(57)【要約】ＶＥＧＦの発現は、臨床的に侵攻性の、タモキシフェン耐性のある転移性乳癌に関連がある。乳癌の増殖、転移及び抗エストロゲン耐性の発生及び線維形成におけるＶＥＧＦ発現の役割を調べるために、ＥＲ−陽性のいくつかのＭＣＦ−７由来細胞株、Ｃ９Ｖを、ドキシサイクリン制御下でＶＥＧＦを発現するよう操作した。乳癌の異種移植片モデルを作製するために胸腺欠損ヌードマウスにＣ９Ｖ細胞を導入した。異種移植片におけるＶＥＧＦの発現により、血管新生が活発化し、腫瘍増殖が促進され、タモキシフェン耐性フェノタイプが刺激され、潜在的転移能が上昇し、線維形成反応が誘導された。これらの結果から、ＶＥＧＦ発現又は作用の抑制は、乳癌治療に有効であることが示唆される。さらに、エストロゲン発現又は作用の抑制によるＶＥＧＦ発現又は作用の抑制もまた有効であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＶＥＧＦ分子の発現を誘導可能なシステムを含有し、さらに次の特徴：すなわち、エストロゲン受容体発現が陽性であること、ＶＥＧＦ発現がない場合に侵襲性がごく小さいこと、エストロゲン応答性増殖及び抗エストロゲン治療に対して感受性があること、のうち少なくとも１つを有する、ヒト乳癌細胞株を得ることと；
ｂ．異種移植片を作製するために前記細胞株を非ヒト哺乳類に導入することと；
ｃ．該細胞株による前記ＶＥＧＦの前記発現を誘導することにより増殖及び転移が起こるように前記異種移植片を刺激することと、
を含む、増殖及び原発部位から第二の部位への転移を誘導することが可能で、さらに非ヒト哺乳類において線維形成反応を誘導することが可能な、前記非ヒト哺乳類においてヒト乳癌を模倣するヒト乳癌異種移植片を作製する方法。
【請求項２】
前記細胞株が、ＭＣＦ−７細胞株、Ｔ−４７Ｄ細胞株又はＺＲ−７５−１細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記非ヒト動物が、選択された時点においてエストロゲン処理を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された時点が、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導前、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導後、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導中及び、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導前、その最中及び後からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト哺乳類が、前記エストロゲン処理の最中に抗エストロゲン処理を受ける、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記抗エストロゲン処理が、タモキシフェン又はタモキシフェン誘導体の投与を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記導入が、皮下経由である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入が、静脈への注入である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト哺乳類が、胸腺欠損ヌードマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌードマウスが卵巣切除されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入が、前記ヌードマウスの乳房脂肪体への前記細胞株の注入である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
マトリゲルが前記細胞株と共に導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記導入が、前記ヌードマウスの尾静脈への注入である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の部位が、肺、リンパ節、骨又は肝臓である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＶＥＧＦの前記発現の結果として、前記異種移植片が刺激物質を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記刺激物質がＦＧＦである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＧＦがｂＦＧＦである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＧＦが前記線維形成反応に寄与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．請求項１に記載の方法により作製された乳癌異種移植片を有する非ヒト哺乳類に治療を適用することと：
ｂ．該異種移植片の増殖に対する前記治療の効果を調べることと、
を含む、ヒト乳癌に対する前記治療を評価するためのアッセイ。
【請求項２２】
前記治療が、前記ＶＥＧＦの作用を阻害する、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記作用が、刺激物質の誘導である、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２６】
前記刺激物質が、ＦＧＦである、請求項２５に記載のアッセイ。
【請求項２７】
前記ＦＧＦが、ｂＦＧＦである、請求項２６に記載のアッセイ。
【請求項２８】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与を含む、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２９】
前記抗体が、中和抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項２８に記載のアッセイ。
【請求項３１】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３２】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与と、エストロゲンの作用を阻害する化合物の投与とを含む、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
前記化合物が、エストロゲン受容体に対する抗体、抗エストロゲン及び前述のあらゆるものの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載のアッセイ。
【請求項３４】
前記ＶＥＧＦに対する前記抗体が、中和抗体である、請求項３２に記載のアッセイ。
【請求項３５】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項３２に記載のアッセイ。
【請求項３６】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項３５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
ａ．請求項１に記載の方法により作製された乳癌異種移植片を有する非ヒト哺乳類に線維形成反応の治療を適用することと：
ｂ．前記線維形成反応の範囲において前記治療の効果を調べることと、
を含む、ヒト乳癌における線維形成反応の前記治療を評価するためのアッセイ。
【請求項３８】
前記治療が、前記ＶＥＧＦの作用を阻害する、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ａである、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４０】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項３９に記載のアッセイ。
【請求項４１】
前記作用が、刺激物質の誘導である、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４２】
前記刺激物質が、ＦＧＦである、請求項４１に記載のアッセイ。
【請求項４３】
前記ＦＧＦが、ｂＦＧＦである、請求項４２に記載のアッセイ。
【請求項４４】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与を含む、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項４５】
前記抗体が中和抗体である、請求項４４に記載のアッセイ。
【請求項４６】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項４４に記載のアッセイ。
【請求項４７】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項４６に記載のアッセイ。
【請求項４８】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与と、エストロゲンの作用を阻害する化合物の投与とを含む、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項４９】
前記化合物が、エストロゲン受容体に対する抗体、抗エストロゲン及び前述のあらゆるものの組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載のアッセイ。
【請求項５０】
前記ＶＥＧＦに対する前記抗体が中和抗体である、請求項４８に記載のアッセイ。
【請求項５１】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ａである、請求項５０に記載のアッセイ。
【請求項５２】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項５１に記載のアッセイ。
【請求項５３】
ａ．請求項１に記載の方法によりヒト乳癌異種移植片を作製すること；及び
ｂ．第二の部位において、乳癌細胞の検出ができるよう、前記ＶＥＧＦ発現の誘導を行った後十分な期間、前記異種移植片を増殖させること、
を含む、原発部位から第二の部位へのヒト乳癌の進行を模倣する方法。
【請求項５４】
前記第二の部位が、肺、リンパ節、骨又は肝臓である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記十分な期間が、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間及び１０週間からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ａ．請求項１に記載の方法により作製された乳癌異種移植片を有する非ヒト哺乳類に治療を適用することと；
ｂ．原発部位から第二の部位へのヒト乳癌の進行に対する前記治療の効果を調べることと、
を含む、原発部位から第二の部位へのヒト乳癌の進行に対する治療を評価するためのアッセイ。
【請求項５７】
前記治療が、前記ＶＥＧＦの作用を阻害する、請求項５６に記載のアッセイ。
【請求項５８】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項５７に記載のアッセイ。
【請求項５９】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６０】
前記作用が、刺激物質の誘導である、請求項５７に記載のアッセイ。
【請求項６１】
前記刺激物質が、ＦＧＦである、請求項６０に記載のアッセイ。
【請求項６２】
前記ＦＧＦが、ｂＦＧＦである、請求項６１に記載のアッセイ。
【請求項６３】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与を含む、請求項５６に記載のアッセイ。
【請求項６４】
前記抗体が、中和抗体である、請求項６３に記載のアッセイ。
【請求項６５】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項６３に記載のアッセイ。
【請求項６６】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項６５に記載のアッセイ。
【請求項６７】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与と、エストロゲンの作用を阻害する化合物の投与とを含む、請求項５６に記載のアッセイ。
【請求項６８】
前記化合物が、エストロゲン受容体に対する抗体、抗エストロゲン及び前述のあらゆるものの組み合わせからなる群から選択される、請求項６７に記載のアッセイ。
【請求項６９】
前記ＶＥＧＦに対する前記抗体が中和抗体である、請求項６７に記載のアッセイ。
【請求項７０】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ａである、請求項６９に記載のアッセイ。
【請求項７１】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項７０に記載のアッセイ。
【請求項７２】
ａ．請求項１に記載の方法によりヒト乳癌異種移植片を作製すること；
ｂ．選択された時点において前記非ヒト哺乳類をエストロゲン処理に曝露すること；及び
ｃ．前記異種移植片のエストロゲン非依存性増殖を検出できるようにするために、前記ＶＥＧＦ発現を誘導後、十分な期間にわたり前記異種移植片を増殖させること、
を含む、エストロゲン依存性増殖からエストロゲン非依存性増殖へのヒト乳癌の進行を模倣する方法。
【請求項７３】
前記選択された時点が、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導前、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導後、前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導中、及び前記ＶＥＧＦの前記発現の誘導前、その最中及び後、からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ａ．請求項１に記載の方法により作製した乳癌異種移植片を有する非ヒト哺乳類に、エストロゲン依存性増殖からエストロゲン非依存性増殖へのヒト乳癌の進行に対する治療を適用すること；及び
ｂ．エストロゲン依存性増殖からエストロゲン非依存性増殖へのヒト乳癌の進行に対する前記治療の効果を調べること、
を含む、エストロゲン依存性増殖からエストロゲン非依存性増殖へのヒト乳癌の進行に対する前記治療を評価するためのアッセイ。
【請求項７５】
前記治療が、前記ＶＥＧＦの作用を阻害する、請求項７４に記載のアッセイ。
【請求項７６】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ａである、請求項７５に記載のアッセイ。
【請求項７７】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項７６に記載のアッセイ。
【請求項７８】
前記作用が、刺激物質の誘導である、請求項７５に記載のアッセイ。
【請求項７９】
前記刺激物質が、ＦＧＦである、請求項７８に記載のアッセイ。
【請求項８０】
前記ＦＧＦが、ｂＦＧＦである、請求項７９に記載のアッセイ。
【請求項８１】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与を含む、請求項７４に記載のアッセイ。
【請求項８２】
前記抗体が、中和抗体である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項８２に記載のアッセイ。
【請求項８４】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項８３に記載のアッセイ。
【請求項８５】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与と、エストロゲンの作用を阻害する化合物の投与とを含む、請求項７４に記載のアッセイ。
【請求項８６】
前記化合物が、エストロゲン受容体に対する抗体、抗エストロゲン及び前述のあらゆるものの組み合わせからなる群から選択される、請求項８５に記載のアッセイ。
【請求項８７】
前記ＶＥＧＦに対する前記抗体が中和抗体である、請求項８５に記載のアッセイ。
【請求項８８】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ａである、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項８９】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項８８に記載のアッセイ。
【請求項９０】
ａ．請求項１に記載の方法によりヒト乳癌異種移植片を作製すること；及び
ｂ．前記異種移植片の血管形成を検出することができるよう、前記ＶＥＧＦ発現を誘導後、十分な期間にわたり前記異種移植片を増殖させること、
を含む、ヒト乳癌における血管形成の進行を模倣する方法。
【請求項９１】
ａ．請求項１に記載の方法により作製した乳癌異種移植片を有する非ヒト哺乳類に、血管形成の進行に対する治療を適用すること；及び
ｂ．前記異種移植片における血管形成の進行に対する前記治療の効果を調べること、
を含む、ヒト乳癌における血管形成の進行に対する前記治療を評価するためのアッセイ。
【請求項９２】
前記治療が、前記ＶＥＧＦの作用を阻害する、請求項９１に記載のアッセイ。
【請求項９３】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項９２に記載のアッセイ。
【請求項９４】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項９３に記載のアッセイ。
【請求項９５】
前記作用が、刺激物質の誘導である、請求項９２に記載のアッセイ。
【請求項９６】
前記刺激物質が、ＦＧＦである、請求項９５に記載のアッセイ。
【請求項９７】
前記ＦＧＦが、ｂＦＧＦである、請求項９６に記載のアッセイ。
【請求項９８】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与を含む、請求項９１に記載のアッセイ。
【請求項９９】
前記抗体が、中和抗体である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項９８に記載のアッセイ。
【請求項１０１】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項１００に記載のアッセイ。
【請求項１０２】
前記治療が、前記ＶＥＧＦに対する抗体の投与と、エストロゲンの作用を阻害する化合物の投与とを含む、請求項９１に記載のアッセイ。
【請求項１０３】
前記化合物が、エストロゲン受容体に対する抗体、抗エストロゲン及び前述のあらゆるものの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０２に記載のアッセイ。
【請求項１０４】
前記ＶＥＧＦに対する前記抗体が、中和抗体である、請求項１０２に記載のアッセイ。
【請求項１０５】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ−Ａである、請求項１０４に記載のアッセイ。
【請求項１０６】
前記ＶＥＧＦ−Ａが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６からなる群から選択されるＶＥＧＦ−Ａアナログである、請求項１０５に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願特許第６０／４４９，９８０号（２００３年２月２６日出願）に対する優先権及び利益を主張する。本願に記載される研究の資金の一部は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  の助成金、Ｐ５０  ＣＡ８９０１９より得ている。本発明において、連邦政府は一定の権利を有し得る。
【０００２】
本開示は、癌の動物モデルに関連する。特に、本開示は、誘導物質による誘導において血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するように操作を受けたヒト乳癌細胞株を含有する乳癌異種移植片モデル及び乳癌増殖、転移及び乳癌に関連する他の特徴の治療における前記動物モデルの適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
月経閉止前及び月経閉止後両方の乳癌患者において、及び転移性があり補助治療され、化学防御性である状態において、抗エストロゲン治療は効果的である。化学療法と比較して、抗エストロゲン薬は耐容性良好であり、毒性が低く、副作用も比較的穏やかである。現在のところ、最も広く使用されている抗エストロゲン薬は、タモキシフェンであるが、これはクエン酸塩として経口投与される。乳癌の全患者のうち約６０％がエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性であり、乳癌の全ステージにおけるＥＲ陽性患者のうち最高で７０％の患者においてタモキシフェン治療が奏功することが示されてきた（Ｃｌａｒｋら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１５：２０−２５，１９８８；Ｂａｕｍら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８  Ｓｕｐｐｌ  ４：１−４，１９９８）。世界中でおよそ７００万人の女性が現在、何らかの形のタモキシフェン治療を受けていると推定される（Ｆａｖｏｎｉら、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９：４０６−４１５，１９９８）。しかし、タモキシフェンは、ＥＲ陽性腫瘍の増殖及び進行を完全に防ぐわけではない。ほとんどの患者において、最初にタモキシフェンに反応する癌が再発し、タモキシフェン耐性となり、転移性となる（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５０：１５１−１９６，１９９８；Ｃｌａｒｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ，２０：３４８４−３４９４，２００１）。従って、このような患者に対する効果的な改良型治療法の開発が必要とされている。
【０００４】
抗エストロゲン  タモキシフェンを用いた治療の例は豊富にあるにもかかわらず、タモキシフェン耐性が生じる明確なメカニズムは未だ明らかではない。長年にわたり、タモキシフェン耐性に関する数々のメカニズムが提唱されてきた。これらの研究から、タモキシフェン耐性が主に、１）腫瘍細胞増殖を補助するためのＥＲ−非依存性選択的シグナリング経路又は２）ＥＲアンタゴニストからＥＲアゴニストへのタモキシフェン作用の切り替え等のＥＲ介在メカニズムのいずれかにより生じることが示唆された。
【０００５】
臨床研究から、腫瘍血管新生及び血管透過性に関与する重要な因子であるＶＥＧＦレベルの上昇が、進行疾患に対してタモキシフェン投与を受けている乳癌患者における腫瘍の微細血管密度上昇及び、反応低下と関連することが示されている（Ｆｏｅｋｅｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：５４０７−５４１４，２００１）。さらに、リンパ節転移陰性の乳癌に対してタモキシフェン投与を受けている患者においてＶＥＧＦレベルが中央値よりも高い場合、生存期間が顕著に短くなる傾向がある（Ｌｉｎｄｅｒｈｏｌｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：２２５６−２２６０，２００１）。これらのデータから、ＶＥＧＦ過剰発現が、乳癌のタモキシフェン耐性及び転移と関連することが示唆される。
【０００６】
ＶＥＧＦファミリーにはいくつかのメンバーがある。本分野において通常ＶＥＧＦと呼ばれるＶＥＧＦ−Ａは、培養系における内皮細胞増殖及び移動、及びインビボにおける血管形成を刺激する（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ．Ｒｅｖ．，７：２５９−２７０，１９９６）。ＶＥＧＦは、生理的及び病理的血管形成に必要とされる内皮細胞機能のキーとなる調節因子である。ＶＥＧＦファミリーの他のメンバーには、ＶＥＧＦ−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ及び胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）が含まれる。これらの細胞性受容体には、３種類の膜チロシンキナーゼ  ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１又はＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）及び１種類の非キナーゼ受容体、ニューロピリン−１が含まれる。細胞プロセスにおけるシグナル伝達に関して、通常ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２に結合することが報告されている。ＶＥＧＦは、１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６個（アミノ酸長はシグナルペプチド配列を除いて計算されている。）のアミノ酸のポリペプチドを含む多くのアイソフォームがあるが、それらは、８個のエクソンを含有する１つの遺伝子の選択的スプライシングにより生じる（Ｎｅｕｆｅｌｄら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：９−２２，１９９９）。ＶＥＧＦ−１２１及びＶＥＧＦ−１６５は、腫瘍細胞により最も一般的に分泌されることが多いアイソフォームであるが、内皮細胞において最も強力に作用するのはＶＥＧＦ−１６５アイソフォームであり、新しい毛細血管の形成を引き起こす（Ｖｅｉｋｋｏｌａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：２０３−２１２，２０００；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：７９５−８０３，２００２）。様々な研究から、乳癌の重症度の予後指標としてＶＥＧＦが重要であることが示されてきた（Ｆｏｅｋｅｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：５４０７−５４１４，２００１）。
【０００７】
癌による死亡の原因のほとんどは、原発腫瘍よりもむしろ転移によるものである。現在のところ、転移性及び抗エストロゲン耐性乳癌に対する効果的な治療は非常に限られたものしかない。有効な治療の開発が進まない原因の１つは、適切な動物モデルがないことである。（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：５６３−５７２、２００２；Ｃｏｕｚｉｎ，Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：１００２−１００６，２００３）。癌細胞の播種は、周辺組織への直接的侵襲、血管系を介した広がり（血行性転移）及びリンパ系を介した広がり（リンパ性転移）等の様々なメカニズムを伴って生じる。臨床研究から、ＶＥＧＦが血管新生を介して転移の可能性を上昇させることが示唆されてきた。（Ｃｌａｆｆｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１７２−１８１，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２：８２１−８２６，１９９６）。血管形成は腫瘍増殖にとって不可欠であり、潜伏状態の微小転移から臨床的に検出可能な転移病巣への初期の進行に関与する（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，１：４１５−４２６，２００２）。
【０００８】
乳癌は体のほとんどあらゆる領域に広がり得る。最も多い転移部位は、リンパ節、肺、骨及び肝臓である。乳癌で死亡した女性のうち最高で７０％が肺転移を起こし、そのうち２１％において、肺が唯一の転移部位であった。転移性乳癌は、ＶＥＧＦレベルの上昇と関連があることが分かっている。その血管形成機能に加えて、ＶＥＧＦが、その受容体ニューロピリン−１を介したその自己分泌作用により腫瘍細胞の移動性及び侵襲性を向上させることが最近示された（Ｂａｃｈｅｌｄｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：７２０３−７２０６，２００２）。
【０００９】
インビトロ及びインビボにおける乳癌のＶＥＧＦの影響をさらに研究するために、本出願人の研究室において、Ｃ９Ｖ細胞株と呼ばれるいくつかのＭＣＦ−７由来ヒト乳癌細胞株を確立した。これらの細胞株は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）による制御下において、ＶＥＧＦを過剰発現するよう操作されている。これらの細胞株とともに、マウス飲用水を介したＤｏｘ投与により厳密に腫瘍ＶＥＧＦ発現が調節される、異種移植片マウスモデルを開発した。マウス腫瘍におけるＶＥＧＦレベルが患者のバイオプシー試料で見られる臨床的に意義のある範囲内になるよう調整され得ることは非常に重要である。Ｃ９Ｖ及びＭＣＦ−７親細胞株の両方がエストロゲン受容体陽性であり、エストロゲン増殖依存性、タモキシフェン感受性であり、ヌードマウスの皮下に導入した場合、ごくわずかの転移能を示す。マウス飲用水中へのＤｏｘ添加によりＣ９Ｖ異種移植片においてＶＥＧＦ発現を誘導し、また、腫瘍微小環境の再構築をＶＥＧＦが促進するメカニズムを介して、ＥＲ陽性、タモキシフェン反応性及び非転移性乳癌がタモキシフェン耐性及び転移性となるよう促進するためには、臨床的に意義のあるレベルまでＶＥＧＦを誘導することで十分であることが示される。原発及び転移部位の両方において、ＶＥＧＦ発現腫瘍細胞は、ヒト乳癌細胞に共通であるが異種移植片モデルにおいてほとんど見られない宿主の間質反応の特徴である、線維形成反応を誘導することができる。離れた臓器である肺において播種性腫瘍細胞のコロニー形成をＶＥＧＦ発現が促進するということが観察されたが、このことから、血管形成効果に加えて、ＶＥＧＦの新しい役割が示唆される。ＶＥＧＦ過剰発現がマウスにおいて初期段階で抑えられた場合、腫瘍増殖は停滞し、転移発生が減少した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本開示のある目的は、Ｄｏｘによる制御下で臨床的に意義のあるレベルまでＶＥＧＦを発現するヒトＥＲ陽性乳癌細胞株を提供することである。
【００１１】
本開示の別の目的は、乳癌の進展及び進行、タモキシフェン耐性の誘導、原発腫瘍から離れた場所にある第二の部位における播種性癌細胞のコロニー形成及び転移性誘導におけるＶＥＧＦの役割についてさらに調べるために動物モデルを提供することである。
【００１２】
本開示のさらなる目的は、乳癌の発生及び進行、タモキシフェン耐性の誘導、原発腫瘍から離れた場所にある第二の部位における播種性癌細胞のコロニー形成及び転移性の誘導におけるＶＥＧＦの作用のメカニズムについて調べるために動物モデルを提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、乳癌進行、抗エストロゲンホルモン耐性及び転移の進行における、腫瘍の間質の二方向性相互作用、腫瘍微小環境再構築及び離れた臓器における播種性癌細胞のコロニー形成におけるＶＥＧＦの作用のメカニズムについて調べるために動物モデルを提供することである。
【００１４】
本開示のさらなる目的は、乳癌の発生、進行、タモキシフェン耐性の誘導及び転移能の誘導におけるＶＥＧＦの作用を抑制するためのＶＥＧＦ作用の阻害剤を同定するために、動物モデルを提供することである。
【００１５】
本開示のさらなる目的は、転移の状況及び補助療法における、エストロゲン及びＶＥＧＦシグナリング経路両方を標的とする、候補治療剤、多剤併用療法の新しい治療の前臨床有効性試験用の動物モデルを提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
乳癌におけるＶＥＧＦレベル上昇は、抗エストロゲン療法に対する耐性、腫瘍細胞増殖促進及び腫瘍転移と関連する。インビトロ及びインビボにおけるこれらのプロセスでのＶＥＧＦの役割を調べるために、誘導可能なヒトＶＥＧＦ遺伝子発現系を開発した。Ｄｏｘによる制御下でＶＥＧＦを発現する、改良型ｔｅｔ−誘導性遺伝子発現系を用いて、数種類のＥＲ陽性ＭＣＦ−７由来細胞株（Ｃ９Ｖ細胞株と呼ぶ。）を開発した（Ｑｕら、Ｇｅｎｅ，２００４，３２７，６１−７３）。これらの細胞株を用いて、ＶＥＧＦ発現及び／又は過剰発現の影響を研究するために、乳癌の異種移植片マウスモデルを開発した。この異種移植片モデルを用いて生成させた腫瘍の細胞質ＶＥＧＦレベルが臨床的に意義のあるレベルであったことは重要である。本明細書で使用する場合、ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦ−Ａ及びその派生物が含まれる。派生物という用語は、これに限定されないが、「断片」、「縮重変異体」、「変異体」、「突然変異体」、「アナログ」及び「化学的誘導体」が含まれる。「断片」という用語は、５個以上の連続する又は連続的なＶＥＧＦのアミノ酸（これに限定されないがＶＥＧＦ１６５等）、又は前記ポリペプチドをコードするあらゆる核酸を組み込むＶＥＧＦアミノ酸配列のあらゆるポリペプチドサブセットを意味することを意図する。ＶＥＧＦのアナログには、ＶＥＧＦの様々なアイソフォーム及びスプライシング変異体が包含され、これらに限定されないが、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６が含まれる。
【００１７】
特定のアミノ酸をコードするコドンには、相当な冗長部分があることが知られている。従って、本開示は、ＶＥＧＦにおける同一のアミノ酸の最終的な翻訳物をコードする選択的コドンを含有するそれらの核酸配列又はそれらの断片に向けられる。この明細書の目的に対して、１つ又は複数の選択的コドンを生じる核酸配列は、「縮重変異体」と定義することとする。変異型は、本ペプチドならびに前記変異型をコードする核酸の機能性に変化を生じ得ない、保存的アミノ酸変化、これらに限定されないが、ロイシンの代わりにバリン、又はグルタミンの代わりにアスパラギンへの置換等、を含有するＶＥＧＦ分子として定義される。翻訳されたＶＥＧＦポリペプチド（「突然変異体」）及び前記突然変異ポリペプチドをコードする核酸のいずれかにおける突然変異体もまた、本開示の範囲に含まれる。本突然変異体は、組織の細胞株から分離し得るか、又は組み換え機構を介して導入され得る。これらの突然変異は、発現されたＶＥＧＦポリペプチドの究極的な物理的性質を大幅に変更し得る、又は変更し得ないものである。突然変異体の特性変化の例には、これらに限定されないが、基質に対する酵素又はリガンドに対する受容体の親和性の変化が含まれる。
【００１８】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基礎となるＶＥＧＦ分子の一部ではないがその構造を実質的に変化させない、さらなる化学部分又はアミノ酸を含有するＶＥＧＦを意味する。ある分子とＶＥＧＦ分子のそれぞれのアミノ酸配列間に少なくとも７５％の同一性がある場合、その分子は構造の点から見てＶＥＧＦと「実質的に同等」である。
【００１９】
ある実施形態において、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦ１６５のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＶＥＧＦ２０６のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２０】
ＶＥＧＦ発現が制御されている細胞株の開発
ＭＣＦ−７細胞は、６９歳の女性の胸水由来のヒト乳癌細胞である。ＭＣＦ−７細胞は、ＥＲ陽性、エストロゲン応答性で、抗エストロゲン感受性があり、ヌードマウスに皮下経由で導入した場合の侵襲性はごくわずかである。ＶＥＧＦを導入するために、この実施形態  ＶＥＧＦ１６５において２種類の核酸ベクターを使用した。すなわち、１）バイシストロン性のＴｅｔ−トランス活性化因子発現ベクター（ｐＢＴＥ）；及び２）ＶＥＧＦの発現を調節するＴｅｔ−応答配列ベクター（ｐＴＲＥ−ｊＶＥＧＦ）（図１）である。ベクターｐＢＴＥは、方法の項で説明するようにして構築した。ｐＢＴＥは、ＶＰ１６毒性を低下させ、基底転写活性を低下させ、ヒト細胞２４においてＤｏｘ感受性を上昇させる、多くの改変を組み込んでいる。Ｔｅｔ−トランス活性化因子は、Ｔｅｔ−トランス活性化因子発現を維持するために細胞選択を行えるようにするブラスチシジンに対する耐性を与えるコード配列の第二のセットと結合された下流の内部リボソーム侵入部位を含むバイシストロン性メッセージの一部として発現される。これらのベクターは、安定的なトランスフェクションにより、ＥＲ陽性のｌａｃ−Ｚタグ付加されたＭＣＦ−７細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ、その結果、Ｄｏｘ制御下でＶＥＧＦを発現又は過剰発現するＭＣＦ−７由来細胞株（これらに限定されないが、Ｃ９Ｖと呼ばれる細胞株が含まれる。）が得られた。
【００２１】
抗生物質ブラスチシジンを使用して、及び、説明したようにＤｏｘ処理又は非処理の細胞培養系由来の馴化培地を用いたｈＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡにより、ＶＥＧＦを発現するクローンを選択した。抗ＶＥＧＦ抗体を用いた馴化培地のウェスタンブロッティングから、ＶＥＧＦ分泌がＤｏｘにより厳重に調節されることが分かった（図２）。親ＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７と呼ぶ。）及び構成的にＶＥＧＦを発現する細胞株（ＭＬＶ−１６５−１６と呼ぶ。）とともに、組み換えヒトＶＥＧＦ１６５を対照として使用した。２種類の代表的なクローン、Ｃ９Ｖ４及びＣ９Ｖ１８は、Ｄｏｘに曝露されるとＶＥＧＦ発現が上昇することが示された。高い分子バンドは、ＶＥＧＦの翻訳後修飾を反映すると思われる。
【００２２】
ＶＥＧＦは、インビトロにおける細胞増殖又はタモキシフェン感受性に対して影響がない。これは、ＭＣＦ−７及びＣ９Ｖ細胞がＶＥＧＦ受容体、Ｒ１及びＲ２タンパク質を発現しないという観察と一致する。Ｃ９Ｖ細胞は、培地中にＶＥＧＦが存在する場合及び非存在の場合において同じ速度で増殖し、４−ヒドロキシタモキシフェンに対する感受性が同様に残っていた（図３）。従って、ＶＥＧＦは、Ｃ９Ｖ細胞増殖において自己分泌作用がないようである。ＦＧＦ及びエストロゲンは、Ｃ９Ｖ細胞増殖を刺激した（図３）。
【００２３】
本明細書は、臨床的に意義のあるレベルまでＶＥＧＦ発現を上昇させるよう改変されたヒト乳癌細胞株を調製するためのある方法の詳細を説明する。ある実施形態において、本細胞株は、ＭＣＦ−７細胞株である。しかし、Ｔ４７Ｄ又はＺＲ−７５−１等の他の乳癌細胞株もまた使用し得る。当業者にとって明らかなように行われる本方法に対する改変は、本開示の範囲内に含まれる。さらに、一時的トランスフェクション等、説明する本方法以外の方法も、臨床的に意義のあるレベルまでＶＥＧＦ発現を上昇させるよう改変された細胞株を作製するために使用し得る。これらの代替法もまた、本開示の範囲内とみなされる。
【００２４】
ＶＥＧＦを発現する異種移植片マウスモデルの開発
エストロゲンにより与えられる分裂刺激に追加する形でＶＥＧＦ発現は乳癌増殖を刺激する。
【００２５】
エストロゲンにより与えられる分裂刺激に追加する形で、ＶＥＧＦ発現は乳癌増殖を刺激する。乳癌細胞増殖に対するインビボでのＶＥＧＦ発現の影響を調べるために、卵巣切除したヌードマウスの乳房脂肪体にＣ９Ｖ細胞を接種した。接種マウスを３群に分けた。１）第１群には、本実験全期間にわたり、飲用水中に０．０５ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを添加し、２）第２群には、本実験全期間にわたり、飲用水中に０．２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを添加し、３）第３群には、本実験全期間にわたり、適切な濃度のスクロースを投与した（ネガティブ対照）。マウスの全３群に、Ｃ９Ｖ細胞増殖が最大になるようにエストロゲンペレットを与えた。週に２回、腫瘍体積を調べた（図４Ａ）。６０日間のタイムコースの最後に、腫瘍を摘出し、ＥＬＩＳＡアッセイにより細胞質ＶＥＧＦ含量を測定するために細胞溶解液を調製した（図４Ｂ）。マウス各群の異種移植片の平均腫瘍体積及び細胞質ＶＥＧＦ量は、マウスの飲用水に添加したＤｏｘ濃度と相関した（図４Ａ及び４Ｂ）。エストロゲン添加マウスに飲用水を介してＤｏｘを連続的に投与した結果、腫瘍体積が著しく増加し、細胞質腫瘍ＶＥＧＦ含量が増加した。
【００２６】
ＶＥＧＦがインビトロにおけるＣ９Ｖ細胞増殖に対して自己分泌作用がないことを示す結果と比較して、このインビボでの結果から、ＶＥＧＦが乳癌細胞の成長において傍分泌作用があり、この傍分泌作用がエストロゲンにより与えられる分裂刺激に対して付加的であることが示唆される。この仮説と一致して、細胞増殖マーカー、Ｋｉ−６７による免疫組織化学染色から、Ｄｏｘ誘導性ＶＥＧＦ発現が異種移植片における増殖細胞の割合を約２倍に増加させたことが示された（図５Ａ−５Ｄ）。異種移植片をエストロゲンに曝露するとかなりの割合の腫瘍細胞がＫｉ−６７に対して陽性染色されることから、エストロゲンが乳癌増殖を（予想通り）刺激することが示される（図５Ｃ及び５Ｄ）。エストロゲンと組み合わせてＤｏｘを投与するとＫｉ−６７陽性細胞の割合が増加することから、エストロゲンの増殖刺激に対して付加的なメカニズムによりＶＥＧＦが増殖進行を刺激したことが示される（図５Ｄ）。抗エストロゲン  タモキシフェンの投与により、エストロゲン投与と比較して、Ｋｉ−６７で陽性染色される腫瘍細胞数が減少した（図５Ａを図５Ｃと比較。）。タモキシフェンと組み合わせてＤｏｘを投与するとＫｉ−６７陽性細胞の割合が増加する（図５Ｄ）ことから、また、エストロゲン増殖刺激とは独立したメカニズムによりＶＥＧＦが増殖進行を刺激することが示される。
【００２７】
Ｄｏｘにより誘導されるＶＥＧＦレベルは、臨床的に意義のあるレベルであり、その範囲は０．６ｎｇから２０ｎｇ（ＶＥＧＦ）／ｍｇ（全細胞質タンパク質）である（図４Ｂ）。８４５例の乳癌患者を含む臨床試験から、ＶＥＧＦ発現の中央値レベルが０．２２ｎｇ／ｍｇ（全細胞質タンパク質）であることが分かった。進行疾患に対してタモキシフェン投与を受け、ＶＥＧＦレベルが中央値を超える患者は、再発後の余命が顕著に短いことと相関した。さらに、腫瘍ＶＥＧＦレベルが１．７３ｎｇ／ｍｇから５４２ｎｇ／ｍｇの範囲の患者の生存率は、ＶＥＧＦレベルが０ｎｇ／ｍｇから０．２２ｎｇ／ｍｇ及び０．２２ｎｇ／ｍｇから１．７３ｎｇ／ｍｇの範囲の患者よりも顕著に低かった。この研究における異種移植片マウスの腫瘍ＶＥＧＦ発現は、臨床的に侵襲性の強い、又はタモキシフェン耐性を獲得した乳癌と関連する範囲内である。本明細書において、「臨床的に意義のある」という用語は、進行性乳癌（タモキシフェン耐性を獲得した腫瘍及び転移能を獲得した腫瘍等）に統計的に関連するＶＥＧＦ濃度の範囲内の、改変ヒト細胞株（本明細書中で説明するようにＶＥＧＦを発現するよう改変されたＭＣＦ−７細胞等）において発現されるＶＥＧＦ濃度を意味する。ある実施形態において、改変ヒト細胞株で発現されるＶＥＧＦ濃度は、約０．２ｎｇから５００ｎｇ  ＶＥＧＦ／ｍｇ（全細胞質タンパク質）の範囲である。別の実施形態において、改変ヒト細胞株で発現されるＶＥＧＦの濃度は、約０．５ｎｇから２５０ｎｇ  ＶＥＧＦ／ｍｇ（全細胞質タンパク質）の範囲である。さらに別の実施形態において、改変ヒト細胞株で発現されるＶＥＧＦの濃度は、約１．７ｎｇから１００ｎｇ  ＶＥＧＦ／ｍｇ（全細胞質タンパク質）の範囲である。本開示は、ＶＥＧＦタンパク質をコードする核酸コンストラクトをその親細胞株のゲノムに組み込むことによるヒト細胞株の改変について記載する。しかし、臨床的に意義のあるレベルまでＶＥＧＦの発現を上昇させるための改変は、本開示の範囲内にあると考えるべきである。さらに、他の乳癌細胞株の使用もまた、本開示の範囲内であると考えるべきである。従って、記載されている異種移植片マウスモデルは、乳癌成長及び進行におけるＶＥＧＦの役割の的確なインビボモデルであり、ヒト乳癌進行に対するＶＥＧＦの影響のさらなる研究及びそのような進行及び成長を阻害する化合物の単離に使用することができる。このモデルはまた、乳癌治療の前臨床有効性試験にも使用し得る。
【００２８】
上述の異種移植片マウスモデルの特徴をさらに明らかにするために、マウス内皮細胞特異的マーカーであるＰＥＣＡＭ−１を用いた免疫組織化学染色により、腫瘍微小血管密度の特徴を調べた（図６Ａ及び６Ｂ）。Ｄｏｘ非存在である場合の対照異種移植片組織（図６Ａ）と比較して、ＶＥＧＦ発現がＤｏｘにより誘導された場合、異種移植片組織における微小血管密度上昇が観察された（図６Ｂ）が、このことから、ＶＥＧＦの血管形成作用が明らかになった。これは、細胞質ＶＥＧＦレベル上昇が微小血管密度上昇と関連しているというヒト原発乳癌における臨床研究と一致する。
【００２９】
乳癌増殖におけるＶＥＧＦの作用は可逆的である。上述の実験と同様の実験において、卵巣切除ヌードマウスの乳房脂肪体にＣ９Ｖ細胞を接種した。接種マウスを３群に分けた。１）第１群には、本実験期間の６０日間にわたり、マウスの飲用水中に０．２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを添加し、２）第２群には、最初の１１日間のみ、マウスの飲用水中に０．２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを添加し、３）第３群には適切な濃度のスクロースを投与した（ネガティブ対照）。Ｃ９Ｖ細胞増殖が最大になるように全３群のマウスにエストロゲンペレットを投与した（図７）。１１日間のみＤｏｘを摂取したマウスの腫瘍増殖がＤｏｘ添加除去により劇的に低下したことから、腫瘍成長の初期段階におけるＶＥＧＦ発現又は作用の阻害により腫瘍進行が停滞し得ることが示唆される。
【００３０】
ＶＥＧＦ発現が抗エストロゲン耐性を誘導する。
【００３１】
臨床研究により、腫瘍ＶＥＧＦのレベルが高いことと、タモキシフェン療法等の抗エストロゲン治療の効果の低下及び治療後の再発とが相関することが明らかとなっている。抗エストロゲン耐性におけるＶＥＧＦの役割をさらに調べるために、抗エストロゲン処理した、腫瘍ＶＥＧＦ発現がＤｏｘにより誘導される異種移植片マウスにおける腫瘍増殖を調べた。卵巣切除マウスにおける乳房脂肪体へのＣ９Ｖ細胞の注入により、最初は腫瘍が増殖した。説明したようにそのマウスにエストロゲンを投与した。約１０日後、腫瘍のサイズが１５０ｍｍ３から２００ｍｍ３に到達した時点で、エストロゲンペレットをやめてタモキシフェンペレットを与えた。その時点でそのマウスを２群に分け、１つの群には、スクロース含有飲用水を与え（ネガティブ対照）、他方の群には飲用水にＤｏｘを添加して与えた。Ｄｏｘ誘導性ＶＥＧＦ発現により、Ｃ９Ｖ異種移植片マウスの腫瘍増殖が継続するようになった（図８Ａ及び８Ｂ）。一方、飲用水中にＤｏｘを添加されていない、タモキシフェン処理マウスにおいて、その腫瘍は停滞し、最終的に消退した（図８Ａ及び８Ｂ）。
【００３２】
このことから、腫瘍のＶＥＧＦ発現により、ＥＲ陽性乳癌がタモキシフェン耐性になるよう促進されることが示される。腫瘍細胞におけるＶＥＧＦのタモキシフェン耐性誘導能に対する他のメカニズムに限らず、これに限定されないがＦＧＦ、ＥＧＦ及びヘレグリン等の腫瘍増殖因子を放出するよう間質細胞を刺激することによる細胞増殖に対する代替的なＥＲ−非依存性経路をＶＥＧＦが活性化する可能性がある。
【００３３】
ＶＥＧＦ発現が転移を誘導する。
【００３４】
乳癌による死亡原因のほとんどは、原発腫瘍よりむしろ転移である。タモキシフェン治療を受けている患者における細胞質ＶＥＧＦレベルの上昇は、全般的な生存率悪化と関連がある。担癌ヌードマウスの転移進行におけるＶＥＧＦ過剰発現の影響を調べた。β−ガラクトシダーゼをコードする細菌性ｌａｃＺ遺伝子をＣ９Ｖ細胞株にトランスフェクションした。これにより、マウス組織がＸ−ｇａｌ染色され、遠隔部位での腫瘍細胞播種及び増殖が検出できる。肺のＸ−ｇａｌ染色から、ＶＥＧＦ発現の誘導により、エストロゲンを投与されるか又はタモキシフェンで処理されたかのいずれかの同所性の異種移植片担癌マウスにおいて、肉眼で見える転移が自然発生的に起こった。２種類の細胞株、Ｃ９Ｖ４及びＣ９Ｖ１８を用いたいくつかの異種移植片マウス実験において、ＶＥＧＦ誘導性肺転移が観察された。腫瘍細胞尾静脈注入による実験的転移アッセイからも、ＶＥＧＦが転移を誘導したことが明らかになった。
【００３５】
マウス実験における肺転移発生について表１にまとめる。全９匹のエストロゲン投与マウスのうち６匹及び全９匹のタモキシフェン処理マウスのうち４匹において、そのマウスがＶＥＧＦ誘導を受けた場合に肺転移が見られた。一方、Ｄｏｘを投与されなかったマウスの場合はいずれも肺において転移が見られなかった。さらに、飲用水からＤｏｘを除去することにより、腫瘍増殖速度が低下するだけでなく、肺転移発生が顕著に減少した。第１１日目にドキシサイクリンを除去することによりＶＥＧＦ過剰発現が抑制された場合、６匹のマウスにおいて肺転移が観察されなかった。これらの結果から、ＶＥＧＦ発現が肺転移を促進すること、及びＶＥＧＦシグナリングを阻害することにより転移進行を防ぐ又は遅らせることができ得ることが示される。図９Ａは、担癌マウスにおいてＸ−ｇａｌ染色した肺転移の典型的な像である。腫瘍試料のＨ＆Ｅ組織染色（図９Ｂ）から、Ｘ−ｇａｌ染色により示される肉眼で見える肺転移が確認される。左側の図は、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのＤｏｘ及びエストロゲンに曝露したＣ９Ｖ異種移植片マウスを表す。右側の図は、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのＤｏｘ及び４−ヒドロキシタモキシフェンに曝露したＣ９Ｖ異種移植片マウスを表す。
【００３６】
ＶＥＧＦ発現により、播種性腫瘍細胞のコロニー形成が促進され、線維芽細胞の化学走性的移動性が向上する。
【００３７】
転移プロセスは、腫瘍細胞が原発腫瘍から血液循環へと漏れて第二の部位に播種され、新しい臓器を捕らえて侵入する一連の段階からなる。連続的段階、標的臓器環境において微小な転移を形成するコロニー形成及び肉眼で見える転移病巣へと進行するための増殖は、転移進行を制限する段階である。転移進行においてＶＥＧＦがどの段階でキーとなる役割を果たすのかをさらに調べるために、尾静脈注入により循環系に腫瘍細胞を直接導入し、上皮細胞マーカーであるサイトケラチンに対する抗体を用いた免疫染色によりマウス肺における播種性腫瘍細胞のパターンを調べた。
【００３８】
尾静脈注入から２時間後、この注入を確実に成功させるドキシサイクリン投与を行った、又は行っていないいずれかのマウス群から適出した肺において、多くの単一の腫瘍細胞が見られた（図１０Ａ及び１０Ｃ）。しかし、４週間後、Ｄｏｘを投与しなかったマウスから摘出した肺において腫瘍細胞が全く検出されなかった（図１０Ｂ）。おそらく、播種性腫瘍細胞はアポトーシスにより死んだと思われる。一方、ドキシサイクリンで処理したマウスにおいて、間質細胞により囲まれた腫瘍細胞コロニーが既に頻繁に見られた（図１０Ｄ）。これらのコロニーは、間質細胞に囲まれ、線維形成反応と呼ばれるものを形成していた。線維形成反応のある同類の腫瘍細胞コロニーが、原発担癌マウスからの転移肺においても容易に見出された。組織学的実験から、これらの間質細胞のうち多くが繊維芽細胞であることが明らかになった。この結果から、ＶＥＧＦ発現が、血管形成作用以外のＶＥＧＦの新しい機能として、血管新生の前に間質細胞との相互作用を介して播種性腫瘍細胞の生存及びコロニー形成を促進することが示唆される。
【００３９】
尾静脈注入から１０週間後、ドキシサイクリン非投与マウスにおいてまだ播種性腫瘍細胞が検出されなかったが、一方で、ドキシサイクリン処理したマウスでは、肉眼で見える肺転移が進行していた。図１１で示されるように、これらの転移病巣内で、単一の腫瘍細胞、様々なサイズの腫瘍細胞コロニー、血管及び血液湖（ｂｌｏｏｄ  ｌａｋｅｓ）が混じったパターンが間質細胞に囲まれていた。尾静脈注入されたマウス及び原発腫瘍担癌マウスの両方由来の転移病巣に含まれる間質含量は高く、１つの観察野あたり約５０％から８０％の線維形成があると推定された。
【００４０】
線維形成反応又は線維形成は、乳癌でよく観察される癌腫に対する間質反応（主に繊維芽細胞性）である。ヒト癌において、原発腫瘍部位及び腫瘍転移部位の両方で線維形成が観察され得る。乳癌、結腸癌、胃癌及び膵臓癌等の一般的な癌腫の多くで、間質は腫瘍質量の大部分を占め、あるケースでは、腫瘍質量の９０％超に及ぶ（Ｅｌｅｎｂａａｓら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６４，１６９−１８４，２００１）。しかし、線維形成は、トランスジェニック及び異種移植モデル両方を含む動物癌モデルにおいてあまり見られない。線維形成反応の特徴は、密度が高いコラーゲン性の間質が存在することであるが、これは、腫瘍の臨床像が「こぶ」状であることの一因であり得る。この証拠から、コラーゲン及び線維形成反応において見られる他の物質が間質に存在する筋繊維芽細胞により合成されることが示唆される。サイトカインメカニズム及び微小血管障害（創傷治癒と同じような性質がある）、及び腫瘍細胞により放出される増殖因子による筋繊維芽細胞の傍分泌性活性化等、筋繊維芽細胞活性化及びコラーゲン合成を説明するメカニズムがいくつか提案されている。
【００４１】
繊維芽細胞間質細胞がＶＥＧＦ発現腫瘍細胞の各コロニーを取り囲んでいるという観察から、ＶＥＧＦにより繊維芽細胞性間質細胞の腫瘍細胞への化学走性的移動性が上昇し得ることが示唆される。従って、ＶＥＧＦがインビトロで繊維芽細胞の化学走性的移動性に影響を与えるか否かを調べるためにヒト包皮繊維芽細胞を使用した。細胞移動トランスウェルアッセイの結果から、ＶＥＧＦがまさに劇的に繊維芽細胞の化学走性的移動性を向上させることが示された（図１２）。この結果から、腫瘍放出性ＶＥＧＦが繊維芽細胞間質細胞を引き付け、これと相互作用し、腫瘍微小環境の再構築を誘導し、この新しい環境が腫瘍細胞生存及び増殖に適していることが示唆される。しかし、他のタイプの間質細胞とのＶＥＧＦの相互作用が転移進行において同じように重要な役割を果たし得る。
【００４２】
ＶＥＧＦ発現が繊維形成反応を誘導し、原発腫瘍におけるＦＧＦ含量を増加させる。
【００４３】
説明したマウス異種移植片モデルを用いて、腫瘍の微小環境の変化を誘導するための、及びタモキシフェン耐性フェノタイプを与えるために傍分泌シグナリングメカニズムを促進するための、ＶＥＧＦ過剰発現の能力をさらに調べた。上皮細胞マーカーとしてサイトケラチンを用いて行った免疫組織染色により、原発腫瘍においてＶＥＧＦにより線維形成反応が促進されたことが観察された。図１３Ａ−１３Ｃ。図１３Ａは、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのＤｏｘ処理を行わずに、Ｃ９Ｖ細胞を接種してから６０日後のタモキシフェン処理マウス由来原発腫瘍試料の代表的なサイトケラチン染色像を示し、一方、図１３Ｂは、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのＤｏｘ処理を行いＣ９Ｖ細胞を接種してから６０日後のタモキシフェン処理マウス由来原発腫瘍試料の代表的なサイトケラチン染色像を示す。ＶＥＧＦ誘導を行わない場合、腫瘍切片のおよそ１０％の領域で線維形成が観察される。しかし、ＶＥＧＦ誘導を行った場合、腫瘍切片の約４０％で線維形成が観察される（図１３Ｃ）。
【００４４】
原発腫瘍においてＶＥＧＦ発現により線維形成反応が促進されると、腫瘍環境におけるマトリックスタンパク質、生存因子、増殖因子及び他のタンパク質含量に影響が及ぼされる。タモキシフェン処理腫瘍における塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の発現を調べた。図１４は、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した腫瘍細胞溶解液におけるｂＦＧＦ含量の定量を示す。Ｄｏｘ処理を行わなかった場合、腫瘍細胞溶解液におけるｂＦＧＦレベルは、７５０ｐｇ／ｍｇ細胞溶解液タンパク質の範囲であった。しかし、Ｄｏｘ誘導性のＶＥＧＦ発現により、腫瘍細胞溶解液におけるｂＦＧＦレベルが顕著に上昇した（ｂＦＧＦレベルは、２５００ｐｇ／ｍｇ細胞溶解液タンパク質の範囲であった。）。この結果から、ＶＥＧＦ発現がヌードマウスのＣ９Ｖ異種移植片におけるｂＦＧＦ含量を増加させることができることが示される。ｂＦＧＦは、細胞増殖、細胞移動、分化、間質反応及び組織の構成ならびに血管形成に関与することが示されている。従って、腫瘍細胞との間質細胞の相互作用には、ｂＦＧＦ等の増殖因子が介在し得る。多くの増殖因子、増殖因子受容体又は増殖因子シグナリング中間体の構成的発現により、ＥＲ陽性乳癌細胞がエストロゲン非存在下又は抗エストロゲン存在下において増殖能を獲得できるようになり得ることが報告されている（Ｓｃｈｉｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，９：４４７Ｓ−４５４Ｓ，２００３）。これらのデータから、原発及び転移部位両方において、腫瘍細胞の生存及び増殖に適した微小環境を確立する際に、腫瘍ＶＥＧＦ発現が腫瘍細胞を助けるメカニズムが示唆される。
【００４５】
臨床的に意義のあるレベルのＶＥＧＦを発現するように、記載したコンストラクトを発現するＭＣＦ−７細胞、Ｃ９Ｖ４及びＣ９Ｖ１８等、を刺激することができる。ＭＣＦ−７細胞それ自身に対する細胞分裂性ではなく、ＶＥＧＦは、繊維芽細胞、内皮細胞及び他の間質細胞成分に対する傍分泌刺激を与える。言い換えると、これらの細胞は、腫瘍細胞を増殖及び生存の面で補助する様々な因子と共に腫瘍細胞を与える。さらに、これらの因子は、原発腫瘍部位及び腫瘍転移の第二の部位において腫瘍細胞が増殖可能になるうような線維形成の誘導及び血管形成等、局所的な微小環境の変化を促進する。さらに、間質細胞成分の刺激によって、腫瘍の侵襲性及び転移プロセスを促進する化学走性因子がもたらされ得る。
【００４６】
記載したモデル系により、癌進行、特に乳癌進行におけるＶＥＧＦの影響を研究するための臨床的に意義のあるモデル系が得られる。記載したモデル系により、乳癌増殖、乳癌細胞の抗エストロゲン療法耐性メカニズム、転移及び線維形成を含む、様々な経路におけるＶＥＧＦの関与を研究するための手段が得られる。記載した異種移植片モデルは、臨床的に意義のある範囲のＶＥＧＦを発現し、ＶＥＧＦ発現が抗生物質Ｄｏｘの添加により厳密に制御可能であるという点でユニークである。さらに、本異種移植片モデルは、線維形成反応等、通常ヒトにおける乳癌に関連する特徴を有する。従って、本明細書中に記載された異種移植片モデルにより、本分野で現在までのところ利用可能なモデルを凌ぐ長所が得られる。
【００４７】
本開示中の論文、書籍、特許、ウェブサイト及び他の公表物に対する全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用されるものとする。外国優先権を主張するためのみの目的で、追加的な請求項を添付する。
【００４８】
材料と方法
材料
リポフェクタミン  ＰｌｕｓＴＭ、Ｚｅｏｃｉｎ、ｐＺｅｏ−ＳＶ  プラスミド及びブラスチシジンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手した。プラスミド  ｐＴｅｔ−ｏｎ、ｐＴＲＥは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）より入手した。改良型改変イーグル培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ‘ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＥＭ））及びウシ胎児血清は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＩ）より入手した。
【００４９】
ベクター構築
ベクター  ｐＢＴＥの構築（図１）：プラスミド  ｐＵＨｒｔ６２−１に含有される、改変ｔｅｔ−トランス活性化因子、ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２は、Ｄｒ．Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｈｉｌｌｅｎ１８より入手した。下記に述べるようにして作製したベクター  ｐＥＦ６−ＩＶＳ−ＩＲＥＳ−ｂｓｄにｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２をサブクローニングし、その結果、ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２及びブラスチシジン耐性遺伝子（ＢｓｄＲ）両方をコードするバイシストロン性メッセージを生じる発現プラスミドを得た。
【００５０】
親プラスミドとしてｐＥＦ６  Ｍｙｃ／Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いることによって、ｐＥＦ６−ＩＶＳ−ＩＲＥＳ−ｂｓｄベクターを構築した。テンプレートとしてｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより）を用いてＰＣＲ断片、ＩＶＳ−ＩＲＥＳを増幅し、ＢｃｌＩ−ＮｃｏＩ制限酵素処理したｐＥＦ６  Ｍｙｃ／Ｈｉｓ  Ａプラスミド骨格にサブクローニングした。続いて、ＥＦ１αプロモーターを、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来のＣＭＶ  ＩＥプロモーターに置換して、最終的なバイシストロン性発現プラスミド  ｐＢＴＥを作製した。
【００５１】
ｐＴＲＥ−ｈＶＥＧＦ（図１）の構築：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲにより、Ｎ末端分泌シグナルペプチド配列を含むヒトＶＥＧＦ１６５型のｃＤＮＡを得た。ｐＴＲＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ部位にｈＶＥＧＦ１６５をサブクローニングして、最終的なベクター、ｐＴＲＥ−ｈＶＥＧＦを作製した。適切な酵素による消化及び配列決定により、方向及びＶＥＧＦインサートを確認した。
【００５２】
Ｄｏｘ制御を受けるＶＥＧＦ発現を伴うＮＣＦ−７由来細胞株の作製
ｌａｃ−Ｚタグ付加ＭＣＦ−７細胞に、バイシストロン性発現ベクター  ｐＢＴＥ中の改変ｔｅｔ−トランス活性化因子を安定的にトランスフェクションし、培地中の３μｇ／ｍｌ  ブラスチシジンを用いて選択し、Ｃ９細胞と名付けた。ｔｅｔ−トランス活性化因子発現クローン  Ｃ９に、ｐＴＲＥ−ｈＶＥＧＦ及びゼオシン耐性を与えるプラスミド、ｐＺｅｏ−ＳＶを再びトランスフェクションした。１００μｇ／ｍｌレベルにおけるゼオシン耐性細胞クローンを単離し、増殖させた。１％ＦＢＳを含有し、０．５μｇ／ｍｌのＤｏｘが存在する、又は非存在のＩＭＥＭ中の４８時間の各培養由来の馴化培地を回収した。ヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、使用説明書に従い使用。）を用いて馴化培地中のＶＥＧＦ濃度を測定した。ＥＬＩＳＡ  ＶＥＧＦ値の正規化のために各培養由来の細胞数を計数した。ポリクローナル抗ｈＶＥＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、馴化培地のウェスタンブロッティングにより、選択された細胞株における分泌ＶＥＧＦのＤｏｘ制御発現をさらに調べた。
【００５３】
細胞増殖アッセイ
このアッセイに使用した細胞は、フェノールレッドフリー（ＰＲＦ）−ＩＭＥＭ中の５％  チャコール処理ウシ血清（ＣＣＳ）で数回培地交換を行って丸一日エストロゲンを除去した。次に、同じ培地の入った２４ウェルプレートに、１ウェルにつき２０，０００個ずつ細胞を播種した。翌日、３ウェルに対して、第０日として計数を行った。示されたように、各条件につき３ウェルずつ、細胞培養系に対して様々な条件を与えた。第３日に各ウェルの細胞数を数えた。組み換えＶＥＧＦ及びＦＧＦａ  タンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手し、ＶＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ；ＦＧＦ−１：２０ｎｇ／ｍｌ；Ｔａｍ：４−ヒドロキシタモキシフェン、１０−７Ｍ及びＥ２：１７−βエストラジオール、１０−８Ｍであった。
【００５４】
皮下異種移植及び尾静脈注入マウス実験
細胞接種３日前に、７週齢から８週齢の卵巣切除した胸腺欠損ヌードマウスにスクロース（２．５％）のみ又はスクロース及び様々な濃度のＤｏｘを含有する飲用水を与えた。６０日間放出型の０．７２ｍｇ−１７ｂ−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を、細胞接種１日前にマウスに埋め込んだ。翌日、２００ｍｌの５０％  フェノールレッドフリーのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に懸濁した１０７個の細胞を、各マウスの乳房脂肪体に皮下接種した。腫瘍サイズ及び動物体重の両方を週に２回測定した。Ｖｔ（ｍｍ３）＝ＬｘＷ２／２（式中、Ｌ及びＷは、各測定値の長径及び短径である。）により腫瘍体積を測定した。タイムコースの最後に、腫瘍を摘出し、半分に切り、片方の半分を液体窒素中で保存し、残りの半分を１０％  リン酸緩衝液ホルマリンで固定した。様々なマウス臓器の試料も回収し、組織学的観察のために固定した。
【００５５】
腫瘍増殖におけるタモキシフェン耐性を分析するために、腫瘍の体積が１５０ｍｍ３から２５０ｍｍ３に到達したところで、埋め込んだエストロゲンペレットを６０日間放出型の５ｍｇタモキシフェンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）と置換した。マウスを無作為に２群に分けた。１つの群には０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｄｏｘ及び２．５％  スクロースを含有する飲用水を与え、もう１つの群には、スクロースのみを含有する飲用水を与えた。
【００５６】
尾静脈注入実験において、１００μｌ  ＰＢＳ中の１Ｘ１０６  Ｖ９Ｖ細胞をマウス尾静脈に注入し、様々な時点において肺組織を回収した。
【００５７】
組織におけるＸ−ｇａｌ染色
１０％  リン酸緩衝ホルマリン中で４時間から６時間、回収した肺及びリンパ節をある程度固定し、次にＸ−ｇａｌ染色溶液で染色した：５ｍＭ  フェリシアン化カリウム、５ｍＭ  フェロシアン化カリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．０１％  デオキシコール酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトシド（ジメチルホルムアミド中の４０ｍｇ／ｍｌ  ｘ−ｇａｌ保存液から希釈し、使用直前に添加）。室温にて暗所で一晩、組織試料を染色した。組織試料をＰＢＳでリンスし、次に観察して青く染色された転移性腫瘍細胞をＬＥＩＣＡ  解剖顕微鏡下で写真撮影した。１０％リン酸緩衝ホルマリンでその試料を再び固定し、パラフィン包埋し、Ｈ＆Ｅ組織学的分析を行った。
【００５８】
肺転移及び免疫組織化学
肺試料をいくつかの細長い小片に切断し、パラフィンに包埋した。肺、リンパ節及び腫瘍試料の５−μｍ切片をＨ＆Ｅ染色した。ＬＥＩＣＡ  ＤＭＬＢ顕微鏡下で転移病巣を調べた。マウス肺における転移病巣のサイズが直径にわたって１０細胞分よりも大きい場合を肉眼的転移とし、小さい場合を微小転移とした。転移病巣に対して、各マウス由来の約１ｃｍ２の肺切片を調べた。
【００５９】
免疫組織化学染色において使用した抗体は、上皮細胞マーカーであるサイトケラチンに対するポリクローナル抗体（Ｋｅｒａｔｉｎ  Ｐａｎ  Ａｂ−１、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓより。）、マウスＰＥＣＡＭ−１に対するラットモノクローナル抗体（Ｍｅｃ  １３．３，ＢＤ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、細胞増殖マーカー、Ｋｉ−６７に対するポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）であった。
【００６０】
腫瘍細胞質ＶＥＧＦレベルの測定
液体窒素中に保存した腫瘍試料を凍結融解し、周囲の脂肪を切り離し、細かい小片にした。組織試料  １００ｍｇに対して細胞質調製緩衝液を０．５ｍｌの割合で添加した。その組織を５０％の出力で氷上でＰｏｌｙｔｒｏｎを用いてホモジェナイズした。ドライアイス上で凍結融解を３回繰り返して処理試料中の細胞を細胞溶解し、高出力で各２秒ずつ３回、超音波破砕にかけてさらに崩壊させた。４℃未満で３０分間、１２０００ｒｐｍで試料を遠心した。ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦ含量測定に使用する細胞質試料を上清から回収した。特異的ＶＥＧＦ含量を計算するために、タンパク質濃度を測定した。細胞質調製緩衝液には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４；１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０ｍＭ  モリブデン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）；１．０ｍＭ  １−チオグリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）が含有されていた。
【００６１】
トランスウェル細胞移動（化学走性的移動性）アッセイ
使用説明書に従い、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手したマトリゲルコートした８μｍポアサイズのインサートを有する２４ウェル化学走性チャンバーを用いることにより細胞移動アッセイを行った。下側のチャンバーに、ＤＭＥＭ細胞培養液又は１０％  ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌ組み換えＶＥＧＦタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を添加した。上側のチャンバーに、２Ｘ１０５個の包皮繊維芽細胞を播種した。３７℃にて４時間インキュベーションした後、フィルターを固定し、０．５％  クリスタルバイオレットで染色し、フィルターを通して移動した細胞を数えた。
【００６２】
【表１】
2006519018.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】１Ａ及び１Ｂは、ヒトＶＥＧＦ１６５を産生させるためにＭＣＦ−７細胞に安定的にトランスフェクションを行ったＤＮＡコンストラクトの図である。図１（ａ）は、バイシストロン性のｔｅｔ−トランス活性化因子コンストラクト（ｐＢＴＥ）を説明し、図１（ｂ）は、ｔｅｔ−応答性配列コンストラクト（ｐＴＲＥ−ｈＶＥＧＦ）を説明する。これらのコンストラクトを安定的に組み込まれたＭＣＦ−７細胞は、説明のように作製される。
【図２】図２は、代表的なＭＣＦ−７由来細胞株からの馴化培地中の分泌ＶＥＧＦタンパク質のウエスタンブロッティング分析を示す。非トランスフェクションＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７という。）、ｐＢＴＥコンストラクトのみをトランスフェクションしたＭＣＦ−７細胞（Ｃ９という。）、ＶＥＧＦを構成的に発現する細胞株（ＭＬＶ−１６５−１６という。）及びヒト組み換え１６５アミノ酸型ＶＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を対照として使用した。０．２μｇ／ｍｌ  Ｄｏｘの存在下及び非存在下の両方で示されるように、ｐＴＲＥ−ｈＶＥＧＦ及びｐＢＴＥコンストラクト両方をトランスフェクションしたＣ９Ｖ４及びＣ９Ｖ１８細胞株を分析した。分子量の大きいバンドは、ＶＥＧＦ翻訳後修飾を反映すると思われる。
【図３】図３は、インビトロにおける細胞増殖に対してＶＥＧＦの自己分泌の影響がないことを示す。エストロゲンがない状態にしたＣ９Ｖ細胞を、説明どおり、エストロゲンフリー培地で培養し、示すように処理した。第３日に、細胞カウントにより、細胞数を計測した。処理条件は、示されるように、ＶＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ；ＦＧＦ：ＦＧＦａ、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｔａｍ：４−ヒドロキシタモキシフェン、１０−７Ｍ、及びＥ２：１７−βエストラジオール、１０−８Ｍである。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、腫瘍増殖におけるＶＥＧＦ発現の効果（腫瘍体積により測定）及び細胞質のＶＥＧＦ濃度と腫瘍体積との相関を示す。説明どおり、ヌードマウスにおいてＶＥＧＦ発現腫瘍を形成させた。図４Ａは、５０日間にわたり、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのマウス飲用水中のＤｏｘ添加により、用量依存的に腫瘍増殖速度が上がったことを示す。図４Ｂは、各マウス群における平均腫瘍体積が、ＥＬＩＳＡにより測定された腫瘍ＶＥＧＦ含量及びマウス飲用水中のＤｏｘ用量に直接相関があることを示す。
【図５】図５Ａから５Ｄは、Ｄｏｘ制御ＶＥＧＦ発現が、腫瘍切片における細胞増殖マーカー、Ｋｉ−６７で陽性染色される核の割合の上昇と関連があったことを示す（Ｄｏｘ制御されていることを示す。）。説明どおり、ヌードマウスにおいてＶＥＧＦ発現腫瘍を形成させた。ＶＥＧＦ発現は、インビボでの腫瘍細胞増殖を刺激した。Ｄｏｘ制御を受けているＶＥＧＦ発現により、タモキシフェン処理マウス（図５Ａ及び５Ｂ）及びエストロゲン補給マウス（図５Ｃ及び５Ｄ）両方において、腫瘍細胞増殖が促進される。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、Ｄｏｘ制御を受けているＶＥＧＦ発現により、マウス内皮細胞特異的マーカーであるＰＥＣＡＭ−１による免疫組織化学染色を特徴とする腫瘍微小血管密度が増加したことを示す。説明どおり、ヌードマウスにおいてＶＥＧＦ発現腫瘍を形成させた。図６Ａは、ＶＥＧＦ発現誘導を行っていない、エストロゲン存在下における免疫組織化学染色を示し、一方、図６Ｂは、Ｄｏｘ誘導性ＶＥＧＦ発現がある、エストロゲン存在下における免疫組織化学染色を示す。
【図７】図７は、乳癌の増殖速度に対するＶＥＧＦの影響が可逆的であることを示す。説明どおり、ヌードマウスにおいてＶＥＧＦ発現腫瘍を形成させた。接種マウスを３群に分けた（全群ともエストロゲンを投与されている。）。第１群には、本実験の全期間中、０．２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを投与し、第２群には、１１日間のみ０．２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを投与し、第３群には、本実験の全期間中、スクロースを投与した（ネガティブ対照）。１１日間のみＤｏｘを投与されたマウスの腫瘍増殖速度は、Ｄｏｘ除去時に劇的に低下したが、このことから、初期段階でのＶＥＧＦの阻害により、疾患の進行が停滞し得ることが示唆される。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ＶＥＧＦ発現がタモキシフェン耐性を誘導することを示す。説明どおり、ヌードマウスにおいてＶＥＧＦ発現腫瘍を形成させた。腫瘍体積が１５０ｍｍ３から２００ｍｍ３に到達した時点で、エストロゲンペレットをタモキシフェンペレットに置き換えた。マウスの腫瘍を０．２ｍｇ／ｍｌのＤｏｘに曝露してＶＥＧＦ発現を誘導すると、腫瘍増殖が継続することが明らかとなった。しかし、Ｄｏｘに曝露しなかったマウスの腫瘍は停滞したままで、タモキシフェン処理マウスにおいては最終的に退消した。図８Ａは、異種移植片を得るためにＣ９Ｖ４細胞株を使用したマウスからの結果を示し、図８Ｂは、異種移植片を得るためにＣ９Ｖ１８細胞株を使用したマウスからの結果を示す。
【図９】図９Ａから９Ｄは、ＶＥＧＦ発現により、原発腫瘍の転移が誘導されたことを示す。親株であるＣ９Ｖ４  ＭＣＦ−７細胞には、ＬａｃＺタグが付加されていた。説明どおり、ヌードマウスにおいてＶＥＧＦ発現腫瘍を形成させた。その肺のＸ−ｇａｌ染色から、Ｄｏｘ及びエストロゲン（図９Ａ及び９Ｃ）、又はエストロゲンの後にタモキシフェン（図９Ｂ及び９Ｄ）を投与されたマウスにおいて腫瘍細胞のマクロ転移性の沈着物があることが示された。Ｘ−ｇａｌ染色は図９Ａ及び９Ｂで示し、肺組織試料のＨ＆Ｅ組織染色は図９Ｃ及び９Ｄで示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｄは、血管形成効果に加えてＶＥＧＦの新しい役割として、ＶＥＧＦ発現により、遠隔臓器において播種性腫瘍細胞のコロニー形成が促進されることを示す。尾静脈注入により循環系にＣ９Ｖ細胞を直接導入し、上皮細胞マーカーであるサイトケラチンに対する抗体を用いた免疫染色を行うことにより、マウス肺における播種性腫瘍細胞のパターンを調べた。図１２Ａ及び１２Ｃは、非Ｄｏｘ投与動物（図１２Ａ）及びＤｏｘ投与動物（図１２Ｃ）における尾静脈注入から２時間後に得た肺切片におけるサイトケラチンによる免疫染色を示す。図１２Ｂ及び１２Ｄは、非Ｄｏｘ投与動物（図１２Ａ）及びＤｏｘ投与動物（図１２Ｃ）における尾静脈注入から４週間後に得た肺切片におけるサイトケラチンによる免疫染色を示す。尾静脈注入から２時間後の場合、Ｄｏｘ処理の有無に関わらず動物の肺において腫瘍細胞が検出された一方で、尾静脈注入から４週間後の場合は、ＶＥＧＦ発現を誘導するためにＤｏｘ投与を受けた動物の肺においてのみ、腫瘍細胞が検出された。
【図１１】図１１は、ＶＥＧＦ発現が肉眼で分かる転移病巣を誘導したことを示す。尾静脈注入から１０週間後、飲用水中のＤｏｘを摂取したマウス由来の肺において、肉眼で分かる転移病巣が数ヶ所観察された。サイトケラチン免疫組織染色により、肉眼で分かる転移病巣において、１個の腫瘍細胞の混合パターン、様々なサイズの腫瘍細胞コロニー、血管、血液湖（ｂｌｏｏｄ  ｌａｋｅｓ）及び間質細胞が観察された（腫瘍は、薄く染色されている間質細胞に囲まれた黒っぽい部分として見える。矢印は、その病巣の血液湖（ｂｌｏｏｄ  ｌａｋｅｓ）を指す。）。
【図１２】図１２は、ＶＥＧＦにより、ヒト繊維芽細胞の化学走性的移動性が向上したことを示す。ヒト包皮繊維芽細胞を用いた細胞移動性に関するトランスウェルアッセイから、対照及び１０％ＦＢＳと比較して、ＶＥＧＦにより、ＶＥＧＦ濃度に向かって繊維芽細胞の化学走性的移動性が劇的に向上することが示された。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｃは、ＶＥＧＦ発現により、タモキシフェン処理マウス由来の原発腫瘍において線維形成反応が促進されたことを示す。上皮細胞マーカー、サイトケラチンの免疫組織染色から、Ｄｏｘ処理したマウスにおいて原発腫瘍の線維形成反応が促進されることが分かった。図１３Ａは、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのＤｏｘ処理を行わなかった動物における線維形成反応を示す。図１３Ｂは、ＶＥＧＦ発現を誘導するためのＤｏｘ処理を行った動物における線維形成反応を示す。タモキシフェン処理マウスにおいて、ＶＥＧＦ誘導により、１つの観察野につき間質細胞のうち１０％だった線維形成反応が、１つの観察野につき間質細胞のうち４０％まで上昇することが示された（図１３Ｃ）。
【図１４】図１４は、ＶＥＧＦ発現により、タモキシフェン処理マウス由来の原発腫瘍のｂＦＧＦ含量が増加したことを示す。タモキシフェン処理腫瘍から調製した腫瘍細胞溶解物を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイによりｂＦＧＦ含量を測定した。飲用水のＤｏｘを摂取したマウス由来の腫瘍において、ｂＦＧＦが顕著に増加していた。この一因は、ＶＥＧＦ誘導された腫瘍における間質含量が高レベルであることであり得る。Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから入手したｂＦＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、使用説明書に従い、このアッセイを行った。
【配列表】
2006519018.tif 000003
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2006519018.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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