(57)【要約】本発明は、ラジカル仲介細胞損傷により特徴づけられる疾患を治療および予防するために、ペルオキシニトライト転移触媒として、ポルフィリン骨格の13‐および17‐位に種々の置換基を有する、常磁性3‐、8‐置換ポルフィリン誘導体を使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラジカル仲介細胞損傷を治療または予防する医薬を製造するための、下記一般式Iのリガンドならびに原子番号20〜32、37〜39、42〜51または57〜83の元素の少なくとも1つのイオンから成るポルフィリン錯体の使用：
【化１】
2006500383.tif 000007
式中、
Mは常磁性イオンを意味し、
R1は水素原子、直鎖状C1‐C6アルキル基、C7‐C12アラルキル基または基OR’を意味し、ここでR’は水素原子またはC1‐C3アルキル基であり、
R2はR3、基‐CO‐Zまたは基‐(NH)o‐(A)q‐NH‐Dを意味し、ここでZは基‐OLであり、ここでLは無機または有機のカチオンまたはC1‐C4アルキル基を意味し、Aはフェニレンオキシ基またはC1‐C12アルキレン基または1または2以上の酸素原子により中断されたC7‐C12アラルキレン基を意味し、oおよびqは互いに独立して数0または1を意味し、そしてDは水素原子または基‐CO‐A‐(COOL)o‐(H)mを意味し、ここでmは0または1に等しく、ただしmおよびoの合計は1に等しく、
R3は基‐(C=Q)(NR4)o‐(A)q‐(NR5)‐Kを意味し、ここでQは酸素原子または2つの水素原子を意味し、R4は基‐(A)q‐Hを意味し、そしてKは一般式 (IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId) または (IIe) の錯化剤を意味し、ここでR5は、Kが式 (IIa) の錯化剤である場合、R4と同一の意味を有し、そしてR5は、Kが式 (IIb)、(IIc)、(IId) または (IIe) の錯化剤である場合、Dと同一の意味を有し、ただし直接的酸素‐窒素結合は不可能であり、そしてKは一般式 (IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe) または (IIf) の錯化剤を意味し、
【化２】
2006500383.tif 000008
【化３】
2006500383.tif 000009
式中、
qは上に示した意味を有し、
A1はAについて示した意味を有し、
R6は水素原子、直鎖状または分枝鎖状のC1‐C7アルキル基、フェニル基またはベンジル基を意味し、
A2はフェニレン、‐CH2‐NHCO‐CH2‐CH(CH2COOH)‐C6H4‐β‐、‐C6H4‐O‐(CH2)0‐5‐β、または‐C6H4‐(OCH2CH2)0‐1‐N(CH2COOH)‐CH2‐β基、またはC1‐C12アルキレン基またはC7‐C12アルキレン基を意味し、ここで前記C7‐C12アルキレン基は1または2以上の酸素原子、1〜3個の‐NHCO基、または1〜3個の‐CONH基により中断されていてもよく、および/または1〜3個の‐(CH2)0‐5COOH基により置換されていてもよく、ここでβはXに対する結合部位を意味し、
Xは‐CO‐またはNHCS‐基を意味し、
L1、L2、L3およびL4は、互いに独立して、水素原子または前述の原子番号の元素の少なくとも1つの金属イオン同等物を意味し、ただしこれらの置換基の少なくとも2つは金属イオン同等物を意味し、そして金属ポルフィリン中に必要に応じて存在する電荷を補償するために、他のアニオンが存在し、ここで錯化に不要である遊離カルボン酸基は生理学的に適合性の無機および/または有機のカチオンとの塩として、またはエステルとして、またはアミドとして存在することもできる。
【請求項２】
ペルオキシニトライト仲介反応により引き起こされかつペルオキシニトライトの変換速度の増加により弱化および/または治療される疾患を治療および予防する薬剤を製造するための請求項1に記載のポルフィリン錯体の使用。
【請求項３】
下記の疾患のグループを含む疾患を治療および予防するための請求項1または2に記載のポルフィリン錯体の使用：虚血性再潅流疾患、例えば、発作、頭部外傷および心筋梗塞、敗血症、慢性または急性の炎症 (例えば、関節炎または炎症性腸疾患)、成人性呼吸ストレス症候群、癌、気管支‐肺形成異常、心臓血管疾患、糖尿病、多発性硬化症、パーキンソン病、家族性筋萎縮性側索硬化症および大腸炎および特殊神経疾患。
【請求項４】
MがFe3+、Mn3+、Cu2+、Co3+、VO2+、Cr3+またはNi2+イオンを意味することを特徴とする、請求項1に記載の一般式Iのポルフィリン錯体の使用。
【請求項５】
R2およびR3が各場合において‐CONHNHK、‐CONH(CH2)2NHK、‐CONH(CH2)3NHK、‐CONH(CH2)4NHK、または‐CONH(CH2)2O(CH2)2NHK基を意味する、請求項1または4に記載の一般式Iのポルフィリン錯体の使用。
【請求項６】
R2およびR3が各場合において‐CONHNHKを意味する、請求項1、4または5に記載の一般式Iのポルフィリン錯体の使用。
【請求項７】
Kが一般式 (IIa) 
【化４】
2006500383.tif 000010
の錯化剤である、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
請求項1に記載の式Iのポルフィリン錯体化合物、すなわち、
{mu‐[{16,16’‐[クロロマンガン(III)‐7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル]‐ビス[3,6,9‐トリス(カルボキシメチル)‐11,14‐ジオキソ‐3,6,9,12,13‐ペンタアザヘキサデカノアト]}(8‐)]}ジガドリナト(2‐)、二ナトリウム、
{mu[{16,16’‐[クロロ鉄(III)‐7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル]‐ビス[3,6,9‐トリス(カルボキシメチル)‐11,14‐ジオキソ‐3,6,9,12,13‐ペンタアザヘキサデカノアト]}(8‐)]}ジガドリナト(2‐)、二ナトリウム、
{mu[{16,16’‐[銅(II)‐7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル]‐ビス[3,6,9‐トリス(カルボキシメチル)‐11,14‐ジオキソ‐3,6,9,12,13‐ペンタアザヘキサデカノアト]}(8‐)]}ジガドリナト(2‐)、二ナトリウム、
の使用。
【請求項９】
下記のグループを含む疾患を診断するための請求項1に記載の一般式Iの使用：
a. 虚血性再潅流疾患、
b. 急性および慢性の炎症性疾患、
c. 自己免疫疾患、
d. 神経変性および神経再生疾患。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患治療薬を製造するためのペルオキシニトライト転移を触媒する金属含有錯体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
早くも1990年には、ペルオキシニトライト（peroxynitrite）は、一酸化窒素 (NO、酸化窒素) と超酸化物（superoxide）アニオン (O2‐) との間の拡散制御反応により製造される毒性代謝物質として記載された (Beckman 他、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、1620‐1624)。ペルオキシニトライト（peroxynitrite）は、疾患、例えば、アルツハイマー痴呆、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症において重要な役割を演ずる、多数の炎症プロセスに関係づけられ、そして細胞変性およびアポトーシス誘導の原因となる。
【０００３】
ペルオキシニトライトは、酸化またはニトロ化されるアミノ酸基により、多数のタンパク質と反応する。ペルオキシニトライトは運動ニューロンのフィラメントのチロシンラジカルのニトロ化を保証するので、ニトロチロシンラジカルは多発性硬化症を患う患者の組織に多く見出される。ニューロン機能障害 (Estevez 他、1999、Science 286、2498‐2500) は、フィラメントのこうした崩壊収縮により生ずる。発作後に障害される血管収縮の原因は、ペルオキシニトライトにより誘導される、細胞膜の脂質ラジカルの酸化にあり、ここでそれから生ずる内皮および表皮に対する損傷‐および好中球の形成‐が起こる。
【０００４】
ペルオキシニトライトにより仲介される作用を防止するための薬理学的関与は、出発物質 (NOおよびO2‐) の一部分または生成物の一部分について行うことができる。
【０００５】
生成物ペルオキシニトライトの一部分に関するアプローチはSalvemini 他が最初に記載した (Salvemini 他、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95、2659‐2663)。このアプローチにおいて、ペルオキシニトライトを触媒で無害の最終生成物に転移させる。わずかに低濃度の触媒で大量のペルオキシニトライトを変換することができる。このアプローチの利点は、それが欠点のある分解生成物、例えば、反応酸素種を生成できず、そしてそれがペルオキシニトライトによるスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) の阻害を排除するという事実に基づく。結局、新規な化合物を使用するこの処理は、疾患の治療において2倍の利点を有する。こうして、一方において、ペルオキシニトライトの変換は加速され、他方において、SODがペルオキシニトライトによる不活性化に関して保護される。
【０００６】
可能な変換触媒として、金属含有錯体が今日まで知られている (WO 95/31197、US 6,245,758、WO 98/04132、US 5,872,124、WO 00/75144、WO 01/26655、US 6,372,727)。Salvemini 他が記載する金属ポルフィリンは炎症モデルにおいて保護作用を示す (Salvemini 他、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95、2659‐2663およびBrit. J. Pharmacol.、1999、127、685‐692)。Cuzzocrea 他は、同一クラスの化合物が腸動脈閉塞モデルにおいて有効であると記載した (Cuzzocrea 他、2000、FASEB J. 14 (9)、1061‐1072およびCuzzocrea 他、2001、Pharmacology Rev. 53、135‐159)。Cross 他は、マウスのMSモデル (「実験的自己免疫性脳脊髄炎」= EAE) において、これらの物質の有効性を証明した (Cross 他、2000、J. Neuroimmunology 107、21‐28)。Mackensen 他は、限局性虚血性モデル、限局性MCAO (中央脳動脈閉塞) においてマンガン含有ポルフィリンの有効性を最初に示した (Mackensen 他、2001、J. Neurosci. 21、4582‐4592)。
【０００７】
今日まで、副作用、例えば、毒性およびin vivo 有効性、ならびにこれらの既知の転位触媒の血液‐脳脊髄透過性についてほとんど知られていない。
ペルオキシニトライトにより仲介される反応において原因を有する疾患を治療および予防するために、緊急の問題は、無害の生成物におけるペルオキシニトライトの転移を増加させるためにin vivo において有効である、十分に許容される化学的に安定な物質 (触媒) を製造することである。In vivo において有効であるこれらの物質を使用して、疾患を治療する薬剤を開発することができる。
【０００８】
本発明は、ペルオキシニトライト転移触媒として使用されるポルフィリン錯体を製造することによって、この問題を解決する。これらのポルフィリンは、すぐれたin vivo 有効性および化学的安定性を有することによって区別される。それらは腫瘍を診断する物質として既に使用されてきており、そして壊死および梗塞の映像法における使用はWO 00/05235に既に開示されている。
【０００９】
本発明において、NMRおよびUV/VISスペクトロスコピーにより、本発明に従いWO 00/05235のポルフィリンが無害の最終生成物、すなわち、硝酸塩および亜硝酸塩においてペルオキシニトライトの転移を触媒することを示すことができた。細胞損傷のモデルにより、本発明によるポルフィリンは保護的であり、そしてペルオキシニトライトドナーSIN‐Iにより誘導されるペルオキシニトライトの損傷から細胞を保護することを示すことができた。これらのポルフィリンヒは非常に十分に特性決定されており、そしてそれらは副作用を示さず、すぐれた水溶性およびすぐれたin vivo 有効性を有することは知られている。
【００１０】
一方において、ペルオキシニトライト転移性質を有し、他方において、診断性質を有する、ポルフィリン錯体を使用すると、ペルオキシニトライトにより引き起こされる疾患の特別の治療、および映像法、例えば、MRTを使用する診断が可能となる。
本発明は、この特殊治療用ポルフィリン錯体を提供し、そして下記一般式Iのリガンドならびに原子番号20〜32、37〜39、42〜51または57〜83の元素の少なくとも1つのイオンから成るポルフィリン錯体に関する：
【００１１】
【化１】
2006500383.tif 000002
【００１２】
式中、
Mは常磁性イオンを意味し；
R1は水素原子、直鎖状C1‐C6アルキル基、C7‐C12アラルキル基または基OR’を意味し、ここでR’は水素原子またはC1‐C3アルキル基であり；
R2はR3、基‐CO‐Zまたは基‐(NH)o‐(A)q‐NH‐Dを意味し、ここでZは基‐OLであり、ここでLは無機もしくは有機のカチオンまたはC1‐C4アルキル基を意味し、Aはフェニレンオキシ基またはC1‐C12アルキレン基またはC7‐C12アラルキレン基（1または2以上の酸素原子により中断されている）を意味し、oおよびqは互いに独立して数0または1を意味し、そしてDは水素原子または基‐CO‐A‐(COOL)o‐(H)mを意味し、ここでmは0または1に等しく、ただしmおよびoの合計は1に等しく；
【００１３】
R3は基‐(C=Q)(NR4)o‐(A)q‐(NR5)‐Kを意味し、ここでQは酸素原子または2個の水素原子を意味し、R4は基‐(A)q‐Hを意味し、そしてKは一般式 (IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId) または (IIe) の錯化剤を意味し、ここでR5は、Kが式 (IIa) の錯化剤である場合、R4と同一の意味を有し、そしてR5は、Kが式 (IIb)、(IIc)、(IId) または (IIe) の錯化剤である場合、Dと同一の意味を有し、ただし直接的酸素‐窒素結合は不可能であり、そしてKは一般式 (IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe) または (IIf) の錯化剤を意味し、
【００１４】
【化２】
2006500383.tif 000003
【００１５】
【化３】
2006500383.tif 000004
【００１６】
式中、
qは上に示した意味を有し；
A1はAについて示した意味を有し；
R6は水素原子、直鎖状もしくは分枝鎖状のC1‐C7アルキル基、フェニル基またはベンジル基を意味し；
【００１７】
A2はフェニレン、‐CH2‐NHCO‐CH2‐CH(CH2COOH)‐C6H4‐β‐、‐C6H4‐O‐(CH2)0‐5‐β、または‐C6H4‐(OCH2CH2)0‐1‐N(CH2COOH)‐CH2‐β基、またはC1‐C12アルキレン基もしくはC7‐C12アルキレン基を意味し、ここで前記のアルキレン基は1または2以上の酸素原子、1〜3個の‐NHCO基、または1〜3個の‐CONH基により置換されていてもよく、そして/または1〜3個の‐(CH2)0‐5COOH基により置換されていてもよく、ここでβはXに対する結合部位を意味し；
Xは‐CO‐またはNHCS基を意味し；
【００１８】
L1、L2、L3およびL4は、互いに独立して、水素原子または前述の原子番号の元素の少なくとも1つの金属イオン同等物を意味し、ただしこれらの置換基の少なくとも2つは金属イオン同等物を意味し、そして金属ポルフィリン中に必要に応じて存在する電荷を補償するために、他のアニオンが存在し、ここで錯化に不要である遊離カルボン酸基は生理学的に適合性の無機および/または有機のカチオンとの塩として、またはエステルとして、またはアミドとして存在することもでき、
そして、その上、前記ポルフィリン錯体は無害の生成物中のペルオキシニトライトの転移速度を増加し、こうしてラジカル仲介細胞損傷を治療および予防する薬剤の製造に使用することができる。
【００１９】
本発明による化合物は、無害の最終生成物、すなわち、硝酸塩および亜硝酸塩中のペルオキシニトライトの転位を触媒することをNMRおよびUV/VISスペクトロスコピーにより示すことができた。ペルオキシニトライトは、酸化窒素 (NO) と超酸化物（superoxide）アニオン (O2‐) との反応により製造される強いオキシダントである。NOは多数の細胞、例えば、マクロファージ、好中性細胞、肝細胞および内皮細胞中で発生することを示すことができた。NOと超酸化物アニオン (O2‐) との直接的反応はペルオキシニトライトイオンを形成し、これは生理的条件下に酸化性中間化合物中に急速に溶解する。これらの中間酸化段階は生物学的標的に対する損傷の原因となる。
【００２０】
この損傷の結果は、タンパク質、脂質およびDNAの酸化およびニトロ化を含む病理的結果に関係付けることができる。ペルオキシニトライトは他のオキシダントよりも有意に高い速度で細胞膜通過し、そして生物学的膜の存在下であってさえ細胞内部に急速に浸透することができる。ペルオキシニトライトはタンパク質中のチロシンラジカルのニトロ化について知られており、そしてスルフヒドリルラジカル、メチオニンおよび高分子、例えば、金属酵素、DNAおよび脂質を酸化する。
【００２１】
ペルオキシニトライトは高い反応性を有するので、ペルオキシニトライトを多数の疾患と接触させた。本発明は、ラジカル仲介細胞損傷を治療および予防する薬剤の製造に、本発明による化合物を使用することに関する。これらは神経変性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、および心臓血管系疾患を包含する。
【００２２】
例えば、下記のものを述べることができる：
脳虚血、虚血性再潅流疾患、低酸素症および炎症に関係付けられる他の神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、ALS (筋萎縮性側索硬化症) および匹敵する硬化性疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、コルサコフ病、癲癇、嘔吐、催眠障害、精神分裂病、鬱病、ストレス、疼痛、片頭痛、低血糖症、痴呆、例えば、アルツハイマー病、HIV痴呆および初老期痴呆。
【００２３】
また、それらは心臓血管系の疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症の治療、および自己免疫性疾患および/または炎症性疾患、例えば、低血圧症、ARDS (成人呼吸窮迫症候群)、敗血症または敗血性ショック、慢性関節リウマチ、骨関節炎、インスリン依存性真性糖尿病 (IDDM)、骨盤/腸管の炎症性疾患 (腸疾患)、髄膜炎、糸球体腎炎、急性および慢性の肝疾患、拒絶反応による疾患 (例えば、同種異系間心臓、腎臓または肝臓移植) または炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬、およびその他の治療に適する。
【００２４】
本発明によるポルフィリン錯体は、ポルフィリン骨格中の常磁性イオンとして、鉄 (III)、マンガン (III)、銅 (II) 、コバルト (III)、クロム (III)、ニッケル (II) またはバナジル (II) イオンを含有し、ここで記載した最初の3つのイオンは好ましい。
ポルフィリン中で結合しているイオンの1つが+2よりも高い酸化段階で存在する場合、1または2以上の過剰の電荷は、例えば、有機酸または無機酸のアニオンにより、好ましくは酢酸塩、塩化物、硫酸塩、硝酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩およびマレイン酸塩のイオンにより、またはR2および/またはR3中に存在する負電荷により補償される。
【００２５】
金属イオンの錯化に不要であるカルボキシル基は必要に応じてエステルとして、アミドとして、または無機塩基または有機塩基の塩として存在することができる。適当なエステル基は1〜6 C原子をもつ基、好ましくはエチルエステルである；適当な無機カチオンは、例えば、リチウムイオンおよびカリウムイオン、特にナトリウムイオンである。有機塩基の適当なカチオンは第一級、第二級または第三級アミン、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、N,N‐ジメチルグルカミン、特にメグルミンのカチオンである。
【００２６】
錯化剤の基Kとして、好ましくはジエチルトリアミン五酢酸および1,4,7,10‐テトラアザシクロドデカン‐1,4,7‐トリ酢酸の誘導体を列挙することができ、これらはリンカーを介してそれぞれのポルフィリンに結合される。
一般式Iの錯体化合物の製造は文献において知られている方法に従い実施される (IIaおよびIIbについて、例えば、DE 4232925参照；IIIcについて、例えば、DE 19507822、DE 19580858およびDE 19507819参照；そしてIId、IIeおよびIIfについて、例えば、US 5,053,503、WO 96/02669、WO 96/01655、EP 0430863、EP 255471、US 5,277,895、EP 0232751、およびUS 4,885,363参照)。
【００２７】
本発明による化合物の製造はWO 00/17205に既に記載されている。
R2およびR3がCONHNHK基を意味する化合物は好ましい。これに関して遊離体として必要な3,3’‐(7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル)ジ(プロパノヒドラジド) の合成は、Z. Physiol. Chem. 241、209 (1936) に記載されている。
【００２８】
ポルフィリンの中への必要な金属 (例えば、Mn) の導入は、文献において知られている方法に従い実施される (例えば、The Porphyrins, 編者D. Dolphin、Academic Press、New York 1980、Vol. V、459；DE 4232925)、ここで本質的に下記の方法を列挙することができる：
a) ピロールNHの置換 (極性溶媒中で無金属リガンドを対応する金属塩、例えば、酢酸塩と、必要に応じて酸緩衝剤、例えば、酢酸ナトリウムを添加して加熱する)、または
b) 「錯化」、ここでリガンドにより既に錯化されている金属を必要な金属で置換する。
【００２９】
溶媒、主として極性溶媒として、例えば、メタノール、氷酢酸、ジメチルホルムアミド、クロロホルムおよび水が適当である。
ポルフィリン系中への常磁性金属Mの導入は、錯化剤基Kの結合の前または後に実施することができる。結局、本発明による化合物を合成する特に柔軟な手順は可能となる。
基Kのキレート化は、文献 (例えば、DE 34 01 052参照) において知られている方法に従い実施され、ここでそれぞれの必要な金属の金属酸化物または金属塩 (例えば、硝酸塩、炭酸塩、塩化物または硫酸塩) を極性溶媒、例えば、水または水性アルコール中に懸濁または溶解し、そして対応する量の錯化性リガンドと反応させる。必要に応じて、存在する酸性水素原子または酸基を無機塩基および/または有機塩基またはアミノ酸のカチオンで置換することができる。
【００３０】
この場合において、中和は無機塩基、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩および/または有機塩基、例えば、なかでも第一級、第二級および第三級アミン、例えば、エタノールアミン、モルホリン、グルカミン、N‐メチルグルカミンおよびN,N‐ジメチルグルカミン、ならびに塩基性アミノ酸、例えば、リシン、アルギニンおよびオルニチン、または本来中性または酸性のアミノ酸のアミドの助けにより実施される。
【００３１】
中性錯体化合物を製造するために、十分な必要な塩基を、例えば、水性溶液または懸濁液中の酸性錯塩に、中性点に到達するように、添加することができる。次いで、得られる溶液を真空中で乾燥状態に蒸発させることができる。水混和性溶媒、例えば、低級アルコール (例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール)、低級ケトン (例えば、アセトン)、極性エーテル (例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、1,2‐ジメトキシエタン) を添加することによって形成した中性塩を沈降させ、こうして結晶を容易に単離し、容易に精製することはしばしば好都合である。必要な塩基を反応混合物の錯化間程度に早い時点で添加し、こうしてプロセス工程を節約することは特に好都合であることが証明された。
【００３２】
酸性錯体化合物がいくつかの遊離酸基を含有する場合、無機カチオンおよび有機カチオンの両方を対イオンとして含有する中性混合塩を製造することはしばしば適当である。
これは、例えば、次のようにして実施できる。すなわち、中心イオンを生ずる元素の酸化物または塩および半分の量の中和に必要な有機塩基と水性懸濁液または溶液中で錯化性リガンドを反応させ、形成した錯塩を単離し、必要に応じて精製し、次いで完全な中和に必要な量の無機塩基と混合する。また、塩基の添加順序を逆転することができる。
中性錯体化合物が生ずる可能性は、錯体中の残りの酸基を完全にまたは部分的にエステルに変換することにある。これは仕上げられた錯体中の引き続く反応により実施することができる (例えば、遊離カルボキシ基を硫酸ジメチルと徹底的に反応させることによって)。
【００３３】
また、本発明による薬剤の製造は、この分野において知られている方法に従い、次のようにして実施される。すなわち、本発明による錯体化合物を、必要に応じて生薬において普通に使用される添加剤を添加して、水性媒質中に懸濁または溶解し、次いで懸濁液または溶液を必要に応じて滅菌する。適当な添加剤は、例えば、生理的に無害の緩衝剤 (例えば、トロメタミン)、少量の錯化剤 (例えば、ジエチレントリアミン五酢酸)、または、必要に応じて、電解質、例えば、塩化ナトリウムまたは、必要に応じて、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸である。
【００３４】
原理的に、錯塩を単離しないでさえ、本発明による薬剤を製造することもできる。各場合において、本発明による塩および塩溶液が毒性作用を有する非錯化金属イオンを事実上含まないように、キレート化を実施することに注意を払わなくてはならない。
これは、例えば、カラーインジケーター、例えば、キシレノールオレンジの助けにより、製造プロセス間のコントロールした滴定により保証できる。したがって、本発明は、また、錯体化合物およびそれらの塩の製造方法に関する。最終の予防手段として、単離された錯塩の精製が残っている。
【００３５】
本発明による化合物を薬剤として使用するために、本発明による化合物は、腸内または非経口的投与のために活性成分に加えて、適当な薬学上の有機または無機の不活性担体物質、例えば、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、およびその他を含有する医薬製剤の形態にされる。医薬製剤は固体の形態、例えば、錠剤、被覆錠剤、坐剤、またはカプセル剤の形態、または液体の形態、例えば、溶液、懸濁液、または乳濁液として存在することができる。その上、医薬製剤は必要に応じてアジュバント、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤；浸透圧変更剤、または緩衝剤を含有する。
【００３６】
また、これらの医薬製剤は本発明の主題である。
非経口的使用のために、注射用溶液または懸濁液、特にポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油中の活性化合物の水溶液は適当である。
水または生理食塩溶液中の本発明による化合物の懸濁液または溶液を腸内投与または他の目的に望む場合、本発明による化合物を生薬において普通に使用される1種または2種以上のアジュバント (例えば、メチルセルロース、ラクトース、マンニトール) および/または1種または2種以上の界面活性剤 (例えば、レシチン、Tween（商標）、Myrj（商標）)および/または味覚補正のための香味剤 (例えば、エーテル油) と混合する。
【００３７】
担体系として、表面活性アジュバント、例えば、胆汁酸塩または動物性または植物性リン脂質、しかしまたそれらの混合物ならびにリポソームまたはそれらの成分を使用することもできる。
経口的投与のために、特にタルクおよび/または炭化水素の賦形剤または結合剤、例えば、ラクトース、トウモロコシまたはジャガイモ澱粉を含む錠剤、被覆錠剤、またはカプセル剤は適当である。また、必要に応じて甘味料を添加した、液体の形態、例えば、ジュースで適用することもできる。
【００３８】
また、腸内、非経口的および経口的投与は本発明の主題である。
活性成分の投与量を投与法、患者の年齢および体重、治療すべき疾患の種類および重症度に依存して変化させることができる。1日量は0.5〜1000 mg、好ましくは50〜200 mgであり、ここで投与量は1回で投与すべき単一投与量として投与することができるか、あるいは2またはそれ以上の毎日の投与のために分割することができる。
本発明は、また、ペルオキシニトライト仲介反応により引き起こされかつペルオキシニトライトの変換速度の増加により弱化および/または治療される疾患を治療および予防するための、本発明による式 (I) のポルフィリン錯体の使用に関する。
【００３９】
本発明は、特に、神経変性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、および心臓血管疾病を包含する疾患を治療および予防するための、本発明による一般式 (I) のポルフィリン錯体の使用に関する。例えば、下記の疾患を列挙することができる：
‐   脳虚血、虚血性再潅流疾患、低酸素症および炎症に関係付けられる他の神経変性疾患、例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および匹敵する硬化性疾患、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、コルサコフ症候群、癲癇、嘔吐、催眠障害、精神分裂病、鬱病、片頭痛、低血糖症、痴呆、例えば、アルツハイマー病、HIV痴呆および初老期痴呆。
【００４０】
‐   また、それらは心臓血管系の疾患の治療、および自己免疫性疾患および/または炎症性疾患、例えば、低血圧症、ARDS (成人呼吸窮迫症候群)、敗血症または敗血性ショック、慢性関節リウマチ、骨関節炎、インスリン依存性真性糖尿病 (IDDM)、骨盤/腸管の炎症性疾患 (腸疾患)、髄膜炎、糸球体腎炎、急性および慢性の肝疾患、拒絶反応による疾患 (例えば、同種異系間心臓、腎臓または肝臓移植) または炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬、およびその他の治療に適する。作用構造に基づいて、本発明による化合物は無害生成物中のペルオキシニトライトの転位に非常によく適する。
本発明の主題は、また、MがFe3+、Mn3+、Cu2+、Co3+、VO2+、Cr3+またはNi2+イオンを意味すること、および特に有効であることを特徴とする、一般式 (I) の化合物の使用である。
【００４１】
さらに、本発明の主題は、R2およびR3が各場合において‐CONHNHK、‐CONH(CH2)2NHK、‐CONH(CH2)3NHK、‐CONH(CH2)4NHK、または‐CONH(CH2)2O(CH2)2NHK基を意味することを特徴とする、一般式Iのポルフィリン錯体化合物の使用である。
本発明の主題は、また、R2およびR3が各場合において‐CONHNHKを意味することを特徴とする、一般式 (I) のポルフィリン錯体化合物の使用である。
これらの化合物は、Kが一般式 (IIa) 
【００４２】
【化４】
2006500383.tif 000005
の錯化剤である場合、非常に特に有効である。
【００４３】
本発明の追加の主題は、特に式 (I) のポルフィリン錯体化合物、すなわち、
{mu‐[{16,16’‐[クロロマンガン(III)‐7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル]‐ビス[3,6,9‐トリス(カルボキシメチル)‐11,14‐ジオキソ‐3,6,9,12,13‐ペンタアザヘキサデカノアト]}(8‐)]}ジガドリナト(2‐)、二ナトリウム、
{mu[{16,16’‐[クロロ鉄(III)‐7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル]‐ビス[3,6,9‐トリス(カルボキシメチル)‐11,14‐ジオキソ‐3,6,9,12,13‐ペンタアザヘキサデカノアト]}(8‐)]}ジガドリナト(2‐)、二ナトリウム、
{mu[{16,16’‐[銅(II)‐7,12‐ジエチル‐3,8,13,17‐テトラメチルポルフィリン‐2,18‐ジイル]‐ビス[3,6,9‐トリス(カルボキシメチル)‐11,14‐ジオキソ‐3,6,9,12,13‐ペンタアザヘキサデカノアト]}(8‐)]}ジガドリナト(2‐)、二ナトリウム、
である。
【００４４】
本発明による化合物はすぐれた水溶性を有するので、高濃度の溶液を調製し、循環系の体積負荷量を合理的限界内に保持し、かつ体液による希釈を補償することができる。さらに、本発明による化合物は高いin vitro 安定性ばかりでなく、かつまた驚くべきほどに高いin vivo 安定性を示すので、造影剤を再び完全に排出するために必要な時間内に、本来毒性でありかつ錯体に共有結合しないイオンの解放または交換を無視することができる。
【００４５】
驚くべきほどに十分に、本発明による錯体は、従来知られている、構造的に類似する化合物に比較して、有意に高い弛緩性を示す。弛緩性は化合物の造影作用のものさしと見なすことができるので、NMR診断領域において本発明による化合物を使用して、低い投与量でさえ、匹敵する陽性信号作用が可能である。これは、弛緩性および適合性の積が指標値であると考えることができる、安全率を有意に増加させる。
【００４６】
さらに、本発明は、下記の疾患のグループを含む疾患を治療および予防するための請求項1に記載の一般式Iのポルフィリン錯体の使用に関する：虚血性再潅流疾患、例えば、発作、頭部外傷および心筋梗塞、敗血症、慢性または急性の炎症 (例えば、関節炎または炎症性腸疾患)、成人性呼吸ストレス症候群、癌、気管支‐肺形成異常、心臓血管疾患、糖尿病、多発性硬化症、パーキンソン病、家族性筋萎縮性側索硬化症および大腸炎および特殊神経疾患。
【実施例】
【００４７】
1.  NMR分光法を使用するペルオキシニトライト分解の研究
この研究のために、3試料を調製し、ここで試料の1つは添加剤を含まない本来の水性ペルオキシニトライト溶液を含有し、そして他の試料はこの溶液を同一量で含有するが、規定された添加量の参照物質または研究すべき物質を含む。各試料から、同一の獲得および処理パラメーターを使用して14Nスペクトルを記録する。処理したペルオキシニトライト溶液と未処理のペルオキシニトライト溶液との間の硝酸塩信号の積分の差は、ペルオキシニトライトの転移による硝酸塩の増加を示す。研究すべき物質と参照化合物との間でデータを比較すると、このプロセスを数量化することができる (第1図)。
【００４８】
2.  ペルオキシニトライトの硝酸塩への変換速度のUV分光学による測定
下記のもの使用した：
UV分光計
フランジ付きキュベットを有する栓付き流れ装置
体積を測定する実験室用装置
試薬 (緩衝剤、ペルオキシニトライト溶液、触媒) 
濃厚ペルオキシニトライト溶液から、ペルオキシニトライトの含量を決定した。基線として、ε= 1670のモル吸光係数を採用する。観測波長301 nmにおける吸収が約1.6に到達するように、この溶液を水で希釈した。こうして調製した貯蔵溶液のpHは11以下に低下しない。
【００４９】
ペルオキシニトライトの設定濃度に対応して、栓付き流れ装置の所定比を考慮して、触媒溶液およびペルオキシニトライトの必要量が合流して反応を発生させることができるように、リン酸塩緩衝液中の研究すべき触媒溶液を調製する。触媒溶液の緩衝剤は、なお強いアルカリ性のペルオキシニトライト溶液を必要なpHに設定しかつ保持できるために十分な能力をもたなくてはならない。触媒を100×不足量で添加する。
栓付き流れ装置の計量噴霧器に2つの溶液を充填し、そしてUV分光計中に位置するキュベットに計量噴霧器から溶液を入れる。301 nmにおいて吸収値を同時に測定する。硝酸塩中のペルオキシニトライトの転位が起こるために、吸収は減少し、ある時間経過後に安定な値をとる。この時点において、転位は停止し、そしてデータの記録を停止する。
【００５０】
測定データを解析し、そして生ずる曲線の反応速度論的特性からペルオキシニトライト濃度を計算することができる。これらのデータを使用して、研究すべき触媒を特性決定する。ペルオキシニトライトの自己分解を考慮するために、触媒を含有しない緩衝剤を添加して、使用するペルオキシニトライトの調製物中のペルオキシニトライト溶液の分解挙動を最初に決定し、そして触媒を使用する測定から得られる特性に関して、それらの特性を設定する。
相対速度定数 = 触媒される分解の記載pHにおいて使用するペルオキシニトライトの自発的分解
(第2図)。
【００５１】
3.  新生児ラットの小脳からのニューロン一次培養物を使用するSIN‐1損傷アッセイ
ペルオキシニトライトにより誘導される障害に関する神経保護用物質をin vitro 試験するために、新生児ラットの小脳からの細胞の一次培養物を適用する。希釈蛍光形態のアラマー・ブルー (Alamar blue) 染料の反応を測定することによって、この培養物中のニューロン細胞の死または生存の測定を間接的に実施する。損傷について、ペルオキシニトライトドナーSIN‐1 (3‐モルホリノ‐シドノニミン) を使用する。
【００５２】
細胞を獲得するために、ウィスター系ラット (P8) を断頭により殺し、小脳を獲得し、小脳から髄膜を除去し (HBSS (GIBCO、14025‐050) 4℃)、破砕し、15 mlのファルコン (Falcon) 管の中に移し、上清を吸引除去し、次いで500 μlのトリプシン‐EDTA溶液 (GIBCO #2530‐054)/小脳の添加により、小脳をトリプシン処理する。インキュベーション (20分、37℃) 後、トリプシン処理した小脳を10 mlのHBSSで3回洗浄する。次いで、500 μlの0.05% DNAsel (BOEHRINGER MANNHEIM、#14953000)/小脳を添加して、滴定を実施する。
【００５３】
5 mlのピペットにより、次いで火炎研磨パスツールピペットを使用し、最後に (必要に応じて) 細長い、火炎研磨パスツールピペットを使用して、細胞を単離し、10 mlの完全培地 (100 mlの神経基底 (GIBCO #21103‐049)、1 mlのB27補助物質 (GIBCO #17504‐044)、0.4 mlのPen/Strep (10,000 IU/ml/10000 UG/ml) (GIBCO #15140‐106)、0.8 mlのKCl‐貯蔵溶液 (MERCK、1.04936.0500)、および1 mlのL−グルタミン (100×‐200 mmol) (GIBCO #15140‐106) と混合する。次いで単離した細胞を遠心 (600 rpmにおいて10分) し、完全培地で1回洗浄し、20 mlの完全培地で再懸濁させ、計数し、2×106/mlに希釈する。
【００５４】
96孔のマイクロタイタープレートの1孔当たり、100 μlの完全培地を導入し、100 μlの細胞懸濁液と混合する (= div 1 = 第1日in vitro)。マイクロタイタープレートを前もって次のように被覆する：50 μl/孔のポリ‐L‐リシン (分子量70〜105 kD) (SIGMA #P‐6282) を適用し、次いでプレートをインキュベーター中で約90分間インキュベートする。細胞を平坦化する前に、溶液を再び吸引除去し、HBSSまたは無菌の2回蒸留水で2回洗浄する。平坦化後24時間に、SIN‐1を添加して、細胞を損傷する。
【００５５】
SIN‐1を添加する1時間前に、試験物質を適用する (10または30 μMの個々の濃度、または濃度系列として、CALBIOCHEM 567028)。アラマー・ブルー (10 μl/ウェル) (BIOSOURCE INT.、DAL 1100) を使用してdiv 2 (第2日in vitro) について、細胞機能を測定する。3時間インキュベートした後、蛍光リーダーで測定を実施する (Victor、Wallac Company、吸光544 nm/発光590 nm)。エクセル・プラグ‐インXLフィット (Excel Plug‐in XL fit) を使用して、IC50値を計算する。
実施例2および3からの結果を下記表に示す。
【００５６】
【表１】
2006500383.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図1は、14NMRスペクトルを示す。
【図２】図2は、100×不足量で投与した、ポルフィリン触媒の存在および非存在におけるペルオキシニトライトの時間依存的分解を示す。
【図１】
2006500383.tif 000011
【図２】
2006500383.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月6日(2004.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシダントONOO(1‐)/ONOOHおよびそれらの二次生成物により生ずる細胞損傷を治療または予防する薬剤を製造するための、下記一般式Iのリガンドならびに原子番号20〜32、37〜39、42〜51または57〜83の元素の少なくとも1つのイオンから成るポルフィリン錯体の使用：
【化１】
2006500383.tif 000013
式中、
Mは常磁性イオンを意味し；
R1は水素原子、直鎖状C1‐C6アルキル基、C7‐C12アラルキル基または基OR’を意味し、ここでR’は水素原子またはC1‐C3アルキル基であり；
R2およびR3は各場合において基‐CONHNHKを意味し；そして
Kは一般式 (IIa) の錯化剤を意味し、
【化２】
2006500383.tif 000014
式中、
L1、L2、L3およびL4は、互いに独立して、水素原子または前述の原子番号の元素の少なくとも1つの金属イオン同等物を意味し、ただしこれらの置換基の少なくとも2つは金属イオン同等物を意味し、そして金属ポルフィリン中に必要に応じて存在する電荷を補償するために、他のアニオンが存在し、ここで錯化に不要である遊離カルボン酸基は生理学的に適合性の無機および/または有機のカチオンとの塩として、またはエステルとして、またはアミドとして存在することもできる。
【請求項２】
オキシダントONOO(1‐)/ONOOHおよびそれらの二次生成物により生成する反応により引き起こされかつペルオキシニトライト（peroxynitrite）の変換速度の増加により弱化される疾患を治療および予防する薬剤を製造するための請求項1に記載のポルフィリン錯体の使用。
【請求項３】
下記の疾患のグループを含む疾患を治療および予防するための請求項1または2に記載のポルフィリン錯体の使用：虚血性再潅流疾患、例えば、発作および頭部外傷、多発性硬化症、パーキンソン病、家族性筋萎縮性側索硬化症、および特殊神経疾患。
【請求項４】
MがFe3+イオンを意味することを特徴とする、請求項1に記載の一般式Iのポルフィリン錯体の使用。
【請求項５】
神経変性および神経再生疾患を監視する療法用診断剤を製造するための請求項1に記載の一般式Iの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、ペルオキシニトライト転移触媒として使用されるポルフィリン錯体を製造することによって、この問題を解決する。これらのポルフィリンは、すぐれたin vivo 有効性および化学的安定性を有することによって区別される。それらは腫瘍を診断する物質として既に使用されてきており、そして壊死および梗塞の映像法における使用はWO 99/62512およびWO 00/05235に既に開示されている。光力学的療法およびMRI診断におけるそれらの使用はWO 99/62512において特許請求されている。


【国際調査報告】
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