(57)【要約】本発明は、ヒト軟骨細胞活性（成長）／分化／細胞外マトリックス生成）に関し、加えて、これら活性の指標としてのＳｏｘ９転写因子およびＣｏｌｔエンハンサーの効果に関する。本発明はまた、キメラ細胞、および、このような細胞を利用した分析に関し、Ｓｏｘ９およびＣｏｌｔ発現／活性により測定された軟骨細胞活性に対するサンプル化合物の効果を予測するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ａ．ヒト軟骨細胞活性への試験化合物の効果を予測する方法であって、
（ａ）ＳＷ１３５３ヒト軟骨肉腫細胞を、Ｓｏｘ９ＤＮＡ結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること；
（ｂ）トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約２〜約２４時間接触させること；および、
（ｃ）レポーターの活性を測定すること、
を含む上記方法、および
１ｂ．Ｃｏｌ２エンハンサーレポーターコンストラクトの発現への試験化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）ＳＷ１３５３ヒト軟骨肉腫細胞を、Ｓｏｘ９ＤＮＡ結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること；
（ｂ）トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約２〜約２４時間接触させること；および、
（ｃ）レポーターの活性を測定すること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
レポータープラスミドは、Ｓｏｘ９反応要素を有する天然に存在するプロモーターまたは調節制御領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＷ１３５３細胞は、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１レポーターでトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｏｘ９反応要素は、Ｃｏｌ２、アグリカン、および、Ｃｏｌ１１レポーターコンストラクトから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
レポーターコンストラクトは、合成Ｓｏｘ９反応要素を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物は、低分子化合物、抗体、抗体フラグメント、および、生物学的物質または組換え物質からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物は、Ｓｏｘ９リプレッサー活性のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試験化合物は、サイトカイン受容体のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験化合物は、負の転写因子を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
負の転写因子は、ＮＦｋＢである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物は、シグナル伝達経路を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試験化合物は、ＩＫＫシグナル伝達経路を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
試験化合物は、有益なシグナル伝達経路のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
有益なシグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ経路である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃｏｌ２ａ１エンハンサーコンストラクトでトランスフェクトされたＳＷ１３５３を含
むキメラ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト軟骨細胞活性（成長）／分化／細胞外マトリックスの生成）に関し、および、このような活性の測定としてのＳｏｘ９転写因子およびＣｏｌ２エンハンサーの効果に関する。本発明はまた、キメラ細胞、および、このような細胞を利用した分析に関し、Ｓｏｘ９およびＣｏｌ２発現／活性により測定された、軟骨細胞活性に対するサンプル化合物の効果を予測するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨の進行性の破壊は、変形性関節症やリウマチ様関節炎に共通している。この組織は、関節の機能に必要な潤滑性や圧縮性を提供している。従って、関節軟骨が減少すると、痛みや罹患率が増加する。関節軟骨は、コラーゲンとプロテオグリカンが豊富な細胞外マトリックスと、それらを生産する軟骨細胞とで構成されている。従って、軟骨細胞は、正常な軟骨の機能や、それに影響を及ぼす関節炎性および変性性の病気を理解するのに重要である。単離された軟骨細胞は、細胞培養においてほとんど増殖能がなく、線維芽細胞様細胞に脱分化する傾向がある。研究用のヒト細胞源、特に病気ではない組織からのヒト細胞源は、明白な倫理上および実質上の理由で非常に不足している。従って、我々の軟骨細胞の生物学的知識のほとんどは、動物での研究またはそれらの培養組織および細胞から得られたものである。
【０００３】
重度の骨格異常に罹ったヒト被験体からの遺伝学的研究は、我々の軟骨細胞の生物学的な理解に役立つ。ヒトＳｏｘ９遺伝子の１つの対立遺伝子の機能／発現を欠損させる突然変異が、彎曲肢異形成症として知られるまれな重度の骨格奇形症候群の原因と同定された（Ｗａｇｎｅｒ  Ｔ，Ｗｉｒｔｈ  Ｊ，Ｍｅｙｅｒ  Ｊ，Ｚａｂｅｌ  Ｂ，Ｈｅｌｄ  Ｍ，Ｚｉｍｍｅｒ  Ｊ，Ｐａｓａｎｔｅｓ  Ｊ，Ｂｒｉｃａｒｅｌｌｉ  ＦＤ，Ｋｅｕｔｅｌ  Ｊ，Ｈｕｓｔｅｒｔ  Ｅ，．；Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｓｅｘ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｎｄ  ｃａｍｐｔｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ａｒｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｄ  ａｒｏｕｎｄ  ｔｈｅ  ＳＲＹ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ＳＯＸ９．Ｃｅｌｌ  ７９：１１１１〜１１２０，１９９４年；Ｗｒｉｇｈｔ  Ｅ，Ｈａｒｇｒａｖｅ  ＭＲ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｊ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｌ，Ｋｕｎ  Ｊ，Ｅｖａｎｓ  Ｔ，Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎ  Ｕ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  Ａ，Ｋｏｏｐｍａｎ  Ｐ：Ｔｈｅ  Ｓｒｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  Ｓｏｘ９  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ９：１５〜２０，１９９５年）。
【０００４】
男性患者は、ＸＹ性転換を示し（Ｗａｇｎｅｒ  Ｔ，Ｗｉｒｔｈ  Ｊ．Ｍｅｙｅｒ  Ｊ，Ｚａｂｅｌ  Ｂ，Ｈｅｌｄ  Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒ  Ｊ，Ｐａｓａｎｔｅｓ  Ｊ，Ｂｒｉｃａｒｅｌｌｉ  ＦＤ，Ｋｅｕｔｅｌ  Ｊ，Ｈｕｓｔｅｒｔ  Ｅ．：Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｓｅｘ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｎｄ  ｃａｍｐｔｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ａｒｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｄ  ａｒｏｕｎｄ  ｔｈｅ  ＳＲＹ−ｒｅｔａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ＳＯＸ９．Ｃｅｌｌ  ７９：１１１１〜１１２０，１９９４年）、発生、男性性決定におけるＳｏｘ９のその他の主要な役割が確認される。
【０００５】
Ｓｏｘ９遺伝子の対立遺伝子を１つだけ発現するように操作されたマウス（Ｓｏｘ９＋／−）は、ヒト骨格症候群の表現型模写に近い状態を示し（Ｂｉ  Ｗ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ＤＪ，Ｄｅｎｇ  ＪＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｓｏｘ９  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａ  ａｎｄ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６６９８〜６７０３．２００１年）、全ての軟骨原基およびそれから生じる骨の形成不全を示す。その上、野生型細胞とＳｏｘ９−／−ＥＳ細胞（β−ガラクトシダーゼを発現する）とのキメリズムにより得られたマウスにより、Ｓｏｘ９発現は、細胞が間充織凝集に取り込まれ、軟骨構造を形成するのに必須であることが示された（Ｂｉ  Ｗ，Ｄｅｎｇ  ＪＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｓｏｘ９  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：８５〜８９，１９９９年）。
【０００６】
Ｓｏｘ９発現が損なわれた、または、高められた、遺伝学的に改変されたマウスはそれぞれ、ＸＹまたはＸＸ性転換を示し（Ｂｉｓｈｏｐ  ＣＥ，Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ＤＪ，Ｑｉｎ  Ｙ，Ａｇｏｕｌｎｉｋ  ＡＩ，Ａｇｏｕｌｎｉｋ  ＩＵ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＷＲ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲ，Ｏｖｅｒｂｅｅｋ  ＰＡ：Ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｓｏｘ９  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ＸＸ  ｓｅｘ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：４９０〜４９４，２０００年：Ｖｉｄａｌ  ＶＰ，Ｃｈａｂｏｉｓｓｉｅｒ  ＭＣ，ｄｅ  Ｒｏｏｉｊ  ＤＧ，Ｓｃｈｅｄｌ  Ａ：Ｓｏｘ９
ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｅｓｔｉｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ＸＸ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２８：２１６〜２１７，２００１年）、マウス、同様にヒトにおける、性決定におけるＳｏｘ９の役割が確認されている。
【０００７】
Ｓｏｘ９は、ＨＭＧ−ｂｏｘタンパク質ファミリーのメンバーである。このタンパク質ファミリーは、ＤＮＡの副溝に結合する点でまれであり、通常はタンパク質パートナーと協同して遺伝子発現を調節する（Ｋａｍａｃｈｉ  Ｙ，Ｕｃｈｉｋａｗａ  Ｍ，Ｋｏｎｄｏｈ  Ｈ：Ｐａｉｒｉｎｇ  ＳＯＸ  ｏｆｆ：ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １６：１８２〜１８７，２０００年で総論されている）。
【０００８】
ｈＬＳｏｘ５およびＳｏｘ６は、Ｓｏｘ９と協力して一部重複した役割を果たし、Ｃｏｌ２ａ１やアグリカンなどの軟骨細胞標的遺伝子の発現を調節すると考えられる（Ｓｍｉｔｓ  Ｐ，Ｌｉ  Ｐ，Ｍａｎｄｅｌ  Ｊ．Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｄｅｎｇ  ＪＭ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲ，ｄｅ  Ｃｒｏｕｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ：Ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｌ−Ｓｏｘ５  ａｎｄ  Ｓｏｘ６  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ
Ｃｅｌｌ  １：２７７〜２９０，２００１年；Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｌ−Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６  ａｎｄ  Ｓｏｘ９  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ９  Ｓｕｐｐｌ  Ａ：Ｓ６９〜Ｓ７５，２００１年）。
【０００９】
Ｓｏｘ９はまた、ＨＭＧ様部位との相互作用により「副軟骨コラーゲン（ｍｉｎｏｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）」であるＣｏｌ１１ａ２を調節するが、これは、プロモーター中（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ  ＬＣ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｌ１１ａ２  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｅｍｂｌｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｌ２ａ１  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１４９９８〜１５００６，１９９８年）、および、イントロンエンハンサー内（Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌｉ  Ｈ，Ｔａｎａｋａ  Ｋ．Ｔｓｕｍａｋｉ  Ｎ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｉｎｔｒｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ２（ＸＩ）ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１２７１２〜１２７１８，２０００年）の両方でなされる。
【００１０】
Ｓｏｘ９は、軟骨マトリックスタンパク質の発現を調節する多くのシグナル伝達経路を統合すると考えられる。このようなシグナルとしては、前肥大軟骨細胞で、軟骨表現型を正に調節するシグナル、例えばＦＧＦやＢＭＰ−２、同様に副甲状線ホルモンが挙げられる（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｓ，Ｋａｎ  Ｍ，ＭｃＫｅｅｈａｎ  ＷＬ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ｓｏｘ９  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ
ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１１１３〜１１１８，２０００年；Ｕｕｓｉｔａｌｏ  Ｈ，Ｈｉｌｔｕｎｅｎ  Ａ，Ａｈｏｎｅｎ  Ｍ．Ｇａｏ  ＴＪ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，Ｈａｒｌｅｙ  Ｖ，Ｋａｈａｒｉ  ＶＭ，Ｖｕｏｒｉｏ  Ｅ：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６，ａｎｄ  Ｓｏｘ９  ｂｙ  ＢＭＰ−２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １６：１８３７〜１８４５，２００１年）。
【００１１】
また、サイトカインおよびレチノイン酸によるマトリックス発現の阻害は、Ｓｏｘ９阻害にも関連する（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｓ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｏｘ９  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３６８７〜３６９２，２０００年）；Ｓｅｋｉｙａ  Ｉ，Ｋｏｏｐｍａｎ  Ｐ，Ｔｓｕｊｉ  Ｋ，Ｍｅｒｌｉｎ  Ｓ，Ｈａｒｌｅｙ  Ｖ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｋ，Ｎｉｇｕｊｉ  Ａ，Ｎｏｄａ  Ｍ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８１：７１〜７８，２００１年）。
【００１２】
研究により、Ｓｏｘ９活性は、発現レベルと翻訳後修飾との両方によって調節されることが示された（Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｚｈｏｕ  Ｘ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＯＸ９  ｂｙ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＳＯＸ９’ｓ  Ａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｏ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ  ａ  Ｃｏｌ２ａ１  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：４１４９〜４１５８，２０００年）。
【００１３】
Ｓｏｘ９は、「主要軟骨形成性転写因子（Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）」と名付けられている（Ｍｕｒａｋａｍｉ
Ｓ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｏｘ９  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３
６８７〜３６９２，２０００年）。それゆえに、軟骨の破壊を食い止め、修復を誘導する方策を考察するには、軟骨の発達、組織の維持、および、病気の経過におけるＳｏｘ９機能を理解することが重要である。
【００１４】
軟骨細胞発達、並びにＩＩ型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子発現の調節の重要な決定因子として、Ｓｏｘ９転写因子が取り上げられている。Ｓｏｘ９転写因子は、軟骨細胞によるＣｏｌ２の発現／活性において役割を果たすことがわかっている。
【００１５】
Ｓｏｘ９の存在レベルとＣｏｌ２の発現／活性との相互関係を示すことができるモデルを構築することが有用であると思われる。また、様々な化合物を試験して、それらがＳｏｘ９発現／活性に効果を有するかどうかを測定することができるモデルを開発することも有用であると思われる。
【００１６】
我々の理解のほとんどは、遺伝学的に改変されたマウスの研究と、インビトロでのマウス軟骨細胞の機能的分析に基づいている。軟骨細胞発達のいくつかの特性が模擬されているように開発されたマウス細胞系も有用であるが、様々な化合物のＣｏｌ２発現に対する効果を測定するのに用いることができるヒト細胞系の利点が極めて有用であり得る。従って、ヒト軟骨細胞の機能および病気の経過におけるＳｏｘ９の可能な役割をより良く特徴付けるには、マウスで同定されたＳｏｘ９調節経路が保存されたヒト細胞系を同定することが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
軟骨細胞でのＣｏｌ２エンハンサー活性を高め、コラーゲン再生を容易にすることが望ましい。様々な化合物をスクリーニングして、Ｃｏｌ２発現に対するそれらの効果を測定することが有用であろう。あいにくにも、軟骨細胞は、インビトロでほとんど増殖能がなく、線維芽細胞様細胞に分化する傾向があるため、化合物を試験するのに軟骨細胞を用いることは不可能である。
【００１８】
従って、本発明の目的は、化合物をスクリーニングして、軟骨細胞においてＣｏｌ２エンハンサー活性を改変するそれらの能力を測定することができる細胞系および分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、ヒト軟骨細胞活性への試験化合物の効果を予測する方法に関する。本方法は、以下の工程：ＳＷ１３５３ヒト軟骨肉腫細胞をＳｏｘ９ＤＮＡ結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること；トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約２〜約２４時間接触させること；および、レポーターの活性を測定すること、を含む。
【００２０】
本発明はまた、Ｃｏｌ２発現／活性に対する様々な化合物の効果を模擬することができるキメラ細胞系を提供する。本細胞系は、Ｓｏｘ９ＤＮＡレポーター結合部位を含むプラスミドでトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞を含む。
【００２１】
ＳＷ１３５３細胞系が、様々な化合物によるＣｏｌ２発現の調節に反応する軟骨細胞の挙動をモデル化できることが分かった。ＳＷ１３５３細胞が、Ｓｏｘ９ＤＮＡ結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトされている場合、この細胞は、導入された化合物が、Ｓｏｘ９レベルを変化させて間接的にＣｏｌ２ａ発現／活性レベルを変化させることにおいて有効かどうかを測定するための分析として用いることができ、従って、軟骨細胞の分化に対する導入された化合物の効果を、程度の差はあるが予測するためのツー
ルとして作用し得る。
【００２２】
一過性トランスフェクション研究により、Ｓｏｘ９依存性Ｃｏｌ２エンハンサーレポーターコンストラクトの基礎的な発現は、Ｓｏｘ９発現ベクターの共発現により高めることができることが示される。マウスＳｏｘ９発現／活性の既知の調節因子のパネルをエンハンサー分析で試験した結果、リアルタイムＰＣＲを用いた内因性Ｓｏｘ９遺伝子の発現と相互関係を示した。
【００２３】
ＳＷ１３５３細胞系は、初期のマウス軟骨細胞で観察されるＣｏｌ２エンハンサー活性に対するサイトカインおよび成長因子の様々な効果（例えば、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２による刺激、ならびに、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαによる抑制）を再現する。これら効果と、Ｓｏｘ９のｍＲＮＡレベルの変化とは、相互関係を示す。本発明者らは、ＦＧＦ−９が、Ｓｏｘ９発現とＣｏｌ２エンハンサー活性を刺激することを発見した。加えて、Ｃｏｌ２エンハンサー活性に対するＩＬ−１β用量の効果を入念に試験したところ、実際には、極めて低いレベルのサイトカインではエンハンサー活性を刺激するが、ＩＬ−８発現を刺激するのに十分なより高い用量では阻害が起こることが示される。
【００２４】
この発見は、変形性関節症の自然な進行と関連を有する。軟骨細胞は、初期の変形性関節症に反応してＣｏｌ２発現を増加させて修復を試み、ＩＬ−１の自己分泌発現と相互関係を示すため、これらの結果は、これら２つの因果関係を示す。本発明者らは、ＳＷ１３５３細胞が、Ｃｏｌ２を刺激する低いレベルから、抑制して異化反応を誘導するより高いレベルまでの、ＩＬ−１レベルの動的な範囲に反応できることを示す。
【００２５】
添付図面において：
図１Ａは、一過性にトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞でのＳｏｘ９共発現による、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１Ｌｕｃエンハンサーレポーターの基礎的な発現の刺激を示す。
図１Ｂは、Ｓｏｘ９発現プラスミドでトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞のウェスタンブロットを示す。
図２は、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーレポーターの活性化または抑制による、ＳＷ１３５３細胞の成長因子およびサイトカインへの反応を示す。
図３は、ＳＷ１３５３細胞におけるＳｏｘ９発現に対する、ＦＧＦおよびサイトカインの逆の効果を示す。
図４は、ＳＷ１３５３の生物学的反応の動的な範囲を、ＩＬ−１β濃度の関数として示す。
【００２６】
本発明は、ヒト軟骨細胞の分化への試験化合物の効果を予測する方法に関する。本方法は、以下の工程：ＳＷ１３５３ヒト軟骨肉腫細胞を、Ｓｏｘ９ＤＮＡ結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること；トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約２〜約２４時間接触させること；および、レポーターの活性を測定すること、を含む。本発明はまた、Ｃｏｌ２発現／活性に対する様々な化合物の効果を模擬することができるキメラ細胞系を提供する。この細胞系は、Ｓｏｘ９ＤＮＡレポーター結合部位を含むプラスミドでトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞を含む。
【００２７】
本発明により、ＳＷ１３５３細胞が初期のマウス軟骨細胞で同定された様々なシグナル伝達経路をモデル化しており、それゆえに、マウス系で得られた実験結果をヒト系に置き換えるのに有用であることが示される。
【００２８】
ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、Ｓｏｘ９ｍＲＮＡレベルを増加させ、それに対応する、Ｓｏｘ９依存性の４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーコンストラクト活性を増加させることがわかった。これは、損傷した軟骨の正常な修復を試みた際の軟骨細胞の正常な反応による関節の修復、または、治療的介入のための方策を考察する場合の関節の修復のいずれかに関連を有する。例えば、突然変異ＩＩＡ型コラーゲン遺伝子の発現により誘導された損傷を修復しようとしているマウスの関節において、Ｓｏｘ９発現が増加する（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｈ，Ｖｕｏｒｉｏ  Ｅ，Ｓａａｍａｎｅｎ  ＡＭ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ９  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩＡ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｔｔｅｍｐｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４４：９４７〜９５５，２００１年）。
【００２９】
インサイチュ分析によれば、Ｓｏｘ９発現は、このモデルの修復組織に存在する増殖性の、および代謝活性の軟骨細胞のほとんどと一致することが示された。また、ウサギモデルにおいて、ＦＧＦ−２に対する中和抗体により全層の軟骨欠損の修復がブロックされるが、その一方で、ＦＧＦ−２を注入することにより修復が改善されることから、内因性ＦＧＦ−２の発現も関節損傷の修復と相互関係を示す（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｈ，Ｖｕｏｒｉｏ  Ｅ，Ｓａａｍａｎｅｎ  ＡＭ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ９  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩＡ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｔｔｅｍｐｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４４：９４７〜９５５，２００１年）。従って、Ｓｏｘ９は、前軟骨形成性の成長因子の投入と、修復に必要な軟骨細胞の遺伝子の発現との間の直接的な関係を提供する。
【００３０】
本発明は、ヒト軟骨細胞様細胞系において、ＦＧＦ−９がＳｏｘ９発現およびＳｏｘ９活性を刺激することを開示する。これらの発見と一致して、ニワトリ軟骨細胞培養物の成長とマトリックス生成を刺激するという点において、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−２が、全ＦＧＦファミリーメンバーのなかでも最も有効であることがわかった（Ｐｒａｕｌ  ＣＡ，Ｆｏｒｄ  ＢＣ，Ｌｅａｃｈ  ＲＭ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  １，２，４，５，６，７，８，９，ａｎｄ  １０  ｏｎ  ａｖｉａｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８４：３５９〜３６６，２００２年）。上述したように、ＦＧＦ−９発現は、軟骨腫症患者の関節における良性の軟骨小結節の成長に関連する。これらの結果より、刺激またはＦＧＦ−９／ＦＧＦＲ／Ｓｏｘ−９シグナル伝達経路は、軟骨損傷の修復を刺激することにおいて価値を有することが示される。
【００３１】
ＦＧＦ−９は、ＦＧＦＲ２ｃとＦＧＦＲ３ｂの両方を介してシグナル伝達し（Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏ  Ｓ，Ｃｏｌｖｉｎ  ＪＳ，Ｃｈｅｌｌａｉａｈ  Ａ，Ｏｒｎｉｔｚ
ＤＭ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−９．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１７２６〜１７３１，１９９６年）、ＦＧＦＲ３が欠失したマウスは、重度の軟骨形成不全を有する（Ｃｏｌｖｉｎ  ＪＳ，Ｂｏｈｎｅ  ＢＡ，Ｈａｒｄｉｎｇ  ＧＷ，ＭｃＥｗｅｎ  ＤＧ，Ｏｒｎｉｔｚ  ＤＭ：Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅａｆｎｅｓｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １２：３９０〜３９７，１９９６年））。
【００３２】
しかしながら、ＦＧＦ９欠失マウスは、正常な軟骨が誘導した構造を有するが、その代わりにＸＹ性転換と肺の形成不全を示す（Ｃｏｌｖｉｎ  ＪＳ，Ｇｒｅｅｎ  ＲＰ，Ｓｃｈｍａｈｌ  Ｊ，Ｃａｐｅｌ  Ｂ，Ｏｒｎｉｔｚ  ＤＭ：Ｍａｌｅ−ｔｏ−ｆｅｍａｌｅ
ｓｅｘ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ９．Ｃｅｌｌ  １０４：８７５〜８８９，２００；Ｃｏｌｖｉｎ  ＪＳ，Ｗｈｉｔｅ  ＡＣ，Ｐｒａｔｔ  ＳＪ，Ｏｒｎｉｔｚ  ＤＭ：Ｌｕｎｇ
ｈｙｐｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｆｇｆ９−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｈｉｓ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：２０９５〜２１０６，２００１年）。
【００３３】
これは、その他のＦＧＦによりＦＧＦ−９の欠失が補われ、正常な軟骨の発達を回復することができるが、その逆は真ではないことを示す；その他のＦＧＦ受容体は、発達中の軟骨でＦＧＦＲ３の欠失を機能的に置き換えることは不可能である。
【００３４】
ＳＷ１３５３細胞と、初期のマウス軟骨細胞との類似性としては、異化反応が挙げられ、この異化反応は、リウマチ様の関節において、炎症性サイトカインにより誘導され、軟骨を破壊する。この細胞系における観察結果そのものは新しくはないが、Ｓｏｘ９レベル／活性の抑制への関連は新規である。本発明者らは、極めて低いレベルのＩＬ−１ｂが、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーの発現を刺激することを発見し、この発見により、変形性関節症の関節でみられる軟骨細胞のＩＬ−１発現とＩＩ型コラーゲン合成の増加とが相互関係を示すという逆説的な結果を説明することができる。従って、ＩＬ−１の低いレベルの自己分泌発現は、実際に、軟骨細胞による有益な反応を促進させて、変質する関節を修復させることが可能である。ＩＬ−１βによるＣｏｌ２発現の抑制は、不死化ヒト軟骨細胞系で報告されているが、ＩＬ−１レベルの動的な範囲に特異的に反応するＳＷ１３５３の能力の発見は新規であり、特にヒト軟骨細胞モデルで有用である。
【００３５】
ＳＷ１３５３細胞の機能的な反応により、それらは、発達中または修復中の骨を含む軟骨細胞よりも、ヒアリン軟骨からなる軟骨細胞の典型であり得ることが示される。生後のＳｏｘ９の機能としては、成長骨における前肥大軟骨細胞の維持が挙げられる。このような研究により、Ｓｏｘ９活性は、発現レベルと翻訳後修飾その両方により制御されることが示された。前肥大軟骨細胞において、Ｓｏｘ９活性は、ＰＴＨｒＰ処理への反応においてタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）により刺激される（Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｃｈｕｎｇ  ＵＩ，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＭ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｏｘ９  ｉｓ  ａ
ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１６０〜１６５，２００１年；Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｚｈｏｕ  Ｘ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＯＸ９  ｂｙ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＳＯＸ９’ｓ  Ａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｏ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ  ａ  Ｃｏｌ２ａ１  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：４１４９〜４１５８，２０００１４）。
【００３６】
本発明者らは、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーでトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞での、ＰＴＨｒＰのＳｏｘ９活性に対する効果を未だ観察していないが、該細胞はｃＡＭＰ類似体に反応し、エンハンサー発現が約２倍に増加する（ＬＢおよびＪＳ，観察結果は未公開）。またＳＷ１３５３細胞は、ＴＧＦα、ＢＭＰ−２、−４、および−６には反応を示さないと考えられ（データは示さず）、それらの表現型が骨より軟骨に近いことに一致する。従って、ＳＷ１３５３細胞は、Ｓｏｘ９シグナル伝達経路、特に軟骨に最も関連するＳｏｘ９シグナル伝達経路を研究するのに有用なモデルと考えられる。
【００３７】
ＦＧＦ／ＦＧＦ受容体シグナル伝達は、インビトロでの軟骨細胞の成長および分化に対して甚大な効果を有する。しかしながら、このファミリーには、４種のＦＧＦ受容体と、２２種のリガンドがあるため、生理学的に関連する相互作用の測定は極めて複雑である。マウス軟骨細胞と不死化軟骨細胞モデル細胞系（ＡＴＤＣ５、および、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）において、４８ｂｐのＬｕｃレポーターは、ＦＧＦ−１やＦＧＦ−２などの前軟骨形成性の因子によって誘導されるが、もっぱら上皮細胞に限定的なＦＧＦＲＩＩＩｂ受容体を介してのみシグナル伝達するＦＧＦ−７では誘導されない（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｓ，Ｋａｎ  Ｍ，ＭｃＫｅｅｈａｎ  ＷＬ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ｓｏｘ９  ｇｅｎｅ  ｂｙ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１１１３〜１１１８，２０００年）。
【００３８】
このレポータープラスミドは、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーの５個のタンデムリピートを含み、インビボでの軟骨細胞特異的な発現を指示するのに十分なＳｏｘ９結合部位を含む最小限の配列を包含する（Ｚｈｏｕ  Ｇ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，Ｚｈａｎｇ
Ｚ，Ｅｂｅｒｓｐａｅｃｈｅｒ  Ｈ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｔｈｒｅｅ
ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ−ｌｉｋｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ４８−ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｌ２ａ１
ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１４９８９〜１４９９７，１９９８年）。
【００３９】
一方で、ＬＳｏｘ５およびＳｏｘ６などの追加のタンパク質がこのエンハンサーフラグメントに結合し、軟骨細胞特異的な発現の促進を補助し（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＲ，ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ  Ｂ：Ｌ−Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６  ａｎｄ  Ｓｏｘ９  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ９  Ｓｕｐｐｌ  Ａ：Ｓ６９〜Ｓ７５，２００１年）、Ｓｏｘ９結合が、完全な活性に必要である（Ｚｈｏｕ  Ｇ等Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１４９８９〜１４９９７，１９９８年）。
【００４０】
ＦＧＦ−９は、有効な軟骨形成性の因子であり、ＦＧＦＲ３ｂとＦＧＦＲ２ｃを介してシグナル伝達する。構成的に活性なＦＧＦＲ３を生産する突然変異により、軟骨形成不全、低軟骨形成症、および、致死性骨異形成などの骨格奇形が引き起こされ、軟骨細胞成長と分化とのバランスが壊される（Ｗｅｋｓｌｅｒ  ＮＢ，Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ＧＰ，Ｒｅｉｄ  ＥＳ，Ｈｏｒｔｏｎ  ＷＡ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）９  ａｎｄ  ＦＧＦ２  ｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４２  Ｐｔ３：６７７〜６８２，１９９９年）。
【００４１】
その上、ＦＧＦ−９の過剰発現は、滑膜における軟骨小結節の形成を特徴とするまれな病気、軟骨腫症に関係する。これらの研究により、幹細胞の軟骨細胞への分化の制御におけるＦＧＦ−９の中心的な役割が示される。
【００４２】
これまでの研究により、Ｃｏｌ２エンハンサー活性は、Ｓｏｘ９発現と相互関係を示す
ことが示された。例えば、初期のマウス軟骨細胞において、ＦＧＦ−２は、Ｓｏｘ９ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を刺激し、サイトカインは、それらを抑制することから、Ｓｏｘ９が、Ｃｏｌ２発現およびアグリカン発現の調節における主要な媒体であることが示される。
【実施例】
【００４３】
１．Ｓｏｘ９発現コンストラクト
ヒトＳｏｘ−９哺乳動物発現コンストラクトを作製するために、不死化ヒト軟骨細胞様細胞Ｔ／Ｃ−２８ａ４の培養物からのｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン）で精製した。全体で１.５Ｋｂのコード領域（ＧｅｎＢａｎｋデータベース，寄託番号Ｚ４６６２９）は、逆転写（クロンテックのアドバンテージＲＴキット）、続いて以下のプライマーを用いてＰＣＲ反応（ロシュのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット）を行って得られた：センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧ−３’、および、アンチセンス５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＴ−３’。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン）にサブクローニングし、配列を確認した。
【００４４】
２．細胞培養
試薬は、特に他の規定がない限り、インビトロジェンから購入した。ＳＷ１３５３ヒト軟骨肉腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−９４）を、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤＭＥＭで培養し、０.２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて継代培養した（１週間に２回）。
【００４５】
３．トランスフェクション実験
トランスフェクションの２４時間前に、培養容器の表面面積に応じて１０ｍｌの成長培地またはそれと同等物の中で、１フラスコあたり〜１０6個の細胞で、Ｔ−７５に細胞をプレーティングした。各トランスフェクションのために、２４μｌのＴｒａｎｓＩｔ（パンベラ（ＰａｎＶｅｒａ））をＯｐｔｉＭＥＭ（２５０μｌ）に希釈し、１２μｇのレポータープラスミドＣｏｌ２ａ１エンハンサーコンストラクト（４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１）を加えた。１５〜３０分間インキュベートした後、成長培地を細胞から除去し、ＤＮＡ−トランスフェクション試薬の複合液をＯｐｔｉＭＥＭで最終体積１０ｍｌに希釈し、細胞に加えた。７時間後、トランスフェクション培地を新しい培地で交換した。トランスフェクトして２４時間後、細胞を、培地単独または指定された因子で処理した。トランスフェクトして４８時間後、細胞を回収し、ＬｕｃＬｉｔｅとＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＬＳＣプレートリーダー（パッカード）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４６】
４．ウェスタンブロッティング
２４ウェルの培養皿の単層培養から、トリスグリシンサンプル緩衝液（インビトロジェン）を添加することによって細胞溶解物を調製した。４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（インビトロジェン）に等量の溶解物をローディングし、電気泳動した。半乾式装置（バイオ・ラッド）を用いてゲルをニトロセルロース（インビトロジェン）にトランスファーした。ウェスタンブロッキング試薬（ロシュ）を用いてメンブレンをブロックした。Ｓｏｘ９抗体を、５０％ウェスタンブロッキング試薬５０％ＴＢＳ−Ｔで１：１０００にして用いた。二次抗体は、ＨＲＰ（ピアス）に結合させたウサギ抗マウスＩｇＧであった。ピアス社製のＥＣＬ試薬を用いて、ブロットを展開させた。化学発光をルミイメージャー（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ）（ロシュ）で画像化した。
【００４７】
５．Ｔａｑｍａｎ  ＲＮＡ分析
ＤＮアーゼ処理を含むＲＮｅａｓｙキット（キアゲン）を製造元のプロトコールに従って用いて（ただしＤＮアーゼの第２アプリケーションを用いた）、７５ｃｍの培養皿から
ＲＮＡを調製した。ランダムヘキサマープライマーと、ＰＥバイオシステムズの逆転写試薬を用いて、１０〜２０μｌのＲＮＡ（１〜４μｇ）からｃＤＮＡを調製した。Ｔａｑｍａｎ反応では、ｃＤＮＡ（８μｌ）、ならびに、２×ＰＥユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＰＥバイオシステムズ）、９００ｎＭのＰＣＲプライマー、および、２００ｎＭのＦＡＭ−ＴＡＭＲＡプローブが用いられた。ＰＥ５７００を用いて４５サイクルの標準的な条件で反応液（５０μｌ）をサイクル処理し、定量した。ＧｅｎｅＡｍｐ５７００ソフトウェアミックス（ＰＥバイオシステムズ）を用いて、全サンプルにつき閾値を直線の範囲に合わせてデータを分析した。正規化群（ＧＡＰＤＨ）を対応する遺伝子特異的な値から引くことにより、ΔＣｔを計算した。処理済みのΔＣｔをコントロールΔＣｔから引くことにより、ΔΔＣｔを計算した。２ΔΔCtを計算することによってフォールディング誘導を決定した。データは、コントロールサンプルに対する増加％として報告した。
【００４８】
６．Ｔａｑｍａｎプライマーおよびプローブ
Ｚ４６６２９
ＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＡＣＣＴＴＧ
Ｓｏｘ９（＋１８６８）フォワードプライマー
ＴＴＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＣＧ
Ｓｏｘ９（−１９４３）リバースプライマー
ＦＲＥＴプローブ：ＦＡＭ−ＣＣＣＡＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＧＧ−ＴＡＭＲＡ。
【００４９】
結果
１．Ｃｏｌ２エンハンサー活性は、Ｓｏｘ９レベルの増加に反応する
我々は、トランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞における４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーコンストラクト（４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１）の活性を分析した。ＳＷ１３５３細胞を、一定量のレポーター（０.２５μｇ）を用いて、増加量のＳｏｘ９発現コンストラクトまたは空のベクターを用いて、または用いずにトランスフェクトした。
【００５０】
基本のルシフェラーゼ活性は、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１レポーター単独（図１Ａ）をエンハンサーを含まないコントロールコンストラクト（同じＣｏｌ２由来の最小限プロモーター（ｐ８９）を含む）として用いて検出された。これは実質的に不活性であり（活性５％未満）、ＳＷ１３５３細胞は正常にエンハンサー活性を刺激する転写因子を発現するであろうことが示された。
【００５１】
Ｓｏｘ９発現プラスミドの効果を測定するために、増加量のＳｏｘ９発現プラスミド（２０：１、１０：１、２：１、および、１：１）を用いてコトランスフェクションを行った。その結果、用量依存性でエンハンサー活性が増加したこと、および、Ｓｏｘ９レベルが限定的であることが示された。大量のＳｏｘ９発現プラスミド（１：１）を含ませると、レポーター活性がわずかに減少した。
【００５２】
二連のトランスフェクションから調製した細胞抽出物からウェスタンブロットを作製したところ、Ｓｏｘ９発現が確認された（図１Ｂ）。最も高いＤＮＡ濃度（０．２５μｇ）で、免疫反応性のバンドが出現し、このバンドは６６ｋＤのマーカーと共に移動しており、Ｓｏｘ９と予測された６８ｋＤのサイズとちょうど一致した（レーン５）。２〜１０倍少ない発現プラスミドのトランスフェクションで、同じサイズのタンパク質が観察された（レーン４および３）。さらに長く露光させたところ、２０：１のトランスフェクションで、Ｓｏｘ９発現プラスミドを導入していない細胞で、抗Ｓｏｘ９免疫反応性のタンパク質がわずかに検出された。
【００５３】
２．ＳＷ１３５３細胞は前軟骨形成性の線維芽細胞成長因子に反応する
我々は、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーのトランスフェクション分析により、これら線維芽細胞成長因子に対するＳＷ１３５３細胞の反応性を分析した。ＦＧＦ−１（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（５.９ｎｇ／ｍｌ）を培養に添加することにより、４８ｂｐのエンハンサー発現が３〜４倍増加したが、一方で、ＦＧＦ−７（２００ｎｇ／ｍｌ）については、発現は効果がなかった（図２）。これら結果により、ＳＷ１３５３細胞において、ＦＧＦ−１とＦＧＦ−２のシグナル伝達経路が保存されていることが示される。
【００５４】
エンハンサー活性に対するＦＧＦ−９の効果を試験するため、Ｃｏｌ２レポーターでトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞の培養にＦＧＦ−９を加えた。ＦＧＦ−９（２００ｎｇ／ｍｌ）は、エンハンサー発現を４倍まで刺激した（図２）。この結果により、ＳＷ１３５３細胞は、機能的ＦＧＦＲ３ｂおよび／またはＦＧＦＲ２ｃ受容体を発現することが示され、さらに、軟骨細胞の生物学の研究において、それらが有効であることが確認された。
【００５５】
３．ＳＷ１３５３において、前炎症性サイトカインはＣｏｌ２エンハンサー活性を抑制する
初期のマウス軟骨細胞でＩＬ−１βとＴＮＦαがＣｏｌ２エンハンサー活性を抑制する能力は、ＮＦｋＢ依存性であり、Ｓｏｘ９発現の減少と一致する。
【００５６】
ＳＷ１３５３細胞を４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１レポーターでトランスフェクトし、次に、ビヒクル、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、または、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した（図２Ａ）。その結果によれば、これらの物質が、ＩＬ−８発現（示す）とマトリックスメタロプロテアーゼ（示さず）を刺激できることが示されたことから、ＳＷ１３５３細胞は、機能的なＴＮＦとＩＬ−１受容体を発現することがわかった。
【００５７】
エンハンサーにより生じたルシフェラーゼ発現は、ＴＮＦα処理では約６０％、ＩＬ−１β処理では５０％減少した。サイトカインが介在するエンハンサー発現の阻害は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−９のいずれかで細胞を共に処理することによって部分的に軽減することができた（図２Ｂ）。これらの結果は、前軟骨形成性の成長因子が、動物またはヒトの関節の炎症において軟骨損傷を減少または回復させる可能性と一致する。
【００５８】
４．Ｃｏｌ２エンハンサー活性は、ＳＷ１３５３における関連するＳｏｘ９ｍＲＮＡ発現と相互関係を示す
ＳＷ１３５３細胞における、Ｓｏｘ９  ＲＮＡ発現に対する軟骨細胞成長因子および抑制性サイトカインの効果は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ，ＰＥアプライドバイオシステムズ）を用いて測定された。細胞を培養し、上で説明した成長因子またはサイトカインで処理した。４８時間後、細胞を回収し、ＲＮＡを調製した。注文生産したＳｏｘ９プライマープローブセットを、いくつかの対数に対する効果プロットにより確認し、相対的Ｓｏｘ９発現を、ＧＡＰＤＨと比較して定量した。
【００５９】
Ｓｏｘ９ｍＲＮＡ発現は、ＦＧＦ−２では約１.５倍、ＦＧＦ１およびＦＧＦ−９では２倍増加したが、一方で、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βでは、Ｓｏｘ９発現は、それぞれ４５％および６０％減少した（図３）。これらのデータは、少なくとも部分的にＳｏｘ９発現レベルで調節されたＳＷ１３５３におけるＣｏｌ２エンハンサー発現と一致する。
【００６０】
５．Ｃｏｌ２エンハンサーレポーターの発現は、低いレベルのＩＬ−１βの存在により刺激される
ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２）発現の増加がヒトおよびイヌの両方で変形性関節症の経過中に観察されている（Ｂｕｒｔｏｎ−Ｗｕｒｓｔｅｒ  Ｎ，Ｈｕｉ−Ｃｈｏｕ  ＣＳ，Ｇｒｅｉｓｅｎ  ＨＡ，Ｌｕｓｔ  Ｇ：Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  
ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｆ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７１８：７４〜８４，１９８２年；Ｕｕｓｉｔａｌｏ  Ｈ，Ｈｉｌｔｕｎｅｎ  Ａ，Ａｈｏｎｅｎ  Ｍ，Ｇａｏ  ＴＪ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ，Ｈａｒｌｅｙ  Ｖ，Ｋａｈａｒｉ  ＶＭ，Ｖｕｏｒｉｏ  Ｅ：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６，ａｎｄ  Ｓｏｘ９  ｂｙ  ＢＭＰ−２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １６：１８３７〜１８４５，２００１年）。
【００６１】
Ｃｏｌ２発現は、初期で最大になり、病気を緩和するようであり、これは、軟骨細胞による反応を反映させて、変質する軟骨の修復を試みているものと考えられる。これに一致して、初期に病気が緩和されたＯＡ患者からの軟骨細胞も、増加したレベルのＩＬ−βおよびＩＬ−１βを発現し、これらも病気の進行と共に減少する（Ｔｏｗｌｅ  ＣＡ，Ｈｕｎｇ  ＨＨ，Ｂｏｎａｓｓａｒ  ＬＪ，Ｔｒｅａｄｗｅｌｌ  ＢＶ，Ｍａｎｇｈａｍ  ＤＣ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ５：２９３〜３００，１９９７年）。
【００６２】
従って、ＩＬ−１発現は、Ｃｏｌ２発現と重複していると考えられる。これは逆説的のようにみえるが、変形性関節症の関節で観察されるＩＬ−１レベルは軟骨細胞由来であって、これらのレベルは、主としてマクロファージ由来の、リウマチ様の関節で観察されるサイトカインの極めて高いレベルとは区別されることに留意すべきである。リウマチ様の関節とは異なり、ＯＡにおいて、軟骨分解が最大である場合に、ＩＬ−１レベルは最も低く、これは、ＩＬ−１は、これら２つの病気で軟骨破壊において同じ役割を有さないことを示す。
【００６３】
トランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞での、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサー発現に対する低いＩＬ−１β用量の効果が測定された。驚くべきことに、極めて低いレベルのＩＬ−１β（０.１〜１ｐｇ／ｍｌ）が、エンハンサー活性を約１５０％刺激した（図４）；しかしながら、誘導の規模はそれほど大きくなく、この反応は、常に観察された。Ｃｏｌ２エンハンサー活性は、ＩＬ−１β濃度が１ｐｇ／ｍｌを超えて増加する場合には減少し、濃度が２０〜１００ｐｇ／ｍｌで最大の阻害が生じた。
【００６４】
２つの反応に対する増加するＩＬ−１β用量の効果が測定された。図４で示すように、ＩＬ−１が２０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度の場合では、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーの最大の抑制を引き起こす濃度だが、ＩＬ−８の誘導は検出されなかった。それゆえに、ＳＷ１３５３細胞は、選択的な機能的な反応を伴い、ＩＬ−１βレベルの動的な範囲に反応すると考えられ、変形性関節症とリウマチ様疾患との両方のモデルで有用とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】一過性にトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞でのＳｏｘ９共発現による、４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１Ｌｕｃエンハンサーレポーターの基礎的な発現の刺激を示す。
【図１Ｂ】Ｓｏｘ９発現プラスミドでトランスフェクトされたＳＷ１３５３細胞のウェスタンブロットを示す。
【図２】４８ｂｐのＣｏｌ２ａ１エンハンサーレポーターの活性化または抑制による、ＳＷ１３５３細胞の成長因子およびサイトカインへの反応を示す。
【図３】ＳＷ１３５３細胞におけるＳｏｘ９発現に対する、ＦＧＦおよびサイトカインの逆の効果を示す。
【図４】ＳＷ１３５３の生物学的反応の動的な範囲を、ＩＬ−１β濃度の関数として示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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