(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象に基づいたインフルエンザ感染および／または複製のための方法および組成物ならびにインフルエンザウイルスの阻害のための有効なｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを同定するためのシステムおよびインフルエンザウイルス感染のメカニズムを研究するためのシステムを提供する。本発明はまた、他の感染性因子、特に体外から直接接近可能な細胞（例えば、皮膚細胞または粘膜細胞）に感染する感染性因子の感染、病原性、および／または複製の阻害のための方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクター）および任意の種々の送達因子を含む組成物を提供する。本発明は、さらに、インフルエンザ治療のための組成物の使用方法を含む。
2006512906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む組成物であって、該標的転写物が薬剤特異的転写物であり、該転写物が感染性因子による感染または複製に関与する、組成物。
【請求項２】
前記感染性因子が、そのゲノムが複数の独立した核酸分子を含む因子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸分子がＲＮＡである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＲＮＡ分子が一本鎖である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記感染性因子の複数の変異型が存在し、該因子が遺伝子再集合を受けることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記感染性因子の複数の変異型が存在し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、そのアンチセンス鎖またはアンチセンス部分が標的ｍＲＮＡの一部と完全に相補的である二重鎖領域を含み、該部分が少なくとも１０ヌクレオチド長であり、複数の変異型の間で高度に保存されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記感染性因子の複数の変異型が存在し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、そのアンチセンス鎖またはアンチセンス部分が標的ｍＲＮＡの一部と完全に相補的である二重鎖領域を含み、該部分が少なくとも１２ヌクレオチド長であり、複数の変異型の間で高度に保存されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記感染性因子の複数の変異型が存在し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、そのアンチセンス鎖またはアンチセンス部分が標的ｍＲＮＡの一部と完全に相補的である二重鎖領域を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長であり、複数の変異型の間で高度に保存されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記感染性因子の複数の変異型が存在し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、そのアンチセンス鎖またはアンチセンス部分が標的ｍＲＮＡの一部と完全に相補的である二重鎖領域を含み、該部分が少なくとも１７ヌクレオチド長であり、複数の変異型の間で高度に保存されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記感染性因子の複数の変異型が存在し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、そのアンチセンス鎖またはアンチセンス部分が標的ｍＲＮＡの一部と完全に相補的である二重鎖領域を含み、該部分が少なくとも１９ヌクレオチド長であり、複数の変異型の間で高度に保存されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
異なる変異型の間で同一である場合に変異型間で一部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
異なる変異型の間で多くとも１つのヌクレオチドが異なる場合に変異型間で一部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
異なる変異型の間で多くとも２つのヌクレオチドが異なる場合に変異型間で一部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも５個の変異型の間で前記部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１０個の変異型の間で前記部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１５個の変異型の間で前記部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも２０個の変異型の間で前記部分が高度に保存されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１８】
前記感染性因子が気道上皮細胞に感染する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記感染性因子がインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記インフルエンザウイルスがインフルエンザＡウイルスである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記インフルエンザウイルスがインフルエンザＢウイルスである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記感染性因子が宿主細胞ｍＲＮＡ翻訳を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記感染性因子が宿主細胞に感染し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞による前記因子の産生を少なくとも約２倍阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記感染性因子が宿主細胞に感染し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞による前記因子の産生を少なくとも約５倍阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記感染性因子が宿主細胞に感染し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞による前記因子の産生を少なくとも約１０倍阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記感染性因子が宿主細胞に感染し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞による前記因子の産生を少なくとも約５０倍阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記感染性因子が宿主細胞に感染し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞による前記因子の産生を少なくとも約１００倍阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記感染性因子が宿主細胞に感染し、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞による前記因子の産生を少なくとも約２００倍阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記標的転写物がウイルスＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記標的転写物が血球凝集素またはノイラミニダーゼをコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記感染性因子がインフルエンザウイルスであり、前記標的転写物が、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、膜タンパク質１、膜タンパク質２、非構造タンパク質１、非構造タンパク質２、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ１、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ポリメラーゼタンパク質ＰＡ、ポリメラーゼタンパク質ＮＰからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが前記感染性因子の複製を阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基対合領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが約１９ヌクレオチド長の塩基対合領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが少なくとも１５ヌクレオチド長の塩基対合領域および少なくとも１つの一本鎖３プライム突出部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが前記標的転写物の一領域と完全に相補的な部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが多くとも１つのヌクレオチド以外は前記標的転写物の一領域と完全に相補的な部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが多くとも２つのヌクレオチド以外は前記標的転写物の一領域と完全に相補的な部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１７個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１９個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１０個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１２個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１５個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１７個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１７個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１〜６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド３〜２１に記載の少なくとも１９個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１９個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずいれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１７個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１９個連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１０個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１２個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１５個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１７個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１７個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがコア二重鎖領域を含み、該コア二重鎖領域のセンス鎖または一部の配列が配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８のいずれかに記載の配列のヌクレオチド１〜１９に記載の少なくとも１９個連続するヌクレオチドを含むが、ただし、該１９個連続するヌクレオチドのうちの１つまたは２つのヌクレオチドが該配列と異なり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖またはその一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号７７および７８のヌクレオチド１〜１９に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センスおよびアンチセンスの一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号７１および７２のヌクレオチド１〜１９に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センスおよびアンチセンスの一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号８３および８４のヌクレオチド１〜１９に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センスおよびアンチセンスの一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号８９および９０のヌクレオチド１〜１９に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センスおよびアンチセンスの一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号９１および９２のヌクレオチド１〜１９に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センスおよびアンチセンスの一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号９３および９４のヌクレオチド１〜１９に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、センスおよびアンチセンスの一部を含み、該部分の配列がそれぞれ配列番号１８８および１８９のヌクレオチド１〜２０に記載の配列を含み、必要に応じて一方または両方の配列に３’突出部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＮＰ−１４９６、ＮＰ−１４９６ａ、ＰＡ−２０８７、ＰＢ１−２２５７、ＰＢ１−１２９、ＰＢ２−２２４０、Ｍ−３７、もしくはＭ−５９８またはこれらの任意の変異型の二重鎖部分からなる群から選択される二重鎖部分を含み、該変異型は、対応するｓｉＲＮＡと多くとも１つのヌクレオチドが異なる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分がＮＰ−１４９６の二重鎖部分と同一である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分がＮＰ−１４９６ａの二重鎖部分と同一である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖またはその一部が、５’→３’方向に読み取って配列番号７１、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９９、および配列番号１８８の最初の１９ヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７０】
少なくとも１つの修飾を含むという点でｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと異なる、請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアナログ。
【請求項７１】
前記修飾により前記ｓｉＲＮＡの安定性が増加するか、前記ｓｉＲＮＡの吸収が強化されるか、前記ｓｉＲＮＡの細胞侵入が強化されるか、これらの任意の組み合わせである、請求項７０に記載のアナログ。
【請求項７２】
前記修飾が、塩基、糖、またはヌクレオチド間結合を修飾する、請求項７０に記載のアナログ。
【請求項７３】
前記修飾がヌクレオチド２’修飾ではない、請求項７０に記載のアナログ。
【請求項７４】
前記修飾がヌクレオチド２’修飾である、請求項７０に記載のアナログ。
【請求項７５】
少なくとも１つのリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドに置換されるという点で前記ｓｉＲＮＡと異なる、請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアナログ。
【請求項７６】
互いにハイブリダイズした場合に請求項１に記載の組成物を形成する複数の一本鎖ＲＮＡを含む、組成物。
【請求項７７】
前記一本鎖ＲＮＡが約２１ヌクレオチド以上２３ヌクレオチド以下の長さの範囲である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
複数の請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む組成物。
【請求項７９】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくともいくつかが、異なるインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされる、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくともいくつかが、同一のインフルエンザウイルス転写物の異なる領域にターゲティングされる、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８１】
インフルエンザウイルス感染に感受性を示す細胞内の前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在により、少なくとも２つのインフルエンザ株による感染に対する該細胞の感受性が減少する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ。
【請求項８２】
インフルエンザウイルス感染に感受性を示す被験体内の前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在により、少なくとも２つのインフルエンザ株による感染に対する該被験体の感受性が減少する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ。
【請求項８３】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む細胞。
【請求項８４】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供するベクター。
【請求項８５】
構築物が宿主細胞に導入された場合に請求項１に記載のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが該宿主細胞内に産生されるように、前記ベクターが、該宿主細胞中で活性な発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含む、請求項８４に記載のベクター。
【請求項８６】
構築物が宿主細胞に導入された場合にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが感染性因子に特異的な転写物にターゲティングされる該宿主細胞内に産生され、該転写物が該因子の感染または複製に関連するように、該宿主細胞中で活性な発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含むベクター。
【請求項８７】
前記感染性因子がウイルスであり、該ウイルスの複数の変異型が存在し、該ウイルスが遺伝子再集合または混合を受けることができる、請求項８６に記載のベクター。
【請求項８８】
請求項８７に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項８９】
請求項８７に記載のベクターを含む、トランスジェニック動物。
【請求項９０】
前記ウイルスが、そのゲノムが複数の独立した核酸分子を含むウイルスである、請求項８７に記載のベクター。
【請求項９１】
前記感染性因子がインフルエンザウイルスである、請求項８７に記載のベクター。
【請求項９２】
前記ベクターが、インフルエンザウイルスによる感染に対する前記細胞の感受性を減少させるかまたはインフルエンザウイルス産生を阻害するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの１つまたは複数の鎖の転写のためのテンプレートを提供する、請求項９１に記載のベクター。
【請求項９３】
前記標的転写産物の分解により、インフルエンザウイルスの感染または複製の１つまたは複数の状態が遅延、防止、または阻害される、請求項９１に記載のベクター。
【請求項９４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分が、ＮＰ−１４９６、ＮＰ−１４９６ａ、ＰＡ−２０８７、ＰＢ１−２２５７、ＰＢ１−１２９、ＰＢ２−２２４０、Ｍ−３７、もしくはＭ−５９８またはこれらの任意の変異型の二重鎖部分からなる群から選択され、該変異型が、そのセンス部分、アンチセンス部分、または両方のいずれかにおいて対応するｓｉＲＮＡと多くとも１つのヌクレオチドが異なる、請求項９２に記載のベクター。
【請求項９５】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分がＮＰ−１４９６の二重鎖部分と同一である、請求項９４に記載のベクター。
【請求項９６】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖部分がＮＰ−１４９６ａの二重鎖部分と同一である、請求項９４に記載のベクター。
【請求項９７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖またはその一部が、５’→３’方向に読み取って配列番号７１、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９９、および配列番号１８８のいずれかの最初の１９ヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する、請求項９４に記載のベクター。
【請求項９８】
前記核酸が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターに作動可能に連結される、請求項８６に記載のベクター。
【請求項９９】
前記プロモーターがＵ６プロモーターまたはＨ１プロモーターである、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１００】
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項８６に記載のベクター。
【請求項１０１】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項８６に記載のベクター。
【請求項１０２】
前記ベクターがＤＮＡベクターである、請求項８６に記載のベクター。
【請求項１０３】
前記ベクターがウイルスである、請求項８６に記載のベクター。
【請求項１０４】
前記ベクターがレンチウイルスである、請求項８６に記載のベクター。
【請求項１０５】
感染性因子による感染の治療または予防方法であって、該方法は、被験体の該感染性因子での曝露前、同時、または曝露後に該被験体に、請求項８６に記載のベクターまたは請求項８８に記載の細胞を含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０６】
前記感染性因子がウイルスである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記感染性因子が気道上皮細胞に感染する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記感染性因子がインフルエンザウイルスである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記組成物を静脈内投与する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組成物を鼻腔内投与する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記組成物を吸入によって投与する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１２】
請求項１に記載の組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１１３】
前記組成物をエアゾールとして処方する、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１４】
前記組成物を鼻腔用スプレーとして処方する、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１５】
前記組成物を静脈内投与のために処方する、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１６】
前記感染性因子がインフルエンザウイルスであり、前記組成物が第２の抗インフルエンザ剤をさらに含む、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１７】
前記第２の抗インフルエンザ剤が米国食品医薬品局で承認されている、請求項１１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１１８】
ウイルスインヒビターを同定するための方法であって、該方法は、
その配列がウイルス感染時に産生される少なくとも１つの転写物との相補領域を含む候補ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む細胞を提供する工程であって、該転写物がその分解によってウイルスの感染または複製の１つまたは複数の状態を遅延、防止、または阻害するという点で特徴付けられる、工程と、
該細胞中の該ウイルスの感染または複製を検出する工程と、
ウイルスの感染性または複製を阻害するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを同定する工程であって、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがウイルスインヒビターである、工程と
を包含する、方法。
【請求項１１９】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記細胞が、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの非存在下で該細胞が少なくとも１つのウイルス転写物を産生することによって特徴付けられる、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
ウイルスゲノムで前記細胞をトランスフェクトするかまたは該細胞に前記ウイルスを感染させる工程をさらに包含する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
ウイルス感染を治療または防止する方法であって、該方法は、被験体の該ウイルスへの曝露前、同時、または曝露後に該被験体に、ＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物を投与する工程を包含し、該ＲＮＡｉ誘導性物質が該ウイルス感染時に産生された転写物にターゲティングされ、該転写物が、該転写物のレベルの低下により該ウイルスの感染または複製の１つまたは複数の状態を遅延、防止、または阻害されるにより特徴付けられる、方法。
【請求項１２３】
前記ウイルスが気道上皮細胞に感染する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記組成物を気道に投与する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
前記組成物を従来の静脈内送達方法によって投与する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質の非存在下で、前記ウイルスが感染性ウイルスを産生させる完全な生活環を経ることができ、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在により該ウイルスの産生が阻害される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質が、ＮＰ−１４９６、ＮＰ−１４９６ａ、ＰＡ−２０８７、ＰＢ１−２２５７、ＰＢ１−１２９、ＰＢ２−２２４０、Ｍ−３７、もしくはＭ−５９８またはこれらの任意の変異型の二重鎖部分からなる群から選択される二重鎖部分を含み、該変異型がそのセンス部分、アンチセンス部分、または両方のいずれかにおいて対応するｓｉＲＮＡと多くとも１つのヌクレオチドが異なる、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２９】
前記二重鎖部分がＮＰ−１４９６の二重鎖部分と同一である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記二重鎖部分がＮＰ−１４９６ａの二重鎖部分と同一である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
二重鎖部分を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを設計するための方法であって、該方法は、以下の工程：
標的転写物の一部分を同定する工程であって、該一部分が、感染性因子の複数の変異型の間で高度に保存されており、少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む、工程と、
該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖または一部分の二重鎖部分の配列として該一部分の配列を選択する工程と
を包含する、方法。
【請求項１３２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖または一部分の二重鎖部分の配列として前記一部に相補的な配列を選択する工程をさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかまたは両方に３’突出部を付加する工程をさらに包含する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記複数の変異体が少なくとも１０個の変異型を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記複数の変異体が少なくとも１５個の変異型を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
前記複数の変異体が少なくとも２０個の変異型を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３７】
前記一部分が約１９個のヌクレオチドを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３８】
前記変異型の間で多くとも１つのヌクレオチドが異なる場合、一部分が複数の変異型の間で高度に保存されていると見なされる、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３９】
前記感染性因子がインフルエンザウイルスである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１４０】
前記感染性因子が再集合を受けることができる、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１４１】
前記変異型が少なくとも２つの変異型を含み、それぞれ異なる種の宿主に天然に感染する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１４２】
前記種が、ヒト、ブタ、ウマ、およびトリ種からなる群から選択される少なくとも２つの種を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記変異型が少なくとも２つの変異型を含み、それぞれ異なる種の宿主中で生じる、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記種が、ヒト、ブタ、ウマ、およびトリ種からなる群から選択される少なくとも２つの種を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項１３１に記載の方法に従って設計したｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む組成物。
【請求項１４６】
転写物レベルを減少または低下させる方法であって、該転写物がｖＲＮＡまたはｃＲＮＡであり、少なくともその一部が該ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ転写物と相補的または同一である配列を有するｍＲＮＡ転写物にターゲティングされたＲＮＡｉ誘導性物質を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４７】
第１の転写物の阻害方法であって、第２の転写物にターゲティングされたＲＮＡｉ誘導性物質を投与する工程を包含し、該第２の転写物の阻害により該第１の転写物が阻害される、方法。
【請求項１４８】
前記第１の転写物のレベルが前記ＲＮＡｉ誘導性物質の非存在下での該第1の転写物のレベルと比較して減少する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第２の転写物のレベルが前記ＲＮＡｉ誘導性物質の非存在下での該第２の転写物のレベルと比較して減少する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第１および第２の転写物のレベルが前記ＲＮＡｉ誘導性物質の非存在下での該第１および第２の転写物のレベルと比較して減少する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質が前記第１の転写物に特異的にターゲティングされない、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５２】
前記第２の転写物がＲＮＡ安定性の維持において機能するタンパク質をコードする、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記タンパク質が核酸結合タンパク質である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５４】
前記核酸結合タンパク質がＲＮＡ結合タンパク質である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記第２の転写物がポリメラーゼをコードする、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５９】
前記第１および第２の転写物のいずれかまたは両方が因子特異的転写物であり、該因子が感染性因子である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記第１および第２の転写物が因子特異的転写物であり、該因子が感染性因子である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６１】
前記感染性因子がウイルスである、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記第２の転写物がウイルスＮＰタンパク質またはウイルスＰＡタンパク質のいずれかをコードする、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記第１の転写物が、Ｍタンパク質、ＨＡタンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、またはＮＳタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
組成物であって、
ＲＮＡｉ誘導性物質であって、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされる、ＲＮＡｉ誘導性物質と、
カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体、肺への導入に適切なサーファクタント、中性またはカチオン性脂質、リポソーム、非カチオン性ポリマー、修飾非カチオン性ポリマー、ブピバカイン、およびクロロキンからなる群から選択される送達因子と
を含む、組成物。
【請求項１６６】
前記送達因子が、目的の細胞への送達を強化するための送達強化部分を含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記送達強化部分が、前記目的の細胞によって発現された分子に特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、またはリガンドを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記目的の細胞が気道上皮細胞である、請求項１６７に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記送達強化部分が、前記送達因子の分解、クリアランス、または非特異的結合を減少させるために選択された部分を含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質がウイルスベクターを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターを含む、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質がＤＮＡベクターを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質がウイルスを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質がレンチウイルスを含む、請求項１７３に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質がｓｉＲＮＡを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質がｓｈＲＮＡを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質が、細胞内でのその存在によりインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生されるＲＮＡｉ誘導性ベクターを含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質が、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたは細胞内でのその存在によりｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡが産生されるＲＮＡｉ誘導性ベクターを含み、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが前記標的転写物の領域と完全に相補的な部分を含み、該部分が少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質が、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたは細胞内でのその存在によりｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡが産生されるＲＮＡｉ誘導性ベクターを含み、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＮＰ−１４９６、ＮＰ−１４９６ａ、ＰＡ−２０８７、ＰＢ１−２２５７、ＰＢ１−１２９、ＰＢ２−２２４０、Ｍ−３７、およびＭ−５９８またはこれらの任意の変異型の二重鎖部分からなる群から選択される二重鎖部分を含み、該変異型がそのセンス部分、アンチセンス部分、または両方のいずれかにおいて対応するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと多くとも１つのヌクレオチドが異なる、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分がＮＰ−１４９６の二重鎖部分を含む、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの二重鎖部分がＮＰ−１４９６ａの二重鎖部分を含む、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質が、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたは細胞内でのその存在によりｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡが産生されるＲＮＡｉ誘導性ベクターを含み、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖または一部の配列が、５’→３’方向に読み取って配列番号７１、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９９、および配列番号１８８の最初の１９ヌクレオチドからなる群から選択される配列を含む、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖または一部分の配列が、配列番号９３の配列を含む、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンス鎖または一部分の配列が、配列番号１８８の配列を含む、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記送達因子が、カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、および肺への導入に適切なサーファクタントからなる群から選択される、請求項１６５に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記カチオン性ポリマーが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、キトサン、およびポリ（β−アミノエステル）ポリマーからなる群から選択される、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記カチオン性ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項１８６に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記修飾カチオン性ポリマーに、該ポリマーのカチオン性を減少させるために選択した修飾を組み込む、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記修飾が、アセチル、イミダゾール、スクシニル、およびアシルからなるリストから選択される基との置換を含む、請求項１８８に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記修飾カチオン性ポリマーの２５％と７５％との間の残基が修飾される、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記修飾カチオン性ポリマーの約５０％の残基が修飾される、請求項１９０に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記送達因子が肺への導入に適切なサーファクタントを含む、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記サーファクタントが、Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）、Ｓｕｒｖａｎｔａ（登録商標）、またはＥｘｏｓｕｒｆ（登録商標）である、請求項１９２に記載の組成物。
【請求項１９４】
インフルエンザウイルスの複製、病原性、または感染性を治療または防止する方法であって、インフルエンザウイルス感染のリスクがあるかまたはインフルエンザウイルス感染に罹患した被験体に請求項１６５に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９５】
前記組成物を、静脈内注射、吸入、鼻腔内、およびエアゾールからなる群から選択される経路によって投与する、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記組成物を静脈内投与する、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９７】
前記組成物を従来の静脈内投与技術を使用して投与する、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記組成物を吸入によって投与する、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９９】
前記組成物を鼻腔内投与する、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２００】
前記組成物をエアゾールとして投与する、請求項１９４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年９月２８日提出の米国仮出願６０／４１４，４５７号および２００３年２月１０日提出の米国仮出願６０／４４６，３７７号の優先権を主張する。これらの各出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府援助）
合衆国政府は、本発明の本発明の開発で使用した助成金を支給した。特に、国立衛生研究所助成金番号５−ＲＯ１−ＡＩ４４４７７，５−ＲＯ１−ＡＩ４４４７８，５−ＲＯＩ−ＣＡ６０６８６、および１−ＲＯｌ−ＡＩ５０６３１で本発明の開発を補助した。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インフルエンザは世界中で最も蔓延している感染症の１つである。命にかかわる感染症であり、１，９１８年インフルエンザＡウイルス流行時には２００万人〜４０００万人が死亡したと推定されている。米国では、２万人〜４万人がインフルエンザＡウイルス感染またはその合併症により死亡している。流行時のインフルエンザに関連する入院は、冬季のみで３００，０００人超に達し得る。
【０００４】
いくつかの性質がインフルエンザウイルスの疫学的な蔓延の原因になっている。第１に、エアゾールによってヒトに容易に感染する（飛沫感染）。第２に、インフルエンザウイルス抗原の小規模の変化（抗原連続変異）が頻繁であるため、ウイルスは異なるウイルス変異型に対する以前の曝露によって誘導された防御免疫を容易に回避する。第３に、異なる株間での遺伝物質の再集合および混合（抗原不連続変異）によって新規のインフルエンザウイルス株を容易に作製することができる。インフルエンザＡウイルスの場合、このような混合は、異なる種に影響を与えるサブタイプまたは株の間で起こり得る。１，９１８年の流行は、ブタおよびヒトでのインフルエンザＡウイルスの間の再集合に由来するハイブリッド株によって引き起こされたと考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
集中的な取り組みにもかかわらず、インフルエンザウイルスの有効な治療方法は依然として存在せず、上記の抗原不連続変異および抗原連続変異のために既存のワクチンの効果が制限される。これらの理由のために、インフルエンザＡウイルスの世界的調査が長年に及んでおり、国立衛生研究所は、生物兵器防御の最優先病原体の１つに指定している。不活性化ウイルスに基づいた現在のワクチンは６５歳未満の健常な個体において約７０〜８０％の疾患を防止することができるにもかかわらず、この比率は高齢者または免疫無防備状態の個体ではさらに低い。さらに、ワクチン投与に関連する費用および潜在的な副作用により、このアプローチは決して最適ではない。米国ではインフルエンザの治療および／または予防用の現在承認された４つの抗ウイルス薬が有益であるが、副作用、服薬遵守、および耐性株出現の可能性が懸念されるためにその用途は制限される。従って、インフルエンザ感染の治療および防止のための有効な治療方法の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象に基づいたインフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型に起因するインフルエンザ治療のための新規の治療薬を提供する。特に、本発明は、ウイルス産生、ウイルス複製、ウイルス感染、および／またはウイルスＲＮＡの転写などに関与する１つまたは複数の標的転写物にターゲティングされた短干渉ＲＮＡ２０（ｓｉＲＮＡ）および／または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を提供する。さらに、本発明は、細胞内でのその存在により１つまたは複数のＲＮＡが転写され、自己ハイブリッド形成するか互いにハイブリッド形成して、ウイルス産生、ウイルス感染、ウイルス複製、および／またはウイルスｍＲＮＡの転写などに関与する少なくとも１つの標的転写物の発現を阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成するベクターを提供する。
【０００７】
本発明は、さらに、本発明のｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡｓ、および／またはベクターを含む種々の組成物を提供する。本発明の一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、鎖が互いにハイブリッド形成して約１９ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成するような相補領域を有する２つのＲＮＡ鎖を含み、各鎖は必要に応じて一本鎖突出部を含む。本発明は、さらに、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／または本発明のベクターを含む様々な組成物を提供している。本発明の一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、相補領域を有する２つのＲＮＡ鎖を備え、相互にハイブリッド形成をして、各鎖が必要に応じて１本鎖突出部を備える約１９ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成している。本発明の一定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、互いにハイブリッド形成して約１９ヌクレオチド長の二重鎖部分および一本鎖ループを有するヘアピン（ステム／ループ）構造を形成する相補領域を有する１つのＲＮＡ分子を含む。このようなＲＮＡ分子を、自己ハイブリッドしたという。ｓｈＲＮＡは、必要に応じてＲＮＡの５’部分および／または３’部分に１つまたは複数の非対合部分を含む。本発明は、さらに、本発明のｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ、および／またはベクターを含む組成物ならびにこのような組成物の送達方法を提供する。
【０００８】
したがって、１つの態様では、本発明は、標的転写物が薬剤特異的転写物であり、転写物が感染性因子の産生、複製、病原性、および／または感染および／または因子特異的ＲＮＡの転写に関与する、標的転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを提供する。説明の目的のために、感染性因子の産生、複製、病原性、および／または感染に関与する標的転写物の発現を阻害し、それにより感染性因子の産生、複製、病原性、および／または感染が阻害されるｓｉＲＮＳＡまたはｓｈＲＮＡは、感染性因子を阻害するといわれる。本発明の一定の実施形態によれば、感染性因子はウイルスである。本発明の一定の好ましい実施形態によれば、感染性因子は気道および／または肺の細胞（例えば、気道上皮細胞）に感染するインフルエンザウイルスなどのウイルスである。本発明の一定の実施形態によれば、標的転写物は、ポリメラーゼ、ヌクレオキャプシドタンパク質、ノイラミニダーゼ、血球凝集素、基質タンパク質、および非構造タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。本発明の一定の実施形態によれば、標的転写物は、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、膜タンパク質１、膜タンパク質２、非構造タンパク質１、非構造タンパク質２、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ１、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ポリメラーゼタンパク質ＰＡ、ポリメラーゼタンパク質ＮＰからなる群から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質をコードする。
【０００９】
別の態様では、本発明は、構築物が細胞に移入された場合に、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが因子特異的転写物にターゲティングされる宿主細胞内で産生され、転写物が感染性因子の産生、複製、および／または感染および／または因子特異的ＲＮＡの転写に関与するるように細胞内で活性な発現シグナル（例えば、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー）に作動可能に連結された核酸を含むベクターを提供する。本発明の一定の実施形態では、感染性因子はウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）である。本発明の一定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、インフルエンザウイルスを阻害する。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、上記の任意の転写物にターゲティングすることができる。一般に、ベクターは、細胞内のその存在により、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が転写され、自己ハイブリッド形成するか互いにハイブリッド形成して細胞内での少なくとも１つのインフルエンザウイルス転写物の発現を阻害する短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形成する、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターレトロウイルス  （例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターであり得る。本発明の一定の実施形態では、ベクターは、プロモーター由来の転写（すなわち、プロモーターによって指示された転写）によって、ハイブリッド形成して標的転写物にターゲティングされたｓｈＲＮＡを形成する相補領域を含むＲＮＡを合成するようにプロモーターに作動可能に連結された核酸セグメントを含む。本発明の一定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、プロモーター由来の転写によって互いにハイブリッド形成して標的転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡを形成する２つの相補ＲＮＡが合成されるように、核酸セグメントに正方向で作動可能に連結された２つのプロモーターに隣接する核酸セグメントを含む。本発明は、さらに、ベクターを含む組成物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターの送達および／または取り込みを容易にする任意の種々の物質（本明細書中で、「送達因子」という）をさらに含む、本明細書中に記載の本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはベクターを含む組成物を提供する。これらの物質には、カチオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体（アルギニンが豊富なペプチドおよびヒスチジンが豊富なペプチドが含まれる）、カチオン性および中性脂質、リポソーム、一定の非カチオン性ポリマー、炭水化物、およびサーファクタント物質が含まれる。本発明はまた、任意の種々の方法（例えば、送達因子への送達強化部分の付加）で修飾した送達因子の使用を含む。
【００１１】
本発明の一定の実施形態では、送達因子を、組成物の安定性の強化、細胞取り込みの促進、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはベクターの細胞内への放出の促進、細胞傷害性の減少、または組成物の特定の細胞型、組織、もしくは器官への指向のための任意の多数の方法で修飾する。例えば、本発明の一定の実施形態では、送達因子は、修飾カチオン性ポリマー（例えば、ポリマーのカチオン性を減少させ、それにより細胞傷害性を減少させるために選択した１つまたは複数の基で置換したカチオン性ポリマー）である。本発明の一定の実施形態では、送達因子は、気道上皮細胞などの細胞の表面上に存在する分子に特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、またはリガンドなどの送達強化部分を含む。
【００１２】
本発明は、さらに、感染因子への曝露前、曝露時、もしくは曝露後、または被験体が感染性因子によって発症する疾患の症状を示す任意の時点における適切な時間枠内での本発明の任意の組成物の被験体への投与による、感染症、特に気管支の感染症（例えば、インフルエンザ）の治療または防止方法を提供する。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、化学合成するか、インビトロ転写を使用して産生するか、インビトロで合成するか、細胞内等に産生することができる。組成物を、種々の経路（静脈内、吸入、鼻腔内、エアゾールとして、腹腔内、皮内、経口などが含まれる）によって投与することができる。
【００１３】
本発明は、遺伝子治療を使用した感染性因子によって発症する疾患（例えば、インフルエンザウイルスによる疾患）のさらなる治療または防止方法を提供する。一定のこれらの方法によれば、細胞（感染または非感染のいずれか）を、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを合成するように処理（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）または操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）する。本発明の一定の実施形態によれば、細胞内でのその存在により１つまたは複数のＲＮＡが合成され、細胞内で自己ハイブリッド形成するか互いにハイブリッド形成して適切な因子特異的標的転写物にターゲティングされた１つまたは複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成するベクターを含むように細胞を処理する。細胞を、インビトロまたは治療すべき被験体内（例えば、被験体の気管支内）で処理することができる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、感染性因子を阻害するための好ましいｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列の選択および設計方法を提供する。本発明は、感染性因子の複数の異なる株または変異型が存在する（特に、遺伝子の再集合または混合によって株が変異し得る）ことを特徴とする感染性因子を阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの選択および設計方法を提供する。これらの方法は、特に、あるサブタイプから別のサブタイプへの全ゲノムセグメントの置換によって遺伝子再集合が迅速且つ予想外に起こり得る、そのゲノムが複数の異なるセグメントからなる感染性因子と戦うためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ配列の選択および設計で使用される。従って、本発明のこれらの態様は、特に、そのゲノムが複数の独立したセグメントからなる（ゲノムが互いに共有結合していない物理的に異なる核酸分子からなることを意味する）感染性因子に適切である。本発明はまた、特に、プラスミド（例えば、治療化合物に耐性を付与する遺伝子をコードするプラスミド）の導入によって遺伝情報を交換する感染性因子のために使用することができる。
【００１５】
本発明はまた、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡなどの１つまたは複数のＲＮＡｉ誘導性物質および／または細胞内でのその存在により１つまたは複数のＲＮＡが産生され、互いにハイブリッド形成するか自己ハイブリッド形成してインフルエンザウイルス転写物にターゲティングするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成するベクターを含み、インフルエンザウイルスの阻害に有用な組成物の同定システムを提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、インフルエンザの複製機構および／またはインフルエンザウイルスＲＮＡの転写機構の分析および特徴づけならびにウイルス生活環に関与する関連ウイルス構成要素の特徴づけおよび分析のためのシステムを提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、複数の感染性因子の変異型が存在する場合に感染性因子を阻害するためのｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡの設計方法を提供する。例えば、本発明は、（ｉ）標的転写物の一部を同定する工程と、一部が感染性因子の複数の変異型の間で高度に保存されており、少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むことと、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを選択する工程と、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはｓｈＲＮＡのセンス部分が高度に保存された配列を含むこととを含む、二重鎖部分を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子の設計方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがその阻害によって複数（または全ての）他のウイルス転写物を阻害する転写物にターゲティングされる、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡおよびその設計方法を提供する。特に、本発明は、ウイルスポリメラーゼ（ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）またはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ組成物を提供する。
【００１９】
本願は、種々の特許、学術論文、および他の出願（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照する。さらに、以下の標準的な参考資料が本明細書中で参考として援用される：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，ｅｄｉｔｉｏｎ  ａｓ  ｏｆ  Ｊｕｌｙ  ２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（略語）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＲＮＡ：リボ核酸
ｖＲＮＡ：インフルエンザウイルスゲノム中のビリオンＲＮＡ（マイナス鎖）
ｃＲＮＡ：相補性ＲＮＡ（ｖＲＮＡの直接的転写物、プラス鎖）
ｍＲＮＡ：ｖＲＮＡまたは細胞遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（タンパク質合成のテンプレート）
ｄｓＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：短干渉ＲＮＡ
ｓｈＲＮＡ：短ヘアピンＲＮＡ
ＲＮＡｉ：ＲＮＡ干渉。
【００２１】
（定義）
一般に、用語「抗体」は、天然または全てもしくは部分的に合成された免疫グロブリンをいう。本発明の一定の実施形態では、この用語は、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のタンパク質も含む。これらのタンパク質は、天然の供給源に由来するか、部分的または全てを合成することができる。抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（任意のヒトクラスが含まれる）のメンバー（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）であり得る。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（単鎖可変部）などの抗体のフラグメント、抗原結合部位を保持する他のフラグメント、または組換え産生したｓｃＦｖフラグメント（組換え産生されたフラグメントが含まれる）であり得る。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０−７６５，２００２およびその引用文献を参照のこと。本発明の一定の実施形態では、この用語には、例えば、げっ歯類起源の可変ドメインがヒト起源の定常ドメインと融合し、それによりげっ歯類抗体の特異性が保持された「ヒト化」抗体が含まれる。ヒト起源のドメインは、ヒトで最初に合成されるという意味でヒトに直接由来する必要が無いことに留意のこと。代わりに、そのゲノムにヒト免疫グロブリン遺伝子が組み込まれたげっ歯類で「ヒト」ドメインを作製することができる。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９を参照のこと。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも良いが、本発明の目的のために、一般にモノクローナル抗体が好ましい。
【００２２】
本明細書中で使用される、数に関する用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、一般に、他で記載するか文脈から明らかでない限り、いずれかの方向（超えるまたは未満）で５％の範囲内の数字を含むこととする（このような数字は可能性のある値の１００％を超えない）。範囲が示されている場合、他で記載するか文脈から明らかでない限り、終点は範囲内に含まれる。
【００２３】
本明細書中で使用される、用語「ハイブリッド形成する」とは、２つの相補核酸配列の相互作用をいう。句「高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する」とは、当該分野で認識される高ストリンジェンシー条件下で維持される十分に安定な相互作用を説明する。ハイブリッド形成反応実施のためのガイダンスは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９８９および最新版（その全てが参照として援用される）で見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１も参照のこと。水性法および非水性法は、この引用文献に記載されており、いずれかを使用することができる。典型的には、約５０〜１００ヌクレオチド長にわたる核酸配列のために、低ストリンジェンシー（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）およびその後少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄（中−低ストリンジェンシー条件のために洗浄温度を５５℃に上昇させることができる））、中ストリンジェンシー（例えば、約４５℃で６×ＳＳＣおよびその後６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回の洗浄）、高ストリンジェンシーハイブリッド形成（例えば、約４５℃で６×ＳＳＣおよびその後６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回の洗浄）、および非常に高いストリンジェンシーでのハイブリッド形成（例えば、約６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよびその後６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回または複数回の洗浄）などの種々のストリンジェンシーレベルを定義する。非常に相補性が高い配列の間でのみ高ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成が起こる。当業者は、異なるストリンジェンシー度についてのパラメーターは、一般に、ハイブリッド形成配列の長さ、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むかどうかなどの種々の要因に基づいて異なることを認識する。例えば、高、中、または低ストリンジェンシーハイブリッド形成に適切な温度は、一般に、オリゴヌクレオチドなどの配列がより長い配列よりもより短い配列のほうが低い。
【００２４】
本明細書中で使用される、用語「インフルエンザ」は、動物またはヒト被験体で疾患を引き起こすことができるか実験分析のための興味深い候補である任意のインフルエンザウイルス株をいう。インフルエンザウイルスは、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ．ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ；ＩＳＢＮ：０７８１７１８３２５，２００１に記載されている。特に、この用語は、動物またはヒト被験体で疾患を引き起こすことができるか実験分析のための興味深い候補である任意のインフルエンザＡウイルス株を含む。非常に多数のインフルエンザＡ単離物が部分的または完全に配列判定されている。付録Ａは、公的データベース（Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ＩＳＤ）（Ｍａｃｋｅｎ，Ｃ．，Ｌｕ，Ｈ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．，＆  Ｂｏｙｋｉｎ，Ｌ．，’’Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．’’ｉｎ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＩＶ  Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，Ｎ．Ｃｏｘ  ＆  Ａ．Ｗ．Ｈａｍｐｓｏｎ（Ｅｄｓ．）Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，１０３−１０６）を参照のこと）に示されているインフルエンザＡゲノムセグメントの完全な配列表の一部のみを示す。このデータベースは、インフルエンザＢおよびＣゲノムセグメントの完全な配列も含む。ユーザーがゲノムセグメント、ウイルスに感染した種、および単離年によって検索可能な従来の検索エンジンと共にＵＲＬがｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／のワールド・ワイド／ウェブのデータベースが利用可能である。Ｇｅｎｂａｎｋのインフルエンザ配列も利用可能である。従って、インフルエンザの遺伝子配列は、当業者が容易に利用可能であるか判定可能である。
【００２５】
本明細書中で使用される、「単離された」は、１）通常天然に会合した少なくともいくつかの構成要素から分離されること、２）人の手を含むプロセスによって調製または精製されること、および／または３）天然に存在しないことを意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される、「リガンド」は、抗原−抗体相互作用以外の機構によって炭水化物部分などの第２の分子（典型的には、ポリペプチドまたはその一部）に特異的に結合する分子を意味する。この用語は、例えば、ポリペプチド、ペプチド、および小分子（天然に存在するか合成されたその構造が人によって発明された構造を有する合成された分子）を含む。この用語は、相互作用して典型的にはその活性を調整する受容体および分子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）の文脈で使用されるが、本明細書中で使用されるこの用語をより一般的に適用する。
【００２７】
本明細書中で使用される、「作動可能に連結された」は、１つの核酸配列の発現が他の核酸配列によって調節、制御、調整などが行われる２つの核酸配列間の関係をいう。例えば、作動可能に連結されたプロモーター配列によって核酸配列の転写が指示される；作動可能に連結されたプロセシング配列によって核酸の転写後プロセシングが指示される；作動可能に連結された翻訳調節配列によって核酸配列の翻訳が指示される；作動可能に連結された輸送体または局在化配列によって核酸またはポリペプチドの局在化が指示される；および、作動可能に連結されたプロセシング配列によってポリペプチドの翻訳後プロセシングが指示される。好ましくは、第２の核酸配列に作動可能に連結された核酸配列はこのような配列と直接または間接的に共有結合するが、任意の有効な三次元会合が許容可能である。
【００２８】
本明細書中で使用される、「精製された」は、多数の他の化合物または物質から分離したことを意味する。化合物または物質は、部分的に精製されているか、実質的に精製されているか、純粋であり得る（実質的に全ての他の化合物または物質から取り出された場合に純粋なものであり得る（すなわち、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて純粋である））。
【００２９】
用語「調節配列」は、作動可能に連結された配列の発現（特に、転写であるが、いくつかの場合、スプライシングまたは他のプロセスなどの他の事象）を指示、強化、または阻害する核酸配列領域を説明するために本明細書中で使用される。この用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節エレメントが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、調節配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示することができ、他の実施形態では、調節配列は、組織特異的および／または誘導性発現を指示することができる。例えば、哺乳動物細胞での使用に適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、リンパ特異的プロモーター（例えば、Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５，１９８８の（Ｔ細胞受容体（例えば、Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：７２９，１９８９を参照のこと）および免疫グロブリン（例えば、Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９，１９８３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：７４１，１９８３を参照のこと）のプロモーターなど）およびニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３，１９８９）が含まれる。成長調節プロモーター（例えば、マウスホックスプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４，１９９０）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７，１９８９）が含まれる）も含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、調節配列は、感染性因子に感染した細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示することができる。例えば、調節配列は、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスポリメラーゼ、転写因子など）によって認識されるウイルス特異的プロモーターまたはエンハンサーなどのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。あるいは、調節配列は、鼻腔、気道、および／または肺中の上皮細胞で活性なプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。
【００３０】
本明細書中で使用される、用語「ＲＮＡｉ誘導性物質」は、細胞内での存在によりＲＮＡｉが得られ、ＲＮＡｉ誘導性物質がターゲティングされる転写物の発現を減少させるＲＮＡ分子およびベクター（人の手によって改変されていない天然に存在する分子）を含む。この用語には、特に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉ誘導性ベクターが含まれる。
【００３１】
本明細書中で使用される、「ＲＮＡｉ誘導性ベクター」は、細胞内での存在により１つまたは複数のＲＮＡが転写され、自己ハイブリッド形成または互いにハイブリッド形成してｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成するベクターである。本発明の種々の実施形態では、この用語は、細胞内での存在により１つまたは複数のＲＮＡが産生され、自己ハイブリッド形成または互いにハイブリッド形成してｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成するプラスミド（例えば、ＤＮＡベクター（その配列がウイルス由来の配列エレメントを含み得る）またはウイルス（人の手によって改変されていない天然に存在するウイルスまたはプラスミド以外））を含む。一般に、ベクターは、ベクターが細胞内に存在する場合にハイブリッド形成または自己ハイブリッド形成してｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つまたは複数のＲＮＡ分子が転写されるように発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含む。したがって、ベクターは、ＲＮＡまたはその前駆体の細胞内合成のためのテンプレートを提供する。ＲＮＡｉの誘導のために、細胞内のウイルスゲノムの存在（例えば、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合後）は、細胞内にウイルスを存在させるのに十分であると見なされる。さらに、ＲＮＡｉの誘導のために、細胞内に移入されるか、細胞に侵入するか、親細胞から遺伝した場合、その後細胞内で修飾またはプロセシングするかに関係なく、ベクターは細胞内に存在すると見なされる。ＲＮＡｉ誘導性ベクターは、細胞内のベクターの存在により１つまたは複数のＲＮＡが産生され、互いにハイブリッド形成するか自己ハイブリッド形成して転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが形成される場合（すなわち、細胞内のベクターの存在によって転写物にターゲティングされた１つまたは複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生される場合）、転写物にターゲティングされたものと見なされる。
【００３２】
短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、約１９塩基対長であるＲＮＡ二重鎖を含み、必要に応じて１つまたは２つの一本鎖突出部をさらに含む。ｓｉＲＮＡを、互いにハイブリッド形成する２つのＲＮＡ分子から形成することができるか、自己ハイブリッド形成部分を含む１つのＲな分子から作製することができる。一般に、ｓｉＲＮＡ分子の遊離の５’末端はリン酸基を有し、３’末端は水酸基を有することが好ましい。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分は、１つまたは複数の非対合ヌクレオチドからなる１つまたは複数のバルジを含み得るが、典型的には含まない。ｓｉＲＮＡの１つの鎖には、標的転写物とハイブリッド形成する部分が含まれる。本発明の一定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的転写物領域と正確に相補的であり、これは、ｓｉＲＮＡが１つもミスマッチせずに標的転写物とハイブリッド形成することを意味する。本発明の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡと標的転写物のターゲティング部分との間の１つまたは複数のミスマッチが存在し得る。完全に相補的ではない本発明のほとんどの実施形態では、一般に、任意のミスマッチをｓｉＲＮＡ末端またはその付近に位置付けることが好ましい。
【００３３】
用語「短ヘアピンＲＮＡ」は、ＲＮＡｉの媒介に十分な長さの（典型的には、少なくとも１９塩基対長）二本鎖（二重鎖）構造を形成するためにハイブリダイズしたかハイブリッド形成することができる少なくとも２つの相補部分およびループを形成する典型的には約１ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間の少なくとも１つの一本鎖部分を含むＲＮＡ分子をいう。二重鎖部分は、１つまたは複数の非対合ヌクレオチドからなる１つまたは複数のバルジを含み得るが典型的には含まない。以下にさらに記載するように、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡにプロセシングされると考えられる。したがって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、一般に、同様に標的転写物の発現を阻害することができる。
【００３４】
本明細書中で使用される、用語「特異的結合」は、標的ポリペプチド（または、より一般的には標的分子）と抗体、リガンド、アゴニスト、またはアンタゴニストなどの結合分子との間の相互作用をいう。相互作用は、典型的には、結合分子によって認識される抗原判定基またはエピトープなどの標的ポリペプチドの特定の構造特徴の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープＡに特異的である場合、エピトープＡを含むポリペプチドの存在または遊離の標識されたＡおよびその抗体の両方を含む反応における遊離の非標識Ａの存在により、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。特異性は、絶対ではないが、一般に、結合する状況をいうと理解すべきである。例えば、多数の抗体が標的分子中に存在するエピトープに加えて、他のエピトープと交差反応することが当該分野で周知である。このような交差反応は、抗体が使用される適用に依存して許容可能である。当業者は、任意の所与の適用（例えば、治療目的などのための標的分子の検出のため）において適切に実施するために十分な特異性を有する抗体を選択することができる。標的ポリペプチドの結合分子の親和性に対する他の標的（例えば、競合物）の結合分子の親和性などのさらなる要因の状況で評価することができるとも理解すべきである。結合分子が検出が所望される標的分子に対して抗親和性を示し、且つ非標的分子に対して低親和性を示す場合、抗体は、免疫診断目的のための許容可能な試薬である可能性が高い。１つまたは複数の状況で一旦結合分子の特異性が確立すると、その特性を再評価することなく他の（好ましくは、類似の）状況で使用することができる。
【００３５】
本明細書中で使用される、用語「被験体」とは、感染性因子に感染しやすい個体（例えば、インフルエンザウイルスなどのウイルスに感染しやすい個体）をいう。この用語には、トリおよび動物（例えば、家禽類および家畜（ニワトリ、哺乳動物（ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど）などが含まれる）、野生動物、非ヒト霊長類、およびヒト）が含まれる。
【００３６】
ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの配列は、１）標的転写物の安定性が、その非存在下での場合と比較してｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在下で減少する場合、および／または２）ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも約１７、さらにより好ましくは少なくとも約１８または１９から約２１〜２３個のヌクレオチドのストレッチについての標的転写物と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％正確な配列相補性を示す場合、および／または３）ｓｉＲＮＡの１つの鎖またはｓｈＲＮＡの自己相補部分の１つが、インビトロで小（５０ヌクレオチド未満）ＲＮＡ分子のストリンジェントなハイブリッド形成条件下および／または哺乳動物の細胞質もしくは核内で典型的に見出される条件下で標的転写物とハイブリッド形成する場合に本明細書中に記載の目的のための標的転写物にターゲティングされたものと見なされる。細胞内でのその存在により転写物にターゲティングしたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生されるＲＮＡ誘導性ベクターも標的転写物にターゲティングされると見なされる。転写物のターゲティング効果は転写物の合成を指示する遺伝子の発現を減少または阻害することであるため、遺伝子自体（すなわち、ゲノムＤＮＡ）が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または細胞サイレンシング機構の構成要素と相互作用しないと考えられる場合でさえ、転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡも転写物の合成を指示する遺伝子をターゲティングすると見なす。したがって、本明細書中で使用されるように、転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターは、転写物合成のためのテンプレートを提供する遺伝子をターゲティングすると理解される。
【００３７】
本明細書中で使用される、「治療」には、疾患、障害、もしくはこのような用語が適用される病態、またはこのような疾患、障害、もしくは病態の１つまたは複数の徴候もしくは発症の進行の逆転、緩和、阻害、または可能性の防止もしくは減少が含まれる。
【００３８】
一般に、用語「ベクター」とは、細胞への第２の核酸分子の侵入（例えば、導入、輸送など）を媒介することができる核酸分子をいう。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結される（例えば、挿入される）。ベクターは、自律複製を指示する配列を含み得るか、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに十分な配列を含み得る。有用なベクターには、例えば、プラスミド（典型的にはＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡプラスミドも公知である）、コスミド、およびウイルスベクターが含まれる。当該分野で周知なように、用語「ウイルスベクター」は、典型的には核酸分子の導入もしくは組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、プラスミド）または核酸導入を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子（例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスが含まれる）のいずれかをいうことができる。当業者に自明なように、ウイルスベクターは、核酸に加えて種々のウイルス構成要素を含み得る。
【００３９】
（本発明の一定の好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．インフルエンザウイルスの生活環および特徴）
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のエンベロープで包まれたマイナス鎖のＲＮＡウイルスである。これらは、インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型に分類され、インフルエンザＡは病原性が最も高く、動物株内で再集合を受けることができる唯一の型と考えられている。インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型を、その核タンパク質および基質タンパク質の相違によって区別することができる（図１を参照のこと）。以下でさらに考察されるように、インフルエンザＡサブタイプを、その血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子の変化によって定義し、通常、対応するタンパク質に結合する抗体によって区別する。
【００４０】
インフルエンザＡウイルスゲノムは、８つのＲＮＡセグメント中に分布した１０個の遺伝子からなる。遺伝子は、以下の１０個のタンパク質をコードする：エンベロープ糖タンパク質血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、基質タンパク質（Ｍ１）、核タンパク質（ＮＰ）、本明細書中でポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体とも呼ばれるＲＮＡ依存性ＲＮＡ転写酵素の構成要素である３つのポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）、イオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）。インフルエンザＡウイルスおよびその分子病原性については、Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２：１７１−１８０，２００１を参照のこと。Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４．ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；ＩＳＢＮ：０７８１７１８３２５，２００１も参照のこと。さらなる詳細については、インフルエンザＢウイルスゲノムの組織化は、インフルエンザＡのそれと非常に類似しているが、インフルエンザＣウイルスゲノムは、７個のＲＮＡセグメントを含み、ＮＡ遺伝子を欠く。
【００４１】
インフルエンザＡウイルス分類は、血球凝集素（Ｈ１〜Ｈ１５）およびノイラミニダーゼ（Ｎ１〜Ｎ９）遺伝子に基づく。世界保健機関（ＷＨＯ）の命名法により、各ウイルス株を各株をその期限となる動物宿主（ヒトでない場合に指定する）、地理的起源、株数、単離年、ならびにＨＡおよびＮＡの抗原についての説明によって定義する。例えば、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、１９３４にプエルトリコでヒトで発生したＡ株の単離物８を示し、且つＨＡおよびＮＡの抗原のサブタイプ１を有する。別の例として、Ａ／Ｃｈｉｋｅｎ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）は、１９９７年にホンコンでニワトリで発生したＡ株の単離物２５８を示し、且つＨＡのサブタイプ５およびＮＡのサブタイプ１を有する。ヒトでの流行は、ＨＡのＨ１、Ｈ２、およびＨ３型およびＮＡのＮ１型およびＮ２型を有するウイルスに起因した。
【００４２】
上記のように、インフルエンザウイルスＡにおいて２つの主な機構によって遺伝子が変化する。点変異を介して遺伝的浮動が起こり、これは、宿主免疫応答由来の選択圧によって抗原的に有意な位置でしばしば起こり、遺伝的シフト（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｈｉｆｔ）（再集合ともいう）は、１つのサブタイプの全ウイルスゲノムセグメントから別のものへの置換を含む。多数の異なる動物種型（ヒト、ブタ、トリ、ウマ、水生動物などが含まれる）が、インフルエンザＡウイルスで感染されるようになり得る。いくつかのインフルエンザＡウイルスは、特定の種に限定され、通常、他の種に感染しない。しかし、いくつかのインフルエンザＡウイルスは、いくつかの異なる動物種（主にトリ（特に渡り鳥）、ブタ、およびヒト）に感染し得る。この能力は、インフルエンザＡウイルスの主な抗原不連続変異を担うと見なされる。例えば、ブタがヒト由来のインフルエンザＡウイルスに感染するようになるとすると、同時にアヒル由来の異なるインフルエンザＡウイルスに感染するようになる。２つの異なるウイルスがブタ細胞で再生される場合、ヒト株およびアヒル株の遺伝子を「混合」することができ、ＲＮＡセグメントの固有の組み合わせを有する新規のウイルスが得られる。このプロセスは、遺伝子の再集合と呼ばれる。（遺伝子再集合型は、減数分裂時に染色体間で起こる遺伝情報の交換と異なることに留意のこと。）
他のウイルスおよび一定の細菌種と同様に、インフルエンザウイルスは細胞内で複製される。インフルエンザＡウイルスは、上気道の上皮細胞で複製される。しかし、単球／マクロファージおよび他の白血球にも感染することができる。シアル酸含有細胞表面糖タンパク質を含む多数の他の細胞型は、ウイルスが受容体としてこれらの分子を使用するため、インビトロで感染しやすい。
【００４３】
インフルエンザＡ感染／複製サイクルを、図１に示す。図１Ａに示すように、インフルエンザＡビリオン１００は、以下のマイナス鎖ＲＮＡセグメントからなるゲノム１０１を含む：ＰＢ２（１０２）、ＰＢ１（１０３）、ＰＡ（１０４）、ＨＡ（１０５）、ＮＰ（１０６）、ＮＡ（１０７）、Ｍ（１０８）、およびＮＳ（１０９）。従来は以下のように１〜８の番号を付けている：ＰＢ２＝１、ＰＢ１＝２、ＰＡ＝３、ＨＡ＝４、ＮＰ＝５、ＮＡ＝６、Ｍ＝７、およびＮＳ＝８。ゲノムＲＮＡセグメントは、エンベロープ糖タンパク質ＨＡ（１４０）およびＮＡ（１５０）の細胞外ドメインならびにイオンチャネルＭ２（１６０）が突き出した脂質二重層１３０に囲まれた膜タンパク質Ｍ１（１２０）の膜内にパッケージングされている。ＲＮＡセグメント（１０２〜１０８）は、核タンパク質ＭＰ（１７０）で覆われており（図１５により詳細に図示する）、ポリメラーゼＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡからなるウイルスポリメラーゼ複合体１８０を含む。非構造タンパク質ＮＳ１（示さず）は、感染細胞内で発見される。非構造タンパク質ＮＳ２  １９０もまた、ビリオン内で発見される。
【００４４】
図１Ｂは、インフルエンザウイルスのゲノム構造およびインフルエンザゲノムから作製した転写物を示す（大きさを考慮しない）。８個のゲノムＲＮＡセグメントのうちの６個（ＰＢ１（１０２）、ＰＢ２（１０３）、ＰＡ（１０４）、ＨＡ（１０５）、ＮＰ（１０６）、ＮＡ（１０７））はそれぞれ対応するタンパク質をコードする１つの非スプライシング転写物のテンプレートとして作用する。以下の３つのｍＲＮＡ転写物は、インフルエンザＡセグメントＭ（１０８）に由来すると同定された：Ｍ１タンパク質をコードする共線的（ｃｏｌｉｎｅａｒ）転写物１９１、Ｍ２タンパク質をコードし、且つ６８９個のヌクレオチドイントロンを含むスプライシングｍＲＮＡ（１９２）、およびウイルス感染細胞で検出されなかった９アミノ酸ペプチド（Ｍ３）をコードする能力を有する別のスプライシングｍＲＮＡ（１９３）。以下の２つのｍＲＮＡ転写物は、インフルエンザウイルスＡセグメントＮＳに由来する：ＮＳ１タンパク質をコードする非スプライシングｍＲＮＡ（１９４）およびＮＳ２タンパク質をコードし、且つ４７３ヌクレオチドイントロンを含むスプライシングｍＲＮＡ（１９５）。
【００４５】
感染サイクル（図２）は、ビリオン１００がその血球凝集素を介してシアル酸含有細胞表面タンパク質との相互作用によって感染しやすい細胞の表面に攻撃した場合に開始される。攻撃されたウイルスは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して被覆小胞にエンドサイトーシスされる。エンドソームの低ｐＨにより、ウイルスとエンドソーム膜との融合を誘発し、それによりウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＰ）複合体（ヌクレオキャプシド）２１０が細胞質に遊離する。ウイルスヌクレオキャプシドが細胞核にインポートされ、その後ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡポリメラーゼからなるウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体によって一次ウイルスｍＲＮＡ合成が開始される。宿主細胞前ｍＲＮＡに対するＰＢ２タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性によって産生されたプライマーを使用して、テンプレートとしてウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）２２０を使用したウイルスｍＲＮＡ合成を開始する。ＰＢ１タンパク質は、細胞質に輸送されて翻訳されるウイルス特異的ｍＲＮＡ２３０の合成を触媒する。
【００４６】
新規に合成されたポリメラーゼＮＰ、ＮＳ１、およびＮＳ２は核に輸送され、複製および二次ウイルスｍＲＮＡ合成を調節する。ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）由来の相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰによって開始され、その後新規のｖＲＮＡ分子（２５０）が合成される。ウイルスポリメラーゼ複合体は、二次ｍＲＮＡ（２６０）の合成のためのテンプレートとしてこれらのｖＲＮＡを使用する。したがって、ウイルスコード転写酵素によるｖＲＮＡの転写により、ウイルスタンパク質合成のためのテンプレートとして作用するｍＲＮＡが産生され、５’キャップおよび３’ポリＡテールの欠如がｍＲＮＡと異なり、且つ新規のビリオン産生のためにより多くのｖＲＮＡを合成するためのテンプレートとして作用する相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）も産生される。感染後期では、ＮＳ１タンパク質は、ＭおよびＮＳのｍＲＮＡのスプライシングを調節し、それによりＭ２およびＮＳ２のｍＲＮＡが産生される。ウイルスｍＲＮＡが細胞質に輸送され、ウイルス構造タンパク質２７０が産生される。タンパク質ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰが核（ｖＲＮＡ複合体（ヌクレオキャプシド）２８０のアセンブリ部位）に輸送される。Ｍ１およびＮＳ２タンパク質は核にも輸送されるため、これらはｖＲＮＰと相互作用してその核輸送を調節する。ウイルスｖＲＮＡ−Ｍ１タンパク質複合体は、原形質膜でＨＡおよびＮＡ分子の細胞質部分と相互作用し、成熟ビリオンが出芽し、ウイルス粒子が放出される。
【００４７】
インフルエンザＡウイルスは細胞内で急速に複製され、細胞溶解効果またはアポトーシスによって宿主細胞が死滅する。感染により広範な種々の細胞活動およびプロセスが変化する（宿主細胞遺伝子発現の阻害が含まれる）。ウイルスポリメラーゼ複合体は、核内で新規に合成された細部ポリメラーゼＩＩ転写物に結合して切断する。ＮＳ１タンパク質は、細胞前ｍＲＮＡスプライシングを遮断し、宿主ｍＲＮＡの核輸送を阻害する。細胞ｍＲＮＡの翻訳が非常に阻害されるのに対して、ウイルスｍＲＮＡは有効に翻訳される。細胞インターフェロン（ＩＦＮ）応答（典型的にはウイルス感染細胞における翻訳を阻害するように作用する宿主応答）のウイルス下方制御によってウイルスｍＲＮＡの有効な翻訳が一部維持される。特に、ウイルスＮＳ１タンパク質は、ＩＦＮ誘導性ＰＫＲに結合し、その活性を阻害する。したがって、インフルエンザウイルスの感染により細胞生合成において著しく変化する（細胞ｍＲＮＡのプロセシングおよび翻訳の変化が含まれる）ことが明らかである。
【００４８】
感染細胞は、ウイルスの蔓延を制限するための多数の方法で応答する。いくつかの転写因子系（核因子κＢ（ＮＦκＢ）、活性化タンパク質（ＡＰ）−１、インターフェロン調節因子、シグナル伝達因子、および転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）、および核因子−ＩＬ−６などが含まれる）が活性化される。これらの転写因子経路の活性化により、炎症細胞の感染部位への移動を刺激し、多数の抗ウイルス効果を発揮し、ウイルス感染に対する免疫応答の役割を果たす化学走性、炎症性、および抗ウイルス性のサイトカインが得られる。Ｉ型（ＩＦＮ−α／β）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８は、インフルエンザＡウイルス感染上皮細胞によって産生されたサイトカインのうちの１つである。インフルエンザＡウイルス感染単球／マクロファージにより、種々のさらなるサイトカイン（ＭＩＰ−１α／β、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＩＰ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１８）が産生される。
【００４９】
一般に、インフルエンザＡウイルス感染から約２０〜４０時間後に、ウイルス複製、ウイルス粒子の産生、ウイルスタンパク質合成の継続、および宿主タンパク質合成の遮断の結果として細胞の細胞溶解死が起こる。アポトーシスに特徴的な変化（例えば、クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化、細胞収縮、およびマクロファージによるアポトーシス細胞のクリアランス）も明らかである。
【００５０】
（ＩＩ．ｓｉＲＮＡの選択、設計、および合成）
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを含む組成物を提供する。上記のインフルエンザウイルス複製サイクルの説明として、種々のウイルスＲＮＡ転写物型（一次および二次ｖＲＮＡ、一次および二次ウイルスｍＲＮＡ、ならびにウイルスのＲＮＡ）がインフルエンザウイルスに感染された細胞内に存在し、ウイルスの生活環で重要な役割を果たすことを証明する。任意のこれらの転写物は、本発明の直接または間接的機構のいずれかによるｓｉＲＮＡ媒介阻害の適切な標的である。任意のウイルスｍＲＮＡ転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡにより、直接的様式で（すなわち、転写物の分解によって）転写物自体のレベルが減少する。さらに、以下で考察するように、一定のウイルス転写物（例えば、ＮＡ、ＰＡ、ＰＢ１）をターゲティングするｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡにより、特異的にターゲティングされないウイルス転写物のレベルが間接的に減少する。別のスプライシングが可能な状況では、Ｍ１およびＭ２をコードするｍＲＮＡならびにＮＳ１およびＮＳ２をコードするｍＲＮＡに関して、非スプライシング転写物またはスプライシング転写物は、標的転写物として作用し得る。
【００５１】
本発明のＲＮＡｉベースの治療のための標的として作用し得る潜在的なウイルス転写物には、例えば、１）任意のインフルエンザウイルスゲノムセグメント、２）タンパク質ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ  １、ＮＳ２、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、またはＮＡをコードする転写物を含む任意のウイルスタンパク質をコードする転写物が含まれる。認識されるように、転写物を、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡによってそのｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡ形態にターゲティングすることができるが、以下でさらに考察するように、本発明者らは、ウイルスｍＲＮＡが唯一または主なＲＮＡｉの標的であることが示唆されるデータを得た。
【００５２】
選択された任意の特定の遺伝子標的のために、本発明で使用するためのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの設計は、一定のガイダンスに従うことが好ましい。一般に、ウイルスに特異的であり（宿主と比較して）、且つ好ましくはウイルス機能に重要または不可欠な配列をターゲティングすることが望ましい。一定のウイルスゲノム、特にＨＡおよびＮＡをコードする遺伝子は高変異率によって特徴付けられ、且つ変異を許容することができるにもかかわらず、一定の領域および／または配列は保存される傾向がある。本発明の一定の実施形態によれば、このような配列は特に適切な標的であり得る。以下にさらに記載するように、このような保存領域を、例えば、文献の再検討および／またはインフルエンザ遺伝子配列の比較（そのうちの多数が公的に利用可能である）によって同定することができる。また、多くの場合、本発明の細胞に送達される因子は、活性な抑制因子（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）となる前に１つまたは複数のプロセシング工程を受け得る（さらなる考察については以下を参照のこと）；この場合、当業者は、そのプロセシングに必要であり得る配列を含むように関連因子を設計することが好ましいと認識する。
【００５３】
本発明者らは、本明細書中に記載の設計パラメーターを使用して選択した配列の有意な比率は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ中に含まれ、且つ下記のように試験した場合に有効な抑制配列であることを示すことを見出した。約１５％の試験ｓｉＲＮＡは高い効果を示し、インフルエンザウイルスのＰＲ８またはＷＳＮ株のいずれかに感染した細胞におけるウイルス産生が阻害された；約４０％が有意な効果を示した（すなわち、ＰＲ８に感染した細胞および／またはＷＳＮに感染した細胞におけるｓｉＲＮＡの存在下と非存在下との間のウイルス産生の統計的有意差（ｐ＜０．５））；約４５％が効果なし、または最小の効果を示した。したがって、本発明は、少なくとも２つの異なるインフルエンザウイルスサブタイプのいずれかに感染した細胞のウイルス産生を阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを提供する。
【００５４】
本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの一般的および特異的な特徴を本明細書中に記載する。短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＷＯ０１／７５１６４に記載のドロソフィラにおけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）減少の研究において最初に発見された。特に、ドロソフィラでは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ様酵素（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３，２００１）によって長い二本鎖ＲＮＡが２１ｎｔ鎖（それぞれ５’リン酸基および３’水酸基を有し、且つ２ｎｔ−３’突出部に隣接した１９ｎｔの二重鎖領域が存在するように他の鎖と正確に相補的な１９ｎｔ領域を含む）から構成されるより小さなｄｓＲＮＡにプロセシングされることが見出された。図３は、ドロソフィラで見出されたｓｉＲＮＡの略図を示す。この構造は、センス鎖３１０およびアンチセンス鎖３１５を含む１９ヌクレオチド二本鎖（ＤＳ）部分３００を含む。各鎖は、２ｎｔの３’突出部を有する。
【００５５】
おそらく、ヘリカーゼ活性によりｓｉＲＮＡ中の１９ｂｐ二重鎖が解かれ、ｓｉＲＮＡの１つの鎖と標的転写物との間に別の二重鎖が形成されるため、これらの単ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ鎖の１つに相補的な領域を含む任意の遺伝子の発現をサイレンシングするように作用する。次いで、この新規の二重鎖は、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）にガイドし、１つの位置で切断（「スライス」）されて細胞機構によって即座に分解される非保護ＲＮＡ末端が得られる（図４）。下記のように、単ＲＮＡ種（ミクロＲＮＡ）によって媒介されるさらなるサイレンシング機構も公知である（例えば、Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，７９７−７９９，２００１；Ｚｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，９，１−２０，２００２を参照のこと）。機構およびこれらを示した図の考察は、本発明の作用機構にいかなる制限も与えないことを意図することに留意のこと。
【００５６】
ヒトからＣ．エレガンスまでの範囲の種々の種でＤＩＣＥＲ酵素のホモログが見出されており（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５；４８５，２００１；Ｚａｍｏｒｅ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：７４６，２００１）、ＲＢＡｉ様機構が種々の異なる細胞型（哺乳動物細胞、さらにはヒト細胞）での遺伝子発現をサイレンシングすることができる可能性が高まっている。しかし、長ｄｓＲＮＡ（例えば、約３０〜５０ヌクレオチドより長い二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡ）は、哺乳動物細胞中でインターフェロン応答を活性化することが公知である。したがって、ドロソフィラＲＮＡｉ機構を使用して認められた特異的遺伝子サイレンシングの達成よりもむしろ、哺乳動物細胞中の長ｄｓＲＮＡの存在により、インターフェロンに媒介されて非特異的に翻訳が抑制され、おそらく細胞が死滅する。したがって、長ｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞における特定の遺伝子発現の阻害に有用であると考えられない。
【００５７】
しかし、本発明者らおよび他は、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物に移入した場合、標的遺伝子（ウイルス遺伝子が含まれる）の発現を有効に減少させることができることを見出した。本発明者らは、種々のインフルエンザウイルスＲＮＡ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ転写酵素および核タンパク質ＮＰをコードするＲＮＡが含まれる）にターゲティングされたｓｉＲＮＡにより、感染哺乳動物細胞で産生されるウイルスレベルが劇的に減少したことを示した（実施例２、４、５、６）。本発明者らは、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがインタクトな生物（すなわち、インフルエンザウイルスに感染したニワトリ胚）においてインビボでインフルエンザウイルスの複製を阻害することができることも示した（実施例３）。さらに、本発明者らは、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがウイルス感染前後に投与した場合にマウスでのウイルス産生を阻害することができることを証明した（実施例１２および１４）。さらに、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ前駆体（ｓｈＲＮＡ）を発現することができるＤＮＡベクターの投与によりマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することができることを示した。したがって、本発明は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは細胞内でのその存在によりｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡが発現されるベクターでの投与はインフルエンザウイルスの感染および／または複製の阻害のための有効なストラテジーであることを証明する。
【００５８】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、この所見が、上記のインフルエンザウイルスの感染によって生じる細胞活性（例えば、代謝活性および生合成活性）の著しい変化に照らして特に有用であると示唆する。インフルエンザウイルス感染は、細胞ｍＲＮＡのスプライシング、輸送、および翻訳のような基本的細胞プロセスを阻害し、それにより細胞タンパク質合成を阻害する。これらの変化にもかかわらず、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡはウイルス複製を阻害するという所見により、遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介阻害の基礎をなす細胞機構はインフルエンザ遺伝子発現の阻害に十分なレベルでインフルエンザウイルスに感染した細胞で操作しつづけると示唆される。
【００５９】
本発明で使用するための好ましいｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、約１９ｎｔ長の塩基対合領域を含み、必要に応じて１つまたは複数の遊離またはループ状の末端を有し得る。例えば、図５は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡとして使用することができる種々の構造を示す。図５Ａは、上記のドロソフィラ系で活性であることが見出された構造を示し、哺乳動物細胞中で活性なｓｉＲＮＡ種を示し得る。本発明は、インフルエンザ感染を治療または防止するための哺乳動物細胞に図５Ａに記載の構造を有するｓｉＲＮＡの投与を含む。しかし、投与した因子がこの構造を有する必要はない。例えば、投与した因子がインターフェロン応答などの望ましくないまたは有害な事象を引き起こさない限り、投与した組成物はインビボで図５Ａの構造にプロセシングすることができる任意の構造を含み得る。（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成、プロセシング、または活性に関して本明細書中で使用される、用語「インビボ」は、一般に、無細胞系と対照的に細胞内で起こる事象をいうことに留意のこと。一般に、細胞を組織培養物中に保存することができるか、インタクトな生物の一部であり得る。）本発明はまた、このような因子が本明細書中で考察したウイルス転写物レベルを大幅に減少させる限り、図５Ａに示す構造に正確にプロセシングされない因子の投与を含み得る。
【００６０】
図５Ｂおよび５Ｃは、ＲＮＡ干渉を媒介するために使用することができるさらなる構造を示す。これらのヘアピン（ステム−ループ）構造は、阻害ＲＮＡとして直接機能することができるか、図５ＡなどのｓｉＲＮＡ構造を得るために細胞内でプロセシングスすることができる。図５Ｂは、互いにハイブリッド形成してステム４００、ループ４１０、および突出部３２０として示す二重鎖領域を形成する２つの相補領域を含むＲＮＡ分子を含む因子を示す。このような分子を自己ハイブリッド形成するといい、この種の構造をｓｈＲＮＡという。好ましくは、ステムは約１９ｂｐ長であり、ループは約１〜２０ｎｔ長、より好ましくは４〜１０ｎｔ長、最も好ましくは約６〜８ｎｔ長であり、そして／あるいは突出部に関しては、約１〜２０ｎｔ、より好ましくは２〜１５ｎｔ長である。本発明の一定の実施形態では、ステムは、最小で１９ヌクレオチド長であってよく、約２９ヌクレオチド長までであってよい。当業者は、４ヌクレオチドまたはそれ以上のループはより短いループよりも立体障害に供する可能性が低いため、好ましいと認識する。いくつかの実施形態では、突出部は５’リン酸基および３’水酸基を含む。以下で考察されるように、図５Ｂに示す構造を有する因子を、インビボまたはインビトロ転写によって容易に作製することができる；いくつかの好ましい実施形態では、突出部中に転写物テールを含み、それによりしばしば突出部は、例えば１Ｕ残基と５Ｕ残基との間に複数のＵ残基を含む。哺乳動物系で研究した合成ｓｉＲＮＡはしばしば２個の突出部Ｕ残基を有することに留意のこと。ｓｈＲＮＡ構造の例については、図２０および２１も参照のこと。その阻害が所望される標的転写物に相補的な領域（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の５’末端または３’末端のいずれかにループを位置付けることができる。
【００６１】
図５Ｃは、約１９ｂｐ長のステム４００の形成に十分な相補エレメントを含むＲＮＡサークルを含む因子を示す。このような因子は、本明細書中に記載の種々の他のｓｉＲＮＡと比較して改良された安定性を示すことができる。
【００６２】
ｓｉＲＮＡの説明では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をいうことが都合がよい場合が多い。一般に、以下でさらに考察するように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の二重鎖部分の配列は、標的転写物のターゲティングされた部分と実質的に同一であるが、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はこの領域中の標的転写物と実質的に相補的である。ｓｈＲＮＡが自己ハイブリッド形成する１つのＲＮＡ分子を含むにもかかわらず、得られた二重鎖構造はセンス鎖およびアンチセンス鎖またはその一部を含むと見なすことができると認識される。したがって、アンチセンス鎖またはその一部が二重鎖を形成するか形成することができ、且つ実質的に標的転写物のターゲティング部分に相補的であり、センス鎖またはその一部が二重鎖を形成するか形成することができ、且つ実質的に標的転写物のターゲティング部分に配列が相補的である場合、ｓｈＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖またはセンス部分およびアンチセンス部分をいうことが本明細書中で都合がよい。
【００６３】
説明のために、以下の考察では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡよりもむしろｓｉＲＮＡをいうことが多い。しかし、当業者に明らかなように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖に関連する技術は、一般に、対応するｓｈＲＮＡのステム部分のセンス部分およびアンチセンス部分に適用可能である。したがって、以下の検討材料を本発明のｓｈＲＮＡの設計、選択、および送達にも適用する。
【００６４】
図５に示す任意の構造または本明細書中に記載の任意の他の有効な構造を有する因子は、全体が天然のＲＮＡヌクレオチドから構成され得るか、その代わりに１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含むことが当業者に認識される。広範な種々のこのようなアナログが当該分野で公知である；ホスホロチオエートが治療用核酸の研究で最も一般的に使用されている（ホスホロチオエートを使用した場合に関与する検討材料のいくつかの検討については、例えば、Ａｇａｒｗａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８９：５３，１９９９を参照のこと）。特に、本発明の一定の実施形態では、例えば、エキソヌクレアーゼによる消化を減少させるために１つまたは複数の遊離鎖末端にヌクレオチドアナログの封入ことによってｓｉＲＮＡ構造を安定化させることが望ましい。１つまたは複数の遊離末端でのデオキシヌクレオチド（例えば、デオキシチミジンなどのピリミジン）の封入を本目的に使用することができる。あるいはまたはさらに、特にｓｉＲＮＡの１つの鎖（またはｓｈＲＮＡのステム部分の１つの鎖）と標的転写物との相互作用によって形成される任意のハイブリッドと比較して１９ｂｐステムの安定性の増減させるために１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含めることが望ましい。
【００６５】
本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで必要に応じて種々のヌクレオチド修飾を使用する。例えば、アンチセンス鎖で未修飾リボヌクレオチドを使用し、センス鎖のいくつかまたは全部の位置で修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾もしくは未修飾デオキシリボヌクレオチドを使用することが好ましい。ｓｉＲＮＡがウイルスｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、および／またはｃＲＮＡをターゲティングするかどうかを判定するためのセンス鎖中のヌクレオチドの２’位を修飾したｓｉＲＮＡの使用を記載した実施例５を参照のこと。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖の二重鎖部分で未修飾リボヌクレオチドのみを使用し、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の突出部は修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。本発明の一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ鎖の一方または両方は、１つまたは複数のＯメチル化リボヌクレオチドを含む。
【００６６】
多数のヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド修飾物が当該分野で公知であり、ハイブリッド形成およびヌクレアーゼ耐性などの性質に対するすその効果を調査した。例えば、塩基、糖、およびヌクレオシド間結合に対する種々の修飾を選択した位置のオリゴヌクレオチドに移入し、得られた効果を未修飾オリゴヌクレオチドと比較した。多数の修飾により、相補核酸とハイブリッド形成する能力、その安定性などのオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の態様を変化させることが示されている。例えば、有用な２’修飾には、ハロ基、アルコキシ基、およびアリルオキシ基が含まれる。米国特許第、６，４０３，７７９号；同第６，３９９，７５４；同第６，２２５，４６０号；同第６，１２７，５３３号；同第６，０３１，０８６号；同第６，００５，０８７号；同第５，９７７，０８９号、およびその引用文献は、本発明の実施で使用することができる広範な種々のヌクレオチドのアナログおよび修飾物を開示する。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（ｅｄ．）’’Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’（ｌｅｓｔｅｄ），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７０５６６１；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）およびその引用文献も参照のこと。当業者によって認識されるように、アナログおよび修飾物を、ウイルス遺伝子の発現が有効に減少したものを選択するために、例えば、本明細書中に記載のアッセイまたは他の適切なアッセイを使用して試験することができる。ｓｉＲＮＡの文脈で有用であることが見出された修飾のさらなる考察については、引用文献１３７〜１３９を参照のこと。本発明は、このような修飾物の使用を含む。
【００６７】
本発明の一定の実施形態では、アナログまたは修飾物により、吸収性が増加した（例えば、粘膜を透過する吸収性の増加、経口吸収の増加）、血流または細胞内での安定性が増加した、細胞膜の透過能力が増加したｓｉＲＮＡなどが得られる。当業者によって認識されるように、アナログまたは修飾物によってＴｍを変化させることができ、それによりｓｉＲＮＡ配列と標的との間のミスマッチの耐性が増大させる一方でさらに有効に抑制することができるか、所望の標的転写物に対し特異的に安定性を増加または減少させることができる。
【００６８】
本発明で使用するための有効なｓｉＲＮＡ分子がヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログではない１つまたは複数の部分を含み得ることが当業者にさらに認識される。
【００６９】
一般に、本発明のｓｉＲＮＡの１つの鎖は、好ましくは、標的転写物の一部で見出される領域と実質的に相補的な領域（「阻害領域」）を含み、その結果インビボでｓｉＲＮＡの１つの鎖または一部（アンチセンス鎖）と標的転写物との間に正確なハイブリッドを形成することができる。ｓｈＲＮＡ構造を使用する本発明のこれらの実施形態では、この実質的に相補的な領域は、好ましくは、図５Ｂに示すステム構造のほとんどまたは全部を含む。本発明の一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの関連阻害領域は、標的転写物と完全に相補的である；他の実施形態では、１つまたは複数の非相補残基はｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖内に存在する。ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖の一定の部分中でのミスマッチを回避することが好ましい（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ  ２０：６８７７，２００１（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００７０】
一般に、好ましいｓｉＲＮＡは、標的転写物にエクソン配列を含む標的部位とハイブリッド形成する。イントロン配列とのハイブリッド形成は除外されないが、一般に、哺乳動物細胞では好ましくないようである。本発明の一定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例外的にエクソン配列とハイブリッド形成する。本発明のいくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１つのエクソン内に唯一の配列を含む標的部位とハイブリッド形成する；他の実施形態では、一次転写物のスプライシングまたは他の修飾によって標的部位を作製する。一般に、転写物をスプライシングおよび分解するｓｉＲＮＡとのハイブリッド形成に利用可能な任意の部位を、本発明にしたがって使用することができる。それにもかかわらず、当業者は、いくつかの例では、ｓｉＲＮＡハイブリッド形成標的として標的転写物の特定の領域を選択することが望ましいことを認識する。例えば、分解されることが望ましくない他の転写物と共有し得る標的転写物の選択を回避することが望ましい。一般に、転写物のコード領域および５’末端よりも３’末端により近い領域が好ましい。
【００７１】
種々のアプローチにしたがって、ｓｉＲＮＡを選択することができる。一般に、上記のように、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、標的転写物の一部（「標的部分」）で見出される領域と完全に相補的であるか実質的に相補的である領域（「阻害領域」または「二重鎖領域」）を含み、その結果インビボでｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的転写物との間にハイブリッドを形成することができる。「コア領域」とも呼ばれるこの二重鎖領域は突出部を含まないと理解されているが、存在する場合、突出部はまた、標的転写物と相補的であり得る。好ましくは、図３、４、および５に示す二本鎖構造のほとんどまたは全部を含む。ｓｉＲＮＡの関連阻害領域は、好ましくは標的転写物と完全に相補的である。しかし、１つまたは複数の非相補残基を含むｓｉＲＮＡもサイレンシングの媒介を示したが、阻害度は、標的転写物と完全に相補的な二重鎖部分を有するｓｉＲＮＡを使用して達成可能な阻害度未満であり得る。一般に、ｓｉＲＮＡ二重鎖部分の３’側の半分のミスマッチによりｓｉＲＮＡ二重鎖部分の５’側の半分のミスマッチよりも阻害効果があまり減少しないようである。
【００７２】
本明細書中の説明のために、ｓｉＲＮＡコア領域の長さは１９ヌクレオチドであると予想され、１９ヌクレオチド配列はＮ１９という。しかし、コア領域は、１５〜２９ヌクレオチド長の範囲であり得る。さらに、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のコア領域（すなわち、標的転写物と相補的な部分）が標的転写物と完全に相補的であるようにｓｉＲＮＡ  Ｎ１９阻害領域を選択すると予想されるが、上記のように、１つまたは複数のミスマッチを許容することができる。一般に、古典的な経路を介した標的転写物の発現を減少させる最大の能力を有するｓｉＲＮＡが望ましい場合、二重鎖領域中のミスマッチを回避することが望ましい。しかし、下記のように、標的転写物の発現を減少する最大能力未満のｓｉＲＮＡを選択することが望ましいか、別の経路を介して作用するｓｉＲＮＡを使用することが望ましい。このような状況では、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分に１つまたは複数のミスマッチを組み込むことが望ましい。一般に、好ましくは、阻害領域中の４個未満の残基または約１５％未満の残基が標的とミスマッチする。
【００７３】
いくつかの場合、全アンチセンス鎖（存在する場合、３’突出部を含む）が標的転写物と完全に相補的であるようにｓｉＲＮＡ配列を選択する。しかし、突出部が必ずしも標的転写物と相補的であるか同一ではない。任意の所望の配列（例えば、ＵＵ）を、ｓｉＲＮＡのアンチセンスおよび／またはセンス１９ｂｐコア領域の３’末端に付加して３’突出部を作製することができる。一般に、１つまたは複数のピリミジン（通常、Ｕ、Ｔ、またはｄＴ）を含む突出部を使用する。ｓｉＲＮＡの合成時、ＵよりもむしろＴを使用するほうがより都合がよい一方で、ＴよりもむしろｄＴを使用して安定性を増加させることができる。上記のように、突出部の存在は選択的であり、存在する場合、標的配列自体といかなる関係も有する必要がない。ｓｈＲＮＡは１つのみの３’末端を有し、１つのみの３’突出部によりプロセシング前にｓｉＲＮＡを形成することが可能であることに留意のこと。
【００７４】
まとめると、一般に、標的転写物中の適切な長さ（例えば、１９ｎｔ）の任意のコア領域の選択ならびにその配列がコア領域と実質的または完全に相補的なアンチセンス鎖およびその配列がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を有するｓｉＲＮＡの選択によって、ｓｉＲＮＡを設計することができる。次いで、上記などの３’突出部を、これらの配列に付加してｓｉＲＮＡ構造を作製することができる。したがって、アンチセンス鎖中の突出部が標的転写物と相補的であることまたはセンス鎖中の突出部が標的転写物中に存在する配列に対応する必要はない。一般に、従来通りにｃＤＮＡがＵよりもむしろＴを含むこと以外は、ｃＤＮＡのセンス鎖がｍＲＮＡと同一であるため、標的転写因子がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡ配列自体よりもむしろ二本鎖ｃＤＮＡの対応する配列を参照してｓｉＲＮＡ配列を選択することができると認識される。（インフルエンザウイルス複製サイクルの文脈では、二本鎖ｃＤＮＡは作製されず、細胞中に存在するｃＤＮＡは一本鎖であり、ウイルスｍＲＮＡと相補的であることに留意のこと。）
全てのｓｉＲＮＡが任意の特定の標的遺伝子の発現の減少または阻害に等しく有効とは限らず（例えば、異なるｓｉＲＮＡの有効性の変動性を報告したＨｏｌｅｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０（８）：１７５７−１７６６を参照のこと）、種々の検討材料を使用して、選択したｓｉＲＮＡが有効である可能性を増加させることができる。例えば、イントロンよりもむしろエクソン内の標的部分を選択することが好ましい。一般に、標的転写物の３’末端付近の標的部分は、標的転写物の５’末端または中央付近の部分をターゲティングすることが好ましい。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ８００２６（ＲＮＡ試薬の販売業者）から市販されているＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｂ，’’ｓｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒＲＮＡｉ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’に記載の原理に従ってｓｉＲＮＡを設計することができる。ＤｈａｒｍａｃｏｎのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ  ＃００３  （ワールド・ワイド・ウェブ（ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ００３Ｂ．ｈｔｍｌ）でアクセス可能）およびｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ００４．ｈｔｍｌで利用可能な＃００４は、ｓｉＲＮＡ設計パラメーター、合成などに関連する種々の情報を含み、本明細書中で参考として援用される。使用することもできるさらなる設計の検討材料は、Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．１１，ｐｐ．６３４７−６３５２に記載されている。
【００７５】
本発明の１つの態様は、感染性因子の複数の株、サブタイプなど（集合的に変異型という）が存在する場合、異なる変異型の間で高度に保存された領域をターゲティングするｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを選択および／または設計することがしばしば望ましいという認識である。特に、十分な数の配列の比較および高度に保存された領域の選択により、その二重鎖部分がこのような高度に保存された領域を含む１つのｓｉＲＮＡを有する複数の変異型をターゲティングすることが可能である。一般に、このような領域は、ｓｉＲＮＡの全二重鎖部分および必要に応じて１つまたは複数の３’突出部を含むのに十分な長さ（例えば、１９ヌクレオチド）のはずであるが、二重鎖の全長よりも短い領域を使用することもできる（例えば、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド）。本発明の一定の実施形態によれば、配列間で同一の場合、領域は複数の変異型の間で高度に保存される。本発明の一定の実施形態によれば、変異型の間で多くとも１つのヌクレオチド（すなわち、０または１ヌクレオチド）が異なる場合、領域（ｓｉＲＮＡの二重鎖部分に含めるべき長さの全て（例えば、１５、１６、１７、１８、または好ましくは１９ヌクレオチド））は高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、変異型の間で多くとも２つのヌクレオチド（すなわち、０、１、または２ヌクレオチド）が異なる場合、このような領域は複数の変異型の間で高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、変異型の間で多くとも３つのヌクレオチド（すなわち、０、１、２、または３ヌクレオチド）が異なる場合、領域は複数の変異型の間で高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、少なくとも５個の変異型、少なくとも１０個の変異型、少なくとも１５個の変異型、少なくとも２０個の変異型、少なくとも２５個の変異型、少なくとも３０個の変異型、少なくとも４０個の変異型、もしくは少なくとも５０個またはそれ以上の変異型の間で高度に保存されている領域をターゲティングする二重鎖部分を含む。
【００７６】
領域が複数の変異型組の間で高度に保存されているかどうかを判定するために、以下の手順を使用することができる。配列組の１つのメンバーを塩基配列（すなわち、他の配列と比較する配列）として選択する。典型的には、塩基配列の長さは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分に所望される長さである（例えば、１５、１６、１７、１８、または好ましくは１９ヌクレオチド）。本発明の異なる実施形態によれば、塩基配列は、比較される配列の１つであり得るか、例えば、各位置について組中の配列の間のその位置で最も頻繁に見出されるヌクレオチドの判定による由来するコンセンサス配列であり得る。
【００７７】
塩基配列が選択されると、複数の変異型組の各メンバーの配列を塩基配列と比較する。塩基配列間の相違数および配列の領域を超えた任意の数の複数の変異型組を使用して、塩基配列およびその数が目的の特定の領域を超えて高度に保存されているかどうかを判定する。上記のように、本発明の種々の実施形態では、２つの領域の間の配列相違数が０；０もしくは１、０、１、もしくは２；または０、１、２、もしくは３である場合、配列は高度に保存されていると見なす。相違が生じた位置で、塩基配列または他の配列の１つと同一のｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。一般に、塩基配列中に存在するヌクレオチドを選択する。しかし、本発明の一定の実施形態では、特に、比較される組中の第２の配列中の特定の位置に存在するヌクレオチドが塩基配列中のヌクレオチドよりも比較される配列中でより多く見出される場合、第２の配列と同一のｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。さらに、本発明の一定の実施形態によれば、相違が生じた位置のコンセンサスヌクレオチド（最も一般的に存在するヌクレオチド）が塩基配列中で見出されたものと異なる場合、コンセンサスヌクレオチドを使用することができる。これにより、比較した任意の配列と同一ではない配列を得ることができることに留意のこと（塩基配列としてコンセンサス配列の使用と同様）。
【００７８】
実施例１は、ヒト宿主起源の６つのインフルエンザＡ株由来の配列組の比較および異なる動物宿主（ヒトが含まれる）由来の７つのインフルエンザＡ株由来の配列組の比較を示す。高度に保存された領域の異なる選択方法を使用することができると理解すべきである。しかし、本発明は、どのようにして高度に保存された領域を選択するかに関係なく、その二重鎖領域（および必要に応じてｓｉＲＮＡ中に含まれる任意の突出部）が本明細書中に提供された基準を満たす高度に保存された領域に基づくｓｉＲＮＡを含む。本発明は、本明細書中に記載の高度に保存された領域の基準を満たさないインフルエンザウイルス転写物の一部にターゲティングされたｓｉＲＮＡを含むことも理解すべきである。このようなｓｉＲＮＡは高度に保存された領域にターゲティングされたものよりも好ましくないが、その転写物がターゲティングされるウイルスのためのインフルエンザウイルス産生に対する依然として有効なインヒビターである。
【００７９】
表１Ａは、各ウイルス遺伝子セグメントにごとのインフルエンザウイルス配列組の間で高度に保存された２１ヌクレオチド領域を列挙している。表１Ａ中の配列を、Ｕの代わりにＴを使用すること以外はウイルスｍＲＮＡ中に存在する配列に従って５’→３’方向に列挙する。数字は、ウイルスゲノム中の配列の位置を示す。例えば、ＰＢ２−１１７／１３７は、セグメントＰＢ２中の１１７位から１３７位に及ぶ配列を示す。本発明の一定の実施形態によれば、これらの配列の基づいてｓｉＲＮＡを設計するために、ｓｉＲＮＡセンス鎖配列のコア領域としてヌクレオチド３〜２１を選択する。ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部をそれぞれに付加する。対応するアンチセンス鎖として各配列のヌクレオチド１〜２１と相補的な配列を選択する。例えば、高度に保存された配列ＰＡ−４４／６４（すなわち、ＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧ（配列番号２２））に基づいてｓｉＲＮＡを設計する場合、配列ＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧ（配列番号１０９）を有する１９ｎｔのコア領域を選択する。ｄＴｄＴからなる２ｎｔ３‘の突出部を付加し、（ＴからＵへの置換後に）配列５’−ＵＧＣＵＵＣＡＡＵＣＣＧＡＵＧＡＵＵＧｄＴｄＴ−３’（配列番号７９）が得られる。これは、ｓｉＲＮＡセンス鎖の配列である。アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖配列（５’→３’方向）は、配列番号２２（すなわち、ＣＡＡＵＣＡＵＣＧＧＡＵＵＧＡＡＧＣＡｄＴｄＴ（配列番号８０））（ＴがｄＴに置換される２ｎｔの３’突出部以外はＴがＵに置換されている）と相補的である。センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を、表１Ａに列挙した各配列から簡単に得ることができる。２０個のこのようなｓｉＲＮＡ配列を、表２に列挙する。
【００８０】
表１Ａに列挙した各配列は、１９ｎｔ領域（ｎｔ３〜２１）および対応するｓｉＲＮＡのセンス鎖中に存在しないがｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’突出部と相補的な最初の２ｎｔ配列を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかまたは両方に異なる３’突出部を有する種々のｓｉＲＮＡ分子を設計するために、１９ｎｔヌクレオチドを使用することができると認識される。表１Ａに列挙した各配列中のヌクレオチド３〜２１は、左から右に５’→３’方向で列挙したｓｉＲＮＡのセンス配列に対応する。対応するアンチセンス配列は、列挙した配列のヌクレオチド１〜２１と相補する。したがって、これらの配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とのハイブリッド形成によって（センス鎖配列に３’ＯＨ突出部が付加され、両配列中でＴがＵに置換されている）、１９塩基対のコア二重鎖領域（各鎖は２ヌクレオチドの３’ＯＨ突出部を有する）を有するｓｉＲＮＡが得られる。しかし、上記説明によれば、表１Ａに示した配列を使用して、この構造を正確に有さない種々のｓｉＲＮＡを設計することができる。例えば、突出部配列を変化させることができ、突出部の１つまたは両方の存在は遺伝子配列の有効なｓｉＲＮＡ媒介阻害に不可欠ではないかもしれない。さらに、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分の好ましい長さは１９ヌクレオチドであり得るが、より短いまたはより長い二重鎖部分も有効であり得る。したがって、表１Ａに示す高度に保存された配列にしたがって設計されたｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖中の３位と２１位との間の領域中のこれらのヌクレオチドのいくつかのみを含み得る。（用語「ｂｅｔｗｅｅｎ」に後に値の範囲がある場合、その範囲は終点を含むことに留意のこと）。
【００８１】
表１Ｂは、インフルエンザウイルスの高度に保存された領域に基づいて設計したさらなるｓｉＲＮＡを列挙する。センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を、５’→３’方向で示す。ｄＴｄＴ３’突出部を各鎖に付加する。表１Ｂに列挙した各センス鎖配列中のヌクレオチド１〜１９は、インフルエンザウイルス転写物の高度に保存された領域と同一の配列を有する。対応するアンチセンス配列は、センス鎖と相補的である。以下の説明のために、「高度に保存された領域」は、表１Ａに列挙した任意の配列中のヌクレオチド３〜２１または表１Ｂに列挙した任意のセンス鎖のヌクレオチド１〜１９をいう。これらは、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ中で二重鎖形態で存在する。これらの領域の配列を、「高度に保存された配列」という。
【００８２】
本発明は、表１Ａおよび１Ｂに列挙した高度に保存された配列の全部または一部を含む配列を含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを提供する。本発明は、さらに、表１Ａおよび１Ｂに列挙した高度に保存された配列の全部または一部を含む配列を含むセンス部分を有するｓｈＲＮＡを提供する。簡単に述べれば、以下の考察は、ｓｉＲＮＡを説明している。しかし、本発明は、ｓｈＲＮＡのセンス部分が表１Ａおよび１Ｂに列挙した高度に保存された配列の全部または一部を含む、対応するｓｈＲＮＡを含むと理解すべきである。
【００８３】
一般に、表１Ａまたは１Ｂに示す高度の保存された配列に従って設計されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙した高度に保存された配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。一般に、表１Ａまたは１Ｂに示す高度の保存された配列に従って設計されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、列挙した高度に保存された配列の一部と完全に相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。したがって、本発明は、相補的である標的転写物の一部に関して表１Ａまたは表１Ｂ中の高度に保存された配列由来の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、９ヌクレオチドまで）を「シフトした」ｓｉＲＮＡを含む。
【００８４】
本発明の一定の実施形態では、表１Ａまたは表１Ｂ中に示す高度に保存された配列にしたがって設計されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙された配列由来の１つのヌクレオチドの相違を有する高度に保存された配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。本発明の一定の実施形態では、表１Ａまたは表１Ｂ中に示す高度に保存された配列にしたがって設計されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、１つのヌクレオチドが相違している他は、高度に保存された配列の一部と完全に相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【００８５】
本発明の一定の実施形態では、表１Ａまたは表１Ｂ中に示す高度に保存された配列にしたがって設計されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、列挙された配列由来の２つのヌクレオチドの相違を有する高度に保存された配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。本発明の一定の実施形態では、表１Ａまたは表１Ｂ中に示す高度に保存された配列にしたがって設計されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列は、２つのヌクレオチドが相違し得る高度に保存された配列と相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。
【００８６】
本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、少なくとも２つの異なる種の生物を天然に感染させた変異体で高度の保存された二重鎖を含む。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、少なくとも２つの異なる種の生物を起源とする変異型で高度に保存された二重鎖部分を含む。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、少なくとも３つの異なる種、少なくとも４つの異なる種、または少なくとも５つの異なる種を起源とする変異型で高度に保存された二重鎖部分を含む。種は、ヒト、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））、トリ（例えば、アヒル、ニワトリ）、およびブタなどを含み得る。本発明の一定の好ましい実施形態では、種にはヒトが含まれる。多数の感染性因子の場合（例えば、多数の以前に同定されたインフルエンザＡサブタイプ）、サブタイプの特定の種の宿主に感染する能力は公知である。さらに、多数のインフルエンザサブタイプ起源の種は、サブタイプの名称に影響を与えることが公知である。当業者は、感染性因子が任意の特定の宿主種に天然に感染するかどうか、および／または文献の再検討もしくはインフルエンザＡウイルスのサブタイプに対して使用されている方法のいずれかによって因子の種の起源を判定することができる。異なる年数で単離した変異型および／または異なるＮＡおよびＨＡサブタイプを発現する変異型を選択することも望ましい。例えば、実施例１に記載のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの二重鎖部分の高度に保存された配列を選択するために使用された変異型は、ヒトおよび広範な異なる動物起源から単離した変異型を含んでいた。変異型は、異なる年数において単離したウイルスおよび公知のＨＡおよびＮＡサブタイプのほとんど全てを発現するウイルスを含んでいた。
【００８７】
本発明の一定の実施形態によれば、感染性因子は、そのゲノムは複数の独立した核酸セグメント（例えば、複数の独立したＲＮＡセグメント）を含む。一般に、二重鎖部分は、複数の変異型で高度に保存された少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含んでいた。好ましくは、二重鎖部分は、複数の変異型で高度に保存された少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含んでいた。本発明の一定の実施形態によれば、二重鎖部分は、複数の変異型で高度に保存されている１９個の連続したヌクレオチドを含む。二重鎖部分に加えて、ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の鎖上に３’突出部を含み得る。ｓｉＲＮＡのセンス鎖突出部は、標的領域の標的転写物の３’に存在する配列と同一であり得る（しかし、本発明の一定の実施形態によれはその必要はない）。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖中の突出部は、標的転写物の標的部分の５’末端のすぐ近くのヌクレオチドと相補的であり得る（しかし、本発明の一定の実施形態によれはその必要はない）。突出部は、本明細書中に記載の１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであり得る。
【００８８】
当業者は、ｓｉＲＮＡは上記原理に従って融点（Ｔｍ）および解離温度（Ｔｄ）の範囲を示し得ると認識する。Ｔｍは、５０％の核酸およびその完全な相補物が溶液中で二重鎖である温度と定義し、Ｔｄは、特定の塩濃度での温度と定義し、５０％のオリゴヌクレオチドおよびその完全なフィルター結合相補物が二重鎖である全鎖濃度は、１つの分子がフィルター上に固定された条件に関する。当該分野で周知の方法（本明細書中の実施例に開示のｓｉＲＮＡに基づいた実験または適切な実験または理論に由来する方式のいずれか）を使用して、許容可能なＴｍの代表的な例を容易に判定することができる。
【００８９】
実際のＴｍを判定するための１つの共通の方法は、ＵＶ分光光度計において恒温細胞（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｔｅｄ  ｃｅｌｌ）を使用することである。吸光度に対して温度をプロットした場合、Ｓ字カーブのプラトーが２箇所存在する曲線が見られる。プラトー間の中間を読み取った吸光度がＴｍに相当する。Ｔｄの最も簡単な式は、Ｗａｌｌａｃｅの法則：Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．；Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｊ．；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｆ．；Ｂｏｎｎｅｒ，Ｊ．；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６，３５４３（１９７９））である。固定化標的鎖の性質により、標的およびプローブの両方が溶液中で遊離している場合の値と比較して認められるＴｍの正味の減少が得られる。減少の程度は約７〜８℃である。１価のカチオンの濃度の適切な値の範囲内でｐＨ５〜９の５０ヌクレオチドよりも長い配列に有用なＤＮＡの別の有用な式は、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇＭ＋４１（ＸＧ＋ＸＣ）−５００／Ｌ−０．６２Ｆ（式中、Ｍは１価のカチオンのモル濃度であり、ＸＧおよびＸＣは配列中のＧおよびＣのモル比率であり、Ｌは二重鎖中で最も短い鎖の長さであり、Ｆはホルムアミドのモル濃度である）（Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ；Ｉｓｒａｅｌ，Ｍ．Ｆ．；Ｌａｗ，Ｍ−Ｆ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，４８７６）である。ＲＮＡについての類似の式は、Ｔｍ＝７９．８＋１８．５ｌｏｇＭ＋５８．４（ＸＧ＋ＸＣ）＋１１．８（ＸＧ＋ＸＣ）２−８２０／Ｌ−０．３５Ｆであり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについては、Ｔｍ＝７９．８＋１８．５ｌｏｇＭ＋５８．４（ＸＧ＋ＸＣ）＋１１．８（ＸＧ＋ＸＣ）２−８２０／Ｌ−０．５０Ｆである。これらの式は、固定化された標的ハイブリッドに由来する。いくつかの研究は、最も近い近隣の相互作用についての熱力学的原理を使用してＴｍの正確な式を有する。ＤＮＡおよびＲＮＡの式は、Ｔｍ＝（１０００ΔＨ）／Ａ＋ＡＳ＋Ｒｌｎ（Ｃｔ／４）−２７３．１５＋１６．６ｌｎ［Ｎａ＋］（式中、ＡＨ（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、ハイブリッドの最も近い近隣のエンタルピーの変化の合計であり、Ａ（ｅｕ）はヘリックス開始の修正を含む定数であり、ΔＳ（ｅｕ）は最も近い近隣のエントロピーの変化の合計であり、ＲはＧａｓ定数（１．９８７ｃａｌ  ｄｅｇ−１ｍｏｌ−１）であり、Ｃｔは鎖の総モル濃度である）である。鎖自体が相補的である場合、Ｃｔ／４をＣｔに置換する。熱力学的パラメーターについての値は、文献に記載のものを利用可能である。ＤＮＡについては、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３７４６−３７５０，１９８６を参照のこと。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖については、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４  （３５）：１１２１１−６，１９９５を参照のこと。ＲＮＡについては、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３，９３７３−９３７７，１９８６．Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２１），６４０９−６４１２，１９９０���参照のこと。Ｔｍ計算のための種々のコンピュータプログラムは広範に利用可能である。例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ．のウェブサイトを参照のこと。
【００９０】
一定のｓｉＲＮＡは、３’ＵＴＲ配列を含むか完全にこれからなる標的部位とハイブリッド形成する。このようなｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖中の非常に多数のミスマッチを許容することができ、特に二重鎖の中央領域内のミスマッチを許容することができる。例えば、１つまたは両方の鎖は、図６に示すバルジを形成する１つまたは複数の「余剰の」ヌクレオチドを含み得る。典型的には、完全な相補性のストレッチは、少なくとも５ヌクレオチド長（例えば、６、７、またはそれ以上のヌクレオチド長）であり、ミスマッチ領域は、例えば、１、２、３、または４ヌクレオチド長であり得る。標的転写物とハイブリダイズした場合、このようなｓｉＲＮＡは、ミスマッチ領域によって分離された２つの完全な相補性ストレッチを頻繁に含む。種々の構造が可能である。例えば、ｓｉＲＮＡは、複数の非同一性領域（ミスマッチ）を含み得る。非同一性領域（ミスマッチ）は、対称である必要はない（すなわち、標的およびｓｉＲＮＡは共に非対合ヌクレオチドを含むことは必要でない）。
【００９１】
いくつかのミスマッチは、３’ＵＴＲ中のｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖形成により古典的なＲＮＡ阻害に関連するが異なる機構によってテンプレート転写物によってコードされたタンパク質の発現を阻害することができる。特に、テンプレート転写物の３’ＵＴＲに結合するｓｉＲＮＡは、その安定性の減少よりもむしろ転写物の翻訳を減少させることができるということが示唆される証拠がある。具体的には、図６に示すように、上記で考察されたドロソフィラ系および種々の生物においてｓｉＲＮＡを作製するＤＩＣＥＲ酵素は、小さな一過性のＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）基質を、標的転写物の３’ＵＴＲ内で結合した場合に転写物の翻訳を遮断する因子にプロセシングすることもできる（Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０６，２３−２４，２００１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４−８３８，２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，２６５４−２６５９を参照のこと）。本発明の目的のために、本明細書中に記載の任意の部分的または全ての二本鎖単ＲＮＡ（そのうちの１つの鎖が標的転写物に結合してその発現を減少させる（すなわち、転写レベルを減少させ、そして／または転写物によってコードされるポリペプチドの合成を減少させる））は、ＲＮＡが分解の誘発、翻訳の阻害、または他の手段のいずれによるかに関係なく、ｓｉＲＮＡであると見なす。本発明の一定の好ましい実施形態では、転写物の発現の減少は、転写物の分解を含む。さらに、このようなｓｉＲＮＡを作製するためにインビボで（すなわち、細胞または生物内で）プロセシングすることができる任意の前駆体構造（例えば、本明細書中に記載される短ヘアピンＲＮＡ）は、本発明の実施で有用である。
【００９２】
当業者は、本発明のＲＮＡｉ誘導性因子を、任意の適用可能な技術（インビボまたはインビトロにおける化学合成、酵素、もしくは化学的分解、またはインビボまたはインビトロにおけるテンプレートの転写が含まれるが、これらに限定されない）に従って調製することができると容易に認識する。上記のように、本発明のＲＮＡ誘導性因子を、自己相補性部分を含む１つのＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡを得るために細胞内でプロセシングすることができるｓｈＲＮＡ）または互いにハイブリダイズした２つの鎖として送達することができる。例えば、２つの個別の２１ｎｔＲＮＡ鎖を作製することができ（それぞれ互いに相補的な１９ｎｔ領域を含む）、各鎖をハイブリッド形成して図５Ａに示される構造を作製することができる。
【００９３】
あるいは、インビトロまたはインビボのいずれかでのプロモーターからの転写によって各鎖を作製することができる。例えば、２つの異なる転写可能な領域を含む構築物を得ることができ、それぞれ互いに相補的な１９ｎｔ領域を含む２１ｎｔ転写物を作製する。あるいは、２つの異なる転写物（それぞれ少なくとも部分的に互いに相補的である）ように位置付けた対立するプロモーターＰ１およびＰ２ならびにターミネーターｔ１およびｔ２を含む１つの構築物を使用することができる。
【００９４】
別の実施形態では、本発明のＲＮＡ誘導性因子を、例えば、自己相補性領域をコードする１つの転写単位の転写によって１つの転写物として作製する。図８は、本発明のこのような実施形態を示す。示すように、第１および第２の相補性領域を含み、必要に応じてループ領域を含むテンプレートを使用する。このようなテンプレートを、プロモーター（および必要に応じて他の調節エレメント（例えば、ターミネーター））を適切に選択して、インビトロまたはインビボ転写のために使用することができる。本発明は、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ鎖をコードする構築物を含む。
【００９５】
種々の利用可能な系（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている系）を使用してインビトロ転写を行うことができる。当業者に認識されるように、Ｔ７またはＴ３プロモーターの使用は、典型的には、５’末端に２つのＧ残基を有するｓｉＲＮＡ配列が必要であり、ＳＰ６プロモーターの使用は、典型的には、その５’末端にＧＡ配列を有するｓｉＲＮＡ配列が必要である。Ｔ７、ＳＰ６、またはＴ３プロモーターを含むベクターは当該分野で周知であり、ｓｉＲＮＡの転写を指示するために容易に修飾することができる。ｓｉＲＮＡをインビトロで合成する場合、これらをトランスフェクションまたは被験体への送達前にハイブリッド形成させることができる。本発明のｓｉＲＮＡ組成物は完全に二重鎖（ハイブリダイズした）分子からなる必要はないと理解すべきである。例えば、ｓｉＲＮＡ組成物は、少量の一本鎖ＲＮＡを含み得る。例えば、ハイブリッド形成分子と非ハイブリッド形成分子との間の平衡の結果として、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖との比の不均衡、自己相補性ＲＮＡの両方の部分の合成前の転写終結などのためにこれが起こり得る。一般に、好ましい組成物は、少なくとも約８０％の二本鎖ＲＮＡ、少なくとも約９０％の二本鎖ＲＮＡ、少なくとも約９５％の二本鎖ＲＮＡ、またはさらに少なくとも約９９〜１００％の二本鎖ＲＮＡを含む。しかし、ｓｉＲＮＡ組成物は、有効であるのに十分な二本鎖ＲＮＡを含むという条件で８０％未満のハイブリッド形成ＲＮＡを含み得る。
【００９６】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ因子をインビボで作製する場合、一般に、１つまたは複数の転写単位の転写を介して産生することが好ましいと認識する。一次転写物を、遺伝子阻害を達成する最終因子を作製するために（例えば、１つまたは複数の細胞酵素によって）選択的にプロセシングすることができる。適切なプロモーターおよび／または調節エレメントを、哺乳動物細胞中の関連の転写単位を発現するように選択することができるとさらに認識される。本発明のいくつかの実施形態では、調節可能なプロモーターを使用することが望ましく、他の実施形態では、構成的発現が望ましい。ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ前駆体の合成（転写）に関して、本明細書中で使用される、用語「発現」は転写されたＲＮＡの翻訳を意味しないことに留意のこと。
【００９７】
本発明の一定の好ましい実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位のインビボ発現を指示するために使用するプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターである。ＰｏｌＩＩＩは、テンプレート中の４〜５個のＴ残基ストレッチとの遭遇によって終結される小転写物の合成を示す。Ｕ６またはＨ１プロモーターなどの一定のＰｏｌＩＩＩプロモーターは、転写領域内にＣＩＳ作用調節エレメント（最初に転写されたヌクレオチド以外）を必要とせず、したがって、所望のｓｉＲＮＡ配列を容易に選択するため本発明の一定の実施形態において好ましい。天然に存在するＵ６プロモーターでは、最初に転写されたヌクレオチドはグアノシンであり、天然に存在するＨ１プロモーターの場合、最初に転写されたヌクレオチドはアデニンである（例えば、Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９  （９），６０４７−６０５２（２００２）；Ｓｕｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，９９（８），５５１５−５５２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，１６，９４８−９５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０−５５３（２００２）；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｋ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，４９７−５００（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，５０５−５０８（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，４４６−４４８（２００２）を参照のこと）。したがって、本発明の一定の実施形態では（例えば、転写をＵ６プロモーターによって駆動する場合）、好ましいｓｉＲＮＡ配列の５−ヌクレオチドはＧである。本発明の一定の他の実施形態では（例えば、転写をＨ１プロモーターによって駆動する場合）、５’ヌクレオチドはＡであり得る。
【００９８】
本発明の一定の実施形態によれば、ＰｏｌＩＩのプロモーターを、例えば、Ｘｉａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，ｐｐ．１００６−１０１０，２００２に記載のように使用することもできる。これらに記載のように、ヘアピン配列は、転写開始部位およびその後のポリＡカセットと極めて近接して並列した構築物（それにより、転写されたヘアピン中の突出部が最小または全くない）を使用することができる。本発明の一定の実施形態では、上記要件を満たす場合、組織特異的、細胞特異的、または誘導性ＰｏｌＩＩプロモーターを使用することができる。さらに、本発明の一定の実施形態では、ＰｏｌＩのプロモーターを、例えば、（ＭｃＣｏｗｎ２００３）に記載のように使用することができる。
【００９９】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供する構築物（図７および図８など）のインビボ発現を、望ましくは、ベクター（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターなど）への構築物の移入および哺乳動物へのベクターの移入によって行うことができると認識される。任意の種々のベクターを選択することができるが、一定の実施形態では、インフルエンザウイルスに感染しやすい１つまたは複数の細胞に構築物を送達することができるベクターを選択することが望ましい。本発明は、ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡ転写単位を含むベクターならびに１つまたは複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ鎖をコードする転写単位を含むように操作されたこのようなベクターまたは他の物を含む細胞を含む。本発明の一定の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、哺乳動物細胞（例えば、家畜動物の細胞）、最も好ましくはヒト細胞への構築物を発現するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達に適切な遺伝子治療ベクターである。このようなベクターを、ウイルスでの感染によって引き起こされる疾患および条件を予防または治療するためにインフルエンザウイルスへの曝露前後に被験体に投与することができる。本発明のＲＮＡｉ誘導性ベクターを、以下にさらに記載のように種々の送達因子を含む組成物中で送達することができる。
【０１００】
したがって、本発明は、細胞内での存在により１つまたは複数のＲＮＡが転写され、自己ハイブリッド形成または互いにハイブリッド形成して細胞中で少なくとも１つのインフルエンザウイルス転写物の発現を阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成する種々のウイルスおよび非ウイルスベクターを提供する。本発明の一定の実施形態では、２つの個別の相補性ｓｉＲＮＡ鎖を２つのプロモーター（それぞれがｓｉＲＮＡ鎖の転写を指示する（すなわち、転写が起こるようにｓｉＲＮＡのテンプレートに作動可能に連結された））を含む１つのベクターを使用して転写する。２つのプロモーターは、１つのｓｉＲＮＡ鎖のテンプレートに作動可能に連結される場合、同一方向であり得る。あるいは、プロモーターは、プロモーター由来の転写によって２つの相補ＲＮＡ鎖が合成されるように隣接する１つのテンプレートと逆方向であり得る。
【０１０１】
本発明の他の実施形態では、２つの相補的領域を含む１つのＲＮＡ分子（例えば、ｓｈＲＮＡ）の転写を駆動するプロモーターを含むベクターを使用する。本発明の一定の実施形態では、複数のプロモーター（それぞれ２つの相補領域を含む１つのＲＮＡ分子の転写を駆動する）を含むベクターを使用する。あるいは、複数の異なるｓｈＲＮＡ（それぞれ１つのプロモーターまたは複数のプロモータに由来する）を転写することができる。種々の配置が可能である。例えば、１つのプロモーターは、複数の相補領域（それぞれハイブリッド形成して複数のステム−ループ構造を作製する）を含む１つのＲＮＡ転写物の合成を指示することができる。これらの構造を、例えば、ＤＩＣＥＲによって切断して複数の異なるｓｈＲＮＡを作製することができる。このような転写物は、好ましくは転写物の３’末端であるが各ｓｈＲＮＡ単位の間ではない終結シグナルを含むと認識される。複数のｓｉＲＮＡを作製することができる１つのＲＮＡをインビボで産生する必要はないが、インビトロ転写を使用して化学合成するか産生し、外因的に得ることができることも認識される。
【０１０２】
本発明の別の実施形態では、ベクターは、複数のプロモーター（それぞれハイブリッド形成してｓｈＲＮＡを形成する自己相補ＲＮＡ分子の合成を指示する）を含む。複数のｓｈＲＮＡは全て同一の転写物をターゲティングすることができるか、異なる転写物をターゲティングすることができる。ウイルス転写物の任意の組み合わせをターゲティングすることができる。実施例１１は、本発明の一定の実施形態にしたがってインフルエンザウイルス感染の阻害のためにＤＮＡベクターから転写したｓｈＲＮＡの設計および試験の詳細を提供する。図２１を参照のこと。一般に、本発明の一定の実施形態によれば、細胞中で発現されたｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の塩基対合（二重鎖）領域を含む。
【０１０３】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのインビボ発現により長期間（例えば、数日、好ましくは少なくとも数週間から数ヶ月、より好ましくは少なくとも１年またはそれ以上、あるいは一生）にわたりｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを産生する細胞を産生することができることをさらに認識する。このような細胞を、インフルエンザウイルスから無期限に防御することができる。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの細胞内発現を得るために組成物で使用するための好ましいウイルスベクターには、例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが含まれる。例えば、フィロウイルスエンベロープタンパク質シュードタイピングＨＩＶベクターに基づいたベクターを記載したＫｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９（３）：２２５−３０，２００１を参照のこと。Ｌｏｉｓ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：８６８−｜８７２，Ｆｅｂ．１，２００２，ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ＦＵＧＷ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４（９）：４４２０−４４２４，２０００；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８２−６８６，１９９９；および米国特許６，０１３，５１６号も参照のこと。
【０１０５】
本発明の一定の実施形態では、ベクターは、細胞内での存在により１つまたは複数のＲＮＡが転写され、自己ハイブリッド形成または互いにハイブリッド形成して細胞中で少なくとも１つの転写物の発現を阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成する種々のレンチウイルスベクターである。説明のために、ベクターは、Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４０１−４０６，２００３などに記載のレンチウイルスベクターであると予想される。しかし、他のレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターも使用することができると理解すべきである。本発明の種々の実施形態によれば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス導入プラスミドまたはレンチウイルス粒子（例えば、細胞に感染することができるレンチウイルス）のいずれかであり得る。本発明の一定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、プロモーターに作動可能に連結された核酸セグメントを含み、その結果、プロモーター由来の転写（すなわち、プロモーターによって指示される転写）によりハイブリッド形成して標的転写物にターゲティングされたｓｈＲＮＡが作製される相補領域を含むＲＮＡが合成される。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の塩基対合領域を含む。本発明の一定の実施形態によれば、本発明のＲＮＡは、２つを超える相補領域を含むことができ、その結果、自己ハイブリッド形成によりループまたは一本鎖領域によって分離された複数の塩基対合領域が得られる。塩基対合領域は同一または異なる配列を有し得るため、１つの転写物または異なる転写物の同一または異なる領域にターゲティングすることができる。
【０１０６】
本発明の一定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、核酸セグメントに作動可能に連結された反対方向の２つのプロモーターに隣接した核酸セグメントを含み、その結果、プロモーター由来の転写によって互いにハイブリッド形成して標的転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡが作製される２つの相補ＲＮＡが合成される。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは約１９ヌクレオチド長の塩基対合領域を含む。本発明の一定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも２つのプロモーター（２つのプロモーターは核酸セグメントに作動可能に連結される）および少なくとも２つの核酸セグメントを含み、その結果、プロモーター由来の転写により、互いにハイブリッド形成して標的転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡが形成される２つの相補ＲＮＡが合成される。
【０１０７】
上記のように、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス導入プラスミドまたは感染性レンチウイルス粒子（例えば、レンチウイルスまたはシュードタイピングレンチウイルス）であり得る。例えば、レンチウイルス導入プラスミド、レンチウイルス粒子、およびレンチウイルス発現系のさらなる考察については、米国特許第６，０１３，５１６号および引用文献１１３〜１１７を参照のこと。当該分野で周知のように、レンチウイルスはＲＮＡゲノムを有する。したがって、レンチウイルスベクターがレンチウイルス粒子（例えば、感染性レンチウイルス）である場合、ウイルスゲノムはＲＮＡ転写を指示することができるＤＮＡを産生するための逆転写および第２の合成を受けなければならない。さらに、プロモーター、調節エレメントなどのエレメントに関する場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子中でＲＮＡ形態で存在し、本発明のレンチウイルス導入プラスミド中でＤＮＡ形態で存在すると理解すべきである。さらに、ＲＮＡ合成のためのテンプレートがレンチウイルス粒子中に存在するＲＮＡ「によって提供される」場合、ＲＮＡはと理解される。ＲＮＡ合成用（転写）のテンプレートとして作用することができるＤＮＡを産生するための逆転写および第２の合成を受けなければならない。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供するベクターは、このような合成が起こる細胞に移入される場合にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを提供すると見なす。
【０１０８】
本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、任意の利用可能な方法によって細胞に移入することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはこれらをコードするベクターを、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して細胞に移入することができる。本明細書中で使用される、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、細胞に外来核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を移入するための当該分野で認識されている種々の技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、注入、またはエレクトロポレーションが含まれる）をいうことが意図される。下記のように、本発明の１つの態様は、細胞へのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクター（ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターのいずれか）を移入するための種々の送達因子（アルギニンが豊富なペプチド、ヒスチジンが豊富なペプチド、ならびにカチオン性および中性脂質；種々の非カチオン性ポリマー；リポソーム；炭水化物；および界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない）の使用を含む。本発明はまた、任意の種々の方法（例えば、以下でさらに記載されている送達因子への送達強化部分の付加）で修飾した送達因子の使用を含む。
【０１０９】
本発明は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供する本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターを含むように操作された任意の細胞を含む。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞、特にヒトである。最も好ましくは、細胞は気道上皮細胞である。必要に応じて、このような細胞は、インフルエンザウイルスＲＮＡも含む。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、生物内における非ヒト細胞である。例えば、本発明では、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むか発現するように操作されたトランスジェニック動物を含む。このような動物は、本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの機能および／もしくは活性の研究ならびに／またはインフルエンザウイルス感染／複製系の研究に有用である。本明細書中で使用される、「トランスジェニック動物」は、１つまたは複数の動物細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物である。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡまたは好ましくはトランスジェニック動物細胞のゲノムに組み込まれるかこのゲノムで起こる再集合（例えば、内因性染色体ＤＮＡの欠失）である。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の１つまたは複数の細胞型または組織中でコードされたｓｉＲＮＡ産物の発現を指示することができる。好ましいトランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリなどのトリ、および両生類などが含まれる。本発明の一定の実施形態によれば、トランスジェニック動物は、潜在的なインフルエンザ治療の試験のための動物モデル（例えば、マウス、フェレット、または霊長類）として様々に使用される。
【０１１０】
（ＩＩＩ．ウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害）
遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介阻害の１つの一般的特徴はその特異性である。言い換えれば、特定の転写物配列にターゲティングされたｓｉＲＮＡは、典型的に、他の転写物を分解しない。しかし、実施例６に記載のように、本発明者らは、ＮＰ、ＰＡ、またはＰＢ１転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡにより、他のウイルスＲＮＡ（ＮＰまたはＰＡ配列に無関係の配列を含むＲＮＡが含まれる）レベルも減少することを発見した。さらに、実施例５に示すように、ｓｉＲＮＡの直接的な標的はウイルスｍＲＮＡであり、ＮＰまたはＰＡ  ｍＲＮＡの蓄積の阻害に加えて、ＮＰ、ＰＡにターゲティングされたｓｉＲＮＡの投与により対応するｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの蓄積を阻害する可能性が高いようである。実施例７に示すように、これらの効果は、インターフェロン応答またはウイルス転写物のウイルス媒介分解に起因しない。さらに、種々の細胞転写物にほとんど効果がないか全く効果がないため、効果はウイルス転写物に特異的であった。この効果を媒介することができる潜在的な機構を、実施例６で考察する。正確な機構に関係なく、これらの所見は、一定の条件下で、第２の転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡの投与はまた、最初の転写物またはｓｉＲＮＡがターゲティングされない転写物（例えば、第２の転写物に有意な同一性またはホモロジーを欠く第１の転写物）に影響を与えることができることを証明する。特に、第２の転写物によってコードされるタンパク質（または、潜在的には、転写物自体）は第１の転写物の合成、プロセシング、または安定性に関与する場合にこれが起こり得る。
【０１１１】
したがって、本発明は、第２の転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡを投与する工程と、第２の転写物の阻害により第１の転写物が阻害されることとを含む、第１の転写物の阻害方法を提供する。一般に、第１および第２の転写物は、少なくともターゲティングされる第２の転写物の一部と非同一および非相同である。しかし、本発明の種々の実施形態では、第１および第２の転写物は、ターゲティングされる第２の転写物の一部と相同および同一の領域を共有することができる（例えば、ｓｉＲＮＡの１９ヌクレオチド二重鎖部分に対応する部分）。ｓｉＲＮＡが少なくとも５個連続するヌクレオチドに同一な領域を含まない場合、ｓｉＲＮＡは第１の転写物にターゲティングされない。一般に、第２の転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡは、第１の転写物にターゲティングされない。相同または同一の共有領域が存在する場合、このような領域は、標的配列の一部または全部を含み得るがその必要はない。適切な第２の転写物（標的転写物）には、ＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡの安定化で役割を果たす任意の他のタンパク質などのタンパク質をコードするものが含まれる。一般に、用語「阻害」は、転写物のレベルまたは量の減少をいう。しかし、他の阻害メカニズムも含まれる。阻害方法は、直接または間接的であり得る。
【０１１２】
実施例６で考察するように、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＮＰにターゲティングされた転写物がＮＳ、Ｍ、ＮＳ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ遺伝子転写物のｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積レベルを減少させる能力はおそらくこれらの転写物の結合および安定化におけるＮＰタンパク質の重要性の結果であり、Ｎｐ特異的ｓｉＲＮＡがＲＮＡ分解を非特異性にターゲティングすることによらないと示唆する。さらに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＰＡにターゲティングされた転写物がＮＳ、Ｍ、ＮＳ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ遺伝子転写物のｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積レベルを減少させる能力はおそらくウイルス転写物の合成におけるＰＡタンパク質の重要性の結果であり、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＲＮＡ分解を非特異性にターゲティングすることによらないと示唆する。ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡの存在下で、新規に転写されたＰＡ  ｍＲＮＡが分解されてＰＡタンパク質合成が阻害される。インフルエンザビリオン（１）あたり約３０〜６０コピーのＰＡタンパク質（ＲＮＡ転写酵素）の存在にもかかわらず、新規に合成したＰＡタンパク質を使用せずに、さらなるウイルスの転写および複製が阻害される可能性が高い。一定のｓｉＲＮＡが特異的にターゲティングされない転写物のレベルを減少させる能力は他の系で証明されていないと考えられる。
【０１１３】
本発明者らは、他のＲＮＡ分子の安定化またはＲＮＡの合成において役割を果たすタンパク質をコードする標的転写物が感染性因子の成長阻害、複製、感染性などのための好ましい標的であり得ると認識している。したがって、本発明は、標的転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡを投与する工程と、標的転写の阻害により少なくとも１つの他の転写物が阻害されることと、このような他の転写物が因子特異的であることとを含む、感染性因子の成長、感染性、または複製を阻害する方法を提供する。標的転写物は、因子特異的転写物であり得るが、その必要はない。少なくとも１つの他の転写物は、標的転写物と相同領域または同一領域を共有することができるが、その必要はない。相同性領域または同一領域を共有する場合、このような領域は、標的配列の一部または全てを含み得るが、その必要はない。適切な標的転写物には、ＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡの安定化で役割を果たす任意の他のタンパク質などのタンパク質をコードするものが含まれる。適切な標的転写物には、ＲＮＡ合成またはプロセシングで役割を果たすもの（例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素など）も含まれる。
【０１１４】
本明細書中に記載の結果により、一般に、通常因子特異的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質をコードする転写物にターゲティングしたｓｉＲＮＡは、ターゲティングされたＲＮＡレベルの単純な減少よりもむしろ広範な効果（例えば、他の因子特異的転写物に対する効果）を有する可能性が高いことが示唆される。同様に、本明細書中に記載の結果により、一般に、感染性因子のポリメラーゼ遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）にターゲティングされたｓｉＲＮＡがポリメラーゼＲＮＡレベルの単純な減少よりもむしろ広範な効果（例えば、他の因子特異的転写物に対する効果）を有する可能性が高いことが示唆される。
【０１１５】
宿主細胞のＲＮＡよりもむしろ感染因子のＲＮＡを特異的に安定化させるタンパク質をコードする標的転写物により、因子特異的転写物のレベルを選択的に減少させながら宿主細胞の転写物レベルに影響を与えないための機会が得られる。したがって、このようなｓｉＲＮＡの送達により宿主生物の細胞に悪影響を及ぼすと予想される。このアプローチは、宿主細胞のＲＮＡよりもむしろ感染性因子のＲＮＡを特異的に安定化させるタンパク質をコードする転写物にだけでなく、宿主細胞転写物よりもむしろ因子特異的転写物（すなわち、テンプレートが宿主細胞のゲノムよりもむしろ因子のゲノムの一部である転写物）のプロセシング、合成、および／または翻訳の任意の態様に特異的に関連するタンパク質をコードする転写物にも適用する。このようなタンパク質には、宿主細胞転写物ではなく因子特異的転写物の合成、スプライシング、キャッピングに関与するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
（ＩＶ．インフルエンザウイルスを阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの同定および試験）
上記のように、本発明は、インフルエンザウイルスの感染および／または複製のインヒビターとして有用なｓｉＲＮＡを同定するための系を提供する。上記のように、ｓｈＲＮＡのステム構造と同一の配列を有する二重鎖部分を有するｓｉＲＮＡを産生するためにｓｈＲＮＡが細胞内でプロセシングされるため、系は、インフルエンザウイルス感染の阻害剤として有用なｓｈＲＮＡの同定に等しく有用であえる。説明の目的で、区分をｓｉＲＮＡというが、系は対応するｓｈＲＮＡも含む。具体的には、本発明は、ウイルス感染および／または複製を遮断または阻害するためのウイルス遺伝子にターゲティングされたｓｉＲＮＡの首尾のよい調製を証明する。本明細書中で考察されるように、本明細書中に記載の技術および試薬を、他の遺伝子または遺伝子領域にターゲティングされた潜在的な新規のｓｉＲＮＡを設計するために容易に適用し、インフルエンザウイルス感染および／または複製の阻害活性について試験することができる。インフルエンザウイルスは変異および再集合を継続し、新規の異なってターゲティングされたｓｉＲＮＡを開発および試験し続けることが望ましいと予想される。
【０１１７】
本発明の種々の実施形態では、潜在的なインフルエンザウイルスインヒビターを、インフルエンザウイルスゲノムもしくはその一部でのトランスフェクション（例えば、数分内、数時間内、または多くとも数日）の前、同時、もしくは後またはインフルエンザウイルス感染の前、同時、もしくは後に細胞への候補ｓｉＲＮＡの移入（例えば、外因性投与またはｓｉＲＮＡの内因性合成を指示するベクターもしくは構築物の移入）によって試験することができる。あるいは、潜在的なインフルエンザウイルスインヒビターを、インフルエンザウイルスを産生的に感染させた細胞（すなわち、子孫ウイルスを産生する細胞）への候補ｓｉＲＮＡの移入によって試験することができる。次いで、候補ｓｉＲＮＡが標的転写レベルを阻害し、そして／またはウイルスの複製、病原性、および／または感染性などのウイルス生活環の１つまたは複数の態様または特徴を阻害する能力を評価する。例えば、ウイルス粒子の産生および／またはウイルスタンパク質の産生などを、当該分野で周知の方法を使用して直接または間接的に評価することができる。
【０１１８】
本発明のｓｉＲＮＡ組成物が送達された細胞（試験細胞）を、本発明の組成物を投与していない類似または同様の細胞（コントロール細胞（例えば、ｓｉＲＮＡを投与しないか、ＧＦＰなどの非ウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡなどのコントロールＲＮＡを投与した細胞））と比較することができる。試験細胞のインフルエンザウイルス感染感受性を、コントロール細胞の感染感受性と比較することができる。ウイルスタンパク質および／または子孫ウイルスの産生について試験細胞とコントロール細胞とを比較することができる。ウイルス感染性の他の特徴、複製、病原性などを同様に比較することができる。標準的なインビトロ抗ウイルスアッセイは、ウイルスプラーク、ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害、およびウイルス血球凝集素もしくは他のタンパク質、ウイルス産生の阻害を使用することができる。ＣＰＥを目視または色素の取り込みによって判定することができる。Ｓｉｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｍｅｅ，Ｄ．Ｆ，’’インビトロ  ａｎｄ  インビボ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ’’Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ２０００  Ｏｃｔ；４８（１）：１−１６，２０００を参照のこと。一般に、試験細胞およびコントロール細胞は同種に由来し、且つ類似または同一の細胞型に由来する。例えば、同一の細胞株由来の細胞を比較することができる。試験細胞が初代細胞である場合、典型的にはコントロール細胞も初代細胞である。典型的には、同一のインフルエンザ株を使用して、試験細胞とコントロール細胞とを比較する。
【０１１９】
例えば、実施例２に記載のように、候補ｓｉＲＮＡがインフルエンザウイルス産生を阻害する能力を、（ｉ）候補ｓｉＲＮＡの細胞への送達（インフルエンザウイルスへの曝露の前、同時、または後のいずれか）、（ｉｉ）血球凝集素アッセイを使用したウイルス血球凝集素産生のアッセイ、および（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡの存在下で産生された血球凝集素量とｓｉＲＮＡの非存在下での産生量との比較によって都合よく判定することができる。（試験は、ｓｉＲＮＡは存在しないが阻害の非存在下で産生された血球凝集素量に関する以前の情報を使用することができるコントロールを含む必要はない。）血球凝集素量の減少により、ウイルス産生の減少が強く示唆される。このアッセイを使用して、任意のウイルス転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡについて試験を行うことができ、ウイルス血球凝集素をコードする転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡに限定されない。
【０１２０】
候補ｓｉＲＮＡが標的転写物レベルを減少させる能力を、例えば、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析などを使用した標的転写物の量の測定によってアッセイすることもできる。（転写または転写後レベルのいずれかでの）候補ｓｉＲＮＡが標的転写物によってコードされたポリペプチド産生を阻害する能力を、種々の抗体ベースのアプローチ（ウェスタンブロット、免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、タンパク質マイクロアレイなどがあるが、これらに限定されるものではない。）を使用して測定することができる。一般に、標的転写物または標的転写物によってコードされたポリペプチドのいずれかの量の任意の測定方法を使用することができる。
【０１２１】
一般に、一定の好ましいインフルエンザウイルスインヒビターは、インヒビターの非存在下（例えば、インヒビターを欠く比較可能なコントロール細胞）で存在するレベルと比較して少なくとも約１／２、好ましくは少なくとも約１／４、より好ましくは少なくとも約１／８、少なくとも約１／１６、少なくとも約１／６４またはさらにそれ以下に標的転写物レベルを減少させる。一般に、一定の好ましいインフルエンザウイルスインヒビターはウイルス複製を阻害し、その結果、インヒビターを含まないコントロール細胞よりもインヒビターを含む細胞において複製レベルが、少なくとも約１／２、好ましくは少なくとも約１／４、より好ましくは少なくとも約１／８、少なくとも約１／１６、少なくとも約１／６４、少なくとも約１／１００、少なくとも約１／２００、またはさらにそれ以下に低下する。特に、実施例２に記載されるように、本発明者らは、血球凝集素の産生によって測定したところ、ウイルス力価は、単一用量のｓｉＲＮＡ（ＰＢ１−２２５７）を投与したインフルエンザウイルスＡ株／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を感染させた細胞で１／２５６未満に減少し、単一用量のｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６および他）を投与したインフルエンザウイルスＡ株／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を感染した細胞で１／１２０未満に減少することを示した。０．００１のＭＯＩでのプラークアッセイで測定した場合、阻害度（ｆｏｌｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、さらに高くなった（すなわち、少なくとも約１／３０，０００）。０．１のＭＯＩでさえ、ＮＰ−１４９６により、ウイルス産生が約１／２００に阻害された。
【０１２２】
一定の好ましいインフルエンザウイルスインヒビターは、検出可能なウイルス力価の進行が、ｓｉＲＮＡの投与および細胞感染から少なくとも２４時間後、少なくとも３６時間後、少なくとも４８時間後、または少なくとも６０時間後に防止されるようにウイルス複製を阻害する。一定の好ましいインフルエンザウイルスインヒビターにより、ｓｉＲＮＡの投与から少なくとも２４時間後、少なくとも３６時間後、少なくとも４８時間後、または少なくとも６０時間後にウイルス複製が防止（すなわち、検出不可能なレベルへの減少）されるか有意に減少する。本発明の種々の実施形態によれば、ウイルス複製の有意な減少は、ｓｉＲＮＡの非存在下で起こるレベルの約９０％未満の減少、ｓｉＲＮＡの非存在下で起こるレベルの約７５％未満の減少、ｓｉＲＮＡの非存在下で起こるレベルの約５０％未満の減少、ｓｉＲＮＡの非存在下で起こるレベルの約２５％未満の減少、ｓｉＲＮＡの非存在下で起こるレベルの約１０％未満の減少である。ウイルス複製の減少を、任意の適切な方法（ＨＡ力価の測定が含まれるが、これに限定されない）を使用して測定することができる。
【０１２３】
潜在的なインフルエンザウイルスインヒビターを、開発された任意の種々の動物モデルを使用して試験することもできる。候補ｓｉＲＮＡ、宿主細胞内でのこのようなｓｉＲＮＡの合成を指示することができる構築物もしくはベクター、または候補ｓｉＲＮＡを含むように処理または操作した細胞を含む組成物を、インフルエンザウイルスでの感染の前、同時、または後に動物に投与することができる。組成物がウイルス感染を防止し、そして／またはインフルエンザ関連症状の出現を遅延もしくは防止し、そして／または潜在的なインフルエンザインヒビターを投与しなかったインフルエンザ感染動物と比較してその重症度を減少させる能力を評価する。このようなモデルには、インフルエンザ感染のためのネズミ、ニワトリ、フェレット、および非ヒト霊長類モデルが含まれるが、これらに制限されず、これらの全てが当該分野で公知であり、潜在的なインフルエンザ治療薬およびワクチンの有効性の試験に使用される。例えば、上記で引用されたＳｉｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｍｅｅ，Ｄ．Ｆを参照のこと。このようなモデルは、天然に存在するインフルエンザウイルス株および／または特定の宿主中で存在するように改変または適合された株（例えば、マウス中の複製に適合されたＷＳＮまたはＰＲ８株）を含み得る。インビトロおよびインビボでのｓｉＲＮＡ組成物の試験のための方法の考察については、実施例６、７、８、９、および１０を参照のこと。
【０１２４】
（Ｖ．ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉ誘導性ベクターの送達を改良するための組成物）
本発明者らは、有効なＲＮＡｉ治療（一般に、インフルエンザウイルス感染の防止および治療が含まれる）は、インタクトな生物中の細胞へのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの有効な送達によって強化されると認識した。インフルエンザウイルスの場合、このような因子を、通常インフルエンザ感染が起こる気道中の細胞に移入しなければならない。ヒトで使用するために、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの細胞内への取り込みを容易にする非ウイルス法を使用することが好ましい。したがって、本発明は、インタクトな生物（例えば、哺乳動物およびトリ）中の細胞へのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの送達を強化するための任意の種々の非ウイルス送達因子を含む組成物を提供する。本明細書中に記載されるように、「送達」の概念には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターの細胞取り込みおよび細胞内ＲＮＡｉ機構（例えば、エンドソームからのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの放出）に利用可能なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの作製に関与する任意のその後の工程に加えて、身体の侵入部位から機能させる細胞の位置へのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの輸送が含まれる。
【０１２５】
したがって、本発明は、細胞内での存在により、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが産生されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターなどのＲＮＡｉ誘導性因子および任意の種々の送達因子（カチオン性ポリマー、修飾カチオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体（アルギニンまたはヒスチジン豊富なペプチドが含まれる）、脂質（カチオン性脂質、中性脂質、およびその組み合わせが含まれる）、リポソーム、リポポリプレックス、リポポリプレックス（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｌｅｘ）、非カチオン性ポリマー、肺などへの移入に適切なサーファクタントが含まれるが、これらに限定されない）を含む組成物を含む。（上記言語および他の場所の「ｗｈｅｒｅｉｎ」節は、細胞内のベクターの存在の結果として産生されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに加えて、組成物中のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをいうことが意図されることに留意のこと）。インフルエンザウイルス転写物を阻害することが望ましい細胞へのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの送達を増加させるか選択的送達を増加させる部分を組み込むために一定の送達因子を修飾する。本発明の一定の実施形態では、送達因子は生分解性である。本発明での使用に適切な一定の送達因子を以下に記載するか、本願と同日に提出された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｓ」というタイトルの同時係属特許出願（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１２６】
（Ａ．カチオン性ポリマーおよび修飾カチオン性ポリマー）
ＤＮＡトランスフェクションのためのキャリアとしてカチオン性ポリマーベースの系が調査されている（３５）。カチオン性ポリマーがＤＮＡの細胞内への取り込みを促進する能力は、ＤＮＡに結合して巨大なプラスミドＤＮＡ分子をより小さなＤＮＡ／ポリマー複合体に縮合する能力から部分的に生じると考えられる。ＤＮＡ／カチオン性ポリマー複合体はまた、細胞表面糖タンパク質の負電荷のシアル酸残基との静電的相互作用により、生体接着剤としても作用する（３６）。さらに、いくつかのカチオン性ポリマーは、エンドソーム膜の分布およびそれによる細胞質ゾルへのＤＮＡの放出を促進するようである（３２）。したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたＲＮＡｉ誘導性物質および（ｉｉ）カチオン性ポリマーを含む組成物を提供する。本発明は、さらに、哺乳動物被験体にインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたＲＮＡ誘導性物質を含む組成物を投与する工程を含む、標的遺伝子発現の阻害方法を提供する。特に、本発明は、哺乳動物被験体にインフルエンザウイルス転写物をターゲティングするＲＮＡ誘導性物質およびカチオン性ポリマーを含む組成物を投与する工程を含む、インフルエンザウイルス感染の治療および／または防止方法を提供する。本発明の種々の実施形態では、ＲＮＡｉ誘導性物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターである。
【０１２７】
一般に、カチオン性ポリマーは、正電荷のおよその生理学的ｐＨ（例えば、約７．０〜７．６、好ましくは約７．２〜７．６、より好ましくは約７．４のｐＨ範囲）のポリマーである。このようなカチオン性ポリマーには、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン（ＰＬＡ）、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（３７）（例えば、（７６）に記載の直鎖ＰＥＩおよび低分子量ＰＥＩが含まれる）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（３８）、およびキトサン（３９，４０）が含まれるが、これらに限定されない。一定のこれらのポリマーは第１級アミン基、イミン基、グアニジン基、および／またはイミダゾール基と認識される。好ましいカチオン性ポリマーは、比較的毒性が低く、ＤＮＡトランスフェクション効率が高い。
【０１２８】
適切なカチオン性ポリマーには、任意の上記ポリマーのサブユニットを含むコポリマー（例えば、リジン−ヒスチジンコポリマーなど）も含まれる。コポリマー中の種々のサブユニットの比率は等しくなる必要はないが、例えば、細胞傷害性を最小にしながら核酸との複合体を形成する能力などの性質を至適化するように選択することができる。さらに、サブユニットは標準的様式で変化する必要はない。所望の性質に関して種々のポリマーを評価するための適切なアッセイを、実施例に記載する。好ましいカチオン性ポリマーには、任意の種々の修飾をさらに組み込んだポリマーも含まれる。適切な修飾は以下に考察されており、アセチル基、スクシニル基、アシル基、またはイミダゾール基での修飾が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーにより、ＤＮＡがエンドサイトーシスによって細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用して細胞に侵入することができる正電荷の粒子に小型化または縮合すると考えられる。このようなポリマーは、エンドソームｐＨで緩衝化し、分解からＤＮＡを保護する「プロトンスポンジ」として作用する性質を有することができる。連続的プロトン流入は、エンドソーム浸透圧性膨張および破裂を誘導し、ＤＮＡ粒子の細胞質への回避機構が得られる。（例えば、ＰＥＩおよび本発明の実施で有用な他のカチオン性ポリマーに関するさらなる情報については、引用文献８５〜８７；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６，０１３，２４０号；ＷＯ９６０２６５５号を参照のこと）。本発明の一定の実施形態によれば、ｊｅｔＰＥＩＴＭ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（ＰＥＩの直鎖形態（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６，０１３，２４０号））として公知の市販のＰＥＩ試薬を使用する。
【０１３０】
実施例１２に記載のように、本発明者らは、ＰＥＩ、ＰＬＬ、またはＰＬＡおよびインフルエンザウイルスＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡを含む組成物は、インフルエンザウイルス感染の前または後のいずれかで静脈内投与した場合、インフルエンザウイルス産生を阻害することを示した。阻害は用量依存性であり、異なるインフルエンザウイルスＲＮＡにターゲティングした２つのｓｉＲＮＡを使用した場合、さらなる効果を示す。したがって、ＰＥＩ、ＰＬＬ、またはＰＬＡなどのカチオン性ポリマーと組み合わせた場合、ｓｉＲＮＡは肺に達し、細胞に侵入し、ウイルス複製サイクルを有効に阻害することができる。これらの所見は、ｓｉＲＮＡを使用した哺乳動物での感染性ウイルスの産生の阻害における有効性についての最初の報告を示すと考えられる（例えば、ウイルス複製サイクルにおけるウイルス転写物または中間体の産生の阻害と対照的である）。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡを静脈内で体内の固体器官および組織に送達する試み（例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ２００２；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ２００３；Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）は、マウスの尾静脈への大量の流動物の迅速な送達を含み、且つ固体器官（特に、肝臓）中に相当な量のプラスミドＤＮＡが蓄積することを示す、水力学的トランスフェクションとして公知の技術を使用することに留意のこと（Ｌｉｕ  １９９９；Ｚｈａｎｇ  １９９９；Ｚｈａｎｇ  ２０００）。約２００μｌの流動物の注射を含む従来技術（Ｌｉｕ  １９９９）と対照的に、この技術は、動物の全血量にほとんど等しい流動物体積（体重１８〜２０ｇのマウスについては１．６ｍｌ（体重の約８〜１２％に等しい））の送達を含む。さらに、水力学的トランスフェクションアプローチを使用した注射を、注射した導入遺伝子の有効な発現に必要な短い時間間隔（例えば、５秒）で行う（Ｌｉｕ  １９９９）。
【０１３２】
水力学トランスフェクションにより肝臓中の注射した導入遺伝子が導入および高レベルで発現する機構は完全に明らかでないが、一過性心臓鬱血に起因する肝静脈を介した肝臓へのＤＮＡ溶液の逆流に起因すると考えられる（Ｚｈａｎｇ  ２０００）。ヒトにおける治療目的のための類似のアプローチは、実行可能ではないようである。本発明者らは、対照的に、従来の体積の流動物（例えば、２００μｌ）を使用し、肝臓（水力学的トランスフェクションを使用して最も容易に発現する部位）中でさえも注射した導入遺伝子の最小発現が得られると予想されることを証明した。
【０１３３】
したがって、本発明は、従来の注射技術（例えば、流動物の従来の圧力および／または従来の体積を使用した技術）を使用して、標的転写物にターゲティングされたＲＮＡｉ誘導性物質を含む組成物を被験体の血管系に移入する工程を含む、哺乳動物被験体内の細胞中のウイルス転写物（インフルエンザウイルス転写物）の発現の阻害方法を提供する。ＲＮＡｉ誘導性物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターであり得る。本発明の一定の好ましい実施形態では、組成物はカチオン性ポリマーを含む。本発明の好ましい実施形態では、組成物を、被験体の体重の１０％以下の液量で移入する。本発明の一定の実施形態では、液量は、被験体の体重の５％以下、２％以下、１％以下、０．１％以下である。本発明の一定の実施形態では、方法は、肝臓以外の生体組織または器官中の細胞中の有効量のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達を達成する。本発明の一定の好ましい実施形態では、組成物を、例えば、静脈内注射によって静脈に移入する。しかし、組成物を動脈に投与し、カテーテル、内在性静脈ラインなどのデバイスを使用して送達させることもできる。本発明の一定の好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ誘導性部分はウイルス産生を阻害する。
【０１３４】
実施例１５に記載のように、本発明者らは、カチオン性ポリマーＰＬＬおよびＰＬＡはｓｉＲＮＡと複合体を形成し、培養細胞中の機能的ｓｉＲＮＡの取り込みを促進することができる。ＰＬＬとＮＰ−１４９６との複合体またはＰＬＡとＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡとの複合体でのトランスフェクションにより、細胞中のインフルエンザウイルスの産生を阻害した。これらの結果および上記で考察下マウスでの結果は、被験体の体内の哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達のためのカチオン性ポリマーとｓｉＲＮＡとの混合物の使用の実現可能性を証明する。実施例１５に記載のアプローチを使用して、細胞傷害性を減少させ、最初に有効なものを至適化させるさらなるポリマー（特に、基（アシル基、スクシニル基、アセチル基、またはイミダゾール基）の付加によって修飾されたポリマー）について試験を行うことができる。一般に、一定の好ましい修飾により、カチオン性ポリマーの正電荷が減少する。一定の好ましい修飾により、第１級アミンが第２級アミンに変換される。このようなさらなる基を移入するためのカチオン性ポリマーの修飾方法は、当該分野で周知である（例えば、引用文献３２を参照のこと）。例えば、種々の残基のε−アミノ基を、例えば、抱合によってポリマー合成後の所望の修飾基と置換することができる。一般に、ポリマーがＲＮＡｉ誘導性物質の送達を強化する能力を非常に大きく減少させることなく非置換ポリマーと比較して細胞傷害性が適切に減少するのに十分な置換率を選択することが望ましい。したがって、本発明の一定の実施形態では、ポリマー中の２５％と７５％との間の残基を置換する。本発明の一定の実施形態では、ポリマー中の約５０％の残基を置換する。適切に選択された単量体サブユニット（すなわち、サブユニットのいくつかは既に所望の修飾が組み込まれている）のコポリマーの最初の形成によって類似の効果を達成することができることに留意のこと。
【０１３５】
種々のさらなるカチオン性ポリマーも使用することができる。新規のカチオン性ポリマーおよびジアクリレートおよびアミンモノマー由来のオリゴマーの巨大ライブラリーを開発し、ＤＮＡトランスフェクションで試験した。これらのポリマーを、本明細書中でポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマーをいう。例えば、７個のジアクリレートモノマーおよび２０アミンモノマー由来の１４０個のポリマーのライブラリーが記載されており（３４）、より巨大なライブラリーを類似または同一の方法を使用して産生することができる。このライブラリーの１４０メンバーのうち、７０メンバーが十分な水溶性を示すことが見出された（２ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．０）。電気泳動移動シフトによって示すように、７０個の水溶性ポリマーのうちの５６個がＤＮＡと相互作用する。最も重要には、５６ポリマーのうちの２つがＣＯＳ−７細胞へのＤＮＡトランスフェクションを媒介した。新規のポリマーのトランスフェクション効率は、ＰＥＩの４〜８倍であり、リポフェクタミン２０００と同等またはより良い。したがって、本発明は、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子およびカチオン性ポリマーを含む組成物（カチオン性ポリマーはポリ（β−アミノエステル））およびこのような組成物の投与による標的遺伝子発現の阻害方法を提供する。ポリ（β−アミノエステル）は、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔａｌ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２００３）によって２００２年９月１９日に提出された’’Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏ  ｅｓｔｅｒｓ）ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ’’というタイトルの米国特許出願第２００２０１３１９５１号にさらに記載されている。ＲＮＡｉ誘導性物質の送達を容易にするために使用するためのカチオン性ポリマーを、ポリマーから構成される主要な１価のサブユニット以外の１つまたは複数の残基が組み込まれるように修飾することができることに留意のこと。例えば、１つまたは複数の別の残基をポリマーの末端に付加することができるか、ポリマーをポリマーが構成される主要な単量体以外の残基によって連結することができる。
【０１３６】
本発明のＲＮＡｉ誘導性部分の送達を強化するために使用することもできるさらなるカチオン性ポリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）およびその第４級アミンアナログであるポリ（２−トリメチルアミノ（ｔｒｉｅｍｅｔｙｈｌａｍｉｎｏ））エチルメタクリレート（ｐＴＭＡＥＭＡ）、ポリ［ａ−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸（ＰＡＧＡ）、およびポリ（４−ヒドロキシ−１−プロリンエステル）が含まれる。これらの薬剤のさらなる説明についてはＨａｎ（２０００）を参照のこと。
【０１３７】
（Ｂ．ペプチド分子輸送体）
研究は、種々のペプチドが核酸の送達因子として作用することができることを示す。（本明細書中で使用される、「ポリペプチド」は約５０アミノ酸長よりも短い場合、「ペプチド」と考えられる。）例えば、転写因子（ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（４２，４３）、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質（４４）、およびドロソフィラのアンテナペディアタンパク質（４５））は、細胞表面から原形質膜に浸透することができる。膜浸透を担うペプチドセグメントは、１１〜３４アミノ酸残基からなり、アルギニンで高度に富化されており、アルギニンリッチペプチド（ＡＲＰ）またはペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎと呼ばれることが多い。）。さらにより大きなポリペプチドと共有結合する場合、ＡＲＰは、原形質膜を通過する融合ポリペプチドを輸送することができる（４６〜４８）。同様に、オリゴヌクレオチドをＡＲＰに共有結合する場合、さらにより迅速に細胞に取り込まれる（４９、５０）。８個のアルギニンのポリマーはこの膜貫通輸送に十分であることが最近の研究で示された（５１）。カチオン性ポリマーと同様に、ＡＲＰはまた正電荷であり、ｓｉＲＮＡに結合することができる可能性が高いため、ｓｉＲＮＡとＡＲＰとの共有結合にはおそらく必要ではないことが示唆される。
【０１３８】
したがって、本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされた少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質およびペプチド分子輸送体を含む組成物ならびにこのような組成物の投与による標的遺伝子発現の阻害方法を提供する。本発明は、インフルエンザのリスクのある被験体またはこれに罹患した被験体にこのような組成物を投与する工程を含む、インフルエンザウイルス感染を治療および／または防止方法を提供する。ペプチド分子輸送体には、引用例４６〜５１、１２０、および１３４〜１３６ならびに当業者に明らかなその変形形態が含まれるが、これらに限定されない。アルギニンリッチペプチドには、アルギニン残基のみからなるペプチドが含まれる。
【０１３９】
一般に、好ましいペプチド分子輸送体は、約５０アミノ酸長未満である。本発明の一定の実施形態によれば、ペプチド分子輸送体は、約７アミノ酸と３４アミノ酸との間の長さを有するペプチドである。多数の好ましいペプチドはアルギニンが豊富である。本発明の一定の実施形態によれば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアルギニンを含む場合、ペプチドはアルギニンリッチである。本発明の一定の実施形態によれば、ペプチド分子輸送体は、６個と２０個との間のアルギニン残基を含むアルギニンリッチペプチドである。本発明の一定の実施形態によれば、アルギニンリッチペプチドは、６個と２０個との間のアルギニン残基からなる。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡおよびペプチド分子輸送体は共有結合しているのに対して、本発明の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡおよびペプチド分子輸送体は共に混合しているが、互いに共有結合していない。本発明の一定の実施形態によれば、ヒスチジンリッチペプチドを使用する（８８）。本発明によれば、ヒスチジンリッチペプチドはアルギニンリッチペプチドについて記載したヒスチジン残基の長さおよび比率を示し得る。したがって、本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされた少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質およびヒスチジンリッチペプチドを含む組成物ならびにこのような組成物の投与による標的転写物発現の阻害方法を提供する。本発明は、インフルエンザのリスクのある被験体またはこれに罹患した被験体にこのような組成物を投与する工程を含む、インフルエンザウイルス感染を治療および／または防止方法を提供する。
【０１４０】
被験体中の細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質の送達を容易にするためのさらなるペプチドまたは修飾ペプチドを、本発明の組成物で使用することもできる。例えば、一般に、８個と５０個との間のリジン残基を含むリジンリッチペプチドのファミリーが記載されている（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ２０００）。これらのペプチドは、組織培養における細胞によって核酸取り込みを強化することができるが、これらは、より長いポリペプチド（例えば、５０個を超えるリジン残基を含むＰＬＬ）よりも効率が低い被験体内への核酸のためのビヒクルである。これは、体内の核酸／ペプチド複合体の不十分な安定性に一部起因する。ペプチド内の種々の位置での複数のシステインの挿入により、プラスミドＤＮＡの結合後に自発的に酸化してペプチド内ジスルフィド結合を形成する低分子量のＤＮＡ縮重ペプチドが得られる。これらの架橋ＤＮＡ送達賦形剤は、細胞へのプラスミドの送達に使用する場合に、非架橋ペプチドＤＮＡ縮合物と比較した場合の遺伝子発現のためのより有効なインデューサーであった（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ２００２）。さらに、ジスルフィド結合形成のためのスルフヒドリル基を含むペプチドは、血清タンパク質への非特異的結合を減少させると考えられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を組み込むことができる（Ｐａｒｋ  ２００２）。
【０１４１】
以下でさらに考察されるように、本発明は、ガラクトースまたはマンノース残基などの部分を含む糖ペプチドを使用して、ＲＮＡｉ誘導性物質の選択的な取り込みを強化することもできる。このような糖ペプチドは、ジスルフィド結合形成のためのスルフヒドリル基をも含み得る（Ｐａｒｋ  ２００２）。本発明は、細胞内液胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の出口（ｅｘｉｔ）を強化する種々の薬剤の投与を含む。このような薬剤には、クロロキン（Ｚｈａｎｇ  ２００３）およびブピバカインが含まれる（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ  ２０００）。出口強化薬を、全身、経口、および／または局所（例えば、所望の作用部位またはそれに極めて近接した部位に）投与することができる。これらを、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはＲＮＡｉ誘導性ベクターと共にまたは個別に送達することができる。
【０１４２】
（Ｃ．さらなる高分子送達薬）
本発明は、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質および任意の種々の高分子送達薬（上記に加えて修飾ポリマーが含まれる）を提供する。本発明は、さらに、細胞中のインフルエンザウイルス転写物発現の阻害方法および組成物の投与によるインフルエンザウイルス感染の治療または防止方法を提供する。適切な送達薬には、細胞へのＤＮＡの送達を強化することが示された種々の薬剤が含まれる。これらには、上記などのカチオン性ポリマーの修飾バージョン（例えば、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）−グラフト−ポリ（Ｌ−リジン）ポリマー（Ｂｅｎｎｓ  ２０００）、ポリヒスチジン−ＰＥＧ（Ｐｕｔｎａｍ  ２００３）、葉酸−ＰＥＧ−グラフト−ポリエチレンイミン（Ｂｅｎｎｓ  ２００２）、ポリエチレンイミン−デキストラン硫酸（Ｔｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ  ２００３）など）が含まれる。ポリマーは、分岐または直鎖であってよく、グラフト化されていてもグラフト化されていなくてもよい。本発明によれば、ポリマーは、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質と複合体を形成し、その後被験体に投与する。複合体を、ナノ粒子またはナノコポリマーということができる。任意のポリマーを、補体活性化および他の原形質タンパク質の結合の減少に有用なＰＥＧまたは他の親水性ポリマーが組み込まれるように修飾することができる。カチオン性ポリマーを複数修飾することができる。例えば、カチオン性ポリマーを、ポリマー（例えば、イミダゾール）の負電荷を減少させる部分が組み込まれるように修飾し、ＰＥＧのような第２の部分でさらに修飾することができる。
【０１４３】
さらに、上記のカチオン性ポリマーと区別される種々のポリマーおよびポリマーマトリクスを使用することもできる。このようなポリマーには、多数の非カチオン性ポリマー（すなわち、生理学的ｐＨでは正電荷ではないポリマー）が含まれる。このようなポリマーは、一定の利点（例えば、細胞傷害性の減少およびいくつかの場合ＦＤＡ承認）を有し得る。多数の適切なポリマーは、他の状況で薬物および遺伝子の送達を増強することを示した。このようなポリマーには、例えば、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質の送達のためのナノ粒子に処方することができるポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧ）、およびポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）（Ｐａｎｙａｍ  ２００２）が含まれる。上記のコポリマーおよび組成物も使用することができる。本発明の一定の実施形態では、カチオン性ポリマーを使用して、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターを縮合することができ、縮合複合体を、ＰＬＧＡまたは別の非カチオン性ポリマーによって保護する。使用することができる他のポリマーには、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ８５と複合体化することができるポリビニルアルコールまたはポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジウムブロミド）などの非縮合ポリマーが含まれる。本発明で使用するための他のポリマーには、カチオン性ポリマーと非カチオン性ポリマーとの組み合わせが含まれる。例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）−グラフト化ポリ（Ｌ−リジン）（Ｊｅｏｎｇ  ２００２）および他の組み合わせ（ＰＬＡ、ＰＬＧ、またはＰＬＧＡが含まれる）および上記などの任意のカチオン性ポリマーまたは修飾カチオン性ポリマーを使用することができる。
【０１４４】
（Ｄ．送達強化部分が組み込まれた送達薬）
本発明は、細胞への薬剤の送達を強化し、そして／または標的転写物を阻害することが望ましい細胞への薬剤の選択的送達を強化する部分を組み込むための任意の送達薬の修飾を含む。任意の種々の部分（（ｉ）阻害が望まれる細胞によって発現された分子と特異的に結合する抗体または抗体フラグメント、（ｉｉ）阻害が望まれる細胞によって発現された分子と特異的に結合するリガンドが含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。好ましくは、分子は、細胞表面上で発現する。モノクローナル抗体が一般に好ましい。気道上皮細胞の場合、適切な部分には、気道上皮細胞への送達および特異性を増大するために種々の上記送達薬と抱合することができる、ｐ２Ｙ２プリノセプター、ブラジキニン受容体、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターＲ、またはセルピン酵素複合体などの受容体と特異的に結合する抗体が含まれる。同様に、これらの種々の分子のためのリガンドを、気道上皮細胞の送達および選択性を増大するための送達薬と抱合することができる。例えば、（Ｆｅｒｒａｒｉ  ２００２）を参照のこと。本発明の一定の好ましい実施形態では、抗体またはリガンドの結合により、結合複合体の内在化が誘導される。本発明の１つの実施形態では、送達強化薬（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはリガンド）を、送達を増大するか選択性を強化するためのＲＮＡｉ誘導性ベクター（例えば、ＤＮＡベクター）に抱合する。抗体またはリガンドと本明細書中に記載の核酸または種々の送達薬との抱合方法は、当該分野で周知である。例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍのウェブサイトから利用可能であり、且つ初版が１９９４−９５年のＰｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇおよびその引用文献である「Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ＬｉｂｒａｒｙならびにＷｏｎｇ  ＳＳ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１を参照のこと。
【０１４５】
（Ｅ．肺への移入に適切なサーファクタント）
天然の内因性サーファクタントは、肺中の肺胞表面と肺胞気との間に層を形成し、肺胞内の表面張力の減少によって肺胞崩壊を減少させる、リン脂質、中性脂質、およびタンパク質（サーファクタントタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）から構成される化合物である（７７〜８４）。サーファクタント分子は、肺胞壁の全細胞被膜を浸漬させる脂質フィルム内に拡散し、これらが本質的に単分子を産生する場合、その上の全てに層が行き渡る。未熟児のサーファクタントの欠損では、しばしば呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）を発症する。したがって、この病態の治療および／または防止のための種々のサーファクタント調製物が開発されている。サーファクタントは、動物肺洗浄物およびヒト羊水から抽出するか、合成材料から生成することができる（例えば、米国特許第４，３３８，３０１号；同第４，３９７，８３９号；同第４，３１２，８６０号；同第４，８２６，８２１号；同第５，１１０，８０６号を参照のこと）。種々のサーファクタント処方物は、市販されており、Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（ＯＮＹ，Ｉｎｃ．，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＮＹ製）；Ｓｕｒｖａｎｔａ（登録商標）（Ｒｏｓｓ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）、およびＥｘｏｓｕｒｆ  Ｎｅｏｎａｔａｌ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）が含まれる。
【０１４６】
本明細書中で使用される、句「肺への移入に適切なサーファクタント」は、市販のサーファクタント製品で使用される特定の処方物ならびに上記の本発明の出願書類およびその等価物に記載されており、且つ特許請求の範囲に記載されている本発明の組成物を含む。本発明の一定の実施形態では、この句は、１０〜２０％のタンパク質および８０〜９０％の脂質（共に全サーファクタントに基づく）を含む調製物を含み、脂質は約１０％の中性脂質（例えば、トリグリセリド、コレステロール）および約９０％のリン脂質（共に全脂質に基づく）からなり、全リン脂質に基づくホスファチジルコリン含有率は８６％である（「％」および「部」は、乾燥材料に基づく）（米国特許第４，３８８，３０１号および同第４，３９７，８３９号）。
【０１４７】
本発明の一定の実施形態では、この句は、タンパク質を完全にまたは実質的に含まなくてもよい合成組成物（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよび脂肪アルコールを含むか本質的に含む組成物であって、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）は主成分としてサーファクタント組成物を含み、脂肪アルコールは副成分として任意必要に応じてチロキサポールなどの非毒性非イオン性界面活性剤を含む（米国特許第４，３１２，８６０号；同第４，８２６，８２１号；および同第５，１１０，８０６号を参照のこと））を含む。当業者は、上記特許および文献に記載の試験を参照することによって、任意の特定のサーファクタント組成物が肺への移入に適切であるかどうかを判定することができる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、サーファクタントが拡散して肺胞を覆う能力を容易にし、サーファクタント自体の組成物の肺中の細胞によるｓｉＲＮＡおよび／またはベクターの取り込みを容易にすることが可能である。
【０１４８】
Ｉｎｆａｓｕｒｆは、気管内点滴注入のみを意図する滅菌非発熱性肺サーファクタントである。これは、リン脂質、中性脂質、および親水性サーファクタント会合タンパク質ＢおよびＣを含む子牛肺由来の天然のサーファクタントの抽出物である。Ｉｎｆａｓｕｒｆは、呼吸窮迫症候群治療用として米国食品医薬品局で承認されているため、気道および肺への投与のための安全かつ許容されるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。Ｓｕｒｖａｎｔａもウシ肺由来の抽出物であり、Ｅｘｏｓｕｒｆ  Ｎｅｏｎａｔａｌは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、セチルアルコール、およびチロキサポールを含むタンパク質非合成の肺サーファクタントである。これらの両サーファクタントも、呼吸窮迫症候群の治療薬としてＵ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａに承認されている。
【０１４９】
実施例１４に記載するように、本発明者らは、インフルエンザＲＮＡにターゲティングされたｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートとして作用するＤＮＡベクターが、Ｉｎｆａｓｕｒｆと混合してマウスに鼻腔内点滴注入によって投与した場合にインフルエンザウイルス産生を阻害することができることを示した。さらに、実施例１３に記載のように、本発明者らは、同一のｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスが細胞組織中の細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示した。これらの結果は、インフルエンザウイルスＲＮＡにターゲティングされたｓｈＲＮＡを細胞に送達し、インフルエンザウイルス感染の治療および／または防止に有効なｓｉＲＮＡにプロセシングすることができることを証明する。結果はまた、Ｉｎｆａｓｕｒｆなどのサーファクタント材料（例えば、組成物および／または天然の肺サーファクタントに類似の性質を有する材料）が肺へのｓｈＲＮＡの送達のための適切なビヒクルであることを証明する。さらに、結果により、インフルエンザウイルスにターゲティングされたｓｉＲＮＡが肺および／または気道に送達された場合にインフルエンザウイルス産生を有効に阻害することが示唆する。したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス調製物にターゲティングされた少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質および（ｉｉ）肺への移入に適切なサーファクタント材料を含む組成物を提供することができる。サーファクタントおよびＲＮＡｉ誘導性物質を含む本発明の組成物を、任意の種々の方法（点滴注入、吸入、エアゾールなど）で肺に移入することができる。組成物が１００％未満のサーファクタントを含み得ることに留意のこと。例えば、組成物は、約１０重量％と２５重量％との間のサーファクタント、約２５重量％と５０重量％との間のサーファクタント、約５０重量％と７５重量％との間のサーファクタント、約７５重量％と１００重量％との間のサーファクタントを含み得る。本発明は、インフルエンザのリスクを有する被験体またはこれを罹患した被験体に上記組成物を投与する工程を含む、インフルエンザを治療または防止方法を提供する。
【０１５０】
（Ｆ．肺へのＲＮＡｉ誘導性物質の送達のためのさらなる薬剤）
本発明は、肺上皮細胞への本発明のＲＮＡｉ誘導性物質の送達を増強するための種々のさらなる薬剤および方法の使用を提供する。方法は、カルシウムキレート化を引き起こすためのＥＧＴＡと共に送達または投与する前のベクターのＣａＰＯ４沈殿を含む。界面活性剤およびチキソトロピック溶液の投与も使用することができる。ペルフルオロ化合物液を、送達ビヒクルとして使用することもできる。これらの方法およびその遺伝子導入における適用性については、（Ｗｅｉｓｓ  ２００２）を参照のこと。さらに、本発明は、肺への送達のための本発明のＲＮＡｉ誘導性物質を組み込むタンパク質／ポリエチレンイミンの使用を含む。このような複合体は、アルブミン（または他の可溶性タンパク質）と組み合わせたポリエチレンイミンを含む。遺伝子導入のためのプラスミドを含む同様の複合体により、血管内投与後に肺組織に送達されることが示された（Ｏｒｓｏｎ  ２００２）。本発明のＲＮＡｉ誘導性物質を含むタンパク質／ＰＥＩ複合体により、肺から離れた細胞への送達を強化することもできる。
【０１５１】
（Ｇ．脂質）
実施例３に記載のように、本発明者らは、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）として公知の脂質薬の存在下でのインタクトなニワトリ胚への注射によってインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡの投与によりインフルエンザウイルス産生が有効に阻害され、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの非存在下でのこのｓｉＲＮＡの投与では有効に阻害されないことを示した。これらの結果は、インタクトな生物中のｓｉＲＮＡの有効性を強化するための脂質送達薬の有用性を証明する。したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス調製物にターゲティングされた少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質および（ｉｉ）脂質を含む組成物を提供する。さらに、本発明は、被験体に本発明の組成物を投与する工程を含む、インフルエンザウイルス産生の阻害方法およびインフルエンザ感染の治療方法を提供する。
【０１５２】
（ＶＩ．インフルエンザウイルス感染／複製の分析）
上記のように、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質の１つの使用は、インフルエンザウイルス感染／複製サイクルおよび宿主細胞に対するインフルエンザウイルスタンパク質の効果の分析および特徴づけにおける使用である。ウイルス感染および／または複製サイクルの１つまたは複数の時期に関与する任意の種々のウイルス遺伝子および／または代謝、生合成、サイトカイン放出などの宿主細胞機能または活性に影響を与えるウイルス遺伝子にターゲティングされたｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＳＡを設計することができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターを、ウイルス感染の前、その間、または後に細胞に移入することができ、所望するならば、種々の感染／複製サイクルの時期ならびに細胞の活性および機能に対する効果をアッセイすることができる。
【０１５３】
（ＶＩＩ．治療への適用）
上記のように、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質を含む組成物を使用して、インフルエンザウイルスの感染または複製を阻害または減少させることができる。このような適用では、有効量の本発明の組成物を、インフルエンザウイルスへの曝露の前、同時、または後で細胞または生物に送達させる。好ましくは、ＲＮＡｉ誘導性物質の量は、インフルエンザウイルス感染の１つまたは複数の症状を軽減または遅延させるのに十分である。説明の目的のために、この節は、本発明のｓｉＲＮＡをいうが、明白なように、本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされた他のＲＮＡｉ誘導性物質のための類似の適用を含む。
【０１５４】
本発明のｓｉＲＮＡ含有組成物は、１つの標的転写物中の１つの部位にターゲティングされた１つのｓｉＲＮＡ種を含み得るか、１つまたは複数の転写物中の１つまたは複数の部位にターゲティングされた複数の異なるｓｉＲＮＡ種を含み得る。実施例８は、単独または組み合わせのいずれかでのインフルエンザウイルス産生を阻害する優れた能力を有するｓｉＲＮＡの体系的同定への一般的アプローチを記載する。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態では、異なる遺伝子にターゲティングされた異なるｓｉＲＮＡ種集団を含む組成物を使用することが望ましい。例えば、異なるウイルス転写物に指向する種々のｓｉＲＮＡを使用したウイルス生活環の複数の時期にウイルスを攻撃することが望ましい。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ組成物は、各ウイルスゲノムセグメントにターゲティングされたｓｉＲＮＡを含む。
【０１５６】
本発明の一定の実施形態によれば、本発明のｓｉＲＮＡ組成物は、１つのウイルス転写物にターゲティングされた２つ以上のｓｉＲＮＡを含み得る。一例を挙げれば、標的転写物のコード領域にターゲティングされた少なくとも１つのｓｉＲＮＡおよび３’ＵＴＲにターゲティングされた少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含むことが望ましい。組成物中の少なくとも１つのｓｉＲＮＡが分解のために転写物をターゲティングする一方で、少なくとも１つの他のｓｉＲＮＡが分解を回避する任意の転写物の翻訳を阻害するため、このストラテジーにより、関連転写物によってコードされる産物は産生されないというさらなる確信を得ることができる。
【０１５７】
上記のように、本発明は、「治療カクテル」（複数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与するアプローチおよび１つのベクターが複数の標的を阻害するｓｉＲＮＡまたは複数のｓｉＲＮＡを得るようにプロセシングすることができるＲＮＡの合成を指示するアプローチが含まれるが、これらに限定されない）を含む。本発明の一定の実施形態によれば、組成物は少なくとも１つのインフルエンザウイルスＡ転写物および少なくとも１つのインフルエンザウイルスＢ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡを含む。本発明の一定の実施形態によれば、組成物は、特定のセグメントの同一部分をターゲティングする異なる配列を有する複数のｓｉＲＮＡを含む。本発明の一定の実施形態によれば、組成物は、異なるインフルエンザウイルス株またはサブタイプを阻害する複数のｓｉＲＮＡを含む。
【０１５８】
本発明者らが、ＨＡ産生の大幅な減少によって明らかなように、例えば、トランスフェクトした遺伝子、組み込まれた導入遺伝子、組み込まれたウイルスゲノム、感染性分子クローンなどと対照的に全感染性ウイルスを使用してインフルエンザウイルス複製の有効なｓｉＲＮＡ媒介阻害を証明したことが重要である。
【０１５９】
上記のように、インフルエンザウイルスが抗原不連続変異および抗原連続変異の両方を受けると認識される。したがって、治療薬に対する耐性が出現し得る。このため、本発明の組成物を同時に使用した後、特定のｓｉＲＮＡによって阻害されない変異体が出現し得るように、変異および／または再集合が起こると予想され得る。したがって、本発明は、進化した治療計画を意図するものとなる。例えば、特定の変異または再集合に関する特定の場合、１つまたは複数の新規のｓｉＲＮＡを選択することができる。例えば、どのような変異をも組み込むか、新規に獲得したＲＮＡセグメントをターゲティングすることになるのかという点以外は元のｓｉＲＮＡと同一の新規のｓｉＲＮＡを設計することがしばしば可能であり、他の場合、同一の転写物内で新規の配列をターゲティングすることが望ましく、さらに他の場合、新規の転写物全体をターゲティングすることが望ましい。
【０１６０】
本発明のｓｉＲＮＡと、感染の１つまたは複数の症状または特徴づけを阻害、減少、または防止するために１つまたは複数の他の抗ウイルス薬とを組み合わせることがしばしば望ましい。本発明の一定の好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡを、１つまたは複数の他の抗ウイルス薬（アマンタジンもしくはリマンタジン（共にウイルス脱外被に関与するイオンチャネルＭ２タンパク質を阻害する）および／またはザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル（ＢＣＸ−１８１２、ＲＷＪ−２７０２０１）、Ｒｏ６４−０７９６（ＧＳ  ４１０４）、またはＲＷＪ−２７０２０１（全てＮＡインヒビターであり、原形質膜からのウイルス粒子の適切な放出を防止する）など）と組み合わせる。しかし、本発明のｓｉＲＮＡ組成物の投与を、１つまたは複数の任意の種々の薬剤（例えば、変種が公知のインフルエンザワクチン（例えば、インフルエンザウイルスまたはウイルス抗原を使用した従来のワクチンおよびＤＮＡワクチン）が含まれる）と組み合わせることもできる。インフルエンザ治療または防止のための使用またはその研究における種々の薬剤に関するさらなる情報については、Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．ａｎｄＧａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，２００２；Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，２００２，Ｌｅｕｓｃｈｅｒ−Ｍａｔｔｌｉ，２０００；ａｎｄ  Ｓｔｉｖｅｒ，２００３を参照のこと。本発明の異なる実施形態では、用語「〜と組み合わせた」または「〜との組み合わせ」は、ｓｉＲＮＡが他の薬剤として同一の混合物中に存在することまたは個体の治療計画がｓｉＲＮＡと他の薬剤の両方を含み、必ずしも同一混合物もしくは同時に送達されないことのいずれかを意味し得る。本発明の一定の実施形態によれば、抗ウイルス薬は、アマンタジン、リマンタジン、レレンザ、またはタミフルなどの米国食品医薬品局で承認された薬剤である。
【０１６１】
本発明のｓｉＲＮＡは、ワクチン接種のための補助的ストラテジーを提供し、現在利用可能であるか開発中の任意の種々のワクチンを接種したか接種していない個体に投与することができる（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ａ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１０（１）：９−１３，２００２に概説）。米国における現在のワクチン処方物は、不活化ウイルスを含み、筋肉内注射によって投与しなければならない。ワクチンは３つの部分から構成され、インフルエンザＢ型に加えて現在市場に出回っているインフルエンザＡの両サブタイプ（Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１）由来の代表的な株を含む。各季節によってその季節のワクチンで使用するための特定の株を同定することが特に推奨される。他のワクチンアプローチには、鼻腔用スプレーによって投与することができる低温馴化（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）インフルエンザ生ウイルス；ウイルスゲノムの欠失または他の変異を含む遺伝子操作されたインフルエンザウイルス生ワクチン；複製欠損インフルエンザウイルス、および１つまたは複数のウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを筋肉内または局所的に投与したＤＮＡワクチンが含まれる（例えば、Ｍａｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，７２（２）：１４９１−６，１９９８；Ｉｌｌｕｍ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，５１（１−３）：８１−９６，２００１；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０：Ｓ７４−Ｓ７６，２００２を参照のこと）。このような治療薬の有効性には有効な免疫応答は必要ないため、免疫無防備状態の患者および高齢の個体は、ＲＮＡｉベースの治療薬から特定の利益を得ることができることに留意のこと。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスに感染した細胞または少なくともインフルエンザウイルス感染に感受性を示す細胞（例えば、シアル酸含有受容体を発現する細胞）に本発明のｓｉＲＮＡ組成物の投与をターゲティングすることが望ましい。他の実施形態では、送達に関する最も広い選択肢が利用可能であることが望ましい。
【０１６３】
上記のように、本発明の治療プロトコールは、インフルエンザウイルスへの曝露の前、同時、または後に有効量のｓｉＲＮＡを投与する工程を含む。例えば、非感染個体を、インフルエンザへの曝露前に本発明の組成物で「免疫化」することができる；危険性のある個体（例えば、高齢の個体、免疫無防備状態の個体、インフルエンザウイルスに感染していることが疑われるか、あるいは可能性が高いか、既知の個体と最近接触した個体）を、疑いがあるか既知の曝露で実質的に一過性に（例えば、４８時間内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内）治療することができる。勿論、感染したことが公知の個体は、いつでも本発明の治療を受けることができる。
【０１６４】
遺伝子治療プロトコールは、インフルエンザウイルス感染の前、実質的に一過性に、または後に被験体に阻害ｓｉＲＮＡの発現を指示することができる有効量の遺伝子治療ベクターを投与する工程を含み得る。上記の代わりまたは上記と組み合わせて使用することができる別のアプローチは、被験体から細胞（例えば、幹細胞または免疫系細胞）を単離し、必要に応じて組織培養物中の細胞を拡大し、インビトロで阻害ｓｉＲＮＡの発現を細胞に指示することができる遺伝子治療ベクターを投与する方法がある。その後、細胞を被験体に戻す。必要に応じて、ｓｉＲＮＡを発現する細胞を、被験体に移入する前にインビトロで選択することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞株または被験体ではない個体由来の細胞であり得る細胞集団を使用することができる。被験体からの幹細胞、免疫系細胞などの単離およびそれらを被験体に戻す方法は、当該分野で周知である。例えば、化学療法を受けた患者における骨髄移植、末梢血幹細胞移植などにおいては、このような方法を使用する。
【０１６５】
さらに別のアプローチでは、経口遺伝子治療薬を使用することができる。例えば、米国特許第６，２４８，７２０号は、プロモーターの調節下で遺伝子が保護されるように微粒子中に含まれ、作動形態（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）で細胞に送達され、それにより非侵襲性遺伝子送達を達成する方法および組成物を記載する。微粒子の経口投与後、遺伝子が腸の吸収細胞を含む上皮細胞に取り込まれ、腸管関連リンパ組織に取り込まれ、粘膜上皮から離れた細胞に均一に輸送される。本明細書中に記載されるように、微粒子は、遺伝子を粘膜上皮から離れた部位に送達することができる（すなわち、上皮バリアを通過し、全身を循環し、それにより他の位置に細胞がトランスフェクトされる）。
【０１６６】
上記のように、インフルエンザウイルスは、ヒトに加えて、広範な種々の種に感染する。本発明は、非ヒト種、特にニワトリ、ブタ、およびウシなどの種の治療のための本発明のｓｉＲＮＡ組成物の使用を含む。
【０１６７】
（ＶＩＩＩ．薬学的処方物）
本発明の組成物を、任意の利用可能な経路（非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口、鼻腔内、気管支、眼内、経皮（局所）、経粘膜、直腸、および膣内が含まれるが、これらに限定されない）による送達のために処方することができる。好ましい送達経路には、経粘膜、鼻腔内、気管支、および経口が含まれる。本発明の薬学的組成物は、典型的には、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることで、ｓｉＲＮＡまたは他の薬剤（送達後にｓｉＲＮＡを産生するベクターなど）が含まれる。本明細書中で使用される、用語「薬学的に受容可能なキャリア」には、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助活性化合物を、組成物に組み込むことがもできる。
【０１６８】
薬学的組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。非経口（例えば、静脈内）、筋肉内、皮内、または皮下適用のために使用される溶媒または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストランなどの緩衝液。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基でｐＨを調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアル中に封入することができる。
【０１６９】
注射に適切な薬学的組成物は、典型的には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切なキャリアには、生理学的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＮＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は滅菌されているべきであり、シリンジ中に容易に存在する範囲の流動物であるべきである。好ましい薬学的組成物は、製造および保存条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。一般に、関連するキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって微生物作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウム））を含めることが好ましい。組成物に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることにより、注射用組成物を長期吸収させることができる。
【０１７０】
上で列挙した成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後濾過滅菌することによって、滅菌注射用溶液を調製することができる。好ましくは、注射用溶液は、内毒素を含まない。一般に、分散媒の基剤および上記由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルへの組み込みによって分散液を調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分およびその予め濾過滅菌した溶液由来の所望の成分の粉末がさらに得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１７１】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態で使用することができる。うがい薬として使用するための流動物キャリアを使用して、経口組成物を調製することもできる。組成物の一部として薬学的に適合する結合剤およびアジュバント材料を含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の任意の成分または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジフレーバーなどの嬌味嬌臭薬。経口送達用の処方物は、胃腸管内の安定性を改善し、そして／または吸収を強化するための薬剤を遊離に組み込むことができる。
【０１７２】
吸入による投与のために、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターを、好ましくは、適切な高圧ガス（例えば、二酸化炭素または）を含む加圧コンテナまたはディスペンサー、または噴霧器由来のエアゾールスプレーの形態で送達する。本発明は、特に、鼻腔用スプレーを使用したｓｉＲＮＡ組成物の送達を意図する。インフルエンザウイルスに指向するＤＮＡワクチンの鼻腔内投与は、ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することが示されており、この経路によって送達された場合、気道内の少なくともいくつかの細胞はＤＮＡを取り込むことができることを示す（例えば、Ｋ．Ｏｋｕｄａ，Ａ．Ｉｈａｔａ，Ｓ．Ｗａｔａｂｅ，Ｅ．Ｏｋａｄａ，Ｔ．Ｙａｍａｋａｗａ，Ｋ．Ｈａｍａｊｉｍａ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｉｓｈｉｉ，Ｍ．Ｎａｋａｚａｗａ，Ｋ．Ｏｋｕｄａ，Ｋ．Ｏｈｎａｒｉ，Ｋ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｋ．−Ｑ．Ｘｉｎ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｍ  ｇｅｎｅ」，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３６８１−３６９１，２００１を参照のこと）。ｓｉＲＮＡは、ワクチンで使用されたものなどのプラスミドＤＮＡよりはるかに小さく、ｓｉＲＮＡがさらにより大量に取り込まれることが示唆される。さらに、本発明の一定の実施形態によれば、気道内の細胞による核酸取り込みを容易にするための本発明の送達因子は、薬学的組成物中に含まれる（Ｓ．−Ｏ．Ｈａｎ，Ｒ．Ｉ．Ｍａｈａｔｏ，Ｙ．Ｋ．Ｓｕｎｇ，Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：３０２３１７，２０００）。本発明の一定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ組成物は、実施例１０により詳細に記載したエアゾール投与のための多孔質巨大粒子として処方される。
【０１７３】
経粘膜または経皮手段によって全身投与を行うこともできる。経粘膜または経皮投与のために、透過すべき障壁に適切な浸透剤を処方物で使用する。このような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。鼻腔用スプレー、または坐剤の使用によって経粘膜投与を行うことができる。経皮投与のために、活性化合物を、当該分野で一般に公知の軟膏、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方する。
【０１７４】
直腸送達のために、座剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の座剤基剤）または浣腸剤の形態で化合物を調製することもできる。
【０１７５】
上記の送達因子に加えて、本発明の一定の実施形態では、徐放正の処方物（移植片およびマイクロカプセル化送達系が含まれる）などの体内からの急速な排除から化合物を保護するキャリアを使用して、活性化合物（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクター）を調製する。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。材料を、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を使用して感染細胞にターゲティングされたリポソームが含まれる）を、薬学的に受容可能なキャリアとして使用することもできる。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法にしたがって、これらを調製することができる。
【０１７６】
投与の容易さおよび投薬量の均一性の点から、単位投与形態で経口または非経口組成物を処方することが有利である。本明細書中で使用される「単位投与形態」とは、治療すべき被験体のための単位投薬量として適切な物理的に個別の単位をいう（必要な薬学的キャリアに関して所望の効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含む各単位）。
【０１７７】
ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療に有効な用量）このような化合物の毒性および治療有効性を判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することもできるが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小にし、それにより副作用を軽減するために罹患組織部位へのこのような化合物をターゲティングする送達系を設計するように注意すべきである。
【０１７８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで使用するための一定の投薬範囲の処方で使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む体循環濃度範囲内である。投薬量は、使用した投与形態および使用した投与経路に依存してこの範囲内で変化することができる。本発明の方法で使用した任意の化合物のために、細胞培養アッセイ由来の治療有効量を最初に評価することができる。細胞培養物において判定したところ、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルの用量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に判定することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィによって血漿レベルを測定することができる。
【０１７９】
治療有効量の薬学的組成物は、典型的には、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。薬学的組成物を、必要に応じて種々の間隔および異なる期間（例えば、１日に複数回、毎日、隔日、１週間と１０週間との間、２週間と８週間との間、３週間と７週間との間（４、５、または６週間など）に１回）投与することができる。当業者は、一定の因子が被験体を有効に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を与えることができると認識し、疾患もしくは障害の重症度、治療歴、身体全体の健康および／または被験体の年齢ならびに存在する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。一般に、本明細書中に記載のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはベクターでの被験体の治療は、１回の治療を含み得るか、多数の場合、一連の治療を含み得る。
【０１８０】
用量の例には、１ｋｇの被験体またはサンプルあたりミリグラムまたはマイクログラム単位の本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）が含まれる。局所投与（例えば、鼻腔内）では、これらよりもはるかに少ない用量を使用することができる。ｓｉＲＮＡの適量はｓｉＲＮＡの潜在性に依存し、必要に応じて特定のレシピに合わせることができることがさらに理解される（例えば、予め選択した所望の応答を達成するまで漸増用量の投与）。任意の特定の動物被験体のための特定の用量レベルは、種々の要因（使用した特定の化合物の活性、年齢、体重、身体全体の健康、性別、被験体の食事、投与期間、投与経路、排泄率、任意の薬物の組み合わせ、および調整すべき発現または活性の程度）に依存し得ると理解される。
【０１８１】
上記のように、本発明は、非ヒト動物（ウマ、ブタ、およびトリが含まれるが、これらに限定されない）の治療のための本発明のｓｉＲＮＡ組成物の使用を含む。したがって、家畜薬理学および医学の公知の原理にしたがって、投与量および投与方法を選択することができる。ガイダンスを、例えば、Ａｄａｍｓ，Ｒ．（ｅｄ．），Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８１３８１７４３９；２００１に見出すことができる。
【０１８２】
上記のように、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの転写のためのテンプレートとして作用する核酸分子を、遺伝子治療ベクターとして使用することができるベクターに挿入することができる。一般に、例えば、静脈内注射、局所投与、または定位注射によって、遺伝子治療ベクターを被験体に送達することができる（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）。本発明の一定の実施形態では、遺伝子治療ベクターおよび送達因子を含む本発明の組成物を経口または吸入によって送達することができ、カプセル化するか、分解から保護するために操作することなどができる。遺伝子治療ベクターを含む薬学的組成物は、許容可能な希釈剤を含み得るか、遺伝子送達用のビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリクスを含み得る。あるいは、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）をインタクトなまま産生することができる場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含み得る。
【０１８３】
本発明の薬学的組成物を、投与についての説明書と共に、コンテナ、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【０１８４】
（さらなる実施形態）
本明細書中に提供した多数の技術を、インフルエンザウイルス以外の感染性因子による感染に容易に適用することができると認識される。したがって、本発明は、感染性因子の生活環に関与する１つまたは複数の薬剤特異的遺伝子の発現または活性を阻害するＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉ誘導性ベクター）の投与を介した任意の感染性因子による感染および／または複製を阻害するための方法および組成物を提供する。例えば、本発明は、体外から容易に接近可能な細胞に感染する感染性因子による感染および／または複製を阻害するための方法および組成物を提供する。このような細胞には、皮膚細胞および粘膜細胞（例えば、気道、尿生殖路、および眼の細胞）が含まれる。
【０１８５】
これらの条件には、ウイルス、原生動物、および／または真菌因子による感染が含まれる。本明細書中に記載の本発明のｓｉＲＮＡ組成物を使用した治療に適切な気道感染には、ハンタウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、コクシジオイデス真菌症、およびヒストプラズマ症感染が含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡｉ誘導性組成物を使用した治療に適切な尿生殖路および皮膚の感染には、乳頭腫ウイルス（他の病態もあるが、子宮頸癌を発症する）およびヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
特に、ＲＮＡｉベースの治療は、（ｉ）有効なワクチンが存在しないこと、および／または（ｉｉ）他の有効な機構が存在しないことおよび／または既存の治療計画が長期にわたるか取り扱いにくいこと、および／または（ｉｉｉ）因子がより古い治療またはワクチンを無効にすることができる遺伝子の変化を受けることのいずれかの相互作用に特に適切であり得ることに留意のこと。これらの因子は、生物兵器で使用するための多くの候補を含み、したがって、有効な予防および治療方法の開発に大きな関心が寄せられている。トリパノゾーマは、遺伝子組換えによって表面抗原を頻繁に変化させる。新規の表面抗原をコードする転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを迅速に設計する能力によって提供される自由度（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）により、ＲＮＡｉベースの治療が表面抗原を急速に変化させる生物に起因する疾患に適切であり得ることから、免疫系ベースのアプローチが回避されることが示唆される。
【０１８７】
いずれの場合にも、当業者は、有効な感染、生存、複製、変異などに必要または重要な１つまたは複数の因子特異的転写物を選択する。「因子特異的転写物」は、通常非感染宿主細胞で見出される転写物の配列とＲＮＡｉの標的として作用するのに十分な長さの領域が異なる配列を有する転写物を意味する。一般に、このような領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。宿主細胞ｍＲＮＡ由来の配列を含むインフルエンザウイルスｍＲＮＡを因子特異的転写物と見なすことに留意のこと。因子特異的転写物は、転写因子のゲノム中に存在し、その後感染プロセス中に産生され得る。次いで、１つまたは複数のｓｉＲＮＡを、本明細書中に示した基準にしたがって設計する。
【０１８８】
候補ｓｉＲＮＡが標的転写物の発現を抑制する能力および／または治療薬としてのｓｉＲＮＡの潜在的有効性を、標的転写物の発現を阻害し、そして／または感染性因子の感染性、病原性、複製などを減少もしくは防止することができるｓｉＲＮＡを選択するための適切なインビトロおよび／またはインビボ（例えば、動物）モデルを使用して試験することができる。適切なモデルは、感染性因子に依存して変化し、当業者によって容易に選択することができる。例えば、一定の感染性因子および一定の目的のために、宿主細胞を提供することが必要である一方で、他の場合、宿主細胞の非存在下で因子に対するｓｉＲＮＡの効果を評価することができる。インフルエンザ感染について上記のように、感染および／または複製サイクルの１つまたは複数の時期に関与する任意の種々の因子特異的遺伝子にターゲティングされたｓｉＲＮＡを設計することができる。このようなｓｉＲＮＡを、感染の前、間、または後に細胞に組み込むことができ、所望ならば、感染／複製サイクルの種々の時期に対するその効果を評価することができる。
【０１８９】
本発明者らは、トランスフェクトした遺伝子、組み込まれた導入遺伝子、組み込まれたウイルスゲノム、感染性分子クローンなどと対照的に全感染性ウイルスを使用して、標的転写物の発現ならびに感染性因子の侵入および複製のＲＮＡｉ媒介阻害を証明している点が重要である。本発明は、感染性因子による複製、病原性、または感染に関与する因子特異的転写物にターゲティングされたＲＮＡｉ誘導性物質を含む。本発明にしたがってターゲティングすることができる好ましい因子特異的転写物には、因子の生活環の間に産生された因子のゲノムおよび／または他の転写物が含まれる。好ましい標的には、感染因子に特異的であり、且つ宿主細胞で見出されない転写物が含まれる。例えば、好ましい標的には、因子特異的ポリメラーゼ、σ因子、転写因子などが含まれ得る。このような分子は当該分野で周知であり、当業者は、因子の生活環の知識に基づいて適切な標的を選択することができる。これに関して、有用な情報を、Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４  ｅｄ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００１；Ｍａｒｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ；ａｎｄＧｅｏｒｇｉ’ｓ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ，Ｂｏｗｍａｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００３で見出すことができる。
【０１９０】
本発明のいくつかの実施形態では、好ましい転写物は、感染性因子のビルレンスに特に関連する転写物（例えば、ビルレンス遺伝子の発現産物）である。ビルレンス遺伝子の種々の同定方法は当該分野で公知であり、多数のこのような遺伝子が同定されている。多数の病原性および非病原性ウイルス、細菌などのゲノム配列の利用可能性により、ビルレンス遺伝子の同定が容易になる。同様に、病原性および非病原性株および／またはその生活環因子の異なる時期の１つの株の遺伝子およびタンパク質の発現プロフィールを判定および比較する方法により、発現がビルレンスに関連する遺伝子を同定することができる。例えば、Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ，’’Ｓｐｏｔ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ’’，ＪＭｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｊｕｎ；５１（６）：４５９−６７；Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ，Ｇ，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｆｅｂ；５（１）：２０−６を参照のこと。例えば、宿主細胞に対して有毒なタンパク質をコードする因子の遺伝子をビルレンス遺伝子と見なし、これはＲＮＡｉの好ましい標的であり得る。本発明の一定の実施形態では、従来の治療に対する因子の耐性に関連する転写物も好ましい標的である。これに関して、本発明のいくつかの実施形態では、標的転写物は因子のゲノムによってコードされる必要はないが、代わりに因子内のプラスミドまたは他の染色体外エレメントによってコードされ得ることに留意のこと。
【０１９１】
本発明のいくつかの実施形態では、ウイルスは呼吸器合胞体ウイルス以外のウイルスである。本発明のいくつかの実施形態では、ウイルスはポリオウイルス以外のウイルスである。
【０１９２】
ＲＮＡｉ誘導性物質は、上記の任意の種々の構造（例えば、２つの相補ＲＮＡ鎖、ヘアピン、構造など）を有し得る。これらを化学合成するか、インビトロ転写によって産生するか、宿主細胞内で産生することができる。
【実施例】
【０１９３】
（実施例１：インフルエンザＡウイルスを阻害するためのｓｉＲＮＡの設計）
インフルエンザウイルス株組由来のゲノム配列を比較し、最も保存された各セグメントの領域を同定した。このウイルス群は、トリ、ブタ、ウマ、およびヒト由来のウイルスを含んでいた。比較するために、異なる年数で単離した異なる動物（非ヒト）種由来のインフルエンザＡウイルスの１２〜１５株由来の各セグメントの配列とは異なる年において単離したヒト由来のそれとを整列させた。広範な種々のＨＡおよびＮＡサブタイプを含むように株を選択した。異なる株の間で０、１、または２個のヌクレオチドが異なる領域を選択した。例えば、ＮＰ転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡの選択のために以下の株を使用し、各鎖の前のアクセッション番号はＮＰ配列のアクセッション番号をいい、配列の比較部分をヌクレオチド数によって示す。
【０１９４】
以下のリスト中のエントリーの順番は、アクセッション番号、株名、比較配列部分、年数、サブタイプである。他のゲノムセグメントのアクセッション番号は異なるが、上記データベースで容易に見出すことができる。以下の株を比較した。
【０１９５】
【表１】
2006512906.tif 000003
図９は、６つのインフルエンザＡ変異型（その全てがヒト宿主起源）の間で高度に保存されている一定のＰＡ転写領域を示し、これらが０、１、または２個のヌクレオチドが異なる場合に高度に保存されたものと見なす。（配列をＲＮＡではなくてＤＮＡとして列挙しているため、ＵではなくてＴを含むことに留意のこと。）Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株の配列を、塩基配列（すなわち、他の配列と比較した配列）として選択した。他の組のメンバーは、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８１／９７（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）であった。図は、コンピュータプログラムＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．４）によって作成された複数の配列アラインメントを示す。塩基配列が異なるヌクレオチドに影をつけている。
【０１９６】
図１０は、５つのインフルエンザＡ変異型（その全てが動物宿主起源）の間およびヒト宿主起源の２つの株の間でも高度に保存されている一定のＰＡ転写領域を示し、領域が０、１、または２個のヌクレオチドが異なる場合に高度に保存されたものと見なす。（配列をＲＮＡではなくてＤＮＡとして列挙しているため、ＵではなくてＴを含むことに留意のこと。）Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株の配列を、塩基配列（すなわち、他の配列と比較した配列）として選択した。他の組のメンバーは、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４（Ｈ７Ｎ１）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／１８９／６６（Ｈ９Ｍ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｌｏｎｄｏｎ／１４１６／７３（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／９／９８（Ｈ９Ｎ２）であった。塩基配列が異なるヌクレオチドに影をつけている。
【０１９７】
図９および１０中の配列比較では、配列の大部分が高度に保存されたという基準を満たすため、多数の異なる高度に保存された領域を選択することができることに留意のこと。しかし、５’末端にＡＡを有する配列により、相補（アンチセンス）ｓｉＲＮＡ鎖中に１９ヌクレオチドのコア配列および２ヌクレオチド３’ＵＵ突出部が得られる。したがって、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖中に存在する相補ヌクレオチドがＵＵであるように、５’末端にＡＡを有する２１ヌクレオチド部分を同定するために高度に保存された領域をスキャニングした。例えば、それぞれ影をつけた配列はその５’末端を有する。表２に示すように、得られたｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖中のＵＵ３’突出部をＴＴまたはｄＴｄＴに置換することができることに留意のこと。しかし、アンチセンス鎖の２ｎｔの３’突出部はＵＵである。
【０１９８】
方法のさらなる例示のために、図１２は、ヒト宿主または動物宿主のいずれかを起源とする１２種のインフルエンザＡウイルスサブタイプまたは単離物の間のＮＰ配列の３’領域部分の間の配列比較を示す。下線を引いた配列および下線を引いた配列の下の対応する配列部分を使用して、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６を設計した（以下を参照のこと）。これらの配列を図１２に示す。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４の配列である。影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【０１９９】
表１は、７種の他のウイルス遺伝子セグメントに加えてＰＡセグメントと比較したインフルエンザウイルス配列組の間で高度に保存されている２１種のヌクレオチド領域を列挙する。多数の配列が、相補鎖中に３’ＵＵ突出部が得られるようにその５’末端にＡＡを有するさらなる基準を満たす。ＰＡセグメントに関しては、１つまたは２つのヌクレオチドが存在する場合、ｓｉＲＮＡの配列は、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）株に基づいた配列ＰＡ−２０８７／２１０７  ＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡ（配列番号３０）以外は、Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）株に基づいていた。２０位では、６つの配列のうちの５つがＧを含み、塩基配列はＡを含むことに留意のこと。したがって、この場合では、ｓｉＲＮＡ設計について塩基配列の配列を使用しなかった。
【０２００】
表１Ａに列挙した配列に基づいたｓｉＲＮＡを設計するために、ｓｉＲＮＡセンス鎖配列のコア領域としてヌクレオチド３〜２１を選択し、ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部を得られた各配列に付加した。各配列のヌクレオチド１〜２１に相補的な配列を、対応するアンチセンス鎖として選択した。例えば、高度に保存された配列ＰＡ−４４／６４（すなわち、ＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧ（配列番号２２））に基づいてｓｉＲＮＡを設計するために、配列ＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧ（配列番号１０９）を有する１９ｎｔのコア領域を選択した。ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部を添加し、（ＴのＵへの置換後に）ｓｉＲＮＡセンス鎖配列である配列５’−ＵＧＣＵＵＣＡＡＵＣＣＧＡＵＧＡＵＵＧｄＴｄＴ−３’（配列番号７９）を得た。対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖配列は、配列番号２２と相補的である（すなわち、ＣＡＡＵＣＡＵＣＧＧＡＵＵＧＡＡＧＣＡｄＴｄＴ（配列番号８０）（ＴがｄＴに置換されている２ｎｔの３’突出部以外はＴがＵに置換されている））。
【０２０１】
表１Ｂは、インフルエンザウイルス転写物のさらなる高度に保存された領域に基づいて設計したｓｉＲＮＡを列挙する。表１Ｂで「センス鎖」として示した配列の最初の１９ｎｔ配列は、高度に保存された領域の配列である。インフルエンザウイルス配列に対応せず、ｓｉＲＮＡの選択的特徴である、３’末端にｄＴｄＴ突出部を有するセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列を示す。選択的特徴として３’末端にｄＴｄＴ突出部も組み込まれた対応するアンチセンス鎖も示す。名称は、表１Ｂのとおりである。例えば、ＰＢ２−４／２２センスは、センス鎖はＰＢ２転写物のヌクレオチド４〜２２の配列を有するｓｉＲＮＡを示す。ＰＢ２−４／２２アンチセンスは、ＰＢ２−４／２２センスに対応する相補アンチセンス鎖を示す。スプライス部位にわたる転写物中の部位をターゲティングするｓｉＲＮＡのために、非スプライシング転写物内の位置を示す。例えば、Ｍ−４４−５２／７４１−７５０は、ゲノム配列の４４〜５２および７４１〜７５０に対応するヌクレオチドをスプライシングされｍＲＮＡ中にターゲティングすることを示す。
【０２０２】
図９および１０の影をつけた領域は、高度に保存されたという基準を満たすいくつかの２１ヌクレオチド領域を示す。上記のこれらの配列に基づいて、ｓｉＲＮＡを設計した。試験した実際のｓｉＲＮＡ配列を、表２に列挙する。
【０２０３】
【表１Ａ−１】
2006512906.tif 000004
【０２０４】
【表１Ａ−２】
2006512906.tif 000005
【０２０５】
【表１Ｂ−１】
2006512906.tif 000006
【０２０６】
【表１Ｂ−２】
2006512906.tif 000007
【０２０７】
【表１Ｂ−３】
2006512906.tif 000008
（実施例２：ウイルスＲＮＡポリメラーゼまたは核タンパク質をターゲティングするｓｉＲＮＡはインフルエンザＡウイルス産生を阻害する）
（材料と方法）
細胞培養。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｐａｌｅｓｅ，Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹからの好意的な贈呈）を、１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で成長させた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。エレクトロポレーションのために、細胞を、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。感染培地（ＤＭＥＭ、０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中でウイルス感染を行った。
【０２０８】
ウイルス。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４  （ＰＲ８）およびＡ／ＷＳＮ／３３  （ＷＳＮ）（サブタイプＨ１Ｎ１、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｐａｌｅｓｅ，Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅからの好意的な贈呈）を、１０日齢の胚含有ニワトリ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）中、３７℃で４８時間成長させた。ウイルス接種から４８時間後に尿膜腔液を回収し、−８０℃で保存した。
【０２０９】
ｓｉＲＮＡ。ｓｉＲＮＡを上記のように設計した。実施例１に記載の選択基準に従うことに加えて、ｓｉＲＮＡを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ  ８００２６（ＲＮＡ試薬の販売業者）から、一般に利用可能な技術告示番号００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｂ，「ｓｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒＲＮＡｉ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」に記載の原理に従って設計した。Ｄｈａｒｍａｃｏｎの技術告示番号００３（ワールドワイドウェブ  ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ００３Ｂ．ｈｔｍｌからアクセス可能）およびｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ００４．ｈｔｍｌから利用可能な＃００４は、ｓｉＲＮＡ設計パラメーター、合成などに関連する種々の情報を含み、本明細書中で参考として援用される。試験したセンスおよびアンチセンス配列を表２に列記する。
【０２１０】
【表２】
2006512906.tif 000009
２’ＡＣＥ保護化学を使用して、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって全てのｓｉＲＮＡを合成した。製造者の説明書に従ってｓｉＲＮＡ鎖を脱保護し、等モル比で混合し、９５℃での加熱および３５℃までの３０秒毎に１℃ずつならびに５℃までの１分毎に１℃ずつの温度のゆっくりとした低下によってアニーリングした。
【０２１１】
ｓｉＲＮＡエレクトロポレーション。ＭＤＣＫ細胞の対数期培養物をトリプシン処理し、洗浄し、無血清ＲＰＭＩ１６４０中に２×１０７細胞／ｍｌを再懸濁し、０．５ｍｌの細胞を０．４ｃｍキュベットに入れ、２．５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを含むＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して４００Ｖ、９７５μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション効率は、約３０〜４０％の生存細胞であった。エレクトロポレーションを行った細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中を含む６ウェルプレートを３ウェルに分割し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２１２】
ウイルス感染。エレクトロポレーションから６〜８時間後、血清含有培地を洗浄し、適切な感染多重度の１００μｌのＰＲ８またはＷＳＮウイルスを、それぞれ約１０６細胞を含むウェルに接種した。細胞を、１，０００ＰＦＵ（１，０００個の細胞あたり１個のウイルス；ＭＯＩ＝０．００１）または１０，０００ＰＦＵ（１００個の細胞あたり１個のウイルス；ＭＯＩ＝０．０１）のウイルスのいずれかを感染させた。室温で１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌのトリプシンを含む２ｍｌの感染培地を各ウェルに付加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。示した時間では、感染培養物から上清を回収し、ウイルス力価をニワトリ赤血球の血球凝集素（５０μｌ、０．５％、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）によって判定した。
【０２１３】
ウイルス力価の測定。感染から２４、３６、４８、および６０時間後に上清を回収した。Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ，ＰＭ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ３４−３５に記載の標準的な血球凝集素アッセイを使用して、ウイルス力価を測定した。Ｖ底９６ウェルプレートで血球凝集素アッセイを行った。各サンプルの連続２倍希釈物を、同体積のニワトリ赤血球の０．５％懸濁液と氷上で１時間インキュベートした（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。接着性の均一な赤血球層を含むウェルを正として記録した。プラークアッセイのために、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３２（本明細書中で参考として援用される）に記載され、且つ当該分野で周知の各サンプルの連続１０倍希釈物のウイルス力価を測定した。
【０２１４】
（結果）
インフルエンザウイルス複製を抑制するためのｓｉＲＮＡ使用の可能性を調査するために、種々のインフルエンザウイルスＡのＲＮＡをターゲティングした。具体的には、容易に感染し、インフルエンザウイルスを研究するために広範に使用されているＭＤＣＫ細胞株を使用した。各ｓｉＲＮＡを、エレクトロポレーションによってそれぞれＭＤＣＫ集団に組み込んだ。ＧＦＰにターゲティングされたｓｉＲＮＡ（センス：５’−ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＵＵ−３’（配列番号１１０）；アンチセンス：５’−ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣＵＵ−３’（配列番号１１１））をコントロールとして使用した。このｓｉＲＮＡを、ＧＦＰ−９４９という。その後の実験（以下の実施例に記載）では、両鎖の３’末端のＵＵ突出部をｄＴｄＴと置換したが、結果として効果はなかった。コントロールとして偽エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションから８時間後、細胞を０．１または０．０１のＭＯＩのインフルエンザＡウイルスＰＲ８またはＷＳＮのいずれかを感染させ、種々の測定点（２４、３６、４８、６０時間）で標準的な血球凝集素アッセイを使用してでウイルス産生について分析した。標準的な方法を使用したフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現をアッセイした。
【０２１５】
図１１Ａおよび１１Ｂは、各ｓｉＲＮＡがインフルエンザウイルスＡ株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（図１１Ａ）またはインフルエンザウイルスＡ株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（図１１Ｂ）の複製を阻害する能力をＨＡ力価の測定によって判定した実験結果を比較している。したがって、高ＨＡ力価は阻害の欠如を示し、低ＨＡ力価は有効な阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞に０．０１のＭＯＩで感染させた。これらの実験のために、ＰＢ１セグメント（ＰＢ１−２２５７／２２７７）をターゲティングする１つのｓｉＲＮＡ、ＰＢ２セグメント（ＰＢ２−２２４０／２２６０）をターゲティングする１つのｓｉＲＮＡ、ＰＡセグメント（ＰＡ−２０８７／２１０７（Ｇ））をターゲティングする１つのｓｉＲＮＡ、ならびにＮＰゲノムおよび転写物をターゲティングする３つの異なるｓｉＲＮＡ（ＮＰ−２３１／２５１、ＮＰ−３９０／４１０、およびＮＰ−１４９６／１５１６）を試験した。図１１Ａおよび１１Ｂは、ｓｉＲＮＡの４’ヌクレオチドを列挙することに留意のこと。
【０２１６】
図１１Ａおよび１１Ｂ中の記号は、以下を示す：黒塗りの四角はｓｉＲＮＡを投与していないコントロール細胞を示す。白抜きの四角は、ＧＦＰコントロールｓｉＲＮＡを投与した細胞を示す。黒塗りの円は、ｓｉＲＮＡ  ＰＢ１−２２５７／２２７７を投与した細胞を示す。白抜きの円は、ｓｉＲＮＡ  ＰＢ２−２２４０／２２６０を投与した細胞を示す。白抜きの三角は、ｓｉＲＮＡ  ＰＡ−２０８７／２１０７（Ｇ）を投与した細胞を示す。Ｘ記号は、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−２３１／２５１を投与した細胞を示す。＋記号は、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−３９０／４１０を投与した細胞を示す。黒塗りの三角は、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６／１５１６を投与した細胞を示す。グラフ中の一定の記号は重なっている場合があることに留意のこと。例えば、図１１Ｂでは、白抜きおよび黒塗りの三角が重なっている。各測定点で数値を列挙した表３および４を、解明のために参考にすることができる。
【０２１７】
図１１Ａおよび１１Ｂ（表３および４）に示すように、ｓｉＲＮＡの非存在下（偽ＴＦ）またはコントロール（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡの存在下で、ウイルス力価が長期間増加し、感染から約４８〜６０時間後にピークに達する。対照的に、６０時間後のウイルス力価は、任意のｓｉＲＮＡの存在下で有意に低かった。例えば、ＷＳＮ株では、ＨＡ力価（ウイルスレベルを反映する）は、ｓｉＲＮＡｓ  ＰＢ２−２２４０またはＮＰ−２３１の存在下ではコントロールの約半分であった。特に、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６の存在下でのウイルスレベルは、両株で検出限界（１０，０００ＰＦＵ／ｍｌ）未満であった。これは、ＰＲ株で６０倍超およびＷＳＮ株で１２０倍超の因子による減少を示す。ウイルスレベルはまた、ＷＳＮ株においてｓｉＲＮＡ  ＰＡ−２０８７（Ｇ）の存在下で検出限界（１０，０００ＰＦＵ／ｍｌ）未満であり、ＰＲ８株では極めて低い。ｓｉＲＮＡによるウイルス産生の抑制は、最も初期の測定点でさえも明らかであった。感染から７２時間後ほどの有効な抑制（検出不可能レベル（ＨＡ力価による測定）へのウイルス産生の抑制が含まれる）が測定点で認められた。
【０２１８】
表５は、阻害倍率に関して示したＭＤＣＫ細胞における６０時間のｓｉＲＮＡ阻害アッセイの結果をまとめている。したがって、低い値は阻害の欠如を示し、高い値は有効な阻害を示す。ウイルス遺伝子内のｓｉＲＮＡの位置を、遺伝子名の後に数字で示す。本明細書中に記載のように、数字は、遺伝子中のｓｉＲＮＡの出発ヌクレオチドを示す。例えば、ＮＰ−１４９６は、ＮＰに特異的なｓｉＲＮＡ（ＮＰ配列のヌクレオチド１４９６から出発する第１のヌクレオチド）を示す。示した値（阻害倍率）は、偽トランスフェクション由来の血球凝集素単位を示したｓｉＲＮＡでのトランスフェクション由来の血球凝集素単位で割ることによって計算し、値１は阻害無しを意味する。
【０２１９】
インフルエンザウイルスゲノムの６つのセグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）にターゲティングされた全部で２０個のｓｉＲＮＡを、を、ＭＤＣＫ細胞株系で試験した（表５）。約１５％の試験したｓｉＲＮＡ（ＰＢ１−２２５７、ＰＡ−２０８７Ｇ、およびＮＰ−１４９６）は、ＰＲ８ウイルスまたはＷＳＮウイルスのいずれを使用したかとは無関係に、ほとんどの場合ＭＯＩ＝０．００１で１／１００未満およびＭＯＩ＝０．０１で１／１６〜１／６４にウイルス産生を阻害する高い効果を示した。特に、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６またはＰＡ−２０８７を使用した場合、阻害は、培養上清が検出可能な研究凝集素活性をもたらさないことが非常に明白であった。これらの強力なｓｉＲＮＡが３つの異なるウイルス遺伝子セグメント（ＲＮＡ転写複合体に関与するＰＢ１およびＰＡならびに一本鎖ＲＮＡ結合核タンパク質であるＮＰ）をターゲティングする。他の系における所見と一致して、これらのｓｉＲＮＡによってターゲティングされた配列は全てコード領域の３’プライム末端に比較的隣接させて配置させる（図１３）。
【０２２０】
約４０％のｓｉＲＮＡはウイルス産生を有意に阻害するが、阻害範囲は一定のパラメーターにしたがって変化した。ＰＲまたはＷＳＮウイルスのいずれを使用したかとは無関係に、約１５％のｓｉＲＮＡがウイルス産生を強力に阻害した。しかし、一定のｓｉＲＮＡの場合、阻害の程度はＰＲ８またはＷＳＮのいずれを使用するかに依存していくらか変化した。いくつかのｓｉＲＮＡは初期の測定点（感染から２４〜３６時間後）でのみまたはより低い感染量（ＭＯＩ＝０．００１）のみウイルス産生を阻害した（ＰＢ２−２２４０、ＰＢ１−１２９、ＮＰ−２３１、およびＭ３７など）。これらのｓｉＲＮＡは、異なるウイルス遺伝子ゲノムをターゲティングし、対応する配列を、コード領域の３−プライム末端または５−プライム末端に近接して位置付ける（図１３および表５）。
【０２２１】
約４５％のｓｉＲＮＡはウイルス力価に対する効果は認識できず、これらがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生の干渉で有効でないことを示す。特に、ＮＳ遺伝子セグメントをターゲティングする４つのｓｉＲＮＡにおいて阻害効果を示したものはなかった。
【０２２２】
ウイルス力価をより正確に評価するために、偽トランスフェクションまたはＮＰ−１４９６でのトランスフェクションを行ったウイルス感染細胞から得た培養物上清由来の培養物上清を使用したプラークアッセイを行った（６０時間後）。偽上清において約６×１０５ｐｆｕ／ｍｌが検出されたのに対し、非希釈ＮＰ−１４９６上清においてはプラークは検出されなかった（図１１Ｃ）。プラークアッセイの検出限界約２０ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌであるため、ＮＰ−１４９６によるウイルス産生を少なくとも約１／３０，０００に阻害する。０．１のＭＯＩでさえ、ＮＰ−１４９６はウイルス産生を約１／２００に阻害した。
【０２２３】
ｓｉＲＮＡの有効性を判定するために、段階的な量のＮＰ−１４９６を、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトし、その後ＰＲ８ウイルスを感染させた。血球凝集素アッセイによって培養上清のウイルス力価を測定した。図１１Ｄに示すように、ｓｉＲＮＡ量が減少するにつれて、培養物上清のウイルス力価が増加した。しかし、トランスフェクションのために２５ｐｍｏｌほどのｓｉＲＮＡしか使用しない場合でさえ、偽トランスフェクションと比較してウイルス産生を約１／４に阻害し、インフルエンザウイルス産生阻害におけるＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡの有効性を示す。
【０２２４】
治療において、ｓｉＲＮＡが既存のウイルス感染を有効に阻害することができることが望ましい。典型的なインフルエンザ感染では、感染から約４時間後から新規のビリオンが放出され始める。ｓｉＲＮＡが既存の感染に反して新規に放出されたウイルスによって感染を減少または消失させることができるかを判定するために、ＭＤＣＫ細胞にＰＲ８ウイルスを２時間感染させ、その後、ＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。図１１Ｅに示すように、偽トランスフェクション後長期間安定にウイルス力価が増大するのに対し、ＮＰ−１４９６トランスフェクト細胞では僅かに増加しただけであった。したがって、ウイルス感染後のｓｉＲＮＡの投与が有効である。
【０２２５】
まとめると、これらの結果は、（ｉ）一定のｓｉＲＮＡはインフルエンザウイルス産生を協力に阻害することができること、（ｉｉ）インフルエンザウイルス産生を、異なるウイルス遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ（ＮＰ、ＰＡ、およびＰＢ１タンパク質をコードするものが含まれる）によって阻害することができること、および（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡの投与と同時または後に動詞に感染させた細胞に加えて、以前に感染した細胞でｓｉＲＮＡ阻害が起こることを示す。
【０２２６】
【表３】
2006512906.tif 000010
【０２２７】
【表４】
2006512906.tif 000011
【０２２８】
【表５】
2006512906.tif 000012
（実施例３：ウイルスＲＮＡポリメラーゼまたは核タンパク質をターゲティングするｓｉＲＮＡはニワトリ胚におけるインフルエンザＡウイルス産生を阻害する）
（材料と方法）
ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体の処方物およびニワトリ胚接種。ｓｉＲＮＡを上記のように調製した。ニワトリの卵を標準的な条件下で保持した。３０μｌのオリゴフェクタミン（製品番号：１２２５２０１１。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｎｏｗ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３０μｌのＯｐｔｉ−ＭｅＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。２．５ｎｍｏｌ（１０μｌ）のｓｉＲＮＡを３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩと混合し、希釈したオリゴフェクタミンに添加した。ｓｉＲＮＡおよびオリゴフェクタミンを、室温で３０分間インキュベートした。１０日齢のニワトリ卵を、１００μｌのＰＲ８ウイルス（５０００ｐｆｕ／ｍｌ）と共にｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体とインキュベートした。卵を、３７℃で指示された時間インキュベートし、尿膜腔液を採取した。尿膜腔液ウイルス力価を、上記のＨＡアッセイによって試験した。
【０２２９】
（結果）
ＭＤＣＫ細胞が得られたか否かを確認するために、ｓｉＲＮＡがニワトリ受精卵中のインフルエンザウイルス産生を阻害する能力もアッセイした。卵にはエレクトロポレーションを使用することができないため、オリゴフェクタミン（ＤＮＡオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを容易にすることが示されている脂質ベースの薬剤）およびインビトロでｓｉＲＮＡを使用した（２５）。簡単に述べれば、図１４Ａに図示するように、ＰＲ８ウイルスのみ（５００ｐｆｕ）またはウイルス＋ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体を、１０日齢のニワトリ卵の尿膜腔液に注射した。血球凝集素アッセイによるウイルス力価の測定のために、１７時間後に尿膜腔液を採取した。図１４Ｂに示すように、ウイルスを単独で注射した場合（オリゴフェクタミンの存在下）、抗ウイルス力価が容易に検出された。ＧＦＰ−９４９の同時注射では、有意にウイルス力価に影響を与えなかった（オリゴフェクタミンを省略した場合、ウイルス力価の有意な減少は認められなかった）。
【０２３０】
インフルエンザウイルスに特異的なｓｉＲＮＡの注射により、ＭＤＣＫ細胞で認められた結果と一致する結果が示された。ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルス産生を阻害した同一のｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６、ＰＡ２０８７、およびＰＢ１−２２５７）もニワトリ卵におけるウイルス産生を阻害するのに対して、ＭＤＣＫ細胞では有効性の低いｓｉＲＮＡ（ＮＰ−２３１、Ｍ−３７、およびＰＢ１−１２９）は、ニワトリ受精卵で無効であった。したがって、ｓｉＲＮＡはまた、ニワトリ受精卵におけるインフルエンザウイルス産生の干渉に有効である。
【０２３１】
（実施例４：ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡレベルでインフルエンザウイルス産生を阻害する）
材料と方法
ｓｉＲＮＡを上記のように調製した。
【０２３２】
ＲＮＡの抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲ。１×１０７ＭＤＣＫ細胞に対して、２．５ｎｍｏｌのＮＰ−１４９６を用いてエレクトロポレーションを行うか、偽エレクトロポレーション（ｓｉＲＮＡなし）を行った。８時間後、ＭＯＩ＝０．１のインフルエンザＡ  ＰＲ８ウイルスを細胞に接種した。感染から１、２、および３時間ｇの、上清を除去し、細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）で溶解した。製造者の説明書に従って、ＲＮＡを精製した。製造者の説明書に従って、２００ｎｇの総ＲＮＡ、特異的プライマー（以下を参照のこと）、およびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ）を含む２０μｌの反応混合物を使用して、３７℃で１時間逆転写（ＲＴ）を行った。ｍＲＮＡ、ＮＰｖＲＮＡ、ＮＰｃＲＮＡ、ＮＳｖＲＮＡ、またはＮＳｃＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーを以下に示す。
【０２３３】
【化１】
2006512906.tif 000013
１μｌのＲＴ反応混合物（すなわち、逆転写の実施によって得られるサンプル）および配列特異的プライマーを、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ二本鎖ＤＮＡ結合色素を含むＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したリアルタイムＰＣＲのために使用した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム（ＡＢ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲサイクルを実施し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００ＳＳソフトウェア（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を５０サイクルでＰＣＲ反応を行った。０．２蛍光単位の読み取りでサイクル時間を分析した。全ての反応を二連で行った。二連の間で１．０を超えて変化することによってサイクル時間は切り捨てた。次いで二連のサイクル時間を平均し、正規化された値のために、これらからβ−アクチンのサイクル時間を引いた。
【０２３４】
ＰＣＲプライマーを以下に示す。
【０２３５】
【化２】
2006512906.tif 000014
（結果）
上記のように、インフルエンザウイルスの複製時、ｖＲＮＡが転写されてｃＲＮＡ（より多くのｖＲＮＡ合成のためのテンプレートとして作用する）およびｍＲＮＡ（タンパク質合成のためのテンプレートとして作用する）を産生する（１）。ＲＮＡｉは配列特異的様式でｍＲＮＡの分解をターゲティングすることが公知であるが（１６〜１８）、インフルエンザＡウイルスのｖＲＮＡがヌクレアーゼに感受性を示すため、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡもｓｉＲＮＡの標的である可能性がある（１）。種々のＲＮＡ種の分解に対するｓｉＲＮＡの効果を調査するために、配列特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲを使用して、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｍＲＮＡのレベルを定量することができた。図１６は、インフルエンザウイルスｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＲＮＡとの関係を示す。図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、ｃＲＮＡはｖＲＮＡの正確に相補的であるが、ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造および宿主細胞ｍＲＮＡ由来のさらなる１０〜１３ヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡは３’末端にポリＡ配列を含み、ｖＲＮＡセグメントの５’末端から１５〜２２ヌクレオチド下流の部位に相補的な部位から始まる。したがって、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡと比較すると、ｍＲＮＡは３’末端の１５〜２２ヌクレオチドを欠く。３つのウイルスＲＮＡ種を区別するために、第１の逆転写反応においてｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用した（図１６Ｂ）。ｍＲＮＡのために、プライマーとしてポリｄＴ１８を使用した。ｃＲＮＡのために、ｍＲＮＡから失われたＲＮＡの３’末端に相補的なプライマーを使用した。ｖＲＮＡのために、ｖＲＮＡに相補的であり、且つ５’末端にあまり接近しない限り、プライマーは、ＲＮＡの間のほとんどどこでも良い。たった１つのＲＮＡから転写して得られたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【０２３６】
インフルエンザウイルス感染後、新規のビリオンがパッケージングされ始め、約４時間までに放出される。ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡの第１の波（ｗａｖｅ）に対するｓｉＲＮＡの効果を判定するために、感染ＲＮＡを感染後の早い時期に単離した。簡単に述べれば、ＮＰ−１４９６を、ＭＤＣＫ細胞にエレクトロポレーションした。偽エレクトロポレーション（ｓｉＲＮＡなし）も行った。６〜８時間後、細胞にＭＯＩ＝０．１のＰＲ８ウイルスを感染させた。次いで、細胞を、感染から１、２、および３時間後に溶解し、ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡのレベルを、各ＲＮＡ種のためのプライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによってアッセイした。
【０２３７】
図１７は、感染前に約６〜８時間偽トランスフェクトするかｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６でトランスフェクトした細胞中の感染後の種々の時間でのウイルスＮＰおよびＮＳＲＮＡ種の量を示す。図１７に示すように、感染から１時間後、ＮＰｓｉＲＮＡトランスフェクションを用いるか用いないサンプルの間のＮＰｍＲＮＡの量に有意差はなかった。早ければ感染から２時間で、ＮＰｍＲＮＡが偽トランスフェクション群で３８倍に増加するのに対して、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＮＰｍＲＮＡレベルは増加しなかった（またはさらに僅かに減少した）。感染から３時間後、偽トランスフェクションにおいてｍＲＮＡ転写物レベルが増加しつづけるのに対して、ｓｉＲＮＡ処理を受けた細胞ではＮＰｍＲＮＡ量が連続的に減少する。偽トランスフェクションにおけるｖＲＮＡおよびＣＲＮＡの量の増加は感染から３時間後のみで有意であったこと以外は、ＮＰｖＲＮＡおよびｃＲＮＡは類似のパターンを示した。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、これはおそらくｃＲＮＡおよびさらなるｖＲＮＡ合成前に最初のｍＲＮＡ転写ラウンドが起こるインフルエンザウイルスの生活環に起因する。
【０２３８】
これらの結果は、血球凝集素アッセイまたはプラークアッセイによるインタクトな生ウイルスの測定結果と一致して、全てのＮＰ  ＲＮＡ種の量が、ＮＰｓｉＲＮＡでの投与によっても有意に減少することを示す。ｓｉＲＮＡが主にｍＲＮＡの分解を媒介することが公知であるにもかかわらず、この実験由来のデータは、ＮＰｃＲＮＡおよびＶＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介分解の可能性が除外しないが、下記の結果により、ＮＰｍＲＮＡ減少の結果としてのＮＰタンパク質レベルの減少によりＮＰｃＲＮＡおよび／またはｖＲＮＡの安定性が減少することが示唆される。
【０２３９】
（実施例５：ＲＮＡ干渉の標的の同定）
（材料と方法）
未修飾ｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡを上記のように調製した。センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両方のいずれかの各ヌクレオチド残基の２’−水酸基が２’−Ｏ−メチル基に置換された修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドもＤｈａｒｍａｃｏｎによって合成した。未修飾オリゴヌクレオチドについて記載のように、修飾オリゴヌクレオチドを脱保護し、相補鎖にアニーリングした。ゲル電気泳動によって二重鎖形成の完了についてｓｉＲＮＡ二重鎖を分析した。
【０２４０】
細胞培養、ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション、およびウイルスでの感染。これらを本質的に上記のように行った。簡単に述べれば、修飾ＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡに関する実験のために、ＭＤＣＫ細胞を最初に野生型（ｗｔ）鎖および修飾（ｍ）鎖から形成したＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトし、８時間後に０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスに感染させる。感染から２４時間後に培養上清のウイルス力価をアッセイした。Ｍ−３７ｓｉＲＮＡに関する実験のために、ＭＤＣＫ細胞を、Ｍ−３７ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトし、０．０１ＭＯＩのＰＲ８ウイルスに感染させ、感染から１、２、および３時間後にＲＮＡ単離のために回収した。Ｍ−３７センスおよびアンチセンス配列については、表２を参照のこと。
【０２４１】
本質的に上記のようにＲＮＡ抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲを行った。逆転写のために使用されるｍＲＮＡ、Ｍ特異的ｖＲＮＡ、およびＭ特異的ｃＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーを以下に示す。
【０２４２】
【化３】
2006512906.tif 000015
（結果）
ｍＲＮＡに加えてｓｉＲＮＡがｖＲＮＡおよび／またはｃＲＮＡを干渉する可能性を調査するために、センス（Ｓまたは＋）鎖またはアンチセンス（ＡＳまたは−）鎖が修飾されたＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを合成した。各ヌクレオチド残基中の２’−水酸基を２’−Ｏ−メチル基に置換する修飾では、二重鎖形成のための塩基対合に影響を与えないが、修飾ＲＮＡはもはやＲＮＡ干渉を補助していない。言い換えれば、センス鎖が修飾されているがアンチセンス鎖が野生型であるｓｉＲＮＡ（ｍＳ：ｗｔＡＳ）は、アンチセンス鎖に相補的な配列を有するＲＮＡの分解を補助するが、センス鎖に相補的な配列はそうではない。逆に、センス鎖が野生型であるがアンチセンス鎖が修飾されているｓｉＲＮＡ（ｗｔＳ：ｍＡＳ）は、センス鎖に相補的な配列を有するＲＮＡの分解を補助するが、センス鎖に相補的な配列を有するＲＮＡの分解は補助しない。この減少は、「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ＲＮＡｉ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ」というタイトルの米国特許仮出願番号６０／４４６，３８７号により詳細に記載されている。
【０２４３】
ＭＤＣＫ細胞を、偽トランスフェクトするかセンス鎖（ｍＳ：ｗｔＡＳ）またはアンチセンス鎖（ｗｔＳ：ｍＡＳ）のいずれかの鎖が修飾される一方で他の鎖が野生型であるＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を、両方の鎖が修飾されたＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ（ｍＳ：ｍＡＳ）でもトランスフェクトした。次いで、細胞を、ＰＲ８ウイルスに感染させ、上清のウイルス力価を測定した。図１８Ａに示すように、偽トランスフェクションに供した培養物で高ウイルス力価が検出された。予想通り、野生型ｓｉＲＮＡ（ｗｔＳ：ｗｔＡＳ）でトランスフェクトした培養物で非常に低いウイルス力価が検出されたが、両方の鎖を修飾したｓｉＲＮＡ（ｍｓ：ｍＡＳ）でトランスフェクトして培養物では高ウイルス力価が検出された。アンチセンス鎖が修飾されたｓｉＲＮＡ（ｗｔＡＳ：ｍＡＳ）でトランスフェクトした培養物でウイルス力価が高かったのに対して、センス鎖のみが修飾されたｓｉＲＮＡ（ｍＳ：ｗｔＡＳ）でトランスフェクトした培養物ではウイルス力価は低かった。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、インフルエンザウイルスの産生を阻害するｓｉＲＮＡ二重鎖の野生型アンチセンス（−）鎖のための要件として、ＲＮＡ干渉の標的は、ｍＲＮＡ（＋）、ｃＲＮＡ（＋）、または両方と示唆する。
【０２４４】
これらの可能性をさらに区別するために、対応するｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積に対するｓｉＲＮＡの効果を試験した。同時に感染した細胞のコホートにおける転写を追跡するために、感染から１、２、および３時間後（新規のビリオンの放出および再感染前）にＲＮＡ単離用のｓｉＲＮＡトランスフェクトＭＤＣＫ細胞を採取した。ウイルスｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡを、特異的プライマーを使用した逆転写によって最初に独立してｃＤＮＡに変換した。次いで、リアルタイムＰＣＲによって各ｃＤＮＡのレベルを定量した。図１８Ａに示すように、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡ  Ｍ−３７を使用した場合、感染から１時間後または２時間後にＭ特異的ｍＲＮＡはほとんど検出されなかった。感染から３時間後、Ｍ−３７の非存在下でＭ特異的ｍＲＮＡが容易に検出された。Ｍ−３７でトランスフェクトされた細胞では、Ｍ特異的ｍＲＮＡのレベルは、約５０％減少した。対照的に、Ｍ特異的ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡのレベルは、Ｍ−３７の存在によって阻害されなかった。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、これらの結果は、ウイルスｍＲＮＡはおそらくｓｉＲＮＡ媒介性干渉の標的であることを示す。
【０２４５】
（実施例６：ウイルスＲＮＡ蓄積に対する一定のｓｉＲＮＡの広範な効果）
（結果）
上記のようにｓｉＲＮＡを調製した。
【０２４６】
実施例３に記載のように、ＲＮＡの抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲを行った。ｍＲＮＡ、ＮＰｖＲＮＡ、ＮＰｃＲＮＡ、ＮＳｖＲＮＡ、ＮＳｃＲＮＡ、ＭｖＲＮＡ、またはＭｃＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーを、実施例４および５に記載した。逆転写に使用するＰＢ１ｖＲＮＡ、ＰＢ１ｃＲＮＡ、ＰＢ２ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｃＲＮＡ、ＰＡｖＲＮＡ、またはＰＡｃＲＮＡに特異的なプライマーを以下に示す。
【０２４７】
【化４】
2006512906.tif 000016
ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ  ＲＮＡのＰＣＲプライマーを以下に示す。
【０２４８】
【化５】
2006512906.tif 000017
（結果）
上記のように（実施例４）、ＮＰ−１４９６がＮＰ遺伝子セグメントの分解を特異的にターゲティングするかどうかまたはＮＰ以外のウイルスＲＮＡレベルも影響を受けるかどうかを判定するために、ＮＳに特異的なプライマーを、異なるＮＳ  ＲＮＡ種（ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ）の量を測定するためのＲＴおよびリアルタイムＰＣＲに使用した。図１９に示すように、ＮＳｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの変化は、ＮＰ  ＲＮＡについて認められたものと同一のパターンを示した。感染から３時間後、偽トランスフェクト細胞で全てのＮＳ  ＲＮＡ種の有意な増加が認められるのに対し、ＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを投与された細胞でＮＳ  ＲＮＡレベルの有意な変化は認められなかった。この結果は、異なるウイルスＲＮＡの転写および複製が少なくともＮＰ  ＲＮＡに関して調和良く調節されることを示す。「調和良く調節された」は、ある転写物レベルが別の転写物レベルに直接または間接的に影響を与えることを意味する。特別な機構は含まれていない。ＮＰ転写物がｓｉＲＮＡ処理によって分解された場合、他のウイルスＲＮＡレベルも減少する。
【０２４９】
他のウイルスＲＮＡに対するＮＰｓｉＲＮＡの効果をさらに調査するために、ＮＰ−１４９６で投与した細胞中の全てのウイルス遺伝子のｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積を測定した。図１９（上のパネル）に示すように、ＮＰ特異的ｍＲＮＡは、感染から１〜２時間後は低かった。感染から３時間後、ＮＰ−１４９６の非存在下でＮＰｍＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＮＰ−１４９６の存在下では、ＮＰｍＲＮＡはバックグラウンドレベルを保持し、ｓｉＲＮＡが特定のｍＲＮＡの蓄積を阻害したことを示す。図１９Ａ（中央および下のパネル）に示すように、ＮＰ−１４９６の存在によってＮＰ特異的およびＮＳ特異的ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡのレベルは大幅に阻害された。これらの結果は、実施例４に記載の結果を確認するものである。さらに、ＮＰ−１４９６投与細胞では、Ｍ、ＮＳ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡのｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害された（図１９Ｂ、１９Ｃ、および１９Ｈ）。さらに、ＰＡ−２０８７については広範な効果も認められた。図１９Ｅ、１９Ｆ、および１９Ｇの左側の上、中央、および下のパネルは、ＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡによるウイルスｍＲＮＡ転写ならびにｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ複製の阻害を示す図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃに示す結果と同一の結果を示す。図１９Ｅ、１９Ｆ、および１９Ｇの右側の下のパネルは、同一濃度でＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡを使用して行った同一の実験の結果を示す。図１９Ｅに示すように、感染から３時間後、ＰＡ−２０８７の非存在下でＰＡ、Ｍ、およびＮＳｍＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＰＡ−２０８７の存在により、ＰＡ、Ｍ、およびＮＳｍＲＮＡの転写が阻害された。図１９Ｆ（それぞれ右側の上、中央、および下のパネル）に示すように、感染から３時間後、ＰＡ−２０８７の非存在下でＰＡ、Ｍ、およびＮＳｖＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＰＡ−２０８７の存在によりＰＡ、Ｍ、およびＮＳｖＲＮＡの蓄積が阻害された。図１９Ｇ（それぞれ右側の上、中央、および下のパネル）に示すように、感染から３時間後、ＰＡ−２０８７の非存在下でＰＡ、Ｍ、およびＮＳｃＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＰＡ−２０８７の存在によりＰＡ、Ｍ、およびＮＳｃＲＮＡの蓄積が阻害された。さらに、図１９Ｈは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＰＢ１（上のパネル）、ＰＢ２（中央のパネル）、およびＰＡ（下のパネル）特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。
【０２５０】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＮＰｓｉＲＮＡの広範な効果は、おそらくｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの結合および安定化の重要な結果であり、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＲＮＡ分解を非特異的にターゲティングするためではないことを示唆する。インフルエンザウイルス中のＮＰ遺伝子セグメントは、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの両方に結合することができる一本鎖ＲＮＡ結合核タンパク質をコードする（図１５を参照のこと）。ウイルスの生活環の内に、ＮＰ  ｍＲＮＡを最初にトランスクライブし、翻訳した。ＮＰタンパク質の主な機能は、ＲＮＡの転写、複製、およびパッケージングのためにウイルスゲノムをキャプシドに包むことである。ＮＰタンパク質の非存在下では、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの全長合成は強く損なわれる。ＮＰｓｉＲＮＡがＮＰ  ＲＮＡの分解を誘導する場合、ＮＰタンパク質合成が損なわれ、それにより十分なＮＰタンパク質の欠乏が他のウイルス遺伝子セグメントの複製に影響を与える。この方法で、ＮＰｓｉＲＮＡは、非常に初期の段階でウイルス産生を強力に阻害することができる。
【０２５１】
感染細胞中のＮＰタンパク質分子数は、ゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ）複製に対してｍＲＮＡ合成レベルを調節すると仮定されている（１）。ＮＰタンパク質の温度感受性変異を使用して、以前の研究で、ｃＲＮＡの合成はインビトロおよびインビボの両方で温度感受性を示すが、ｍＲＮＡはそうではないことが示されている（７０、７１）。ＮＰタンパク質は、初期のｃＲＮＡおよびｖＲＮＡ転写物の伸長および抗終結のために必要であることが示された（７１、７２）。上記の結果は、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡが感染細胞中の全てのウイルスＲＮＡの蓄積を阻害したことを示す。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、おそらく、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡの存在下で、新規に転写されたＮＰｍＲＮＡが分解され、ウイルス感染後にＮＰタンパク質合成が阻害されるようである。新規に合成されたＮＰ、さらなるウイルス転写、および複製がなければ、新規のビリオン産生は阻害される。
【０２５２】
同様に、ＰＡ特異性の存在下で、新規に転写されたＰＡｍＲＮＡが分解され、ＰＡタンパク質合成が阻害される。インフルエンザウイルスあたり３０〜６０コピーのＲＮＡ転写酵素が存在するにもかかわらず（１）、新規に合成されたＲＮＡ転写酵素がなければ、さらなるウイルスの転写および複製は同様に阻害される。ＰＢ１に特異的なｓｉＲＮＡを使用しても類似の結果が得られた。対照的に、ウイルス感染後期まで基質（Ｍ）タンパク質は必要ない（１）。したがって、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡはＭ特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害するが、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、または他のウイルスＲＮＡの蓄積は阻害しない。まとめると、これらの所見は、インフルエンザウイルスＲＮＡの転写および複製における新規に合成された核タンパク質およびポリメラーゼタンパク質の重要な要件を証明する。ＮＰ、ＰＡ、およびＰＢ１特異的ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡの蓄積および他のウイルスＲＮＡ転写を干渉するｍＲＮＡおよびウイルス特異的機構により、これらのｓｉＲＮＡはインフルエンザウイルス感染の特に強力なインヒビターであり得ることが示唆される。特に、本明細書中に記載の結果により、一般に、通常は因子特異的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質をコードする転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡはターゲティングされたＲＮＡレベルの単純な減少よりもむしろ広範な効果（例えば、他の因子特異的転写物に対する効果）を有する可能性が高いことが示唆される。同様に、本明細書中に記載の結果により、一般に、感染性因子のポリメラーゼ遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）にターゲティングされたｓｉＲＮＡはポリメラーゼＲＮＡレベルの単純な減少よりもむしろ広範な効果（例えば、他の因子特異的転写物に対する効果）を有する可能性が高いことが示唆される。
【０２５３】
（実施例７：一定のｓｉＲＮＡによるウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害は、インターフェロン応答やウイルス誘導性ＲＮＡ分解に起因しない）
（材料と方法）
ＲＮＡレベルの測定。標準的な条件下でＰＣＲを使用してＲＮＡレベルを測定した。ＰＣＲ後、γ−アクチンＲＮＡの測定のためにプライマーを使用した。
【０２５４】
【化６】
2006512906.tif 000018
以下に引用された引用文献に記載の標準的な技術にしたがって、ベロ細胞の培養およびリン酸化ＰＫＲの測定を行った。
【０２５５】
（結果）
ウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害についての１つの可能な理由は、ｓｉＲＮＡの存在下での感染細胞のインターフェロン応答である（２３、６５、６６）。したがって、全ＩＦＮ遺伝子座（全てのα、β、およびω遺伝子が含まれる）が欠失したベロ細胞において上記実験を繰り返した（６７、６８）（Ｑ．Ｇ．およびＪ．Ｃ．未公開データ）。ＭＤＣＫ細胞と同様に、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ特異的ｍＲＮＡの蓄積の全てがＮＰ−１４９６によって阻害された（図１９Ｄ）。さらに、細胞遺伝子由来の転写物（β−アクチン、γ−アクチン、およびＧＡＰＤＨが含まれる）のレベルに対するｓｉＲＮＡの効果を、ＰＣＲを使用してアッセイした。ｓｉＲＮＡの非存在下または存在下で転写レベルの有意な相違は検出されず（γ−アクチンｍＲＮＡに対するＭ−３７ｓｉＲＮＡの効果の欠如を示す図１８Ｃの下のパネル、データ示さず）、ｓｉＲＮＡの効果が、ウイルスＲＮＡに特異的であることを示唆している。一定のｓｉＲＮＡによるウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害は細胞インターフェロン応答の結果ではないことが示唆される。
【０２５６】
インフルエンザウイルス感染後、ｄｓＲＮＡの存在は、分解のためにＲＮＡにターゲティングする細胞経路も活性化させる（２３）。本経路の活性化に対するｓｉＲＮＡの効果について試験を行うために、本発明者らは、リン酸化タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）（経路の最も重要な成分）のレベルをアッセイした（２３）。ウイルス感染の非存在下におけるＮＰ−１４９６でのＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションは、活性化ＰＫＲレベルに影響を与えなかった（データ示さず）。インフルエンザウイルスによる感染によってリン酸化ＰＫＲレベルが増加し、これは以前の研究と一致する（６５、６６、６９）。しかし、ＮＰ−１４９６の存在下または非存在下で増加は同一であった（データ示さず）。したがって、ウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害は、ｓｉＲＮＡの存在下での強化されたウイルス誘導性分解の結果ではない。
【０２５７】
（実施例８：単独または組み合わせのいずれかでインフルエンザウイルス産生を阻害する優れた能力を有するｓｉＲＮＡの体系的同定）
本実施例は、インフルエンザウイルス産生を阻害する優れた能力を有するｓｉＲＮＡの同定への体系的アプローチを記載する。例としてｓｉＲＮＡに言及しているが、二重鎖部分が下記のｓｉＲＮＡの二重鎖部分と同一であり、且つ上記のように配列が変化し得るループを含むｓｈＲＮＡの評価のために同一の方法を使用することができると理解すべきである。
【０２５８】
原理：予防および治療目的のために、優れたインフルエンザウイルス感染阻害能力を示すｓｉＲＮＡを同定することが望ましい。上記のように、２０個のｓｉＲＮＡ（そのうちの１９個が５’末端にＡＡジヌクレオチドを含む高度に保存された配列に基づいている）を設計および試験した。この位置でのＡＡジヌクレオチドの存在はｓｉＲＮＡ機能に重要であると最初に見なされ、より最近の所見では、この位置に他のヌクレオチドを含む配列に基づいたｓｉＲＮＡも同様に有効であるため、これらは必要ないことが示されている（２２、２８）。したがって、ＡＡで始まらない配列に基づいて設計されたさらなるｓｉＲＮＡを設計し、インフルエンザウイルス産生を有効に阻害するさらなるｓｉＲＮＡを同定するために試験した。
【０２５９】
いくつかの強力な阻害ｓｉＲＮＡの利用可能性により、組み合わせで使用することができる。ポリオウイルスのｓｉＲＮＡについての最近の研究は、１つのｓｉＲＮＡの使用によりｓｉＲＮＡによってターゲティングすることができない既存の変異ポリオウイルスの増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）が得られることを示した（２４）。インフルエンザウイルスが高い比率で変異することが公知であるため（４）、１つのｓｉＲＮＡの使用によりおそらく耐性ウイルスの増殖を促進することができ、それによりｓｉＲＮＡが一定期間後に無効にする可能性がある。他方では、２つまたはそれ以上の異なるｓｉＲＮＡ（特に異なるウイルスＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ）を同時に使用する場合、耐性ウイルスが出現する可能性を桁数によって減少させる。したがって、最も有効な組み合わせを見出すために、２つまたはそれ以上の組み合わせにおいてｓｉＲＮＡについて試験を行う。
【０２６０】
本実施例は、以下の目的を達成するための体系的アプローチを記載する。
【０２６１】
１）インフルエンザウイルスゲノムの全保存領域が非重複ｓｉＲＮＡによって一度対象となるようにさらなるｓｉＲＮＡを設計および試験すること。
【０２６２】
２）漸増する高感染多重度（ＭＯＩ）を使用したスクリーニングによる最も強力な阻害ｓｉＲＮＡを同定すること。
【０２６３】
３）耐性ウイルスの出現を防止するために有効なｓｉＲＮＡの最も強力な組み合わせを同定すること。
【０２６４】
さらなるｓｉＲＮＡの設計および試験。実施例１に記載のｓｉＲＮＡによって対象とされないウイルスゲノムの保存領域に特異的なさらなるｓｉＲＮＡを設計する。ウイルスゲノムの保存領域が非重複ｓｉＲＮＡを一度対象とすることを目的とする。２つの理由から非重複ｓｉＲＮＡを選択する。第１に、いくつかの標的配列を共有するため、重複ｓｉＲＮＡの同時適用ではおそらく最も有効な組み合わせは得られない。重複領域の変異により両ｓｉＲＮＡが無効になる可能性が高い。第２に、広範なスクリーニングのために、重複ｓｉＲＮＡ数は、合理的な期間内での試験には大き過ぎ得る。各ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳについて少なくとも１つの強力なｓｉＲＮＡを得ることを目的とする。（ＲＮＡスプライシングによって、ＭおよびＮＳ遺伝子はそれぞれ２つのタンパク質をコードする。可能ならば、同一の遺伝子由来の両方の転写物に特異的なｓｉＲＮＡを設計する。）ＮＰ、ＰＡ、およびＰＢ１に特異的な強力なｓｉＲＮＡは既に同定されているため（表５）、ＰＢ２、Ｍ、およびＮＳに特異的なより多くのｓｉＲＮＡ候補について試験を行うことに集中する。非重複ｓｉＲＮＡの試験によってこれらの遺伝子の強力なｓｉＲＮＡが明らかにならない場合、重複ｓｉＲＮＡ候補について試験を行う。６つの各遺伝子に特異的な強力な阻害ｓｉＲＮＡの適用可能性により、最も強力な組み合わせの同定が容易になる。
【０２６５】
さらなる非重複ｓｉＲＮＡを設計するために、最初のＡＡジヌクレオチドが必要でないこと以外は、実施例１および詳細な説明に記載の同一の基準を使用する。これらの基準に基づいて、約４０個のｓｉＲＮＡについて試験を行うことが望ましいと予想される。一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを市販用に合成し、その相補鎖にアニーリングする。血球凝集素アッセイによって測定した場合にＭＤＣＫ細胞中でインフルエンザウイルス産生（ＰＲ８、ＷＳＮ、またはその両方）を干渉する能力について得られたｓｉＲＮＡ二重鎖について試験を行う。細胞株中で有効なｓｉＲＮＡを、ニワトリ胚中でさらに評価する。ウイルスの両サブタイプならびに細胞および胚の両方と阻害効果が一致するｓｉＲＮＡをさらに調査することが好ましい。
【０２６６】
ｓｉＲＮＡの効力の比較。一旦インフルエンザウイルス産生を有意に阻害するｓｉＲＮＡが同定されると、最も強力なものを同定するために同一アッセイにおけるその効力を比較する。ＭＤＣＫ細胞を使用したほとんどの上記アッセイでは、０．００１または０．０１のＭＯＩのウイルスを使用した。２つのサンプル（ＮＰ−１４９６およびＰＡ−２０８７）ウイルス力価が血球凝集素アッセイによって検出不可能であり、１つのサンプル（ＮＰ−１４９６）ではプラークアッセイによって検出不可能であることが見出された。これらのｓｉＲＮＡ（具体的には、同一の遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ）の効力を区別するために、ＭＤＣＫ細胞を感染するために使用したＭＯＩを０．１またはそれ以上に増加させる。ｓｉＲＮＡもニワトリ胚で試験する。プラークアッセイを使用して、ウイルス力価をより正確に測定する。
【０２６７】
さらに、トランスフェクションのために使用したｓｉＲＮＡ量の滴定によってｓｉＲＮＡの効力を比較する。簡単に述べれば、異なる量のｓｉＲＮＡ（０．０２５、０．０５、０．１、および０．２５ｎｍｏｌ）を使用してＭＤＣＫ細胞（１×１０７）にエレクトロポレーションを実施する。細胞に固定ＭＯＩ（０．０１など）のＰＲ８またはＷＳＮウイルスを感染させ、血球凝集素によるウイルス力価を測定するために６０時間後に培養上清を回収した。これらの実験結果は、各ｓｉＲＮＡの相対効力だけでなく、最大阻害の最小必要量を判定するために役立つ。後者は、上記組み合わせに各ｓｉＲＮＡをどの程度使用するのかということの判定に有用である。
【０２６８】
ｓｉＲＮＡの最も強力な組み合わせの同定。２つまたはそれ以上の異なるｓｉＲＮＡの同時使用は、１つのｓｉＲＮＡによる干渉を回避することができる変異ウイルスの出現を防止するために非常に有用であり得る。一旦多数の８個のウイルス遺伝子の強力なｓｉＲＮＡが同定されると、組み合わせにおけるその有効性について試験を行う。好ましくは、少なくとも２個の遺伝子にターゲティングされた強力なｓｉＲＮＡを同定する。または、さらに好ましくは、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、またはさらに８個全ての遺伝子にターゲティングされた強力なｓｉＲＮＡを同定する。しかし、最初は８個全部の遺伝子未満に制限することが望ましい（例えば、５または６遺伝子）。これらの研究のために、以下の検討材料が重要である：ｉ）同一の混合物で使用した異なるｓｉＲＮＡ数、ｉｉ）「カクテル」における各ｓｉＲＮＡの最小使用量、およびｉｉｉ）最も強力な組み合わせを同定するための最も有効な方法。
【０２６９】
インフルエンザウイルスの変異率は、１．５×１０−５／ヌクレオチド／感染サイクルと推定される（４）。異なる遺伝子に特異的な２つのｓｉＲＮＡを同時に使用する場合、耐性ウイルスの出現率は、２．２５×１０−１０である。ｓｉＲＮＡは時折１つのヌクレオチドミスマッチ（２６）（具体的には、アンチセンス鎖の末端（２８）および３’側の半分）を許容することができることを考慮すると、２つのｓｉＲＮＡの同時使用は、耐性ウイルスの出現防止に非常に有効なはずである。控えめにいえば、組み合わせ中には３つのｓｉＲＮＡで十分なはずである。この計算は、混合物中の各ｓｉＲＮＡが独立して作用することを前提にしている。最初、このｓｉＲＮＡのみを使用して上記のように判定したインフルエンザウイルス産生の最大阻害に必要なｓｉＲＮＡの最小量を組み合わせ中に使用する。いくつかの研究は、哺乳動物細胞およびドロソフィラのＲＮＡｉ機構は限定的であり得ることを示す（２７、２９、３０）。これがインフルエンザウイルス産生のＲＮＡ干渉と思われる場合、本発明者らは組み合わせ中の各ｓｉＲＮＡ量を減少させて試験する（２つの組み合わせ中の各ｓｉＲＮＡの最大量の半分をについて試験を行う）。
【０２７０】
最初に、２つのｓｉＲＮＡの試験組み合わせを体系的に試験する。このストラテジーの利点は、２つのｓｉＲＮＡの最も強力な組み合わせだけでなく３つのｓｉＲＮＡの組み合わせ中の強力な成分も得られるという点である。異なる遺伝子またはウイルス生活環の異なる時期に特異的な２つのｓｉＲＮＡの組み合わせが潜在的相乗効果のためにより望ましいが、転写酵素が豊富なタンパク質ではなく、且つウイルス産生に重要であるため、転写酵素の異なる成分に特異的なｓｉＲＮＡの組み合わせについて試験を行う価値がある。各遺伝子（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）のための１つの強力なｓｉＲＮＡを同定すると仮定すると、２つのｓｉＲＮＡの全ての可能な組み合わせを対象とするために１５個の組み合わせについて試験を行う必要がある。
【０２７１】
個別または２つの組み合わせのエレクトロポレーションによって、ｓｉＲＮＡをＭＤＣＫ細胞に移入する。８時間後、細胞に所定のＭＯＩのＰＲ８またはＷＳＮウイルスを感染させ、培養上清を、血球凝集素によるウイルス力価のアッセイのために６０時間後に回収する。実質的に低い血球凝集素単位を有するサンプル中の正確な力価を、プラークアッセイによって判定する。細胞株由来の結果を確認するために、ニワトリ胚中でｓｉＲＮＡの組み合わせをアッセイする。
【０２７２】
この一連の実験結果により、２つのｓｉＲＮＡの組み合わせの相対効力および２つのｓｉＲＮＡの組み合わせが相乗効果を有するかどうかが明らかとなる。例えば、ＮＰ−１４９６とＰＡ−２０８７との組み合わせがＮＰ−１４９６およびＰＡ−２０８７の個別の効果を合計した効果よりも高い場合、組み合わせは相乗効果を有する。これらの結果は、３つのｓｉＲＮＡのどの組み合わせが必要に応じて有効である可能性が高いかについての目安が得られる。例えば、ＮＰ−１４９６とＰＡ−２０８７との組み合わせがＮＰ−１４９６またはＰＡ−２０８７のみよりも有効であり、且つＰＡ−２０８７とＰＢ１−２２５７との組み合わせがＰＡ−２０８７またはＰＢ１−２２５７のみよりも有効であると仮定すると、ＮＰ−１４９６、ＰＡ−２０８７、およびＰＢ１−２２５７を含むカクテル中の３つのｓｉＲＮＡは特に有効である可能性が高い。ＭＤＣＫ細胞およびニワトリ胚で有効である可能性が最も高い少なくとも３つのｓｉＲＮＡカクテルの効力を測定する。２つのｓｉＲＮＡの組み合わせ由来の結果が役に立たない場合、３つのｓｉＲＮＡカクテルの効力を、２つのｓｉＲＮＡカクテルの試験について記載のように体系的に試験する。全ての可能性を対象とするために、１０の異なる組み合わせについて試験を行う必要がある。
【０２７３】
まとめると、推奨される実験から得た結果により、多数の８個のインフルエンザウイルス遺伝子の保存領域由来の最も強力なｓｉＲＮＡおよびインフルエンザウイルス産生阻害におけるその最も有効な組み合わせが同定される可能性が高い。
【０２７４】
（実施例９：ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを容易にする非ウイルス送達因子の評価）
本実施例は、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを強化する能力についての種々の非ウイルス送達因子の試験を記載する。その後の実施例で、上記および実施例自体で試験した多数のポリマーを使用して正の結果を示すデータを提供する。他の送達因子も同様に試験することができる。
【０２７５】
カチオン性ポリマー。カチオン性ポリマーがＤＮＡの細胞内への取り込みを容易にする能力は、より有効なエンドサイトーシスのためにＤＮＡに結合して巨大なプラスミドＤＮＡ分子をより小さなＤＮＡ／ポリマー複合体に縮合する能力に一部起因すると考えられる。ｓｉＲＮＡ二重鎖は短いため（例えば、たった２１ヌクレオチド長）、これらはおそらくさらにより縮合することができるとが示唆される。ｓｈＲＮＡなどのｓｉＲＮＡ前駆体もまた比較的短い。しかし、カチオン性ポリマーが負電荷のｓｉＲＮＡに結合して負電荷の細胞表面と相互作用する能力を有するため、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの細胞内への取り込みを容易にすることができる。したがって、公知のカチオン性ポリマー（ＰＬＬ、修飾ＰＬＬ（例えば、アシル基、スクシニル基、アセチル基、またはイミダゾール基での修飾（３２））、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（３７）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（３８）、およびキトサン（３９、４０）が含まれるが、これらに限定されない）は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの送達因子としての有望な候補である。
【０２７６】
さらに、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｇｅｒ’ｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで開発された新規のカチオン性ポリマーおよびオリゴマーは、送達因子として有望な候補である。ＤＮＡトランスフェクションで使用するためのジアクリレート単量体およびアミン単量体由来の新規のカチオン性ポリマーおよびオリゴマーの巨大ライブラリーを合成および試験するための有効なストラテジーを開発した。本明細書中では、これらのポリマーを、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマーという。第１の研究では、７種のジアクリレート単量体および２０種のアミン単量体由来の１４０種のポリマーのライブラリーを合成し、試験した（３４）。１４０種のメンバーのうち、７０種は十分に水溶性であることが見出された（２ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０））。電気泳動移動度シフトによって示されるように、７０種の水溶性ポリマーのうちの５６種はＤＮＡと相互作用した。最も重要なこととして、これらは、５６種のポリマーのうちの２種でＣＯＳ−７細胞へのＤＮＡトランスフェクションの媒介が認められた。新規のポリマーのトランスフェクション効率は、ＰＥＩの４〜８倍であり、リポフェクタミン２０００と同等またはそれ以上であった。
【０２７７】
最初の研究以来、２，４００種のカチオン性ポリマーが構築およびスクリーニングされており、効率的なＤＮＡトランスフェクションを促進する別の約４０種のポリマーが得られている（１１８）。構造のばらつきはＤＮＡ結合およびトランスフェクション効率に有意な影響を与えることができ（３３）、ｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みを促進する能力について多数のポリマーについて試験を行うことが好ましい。さらに、インビボ系（すなわち、哺乳動物被験体）への移行中に、そのインビボでの能力、吸収、分配、代謝、および排泄（ＡＤＭＥ）の研究の結果として一定のポリマーが排除される可能性がある。したがって、インタクトな生物での試験は重要である。
【０２７８】
まとめると、少なくとも約５０種のカチオン性ポリマーを、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試験で試験する。これらのほとんどは上記のＰＡＥおよびイミダゾール基修飾ＰＬＬである。ＰＥＩ、ＰＶＰ、およびキトサンを、販売業者から購入する。これらのポリマーを迅速且つ効率的にスクリーニングするために、首尾よく細胞をトランスフェクトするＰＡＥポリマーのライブラリーを９６ウェルプレートに移す。この標準的な９６ウェル形式でのポリマーの保存により、滅菌Ｌａｂｃｙｔｅ  ＥＤＲ  ３８４Ｓ／９６Ｓマイクロピペッターロボットを使用した半自動的スクリーニングを簡単に開発することが可能である。適切なポリマーｓｉＲＮＡ比および最も効率的な送達条件を定義するために一定量のポリマーを滴定する（所定量のｓｉＲＮＡを使用）。下記のように、特異的アッセイによっては半自動スクリーニングは僅かに異なる。
【０２７９】
ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の特徴づけ。ｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みを容易にするための種々のカチオン性ポリマーについて、これらは、ｓｉＲＮＡと複合体を形成することができるべきである。（３４）に記載のものに類似のプロトコールにしたがった電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってこの問題について試験を行う。簡単に述べれば、マイクロピペッターロボットを使用して９６ウェルプレート中でＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、それぞれ５０種ほどのポリマーと、１：０．１、１：０．３、１：０．９、１：２．７、１：８．１、および１：２４．３（ｓｉＲＮＡ／ポリマー、ｗ／ｗ）の比で混合する。混合物を、マルチチャネルピペッターを使用して５００サンプルまでアッセイすることができる４％アガロースゲルスラブにロードする。臭化エチジウム染色によっｓｉＲＮＡの移動パターンを視覚化する。ポリマーの存在下でｓｉＲＮＡの移動度が減少した場合、ｓｉＲＮＡは、このポリマーと複合体を形成する。ｓｉＲＮＡ−ポリマー比に基づいて、中和比を同定することが可能である。ｓｉＲＮＡに結合しないポリマーはあまり好ましくなく、さらなる試験はｓｉＲＮＡに結合しないポリマーに注目する。
【０２８０】
イミダゾール基修飾ＰＬＬ，ＰＥＩ、ＰＶＰ、キトサン、およびいくつかのＰＡＥポリマーを、単独または細胞株中のＤＮＡとの複合体として測定した。細胞傷害性は結合した分子によって変化するため、ｓｉＲＮＡと複合体化した種々のポリマーおよび修飾ポリマーをＭＤＣＫ細胞中で測定する。簡単に述べれば、滅菌Ｌａｂｃｙｔｅマイクロピペッターロボットを使用して、ＮＰ−１４９６を異なる量の上記ポリマーと混合する。複合体を９６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞に４時間アプライする。次いで、ポリマー含有培地を、通常の成長培地に置換する。２４時間後、細胞の代謝活性を、ＭＴＴアッセイを使用して９６ウェル形式で測定する（４１）。最も低い使用量で細胞を９０％またはそれ以上死滅させるポリマーはあまり好ましくなく、最も低い使用量で細胞が９０％を超えて死滅しないポリマーをさらに調査することにさらに注目する。
【０２８１】
いくつかの場合、ＤＮＡ／ポリマー組成物を使用して類似の研究を行い、ＤＮＡ／ポリマー組成物を使用して類似の結果（例えば、細胞傷害性、細胞取り込みの促進）が得られるかどうかを判定することが重要である。
【０２８２】
培養細胞によるｓｉＲＮＡ取り込み。一旦ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体が特徴付けられると、２つの異なるアッセイ系を使用した培養細胞から出発するそのｓｉＲＮＡの細胞取り込み能力について試験を行う。第１のアプローチでは、蛍光強度の測定によってＧＦＰ発現の減少が容易に定量されるので、ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ−９４９）を、ＧＦＰ発現ＭＤＣＫ細胞に対して試験する。簡単に述べれば、同一の比の上記のＧＦＰ−９４９／ポリマーを、９６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞にアプライする。負のコントロールとして、ＮＰ−１４９６を使用するか、ｓｉＲＮＡを使用しない。正のコントロールとして、エレクトロポレーションによってＧＦＰ−９４９を細胞に移入する。３６時間後、細胞を９６ウェルプレート中で溶解し、溶解物の蛍光強度を蛍光プレートリーダーによって測定した。ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進するための種々のポリマーの能力ＧＦＰ強度の全減少によって示す。あるいは、９６ウェル形式においてサンプルを取り扱うために具備したフローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現について細胞を分析した。ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する種々のポリマーの能力を、ＧＦＰ強度が減少した細胞の比率およびＧＦＰ強度の減少の程度によって示す。これらのアッセイ由来の結果により、最も有効なトランスフェクションの至適なｓｉＲＮＡ：ポリマー比が明らかとなる。
【０２８３】
第２のアプローチでは、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生の阻害を直接測定する。上記のように、種々の比のＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ／ポリマーを、９６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞にアプライする。正のコントロールとして、エレクトロポレーションによってｓｉＲＮＡをＭＤＣＫ細胞に移入する。負のコントロールとして、ＧＦＰ−９４９を使用するか、ｓｉＲＮＡを使用しない。８時間後、細胞に所定のＭＯＩのＰＲ８またはＷＳＮウイルスに感染させる。６０時間後に培養上清を回収し、９６ウェルプレートにおいて血球凝集反応によって希釈することなくウイルスをアッセイする。最初のアッセイで低ウイルス力価を有するウェル由来の上清を希釈し（したがって、ｓｉＲＮＡ／ポリマー組成物がウイルス産生を阻害することを示す）、血球凝集反応によってアッセイする。あるいは、６０時間後、感染培養物を、ＭＴＴアッセイによる代謝活性についてアッセイする。最終的に感染細胞は溶解するため、代謝活性の相対レベルはまた、ウイルス感染の阻害の目安が得られる。
【０２８４】
ｓｉＲＮＡ／ポリマーで投与した培養物中でウイルス力価または代謝活性が投与していないものよりも実質的に低い場合、ポリマーがｓｉＲＮＡトランスフェクションを促進すると結論付ける。エレクトロポレーションによるｓｉＲＮＡが移入された培養物中のウイルス力価の比較により、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／ポリマー組成物の相対トランスフェクション効率を評価する。
【０２８５】
最初の２つのスクリーニング由来の多数の最も有効なカチオンポリマーを、ｓｉＲＮＡおよびポリマーの両方の滴定によって９６ウェルプレート中のウイルス感染アッセイで確認する。得られた結果に基づいて、最も有効なｓｉＲＮＡ：ポリマー比での６種のポリマーの能力を、２４ウェルプレートおよび６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞中でさらに分析する。多数の最も有効なポリマーを、実施例１０に記載のようにマウスにおけるさらなる研究のために選択する。
【０２８６】
別のアプローチ。培養細胞中のｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みの効率的な促進のためのカチオン性ポリマーの代替物として、アルギニンリッチペプチドを、ｓｉＲＮＡトランスフェクション実験で調査する。ＡＲＰが負電荷リン脂質との相互作用によって原形質膜を直接透過すると考えられるため（４８）、最も最近使用したカチオン性ポリマーは、エンドサイトーシスによるＤＮＡの細胞取り込みを促進すると考えられ、ｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みの促進におけるＡＲＰの効率を調査する。カチオン性ポリマーのように、ＡＲＰおよびポリアルギニン（ＰＬＡ）も正電荷であり、ｓｉＲＮＡを結合する可能性が高く、ＡＲＰまたはＰＬＡへｓｉＲＮＡが共有結合する必要はおそらくないことが示唆される。したがって、他のカチオン性ポリマーと同様にＡＲＰまたはＰＬＡを投与する。Ｔａｔ由来のＡＲＰおよび異なる長さのＰＬＡ（Ｓｉｇｍａから市販）がｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する能力を上記のように判定する。
【０２８７】
（実施例１０：マウスにおけるｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／送達因子組成物の試験）
原理：同定されたポリマーがマウスの気道細胞によるｓｉＲＮＡ取り込みを促進する能力を評価し、マウスにおけるインフルエンザウイルス感染の防止および治療におけるｓｉＲＮＡの効率について試験を行う。マウスにおけるインフルエンザウイルス感染のｓｉＲＮＡ阻害の証明により、例えば、ｓｉＲＮＡの鼻腔内または肺投与によるヒトにおけるインフルエンザウイルス感染を防止または治療するための潜在的使用の証拠が得られる。細胞にｓｉＲＮＡを有効に送達し、且つインフルエンザウイルス感染を有効に治療または防止するｓｉＲＮＡ含有組成物の同定方法を、本実施例に記載する。簡単にするために、実施例は、ｓｉＲＮＡ／ポリマー組成物の試験を記載する。ｓｉＲＮＡ／カチオン性ポリマー組成物、ｓｉＲＮＡ／アルギニンリッチペプチド組成物などの他のｓｉＲＮＡ／送達因子組成物の試験のために類似の方法を使用することができる。
【０２８８】
投与経路。インフルエンザウイルスは、上気道および肺内の上皮細胞に感染するため、気道内の上皮細胞へのｓｉＲＮＡの送達方法に注目する。多数の異なる方法を使用して、小分子薬物、タンパク質、およびＤＮＡ／ポリマー複合体はマウス上気道および／または肺に送達されている（点滴注入法、エアゾール（液体または乾燥粉末の両方）吸入、気管内投与、および静脈内注射が含まれる）。点滴注入法により、マウスと通常軽く麻酔し、直立で保持した。少量（通常、３０〜５０μｌ）での治療（すなわち、ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体）を、流動物を吸入する場合、一方の鼻孔にゆっくりと適用する。点滴注入した流動物を肺に到達させるために、動物を短期間直立に維持する。点滴注入法は、治療薬を上気道および肺の両方に送達させるために有効であり、同一のマウスに複数回繰り返すことができる。
【０２８９】
エアゾールにより、液体および乾燥粉末を通常は別に適用する。噴霧器によってマウスを入れた密封したプラスチック製のケージに液体エアゾールを産生する（５２）。エアゾールを動物の呼気として吸入するため、この方法は無効且つ不正確であり得る。通常、麻酔マウスへの強制された通気によって乾燥粉末エアゾールを投与する。エアゾール粒子が巨大且つ多孔質である限り、この方法は非常に有効であり得る（以下を参照のこと）（３１）。気管内投与のために、チューブを介して麻酔マウスの肺へ治療薬を含む溶液を注射する（５４）。肺への送達に非常に有効であるにもかかわらず、上気道を外している。タンパク質およびポリエチレンイミンと複合体形成した少量のＤＮＡ（約１μｇ）の静脈内注射は、内皮細胞および肺間質組織細胞をトランスフェクトすることを示した（５５）。この検討材料に基づいて、ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体を、点滴注入法によってマウスに最初に投与する。巨大多孔質粒子を使用した静脈内送達およびエアゾール送達も調査する。さらに、静脈内注射および腹腔内注射を含む他の送達方法も試験する。
【０２９０】
気道内の細胞によるｓｉＲＮＡ取り込み。実施例９に記載の多数の最も有効なポリマーを、マウス気道内のｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みを促進する能力について試験する。調査を促進するために、ＧＦＰ発現トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ−９４９）によるＧＦＰ発現の阻害を使用する。最初にＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを使用する利点は、アッセイの単純さおよび正確さによりマウスにおける有効なポリマーの同定を迅速化することができる点である。さらに、得られた結果により、インビボでｓｉＲＮＡを取り込む細胞の領域または型が明らかとなる。後者の情報は、送達因子の修飾および気道上皮細胞へのｓｉＲＮＡの至適な送達のための投与方法に有用である。
【０２９１】
簡単に述べれば、段階的用量のＧＦＰ−９４９／ポリマー複合体（実施例９で判定した最も有効な比）を、点滴注入によってＧＦＰトランスジェニックマウスに投与する。コントロールとして、マウスにｓｉＲＮＡのみ、ポリマーのみ、なし、または非特異的ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体を投与する。上気道および肺由来の組織を、ｓｉＲＮＡ投与から３６〜４８時間後に採取し、ＯＣＴに包埋し、凍結する。切片を、ＧＦＰ強度について調べ、蛍光顕微鏡下で視覚化し、隣接切片をヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）で染色した。あるいは、組織をパラホルムアルデヒド中に固定し、ＯＣＴに包埋した。いくつかの切片を、Ｈ＆Ｅで染色し、隣接する切片をＨＲＰ抱合抗ＧＦＰ抗体で染色する。組織学とＧＦＰ画像（または抗ＧＦＰ染色）の重ね合わせにより、ＧＦＰ発現が阻害される領域または細胞型を同定することができる。感受性の増大について、組織を、ＧＦＰ強度が減少した領域を同定するために共焦点顕微鏡によって試験することができる。
【０２９２】
点滴注入によるＤＮＡトランスフェクションからの所見に基づいて（５２、５６）、ｓｉＲＮＡは気道の管腔表面上の上皮細胞によって取り込まれる可能性が最も高いと予想される。コントロールマウスと比較してＧＦＰ−９４９／ポリマー処理マウスでＧＦＰ強度の有意な減少が認められる場合、これは、特定のポリマーがインビボでのｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進することを示す。
【０２９３】
マウスにおけるインフルエンザウイルス感染のｓｉＲＮＡ阻害。ＧＦＰトランスジェニックマウスにおける上記ＧＦＰ−９４９研究に加えて、マウスにおけるｓｉＲＮＡ取り込みの促進における多数の最も有効なポリマーを、インフルエンザウイルスに特異的なｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６など）またはおそらく２つまたは３つのｓｉＲＮＡ「カクテル」を使用して試験する。最初の研究のために、ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体およびインフルエンザウイルスを、点滴注入の前にｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体およびウイルスの混合によって同時にマウスに組み込む。段階的用量のｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体およびＰＲ８ウイルス（所定用量）を使用する。コントロールとして、マウスにｓｉＲＮＡのみ、ポリマーのみ、なし、またはＧＦＰ−９４９／ポリマーを投与する。感染後の種々の時間で（例えば、２〜３日、またはそれ以上（例えば、数日または１週間またはそれ以上））、鼻孔洗浄物を調製し、凍結融解によってウイルスを溶離するために肺をホモジナイズする。洗浄物および肺中のウイルス力価を、血球凝集反応によって測定する。血球凝集素アッセイによって力価は結果的に検出には低すぎる場合、血球凝集素アッセイ前にウイルスをＭＤＣＫ細胞中で増殖させる。ウイルス力価のより正確な判定のために、選択されたサンプルに対してプラークアッセイを行う。
【０２９４】
単回用量のｓｉＲＮＡ／ポリマーがインフルエンザ感染の阻害に有効ではない場合、複数回投与がより有効であるかを判定するために、ｓｉＲＮＡの複数回投与（比較的高い投薬量）を調査する。例えば、最初のｓｉＲＮＡ／ポリマーおよびウイルス投与後、マウスにｓｉＲＮＡ／ポリマーを１２時間ごとに２日間（４回投与）投与する。肺および鼻腔内洗浄物のウイルス力価を、最初の感染から種々の時点で測定する。
【０２９５】
これらの実験由来の結果は、ｓｉＲＮＡが上気道および肺のインフルエンザウイルス感染の阻害に有効であるかどうかを示し、最も有効な単回用量を示す。ｓｉＲＮＡ／ポリマーの複数回の投与は、インフルエンザウイルス感染治療において単回投与よりも有効である可能性が高いと予想される。他のポリマーまたは送達因子およびｓｉＲＮＡ／ポリマー送達のための異なるアプローチ（例えば、下記のアプローチ）を調査することもできる。
【０２９６】
巨大多孔質粒子を使用したｓｉＲＮＡ／ポリマー送達。上気道および肺への別の有効な送達方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｇｅｒグループによって最初に開発された巨大多孔質粒子の使用である。液体ベースの点滴注入法と対照的に、後者の方法は、治療薬を保有する巨大な多孔質粒子（乾燥粉末）の吸入に依存する。その最初の研究では、これらは、治療薬およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはポリ（乳酸−コ−リジン−グラフト−リジン）（ＰＬＡＬ−Ｌｙｓ）のダブルエマルジョン溶媒の蒸発により、巨大多孔質粒子が作製されることを示した（３１）。これらの粒子は、密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満であり、平均直径が５μｍを超える。低密度のために、これらを肺深部に効率的に吸入することができる。これらは、肺内のマクロファージによってあまり有効にクリアランスされない（５７）。ラットによる巨大な多孔質インスリン含有粒子の吸入により、小非多孔質粒子による４時間と比較して、インスリンの全身レベルが上昇し、９６時間全身のグルコースレベルが抑制される。
【０２９７】
吸入についてＦＤＡにより承認されているが、肺に対して内因性である（または両方）賦形剤を使用した巨大な多孔質粒子の産生手順が開発された（５８）。この手順では、水溶性賦形剤（すなわち、ラクトース、アルブミンなど）および治療薬を蒸留水に溶解した。溶液を、Ｎｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ（Ｎｉｒｏ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｏｍｂｕｓ，ＭＤ）に送り込んで、３μｍと１５μｍとの間の範囲の平均幾何学的直径である０．０４ｇ／ｃｍ３と０．６ｇ／ｃｍ３との間のタップ密度を有する乾燥粉末を作製した。
【０２９８】
吹き付け乾燥法を使用して、治療薬がｓｉＲＮＡ／ポリマーに置換されたこと以外はＬａｎｇｅｒによって記載のｓｉＲＮＡ／ポリマーを保有する巨大多孔質低密度粒子を作製する。（３１，５８）に記載のように、得られた粒子を、空隙率、密度、およびサイズについて特徴付ける。上記基準に到達した粒子を、Ｈａｒｖａｒｄ呼吸器を使用した強制通気によって麻酔マウスに投与する。ＧＦＰまたはインフルエンザウイルスのいずれかに特異的なｓｉＲＮＡを使用するかどうかに依存して、上記のように異なるアッセイを行う。特異的ｓｉＲＮＡ／ポリマーを含む巨大な多孔質粒子を投与したマウスにおけるＧＦＰ発現またはウイルス力価は、コントロールマウスよりも有意に低く、巨大多孔質粒子を介したエアゾール吸入はｓｉＲＮＡ送達のための有効な方法なるようである。
【０２９９】
ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の予防および治療適用。マウスにおけるインフルエンザウイルス感染のための予防または治療としてのｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の有効性について試験を行う。単回用量のｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体が有効であると仮定すると、ｓｉＲＮＡがインフルエンザ感染の干渉に有効なままである投与後の時間を評価する。ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体を、点滴注入法または巨大多孔質エアゾール（上記で判定するように、より有効であることに依存して）によってマウスに投与する。マウスにインフルエンザウイルスを直後、１、２、または３日後に感染させ、ウイルス感染から２４時間後または４８時間後に鼻腔内洗浄物および肺のウイルス力価を測定する。ｓｉＲＮＡが３日後に依然として有効であることが見出された場合、ｓｉＲＮＡ／ポリマー投与から４、５、６、および７日後にマウスに感染させ、感染から２４時間後のウイルス力価のアッセイのために組織を採取する。これらの実験からの結果は、投与後の長さが明らかになる可能性が高く、ｓｉＲＮＡはマウスにおけるウイルス産生の干渉で有用なままであり、ヒトにおける使用をガイドする。
【０３００】
ｓｉＲＮＡの治療有効性を評価するために、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、その後、感染後の異なる時間でｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体を投与する。具体的には、マウスに鼻腔内投与し、有効用量（上記で判定）のｓｉＲＮＡ／ポリマーを、直後、１、２、または３日後に投与する。コントロールとして、感染直後のマウスにＧＦＰ−９４９を投与するかｓｉＲＮＡを全く投与しない。鼻腔内洗浄物および肺のウイルス力価を、ｓｉＲＮＡ投与から２４または４８時間後に測定する。
【０３０１】
さらに、マウスに致死量のインフルエンザウイルスを感染させ、５つの群（５〜８マウス／群）に分類する。群１に直後に有効用量のｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体を投与する。群２〜４に有効用量のｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体を注射から１〜３日後にそれぞれ投与する。５群には、感染直後にＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを投与して、コントロールとする。感染マウスの生存を追跡する。これらの実験結果は、感染後どれぐらいの期間ｓｉＲＮＡがマウスで治療効果を発揮するかが明らかになる可能性が高い。
【０３０２】
（実施例１１：ＤＮＡベクターまたはレンチウイルスによって提供されたテンプレートから転写されたｓｉＲＮＡによるインフルエンザウイルス感染の阻害）
原理：インフルエンザウイルス感染の有効なｓｉＲＮＡ治療は、インビボで候補細胞に十分量のｓｉＲＮＡを送達させる能力に依存する。耐性ウイルスの出現を防止するために、２つまたは３つのｓｉＲＮＡを互いに使用することが好ましい。同一細胞への２つまたは３つのｓｉＲＮＡの同時送達は、有効な送達系が必要である。上記アプローチの代替法として、ｓｉＲＮＡ前駆体を転写し、有効なｓｉＲＮＡにプロセシングすることができるＤＮＡベクターの使用を調査する。
【０３０３】
本発明者らは、ＤＮＡベクターから転写されたｓｉＲＮＡは、同一の細胞に移入された合成ｓｉＲＮＡと同一の程度でＣＤ８α発現を阻害することができることを以前に示していた。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８−６１と呼ばれるＣＤ８α遺伝子をターゲティングするように設計された５つのｓｉＲＮＡのうちの１つがマウスＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株中のＣＤ８を阻害するがＣＤ４発現は阻害しないことを見出した（２７）。ＣＤ８−６１ｓｉＲＮＡの種々のヘアピン誘導体の試験により、本発明者らは、ＣＤ８−６１ＦはＣＤ８−６１に類似の阻害活性を有することを見出した（図２０Ａおよび２０Ｂ）（５９）。ヘアピン構造のために、ＣＤ８−６１をｐＳＬＯＯＰＩＩＩ（ＣＤ８−６１ＦがＨ１  ＲＮＡプロモーターによって駆動するＤＮＡベクター（図２０Ｃ））に構築した。Ｈ１ＲＮＡプロモーターは小型であり（６０）、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）によって転写される。通常は単ＲＮＡを転写し、以前にｓｉＲＮＡ型サイレンシングを作製するために使用されているため（６１）、ＰｏｌＩＩＩプロモーターを使用した。ＤＮＡベクターについて試験を行うために、本発明者らは、ＣＤ８α発現ベクターでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を使用した。図２０Ｄに示すように、ｐＳＬＯＯＰ  ＩＩＩ−ＣＤ８−６１ＦプラスミドのＣＤ８α発現ＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクションにより、合成ＣＤ８−６１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞と同一の程度でＣＤ８α発現が減少した。対照的に、プロモーターレスベクターのトランスフェクションはＣＤ８α発現を有意に減少させなかった。これらの結果は、ＲＮＡヘアピンを、ＤＮＡベクターから転写し、その後ＲＮＡスプライシングのためにｓｉＲＮＡにプロセシングすることができることを示す。類似のアプローチを使用して、インフルエンザウイルスに特異的なｓｉＲＮＡ前駆体を発現するＤＮＡベクターを設計する。
【０３０４】
培養細胞中のＤＮＡテンプレートから転写したｓｉＲＮＡの調査。ＤＮＡベクターからｓｉＲＮＡ前駆体を発現するために、ｓｉＲＮＡ二重鎖にプロセシングすることができるｓｉＲＮＡのヘアピン誘導体（インフルエンザウイルスに特異的）を設計する。さらに、２つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡ前駆体を転写することができるベクターを産生する。これらの調査を迅速化するために、ＧＦＰ−９４９およびＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、ＧＦＰを発現するＭＤＣＫ細胞で使用する。ＣＤ８−６１Ｆ設計後、ＧＦＰ−９４９およびＮＰ−１４９６のヘアピン誘導体（それぞれ、ＧＦＰ−９４９ＨおよびＮＰ−１４９６Ｈ）合成する（図２１Ａ）。
【０３０５】
ＧＦＰ−９４９およびＧＦＰ−９４９Ｈの両方を、ＧＦＰ発現ＭＤＣＫ細胞にエレクトロポレーションを行う。ＮＰ−１４９６または偽エレクトロポレーションを負のコントロールとして使用する。２４時間後および４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによるＧＦＰ発現についてアッセイする。ＧＦＰ陽性細胞の比率およびＧＦＰレベルの強度がＧＦＰ−９４９Ｈを投与した培養物で有意に減少する場合、ヘアピン誘導体の有効性を証明した。その有効性を、標準的なＧＦＰ−９４９を投与した細胞中のＧＦＰ強度との比較によって示す。
【０３０６】
同様に、ＮＰ−１４９６およびＮＰ−１４９６ＨをＭＤＣＫ細胞にエレクトロポレーションを行う。ネガティブコントロールとしてＧＦＰ−９４９または偽エレクトロポレーションを使用する。転写から８時間後、細胞にＰＲ８またはＷＳＮウイルスを感染させた。培養上清のウイルス力価を、感染から６０時間後の血球凝集反応によって測定する。ＮＰ−１４９６Ｈを投与した培地でウイルス力価が有意に減少する場合、ヘアピン誘導体は、ウイルス産生を阻害する。ＣＤ８−６１Ｆでの研究に基づいてヘアピン誘導体が機能的であることが予想される。そうでなければ、（５９、６１、６２）に記載のものに類似するヘアピン誘導体の異なる設計を合成および試験する。
【０３０７】
ＤＮＡベクターの設計および培養細胞中での試験。一旦ＧＦＰ−９４９ＨおよびＮＰ−１４９６Ｈが機能的であることが示されると、対応する発現ベクターを構築する。ＧＦＰ−９４９ＨおよびＮＰ−１４９６Ｈを、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクター中のＨ１プロモータの後ろにそれぞれクローン化する。得られたベクターを、エレクトロポレーションによってＧＦＰ発現ＭＤＣＫ細胞に一過性にトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞をＧＦＰ強度について分析するか、ウイルスを感染させ、且つウイルス産生についてアッセイする。ｓｉＲＮＡ前駆体転写のために強力なプロモーターを同定するための他のプロモーターに加え、高レベルのｓｉＲＮＡ前駆体発現を駆動することも示されているＵ６  ＰｏｌＩＩＩプロモーターをこれについて試験する。
【０３０８】
一旦１つのｓｉＲＮＡ前駆体を転写するベクターが有効であると示される場合、２つのｓｉＲＮＡ前駆体を転写できるベクターを構築する。この目的のために、ＧＦＰ−９４９ＨおよびＮＰ−１４９６Ｈを、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターに縦列でクローン化する（５’末端のＧＦＰ−９１９Ｈおよび３’末端のＮＰ−１４９６または他の周辺の方法のいずれか）（図２１Ｃ、中央）。得られたベクターでは、２つのｓｉＲＮＡ前駆体を、ヘアピン構造中に存在する余剰のヌクレオチドによって連結される（図２１Ｂ）。１つの構築物から２つのｓｉＲＮＡをプロセシングすることができるかどうか公知ではないので、ＧＦＰ−９４９ＨおよびＮＰ−１４９６Ｈの両方が独立したプロモーターによって転写されるベクターも構築する（図２１Ｃ、下）。
【０３０９】
ＭＤＣＫのトランスフェクション効率が約５０％であるため、一過性トランスフェクションは、２つのｓｉＲＮＡ前駆体をコードするベクターの評価と同一ではないかもしれない。したがって、線状化ベクター＋ｎｅｏ耐性ベクターでのＧＦＰ発現ＭＤＣＫ細胞のエレクトロポレーションによって安定なトランスフェクタントを確立する。サザンブロットによってｓｉＲＮＡ発現ベクターの存在を確認するために、複数のトランスフェクタントからＤＮＡを単離する。安定に組み込まれたベクターから転写されたＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡがＧＦＰ発現を阻害することができるかどうかを判定するために、正のトランスフェクタントをＧＦＰ発現についてアッセイする。ＧＦＰ発現が阻害されたトランスフェクタントにＰＲ８またはＷＳＮウイルスを感染させ、血球凝集反応によってウイルス力価を測定する。トランスフェクタントの有意な画分でＧＦＰ発現およびウイルス産生の両方が阻害されるという所見は、２つのｓｉＲＮＡ前駆体を転写し、１つのＤＮＡベクターからプロセシングすることができることが確立される。
【０３１０】
類似のアプローチが以前の研究で首尾よく使用されているので、１つのｓｉＲＮＡ前駆体を転写するベクターの構築は容易である（５９）。多数の研究により、同一のプロモーターおよび終結配列を使用して同一のベクターから２つの遺伝子を独立して転写することができることが示されているため、２つのｓｉＲＮＡ前駆体を同一のベクターから転写することができる可能性が高い。後者のアプローチでは、ｓｉＲＮＡ前駆体を独立して転写する。得られたｄｓＲＮＡ前駆体の長さは、５０ヌクレオチド未満である可能性が高い。対照的に、２つのｓｉＲＮＡ前駆体がタンデムで転写される場合（図２１ＢおよびＣ）、得られたｄｓＲＮＡ前駆体は、５０ヌクレオチド超である。５０ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡの存在は、哺乳動物細胞中のインターフェロン応答を活性化させる（２２、２３）。したがって、同一のベクター由来の２つのｓｉＲＮＡ前駆体の独立した転写の別の利点は、インターフェロン応答を回避するという点である。インターフェロンはウイルス感染を阻害するので有用であり得るが、応答はまた多数の代謝経路を遮断し、それにより細胞機能を干渉する（６３）。
【０３１１】
インターフェロン応答が種々のＤＮＡベクターでトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞で誘導されるかどうかを判定するために、インターフェロンにはＰＫＲのリン酸化が必要であるため、全部およびリン酸化されたｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）のレベルをアッセイする（２３）。ベクタートランスフェクト細胞および偽トランスフェクト細胞から調製した細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画する。タンパク質をメンブレンに移し、メンブレンを、リン酸化ＰＫＲまたは全ＰＫＲに特異的な抗体で探索した。アッセイの感度が十分でない場合、免疫沈降およびその後のウェスタンブロッティングを行う。活性化ＰＫＲレベルの相違が検出されない場合、ＤＮＡベクターから転写されたｄｓＲＮＡ前駆体はインターフェロン応答を活性化しない。ｓｉＲＮＡの細胞内合成のための好ましいＤＮＡベクターは、インターフェロン応答を活性化せず、本発明はこのようなベクターを提供する。
【０３１２】
マウスにおけるＤＮＡベクターの調査。一旦ＤＮＡベクターから転写されたｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞中でインフルエンザウイルス産生を阻害することができることが示されると、マウスにおけるその有効性を調査する。細胞ゲノムへの移入プラスミドＤＮＡの組み込みを最小にするために、一過性発現のために超らせんＤＮＡを使用する。一過性発現の他の利点は、配列レベルが高い傾向があるという点であり、これはおそらく組み込み前の細胞あたりのプラスミド数が多いからである。マウスにおけるＤＮＡトランスフェクションを容易にするために、遺伝子治療のために開発されたカチオン性ポリマー（実施例８に記載のイミダゾール基修飾ＰＬＬ、ＰＥＩ、ＰＶＰ、およびＰＡＥが含まれる）を使用する。
【０３１３】
具体的には、ＧＦＰ−９４９ＨまたはＮＰ−１４９６Ｈを単独でまたはＮＰ−１４９６ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈと共に発現するＤＮＡベクターを所定の比で特異的ポリマーと混合する。段階的な量の複合体＋ＰＲ８またはＷＳＮウイルスを、点滴注入によって麻酔ＧＦＰトランスジェニックマウスに移入する。コントロールとして、マウスにＤＮＡのみまたはポリメラーゼのみを投与するか、何も投与しない。感染から２日後および３日後、実施例１０に記載のようにウイルス力価をアッセイするために、鼻腔内洗浄物および肺を採取した。さらに、上気道および肺切片を、ＧＦＰ発現での減少について試験する。
【０３１４】
ＤＮＡ／ポリマー複合体を複数回投与する（例えば、最初にウイルスと共に投与し、その後の２日間は１日２回投与する）。複数回投与の効果を、感染から３日後に試験する。さらに、２つまたは３つのインフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡベクターを構築し、マウスにおけるインフルエンザ感染の阻害におけるその有効性を試験する。
【０３１５】
レンチウイルス。上記構築物を、レンチウイルス導入プラスミドに挿入し、感染性レンチウイルスの産生で使用する。したがって、レンチウイルスは、ウイルス感染細胞内でのｓｈＲＮＡ合成のためのテンプレートを提供する。ＤＮＡベクターについて上記のように、レンチウイルスベクターがインフルエンザウイルス産生を阻害する能力を組織培養およびマウスで試験する。本発明の任意の送達因子またはレンチウイルスもしくは他のウイルス遺伝子治療ベクターの投与のために既に使用されている送達因子を使用して、レンチウイルスをマウスに投与することができる。
【０３１６】
（実施例１２：ｓｉＲＮＡによるマウスにおけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
本実施例は、インフルエンザウイルスでの感染の前または後のいずれかで投与した場合、インフルエンザウイルスＮＰまたはＰＡ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡの投与によりマウスにおけるインフルエンザウイルスの産生を阻害することを示す実験を記載する。阻害は用量依存性であり、２つの異なるインフルエンザウイルス遺伝子から発現した転写物にターゲティングした２つのｓｉＲＮＡを共に投与した場合、さらなる効果を示す。
【０３１７】
（材料と方法）
ｓｉＲＮＡの調製。上記のようにこれを行う。
【０３１８】
ｓｉＲＮＡ送達。ｓｉＲＮＡ（３０もしくは６０μｇのＧＦＰ−９４９、ＮＰ−１４９６、またはＰＡ−２０８７）を、オリゴヌクレオチドカチオン性ポリマートランスフェクション試薬Ｎ／Ｐ（比＝５）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＤＳＰ２０１３０；Ｎ／Ｐは、ｊｅｔＰＥＩ試薬中のリン酸ヌクレオチドあたりの窒素残基数をいう）のためのｊｅｔＰＥＩ（商標）またはポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ）（ｖｉｓ）５２，０００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）４１，８００、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２６３６）と５％グルコース中で室温にて２０分間インキュベートした。混合物をマウスに静脈内注射し、眼窩静脈に注射する（マウスあたり２００μｌ、群あたり４マウス）。２００μｌの５％グルコースをコントロール（未投与）マウスに注射した。マウスを２．５％Ａｖｅｒｔｉｎｓで麻酔し、その後ｓｉＲＮＡ注射または鼻腔内感染を行った。
【０３１９】
ウイルス感染。Ｂ６マウス（標準的な実験条件下で保持）に、ピペットを使用して３０μｌ（１２，０００ｐｆｕ）／マウスでマウスの鼻腔にウイルス含有緩衝液を滴下することによってＰＲ８ウイルスを鼻腔内注射した。
【０３２０】
ウイルス力価の決定。マウスを、感染後の種々の時間で屠殺し、肺を採取した。肺をホモジナイズし、ホモジネートを２回凍結融解してウイルスを放出させた。感染肺中に存在するＰＲ８ウイルスを、ＭＤＣＫ細胞の感染によって滴定した。平底９６ウェルプレートに、３×１０４ＭＤＣＫ細胞／ウェルを播種し、２４時間後に血清含有培地を除去した。２５μｌの肺ホモジネート（非希釈または１×１０−１〜１×１０−７に希釈）を３連のウェルに接種した。４μｇ／ｍｌのトリプシンを含む１７５μｌの感染培地を、各ウェルに添加した。３７℃で４８時間後、感染細胞由来の上清によるニワトリＲＢＣの血球凝集反応によってウイルスの有無を判定した。Ｖ底９６ウェルプレート中で血球凝集反応アッセイを行った。上清の連続２倍希釈物を、同体積の０．５％懸濁液（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のニワトリ赤血球（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合し、氷上で１時間インキュベートした。接着性で均一な赤血球層を含むウェルを、正とスコアリングした。ウイルス力価を、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ法（ＴＣＩＤ５０）による５０％のウェルが感染した希釈終点の内挿によって判定した。任意の２つの群由来のデータを、有意を評価するために本明細書中に記載の実験を通して使用したスチューデントｔ検定によって比較した。
【０３２１】
（結果）
図２２Ａは、感染前に投与した場合、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明する実験結果を示す。上記の材料と方法に記載のように、３０または６０μｇのＧＦＰ−９４９またはＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、ｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静脈内注射した。３時間後、マウスに、マウスあたり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを鼻腔内注射した。感染から２４時間後、肺を採取した。図２２Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ未投与（ＮＴ；黒塗りの四角）またはＧＦＰにターゲティングされたｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ６０μｇ；白抜きの四角）を投与されたマウス肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であった。ＮＰ（ＮＰ３０μｇ；白抜きの円）およびｊｅｔＰＥＩにターゲティングされた３０μｇのｓｉＲＮＡで事前投与したマウスでは、平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．９であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；黒塗りの円）およびｊｅｔＰＥＩにターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡで事前投与したマウスでは、平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。未投与群と６０μｇＮＰｓｉＲＮＡを投与した群との間の肺ホモジネートにおけるウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．０００２で有意であった。各マウスについてのデータを、表６Ａ（ＮＴ＝未投与）に示す。
【０３２２】
図２２Ｂは、感染前にカチオン性ポリマーＰＬＬを含む組成物中で静脈内投与した場合、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明する別の実験結果を示す。上記の材料と方法に記載のように、３０または６０μｇのＧＦＰ−９４９またはＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、ＰＬＬとインキュベートし、マウスに静脈内注射した。３時間後、マウスに、マウスあたり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを鼻腔内注射した。感染から２４時間後、肺を採取した。図２２Ｂに示すように、ｓｉＲＮＡ未投与（ＮＴ；黒塗りの四角）またはＧＦＰにターゲティングされたｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ６０μｇ；白抜きの四角）を投与されたマウス肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．１であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；黒塗りの円）およびＰＬＬにターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡで事前投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．０であった。６０μｇＧＦＰを投与した群と６０μｇＮＰｓｉＲＮＡを投与した群との間の肺ホモジネート中のウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．００１で有意であった。各マウスのデータを表６Ａに示す（ＮＴ＝未投与）。これらのデータは、インフルエンザＮＰ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡは、ウイルス感染前に投与した場合に肺のウイルス力価が減少することを示す。これらはまた、ｓｉＲＮＡとカチオン性ポリマーとの混合物は静脈内注射した場合に（水力学的トランスフェクションなどの技術は必要ない）肺のインフルエンザウイルスの阻害に有用な因子であることを示す。
【０３２３】
【表６Ａ】
2006512906.tif 000019
図２２Ｃは、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡが感染前に投与した場合にマウスのインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明し、カチオン性ポリマーの存在はｓｉＲＮＡの阻害効果が有意に増加する第３の実験結果を示す。上記の材料と方法に記載のように、６０μｇのＧＦＰ−９４９またはＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはｊｅｔＰＥＩとインキュベートしｔ、マウスに静脈注射した。３時間後、マウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８を鼻腔内注射した。注射から２４時間後、肺を採取した。図２２Ｃに示すように、ｓｉＲＮＡ投与を行っていないマウス（ＮＴ；白抜きの四角）についての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．１であり、ＰＢＳ中のＧＦＰにターゲティングされたｓｉＲＮＡを受けたマウス（ＧＦＰ  ＰＢＳ；白抜きの三角）についての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は、４．４であった。ＰＢＳ中のＮＰ（ＮＰ  ＰＢＳ；白抜きの円）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡで事前投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であり、投与なしまたはＧＦＰにターゲティングされたｓｉＲＮＡでの投与と比較して最も穏やかな有効性のみを示す。ｊｅｔＰＥＩ中のＧＦＰ（ＧＦＰ  ＰＥＩ；白抜きの円）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡで事前投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であった。しかし、ｊｅｔＰＥＩ中のＮＰ（ＮＰ  ＰＥＩ；黒塗りの円）およびｊｅｔＰＥＩにターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．９であった。ｊｅｔＰＥＩ中のＮＰ（ＮＰ  ＰＥＩ；黒塗りの円）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。ＧＦＰｓｉＲＮＡを含むＰＢＳを投与された群とＮＰｓｉＲＮＡを含むＰＢＳを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．０４で有意であり、ｊｅｔＰＥＩを含むＧＦＰｓｉＲＮＡを投与された群とｊｅｔＰＥＩを含むＮＰｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．００３であり高度に有意義であった。各マウス由来のデータを、表６Ｂで示す（ＮＴ＝未投与）。
【０３２４】
【表６Ｂ】
2006512906.tif 000020
図２３は、異なるインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがさらなる効果を示すことを証明する実験結果を示す。上記の材料と方法に記載するように、６０μｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡを、ｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静脈内注射した。３時間後、マウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを鼻腔内注射した。感染から２４時間後に肺を採取した。図２３に示すように、ｓｉＲＮＡ投与を受けていない（ＮＴ；黒塗りの四角）マウスの肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；白塗りの円）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。ＰＡ（ＰＡ６０μｇ；白抜きの三角）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．４であった。ＮＰにターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡ＋ＰＡにターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡ（ＮＰ＋ＰＡ；白抜きの円）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は２．４であった。未投与群と、６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺のウイルス力価の相違は、それぞれＰ＝０．００３、０．０１、および０．０００１で有意であった。６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡまたは６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡを投与された群と、６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートの相違は、Ｐ＝０．０１で有意であった。各マウスのデータを、表７に示す（ＮＴ＝未投与）。これらのデータは、インフルエンザＮＰまたはＰＡ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡでの事前投与によりインフルエンザウイルスにその後感染したマウス肺のウイルス力価が減少することを示す。データは、さらに、異なるウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡの組み合わせによりさらなる効果を示すことを示し、異なる転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡの組み合わせを使用した治療は、等価な有効性を達成するために必要な１つのｓｉＲＮＡの量と比較して各ｓｉＲＮＡの用量を減少させることができると示唆される。異なる転写物にターゲティングされた一定のｓｉＲＮＡが相乗効果（すなわち、相加効果よりも高い効果）を示すことが可能である。強力なｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの組み合わせの同定への全身アプローチを使用して、ｓｉＲＮＡが相乗効果を示すｓｉＲＮＡの組み合わせを示すことができる。
【０３２５】
【表７】
2006512906.tif 000021
図２４は、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡが感染後に投与された場合にマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明する実験結果を示す。マウスに、５００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染させた。上記の材料と方法に記載のように、６０μｇのＧＦＰ−９４９ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡｓｉＲＮＡをｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、５時間後にマウスに静脈内注射した。ｓｉＲＮＡの投与から２８時間後に肺を採取した。図２４に示すように、ｓｉＲＮＡ投与なし（ＮＴ；黒塗りの四角）またはＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡＧＦＰ−９４９（ＧＦＰ；白塗りの四角）を投与された肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．０であった。ＰＡ（ＰＡ６０μｇ；白抜きの三角）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は２．２であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；白抜きの円）にターゲティングされた６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は２．２であった。６０μｇのＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ（ＰＡ＋ＮＰ；黒塗りの円）を投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は１．８であった。未投与群と、６０μｇのＰＡ、ＮＰｓｉＲＮＡ、または６０μｇ  ＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇＰＡｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、それぞれＰ＝０．０９、０．０２、および０．００３で有意であった。ＮＰｓｉＲＮＡおよびＰＡ＋ＮＰｓｉＲＮＡを投与された群の間の肺サーファクタントのウイルス力価の相違は、Ｐ値が０．２であった。各マウスのデータを表８に示す（ＮＴ＝未投与）。これらのデータは、インフルエンザＮＰおよび／またはＰＡ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡによりウイルス感染後に投与された場合に肺のウイルス力価が減少することを示す。
【０３２６】
【表８】
2006512906.tif 000022
（実施例１３：ｓｈＲＮＡ産生のテンプレートを提供するレンチウイルス投与による細胞におけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
（材料と方法）
細胞培養。２４ウェルプレートに、４×１０５細胞／ウェルを含む１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを含むベロ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０３２７】
ｓｈＲＮＡ産生のためのテンプレートを提供するレンチウイルスの産生。図２５Ａに図示されるように、ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートとして作用するオリゴヌクレオチド（図２５Ａを参照のこと）を、レンチウイルスベクターのｐＬＬ３．７のＵ６プロモーターと終結配列との間でクローン化した（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４０１−４０６，２００３）。オリゴヌクレオチドを、ｐＬＬ３．７のマルチクローニング部位内のＨｐａＩとＸｈｏＩ制限部位との間に挿入した。レンチウイルスベクターは、トランスフェクト／感染疾患のモニタリングを容易にするためにＥＧＦＰも発現する。ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡ産生用のテンプレートを含むＤＮＡベクターの同時トランスフェクションおよび２９３Ｔ細胞へのベクターのパッケージングによってレンチウイルスが産生された。４８時間後、レンチウイルスを含む培養上清を回収し、４℃、２０００ｒｐｍで７分間スピンし、０．４５μｍのフィルターで濾過した。１×１０５／ウェルのベロ細胞を、２４ウェルプレートに播種した。一晩の培養後、インサート（０．２５ｍｌまたは１．０ｍｌ）を含む培養上清を、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でウェルに添加した。ついで、プレートを、２５００ｒｐｍにて室温で１時間遠心分離し、培養物に戻した。感染から２４時間後、得られたベロ細胞株（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）を、親（非感染）ベロ細胞を用いたフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。ＮＰ−１４９６中の１９よりもむしろ２０ｎｔ長の二重鎖が得られる、センス部分の３’末端のさらなるヌクレオチド（Ａ）およびアンチセンス部分の５’末端の相補的ヌクレオチド（Ｕ）の偶発的封入によってＮＰ−１４９６ａがＮＰ−１４９６と異なることに留意のこと（表２を参照のこと）。本発明の他の実施形態によれば、ＮＰ−１４９６ａ配列よりもむしろＮＰ−１４９６配列を使用する。さらに、図２１に示すＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡループ部分は、ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡのそれと異なる。
【０３２８】
インフルエンザウイルス感染およびウイルス力価の判定。コントロールベロ細胞およびインサートを含むレンチウイルスでトランスフェクトしたベロ細胞（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）に、０．０４、０．２、および１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。実施例１２に記載のように、上清中のインフルエンザウイルス力価を、感染から４８時間後の血球凝集反応（ＨＡ）アッセイによって判定した。
【０３２９】
（結果）
ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡの産生のためのテンプレートを含むレンチウイルスを、ベロ細胞中のインフルエンザウイルス産生を阻害する能力について試験した。ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡは、上記のＮＰ−１４９６ａｓｉＲＮＡと同一の配列を有する二重鎖部分を含むステム−ループ構造を形成することができる２つの相補領域を含む。図２５Ｂに示すように、ベロ細胞と共にレンチウイルス含有上清の一晩の封入により、ＥＧＦＰが発現され、レンチウイルスによるベロ細胞の感染が示される。影をつけた曲線は、コントロール細胞（非感染）の平均蛍光強度を示す。１ｍｌの上清を使用した場合、ほとんど全ての細胞がＥＧＦＰ陽性となり、平均蛍光強度は高かった（１８１８）（Ｖｅｒｏ−ＮＰ−１．０）。０．２５ｍｌの上清を使用した場合、ほとんどの細胞（約９５％）はＥＧＦＰ陽性であり、平均蛍光強度は低かった（５０３）（ベロ−ＮＰ−０．２５）。
【０３３０】
次いで、親ベロ細胞およびレンチウイルス感染ベロ細胞に、０．０４、０．２、および０．１のＭＯＩのインフルエンザウイルスを感染させ、インフルエンザウイルス感染から４８時間後にウイルス力価をアッセイした。ＭＯＩの増加につれて、親ベロ細胞培養物の上清のウイルス力価が増加した（図２５Ｃ）。対照的に、ベロ−ＮＰ−１．０細胞培養物上清のウイルス力価は非常に低値のままであり、インフルエンザウイルス産生がこれらの細胞中で阻害されることを示す。同様に、ベロ−ＮＰ−０．２５細胞培養物中のインフルエンザウイルス産生も部分的に阻害された。ウイルス力価を、表９に示す。これらの結果により、ベロ細胞中のインフルエンザウイルス産生を阻害するためにレンチウイルスベクターから発現されたＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡにプロセシングすることができることが示唆される。阻害の程度は、細胞あたりのウイルス感染の程度に比例するようである（ＥＧＦＰレベルによって示される）。
【０３３１】
【表９】
2006512906.tif 000023
（実施例１４：ｓｉＲＮＡ前駆体を転写することができるＤＮＡベクターの鼻腔内投与によるマウスにおけるインフルエンザ産生の阻害）
（材料と方法）
ｓｈＲＮＡのテンプレートとして作用するプラスミドの構築。ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡが発現するプラスミドの構築を実施例１３に記載する。実施例１３に記載のように、ＰＢ１−２２５７ｓｈＲＮＡまたはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートとして作用するオリゴヌクレオチドを、レンチウイルスベクターｐＬＬ３．７のＵ６プロモーターと終結配列との間にクローン化し、ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡについて図２５Ａに図示する。オリゴヌクレオチドの配列を以下に示した。
【０３３２】
【化７】
2006512906.tif 000024
上記オリゴヌクレオチドを含むベクターから発現したＲＳＶｓｈＲＮＡを、インビボでプロセシングして、以下の配列を含むセンスおよびアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを作製する。
【０３３３】
【化８】
2006512906.tif 000025
ＰＡ特異的ヘアピンを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して簡単に構築することができる。
【０３３４】
【化９】
2006512906.tif 000026
ウイルス感染およびウイルス力価の判定。実施例１２に記載のようにこれらを行った。
【０３３５】
ＤＮＡ送達。上記のように、ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡ、ＰＢ１−２２５７ｓｈＲＮＡ、またはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡ（各６０μｇ）の発現のためのテンプレートとして作用することができるプラスミドＤＮＡを、４０μｌ  Ｉｎｆａｓｕｒ（登録商標）（ＯＮＹ，Ｉｎｃ．，ＡｍｈｅｒｓｔＮＹ）および２０μｌの５％グルコースと個別に混合し、マウス群（各群あたり４匹）に鼻腔内投与した。４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆと２０μｌの５％グルコースとの混合物を、未投与（ＮＴ）群のマウスに投与した。上記のように、１３時間後にマウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを鼻腔内に感染させた。感染から２４時間後に肺を採取してウイルス力価を判定した。
【０３３６】
（結果）
ＤＮＡベクターから発現されたｓｈＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス感染を阻害する能力を試験した。これらの実験では、プラスミドＤＮＡを、Ｉｎｆａｓｕｒｆ（肺内の遺伝子導入を促進することが以前に示されたビヒクルに類似の子牛肺由来の天然サーファクタント抽出物）と混合した（７４）。ＤＮＡ／Ｉｎｆａｓｕｒｆ混合物を、ピペットを使用して鼻に混合物を滴下することによってマウスに滴下した。１３時間後、マウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを感染させた。インフルエンザウイルス感染からの２４時間後、肺を採取し、ＭＤＣＫ／血球凝集素アッセイによって測定した。
【０３３７】
図２６に記載のように、ウイルス力価は、いかなるプラスミドＤＮＡも投与していないか呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）特異的ｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡベクターを投与したマウスで高かった。ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡまたはＰＢ１−２２５７ｓｈＲＮＡのいずれかを発現するプラスミドＤＮＡをマウスに投与した場合により低いウイルス力価が認められた。マウスに両インフルエンザ特異的プラスミドＤＮＡ（一方はＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡを発現し、他方はＰＢ１−２２５７ｓｈＲＮＡを発現する）を投与した場合、ウイルス力価はより有意に減少した。未投与（ＮＴ；白抜きの四角）またはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡ（ＲＳＶ；黒塗りの四角）をコードするプラスミドを投与したマウスの肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は、それぞれ４．０または４．１であった。ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡ（ＮＰ；白抜きの円）のテンプレートとして作用することができるプラスミドを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．４であった。ＰＢ１−２２５７ｓｈＲＮＡ（ＰＢ；白抜きの三角）のテンプレートとして作用することができるプラスミドを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．８であった。ＮＰおよびＰＢｓｈＲＮＡ（ＮＰ＋ＰＢ１；黒塗りの円）のテンプレートとして作用することができるプラスミドを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。未投与またはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡプラスミドを投与された群とＮＰｓｈＲＮＡプラスミド、ＰＢ１ｓｈＲＮＡプラスミド、またはＮＰおよびＰＢ１ｓｈＲＮＡプラスミドを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違についてのＰ値は、それぞれ０．０４９．０．１２４、および０．００４であった。各マウスのデータを、表１０に示す（ＮＴ＝未投与）。予備試験はＰＢＳまたはｊｅｔＰＥＩの存在下ではＮＰｓｈＲＮＡよりもむしろＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡの鼻腔内投与を含むが、Ｉｎｆａｓｕｒｆの非存在下では、インフルエンザウイルスが有効に阻害される。これらの結果は、ＤＮＡベクターから発現したｓｈＲＮＡを、マウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害するためにｓｉＲＮＡにプロセシングすることができ、ＩｎｆａｓｕｒｆがｓｈＲＮＡを発現することができるプラスミドの送達のための適切なビヒクルであることが証明されることを示す。特に、これらのデータは、インフルエンザＮＰおよび／またはＰＢ１転写物にターゲティングされたｓｈＲＮＡにより、以下のウイルス感染を投与した場合に肺内ウイルス力価を減少することを示す。
【０３３８】
【表１０】
2006512906.tif 000027
（実施例１５：カチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する）
（材料と方法）
試薬。２つの異なる平均分子量のポリ−Ｌ−リジン（ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ（ｖｉｓ）５２，０００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）４１，８００，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２６３６）およびポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ（ｖｉｓ）９，４００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）８，４００，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２６３６）、ポリ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  （ＭＷ  １５，０００−７０，０００  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ７７６２）、および３−（４，５−ジメチルチアゾン−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）をＳｉｇｍａから購入した。説明の目的で、ＬＡＬＬＳ法を使用して得られる分子量と仮定するが、ポリマーはいくらかサイズが異なるため、分子量はおおよそであると理解すべきである。
【０３３９】
ゲル遅延アッセイ。１０μｌのｓｉＲＮＡ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）中に１０ｐｍｏｌ）と種々の量のポリマーを含む１０μｌのポリマー溶液との混合によってｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成した。室温で３０分間複合体を形成し、その後２０μｌを４％アガロースゲルで泳動した。エチジウムブロミド染色を使用して、バンドを視覚化した。
【０３４０】
細胞傷害性アッセイ。等量（５０ｐｍｏｌ）のｓｉＲＮＡを含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）と種々の量のポリマーを含むポリマー溶液と室温で３０分間混合することによってｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成した。ＭＴＴアッセイによって細胞傷害性を評価した。細胞を、３０，０００細胞／ウェルで１０％ウシ胎児結成（ＦＣＳ）を含む０．２ｍｌのＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートに播種する。３７℃で一晩のインキュベーション後、培地を除去し、０．１８ｍｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）と置換した。ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を含む２０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液を細胞に添加した。３７℃で６時間のインキュベーション後、ポリマー含有培地を除去し、ＤＭＷＭ−１０％ＦＣＳと置換した。製造者の説明書に従って、ＭＴＴアッセイを使用して２４時間後に細胞の代謝活性を測定した。実験を３連で行い、データを平均した。
【０３４１】
細胞培養、トランスフェクション、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体形成、およびウイルス力価判定。１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気にてベロ細胞を成長させた。トランスフェクション実験のために、４×１０５細胞／ウェルの対数期ベロ細胞を、１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを含む２４ウェルプレートに播種した。３７℃で一晩のインキュベーション後、５０μｌのｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ（約７００ｎｇ）を含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２））の５０μｌのポリマーボルテックスへの添加によってｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成した。ｓｉＲＮＡとポリマーとの間の完全な複合体形成を達成するために、異なる濃度のポリマーを使用した。複合体形成を完了するために混合物を室温で３０分間インキュベートした。細胞成長培地を除去し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）に置換し、その直後に複合体を添加した。
【０３４２】
５％ＣＯ２下にて３７℃で６時間の細胞と複合体とのインキュベーション後、複合体含有培地を除去し、ＤＭＥＭ、０．３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００単位／ｍｌペニシリン、おいよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる感染培地中の２００μｌのＰＲ８ウイルスを、各ウェルに添加した。継続的に揺り動かしながら室温で１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌトリプシンを含む０．８ｍｌの感染培地を各ウェルに添加し、細胞を３７℃の５％ＣＯ２下で培養した。上記のように、感染から異なる時間後に、感染培養物から上清を回収し、血球凝集反応（ＨＡ）アッセイによってウイルス力価を判定した。
【０３４３】
接着性細胞株について製造者の説明書に従って、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。簡単に述べれば、４×１０５細胞／ウェルの対数期のベロ細胞を１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを含む２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ＣＯ２下にてインキュベートした。翌日、５０μｌの希釈リポフェクチン２０００を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩを５０μｌのｓｉＲＮＡに添加して（４００ｐｍｏｌを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ）、複合体を形成させた。細胞を洗浄し、無血清培地でインキュベートした。上記のように、複合体を細胞に適用し、細胞を３７℃で６時間インキュベートし、その後洗浄してインフルエンザに感染させた。上記のように、感染から異なる時間後、感染培養物から上清を回収し、ウイルス力価を、血球凝集反応（ＨＡ）によって判定した。
【０３４４】
（結果）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）がｓｉＲＮＡと複合体を形成する能力および培養細胞によってｓｉＲＮＡの取り込みを促進する能力を試験した。ＰＬＬおよび／またはＰＬＡがｓｉＲＮＡと複合体を形成するかどうかを判定するために、定量のＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを漸増量のポリマーと混合した。次いで、ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の形成を、４％アガロースゲルによって視覚化した。ポリマーが漸増するにつれて、ｓｉＲＮＡの電気泳動移動度が遅延し（図２７Ａおよび２７Ｂ）、複合体形成が示される。図２７Ａおよび２７Ｂは、ｓｉＲＮＡとＰＬＬ（４１．８Ｋ）またはＰＬＡとの間の複合体が形成される。各パネルで使用したポリマーの量は、左から右に増加する。図２７Ａおよ２７Ｂでは、各ウェル中で、左側のレーンにバンドが認められ、複合体形成の欠如が示され、それにより、ｓｉＲＮＡがゲルに侵入し、その後移動する。右側に移動するにつれて、バンドは消滅し、複合体形成および複合体のゲル侵入および移動に失敗する。
【０３４５】
ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の細胞傷害性を調査するために、異なる比でのｓｉＲＮＡとＰＬＬまたはＰＬＡとの混合物を、９６ウェルプレート中のベロ細胞培養物に添加した。細胞の代謝活性をＭＴＴによって測定した。３連で実験を行い、データを平均にした。ＰＬＬ（ＭＷ約４２Ｋ）の増加に伴って細胞生存度が有意に減少するのに対して、ＰＬＬ（約８Ｋ）は、毒性を有意に低減させ、ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ比が４：１もの高さでも毒性をほとんどまたは全く示さなかった（図２８Ａ；円＝ＰＬＬ（ＭＷ約８Ｋ）；四角＝ＰＬＬ（ＭＷ約４２Ｋ））。図２８Ｂに示すように、細胞生存度はＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が増大するほど減少するが、生存度は、ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が４．５：１もの高さで約８０％超に保持された。図２８Ａおよび２８Ｂにおいて、ポリマー／ｓｉＲＮＡ比をｘ軸に示す。図２８Ａおよび２８Ｂにプロットしたデータを、表１１および１２に示す。表１１では、数値は、非投与細胞の生存率と比較したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体での投与後の細胞の生存度を示す。ＮＤ＝実施せず。表１２では、数値は、ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比、生存度、および標準偏差を示す。
【０３４６】
【表１１】
2006512906.tif 000028
【０３４７】
【表１２】
2006512906.tif 000029
ＰＬＬまたはＰＬＡがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進するかどうかを判定するために、種々の量のポリマーおよびＮＰ−１４９６を、全てのｓｉＲＮＡがポリマーと複合体化する比で混合した。それぞれ等量のｓｉＲＮＡを使用した。約４２Ｋ  ＰＬＬについては約８Ｋ  ＰＬＬよりも低いポリマー／ｓｉＲＮＡ比を使用した。前者の細胞毒性がより高いからである。ベロ細胞に複合体を添加し、６時間後に培養物にＰＲ８ウイルスを感染させた。感染から異なる時間後、培養上清を回収し、ＨＡアッセイによってウイルスについてアッセイした。図２９Ａは、種々のトランスフェクション投与（円＝未投与、四角＝リポフェクタミン；黒塗りの三角＝ＰＬＬ（約４２ＫのＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ比＝２）；白塗りの三角＝ＰＬＬ（約８ＫのＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ比＝８））を受けた細胞における長期にわたるウイルス力価のプロットである。図２９Ａに示すように、ウイルス力価は、非トランスフェクト培養物で時間と共に増加した。ウイルス力価は、ＮＰ−１４９６／リポフェクタミンでトランスフェクトされた細胞で有意に低く、ＰＬＬ／ＮＰ−１４９６複合体で投与した培養物でさらに低かった。図２９Ａでプロットしたデータを、表１３に示す（ＮＴ＝未投与；ＬＦ２Ｋ＝リポフェクタミン）。ＰＬＬ：ｓｉＲＮＡ比を括弧で示す。
【０３４８】
一定範囲のポリマー／ｓｉＲＮＡ比にわたりＰＬＡを同様に試験した。図２９Ｂは、種々のトランスフェクション投与（黒塗りの四角＝偽トランスフェクション；黒塗りの円＝リポフェクタミン；白抜きの四角＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比＝１でのＰＬＡ；白抜きの円＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比でのＰＬＡ＝２；白抜きの三角＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比＝４でのＰＬＡ；黒塗りの三角＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比＝８でのＰＬＡ）を受けた細胞における長期にわたるウイルス力価のプロットである。図２９Ｂに示すように、ウイルス力価はコントロール（偽トランスフェクション）培養物およびＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が１：１で投与した培養物で時間と共に増加した。ウイルス力価は、ＮＰ−１４９６／リポフェクタミンでトランスフェクトした培養物で有意に低く、ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が４：１またはそれ以上の複合体を含むＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ複合体で投与した培養物でさらに低かった。漸増量のポリマーにより、ウイルス力価がより大きく減少した。図２９Ｂでプロットしたデータを、表４に示す。
【０３４９】
【表１３】
2006512906.tif 000030
【０３５０】
【表１４】
2006512906.tif 000031
したがって、カチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進、細胞株中のインフルエンザウイルス産生を阻害し、広範に使用されているトランスフェクション試薬であるリポフェクタミンより有効である。これらの結果はまた、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激し、その同定方法を記載するためにさらなるカチオン性ポリマーを容易に同定することができることが示唆される。ＰＬＬおよびＰＬＡは、このような試みのための正のコントロールとして作用することができる。
【０３５１】
（等価物）
当業者は、日常的実験だけでなく、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態の多数の等価物を使用して認識する確認することができる。本発明の範囲は、上記説明に制限されることを意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０３５２】
【表１５−１】
2006512906.tif 000032
【０３５３】
【表１５−２】
2006512906.tif 000033
【０３５４】
【表１５−３】
2006512906.tif 000034
【０３５５】
【表１５−４】
2006512906.tif 000035
【０３５６】
【表１５−５】
2006512906.tif 000036
【０３５７】
【表１５−６】
2006512906.tif 000037
【０３５８】
【表１５−７】
2006512906.tif 000038
【０３５９】
【表１５−８】
2006512906.tif 000039
【０３６０】
【表１５−９】
2006512906.tif 000040
【０３６１】
【表１５−１０】
2006512906.tif 000041
【０３６２】
【表１５−１１】
2006512906.tif 000042
【０３６３】
【表１５−１２】
2006512906.tif 000043
【図面の簡単な説明】
【０３６４】
【図１Ａ】図１Ａ（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（本明細書中で参考として援用される）を適用）は、インフルエンザウイルスの略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ（Ｆｉｌｅｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（本明細書中で参考として援用される）を適用）は、インフルエンザウイルスのゲノム構造およびインフルエンザゲノム由来の転写物を示す。ｍＲＮＡの５’末端および３’末端の細線は、非翻訳領域を示す。影をつけた領域または斜線の領域は、それぞれ０または＋１読み取り枠中にコード領域を示す。Ｖ型の線はイントロンを示す。ｍＲＮＡの５’末端の小さな四角は、ウイルス核酸に共有結合した異種細胞ＲＮＡを示す。Ａ（ｎ）は、ポリＡテールを示す。
【図２】図２（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（本明細書中で参考として援用される）を適用）は、インフルエンザウイルス複製サイクルを示す。
【図３】図３は、ドロソフィラ系で認められるｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図４】図４は、ドロソフィラにおけるＲＮＡ干渉に関与する工程の略図を示す。
【図５】図５は、本発明で有用なｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ構造の種々の例を示す。
【図６】図６は、ＤＩＣＥＲ酵素がステム中の塩基ミスマッチを有する基質を切断して標的転写物の３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する阻害産物を作製する別の阻害経路の図を示す。
【図７】図７は、本発明のｓｉＲＮＡの両方の鎖の転写を指示するために使用することができる構築物の一例を示す。
【図８】図８は、ハイブリッド形成して本発明のｓｈＲＮＡを形成する１つのＲＮＡ分子の転写を指示するために使用することができる構築物の一例を示す。
【図９−１】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図９−２】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図９−３】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図９−４】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図９−５】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図９−６】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−１】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−２】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−３】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−４】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−５】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−６】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−７】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫに移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ａは、種々のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）による感染後の種々の時間での血球凝集素アッセイによって測定した培養上清中のウイルス力価を示す経時変化である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫに移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｂは、種々のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で０．０１のＭＯＩでインフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＷＳＮ）での感染後の種々の時間での血球凝集素アッセイによって測定した培養上清中のウイルス力価を示す経時変化である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫに移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｃは、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６で偽トランスフェクトするかトランスフェクトしたウイルス感染細胞由来の培養上清中のウイルス力価を示すプラークアッセイを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫに移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｄは、異なる用量のｓｉＲＮＡでのインフルエンザウイルス産生阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞を、表示量のＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後０．０１のＭＯＩでＰＲ８を感染させた。感染から４８時間後にウイルス力価を測定した。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫに移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｅは、ウイルス感染後に投与したｓｉＲＮＡによるインフルエンザウイルス産生阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞に０．０１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを２時間感染させ、その後ＮＰ−１４９６（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトした。感染後の表示の時間でウイルス力価を測定した。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１２】図１２は、ヒトまたは動物宿主起源の１２種のインフルエンザＡウイルスのサブタイプまたは単離物の間のＮＰ配列の３’領域部分の間の配列比較を示す。影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２および３に記載のように試験した。塩基配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。影をつけた文字は、塩基配列が異なるヌクレオチドを示す。
【図１３】図１３は、インフルエンザウイルス阻害の有効性と相関する、インフルエンザウイルス遺伝子セグメントと比較した種々のｓｉＲＮＡの位置を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／送達因子組成物の注射領域を示す成長中のニワトリ胚の略図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、種々のｓｉＲＮＡの成長中のニワトリ胚におけるインフルエンザウイルス産生を阻害する能力を示す。
【図１５】図１５は、核タンパク質のウイルスＲＮＡ分子との相互作用を示す略図である。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡと、ｍＲＮＡと、ｃＲＮＡ（テンプレートＲＮＡ）との間の相違およびこれらの間の関係を示す略図を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡと、ｍＲＮＡと、ｃＲＮＡ（テンプレートＲＮＡ）との間の相違およびこれらの間の関係を示す略図を示す。各インフルエンザＡウイルスｖＲＮＡセグメントの３’末端の保存された１２個のヌクレオチドおよび５’末端の１３個のヌクレオチドを図１６Ｂに示す。ｍＲＮＡは、７ＧｐｐｐＮｍキャップ構造および宿主細胞ＲＮＡのサブセット由来の平均して１０〜１３個のヌクレオチドを含む。ｖＲＮＡセグメントの５’末端から１５〜２２ヌクレオチド前の位置に対応するｍＲＮＡ中の部位でｍＲＮＡのポリアデニル化が起こる。矢印は、各ＲＮＡ種に特異的なプライマーの位置を示す（引用文献（１）の適用）。
【図１７】図１７は、感染の６〜８時間前にｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６で偽トランスフェクトするかトランスフェクトした細胞におけるウイルス感染後の種々の時間でのウイルスＮＰおよびＮＳ  ＲＮＡ種の量を示す。
【図１８】図１８Ａは、インフルエンザウイルス産生の阻害には二重鎖ｓｉＲＮＡ中に野生型（ｗｔ）アンチセンス鎖が必要であることを示す。ＭＤＣＫ細胞を、最初にｗｔ鎖および修飾（ｍ）鎖から形成されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、８時間後に０．１ＭＯＩのＰＲウイルスを感染させた。感染から２４時間後に培養上清のウイルス力価をアッセイした。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。図１８Ｂは、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡが特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞をＭ−３７でトランスフェクトし、０．０１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。Ｍ特異的ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡ（下のパネル）のレベルに正規化する。ＲＮＡの相対レベルを、平均±Ｓ．Ｄ．として示す。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９Ａ−Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＮＰだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ〜Ｃ）細胞およびベロ（Ｄ）細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＮＰ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９Ｇ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９Ｈ】図１９Ｈは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＰＢ１（上のパネル）、ＰＢ２（中央のパネル）、およびＰＡ（下のパネル）特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡのｍＲＮＡに特異的なｍＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図２０】図２０Ａは、ｓｉＲＮＡ  ＣＤ８−６１およびそのヘアピン誘導性ＣＤ８−６１Ｆの配列を示す。図２０Ｂは、ＣＤ８−６１およびＣＤ８−６１ＦによるＣＤ８α発現の阻害を示す。ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、エレクトロポレーションによってＣＤ８−６１またはＣＤ８−６１Ｆのいずれかでトランスフェクトした。ＣＤ８α発現を、４８時間後のフローサイトメトリーによってアッセイした。印をつけていない線は偽トランスフェクションを示す。図２０Ｃは、ＣＤ８−６１ＦヘアピンＲＮＡの発現がＨ１ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターによって駆動される、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターの略図を示す。Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはシグナル配列の終結を示す。図２０Ｄは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩを使用したＨｅＬａ細胞中でのＣＤ８αのサイレンシングを示すプロットを示す。非トランスフェクト細胞は、ＣＤ８αを発現しなかった。細胞をＣＤ８α発現ベクターおよび無プロモーターｐＳＬＯＯＰＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆ構築物、合成ｓｉＲＮＡ、またはプロモーターを含むｐＳＬＯＯＰＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆのいずれかでトランスフェクトした。
【図２１】図２１Ａは、ＮＰ−１４９６おｙびＧＦＰ−９４９のｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の略図を示す。図２１Ｂは、２つの異なる順番でのＮＰ−１４９６ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈのタンデムアレイを示す。図２１Ｃは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン前駆体を、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターのみ（上）、タンデムアレイ（中央）、または独立プロモーターおよび終結配列（下）と同時にでクローン化する。
【図２２Ａ】図２２Ａは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーＰＥＩと共に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（ＧＦＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（３０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーＰＬＬと共に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（ＧＦＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーｊｅｔＰＥＩと共に投与した場合に、ＰＢＳ中で投与した場合よりも有意により有効にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。白抜きの四角（未処理）、白抜きの三角（ＰＢＳ中のＧＦＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの三角（ＰＢＳ中のＮＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（ｊｅｔＰＥＩを含むＧＦＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（ｊｅｔＰＥＩを含むＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２３】図２３は、インフルエンザウイルスでの感染前に共に投与した場合にインフルエンザウイルスＮＰおよびＰＡ転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡがさらなる効果を示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ＋６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２４】図２４は、インフルエンザウイルスでの感染後に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（６０μｇＧＦＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰ＋６０μｇＰＡｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２５】図２５Ａは、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの略図である。ｓｈＲＮＡの転写は、Ｕ６プロモーターによって駆動される。ＥＧＦＰ発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＳＩＮ−ＬＴＲ、Ψ、ｃＰＰＴ、およびＷＲＥは、レンチウイルス構成要素である。ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡの配列を示す。図２５Ｂは、図２５Ｂに示すレンチウイルスに感染したベロ細胞が用量依存的にＥＧＦＰを発現することを証明するフローサイトメトリーの結果のプロットを示す。ＮＰ−１４９６ａｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターおよびパッケージングベクターの２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによってレンチウイルスを産生した。培養上清（０．２５ｍｌまたは１．０ｍｌ）を使用して、ベロ細胞を感染させた。得られたベロ細胞株（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）ならびにコントロール（非感染）ベロ細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。ベロ−ＮＰ−０．２５（図の上部）およびベロ−ＮＰ−１．０（図の下部）細胞の平均蛍光強度を示す。影をつけた曲線は、コントロール（非感染）ベロ細胞の平均蛍光強度を示す。図２５Ｃは、ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡを発現するベロ細胞におけるインフルエンザウイルス産生の阻害を示すプロットである。親ベロ細胞およびＮＰ−１４９６発現ベロ細胞に、０．０４、０．２、および１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。上清中のウイルス力価を、感染から４８時間後に血球凝集素（ＨＡ）アッセイによって判定した。
【図２６】図２６は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされたｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡベクターの投与によってマウスにおけるインフルエンザウイルス産生が阻害されることを示すプロットである。６０μｇのＲＳＶ、ＮＰ−１４９６（ＮＰ）、またはＰＢ１−２２５７（ＰＢ１）ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを、４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆと混合し、点滴注入法によってマウスに投与した。未処理（ＮＴ）群について、マウスに６０μｌの５％グルコースを点滴した。１３時間後、マウスにＰＲウイルスを１２０００ｐｆｕ／マウスで鼻腔内感染させた。感染２４時間後にＭＤＣＫ／血球凝集素アッセイによって肺のウイルス力価を測定した。各データポイントは１匹のマウスを示す。群間のｐ値を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ｓｉＲＮＡとポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）との間の複合体形成を検出するための電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。１５０ｎｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡと漸増量のポリマー（０〜１２００ｎｇ）との室温で３０分間の混合によって、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成させた。次いで、反応混合物を、４％アガロースゲルで泳動し、ｓｉＲＮＡを臭化エチジウム染色を使用して視覚化した。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ｓｉＲＮＡとポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）との間の複合体形成を検出するための電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。１５０ｎｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡと漸増量のポリマー（０〜１２００ｎｇ）との室温で３０分間の混合によって、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成させた。次いで、反応混合物を、４％アガロースゲルで泳動し、ｓｉＲＮＡを臭化エチジウム染色を使用して視覚化した。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ｓｉＲＮＡ／ＰＬＬ複合体の細胞傷害性を示すプロットである。９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体で６時間処理した。次いで、ポリマー含有培地を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。２４時間後にＭＴＴアッセイの使用によって細胞の代謝活性を測定した。四角＝ＰＬＬ（分子量約８Ｋ）、円＝ＰＬＬ（分子量約４２Ｋ）、黒塗りの四角＝２５％、白抜きの三角＝５０％、黒塗りの三角＝７５％、Ｘ＝９５％。三つ組みの平均としてデータを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ｓｉＲＮＡ／ＰＬＡ複合体の細胞傷害性を示すプロットである。９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体で６時間処理した。次いで、ポリマー含有培地を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。２４時間後にＭＴＴアッセイの使用によって細胞の代謝活性を測定した。三つ組みの平均としてデータを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＰＬＬがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激することを示すプロットである。２４ウェルプレート中のベロ細胞を、リポフェクタミン＋ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）またはｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体と６時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．０４のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。異なる感染時点での培養上清中のウイルス力価を、ＨＡアッセイによって測定した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ比を示す。白抜きの円＝未処理、黒塗りの四角＝リポフェクタミン、黒塗りの三角＝ＰＬＬ（分子量約４２Ｋ）、白塗りの三角＝ＰＬＬ（分子量約８Ｋ）。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ポリ−Ｌ−アルギニンがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激することを示すプロットである。２４ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体と６時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．０４のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。異なる感染時点での培養上清中のウイルス力価を、ＨＡアッセイによって測定した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ比を示す。０，２５％、５０％、７５％、および９５％は、イミダゾールアセチル基に置換したＰＬＬ上のε−アミノ基の割合をいう。黒塗りの円＝非トランスフェクション、白抜きの円＝リポフェクタミン、白抜きおよび黒塗りの四角＝０％および２５％（０％と２５％のデータポイントは同一であることに留意のこと）、黒塗りの三角＝５０％、白抜きの三角＝７５％、Ｘ＝９５％。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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