(57)【要約】本発明は、画定されたポリヌクレオチド配列上での反復的かつ酵素的なオリゴヌクレオチド合成を介して、複数の検出可能なオリゴヌクレオチドを作製することによって、標的分子の存在を検出するための方法を提供する。該方法は、一般に、ヌクレオシド、モノヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、またはその類似体を使用して、画定されたポリヌクレオチド配列上で標的部位に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド産物の合成を開始すること；場合により、オリゴヌクレオチド鎖エロンゲーターとしてヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用すること；チェーンターミネーターを使用して、重合反応を終止すること；ならびにポリメラーゼによって合成された複数のオリゴヌクレオチド産物を検出することを含む。１つの態様では、本発明は、不稔転写により複数の検出可能なＲＮＡオリゴリボヌクレオチドを作製することによって、標的タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成される、目的のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオシドもしくはヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記イニシエーターは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、２５０を超えるヌクレオチド、ならびにヌクレオチド類似体よりなる群から選択される分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベート工程では、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドにイニシエーターをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、標的部位プローブ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；ならびに
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１４】
前記標的部位プローブサイズは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターミネーター、前記イニシエーター、および前記標的部位プローブよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記「ａ」における混合物は、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
標的ポリヌクレオチド中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって、
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；
（ｂ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾される工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２７】
標的遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって：
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；
（ｂ）標的部位プローブと前記一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、イニシエーター、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、または前記ターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣｐＧ部位に相補的である工程、
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２８】
前記標的部位プローブのサイズは、約５〜１９；約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
一本鎖標的ＤＮＡ配列の脱アミノ化は前記一本鎖標的ＤＮＡ配列を重亜硫酸ナトリウムで処理することを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域、および前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域を含むバブル複合体を形成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
標的ＤＮＡ配列における変異の有無を検出する方法であって：
（ａ）一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドに標的部位プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが正常または野生型遺伝子に対する変異を含有しうる、工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーターならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的変異部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから転写される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項４２】
前記標的部位プローブのサイズは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記変異は、欠失、挿入、置換、染色体再編成、および一塩基多型よりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的変異部位の上流の第１の二本鎖領域、前記標的変異部位を含む一本鎖領域、および前記標的変異部位の下流の第２の二本鎖領域を含むバブル複合体を形成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
標的ＤＮＡポリヌクレオチドにおける変異を検出する方法であって：
（ａ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；
（ｂ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドに前記捕捉プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが正常または野生型遺伝子に対する変異を含有しうる、工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項５５】
試験サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法であって：
（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドと、
該一本鎖標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項５６】
試験サンプル中の病原体の存在を検出する方法であって：
（ａ）前記試験サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼおよびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の存在を決定する工程、を含む方法。
【請求項５７】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することをさらに含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項６６】
前記一本鎖標的ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡのうちの１つである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記イニシエーターはＲＮＡのうちの１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２５〜５０ヌクレオチド、５０〜７５ヌクレオチド、７５〜１００ヌクレオチド、１００〜１２５ヌクレオチド、および１２５〜１５０ヌクレオチド、１５０〜１７５ヌクレオチド、１７５〜２００ヌクレオチド、２００〜２２５ヌクレオチド、ならびに２２５〜２５０ヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で一本鎖バブルを形成する自己相補的オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記バブル領域のある領域が、前記ポリメラーゼによる転写によって検出され得る、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項７０】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的病原体ポリヌクレオチドの末端にハイブリダイズするように適応されるＡＰＣリンカーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
試験サンプル中の病原体を検出する方法であって：
（ａ）前記試験サンプル中の標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；
（ｂ）前記捕捉プローブと前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含有する可能性のある試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記試験サンプル中の一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドと、
一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｅ）ＡＰＣの前記転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項７２】
試験サンプル中のｍＲＮＡ発現を検出する方法であって：
（ａ）標的ｍＲＮＡ配列と、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ｍＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、ｍＲＮＡの有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項７３】
（ａ）捕捉プローブを固定化する固定であって、前記プローブが標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする、工程；
（ｂ）前記捕捉プローブと、前記標的ｍＲＮＡ配列を含有する可能性のある試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；および
（ｃ）補足された標的ｍＲＮＡ配列を洗浄して、前記試験サンプルの非ハイブリダイズ成分を除去する工程、をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
修飾は、前記イニシエーター、前記ターミネーター、および前記ヌクレオチドの少なくとも１つに、独立に選択される標識部分を取り込む工程をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
検出は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出することを含み、前記蛍光体部分は蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターのうちの１つを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および修飾されたポリメラーゼ、ならびにプライマーゼのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つに由来するＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記イニシエーターはＲＮＡまたはＤＮＡのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的部位を含む一本鎖バブル領域を形成する自己相補的オリゴヌクレオチドを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的ｍＲＮＡ配列のｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌにハイブリダイズするように適応されるＡＰＣリンカーを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８４】
前記チェーンターミネーターは、ヌクレオチド欠損およびヌクレオチド類似体のうちの１つを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８５】
標的ＤＮＡ配列から合成されるオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）ＤＮＡプライマーと一本鎖標的ＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチド配列を反復的に合成するように、前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドによって前記ＤＮＡプライマーを伸長させる工程；および
（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼによって合成される反復配列からなるオリゴヌクレオチドを検出する工程、を含む方法。
【請求項８６】
前記ＤＮＡプライマーおよび前記ヌクレオチドの少なくとも１つを修飾して、反復配列からなる前記オリゴヌクレオチドの検出を可能にすることをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
修飾は、独立して選択される標識部分を、前記ＤＮＡプライマーおよび前記ヌクレオチドの少なくとも１つに取り込むことをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
検出は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出することを含み、前記蛍光体部分は蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターのうちの１つを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、末端基転移酵素およびテロメラーゼよりなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＤＮＡプライマーは１〜約２５ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記オリゴヌクレオチド反復配列は約２〜約２６ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記検出は、反復配列を含む合成されるオリゴヌクレオチドに相補的な配列をハイブリダイズさせることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記相補的配列は、独立して選択される標識部分を含むように修飾される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記一本鎖標的ＤＮＡ配列を固定化することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
固定化は、前記一本鎖標的ＤＮＡ配列の一部に、捕捉プローブをハイブリダイズさせることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項９９】
マイクロアレイを製造する方法であって：
（ａ）請求項１に記載の方法によって標的ＤＮＡ配列から複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を合成する工程；および
（ｂ）前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を固相担体に結合させて、前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製のマイクロアレイを製造する工程、を含む方法。
【請求項１００】
前記蛍光体部分は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン・ブチレート、スクシンイミジル１ピレン；ブチレート・クォンタム・ドット；リアクティブ・レッド４；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ）；フタロシ��ニン；およびナフタロシアニンよりなる群から選択される、請求項４、１７、３１、４５、７５、８８、または９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出するための方法であって、
（ａ）イニシエーターおよびＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中で、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターはヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０２】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから、複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）イニシエーター、ＲＮＡポリメラーゼ、および標的部位プローブを含む混合物中で一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブと前記標的ポリヌクレオチドとがハイブリダイズし、標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターがヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０３】
標的遺伝子付近のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって：
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；
（ｂ）イニシエーター、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼおよび標的部位プローブを含む混合物中で、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートすること；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターがヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０４】
（ａ）標的遺伝子に関連するＣｐＧアイランド付近の配列に特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化する工程；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド補足プローブと、前記標的ＤＮＡ配列を潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせる工程、をさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記標的部位プローブは癌特異的遺伝子に特異的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項１０６】
試験サンプル中の標的タンパク質を検出する方法であって：
（ａ）標的タンパク質を、不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）に、反応性ＡＰＣリンカーにより共有結合させる工程であって、前記ＡＰＣは、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含むこと；
（ｂ）前記標的タンパク質を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、標的タンパク質の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項１０７】
標的特異的プローブによって標的タンパク質を固定化することをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標的特異的プローブは抗体である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＡＰＣリンカーは、チオール反応性またはアミン反応性タンパク質架橋剤の修飾によって、標的タンパク質に共有結合される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記タンパク質架橋剤は、マレアミド、ヨードアセトアミド、およびジスルフィドよりなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的タンパク質は精製されているか、または細胞溶解産物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）内にある、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
癌を検出する方法であって：
（ａ）癌の検出が必要な患者からサンプルを入手する工程；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基は改変しない条件下でＤＮＡを脱アミノ化する工程；
（ｃ）標的ポリヌクレオチドに対してイニシエーターをハイブリダイズさせる工程であって、前記イニシエーターはモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド（ｂｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、オリゴヌクレオチドまたはそれらの類似体である工程；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーターおよびＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、ここで、前記イニシエーター、ターミネーターのいずれか１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されている工程；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程；および、結果を、コントロールサンプルから同様に得られる結果と比較する工程、を含む方法。
【請求項１１３】
病原体を検出する方法であって：
（ａ）病原体の検出が必要なサンプルを入手する工程；
（ｂ）前記サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、
一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｄ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項１１４】
（ａ）前記標的病原体ポリヌクレオチドに特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化すること；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド補足プローブと、前記標的病原体ポリヌクレオチドを潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせること、をさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから、複数の反復されたオリゴヌクレオチドを合成する方法であって：
（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成すること、を含む方法。
【請求項１１６】
前記ターミネーターおよび前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、オリゴヌクレオチドを合成することをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチドおよび約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記インキュベートでは、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２５】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２６】
前記インキュベートは、リボヌクレオチドの存在をさらに含む、請求項１、１３、２６、２７、４１、５４、５５、５６、７１、７２、１０１、１０２、１０３、１０６、１１２、１１３、または１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記リボヌクレオチドは修飾される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記修飾は独立して選択される標識部分を取り込むことをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記サンプルは、動物、植物またはヒトの組織、血液、唾液、精液、尿、血清、脳脊髄液または髄液、胸膜液、リンパ、痰、乳管洗浄由来の液、粘膜分泌物、動物固体、糞、微生物の培養物、液体および固体の食物ならびに食品、廃棄物、化粧品、空気および水よりなる群から入手される、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１３１】
前記不稔プロモーターカセットは、バブル領域を形成する２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でバブル領域を形成する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写バブルを形成し得る１つの連続的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記蛍光体部分は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン・ブチレート、スクシンイミジル１ピレン；ブチレート・クォンタム・ドット；リアクティブ・レッド４；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ）；フタロシ��ニン；およびナフタロシアニンよりなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記イニシエーターは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体よりなる群から選択される、請求項１、１３、２６、２７、４１、５４〜５６、７１、７２、８５、１０１〜１０３、１０６、１１２、１１３、または１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
脱アミノ化に先立って、一本鎖標的ＤＮＡ配列を標的部位プローブと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程をさらに含む、請求項２６、２７、１０３または１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
標的ポリヌクレオチド中のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法であって、
（ａ）一本鎖標的ＤＮＡ配列を、標的部位プローブと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；
（ｃ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されている工程；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１３８】
複数の標的部位プローブを使用することをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
目的のサンプル中のＣＧメチル化を決定する方法であって、
複数のＣＧ部位におけるメチル化の程度を決定するための、単一のサンプルに対する複数の標的特異的プローブと、特定のＣＧ部位でのメチル化の程度を決定するための個々の標的特異的プローブとを使用することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、概して、標的分子の検出および検出のためのキット、および、より詳細には、画定された核酸テンプレートでの反復合成、特に不稔転写を介して、検出可能なオリゴヌクレオチドを複数コピー作製することにより標的分子から複数のシグナルを生成する、核酸に基づく検出アッセイに関する。本発明の方法およびキットを使用して、変異、ＲＮＡ分子、病原体、タンパク質、または前癌状態を検出することができる。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
核酸検出および核酸増幅産物の検出のための様々な方法が開発されたことによって、最近、核酸配列の検出、同定、および定量が進歩している。核酸検出は、画定された核酸配列の存在の検出などの定性分析、および画定された核酸配列の定量などの定量分析の両方に潜在的に有用である。例えば、核酸検出は、病原体を検出および同定すること；画定された表現型に関連する遺伝的およびエピジェネティック改変を検出すること；遺伝病または特定の疾患への遺伝的感受性を診断すること；発生、疾患、および／または薬物を含む規程された刺激に対する応答における遺伝子発現を評価すること；ならびに細胞活動を支持する分子および生化学的機構を研究するためのさらなる手段を研究者に提供することによって、当該分野の進歩を一般に促進することができる。
【０００３】
核酸検出技術は、一般に、プローブハイブリダイゼーション、即ち、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するための１つの核酸配列と、相補的、またはほぼ相補的な核酸配列の第２の鎖との塩基対形成を介する画定された核酸配列の検出を可能にする。そのようなハイブリッドは、リボ核酸（ＲＮＡ）セグメントおよびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）セグメント、２つのＲＮＡセグメント、または２つのＤＮＡセグメントから形成されるが、但し、２つのセグメントは相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を有する。十分にストリンジェントな条件下では、核酸ハイブリダイゼーションは高度に特異的であり得、ハイブリダイズされた鎖間の正確な相補性が要求される。典型的に、核酸ハイブリッドは、塩基対形成した核酸鎖の結合安定性を確実にするために、約８もしくはそれ以上の塩基対のハイブリダイズされた領域を含む。ハイブリダイゼーション技術によって、検出を可能にするために適切に修飾された１つの核酸セグメントを使用して、感度かつ特異性の両方で第２の相補的な核酸セグメントを「プローブ」し、検出することができる。基本的な核酸ハイブリダイゼーションでは、一本鎖標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか一方）が標識された核酸プローブに直接もしくは間接的にハイブリダイズされ、標識を含有する二重鎖が定量される。放射性および非放射性標識の両方が使用されている。
【０００４】
しかし、核酸プローブ技術について認識されている欠点は、試験サンプルにおいて標的配列が低コピー数または希薄濃度で存在する場合のそのようなアッセイの感度の欠如である。多くの場合、極微量の標的核酸の存在でも、サンプルに存在し得る他の無数の核酸の間から正確に検出しなければならない。検出アッセイの感度は、いくらかの要因：プローブが標的分子に結合する能力；各ハイブリダイズされたプローブによって発生するシグナルの大きさ；および検出可能な期間に依存する。
【０００５】
いくつかの方法が、試験サンプル中の低レベルの標的核酸の存在を検出するための適切な手段として進歩している。そのような方法の１つのカテゴリーは、一般に標的増幅と呼ばれ、これは、複数コピーの標的配列を作製し、次いで、これらのコピーは、例えば、ゲル電気泳動などのさらなる分析に供される。他の方法は、例えば、複数の産物を形成させるためにハイブリダイズされたプローブを切断するか、もしくは独特なハイブリダイゼーション依存生産物を形成するために隣接するプローブを連結することによって、ハイブリダイズされたプローブまたは複数のプローブから複数の産物を作製する。さらなる他の方法は、標的配列結合ドメインおよび標識されたれポーティング配列結合ドメインを有する分岐したＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに基づく方法などのハイブリダイゼーション事象によって、発生するシグナルを増幅する。
【０００６】
例えば、指数増幅、連結に基づく増幅、および転写に基づく増幅を含む標的核酸増幅の多くのバリエーションが存在する。指数関数的核酸増幅方法の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、多くの刊行物において開示されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，５８２，７８８号；およびＳａｉｋｉ  Ｒ．ら、米国特許第４，６８３，１９４号を参照のこと。連結に基づく増幅の例は、連結増幅反応（ＬＡＲ）であって、Ｗｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）により開示されている。転写に基づく増幅のための様々な方法が米国特許第５，７６６，８４９号および同第５，６５４，１４２号ならびにＫｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３（１９８９）において開示されている。
【０００７】
最も一般的に使用される標的増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、ＤＮＡポリメラーゼにより作製されるプライマー伸長反応のサイクルの繰り返しよりなる。各反応サイクルには、標的核酸の熱変性；増幅すべき標的の対向鎖に対する標的配列を両側から挟む２つのオリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーション；複数の二本鎖コピーの標的配列を産生するためのヌクレオチドポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドプライマーの伸長が含まれる。ＰＣＲのための多くのバリエーションが記載されており、この方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の増幅、配列決定、変異分析などのために使用される。単一のプライマーを用いる熱循環に基づく方法についても記載されている。例えば、米国特許第５，５０８，１７８号；同第５，５９５，８９１号；同第５，６８３，８７９号；同第５，１３０，２３８号；および同第５，６７９，５１２号を参照のこと。プライマーは、米国特許第５，７４４，３０８号に記載されているようなＤＮＡ／ＲＮＡキメリックプライマーであることができる。熱循環に依存する他の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および関連の修復連鎖反応（ＰＣＲ）がある。
【０００８】
標的核酸増幅は、様々な温度（即ち、熱循環）または一定温度（即ち、等温過程）での複数のサイクルのインキュベーションを介して行ってもよい。耐熱性核酸修飾酵素の発見は、核酸増幅技術の迅速な進歩に寄与している。Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）を参照のこと。ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼなどの耐熱性核酸修飾酵素は、熱循環に依存する方法ならびに等温増幅方法に使用される。
【０００９】
例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの等温方法については、Ｆｒａｉｓｅｒら、米国特許第５，６４８，２１１号；Ｃｌｅｕｚｉａｔら、米国特許第５，８２４，５１７号；およびＷａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６（１９９２）により開示されている。他の等温標的増幅方法には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、増幅の初期段階でプライマー伸長産物に組み入れられ（国際公開第８９／０１０５０号）、さらなる相補的標的配列が逆転者を介して増幅され、続いてＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中間産物のＲＮＡ鎖の物理的分離または消化が行われる転写に基づく増幅方法が含まれる。例えば、米国特許第５，１６９，７６６号および同第４，７８６，６００号を参照のこと。転写に基づく増幅方法のさらなる例としては、転写介在増幅（ＴＭＡ）、自立型配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、およびそれらのバリエーションが挙げられる。例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８（１９９０）（３ＳＲ）；米国特許第５，７６６，８４９号（ＴＭＡ）；および米国特許第５，６５４，１４２号（ＮＡＳＢＡ）を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
最近、例えば、細菌、ウイルス、および真菌などの病原体の迅速かつ正確な検出、ならびに正常および異常な遺伝子の検出の需要を満たすためのこれらおよび他の技術が開発されている。これらの全ての技術は、サンプル中の微量の標的核酸の検出および同定のための強力な道具を提供する一方、それらは全て様々な問題を有する。
【００１１】
特にＰＣＲに関する１つの問題は、以後の検出および随意的な定量のための標的核酸を増幅するための条件がそれぞれの試験によってばらつき、即ち、試験標準化を支持する一定の条件が存在しない。さらに、熱循環過程を使用する増幅方法は、各サイクルについて熱循環ブロックが「標的温度」に到達するのに必要とされる遅延時間が延長されるというさらなる欠点を有する。従って、熱循環過程を使用して実施される増幅反応には、完了に達するのに十分な時間が必要である。多様な等温標的増幅方法にはサーマルサイクラーは必要ではなく、従って、一般的な手段プラットホームへの適応に容易である。しかし、先に記載の等温標的増幅方法もいくらかの欠点を有する。ＳＤＡ方法に従う増幅には、制限酵素の画定された部位の存在が必要であり、このため適用性が制限される。ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡ方法などの転写に基づく増幅方法は、プライマーによってポリメラーゼプロモーター配列を増幅産物に取り込む必要があるため制限される。
【００１２】
従って、試験サンプル中の低レベルの標的核酸を検出することができる迅速、高感度、および標準化された核酸シグナル検出方法が必要とされる。これらの必要性、ならびに他の必要性は、本出願の発明によって満たされる。
【００１３】
個々の文書が具体的かつ個々にその全体が参考として援用されるように示唆されるがごとく、それと同程度に、本出願において引用または同定される全ての特許、特許文献、および科学文献は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、標的分子の検出のために画定されたポリヌクレオチドに対する反復オリゴヌクレオチド合成反応を介して、複数の検出可能なシグナルを精製するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、反復合成および検出方法のためのアプリケーションを提供する。本発明の方法およびキットの重要なアプリケーションは、変異および一塩基多型、ＲＮＡ分子、病原体、並びに前癌性または癌性変異および状態の検出を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
従って、１つの態様では、本発明は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の相補的オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は：（ａ）イニシエーター（ヌクレオシド、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）と一本鎖標的ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）とをハイブリダイズさせる工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミネーター、ならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程、を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミネーター、ならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；ならびに（ｄ）目的のポリヌクレオチドの前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドに対してイニシエーターをハイブリダイズさせる工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、標的部位プローブ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミネーターならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチド由来の前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含み、合成される前記オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチド中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化すること；（ｂ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせること；（ｃ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、ターミネーター、または随意的なリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されること；（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む。
【００１９】
なおさらなる態様では、本発明は、標的遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；（ｂ）標的部位プローブと前記一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、イニシエーター、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、前記ターミネーターまたは前記ヌクレオチドのうちの前記少なくとも１つがＣｐＧ部位に相補的である、工程、（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、ここで、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量すること、を含む。
【００２０】
なお、さらなる態様では、本発明は、標的ＤＮＡ配列における変異の有無を検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドに対して標的部位プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドは、正常または野生型遺伝子に対する変異を含有し得る工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、ターミネーターならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的変異部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および（ｄ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから転写される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、捕捉プローブを使用して、標的ＤＮＡポリヌクレオチドにおける変異を検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；（ｂ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドに対して前記捕捉プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが、正常または野生型遺伝子に対する変異を含有し得ること；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、ターミネーターおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートすること；（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、ここで、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成すること；ならびに（ｅ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、変異の有無を決定すること、を含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、試験サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドと、一本鎖標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列、およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、ターミネーターおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートすること；（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量すること、を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、試験サンプル中の病原体の存在を検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）前記試験サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミネーターならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；ならびに（ｄ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の存在を決定する工程、を含む。
【００２４】
なお、さらなる態様では、本発明は、捕捉プローブを使用して、試験サンプル中の病原体を検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）前記試験サンプル中の標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；（ｂ）前記捕捉プローブと前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドを潜在的に含有する試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；（ｃ）前記試験サンプル中の一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドと、一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域、およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、ターミネーターおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｅ）ＡＰＣの前記転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；ならびに（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定すること、を含む。
【００２５】
なお、さらなる態様では、本発明は、試験サンプル中のｍＲＮＡ発現を検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）標的ｍＲＮＡ配列と、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせること；（ｂ）前記標的ｍＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、ターミネーターおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートすること；（ｃ）転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、ここで、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成すること；ならびに（ｄ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、ｍＲＮＡの有無を決定すること、を含む。
【００２６】
なおさらなる態様では、本発明は、標的ＤＮＡ配列から合成されるオリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）ＤＮＡプライマーと一本鎖標的ＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせること；（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチド配列を反復的に合成するように、前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドによって前記ＤＮＡプライマーを伸長させること；ならびに（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼによって合成される反復配列からなるオリゴヌクレオチドを検出すること、を含む。
【００２７】
なおさらなる態様では、本発明は、マイクロアレイを製造する方法を提供する。該方法は：（ａ）請求項１に記載の方法によって標的ＤＮＡ配列から複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を合成すること；および（ｂ）前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を固相担体に結合させて、前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製のマイクロアレイを製造すること、を含む。
【００２８】
なおさらなる態様では、本発明は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド由来の複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）イニシエーターを含む混合物中の一本鎖標的ポリヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドをインキュベートすること；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチド由来の複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、ここで、前記イニシエーターはヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成すること；ならびに（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量すること、を含む。
【００２９】
なおさらなる態様では、本発明は、標的部位プローブによって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド由来の複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）イニシエーターを含む混合物中の一本鎖標的ポリヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、標的部位プローブおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドをインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせて、標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；（ｂ）前記標的ポリヌクレオチド由来の複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターはヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；ならびに（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む。
【００３０】
なおさらなる態様では、本発明は、標的遺伝子付近のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法を提供する。該方法は：
【００３１】
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；（ｂ）イニシエーター、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼ、標的部位プローブおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドを含む混合物において、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチド由来の複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターはヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む。
【００３２】
なおさらなる態様では、本発明は、試験サンプル中の標的タンパク質を検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）標的タンパク質を不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）に、反応性ＡＰＣリンカーにより共有結合させる工程であって、前記ＡＰＣが、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む、工程；（ｂ）前記標的タンパク質を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、ターミネーターおよび場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｃ）ＡＰＣの転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成すること；および（ｄ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、標的タンパク質の有無を決定すること、を含む。
【００３３】
なおさらなる態様では、本発明は、癌を検出するための方法を提供する。該方法は：（ａ）癌の検出が必要な患者から組織サンプルを入手する工程；（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基は改変しない条件下でＤＮＡを脱アミノ化する工程；（ｃ）標的ポリヌクレオチドに対してイニシエーターをハイブリダイズさせる工程であって、前記イニシエーターはモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド（ｂｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの類似体である工程；（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程であって、ここで、前記イニシエーター、ターミネーター、または随意的なリボヌクレオチドのいずれか１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾される、工程；（ｅ）前記標的ポリヌクレオチド由来の前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程；ならびに（ｇ）結果を、コントロールサンプルから同様に得られる結果と比較する、工程、を含む。
【００３４】
なおさらなる態様では、本発明は、病原体を検出する方法を提供する。該方法は：（ａ）病原体の検出が必要なサンプルを入手する工程；（ｂ）前記サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミネーターならびに場合によりさらなるリボヌクレオチドと共にインキュベートする工程；（ｄ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、ここで、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成すること；ならびに（ｅ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定すること、を含む。
【００３５】
別の態様では、ＣＧメチル化を検出するための方法は、一本鎖標的ＤＮＡ配列を、脱アミノ化の前に、標的部位プローブと共にインキュベートすることをさらに含み、ここで、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する。関連する態様では、そのように処置されるＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウムで処置され、一本鎖ＤＮＡの脱アミノ化を生じる。さらに関連する態様では、脱アミノ化の条件は、標的部位プローブの非存在下で使用される条件よりも穏やかであり得る。そのような条件は、約５０℃未満、約４５℃未満、約４０℃未満、および３５℃を含むより低い温度を含む。条件はまた、脱アミノ化剤とのより減少した期間でのインキュベーションを含み得、約１２時間未満、約８時間未満、約６時間未満、および約４時間を含み得る。
【００３６】
関連する態様では、本発明は：
（ａ）一本鎖標的ＤＮＡ配列を、標的部位プローブと共にインキュベートすることであって、ここで、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域を含むバブル複合体、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域、および前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域を形成すること；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する一方で、メチル化シトシン残基をウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化すること；
（ｃ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせること；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることであって、ここで、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されること；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチド由来の前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成することであって、ここで、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成すること；ならびに
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量すること、
を含む、標的ポリヌクレオチド中のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法を提供する。
上記の方法を用いることができ、ここで、標的ポリヌクレオチドは遺伝子に関連し、遺伝子であり、および／または癌遺伝子である。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、目的のサンプル中のＣＧメチル化を決定するための方法を提供し、複数のＣＧ部位におけるメチル化の程度を決定するために単一のサンプルに対する複数の標的特異的プローブを使用することを含む。関連する態様では、複数のＣＧ部位におけるメチル化の程度の決定に続いて、特定のＣＧ部位におけるメチル化の程度を決定するために個々の標的特異的プローブが使用される。関連する態様では、同じサンプルを先ず複数のプローブで；次いで、単一のプローブで分析してもよい。 
【００３８】
本発明はまた、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド合成および検出方法を行うためのキットを提供する。１つの態様では、例えば、本発明は、本明細書に記載の様々な組み合わせを含有する試薬容器を提供する。適切なパッケージ内にあり、一般に（しかし、必ずしも必要ではない）適切な取扱説明書を含有するこれらのキットは、オリゴヌクレオチド合成および検出方法において使用される１つもしくはそれ以上の成分を含有する。キットはまた、以下の項目：重合酵素、イニシエーター、プライマー、緩衝液、ヌクレオチド、コントロールＤＮＡ、抗体、ストレプトアビジン、およびビオチンのうちの１つもしくはそれ以上を含有してもよい。キットはまた、本発明の方法を実施するために適切な量で混合された試薬を含有してもよい。試薬容器は、主題方法を実施する場合、測定工程を回避する試薬を単位量で好適に含有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、画定された核酸に対する反復合成事象を介して複数の検出可能なオリゴヌクレオチドを作製することによって、（核酸配列またはタンパク質などの）標的分子の存在を検出するための方法およびキットを提供する。該方法は、一般に、標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド転写イニシエーターを使用して、標的核酸上の画定された部位に実質的に相補的である不稔オリゴヌクレオチド産物の合成を開始すること；チェーンターミネーターを使用して、重合反応を終止すること；および場合により、（１）いずれかの側の一本鎖標的部位に対して二本鎖セグメントを含む転写バブル複合体を形成するための標的部位プローブかまたは（２）標的部位を含む転写バブル領域を含む不稔プロモーターカセットかまたは（３）任意の標的分子に結合され、次いでシグナルを発生するために使用される不稔プロモーターカセットのいずれかを使用することを含む。
【００４０】
１つの態様に従えば、本発明は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の部分に由来の複数の不稔オリゴヌクレオチド転写物を合成する方法を提供し、ここで，該方法は、次のもの：（ａ）少なくとも１つの標的部位を含む一本鎖標的核酸；（ｂ）標的部位の上流にある標的核酸上の部位に相補的であるＲＮＡイニシエーター；（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼ；（ｄ）場合により、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体；（ｅ）チェーンターミネーター；ならびに（ｆ）場合により、（１）標的核酸上の標的領域に部分的にハイブリダイズし、一本鎖標的部位のいずれかの側に第１および第２の二本鎖領域を含む転写バブル複合体を形成する標的部位プローブかまたは（２）転写開始部位を含む転写バブル領域を含む不稔プロモーターカセットのいずれかを組み合わせて、反応させることを含む。組み合わせは、下記のような適切な条件に供される：（ａ）標的部位プローブが標的部位を含む標的領域内の標的核酸にハイブリダイズする；（ｂ）ＲＮＡイニシエーターが標的部位の上流にハイブリダイズする；（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡイニシエーターを利用して、標的部位で転写を開始し、延長が生じ、オリゴヌクレオチド転写物が合成される；（ｄ）延長中に、チェーンターミネーターが転写を終止する；（ｅ）実質的に、ポリメラーゼ結合部位から転位することもテンプレートから解離することもなく、ＲＮＡポリメラーゼが短い不稔オリゴヌクレオチド転写物を放出する；および（ｆ）十分なシグナルが発生するまで（ｃ）〜（ｅ）が反復され、反応が停止する。あるいは、（ａ）不稔プロモーターカセットが標的核酸の末端にハイブリダイズする；（ｂ）ＲＮＡイニシエーターが転写開始部位の上流にハイブリダイズする；（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡイニシエーターを利用して、標的部位で転写を開始し、延長が生じ、オリゴヌクレオチド転写物が合成される；（ｄ）延長中に、チェーンターミネーターが転写を終止する；（ｅ）実質的に、ポリメラーゼ結合部位から転位することもテンプレートから解離することもなく、ＲＮＡポリメラーゼが短い不稔オリゴヌクレオチド転写物を放出する；および（ｆ）十分なシグナルが発生するまで（ｃ）〜（ｅ）が反復され、反応が停止する。
【００４１】
一般的技術
本発明の実施では、他に示さない限り、当該分野の技術内にある（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、（コイン（Ｃｏｙｎｅ）ら、２００１）；「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第４版、（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９９９）；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９８７、および定期更新）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら編、１９９４）などの文献に詳細に説明されている。
【００４２】
本発明において反応物として用いられるプライマー、イニシエーター、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドは、当該分野において既知の標準的な技術を使用して作製することができ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）／アルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、トリリンク・テクノロジー（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むがこれらに限定されない商業的供給源から入手することができる。
【００４３】
用語
本発明の理解を容易にするために、以下の用語は、他に表現しない限り、以下のような意味を有する：
【００４４】
本明細書において使用される「約」は、「約」として言及される数字が、引用される数字プラスまたはマイナス該引用される数字の１〜１０％を含むことを意味する。例えば、「約」５０ヌクレオチドは、４５〜５５ヌクレオチドまたは状況に依存して僅か４９〜５１ヌクレオチドを意味することができる。
【００４５】
「転写」は、核酸テンプレート配列に対応する相補的ＲＮＡ転写物を合成する酵素介在過程である。転写は、典型的に、３つの相、即ち、開始、延長、および終結を含む。テンプレートの転写は、テンプレートからの発生期の転写物もしくはポリメラーゼのいずれもの解離を伴わずに、ポリメラーゼがテンプレート上の終結配列またはテンプレート配列の末端に到達するかあるいはタンパク質−ＤＮＡ転写障害などの他の手段によって停止されるまで、イニシエーター（モノヌクレオシド、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドであってもよい）とその後のＮＴＰなどとの間のホスホジエステル結合の形成を介して、ポリメラーゼによって漸次に合成される。典型的なハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用されるように、ポリメラーゼが延長相を完了し、テンプレート上の最初の酵素結合部位（プロモーター）からの転位後、テンプレート配列の末端または特定の転写終結シグナルに到達する場合、一般に転写の終結が達成される。ここでは、「転位」は、ポリメラーゼが、テンプレート上の最初の酵素結合部位から、酵素結合部位の少なくとも５０ヌクレオチド下流にあるテンプレート上の別のポイントに向かって、テンプレート配列に沿って移動することを意味する。
【００４６】
「不稔転写」は、相補的核酸テンプレート配列の少なくとも１つの部分、または標的部位に対応するオリゴヌクレオチドの合成を反復的に開始および終止する酵素介在過程である。合成される不稔オリゴヌクレオチドの長さは変動し、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチドおよび約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドを含有することができる。
【００４７】
「不稔転写」はまた、３つの相、即ち、開始、延長、および終結を含む。開始相の間、ポリメラーゼはイニシエーターと第２のＮＴＰとの間にホスホジエステル結合を形成し、次いで、その後のＮＴＰなどを添加して、テンプレート配列を転写し、約２〜約５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド転写物を合成し、次いで、ポリメラーゼは実質的にポリメラーゼ結合部位から転位することもテンプレートから解離することもなく、発生期のオリゴヌクレオチド転写物を遊離することによって、転写事象を終止する。言い換えれば、ＲＮＡポリメラーゼは実質的にテンプレート上の開始結合部位に留まり、第１の発生期のオリゴヌクレオチド転写物を遊離し、次いで、別の転写開始事象に従事して、転写されて第１のオリゴヌクレオチド転写物を産生したものと実質的に同じ標的部位に実質的に相補的である第２のオリゴヌクレオチド転写物を産生することが可能である。この様式では、ポリメラーゼは、テンプレートの単一の部分（即ち、標的領域）を反復的に転写し、複数コピーの実質的に同一な発生期のオリゴヌクレオチド転写物を遊離する。
【００４８】
「逆転写」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するためのＲＮＡテンプレートの転写を指す。
【００４９】
「反復的」は、複数コピーの同一または高度に類似する目的の配列を指す。
【００５０】
「複製」は、一本鎖核酸テンプレート配列から相補的核酸分子を合成する酵素介在過程である。テンプレートのＤＮＡ複製は、ＤＮＡポリメラーゼがテンプレート上の終結配列かもしくはテンプレート配列の末端のいずれかに到達するまで、テンプレートからＤＮＡ複製またはＤＮＡポリメラーゼのいずれもの解離も伴わずに、プライマーと第１のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）との間のホスホジエステル結合の形成、続く第１のｄＮＴＰとその後のｄＮＴＰなどとの間の第２のホスホジエステルの形成を介して、ＤＮＡポリメラーゼにより、合成される。典型的なＤＮＡプライマー伸長反応では、テンプレート上の最初の酵素結合部位からの転位後に、ＤＮＡポリメラーゼがテンプレート配列全体を合成する場合、テンプレートの複製が終止する。ここでは、「転位」は、ＤＮＡポリメラーゼが、テンプレート上の最初の酵素結合部位から、酵素結合部位の下流にあるテンプレート上の別のポイントに向かって、テンプレート配列に沿って移動することを意味する。
【００５１】
「オリゴヌクレオチド産物」は、本発明の反復合成反応によって合成されるオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド産物は、重合反応がＲＮＡポリメラーゼによって触媒される転写反応である場合「オリゴヌクレオチド転写物」、または重合反応がテロメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ合成反応である場合「オリゴヌクレオチド反復」であり得る。
【００５２】
「終結」は、ポリメラーゼによって触媒される鎖延長またはプライマー伸長反応を完結するチェーンターミネーターの使用を指す。「チェーンターミネーター」または「ターミネーター」は、任意の化合物、組成物、複合体、反応物、反応条件、あるいは開始および／または延長相以後のポリメラーゼによる転写の継続を阻害する（化合物、反応物、もしくは反応条件を制止することを含む）過程を含むことができる。「鎖終結ヌクレオチド」は、コピーもしくは転写されるヌクレオチド類似体の構造または核酸の配列により、一旦取り込まれるとさらなる鎖延長を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むチェーンターミネーターである。
【００５３】
「標的配列」または「標的ヌクレオチド」は、検出、特徴付けまたは定量が所望される目的のポリヌクレオチド配列である。標的配列の実際のヌクレオチド配列は、既知であってもまたは既知でなくてもよい。
【００５４】
「標的部分」は、オリゴヌクレオチド産物を形成するためにポリメラーゼによって検出される標的配列の部分である。本発明に従えば、標的核酸には少なくとも１つの標的部位が存在する。標的部位の配列は、既知であってもよく、または特に公知でなくてもよい。即ち、標的核酸の実際の遺伝子配列は既知であってもよいが、ポリメラーゼによって転写または複製される特定の標的部位の遺伝子配列は既知である必要はない。
【００５５】
「標的領域」は、以下に詳述するように、バブル複合体を形成するために標的部位プローブが部分的にハイブリダイズする標的配列の部分である。本発明に従えば、標的核酸上に少なくとも１つの標的領域が存在し、各標的領域は標的部位を含む。標的領域の配列は、標的部位プローブが標的領域と共にバブル複合体を形成するように、相補的な標的部位プローブの十分なストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にすることが特に公知である。
【００５６】
一般に、「テンプレート」は、標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドである。場合によって、用語「標的配列」、「テンプレートポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「核酸テンプレート」、「テンプレート配列」、およびそれらのバリエーションは、交換可能に使用される。具体的には、用語「テンプレート」は、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼの活性を介して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から相補的コピーが合成される核酸の鎖を指す。二重鎖内では、テンプレート鎖は、慣例により、「底部の」鎖として表示または記載される。同様に、非テンプレート鎖は、しばしば、「頂部の」鎖として表示または記載される。「テンプレート」鎖はまた「センス」鎖と呼称し、非テンプレート鎖を「アンチセンス」鎖と呼称してもよい。
【００５７】
「合成」は、一般に、標的配列の標的部分または他の部分の少なくとも１つの相補的コピーを産生する過程を指す。「複数コピー」は、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、必ずしも、テンプレート配列との完全な配列相補性または同一性を意味する必要はない。例えば、コピーは、ヌクレオチド類似体、（テンプレートに対してハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して誘導される配列改変などの）意図する配列改変、および／または合成中に生じる配列エラーを含むことができる。「合成」は、標的核酸の転写および標的核酸の複製の両方を包含する。
【００５８】
本明細書において交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸鎖」は、２もしくはそれ以上のような任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド核酸、（修飾されたリン酸部分、塩基、もしくは糖を含む）ヌクレオチド類似体、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼなどの適切な酵素によってポリマーに取り込むことができる任意の基質であることができる。従って、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド、およびそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在するならば、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの合成の前後に付与してもよい。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分を介入させることができる。重合後に、標識成分との結合などによって、ポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、１つもしくはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、カルバメート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものなどのヌクレオチド内修飾、例えば、タンパク質（例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）などのペンダントを含有するもの、インターカレーター（例えば、エチジウム、アクリジン、プソラレンなど）によるもの、抗体特異的ハプテン（ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ビオチンなど）によるもの、アフィニティータグ（ヘキサヒスタジン、グルタチオンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキレーターを含有するもの、修飾された結合（例えば、αアノマー核酸など）によるもの、化学または光化学活性（ＤＮＡまたはＲＮＡ切断剤、架橋剤、蛍光化合物など）によるものならびに非修飾形態のポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、ヌクレオチドのペントース（例えば、リボースまたはデオキシリボース）環上に通常存在する任意の水酸基を、例えば、ホスホン酸またはリン酸基によって置き換え、標準的な保護基で保護し、活性化して、さらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するか、または固体支持体に結合する。ヌクレオチドのペントース環上の５’および３’末端ＯＨ基をリン酸化するか、またはアミンもしくは約１〜約５０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。また、リボースまたはデオキシリボース環上の他の水酸基には、標準的な保護基を誘導してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式等類似体、アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、ピラノース糖、フラノース糖、セドペプツロース、非環式類似体、ならびにメチルリボシドなどの非塩基性ヌクレオシド類似体を含む一般に当該分野において公知である類似形態のリボ���スまたはデオキシリボース等を含有することができる。１つもしくはそれ以上のホスホジエステル結合を、代替的結合基で置き換えてもよい。これらの代替的結合基としては、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（各ＲあるいはＲ’は独立してＨまたは置換されたもしくは置換されていないアルキル（１〜２０Ｃ）であり、場合によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルを含有する）によって置き換えられる実施形態が挙げれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドにおける必ずしも全ての結合が同一である必要はない。今述べた説明は、本明細書において言及されるＲＮＡおよびＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００５９】
「ヌクレオチド」または「ＮＴＰ」は、塩基−糖−リン酸化号物を指す。「塩基」は、ペントース糖およびリン酸基と組み合わせた場合にヌクレオチドを形成する窒素含有環分子を指す。塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）などの一員環ピリミジン、ならびにアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）などの二員環プリンを含む。「糖」または「ペントース糖」は、一般に、リボース環またはデオキシリボース環などのペントース環を指す。ヌクレオチドは、両タイプの核酸ポリマー、即ち、ＲＮＡおよびＤＮＡのモノマーサブユニットである。「ヌクレオチド」または「ＮＴＰ」は、任意のヌクレオシド５’リン酸、即ち、リボヌクレオシド５’リン酸（即ち、一リン酸、二リン酸、および三リン酸）ならびにデオキシリボヌクレオチド５’リン酸（即ち、一リン酸、二リン酸、および三リン酸）を指し、「ヌクレオシドリン酸類似体」、「ヌクレオチド類似体」、および「ＮＴＰ類似体」を含む。「ヌクレオシドリン酸類似体」、「ヌクレオチド類似体」、および「ＮＴＰ類似体」は、生来のヌクレオチドに類似するが、対応する生来のヌクレオチドと比較した場合、１つもしくはそれ以上の化学修飾を含有する任意のヌクレオシド５’リン酸（即ち、一リン酸、二リン酸、および三リン酸）を指す。ヌクレオチド類似体は、塩基修飾類似体（例えば、５−メルカプトピリミジン、８−メルカプトプリン）、リン酸修飾類似体（例えば、α−チオ−三リン酸）、および糖修飾類似体（３’ＯＭｅ、３’デオキシ）を含み、修飾された形態のデオキシリボヌクレオチドならびにリボヌクレオチドを含むことができる。
【００６０】
「ヌクレオシド」は、リン酸基を有さない塩基−糖の組み合わせを指す。ヌクレオシドとしては、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般に、短い、典型的に一本鎖の合成ポリヌクレオチドを指し、これは、一般に（しかし必ずしもそうとは限らない）、約２００未満ヌクレオチド長である。より詳細には、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む２つもしくはそれ以上のヌクレオチドからなる分子として規定される。正確なサイズは、多くの因子に依存し、これらの因子は、順次、究極的機能またはオリゴヌクレオチドの使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、より長いＤＮＡまたはＲＮＡの分解、転写、逆転者、不稔転写または反復合成（本明細書においてさらに説明する）およびそれらの組み合わせを含む任意の様式で作製することができる。
【００６２】
モノヌクレオチドは、第１のモノヌクレオチドペントース環の３’酸素を、ホスホジエステル結合を介して第２のモノヌクレオチドの５’リン酸に共有結合させることによってオリゴヌクレオチドを合成する反応を経験するため、末端ヌクレオチドの５’リン酸がヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合、オリゴヌクレオチドの第１の末端は「５’末端」と呼称され、末端ヌクレオチドの３’酸素が次のヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していない場合、ヌクレオチドの第２の末端は「３’末端」と呼称される。本明細書において使用する核酸配列はまた、たとえ配列がより長いオリゴヌクレオチドと同一であるとしても、５’および３’末端を有するということができる。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡでは、５’→３’方向で核酸の鎖に沿って移動するとき、第１の領域の３’末端が第２の領域の５’末端の前にある場合、核酸鎖に沿った第１の領域は、第２の領域の「上流」であるという。対照的に、５’→３’方向で核酸の鎖に沿って移動するとき、第１の領域の５’末端が第２の領域の３’末端の後にある場合、核酸鎖に沿った第１の領域は、第２の領域の「下流」であるという。
【００６３】
用語「３’」は、一般に、５’→３’方向でポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに沿って移動するとき、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域もしくは位置から３’（下流）側にあるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの領域もしくは位置を指す。
【００６４】
用語「５’」は、一般に、５’→３’方向でポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに沿って移動するとき、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域もしくは位置から５’（上流）側にあるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの領域もしくは位置を指す。
【００６５】
「核酸配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびフラグメント、セグメント、もしくはその部分、ならびにゲノムまたは合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡを指し、これらは、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよく、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかを表す。
【００６６】
核酸基質を参考にして使用される場合の用語「実質的に一本鎖」は、鎖間もしくは鎖内塩基対形成相互作用によって共に保持される核酸の２つの実質的に相補的なセグメントまたは領域として存在する二本鎖基質とは対照的に、基質分子が主に一本鎖の核酸として存在することを意味する。
【００６７】
本明細書において使用される用語「相補的な」または「相補性」は、第１のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドであってもよい）を参考に使用され、第２のポリヌクレオチド（これもまたオリゴヌクレオチドであってもよい）と「逆平行会合」の状態にある。本明細書において使用される用語「逆平行会合」は、２つの会合したポリヌクレオチドの個々のヌクレオチドまたは塩基が、実質的にワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）−クリック（Ｃｒｉｃｋ）の塩基対形成規則に従って対形成されるような２つのポリヌクレオチドのアラインメントを指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、この場合、ポリヌクレオチド塩基のいくつかのみが対形成規則に従って一致する。または、ポリヌクレオチド間で「完全」もしくは「全体的」相補性が存在してもよい。ポリヌクレオチド間の相補性の程度は、２つのポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な効果を有する。これは、合成反応、ならびにポリヌクレオチド間の結合に依存する検出方法に特に重要である。核酸技術に係わる当業者であれば、例えば、第１のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドであってもよい）の長さ、第１のポリヌクレオチドの塩基組成および配列、ならびにイオン強度およびミスマッチした塩基対の発生率を含む多くの変数を考慮することによって、経験的に二重鎖の安定性を決定することができる。オリゴヌクレオチドの融解温度を算出するのに使用することができる一般式は：１％ホルムアミドごとにＴｍ＝（２（ＵＡ）＋４（ＧＣ））−０．５Ｃである。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔｍは次の式によって近似される：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−５００／Ｌ；Ｍは、１価のカチオンのモル濃度であり；Ｌは、ハイブリッド塩基対の長さである（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４，１９８４）。
【００６８】
ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を参考にして使用される場合の用語「自己相補的な」および「自己相補性」は、ポリヌクレオチドの個別の領域が相互に対形成できることを意味する。この用語は、分子内塩基対形成のみを指すため、自己相補性の領域を有するといわれる任意の鎖は、相互に塩基対形成することが可能な少なくとも２つの領域を有さなければならない。上記で規定したように、相補性は、「完全」または「部分的」のいずれであってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドを参考にして使用されるように、オリゴヌクレオチドの領域は、これらの領域が少なくとも３つの連続対形成（即ち、完全な相補性の３塩基対）の二重鎖を形成することが可能である場合、またはそれらが部分的に相補的であるより長い二重鎖を形成し得る場合、有意な自己相補性を有すると思われる。
【００６９】
用語「プライマー」は、一般に、遊離の３’−ＯＨ基を有し、目的のサンプルに潜在的に存在する標的配列に結合およびハイブリダイズすることができる短い、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。標的配列にハイブリダイズした後、プライマーは、標的配列に相補的であるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド伸長産物または標的配列の一部の重合あるいは合成を促進または開始することが可能である。プライマーは、標的核酸配列の特定の部分に「実質的に」相補的であるように選択される。プライマーは、標的配列にハイブリダイズし、標的核酸の一部の転写または複製のいずれかを容易にするのに十分相補的である。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマー配列の残りの部分がテンプレート鎖に実質的に相補的であれば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に結合してもよい。非相補的塩基はプライマー内で散在することができるが、但し、プライマー配列はテンプレート配列に十分な相補性を有して、テンプレートにハイブリダイズし、従って、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド産物の合成を開始するためのテンプレート−プライマー複合体を形成する。
【００７０】
用語「イニシエーター」は、発生期のＲＮＡ分子の５’末端に取り込まれるモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの類似体を指し、ＲＮＡ合成のための「プライマー」（「イニシエータープライマー」）と考えることができる。
【００７１】
１つの実施形態では、当該分野において公知であるように、ＲＮＡイニシエーターは、テンプレートプロモーター配列の非存在下で一本鎖標的核酸上の標的部位で転写の開始を容易にする。（米国特許第５，５７１，６６９号；ダウベ（Ｄａｕｂｅ）およびフォン・ヒッペル（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３２０−１３２４（１９９２）を参照のこと）。別の実施形態では、イニシエーターを使用して、核酸テンプレート上の複数の標的部位で無作為に不稔転写を開始する（図１６）。イニシエーターおよび／またはイニシエーターを伸長するために使用される個々のヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体を適切に使用して、シグナル発生、オリゴヌクレオチド産物の検出、および標的核酸の有無の決定を可能にしてもよい。
【００７２】
例えば、不稔オリゴヌクレオチド産物の検出を含む様々な目的のための標識部分を有するイニシエーターを提供するために、イニシエーターを修飾することを所望してもよい。そのような修飾の例として、蛍光分子およびエネルギー移動色素（例えば、フルオレセイン、アエダンス（ａｅｄａｎｓ）、クマリン、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）色素、およびローダミンを基剤とする色素）、蛍光消光分子（例えば、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ））、タンパク質、ペプチド、アミノリンカー、またはアミノ酸に基づく分子（例えば、ポリヒスチジン）、修飾された塩基ならびに修飾されたおよび修飾されていない塩基類似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート、放射性標識、末端リン酸、３’グリセリル、他の炭水化物に基づく分子、脂肪酸誘導性分子、炭素スペーサー分子、電気化学発光標識、ランタニド標識、アビジンおよびその誘導体（例えば、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）など）、ビオチン、ステロイド分子（例えば、ジゴキシゲニン）、チオール結合、フェリチン標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成を参考にして使用され、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（即ち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の強度、関与する反応条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、および二重鎖核酸内のＧ：Ｃ比などの因子の影響を受ける。一般に「ハイブリダイゼーション」方法は、標的核酸（即ち、直接的または間接的手段のいずれかによって検出しようとする配列）に対して相補的なポリヌクレオチドをアニールさせることに関与する。相補的配列を含有する２つのポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが相互に配置し、塩基対形成相互作用を介して相互にアニールする能力は、よく認識されている現象である。
【００７４】
相補性に関して、いくつかの診断アプリケーションが、２つのポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが完全または部分的相補性を表すかどうかを決定することは重要であり得る。例えば、（例えば、ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、または原生動物由来などの）病原体ＤＮＡの有無を単純に検出することが所望される場合、ハイブリダイゼーション方法は、関連配列が存在する場合にハイブリダイゼーションが生じることを確実にすることのみを必要とし；部分的相補プローブおよび完全相補プローブの両方がハイブリダイズする条件を選択することができる。しかし、他の診断アプリケーションは、ハイブリダイゼーション方法が、遺伝子多型、即ち、特定の遺伝子または遺伝子マーカーに対して存在することができる複数の対立遺伝子（バリエーション）間の一塩基対の差異を検出することを目的とし得る場合において、部分相補性と完全相補性とを区別することが可能であることを必要とする。
【００７５】
「ストリンジェンシー」は、一般に、核酸ハイブリダイゼーションが行われる条件を指し、温度、イオン強度、および他の化合物の存在を含む。「高ストリンジェンシー」条件は、一般に、高い頻度の相補塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド領域間のみで核酸塩基対形成が生じる条件を指す。従って、相互に完全には相補的でない２つのポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドをハイブリダイズもしくはアニールさせることを所望する場合、「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件が好適であり得る。
【００７６】
用語「反応物」は最も広い意味で使用される。反応物は、酵素反応物、化学反応物、または紫外光（紫外光、特に短い波長の紫外光は、ポリヌクレオチドポリマーを切断することが公知である）を含むことができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと反応してオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを修飾することが可能ないずれの因子も用語「反応物」に包含され、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド産物への組み入れのために、反応混合物に添加される「反応物ヌクレオチド」を含む。
【００７７】
「複合体」は、成分の週生体である。複合体は、安定であっても、または安定でなくてもよく、直接的または間接的に検出することができる。例えば、本明細書に記載されるように、反応の所定の成分および反応の産物のタイプが与えられれば、複合体が存在しているとみなすことができる。本発明の目的のために、複合体は、一般に、例えば、最終不稔転写または複製産物などの最終反復合成産物の中間体である。
【００７８】
「反応混合物」は、成分の集合物であり、安定な条件下で反応して、複合体（中間体であってもよい）および／または産物を形成する。
【００７９】
「酵素結合部位」は、ポリメラーゼなどの特定の酵素もしくは酵素のクラスに結合することが可能である配列または構造によって特徴付けられるポリヌクレオチド領域を指す。
【００８０】
「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体の重合（接続）を容易にするかあるいは触媒することが可能な任意の因子を指す。適切な因子は、天然に存在するＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む）などの天然に存在する酵素、ならびに現存し得る修飾されたもしくは変異酵素（例えば、ソーサ（Ｓｏｕｓａ）ら、米国特許第６，１０７，０３７号において開示された変異ＲＮＡポリメラーゼなど）を含むか、あるいは今後作製または設計することができ、特定のアプリケーションに所望される特徴を示すように、修飾されたもしくは変異酵素を設計することもできる。修飾されたもしくは変異酵素の例示的特徴として、温度特異性の緩和、基質特異性の緩和、耐熱性の増加、および／またはその他が挙げられるが、これらに限定されない。用語「ポリメラーゼ」は、耐熱性および不耐熱性酵素の両方を包含することが意図される。
【００８１】
例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を参考にして使用する場合の用語「耐熱性」は、酵素が、高い温度、即ち、約５５℃もしくはそれ以上で機能的または活性である（即ち、触媒を実施することができる）ことを示す。従って、耐熱性ポリメラーゼは、約５５℃の高低両方の温度を含む広範な温度にわたって、触媒を実施することができる。
【００８２】
用語「温度依存性ポリメラーゼ」は、上記のように、テンプレート核酸をコピーもしくは転写することによって、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド産物を合成し、テンプレートの非存在下ではポリヌクレオチドを合成しない核酸ポリメラーゼを指す。これは、例えば、テンプレートの非存在下でも核酸を合成または伸長することができるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはポリＡポリメラーゼなどのテンプレート非依存性核酸ポリメラーゼの活性とは対照的である。
【００８３】
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」は、相補的ＤＮＡテンプレート由来のＲＮＡの重合を容易にするかまたは触媒する酵素である。
【００８４】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ複製または合成、即ち、相補的ＤＮＡテンプレート由来のＤＮＡの重合を容易にするかまたは触媒する酵素である。
【００８５】
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」は、相補的ＲＮＡテンプレート由来のＲＮＡの重合を容易にするかまたは触媒する酵素である。
【００８６】
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は、相補的ＲＮＡテンプレート由来のＤＮＡの重合を容易にするかまたは触媒する酵素である。
【００８７】
「プライマー伸長」、「伸長」、「延長」、および「伸長反応」は、より長い、テンプレートポリヌクレオチドにアニールまたはハイブリダイズしているモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドイニシエーターもしくはプライマーの３’末端へのヌクレオチドの連続付加であり、ここで、付加は、テンプレートの核酸配列および／またはポリメラーゼの結合部位によって指令される。伸長は、一般に、プライマーまたはイニシエーター、ヌクレオチドおよびテンプレートからポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド産物を合成することが可能な酵素によって容易にされる。これらの目的に適切な酵素には、上記のポリメラーゼのいずれもが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
「組み入れ」は、核酸ポリマーの一部となることを指す。核酸前駆体の組み入れに関する述語については、自由度があることが公知である。例えば、ヌクレオチドｄＧＴＰは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸である。ＤＮＡへの組み入れ時に、ｄＧＴＰはｄＧＭＰ、即ち、デオキシグアノシン一リン酸部分となる。ＤＮＡは、ｄＧＴＰ分子を含まないが、ｄＧＴＰをＤＮＡに取り込むと表現してもよい。
【００８９】
用語「サンプル」および「試験サンプル」は、最も広範な意味で使用される。例えば、「サンプル」または「試験サンプル」は標本または培養物（例えば、微生物学的培養物）ならびに生物学的および環境サンプルの両方を含むことを意味する。本発明の方法において使用される核酸のサンプルは、生物学的または環境サンプルから誘導される核酸の水溶液であり、サンプル中に存在し得、かつ本発明の方法を妨害し得るかまたは該方法を行うときに「バックグランド」シグナルを有意に増大し得るタンパク質、脂質などの他の材料から、当該分野において公知の方法によって分離することができる。
【００９０】
生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）組織、動物液体（例えば、血液、唾液、粘膜分泌物、精液、尿、血清、脳脊髄液または髄液、胸膜液、リンパ、痰、乳管洗浄など）、動物固体（例えば、糞）、微生物の培養物、液体および固体の食物ならびに食品、廃棄物、化粧品、または微生物が混入し得る水などの核酸を含み得るいずれの物質を含む。環境サンプルは、表面質、土壌、水、および産業サンプルなどの環境材料、ならびに食物および酪農処理器具、装置、設備、用具、ならびに使い捨ておよび非使い捨て品目から入手されるサンプルを含むことができる。これらの例は単なる例示であって、本発明に適用可能なサンプルのタイプを制限することを意図していない。
【００９１】
「精製された」または「実質的に精製された」は、天然の環境から取り出され、単離または分離された核酸を指し、核酸と天然に会合する他の成分から少なくとも６０％純粋（ｆｒｅｅ）、好ましくは７５％純粋、最も好ましくは９０％純粋である。従って、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００９２】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御およびコーディング配列を含むＤＮＡ配列を指す。ポリペプチドは、所望される機能的活性が保持される限り、全長コーディング配列またはコーディング配列の任意の部分によってコードすることができる。
【００９３】
「欠失」は、標準的な核酸配列と比較して、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドが存在しない核酸配列の変化として規定される。
【００９４】
「挿入」または「付加」は、標準的な核酸配列と比較して、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの付加が生じている核酸配列の変化である。
【００９５】
「置換」は、異なるヌクレオチドによって、核酸における１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの置き換えから生じる。
【００９６】
核酸配列の「改変」は、欠失、付加、付加−欠失、置換、挿入、復帰、トランスバージョン、点変異、もしくはマイクロサテライト改変、またはメチル化を含むが、これらに限定されない核酸配列あるいは構造の任意の変化を指す。
【００９７】
「メチル化」は、ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基へのメチル基（−ＣＨ３）の付加を指す。
【００９８】
配列「変異」は、参照配列との比較において、目的の配列における任意の配列改変を指す。参照配列は、野生型配列または目的の配列を比較することを所望する対照の配列であり得る。配列変異は、置換、欠失、または挿入などの機構による単一ヌクレオチド変化、または配列における１ヌクレオチドを超える改変を含む。一塩基多型（ＳＮＰ）もまた、本明細書において使用される配列変異である。
【００９９】
本明細書において交換可能に使用される「マイクロアレイ」および「アレイ」は、集中した位置におけるポリヌクレオチド配列の収集の配置構成を指す。アレイは、スライドガラスなどの固相担体支持体上、またはニトロセルロースメンブランなどの半固相担体上にあることができる。ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその任意の組み合わせであることができる。
【０１００】
用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを直接的または間接的のいずれかで提供するために使用することができ、かつヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド一、二、もしくは三リン酸、ヌクレオシド一、二、もしくは三リン酸類似体、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに結合することができる任意の原子、分子、または部分を指す。標識は、蛍光、放射能、化学発光、電気、常磁性、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性などによって検出可能であるシグナルを提供する。標識は、荷電部分（正または負電荷）であってもよく、あるいは電気的に中性であってもよい。
【０１０１】
「検出」は、検出するための任意の手段を含み、直接的および間接的検出を含む。例えば、「より少なく検出される」産物は、直接的または間接的に観察することができ、該用語は、産物の数の任意の減少を示す（産物がないことを含む）。同様に、「より多く検出される」産物は、直接的または間接的に観察されるかどうかにかかわらず、任意の増加を意味する。
【０１０２】
本明細書において使用される用語「含む」、「含んでなる」、「含む」、および「含んでいる」、または他の任意のバリエーションは、エレメントのリストを含む過程、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置が該エレメントのみを含まず、前記過程、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置について特に列挙せず、また固有でもない他のエレメントを含み得るような、非排他的内包にも範囲が及ぶことが意図される。
【０１０３】
「Ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などは、他に示さない限り、複数形も含む。
【０１０４】
成分および反応条件
標的核酸
標的核酸は、天然に存在するポリヌクレオチドセグメント化または合成ポリヌクレオチドセグメントのいずれかであることができ、該核酸は、当該分野において周知である技術によって入手または合成することができる。試験サンプル中の検出しようとする標的配列は、はじめから個別の分子として存在してもよく、そのため、検出しようとする配列は、核酸全体を構成するか、またはより大きな分子の唯一の成分として存在してもよい。標的核酸は、生物学的サンプルなどの複雑な混合物の極少量の画分であり得、当該分野において周知である手順によって様々な生物学的材料から入手することができる。検出しようとする標的核酸は、精製されたか、または精製されていない形にある任意の供給源由来の核酸を含むことができ、該核酸は、ＤＮＡ（二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡおよび一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを含む）またはＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡを含む）、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはそれらの混合物；遺伝子、染色体、またはプラスミド；ならびに微生物（細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、および真菌を含む）、植物、動物、ヒトのゲノムなどの生物学的材料のゲノム、またはそのフラグメントであることができる。当該分野において標準的な技術を使用して、試験サンプルから核酸を入手および精製する。前記核酸の抽出および／または精製のための方法については、例えば、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第３版、２０００）に記載されている。ＲＮＡ標的の検出は、当該分野において公知のような初期の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成を必要としても、必要としなくてもよい。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの検出には、ｓｓＤＮＡを得るためのハイブリッドの変性、または変性に続いて、ｃＤＮＡを得るための逆転写が必要である。
【０１０５】
標的タンパク質
本発明の別の実施形態では、標的は、タンパク質などの別の分子であってもよく、反復オリゴヌクレオチド合成のために使用することができる画定された核酸配列の共有または非共有結合により標識される（図２３）。標的タンパク質は、天然に存在するポリペプチドセグメントまたは合成ポリペプチドセグメントのいずれであることもでき、該タンパク質は、当該分野において周知である技術によって入手または合成することができる。試験サンプル中の検出しようとする標的タンパク質は、はじめから個別の分子として存在してもよく、そのため、検出しようとするタンパク質は、タンパク質全体を構成するか、またはより大きな複合体の唯一の成分として存在してもよい。標的タンパク質は、生物学的サンプルなどの複雑な混合物の極少量の画分であり得、当該分野において周知である手順によって様々な生物学的材料から入手することができる。検出しようとする標的タンパク質は、精製されたか、または精製されていない形にある任意の供給源由来のタンパク質を含むことができる。当該分野において標準的な技術を使用して、試験サンプルからタンパク質を入手および精製する。前記タンパク質の抽出および／または精製のための方法については、例えば、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第３版、２０００）に記載されている。
【０１０６】
固定化
本発明の１つの実施形態では、標的分子を固定化することができる。別の実施形態では、標的分子を固定化して、例えば、マイクロアレイを形成することができる。本実施形態に従う単一分子アレイは、固体マトリックス、生体反応性または生体付着性層、および生物耐性層を含む。本発明のマトリックスとして有用である固相として、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカルボネート、または試験管、ビーズ、微粒子、ディップスティックなどの形状をした任意の固体プラスチック材料が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、マトリックスとして、メンブラン、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルおよび３８４ウェル）、試験管、およびエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管が挙げられるが、これらに限定されない。固相はまた、ガラスビーズ、ガラス試験管、およびガラスから作製される他の任意の適切な形状を含む。表面がカルボキシル、アミノ、ヒドラジド、またはアルデヒド基を担持するように修飾されているプラスチックまたはガラスなどの機能的にされた固相も使用することができる。一般に、適切な固体マトリックスは、リガンド結合剤などの生体付着性層を結合することができる任意の表面かまたはそれ自体でリガンド結合部位を提供する任意の表面を含む。
【０１０７】
生体付着性層は、金、ニッケル、または銅などのイオン性吸着性材料（モンテマグノ（Ｍｏｎｔｅｍａｇｎｏ）およびバカンド（Ｂａｃｈａｎｄ）、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｏｗｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｔｏｒｓ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：２２５−２３１（１９９９））、ポリスチレンなどのタンパク質吸着性プラスチック（米国特許第５，８５８，８０１号）、またはチオール基などの共有結合性反応物であることができる。生体付着性層に型取りしたアレイを作製するために、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などの電子感受性ポリマーを使用して、固体支持体を被覆することができ、電子ビームにより任意の所望されるパターンでエッチングすることができ、続いて、顕出させて増感されたポリマーを取り出す。ついで、ポリマーのエッチングされた部分を、ニッケルなどの金属で被覆し、溶媒でポリマーを取り出すと、基体上に金属柱のパターンが後に残る。この電子ビーム・リソグラフィーの方法は、型取りされたアレイの各ポイントにおいて、単一分子を固定化することを容易にする高い空間分解能および小さな形状サイズを提供する。型取りされた高分解能のアレイを作製するための代替的手段は、原子間力顕微鏡である。さらなる手段は、Ｘ線リソグラフィーである。
【０１０８】
抗体またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブは、金属生体付着性パターンに結合する捕捉プローブ上にポリヒスチジンタグを提供することによって、生体付着性パターンに結合させることができる。捕捉プローブは、例えば、約１５〜約５００ヌクレオチド長であってもよい。結合のための他の従来の手段は、ホモ二価性試薬およびヘテロ二価性試薬を用いる。ホモ二価性試薬は２つの同一の官能基を担持する一方、ヘテロ二価性試薬は２つの異なる官能基を含有し、捕捉プローブと生体付着剤とを結合する。ヘテロ二価性架橋剤は、一級アミン反応性基およびチオール反応性基を含有することができる。共有結合性架橋剤は、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）、グリコール（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ２−）、エステル（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、またはアミド（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−）架橋を形成することが可能な試薬から選択される。架橋剤として、マレアミド、ヨードアセトアミド、およびジスルフィ（ｄｉｓｕｌｆｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。表１は、代表的なクラスの架橋試薬およびそれらの基特異性を列挙したものである（ウォングＳ．Ｓ．（Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１、ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）米国、ボッカ・レートン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ））。
【０１０９】
【表１】
2006507792.tif 000002
【０１１０】
生物耐性層は、捕捉プローブの生体付着層への結合の前または後のいずれかに、生体付着層上に配置もしくは重畳することができる。生物耐性層は、捕捉プローブに結合しない任意の材料である。非限定的例として、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、リゾチーム、オクトキシノール、ポリソルベート２０（モノラウリン酸ポリエテンソルビタン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ））、ならびにブロックコポリマーおよび界面活性剤を含有するポリエチレン・オキシド（米国特許第５，８５８，８０１号）が挙げられる。生体付着性および生物体性層の沈積は、噴霧、浸漬、および蒸着（金属）によって達成してもよい。
【０１１１】
１つの実施形態では、固体マトリックスを、入り口および出口を有するフローチャンバに収容し、複数の溶液および反応物を適応して固定化された捕捉プローブへ流動させることができる。フローチャンバは、プラスチックまたはガラスから作製することができ、顕微鏡または光学式読み取り装置によって観察される平面が開放されているかまたは透明であるかのいずれかであり得る。電気浸透流は、固体支持体上の固定電荷および固体支持体の対抗末端に配置された２つの電極間を通過する電圧勾配（電流）を含む。
【０１１２】
プライマー
本発明に従えば、プライマーを使用して、標的核酸上の標的部位のＤＮＡポリメラーゼにより、複製を開始する。ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである場合、プライマーは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドからなることができる。プライマーおよび／またはプライマーを伸長するために使用される個々のヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体を適切に修飾して、シグナル発生、オリゴヌクレオチド産物の検出、および標的配列の有無の決定を可能にすることができる。
【０１１３】
本発明の実施において使用されるプライマーは、従来の化学的または酵素的核酸合成技術を使用して、合成により作製することができる。１つの実施形態では、プライマーは、約２５ヌクレオチド長未満、通常は、約１〜約１０ヌクレオチド長、好ましくは、約２〜３ヌクレオチド長である。プライマーの１つもしくはそれ以上の位置でヌクレオチドまたはホスホジエステル結合を修飾することを所望することもできる。そのような修飾の例としては、蛍光分子およびエネルギー移動色素（例えば、フルオレセイン、アエダンス（ａｅｄａｎｓ）、クマリン、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）色素、およびローダミンを基剤とする色素）、蛍光消光分子（例えば、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ））、タンパク質、ペプチド、アミノリンカー、またはアミノ酸に基づく分子（例えば、ポリヒスチジン）、修飾された塩基ならびに修飾されたおよび修飾されていない塩基類似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート、放射性標識、末端リン酸、３’グリセリル、他の炭水化物に基づく分子、脂肪酸誘導性分子、炭素スペーサー分子、電気化学発光標識、ランタニド標識、アビジンおよびその誘導体（例えば、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）など）、ビオチン、ステロイド分子（例えば、ジゴキシゲニン）、チオール結合、フェリチン標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
標的部位プローブ
本発明に従えば、オリゴヌクレオチド標的部位プローブを使用して、標的核酸の標的領域においてバブル複合体を形成することにより、標的核酸上の標的部位に対してポリメラーゼを指令する（図１１）。標的部位プローブは、ヌクレオチドの長さを変動することができ、該長さは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチド、および１００を超えるヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。バブル複合体は、標的部位を含む一本鎖領域のいずれかの側に二本鎖領域を含む。１つの実施形態では、標的部位プローブは、次の３つの領域を含む：標的部位プローブの５’末端上の第１の領域は、テンプレート配列上の標的部位の上流のテンプレート配列に相補的であり、該配列にハイブリダイズする；第１の領域の３’である第２の領域は、テンプレート配列に非相補的であり、従って、テンプレート配列にハイブリダイズしない；標的部位プローブの３’末端上にある第３の領域は標的部位の下流のテンプレート配列に相補的であり、該配列にハイブリダイズする。標的部位プローブは、ヌクレオチドの長さを変動することができ、該長さは、約５〜１９；約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチド、および１００を超えるヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
標的部位プローブの使用により、テンプレート配列上の特定の酵素結合部位（即ち、テンプレート配列およびプライマーによって、標的部位の上流で形成される二本鎖セグメントおよびバブル）に対してポリメラーゼが指令され、特定の標的部位での転写の開始が容易になる。即ち、上記のように、一本鎖テンプレート配列の長さにそったポリメラーゼにより、合成反応の無作為な開始を容易にするのではなく、本実施形態は、標的部位プローブによって形成されるバブル複合体に包含される特定の標的部位の検出のために、ポリメラーゼの標的化された結合を提供する。
【０１１６】
本発明の実施において使用される標的部位プローブは、例えば、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、またはホスホトリエステル化学などの従来の核酸合成技術を使用して、酵素的または合成的に作製することができる。ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなどの非天然骨格基を生じる化学などの代替的化学もまた、用いることができる。標的部位プローブは、オペロン社（Ｏｐｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．））のような注文のポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドに特化した様々な会社から商業的に注文してもよい。
【０１１７】
標的部位プローブの配列は、標的配列に依存して変動する。標的部位プローブの全体の長さを選択して、第１および第３の領域と標的配列とのハイブリダイゼーションおよび第２のハイブリダイズしない領域の長さの最適化を提供する。標的部位プローブの第１および第３の領域は、標的核酸テンプレート上の既知の内部部位にハイブリダイズするように設計する。アプリケーションに依存して、標的部位プローブ上の第２の領域の配列は、第２の領域が自己相補的であってもよく、または自己相補的でなくてもよいように設計することができる。標的部位プローブの全体の長さは約２０〜約５０ヌクレオチド、好ましくは、約２５〜約３５ヌクレオチドの範囲である。標的部位プローブの第１および第３の領域は、それぞれ、約５〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは、約８〜約１０ヌクレオチド長の範囲である。１つの実施形態では、標的部位プローブの第１および第３の領域は、それぞれ、約１０ヌクレオチド長である。標的部位プローブ上の内部の第２の領域は、約８〜約１４ヌクレオチド、好ましくは、約１２〜約１４ヌクレオチドの範囲である。
【０１１８】
１つの実施形態では、少なくとも１つの標的部位プローブを使用して、核酸テンプレート上の１つもしくはそれ以上の標的部位で不稔オリゴヌクレオチド合成を特異的に開始して、複数のオリゴヌクレオチド産物を産生させる。別の実施形態では、当該分野において公知であるように、標的部位プローブは、テンプレートプロモーター配列の非存在下で、一本鎖標的部位上の不稔転写の開始を指令する。（米国特許第５，５７１，６６９号；ダウベ（Ｄａｕｂｅ）およびフォン・ヒッペル（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３２０−１３２４（１９９２）を参照のこと）。
【０１１９】
不稔プロモーターカセット
本発明に従えば、不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）を使用して、標的を画定された配列に結合し、試験サンプルにおいて標的の存在を示す複数の検出可能なオリゴヌクレオチド産物が作製される。ＡＰＣは、（１）ＲＮＡポリメラーゼが結合して、転写バブルを形成することができる１つの連続オリゴヌクレオチド；（２）イニシエーターおよび適切なＲＮＡポリメラーゼが不稔オリゴヌクレオチド産物を合成することができる規定された部位を含む一本鎖転写バブル領域を形成する２つの部分的に相補的な上流および下流オリゴヌクレオチド；または（３）不稔オリゴヌクレオチド産物の合成を可能にするＲＮＡポリメラーゼの存在下で、転写バブル領域を形成する２つの相補的オリゴヌクレオチドからなることができるＤＮＡの自己相補的配列である。ＡＰＣは、人工的プロモーターを含有してもよく、または該ＡＰＣは、特定のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有してもよい。例えば、一般のファージＲＮＡポリメラーゼによって作製し得るトリヌクレオチドまたはテトラヌクレオチド産物は、標識されたＧｐＡまたはＧｐＡｐＡイニシエーターおよび標識されたｐｐｐＧまたはｐｐｐＡターミネーターにより作製することができる。
【０１２０】
例示的実施形態では、図１に示されるように、ＡＰＣは８つの領域を含み、３’または５’一本鎖張り出し領域（即ち、「粘着末端」）のいずれかを含むＡＰＣリンカー配列を含む。ＡＰＣの５’末端上の第１の領域（Ａ）は、ＡＰＣの３’末端付近の第２の領域（Ａ’）に相補的である。第３の領域（Ｂ）および第４の領域（Ｅ）は、領域Ｃ、Ｄ、およびＣ’によって相互に分離され、相互に非相補的であり、そのため、ＡＰＣの自己相補領域が相互に相互作用する場合、領域ＢおよびＥは、ＡＰＣ上で一本鎖バブル領域を形成する。領域ＣおよびＣ’は実質的に自己相補的であり、そのため、領域Ｃの５’末端は領域Ｃ’の３’末端に相補的である。領域Ｄは、連続ＡＰＣのＣとＣ’とを接続する短い配列であり得るか、または２つの部分のＡＰＣについて、２つの個別の上流および下流オリゴヌクレオチドの遊離３’または５’末端を含む領域であり得る。最後に、ＡＰＣはまた、ＡＰＣリンカー、領域ＡおよびＡ’の相補的相互作用を介して形成されるＡＰＣオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれか上の一本鎖領域を含む。ＡＰＣリンカーは、ＡＰＣと、例えば、捕捉される標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの他の標的分子との結合を容易にする。
【０１２１】
本発明の実施において使用されるＡＰＣは、例えば、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、またはホスホトリエステル化学などの従来の核酸合成技術を使用して、酵素的または合成的に作製することができる。ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなどの非天然骨格基を生じる化学などの代替的化学もまた、用いることができる。ＡＰＣは、オペロン社（Ｏｐｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．））のような注文のポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドに特化した様々な会社から商業的に注文してもよい。
【０１２２】
ＡＰＣの長さを選択して、バブル領域の安定性を最適化し、ＡＰＣリンカーと標的配列とのハイブリダイゼーション提供する。ＡＰＣの全体の長さは約５０〜約１５０ヌクレオチド、好ましくは、約５５〜約１２５ヌクレオチドの範囲である。領域ＡおよびＡ’は、それぞれ、約５〜約２５ヌクレオチドを含み、好ましくは、約７〜約１５ヌクレオチドを含むことができる。領域ＢおよびＥは、約８〜約１６ヌクレオチドを含み、好ましくは、約１０〜約１４ヌクレオチドを含むことができる。領域ＣおよびＣ’は、それぞれ、約５〜約２５ヌクレオチドを含み、好ましくは、約１０〜約２０ヌクレオチドを含むことができる。一本鎖張り出し領域は、約５〜約４０ヌクレオチドを含み、好ましくは、約１０〜約２５ヌクレオチドを含むことができる。
【０１２３】
ポリメラーゼ
本発明の方法および組成物における使用のためのテンプレート依存性ポリメラーゼは、当該分野において公知である。真核生物または原核生物のいずれものポリメラーゼを使用してよい。１つの実施形態では、テンプレート依存性ポリメラーゼは、耐熱性ポリメラーゼである。別の実施形態では、ポリメラーゼはまた、リン酸基、ヌクレアーゼ、および／または組み入れられなかったヌクレオチドのペントース環上の標識部分に忍容性であることができる。１つの実施形態では、ポリメラーゼは、プロモーター配列を伴わずに、一本鎖ＤＮＡテンプレートを転写することが可能なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、ポリメラーゼは、使用している特定のＲＮＡポリメラーゼに結合することが可能であるプロモーター配列を有する一本鎖ＤＮＡテンプレートを転写することが可能なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ標的部位を複製して、ＤＮＡオリゴヌクレオチド産物を形成することが可能なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。さらなる実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートから一本鎖相補的ＤＮＡ転写物を合成することが可能なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。適切なポリメラーゼの例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）バクテリオファージＴ７、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）バクテリオファージＳＰ６によってコードされるＲＮＡポリメラーゼ；ポリオウイルスＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＨＩＶ逆転写酵素などの逆転写酵素；ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｔ７、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、末端基転移酵素、プライマーゼ、およびテロメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０１２４】
一般に、本発明の方法に含まれる酵素は、好ましくは、該方法によって産生される核酸成分の実質的な分解を生じない。
【０１２５】
ヌクレオチド
本発明に従えば、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド産物に対して通常５’→３’の方向での反応を触媒し、ヌクレオチド（ＮＴＰ）（ヌクレオチド類似体（ＮＴＰ類似体）を含んでもよく、かつ標識されていても、もしくは標識されていなくてもよい）の連続付加を介してイニシエーターまたはプライマーの３’末端を伸長することによって、標的核酸の転写あるいは複製のいずれかを行う。反復的、不稔合成開始事象を容易にするために、合成反応前および／または中に反応混合物に添加されるＮＴＰおよび／またはＮＴＰ類似体は、ポリメラーゼによって開始された合成事象を終止することが可能であるチェーンターミネーターを含む。チェーンターミネーターを使用すると、合成反応中でポリメラーゼを停止し、漸次的延長複合体の形成を阻害し、従って、標的部位由来の短い不稔オリゴヌクレオチドの反復合成を促進する。（ダウベ（Ｄａｕｂｅ）およびフォン・ヒッペル（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３２０−１３２４（１９９２））。
【０１２６】
本発明に従えば、チェーンターミネーターは、任意の化合物、組成物、複合体、反応物、反応条件、あるいはプライマー伸長反応中のポリメラーゼによる転写もしくは複製の連続を阻害することが可能な過程（化合物、反応物、または反応条件を制止することを含む）を含むことができる。１つの実施形態では、適切なチェーンターミネーターは、ＮＴＰ欠損であり、即ち、テンプレート配列の以後の相補的ヌクレオチドに対応する特定のＮＴＰをポリメラーゼから奪う。言い換えれば、鎖延長のためのＮＴＰの要件は、相補鎖の配列に支配されているため、画定されたテンプレート配列および画定されたプライマー長が与えられれば、選択したＮＴＰを反応混合物から制止することができ、そのため、反応混合物が転写の継続またはテンプレート配列の複製に必要なＮＴＰをポリメラーゼに提供することができなくなると、ポリメラーゼによる鎖延長の終結が生じる。
【０１２７】
あるいは、別の実施形態では、チェーンターミネーターは、ヌクレオチド類似体を含むことができ、該類似体は、標識されていても、もしくは標識されていなくてもよく、かつポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド産物への組み入れ時に、ヌクレオチド重合の終結を生じる。具体的には、ポリメラーゼによる鎖延長は、以後のヌクレオチドの付加のために３’ＯＨを必要とするため、適切に修飾された３’末端を有するヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチド産物への組み入れ時に鎖延長を終止する。ペントース糖の３’炭素への鎖終結修飾を有するヌクレオチド類似体は当該分野において公知であり、３’ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）および３’Ｏ−メチルリボヌクレオシド５’三リン酸などのヌクレオチド類似体、ならびにペントース環の３’炭素上の−Ｈまたは−ＯＣＨ２部分のいずれかを有するヌクレオチド類似体を含む。あるいは、さらなる実施形態では、本明細書に記載のように、チェーンターミネーターは、３’ＯＨ基を有するが、しかし、オリゴヌクレオチド産物への組み入れ時になお、いくつかの位置で、鎖終結を生じるヌクレオチド類似体（標識されたまたは標識されていないのいずれか）を含むことができる（コスタス（Ｃｏｓｔａｓ）、ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１８４９−５８（２０００）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.），Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８０：３８３−４０９（１９８９）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：２０７３−７９（１９９３）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：１３６９−７６（１９９９））。
【０１２８】
本発明の方法に従って不稔ヌクレオチド産物を合成するために用いることができるＮＴＰおよび／またはＮＴＰ類似体は、約１〜約５０００μＭ、好ましくは、約１０〜約２０００μＭの範囲の量で提供することができる。好適な態様では、本発明の方法によってオリゴヌクレオチドＲＮＡ転写物を合成するために用いることができるリボヌクレオシド三リン酸もしくはその類似体などのヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、約１〜約６０００μＭ、好ましくは約１０〜約５０００μＭの範囲の量で提供することができる。
【０１２９】
標識化および検出
本発明の態様によれば、検出可能なオリゴヌクレオチドが、標的核酸テンプレートからが合成される。オリゴヌクレオチド産物の検出および同定は、イニシエーターならびに／あるいは合成複合体の部分であるかもしくは合成複合体の１つもしくはそれ以上の成分と相互作用する標的核酸および／または他の分子上で合成される各オリゴヌクレオチド産物にポリメラーゼによって取り込まれるＮＴＰもしくはＮＴＰ類似体上の標識部分によって、容易にされる。標識あるいはレポーター部分は、プライマーを形成するヌクレオチドおよび／あるいは伸長反応中にポリメラーゼに利用される反応物ＮＴＰもしくはＮＴＰ類似体、または他の分子に、化学的または酵素的に取り込むことができ、例えば、蛍光タグ；常磁性基；化学発光基；金属結合部分；インターカレーター；光化学架橋剤；抗体特異的ハプテン；金属；特異的結合対のメンバーである小さな分子（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンなど）；ならびに他の任意のレポーター部分あるいは検出可能および／または定量可能なシグナルを直接的もしくは間接的に生じることができる部分を含むことができる。例示的ヌクレオチドとしては、例えば、８−修飾プリン（８−ＡＰＡＳ−ＡＴＰ）（コスタス（Ｃｏｓｔａｓ）、ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１８４９−５８（２０００））；５−修飾ピリミジン（５−ＡＰＡＳ−ＵＴＰ；５−ＡＰＡＳ−ＣＴＰ）（ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.），Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８０：３８３−４０９（１９８９）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：２０７３−７９（１９９３））；蛍光リボヌクレオチド（５−ＳＦ−ＵＴＰ）（ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：１３６９−７６（１９９９））；およびハプテン−タグ化デオキシヌクレオチド前駆体（５−ＤＮＰ−ＳｄＵ）（メーヤー（Ｍｅｙｅｒ）およびハンナ（Ｈａｎｎａ），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ７：４０１−４１２（１９９６）；米国特許第６，００８，３３４号および同第６，１０７，０３９号）を挙げることができる。
【０１３０】
１つの実施形態では、蛍光体部分が、標的核酸の転写を開始するために使用されるイニシエーターの５’末端に結合される。別の実施形態では、蛍光体部分は、イニシエータープライマーを伸長するためにポリメラーゼによって使用されるＮＴＰまたはＮＴＰ類似体の塩基の５または８位に結合される。さらなる実施形態では、第１の蛍光体はイニシエーターに結合され、第２の蛍光体は、イニシエーターを伸長するために使用されるＮＴＰまたはＮＴＰ類似体に結合される。この後者の実施形態では、蛍光エネルギー移動機構を使用することができ、ここで、第１の蛍光体（例えば、フルオレセイン、アエダンス（ａｅｄａｎｓ）、クマリンなど）が励起され、オリゴヌクレオチド産物の合成中にポリメラーゼによって第２の蛍光体が第１の蛍光体に接近する場合、第２の蛍光体（例えば、フルオレセイン、アエダンス（ａｅｄａｎｓ）、クマリンなど）からの放射が読み取られる。あるいは、第１および第２の蛍光体は、電子移動機構により機能することができ、ここで、ポリメラーゼが第１および第２の蛍光体を相互に接近する場合、第１の蛍光体は第２の蛍光体からエネルギーを吸収し、第１の蛍光体は、放射性様式でエネルギーを放出し、従って、検出を可能にする。
【０１３１】
１つの態様では、第１の蛍光体は蛍光エネルギードナーであり、第１の反応物（即ち、イニシエーターに取り込まれるヌクレオチドかまたはオリゴヌクレオチド産物にポリメラーゼによって取り込まれるヌクレオチドのいずれか）に結合し、第２の蛍光体は蛍光エネルギーアクセプターであり、第１の反応物とは異なる第２の反応物（イニシエーターヌクレオチドに取り込まれるヌクレオチドかまたはオリゴヌクレオチド産物にポリメラーゼによって取り込まれるヌクレオチドのいずれか）に結合する。１つの実施形態では、プライマーを伸長するために使用することができる４つのＮＴＰまたはＮＴＰ類似体のそれぞれは、プライマー上で蛍光エネルギードナーに接近する場合、異なる放出波長が可能である独特な蛍光エネルギーアクセプターでタグ化される。イニシエーターも組み入れられなかったＮＴＰまたはＮＴＰ類似体もまた単独では、検出のために使用される波長でシグナルを生じないため、好ましくは、蛍光エネルギー移動は、オリゴヌクレオチド産物を単離することなく、実時間で測定することができる。
【０１３２】
蛍光および発色分子ならびにそれらに関連する光学的特性については、文献に十分に記載されている。例えば、ベールマン（Ｂｅｒｌｍａｎ），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第２版（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７１）；グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ），Ｃｏｌｏｕｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７６）；ビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ）編、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（パーガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ），１９７２）；ホーグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、オイジーン（Ｅｕｇｅｎｅ），１９９２）；プリングシェイム（Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ），Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（インターサイエンス・パブリッシャーズ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９４９）；などを参照のこと。さらに、ヌクレオチドに添加することができる一般の反応基を介する共有結合のための蛍光体および消光分子を誘導するための文献に広範な指針が掲載されており、以下の参考文献に例示されている：ホーグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ）（上掲）；ウルマン（Ｕｌｌｍａｎ）ら、米国特許第３，９９６，３４５号；カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら、米国特許第４，３５１，７６０号；コスタス（Ｃｏｓｔａｓ）、ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１８４９−５８（２０００）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：１３６９−７６（１９９９））；ならびにメーヤー（Ｍｅｙｅｒ）およびハンナ（Ｈａｎｎａ），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ７：４０１−４１２（１９９６）。
【０１３３】
一般に、ヌクレオチドの標識化は、既知の結合、結合基、および関連する相補的機能性を使用する任意の多数の公知のヌクレオチド標識化技術を介して達成することができる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができる適切なドナーおよびアクセプター部分として、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）；ブリリアント・イエロー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ）；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクルアリン（ＡＭＣ、クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロール・レッド（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ））；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン酪酸、スクシンイミジル１ピレン；酪酸量子ドット；リアクティブ・レッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ）４（シバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ）ＴＭブリリアント・レッド（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ）３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ））；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウム（ｔｅｒｂｉｕｎ）キレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３４】
蛍光体をヌクレオチドに結合させるための多くの結合部分および方法論が存在し、以下の参考文献に例示されている：エクステイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ），１９９１）；ツッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；シャルマ（Ｓｈａｒｍａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル）；ギウスチ（Ｇｉｕｓｔｉ）ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２２３−２２７（１９９３）；フング（Ｆｕｎｇ）ら、米国特許第４，７５７，１４１号（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）より販売されているアミノリンク（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ）ＴＭＩＩによる５’ホスホアミノ基、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））；スタビンスキー（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ）、米国特許第４，７３９，０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３１：１５４３−１５４６（１９９０）（ホスホルアミデートによる結合）；スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：４８３７（１９８７）（５−メルカプト基）；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.），Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８０：３８３−４０９（１９８９）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：２０７３−７９（１９９３）；ハンナ，Ｍ（Ｈａｎｎａ，Ｍ.）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：１３６９−７６（１９９９）（５−メルカプト基）；コスタス（Ｃｏｓｔａｓ）、ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１８４９−５８（２０００））（８−メルカプト基）；など。
【０１３５】
本発明によれば、オリゴヌクレオチド産物の検出は、標的配列の存在を示す。定量分析もまた実行可能である。直接的および間接的検出方法（定量を含む）は当該分野において周知である。例えば、既知量の標的核酸を有する参照サンプルから作製されるオリゴヌクレオチド産物の量に対して未知の量の標的核酸を含有する試験サンプルから作製されるオリゴヌクレオチド産物の量を比較することによって、試験サンプル中の標的核酸の量を決定することができる。本発明の反復的不稔合成開始および検出方法もまた、以下にさらに説明する通り、標的核酸の遺伝子改変の分析にまで範囲が及び得る。
【０１３６】
反応条件
ほとんどの転写反応条件は、全長転写物の産生のために設計されているが、不稔転写を終了する条件については同定されていない。本発明の方法を行うための適切な反応媒体および条件は、特定のポリメラーゼのために最適化される水性緩衝媒体を含む。一般に、緩衝液は、１価のイオンの供給源、２価のカチオンの供給源、および還元型のポリメラーゼのスルフヒドラル基を維持するために添加される還元剤を含む。ＫＣｌ、酢酸Ｋ、酢酸ＮＨ４、グルタミン酸Ｋ、ＮＨ４Ｃｌ、硫酸アンモニウムなどの１価のイオンの任意の従来の供給源を用いることができる。２価のカチオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛などであってもよいが、典型的に、カチオンはマグネシウム（Ｍｇ）である。ＭｇＣｌ２、酢酸Ｍｇなどを含むマグネシウムカチオンの任意の従来の供給源を用いてもよい。緩衝液中に存在するＭｇ２＋の量は、約０．５〜２０ｍＭの範囲であってもよく、好ましくは、約１〜１２ｍＭの範囲である。
【０１３７】
代表的な緩衝材または緩衝液中に存在することができる塩として、トリス・リン酸（Ｔｒｉｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどが挙げられ、ここで、緩衝剤の量は、典型的に、約５〜１５０ｍＭ、通常は、約１０〜１００ｍＭ、好ましくは、約２０〜５０ｍＭの範囲である。所定の実施形態では、緩衝剤は、約６．０〜９．５の範囲、好ましくは、７．０〜８．０の範囲のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。緩衝媒体中に存在することができる他の薬剤として、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤、もしくは他のポリアニオン性またはカチオン性分子（ヘパリン、スペルミジン）、タンパク質キャリア（ＢＳＡ）または転写因子（σ、ＮｕｓＡ、Ｒｈｏ、リゾチーム、ＧｒｅＡ、ＧｒｅＢ、ＮｕｓＧなど）を含む他のタンパク質が挙げられる。
【０１３８】
全ての反応成分のバリエーションは、潜在的に、全長転写物に対する不稔転写物の割合を改変することができる。塩の濃度（１０ｍＭ〜１００ｍＭ）または代替的１価のカチオン（Ｋ＋対Ｎａ＋対Ｒｂ＋）の使用の改変は、線状ＤＮＡテンプレートに対する転写のレベル（不稔転写として測定される）に影響を及ぼすことが明らかにされている（ワングＪ−Ｙ（Ｗａｎｇ，Ｊ−Ｙ）ら、Ｇｅｎｅ  １９６：９５−９８（１９９７））。代替的スルフヒドラル還元試薬は、不稔転写に対して異なる効果を有することが報告されている。１〜２ｍＭでの２−メルカプトエタノールは、代替的還元剤５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロベンゼン）酸と比較して、ポリ［ｄＡ−ｄＴ］テンプレートに対する不稔転写を増強することが報告されている（ジョブＤ（Ｊｏｂ，Ｄ），Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｏｌ．４１：４１５−４１９（１９９４））。
【０１３９】
テンプレートに対してＲＮＡポリメラーゼのモル比が高ければ、λＰＲプロモーターに対する全長転写に関する不稔転写の頻度が増大する。このような効果は、明らかに、プロモーターにおけるタンデムポリメラーゼ間の衝突から生じる。
【０１４０】
所定のＲＮＡポリメラーゼ変異は、野生型ポリメラーゼと比較して、高い割合の不稔転写を有する。例えば、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット遺伝子のコドン５２９でアルギニンをシステインに変更する変異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐｙｒＢ１プロモーターで不稔転写の増加を生じる（ジンＤ．Ｊ．（Ｊｉｎ，Ｄ．Ｊ．）およびターンボフＪｒ．，Ｃ．Ｌ．（Ｔｕｒｎｂｏｕｇｈ，Ｊｒ．，Ｃ．Ｌ．），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６：７２−８０（１９９４））。
【０１４１】
不稔転写の相対レベルは、プロモーターのヌクレオチド配列に対して感受性である。異常に不稔転写を受けやすい多数のプロモーター（例えば、ｇａｌＰ２プロモーター）が同定されている。最大開始頻度および不稔転写の最大割合について候補プロモーターをスクリーニングすることによって、画定されたプロモーターの漸増に依存するアッセイシステムを最適化することができる。
【０１４２】
本発明の方法の任意の態様は、同じまたは異なる温度で生じることができる。１つの実施形態では、反応は等温的に実施され、めんどうな温度循環過程が回避される。合成反応は、標的部位プローブ、捕捉プローブ、およびＡＰＣならびに標的核酸テンプレートに対するプライマーを含む様々なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にし、用いられる酵素の活性を実質的に阻害しない温度で行われる。温度は、約２５℃〜約８５℃、より好ましくは約３０℃〜約７５℃、最も好ましくは約２５℃〜約５５℃の範囲にあることができる。いくつかの実施形態では、転写または複製のための温度は、アッセイにおいて、このアッセイ以外で使用されている温度とは異なっていてもよい。転写または複製を実施することができる温度は、約２５℃〜約８５℃、より好ましくは約３０℃〜約７５℃、最も好ましくは約２５℃〜約５５℃の範囲にあることができる。
【０１４３】
試験サンプル中の標的核酸の変性は、標的核酸が二本鎖の形態で見出され、剛性構造を維持する傾向を有する場合、本発明のアッセイを行うのに必要であり得る。変性は、一本鎖核酸を生じる過程であり、当該分野において周知であるいくらかの方法によって達成することができる。例えば、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、第３版、２０００）を参照のこと。変性を達成するための１つの方法には、試験サンプル中の核酸を約９０〜１００℃の温度に約２〜２０分間暴露するなどの熱の使用が含まれる。あるいは、核酸がＤＮＡを含む場合、塩基性を変性剤として使用してもよい。ＤＮＡサンプルを変性するために、当該分野において周知である多くの塩基性溶液を使用することができる。例示的な方法では、ＤＮＡサンプルをＮａＯＨなどの塩基性と共に、例えば、約０．１〜２．０Ｎ  ＮａＯＨの濃度で、約２０℃〜約１００℃の範囲の温度で、約５〜１２０分間、インキュベートする。水酸化ナトリウムなどの塩基性による処置は、サンプルの粘度を減少して、以後の酵素反応の動力学を増大するだけではなく、サンプルを均質化して、サンプル中に存在し得る任意の存在するＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊することによるバックグランドの可能性を減少するのに役立つ。
【０１４４】
本発明の多様な態様および実施形態に従えば、標的核酸分子は、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、標的核酸の一部に相補的であるモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドイニシエーター、標的核酸の一部に相補的であるＡＰＣリンカー配列、および／または標的部位のいずれかの側上の領域に相補的である標的部位プローブにハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーションは、当業者に周知である標準的なハイブリダイゼーション条件下で行う。標的核酸のオリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチド）のハイブリダイゼーションのための反応条件は、オリゴヌクレオチド長、オリゴヌクレオチドに存在するＧ：Ｃ塩基対の数、およびハイブリダイゼーション反応に利用される緩衝液の組成などの因子に依存して、オリゴヌクレオチドによって変動する。中等度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、一般に、当業者は、完全に塩基対形成される二本鎖ＤＮＡの融解温度未満の約２５℃である条件であると理解している。より高い特異性は、より高い温度を有するインキュベーション条件などのよりストリンジェントな条件を用いることによって、一般に達成される。周知の実験マニュアルであるサンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９）の第１１章には、関連因子および所望される程度の特異性でハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシーのレベルを含むオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーのハイブリダイゼーション条件がかなり詳細に記載されている。
【０１４５】
オリゴヌクレオチド捕捉プローブ、標的部位プローブ、ＡＰＣ、および／またはイニシエーターは、それぞれ、標的核酸と共に約５〜１２０分間、ハイブリダイゼーションを可能にする約２０〜８０℃でインキュベートすることができる。好ましくは、標的核酸およびオリゴヌクレオチドプローブ、ＡＰＣ、および／またはイニシエーターは、約５〜６０分間、約２５〜７０℃でインキュベートされる。より好ましくは、標的核酸およびオリゴヌクレオチドプローブ、ＡＰＣ、および／またはプライマーは、約５〜３０分間、約３５〜５０℃でインキュベートされる。
【０１４６】
ハイブリダイゼーションは、典型的に、緩衝化された水溶液および温度条件で実施し、塩濃度、およびｐＨは、オリゴヌクレオチドプローブ、ＡＰＣ、またはプローブが標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他の任意の配列にはハイブリダイズしないことが可能である十分なストリンジェンシーを提供するように選択する。一般に、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと標的核酸テンプレートとの間のハイブリダイゼーションの効率は、反応混合物に添加されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの量が、テンプレートに対してモル過剰である、好ましくは、約１０３〜１０６の範囲にあるモル過剰である条件下で、改善される。しかし、試験サンプル中の標的核酸の量は、既知でないことがあり得、そのため、標的核酸テンプレートの量に対する、例えばオリゴヌクレオチド捕捉プローブ、標的部位プローブ、またはＡＰＣの量などのオリゴヌクレオチドの量は、明確に決定することができない。
【０１４７】
あるいは、標的ＤＮＡ配列が塩基性で処置されて変性されている場合、中和ハイブリダイゼーション緩衝液としても作用する希釈液にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを希釈する。この様式では、試験サンプルのｐＨを約６〜９に保つことができ、ハイブリダイゼーション反応を支持し、以後の酵素反応を妨害しない。好ましくは、中和緩衝液は、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（「ＢＥＳ」）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セント・ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））および酢酸トリウム緩衝液である。より好ましくは、中和ハイブリダイゼーション緩衝液は、２Ｍ  ＢＥＳ、１Ｍ酢酸ナトリウム、ＮａＮ３などの０．０５％の抗微生物剤、ＥＤＴＡなどの５ｍＭのキレート剤、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ）ＴＭなどの０．４％の界面活性剤、および硫酸デキストランなどの２０％のハイブリダイゼーション促進剤の混合物である。中和ハイブリダイゼーション緩衝液のｐＨは、約５〜５．５の間である。
【０１４８】
転写条件および試薬は、当該分野において周知である。ＲＮＡポリメラーゼ転写およびＤＮＡポリメラーゼ複製のための典型的な条件および試薬の例は、文献において容易に見出される。例えば、チャンバーレイン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）ら、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）編、ニューヨーク・アカド・プレス（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ）、第３版、ｐ．８５（１９８２）；ダン（Ｄｕｎｎ）ら、Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：４７７−５３５（１９８３）；ガイダー（Ｇｅｉｄｅｒ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：６４５−６４９（１９７８）；グルビッヒ（Ｇｕｒｕｖｉｃｈ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９５：２０７−２１３（１９９１）；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９２８−４９３６（１９８０）；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：３９６６−３９７４（１９８８）；およびミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１８０ａ巻、編、５０−５２（１９８９）を参照のこと。ル（Ｌｕ）ら、米国特許第５，５７１，６６９号に記載のように、人工転写バブル複合体から開始される転写のためのポリメラーゼ濃度は、プロモーター開始、または回文配列開始転写に理想的なポリメラーゼ濃度よりも一般に約１桁大きい。
【０１４９】
１つの実施形態では、前記成分は不稔合成および検出方法の開始と同時に添加される。別の実施形態では、成分は、様々な方法によって要求および／または許容される通り、方法中の適切な時間ポイントの前または後に、任意の順序で添加される。そのような時間ポイントは、当業者によって容易に同定することができる。本発明の方法に従う核酸検出のために使用される酵素は、核酸変性の前もしくは後、標的核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションの前もしくは後、標的核酸への標的プローブの随意的ハイブリダイゼーションの前もしくは後、またはＡＰＣの随意的ハイブリダイゼーションの前もしくは後に、反応混合物に添加することができ、酵素の熱安定性および／または当業者に公知である他の考慮によって決定される。
【０１５０】
本発明の方法における様々な反応を様々な時間ポイントで停止し、次いで、後に再開することができる。これらの時間ポイントは当業者によって容易に同定することができる。反応を停止するための方法は、当該分野において公知であり、例えば、反応混合物を、酵素活性を阻害する温度にまで冷却することを含む。反応を再開する方法も当該分野において公知であり、例えば、酵素活性を可能にする温度にまで、反応混合物の温度を上昇させることを含む。いくつかの実施形態では、様々な反応の１つもしくはそれ以上の成分を、反応の再開の前、その時間、またはその後に補充することができる。あるいは、中断することなく、反応を進行させる（即ち、開始から終了まで）こともできる。
【０１５１】
本発明の不稔合成および検出方法
本発明についてさらに具体的に説明するために、以下に、本発明の不稔合成および検出方法の例を示す。これらの例示的方法は、単に例示することを目的とするものであって、上記の説明を制限することを意図しない。上記の一般的説明が与えられれば、他の様々な実施形態も実施することができることが理解されよう。例えば、プライマーの使用について参考にすることは、ＲＮＡイニシエーターを含む本明細書に記載の任意のプライマーを使用することができることを意味する。
【０１５２】
本発明の態様によれば、標的ポリヌクレオチド上で反復合成開始事象を介して複数の検出可能なオリゴヌクレオチド産物を作製することによって、標的ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法が提供される。図２は、複数の検出可能なオリゴヌクレオチド産物を合成するために、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で組み合わせおよび反応させることができる様々な反応物の概要を図示する。本発明の方法は、標的配列を潜在的に含有する試験サンプルを使用して、実施することができる。試験配列を直接検出してもよく、または標的のプライマー伸長もしくは逆転写の産物を検出してもよい。配列またはタグを標的のコピーに添加することもできる（例えば、ビオチン、ｓｓＤＮＡ領域）。試験サンプルは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡを含むことができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞、組織、または他のサンプルからＤＮＡもしくはＲＮＡを単離するために、標準的な技術によって、単離および精製することができる。そのような標準的な方法は、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、第３版、２０００）などの参考文献に見出すことができる。１つの実施形態では、標的核酸は適切な媒体中にあるＤＮＡまたはＲＮＡであるが、標的核酸は凍結乾燥の形態であることができる。適切な媒体は、（純水または緩衝液などの）水性媒体を含むが、これに限定されない。別の実施形態では、標的核酸は、合成反応のための基質として利用する前に固定化される。
【０１５３】
例示的実施形態では、標的配列は、マイクロタイタープレートなどの固体マトリックスに結合される配列特異的（例えば、遺伝子特異的）オリゴヌクレオチド捕捉プローブによって固定化される。固定化された捕捉プローブは、ハイブリダイズ条件下で、一本鎖ＤＮＡ（即ち、変性されたＤＮＡ）またはＲＮＡを含む試験サンプルで処置される。試験サンプルに存在する任意の標的配列は、捕捉プローブにハイブリダイズし、次いで、本発明に従ってさらなる試薬に暴露される。
【０１５４】
例示的実施形態では、イニシエーター（ｎ個の５’−Ｒ１−（ＮＩ）ｘ−ＯＨ  ３’）は、標的部位プローブ（図１１）の存在下で標的部位の上流の標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる標的部位での重合反応の触媒を容易にする。開始プライマーは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体からなることができる。イニシエータープライマーは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、および２５０を超えるヌクレオチド由来のヌクレオチドなどのように、ヌクレオチドの数が変動してもよく、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて、標的配列またはその任意の部分からオリゴヌクレオチド産物が合成される。ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであっても、またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列は、例えば、タンパク質などの他の分子に結合していても、または結合していなくてもよい。
【０１５５】
重合反応中、イニシエーターは、反応混合物に添加されているヌクレオチドの組み入れを介して、ポリメラーゼによって伸長または延長される。ポリメラーゼ反応が進行するとき、ポリメラーゼは、反応混合物中に存在する対応するヌクレオチドを取り込むことにより、テンプレート配列によって指令される通りにイニシエーターを伸長させる。１つの実施形態では、これらの反応物ヌクレオチドは、チェーンターミネーター（例えば、ｎ個の５’ｐｐｐＮＴ−Ｒ２、上記の鎖終結類似体）を含む。ポリメラーゼがチェーンターミネーターを発生期のオリゴヌクレオチド産物に取り込むと、ポリメラーゼはチェーンターミネーターのペントース環上の３’位のヌクレオチドの付加を触媒することができないため、鎖延長が終止する。従って、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド産物（即ち、５’Ｒ１−（ＮＩ）ｚｐＮＴ−Ｒ２、ここで、ｚ＝ｘ＋ｙ）を遊離し、標的部位での不稔開始合成反応を再開することによって、開始された合成事象を中断する。
【０１５６】
不稔開始反応は、予め定められた数のヌクレオチドだけイニシエーターを伸長した後に合成を中断するように、制御することができる。例えば、イニシエータが単一のヌクレオチドによって伸長された後に合成反応を終止することを所望する場合、例えば、（１）反応混合物に、チェーンターミネーターであるヌクレオチドのみを添加し、従って、ポリメラーゼによる第１のヌクレオチドの組み入れ後に重合を阻害すること；または（２）標的部位の遺伝子配列が既知である場合、反応混合物に、標的部位でヌクレオチドに相補的である予め選択されたヌクレオチド類似体（即ち、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、もしくはＵのうちの１つを含むヌクレオチド類似体）のみを添加することのいずれかによって、これを達成することができる。あるいは、予め決定された数のヌクレオチドだけイニシエーターが延長された後に合成反応を終止することを所望する場合、および標的部位の遺伝子配列が既知である場合、例えば、反応混合物に、標的部位のＮ番目のヌクレオチドに相補的である（ここで、Ｎは、イニシエーターを除くオリゴヌクレオチドが含む予め決定された数のヌクレオチド）予め決定された鎖終結ヌクレオチド類似体（即ち、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、もしくはＵのうちの１つを含むヌクレオチド類似体）を添加することによって、これを達成することができる。この様式では、イニシエーターおよび鎖終結ヌクレオチド類似体を含む複数の不稔オリゴヌクレオチド産物がポリメラーゼによって合成される。
【０１５７】
ポリメラーゼは、酵素結合部位から転位することもまたは標的ポリヌクレオチド配列から解離することもなく、オリゴヌクレオチド産物を遊離する。ヌクレオチド欠損を使用して、ポリメラーゼ結合部位のポリヌクレオチドを隔離することもできる。例えば、イニシエーターおよびターミネーターのみが供給される場合、ポリメラーゼによる延長は不可能である。
【０１５８】
さらに、不稔転写開始のために反応条件を最適化することができ、それによって、ポリメラーゼが、延長しているヌクレオチドの存在下ででも、ポリメラーゼ結合部位への結合を保持することが支持される。不稔開始反応緩衝液を最適化して、塩の濃度、２価のカチオン、グリセロールの含有量、および使用すべき還元剤の量およびタイプを調節することによって、不稔事象を増大する。さらに、「障害（ｒｏａｄｂｌｏｃｋ）」タンパク質を使用して、ポリメラーゼが転位することを防止することができる。
【０１５９】
本発明の別の態様では、イニシエーターは、５’リン酸基（図３に記載）、ペントース環の２’位、またはイニシエーターに取り込まれるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のうちの１つのプリンもしくはピリミジン塩基に共有結合できる部分（例えば、図２に記載のＲ１）を含む。さらに、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドへの組み入れのための反応混合物に含まれる反応物ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体もまた、それぞれ、核酸塩基（図４に記載）か、またはペントース環の２’位もしくは３’位のいずれかに共有結合する部分（例えば、図２に記載のＲ２）を含む。例示的実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、イニシエーターおよびチェーンターミネーター上の標識部分（図５に記載）であり、ポリメラーゼによってオリゴヌクレオチドに組み入れられ、検出可能なシグナル（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（図７）、蛍光または比色（図８））、を発生する様式で相互作用するように適応され、従って合成されるオリゴヌクレオチド産物の検出および定量を可能にする。１つの実施形態では、図９に示されるように、エネルギードナー基（Ｒ１）を有するイニシエーター（ＮＩ）およびエネルギーアクセプター基（Ｒ２）を有する鎖終結ヌクレオチド（ＮＴ）を取り込むオリゴヌクレオチド産物（５’−Ｒ１−（ＮＩ）ｘｐＮＴ−Ｒ２）は、合成されたオリゴヌクレオチド産物が特定の波長の光を照射される場合、Ｒ１からＲ２への蛍光共鳴エネルギー移動を介してシグナルを発生する。図９に示されるように、特定された波長（λ１Ａ）（例えば、Ｒ１の吸収極大）の光への暴露によって、イニシエーター上のエネルギードナー部分Ｒ１が励起される場合、励起されたドナー部分Ｒ１は、Ｒ２により吸収可能である第２の波長（λ１Ｅ／２Ａ）（例えば、Ｒ１の放射極大）を放射する。ＮＴが、ポリメラーゼによって、オリゴヌクレオチド産物に適切に組み入れられた場合、ＮＴ上のエネルギーアクセプターＲ２は、ＮＩ上にあるＲ１の十分付近に配置され（例えば、約８０Å内）、Ｒ１とＲ２との間での効率的なエネルギー移動を可能にし、そのため、Ｒ２は、励起されたドナー部分Ｒ１から放射される光の波長（λ１Ｅ／２Ａ）を吸収する。λ１Ｅ／２Ａの吸収に応答して、励起されたＲ２アクセプター部分は、第３の波長（λ２Ｅ）の光を放射し、次いで、当該分野において周知である方法に従って検出および定量することができる。例示的Ｒ１および／またはＲ２のＦＲＥＴ標識部分は、アエダンス（ａｅｄａｎｓ）およびフルオレセイン（図７に記載）、またはピレン、スチルベン、クマリン、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、ナフタレン、ピリジルオキサゾール、ナフタルイミド、ＮＢＤ、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）ＴＭ、ならびに上記でより詳細に説明した任意のものを含む。
【０１６０】
図１０において概要を図示した代替的実施形態では、いずれかのヌクレオチド（それぞれ、Ｎ１およびＮ２）上のレポーター部分（Ｒ１およびＲ２）含むｎコピーのジヌクレオチドイニシエーター（５’Ｒ１−Ｎ１ｐＮ２−Ｒ２−ＯＨ３’）は、ポリメラーゼによって伸長され、第３のレポーター部分（Ｒ３）を含むｎコピーのチェーンターミネーター（５’ｐｐｐＮ３Ｒ３）を取り込むことができ、ｎコピーの検出可能なトリヌクレオチド転写物（５’Ｒ１−Ｎ１ｐＮ２Ｒ２ｐＮ３−Ｒ３−ＯＨ３’）を生じる。図１０を参考にして、上記の様式と同様の様式で、トリヌクレオチド転写物に、第１のヌクレオチド（Ｎ１）上のＲ１エネルギードナー基を励起して、λ１Ｅ／λ３Ａを放射する第１の波長の光（λ１Ａ）を照射することができる。次いで、λ１Ｅ／λ３Ａは、鎖終結ヌクレオチド（Ｎ３）上のＲ３エネルギーアクセプター基に吸収され、次いで、励起されたＲ３はをλ３Ｅを放射し、次いで、これは検出および定量することができる。あるいは、転写物に、第２のヌクレオチド（Ｎ２）上のＲ２エネルギードナー基を励起して、λ２Ｅ／λ３Ａを放射する第２の波長の光（λ２Ａ）を照射することができる。次いで、λ２Ｅ／λ３Ａは、Ｒ３エネルギーアクセプター基に吸収され、次いで、励起されたＲ３はをλ３Ｅを放射し、次いで、これは検出および定量することができる。いずれの場合においても、ポリメラーゼが、イニシエーター（Ｒ１またはＲ２）上のエネルギードナーレポーター部分を、組み入れられたヌクレオチド上の対応するエネルギーレポーター部分（Ｒ３）の十分近接に運んで初めて、検出可能な波長（λ３Ｅ）が入手される。
【０１６１】
別の実施形態では、図１１において概要を図示した通り、標的部位プローブを使用し、標的配列の標的部分にバブル複合体を形成させることができる。上記のようにして、バブル複合体は、標的部位を含む一本鎖領域に隣接する二本鎖領域を含む。本実施形態では、標的部位プローブを使用して、一本鎖バブル領域と標的配列上の下流の二重鎖領域との接続部に標的配列を位置させることにより、ポリメラーゼを標的部位に指向させる。例示的実施例では、標的部位プローブは、次の約１８〜５４ヌクレオチドを含む：標的部位の上流の標的配列（Ａ’）にハイブリダイズする第１の領域（Ａ）は約５〜２０ヌクレオチドを含む；塩基対形成をしないヌクレオチドの内部の第２の領域（Ｂ）は約８〜１４ヌクレオチドを含む；および標的の下流の標的配列（Ｃ’）にハイブリダイズする第３の領域（Ｃ）は約５〜２０ヌクレオチドを含む。ポリメラーゼはイニシエーターと会合し、テンプレート配列上の標的部位で合成反応を開始する。ポリメラーゼはイニシエーターを延長し、適切なチェーンターミネーターを含むヌクレアーゼの組み入れを介して、不稔オリゴヌクレオチド産物を合成する。鎖終結ヌクレオチドを含むイニシエーターおよびヌクレオチドの両方は、標識部分で修飾され、上記のように、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動などによって、シグナルの検出を可能にする。
【０１６２】
従って、標的配列上の反復合成開始事象を介する複数のオリゴヌクレオチド産物を検出するための例示的手順は：（ａ）場合により、特定または一般的標的配列にハイブリダイズするように設計されるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化すること；（ｂ）場合により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブと標的配列を潜在的に含有する試験サンプルとをハイブリダイズさせること；（ｃ）場合により、標的配列と標的部位プローブとをハイブリダイズさせること；（ｄ）イニシエーターおよびチェーンターミネーターを含むヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾して、ポリメラーゼによって合成されたオリゴヌクレオチド産物の検出を可能にすること；（ｅ）標的配列とプライマーとをハイブリダイズさせること；ならびに（ｆ）チェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを組み入れ、酵素結合部位からの転位もまたは標的配列からの解離のいずれも伴わずに不稔オリゴヌクレオチド産物を遊離させることによって、ポリメラーゼが、オリゴヌクレオチド産物を反復的に合成するように、ポリメラーゼによってイニシエーターを伸長させること、を含むことができる。
【０１６３】
ＲＮＡポリメラーゼによるテンプレートの転写の間、ＲＮＡイニシエーターは、反応混合物に添加されているヌクレオチドの組み入れを介して、ＲＮＡポリメラーゼによって伸長される。ポリメラーゼ反応が進行するとき、ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレート配列によって指令される通りに、反応混合物に存在する対応するヌクレオチドを取り込むことによって、ＲＮＡイニシエーターを伸長する。１つの実施形態では、これらの反応物ヌクレオチドはチェーンターミネーター（例えば、ｎ個の５’ｐｐｐＮＴ−Ｒ２、上記の鎖終結ヌクレオチド類似体）を含む。ＲＮＡポリメラーゼがチェーンターミネーターを発生期の転写物に取り込むと、ポリメラーゼはチェーンターミネーターのリボース環上の３’位のヌクレオチドの付加を触媒することができないため、鎖延長が終止し、ＲＮＡポリメラーゼは、転写物を遊離し、標的部位で転写を再開することによって、開始された転写事象を中断する。不稔転写開始反応は、ＲＮＡプライマーおよび鎖終結ヌクレオチド類似体を含む予め決定された複数の不稔オリゴヌクレオチド転写物が作製されるように、制御することができる。
【０１６４】
例示的実施形態では、ＲＮＡイニシエーターはモノヌクレオチドであってもよく、反応混合物に提供されるヌクレオチドは、チェーンターミネーターのみを含むこともできる。本実施形態では、ＲＮＡイニシエーターが単一のヌクレオチドによって伸長された後、ＲＮＡポリメラーゼによって転写は中断され、不稔ジヌクレオチド転写物が作製される。別の実施形態では、ＲＮＡイニシエーターは、例えば、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを含むことができ、不稔転写開始事象は、それぞれ、トリヌクレオチドまたはテトラヌクレオチドを含む不稔転写物を作製する。ＲＮＡイニシエーターの長さならびに反応混合物に含めるために選択される反応物ヌクレオチドの性質および組成に依存して、任意の所望される長さの不稔転写物を得ることができることが理解されよう。例えば、テンプレートのヌクレオチド配列が既知である場合、任意の所望される長さの不稔転写物が、本発明の方法によって作製されるように、転写反応の成分（例えば、標的部位、イニシエーター、および反応物ヌクレオチド）を選択することができる。
【０１６５】
本発明の別の実施形態では、ＲＮＡイニシエーターは、５’リン酸基、リボース環の２’位、あるいはＲＮＡイニシエーターに取り込まれるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のうちの１つのプリンもしくはピリミジン塩基に共有結合することができる部分（例えば、図６に記載のＲ１）を含む。さらに、ＲＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド転写物への組み入れのために、反応混合物に含まれる反応物ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体はまた、それぞれ、核酸塩基か、またはリボース環の２’位もしくは３’位のいずれかに共有結合する部分（例えば、図６に記載のＲ２）を含むことができる。部分Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、Ｈ、ＯＨ、または上記でより詳細に説明した任意の適切な標識部分、レポーター基、もしくはレポーター基前駆体を含むことができる。
【０１６６】
従って、標的配列上の反復合成開始事象を介する複数のオリゴヌクレオチド転写物を検出するための例示的手順は：（ａ）場合により、特定または一般的標的配列にハイブリダイズするように設計されるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化すること；（ｂ）場合により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブと標的配列を潜在的に含有する試験サンプルとをハイブリダイズさせること；（ｃ）場合により、標的配列と標的部位プローブとをハイブリダイズさせること；（ｄ）ＲＮＡイニシエーターおよびチェーンターミネーターを含むヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾して、ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたオリゴヌクレオチド転写物の検出を可能にすること；（ｅ）標的配列とＲＮＡイニシエーターとをハイブリダイズさせること；ならびに（ｆ）チェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを組み入れ、酵素結合部位からの転位もまたは標的配列からの解離のいずれも伴わずに不稔オリゴヌクレオチド転写物を遊離させることによって、ＲＮＡポリメラーゼが、オリゴヌクレオチド転写物を反復的に合成するように、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡイニシエーターを伸長させること、を含むことができる。
【０１６７】
本発明の別の態様に従えば、図８において概要を図示した通り、本発明の方法を利用して、例えば、固定化タグなどの部分（Ｒ１）を有する（ＮＩ）；例えば、シグナルジェネレーターまたはシグナルジェネレーター前駆体などの標識部分（Ｒ２）を含む鎖終結ヌクレオチド（ＮＴ）を作製することができる。本実施形態では、オリゴヌクレオチド産物は、例えば、メンブラン上などで捕捉または固定化され、不稔合成反応のオリゴヌクレオチド産物の検出を容易にする。例示的実施形態では、Ｒ１は、例えば、ビオチンなどの生体付着性タグであり；Ｒ２は、例えば、フルオレセインなどの標識部分であり；Ｒ１生体付着性タグによって固体マトリックスに結合されるオリゴヌクレオチド産物は、Ｒ２標識部分からの放射を介して検出を指令することが可能である。別の例示的実施形態では、例えば、抗ジニトロフェニル（抗ＤＮＰ）などの抗体は固体マトリックスに結合され；Ｒ１は、例えば、ジニトロフェニル(ＤＮＰ)などの固定化タグであり；Ｒ２は、例えば、反応性チオールなどのレポーターまたはレポーター前駆体であり；ならびに銀／金発達時では、Ｒ１タグによって固体マトリックスに結合するオリゴヌクレオチド産物は、照射を伴わずに裸眼で見ることができる発色シグナルを生じる。
【０１６８】
本発明の不稔合成および検出方法の応用
本発明の方法は、様々な診断場面で使用することができる。例示目的のために、特定の遺伝子のメチル化状態を評価する方法、既知の遺伝子変異の存在を検出する方法、ｍＲＮＡ発現レベルを検出する方法、ならびにタンパク質を検出および増幅する方法について説明する。
【０１６９】
ＤＮＡメチル化
本発明の方法は、特定の疾患状態に関連することが公知である特定の遺伝子およびそれらの調節領域のメチル化を評価することによって、疾患の初期および進行に関連するエピジェネティックな変化を検出する診断アッセイに使用することができる。ＤＮＡメチル化は、配列のコーディング機能を改変することなく、ＤＮＡの特性を改変するための細胞機構である。ＤＮＡ−（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼによって触媒されるメチル化反応は、Ｓ−アデノシルメチオニンから標的のシトシン残基にメチル基を転移し、５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）を形成する（図１２）。ゴンザルゴ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ）ら、米国特許第６，２５１，５９４号を参照のこと。ＣｐＧジヌクレオチドで５−ｍＣｙｔを含有するゲノムの領域は、「ＣｐＧアイランド」と呼称される。ＤＮＡ  ＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化状態の変化は、一般に、加齢細胞において生じる一方、遺伝子メチル化の改変（増加かまたは減少のいずれか）は、癌を含む多くのタイプの疾患において、しばしば、早期かつ恒久的事象である。ＣｐＧアイランドは、付近の遺伝子であるＤＮＡ調節領域に見出される傾向があり、これらの遺伝子が活性であるかまたは不活性であるかのいずれかを決定する。細胞増殖を調節する、従って、腫瘍抑制遺伝子のように癌の発達を防止または阻害する多くの遺伝子が、正常な細胞増殖を促進するために活性（非メチル化）でなければならない。例えば、癌遺伝子などの他の遺伝子は、異常な細胞増殖を促進しないように、不活性（メチル化）でなければならない。
【０１７０】
例えば、多くのタイプの癌は、ＣｐＧアイランドメチル化の異なる組み合わせまたはパターンに関連する。図１６のグラフは、遺伝子メチル化の改変が、様々なタイプの癌に関連し得る様式を例示している。グラフは、１３種の例示的癌（前立腺、腎臓、膀胱、食道、肺、胃、大腸、血液、乳房、皮膚、脳、肝臓、および卵巣）を、同定されたタイプの癌の初期および進行に関連するメチル化の変化を有することが明らかにされている４９の遺伝子に対してプロットしている。グラフ内の長円形（癌のタイプによってコードされる）は、遺伝子に対する異常なメチル化状態（即ち、正常な状態が非メチル化である場合にメチルかまたは正常な状態がメチル化である場合に非メチル化）を示す。各タイプの癌は、異なるパターンのメチル化改変遺伝子に関連し得るため、癌に罹患した器官は、メチル化遺伝子の器官特異的組み合わせに基づいて潜在的に同定することができる。例えば、前立腺癌細胞の場合、遺伝子４、９、１０、１４、１９、２２、３２、および３３は、異常なメチル化状態を示すことが明らかにされている。従って、標準化された診断が、これらの８つの遺伝子のメチル化状態を容易に評価し得るならば、前立腺癌の初期、進行、および再発を容易にモニターし、より有効な患者処置戦略を開発することができる。図１６は、メチル化状態およびパターンの改変が様々なタイプの癌を示す遺伝子の唯一のサブセットを表す。
【０１７１】
遺伝子疾患としての癌
癌は、細胞分裂サイクルを調節する多数の腫瘍抑制遺伝子の発現を介して活発に防止される。このネガティブコントロールシステムは増殖促進遺伝子（癌原遺伝子）の効果が、高度に規定された条件下のみで個々の細胞が増殖および分裂を経験することを確実にすることを調和する。良性および悪性腫瘍に関する研究から、癌は、無作為に蓄積された変異全体が癌原遺伝子の発現を増強するかまたは腫瘍抑制遺伝子を不活化するかのいずれかである複数の段階過程で発達することが示唆されている（ボーゲルシュテインＢ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ）およびキンズラーＫ．Ｗ．（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．９：１３８−１４１（１９９３）；ノーウェルＰ．Ｃ．（Ｎｏｗｅｌｌ．Ｐ．Ｃ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９４：２３−２８（１９７６））。腫瘍細胞では、ヘテロ接合性が頻繁に消失することから、乳癌では少なくとも１ダースの劣性変異の関与が指摘されている（カラハンＲ（Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｒ）ら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９８：２１−３０（１９９３））。ゲノムの不安定性は、悪性細胞においてさえ重要な因子を構成し、該細胞のいくつかに薬物耐性などの変化をもたらす新たな改変を獲得させる（シフォンＭ．Ａ．（Ｃｉｆｏｎｅ，Ｍ．Ａ．）およびフィドラーＬ．Ｊ．（Ｆｉｄｌｅｒ，Ｌ．Ｊ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８：６９４９−６９５２（１９８１）；ホリイＡ．（Ｈｏｒｉｉ，Ａ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３３７３−３３７５（１９９４）；ローブＬ．Ａ．（Ｌｏｅｂ，Ｌ．Ａ．），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３０７５−３０７９（１９９１）；ティスティーＴ．Ｄ．（Ｔｉｓｔｙ，Ｔ．Ｄ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：９４４１−９４４５（１９８９））。ゲノム不安定性の供給源における腫瘍進行における重要な問題。かなりの証拠により、体細胞変異が癌原遺伝子の調節の欠損、ならびに腫瘍抑制遺伝子およびＤＮＡ修復遺伝子の不活化の原因であることを示している。これらの変化は、アポトーシスの消失から生じる変異および持続的ＤＮＡ損傷の存在下での細胞分裂の制御不能を介して、相互作用し、ゲノム不安定性を促進する。最近の証拠は、ＣｐＧ配列での不稔ＤＮＡメチル化事象が、それらのプロモーターを不活化することによって、腫瘍抑制遺伝子の不活化への代替的経路を提供することを示している。
【０１７２】
ＣｐＧアイランドメチル化および遺伝子発現
ヒトゲノムのＤＮＡメチル化は、ジヌクレオチド配列ＣｐＧのＣに対して最も頻繁に生じる。これらの部位でのメチル化は、遺伝子刷り込み、転位因子の不活化、および女性におけるＸ染色体の不活化を含む多くの過程に役割を果たすと考えられている。ＣｐＧ配列には明らかな機能的重要性があるにも係わらず、ヒトゲノムは、ヒトＤＮＡにおけるＣおよびＧの全体の頻度に与えられる予想よりも４〜５倍低い頻度でしかＣｐＧ字ヌクレオチドを有さない。この分布は、おそらく、５−メチルシトシンのチミンへの脱アミノ化によって駆動されるメチル化Ｃの緩徐な選択的除去に反映する。ゲノムのＣｐＧ含有量は、２つのクラスに組織化される。ＣｐＧ配列の大きな画分は、局所Ｃ＋Ｇ含有量に与えられるＣｐＧの予想される頻度を含有するＣｐＧアイランドとして既知である約４５，０００クラスターに分布する。ＣｐＧアイランドは、約３００〜３０００ｂｐの長さの範囲であり、全てのヒトプロモーターの約５０％で重複する（アンテクエラＦ．（Ａｎｔｅｑｕｅｒａ，Ｆ．）およびバードＡ．（Ｂｉｒｄ，Ａ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：１１９９５−１１９９９（１９９３））。正常な細胞では、ＣｐＧアイランドはメチル化されていない一方、ＣｐＧアイランド以外のクラスター化されていないＣｐＧ配列は一様にメチル化されている。ＣｐＧ配列のＣのメチル化と重複するプロモーターの活性との間には相反する関係が存在する。ＣｐＧアイランドの緩徐な加齢に関連するメチル化は、影響を受けた遺伝子の発現の緩徐な減少をもたらし得る。
【０１７３】
発癌に対するバイオマーカーとしてのＣｐＧアイランドのメチル化
ＣｐＧメチル化は、癌の進行に対する潜在的に強力なマーカーである。腫瘍生検由来の腫瘍抑制遺伝子のプロモーターの検査により、ＣｐＧメチル化は、腫瘍の促進における変異の影響に十分相当する程度に一般的であることが示唆されている（トヨタＭ．（Ｔｏｙｏｔａ，Ｍ．）およびイッサＪ．−Ｐ．（Ｉｓｓａ，Ｊ．−Ｐ．），Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：３２９−３３３（２０００））。遺伝子癌に関連する腫瘍抑制遺伝子の２分の１は、それらのプロモーターの過剰メチル化を介して潜在的に不活化することができる。ＣｐＧメチル化の遺伝子パターンは、多くの細胞分裂について安定であるが、ＣｐＧアイランドのメチル化の加齢に関連する増加は、正常細胞でも発生する。ＥＲおよびベリスキャン（Ｖｅｒｉｓｃａｎ）遺伝子の場合、メチル化の加齢に関連する増加は、他の正常細胞での遺伝子発現の減少と相関する（イッサＪ．Ｐ．（Ｉｓｓａ，Ｊ．Ｐ．）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：５３６−５４０（１９９４）；トヨタＭ．（Ｔｏｙｏｔａ，Ｍ．）およびイッサＪ．Ｐ．（Ｉｓｓａ，Ｊ．Ｐ．），Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９：３４９−３５７（１９９９））。ＣｐＧアイランドメチル化の加齢に関連する増加に伴い、影響を受けやすい腫瘍抑制遺伝子が普及することから、加齢と癌との間の関係についての妥当な機構が示唆されている。加齢に関連するＣｐＧメチル化は、腫瘍抑制遺伝子発現が減少するときに腫瘍発生を促進する過剰増殖状態に寄与する。
【０１７４】
腫瘍抑制遺伝子プロモーターのＣｐＧ過剰メチル化は、腫瘍発生における変異と並んで重要であることは、遺伝性癌と自発癌との比較でも実証されている。ｈＭＬＨ１の生殖系列変異は、ミスマッチ修復の欠損により、マイクロサテライト反復配列における包括的改変に関連する家族性大腸癌を生じる。約１０〜１５％の散発性大腸癌は、マイクロサテライトの不安定性を示すが、ミスマッチ修復遺伝子の変異は、非家族請願では一般的ではない。ミスマッチ修復欠損を伴う８０％までの散発性腫瘍は、他の正常なｈＭＬＨ１遺伝子の転写を阻止するｈＭＬＨ１プロモーターの過剰メチル化を受けている（ハーマンＪ．Ｇ．（Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｇ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６８７０−６８７５（１９９８））。腫瘍細胞のｈＭＬＨ１発現は、過剰メチル化の反転後、回復した（ハーマンＪ．Ｇ．（Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｇ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６８７０−６８７５（１９９８））。同様の状況は、乳癌についても記載されている。家族性乳癌は、ＢＲＣＡ１の変異と強く関連する。他方、散発性乳癌はＢＲＣＡ１変異には関与しないが、ＢＲＣＡ１プロモーターの過剰メチル化によって促進される（ライスＪ．Ｃ．（Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｃ．）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１７：１８０７−１８１２（１９９８）；エステラーＭ．（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：５６４−５６９（２０００））。場合によって、不活化の態様は、明らかに組織特異的である。例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ａ／サイクリンＤ−Ｒｂシグナリング経路は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ欠損かまたはＲｂ遺伝子の変異のいずれかによって、事実上全ての癌で不活化される。ｐ１６ＩＮＫ４ａ消失は、欠失、点変異、またはプロモーターの過剰メチル化によって生じる。不活化の態様は、腫瘍タイプに依存する。ｐ１６ＩＮＫ４ａの欠損を有する大腸癌は、事実上常にｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターの過剰メチル化に関連する（ハーマンＪ．（Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４５２５−４５３０（１９９５））。
【０１７５】
ＣｐＧメチル化は多数の癌に関連し、しばしば、腫瘍発生の早期マーカーである。
事実上全ての一般的な癌由来の主な主要の公開された調査で、散発性癌において過剰メチル化されている６０種もの多くの遺伝子が同定された。これらの遺伝子は、腫瘍抑制、ＤＮＡ修復、細胞接着、およびアポトーシスを含む腫瘍発生の全ての生理学的に重要な態様に関与する。ＣｐＧメチル化パターンは、しばしば、癌の特定のタイプの特定の遺伝子に偏る。従って、癌のタイプおよび段階の両方を示す一般的癌のメチル化特性を開発することが可能であるはずである（ロバートソンＫ．（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｋ．），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：３１３９−３１５５（２００１））。複数のプロモーターのメチル化状態に関するデータは、いくらかの器官がサンプルに寄与することができる場合、腫瘍の局在についての手掛かりを付与し得る。例えば、脱離した膀胱、腎臓または前立腺細胞は、尿サンプルに多数存在し得る。これらの組織のそれぞれに由来する腫瘍は、しばしば、異なる組み合わせのＣｐＧアイランドメチル化に関連する（図１６）。
【０１７６】
事実上すべての場合において、腫瘍抑制遺伝子の欠損発現は、腫瘍進行の初期段階に始まる。進行した症状が出現する前にこれらの初期メチル化事象を検出することにより、癌の治療可能性が高いうちに癌を処置する機会が向上されるはずである。１つの研究では、喫煙者由来の喀痰サンプル中のＭＧＭＴおよびｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターのＣｐＧメチル化の検出により、肺がんの臨床診断が３年まで先行した（パルミサノＷ．Ａ．（Ｐａｌｍｉｓａｎｏ，Ｗ．Ａ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５９５４−５４５８（２０００））。
【０１７７】
例示的実施形態では、本発明の方法を利用して、メチル化状態およびパターンの改変を検出することができる診断技術を提供することによって、疾患の初期、進行、転移、再発、および処置治療に対する任意の応答をモニターすることができる。ＤＮＡフラグメントのメチル化シトシン残基は、例えば、重亜硫酸ナトリウムなどの脱アミノ化剤による脱アミノ化に対する上記残基の耐性に基づいて検出することができる。変性（即ち、一本鎖）ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムなどの脱アミノ化剤に暴露する場合、非メチル化シトシン（Ｃ）残基はウラシル残基（Ｕ）に変換され、メチル化シトシン残基（５−ｍＣｙｔ）は未変化のままである。即ち、図１４に例示されるように、重亜硫酸ナトリウムによる処置から生じる脱アミノ化によって、本来メチル化されていないシトシンは、それらの相補的塩基対形成パートナーをグアニン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）に変化させる。しかし、メチル化シトシン（５−ｍＣｙｔ）は、Ｇに対するそれらの塩基対形成特異性を保持する。従って、重亜硫酸ナトリウムによる脱アミノ化後、標的ＤＮＡ配列は、本来の非処置標的ＤＮＡ配列に存在するメチル化ＣｐＧアイランドと同じ数だけの相補的ＣｐＧアイランドを有する。さらに、図１４においてさらに例示されるように、本来の非処置の標的ＤＮＡ配列がメチル化ＣｐＧアイランドを有さない場合、重亜硫酸ナトリウム処置された標的ＤＮＡはもはやＣｐＧアイランドを含有しない。
【０１７８】
上記より、標的ＤＮＡ配列のＣｐＧアイランドのメチル化のレベルは、改変されていないＣｐＧの相対レベルを測定することによって、決定することができる。この相対的測定は、標的ＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムなどの脱アミノ化剤に暴露させた後、保持しているＣｐＧ部位で不稔転写を開始することによって、達成することができる。重亜硫酸ナトリウム反応は、標準的な技術に従って実施される。例えば、ゴンザルゴ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ）ら、米国特許第６，２５１，５９４号を参照のこと。１つの実施形態では、図１５に例示されるように、重亜硫酸ナトリウム処置されたＤＮＡ標的配列を、ＲＮＡポリメラーゼおよび例えば、モノヌクレオチドイニシエーター（５’Ｒ１−Ｃ−ＯＨ３’）などのイニシエーターと共にインキュベートされる。イニシエーターはポリメラーゼと会合し、ＤＮＡテンプレート上の無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＣｐＧ部位で転写およびＲＮＡ合成を開始する。各ＣｐＧ部位は、イニシエーターの伸長を指令し、図１５の部位１、３、および４に例示されるように、適切なチェーンターミネーター（例えば、ｐｐｐＧ−Ｒ２）の組み入れを介して、不稔転写物（例えば、５’Ｒ１−ＣｐＧ−Ｒ２３’）を合成することができる。イニシエーターおよび鎖終結ヌクレオチドのいずれかまたは両方を標識部位（例えば、それぞれ、Ｒ１およびＲ２）で修飾し、シグナル検出を可能にすることができる。例示的実施形態では、上記で詳述した通り、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介して転写物を検出することができる（例えば、プライマーは、その５’末端にエネルギードナー（Ｒ１）を含有し、ＮＴＰは、核酸塩基に結合したエネルギーアクセプター（Ｒ２）を含有する）。
【０１７９】
代替的実施形態では、重亜硫酸ナトリウム処置したＤＮＡ標的配列を、ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオチドイニシエーター（５’Ｒ１−ＣｐＧ−ＯＨ３’）と共にインキュベートすることができる。次いで、イニシエーターはポリメラーゼと会合し、ＤＮＡテンプレート上の無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＣｐＧ部位で転写およびＲＮＡ合成を開始する。次いで、各ＣｐＧ部位は、ジヌクレオチドイニシエーターの伸長を指令し、適切なチェーンターミネーターの組み入れを介して、不稔トリヌクレオチド転写物を合成する。チェーンターミネーターを含むヌクレオチド類似体は、ＤＮＡテンプレート配列に依存する。例えば、図１５の部位１では、適切なチェーンターミネーターは５’ｐｐｐＡ−Ｒ２３’を含み、得られる不稔トリヌクレオチド転写物は、５’Ｒ１−ＣｐＧｐＡ−Ｒ２３’である。
【０１８０】
別の実施形態では、図１５において概要を図示した通り、標的ＤＮＡ配列を、例えば、重亜硫酸ナトリウムで処置するなどによって、標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化した後、標的部位プローブを使用して、標的ＤＮＡ配列上に標的ＣｐＧ部位を含むバブル複合体を形成することができる。本実施形態では、標的部位プローブを使用して、一本鎖バブル領域と標的ＤＮＡ配列上の下流の二重鎖領域との接続部に標的ＣｐＧ部位を位置させることにより、ＲＮＡポリメラーゼを標的ＣｐＧ部位に指向させる。例示的実施例では、標的部位プローブは、次の約１８〜５４ヌクレオチドを含む：標的部位の上流の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする第１の領域は約５〜２０ヌクレオチドを含む；塩基対形成をしないヌクレオチドの内部の第２の領域は約８〜１４ヌクレオチドを含む；および標的部位の下流の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする第３の領域は約５〜２０ヌクレオチドを含む。ＤＮＡ標的配列をＲＮＡポリメラーゼおよび適切なＲＮＡイニシエーターと共にインキュベートする前、またはその間に、標的部位部プローブを、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることができる。ポリメラーゼはＲＮＡイニシエーターと会合し、ＤＮＡテンプレート上のＣｐＧ部位で転写およびＲＮＡ合成を開始する。ポリメラーゼはイニシエーターを伸長し、適切なチェーンターミネーターの組み入れを介して、不稔オリゴヌクレオチド転写物を合成する。イニシエーターおよび鎖終結ヌクレオチドのいずれかまたは両方を標識部位で修飾し、上記で詳述するように、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動などによって、シグナルの検出を可能にする。
【０１８１】
別の実施形態では、目的の遺伝子を捕捉するように、捕捉プローブを設計することができ、不稔転写開始を使用して、所望の遺伝子のメチル化状態を決定することができる。例えば、大腸癌などの特定の癌の進行に関連することが公知である遺伝子をモニターすることができ、該遺伝子には、ＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）、ＣＡＬＣＡ（カルシトニン）、ＥＲ（エストロゲン・レセプター）、ＧＳＴＰ１、ＨＩＣ１（癌１の過剰メチル化）、ｈＨＬＨ１、ＨＰＰ１／ＴＲ／ＴＥＮＢ２／ＴＭＥＦＦ２（ＥＦＧ様および２つのフォリスタチン様ドメイン２を有する膜貫通タンパク質）、ＬＫＢ１／ＳＴＫ１１、ＩＧＦ２  ＩＧＦ２（インスリン様成長因子）、ＭＧＭＴ（Ｏ６メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ１）、ＭＩＮＴ２５、ｐ１４（ＡＲＦ）、ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）／ＭＴＳＩ／ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＡＸ６（対形成ボックス遺伝子６）、ＲＡＲ−ベータ２、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン−１）、ベリスキャン（Ｖｅｒｉｓｃａｎ）、およびＷＴ１（ウィルムスの腫瘍抑制遺伝子）が含まれるが、これらに限定されない。目的のそれぞれの遺伝子は、目的の遺伝子に独特である捕捉配列へのハイブリダイゼーションにより、サンプルから取り出すことができる。捕捉配列は、磁気ビーズ、マイクロタイタープレート、セファロース、アガロース、陽イオン交換樹脂、側方フローストリップ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｓｔｒｉｐ）、ガラスビーズ、およびマイクロアレイチップを含むが、これらに限定されない固体マトリックスに固定化することができる。一旦、目的の遺伝子がサンプルから取り出されたら、不稔転写開始を使用して、各特定の遺伝子のメチル化状態を決定することができる。
【０１８２】
従って、ＤＮＡメチル化状態およびパターンを検出するための例示的手順は、（ａ）場合により、標的遺伝子のＣｐＧアイランド付近の領域に特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化すること；（ｂ）場合により、オリゴヌクレオチド捕捉プローブを、標的ＤＮＡ配列を潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルで処置すること；（ｃ）標的ＤＮＡ配列上の任意の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換し、任意のメチル化シトシン残基を改変せずに残すこと；（ｄ）場合により、標的ＤＮＡ配列と標的部位プローブとをハイブリダイズさせること；（ｅ）ＲＮＡイニシエーターおよびチェーンターミネーターを含むヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾し、オリゴヌクレオチド転写物の検出を可能にすること；（ｆ）標的ＤＮＡとＲＮＡイニシエーターとをハイブリダイズすること；ならびに（ｇ）チェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを組み入れ、酵素結合部位からの転位もまたは標的ＤＮＡ配列からの解離のいずれも伴わずに不稔オリゴヌクレオチド転写物を遊離させることによって、ＲＮＡポリメラーゼが、オリゴヌクレオチド転写物を反復的に合成するように、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡイニシエーターを伸長させること；ならびに（ｇ）複数の不稔オリゴヌクレオチド転写物を検出および場合により定量すること、を含むことができる。
【０１８３】
別の実施形態では、ＣｐＧメチル化は、２つのアッセイで評価される。第１のアッセイは、単一の反応において、複数の特異的ＣｐＧ部位のメチル化を測定することによって、ＣｐＧアイランドのメチル化の全体的レベルを示す。本アッセイの結果が、異常なレベルでＣｐＧがメチル化されていることを示す場合、第２のハイスループットメチル化アッセイを実施して、個々のＣｐＧ部位でのメチル化の程度を評価する。
【０１８４】
ＣｐＧエピジェネティックアッセイシステムを設計して、患者ＤＮＡサンプルを重亜硫酸ナトリウムに暴露することにより作製される配列の変化に基づいてシトシンおよび５−メチルシトシン間を区別する。重亜硫酸処置は、患者ＤＮＡの固定化の後に行われる。このアプローチは、小さなＤＮＡサンプル（＜１μｇのＤＮＡ）からの消失を伴わずに、緩衝液の交換を可能にする。図３２は、ＣｐＧアッセイの調製を示す。患者ＤＮＡ鎖を分離し、ＣｐＧアイランドに隣接するビオチン標識化プライマーを使用するプライマー伸長によって、アフィニティータグ化する（図３２Ａ）。ハイブリッド二重鎖を、二重結合ストレプトアビジンプレート上に固定化し、ここで、患者ＤＮＡ鎖の５’末端はチオホスフェートで標識される（図３２、ＣおよびＤ）。次いで、患者鎖を、ビオチン化ＤＮＡ鎖から分離し、それらのチオホスフェートを介して、マレイミドプレートに共有結合させる。この段階で、ＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウム介在性脱アミノ化反応への準備ができている。
【０１８５】
ＣｐＧメチル化を測定するために最も一般的に使用される重亜硫酸処置方法は、高温および低ｐＨで遊離ＤＮＡ鎖の長期インキュベーションを行うため（典型的に５５℃およびｐＨ５で１６時間）、相当なＤＮＡ損傷を生じる（フロマーＭ．（Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｍ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１８２７−１８３１（１９９２））。ほとんどの従来のＤＮＡメチル化アッセイでは、脱アミノ化からＤＮＡのセグメントを保護するヘアピン形成を防止するため、高温でのインキュベーションが必要である。標的化ＣｐＧはデオキシヌクレオチド標的部位プローブ（ＴＳＰ）との会合を介して一本鎖を保持すると考えられるため、比較的穏やかな条件（ｐＨ５で、３５℃を４時間）下で反応を行うことが可能である。最終メチル化アッセイでＴＰＳを使用し、部分的二重鎖構造に特定のＧｐＣを置くことによって、該特定のＧｐＣを標的化する（図３２、ＦおよびＨ）。ＣｐＧ検出アッセイにおいて、複数のＴＳＰをアイランドＤＮＡにアニールし、ＣｐＧメチル化の集成測定を得る。第２のＣｐＧアッセイでは、ウェルあたり単一のＴＳＰをアニールさせる。
【０１８６】
メチル化および非メチル化部位間の区別は、ＣｐＧ部位から短いオリゴヌクレオチド産物を反復的に産生するＲＮＡポリメラーゼによって実施される。個々のＣｐＧを、２つの成分：オリゴデオキシヌクレオチド標識部位プローブ（ＴＳＰ）およびジ−またはトリヌクレオチドイニシエーター、で標的化する。イニシエーターＣｐＧは、メチル化ＣｐＧ部位に特異的であり、イニシエーターＣｐＡは重亜硫酸処置によってＵｐＧに変換されている脱アミノ化部位に特異的である。適切なイニシエーターのアラインメントは、ＣｐＧに隣接する塩基によってコードされる放射性ＮＴＰの組み入れを可能にする。ＣｐＧｐＮおよびＣｐＡｐＮのオリゴヌクレオチド産物は、薄層クロマトグラフィーにより分離し、オートラジオグラフィーで検出することができる。両イニシエーターを同じ反応に含めて、ｐｍｏｌｅ  ＣｐＧｐＮ／ｐｍｏｌｅ  ＣｐＧｐＮ＋ＣｐＡｐＮで定義されるメチル化指数を与えた。
【０１８７】
メラノーマ以外の皮膚癌におけるＣｐＧメチル化の役割に関する情報はほとんどない。従って、本発明は、癌のメチル化状態を決定すること、およびそれ自体が広範な癌について改善された診断試験の開発において有用である。
【０１８８】
遺伝子変異
本発明の別の態様では、本明細書において開示された方法は、総染色体再配列または単一もしくは複数のヌクレオチド改変、置換、挿入、または欠失の形態で変異を検出する診断アッセイにおいて使用することができる。例示的実施形態では、図１７において概要を図示した通り、不稔オリゴヌクレオチド合成反応の使用を介して、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することができる。既知の標的ＳＮＰ配列（例えば３’ｄＮＸ’ｐｄＮＹ’ｐｄＮＴ’５’、式中、ｄＮＴ’は標的ＳＮＰ部位である）を、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ジヌクレオチドイニシエーターなどのＲＮＡイニシエーター、およびヌクレオチド（例えば、５’ｐｐｐＮＴ−Ｒ２などのチェーンターミネーター）と共にインキュベートすることができる。イニシエーターは、標的ＳＮＰ配列の上流に直ちに結合し、ポリメラーゼと会合し、標的ＳＮＰ部位で転写およびＲＮＡ合成を開始する。ある実施形態では、チェーンターミネーターを取り込むことによりポリメラーゼがイニシエーターを延長し、不稔トリヌクレオチド産物を産生する。イニシエーターおよび鎖終結ヌクレオチドのいずれかまたは両方を標識部位（例えば、それぞれ、Ｒ１およびＲ２）で修飾し、シグナル検出を可能にすることができる。例示的実施形態では、上記で詳述した通り、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介して転写物を検出することができる（例えば、イニシエーターは、その５’末端にエネルギードナー（Ｒ１）を含有し、チェーンターミネーターは、核酸塩基に結合したエネルギーアクセプター（Ｒ２）を含有する）。
【０１８９】
従って、標的ＤＮＡ配列の変異を検出するための例示的手順（図１８）は、（ａ）場合により、変異を含む標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化すること；（ｂ）場合により、捕捉プローブと、標的ＤＮＡ配列を潜在的に含有するＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせること；（ｃ）場合により、標的ＤＮＡ配列と標的部位プローブとをハイブリダイズさせること；（ｄ）場合により、ＲＮＡイニシエーター（Ｒ１Ｎ１−ＯＨ）およびチェーンターミネーターを含むヌクレオチド（ｐｐｐＮＴ−Ｒ２）のうちの少なくとも１つを修飾し、ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるオリゴヌクレオチド転写物の検出を可能にすること；（ｅ）標的ＤＮＡ配列とＲＮＡイニシエーターとをハイブリダイズすること；（ｆ）チェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを組み入れ、酵素結合部位からの転位もまたは標的ＤＮＡ配列からの解離のいずれも伴わずに不稔オリゴヌクレオチド転写物を遊離させることによって、ＲＮＡポリメラーゼが、標的変異に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を反復的に合成するように、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡイニシエーターを伸長させること；ならびに（ｇ）複数の不稔オリゴヌクレオチド転写物を検出および場合により定量すること、を含むことができる。
【０１９０】
病原生物体
本発明の別の態様では、本明細書において開示された方法は、生物体を培養する必要性を伴わずに、遺伝子を含有するか、もしくは特定の生物体の遺伝子タイピングを可能にする特定または包括的生物体のいずれかの存在を示すのに役立つことによって、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の存在を検出する診断アッセイにおいて使用することができる。試験サンプルは、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌などの特定の微生物由来の標的核酸配列を含有することが疑わしくあり得る。試験サンプルは、動物、植物またはヒト組織、血液、唾液、精液、尿、血清、脳脊髄液または髄液、胸膜液、リンパ、痰、乳管洗浄由来の液、粘膜分泌物、動物固体、糞、微生物の培養物、液体および固体の食物ならびに食品、廃棄物、化粧品、空気および水を含むが、これらに限定されない様々な供給源から回収することができる。
【０１９１】
本発明の別の態様では、本明細書において開示された方法は、生物体を培養する必要性を伴わずに、遺伝子を含有するか、もしくは特定の生物体の遺伝子タイピングを可能にする特定または包括的生物体のいずれかの存在を示すのに役立つことによって、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の存在を検出する診断アッセイにおいて使用することができる。例示的実施形態では、図１９において概要を図示した通り、標的病原体ポリヌクレオチドに配列特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを、例えば、マイクロタイタープレートなどの固体マトリックスに結合させ、捕捉プローブを、ハイブリダイズ条件下で、標的病原体ポリヌクレオチドを潜在的に含有する試験サンプルで処置する。試験サンプルは、例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌などの微生物などの特定の病原体由来の標的核酸配列を含有することが疑わしくあり得る。試験サンプルは、動物、植物またはヒト組織、血液、唾液、精液、尿、血清、脳脊髄液または髄液、胸膜液、リンパ、痰、乳管洗浄由来の液、粘膜分泌物、動物固体、糞、微生物の培養物、液体および固体の食物ならびに食品、廃棄物、化粧品、空気および水を含むが、これらに限定されない様々な供給源から回収することができる。
【０１９２】
標的病原体ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよい。試験サンプルに存在する標的病原体ポリヌクレオチドは捕捉プローブにハイブリダイズし、次いで、捕捉プローブによって固定化されなかった試験サンプルの任意の成分を除去するために、洗浄を実施する。標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば、プライマー伸長を介して特異的配列を添加することによって、回収することができる。例示的実施形態では、捕捉された標的病原体ポリヌクレオチドは、不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）にハイブリダイズさせる。ＡＰＣリンカー配列は、その３’または５’末端のいずれかに一本鎖張り出し領域を含む（捕捉プローブと逆併行ハイブリッドを作成するのに必要な配向に依存する）。言い換えれば、ＡＰＣリンカーは、捕捉された標的病原体ヌクレオチドの遊離末端上の配列に相補的であり、従って、ＡＰＣリンカーが標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする。
【０１９３】
イニシエーターおよびポリメラーゼは、反応混合物に添加される。イニシエーターは、標的部位での適切なポリメラーゼによる合成反応の触媒を容易にする位置で、ＡＰＣのバブル領域内でハイブリダイズする。イニシエーターは、ＲＮＡであってもまたはＤＮＡであってもよく、約１〜２５ヌクレオチドを含むことができ、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド類似体ならびにヌクレオチドを含むことができる。ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってもまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡ  ＡＰＣは、例えば、タンパク質などの他の分子に結合していてもまたは結合していなくてもよい。例示的実施形態では、ＡＰＣはＤＮＡを含み、イニシエーターはＲＮＡであり、ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１９４】
重合反応中、イニシエーターは、反応混合物に添加されているヌクレオチドの組み入れを介して、ポリメラーゼによって伸長または延長される。ポリメラーゼ反応が進行するとき、ポリメラーゼは、反応混合物中に存在する適切なチェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを取り込むことにより、バブル領域内のＡＰＣテンプレート配列によって指令される通りにイニシエーターを伸長させる。ポリメラーゼがチェーンターミネーターを発生期のオリゴヌクレオチド産物に取り込むと、ポリメラーゼは、組み入れられたチェーンターミネーターのペントース環上の３’位のヌクレオチドの付加を触媒することができないため、鎖延長が終止する。従って、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド産物を遊離し、標的部位での合成反応を再開することによって、開始された合成事象を中断する。イニシエーターおよび鎖終結ヌクレオチドのいずれかまたは両方を標識部位で修飾し、シグナル検出を可能にすることができる。例示的実施形態では、上記のような、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介してオリゴヌクレオチド産物を検出することができる（例えば、イニシエーターは、その５’末端にエネルギードナー（Ｒ１）を含有し、チェーンターミネーターは、核酸塩基に結合したエネルギーアクセプター（Ｒ２）を含有する）。
【０１９５】
従って、病原体の存在を検出するための例示的手順（図２０）は、（ａ）場合により、標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化すること；（ｂ）場合により、捕捉プローブと、標的病原体ポリヌクレオチドを潜在的に含有する試験サンプルとをハイブリダイズさせること、を含むことができる。標的核酸は、（ＲＮＡ病原体のための）逆転写酵素または（ＤＮＡ病原体のための）プライマー伸長を介してＤＮＡにコピーされてもよい。両塩基の場合とも、不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）リンカーに対応するＤＮＡ配列を標的コピーに添加する（図１）；（ｃ）場合により、捕捉された標的病原体ポリヌクレオチドを洗浄して、試験サンプルのハイブリダイズしなかった任意の成分を除去すること；（ｄ）捕捉された標的病原体ポリヌクレオチドと不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせること；（ｅ）イニシエーターおよびチェーンターミネーターを含むヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾し、ポリメラーゼによって合成されるオリゴヌクレオチド産物の検出を可能にすること；（ｆ）不稔プロモーターカセットとイニシエーターとをハイブリダイズさせること；（ｇ）チェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを組み入れ、酵素結合部位からの転位もまたはＡＰＣからの解離のいずれも伴わずに不稔オリゴヌクレオチド産物を遊離させることによって、ポリメラーゼが、標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド産物を反復的に合成するように、ポリメラーゼによってイニシエーターを伸長させること；ならびに（ｈ）複数の不稔オリゴヌクレオチド産物を検出および場合により定量すること、を含むことができる。
【０１９６】
本発明は、哺乳動物の病原体を検出するのに有用である。特に、本発明は、細菌、ウイルス、真菌、カビ、アメーバ、原核生物、および真核生物の検出に有用である。好適な哺乳動物としては、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。ヒトは特に好適である。
【０１９７】
本発明の方法は、病原体核酸およびタンパク質の有無をモニターするのに特に有用である。本発明を使用して、病原体ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する疾患および／または障害を検出、診断、およびモニターすることができる。本発明は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの異常発現の検出を提供する。該方法は、（ａ）上記の不稔開始転写の方法を使用して、個体の細胞、組織または体液中の目的のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現をアッセイすること、ならびに（ｂ）目的の配列の遺伝子発現、タンパク質発現のレベル、または存在と、標準的遺伝子もしくはタンパク質発現レベルまたは目的の配列とを比較し、それによって、標準レベルと比較したアッセイされたポリペプチドもしくはポリヌクレオチドレベルの増加または減少が、異常発現を示し、目的の病原体の存在を示すこと、を含む。
【０１９８】
個体由来の生検組織または体液中の転写物の異常な量の存在は、実際の臨床症状の出現の前に疾患を検出する手段を提供することができる。このタイプのより明確な診断は、医療従事者が予防的測定もしくは積極的治療を早期に用いることが可能であり、それによって、病原体によって生じる疾患の発症またはさらなる進行を防止することができる。
【０１９９】
本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、レンサ球菌（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ＨＩＶ、および肝炎病原体（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）を含むが、これらに限定されない病原生物体の存在をモニターするのに特に有用である。
【０２００】
本発明の方法を使用して、水性液体、特に水（飲料水または水泳用もしくは浴槽用の水など）、あるいは他の水溶液（細胞培養で使用される発酵ブロスおよび溶液）、あるいは呼吸に適した空気などの気体および気体の混合物、ならびに表面から粒状物質を散布、浄化、または取り出すために使用される気体における病原性微生物について試験することができる。家屋、学校、教室、作業場、航空機、スペースクラフト、車、機関車、バス、および人が集まる他の任意の建築物または構造物を含むが、これらに限定されない任意の供給源由来の呼吸に適した空気も、病原性微生物の存在について試験することができる。
【０２０１】
ｍＲＮＡ発現
本発明の別の態様では、本明細書において開示された方法は、定量または半定量様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現レベルを検出する診断アッセイに使用することができる。例示的実施形態では、図２１において概要を図示した通り、ｍＲＮＡ配列に配列特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを、例えば、マイクロタイタープレートなどの固体マトリックスに結合させ、捕捉プローブを、ハイブリダイズ条件下で、標的ｍＲＮＡ配列を含有することが疑わしい試験サンプルで処置する。試験サンプルに存在する標的ｍＲＮＡ配列は捕捉プローブにハイブリダイズし、次いで、捕捉プローブによって固定化されなかった試験サンプルの任意の成分を除去するために、洗浄を実施する。次いで、捕捉された標的ｍＲＮＡ配列を不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）にハイブリダイズさせる。例示した実施形態では、ＡＰＣは、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端上のｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌに相補的であるその３’末端に一本鎖ポリＴ張り出し領域を含むＡＰＣリンカー配列を有し、それによって、ＡＰＣリンカーが標的ｍＲＮＡのｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌにハイブリダイズすることを可能にする。
【０２０２】
イニシエーターおよびポリメラーゼは、反応混合物に添加される。イニシエーターは、標的部位の上流のＡＰＣのバブル領域内でハイブリダイズし、標的部位での適切なポリメラーゼによる合成反応の触媒を容易にする。イニシエーターは、約１〜２５ヌクレオチドを含むことができ、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド類似体ならびにヌクレオチドを含むことができる。ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってもまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。ＡＰＣは、例えば、タンパク質などの他の分子に結合していてもまたは結合していなくてもよい。例示的実施形態では、ＡＰＣはＤＮＡを含み、イニシエーターはＲＮＡであり、ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【０２０３】
重合反応中、イニシエーターは、反応混合物に添加されているヌクレオチドの組み入れを介して、ポリメラーゼによって伸長または延長される。ポリメラーゼ反応が進行するとき、ポリメラーゼは、反応混合物中に存在するチェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを取り込むことにより、バブル領域内のＡＰＣテンプレート配列によって指令される通りにイニシエーターを伸長させる。ポリメラーゼがチェーンターミネーターを発生期のオリゴヌクレオチド産物に取り込むと、ポリメラーゼは、組み入れられたチェーンターミネーターのペントース環上の３’位のヌクレオチドの付加を触媒することができないため、鎖延長が終止する。従って、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド産物を遊離し、標的部位での合成反応を再開することによって、開始された合成事象を中断する。イニシエーターおよび鎖終結ヌクレオチドのいずれかまたは両方を標識部位で修飾し、上記で詳述されているような例えば、蛍光共鳴エネルギー移動などのシグナル検出を可能にすることができる。
【０２０４】
従って、ｍＲＮＡ発現レベルを検出するための例示的手順は、（ａ）場合により、特定のまたは一般的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化すること；（ｂ）場合により、捕捉プローブと、標的ｍＲＮＡ配列を潜在的に含有する試験サンプルとをハイブリダイズさせること；（ｃ）場合により、捕捉された標的ｍＲＮＡ配列を洗浄して、試験サンプルのハイブリダイズしなかった任意の成分を除去すること；（ｄ）捕捉された標的ｍＲＮＡ配列と不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせること；（ｅ）イニシエーターおよびチェーンターミネーターを含むヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾し、ポリメラーゼによって合成されるオリゴヌクレオチド産物の検出を可能にすること；（ｆ）不稔プロモーターカセットとイニシエーターとをハイブリダイズさせること；（ｇ）チェーンターミネーターを含む相補的ヌクレオチドを組み入れ、酵素結合部位からの転位もまたはＡＰＣからの解離のいずれも伴わずに不稔オリゴヌクレオチド産物を遊離させることによって、ポリメラーゼが、標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド産物を反復的に合成するように、ポリメラーゼによってイニシエーターを伸長させること；ならびに（ｈ）複数の不稔オリゴヌクレオチド産物を検出および場合により定量すること、を含むことができる。
【０２０５】
タンパク質の検出
本発明の別の態様では、本明細書において開示された方法は、タンパク質を検出する診断アッセイに使用することができる。図２２に示されるように、不稔プロモーターカセットリンカーは、リンカーが、ＡＰＣに結合したＡＰＣリンカーに相補的であるように、結合したタンパク質修飾基によって作製することができる。
【０２０６】
従って、タンパク質を検出するための例示的手順は、（ａ）一級アミン、二級アミン、またはスルフヒドラル基を介して、画定された配列（ＡＰＣリンカー）のＤＮＡの短片をタンパク質に結合させること；（ｂ）タンパク質に対する抗体または他のいくらかのアフィニティー剤で修飾されたタンパク質を回収および固定化すること；ならびに（ｃ）標識されたタンパク質上のＡＰＣリンカーに対するＡＰＣカセットのハイブリダイゼーションにより、タンパク質に不稔プロモーターカセットを結合させること；（ｄ）（ｉ）ハイブリダイズ条件下でＤＮＡをイニシエーターヌクレオチドで処理すること；および（ｉｉ）ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼおよび検出を可能にするヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体で処置すること、によってタンパク質を検出すること、を含むことができる。過程（ｄ）は、結合した各ＲＮＡポリメラーゼに対し反復的に生じる。
【０２０７】
癌の検出
本発明は、哺乳動物において癌を検出するのに有用である。特に、本発明は、癌の診断中に有用である。好適な哺乳動物としては、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。ヒトは特に好適である。
【０２０８】
本発明の方法は、ＤＮＡメチル化の状態、遺伝子変異、ｍＲＮＡ発現パターン、およびタンパク質発現パターンをモニターするのに特に有用である。本発明を使用して、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの異常発現および／または活性に関連する疾患ならびに／あるいは障害を検出、診断、およびモニターすることができる。本発明は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの異常発現、変異の存在、およびＤＮＡのメチル化状態の変化の検出を提供する。該方法は、（ａ）上記の不稔開始転写の方法を使用して、個体の細胞、組織または体液中の目的のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現をアッセイすること、ならびに（ｂ）目的の配列の遺伝子発現、タンパク質発現のレベル、または存在と、標準的遺伝子発現レベルとを比較し、それによって、標準レベルと比較したアッセイされたポリペプチドもしくはポリヌクレオチドレベルの増加または減少が、異常発現を示し、目的の癌あるいは病原体の存在を示すこと、を含む。
【０２０９】
個体由来の生検組織または体液中の転写物の異常な量の存在は、目的の癌もしくは疾患の発症についての素因を示すことができるか、または実際の臨床症状の出現の前に疾患を検出する手段を提供することができる。このタイプのより明確な診断は、医療従事者が予防的測定もしくは積極的治療を早期に用いることが可能であり、それによって、病原体によって生じる癌もしくは疾患の発症またはさらなる進行を防止することができる。
【０２１０】
本発明の診断アッセイは、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、癌、乳癌、大腸癌、嚢胞性線維症、脆弱Ｘ症候群、血友病ＡおよびＢ、腎疾患、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、網膜芽腫、筋緊張性ジストロフィー、テイ−サックス病、ウィルソン病、ならびにウィリアム病を含むが、これらに限定されない任意の疾患の診断および予後のために使用することができる。これらのアッセイは、全てのタイプの癌の診断および予後に特に有用である。
【０２１１】
本発明のキット
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットを提供する。そのようなキットは、本発明に従ってアッセイを行うのに必須である定量の様々な組成物を、１つもしくはそれ以上の容器内に、アッセイおけるキットの使用を容易にするために通常簡便に包装して、含む。従って、キットは、本発明に従う１つもしくはそれ以上のイニシエーターを含む。キットは、例えば、キットのプライマーを伸長するためのＲＮＡおよび／またはＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ活性を有する酵素、ならびに標的核酸を処理するための試薬をさらに含んでなってもよい。キットはまた、本発明の方法によって合成されるオリゴヌクレオチド産物の検出を可能にするためのヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体を含んでなってもよい。キットはまた、標的核酸上にバブル複合体を形成するためのオリゴヌクレオチド標的部位プローブを含んでもよい。キットはまた、不稔プロモーターカセットを含有してもよい。キットはまた、メンブラン、アフィニティー材料、試験管、ペトリ皿、およびディップスティックを含むが、これらに限定されない材料の回収ならびに輸送のための成分を含有してもよい。キットはまた、特定の標的配列に特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブが結合しているマイクロタイタープレート、バイオチップ、磁気ビーズ、ゲルマトリックス、または他の形態の固体マトリックスを含んでもよい。キットにおける成分の相対量は、本明細書において開示した方法の実施に関与する反応を実質的に最適化するおよび／または任意のアッセイの感度をさらに最適化する試薬濃度を提供するために、変動することができる。
【０２１２】
本発明のキットはまた、当業者に周知である通り、キットを使用して行われるアッセイの信頼性および確度を確実にし、キットを使用する試験サンプルの定量分析を可能にするために、標的配列がない（ネガティブコントロール）場合も含む既知の標的核酸濃度の溶液などの様々なコントロールおよび標準を含むことができる。場合により、キットは、一般的な取扱説明書である１組の指示書を含んでもよいが、本発明の方法の成分の使用に関する該指示書は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスクまたは光学ディスク）に保存されていてもよい。キットによって提供される指示書はまた、一般に、本発明の方法を実施するために必要または好適である試薬（キットに含まれているかまたは含まれていないかに係わらず）、キットの使用方法に対する指示、および／または適切な反応条件に関する情報を含む。
【実施例】
【０２１３】
以下の実施例は、例示のみの目的で提供さるものであり、これに限定する趣旨はない。当業者であれば、本質的に同様の結果を得るために変更または改変することができるそれほど重要ではない多様なパラメータについては、容易に認識するであろう。
【０２１４】
実施例１
色素標識イニシエーターの合成
ヌクレオチドを化学的に修飾するためのいくらかの反応のうちの１つについて、ここで説明する。トリリンク・バイオ・テクノロジーズ（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）より購入した５’ａ−Ｓ−ＣＴＰを、製造者の指示に従って、仔ウシ腸製ホスファターゼで処置した。ホスファターゼは標識反応の効率を増大するため、ホスファターゼ処置は重要である。ホスファターゼ処置後、１２．５ｍＭα−Ｓ−ＣＭＰを、５μｌの０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１５μｌのＤＭＦ、および１５μｌのＤＭＦ中９０ｍＭ  ＩＡＥＤＡＮＳ（モレキュラー・ブローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）より購入）に混合し、室温で、１時間、インキュベートした。反応物を５容量の水飽和エチルエーテルで抽出した。水相を取り出し、エバポレーションでエーテルを除いた。当該分野において公知の標準的なプロトコルに従って、薄層クロマトグラフィーを実施したところ、反応は、首尾よく、５’−ＩＥＡＤＡＮＳ−Ｓ−ＣＭＰを生成したことを実証した（図２６）。
【０２１５】
実施例２
ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡプライマー開始不稔転写
不稔転写開始のために、反応条件を最適化した。バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｔの成分および濃度は、不稔転写開始を支持する。バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｔは：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、２．８％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる。プライマーは、リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）かまたはジヌクレオチドのいずれかであり、０．２〜１．３ｍＭの濃度範囲にある。最終ＮＴＰ濃度は、０．２〜１．３ｍＭの範囲である。濃度の上限は、調製不稔転写のために設計した。テンプレートＤＮＡ濃度は、リン酸濃度で２μＭ未満である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼは、１５ｎＭ〜４００ｎＭの間の最終濃度で添加する。ホロ酵素またはコアのいずれかを一本鎖テンプレートＤＮＡと共に使用することができる。酵母無機ピロリン酸ホスファターゼは、ピロリン酸の蓄積を防止するために、調製反応において１単位／ｍｌで添加した。高濃度のピロリン酸は、合成反応を反転することができ、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ産物を犠牲にして、ＮＴＰを再作製する。１単位のピロリン酸は、２５℃およびｐＨ７．２で１分間あたり１．０μＭの無機オルトリン酸を遊離させる酵素の量として規定される。反応は、調製反応で３７℃で７２時間までインキュベートする。これらの条件は、特定のテンプレートについて代表的なものであり、特定の成分および濃度について最適化することにより、不稔転写の効率を増強することができる。
【０２１６】
本実施例では、次の３つの異なるイニシエーターを使用した：（１）ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧ；（２）ビオチンＡｐＧ；および（３）ＡｐＧ。５分間９５℃で煮沸することにより、標的核酸テンプレートを変性し、直ちに氷上に置いた。
各反応物を以下の通りに調製した：
５．０μｌ  １×バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｔ
２．５μｌのａ−３２Ｐ−ＵＴＰ
１４．３μｌ  ｄｄＨ２Ｏ
１μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）
１００ｎｇ（２μｌ）のテンプレートＤＮＡ
１０ｎｍｏｌｅ（１．２μｌ）のイニシエーター
２２．８μｌの反応緩衝液
【０２１７】
３７℃で１２〜１６時間、インキュベートする。当該分野において公知の標準的方法を使用して、薄層クロマトグラフィーを実施し、３位におけるＵＴＰの組み入れの程度を決定した（図２７）。
【０２１８】
ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧおよびビオチンＡｐＧの両方は、ヌクレオチドＵＴＰの組み入れを可能にした。ビオチンＡｐＧは、ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧよりも効率的に組み入れたが、ＡｐＧほどではなかった。
【０２１９】
実施例３
標識されたターミネーターによる不稔開始反応
標識されたイニシエーターおよび／または標識されたターミネーターによって、不稔転写開始反応を実施することができる。以下の反応条件を使用して、標識されたターミネーターを組み入れた。
５μｌ  １×バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｔ
１３．５μｌ  ｄｄ  Ｈ２Ｏ
３μｌ  １００ｎｇ変性ＤＮＡテンプレート（ｐＢＲ３２２）
１μｌ  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
１．２μｌ  ジヌクレオチドイニシエーターＡｐＧ
１．５μｌの７ｍＭ  ＳＦ−ＵＴＰ
【０２２０】
温度制御マイクロタイタープレートリーダー中、３７℃で１６時間、混合物をインキュベートする。当該分野において公知の標準的方法を使用して、薄層クロマトグラフィーを実施し、標識されたトリヌクレオチドＡｐＧｐＵが作製されたことを実証した（図２８）。
【０２２１】
実施例４
ドナーおよびアクセプター間の蛍光エネルギー移動
上記の実施例では、標識されたイニシエーターおよびターミネーターの両方がオリゴヌクレオチド産物に組み入れられ得ることを実証した。標識されたヌクレオチドの組み入れを測定するための１つの効率的な方法は、蛍光共鳴エネルギー移動によるものである。以下の条件を使用して、標識されたイニシエーターおよび標識されたターミネーター間のＦＲＥＴを実証した。
５μｌ  １×リアクション・バッファー（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）(バッファー(Ｂｕｆｆｅｒ)Ｔ)
３μｌ  変性ＤＮＡテンプレート（３００ｎｇ  ｐＢＲ３２２）
１３．５μｌ  ｄｄＨ２Ｏ
１μｌ  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
１．２μｌ  イニシエーター（ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧまたはＡｐＧまたはビオチン−ＡｐＧ）
１．５μｌの７ｍＭ  ＳＦ−ＵＴＰ
【０２２２】
反応混合物を、温度制御マイクロタイタープレートリーダー中、３７℃で１６時間、インキュベートし、以下のパラメータで読み取りを設定した：Ｅｘ４８５、Ｅｍ６２０、ゲイン３５、９９読み取り／ウェル／サイクル。上記の反応条件下で、ＲＮＡポリメラーゼは、イニシエーター（ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧ）およびターミネーター（ＳＦ−ＵＴＰ）からなるオリゴヌクレオチド産物を反復的に合成する。
【０２２３】
オリゴヌクレオチド産物ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵ−ＳＦの形成により、イニシエーターおよびターミネーターは相互に８０オングストローム内に配置され、化学部分間のエネルギーの移動を可能にする。エネルギーは、ドナーであるＳＦ−ＵＴＰからアクセプターであるＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧへ移動する。エネルギーのこの移動は、ＴＡＭＡＲＡ（ＴＡＭＡＲＡ吸収＝５４０ｎｍ；放射＝５６５ｎｍ）の波長放射の変化によって検出および／または定量することができる。
【０２２４】
図２９Ａに示される通り、オリゴヌクレオチド産物が作製されると、ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧとＳＦ−ＵＴＰとの間でエネルギー移動が生じ、ＴＡＭＡＲＡが放射する波長が変化する。ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡが反応から除かれる場合、イニシエーターとターミネーターとの間のエネルギーの移動は認められず、ＴＡＭＡＲＡが放射する波長は変化しない（図２９Ｂおよび２９Ｃ）。
【０２２５】
実施例５
ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の特定の残基のメチル化状態の決定
分析しようとするサンプルを、ヒト糞便サンプルから回収する。糞便サンプルからのＤＮＡ抽出の方法については、当該分野において周知であり、キアゲン(Ｑｉａｇｅｎ)（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））製ＱＩＡアンプＤＮＡスツール・ミニ・キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）などの糞便サンプルからヒトＤＮＡを抽出するための商業用キットが市販されている。
【０２２６】
抽出後、目的の遺伝子のための捕捉プローブを含有するマイクロタイタープレートのウェルにサンプルを適用し、この特定の実施例では、捕捉プローブはＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のためのものである。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のＣｐＧアイランドに対する代表的捕捉プローブは、次の通りである：
【０２２７】
ＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧ。ＤＮＡサンプルを捕捉プローブと共にインキュベートして、ハイブリダイゼーションを可能にする。代表的ハイブリダイゼーションプロトコルは、次の通りである：（１）２．５×ＳＳＣ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）で室温で３０分間、プレハイブリダイズする；（２）２．５×ＳＳＣ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、３０％ホルムアミドで室温で２時間、ハイブリダイズする；（３）１×ＳＳＣ、４２℃で１０分間２回洗浄し、４２℃を維持する；（４）０．１×ＳＳＣ、４２℃で１０分間３回洗浄し、４２℃を維持する。
【０２２８】
ＤＮＡを、重亜硫酸ナトリウムなどの脱アミノ化剤で処置し、ＤＮＡ中の非メチル化Ｃを脱アミノ化する一方、メチル化Ｃは未変化のままにする。次いで、ウェルを中等度のストリンジェンシー条件で洗浄し、残りの重亜硫酸ナトリウムを除去する。
【０２２９】
代表的転写反応は、以下の成分からなる：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホロ酵素ＲＮＡポリメラーゼ；反応緩衝液：１０ｎＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０；１０ｍＭ  ＫＣｌ；０．５ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ；および５０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；イニシエーター、およびヌクレオチド類似体。特定のヌクレオチド配列に対する反応条件は変動してもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７、またはＳＰ６などの他のポリヌクレアーゼを使用してもよい。塩濃度、２価のカチオンおよび濃度、グリセロール含有量、ならびに使用すべき還元剤の量およびタイプを調整することによって、不稔開始事象を増大するために、反応緩衝液を最適化することができる。
【０２３０】
イニシエーターは、フルオレセインにより５’−Ｓを介して標識される５’−αＳｐＣｐＧ二量体であり、本反応ではドナーとして機能する。ヌクレオチド類似体はＴＡＭＡＲＡで標識され、本反応ではアクセプターとして機能する。イニシエーターは、ＦＲＥＴ反応において、ドナーまたはアクセプターのいずれかで標識することができ、標識イニシエーターに使用されるフルオレセインに依存して、ヌクレオチド類似体は、ドナーまたはアクセプターのいずれかで標識される。
【０２３１】
フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され、得られる放射ピークは約５１５ｎｍにおいてである。ＴＡＭＡＲＡがフルオレセインに接近している場合、５４２ｎｍで励起され、５６８ｎｍの放射ピークが得られる。金紫外線波長はフルオレセインを励起するが、ローダミンは励起しない。従って、シグナルは、フルオレセインがローダミンの付近にある場合にのみ発生する。このシグナルは、このＦＲＥＴ対のための特定の励起および放射フィルターが固定されている蛍光マイクロタイタープレートリーダー内で発生およびモニターすることができる。これらのフィルターおよびプレートリーダーは、多くの供給源から市販されているが、ほとんどの臨床検査室および研究施設はすでにフルオレセンマイクロタイタープレートリーダーを使用している。
【０２３２】
実施例６
ＣｐＧメチル化の測定
ＣｐＧメチル化は２つのアッセイで評価される。第１のアッセイは、単一の反応において、複数の特異的ＣｐＧ部位のメチル化を測定することによって、ＣｐＧアイランドのメチル化の全体的レベルを決定する。本アッセイが、異常なレベルでＣｐＧがメチル化されていることを示す場合、個々のＣｐＧ部位に対して、第２のハイスループットメチル化アッセイを実施する。
【０２３３】
脱アミノ化のための患者ＤＮＡの調製
ＣｐＧエピジェネティックアッセイシステムを設計して、患者ＤＮＡサンプルを重亜硫酸ナトリウムに暴露することにより作製される配列の変化に基づいてシトシンおよび５−メチルシトシン間を区別する。重亜硫酸処置は、患者ＤＮＡの固定化の後に行われる。このアプローチは、小さなＤＮＡサンプル（＜１μｇのＤＮＡ）からの消失を伴わずに、緩衝液の交換を可能にする。図３２は、ＣｐＧ検出アッセイの調製を示す。患者ＤＮＡ鎖を分離し、ＣｐＧアイランドに隣接するビオチン標識化プライマーを使用するプライマー伸長によって、アフィニティータグ化する（図３２、Ａ）。ハイブリッド二重鎖を、二重結合ストレプトアビジンプレート上に固定化し、ここで、患者ＤＮＡ鎖の５末端はチオホスフェートで標識される（図３２、ＣおよびＤ）。次いで、患者鎖を、ビオチン化ＤＮＡ鎖から分離し、それらのチオホスフェートを介して、マレイミドプレートに共有結合させる。この段階で、ＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウム介在性脱アミノ化反応への準備ができている。
【０２３４】
ＣｐＧメチル化を測定するために最も一般的に使用される重亜硫酸処置方法は、高温および低ｐＨで遊離ＤＮＡ鎖の長期インキュベーションを行うため（典型的に５５℃およびｐＨ５で１６時間）、相当なＤＮＡ損傷を生じる（フロマーＭ．（Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｍ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１８２７−１８３１（１９９２））。ほとんどの従来のＤＮＡメチル化アッセイでは、脱アミノ化からＤＮＡのセグメントを保護するヘアピン形成を防止するため、高温でのインキュベーションが必要である。標的化ＣｐＧはデオキシヌクレオチド標的部位プローブ（ＴＳＰ）との会合を介して一本鎖を保持すると考えられるため、比較的穏やかな条件（ｐＨ５で、３５℃を４時間）下で反応を行うことが可能である。最終メチル化アッセイでＴＰＳを使用し、部分的二重鎖構造に特定のＧｐＣを置くことによって、該特定のＧｐＣを標的化する（図３２、ＦおよびＨ）。ＣｐＧ検出アッセイにおいて、複数のＴＳＰをアイランドＤＮＡにアニールし、ＣｐＧメチル化の集成測定を得る。第２のアッセイでは、ウェルあたり単一のＴＳＰをアニールさせる。
【０２３５】
ＲＮＡ転写反応によるＣｐＧメチル化の測定
メチル化および非メチル化部位間の区別は、ＣｐＧ部位から短いオリゴヌクレオチド産物を反復的に産生するＲＮＡポリメラーゼによって実施される。個々のＣｐＧを、２つの成分：オリゴデオキシヌクレオチド標識部位プローブ（ＴＳＰ）およびジ−またはトリヌクレオチドイニシエーター、で標的化する。イニシエーターＣｐＧは、重亜硫酸処置によってＵｐＧに変換されている脱アミノ化部位に特異的である。適切なイニシエーターのアラインメントは、ＣｐＧに隣接する塩基によってコードされる放射性ＮＴＰの組み入れを可能にする。ＣｐＧｐＮおよびＣｐＡｐＮのオリゴヌクレオチド産物は、薄層クロマトグラフィーにより分離し、オートラジオグラフィーで検出することができる。両イニシエーターを同じ反応に含めて、ｐｍｏｌｅ  ＣｐＧｐＮ／ｐｍｏｌｅ  ＣｐＧｐＮ＋ＣｐＡｐＮで定義されるメチル化指数を与えた。
【０２３６】
実施例７
癌におけるＣｐＧアイランドの役割
メラノーマ以外の皮膚癌におけるＣｐＧメチル化の役割に関する情報はほとんどない。従って、メチル化研究は、広範な癌における異常にメチル化された６つのＣｐＧおよびメラノーマに関連する１つのアイランドに注目して行った（表２）。
【０２３７】
【表２】
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【０２３８】
実施例８
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素によるＲＮＡプライマー開始不稔転写
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素によるＲＮＡプライマー開始不稔転写。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は、プロモーター配列を欠く一本鎖ＤＮＡ分子から転写を開始することができる。図３４は、変性ポリ［ｄＧ−ｄＣ］（１０μｇ／２５μｌ反応）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素（１．９ｐｍｏｌｅ／反応）により転写された実験を示す。不稔転写は、ジヌクレオチドＧｐＣにより開始された。ＧＴＰは、プライマーの延長に利用可能な唯一のヌクレオシド三リン酸であった。テンプレート鎖(ＣＴＰ)によってコードされる他のヌクレオシド三リン酸は、脱落した。図３４ａは、トリヌクレオチド産物ＧｐＣｐＧの存在およびＧＴＰ濃度に対する依存を示す。図３４ｂの結果は全ての検出可能な産物が１つのサイズであることを示すことから、トリヌクレオチド産物の形成後、ＣＴＰの脱落により、効率的に転写が終止したことを示す。
【０２３９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は、部分的な相補的非テンプレートパートナーを欠くテンプレート鎖では、バブル複合体基体を強く優先する。図３５は、ＤＮＡバブル複合体対対応する単一のテンプレート鎖で見た大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素による相対的転写活性を示す。ＲＮＡポリメラーゼは、等価モル量のテンプレート鎖単独（図３３ｃ、図３５、サンプル１〜４対サンプル５〜８）で供給される場合よりも、バブル複合体１（図３３ｂ）では、７０倍高い活性レベルを示した。バブル複合体ＤＮＡを優先するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを調べた実験でも同様の結果が得られた。
【０２４０】
多様なプロモーター認識特性を有するＲＮＡポリメラーゼは、バブル複合体１を、不稔転写の基質として使用することができる。図３６は、バブル複合体１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホロ酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コアＲＮＡポリメラーゼ、ファージＴ７およびファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした実験の結果を示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホロ酵素および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コアポリメラーゼの反応緩衝液は、１５０ｍＭ酢酸Ｎａを含んだ。高塩濃度はＴ７およびＳＰ６酵素を阻害するため、Ｔ７およびＳＰ６反応からは酢酸Ｎａを除いた。全ての反応は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８緩衝液、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＤＴＴを含有した。イニシエーターＡｐＡおよびＵＴＰは、それぞれ全ての反応において１ｍＭで提供された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホロ酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コアポリメラーゼよりも約２倍多い産物を産生し、Ｔ７およびＳＰ６よりもポリメラーゼあたり約１０倍多い産物を産生した。Ｔ７およびＳＰ６酵素の性能は、それらの反応緩衝液の最適化によって、潜在的に改善され得る。
【０２４１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素およびコア酵素に活性のレベルが同様であることから、コア酵素は、ホロ酵素の特性であるプロモーター配列特異性を欠くため、ポリメラーゼによる認識には、特定のプロモーター配列を所有することよりも、バブル複合体の構造の方が重要であることが示唆される。同様に、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターを認識する能力を欠く。
【０２４２】
アッセイの感度は、放射性前駆体およびオートラジオグラフィー検出によるプライマー開始不稔転写に基づく。プライマー開始不稔転写反応に基づく検出アッセイの感度は、検出可能なシグナルを発生し得る最小量のバブル複合体１を規定することによって決定した（図３７）。一連の不稔転写反応は、減少した量（１０フェムトモル〜１ゼプトモル／２５μｌ反応）のバブル複合体１で実施した。転写は、ＡｐＡおよび放射性ＵＴＰで開始した。ＵＴＰは、産物をトリヌクレオチドＡｐＡｐＵに限定するために反応に含まれる唯一のヌクレオシド三リン酸であった。図３７ａおよび３７ｂは、各転写反応の時間経過における薄層クロマトグラフを示す。各ＴＬＣプレートを１時間、−４０℃でＸ線フィルムに暴露した。３時間のＲＮＡポリメラーゼ不稔転写反応後、１０フェムトモルのバブル複合体由来のシグナルは、本来のオートラジオグラフで明らかに検出可能であった。１００アットモルのバブル複合体１由来のＡｐＡｐＵシグナルは、２４時間の転写後、検出可能であった（図３７ｂ）。感度のレベルは、リン光発光またはβ照射の直接計数を用いて、放射性検出の代替的方法で改善することができる。
【０２４３】
上記において、特定の実施形態を参考にして本発明を説明した。しかし、以下の請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修飾および変更を行うことができることが理解されよう。本明細書および図面は、制限的様式ではなく、例示的様式でを考慮すべきであり、全ての改変は、本発明の範囲内にあることが意図される。従って、本発明の範囲は、添付の請求の範囲およびそれらの法的等価物によって決定されるべきであり、上記の実施例によるものではない。例えば、任意の方法またはプロセスクレームにおいて引用される個々の作用は、任意の準で実行することができ、請求の範囲に記載された順に制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２４４】
【図１】不稔プロモーターカセットを表す。不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）は、ポリメラーゼ結合部位を形成する核酸の領域であり、ＡＰＣＲリンカーと呼ばれる特定の核酸配列との相互作用を介して他の高分子と結合することができる。ＡＰＣリンカーは、標的核酸のテンプレートまたは非テンプレート鎖のいずれかにおける相補的な配列へのハイブリダイゼーションによって、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合することができるＡＰＣリンカーはまた、タンパク質に結合する分子の検出のために、前記タンパク質などの任意の分子に配置される相補的配列にもハイブリダイズすることができる。複数の検出可能なオリゴヌクレオチドは、不稔プロモーターカセットに結合したポリメラーゼによって作製される。本図面に示したＡＰＣは、「バブル領域」によって分離される必須相補性（Ａ、Ａ’およびＣ、Ｃ’）の２つの領域を含有する。本スキームでは、２つの鎖に非相補的な領域が存在する（Ｂ、およびＥ）ため、「バブル領域」が作製される。あるいは、ＡＰＣは、２つの完全な相補鎖を有することもできる。ＲＮＡポリメラーゼの結合時に、ＤＮＡは分離して、「バブル領域」の形成をもたらす。  領域Ａ、Ｂ、およびＣは１つの鎖の上に存在する。領域Ｃ’、Ｅ、およびＡ’は相補砂上に存在する。ＡＰＣは、２つの個別の鎖（ＡＢＣおよびＣ’ＥＡ’）からされていてもよく、また６つの全ての領域は、領域ＣおよびＣ’がリンカー領域Ｄによって分離され、必要な長さであるように修飾することができるように単一のポリヌクレオチド上にあってもよい。リンカー領域Ｄは、ＣおよびＣ’を結合する役割のみを果たしてもよく、また領域Ｄの配列は、ＥｃｏＲＩ  ＱＩＩＩ変異、ｌａｃリプレッサーおよび他のＲＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されない転写障害タンパク質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｏａｄｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの不稔転写を増強することができる他の因子に対する結合部位としての役割を果たしてもよい。単一の障害タンパク質、または複数の障害タンパク質のためにリンカー領域Ｄを設計してもよい。リンカー領域Ｄの長さは、リンカー領域の機能に依存する。
【図２】反復オリゴヌクレオチド合成によるシグナル発生を表す。複数（ｎ個の）高度に類似または同一のオリゴヌクレオチド産物への１つもしくはそれ以上のヌクレオチド類似体の酵素的組み入れによって、シグナルが発生する。適切な条件において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、プロモーターの非存在下で核酸テンプレートから作製することができる。イニシエーターは、１つもしくはそれ以上のヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体からなり得る。イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチドならびに２５０を超えるヌクレオチドを含むがそれらに限定されない１つもしくはそれ以上の共有結合したヌクレオチドを含有し得、官能性Ｒ基を含有し得る。イニシエーター（ｎコピー）は、ｎコピーのターミネーターによって末端鎖延長まで直接延長することができるか、またはｎコピーの他のエロンゲーターヌクレオチド（Ｙ位）をイニシエーターとターミネーターとの間に組み入れてより長いオリゴヌクレオチドを形成させることができる。ターミネーターは第２の官能基を含有してもよい。ＮＩ＝モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の開始、ＮＥ＝モノヌクレオチドまたは類似体の延長、ＮＴ＝モノヌクレオチドまたは類似体の終結、Ｚ＝ｘ＋ｙ；Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、またはレポーター基；Ｒ２＝Ｈ、ＯＨ、またはレポーター基；Ｎ＝デオキシまたはリボヌクレオチド；ポリメラーゼ＝ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡまたはＲＮＡはタンパク質などの他の分子に結合してもよい。
【図３】５’ＡＥＤＡＮＳ−Ｓ−ＡＭＰの合成を表す。モノヌクレオチド転写イニシエーター：ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（２−（（ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ−１−ナフタレンスルホン酸アルキレート））ＡＭＰＳ（５−α−チオ−ＡＭＰ）が蛍光転写イニシエーターを形成する例。この類似体は５’三リン酸基を有さないため、転写のみを開始することができ、従って、内部にも終末にも組み入れられ得ない。
【図４】エロンゲーターまたはターミネーターになりうるヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチドの内部または３’末端位に含まれ得るヌクレオチド類似体を示す。これらの全ての類似体は、３’ＯＨ基を単純に置き換えることによってターミネーターに変換することができる。
【図５】Ｒ１またはＲ２になり得る他の蛍光基を表す。オリゴヌクレオチドは、様々な官能基で標識することができる。いくらかの好適な蛍光基を示す。
【図６】一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける不稔開始を介するジヌクレオチド合成を表す。一本鎖（ｓｓ）核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＮＩ＝３’−ＯＨヌクレオシドまたはヌクレオチドイニシエーター；ＮＴ＝５’三リン酸ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体ターミネーター。Ｒ１は、５’リン酸基上、糖の２’位、またはプリンもしくはピリミジン塩基上にあってもよい。Ｒ２は、ピリミジンもしくはプリン塩基上あるいは糖／リボースまたはデオキシリボースの２’もしくは３’位にあってもよい。Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、および／または本明細書に記載の任意のレポーター基もしくはレポーター基前駆体。Ｒ２＝Ｈ、ＯＨ、および／または本明細書に記載の任意のレポーター基もしくはレポーター基前駆体。シグナルは、検出することができる任意のシグナルであってもよく、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または比色を含むがこれらに限定されない。１つの例として、Ｒ１は、ＡＥＤＡＮＳであってもよく、Ｒ２はフルオレセインであってもよい。シグナルはＲ１からＲ２へのＦＲＥＴにより発生する。
【図７】５’−ＡＥＤＡＮＳ−ＳｐＡｐＵ−フルオレセインを表す。ＦＲＥＴ検出のための不稔開始により作製されるジヌクレオチド。適切な波長の光により励起されると、Ｒ１（ＡＥＤＡＮＳ）は、Ｒ２（フルオレセイン）に蛍光エネルギーを付与し、次いで、検出かつ定量することができる異なる波長の蛍光を放射する。この蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、効率的なエネルギー移動のために２つの基を十分に近づける転写中に２つの基が共に結合して、ＡＥＤＡＮＳ−ＳｐＡｐＵ−フルオレセインを形成する場合にのみ生じる。
【図８】ジヌクレオチド産物を介するシグナル発生を表す。Ｒ基が異なる機能を有するように、イニシエーターヌクレオチド上に１つのＲ基およびターミネーターヌクレオチド上に別の基を含有するオリゴヌクレオチドを合成することができる。例えば、Ｒ１がビオチンである場合、Ｒ１はオリゴヌクレオチド産物の固定化に使用することができ、Ｒ２はシグナル生成を可能にする。  例１：Ｒ１タグ＝ビオチン、Ｒ２タグ＝フルオレセイン：フルオレセイン放射の検出。  例２：Ｒ１タグ＝ＤＮＰ、Ｒ２タグ＝反応性チオール
【表３】
2006507792.tif 000004
【図９】不稔開始によるＦＲＥＴ検出のためのシグナル発生を表す。２〜２５ヌクレオチドを含有し、異なる２つのＲ基（１つは転写中に作製されるオリゴヌクレオチド産物の各末端にあるかまたは末端付近にある）を有するオリゴヌクレオチドを反復的に合成することができる。基質上の２つのＲ基間のエネルギー移動は、標識されたイニシエーターおよび標識されたターミネーターヌクレオチド間での酵素的ホスホジエステル結合形成によるテンプレート指向性オリゴヌクレオチド合成中に２つのＲ基が接近した後にのみ生じることができる。ＮＩ上のＲ１ドナー基は、サンプルにλ１Ａの波長の光（ここで、λ１ＡはＲ１基の吸収極大である）を照射することによって励起することができる。励起されたＲ１ドナー基は、λ１Ｅの波長の光（ここで、λ１ＥはＲ１基の放射極大であり、また、Ｒ２基による吸収のための波長（λ２Ａ）でもある）を放射する。ＮＴ上のアクセプターＲ２基は、ＮＩ上の励起されたＲ１ドナー基によって放射された波長λ１Ｅ／λ２Ａの光を吸収する。ＮＴ上の励起されたアクセプターＲ２基は、検出かつ定量される波長λ２Ｅの光を放射する。同様に、Ｒ２は、Ｒ１へのエネルギードナーであってもよく、Ｒ１からの放射が検出される。標的関連テンプレートが存在しなければ、オリゴヌクレオチドは合成されない。
【図１０】トリヌクレオチドエネルギー移動を表す。標識されたオリゴヌクレオチド合成は、標識されたジヌクレオチドイニシエーターによって開始される。標識は、ジヌクレオチドイニシエーターの５’ヌクレオチド（Ｒ１）または３’ヌクレオチド（Ｒ２）のいずれの上にあってもよい。イニシエーターは、標識された（Ｒ３）５’−ヌクレオシド三リン酸ターミネーターヌクレオチド類似体によって延長される。示されるように、エネルギー移動を介する検出を調整して、Ｒ１またはＲ２を利用することができる。イニシエーターおよびターミネーター間での核酸テンプレート指向性ホスホジエステル結合形成が存在しなければ、Ｒ基は十分に離れたままであり、エネルギー移動は検出されない。この例では、λ３Ｅとして放射されるエネルギーの量は、テンプレート関連標的の存在量に正比例する。同様に、Ｒ基は、図８において実証されるように、他のアプリケーションのために変更してもよい。
【図１１】標的部位プローブを表す。ＲＮＡポリメラーゼは、遺伝子特異的または領域特異的標的部位プローブ（ＴＳＰ）のハイブリダイゼーションによって、標的核酸の特異的ヌクレオチド位置（部位）に指向される。標的部位とは、配列（一塩基多型の検出におけるように）または構造（特定のヌクレオチドのメチル化状態の評価におけるように）のために分析しようとするＤＮＡのヌクレオチド位置であり、該部位は、標的配列における領域ＥおよびＣ’の接続部における標的配列のテンプレート鎖上に位置する。ＴＳＰは、標的ヌクレオチドの上流約８〜１４ヌクレオチドから始まり、約１５〜３５ヌクレオチドで終了する標的核酸（領域Ａ）に対して相同である領域を含有する。ＴＳＰの第２の領域は、ＴＳＰが標的核酸にハイブリダイズする場合に融解状態の「バブル」領域を形成するように、標的部位（領域Ｂ）の直ぐ上流の８〜１４ヌクレオチドに対しては非相補的であるように設計される。ＴＳＰは、標的ヌクレオチドの直ぐ下流の５〜２５ヌクレオチドに対して本質的に相補的である第３の領域（領域Ｃ）を含有する。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ／Ｃ’接続部で転写が開始し、下流のＣ／Ｃ’ハイブリッドの方へ移動するように、バブル複合体に結合する。
【図１２】ＤＮＡ中のＣｐＧアイランドのメチル化を表す。ヒトゲノムは、ヒトＤＮＡにおけるＣおよびＧの全体の頻度が与えられた場合に予想されるよりも４〜５倍低い頻度のＣｐＧジヌクレオチドを有する。ＣｐＧ配列の大きな画分がＣｐＧアイランドとして公知であるクラスターに分布している。これらの配列パターンは、３００から３０００ヌクレオチド長の間であり、全てのヒトプロモーターの約６０％で重複する。ＣｐＧアイランド以外の残りのＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化Ｃを含有する。ＣｐＧアイランド以外のＣｐＧメチル化は寄生性ＤＮＡの発現を不活化することによってゲノムを安定化し、発生において非依存的に必須な役割を果たす。ＣｐＧアイランドにおけるシトシンのメチル化状態の変化は、多くの癌における早期事象および多くの腫瘍に見出される恒久的変化である。これらのＣｐＧアイランドは、遺伝子が「オン」であるかまたは「オフ」であるかを決定する遺伝子の隣の領域に見出される。腫瘍抑制遺伝子などの癌を防止するのに重要な多くの遺伝子は、細胞を正常に増殖させるのに「オン」である必要がある。細胞の酵素は、これらのＣｐＧアイランド内のＣ残基にメチル基を付加すること（メチル化）ができる。このメチル化により、これらの遺伝子の閉じられた「オフ」の状態が生じる。腫瘍抑制遺伝子が閉じた「オフ」状態である場合、細胞は、もはや該遺伝子がコードするタンパク質を作らず、細胞は、制御チェックポイントを伴わずに増殖を始める。これは、細胞の「形質転換」および癌の進行をもたらすことができる早期事象の１つである。
【図１３】ＤＮＡにおける非メチル化シトシン基の脱アミノ化変換を表す。真核生物の遺伝子を調節する脱アミノ化は、非メチル化ＣをＵに変換する。ＣｐＧアイランドにおけるようなメチル化Ｃ基は、脱アミノ化に対して耐性であり、産物ＤＮＡにおいてＣとして保持する。１００％の脱アミノ化が生じる場合、メチル化ＤＮＡはなおＣｐＧダブレットを含有する一方、非メチル化ＤＮＡはシトシンを含有せず、脱アミノ化の前にＣｐＧダブレットが存在していた場所に今度はＵｐＧを含有する。２つのＤＮＡは異なるジヌクレオチドをコードするため、ＤＮＡ配列におけるこのような差異を使用して、不稔転写によりメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別することができる。
【図１４】ジヌクレオチド合成を使用するメチル化の検出を表す。ジヌクレオチド合成を使用して、ＤＮＡの全てのメチル化常態を評価することができる。ＲＮＡポリメラーゼ、ＣＴＰまたはＣＴＰ類似体（Ｒ１−Ｃ−ＯＨ）およびＧＴＰまたはＧＴＰ類似体（Ｒ１−ＣｐＧ−Ｒ２）が存在する場合、脱アミノ化メチル化ＤＮＡテンプレートは、ｎコピーの標識されたジヌクレオチド産物を産生し、ここで、ｎは、開始ＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧジヌクレオチドの数に比例する。脱アミノ化非メチル化ＤＮＡテンプレートは、テンプレートがもはやいずれの位置にも「Ｃ」をコードしないため、これらの基質を有するジヌクレオチドを産生することができない  Ｒ１およびＲ２が適切に標識される場合、ジヌクレオチドは、メチル化ＣｐＧ部位の数に比例するシグナルを産生する。例えば、Ｒ１が、第２のドナーまたはアクセプターであるＲ２に適合する蛍光エネルギードナーまたはアクセプターであるならば、酵素的テンプレート依存性反応においてジヌクレオチドに組み入れられた後に２つの基が接近する場合にのみ、Ｒ１とＲ２との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、シグナルが検出される。不稔転写中のこれらのジヌクレオチドの反復合成により、各ＣｐＧ標的由来の複数のシグナルが生じ、これを使用して、ＤＮＡのメチル化のレベルを評価することができる。  同様に、Ｃで終了する標識されたジヌクレオチド（ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＧｐＣ、ＵｐＣ）による転写開始および標識されたＧＴＰによる終結によるトリヌクレオチドの不稔合成を使用して、脱アミノ化メチル化テンプレートからシグナルを生じることができるが、脱アミノ化非メチル化テンプレートからはシグナルは生じない。図１５に例示するように、部位特異的オリゴヌクレオチドを追加することによって、このトリヌクレオチド合成アプローチを拡張し、アイランド全体ではなくむしろ特定のＣｐＧ部位のメチル化状態の評価を可能にすることができる。
【図１５】不稔開始によるＣｐＧアイランドにおける特定のＣｐＧ部位のメチル化状態の評価を表す。標的部位プローブを使用して、特定の遺伝子における特定のＣｐＧアイランドのメチル化状態を調べることができる。脱アミノ化メチル化ＤＮＡでは、ジヌクレオチドＣｐＧは、３メチル化部位１、３および４におけるテンプレートによってコードされるが、非メチル化部位２によってはコードされない。部位３がメチル化されているかどうか、そしてメチル化されているのであればどの程度までメチル化されているのかを具体的に決定するためには、図１１に記載のように、位置（Ｃ２１）を、標的部位プローブで標的化することができる。問題のテンプレートＣは、該テンプレートが、バブル領域に結合する適切にプライム化されたＲＮＡポリメラーゼに対してその隣の組み入れられたヌクレオチドをコードするように、バブル領域と下流二重鎖との接続部に位置する。標識されたイニシエーターＲ１−ＮＸｐＣ−ＯＨ（式中、ＮＸはジヌクレオチドＣｐＣイニシエーターのＣであり得るか、またはＮＸはトリヌクレオチドイニシエーターのＣｐＣなどであり得る）を使用する場合、イニシエーターを標識されたＧＴＰ類似体ｐｐｐＧ−Ｒ２Ｇで延長し、トリヌクレオチドＲ１ＮＸＣｐＧ−Ｒ２を形成させることができる。同様に、問題のＣがメチル化されなかった場合、この時の位置はＵであり、ヌクレオチドＡをコードする。ＡＴＰ類似体ｐｐｐＡ−Ｒ２Ａが存在する場合、該類似体は対向する位置に組み入れられ、ここで、Ｃはメチル化されなかった。ＧＴＰ類似体が、イニシエーターＲ１上のＲ基からのエネルギーアクセプターであるＲ２Ｇ基で標識される場合、波長λ２ＧＥでＲ２Ｇ由来の放射を測定することにより、該位置に存在するメチル化Ｃの量に比例するＲ１ＮＸＣｐＧＲ２Ｇの量を定量することができる。ＡＴＰ類似体の組み入れ、およびそのＲ基からの放射、またイニシエーターＲ１からのエネルギーアクセプターの測定についても同様の状況が存在する。ＡＴＰおよびＧＴＰ類似体の両方からの全放射に対するＧＴＰ類似体からの放射の大きさの割合を決定することにより、部位をメチル化指数Ｍに割り当てることができる。該位置における全てのＣがメチル化されている場合、Ｍ＝１である。メチル化されている部位が存在しない場合、Ｍ＝０である。
【図１６】癌において改変されたメチル化を有する遺伝子を表す。癌のイニシエーションおよび進行に関連するメチル化の変化を伴う４９遺伝子を、１３種の癌に対してプロットしている。長円形は、癌のタイプによってコードされる遺伝子の異常なメチル化状態を示す。癌は、細胞分裂を調節する約１００種の腫瘍抑制遺伝子の発現を介して、積極的に防止される。ＣｐＧメチル化は癌検出のための潜在的に強力なバイオマーカーである。腫瘍生検由来の腫瘍抑制遺伝子のプロモーターについて調べたところ、腫瘍促進に及ぼす変異誘発の影響に十分匹敵する程にＣｐＧメチル化が一般化していることが示唆されている。少なくとも６０の腫瘍抑制および修復遺伝子が、事実上全ての一般的腫瘍タイプにわたって異常に高いレベルのＣｐＧメチル化に関連する。事実上すべての場合において、腫瘍抑制遺伝子の欠損発現は、腫瘍進行の初期段階に始まる。進行した症状が出現する前にこれらの初期メチル化事象を検出することにより、癌の治療可能性が高いうちに癌を処置する機会が向上されるはずである。ＣｐＧメチル化パターンは、しばしば、癌の特定のタイプの特定の遺伝子に偏る。従って、癌のタイプおよび段階の両方を示す一般的癌のメチル化特性を開発することが可能であるはずである。複数のプロモーターのメチル化状態に関するデータは、いくらかの器官がサンプルに寄与することができる場合、腫瘍の局在についての手掛かりを付与し得る。例えば、脱離した膀胱、腎臓または前立腺細胞は、尿サンプルに多数存在し得る。これらの組織のそれぞれに由来する腫瘍は、しばしば、異なる組み合わせのＣｐＧアイランドメチル化に関連する。
【図１７】不稔オリゴヌクレオチド合成による一塩基多型検出を表す。特定の位置におけるヌクレオチドの同定は、標的核酸および位置特異的標的部位プローブの存在下における不稔開始によっても決定することができる。このことは、ＳＮＰ部位よりも上流のＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドにより転写を開始することによってＳＮＰ同定に適用することができる。例えば、トリヌクレオチド合成では、ジヌクレオチドイニシエーターは、ＳＮＰ部位に対して位置−１および−２の既知のヌクレオチドに相補的である。
【図１８】不稔転写による一塩基多型（ＳＮＰ）の検出および同定を表す。特定のＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／ｄＵ）の同定は、標的部位プローブ（ＴＳＰ）の使用による不稔転写によって同定することができる。例えば、ＤＮＡが正常なヌクレオチド（野生型）を含有するか、または変異ヌクレオチド（点変異、一塩基多型／ＳＮＰ）を含有するかを決定するためには、ＳＮＰの位置が下流二重鎖とバブル領域との接続部のＣ／Ｃ’ハイブリッドの最後のヌクレオチドに対応するように、遺伝子特異的ＴＳＰを標的ＤＮＡ（または増幅／複製産物）に添加することができる。ＳＮＰ部位の上流の領域に相補的である標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＮＩ−ＯＨ）を、ＲＮＡポリメラーゼによって延長し、ＳＮＰに対応する次にコードされるヌクレオチドを添加することができる。標識されたターミネーター（ｐｐｐＮＴ−Ｒ２またはｐｐｐＵ−Ｒ２Ｕ、ｐｐｐＡ−Ｒ２Ａ、ｐｐｐＣ−Ｒ２Ｃ、ｐｐｐＧ−Ｒ２Ｇ）は、それぞれ異なるＲ基で標識することができ、例えば、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｃ、Ｒ２ＧおよびＲ２Ｕは、それぞれ、Ｒ１由来の共鳴エネルギーアクセプターであり得る、それぞれが異なる検出可能な波長を有する光を放射する。
【図１９】不稔プロモーター由来のシグナル発生を表す。不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）は、標的分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）への結合のために、リンカー領域（ＡＰＣリンカー）に結合したＲＮＡポリメラーゼに対して共に特異的結合部位を作製する１つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからなる。ＡＰＣは人工プロモーターを含有してもよく、また該ＡＰＣは特異的ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含有してもよい。例えば、一般的なファージＲＮＡポリメラーゼから生じ得るトリヌクレオチドまたはテトラヌクレオチド産物は、標識されたＧｐＡまたはＧｐＡｐＡイニシエーターおよび標識されたｐｐｐＧまたはｐｐｐＡターミネーターにより作製することができる。
【図２０】不稔転写による核酸の検出を表す。特定の疾患またはウイルスおよび細菌病原体に関連するＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の検出のために、核酸を直接かまたは複製もしくはプライマー伸長後のいずれかに検出することができる。第１の場合、不稔プロモーター活性におけるＡＰＣリンカーは、標的核酸の既知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるように設計される。あるいは、標的ＲＮＡの１もしくはそれ以上のコピーの標的ＤＮＡまたはｃＤＮＡコピーを、５’末端で普遍的ＡＰＣリンカー配列を含有するプライマーで開始されるプライマー伸長または逆転写により作製することができる。いずれの場合においても、「捕捉配列」と呼ばれる第２の標的特異的配列を含有するオリゴヌクレオチドが、ビオチン、ヘキサヒスチジンまたは他の任意のハプテンを含むがこれらに限定されない任意の数の固定化タグを介して結合している固体支持体への結合によって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡをサンプルから回収することができる。一旦結合すれば、ポリメラーゼおよび適切な標識されたヌクレオチドの添加によって転写が開始され、先に記載のようなシグナルの発生が生じる。
【図２１】不稔転写によるｍＲＮＡの検出を表す。ｍＲＮＡの検出のための不稔プロモーターカセットは、そのＡＰＣリンカーとして、オリゴＴテイルを含有する。このテイルは、真核生物のｍＲＮＡの３’末端に見出されるｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌに相補的であり、標的ｍＲＮＡへのＡＰＣの結合のために使用される。標的ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのいくつかの領域に相補的である捕捉配列を含有する固定化された捕捉プローブへの結合によって、サンプルから回収することができる。
【図２２】不稔転写によるタンパク質または他のハプテン／抗原の検出を表す。不稔プロモーターカセットからの不稔開始を介するシグナル発生を使用して、タンパク質などの他の分子を検出することができる。例えば、チオール反応性またはアミン反応性タンパク質架橋剤Ｒが共有結合するＡＰＣリンカー配列を調製することができる。ＡＰＣリンカーは、精製されているかまたは（細胞溶解産物などの）複雑な混合物中にあり得る標的タンパク質に添加され、ＡＰＣリンカーは、タンパク質のチオールおよび／またはアミン基の修飾を介して標的タンパク質に共有結合される。次いで、（抗体などの）標的特異的プローブを利用して、標識されたタンパク質を固定化することができる。次いで、不稔プロモーターカセットを、ＡＰＣリンカーを介して結合させ、先に記載のようにシグナルを発生させる。
【図２３】ＡＰＣ粒子における不稔転写を介する分子標的の増強された検出を表す。数十、数百、数千、数万またはそれ以上を含む複数の不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）が結合している粒子を使用することにより、さらにより大きな検出感度を達成することができる。球体はまた、標的分子に結合することができる基に特異的に結合するリンカーを含有する。例えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）をＡＰＣ粒子、そしてビオチンを標的分子に結合させることができ、次いで、標的特異的捕捉プローブとの相互作用を介して固定化することができる。一旦、ＡＰＣ粒子が、例えばＳＡ−ビオチン相互作用を介して標的と相互作用すると、記載のように、ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドをシグナル発生のために添加することができる。
【図２４】超高感度検出あるいは分子画像のためのＡＰＣ粒子によるＤＮＡまたはＲＮＡ標的のコーティングを表す。標的ＤＮＡまたはＲＮＡの超高感度検出あるいは可視化のための代替的方法は、標的ＲＮＡの逆転写かもしくはプローブ標識化ｄＮＴＰ類似体の存在下での標的ＤＮＡのコピー化（単一コピーまたは増幅）により達成することができる。例として、５−ＳＨ−ｄＵＴＰを極めて高頻度でＤＮＡ分子に取り込むことができ、次いで、固定化し、ビオチンなどの他の分子で更に修飾することができる。このために、図２３に記載のように、ＡＰＣ粒子を添加することができ、各粒子は標的上のヌクレオチド類似体と相互作用する。これにより、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、分子検出の様々な方法のために、複数のオリゴヌクレオチド産物を作製することが可能なＡＰＣ粒子で本質的に被覆される。
【図２５】反復オリゴヌクレオチド合成によるテロメラーゼ活性の検出を表す。シグナル発生のために、ＤＮＡポリメラーゼによる反復オリゴヌクレオチド合成を使用することもできるが、しかし、産物であるオリゴヌクレオチドを遊離させる必要はなく、産物においてタンデムに接続させてもよい。例として、テロメラーゼ特異的プローブを固体マトリックスに固定化し、ＤＮＡ合成のためのそれ自体のＲＮＡテンプレートを担持する細胞性テロメラーゼを捕捉することによって、テロメラーゼ活性を検出することができる。例えば、ヒトテロメラーゼにより、酵素上のＲＮＡテンプレートは、ＤＮＡ配列ＧＧＧＴＴＡをコードする。テロメラーゼがサンプル内に存在する場合、捕捉プローブは、テロメラーゼ捕捉プローブの末端に反復的に添加される配列ＧＧＧＴＴＡを含有することができる。シグナル発生は、いくらかの方法で達成することができ、それらのうちの１つは、ＤＮＡ産物の骨格に沿って結合した複数のＲ１基を有する産物を産生させるための合成反応中に１つもしくはそれ以上のレポータータグ化ｄＮＴＰを含むことに関与する。次いで、検出のために、この産物を、Ｒ１標識された産物にハイブリダイズする第２のＲ基（Ｒ２）を結合させたヌクレオチドを含有する相補的プローブにハイブリダイズさせることができる。これにより、Ｒ１およびＲ２間からのＦＲＥＴを介するかまたは多の方法を介するシグナル発生のために、Ｒ１およびＲ２基を集める。あるいは、テロメラーゼは、産物ＤＮＡ内に２つの標識されたヌクレオチドを組み入れて、一本鎖のＤＮＡ内で２つの標識されたヌクレオチド間のエネルギー移動を求めてもよい。
【図２６】色素標識されたイニシエーターの合成を表す。ＩＡＥＤＡＮＳおよびα−Ｓ−ＣＭＰの共役から５’ＥＡＤＡＮＳ−Ｓ−ＣＭＰを合成した。薄層クロマトグラフィープレートのスキャン画像は、コントロールのＩＡＥＤＡＮＳおよびＩＡＥＤＡＮＳ標識化産物を示す。レーン１：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）；レーン２：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）；レーン３：５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン４：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）および（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン５：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）および（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン６：アデノシン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）；レーン７：アデノシン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）および（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン８：（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン９：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）；レーン１０：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）。レーン４、５および７はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｔおよび１５０ｎｇの変性ｐＢＲ３２２を含有する。
【図２７】標識されたイニシエーターによる不稔転写開始を表す。ゲルの写真は、異なる３つのジヌクレオチドイニシエーター（（１）ＡｐＧ；（２）ビオチン−ＡｐＧ；および（３）５’ＴＡＭＲＡ−ＳｐＡｐＧであった）ならびに終結ヌクレオチド（α３２Ｐ−ＵＴＰであった）を使用する不稔転写開始反応の結果を示す。３つの全てのジヌクレオチドは３位のＵＴＰの組み入れを可能にし、５’ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵを作製した。標識されていないＡｐＧは、ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧよりも効率的に取り込まれるビオチン−ＡｐＧよりも効率的に取り込まれる。
【図２８】標識されたターミネーターによる不稔転写開始を表す。薄層クロマトグラフィープレートのスキャン画像は、標識されていないジヌクレオチドイニシエーター、ＡｐＧ、および標識されたターミネーター（５’−ＳＦ−ＵＴＰ（５−チオアセトアミドフルオレセイン（ｔｈｉｏａｓｅｔｅｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）−ウリジン三リン酸）であった）を使用する不稔転写開始反応の結果を示す。標識されたターミネーターは、効率的に組み入れられ、オリゴヌクレオチド産物ＡｐＧｐＵを作製した。
【図２９】標識されたイニシエーターおよび標識されたターミネーターによる不稔転写開始反応を表す。標識されたジヌクレオチドイニシエーター５’ＴＡＭＡＲＡ  ＳｐＡｐＧを標識されたターミネーターＳＦ−ＵＴＰと混合して、オリゴヌクレオチド産物ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵ−ＳＦを作製した。ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵ−ＳＦの形成を、温度制御マイクロタイタープレートリーダーにおいて、蛍光エネルギー移動により測定した。プレートは、以下のパラメータ：励起４８５、放射６２０；ゲイン３５、サイクルあたりウェルあたり９９読み取りで、１時間ごとに読み取るように設定した。（Ａ）バックグランドを超えるシグナル。バックグランドは、蒸留水のみを含有するウェルとして規定される。読み取りは、０時から始めて１２時間の間１時間ごとに行われた。フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され；得られる放出ピークは５１５ｎｍにある。ＴＡＭＲＡがフルオレセインの極付近にある場合、それは、ピーク励起が５４２ｎｍにあるときに励起され、５６８ｎｍの放出ピークが生じる。（Ｂ）模擬反応を超えるシグナル。模擬反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼおよびｐＢＲ３２２プラスミドを除く全ての反応成分を含有する。読み取りは、０時から始めて１２時間の間１時間ごとに行われた。フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され；得られる放出ピークは５１５ｎｍにある。ＴＡＭＲＡがフルオレセインの極付近にある場合、それは、ピーク励起が５４２ｎｍにあるときに励起され、５６８ｎｍの放出ピークが生じる。（Ｃ）ＳＦ−ＵＴＰを超えるシグナル。ＳＦ−ＵＴＰ反応は、ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧの代わりに該反応が標識されていないＡｐＧを含有することを除いて、全ての反応成分を含有する。読み取りは、０時から始めて１２時間の間１時間ごとに行われた。フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され；得られる放出ピークは５１５ｎｍにある。ＴＡＭＲＡがフルオレセインの極付近にある場合、それは励起される。
【図３０】ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のコンティグ配列のタンパク質を表す。配列はコンティグ配列の始点から８５６６３０ヌクレオチドで開始するコンティグの小さな部分を表す。配列は、ＣｐＧアイランドを表す。コンティグ番号：ＮＴ  ００８４１０．４。
【図３１】特定の遺伝子のメチル化状態を決定するための「捕捉プローブ」の概略図である。標的遺伝子のＣｐＧアイランド付近の領域に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブをマイクロタイタープレート上に固定化する。目的のＤＮＡを固定化されたプローブに添加し、捕捉プローブに結合させる。次いで、ＤＮＡを化学的に修飾して、非メチル化ＣをＴに変換し、メチル−Ｃが影響を受けないまま残す。次いで、場合により、変換されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、シグナルをさらに増幅させる。次いで、標識したＣｐＧイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドと共に添加する。
【図３２】ＣｐＧ検出アッセイのためのサンプルＤＮＡの調製を表す。ＣｐＧ検出アッセイは、固定化されたＣｐＧアイランドの操作および検出に基づく。ＣｐＧアイランド差を、ビオチンかプライマーを使用するプライマー伸長反応によって分離する（Ａ）。ハイブリッド二重鎖をストレプトアビジンマイクロタイタープレートに固定化する（Ｂ）。ホスファターゼによる末端リン酸の除去（Ｃ）およびポリヌクレオチドキナーゼによる三リン酸の付加（Ｄ）を介して、サンプルＤＮＡ鎖を５’末端で修飾する。変性後、イオウ修飾鎖を、ストレプトアビジンプレートから取り出し、次いで、マレイミドマイクロタイタープレートに共有結合させ（Ｅ）、ここで１つもしくはそれ以上の標的部位プローブ（ＴＳＰ）がアニールされる（Ｆ）。ＴＳＰは、重亜硫酸ナトリウム処置により、標的化されたＣｐＧ配列においてテンプレートＣを潜在的脱アミノ化に暴露する一方、テンプレート鎖／ＴＳＰ複合体の二本鎖部分を保護する（Ｇ）。配列のこの変換は、脱アミノ化反応における最後の変性後のＴＳＰの置き換えを可能にする（Ｈ）。この段階で、重亜硫酸処置された鎖は、ＴＳＰ複合体でのＣｐＧメチル化のレベルを定量する転写反応に使える状態にある。必要であれば、ＨでＴＳＰを添加する前に、脱アミノ化鎖をＰＣＲにより増幅することができる。
【図３３】図３４〜３７に示される不稔転写反応のためのテンプレート配列を示す。図３３ａ：ポリ［ｄＧ−ｄＣ］は、ｄＣｐｄＧを反復する合成でオキシヌクレオチドポリマーである。個々の鎖は、変動可能な数のジヌクレオチド反復を含有する。図３３ｂ：バブル複合体１は、合成、部分的に相補的なテンプレートおよび非テンプレート鎖をアニーリングすることによって作製した。垂直方向にずれた非テンプレート鎖は、分子の一本鎖、バブル部分を表す。座標系はバブルの下流端縁に基づく。二本鎖セグメントの隣の対形成していない塩基は、位置＋１にある。位置＋１の左側（上流）に対する位置に、−１から始まる負の数が付与される。座標系を使用して、リボヌクレオチドイニシエーターの３’末端の位置が示される。イニシエーターＡＡの３’末端は＋１に整列され、イニシエーターのＡＵの３’末端は＋２に整列される。転写反応は、理論に従って、イニシエーターの３’末端の左側から右側へ進行する。図３３ｃは、相補的な非テンプレート鎖を伴わないテンプレート鎖を表す。配列を３’〜５’の配向で示す。
【図３４】図３４ａおよび３４ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼおよびＧｐＣリボヌクレオチドイニシエーターによる一本鎖ポリ［ｄＧ−ｄＣ］の転写の結果を示す。γ−３２Ｐ  ＧＴＰは、反応に含まれる唯一のリボヌクレオシド三リン酸であった。ポリ［ｄＧ−ｄＣ］の濃度は１０μｇ／２５μｌ反応に設定した。図３４ａは、転写反応の薄層クロマトグラフを表す。サンプル（１μｌ）を、ＧＴＰでマークされた部位でプロットした。トリヌクレオチド産物ＧｐＣｐＧは、起点から移動する一方、ＧＴＰの移動は認められなかった。図３４ｂは、図３４ａにおいて分析した反応の６μｌサンプルを電気泳動するために使用した２５％変性ポリヌクレオチドゲルを表す。ＢＰＢは、ブロモフェノールブルーマーカーを指す。反応ではＧＴＰのみが含まれるため、産物はＧｐＣｐＧに限定された。
【図３５】バブル複合体（サンプル１〜４）またはテンプレート鎖のみ（サンプル５〜８）を用いる転写反応の薄層クロマトグラフィーを表す。反応は、酢酸Ｎａの非存在下または１５０ｍＭ酢酸Ｎａの存在下で行った。ＡｐＡイニシエーターを用いて、放射性ＵＴＰを反応に含めた。放射性ＡＴＰを、ＡｐＵイニシエーターを含有する反応に添加した。ＡｐＡの３’末端は＋１と共に整列する一方、ＡｐＵの３’末端は＋２に偏位される。ＡｐＡおよびＡｐＵのトリヌクレオチド産物は、クロマトグラフィー中、ほぼ同じ速度で移動する。全ての反応は、１７ｎｇのバブル複合体または８．５ｎｇの一本鎖を含有した。サンプル９およびサンプル１０は、それぞれ高塩および低塩緩衝液において放射性ＡＴＰを含有するネガティブコントロールである。サンプル１１および１２は、高および低塩緩衝液において放射性ＵＴＰを含有するネガティブコントロールである。
【図３６】異なるＲＮＡポリメラーゼによるバブル複合体１（１７ｎｇ／反応）の転写を比較する薄層クロマトグラフを示す。全ての転写反応は、ＡｐＡにより開始した。放射性ＵＴＰの組み入れにより、トリヌクレオチド産物ＡｐＡｐＵが生成された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素およびコア酵素を含有する反応は、１５０ｍＭ酢酸Ｎａを含有した。Ｔ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含有する反応は酢酸Ｎａを補充しなかった低塩反応において行われた。「ＵＴＰ」にて標識したサンプルは、高塩転写緩衝液中に放射性ＵＴＰを含有するネガティブコントロールである。
【図３７】図３７ａおよび３７ｂは、バブル１複合体の量を減少して実施した転写反応の薄層クロマトグラフを示す。全ての反応は、放射性ＵＴＰの存在下で、ＡｐＡにより開始した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は、反応あたり１．５ｐｍｏｌｅで存在した。図に列挙したテンプレートの量は、２５μｌ反応容積中のものであった。
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【図４】
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【図７】
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【図３０】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３３ｃ】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７ａ】
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【図３７ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月27日(2004.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月25日(2005.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
ＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧ（配列番号：１）。ＤＮＡサンプルを捕捉プローブと共にインキュベートして、ハイブリダイゼーションを可能にする。代表的ハイブリダイゼーションプロトコルは、次の通りである：（１）２．５×ＳＳＣ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）で室温で３０分間、プレハイブリダイズする；（２）２．５×ＳＳＣ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、３０％ホルムアミドで室温で２時間、ハイブリダイズする；（３）１×ＳＳＣ、４２℃で１０分間２回洗浄し、４２℃を維持する；（４）０．１×ＳＳＣ、４２℃で１０分間３回洗浄し、４２℃を維持する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
【図１】不稔プロモーターカセットを表す。不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）は、ポリメラーゼ結合部位を形成する核酸の領域であり、ＡＰＣＲリンカーと呼ばれる特定の核酸配列との相互作用を介して他の高分子と結合することができる。ＡＰＣリンカーは、標的核酸のテンプレートまたは非テンプレート鎖のいずれかにおける相補的な配列へのハイブリダイゼーションによって、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合することができるＡＰＣリンカーはまた、タンパク質に結合する分子の検出のために、前記タンパク質などの任意の分子に配置される相補的配列にもハイブリダイズすることができる。複数の検出可能なオリゴヌクレオチドは、不稔プロモーターカセットに結合したポリメラーゼによって作製される。本図面に示したＡＰＣは、「バブル領域」によって分離される必須相補性（Ａ、Ａ’およびＣ、Ｃ’）の２つの領域を含有する。本スキームでは、２つの鎖に非相補的な領域が存在する（Ｂ、およびＥ）ため、「バブル領域」が作製される。あるいは、ＡＰＣは、２つの完全な相補鎖を有することもできる。ＲＮＡポリメラーゼの結合時に、ＤＮＡは分離して、「バブル領域」の形成をもたらす。  領域Ａ、Ｂ、およびＣは１つの鎖の上に存在する。領域Ｃ’、Ｅ、およびＡ’は相補砂上に存在する。ＡＰＣは、２つの個別の鎖（ＡＢＣおよびＣ’ＥＡ’）からされていてもよく、また６つの全ての領域は、領域ＣおよびＣ’がリンカー領域Ｄによって分離され、必要な長さであるように修飾することができるように単一のポリヌクレオチド上にあってもよい。リンカー領域Ｄは、ＣおよびＣ’を結合する役割のみを果たしてもよく、また領域Ｄの配列は、ＥｃｏＲＩ  ＱＩＩＩ変異、ｌａｃリプレッサーおよび他のＲＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されない転写障害タンパク質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｏａｄｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの不稔転写を増強することができる他の因子に対する結合部位としての役割を果たしてもよい。単一の障害タンパク質、または複数の障害タンパク質のためにリンカー領域Ｄを設計してもよい。リンカー領域Ｄの長さは、リンカー領域の機能に依存する。
【図２】反復オリゴヌクレオチド合成によるシグナル発生を表す。複数（ｎ個の）高度に類似または同一のオリゴヌクレオチド産物への１つもしくはそれ以上のヌクレオチド類似体の酵素的組み入れによって、シグナルが発生する。適切な条件において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、プロモーターの非存在下で核酸テンプレートから作製することができる。イニシエーターは、１つもしくはそれ以上のヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体からなり得る。イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチドならびに２５０を超えるヌクレオチドを含むがそれらに限定されない１つもしくはそれ以上の共有結合したヌクレオチドを含有し得、官能性Ｒ基を含有し得る。イニシエーター（ｎコピー）は、ｎコピーのターミネーターによって末端鎖延長まで直接延長することができるか、またはｎコピーの他のエロンゲーターヌクレオチド（Ｙ位）をイニシエーターとターミネーターとの間に組み入れてより長いオリゴヌクレオチドを形成させることができる。ターミネーターは第２の官能基を含有してもよい。ＮＩ＝モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の開始、ＮＥ＝モノヌクレオチドまたは類似体の延長、ＮＴ＝モノヌクレオチドまたは類似体の終結、Ｚ＝ｘ＋ｙ；Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、またはレポーター基；Ｒ２＝Ｈ、ＯＨ、またはレポーター基；Ｎ＝デオキシまたはリボヌクレオチド；ポリメラーゼ＝ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡまたはＲＮＡはタンパク質などの他の分子に結合してもよい。
【図３】５’ＡＥＤＡＮＳ−Ｓ−ＡＭＰの合成を表す。モノヌクレオチド転写イニシエーター：ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（２−（（ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ−１−ナフタレンスルホン酸アルキレート））ＡＭＰＳ（５−α−チオ−ＡＭＰ）が蛍光転写イニシエーターを形成する例。この類似体は５’三リン酸基を有さないため、転写のみを開始することができ、従って、内部にも終末にも組み入れられ得ない。
【図４】エロンゲーターまたはターミネーターになりうるヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチドの内部または３’末端位に含まれ得るヌクレオチド類似体を示す。これらの全ての類似体は、３’ＯＨ基を単純に置き換えることによってターミネーターに変換することができる。
【図５】Ｒ１またはＲ２になり得る他の蛍光基を表す。オリゴヌクレオチドは、様々な官能基で標識することができる。いくらかの好適な蛍光基を示す。
【図６】一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける不稔開始を介するジヌクレオチド合成を表す。一本鎖（ｓｓ）核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＮＩ＝３’−ＯＨヌクレオシドまたはヌクレオチドイニシエーター；ＮＴ＝５’三リン酸ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体ターミネーター。Ｒ１は、５’リン酸基上、糖の２’位、またはプリンもしくはピリミジン塩基上にあってもよい。Ｒ２は、ピリミジンもしくはプリン塩基上あるいは糖／リボースまたはデオキシリボースの２’もしくは３’位にあってもよい。Ｒ１＝Ｈ、ＯＨ、および／または本明細書に記載の任意のレポーター基もしくはレポーター基前駆体。Ｒ２＝Ｈ、ＯＨ、および／または本明細書に記載の任意のレポーター基もしくはレポーター基前駆体。シグナルは、検出することができる任意のシグナルであってもよく、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または比色を含むがこれらに限定されない。１つの例として、Ｒ１は、ＡＥＤＡＮＳであってもよく、Ｒ２はフルオレセインであってもよい。シグナルはＲ１からＲ２へのＦＲＥＴにより発生する。
【図７】５’−ＡＥＤＡＮＳ−ＳｐＡｐＵ−フルオレセインを表す。ＦＲＥＴ検出のための不稔開始により作製されるジヌクレオチド。適切な波長の光により励起されると、Ｒ１（ＡＥＤＡＮＳ）は、Ｒ２（フルオレセイン）に蛍光エネルギーを付与し、次いで、検出かつ定量することができる異なる波長の蛍光を放射する。この蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、効率的なエネルギー移動のために２つの基を十分に近づける転写中に２つの基が共に結合して、ＡＥＤＡＮＳ−ＳｐＡｐＵ−フルオレセインを形成する場合にのみ生じる。
【図８】ジヌクレオチド産物を介するシグナル発生を表す。Ｒ基が異なる機能を有するように、イニシエーターヌクレオチド上に１つのＲ基およびターミネーターヌクレオチド上に別の基を含有するオリゴヌクレオチドを合成することができる。例えば、Ｒ１がビオチンである場合、Ｒ１はオリゴヌクレオチド産物の固定化に使用することができ、Ｒ２はシグナル生成を可能にする。  例１：Ｒ１タグ＝ビオチン、Ｒ２タグ＝フルオレセイン：フルオレセイン放射の検出。  例２：Ｒ１タグ＝ＤＮＰ、Ｒ２タグ＝反応性チオール
【表３】
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【図９】不稔開始によるＦＲＥＴ検出のためのシグナル発生を表す。２〜２５ヌクレオチドを含有し、異なる２つのＲ基（１つは転写中に作製されるオリゴヌクレオチド産物の各末端にあるかまたは末端付近にある）を有するオリゴヌクレオチドを反復的に合成することができる。基質上の２つのＲ基間のエネルギー移動は、標識されたイニシエーターおよび標識されたターミネーターヌクレオチド間での酵素的ホスホジエステル結合形成によるテンプレート指向性オリゴヌクレオチド合成中に２つのＲ基が接近した後にのみ生じることができる。ＮＩ上のＲ１ドナー基は、サンプルにλ１Ａの波長の光（ここで、λ１ＡはＲ１基の吸収極大である）を照射することによって励起することができる。励起されたＲ１ドナー基は、λ１Ｅの波長の光（ここで、λ１ＥはＲ１基の放射極大であり、また、Ｒ２基による吸収のための波長（λ２Ａ）でもある）を放射する。ＮＴ上のアクセプターＲ２基は、ＮＩ上の励起されたＲ１ドナー基によって放射された波長λ１Ｅ／λ２Ａの光を吸収する。ＮＴ上の励起されたアクセプターＲ２基は、検出かつ定量される波長λ２Ｅの光を放射する。同様に、Ｒ２は、Ｒ１へのエネルギードナーであってもよく、Ｒ１からの放射が検出される。標的関連テンプレートが存在しなければ、オリゴヌクレオチドは合成されない。
【図１０】トリヌクレオチドエネルギー移動を表す。標識されたオリゴヌクレオチド合成は、標識されたジヌクレオチドイニシエーターによって開始される。標識は、ジヌクレオチドイニシエーターの５’ヌクレオチド（Ｒ１）または３’ヌクレオチド（Ｒ２）のいずれの上にあってもよい。イニシエーターは、標識された（Ｒ３）５’−ヌクレオシド三リン酸ターミネーターヌクレオチド類似体によって延長される。示されるように、エネルギー移動を介する検出を調整して、Ｒ１またはＲ２を利用することができる。イニシエーターおよびターミネーター間での核酸テンプレート指向性ホスホジエステル結合形成が存在しなければ、Ｒ基は十分に離れたままであり、エネルギー移動は検出されない。この例では、λ３Ｅとして放射されるエネルギーの量は、テンプレート関連標的の存在量に正比例する。同様に、Ｒ基は、図８において実証されるように、他のアプリケーションのために変更してもよい。
【図１１】標的部位プローブを表す。ＲＮＡポリメラーゼは、遺伝子特異的または領域特異的標的部位プローブ（ＴＳＰ）のハイブリダイゼーションによって、標的核酸の特異的ヌクレオチド位置（部位）に指向される。標的部位とは、配列（一塩基多型の検出におけるように）または構造（特定のヌクレオチドのメチル化状態の評価におけるように）のために分析しようとするＤＮＡのヌクレオチド位置であり、該部位は、標的配列における領域ＥおよびＣ’の接続部における標的配列のテンプレート鎖上に位置する。ＴＳＰは、標的ヌクレオチドの上流約８〜１４ヌクレオチドから始まり、約１５〜３５ヌクレオチドで終了する標的核酸（領域Ａ）に対して相同である領域を含有する。ＴＳＰの第２の領域は、ＴＳＰが標的核酸にハイブリダイズする場合に融解状態の「バブル」領域を形成するように、標的部位（領域Ｂ）の直ぐ上流の８〜１４ヌクレオチドに対しては非相補的であるように設計される。ＴＳＰは、標的ヌクレオチドの直ぐ下流の５〜２５ヌクレオチドに対して本質的に相補的である第３の領域（領域Ｃ）を含有する。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ／Ｃ’接続部で転写が開始し、下流のＣ／Ｃ’ハイブリッドの方へ移動するように、バブル複合体に結合する。
【図１２】ＤＮＡ中のＣｐＧアイランドのメチル化を表す。ヒトゲノムは、ヒトＤＮＡにおけるＣおよびＧの全体の頻度が与えられた場合に予想されるよりも４〜５倍低い頻度のＣｐＧジヌクレオチドを有する。ＣｐＧ配列の大きな画分がＣｐＧアイランドとして公知であるクラスターに分布している。これらの配列パターンは、３００から３０００ヌクレオチド長の間であり、全てのヒトプロモーターの約６０％で重複する。ＣｐＧアイランド以外の残りのＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化Ｃを含有する。ＣｐＧアイランド以外のＣｐＧメチル化は寄生性ＤＮＡの発現を不活化することによってゲノムを安定化し、発生において非依存的に必須な役割を果たす。ＣｐＧアイランドにおけるシトシンのメチル化状態の変化は、多くの癌における早期事象および多くの腫瘍に見出される恒久的変化である。これらのＣｐＧアイランドは、遺伝子が「オン」であるかまたは「オフ」であるかを決定する遺伝子の隣の領域に見出される。腫瘍抑制遺伝子などの癌を防止するのに重要な多くの遺伝子は、細胞を正常に増殖させるのに「オン」である必要がある。細胞の酵素は、これらのＣｐＧアイランド内のＣ残基にメチル基を付加すること（メチル化）ができる。このメチル化により、これらの遺伝子の閉じられた「オフ」の状態が生じる。腫瘍抑制遺伝子が閉じた「オフ」状態である場合、細胞は、もはや該遺伝子がコードするタンパク質を作らず、細胞は、制御チェックポイントを伴わずに増殖を始める。これは、細胞の「形質転換」および癌の進行をもたらすことができる早期事象の１つである。
【図１３】ＤＮＡにおける非メチル化シトシン基の脱アミノ化変換を表す。真核生物の遺伝子を調節する脱アミノ化は、非メチル化ＣをＵに変換する。ＣｐＧアイランドにおけるようなメチル化Ｃ基は、脱アミノ化に対して耐性であり、産物ＤＮＡにおいてＣとして保持する。１００％の脱アミノ化が生じる場合、メチル化ＤＮＡはなおＣｐＧダブレットを含有する一方、非メチル化ＤＮＡはシトシンを含有せず、脱アミノ化の前にＣｐＧダブレットが存在していた場所に今度はＵｐＧを含有する。２つのＤＮＡは異なるジヌクレオチドをコードするため（配列番号：２、３、４、５）、ＤＮＡ配列におけるこのような差異を使用して、不稔転写によりメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別することができる。
【図１４】ジヌクレオチド合成を使用するメチル化の検出を表す。ジヌクレオチド合成を使用して、ＤＮＡの全てのメチル化常態を評価することができる。ＲＮＡポリメラーゼ、ＣＴＰまたはＣＴＰ類似体（Ｒ１−Ｃ−ＯＨ）およびＧＴＰまたはＧＴＰ類似体（Ｒ１−ＣｐＧ−Ｒ２）が存在する場合、脱アミノ化メチル化ＤＮＡテンプレートは、ｎコピーの標識されたジヌクレオチド産物を産生し、ここで、ｎは、開始ＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧジヌクレオチドの数に比例する。脱アミノ化非メチル化ＤＮＡテンプレートは、テンプレートがもはやいずれの位置にも「Ｃ」をコードしないため、これらの基質を有するジヌクレオチドを産生することができない  Ｒ１およびＲ２が適切に標識される場合、ジヌクレオチドは、メチル化ＣｐＧ部位の数に比例するシグナルを産生する。例えば、Ｒ１が、第２のドナーまたはアクセプターであるＲ２に適合する蛍光エネルギードナーまたはアクセプターであるならば、酵素的テンプレート依存性反応においてジヌクレオチドに組み入れられた後に２つの基が接近する場合にのみ、Ｒ１とＲ２との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、シグナルが検出される。不稔転写中のこれらのジヌクレオチドの反復合成により、各ＣｐＧ標的由来の複数のシグナルが生じ、これを使用して、ＤＮＡのメチル化のレベルを評価することができる。  同様に、Ｃで終了する標識されたジヌクレオチド（ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＧｐＣ、ＵｐＣ）による転写開始および標識されたＧＴＰによる終結によるトリヌクレオチドの不稔合成を使用して、脱アミノ化メチル化テンプレートからシグナルを生じることができるが、脱アミノ化非メチル化テンプレートからはシグナルは生じない。図１５に例示するように、部位特異的オリゴヌクレオチドを追加することによって、このトリヌクレオチド合成アプローチを拡張し、アイランド全体ではなくむしろ特定のＣｐＧ部位のメチル化状態の評価を可能にすることができる（配列番号：６、７）。
【図１５】不稔開始によるＣｐＧアイランドにおける特定のＣｐＧ部位のメチル化状態の評価を表す。標的部位プローブを使用して、特定の遺伝子における特定のＣｐＧアイランドのメチル化状態を調べることができる。脱アミノ化メチル化ＤＮＡでは、ジヌクレオチドＣｐＧは、３メチル化部位１、３および４におけるテンプレートによってコードされるが、非メチル化部位２によってはコードされない。部位３がメチル化されているかどうか、そしてメチル化されているのであればどの程度までメチル化されているのかを具体的に決定するためには、図１１に記載のように、位置（Ｃ２１）を、標的部位プローブで標的化することができる。問題のテンプレートＣは、該テンプレートが、バブル領域に結合する適切にプライム化されたＲＮＡポリメラーゼに対してその隣の組み入れられたヌクレオチドをコードするように、バブル領域と下流二重鎖との接続部に位置する。標識されたイニシエーターＲ１−ＮＸｐＣ−ＯＨ（式中、ＮＸはジヌクレオチドＣｐＣイニシエーターのＣであり得るか、またはＮＸはトリヌクレオチドイニシエーターのＣｐＣなどであり得る）を使用する場合、イニシエーターを標識されたＧＴＰ類似体ｐｐｐＧ−Ｒ２Ｇで延長し、トリヌクレオチドＲ１ＮＸＣｐＧ−Ｒ２を形成させることができる。同様に、問題のＣがメチル化されなかった場合、この時の位置はＵであり、ヌクレオチドＡをコードする。ＡＴＰ類似体ｐｐｐＡ−Ｒ２Ａが存在する場合、該類似体は対向する位置に組み入れられ、ここで、Ｃはメチル化されなかった。ＧＴＰ類似体が、イニシエーターＲ１上のＲ基からのエネルギーアクセプターであるＲ２Ｇ基で標識される場合、波長λ２ＧＥでＲ２Ｇ由来の放射を測定することにより、該位置に存在するメチル化Ｃの量に比例するＲ１ＮＸＣｐＧＲ２Ｇの量を定量することができる。ＡＴＰ類似体の組み入れ、およびそのＲ基からの放射、またイニシエーターＲ１からのエネルギーアクセプターの測定についても同様の状況が存在する。ＡＴＰおよびＧＴＰ類似体の両方からの全放射に対するＧＴＰ類似体からの放射の大きさの割合を決定することにより、部位をメチル化指数Ｍに割り当てることができる。該位置における全てのＣがメチル化されている場合、Ｍ＝１である。メチル化されている部位が存在しない場合、Ｍ＝０である（配列番号：８、９、１０）。
【図１６】癌において改変されたメチル化を有する遺伝子を表す。癌のイニシエーションおよび進行に関連するメチル化の変化を伴う４９遺伝子を、１３種の癌に対してプロットしている。長円形は、癌のタイプによってコードされる遺伝子の異常なメチル化状態を示す。癌は、細胞分裂を調節する約１００種の腫瘍抑制遺伝子の発現を介して、積極的に防止される。ＣｐＧメチル化は癌検出のための潜在的に強力なバイオマーカーである。腫瘍生検由来の腫瘍抑制遺伝子のプロモーターについて調べたところ、腫瘍促進に及ぼす変異誘発の影響に十分匹敵する程にＣｐＧメチル化が一般化していることが示唆されている。少なくとも６０の腫瘍抑制および修復遺伝子が、事実上全ての一般的腫瘍タイプにわたって異常に高いレベルのＣｐＧメチル化に関連する。事実上すべての場合において、腫瘍抑制遺伝子の欠損発現は、腫瘍進行の初期段階に始まる。進行した症状が出現する前にこれらの初期メチル化事象を検出することにより、癌の治療可能性が高いうちに癌を処置する機会が向上されるはずである。ＣｐＧメチル化パターンは、しばしば、癌の特定のタイプの特定の遺伝子に偏る。従って、癌のタイプおよび段階の両方を示す一般的癌のメチル化特性を開発することが可能であるはずである。複数のプロモーターのメチル化状態に関するデータは、いくらかの器官がサンプルに寄与することができる場合、腫瘍の局在についての手掛かりを付与し得る。例えば、脱離した膀胱、腎臓または前立腺細胞は、尿サンプルに多数存在し得る。これらの組織のそれぞれに由来する腫瘍は、しばしば、異なる組み合わせのＣｐＧアイランドメチル化に関連する。
【図１７】不稔オリゴヌクレオチド合成による一塩基多型検出を表す。特定の位置におけるヌクレオチドの同定は、標的核酸および位置特異的標的部位プローブの存在下における不稔開始によっても決定することができる。このことは、ＳＮＰ部位よりも上流のＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドにより転写を開始することによってＳＮＰ同定に適用することができる。例えば、トリヌクレオチド合成では、ジヌクレオチドイニシエーターは、ＳＮＰ部位に対して位置−１および−２の既知のヌクレオチドに相補的である。
【図１８】不稔転写による一塩基多型（ＳＮＰ）の検出および同定を表す。特定のＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／ｄＵ）の同定は、標的部位プローブ（ＴＳＰ）の使用による不稔転写によって同定することができる。例えば、ＤＮＡが正常なヌクレオチド（野生型）を含有するか、または変異ヌクレオチド（点変異、一塩基多型／ＳＮＰ）を含有するかを決定するためには、ＳＮＰの位置が下流二重鎖とバブル領域との接続部のＣ／Ｃ’ハイブリッドの最後のヌクレオチドに対応するように、遺伝子特異的ＴＳＰを標的ＤＮＡ（または増幅／複製産物）に添加することができる。ＳＮＰ部位の上流の領域に相補的である標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＮＩ−ＯＨ）を、ＲＮＡポリメラーゼによって延長し、ＳＮＰに対応する次にコードされるヌクレオチドを添加することができる。標識されたターミネーター（ｐｐｐＮＴ−Ｒ２またはｐｐｐＵ−Ｒ２Ｕ、ｐｐｐＡ−Ｒ２Ａ、ｐｐｐＣ−Ｒ２Ｃ、ｐｐｐＧ−Ｒ２Ｇ）は、それぞれ異なるＲ基で標識することができ、例えば、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｃ、Ｒ２ＧおよびＲ２Ｕは、それぞれ、Ｒ１由来の共鳴エネルギーアクセプターであり得る、それぞれが異なる検出可能な波長を有する光を放射する。
【図１９】不稔プロモーター由来のシグナル発生を表す。不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）は、標的分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）への結合のために、リンカー領域（ＡＰＣリンカー）に結合したＲＮＡポリメラーゼに対して共に特異的結合部位を作製する１つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからなる。ＡＰＣは人工プロモーターを含有してもよく、また該ＡＰＣは特異的ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含有してもよい。例えば、一般的なファージＲＮＡポリメラーゼから生じ得るトリヌクレオチドまたはテトラヌクレオチド産物は、標識されたＧｐＡまたはＧｐＡｐＡイニシエーターおよび標識されたｐｐｐＧまたはｐｐｐＡターミネーターにより作製することができる（配列番号：１１、１２）。
【図２０】不稔転写による核酸の検出を表す。特定の疾患またはウイルスおよび細菌病原体に関連するＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の検出のために、核酸を直接かまたは複製もしくはプライマー伸長後のいずれかに検出することができる。第１の場合、不稔プロモーター活性におけるＡＰＣリンカーは、標的核酸の既知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるように設計される。あるいは、標的ＲＮＡの１もしくはそれ以上のコピーの標的ＤＮＡまたはｃＤＮＡコピーを、５’末端で普遍的ＡＰＣリンカー配列を含有するプライマーで開始されるプライマー伸長または逆転写により作製することができる。いずれの場合においても、「捕捉配列」と呼ばれる第２の標的特異的配列を含有するオリゴヌクレオチドが、ビオチン、ヘキサヒスチジンまたは他の任意のハプテンを含むがこれらに限定されない任意の数の固定化タグを介して結合している固体支持体への結合によって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡをサンプルから回収することができる。一旦結合すれば、ポリメラーゼおよび適切な標識されたヌクレオチドの添加によって転写が開始され、先に記載のようなシグナルの発生が生じる。
【図２１】不稔転写によるｍＲＮＡの検出を表す。ｍＲＮＡの検出のための不稔プロモーターカセットは、そのＡＰＣリンカーとして、オリゴＴテイルを含有する。このテイルは、真核生物のｍＲＮＡの３’末端に見出されるｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌに相補的であり、標的ｍＲＮＡへのＡＰＣの結合のために使用される。標的ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのいくつかの領域に相補的である捕捉配列を含有する固定化された捕捉プローブへの結合によって、サンプルから回収することができる。
【図２２】不稔転写によるタンパク質または他のハプテン／抗原の検出を表す。不稔プロモーターカセットからの不稔開始を介するシグナル発生を使用して、タンパク質などの他の分子を検出することができる。例えば、チオール反応性またはアミン反応性タンパク質架橋剤Ｒが共有結合するＡＰＣリンカー配列を調製することができる。ＡＰＣリンカーは、精製されているかまたは（細胞溶解産物などの）複雑な混合物中にあり得る標的タンパク質に添加され、ＡＰＣリンカーは、タンパク質のチオールおよび／またはアミン基の修飾を介して標的タンパク質に共有結合される。次いで、（抗体などの）標的特異的プローブを利用して、標識されたタンパク質を固定化することができる。次いで、不稔プロモーターカセットを、ＡＰＣリンカーを介して結合させ、先に記載のようにシグナルを発生させる。
【図２３】ＡＰＣ粒子における不稔転写を介する分子標的の増強された検出を表す。数十、数百、数千、数万またはそれ以上を含む複数の不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）が結合している粒子を使用することにより、さらにより大きな検出感度を達成することができる。球体はまた、標的分子に結合することができる基に特異的に結合するリンカーを含有する。例えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）をＡＰＣ粒子、そしてビオチンを標的分子に結合させることができ、次いで、標的特異的捕捉プローブとの相互作用を介して固定化することができる。一旦、ＡＰＣ粒子が、例えばＳＡ−ビオチン相互作用を介して標的と相互作用すると、記載のように、ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドをシグナル発生のために添加することができる。
【図２４】超高感度検出あるいは分子画像のためのＡＰＣ粒子によるＤＮＡまたはＲＮＡ標的のコーティングを表す。標的ＤＮＡまたはＲＮＡの超高感度検出あるいは可視化のための代替的方法は、標的ＲＮＡの逆転写かもしくはプローブ標識化ｄＮＴＰ類似体の存在下での標的ＤＮＡのコピー化（単一コピーまたは増幅）により達成することができる。例として、５−ＳＨ−ｄＵＴＰを極めて高頻度でＤＮＡ分子に取り込むことができ、次いで、固定化し、ビオチンなどの他の分子で更に修飾することができる。このために、図２３に記載のように、ＡＰＣ粒子を添加することができ、各粒子は標的上のヌクレオチド類似体と相互作用する。これにより、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、分子検出の様々な方法のために、複数のオリゴヌクレオチド産物を作製することが可能なＡＰＣ粒子で本質的に被覆される。
【図２５】反復オリゴヌクレオチド合成によるテロメラーゼ活性の検出を表す。シグナル発生のために、ＤＮＡポリメラーゼによる反復オリゴヌクレオチド合成を使用することもできるが、しかし、産物であるオリゴヌクレオチドを遊離させる必要はなく、産物においてタンデムに接続させてもよい。例として、テロメラーゼ特異的プローブを固体マトリックスに固定化し、ＤＮＡ合成のためのそれ自体のＲＮＡテンプレートを担持する細胞性テロメラーゼを捕捉することによって、テロメラーゼ活性を検出することができる。例えば、ヒトテロメラーゼにより、酵素上のＲＮＡテンプレートは、ＤＮＡ配列ＧＧＧＴＴＡをコードする。テロメラーゼがサンプル内に存在する場合、捕捉プローブは、テロメラーゼ捕捉プローブの末端に反復的に添加される配列ＧＧＧＴＴＡを含有することができる。シグナル発生は、いくらかの方法で達成することができ、それらのうちの１つは、ＤＮＡ産物の骨格に沿って結合した複数のＲ１基を有する産物を産生させるための合成反応中に１つもしくはそれ以上のレポータータグ化ｄＮＴＰを含むことに関与する。次いで、検出のために、この産物を、Ｒ１標識された産物にハイブリダイズする第２のＲ基（Ｒ２）を結合させたヌクレオチドを含有する相補的プローブにハイブリダイズさせることができる。これにより、Ｒ１およびＲ２間からのＦＲＥＴを介するかまたは多の方法を介するシグナル発生のために、Ｒ１およびＲ２基を集める。あるいは、テロメラーゼは、産物ＤＮＡ内に２つの標識されたヌクレオチドを組み入れて、一本鎖のＤＮＡ内で２つの標識されたヌクレオチド間のエネルギー移動を求めてもよい（配列番号：１３、１４、１５、１６）。
【図２６】色素標識されたイニシエーターの合成を表す。ＩＡＥＤＡＮＳおよびα−Ｓ−ＣＭＰの共役から５’ＥＡＤＡＮＳ−Ｓ−ＣＭＰを合成した。薄層クロマトグラフィープレートのスキャン画像は、コントロールのＩＡＥＤＡＮＳおよびＩＡＥＤＡＮＳ標識化産物を示す。レーン１：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）；レーン２：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）；レーン３：５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン４：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）および（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン５：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）および（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン６：アデノシン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）；レーン７：アデノシン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）および（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン８：（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）；レーン９：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）；レーン１０：シチジン−５’−Ｏ−（１−チオ一リン酸）。レーン４、５および７はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｔおよび１５０ｎｇの変性ｐＢＲ３２２を含有する。
【図２７】標識されたイニシエーターによる不稔転写開始を表す。ゲルの写真は、異なる３つのジヌクレオチドイニシエーター（（１）ＡｐＧ；（２）ビオチン−ＡｐＧ；および（３）５’ＴＡＭＲＡ−ＳｐＡｐＧであった）ならびに終結ヌクレオチド（α３２Ｐ−ＵＴＰであった）を使用する不稔転写開始反応の結果を示す。３つの全てのジヌクレオチドは３位のＵＴＰの組み入れを可能にし、５’ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵを作製した。標識されていないＡｐＧは、ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧよりも効率的に取り込まれるビオチン−ＡｐＧよりも効率的に取り込まれる。
【図２８】標識されたターミネーターによる不稔転写開始を表す。薄層クロマトグラフィープレートのスキャン画像は、標識されていないジヌクレオチドイニシエーター、ＡｐＧ、および標識されたターミネーター（５’−ＳＦ−ＵＴＰ（５−チオアセトアミドフルオレセイン（ｔｈｉｏａｓｅｔｅｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）−ウリジン三リン酸）であった）を使用する不稔転写開始反応の結果を示す。標識されたターミネーターは、効率的に組み入れられ、オリゴヌクレオチド産物ＡｐＧｐＵを作製した。
【図２９】標識されたイニシエーターおよび標識されたターミネーターによる不稔転写開始反応を表す。標識されたジヌクレオチドイニシエーター５’ＴＡＭＡＲＡ  ＳｐＡｐＧを標識されたターミネーターＳＦ−ＵＴＰと混合して、オリゴヌクレオチド産物ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵ−ＳＦを作製した。ＴＡＭＡＲＡ−ＳｐＡｐＧｐＵ−ＳＦの形成を、温度制御マイクロタイタープレートリーダーにおいて、蛍光エネルギー移動により測定した。プレートは、以下のパラメータ：励起４８５、放射６２０；ゲイン３５、サイクルあたりウェルあたり９９読み取りで、１時間ごとに読み取るように設定した。（Ａ）バックグランドを超えるシグナル。バックグランドは、蒸留水のみを含有するウェルとして規定される。読み取りは、０時から始めて１２時間の間１時間ごとに行われた。フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され；得られる放出ピークは５１５ｎｍにある。ＴＡＭＲＡがフルオレセインの極付近にある場合、それは、ピーク励起が５４２ｎｍにあるときに励起され、５６８ｎｍの放出ピークが生じる。（Ｂ）模擬反応を超えるシグナル。模擬反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼおよびｐＢＲ３２２プラスミドを除く全ての反応成分を含有する。読み取りは、０時から始めて１２時間の間１時間ごとに行われた。フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され；得られる放出ピークは５１５ｎｍにある。ＴＡＭＲＡがフルオレセインの極付近にある場合、それは、ピーク励起が５４２ｎｍにあるときに励起され、５６８ｎｍの放出ピークが生じる。（Ｃ）ＳＦ−ＵＴＰを超えるシグナル。ＳＦ−ＵＴＰ反応は、ＴＡＭＡＲＡ−ＡｐＧの代わりに該反応が標識されていないＡｐＧを含有することを除いて、全ての反応成分を含有する。読み取りは、０時から始めて１２時間の間１時間ごとに行われた。フルオレセインは、３６０ｎｍの波長フィルターを使用して励起され；得られる放出ピークは５１５ｎｍにある。ＴＡＭＲＡがフルオレセインの極付近にある場合、それは励起される。
【図３０】ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のコンティグ配列のタンパク質を表す。配列はコンティグ配列の始点から８５６６３０ヌクレオチドで開始するコンティグの小さな部分を表す。配列は、ＣｐＧアイランドを表す。コンティグ番号：ＮＴ  ００８４１０．４（配列番号：１７）。
【図３１】特定の遺伝子のメチル化状態を決定するための「捕捉プローブ」の概略図である。標的遺伝子のＣｐＧアイランド付近の領域に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブをマイクロタイタープレート上に固定化する。目的のＤＮＡを固定化されたプローブに添加し、捕捉プローブに結合させる。次いで、ＤＮＡを化学的に修飾して、非メチル化ＣをＴに変換し、メチル−Ｃが影響を受けないまま残す。次いで、場合により、変換されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、シグナルをさらに増幅させる。次いで、標識したＣｐＧイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドと共に添加する。
【図３２】ＣｐＧ検出アッセイのためのサンプルＤＮＡの調製を表す。ＣｐＧ検出アッセイは、固定化されたＣｐＧアイランドの操作および検出に基づく。ＣｐＧアイランド差を、ビオチンかプライマーを使用するプライマー伸長反応によって分離する（Ａ）。ハイブリッド二重鎖をストレプトアビジンマイクロタイタープレートに固定化する（Ｂ）。ホスファターゼによる末端リン酸の除去（Ｃ）およびポリヌクレオチドキナーゼによる三リン酸の付加（Ｄ）を介して、サンプルＤＮＡ鎖を５’末端で修飾する。変性後、イオウ修飾鎖を、ストレプトアビジンプレートから取り出し、次いで、マレイミドマイクロタイタープレートに共有結合させ（Ｅ）、ここで１つもしくはそれ以上の標的部位プローブ（ＴＳＰ）がアニールされる（Ｆ）。ＴＳＰは、重亜硫酸ナトリウム処置により、標的化されたＣｐＧ配列においてテンプレートＣを潜在的脱アミノ化に暴露する一方、テンプレート鎖／ＴＳＰ複合体の二本鎖部分を保護する（Ｇ）。配列のこの変換は、脱アミノ化反応における最後の変性後のＴＳＰの置き換えを可能にする（Ｈ）。この段階で、重亜硫酸処置された鎖は、ＴＳＰ複合体でのＣｐＧメチル化のレベルを定量する転写反応に使える状態にある。必要であれば、ＨでＴＳＰを添加する前に、脱アミノ化鎖をＰＣＲにより増幅することができる。
【図３３】図３４〜３７に示される不稔転写反応のためのテンプレート配列を示す。図３３ａ：ポリ［ｄＧ−ｄＣ］は、ｄＣｐｄＧを反復する合成でオキシヌクレオチドポリマーである。個々の鎖は、変動可能な数のジヌクレオチド反復を含有する（配列番号：１８）。図３３ｂ：バブル複合体１は、合成、部分的に相補的なテンプレートおよび非テンプレート鎖をアニーリングすることによって作製した。垂直方向にずれた非テンプレート鎖は、分子の一本鎖、バブル部分を表す。座標系はバブルの下流端縁に基づく。二本鎖セグメントの隣の対形成していない塩基は、位置＋１にある。位置＋１の左側（上流）に対する位置に、−１から始まる負の数が付与される。座標系を使用して、リボヌクレオチドイニシエーターの３’末端の位置が示される。イニシエーターＡＡの３’末端は＋１に整列され、イニシエーターのＡＵの３’末端は＋２に整列される。転写反応は、理論に従って、イニシエーターの３’末端の左側から右側へ進行する（配列番号：１９、２０）。図３３ｃは、相補的な非テンプレート鎖を伴わないテンプレート鎖を表す。配列を３’〜５’の配向で示す（配列番号：２１）。
【図３４】図３４ａおよび３４ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼおよびＧｐＣリボヌクレオチドイニシエーターによる一本鎖ポリ［ｄＧ−ｄＣ］の転写の結果を示す。γ−３２Ｐ  ＧＴＰは、反応に含まれる唯一のリボヌクレオシド三リン酸であった。ポリ［ｄＧ−ｄＣ］の濃度は１０μｇ／２５μｌ反応に設定した。図３４ａは、転写反応の薄層クロマトグラフを表す。サンプル（１μｌ）を、ＧＴＰでマークされた部位でプロットした。トリヌクレオチド産物ＧｐＣｐＧは、起点から移動する一方、ＧＴＰの移動は認められなかった。図３４ｂは、図３４ａにおいて分析した反応の６μｌサンプルを電気泳動するために使用した２５％変性ポリヌクレオチドゲルを表す。ＢＰＢは、ブロモフェノールブルーマーカーを指す。反応ではＧＴＰのみが含まれるため、産物はＧｐＣｐＧに限定された。
【図３５】バブル複合体（サンプル１〜４）またはテンプレート鎖のみ（サンプル５〜８）を用いる転写反応の薄層クロマトグラフィーを表す。反応は、酢酸Ｎａの非存在下または１５０ｍＭ酢酸Ｎａの存在下で行った。ＡｐＡイニシエーターを用いて、放射性ＵＴＰを反応に含めた。放射性ＡＴＰを、ＡｐＵイニシエーターを含有する反応に添加した。ＡｐＡの３’末端は＋１と共に整列する一方、ＡｐＵの３’末端は＋２に偏位される。ＡｐＡおよびＡｐＵのトリヌクレオチド産物は、クロマトグラフィー中、ほぼ同じ速度で移動する。全ての反応は、１７ｎｇのバブル複合体または８．５ｎｇの一本鎖を含有した。サンプル９およびサンプル１０は、それぞれ高塩および低塩緩衝液において放射性ＡＴＰを含有するネガティブコントロールである。サンプル１１および１２は、高および低塩緩衝液において放射性ＵＴＰを含有するネガティブコントロールである。
【図３６】異なるＲＮＡポリメラーゼによるバブル複合体１（１７ｎｇ／反応）の転写を比較する薄層クロマトグラフを示す。全ての転写反応は、ＡｐＡにより開始した。放射性ＵＴＰの組み入れにより、トリヌクレオチド産物ＡｐＡｐＵが生成された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素およびコア酵素を含有する反応は、１５０ｍＭ酢酸Ｎａを含有した。Ｔ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含有する反応は酢酸Ｎａを補充しなかった低塩反応において行われた。「ＵＴＰ」にて標識したサンプルは、高塩転写緩衝液中に放射性ＵＴＰを含有するネガティブコントロールである。
【図３７】図３７ａおよび３７ｂは、バブル１複合体の量を減少して実施した転写反応の薄層クロマトグラフを示す。全ての反応は、放射性ＵＴＰの存在下で、ＡｐＡにより開始した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は、反応あたり１．５ｐｍｏｌｅで存在した。図に列挙したテンプレートの量は、２５μｌ反応容積中のものであった。
【国際調査報告】
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