(57)【要約】本発明は、改変グルテニンポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関し、ここでジスルフィド架橋を介する分子間架橋を担う一つ以上のシステイン残基をコードする上記配列は、欠失しているか、もしくは上記コード配列のする読取り枠を修正することなく他のアミノ酸をコードする配列によって置換されている。さらに、本発明は、小麦貯蔵タンパク質を含む食品の有利な特性を有し、グリアジンが減少したもしくはグリアジンを含まない食品を提供することの課題に関する。
2006518584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変グルテニンポリペプチドをコードする配列を含む核酸であって、ここで、ジスルフィド架橋を介する分子間架橋を担う一つ以上のシステイン残基をコードする該配列は、欠失しているか、もしくは該コード配列の読取り枠を修正することなく他のアミノ酸をコードする配列によって置換されている、核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸であって、該核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、核酸。
【請求項３】
請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の核酸であって、ここで、前記グルテニンコード配列は、配列番号９で示される配列と少なくとも７５％の相同性を有する配列である、核酸。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の核酸であって、ここで、該核酸は、ドメインＩにおけるシステイン残基および／もしくはドメインＩＶにおけるシステイン残基は、欠失しているか、または別のアミノ酸によって置換されているポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の核酸であって、ここで、該改変グルテニンポリペプチドは、ジスルフィド結合形成が可能な状態で、２００  ｋＤａ未満、好ましくは１００  ｋＤａ未満の大きさのモノマーとして維持される、核酸。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の核酸であって、ここで、該核酸は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の核酸であって、ここで、該核酸は、無改変のＬＭＷグルテニンポリペプチドおよび／もしくは改変のＨＭＷグルテニンポリペプチドをさらにコードする、核酸。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターであって、前記グルテニンポリペプチドの発現を調節するための配列をさらに含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載のベクターであって、ここで、前記グルテニンポリペプチドの発現を調整するための前記配列が、プロモーターおよびターミネーター配列を含む、ベクター。
【請求項１１】
請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載のベクターであって、ここで、前記プロモーターは誘導プロモーターである、ベクター。
【請求項１２】
請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載のベクターであって、ここで、前記プロモーターは構成プロ−モーターである、ベクター。
【請求項１３】
請求項８から請求項１２のいずれか１項に記載のベクターであって、ここで、前記プロモーターは、微細菌または酵母のプロモーターである、ベクター。
【請求項１４】
請求項８から請求項１３のいずれか１項に記載のベクターであって、ここで該ベクターが、前記グルテニンのタンパク質の直接の分泌が可能なシグナル配列をさらに含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドであって、配列番号１０において示される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
グリアジン置換のような、請求項１５または請求項１６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用であって、ここで、該使用が改変グルテニンポリペプチドの組み合わせた使用を含み、ここで、ジスルフィド架橋を介して分子間架橋を担う一つ以上のシステイン残基をコードする該配列が、欠失しているか、もしくは無改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドおよび／または無改変ＨＭＷグルテニンポリペプチドで置換される、使用。
【請求項１９】
請求項１７または請求項１８に記載の使用であって、ここで、前記ポリペプチドが、小麦粉、パン生地、生地、ペストリー、クッキー、めん類、ワッフル、パン、および／または菓子類のような食品の調製、または錠剤のような医薬品の調製のために使用される、使用。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９のいずれか１項に記載の使用であって、ここで、該食品が、かなり減少した量のグリアジンタンパク質を含むか、もしくはグリアジンタンパク質を含まない、使用。
【請求項２１】
請求項８〜請求項１４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞であって、ここで、該細胞が細菌細胞または酵母細胞である、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞であって、該細胞が、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、または細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、宿主細胞。
【請求項２４】
核酸を調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）グルテニンポリペプチドをコードする核酸が同定される工程；
（ｂ）ジスルフィド架橋を介するグルテニンポリペプチドの分子間架橋を担うシステイン残基をコードする（ａ）の該核酸内の配列が、同定される工程；および
（ｃ）（ａ）の該核酸が、（ｂ）において同定されるシステイン残基をコードする該配列を、該コード配列の読取り枠を変化することなく異なるアミノ酸をコードする配列に変化するために改変される工程；
を包含する、方法。
【請求項２５】
改変したＬＭＷグルテニンポリペプチドを調整する方法であって、ここで、以下：
（ａ）細菌が、請求項１〜請求項１４の内のいずれか１項に記載の核酸、もしくは請求項２４の記載に従って調製された核酸を形質移入される工程；および
（ｂ）該ポリペプチドが、培地の上清または細菌から単離される工程；
の工程を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の改変ＬＭＷグルテニンポリペプチド、もしくは請求項２５の記載に従って調製された改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドを使用した、小麦粉の調製物を含む食品を調製する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組み換え的に発現されたポリペプチドから食品を調製する方法であって、ここで、前記改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドが、小麦粉および小麦以外の小麦粉を補強するための、小麦粉の調製において使用される、方法。
【請求項２８】
請求項２６または請求項２７のいずれか１項に記載の組み換え的に発現されたポリペプチドから食品を調製する方法であって、ここで、前記小麦粉は、パン生地、生地、ペストリー、クッキー、めん類、ワッフル、パンおよび／または菓子類の調製について使用される、方法。
【請求項２９】
請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含み、もしくは、請求項２６-〜請求項２８のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る食品であって、ここで、該食品は、好ましくはパン生地、生地、ペストリー、ワッフル、パンおよび／または菓子類である、食品。
【請求項３０】
０．０１％重量未満のグリアジンタンパク質を含む、請求項２９に記載の食品。
【請求項３１】
請求項１５〜請求項１７までのいずれか１項に記載の改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドを使用した錠剤の調製を含み、もしくは請求項２５の記載に従って調製される薬学的組成物の調製法。
【請求項３２】
請求項３１の記載の方法であって、ここで、前記改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドが錠剤で覆われる、方法。
【請求項３３】
請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含み、もしくは請求項３１または請求項３２に記載の方法によって得られ得る、錠剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変グルテニンポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関し、ここでジスルフィド架橋を介して分子間架橋を担う一つ以上のシステイン残基をコードする配列は、欠失されるか、もしくはまたそのコード配列の読取り枠の修正無しに他のアミノ酸をコードする配列により置換された。本発明は、さらにこれらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、ならびにグリアジン代用品としてのその使用、特にグリアジンを含まない食品の調製のための、さらに関する。最終的に、本発明はまた、セリアック病およびあまり重篤でない状態のグルテニン不耐性に罹患する患者の食事のためのそれぞれのグリアジンを含まない食料の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
セリアック病は、小腸の裏側が、近接の関連種の種子、と同様に小麦種子およびライ麦種子ならびにデンプン質の胚乳において見出される貯蔵タンパク質であるグルテンによって損傷を受ける状態である。グルテンマトリクスは、グリアジンおよびグルテニンタンパク質のほぼ等量の混合物からなる。セリアック病は、主にグリアジンタンパク質によって引き起こされる。特に、この疾患において小腸の絨毛が破壊され、その裏側は平板化し、ひどく栄養分の吸収を損なう。代表的な症状は、体重の減少、悪臭のある下痢、嘔吐、腹痛および下肢の腫脹である。現在利用可能な唯一の治療法は、全ての食料および小麦、ライ麦および大麦を含む薬学的組成物を厳密に差し控える長期間のグルテンを含まない食事療法である。
【０００３】
さらに、多くの人は、グルテンに対する一般的な不耐性を罹患する。腸腔傷害のような明確な臨床的症状は存在しないが、不耐性の範囲は、大きく変化する。従って多くの人は、グルテンの摂取を減少させることで利益を得る。
【０００４】
小麦粉が、水と混合される場合、グルテンタンパク質は、多種の食料産物の調製を可能にする固有の粘弾性の構造を生じる。少量の水と混合された小麦粉は、パン生地を生じ、そこから発酵パン、非発酵パン（例えば、ナン、チャパティ（ｃｈａｐａｔｔｉ））ビスケット、クッキーおよびケーキが、世界の各地域において作られる。多量の水が小麦粉に添加される場合、生地が形成され、これは、ワッフル、パンケーキおよび他の製品を作るのに使用される。デュラム小麦から作られたパン生地は、クスクスおよび麺類産物（ピザ、スパゲッティー、マカロニなど）を作るのに使用される。これら全ての製品において、グルテンマトリクスは、調理中に生成されるガスを捕捉し、粘性流を通して製品を増加／伸展し、そしてなお弾性の制限を構築させることにより、（上記食品の）構造を維持することを可能にする。
【０００５】
グリアジンタンパク質は、約３０，０００から約７０，０００の範囲の分子量のモノメリックポリペプチドの複合混合物を含む。グリアジンは、多くの場合、α／β−、γ−およびω−グリアジンの別個の群にしばしば分類される。
【０００６】
対照的に、グルテニンタンパク質は、数百万までの分子量を有し、今日において公知である最大の天然ポリマー間の一つである。それらは、ジスルフィド結合を介して結合したポリペプチドサブユニットから形成される。モノマーの大多数は、グリアジンに類似の分子量を有し、低分子量（ＬＭＷ）サブユニットと呼ばれる。残りは、より大きく、高分子量（ＨＭＷ）グルテニンサブユニットと呼ばれる。グリアジンおよびグリテニンは、水性アルコールとともに小麦粉を抽出することにより都合よく分離されるがこれは、これらの条件下でグリアジンは溶解性であり、グルテニンは非溶解性であるためである。
【０００７】
グリアジンは、パン生地に粘性流動または伸展性を与えるのに対し、グルテニンは、弾性と伸展性の両方を与える。高グルテニン分子が、弾性により貢献し、伸展性にあまり貢献しないのに対し、低グルテニン分子は、逆の効果を有する。従って、グルテニンモノマーの平均分子量の分布、ならびにグリアジンに対するグルテニンの割合は、パン生地の粘弾性を支配する。上述の異なる小麦食品は、異なる粘弾性性質を必要とする。例えば、ビスケットは、（わずかなパン生地シートを生成するのを可能にするために）最大限の伸張性および（焼くのに先んじてビスケットの収縮を引き起こす）最小限の弾性を必要とするのに対し、パンは（パン生地を膨らますこと可能にする）伸展性および（オーブンにセットされる前にパン生地の容量を維持するための）弾性のバランスを必要とする。
【０００８】
小麦のグルテンタンパク質は、多数の他の製品においてもまた消費される。単離されたグリアジンは、被膜形成性質を有し、固着を阻害するための、菓子上の表面の層または被膜として使用される。グリアジンはさらに、同一の理由、または錠剤の消化の間の好ましくない風味を防ぐために、医薬錠剤のための表面被膜として適用される。深刻な種類のセリアック病を有する個人は、これらの産物の消費に起因する危険に既にさらされている。
【０００９】
α／β−グリアジン、γ−グリアジンおよびＬＭＷグルテニンサブユニットの構造は、密接に関連し、アミノ酸配列は５つの配列ドメイン内の２つについて相同である（図１を参照のこと）。
【００１０】
α−およびγ−グリアジンならびにＬＭＷグルテニンは、３つまたは４つの相同な細胞内ジスルフィド結合を形成する６つまたは８つのシステイン残基を含む。アミノ酸配列におけるこれらのシステイン残基の位置は、ほとんどのＬＭＷグルテニンタンパク質の間で保存される（図２）。ＬＭＷグルテニンにおいて存在する二つのシステイン残基は、他のグルテニンタンパク質のシステイン残基と分子間ジスルフィド結合を形成する。その結果、これらの２つのシステイン残基は、ＬＭＷグルテニンサブユニットの凝集性の性質を担う。貯蔵タンパク質の構造およびグルテニンの分子間架橋のためのシステイン残基の関連性が、当該分野で、非常に詳細に解析されている（ＷｅｅｇｅｌｓおよびＨａｍｅｒ，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５巻（１９９７），１５５−１６３；Ｏｒｓｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６巻（２００１），３２３２２−３２３２９；ＳｈｅｗｒｙおよびＴａｔｈａｍ，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５巻（１９９７），２０７−２２７；Ｌｉｎｄｓａｙら，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１巻（２０００），３２１−３３３；およびＭｕｅｌｌｅｒら，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７巻（１９９８），１０９−１１６）。
【００１１】
小麦のグルテンおよび小麦製品を改変するため、または改良するための遺伝子工学方法の使用が、当該分野において提案されている。例えば、ＶａｓｉｌおよびＡｎｄｅｒｓｅｎは、ＨＭＷ−ＧＳ遺伝子数を増幅させることにより小麦のグルテンを改変する方法、システイン残基の数や位置を変更する方法、グルテンマトリクスの物理学的性質を変化させる方法、反復ドメインにおける反復モチーフの組成および配列を変化させる方法、巨大ポリマー画分におけるグルテニンの割合を増加する方法、ポリマーネットワークを改変する方法、ポリマー鎖のターミネーターのような分子間の結合について利用可能な一つのシステインのみを有するＬＭＷ−ＧＳを導入する方法ならびに小麦の性質の改良を達成するようにＬＭＷ−ＧＳを改変する方法を、提案した（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，２巻（１９９７），２９２−２９７）。
【００１２】
グルテンに組み込むための能力、もしくはリガンドまたは他の巨大分子に結合する能力を与えるドメインをコードする配列が、遺伝子配列に導入された改変グルテニンの遺伝子が、当該分野においてさらに報告されている（ＷＯ  ００／０２９１４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、これまでに、その調製された食品がセリアック病および他の状態のグルテン非耐性を有する患者に対する危険性をもはやもたらさないような様式で、グルテン組成物を改良するための提案はなされていない。従って、本発明は、小麦貯蔵タンパク質を含む食品の有利な特性を有し、グリアジンが減少したもしくはグリアジンを含まない食品を提供することの課題に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題は、改変グルテニンポリペプチドをコードする配列を含む核酸による本発明に従って解決され、ここで、ジスルフィド架橋を介して分子間架橋を担う一つ以上のシステイン残基をコードする上記配列は、欠失しているか、または上記コード配列の読取り枠を修正することなく他のアミノ酸をコードする配列によって置換される。
【００１５】
さらなる局面において、本発明はベクター、およびそれぞれの核酸を含む宿主細胞、もしくはパン生地（特にグリアジンが減少したパン生地またはグリアジンを含まないパン生地）の調製のためのポリペプチドの使用に加えて核酸によってコードされるポリペプチドを含む宿主細胞に関する。
【００１６】
本発明者は、驚いたことに、グルテニンの分子間架橋を担うシステイン残基を欠失したグルテニンポリペプチドが、グ例えば、顕著に減少した濃度のグリアジンを含有するかもしくはグリアジンを全く含有しないパン生地の調製のためにリアジン置換体として有利に使用され得ること見出した。より新しい食品は、小麦から調製されるそれぞれの食品の有利な性質を有し、そして、セリアック病の患者によって副作用なく消費され得る。そのようにして、本発明は、長期に感じられる要求、特にセリアック病もしくはグルテンに対する一般的な非耐性を有する患者の処置における要求に焦点を当てる。
【００１７】
本発明に従って、語句「改変グルテニンポリペプチドをコードする核酸、ここでジスルフィド架橋を介して分子間架橋を担う１つ以上のシステイン残基は、欠失しているか、または置換される」は、それぞれのグルテニンポリペプチドの天然の配列と比較される場合、システイン残基の数の減少したグルテニンポリペプチドをコードする核酸をいうのに使用される。特に、少なくとも一つ、好ましくは全ての分子間架橋ジスルフィド架橋を担うシステイン残基をコードする配列は、欠失しているか、または他のアミノ酸をコードする核酸配列によって置換される。
【００１８】
本出願において、それぞれのシステイン残基を含むポリペプチドが、ジスルフィド結合の形成を可能にする適切な条件で（例えば、実施例において概説されるような酵母における発現により得られる条件下で）それぞれのシステイン残基を含む他のグルテニンポリペプチドと架橋されるダイマー、オリゴマーもしくはポリマーを形成する場合、システイン残基は、「ジスルフィド架橋を介して分子間架橋を担うシステイン残基」といわれる。グルテニン遺伝子におけるドメイン構造および種々のシステイン残基の架橋活性は、当該分野において周知であるので、当業者は、任意の公知の、もしくは新たに単離されたグルテニン遺伝子において改変される、もしくは欠失されるべきシステイン残基を同定することに何の問題も有さない。
【００１９】
従って、本発明に従った改変グルテニンポリペプチドは、ジスルフィド結合の形成を可能にする条件で、そのポリペプチドが２００ｋＤａ未満のサイズ、好ましくは１００ｋＤａ未満のサイズを有するモノマーとして維持されるという事実によってさらに特徴付けられる。そのようにして、それぞれの条件で、未改変グルテニンポリペプチドは、数百万ダルトンまでのサイズを有するオリゴマーまたはポリマーを形成する。
【００２０】
ジスルフィド結合を介して分子間架橋を担うシステイン残基をコードする配列を欠失もしくは置換するための核酸配列の改変は、遺伝子の部位特異的突然変異誘発といった当該分野で周知の方法に従って実行され得る。その改変は、好ましくはグルテニン遺伝子の残存構造がシステイン残基の欠失によって影響を受けないような様式で実施される。
【００２１】
本発明の核酸は、好ましくは、ＤＮＡまたは天然ＲＮＡの核酸である。
【００２２】
本発明の一つの局面に従って、核酸は、グルテニン、好ましくは低分子量（ＬＭＷ）のグルテニンをコードする。ＬＭＷグルテニンをコードする多数の野生型遺伝子は、当該分野において公知である。
【００２３】
本発明のグルテニン遺伝子は、野生型グリアジン遺伝子といった公知の硫黄リッチプロラミンと異なる。例えば、本発明のグルテニン遺伝子と天然のグリアジン遺伝子を比較すると、その遺伝子のＮ末端のヌクレオチド配列において、遺伝子の低い相同性（５０％未満、好ましくは３０％未満）を示すか、または相同性を示さず、ここでＮ末端ヌクレオチド配列は、コード領域のＮ末端に見出される少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０のヌクレオチドを網羅する。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、核酸は、配列番号９に示される配列に対し少なくとも７５％の相同性を有する核酸配列を含む。好ましくは、配列の相同性は、配列番号９に示される配列に対し少なくとも８５％、または９５％である。配列の相同性を決定するための方法は、当該分野において周知である。本発明の好ましい実施形態に従って、配列相同性は、ＢＬＡＳＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して決定される。
【００２５】
本発明は、改変グルテニンポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関し、ここで、ジスルフィド架橋を介して分子間架橋を担う一つ以上のシステイン残基をコードする上記配列は欠失しているか、またはコード配列の読取り枠を修正することなく他のアミノ酸をコードする配列によって置換される。
【００２６】
ＬＭＷサブユニットの異なる型のアライメントは、アミノ酸配列におけるシステイン残基の分布を示す（図２）。分子間ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基の分布は、ＬＭＷ配列において保存され、公知のＬＭＷサブユニットの配列の分類について使用され得る。
【００２７】
例えば、本発明の核酸は、配列番号１０において示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし得る。
【００２８】
さらなる実施形態に従って、本発明は、上記の核酸を含むベクターに関する。そのベクターはまた、好ましくは、グルテニンポリペプチドのコード配列の発現を調節するための配列を含む。コード配列の発現を調節するための多数の配列は、当該分野において公知である。通常、そのコード配列は、プロモーター配列およびターミネーター配列のそばに隣接する。それぞれの配列が、そのコード配列の転写の開始および終止を可能にする。好ましくは、本発明の核酸およびベクターはさらに、翻訳を調節する配列を含む。
【００２９】
プロモーターは、誘導プロモーターもしくは構成プロモーターであり得る。
【００３０】
本発明の代替の実施形態に従って、改変グルテニンポリペプチドをコードする配列の発現を調節する配列は、細菌起源または酵母起源の配列である。この実施形態は、細菌または酵母におけるコード配列の発現、従って細胞培養において本発明の核酸によってコードされるグルテニンポリペプチドの大量の生産を可能にする。本発明の実施形態に従って、ベクターはさらに、好ましくは宿主細胞からのグルテニンポリペプチドの分泌を指向し得るシグナル配列を含む。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、上記核酸の一つによってコードされるグルテニンポリペプチドに関する。例えば、ポリペプチドは、配列番号１０において示される配列を有し得る。
【００３２】
さらなる実施形態に従って、本発明のポリペプチドは、グリアジン置換体として使用される。例えば、ポリペプチドは、小麦粉、パン生地、生地、ペストリー、クッキー、麺類、ワッフル、パンおよび／もしくは菓子類といった食品の調製、または錠剤といった医薬品の調製に使用され得る。これらの食品は、かなり量の減少したグリアジンタンパク質を含むかまたはグリアジンタンパク質を含まない。食品は、本発明の改変ポリペプチドを含み、そして未改変のＬＭＷグルテニンポリペプチドおよび／またはＨＭＷグルテニンポリペプチドをさらに含み得る。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、本発明のベクターまたは核酸を含む宿主細胞に関する。そのベクターは、非改変のＬＭＷグルテニンポリペプチドおよび／またはＨＭＷグルテニンポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み得る。細菌細胞または酵母細胞が特に好ましいが、宿主細胞は、任意の宿主細胞であり得る。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、上記の核酸を調製する方法に関し、ここで、その方法は：
（ａ）グルテニンポリペプチドをコードする核酸が同定される工程；
（ｂ）（ａ）の核酸内の、ジスルフィド架橋を介してグルテニンポリペプチドの分子間架橋を担うシステイン残基をコードする配列が同定される工程；および、
（ｃ）（ａ）の核酸が、（ｂ）において同定されたシステイン残基をコードする配列を、コード配列の読取り枠を変更せずに異なるアミノ酸をコードする配列に変化するように改変される工程；
を含む。
【００３５】
さらに改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドを調製する方法が提供され、ここでその方法は：
（ａ）本発明に従って、微生物が、核酸でトランスフェクトされる工程；および、
（ｂ）ポリペプチドが、培地の上清または微生物から単離される工程；
を含む。
【００３６】
本発明の特定の好ましい実施形態において、いかなるグリアジンポリペプチドも含まない食品が提供される。その食品は、酵母、または形質転換された細菌から発現した組み換えグルテニンポリペプチドから調製され得、本発明の核酸でトランスフェクトされたかもしくは形質転換された、そしてさらに未改変のＨＭＷグルテニンおよび天然の、もしくは組み換え体起源のどちらかのＬＭＷグルテニンサブユニットで補充され得る。これは、小麦から調製されるそれぞれの食品の有利な特性を維持することを可能にする。
【００３７】
食品は、セリアック病またはグルテンに対する一般的な不耐性を有する患者によって、有利に消費され得る。
【００３８】
特に好ましい実施形態に従って、食品が、組換え発現ポリペプチドから調製され、そして非改変ＨＭＷグルテニンタンパク質およびＬＭＷグルテニンタンパク質と共に使用され、小麦の小麦粉および小麦でない小麦粉を補充するための小麦粉の調製のための小麦から調製したそれぞれの食品の有利な特性を得る。その小麦粉は、パン生地、ペストリー、クッキー、麺類、パン、生地および／または菓子類の調製に使用され得る。
【００３９】
例えば、上記使用について組換え発現ポリペプチドは、ＨＰＬＣ法を使用して精製され得る。そのポリペプチドは、ＨＰＬＣ後に再酸化され得る（例えば、Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３巻（２００１），２５３−２６０を参照のこと）。そのタンパク質は、他の小麦タンパク質と組み合せて使用され得、いくつかの食品の調製についてセリアック病およびあまり深刻な状態のグルテン不耐性をそれほど引き起こさない、例えば、コメ、トウモロコシまたは雑穀キビ由来の非小麦粉末に対する添加物として粘弾性性質を与える。
【００４０】
好ましい実施形態に従って、食品は、パン生地、ペストリー、クッキー、麺類、パン、生地および／または菓子類である。
【００４１】
本発明はまた、酵母または細菌におけるいくつかの貯蔵タンパク質型の組み合せ発現にも関する。酵母における組換え発現ＬＭＷサブユニット、ＨＭＷサブユニットおよび改変ＬＭＷサブユニットの組み合わせは、パン生地、ペストリー、クッキー、麺類、パン、生地および／または、菓子類のようないくつかの食品の調製のための非小麦粉末における添加物としての使用のための酵母におけるセリアック毒性を有さないグルテン様タンパク質の産生を可能にする。
【００４２】
代替の実施形態において、本発明は、本発明に従った改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドを使用して錠剤の調製を含む薬学的組成物の調製のための方法を提供する。改変ＬＭＷグルテニンポリペプチドは、好ましくは錠剤上にコーティングされている。本発明はまた、本発明の改変グルテニンポリペプチドを含む錠剤にも関する。
【００４３】
以下の実施例は、ジスルフィド架橋による分子間架橋が阻害されるような様式でＬＭＷグルテニンの構造を変化させることが可能であることを示す。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉは、それぞれの遺伝子の非相同的発現のための宿主として使用され、同様に、翻訳後修飾、例えば、ジスルフィド結合形成を実行し得、これは、これらの遺伝子がそれらの元の宿主で発現される場合にも観察される。さらに、これらの宿主（酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）のゲノムが、分子技術を使用して、容易に操作され得る。
【００４４】
酵母におけるα−グリアジン遺伝子およびγ−グリアジン遺伝子の発現が、報告されている（例えば、Ｂｌｅｃｈｌら，Ｇｅｎｅ，１１６巻（１９９２），１１９−１２７；Ｎｅｉｌｌら、Ｇｅｎｅ、５５巻（１９８７）、３０３−３１７；および、ＳｃｈｅｅｔｓおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，３７巻（１９８９），８２９−８３３を参照のこと）。しかし、これらの研究は全て、組換え発現グリアジンの構造および機能の解析に集中され、その目的のための宿主系として酵母を使用する。
【００４５】
酵母におけるα−グリアジン遺伝子の発現は、焼いた製品のためおよびグルテンタンパク質によって引き起こされる人における病気の診断処置に使用するための小麦の粉末および小麦でない粉末を補充するために酵母株を使用する目的で、提案された（米国特許第４，８２６，７６５号）。
（材料および方法）
下記の材料および方法は、後の実施例で使用した：
（株）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ＳＦ８：ｒｅｃＢＣ、ｒｅｃＣ２２、ｌｏｐ１１、ｔｏｎＡ１、ｔｈｒ１、ｌｅｕＢ６、ｔｈｙ１、ｌａｃＹ１、ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＭ−、ｈｓｄｒＲ−、Ｓｍｒ、λ−（Ｓｔｒｕｌら，Ｐｒｏｃｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３巻（１９７６）、１４７１−１４７５）。
【００４６】
ＢＬ２１（ＤＥ３）：Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ  Ｂ  （ｒ  Ｂ−ｍ  Ｂ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）
ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ：Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ  Ｂ  （ｒ  Ｂ−ｍ  Ｂ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＣｍＲ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２ｕｒａ３：ＭＡＴａ；Ｌｅｕ２−３；Ｌｅｕ２−１１２；ｈｉｓ４−５１９；ｃａｎ１；ｕｒａ３Δ：ｃｉｒ＋（Ｐｏｌａｋｏｗｓｋｉ  Ｔ．（１９９９）Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｂｅｅｉｎｆｌｕｓｓｕｎｇ  ｄｅｓ  Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｓｔｏｆｆｗｅｃｈｓｅｌｓ  ｄｅｒ  Ｈｅｒｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｓｈａｋｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ａａｃｈｅｎ）。
【００４７】
（プラスミド）
ＹｐＡＤＨ−ＡΔＵＲＡ３：酵母特異的なＡＤＨ１プロモーターおよび選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を保有するＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  シャトルベクターＹｐＡＤＨ−γＥ１／Ｃ２：プラスミド  ｐＷ１０２０由来のγ−グルテニンサブユニットを保有するＹｐＡＤＨ−ＡΔ−ＵＲＡ３ベクター（ＳｈｅｅｔｓおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，５７巻（１９８８），１４１−１５０）。
ＰＥＴ−２８ａ（＋）：（Ｎｏｖａｇｅｎ）
（オリゴヌクレオチド）
以下のオリゴヌクレオチドは、クローニングまたはインビトロの突然変異誘発について使用された：
ＬＭＷ−Ｅ１：５’−ＣＣＧ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＡＴＣ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＡＣＣ−ＴＴＣ−ＣＴＣ−３’（配列番号３）
ＬＭＷ−Ｃ２：５’−ＣＣＡ−ＴＣＧ−ＡＴＣ−ＡＧＴ−ＡＧＧ−ＣＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＣ−ＧＧ−３’（配列番号４）
ＬＭＷ−Ａｆ：５’−ＡＧＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＴＣＣ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＴＧＧ−３’（配列番号５）
ＬＭＷ−Ａｒ：５’−ＣＣＡ−ＧＧＧ−ＡＴＧ−ＣＴＡ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＡＴＣ−３’（配列番号６）
ＬＭＷ−Ｂｆ：５’−ＧＣＴ−ＣＧＧ−ＡＣＡ−ＡＧＧ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＣＣ−３’（配列番号７）
ＬＭＷ−Ｂｒ：５’−ＧＧＡ−ＡＡＧ−ＡＡＣ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＣＧＡ−ＧＣ−３’（配列番号８）
（培地および生育条件）：
ＬＢ培地：１リットルあたり１０ｇのペプトン、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ、ＮａＯＨを使用してｐＨを７．５に調整。
【００４８】
ＹＥＰＤ培地：１リットルあたり、２０ｇのグルコース、２０ｇのペプトン、１０ｇの酵母抽出物。
【００４９】
ＹＮＢ培地：１リットルあたり、６．７ｇの酵母窒素培地（ＹＮＢ、Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇのグルコース、１００ｍｇのロイシン。
【００５０】
ＤＳ培地：１リットルあたり、５０ｇのスクロース、５．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０．０ｇのグルタミン酸ナトリウム、３．２ｇの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、１．５ｇのＫＣｌ、０．７５ｇのＭｇＳＯ４、０．１ｇのＣａＣｌ２、０．１ｇのミオイノシトール、２．５ｇのカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、０．３ｇのロイシン。
【００５１】
ビタミン溶液：１リットルあたり、１１．５ｍｇのビオチン、２．０ｇのＤ−パントテン酸、２．０ｇのピリドキシン、２．０ｇのチアミン、２．０ｇのニコチン酸。
【００５２】
微量元素溶液：１リットルあたり、１．０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、３．５ｇのＭｎＳＯ４。
【００５３】
４ｍｌ／ｌのビタミン溶液、および２ｍｌ／ｌの微量元素溶液をオートクレーブそして冷却後に培地に添加した。
【００５４】
Ｅ．Ｃｏｌｉ株をＬＢ培地中で３７℃で培養した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、もしくは３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを選択のために添加したＬＢで培養した。固体培地を、１．５パーセント寒天を添加することにより得た。
【００５５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、複合培地ＹＥＰＤかまたは合成培地ＹＮＢもしくはＤＳのいずれかで２８℃で培養した。固体培地を、１．５パーセント寒天を添加することにより得た。
【００５６】
（１０リットルの研究室規模の酵母発酵：）
（バッチ培地）
ＤＳ培地：１リットルあたり、５０ｇのスクロース、５．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０．０ｇのＬ−グルタミン酸ナトリウム、３．２ｇ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、１．５ｇのＫＣｌ、０．７５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇのミオイノシトール、４ｍｌのビタミン溶液、１ｍｌのＦｅＳＯ４。
【００５７】
摂食培地：１リットルあたり、１００ｇのスクロース、７．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０．０ｇのＬ−グルタミン酸ナトリウム、１．９ｇの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、１．０ｇのＭｇＳＯ４、０．２ｇのＣａＣｌ２、０．２ｇのミオイノシトール、２．０ｇのＬ−ロイシン、１０ｇのカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、８ｍｌのビタミン溶液、２ｍｌの微量元素溶液、２ｍｌのＦｅＳＯ４。
【００５８】
ビタミン溶液：１リットルあたり  １１．５６ｍｇのビオチン、２．０３６ｇのＤ−パントテン酸カルシウム塩、２．０ｇのピリドキシン、２．０ｇのチアミン、２．０ｇのニコチン酸。４℃で保存。
【００５９】
微量元素溶液：５０ｍｌあたり、０．３４９ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．３４９ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ。４℃で保存。
【００６０】
ＦｅＳＯ４溶液：１リットルあたり２．０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。−２０℃で保存。
【００６１】
（組換えＤＮＡ技術）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを使用した組換えＤＮＡ技術をＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（ＴＢ０５５  第９版、０５／２０００）に記載されるとおりに実施した。
【００６２】
他に言及しない場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび共同研究者によって記載される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９）標準組み換えＤＮＡ技術を使用した。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
（小麦のシェイアン種由来のＬＭＷサブユニットのクローニング）
小麦ゲノムは、グルテニンのＬＭＷサブユニットをコードする２０より多い種々の遺伝子を含む。この研究の目的は、アレルギー反応を起こすと報告されている、エピトープＱＱＱＰＰを含まないＬＭＷサブユニットを単離することである。
【００６４】
ＬＭＷサブユニット遺伝子をシェイアン種の小麦ゲノム遺伝子からポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって単離した。シェイアン種由来のゲノムＤＮＡは、Ｄｉｒｋ  Ｂｅｃｋｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｍｂｕｒｇによって提供された。これまでに公知の全てのＬＭＷサブユニット遺伝子は相同な５’末端および３’末端を有するのでシグナルペプチドをコードする領域を含む全体のＬＭＷサブユニット遺伝子を増幅するプライマーを、公開された配列に従って設計した。増幅ＰＣＲフラグメントを直接、酵母発現ベクターＹｐＡＤＨ−ΔＡ  ＵＲＡ３（図３）にクローン化するために、フォーワードプライマー  ＬＭＷ−Ｅ１（配列番号３）は、新規ＥｃｏＲＩ部位を含み、そして逆プライマーＬＭＷ−Ｃ２（配列番号４）は、新規ＣｌａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅は、２０μｌの以下の反応混合物の中で行った：９．８μｌ  Ｈ２Ｏ、２μｌ  １０×ｄＮＴＰ（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、５μｌ  ４×反応緩衝液（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、各１μｌの１０ｐｍｏｌ  プライマー、１μｌ  テンプレートＤＮＡ（１００ｎｇのゲノムＤＮＡ）、０．２μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（４Ｕ／μｌ、ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。ＰＣＲ条件は以下であった：９４℃で２分間の第一の工程、次に９４℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間を３０サイクル、そして７２℃で２分間の最終工程。
【００６５】
ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルを使用する電気泳動によって分析し、その後ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製したＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａｌを使用して消化し、酵母発現ベクターＹｐＡＤＨ−ΔＡ  ＵＲＡ３に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＦ８をライゲーション混合物で形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉクローンを、ＬＭＷサブユニット挿入部を保有することに関してＰＣＲによって分析し、次に制限酵素分析を行った。種々の制限パターンを示すクローンのＤＮＡ挿入部を、さらに配列決定によって特徴付けた。
【００６６】
いくつかのクローンを、配列決定によってさらに特徴付けた種々の制限パターンによって識別可能にした。生じたヌクレオチド配列を、ＬＭＷサブユニット遺伝子に対する公開された配列とコンピュータ分析によって比較した。クローンＬＭＷ６の配列（図４および図５、配列番号１および配列番号２）にはアレルギーエピトープＱＱＱＰＰが含まず、わずかではあるが、公開された配列といくつかの相違を示し、従って、以前に公開されていないＬＭＷサブユニット遺伝子についての新しい対立遺伝子を表す。
【００６７】
（実施例２）
（クローンＬＭＷ６のＬＭＷサブユニットの遺伝子の改変）
ＬＭＷサブユニットの集合性性質（挙動）を変化させるために、細胞間ジスルフィド結合形成を担う二つのシステイン残基、ドメインＩにおけるシステイン１およびドメインＩＶにおけるシステイン７（図３において太字および下線文字で標識印をつけた）は欠失させることによるか、またはコードするトリプレットの改変させることのどちらかによって、取り除かれるべきである。
【００６８】
ＬＭＷサブユニット遺伝子の部位特異的改変を、ＰＣＲ方法を使用するインビトロ突然変異誘発によって実施した。方法の原理を図８に示す。二つの重複するプライマー対、各改変に対するプライマーであって、所望の変異を有するプライマー対を作成した。望ましい変異を有する３つのメガプライマーを、第一の工程において増幅した。反応混合物は、以下：２２．８μｌ  Ｈ２Ｏ、４μｌ  １０×ｄＮＴＰ（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１０μｌ  ４×反応緩衝液（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１μｌ  テンプレートＤＮＡ（１００ｎｇのＹｐＡＤＨ  ＬＭＷ６）、０．２μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（４Ｕ／μｌ、ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および各１μｌの１０ｐｍｏｌ  の以下のプライマー対：
ＰＣＲ１：プライマー  ＬＭＷ−Ｅ１（配列番号３）およびＬＭＷ−Ａｒ（配列番号６）、
ＰＣＲ２：プライマー  ＬＭＷ−Ａｆ（配列番号５）およびＬＭＷ−Ｂｒ（配列番号８）、
ＰＣＲ３：プライマー  ＬＭＷ−Ｂｆ（配列番号７）およびＬＭＷ−Ｃ２（配列番号４）、
を含有した。
【００６９】
ＰＣＲ条件をＬＭＷサブユニット遺伝子の増幅と同じにしたが、ＰＣＲ産物のＡ−テーリングを防止するために最後の２分間の伸張工程を行わなかった。
【００７０】
生じたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動で分析し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【００７１】
完全な遺伝子を増幅するために、３メガプライマーを第二の工程において重複伸張により一緒に結合させ、４μｌの各メガプライマー、２μｌの各プライマーＬＭＷ−Ｅ１およびＬＭＷ−Ｃ２、４μｌ  １０×ｄＮＴＰ（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１０μｌの４×緩衝液（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および、２．０μｌのＴａｑポリメラーゼ（４Ｕ／μｌ、ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、を一つのチューブ内で混合した。ＰＣＲの条件は、１分間伸張時間が長いことを除いて、上記と同じである。生じたＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分析し、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａｌで制限酵素処理し、上記のようにベクターＹｐＡＤＧ−ΔＡ  ＵＲＡ３中にクローン化した。形質転換体を、ＰＣＲおよび制限分析によって分析し、ＬＭＷサブユニット遺伝子の改変を、配列決定によって確認した。
【００７２】
生じた改変ＬＭＷサブユニット遺伝子および酵母発現ベクターを、それぞれＬＭＷａ３Δｃｙｓ２およびＹｐＡＤＨ  ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２と、名付けた。改変ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図１０および図１１に示す（配列番号９および配列番号１０）。
【００７３】
（実施例３）
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉにおける改変グルテニン遺伝子の発現および細菌タンパク質の分析）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＬＭＷサブユニットの発現のために、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，４４１  Ｃｈａｒｍａｎｙ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１９，ＵＳＡ）のｐＥＴシステム、ベクター、および菌株を使用した。
【００７４】
ＬＭＷ６遺伝子（配列番号１）および改変ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２遺伝子（配列番号９）をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター  ｐＥＴ２８（ａ）中へクローン化するために、酵母発現プラスミドＹｐＡＤＨ  ＬＭＷ６およびＹｐＡＤＨＬＭＷａ３Δｃｙｓ２を、ＬＭＷコード配列を遊離するため制限酵素ＢｓｐＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。精製されたＬＭＷフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＥＴ２８（ａ）ベクター中に連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＳＦ８へ形質転換し、形質転換体をカナマイシン含有ＬＢ寒天プレート上で選別した。Ｅ．ｃｏｌｉクローンを、ＬＭＷサブユニット挿入物の保有についてＰＣＲにより分析し、その後、制限解析した。プラスミドを、ｐＥＴ２８ａ  ＬＭＷ６およびｐＥＴ２８ａ  ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２と名付けた。
【００７５】
タンパク質発現株について、株ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥを、プラスミドｐＥＴ２８ａ  ＬＭＷ６およびｐＥＴ２８ａ  ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２を使用して形質転換した。遺伝子発現の誘導を、Ｎｏｖａｇｅｎのマニュアルに記載されるとおりに実施した。
【００７６】
タンパク質発現をマニュアルに記載のとおりに実施した。１ｍｌのサンプルを培地から取り出し、その細胞を遠心分離によって回収した。細胞のペレットを（ＤＴＴとともに）１００μｌのサンプル緩衝液中に懸濁し、５分間煮沸した。１０μｌの各サンプルを、１５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、その後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。免疫検出を、グリアジンサブユニットおよびＬＭＷグルテニンサブユニットの両方に対して特異的なマウス抗グリアジン抗体を使用して実施した。免疫反応バンドを、抗マウス抗体と結合するＰＯＤおよび検出物質としてＨ２Ｏ２を使用して検出した。
【００７７】
図１２に示されるように、改変ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２サブユニットと同様に天然のＬＭＷ６サブユニットは、ＩＰＴＧを使用した誘導後にＥ．ｃｏｌｉにおいて産生され、非誘導培地では、タンパク質は産生されなかった。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株の発現レベルは、ＢＬ２１（ＤＥ３）株の発現レベルよりもわずかであった。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＮ末端リーダー配列のプロセッシングを行わないので、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生されたＬＭＷサブユニットは天然タンパク質よりもわずかに大きなサイズを有している。この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉが、大量の改変ＬＭＷサブユニットを産生するための、代替の発現系としても使用され得ることを示す。
（実施例４）
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換ならびに酵母タンパク質の単離および分析）
酵母株ＡＨ２２ｕｒａ３を、ベクターＹｐΔＡＨ  ＬＭＷ６（図６）、ＹｐＡΔＨ−ＬＭＷａ３Δｃｙｓ２、ＹｐＡＤＨ−γＥ１／Ｃ２および空のコントロールベクターＹｐＡＤＨ−ＡΔＵＲＡ３を使用して、ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４巻（１９９１），１８２−１８７）に記載される改変エレクトロポレーションプロトコルを使用して形質転換し、タンパク質産生を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット検出によって研究した。形質転換体を、ウラシル欠乏ＹＮＢ寒天上で選択した。
【００７８】
酵母の総細胞内タンパク質を、ウラシル欠乏ＤＳ培地において形質転換された酵母から調製した。細胞を遠心分離によって回収し、ガラスビーズで破砕させた。細胞の細片を、（ジチオスレイトールＤＴＴを含むかまたは含まない）サンプル緩衝液中で懸濁し、ゲルにロードする前に、沸騰水の水槽で３分間熱した。
【００７９】
タンパク質のポリマーまたはモノマーの性質を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、還元条件下および非還元条件下の両方で実施した。総細胞タンパク質（還元および非還元サンプル）を、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離して、ニトロセルロース膜に移した。免疫検出を、グリアジンおよびＬＭＷグルテニンサブユニットの両方に対し特異的なマウス抗グリアジン抗体を使用して実施した。免疫反応バンドを、ルミノールおよびＨ２Ｏ２を検出物質として使用してＰＯＤ結合抗マウス抗体（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出した。
【００８０】
図７に示されるように、成熟ＬＭＷ６サブユニットに対する予測された大きさと一致する約３５ｋＤａの単一のタンパク質バンドが、酵母細胞抽出物において検出され得た。ＬＭＷタンパク質の主要な部分を、０．５％のＤＤＴを含む５０％イソプロパノールを使用して破砕細胞から抽出した。これは、ＬＭＷサブユニット遺伝子の発現および酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける成熟ＬＭＷサブユニットタンパク質の産生における最初の報告である。
【００８１】
酵母において産生された非相同性のタンパク質を、グリアジンおよびＬＭＷ−グルテニンサブユニットに対して特異的な抗体を使用してウエスタンブロット分析によって検出した。そのウエスタンブロットを図１３に示す。全てのタンパク質、野生型ＬＭＷサブユニット、改変ＬＭＷサブユニットおよびγ−グリジアンのモノマー形態を、約３５ｋＤａのサイズで、還元条件下で単一のバンドとして検出し得た。
【００８２】
非還元条件下で、モノマー形態のγ−グリアジンおよび改変ＬＭＷサブユニットのみが検出され得、ここでは、モノマー形態の野生型ＬＭＷサブユニットは検出され得なかった。遺伝的に改変されたＬＭＷサブユニットは、変化したタンパク質構造を有し、グリアジン様モノマー形態様式ふるまう。インビボにおいて最初に、ＬＭＷサブユニットのシステイン１およびシステイン７が分子間ジスルフィド結合形成に関与し、これらのシステイン残基の欠失がモノマーのタンパク質構造を生じることを示した。
【００８３】
従って、酵母細胞において産生された改変ＬＭＷサブユニットは、グリアジンについての機能的置換体として使用され得、例えば、セリアック疾患を有する患者のためのグルテンを含まない食品中の凝集グルテニンのための「溶媒」として使用され得る。さらに、その結果は、酵母において産生された小麦胚乳タンパク質のジスルフィド結合形成が、小麦植物（改変ＬＭＷサブユニットがγ−グリアジンに類似したモノマー形態において存在することに対し、野生型ＬＭＷサブユニットがポリマー構造を形成する）におけるジスルフィド結合の形成に類似していることを示唆している。それゆえに、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、グルテニンタンパク質の異種産生のための適切な宿主生物である。
【００８４】
（実施例５）
（酵母細胞からの小麦貯蔵タンパク質の産生および精製）
上に概説されるようにトランスフェクトされた酵母の発酵を、流加培養様式において実施した。
【００８５】
流加培養プロセスを、２７℃〜３０℃、ｐＨ５で実施した。溶解した酸素量をガルヴァニック（Ｐｔ／Ｐｂ）電極を使用して計測した。発酵の間に、バイオリアクターを、１ｖｖｍ（空気体積／体積・分）の空気の流動で通気し、６００ｒｐｍと１０００ｒｐｍの間で攪拌した。溶解酸素量を、開始時の９０％飽和と発酵終了時の２０％との間にした。ｐＨを、４Ｍ  ＫＯＨを添加することにより５．０に維持した。必要な場合、気泡を、ポリプロピレングリコール２０００を添加することにより抑制した。
【００８６】
供給速度を、１時間あたり０．１４の定常成長率μを得るために、増殖培地の供給速度をを調節するコンピュータシステム（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ２．０１，Ｐ．Ｇｏｅｔｚ／Ｌ．Ｂａｕｍａｎｎ，Ｂｅｒｌｉｎ  ２００２）によって制御した。
【００８７】
（細胞破砕）
発酵の終了時に、酵母細胞を遠心分離によって回収し、その細胞を、細胞湿重量１グラム当たり０．５ｍｌの破砕緩衝液の比で、ＰＢＳ破砕緩衝液中（（ＰＢＳ：１０ｍＭ  リン酸  ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、１ｍＭフェニル−メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に懸濁した。細胞を直径０．７５ｍｍ〜１．００ｍｍのガラスビーズを使用してＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｉｌｌ  ｔｙｐｅ  ＫＤＬ，Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で破砕した。
【００８８】
（酵母細胞からの小麦貯蔵タンパク質の抽出）
破砕した酵母細胞懸濁液（粗製細胞溶解物）を同量のイソプロパノールと混合し、遠心分離した。上清（抽出前物）を廃棄し、ペレットを、５０％イソプロパノールおよび１％ＤＴＴを使用して１回から２回、６０℃で２時間再抽出した。さらに、超音波処理を１０分間実施した。その懸濁液を室温まで冷却し、遠心分離した。その上清（主な抽出物）を収集し、タンパク質を、イソプロパノールの濃度を８３％まで増幅させることにより沈殿させた。その沈殿物を、遠心分離により収集し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し凍結乾燥した
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の抽出物の複数のフラクションにおける酵母細胞由来の小麦貯蔵タンパク質を図１４に示す。
【００８９】
酵母における異種発現したタンパク質のさらなる分析を、酵母由来の精製されたタンパク質が、流体力学的な性質および製パン上の性質を調査するためにコメおよびトウモロコシの粉とともに混合される場合を除いて、Ｋｉｐｐら（Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３巻（１９９６），２２７−２３４）およびＫｉｅｆｅｒら（Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７巻（１９９８），５３−６０）で記載されるとおりに実施し得る。
（実施例６）
（酵母におけるＨＭＷサブユニットの発現）
貯蔵タンパク質の複数を組み合わせた発現を研究するために、酵母細胞を、発現プラスミドＹｐＡＤＨ  ＨＭＷ  Ｄｘ５（図１５）およびＹｐＡＤＨ  ＨＭＷ  Ｄｙ１０（図１６）、それぞれを使用する小麦のＨＭＷサブユニットＤｘ５およびＤｘ１０で標準プロトコルで形質転換した。形質転換された酵母細胞を培地中で培養し、破砕し、小麦貯蔵タンパク質を、本質的に上に概説したように抽出した。酵母形質転換体由来のイソプロパノール抽出（実施例５を参照のこと）によって得られた主要な抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。図１７における矢印で印をつけたタンパク質のバンドは、酵母における小麦ＨＭＷ  ＤＸ５サブユニットおよびＨＭＷ  Ｄｙ１０サブユニットの生成を示す。これは第一に、小麦ＨＭＷサブユニットの発現が、形質転換した酵母細胞において検出可能であったことを示す。
【００９０】
ＨＭＷの酵母における発現と組み合せて、改変および非改変ＬＭＷサブユニットは、酵母におけるグルテン様構造物を含むタンパク質混合物を提供する。精製後、これらのタンパク質の構造は、セリアック毒性を引き起こさず、小麦粉から調製されたそれぞれの食品の有利な特徴を維持する非小麦粉のための補助食品として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ドメイン構造と比較し、そして、α−グリアジン、γ−グリアジンおよびグルテニンのＬＭＷサブユニットのジスルフィド架橋を示す概念図。
【図２−１】ＬＭＷサブユニットの異なる型の配列およびシステイン残基の分布。ＬＭＷサブユニットのジスルフィド結合形成を担うシステイン残基を四角で囲む。２３７位、２４５位、２６５位、２７２位、２７３位および３８５位のシステイン残基が、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。３３５位の高度に保存されたシステイン残基、２５位の保存されたシステイン残基および非定型的に分布する６６位および２５３位のシステイン残基は、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。
【図２−２】ＬＭＷサブユニットの異なる型の配列およびシステイン残基の分布。ＬＭＷサブユニットのジスルフィド結合形成を担うシステイン残基を四角で囲む。２３７位、２４５位、２６５位、２７２位、２７３位および３８５位のシステイン残基が、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。３３５位の高度に保存されたシステイン残基、２５位の保存されたシステイン残基および非定型的に分布する６６位および２５３位のシステイン残基は、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。
【図２−３】ＬＭＷサブユニットの異なる型の配列およびシステイン残基の分布。ＬＭＷサブユニットのジスルフィド結合形成を担うシステイン残基を四角で囲む。２３７位、２４５位、２６５位、２７２位、２７３位および３８５位のシステイン残基が、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。３３５位の高度に保存されたシステイン残基、２５位の保存されたシステイン残基および非定型的に分布する６６位および２５３位のシステイン残基は、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。
【図２−４】ＬＭＷサブユニットの異なる型の配列およびシステイン残基の分布。ＬＭＷサブユニットのジスルフィド結合形成を担うシステイン残基を四角で囲む。２３７位、２４５位、２６５位、２７２位、２７３位および３８５位のシステイン残基が、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。３３５位の高度に保存されたシステイン残基、２５位の保存されたシステイン残基および非定型的に分布する６６位および２５３位のシステイン残基は、分子間ジスルフィド結合の形成に関与する。
【図３】酵母の発現プラスミド  ＹｐＡＤＨ  ΔＡ  ＵＲＡ３。
【図４】クローンＬＭＷ６（９９１塩基対）の核酸配列（配列番号１）。
【図５】クローンＬＭＷ６（２９８アミノ酸）のアミノ酸配列（配列番号２）；分子間ジスルフィド結合形成を担うシステイン残基は、太字により印をつけられる；分子内ジスルフィド結合形成を担うシステイン残基は、太字および下線を引いた字として印をつけられる。
【図６】ＬＭＷ６サブユニット発現プラスミド  ＹｐＡＤＨ  ＬＭＷ６。
【図７】プラスミド  ＹｐＡＤＨ  ＬＭＷ６で形質転換された酵母のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析；異なる細胞の画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。
【図８】インビトロ突然変異誘発についてのＰＣＲ方法の概略の提示。
【図９】ＬＭＷサブユニットのインビトロ突然変異誘発；ＰＣＲ産物のゲル電気泳動；左のゲル：レーン１、メガプライマー１；レーン２、メガプライマー２；レーン３、メガプライマー３；ＭおよびλＤＮＡ、分子サイズの基準；右のゲル：レーン１、メガプライマーの重複伸張、正しいサイズを示すフラグメントを、矢印によって印をつける；レーン２、ポジティブコントロール；Ｍ、ＤＮＡ分子サイズ標準。
【図１０】改変ＬＭＷ  ａ３Δｃｙｓ２遺伝子の核酸配列（９０８塩基対）（配列番号９）；改変配列は、太字および下線で印をつける。
【図１１】改変ＬＭＷ  ａ３Δｃｙｓ２タンパク質のアミノ酸配列（２９７アミノ酸）（配列番号１０）；改変部分には、下線を引く。
【図１２】Ｅ．Ｃｏｌｉ形質転換体のウエスタンブロット分析；レーン１およびレーン２：１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導していないＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰＥＴ２８ａＬＭＷ６（１）および１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰＥＴ２８ａＬＭＷ６（２）；レーン３およびレーン４：１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導していないＢＬ２１（ＤＥ３）株のｐＥＴ２８ａＬＭＷａ３Δｃｙｓ２（３）および１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰＥＴ２８ａＬＭＷａ３Δｃｙｓ２（４）；レーン５およびレーン６：１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導していないＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ株のｐＥＴ２８ａＬＭＷ６（５）および１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰＥＴ２８ａＬＭＷａ６（６）；レーン７およびレーン８：１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導していないＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ株のＰＥＴ２８ａＬＭＷａ３Δｃｙｓ２（７）および１００ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ株のＰＥＴ２８ａＬＭＷａ３Δｃｙｓ２（８）；Ｍ：タンパク質標準。
【図１３】酵母形質転換体のウエスタンブロット分析；レーン１およびレーン６：ＡＨ２２ｕｒａ３：ＹｐＡＤＨΔＵＲＡ３、空のコントロールプラスミド；レーン２およびレーン７：ＡＨ２２ｕｒａ３：ＹｐＡＤＨ  ＬＭＷ６、野生型のＬＭＷグルテニン；レーン３およびレーン８：ＡＨ２２ｕｒａ３：ＹｐＡＤＨ  γ−グリアジン、モノマー参照；レーン４およびレーン９：ＡＨ２２ｕｒａ３：ＹｐＡＤＨ  ＬＭＷａ３Δｃｙｓ、改変ＬＭＷサブユニット；レーン５：タンパク質標準。
【図１４】酵母細胞からの小麦の貯蔵タンパク質の抽出。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１：粗製細胞抽出物；レーン２：抽出前物質；レーン３：主要抽出物；Ｍ：分子量基準；レーン４：精製されたＬＭＷサブユニット
【図１５】ＨＭＷ  Ｄｘ５サブユニット発現プラスミド  ＹｐＡＤＨ  ＨＭＷ  Ｄｘ５。
【図１６】ＨＭＷ  Ｄｙ１０  サブユニット発現プラスミドＹｐＡＤＨ  ＨＭＷ  Ｄｙ１０。
【図１７】ＨＭＷサブユニットを産生する酵母形質転換体由来のイソプロパノール抽出物（主要な抽出物）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ；レーン１：ＨＭＷ  Ｄｘ５サブユニット；レーン２：ＨＭＷ  Ｄｙ１０  サブユニット；Ｍ：分子量基準。
【配列表】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月31日(2005.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2006518584.tif 000029
2006518584.tif 000030
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