００４１】
あらゆる理論に束縛されることなく、HSPはサイトカインの分泌ならびに抗原提示性および同時刺激性分子の表面発現を誘導し、どちらもT細胞応答の開始および維持に重要である。α2Mがサイトカインの分泌ならびに抗原提示性および同時刺激性分子の表面発現を誘導することも信じられている。CD11b＋細胞活性化を用いた発明者の実験法は、細胞外環境におけるHSPの存在がインターロイキン-1βの分泌およびMHCクラスII分子の表面発現を誘導することを示す。さらに、HSP/α2Mワクチン組成物におけるHSP-ペプチド複合体およびα2M-ペプチド複合体等は抗原提示細胞によって取り込まれ、特異的なT細胞応答の活性化を引き起こし得る。従って、被験体に投与されるHSP調製物またはα2M調製物は、T細胞の活性化状態を延長させることでHSP/α2Mワクチン組成物の有効性を向上させ得ると信じられている。
【００４２】
本発明において使用されるHSP調製物は、好ましくは遊離のHSPでいかなる分子にも結合していないもの、または好ましくは免疫応答が所望される同じ構成成分ではないペプチドに、共有もしくは非共有結合的に付着したHSPを含むHSP-ペプチド複合体である。
【００４３】
本発明において使用されるα2M調製物は、好ましくは遊離のHSPでいかなる分子にも結合していないもの、または好ましくは免疫応答が所望される同じ構成成分ではないペプチドに、共有もしくは非共有結合的に付着したα2Mを含むHSP-ペプチド複合体である。
【００４４】
また、本発明は、免疫応答が所望されるHSP/α2Mワクチン組成物の構成成分に対するHSP/α2Mワクチン組成物によって誘発される免疫応答を増強するのに効果的な量のHSP調製物を各々に含んだ１つ以上の容器、および該構成成分に対する免疫応答を誘導するのに効果的な（a）の熱ショックタンパク質調製物の投与前、同時または後に投与された場合のある量でのHSP/α2Mワクチン組成物を各々に含んだ１つ以上の容器を含むキットを包含する。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。本発明はまた、免疫応答が所望されるHSP/α2Mワクチン組成物の構成成分に対するHSP/α2Mワクチン組成物によって誘発される免疫応答を増強するのに効果的な量のα2M調製物を各々に含んだ１つ以上の容器、および該構成成分に対する免疫応答を誘導するのに効果的な（a）のα2M調製物の投与前、同時または後に投与された場合のある量でのHSP/α2Mワクチン組成物を各々に含んだ１つ以上の容器を含むキットを包含する。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００４５】
4. 発明の詳細な説明
これらのワクチンで、請求項に記載の方法を用いて免疫応答を増強または持続させる能力は望ましくかつ有利である。本発明の方法はまた、単独で使用した場合に免疫応答を誘導するために不十分な量のHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答の誘導を補助することができる。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体ワクチンである。別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体ワクチンである。HSP/α2Mワクチン組成物はアジュバントを含み得る。HSP/α2Mワクチン組成物は１以上のアジュバントとともに投与してもよい。HSPまたはα2Mの由来は、好ましくは真核生物およびより好ましくは哺乳動物である。治療を受ける被験体は、好ましくはネコ、イヌ等の家畜、キツネ、アライグマ等の野生動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、シチメンチョウならびにニワトリを含む牧畜および家禽はもちろん、あらゆるげっ歯動物を含む哺乳動物であるがこれらに限定されない。最も好ましくは、被験体はヒトである。本発明の目的のために、HSP調製物は好ましくは精製されており、いかなる分子とも結合していない遊離のHSPとペプチド等の別の分子とのHSPの分子複合体を含み得る。従って、HSP調製物は共有または非共有的にペプチドに結合したHSPを含み得る。本発明の方法は、被験体への投与に先立った、あらゆる特異的抗原または抗原性ペプチドへの、HSPの共有もしくは非共有的な結合が必要であってもよく、またなくてもよい。好ましい実施形態において、HSP調製物のペプチドは治療されるべき感染性疾患もしくは障害または特定の癌とは無関係である。HSP調製物はHSPを含む未精製の細胞可溶化物を含み、100〜108の間の細胞当量に相当する量の可溶化物であり得る。HSPは、HSPに非共有的に結合している異なるペプチド複合体の集合として、ほとんどの細胞材料から簡便に精製することができる。HSPは、低pHおよび/もしくはアデノシン三リン酸または当技術分野で公知の他の方法に曝露することで非共有的に結合したペプチドから分離することができる。
【００４６】
本発明の種々の実施形態において、HSP調製物は、hsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170またはカルレティキュリンを、単独またはお互いに組み合わせて含み得るがこれらに限定されない。
【００４７】
本発明の目的のために、α2M調製物は好ましくは精製されており、いかなる分子とも結合していない遊離のα2Mとペプチド等の別の分子とのα2Mの分子複合体を含み得る。従って、α2M調製物は共有または非共有的にペプチドに結合したα2Mを含み得る。本発明の方法は、被験体への投与に先立った、あらゆる特異的抗原または抗原性ペプチドへのα2Mの共有もしくは非共有的な結合が必要であってもよく、またなくてもよい。好ましい実施形態において、α2M調製物のペプチドは治療されるべき感染性疾患もしくは障害または特定の癌とは無関係である。α2M調製物はα2Mを含む未精製の細胞可溶化物を含み、100〜108の間の細胞当量に相当する量の可溶化物であり得る。α2Mは、α2Mに非共有的に結合している異なるペプチド複合体の集合として、ほとんどの細胞材料から簡便に精製することができる。α2Mは、低pHおよび/もしくはアデノシン三リン酸または当技術分野で公知の他の方法に曝露することで非共有的に結合したペプチドから分離することができる。
【００４８】
好ましい実施形態において、HSP-ペプチドワクチン組成物はHSPとペプチドとの複合体であり、感染性疾患の、または治療される癌のタイプの腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原の病原体の抗原の抗原性を示すものを含む。さらに好ましくは、感染性疾患の治療のために、HSP調製物は感染性疾患を引き起こす感染性病原体（またはその抗原性を示すその感染性変異体）に感染した細胞から単離した非共有結合HSP-ペプチド複合体を含む。さらに好ましくは、あるタイプの癌の治療のために、HSPペプチドワクチン複合体は、患者（自己）またはそうでないもの（同種）由来であり得る上記のタイプの癌の癌組織またはその転移から単離された、非共有結合HSP-ペプチド複合体を含む。
【００４９】
本発明の種々の実施形態において、HSPペプチドワクチン組成物は、hsp70、hsp90、gp96、hsp110、grp170またはカルレティキュリンを、単独またはお互いに組み合わせて含み得るが、これらに限定されない。
【００５０】
好ましい実施形態において、α2Mペプチドワクチン組成物はα2Mとペプチドとの複合体であり、感染性疾患の、または治療される癌のタイプの腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原の病原体の抗原の抗原性を示すものを含む。感染性疾患の治療のために、α2Mペプチドワクチン組成物は感染性疾患を引き起こす感染性病原体（またはその抗原性を示すその感染性変異体）に感染した細胞から単離した非共有結合α2M-ペプチド複合体を含む。あるタイプの癌の治療のために、α2M調製物は患者（自己）またはそうでないもの（同種）由来であり得る上記のタイプの癌の癌組織またはその転移から単離された、非共有結合α2M-ペプチド複合体を含む。
【００５１】
種々の実施形態において、HSPおよびα2Mの由来は、好ましくは真核生物、より好ましくは哺乳動物および最も好ましくはヒトである。従って、本発明の方法で使用するHSP調製物は、真核生物HSP、哺乳動物のHSPおよびヒトHSPを含む。α2M調製物は、真核生物α2M、哺乳動物のα2Mおよびヒトα2Mを含む。HSP調製物またはα2M調製物が由来する真核生物源、およびHSP調製物またはα2M調製物を受ける被験体は、それぞれ好ましくは同種である。
【００５２】
本発明は、HSP/α2Mワクチン組成物の単独での投与より、優れた治療特性を提供する治療方法を包含する。別の実施形態において、本発明はHSPワクチン組成物の単独での投与より、優れた治療特性を提供する治療方法を包含する。別の実施形態において、本発明はα2Mワクチン組成物のみの投与より、優れた治療特性を提供する治療方法を包含する。本発明は、HSP調製物またはα2M調製物を用いた治療様式における投与が、相加的な効力または相加的な治療効果を有する方法を包含する。本発明はまた治療有効性が相加的なものよりも高い相乗的な結果を包含する。好ましくは、HSP調製物またはα2M調製物を有するHSP/α2Mワクチン組成物をそのように投与することはまた、不必要もしくは有害な効果を減少または回避させる。ある実施形態において、本発明であれば、HSP/α2Mワクチン組成物の投与量または投与の回数を低減させること、好ましくは患者の服薬率を増加させ、治療の改良および/または不必要もしくは有害な効果を減少させることが可能である。本発明では特定の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物をより低い量でまたはより少ない回数でで投与することで、不必要な効果を減少または回避する。あるいはまた、HSP/α2Mワクチン組成物とともに投与する場合、HSP調製物の投与量およびα2M調製物の投与量または投与の回数を減らすことが可能である。好ましくは、被験体に投与されるα2M調製物またはHSP調製物は、T細胞の活性化状態を延長させることでHSP/α2Mワクチン組成物の効果を向上させることができる。
【００５３】
一般に、HSP調製物またはα2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物とは別に投与される。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。別の好ましい実施形態において、ワクチン組成物の構成成分はα2Mと複合体形成したペプチドである場合、α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００５４】
HSP調製物またはα2M調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物の投与前、同時または後に投与され得る。
【００５５】
１つの実施形態において、HSP調製物は適切にワクチンと同時に被験体に投与され、好ましくは混合されていない。本方法は、２つの投与の時間枠がお互いに1分以上約5分以内または約60分以内で、例えば同じ医師の訪問で、行われることを提供する。
【００５６】
１つの実施形態において、α2M調製物は適切にワクチンと同時に被験体に投与され、好ましくは混合されていない。本方法は、２つの投与の時間枠がお互いに1分以上約5分以内または約60分以内で、例えば同じ医師の訪問で、行われることを提供する。
【００５７】
１つの実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は正確に同じ時間に投与される。別の実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は連続してある時間間隔で投与されることで、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物がともに作用することが可能であり、それらが単独で投与された場合より多くの利益を提供する。別の実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は時間を十分に近付けて投与することで、所望の治療または予防結果を提供する。各々はあらゆる適切な形態およびあらゆる適した経路で、同時にまたは別々に投与することが可能である。１つの実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は異なる投与経路で投与される。もう１つの実施形態において、各々は同じ投与経路で投与される。HSP調製物は、例えば腕および足といった同じまたは異なる部位に投与できる。好ましくは、同時に投与する場合、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は、同じ投与経路で混合してまたは同じ投与部位に投与されない。
【００５８】
１つの実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は正確に同じ時間に投与される。別の実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は連続してある時間間隔で投与されることで、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物がともに作用することが可能であり、それらが単独で投与された場合より多くの利益を提供する。別の実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は時間を十分に近付けて投与することで、所望の治療または予防結果を提供する。各々はあらゆる適切な形態およびあらゆる適した経路で、同時にまたは別々に投与することが可能である。１つの実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は異なる投与経路で投与される。もう１つの実施形態において、各々は同じ投与経路で投与される。α2M調製物は、例えば腕および足といった同じまたは異なる部位に投与できる。好ましくは、同時に投与する場合、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は、同じ投与経路で混合してまたは同じ投与部位に投与されない。
【００５９】
種々の実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は1時間未満離して、約1時間離して、1〜2時間離して、2〜3時間離して、3〜4時間離して、4〜5時間離して、5〜6時間離して、6〜7時間離して、7〜8時間離して、8〜9時間離して、9〜10時間離して、10〜11時間離して、11〜12時間離して、24時間以下または48時間以下離して投与される。他の実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は2〜4日離して、4〜6日離して、1週間離して、1〜2週間離して、2〜4週間離して、1ヶ月離して、1〜2ヶ月離してまたは2ヶ月以上離して投与される。好ましい実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は双方がまだ活性化している時間枠内で投与される。当業者は、各々の投与される構成成分の半減期を決定することで、そのような時間枠を決定することができ得る。
【００６０】
種々の実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は1時間未満離して、約1時間離して、1〜2時間離して、2〜3時間離して、3〜4時間離して、4〜5時間離して、5〜6時間離して、6〜7時間離して、7〜8時間離して、8〜9時間離して、9〜10時間離して、10〜11時間離して、11〜12時間離して、24時間以下または48時間以下離して投与される。他の実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は2〜4日離して、4〜6日離して、1週間離して、1〜2週間離して、2〜4週間離して、1ヶ月離して、1〜2ヶ月離してまたは2ヶ月以上離して投与される。好ましい実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は双方がまだ活性化している時間枠内で投与される。当業者は、各々の投与される構成成分の半減期を決定することで、そのような時間枠を決定することができ得る。
【００６１】
１つの実施形態において、HSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は患者の同じ来院時中に投与される。特定の好ましい実施形態において、HSP調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与に先立って投与される。もう１つの特定の実施形態において、HSP調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に投与される。
【００６２】
１つの実施形態において、α2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は患者の同じ来院時中に投与される。特定の好ましい実施形態において、α2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与に先立って投与される。もう１つの特定の実施形態において、α2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与の後に投与される。
【００６３】
ある実施形態において、HSP調製物またはα2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は周期的に被験体に投与される。周期治療は、HSP調製物またはα2M調製物の時間周期での投与の後のHSP/α2Mワクチン組成物の時間周期での投与、およびこの連続的な投与の繰り返しを含む。周期治療は、治療効果を改善し、１つ以上の治療に対する抵抗性発生を減少させ、ならびに治療の１つの副作用を回避および減少できる。そのような実施形態において、本発明はHSP/α2Mワクチン組成物の投与後4〜6日後、好ましくは2〜4日後、より好ましくは1〜2日後にHSP調製物を投与する交互の投与を包含し、ここでそのような周期は所望の回数繰り返され得る。ある実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は、3週間未満、2週間毎、10日毎または1週間毎の周期で交互に投与される。本発明はまた、HSP/α2Mワクチン組成物の投与後4〜6日後、好ましくは2〜4日後、より好ましくは1〜2日後にα2M調製物を投与する交互の投与を包含し、ここでそのような周期は所望の回数繰り返され得る。ある実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は3週間未満、2週間毎、10日毎または1週間毎の周期で交互に投与される。
【００６４】
さらに別の実施形態において、本発明は被験体におけるHSP/α2Mワクチン組成物による免疫応答の誘導のための方法を提供し、ここで副免疫原性となる量のHSP/α2Mワクチン組成物が使用される。本明細書で使用されるように、副免疫原性となる量のHSP/α2Mワクチン組成物とは、HSP/α2Mワクチン組成物がHSP調製物またはα2M調製物とは独立して投与された場合に免疫応答を誘導するために不十分な量を指す。本方法は、HSP/α2Mワクチン組成物の投与の前、同時または後におけるある量の熱ショックタンパク質調製物またはある量のα2M調製物の被験体への投与を含み、HSP/α2Mワクチン組成物の上記の量は被験体における免疫応答が効果的に誘導されるようにする量である。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。さらに別の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分がα2Mと複合体形成したペプチドである場合、α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００６５】
他の実施形態において、各々の上記実施形態はHSP/α2Mワクチン組成物と組み合わせたHSP調製物およびα2M調製物の投与を含み得る。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物はHSP-ペプチド複合体である。別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物はα2M-ペプチド複合体である。別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物、熱ショックタンパク質調製物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００６６】
種々の実施形態において、本発明の方法は、治療的または予防的なHSP/α2Mワクチン組成物が効果的となり得る（すなわち、それらが免疫応答の増強によって治療または予防に影響を与える）、あらゆる疾患および障害を治療または予防するために使用される。特定の実施形態において、疾患は感染性疾患または癌である。熱ショックタンパク質調製物およびα2M調製物は、一般的にHSP/α2Mワクチン組成物とは別に投与される。
【００６７】
本発明は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、および熱ショックタンパク質調製物の被験体への投与（ここで、熱ショックタンパク質調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては該構成成分に対する免疫応答が誘発されない）を含む免疫応答の誘導のための方法を含む。好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物は熱ショックタンパク質またはα2Mを含まない。別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。さらに別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分がα2Mと複合体形成したペプチドである場合、α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００６８】
本発明は、免疫応答が誘導されることが所望される構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与、およびα2M調製物の被験体への投与（ここで、α2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物の投与がなくては該構成成分に対する免疫応答が誘発されない）を含む免疫応答の誘導のための方法を含む。別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。さらに別の好ましい実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分がα2Mと複合体形成したペプチドである場合、α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００６９】
本発明は、感染性疾患を引き起こす感染性病原体の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与（例えば、原因となる感染性病原体における抗原の免疫原性量）、および被験体における構成成分に対する免疫応答を誘導または増強させるHSP/α2Mワクチン組成物と組み合わせた場合に効果的な量の熱ショックタンパク質調製物（ここで、熱ショックタンパク質調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物の上記の投与がなくては上記の構成成分に対する免疫応答を誘発しない）の被験体への投与のステップのあらゆる順番を含む、被験体における感染性疾患を治療または予防するための方法を包含する。別の特定の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。さらに別の特定の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分がα2Mと複合体形成したペプチドである場合、α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００７０】
本発明は、感染性疾患を引き起こす感染性病原体の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与（例えば、原因となる感染性病原体における抗原の免疫原性量）、および被験体における構成成分に対する免疫応答を誘導または増強させるHSP/α2Mワクチン組成物と組み合わせた場合に効果的な量のα2M調製物（ここで、熱ショックタンパク質調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物の上記の投与がなくては上記の構成成分に対する免疫応答を誘発しない）の被験体への投与のステップのあらゆる順番を含む、被験体における感染性疾患を治療または予防するための方法を包含する。別の特定の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分が熱ショックタンパク質と複合体形成したペプチドである場合、HSPワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。さらに別の特定の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分がα2Mと複合体形成したペプチドである場合、α2Mワクチン組成物およびα2M調製物は混合して存在しない。
【００７１】
本発明はまた、癌細胞の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与（例えば、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原またはそれ自身が抗原性を示す分子等（しかしこれらに限定されない）の癌における抗原の免疫原性量）、および被験体における構成成分に対する免疫応答を誘導または増強させるのに効果的な量の熱ショックタンパク質調製物（ここで、熱ショックタンパク質調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物の上記の投与がなくては上記の構成成分に対する免疫応答を誘発しない）の被験体への投与のステップのあらゆる順番を含む、被験体における癌または転移を治療または予防するための方法を包含する。好ましくは、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。
【００７２】
本発明はまた、癌細胞の抗原性を示す構成成分と複合体形成したHSPまたはα2Mを含むHSP/α2Mワクチン組成物の被験体への投与（例えば、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原またはそれ自身が抗原性を示す分子等（しかしこれらに限定されない）の癌における抗原の免疫原性量）、および被験体における構成成分に対する免疫応答を誘導または増強させるのに効果的な量のα2M調製物（ここで、α2M調製物は、HSP/α2Mワクチン組成物の上記の投与がなくては上記の構成成分に対する免疫応答を誘発しない）の被験体への投与のステップのあらゆる順番を含む、被験体における癌または転移を治療または予防するための方法を包含する。好ましくは、HSP/α2Mワクチン組成物の構成成分および熱ショックタンパク質調製物は混合して存在しない。
【００７３】
HSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体はHSPまたはα2M調製物として使用される場合、ペプチドは好ましくはHSP/α2Mワクチン組成物の分子/構成成分の抗原性を示さない。この場合、本発明の目的は、HSP/α2Mワクチン組成物に提示されるペプチドに対する特異的な免疫応答を誘発するためにHSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体を使用することではない。本発明のHSP調製物およびα2M調製物は一般的に被験体における全ての種類の抗原の提示を援助し、それらは特にHSP/α2Mワクチン組成物中の被験体に投与されるものである。
【００７４】
HSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体はHSP/α2Mワクチン組成物として使用される場合、ペプチドは本件の状態に関連する分子/構成成分の抗原性を示す（「関連」は、本件の状態に対する治療または予防となり得る免疫応答を意味する）。
【００７５】
4.1. 熱ショックタンパク質の調製
HSPの３つの主要なファミリーが分子量に基づいて同定されている。ファミリーはhsp60、hsp70およびhsp90と呼ばれてきており、その数字がストレスタンパク質のキロダルトンとしての推定分子量を反映している。これらファミリーの多くのメンバーは、結果的に他のストレス性刺激（栄養欠乏、代謝破壊、活性酸素および細胞内病原体の感染を含むがこれに限定されない）に応答して誘導されることが発見された（Welch, May 1993, Scientific American 56-64、Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420、Craig, 1993, Science 260:1902-1903、Gethingら, 1992, Nature 355:33-45およびLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677参照）。シャペロン機能を有すると考えられるいくつかのタンパク質は小胞体（ER）内腔に常在し、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI; Gethingら, 1992, Nature 355:33-45）、カルレティキュリン（Herbertら, 1997, J. Cell Biol. 139:613-623）、Grp94またはERp99（SorgerおよびPelham, 1987, J. Mol. Biol. 194(2)341-4）を含み、これらはhsp70に関連するhsp90およびGrp78またはBiPに関連する（Munroら, 1986, Cell 46:291-300、HaasおよびWebl, 1983, Nature 306:387-389）。そのようなHSPの断片を含むこれらの３つのファミリー全てに属するHSPは、本発明の実施に使用され得ることが考慮される。
【００７６】
本発明はまたhsp110gp96grp170およびカルレティキュリンを含むがこれらに限定されない他のHSPおよびその断片の使用を考慮する。
【００７７】
熱ショックタンパク質は、現存するタンパク質の中で最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のhsp70であるDnaKは、擦過傷（excoriates）からのhsp70タンパク質に対して約50％のアミノ酸配列同一性を有する（Bardwellら， 1984， Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852）。hsp60およびhsp90ファミリーも同様に高いレベルのファミリー内保存性を示す（Hickeyら, 1989 Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626、Jindal, 1989, Mol. Call. Biol. 9:2279-2283）。さらに、Hsp-60、Hsp-70およびHsp-90ファミリーは、ストレスタンパク質とアミノ酸配列（例えば、35％以上のアミノ酸同一性を有する）において関連するが、その発現レベルがストレス性刺激によっては変化しないようなタンパク質から構成されることが発見されてきた。従って、本明細書で用いるストレスタンパク質の定義は、他のタンパク質、突然変異体、類似体およびその変異体で、細胞における発現レベルがストレス性刺激に応答して刺激される３つのファミリーのメンバーと少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％および最も好ましくは75％〜85％のアミノ酸同一性を有するものが含まれることを企図する。これら３つのファミリーに属するストレスタンパク質の調製を以下に記載する。
【００７８】
さらに、HSPが免疫学的および抗原的特徴を有することが分かってきている。HSPは現在免疫調節において不可欠な役割を果たしていると理解されている。例えば、これまでの実験は、HSPがHSPに共有的または非共有的に結合した抗原性ペプチドに対する、強く持続性の特異的な免疫応答を刺激することを示してきている。特異的ペプチドの使用により生じる免疫応答は、このペプチドに「特異的」またはこれを標的にしたものである。
【００７９】
本発明において、精製された非結合HSP、特異的ペプチドまたは非特異的ペプチドに共有的または非共有的に結合したHSP（本明細書においては、まとめてHSP-ペプチド複合体という）およびそれらを組み合わせたものが使用される。複合体または非複合体型のHSPの精製は次のサブセクションに記載する。さらに、当業者はまた以下に記載する組換え発現またはペプチド合成によってHSPを合成することができる。本発明において、HSP調製物は非結合hsp70、hsp90、gp96、カルレティキュリン、hsp110もしくはgrp170またはそれ自身がペプチドと複合体形成した非共有結合もしくは共有結合複合体を含み得る。HSPの調製および精製の方法は当技術分野において公知であり、以下に記載する。さらに特に、カルレティキュリンおよび細胞性の非共有結合カルレティキュリンペプチド-複合体の調製ならびに精製の方法は当技術分野において知られる。BasuおよびSrivastava, 1999, J. Exp. Med. 189:797-802等の文献にそのような方法が記載されており、その全文を参照により本明細書中に組み入れる。他の代表的なHSPおよびHSP-ペプチド複合体の精製は、以下にその詳細を記載する。
【００８０】
4.1.1. hsp70および細胞性、非共有結合hsp70-ペプチド複合体の調製ならびに精製
hsp70-ペプチド複合体の精製は、これまでに例えばUdonoら, 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396参照に記載されている。使用され得る手順は以下のような例示により提示されるが、これらに限定されない：
まず、ヒトまたは哺乳動物細胞を5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、1mM フェニルメチルスルフォニルフロリド（PMSF）を含む3倍容の1×溶解バッファーに懸濁する。次に、ペレットを顕微鏡的検査によって99％以上の細胞が溶解することを確認するまで氷上でソニケートする。ソニケーションの代わりに、細胞は機械的剪断によって溶解してもよく、このアプローチにおいて細胞を典型的には30mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）、1mM PMSF中に再懸濁し、氷上で20分間インキュベートし、次にダウンスホモジェナイザー中で95％以上の細胞が溶解するまでホモジェナイズする。
【００８１】
次に、溶解液を1,000gで10分間遠心分離して未破壊の細胞、核および他の細胞片を除去する。生じた上清を100,000gで90分間再遠心分離し、上清を回収してから2mM Ca2＋および2mM Mg2＋を含むリン酸バッファー塩（PBS）で平衡化したCon A Sepharose（商標）と混合する。細胞を機械的剪断により溶解した場合、Con A Sepharose（商標）と混合する前に上清を等量の2×溶解バッファーで希釈する。次に、上清をCon A Sepharose（商標）に2〜3時間、4℃で結合させる。結合しなかった物質を除去し、10mM Tris-酢酸（pH 7.5）、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSFに対して36時間透析する（3回、各回毎に100倍容）。次に、透析物を17,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で20分間遠心分離する。次に、生じた上清を回収し、20mM Tris-酢酸（pH 7.5）、20mM NaCl、0.1mM EDTAおよび15mM 2-メルカプトエタノール中で平衡化したMono Q FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にアプライする。次に、カラムを20mM〜500mM NaCl勾配によって展開し、次に溶出画分をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって画分化し、適切な抗hsp70抗体（クローンN27F3-4等、StressGenより）を用いた免疫ブロットによって特性決定をする。
【００８２】
抗hsp70抗体に対して強い免疫応答性のある画分をプールし、hsp70-ペプチド複合体を硫酸アンモニウムで沈殿させ、具体的には50〜70％硫酸による。次に、生じた沈殿物を17,000 rpm（SS34 Sorvallローター）での遠心分離により回収し、70％硫酸アンモニウムで洗浄する。次に、洗浄した沈殿物を可溶化し、残留した硫酸アンモニウムをSephadex（登録商標）G25カラム（Pharmacia）上でゲル濾過することで除去する。必要ならば、このようにして得たhsp70調製物は、上記のようにMono Q FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）を通して再精製することができる。
【００８３】
hsp70-ペプチド複合体は、この方法を用いて見かけ上均一になるように精製することができる。典型的には、1mgのhsp70-ペプチド複合体は1gの細胞/組織より精製することができる。
【００８４】
hsp70-ペプチド複合体の精製のために改良した方法は、細胞性タンパク質を固体基質に付着させたADPまたはATPの加水分解抵抗性アナログと接触させることで、溶解液中のhsp70をADPまたは加水分解抵抗性ATPアナログと結合できるようにし、結合したhsp70を溶出することを含む。好ましい方法は、固相基体（solid substratum）（例えばADP-アガロース）に付着させたADPを有するカラムクロマトグラフィーを使用する。生じたhsp70調製物は純度が高く、ペプチドが混入していない。hsp70複合体収率もまた約10倍以上も有意に増加する。また、ADPの代わりにATPの加水分解抵抗性アナログを用いたクロマトグラフィーがhsp70-ペプチド複合体の精製に使用することができる。限定としてではなく例示として、ADP-アガロースクロマトグラフィーによるhsp70-ペプチド複合体の精製は以下のように実施することができる。
【００８５】
Meth A肉腫細胞（5億個の細胞）を低浸透圧性バッファー中でホモジェナイズし、溶解液を100,000gで、90分間4℃で遠心分離する。上清をADP-アガロースカラムにアプライする。カラムをバッファー中で洗浄し、カラム容積の5倍容の3mM ADPで溶出する。hsp70-ペプチド複合体は、溶出した計15の画分のうち画分2〜10に溶出する。溶出画分をSDS-PAGEにより解析する。この手順を用いて、hsp70-ペプチド複合体は見かけ上均一になるように精製することができる。
【００８６】
hsp70-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATP存在下または低pHで実施することができる。これら２つの方法は、hsp70-ペプチド複合体由来のペプチドを溶出するために使用され得る。第１のアプローチは、ATP存在下におけるhsp70-ペプチド複合体調製物のインキュベートを含む。他のアプローチは、低pHバッファー中におけるhsp70-ペプチド複合体調製物のインキュベートを含む。これらの方法および当技術分野で知られる他のあらゆる方法が、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドとを分離するために適用され得る。
【００８７】
4.1.2. hsp90および細胞性、非共有結合hsp90-ペプチド複合体の調製ならびに精製
使用できる手順は以下のような例示により提示されるが、これらに限定されない。
【００８８】
まず、ヒトまたは哺乳動物細胞を5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、1mMフェニルメチルスルフォニルフロリド（PMSF）を含む3倍容の1×溶解バッファーに懸濁する。次に、ペレットを顕微鏡的検査によって99％以上の細胞が溶解することを確認するまで氷上でソニケートする。ソニケーションの代わりに、細胞を機械的剪断によって溶解してもよく、このアプローチにおいて細胞を典型的には30mM炭酸水素ナトリウム（pH 7.5）、1mM PMSF中に再懸濁し、氷上で20分間インキュベートし、次にダウンスホモジェナイザー中で95％以上の細胞が溶解するまでホモジェナイズする。
【００８９】
次に、溶解液を1,000gで10分間遠心分離して、未破壊の細胞、核および他の細胞片を除去する。生じた上清を100,000gで90分間再遠心分離し、上清を回収してから2mM Ca2＋および2mM Mg2＋を含むPBSで平衡化したCon A Sepharose（商標）と混合する。細胞を機械的剪断により溶解した場合、Con A Sepharose（商標）と混合する前に上清を等量の2×溶解バッファーで希釈する。次に、上清をCon A Sepharose（商標）に2〜3時間、4℃で結合させる。結合しなかった物質を除去し、10mMトリス酢酸（pH 7.5）、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSFに対して36時間透析する（3回、各回毎に100倍容）。次に、透析物を17,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で20分間遠心分離する。次に、生じた上清を回収し、溶解バッファーで平衡化したMono Q FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にアプライする。次にタンパク質を200mM〜600mM NaClの塩勾配によって溶出する。
【００９０】
溶出した画分をSDS-PAGEによって画分化し、hsp90-ペプチド複合体を含む画分を3G3（Affinity Bioreagents）等の抗hsp90抗体を用いた免疫ブロットによって同定する。hsp90-ペプチド複合体はこの手順を用いて見かけ上均一になるように精製することができる。典型的には、150〜200μgのhsp90-ペプチド複合体は1gの細胞/組織から精製することができる。
【００９１】
hsp90-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATP存在下または低pHで実施することができる。これら２つの方法は、hsp90-ペプチド複合体由来のペプチドを溶出するために使用され得る。第１のアプローチは、ATP存在下におけるhsp90-ペプチド複合体調製物のインキュベートを含む。他のアプローチは、低pHバッファー中におけるhsp90-ペプチド複合体調製物のインキュベートを含む。これらの方法および当技術分野で知られる他のあらゆる方法が、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドとを分離するために適用され得る。
【００９２】
4.1.3. gp96および細胞性、非共有結合gp96-ペプチド複合体の調製ならびに精製
使用できる手順は以下のような例示により提示されるが、これらに限定されない。
【００９３】
ヒトまたは哺乳動物細胞のペレットを30mM炭酸水素ナトリウムバッファー（pH 7.5）および1mM PMSFを含む3倍容のバッファーに再懸濁し、細胞を氷上で20分間膨潤させる。次に、細胞ペレットをダウンスホモジェナイザー中で95％以上の細胞が溶解するまで氷上でホモジェナイズする（ホモジェナイザーの適切なクリアランスは各細胞のタイプによって変化し得る）。
【００９４】
溶解液を1,000gで10分間遠心分離して、未破壊の細胞、核および他の細片を除去する。次に、遠心分離のステップでの上清を100,000gで90分間再遠心分離する。gp96-ペプチド複合体は、100,000ペレットまたは上清の双方から精製することができる。
【００９５】
上清から精製する場合、上清は等量の2×溶解バッファーで希釈し、上清を2mM Ca2＋および2mM Mg2＋を含むPBSで平衡化したCon A Sepharose（商標）と2〜3時間、4℃で混合する。次にスラリーをカラム内に充填し、OD280がベースラインに落ちるまで1×溶解バッファーで洗浄する。次に、カラムを1/3カラム総容積の2mM Ca2＋および2mM Mg2＋を含むPBSに溶解した10％α-メチルマンノシド（α-MM）で洗浄し、カラムを１枚のパラフィルムで密封し、37℃で15分間インキュベートする。次に、カラムを室温まで冷却し、カラムの底からパラフィルムを剥がす。5カラム容積のα-MMバッファーをカラムにアプライし、溶出液をSDS-PAGEによって解析する。典型的には、生じた物質は約60〜95％の純度であるが、これは細胞のタイプおよび使用した組織と溶解バッファーの比率による。次に、サンプルを5mMリン酸ナトリウム（pH 7）を含むバッファーで平衡化したMono Q FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にアプライする。次に、タンパク質を0〜1M NaCl勾配でカラムから溶出させ、gp96画分は400mMおよび550mM NaClの間に溶出する。
【００９６】
しかし、本手順は２つのさらなるステップを単独または組み合わせて使用することにより改変され得ることで、確実に見かけ上均一なgp96-ペプチド複合体を産生する。１つの任意のステップはCon A精製ステップに先立った硫安塩析を含み、他の任意のステップはCon A精製ステップの後（Mono Q FPLC（商標）ステップの前ではない）のDEAE-Sepharose（商標）精製を含む。
【００９７】
第１のさらなるステップにおいて、以下のような例示により記載されるが、100,000g遠心分離ステップから生じた上清は硫酸アンモニウムの添加により最終濃度50％の硫酸アンモニウムとなる。氷水のトレー中に置いたビーカー内の溶液を穏やかに攪拌しながら硫酸アンモニウムをゆっくり添加する。溶液を約1/2〜12時間4℃で攪拌し、生じた溶液を6,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で遠心分離する。このステップで生じた上清を除去し、硫酸アンモニウム水溶液の添加により70％硫酸アンモニウム飽和とし、6,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で遠心分離する。このステップで生じたペレットを回収し、70％硫酸アンモニウムを含むPBS中に懸濁してペレットをすすぐ。この混合物を6,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で遠心分離し、ペレットを2mM Ca2＋および2mM Mg2＋を含むPBS中に溶解する。不溶性物質を15,000 rpm（Sorvall SS34ローター）での短時間の遠心分離により除去する。次に、溶液をCon A Sepharose（商標）と混合し、上記の手順に従う。
【００９８】
第２のさらなるステップにおいて、以下のような例示により記載されるが、Con Aカラムから溶出したgp96を含む画分をプールし、バッファーを透析により5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、300mM NaClに交換し、また好ましくはSephadex G25カラム上におけるバッファー交換による。バッファー交換の後、溶液を事前に5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、300mM NaClで平衡化したDEAE-Sepharose（商標）と混合する。タンパク質溶液およびビーズを1時間穏やかに混合し、カラム内に注ぐ。次に、280nmにおける吸光度がベースラインに落ちるまで、カラムを5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、300mM NaClで洗浄する。次に、結合したタンパク質を5倍容の5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）、700mM NaClでカラムから溶出する。タンパク質を含む画分をプールし、5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）で希釈して塩濃度を175mMまで低下させる。次に、生じた物質を5mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7）で平衡化したMono Q FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）にアプライし、Mono Q FPLC（商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（Pharmacia）に結合したタンパク質を上記のように溶出する。
【００９９】
しかし、当業者がルーチンな実験によって第２のさらなるステップを精製プロトコルに組み入れることの利益を評価し得ることが理解される。さらに、各々のさらなるステップの追加による利益が出発材料源に依存し得ることもまた理解される。
【０１００】
gp96画分を100,000gペレットから単離する際に、ペレットを5倍容の1％炭酸水素ナトリウムまたは1％オクチル（oxtyl）グルコピラノシドのどちらかを含むPBS（しかしMg2+およびCa2+を含まない）に懸濁し、氷上で1時間インキュベートする。懸濁液を20,000gで30分間遠心分離し、生じた上清をいくつか変化させたPBS（またMg2+およびCa2+を含まない）に対して透析し、界面活性剤を除去する。透析物を100,000gで90分間遠心分離し、上清を回収し、上清にカルシウムおよびマグネシウムを添加して最終濃度が各々2mMとなるようにする。次に、サンプルを未改良のまたは改良した方法のどちらかによって精製して、上記参照のように100,000g上清からgp96-ペプチド複合体を単離する。
【０１０１】
gp96-ペプチド複合体は、この手順を用いて見かけ上均一に精製することができる。約10〜20μgのgp96は1gの細胞/組織から単離することができる。
【０１０２】
gp96-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATP存在下または低pHで実施することができる。これら２つの方法はgp96-ペプチド複合体由来のペプチドを溶出するために使用され得る。第１のアプローチはATP存在下におけるgp96-ペプチド複合体調製物のインキュベートを含む。他のアプローチは低pHバッファー中におけるgp96-ペプチド複合体調製物のインキュベートを含む。これらの方法および当技術分野で知られる他のあらゆる方法が、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドとを分離するために適用され得る。
【０１０３】
4.1.4. hsp110および細胞性、非共有結合hsp110-ペプチド複合体の調製ならびに精製
Wangら, 2001, J. Immnol. 166(1):490-7によって記載され、使用できる手順は以下のような例示により提示されるが、これらに限定されない。
【０１０４】
例えば腫瘍細胞組織のような細胞または組織のペレット（40〜60ml）を、5倍容の低浸透圧性バッファー（30mM炭酸水素ナトリウム、pH7.2およびプロテアーゼ阻害剤）中でダウンスホモジェナイザーによりホモジェナイズする。溶解液を4,500×gおよび次に100,000×gで2時間遠心分離する。細胞または組織が肝臓由来である場合、生じた上清をまずblue Sepharose column（Pharmacia）にアプライしてアルブミンを除去する。また、生じた上清を事前に結合バッファー（20mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM MnCl2および15mM 2-ME）で平衡化したCon A-Sepharose column（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）にアプライする。結合したタンパク質は15％α-D-o-メチルマンノシド（Sigma, St. Louis, MO）を含む結合バッファーによって溶出する。
【０１０５】
Con A-Sepharose非結合物質をまず20mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM NaClおよび15mM 2-ME溶液に対して透析し、次にDEAE-Sepharoseカラムにアプライし、100〜500mM NaCl塩勾配によって溶出する。hsp110を含む画分を収集、透析し、20mM Tris-HCl、pH 7.5、200mM NaClおよび15mM 2-MEで平衡化したMono Q（Pharmacia）10/10カラムにのせる。結合したタンパク質を200〜500mM NaCl勾配によって溶出する。Wangら, 1999, J. Immnol. 162:3378によって記載されるように、画分をSDS-PAGEによって解析した後にhsp110に対するAbで免疫ブロットをする。hsp110を含むプールした画分をCentriplus（Amicon, Beverly, MA）により濃縮し、Superose 12 column（Pharmacia）上にアプライする。タンパク質を40mM Tris-HCl、pH 8.0、150mM NaClおよび15mM 2-MEにより0.2ml/minの流速で溶出する。
【０１０６】
4.1.5. grp170および細胞性、非共有結合grp170-ペプチド複合体の調製ならびに精製
Wangら, 2001, J. Immnol. 166(1):490-7によって記載され、使用できる手順は以下のような例示により提示されるが、これらに限定されない。
【０１０７】
例えば腫瘍細胞組織のような細胞または組織のペレット（40〜60ml）を、5倍容の低浸透圧性バッファー（30mM炭酸水素ナトリウム、pH7.2およびプロテアーゼ阻害剤）中でダウンスホモジェナイザーによりホモジェナイズする。溶解液を4,500×gおよび次に100,000×gで2時間遠心分離する。細胞または組織が肝臓由来である場合、生じた上清をまずblue Sepharose column（Pharmacia）にアプライしてアルブミンを除去する。また、生じた上清を事前に結合バッファー（20mM Tris-HCl、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM MnCl2および15mM 2-ME）で平衡化したCon A-Sepharose column（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）にアプライする。結合したタンパク質は15％α-D-o-メチルマンノシド（Sigma, St. Louis, MO）を含む結合バッファーによって溶出する。
【０１０８】
Con A-Sepharose結合物質をまず20mM Tris-HCl、pH 7.5、および150mM NaClに対して透析し、次にMono Qカラムにアプライし、150〜400mM NaCl勾配によって溶出する。プールした画分を濃縮し、Superose 12 column（Pharmacia）上にアプライする。均一化したgrp170を含む画分を収集する。
【０１０９】
4.1.6. HPSの組換え発現
当技術分野で知られる方法は組換え的なHSPの産生に使用することができる。熱ショックタンパク質をコードする核酸配列は、発現ベクターに挿入することができ、宿主細胞内で増殖および発現する。
【０１１０】
本明細書において使用する発現構築物は、適切な宿主細胞内でHSPを発現させることが可能な、１つ以上の調節領域と機能的に連結したHSPをコードするヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結した」とは、調節領域および発現するHSP配列が転写および最終的には翻訳を許容するような方法で連結および位置された結合を指す。
【０１１１】
HSPの転写に不可欠な調節領域は、発現ベクターにより提供され得る。翻訳開始コドン（ATG）はまた、その同族の開始コドンを欠くHSP遺伝子配列を発現させる場合に提供され得る。適合する宿主-構築物システムにおいて、RNAポリメラーゼ等の細胞性転写因子は発現構築物上の調節領域に結合し得ることで、宿主生物内で改変されたHSP配列の転写に影響する。遺伝子発現に必要な調節領域の詳細な種類は、宿主細胞によって変化し得る。一般的に、プロモーターはRNAポリメラーゼの結合および機能的に連結した核酸配列の転写の促進が可能であることに必要とされる。そのような調節領域は、TATAボックス、キャップ配列、CAAT配列等の転写および翻訳の開始点を含む5'非コード配列を含み得る。3'からコード配列までの非コード領域は、ターミネーターおよびポリアデニル化部位等の転写終止調節配列を含み得る。
【０１１２】
HSP遺伝子配列にプロモーター等の調節機能を有するDNA配列を付加するため、またはHSP遺伝子配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、当技術分野で公知の技術によって、cDNAの末端に適切な適合する制限酵素切断部位を提供するリンカーまたはアダプターを連結してもよい（Wuら, 1987, Methods in Enzymol 152:343-349）。制限酵素による切断の後、連結前に一本鎖のDNA末端を消化または埋め合わせることで平滑末端が作製されるように改変することができる。あるいはまた、所望の制限酵素切断部位を含むプライマーを用いたPCRによりDNAを増幅させ、DNA断片中に所望の制限酵素切断部位を導入することができる。
【０１１３】
調節領域と機能的に連結したHSP配列を含む発現構築物は、さらにクローニングすることなく、HSP-ペプチド複合体を発現および産生するための適切な宿主細胞内に直接導入することができる。例えば米国特許第5,580,859号を参照。発現構築物はまた、HSP配列の宿主ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするDNA配列を含み得る。この場合、宿主細胞内でのHSPの増殖および発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【０１１４】
種々の発現ベクターには、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミドまたは改変したウイルス（しかしこれらに限定されない）を含むものが使用され得る。典型的には、このようなベクターは、適切な宿主内でのベクターの増殖のための機能的な複製起点、HSP遺伝子配列の挿入のための１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。発現ベクターは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物およびヒト（しかしこれらに限定されない）を含む原核または真核生物由来であり得る、適合する宿主細胞とともに使用されなければならない。
【０１１５】
長期にわたる、適切に修飾されたHSPまたはHSP-ペプチド複合体の高収率での産生には、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。HSPまたはHSP-ペプチド複合体を安定して発現する細胞系は、選択マーカーを含むベクターを用いて操作され得る。限定としてではなく例示として、発現構築物の導入の後、操作された細胞を1〜2日間栄養分に富む培地中で増殖させてもよく、次に選択培地に換える。発現構築物における選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、最適には、細胞が安定して発現構築物をそれらの染色体中に組み込み、培地中で増殖し、細胞系へと拡大することを可能にする。そのような細胞は長期間培養することができる一方、HSPは連続的に発現する。
【０１１６】
組換え細胞は標準的な温度、インキュベーション時間、吸光度および培地組成の条件下で培養され得る。しかし、組換え細胞の増殖条件は、HSPおよび抗原性タンパク質の発現のためのそれとは異なる可能性がある。改変した培養条件および培地もまたHSPの産生を向上させるために使用され得る。例えば、同族のプロモーターを有するHSPを含む組換え細胞を、熱もしくは他の環境ストレスまたは化学ストレスに曝露してもよい。当技術分野で知られるあらゆる技術は、HSPまたはHSP-ペプチド複合体の産生のための最適な条件を確立するために適用され得る。
【０１１７】
4.1.7. ペプチド合成
組換え技術によるHSP産生のための代用法はペプチド合成である。例えば、完全なHSPまたはHSPの一部分に対応するペプチドはペプチド合成機の使用により合成することができる。当技術分野で公知の従来のペプチド合成または他の合成プロトコルが使用され得る。
【０１１８】
HSPまたはその一部分のアミノ酸配列を有するペプチドは、Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149によって記載されるものと同様の手順を用いて、固相ペプチド合成によって合成され得る。合成中、保護側鎖を有するN-α-保護アミノ酸を、C末端に連結した伸長するポリペプチド鎖および不溶性ポリメリック担体（すなわち、ポリスチレンビーズ）に段階的に添加する。ペプチドは、N-α-脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の試薬と反応させることで活性化されたN-α-保護アミノ酸のα-カルボキシル基に連結することによって合成される。遊離のアミノ基を活性化されたカルボキシル基に付加することでペプチド結合が形成される。最も一般的に使用されるN-α-保護基は、酸不安定性のBocおよび塩基不安定性のFmocを含む。適切な化学反応法、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は、当技術分野で公知であり、本明細書中では記載しない（Athertonら, 1989, Solid Phase Peputide Synthesis: A Practical Approach, IRL PressおよびBodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 第２版, Springer-Verlagを参照）。
【０１１９】
生じたHSPの精製は、ゲル濾過を用いた調製的HPLC、分配および/またはイオン交換クロマトグラフィー等の従来の方法を用いて行われる。適切な基質およびバッファーの選択は当技術分野で公知であり、本明細書中では記載しない。
【０１２０】
4.2. α2Mの調製
α-2-マクログロブリン（α2M）は商業的供給者から購入するか、またはヒトの血液からの精製により調製することができる。血液からのα2M-ペプチド複合体の精製のために、以下の限定されないプロトコルが使用できる。
【０１２１】
被験体から血液を収集し、凝血させる。次にこれを30分間14,000×gで遠心分離して血清を得、次にこれを0.04Mトリスバッファー、pH 7.6に加え0.3M NaClで平衡化したゲル濾過カラム（Sephacryl S-300R）にアプライする。65mlカラムを約10mlの血清に使用する。3ml画分を収集し、各々の画分を、α2M特異的抗体を用いたドットブロットによりα2Mの存在を試験する。α2M陽性画分をプールし、PD10カラムにアプライしてPMSFを含む0.01Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.5にバッファーを交換する。プールした画分を次に、リン酸バッファーで平衡化したCon Aカラム（10ml）にアプライする。カラムを洗浄し、5％メチルマンノースピラノシドでタンパク質を溶出させる。溶出液をPD10カラムに通して酢酸ナトリウムバッファー（0.05M; pH 6.0）にバッファーを換える。次にDEAEカラムを酢酸バッファーで平衡化し、サンプルをDEAEカラムにアプライする。カラムを洗浄し、0.13M酢酸ナトリウムでタンパク質を溶出させる。次にα2Mを有する画分をプールする。
【０１２２】
4.2.1. 熱ショックタンパク質およびα2Mの組換え発現
本発明の特定の実施形態において、HSPおよびα2Mは組換え法を通して高レベルのHSPおよびα2Mを発現する細胞から調製できる。多くのHSPおよびα2Mのアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列は一般的にGenBank等の配列データベースで入手できる。Entrez等のコンピュータープログラムを用いてデータベースを閲覧することが可能であり、登録番号によって対象のあらゆるアミノ酸配列および遺伝子配列データを検索する。データベースを検索してクエリー配列と種々の程度の類似性を有する配列を同定することもでき、それにはFASTAおよびBLAST等のプログラムを用い、それらはアライメントスコアおよび統計解析によって類似配列をランク付けするものである。本発明の組成物、方法ならびにHSPペプチド-複合体の調製に用いることができる、限定されないHSPの例示のようなヌクレオチド配列は以下のものである：ヒトHSP70, Genbank登録番号M24743, Huntら, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:6455-6489、ヒトHSP90, Genbank登録番号X15183, Yamazakiら, Nucl. Acids Res. 17:7108、ヒトgp96: Genbank登録番号X15187, Makiら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5658-5562、ヒトBiP: Genbank登録番号M19645; Tingら, 1988, DNA 7:275-286、ヒトHSP27, Genbank登録番号M24743; Hickeyら, 1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45、マウスHSP70: Genbank登録番号M35021, Huntら, 1990, Gene 87:199-204、マウスgp96: Genbank登録番号M16370, Srivastavaら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:3807-3811およびマウスBiP: Genbank登録番号U16277, Haasら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2250-2254。遺伝暗号の縮重のために、天然のヌクレオチド配列のみならずHSPをコードする他の縮重DNA配列全てをもHSPを発現するために使用できる。
【０１２３】
さらにおよびあるいはまた、α2Mタンパク質、ポリペプチド断片、類似体およびα2Mの変異体も請求項に記載の発明の実施において使用でき、これは少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％および最も好ましくは75％〜85％のα2Mとのアミノ酸同一性を有し、抗原提示細胞によって取り込まれ、抗原性分子に対する免疫応答を誘発することのできる複合体である抗原性ペプチドとの複合体を形成することが可能である。本発明のα2M分子は市販のものまたは天然由来から精製したもの（Kureckiら, 1979, Anal. Biochem. 99:415-420）、化学的に合成されたものまたは組換え的に産生されたものであり得る。本発明のα2Mポリペプチドの調製に使用できるα2M配列の限定されない例示は以下のものである：Genbank登録番号M11313, P01023, AAA51551; Kenら, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. 82:2282-2286。遺伝暗号の縮重のために、天然のヌクレオチド配列のみならずα2Mをコードする他の縮重DNA配列全てをもα2Mを発現するために使用することができる。
【０１２４】
選択したHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列が一度同定されると、ヌクレオチド配列またはその断片を入手し組換え発現のための発現ベクター中にクローン化することができる。発現ベクターは次にHSPまたはα2Mを増殖させるために宿主細胞内に導入される。HSPまたはα2Mの組換え産生のための方法は、本明細書にその詳細を記載する。
【０１２５】
DNAは標準的な分子生物学的技術を用いて、組織、細胞培養物またはクローン化DNA（例えばDNA「ライブラリー」）からの直接的なDNA増幅または分子クローニングにより取得され得る（例えば、Methods in Enzymology, 1987,第154巻, Academic Press、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Press, New YorkおよびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら（編）, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照、これら各々は全文を参照として本明細書に組み込む）。ゲノムDNA由来のクローンは、コード領域に加えて調節およびイントロンDNA領域を含み得る；cDNA由来のクローンはエクソン配列のみを含み得る。どのような資源であっても、HSPまたはα2M遺伝子は遺伝子を増殖するために適したベクター中にクローン化されるべきである。
【０１２６】
好ましい実施形態において、DNAはHSPまたはα2Mに関連したまたは相同的な既知の配列由来のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）増幅により、ゲノムまたはcDNAから増幅することができる。PCRは、選択する前にDNAクローンまたはゲノムもしくはcDNAライブラリーにおける所望の配列を増幅するために用いられる。PCRは例えばサーマルサイクラーおよびTaqポリメラーゼ（Gene Amp（商標登録））を使用することで実施することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は一般的に対象の遺伝子または遺伝子断片を取得するために用いられる。例えば、あらゆる所望の長さのHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列は、翻訳領域をコードするヌクレオチド配列に隣接するPCRプライマーを用いて産生することができる。あるいはまた、HSPまたはα2M遺伝子配列は制限エンドヌクレアーゼによって適切な部位で切断することが可能であり、それはそのような部位が利用でき、HSPまたはα2M遺伝子をコードするDNAの断片を放出する場合である。都合のよい制限酵素切断部位が利用できない場合には、当技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発および/またはDNA増幅法によって、そのような部位を適切な位置に作製してもよい（例えば、Shankarappaら, 1992, PCR Method Appl. 1:277-278参照）。次に、HSPまたはα2MをコードするDNA断片を単離し、適切な発現ベクター中に連結し、適切な翻訳読み取り枠が維持されていることが確実であるか注意する。
【０１２７】
別の実施形態において、ゲノムDNAからのHSPまたはα2M遺伝子の分子クローニングのために、DNA断片を産生してゲノムライブラリーを形成する。HSPまたはα2Mに関連した配列をコードする配列のいくつかは利用可能であり、精製および標識が可能であるため、ゲノムDNAライブラリーにおけるクローン化DNA断片を、標識化プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングしてもよい（BentonおよびDavis, 1977, Science 196:180、GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。プローブと実質的な相同性を有するそれらのDNA断片がハイブリダイズし得る。制限酵素消化および既知の制限酵素地図に従って予想される断片サイズの比較によって、適切な断片を同定することも可能である。
【０１２８】
HSPまたはα2MゲノムDNAの単離をするための代用法は、既知の配列から化学的に合成した遺伝子配列またはHSPもしくはα2MをコードするcDNAからのmRNAの合成を含むが、これらに限定されない。例えば、HSPまたはα2M遺伝子のcDNAクローニングのためのRNAは、HSPまたはα2Mを発現する細胞から単離することができる。cDNAライブラリーは当技術分野で知られる方法により産生してもよく、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするために開示されるような方法によってスクリーニングしてもよい。HSPまたはα2Mに対する抗体が利用できる場合、HSPまたはα2MはHSPまたはα2M-合成クローンに対する標識化抗体の結合により同定され得る。
【０１２９】
HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列のクローニングのための他の特定の実施形態は、例示として提示するが、以下に限定されない：特定の実施形態において、媒体ストリンジェンシーの低い条件下におけるHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとのハイブリダイゼーションによって、HSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を同定および取得することができる。限定としてではなく例示により、そのような低いストリンジェンシーの条件を用いた手順は以下の通りである（ShiloおよびWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:6789-6792も参照）。DNAを含むフィルターを35％ホルムアミド、5×SSC、50mM Tris-HCl（pH 7.5）、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSAおよび500μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で、6時間40℃で前処理をする。ハイブリダイゼーションは以下の改変をした。
【０１３０】
同じ溶液中で行う：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％（wt/vol）デキストラン硫酸および5〜20×106cpmの32P標識化プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合液中で18〜20時間40℃でインキュベートし、次に2×SSC、25mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM EDTAおよび0.1%SDSを含む溶液中で、1.5時間55℃で洗浄する。洗浄液を新しい液に換えてさらに1.5時間60℃でインキュベートする。フィルターをブロットして乾燥させ、オートラジオグラフィーに曝露する。必要ならば、フィルターを65〜68℃で3回目の洗浄を行い、フィルムに再曝露する。用いてもよい低いストリンジェンシーの他の条件は当技術分野において公知である（例えば、種間(cross-species)ハイブリダイゼーションの実施）。
【０１３１】
発現させるペプチド配列中のアミノ酸置換を生じる目的のため、またはさらなる操作が容易になるように制限酵素切断部位を作製/欠失させるために、当技術分野で知られる突然変異誘発のためのあらゆる技術がDNA配列における個々のヌクレオチドを改変するために用いることができる。そのような技術は化学的突然変異誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発（Hutchinsonら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551）、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463、Hillら, 1987, methods Enzymol. 155:558-568）、PCRに基づくオーバーラップ伸長（Hoら, 1989, Gene 77:51-59）、PCRに基づくメガプライマー突然変異誘発（Sarkarら, 1990, Biotechniques 8:404-407）等を含むがこれらに限定されない。改変は、二本鎖ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定によって確認することができる。
【０１３２】
特定の実施形態において、分泌型の非分泌性HSPをコードする核酸が、本発明の方法を実施するために使用される。このような核酸はER係留シグナルであるKDELに対するコード配列を欠失することで構築することができる。さらに、KDELコード配列はマウスIgG1のFc部分等のHSPの認識および精製を容易にするための分子タグと入れ替えられる。別の実施形態において、分子タグは天然に分泌されるHSPまたはα2Mに付加することができる。米国特許出願第09/253,429は、gp96のER係留シグナルの欠失が、トランスフェクトされた腫瘍細胞からのgp96-Igペプチド-複合体の分泌をもたらし、マウスIgG1と融合したKDEL-欠失gp96が、ELISAおよびFACS解析による検出ならびにプロテインAの補助を伴ったアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にすることを示す。
【０１３３】
4.2.1.1.発現系
HSPまたはα2M分子をコードするヌクレオチド配列は、組換え細胞内での増殖および発現のための発現ベクター中に挿入することができる。本明細書中で用いる発現構築物は、適切な宿主細胞内でHSPまたはα2M分子の発現が可能である１つ以上の調節領域と機能的に連結したHSPまたはα2Mをコードするヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結した」とは、調節領域および発現するHSPまたはα2Mポリペプチド配列が、HSPまたはα2M配列の転写および最終的には翻訳を許容するような方法で連結および位置された関連性を指す。種々の発現ベクターには、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミドまたは改変したウイルス（しかしこれらに限定されない）を含むものが使用され得る。例示は、λ誘導体等のバクテリオファージまたはpBR322もしくはpUCプラスミド誘導体もしくはBluescriptベクター（Stratagene）等のプラスミドを含む。典型的には、このような発現ベクターは、適切な宿主内でのベクターの増殖のための機能的な複製起点、HSPまたはα2M遺伝子配列の挿入のための１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。
【０１３４】
哺乳動物宿主細胞内におけるHSPまたはα2Mの発現のために、種々の調節領域が使用可能であり、それらは例えばSV40初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスLTR（RSV-LTR）プロモーターである。哺乳動物細胞内で有用となり得る誘導プロモーターは、メタロチオネインII遺伝子、マウス乳癌ウイルスのグルココルチコイド応答性LTR（MMTV-LTR）、β-インターフェロン遺伝子およびHSP70遺伝子と連結したものを含むが、これらに限定されない（Williamsら, 1989, Cancer Res. 49:2735-42、Taylorら, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:165-75）。宿主細胞内でのHSPまたはα2Mの発現の有効性は、適切な転写エンハンサーエレメントを、SV40ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β-アクチンで見られるような発現ベクター中に含ませることで増強し得る（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544、Gorman, 1990, Curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47参照）。
【０１３５】
発現ベクターはまた、２つ以上のタイプの宿主においてベクターの維持および複製を行うことのできる、またはベクターを宿主染色体中に組み入れることのできる配列をも含み得る。そのような配列は、複製起点、自己複製配列（ARS）、セントロメアDNAおよびテロメアDNAを含み得るが、これらに限定されない。また、少なくとも２つのタイプの宿主細胞内で複製および維持され得るシャトルベクターを用いることも有利となり得る。
【０１３６】
さらに、発現ベクターは、HSPまたはα2MをコードするDNAを含む宿主細胞を最初に単離または同定するために、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含み得る。長期にわたる、適切に修飾されたHSPまたはα2Mの高収率での産生には、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。いくつかの選択系を哺乳動物細胞に用いてもよく、それらは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskiおよびSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48:2026）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子をそれぞれtk−、hgprt−またはaprt−細胞内で用いることができるものを含むが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性もまた、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）（Wiglerら,1980, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567、O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1527）、ミコフェノール酸への耐性を付与するgpt（MulliganおよびBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072）、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hyg）（Santerreら, 1984, Gene 30:147）に対する選択の基礎として用いることができる。他の選択可能なマーカーは、ヒスチジノールおよびZeocin（商標）等も用いることができるが、これらに限定されない。
【０１３７】
調節領域と機能的に連結したHSP-またはα2M-コード配列を含む発現構築物は、さらにクローニングすることなく、本発明のHSPまたはα2M複合体の発現および産生するための適切な宿主細胞内に直接導入することができる。（例えば、米国特許第5,580,859参照）。発現構築物はまた、コード配列の宿主ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするDNA配列をも含み得る。この場合、宿主細胞内でのHSPまたはα2M分子の増殖および発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【０１３８】
クローン化したHSPまたはα2Mコード配列を含む発現構築物は、当技術分野で知られる種々の技術によって哺乳動物宿主細胞内に導入することができ、それらはリン酸カルシウム介在トランスフェクション（Wiglerら, 1977, Cell 11:223-232）、リポソーム介在トランスフェクション（Schaefer-Ridderら, 1982, Science 215:166-168）、エレクトロポレーション（Wolffら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:3344）およびマイクロインジェクション（Cappechi, 1980, Cell 22:479-488）を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
本明細書中に記載するあらゆるクローニングおよび発現ベクターも、当技術分野で公知の技術により既知のDNA配列から合成および構築してもよい。調節領域およびエンハンサーエレメントは天然および合成の種々の由来であり得る。いくつかのベクターおよび宿主細胞は市販のものであり得る。有用なベクターの限定されない例示はCurrent Protocols in Molecular Biologyの付録5, 1988,Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceに記載され、これは参照ならびにClontech Laboratories、Stratagene Inc.およびInvitrogen, Inc.等の商業的供給者のカタログにより本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
あるいはまた、多くのウイルスに基づいた発現系は、HSPまたはα2Mの組換え発現のための哺乳動物細胞とともに利用され得る。DNAウイルス骨格を用いたベクターは、サルウイルス40（SV40）（Hamerら, 1979, Cell 17:725）、アデノウイルス（Van Dorenら, 1984, Mol. Cell Biol. 4:1653）、アデノ随伴ウイルス（McLaughlinら, 1988, J. Viol. 62:1963）およびウシパピローマウイルス（Zinnら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4897）から由来してきた。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、ドナーDNA配列はアデノウイルス転写/翻訳調節領域（例えば、後期プロモーターおよびトリパータイト(tripartite)リーダー配列）に連結される。このキメラ遺伝子は次にin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須な領域（例えばE1またはE3領域）への挿入によって、感染した宿主内で相同的産物を発現させることが可能な組換えウイルスが生じる（例えば、LoganおよびShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659参照）。
【０１４１】
ウシパピローマウイルス（BPV）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染することができ、そのDNAはエピソームとして複製する。いくつかのシャトルベクターは、哺乳動物細胞において安定な多コピー（20〜300コピー/細胞）の染色体外エレメントとして存在する組換え遺伝子発現のために開発されてきた。典型的には、これらのベクターは大腸菌内でのベクターの増殖を許容するBPV DNAのセグメント（完全なゲノムまたは69％トランスフォーミング断片）、広い宿主範囲を有するプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライシングシグナル、選択マーカーおよび「無毒性の」プラスミド配列を含む。細菌内での構築および増幅の後、例えばリン酸カルシウム共沈殿またはエレクトロポレーションの技術によって、発現構築物を培養した哺乳動物細胞内にトランスフェクトする。形質転換された表現型を表さない宿主細胞のために、ヒスチジノールおよびG418耐性等の優性選択マーカーを用いて形質転換体の選択を行う。例えば、pBCMGSNeoおよびpBCMGHis等のBPVベクターはHSPまたはα2Mを発現させるために使用してもよく（Karasuyamaら, Eur. J. Immunol. 18: 97-104、Oheら, Human Gene Therapy 6: 325-33）、次にHSPまたはα2M発現のための多様な細胞タイプ内にトランスフェクトされ得る。
【０１４２】
あるいはまた、ワクシニア7.5Kプロモーターを使用してもよい（例えば、Mackettら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:7415-7419、Mackettら, 1984, J. Viol. 49:857-864、Panicaliら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:4927-4931参照）。ヒト宿主細胞を使用する場合、エプスタイン-バーウイルス（EBV）複製起点（OriP）およびEBV核抗原1（EBNA-1、トランス活性化複製因子）を使用してもよい。このようなベクターは広範囲のヒト宿主細胞とともに使用でき、それらは例えばEBO-pCD（Spickofskyら, 1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2:14-18）、pDR2およびλDR2（Clontech Laboratoriesより入手できる）である。
【０１４３】
組換えHSPまたはα2M発現はまた、レトロウイルスに基づいた発現系によっても行われる。トランスフェクションと対照的に、レトロウイルスは効果的に感染し、遺伝子を広範囲の細胞タイプ（例えば一次造血細胞）に移行することができる。モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスにおいて、ウイルス遺伝子配列の多くは除去およびHSPまたはα2Mコード配列と入れ換えることができる一方、失ったウイルス機能は外部から(in trans)供給することができる。レトロウイルスベクターによる感染の宿主範囲もまた、ベクターのパッケージングに用いる外被の選択によって操作できる。
【０１４４】
例えば、レトロウイルスベクターは5'側の末端反復配列（LTR）、3'LTR、パッケージングシグナル、細菌性複製起点および選択マーカーを含み得る。ND-関連抗原性ペプチドDNAを5'LTRと3'LTRとの間の位置に挿入して、5'LTRプロモーターからの転写がクローンDNAを転写するようにする。5'LTRは、LTRプロモーター、R領域、U5領域およびプライマー結合部位をこの順番に含むプロモーターを含むが、これらに限定されない。これらLTRエレメントのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。異種性のプロモーターと同様に多剤選択マーカーもまた、感染細胞の選択を容易にするための発現ベクター中に含まれる（McLauchlinら, 1990, Prog. Nucleic Acid Res. and Molec. Biol. 38:91-135、Morgenstermら, 1990, Nucleic Acid Res. 18:3587-3596、Choulikaら, 1996, J. Viol 70:1792-1798、Boesenら, 1994, Biotherapy 6:291-302、SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114参照）。
【０１４５】
組換え細胞は標準的な温度、インキュベーション時間、吸光度および培地組成の条件下で培養してもよい。あるいはまた、HSPが内因的に発現する細胞が必要とする栄養要求性および生理的要求性に匹敵する条件下で細胞を培養してもよい。改変された培養条件および培養液はHSP-ペプチド複合体の産生を増加させるために使用してもよい。例えば、組換え細胞は誘導性のHSP発現を促進する条件下で増殖させてもよい。
【０１４６】
本発明のα-2-マクログロブリンおよびHSPポリペプチドは、それらが発現する細胞内からの回収および精製を容易にするために、融合タンパク質として発現され得る。例えば、HSPまたはα2Mポリペプチドは培養液中への分泌のためのER膜を経由する輸送を指示するシグナル配列リーダーペプチドを含み得る。さらに、HSPまたはα2Mポリペプチドは、例えばカルボキシ末端等の結合抗原性ペプチドに関連しないHSPまたはα2Mポリペプチドの、任意の部位に融合したアファニティー標識等のアフィニティー標識を含み得る。アフィニティー標識は、アフィニティーパートナー分子への結合によってタンパク質の精製を容易にするために使用することができる。
【０１４７】
そのようなタンパク質の産生のための種々の方法は、当技術分野で公知のものである。それらの産生をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベル、好ましくは遺伝子レベルで行うことができる。例えば、クローン化されたHSPまたはα2Mポリペプチドのコード領域は、当技術分野で知られる多数の組換えDNA法のいずれかによって改変され得る（Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biologyの第8章, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）。置換、欠失、挿入またはそれらのあらゆる組み合わせが、HSPまたはα2Mポリペプチドをコードする最終的なヌクレオチド配列に達するために導入または併用されることが以下の議論から明らかである。
【０１４８】
種々の実施形態において、HSPまたはα2Mポリペプチドを含む融合タンパク質は組換えDNA技術を用いて作製され得る。例えば、HSPまたはα2Mポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、HSPまたはα2Mポリペプチドがペプチド-タグ化融合タンパク質として発現するようなアフィニティー標識の配列を含むベクター中への、適切な読み取り枠内のHSPまたはα2M遺伝子断片の導入によって構築され得る。アフィニティー標識は特異的結合パートナーによって認識され得、HSPまたはα2Mポリペプチドのアフィニティー精製のために使用してもよい。
【０１４９】
好ましい実施形態において、アフィニティー標識はそのアミノ末端がHSPまたはα2Mのカルボキシ末端に融合される。カルボキシ末端に作製される融合の正確な位置は重要ではない。最適な位置はルーチンな実験によって決定することができる。
【０１５０】
使用され得る当技術分野で知られる種々のアフィニティー標識は、免疫グロブリン定常部、ポリヒスチジン配列（Petty, 1996, Current Protocols in Molecular Biology第2巻中のMetal-chelate affinity chromatography, Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Guanら, 1987, Gene 67:21-30）および種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第5,496,934号、5,202,247号、5,137,819号、Tommeら, 1994, Protein Eng. 7:117-123）等であるが、これらに限定されない。他のアフィニティー標識はHSPまたはα2Mポリペプチドに、例えば緑色蛍光タンパク質の部分等の蛍光特性を与え得る。他の可能なアフィニティー標識はモノクローナル抗体を取得できる短いアミノ酸配列であり、以下の公知の例示に限定されず、それらはFLAGエピトープ、mycエピトープの408〜439番目のアミノ酸、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（HA）エピトープ等である。他のアフィニティー標識は特異的結合パートナーによって認識されるため、固相支持体上に固定することが可能な結合パートナーへのアフィニティー結合による単離を容易にする。いくつかのアフィニティー標識は、HSPまたはα2Mポリペプチドに多量体形成能等の新規の構造的特性を付与し得る。結合化ペプチドによるHSPまたはα2Mポリペプチドの二量体化は、HSPまたはα2Mポリペプチド間の相互作用および抗原提示の過程におけるパートナーの結合活性を増強し得る。これらのアフィニティー標識は普通、通常ホモポリマーとして存在するタンパク質由来のものである。CD8（Shiueら, 1988, J. Exp. Med. 168:1993-2005）の細胞外領域もしくはCD28（Leeら, 1990, J. Immnol. 145:344-352）または内部鎖ジスルフィド結合のための部位を含む免疫グロブリン分子の一部等のアフィニティー標識は、多量体を形成させ得る。当業者によって理解されるように、上記のアフィニティー標識のコード領域を取得するための多くの方法を用いることができ、それらはDNAクローニング、DNA増幅および合成法を含むがこれらに限定されない。いくつかのアフィニティー標識ならびにそれらの検出および単離のための試薬は市販のものである。
【０１５１】
好ましいアフィニティー標識は、免疫グロブリン分子の不変部である。典型的には、そのような部分は、少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常部の、機能的に作用するCH2およびCH3ドメインを含む。融合物はまた定常部のFc部分のカルボキシ末端または重もしくは軽鎖のCH1に隣接したアミノ末端領域を用いて作製される。適切な免疫グロブリンに基づいたアフィニティー標識はIgG-1、-2、-3もしくは-4サブタイプ、IgA、IgE、IgDまたはIgM、しかし好ましくはIgG1から取得され得る。好ましくは、ヒト免疫グロブリンは、HSPまたはα2Mポリペプチドがヒトに対してin vivoで使用される場合に用いられる。免疫グロブリン軽または重鎖定常部をコードする多くのDNAは公知であり、またはcDNAライブラリーより容易に入手できる。例えば、Adamsら, Biochemistry, 1980, 19:2711-2719、Goughら, 1980, Biochemistry, 19:2702-2710、Dolbyら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:6027-6031、Riceら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:7862-7865、Falknerら, 1982,Nature, 298:286-288およびMorrisonら, 1984, Ann. Rev. Immunol, 2:239-256を参照。多くの免疫学的試薬および標識系が免疫グロブリンの検出のために利用可能であり、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、免疫沈降、蛍光標示式細胞分取器（FACS）等の使用といった当技術分野で知られる種々の免疫学的技術によって、HSPまたはα2Mポリペプチド-Ig融合タンパク質を容易に検出および定量することができる。同様に、アフィニティー標識が容易に入手できる抗体を有するエピトープである場合、アフィニティー標識を含むHSPまたはα2Mポリペプチドを検出、定量および単離するために、そのような試薬を上記の技術によって使用することができる。多くの場合、HSPまたはα2Mポリペプチドに対する特異的抗体を開発する必要はない。
【０１５２】
特に好ましい実施形態は、HSPまたはα2Mポリペプチドのヒンジ、ヒト免疫グロブリンG-1（IgG-1; Bowenら, 1996, J. Immunol. 156:442-49参照）のCH2およびCH3ドメインへの融合である。このヒンジ領域は3つのシステイン残基を含み、それらは通常Ig分子内の他のシステインとのジスルフィド結合に含まれる。ペプチドが標識として機能するために必要なシステインはないため、1つ以上のこれらのシステイン残基は場合によっては例えばセリン等の別のアミノ酸残基と置換してもよい。
【０１５３】
当技術分野で知られる種々のリーダー配列は、細菌および哺乳動物細胞由来のHSPまたはα2Mポリペプチドの効果的な分泌のために用いることができる（von Heijne, 1885, J. Mol. Biol. 184:99-105）。リーダーペプチドは対象とする宿主細胞に基づいて分泌され、細菌、酵母、ウイルス、動物および哺乳動物の配列を含み得る。例えば、ヘルペスウイルスグリコプロテインDリーダーペプチドは種々の哺乳動物細胞内での使用に適している。哺乳動物細胞内での使用に好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のV-J2-C領域より得ることができる（Bernardら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5812-5816）。細菌細胞内でのHSPまたはα2Mポリペプチド発現を標的とする好ましいリーダー配列は、大腸菌タンパク質OmpA（Hobomら, 1995, Dev. Biol. Stand. 84:255-262）、PhoA（Okaら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212-16）、OmpT（Johnsonら, 1996, Protein Expression 7:104-113）、LamBおよびOmpF（HoffmanおよびWright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:5107-5111）、β-ラクタマーゼ（Kadonagaら, 1984, J. Biol. Chem. 259:2149-54）、エンテロトキシン（Morioka-Fujimotoら, 1991, J. Biol. Chem. 266:1728-32）ならびに黄色ブドウ球菌プロテインA（Abrahmsenら, 1986, Nucleic Acid Res. 14:7487-7500）および枯草菌エンドグルカナーゼ（Loら, Appl. Environ. Microbiol. 54:2287-2292）と同様に、人為的および合成的シグナル配列（MacIntyreら, 1990, Mol. Gen. Genet. 221:466-74、Kaiserら, 1987, Science, 235:312-317）を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
所望のアフィニティー標識もしくはリーダーペプチドをコードするDNA配列は、合成的に作製されるライブラリーから容易に入手され得、または商業的供給者から入手可能であり、本発明の実施に適している。そのような方法は当技術分野で公知のものである。
【０１５５】
4.3. ペプチド断片のHSPおよびα2Mとの複合体形成
本明細書に記載されるのは、抗原性細胞のタンパク質調製物の消化によって生じてきたペプチドの集団への、HSPまたはα2Mのin vitroでの複合体形成のための方法である。複合体形成反応は、HSPとペプチドとのまたはα2Mとペプチドとの間の共有結合の形成によって生じ得る。複合体形成反応はまた、HSPとペプチドとのまたはα2Mとペプチドとの間の非共有結合の形成によっても生じ得る。
【０１５６】
非共有結合HSP-抗原性分子複合体およびα2M-抗原性分子複合体を産出する方法において、複合体はBlachereら, 1997, J. Exp. Med. 186(8):1315-22によって記載される方法に従って調製され、これは参照により本明細書にその全てを組み入れる。Blachereはhspの抗原性分子とのin vitroでの複合体形成を教示する。Blachereが記載するプロトコルは、hsp構成成分をα2Mと入れ替えるために改変することができる。Binderら（2001, J. Immunol. 166:4968-72）はBlachere法が抗原性分子と結合したα2Mの複合体をもたらすことを明らかにする。
【０１５７】
複合体形成の前に、HSPをATPまたは低pHで前処理して対象のHSPと非共有的に結合し得るあらゆるペプチドを除去することができる。ATP法を用いる場合、Levyら, 1991, Cell 67:265-274に記載されるようにアピラーゼ（apyranase）の添加により過剰のATPを調製物から除去する。低pH法を用いる場合、pH改変試薬の添加によりバッファーを中性pHに再調整する。ペプチドの集団（平均長7〜20アミノ酸）のHSPまたはα2Mとのin vitroでの複合体形成のための好ましい、代表的なプロトコルは以下に記載する。
【０１５８】
ペプチドの集団（1μg）および前処理したHSP（9μg）を約5ペプチド：1ストレスタンパク質のモル比になるよう混合する。次に、混合物を15分〜3時間4〜45℃で、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.2、350mM NaCl、3mM MgCl2および1mMフェニルメチルスルフォイルフロリド（PMSF）を含むような適切な結合バッファー中でインキュベートする。調製物をCentricon 10 assembly（Millipore）を通して遠心分離して、あらゆる非結合ペプチドを除去する。ペプチドのストレスタンパク質への非共有結合は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または質量分析法（MS）によってアッセイすることができる。
【０１５９】
ペプチド断片へのHSP70の非共有複合体を産出するために好ましい、本発明の別の実施形態において：5〜10μgの精製したHSP70を等モル量のペプチド断片とともに、100μlの量の20mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.5、0.5M NaCl、3mM MgCl2および1mM ADP中で、37℃で1時間インキュベートする。このインキュベーション混合物を必要なら1回以上遠心分離し、Centricon 10 assembly（Millipore）を通してあらゆる非結合ペプチドを除去する。
【０１６０】
ペプチド断片へのgp96またはHSP90の複合体を産出するために好ましい、本発明の別の実施形態において、5〜10μgの精製したgp96またはHSP90を等モル量または過剰量ののペプチド断片とともに、20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.5、0.5M NaCl、3mM MgCl2を含むような適切なバッファー中で60〜65℃で5〜20分間インキュベートする。このインキュベーション混合物は室温まで冷却し、必要なら1回以上遠心分離し、Centricon 10 assembly（Millipore）を通してあらゆる非結合ペプチドを除去する。
【０１６１】
複合体形成の後、免疫原性HSP-ペプチド複合体またはα2M-ペプチド複合体は、場合によっては、例えば以下に記載される混合したリンパ球標的細胞アッセイ（MLTC）を用いてアッセイすることができる。一度HSP-ペプチド複合体が単離および希釈されると、それらは場合によっては、動物モデル中で以下に記載される好ましい投与プロトコルおよび賦形剤を用いて、さらに特徴づけることができる。
【０１６２】
HSPとペプチドとの非共有複合体を作製するための代用法は、ペプチドの集団を共有的にHSPに結合することができる。共有的に連結した複合体はB細胞応答が所望される場合に選択する複合体である。
【０１６３】
1つの実施形態において、化学的架橋によってHSPは共有的にペプチド断片と結合する。化学的架橋法は当技術分野で公知である。例えば、好ましい実施形態において、グルタルアルデヒド架橋を使用してもよい。グルタルアルデヒド架橋はペプチドとHSPとの共有結合複合体を形成するために使用されてきた（Barriosら, 1992, Eur. J. Immunol. 22:1365-1372参照）。好ましくは、1〜2mgのHSP-ペプチド複合体を0.002％グルタルアルデヒド存在下で2時間架橋化する。グルタルアルデヒドはリン酸バッファー塩（PBS）に対して一晩透析することで除去される（Lussowら, 1991, Eur. J. Immunol. 21:2297-2302）。あるいはまた、HSPとペプチドの集団とは当技術分野で知られる条件下での紫外線（UV）架橋によって架橋することができる。本発明の別の実施形態において、ペプチドの集団はペプチド断片のα2Mとの50:1モル比でのインキュベートによりα2Mと複合体形成することができ、50℃で10分間インキュベートした後、30分間25℃でインキュベートする。次に遊離の（非結合）ペプチドをサイズ排除フィルターによって除去する。タンパク質-ペプチド複合体を好ましくはシンチレーションカウンターによって測定し、モル当たりに、各々のタンパク質が等量のペプチドを結合していることが観察できるか確認する（ペプチドの開始量の約0.1％）。詳細はBinder, 2001, J. Immnol. 166(8):4968-72を参照し、その全文を参照により本明細書中に組み入れる。
【０１６４】
あるいはまた、抗原性ペプチドの集団は、PCT国際公開WO94/14976およびWO99/50303に記載されるペプチドのα2Mとの複合体形成のための方法により、α2Mと共有結合的に複合体形成することが可能であり、その全文を参照により本明細書中に組み入れる。抗原性ペプチドの集団のα2Mへの共有結合は二機能性の架橋剤を用いて行われる。そのような架橋剤およびその使用法も当技術分野で公知である。
【０１６５】
4.4. 使用するHSP/α2Mワクチン組成物
本発明のHSPまたはα2M調製物とともに使用され得るHSP/α2Mワクチン組成物は、例えば種々のタイプの癌の治療もしくは予防のために開発されてきた腫瘍特異的または腫瘍関連抗原を含む腫瘍抗原と複合体形成したHSP/α2M-ペプチド複合体、あるいは癌組織または癌細胞系から単離された複合体を含み得るが、これらに限定されない。ワクチン組成物に使用され得る腫瘍抗原の限定されない例示は、KS1/4膵癌抗原（PerezおよびWalker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667、Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415）、卵巣癌抗原（CA125）（Yuら, 1991, Cancer Res. 51(2):468-475）、前立腺酸性ホスファターゼ(prostatic acid phospate)（Tailerら, 1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928）、前立腺特異的抗原（HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910、Israeliら, 1993, Cancer Res. 53:227-230）、黒色腫関連抗原p97（Estinら, 1989, J. Natl. Cancer inst. 81(6):445-446）、黒色腫抗原p75（Vijayasardahlら, 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380）、高分子量黒色腫抗原（Nataliら, 1987, Cancer 59:55-63）、MAGEファミリーの抗原（Huら, 1996, Cancer Res. 56:2479-2483、Marchandら, 1995, Int. J. Cancer 63:883-885）および前立腺特異的膜抗原を含む。
【０１６６】
感染性疾患の治療または予防に有用なHSP/α2Mワクチン組成物は、特定の感染性疾患の薬剤に関連する既知の抗原と複合体形成したもしくはそのような抗原の抗原性を示す分子と複合体形成したHSPまたはα2Mを含み得り、感染した細胞から単離することができる。
【０１６７】
本発明のHSP/α2Mワクチン組成物は自己のHSP-ペプチド複合体およびα2M-ペプチド複合体であってもよく、または複合体のHSP/α2M構成成分もしくはペプチド構成成分が自己のものであってもよく、例えば投与された患者から単離されたものである。あるいはまた、HSP/α2Mワクチン組成物または構成成分は自己のものであってもよい。
【０１６８】
多くの方法がワクチンを導入するために用いられ得る：それらは経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内経路および乱切（scarification）（例えば二股針を用いた皮膚の最上層を通した掻は（scratching））を介したものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
ワクチンを投与される患者は好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えばニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含むヒトではない動物でもあってもよく、これらに限定されない。
【０１７０】
HSP/α2Mワクチン組成物はアジュバントを含み、また1つ以上のアジュバントとともに投与され得る。使用され得るアジュバントは無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバント、粒状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜性アジュバントおよび免疫刺激性アジュバントを含むが、これらに限定されない。アジュバントの例示は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、スクアレンまたはスクアレン油中水型アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合体化リポソーム、トリテルペノイドグリコシドまたはサポニン（例えば、QuilAおよびQS-21、また商標STIMULON, ISCOPREPで販売される）、N-アセチルムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（スレオニル-MDP、商標TERMURTIDEで販売される）、LPS、モノホスホリルリピッドA（商標MPLとして販売される3D-MLA）を含むが、これらに限定されない。
【０１７１】
4.5. キット、投与計画、投与および調剤
本発明のワクチン接種の方法を行うためのキットも提供される。特定の実施形態において、キットは、HSP/α2Mワクチン組成物によって誘発される、免疫応答が所望されるHSP/α2Mワクチン組成物の構成成分に対する免疫応答を増強もしくは持続させるために効果的な量の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物を含む第1の容器、および第1の容器中の熱ショックタンパク質もしくはα2M調製物の投与前、同時または後に投与された場合に構成成分に対する免疫応答を誘導するのに効果的な量のHSP/α2Mワクチン組成物を含む第2の容器を含む。もう１つの実施形態において、キットはHSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物の両方を含む容器を含み、ここでHSP調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は混合して存在しない。別のもう１つの実施形態において、キットはα2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物の双方を含む容器を含み、ここでα2M調製物およびHSP/α2Mワクチン組成物は混合して存在しない。
【０１７２】
本発明のキットは、疾患もしくは障害を治療または予防するために効果的な量のHSP/α2Mワクチン組成物が入った容器、およびワクチンによって誘発される免疫応答を増強もしくは持続させるために効果的な量の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物のどちらかを含む別の容器を含む。ある実施形態において、容器内に提供されるHSP/α2Mワクチン組成物の量は、他の容器中の熱ショックタンパク質調製物またはα2M調製物が別々に投与される場合に、被験体における免疫応答を誘導するためには不十分である。場合によっては、キットに使用説明書を添付してもよい。
【０１７３】
投与されるHSP調製物またはα2M調製物の投与量は、投与されるHSP/α2Mワクチン組成物の量、治療の回数および投与経路はもちろん、治療される被験体の状態およびサイズに広範囲で依存する。部位、投与量および回数を含む継続的な治療のための投与計画は、初期応答および臨床上の判断によって方針付けられる。
【０１７４】
投与経路およびHSP調製物中のHSPのタイプに応じて、HSP調製物中のHSPの量を例えば投与量当たり0.1〜1000μgに変えることができる。好ましいgp96またはhsp70の量は投与量当たり10〜600μg、およびHSP調製物を皮内に投与する場合は0.1〜10μgの範囲内である。hsp90の好ましい量は投与量当たり約50〜1000μg、および皮内投与には5〜50μgである。投与されるα2Mの量は2〜1000μg、好ましくは20〜500μg、最も好ましくは約25〜250μgに変えることができ、約4〜6週間に渡って週に1回、経時的に投与部位を変えて皮内に与えられる。
【０１７５】
1つの好ましい実施形態において、HSP調製物またはα2M調製物はワクチンの投与と同時に投与される。HSP調製物またはα2M調製物およびワクチンを同時に投与するとは、HSPまたはα2M調製物をワクチンと適切に同じ時間に与えることを意味する。本方法は、例えば同じ医師の訪問で、２つの投与の時間枠がお互いに1分〜約5分未満または約60分以内で行われることを提供する。
【０１７６】
HSP調製物またはα2M調製物の投与のため、より少ない量のワクチンが被験体における免疫応答を誘発するために必要である。特定の実施形態において、HSP/α2Mワクチン組成物の量の約10％、20％、30％、40％および50％を減少させることができる。平均の副免疫原性となる量のHSP/α2Mワクチン組成物が使用され得るのは、適量のHSP調製物またはα2M調製物が組み合わせて使用される場合である。副免疫原性となる範囲の量を含むHSP調製物またはα2M調製物とともに使用されるHSP/α2Mワクチン組成物の量は、当技術分野で公知の方法により動物モデルにおいて行われる投与応答実験によって決定することができる。
【０１７７】
溶解度およびワクチン接種の部位は、本発明のHSPまたはα2M調製物の投与経路を選択する際に考慮するべきファクターである。投与の方法は変えることができ、それらは例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または粘膜への投与を含むがこれらに限定されない。粘膜経路はさらに経口、直腸内および経鼻投与の形態をとることができる。上記のファクターを考慮すると、HSPもしくはα2Mをワクチン接種部位と同じまたは近位の部位に投与するのが好ましい。
【０１７８】
本発明の実施形態において、HSPまたはα2Mはあらゆる望ましい投与経路を用いて投与され得る。皮内投与の利点はそれぞれ、少ない投与量での使用および迅速な吸収を含む。皮下または筋肉内投与はそれぞれいくつかの不溶性懸濁液および油性懸濁液への適合性を含む。粘膜経路の投与は、例えば経口、直腸内および経鼻投与を含むがこれらに限定されない。粘膜投与用の調製物は以下に記載するような種々の調剤に適している。
【０１７９】
好ましい実施形態において、本発明はHSP調製物を導入する方法を提供し、これはhsp70、hsp90およびgp96を単独またはお互いに組み合わせて、ワクチンの投与と同時に同じ部位または近接した部位に被験体に投与することを含むが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態において、本発明はα2M調製物をワクチンの投与と同時に同じ部位または近接した部位に導入する方法を提供する。好ましくは、HSP調製物またはα2M調製物はHSP/α2Mワクチン組成物と混合して投与されない。
【０１８０】
HSPまたはα2M調製物が水溶性である場合、次に例えばリン酸バッファー塩または他の生理的に適合する溶液、好ましくは無菌的な、適切なバッファー中に調剤され得る。あるいはまた、生じた複合体の水溶性溶媒に対する溶解度が低い場合、さらにTweenまたはポリエチレングリコール等の非イオン性界面活性剤とともに調剤され得る。従って、複合体およびそれらの生理的に許容可能な溶媒和化合物は、吸入もしくはガス注入（口もしくは鼻から）による投与、または経口、バッカル、非経口もしくは直腸内投与のために調剤してもよく、あるいは腫瘍の場合、直接的に固形腫瘍内に注入してもよい。
【０１８１】
経口投与用の医薬調製物は液状、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態であってもよく、使用前に水または他の適切なビヒクルで再構成するための薬剤産物として提供され得る。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化食用脂肪）、乳化剤（例えばレシチンもしくはアカシア）、非水溶性ビヒクル（例えばアーモンドオイル、油性エステルもしくは画分化植物油）および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル-p-水酸化安息香酸塩またはソルビン酸）等の製薬上許容され得る添加剤とともに従来の手段により調製され得る。医薬調製物は、例えば結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）、崩壊剤（例えばジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の製薬上許容され得る賦形剤とともに、従来の手段により調製され得る錠剤あるいはカプセルの形態のものであってもよい。錠剤は当技術分野で公知の方法によりコーティングしてもよい。
【０１８２】
経口投与用のHSP調製物は、活性化合物の放出が制御されるよう適切に調剤され得る。
【０１８３】
バッカル投与用の調製物は、従来の方法で処方される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１８４】
調製物は、注射（例えばボーラス注射または継続的な注入による）による非経口投与用に調剤され得る。注射用の製剤は単位用量形態中、例えばアンプルまたは多数回用量用の容器中に保存剤を添加して提供され得る。調製物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳剤等の形態であってもよく、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤等の製剤を含んでもよい。あるいはまた、活性成分は使用前に適切なビヒクル（例えば無菌的な発熱物質不含水）で構成するための粉末形態のものであってもよい。
【０１８５】
調製物はまた、例えばカカオバターもしくは他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む坐剤または貯留浣腸等の直腸用調製物として調剤され得る。
【０１８６】
上記の調剤に加え、調製物はまたデポー製剤として調剤され得る。このような長期間作用性の製剤は、（例えば皮下もしくは筋肉内への）移植または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば調製物は適切な重合体もしくは疎水性材料（例えば許容可能な油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは例えば難溶解性塩等の難溶性誘導体として調剤され得る。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬剤の送達ビヒクルまたは運搬体の公知の例示である。
【０１８７】
吸入による投与のために、本発明で使用される調製物は、適切な噴射剤（例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切な気体）を用いて、加圧パックまたは噴霧器より供給されるエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、単位用量は一定量を送達するためのバルブの提供により決定され得る。吸入器および吹入器で用いる、例えばゼラチン等のカプセルならびに薬包は、ラクトースまたはデンプン等の適切な粉末基剤と化合物との混合粉末を含んで調剤され得る。
【０１８８】
所望されるなら、調製物はHSP調製物もしくはα2M調製物を含む1つ以上の単位用量の剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置に入れて提供され得る。パックは例えばブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔製のものを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には投与のための説明書が添付され得る。
【０１８９】
4.6. HSPまたはα2M処理後のワクチンの免疫原性の測定
任意の手順において、本発明のHSPもしくはα2M調製物とともに使用されるワクチンの産出または免疫原性の増強は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて評価することができる。
【０１９０】
1つの方法において、ワクチンおよびHSP調製物またはα2M調製物の免疫原性は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）等の抗体アッセイにより、応答により産出する抗体を測定することによって測定される。そのようなアッセイの方法は当技術分野で公知である（例えば、2.1節のCurrent Protocols in Immunology, Coliganら（編）, John Wiley and Sons, Inc. 1997参照）。例えば、マイクロタイタープレート（96-ウェル Immuno Plate II, Nunc）を50μl/ウェルのPBS中の癌細胞もしくは感染細胞の抽出液または可溶化液0.75μg/mlによって4℃で16時間および20℃で1時間コートする。ウェルを空にして、ウェル当たり200μlのPBS-T-BSA（0.05％(v/v)Tween 20および1％(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBS）によって20℃で1時間ブロッキングし、次にPBS-Tで3回洗浄する。50μl/ウェルのワクチン接種した動物（HSP調製物の投与をしたもしくはしていないモデルマウスまたはヒト患者等）由来の血漿あるいはCSFを20℃で1時間アプライし、プレートをPBS-Tで3回洗浄する。次に、50μl/ウェルの抗-マウスまたは抗-ヒトヒツジ免疫グロブリン、適切にはPBS-T-BSA中に1:1,500に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼおよび（上記のPBS-T洗浄をさらに3回した後）50μlのo-フェニレンジアミン(OPD)-H2O2基質溶液を混合したものによって、抗原抗体活性を比色分析的に測定する。5分後に150μlの2M H2SO4により反応を停止させ、吸光度計で492nm（レファレンス波長：620nm）の吸光度を標準的な技術を用いて測定する。
【０１９１】
別の方法において、抗原-特異的T細胞を同定するために「四量体染色」アッセイ（Aitmanら, 1996, Science 274:94-96）を使用してもよい。例えば、1つの実施形態において、腫瘍-特異的抗原等の特異的ペプチド抗原を含むMHC分子は多量体化して可溶性ペプチド四量体を形成し、例えばストレプトアビジンとの複合体形成によって標識される。次にMHC-ペプチド抗原複合体を、ワクチンおよびHSP調製物で処置された患者から得たT細胞の集団と混合する。次にビオチンを用いて、対象の腫瘍-特異的抗原を発現するT細胞を染色する。
【０１９２】
さらに、混合リンパ球標的培養アッセイを用いて、4時間51Cr-放出アッセイ（Palladinoら, 1987, Cancer Res. 47:5074-5079参照）でT細胞の細胞傷害性を試験することができる。このアッセイにおいて、混合したリンパ球培養物を標的細胞懸濁液に添加して、異なるエフェクター:標的（E:T）比（通常1:1〜40:1）を得る。標的細胞は、1×106個の標的細胞をml当たり500μCiの51Crを含む培養液中で、1時間37℃でインキュベートすることにより前標識される。標識化の後、細胞を3回洗浄する。各々のアッセイポイント（E:T比）は3回、ならびに自発的な51Cr放出（アッセイにリンパ球を添加しない）および100％放出（界面活性剤で溶解した細胞）の測定に組み入れられる適切な対照において実施される。細胞混合物を4時間インキュベートした後、200gで5分間の遠心分離によって細胞をペレット化する。上清に放出された51Crの量をγカウンターによって測定する。試験サンプル中のcpm−自発的に放出されたcpmを全界面活性剤放出cpm−自発的に放出されたcpmで割ることで、細胞障害性の割合を測定する。MHCクラスIカスケードを阻止するために、K-44ハイブリドーマ細胞（抗-MHCクラスIハイブリドーマ）由来の濃縮したハイブリドーマ上清を試験サンプルに添加して最終濃度を12.5％にする。
【０１９３】
あるいはまた、ELISPOTアッセイを用いて、ワクチンおよびHSP調製物またはα2M調製物による刺激後の細胞傷害性T細胞によってin vitroでのサイトカイン放出を測定することができる。サイトカイン放出は、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子αまたはインターフェロン-γ等（例えばScheibenbogenら, 1997, Int. J. Cancer, 71:932-936参照）の特定のサイトカインに特異的な抗体によって検出される。アッセイは、T細胞によって分泌されるサイトカインを捕獲する、対象のサイトカインに特異的な抗体でプレコートされた（pre-coated）マイクロタイタープレート中で行われる。コートしたウェル中でT細胞を24〜48時間インキュベートした後、細胞傷害性T細胞を除去し、サイトカイン上の異なるエピトープを認識する二次標識抗体と入れ替える。非結合抗体を除去するために何度も洗浄した後、発色反応産物を産生する酵素基質をプレートに添加する。サイトカイン産生細胞の数を顕微鏡下で数える。この方法は短いアッセイ時間、および多数の細胞傷害性T細胞を必要とせず、感度において利点を有する。
【０１９４】
4.7. 感染性疾患の治療および予防
本発明の方法と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の使用によって治療または予防できる感染性疾患は、ウイルス、細菌、菌類、原生動物および寄生体を含む感染性病原体を含むが、これらに限定されない。
【０１９５】
本発明の方法と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の使用によって治療または予防できるウイルス性疾患は、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹Iウイルス、単純疱疹IIウイルス、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスI型（HIV-I）およびヒト免疫不全症ウイルスII型（HIV-II）を含むが、これらに限定されない。
【０１９６】
本発明の方法と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の使用によって治療または予防できる細菌性疾患は、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリアおよびレジオネラを含む細菌によって引き起こされるが、これらに限定されない。
【０１９７】
本発明の方法と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の使用によって治療または予防できる原生動物性疾患は、レーシュマニア、コクシジウム原虫およびトリパノゾーマを含むプロトゾアによって引き起こされるが、これらに限定されない。
【０１９８】
本発明の方法と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の使用によって治療または予防できる寄生体病は、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫によって引き起こされるが、これらに限定されない。
【０１９９】
4.8 癌の治療
本発明の方法と組み合わせたHSP/α2Mワクチン組成物の使用によって治療または予防できる癌は以下のタイプの癌を含むが、これらに限定されない：ヒト肉腫および癌腫（例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌腫、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫）；白血病（例えば急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病）（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症および重鎖病）。
【０２００】
本明細書中に引用された全ての文献は全文を参照として、およびあらゆる目的のためにその全文を参照として組み込むために、各々の個々の出版物または特許もしくは特許出願が特別かつ個々に示される場合、同じ範囲に対するあらゆる目的のために、本明細書中に組み込まれる。
【０２０１】
本発明の多くの改良および変更は、当業者にとって明らかとなり得るように、その精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。本明細書中に記載する特定の実施形態は、例示によってのみ提供され、本発明は特許請求の用語に加えて表題の特許請求等に相当する全ての範囲によってのみ限定される。
【国際調査報告】
2006507272.tif 000002
2006507272.tif 000003