(57)【要約】動物細胞において、反対方向を向いた少なくとも2種類のコード配列を発現させるための両方向性プロモーター、両方向性発現カセット、発現構築物、遺伝子移入発現ベクターおよびそれらの使用方法について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'末端から3'末端に向かって、
a)サイトメガロウイルス(CMV)またはマウス乳腺癌ウイルス(MMTV)ゲノムに由来する第1の最小プロモーター配列、
b)動物遺伝子に由来する十分効率の良いプロモーター配列
を含み、前記2種類のプロモーター配列が反対方向を向いたコード配列の同等の転写を推進する、反対方向を向いた少なくとも2種類の前記コード配列を動物細胞内で発現させるための両方向性プロモーター。
【請求項２】
前記十分効率の良いプロモーター配列は、エンハンサー領域および第2の最小プロモーター配列からなる請求項1に記載の両方向性プロモーター。
【請求項３】
前記十分効率の良いプロモーター配列は、ホスホグリセレートキナーゼまたはユビキチン遺伝子を含む偏在的に発現する遺伝子に由来する請求項1に記載の両方向性プロモーター。
【請求項４】
便利な挿入部位が各プロモーターの下流に配置され、ポリアデニル化部位が各挿入部位の下流に配置された請求項1から3に記載の両方向性プロモーターを本質的に含む両方向性発現カセット。
【請求項５】
1個またはそれぞれのポリアデニル化部位の上流に位置する少なくとも1個の転写後制御因子をさらに含む請求項4に記載の両方向性発現カセット。
【請求項６】
3個以上の遺伝子を発現するために少なくとも1個の内部リボソーム進入部位(IRES)配列をさらに含む請求項4または5に記載の両方向性発現カセット。
【請求項７】
請求項1または2に記載の両方向性プロモーターを含有する発現構築物。
【請求項８】
請求項4から6に記載の両方向性発現カセットを含有する発現構築物。
【請求項９】
レンチウイルスまたはレトロウイルス配列をさらに含む請求項7または8に記載の発現構築物を含有する遺伝子移入発現ベクター。
【請求項１０】
動物細胞で複数の遺伝子を送達し、発現するための請求項9に記載の遺伝子移入発現ベクターの使用。
【請求項１１】
動物細胞がin vivoにおける組織動物細胞である請求項10に記載の遺伝子移入発現ベクターの使用。
【請求項１２】
組織動物細胞が脳神経細胞を含む請求項11に記載の遺伝子移入発現ベクターの使用。
【請求項１３】
d)請求項9に記載の遺伝子移入発現ベクターに前記コード配列をクローニングする段階であって、各コード配列は両方向性プロモーターの2種類のプロモーターの1つの制御下にある段階、
e)前記ベクターによって動物細胞を形質転換する段階、
f)前記ベクターの発現を可能にする段階
を含む、動物細胞に2種類の外来コード配列を同等に発現させるための方法。
【請求項１４】
前記動物細胞がヒト細胞である請求項10に記載の2種類の外来コード配列を同等に発現させるための方法。
【請求項１５】
前記ヒト細胞が再移植可能なヒト細胞である請求項14に記載の2種類の外来コード配列を同等に発現させるための方法。
【請求項１６】
前記再移植可能なヒト細胞が造血細胞である請求項15に記載の2種類の外来コード配列を同等に発現させるための方法。
【請求項１７】
請求項7または8に記載の両方向性発現カセットを含有する発現構築物で適切な細胞を形質転換する段階を含む、非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法。
【請求項１８】
請求項9に記載の遺伝子移入発現ベクターによって適切な細胞を形質転換する段階を含む、非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2種類以上の遺伝子を効率よく、同等に発現させる両方向性プロモーター、これらのプロモーターを含有する遺伝子移入ベクター、前記ベクターを細胞に形質導入する粒子、標的細胞への複数の遺伝子の輸送および発現のため、また遺伝子治療のため、および薬剤の製造のための前記ベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
同一標的細胞内で複数の導入遺伝子を発現させることは、いくつかの遺伝子移入および治療適用に必要不可欠である1。遺伝子機能の研究は、マーカー遺伝子と共にcDNAを発現させて実施することが最良で、この方法によって、遺伝的に変更された細胞はin vitroおよびin vivoにおいて同定され、モニターすることができる。同様に、遺伝子治療適用は、選択マーカーが協調して発現することを利用して、in vivoで投与する前に遺伝子修正細胞を精製することによって改善することができる。形質導入された造血幹細胞(HSC)のMGMTによる選択によって最近示されたように、遺伝的に変更された細胞は、治療遺伝子と共に成長促進遺伝子または薬剤耐性遺伝子を導入することによって、ex vivoまたはin vivoで増幅することができ2、この試みを使用して遺伝子治療の効率を高めることができ、これは広い範囲の疾患に適用できる能力を備えている3、4。反対に、治療遺伝子と共に、条件によって細胞毒性遺伝子を発現する遺伝子的に変更された細胞は、有害反応が生じるならばin vivoで除去することができ、この方法は、白血病再発治療用にドナーのTリンパ球を注入した後で移植片対宿主病を制御するために使用される5。首尾良く行われているX染色体性重症複合免疫不全の臨床試験において、最近ベクター組み込みに関連して白血病が発症していることを考えると、これはまた、HSC遺伝子移入における重要な安全基準となり得る6。遺伝子移入によって再構成される活性が、異なる遺伝子によってコード化される複数のサブユニットによって左右されるとき、または別の分子の相乗作用を必要とするとき、複数の導入遺伝子を同等に発現させることが必要不可欠である。たとえば、パーキンソン病患者の線条体神経におけるドーパミン生合成経路の再構成には、チロシン水酸化酵素とGTP-シクロヒドロラーゼIおよび/またはDOPA脱炭酸酵素を一緒に発現させることが必要で7、癌の遺伝子治療では、免疫治療用に抗原提示細胞において複数の抗原および/またはサイトカインを、養子移入用に操作されたT細胞において2種類のT細胞受容体鎖を同時に発現させることが必要であり得る8。
【０００３】
このように必要性がよく認識されているにもかかわらず、標的細胞の大部分で複数の導入遺伝子を高濃度に発現させることは遺伝子移入技術にとって非常に難題である。2種類の異なる導入遺伝子は、2種類の別々のベクターによって発現されてきたが、今のところ、両ベクターによって形質導入された標的細胞はほんの少しのみで、1種または2種の遺伝子を様々な比で発現する不均一な細胞集団が得られ、信頼できる研究および/または効果的な適用を妨害している。あるいは、2種類以上の導入遺伝子を同一ベクター内で異なるプロモーターによって発現させると9、今のところ、プロモーター間の異なる組織特異性および相互の干渉によって、同一標的細胞内における効率的な同時発現が妨害されることが多い10。差異的スプライシングによって、同一プロモーターから複数の転写物が生じるが、複数の導入遺伝子のウイルス輸送に適応することは困難であることが分かってきた11。一緒に翻訳して別々の成分に自己処理するキメラポリ蛋白質は、口蹄病ウイルス2Aの自己切断ペプチドを使用して生じた12、13。しかし、この技術には熟練した技術が必要とされ、両方の蛋白質を同一の細胞区画に限局し、蛋白質の活性、安定性および免疫原性に影響を及ぼす可能性がある配列変化を導入するので、今までは複数の遺伝子移入に適用することには限界があった。複数の遺伝子を移入するために、現在のところ最も満足のいく取り組みは、内部リボソーム進入部位(IRES)の使用に基づいている14。ウイルス転写物および細胞転写物で同定されたこれらの配列は、mRNACap依存的に翻訳を制御し、2シストロン性伝令RNAの2種類の遺伝子の間に挿入すると、下流遺伝子の翻訳を可能にする。発明者等は、自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクター(LV)に関して異なるIRESの性能を試験し、この取り組みには重大な限界があることを発見した。
【０００４】
WO02/064804は、植物における導入遺伝子の転写活性を高めるために有効な両方向性デュアルプロモーター複合体について記載している。
【０００５】
本発明の両方向性プロモーターには、変更されたエンハンサー領域を含み、該変更されたエンハンサーの両側に反対方向を向いた少なくとも2個のコアプロモーターが備わっている。この適用は、植物における遺伝子発現に関係する。さらに、この試みには、該構築物の変更された内部領域に、両側の2つの同一な、または相同な最小プロモーターを連結した直列型エンハンサー配列が複製されることが必要である。本発明では、両方向性構築物の効果的なプロモーター内にエンハンサーまたはその他のいかなる配列も複製することは必要ではなく、その両側のコアプロモーターが少なくとも30%の同一性を共有することも必要ではない。最後に、直列型複製は、レトロ/レンチウイルス輸送と適合しない可能性がある。
【０００６】
米国特許第6388170号は、最小プロモーターおよび通常のプロモーターを含む両方向性プロモーターを有する植物ベクターを開示しており、前記最小プロモーターは、前記通常プロモーターとは反対向きで、前記通常プロモーターの5'末端に前記通常プロモーターに操作可能に結合している。植物および植物感染ウイルスに由来するプロモーター配列は開示され、植物細胞または植物部分において試験された。植物と動物との間には実質的に進化の距離があるので、米国特許第6388170号は、両方向性活性のためにどのように動物プロモーターを操作し、両方向性プロモーターが動物細胞で効果的に作動するかどうかは教示していない。さらに、米国特許第6388170号は、有用な遺伝子移入方法を使用して、動物および動物細胞で遺伝子を発現させるために両方向性プロモーターをどのように操作するのか教示していない。
【０００７】
WO01/34825は、遺伝子治療に有用なアデノウイルスなどの組換えウイルスの産生に有用な細胞系、プラスミドおよびベクターを開示している。該細胞系、プラスミドおよびベクターには、誘導性プロモーター、たとえば、両方向にクローン遺伝子を同等に発現するための両方向性プロモーターが含まれる。しかし、両方向性Tet-制御構築物のみが開示されている。
【特許文献１】WO02/064804
【特許文献２】米国特許第6388170号
【特許文献３】WO01/34825
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、発明者等は、効果的なex vivo形質導入を可能にし、in vivo投与を対象とするLVなどの遺伝子移入系を十分利用した新規戦略を探究する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者等は、両方向性合成プロモーターが2種類の異なるRNAを同等に転写する新規ベクター設計を開発した。発明者等は、両方向性プロモーターを備えたLVが、非常に多くの形質導入細胞で2種類の導入遺伝子を同等に発現し、2シストロン性ベクターよりも明らかに性能が優れていることを示した。初代造血細胞における効率の良い新規両方向性LVの性能は、移植後ex vivoにおいて、いくつかの組織では、in vivoにおいて、直接的ベクター輸送または遺伝子組み換えを確立した後で測定した。本発明は、改善された遺伝子発現手段の探究に長年に立ちはだかっていた障害物を克服し、遺伝子治療の及ぶ範囲および安全性を高めることが期待される。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、5'末端から3'末端に向かって、
a)サイトメガロウイルス(CMV)またはマウス乳腺癌ウイルス(MMTV)ゲノムに由来する第1の最小プロモーター配列、
b)動物遺伝子に由来する十分効率的の良いプロモーター配列
を含み、前記2種類のプロモーター配列は反対方向を向いた前記コード配列の同等の転写を推進する、反対方向を向いた少なくとも2種類の前記コード配列を動物細胞内で発現させるための両方向性プロモーターである。
【００１１】
本発明の範囲では、十分効率の良いプロモーター配列は、1次転写物の効率の良い転写を推進する配列を意味する。好ましくは、異なるか、または重複したエンハンサー領域および最小プロモーター配列を含む。より好ましくは、十分効率の良いプロモーター配列は、ホスホグリセレートキナーゼまたはユビキチンプロモーターから得られる。
【００１２】
本発明の目的は、前記で開示したような両方向性プロモーターを本質的に含む両方向性発現カセット、各プロモーターの下流に位置する便利な挿入部位および各挿入部位の下流に位置するポリアデニル化部位である。
【００１３】
好ましくは、該両方向性発現カセットはさらに、1個またはそれぞれのポリアデニル化部位の下流に位置する少なくとも1個の転写後制御因子を含む。より好ましくは、該両方向性発現カセットはさらに、3個以上の遺伝子を発現するために少なくとも1個の内部リボソーム進入部位(IRES)を含む。
【００１４】
本発明の目的は、前記で開示したように、該両方向性プロモーターを含有する発現構築物である。
【００１５】
本発明の目的は、前記で開示したように、該両方向性発現カセットを含有する発現構築物である。
【００１６】
本発明の目的は、さらにレンチウイルスまたはレトロウイルス配列を含む、前記で開示した発現構築物を含有する遺伝子移入発現ベクターである。
【００１７】
本発明の目的は、動物細胞、好ましくはin vivo組織動物細胞、より好ましくは脳神経細胞において複数の遺伝子を輸送し、発現するための遺伝子移入発現ベクターの使用である。
【００１８】
本発明の目的は、
a)請求項8に記載の遺伝子移入発現ベクターに前記コード配列をクローニングする段階であって、各コード配列は両方向性プロモーターの2種類のプロモーターのうちの1つの制御下にある段階、
b)前記ベクターによって動物細胞を形質転換する段階、
c)ベクターの発現を可能にする段階
を含む動物細胞に2種類の外来コード配列を同等に発現させるための方法である。
【００１９】
好ましくは、該動物細胞はヒト細胞であり、より好ましくは、該ヒト細胞は再移植可能なヒト細胞であり、さらにより好ましくは、該再移植可能なヒト細胞は造血細胞である。
【００２０】
あるいは、in vivoにおける組織細胞の形質転換は、たとえば脳神経細胞へのベクターの直接的輸送によって実施することが可能である。
【００２１】
本発明の目的は、前記に開示したような遺伝子移入発現ベクターによって適切な細胞を形質転換する段階を含む非ヒトトランスジェニック生物を作製する方法である。
【００２２】
本発明のベクターは、in vitroおよびin vivoでの遺伝子機能および標的確認研究、遺伝子治療、動物細胞における複数遺伝子の発現、トランスジェニック動物の作製および複数の遺伝子の均等なノックダウン並びに薬剤製造のためにも有利に使用することができる。
【００２３】
ここでは、以下の図面を参考にして本発明を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
(実施例)
(実施例1)
材料および方法
プラスミド構築物
輸送ベクターは全て、以下の既に記載した配列要素、IRESの11番目のATGで開始する下流の遺伝子コード配列を備えたEMCV IRES(wt)、またはHindIIIクローニング部位を作製し、下流導入遺伝子ATG16での翻訳開始を可能にするために変異したIRESの11番目のATGを備えたEMCV IRES(EMCVmut)、NFR IRES18、MPMV CTE21、最小CMVコアプロモーター20、ユビキチン-Cプロモーターの1226bp断片19を使用してプラスミドpCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE15から構築した。
【００２５】
両方向性プロモーターを備えたレンチウイルスベクターの構築
レンチウイルス構築物RRL-MA1を作製するために、(レンチウイルス構築物pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.minhCMV.TetO7.minMMTV.eGFPに由来する)SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.minhCMV要素を含有するXhoI-XhoI断片を同酵素で切断したレンチウイルスベクター構築物pRRL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre(Follenzi他、2000)にクローニングして、RRL-MA1-lucif/GFP(pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.minhCMV.hPGK.eGFP.Wpre)を得た。
【００２６】
レンチウイルス構築物CCL-MA1を作製するために、2種類の断片を、まずKpnIで切断し、末端平滑化して、次にXhoIで切断したレンチウイルス構築物pRRL.sin.cPPT.hPGK.ΔLNGFRWpreにクローニングし、minhCMV.eGFP要素を含有する第1断片は、KpnIで切断し、末端平滑化し、次にXhoIで切断したレンチウイルス構築物pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.minMMTV.TetO7.minhCMV.eGFPから得られ、第2の断片はBamHIで切断し、末端平滑化し、次にNotIで切断した構築物pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.tTA2.Wpreに由来する。得られたレンチウイルス構築物pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.minMMTV.TetO7.minhCMV.eGFPは、NotIおよびAvrIIで切断し、cPPT.SV40ポリA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.ΔLNGFRWpreを含有する断片は、同酵素で切断したレンチウイルス構築物pCCL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpreにクローニングして、CCL-MA1-GFP/ΔLNGFR(pCCL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.ΔLNGFRWpre)を得た。
【００２７】
レンチウイルス構築物RRL-MA2を作製するために、(レンチウイルスベクター構築物pRRL.sin.cPPT.hPGK.ルシフェラーゼ.IRES.Wpreに由来する)hPGK.ルシフェラーゼ要素を含有するHindIII-BamHI断片を同酵素で切断した(Rainer Loew、Heidelberg大学、FRGから入手した)レトロウイルス構築物SF2-cLCM2Gにクローニングして、構築物cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.hPGK.minMMTV.eGFPを得た。この構築物は、最初にSaIIで切断し、末端平滑化し、次にBamHIで切断して、ルシフェラーゼ.hPGK.minMMTV.eGFP要素を含有する断片は、同様に切断したレンチウイルスベクター構築物pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.tTA2.Wpreにクローニングして、RRL-MA2-lucif/GFP(pRRL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.hPGK.minMMTV.eGFP.Wpre)を得た。
【００２８】
レンチウイルス構築物CCL-MA3を作製するためには、HindIIIおよびXhoIで切断したpBLKS+に2種類の断片をクローニングして構築物pBLKS+minMMTV.GFP.CTE.SV40ポリAを得、CTE.SV40ポリA要素を含有する第1の断片は、HindIIIおよびXbaIで切断したレンチウイルスベクター構築物pRRL.sin.cPPT. SV40ポリA.CTE.tTA2から得られ、minMMTV.GFP要素を含有する第2の断片は、XhoIおよびXbaIで切断した構築物cPPT.SV40ポリA.CTE.ルシフェラーゼ.hPGK.minMMTV.eGFPに由来する。得られた構築物は、EcoRVおよびXhoIで切断して、minMMTV.GFP.CTE.SV40ポリAを含有する断片は、同酵素で切断したレンチウイルスベクター構築物pCCL.sin.cPPT.hPGK.ΔNGFR.Wpreにクローニングして、最終的なレンチウイルスベクター構築物CCL-MA3-GFP/ΔNGFR(pCCL.sin.cPPT. SV40ポリA.CTE.GFP.minMMTV.hPGK.ΔNGFR.Wpre)を得た。
【００２９】
レンチウイルス構築物CCL-MA4を作製するために、UBI-Cプロモーター配列を含有し、PacIで切断し、末端平滑化し、PstIで切断したpHR'.UBI-C.eGFPに由来する断片を、EcoRVおよびPstIで切断した構築物pCCL.sin.cPPT.SV40ポリA.CTE.GFP.minCMV.PGK.ΔNGFR.WpreのPGKプロモーターの位置に挿入し、最終的なレンチウイルスベクター構築物CCL-MA4-GFP/ΔNGFR(pCCL.sin.cPPT. SV40ポリA.CTE.GFP.minCMV.UBI-C.ΔNGFR.Wpre)を得た。
【００３０】
RRL-MA1-lucif/GFP、CCL-MA1-GFP/ΔLNGFR、RRL-MA2-lucif/GFP、CCL-MA3-GFP/ΔLNGFR、CCL-MA4-GFP/ΔLNGFR構築物の地図およびヌクレオチド配列は、それぞれ図7a〜11aおよび図7b〜11bに示す。
【００３１】
ベクターの生成および力価測定
VSV仮型第3世代LVは、293T細胞への一時的4-プラスミドコトランスフェクションによって生成され、ベクター収集のために酪酸ナトリウム1mMを培養物に添加する変更を加えて、前述のように15超遠心によって精製した。GFPまたはΔLNGFRの発現力価は、HeLa細胞で限界希釈することによって評価した47。ベクター粒子は、HIV-1 gag p24抗原免疫捕捉(NEN Life Science Products)によって測定した。ベクターの感染性は、GFPまたはΔNGFRを発現するベクターについて力価と粒子の間の比として計算した。293T上清におけるベクター発現力価は、1シストロン性CMVまたはPGKベクターでは0.7から1x107Transducing UnitHeLa(TU)/mlの範囲で、2シストロン性ベクターおよび両方向性ベクターでは3から8x106TU/mlの範囲である。1シストロン性CMVまたはPGKベクターのベクター感染性は、0.5から1x105TU/p24 ngの範囲で、2シストロン性ベクターおよび両方向性ベクターでは2から6x104TU/p24 ngの範囲であった。
【００３２】
細胞培養
HeLa細胞および293T細胞の連続培養は、牛胎児血清10%(FBS、Gibco、Invitrogen Corporation、UK)およびペニシリン-ストレプトマイシンおよびグルタミンの組み合わせを補ったイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、Sigma、Milan、Italy)で維持した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、末梢血リンパ球および臍帯血CD34+前記細胞の一次培養物を得て前述のように維持した15。CD34+前駆体は、LV 5x107TU/mlで形質導入し、前述のように組換えヒトインターロイキン6(rhIL6、20ng/ml)、組換えヒト幹細胞因子(rhSCF、100ng/ml)、組換えヒトFLT-3リガンド(rhFLT-3、リガンド、100ng/ml)(いずれもPeproTech(Rocky Hill、NJ)から入手)および組換えヒト血小板産生因子(rhTPO、20ng/ml、Amgen、Thousand Oaks、CA)の存在下で、少なくとも7日間培養した23。分化状態にするために、形質導入した前駆体は、rhSCF 50ng/ml、組換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子(rhGM-CSF、20ng/ml)、組換えヒト単球コロニー刺激因子(rhG-CSF、20ng/ml)(いずれもPeproTechから入手)の存在下で、10日間培養した。コロニー形成測定には、形質導入した細胞をヒト完全MethoCult培地(StemCell Technologies、Vancouver、CA)に800細胞/mlの密度で播き、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡で14日後に計数した。
【００３３】
ヒト末梢血リンパ球は、フィコール勾配で精製して、前述のように、抗CD3抗体(Orthoclone、Milan、Italy)30ng/mlおよび抗CD28抗体(PharMingen、San Diego、CA)1μg/mlで2日間活性化した後、またはインターロイキン7(Boehringer Mannheim-Roche GmbH、Mannheim、Germany)5ng/mlで4日間処理した後、ベクター0.5〜5x107TU/mlで形質導入した24。
【００３４】
C57BL/6マウス骨髄の系列マーカー陰性細胞の磁気細胞分離技術(StemCell Technologies、Vancouver、CA)による精製、血清を含まないStemSpan培地(StemCell Technologies、Vancouver、CA)におけるベクター0.5〜2x107TU/mlによるex vivo形質導入および致死照射された同型レシピエントへの移植は、前述のように実施した48。
【００３５】
マウス
CD1、C57BL/6およびFVBマウスは、Charles Rivers Laboratories(Calco、Italy)から購入し、SPF条件下で維持した。動物実験はいずれも、サンラファエロ病院の所内動物管理使用委員会によって承認された方法に従って実施した。
【００３６】
DNA分析:サザンおよびリアルタイムPCR
ゲノム当たりのベクターコピー数は、市販のキット(Qiagen)によって、LV主鎖を検出するためのプライマーおよびプローブの1組み合わせを使用して、細胞から抽出した鋳型DNA 300ngからリアルタイムPCRによって定量した。
LVフォワードプライマー、5'-TGAAAGCGAAAGGGAAACCA-3'
LVリバースプライマー、5'-CCGTGCGCGCTTCAG-3'
LVプローブ、5'-(VIC)-CTCTCTCGACGCAGGACT-(TAMRA)-3'。
【００３７】
反応は、製造元の指示に従って実施し、ABI Prism 7700配列検出系(PE-Applied Biosystem)を使用して分析した。サザンブロットでは、DNAを形質導入細胞から抽出し、Afl-IIで消化して、組み込まれたベクターDNAから発現カセットを遊離させ、WPREプローブで分析してベクター配列を検出した。組み込まれたベクターコピー数の平均は、プラスミド標準曲線に関して決定した。
【００３８】
これらの数を使用して、ベクター組み込み力価を計算し、その後の形質導入実験全てに使用するベクター保存物を正規化して、試験したそれぞれのベクターの組み込み濃度が同じであることを確かめた。
【００３９】
実験計画および定位注射
9週齢のC57BL/6マウスにトリブロモエタノール1.25%(SIGMA)を腹腔内注射して麻酔し、定位固定装置に固定し(David Kopf Instruments、Tujunga、CA)、小さく切開して頭蓋骨を露出させた。ベクター濃縮物(2x106TU/μl)2μlは、33Gブラントチップ針を備えたハミルトンシリンジ(Hamilton、Reno、NV)によって左半球線条体(mmで表したブレグマからの定位座標:AP=+0.74、ML=-1.9および頭蓋骨表面からのDV=-3.5)に0.2μl/分の速度で注射した。該針は、さらに5分間適所に放置し、ゆっくり取り除いた。
【００４０】
遺伝子組換え
トランスジェニックマウスは、Lois他によって記載されたようにLVを使用して作製した19。簡単に説明すると、雌のFVBマウスを妊娠した雌ウマの血清およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの組み合わせで過排卵させる。雌から平均して20個から30個の胚を収集し、同日に卵黄周囲腔に5x107TU/mlのLV保存物10〜100pLを微量注入した。処置した胚はすぐに偽妊娠CD1マウスの卵管に移植した。子は、前述のようにPCR分析によってGFP配列の存在を遺伝子型同定した49。陽性マウスを飼育して、導入遺伝子の生殖系列伝達を試験した。尾からDNAを抽出して、リアルタイムPCRによって初代およびF1世代マウスのベクターコピー数を定量した。
【００４１】
フローサイトメトリーおよびルシフェラーゼ測定
形質導入した細胞は、GFP発現を定常状態に到達させ、偽形質導入を除外するために、FACS分析をする前に少なくとも4日間増殖させた。FACS分析を行う前に、0.05%トリプシン-EDTAで接着細胞を分離させ、洗浄して、パラホルムアルデヒド(PAF)およびFBS 2%を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で固定した。懸濁液中で増殖した細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム(PI)(BD Bioscience PharMingen、San Diego、CA)2μg/mlを含有するPBSに再懸濁した。免疫染色用に、細胞105個をPBS、マウス血清5%、ヒト血清5%、FBS2%で4℃で15分間ブロックした。ブロック後、R-フィコエリスリン(RPE)結合抗体(抗CD34および抗CD13、Dako、Glostrup、Denmark、および抗ΔLNGFR、BD Bioscience PharMingen、San Diego、CA)10μlを添加して、該細胞を4℃で30分間インキュベートして、洗浄して、PIで染色して、3色フローサイトメトリーによって解析した。PI陰性の生細胞のみを分析に使用した。ルシフェラーゼは、調製した細胞溶解物で製造者の説明通り測定した(ルシフェラーゼ測定系、Promega)。細胞溶解物(BCA蛋白質測定試薬キット Pierceによって測定された蛋白質含量で正規化)とルシフェラーゼ基質(Promega)を混合した後、Lumat LB9507照度計(Berthold)でRLUを測定した。
【００４２】
組織分析
麻酔したマウスは、NaCl0.9%、その後PAF 4% PBS溶液で還流した。組織試料を収集し、スクロース20% PBS溶液で4℃で48時間平衡化させ、迅速に凍結させるために最適切削温度化合物(OCT)に包埋した。厚い凍結部分10μm(トランスジェニックマウス)および20μm(定位注射マウス)は、PAFで後で固定し、-80℃で凍結させた。切片は、ウシ血清アルブミン(BSA)1%および0.1%Triton X-100(PBS-T)を含有するPBSに溶かしたヤギ血清(Vector Laboratiries)5%でブロックして、ウサギアフィニティー精製GFP抗体(Molecular Probes)およびR-フィコエリスリン(RPE)結合ΔLNGFRモノクローナル抗体(BD Bioscience PharMingen、San Diego、CA)で1時間インキュベートして、洗浄して、PBS-TおよびBSA1%に溶かしたAlexaFluor488結合ヤギ抗ウサギ抗体(Molecular Probes)で1時間染色した。細胞の核は、RNA分解酵素処理(Molecular Probes)の1時間後にTOPRO-3で染色した。切片を封入し、3レーザー共焦点顕微鏡(Radiance 2100、BioRad)で解析した。1光学切片画像の蛍光シグナルを連続的に取得して、PhotoShop7.0(Adobe)で解析した。
【００４３】
結果
2シストロン性LV
1個のベクターから複数個の導入遺伝子を発現させるために、まず新世代の自己不活性化LV15に関して様々なIRESの性能を評価した。5'から3'末端に向かって、ルシフェラーゼリポーター、IRESおよび細胞関連GFPマーカーをコード化する2シストロン性転写物を発現させるために(図1a)、強力なCMVおよびPGKプロモーターを使用した。下流の翻訳を開始するATGのために異なる野生型(EMCVwt)および変異(EMCVmut)型16、17の2種類のIRESは、脳心筋炎ウイルスに由来する。他のIRESは、NF-kB転写制御因子(NRF)mRNA18の5'非翻訳配列に由来する。
【００４４】
2シストロン性および対照1シストロン性ベクター全ての高力価VSV仮型保存物を作製し、形質導入活性を正規化して、HeLa細胞における組み込みをサザンブロットで測定した(図1b)。次に、形質導入した細胞における遺伝子発現を比較して、ベクターコピー数を等しくした(図1c〜f)。ルシフェラーゼ活性は、CMV-ルシフェラーゼベクターで形質導入したHeLa細胞と性能が最も良い2シストロン性ベクターで形質導入した細胞とで同等であったが、後者の細胞では少数の画分のみがIRES依存性GFP遺伝子を発現し、対照CMV-GFPベクターによって形質導入された細胞と比較して発現力価が10倍減少していた(図1c)。さらに、GFP平均蛍光強度(MFI)は、IRESから蛋白質を発現する細胞では、mRNACapから蛋白質を発現する細胞よりも有意に低かった。次に、臍帯静脈内皮細胞、末梢血リンパ球およびCD34+臍帯血造血細胞前駆体(HPC)を含めた初代ヒト細胞において2シストロン性LVを試験した(図1d〜f)。対照CMV-GFPベクターによって形質導入された培養物中のGFP陽性細胞の頻度によって示されるように、全細胞種は効率的に形質導入されたが、IRES依存性GFP発現は、2シストロン性ベクターで形質導入された細胞のわずかな部分においてのみ認められた。IRES活性は、標的とした細胞種で広範囲に亘って変化し、NRF IRESはリンパ球では下流遺伝子の発現が検出可能に達したのは1個のみで、一方EMCVwtIRESは、その他の細胞種の中で最も効率が良かった。さらに、IRESでは全て、対照のCMV-ルシフェラーゼベクターと比較して下流遺伝子発現が、場合によっては1ログを上回って減少していた。
【００４５】
2種類の細胞関連マーカー、GFP、および親和性の低いNGF受容体の切断型(ΔLNGFR)の発現によってもまた、IRESをベースとしたベクターを評価した(図1g、h)。低用量の、性能が最も良い2シストロン性ベクターを形質導入したHeLa細胞の中で、高濃度のΔLNGFRを発現した細胞のみがまた、GFPを発現し、平均してΔNGFR陽性細胞4個に1個が検出可能な濃度のGFPを発現した(図1g)。同様に、ΔNGFRを発現する形質導入CD34+前駆体の小画分のみがまた、検出可能な濃度のGFPを発現した(図1h)。全体的に、これらの結果は、IRESをベースとした2シストロン性ベクターでは、試験したほとんどの標的細胞種において2種類の導入遺伝子を確実に同等に発現することができないこと、および複数コピー形質導入または下流遺伝子発現のために形質導入された細胞の選択が大多数の細胞において両導入遺伝子を発現する集団を得るために必要であることを示唆した。
【００４６】
両方向性LV
2シストロン性ベクターの限界を克服するために、導入遺伝子を同等に発現するための新規プロモーター設計を探究した。最小コアプロモーター上流を効率的なプロモーターと反対向きに連結した。この設計の原理は、コアプロモーターが両側に隣接するとき、効率的なプロモーター内の上流要素が両方向への転写活性を作動させることができることである。もしこのような両方向性活性化が生じたら、両転写物の発現が同等に制御されるだろう。LVにおいて着実かつ効率的に導入遺伝子発現を作動させることが既に示された2種類の偏在的発現プロモーター、前述の、ヒトホスホグリセレートキナーゼプロモーター(PGK)15の516bp断片およびヒトユビキチンCプロモーター(UBI C)19の1226bp断片を試験した。真核細胞転写の開始をテトラサイクリン(Tc)依存性オペレーター20に結合させるために既に開発されたサイトメガロウイルス(minCMV)に由来する最小コアプロモーターにそれらを連結させた。それらは、LVによる遺伝子輸送に最適化された2種類の発現カセットを備えた両方向性プロモーターに隣接した(図2a)。ベクターLTRに対してアンチセンス方向の上流カセットには、Mason-Pfizerウイルス21の構成的輸送要素(CTE)およびシミアンウイルス40(SV40)のポリアデニル化部位が含まれた。下流カセットには、マーモット肝炎ウイルス転写後制御因子(WPRE)22およびSIN HIV-1LTRポリアデニル化部位が含まれた。
【００４７】
2シストロン性LVについて前述したように、形質導入された細胞のサザンブロット分析およびリアルタイムPCRによって、各ベクターの正確な輸送および正規化された形質導入を確認した。両方向性発現カセットを有するLVは、標準ベクターで得られたものと同様に高い力価および感染性を生じた(方法参照)。該両方向性設計は、効率的なプロモーターによる下流発現に影響を及ぼすことなく、上流の最小プロモーターによる転写を有意に高めた(図2b〜h)。たとえば、minCMVプロモーターによるルシフェラーゼ発現は、PGKプロモーターの上流に融合させると少なくとも1ログ増加した(図2b)。驚いたことに、両方向性PGKプロモーターは、両方向性ベクターによって形質導入された細胞において、対照PGKベクターによって形質導入された細胞と同じ頻度および同様の発現濃度でのGFP(またはΔLNGFR、示さず)の検出を可能にし、該プロモーターの両側からの蛋白質の発現を可能にした。2種類の細胞関連マーカー、ΔLNGFRおよびGFPを使用して、高低両方のベクターコピー数においても、両方向性LVが安定で、効率的な協調発現をすることが示された(図2f)。ベクターの投入量が高ければ、実質的に全ての標的細胞で両導入遺伝子の発現が高濃度に達した。ベクターの投入量が低ければ、形質導入されたほとんどの細胞がプロウイルスのコピーを1つ有するとき、実質的に全ての標的細胞において導入遺伝子の共発現が示され、両方向性プロモーターによって分岐転写が生じることが示唆された。いずれの条件においても、導入遺伝子発現は、形質導入後の早期および後期に分析した細胞で同じ濃度に維持された(図示せず、以下の図3)。導入遺伝子発現細胞は、2色FACSプロットにおいて対角線上に沿って分布する傾向があり、2種類の導入遺伝子の発現は同等に制御されたことが示唆された。
【００４８】
興味深いことに、開発した両方向性発現カセットに関して単一のPGKプロモーターを試験したとき、下流側よりも上流側で有意に効率が悪かったが、同等の両方向性発現が観察された(図2g)。2種類の導入遺伝子の位置をPGKプロモーターのそれぞれの側に交換した後でも、この発見は再現された(図示せず)。これらの結果から、PGKプロモーターの転写活性化因子は、本質的に分岐転写を引き起こすことができ、したがって、新規LVにおいてデュアル遺伝子発現の主要な駆動力を提供し、両方向性プロモーターの両側における転写を確実に同等に制御することが示唆された。それ自体は非常に活性が低いminCMVコアプロモーター(前記の図2hおよび図2b)を並置すると、おそらく開始がより効率的になるので、PGKプロモーターから上流の転写が高まった(図2gと図2fを比較すること)。両方向性ベクターにおける駆動プロモーターをPGKからUBI-Cに変更すると、PGKプロモーターで認められた発見が再現された(図2i)。minCMVプロモーターを上流に添加することによって有意に増強されるUBI-Cプロモーター(図2j)の本質的な両方向性活性が明らかにした。
【００４９】
次に、リアルタイムPCRで測定したように、組み込まれたコピー数に関する両方向性ベクターと2シストロン性ベクターの性能を直接比較した(図3)。ベクター用量を増加させて形質導入した293T細胞を分析することによって、PGK(MA1)またはUBI-C(MA4)プロモーターをベースにした組み込み両方向性ベクターの大部分が両導入遺伝子を効率的に発現し、効率が最良のIRESをベースとした2シストロン性ベクターより明らかに優れていることを証明した。
【００５０】
Ex VivoおよびIn Vivoデュアル遺伝子移入
次に、遺伝子治療に適用するために、異なる輸送戦略によって、より適切な標的における両方向性MA1LVの性能を調べた。既に最適化された方法23、24に従って、ヒト臍帯血HPCおよびPBLをex vivoにおいてΔLNGFR-GFP MA1LVで形質導入した(図4)。両遺伝子の産物は、初期に作用するサイトカインの存在下で増殖させた未成熟な細胞、および液体培養(図4b)またはクローン形成測定(図4c、GFPのみ)で分化させた後の両方で計数したHPCの大部分において高濃度で同等に発現した。同様に、CD3/CD28の同時誘発によって惹起した(図4d)、標準的な増殖条件下において形質導入したPBLにおいて、未処理の細胞特性を維持するようにIL-7のみで処理した非増殖細胞のように(図4e)、同等のΔLNGFRおよびGFPの発現が得られた。ネガティブ選択によって骨髄から濃縮した形質導入マウスHPCでもまた、移植研究を実施し、長期間再増殖させたHSCの後代において安定して2重の導入遺伝子が発現することを明らかにした(図4f)。移植前にex vivoで形質導入した細胞において、および長期間移植されたマウスの白血球細胞において、ΔLNGFRおよびGFPは同濃度で同等に発現した。総合的に、これらの結果から、原始的な、免疫委任され分化した造血細胞において洗練されたデュアル遺伝子移入を行うための新規LVであることが確認された。
【００５１】
濃縮ΔLNGFR-GFP MA1LVを成体マウスの線条体に注射し、注射して4週間後に、GFPおよびΔLNGFRで免疫染色した脳切片の共焦点顕微鏡によって導入遺伝子発現を計数した(図5)。注射部位の周囲の脳組織に両導入遺伝子が着実に共発現していることが認められた。既に、VSV仮型LV25〜27の線条体注射後に報告されたように、該マーカーを発現する細胞の大部分は、線条体神経細胞の典型的な形態を呈していた。したがって、新規両方向性LVは、in vivoにおいて効果的なデュアル遺伝子移入を可能にした。
【００５２】
デュアル遺伝子組換え
新規両方向性LVがデュアルトランスジェニックマウス系の作成を可能にするかどうかを評価した。Lois他によって既に説明されたように19、ΔNGFR-GFP LVを単一細胞胚の卵黄周囲腔に微量注入し、偽妊娠の雌に移植した。ベクターDNAの存在によって評価されるように、トランスジェニックマウスを高頻度で得て(新生児の50%を上回る)、数匹の初代マウスを交配し、後代のベクターDNA含量および導入遺伝子発現を分析することによって生殖系列におけるベクターの組み込みを明らかにした(図6)。ゲノムに2個および5個のベクターコピーを有する2匹のF1マウスを分析すると、脳、肝臓、脾臓、消化管、心臓、骨格筋および腎臓を含めた、研究した組織の実質的に全ての細胞において両導入遺伝子が非常に確実に発現していることが発見された。ベクターの発現はまた、数匹のマウスにおいて骨髄および末梢血によく検出することができたが、100%未満の細胞において、GFPよりもΔNGFRがより明らかであった(図示せず)。これらのデータによって、両方向性LV遺伝子組換えは、遺伝的に操作されたマウスにおける着実で安定かつ同等な2種類の導入遺伝子の発現を得るための迅速かつ効果的な方法であることが示唆された。さらに、開発したminCMV-PGK両方向性プロモーターは、マウスの分化した組織の大部分におけるデュアル導入遺伝子の発現を調節し、生殖系列によって受け継がれた後も発現を維持することが示された。
【００５３】
考察
効率の良いデュアル遺伝子移入を可能にする戦略の遂行において、最初にIRESをベースとした取り組みの重大な限界に直面した。2シストロン性LVに関して試験したとき、IRES依存性遺伝子発現は、mRNACapに依存した発現よりも有意に低く、形質導入した細胞の大部分に下流遺伝子を共発現させるためには多コピー形質導入が必要であった。さらに、IRESは、転写物における上流遺伝子の発現を減少させ、細胞型依存の有意な活性変化を示した。IRESをその他の種類の遺伝子移入ベクターに組み込んだときも、同様の限界が報告された14、28〜32。したがって、IRESを使用したとき、下流遺伝子発現の選択には、標的細胞全部に共発現していることを確かめる必要があるものと思われる。選択方法はいくつかのex vivoでの遺伝子移入適用および治療適用に適合するが、特に選択マーカーの発現の効率が悪いとき、遺伝子修正細胞の生物学的特性に悪影響を及ぼす可能性がある。実際に、長期間にわたるex vivo培養および形質導入細胞集団の大きさまたはクローン構成の限界によって、移植、移植後の長期間生存率および組織再生が制限される33。さらに重要なのは、IRES依存性発現の効率が悪いと、in vivoにおける遺伝子移入を対象とする2シストロン性ベクターのほとんどの適用が妨害される。したがって、発明者等は、効果的なex vivo形質導入を可能にし、in vivo投与を対象とするLVなどの遺伝子移入系を十分利用した新規戦略を探究した34。
【００５４】
コアプロモーター要素を効率的なプロモーターの上流に反対方向に並置することに基づいた新規プロモーターデザインを開発した。両方向性構築物は、分岐転写を作動させたので、効率的なプロモーター内の上流エンハンサー/プロモーター要素は、両側から同時に方向依存的に転写を促進することができることを示す。これらのプロモーターをLVに取り込むと、継代細胞系および初代細胞においてex vivoで効率的にデュアル遺伝子移入し、同等に発現させることが達成された。両導入遺伝子は非常に多様な形質細胞で発現したので、導入遺伝子共発現を確実にするために細胞を選択する必要はなかった。CNSに両方向性LVを直接注射すると、in vivoにおいて神経細胞への2種類の導入遺伝子の同等な発現が示された。さらに、両方向性LVは強いデュアル遺伝子組換えを可能にし、試験した組織全てにおける両導入遺伝子の汎細胞発現を導いた。これらの結果は全て、今までに現在有用な技術を使用して到達することはできなかった。
【００５５】
単一のベクターコピーを有する形質導入細胞をモニターすることによって、発明者等は、単一の両方向性プロモーターから分岐転写が生じること、両導入遺伝子の発現は機能的に結合し、同等に制御されること、および両方向性プロモーターは、細胞が分化した後も転写の1方向が沈黙したり、無作為に停止したりすることなく、試験した標的細胞全種において一貫して活性があることを明らかにした。この2種類の反対向きのコアプロモーターが機能的に結合するためにどの位接近していなければならないかを位置づけることはしなかったが、コアと上流要素との間の天然のプロモーターに認められるように、効率的なプロモーターの上流要素のいくつかに融合最小コアプロモーターを密接に並置することが必要であり得ることを予測することができる。この研究で試験したPGKおよびUBI-Cプロモーターはいずれも、最小コアプロモーターに反対方向に融合させたとき、分岐転写を作動させた。興味深いことに、これらのプロモーターを開発した両方向性発現カセットに組み込むと、下流側よりも上流側の効率が低かったが、いずれも本質的に分岐転写を促進することができることが示された。この驚くべき発見によって、偏在的に発現したハウスキーピングプロモーター類の、おそらくCpG島の含量に関係した(以下および35〜37参照)特異的な特徴を示すことができる。しかし、翻訳を促進する転写後制御因子が備わった2種類の効率的な発現カセット間への該プロモーターの配置、およびクロマチン内の転写遺伝子を優先的に標的化することが示されたLVを介した組み込みの両方によって、潜在的な転写活性の解明に貢献できることを忘れてはならない。試験したハウスキーピングプロモーターに本来備わっている両方向性活性は、この研究で説明したコアプロモーター要素を上流に組み込まないとそれ自体では利用上十分な効率は得られないが、新規ベクターによって達成したデュアル遺伝子発現の同等な制御の基礎を形成する。一方、これらのプロモーターが分岐転写を作動する傾向は、ベクターの操作時および形質導入した細胞または組織の分析時に留意するべきであり38、同ベクター構築物の隣接するベクター間でしばしば認められる障害の可能性のある機構となり得る10、39。本明細書で説明した両方向性の設計は、特定の組織において2種類の導入遺伝子の同等発現を得るための組織特異的プロモーターにうまく適用することができる。さらに、両方向性プロモーターと2シストロン性転写とを組み合わせることによって、IRES依存性ベクターについて前述した制限が伴うが、同一細胞内で2種類以上の導入遺伝子を発現することができた。誘導性両方向性プロモーターは、2種類の導入遺伝子の発現を外因的に制御するために、一連のTetオペレーター反復の両側に最小プロモーターを繰り返すことによって、Tet制御発現系で元々開発された36、40、41。この設計は、最近、遺伝子発現を制御するために、原核動物のエンハンサー要素とキメラのトランス転写活性化因子とをまた一緒にするその他の系に適用された42。これらの誘導性発現系は、遺伝子機能研究の強力な手段となるが、共発現および蛋白質トランス活性化因子の機能的活性に依存し、ベクターをベースとした輸送およびin vivoにおける適用に適用するとき、いくつかの障害を有する。最近、植物の生物工学において、構成的両方向性プロモーターの外来遺伝子発現について調べられた43。本発明者らの結果は、2種類の分岐転写物を着実に構成的に発現させるために、ほとんどの動物細胞種で使用できる内在性転写機構を利用した両方向性合成プロモーターについての初めての報告となる。現実に、今までに両方向性プロモーターが報告された例はほとんどなかった。驚くべきことに、ヒトゲノムの最近の調査では、転写開始部位の距離が1kb未満である分岐的転写遺伝子対が多数あることが示された44、45。これらの遺伝子対の間に見いだされるプロモーター要素の多くは、両方向に転写を開始することができ、両遺伝子を制御する要素を共有して含有するようである46。したがって、開発した両方向性合成プロモーターは、真核細胞転写の非常に代表的で、進化的に保存された特徴を模倣することが可能で、性能を確実にするための構造的基礎となる。これらの両方向性プロモーターの回りに構築された新規レンチウイルスベクターは、遺伝子治療の及ぶ範囲および安全性、遺伝子機能の力および標的を確認する研究、並びに動物の遺伝子組換えの適用を拡大すると考えられる。短い干渉RNAの発現のために適応するならば、これらはまた、複数の遺伝子のノックダウンを調製することが可能である。
【００５６】
［参考文献］
2006524051.tif 000002
2006524051.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】2シストロン性レンチウイルスベクターの遺伝子移入性能を示した図である。(a)プロウイルスベクター型の概要。野生型(wt)または変異型(mut)翻訳開始部位を備えた脳心筋炎ウイルス(EMCV)または5'非翻訳NF-kB抑制因子mRNA(NRF)に由来する内部リボソーム進入部位(IRES)を含有する2シストロン性発現カセットは、ヒト前初期サイトメガロウイルス(CMV)またはホスホグリセレートキナーゼ(PGK)プロモーターによって作動した。ΔU3、RおよびU5、U3に欠失のあるLTR領域、SDおよびSA、スプライシング供与体および受容体部位、Ψ、gag遺伝子(GA)の5'部分を含むキャプシド形成シグナル、RRE、Rev-応答因子、cPPT、セントラルポリプリン配列、WPRE、マーモット肝炎ウイルス転写後制御因子。(b)CMVプロモーターからルシフェラーゼ(遺伝子1)およびGFP(遺伝子2)を発現する指定した1シストロン性(CMV)または2シストロン性ベクターによって形質導入されたHeLa細胞を、WPRE配列で探索したサザンブロット分析。ベクターは全て、予測した長さのDNAと結合した。ベクターのコピー数は、プラスミド標準曲線に対して決定し、ベクター保存物を正規化するために使用して、c〜fで示した実験において、所与の標的細胞型の各ベクターの組み込み濃度が同じであるようにした。(c〜f)1シストロン性(□、CMV)または指定した2シストロン性CMV-ルシフェラーゼ-GFPベクターで5〜7日前に形質導入した、ヒトHeLa細胞(c)、臍帯静脈内皮細胞(HUVEC、d)、末梢血リンパ球(PBL、e)および臍帯血由来CD34+前駆体(f)におけるルシフェラーゼおよびGFP発現。左の円柱、細胞抽出物中の正味ルシフェラーゼ活性を示した柱状グラフ、平均±SD。右パネル、FACS分析によるGFP発現を示したドットプロットで、GFP+細胞の平均蛍光強度(MFI、X)を示す。対照の1シストロン性ベクターのルシフェラーゼは、柱状グラフにおいて(□)で表わされ、GFPは各細胞型の最も左のドットプロット(CMV)で表された。(g、h)PGKプロモーターからΔNGFRおよびGFPを発現するEMCVwtIRESベクターによって形質導入された293T細胞(g)およびCD34+前駆体(h)におけるΔNGFRおよびGFP発現のFACS分析。パネル(h)におけるヒストグラムは、分析した全生細胞におけるΔNGFR発現(左)および区分された(M1)ΔNGFR+細胞におけるGFP発現(右)の分布を示す。示した実験は、少なくとも3回実施し、同様の結果が得られたものを表す。
【図２】両方向性レンチウイルスベクターの遺伝子移入性能を示した図である。(a)プロウイルスベクター型の概要。ヒトホスホグリセレートキナーゼ(PGK)またはポリ-ユビキチンUBI-C遺伝子に由来する、効率的なプロモーターの上流にヒトサイトメガロウイルス(mCMV)の最小コアプロモーター要素を結合させることによって作製された両方向性プロモーターは、2個のRNAの分岐転写を作動していた。CTE、Mason-Pfizerサルウイルスの構成的輸送因子(constitutive transport element)、pA、シミアンウイルス40のポリアデニル化部位A。その他のベクターの特徴は、図1の脚注にある通りである。(b)指定した両方向性発現カセットまたは対照発現カセットを有するLVで5〜7日前に形質導入したHeLa細胞における正味ルシフェラーゼ活性および(c〜e)GFP発現。FACS分析によるGFP+細胞の発生頻度およびMFI(X)は、右方向へプロットした点で示す。ルシフェラーゼ活性は、2種類の印を付けたベクター(□、■)について測定した。(f〜j)指定した発現カセットを有するLVの10倍系列希釈で5〜7日前に形質導入したHeLa細胞におけるΔNGFRおよびGFP発現。ΔNGFR+(左上部分)細胞およびΔNGFR/GFP2重陽性(右上部分)細胞の発生頻度は、FACSドットプロットで示す。示した実験は、少なくとも3回実施し、同様の結果が得られたものを表す。
【図３】両方向性および2シストロン性レンチウイルスベクターの性能の比較を示した図である。指定した発現カセットを備えたLVの10倍系列希釈で3週間前に形質導入した293T細胞におけるΔNGFRおよびGFP発現。ΔLNGFR発現細胞およびΔLNGFR/GFP2重陽性細胞(括弧内)の合計パーセントはFACSドットプロットの上部に示す。細胞当たりのベクターコピー数(CpC)の平均値は、無作為な独立した現象のポアソン分布に従って、形質導入された細胞の予測発生頻度と共に各プロットに示す。実質的に全ての組み込みベクターがΔNGFRを発現したが、発現濃度およびGFPを一緒に発現する形質導入細胞の画分は、EMCVwtIRES 2シストロン性ベクターと比較して2種類の試験した両方向性ベクター(MA1およびMA4)ではずっと高かった。
【図４】両方向性ベクターによる造血細胞でのデュアル遺伝子移入を示した図である。(a〜c)ヒト臍帯血CD34+前駆体は、説明したような23初期に作用するサイトカインの存在下でGFP-ΔNGFR MA1ベクターによって形質導入し、同培地中で7日間培養した後(a)、脊髄分化を促進する培地中でさらに10日間培養した後(b)、またはメチルセルロースをベースとしたコロニー形成培地に接種した後のいずれかで分析した。(a)および(b)では、FACS分析によってΔNGFRおよびGFP発現を示したドットプロットと共に、分析した全生細胞におけるΔNGFR発現(上部)および区分された(M1)ΔNGFR+細胞におけるGFP発現(下部)の分布を示したヒストグラムを表す。分析した時点のCD34を発現する未熟な前駆体およびCD13脊髄マーカーを発現する分化した細胞のパーセントを示す。(c)については、指定した種類のCFCの代表的な光学(左)および蛍光(右)顕微鏡写真を示す。(d、e)ヒト末梢血リンパ球は、抗CD3および抗CD28抗体で活性化して2日後(d)、または説明したように、インターロイキン-7で4日間処理した後(e)で形質導入し、前述のように24ΔNGFRおよびGFP発現について分析した。(f、g)精製した(lin-)マウス骨髄前駆体は、前述のようにサイトカインで刺激することなく形質導入し、液体培養7日後にΔNGFRおよびGFP発現について分析し(f)、または致死量を放射した同型レシピエントにすぐに移植した。移植後2ヶ月の代表的なマウスの末梢血のFACS分析をgに示す。示した実験は、3回実施し、同様の結果が得られたものを表す。d〜fにおいて、少ないベクターコピー数で形質導入した細胞は、より厳密な性能分析のために示す。
【図５】両方向性ベクターによるin vivoでのデュアル遺伝子移入を示した図である。高力価のGFP-ΔNGFR MA1LVは、マウス成体の線条体に定位的に注射した。注射して2ヶ月後に脳凍結切片を採取し、免疫蛍光法および共焦点顕微鏡によって分析した。ΔNGFR(赤)、GFP(緑)を免疫染色した後、および核DNAをTO-PRO3染色(青)した後の注射領域の代表的な写真を示す。蛍光シグナルは、単一の光切片から連続的に入手し、重ね合わせた(merge)後で別々に示した。元の倍率200X(縮尺=120μm)。
【図６】両方向性ベクターによるデュアル遺伝子移入を示した図である。トランスジェニックマウス系は、説明通りに19、GFP-ΔNGFR MA1LVを単一細胞胚の卵黄周囲腔に直接注射することによって作製し、指定した組織のΔNGFR(赤)およびGFP(緑)の発現は、凍結切片を免疫蛍光法および共焦点顕微鏡によって分析した。核は、TO-PRO3(青)によって染色した。蛍光シグナルは、単一の光切片から連続的に入手し、重ね合わせた(merge)後で別々に示した。示した写真は、生殖系列に組み込まれた2種類のベクターゲノムを有するF1マウスに由来する。同様の写真は、ベクターコピー数が同等以上の、分析したその他のトランスジェニックマウスに由来する。元々の倍率200X(脾臓、肺)、400X(心臓、腎臓、脳、肝臓)、630X(消化管)(縮尺=120μm)
【図７ａ】レンチウイルスベクター構築物RRL-MA1-lucif/GFPを含有するプラスミドの地図を示した図である。
【図７ｂ】レンチウイルスベクター構築物RRL-MA1-lucif/GFPを含有するプラスミドの配列を示した図である。
【図８ａ】レンチウイルスベクター構築物CCL-MA1-GFP/deltaLNGFRを含有するプラスミドの地図を示した図である。
【図８ｂ】レンチウイルスベクター構築物CCL-MA1-GFP/deltaLNGFRを含有するプラスミドの配列を示した図である。
【図９ａ】レンチウイルスベクター構築物RRL-MA2-lucif/GFPを含有するプラスミドの地図を示した図である。
【図９ｂ】レンチウイルスベクター構築物RRL-MA2-lucif/GFPを含有するプラスミドの配列を示した図である。
【図１０ａ】レンチウイルスベクター構築物CCL-MA3-GFP/deltaLNGFRを含有するプラスミドの地図を示した図である。
【図１０ｂ】レンチウイルスベクター構築物CCL-MA3-GFP/deltaLNGFRを含有するプラスミドの配列を示した図である。
【図１１ａ】レンチウイルスベクター構築物CCL-MA4-GFP/deltaLNGFRを含有するプラスミドの地図を示した図である。
【図１１ｂ】レンチウイルスベクター構築物CCL-MA4-GFP/deltaLNGFRを含有するプラスミドの配列を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図９ａ】
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【図１１ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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