(57)【要約】本発明は、Ｒｏｒ分子を調節することにより対象の体内の骨関連活性を調節することに関する。本発明はさらに、骨関連障害についてのスクリーニング、診断および療法開発のための組成物および方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｏｒポリペプチドあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、そのポリヌクレオチドが骨細胞の中で操作可能なプロモータの制御下にあるところの発現カセット。
【請求項２】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ１ポリペプチドである、請求項１記載の発現カセット。
【請求項３】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ２ポリペプチドである、請求項１記載の発現カセット。
【請求項４】
該プロモータがコーディング配列に対し異種である、請求項１記載の発現カセット。
【請求項５】
プロモータが骨特異的プロモータである、請求項１記載の発現カセット。
【請求項６】
骨特異的プロモータがラット３．６ＫｂＩ型コラーゲンまたはラット１．７Ｋｂオステオカルシンプロモータである、請求項５記載の発現カセット。
【請求項７】
該プロモータが誘発可能なプロモータである、請求項１〜６のいずれか１項記載の発現カセット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項９】
ベクターがウイルスベクターである、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
該ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
該発現カセットがさらにポリアデニル化シグナルを含む、請求項１記載の発現カセット。
【請求項１２】
Ｒｏｒポリペプチドあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドが真核細胞内で操作可能なプロモータの制御下にあり、該プロモータが該ポリヌクレオチドに対し異種であるところの、宿主細胞。
【請求項１３】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ１ポリペプチドである、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ２ポリペプチドである、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１５】
有効量のＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体を含む骨関連活性を調節する組成物。
【請求項１６】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ１分子である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
医薬上許容される担体をさらに含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
骨関連活性が骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性、または破骨細胞活性である、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）作用物質をＲｏｒ分子と組み合せ、（ｂ）該作用物質のＲｏｒ活性に対する効果を検出することを含む、作用物質についてのスクリーニング方法であって、Ｒｏｒ活性の減少および増加の検出が、作用物質が骨関連作用物質であることの指標であるところの、方法。
【請求項２１】
Ｒｏｒ活性の減少または増加が、Ｒｏｒ誘発のＷｎｔ−３シグナル化の阻害の減少または増加によって検出される。請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ１分子であり、Ｒｏｒ活性がＲｏｒ１活性である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子であり、Ｒｏｒ活性がＲｏｒ２活性である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子であり、Ｒｏｒ活性の減少および増加がＲｏｒ２誘発のＷｎｔ−１シグナル化の活性化の減少または増加によって検出される、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒポリペプチドであり、Ｒｏｒ活性の減少および増加がＲｏｒ自己リン酸化反応の減少または増加によって検出される、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ１ポリペプチドであり、Ｒｏｒ活性がＲｏｒ１活性である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ２ポリペプチドであり、Ｒｏｒ活性がＲｏｒ２活性である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）作用物質をレポータ遺伝子に操作可能な形で連結されたＲｏｒプロモータ配列を含む単離された細胞と組み合わせ；（ｂ）該作用物質のレポータ活性に対する効果を検出することを含む、作用物質についてのスクリーニング方法であって、レポータ活性により測定されるＲｏｒプロモータ活性の減少または増加の検出が、作用物質が骨関連作用物質であることの指標であるところの、方法。
【請求項２９】
ＲｏｒプロモータがＲｏｒ１プロモータである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Ｒｏｒ１プロモータがヒトＲｏｒ１プロモータである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＲｏｒプロモータがＲｏｒ２プロモータである、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
Ｒｏｒ２プロモータがマウス２プロモータである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
Ｒｏｒポリペプチドの結合パートナーとの結合を調節する作用物質についてのスクリーニング方法であって、（ａ）作用物質の存在下でＲｏｒポリペプチドをＲｏｒ結合パートナーと接触させ；（ｂ）対照の存在下または作用物質の不在下でＲｏｒポリペプチドをＲｏｒ結合パートナーと接触させ；（ｃ）工程（ａ）における該Ｒｏｒポリペプチドの結合パートナーに対する結合を、工程（ｂ）における該Ｒｏｒポリペプチドの結合パートナーに対する結合と比較することによって、ＲｏｒポリペプチドのＲｏｒ結合パートナーに対する結合を調節する作用物質を選択すること、を含む方法。
【請求項３４】
ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ２ポリペプチドであり、Ｒｏｒ結合パートナーがＲｏｒ２結合パートナーである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
Ｒｏｒ２結合パートナーが、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ様１、１４−３−３タンパク質ベータ／アルファ、１４−３−３タンパク質ガンマ、リボフォリン１、アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、細胞アポトーンス感受性タンパク質、ＮＯＴＣＨ２タンパク質、およびヒト骨格筋ＬＩＭ−タンパク質３からなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
標的Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する作用物質を対象に投与することを含む、対象の骨関連活性を調節する方法。
【請求項３７】
該作用物質がＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体のうちの１つまたはそれ以上のものを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該作用物質がＲｏｒ分子結合パートナーあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体のうちの１つまたはそれ以上のものを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
標的Ｒｏｒ分子がＲｏｒ１分子である、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
標的Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子である、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
標的Ｒｏｒ分子活性がチロシンキナーゼ活性である、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
骨関連活性が骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性である、請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
該作用物質が、抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドからなる群から選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
該作用物質がＲｏｒ遺伝子に特異的なアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ分子を含み、そのアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ分子が１つまたはそれ以上のＲｏｒポリペプチドあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体をコードする核酸を認識して結合する、請求項３６記載の方法。
【請求項４５】
Ｒｏｒ遺伝子がＲｏｒ１遺伝子であり、ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ１ポリペプチドである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
Ｒｏｒ遺伝子がＲｏｒ２遺伝子であり、ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ２ポリペプチドである、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
該作用物質が、Ｒｏｒ結合パートナーと結合することによって、標的Ｒｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の発現および／または活性を調節する、請求項３６記載の方法。
【請求項４８】
該作用物質が、Ｒｏｒ結合パートナーと結合することによって、標的Ｒｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の発現および／または活性を阻害する、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
該作用物質が、Ｒｏｒ結合パートナーと結合することによって、標的Ｒｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の発現および／または活性を増強させる、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
標的Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子であり、Ｒｏｒ結合パートナーがＲｏｒ２結合パートナーである、請求項４７〜４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
Ｒｏｒ２結合パートナーが、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ様１、１４−３−３タンパク質ベータ／アルファ、１４−３−３タンパク質ガンマ、リボフォリン１、アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、細胞アポトーンス感受性タンパク質、ＮＯＴＣＨ２タンパク質、およびヒト骨格筋ＬＩＭ−タンパク質３からなる群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該作用物質がＲｏｒ結合パートナーに対するＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の結合を調節する、請求項３６記載の方法。
【請求項５３】
該作用物質がＲｏｒ結合パートナーに対するＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の結合を増強させる、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該作用物質がＲｏｒ結合パートナーに対するＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の結合を阻害する、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子であり、Ｒｏｒ結合パートナーがＲｏｒ２結合パートナーである、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
Ｒｏｒ２結合パートナーが、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ様１、１４−３−３タンパク質ベータ／アルファ、１４−３−３タンパク質ガンマ、リボフォリン１、アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、細胞アポトーンス感受性タンパク質、ＮＯＴＣＨ２タンパク質、およびヒト骨格筋ＬＩＭ−タンパク質３からなる群から選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
作用物質が培養中の単離された細胞に投与される、請求項３６記載の方法。
【請求項５８】
細胞が一次骨芽細胞、骨芽細胞起源の不死化細胞系列または非骨芽細胞起源の不死化細胞系列である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
骨芽細胞起源の不死化細胞系列がＨＯＢ、Ｕ２ＯＳおよびＳａＯＳ−２細胞からなる群から選択される、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
作用物質がヒト以外のトランスジェニック動物に投与される、請求項３６記載の方法。
【請求項６１】
トランスジェニック動物がマウスである、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
作用物質がヒト以外のノックアウト動物に投与される、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
該対象が脊椎動物または無脊椎動物生体である、請求項３６記載の方法。
【請求項６４】
対象が哺乳動物である、請求項３６記載の方法。
【請求項６５】
哺乳動物がヒトである、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
対象におけるＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３活性を調節する方法であって、標的Ｒｏｒ２分子の発現または活性を調節する作用物質をＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３活性を調節するのに有効な量にて投与することを含む、方法。
【請求項６７】
骨関連活性を調節するための作用物質を同定する方法であって、（ａ）細胞内でＲｏｒ分子を発現するかまたは内因性Ｒｏｒ発現を使用し；（ｂ）細胞を作用物質と接触させ；および（ｃ）Ｒｏｒ分子の発現または活性をモニター観察することを含み、作用物質の存在下でのＲｏｒ分子の発現または活性の向上または低下が骨関連活性を調節するものとして作用物質を同定するところの、方法。
【請求項６８】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ１分子である、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子である、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
Ｒｏｒ分子活性がチロシンキナーゼ活性である、請求項６７記載の方法。
【請求項７１】
骨関連活性が骨芽細胞分化、破骨細胞分化、骨芽細胞生存、破骨細胞生存、骨芽細胞活性または破骨細胞活性である、請求項６７記載の方法。
【請求項７２】
該作用物質が、抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドからなる群から選択される、請求項６７記載の方法。
【請求項７３】
該作用物質がＲｏｒ遺伝子に特異的なアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ分子を含み、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ分子が、１つまたはそれ以上のＲｏｒポリペプチドあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体をコードする核酸を認識してそれと結合する、請求項６７記載の方法。
【請求項７４】
Ｒｏｒ遺伝子がＲｏｒ１遺伝子であり、ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ１ポリペプチドである、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
Ｒｏｒ遺伝子がＲｏｒ２遺伝子であり、ＲｏｒポリペプチドがＲｏｒ２ポリペプチドである、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
該作用物質が、Ｒｏｒ結合パートナーと結合することによって、Ｒｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体の発現および／または活性を調節する、請求項６７記載の方法。
【請求項７７】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子であり、Ｒｏｒ結合パートナーがＲｏｒ２結合パートナーである、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
Ｒｏｒ２結合パートナーが、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ様１、１４−３−３タンパク質ベータ／アルファ、１４−３−３タンパク質ガンマ、リボフォリン１、アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、細胞アポトーンス感受性タンパク質、ＮＯＴＣＨ２タンパク質、およびヒト骨格筋ＬＩＭ−タンパク質３からなる群から選択される、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
該作用物質がＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体のＲｏｒ結合パートナーとの結合を調節する、請求項６７記載の方法。
【請求項８０】
Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２分子であり、Ｒｏｒ結合パートナーがＲｏｒ２結合パートナーである、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
細胞が一次骨芽細胞、骨芽細胞起源の不死化細胞系列または非骨芽細胞起源の不死化細胞系列である、請求項６７記載の方法。
【請求項８２】
骨芽細胞起源の不死化細胞系列がＨＯＢ、Ｕ２ＯＳおよびＳａＯＳ−２細胞からなる群から選択される、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
作用物質がさらにＲｏｒ分子の発現または活性をモニター観察するため脊椎動物生体に投与され、作用物質の存在下でのＲｏｒ分子の発現または活性の向上または低下が、作用物質を骨関連活性を調節するとして同定する、請求項６７記載の方法。
【請求項８４】
該脊椎動物生体が哺乳動物である、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
該脊椎動物生体がヒト以外のトランスジェニック動物である、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
Ｗｎｔシグナル化経路を調節するための作用物質を同定する方法であって、Ｒｏｒ分子の発現または活性の調節能について１つまたはそれ以上の作用物質をスクリーニングすることを含み、Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節することのできる作用物質が、Ｗｎｔシグナル化経路を調節する作用物質であるところの、方法。
【請求項８７】
Ｗｎｔペプチドを発現する細胞に対し生物活性分子を連結する方法であって、細胞を生物活性分子に結合させるＲｏｒ２ポリペプチドと接触させ、Ｗｎｔポリペプチドと該Ｒｏｒ２ポリペプチドを互いに結合させ、それにより該生物活性分子を該細胞に連結させることを含む、方法。
【請求項８８】
ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３からなる群から選択される、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
対象を骨関連障害についてスクリーニングする方法であって、対象におけるＲｏｒ分子の発現を測定し、その対象における該Ｒｏｒ分子の、正常な対象におけるその発現と比較した、または骨関連障害について治療を受けた後の同じ対象でのその発現に比較した相対発現を決定する、方法。
【請求項９０】
骨形成に関与する遺伝子を同定する方法であって、ａ）細胞内でＲｏｒ分子を過剰発現させ、ｂ）遺伝子発現プロフィールにおける変化をモニター観察し、およびｃ）Ｒｏｒ発現によりどの遺伝子が調節されるかを決定し、それにより骨形成に関与する遺伝子を同定することを含む、方法。
【請求項９１】
Ｗｎｔシグナル化経路を調節する遺伝子を同定する方法であって、ａ）細胞内でＲｏｒ分子を過剰発現させ、ｂ）遺伝子発現プロフィールにおける変化をモニター観察し、およびｃ）Ｒｏｒ発現によりどの遺伝子が調節されるかを決定し、それによりＷｎｔシグナル化経路を調節する遺伝子を同定することを含む、方法。
【請求項９２】
マーカーとしてＲｏｒ２を用いて増殖性ヒト前骨芽細胞を同定する方法であって、ヒト骨芽細胞内でのＲｏｒ２遺伝子の発現を決定することを含み、ここでＲｏｒ２発現の増加がその細胞を増殖性前骨芽細胞であると同定する、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分子生物学の分野に関する。より特定的に言うと、本発明は、骨関連障害の診断、予後診断、予防、治療および療法の評価のための方法および組成物に関する。
【０００２】
（背景技術）
骨関連障害および疾患の話題は近年著しく注目を集めてきている。骨関連障害は骨の再吸収と骨の形成の間のアンバランスの結果として生じる骨粗鬆によって特徴づけられる。人生を通して、骨格の骨はつねに改造されている。この改造プロセスにおいては、破骨細胞による骨の再吸収と骨芽細胞によるその後の復元の間に微妙なバランスが存在する。軟骨内および膜内の両方の骨化に関与する骨芽細胞は、マトリクスタンパク質を作り新しい骨の形成を結果としてもたらす骨組織内の特殊化された細胞である。骨形成すなわちオステオジェネシスは、骨格内の骨量の維持にとって不可欠である。骨芽細胞とは異なり、破骨細胞は、骨の再吸収および除去に関連している。正常な骨では、骨芽細胞媒介の骨形成と破骨細胞媒介の骨再吸収の間のバランスは調節された複雑な相互作用を通して維持される。
【０００３】
骨格系に関連する欠陥、疾病および障害は数多く存在する。いくつかの例としては、これらに限定されるわけではないが、骨粗鬆症、骨肉腫、関節炎、くる病、骨折、歯周病、骨分節欠陥、溶骨性疾患、原発性および続発性上皮小体亢進症、パジェット病、骨軟化症、骨化過剰症、および大理石骨病が含まれる。骨原性分化および再生プロセスに関与するメカニズムの同定は、骨粗鬆症といったような骨障害および骨の生理学を理解するためにきわめて重要である。これらの障害には、推定上の骨芽細胞始原細胞の不完全な突然変異に起因する骨形成の欠陥が関与している可能性がある。
【０００４】
骨の成長に付随する疾病または障害を治療する方法、骨形成を加速する方法、骨形成を調節（増加または減少）させる作用物質を同定する方法、骨関連障害に付随する遺伝子またはそのタンパク質産物を同定する方法を開発する必要性が存在している。
【０００５】
骨形成および骨再吸収に関与するメカニズムの同定は、骨粗鬆症といったような骨障害および骨の生理を理解するためにきわめて重要である。骨関連障害に付随する遺伝子またはそのタンパク質産物は、骨形成の分子メカニズムの解明のため、新しい薬物のスクリーニングおよび開発のため、骨の発育および骨粗鬆障害の診断、予後診断、予防および治療のため、そして骨粗鬆症といったような骨関連障害用の療法の評価のために使用することができる。
【０００６】
本発明は、骨関連活性を調節する方法を提供するのみならず、骨形成および骨再吸収に関与するメカニズムの理解を増進する方法をも提供する。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、Ｒｏｒポリペプチドあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、そのポリヌクレオチドが骨細胞の中で操作可能なプロモータの制御下にある発現カセットに関する。
【０００８】
本発明は、Ｒｏｒポリペプチドあるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドが、真核細胞内で操作可能なプロモータの制御下にあり、前記プロモータが前記ポリヌクレオチドに対し異種である、宿主細胞に関する。
【０００９】
本発明は、有効量のＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体を含む骨関連活性を調節するための組成物に関する。
【００１０】
本発明は、（ａ）作用物質をＲｏｒ分子と組合せる工程および（ｂ）前記作用物質のＲｏｒ活性に対する効果を検出する工程を含む、作用物質についてのスクリーニング方法であって、Ｒｏｒ活性の減少および増加の検出が、作用物質の骨関連作用物質であることの指標である方法に関する。
【００１１】
本発明は、（ａ）レポータ遺伝子に操作可能な形で連結されたＲｏｒプロモータ配列を含む単離された細胞と作用物質を組合せる工程および（ｂ）レポータ活性に対する前記作用物質の効果を検出する工程を含む、作用物質についてのスクリーニング方法であって、レポータ活性により測定される通りのＲｏｒプロモータ活性の減少または増加の検出が、作用物質が骨関連作用物質であることの指標である方法に関する。
【００１２】
本発明は、結合パートナーに対するＲｏｒポリペプチドの結合を調節する作用物質についてのスクリーニング方法であって、（ａ）作用物質の存在下でＲｏｒ結合パートナーとＲｏｒポリペプチドを接触させる工程；（ｂ）対照の存在下または作用物質の不在下でＲｏｒ結合パートナーとＲｏｒポリペプチドを接触させる工程；および（ｃ）工程（ａ）における結合パートナーに対する前記Ｒｏｒポリペプチドの結合を工程（ｂ）における結合パートナーに対する前記Ｒｏｒポリペプチドの結合と比較することによってＲｏｒ結合パートナーに対するＲｏｒポリペプチドの結合を調節する作用物質を選択する工程を含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、標的Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する作用物質を対象に投与する工程を含む、対象の体内において骨関連活性を調節する方法に関する。
【００１４】
本発明は、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３活性を調節するのに有効な量で標的Ｒｏｒ２分子の発現または活性を調節する作用物質を投与する工程を含む、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３活性を調節する方法に関する。
【００１５】
本発明は、Ｗｎｔ−３活性を調節するのに有効な量で標的Ｒｏｒ１ポリペプチドの発現または活性を調節する作用物質を投与する工程を含む、Ｗｎｔ−３活性を調節する方法に関する。
【００１６】
本発明は、骨関連活性を調節するための作用物質を固定する方法であって、（ａ）細胞内でＲｏｒ分子を発現するかまたは内因性Ｒｏｒ発現を使用する工程；（ｂ）作用物質と細胞を接触させる工程；および（ｃ）Ｒｏｒ分子の発現または活性をモニター観察する工程を含み、作用物質の存在下でのＲｏｒ分子の発現または活性の減少または増加が骨関連活性を調節しているものとして作用物質を同定する方法に関する。
【００１７】
本発明は、Ｗｎｔシグナル化経路を調節するための作用物質を同定する方法であって、Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する能力について１つ以上の作用物質をスクリーニングする工程を含み、Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節することのできる作用物質が、Ｗｎｔシグナル化経路を調節する作用物質である方法に関する。
【００１８】
本発明は、Ｗｎｔペプチドを発現する細胞に対し生物活性分子を連結する方法であって、生物活性分子に結合させられるＲｏｒ２ポリペプチドと前記細胞を接触させる工程および前記Ｗｎｔポリペプチドと前記Ｒｏｒ２ポリペプチドを互いに結合させかくして前記生物活性分子を前記細胞に連結する工程を含む方法に関する。
【００１９】
本発明は、対象の体内でのＲｏｒ分子の発現を測定する工程および正常な対象の体内でのその発現に比較するかまたは骨関連障害について治療を受けた後の同じ対象の体内でのその発現に比較した対象の体内での前記Ｒｏｒ分子の相対的発現を決定する工程を含む、骨関連障害について対象をスクリーニングするための方法に関する。
【００２０】
対象の体内でのＲｏｒポリペプチドの発現を測定する工程および正常な対象の体内でのその活性に比較するかまたは骨関連障害について治療を受けた後の同じ対象の体内でのその発現に比較した対象の体内での前記Ｒｏｒポリペプチド分子の相対的活性を決定する工程を含む、骨関連障害について対象をスクリーニングするための方法。
【００２１】
本発明は、骨形成に関与する遺伝子を同定する方法であって、ａ）細胞内でＲｏｒ分子を過剰発現する工程、ｂ）遺伝子発現プロフィール内の変化をモニター観察する工程およびｃ）Ｒｏｒ発現によりどの遺伝子が調節されるかを決定しかくして骨形成に関与する遺伝子を同定する工程を含む方法に関する。
【００２２】
本発明は、Ｗｎｔシグナル化経路を調節する遺伝子を同定する方法であって、ａ）細胞内でＲｏｒ分子を過剰発現する工程、ｂ）遺伝子発現プロフィール内の変化をモニター観察する工程およびｃ）Ｒｏｒ発現によりどの遺伝子が調節されるかを決定しかくしてＷｎｔシグナル化経路を調節する遺伝子を同定する工程を含む方法に関する。
【００２３】
本発明は、マーカーとしてＲｏｒ２を用いて増殖性のヒト前骨芽細胞を同定するための方法であって、ヒト骨芽細胞内でのＲｏｒ２遺伝子の発現を決定する工程を含み、ここで増大したＲｏｒ２発現が前記細胞を増殖前骨芽細胞であるものとして同定する方法に関する。
【００２４】
本発明は、マーカーとしてＲｏｒ２を用いてマトリクス成熟期にあるマウス骨芽細胞を同定するための方法であって、マウス骨芽細胞内でのＲｏｒ２遺伝子の発現を決定する工程を含み、ここで増大したＲｏｒ２発現が、該細胞をマトリクス成熟期にある骨芽細胞であるものとして同定する、方法に関する。
【００２５】
本発明は、Ｒｏｒ２キナーゼ活性を決定する方法であって、（ａ）Ｒｏｒ２ポリペプチドを得る工程；（ｂ）３２ＰγＡＴＰの存在下でＲｏｒ２ポリペプチドを標識する工程；（ｃ）取込まれた３２Ｐの量を測定することによりＲｏｒ２キナーゼ活性を決定する工程を含み、３２Ｐの量がＲｏｒ２キナーゼの活性を標示する方法に関する。
【００２６】
（図面の簡単な記載および配列の記載）
本発明は、本出願の一部を成す以下の詳細な説明および添付の図面および配列リストから、さらに完全に理解することができる。
【００２７】
図１は、Ｒｏｒキナーゼの発現が、ヒト骨芽細胞分化の後期段階の間に減少することを示している。前骨芽細胞から成熟骨細胞までの異なる骨芽細胞分化期を表す細胞内のＲｏｒ２（図１Ａ）およびＲｏｒ１（図１Ｂ）の発現を、ＧＩヒト１ａチップ上の遺伝子チップ解析（円）およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（棒）によって査定した。両方法について、ＨＯＢ−０３−Ｃ５中の相対的ｍＲＮＡ発現を１に設定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、実施例１の表１中に列挙されているプローブとプライマを用いて実施した。ｍＲＮＡのレベルを、各標本において１８ＳｒＲＮＡの発現に対して正規化した。１つの細胞系列あたり３つのＲＴ−ＰＣＲ反応の平均±標準誤差（ＳＥ）。ＨＯＢ−０５−Ｔ１細胞中のＲｏｒ２発現は、ＲＴ−ＰＣＲでは検出不能であった。細胞系列：０３−Ｃ５−ＨＯＢ−０３−Ｃ５、前骨芽細胞、０３−ＣＥ６−ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、初期骨芽細胞；０２−Ｃ１−ＨＯＢ−０２−Ｃ１、成熟骨芽細胞；０１−Ｃ１−ＨＯＢ−０１−Ｃ１、前骨細胞；０５−Ｔ１−ＨＯＢ−０５−Ｔ１、成熟骨細胞（図１は実施例１の中で言及されている）。
【００２８】
図２は、ＳＦＲＰ−１がＲｏｒ２発現を抑圧することを示している。ＳＦＲＰ−１（０１−０９ＳＦＲＰ−１）または空のベクター（０１−０９ベクター）を安定した形で過剰発現するＨＯＢ−０１−０９骨細胞由来または野生型またはＳＦＲＰ−１−／−マウスの頭蓋冠骨由来のポリＡ（＋）ＲＮＡを用いた、Ｇｌヒト１ａチップ上でのＲｏｒ２（黒色棒）およびＲｏｒ１（白色棒）発現の遺伝子チップ分析の結果。野生型およびＳＦＲＰ１−／−マウスのＲｏｒ１発現レベルは、チップ検出限界より低いものであった。０１−０９ベクター細胞および野生型マウス内での相対的ｍＲＮＡ発現は１に設定された（図２は実施例１の中で言及されている）。
【００２９】
図３は、Ｒｏｒタンパク質の予測されたドメイン構造を示している。該ドメインは以下のものである：ＩＧ−免疫グロブリン；ＦＲＺ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；クリングル−元来プロトロンビン中で発見された３対のジスルフィド結合により連結されている３重ループ構造；Ｍ−膜内外；Ｔｙｒ  Ｋｉｎ−チロシンキナーゼ。Ｂ．Ｒｏｒ１のＦｒｉｚｚｌｅｄモジュール内でのジスルフィド結合の位置特定（ロズマス（Ｒｏｓｚｍｕｓｚ）ら編、２００１、生物化学ジャーナル。２７６：１８４８５−９０）。数字は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン内の１０個の保存されたシステインを意味する（図３は、実施例１の中で言及されている）。
【００３０】
図４は、Ｒｏｒ１ではなくＲｏｒ２キナーゼの発現が、ヒト骨芽細胞分化の初期の間そしてマウス骨芽細胞分化の後期を通じては増加することを示している。Ａ．ヒトＭＳＣを、ヒト骨形成培地（成長培地中０．１ｍＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸および１０ｍＭのβ−グリセロホスファート）中でインキュベートし、全細胞ＲＮＡを指示された時点で収集し、Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２遺伝子の発現についてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。Ｂ．マウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、マウス骨形成培地（成長培地中２５ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸および１０ｍＭのβ−グリセロホスファート）中でインキュベートし、全細胞ＲＮＡを指示された時点で収集し、Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、およびオステオカルシン（ＯＣ）遺伝子の発現についてＲＴ−ＰＣＲにより分析した（図３は、実施例２の中で言及されている）。
【００３１】
図５は、Ｕ２ＯＳ細胞中のＲｏｒタンパク質の発現を示している。Ａ．全長Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２キナーゼおよびＲｏｒ２変異体の概略的表現。ＦＬＡＧ−フラグエピトープタグ；Ｍ−膜内外ドメイン；Ｔｙｒ  Ｋｉｎ−チロシンキナーゼドメイン。Ｂ．指示されたＲｏｒ構成体でトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞由来の全細胞タンパク質抽出物（５０ｐｇ／レーン）のフラグエピトープタグについてのウエスタン免疫ブロット法。Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２およびＲｏｒ２ＫＤの位置は、矢印の頭で、またＲｏｒ２ΔＣ−フラグは矢印によってマークされている。Ｃ．上部図版は、フラグ親和性アガロース上で免疫沈降されたＲｏｒ２−フラグまたはＲｏｒ２ＫＤ−フラグを用いた「一般的な方法」の下で記述された通りに実施されたインビトロ自己リン酸化検定の結果のオートラジオグラフを示している。下部図版では、フラグ免疫沈降されたタンパク質の１０パーセントがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、自己リン酸化反応中のキナーゼレベルを査定するために銀染色法により分析された（図５は、実施例３、６および８中で言及されている）。
【００３２】
図６は、Ｒｏｒ２キナーゼが、Ｗｎｔ−３を阻害するものの、Ｗｎｔ−１活性を増強させることを示している。Ｕ２ＯＳ培養を、チミジンキナーゼプロモータに対して５’のところでクローニングされたＴＣＦ結合部位の１６のコピーを含む組換え型ルシフェラーゼレポータ遺伝子で一過性にトランスフェクトした。Ａでは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ベクター）、Ｒｏｒ２−フラグ（Ｒ２）、Ｗｎｔ−３−ＨＡ（ｗ３）、またはＷｎｔ−３−ＨＡと指示された量のＲｏｒ２−フラグ（９６−ウェル平板の１ウェルあたりのｎｇ単位）またはＳＦＲＰ−１（Ｓ）或はその両方でプロモータ−レポータ遺伝子を同時トランスフェクトした。Ｂでは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、Ｗｎｔ−１−ＨＡ（ｗ１）、またはＷｎｔ−１−ＨＡと指示された量のＲｏｒ２−フラグまたはＳＦＲＰ−１或はその両方でプロモータ・レポータ遺伝子を同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）の存在下でのレポーター遺伝子のトランスフェクション後に測定されたルシフェラーゼ値には、任意に１の値を与えた。Ａにおいて、結果は、ｎ≧１６で少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥであり、アスタリスクは、Ｗｎｔ−３−ＨＡ単独で得られたレベル未満へのルシフェラーゼ活性の有意な減少を示している（＊−ｐ＜０．０５、＊＊−ｐ＜０．０００１）。Ｂにおいて、結果は、ｎ≧２４で少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥであり、アスタリスクは、Ｗｎｔ−１−ＨＡ単独の存在下でのレベルより高いルシフェラーゼ活性の有意な増加を示している（＊−ｐ＜０．０５、＊＊−ｐ＜０．０００１）（図６は実施例４中で言及されている）。
【００３３】
図７は、Ｒｏｒ１キナーゼがＷｎｔ−３を阻害するが、Ｗｎｔ−１活性にはまったく影響を及ぼさないことを示している。Ｒｏｒ２−フラグの代わりにＲｏｒ１−フラグ（Ｒ１）が用いられた点を除き、図６と同様であった。平均±ＳＥ、ｎ≧８。Ａでは、アスタリスクは、Ｗｎｔ−３−ＨＡ単独で得られたレベルより低いルシフェラーゼ活性の有意な減少を示している（＊−ｐ＜０．０１、＊＊−ｐ＜０．０００１）（図７は実施例５で言及されている）。
【００３４】
図８は、Ｗｎｔ−１の増強およびＷｎｔ−３活性の阻害のの大部分のためにＲｏｒ２チロシンキナーゼ活性が必要とされることを示している。Ｒｏｒ２−フラグの代わりにＲｏｒ２ＫＤ−フラグ（Ｒ２ＫＤ）を用いた点を除き、図６と同様であった。ＡおよびＢにおいて、結果は、ｎ≧２４で少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥである。アスタリスクは、Ｗｎｔ−３−ＨＡ単独で得られるレベルより低いルシフェラーゼ活性の有意な減少を示している（＊＊−ｐ＜０．０００１）（図８は実施例６で言及されている）。
【００３５】
図９は、Ｗｎｔ−１の増強およびＷｎｔ−３活性の阻害の一部についてＲｏｒ２の細胞質ドメインが必要であることを示している。Ｒｏｒ２−フラグの代わりにＲｏｒ２ΔＣ−フラグ（Ｒ２ｄ）を用いた点を除き、図６と同様であった。Ａにおいて、結果は、ｎ≧１６で少なくとも２つの独立した実験の平均±ＳＥである。アスタリスクは、Ｗｎｔ−３−ＨＡ単独で得られたレベルより低いルシフェラーゼ活性の有意な減少を示している（＊−ｐ＜０．０５、＊＊−ｐ＜０．０００１）。Ｂでは、ｎ≧８  （図９は実施例６で言及されている）。
【００３６】
図１０は、Ｒｏｒ２およびＲｏｒ２ＫＤは、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３に結合することを示している。ベクター対照またはＲｏｒ２−フラグおよびＷｎｔ−ＨＡの指示された組合せを用いてＣＯＳ７細胞を一過性にトランスフェクトした。ＤＮＡの合計量は、それぞれＲｏｒ２またはＷｎｔの代わりにｐｃＤＮＡ３．１（＋）またはｐＵＳＥａｍｐを加えることによって一定に保たれた。２４時間目に、溶解物を直接（上）または抗フラグ抗体での抗体免疫沈降後に（下）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロット法を実施した（図１０は実施例７で言及されている）。
【００３７】
図１１は、Ｒｏｒ２が異なるＷｎｔを区別することを示している。指示されたＷｎｔ−ＨＡおよびＲｏｒ２−フラグ（＋）またはｐｃＤＮＡ３．１を用いてＣＯＳ７細胞を一過性にトランスフェクトした。２４時間で、溶解物を抗フラグ抗体で免疫沈降させ、抗ＨＡ抗体（上）によりＷｎｔの存在について分析した。下部図版は、指示されたＷｎｔおよびＲｏｒ２−フラグ（免疫沈降反応における等しい投入に対する対照）を含むＣＯＳ７抽出物の抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット分析を示している（図１１は実施例７で言及されている）。
【００３８】
図１２は、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３の過剰発現が、Ｒｏｒ２自己リン酸化の程度に全く影響を及ぼさないことを示している。Ａ．上部図版は、Ｒｏｒ２−フラグおよび指示されたＷｎｔを用いて同時トランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞からフラグ親和性アガロース上で免疫沈降されたＲｏｒ２−フラグを用いて「一般的方法」の下で説明した通りに実施されたインビトロ自己リン酸化検定の結果のオートラジオグラフを示している。下部図版は、抗フラグ抗体を用いた同じ膜のウエスタン免疫ブロット法を示している。Ｂ．オートラジオグラフのシグナルを、各反応における免疫反応性Ｒｏｒ２タンパク質の合計量に対して正規化し、Ｗｎｔの不在下で得られた相対的なシグナルを１に設定した。３つの独立した実験の平均±ＳＥ（図１２は実施例８で言及されている）。
【００３９】
図１３は、Ｒｏｒ２が、細胞質ゾルβ−カテニンのＷｎｔで媒介された安定化を阻害することを示している。Ｒｏｒ２（Ｒ２）およびＷｎｔ（Ｗ）の指示された組合せを用いてＵ２ＯＳ培養を、一過性にトランスフェクトした。ＤＮＡの合計量を、それぞれＲｏｒ２またはＷｎｔの代わりにｐｃＤＮＡ３．１（＋）またはｐＵＳＥａｍｐを加えることによって一定に保った。２４時間目で、細胞質タンパク質を抗β−カテニン抗体を用いたウエスタン免疫ブロット法により分析した。等しい負荷が抗β−アクチン抗体での染色によって確認された後にＷｎｔの不在下で得られたシグナルに対してβ−カテニンのレベルを、正規化した。数字は、３つの独立した実験の平均である。（図１３は実施例  ９で言及されている）。
【００４０】
図１４は、Ｒｏｒ２が両方のＷｎｔを結合させ、それらをＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体から遠くに隔離しかつβ−カテニンを安定化させるその能力を阻害することになる、Ｒｏｒ２活性についての提案されているモデルを示している。さらに、Ｒｏｒ２受容体に結合するＷｎｔ１は、Ｒｏｒ２受容体のチロシンキナーゼ活性を要求しかつＷｎｔ−応答性プロモータ活性を増強させる結果となる、未同定シグナルリングカスケードの活性化を引き起こす。Ｗｎｔ３結合は同じカスケードを刺激しないが、その代わりに、Ｗｎｔ−応答性プロモータの阻害を導く他のチロシンキナーゼ依存性事象を活性化する。ＦＺ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ＧＳＫ−３β−グリコーゲンシンターゼキナーゼβ、β−ｃａｔ−β−カテニン、Ｌｅｆ／Ｔｃｆ−リンパ−エンハンサ結合因子／Ｔ−細胞転写因子（図１４は実施例１０で言及されている）。
【００４１】
図１５は、Ｕ２ＯＳ細胞内のＲｏｒ２結合パートナの同定を示している。上部で識別されている構成体で一過性にトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞由来の全細胞抽出物を、抗フラグ抗体で免疫沈降させ、４−１２％（Ａ）または７％（Ｂ）ポリアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。並行した実験において、４−１２％ゲルをニトロセルロース膜上にトランスブロットし、抗−フラグ（Ｃ）または抗ホスホチロシン（Ｄ）抗体を用いてウエスタン免疫ブロット法を実施した。矢印は、Ｒｏｒ２依存性であると思われるバンドを指している。Ｍ−ｋＤａ単位の分子量。５５および２５ｋＤａ前後の際立ったバンドは、フラグ親和性アガロースから解離したＩｇＧサブユニットである（図１５は実施例１１で言及されている）。
【００４２】
図１６は、Ｒｏｒ２がＮｏｔｃｈ２の細胞間ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ｌＣ）に結合することを示している。ベクター対照またはＲｏｒ２−フラグおよびＮｏｔｃｈ２ｌＣ−Ｖ５−ｈｉｓの指示された組合せを用いて、Ｕ２ＯＳ細胞を一過性にトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を加えることによって、ＤＮＡの合計量を一定に保った。２４時間目で、溶解物を直接（上）または抗フラグ抗体での免疫沈降後に（下）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。免疫ブロット法は、抗−Ｖ５（上）または抗ｈｉｓ（下）を用いて実施した（図１６は実施例１２で言及されている）。
【００４３】
図１７は、Ｒｏｒ２およびＲｏｒ１を安定した形で過剰発現する細胞系列の生成を確認している。Ａ．Ｒｏｒ２、Ｒｏｒ２−Ｆｌａｇ、Ｒｏｒ１−Ｆｌａｇ、または空のベクター（ｐｃＤＮＡ  ３．１（＋））を過剰発現するＨＯＢ−０１−０９細胞中の相対的Ｒｏｒ２およびＲｏｒ１  ｍＲＮＡ発現。ＨＯＢ−０１−０９−ｐｃＤＮＡ細胞中での相対的ｍＲＮＡ発現を１に設定した。実施例１の表１中に列挙されているプローブおよびプライマを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｍＲＮＡのレベルを、各標本中において１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現に対して正規化した。Ｂ．Ｒｏｒ２、Ｒｏｒ２−Ｆｌａｇ、Ｒｏｒ１−Ｆｌａｇ、または空のベクターを過剰発現するＨＯＢ−０１−０９細胞由来の全細胞タンパク質抽出物（５０μｇ／レーン）の、指示された抗体を用いたウエスタン免疫ブロット法（図１７は実施例１３で言及されている）。
【００４４】
表１は、ヒトＲｏｒ  ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析に使用されたプライマとプローブを示す（表１は実施例１で言及されている）
表２は、マウスＲｏｒ  ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析に使用されたプライマとプローブを示す（表２は実施例２で言及されている）
表３は、マウスアルカリホスファターゼおよびオステオカルシンｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析で使用されたプライマとプローブを示す（表３は実施例２で言及されている）
表４は、潜在的なＲｏｒ２相互作用タンパク質を示す（表４は実施例９で言及されている）
【００４５】
以下の４８個の配列の説明および本書に添付された配列リストは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願についての規定要件−配列規則」）に記され国際知的所有権機構（ＷＩＰＯ）規格ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト規定要件（規則５．２および４．９５（ａ−２）並びに実施細則第２０８条および補遺Ｃ）に合致するような特許出願中のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を支配する規則に適合するものである。配列挙述には、本明細書に参照により援用されている核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１３、３０２１−３０３０、（１９８５）および生化学ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．）、２１９（２）、３４５−３７３、（１９８４）中で記述されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ規格に適合して定義された通りのヌクレオチド配列文字に対する１文字コードアミノ酸についての３文字コードが含まれる。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記された規則に適合する。
【００４６】
配列番号１は、当初ＴＣＲ−アルファエンハンサ、ＣＤ３−ｅエンハンサ、およびコンセンサスＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位内で同定されたＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位を含む第１のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号２は、当初ＴＣＲ−アルファエンハンサ、ＣＤ３−ｅエンハンサ、およびコンセンサスＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位内で同定されたＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位を含む第２のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３は、Ｒｏｒ１タンパク質についてコードするヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号４は、Ｒｏｒ１タンパク質の推定アミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号５は、Ｒｏｒ２タンパク質についてコードするヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号６は、Ｒｏｒ２タンパク質の推定アミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号７は、Ｒｏｒ１−フラグタンパク質についてコードするヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号８は、Ｒｏｒ１−フラグタンパク質の推定アミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号９は、Ｒｏｒ２−フラグタンパク質についてコードするヌクレオチド配列である。
【００５５】
配列番号１０は、Ｒｏｒ２−フラグタンパク質の推定アミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号１１は、Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグタンパク質についてコードするヌクレオチド配列である。
【００５７】
配列番号１２は、Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグタンパク質の推定アミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号１３は、Ｒｏｒ１−フラグを構築するために用いられる最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００５９】
配列番号１４は、Ｒｏｒ１−フラグを構築するために用いられる最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号１５は、Ｒｏｒ２−フラグを構築するために用いられる第１の最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６１】
配列番号１６は、Ｒｏｒ２−フラグを構築するために用いられる第１の最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号１７は、Ｒｏｒ２−フラグを構築するために用いられる第２の最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６３】
配列番号１８は、Ｒｏｒ２−フラグを構築するために用いられる第２の最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号１９は、Ｒｏｒ２−フラグを構築するために用いられる第３の最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６５】
配列番号２０は、Ｒｏｒ２−フラグを構築するために用いられる第３の最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号２１は、Ｒｏｒ２ＫＤ−フラグを構築するために用いられる最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６７】
配列番号２２は、Ｒｏｒ２ＫＤ−フラグを構築するために用いられる最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６８】
配列番号２３は、Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグを構築するために用いられる最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００６９】
配列番号２４は、Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグを構築するために用いられる最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００７０】
配列番号２５は、ヒトＲｏｒ１（２９９３−３０１３）を同定するための順方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００７１】
配列番号２６は、ヒトＲｏｒ１（３０４９−３０７４）を同定するための逆方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００７２】
配列番号２７は、ヒトＲｏｒ１（３０１８−３０４４）を同定するためのプローブのヌクレオチド配列である。
【００７３】
配列番号２８は、ヒトＲｏｒ２（１１４９−１１６９）を同定するための順方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００７４】
配列番号２９は、ヒトＲｏｒ２（１２３９−１２５９）を同定するための逆方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００７５】
配列番号３０は、ヒトＲｏｒ２（１１７４−１１９８）を同定するためのプローブのヌクレオチド配列である。
【００７６】
配列番号３１は、マウスＲｏｒ１（２３５０−２３７０）を同定するための順方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００７７】
配列番号３２は、マウスＲｏｒ１（２４０２−２４２１）を同定するための逆方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００７８】
配列番号３３は、マウスＲｏｒ１（２３７２−２３９５）を同定するためのプローブのヌクレオチド配列である。
【００７９】
配列番号３４は、マウスＲｏｒ２（３６４−３８６）を同定するための順方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００８０】
配列番号３５は、マウスＲｏｒ２（４２９−４４８）を同定するための逆方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００８１】
配列番号３６は、マウスＲｏｒ２（４００−４２４）を同定するためのプローブのヌクレオチド配列である。
【００８２】
配列番号３７は、マウスアルカリホスファターゼ（１３５４−１３７３）を同定するための順方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００８３】
配列番号３８は、マウスアルカリホスファターゼ（１４４５−１４６４）を同定するための逆方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００８４】
配列番号３９は、マウスアルカリホスファターゼ（１４１６−１４４２）を同定するためのプローブのヌクレオチド配列である。
【００８５】
配列番号４０は、マウスオステオカルシン（７８−９６）を同定するための順方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００８６】
配列番号４１は、マウスオステオカルシン（１２４−１４５）を同定するための逆方向プライマのヌクレオチド配列である。
【００８７】
配列番号４２は、マウスオステオカルシン（９８−１２１）を同定するためのプローブのヌクレオチド配列である。
【００８８】
配列番号４３は、ヒトＲｏｒ１遺伝子（−２０００〜＋１）の５’未翻訳領域のヌクレオチド配列である。
【００８９】
配列番号４４は、マウスＲｏｒ２遺伝子（−２０００〜＋１）の５’未翻訳領域のヌクレオチド配列である。
【００９０】
配列番号４５は、Ｎｏｔｃｈ２ｌＣ（１−７８２）の５’部分を構築するために用いられる最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００９１】
配列番号４６は、Ｎｏｔｃｈ２ｌＣ（１−７８２）の５’部分を構築するために用いられる最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００９２】
配列番号４７は、Ｎｏｔｃｈ２ｌＣ（７８３−２３０７）の３’部分を構築するために用いられる最上ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００９３】
配列番号４８は、Ｎｏｔｃｈ２１Ｃ（７８３−２３０７）の３’部分を構築するために用いられる最下ストランドプライマのヌクレオチド配列である。
【００９４】
（発明の詳細な記載）
出願人らは、ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１および２（Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２）についてコードする遺伝子の発現が、ヒト骨芽細胞分化の間に著しくダウンレギュレートされることを発見した。出願人らは又、Ｒｏｒ２発現が分泌されたｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ＳＦＲＰ−１）の発現と反比例するということの証拠をも提供した。ＳＦＲＦ−１は、インビトロおよびインビボで骨芽細胞のアポトーシスを刺激する潜在的骨粗鬆症標的であることが報告されている（国際公開第０１／１９８５５号パンフレット）。
【００９５】
さらに、出願人らは、骨芽細胞中で、Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２が骨形成性骨芽細胞の生存を調節するＷｎｔシグナル化経路を調節することをも発見した。１つの実施形態においては、Ｒｏｒ２キナーゼは、Ｗｎｔ−３を阻害するもののＷｎｔ−１活性を増強する。さらに、Ｒｏｒ２はＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３の両方のタンパク質に結合する。もう１つの実施形態においては、Ｒｏｒ２の細胞質ドメインは、Ｗｎｔ−１の増強のためには必要とされるが、Ｗｎｔ−３活性の阻害のためには必要とされない。さらにもう１つの実施形態においては、Ｒｏｒ１キナーゼはＷｎｔ−３を阻害するものの、Ｗｎｔ−１活性については全く効果を示さない。
【００９６】
複数のＲｏｒ２結合パートナーも同様に同定されてきた。
【００９７】
本発明は、骨細胞中で操作可能なプロモータの制御下でＲｏｒポリペプチドを含む発現カセットを提供する。本発明はさらに、有効量のＲｏｒ分子あるいはその相同体または誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体を含む骨関連活性を調節するための組成物を提供している。
【００９８】
本発明は、（ａ）作用物質をＲｏｒ分子と組合せる工程および（ｂ）前記作用物質のＲｏｒ活性に対する効果を検出する工程を含む、作用物質についてのスクリーニング方法であって、Ｒｏｒ活性の減少または増加の検出が、作用物質の骨関連作用物質であることの指標である方法を提供する。
【００９９】
さらに本発明は、結合パートナーに対するＲｏｒの結合を調節する作用物質についてのスクリーニング方法であって、（ａ）作用物質の存在下でＲｏｒ結合パートナーとＲｏｒを接触させる工程；（ｂ）対照の存在下または作用物質の不在下でＲｏｒ結合パートナーとＲｏｒを接触させる工程；および（ｃ）工程（ａ）における結合パートナーに対する前記Ｒｏｒの結合を工程（ｂ）における結合パートナーに対する前記Ｒｏｒの結合と比較することによってＲｏｒ分子を調節する作用物質を選択する工程を含む方法を提供している。
【０１００】
本発明は同様に、（ａ）レポータ遺伝子に操作可能な形で連結されたＲｏｒプロモータ配列を含む単離された細胞と作用物質を組合せる工程および（ｂ）Ｒｏｒ活性に対する前記作用物質の効果を検出する工程を含む、作用物質についてのスクリーニング方法であって、レポータにより測定される通りのＲｏｒ活性の減少または増加の検出が、作用物質が骨関連作用物質であることを表示している方法を含むこともできる。
【０１０１】
本発明は、骨関連障害を治療するべく対象にＲｏｒ発現または活性を調節するものとして同定された作用物質を薬学組成物の形で投与する方法を提供する。その上、本発明は、Ｗｎｔシグナル化経路に付随する疾病または身体条件の診断を受けた対象を治療するためにＲｏｒ発現を調節するべく同定された作用物質を投与する方法を提供している。
【０１０２】
本発明はさらに、骨関連障害の治療において骨関連活性を調節するための組成物の調製における標的Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する有効量の作用物質の使用を提供している。好ましくは該作用物質は、本書で提供されているスクリーニング方法によって同定される。
【０１０３】
該組成物の調製において使用される標的Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する作用物質は、抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドからなる群から選択され得る。
【０１０４】
好ましくは、本発明に従った使用のための作用物質は、Ｒｏｒ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ分子またはアンチセンス核酸を含み、ここで前記アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ分子は１つ以上のＲｏｒポリペプチド、その相同体、誘導体、フラグメント、変種または変異体をコードする核酸を認識し結合する。
【０１０５】
一変形実施形態においては、Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節するために本発明に従って使用するための作用物質は、Ｒｏｒ結合パートナーに結合する能力をもつ。
【０１０６】
標的Ｒｏｒ分子がＲｏｒ２である場合、本発明に従った組成物の調製において使用するための作用物質は、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ様１、１４−３−３タンパク質ベータ／アルファ、１４−３−３タンパク質ガンマ、リボフォリンＩ、アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、細胞アポトーンス感受性タンパク質、ＮＯＴＣＨ２タンパク質、およびヒト骨格筋ＬＩＭ−タンパク質３からなる群から選択され得る。
【０１０７】
本発明はさらに、
（ｉ）Ｒｏｒ分子と作用物質を組合わせ、Ｒｏｒ活性に対する前記作用物質の効果を検出することによって骨関連作用物質を同定する工程、
（ｉｉ）組成物を形成するべく、工程（ｉ）で同定された有効量の骨関連作用物質と医薬上許容される担体を組合せる工程、
を含む、骨関連活性を調節するための組成物を調製する方法をも提供する。
【０１０８】
本発明は同様に、骨形成および／またはＷｎｔシグナル化を調節する作用物質の同定、骨形成および／またはＷｎｔシグナル化に関与する遺伝子またはタンパク質の同定、診断用途、薬学的薬物標的としての使用、薬物の効能の評価および宿主細胞およびトランスジェニック動物の生成といったような、Ｒｏｒ分子のさらなる使用をも提供している。
【０１０９】
本発明は、マーカーとしてＲｏｒ２を用いて増殖性のヒト前骨芽細胞を同定する方法であって、ヒト骨芽細胞内でのＲｏｒ２遺伝子の発現を決定する工程を含み、ここで増大したＲｏｒ２発現が前記細胞を増殖前骨芽細胞であるものとして同定する方法を提供する。
【０１１０】
本発明はさらに、マーカーとしてＲｏｒ２を用いてマトリクス成熟期にあるマウス骨芽細胞を同定する方法であって、マウス骨芽細胞内でのＲｏｒ２遺伝子の発現を決定する工程を含み、ここで増大したＲｏｒ２発現が、該細胞をマトリクス成熟期にある骨芽細胞であるものとして同定する方法を提供する。
【０１１１】
さらに、本発明は、Ｒｏｒ２キナーゼ活性を決定する方法であって、（ａ）Ｒｏｒ２ポリペプチドを得る工程；（ｂ）３２ＰγＡＴＰの存在下でＲｏｒ２ポリペプチドを標識する工程；（ｃ）取込まれた３２Ｐの量を測定することによりＲｏｒ２キナーゼ活性を決定する工程を含み、３２Ｐの量がＲｏｒ２キナーゼの活性を標示する方法を提供する。
【０１１２】
（略号および用語の定義）
以下の定義は、本明細書で使用されている用語および略号を充分に理解するために提供されている。
【０１１３】
本書でおよび添付の特許請求の範囲中で使用されている通り、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、前後関係により相反する指示が明確になされているのでないかぎり、複数の意味を含む。従って、例えば、「１つの宿主細胞（ａ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のこのような宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ）も含まれ、「１つの抗体（ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、１つ以上の抗体および当業者にとっては既知のその等価物に対する言及である、というふうになる。
【０１１４】
本明細書中の略号は、以下の通りの尺度単位、技術、特性または化合物に対応する。「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラム、「ｎｇ」はナノグラム、「ｋＤａ」はキロダルトン、「℃」は摂氏温度、「ｃｍ」はセンチメートル、「ｓ」は秒、「ｍｉｎ」は分、「ｈ」は時、「ｌ」はリットル、「ｍｌ」はミリリットル、「μｌ」はマイクロリットル、「ｐｌ」はピコリットル、「Ｍ」はモル、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）、「ｍｍｏｌｅ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）、「ｋｂ」はキロベース、「ｂｐ」は塩基対そして「ＲＴ」は室温を意味する。
【０１１５】
「ダルベッコの修正イーグル培地」はＤＭＥＭと略される。
「高性能液体クロマトグラフィ」はＨＰＬＣと略される。
「ハイスループットスクリーニング」はＨＴＳと略される。
「読取り枠」はＯＲＦと略される。
「質量分析」はＭＳと略される。
「タンデム質量分析」はＭＳ／ＭＳと略される。
「ポリアクリルアミドゲル電気泳動法」はＰＡＧＥと略される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと略される。
「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと略される。
「ドデシル硫酸ナトリウム」はＳＤＳと略される。
「ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略される。
「ヒト骨格筋ＬＩＭ−タンパク質３」は（ＳＬＩＭ３）と略される。
「アデニンヌクレオチド輸送体２」は、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質と略される。
「骨ミネラル密度」はＢＭＤと略される。
「リボソームＲＮＡ」はｒＲＮＡと略される。
「未翻訳領域」はＵＴＲと略される。
「Ｔ細胞因子」は、ＴＣＦと略される。
「ジチオトレイトール」はＤＴＴと略される。
【０１１６】
この開示の文脈中では、数多くの用語が使用されることになる。本書で使用されるＲｏｒという語は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体のファミリーを意味する。「Ｒｏｒ分子」は、Ｒｏｒポリペプチド、Ｒｏｒペプチド、そのフラグメント、変種および変異体ならびに、Ｒｏｒポリペプチド、Ｒｏｒペプチドおよびそのフラグメントまたは変種または変異体をコードする核酸を意味する。「Ｒｏｒ分子」は同様に、Ｒｏｒポリヌクレオチド、遺伝子およびその変種および変異体を意味する。「Ｒｏｒ分子」および「Ｒｏｒ」はＲｏｒ１およびＲｏｒ２の両方の分子を意味する。
【０１１７】
「標的Ｒｏｒ分子」は、その活性が本発明の作用物質により調節されるＲｏｒ分子を意味する。標的Ｒｏｒ分子は、Ｒｏｒポリペプチド、その相同体、誘導体またはフラグメントまたは変種または変異体であり得る。問題のＲｏｒ分子は同様に核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）でもあり得る。例えば、遺伝子の写しが１つの実験の関心の的である場合、標的Ｒｏｒ分子は写しとなる。標的Ｒｏｒ分子という語が全長分子およびそのフラグメント、変種および変異体例えばタンパク質のエピトープの両方を意味するということを理解すべきである。標的Ｒｏｒ分子は、Ｒｏｒ１分子またはＲｏｒ２分子あるいはその両方のいずれでもあり得る。
【０１１８】
「Ｗｎｔ」という語は、早期胚発育のきわめて重要な局面に関与する保存されたシステイン富有の分泌糖タンパク質のファミリーを意味する。Ｗｎｔ遺伝子はガンにも同じく関与している。本書で使用する「Ｗｎｔ」という語は、特定的に、ヒト、マウス、ラットおよびその他のゲッ歯類などといった哺乳動物を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）全てのヒトおよびヒト以外の動物種のＷｎｔ遺伝子を含んでいる。「Ｗｎｔ」という語は、ヒトＷｎｔ−１（以前ｉｎｔ−１と呼ばれたもの）（ヴァンオーエン（Ｖａｎ  Ｏｏｙｅｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ、４、２９０５−９、（１９８５））、Ｗｎｔ−３（ローリンク（Ｒｏｅｌｉｎｋ）ら、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１７、７９０−７９２、（１９９３）；ユゲー（Ｈｕｇｕｅｔ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、５４．２６１５−２５２１、（１９９４））を含めた未変性ヒトＷｎｔ遺伝子およびコードされたポリペプチド、およびそれらの変種、特にアミノ酸配列変種を含む。
【０１１９】
「Ｗｎｔシグナル化経路」というのは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ−３などといったＷｎｔタンパク質によって調節されたあらゆる経路を意味する。
【０１２０】
「正統なＷｎｔシグナル化経路」というのは、それ自体リン酸化β−カテニン由来のグリコーゲンシンセターゼキナーゼ−３を阻害するＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄタンパク質のＷｎｔタンパク質による活性化を意味する。リン酸化されたβ−カテニンは、ユビキチン化の後急速に分解される。しかしながら、リン酸化されていないβ−カテニンは蓄積して核へと転座し、そこでそれは、Ｔ細胞因子転写活性剤複合体の共同因子として作用する。
【０１２１】
「分泌されたｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質」または「ＳＦＲＰ」という語は、Ｗｎｔシグナル化経路の分泌された受容体に関するものである。
【０１２２】
「核酸分子」という語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ分子）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ分子）のリン酸エステル形態または、一本鎖形態または２本鎖らせんのいずれかでのあらゆるホスホジエステル類似体を意味する。２本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という語は、分子の一次および二次構造を意味し、それを何らかの特定の三次形態に制限するものではない。かくして、この用語は、なかんづく線状（例えば制限フラグメント）または円形ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体の中に見られる２本鎖ＤＮＡを内含する。特定の２本鎖ＤＮＡ分子の構造を論述するにあたっては、配列は、ＤＮＡの転写されていないストランド（すなわちｍＲＮＡと相同な配列をもつストランド）に沿って５’→３’方向の配列のみを示すという正規の慣例に従って記述することができる。
【０１２３】
「組換え型核酸分子」というのは、分子生物学的操作を受けた核酸分子すなわち、天然に発生しない核酸分子である。さらに、「組換え型ＤＮＡ分子」という語は、天然に発生しないかまたは、そうでなければ分離している２つの配列セグメントの人工的組合せによってすなわち通常は連続していないＤＮＡの断片を併せてライゲートすることによって作ることのできる核酸配列を意味する。「組換えにより産生された」というのは、化学的合成手段または核酸の単離されたセグメントの人工的操作、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州、プレインヴュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）（１９８９）またはアウシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（１９８９）および「ＤＮＡクローニング：その実践的アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ｄ．Ｎ．グローバ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＩＲＥＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、（１９８５）によって記述されているものと類似の技術、および制限酵素、リガーゼを用いた遺伝子工学処理技術のいずれかによって往々にして達成される人工的組合せを意味する。
【０１２４】
このようなことは、通常、標準的には配列認識部位を導入するかまたは除去しながら、１つのコドンをそのコドンをコードする冗長なコドンまたは保存的アミノ酸で置換するために行なわれる。代替的には、所望の機能の核酸セグメントを併合して一般の自然な形態では発見されない機能の所望の組合せを含む単一の遺伝的実体を生成するためにそれを実施することもできる。制限酵素認識部位が往々にしてかかる人工的操作の標的であるが、その他の部位特異的標的、例えばプロモータ、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列またはその他の有用な特長を設計により取り込むことも可能である。組換え型核酸分子の例には、５’→３’（センス）配向または３’→５’（アンチセンス）配向にあるｐｈＩ遺伝子タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するクローニングまたは発現ベクターといったような組換え型ベクターが含まれる。
【０１２５】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」という語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ内の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を意味し、かつ、２つ以上のヌクレオチドのあらゆる連鎖を意味する。ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖のそのキメラ混合物または誘導体または修飾されたバージョンであり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性そのハイブリダイゼーションパラメータなどを改善するために塩基部分、糖部分またはリン酸塩主鎖において修飾され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらに限定されるわけではないが５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される修飾された塩基部分を含み得る。ヌクレオチド配列は標準的には、タンパク質および酵素を作るため細胞機構が使用する情報を含めた遺伝子情報を担持する。これらの用語には、２本鎖または１本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、およびセンスおよびアンチセンスの両方のポリヌクレオチドが含まれる。これには、１本鎖および２本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドならびにアミノ酸主鎖に対し塩基を接合することにより形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これは同様に、例えばチオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルといった修飾された塩基を含有するかまたは炭水化物または脂質を含有する核酸を含む。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば自動化されたＤＮＡ合成装置（例えばバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などから市販されているもののようなもの）を用いて当該技術分野において既知の標準的方法によって合成可能である。１例としては、ステインら（Ｓｔｅｉｎ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１６、３２０９（１９８８）の方法によりホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドを合成することができ、制御された多孔ガラス重合体支持体を用いてメチルホスホナート・オリゴヌクレオチドを調製することができる（サリン（Ｓａｒｉｎ）ら、全米科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５、７４４８−７４５１、（１９８８）。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために数多くの方法が開発されてきており、例えば、アンチセンス分子を直接組織部位に注射することもできるし、或いは、所望の細胞をターゲティングするように設計された修飾済みアンチセンス分子（標的細胞表面上で発現された受容体または抗原を特異的に結合させるペプチドまたは抗原に連続されたアンチセンス）を全身的に投与することもできる。代替的には、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモータといったような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを取込むさまざまなベクター内に取込まれ得る。代替的には、使用されるプロモータに応じてアンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘発的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成体を、細胞系列内に安定した形で導入することができる。しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑圧するのに充分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは往々にして困難である。従って、好ましいアプローチでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモータの制御下に置かれている組換え型ＤＮＡ構成体が利用される。患者の体内に標的細胞をトランスフェクトするためのかかる構成体の使用は、結果として、内因性標的遺伝子の写しと相補的塩基対を形成しかくして標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨げることになる充分な量の１本鎖ＲＮＡの転写をもたらす。例えば、細胞により取上げられアンチセンスＲＮＡの転写を導くような形でインビボでベクターを導入することが可能である。かかるベクターは、それが所望のアンチセンスＲＮＡを産生するべく転写され得るかぎり、エピゾームにとどまることも又染色体的に組込まれた状態となることもできる。かかるベクターは、当該技術分野において標準的である組換え型ＤＮＡ技術方法によって構築可能である。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞内での複製および発現のために用いられるその他の当該技術分野において既知のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物好ましくはヒトの細胞内で作用するべく当該技術分野において既知のあらゆるプロモータによるものであり得る。かかるプロモータは、誘発性でも構成性でもあり得る。かかるプロモータには、ＳＶ４０早期プロモー��領域（バーノイスト（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ）およびシャンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９０、３０４−３１０（１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復内に含まれたプロモータ、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、２２、７８７−７９７、（１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ、ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、全米科学アカデミー会報、７８、１４４１〜１４４５、（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、ブリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９６、３９−４２（１９８２）などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。組織部位内に直接導入され得る組換え型ＤＮＡ構成体を調製するには、あらゆるタイプのプラスミド、コスミド、酵母人工染色体またはウイルスベクターを使用することができる。代替的には、所望の組織を選択的に感染させるウイルスベクターを使用することができ、この場合、もう１つの経路により投与を達成することができる（例えば全身的に）。
【０１２７】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した要領でその他の１本鎖ＲＮＡを特異的に分割する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を通して、ＲＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列を認識しそれを分割する分子を工学処理することが可能である。チェフ（Ｃｅｃｈ）、米国医学会ジャーナル（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．）、２６０、３０３０、（１９８８）。このアプローチの主たる利点は、それらが配列特異的であることから、特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるという点にある。
【０１２８】
ポリヌクレオチドは、天然の調節（発現制御）配列によってフランキングされ得、そうでなければ、プロモータ、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびその他のリボソーム結合部位配列、エンハンサ、応答要素、サプレッサ、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コーディング領域などを含む非相同配列と会合され得る。核酸は同じく、当該技術分野において既知の数多くの手段によっても修飾され得る。かかる修飾の制限的意味のない例としては、メチル化、「ｃａｐｓ」、天然に発生するヌクレオチドのうちの１つ以上のものの類似体による置換、および例えば非荷電性連結（例えばメチルスルホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバマートなど）および荷電性連結（例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）を伴うものといったようなヌクレオチド内修飾が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インタカレータ（例えばアクリジン、プソラレンなど）、キレート剤（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など）およびアルキル化剤といったような１つ以上の付加的な共有結合により連結された部分を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチルまたはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホルアミダート連結の形成により誘導体化され得る。さらに、本書では、ポリヌクレオチドは、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する能力をもつ標識ででも修飾され得る。標識例としては、放射性同位元素、螢光性分子、ビオチンなどが含まれる。
【０１２９】
「ＲＮＡ写し」というのは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼを触媒とする転写の結果として得られた産物を意味する。ＲＮＡ写しがＤＮＡ配列の相補的コピーである場合それは一次写しと呼ばれるか、そうでなければそれは、一次写しの転写後のプロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」というのは、イントロンが無く、細胞によりポリペプチドへと翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＲＮＡ」は、組換え型ｃＤＮＡ鋳型から転写された相補的ＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」というのは、１つのｍＲＮＡ鋳型に相補的でかつこれから誘導されたＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは、１本鎖であるかまたは例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて２本鎖形態に転換され得る。
【０１３０】
ＲＮＡの一部分に「相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリッド形成できるように充分な相補性をもち、安定した２重鎖を形成する配列を意味する。２本鎖アンチセンス核酸の場合には、２重鎖ＤＮＡの１本鎖をかくして試験することができ、または３重鎖形成を検定することもできる。ハイブリッド形成する能力は、相補性の度合およびアンチセンス核酸の長さの両方により左右されることになる。一般的に、ハイブリッド形成する核酸が長くなればなるほど、より多くの塩基が自ら含有し得かつなおも安定した２重鎖（または場合によっては３重鎖）を形成し得るＲＮＡとミス対合する。当業者であれば、ハイブリッド形成した複合体の融点を決定するための標準的な手順を使用することによって許容ミス対合度を確認することができる。
【０１３１】
特定のポリヌクレオチドの「アンチセンスコピー」というのは、ポリヌクレオチドに対し水素結合する能力をもちそのためにポリヌクレオチドの発現を調節する能力をもち得る相補的配列を意味する。これらは、上述のような改変された主鎖をもつ類似体を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類似体である。アンチセンスコピーが結合するポリヌクレオチドは、１本鎖の形をしていてもまたは２本鎖の形をしていてもよい。「アンチセンス配向」でプロモータに連結されたＤＮＡ配列は、標的遺伝子のコーディングｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子が産生されるような形でプロモータに連結され得る。
【０１３２】
アンチセンスポリヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）群から選択された少なくとも１つの修飾された糖部分を含み得る。１つの実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択された少なくとも１つの修飾されたリン酸塩主鎖を含み得る。
【０１３３】
「センス」という語は、コーディングｍＲＮＡ核酸配列と同じ配向にある核酸の配列を意味する。「センス配向」でプロモータに連結されたＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡと同一の配列を含むＲＮＡ分子が転写されるような形で連結されている。しかしながら産生されたＲＮＡ分子は、機能的タンパク質内へと転写される必要はない。
【０１３４】
「センス」ストランドおよび「アンチセンス」ストランドが同じ文脈内で使用される場合、これらは、互いに相補的である１本鎖ポリヌクレオチドを意味する。これらは、２本鎖ポリヌクレオチドの相対するストランドであってもよいし、そうでなければ、一般的に受容されている塩基対合法則に従って一方のストランドを他方のストランドから予測することも可能である。相反する規定または暗示のないかぎり、一方のストランドまたは他方のストランドへの「センス」または「アンチセンス」としての割当ては任意である。
【０１３５】
「核酸」または「核酸配列」、「核酸分子」、「核酸フラグメント」または「ポリヌクレオチド」という語は、「遺伝子」、「遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ」および「ｃＤＮＡ」と互換的に使用可能である。
【０１３６】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という語は、コーディング配列のみを含み得るポリヌクレオチドならびに付加的なコーディングまたは非コーディング配列を含み得るポリヌクレオチドを包含する。
【０１３７】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で核酸分子の１本鎖形態がもう１方の核酸分子にアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡといったもう１つの核酸分子に対して「ハイブリッド形成可能である」。サムブルック  Ｊ．ら編、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）、第１〜３巻（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸についての予備的スクリーニングのためには、５５℃のＴｍに対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％の乳およびホルムアミド無し、または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳといった条件を使用することができる。中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば５×または６×のＳＳＣで４０％のホルムアミドといったように、より高いＴｍに対応する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最高のＴｍ、例えば５０％のホルムアミド、５×または６×のＳＳＣに対応する。ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって塩基間のミス対合が可能ではあるものの、２つの核酸が相補的な配列を含有していることが必要である。核酸をハイブリッド形成させるための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性度によって左右される。２つの核酸配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、これらの配列をもつ核酸ハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。（より高いＴｍに対応する）核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性は、以下の順序で減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための等式が導出されてきた。サムブルックら編、分子クローニング：実験室マニュアル（第２版、１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク（ＮＹ）、第１〜３巻（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）、９．５０−９．５１）。より短かい核酸すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミス対合の位置がさらに重要になり、オリゴヌクレオチドの長さからの特異性を決定する。サムブルックら編、分子クローニング：実験室マニュアル（第２版、１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、第１〜３巻（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６、１１．７〜１１．８）。
【０１３８】
「相補的」という語は、互いにハイブリッド形成する能力をもつヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノミンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【０１３９】
当該技術分野において既知の通り「同一性」または「類似性」という語は、配列を比較することによって決定される通り、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野においては、同一性は同様に、その配列のストリング間の整合によって決定されるように、場合に応じてポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性度をも意味する。同一性および類似性は両方共、コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク  Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８８；バイオコンピューテイング：情報処理とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９３；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、フォン・ハインジ  Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  Ｇ．）、アカデミックプレス、１９８７；配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）、第一部（Ｐａｒｔ  Ｉ）、グリフィン  Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．）、およびグリフィン  Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４；および配列解析プライマ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ  Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｍ．）およびドブルー  Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．）編、Ｍ  ストックトンプレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１、に記述されているもののような既知の方法によって容易に計算可能である。配列間の同一性または類似性を決定するために一般に利用される方法には、カリロ  Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ  Ｈ．）、およびリップマン  Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ．）、ＳＩＡＭ  応用数学ジャーナル（Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．）、４８、１０７３（１９８８）、に開示されているものが含まれるが、これらに制限されるわけではない。同一性および類似性を決定するための方法は、公開されているコンピュータプログラムの中で体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ドブルーＪ．ら、核酸研究、１２（１）、３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ  アトシュル  Ｓ．Ｆ．（Ａｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、分子生物学ジャーナル（Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、２１５、４０３（１９９０））が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１４０】
「相同な」という語は、２つの重合体（すなわちポリペプチド分子または核酸分子）の間の配列類似性の度合を意味する。本書で言及されている相同性百分率の数字は、２つの重合体の間に考えられる最大限の相同性すなわち、最大数の整合した（相同な）位置を有するように２つの重合体が整列させられた場合の相同性百分率を反映している。
【０１４１】
「相同性百分率」という語は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性の程度を意味する。任意の２つのポリペプチドの間の相同性は、いずれかの配列の一定の与えられた位置での整合するアミノ酸の合計数の一次関数である。例えば、いずれかの配列内のアミノ酸の合計数の半分が同じである場合には、２つの配列は５０％の相同性を示すと言われる。
【０１４２】
本発明のポリペプチドに言及している場合の「フラグメント」、「類似体」および「誘導体」（例えば配列番号４、６、８、１０および１２）という語は、かかるポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を基本的に保持し得るポリペプチドを意味する。かくして、類似体には、活性成熟ポリペプチドを産生するべく前駆体タンパク質部分の分割により活性化され得る前駆体タンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメント、類似体または誘導体（例えば配列番号４、６、８、１０および１２）は、１つ以上のアミノ酸が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基で置換されているおよびかかるアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされたものであってもなくてもよいフラグメント、類似体または誘導体であり得、そうでなければ、アミノ酸残基のうち１つ以上のものが置換基を含んでいるもの、またはポリペプチドの半減期を増大させるべくポリエチレングリコールといった化合物とポリペプチドが融合させられているもの、または、ポリペプチドまたは前駆体タンパク質の精製のために用いられるポリヒスチジンタグといったような配列またはシグナルペプチドといったようなポリペプチドに付加的なアミノ酸が融合されているもの、であり得る。かかるフラグメント、類似体または誘導体は、本発明の範囲内に入るものとみなされる。
【０１４３】
ポリヌクレオチド配列の「保存された」残基は、比較されている２つ以上の関連する配列の同じ位置において未改変の状態で発生する残基である。比較的保存されている残基というのは、配列内のその他の場所で現われる残基よりもさらに関連性の高い配列の間で保存されているものである。
【０１４４】
関連したポリヌクレオチドというのは、同一の残基を有意な割合で共有するポリヌクレオチドである。
【０１４５】
異なるポリヌクレオチドは、一方がもう一方から究極的に誘導される場合、互いに「対応している」。例えば、メッセンジャーＲＮＡは、それを転写させる遺伝子に対応している。ｃＤＮＡは、ＲＮＡ配列の知識に基づきＤＮＡの化学的合成によってかまたは逆転反応などによってそれを産生させたＲＮＡに対応する。ｃＤＮＡは同様に、ＲＮＡをコードする遺伝子にも対応する。複数のポリヌクレオチドは同様に、それらが例えば比較中の異なる種、菌株または変種の中で関連するポリペプチドをコードすることといった類似の機能に役立つ場合、互いに「対応する」。
【０１４６】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリヌクレオチドの「類似体」というのは、形態および／または機能において（例えば、相補的ポリヌクレオチド配列上の塩基対に対する配列特異的水素結合に携わる能力において）天然に発生するポリヌクレオチドに似ているものの、例えば普通でないまたは非天然の塩基または改変された主鎖の所有においてＤＮＡまたはＲＮＡと異なっている分子を意味する。例えばユールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）ら、ケミカルレヴュー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）９０、５４３−５８４、（１９９０）を参照のこと。
【０１４７】
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素といったような、発現産物を「コードする」配列または「コーディング配列」は、発現された時点でそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生を結果としてもたらすヌクレオチド配列であり、すなわち該ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のためのアミノ酸配列をコードする。
【０１４８】
「コドン縮重」というのは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくポリヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの枝分かれを意味する。当業者であれば、一定の与えられたアミノ酸を特定するのにヌクレオチドコドンを使用するために特異的宿主細胞が示す「コドン−バイアス」を充分に認識している。従って、宿主細胞中での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン利用頻度が宿主細胞の好ましいコドン利用頻度に近づくような形でその遺伝子を設計することが望ましい。
【０１４９】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」というのは、当業者による配列の手作業による評価によってかまたはＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント探究ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）：アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ．Ｓ．Ｆ．）ら、分子生物学ジャーナル、２１５、４０３〜４１０、（１９９３）；同様にｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴも参照のこと）といったようなアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によってそのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するべく１つの遺伝子のヌクレオチド配列またはポリペプチドのアミノ酸配列を充分に含んでいる部分である。
【０１５０】
従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、該配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定しかつ／または単離するのに充分な該配列を含んでいる。当業者は、本書で報告されているような配列のおかげで、今や当業者にとって既知の目的で、開示された配列の実質的部分または全てを使用することができる。
【０１５１】
「合成遺伝子」は、当業者にとっては既知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組立てることが可能である。これらのビルディングブロックは、ライゲートされアニールされて、遺伝子セグメントを形成し、このセグメントは次に酵素的に組立てられて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡの配列に関連した「化学的に合成された」という語は、成分ヌクレオチドがインビトロで組立てられたことを意味する。ＤＮＡの手作業による化学的合成は周知の手順を用いて達成され得、そうでなければ、一定数の市販の機械のうちの１つを用いて自動化した化学合成を実施することができる。従って、宿主細胞のコドンバイアスを反映するべくヌクレオチド配列の最適化に基づき最適な遺伝子発現のために遺伝子を調製することが可能である。当業者は、宿主が選好するようなコドンに向かってコドン利用が偏向された場合の遺伝子発現の成功の確率を評価する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１５２】
「遺伝子」というのは、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）および後続する（３’非コーディング配列）調節配列を含む特異的タンパク質を発現する核酸フラグメントを意味する。「未変性遺伝子」というのは、独自の調節配列を伴う天然に見られる通りの遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」または「キメラ構成体」は、天然に一緒に発見されない調節およびコーディング配列を含む、未変性遺伝子でないあらゆる遺伝子または構成体を意味する。従って、キメラ遺伝子またはキメラ構成体は、異なる供給源から誘導される調節配列およびコーディング配列、または同じ供給源から誘導されるものの天然で見られるものとは異なる形で配置されている調節配列およびコーディング配列を含み得る。「内因性遺伝子」というのは、生体のゲノム内でその天然の場所にある未変性遺伝子を意味する。「外来性」遺伝子というのは、宿主生体内に通常発見されないものの、遺伝子トランスファにより宿主生体内に導入される遺伝子を意味する。外来性遺伝子は、非未変性生体内に挿入された未変性遺伝子またはキメラ遺伝子を含む可能性がある。「トランス遺伝子」というのは、形質転換手順によりゲノム内に導入された遺伝子である。
【０１５３】
「調節配列」は、コーディング配列の上流側（５’非コーディング配列）、その内部またはその下流側（３’非コーディング配列）に位置設定され、会合されたコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列には、プロモータ、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。
【０１５４】
「遺伝子制御配列」は、遺伝子転写を開始させるのに必要とされるＤＮ配列および、開始が起こる速度を調節するのに必要とされるＤＮＡ配列を意味する。かくして、遺伝子制御配列は、一般的転写因子およびポリメラーゼが組合わさるプロモータに加えて、プロモータにおいてこれらの組立てが進行する速度を制御するために遺伝子調節タンパク質が結合する全ての調節配列で構成され得る。例えば、原核生物に適した制御配列には、プロモータ、任意にはオペレータ配列およびリボソーム結合部位が含まれ得る。真核細胞はプロモータ、エンハンサおよび／またはポリアデニル化シグナルを利用し得る。
【０１５５】
「プロモータ」というのは、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御する能力をもつヌクレオチド配列を意味する。一般的には、コーディング配列はプロモータ配列に対し３’のところに位置設定されている。該プロモータ配列は、近位およびより遠位の上流側要素で構成されており、より遠位の要素は往々にしてエンハンサと呼ばれる。従って、「エンハンサ」というのは、プロモータ活性を刺激でき、プロモータの生得の要素またはプロモータのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入される異種要素であり得るヌクレオチド配列である。プロモータはその全体が未変性遺伝子から誘導されてもよいし、または天然に発見される異なるプロモータから誘導された異なる要素からなるか、さらには合成のヌクレオチドセグメントさえ含んでいてよい。当業者にとっては、異なるプロモータが、異なる組織または細胞型の中、または異なる発達期で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を導くことができる、ということは言うまでもないことである。
【０１５６】
「３’非コーディング配列」というのは、コーディング配列の下流側に位置づけされたヌクレオチド配列であり、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼす能力のある調節シグナルをコードするその他の配列を意味する。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸の添加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【０１５７】
「翻訳リーダー配列」というのは１つの遺伝子のプロモータ配列とコーディング配列の間に位置設定されたヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流側で完全にプロセシングされたｍＲＮＡの中に存在する。該翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡに対する一次写しのプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【０１５８】
「操作可能な形で連結された」という語は、１つのフラグメントの機能がもう１つのフラグメントの影響を受けるような形で単一の核酸フラグメント上の２つ以上の核酸フラグメントの会合を意味する。例えば、プロモータは、そのコーディング配列の発現に影響を及ぼす能力をもつ場合（すなわちコーディング配列がプロモータの転写制御下にある場合）コーディング配列と操作可能な形で連結されている。コーディング配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に対し操作可能な形で連結可能である。「骨細胞内で操作可能なプロモータ」というのは、骨細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータを意味する。
【０１５９】
「ＲＮＡ写し」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼを触媒とする転写の結果としての産物を意味する。ＲＮＡ写しがＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは、一次写しと呼ばれるが、そうでなければ一次写しの転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」というのは、イントロンが無く、ポリペプチドへと翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」というのは、ｍＲＮＡに相補的でかつこれから誘導された２本鎖ＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡというのは、ｍＲＮＡを含み従って細胞によりポリペプチドへと翻訳され得るＲＮＡ写しを意味する。「アンチセンスＲＮＡ」というのは、標的一次写しまたはｍＲＮＡの全てまたは一部分と相補的であり標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ写しを意味する（本明細書に参照により援用されている米国特許第５，１０７，０６５号明細書参照）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的ヌクレオチド配列のいずれの部分との相補性でもありうる。すなわち５’非−コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列におけるものであり得る。「機能的ＲＮＡ」というのは、翻訳され得ないもののそれでも細胞プロセスに対して効果を及ぼすセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはその他のＲＮＡを意味する。
【０１６０】
「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」という語は、細胞内、例えば（ヒトの細胞を含めた）哺乳動物の細胞内および体内例えば（ヒトを含めた）哺乳動物の体内において、干渉をひき起こす能力を有し特異的遺伝子の翻訳後サイレンシングをひき起こすことのできる小さな干渉性ＲＮＡを意味する。ＲＮＡ干渉の現象は、干渉性ＲＮＡを作る方法も同じく論述されているバス（Ｂａｓｓ）、ネイチャー、４１１、４２８−２９、（２００１）；エルバヒール（Ｅｌｂａｈｉｒ）ら、ネイチャー、４１１、４９４−９８、（２００１）；およびファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら、ネイチャー、３９１、８０６−１１、（１９９８）において記述され論述されている。本書で開示された配列に基づくｓｉＲＮＡｓは、相補的ＤＮＡストランドまたは合成アプローチの使用を含めた当該技術分野において既知のアプローチによって作ることができる。ｓｉＲＮＡｓの例は、２９、２５、２２、２１、２０、１５、１０、５までまたはその前後またはその間の任意の整数のｂｐを有することができる。
【０１６１】
「発現」という語は、本発明の核酸フラグメントから誘導されたセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を意味する。発現という語は同様に、１つのポリペプチド内へのｍＲＮＡの翻訳を意味し得る。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑圧する能力をもつアンチセンスＲＮＡ写しの産生を意味する。
【０１６２】
「過剰発現」という語は、正常なまたは形質転換を受けていない生体の中での産生レベルを上回る１つの生体内の遺伝子産物の産生を意味する。「抑圧」というのは、外来性または内因性遺伝子またはＲＮＡ写しの発現を抑圧することを意味する。
【０１６３】
「改変されたレベル」というのは、正常なまたは形質転換を受けていない生体のものとは異なる量または割合での生体内の遺伝子産物の産生を意味する。本発明のポリペプチドの過剰発現は、まず最初に、コーディング領域が所望の発達期で所望の組織内での遺伝子または構成体の発現を導く能力をもつプロモータに対し操作可能な形で連結されているキメラ遺伝子またはキメラ構成体を構築することによって達成可能である。便宜上、該キメラ遺伝子またはキメラ構成体は、同じ遺伝子から誘導されたプロモータ配列および翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コーディング配列も同様に提供され得る。当該キメラ遺伝子またはキメラ構成体は同様に、遺伝子発現を容易にするべく１つ以上のイントロンをも含み得る。当該キメラ遺伝子またはキメラ構成体を含むプラスミドベクターを次に構成することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するために用いられることになる方法によって左右される。当業者は、キメラ遺伝子またはキメラ構成体を含む宿主細胞をうまく形質転換、選択および繁殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝子要素を充分に認識している。当業者は同様に、独立した異なる形質転換事象が異なるレベルおよび発現パターンを結果としてもたらすことになるということ、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯジャーナル、４、２４１１−２４１８、（１９８５）；デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１８、７８−８６、（１９８９）、そしてかくして、所望の発現レベルおよびパターンを示す系列を得るためには多数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識するだろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタンまたは免疫細胞化学分析または表現型分析によって達成可能である。
【０１６４】
「発現カセット」は、規定の制限部位でベクター内に挿入され得る発現産物についてコードするＤＮＡのセグメントまたはＤＮＡコーディング配列を意味する。カセット制限部位は、適切な読取り枠内へのカセットの挿入を確保するように設計されている。一般に、外来性ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ以上の制限部位に挿入され、次にベクターによって伝染性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞内へと搬送される。発現ベクターといったような挿入されたまたは添加されたＤＮＡをもつＤＮＡのセグメントまたは配列は同様に「ＤＮＡ構成体」と呼ぶこともできる。
【０１６５】
「ポリペプチド」という語は、重合体の長さとは無関係にアミノ酸の重合体を意味する。かくして、ポリペプチドの定義内には、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」が内含され、本書では互換的に使用されている。この語は同様に、本発明のポリペプチドの化学的または発現後修飾を特定または除外するものではないが、これらのポリペプチドの化学的または発現後修飾を特定的実施形態として内含または除外することも可能である。従って例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸塩基、脂質基などの共有結合による付着を含むポリペプチドに対する修飾は、明示的にポリペプチドという語によって包含される。さらに、これらの修飾を伴うポリペプチドを本発明に内含すべきまたはそこから除外すべき個別の種として特定することも可能である。上述の例で列挙したもののような天然のまたはその他の化学的修飾は同様に、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めたポリペプチド内のどこででも発生し得る。一定の与えられたポリペプチド内の複数の部位で同じまたは変動する度合で同じタイプの修飾が存在し得るということがわかるだろう。同様に、一定の与えられたポリペプチドが数多くのタイプの修飾を含有することもできる。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として有枝となり得、これらは分枝を伴ってまたは伴わずに環状であり得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付着、ヘム部分の共有結合により付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合により付着、脂質または脂質誘導体の共有結合により付着、ホスホチジルイノトシトールの共有結合により付着、架橋結合、環化、ジフルフィド結合形成、ジメチル化、共有架橋形成、システイン形成、ピログルタマート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペジル化、タンパク質分解、リン酸化反応、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化といったようなタンパク質に対するトランスファ−ＲＮＡ媒介型アミノ酸添加、およびユビキチン化が含まれる。（例えば、タンパク質−構造および分子特性（ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、第２版、Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク、（１９９３）；タンパク質の翻訳後共有結合修飾（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｂ．Ｃ．ジョンソン（Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、アカデミックプレス、ニューヨーク、１−１２頁、１９８３；セイフター（Ｓｅｉｆｔｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２、６２６−６４６、１９９０；ラッタン（Ｒａｔｔａｎ）ら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３、４８−６２、１９９２を参照のこと）。同様に該定義中に含まれるのは、（例えば天然に発生しないアミノ酸、無関係の生物系内でのみ天然に発生するアミノ酸、哺乳動物系などからの修飾されたアミノ酸を含む）アミノ酸の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、置換された連結ならびに、天然発生および非天然発生の両方の当該技術分野において既知のその他の修飾を伴うポリペプチドである。「ポリペプチド」という語は同様に、「タンパク質」または「ペプチド」という語と互換的に使用可能である。
【０１６６】
「ペプチド」という語は、ＮＨ．ｓｕｂ．２と隣接するアミノ酸のＣＯＯＨ基の間で形成されたペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）を介して１個または２個のその他のアミノ酸に各アミノ酸が連結されている、２個以上のアミノ酸の任意の重合体を意味する。好ましくは、アミノ酸は、天然に発生するアミノ酸、特にＬ−鏡像体形態のアルファ−アミノ酸である。しかしながら、その他のアミノ酸、鏡像体形態および、アミノ酸誘導体がペプチドの中に含まれてもよい。ペプチドには、加水分解の時点で３個以上のアミノ酸を生成する「ポリペプチド」が含まれる。ポリペプチドは、５０個以上のアミノ酸を標準的に含むタンパク質を含んでいてよい。
【０１６７】
単数または複数での「変種」という語は、Ｒｏｒ分子の核酸またはアミノ酸配列の変形形態を意味する。「変種」という語の中に包含されるのは、Ｒｏｒ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸置換、添加または欠失である。同様に、「変種」という語の中に包含されるのは、化学的に修飾された天然および合成のＲｏｒ分子である。例えば、変種は、基準ポリペプチドとは異なるポリペプチドを意味し得る。一般に、基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なっているポリペプチドと基準ポリペプチドの間の差は、基準と変種のアミノ酸配列が全体的に密に類似し一部の領域では同一となるような形で制限される。変種および基準ポリペプチドは、保存的または非保存的であり得又任意の組合せで存在し得る１つ以上の置換、欠失、付加、融合およびトランケーション分だけアミノ酸配列において異なる可能性がある。例えば、変種は、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１個または１個といったアミノ酸があらゆる組合せで挿入、置換、または欠失される変種であり得る。さらに、変種は、末端または内部欠失などによって基準配列よりも短かくなることにより基準ポリペプチド配列と異なっている本発明のポリペプチドのフラグメントであり得る。本発明のポリペプチドの変種は同様に、例えば活性成熟ポリペプチドを産生するべく前駆体部分の分割により活性化され得る前駆体タンパク質などの、かかるポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を基本的に保持しているポリペプチドをも内含している。これらの変種は、タンパク質についてコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差異を特徴とする対立遺伝子変形形態であってもよいし、或いは又、差動スプライシングまたは翻訳後修飾が関与し得る。変種は同様に、実質的に同じ生物活性をもつものの異なる種から得られた関係するタンパク質をも内含している。当業者は、単一のまたは多数のアミノ酸置換、欠失、付加または交換をもつ変種を生成することができる。これらの変種は、なかでも、（ｉ）アミノ酸残基のうちの１つ以上のものが保存型または非保存型アミノ酸残基（好ましくは保存型アミノ酸残基）で置換され、かかる置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされたものであってもなくてもよい変種、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸がペプチドまたはタンパク質という欠失されている変種、または（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されている変種、または（ｉｖ）アミノ酸残基のうちの１つ以上のものが置換基を含んでいる変種または（ｖ）ポリペプチド（例えばポリエチレングリコール）の半減期を増大させるための化合物といったようなもう１つの化合物と成熟ポリペプチドが融合されている変種、または（ｖｉ）リーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製のために利用される配列または前駆体タンパク質配列といったような成熟ポリペプチドに付加的なアミノ酸が融合されている変種を含み得る。ポリペプチドの変種は同様に、天然に発生する対立遺伝子変種といったような天然発生変種であってもよく、そうでなければ、天然に発生するものとして知られていない変種であってもよい。上述のような変種は全て、当該技術分野における教示の範囲内に入るとみなされている。
【０１６８】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、均質性に至るまで精製され得る。
【０１６９】
「単離された」という語は、材料がそのもとのまたは未変性環境（例えばそれが天然に発生している場合には自然環境）から取出されていることを意味する。従って、生きた動物の体内に存在する天然に発生するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されておらず、自然系内に共存する材料のうちの一部または全てから人間の介入により分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。例えば、「単離された核酸フラグメント」は、１本鎖または２本鎖で、任意には合成、非天然または改変型のヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡの重合体である。ＤＮＡの重合体の形をした単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから成り、炭水化物、脂質、タンパク質またはその他の材料と組合わせられ得る。かかるポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、かつ／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは１つの組成物の一部であり得、かつかかるベクターまたは組成物がその天然で発見される環境の一部を成していないという点でなお単離されている。同様にして、「実質的に精製された」という語は、天然にそれが発生する直接の化学的環境から人間の介入を通して分離されたまたはその他の形で取り出された物質を意味する。実質的に精製されたポリペプチドまたは核酸は、この分野で一般的に知られている数多くの技術および手順のいずれかによって得られるかまたは産生され得る。
【０１７０】
「精製」という語は、試料中の特定の１つ以上のポリペプチドの比活性または濃度を増大させることを意味する。１つの実施形態においては、比活性は、その試料中の全ポリペプチドの濃度と標的ポリペプチドの活性間の比として表わされる。もう１つの実施形態においては、比活性は、標的ポリペプチドの濃度と合計ポリペプチドの濃度の間の比率として表わされる。精製方法には、当業者にとっては周知の手順である透析、遠心分離およびカラムクロマトグラフィ技術が含まれるが、これらに制限されるわけではない。例えばヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、１９９７、「トランスジェニック乳畜の乳中の生物医薬品タンパク質の産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｄａｉｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ）」、生物製薬学（Ｂｉｏ  Ｐｈａｒｍ）、１０（６）；３４−３８を参照のこと。
【０１７１】
「実質的に純粋な」および「単離された」という語は、天然にポリヌクレオチドまたはポリペプチドと会合されていない物質を伴うポリヌクレオチドまたはポリペプチドの混合物を除外するものとして意図されている。
【０１７２】
「細胞」、「細胞系列」および「細胞培養」という語は互換的に使用可能である。これらの語は全て、任意のおよび全ての後続する世代であるその後代をも内含する。全ての後代が、意図的なまたは故意でない突然変異に起因して同一であり得ないということは言うまでもない。非相同核酸配列の発現という状況下では、「宿主細胞」は、インビトロまたはインビボのいずれに任意設定されようと、原核または真核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といった細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞および昆虫細胞）を意味する。例えば、宿主は、複製能力をもつ任意の形質転換可能な生体を内含でき、細胞は、トランスジェニック動物の体内にあってもよい。宿主細胞は、ベクター用のかつ／またはベクターによりコードされた非相同核酸を発現するレシピエントとして使用可能である。
【０１７３】
哺乳動物細胞系列により産生される外因性タンパク質を発現し回収するための一般的な方法は、例えばエチェベリー（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ）、「哺乳類細胞培養中における工学処理されたタンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、タンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）誌中：原理と実践（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、クレランド（Ｃｌｅｌａｎｄ）ら編、１６３頁（ワイリー・リス社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１９９６）により提供されている。細菌系により産生されたタンパク質を回収するための標準的な技術は、例えばグリスハマー（Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ）ら、「大腸菌細胞由来の過剰産生されたタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ）」ＤＮＡクローニング２：発現系（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中、第２版、グローバ（Ｇｌｏｖｅｒ）ら編、５９−９２頁（オックスフォード大学出版、１９９５）により提供されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来性ポリペプチドの産生は、グアリノ（Ｇｕａｒｉｎｏ）ら、米国特許第５１６２２２２号明細書および国際公開第９４／０６４６３号パンフレットにより開示されている。バキュロウイルスシステムから組換え型タンパク質を単離するための方法は同様にリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）編、「バキュロウイルス発現プロトコル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（ヒューマナプレス社（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）１９９５）によって記述されている。１つの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現系を用いて発現され得る（例えば、各々全体が本明細書に参照により援用されている（ラッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８８、６、４７、「バキュロウイルス発現ベクター：実験室マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、オライリー（Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙ）ら（編集者）、Ｗ．Ｈ．フリーマン社、ニューヨーク、１９９２、米国特許第４，８７９，２３６号明細書参照）を参照のこと）。さらに、ＭＡＸＢＡＣ．ＴＭ．完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を昆虫細胞内での産生のために使用することができる。
【０１７４】
本発明のポリペプチドは同様に特定の特性を活用することによっても単離可能である。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィを用いて、ポリヒスチジンタグを含むものを含めたヒスチジン富有タンパク質を精製することができる。簡単に言うと、キレートを形成するために二価の金属イオンをまず最初にゲルに充填する（（サルコウスキー（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ）、生化学の動向（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）３：１（１９８５））。使用される金属イオンに応じて異なる親和力でこのマトリクスにヒスチジン富有タンパク質が吸着され、競争的溶出か、ｐＨを下げるかまたは強いキレート化剤の使用により溶出されることになる。その他の精製方法には、レクチンアフィニティクロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィによるグリコシル化タンパク質の精製が含まれる（Ｍ．ドイッチャー（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）編、酵素学的方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１８２：５２９（１９９０））。本発明の付加的な実施形態においては、問題のポリペプチドと親和性タグ（例えばマルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合を構築して精製を容易にすることができる。
【０１７５】
本発明の宿主細胞は、細胞が適切な培地中で成長させられ、所望のポリペプチド産物が細胞からまたは細胞が中で成長させられる培地から、例えばイムノアフィニティクロマトグラフィ、受容体アフィニティクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、レクチンアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除ろ過、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィ、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなどを含めた従来のクロマトグラフィ方法などの当該技術分野において既知の精製方法によって単離される、Ｒｏｒポリペプチドの大規模生産のための方法において使用可能である。その他の精製方法としては、所望のタンパク質が、特異的結合パートナーまたは作用物質により認識される特異的タグ、標識またはキレート化部分を有する融合タンパク質として発現、精製される方法が含まれる。精製されたタンパク質は、所望のタンパク質を生成するように分割可能であり、そうでなければ、無傷の融合タンパク質として放置できる。融合成分の分割は、分割プロセスの結合として付加的なアミノ酸残基を有する所望のタンパク質の一形態を産生し得る。
【０１７６】
「インサイチュ」という語は、「インビボ」、「エックスビボ」および「インビトロ」という語を、これらの語が一般に当業者によって認識され理解される通りに、意味し内含する。さらに、「インサイチュ」という語句は、本書では、その最も広い内包的および外延的文脈内で、その場所または位置におけるその持続時間または寿命またはその供給源または由来、その条件または状態とは無関係に、所定の位置でまたは発見されるままに１つの実体、細胞または組織を同定するために利用される。
【０１７７】
「インビトロ」という語は、人工的環境および人工的環境内で発生する反応またはプロセスを意味する。インビトロ環境には、試験管および細胞培養が含まれるがこれらに制限されるわけではない。「インビボ」という語は、自然環境（例えば動物または細胞）および自然環境内で発生するプロセスまたは反応を意味する。
【０１７８】
本発明の方法は、該抽出物を含む細胞（培養した細胞）および細胞溶解物を用いてインビトロで実施可能である。骨形成を調節する作用物質を同定するために考慮されている細胞の例としては、頭蓋冠細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞および多能性前駆体細胞、例えば多能性骨髄間質細胞が含まれるがこれらに制限されるわけではない。骨芽細胞および骨芽細胞前駆体細胞系列統の特定的な例としては、ＡＴＣＣ（国際公開第０１／１９８５５号パンフレット）からのカタログの中で提供されているＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、Ｃ２Ｃ１２、ＭＧ−６３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＵＭＲ１０６細胞、ＲＯＳ１７／２．８細胞、ＳａＯＳ−２細胞など、ならびに、ボディン  ＰＶ（Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶ）、ベルノン  ＳＫ（Ｖｅｒｎｏｎ  ＳＫ）、コーム  ＢＳ（Ｋｏｍｍ  ＢＳ）、内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１３７、４５９２−４６０４、（１９９６）、ボディン  ＰＶＮ、トレールスミス  Ｍ（ＴｒａｉｌＳｍｉｔｈ  Ｍ）、コーム  ＢＳ、骨代謝研究ジャーナル（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ）、１１、８０６−８１９、（１９９６）、ボディン  ＰＶ、グリーン  Ｊ（Ｇｒｅｅｎ  Ｊ）、ハリス  ＨＡ（Ｈａｒｒｉｓ  ＨＡ）、バート  ＲＡ（Ｂｈａｔ  ＲＡ）、スタイン  ＧＳ（Ｓｔｅｉｎ  ＧＳ）、ライアン  ＪＢ（Ｌｉａｎ  ＪＢ）、コーム  ＢＳ、細胞生化学ジャーナル（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、６５、３６８−３８７、（１９９７）、ボディン  ＰＶ、コーム  ＢＳ、骨（Ｂｏｎｅ）、２５、５３５−４３（１９９９）、ボディン  ＰＶＮ、ハリス  ＨＡ（Ｈａｒｒｉｓ  ＨＡ）、コーム  ＢＳ、内分泌学、１４０、２４３９−２４５１、（１９９９）、プリンス  Ｍ（Ｐｒｉｎｃｅ  Ｍ）、バナージー  Ｃ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  Ｃ）、ジェーブド  Ａ（Ｊａｖｅｄ  Ａ）、グリーン  Ｊ、ライアン  ＪＢ、スタイン  ＧＳ、ボディン  ＰＶ、コーム  ＢＳ、細胞生化学ジャーナル（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、８０、４２４−４０、（２００１）の中で記述されているＨＯＢ細胞が含まれる。
【０１７９】
本発明の方法は同様に、無細胞系列を用いて実施することもできる。
【０１８０】
「発現系」という語は、例えばベクターにより搬送され宿主細胞内に導入された外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現用などの適切な条件下で宿主細胞および相容性あるベクターを意味する。一般的な発現系には、大腸菌宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ベクター、および哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。
【０１８１】
「形質転換」というのは、遺伝的に安定した遺伝的形質を結果としてもたらす、宿主生体のゲノム内への核酸フラグメントのトランスファを意味する。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生体は、「トランスジェニック」生体と呼ばれる。
【０１８２】
「クローン」というのは、有糸分裂により単細胞または共通の先祖から誘導された細胞集合を意味する。「細胞系列」というのは、複数の世代についてインビトロで安定して成長する能力をもつ一次細胞のクローンを意味する。
【０１８３】
「分化する」という語は、もとの組織または細胞型とは異なる性質または機能を有することを意味する。かくして、「分化」は、分化するプロセスまたは行為である。
【０１８４】
「骨芽細胞分化」という語は、１つの細胞が骨芽細胞への突然変異の間に専門化した機能を発達させるプロセスを意味する。骨芽細胞分化は、前骨芽細胞、早期および成熟骨芽細胞、前骨細胞および成熟骨細胞期を含み得る（ボディンら、ビタミンおよびホルモン（Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）６５、１０１−１５１（２００２）、スタインら、内分泌学評論（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）１４、４２４−４４２（１９９３）、およびライアンら、ビタミンおよびホルモン（Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）５５、４４３−５０９（１９９９））。
【０１８５】
「増殖」という語は、類似の細胞の成長および産生を意味する。
【０１８６】
「表現型」という語は、１つの細胞のまたは生体の観察可能な性質を意味する。このような観察可能な性質には、物理的外観、ならびにその細胞または生体の体内に存在する特定の生理学的組成物のレベルが関与し得る。骨芽細胞表現型には、骨特異的転写因子Ｃｂｆａ１；１型コラーゲン；アルカリホスファターゼ、オステオカルシン；および骨シアロタンパク質といったような複数のマーカータンパク質の発現が含まれる。
【０１８７】
「遺伝子誘発系」という語は、遺伝子発現を調節するためのリガンドの使用を意味する。遺伝子発現を誘発するために小分子を利用する複数の調節系が開発されてきた（クラークソン  Ｔ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ．）、生物化学の最新意見（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ）、１、２１０−２１８、（１９９７）；レワンドスキー（Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ  Ｍ．）、ネイチャーレビュー誌遺伝学（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．）、２、７４３−７５５、（２００１）において再考されているもの）。遺伝子誘発可能な系は、その系が活性化されていない場合には標的遺伝子の低から検出不可能での基礎発現を可能にし、系が活性化されている場合には標的遺伝子の増大した発現レベルを可能にする分子ツールである。
【０１８８】
「成熟」タンパク質というのは、翻訳後にプロセッシングされたポリペプチドすなわち一次翻訳産物内に存在するあらゆるプレ−またはプロ−ペプチドが除去されたものを意味する。「前駆体」タンパク質というのは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、すなわち、プレ−およびプロ−ペプチドが存在する状態のものを意味する。プレ−およびプロ−ペプチドは、細胞内局在化シグナルを含むが、これに制限されるわけではない。
【０１８９】
本書で使用される、「結合パートナー」または「相互作用タンパク質」という語は、例えば抗原および抗原特異的抗体または酵素およびその阻害物質といったように、特異性をもってもう１つの分子に結合する能力をもつ分子を意味する。結合パートナーは、例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ｌｇＧおよびプロテインＡ、受容体−リガンド対、タンパク質−タンパク質相互作用および相補的ポリヌクレオチドストランドを内含し得る。「結合パートナー」という語は、同様に、細胞内でキナーゼに結合するポリペプチド、脂質、小分子または核酸をも意味しうる。キナーゼと結合パートナーの間の相互作用の変化は、その相互作用が形成する確率の増大または減少、またはキナーゼ結合パートナー複合体の濃度の増大または減少として現われる可能性がある。例えば、Ｒｏｒ１またはＲｏｒ２タンパク質は、もう１つのタンパク質またはポリペプチドと結合し、Ｒｏｒ１またはＲｏｒ２活性の調節を結果としてもたらしうる複合体を形成し得る。
【０１９０】
「シグナル形質導入経路」は、細胞膜を通って細胞外シグナルを伝播させて細胞内シグナルとなるようにする分子を意味する。このシグナルは、このとき、細胞応答を刺激することができる。シグナル形質導入プロセスに関与するポリペプチド分子は受容体および非受容体タンパク質チロシンキナーゼであり得る。
【０１９１】
「受容体」というのは、一般的に特異的物質の選択的結合を特徴とする細胞の内部または表面上の分子構造を意味する。受容体の例としては、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体フラグメントおよび免疫グロブリンのための細胞表面受容体、ならびにステロイドホルモンのための細胞質受容体が含まれる。
【０１９２】
「調節する」という語は、１つの機能の抑圧、増強または誘発を意味する。例えば、遺伝子発現の「調節」または「調節」は、遺伝子の活性の変化を意味する。発現の調節は、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含むが、これに制限されるわけではない。「調節する」または「調節する」というのは同じく、タンパク質、酵素、阻害物質、シグナルトランスデューサ、受容体、転写活性化体、共同因子などの生物活性を増加または減少する方法、条件または作用物質をも意味する。この活性の変化は、それ自体生物活性の増加または減少に対応し得るｍＲＮＡ翻訳、ＤＮＡ転写および／またはｍＲＮＡまたはタンパク質分解の増加または減少であり得る。かかる増強または阻害は、シグナル変換経路の活性化といったような特定の事象の発生時点で不確定であり得る。
【０１９３】
「調節された活性」というのは、１つのタンパク質の生物学的に活性な形態により調節されるあらゆる活性、条件、疾病または表現型を意味する。調節は、生物学的に活性なタンパク質の濃度に影響を与えること、例えば発現または分解を調節することによって、または、例えば化学的または構造的な修飾、基質の阻害、活性化、結合または放出などを通した直接的なアゴニストまたはアンタゴニスト効果によって、または付加的な因子が関与し得る直接的または間接的相互作用によって、影響を受ける可能性がある。
【０１９４】
「モジュレータ」というのは、骨形成またはＲｏｒ分子発現といったような特定の活性の発現を改変するあらゆる作用物質を意味する。例えば、骨形成を調節する作用物質は骨形成を改変または変更する（増加または減少させる）。モジュレータは、あらゆる化合物、例えば抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むように意図されている。
【０１９５】
「小分子」という語は、例えば任意に誘導体化され得るペプチドまたはオリゴヌクレオチド、天然産物、または天然または合成由来のその他のあらゆる低分子量（標準的には約５ｋダルトン未満）の有機、生物無機または無機化合物といったような合成的にまたは天然に発生する化学的化合物を意味する。かかる小分子は、治療用に送達可能な物質であってもよいし、または送達を容易にするためにさらに誘導体化されてもよい。
【０１９６】
本書で使用される通り、「インデューサ」という語は、骨形成またはＲｏｒ分子発現といったような特定の活性を誘発、増強、促進または増大させるあらゆる作用物質を意味する。
【０１９７】
本書で使用される「阻害物質」または「リプレッサー」という語は、骨形成またはＲｏｒ分子発現といったような特定の活性を阻害、抑圧、抑制または減少させるあらゆる作用物質を意味する。
【０１９８】
本書で使用されている通り、「作用物質」または「テスト作用物質」という語は、試験すべきあらゆる化合物または分子を意味する。
【０１９９】
本発明の作用物質の例には、ペプチド、小分子、および抗体が含まれるが、これに制限されるわけではない。作用物質は無作為に選択され得、そうでなければ合理的に選択または設計され得る。本書で使用する作用物質は、それが標的化合物または部位との間のその特異的相互作用を考慮せずに無作為に選択される場合に、「無作為に選択される」と言われる。本書で使用する通り、作用物質は、それが標的化合物または部位との間のその特異的相互作用および／またはその作用物質の作用と結びつけた立体構造を考慮に入れて非無作為ベースで選択される場合に、「合理的に選択または設計される」と言われる。
【０２００】
本書で使用する通り、「抗体」という語は、免疫グロブリン分子あるいはその免疫学的に活性な部分すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、ペプシンといったような酵素で抗体を分割することによって生成され得るＦ（ａｂ）、Ｆｖ、およびＦ（ａｂ’）フラグメントが含まれる。
【０２０１】
本書で使用されている通り、「治療（処置）」、「治療（処置）する」および「療法」という語は、治療的処置および予防または防止用操作、または骨細胞分化または骨形成を刺激し、骨の障害の症候の発生を遅らせかつ／または骨の障害および／または骨の障害から発生することになるまたは発生すると予想されるような症候の重症度を軽減する操作を意味する。これらの語はさらに、既存の骨の障害症候を改良すること、付加的な症候を予防すること、根底にある症候の代謝的原因を改善または防止すること、症候の代謝的原因を防止するまたは逆転させることまたは、骨の成長を防止または促進することも含まれる。かくして、該用語は、骨の障害をもつかまたはかかる障害を発生させる潜在性を有する対象に対して有利な結果が付与されたということを意味している。さらに、「治療（処置）」という語は、１つ疾病、疾病の症候または疾病に対する素因を有し得る対象または該対象からの単離組織または細胞系列に対する、該疾病、疾病の症候または疾病に対する素因を治す、治ゆする、緩和する、軽減する、改変させる、矯正する、改善する、改良するまたは影響を加えることを目的とした、作用物質（例えば治療薬または治療用組成物）の塗布または投与として定義される。本書で使用されている通り「治療剤」というのは、疾病の治療を助ける、例えば骨形成活性を調節するかまたは新しい骨形成を誘発するあらゆる物質または物質の組合せを意味する。従って、治療剤には、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２０２】
治療剤または治療用組成物は同様に、特定の疾病の症候を防止および／または低減させる医薬上許容される形態をした化合物をも含み得る。例えば、治療用組成物は、骨関連障害の症候を防止および／または低減させる薬学組成物であり得る。本発明の治療用組成物は適切なあらゆる形態で提供されることになると考えられている。治療用組成物の形態は、投与様式を含む数多くの要因によって左右される。治療用組成物は、その他の成分の中でも希釈剤、アシュバントおよび賦形剤を含有し得る。
【０２０３】
骨強度は、骨密度（体積１ｃｍ３あたりの無機質のグラム数）および骨質（ミネラル化、骨構築、骨代謝回転、微少骨折）によって決定可能である。骨強度の尺度としては通常、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が使用される。例えば、骨は、そのＢＭＤが若い白人成人女性のＢＭＤの平均よりも標準偏差の２．５倍を超えて低い場合に骨粗鬆症と宣告され得る（世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）、１９９４、骨折リスクの査定と閉経後骨粗鬆症についてのスクリーニングに対するその応用（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｔ’ｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）技術報告シリーズ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ）８４３．ジュネーブ（Ｇｅｎｅｖａ）：世界保健機構））。
【０２０４】
「骨組織」は、石灰化組織（頭蓋冠、脛骨、大腿骨、脊椎、歯）、骨梁とは異なる空洞である骨髄空洞、骨梁と骨髄空洞の外周を覆う皮質骨などを意味する。骨組織は同様に、全体的にミネラル化したコラーゲンのマトリクスの内部に存在する骨細胞；骨細胞に栄養を提供する血管；骨髄穿刺；滑液；骨組織に由来する骨細胞をも意味し、脂肪質骨髄を含み得る。骨組織は、全骨、全骨切片、骨細片、骨粉、骨組織生検材料、コラーゲン調製物またはそれらの混合物などの骨産物を含む。本発明の目的では、「骨組織」という語は、相反する記述のないかぎり、ヒトまたは動物のいずれであれ、上述の骨組織および産物の全てを包含するように使用されている。
【０２０５】
本書で用いられる「骨関連活性」というのは、骨形成活性および骨再吸収活性である。
【０２０６】
骨形成活性は、骨芽細胞活性、骨始原細胞からの骨芽細胞分化および骨芽細胞増殖を増大させること、骨芽細胞アポトーシスを減少させることおよびそれらのいずれかの組合せによって誘発可能である。さらに、骨再吸収活性は、破骨細胞活性、破骨細胞分化および増殖を減少させること、破骨細胞アポトーシスを増大させることおよびそれらのあらゆる組合せによって抑圧可能である。骨形成活性は、さまざまな骨組織または細胞の中で誘発可能である。
【０２０７】
本書で使用されているように、「骨形成を調節する」という語は、骨形成の増加または減少を意味する。「増加した骨形成」というのは、成熟骨芽細胞への細胞の分化および骨物質にミネラル化しその部位での骨量を増大させるコラーゲン質のマトリクスの分泌をもたらす、骨部位への骨芽細胞または骨芽細胞前駆体の動員を意味する。この用語は同様に、成熟骨芽細胞によるコラーゲン質マトリクスの産生および分泌の増大をも包含する。増加した骨形成は、骨折率の減少、面積骨密度の増加、体積骨ミネラル密度の増加、骨梁結合性の増加、骨梁密度の増加、皮質密度または厚みの増加、骨直径の増加および無機骨含有率の増加のうちの１つ以上のものを介して決定可能である。増加した骨形成は、例えば骨芽細胞といった骨細胞の増加した付着、増殖、生存および／または分化およびその後の骨ミネラル化の結果であり得る。
【０２０８】
「骨関連障害」には、骨形成および骨再吸収の障害が含まれる。これらの疾病および身体条件としてはくる病、骨軟化症、骨減少症、骨硬化症、腎性骨形成異常症、骨粗鬆症（老人性および閉経後骨粗鬆症を含む）、パジェット病、骨転移、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、大理石骨病、歯周炎および関節リューマチおよび変形性関節症に付随することのある骨代謝の異常変化が含まれるが、これに制限されるわけではない。これらの疾病のうちの一部分は、不充分な骨形成または骨粗鬆を特徴とするが、その他の疾病には、骨組織の異常な肥厚化または硬化が関与する。骨の異常な肥厚化を阻害することの恩恵を受けることになる疾病の例としては、大理石骨病および骨硬化症が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２０９】
「骨関連作用物質」というのは骨形成または骨再吸収に影響を及ぼす作用物質を意味する。「骨関連作用物質」は、同化効果または異化効果を誘発でき、骨の再吸収を阻害して骨ミネラル密度の増大をもたらすことができ、骨形成を増加させることができ、または骨形成と骨再吸収の間のバランスを維持することができる。
【０２１０】
「化合物」または「作用物質」という語は、本書では対象（ヒトまたは動物）に投与された時点で局所的および／または全身的作用により所望の薬理および／または生理的効果を誘発する物質の単数または複数の化合物または組成物を意味するべく互換的に使用される。
【０２１１】
「対象」という語は、ヒトまたはヒト以外の対象を含めたあらゆる哺乳動物を意味する。ヒト以外の対象は、実験用、テスト用、農耕用、ショー用の動物またはコンパニオンアニマルを含み得る。
【０２１２】
「生物試料」という語は、あらゆる細胞、組織、生体液、器官、多細胞生体などを内含するように広く定義される。生物試料は例えばインビトロでの細胞または組織培養に由来し得る。代替的には、生物試料は、単細胞生体の集合からかまたは生きた生体に由来してもよい。生物試料は、生きた骨といったような生きた組織であってよい。「生物試料」という語は同様に、対象から単離された細胞、組織または生体液といったような試料、ならびに対象の体内に存在する試料を内含するようにも意図されている。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボでの生物試料中のＲｏｒｍＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＤＮＡまたは活性を検出するために用いることができる。例えば、ＲｏｒｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術には、ＴａｑＭａｎ分析、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。Ｒｏｒタンパク質の検出のためのインビトロ技術には、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法および免疫螢光法が含まれる。ＲｏｒゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術にはサザンハイブリダイゼーションが含まれる。
【０２１３】
「テスト試料」は、問題の対象からの生物試料を意味する。
【０２１４】
「体液」というのは、これらに限定されるわけではないが、血清、血漿、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、汗、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、蒸泄、鼻汁、組織培地、組織抽出物および細胞抽出物を含めたあらゆる体液を意味する。これは同様に体液の画分および希釈液にもあてはまり得る。体液の供給源は、ヒトの体、動物の体、実験動物、植物またはその他の生体であってよい。
【０２１５】
（発明の実施形態の記載）
骨関連活性のモジュレータとしてＲｏｒ分子の発現または活性を調節する作用物質を使用する方法：Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する作用物質が骨関連活性を調節するために有用である。例えば骨形成を増強することといった骨関連活性を調節する必要性によって特徴づけされる疾病および身体条件が数多く存在する。最も明白であるのは、骨の成長を刺激し骨の修復を加速し完了させることが望まれる骨折の場合である。例えば、骨形成を増強する作用物質は、顔面復元手術において潜在的に有用であり得る。その他の骨欠損条件としては、骨分節の欠陥、歯周病、転移性骨疾患、溶骨性骨疾患、および、軟骨欠陥または損傷の治ゆまたは再生といった結合組織の修復が有利であると思われる身体条件が含まれるが、これに制限されるわけではない。同様にきわめて有意であるのは、加齢性骨粗鬆症および閉経後ホルモン状態に関連する骨粗鬆症を含めた骨粗鬆症の慢性的身体条件である。骨成長の必要性を特徴とするその他の身体条件としては、原発性および続発性上皮小体亢進症、糖尿病関連骨粗鬆症、廃用性骨粗鬆症およびグルココルチコイド関連骨粗鬆症が含まれる。
【０２１６】
本発明の方法において使用するための作用物質は、投与に適した薬学組成物の中に取込むことができる。本書で使用される「作用物質」という語は、Ｒｏｃ核酸分子、Ｒｏｒポリペプチドのフラグメント、および抗−Ｒｏｒ抗体ならびにＲｏｒ分子の発現、合成、および／または活性を調節する同定された化合物（例えば、小さく、かつ経口活性をもつ有機分子）が含まれるが、これに制限されるわけではない。かかる組成物は標準的に、化合物、核酸分子、タンパク質、抗体ならびにかかる核酸分子を発現するベクターおよび宿主細胞、および医薬上許容される担体を含む。本発明の組成物は、骨関連活性を調節するものとして知られている１つ以上の作用物質と組合せた形で１つ以上の作用物質を含有し得る。例えば、Ｒｏｒの発現を誘発する作用物質は、エストロゲン、ビスホスホナートまたは組織選択性エストロゲン（すなわち選択的エストロゲン受容体モジュレータすなわちＳＥＲＭ）のような骨の再吸収を阻害する作用物質と組合せることができる。
【０２１７】
１つ以上の作用物質が治療上有効な用量で使用される。治療上有効な用量というのは、利点（例えば治療対象の障害、疾病または身体条件に付随する症候の減少）を示すのに充分な量の作用物質を意味する。単独で投与される個々の成分に適用された場合、この語はその成分だけを意味する。組合せに適用された場合、この語は、組合せで、連続的にまたは同時にのいずれで投与されるかとは無関係に、利点をもたらす成分の組合わせた量を意味する。例えば、治療的用途のための有効量は、骨折修復における治ゆ速度の臨床的に有意な増加；骨粗鬆症における骨折の防止および骨粗鬆の逆転；軟骨欠陥または障害の逆転；骨粗鬆症の発症の防止または遅延；骨折偽関節および仮骨延長術における骨形成の刺激および／または阻害；人工補装具内への骨の成長の増加および／または減少；歯の欠陥の修復などを提供する作用物質を含む組成物の量である。かかる有効量は、日常的な最適化技術を用いて決定されることになり、治療すべき特定の身体条件、患者の身体条件、投与経路、処方、医師の判断および当業者にとって明白であるその他の要因に左右される。本発明の化合物に必要とされる投薬量（例えば骨形成の増加が望まれる骨粗鬆症において）は、治療グループと対照グループの間の骨量の統計的に有意な差異を確保する投薬量である。骨量のこの差異は、例えば治療グループにおいて骨量の５〜２０％またはそれ以上の増加として捉えられる可能性がある。臨床的に有意な治ゆ増加のその他の測定には、例えば破壊強度および張力、破壊強度とねじれ、４点曲げ、骨生検材料における結合性の増加についての試験、および当業者にとっては周知のその他の生体力学試験が含まれ得る。治療法についての一般的な指針は、問題の疾病の動物モデルで実施された実験から得ることができる。
【０２１８】
作用物質の毒性および治療上の効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上の有効な用量）を決定するため、細胞培養中または実験動物の体内で、標準的な薬学的手順により決定可能である。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現できる。大きい治療指数を示す作用物質または化合物が好まれる。細胞培養検定および動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を公式化する上で使用することができる。かかる作用物質または化合物の投薬量は、ほとんどまたは全く毒性の無いＥＤ５０を内含する循環濃度範囲内にあり得る。該投薬量は、利用される投薬形態および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０２１９】
本発明の方法において使用されるいずれの作用物質についても、治療的に有効な用量は、当初細胞培養検定から見積られてよい。例えば、細胞培養内で決定される通りのＥＤ５０（すなわち、タンパク質複合体の半最大分断または複合体成分の細胞レベルおよび／または活性の半最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて用量を公式化することができる。かかる情報を用いてより正確にヒトにおける有用な用量を決定することが可能である。血漿レベルは、例えばＨＰＬＣにより測定可能である。投薬量は、患者の条件に照らして、個々の医師が選択できる。主治医は、投与を終結、中断または調整する方法と時期を知っているはずである。換言すると、主治医は、同様に、臨床応答が適切でなかった場合により高いレベルに治療を調製する（毒性を排除する）こともできると思われる。問題の障害の管理における投与される用量の規模は、治療すべき身体条件の重症度と共に変動することになる。身体条件の重症度は、例えば一部には標準的予後診断評価方法によって評価され得る。さらに、用量およびおそらくは用量頻度は、同様に、個々の患者の年令、体重および応答に従っても変動することになる。上述のものに匹敵するプログラムを獣医学において利用することができる。
【０２２０】
特定の状況のための適切な投薬量の決定は、当該技術分野の技能範囲内にある。一般に、治療は、該化合物の最適な用量より少ない比較的少量の投薬量で開始される。その後、投薬量を、状況下の最適な効果が達成されるまで、小さい増分で増加させることができる。例えば、合計一日投薬量を、望ましい場合、一日の間で複数の分量に分割して投与することができる。
【０２２１】
治療対象の特定の条件に応じて、作用物質を処方し全身的または局所的に投与することができる。本発明の薬学組成物は、その意図された投与経路と相容性をもつように処方される。処方および投与の技術は、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版、マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ）（１９９０）の中に見い出すことができる。適切な経路には、いくつか挙げるだけでも、経口、直腸内、経膣、経皮、経粘膜または腸内投与；筋内、皮下および髄内注射を含む非経口送達、ならびに鞘内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が含まれると考えられる。使用可能ないくつかの送達方法としては、リポゾーム内へのカプセル封じ、レトロウイルスベクターによる形質導入、大部分の核タンパク質上に見られる核ターゲティング部位を利用した核区画への局在化、トランスフェクションを受けた細胞のその後の再移植または管理を伴うエクスビボでの細胞のトランスフェクション、およびＤＮＡトランスポータ系が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２２２】
組成物が薬学的に使用される場合、これらは、診断および治療用の「医薬上許容される担体」と組合せられる。かかる組成物の処方は当業者にとって周知である。本発明の薬学組成物は、１つ以上の付加的作用物質を含み、好ましくは、医薬上許容される担体を含む。
【０２２３】
適切な医薬上許容される担体および／または希釈剤は、任意のそして全ての従来の溶媒、分散媒体、充填剤、個体担体、水溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを含む。「医薬上許容される担体」という語は、それが投与される患者の体内でアレルギー反応またはその他の上向き効果をひき起こさない担体を意味する。適切な医薬上許容される担体には、例えば、水、塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上のものならびにそれらの組合せを内含する。医薬上許容される担体はさらに、組成物の作用物質のうちの１つ以上のものの保管寿命または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤といったような補助物質をわずかに含むことができる。医薬上許容される物質のためのかかる媒質および作用物質の使用は、当該技術分野において周知である。
【０２２４】
非経口、皮内または皮下での適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の構成成分を含むことができる。注射用水、食塩溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒といった無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンといったような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムといったような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸といったキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩といった緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースといったような張度の調整用作用物質。塩酸または水酸化ナトリウムといったような酸または塩基でｐＨを調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスまたはプラスチックで作られた複数回投与水薬瓶の中に封入することができる。注射に適した薬学組成物には、無菌注射可能溶液または分散の即席調製物のための無菌水溶液（水溶性の場合）または分散および無菌粉末が含まれる。静脈内投与のためには、適切な担体として生理食塩水、静菌性水、クレモフォールＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ）（登録商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パルシッパニー（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．））またはリン酸緩衝生理食塩水がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、レシチンといったようなコーティングの使用、分散の場合における必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用によって維持可能である。微生物による作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどのさまざまな抗菌および抗真菌剤によって達成可能である。数多くの場合において、組成物中にマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムといったような糖またはポリアルコールなどの等張剤を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間にわたる吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅らせる作用物質を組成物中に内含させることによってもたらすことができる。
【０２２５】
さらに、本発明により同定された疾病および身体条件を治療するための作用物質は同様に、治療中の身体条件に対するその特別な有用性のために選択されるその他の治療剤と同時投与することもできる。例えば、作用物質をエストロゲンまたはエストロゲン関連化合物またはその他の骨再吸収阻害物質と組合わせることもできる。エストロゲン化合物には、接合されたエストロゲン、エストラジオールおよびその類似体が含まれるがそれに限定されるわけではない。その他の骨関連治療用化合物には、ビスホスホナートおよび関連化合物（例えば米国特許第５，３１２，８１４号明細書に記されているもののようなもの）、カルシウムサプリメント（プリンス、Ｒ．Ｌ．（Ｐｒｉｎｃｅ、Ｒ．Ｌ．）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５、１１８９、（１９９１）、ビタミンＤサプリメント（シャピュイ  Ｍ．Ｃ．（Ｃｈａｐｕｙ  Ｍ．Ｃ．）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７、１６３７、（１９９２）、フッ化ナトリウム（リッグス、Ｂ．Ｌ．（Ｒｉｇｇｓ、Ｂ．Ｌ．）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２７、６２０、（１９９２）、アンドロゲン（ナジャン・ド・ドゥシェスヌ、Ｃ．（Ｎａｇｅｎｔ  ｄｅ  Ｄｅｕｘｃｈａｉｓｎｅｓ  Ｃ．）、骨粗鬆症（Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）中、多診療科問題、王立医学会国際会議およびシンポジウムシリーズ（Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ）第５５号、アカデミックプレス、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）、２９１頁、（１９８３）、およびカルシトニン（クリスチャンセン、Ｃ．（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ｃ．）、骨（Ｂｏｎｅ）１３（増補１）：Ｓ３５、（１９９２）が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２２６】
医薬品標的としてのＲｏｒ分子：本発明は、インビトロおよびインビボアプローチによる骨粗鬆症薬物標的としてＲｏｒ分子を検証している。例えば、哺乳動物細胞の中でＲｏｒ発現を特異的に分断することになるｓｉＲＮＡ分子が生成され得る。これらのｓｉＲＮＡは、比較的高レベルのＲｏｒｍＲＮＡで早期骨芽細胞内で過剰発現され得、細胞の分化および／または生存に対するＲｏｒ分断の効果をモニター観察することができる。Ｒｏｒ依存性遺伝子を同定するため、遺伝子チップ分析も実施し得る（米国特許第５７９５７１６号明細書、米国特許第５９７４１６４号明細書）。Ｒｏｒ２発現パターンおよびＳＦＲＰ−１およびＷｎｔシグナル化に対するその関係に基づいて、Ｒｏｒ２ダウンレギュレーションは、骨芽細胞分化を加速することができ、同様にアポトーシスを促進することもできる。補足的アプローチには、検出可能なレベルのＲｏｒ２ｍＲＮＡを全くもたず低レベルのＲｏｒ１ｍＲＮＡしかもたない骨細胞前細胞中のＲｏｒの過剰発現およびこれらの細胞の分化状態の監視が関与する。インビトロ検証の後、組織および／または時間依存的にＲｏｒを条件付きで過剰発現するトランスジェニックマウスを生成することによって、骨粗鬆症標的としてのＲｏｒのインビボ検証を実施することができる。発達中の異なる時点で条件付きで分断されたＲｏｒ発現を伴うマウスも同様に生成可能である。
【０２２７】
骨関連活性および／またはＷｎｔシグナル化経路を調節する作用物質を同定する方法：本発明は、Ｒｏｒ分子の発現または活性の増加または減少が、その作用物質が骨関連活性および／またはＷｎｔシグナル化を調節していることを表わしている、テスト作用物質を投与する工程および作用物質が骨関連活性を調節するか否かを決定するべくＲｏｒ分子の発現または活性をモニター観察する工程を含む、骨関連活性および／またはＷｎｔシグナル化を調節する作用物質を同定するための方法を提供する。
【０２２８】
１つの作用物質がＲｏｒ分子の発現または活性を改変するか否かを決定するための方法には、当業者にとって周知の分析および検定を実施する工程が含まれる。例としては、組織化学分析、ノーザンブロット分析、ＴａｑＭａｎ分析、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、および例えばＲｏｒリン酸化の測定（より高いリン酸化状態がより高い活性を反映している）を含む機能的分析が含まれるが、これに制限されるわけではない。Ｒｏｒの発現および活性を調節するテスト作用物質を同定するために本発明が考慮しているその他の方法には、ＰＣＲ分析およびレポータ遺伝子系が含まれる。レポータ遺伝子はルシフェラーゼをコード化でき、例えばＷｎｔ−３シグナル化によって活性化されるプロモータの制御下にあり得る。Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２はＷｎｔ−３活性を阻害することから、レポータの発現は、Ｒｏｒ分子の発現および／または活性の変化を反映している。
【０２２９】
本発明の方法は、ハイスループット検定を含む任意の利用可能な形式で修正するかまたは実施することが可能である。ハイスループット検定は、一定の与えられた時限内で多数の化合物をスクリーニングするために有用である。１つの実施形態においては、ＤＮＡチップ上に置かれている核酸を用いて検定を形成することができる。もう１つの実施形態においては、細胞ベースのスクリーニングを用いた検定が実施される。米国特許第６，１０３，４７９号明細書は、小型細胞アレイ方法および細胞ベースのスクリーニングのための器具を開示している。例えば、光化学レジスト−フォトリソグラフィといったその他の利用分野のために細胞の均等なマイクロパターン型アレイを作るための方法が記述されてきた（ムルキッチ（Ｍｒｋｓｉｃｈ）およびホワイトサイド（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）、生物物理学および生体分子構造年報（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．）、２５、５５−７８、（１９９６））。米国特許第６，０９６，５０９号明細書は、一連の細胞型の各成員の均質な懸濁液が特定の濃度のテスト化合物と組合わされ、検出ゾーンを通って導かれ、テスト混合物中の細胞が検出ゾーン内を流れるにつれてリアルタイムで生きた細胞の細胞応答が測定される、流動する細胞懸濁液上のテスト化合物に対する細胞応答のリアルタイム測定のための器具および方法を提供している。該特許は、化合物ライブラリの自動化されたスクリーニングにおける該器具の使用を開示している。米国特許に開示された方法は、骨芽細胞（ＨＯＢ、Ｕ２ＯＳ、ＳａＯＳ−２その他）または非骨芽細胞（ＣＯＳ−７その他）といったような細胞を用いてテスト作用物質がＲｏｒ分子の発現または活性を調節するか否かを決定するように修正可能である。
【０２３０】
骨関連活性および／またはＷｎｔシグナル化を調節する遺伝子またはタンパク質を同定する方法：本発明は同様に、Ｒｏｒの発現により調節され得ひいては骨関連活性に参与しうる遺伝子またはタンパク質の同定方法をも考慮している。例えば、かかる遺伝子またはタンパク質は、Ｒｏｒ分子を過剰発現し遺伝子発現プロフィールの変化をモニター観察することにより同定可能である。さらに、Ｒｏｒダウンレギュレーションの（アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いた）遺伝子発現プロフィールに対する効果を調査することができる。さらに、Ｒｏｒ発現により調節される遺伝子またはタンパク質は、Ｗｎｔシグナル化に対する効果を有する可能性がある。
【０２３１】
さらに高等な生体においては、細胞中の或る遺伝子の発現は、細胞が実施するべき生命現象例えば発達および分化、ホメオスタシス、さまざまな作用物質に対する応答、細胞サイクルの調節、加齢、アポトーシスなどを決定する。遺伝子発現の改変が、正常な細胞の発達の経路を変更する。従って、遺伝子発現を分析するための方法が基本的な分子生物学研究にとってきわめて重要である。示差的に発現される遺伝子の同定は、ヒトを含む動物における、さまざまな疾病または身体条件の状態の診断、予後診断および治療に対する鍵である。さらに、これらの方法は、例えば骨関連活性に結びつけられる、疾病または身体条件に対する素因と結びつけられた遺伝子発現レベルの変化に起因する示差的に発現された配列を同定するために使用することができる。
【０２３２】
例えば、示差的遺伝子発現検定は、特定の細胞内で実施することができ、異なる細胞中の遺伝子の発現を比較し、あらゆる発現の相違を同定することができ、ここで相違の存在は比較されている細胞内で発現された遺伝子のクラスにおける差異を表わす。
【０２３３】
本書で使用されているような「示差的遺伝子発現」という語は、遺伝子の時間的および／または組織発現パターンにおける量的ならびに質的な差異の両方を意味する。かくして、示差的に発現された遺伝子は、正常対異常骨形成状態または異常な体重状態でまたは対照対実験条件下で、定性的にその発現を活性化させるかまたは完全に不活性化させ得る。このような定性的に調節された遺伝子は、対照の対象または疾患をもつ対象のいずれかで検出可能となるが、その両方においてということはない。代替的には、かかる定性的に調節された遺伝子は対照または実験の対象のいずれかで検出可能となるが、その両方においてということはない。「検出可能な」という語は、発現パターン、例えば当業的にとって周知である示差的表示、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析という標準的技術を介して検出可能であるＲＮＡ発現パターンを意味する。
【０２３４】
Ｒｏｒにより調節されるかまたは調節される示差的に発現された遺伝子を同定するために、正常および異常な動物または細胞系列のさまざまなモデルを使用することができる。例えば骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、骨減少症、骨硬化症、副甲状腺機能亢進症、大理石骨病、歯周炎、腎性骨形成異常症、パジェット病、骨への転移、高カルシウム血症、肥満症、拒食症、悪液質、並びに非震えおよび震え熱産生を含むが、これに制限されるわけではない疾病をもつ個体および正常な個体から誘導された細胞系列が、Ｒｏｒ発現と結びつけられる示差的遺伝子発現を研究するために利用される。
【０２３５】
示差的に発現された遺伝子を同定するためには、全またはｍＲＮＡのいずれかのＲＮＡを動物の組織からかまたは上述の細胞から単離することができる。ＲＮＡ試料は、テスト対象の組織からおよび対照となる対象の対応する組織から得ることができる。ｍＲＮＡの単離に対して選択しないあらゆるＲＮＡ単離技術をかかるＲＮＡ試料の精製のために利用することがたできる（例えばアウスベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら編、（１９８７−１９９３）、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サン社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））。さらに、当業者にとって周知の技術を用いて多数の組織試料を容易にプロセッシングすることができる（例えば米国特許第４，８４３，１５５号明細書）。
【０２３６】
示差的に発現された遺伝子により産生されたＲＮＡを表わす収集されたＲＮＡ試料内の写しを、当該技術分野において周知の方法を利用することによって同定することができる。例えば、遺伝子チップ分析（米国特許第５７９５７１６号明細書、米国特許第５９７４１６４号明細書）、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析（例えばオノ  Ｋ（Ｏｎｏ  Ｋ）、タナカ  Ｔ（Ｔａｎａｋａ  Ｔ）、ツノダ  Ｔ（Ｔｓｕｎｏｄａ  Ｔ）、キタハラ  Ｏ（Ｋｉｔａｈａｒａ  Ｏ）、キハラ  Ｃ（Ｋｉｈａｒａ  Ｃ）、オカモト  Ａ（Ｏｋａｍｏｔｏ  Ａ）、オチアイア  Ｋ（Ｏｃｈｉａｉａ  Ｋ）、タカギ  Ｔ（Ｔａｋａｇｉ  Ｔ）、ナカムラ  Ｙ（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．）、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）６０、５００７−５０１１、（２０００）参照）、サブトラクションハイブリダイゼーション（ヘドリック（Ｈｅｄｒｉｃｋ）ら、ネイチャー３０８、１４９−１５３、（１９８４）；リー（Ｌｅｅ）ら、全米科学アカデミー会報、８８、２８２５、（１９８４））または示差的表示（リアン（Ｌｉａｎｇ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５７、９６７−９７１（１９９２）、米国特許第５，２６２，３１１号明細書））を利用して、示差的に発現される遺伝子から誘導された核酸配列を同定することができる。
【０２３７】
潜在的に示差的に発現された遺伝子配列がひとたび前述の技術を介して同定された時点で、かかる推定上示差的に発現される遺伝子の示差的発現を、ＴａｑＭａｎ分析、ノーザン分析または定量的ＲＴ−ＰＣＲといったような当該技術分野において周知の技術を用いてさらに特徴づけすることができる。
【０２３８】
宿主細胞の生成：当該技術分野において既知の技術を用いることによりさまざまな細胞機能におけるその役割を同定するべく異なる細胞系列内でＲｏｒヌクレオチド配列を過剰発現させることができる。例えば、Ｒｏｒを骨芽細胞系列内で過剰発現させ、分化におけるその役割を次に標準的技術によりモニター観察することが可能である。さらに、作用物質が骨形成に対し効果をもつか否かを決定するために、一過性トランスフェクション検定において遺伝子誘発可能な系内でＲｏｒを使用することができる。
【０２３９】
Ｒｏｒヌクレオチド配列を含有するベクターで宿主細胞を工学処理することができる。宿主生体（組換え型宿主細胞）は任意の真核または原核細胞または多細胞生体であり得る。これらは、哺乳動物、酵母、真菌またはウイルスに由来するものであってよい。適切な宿主細胞には、哺乳動物細胞、例えば非骨芽細胞（サル腎臓ＣＯＳ−７、ヒト腎臓２９３、ハムスター卵巣ＣＨＯ、ヒト肝臓ＨｅｐＧ２、ヒト頸部ＨｅＬａ、またはマウス線維芽細胞  ＮＩＨ３Ｔ３）または骨芽細胞（一次骨芽細胞、ヒト骨芽細胞、例えばＴＥ−８５、Ｕ２ＯＳ、ＳａＯＳ−２またはＨＯＢ、ラット骨芽細胞例えばＵＭＲ１０６またはＲＯＳ１７／２．８またはマウス骨芽細胞例えばＭＣ３Ｔ３）が含まれるが、これに制限されるわけではない。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＨ５アルファ、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂなど）、酵母細胞（シザサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚａｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉｃｅ）、ピチアパストリ（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチアメタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）および昆虫細胞（ＳＦ９、ＳＦ２１、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓ２シュナイダー細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵）由来のハイファイブ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）細胞）のさまざまな菌株を分子生物学的操作のために宿主細胞として使用することができる。
【０２４０】
ベクターは、例えばプラスミド、コスミドまたはファージ或いは宿主細胞内で複製可能および生存可能であるその他のあらゆるベクターの形をしたクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。プロモータを活性化し、形質転換体を選択しまたは本発明のポリヌクレオチドを増幅するために適宜修正した従来の栄養培地の中で、工学処理済みの宿主細胞を培養することができる。ｐＨ、温度などといったような培養条件は、当業者にとって既知の通りのポリヌクレオチドの発現のために選択された宿主細胞での使用に適したものである。
【０２４１】
プラスミドは一般に、ここでは、当業者は精通している標準命名法に従って、小文字の「ｐ」とその前および／またはその後にある大文字および／または番号により呼称される。本書のプラスミドは、市販されているか、無制限ベースで公然と入手可能であるか、または周知の公開済みの手順を日常的に応用することにより、利用可能なプラスミドから構築可能である。さらに、本発明に従って使用できる数多くのプラスミドおよびその他のクローニングおよび発現ベクターは周知であり、当業者には容易に入手可能である。その上、当業者は、本発明で使用するのに適したその他のプラスミドをいくらでも構築することができる。本発明においては、このようなプラスミドならびにその他のベクターの特性、構成および使用は、当該開示から当業者には容易に明らかになることだろう。
【０２４２】
適切なＤＮＡ配列は、当該技術分野において既知のさまざまな手順によりベクター内に挿入可能である。
【０２４３】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くべく適切な発現制御要素に操作可能な形で連結され得る。発現制御要素は、当該技術分野において既知であり、誘発可能なプロモータ、構成性プロモータ、分泌シグナルおよびその他の調節要素を含むが、これに制限されるわけではない。好ましくは、誘発可能なプロモータは、宿主細胞の媒質の中の栄養素に対し応答性をもつといったように、容易に制御される。適切な非未変性哺乳動物プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアン・ウイルス（ＳＶ４０、フィアーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、ネイチャー、２７３、１１３（１９７８））からの早期および晩期プロモータまたは、モロニーマウス白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマ由来のプロモータを含む可能性がある。好ましい骨関連プロモータは、ＣＭＶβアクチンまたはＩ型コラーゲンプロモータを含む。プロモータに加えて、タンパク質をコードするＤＮＡ配列がこの発現構成体を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞内のＲＮＡ中に転写されるような形で、リボソーム結合部位（細菌発現のため）、適切な遺伝子制御配列または調節配列の制御下に遺伝子を置くことができる。一部のケースでは、その後の分泌シグナルの分割を伴って、宿主細胞からのポリペプチドの分泌をひき起こす配列を付加することが望ましいかもしれない。発現ベクターは同様に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネータ、および発現を増幅するための適切な配列をも含む可能性がある。発現ベクターは同様に、真核細胞についてのネオマイシン耐性または大腸菌についてのアンピシリン耐性といったような形質転換された宿主細胞の選択のための特異的表現型を提供するべく、１つ以上の選択性マーカー遺伝子も含んでいてよい。さらに、該構成体は、遺伝子の多重コピーを作ることができるように、増幅可能な遺伝子（他ＤＨＦＲ）に接合可能である。適切なエンハンサおよびその他の発現制御配列については、エンハンサおよび真核性遺伝子発現（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）、（１９８３））も参照のこと。
【０２４４】
酵母の発現において使用するのに適したベクターおよびプロモータは、欧州特許出願第７３，６７５Ａ号明細書に記述されている。哺乳動物の発現に適したベクターの例としてはｐＣＭＶ  ＳＰＯＲＴ６、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ、およびｐＣＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２４５】
Ｒｏｒ発現を阻害する方法：本発明は、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムならびに抗体、ペプチドおよび小分子の使用を含むが、これに制限されるわけではないＲｏｒの発現および／または活性を阻害するための方法を提供している。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲティングされたｍＲＮＡに対しハイブリッド形成しタンパク質翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンスアプローチには、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計が関与している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ写しに結合して、翻訳を妨げることになる。
【０２４６】
Ｒｏｒ相互作用タンパク質の同定方法：Ｒｏｒ相互作用タンパク質は、当業者にとって既知の方法により同定可能である。例えば、免疫沈降法とそれに続く質量分光分析（ヒル（Ｈｉｌｌ）ら、生物化学ジャーナル(Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ)、２７７、４０７３５−４０７４１（２００２））ならびに哺乳動物および酵母２−ハイブリッド系を、タンパク質−タンパク質相互作用の研究のために使用することができる。例えば米国特許第６，２５１，６０２号明細書、チェン（Ｃｈｉｅｎ）ら、全米科学アカデミー会報、８８、９５７８−８２（１９９１）；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら、遺伝学動向（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１０、２８６−９２（１９９４）；ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）ら、セル、７５、８０５−１６（１９９３）；バイテック（Ｖｏｊｔｅｋ）ら、セル、７４、２０５−１４（１９９３）；ルバン（Ｌｕｂａｎ）ら、セル、７３、１０６７−７８（１９９３）；リー（Ｌｉ）ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７、９５７−６３（１９９３）；ザング（Ｚａｎｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３６４、３０８−１３（１９９３）；ゴレミス（Ｇｏｌｅｍｉｓ）ら、分子細胞生物学（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１２、３００６−１４（１９９２）；サトウ（Ｓａｔｏ）ら、全米科学アカデミー会報、９１、９２３８−４２（１９９４）；コフラン（Ｃｏｇｈｌａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６７：１０８−１１１、（１９９５）；カルパナ（Ｋａｌｐａｎａ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６６、２００２−６（１９９４）；ヘルプス（Ｈｅｌｐｓ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３４０、９３−８（１９９４）；ユェン（Ｙｅｕｎｇ）ら、遺伝子と開発（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．）、８、２０８７−９、（１９９４）；デュルフィー（Ｄｕｒｆｅｅ）ら、遺伝子と開発（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．）、７、５５５−５６９、（１９９３）；パエットカウ（Ｐａｅｔｋａｕ）ら、遺伝子と開発（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．）、８、２０３５−４５、（１９９４）；スパールガレン（Ｓｐａａｒｇａｒｅｎ）ら、全米科学アカデミー会報、９１、１２６０９−１３、（１９９４）；およびイェ（Ｙｅ）ら、全米科学アカデミー会報、９１、１２６２９−３３（１９９４）を参照のこと。
【０２４７】
酵母ファージミド（例えば、ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）、細胞相互作用および開発：実践的アプローチ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、１５３−１７９（１９９３）；エレッジ（Ｅｌｌｅｄｇｅ）ら、全米科学アカデミー会報、８８、１７３１−５（１９９１）を参照のこと）またはプラスミド（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）、１９９３およびバーテル（Ｂａｒｔｅｌ）、セル、１４、９２０−４（１９９３））；フィンレイ（Ｆｉｎｌｅｙ）ら、全米科学アカデミー会報、９１、１２９８０−４（１９９４））のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして相互作用するタンパク質をクローニングし、ならびに既知のタンパク質対を研究するために、該系の変形が利用可能である。
【０２４８】
例えばＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＬａｃＺ、ＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＨＩＳ３、またはＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＵＲＡ３（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）、細胞相互作用および開発：実践的アプローチ中、１５３−１７９（１９９３）；ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）ら、セル、７５、８０５−１６、（１９９３）；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら、遺伝学動向、１０、２８６−９２（１９９４））といったようなさまざまなレポータ遺伝子カセットの組込まれたコピーを伴う酵母菌株を、各々異なる融合タンパク質を発現する２つのプラスミドと同時形質転換させることができる。１つのプラスミドは、タンパク質「Ｘ」と例えばＧＡＬ４酵母転写活性化体のＤＮＡ結合ドメインの間の融合をコードし（ブレント（Ｂｒｅｎｔ）ら、セル、４３、７２９−３６（１９８５）；マー（Ｍａ）ら、セル、４８、８４７−５３（１９８７）；キーガン（Ｋｅｅｇａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３１、６９９−７０４（１９８６））、一方もう１つのプラスミドは、タンパク質「Ｙ」とＧＡＬ４のＲＮＡポリメラーゼ活性化ドメインの間の融合をコードする（キーガン（Ｋｅｅｇａｎ）ら、１９８６）。プラスミドは、ＧＡＬ４結合部位を含有する調節領域をもつｌａｃＺといったようなレポータ遺伝子を含む酵母の菌株へと形質転換され得る。タンパク質ＸおよびＹが相互作用する場合、これらは、転写を活性化するのに充分近位に２つのＧＡＬ４成分を持ってくることによって、機能的ＧＡＬ４転写活性化体タンパク質を再構成する。転写活性化は、β−ガラクトシダーゼの発現または例えばＵＲＡ３（ウラシル選択）またはＨＩＳ３（ヒスチジン選択）といった転写産物についての栄養素要求性選択を可能にする特異的栄養素が欠如した最小培地上での形質転換体の成長のいずれかを測定することによって評定される。例えば例えば、バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）、（１９９３）；デュルフィー（Ｄｕｒｆｅｅ）ら、遺伝子および開発（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．）、７、５５５−５６９（１９９３）；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら、遺伝学動向、１０、２８６−２９２（１９９４）；および米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照のこと。
【０２４９】
２−ハイブリッド分析またはスクリーニングのための付加的な方法は、当業者には明らかであると思われる。例えばフィンレー（Ｆｉｎｌｅｙ）ら、「遺伝子調節ネットワークの２ハイブリッド分析（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」、酵母２ハイブリッドシステム（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）中（ポール  Ｌ．バーテル（Ｐａｕｌ  Ｌ．Ｂａｒｔｅｌ）ら編、オクッスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、（１９９７））；メイジャ・ヤング（Ｍｅｉｊｉａ  Ｙａｎｇ）、「２ハイブリッド検定における組合せペプチドライブライリの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ）」、酵母２ハイブリッドシステム（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）中（ポール  Ｌ．バーテル（Ｐａｕｌ  Ｌ．Ｂａｒｔｅｌ）ら編、オクッスフォード、（１９９７））；ギエズ（Ｇｉｅｔｚ）ら、「問題のタンパク質と相互作用するタンパク質の同定：酵母２ハイブリッドシステムの応用（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）」、分子および細胞化学（Ｍｏｌ．＆  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１７２、６７−９（１９９７）；Ｋ．Ｈ．ヤング（Ｋ．Ｈ．Ｙｏｕｎｇ）、「酵母２ハイブリッド：ごく短時間での非常に多くの相互作用（Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ：Ｓｏ  Ｍａｎｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，（ｉｎ）  ｓｏ  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｔｉｍｅ）」、生殖の生物学（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．）、５８、３０２−３１１、（１９９８）；Ｒ．ブレント（Ｒ．  Ｂｒｅｎｔ）ら、「２ハイブリッド法で遺伝子と対立遺伝子の機能を理解する（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、遺伝学年報（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．）、３１、６６３−７０４（１９９７）を参照のこと。
【０２５０】
Ｒｏｒの全長または異なる部分は、酵母２−ハイブリッドベクター内にクローニングされ得る。これらのベクターには、ｐＡＳ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＢＴ９、ｐＧＢＫＴ７が含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の結合ドメイン（例えばＧＬＡ４またはＬｅｘＡ（セレブリスキー  Ｉ．Ｇ．（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ  Ｉ．Ｇ．）ら、バイオ技術（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、３０、６３４−６５５、（２００１））を伴う融合タンパク質として発現されているクローニングされたＲｏｒは、既知のまたは未知のタンパク質のための餌を表わすと思われる。活性化ドメイン（例えばＧＡＬ４またはＶＰ１６）（セレブリスキー  Ｉ．Ｇ．（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ  Ｉ．Ｇ．）ら、バイオ技術（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、３０、６３４−６５５、（２００１））ベクター内にクローニングされたｃＤＮＡは、異なる骨芽細胞系列、骨、脳およびＲｏｒが発現されるその他の組織から作られたｃＤＮＡライブラリに由来するものであり得る。
【０２５１】
相互作用するパートナーがひとたび同定されたならば、全長ｃＤＮＡは単離されクローニングされ得る。さらに、哺乳動物の２−ハイブリッド系の中で相互作用を確認することができる。同様に、Ｒｏｒ内部の結合ドメインをより明確に定義することになる実験を実施することもできる。
【０２５２】
Ｒｏｒの相互作用するパートナーが骨芽細胞内で発現された新規遺伝子である場合、骨形成および／または再吸収においてそのタンパク質を位置づけするべく付加的な実験的アプローチに着手することができる。しかしながら、Ｒｏｒ相互作用パートナーが既知の生物学的機能をもつ遺伝子である場合、それは、骨形成および／または再吸収の調節におけるＲｏｒ相互作用パートナーの役割を標示することができる。
【０２５３】
診断的利用分野：本発明のＲｏｒ分子は同様に、骨関連障害または疾病状態のマーカーとして、疾病状態の前駆体用のマーカーとして、疾病状態に対する素因についてのマーカーとして、薬物活性のマーカーとしてまたは対象の薬理ゲノムプロフィールのマーカーとしても有用である。本書に記述する方法を用いて、本発明のＲｏｒ分子の存在、不在および／または数量を検出でき、インビボで１つ以上の生物学的状態と相関させることができる。例えば、本発明のＲｏｒ分子は、１つ以上の骨の障害または疾病状態についてまたは疾病状態まで導く身体条件について、生化学マーカーとして役立つことができる。本書で使用されているように、生化学マーカーは疾病または障害の不在または存在と、または疾病または障害の進行と（例えば減少した骨ミネラル密度（ＢＭＤ）と）相関関係をもつ。従って、これらのマーカーは、特定の治療過程が疾病状態または障害を少なくする上で有効であるか否かを標示するために役立ち得る。
【０２５４】
本発明は、正常な対象由来の匹敵する試料中のＲｏｒ分子の発現および／または活性のレベルと対象におけるＲｏｒ分子の発現および／または活性のレベルを比較する工程を含む、患者の体内の骨関連障害を診断する方法を提供する。試料は、患者の組織、細胞または体液試料であり得る。
【０２５５】
さらに、本発明は、１つの作用物質の投与の前後にこれらの細胞または組織質中のＲｏｒ分子の発現および／または活性のレベルを測定することにより正常な状態または疾病状態で骨修飾作用物質に対する応答性をもつ細胞および組織を同定するためのＲｏｒ分子の使用を提案している。Ｒｏｒ分子の発現および／または活性における変化は、該作用物質に対する細胞または組織の反応性を反映すると思われる。
【０２５６】
例えば、Ｒｏｒ分子は、既存の骨粗鬆症を治療するにあたって、または閉経前の女性またはその他の高リスクの個体において骨折および骨粗鬆症の危険性を低減させるための予防療法の中で薬剤として有用であり得る化合物の設計および／または同定を容易にするための標的として使用可能である。
【０２５７】
これらの化合物は、骨のさらなる劣化を防止し、かつ／または新しい骨形成を誘発するため更年期の女性における骨粗鬆症の治療においても使用可能である。それは、単一療法としておよび／または骨粗鬆を阻害する既存の療法と組合せた形でまたはエストロゲンに対する付加的な療法として与えることができる。
【０２５８】
さらに、本発明は、ヒトＲｏｒ２が増殖中の骨芽細胞前細胞においてピークに達することの証拠を提供している。従って、Ｒｏｒ２は、培養中またはインサイチュのこのタイプの細胞のためのマーカーとして使用可能である。
【０２５９】
薬物の効能を評価するためのＲｏｒ分子の使用：本発明は、（ｉ）作用物質の投与に先立ち対象から投与前試料を得る工程；（ｉｉ）投与前試料においてＲｏｒ分子の発現または活性レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試料を得る工程；（ｉｖ）投与後試料内のＲｏｒ分子の発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）投与前および投与後試料において、Ｒｏｒ分子の発現または活性のレベルを比較する工程；および（ｖｉ）それに応じて対象に対する作用物質の投与を改変させる工程を含む、作用物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類似物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または本書で記述されているスクリーニング検定によって同定されるその他の薬物候補）での対象の治療の有効性をモニター観察するための方法を提供する。例えば、Ｒｏｒの発現または活性をさらに強く調節するため、すなわち作用物質の有効性を増大させるために、作用物質の投与の増大が望まれる可能性がある。このような実施形態に従うと、観察可能な表現型応答が存在しない場合でも、１つの作用物質の有効性の指標としてＲｏｒ分子の発現または活性を使用することができる。
【０２６０】
本発明はさらに、薬物の効能を評価し、骨関連障害の治療のための臨床試験に関与する患者の推移をモニター観察するための方法を提供する。Ｒｏｒ分子の発現または活性に対する作用物質（例えば薬物）の影響をモニター観察する作業は、基本的な薬物スクリーニングにおいてのみならず、臨床試験内またはその他のあらゆる使用期間中に適用することができる。例えば、Ｒｏｒ遺伝子またはポリペプチド発現レベルを増大させるための、本書に記述されている通りのスクリーニング検定により決定される作用物質の有効性は、Ｒｏｒ遺伝子またはポリペプチドの発現レベルの低下を示す対象の臨床試験において監視可能である。代替的には、Ｒｏｒ遺伝子またはポリペプチドの発現レベルを低下させるためのスクリーニング検定によって決定される作用物質の有効性は、増大したＲｏｒ遺伝子またはポリペプチドの発現レベルを示す対象の臨床試験において監視可能である。かかる臨床試験においては、Ｒｏｒ遺伝子またはポリペプチドおよび例えばＲｏｒ関連性障害に関与してきたその他の遺伝子およびポリペプチドの発現および活性を、特定の細胞例えば骨細胞内の表現型の「読出し情報」またはマーカーとして使用することができる。さらに、Ｒｏｒ遺伝子またはポリペプチドの発現を、骨関連障害の状態に対する特定の薬物または作用物質の効果の読出し情報として使用することが可能である。
【０２６１】
例えば、制限するものではなく、（例えば本書に記述されている通りのスクリーニング検定で同定される）Ｒｏｒ分子の発現または活性を調節する作用物質（例えば化合物、薬物または小分子）での処置により細胞内で調節されている遺伝子を同定することができる。かくして、例えば臨床試験においてＲｏｒ関連性障害（例えば骨関連）に対する作用物質の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し遺伝子アレイ分析（例えば遺伝子チップ分析）に付すことができる。未処置状態と処置済み状態の間で発現が著しく変化した遺伝子は、作用物質に対する細胞の生理学応答を表わすマーカーとして役立つことができる。従ってこの応答状態は、該作用物質での該個体の処置の前およびその最中のさまざまな時点で決定可能である。
【０２６２】
トランスジュニック動物：「トランスジュニック動物」の中の「動物」という語は、ヒトを除く全ての脊椎動物を内含する。これには同様に、胚形成期および胎児期を含む発達の全ての期における個々の動物をも内含する。「トランスジェニック動物」というのは、組換え型ウイルスでのマイクロインジェクションまたは感染などによる細胞以下のレベルでの計画的な遺伝子操作によって直接的または間接的に受取った遺伝子情報を担持する１つ以上の細胞を含有する動物である。この導入されたＤＮＡ分子は、染色体内に一体化され得、そうでなければ、染色体外で複製するＤＮＡであり得る。「トランス遺伝子」という語は、人間の介入により動物の生殖細胞系列内に導入されたＤＮＡ配列を意味する。「生殖細胞系列トランスジェニック動物」という語は、生殖細胞系列の細胞内に遺伝子情報が導入され、かくして該情報を子孫に移入する能力を付与するトランスジェニック動物を意味する。実際、このような子孫がその情報の一部または全てを有する場合には、それらも同様にトランスジェニック動物である。
【０２６３】
情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来性のものであっても、特定の個々のレシピエントのみにとって外来性のものであっても、またはレシピエントがすでに所有している遺伝子情報であってもよい。最後のケースでは、導入された遺伝子は、未変性内因性遺伝子と比較して異なる形で発現され得る。
【０２６４】
遺伝子は、ゲノム供給源からそれらを単離することによって、単離されたＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの調製によって、直接合成することによって、またはそのいくつかの組合せによって得ることができる。
【０２６５】
発現されるためには、遺伝子は調節領域に操作可能な形で連結される。プロモータといったような調節領域を用いて、１つの遺伝子の発現を増大、減少、調節するかまたは、発達の或る期または或る組織に指定することができる。該プロモータは、天然に発生するプロモータである必要はない。
【０２６６】
細胞内へのＤＮＡの導入を可能にする方法は、一般に入手可能であり、当該技術分野において周知である。トランス遺伝子を導入するさまざまな方法が使用可能である。一般に、接合子はマイクロインジェクションのための最高の標的である。例えばマウスの体内で、雄の前核は直径約２０μｍのサイズに達し、このことは１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再現可能な注入を可能にする。遺伝子トランスファの標的としての接合子の使用には大きな利点がある。大部分のケースで、注入されたＤＮＡは最初の分割の前に宿主遺伝子内に取込まれることになる（ブリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、１９８５）。従って、ヒト以外のトランスジェニック動物のほぼ全ての細胞は、取込まれたトランス遺伝子を担持することになる。一般に、生殖細胞の５０％がトランス遺伝子を内部に有することから、このことは同様に、創始細胞の子孫へのトランス遺伝子の効率の良い伝達を結果としてもたらすことになる。接合子のマイクロインジェクションは、本発明を実践する上でトランス遺伝子を取入れるための好ましい方法である。
【０２６７】
ヒト以外の動物内にトランス遺伝子を導入するために、レトロウイルス感染を使用することもできる。発達中のヒト以外の胚を胚盤胞期までインビトロで培養することができる。この時期の間、割球がレトロウイルス感染の標的であり得る。割球の効率の良い感染は、透明帯を除去するための酵素処置によって得られる。トランス遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は、標準的に、トランス遺伝子を担持する複製不良のレトロウイルスである。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することにより容易かつ効率良く得られる（ファン・デル・パッテン（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ）、上掲書；スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、１９８７））。代替的には、さらに後期で感染を実施することができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔内に注入することができる。創始動物の大部分は、ヒト以外のトランスジェニックを形成した細胞のサブセットの中でのみ取込みが起こることから、トランス遺伝子に対しモザイク式となる。その上、創始動物は、ゲノム中のさまざまな位置でトランス遺伝子のレトロウイルス挿入を含んでいる可能性がある。これらは一般に子孫の中で分離する。さらに、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染により、低い効率ではあるものの、生殖細胞系列内にトランス遺伝子を導入することも可能である（ジョナー（Ｊａｈｎｅｒ）ら、（１９８２）上掲書）。
【０２６８】
トランス遺伝子導入のための第３のタイプの標的細胞は、胎生期基幹（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養された移植前胚芽から得られる（（エバンズ、Ｍ．Ｊ．（Ｅｖａｎｓ、Ｍ．Ｊ．）ら、１９８１；ブラッドレー、Ａ．（Ｂｒａｄｌｅｙ、Ａ．）ら、１９８４；ゴスラー（Ｇｏｓｓｌｅｒ）ら、１９８６；およびロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）ら、１９８６）。トランス遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションによってかまたはレトロウイルス媒介形質導入によってＥＳ細胞内に効率良く導入され得る。結果として得られた形質転換済みＥＳ細胞をその後、ヒト以外の動物からの胚盤胞と組合せることができる。ＥＳ細胞は胚芽をコロニー化し、結果としてのキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する（再考には、イーニシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）、Ｒ．、１９８８を参照）。
【０２６９】
トランスジェニック動物を作り上げるための一般的な方法は当該技術分野において既知であり、例えばトランスジェニック動物科学の戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（グレン  Ｍ．モナスタスキー（Ｇｌｅｎｎ  Ｍ．Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ）およびジェームス  Ｍ．ロブル（Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｒｏｂｌ）編、ＡＳＭプレス（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ）；ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、１９９５）；トランスジェニック動物技術：実験室ハンドブック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）（カール  Ａ．ピンカート（Ｃａｒｌ  Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ）編、アカデミックプレス（１９９４）；トランスジェニック動物（Ｔａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ）（ルイ・マリー・フドビン（Ｌｏｕｉｓ  Ｍａｒｉｅ  Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ）編、ハーウッドアカデミープレス（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７）；トランスジェニックマウス中のサイトカインの過剰発現およびノックアウト（Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ）（チャイム  Ｏ．ジャコブ（Ｃｈａｉｍ  Ｏ．Ｊａｃｏｂ）編、アカデミックプレス、１９９４）；マイクロンジェクションと遺伝子導入：戦略とプロトコル（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（スプリンガー・ラブ・マニュアル（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）（アンヘル・シド・アレギ（Ａｎｇｅｌ  Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ）およびアレハンドロ・ガルシア・カランカ（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｒａｎｃａ）編、スプリンガー・ベルラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  １９９８）；および、マウス胚の操作：実験室マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（ブリジット・ホーガン（Ｂｒｉｇｉｄ  Ｈｏｇａｎ）ら編、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９９４）の中で記述されている。導入されたＤＮＡならびにその発現の存在を評価するための方法は、同様に当該技術分野において容易に利用可能であり、周知である。かかる方法には、外因性ＤＮＡまたはＰＡＧＥを検出するためのＤＮＡハイブリダイゼーション（サザンハイブリダイゼーション）またはＰＣＲ、およびタンパク質を検出するためのウエスタンブロットが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２７０】
Ｒｏｒが骨関連障害において１つの役割を果たすか否かを見極めるために、全長遺伝子またはその任意のフラグメントまたは変種または変異体を全ての組織内または骨の中のみで過剰発現するトランスジェニックマウスが作り出される。骨ならびに骨以外の組織の中のＲｏｒの広範な過剰発現を立証するためには、汎存プロモータ（例えばＣＭＶβ−アクチン）が使用される。Ｒｏｒの発現は、ミフェプリストン依存性遺伝子誘発型系を用いて条件付きにすることができる。ラットｃＤＮＡの骨特異的過剰発現は、ラット３．６ｋｐＩ型コラーゲンまたはラット１．７ｋｂオステオカルシンプロモータといったようなプロモータによって駆動される。ラット３．６ｋｂＩ型コラーゲンプロモータは、発達中の骨の中で早期発現を提供するために有用であり、一方、ラット１．７ｋｂオステオカルシンプロモータはより骨に制限された発現パターンを付与することができる。同じ構成体がトランスジェニックラットを生成するためにも使用される。Ｒｏｒの条件付き発現のためには、オステオカルシンプロモータ（カパレリ、Ｆ．Ｂ．（Ｃａｐｐａｒｅｌｌｉ、Ｆ．Ｂ．）、内分泌学、１３８、２１０９−２１１６、（１９９７））が遺伝子誘発型系を駆動し、Ｇａｌ４最小プロモータはＲｏｒを駆動する。独立したトランスジェニック系列が交配され、２種トランスジェニックマウスがミフェプリストンで処置されて、需要に応じてＲｏｒ発現を調節する。トランスジェニック動物の表現型検査には、インビボおよびエクスビボの検定の組合せが関与する。増加したＢＭＤは、Ｒｏｒ分子が実際に骨関連障害のための潜在的な新しい標的であるという概念の証拠を提供する。さらに、これらのトランスジェニック動物は、Ｒｏｒの過剰発現が、これらの立証済みの骨減少症モデルにおいてラットおよびマウスの体内の卵巣切除誘発型の骨減少症を救済できるか否かを見極めるために使用される（Ｙ．Ｐ．カロード（Ｙ．Ｐ．Ｋｈａｒｏｄｅ）ら、骨代謝研究ジャーナル、１４（１）、Ｓ５２３、（１９９９）、Ｙ．Ｐ．カロードら、骨代謝研究ジャーナル、１６（１）、Ｓ５４０、（２００１））。
【０２７１】
トランスジェニック動物は、扁平骨（頭蓋骨、肩甲骨、下アゴ、および腸骨）および長骨または軸骨格（腔骨、大腿骨および上腕骨）などを含む骨格のさまざまな骨の骨表現型の分析のために、当該技術分野において既知のさまざまな組織形態計測パラメータと共に使用することができる。
【０２７２】
さらに、Ｒｏｒトランスジェニック動物は、卵巣切除誘発型骨減少症、糖質コルチコイド誘発型骨減少症およびさまざまな廃用性モデルなどの当該技術分野において既知のものを含むさまざまな骨粗鬆モデルにおける骨粗鬆からの防御について試験することができる。さまざまな骨同化剤（例えば同定済みの小分子）の組合せの有効性を調査し決定して、さらに骨表現型を同化的（相乗作用的、付加的に）または異化的に修飾することが可能である。
【０２７３】
その上、集合的に骨形成に影響を及ぼす骨始原細胞および骨芽細胞の活性、増殖速度およびアポトーシス速度におけるＲｏｒの役割を研究するためにＲｏｒトランスジェニック動物を使用することができる。
【０２７４】
Ｒｏｒトランスジェニック動物は、骨関連障害の治療のために有効な作用物質を同定するために使用可能である。本発明のトランスジェニック動物に対し作用物質を投与することができる。治療を受けた動物の体内での骨形成およびその他の骨関連活性の改変を測定し、未治療の対照動物の体内の骨形成およびその他の骨関連活性と比較することができる。
【０２７５】
条件付きノックアウト動物：
代替的には、その遺伝子をコードする内因性遺伝子と動物の胚細胞内に導入された同じポリペプチドをコードする改変されたゲノムＤＮＡの間の相同的組換えの結果として、スクリーン内で同定された遺伝子をコードする不良のまたは改変された遺伝子をもつ「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、立証された技術に従って、そのポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために、同定された遺伝子をコードするｃＤＮＡを使用することができる。同定された遺伝子をコードするゲノムＤＮＡの一部分を欠失させるかまたは、組込みをモニター観察するのに使用可能な選択性マーカーをコードする遺伝子といったようなもう１つの遺伝子と交換することが可能である。標準的には、数キロベースの未改変のフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方におけるもの）が、ベクター内に含まれる（例えば相同組換えベクターの記述については、例えば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびカペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、セル、５１（３）、５０３−１２、（１９８７）参照のこと）。ベクターは、胚基幹細胞系列内に（例えば電気穿孔法によって）導入され、内部において導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同的に組換えられている細胞が選択される（例えばリー（Ｌｉ）ら、セル、６９（６）、９１５−２６、（１９９２）を参照のこと）。選択された細胞は次に動物（例えばマウスまたはラット）の胚盤胞内に注入されて、凝集キメラを形成する（例えばブラッドレー（Ｂｒａｄｌｅｙ）、奇形癌と胚幹細胞：実践的アプローチ（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）中、Ｅ．Ｊ．ロバートソン（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）編、ＩＲＬ、オックスフォード、１１３−１５２１、（１９８７）を参照のこと）。キメラ胚をその後適切な偽妊娠した雌の里親動物内に移植し、胚を出産予定日まで至らせて「ノックアウト」動物を作り出すことができる。その生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡを宿した後代を、標準的な技術により同定し、その全ての細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を飼育するのに用いることができる。ノックアウト動物は例えば、或る種の病的状態に対して防護するその能力および同定された遺伝子の不在に起因する病的状態の発生によって特徴づけすることができる。
【０２７６】
ノックアウト動物は、研究対象である特定の生理障害に関する生化学および病理的パラメータに影響を及ぼしうる薬物をスクリーニングするために使用可能である。細胞系列は、同じく、生理障害の細胞モデルとしてのまたは薬物スクリーニングにおける使用のために、これらの動物から誘導することが可能である。例えば、Ｒｏｒ１またはＲｏ２配列内に突然変異を導入しかくして、もはや機能的なＲｏｒ１またはＲｏｒ２遺伝子を発現しない動物を生成することによって、ノックアウト動物を発生させることができる。このようなノックアウト動物は、例えば骨関連活性またはその他の関連する生理的機能におけるＲｏｒ１またはＲｏｒ２の役割を研究するために有用である。
【０２７７】
本発明は、内部においてＲｏｒ遺伝子が条件付きで不活性化されている動物を提供する。条件付き不活性化というのは、選択された組織（すなわち骨）の中でかつ／または発達中の特定の時点での１つの遺伝子の不活性化を意味する。条件付きで不活性化された遺伝子は、その他全ての組織内で、不活性に先立つ全ての時点で正常な内因性レベルで発現される。１つの実施形態においては、本発明は、条件付きＲｏｒノックアウトマウスを発達させるための遺伝子情報を提供する。
【０２７８】
特異的に骨の中でＣｒｅリコンビナーゼの発現に左右されうる条件付きマウスノックアウトが生み出される。骨の中のターゲティングされた対立遺伝子の欠失が、特異的に骨の中でＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスと遺伝子ターゲティングされた動物を交配することによって行なわれる。例えば、ラット３．６ｋｂＩ型コラーゲンプロモータまたはラット１．７ｋｂオステオカルシンプロモータのいずれかによってＣｒｅが駆動されるトランスジェニックマウスが作り出される。
【０２７９】
予想される表現型は、骨形成が改変されているものである。ターゲティングされた動物の表現型検査には、インビボおよびエクスビボ検定の組合せが関与する。正常な骨を発達させるかまたは骨を作り直すことができない場合、通常骨の発達におけるＲｏｒの役割および骨関連障害のための新規標的としてのその用途が提供される。
【０２８０】
条件付きノックアウト動物は、扁平骨（頭蓋骨、肩甲骨、下アゴ、および腸骨）および長骨または軸方向骨格（腔骨、大腿骨および上腕骨）などを含む骨格のさまざまな骨の骨表現型を分析するために、当該技術分野において既知のさまざまな組織形態計測パラメータと共に使用することができる。
【０２８１】
さらに、Ｒｏｒの不在下での骨始原細胞および骨芽細胞の活性、増殖速度およびアポトーシス速度を査定するために、条件付きＲｏｒノックアウト動物を使用することができる。
【０２８２】
本発明は、分子および細胞生物学の分野で周知の方法および技術を参照により援用している。これらの技術には以下の刊行物の中で記述されている技術が含まれるが、これに制限されるわけではない。オールド、Ｒ．Ｗ．（Ｏｌｄ、Ｒ．Ｗ．）およびＳ．Ｂ．プリムローズ（Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）、遺伝子操作の原理：遺伝子工学入門（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（第３版、１９８５）、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、微生物学研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）；第２巻：４０９頁、（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０１３１８−４）、サムブルック、Ｊ．ら編、分子クローニング：実験室マニュアル（第２版、１９８９）コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、第１−３巻、（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）、ミラー、Ｊ．Ｈ．（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｈ．）およびＭ．Ｐ．カロス（Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ）編、哺乳類細胞用の遺伝子移転ベクター（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）（１９８７）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、１６９頁、（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−１９８−０）。
【０２８３】
（実施例）
本発明は、記述のないかぎり、全ての部分および百分率が重量百分率であり、度数は摂氏度である、以下の実施例の中でさらに定義づけされる。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を表わすものの例示を目的として示されているにすぎないということを理解すべきである。以上の論述、実施形態およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の新規の教示から著しく逸脱することなく又、その精神および範囲から逸脱することなく、例示的な実施例の中で数多くの修正を加えることが可能であることを容易に認識することだろう。さらに、本発明をさまざまな用途および条件に適合させるため、本発明に対するさまざまな変更およびその修正を行なうことが可能である。従って、かかる修正の全てが、特許請求の範囲で定義されている通りの本発明の範囲内に内含されるように意図されている。
【０２８４】
本明細書にて言及されている特許、出願、試験方法および刊行物は、出典を明示することでその内容を本明細書の一部とする。
【０２８５】
一般的方法
材料および組織培養
指摘がある場合を除き、組織培養試薬は、インビトロジェン株式会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））から購入され、その他の試薬および化学物質はシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはインビトロジェンのいずれかから購入された。抗−フラグＭ２マウスモノクローナル抗体、抗−Ｖ５ウサギポリクローナル抗体および抗−フラグＭ２親和性アガロースは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た；抗−ＨＡタグおよび抗β−カテニンウサギポリクローナル抗体および抗−ホスホチロジンマウスモノクローナル抗体、クローン４Ｇ１０は、アップステート社細胞シグナル化ソリューション（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（バージニア州シャルロッツビル（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ））製のものであった；抗−ｈｉｓマウスモノクローナル抗体はＢＤ  バイオサイエンスクローンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））製のものであった；抗−β−アクチンマウスモノクローナル抗体はシグマ製であった；ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合二次抗体は、サンタクルスバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）。、カリフォルニア州サンタクルス（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）またはアマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（英国バッキンガムシャー（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ））から購入した。
【０２８６】
ＨＯＢ細胞系列を、１０％の熱不活性化したウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭのｇｌｕｔａＭＡＸ−１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍地を用いて、５％ＣＯ２／９５％加湿空気インキュベータ内で３４％で維持した。Ｕ２ＯＳヒト骨肉種細胞を、１０％の熱不活性化したウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭのｇｌｕｔａＭＡＸ−１を含む、マッコイ（ＭｃＣｏｙ）の５Ａ修正培地中で３７℃に保った。ＣＯＳ−７細胞を、１０％の熱不活性化したウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１を含有するＤＭＥＭ中で３７℃で維持した。
【０２８７】
プラスミド
ｐＵＳＥａｍｐ（Ｗｎｔ−１−ＨＡ）中のＨＡエピト−プでタグ付けしたヒトＷｎｔ−１、ｐＵＳＥａｍｐ（Ｗｎｔ−３−ＨＡ）中のＨＡエピトープでタグ付けしたヒトＷｎｔ−３およびｐＵＳＥａｍｐ（＋）をアプステートバイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得た。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）はインビトロジュン製のものであった。ＣＭＶプロモータ駆動のβ−ガラクトシダーゼレポータ遺伝子（ｐＣＭＶＢ）はＢＤバイオサイエンスクローンテック製のものであった。ヒトＳＦＲＰ−１は国際公開第０１／１９８５５号パンフレット中に記述された。
【０２８８】
最小チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータに対し５’で融合されたＴ細胞因子（ＴＣＦ）ＤＮＡ結合部位の１６のコピー（１６×ＴＣＦ−ｌｕｃ）を含有するルシフェラーゼレポータ遺伝子を、以下の通りに構築した。当初、ＴＣＲ−アルファエンハンサ、ウォータマン、Ｍ．Ｌ．（Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｍ．Ｌ．）ら、遺伝子と開発（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）、５、６５６−６６９（１９９１）、ＣＤ３−ｅエンハンサ、ヴァン・デ・ウェタリング、Ｍ．（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  Ｍ．）ら、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、１０、１２３−１３２（１９９１）、およびコンセンサスＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位、コリネック、Ｖ．（Ｋｏｒｉｎｅｋ、Ｖ．）ら、サイエンス、２７５、１７８４−１７８７（１９９７）内で同定されたＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドを生成した。
【０２８９】
これらのオリゴヌクレオチドは、次のとおりであった（ＴＣＦ結合部位には下線が付されている。
５’−  ＣＴＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＣ−３’、（配列番号１）および、
５’−ＴＣＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＣＧ−３’（配列番号２）
【０２９０】
８０℃で１０分間加熱したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニールさせた。アニールされた２本鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれ５’および３’末端でＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ相容性配列を含んでいた。アニールされたオリゴヌクレオチドをＴＫ−ルシフェラーゼレポータの上流でＮｈｅＩ−およびＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））内にクローニングして４×ＴＣＦ−ｌｕｃを生成した。ＴＣＦ結合部位およびＴＫプロモータをＤＮＡ配列決定により確認した。次に、４×ＴＣＦ−ｌｕｃからのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをライゲートすることによって、ＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位の８つのコピー（８×ＴＣＦ−ｌｕｃ）を伴うプラスミドを発生させた。同様にして、８×ＴＣＦ−ｌｕｃを利用して、ＴＣＦ  ＤＮＡ結合部位の１６のコピーを伴うプラスミドを調製した。配列決定により全てのプラスミドを確認した。
【０２９１】
以下の要領でフラグ−タグ付けヒトＲｏｒ１（Ｒｏｒ１−フラグ）を構築した。ヒトＲｏｒ１をヒト子宮ＲＮＡからクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位内に挿入してｈＲｏｒ１−ｐｃＤＮＡ３を得た。このクローンをさらにＰＣＲ媒介突然変異誘発により修飾した。３’未翻訳領域を除去し、最下ストランドプライマを用いて停止コドンとＮｏｔＩ部位の前にｃＤＮＡの３’末端にフラグエピトープタグ（下線のついたコドン）を付加した。５’−ＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＡＴ−３’（配列番号１４）。最上ストランドプライマは、Ｒｏｒ１の内部領域に対し相補的であり、これはＢａｍＨＩ部位を含んでいた。５’−ＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１３）。増幅されたＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩでカットし、ＢａｍＨＩ−およびＮｏｔＩ−で消化されたｈＲｏｒ１−ｐｃＤＮＡ３内にクローニングした。意図した変更を、配列決定によって確認した。
【０２９２】
フラグでタグ付けしたヒトＲｏｒ２（Ｒｏｒ２−フラグ−ｐｃＤＮＡ３）を以下通りに作製した。ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６中のインビトロジェンのＩＭＡＧＥクローン収集物（クローンＩＤ３１４６５８７）から、コドン５８−２２９６を含有するヒトＲｏｒ２についての部分クローンを得、両方のストランドを配列決定することによって確認した。鋳型としてのＨＯＢ−０３−Ｃ５ＲＮＡおよびＲｏｒ２−特異的プライマを用いてＲＴ−ＰＣＲにより３’部分（コドン２２９７−２８３２）を産生した。最上ストランドプライマは、Ｒｏｒ２のコドン２１９２−２２１６に相補的であり、内部ＸｍｎＩ部位を含有し（５’−ＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号１５））、最下ストランドプライマは、停止コドン（太字活字）に隣接してＸｂａＩ部位を含んでいた（５’−ＴＡＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号１６））。増幅されたＤＮＡを、Ｒｏｒ２の３’末端を得るべくＸｍｎＩおよびＸｂａＩで消化させた。５’部位をＮｏｔＩおよびＸｍｎＩでＩＭＡＧＥクローンから切除し、両方のフラグメントを、ＮｏｔＩ−およびＸｂａＩ−消化されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）内にクローニングしてＲｏｒ２−３’−ｐｃＤＮＡ３を得た。Ｒｏｒ２の最初の５７個のコドンも同様に、鋳型としてのＨＯＢ−０３−Ｃ５ＲＮＡおよびＲｏｒ２−特異的プライマを用いてＲＴ−ＰＣＲによって産生した。最上ストランドプライマは、ＡＴＧコドン（太字活字）に対し５’のところにＫｐｎＩ部位を含み；（５’−ＧＡＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＧＣＴ−３’（配列番号１７））；最下ストランドプライマは、Ｒｏｒ２の内部領域に相補的で、ＢａｍＨＩ部位を含んでいた（５’−ＴＣＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣ−３’（配列番号１８））。
【０２９３】
増幅されたＤＮＡを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、ＫｐｎＩ−およびＢａｍＨＩ−で消化したＲｏｒ２−３’−ｐｃＤＮＡ３にクローニングしてＲｏｒ２−ｐｃＤＮＡ３を得た。コーディング領域全体は、両方のストランドを配列決定することによって確認した。その後、フラグ−タグ付けしたヒトＲｏｒ２をＰＣＲ媒介された突然変異誘発によって生成した。フラグエピトープタグ（下線の付いたコドン）を、最下ストランドプライマを用いて停止コドン（太字活字）およびＸｂａＩ部位より前のｈＲｏｒ２ｃＤＮＡの３’末端に付加した。５’−ＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣ−３’（配列番号２０）。最上ストランドプライマは、Ｒｏｒ２の内部領域に相補的であり、これはＡｌｅＩ部位を含んでいた。５’−ＧＣＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１９）。増幅されたＤＮＡをＡｌｅＩおよびＸｂａＩでカットし、ＡｌｅＩ−およびＸｂａＩ−で消化されたＲｏｒ２−ｐｃＤＮＡ３内にクローニングした。意図した変更を、配列決定により確認した。
【０２９４】
図５Ａで概略的に示したフラグでタグ付けしたＲｏｒ２「キナーゼ−デッド」型変異体（Ｒｏｒ２ＫＤ−フラグ）は、公開された証拠に基づいて設計された（ヒカサ  Ｈ（Ｈｉｋａｓａ  Ｈ）、シバタ  Ｍ（Ｓｈｉｂａｔａ  Ｍ）、ヒラチ  Ｉ（Ｈｉｒａｔｉ  Ｉ）、タイラ  Ｍ（Ｔａｉｒａ  Ｍ）、開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、１２９、５２２７−５２３９、（２００２））。イソロイシンへのリジン５０７、５１０および５１２の３点突然変異は、メーカーの指示事項に従って、クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））を用いＰＣＲ媒介突然変異誘発によりＲｏｒ２−フラグ−ｐｃＤＮＡ３内に導入した。意図した突然変異（太字）を含む最上ストランドプライマは、５’−ＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＴＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＣ−３’（配列番号２１）であり、最下ストランドプライマは、最上ストランドプライマに相補的であった。（５’−ＧＣＣＣＣＴＣＣＧＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣ−３’（配列番号２２））。配列決定により意図した変化を確認した後、突然変異を受けた部分をＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩでカットし、ＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩ消化済みＲｏｒ２−フラグ−ｐｃＤＮＡ３内にクローニングした。
【０２９５】
図５Ａ内で概略的に示されているフラグ−タグ付けしたＲｏｒ２トランケーション変異体（Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグ）をＰＣＲ媒介突然変異誘発によって構築した。最下ストランドプライマを用いて、フラグエピトープタグ（下線の付いたコドン）を、停止コドン（太字活字）およびＸｂａＩ部位が後続する膜内外ドメインのＣＯＯＨ末端をちょうど超えたところでコドン１２８４の後に導入した。５’−ＧＡＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号２４）。最上ストランドプライマは、ＳｐｈＩ部位に対し５’のところにあるＲｏｒ２の内部領域に対し相補的であった。５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴ−３’（配列番号２３）。増幅されたＤＮＡを、ＳｐｈＩおよびＸｂａＩで消化させ、ＳｐｈＩ−およびＸｂａＩ−で消化されたＲｏｒ２−ｐｃＤＮＡ３内にクローニングし、配列決定により意図した変更を確認した。
【０２９６】
ＰＣＲ媒介突然変異により、ヒトＮｏｔｃｈ２（ｂｐ５１２５−７４３１）のＶ５およびｈｉｓ−タグ付けした細胞内ドメインを構築した。第５’末端（塩基５１２５−５９０６）を、ＥｃｏＲＩ部位とそれに続くＡＴＧコドンを含む最上ストランドプライマ（５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴ−３’（配列番号４５））およびＢｃｌＩ部位を含むＮｏｔｃｈ２の内部領域に相補的な最下ストランドプライマ（５’−ＣＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号４６））を用いて、ヒト胎児脳および肺ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより産生した。
【０２９７】
コドン５９０７−７４２５を含む３’部分は、インビトロジェンのＩＭＡＧＥクローン収集物（クローンＩＤ５５２９００９）から得、ＰＣＲにより増幅した。ＢｃｌＩ部位を含む最上ストランドプライマは、５’−ＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号４７）であり、ＮｏｔＩ部位を含む最下ストランドプライマは５’−ＧＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＴＡＡＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号４８）であった。５’および３’部分を、タンパク質配列内にＶ５およびＨｉｓタグを取込むｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン）のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位内に枠内でクローニングした。
【０２９８】
ＲＮＡ単離
ＨＯＢ細胞を９．８×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、３４℃で一晩付着させ、０．２５％（ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミン（セロロジカルズ・プロテインズ社（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎｃ）、イリノイ州カンカキー（Ｋａｎｋａｋｅｅ、ＩＬ））、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭのｇｌｕｔａＭＡＸ−１、５０μｇ／ｍｌのアスコルバート−２−ホスファート（和光純薬工業株式会社（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）日本国大阪（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ））および１０ｎＭのメナディオン重亜硫酸ナトリウム（ビタミンＫ３）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍地中で３９℃になるまで移送した。４８時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、全細胞ＲＮＡをメーカーのプロトコルに従い、ＴＲＩゾル試薬（インビトロジェン）で単離した。その後、ｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡ画分を、メーカーの指示事項に従ってオリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）ｍＲＮＡＭａｘｉキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））を用いて抽出した。
【０２９９】
一過性トランスフェクションおよびウエスタン免疫ブロット法
ＣＯＳ−７またはＵ２ＯＳ細胞を約８０％のコンフルーエント密度で播種し、メーカーの指示事項に従い、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナ州インデイアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））を用いて１４３ｃｍ２あたり４０μｇの合計プラスミドＤＮＡで２４時間後にトランスフェクトした。２４〜７２時間後に、細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａｃｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトン×１００、２０ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのバナジウム酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害物質カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、２５０μＭのフッ化フェニルメチルスルホニル）中で可溶化させた。ＨＯＢ−０１−０９細胞系列の分析のために、溶解緩衝液中での可溶化の前にコンフルーエンスに至るまで細胞を成長させた。４℃で３０分間５００，０００×ｇで遠心分離により抽出物を清澄させた。β−カテニンの安定化を査定するために、６ウエルの平板内で約８０％のコンフルーエント密度でＵ２ＯＳ細胞を平板固定し、メーカーのプロトコルに従って、６．９μｇの合計プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を用いて２４時間後にトランスフェクトした。２４時間後、細胞質タンパク質抽出物を、低張性緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００μＭのＭｇＣｌ２；プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質カクテル（共にシグマより））中での可溶化とそれに続くダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー内での４０回の作業と４℃９０分間の１００，０００×ｇでの遠心分離により、調製した。免疫ブロット法のためには、全細胞溶解物５０μｇまたは細胞質抽出物１９μｇを、０．４５μｍのニトロセルロース膜上への移送に先立ち変性および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。０．１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０および５％のブロット（サンタクルス（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））を含むＰＢＳ中で膜を遮断し、その後一次抗体と共に２５℃で２時間インキュベートした（抗フラグエピトープタグ、１０μｇ／ｍｌ；抗−ｈｉｓタグ、１．４μｇ／ｍｌ；抗−ＨＡタグ、２μｇ／ｍｌ；抗−ホスホチロシン、２μｇ／ｍｌ；抗−β−カテニン１．５μｇ／ｍｌ；抗−β−アクチン１：５０００；抗−Ｖ５、３μｇ／ｍｌ；または抗−Ｒｏｒ２、１μｇ／ｍｌ）。２５℃で１時間、１：２０００でＨＲＰ−接合二次抗体を添加した後、膜を増強した化学発光（アマーシャム・バイオサイエンス、英国バッキンガムシャー）により分析し、その後Ｘ線フィルムに暴露した。指示のある場合には、膜を５５℃で３０分間、ストリッピング緩衝液（６２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２％のＳＤＳ、０．１％のβ−メルカプトエタノール）中でストリッピングし、次の抗体セットで再度プローブ検定した。
【０３００】
免疫沈降およびインビトロ自己リン酸化検定
Ｕ２ＯＳ細胞をウエスタン免疫ブロット法の場合と同様にトランスフェクションに付し、２４時間後、溶解緩衝液内で可溶化させ、４℃で３０分間５００，０００×ｇで遠心分離により清澄させた。１ミリグラムの全細胞溶解物を４℃で回転させながら１時間、Ｍ２フラグ親和性アガロース（シグマ）５０μｌでインキュベートした。ビーズを遠心分離により収集し、３５０ｍＭのＮａＣｌを含む溶解緩衝液中で３回、溶解緩衝液中で３回洗浄し、還元剤（インビトロジェン）と共に５０μｌの２×ＬＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で沸とうさせ、可溶化されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。各々の特異的抗体での検出の前に０．４５μｍのニトロセルロース膜上にゲルを移送した。
【０３０１】
自己リン酸化検定のため、キナーゼ溶解緩衝液（ＥＤＴＡ無しの溶解緩衝液）中の３ｍｇの全細胞溶解物を、５０μｌのＭ２フラグ親和性アガロース（シグマ）と共に４℃で回転させながら１時間インキュベートした。抽出物を４℃で３０分間５００，０００×ｇで遠心分離により清澄させた。３ミリグラムの全細胞溶解物を４℃で回転させながら１時間５０μｌのＭ２フラグ親和性アガロース（シグマ）と共にインキュベートした。ビーズを遠心分離によって収集し、３５０ｍＭのＮａＣｌを含有するキナーゼ溶解緩衝液中で３回、キナーゼ溶解緩衝液中で３回、キナーゼ反応緩衝液（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭのジチオトリエトール）中で２回洗浄した。ビーズの１０パーセントをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために取り置きし、残りを、１ｍＭのＡＴＰおよび１５μＣｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有するキナーゼ反応緩衝液５０μｌ中に再懸濁させた。３０℃で３０分間キナーゼ反応を進行させ、１×ＬＤＳ緩衝液と還元剤（インビトロジェン）の中での沸とうにより停止させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、０．４５μｍのニトロセルロース膜上に移し、増感スクリーンで−８０℃で１２時間、Ｘ線フィルムに暴露した。指示がある場合には、ウエスタン免疫ブロット法で記述されている通り、抗フラグ抗体でその後膜をプローブ検定した。
【０３０２】
統計的分析
平均±標準誤差（ＳＥ）としてデータを提示する。統計的意義をスチューデントのｔ試験を用いて決定した。結果は、ｐ＜０．０５である場合に、統計的に異なるものとみなされた。
【０３０３】
実施例１
Ｒｏｒ２遺伝子の発現は、ヒト骨芽細胞分化の後期の間減少し、ＳＦＲＰ−１により抑圧される
Ｒｏｒ２がヒト骨芽細胞分化に関与しているという発見は、遺伝子チップ技術を用いてなされた。これらの実験ため、骨芽細胞分化の全く異なる期（それぞれ増殖期、早期および成熟骨芽細胞、前骨細胞期および骨細胞期）を表わす固有のＨＯＢ細胞系列（ＨＯＢ−０３−Ｃ５、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、ＨＯＢ−０２−Ｃ１、ＨＯＢ−０１−Ｃ１およびＨＯＢ−０５−Ｔ１）由来のｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ試料を、骨および軟骨ｃＤＮＡが富化されたＧＩヒト１ａチップを用いた遺伝子チップ分析に付した。標的相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）調製およびアフィメトリック・ジーン・チップス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）に対するハイブリダイゼーションは、基本的にヒル  ＡＡ（Ｈｉｌｌ  ＡＡ）ら、ゲノム生物学（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．）、２、（２００１）、ヒル  ＡＡ（Ｈｉｌｌ  ＡＡ）ら、サイエンス、２９０、８０９−１２、（２０００）に記述されている通りに行なわれた。１１のビオチン標識された対照ｃＲＮＡ写しを既知の濃度でハイブリダイゼーション溶液内にスパイクし、平均差（ＡＤ）値とピコモル濃度の間の較正曲線を生成するためにこれを使用した。ピコモル濃度を、平均ｃＲＮＡ長が１ｋＢであるという仮定に基づいて１００万分の１周波数に変換した。チップを走査し、アフィメトリックス(Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ)ＭＡＳ４．０ソフトウェアを用いて分析し、各プローブセットについてのＡＤ値をアフィメトリックス（カリフォルニア州サンタクララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の指示事項に従って計算した。その後、対照写しから得た較正曲線を用いて各プローブセットについて１００万分の１周波数を導出した。この分析により、骨芽細胞分化の間に２倍超変化した２９のキナーゼを同定した。
【０３０４】
ボディンらは、Ｗｎｔシグナル化アンタゴニストＳＦＲＰ−１が骨芽細胞アポトーシスを促進すること（ボディン、Ｐ．Ｖ．Ｎ．ら、国際公開第０１／１９８５５号パンフレット、ボディン、Ｐ．Ｖ．Ｎ．ら、米国骨代謝学会（ＡＳＢＭＲ）第２３回会議、アリゾナ州フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ、２００１））、およびＳＦＲＰ−１が欠如しているように工学処理されたマウス（レキシコン・ジェネティックス社（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、テキサス州ウッドランド（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）との協同作業で生成されたもの）が、骨形成を増加させたこと（ボディン、Ｐ．Ｖ．Ｎ．ら、米国骨代謝学会（ＡＳＢＭＲ）第２４回会議、テキサス州サンアントニオ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ））を、以前に示してきた。ＳＦＲＰ−１作用メカニズムを特徴づけするため、ＳＦＲＰ−１または対照ベクターのいずれかを安定した形で過剰発現するＨＯＢ−０１−０９前骨細胞由来のｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ上で、遺伝子チップ分析を実施した。野生型対照と比較したＳＦＲＰ−１ノックアウトマウスの転写プロフィールを考察するためにも、遺伝子チップ技術を使用した。
【０３０５】
遺伝子チップスクリーンの結果を比較して、出願人は、１つのキナーゼの発現が骨芽細胞分化の間に変化するだけでなくＳＦＲＰ−１発現によっても調節されるということを発見した。これは、ＳＦＲＰ−１発現の増加と並行して、骨細胞表現型に向かって骨芽細胞が進歩していくにつれて（図１Ａ）そのｍＲＮＡ発現が減少するＲｏｒ２キナーゼであった。Ｒｏｒ２ｍＲＮＡレベルの変化は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によっても確認された（図１Ａ）。遺伝子チップ分析のために用いられるものと同じｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ試料は、メーカーの指示事項に従い、ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに付された。使用されたプライマおよびプローブの配列が表１に列挙されている。
【０３０６】
【表１−１】
2006524508.tif 000002
【０３０７】
【表１−２】
2006524508.tif 000003
【０３０８】
プローブを、アプライド・バイオシステムズから得、レポータ螢光染料ＦＡＭで標識した。１８ＳｒＲＮＡに特異的なレポータ螢光染料ＶＩＣで標識されたプローブおよびプライマをアプライド・バイオシステムズから購入し、内部対照としてこれを反応の中に含み入れた。３０分間４８℃で逆トランスクリプターゼ工程を実施し、ｃＤＮＡを以下の条件下で４０サイクルの間増殖させた。１５秒間９５℃および１分間６０℃。各遺伝子のためのｍＲＮＡ量をユーザー広報（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）＃２（アプライド・バイオシステムズ）内で記述された標準曲線方法を用いて計算し、１８ＳｒＲＮＡの発現に対し正規化した。
【０３０９】
ＲＴ−ＰＣＲを一次ヒト骨芽細胞中のＲｏｒ２の発現を確認するためにも使用した（図１Ａ）。ヒト骨芽細胞内のＲｏｒ２発現のレベルは、ＨＯＢモデル中の早期骨芽細胞内で観察したものと類似していた。ＨＯＢ−０１−０９細胞内のＳＦＲＰ−１の過剰発現は、Ｒｏｒ２ｍＲＮＡレベルの強い抑圧を結果としてもたらし、一方ＳＦＲＰ−１で分断されたマウスの頭蓋冠は、野生型対照の場合よりも２倍多いＲｏｒ２メッセージを発現した（図２）。Ｒｏｒファミリーの１つだけの他の既知の成員であるＲｏｒ１の発現も同様に、骨芽細胞分化の間に減少した（図１Ｂ）が、ＳＦＲＰ−１により調節されるとは思われなかった。実際Ｒｏｒ１レベルは、野生型ならびにＳＦＲＰ−１−ヌルの両方のマウスの頭蓋冠内で検出限界よりも低いものであり、ＨＯＢ−０１−０９細胞内でのＳＦＲＰ−１過剰発現の時点で変化しなかった（図２）。
【０３１０】
デキアラ（ＤｅＣｈｉａｒａ）ら、ネイチャー・遺伝学（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２４、２７１−４、（２０００）およびタケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ）ら、遺伝子から細胞へ（Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ）、５、７１−８、（２０００）は、マウス体内でのＲｏｒ２遺伝子の分断が広範囲の骨格異常に導くということを報告した。さらに、マシアコフスキー（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ）ら、生物化学ジャーナル、２６７、２６１８１−９０、（１９９２）は、Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２キナーゼが、Ｗｎｔタンパク質への結合を媒介するＳＦＲＰ−１のものに対し相同なｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ドメインを有することを報告した（図３）。ロスマス（Ｒｏｓｚｍｕｓｚ）ら、生物化学ジャーナル、２７６、１８４８５−９０、（２００１）は、Ｒｏｒ１のｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン内でのジスルフィド結合の局在化がＳＦＲＰ−１のものと同一であることを報告した。これらのデータは、Ｒｏｒ２が骨芽細胞分化に参加することおよびそれがＷｎｔおよびＳＦＲＰ−１シグナル化経路に関与していることを示唆した。
【０３１１】
実施例２
Ｒｏｒ２遺伝子の発現は、ヒト骨芽細胞分化の初期の間およびマウス骨芽細胞分化の初期および後期の間に増大する
ヒト骨芽細胞分化の早期の間のＲｏｒキナーゼの発現を査定するために、多能性ヒト間葉基幹細胞（ｈＭＳＣ、バイオホィッタカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））の骨芽細胞分化を分析した。１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（バイオホイタッカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭのｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（成長培地）を含むフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地を用いて、５％ＣＯ２／９５％加湿空気のインキュベータ内で３７℃でｈＭＳＣを維持した。９６ウェル平板中で１ウェルあたり９９２細胞でｈＭＳＣを播種し、２４時間後（０日目）、２１日間にわたり骨原性培地（生成培地中の０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸および１０ｍＭのβ−グリセロホスファート）を添加することにより、骨発生を誘発した。７日毎に、全細胞ＲＮＡを単離し、Ｒｏｒ遺伝子の発現を、表１に列挙されたプライマおよびプローブを用いて実施例１で記述されている通りのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により査定した。図４Ａに示されているように、Ｒｏｒ２発現は、分化の経時変化の間に劇的に増加し、２１日目には３００倍超の誘発が観察された。これとは対照的に、Ｒｏｒ１の発現は、分化の経時変化全体の間に変化しなかった（図４Ａ）。
【０３１２】
さらに、マウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞様細胞のアスコルビン酸誘発された分化の間のＲｏｒ発現を監視した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭのｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを含むＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２／９５％加湿空気インキュベータの中で３７℃に維持した。１００ｍｍのプラスチック製培養皿の中で１皿あたり３×１０６個の細胞の割合で細胞を播種し、７２時間後に（０日目、集密時点で）、１０ｍＭのβ−グリセロホスファートおよびアスコルビン酸（第１の補給には１２．５μｇ／ｍｌおよびその後の補給には２５μｇ／ｍｌ）を補足した成長培地を付加することによって分化を誘発した。培地を４８時間毎に交換した。３日毎に全細胞ＲＮＡを単離し、内部対照としてゲッ歯類ＧＡＰＤＨ（アプライド・バイオシステムに特異的なＶＩＣ標識したプローブおよびプライマを使用するという点を除いて、実施例１で記述した通りに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｒｏｒ分析に使用したプライマとプローブの配列が表２に列挙されている。
【０３１３】
【表２−１】
2006524508.tif 000004
【０３１４】
【表２−２】
2006524508.tif 000005
【０３１５】
２つの特異的骨芽細胞マーカーすなわちアルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびオステオカルシン（ＯＣ）の発現を、表３に列挙されたプライマおよびプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲにより分析することにより骨芽細胞表現型へのＭＣ３Ｔ３分化の進行を監視した。
【０３１６】
【表３−１】
2006524508.tif 000006
【０３１７】
【表３−２】
2006524508.tif 000007
【０３１８】
図４Ｂに示されているＡＰおよびＯＣの発現の経時変化は、ＭＣ３Ｔ３細胞が骨原性培地内で６日間経過した後最高レベルのＡＰ発現を特徴とする成熟骨芽細胞表現型に達し、９日後に高いＯＣを伴ってマトリクスミネラル化期に入る、ということ明らかにしている。Ｒｏｒ２発現は、分化の経時変化全体を通して増大した（図４Ｂ）。これとは対照的に、Ｒｏｒ１発現は、同じ経時変化全体にわたり漸減し、１９日目までにそのもとの値の約２０％にまで下降した（図４Ｂ）。
【０３１９】
かくして、ヒトの骨芽細胞において、Ｒｏｒ２発現は分化早期の間に増加し、増殖する前骨芽細胞期にピークに達し、その後末期骨細胞分化の間に減衰する。マウスの骨芽細胞においては、Ｒｏｒ２発現は、分化の早期および晩期の両方を通して増加する。
【０３２０】
実施例３
ヒトＲｏｒ１およびＲｏｒ２のクローニングおよび発現
ヒトＲｏｒ１およびＲｏｒ２は、インビトロジェン社（カリフォルニア州カールスバッド）との協同作業でクローニングされ、それぞれ配列番号３および５として提示されている。Ｒｏｒ１配列は以下の置換を有していた。すなわちＴ５９０Ｃ（サイレント）、Ｔ１５８０Ｇ（サイレント）、Ｔ１９６３Ｃ（Ｍ５１８Ｔ）、およびＡ３１４２Ｇ（Ｋ９１１Ｒ）。Ｒｏｒ２配列は、Ｃ２０８８Ｔ（サイレント）およびＧ２４５５Ａ（Ｖ８１９１）という２つのヌクレオチドにより、米国特許第５，８４３，７４９号明細書の中で開示されているものと異なっている。米国特許第５，８４３，７４９号明細書中の番号付けは、５’ＵＴＲの長さの可変性に起因して異なっており、Ｒｏｒ１については３５を差し引き、Ｒｏｒ２については１９９を加えることによって得ることができる。
【０３２１】
全長Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２用および２つのＲｏｒ２変異体用の発現プラスミドを生成した（図５Ａ）。第１のＲｏｒ２変異体（Ｒｏｒ２ＫＤ）においては、５０４位（推定上のＡＴＰ結合ドメイン内）、５０７および５０９位にある３つのリジンはイソロイシンで置き換えられ、第２の変異体（Ｒｏｒ２ΔＣ）では、チロシンキナーゼ相同性ドメインを含む細胞質部分全体が欠失された。４つの発現プラスミドは全て、タンパク質の同定のためのＣＯＯＨ−末端フラグエピトープタグを含んでいた。ウエスタン免疫ブロット法は、Ｒｏｒ１−フラグ、Ｒｏｒ２−フラグおよびＲｏｒ２ＫＤ−フラグがＵ２ＯＳ、骨肉種細胞内で高いレベルで発現し、一方Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグは比較的低いレベルの発現を示すということを示した（図５Ｂ）。Ｒｏｒ２−フラグおよびＲｏｒ２ＫＤ−フラグの両方共を、フラグ親和性アガロース上でＵ２ＯＳ抽出物から沈降させることができた（図５Ｃ、下部図版）。しかしながら、Ｒｏｒ２ＫＤ変異体はインビトロ自己リン酸化検定において自らリン酸化することができず（図５Ｃ、上部図版）、それがそのキナーゼ活性を失なったことを確認している。フラグ免疫沈降およびインビトロ自己リン酸化検定を、一般的方法で記述される通りに実施した。
【０３２２】
実施例４
Ｒｏｒ２キナーゼはＷｎｔ−３を阻害するものの、Ｗｎｔ−１活性を増強する
Ｒｏｒ２キナーゼがＷｎｔシグナル化内で沈降するか否かを査定するために、ルシフェラーゼレポータ検定を実施した。Ｕ２ＯＳ細胞を９６ウェルの平板内で１ウェルあたり２０，０００細胞の割合で播種し、メーカーのプロトコルに従って、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（インビトロジェン）を１ウェルあたり０．１６μｌ用いて、抗生物質無しで培地中で２４時間後にトランスフェクトした。１８０ｎｇの１６×ＴＣＦ−ｌｕｃ（一般的方法のプラスミドの節で記述されたもの）、５ｎｇのＷｎｔ−１−ＨＡまたはＷｎｔ−３−ＨＡ；１５ｎｇのＳＦＲＰ−１；５ｎｇのｐＣＭＶβ；指示された量のＲｏｒ１−フラグ、Ｒｏｒ２−フラグまたはＲｏｒ２ΔＣ−フラグといったＤＮＡの組合せを１ウェルあたりに使用し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）で２３０ｎｇに調整した。ＤＮＡの付加から４時間後に培地を交換し、２４時間後に、培地を吸引しＰＢＳ中で洗浄した後、細胞を溶解させ、抽出物をルシフェラーゼ検定試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてルシフェラーゼ活性について、およびＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ（アプライド・バイオシステムズ）を用いてβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性について検定した。ルシフェラーゼについては１０秒、β−ｇａｌについては５秒間にわたる組込みにより、マイクロルーマット（ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ）ＬＢ・９６Ｐリュミノメータ（ＥＧ＆Ｇベルトールド（ＥＧ＆ＧＢｅｒｔｈｏｌｄ）、オーストラリア、バンドゥーラ（Ｂａｎｄｏｏｒａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ））で発光を測定した。ルシフェラーゼについて得た発光値を、β−ｇａｌについてのものに正規化した。最小チミジンキナーゼプロモータに対し５’のところで融合されたＷｎｔ応答性ＴＣＦ結合部位の１６のコピーを含むルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現を、Ｗｎｔ−３−ＨＡ構成体とのＵ２ＯＳ細胞の同時トランスフェクションの後２０倍超に刺激した（図６Ａ）。Ｒｏｒ２−フラグとの同時トランスフェクションは、９６ウェル平板の１ウェルあたりＩＣ５０＝５．８ｎｇでかつ６８％の最大阻害で、プロモータのＷｎｔ−３誘発された活性化を用量依存的に阻害した（図６Ａ）。ＩＣ５０というのは、Ｗｎｔ単独の存在下で観察された活性の最大阻害の５０％を達成するのに必要とされる作用物質の量を意味する。Ｒｏｒ２−フラグはそれ自体プロモータ活性に対しいかなる効果ももたなかった（図６Ａ）。Ｗｎｔシグナル化の強力な阻害物質であるＳＦＲＰ−１は、Ｗｎｔ−３−ＨＡ活性を抑圧し、ＳＦＲＰ−１とＲｏｒ２−フラグが併さると、それをさらに一層抑圧した。これとは対照的に、同じプロモータがＷｎｔ−１−ＨＡによって活性化された場合、Ｒｏｒ２−フラグは、２相用量応答と共にＷｎｔ−１活性を増強した（図６Ｂ）。ＳＦＲＰ−１の添加はこの増強を克服し、ルシフェラーゼ活性をＷｎｔ−１−ＨＡ単独の存在下の場合と同レベルまで阻害した（図６Ｂ）。
【０３２３】
実施例５
Ｒｏｒ１キナーゼはＷｎｔ−３を阻害するものの、Ｗｎｔ−１活性に対しいかなる効果ももたない
Ｗｎｔ経路活性に対するＲｏｒ１の効果を査定するために、ルシフェラーゼレポータ検定を実施例４に記述されている通りに実施した。図７Ａに示されている通り、Ｒｏｒ１−フラグはそれ自体ＴＣＦプロモータに対しいかなる活性ももたないが、ＩＣ５０＝５ｎｇ／ウェルおよび３７％の最大阻害で、Ｗｎｔ−３−ＨＡによるシグナル化を阻害した。任意の用量でのＲｏｒ１−フラグの添加は、Ｗｎｔ−１−ＨＡで刺激された転写に対しいかなる効果ももたなかった（図７Ｂ）。
【０３２４】
実施例６
Ｒｏｒ２のチロシンキナーゼ活性は、Ｗｎｔ−１の増強およびＷｎｔ−３活性の阻害の大部分のために必要とされる
Ｗｎｔシグナル化の調節のためにＲｏｒ２キナーゼ活性が必要とされるか否かを調査するために、チロシンキナーゼ活性を全くもたないＲｏｒ２ＫＤ点変異体を用いて実施例４に記述されている通りにルシフェラーゼレポータ検定を実施した（図５Ｃ参照）。この変異体は、ＴＣＦプロモータに対するＷｎｔ−１シグナル化を増強せず（図８Ａ）、プロモータのＷｎｔ−３誘発された活性化を弱く阻害したにすぎない（図８Ｂ）。
【０３２５】
細胞質ドメインが完全に欠如したＲｏｒ２変異体（Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグ）を用いて類似の結果を得た。Ｒｏｒ２ΔＣ−フラグは、Ｗｎｔ−１−ＨＡ活性を増強せず（図９Ｂ）、同じくＵ２ＯＳ細胞内でＷｎｔ−３シグナル化を阻害するその能力の一部分を失った（図９Ａ）。かくして、Ｒｏｒ２のチロシンキナーゼ活性は、Ｗｎｔ−１シグナル化の増強のためおよびＷｎｔ−３活性の阻害の大部分のために必要とされる。
【０３２６】
実施例７
Ｒｏｒ２およびＲｏｒ２ＫＤはＷｎｔ−１およびＷｎｔ−３に結合し、Ｒｏｒ２は異なるＷｎｔ間の区別を行なう。
Ｗｎｔに対するＲｏｒ２の考えられる直接的結合を評価するために、一般的方法の中で記述されているように、ＨＡ−標識されたＷｎｔ１および３およびＲｏｒ２−フラグとの同時トランスフェクションを受けたＣＯＳ−７またはＵ２ＯＳ細胞の溶解物での免疫沈降実験を実施した。図１０は、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３の両方がＲｏｒ２との複合体の中で免疫沈降したことを示している。相互作用の特異性は、抗−フラグがＲｏｒ２−フラグ同時発現の不在下でＷｎｔを免疫沈降させることができないという事実によって実証された。Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３の両方共がＲｏｒ２ＫＤとの複合体の中で免疫沈降させられたことから、キナーゼ活性の喪失が、Ｒｏｒ２のＷｎｔ結合能力に影響を与えることはなかった（図１０）。
【０３２７】
Ｒｏｒ２−Ｗｎｔ相互作用の特異性に取組むため、異なるＷｎｔタンパク質の一因を用いた免疫沈降実験（図１１）を実施した。この実験では、Ｒｏｒ２の不在下または存在下でＣＯＳ７細胞内で１０の異なるＨＡタグ付けされたＷｎｔが過剰発現された。図１１に示されているように、Ｒｏｒ２は、Ｗｎｔ３ａに最も良く結合し、その後にＷｎｔ３、４、２、１、５ｂおよび５ａが続くことが観察された。Ｒｏｒ２は、Ｗｎｔ６および７ａをわずかだけ結合したが、ＣＯＳ７細胞内のＷｎｔ６の発現は、その他のＷｎｔのものほど高くなかった（図１１、下部図版）。Ｒｏｒ２は、本発明者らの実験条件下で、Ｗｎｔ７ｂと結合しなかった。かくして、Ｒｏｒ２は、Ｗｎｔとその相互作用において特異性を示している。
【０３２８】
実施例８
Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３の過剰発現は、Ｒｏｒ２の自己リン酸化に対し効果を及ぼさない
Ｒｏｒ２は、Ｕ２ＯＳ抽出物から免疫沈降された場合、おそらくは、その固有のチロシンキナーゼ活性に起因してインビトロで自らリン酸化する能力を有していた（図５Ｃ）。Ｗｎｔの同時発現がＲｏｒ２の自己リン酸化の程度に影響を及ぼすか否かを決定するために、Ｕ２ＯＳ細胞をＷｎｔ−１、Ｗｎｔ−３または対照プラスミドの存在下で、Ｒｏｒ２で一過性にトランスフェクトした。全細胞抽出物を２４時間後に単離した。Ｒｏｒ２−フラグをフラグ親和性アガロース上で免疫沈降し、一般的方法の中で記述されているようにインビトロ自己リン酸化検定を実施した。図１２Ａは、オートラジオグラフとそれに続く同じ膜のウエスタン免疫ブロットを示している。図１２Ｂでは、少なくとも３つの独立した実験の結果がクオンティティー・ワン１−Ｄ画像解析ソフトウェア（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））を用いて定量化されており、放射性シグナルは各反応中に存在する免疫反応性Ｒｏｒ２の合計量に対し正規化された。Ｗｎｔ１および３の不在下または存在下でのＲｏｒ２自己リン酸化の著しい差異は全く存在しなかった。
【０３２９】
実施例９
Ｒｏｒ２はβ−カテニンのＷｎｔ誘発された安定化を阻害する
古典的Ｗｎｔシグナル化経路の中のどこでＲｏｒ２が機能するかということに取組むために、Ｗｎｔ−媒介された細胞質ゾルβ−カテニンの安定化に影響を及ぼすＲｏｒ２キナーゼの能力を査定した。Ｕ２ＯＳ細胞内へのＷｎｔ１または３のトランスフェクションの時点で、β−カテニンの細胞質レベルはそれぞれ１．７または２．８倍だけ、再現可能な形で増大した（図１３）。Ｒｏｒ２の増大する量での同時トランスフェクションは、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３の両方の細胞質ゾルβカテニン安定化能力を用量依存的に阻害した。興味深いことに、キナーゼ−デッド型Ｒｏｒ２変異体は、β−カテニン安定化を阻害する上でＲｏｒ２と同じ位強力であり、キナーゼ活性がこの効果のために必要とされないことを表わしていた。従って、ＴＣＦプロモータ上のＷｎｔ３シグナル化のＲｏｒ２誘発された阻害は、少なくとも部分的にβ−カテニンの分解に起因するものであり得る。しかしながら、Ｒｏｒ２はβ−カテニン安定化の下流側で作用することにより、ＴＣＦプロモータ上のＷｎｔ１シグナル化を増強するはずである。その上、Ｒｏｒ２シグナル化のこのもう一方の腕は、β−カテニンレベルのＲｏｒ２−誘発された減少を克服しなければならない。
【０３３０】
実施例１０
Ｗｎｔシグナル化におけるＲｏｒ２の機能のモデル
図１４は、Ｒｏｒ２による古典的Ｗｎｔシグナル化の調節についてのワーキングモデルを提示している。Ｒｏｒ２はＷｎｔ１およびＷｎｔ３を結合し、それらをそのＦＺ受容体から隔離し、その結果β−カテニンの分解を増大させる。このプロセスは、Ｒｏｒ２受容体のチロシンキナーゼ活性を必要としない。さらに、Ｒｏｒ２に結合するＷｎｔ１は、Ｒｏｒ２キナーゼ依存性のシグナル化経路を活性化し、これが究極的にＴＣＦプロモータ活性の増強をもたらす。Ｗｎｔ結合はＲｏｒ２キナーゼ活性を調節するように思われないという事実は、Ｗｎｔ１がＲｏｒ２活性化にとって必要なその他の何らかの事象すなわち受容体二量体化を開始させることおよびＲｏｒ２自己リン酸化のバックグラウンドレベルが機能に充分なものであることを示唆している。Ｗｎｔ３結合は、この付加的なシグナル化経路を活性化するようには思われず、Ｒｏｒ２はＴＣＦプロモータ上のＷｎｔ３活性を阻害する。しかしながら、キナーゼ−デッド型Ｒｏｒ２はβ−カテニン安定化に拮抗するもののＴＣＦプロモータを阻害するその能力を失なうことから、この阻害には、β−カテニンの下流側の付加的なキナーゼ依存性事象が必要とされる。かくして、Ｗｎｔシグナル化に対するＲｏｒ２の最終的な効果は、細胞内で発現される特定のＷｎｔにより決定される。
【０３３１】
実施例１１
Ｕ２ＯＳ細胞内のＲｏｒ２結合パートナーの同定
Ｒｏｒ２結合パートナーは、免疫沈降およびそれに続く質量分光分析によって同定された。この目的でｐｃＤＮＡ３．１（＋）またはＲｏｒ２−フラグでのトランスフェクションを一過性に受けたＵ２ＯＳ細胞のタンパク質抽出物を、まず第１に抗−フラグ親和性アガロース上で免疫沈降させ、異なる百分率のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させた。銀染色により、恐らくは１００ｋＤａ前後のＲｏｒ２−フラグ自体を含むＲｏｒ２−フラグ含有抽出物（図１５Ａ−Ｃ内に矢印でマークされている）の中のみに存在する複数のバンドを同定した。重要なことに、矢印によりマーキングされたバンドのうち複数のものが抗フラグ抗体によって認識されておらず（図１５ＡおよびＤを比較のこと）、このことは、これらのタンパク質がＲｏｒ２−フラグまたはそのタンパク質分解フラグメントとは全く異なるものであることを表わしていた。その上、これらのタンパク質のいくつかは、抗ホスホチロシジン抗体により同定された（図１５Ｅ）。質量分光（ＭＳ）分析を、以下の通り、免疫沈降したＲｏｒ２−フラグおよび対照試料について実施した。免疫沈降樹脂から０．０５％（ｗ／ｖ）まで溶出された試料に対してＳＤＳを添加した。その後試料を０．０５％のＳＤＳに対し透析し、もとの体積の約１／５０になるまで蒸発により体積を減少させた。その後、１０％のトリシンゲル（インビトロジェン）に試料を適用し、ゲルを銀染色した。各試料のレーン全体にまたがるスライスをゲルから切除した。各ゲルスライス内のタンパク質をＤＴＴで還元し、ヨードアセタミドでアルキル化し、プロゲストインベスティゲータ（ＰｒｏＧｅｓｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ）（プロメガ）を用いてトリプシンでのゲル内消化に付した。消化した試料の体積を蒸発によって縮小し、次に、０．１Ｍの酢酸および２％のアセトニトリルを含むように約２０μｌまで戻した。
【０３３２】
次に、各試料を１０マイクロリットルずつ、ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰプラス質量分光計（フィニンガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）；カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ））と整列したピコフリットニードル（Ｐｉｃｏｆｒｉｔ  ｎｅｅｄｌｅ）（ニューオブジェクティブス（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ）；マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ））内に充填された１０ｃｍ×７５μｍのＣ１８逆相カラム上に投入した。３７５から１２００までのｍ／ｚ範囲を走査することによりペプチド質量を記録した。ＭＳスキャンからの最初の３つの最も強いイオンについての連続的なＭＳ／ＭＳ実験が各ＭＳスキャンの後に続くデータ依存的な要領で、フラグメントイオンスペクトル（直列質量分析（ＭＳ／ＭＳ））を獲得した。結果としてのＭＳ／ＭＳデータを、セクエスト（Ｓｅｑｕｅｓｔ）プログラム（フィニガン）を用いてＮＣＢＩ非冗長性データベースに対して探索した。
【０３３３】
Ｒｏｒ２−フラグにより特異的に免疫沈降されることがわかったタンパク質は、表４に列挙されている。
【０３３４】
【表４】
2006524508.tif 000008
【０３３５】
実施例１２
Ｒｏｒ２はＮｏｔｃｈ２受容体の細胞内ドメインと相互作用する
Ｒｏｒ２とＮｏｔｃｈ２の間の相互作用を確認するために、ＣＯＯＨ末端Ｖ５とｈｉｓタグ付けされたヒトＮｏｔｃｈ２細胞内ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ＩＣ、ｂｐ５１２５〜７４３１）を含む構成体を一般的方法の中で記述される通りに生成した。Ｎｏｔｃｈ２ＩＣ−Ｖ５−ＨｉｓおよびＲｏｒ２−フラグをＵ２ＯＳ細胞内に同時トランスフェクトし、１ｍｇの全細胞溶解物をＭ２フラグ親和性アガロース上で免疫沈降させ、一般的方法で記述されている通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解させた。
【０３３６】
図１６は、Ｒｏｒ２との複合体の中でＮｏｔｃｈ２ＩＣが免疫沈降したことを示している。相互作用の特異性は、抗フラグがＲｏｒ２−フラグの同時発現の不在下でＮｏｔｃｈ２ＩＣを免疫沈降できなかったという事実によって実証された。
【０３３７】
実施例１３
Ｒｏｒ２およびＲｏｒ１を安定した形で過剰発現するＨＯＢ−０１−０９骨細胞前細胞の生成
骨芽細胞生理学に対するＲｏｒキナーゼの効果を調査するため、本発明者らは、本発明者らのヒト骨芽細胞系列のうちの１つの中でＲｏｒ２、Ｒｏｒ２−フラグ、およびＲｏｒ１−フラグを安定した形で過剰発現させた。本発明者らは、低レベルの内因性Ｒｏｒ２をもつＨＯＢ−０１−０９骨細胞前細胞（図１のＨＯＢ−０１−Ｃ１骨細胞前細胞に類似するもの）を使用した。ＨＯＢ−０１−０９細胞は以前に記述されており（ボディン、Ｐ．Ｖ．Ｎ．（ウェス社（Ｗｙｅｔｈ  Ｃｏｒｐ．））例えば変形性骨関節症の治療に有用な分泌されたｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質を含む組成物、ＰＣＴ番号、国際公開第２００１１９８５５−Ａ２号パンフレット；２０００）、ＡＴＣＣに寄託されている。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）または空のｐｃＤＮＡ３．１（＋）内のＲｏｒ２、Ｒｏｒ２−フラグおよびＲｏｒ１−フラグを、電気穿孔によりＨＯＢ−０１−０９細胞内にトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、１０μｇのプラスミドＤＮＡをＰＢＳ中の８×１０６個の細胞に添加し、５分間氷上でインキュベートした。混合物を、１００μＦ、４８オーム、１５０Ｖ（パルス持続時間約１０ｍｓｅｃ）というパラメータでＥＣＭ６００電気穿孔装置（ＢＴＸ）を用いて２ｍｍ空隙のキュベット（ＢＴＸ、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））の中で電気穿孔に付した。氷上で５分、細胞を冷却し、１５０ｍｍ入りの培養フラスコに移し、Ｇ４１８耐性細胞の単離コロニーが形成されるまで、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン）で補足された２ｍＭのｇｌｕｔａＭＡＸ−１（ＨＯＢ成長培地）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍地を用いて、５％のＣＯ２／９５％の加湿空気インキュベート内で３４℃で維持した。コロニーをトリプシン処理し、９６ウェルの平板上に１ウェルあたり１つの割合で移送した。コロニーを、１２５μｇ／ｍｌのＧ４１８で補足されたＨＯＢ成長培地中で３４℃で成長させ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタン免疫ブロット法により、Ｒｏｒ発現のレベルを査定した。この手順は、空ベクターを過剰発現するＨＯＢ−０１−０９細胞に比べて、３〜５倍のＲｏｒ２、Ｒｏｒ−２−フラグおよびＲｏｒ１−フラグｍＲＮＡの過剰細胞を伴う複数の細胞系列を生み出した（図１７Ａ）。これらの系列は同様に、適切なサイズの免疫反応性タンパク質の発現をも実証した（図１７Ｂ）。本発明者らは、これらの細胞系列がＲｏｒ２およびＲｏｒ１を過剰発現し、アポトーシス、アルカリホスファターゼ活性およびオステオカルシン分泌に対する効果を含めた骨芽細胞表現型に対するＲｏｒキナーゼの効果を査定するのに使用できるという結論を下している。
【０３３８】
実施例１４
骨粗鬆症薬物標的としてのＲｏｒ２の検証
Ｒｏｒ２を、インビトロおよびインビボアプローチにより骨粗鬆症薬物標的として検証する。哺乳動物細胞内のＲｏｒ２発現を特異的に分断するｓｉＲＮＡ分子を生成する。比較的高いレベルのＲｏｒ２ｍＲＮＡで早期骨芽細胞内でｓｉＲＮＡを過剰発現し、細胞の分化および／または生存に対するＲｏｒ２分断の効果をモニター観察する。骨芽細胞内でＲｏｒ２発現により調節される遺伝子を同定するために遺伝子チップ分析が実施される。Ｒｏｒ２発現パターンおよびＳＦＲＰ−１およびＷｎｔシグナル化に対するその関係に基づいて、Ｒｏｒ２ダウンレギュレーションが骨芽細胞分化を増大させると同時にアポトーシスを促進する。相補的アプローチには、検出可能なレベルのＲｏｒ２ｍＲＮＡを全くもたない骨細胞前細胞内のＲｏｒ２−フラグの過剰発現およびこれらの細胞の分化状態の監視が関与する。インビトロ検証の後、骨粗鬆症標的としてのＲｏｒ２のインビボ検証を、組織依存性および／または時間依存性の要領でＲｏｒ２を条件付きで過剰発現するトランスジェニックマウスを生成し、かつ条件付きＲｏｒ２ノックアウトマウスを生成することによって実施する。
【０３３９】
実施例１５
Ｒｏｒ２レギュレータを同定するためのハイスループットスクリーニング
小分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）のためのベースとしてＲｏｒ２リン酸化を利用する。Ｒｏｒ２の活性化体または阻害物質のいずれを探究すべきかは、インビトロ標的検証の発見事実により決定され、受容体アゴニストがスクリーニングされる。受容体チロシンキナーゼの一般的活性化メカニズムは、受容体オリゴマ化および自己リン酸化を通してのものと考えられ（参考資料、フォレスター、Ｗ．Ｃ．（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ、Ｗ．Ｃ．）、細胞および分子の生命科学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）５９、８３−９６、（２００２）、および同書中の参考文献を参照のこと）、従って、受容体のリン酸化を調節する分子がその活性を調節するものと予想できる。ＣＯＯＨ−末端ＧＳＴタグを含むヒトＲｏｒ２のための発現プラスミドを生成し、細菌細胞内のタンパク質を産生させ、グルタチオン−コーティングされた多重ウェル平板に結合させる。未結合のタンパク質を洗い流した後、チロシン上のＲｏｒ２リン酸化レベルを、例えば抗ホスホチロシン抗体により決定し、続いて化学発光試薬で検出を行なう。その後、Ｒｏｒ２リン酸化レベルを増強する分子のための２価のカチオンおよびＡＴＰの存在下でスクリーニングする。これは、一般に細胞ベースのスクリーンに比べてより頑強でセットアップが容易な無細胞ＨＴＳであるが、「偽陽性」すなわち無傷の細胞内で働かない化合物を生成する可能性がある。代替的には、ＨＴＳをセットアップするのにその他の細胞ベースならびに非細胞ベースのアプローチを使用することができる。これらには、ＴＣＦプロモータ−ルシフェラーゼレポータ検定においてＷｎｔ−３によるシグナル化を分断するＲｏｒ２の能力に拮抗するそれらの潜在性について化合物をスクリーニングすることが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０３４０】
実施例１６
Ｒｏｒ２キナーゼ活性に影響を及ぼす組成物の検証
ＨＴＳ中でＲｏｒ２キナーゼ活性を修飾した化合物を次に付加的なインビトロ検定へと移す。第１のベンチトップ確認検定には、哺乳動物細胞系列中のＲｏｒ２の過剰発現および候補化合物での処置とそれに続く抗ホスホチロシン抗体でのウエスタン免疫ブロット法が含まれる。この検定は、同様に、Ｒｏｒ２キナーゼ活性を調節するための確認済みの化合物の効力および効能を決定するためにも使用される。これらの化合物のヒト骨芽細胞の死を遮断するまたはＲｏｒ２に依存した形または独立した形での骨芽細胞分化を促進する能力を測定し、これらの効果のためのこれらの化合物の効力および効能を決定するように、付加的な検定が設計されている。これらの化合物の細胞選択性（例えばＨｅＬａまたはその他のＲｏｒ２−発現細胞系列を用いることによる）ならびにＲｏｒ２対もう１つのファミリー成員Ｒｏｒ１に対するこれらの化合物の特異性を決定するためにも、付加的な検定が用いられる。同様に、これらの化合物が、アポトーシス（例えばカスパーゼ活性）、分化（例えばアルカリホスファターゼ活性またはオステオカルシン発現）またはＷｎｔ活性（例えば、β−カテニンレベルＴＣＦ−ルシフェラーゼ検定を介した機能）に関与する下流側シグナル化事象を調節するか否かを決定するためにも、付加的な検定が利用される。最後に、これらのインビトロ検定において適切な活性を示した化合物を、骨形成、骨減少症または骨粗鬆症についてのさまざまな動物モデル（例えば卵巣切除を受けたラットまたはマウス）において使用することができる。骨芽細胞／骨細胞アポトーシスを阻害したまたは骨芽細胞分化を促進した化合物は、これらの細胞を延命しかくして合成されミネラル化される骨マトリクスの量を増大させるかつ／または骨の無欠性を維持することによる骨同化作用物質であると考えられるだろう。
【０３４１】
実施例１７
Ｒｏｒ２レギュレータを同定するためのハイスループットスクリーニング
小分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）のためのベースとしてＲｏｒ２リン酸化を利用する。Ｒｏｒ２の活性化体または阻害物質のいずれを探究すべきかは、インビトロ標的検証の発見事実により決定され、受容体アゴニストがスクリーニングされる。受容体チロシンキナーゼの一般的活性化メカニズムは、受容体オリゴマ化および自己リン酸化を通してのものと考えられ（参考資料、フォレスター、Ｗ．Ｃ．、細胞および分子の生命科学、５９、８３−９６、（２００２）、および同書中の参考文献を参照のこと）、従って、受容体のリン酸化を調節する分子がその活性を調節するものと予想できる。ＣＯＯＨ−末端ＧＳＴタグを含むヒトＲｏｒ２のための発現プラスミドを生成し、細菌細胞内のタンパク質を産生させ、グルタチオン−コーティングされた多重ウェル平板に結合させる。未結合のタンパク質を洗い流した後、チロシン上のＲｏｒ２リン酸化レベルを、例えば抗ホスホチロシン抗体により決定し、続いて化学発光試薬で検出を行なう。その後、Ｒｏｒ２リン酸化レベルを増強する分子のための２価のカチオンおよびＡＴＰの存在下で化合物ライブラリをスクリーニングする。これは、一般に細胞ベースのスクリーンに比べてより頑強でセットアップが容易な無細胞ＨＴＳであるが、「偽陽性」すなわち無傷の細胞内で働かない化合物を生成する可能性がある。代替的には、ＨＴＳをセットアップするのにその他の細胞ベースならびに非細胞ベースのアプローチを使用することができる。これらには、ＴＣＦプロモータ−ルシフェラーゼレポータ検定においてＷｎｔ−３によるシグナル化を分断するＲｏｒ２の能力に拮抗するそれらの潜在性について化合物をスクリーニングすることが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０３４２】
実施例１８
Ｒｏｒ２キナーゼ活性に影響を及ぼす組成物の検証
ＨＴＳ中でＲｏｒ２キナーゼ活性を修飾した化合物を次に付加的なインビトロ検定へと移す。第１のベンチトップ確認検定には、哺乳動物細胞系列中のＲｏｒ２の過剰発現および候補化合物での処置とそれに続く抗ホスホチロシン抗体でのウエスタン免疫ブロット法が含まれる。この検定は、同様に、Ｒｏｒ２キナーゼ活性を調節するための確認済みの化合物の効力および効能を決定するためにも使用される。これらの化合物のヒト骨芽細胞の死を遮断するまたはＲｏｒ２に依存した形または独立した形での骨芽細胞分化を促進する能力を測定し、これらの効果のためのこれらの化合物の効力および効能を決定するように、付加的な検定が設計されている。これらの化合物の細胞選択性（例えばＨｅＬａまたはその他のＲｏｒ２−発現細胞系列を用いることによる）ならびにＲｏｒ２対もう１つのファミリー成員Ｒｏｒ１に対するこれらの化合物の特異性を決定するためにも、付加的な検定が用いられる。同様に、これらの化合物が、アポトーシス（例えばカスパーゼ活性）、分化（例えばアルカリホスファターゼ活性またはオステオカルシン発現）またはＷｎｔ活性（例えば、β−カテニンレベルおよびＴＣＦ−ルシフェラーゼ検定を介した機能）に関与する下流側シグナル化事象を調節するか否かを決定するためにも、付加的な検定が利用される。最後に、これらのインビトロ検定において適切な活性を示した化合物を、骨形成、骨減少症または骨粗鬆症についてのさまざまな動物モデル（例えば卵巣切除を受けたラットまたはマウス）において使用することができる。骨芽細胞／骨細胞アポトーシスを阻害したまたは骨芽細胞分化を促進した化合物は、これらの細胞を延命しかくして合成されミネラル化される骨マトリクスの量を増大させるかつ／または骨の無欠性を維持することによる骨同化作用物質であると考えられるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０３４３】
【図１】Ｒｏｒキナーゼの発現が、ヒト骨芽細胞分化の後期段階の間に減少することを示している。
【図２】ＳＦＲＰ−１がＲｏｒ２発現を抑圧することを示している。
【図３】Ｒｏｒタンパク質の予測されたドメイン構造を示している。
【図４】Ｒｏｒ１ではなくＲｏｒ２キナーゼの発現が、ヒト骨芽細胞分化の初期の間そしてマウス骨芽細胞分化の後期を通じては増加することを示している。
【図５】Ｕ２ＯＳ細胞中のＲｏｒタンパク質の発現を示している。
【図６】Ｒｏｒ２キナーゼが、Ｗｎｔ−３を阻害するものの、Ｗｎｔ−１活性を増強させることを示している。
【図７】Ｒｏｒ１キナーゼがＷｎｔ−３を阻害するが、Ｗｎｔ−１活性にはまったく影響を及ぼさないことを示している。
【図８】Ｗｎｔ−１の増強およびＷｎｔ−３活性の阻害のの大部分のためにＲｏｒ２チロシンキナーゼ活性が必要とされることを示している。
【図９】Ｗｎｔ−１の増強およびＷｎｔ−３活性の阻害の一部についてＲｏｒ２の細胞質ドメインが必要であることを示している。
【図１０】Ｒｏｒ２およびＲｏｒ２ＫＤは、Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３に結合することを示している。
【図１１】Ｒｏｒ２は、異なるＷｎｔを区別することを示している。
【図１２】Ｗｎｔ−１およびＷｎｔ−３の過剰発現が、Ｒｏｒ２自己リン酸化の程度に全く影響を及ぼさないことを示している。
【図１３】Ｒｏｒ２が、細胞質ゾルβ−カテニンのＷｎｔで媒介された安定化を阻害することを示している。
【図１４】Ｒｏｒ２が両方のＷｎｔを結合させ、それらをＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体から遠くに隔離しかつβ−カテニンを安定化させるその能力を阻害することになる、Ｒｏｒ２活性についての提案されているモデルを示している。
【図１５】Ｕ２ＯＳ細胞内のＲｏｒ２結合パートナの同定を示している。
【図１６】Ｒｏｒ２がＮｏｔｃｈ２の細胞間ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ｌＣ）に結合することを示している。
【図１７】Ｒｏｒ２およびＲｏｒ１を安定した形で過剰発現する細胞系列の生成を確認している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年12月16日(2005.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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