(57)【要約】本発明は、場合により、生分解性ポリマなどの製薬上許容される担体中に、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の相乗的作用量および、少なくとも一つのピロリドンの相乗的作用量を含有する医薬組成物に関する。本発明はまた、場合により、製薬上許容される担体中の、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の相乗的作用量および、少なくとも一つのピロリドンの相乗的作用量を、そのような処置を必要とする患者に同時に投与することにより、整形外科および歯周を含む歯科疾患を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学上許容される担体中に、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンを含み、前記ＢＭＰおよび前記ピロリドンが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンは、場合によってアルキル基またはシクロアルキル基で置換されているピロリドン、およびポリピロリドンより選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンは１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）、  １ - エチル - ２ - ピロリドン（ＮＥＰ）、  ２ - ピロリドン（ＰＢ）および１ - シクロヘキシル - ２ - ピロリドン（ＣＰ）より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンはＮ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記ＢＭＰは遺伝子組換えＢＭＰ（ｒＢＭＰ）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の医薬組成物において、前記遺伝子組換えＢＭＰはｒＢＭＰ-２、ｒＢＭＰ-３、ｒＢＭＰ-４、ｒＢＭＰ-５、ｒＢＭＰ-６、ｒＢＭＰ-７、ｒＢＭＰ-８、ｒＢＭＰ-９、ｒＢＭＰ-１０、ｒＢＭＰ-１１、ｒＢＭＰ-１４、ｒＢＭＰ-１５、ｒＢＭＰ-１６、ｒＧＤＦ-１、ｒＧＤＦ-３、ｒＧＤＦ-８、ｒＧＤＦ-９、ｒＧＤＦ-１２、ｒＧＤＦ-１４およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物において、前記遺伝子組換えＢＭＰはｒＢＭＰ-２、ｒＢＭＰ-４、ｒＢＭＰ-５、ｒＢＭＰ-６およびｒＢＭＰ-７およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の医薬組成物において、前記遺伝子組換えＢＭＰはｒＢＭＰ-２およびｒＢＭＰ-４およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンはＮ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）であり、ＢＭＰはｒＢＭＰ２およびｒＢＭＰ４およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記薬学上許容される担体は生分解性ポリマであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物において、前記生分解性ポリマはポリグリコリド、ポリラクチド類、ポリカプロラクトン類、ポリトリメチレンカルボネート類、ポリヒドロキシブチレート類、ポリヒドロキシバレレート類、ポリジオキサノン類、ポリオルトエステル類、ポリカーボネート類、ポリチロシンカルボネート類、ポリオルトカルボネート類、ポリアルキレン・オキサレート類、ポリアルキレン・サクシネート類、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド類、ポリデプシペプチド類、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド類、ポリアミド類、ポリ無水物類(polyanhydrides)、ポリウレタン類、ポリホスファゼン類、ポリシアノアクリレート類、ポリフマレート類、ポリ（アミノ酸）類、修飾ポリサッカライド類、修飾蛋白質類およびそれらのコポリマ類、テルポリマ類、およびそれらの組み合わせ、およびそれらの混合物類、およびそれらのポリマー・ブレンド類より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の医薬組成物において、前記生分解性ポリマはポリグリコリド、ポリ（Ｌ - ラクチド - co -  グリコリド）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -  グリコリド）、ポリ（Ｌ - ラクチド）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド）、ポリ（Ｌ - ラクチド - co - Ｄ,Ｌ - ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ - ラクチド - co - カプロラクトン）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -カプロラクトン）ポリトリメチレンカルボネート、ポリ（Ｌ - ラクチド - co -トリメチレンカルボネート）、 ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -トリメチレンカルボネート）、ポリジオキサノンおよびそれらのコポリマ類、それらのテルポリマ類(terpolymers)およびそれらのポリマー・ブレンド類より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物において、前記生分解性ポリマがポリ - Ｄ,Ｌ - ラクチド - co - グリコリド（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
生分解性ポリマ中に、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンを含み、前記ＢＭＰ、前記ピロリドンおよび前記生分解性ポリマが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物において、前記少なくとも一つのＢＭＰが遺伝子組換え骨形成蛋白質（ｒＢＭＰ）で、前記ピロリドンがＮＭＰで、前記生分解性ポリマがポリ - Ｄ,Ｌ - ラクチド - co - グリコリド（ＰＬＧＡ）であり、前記遺伝子組換えＢＭＰ、前記ＮＭＰおよび前記ＰＬＧＡが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量で存在することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
骨形成の誘導を必要とする被験者を治療する方法であって、場合により薬学上許容される担体中の、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の骨形成誘導量および、少なくとも一つのピロリドンの骨形成誘導量を前記被験者に同時に投与し、前記ＢＭＰおよび前記ピロリドンは、骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、場合により薬学上許容される担体中の、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の骨形成誘導量および少なくとも一つのピロリドン骨形成誘導量を含む医薬組成物の形で、前記少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および少なくとも一つのピロリドンを同時に投与し、その中に前記ＢＭＰおよび前記ピロリドンが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量で存在することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記ピロリドンは場合によりアルキルまたはシクロアルキル基で置換されているピロリドン類およびポリピロリドン類より選択され、前記ＢＭＰはｒＢＭＰ-２、ｒＢＭＰ-３、ｒＢＭＰ-４、ｒＢＭＰ-５、ｒＢＭＰ-６、ｒＢＭＰ-７、ｒＢＭＰ-８、ｒＢＭＰ-９、ｒＢＭＰ-１０、ｒＢＭＰ-１１、ｒＢＭＰ-１４、ｒＢＭＰ-１５、ｒＢＭＰ-１６、ｒＧＤＦ-１、ｒＧＤＦ-３、ｒＧＤＦ-８、ｒＧＤＦ-９、ｒＧＤＦ-１２およびｒＧＤＦ-１４およびそれらの混合物より選択され、前記薬学上許容される担体は生分解性ポリマであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記ピロリドンは１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）、  １ - エチル - ２ - ピロリドン（ＮＥＰ）、  ２ - ピロリドン（ＰＢ）および１ - シクロヘキシル - ２ - ピロリドン（ＣＰ）より選択され、前記ＢＭＰはｒＢＭＰ-２、ｒＢＭＰ-４、ｒＢＭＰ-５、ｒＢＭＰ-６およびｒＢＭＰ-７およびそれらの混合物より選択され、前記薬学上許容される担体はポリグリコリド、ポリ（Ｌ - ラクチド - co -  グリコリド）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -  グリコリド）、ポリ（Ｌ - ラクチド）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド）、ポリ（Ｌ - ラクチド - co - Ｄ,Ｌ - ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ - ラクチド - co - カプロラクトン）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -カプロラクトン）ポリトリメチレンカルボネート、ポリ（Ｌ - ラクチド - co -トリメチレンカルボネート）、 ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -トリメチレンカルボネート）、ポリジオキサノンおよびそれらのコポリマ類、それらのテルポリマ類(terpolymers)およびそれらのポリマー・ブレンド類より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、前記ピロリドンは１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）であり、前記ＢＭＰはｒＢＭＰ-２およびｒＢＭＰ-４およびそれらの混合物より選択され、前記薬学上許容される担体はポリ - ＤＬ - ラクチド - co - グリコリド（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、場合により、生分解性ポリマなどの製薬上許容される担体中に、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の相乗的作用量および、少なくとも一つのピロリドンの相乗的作用量を含有する医薬組成物に関するものである。本発明はまた、場合により、製薬上許容される担体中の、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の相乗的作用量および、少なくとも一つのピロリドンの相乗的作用量を、そのような処置を必要とする患者に同時に投与することにより、整形外科および歯周を含む歯科疾患を治療する方法に関するものである。
【発明の背景】
【０００２】
ここ１０年で、骨再生誘導法（ＧＢＲ）は骨の治癒を高めるための予測できる効果的な方法として導入されており、とくに歯科インプラントの定着との関連において、ＧＢＲは臨床的によく証明されかつ成功した技法である[Dahlin, C., et al., Int J Periodontics Restorative Dent 11 (1991) 273 - 281; H&auml;mmerle, C. H. and Karring, T., Periodontol 2000 17 (1998) 151 - 175; Nyman, S. R. and Lang, N. P. Periodontol 2000 4 (1994) 109 - 118]。ＧＢＲにおいては、膜は結合組織のためのバリアーとして働き、骨がそれを満たすのに必要な時間、オープンな空間を維持する。
【０００３】
もし空のスペースが新しく形成される骨のための骨格として働く多孔性材料で満たされているならば、この骨を満たす過程を加速することは、骨誘導という原理によって達成することができる[Reddi, H., Cytokine & Growth Factor Reviews 8 (1997) 11 - 20]。また骨修復は、間葉幹細胞を骨芽細胞に分化させる能力のある適当な成長因子の適用を含む骨誘導により加速できる [Wozney, J. M. and Rosen, V., Clin Orthop Rel Res 346 (1998) 26 - 37]。
【０００４】
骨誘導における最も有用な成長因子は、分化因子であり、骨形成を誘導する能力に基づいて分離された骨形成蛋白質（ＢＭＰ）である[Wozney, J. M., et al. Science 242 (1988) 1528 - 1534]。これらは ＴＧＦ-β-スーパーファミリに属する30以上のメンバーを有するＢＭＰ-ファミリを形成している。ＢＭＰファミリは、ＢＭＰ-２およびＢＭＰ-４などのＢＭＰ、ＯＰ-１またはＢＭＰ-７、ＯＰ-２またはＢＭＰ-８、ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６またはＶｇｒ-１などのオステオジェニック蛋白質（ＯＰ）、ＣＤＭＰ-１またはＢＭＰ-１４またはＧＤＦ-５などの軟骨由来形態形成蛋白質（ＣＤＭＰ）、ＧＤＦ-１、ＧＤＦ-３、ＧＤＦ-８、ＧＤＦ-９、ＧＤＦ-１１またはＢＭＰ-１１、ＧＤＦ-１２およびＧＤＦ-１３などの成長 / 分化因子（ＧＤＦ）を含むサブファミリ、ならびにＢＭＰ-３またはオステオジェニン、ＢＭＰ-９またはＧＤＦ-２およびＢＭＰ１０などの他のサブファミリに分けられる (Reddi et al., 1997, supra) 。
【０００５】
とくに動物モデルでは、ＢＭＰは骨形成および骨修復の強力な誘導物質であることが証明された。しかしながら、体液に触れると直ぐに起こるＢＭＰの分解およびＢＭＰの強力な骨形成作用のために、骨誘導の生物学的活性のためには非生理的に高い用量のＢＭＰが必要とされる[Weber, F. E. et al., Int J Oral Maxillofac Surg 31 (2002) 60 - 65; Rose, F. R. A. and Oreffo, R. O. C. Biochem Biophys Res Com 292 (2002) 1 - 7]。担体系の選択が決定的となる、局所適用ルートを使用しなければならず、適当な担体系は現在のところ入手できない。ＢＭＰは通常遺伝子組換え法によって製造され、それ故、高価で限られた量でしか入手できないため、ＢＭＰはそのわかっている作用にもかかわらず、患者の医学的治療に大きな影響を持たず、現在のところ臨床的には適用されてはいない。
【０００６】
生分解性（再吸収性、吸収性および腐食性とも呼ばれる）ポリマが現在のところ制御放出系のために選択できる材料であり、それらの一時的な異物反応および組織を再生させる能力のために、治療する患者に移植できる材料を含んでいる(例えば、The Biomedical Engineering Handbook, Bronzino, J. D., Ed., CRC Press, Boca Raton, 2000, chapter 41, page 41-1 〜 41-22を参照)。最も研究されている生分解性ポリマはポリ（乳酸）類 (ＰＬＡ)、ポリ（ラクチド - co - グリコリド）- ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧ−ＰＥＧ）コポリマ類、ＰＬＧ−ＰＧＡコポリマ類およびそれに類似したものを含んでいる。しかしながら、合成生分解性ポリマは硬く、例えばＧＢＲに、とくに歯科ＧＢＲに適用するために必要な柔軟性に欠けている。
【０００７】
米国公開特許出願第20030104029号において、出願人は公知の可塑剤 N - メチル - 2 - ピロリドン（ＮＭＰ）で処理することにより、ＧＢＲで使用できる程度まで生分解性ポリマの硬さを柔らかくし、その柔軟性を増すことができると開示している。さらに、ＮＭＰ自体が予期せぬ骨形成誘導作用を持っていることが発見された。
【０００８】
医学における担体としての生分解性ポリマの適用と同様に、ＢＭＰの利用での新しいアプローチがなお必要とされている。
【０００９】
本発明の目的はこの必要を満たすことであり、上で述べたような欠点や欠陥を克服する新しい手段を提供することである。
【００１０】
本発明の一つの目的は、このように歯周病学を含む歯科および整形外科などの他の医学分野での患者の治療において、ＢＭＰの骨形成誘導作用を利用するための新しい手段を提供することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、歯周病学を含む歯科および整形外科などの他の医学分野での患者の治療において、それによりＢＭＰの安全で費用の上で効果的な使用を可能にする、ＢＭＰの用量の減少、とくに遺伝子組換えにより製造されたＢＭＰの用量の減少を可能にする手段を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、骨再生誘導法を使用するための新しい手段を提供することである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、それにより第二の外科段階を避けることができるような、ＧＢＲにおける生分解性膜の使用のための新しい手段を提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、ＢＭＰの骨形成作用がＮＭＰなどのピロリドンの骨形成誘導作用とともに相乗的な様式で利用される、医薬組成物を提供することであり、その組成物は歯科インプラントの形成および抜歯後の歯槽の充填を含む、歯科および歯周病学的な疾患の治療に有用なことである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、ＢＭＰの骨形成作用がＮＭＰなどのピロリドンの骨形成誘導作用および生分解性ポリマとともに相乗的な様式で利用される、医薬組成物を提供することであり、その組成物は歯科インプラントの形成および抜歯後の歯槽の充填を含む、歯科および歯周病学的な疾患の治療、とくに骨再生誘導法（ＧＢＲ）を経由しての治療に有用なことである。
【００１６】
本発明のなお更なる目的は、骨形成の誘導を必要としている被験者を治療する方法を提供することであり、ＢＭＰの骨形成作用がＮＭＰなどのピロリドンの骨形成誘導作用および、場合により生分解性ポリマとともに、歯科インプラントの形成および抜歯後の歯槽の充填を含む歯科および歯周病学的な疾患を治療するため、および整形外科的疾患および障害を治療するために相乗的な様式で利用される。その中では、外科的骨手術または事故による骨折の患者の回復を高めることを含む、歯槽堤増大、洞床上昇および非癒合の治療におけるような、骨折の治癒の亢進および骨の増大が望まれている。
【発明の簡単な説明】
【００１７】
驚くべきことだが、ピロリドン単独または生分解性インプラント、とくに、場合によりＮＭＰなどのピロリドンで前処理した膜とともにＢＭＰを投与することにより、従来技術で報告されているような、ＢＭＰまたはＮＭＰまたはＮＭＰと生分解性ポリマの併用による活性を含む個別の骨形成誘導作用に基づいては期待できなかった程度まで、骨形成が相乗的な様式で高められることが今や発見された。
【００１８】
本発明は、場合により製薬上許容し得る担体中に、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンを含有し、前記ＢＭＰおよび前記ピロリドンが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量でその中に存在する、医薬組成物に関するものである。
【００１９】
本発明の一つの実施態様においては、ピロリドンは N - メチル - 2 - ピロリドン（ＮＭＰ）であり、ＢＭＰは遺伝子組換えＢＭＰであり、ＮＭＰおよび前記遺伝子組換えＢＭＰが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量で存在している。
【００２０】
本発明のもう一つの実施態様においては、薬学上許容される担体は生分解性ポリマである。
【００２１】
本発明のもう一つの実施態様においては、薬学上許容される担体はピロリドンで前処理した生分解性ポリマである。
【００２２】
本発明の実施態様の一つの例は、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、ピロリドンおよび生分解性ポリマを含有する医薬組成物であり、その中には前記ＢＭＰ、前記ピロリドンおよび前記生分解性ポリマが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する用量で存在している。
【００２３】
本発明の実施態様のもう一つの例は、少なくとも一つの遺伝子組換え骨形成蛋白質（ｒＢＭＰ）、メチル - 2 - ピロリドン（ＮＭＰ）およびＮＭＰで前処理した生分解性ポリマを含有する医薬組成物であり、その中には前記ｒＢＭＰ、前記ＮＭＰおよび前記前処理生分解性ポリマが骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する用量で存在している。
【００２４】
本発明はさらに、骨形成の誘導を必要とする被験者を治療する方法に関するものであり、その方法は、場合により薬学上許容される担体中で、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンを同時に投与することから成り立っていて、その中には前記ＢＭＰおよび前記ピロリドンが前記被験者に対して骨形成に対して相乗的に治療作用を提供する用量で存在している。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
本発明は、ピロリドンとくにＮＭＰがどのようにして骨再生を高めることができるかというメカニズムを解明するための、出願人の更なる研究に基づいている。非ＢＭＰ産生細胞株のin vitroではなく、ウサギのin vivoおよびＢＭＰ産生細胞株のin vitro の両方で、可塑剤、N - メチル - 2 - ピロリドン（ＮＭＰ）で柔軟にした時、ＧＢＲで使用するにはその膜が硬すぎる合成生分解性ポリマ、すなわちポリラクチド/グリコリド（ＰＬＧＡ）より成り立つピロリドン処理膜は、in vivo骨再生において、未処理またはＰＬＧＡ膜などの組織より良好な結果を示していた。
【００２６】
骨の治癒に対して悪い作用を持つ血液の供給が少ないことおよび骨の膜（皮質）構造の故に、それが骨再生のために最も選ばれるモデルであるため、頭蓋冠欠損モデルを動物モデルとして選んだ。欠損サイズは危険欠損サイズ以下にし、顎顔面外科における骨切断裂孔の典型的な大きさおよび歯科での欠損に似るように選んだ [Klinge, B., et al., J Oral Maxillofac Surg 50 (1992) 241 - 249] 。この動物モデルでは、二つの市販膜、Ｅ１Ｍ−１１およびOsseoquest、ならびにＮＭＰ（Ｅ１Ｍ−１１ＮＭＰ）で処理したＥ１Ｍ−１１を試験したが、これらすべてが骨再生を改善していた（図１）。
【００２７】
しかしながら、ＮＭＰ処理膜は有意に良好な働きを示し、これがＢＭＰ受容体を経由する信号伝達の増加に起因すると結論された。この説明は、ＮＭＰの低用量の適用がそれらの成熟を亢進する（図２）、前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）に由来するin vitroのデータによって支持されていた。この細胞株はＢＭＰを分泌し、それを細胞外マトリックス中に放出し、Ｓｍａｄｓを経由してＢＭＰ信号伝達に専ら作用する、細胞外ＢＭＰの作用により成熟することが知られている[Suzawa, M., et al., Endocrin 140 (1999) 2125 - 2133]。同じ信号伝達経路はまたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中にも存在するが[Katagiri, T., et al., Biochem Biophys Res Com 172 (1990) 295 - 300]、ＮＭＰ適用に対する反応は見つかっていない。それ故、ＮＭＰの作用部位はＢＭＰ受容体レベルあるいはその下流ではなく、ＮＭＰは細胞外ＢＭＰに直接作用する。このように、in vivoで見られるＮＭＰにより誘導される骨再生の改善および、in vitroでのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の成熟の亢進は、両方の系に存在する自己由来ＢＭＰの生物学的活性/生物学的有用性のＮＭＰが仲介する増加に起因している。
【００２８】
ＧＢＲにおいて、ＰＬＧＡ膜などのＮＭＰで処理した合成生分解性ポリマ膜の併用は、ＮＭＰのためのデリバリー・デバイスに対して骨の内部成長のために作成したオープンな空間からの、結合組織の純粋に機械的な分離物より膜の機能を大幅に向上させる。In vivoで自己由来ＢＭＰの生物学的活性／生物学的有用性が実質的に向上するので、この併用によってＧＢＲを直接骨誘導と結びつけられる。同じ動物モデルでかなりの強度の骨再生を得るためには、ウサギに存在するＢＭＰの全量（ふくらはぎ中のＢＭＰ量に基づいて計算した、Reddi et al., 1997, supra)と同じである、15 μgのｒｈＢＭＰ-２が必要である（結果は示していない）。
【００２９】
それ故、自己由来ＢＭＰを経由するこのケースにおいては、このモデルでのＮＭＰの使用はまた自己治癒の過程を増強するためのよい実例である。
【００３０】
これらの結果は出願人を勇気づけ、臨床適用で必要とされる外部ＢＭＰの量を減らすことができるであろうという期待を持って、付加したＢＭＰに対するＮＭＰの作用についてのさらなる研究に駆り立てた。
【００３１】
しかしながら、驚くべきことだが更なる研究において、ＮＭＰなどのピロリドンと併用してＢＭＰと投与すると、骨形成は予期せぬ程度まで相乗的な様式で高められことが発見され、この事は従来技術で報告されたＢＭＰまたはＮＭＰの個別の骨形成誘導作用に基づいては予見できないことであった（図３）。
【００３２】
この事は望ましい作用に必要な材料の量を少なくするという利点を提供し、とくにｒＢＭＰの製造は困難であるという点からすると、この事は非常に重要である。また、より少ない異物を使用することができるので、副作用の危険が非常に減少する。すべての点において、本発明はＢＭＰ、とくにｒＢＭＰの骨誘導力の経費的に効果的な治療での使用を初めて可能にしている。
【００３３】
今回の目的では、ＢＭＰまたはｒＢＭＰという用語は、それぞれ二量体の天然型または遺伝子組換え型の生成物としてのＢＭＰファミリのメンバーを意味する。このように、例えば、ｒＢＭＰという用語は、遺伝子組換え技術によって製造された場合の、ＢＭＰ-１５および１６と同様に、ＢＭＰ-２およびＢＭＰ-４などのＢＭＰサブファミリのメンバー、ＯＰ-１（またはＢＭＰ-７）、ＯＰ-２（またはＢＭＰ-８）、ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６（またはＶｇｒ-１）などのＯＰサブファミリのメンバー、ＣＤＭＰ-１（またはＢＭＰ-１４またはＧＤＦ-５）などのＣＤＭＰサブファミリのメンバー、ＧＤＦ-１、ＧＤＦ-３、ＧＤＦ-８、ＧＤＦ-９、ＧＤＦ-１１（またはＢＭＰ-１１）、ＧＤＦ-１２およびＧＤＦ-１４などのＧＤＦサブファミリのメンバー、およびＢＭＰ-３（またはオステオジェニン）、ＢＭＰ-９（またはＧＤＦ-２）およびＢＭＰ-１０などの他のＢＭＰのサブファミリのメンバーを網羅している。本発明の医薬組成物中で用いられるＢＭＰおよびｒＢＭＰの好ましい実例には、ＢＭＰが新しい骨の形成に決定的に含まれていることが現在知られている、天然型および遺伝子組換え型ＢＭＰ-２、ＢＭＰ-４、ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６およびＢＭＰ-７が含まれている。しかしながら、本発明が意図するものには、骨形成におけるその役割がまだ十分には解明されていないＢＭＰを含有する組成物も含まれる。
【００３４】
本発明で有用な天然型ＢＭＰは、Johnson EE, et al. [Clin Orthop 250 (1990) 234 - 240]によって記載されているように、例えばヒトの骨から、または従来技術に精通した人には容易にわかるように、他の哺乳類の骨を起源として得ることができる。
【００３５】
本発明で有用なｒＢＭＰは、従来の方法で原核性および真核性発現系の両方を用いる標準の遺伝子組換え技術により製造することができる。この点については、参考文献は例えば Cerletti et al. (欧州特許出願公開公報 0 433 225 A1) およびIsrael D. I. et al., Growth Factors 7 (1992) 139 - 150である。大腸菌(Escherichia coli)株または他の適当な細菌株などの、原核性発現系での製造は収量という点で有利である。原核性発現系は、例えば Cerletti et al. (supra)によって記載されているように、その時二量体化できるｒＢＭＰモノマの製造にとくに適している。他方、哺乳類または昆虫細胞、とくに哺乳類の細胞などの真核性発現系、およびとくに蛋白質を含まない培地を使う発現系は生成物の安全性という点で有利である。適した哺乳類細胞の例には、チャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。哺乳類発現系はｒＢＭＰの製造にはとくに好ましい。しかしながら、適した生産系の選択は、従来技術に精通した人には容易にわかることである。
【００３６】
本発明の医薬組成物で有用なピロリドンは、組織に対して障害作用や毒性作用を持たないならば、化学技術で知られている、柔軟性や可溶性のあるどのようなピロリドンでもよい。そのようなピロリドンには、例えば１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）、１ - エチル - ２ - ピロリドン（ＮＥＰ）、２ - ピロリドン（ＰＢ）および１ - シクロヘキシル - ２ - ピロリドン（ＣＰ）などの、アルキルまたはシクロアルキル置換ピロリドンが含まれ，ＮＭＰおよびＮＥＰは好ましい例である。さらに、ポリビニルピロリドンなどのピロリドンをベースとするポリマも本発明の医薬組成物で有用である。
【００３７】
本発明の医薬組成物は薬学上許容される担体を含んでいてもよい。担体は、溶液または懸濁液を作るために水、生理食塩液、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの緩衝液および同様の緩衝液を含む、適当な液体、固体または半固体担体でもよく、天然または合成生分解性ポリマまたはコポリマでもよい。組成物のピロリドン成分の可溶化性質のために、ＢＭＰ成分の溶解性を高めるために追加のアジュバントは通常必要ではない。しかしながら、液体担体は、共溶媒(co-solvent)、界面活性剤、安定化剤、抗酸化剤、増粘剤、保存剤およびそれに類する物などの、医薬溶液および懸濁液を作るために通常用いられるアジュバントを含んでいてもよい。必要な場合は、組成物を膜濾過などの適当な滅菌方法で滅菌してもよい。
【００３８】
本発明の一つの好ましい実施態様においては、薬学上許容される担体は合成生分解性ポリマに基づく次のような徐放系である：ポリグリコリド、ポリラクチド類、ポリカプロラクトン類、ポリトリメチレンカルボネート類、ポリヒドロキシブチレート類、ポリヒドロキシバレレート類、ポリジオキサノン類、ポリオルトエステル類、ポリカルボネート類、ポリチロシンカルボネート類、ポリオルトカルボネート類、ポリアルキレン・オキサレート類、ポリアルキレン・サクシネート類、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド類、ポリデプシペプチド類、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド類、ポリアミド類、ポリアンハイドライド類(polyanhydrides)、ポリウレタン類、ポリホスファゼン類、ポリシアノアクリレート類、ポリフマレート類、ポリ（アミノ酸）類、修飾ポリサッカライド類（セルロース、でんぷん、デキストラン、キチン、キトサン、その他などの）、修飾蛋白質類（コラーゲン、カゼイン、フィブリン、その他などの）、およびそれらのコポリマ類、テルポリマ類またはそれらの併用物またはそれらの混合物またはそれらのポリマー・ブレンド類。ポリグリコリド、ポリ(L - ラクチド - co - グリコリド）、ポリ(D,L - ラクチド - co - グリコリド）、ポリ(L - ラクチド）、ポリ(D,L - ラクチド）、ポリ(L - ラクチド - co - D,L - ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ(L - ラクチド - co - カプロラクトン）、ポリ(D,L - ラクチド - co - カプロラクトン）ポリトリメチレンカルボネート、ポリ(L - ラクチド- co - トリメチレンカルボネート）、ポリ(D,L - ラクチド - co - トリメチレンカルボネート）、ポリジオキサノンおよびそれらのコポリマ類、それらのテルポリマ類およびそれらのポリマ・ブレンド類は非常に好ましいポリマの例である。最も好ましくは、ポリ - D,L - ラクチド - co - グリコリド（ＰＬＧＡ）などのポリラクチドとグリコリドとのコポリマが担体として用いられる。
【００３９】
本発明で用いられる薬学上許容される担体の他の例には、コラーゲンおよびフィブリン、リン酸カルシウム（トリ - カルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト）、骨セメント類、バイオガラス、珊瑚ミネラル類(Algipore (登録商標))、真珠貝、卵の殻、牛由来ヒドロキシアパタイト(Bio-Oss (登録商標))などの蛋白質類およびすべての骨化誘導（多孔性）材料類が含まれる。
【００４０】
本発明の医薬成分はＢＭＰ成分およびピロリドン成分を同時に投与するのに適した適当な方法で製剤化できる。一つの実施態様において、本発明の医薬組成物は、適当な骨形成を誘導する量のＢＭＰおよびピロリドン成分、および場合によって薬学上許容される担体と混ぜて製造することができる。
【００４１】
また、本発明のもう一つの実施態様において、生分解性ポリマは、好ましくは膜の形で、ピロリドンで前処理して使用する。処置には、成型したポリマを望むピロリドンを含む溶液に、１５秒から３分間などの、そのポリマを柔軟にするのに必要な時間、またはそのポリマ中でピロリドンを一定の濃度にするための時間浸し、その後空気乾燥することが含まれる。その後、ＢＭＰを担体膜のヘパリン化によって導入することができる[Ruppert, R. et al., Eur J Biochem 237 (1996) 295 -302]。ポリマはインプラントを装着する間、十分に柔軟性を保っている。また、成型したポリマを同様にピロリドンおよびＢＭＰの混合物で前処理すると、それによりＢＭＰは単純な吸着によりポリマに付着する。また、ＢＭＰは別々に適用できるが、フィブリン、コラーゲン、ポリエチレン・グリコール、バイオグラス、ヒドロキシアパタイト、カルシウム・ホスファテート類(calcium phosphates)などの異なった担体中で、および上述したような同様の担体材料中で同時に適用できる。
【００４２】
本発明の一つの実施態様においては、医薬組成物は膜、フィルム、プレート、メッシュ・プレート、ネジ型タブおよび他の成型物を含むインプラントの形である。
【００４３】
本発明の医薬組成物は少なくとも一つのＢＭＰまたはｒＢＭＰの骨形成誘導量および少なくとも一つのピロリドンの骨形成誘導量を含有している。例えば、その量はＢＭＰまたはｒＢＭＰでは約 0.001 から約 4 mgで、ピロリドンでは用量当り約 0.005 から約 50 重量パーセントであってよい。しかしながら、骨形成誘導量は異なった適用で、とくにＢＭＰの場合は異なっている。このように、例えば歯科適用ではより少ない量で十分であるが、他方例えば片側および多側脊椎固定、非癒合の治療、骨粗鬆症の治療および（股関節）インプラントの内部成長(in-growth)での望まれる作用のためには、多少大きめの量が必要となる。
【００４４】
本発明の組成物の用量は個々の患者で、また治療する疾患によって異なる。本発明の組成物の典型的な用量は約 0.001 から約 4 mg の範囲内である。しかしながら、例えば歯科患者の治療においてはより少ない量で十分であるが、他方他の治療での望まれる作用のためには多少多い用量が必要かもしれない。
【００４５】
本発明の治療法は、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンの骨形成誘導量の同時使用に基づいていて、それにより相乗的作用が達成される。本発明の方法においては、骨形成の誘導を必要としている被験者に、場合により薬学上許容される担体中の、少なくとも一つの骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の骨形成誘導量および、少なくとも一つのピロリドンの骨形成誘導量を同時に投与し、前記ＢＭＰおよび前記ピロリドンを骨形成に対して相乗的な治療作用を提供する量で投与する。本発明の目的のためには、「同時に投与する」という表現は同時にそして連続的に投与することを含む。このように、本発明の方法の一つの実施態様においては、ＢＭＰ成分およびピロリドン成分は本発明の医薬組成物の形で投与する。本発明の方法のもう一つの実施態様においては、ＮＭＰなどのピロリドンで前処理した薬学上許容される担体を導入しながら、その後ＢＭＰの適当な相乗的作用量を適用しながら、ＢＭＰを治療部位に連続的に投与してもよい。
【００４６】
本方法で使用されるＢＭＰ成分およびピロリドン成分の量は治療する条件によって異なり、担当医師によって決定されるであろう。典型的な例は上に示した通りである。
【００４７】
本発明を次の実施例で示すが、これは説明の目的でのみ示すものである。
【００４８】
統計学的解析には、unpaired Student T 検定を市販のソフトウエア・パッケージ(SSPE、Chicago、Il)によって行なった。すべての値は平均値±標準誤差で表した。
【データの解析】
【００４９】
6 mm 離れていた欠損のふちを局在化するために、欠損の中央からの垂直切片のデジタル像を mm のスケールでとった。周辺骨の頭蓋冠骨の厚さと関連して、欠損の全面積を再構築することができた。Adobe Photoshop 5.0 プログラムを用いることにより、欠損の全ピクセル数を測定することができた。全欠損の骨により満たされた部分もまた測定し、骨面積のピクセル数により表現した。骨治癒のパーセントを次のように計算した。
【００５０】
骨の治癒[％]＝骨面積のピクセル数 X 100 / 欠損の全ピクセル数。
【００５１】
細胞培養法およびアルカリ・ホスファターゼ測定。
【００５２】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を 10% 牛胎児血清(Life Technologies, Inc.)、50 μg / ml ゲンタマイシン、および 50 μg / ml アスコルビン酸を含む alpha-modified Minimum Essential 培地(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)中で培養した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１/２細胞を基本 Eagle 培地中で、50 μg / ml ゲンタマイシンとともに培養した。両細胞株に対するＮＭＰの作用を調べるために、１穴当り 1 X 105 細胞を６穴プレート中に接種し、つづいてＮＭＰを加えた。培地の交換は３日後に行ない、アルカリ・ホスファターゼ（ＡＬＰ）を Lowry, O. et al. [J. Biol. Chem. 207 (1954) 19 - 37]に従って測定した：遊離した p - ニトロフェノールを 400 μl の１M NaOH を加えることにより、p - ニトロフェニレートに変換し、410 nm で吸収を測定することにより定量した (epsilon = 17500 / molxcm)。アルカリ・ホスファターゼ活性を全蛋白質に対して標準化し、1分間 mg 蛋白質当り発生した nmol ニトロフェニレートとして表現した。
【００５３】
無機質化を、5 mM グリセロール・ホスフェートおよび 1 μg / ml ｒｈＢＭＰ-２を補充した同じ培地で培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中で測定した。Alizarin red-S 染色を、Bodine, P. V. N., et al., [J Bone Mineral Res 11 (1996) 806 - 819]の方法に従って４週間後に行なった。
【実施例１】
【００５４】
骨再生に対するＮＭＰ処理ＰＬＧＡ膜の作用
骨再生を評価するために、ウサギの頭蓋冠骨中に標準化した欠損を作った。ニュージーランド白ウサギ(3.5 〜 4.0 kg)を当該地域機関のガイドラインに従って処理した。これらの研究のためのプロトコールは kantonalem Verterin&auml;ramt, Zurichによって承認され指導を受けたものである。鎮静後、歯科用ハンド・ピース(dental hand piece)中で 6 mm の穿孔器を用いて４個の 6 mm 開頭術欠損を作成した。硬膜側から欠損を覆うために、直径 6.1 mm の膜を頭蓋冠骨を通して差し込んだ。この膜は硬膜からの圧力で固定した。もう一つの 10 x 10 mm の矩形膜を欠損の上に置いた。頂上の４個の膜を一緒に縫合し、全体のユニットを側方の残存する骨膜に縫合した。４週間後に、動物を殺し、頭蓋冠骨を切除し、ラジオグラフで調べ、メタアクリレート中に包埋し、Weber, F. E., et al., [Biochem. Biophys Res. Commun. 286 (2001) 554 - 558]の記載に従って、Goldner-Trichrome 染色で染色した。
【００５５】
すべてＰＬＧＡで成り立っている３個の異なった膜をすべて試験した：OsseoQuest (Gore - Tex(登録商標), USA)、Ｅ１Ｍ−１１(Inion OY, Finland)およびＮＭＰ（Ｅ１Ｍ−１１  ＮＭＰ）で処理したＥ１Ｍ−１１膜。ＮＭＰ処置には、30 秒間膜をＮＭＰ中に浸し、その後 15 分間空気で乾燥することが含まれる。骨誘導性ｒｈＢＭＰ-２はWeber, F. E. et al., 2001, supra の記載する方法に従って製造した。
【００５６】
ウサギの頭蓋冠骨中に作成した標準化した欠損中の骨再生の評価は、未処置のコントロール欠損と比較して、３個すべての膜が骨治癒の有意な改善を示していた。欠損の 79.06±5.6 % の骨治癒により、ＮＭＰ処理Ｅ１Ｍ−１１ＮＭＰ膜で最も効果があった。
【００５７】
他の２個の膜と比較しての骨再生の有意な改善の理由は、対照の膜 Osseoquest はその構造の故に柔らかく柔軟なので、Ｅ１Ｍ−１１膜に対するＮＭＰの柔軟化作用のみに起因することはできない。それ故、２個のＥ１Ｍ−１１ＮＭＰ処置欠損の次に位置する、２個の未処置のコントロール欠損の配列を用いて追加の実験を行なった。膜によりこれらの未処置欠損の近くに適用されたＮＭＰの存在の故に、これらを偽コントロール欠損と名づけた。結果は、偽コントロール欠損は真のコントロール欠損より有意によく治癒していることを示していた（偽コントロール 60.05±5.4 %；コントロール 30.3±4.1 %治癒；Ｐ＜.038)。それ故、すべてのin vivoデータはＮＭＰによる骨治癒に対して陽性の作用を示していた。
【実施例２】
【００５８】
骨再生に対するＮＭＰ処理ＰＬＧＡ膜およびｒｈＢＭＰ-２の共同による相乗的作用
第一に、ＮＭＰの骨誘導作用を立証するために、ネズミ胎児間葉幹細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２および前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用い、上記のように培養した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は軟骨、骨または脂肪細胞に分化し、一方ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は自己由来ＢＭＰを産生し放出する。骨芽細胞系列への分化のマーカーとして、アルカリ・ホスファターゼ活性を用いた。
【００５９】
図２に示すように、ＮＭＰの低用量はアルカリ・ホスファターゼ活性を 2.5〜3.0 倍に増加し、ＭＣ３Ｔ３−Ｅでの前骨芽細胞から骨芽細胞への成熟を加速していた。Alizarin-S染色によって測定したように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＮＭＰ処理は成熟した骨芽細胞によってなされる無機質化を増加させるので、成熟のこの加速もまた長時間続いた（２Ｂ図）。他方で、5 mM までのＮＭＰによって処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリ・ホスファターゼ活性は増加しなかった（データは示していない）。このように、ＮＭＰ単独では骨誘導作用はない。
【００６０】
細胞株間での主な違いはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞によってのみ生成されるＢＭＰの存在であるので、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて外部ＢＭＰの作用について、同じ試験系で研究した。とくに、細胞を 4 ml の培地中に１日目に接種し、ＡＬＰ測定を６日目に行なった。第１日目に、1 mM ＨＣｌ中に 2 mg / ml のｒｈＢＭＰを含む保存溶液からＢＭＰを細胞に 1 μg / ml の濃度になるように加えた。ＮＭＰを非希釈液として同じ時点で、 0.1 〜 20 mM の濃度になるように細胞に加えた。添加後、全６穴プレートをゆっくりとまわして、ＮＭＰおよびｒｈＢＭＰを混合した。別の実験において、細胞をＮＭＰでのみ処理した。相乗的作用を計算するために、ｒｈＢＭＰの単独処理によって誘導されるＡＬＰ活性およびＮＭＰの単独処理によって誘導されるＡＬＰ活性をｒｈＢＭＰおよびＮＭＰ両方の存在で達成されたＡＬＰ活性から差し引いた。その結果を図３に示す。
【実施例３】
【００６１】
異なったピロリドンとｒｈＢＭＰ-２との相互作用
ＮＭＰはいろいろの有機および無機物質に対してよい溶媒であることが知られているので、ＮＭＰとＢＭＰの観察された相乗作用がｒｈＢＭＰに対するＮＭＰの可溶化作用によるか否かを推測し、分析した。２〜２０マイクログラムのｒｈＢＭＰ蛋白質を高速真空で凍結乾燥し、固体ｒｈＢＭＰのディスクを作った。
増加する量の１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ），１ - エチル - ２ -ピロリドン（ＮＥＰ）、２ - ピロリドン（ＰＢ）および１ - シクロヘキシル - ２ - ピロリドン（ＣＰ）を含む 50 μl のリン酸緩衝生理食塩液を加えて、混合し、激しくふって可溶化した。２時間後に、残っているディスク中の蛋白質を沈殿させ(22,000 xg、30 分間)、上清液よりの 20 μl の蛋白質量を slot-blot法で測定した（Weber, F. E., et al., 2002, supra)。
【００６２】
図４に見られる通り、ＮＭＰを用いた実施例２で記載したin vitroの研究で使用したのと同じ範囲のピロリドン濃度で、他では不溶なｒｈＢＭＰを可溶化するのに十分であった。図４Ａに示す結果は、異なったピロリドンのｒｈＢＭＰ-２を可溶化する力の右下がりの傾向を示している：１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）＞１ - エチル - ２ -ピロリドン（ＮＥＰ）＞２ - ピロリドン（ＰＢ）＞１ - シクロヘキシル - ２ - ピロリドン（ＣＰ）。
【００６３】
実施例２で記載したように、同じピロリドンをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で試験した時、アルカリ・ホスファターゼ活性の増加は同じ傾向を示していた（図４Ｂ）。それ故、ピロリドンのｒｈＢＭＰを可溶化する力はピロリドンのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の成熟に対する作用と直接関連している。
【００６４】
前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）に対する純粋なＮＭＰの作用を研究した。低用量のＮＭＰは、ＢＭＰに対する結合および可溶化能力のために、おそらく自己由来骨形成蛋白質（ＢＭＰ）の生物学的活性／生物学的有用性を増加させることにより、前骨芽細胞の骨芽細胞への成熟を加速していることを、結果は示していた。それ故、自己由来蛋白質の生物学的活性を増加させ、低溶解性の遺伝子組換え蛋白質を適用するために、ＮＭＰまたは他のピロリドンは医学分野で利用することができる。加えて、我々はＧＢＲ膜の機能を組織の単なる機械的壁から生物活性物質のためのデリバリー・デバイスへと発展させた。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は骨再生誘導法およびＮＭＰによる骨修復の向上を図示している：頭蓋冠骨中の6 mm（半径）の欠損を三つの異なった膜（Ｅ１Ｍ−１１、OsseoquestおよびＥ１Ｍ−１１ＮＭＰ）によって処理するか、または未処理のまま残した（コントロール）。手術の4週間後に、欠損中の骨再生を測定した。上部パネル（図１Ａ）は元の欠損面積に対しての、欠損中の骨再生が起こった面積のパーセントを示している。各値は8個の独立した欠損の結果を示している。Ｐ値が示されている。Goldner-Trichromeによって染色した欠損の中央部分を用いて評価を行なった。下部パネル（図１Ｂ）中に、コントロールおよびＥ１Ｍ−１１ＮＭＰで処理した欠損の中央部分の一例を示している。Goldner-Trichrome染色後、骨は暗い緑色に、類骨は赤く見える。欠損の程度が示されている。
【図２】図２はin vitroでの前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）のＮＭＰにより誘導された成熟の増加を示している。図２Ａ：増加するNMPの量で処理したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞および6日後にアルカリ・フォスファターゼ活性によって測定された成熟。0 から5 mMの範囲で適用されたＮＭＰの量により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の成熟は濃度に依存する様式で増加している。図２Ｂ：アリザリンＳ染色によって可視化した、６穴プレート上に接種したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の無機質化。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を5 mMのグリセロール・フォスフェートおよび1 μg/mlのｒｈＢＭＰ−２の存在下で 4週間培養した。上の列ではＮＭＰは加えず、下の列では実験期間を通して2.5 μM のＮＭＰが存在していた。上の列と比較した下の列中の赤く染まった面積の増加は、無機質化によって測定した成熟が2.5 mM ＮＭＰの存在下で増加したことを示している。
【図３】図３はアルカリ・フォスファターゼ活性によって測定したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の成熟に対するＮＭＰおよびｒｈＢＭＰ−２の相乗的作用を示している。培地の 1μg ｒｈＢＭＰ−２/mlの存在下または不在下で、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＮＭＰで処理した。相乗作用を計算するために、ＢＭＰ処理単独で誘導されたＡＬＰ活性およびＮＭＰ処理単独で誘導されたＡＬＰ活性を、ＢＭＰおよびＮＭＰの両方の存在下で達成されたＡＬＰ活性から差し引いた。ＳＤをグラフの中に示した。
【図４】図４は異なったピロリドンがｒｈＢＭＰ−２の二量体を可溶化する力と前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）の成熟に対する同じ物質の作用との間の相関性を示している。図４Ａ：ｒｈＢＭＰ−２の二量体のペレットを、異なったピロリドンの量を増加することにより補足したリン酸緩衝生理食塩液中で２時間可溶化した（ＮＭＰ：1 - メチル - 2 - ピロリドン；ＮＥＰ:1 - エチル - 2 - ピロリドン；ＰＢ : 2 - ピロリドン；ＣＰ: 1 - シクロヘキシル - 2 - ピロリドン）。ｒｈＢＭＰ - ２を可溶化するためのピロリドンの濃度依存性を示している。図４Ｂ中に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の成熟に対するＮＭＰ、ＮＥＰ、ＰＢおよびＣＰの影響を示している。培地中の４個のピロリドンの濃度は5 mMであった。
【配列表】
2006519782.tif 000002
【図１】
2006519782.tif 000003
【図２】
2006519782.tif 000004
【図３】
2006519782.tif 000005
【図４】
2006519782.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月31日(2005.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学上許容される担体中に、少なくとも一つの遺伝子組換え骨形成蛋白質（ｒＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンを含み、前記少なくとも一つのｒＢＭＰは 0.001 〜 4 mgの量が存在し、前記少なくとも一つのピロリドンは、1 〜 20 mmol/lの量が存在し、該量は骨形成を相乗的に高めるものであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンは、場合によってアルキル基またはシクロアルキル基で置換されているピロリドン、およびポリピロリドンより選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンは１ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）、  １ - エチル - ２ - ピロリドン（ＮＥＰ）、  ２ - ピロリドン（ＰＢ）および１ - シクロヘキシル - ２ - ピロリドン（ＣＰ）より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンはＮ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記遺伝子組換えＢＭＰはｒＢＭＰ-２、ｒＢＭＰ-３、ｒＢＭＰ-４、ｒＢＭＰ-５、ｒＢＭＰ-６、ｒＢＭＰ-７、ｒＢＭＰ-８、ｒＢＭＰ-９、ｒＢＭＰ-１０、ｒＢＭＰ-１１、ｒＢＭＰ-１４、ｒＢＭＰ-１５、ｒＢＭＰ-１６、ｒＧＤＦ-１、ｒＧＤＦ-３、ｒＧＤＦ-８、ｒＧＤＦ-９、ｒＧＤＦ-１２、ｒＧＤＦ-１４およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の医薬組成物において、前記遺伝子組換えＢＭＰはｒＢＭＰ-２、ｒＢＭＰ-４、ｒＢＭＰ-５、ｒＢＭＰ-６およびｒＢＭＰ-７およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の医薬組成物において、前記遺伝子組換えＢＭＰはｒＢＭＰ-２およびｒＢＭＰ-４およびその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンはＮ - メチル - ２ - ピロリドン（ＮＭＰ）であり、ｒＢＭＰはｒＢＭＰ２、ｒＢＭＰ４およびｒＢＭＰ７ならびにその混合物より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記薬学上許容される担体は生分解性ポリマであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の医薬組成物において、前記生分解性ポリマはポリグリコリド、ポリラクチド類、ポリカプロラクトン類、ポリトリメチレンカルボネート類、ポリヒドロキシブチレート類、ポリヒドロキシバレレート類、ポリジオキサノン類、ポリオルトエステル類、ポリカーボネート類、ポリチロシンカルボネート類、ポリオルトカルボネート類、ポリアルキレン・オキサレート類、ポリアルキレン・サクシネート類、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリペプチド類、ポリデプシペプチド類、ポリビニルアルコール、ポリエステルアミド類、ポリアミド類、ポリ無水物類(polyanhydrides)、ポリウレタン類、ポリホスファゼン類、ポリシアノアクリレート類、ポリフマレート類、ポリ（アミノ酸）類、修飾ポリサッカライド類、修飾蛋白質類およびそれらのコポリマ類、テルポリマ類、およびそれらの組み合わせ、およびそれらの混合物類、およびそれらのポリマー・ブレンド類より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の医薬組成物において、前記生分解性ポリマはポリグリコリド、ポリ（Ｌ - ラクチド - co -  グリコリド）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -  グリコリド）、ポリ（Ｌ - ラクチド）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド）、ポリ（Ｌ - ラクチド - co - Ｄ,Ｌ - ラクチド）、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ - ラクチド - co - カプロラクトン）、ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -カプロラクトン）ポリトリメチレンカルボネート、ポリ（Ｌ - ラクチド - co -トリメチレンカルボネート）、 ポリ（Ｄ,Ｌ - ラクチド - co -トリメチレンカルボネート）、ポリジオキサノンおよびそれらのコポリマ類、それらのテルポリマ類(terpolymers)およびそれらのポリマー・ブレンド類より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物において、前記生分解性ポリマがポリ - Ｄ,Ｌ - ラクチド - co - グリコリド（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記薬学上許容される担体は、フィブリン、コラーゲン、ポリエチレン・グリコール、バイオグラス、ヒドロキシアパタイト、カルシウム・ホスファテート類および同様の担体材料から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
生分解性ポリマ中に、少なくとも一つの遺伝子組換え骨形成蛋白質（ｒＢＭＰ）および、少なくとも一つのピロリドンを含み、前記少なくとも一つのＢＭＰは 0.001 〜 4 mgの量が存在し、前記少なくとも一つのピロリドンは、1 〜 20 mmol/lの量が存在し、該量は骨形成を相乗的に高めるものであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物において、前記ピロリドンはＮＭＰであり、前記生分解性ポリマがポリ - ＤＬ - ラクチド - co - グリコリド（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする医薬組成物。
【国際調査報告】
2006519782.tif 000007
2006519782.tif 000008
2006519782.tif 000009
2006519782.tif 000010