(57)【要約】1つまたは複数の抗逆転写酵素(RT)抗体および／または1つまたは複数の抗DNAポリメラーゼ(DNAP)抗体および／または1本鎖結合タンパク質(SSB)を含む、好ましくは核酸合成に使用するための組成物が開示されている。開示されている組成物は、1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗RT抗体および1つまたは複数のSSBを含むものもある。開示されている組成物は、2つまたはそれ以上のSSBを含むものもある。開示されている核酸合成組成物はまた、1つまたは複数のDNAP、1つまたは複数のRT、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のプライマーおよび／または1つまたは複数の鋳型を含む。抗RT抗体、抗DNAP抗体および／またはSSBの種々の組み合わせがプライマー伸長産物の収率および／または均一性を改善することができる、核酸合成、増幅および配列決定にこのような組成物を使用する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも1つの抗DNAP抗体および／または少なくとも1つの抗RT抗体と、
(b)少なくとも1つのSSB
を含む組成物。
【請求項２】
少なくとも2つの異なるSSBを含む組成物。
【請求項３】
1つまたは複数の核酸鋳型をさらに含む、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項４】
1つまたは複数の鋳型の少なくとも1つがcDNAである、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも1つのプライマーをさらに含む、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項６】
1つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項７】
1つまたは複数のDNAPをさらに含む、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項８】
1つまたは複数の逆転写酵素をさらに含む、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項９】
(a)1つまたは複数の核酸鋳型、1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗RT抗体および1つまたは複数のSSBを含む混合物を提供する段階と、
(b)1つまたは複数の鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を合成するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と
を含む、核酸を合成する方法。
【請求項１０】
段階(a)が核酸合成を阻害するのに十分な温度において実施され、段階(b)が1つまたは複数の抗体の阻害作用を低下するのに十分な温度において実施される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
(a)1つまたは複数の核酸鋳型および2つまたはそれ以上のSSBを含む混合物を提供する段階と、
(b)1つまたは複数の鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸を作製するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と
を含む、核酸を合成する方法。
【請求項１２】
1つまたは複数の鋳型の少なくとも1つがcDNAである、請求項9または請求項11記載の方法。
【請求項１３】
1つまたは複数の鋳型の少なくとも1つがRNAである、請求項9または請求項11記載の方法。
【請求項１４】
混合物が、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のDNAP、1つまたは複数の逆転写酵素および1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩からなる群から選択される少なくとも1つの成分をさらに含む、請求項9または請求項10記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸合成(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に基づいた核酸合成)に有用な方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
DNAポリメラーゼ(DNAP)は、核酸鋳型(好ましくはDNA鋳型)の全てまたは一部に相補的なDNA分子を合成する。プライマーをDNA鋳型にハイブリダイゼーションしてプライマーが結合した鋳型が形成されると、DNAポリメラーゼは、鋳型依存的に(すなわち、鋳型のヌクレオチド配列に依存して)プライマーの3'ヒドロキシ末端にヌクレオチドを付加することができる。従って、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)およびプライマーの存在下において、1つまたは複数の核酸鋳型の全てまたは一部に相補的な新規DNA分子を合成することができる。
【０００３】
DNAPは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づいた核酸合成を使用して、生物的および環境的試験試料中の核酸を検出するために使用することができる(例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,965,188号を参照されたい)。PCRに基づいた核酸合成では、熱安定なDNAPおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下において1つまたは複数の鋳型を小型の相補的な「プライマー」核酸にハイブリダイゼーションする。プライマーと鋳型をハイブリダイゼーションして、「プライマーが結合した鋳型複合体」が形成されると、DNAPは鋳型特異的にプライマーを伸長して、プライマー伸長産物を作製することができる。次いで、プライマー伸長産物は核酸合成のための鋳型として作用することができる。変性の結果、プライマー伸長産物はプライマーにハイブリダイゼーションして、DNAP基質として作用することができるプライマーが結合した鋳型複合体を形成することができる。ハイブリダイゼーション、プライマー伸長および変性のサイクルは多数回反復されて、プライマー伸長産物の数を指数関数的に増加することができる。従って、PCRに基づいた核酸合成は、鋳型核酸を検出するための非常に感度の高い技術である。
【０００４】
DNAPによって作製されるプライマー伸長産物の収率および均一性は、「ミスプライミング」(すなわち、鋳型の不適当な領域または鋳型でない核酸へのプライマーのハイブリダイゼーション)によって有害に影響されることがある。プライマーは、鋳型核酸の特定の領域にハイブリダイゼーションするように設計される。ミスプライミングは、鋳型、プライマー、DNAPおよびヌクレオチドを含有する核酸合成混合物が(例えば、製造、出荷または保存中に)低温で維持される場合に生じることがある。ミスプライミングされた核酸の伸長は、適切にプライミングされたプライマー伸長産物を不明瞭にすることがある(すなわち、高いバックグラウンドを生じる)。また、ミスプライミングされた核酸を伸長するために核酸合成反応構成要素が使用されると、適切にプライミングされたプライマー伸長産物の収率が低下することがあり、検出感度が低下することがある。
【発明の開示】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、核酸を合成するための組成物および方法を特徴とする。本発明の方法および材料は、DNAPによって作製されるプライマー伸長産物の収率および／または均一性を増強することができる。
【０００６】
一局面において、本発明の組成物および方法は、1つまたは複数の(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ等)の1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)を使用するまたは組み入れる。
【０００７】
別の局面において、本発明の組成物および方法は、1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗逆転写酵素(RT)抗体を使用するまたは組み入れる。
【０００８】
さらに別の局面において、本発明の組成物および方法は1つまたは複数のSSBおよび1つまたは複数の抗DNAP抗体を使用するまたは組み入れる。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明の組成物および方法は1つまたは複数のSSBおよび1つまたは複数の抗RT抗体を使用するまたは組み入れる。
【００１０】
好ましい組成物および方法は、SSBおよび／または抗DNAP抗体および／または抗RT抗体以外に、1つまたは複数の鋳型、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のベクター、1つまたは複数のリガーゼ、1つまたは複数のトポイソメラーゼ、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数の核酸分子、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRTおよび1つまたは複数のDNAPを使用してもよいまたは組み入れてもよい。
【００１１】
本発明はまたキット(好ましくは、本発明の方法を実施する際に使用するキット)に関する。このようなキットは1つまたは複数のSSBおよび／または抗DNAP抗体および／または抗RT抗体を含んでもよい。本発明のキットはまた、1つまたは複数の宿主細胞(好ましくは、核酸分子を取り込む能力がある)、1つまたは複数の鋳型、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の核酸分子、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のベクター、1つまたは複数のリガーゼ、1つまたは複数のトポイソメラーゼ、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRT、1つまたは複数のDNAPおよび本発明の任意の方法を実施するための取扱い説明書またはプロトコールからなる群から選択される1つまたは複数の要素を含んでもよい。
【００１２】
本発明の組成物は、好ましくは、核酸合成反応に使用されるか、または核酸合成反応中に作製される。本発明の方法は、好ましくは、1つまたは複数の核酸分子を合成するために使用される。従って、本発明は、核酸分子の増幅(例えば、PCRによる)、核酸分子の逆転写(例えば、cDNA合成)および逆転写／増幅連動または非連動反応(例えば、RTPCR)に使用することができる。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。開示されている材料、方法および実施例は例示的にすぎず、限定する意図のものではない。本明細書に記載するものと同様または等価な方法および材料を本発明を実施するために使用できることを当業者は理解している。
【００１４】
特に規定しない限り、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当技術分野の当業者に通常理解される意味を有する。本明細書に記載する文献、特許出願、特許および他の参照文献は全て全体として参照として組み入れられている。争議の場合には、定義を含む本明細書が支配する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸合成(例えば、PCRを用いる核酸合成)の方法および材料を提供する。本発明は、一部には、DNAPによって作製されるプライマー伸長産物の収率および／または均一性は、核酸合成混合物に抗DNAP抗体および／または1本鎖DNA結合タンパク質(好ましくは熱安定性SSB)の組み合わせを含むことによって増大することができるという驚くべき発見に基づいている。核酸合成混合物の構成要素、核酸合成方法およびこれを実施するのに有用なキットを、分子生物学の分野の当業者に普通に使用される用語の簡単な用語解説と共に本明細書に記載する。
【００１６】
核酸
一般に、核酸は、ホスホジエステル結合によって接続されるヌクレオチドの連続的なシリーズ(別名、「鎖」および「配列」)を含む。核酸は1本鎖であっても、または2本鎖であってもよく、2本鎖は、相補的なヌクレオチド塩基間のストランド間相互作用を介して連結されている。核酸は、天然型ヌクレオチドおよび／または非天然型ヌクレオチド(例えば、非天然型糖部分および／または非天然型塩基部分を有する)を含んでもよい。核酸はリボ核酸(RNA、mRNAを含む)を含むであってもまたはデオキシリボ核酸(DNA、ゲノムDNA、組換えDNA、cDNAおよび合成DNAを含む)であってもよい。核酸は、染色体またはcDNA分子などの別個の分子であってもよい。核酸はまた、別個の分子のセグメント(すなわち、ホスホジエステル結合によって接続される一連のヌクレオチド)であってもよい。
【００１７】
鋳型
鋳型は、プライマー-鋳型複合体の一部である場合に、DNAPまたはRTの基質として働くことができる1本鎖核酸である。核酸合成混合物は1種類の鋳型を含んでも、または異なるヌクレオチド配列を有する鋳型を含んでもよい。特定の鋳型に特異的なプライマーを使用することによって、核酸合成混合物中の複数の鋳型についてプライマー伸長産物を作製することができる。複数の鋳型は異なる別個の複数の核酸内に存在しても、または別個の1つの核酸内に存在してもよい。
【００１８】
鋳型は、生物起源(例えば、細胞、組織、器官および生物)に存在する核酸から入手または作製することができる。従って、鋳型は、細菌(例えば、エシェリキア（Escherichia）種、バシラス（Bacillus）種、セラチア（Serratia）種、サルモネラ（Salmonella）種、ブドウ球菌（Staphylococcus）種、トレプトコッカス（Streptococcus）種、クロストリジウム（Clostridium）種、クラミジア（Chlamydia）種、ナイセリア（Neisseria）種、トレポネーマ（Treponema）種、マイコプラズマ（Mycoplasma）種、ボレリア（Borrelia）種、レジオネラ（Legionella）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、マイコバクテリウム-（Mycobacterium）種、ヘリコバクター（Helicobacter）種、エルウィニア（Erwinia）種、アグロバクテリウム（Agrobacterium）種、根粒菌（Rhizobium）種およびストレプトミセス（Streptomyces）種)、酵母などの真菌、ウイルス(例えば、オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘパドナビリダエ（Hepadnaviridae）、レトロウイルス科（Retroviridiae）)、原虫、植物および動物(例えば、ショウジョウバエ（Drosophia）
spp.などの昆虫、エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）などの線虫、魚類、鳥類、齧歯類、ブタ、ウマ、ネコ、イヌおよびヒトを含む霊長類)に存在する核酸から入手または作製することができる。鋳型はまた、土壌、水および空気試料などの環境試料に存在する核酸から入手または作製することもできる。核酸は、当業者に知られている通常の方法を使用してこのような生物起源および環境起源から作製することができる(例えば、Maniatis,
T.ら(1978) Cell 15: 687-701; Okayama, H.およびP. Berg(1982) Mol. Cell. Biol. 2:
161-171; Gubler, U.およびB. Hoffman(1983) Gene 25: 263-269を参照されたい)。
【００１９】
いくつかの態様において、鋳型は、生物起源または環境起源から直接入手される。他の態様において、鋳型は、生物起源または環境起源から入手される2本鎖核酸を完全または部分的に変性することによって提供される。いくつかの態様において、鋳型は組換えDNA分子または合成DNA分子である。組換えまたは合成DNAは1本鎖であっても、2本鎖であってもよく、この場合それは、好ましくは、完全または部分的に変性されて鋳型を提供する。いくつかの態様において、鋳型はmRNA分子またはmRNA分子の集団である。他の態様において、鋳型はcDNA分子またはcDNA分子の集団である。cDNA鋳型は、逆転写酵素活性を有する酵素による核酸合成反応において合成されても、または外因的起源(例えば、cDNAライブラリー)から提供されてもよい。
【００２０】
プライマー
プライマーは、鋳型より短く、鋳型のセグメントに相補的である1本鎖核酸である。プライマーは、DNAPが、鋳型の全てまたは一部に相補的である核酸分子(すなわち、プライマー伸長産物)を合成できるように、鋳型にハイブリダイゼーションしてプライマー-鋳型複合体(すなわち、プライマーが結合した鋳型)を形成することができる。
【００２１】
プライマーは、典型的には、ヌクレオチド鎖長が12〜60ヌクレオチド(例えば、ヌクレオチド鎖長が18〜45ヌクレオチド)であるが、鎖長はこれより短くてもまたは長くてもよい。プライマーは、鋳型に特異的にハイブリダイゼーションして、DNAPの基質として作用してプライマー伸長産物を作製することができるプライマー-鋳型複合体を形成することができるように、同族の鋳型と実質的に相補的であるように設計される。プライマー-鋳型複合体によっては、プライマーの各ヌクレオチドが鋳型のヌクレオチドと相補的で、相互作用するように、プライマーと鋳型が完全に相補的であるものもある。プライマーは(例えば、Applied
Biosystems社製のABI DNA SynthesizerまたはMilligen-Biosearch, Inc.社製のBiosearch 8600もしくは8800
Series Synthesizerを使用して)当業者が通常に作製しても、または数多くの供給業者から入手してもよい。
【００２２】
DNAポリメラーゼ(DNAP)
DNAポリメラーゼは、デオキシヌクレオシド一リン酸分子をプライマー-鋳型複合体のプライマーの3'ヒドロキシ末端に付加し、次いで鋳型依存的に(すなわち、鋳型のヌクレオチド配列に依存して)成長中のプライマー伸長産物の3'ヒドロキシ末端に逐次的に付加する酵素である。DNAPは、典型的には、使用する鋳型に相補的であるヌクレオチドを付加するが、DNAPは重合すなわち合成過程中に非相補的なヌクレオチド(ミスマッチ)を付加する場合もある。従って、合成された核酸鎖は鋳型に完全に相補的でない場合もある。DNAPは、使用する鋳型より鎖長が短い核酸分子を作製する場合もある。DNAPには2つの好ましい基質がある。1つは、プライマー末端が遊離の3'-ヒドロキシ基を有するプライマー-鋳型複合体であり、他方はデオキシヌクレオチド5'-三リン酸(dNTP)である。ホスホジエステル結合は、dNTPのα-リン酸基に対するプライマー末端の3'-OHの求核的な攻撃および末端のピロリン酸の離脱によって形成される。DNAPは、当業者が通常に生物から単離することができ、また数多くの供給業者から入手することができる。
【００２３】
いくつかのDNAPは熱安定性で、PCRを用いる核酸合成に通常使用される温度において実質的に不活性化されない。このような温度は、pH、鋳型およびプライマーのヌクレオチド組成、プライマーの鎖長並びに塩濃度を含む反応パラメーターに応じて変わる。熱安定なDNAPには、サームス・サーモフィラス（Thermus
thermophilus）(Tth)DNAP、サームス・アクアティカス（Thermus aquaticus）(Taq)DNAP、サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga
neopolitana）(Tne)DNAP、サーモトガ・マルティマ（Thermotoga martima）(Tma)DNAP、サーモトガ（Thermatoga）株FjSS3-B.1
DNAP、サーモトガ・リトラリス（Thermococcus litoralis）(TliまたはVENT(商標))DNAP、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus
furiosus）(Pfu)DNAP、DEEPVENT(商標)DNAP、ピロコッカス・ワオシ（Pyrococcus woosii）(Pwo)DNAP、ピロコッカス（Pyrococcus）種
KOD2(KOD)DNAP、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus sterothermophilus）(Bst)DNAP、バシラス・カルドフィラス（Bacillus
caldophilus）(Bca)DNAP、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）(Sac)DNAP、サーモプラスマ・アシドフィラム（Thermoplasma
acidophilum）(Tac)DNAP、サームス・フラバス（Thermus flavus）(Tfl/Tub)DNAP、サームス・ラバー（Thermus
ruber）(Tru)DNAP、サームス・ブロッキアヌス（Thermus brockianus）(DYNAZYME(商標)DNAP、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho
africanus）DNAP並びにそれらの突然変異体、変種および誘導体が挙げられる(米国特許第6,077,664号；米国特許第5,436,149号；米国特許第4,889,818号；米国特許第5,532,600号；米国特許第4,965,188号；米国特許第5,079,352号；米国特許第5,614,365号；米国特許第5,374,553号；米国特許第5,270,179号；米国特許第5,047,342号；米国特許第5,512,462号；国際公開公報第94/26766号；国際公開公報第92/06188号；国際公開公報第92/03556号；国際公開公報第89/06691号；国際公開公報第91/09950号；91/09944号；国際公開公報第92/06200号；国際公開公報第96/10640号；国際公開公報第97/09451号；Barnes,
W. Gene 112: 29-35(1992)；Lawyer, F.ら(1993) PCR Meth. Appl. 2: 275-287およびFlaman,
Jら(1994) Nucl. Acids Res. 22: 3259-3260を参照されたい)。
【００２４】
pol IファミリーDNAP(例えば、大腸菌（E. coli）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、放射線抵抗性細菌（D.
radiodurans）、ヘリコバクター・ピロリ（H.pylori）、C. オウランティカス（C. aurantiacus）、R. プロワゼッキ（R.
Prowazekki）、梅毒トレポネーマ（T. Pallidum）、シネコシス種（Synechosis sp.）、枯草菌（B. subtilis）、ラクトコッカス・ラクティス（L.
lactis）、肺炎球菌（S. pneumonia）、結核菌（M. tuberculosis）、らい菌（M. leprae）、スメグマ菌（M.
smegmatis）、バクテリオファージ（Bacteriophage）L5、phi-C31、T7、T3、T5、SP01、SP02、サッカロミセス・セレビジエ（S.
cerevisiae）およびキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）)、pol III型DNAP並びにそれらの突然変異体、変種および誘導体を含む他のDNAPは中等温度好性である。
【００２５】
逆転写酵素(RT)
逆転写酵素は、逆転写活性を有する(すなわち、1本鎖RNA鋳型からのDNAの合成を触媒する)酵素である。このような酵素には、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、B型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Tth
DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(Saiki, R. K.ら、(1988) Science 239: 487-491；米国特許第4,889,
818号および同第4,965,188号)、Tne DNAポリメラーゼ(国際公開公報第96/10640号および国際公開公報第97/09451号)、Tma DNAポリメラーゼ(米国特許第5,374,553号)並びにそれらの突然変異体、変種および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、国際公開公報第97/09451号および国際公開公報第98/47912号を参照されたい)。RTには、RNase
H活性が低下されているもの、実質的に低下されているものまたはRNase H活性がないものがある。「RNase H活性が実質的に添加されている酵素」は、酵素が、対応する野生型または野生型モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)もしくはラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素などのRNase
H+酵素のRNase H活性の約20%未満である、さらに好ましくは約15%未満、10%未満または5%未満である、最も好ましくは約2%未満であることを意味する。任意の酵素のRNase
H活性は、例えば、米国特許第5,244,797号、Kotewicz, M. L.ら(1988) Nucl. Acids Res. 16: 265およびGerard,
G. F.ら、(1992) FOCUS 14: 91に記載されているものなどの種々のアッセイ法によって測定することができる。本発明に使用するために特に好ましいポリペプチドには、M-MLV
H-逆転写酵素、RSV H-逆転写酵素、AMV H-逆転写酵素、RAV(ラウス随伴ウイルス(rous-associated
virus)) H-逆転写酵素、MAV(骨髄芽球症随伴ウイルス(myeloblastosis-associated virus)) H-逆転写酵素およびHIV
H-逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない(米国特許第5,244,797号および国際公開公報第98/47912号を参照されたい)。リボ核酸分子からDNA分子を作製することができる(すなわち、逆転写酵素活性を有する)任意の酵素を本発明の組成物、方法およびキットに等しく使用することができる。
【００２６】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、有機塩基に結合されているペントース(RNAではリボースであり、DNAではデオキシリボースである)にホスホエステル結合によって結合されたリン酸基からなる。核酸のモノマー単位はヌクレオチドである。天然型DNAおよびRNAは、各々4つの異なるヌクレオチドを含有する：アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基を有するヌクレオチドは天然型DNAに見られ、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル塩基を有するヌクレオチドは天然型RNAに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルはそれぞれ、A、G、C、TおよびUと略されることが多い。
【００２７】
ヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型および三リン酸型(すなわち、リン酸基が、それぞれ、1つ、2つまたは3つのリン酸部分を有する)を含む。従って、ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸(例えば、ATP、UTP、CTGおよびGTP)およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸(例えば、dATP、dCTP、dITP、dGTPおよびdTTP)並びにそれらの誘導体を含む。ヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPを含むddNTP)およびそれらの誘導体を含む。
【００２８】
ヌクレオチド誘導体は、[αS]dATP、7-デアザ-dGTP、7-デアザ-dATPおよび核酸分解に抵抗性を示すヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、32Pもしくは35Sなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分または酵素で検出できるように標識されているヌクレオチドを含む。
【００２９】
プライマー伸長産物
プライマー伸長産物は、DNAPが1つまたは複数のヌクレオチドを付加したプライマーを含む核酸である。プライマー伸長産物は、プライマー-鋳型複合体と同じ長さであってもまたはそれより短くてもよい。
【００３０】
増幅
増幅は、DNAPを使用して核酸のコピー数を増加するためのインビトロ方法をいう。核酸増幅により、プライマーまたは成長中のプライマー伸長産物にヌクレオチドが付加されて、鋳型に相補的な新たな分子が形成される。核酸増幅では、プライマー伸長産物およびその鋳型は変性されて、鋳型として使用されて、追加の核酸分子を合成することができる。増幅反応は、多数の複製ラウンドからなりうる(例えば、1回のPCRは、5〜100「サイクル」の変性とプライマー伸長からなる場合がある)。核酸を増幅する一般的な方法は当業者に既知である(例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,800,159号；Innis,
M. A.ら編、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、San Diego、California：Academic
Press, Inc.(1990)；Griffin, H.およびA. Griffin編、PCR Technology: Current Innovations、Boca
Raton、Florida: CRC Press(1994)を参照されたい)。本発明により使用することができる増幅方法には、PCR(米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号)、Strand
Displacement Amplification(SDA；米国特許第5,455,166号；欧州特許第0 684 315号)、Nucleic Acid
Sequenced-Based Amplification(NASBA；米国特許第5,409,818号；欧州特許第0 329 822号)が挙げられる。
【００３１】
抗体
一般に、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子(例えば、IgGおよびIgM分子)および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分(例えば、F(ab)およびF(ab')2断片)をいう。1本鎖抗体およびその断片も本発明に使用することが考慮されている。抗体は、好ましくは、1つまたは複数の抗原に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位を含有する。抗DNAP抗体は、DNAPに特異的に結合するまたは相互作用する抗体である。抗RTは、RTに特異的に結合するまたは相互作用する抗体である。抗体には、温度感受性で、1つの温度において同族の抗原に特異的に結合し、それより高い温度では抗原結合の低下を示すものがある。
【００３２】
ポリクローナル抗体調製物は、抗原(例えば、DNAPまたはRT)の異なるエピトープ(すなわち、抗原性部分)と免疫反応することができる異なる抗原結合部位を有する抗体分子の集団を含む。モノクローナル抗体調製物は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる1つの種の抗原結合部位を有する抗体分子の集団を含む。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、免疫反応する抗原に1つの結合親和性を示す。
【００３３】
好ましくは、本発明の抗DNAPおよび／または抗RT抗体は、不活性化を生じる条件を与えられていない対照抗体と比較したとき、25%未満(例えば、20%未満、15%未満、好ましくは10%未満、最も好ましくは5%未満)の抗原阻害作用を保持するように不活性化または実質的に不活性化することができる。抗体を不活性化または実質的に不活性化するために使用することができる条件には、例えば、温度、pH、イオン条件が挙げられるが、温度の変化が好ましい。米国特許第5,338,671号は、温度感受性モノクローナルIgG抗DNAP抗体を開示している。抗体は、抗体が不活性化または実質的に不活性化される温度が異なるように設計または作製することができる。好ましくは、抗体を不活性化する温度は、45℃より高く、50℃より高く、55℃より高く、60℃より高く、65℃より高く、70℃より高く、75℃より高く、80℃より高く、85℃より高く、90℃より高く、95℃より高く、100℃より高い。
【００３４】
抗DNAPおよび抗RT抗体は、単離したDNAPもしくはRTまたはその免疫原性部分を含有する免疫原性調製物で好適な被験者(例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類)を免疫化することによって作製することができる。免疫原性調製物は、例えば、組換えDNAPもしくはDNAP部分または組換えRTもしくはRT部分を含有してもよい。組換えDNAPまたはRT部分および酵素的または化学的タンパク質分解によって作製された部分を含む免疫原性DNAPまたはRT部分は少なくとも5つのアミノ酸(例えば、少なくとも10のアミノ酸、少なくとも15のアミノ酸、少なくとも20のアミノ酸および少なくとも30のアミノ酸)を有する。いくつかの免疫原性DNAPまたはRT部分は、酵素の表面に位置するDNAPまたはRT領域(例えば、親水性領域)に対応する。免疫原性調製物は、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントまたは他の免疫賦活性剤などのアジュバントも含むことができる。
【００３５】
好適な被験者を免疫原性DNAPまたはRT調製物で免疫化すると、それぞれ、ポリクローナル抗DNAPまたは抗RT抗体応答を誘導する。免疫化した被験者の抗体価は、標準的な技術(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA))を使用して経時的にモニターすることができる。免疫化後適当な時間経過時(例えば、抗体価が最大になるとき)に、抗体を被験者から(例えば、血液から)単離して、ポリクローナル抗体調製物を得ることができる。抗体は、通常の技術(例えば、IgG画分を得るためのプロテインAクロマトグラフィー)を使用してさらに精製することができる。
【００３６】
モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(1975) Nature 256: 495-497(Brownら(1981) J.
Immunol. 127: 539-46；Brownら(1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83；Yehら(1976) PNAS
76: 2927-31およびYehら(1982) Int. J. Cancer 29: 269-75も参照されたい)によって開示されているハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozborら(1983)
Immunol Today 4: 72を参照されたい)、EBV-ハイブリドーマ技術(例えば、Coleら(1985), Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.、pp77〜96を参照されたい)またはトリオーマ技術などの標準的な技術を使用して作製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製する技術は日常的であり、当技術分野において既知である(例えば、R.
H. Kenneth、Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses、Plenum
Publishing Corp.、New York、N. Y. (1980); E. A. Lerner(1981) Yale J. Biol. Med.
54: 387-402およびM. L. Gefterら(1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36を参照されたい)。簡単に説明すると、不死細胞系統(例えば、骨髄腫)を、DNAPもしくはその一部またはRTもしくはその一部などの免疫原で免疫化した哺乳類のリンパ球(例えば、脾細胞)に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００３７】
モノクローナル抗体は、リンパ球と不死化細胞系統を融合するための通常のプロトコールを使用して作製することができる(例えば、G. Galfreら(1977)
Nature 266: 55052；GefterらSomatic Cell Genet.、上記に引用されている；Lerner, Yale J. Biol.
Med.、上記に引用されているおよびKenneth、Monoclonal Antibodies、上記に引用されているを参照されたい)。不死細胞系統(例えば、骨髄腫細胞系統)は、リンパ球と同じ哺乳類種由来であってもよい。例えば、マウスハイブリドーマは、免疫原性調製物で免疫化したマウスのリンパ球と不死化マウス細胞系統を融合することによって作製することができる。不死細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地(「HAT培地」)に感受性のマウス骨髄腫細胞系統を含む。融合相手として使用することができる例示的な骨髄腫細胞系統はP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫系統である。HAT-感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコールを使用してマウス脾細胞に融合することができる。次いで、未融合の骨髄腫細胞および融合したが、産生能力のない骨髄腫細胞を死滅させるHAT培地を使用して得られたハイブリドーマ細胞を選択することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、ELISA法を使用して、免疫原に特異的に結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出することができる。
【００３８】
モノクローナル抗DNAPおよび抗RT抗体はまた、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー)をDNAPもしくはRTまたはその一部でスクリーニングして、DNAPまたはRTに結合するライブラリーメンバーを同定することによっても入手することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングする技術は既知であり、これを実施するキットは市販品を購入可能である。抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするのに好適な方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；国際公開公報第92/18619号；国際公開公報第91/17271号；国際公開公報第92/20791号；国際公開公報第92/15679号；国際公開公報第93/01288号；国際公開公報第92/01047号；国際公開公報第92/09690号；国際公開公報第90/02809号；Fuchsら(1991)
Bio/Technology 9: 1370-1372；Hayら(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85；Huseら(1989)
Science 246: 1275-1281；Griffithsら(1993) EMBO J 12: 725-734；Hawkinsら(1992) J.
Mol. Biol. 226: 889-896；Clarksonら(1991) Nature 352: 624-628；Gramら(1992) PNAS
89: 3576-3580；Garradら(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377；Hoogenboomら(1991) Nuc.
Acid Res. 19:4133-4137；Barbasら(1991) PNAS 88: 7978-7982およびMcCaffertyら(Nature)1990
348:552-554に開示されている。
【００３９】
本発明に使用するのに好適な抗DNAP抗体は、例えば、米国特許第5,338,671号に開示されている。本発明に使用するのに好適な抗RT抗体は、例えば、国際公開公報第0052027A1号に開示されている。
【００４０】
1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)
1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)は、ヌクレオチド配列に関係なく、2本鎖DNAよりも1本鎖DNA(ssDNA)に主に結合するタンパク質である。SSBは実質的に全ての既知の生物において同定されており、複製、組換えおよび修復を含むDNA代謝に重要であると思われる。天然型SSBは、典型的には、同じであってもまたは異なってもよい2つ、3つまたは4つのサブユニットを含む。一般に、天然型SSBサブユニットは、天然型SSGが4つまたはそれ以上のOBフォールドを有するように、少なくとも1つの保存されたDNA結合ドメインまたは「OBフォールド」を含有する(例えば、Philipova,
D.ら(1996) Genes Dev. 10: 2222-2233およびMurzin, A.(1993) EMBO J. 12: 861-867を参照されたい)。
【００４１】
中等温度好性生物のSSBは、報告によると、PCR効率を改善することができる(例えば、米国特許第5,605,824号および同第5,773,257号；Chou,
Q. (1992)Nucl. Acids Res. 20: 4371；Rapley, R. (1994) Mol. Biotechnol. 2:
295-298およびDabrowski,S.およびJ. Kurr(1999) Protein Expr. Purif. 16: 96-102を参照されたい)。しかし、PCRを使用する核酸合成に通常使用する温度は、中等温度好性SSBがDNAに結合する上限を超えることがあり、PCRを使用する核酸合成の有効性を制限している。
【００４２】
熱安定性SSBは70℃において少なくとも70%(例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%および少なくとも95%)ssDNAに結合するだけでなく、それらは37℃においても同様であり、中等温度好性SSBよりPCR適用に好適である。熱安定性SSBは古細菌から入手することができる。古細菌は、16S
rDNA配列分析により真正細菌から識別される微生物群である。古細菌は3つのグループに分類することができる：クレン古細菌門、ユーリ古細菌門およびコル古細菌門(例えば、Woese,
C.およびG. Fox(1977) PNAS 74: 5088-5090；Woese, C.ら、(1990) PNAS 87: 4576-4579およびBarns,
S.ら(1996) PNAS 93: 9188-9193を参照されたい)。最近、メタン細菌(Methanococcus jannachii) SSB、水素資化性メタン菌(Methanobacterium
thermoautrophicum) SSBおよびアーケオグロブス  フルギダス(Archaeoglobus fulgidus) SSBを含む、ユーリ古細菌門SSB並びにスルフォロブス・スルファタリカス（Sulfolobus
sulfataricus） SSBおよび超好熱好気性古細菌(Aeropyrum pernix )SBBを含む、クレン古細菌門SSBの同定および特徴付けに関して報告されている(例えば、Chedin,
F. ら(1998) Trends Biochem. Sci. 23:273-277；Haseltine C.ら(2002) Mol Microbiol.
43: 1505-1515；Kelly, T. ら(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14634-14639；Klenk,
H. ら(1997) Nature 390: 364-370；Smith, D. ら(1997) J. Bacteriol. 179: 7135-55；Wadsworth,
R.およびM. White (2001) Nucl. Acids Res. 29:914-920並びに米国特許出願第60/147,680号を参照されたい)。
【００４３】
当業者は、Haseltine C.ら(2002) Mol Microbiol. 43:1505-1515に開示されているものなどの通常の方法を使用して、(古細菌SSBを含む)SSBを精製し、組換え変種を作製し、SSB活性を測定することができる。
【００４４】
既知のSSBおよびGenBank寄託番号の非包括的なリストを表1に提供する。
【００４５】
【表１】
2006522582.tif 000002
2006522582.tif 000003
2006522582.tif 000004
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2006522582.tif 000021
【００４６】
単離
ポリペプチドに関して、「単離された」は、成分の混合物において主要な成分、例えば、30重量％またはそれ以上、40重量％またはそれ以上、50重量％またはそれ以上、60重量％またはそれ以上、70重量％またはそれ以上、80重量％またはそれ以上、90重量％またはそれ以上、または95重量％またはそれ以上を構成するポリペプチドをいう。単離ポリペプチドは、典型的には、そのポリペプチドを含有する生物(例えば、そのポリペプチドを発現する遺伝子組換え生物)から精製することによって得られるが、化学合成も可能である。ポリペプチドの精製方法には、例えば、硫酸アンモニウム沈降法、クロマトグラフィーおよび免疫親和性技術が挙げられる。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いで実施するクーマシーブルー染色または検出対象のポリペプチドに対する結合親和性を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析を含む、当技術分野において既知の任意の手段によって検出することができる。
【００４８】
熱安定性
「耐熱性」は、熱によって不活性化されない酵素またはタンパク質(例えば、DNAP、RTおよびSSB)をいう。一般に、耐熱性酵素は、中等温度好性酵素と比較して、熱不活性化に対する耐性が大きい。従って、耐熱性酵素またはタンパク質の核酸合成活性または1本鎖結合活性は熱処理によってある程度低下されることがあるが、中等温度好性酵素またはタンパク質ほど大きくない。
【００４９】
耐熱性DNAPは、核酸合成混合物中で90℃において30秒間加熱されても、その核酸合成活性の少なくとも50%(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%および少なくとも95%)を保持する。一方、中等温度好性DNAPは、このような熱処理後では、核酸合成活性のほとんどを損失する。耐熱性DNAPはまた、典型的には、中等温度好性T5
DNAPより至適核酸合成温度が高い。
【００５０】
耐熱性SSBは70℃においてssDNAに少なくとも70%(例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%および少なくとも95%)結合するだけでなく、37℃においても同様である。
【００５１】
SSBがこのような温度でssDNAに結合する程度は、SSBの固有蛍光を測定することによって求めることができる。SSBの固有蛍光は保存されているOBフォールドアミノ酸に相関し、ssDNAに結合すると消光する(例えば、Alani,
E.ら(1992) J. Mol. Biol. 227: 54-71を参照されたい)。SSB-ssDNA結合を測定する通常のプロトコールはKelly, T.ら(1998)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14634-14639に記載されている。簡単に説明すると、30 mM HEPES(pH 7.8)、100
mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5%イノシトールおよび1 mM DTTを含有する2 mlの緩衝液中でSSB-ssDNA結合反応を実施する。一定量のSSBを種々の量のポリ(dT)と共にインキュベーションし、励起波長約295
nmおよび放射波長約348 nmを使用して蛍光を測定する。
【００５２】
忠実度
忠実度は核酸重合の正確さ；鋳型に相補的な核酸分子を合成する際に、DNAPまたはRTが正しい基質と間違った基質(例えば、ヌクレオチド)を識別する能力をいう。忠実度が高いと、核酸合成中に酵素が成長中の鎖にヌクレオチドを誤取り込みすることが少ない。従って、忠実度の増加または増強により、DNAPまたはRTによる核酸合成はより忠実になり、誤取り込みが低下する。
【００５３】
増加した／増強した／高い忠実度は、忠実度の増加、核酸合成中に(例えば、SSBの非存在下における)対照DNAPまたはRTの忠実度と比較したとき、所定の鎖長の核酸の合成中に誤取り込みされるヌクレオチドの数の好ましくは約1.2〜約10,000倍、約1.5〜約10,000倍、約2〜約5,000倍または約2〜約2000倍の(好ましくは約5倍より多い、さらに好ましくは約10倍より多い、よりさらに好ましくは約50倍より多い、よりさらに好ましくは約100倍より多い、よりさらに好ましくは約500倍より多い、最も好ましくは約100倍より多い)低下を生ずることを意味する。
【００５４】
誤取り込みの低下は、核酸合成中に(例えば、SSBの非存在下にける)対照DNAPまたはRTと比較したとき、相対的な誤取り込みが90%未満、85%未満、75%未満、70%未満、60%未満、または好ましくは50%未満、好ましくは25%未満、さらに好ましくは10%未満、最も好ましくは1%未満であることを意味する。
【００５５】
相同体および変種
本発明の組成物および方法に好適なDNAP、RTおよびSSBは、相同ヌクレオチドおよびポリペプチド配列分析によって同定することができる。1つの生物の既知のポリペプチドを使用して、別の生物の相同なポリペプチドを同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースの問い合わせを実施することにより、既知のポリペプチドの相同体を同定することができる。相同配列分析は、既知のポリペプチドアミノ酸配列を使用するBLASTまたはPSI-BLASTデータベース分析に関係することもある。配列の同一性が35%より大きいデータベース中のタンパク質は、本発明の組成物および方法に好適であることをさらに評価する候補である。望ましい場合には、さらに評価することができる候補の数を絞るために、このような候補の手作業による調査を実施することがある。手作業による調査は、既知のポリペプチドに保存されているドメインを有すると思われる候補を選択することによって実施される。
【００５６】
別の「標的」核酸またはアミノ酸配列と比較した任意の本発明の核酸またはアミノ酸配列の同一性の割合は以下のように求めることができる。最初に、BLASTNおよびBLASTPを含むBLASTZの独立型バージョン(例えば、バージョン2.0.14)のBLAST
2 Sequences(Bl2seq)プログラムを使用して、標的核酸またはアミノ酸配列を本発明の核酸またはアミノ酸配列と比較し、配列することができる。BLASTZのスタンド-アロンバージョンは<www.fr.com/blast>または<www.ncbi.nlm.nih.gov>で入手することができる。BLASTZ、特にBl2seqプログラムの使用方法を説明する取扱い説明書は、BLASTZに添付の「readme」ファイルで見つけることができる。プログラムは、Karlinら(1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264；Karlinら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873およびAltschulら(1997)
Nucl. Acids Res. 25:3389にも詳細に記載されている。
【００５７】
Bl2seqは、BLASTN(核酸配列を比較するために使用される)アルゴリズムまたはBLASTP(アミノ酸配列を比較するために使用される)アルゴリズムを使用して、本発明の配列と標的配列の比較を実施する。典型的には、アミノ酸配列アラインメントを実施する際には、BLOSUM62スコアリングマトリックスのデフォルトパラメーター、ギャップ開始コスト11およびギャップ継続コスト1、ワードサイズ3、期待値10、パー-ポジションコスト
1およびλ比0.85を使用する。アウトプットファイルは、標的配列と本発明の配列間の配列された相同領域を含む。配列されたら、任意の一致位置から開始して、任意の他の一致位置で終わる本発明の配列の配列と共に配列している標的配列の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸(すなわち、ギャップを除く)の数を計数することによって求められる。一致位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列および本発明の配列の両方に存在する任意の位置である。1つまたは複数の位置のギャップを標的または本発明の配列に挿入して、構造的に保存されているドメイン間の配列アラインメントを最大にする。
【００５８】
特定の鎖長の同一性の割合は、その特定の鎖長の一致位置の数を計数し、その数を鎖長で割り、得られた値に100をかけることによって求められる。例えば、(i)500のアミノ酸標的配列を本発明のアミノ酸配列と比較し、(ii)Bl2seqプログラムが、200のアミノ酸領域の最初と最後のアミノ酸が一致している、本発明の配列の領域と共に配列されている標的配列の200のアミノ酸を提供し、かつ(iii)200の配列されているアミノ酸の一致数が180である場合には、500のアミノ酸標的配列は、鎖長200で、その鎖長の配列の同一性90%(すなわち、180÷200×100=90)を含む。いくつかの態様において、好適な相同体または変種のアミノ酸配列は、既知のポリペプチドのアミノ酸配列と40%の配列の同一性を有する。本発明の配列と共に配列している核酸またはアミノ酸標的配列により、各鎖長がそれぞれの同一性の割合を有する異なる鎖長を生じることができることが考慮される。同一性の割合は少数第2位で四捨五入することができることが注目される。例えば、78.11、78.12、78.13および78.14は78.1に切り捨てられるが、78.15、78.16、78.17、78.18および78.19は78.2に切り上げられる。鎖長の値は常に整数であることも注目される。
【００５９】
いくつかの態様において、好適な相同体または変種のアミノ酸配列は、既知のポリペプチドのアミノ酸配列との配列の同一性が40%より大きい(例えば、>80%、>70%、>60%、>50%または>40%)。
【００６０】
本発明のポリペプチドの保存されている領域を同定することにより、相同なポリペプチド配列の分析を容易にすることができる。保存されている領域は、反復配列である、二次構造(例えば、αヘリックスおよびβシート)を形成する、正もしくは負に荷電したドメインを確立するまたはタンパク質モチーフもしくはドメインを提供する本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域を位置づけることによって同定することができる。例えば、http://www.sanger.ac.uk/Pfamおよびhttp;/genome.wustl.edu/Pfam/において種々のタンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を記載しているPfamウェブサイトを参照されたい。Pfamデータベースに含まれる情報の説明は、Sonnhammerら(1998)
Nucl. Acids Res. 26: 320-322；Sonnhammerら(1997) Proteins 28: 405-420およびBatemanら(1999)
Nucl Acids Res. 27: 260-262に記載されている。Pfamデータベースから、タンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を鋳型ポリペプチド配列と共に配列して、保存されている領域を求めることができる。本発明のポリペプチドの保存されている領域を同定する他の方法は、例えば、1999年2月25日提出のBouckaertら米国特許出願第60/121,700号に記載されている。
【００６１】
典型的には、少なくとも約35%のアミノ酸配列の同一性を示すポリペプチドは保存されている領域を同定するのに有用である。関連タンパク質の保存されている領域が少なくとも40%のアミノ酸配列の同一性(例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のアミノ酸配列の同一性)を示すことがある。いくつかの態様において、標的および鋳型ポリペプチドの保存されている領域は少なくとも92、94、96、98または99%のアミノ酸配列の同一性を示す。アミノ酸配列の同一性は、アミノ酸またはヌクレオチド配列から推定することができる。
【００６２】
本発明の組成物および方法に使用するのに好適な既知のタンパク質のいくつかの変種は、既知のポリペプチドまたは相同体と比較して、置換、挿入または欠損を有するアミノ酸配列を有する。従って、いくつかの態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、既知のポリペプチドまたは相同体の完全長の配列(例えば、保存されているまたは機能的ドメイン)より短い配列に相当する。
【００６３】
当業者は、コードされた配列の1つのアミノ酸または少数パーセントのアミノ酸を変更、付加または欠損する個別の置換、欠損または付加をポリペプチドに加え、変更によってアミノ酸を化学的に類似のアミノ酸と置換することによって、「保存的に改変した変種」を作製することができる。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は当技術分野において既知である。以下の6つの群は各々、互いに同類置換であるアミノ酸を含む：
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リジン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
(例えば、Creighton、Proteins(1984)を参照されたい)。
【００６４】
ベクター
ベクターは、宿主細胞において自己複製することができるプラスミド、コスミド、ファージまたはファージミドなどの核酸である。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって測定可能であるように切断されて、DNAを挿入することができる1つの部位または少数の部位を有する。ベクターはまた、ベクターを含む宿主を同定する際に使用するのに好適なマーカーも含むことができる。マーカーは、このようなマーカーを発現する宿主細胞に認識可能な表現型を与える。通常使用されるマーカーには、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与えるものなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。ベクターはまた、ベクターの宿主への導入を促進するポリペプチドをコードする配列も含むことができる。このようなポリペプチドは宿主におけるベクターの維持を促進することもできる。
【００６５】
「発現ベクター」は、宿主への導入後に、挿入したDNAの発現を増強および／または調節することができる核酸配列を含む。発現ベクターは、DNA挿入物に機能的に結合した1つまたは複数の調節要素を含む。このような調節要素には、核酸の発現を調節するプロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位または誘導配列が挙げられる。本明細書において使用する「機能的に結合する」は、挿入物の転写および／または得られたRNA転写物の翻訳を可能にするまたは容易にする方法で、DNA挿入物に対して調節要素をベクター内に位置づけることをいう。発現ベクターに含まれる要素の選択は、複製効率、選択性、誘導性、望ましい発現レベルおよび細胞または組織特異性を含むいくつかの因子に依存する。
【００６６】
宿主
「宿主」という用語は、大腸菌(E. coli)などの原核生物並びに真菌、昆虫、植物および動物細胞などの真核生物を含む。動物細胞には、例えば、COS細胞およびHeLa細胞が挙げられる。真菌細胞には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cereviseae)細胞などの酵母細胞が挙げられる。宿主細胞は、リン酸カルシウムまたは酢酸リチウム沈降法、エレクトロポレーション法、リポフェクチン法および微粒子銃などの当業者に既知の技術を使用してベクターを形質転換またはトランスフェクトすることができる。ベクターまたはその一部を含む宿主細胞(別名、「組換え宿主」)は、ベクターを増殖させる、核酸(例えば、DNA、RNA、アンチセンスRNA)
を作製するまたはポリペプチドを発現するなどの目的のために使用することができる。いくつかの例において、組換え宿主は、宿主ゲノムにベクター(例えば、DNA挿入物)の全てまたは一部を含む。
【００６７】
核酸合成組成物
本発明は、1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗RT抗体および／または1つまたは複数のSSB(またはそれらの組み合わせ)を含む核酸合成組成物を提供する。特に、本発明は、1つまたは複数の温度感受性抗DNAP抗体、1つまたは複数の温度感受性抗RT抗体および／または1つまたは複数のSSBを含む組成物を提供する。好ましくは、1つまたは複数の耐熱性SSBを本発明に使用する。いくつかの態様において、核酸合成組成物は、1つまたは複数の温度感受性抗DNAP抗体および1つまたは複数の耐熱性SSBを含む。別の局面において、核酸合成組成物は、温度感受性抗RT抗体および1つまたは複数のSSBを含む。いくつかの態様において、本発明の核酸合成組成物は、好ましくは耐熱性SSBである、2つまたはそれ以上のSSBを含む。
【００６８】
本発明による核酸合成組成物はまた、1つまたは複数のDNAP(好ましくは、耐熱性DNAP)、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のプライマーおよび／または1つまたは複数の鋳型を含むことができる。いくつかの態様において、核酸合成反応は、mRNAと逆転写酵素活性を有する酵素を含むことができる。
【００６９】
核酸を合成する方法
本発明の組成物は、核酸合成中(例えば、第1の鎖の合成中、cDNA合成中、増幅中およびcDNAの合成／増幅を組み合わせた反応中)にDNAPによって作製されるプライマー伸長産物の収率および／または均一性を改善するために使用することができる。
【００７０】
本発明の組成物は、例えば、抗DNAP抗体および／または抗RT抗体が核酸合成を示すことができる温度において反応が開始され、その結果、温度を上昇して抗DNAP抗体および／または抗RT抗体による阻害を低下することによって核酸合成が開始される「ホットスタート」核酸合成に使用することができる。従って、本発明は：(a)1つまたは複数の鋳型を1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗RT抗体および／または1つまたは複数のSSB(またはそれらの組み合わせ)と混合して混合物を形成する段階と、(b)核酸合成を阻害または妨害するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と、(c)鋳型の全てまたは一部に相補的な1つまたは複数の核酸分子(すなわち、プライマー伸長産物)を作製するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階とに関係する核酸を合成する方法を提供する。核酸合成を可能にするのに十分な反応条件(例えば、pH、温度、イオン強度およびインキュベーション時間)は、当業者に既知の通常の方法により最適化することができ、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRTおよび／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせ)の使用に関係してもよい。
【００７１】
一局面において、本発明の核酸方法は、1つまたは複数の鋳型を1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗RT抗体および／または1つまたは複数のSSBと混合して混合物を形成する段階と、鋳型の全てまたは一部に相補的な1つまたは複数の核酸分子を作製するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階を含むことができる。このような条件は、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRTおよび／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせ)の使用に関係してもよい。pH、イオン強度、温度およびインキュベーション時間などの核酸合成を促進する条件は当業者が通常どおりに決定することができる。
【００７２】
一態様において、核酸分子は、1つまたは複数の鋳型、1つまたは複数の耐熱性DNAP、1つまたは複数の温度感受性抗DNAP抗体および1つまたは複数の耐熱性SSBを混合して混合物を形成することによって合成される。別の態様において、核酸合成は、1つまたは複数の鋳型、1つまたは複数のRT、1つまたは複数の温度感受性抗RT抗体および1つまたは複数のSSBを混合して混合物を形成することによって実施される。鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子の合成は、反応温度を上昇させ、それによって抗DNAP抗体によるDNAPの阻害を低下するおよび／または抗RT抗体によるRTの阻害を低下することによって実施される。核酸合成は、ヌクレオチド(例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)および／またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)またはその誘導体)の存在下において実施される。
【００７３】
別の局面において、本発明は、(a)1つまたは複数の鋳型を2つまたはそれ以上(3つまたはそれ以上、4つまたはそれ以上、5つまたはそれ以上、6つまたはそれ以上等)のSSBと混合して混合物を形成する段階と、(b)鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸(すなわち、プライマー伸長産物)を作製するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階とに関係する核酸を合成する方法を提供する。核酸合成を可能にするのに十分な反応条件(例えば、pH、温度、イオン強度およびインキュベーション時間)は、当業者に既知の通常の方法により最適化することができ、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRTおよび／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせ)の使用に関係してもよい。
【００７４】
本発明はまた、(a)1つまたは複数の鋳型を1つまたは複数の抗DNAP抗体(および任意に、1つまたは複数の抗RT抗体)および1つまたは複数の耐熱性SSBと混合して混合物を形成する段階と、(b)核酸増幅を阻害または妨害するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と、(c)1つまたは複数のDNAPに、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を増幅させるのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階とに関係する核酸を増幅する方法を提供する。核酸合成を可能にするのに十分な反応条件(例えば、pH、温度、イオン強度およびインキュベーション時間)は、当業者に既知の通常の方法により最適化することができ、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRTおよび／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせ)の使用に関係してもよい。
【００７５】
一態様において、核酸は、1つまたは複数の鋳型、1つまたは複数の耐熱性DNAP(および任意に1つまたは複数の逆転写酵素)、1つまたは複数の温度-感受性抗DNAP抗体(および任意に1つまたは複数の抗RT抗体)および1つまたは複数の耐熱性SSBを混合して混合物を形成することによって増幅される。鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を増幅する段階は、反応温度を上昇させて、それによって抗DNAP抗体によるDNAPの阻害を低下することによって実施される。核酸合成は、ヌクレオチド((例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)および／またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)またはその誘導体)の存在下において実施される。
【００７６】
別の局面において、本発明は、(a)1つまたは複数の鋳型を2つまたはそれ以上のSSBと混合して混合物を形成する段階と、(b)鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階とに関係する核酸を増幅する方法を提供する。このような条件は、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数のRTおよび／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせ)の使用に関係してもよい。pH、イオン強度、温度およびインキュベーション時間などの核酸合成を促進する条件は当業者が通常どおりに決定することができる。
【００７７】
核酸増幅方法は、ワン-ステップ(例えば、ワン-ステップRT-PCR)またはツー-ステップ(例えば、ツー-ステップRT-PCR)逆転写酵素-増幅反応として当技術分野において既知の方法において逆転写酵素活性を有する1つまたは複数の酵素の使用に関係してもよい。長い核酸分子(例えば、鎖長約3〜5
Kbより大きい)を増幅するためには、国際公開公報第98/06736号および国際公開公報第95/16028号に開示されているように、DNAポリメラーゼの組み合わせを使用することができる。
【００７８】
核酸合成後、核酸を単離して、さらに使用または特徴づけすることができる。合成した核酸は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー(例えば、サイズ、アフィニティーおよびイムノクロマトグラフィー)、密度勾配遠心分離および免疫吸着法を含む、当技術分野において既知の任意の手段によって核酸合成反応液に存在する他の核酸および他の構成成分から分離することができる。ゲル電気泳動による核酸の分離は、迅速で、再現性のある核酸分離手段となり、同じまたは異なる試料に存在する核酸の直接的な同時比較が可能になる。提供する方法によって作製される核酸は、通常の方法を使用して単離することができる。例えば、核酸は、電気溶出または物理的切断によって電気泳動ゲルから取り出すことができる。単離した核酸は、原核または真核細胞にトランスフェクトまたは形質転換するのに好適な、発現ベクターを含むベクターに挿入することができる。
【００７９】
いくつかの核酸合成技術は、例えば、当技術分野において既知の通常の方法による核酸の配列決定に関係する(例えば、米国特許第4,962,022号および米国特許第5,498,523号を参照されたい)。本発明は、サイクルシークエンシング反応に特に好適である。サイクルシークエンシングは蛍光色素の使用に関係することが多い。いくつかのサイクルシークエンシングプロトコールにおいて、配列決定用のプライマーは、(例えば、Amersham
Bioscience MegaBACE DYEnamic ET Primers、ABI Prism(登録商標)BigDye(商標)プライマーサイクルシークエンシングキットおよびBeckman
Coulter WellRED 蛍光色素を使用して)蛍光色素で標識される。蛍光プライマーを使用する配列決定反応は、正確さおよび読み取り可能な配列長さに利点を提供する。しかし、配列の位置を求める必要がある各ヌクレオチド塩基のために分離反応を調製しなければならない。他のサイクルシークエンシングプロトコールでは、(例えば、Amersham
Bioscience MegaBACE DYEnamic ET Teminatorサイクルシークエンシングキット、ABI Prism(登録商標)BigDye(商標)Terminatorサイクルシークエンシングキット、ABI
Prism(登録商標)dRhodamine Terminatorサイクルシークエンシングキット、LI-COR IRDye(商標)Terminator MixおよびCEQ
Dye Terminator Cycle シークエンシングキットをBeckman Coulter WellRED色素と共に使用して)蛍光色素をダイターミネーターとしてddNTPに結合する。ダイターミネーターは各塩基について独自の蛍光色素で標識することができるので、配列決定は1つの反応において実施することができる。
【００８０】
従って、本発明は、(a)配列決定対象の1つまたは複数の鋳型を1つまたは複数の抗DNAP抗体および1つまたは複数のSSB(および任意にddNTPなどの1つまたは複数の停止剤を混合して、混合物を形成する段階と、(b)核酸シークエンシングまたは合成を阻害または妨害するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と、(c)配列決定対象の鋳型の全てまたは一部に相補的な分子集団を合成するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と、(d)集団を分離して、配列決定対象の鋳型の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階とに関係する、核酸を配列決定する方法を提供する。核酸合成を可能にするのに十分な反応条件(例えば、pH、温度、イオン強度およびインキュベーション時間)は、当業者に既知の通常の方法により最適化することができ、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩および／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせの使用に関係してもよい。
【００８１】
一局面において、本発明の配列決定方法は、配列決定対象の1つまたは複数の鋳型を1つまたは複数の抗DNAP抗体および／または1つまたは複数のSSBを混合して、混合物を形成する段階と、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子集団を合成するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と、核酸分子の集団を分離して、配列決定対象の鋳型の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階を含んでもよい。このような条件は、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数の緩衝剤または緩衝塩、1つまたは複数の核酸合成停止剤(例えば、ddNTP)および／または1つまたは複数のDNAP(またはそれらの組み合わせ)の使用に関係してもよい。pH、イオン強度、温度およびインキュベーション時間などの核酸合成を促進する条件は、当業者が通常どおりに決定することができる。
【００８２】
一態様において、核酸は、配列決定対象の1つまたは複数の鋳型を1つまたは複数の耐熱性DNAP、1つまたは複数の温度感受性抗DNAP抗体および1つまたは複数の耐熱性SSBと混合して混合物を形成することによって配列決定される。配列決定対象の鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子の合成は、反応温度を上昇させ、それによって抗DNAP抗体によるDNAPの阻害を低下することによって実施される。
【００８３】
別の局面において、本発明は、(a)配列決定対象の1つまたは複数の鋳型を2つまたはそれ以上のSSB(および任意にddNTPなどの1つまたは複数の核酸合成停止剤)と混合して混合物を形成する段階と、(b)配列決定対象の鋳型の全てまたは一部に相補的な分子集団を合成するのに十分な条件下において混合物をインキュベーションする段階と、(c)集団を分離して、配列決定対象の鋳型の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階とに関係する核酸を配列決定する方法を提供する。
【００８４】
キット
本発明はまた、例えば、核酸の合成、増幅または配列決定に使用するためのキットを提供する。キットは以下の構成要素の1つまたは複数のを含むことができる：1つまたは複数ののDNAP、1つまたは複数のRT、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数の鋳型、1つまたは複数の抗DNAP抗体、1つまたは複数の抗RT抗体および1つまたは複数のSSB。いくつかの態様において、本発明のキットは、1つまたは複数のの抗DNAP抗体および／または1つまたは複数の抗RT抗体および／または1つまたは複数のSSB(またはそれらの組み合わせ)を含む。いくつかの態様において、キットは2つまたはそれ以上のSSBを含む。本発明のキットはまた、(化学的にコンピテントな細胞またはエレクトロコンピテント細胞などの核酸分子を取り込むのに適格でありうる)1つまたは複数の宿主細胞を含むことができる。本発明のキットはまた、1つまたは複数ののリガーゼ(好ましくはT4
DNAリガーゼなどのDNAリガーゼ)、1つまたは複数のトポイソメラーゼ(タイプ1Aおよび1Bなどの)および／または1つまたは複数のベクターを含むことができる。キットの構成要素は、典型的には、容器(例えば、バイアル、チューブ、アンプルおよび瓶)に入れて個別にまたは集合的に提供される。キットは、典型的には、例えば、核酸を合成、増幅または配列決定するためにキットを使用することができる方法を記載している取扱い説明書を含む包装材料を含む。
【００８５】
本発明または本発明の任意の態様の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載している方法および適用に他の好適な改良および改作を加えることができることは、関連技術の当業者に容易に明らかになる。本発明は詳細な説明と合わせて記載されているが、以下の記載は例示する意図のものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきある。他の局面、利点および改良点は特許請求の範囲内である。ここで本発明を詳細に記載しているが、これは、例示のみの目的のために含まれており、本発明を限定する意図のものではない以下の実施例を参照することによってさらに明らかに理解される。
【００８６】
実施例
本発明は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
【００８７】
実施例1.
ACCUPRIME(商標) TAQポリメラーゼシステム
説明：
AccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼシステムは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸鋳型の増幅に適任の試薬を提供する。AccuPrime(商標)Taq
DNAポリメラーゼは抗Taq DNAポリメラーゼ抗体を含有する。10×AccuPrime(商標)緩衝剤は、PCR中に増幅を可能にするのに十分な濃度の耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質(すなわち、メタン細菌(Methanococcus
jannachii) SSB)、Mg++およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含有する。2つの個別の緩衝剤システム(10×AccuPrime(商標)PCR
緩衝剤IおよびII)は特定の種類の鋳型の増幅のために提供される。25μlの200回または1,000回の増幅反応に十分な試薬が各々提供されている。
【００８８】
抗Taq DNAポリメラーゼ抗体は、自動「ホットスタート」を提供するポリメラーゼ活性を阻害し(Chou, Qら(1992) Nucl. Acids Res.
20: 1717およびSharkey, Dら(1994) BioTechnology 12: 506)、周囲温度セットアップを可能にする。耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質は、PCRの全てのサイクル中特異的なプライマー-鋳型ハイブリドーマを増強する。抗体／AccuPrime(商標)タンパク質が媒介する増幅はPCRの特異性を劇的に改善する。それはまたTaqの忠実度を2倍改善し、マルチプレックスPCRおよび最適以下のプライマーセットのためのロバストなPCRを提供する。
【００８９】
製剤：
2006522582.tif 000022
*10×AccuPrime(商標)PCR緩衝剤Iは、小型のゲノムDNAアンプリコン(≦200 bp)、プラスミドまたはcDNA適用のために設計されている。ゲノムDNA(200
bp〜4 kb)適用のためには10×AccuPrime(商標)PCR緩衝剤IIを使用すること。
【００９０】
10×AccuPrime PCR 緩衝剤IおよびII：
200 mM Tris-HCl(pH 8.4)、500 mM KCl、15 mM MgCl2、2 mM dGTP、2 mM dATP、2
mM dTTP、2 mM dCTP、耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質(緩衝剤Iは10 ug/ml、緩衝剤IIは80 ug/ml)、10%グリセロール。
【００９１】
保存緩衝剤：
20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、安定剤、50%(v/v)グリセロール。
【００９２】
品質管理：
AccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼはPCR機能アッセイ法において評価する。AccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼおよび10×AccuPrime(商標)PCR緩衝剤は増幅について機能的に試験する。AccuPrime(商標)Taq
DNAポリメラーゼおよびAccuPrime(商標)タンパク質は2本鎖および1本鎖エンドヌクレアーゼ活性がないこと並びに5'-および3'-エキソヌクレアーゼ活性がないことについて試験する。
【００９３】
PCRの注意点：
PCRは微量のDNAを増幅することができる強力な技術であるので、交差-汚染が生じないようにあらゆる適当な注意を払うべきである。理想的には、増幅反応は、DNA-フリーの環境においてアセンブリーされるべきである。エアゾール-レジスタントバリアチップを使用することが推奨される。個々の反応に使用するプライマーまたは鋳型DNAによる汚染を生じないように注意を払うこと。PCR産物は反応アセンブリー領域から離れた領域において分析するべきである。
【００９４】
一般的なプロトコール：
以下の一般的な手法は、任意のPCR増幅においてAccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼを使用する際のガイドラインおよび出発点として示唆されている。最適な反応条件(インキュベーション時間および温度、AccuPrime(商標)Taq
DNAポリメラーゼ、プライマー、MgCl2および鋳型DNAの量)は異なり、最適化する必要がある。反応サイズは、ユーザーの希望に沿うように変更されてもよい。一般的なPCR反応アセンブリーについては、以下の表のカラム3の容量および量を参照されたい。小型化については、推奨されている小型化PCR反応アセンブリーのための以下の表のカラム1および2の量を参照されたい。
1.  以下の成分を滅菌した薄壁の0.25 mlまたは0.5 ml PCRチューブに周囲温度においてまたは氷上において添加する。
小型ゲノムDNA(≦200 bp)、プラスミドまたはcDNA：
2006522582.tif 000023
ゲノムDNA(200 bp〜4 kb)：
2006522582.tif 000024
【００９５】
望ましい場合には、試薬のロスを最小にし、正確なピペット操作を可能にするために多数の反応用にマスターミックスを調製することができる。
2.  チューブの内容物を混合し、適宜50μlの鉱物油またはシリコーン油を積層する。
3.  チューブに蓋をし、短時間遠心分離して内容物を回収する。
4.   サーマルサイクラーで94℃において2分間チューブをインキュベーションして、鋳型を完全に変性させ、酵素を活性化させる。
5.  以下のように25〜35サイクルのPCR増幅を実施する。
変性：        94℃、15〜30秒
アニーリング：55℃〜60℃、15〜30秒
伸長：        68℃、1 kbあたり1分
6.  サイクル終了後4℃において反応液を維持する。使用時まで試料を-20℃において保存することができる。
7.  アガロースゲル電気泳動によって増幅産物を分析し、臭化エチジウム染色によって可視化する。適当な分子量標準を使用する。
【００９６】
特殊なプロトコール：
以下の特殊な手法は、マルチプレックスPCR 増幅においてAccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼを使用する際のガイドラインおよび出発点として示唆されている。最適な反応条件(インキュベーション時間および温度、AccuPrime(商標)Taq
DNAポリメラーゼ、プライマー、MgCl2および鋳型DNAの量)は異なり、最適化する必要がある。反応サイズは、ユーザーの希望に沿うように変更されてもよい。
【００９７】
以下の成分を滅菌した薄壁の0.25 mlまたは0.5 ml PCRチューブに周囲温度においてまたは氷上において添加する。
2006522582.tif 000025
【００９８】
最高5セットまでのプライマーミックスについては、1μlの酵素で十分である。望ましい場合には、試薬のロスを最小にし、正確なピペット操作を可能にするために多数の反応用にマスターミックスを調製することができる。一般的なプロトコールの段階2〜7を繰り返す。
【００９９】
実施例2
ACCUPRIME(商標)SUPERMIX II
AccuPrime(商標)SuperMix IIは、ゲノムDNA(200 bp〜4 kb)の鋳型の増幅のために設計されている。
【０１００】
説明：
AccuPrime(商標)SuperMix IIは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸鋳型の増幅のための試薬を提供する。混合物は、PCR中に増幅を可能にするのに十分な濃度の抗Taq
DNAポリメラーゼ抗体、耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質(すなわち、メタン細菌(Methanococcus jannachii) SSB)、Mg++、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および組換えTaq
DNAポリメラーゼを含有する。AccuPrime(商標)SuperMix IIは、プライマーおよび鋳型溶液を添加するために最終反応容量の50%が使用されるように2×濃度で供給される。各々25μlの200回または1,000回の増幅反応に十分な試薬が提供されている。
【０１０１】
抗Taq DNAポリメラーゼ抗体はポリメラーゼ活性を阻害して、自動「ホットスタート」を提供し(Chouら(1992) Nucl. Acids Res.
20: 1717およびSharkey, D.ら(1994) BioTechnology 12: 506)、周囲温度におけるセットアップを可能にする。耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質は、PCRの全てのサイクル中特異的なプライマー-鋳型ハイブリダイゼーションを増強する。抗体／AccuPrime(商標)タンパク質が媒介する増幅はPCR特異性を劇的に改善する。それはまたTaqの忠実度を2倍改善し、マルチプレックスPCRおよび最適以下のプライマーセットのための最良のロバストPCRを提供する。
【０１０２】
AccuPrime(商標)SuperMix IIは-20℃または4℃において保存することができる。4℃における保存は、PCRをアセンブリーする前にミックスを融解する必要がない。AccuPrime(商標)SuperMix
IIを4℃において12ヶ月保存しても、PCR性能または酵素活性の検出できるほどの低下は観察されない。凍結-融解のサイクルを反復すると性能または活性が低下することがある。
【０１０３】
構成：
2006522582.tif 000026
【０１０４】
AccuPrime(商標)SuperMix II：
40 mM Tris-HCl(pH 8.4)、100 mM KCl、3 mM MgCl2、400 μM dGTP、400μM dATP、400μM
dTTP、400μM dCTP、AccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼ、耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質、安定剤。
【０１０５】
品質管理：
AccuPrime(商標) SuperMix IIはPCR機能アッセイ法において評価する。AccuPrime(商標) SuperMix IIの成分はDNase、RNaseおよびエキソヌクレアーゼ活性がないことについて試験する。AccuPrime(商標)Taq
DNAポリメラーゼおよびAccuPrime(商標)タンパク質は、エキソヌクレアーゼ活性並びに2本鎖および1本鎖エンドヌクレアーゼ活性がないことについて試験する。酵素は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定するとき>90%均質である。
【０１０６】
PCRの注意点：
PCRは微量のDNAを増幅することができる強力な技術であるので、交差-汚染が生じないようにあらゆる適当な注意を払うべきである。理想的には、増幅反応は、DNA-フリーの環境においてアセンブリーされるべきである。
【０１０７】
一般的なプロトコール：
以下の一般的な手法は、任意のPCR増幅においてAccuPrime(商標) SuperMix IIを使用する際のガイドラインおよび出発点として示唆されている。最適な反応条件(インキュベーション時間および温度、プライマー鋳型DNA)は異なり、最適化する必要がある。反応サイズは、ユーザーの希望に沿うように変更されてもよい。
【０１０８】
AccuPrime(商標) SuperMix IIの推奨される出発容量：
2006522582.tif 000027
【０１０９】
反応成分からのPCRアセンブリー：
1.  ガイドとして上記のチャートを使用して、以下の成分を任意の順序で各反応液に添加する。
a.   AccuPrime(商標) SuperMix II
b.  プライマー溶液(各々の最終濃度200 mMが推奨される)
c.  鋳型DNA
d.   最終総容量までのDNaseフリーのH2O 
2.  チューブの内容物を混合し、適宜鉱物油またはシリコーン油で被覆する。
3.  チューブに蓋をし、短時間遠心分離して内容物をチューブの底部に回収する。
4.   サーマルサイクラーで94℃において2分間チューブをインキュベーションして、鋳型を完全に変性させ、酵素を活性化させる。
5.  以下のように25〜35サイクルのPCR増幅を実施する。
変性：        94℃、15〜30秒
アニーリング：55℃〜60℃、15〜30秒
伸長：        68℃、1 kbあたり1分
6.  サイクル終了後4℃において反応液を維持する。使用時まで試料を-20℃において保存することができる。
7.  アガロースゲル電気泳動によって増幅産物を分析し、臭化エチジウム染色によって可視化する。適当な分子量標準を使用する。
【０１１０】
実施例3
ACCUPRIME(商標)SUPERMIX I
AccuPrime(商標)SuperMix Iは、ゲノムDNAアンプリコン(≦200 bp)、プラスミドDNAまたはcDNA鋳型の増幅のために設計されている。
【０１１１】
説明：
AccuPrime(商標)SuperMix Iは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸鋳型の増幅のための好適な試薬を提供する。混合物は、PCR中に増幅を可能にするのに十分な濃度の抗Taq
DNAポリメラーゼ抗体、耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質(すなわち、メタン細菌(Methanococcus jannachii) SSB)、Mg++、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および組換えTaq
DNAポリメラーゼを含有する。AccuPrime(商標)SuperMix Iは、プライマーおよび鋳型溶液を添加するために最終反応容量の50%が使用されるように2×濃度で供給される。各々25μlの200回または1,000回の増幅反応に十分な試薬が提供されている。
【０１１２】
抗Taq DNAポリメラーゼ抗体はポリメラーゼ活性を阻害して、自動「ホットスタート」を提供し(Chouら(1992) Nucl. Acids Res.
20: 1717およびSharkey, D.ら(1994) BioTechnology 12: 506)、周囲温度におけるセットアップを可能にする。耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質は、PCRの全てのサイクル中特異的なプライマー-鋳型ハイブリダイゼーションを増強する。抗体／AccuPrime(商標)タンパク質が媒介する増幅はPCR特異性を劇的に改善する。それはまたTaqの忠実度を2倍改善し、マルチプレックスPCRおよび最適以下のプライマーセットのための最良のロバストPCRを提供する。
【０１１３】
AccuPrime(商標)SuperMix Iは-20℃または4℃において保存することができる。4℃における保存は、PCRをアセンブリーする前にミックスを融解する必要がない。AccuPrime(商標)SuperMix
Iを4℃において12ヶ月保存しても、PCR性能または酵素活性の検出できるほどの低下は観察されない。凍結-融解のサイクルを反復すると性能または活性が低下することがある。
【０１１４】
構成：
2006522582.tif 000028
【０１１５】
AccuPrime(商標)SuperMix I：
40 mM Tris-HCl(pH 8.4)、100 mM KCl、3 mM MgCl2、400 μM dGTP、400μM dATP、400μM
dTTP、400μM dCTP、AccuPrime(商標)Taq DNAポリメラーゼ、耐熱性AccuPrime(商標)タンパク質、安定剤。
【０１１６】
品質管理：
AccuPrime(商標) SuperMix IはPCR機能アッセイ法において評価する。AccuPrime(商標) SuperMix Iの成分はDNase、RNaseおよびエキソヌクレアーゼ活性がないことについて試験する。AccuPrime(商標)Taq
DNAポリメラーゼおよびAccuPrime(商標)タンパク質は、エキソヌクレアーゼ活性並びに2本鎖および1本鎖のエンドヌクレアーゼ活性がないことについて試験する。酵素は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定するとき>90%均質である。
【０１１７】
PCRの注意点：
PCRは微量のDNAを増幅することができる強力な技術であるので、交差-汚染が生じないようにあらゆる適当な注意を払うべきである。理想的には、増幅反応は、DNA-フリーの環境においてアセンブリーされるべきである。
【０１１８】
一般的なプロトコール：
以下の一般的な手法は、任意のPCR増幅においてAccuPrime(商標) SuperMix Iを使用する際のガイドラインおよび出発点として示唆されている。最適な反応条件(インキュベーション時間および温度、プライマー鋳型DNA)は異なり、最適化する必要がある。反応サイズは、ユーザーの希望に沿うように変更されてもよい。
【０１１９】
AccuPrime(商標) SuperMix Iの推奨される出発容量：
2006522582.tif 000029
【０１２０】
反応成分からのPCRアセンブリー：
1.  ガイドとして上記のチャートを使用して、以下の成分を任意の順序で各反応液に添加する。
a.   AccuPrime(商標) SuperMix I
b.  プライマー溶液(各々の最終濃度200 nMが推奨される)
c.  鋳型DNA
d.   最終総容量までのDNaseフリーのH2O 
2.  チューブの内容物を混合し、適宜鉱物油またはシリコーン油で被覆する。
3.  チューブに蓋をし、短時間遠心分離して内容物をチューブの底部に回収する。
4.   サーマルサイクラーで94℃において2分間チューブをインキュベーションして、鋳型を完全に変性させ、酵素を活性化させる。
5.  以下のように25〜35サイクルのPCR増幅を実施する。
変性：        94℃、15〜30秒
アニーリング：55℃〜60℃、15〜30秒
伸長：        68℃、1 kbあたり1分
6.  サイクル終了後4℃において反応液を維持する。使用時まで試料を-20℃において保存することができる。
7.  アガロースゲル電気泳動によって増幅産物を分析し、臭化エチジウム染色によって可視化する。適当な分子量標準を使用する。
【０１２１】
実施例4
ACCUPRIME(商標)TAQ DNAポリメラーゼシステムの開発および特徴づけ
序文
本発明者らが本明細書においてAccuPrimeタンパク質と呼ぶ、古細菌由来の高耐熱性1本鎖結合タンパク質(米国特許出願第60/149,680号を参照されたい)は、DNAポリメラーゼ(例えば、Taq
DNAポリメラーゼ)に特異的な抗体と一体化に成功し、次世代の増幅酵素-AccuPrime Taq(商標)DNAポリメラーゼを作製している。本発明者らは、高い特異性、高い感度およびロバスト性を要求するPCR適用のために、(古細菌由来の1本鎖結合タンパク質、Taq
DNAポリメラーゼおよび2つの異なるTaq抗体を含むAccuPrime Taq(商標)DNAポリメラーゼを最適化した。このような適用には、マルチプレックスPCR、遺伝子型解析、コロニーPCR、ハイスループットPCRおよびPCR小型化が挙げられる。
【０１２２】
AccuPrimeタンパク質はTaq DNAポリメラーゼの活性を増強し、PCRにおいて特異性を大幅に改善することを本発明者らは見出している。他のホットスタートDNAポリメラーゼとは異なり、それは、PCRの全てのサイクルの前および最中に特異的なプライマー-鋳型ハイブリダイゼーションを促進することによってPCR性能を改善する。市販のホットスタートTaq
DNAポリメラーゼは全て、化学的な改変または抗Taq抗体付加によって、PCRサイクル前にDNAポリメラーゼ活性を遮断するように設計されているが、PCRサイクル中は遮断するようには設計されていない。300を超えるプライマーセットを使用するPCR検討では、AccuPrime
Taq(商標)DNAポリメラーゼは、検討例の75%において他のホットスタートPCR酵素と比較して収率、感度および／または特異性の改善を示した。感度および特異性により、新規増幅酵素は種々のPCR/RT-PCR適用に理想的なものになるが、ロバスト性は、任意の特定のPCR適用では、最適化を最小にする必要性を低下する。遺伝子型解析、コロニーPCRおよびPCR小型化などのハイスループットまたはマルチプレックス様式では、新規PCR酵素は現在のPCR市場の全てのプレミアゴールドな標準的な酵素より優れている。AccuPrimeタンパク質は、Taq
DNAポリメラーゼの忠実度を少なくとも2倍改善することも実証されている。
【０１２３】
1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)は、DNA複製システムにおいてタンパク質の機能に基づいて、特異性、収率および感度に関してPCRの助けになると思われると考えられていた。DNAの複製では、ヘリカーゼが2本鎖(ds)DNAを巻き戻して、プライマーゼおよびDNAポリメラーゼの機能に必要な2本の相補的な1本鎖(ss)にする。SSBは、単に分子をコーティングすることによってssDNA鋳型を保護するが、そうすると、ssDNAは相補鎖との塩基対形成が妨げられる。SSBは種特異的にDNAポリメラーゼと直接相互作用するという証拠もある(Kimら、1992；KimおよびRichardson、1994年；GloverおよびMcHenry、1998年；Leeら、1998年)。
【０１２４】
SSBがPCR反応を増強する最も明白な理由は、鋳型から二次構造(ヘアピン等)をなくし、DNA鋳型を1本鎖で維持する能力であると思われる。実際、大腸菌(E.
coli)および他の中等温度好性生物のSSBはPCR効率を改善したことが報告されている(Chou、1992年；Rapley、1994年；DabrowskiおよびKur、1999年)。しかし、中等温度好性SSBの熱不安定性により、そのタンパク質による増強は限られていて、サイクル化するインキュベーション温度がそれらの耐熱性の上限を超えるPCR適用には実用的ではない。
【０１２５】
古細菌由来の耐熱性SSBの存在はUC,DavisのDr. Stephen C. Kowalczykowskiによって最初に報告され(Chedinら、1998年)、その後その遺伝子がJohns
Hopkins UniversityのThomas J. Kellyのグループによってクローニングされた(Kellyら、1998年)。本発明者らはUC,
DavisのSSBを使用し(そのタンパク質は本明細書において「AccuPrimeタンパク質」と呼ぶ)、DNAポリメラーゼの活性および忠実度に対する影響を検討した。この原稿は、次世代のPCR増幅技術を作製する際の本発明者らの試みを報告するものである。新規技術は、PCRサイクルの開始時まで機能するホットスタート技術と異なり、PCRの全てのサイクルにおいてPCRの特異性の改善を提供する。
【０１２６】
材料と方法
AccuPrimeタンパク質の小規模精製
AccuPrimeタンパク質遺伝子を含有するプラスミドは、UC DavisのDr. Steve Kowalczykowskiにより提供された。プラスミドは、タンパク質の精製ごとにBL21(DE3)細胞に新たに形質転換した。形質転換プレートの1つのコロニーを使用して、500
mlのスターター培養物に接種した。使用した培地は、500μg/mlのカナマイシンを添加したテリフィックブロス(Life Technologies)であった。スターター培養物は37℃において終夜インキュベーションし、10リッターのTB
+ Kan培地に接種するために全体を使用した。培養物は、1 OD600に達するまで(4〜6時間)37℃においてインキュベーションし、1
mM IPTGで誘導し、インキュベーションをさらに2.5時間継続した。4℃において20分間3,000gで遠心分離して細胞をペレット化した。
【０１２７】
プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma、P 8849；細胞ペレット20 gあたり1 mlのカクテル)を含有する溶解緩衝液(細胞ペレット1gあたり2 ml；0.5
M NaCl、50 mMリン酸カリウム、pH8.0、0.25 mM PMSF、10 mMイミダゾール)に細胞を懸濁させた。超音波処理(出力80%において1/4インチプローブにより10秒間のパルスを10サイクルまたは>80%が溶菌するまで継続)によって細胞を溶菌した。4℃において1時間23,000g(SS34ローターにおいて14,000
rpm)の遠心分離によって細胞片を除去した。上清をNi-NTAアガロースカラムにロードした。
【０１２８】
Ni-NTAアガロース(Qiagen)カラム(樹脂容量20 ml)は、プロテアーゼ阻害剤カクテル(0.5 M NaCl、50 mMリン酸カリウム、pH8.0、0.25
mM PMSF、20 mMイミダゾール；緩衝液1リッターあたり1mlの阻害剤カクテル)を含有する平衡緩衝液で平衡させた。カラムは10カラム容量(200ml)の低イミダゾール緩衝液(1
M NaCl、50 mMリン酸カリウム、pH 8.0、0.25 mM PMSF、20 mMイミダゾール；緩衝液1リッターあたり1mlの阻害剤カクテル)で洗浄した。タンパク質は、高イミダゾール緩衝液(1
M NaCl、50 mMリン酸カリウム、pH 8.0、0.25 mM PMSF、250 mMイミダゾール；緩衝液1リッターあたり1mlの阻害剤カクテル)で4ml画分に溶出した。AccuPrimeタンパク質を含有する画分(SDS-PAGEでモニターした)をプールし、低塩濃度ssDNAアガロースカラム緩衝液(1
M NaCl、25 mM Tris-HCl、pH7.5、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.25 mM PMSF、10%グリセロール)中で4℃において終夜透析した。
【０１２９】
透析した画分プールを、低塩濃度ssDNAアガロースカラム緩衝液(1 M NaCl、25 mM Tris-HCl、pH7.5、1 mM EDTA、1 mM
DTT、0.25 mM PMSF、10%グリセロール)で事前に平衡させておいたssDNAアガロースカラム(樹脂容量20 ml)にロードした。カラムを10カラム容量(200
ml)の低塩濃度緩衝液で洗浄した。タンパク質を、高塩濃度ssDNAカラム緩衝液(2.5 M NaCl、40%エチレングリコール、25 mM Tris-HCl、pH
7.5、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.25 mM PMSF、10%グリセロール)で5 ml画分に溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、低塩濃度monoQカラム緩衝液(50
mM NaCl、25 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、1 mM DTT、5%グリセロール)中で透析した。
【０１３０】
低塩濃度monoQカラム緩衝液中で透析したssDNAカラム画分のプールを、低塩濃度monoQカラム緩衝液(50 mM NaCl、25 mM Tris-HCl、pH
8.0、1 mM EDTA、1 mM DTT、5%グリセロール)で事前に平衡させておいたMonoQ(5/5)カラム(Pharmacia、樹脂容量1 ml)にロードした。カラムは、FPLCで流速を1
ml/minに設定して操作した。カラムは10カラム容量(10 ml)の低塩濃度緩衝液で洗浄し、20カラム容量の直線的に濃度勾配させた塩(50〜1000 mM
NaCl)で溶出して、1 ml画分を回収した。タンパク質を含有する画分をプールし、保存緩衝液(100 mM NaCl、25 mM Tris-HCl、pH
7.5、1 mM EDTA、1 mM DTT、10%グリセロール)中で透析した。
【０１３１】
AccuPrimeタンパク質の大規模精製
AccuPrimeタンパク質遺伝子は(内部リボソーム結合部位(internal ribosome biding site)を排除するように)改変し、T7プロモーターの制御下でpETベクターに再クローニングし、BL21(DE3)pLysP細胞に形質転換した。大規模培養物(120リッター)は、Fermantaを使用してBuffered
Rich培地中でスターター培養物から増殖させた。培養物は2.5〜3 OD600に達するまで37℃においてインキュベーションし、I mMのIPTGで誘導し、インキュベーションをさらに4時間継続した。4℃において20分間3,000gで遠心分離して細胞をペレット化し(120リッターの培養物から湿重量1.7
Kgの細胞)、使用時まで-20℃において保存した。
【０１３２】
細胞ペレットの一部を融解して、緩衝液A(細胞ペレット1 Kgあたり2 L；50 mM Tris-HCl、pH 8.5、5 mM アジ化ナトリウム、5
mMβ-メルカプトエタノール、10 mMイミダゾール)に懸濁させた。細胞は、5 mM PMSFの存在下においてTurraxホモジナイザーでホモジナイズし、9,000psiでBig
Gaulinに2回通して溶解した。細胞抽出物を水浴中で90℃において30分間熱処理し(内部温度は熱処理終了時には80℃に達した)、内部温度が8℃未満になるまで氷／水浴で冷却した。熱処理後、細胞懸濁液の1/3の容量の緩衝液B(4
M NaCl、50 mM Tris-HCl、pH8.5、5 mM アジ化ナトリウム、5 mMβ-メルカプトエタノール、10 mMイミダゾール)を添加することによって塩を最終濃度1Mまで添加した。RC-3B遠心分離機を使用して、4℃において1.5時間H-6000ローターにおいて4,500
rpmで遠心分離することによって細胞片を除去した。適宜、0.45μmのNalgeフィルター装置によって上清を浄化した。浄化した上清を、流速60ml/minの500
ml Tosof、AF-Chelate-650Mカラムにロードした。
【０１３３】
AF-Chelate-650Mカラム(TosoHaas、樹脂容量500 ml)は、平衡緩衝液(0.2 M NaCl、50 mM Tris-HCl、pH
7.5、1 mMアジ化ナトリウム、2 mM EDTA)で平衡させた。カラムは6カラム容量(3000ml)の緩衝液B、6カラム容量の緩衝液C(2.5 M
NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8.5、5 mMアジ化ナトリウム、5 mMβ-メルカプトエタノール、10 mMイミダゾール、40%エチレングリコール)および10カラム容量の緩衝液Aで洗浄した。タンパク質は、10
mM〜150 mMのイミダゾールの濃度勾配(7カラム容量の緩衝液Aおよび0〜50%の緩衝液D;50 mM Tris-HCl、pH8.5、5 mMアジ化ナトリウム、5
mMβ-メルカプトエタノール、300 mMイミダゾール)で流速13ml/minで溶出した。溶出液は20 mlの画分に回収した。AccuPrimeタンパク質を含有する画分(280
nmの吸光度でモニターした)をプールし、緩衝液E(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、5 mMβ-ME、5 mMアジ化ナトリウム)で2倍希釈した。
【０１３４】
希釈した画分プールは、平衡緩衝液(0.2M NaCl、50 mM Tris-HCl、pH7.5、1 mMアジ化ナトリウム、2 mM EDTA)で流速6.6
ml/minにおいて事前に平衡させたEMD SO3-650Mカラム(EMERK、総容積200ml)にロードした。カラムは10カラム容量(2000
ml)の緩衝液Eで洗浄した。タンパク質は、10カラム容量(2000 ml)の0〜600 mMのNaCl濃度勾配(緩衝液Eおよび0〜60%の緩衝液F；50 mM
Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、5 mMβ-ME、5 mMアジ化ナトリウム、1 M NaCl)で流速3.3 ml/minで15 ml画分に溶出した。タンパク質を含有する画分(ピーク高さが50%より高いOD280の画分)をプールし、緩衝液Eで3倍に希釈した。
【０１３５】
EMD SO3-650Mカラム画分の希釈したプールを、流速17 ml/minのHigh Qカラム(BioRad、総容積160 ml)にロードした。カラムは、緩衝液E(90%)とF(10%)(100
mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、5 mMβ-ME、5 mMアジ化ナトリウム)のミックスで事前に平衡させた。カラムは、緩衝液EとFのミックス(9:1)の10カラム容量(1.6
L)で洗浄し、NaClの100〜550 mM(緩衝液Eおよび10〜55%の緩衝液F)の直線的な濃度勾配の15カラム容量で流速3.3 ml/minで溶出して、10
ml画分を回収した。濃度勾配後、カラムを1.5 カラム容量の緩衝液Fでさらに溶出して、タンパク質を確実に完全に溶出させた。タンパク質を含有する画分(ピーク高さが50%より高いOD280の画分)をプールした。1/4容量の保存緩衝液(100
mM NaCl、25 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA、1 mM DTT、50%グリセロール)をプールに添加後20容量の保存緩衝液に対して終夜透析し、緩衝液を2回交換した。
【０１３６】
精製したAccuPrimタンパク質のタンパク質アッセイ法
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad；Part#500-0006)および1.41
mg/mlに再構成した凍結乾燥ウシγグロブリン(Bio-Rad；Part#500-0005)を標準品として使用してBradfordタンパク質アッセイ法を実施した。0.31
mg/mlの濃度のAccuPrimeタンパク質(ロット#KP-3)をストックとして使用した。日を変えて3日間で3回の異なる測定を実施して、定量値の再現性を試験した。
【０１３７】
同じAccuPrimeタンパク質ストック溶液を使用して、275 nmのUV吸光度を使用して濃度を測定した。Beckman Model DU-640分光光度計を使用して、220〜320
nmのBeckmanマイクロ石英セル(8 mm)でUVスペクトルを測定した。320、310、275および245 nmの吸光度をスペクトルから読んだ。320および310
nmの吸光度を使用して、ベースラインの傾斜を算出し、275および245 nmの吸光度を使用して、核酸汚染の程度を推定した。275 nmの吸光度はベースラインを引くことによって較正し、等式：Abs(275)cal
= Abs(275)obs - 4.5×(Abs(310)obs - Abs(320)obs)(式中、Abs(275)calは較正後の275
nmの吸光度であり、Abs(275)obs、Abs(310)obsおよびAbs(320)obsは、それぞれ、275、310および320
nmの測定された吸光度である)を使用して、ベースラインの傾斜から算出した。
【０１３８】
精製したAccuPrimeタンパク質のQCアッセイ法
エンドヌクレアーゼ活性
AccuPrimeタンパク質のバッチのエンドヌクレアーゼアッセイ法は、2本鎖エンドヌクレアーゼアッセイ法を使用して実施した。各反応液は、1μgの高次コイルφX174
RF DNAおよび4(10×)μgまたは8(20×)μgのAccuPrimeタンパク質を、1.5 mMのMgCl2を含む50μlの1×PCR緩衝液(20
mM Tris-HCl、pH 8.4、50 mM KCl)中に含有する。反応ミックスを37℃において1時間インキュベーションし、6μlの10×BlueJuice(ゲルロード用緩衝液)を添加することによって反応を停止した。反応ミックスは、アガロースゲル電気泳動でアッセイした。電気泳動は0.8%水平型アガロースゲルで混合物の10μlについて実施し、ゲルを臭化エチジウムで染色した。
【０１３９】
エキソヌクレアーゼアッセイ法
100 pmolのオリゴヌクレオチド
2006522582.tif 000030
を、50μlの1×PNK中で10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび10μCiの[γ-32P]ATPを使用して5'末端を32Pで標識した。反応ミックスを37℃において30分間インキュベーションし、ミックスを70℃において10分間インキュベーションすることによって反応を停止した。製造業者の指示に従って、反応ミックスをAmersham-Pharmacia
Micro Spin G-25カラムで2回溶出することによって取り込まれていないヌクレオチドを除去した。
【０１４０】
40 pmolの放射性標識したオリゴヌクレオチドを、1.5 mMのMgCl2を含む100μlの1×PCR緩衝液(20 mM
Tris-HCl、pH 8.4、50 mM KCl)中で8μg(10×)のAccuPrimeタンパク質と共に37℃または72℃においてインキュベーションした。72℃においてインキュベーションした試料については、20μlの分量を0分、5分、10分および30分経過時に取り出し、10μlの3×ホルムアミド配列決定用ゲルロード用緩衝液と混合して、氷上で保存した。試料を95℃において5分間加熱し、各々10μlを8%ポリアクリルアミド配列決定用ゲルにロードした。37℃においてインキュベーションした試料については、20μlの分量を0分、15分、30分および60分経過時に取り出し、各々1μlの10%
SDSおよび20 mg/mlのプロテイナーゼK(Invitrogen；part#25530-049)と混合し、55℃において45分間インキュベーションした。反応の終了時に、試料を10μlの3×ホルムアミド配列決定用ゲルロード用緩衝液と各々混合し、95℃において5分間加熱した。各々10μlを8%ポリアクリルアミド配列決定用ゲルにロードした。ポリアクリルアミドゲルを乾燥し、Kodak
BioMax MR X線フィルムを使用してオートラジオグラフした。
【０１４１】
AccuPrimeタンパク質の特徴づけ
1本鎖DNA結合
1本鎖DNAの二次構造のAccuPrimeタンパク質親和性は、84 merの合成オリゴヌクレオチドKP_PALIN_cont：
2006522582.tif 000031
を用いて試験した。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド濃度5μMにおいて、上記のエキソヌクレアーゼ活性のアッセイ法の5'(ss)基質と同じ方法において5'末端を放射性標識した。
【０１４２】
タンパク質-オリゴヌクレオチド結合は、オリゴヌクレオチド濃度20 nMにおて、タンパク質濃度を10 nMの段階的な増分で0〜40 nMまで変更して、1.5
mM MgCl2を含む50μlの1×PCR緩衝液中で実施した。反応ミックスは70℃において5分間インキュベーションし、電流が流れている6%非変性水平型ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動は100
Vにおいて1時間実施した。ゲルを乾燥し、Kodak BioMax MR X線フィルムにオートラジオグラフした。
【０１４３】
Taq DNAポリメラーゼユニット活性に対する影響
伸長段階におけるTaq DNAポリメラーゼ活性に対するAccuPrimeタンパク質の影響を見るために、放射性標識したヌクレオチドの取り込み速度は、種々の濃度のTaq
DNAポリメラーゼおよびAccuPrimeタンパク質の存在下においてニックを入れたサケ精巣DNAまたはプレプライム型M 13mp19環状1本鎖DNAを使用して測定した。酸不溶性画分へのヌクレオチドの取り込みは、反応画分をGF/Cフィルターにスポットし、フィルターをTCA溶液で洗浄し、シンチレーションカウンターを使用してフィルターの放射能崩壊量を計数することによって測定した。
【０１４４】
アッセイ法の簡単な説明は以下のようである。AccuPrimeタンパク質の存在下における標準的なユニットアッセイ法については、Taq DNAポリメラーゼの0.0083、0.0125、0.025単位への連続希釈液の各々を、0.1μg、0.2μg、0.4μg、1μgまたは3.2μgのAccuPrimeタンパク質を含有する50μlの反応セットに添加した。各反応液は、0.5μg/μlのニックを入れたサケ被験DNA、各々0.2
mMのヌクレオチドを、反応あたり50μlの最終容量の1×Taqユニットアッセイ緩衝液(25 mM TAPS、pH 9.3、50 mM KCl、2 mM
MgCl2、1 mM DTTおよび1〜2μCi[α-32P]dCTP中に含有した。Taqポリメラーゼを添加し、72℃に平衡させた加熱ブロックに移して反応を開始した。反応は10分間継続させ、10μlの0.5
M EDTAを50μlの反応液の各々に氷上で添加することによって停止させた。TCA沈降のために、反応液の各々40μlをGF/Cフィルターにスポットした。同様の実験において、インキュベーション中にGF/Cフィルターを分離するために、いくつかの経過時点、0分、5分、10分および30分経過時において10μlの分量の反応液をスポットすることによってヌクレオチドの取り込み速度を測定した。この実験のインキュベーション温度は、AccuPrimeタンパク質の機能に対する温度の影響を見るために、5℃の増分で55〜74℃まで変更した。AccuPrimeタンパク質の濃度は、存在する場合には、50μlの反応液あたり0.1μgであった。
【０１４５】
さらに明解な力学的検討については、プレプライム型1本鎖環状M13mp19 DNAを鋳型としてニックを入れたサケ精巣DNAの変わりに使用した。この検討に使用したプライマー、M13mp19_1442L30は、M13mp19
DNAの(+)鎖の座標1442にアニーリングするように設計されており、配列
2006522582.tif 000032
を有する。
【０１４６】
プライマーは、TE緩衝液中で、鋳型に対して2〜10倍モル過剰量を鋳型と混合し、95℃において5分間加熱し、30分かけて室温に徐々に冷却した。50μlの反応液については、0.4〜3.2
pmoleの鋳型を0.125〜0.5単位のTaq DNAポリメラーゼと共に使用した。しかし、基質：ポリメラーゼ比が低いことにより、反応速度は、所定の濃度の鋳型に対して酵素がわずかに増加することによって容易に飽和されると思われる。ポリメラーゼの総量は、所定の鋳型濃度において実験的に測定されるべきである飽和レベル未満であるべきである。例えば、0.125単位のポリメラーゼは0.4
pmoleの鋳型では飽和に至っていなかったが、0.5単位の酵素は3.2 pmoleの鋳型で飽和されていた。AccuPrimeタンパク質濃度は、存在する場合には、50μlの反応液あたり50
ngであった。インキュベーション温度は70℃に設定したが、全ての他の条件は上記と同じであった。ヌクレオチドの取り込み速度は、インキュベーション中にGF/Cフィルターを分離するために、種々の経過時点、0分、5分、10分および30分経過時に10μlの分量の反応液をスポットすることによって測定した。
【０１４７】
GF/Cフィルターへの試料のTCA沈降は、標準的なプロトコール、30001. SOPに従って実施した。フィルターは、最初に、1%ピロリン酸ナトリウムを含有する10%TCA溶液で15分間洗浄し、5%TCAでの10分間の洗浄を3回実施し、次に95%エタノール中で10分間洗浄した。フィルターを加熱ランプ下で5〜10分間乾燥し、Beckmanシンチレーションカウンター(Model#LS3801)を使用してScintiSafe
Econo 1シンチレーションカクテル(Fisher Scientific、part#SX20-5)中で放射能の崩壊を測定した。
【０１４８】
Taq DNAポリメラーゼの伸長活性に対する影響
T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ-32P]ATPを上記のように使用して、M13mp19プライマー、M13mp19_1442L30を放射性標識し、プライマー：鋳型モル比10：1で1本鎖環状M13mp19
DNAにアニーリングした。
【０１４９】
伸長反応は、7×50μlの反応液に等価である、最終容量350μlにおいてセットした。70℃におけるインキュベーション中、50μl分量を30秒間隔で2分まで採取して、伸長を停止するための10μlの0.5M
EDTAと混合した。50μlの分量は各々0.18 pmoleのプレプライム型鋳型、10単位のTaq DNAポリメラーゼおよび0 ng、50 ngもしくは100
ngのAccuPrimeタンパク質または100 ngのMthSSB(M. thermoautotropicumのAccuPrimeタンパク質相同体)を1×Taqポリメラーゼユニットアッセイ緩衝液中に含有した。60μl分量の各々に、7μlの3
M酢酸ナトリウムおよび175μlの95%エタノールを添加した。DNAを-20℃において2時間沈殿させ、最高速度のマイクロ遠心分離機で4℃において15分間遠心分離してペレット化した。上清を除去後、ペレットを空気乾燥し、20μlのアルカリ性ゲルロード用緩衝液(10
mM NaOH、0.1%ブロモフェノールブルーおよび10%グリセロール)に再懸濁させた。
【０１５０】
1%アガロースゲル(11×14 cm)を50 mM NaCl、1 mM EDTA溶液中で作製し、凝固後、30 mM NaOH、1 mM EDTA溶液に室温において少なくとも2時間浸漬した。試料の8μl各々をゲルにロードし、電気泳動を95ボルトにおいて1時間実施した。ゲルを加熱しないで真空下において30分間乾燥し、さらに真空下において50℃においてさらに1時間乾燥した。ゲルを、Molecular
Dynamics社製のphospho-imagerプレートにオートラジオグラフし、ImageQuant ver 3.3プログラムを使用して、イメージを処理した。ImageQuantプログラムにおいてTIFFフォーマットに変換したイメージファイルからNIH
Image ver 1.61プログラムを用いてデンシトメトリーを実施した。
【０１５１】
AccuPrime製剤におけるAccuPrimeタンパク質の安定性
加速安定性アッセイ法
加速安定性アッセイ法は、温度の上昇は反応速度を熱力学的に加速すると思われることおよびタンパク質の劣化(不活性化、変性または分解)は熱力学的観点による反応であるという仮定に基づいている。従って、高温における所定の期間のタンパク質溶液のインキュベーションは、低温における長期間の保存の影響に類似していると思われる。加速の程度は、アレニウス式：k
= Ae[-Ea/RT](式中、kは速度定数であり、Aは定数であり、Eaは活性化エネルギーであり、Rは一般ガス定数8.314×10-3
kJ mol-1K-1であり、Tは温度(ケルビン度単位)である)を使用して推定した。
【０１５２】
4つの異なるAccuPrime Taq DNAポリメラーゼ製剤全てを、-20℃における1年間の保存と等価である、37℃および45℃において7日間および4日間それぞれ試験した。4つの異なる製剤は：AccuPrimeタンパク質濃度が4μg/50μlであるゲノムのための10×反応ミックス(10×AccuPrime
Taq PCR反応ミックスII)；タンパク質濃度が0.5μg/50μlであるcDNAのための10×反応ミックス(10×AccuPrime Taq PCR反応ミックスI)；タンパク質濃度が0.8μg/50μlのゲノムのための2×Supermix(2×AccuPrime
Taq PCR SuperMix II)およびタンパク質濃度が0.1μg/50μlであるcDNAのための2×Supermix(2×AccuPrime Taq
PCR反応ミックスI)。ゲノムのための10×反応ミックス製剤については、2つの異なるバッチを作製した。一方はヌクレオチドを含有し、他方はヌクレオチドを含有しない。
【０１５３】
インキュベーション期間後、反応ミックス(またはSupermix)を、1×強度のPCRを使用して、その機能について試験した。機能的アッセイ法については、プライマーセットは、他のTaq
DNAポリメラーゼを用いて特異的産物を得る際にPCRが困難であるように選択した。Rhod_626プライマーセットプライマーの配列は以下のようである：順方向プライマー
2006522582.tif 000033
；逆方向プライマー
2006522582.tif 000034
。
【０１５４】
非特異的バンドは機能的AccuPrime Taqによって排除され、鎖長626 bpの特異性が増加したバンドだけを残すことができた。PCR反応は、鋳型としての20
ngのK562遺伝子型解析用DNAおよび各0.2μMのプライマーを使用して、1.5 mM MgCl2を含む50μlの1×PCR緩衝液中で標準的な方法で実施した。PCRインキュベーションは、94℃のプレインキュベーションを2分間、次に94℃で15秒、58℃で30秒および68℃で1分を35サイクルとセットした。PCR産物は1%水平型アガロースゲルで分析した。
【０１５５】
リアルタイム安定性アッセイ法
リアルタイム安定性アッセイ法は、数箇所の例外を加えて加速安定性アッセイ法と同様に実施した。今回全ての製剤はヌクレオチドを含有した。10×反応ミックス製剤のロットは、グリセロールを含有しない1バッチを含む2つのバッチに分割した。インキュベーションは3つの異なる温度、-20℃、4℃および22℃において実施した。
【０１５６】
上記のプライマーセット以外にもう1つのプライマーセットを、それぞれゲノムおよびcDNA鋳型の反応ミックスのPCR機能的アッセイ法に使用した。AccuPrime
Taq Reaction Mix IおよびAccuPrime Taq SuperMix Iについては、pUC19_2.7プライマーを使用した。順方向プライマー：
2006522582.tif 000035
；逆方向プライマー
2006522582.tif 000036
。AccPrime Taq Reaction Mix IIおよびAccuPrime Taq SuperMix IIについては、Rhod_626プライマーセットを使用した。
【０１５７】
PCR機能的アッセイ法の基準は、機能的反応ミックスが非特異的バンドを抑制すると同時に、p53_4.4、Rhod_626およびpUC19_2.7プライマーセットについては、それぞれ、4.4
Hb、626 bpおよび2.7 Kbの特異的なバンドを増強するという点において上記と同じであった。PCR反応は、ゲノム鋳型として20 ngのK562遺伝子型解析用DNAまたはcDNA鋳型として200
fgのpUC19および各々0.2μMのプライマーを50μlの1×PCR緩衝液において使用して標準的な方法で実施した。PCRインキュベーションは、p53_4.4では60℃を4分、Rhod_626では58℃を1分およびpUC19_2.7では54℃を2.5分としたアニーリング温度および伸長期間を除いて上記と同じにセットした。PCR産物は、0.8〜1%アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１５８】
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼ増幅のためのポスト-PCRアッセイ法
試験中、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼを使用するPCR増幅の最終産物に関するいくつかの疑問点が生じた。疑問点は、TOPO TAクローニングおよびRFLPアッセイ法などの下流部門への適用による増幅産物の適合性に関連する。このような懸念事項に対処するために、本発明者らはPCR増幅を実施し、このような下流部門への適用の適合性について増幅産物をアッセイした。
【０１５９】
TOPO TAクローニング
pUC19の2つの別個のアンプリコンをその一般的な用途およびGCリッチ性について選択した。最初のアンプリコン(マルチ-クローニングサイト)は使用頻度について選択した。市販のM13/pUC
増幅プライマーをPCR反応に使用した。順方向プライマー
2006522582.tif 000037
；逆方向プライマー
2006522582.tif 000038
。第2のアンプリコンはGCリッチ性(GC含有量62%)について選択した。順方向プライマー(pUC19_606f)5'-CCA GTC GGG AAA CCT
GTC GT-3'；逆方向プライマー(pUC19 745r)：5'-ACC GCC TTT GAG TGA GCT GA-3'。アンプリコンは、それぞれ、鎖長136
bpおよび159 bpであった。
【０１６０】
PCR反応液は、1×PCR緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH8.4、50 mM KCl)、1.5 mM MgCl2および0.2
μMの各プライマーを含有する50μlの反応容量中で調製した。4つのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の各々の濃度は0.2 mMであった。鋳型濃度は、適用に応じて100
pg(プラスミドおよびcDNA用)〜100 ng(ゲノムDNA)と変えた。2単位のAccuPrime Taq DNAポリメラーゼおよび対照としての2単位のPlatinum
Taq DNAポリメラーゼを典型的な50μlの反応に使用した。熱サイクリングは、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400を使用して実施した。
94℃  2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
58℃    30秒
68℃    1分
4℃において維持
【０１６１】
熱サイクリングの終了後、PCR増幅産物を、2%アガロースゲル電気泳動で分析して、正しいサイズのアンプリコンが増幅されたことを確認した。次いで、製造業者の指示に従って、PCR産物をTOPO
TAクローニングに使用した。得られたクローンを精製し、ABI自動シークエンサーを使用して配列決定した。
【０１６２】
制限エンドヌクレアーゼ消化
RFLPアッセイ法については、アンプリコンサイズが220 bpのp53プライマーセットを、鋳型としての50〜200 ngのゲノムDNA(K562)と共に使用した。PCRは、Platinum
Taq対照反応を含んで、上記と同様に実施した。
94℃    2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
55℃    30秒
68℃    1分
【０１６３】
PCR増幅後、製造業者が推奨するように、適当な緩衝液中で、20μlの消化反応液中で10単位のScaIまたはPvuIIで産物、各反応の5μlまたは10μlを37℃において2時間消化した。消化産物は2%アガロースゲル電気泳動でアッセイした。
【０１６４】
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼのPCR適用の開発
標準的なPCR反応
特に示さない限り、全てのPCR反応は、標準的なプロトコールに従って実施した。PCR反応液は、1×PCR緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 8.4、50
mM KCl)、1.5 mM MgCl2および0.2μMの各プライマーを含有する50μlの反応容量において調製した。4つのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の各々の濃度は0.2
mMであった。鋳型濃度は、適用に応じて100 pg(プラスミドおよびcDNA用)〜100 ng(ゲノムDNA)と変えた。2単位のAccuPrime Taq
DNAポリメラーゼを典型的な50μl反応液に使用した。AccuPrime Taq DNAポリメラーゼシステムを開発する際に使用するプライマーセットおよびその適用を表2に掲載する。
【０１６５】
【表２】
2006522582.tif 000039
2006522582.tif 000040
【０１６６】
熱サイクリングは、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600またはPerkin Elmer GeneAmp PCR
System 2400を使用して実施した。
【０１６７】
標準的なPCRプログラム：
94℃  2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
55℃〜60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃において維持
【０１６８】
熱サイクリングの終了後、PCR増幅産物は、5 mlの10×BlueJuiceと混合し、少量(各レーンあたり総反応容量の20%または10μl)を、0.5×TBEにおいて0.5μg/mlの濃度の臭化エチジウムを事前に混合しておいた0.8%〜1.5%アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１６９】
小型化
PCR反応液は、10×PCR緩衝液、50 mM MgCl2および10μMプライマーからなる均等に低下した容量を使用して、10μlおよび25μl用に調製した。各成分の最終標準濃度は、それぞれ、1×、1.5
mMおよび0.2μMであった。脱イオン水を適当な容量までのQSに使用した。K562ヒト遺伝子型解析用DNA鋳型の20ng/μl量および濃度は全ての実験を通して一定にした。熱サイクリングは、Perkin
Elmer GeneAmp PCR System 9600またはPerkin Elmer GeneAmp PCR System 2400を使用して実施した。
【０１７０】
dNTPおよびプライマーの滴定は、5つの時点、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.3 mMおよび0.4 mMの最終濃度で実施した。また、酵素単位の比較は、0.5単位〜1単位の間で実施した。PCR反応液は、ポリメラーゼの効率を低下し、AccuPrime
Taqの利点を増強する試みにおいて室温において調製した。
【０１７１】
dNTPおよびプライマー滴定のためのPCRプログラム：
25℃    60分
94℃    2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
55℃〜60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃において維持
【０１７２】
必要な最適酵素単位を求めるために、滴定は6つの異なる量に絞った。0.2単位、0.4単位、0.6単位、1単位、1.5単位および2単位。
【０１７３】
酵素滴定のためのPCRプログラム：
94℃    2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
55℃〜60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃において維持
【０１７４】
小型化反応における1本鎖結合タンパク質の濃度を最適化するために、滴定は、10μl反応液では80 ng、100 ngおよび120 ng、20〜25μl反応液では160
ng、200 ngおよび240 ngを使用して実施した。また、1単位の酵素を全体を通して使用した。
【０１７５】
SSB滴定のためのPCRプログラム：
94℃    2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
55℃〜60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃において維持
【０１７６】
熱サイクリングの終了後、PCR増幅産物は、0.5×TBEにおいて0.5μg/mlの濃度の臭化エチジウムを事前に混合しておいた1.2%〜1.5%アガロースゲル電気泳動で分析した。比較は、異なる試料の特異性と収率について目で見て実施した。
【０１７７】
困難な鋳型
最初の実験は、アニーリング温度だけを55〜60℃の範囲で変更することによって実施した。PCR緩衝液、MgCl2、dNTPおよびプライマーの標準的な濃度および量を使用した。次のシリーズの実験を用いて、本発明者らは、10×PCR緩衝液およびMgCl2をHi-Fi
BufferおよびMgSO4に交換することを試みた。第3のシリーズの実験において、本発明者らは、困難な鋳型を改善するように特別に設計した溶液であるPCR×エンハンサーを使用した。PCR×エンハンサー溶液(Invitrogen
Corp.製)の滴定は、ゼロから3×の範囲をカバーするように適用した。
【０１７８】
困難な鋳型のPCRプログラム：
94℃    2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
55℃〜60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃において維持
【０１７９】
マルチプレックスPCR
異なる遺伝子由来のランダムデザインのプライマーセットをマルチプレックスPCRのために選択した。最適な条件を求めるために、以下などの標準的なPCRの全ての実用面に関係する滴定を実施した。
a)DNA鋳型−100 ng、200 ngおよび500 ngを使用。
b)酵素単位−2単位、5単位および10単位を用いる。
c)dNTP−0.1 mM、0.2 mMおよび0.4 mM最終濃度に絞る。
d)MgCl2−1.2、1.5、1.8、2および2.5 mM最終濃度に絞る。
e)1本鎖結合タンパク質濃度−200 ng、400 ng、600 ngおよび800 ng。
【０１８０】
PCR反応液は、上記に概略する変数の各々の明らかな置換以外に、鋳型としての100 ngのK562遺伝子型解析用DNAおよび2〜5単位の酵素を使用して、標準的なフォーマットで氷上で調製した。マルチプレックスPCRに使用したプライマーセットを表3に掲載する。
【０１８１】
【表３】
2006522582.tif 000041
2006522582.tif 000042
2006522582.tif 000043
2006522582.tif 000044
【０１８２】
マルチプレックスPCR反応の標準的なプログラム
94℃    2分
以下を35サイクル
94℃    15秒
60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃で維持する
【０１８３】
PCR増幅産物は、0.5×TBEにおいて0.5μg/mlの濃度の臭化エチジウムを事前に混合しておいた3%水平型アガロースゲルで分析した。比較は、異なる試料の特異性と収率について目で見て実施した。
【０１８４】
ハイスループットPCR
ハイスループットスクリーニングにおける改善を調査するために、Accuprime Taq DNAポリメラーゼをPlatinum(商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen
Corp.)と比較した。2単位のAccuprime Taq DNAポリメラーゼおよび2単位のPlatinum Taq DNAポリメラーゼを使用して、標準的なPCRを18サイクルの増幅のために実施した。
【０１８５】
pUC19プラスミドDNA挿入物を含有するX-gal/IPTG/Ampプレートで培養した形質転換細胞をハイスループットスクリーニングのプラスミド鋳型として使用した。滅菌したピペットチップで突然変異体コロニーを選択して、標準的なPCR反応液に混合した。PCRサイクリングパラメーターは、94℃で2分、次に94℃で15秒、55℃で30秒および68℃で3分を18サイクルとした。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１８６】
rpsL忠実度アッセイ法
忠実度アッセイ法は、rpsL突然変異が示すストレプトマイシン耐性に基づいて実施した(Lackovichら、2001年；Fujiiら、1999年)。簡単に説明すると、アンピシリン(Apr)および(rpsL)遺伝子を含有するpMOL
21プラスミドDNA(4 kb)をSca Iで直線化して、ビオチン化プライマーを使用して直線化した産物に標準的なPCRを実施した。2単位のAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼを使用して増幅を完了させた。鋳型DNAは25サイクルの増幅あたり1 ngとした。PCRサイクリングパラメーターは、94℃で2分、次に94℃で15秒、58℃で30秒および68℃で5分を25サイクルとした。PCR産物は、直線性を確かめるために、ストレプトアビジン磁気ビーズ精製した。精製したPCR産物はアガロースゲルで分析し、DNA濃度および鋳型の倍加を推定した。精製したDNAは、T4
DNAリガーゼでライゲーションして、MF101コンピテント細胞に形質転換した。形質転換細胞の総数を求めるために、細胞をアンピシリンプレートで培養した。rpsL突然変異体の総数を求めるために、細胞をアンピシリンおよびストレプトマイシンプレートで培養した。突然変異の頻度は、突然変異の総数を形質転換細胞の総数で割ることによって求めた。エラー率は、突然変異頻度を130(rpsLの表現型の変化を生じるアミノ酸数)および鋳型倍加で割ることによって求めた。
【０１８７】
結果と考察
AccuPrimeタンパク質の精製
構築物に使用した基底レベルのlacプロモーターにおいても、複製および組換え中間体を妨害することによって発揮される可能性が最も高い、発現されたタンパク質の毒性のために、細胞は極めてゆっくり増殖した(倍加時間1.5時間)。おそらく毒性のために、精製タンパク質の収率は非常に低く、使用した培地への依存性が高かった(表4)。
【０１８８】
【表４】
2006522582.tif 000045
【０１８９】
低収率の他の理由は、精製中のタンパク質の活発な分解に見出すことができた。タンパク質分解の証拠として、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含ませると、収率が大幅に増大した。細胞をMagnificent
Broth(MacConnell Research)で増殖させると、凍結した細胞ペレットの誘拐中に細胞の自然溶解が観察された。プロテアーゼ阻害剤を融解中に導入しなかったので、SDS-PAGEにおいて主要な完全長のタンパク質バンドの下方に第2の小さいバンドが出現することによって明らかなように、プロテアーゼはタンパク質のかなりの画分を消化することができた。これは、プロテアーゼ阻害剤を添加した溶解緩衝液中で融解することによって防げた。
【０１９０】
このプロトコールは、タンパク質の損失を防ぐ上で最適化されていなかった。以下に示すプロトコールIはUC Davisのグループによって開発され、最適な精製スキームが調製物あたり最大量のタンパク質の要素になっていなかったと思われる(図1)。問題の手法は、ssDNAカラムクロマトグラフィー段階である。タンパク質は、ssDNAアガロースカラムから2カラム容量以内に広いピークで溶出されたが、かなりの量のタンパク質が、メインピークに続く長いテールとして溶出された。テールをピークから切断することによるロスは、可能な量の最大50%であると推定された。それにもかかわらず、ssDNAカラムは、ロスを埋め合わせるほどの純度を改善しなかった(図2)。
【０１９１】
AccuPrimeタンパク質のタンパク質アッセイ法
表5は3つの独立した測定を示し、2つのタンパク質アッセイ法は各々1つのタンパク質ストック溶液を使用する。Bradfordアッセイ法の標準偏差は、UV吸光度の2倍高かった。タンパク質濃度がBradfodアッセイ法によって求められた3つの測定値の1つは、UV吸光度方法の約6%と比較したとき、実際の濃度から15%より多く離れていると思われることを値は示している。結果は、Bradfordアッセイ法などの発色色素を使用するタンパク質アッセイ方法に関連する本質的な問題を明確に示している。UV吸光度は集約的な性質の解決法であるが、Bradfordアッセイ法は広範な性質の溶液を測定する(濃度以外に、色素溶液に添加される試料溶液の容量が成果を決定する)。別の形態のBradfordアッセイ法は、さらに別の操作エラーを導入する必要な検量線である。
【０１９２】
【表５】
2006522582.tif 000046
【０１９３】
AccuPrimeタンパク質のQCアッセイ法
エンドヌクレアーゼ活性
2本鎖、高次コイル基質を使用するPCR反応に推奨された最大20×のタンパク質濃度におけるAccuPrimeタンパク質調製物において検出可能なエンドヌクレアーゼ活性は見られなかった(図3)。37℃において時間インキュベーションした後、リラックス型DNAと高次コイルDNAのバンド強度比は、タンパク質が存在しないことを除いて、同じ条件下でインキュベーションした対照と変わりがなかった。この結果は、この調製物にはニッキング活性も見られなかったことを示している。
【０１９４】
エキソヌクレアーゼ活性
2つの異なる温度：37℃および72℃以外は同じ条件下でエキソヌクレアーゼ活性を試験した。精製中に大腸菌(E. coli)に起因するエキソヌクレアーゼ活性は低温度インキュベーションでチェックしたが、タンパク質が持っていると思われる本質的なエキソヌクレアーゼ活性は高温度においてチェックした。両方の場合ともエキソヌクレアーゼ活性アッセイ法は、5'を放射性標識した1本鎖オリゴヌクレオチドを用いた。反応の進行をチェックするために時間経過中のいくつかの経過時点において、両方の反応液から少量を取り、反応を停止し、産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オートラジオグラムは、溶液が3'エキソヌクレアーゼ活性または5'エキソヌクレアーゼ活性を有するかどうかを識別することができると思われる。3'エキソ活性は、標識したヌクレオチドの鎖長を徐々に低下すると思われるが、一方、5'エキソ活性は完全長のオリゴヌクレオチドバンドのバンド強度を低下すると思われ、同時に放射性標識されたモノヌクレオチドに対応するバンドが出現し、その間の中間のバンドはない。
【０１９５】
ゲル(図4)は、放射性標識した完全長のオリゴヌクレオチドに対応する1つのバンドだけを示し、72℃において30分または37℃において60分経過してもバンド強度の低下は見られなかった。しかし、1つの特異な観察により、おそらく30%ホルムアミドの存在下において95℃における5分間の加熱処理を生き延びたタンパク質結合のために、バンドの移動度のシフトにより、タンパク質と共にインキュベーション試料にはプロテイナーゼK処理が必要であった。この事実および精製のデータは、特にオリゴヌクレオチドが十分に短い場合には、オリゴヌクレオチドを任意の汚染エキソヌクレアーゼ活性から保護すると思われる。タンパク質とオリゴヌクレオチドの非常に強力な結合を示している。
【０１９６】
AccuPrimeタンパク質の特徴づけ
1本鎖DNA結合
AccuPrimeタンパク質の1本鎖DNA(ssDNA)への結合親和性は、TBEにおいて6%水平型ポリアクリルアミドゲルの電気泳動移動度シフトアッセイ法(EMSA)を使用して測定した。このアッセイ法に使用したssDNA分子は合成86
merオリゴヌクレオチドであった。5'放射性標識したオリゴヌクレオチドを、1×PCR(20 mM Tris-HCl、pH 8.4、50 mM KCl、1.5
mM MgCl2)中で量を増加させたタンパク質と共に70℃において5分間インキュベーションし、反応ミックスの少量を、電流を流しているゲルにロードした。電気泳動を1時間継続させ、乾燥後、ゲルをオートラジオグラフした。
【０１９７】
ゲル(図5)は、反応ミックス中のタンパク質量とほぼ化学量論的にシフトしたオリゴヌクレオチドの移動度を示し、予想されたように強力な結合を示している。予想されなかったことは、スーパー-シフトしたバンド(シフトしたバンドの上方に示す高い移動度シフトを示すバンド)の存在であった。スーパー-シフトしたバンドは、通常、タンパク質-DNA複合体への追加のタンパク質が結合し、すでに遅延しているタンパク質-DNA複合体バンドをさらに遅延させると説明される。
【０１９８】
オリゴヌクレオチドの場合には、タンパク質濃度が増加するときの移動度シフトパターンは、DNAとのタンパク質結合ものであり、負の協同性を伴う。典型的な負の共同性は、最も高いタンパク質濃度においても任意のスーパー-シフトを示さないと思われる。しかし、弱い負の共同性を有するタンパク質は、タンパク質濃度が十分に高い場合にのみ、同じDNA分子に対する第2のタンパク質の結合を可能にすると思われる。これは、対照オリゴヌクレオチドの観察であった。
【０１９９】
Taqポリメラーゼユニット活性に対する影響
SSBタンパク質は、鋳型DNAから二次構造を除去することによって、伸長段階においてDNAポリメラーゼを助けると思われると考えられていた。しかし、高温で反応が実施されるPCRでは、二次構造は、ポリメラーゼの伸長において、あったとしてもわずかな役割しか果たさないと思われ、結果として、このような機序によるポリメラーゼ活性の任意の増強はわずかであると思われる。にもかかわらず、それは、Taq
DNAポリメラーゼ活性の増強におけるAccuPrimeタンパク質の機序を調査する際の優れた出発点となる。
【０２００】
Taq DNAポリメラーゼのユニット活性アッセイ法は、2つの異なる鋳型を使用して実施した。先ず、プライマー結合部位がポリメラーゼのそれに対してモル過剰であると思われるニックおよびギャップを入れたサケ精巣DNAは、伸長の最初の段階に関する情報を提供すると思われる。最初の段階は、ポリメラーゼを含む、必要な伸長要素を全てプライマー結合部位に補充することに関係する。第2に、配列特異的プライマーが長い環状ssDNA鋳型にアニーリングされているプレプライム型環状1本鎖DNA鋳型が、伸長速度についての情報を提供すると思われる。
【０２０１】
ニックおよびギャプを入れたサケ精巣DNAを用いると、鋳型濃度およびインキュベーション温度に応じて、ユニット活性が約10〜40%増加した(図6)。まるで、増強があまり最適でない(未飽和)条件においてより検出可能になるかのように、増強は低い鋳型濃度(0.05μg/μl未満または50μlの反応液において2.5μg)においてより顕著であった。しかし、増強における温度の影響は最初はあまり明白ではなかった。温度を変化させた系統的な検討は、増強は約70℃において最大であり、それより高い温度または低い温度では徐々に低下することを明らかにした(図7)。温度の影響は、AccuPrimeタンパク質によるTaq
DNAポリメラーゼユニット活性を増強させる際には少なくとも2つの独立した因子が関与していたことを示唆している。ポリメラーゼ活性自体の温度最適値は74℃であったことを考慮すると、負の因子は70℃以上において支配している可能性がある。
【０２０２】
鋳型濃度およびインキュベーション温度の変更にもかかわらず、プレプライム型環状ssDNA鋳型ではポリメラーゼユニット活性の検出可能な増強はほとんど観察されなかった。AccuPrimeタンパク質によるTaqDNAポリメラーゼユニット活性の増強は、プライマー結合部位へのポリメラーゼの補充によることをこれらの結果は強く示唆している。
【０２０３】
Taqポリメラーゼの伸長活性に対する影響
酸不溶性画分への放射性ヌクレオチドの取り込みに基づいたポリメラーゼユニットアッセイ法は、取り込み速度を定量的に提供することができるという点において、ポリメラーゼ活性を測定するのに好適である。しかし、それは、処理性および忠実度などの酵素の他の特徴を示す上で欠けるものがある。ポリメラーゼの処理性は、変性アガロースゲル電気泳動で伸長産物を分析することによって評価することができる。
【０２０４】
伸長は、環状ssDNA鋳型にアニーリングした5'放射性標識プライマーを使用するユニットアッセイ法を用いて同様に実施した。ヌクレオチドミックスの添加後所定の経過時点において、少量を取り、最終濃度0.1
M までのEDTAを混合することによって反応を停止した。伸長産物はエタノール沈降によって濃縮し、アルカリ性ゲルロード用緩衝液に再溶解した。濃縮した試料を1%アルカリ性アガロースゲルにロードした。電気泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフした。
【０２０５】
AccuPrimeタンパク質タンパク質を反応液に添加することによる伸長産物の鎖長分布には注目するほどの変化がないことをゲルは示した(図8)。タンパク質の存在下では、伸長された分子集団の大半は、タンパク質が存在しない場合のものと比較して、短い分子にシフトした。この結果は、AccuPrimeタンパク質はTaq
DNAを離散性にしたことを示唆している。タンパク質がポリメラーゼの開始段階を増強したかどうかまたは一旦開始されたら、酵素が重合を続行するのを妨害したかどうかは、この実験だけでは明らかではない。上記のユニットアッセイ結果の結果を考慮すると、AccuPrimeタンパク質は、Taq
DNAポリメラーゼがプライマー結合部位にロードされることを助けることを推論することができると思われる。
【０２０６】
AccuPrime製剤におけるAccuPrimeタンパク質の安定性
加速安定性アッセイ法
AccuPrime Taq PCR反応ミックスの4つの製剤全て(10×AccuPrime Taq PCR Reaction Mix IおよびIIならびに2×Accuprime
Taq PCR SuperMix IおよびII)を、-20℃における1年間の保存と等価である、2つの異なるインキュベーション温度、37℃および45℃において7日間および4日間それぞれ試験した。インキュベーション期間後、機能的QCと同様のPCR反応に使用した。
【０２０７】
PCR産物は1%アガロースゲル電気泳動でアッセイして、臭化エチジウム染色した。特異的および非特異的産物のバンド強度の目による調査は、インキュベーション後の反応ミックスは、対照と同様に機能したことを示した(図9)。対照反応ミックスは-20℃において凍結保存し、高温のインキュベーションを実施しないで、使用直前に融解するかまたは使用時に作製した。AccuPrimeタンパク質は高濃度および低濃度で、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼを組み合わせた反応ミックスにおいて-20℃における最長の保存において安定であったことをこの結果は示している。
【０２０８】
リアルタイム安定性アッセイ法
加速安定性アッセイ法は本発明者らに、反応ミックスの安定性についての必要な情報を提供したが、リアルタイム安定性試験は、現実的であって、模擬実験でないという事実により好ましい。少量の反応ミックス(各分量は、50μl
PCR反応液10回分と等価な反応ミックスを含有する)を3つの異なる温度、-20℃、4℃および室温において保存し、所定の経過時点において、インキュベーションから数個の試料を回収し、PCR機能アッセイ時まで-20℃において保存した。PCR機能アッセイ法は、加速安定性アッセイ法と同じ方法で実施した。
【０２０９】
本明細書を書いている時点において、6ヶ月のインキュベーションが終了しており、全ての反応ミックスは、室温における6ヶ月のインキュベーション後に機能的であることが見出された(図10)。しかし、一連の凍結および融解サイクル(6回以上)は、その期間の間室温においてそれらを維持することと比較して、特にSuperMix製剤の場合では、機能に有害であった。頻繁に使用する場合には、反応ミックスを少量ずつに分割することが強く勧められるべきであることおよび少量を4℃で保存すべきであることをこの結果は示している。
【０２１０】
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼ増幅のためのポスト-PCRアッセイ法
TOPO TAクローニング
全ての他のパラメーターが同じであると仮定すると、TOPO TAクローニング直後の形質転換効率は、Platinum対照と比較したとき、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼによる増幅産物ではわずかに低かった(マルチクローニングサイトアンプリコンでは70%であり、GCリッチアンプリコンでは37%であった)。低い形質転換効率は、クローニングおよび形質転換までキャリーオーバーされたAccuPrimeタンパク質によるssDNAに対する高い親和性によって生じた可能性があり、αテスターの1つの問題を生じた可能性がある。
【０２１１】
しかし、各形質転換について無作為に選択した6つのコロニーのうち、AccuPrime Taqによって増幅された各アンプリコンからの5つの形質転換体は、Platinum
Taq PCRによって、GCリッチアンプリコンでは4つだけであり、マルチクローニングサイトアンプリコンでは6つであったことと比較すると、正しい挿入を示した。この結果は、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼによるアンプリコンカンの識別が低いことを示した。
【０２１２】
増幅産物はTOPO TAクローニングに匹敵するというさらに決定的な証拠が配列決定結果によって提供された(図11)。pCR2.1-TOPOベクターへの挿入物には、5'末端にTTが、3'末端にAAが隣接していることを配列決定は明白に実証した。この結果は、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼは、TOPO TAクローニングに必要な3' Aオーバーハングを正しく作製することを示している。
【０２１３】
制限エンドヌクレアーゼ消化
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼの増幅産物のRFLPアッセイ法への適合性は、PCR反応の増幅産物を、2つの異なる制限酵素を用いた消化反応に直接使用することによって分析した。PCR反応からキャリーオーバーされる最高50%までの反応容量については、制限消化の検出可能な妨害は観察されなかった(図12)。消化反応にキャリーオーバーされる可能性のある成分が何であったとしても、増幅産物の酵素消化を妨害しなかったことをこの結果は示している。
【０２１４】
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼのPCR適用の開発
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼの特異性の増強
264〜4,350 bpの範囲のアンプリコンを有する6つのプライマーセット(Pr 1.3, 264 bp；Rhod, 646 bp；β-グロビン, 731
bp；Hpfh, 1,350 bp；p 53, 2,108 bp；p53, 4,350 bp)を使用する性能比較において、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼはTaq
DNAポリメラーゼおよび全ての他のホットスタートポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、Perkin Elmer；Jump Start, Sigma；Fast
Start, Roche；Hot Star Taq, Qiagen；Sure Start, Stratagene)より優れていた。AccuPrime Taqは、アンプリコンサイズにかかわらず、最も高い特異性と一定の収率を示す(図13および14)。AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼの収率は最も高い範囲である。さらに詳細な調査において、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼは、現在の市場のゴールド的な標準品、AmpliTaq
Gold(Perkin Elmer)(図15)またはHotStar Taq(Qiagen)(図16)と比較したとき、一定の高い特異性を得るためにプライマーのアニーリングまたはアンプリコンサイズに関して最適化の必要性が少なかった。
【０２１５】
非特異的なプライマー結合を抑制する能力を確立するために、プライマーが1つの部位に完全にアニーリングし、完全にアニーリングした部位の350 bp下流の別の部位には部分的に(3'末端の13
bp)アニーリングするようにプライマーを設計した。それは、下流部位と13-bpの相同性を有する増幅標的を利用することによって達成された。部分的なアニーリング部位を識別できないHotStar
TaqまたはTaq単独とは異なり、AccuPrime Taqは間違ったプライマー結合を抑制して、特異的産物だけを作製することができた(図7)。AccuPrime
Taqは、他のホットスタート酵素を上回り、AccuPrimeはPCRサイクリング中機能して、非特異的なプライマー結合を防止するという利点をこの結果は再度強調している。
【０２１６】
PCRにおいて、AccuPrimeタンパク質は、感度、特性および忠実度においてTaq DNAポリメラーゼ活性を増強する(表6)。このような増強により、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼシステムは、ハイスループットPCR、マルチプレックスPCRおよびPCR小型化などの多数の分野のPCR適用に好適となる(表7)。本発明者らは、PCRにおいてその役割を説明する機序をここに提供する。本発明のタンパク質は、特異的なプライマー：鋳型相互作用を安定化し、非特異的なプライマーアニーリングを生じないように競合し、プライマー結合部位にTaq
DNAポリメラーゼを補充すると思われる(図18)。結果として、それは、プライマーおよびポリメラーゼが各反応サイクルにおいてアニーリングと伸長を反復するPCRにおける特異的なプライマー伸長反応にとって利用可能な供給源を活用する。
【０２１７】
【表６】
2006522582.tif 000047
【０２１８】
【表７】
2006522582.tif 000048
【０２１９】
小型化
小型化の概念は、最初は、PCR反応実施する費用効果的な方法として着想された。3つの異なる容量の反応、10μl、20〜25μlおよび対照としての標準的な50μlに焦点が置かれた。dNTP、プライマー、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼおよび具体的に本発明の産物については、AccuPrimeタンパク質(1本鎖DNA結合タンパク質またはAccuPrimeタンパク質)などの典型的なPCR反応の各成分について漸増および最適化を実施した。
【０２２０】
本発明者らの実験から、dNTP、緩衝剤およびプライマーの濃度は、標準的な50μlの反応で見られる高性能を比例的に低下し、維持することを本発明者らはみいだした(図19および20)。結果を合わせて表8に要約する。最も重要なことには、同じ品質のPCR産物を作製する際には、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼの必要な量は、TaqまたはPlatinum Taqより2〜3倍少ないということも本発明者らは見出した。
【０２２１】
【表８】
2006522582.tif 000049
1.  Taq：Taq DNAポリメラーゼ単独
2.  Pt：Platinum Taq DNAポリメラーゼ
3.  AP：AccuPrime Taq DNAポリメラーゼ
【０２２２】
困難な鋳型
高GC含量(>70%)の鋳型は、融点が高いことにより、増幅が困難であることで有名である。AccuPrime Taq PCR反応ミックスを使用して、これらの鋳型の特異性および収率を改善することが本発明者らの目的であった。
【０２２３】
Accuprime タンパク質の滴定は、Platinum Taqが失敗している、1×濃度のSSBが特異的産物を得るのに十分すぐれていることを示した(図21)。しかし、アニーリング温度を最適化することによって特異性を改善する試みは成功が証明されなかった。Hi-Fi
BufferおよびMgSO4を標準的なPCR緩衝液およびMgCl2と交換することによって、試験した試料の50%は特異性の改善を示した。独立して、標準的なPCR反応混合物にPCRxエンハンサー溶液を添加すると、AccuPrime
Taqと併用して使用するとき、特異性の改善を示した。また、収率は、Platinum Taqより3倍高いことが見出された(図22)。合わせて考えると、Hi-Fi緩衝液、MgSO4およびPCRxエンハンサー溶液は、一体として、Platinum
Taqをうわまわって、産物の性能のさらに3倍の改善を生じた。
【０２２４】
優れた特異性および困難な鋳型を増幅する能力により、AccuPrime Taq DNAは、PCR遺伝子型解析などの適用において理想的であると思われる。2つの独立したゲノム標的を使用して、遺伝子型解析にAccuPrime
Taqを使用できるかどうかの可能性を試験した。遺伝子、SRYおよびDYS-391は共にY染色体に存在するので、男性のゲノムDNAだけが特異的な標的を有する。両方の場合において、AccuPrime
Taq(AP Taq)は特異的な増幅産物を示すと同時に、バックグラウンドを抑制した。対照のHotStar Taq(HS Taq)は、特にSRY遺伝子においてバックグラウンドに多数の非特異的産物を示した(図23)。
【０２２５】
マルチプレックスPCR
マルチプレックスPCRの使用は、エンドユーザーにとって時間、労働および費用の節約になるという点において、望ましい実用的な目的を果たす。しかし、全ての実用的な目的では、マルチプレックスPCRの最適化は、一部には、異なるプライマーペア間の交差-相互作用の確率が高いことおよび反応において他と等しく性能を発揮するように各セットのプライマーを最適化する際に困難を伴うことにより、面倒で、時間がかかることがある。AccuPrime
Taqの特性を増加する特異性に後押しされて、AccuPrime Taq PCR反応ミックスを使用して、実用的なマルチプレックスPCRの可能性を試験した。
【０２２６】
これらの実験を終了したとき、マルチプレックスの最適なPCR条件は、標準的なPCR反応におけるように標準的な条件を使用するのではなく、大幅な最適化を必要としなかったことが見出された(図24)。典型的なマルチプレックスPCR反応は、0.2
mM dNTP、1.5 mM MgCl2および400 ngのAccuPrimeタンパク質を含有すると思われる。2〜10個のプライマーセット間のマルチプレックスPCRには2単位のAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼで十分であることも本発明者らは見出した。これを超えて、最高20セットでは、最適な結果を得るために、反応あたり5単位の酵素を必要とした(図25)。
【０２２７】
ハイスループットPCR
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼは、Platinum Taq DNAポリメラーゼと比較するとき、ハイスループットスクリーニングのロバスト性を改善し、総サイクル数を低下し、特異性を増加した(図26)。
【０２２８】
忠実度の増強
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼの忠実度の増強は、rpsL忠実度アッセイ法を使用して確認した(Lackovichら、2001年；Fujiiら、1999年)。AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼの忠実度は、rpsL忠実度アッセイ法を使用して求めた。Invitrogen Corporation社製のTaq DNAポリメラーゼを対照として使用した。AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼのエラー率は、1.72×10-5であることが求められた(表9)。3つの独立した忠実度実験過程を終了して、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼは、各時点においてTaq DNAポリメラーゼを上回って、忠実度のほぼ2倍の改善を示した。突然変異体コロニーを、rpsLプライマーを用いてPCR増幅し、ゲル分析して、突然変異体遺伝子の存在を実証した。
【０２２９】
【表９】
2006522582.tif 000050
【０２３０】
結論
本発明者らは、次世代のPCR酵素システム、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼシステムおよびAccuPrime Taq PCR SuperMixの開発を報告している。これらのシステムは、PCRにおいてTaq
DNAポリメラーゼ活性を増強するPlatinum技術に耐熱性AccuPrimeタンパク質を組込んでいる。AccuPrimeタンパク質はメタン細菌(Methanococcus
jannachii)由来の耐熱性SSBであり、他のSSBとは異なり、1本のポリペプチド鎖からなる。クローニングされた遺伝子はUC, DavisのDr.
Stephen C. Kowalczykowskiから入手され、タンパク質は、改良型精製プロトコールを使用して純度95%まで精製された。PCRにおいて、それは感度、特異性および忠実度においてTaq
DNAポリメラーゼ活性を増強する。このような増強により、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼシステムは、ハイスループットPCR、マルチプレックスPCRおよびPCR小型化などの多数の分野のPCR適用に好適となる。AccuPrimeタンパク質によるポリメラーゼ活性の増強はTaq
DNAポリメラーゼに特異的であることも示されている。AccuPrimeタンパク質およびTaq DNAポリメラーゼは2つの独立した生物由来であるので、相互作用は構造相同性によって誘導されると思われる。
【０２３１】
要約すると、AccuPrimeタンパク質はTaq DNAポリメラーゼの活性を増強し、PCRにおいて、特異性をかなり改善する。他のホットスタートDNAポリメラーゼとは異なり、それは、PCRの前だけでなく、全てのサイクル中にも特異的なプライマー-鋳型ハイブリダイゼーションを促進することによってPCRの性能を改善する。全ての市販のホットスタートTaq
DNAポリメラーゼは、化学修飾または抗Taq抗体の添加によって、PCRサイクルの前にDNAポリメラーゼ活性を遮断するように設計されているが、PCRサイクル中は遮断しない。300を超えるプライマーセットを使用するPCR検討では、AccuPrime
Taq(商標)DNAポリメラーゼは、検討例の75%において他のホットスタートPCR酵素と比較して収率、感度および／または特異性の改善を示した。感度および特異性により、新規増幅酵素は種々のPCR/RT-PCR適用に理想的なものになるが、ロバスト性は、任意の特定のPCR適用では、最適化を最小にする必要性を低下する。遺伝子型解析、コロニーPCRおよびPCR小型化などのハイスループットまたはマルチプレックス様式では、新規PCR酵素は現在のPCR市場の全てのプレミアゴールドな標準的な酵素より優れている。AccuPrimeタンパク質は、Taq
DNAポリメラーゼの忠実度を2倍改善することも実証されている。
【０２３２】
システムの構成を表10に提供する。
【０２３３】
【表１０】
2006522582.tif 000051
2006522582.tif 000052
【０２３４】
参照文献
2006522582.tif 000053
2006522582.tif 000054
【０２３５】
実施例5
ACCUPRIMEPFX DNAポリメラーゼシステムの開発および特徴づけ
序文
高度に耐熱性のAccuPrimeタンパク質は、KOD DNAポリメラーゼ(Toyobo(別名 Pfx(商標) DNAポリメラーゼ))およびKOD DNAポリメラーゼに特異的な抗体と一体化して、次世代の高忠実度PCR酵素-AccuPrime
Pfx(商標) DNAポリメラーゼを作製した。AccuPrime技術は、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼにすでに組込まれており、成功が証明されている。本発明者らは、高忠実度、高感度およびロバスト性を要求するPCR適用のためにAccuprime
Pfx(商標) DNAポリメラーゼを最適化した。
【０２３６】
現在市場において入手可能な高忠実度の酵素はほとんどが広範な最適化を必要としており、特異的産物の保証はない。AccuPrimeタンパク質をPlatinum
Pfx DNAポリメラーゼに導入することによって、本発明者らは、PCR反応において酵素をロバスト性および再現性にすることができる。市販の高忠実度PCR酵素には、反応のアセンブリー中にポリメラーゼ活性を遮断するように化学修飾によってまたは抗体を添加することによって、ホットスタート技術の1つを使用しているものもある。しかし、既存のホットスタート技術はほとんどがPCRサイクルの前では機能するが、PCRサイクル中には機能しない。他のホットスタートDNAポリメラーゼとは異なり、Accuprime技術は、PCRの全てのサイクルの前だけでなく、サイクル中も特異的なプライマー-鋳型ハイブリダイゼーションを促進することによってPCR性能を改善する。Pfx
DNAポリメラーゼのためのAccuPrime技術は、酵素のロバスト性を増強する第2の相補的なAccuPrimeタンパク質、AccuPrimeタンパク質IIを含むように改良されている。(2つまたはそれ以上の)AccuPrimeタンパク質をブレンドすることは、ロバスト性のある高忠実度のPCR酵素を作製する上で、AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼに独自である。
【０２３７】
ゲノムDNAを標的とする90を超えるプライマーセット、プラスミド、バクテリオファージλDNAまたはcDNAを使用するPCR検討では、Accuprime
Pfx(商標)DNAポリメラーゼは、全体として実験例の約50%においてホットスタート酵素を上回る、収率、感度および／または特異性の改善を示した。AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼは、感度、特異性および再現性が増強されていることにより、種々のPCR/RT-PCR適用に理想的であるが、そのロバスト性は最適化を最小にする必要性を低下する。AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼは、プレミア的な次世代のPCR酵素ファミリーを作製する際にAccuPrime Taq DNAポリメラーゼを十分に補足する。
【０２３８】
1本鎖DNA結合タンパク質(SSB)は、DNA複製システムにおいてタンパク質の機能に基づいて、特異性、収率および感度に関してPCRの助けになると思われると考えられていた。DNAの複製では、ヘリカーゼが2本鎖(ds)DNAを巻き戻して、プライマーゼおよびDNAポリメラーゼの機能に必要な2本の相補的な1本鎖(ss)にする。SSBは、単に分子をコーティングすることによってssDNA鋳型を保護するが、そうすると、ssDNAは相補鎖との塩基対形成が妨げられる。SSBは種特異的にDNAポリメラーゼと直接相互作用するという証拠もある(Kimら、1992；KimおよびRichardson、1994年；GloverおよびMcHenry、1998年；Leeら、1998年)。
【０２３９】
SSBがPCR反応を増強する最も明白な理由は、鋳型から二次構造(ヘアピン等)をなくし、DNA鋳型を1本鎖で維持する能力であると思われる。実際、大腸菌(E.
coli)および他の中等温度好性生物のSSBはPCR効率を改善したことが報告されている(Chou、1992年；Rapley、1994年；DabrowskiおよびKur、1999年)。しかし、中等温度好性SSBの熱不安定性により、そのタンパク質による増強は限られていて、サイクル化するインキュベーション温度がそれらの耐熱性の上限を超えるPCR適用には実用的ではない。
【０２４０】
古細菌由来の耐熱性SSBの存在はUC,DavisのDr. Stephen C. Kowalczykowskiによって最初に報告され(Chedinら、1998年)、その後その遺伝子がJohns
Hopkins UniversityのThomas J. Kellyのグループによってクローニングされた(Kellyら、1998年)。その後、他のグループによってさらに数種の古細菌SSBがクローニングされ、精製された。本発明者らはUC,
Davisの2つのSSBタンパク質を使用し(そのタンパク質は本明細書において「AccuPrimeタンパク質 I」および「AccuPrimeタンパク質 II」と呼ぶ)、DNAポリメラーゼの活性および忠実度に対する影響を検討し、本明細書に記載するAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼおよびAccuPrime Pfx DNAポリメラーゼを開発した。AccuPrime PfxのためのAccuPrime技術の改善は、既存のSSBに種々の起源の第2の相補的なSSBを付加することを含む。異なる起源のSSBタンパク質は構造および機能に広範な相同性を有するという一般的な考えとは異なり、AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼは、Pfx DNAポリメラーゼの性能を増強する際には、異なった方法ではあるが、相補的な方法で2つの異なるSSB機能を示す。
【０２４１】
この原稿は、新規AccuPrime技術を含む、次世代の高忠実度PCR酵素を作製する際の本発明者らの試みを報告するものである。
【０２４２】
材料と方法
AccuPrimeタンパク質IおよびIIの小規模精製
AccuPrimeタンパク質I
AccuPrimeタンパク質Iの精製は、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼシステムについて上記に報告されている。簡単に説明すると、AccuPrimeタンパク質遺伝子を含有するプラスミドは、タンパク質の精製ごとにBL21(DE3)細胞に新たに形質転換した。培地(50μg/mlのカナマイシンを添加したテリフィックブロス50
ml)はスターター培養物から接種し、1 OD600に達するまで(4〜6時間)37℃においてインキュベーションし、I mM IPTGで誘導した。ペレット化した細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma、P
8849；細胞ペレット20 gあたり1 mlのカクテル)を含有する溶解緩衝液(細胞ペレット1gあたり2 ml；0.5 M NaCl、50 mMリン酸カリウム、pH8.0、0.25
mM PMSF、10 mMイミダゾール)に再懸濁させ、超音波処理によって溶解し、遠心分離によって浄化した。Ni-NTAアガロース(Qiagen)カラムクロマトグラフィーを実施し、次にssDNAアガロースカラムおよびMonoQカラムクロマトグラフィーを実施することにより、純度90%のタンパク質約25
mgを得た。
【０２４３】
AccuPrimeタンパク質 II
pET21+rSsoSSBを含有する宿主細胞、BL21(DE3)を、100μg/mlのアンピシリンを添加したLB培地において30℃で、OD600が1.0に達するまでインキュベーションし、最終濃度1
mMまでのIPTGによって2時間誘導した。遠心分離によって細胞を採取し、湿重量1gの細胞ペーストあたり2 mlの溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH
7.5)、1 mM EDTA、50 mM NaCl、50μg/ml PMSF)中に再懸濁させ、超音波処理によって溶解した(ODに基づいて70〜80%溶解)。溶解液は、JA-20ローターで16,000
rpmで45分間遠心分離し、時折混合しながら、80℃において1時間加熱処理することによって浄化した。加熱処理による沈殿物は、JA-20ローターで16,000
rpmで60分間遠心分離することによって除去した。
【０２４４】
EMD SO3カラムにロードする前に、JA-20ローターにおいて16,000 rpm(〜20,000 g)で遠心分離することによって上清をさらに浄化した。低塩濃度緩衝液(30
mM tris-HCl(pH 7.5)、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10%グリセロール)で平衡させておいた10 mlのEMD-SO3カラム(1.6×5
cm)に上清をロードした。カラムを4カラム容量の低塩濃度緩衝液で洗浄し、低塩濃度緩衝液から65%の高塩濃度緩衝液(30 mM tris-HCl(pH 7.5)、1000
mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10%グリセロール)の直線的な濃度勾配の5カラム容量で溶出した。2.5 mlの画分を回収した。カラムを、さらに3カラム容量の65%の高塩濃度緩衝液で溶出した。画分をSDS-PAGE(4〜20%
Novex Tris-グリシンゲル)によって分析し、製造業者のマニュアルに従ってNovex SimplySafe染色で染色した。17.5 kDaのタンパク質を含有する画分をプールした。画分プールは、タンパク質がBL21(DE3)から精製された場合には、2リッターのヒドロキシアパタイト平衡緩衝液(50
mM NaCl、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、1 mM DTT、5%グリセロール)で、またはBL21-CodonPlusから精製された場合には保存緩衝液(20
mM NaCl、25 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA、1 mM DTT、10%グリセロール)で透析した。
【０２４５】
ヒドロキシアパタイト平衡緩衝液で透析した試料は、平衡緩衝液で平衡させた2 mlのセラミックヒドロキシアパタイトカラム(0.7×5.2 cm)にロードした。カラムは10カラム容量の平衡緩衝液で洗浄し、平衡緩衝液から溶出緩衝液(50
mM NaCl、500 mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、1 mM EDTA、1 mM DTT、5%グリセロール)までの直線的な濃度勾配の10カラム容量で溶出し、1
mlの画分を回収した。画分はSDS-PAGE(4〜20% Novex Tris-グリシンゲル)で分析して、Novex SimplySafe染色で染色した。17.5
kDaのタンパク質を含有する画分をプールし、保存緩衝液で透析した。
【０２４６】
精製したAccuPrimeタンパク質のタンパク質アッセイ法：Bradfordタンパク質アッセイ法
Bradfordタンパク質アッセイ法は、Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad；Part#500-0006)および標準品として、1.41mg/mlの濃度に再構成した凍結乾燥ウシγグロブリン(Bio-Rad；Part#500-0005)を使用して実施した。日を変えて3日間で3回の異なる実験を実施して、定量値の再現性を試験した。
【０２４７】
精製したAccuPrimeタンパク質 IIのQCアッセイ法
エンドヌクレアーゼ活性
AccuPrimeタンパク質II調製物のバッチのエンドヌクレアーゼアッセイ法は2本鎖エンドヌクレアーゼアッセイ法を使用して実施した。各反応液は、1 mM
MgSO4を添加した50μlの1×Pfx増幅緩衝液(18 mM (NH4)2SO4、60
mM Tris-SO4、pH 8.9)中に1μgの高次コイルφX174 RF DNAおよび4(10×)または8(20×)μgのAccuPrimeタンパク質を含有した。反応ミックスは37℃において1時間インキュベーションし、2.5μlの10%
SDSを添加し、95℃において5分間加熱することによって反応を停止した。反応ミックスは、アガロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動は、0.8%水平型アガロースゲルでミックスの各々10μlについて実施し、ゲルは臭化エチジウムで染色した。
【０２４８】
エキソヌクレアーゼアッセイ法
100 pmolのオリゴヌクレオチド
2006522582.tif 000055
は、50μlの1×PNK交換緩衝液中で、10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび10μCiの[γ-32P]ATPを使用して5'末端を32Pで標識した。反応ミックスは37℃において30分間インキュベーションし、ミックスを70℃において10分間インキュベーションすることによって反応を停止した。製造業者の指示に従って、反応ミックスをAmersham-Pharmacia
Micro Spin G-25カラムで2回溶出することによって、取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。
【０２４９】
40 pmolの放射性標識したオリゴヌクレオチドを、1 mM MgSO4を添加した100μLの1×Pfx増幅緩衝液(18 mM (NH4)2SO4、60
mM Tris-SO4、pH 8.9)中で6μg(10×)のAccuPrimeタンパク質と共に37℃または72℃においてインキュベーションした。72℃においてインキュベーションした試料については、20μl量を0分、5分、10分および30分経過時に取り出し、10μlの3×ホルムアミド配列決定用ゲルロード用緩衝液と混合し、氷上で保存した。試料を95℃において5分間加熱し、各10μlを15%
TBE尿素ゲルにロードした。37℃においてインキュベーションした試料については、20μl量を0分、15分、30分および60分経過時に取り出し、各1μlの10%SDSおよび20
mg/mlプロテイナーゼK(Invitrogen；part#25530-049)と混合し、55℃において45分間インキュベーションした。反応終了時に、試料を10μlの3×ホルムアミド配列決定用ゲルロード用緩衝液と各々混合し、95℃において5分間加熱した。各10μlを15%
TBE尿素ゲルにロードした。ポリアクリルアミドゲルを乾燥し、Kodak BioMax MR X線フィルムを使用してオートラジオグラフした。
【０２５０】
宿主DNA汚染
宿主DNA汚染アッセイ法は、DNAを鋳型を添加しないで、1×(50μlの反応液あたり300 ng)または2×(600 ng)濃度の変性AccuPrime タンパク質IIの存在下において、大腸菌(E.
coli)ゲノム(priA)のシングルコピー遺伝子を標的とするプライマーセットを使用してPCRによって実施した。AccuPrimeタンパク質IIの変性は、タンパク質溶液(0.52
mg/mlを100μl)を50μgのプロテイナーゼK消化で55℃において1時間処理することによって実施した。ペプチジル残基およびプロテアーゼは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1)ミックスで抽出し、次にG-25スピンカラム(Pharmacia)によって除去した。タンパク質溶液は、この目的のために最初の濃度でタンパク質を含有しているかのように処理した。対照反応は、濃度マーカーとしてのタンパク質が存在しない以外は同じ条件で既知量の大腸菌(E.
coli)ゲノムDNAを含有する。大腸菌(E. coli)priA 260 bpプライマーセットを使用した。順方向プライマー
2006522582.tif 000056
；逆方向プライマー
2006522582.tif 000057
。
【０２５１】
大腸菌(E. coli)DNA濃度対照反応液は、大腸菌(E. coli)BL21株由来の0.1 ng、0.5 ngまたは1 ngのゲノムDNAを含有した。PCR反応は、それぞれの反応条件において、Platinum
Pfx DNAポリメラーゼまたはPlatinum Taq DNAポリメラーゼを用いて実施した。PCR反応においてAccuPrimeタンパク質 IIの増強している活性化を不活性化するために、タンパク質をプロテイナーゼKで消化した。プロテイナーゼK消化は、20μgのAccuPrimeタンパク質IIおよび20μgのプロテイナーゼKを含有する50μlの反応液中で55℃において1時間実施した。その後、フェノール抽出およびG-50スピンカラムによってプロテイナーゼKをタンパク質から除去した。プロテイナーゼ処理したAccuPrimeタンパク質溶液は、この目的のためにプロテアーゼ処理する前と同じタンパク質濃度のタンパク質を含有しているかのように処理した。反応ミックスはアガロースゲル電気泳動でアッセイした。電気泳動は、0.8%水平型アガロースゲルでミックスの各10μlについて実施し、ゲルは臭化エチジウムで染色した。
【０２５２】
機能的PCRアッセイ法
機能的PCRアッセイ法は、精製したAccuPrimeタンパク質IIの機能性を確立するために実施した。アッセイ法は、100 ngのAccuPrimeタンパク質Iの存在下において、100
ngの増分で反応液あたり100 ngから600 ngまでAccuPrimeタンパク質IIの量を増加させたことを除いて、50μlの反応液中で、p53 2380プライマーセットおよび100
ngのヒトゲノムDNA(K562、遺伝子型解析用)を使用して実施した。ヒトp53 2380 bpプライマーセットを使用した。順方向プライマー
2006522582.tif 000058
；逆方向プライマー
2006522582.tif 000059
。
【０２５３】
1 mM MgSO4を添加した1×Pfx増幅緩衝液中のPlatinum Pfx DNAポリメラーゼを対照反応として使用した。PCR反応は以下のように実施した。
【０２５４】
機能性アッセイ法のPCRプログラム：
プレインキュベーション
95℃    5分
以下を35サイクル
95℃    15秒
63℃    30秒
68℃    3分
4℃において維持する
【０２５５】
サーモサイクリング終了後、PCR増幅産物を5μlの10×BlueJuiceと混合し、少量(各レーンあたり、総反応容量の20%または10μl)を、0.5×TBEにおいて0.4μg/mlの濃度の臭化エチジウムを事前に混合しておいた0.8%アガロースゲル電気泳動で分析した。得られたゲルは、異なる試料間の特異性および収率について視覚的に分析した。
【０２５６】
AccuPrime製剤におけるAccuprimeタンパク質の安定性
加速安定性アッセイ法
加速安定性アッセイ法は、温度の上昇は反応速度を熱力学的に加速すると思われることおよびタンパク質の劣化(不活性化、変性または分解)は熱力学的観点による反応であるという仮定に基づいている。従って、高温における所定の期間のタンパク質溶液のインキュベーションは、低温における長期間の保存の影響に類似していると思われる。加速の程度は、アレニウス式：k
= Ae[-Ea/RT](式中、kは速度定数sであり、Aは定数であり、Eaは活性化エネルギーであり、Rは一般ガス定数8.314×10-3
kJ mol-1K-1であり、Tは温度(ケルビン度単位)である)を使用して推定した。
【０２５７】
10×AccuPrime Pfx反応ミックスを、-20℃における1年間の保存と等価である、37℃および45℃において7日間および4日間それぞれ試験した。インキュベーション期間後、反応ミックス(またはSupermix)を、1×強度のPCRを使用して、その機能について試験した。機能的アッセイ法については、プライマーセットは、他のPfx
DNAポリメラーゼを用いて特異的産物を得る際にPCRが困難であるように選択した。ヒトβ-グロビン(Hbg)3.6 kbプライマーセットを使用した。順方向プライマー
2006522582.tif 000060
；逆方向プライマー
2006522582.tif 000061
。
【０２５８】
特異的なバンドの強度は、鎖長3.6 kbの機能的AccuPrime Pfxによって増強することができた。PCR反応は、1 mM MgSO4を含む50μlの1×Pfx増幅緩衝液中で鋳型として50
ngのK562遺伝子型解析用DNAおよび各0.3μMのプライマーを使用して標準的な方法で実施した。PCRインキュベーションは、95℃におけるプレインキュベーションを5分、次に95℃において15秒、62℃において30秒および68℃において4分を35サイクル実施するように設定した。PCR産物は0.8%水平型アガロースゲルで分析した。
【０２５９】
リアルタイム安定性アッセイ法
リアルタイム安定性アッセイ法は、数箇所の例外を加えて加速安定性アッセイ法と同様に実施した。今回全ての製剤はヌクレオチドを含有した。10×反応ミックス製剤のロットは、グリセロールを含有しない1バッチを含む2つのバッチに分割した。インキュベーションは3つの異なる温度、-20、4および22℃において実施した。
【０２６０】
PCR機能的アッセイ法の基準は、機能的反応ミックスがHBg 3.6プライマーセットについては鎖長が3.6 Kbの特異的なバンドを増強するという点において上記と同じであった。PCR反応は、ゲノム鋳型として20
ngのK562遺伝子型解析用DNAまたはcDNA鋳型として200 fgのpUC19および各々0.2μMのプライマーを50μlの1×PCR緩衝液において使用して標準的な方法で実施した。PCRインキュベーションは、95℃におけるプレインキュベーションを5分実施し、次に95℃において15秒、62℃において30秒および68℃において4分を35サイクル実施するように設定した。PCR産物は、0.8%水平型アガロースゲルで分析した。
【０２６１】
AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼのPCR反応
標準的なPCR反応
特に示さない限り、全てのPCR反応は、標準的なプロトコールに従って実施した。PCR反応液は、1 mM MgSO4を添加した1×Pfx増幅緩衝液(18
mM (NH4)2SO4、60 mM Tris-SO4、pH 8.9)および0.3μMの各プライマーを含有する50μlの反応容量において調製した。4つのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の各々の濃度は0.3
mMであった。1×AccuPrime Pfx反応ミックスは、50μl反応液あたり100 ngのAccuPrimeタンパク質Iおよび300 ngのAccuPrimeタンパク質IIも含有する。鋳型濃度は、適用に応じて20
ng〜200 ngと変えた。1単位のAccuPrime Taq Pfxポリメラーゼを典型的な50μl反応液に使用した。サーモサイクリングは、Perkin
Elmer GeneAmp PCR System 9600、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400またはMJR
Peltier Thermal Cycler(PTC)200を使用して実施した。
【０２６２】
標準的なPCRプログラム：
プレインキュベーション
95℃  5分
以下を35サイクル
95℃    15秒
55℃〜60℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃    1min/kb
4℃において維持
【０２６３】
サーモサイクリングの終了後、PCR増幅産物は、5 μlの10×BlueJuiceと混合し、少量(各レーンあたり総反応容量の20%または10μl)を、0.5×TBEにおいて0.4μg/mlの濃度の臭化エチジウムを事前に混合しておいた0.8%〜1.5%アガロースゲル電気泳動で分析した。得られたゲルは異なる試料間で特異性および収率について視覚的に分析した。
【０２６４】
rpsL忠実度アッセイ法
忠実度アッセイ法は、rpsL突然変異が示すストレプトマイシン耐性に基づいて実施した(Lackovichら、2001年；Fujiiら、1999年)。簡単に説明すると、アンピシリン(Apr)および(rpsL)遺伝子を含有するpMOL
21プラスミドDNA(4 kb)をSca Iで直線化して、ビオチン化プライマーを使用して直線化した産物に標準的なPCRを実施した。2単位のAccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼを使用して増幅を完了させた。鋳型DNAは25サイクルの増幅あたり1 ngとした。PCRサイクリングパラメーターは、95℃で5分、次に95℃で15秒、58℃で30秒および68℃で5分を25サイクルとした。PCR産物は、直線性を確かめるために、ストレプトアビジン磁気ビーズ精製した。精製したPCR産物はアガロースゲルで分析し、DNA濃度および鋳型の倍加を推定した。精製したDNAは、T4
DNAリガーゼでライゲーションして、MF101コンピテント細胞に形質転換した。形質転換細胞の総数を求めるために、細胞をアンピシリンプレートで培養した。rpsL突然変異体の総数を求めるために、細胞をアンピシリンおよびストレプトマイシンプレートで培養した。突然変異の頻度は、突然変異の総数を形質転換細胞の総数で割ることによって求めた。エラー率は、突然変異頻度を130(rpsLの表現型の変化を生じるアミノ酸配列の変化の数)および鋳型倍加で割ることによって求めた。
【０２６５】
AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼの競合的審査
AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼの性能を、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene、カタログ番号600252、ロット1210608)、Pwo
DNAポリメラーゼ(Roche、カタログ番号1644 955、ロット49215324)、Tgo DNAポリメラーゼ(Roche、カタログ番号3186 199、ロット90520522)およびKOD
Hot Start DNAポリメラーゼ(Novagen、カタログ番号71086-3、ロットN33243)などの競合的高忠実度PCR酵素と比較した。各酵素は、100〜200
ngのヒトゲノムDNA(K562、遺伝子型解析用)を使用して822 bp〜6816 bpの範囲の標的を増幅するために使用した。プライマーおよびそれらの配列は以下のようである：(#1、c-myc
822 bpプライマーセット)順方向プライマー
2006522582.tif 000062
、逆方向プライマー
2006522582.tif 000063
；(#2、p53 2380 bpプライマーセット)順方向プライマー
2006522582.tif 000064
、逆方向プライマー
2006522582.tif 000065
；(#3、ヒトβ-グロビン(Hbg) 3.6 kbプライマーセット)順方向プライマー
2006522582.tif 000066
、逆方向プライマー
2006522582.tif 000067
；(#4、Rhod 6173 bpプライマーセット)順方向プライマー
2006522582.tif 000068
、逆方向プライマー
2006522582.tif 000069
；(#5、Rhod 6816 bpプライマーセット）順方向プライマー
2006522582.tif 000070
、逆方向プライマー
2006522582.tif 000071
。
【０２６６】
PCR反応は、実用的に可能な限り厳密に製造業者の推奨に従って実施した。各プライマーセットのアニーリング温度は、試験した全てのポリメラーゼについて同じに設定し、c-myc
822 bpおよびp53 2380については65℃；bp(Hbg)3.6 kbについては62℃およびRhod 6173 bp Rhod 6816 bpについては64℃である。詳細なPCR条件は以下のようである。
【０２６７】
Pfu TurboおよびTgo DNAポリメラーゼのPCRプログラム：
プレインキュベーション
95℃    5分
以下を35サイクル
95℃          30秒
62℃〜65℃    30秒(上記を参照されたい)
72℃          1 min/kb
4℃において維持する
【０２６８】
Pwo DNAポリメラーゼのPCRプログラム：
プレインキュベーション
94℃    2分
以下を10サイクル
94℃          15秒
62℃〜65℃    30秒(上記を参照されたい)
72℃          2分
以下を25サイクル
94℃          15秒
62℃〜65℃    30秒(上記を参照されたい)
72℃          2分+各サイクルあたり5秒延長
ポスト-サイクルインキュベーション
72℃          7分
4℃において維持する
【０２６９】
KOD Hot StartおよびAccuPrime Pfx DNAポリメラーゼのPCRプログラム：
プレインキュベーション
95℃          5分
以下を35サイクル
95℃          15秒
62℃〜65℃    30秒(Tmより5度低い)
68℃          1 min/kb
4℃において維持する
【０２７０】
PCR増幅産物は、5μlの10×BlueJuiceと混合し、アリコート（全反応量の20％または各レーン10μl）を0.5×TBE中で0.4μg/ml濃度の臭化エチジウムと事前に混合しておいた0.8%アガロースゲル電気泳動で分析した。得られたゲルは、異なる試料間で特異性および収率について視覚的に分析した。
【０２７１】
結果と考察
AccuPrimeタンパク質IIの精製
AccuPrimeタンパク質IIのクローンは、遺伝子におけるレアコドンの頻回な使用により、BL21(DE3) CodonPlus株に組込まれた形態で、UC
DavisのDr. Steve Kowalcaykowskiから提供を受けた。オリジナルの精製プロトコールは、80℃における1時間の加熱処理が終了したら、室温における精製を必要とした。プロトコールはssDNAセルロースカラム、Resource
Qカラム(Pharmacia)クロマトグラフィーを必要とし、1リッターの培養物から約0.8 mgのタンパク質が得られると思われた。このプロセスに従って本発明者らの実験室で数回精製を試みたが、残念なことに、主に、2つのカラムのどちらにおいてもタンパク質が十分に保持されないことにより、収率は非常に悪かった。
【０２７２】
1本鎖DNAの解離定数は、約0.5μMまたはAccuPrimeタンパク質Iより3桁大きかったことをDr. Kowalczykowskiら(HaseltineおよびKowalczykowski、2002年)は報告している。この結果は、ssDNAセルロースカラムにおいてタンパク質の保持が悪いことを説明している。
【０２７３】
収率を改善するために、ssDNAカラムクロマトグラフィーの代わりに、Fractogel EMD-SO3カラムクロマトグラフィーを精製プロトコールに導入した。図27および28は、それぞれ、SDS-PAGEの溶出プロファイルおよびクロス-カラム分析を示す。結果は、シングルカラムクロマトグラフィー段階によってAccuPrimeタンパク質IIから任意の夾雑タンパク質がほぼ完全に除去されたことを示している。図29も、ワンステップ精製の妥当性示しており、オリジナルのプロトコールと比較して収率が3〜4倍増加されている(10リッターの培養物から25
mgのタンパク質が精製され、これと比較して、オリジナルのプロトコールを使用すると同じ容量の培養物から8 mgのタンパク質が精製される)。
【０２７４】
一方、EMD-SO3によりBL21(DE3)株から精製されたタンパク質は、小型のペプチドによる夾雑物の量が多かった(図30)。MonoQカラムによりそのような夾雑物を分離しようとしたが、いい結果が得られなかった。その理由は、タンパク質も夾雑物もこのカラムによって保持されないからであった(データは示していない)。そのような夾雑物は、遺伝子においてレアコドンの使用頻度が高いことにより、翻訳中の早期停止による産物である可能性がある。
【０２７５】
夾雑物の大半は、洗浄段階中に50 mMリン酸Na緩衝液(pH6.8)ヒドロキシアパタイトカラム(BioRad、Bio-Scale CHT2-1ヒドロキシアパタイトカラム、タイプI、2
ml、バッチ#74603)から溶出されたが、AccuPrimeタンパク質IIはリン酸濃度約200 mMの濃度勾配段階で溶出された(図31)。純度は約85%であると推定され、湿重量50グラムの細胞(約20リッターの培養液と等価)から5
mgのAccuPrimeタンパク質IIが得られた。
【０２７６】
本発明者らは、重複のある合成オリゴヌクレオチドを使用してレアコドンを一般的なコドンに変換した。BL21(DE3)CodonPlus宿主から精製したものと同じくらいの高い収率および高い純度を得るために、新規構築物にEMD-SO3カラムを用いるワンステップ精製を実施した(図29)。
【０２７７】
AccuPrimeタンパク質IIのタンパク質アッセイ法
表11は、1つのタンパク質ストック溶液(ロット2002-50-67)を使用して、数回反復して実施したBradfordタンパク質アッセイ法、標準アッセイ法またはマイクロアッセイ法を示す。Bradford
標準アッセイ法の標準偏差はマイクロアッセイ法の標準偏差の約4倍高かったが、マイクロアッセイ法は濃度が約50%高い値を示した。これはSDS-PAGEのバンド強度に関連していると思われた。
【０２７８】
【表１１】
2006522582.tif 000072
【０２７９】
Bradfordアッセイ法は変動性であることが知られているが、標準的な方法の標準偏差が大きいことにより、マイクロアッセイ法より信用性が低い。結果は、Bradfordアッセイ法などの、発色色素を使用するタンパク質アッセイ方法に関連する本質的な問題を明白に示している。Bradfordアッセイ法は広範な特性の溶液を測定する(濃度以外に、色素溶液に添加される試料溶液の容量が成果を決定する)。この結果は、標準的なアッセイ法は、アッセイ法を実施する条件の変動を受けやすいことを示していると思われる。結果として、AccuPrimeタンパク質IIのタンパク質アッセイ法のためにマイクロアッセイ法に従うことを決定した。
【０２８０】
BL21(DE3)(ロット2002-132-41)の新たなバッチのAccuPrimeタンパク質IIのタンパク質濃度は0.52 mg/mlであると求められ、合計5
mgが得られた(上記を参照されたい)。
【０２８１】
AccuPrimeタンパク質のQCアッセイ法
エンドヌクレアーゼ活性
2本鎖高次コイル基質を使用するPCR反応に推奨される最高10×までのタンパク質濃度において、検出可能なエンドヌクレアーゼ活性はAccuPrimeタンパク質調製物中には見られなかった(図32)。37℃においてインキュベーション後、バンドパターンは、タンパク質が含有されないことを除いて同じ条件下でインキュベーションした対照のパターンと変わらなかった(図32、パネルCのレーン1、5および9)。この結果は、ニッキング作用もこの調製物中に見られないことを示している。
【０２８２】
しかし、観察されたことは、加熱およびSDS処理しなかった試料の移動度シフトであった(図32のパネルA)。SDSの存在下における熱処理は移動度を回復させたので、それはタンパク質がDNA鋳型に結合する結果である。同様の結果は、AccuPrimeタンパク質Iでも示された(図32、レーン9〜12)。しかし、DNAバンドが常に高次コイルとリラックス型の環状の間にあるAccuPrimeタンパク質I結合とは異なり、AccuPrimeタンパク質II結合は、リラックス型環状DNAより遅い移動度シフトを生じる。
【０２８３】
強いssDNA結合活性は、特に負の高次コイルDNAの場合では、dsDNAの巻き戻しを生ずることがある。このような巻き戻しはゲル移動度がより低いシュード-トポイソマーを形成すると思われ、移動度は、AccuPrimeタンパク質Iに見られるように、リラックス型環状DNAと比較して遅くないと思われる。AcuuPrimeタンパク質IIは、AccuPrimeタンパク質Iと比較して、ssDNAに対する結合親和性が約3桁低い。そのような事実を考慮すると、シフトはAccuPrimeタンパク質IIのdsDNA結合により生じる可能性がある。
【０２８４】
PCR機能的アッセイ法
精製AccuPrimeタンパク質IIの機能は、50μl反応液あたり100 ngのAccuPrimeタンパク質Iの存在下において、Platinum Pfx
DNAポリメラーゼのPCR反応を濃度依存的に増強する能力によってアッセイした(図33)。p53 2380 bpプライマーセットを使用するPCR反応(材料と方法を参照されたい)は、図の説明に示すように、AccuPrimeタンパク質の存在下または非存在下において、それ以外は標準的なPlatinum
Pfx DNAポリメラーゼ条件下で実施した。
【０２８５】
AccuPrimeタンパク質IIの添加は、最高600 ngのタンパク質までにおいて濃度依存的に、鎖長2380 bpの特異的産物の収率を増大すると同時に非特異的産物を抑制したことを結果は示している。しかし、いくつかのプライマーセットでは、50μlの反応液あたり300
ngより高い濃度のAccuPrimeタンパク質は阻害的であることが以前に観察された。
【０２８６】
宿主DNA汚染アッセイ法
DNA結合活性を有するタンパク質を生物から精製する場合には、タンパク質は、タンパク質に結合しているいくつかの宿主ゲノムDNAと同時精製されてしまう可能性が常に存在する。PCRは少量のDNAを増幅する際の強力な技術であるので、PCRに関連するタンパク質は宿主DNAの汚染がないことが常に懸念事項である。
【０２８７】
各バッチにおける宿主DNA汚染の存在についてAccuPrimeタンパク質IIを試験した。宿主DNA汚染は、タンパク質が発現され、精製される大腸菌(E.
coli)のゲノムのシングル-コピー遺伝子を標的とするプライマーセットを用いるPCR反応を使用して試験した。宿主DNA汚染アッセイ法は、DNA鋳型を添加しないで、1×(50μlの反応液あたり300
ng)または2×(600 ng)濃度の変性AccuPrimeタンパク質IIの存在下において大腸菌(E. coli)ゲノム(priA)のシングルコピー遺伝子を標的とするプライマーセットを使用するPCRによって実施した。対照反応は、濃度マーカーとしてのタンパク質が存在しないこと以外は同じ反応において、既知量の大腸菌(E.
coli)ゲノムDNAを含有する。
【０２８８】
Pfx DNAポリメラーゼを含有する反応では特異的なバンドは観察されなかった(図34)。しかし、特異的なバンドは、対照レーンにおいてもTaq DNAポリメラーゼを含有する反応において観察された。バンド強度はタンパク質量の増加により増加せず、汚染DNA源はAccuPrimeタンパク質IIではなく、ポリメラーゼであったことを示している。
【０２８９】
AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼのPCR適用の開発
AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼの最適化
Platinum Pfx DNAポリメラーゼおよびAccuPrimeタンパク質Iからなると思われるという点において、AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼをAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼと同様に製剤化することを目的とした。
【０２９０】
酵素に対する抗体の比が低い(Platinum Pfx DNAポリメラーゼの5:5:1の代わりにAb1:Ab2:Pfx=2:2:1)AccuPrimeタンパク質Iを含有する最初の製剤すなわち、「製剤A」は、表12に要約するように、Pfx
DNAポリメラーゼの性能を増強する能力において最適に達しないことが証明された。
【０２９１】
【表１２】
2006522582.tif 000073
【０２９２】
最新の製剤すなわち、「製剤B」は、メタン細菌(Methanococcus jannachii)およびスルフォロブス・スルファタリカス（Sulfolobus
sulfataricus）S由来の2つの異なる1本鎖DNA結合タンパク質、すなわち、MjaSSB(AccuPrimeタンパク質I、50μlの反応液あたり100
ng)およびSsoSSB(AccuPrimeタンパク質II、300 ng)を含有する。抗体含量が低い組み合わせにおいて、新規製剤はロバスト性が良好で、特異性および感度が高いことが証明された(以下を参照されたい)。
【０２９３】
35個のプライマーセットおよび504 bp〜4.4 kbの範囲のアンプリコンを使用する性能比較において、AccuPrimeタンパク質IおよびAccuPrimeタンパク質IIの両方を含有する新規AccuPrime
Pfx製剤(製剤B)は、Platinum Pfx DNAポリメラーゼおよび旧型のAccuPrime Pfx製剤(製剤A)より優れていた(図35)。結果の統計分析を表13に示す。
【０２９４】
【表１３】
2006522582.tif 000074
【０２９５】
AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼ製剤は、酵素に対する抗体の比が低い(Ab1:Ab2:Pfx=2:2:1)のAccuPrimeタンパク質IおよびAccuPrimeタンパク質IIを含有する製剤Bで確定され、この時点においてAccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼを製剤Bと呼ぶ。
【０２９６】
しかし、AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼによる増強は、3 kb未満のアンプリコンサイズを標的とするプライマーセットの場合に大部分が示されることが観察された。これは、AccuPrime
Pfxが3 kbより長い標的に作用しないと言うことを意味するのではなく、長い標的の場合の性能は、少なくとも、12 kbもの長い標的を増幅することが以前に示されているPlatinum
Pfxのレベルである。表14は、アンプリコンが3 kbより短い場合のAccuPrime Pfx DNAポリメラーゼによる顕著な増強を示す。
【０２９７】
【表１４】
2006522582.tif 000075
【０２９８】
要約すると、AccuPrimeタンパク質は、感度および特異性においてPfx DNAポリメラーゼを増強する。しかし、異なる起源の2つのSSBタンパク質の併用効果が、個々のタンパク質による効果の合計より大きいことが観察されることは予想していなかった。AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼシステムに関する以前の検討は、MjaSSB(AccuPrimeタンパク質I)は、プライマーが非特異的にアニーリングしないようにし、非特異的にアニーリングするプライマーに対する競合的阻害剤として作用し、特異的にプライマーが結合した部位にポリメラーゼを補充し、必要とされる酵素の局所濃度を増加することによって、Taq
DNAポリメラーゼの特異性を増強することを明らかにした。AccuPrimeタンパク質IIは、PCR産物、場合によっては非特異的なものの収率を増加する際に、PCR酵素をかなりロバスト性にし(結果は別に報告されている)、明らかにAccuPrimeタンパク質Iとは異なる方法で機能している。
【０２９９】
SSBは、相同性および進化における配列の大きな保存性にもかかわらず、別のSSBと機能が異なったことは新規所見である。機能が異なる2つのSSBタンパク質が、PCR酵素の性能を増強する際に互いに補足することも独特である。このような新規特性により、そのことはAccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼを第1のPCR酵素にしている。
【０３００】
反応液におけるPfx増幅緩衝液の濃度が高いと、PCRにおけるPlatinum Pfx DNAポリメラーゼの活性を増強することが見出された。この観察は、AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼおよび3.6 Kb〜7.4 Kbのサイズ範囲のアンプリコンによるPCR反応セットによって確認した(図36)。しかし、3×緩衝液濃度は阻害作用があることが証明された。
【０３０１】
試験したほとんど全ての症例の全てにおいて、高い緩衝液濃度は、一般にPfx DNAポリメラーゼの全般的な性能を増強した。いくつかの場合において、増強効果は、使用したプライマーに依存して、一方のPfxの製剤では他方よりも高かったことも真実であると思われる。しかし、このような場合でも、低い程度の増強は、1×緩衝液濃度で得られた結果の増強であった。しかし、最良の結果をえるためには、緩衝液濃度を漸増することが必要であると思われる。この結果に基づいて、本発明者らが一定の性能を保証することができた、1×濃度をAccuPrime
Pfx反応ミックスの最終的な製剤において維持することに決定した。
【０３０２】
AccuPrime Pfx反応ミックスは全ての緩衝液成分を含有し、キットと共に提供される別個の増幅緩衝液はないので、PCR最適化の選択肢として緩衝液濃度の漸増を推奨することは困難であると思われる。緩衝液成分のいずれかまたは追加の因子が同様の増強効果を生ずるかどうかを調べる調査をした。そのために、硫酸アンモニウムおよび塩化カリウムを試験した。
【０３０３】
Hbg_3.6プライマーセットを使用してPCR反応セットを実施した。このプライマーセットはPlatinum Pfx DNAポリメラーゼの機能的QCアッセイ法に現在使用されており、おそらくAccuPrime
Pfx用でもある。図36の最初のパネルに見られるように、このプライマーセットによる増幅は容易な作業ではなかった。しかし、使用した全ての増幅選択肢は増幅を示す。使用した最適化選択肢は、2×Pfx増幅緩衝液、2.5×硫酸アンモニウムまたは40
mM KClである。図37の結果は、少なくともこのプライマーセットについては、反応ミックスへの硫酸アンモニウムまたは塩化カリウムの追加はPfx性能の同等または良好な増強を示すことを示した。KClを用いたいくつかの他のプライマーセットテストも、PCR最適化のためのKClの漸増は実行可能な選択肢であると思われることを証明した(データは示していない)。
【０３０４】
他の高忠実度PCR酵素に対するAccuPrime Pfx DNAポリメラーゼの比較調査
5つのプライマーセットおよび822〜6,816 bpの範囲のアンプリコン(c-myc 822 bp; p53 2380 bp; Hbg 3.6 kb;
Rhod 6173 bpおよびRhod 6816 bp)を使用する性能比較において、AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼの性能を、Pfu Turbo
DNAポリメラーゼ(Stratagene)、Pfu Ultra DNAポリメラーゼ(Stratagene)、Tgo DNAポリメラーゼ(Roche)およびKOD
Hot Start DNAポリメラーゼ(Novagen)などの他の主要な高忠実度ポリメラーゼと直接比較した。AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼは、収率、特異性、ロバスト性および一貫性において試験した他の全てを上回る優れた性能を示した(図38)。
【０３０５】
本発明者らは、Stratagene社のPfu Turbo DNAポリメラーゼの性能をPlatinum Pfx DNAポリメラーゼと対応させ、確かにAccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼの場合には上回った。
【０３０６】
考察
本発明者らは、次世代PCR酵素ファミリーの別のメンバー、すなわち、AccuPrime技術の開発をここで報告する。AccuPrime Taq DNAポリメラーゼシステムおよびその関連物AccuPrime
Taq PCR SuperMixは、Platinum技術に耐熱性AccuPrimeタンパク質を組み入れ、PCRにおいてPlatinum Taq DNAポリメラーゼを上回ってTaq
DNAポリメラーゼの性能を増強する。増強は、特性、感度およびロバスト性などの酵素のPCR性能の全ての局面において示される。システムの増強因子はAccuPrimeタンパク質Iすなわち、メタン細菌(Methanococcus
jannachii)由来の耐熱性SSBである。全ての生きている生物において複製時にDNAポリメラーゼを助けるように自然がSSBを設計したので、本発明者らはDNAポリメラーゼに対する増強効果を予想した。このような増強によりAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼシステムは、ハイスループットPCR、マルチプレックスPCRおよびPCR小型化などの多数の分野のPCR適用に好適になる。
【０３０７】
全ての高忠実度DNAポリメラーゼの最も細心の注意が必要なPCR適用に本発明者らがその技術を適用するのは当然のことである。酵素が、ポリメラーゼ活性以外にプルーフリーティングまたは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する高忠実度DNAポリメラーゼの性質による。ポリメラーゼのこのような相対する活性は、それらを有用にするが、PCR適用に利用するのを困難にしている。チャレンジは、本発明者らがAccuPrime技術をこのような細心の注意が必要な酵素に適用できるかどうかであった。明らかになったように、本発明者らは、高忠実度DNAポリメラーゼであるPfx
DNAポリメラーゼに対応するためにAccuPrime技術を改良しなければならなかった。改良は、第2のSSB、スルフォロブス・スルファタリカス（Sulfolobus
sulfataricus）由来のSSBすなわち、AccuPrimeタンパク質IIの追加を含む。機能的に相同であると思われるタンパク質対がポリメラーゼを増強する際に互いに補足することができたことは驚くべき所見である。AccuPrimeタンパク質の相補的な作用は、四次構造並びにssDNAおよびdsDNAの結合親和性などの2つのSSBの異なる特徴に由来する可能性がある。改良型AccuPrime技術を用いると、AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼは、現在の市場における他の全ての高忠実度の酵素より高い特異性および感度を有するロバスト性が高い高忠実度DNAポリメラーゼになる。
【０３０８】
システムの構成を表15に提供する。
【０３０９】
【表１５】
2006522582.tif 000076
【０３１０】
参照文献
2006522582.tif 000077
2006522582.tif 000078
【０３１１】
実施例6
SSB単独および併用によるTHERMALACE(商標)DNAポリメラーゼ性能の増強
ThermalAce(商標)DNAポリメラーゼ(Invitrogen Corp.)は、高い処理性および3'-5'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する耐熱性古細菌酵素である(米国特許第5,972,650号を参照されたい)。PCRは、ThermalAce(商標)DNAポリメラーゼをメタン細菌（M.
jannachii）SSB(MjaSSB)、水素資化性メタン菌（M. thermoautotrophicum）SSB(Mth SSB)およびS.
solfataricus SSB(SsoSSB)と併用使用して実施した。PCR反応液は、1〜100 ngのDNA鋳型(K562ヒトゲノムDNA、遺伝子型解析用)、100
ngの各増幅プライマー
2006522582.tif 000079
、200μMの各dNTP、ThermalAce(商標)緩衝液(Invitrogen Corp.)、滅菌水および2単位のThermalAce(商標)(最後に添加した)を含んだ。存在する場合には、SSBは0.1μg、0.2μgまたは0.4μgの濃度で含まれた。ThermalAce(商標)を添加したら、反応液を十分に混合し、氷上に置いてから、サーモサイクリングを実施した。サーモサイクリングパラメーターは以下のようである。
2006522582.tif 000080
【０３１２】
サーモサイクリング後、反応液を4℃において維持するかまたはもっと低い温度において保存した。反応液を0.8%水平型アガロースゲルで電気泳動した。
【０３１３】
一般に、SSBは特異的なPCR産物の収率を増加した(図39)。MjaSSBは特異的なPCR産物の収率を増加し、非特異的なPCR産物の収率を低下した。MthSSBは特異的なPCR産物の収率をMjaSSBで観察されるものと同じくらいのレベルに増加したが、非特異的産物の収率を低下しなかった。SsoSSBは、特異的なPCR産物および非特異的なPCR産物の収率を共に増加した。
【０３１４】
一定量のSSB(一方のSSBの300 ngまたは2つの異なるSSBの各々150 ngの併用)を使用し、サイズが590〜1959 bpの範囲のK562アンプリコンを標的とする6つの異なるプライマーセットを使用して別のアッセイ法を実施した。プライマーセットは以下のようであった。a)p53
590 bp；b)p53 839 bp；c)p53 1212 bp；d)c-myc 1243 bp；e)c-myc 1543 bpおよびf)c-myc
1959 bp。MjaSSBとSsoSSBの併用は、SSBの併用効果が、個別に添加されるSSBの効果の合計より大きくなると思われるように、収率を増加することが観察された(図40)。SSBの併用は、驚くべきことに、互いに補足すると思われる。
【０３１５】
実施例7
蛍光色素ターミネーターを用いるサイクルシークエンシングにおけるSSBの用途
本発明者らは、メタン細菌(Methanococcus jannachii)SSB(MjaSSB)が蛍光色素ターミネーターを用いるサイクルシークエンシングを改善することができるかどうかを試験した。サイクルシークエンシングは、ABI
Prism(登録商標)377 DNAシークエンサー、ABI Prism(登録商標)BigDye(商標)ターミネーターサイクルシークエンシングキット、0.25×BigDye
ReadiReaction Mixおよび種々の量のMjaSSBを使用して実施した。配列決定反応液は、20μlの反応あたり、500 ngの鋳型(遺伝子がattB部位間にクローニングされているプラスミド)および3.2
pmolのT7プロモーター配列決定用プライマー
2006522582.tif 000081
を含んだ。MjaSSBは反応あたり50または100 ngの濃度で含まれた。図41のパネルAは、SSBが存在しない場合のサイクルシークエンシング反応の結果を示す。位置35付近およびそれ以降の読み取り不可能な配列のピークパイルアップ(シグナル融合)はattBの二次構造によって生じる可能性がある。MjaSSBの添加はピークパイルアップを除き、読み取り可能な配列の鎖長を増加した(図41のパネルBおよびC)。
【０３１６】
他のサイクルシークエンシング反応は上記のようであるが、異なる濃度のMjaSSB(20μlの反応あたり20 ngおよび200 ng)、鋳型としてpCMV-Sport6発現構築物および1.9
pmolのプライマーを使用して実施した。Phredを使用して、各MjaSSB量(すなわち、0 ng、20 ngおよび200 ng)の約90の配列決定反応を分析した(例えば、Ewing,
B.ら(1998)Genome Res. 8: 175-185並びにEwing, BおよびP. Green(1998)Genome Res. 8:
186-194を参照されたい) 。Q値が20より大きいと言われている塩基の数(エラー率が1%未満であるといわれる塩基を示す)をスコアリングした。20 ngのMjaSSBが配列決定用反応液に存在する場合には、Q値が20より大きい塩基の数は平均約70%であった。同様に、200
ngのMjaSSBが存在する場合には、Q値が20より大きい塩基の数は平均約55%増加した。
【０３１７】
他の配列決定反応は、読み取り可能な配列の鎖長を最大にするようにMjaSSBの量を漸増した以外は、すぐ上に上記するように実施した。読み取り可能な配列は、配列決定反応中のPhred
Q値が20より大きい塩基の数と規定した。図42は、30 ngのMjaSSBの添加は読み取り可能な配列の鎖長を約370塩基から500塩基以上に増加したことを示す。
【０３１８】
実施例8
細菌宿主における古細菌SSBの発現を増強するためのコドン最適化
序文
コドン使用の偏りは、真核細胞もしくは古細菌タンパク質を細菌にクローニングして発現する場合またはその逆の場合に問題になることがある。コドン使用の偏りに関連する問題には、切断型ペプチド産物、フレームシフト突然変異、点突然変異および極端な例では細胞増殖が停止するタンパク質合成の一般的な効率の悪さまたは阻害が挙げられる。コドン使用の偏りに関連する問題を回避するために通常4つの方法が使用される：1)レアtRNAの同時発現(例えば、レアtRNA遺伝子を補足した市販の株を使用する)；2)完全長のポリペプチドだけが精製されうるようにc-末端親和性タギング；3)レアコドンをより一般的なものと交換するための部位特異的突然変異および4)コドン使用頻度が互換性の高い別の宿主を使用する。第3の方法を使用すると、遺伝子(例えば、SSBをコードする遺伝子)の1つまたは複数のレアコドンは、望ましい発現レベルに応じて、特定の宿主における発現を改善するように最適化することができる。従って、1つのレアコドンまたは大きな割合(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%および100%)のレアコドンをSSB遺伝子において最適化することができる。
【０３１９】
大腸菌(E. coli)において古細菌SSBを発現し、精製する試みは、コドン使用の偏りに関連する問題に対処している。例えば、メタン細菌(Methanococcus
jannachii)(MjaSSB)およびスルフォロブス・スルファタリカス（Sulfolobus sulfataricus）(SsoSSB)のSSBはBL21(DE3)細胞において比較的低レベルで発現される。また、SsoSSBは、短いペプチド、おそらく早期停止によって生じる切断型タンパク質と同時精製される。短いペプチドが十分に高い量で存在すると、SsoSSBが媒介するPCRの改善を無効にすることがある。
【０３２０】
MjasSSBおよびSsoSSB遺伝子は、大腸菌(E. coli)ではまれにしか使用されないコドンを使用する。例えば、未処理のMjaSSBおよびSsoSSB遺伝子では、AGAまたはAGGはアルギニンを要求し、ATAはイソロイシンを要求し、CTAはロイシンを要求する(表16および17；レアコドンは下線をつけてある)。これらのレアコドンの多くはタンデムペアまたはトリプレットの形態で存在し、低発現レベルおよび／または切断型ペプチド不純物の原因となることがある。
【０３２１】
【表１６】
2006522582.tif 000082
【０３２２】
【表１７】
2006522582.tif 000083
2006522582.tif 000084
【０３２３】
SsoSSBのコドン最適化
SsoSSBの低発現がコドン使用の偏りに関連するかどうかを試験するために、未処理の遺伝子を、Arg(AGA、AGG)、Ile(AUA)およびLeu(CUA)レアコドンの補足のtRNA遺伝子(Stratagene)と共にBL21
CodonPlusに形質転換した。この宿主で発現されると、SsoSSBは高レベルで作製され(図43のレーン12とレーン13を比較されたい)、精製後切断型ペプチドは少なかった(図30および31を図28と比較されたい)。
【０３２４】
本発明者らは、「合成遺伝子」技術を使用して、SsoSSB遺伝子のレアコドンを大腸菌(E. coli)に一般的なコドンと交換した(Stemmer, W. P.ら(1995)
Gene 164: 49-53)。従って、AGAおよびAGGは、CGG、CGT、CGAまたはCGCによって交換され；ATAはATTまたはATCによって交換され；CTAはCTT、CTGまたはCTAによって交換された(表18；最適化したコドンは下線をつけ、太字の斜体で記載されている)。
【０３２５】
【表１８】
2006522582.tif 000085
【０３２６】
コドン最適化したSsoSSB遺伝子を作製するために、21の重複プライマーを使用した(表19)。プライマーは等量(約4.5 uM)を鋳型DNAを含有しないPCR反応液において混合した。Taq
Hi-FI Supermix(Invitrogen Corp.)を使用してPCRを実施した。サーモサイクラーは、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリングおよび72℃で30の伸長を20サイクル実施するようにプログラムした。このPCR反応液の少量(2μlまたは容量の1/25)を、再会合した遺伝子の5'および3'末端にアニーリングする2つの2アンカープライマーと共に第2のPCR反応液に添加した(表19)。これらのプライマーも、遺伝子の5'末端にNdeI部位を、3'末端にBamHI部位を付加する。上記のように設定したパラメーターを使用してPCRをさらに2ラウンド実施後、約450塩基対の別個産物を得た。この産物を電気泳動ゲルから切断し、精製し、pET21aベクターのマルチクローニングサイトのNdeIおよびBamHI部位にクローニングした。得られたクローンは配列を確認するために配列決定した。
【０３２７】
【表１９】
2006522582.tif 000086
2006522582.tif 000087
【０３２８】
組換えコドン最適化SsoSSB遺伝子を含有するpET21aをBL21(DE3)およびBL21(DE3)-AI(アラビノース誘導性)株に形質転換した。誘導培養物および未誘導培養物の溶解液に存在するSsoSSBのレベルを、BL21(DE3)-AIおよびBL21-CodonPlusにおいて未処理のSsoSSB遺伝子を発現させることによって得られるSsoSSBの量と比較した。細胞は超音波処理によって溶解し、80℃において1時間加熱し、可溶性画分を、マーカーとしての精製タンパク質と共にSDSゲルで分析した(図43)。未誘導の培養物では、任意の発現は観察されてもごくわずかであった(図43、レーン1〜6)。誘導した場合には、rSsoSSBは、BL21-CodonPlusにおける未処理のSsoSSBと比較して、BL21(DE3)細胞における発現が同じかまたは優れていた(図43においてレーン10および11をレーン12と比較されたい)。BL21(DE3)-AIにおいてrSoSSBを使用すると、未処理のSsoSSBと比較したとき、大量の発現が観察された(図43においてレーン8および9をレーン13と比較されたい)。
【０３２９】
SsoSSBタンパク質は、rSsoSSBを発現するBL21(DE3)宿主の2リッターの培養物から精製した。精製は、培養物をアンピシリンを添加したLB培地で増殖させたことを除いて、実施例5に記載するように実施した。簡単に説明すると、細胞を、アンピシリンを添加した2リッターのLB培地でODが1.0に達するまで増殖させ、IPTGを最終濃度1
mMまで添加することによってタンパク質の発現を誘導した。2時間後、遠心分離によって細胞を採取し、超音波処理によって溶解し、80℃において1時間加熱処理し、遠心分離によって浄化した。可溶性画分を10
mlのEMD-SO3カラムにロードし、最初は50〜650 mM NaClの直線的な濃度勾配で溶出し、次いで650 mM NaClで溶出した(図44)。画分をSDS
PAGEで分析し、17.4 KDaのタンパク質を含有する画分をプールした(図44および45A)。プールを保存緩衝液(20 mM NaCl、20 mM Tris、pH
7.5、1 mM EDTA、1 mM DTTおよび10%グリセロール)で透析した。得られたタンパク質調製物は、SDS-PAGEによって純度が95%を超えることが観察された(図45B)。
【０３３０】
MjaSSBのコドン最適化
コドン最適化したMjaSSB遺伝子の配列を表20に示し、最適化部分は下線をつけ、太字の斜体で示す。
【０３３１】
【表２０】
2006522582.tif 000088
2006522582.tif 000089
【０３３２】
表21において同定されているプライマーは、SsoSSB遺伝子について実施した技術と同じように、「合成遺伝子」技術を使用して、MjaSSB遺伝子のレアコドンを大腸菌(E.
coli)に一般的なコドンと交換するために使用した。順方向および逆方向のプライマーは鎖長約60ヌクレオチドであり、隣接プライマーと少なくとも15ヌクレオチドが重複している。
【０３３３】
【表２１】
2006522582.tif 000090
2006522582.tif 000091
2006522582.tif 000092
【０３３４】
本発明は、本発明のある態様を参照して記載されている。しかし、本発明の範囲は記載されている態様に限定されない。本発明の範囲から逸脱することなく、他の態様を実施することができることを当業者は容易に理解している。このような変更は全て本発明の一部であり、従って本発明に含まれると考えられる。
【０３３５】
本明細書に記載する全ての文献、特許および特許出願は、本発明が属する当技術分野の当業者のレベルを示すものであり、個々の文献、特許または特許出願各々が具体的且つ個別に参照として組み入れられていることが示されているものと同じ程度で参照として本明細書に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
(図１)AccuPrimeタンパク質精製の中間段階の試料のSDS PAGE分析である。精製後のタンパク質(レーン4)は、対照タンパク質(レーン5)と比較して、不純タンパク質が少ないことを示した。レーン1、過剰発現したAccuPrimeタンパク質を含有する細菌溶解物；レーン2、Ni-NTAアガロースカラムの、AccuPrimeタンパク質を含有するピークの画分プール；レーン3a、ssDNAアガロースカラムの、AccuPrimeタンパク質を含有するピークの画分プール；レーン3b、ssDNAアガロースカラムの、AccuPrimeタンパク質を含有する主要なピーク直後の画分プール；レーン4、Mono
Q(5/5)カラムのAccuPrimeタンパク質を含有するピークの画分プール；レーン5、UC Davisグループから入手した対照AccuPrimeタンパク質。
(図２)改良したプロトコールによって精製したAccuPrimeタンパク質調製物のSDS PAGE比較である。改良したプロトコールは、カラムクロマトグラフィー用の緩衝液中にプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する。Ni-NTAカラム段階において十分に洗浄することにより、1つのカラムだけを使用して、対照と同じくらい純粋なタンパク質が得られる：レーン1、十分な洗浄後にNi-NTAアガロースカラムから溶出したAccuPrimeタンパク質(10カラム容量の洗浄)；レーン2、中程度の洗浄後にNi-NTAアガロースカラムから溶出したAccuPrimeタンパク質(5カラム容量の洗浄)；レーン3、UC,
Davisからの対照AccuPrimeタンパク質。
(図３)AccuPrimeタンパク質調製物(ロット3および4)のエンドヌクレアーゼ活性アッセイ法である。このアッセイ法は、高次コイルの環状dsDNAのリラックス型環状分子への変換の程度をチェックしている：レーン1および6、対照DNA(φX174)単独；レーン2および3、それぞれ、10×および20×の対照AccuPrimeタンパク質と共にインキュベーションしたφX174
DNA；レーン4および5、それぞれ、10×および20×のAccuPrimeタンパク質(ロット3)と共にインキュベーションしたφX174 DNA；レーン7および8、それぞれ、10×および20×のAccuPrimeタンパク質(ロット4)と共にインキュベーションしたφX174
DNA；レーン9〜15、それぞれ、レーン1、2、3、4、5、7および8の繰り返しで、添加した試料は2倍多い。レーン2、3、10および11は、高次コイルDNAへのAccuPrimeタンパク質の結合を示す。
(図４)AccuPrimeタンパク質調製物(ロット3および4)のエキソヌクレアーゼ活性のアッセイ法である。エキソヌクレアーゼアッセイ法は、72℃において30分間エキソヌクレアーゼ活性についておよび内部エキソヌクレアーゼ活性について実施した。アッセイ法は、検出可能なヌクレアーゼ活性を示さない。37℃においてインキュベーションすることにより、分解産物がないことを示す同様のゲルを生じた。
(図５)86 merのAccuPrimeタンパク質の電気泳動移動度シフトアッセイ法(EMSA)である。指定の量のAccuPrimeタンパク質をオリゴヌクレオチドに添加し、70℃において5分間インキュベーションし、反応液の少量を、電流が流れている6%未変性ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動は100Vにおいて1時間実施し、ゲルを乾燥して、オートラジオグラフ分析を実施した。ゲルはシフトしたバンドの前方にスーパーシフトを示し、オリゴヌクレオチド分子への第2のタンパク質の結合を示している。タンパク質濃度が増加すると、シフトの強度は増加したが、スーパーシフトは変わらず、負の協同性を示している。
(図６)種々の条件下において、SSB(AccuPrimeタンパク質または大腸菌(E. coli)SSB)の存在下におけるTaq DNAポリメラーゼのユニットアッセイ法である。タンパク質濃度が増加すると、一般的な阻害傾向を示す大腸菌(E.
coli)SSBとは異なり、AccuPrimeタンパク質は、濃度依存的にTaq DNAポリメラーゼユニット活性を増加し、最適な増加は0.1 mg/50mlタンパク質のAccuPrimeタンパク質濃度でポリメラーゼの最適以下の条件下で達成される。
(図７)AccuPrimeタンパク質によるTaq DNAポリメラーゼのユニット活性増加の濃度依存性である。温度依存的な増加は3つの相：65℃までの第1の温度非依存的な相、温度に正比例し、70℃において最大である第2の相および70℃を超える温度に逆比例する第3の相を示す。
(図８)AccuPrimeタンパク質の存在下または非存在下において特異的なプライマーと鋳型としての1本鎖環状M13mp19DNAを使用して、Taq DNAポリメラーゼによるプライマー伸長産物のアルカリ性アガロースゲル電気泳動のスキャンプロファイルである：(A)
AccuPrimeタンパク質の非存在下におけるプライマー伸長；(B)50 ng AccuPrimeタンパク質/50 ml rxnを用いたプライマー伸長；(C)100
ng AccuPrimeタンパク質/50 ml rxnを用いたプライマー伸長および(D)100 ng MthSSB/50 ml rxnを用いたプライマー伸長。結果は、50
ml rxnに100 ngのAccuPrimeタンパク質が存在する場合には、伸長産物のピーク集団は低分子量方向にシフトすることを示し、ポリメラーゼは、対照と比較したときAccuPrimeタンパク質の存在下ではプライマーの伸長が短いことを示している。この現象は1.5分の経過時点において一番明らかであった。下のパネル(CおよびD)のゲルの上部に示す第2のピークは上のパネルのプライマーである。
(図９)10×AccuPrimeタンパク質Taq PCR反応ミックスおよび2×AccuPrimeTaq PCRスーパーミックスの加速安定性アッセイ法である。右側の矢印はプライマーセットから予想される産物を示す。-20℃における半年間の保存(42℃において2日)および1年の保存(42℃において4日)と等価なインキュベーション後でも、反応ミックスは対照と同じくらい良好に機能することが示されている。添加した外部ヌクレオチド源は性能が良好であるが、ヌクレオチドと共に-20℃において保存したものは性能が不良であったので、ミックスを調製するために使用したヌクレオチドミックスは適切に機能していないこともゲルは示している。
(図１０)室温において最長6ヶ月までのAccuPrime Taq PCR反応ミックスおよびスーパーミックスのリアルタイム安定性アッセイ法である。各試料はデュープリケートで実施した。パネルAレーン1および12、PlatinumTaq
DNAポリメラーゼ対照；レーン2、AccuPrime Taq PCR反応ミックスI(RMI)対照；レーン3〜6、室温においてそれぞれ1、2、3および6ヶ月インキュベーション後のRMI；レーン7、グリセロール(RMI-gly)対照を使用しない場合のAccuPrime
Taq PCR反応ミックスI；レーン8〜11、室温においてそれぞれ1、2、3および6ヶ月インキュベーション後のRMI-gly；レーン13、AccuPrime
Taq PCRスーパーミックスI(SMI)対照；レーン8〜11、室温においてそれぞれ1、2、3および6ヶ月インキュベーション後のSMI。パネルBは、パネルAに示すグリセロールが存在する場合および存在しない場合におけるAccuPrime
Taq PCR反応ミックスII並びにAccuPrime Taq PCRスーパーミックスIIの対応物を示す。
(図１１)AccuPrime Taq DNAポリメラーゼによるPCR増幅産物によるTOPO TAクローニングである。2つの異なるプライマーセットを使用したPCR増幅産物をpCR2.1
TOPOベクターにクローニングし、TOP10細胞に形質転換し、各形質転換から6つの形質転換体を無作為に選択した。形質転換体から精製したプラスミドを、挿入が正しく行われているかどうかについてチェックし、隣接領域の配列決定をして、5'末端にTT、3'末端にAAが隣接していることを確認した。配列決定は、TTおよびAAが隣接する正しい挿入(青い矢印)を示し、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼが、TOPO TAクローニングに必要な3'Aオーバーハングを付加したことを示している。
(図１２)AccuPrime Taq DNAポリメラーゼが媒介するPCRによる増幅産物の制限酵素消化アッセイ法である。PCRは、反応に50 ngまたは200
ngのゲノムDNA鋳型(K562)を用いて実施した。PCR後、5〜10μlの増幅反応ミックスを20μlの制限消化反応に直接使用した。2つの異なる消化反応は、PCRミックスで実施した成分による検出可能な妨害を示さなかった。
(図１３)1〜4.4 kbのアプリコンサイズをカバーする4つの異なるプライマーセットを使用した、AccuPrime TaqとTaq単独およびHot
Star Taq(Qiagen)のPCR性能の比較である。AccuPrime Taqは、特異性および特定の産物の収率において他より優れていた。
(図１４)アプリコンサイズに基づいた2つのプライマーセットを使用した、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼとHot Star
Taq(Qiagen)の性能比較である；(A)β-グロビン、468 bp；β-グロビン、731 bp；c-myc、822 bp；β-グロビン、1100 bpおよびHpfh、1,350
bp、(B)β-グロビン、2.2 kbおよびβ-グロビン3.6 kb。AccuPrime Taqは、最大3.6 kbまでのアプリコンサイズにかかわらず、常に高い特異性で機能するが、Hot
Start Taqは、アプリコンサイズが増加すると、非特異的なバンドを形成する傾向が強かった。
(図１５)Taq DNAポリメラーゼまたはHot Star Taq(Qiagen)と比較した、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼによる偽プライミング部位の識別である。偽プライミング部位は、逆方向プライマーの3'末端の13ヌクレオチドがアニーリングすると思われる鋳型の350
bp離れた2箇所の異なる位置に13塩基の相同体を導入した。長さ20ヌクレオチドの逆方向プライマーの残りの7ヌクレオチドが真のプライミング部位(13951)にアニーリングする。AccuPrime
Taqだけが、高い収率を維持して、13塩基の相同プライミングを識別した。
(図１６)PCR反応におけるMjaSSBの機序を略図で示す。図において、
2006522582.tif 000093
はTaq DNAポリメラーゼを示し、
2006522582.tif 000094
は抗 Taq DNAポリメラーゼ抗体を示し、
2006522582.tif 000095
は熱変性した抗体を示し、
2006522582.tif 000096
はAccuPrimeタンパク質を示し、−はDNA分子を示し、
2006522582.tif 000097
はプライマーを示し、
2006522582.tif 000098
は非特異的にアニーリングしたプライマーを示し、・・・・は新規に合成されたDNAを示す。この略図は、特異的なプライマー-鋳型複合体の安定剤、非特異的なプライマーアニーリングのための競合的阻害剤および特異的にプライミングした部位へのTaq
DNAポリメラーゼのリクルーターとしてのMjaSSBの機能を図示する。
(図１７)AccuPrime Taq DNAポリメラーゼを使用したPCR小型化の実現可能性アッセイ法である。Taq DNAポリメラーゼ単独とは異なり、AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼは反応容量にかかわらず効率的に機能し、酵素自体の量は、反応の信頼性または特異性を損失することなく、反応容量に比例して減少することができた。
(図１８)AccuPrime Taq DNAポリメラーゼおよび鋳型として反応あたり5 ngのヒトゲノムDNA(K562)を使用したPCR小型化である。プライマーは、長さ1013
bpのアプリコンを増幅するように設計した。PlatinumTaq DNAポリメラーゼとは異なり、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼは反応容量にかかわらず効率的に機能し、酵素自体の量は、反応の信頼性または特異性を損失することなく、反応容量に比例して減少することができた。
(図１９)Taq DNAポリメラーゼまたはPlatinumTaq DNAポリメラーゼに添加するAccuPrimeタンパク質の量を増加させた場合の異なる鋳型(GC70%)のPCR増幅である。1×AccuPrimeタンパク質濃度(400
ng/50 ml rxn)のTaq DNAポリメラーゼの場合に、特定の産物の収率の顕著な改善が示される。PlatinumTaq DNAポリメラーゼ単独はTaq
DNAポリメラーゼ単独より優れていたが、高い特異性で特定の産物を増幅するためにはAccuPrimeタンパク質の添加が必要である。
(図２０)PCRxエンハンサー溶液を組み合わせた場合の異なる鋳型(GCリッチ)のPCR増幅である。1×PCRx濃度でもAccuPrime Taq DNAポリメラーゼの場合には特定の産物の収率の顕著な改善が示される。PlatinumTaqの場合には、特異性の任意の増加を得るには少なくとも3×PCRxが必要であった。
(図２１)標的アプリコンとして性別特異的な遺伝子のPCR増幅を使用する遺伝子型同定である。遺伝子SRYおよびDYS-391は共にY染色体に存在するので、雄のゲノムDNAだけが特異的な標的を有すると思われる。どちらの場合も、AccuPrime
Taq(AP Taq)は、バックグラウンドを抑えて、特異的な増幅産物を示した。対照HotStar Taq(HS Taq)は、特にSRY遺伝子においてバックグラウンドに多数の非特異的産物を示した。
(図２２)50 ml反応において鋳型として100 ngのヒトゲノムDNAを用いた12セットのプライマーのマルチプレックスPCRである。5単位のAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼを用いて12のアプリコンを全て増幅した。しかし、収率(バンド強度)は、アプリコンの数が増加してもアプリコン間で一定であり、AccuPrime
Taqを用いたマルチプレックスPCR適用が堅牢であり、個々のプライマーセットの最適性は小さいことを示した。
(図２３)種々の量のポリメラーゼを用いた20セットのプライマーのマルチプレックスPCRである。2、5または10単位のTaqまたはAccuPrime Taqを用いて20のアプリコンを全て増幅した。しかし、アプリコン間のバンド強度(収率)の変動は、AccuPrime
Taqでは小さく、AccuPrime Taqを用いたマルチプレックスPCRが堅牢であり、必要な最適性は小さいことを示した。
(図２４)PlatinumTaqとAccuPrime Taqのハイスループットスクリーニングの比較である。終夜インキュベーションしたプレートのコロニーをピペットチップで「採取し」、PCR反応ミックスと混合して18サイクルのPCRを実施した。AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼだけが、96のコロニーの90%を超えるコロニーの特定のアプリコンの増幅に成功できた。AccuPrime Taq DNAポリメラーゼの高い感度により、この種類のハイスループット適用が可能になった。
(図２５)6セットのプライマーおよび264〜4,350 bpの範囲のアプリコン(Pr 1.3, 264 bp；Rhod, 646 bp；β-グロビン,
731 bp；Hpfh, 1,350 bp；p53, 2,108 bp；p53, 4,350 bp)を使用した、AccuPrime Taq DNAポリメラーゼとTaq
DNAポリメラーゼおよび他のホットスタートポリメラーゼ(AmpliTaq Gold, Perkin Elmer；Jump Start、Sigma；Fast
Start, Roche；Hot Star, Qiagen；Sure Start、Stratagene)の性能の比較である。AccuPrime Taqは、アプリコンサイズにかかわらず、最も高い特異性と一定の収率を示す。AccuPrime
Taq DNAポリメラーゼによる収率が最も高い。
(図２６)4セットのプライマー(Pr 1.3, 264 bp；Rhod, 646 bp；β-グロビン, 731 bp；Hpfh, 1,350 bp)を使用した、2段階PCR(94℃における変性後、1段階におけるアニーリングおよび伸長)におけるAccuPrime
Taq DNAポリメラーゼとAmpliTag Gold(Perkin Elmer)の性能の比較である。AccuPrime Taqは、アニーリング温度にかかわらず、常に高い特異性および高い収率で性能を発揮したが、AmpliTag
Goldは各プライマーセットに必要なアニーリング温度範囲が狭かった。結果は、AccuPrime Taqに必要な最適性は、AmpliTag Goldと比較して小さいことを示している。
(図２７)BL21(DE3)CodonPLus(Stratagene)株からAccuPrimeタンパク質IIを精製するためのEMD-SO3カラムクロマトグラフィーの溶出プロファイルである。洗浄および溶出過程において、2.5
mlの画分を回収した。50から650 mM NaClによる濃度勾配溶出、次に650 mM NaClによる溶出は、ショルダー部分(画分38〜44)の不純物を含有するタンパク質を分離するが、50から1000
mMの塩による濃度勾配溶出は、不純物とタンパク質を同時に溶出する(図2のゲル電気泳動を参照されたい)。
(図２８)BL21(DE3)CodonPlus宿主のFractogel EMD-SO3カラムによる画分のクロス-カラム分析のためのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex
4〜20%トリスグリシンゲル)である。ゲルのレーンは以下を含有する：M)マーカー(BenchMarkタンパク質ラダー、Invitrogen)；1)素通り画分；2)画分#24(2.5
ml画分)；3)画分#28；4)画分#32；5)画分#34；6)画分#38；7)画分#40；8)画分#42；9)画分#44；10)画分#48および11)画分#52。ゲルは2つのピークを示し、AccuPrimeタンパク質IIは主要な成分として溶出し、第1のピークは第2のピークより不純物を多く含有する。実際、第2のピークのAccuPrimeタンパク質IIの純度は、宿主から1段階精製を可能にするほど十分に高い。
(図２９)改良したプロトコールの精製段階のためのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex 4〜20%トリスグリシンゲル)分析である。ゲルのレーンは以下を含有する：M)マーカー；1)溶解物；2)熱処理段階の上清；3)EMD-SO3カラムのロード；4)
EMD-SO3カラムからの素通り画分および5)EMD-SO3カラムの第2のピークの画分プール。ゲルは、EMD-SO3カラムにおけるAccuPrimeタンパク質IIのほぼ完全な保持およびカラム段階によって90〜95%の純度が得られることを示し、タンパク質の1段階精製の妥当性を示唆している。
(図３０)BL21(DE3)宿主のEMD-SO3カラムによる画分のクロス-カラム分析のためのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex
4〜20%トリスグリシンゲル)である。ゲルのレーンは以下を含有する：M)マーカー；1)溶解物；2)熱処理上清；3)素通り画分；4)50 mM NaClによる洗浄；5)画分#29(2.5
ml画分)；6)#31；7)#33；8)#35；9)#36；10)#38；11)#40；12)#42；13)#44；14)#46；15)#48；16)#50；17)#52；18)#54；19)#56；20)#60；21)#65および22)#69。ゲルは、AccuPrimeタンパク質IIは以前と同様に(図2)2つのピークで溶出するが、第2のピークは依然としてかなりの量の不純物を含有することを示している。
(図３１)BL21(DE3)宿主のCHT2-1ヒドロキシアパタイトカラムによる画分のクロス-カラム分析のためのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex
4〜20%トリスグリシンゲル)である。レーンMはマーカーを示す。1)ロード(EMD-SO3からのプール)；2)素通り画分；3)50 mM
リン酸Naによる洗浄；4)直線的濃度勾配法による#6画分(各1 ml)；5)#8；6)#9；7)#11；8)#13；9)#15；10)#20および11)500
mMリン酸Na溶出による#10画分。ゲルは洗浄段階において溶出される不純物の大半を示す（レーン3）が、AccuPrimeタンパク質IIは濃度勾配中に溶出される(レーン5)。
(図３２)50μlの反応溶液において種々の量のAccuPrimeタンパク質と共に37℃において1時間インキュベーションした高次コイル環状プラスミド(φX174)を使用したエンドヌクレアーゼ活性アッセイ法である。得られたプラスミドを5μlの10×BlueJuiceと混合し、リラックス型環状または直鎖状DNAの出現について0.8%アガロースゲル上で分析した。レーン1〜4は、市販のPlatinumPfx増幅緩衝液とそれぞれ、0μg、0.75(2.5×)μg、1.5(5×)μgおよび3(10×)μgのAccuPrimeタンパク質II(APP
II)から作製した試料由来であった。レーン5〜8は、全ての成分がパイロットロット用に集められたことを除いてレーン1〜4と同じであった。レーン9〜12は、それぞれ、0μg、0.5(5×)μg、1(10×)μgおよび2(20×)μgの量のAccuPrimeタンパク質I(APP
I)を含有する。パネル(A)の試料は1×BlueJuiceに含有され、加熱しないでゲルにロードした。パネル(B)の試料は1×BlueJuice中で95℃において5分間加熱し、ゲルにロードした。パネル(C)の試料は1×BlueJuiceおよび0.5%
SDS中で95℃において5分間加熱し、ゲルにロードした。ゲルは、DNAバンドの移動度をシフトさせたAccuPrimeタンパク質IIの強力な結合とSDSがなくても熱処理に耐えることを明らかに示す。AccuPrimeタンパク質Iは、SDSが存在しない場合でも95℃における5分間の加熱の結果、DNAから作製された。
(図３３)精製したAccuPrimeタンパク質II(APP II)のPCR機能アッセイ法である。PCRは、示すようにAccuPrimeタンパク質の存在下または非存在下においてPlatinum
Pfxを用いて実施した。プライマーセット(p53 2380 bp)はヒトp53遺伝子を標的とし、遺伝子の2380 bpセグメントを増幅する。PCR産物をBlueJuiceと混合し、0.8%アガロースゲルにロードして分析した。Platinum
Pfxによる特定のPCR産物(矢印で示す)の強度は、AccuPrimeタンパク質II(APP II)の量が100 ngのAccuPrimeタンパク質I(APP
I)の存在下において増加すると、増大されることを示した。
(図３４)AccuPrimeタンパク質IIを作製する際の宿主DNA混入アッセイ法である。アッセイ法は、2つの異なるポリメラーゼ、PfxおよびTaq DNAポリメラーゼを用い、DNA鋳型を添加しないで、1×(50μlの反応液あたり300
ng)または2×(600 ng)濃度の変性AccuPrimeタンパク質IIの存在下において、大腸菌(E. coli)ゲノム(priA)のシングルコピー遺伝子を標的とするプライマーセットを使用するPCRで実施した。対照反応は、混入しているDNAの量を推定する際に濃度マーカーとして作用する既知量の大腸菌(E.
coli)ゲノムDNAを含有する。
(図３５)反応ミックスにAccuPrimeタンパク質IおよびAccuPrimeタンパク質IIの両方を添加することによるPfx DNAポリメラーゼに対するPCR増強作用の選択した例である。「Cont」はPlatinum
Pfx DNAポリメラーゼ対照を示し、「A」は調製物A(AccuPrimeタンパク質Iのみ)を示し、「B」は調製物B(AccuPrimeタンパク質IおよびAccuPrimeタンパク質IIの両方)を示す。調製物Aは、Rhod_670およびRhod_3831などの数例においてわずかな増強が見られたが、調製物Bは、いくつかの例において収率、特異性または両方の顕著な増強が見られたことをゲルは示す。
(図３６)Pfx増幅緩衝液濃度を増加することによるPCR最適化の選択した例である。緩衝液濃度は、最高2.5×まで0.5×の増分で増加した。高い濃度の緩衝液は阻害作用があることが証明された。ゲルが示すように、緩衝強度の増加が調製物(白金、調製物Aまたは調製物B)に関係なく全体的な性能を増強す場合もあれば、AccuPrime
Pfxからなる調製物Bだけが増強する場合もあり、白金および調製物Aが増強する場合もある。しかし、緩衝強度の漸増は、AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼのPCR性能を増強するための一選択肢であると思われる。
(図３７)追加の成分を添加することによるPCR最適化の選択した例である。PCR反応は、比較を容易にするために異なる最適化スキームのためにHbg_3.6プライマーセットを用いて実施した。Pfx増幅緩衝液は18
mMの硫酸アンモニウムを含有するので、45 mMの硫酸アンモニウムが2.5×の緩衝液と等価であると思われる。KClはPfxの全く新たな成分であるが、一般にTaq
PCR緩衝液に使用される。ゲルが示すように、追加の成分は、AccuPrime Pfxの全体的な性能を増強することができた。これは、AccuPrime Pfx
DNAポリメラーゼのPCR性能を増強するための別の選択肢となる。
(図３８)AccuPrime Pfx DNAポリメラーゼとPfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stragene)、Pfu Ultra DNAポリメラーゼ(Stragene)、Tgo
DNAポリメラーゼ(Roche)およびKOD Hot Start DNAポリメラーゼ(Novagen)の競合的検査である。各酵素を使用して、100〜200
ngのヒトゲノムDNA(K562、遺伝子型同定用)を使用した822 bp〜6816 bpの範囲の標的を増幅するために使用した。それらは：1)c-myc 822
bp;2)p53 2380 bp;3)Hbg 3.6kb;4)Rhod 6173 bpおよび5)Rhod 6816 bpである(詳細は材料と方法を参照されたい)。ゲルは、AccuPrime
Pfx DNAポリメラーゼの競合相手の産物を上回る明白で一定の性能を示す。
(図３９)ThermalAce(商標)DNAポリメラーゼをSSBと併用使用したPCRである。PCRは、メタン細菌(M. jannachii)、水素資化性メタン菌(M.
thermoautotrophicum)またはスルフォロブス・スルファタリカス（S. solfataricus）のSSBを使用して実施した。
(図４０)ThermalAce(商標)DNAポリメラーゼを、個別に添加および組み合わせてSSBと併用使用したPCRである。
(図４１)ABI Prism(登録商標)BigDye(商標)Terminator Cycleシークエンシングキットを用いたサイクルシークエンシングにおけるメタン細菌(Methanococcus
jannachii)SSBの使用である。
(図４２)ABI Prism(登録商標)BigDye(商標)Terminator Cycleシークエンシングキットを用いたサイクルシークエンシングにおけるメタン細菌(Methanococcus
jannachii)SSBの使用である。
(図４３)種々の大腸菌(E. coli)宿主における組換えSsoSSB(rSsoSSB;コドン最適化)の発現プロファイリングのためのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex
4〜20% Tris Glicineゲル)である: BL21(DE3); BL21(DE3)-AI(アラビノース誘導)およびBL21-CodonPlus(レアコドンの供給)。SSBタンパク質を誘導した(レーン8〜13)または誘導しない(レーン1〜6)の細菌培養物の溶解物を熱処理して、ゲルにロードし、発現されるタンパク質レベルを見た。特に、レーンには以下のようにロードした:レーン1および2、誘導していないBL21(DE3)-AIのrSsoSSBのデュープリケート;レーン3および4、誘導していないBL21(DE3)のrSsoSSBのデュープリケート;レーン5、誘導していないBL-21-CodonPlusの野生型SsoSSB;レーン6、誘導していないBL21(DE3)-AIの野生型SsoSSB;レーン8および9、誘導したBL21(DE3)-AIのrSsoSSBのデュープリケート;レーン10および11、誘導したBL21(DE3)のrSsoSSBのデュープリケート;レーン12、誘導したBL-21-CodonPlusの野生型SsoSSBおよびレーン13、誘導したBL21(DE3)-AIの野生型SsoSSB。レーン7は、対照として作用する精製した野生型SsoSSBを含有する。
(図４４)BL21(DE3)宿主のrSsoSSBのEMD-SO3カラムクロマトグラフィーの溶出プロファイルである。タンパク質は、50〜650
mMのNaCl濃度勾配、次に650 mMのNaClにより溶出した。主要なタンパク質ピークは、高塩濃度溶出により溶出した。ショルダーは大量の切断型タンパク質を含有する。画分26〜30をプールし、保存緩衝液で透析した。
(図４５)(A)EMD-SO4画分のSDSゲルである。Lはロードであり、FTはロード素通り画分である。画分26〜30をプールした。(B)プールした画分を透析し、2
ugまたは5 ugを、Codon Plus 細胞から精製したSso SSBと共にSDSゲルで分析した。1はCodon PLus由来のオリジナルであり、2は、BL21
DE3由来のrSso SSBである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2006522582.tif 000101
【図４】
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【図５】
2006522582.tif 000103
【図６】
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【図７】
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【図８】
2006522582.tif 000106
【図９】
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【図１０】
2006522582.tif 000108
【図１１Ａ】
2006522582.tif 000109
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2006522582.tif 000112
【図１４】
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【図１５】
2006522582.tif 000114
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2006522582.tif 000139
【図４１Ａ】
2006522582.tif 000140
【図４１Ｂ】
2006522582.tif 000141
【図４１Ｃ】
2006522582.tif 000142
【図４２】
2006522582.tif 000143
【図４３】
2006522582.tif 000144
【図４４】
2006522582.tif 000145
【図４５】
2006522582.tif 000146
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月18日(2005.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006522582000001.app
【国際調査報告】
2006522582.tif 000147
2006522582.tif 000148