(57)【要約】本発明は、（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンを、ロードコッカス・エリスロポレス（Rhodococcus erythropolis）NCIMB 11540 の存在下の酵素的加水分解により、それぞれ（Ｒ）−又は（Ｓ）−α−ヒドロキシカルボン酸に変換することを特徴とする、結晶性のキラルα−ヒドロキシカルボン酸の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キラルα−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法であって、（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンを、ロードコッカス・エリスロポレス（Rhodococcus erythropolis）NCIMB 11540 の存在下で酵素的加水分解を行うことにより、共役の（Ｒ）−又は（Ｓ）−α−ヒドロキシカルボン酸に変換することを含む方法。
【請求項２】
対応する脂肪族、芳香族又は複素芳香族のアルデヒド又はケトンへの、シアニド基の酵素的な、又は化学的に触媒された付加によって得られる（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンを出発物質として用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式：
【化１】
2006525795.tif 000008
［式中、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、Ｈ、反応条件下で不活性である置換基によって一置換又は多置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルラジカル若しくはＣ１−Ｃ６アルケニルラジカル、又は、反応条件下で不活性である置換基によって一置換又は多置換されていてもよいフェニルラジカルである。但し、Ｒ１及びＲ２が共にＨであることはない。］
の（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物ロードコッカス・エリスロポレス（Rhodococcus erythropolis）NCIMB 11540 を、粉砕細胞、粗酵素若しくは精製酵素、組換え酵素、固定化細胞若しくは固定化酵素、凍結乾燥細胞、又は「休止細胞」の形態で用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
微生物ロードコッカス・エリスロポレス（Rhodococcus erythropolis）NCIMB 11540 を水性溶媒に懸濁し、得られた懸濁物を、共溶媒としての可溶化剤の存在下、対応するキラルシアノヒドリンと混合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
可溶化剤として、有機溶媒、界面活性剤又は相間移動触媒を用いることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒として、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｃ１−Ｃ６アルコール、ＴＭＢＥ又はそれらの混合物を用いることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
共溶媒の割合が、反応溶液の全体積を基準として、０．５〜２０体積％の範囲内にあることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
反応混合物のｐＨが４．５〜１１の範囲内にあることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
加水分解を１０〜６０℃の範囲内の温度で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
組換え酵素として、適当な宿主細胞における pMS470 プラスミド系の発現によって得られる酵素を用いることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸は、例えば、食品添加物として、又は、医薬用活性化合物、ビタミン及び液晶の製造において用いられる。
【０００２】
これらの光学活性α−ヒドロキシカルボン酸はまた、有利なことに、例えば Effenberger 他，Angew. Chem.，95(1983)，No.1，50頁に従って、他の方法では調製が極めて困難なＮ−置換光学活性α−アミノ酸に変換することができる。
【０００３】
キラルα−ヒドロキシカルボン酸は、今日では、化学的に、又は発酵によって、又は酵素的に得ることができる。
【０００４】
従って、文献には、キラルα−ヒドロキシカルボン酸を合成する多くの種々の方法が開示されている。
【０００５】
例えば、適当な微生物の添加により、シアノヒドリンのラセミ体を加水分解して、所望のキラルα−ヒドロキシカルボン酸を得ることができる。
【０００６】
アルカリゲネス（Alcaligenes）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ロードコッカス（Rhodococcus）属、カンジダ（Candida）属等の種々の微生物を用いる、シアノヒドリンのラセミ体からのキラルα−ヒドロキシカルボン酸の製造、特に光学活性な乳酸又はマンデル酸の製造が、例えば、欧州特許第０４４９６８４号明細書、欧州特許第０５２７５５３号明細書、欧州特許第０６１００４８号明細書等に記載されている。
【０００７】
このような従来技術からは、ラセミ体のシアノヒドリンをニトリラーゼの存在下で共役α−ヒドロキシカルボン酸に酵素的に加水分解するとき、酵素が短時間のうちに失活し、その結果、所望のα−ヒドロキシカルボン酸が、通常、低い収率及び濃度でしか得られないという問題が生じていることも分かる。このことは、シアノヒドリンを共役のα−ヒドロキシアミドに変換するニトリルヒドラターゼの使用にも当てはまる。このヒドロキシアミドは、共役のα−ヒドロキシカルボン酸に更に変換することができる。
【０００８】
例えば Angew. Chem.，1994，106，1615頁以降からは、光学活性シアノヒドリンを、ラセミ化を行わずに濃塩酸で加水分解して、共役のキラルα−ヒドロキシカルボン酸を得ることができることも分かる。そのようにして製造されたキラルα−ヒドロキシカルボン酸の光学純度は、用いたキラルシアノヒドリンの光学純度に一致する。このことは、用いるキラルシアノヒドリンを、シアニド基を共役のアルデヒド又はケトンに酵素触媒で付加することにより in situ で得、単離又は精製を行わずに更に処理する場合にも当てはまる。
【０００９】
この反応の欠点は、反応性の高い基質が分解し、腐食を引き起こすことである。
【００１０】
本発明は、キラルシアノヒドリンと同程度の極性を有するニトリルを、穏和かつ効率的な方法を用いて、シアノヒドリンとほぼ同じエナンチオマー純度を有する共役のキラルヒドロキシカルボン酸に変換することができる方法を見出すことを目的としていた。
【００１１】
意外なことに、この目的は、ロードコッカス属に属する特殊な細菌を用いることによって達成された。
【００１２】
すなわち、本発明は、キラルα−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法であって、（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンを、ロードコッカス・エリスロポレス（Rhodococcus erythropolis）NCIMB 11540 の存在下で酵素的加水分解を行うことにより、共役の（Ｒ）−又は（Ｓ）−α−ヒドロキシカルボン酸に変換することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明の方法において、（Ｒ）−及び（Ｓ）−シアノヒドリンは、光学純度が＞９９％ｅｅまでの（Ｒ）−及び（Ｓ）−α−ヒドロキシカルボン酸に変換される。
【００１４】
対応するアルデヒド又はケトンへの、シアニド基の酵素的な、又は化学的に触媒された付加によって得られる（Ｒ）−及び（Ｓ）−シアノヒドリンは、出発化合物となる。
【００１５】
対応するアルデヒド又はケトンへの、シアニド基の酵素的な、又は化学的に触媒された付加は、従来技術に準じて、例えば、欧州特許第０９５１５６１号明細書、欧州特許第０９２７７６６号明細書、欧州特許第０６３２１３０号明細書、欧州特許第０５４７６５５号明細書、欧州特許第０３２６０６３号明細書等の方法に準じて行うことができる。
【００１６】
好適な出発化合物は、従来技術において挙げられているアルデヒド又はケトンである。
【００１７】
好適なアルデヒドの例としては、脂肪族、芳香族又は複素芳香族アルデヒドがある。脂肪族アルデヒドとは、飽和又は不飽和の脂肪族の直鎖、分枝鎖又は環状アルデヒドを意味するものとする。好ましい脂肪族アルデヒドは、特に２個〜１８個、特に好ましくは２個〜１２個の炭素原子を有する、飽和又はモノ不飽和若しくはポリ不飽和の直鎖アルデヒドである。アルデヒドは、Ｃ−Ｃ二重結合を有しても、Ｃ−Ｃ三重結合を有してもよい。アルデヒドは、置換されていなくても、また、反応条件下で不活性である基によって一置換又は多置換されていてもよい。例えば、置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基（例えば、フェニル基又はインドリル基）、或いは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基（これは、Ｏ、Ｓ、Ｐ又はＮの群より選ばれる１つ又は複数のヘテロ原子を有してもよい）、ハロゲン基、エーテル基、アルコール基、アシル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、ニトロ基又はアジド基によって一置換又は多置換されていてもよい。
【００１８】
芳香族又は複素芳香族アルデヒドの例としては、ベンズアルデヒド、又は種々の置換基で置換されたベンズアルデヒド（例えば、２−クロロベンズアルデヒド、３，４−ジフルオロベンズアルデヒド、４−メチルベンズアルデヒド、３−フェノキシベンズアルデヒド、４−フルオロ−３−フェノキシベンズアルデヒド）があり、更に、フルフラール、アントラセン−９−カルボアルデヒド、フラン−３−カルボアルデヒド、インドール−３−カルボアルデヒド、ナフタレン−１−カルボアルデヒド、フタルジアルデヒド、ピラゾール−３−カルボアルデヒド、ピロール−２−カルボアルデヒド、チオフェン−２−カルボアルデヒド、イソフタルアルデヒド、ピリジンアルデヒド等がある。
【００１９】
ケトンの例としては、カルボニル炭素原子が不均等に置換されている脂肪族、芳香族又は複素芳香族ケトンがある。脂肪族ケトンとは、直鎖、分枝鎖又は環状ケトンを意味するものとする。ケトンは、飽和であっても、モノ不飽和又はポリ不飽和であってもよい。ケトンは、置換されていなくても、また、反応条件下で不活性である基によって一置換又は多置換されていてもよい。例えば、置換されていてもよいアリール基又はヘテロアリール基（例えば、フェニル基又はインドリル基）、或いは、ハロゲン基、エーテル基、アルコール基、アシル基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、ニトロ基又はアジド基によって一置換又は多置換されていてもよい。
【００２０】
芳香族ケトン又は複素芳香族ケトンの例としては、アセトフェノン、インドリルアセトン等がある。
【００２１】
好ましいのは、式：
【化１】
2006525795.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は相互に独立して、Ｈ、反応条件下で不活性である置換基によって一置換又は多置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルラジカル若しくはＣ１−Ｃ６アルケニルラジカル、又は、反応条件下で不活性である置換基によって一置換又は多置換されていてもよいフェニルラジカルである。但し、Ｒ１及びＲ２が共にＨであることはない。］
の（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンである。
【００２２】
反応条件下で不活性である置換基として好ましいのは、例えば、ハロゲン（例えば、フッ素、臭素及び塩素）、Ｃ１−Ｃ６アルキル若しくはＣ１−Ｃ６アルコキシ、エーテル、エステル、アセタール、又は置換されていてもよいフェニル若しくはフェニルオキシである。
【００２３】
本発明の方法における適当な化合物は、特に好ましくは、（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンであり、例えば、（Ｒ）−又は（Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−２−クロロマンデロニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−マンデロニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−４−メチルマンデロニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−３−フェノキシマンデロニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−メチルヘプタンニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルプロピオニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−ペンテンニトリル、（Ｒ）−又は（Ｓ）−１−ヒドロキシシクロヘキサンニトリル、及び（Ｒ）−又は（Ｓ）−アセトフェノンシアノヒドリンである。
【００２４】
次いで、対応する（Ｒ）−又は（Ｓ）−シアノヒドリンを、本発明に従って酵素的に加水分解する。
【００２５】
酵素的加水分解は、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 の存在下、本発明に従って行う。
【００２６】
ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 は、意外なことに、上記のシアノヒドリンと同様の極性を有するニトリルのニトリル官能基を加水分解することができる、利用可能なニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ酵素系を有することを特徴とする微生物であった。
【００２７】
ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 のニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ酵素系を用いると、最初のステップにおいて、キラルシアノヒドリンが、ニトリルヒドラターゼにより共役のキラルヒドロキシアミドに加水分解され、次の加水分解ステップにおいて、キラルヒドロキシアミドが、アミダーゼにより、対応するキラルα−ヒドロキシカルボン酸に変換される。
【００２８】
微生物は、本発明の方法では、任意の所望の形態で、例えば、粉砕細胞、粗酵素若しくは精製酵素、組換え酵素、固定化細胞若しくは固定化酵素、凍結乾燥細胞、又は「休止細胞」の形態で用いることができる。
【００２９】
組換え酵素、休止細胞又は凍結乾燥細胞を用いるのが好ましく、組換え酵素又は休止細胞を用いるのが特に好ましい。
【００３０】
ニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性を有する、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 細胞の調製物を直接用いる代わりに、適当な微生物（例えば、大腸菌（E. coli）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、K. Lactis 等）において発現させた組換え調製物を用いるのもよい。対応する遺伝子は、プラスミド構築物を用いて、適当な宿主細胞に、例えば、大腸菌、ピキア・パストリス、サッカロマイセス、アスペルギルス又は K. Lactis の宿主細胞に導入する。誘導可能なプロモーターを選ぶことによって、ニトリルヒドラターゼだけでなく、アミダーゼも、活性な形態で過剰発現させることができる。アミダーゼの場合、ロードコッカス細胞の対応する発酵の場合よりもはるかに高い活性レベルを達成することができる。
【００３１】
次いで、微生物を、所望の形態で水性溶媒（例えば、水又は緩衝溶液）に懸濁する。好適な緩衝溶液は、例えば、リン酸緩衝液（例えば、Ｋ／Ｎａリン酸緩衝液）、ＰＢＳ緩衝液、酪酸緩衝液、クエン酸塩溶液等である。
【００３２】
用いる緩衝溶液のｐＨは、４．５〜１１、好ましくは５．５〜８．５の範囲内にあるのがよい。
【００３３】
次いで、得られた懸濁物を、対応するキラルシアノヒドリンと混合する。キラルシアノヒドリンは、限定された水溶性を有する脂溶性化合物であるので、シアノヒドリンを水性溶媒に溶解させるためには、共溶媒として可溶化剤を用いる必要がある。
【００３４】
適当な可溶化剤は、例えば、有機溶媒、界面活性剤、相間移動触媒等である。
【００３５】
本発明の方法における共溶媒として適当な有機溶媒は、第１に、基質を十分に溶解することができ、第２に、酵素活性に対する悪影響が可能な限り小さいものである。
【００３６】
このような有機溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｃ１−Ｃ６アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、tert−ブタノール又は１−ペンタノール）、トルエン又はtert−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、或いはそれらの混合物がある。
【００３７】
用いる共溶媒としては、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、エタノール、イソプロパノール又はそれらの混合物が好ましく、ＤＭＳＯ又はＤＭＦが特に好ましい。
【００３８】
共溶媒の割合は、反応溶液の全体積を基準として、０．５〜２０体積％の範囲内にあるのがよい。
【００３９】
共溶媒の割合は、好ましくは１〜１５体積％、特に好ましくは２〜１０体積％である。
【００４０】
本発明の方法における反応液中の基質濃度は、（反応溶液の全体積を基準として、）１〜１００ｇ／ｌの範囲内にあるのがよい。十分に高い基質濃度が許容されることは、本発明の酵素的加水分解を実験規模で用いるための基本的前提条件である。
【００４１】
基質濃度としては、５０ｇ／ｌ以下が好ましく、２５ｇ／ｌ以下が特に好ましい。
【００４２】
反応可能な基質濃度は、用いる酵素量に依存する。効率的な定量的反応のためには、最初の加水分解ステップを極めて迅速に行って、シアノヒドリンの分解及びこれに伴うラセミ化を避けなければならず、そのため、比較的大きい細胞密度が必要となる。
【００４３】
この場合、反応系の十分な混合を確実に行うことに留意する必要がある。
【００４４】
細胞量又は酵素量は、用いる形態における微生物の活性に依存し、更に、基質濃度及び共溶媒にも依存する。
【００４５】
反応混合物のｐＨは、４．５〜１１、好ましくは５．５〜８の範囲内にあるのがよい。
【００４６】
また、必要に応じて、適当な酸又は酸性塩（例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸等）を反応混合物に加えて、ｐＨを調節することができる。
【００４７】
本発明の酵素的加水分解は、１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、特に好ましくは２０〜４５℃の範囲内の温度で行う。
【００４８】
加水分解を行って、所望のキラルα−ヒドロキシカルボン酸を得た後、キラルα−ヒドロキシカルボン酸は、既知の技術によって、例えば、細胞の遠心分離、又はＨＣｌ（例えば、ｐＨ２）による酸性化後の生成物の抽出によって、また、必要に応じて更に、活性炭濾過及び再結晶による精製を行うことによって、反応混合物から単離される。
【００４９】
従って、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 を本発明に従って用いれば、極性のニトリル（例えば、キラルシアノヒドリン）が、穏和な条件下で簡便かつ効率的に、ラセミ化が生じることなく、共役のキラルα−ヒドロキシカルボン酸に変換される。所望のα−ヒドロキシカルボン酸が、用いたシアノヒドリンのｅｅ値に応じて、９９％超までの高い光学純度で、かつ９８％超までの高い収率で得られる。
【００５０】
（実施例１：生体触媒の製造）
ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 のバイオマスを製造するために、複合的な標準培地（培地Ａ、表１参照）を用いた。菌株を、培地Ａを用いた寒天プレート上に保持した（１５ｇ／ｌの寒天を用いた固化）。プレートを、パラフィルムで側面から包むことによって密封し、冷蔵庫に４℃で保存した。
【００５１】
液体培養物の増殖を、２５０ｍｌの培地Ａを用いて、シケイン（chicane）付きの１０００ｍｌ三角フラスコ内で、３０℃及び１３０ｒｐｍで行った。
【００５２】
変形例Ｉ（前培養なし）：  寒天プレートのバイオマスの約半分を、５ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁した。細胞懸濁物を２５０ｍｌの培地に加えた。
【００５３】
変形例ＩＩ（前培養あり）：  前培養のために、寒天プレートのバイオマスの一部を５ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁した。細胞懸濁物を１００ｍｌの培地に加えた（＝前培養）。２０〜２４時間の増殖後、この前培養物の５ｍｌを２５０ｍｌの培地に加えた。
【００５４】
細胞を、０〜４℃で、３０分間、約３０００ｒｐｍの遠心分離によって集めた。細胞をＫ／Ｎａリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）で１回洗浄した。次いで、細胞を新しい緩衝液に再懸濁し、急速冷凍後に凍結乾燥し（凍結乾燥細胞を用いる反応、実施例２）、或いは、この細胞懸濁物（培養体積の約６〜８％）を生体触媒反応にそのまま用いた（休止細胞を用いる反応、実施例３）。
【００５５】
【表１】
2006525795.tif 000003
【００５６】
（実施例２：分析スケールで凍結乾燥細胞を用いる反応）
３１．６ｍｇ、５２．６ｍｇ及び１０５．２ｍｇの凍結乾燥細胞を、１３０ｒｐｍ、２０〜２５℃で約１時間、１０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）中で再水和した。この細胞懸濁物の４７５μｌ分を１．５ｍｌエッペンドルフ反応容器に移し、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリルの約２００ｍＭ基質ＤＭＳＯ溶液２５μｌと混合した（細胞３ｍｇ、５ｍｇ及び１０ｍｇ／ｍｌ；基質濃度約１０ｍＭ；５％ＤＭＳＯ）。反応を、Thermomixer 内で３０℃及び１０００ｒｐｍで行った。０分、２分、４分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分、６０分及び１２０分後の各時点で、１個のエッペンドルフ反応容器を０．５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌと混合した。遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ）及び対応する希釈の後、シアノヒドリン、ヒドロキシアミド及びヒドロキシ酸の濃度をＨＰＬＣによって測定した。
【００５７】
【表２】
2006525795.tif 000004
【００５８】
（実施例３：休止細胞及び凍結乾燥細胞を用いる酵素的加水分解）
生体触媒を、実施例１、変形例Ｉと同様にして作製した（培養フラスコ２つ）。２０時間後（ＯＤ546＝３．５及び１．８）、細胞を、発酵液の１０ｍｌ分×４から遠心分離し、Ｋ／Ｎａ−ＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）で１回洗浄した。細胞サンプルのうちの２つを活性測定前に凍結乾燥し、残りの２つを休止細胞として用いた。
【００５９】
細胞を１．８ｍｌのＫ／Ｎａ−ＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）に再懸濁した（凍結乾燥細胞を再水和のために１時間振盪した）。２００ｍＭ基質ＤＭＳＯ溶液２００μｌを加える（基質濃度約２０ｍＭ）ことによって反応を開始させ、振盪キャビネット内で３０℃及び１３０ｒｐｍで反応を行った。３０分、６０分及び１７時間後、２００μｌを抜き取り、２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合した。遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ）及び希釈の後、変換率をＨＰＬＣによって測定した。ここでは、基質及び２つの生成物のみを考慮した。基質としては、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）を用いた。結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
2006525795.tif 000005
【００６１】
（実施例４：異なる基質濃度を用いる酵素的加水分解）
実験４.１：
実験４.１では、反応を、３種の基質濃度（２．２ｇ／ｌ、６．６ｇ／ｌ、１３．２ｇ／ｌ）を用いて、分析スケール（反応体積 １ｍｌ）で行った。
【００６２】
生体触媒を実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地２ｌ）、２０時間後（ＯＤ546 ６．１）に集めた。発酵溶液１０ｍｌ分×８から得られる細胞を培養チューブ中で遠心分離した。得られた細胞集団を各々、２ｍｌのＫ／Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．８、５０ｍＭ）で１回洗浄した。
【００６３】
２個のチューブの内容物を、乾燥重量を測定するために凍結乾燥した。
重量：  １．  凍結乾燥細胞３７ｍｇ／発酵溶液１０ｍｌ  ２．  ３０ｍｇ
（この量は、下記の反応における１ｍｌ当たりの細胞の使用量にほぼ相当する。）
【００６４】
残りの６個のチューブの内容物を９５０μｌの緩衝液に再懸濁し（ＯＤ 約４０）、エッペンドルフ容器に移した。これらの細胞懸濁物の各々に、種々の濃度の基質溶液５０μｌを加えた（３種の濃度、並列バッチ、共溶媒として５％ＤＭＳＯ）。エッペンドルフ容器を、Thermomixer 上で３０℃及び１０００ｒｐｍで振盪した。変換率をモニターするために、各々の場合に、２００μｌを抜き取り、２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合した。遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ）及び希釈の後、変換率をＨＰＬＣによって測定した。
【００６５】
下記の濃度の（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルを用いた。
ａ．  基質溶液：ＤＭＳＯ２５０μｌ中に（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル１１ｍｇ（約２６０ｍＭ）  バッチ内の基質濃度：２．２ｇ／ｌ（１３．１ｍＭ）
ｂ．  基質溶液：ＤＭＳＯ２５０μｌ中に（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル３３ｍｇ（約２９０ｍＭ）  バッチ内の基質濃度：６．６ｇ／ｌ（３９．４ｍＭ）
ｃ．  基質溶液：ＤＭＳＯ２５０μｌ中に（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル６６ｍｇ（約１５８０ｍＭ）  バッチ内の基質濃度：１３．２ｇ／ｌ（７８．８ｍＭ）
【００６６】
表４.１では、バッチａ〜ｃが、２−クロロマンデル酸の形成（％）に関して比較されている。すべてのバッチにおいて、ヒドロキシ酸が定量的に形成された。比較的高い基質濃度も、問題なく許容されることが分かった。
【００６７】
【表４】
2006525795.tif 000006
【００６８】
実験４.２：
実験４.２では、反応を、２種の異なる基質濃度（１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ）を用いて、５ｍｌスケールで行った。
【００６９】
生体触媒を実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地２ｌ）、１９時間後（ＯＤ546 ８．４）に集めた。細胞を約１４０ｍｌの緩衝液に再懸濁した（休止細胞、ＯＤ546 ５２）。各々の場合に、この細胞懸濁物の４．７５ｍｌを酵素反応に用いた。
【００７０】
２種の異なる濃度の（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルを並列バッチ内で調べた。２５０μｌの基質溶液を加えることによって反応を開始させ、振盪キャビネット内の培養チューブ中で３０℃及び１３０ｒｐｍで行った。変換率をモニターするために、各々の場合に、２００μｌを抜き取り、２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合した。遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ）及び希釈の後、変換率をＨＰＬＣによって測定した。
【００７１】
ａ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル５０ｍｇ、ＤＭＳＯ２５０μｌに溶解（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ、共溶媒：５％ＤＭＳＯ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してヒドロキシアミドを形成し、２時間後には、約４０％のヒドロキシ酸が形成された。２０時間後、反応は定量的であった。
【００７２】
ｂ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル１００ｍｇ、ＤＭＳＯ２５０μｌに溶解（［Ｓ］＝１２０ｍＭ、２０ｇ／ｌ、共溶媒：５％ＤＭＳＯ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、１８時間後には、３６％のヒドロキシ酸が形成された。４３時間後には、４１％のヒドロキシ酸が形成され、その後は、更なる反応が起こらなかった。
【００７３】
実験４.３：
実験４.３では、反応を、１０ｇ／ｌ及び１５ｇ／ｌの（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルを用いて行った。更に、変換完了後、形成されたヒドロキシ酸のｅｅを測定した。
【００７４】
生体触媒を実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地２．７５ｌ）、２０時間後に集めた。細胞を約２００ｍｌの緩衝液に再懸濁した（休止細胞、ＯＤ546 ４４）。各々の場合に、この細胞懸濁物の４．８５ｍｌを酵素反応に用いた。
【００７５】
２種の異なる濃度の（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルを並列バッチ内で調べた。１５０μｌの基質溶液を加えることによって反応を開始させ、振盪キャビネット内の培養チューブ中で４０℃及び１５０ｒｐｍで行った。変換率をＨＰＬＣによってモニターした。変換完了時に、ヒドロキシ酸を酸性化して抽出し、ｅｅを測定した。
【００７６】
ａ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル５０ｍｇ、ＤＭＳＯ１５０μｌに溶解（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ、共溶媒：３％ＤＭＳＯ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、８０％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、ヒドロキシ酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＞９９％）。
【００７７】
ｂ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル７５ｍｇ、ＤＭＳＯ１５０μｌに溶解（［Ｓ］＝９０ｍＭ、１５ｇ／ｌ、共溶媒：３％ＤＭＳＯ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、約６０％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、ヒドロキシ酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＝９９％）。
【００７８】
（実施例５：異なる共溶媒を用いる酵素的加水分解）
実験５.１：
５０ｍｌスケールの反応において、ＤＭＳＯを、共溶媒としてＥｔＯＨと比較した。５％の共溶媒を用いたが、基質濃度は（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル４ｇ／ｌにすぎなかった。
【００７９】
発酵培地２５０ｍｌ分×８（−８０ｍｌ、実験４.１参照）（ＯＤ 約６．１）からのバイオマスを２０時間後に集めた。細胞を１００ｍｌのＫ／Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）に懸濁した。この細胞懸濁物（ＯＤ ６０）を酵素反応に用いた。ＤＭＳＯ又はＥｔＯＨに溶解した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの反応を、１００ｍｌ磨りガラス連結三角フラスコ内で１５０ｒｐｍ及び３０℃で行った。変換率をＨＰＬＣによってモニターするために、各々の場合に、測定前に、２００μｌのサンプルを２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合し、遠心分離し（５分、１３０００ｒｐｍ）、希釈した。変換完了後、生成物のｅｅを測定した。
【００８０】
ａ．  細胞懸濁物５０ｍｇを、ＤＭＳＯ２３００μｌ及び０．１％Ｈ３ＰＯ４２００μｌに溶解した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（＞９９％）２００ｍｇと混合した。
基質濃度：４ｇ／ｌ（２４ｍＭ）、共溶媒として５％ＤＭＳＯ
（Ｒ）−（２）−クロロマンデル酸の生成物ｅｅ：９７％
【００８１】
ｂ．  細胞懸濁物５０ｍｇを、ＥｔＯＨ２３００μｌ及び０．１％Ｈ３ＰＯ４２００μｌに溶解した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（＞９９％）２００ｍｇと混合した。
基質濃度：４ｇ／ｌ（２４ｍＭ）、共溶媒として５％ＥｔＯＨ
（Ｒ）−（２）−クロロマンデル酸の生成物ｅｅ：＞９９％
【００８２】
実験５.２：
ここでは、溶媒ＤＭＳＯ、ＥｔＯＨ及びｉＰｒＯＨを５％の割合で再び用いた。基質濃度は（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル１０ｇ／ｌであった。反応を５ｍｌスケールで行った。
【００８３】
生体触媒を、実施例４、実験４.２に従って作製した（ＯＤ546 ８．４）。各々の場合に、４．７５ｍｌの細胞懸濁物（休止細胞、ＯＤ546 ５２）を酵素反応に用いた。ＤＭＳＯ、ＥｔＯＨ及びｉ−ＰｒＯＨに溶解した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（＞９９％）の反応を、培養チューブ中で１５０ｒｐｍ及び３０℃で行った（並列バッチ）。
【００８４】
変換率をＨＰＬＣによってモニターするために、各々の場合に、測定前に、２００μｌのサンプルを２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合し、遠心分離し（５分、１３０００ｒｐｍ）、希釈した。変換完了後、生成物のｅｅを測定した。
【００８５】
ａ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル５０ｍｇ、ＤＭＳＯ２５０μｌに溶解（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ、共溶媒：５％ＤＭＳＯ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してヒドロキシアミドを形成し、２時間後には、約４０％のヒドロキシ酸が形成された。２０時間後、反応は定量的であった（生成物ｅｅ＝９５％）。
【００８６】
ｂ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル５０ｍｇ、ＥｔＯＨ２５０μｌに溶解（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ、共溶媒：５％ＥｔＯＨ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、３時間後には、３５％のヒドロキシ酸が形成された。１９時間後には、ヒドロキシ酸を形成する加水分解は９４％完了し、２８時間後には、反応は事実上完了した（生成物ｅｅ＝９７％）。
【００８７】
ｃ．  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル５０ｍｇ、ｉ−ＰｒＯＨ２５０μｌに溶解（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ、共溶媒：５％ｉ−ＰｒＯＨ）
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、３時間後には、８％のヒドロキシ酸が形成された。４４時間後には、６４％のヒドロキシ酸が形成された（生成物ｅｅ＝９２．３）。
【００８８】
（実施例６：異なる温度における酵素反応）
実験６.１：
実験６.１では、反応の経過を、３０℃、３５℃及び４０℃の反応温度で比較した。バッチ反応を、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル１０ｇ／ｌの基質濃度を用いて、５ｍｌスケールで行った。反応完了後、生成物のｅｅを測定した。
【００８９】
生体触媒を、実施例４、実験４.２に従って作製した（ＯＤ546 ８．４）。各々の場合に、４．７５ｍｌの細胞懸濁物（休止細胞、ＯＤ546 ５２）を酵素反応に用いた。ＤＭＳＯ２５０μｌに溶解した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（＞９９％）５０ｍｇ（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ）の反応を、培養チューブ中、１５０ｒｐｍで３種の異なる温度（３０℃、３５℃、４０℃）で行った（並列バッチ）。
【００９０】
変換率をＨＰＬＣによってモニターするために、各々の場合に、測定前に、２００μｌのサンプルを２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合し、遠心分離し（５分、１３０００ｒｐｍ）、希釈した。反応完了後、生成物のｅｅを測定した。
【００９１】
ａ．  Ｔ＝３０℃
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、４２％のヒドロキシ酸が形成され、約２０時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＝９５％）。
【００９２】
ｂ．  Ｔ＝３５℃
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、６５％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＝９６．５％）。
【００９３】
ｃ．  Ｔ＝４０℃
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、８６％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＝９７．９％）。
【００９４】
実験６.２：
実験６.２では、温度を５０℃に上げた。
【００９５】
生体触媒を、実施例４、実験４.３に従って作製した（ＯＤ546 ４４）。各々の場合に、４．８５ｍｌの細胞懸濁物（休止細胞、ＯＤ546 ４４）を酵素反応に用いた。ＤＭＳＯ（３％）１５０μｌに溶解した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（＞９９％）５０ｍｇ（［Ｓ］＝６０ｍＭ、１０ｇ／ｌ）の反応を、培養チューブ中、１５０ｒｐｍで３種の異なる温度（３０℃、４０℃、５０℃）で行った（並列バッチ）。
【００９６】
変換率をＨＰＬＣによってモニターするために、各々の場合に、測定前に、２００μｌのサンプルを２００μｌの１Ｎ ＨＣｌと混合し、遠心分離し（５分、１３０００ｒｐｍ）、希釈した。反応完了後、生成物のｅｅを測定した。
【００９７】
ａ．  Ｔ＝３０℃
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、４２％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、ヒドロキシ酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＞９９％）。
【００９８】
ｂ．  Ｔ＝４０℃
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、８０％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、ヒドロキシ酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＞９９％）。
【００９９】
ｃ．  Ｔ＝５０℃
早くも３０分後には、シアノヒドリンのすべてが反応してアミドを形成し、２時間後には、９２％のヒドロキシ酸が形成され、１９時間後には、ヒドロキシ酸を形成する加水分解は完了した（生成物ｅｅ＞９９％）。
【０１００】
（実施例７：セミ分取スケールで行う、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 の存在下のアルデヒドのシアノヒドリンの反応）
すべての反応について、Ｋ／Ｎａ−リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）を用いた。反応をＨＰＬＣで追った。サンプル採取後、生体触媒反応を停止させるために、サンプル容量分を１Ｎ ＨＣｌと混合した（並列サンプル）。遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ）後、サンプルをＨＰＬＣ溶離液で希釈した。
【０１０１】
精密な分析のために、バイオマスを、４℃及び３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、蒸留Ｈ２Ｏで１回洗浄した。上清を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した後、ＴＢＭＥで３〜４回抽出した。
【０１０２】
実験７.１：
生体触媒を、実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地３ｌ）、２０時間後（ＯＤ546 ５．９）に集めた。細胞を緩衝液に再懸濁して、約１８０ｍｌにした（休止細胞、ＯＤ546 ８０）。
【０１０３】
（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）０．６ｇをＤＭＳＯ１．５ｍｌに溶解し、この細胞懸濁物の６０ｍｌと混合した。加水分解を、振盪キャビネット内で３０℃及び１５０ｒｐｍで行った。３０分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、１７時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：０．７３ｇ（１０９％）
生成物ｅｅ：＞９９％
【０１０４】
実験７.２：
実験７.２では、いくつかの反応パラメーターを変えた。標準的な条件は、１０ｇ／ｌの基質、及び共溶媒としてのＤＭＳＯ（ここでは２．５％）であった。別のバッチ反応を、１５ｇ／ｌの基質を用い、更には１０ｇ／ｌの基質、及び共溶媒としてのＤＭＦを用いて行った。
【０１０５】
生体触媒を、実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地３ｌ）、２０時間後（ＯＤ546 ６．８）に集めた。細胞を緩衝液に再懸濁して、約１９０ｍｌの緩衝液を得た（休止細胞、ＯＤ546 ６９）。３種の反応を行った。
【０１０６】
バッチＡ：  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）０．３ｇをＤＭＳＯ７５０μｌに溶解し、この細胞懸濁物の３０ｍｌと混合した。加水分解を、振盪キャビネット内で４０℃及び１５０ｒｐｍで行った。３０分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、５時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：０．３１ｇ（９３％）
生成物ｅｅ：＞９９％
【０１０７】
バッチＢ：  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）０．３ｇをＤＭＦ７５０μｌに溶解し、この細胞懸濁物の３０ｍｌと混合した。加水分解を、振盪キャビネット内で４０℃及び１５０ｒｐｍで行った。３０分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、５時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：０．３０ｇ（９０％）
生成物ｅｅ：９８．５％
【０１０８】
バッチＣ：  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）０．４５ｇをＤＭＳＯ７５０μｌに溶解し、この細胞懸濁物の３０ｍｌと混合した。加水分解を、振盪キャビネット内で４０℃及び１５０ｒｐｍで行った。３０分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、５時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が事実上完了した。
粗収量：０．４５ｇ（９０％）
生成物ｅｅ：＞９９％
【０１０９】
実験７.３：
ここでは、異なる基質濃度を有する２つのバッチ（バッチＡ １０ｇ／ｌ；バッチＢ １５ｇ／ｌ）で反応を行った。両方の反応は実質的に同一の速度で進行し、２時間後には完了した。
【０１１０】
生体触媒を、実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地３ｌ）、２０時間後（ＯＤ546 １．２）に集めた。細胞を約１８０ｍｌの緩衝液に再懸濁した（休止細胞、ＯＤ546 ７０）。２種の反応を行った。
【０１１１】
バッチＡ：  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）０．８ｇをＤＭＳＯ１．６ｍｌに溶解し、細胞懸濁物（８０ｍｌ）に加えた。加水分解を、振盪キャビネット内で５０℃及び１５０ｒｐｍで行った。１５分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、２時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：０．８５ｇ（９５％）
生成物ｅｅ：＞９９％
【０１１２】
バッチＢ：  （Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）１．２ｇをＤＭＳＯ１．６ｍｌに溶解し、細胞懸濁物（８０ｍｌ）に加えた。加水分解を、振盪キャビネット内で５０℃及び１５０ｒｐｍで行った。３０分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、２時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：１．２６ｇ（９４％）
生成物ｅｅ：９８．９％
【０１１３】
実験７.４：
生体触媒を、実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地２．５ｌ）、２０時間後（ＯＤ546 ６．９）に集めた。細胞を約１６０ｍｌの緩衝液に再懸濁した（休止細胞、ＯＤ546 ６３）。
【０１１４】
（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）１．３ｇをＤＭＳＯ２．５ｍｌに溶解し、この細胞懸濁物の１４０ｍｌに加えた。加水分解を、振盪キャビネット内で４０℃及び１５０ｒｐｍで行った。１５分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、３時間後には、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：１．４３ｇ（９８％）
生成物ｅｅ：＞９９％
【０１１５】
実験７.５：
この反応では、１ｇのマンデロニトリルを８ｇ／ｌの基質濃度で加水分解して、対応するヒドロキシ酸を得た。
【０１１６】
生体触媒を、実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地２ｌ）、２０時間後（ＯＤ546 ８．４）に集めた。細胞を約１２０ｍｌの緩衝液に再懸濁した（休止細胞、ＯＤ546 ７４）。生体触媒を超低温冷凍した後、反応を一晩行った。
【０１１７】
（Ｒ）−（＋）−マンデロニトリル１．０ｇをＤＭＳＯ２．４ｍｌに溶解し、細胞懸濁物（１２０ｍｌ）に加えた。加水分解を、振盪キャビネット内で４０℃及び１５０ｒｐｍで行った。１５分後には、シアノヒドリンが完全に加水分解され、５時間後には、（Ｒ）−マンデル酸を生成する反応が完了した。
粗収量：１．１６ｇ（１００％）
生成物ｅｅ：９３％
【０１１８】
（実施例８：セミ分取スケールで行う、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 の存在下のケトンのシアノヒドリンの反応）
Ｋ／Ｎａ−リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）を用いた。反応をＴＬＣで追った。
【０１１９】
精密な分析のために、バイオマスを、４℃及び６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、蒸留Ｈ２Ｏで１回洗浄した。上清を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した後、ＴＢＭＥで３〜４回抽出した。
【０１２０】
生体触媒を、実施例１、変形例ＩＩに従って作製し（発酵培地２ｌ）、２０時間後に集めた。細胞を約６０ｍｌの緩衝液に再懸濁した（休止細胞、ＯＤ546 ６０）。
【０１２１】
（Ｓ）−アセトフェノンシアノヒドリン（アセトフェノン ２５％、ｅｅ ９４％）３００ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶解し、細胞懸濁物に加えた。２０時間後には、反応が完了し（ＴＬＣによる）、生成物（１−フェニルエタノール及び微量の他の不純物を含有）を抽出した。反応は、エナンチオマー純度を喪失することなく進行した。
粗収量：３５７ｍｇ
【０１２２】
（実施例９：大腸菌における組換え発現による、置換シアノヒドリンの加水分解のためのニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの酵素調製物の作製）
ニトリルヒドラターゼを発現させるために、また、アミダーゼを発現させるために、pMS470 プラスミド系を用いた。このプラスミドは、複製されたエレメントに加えて、選択可能なアンピシリン抵抗性を有し、また、誘導性 tac プロモーターによって、クローン化されたオープンリーディングフレームの制御された過剰発現を可能にする Lac リプレッサー遺伝子 lac Ｉを有する。
【０１２３】
ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 のニトリルヒドラターゼのための発現プラスミド：
プラスミドマップが図１に示されている。このプラスミドは、pMS470Nhase7.3 という名称を有する。このプラスミドは、ニトリルヒドラターゼの２つの遺伝子領域（α−及びβ−サブユニット）に加えて、アクチベータータンパク質をコードする第３のオープンリーディングフレームも有する。
【０１２４】
ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 のアミダーゼのための発現プラスミド：
ニトリルヒドラターゼの場合とは異なり、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 のアミダーゼの発現に必要なのは１つのリーディングフレームのみである。これを、プラスミド pMS470-33/3/1/11 の、tac プロモーターの下流側にクローン化した。図２は、この構築物のプラスミドマップを示す。
【０１２５】
組換えニトリルヒドラターゼ及び組換えアミダーゼの発酵：
２つの酵素の発酵はすべて、pMS470 系における酵素の過剰発現のために開発された一般的なプロトコールによって行った。
【０１２６】
ここで、サンプルは、
・一晩培養した培養物（ＯＮＣ）から、ＬＢ培地及び抗生物質を含有する振盪フラスコ内の主培養液に接種し、
・対数期まで増殖させ、
・０．８〜１．５のＯＤ600（６００ｎｍにおける光学濃度）で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）で誘導し、
・更に１８時間誘導し（タンパク質発現）、
・集め（遠心分離）、破砕した（超音波）。
【０１２７】
ニトリルヒドラターゼの発現：
pMS470Nhase7.3（又は pMSNhasetactac7.3）によって形質転換された大腸菌Ｂ ＢＬ２１細胞をＬＢ−アンピシリンプレート上で単離し、１００ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地のＯＮＣに個々のコロニーを接種した。翌朝、０．０１〜０．０３のＯＤ600（Beckmann光度計）に達するように、１０００ｍｌシケイン付フラスコ内の、２５０ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地からなる主培養液に接種した。２５℃よりも高い温度では専ら不溶性の封入体が形成されるので、増殖温度を２５℃に制御した。誘導密度（ＯＤ600＝１、Beckmann光度計）に到達した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭの濃度まで加えることによって培養物を誘導した。更に、培地に０．１ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウムを補充した。＞４のＯＤ600に達した後、培養物を集め（約３０００×ｇで１５分間遠心分離）、約１００ｍｌのＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後、細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液に再懸濁し（総容量約５ｍｌ）、超音波プローブ（BRANSON Sonifier 250、出力６０％に設定、一定周波数で処理、１回３０秒を５回、１回ごとに冷却のために１分間休止）を用いて破砕した（破砕を顕微鏡で目視して確認）。得られた粗ライセートを、下記に列挙する条件の下でメタクリロニトリルを基質として用いて分析したところ、約１００〜２５０Ｕ／ｍｌ（pMSNhasetactac7.3 については約３５０〜５００Ｕ／ｍｌ）の典型的な活性を有していた。
【０１２８】
保存のために、ライセートを−２０℃で貯蔵した。室温で貯蔵すると、活性が急速に失われる。
【０１２９】
活性測定：  粗ライセートを、活性測定の直前にＰＢＳ緩衝液で１：１０に希釈した。ＰＢＳ緩衝液を溶媒とする４０ｍＭメタクリロニトリル溶液１．４ｍｌを希釈ライセート２０μｌと混合し、２８℃でインキュベートした（Eppendorf Thermomixer 5436）。０分、１分、２分、５分、１０分及び１５分の時点で、２００μｌのサンプルを抜き取り、これらのサンプル中の酵素反応を８００μｌの０．１７％リン酸によって直ちに停止させた。遠心分離（１６０００×ｇ、１０分）の後、サンプルを２２４ｎｍで分光光度法により分析した（Perkin Elmer ＵＶ／ＶＩＳ分光計 Lambda Bio）。吸光の増大がメタクリルアミドの濃度の増大と相関することが明らかとなった。なお、０．５７ｌ・ｍmol−１・ｃｍ−１のε値を基準として用いた。
【０１３０】
アミダーゼの発現：
pMS470-33/3/1/11 によって形質転換された大腸菌Ｂ ＢＬ２１細胞をＬＢ−アンピシリンプレート上で単離し、１００ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地のＯＮＣに個々のコロニーを接種した。翌朝、０．０１〜０．０３のＯＤ600（Beckmann光度計）に達するように、１０００ｍｌシケイン付フラスコ内の、２５０ｍｌのＳＯＣ−アンピシリン培地からなる主培養液に接種した。３７℃で発酵させると、専ら不溶性の、かつ不活性なタンパク質が形成されるので、増殖温度を３０℃に制御した。誘導密度（ＯＤ600＝１、Beckmann光度計）に到達した後、ＩＰＴＧを０．３ｍＭの濃度まで加えることによって培養物を誘導した。１６時間の誘導の後、細胞を集め（約３０００×ｇで１０分間遠心分離）、リン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７）で洗浄した。得られたペレットを洗浄緩衝液に再懸濁し（総容量約５ｍｌ）、超音波プローブ（BRANSON Sonifier 250、出力６０％に設定、一定周波数で処理、１回３０秒を５回、１回ごとに冷却のために１分間休止）を用いて破砕した（冷却負荷は終始一定）（破砕を顕微鏡で目視して確認）。このようにして得られた粗ライセートを、−２０℃で凍結保存した。ライセートは、ＰＢＳ緩衝液中のアセトアミド（４０ｍＭ）を基質として用いて３７℃で測定した（インドフェノールブルー法による遊離アンモニウムの測定）ところ、約７５Ｕ／ｍｌの活性を有していた。
【０１３１】
アミダーゼ活性の測定：  下記の溶液を用いた。
基質溶液：４０ｍＭアセトアミドのＰＢＳ溶液
溶液Ａ：１０％（w/v）フェノールのエタノール（９５％）溶液
溶液Ｂ：０．５％（w/v）ニトロプルシドナトリウムのｄｄＨ２Ｏ溶液
溶液Ｃ：クエン酸三ナトリウム１００ｇ及び水酸化ナトリウム５ｇが水５５０ｍｌに溶解した溶液
溶液Ｄ：市販の通常の次亜塩素酸ナトリウム溶液６００ｍｌが、１０００ｍｌになるように希釈された溶液
アンモニウム標準液：０μｇ／ｌ、８０μｇ／ｌ、１２０μｇ／ｌ、２００μｇ／ｌ、２８０μｇ／ｌ及び４００μｇ／ｌの硫酸アンモニウム水溶液
【０１３２】
１．４ｍｌの基質溶液を３０℃で１０μｌの酵素希釈物（ＰＢＳ中１：１０）と共にインキュベートした（Eppendorf Thermomixer 5436）。０分、１分、２分、５分、１０分及び１５分後に、サンプル１００μｌ中の酵素反応を、２０μｌの溶液Ａを用いて停止させた。最後のサンプルを抜き取った後、得られた溶液を４００μｌの水で希釈した。更に、較正のために、アンモニウム標準溶液（各５００ｍｌ）を２０μｌの溶液Ａと混合した。その後直ちに、サンプルに、また、標準液に、溶液Ｂ２０μｌ、及び、４部の溶液Ｃと１部の溶液Ｄとの混合液５０μｌをピペットで加えた。ボルテックスによって十分に混合されるようにした。得られたサンプル及び標準液を３７℃で１５分間放置した。すべてのサンプル及び標準液を水で希釈（１：１０）した後、得られた青色の呈色を、分光光度計（Perkin Elmer ＵＶ／ＶＩＳ分光計 Lambda Bio）を用いて６４０ｎｍで定量した。青色の呈色の経時的な増大と標準液の吸光度との相関関係を求めることによって、活性（１分当たりの遊離アンモニウムのμｍｏｌ数）を逆算することができる。
【０１３３】
（実施例１０：組換え酵素を用いる加水分解）
これらの反応では、ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 のクローン化ニトリルヒドラターゼを大腸菌クローン７．３（実施例９に従って作製）の粗ライセートとして用いた。
【０１３４】
手順：
５０μｌの粗ライセートを４２５μｌの緩衝液（Ｋ／Ｎａ−ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７、５０ｍＭ）で希釈し、ＤＭＳＯを溶媒とする約２２０ｍＭの基質溶液２５μｌと混合した（タンパク質５ｍｇ／ｍｌ、基質濃度約１０ｍＭ、５％ＤＭＳＯ）。反応を、Thermomixer 内で３０℃及び１０００ｒｐｍで行った。０分、２分、４分、６分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分、６０分及び１２０分後、各々の場合に、１個のエッペンドルフ容器を０．５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌと混合した。遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ）及び対応する希釈の後、シアノヒドリン及びヒドロキシアミドの濃度をＨＰＬＣによって測定した。ニトリルヒドラターゼの活性をヒドロキシアミドの形成速度（初期範囲における傾き）から求めた。標準基質（活性１００％）として、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリルを用いた。その他の基質の加水分解における活性を、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリルに対する活性と比較した（表５）。
【０１３５】
結果：
２−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリルの加水分解における、大腸菌クローン７．３の粗ライセート中のニトリルヒドラターゼの活性は、約０．３μmol・ｍｇ−１・min−１であった。表５では、異なる基質に対する活性が比較されている。
【０１３６】
【表５】
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【０１３７】
（セミ分取スケールで行う（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの反応）
ロードコッカス・エリスロポレス NCIMB 11540 由来のクローン化ニトリルヒドラターゼ（大腸菌クローン７．３、実施例９に従って作製）の粗ライセート５０ｍｌを１００ｍｌの緩衝液（Ｋ／Ｎａ−ＰＯ４緩衝液、５０ｍＭ、ｐＨ６．５）で希釈した。（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル（ｅｅ＞９９％）１．０ｇがＤＭＳＯ１．５ｍｌに溶解した溶液を加えた後、懸濁物を１５０ｒｐｍ及び３０℃で振盪した。反応完了後、細胞破片を遠心分離し、生成物を、４日間にわたってＣＨ２Ｃｌ２で連続抽出した。
粗生成物のｅｅ：＞９９％
精製後の収量：０．９１ｇ（８２％）
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】pMS470Nhase7.3 のプラスミドマップある。
【図２】pMS470-33/3/1/11 のプラスミドマップある。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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