(57)【要約】本発明は、水性環境に少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質を有する非小胞性調製物、その製法およびその使用ならびにそれらから得られる高い薬物捕捉比（drug trap ratio）を有するカチオン性リポソーム懸濁液、および薬理学、医学のようなその適用分野、特に活性物質のキャリヤー系としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全体の両親媒性物質濃度に対して、約１０mM〜約６００mMの濃度で少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質、場合により約６０mol%までの少なくとも１つの更なる両親媒性物質ならびに場合により水相中に約１０mM〜約６００mMの濃度で少なくとも１つの安定剤を有している非小胞性調製物において、前記調製物が透明で、等方性であり、かつ実質的に均一であることに特徴づけられる、非小胞性調製物。
【請求項２】
約２５mM〜約５００mMの濃度で、有利には約１００mM〜約４００mMの濃度で、最も有利には約２００mM〜約３００mMの濃度で、少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質を有する、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
約１００mM〜約５００mMの濃度、有利には約２００mM〜約４００mMの濃度で安定剤を有している、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
カチオン性両親媒性物質は、正の実効電荷を有する脂質、リゾ脂質、ペグ化脂質から選択される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の調製物。
【請求項５】
カチオン性両親媒性物質は、N−［１−（２，３−ジアシルオキシ）プロピル］−N,N−ジメチルアミンまたはN−［１−（２，３−ジアシルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムのような少なくとも１個の第三アミノ基または第四アンモニウム基を有するカチオン脂質から選択される、請求項４に記載の調製物。
【請求項６】
更なる両親媒性物質は、負または中性の実効電荷を有する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の調製物。
【請求項７】
更なる両親媒性物質は、コレステロール、リン脂質、リゾ脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質またはペグ化脂質のような負または中性の実効電荷を有するステロールまたは脂質から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の調製物。
【請求項８】
中性の両親媒性物質は、ジアシルホスファチジルコリンである、請求項７に記載の調製物。
【請求項９】
安定剤は、トレハロース、マルトース、スクロール、グルコース、ラクトース、デキストラン、マンニトールまたはソルビトールのような糖またはアルコール、またはこれらの組合せから選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１０】
安定剤は、トレハロースまたはグルコースである、請求項９に記載の調製物。
【請求項１１】
さらに、活性化合物を有し、該活性化合物は親水性、疎水性または両親媒性物質であってよい、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１２】
化合物は、治療薬、有利にはカンプトテシンまたはこれらの誘導体、タキサン、または、エポチロン、ディスコデルモライド、ラウリマライド、イソラウリマライド、エレウテロビン、コルキシンおよび／またはこれらの誘導体、ビノレルビンのようなビンカアルカロイド、オキサリプラチンのような白金錯体、ドキソルビシンのようなアントラサイクリン、またはスタチン（例えば、ロバスタチン）のような微小管と相互作用する他の薬剤、より有利にはカンプトテシンまたはカルボキシレートの形のこれらの誘導体から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
治療剤は、全体の両親媒性物質の濃度に対して、約０．１mol%〜約２０mol%の範囲内、有利には約１mol%〜約１５mol%の範囲内、より有利には約３mol%〜約１０mol%の範囲内である、請求項１２に記載の調製物。
【請求項１４】
化合物は、診断薬、有利にはイメージング剤である、請求項１１に記載の調製物。
【請求項１５】
診断薬は、全体の両親媒性物質の濃度に対して、約０．１mol%〜約５０mol%の範囲内、有利に約１０mol%〜約５０mol%の範囲内、より有利に約３０mol%〜約５０mol%の範囲内である、請求項１４に記載の調製物。
【請求項１６】
リポソーム懸濁液を製造するための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の調製物の使用。
【請求項１７】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載の調製物から得られるカチオン性リポソーム懸濁液。
【請求項１８】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載の調製物または請求項１７に記載の懸濁液を、場合により製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈剤および／または補助剤と一緒に有している、製剤学的組成物。
【請求項１９】
医薬品または診断調製物を製造するための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の調製物、請求項１７に記載の懸濁液または請求項１８に記載の製剤学的組成物の使用。
【請求項２０】
癌、慢性もしくは急性炎症疾患、リウマチ様関節炎、皮膚炎、乾癬または創傷のような症状と関連する血管新生に有効な医薬品を製造するための請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
次の：
（ａ）カチオン性両親媒性物質、場合により更なる両親媒性物質、場合により安定剤、場合により活性化合物および水相を用意し、
（ｂ）工程ａ）の成分に、等方性で透明で、実質的に均一な調製物が形成されるような条件を課す
工程からなる、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の非小胞性調製物を製造する方法。
【請求項２２】
工程ｂ）は、単相蒸発または高圧ホモジナイゼーション法を含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性環境に少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質を有する非小胞性調製物、その製法およびその使用ならびに、それらから得られる高い薬物捕捉比（drug trap ratio）を有するカチオン性リポソーム懸濁液、および薬理学、医学のようなその適用分野、特に活性物質のキャリヤー系としてのその使用に関する。
【０００２】
リポソームは、医学的および製剤学的科学においてドラッグ・デリバリー・システムとしての重要な役割がある。一般的な適用では、活性化合物が標的部位に運ばれるようにするために、活性化合物が親油性であれば、リポソームの脂質二重膜中に封入され、疎水性であれば、水性コンパートメント中に挿入される。
【０００３】
リポソームの製造に関しては、多様な公知の方法が利用可能である（R.R. C. New(ed.)Liposomes, A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford 1990）。しかし、水溶性化合物を有し、均一性、小さなリポソームサイズを有する狭い粒度分布ならびに脂質に対する薬物の高い比率の条件を満たすリポソームを得ることは困難である。しかし、脂質に対する薬物の高い比率は、特に医薬品の用途にとって重要である。
【０００４】
リポソームを形成するための通常の標準的方法では、水溶性化合物の封入効率が低い。例えば、化合物を周知のフィルム法に基づいて負荷することができる：フラスコの内壁にある脂質の薄層フィルムを、封入すべき化合物を含有している水溶液で戻す。このように形成されたリポソーム中に封鎖された化合物のフラクションは、全体容量に対して封入されたフラクションに相当する。一般的なリポソーム調製物は、１００〜３００nmの範囲内のリポソーム直径で１０〜５０mMの範囲内の濃度を有する。このような調製物に関しては、全体容量に対する封入された容量は小さく、よって封入効率が低い。化合物の殆どはフリーな水相に残り、通常は透析により除去される。これは、さらに殆どの貴重な化合物が損失するという欠点を有する。
【０００５】
封入されない化合物は除去されてしまう。それというのも、これはリポソーム性キャリヤー中で保護されない場合に副作用を起こし得るからである。さらに、これはリポソーム薬とは異なる薬物動態学的特徴を有していてもよい。リポソームによる標的輸送の場合には、化合物の非リポソーム性フラクションは不活性である。この理由で、薬物の非リポソーム性フラクションを最小化することが重要である。
【０００６】
リポソームの水性コンパートメント中に化合物を封入する、この本質的な問題を克服するための多様な方法が記載されてきていた。このうちの１つは、活性負荷技法（active loading technique）であり、これは膜透過性、例えば、ｐH値の関数が異なる化合物に適用できる（R.R.C. New(ed.)Liposomes, A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford 1990）。この場合には、リポソームの内側からもう一方に向かってｐH勾配を適用することにより、化合物を小胞中に閉じ込めることができる。しかし、これらのアプローチは、限られた数の適切な分子にだけ、かつ特別な環境条件にだけに適用可能である。よって、これまでに前記アプローチのいずれも、水溶性化合物のリポソーム調製物にとって一般的な突破口を提供していない。
【０００７】
WO96/05808とWO99/49716には、高圧ホモジナイゼーションを使用することにより濃縮された“小胞性リン脂質ゲル”を製造する方法が開示されている。高い脂質含量を有するこれらの半固形リン脂質ペーストもしくはゲルは、殆どが小胞構造から成っている（WO 96/05808, WO 99/49716およびBrandI 2001（M. Brand I (2001) Liposomes as drug carriers: a technological approach, Biotechnology annual review Volume 759-85）。WO 96/05808は、小さいサイズと中程度のサイズ（100〜300nm）を有し、少なくとも２０％w/wの高い薬物比を有するユニラメラ小胞からのリポソーム調製物を開示している。しかし、このアプローチは幾つかの欠点と結びついている。すなわち、この調製物は高粘性であり、かつ繊細な材料にとって不利である振動バスミルのような過酷な機械圧の元でしか再分散が最もよく行われない。WO99/49716も同じく、少なくとも２０％の活性化合物を有するリポソームゲルに関し、加熱または機械圧により化合物がリポソームゲルに添加され、化合物が均一に小胞の内部と外部に分布している。しかし、これらのリポソームゲルの高い粘度により、かつ小胞のサイズにより、製剤学的調製物の形成の際に重要な工程である無菌濾過が不可能である。
【０００８】
最近では、カチオンリポソームが充実性腫瘍の周囲の脈管形成性血管に高い親和性を有することが報告され（Schmitt-Sody M. et al. (2003) Clin Cancer Res 9, 2335-41）、このことは、カチオンリポソームを薬物の腫瘍部位へ特異的にターゲッティング（血管ターゲッティング）することを有効にする。しかし、上記のように、多くの有利な薬物は水相に入り込むことができる。このような化合物のリポソーム調製物に関しては、フリーな水相中に一定のフラクションが存在し、カチオンリポソームのターゲッティング能に関しては不活性である。
【０００９】
一般的には、水中で一定の溶解度を有するか、または膜を介して高い透過性を有する化合物にとって、薬物でのリポソームの負荷が問題となり、これまでに十分に解決されてこなかった。現在可能なアプローチでは、化合物の多くのフラクションが封入されない。キャリヤーの特異的なターゲッティングの意味では、活性ではない。これは、透析か同等の技術により除去されるかもしれないが、著しい量が失われてしまう。別の難問は、封入状態が一般には非平衡状態であることである。それというのも、熱力学的平衡では、化合物が均一に分布するからである。従って、化合物の膜透過性に応じて、透析と適用の間に、さらなる材料がリポソームから水相へ放出され得る。
【００１０】
本発明の根底を成す課題は、脂質に対する高い薬物比、標的特異性ならびに製剤学的用途に十分な安定性を有する改善されたドラッグ・デリバリーシステムおよび／またはリリースシステムを提供することであった。
【００１１】
このように、上記の問題の解決は、請求項に特徴づけられる実施態様を提供することにより、本発明により達成された。
【００１２】
本発明は、全体の両親媒性物質濃度に対して、約１０mM〜約６００mM、有利に約２５mM〜約５００mM、より有利には約１００mM〜約４００mM、最も有利には約２００mM〜約３００mMの範囲内の少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質、場合により約６０mol%までの範囲内の更なる両親媒性物質ならびに場合により約１０mM〜約６００mM、有利に約１００mM〜約５００mM、より有利には約２００mM〜約４００mMの範囲内の安定剤を有する非小胞性調製物に関する。
【００１３】
意外にも、カチオン性両親媒性物質、有利には脂肪を水相中で混合する場合には、実質的に散乱粒子を不含で、リポソームの分散液ではなく、または他の粒子の分散液ではないクリアで透明な相が得られることが見出された。この新たな相は、約＜２０mM〜約＞６００mMの幅広い範囲内の両親媒性物質濃度で得ることができる。濃度の下限がなく、濃度の上限が過剰の水が無い膨潤脂質二分子層の状態に近いように見える。
【００１４】
本発明の調製物は、基本的な様々な面で従来のリポソーム懸濁液とは異なる、透明で、等方性で、実質的に均一な相であることにより説明できる（図２）。特性から直に分かるように、リポソーム粒子からの光散乱によりリポソーム懸濁液は白色タンパク光のように見える。これに対して、本発明の調製物は、クリアで透明である。すなわち、実質的に散乱粒子が存在しない。準弾性光散乱測定値の実験（Zetasizer 3000, Malvern, Herrenberg, Germany）は、拡散密度が約１８０nmの平均粒度を有するリポソーム懸濁液に対して、少なくとも３００倍減少することが示される。通常の条件下では、１mM濃度のリポソーム懸濁液は、６０kCps.のカウント率を生じる。２７０mMでの本発明のDOTAP調製物に関しては、約４０kCpsのカウント率が測定される。事実上、粒度分布が測定されず、＞１０nmの粒子に関しては、何も表示が見られない（Malvern Contin analysis）。
【００１５】
粒子数を濁度の測定値から推測することもでき、これはUV-vis分光分析法により行うことができる。図５には、３０mM  DOTAPリポソーム懸濁液と、２７０mMのDOTAPの非小胞性調製物のUVスペクトルが示されている。これから分かるように、非小胞性調製物が約一桁高い濃度を有しているにもかかわらず、リポソーム懸濁液では、吸収（ひいては散乱）が非小胞性調製物と比べてはるかに高い。選択された波長（４００nm）での吸収の比較により、非小胞性調製物のモル散乱がリポソーム懸濁液よりも２％未満であることが示される。
【００１６】
さらなる特徴として、本発明の調製物は、むしろ高い脂質濃度（＞２００mM）よりも、低い顕微鏡学的粘度を示す。すなわち、視覚的検査は、水相の状態に類似した液体を示唆している。それというのも、２００nmの孔径の膜を介して容易に押出しできるからである（通常は滅菌濾過に使用される孔径である）。これは、調製物を実質的に即使用可能な製剤学的組成物として適用できるようにし、また滅菌濾過が必要とされる用途で、特に活性化合物が存在する場合にも適用できる。これと比較して、一定の濃度（＞５０mM）を上回るリポソーム懸濁液の粘度は、押出しと滅菌濾過に関しては、しばしば高すぎるので、製剤学的用途には不向きである。
【００１７】
本発明の調製物は、前記のいわゆる小胞性リポソームゲル（WO 96/05808およびWO99/49716）とは著しく異なる。というのも、ゲルは、固体のようなコロイド構造であるか、または半固体のコロイド構造であるからである。このリポソームゲルは、高い密閉密度で個々の脂質小胞から成っている。脂質小胞中に成分を挿入させるために、機械的撹拌または高温が必要である（WO 99/49716）。しかし、本発明の調製物は、封入された相またはフリーな水相が区別できない均一な相として記載することができる。水相中の全ての成分は、しばしば全ての容積にわたって自由に動くことができる。さらなる成分を添加する場合には、全相に渡って分布でき、均一な混合物が得られる。
【００１８】
本発明の調製物は、水または水溶液で希釈することにより、リポソーム懸濁液に変換することができる。本発明の調製物が低濃度でも製造できるので、この結果は予測不可能であった。事実、“単相法（single phase method）”により、＜２５mMの濃度でも本発明の調製物は得られ、引き続き更なる溶剤蒸発により、その物理的状態に影響することなく６００mM以上まで濃縮することができる（すなわち、クリアで透明な相であり続ける）。よって、本発明の調製物は、凝集の分子状態に影響することなく希釈することができる。その代わりに、希釈により分子会合が変化し、リポソームが形成される。
【００１９】
このように形成されるリポソームは、好ましくは、狭い粒度分布で小から中程度のサイズ（３０〜３００nm）の範囲にある（＞０．５準弾性光散乱によるサイズ測定値からのPl値）。このことは、前記リポソームを製剤学的用途に利用可能にする。さらに、リポソーム（開示したように調製物の希釈により形成したもの）の水性コンパートメント中への水溶性活性化合物の捕捉は、リポソーム形成時の封入容量／全体容量の関数である。リポソーム形成が最終的なリポソーム濃度（一般には１０〜２５mMの範囲内である）よりも高い濃度、例えば、約１００mMの濃度で生じる場合には、結果として得られるリポソームの捕捉率は、低濃度で直接にリポソームを形成する場合に達成可能なよりも高い（例えば、脂質フィルム成分含有の水相で脂質を戻すことにより、図３参照）。
【００２０】
まとめると、本発明の調製物は以下の利点を有する：
−  直接的な製剤学的用途に適切である
−  活性化合物を負荷するために適切である
−  高い捕捉率と狭い粒度分布を有するリポソームの製造に適切である。
【００２１】
本発明は、その製法により更に明確に特徴づけられる。水中の脂質分散液は、多くの種々の相中に、凝集状態で存在し、これは熱力学的に安定であるか、または準安定性である（D.F. Evans, H. Wennerstroem: The Colloidal Domain: Where Physics Chemistry, Biology and Technology Meet, VHC publishers, Weinheim, 1994）。従って、種々の製法を選択することにより、結果として生じる相中で種々のタイプの分子構成が得られる。相状態が熱力学的に最も好ましくない場合でも、長期間にわたって、特に適用前の製造と貯蔵にとって十分な貯蔵安定性を提供できるほど長く安定である。もう一方で、準安定な相は、系に適切な圧力を用いることにより安定な形に変換することができる。
【００２２】
一例として、分子組成物にて本発明の調製物を得るための１つの方法があり、このために別の方法を使用することにより、従来のリポソームが得られる：水中のDOTAPの２５mM分散液は、例えば、これが周知のフィルム法または、エタノール注入により製造される場合には、従来のリポソーム分散液として製造することができる。しかし、同じ分子組成物を用いて、下記の“単相蒸発技法”により分散液を製造する場合には、本発明の調製物が得られる。遷移のような高エネルギーバリアにより、熱力学的にあまり好ましくない状態は、より好ましい状態へ変換することが妨げられる。リポソームを形成または分解するために（これは好ましい熱力学的状態である）、脂質二重膜を壊さなくてはならず、そのために著しい量のエネルギーが必要である。
【００２３】
一般には、本発明の調製物は、例えば、両親媒性物質が可溶化される水と有機溶剤を混合することにより幾つかの方法により得ることができる。有機溶剤を除去することにより、本発明の調製物が形成される。しかし、化学、物理または機械的方法により、粒子不含の水中の脂質分散液を得ることができる当業者に周知のその他のどの技術も、本発明の調製物を製造するために適切である。他方で、二重膜の破裂と、それに引き続く閉じた小胞への再融合（refusion）が関わる全ての方法、すなわち、周知のフィルム法やエタノール注入法のようなリポソーム製造に一般に適用される方法は、あまり好ましくない。それというのも、これらの方法は、調製物中で安定または準安定性のままである小胞の形成につながるからである。よって、WO96/05808に記載されているようなマルチラメラ小胞への脂質フィルムの再構成は、本発明の調製物を得るためには避けるべきである。
【００２４】
本発明の調製物は、正の実効電荷を有する脂質、リゾ脂質またはペグ化脂質から選択されるカチオン性両親媒性物質を有する。脂質は、幾つかの、例えば、必ずしも同じでなくてよく、C１２〜C２４個の平均鎖長を有する、分枝または非分枝、飽和または不飽和の２個の炭化水素鎖を有していてもよい。少なくとも１個の第３アミノまたは第４アンモニウム基を有するカチオン脂質が有利である。
【００２５】
本発明の有利な脂質には、次のものが含まれる：
DDAB、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；N−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（DOTAP）；１，２−ジアシルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン、（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルが含まれる；また２個の異なるアシル鎖はグリセロール主鎖に結合することができる）；N−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N−ジメチルアミン（DODAP）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルが含まれる；２個の異なるアシル鎖はグリセロール主鎖に結合することができる）；N−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル、ジミリスチル、ジラウリル、ジパルミチルおよびジステアリルが含まれる；２個の異なるアルキル鎖はグリセロール主鎖に結合することができる）；
ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）；３β−［N−（N', N'−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）；２，３−ジオレオイルオキシ−N−（２−（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−N,N−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）；β−アラニルコレステロール；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）；diC14−アミジン；N−tert−ブチル−N'−テトラデシル−３−テトラデシルアミノプロピオンアミジン；１４Dea２；N−（アルファ−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−D−グルタメートクロリド（TMAG）；O,O'−ジテトラデカノイル−N−（トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（DOSPER）；N,N,N',N'−テトラメチル−N,N'−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨージド；Solodin et al. (1995) Biochem. 43:13537-13544に記載されているような１−［２−（アシルオキシ）エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば、１−［２−（９（Z）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Z）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド）（DOTIM）、１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（DPTIM）、例えば、Felgner et al.[Felgner et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550−2561]に記載されているような、第四アミンにヒドロキシアルキル部分を有している２，３−ジアルキルオキシプロピル第四アンモニウム化合物誘導体、例えば１，２−ジオレイル−３−ジメチルーヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORI）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（DORIE-HP）、１，２−ジパルミチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（DORIE-HB）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシペンチルアンモニウムブロミド（DORIE-Hpe）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、１，２−ジパルミトイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DPRIE）、１，２−ジステリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DSRIE）；Santanielloら.により報告されているアシルカルニチンのカチオンエステル[US5498633]；ホスファチジルコリンのカチオントリエステル、すなわち、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−エチルホスホコリン、その際、炭化水素鎖はC１２〜C２４の鎖長を有する飽和または不飽和であり、かつ分枝または非分枝であり、２個のアシル鎖は必ずしも同一でなくてもよい。
【００２６】
有利な実施態様では、カチオン性両親媒性物質はN−［１−（２，３−ジアシルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムのような第四アンモニウム塩から選択され、その際、第四アミノ化合物の製剤学的に認容性の対イオンは、クロリド、ブロミド、フルオリド、ヨージド、ニトレート、スルフェート、メチルスルフェート、ホスフェート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、グルタメートまたはラクテートから成るグループから選択される。好ましくは、カチオン脂質は室温で液晶状態である。例として、種々の鎖により、炭化水素鎖が１個以上の二重結合を含有する脂質、炭化水素鎖が分枝である脂質、またはその他のパッキング不適合がある脂質がある。さらに、多くの場合にはC１４よりも短い鎖を有する脂質が要求を満たす。
【００２７】
本発明の調製物は、全体の両親媒性物質の濃度に対して、０〜約６０mol%、有利に約２０mol%〜約５０mol%、最も有利に約３０mol%〜約４０mol%の量で、少なくとも１つの更なる両親媒性物質を有することができる。
【００２８】
更なる両親媒性物質は、負および／または中性（アニオンおよび／または中性の両親媒性物質）の実効電荷を有していてよい。これらは、負または中性の実効電荷を有するコレステロール、リン脂質、リゾ脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質またはペグ化脂質のようなステロールまたは脂質から選択することができる。それに関して、有効なアニオンおよび中性脂質には、次のものが含まれる：ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特定の糖に限定されるわけではない）、脂肪酸、カルボン酸基を含有するステロール、コレステロール、１，２−ジアシル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル（DOPE）、１，２−ジアシル−グリセロ−３−ホスホコリンおよびスフィンゴミエリンが含まれる。グリセロール主鎖に結合する脂肪酸は、特定の長さまたは二重結合の数に限定されない。リン脂質は、２個の異なる脂肪酸を有することもできる。好ましくは、更なる脂質は室温で液晶状態であり、これらは適用される割合で、使用されるカチオン性両親媒性物質と混合可能である（すなわち、均一な相が形成でき、相分離またはドメイン形成が生じない）。
【００２９】
有利な実施態様では、中性の両親媒性物質はホスファチジルコリンである。
【００３０】
調製物は、さらに、安定剤を有することができ、これは、例えば、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース、デキストラン、マンニトールまたはソルビトールのような糖または多価アルコールもしくはこれらの組合せから選択される。有利な実施態様では、安定剤はトレハロースまたはグルコースである。
【００３１】
調製物は、さらに有機溶剤、特に水溶性の有機溶剤、例えば、エタノールを約５％（v/v）までの量で有することができる。エタノールの代わりに、他のアルコールまたは有機溶剤を同様に使用することができる。製剤学的組成物を製造するために、エタノールではない有機溶剤を除去する必要がある。適切な有機溶剤は、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、エーテル、例えば、テトラヒドロフランまたはジエチルエーテル、またはハロゲン化炭化水素、例えば、クロロホルムまたはこれらの溶剤の混合物である。
【００３２】
特記されない限り、本明細書中で使用される技術用語と科学的用語は、本発明に関わる通常の当業者により一般に解釈されるものと同じ意味を有すると考えられる。
【００３３】
量の値に関する“約”とは、表示された値に対して、最大＋／−２０％、有利に＋／−１０％の平均偏差を意味する。例えば、約３０mol％のカチオン脂質の量とは、全体の脂質／両親媒性物質のモル濃度に関して、３０mol％＋／−６mol％、有利に３０mol％＋／−３mol％のカチオン脂質を意味する。
【００３４】
“両親媒性物質”とは、水溶性（親水性）と油溶性（疎水性）部分から成る分子を意味する。脂質とリン脂質は、両親媒性物質の最も一般的で代表的な物である。本明細書中では、脂質と両親媒性物質は同義語である。
【００３５】
“血管新生に関する症状”とは、例えば、種々のタイプの癌、慢性炎症疾患、リウマチ様関節炎、皮膚炎、乾癬、創傷およびその他を意味する。
【００３６】
“カンプトテシン”は、２０（S）−カンプトテシン（1H−ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン−3,14(4H,12H)−ジオン、４−エチル−４−ヒドロキシ−,（Ｓ）−）、CAS7689-03-4を意味する。本発明の範囲内の“カンプトテシン”または“カンプトテシン薬”は、薬物のカルボキシレート形を含む。
【００３７】
“カンプトテシン薬”は、カンプトテシン自体またはそれらの誘導体を意味する。カンプトテシン誘導体は、カンプトテシンの化学的誘導化によって得られる（構造参照）。可能性のあるカンプトテシン薬の非限定的リストは、2002年の8月19日からhttp://dtp.nci.nih.govに挙げられている。分子図のうち、最も頻繁な誘導化部位はＲ１〜Ｒ５として記載されている。
【００３８】
カンプトテシン薬の構造：
【００３９】
【化１】
2006508912.tif 000002
【００４０】
以下の表には、種々の部位での誘導化の一般例が記載されている。カンプトテシンは、塩酸塩として存在していてもよい。ラクトン環（E環）は、６員環の代わりに７員環であってもよい（ホモカンプトテシン）。
【００４１】
【表１】
2006508912.tif 000003
【００４２】
誘導化は、ＣＰＴの特性に影響し、分子をより親水性または親油性にすることができ、またはラクトンカルボキシレートの平衡に影響することができる。CPTを抗癌剤として適用することに関して、誘導化には活性を保持または増大する意図がある。
【００４３】
“癌”とは、癌のより一般的な形、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭部癌、頚部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌および小児癌、例えば、脳幹グリオーム、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣細胞腫、ユーイング肉腫／腫瘍ファミリー、胚細胞腫瘍、頭蓋外疾患、ホジキン疾患、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性癌、肝臓癌、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨の骨肉腫／悪性繊維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、テント上原始神経外胚芽腫瘍および松果体部腫瘍、異常小児癌、視覚路および視床下部グリオーム、ウィルムス腫瘍およびその他の小児腎臓腫瘍ならびに急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、脳腫瘍、子宮頚癌、小児癌、小児肉腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、ヘアリー・セル白血病、腎癌、肝臓癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、すい臓癌、原発性中枢神経系白血病、皮膚癌、小細胞肺癌を含む一般的ではない癌を意味する。
【００４４】
“キャリヤー”とは、診断薬または治療薬と投与するために適切である希釈剤、補助剤、付形剤またはベヒクルを意味する。この用語は、複合体を含む製剤学的に認容性の成分も意味し、さらには薬剤と会合して意図する標的部位に、このような薬剤の輸送を促進する。キャリヤーには、当業者に周知のようなリポソーム、ポリマー、脂質複合体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリンおよびデキストラン、キレートならびに他の超分子集成体が含まれる。
【００４５】
“カチオン”とは、各環境下で生理学的ｐHで正の実効電荷または正のゼータ電位を有する薬剤を意味する。本発明では、これはｐHが３〜９、有利に５〜８の範囲内である環境を意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される“カチオン性両親媒性物質”とは、定義付けしたようなカチオン脂質を意味する。
【００４７】
“カチオンリポソーム”とは、正の実効電荷を有するリポソームを意味する。本発明では、これはｐＨが３〜９、有利に５〜８の間である環境を意味する。カチオンリポソームは、カチオン脂質または両親媒性物質自体から製造されるか、または他の両親媒性物質との、特に中性もしくはアニオン性脂質との混合物の形である。
【００４８】
“誘導体”とは、その一般的な構造特性を保持しながら、ある他の化合物から誘導される化合物を意味する。誘導体は、例えば化学的官能化または誘導化により得ることもできる。
【００４９】
本明細書中で使用される“薬物”とは、製剤学的に認容性の薬理学的活性物質、生理学的活性物質および／または診断用途用の物質を意味する。
【００５０】
“封入効率”とは、所定の方法により、リポソーム懸濁液のリポソームへ封入される化合物のフラクションを意味する。
【００５１】
“ホモジナイゼーション”とは、幾つかの成分の間で均一な分布を達成する物理的プロセスを意味する。一例は、高圧ホモジナイゼーションである。
【００５２】
“脂質”は、その通常の意味で、脂肪、脂質、原形質のアルコール−エーテル溶解性成分を包含する一般用語として使用され、これらは水に不溶である。脂質は、脂肪酸、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホリピド、アミノリピド、色素類脂肪のような両親媒性分子である。この用語は、天然に存在する脂質と合成脂質の両方を含む。より一般的な意味で、脂質は、両親媒性物質として特徴づけられる。すなわち、これらは親油性ならびに親水性部分から成る分子である。本発明と関連する有利な脂質は、少なくとも１２個の炭素鎖を有する少なくとも２個のアルキル鎖を有し、次のものである：ステロイドとステロール、特にコレステロール、ホスファチジルおよびホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、およびスフィンゴミエリンを含むリン脂質。脂肪酸は、６個までの二重結合を含有する約１２〜２４個の炭素鎖の長さであり、主鎖に結合していることができる。炭化水素鎖は、異なっている（非対称）か、または１個だけの脂肪酸鎖、例えば、リゾレシチンが存在していてもよい。特に非カチオン脂質が天然源、例えば、卵黄、ウシの心臓、脳もしくは肝臓または大豆から精製されるレシチン（ホスファチジルコリン）から由来する場合には、混合調製物も可能である。
【００５３】
“リポソーム”は、研究室で人工的に作られた顕微的球状の膜に封入された小胞（約５０〜２０００nmの直径）を意味する。“リポソーム”という用語には、脂質二分子層により封入されたいずれかのコンパートメントも含まれる。リポソームは、脂質小胞ともいわれる。
【００５４】
“リゾ脂質”とは、１個の脂肪酸エステルが切断されて１個の遊離ヒドロキシ基を有するグリセロー主鎖を生じる脂質を意味する。
【００５５】
“リゾリン脂質”とは、１個の脂肪酸エステルが切断されて１個の遊離ヒドロキシ基を有するグリセロール主鎖を生じるリン脂質を意味する。
【００５６】
“負に帯電した脂質”とは、負の実効電荷を有する脂質を意味する。本発明では、これはｐHが３〜９、有利に５〜８の範囲内である環境を意味する。例としては、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特定の糖に限定されることはない）、脂肪酸、ステロールがある。
【００５７】
“中性脂質”とは、中性の実効電荷を有する脂質、例えば、コレステロール、１，２−ジアシル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、次のものに限定されるわけではないが、ジオレオイル（DOPE）、１，２−ジアシル−グリセロー３−ホスホコリン、スフィンゴミエリンを意味する。本発明では、これはｐHが３〜９、有利に５〜８の範囲内である環境を意味する。
【００５８】
本明細書中で使用されているような“非小胞性カチオン性調製物”とは、水性環境中に少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質を有する組成物を意味する。さらにアニオンまたは中性の両親媒性物質が存在する場合は、両親媒性物質の全体の実効電荷は正である。
【００５９】
“粒子直径”とは、粒子のサイズを意味する。実験により粒子直径を測定するために、Malvern Zetasizer 1000または3000（Malvern, Herrenberg,ドイツ）を用いて、動的光散乱（DLS）測定を行った。定量的データ分析のために、Ｚ（平均）とPｌの測定を行うか、または付加的に“Contin”フォルマリズムを用いてデータ分析を行った。
【００６０】
“ペグ化脂質”とは、１個以上のポリエチレングリコール残基を有する脂質を意味する。
【００６１】
“製剤学的組成物”は、どちらか一方の成分が有するよりも優れた製剤学的特性を有する２種以上の異なる材料の組合せを意味する。
【００６２】
“リン脂質”とは、グリセロール主鎖、ホスフェート基と、前記グリセロール主鎖にエステル結合により結合した１個以上の脂肪酸から成る脂質を意味する。
【００６３】
“正に帯電した脂質”とは、カチオン脂質と同義語である（定義に関しては、“カチオン脂質”の定義参照）。本発明では、これはpＨが３〜９、有利に５〜８の範囲内である環境を意味する。
【００６４】
本明細書中で使用される“安定剤”とは、水溶性であり、本発明の調製物の安定性に好ましい化合物を意味する。
【００６５】
“ステロール”とは、ステロイドアルコールを意味する。ステロイドは、シプロペンタノペルヒドロフェナントレンと呼ばれる化合物から誘導される。ステロールの周知の例には、コレステロール、ラノステロールおよびフィトステロールが含まれる。
【００６６】
“治療薬”とは、癌のような疾患の病理の程度を減少させる化学種を意味する。このような化合物は、例えば、原発腫瘍成長、有利には癌の転移の可能性を減少させることができる。二者択一的に、このような化合物は、例えば、微細血管のサイズまたは数を減らすことによるか、または血管密度の割合を減少させることにより腫瘍の血管分布を減少させることができる。
【００６７】
化学種を“実質的に不含”とは、HPTLCにより検出不可能であるものと定義される。“リポソームを実質的に不含”とは、光散乱のような所定の方法からのシグナル（リポソーム濃度に比例する）が、同じ分子組成物を有するが、リポソームから成る系で得られるような値の５％未満である状態を意味する。
【００６８】
本発明の調製物は、少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質、場合により少なくとも１つの更なる両親媒性物質、場合により安定剤ならびに場合により活性化合物を有する、実質的に均一な相である。よって、活性化合物は、親水性、親油性または両親媒性化合物であるか、または化合物の混合物であることができ、有利には治療薬または診断薬から選択することができる。
【００６９】
好ましくは、治療薬は、全体の両親媒性物質濃度に対して、約０．１mol%〜約２０mol%の範囲内、有利に約１mol%〜約１５mol%の範囲内、より有利に約３mol%〜約１０mol%の範囲内で存在する。
【００７０】
治療学的活性剤は、抗炎症剤、抗癌剤、酵素薬、抗生物質、抗酸化剤、ホルモン剤、血管形成阻害剤、平滑筋細胞増殖／遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、化学伝達物質用放出阻害剤、血管内皮用の増殖／遊走阻害剤のような薬剤から選択することができる。特殊な例は、タキサン、微小管と相互作用する他の薬剤、例えば、エポチロン、ディスコデルモライド、ラウリマライド、イソラウリマライド、エレウテロビン、コルキシンならびにこれらの誘導体、ビンカアルカロイド、例えば、ビノレルビン、白金錯体、例えば、オキサリプラチン、カンプトテシン、アントラサイクリン、例えばドキソルビシンまたはスタチン（例えば、ロバスタチン）から選択される。
【００７１】
より好ましくは、本発明の調製物は、カンプトテシン、カンプトテシン薬またはこれらの誘導体を全体の両親媒性物質濃度に対して、約０．１mol%〜約２０mol%の範囲内、有利に約１mol%〜約１５mol%の範囲内、より有利には約３mol%〜約１０mol%の範囲内で有する。
【００７２】
さらなる実施態様において、活性化合物は、イメージング剤のような診断薬、例えば、磁気共鳴イメージング剤（ガドリニウム錯体、例えば、Magnevist, Omniscanおよびその他）、Ｘ線造影剤およびコンピュータ断層撮影造影剤（多量の電子を有する重元素を有する化合物、例えば、ヨード、バリウム、ジスプロシウムおよびその他；例として、イオン化安息香酸誘導体のイオン化および非イオン化誘導体、例えば、イオパミドール、イオジキサノール、硫酸バリウムおよびその他が含まれる）ならびにその他の造影理学療法  で使用されるその他の薬剤（超音波、蛍光、近赤外およびその他）から選択される。
【００７３】
好ましくは、イメージング剤のような診断薬は、全体の両親媒性濃度に対して、約０．１mol%〜約５０mol%の範囲内、有利に約１０mol%〜約５０mol%の範囲内、より有利には約３０mol%〜約５０mol%の範囲内で存在する。
【００７４】
上記に開示したように、意外にも水溶液で希釈した後にも、本発明の調製物からリポソームの懸濁液が得られる。このように、本発明のもう１つの面は、非小胞性調製物から得られるカチオンリポソーム懸濁液に関する。
【００７５】
意外にも、このように形成されたリポソームは、厳密な粒度分布に特徴づけられる。例えば、約２８０mM DOTAPと２．５mM CPTを有する調製物の希釈後に、準弾性光散乱によるサイズ測定値は、７０nmのZ平均と０．４のPｌを示す。図４には、分析的超遠心測定値からの結果が示されている。極めて狭い粒度分布が得られた。
【００７６】
有利な実施態様では、本発明のカチオンリポソーム懸濁液は、約５０nm〜約１０００nmの範囲内の粒度分布のリポソームを有し、さらに有利な実施態様では、約５０nm〜約５００nm、好ましくは約５０nm〜約３００nmの粒度分布を有するリポソームを有する。明確な粒度分布を有する小さなリポソームサイズは、懸濁液を特にダイレクトな製剤学的投与に適切なものにする。
【００７７】
さらに、リポソーム懸濁液は、最新の方法で得られるようなリポソームにより負荷された化合物を多量に有することができる。すなわち、リポソームを化合物で“オーバーロード（over load）”する。リポソームは、希釈により本発明の調製物から製造される。理論的に入手可能な最大の増量は、簡単な計算に基づいて算定することができる：調製物が１００mMの全体の両親媒性物質濃度で形成される場合には、最終的なリポソーム濃度は１０mMであり、遊離活性化合物のフラクションは、脂質フィルム法またはエタノール注入法のような従来の技術により製造されるリポソーム調製物と比較して約１０倍少ない。
【００７８】
本発明は、製剤学的用途に適切である。従って、本発明は、上記で開示したような本発明の調製物またはカチオンリポソーム懸濁液を、場合により製剤学的に認容性のキャリヤー、希釈剤および／または補助剤と一緒に有する、製剤学的組成物を提供する。
【００７９】
単に水溶性活性剤が希釈の時点で存在する場合には、あたかもリポソームが従来技術により形成されているかのように、高い割合まで活性化合物がリポソームの水性コンパートメント中に封入される。水溶性化合物が膜二重層中に入り込むことができる場合には、希釈後の膜中でのその捕捉率は、同じ濃度でのその平衡状態よりも高くなるであろう。意外にも、膜からフリーな水相中への、このような化合物の放出は、薬理学的投与が可能であるほどゆっくり生じることができる。よって、上記の血管性ターゲッティング効果は、従来技術で開示されたリポソーム調製物よりも高い効率で達成できる。
【００８０】
多くのリポソーム調製物において、親水性化合物は一定の時間間隔でリポソームから放出される。これは、特に化合物の膜透過性が高い場合である。多くの場合に、放出が速すぎて製造できず、投与前に十分な貯蔵安定性で貯蔵することができない。リポソーム懸濁液、またはこれから得られる製剤学的組成物を使用の直前に提供できることは、本発明の利点である。既に活性化合物を有する本発明の調製物が濃縮状態で貯蔵される場合には、極めて低いフラクションだけがフリーな水相へ放出される。それというのも、水相の相対量が小さいからである。十分な貯蔵安定性を有さないとしても、本発明の調製物と活性化合物は別々に貯蔵することができ、使用の直前に混合および希釈することができる。このように、一般に極めて短い寿命を有する調製物を製剤学的用途に使用することができる。例えば、数日もしくは数時間という時間のスケールで封入された水溶性化合物がリポソームから放出される場合には、適用前に貯蔵することができる。このような調製物が従来の方法により、使用直前に製造されたとしても、未封入のフラクションを時間のかかる方法で除去しなくてはならない。本発明のアプローチでは、化合物と、濃縮された非小胞性調製物を混合し、場合により滅菌濾過し、製剤学的適用の直前に、高い封入率でリポソーム懸濁液に戻し、このリポソーム懸濁液を希釈の直後に使用することができる。よって、短い寿命を有する負荷リポソーム懸濁液であっても通常のベースに基づいて適用することができる。
【００８１】
従って、本発明の他の面は、本発明の調製物と、開示したような活性化合物の水溶液を有するキットに関する。
【００８２】
カンプトテシンカルボキシレートは、水溶性であるが、カチオン脂質との有効な相互作用によりカチオン脂質膜中に挿入することができる化合物である。リポソームフラクションを最大化するために、脂質濃度を最大化するのが望ましい。しかし、実際の適用では、高すぎるリポソーム濃度は、例えば高い粘度ゆえに欠点である。
【００８３】
カチオン性両親媒性物質、有利には脂質とカンプトテシンを有する濃縮された非小胞性調製物を使用することにより、リポソームを形成することができ、その際、希釈直後にリポソームフラクションは濃縮状態に相当する。すなわち、これは一時的に希釈後に平衡状態よりも高くなる。平衡は、ほんの数時間後に達成できるため、リポソームを本発明の非小胞性調製物から製造し、希釈直後に適用する場合には、これらはリポソーム性カンプトテシンの高いフラクションを有し、よって平衡状態のリポソームよりも高い効率を有することになるであろう。
【００８４】
説明として、図４では本発明の調製物から得られるリポソーム懸濁液と、エタノール注入法と押出しにより製造される従来のリポソーム懸濁液が比較されている。両方のリポソーム懸濁液は、２２．５mM DOTAPと２．５mMカンプトテシンを有する。本発明の調製物を使用して、４５０mM DOTAPと５０mM カンプトテシンを有する非小胞相を希釈して、２２．５mM DOTAPの濃度にした。次に、両方の懸濁液１０ｍｌを１：１０に希釈し、得られた１００ｍｌから遊離カンプトテシンをクロスフロー濾過により除去した。濾過の過程で、分子的に溶解された全ての化合物を有する水相が膜を通ることができる。濾液は５ｍｌの容量で分取し、遊離CPTの量をUV-vis分光分析法により測定した。図４では、濾液の吸収は、希釈直後に本発明の調製物から得られたリポソームと、２日後の同じものに関して記載されており、通常のリポソーム懸濁液の結果と比較している。このことから分かるように、希釈直後に遊離CPTのフラクションは、２日後よりも約２倍低い。２日後の遊離カンプトテシンの値は、従来の方法で製造されたリポソームよりも僅かに低かった。このことは平衡がまだ達成されていないことを示している。一般的には、DOTAP／カンプトテシン系では、平衡は数時間後に達成される。
【００８５】
本発明の非小胞性調製物は、実験の説明で概説されているような種々の方法により製造することができる。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は開示したようなカチオン性両親媒性物質を有する非小胞性調製物の製法に関する。概説したように、調製物の形式は、本発明の調製物を得るために重要である。１つの同じ分子組成物でも、いくつかの準安定性の相と凝集状態を生じることができる。これらの状態は、熱力学的に準安定性であるにもかかわらず、これらは一定の時間スケールで安定であり、製剤学的用途にとって十分な貯蔵安定性で製造し、貯蔵される。外部応力（成分を添加することにより可能である）、pHの変化、機械応力、加熱または他の環境条件を用いることにより、１つの相を熱力学的により好ましい別の相に変換することができる。他方で、一定の準安定性相で系を保持するために、このような応力を回避するのが好ましい。
【００８７】
これに限定されるわけではないが、好ましくは低い脂質濃度（＜１００mM）で本発明の調製物を製造するために、例えば、エタノールと水の混合物のような均一な脂質溶液の状態を通るのが好ましい。このような調製物は、例えば、エタノール性脂質溶液（約１mM〜約１００mM未満）と水または場合により他の成分を含有する水溶液と簡単に混合することにより得ることができる。エタノールと場合により水は、引き続き蒸発により除去することができ、水相中でクリアな脂質の分散液が得られる（“単相蒸発法”）。過剰の水が調製物中に残されている限り、蒸発は初期値に対して、どのような値まででも生じることができる。
【００８８】
より詳しくは、カチオン性脂質濃度、有利にはエタノール中のDOTAPの濃度は、約０．５mM〜５０mM、より有利には約１mM〜約２５mMであることができる。エタノール対水の割合は、約１：２０〜約２０：１、有利には約１：１０〜約１０：１、より有利には約１：５〜約５：１の範囲であることができる。最終的な濃度は、過剰の水がない膨潤脂質二分子層を下回る濃度、有利には約１００mM〜約６００mM、より有利には約２００mM〜約４００mMであることができる。
【００８９】
脂質の代わりに、定義したような両親媒性物質を使用してもよく、エタノールの代わりに、水中で混合可能な適切な有機溶剤、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、テトラヒドロフラン、クロロホルムまたはジエチルエーテルもしくはこれらの混合物を使用してもよい。
【００９０】
この方法では、リポソームが形成されない。リポソーム懸濁液が熱力学的により好ましいにもかかわらず、究極のリポソームの形成は回避される。それというのも、十分な機械的、熱的または他の応力を用いないと、閉じた二分子層小胞を形成するエネルギーバリアが高すぎるからである。
【００９１】
ところが、標準的なリポソーム調製法では、十分なエネルギーを提供して、二分子膜を破断し、閉じた小胞を形成するために、機械応力、化学応力または他の応力を系に適用する工程がある。例えば、フィルム法では、これは膨潤脂質二分子層の薄層フィルムを水で振とうすることにより、かつエタノール注入法において、迅速に水中の高濃縮エタノール溶液を希釈することにより行われる。
【００９２】
本発明の調製物を特に高濃度（＞１００mM）で形成するための他の可能性は、高圧ホモジナイゼーションである。乾いた両親媒性物質、有利には脂質と水相を更に処理せずにホモジナイザーに加える。WO99/49716とWO96/05808に開示されているように、特に多重ラメラリポソーム懸濁液の工程を通る必要はなく、望ましくない。よって、リポソームの形成を避けるために、はじめにあらゆる種類の応力を回避する必要がある。
【００９３】
本発明のもう１つの対象は、少なくとも１つのカチオン性両親媒性物質を有する非小胞性調製物を製造する方法であり、前記方法は次の：
（ａ）カチオン性両親媒性物質、場合によりもう１つの両親媒性物質、場合により安定剤、場合により活性化合物および水相を用意し、
（ｂ）工程（ａ）の成分に、等方性で透明で、実質的に均一な調製物が形成されるような条件を課す
工程からなる。
【００９４】
工程（ｂ）は、“単相蒸発”または高圧ホモジナイゼーション法を含んでもよい。
【００９５】
好ましくは、有機溶剤中の両親媒性物質の溶液を水相と混合し、続いて有機溶剤と場合により水を除去して、所望の最終濃度にすることにより非小胞性調製物が製造される（図１）。このように、膨潤脂質二分子層の限界までの濃度で、すなわち、脂質のヘッド基に結合する水以外の付加的な水が存在しない場合に本発明の調製物が得られる。
【００９６】
しかし、均一な粒子不含の状態を形成するために適切な他の技法も本発明の調製物を製造するために使用でき、これらは例えば、以下に記載されている（D.F. Evans, H.Wennerstroem: The Colloidal Domain: Where Physics Chemistry, Biology and Technology Meet, VHC publishers, Weinheim, 1994）。
【００９７】
上記に開示したように、本発明の調製物はさらに活性化合物を有していてもよい。有利には、活性化合物が親水性である場合に、本発明の調製物を製造するための両親媒性物質と簡単に混合することができ、また活性化合物が水溶性である場合には水相中にあることができる。二者択一的に、活性化合物を既に形成された調製物中に添加することができる。水中に溶解した活性化合物を既に形成された本発明の調製物中に添加する場合には、全体の相を介して自由に分布していてもよい。親水性化合物を乾燥した形で添加してもよく、さらに脂質相中での均一な分布のために、高圧ホモジナイゼーションサイクルを利用してもよい。
【００９８】
本発明の調製物が定義付けられた閉じた小胞中で作成されないので、添加化合物の均一な分布が大きく促進される。各々の添加化合物は、全体の相中で均一に分布することができ、希釈後に活性化合物が最終的にはリポソーム膜中に封入されるか、または挿入される。従って、リポソーム中に負荷される活性化合物のフラクションは、上記に概説したような通常のリポソーム形成技術によって、あたかも調製物が低い脂質濃度で直に製造されたかのように高い。従って、活性化合物を有するリポソーム調製物を製造でき、その際、水溶性活性化合物のリポソーム封入フラクションは、平衡状態に比例して増大する。
【００９９】
カチオン脂質と活性化合物を有する本発明の調製物は、さらに希釈することなく、すぐに使用できる製剤学的調製物として使用できる。高濃度までのその低い粘度は、滅菌濾過を可能にするか、または１００nmもしくは２００nmのような定義付けられた孔径を有する膜を介する押出しを可能にする。これはin vivoでの適用にとって前提条件である。
【０１００】
上記に開示したように、本発明は医薬品または診断調製物の製造に適切である。従って、本発明のもう１つの対象は、開示したような調製物、懸濁液または製剤学的組成物を医薬品または診断調製物の製造、特に血管新生に関連する疾患のような血管新生に有効な医薬品または診断調製物の製造に使用できることである。
【０１０１】
血管新生と関連する疾患は血液供給に依存している。血管系の局所的阻害は多大な細胞死を引き起こす。血管内皮は血管と直接に接触している。種々の疾患が前記の方法と組成物で予防かつ治療できると考えられている。有利な実施態様では、本発明により提供されるような調製物、リポソーム懸濁液または製剤学的組成物は、癌、種々の炎症疾患、糖尿病性網膜症、リウマチ様動脈炎、炎症、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍、筋肉退化、血行性腫瘍および充実性腫瘍のような疾患の予防および／または治療に有効である。さらに有利な実施態様では、本発明の調製物と組成物は、膀胱、脳、乳、頚部、直腸結腸、子宮内膜、頭および首、または腎臓癌、白血病、肝臓または肺癌、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、子宮癌、すい臓癌または前立腺癌のような充実性腫瘍およびそれらの転移を予防および／または治療するための医薬品を製造するために利用できる。
【０１０２】
本発明の調製物は、注射（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内）による希釈の直後または移植の後に適用してもよい。これを血管腔に置くか、または局所的に粘膜上、角膜、または皮膚の部分に適用することもできる。このように調製物は活性化合物のキャリヤーとして役立ち、活性化合物の変性またはコントロールされた放出にとって重要である。この懸濁液を注射（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内）により、または移植により直に適用してもよい。リポソームの封入は、リポソームにより運ばれる活性化合物を体内で分布させることにつながり、この分布は標的部位（活性化された内皮細胞）で活性化合物が長続きする濃度に選択的に影響する。よって、効果の改善または効果と副作用の割合の改善、または治療もしくは診断指数の改善にも影響する。
図の説明文：
図１  単相溶剤蒸発（single phase solvent evaporation）による本発明の調製物を製造するためのスキーム：（カチオン）両親媒性物質、有利には脂質の希釈溶液および他の成分（場合により活性化合物）を有する溶液を混合し、均一な相を製造する。有機溶剤を、有利にはエタノールと、場合には水溶液の部分を所望の濃度が達成されるまで蒸発する。調製物はクリアで透明な非小胞性相として残った。濃縮調製物を希釈した後にリポソームが形成された。
図２  約２５０mg／g（w/w）の濃度での、水中のDOTAP含有の濃縮調製物。調製物は透明であり、液体のようであった。
図３  種々のリポソーム調製物中の遊離カンプトテシン（CPT）の測定値。４５０mMDOTAP と５０mMCPTの非小胞性調製物を希釈して、２３．５mMDOTAPと２．５mM CPTリポソーム懸濁液にした。リポソームが形成された直後に、懸濁液１０ｍｌをさらに１：１０に希釈し、クロスフロー濾過を行った。濾液の５ｍｌアリコートを取り、UV-vis測定値を前形成して、遊離CPTを測定した。グラフ中、３６９nmでの吸収が示されている。同じ２３．５mM DOTAPリポソーム懸濁液を形成し、系が平衡になったと予想された時に、さらに１０ｍｌを２日後に希釈した。このことから分かるように、この場合に、放出は希釈直後に約２倍であった。比較のために、２３．５mM DOTAPと２．５mM CPTリポソーム懸濁液をエタノール注入により直に製造した。押出しした（２００nm）リポソーム調製物の１０ｍｌを１：１０に希釈し、同様に試験した。このことから分かるように、遊離CPTの値は、２日後に非小胞調製物を希釈した懸濁液と同じ範囲であった。
図４  リポソーム調製物中での粒度分布を測定するための超遠心分離の分析測定値。測定は、２．５mM DOTAPと０．２５mM CPTでそれぞれ行った。上のグラフでは、エタノール注入法と押出し（UF60）により２５mMの全体濃度にした、従来のリポソーム調製物の測定結果が示されている。測定のために、試料を１：１０に希釈した。下のグラフには、１：２００に希釈後に、５００mM（UF62）の全体濃度で非小胞性調製物から得られたようなリポソームの測定結果が示されている。非小胞性調製物を希釈して得られる試料の粒度分布は、むしろ狭く、押出ししたリポソームのうちの１つよりも良好である。
図５  リポソーム懸濁液と本発明の非小胞性調製物の濁度を比較するUV-vis分光分析法による測定値。３０mMDOTAPリポソーム（２００nmで押出し）と２７０mM DOTAPの非小胞性調製物を測定した。リポソーム懸濁液からの吸収は、非小胞性調製物よりもはるかに高かった。但し、後者は、ほとんど１０倍濃縮されている。定量分析（４００nm）は、リポソーム懸濁液のモル吸収（散乱による）が非小胞性調製物のモル吸収よりも５０倍以上高いことを示している。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、実例としてのみあるべきである。他の当業者から明らかであろう。
実施例
例１
Ａ：高濃度での水中のDOTAP非小胞性調製物（single phase evaporation）
DOTAPエタノール性溶液３３ｍｌ（濃度＝６mM）とトレハロース０．５％水溶液１０ｍｌを丸底フラスコ中で混合した。クリアな溶液が得られた。フラスコ中の溶液の重さが６９０mgになるまで溶剤を４０℃、圧力１００mbarで蒸発させた。散乱粒子が存在する兆候がなく、濃縮物はクリアで均一な相であった。調製物の濃度は、約１ｇ／ｍｌであり、得られたDOTAP濃度は約２９０mMであり、得られたトレハロース濃度は約７％であった。
Ｂ．希釈によるリポソーム懸濁液の形成
パートAの濃縮調製物を１０％トレハロース水溶液約７ｍｌで希釈し、約２５mM DOTAPの最終濃度にした。希釈後に、クリアな相がタンパク光のリポソーム懸濁液になった。リポソームの大きさは、準弾性光散乱測定の実験（Zetasizer 300, Malvern, Herrenberg, Germany）により測定した。
例２
２５mM〜４００mMの範囲内の種々の濃度での、DOTAPの非小胞性調製物（単相蒸発）
全ての調製物は、エタノール中のDOTAP（DOTAP-Cl）、濃度＝２５mMの溶液と水中の１０％トレハロース溶液を用いて形成した。濃度＝２５mM、１００mM、２００mM、３００mMおよび４００mM（所望の最終濃度を得るために必要である等量容積）を有するDOTAP調製物を製造するために、表に挙げられているようなトレハロース水溶液と水を混合した。
【０１０４】
約０．５ｍｌの最終容積が得られるまで、この溶液から溶剤を蒸発させた。全ての濃縮物は、透明な相として存在した。
【０１０５】
【表２】
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例３
高濃度（高圧ホモジナイゼーション）での水中のDOTAP非小胞性調製物
DOTAP硫酸メチル８．１３ｇに、水３５ｍｌを添加した。この混合物を高圧ホモジナイザーの圧力室に移した。７５０bar、室温で、懸濁液を１０回ホモジナイズして３００mMの透明なゲル様調製物約４０ｍｌが得られた。
例４
高濃度（高圧ホモジナイゼーション）でのDOTAPと水中のGｄ錯体の非小胞性調製物
高圧ホモジナイザー（Gaulin Micron LAB 40）を試料容積４０ｍｌに保持した。０．５M Gd錯体（Omniscan）の３６ｍｌとDOTAP硫酸メチル４．６５ｇの試料を、圧力室に懸濁させた。ホモジナイゼーション法（室温、７５０bar）を１０回繰り返した結果、個々の材料が得られた。実験は１５０mMと３００mMの２つのDOTAP濃縮物を用いて行った。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
ホモジナイゼーション後、均一な液体調製物が得られ、２００nm孔径を有するポリカーボネート膜を通して押出した。得られた調製物を５％グルコースに対して４回透析し、封入されていない造影剤Omniscanを取り除いた。透析の間、透析管中の溶液の容積は、２．３〜３．４倍に増大した。この増大は、ラベリング効率が確立していることを考慮に入れることができる。この透析の間に３００mM溶液は粘性の非小胞性相に変わった。透析後に封入効率は１５０mM DOTAPについては６．１％であり、３００mM DOTAPについては７．８％であった。
例５
Ａ：非小胞性DOTAP/CPT濃縮調製物：DOTAP500mM、CPT50mM（single phase evaporation）
DOTAP（６mM）のエタノール性溶液を、１％トリス／HCl−緩衝液含有（ｐH７．５）の０．５％トレハロース中のCPT−カルボキシレート（濃度＝２mM）の水溶液に添加した。溶剤を蒸発させ（３０℃および２５mbar）て５００mM DOTAPと５０mMカンプトテシンの全体濃度にした。
【０１０８】
Ｂ：希釈によるDOTAP/CPTリポソーム懸濁液の形成と希釈直後のオーバーローディングの測定
クリアなパートＡの濃縮調製物を希釈して１mM（1:500）の濃度のDOTAPにした。希釈後に、タンパク光リポソーム懸濁液が形成された。
【０１０９】
非リポソーム性の遊離CPTは、５０kDa MWCOの膜を通して“クロスフロー濾過”により測定した。遊離CPTを希釈の直後と２日後に測定した。希釈後に、遊離CPTのフラクションは１０％であり、２日後に２０％であった。２日後の状態が平衡状態であることが考えられる。このことは、遊離CPTのフラクションが希釈直後に２倍減少していることを示している。
例６
予備形成した非小胞性DOTAP濃縮調製物へのCPTの添加
高圧ホモジナイゼーションにより得られた水中のDOTAPの２８０mM非小胞性調製物５ｍｌ（例３参照）に、水中のCPTカルボキシレート１４mM溶液の５ｍｌ溶液を添加した。クリアな、わずかに黄色い相が得られた。
【０１１０】
調製物１ｍｌを１０mMトリス／HCｌ緩衝液（pH 7.5）で希釈して、最終濃度１５mMにした。
例７
非小胞性DOTAP/CP調製物から得られたリポソームのマウスにおける許容性
非小胞性調製物、DOTAP450mM、カンプトテシン２５mMを１０％トレハロース水溶液で戻し、約２５mM（希釈１：２０）のリポソーム懸濁液にした。希釈直後、マウスを５μmol／gの１回注射で処置した。注射は許容可能であり、副作用は何も見られなかった。
例８
ヒトの治療プロトコール
この例は、開示した調製物と懸濁液を用いるヒトの治療プロトコールに関する。治療は、増強した血管新生活性と関連する様々なヒトの症状と疾患を診断および／または治療するために使用される。抗腫瘍治療、例えば、充実性腫瘍および血液学的悪性疾患を患った患者の治療において、または乾癬のような様々な慢性炎症疾患の治療において特に有効であると考えられる。
【０１１１】
本発明の特徴は、異常のある組織を直接に治療することなく、多くのクラスの疾患および／または異常を治療することである。例えば、血管新生を阻害することにより、腫瘍への血液供給を遮断し、その腫瘍は腫瘍細胞を直接に治療することなく、いずれかの方法で死滅する。
【０１１２】
このような脂質・薬物複合体を使用する患者の治療法は、すでに開発されている。このような方法は、本明細書中に記載されている方法を用いて簡単に使用できると予想されている。すでに述べたように、他の治療薬も同時にまたは別の時点で投与できると考えられる。よって、プレミックスされた薬理学的組成物または治療薬の“カクテル”を使用するか、または二者択一的に、別々の容器からの薬物の一定量を使用することもできる。
【０１１３】
患者の治療とモニタリングを含む臨床的試みを行う種々の要素は、本発明の開示に照らし合わせながら当業者にとって明らかであろう。
【０１１４】
規制上の承認を目的に、実験用に選択された患者が、通常の治療の少なくとも１過程に反応することに失敗し、身体検査、実験手法または放射線法により測定されるような客観的に測定可能な疾患を患うことが考えられる。心疾患や腎疾患の経歴も無いと思われるこのような患者は、実験に入る前の少なくとも２週間には化学療法を中止すべきである。
【０１１５】
必要な適用量は、患者の体重と薬用量計画から計算される。適用前に、調製物が凍結乾燥している場合には、調製物を水溶液中で戻すことができる。また、必要な適用量は患者の体重と薬用量計画から計算される。
【０１１６】
開示された調製物は短い注入時間で投与される。いずれかの用量レベルで投与される注射は、それぞれの後に到達する毒性に応じるべきである。よって、グレードIIの毒性が１回注射の後、または一定量注射について特定の期間で達成された場合には、毒性が改善されないのであれば、さらなる投薬を留めておくか、または一定量注射を中止するのがよい。約６０％の患者が、いずれかのカテゴリーで容認できないグレードIIIまたはIVの毒性を示すまで、用量を増加させて患者グループに投与すべきである。この値の２／３である用量は、安全な用量として定義される。
【０１１７】
身体実験、腫瘍測定および実験室試験は、当然ながら治療前と、約３〜４週間の間隔をあけた後に行うべきである。実験室試験は完全血球計算、血清クレアチン、クレアチンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、SGOT、ビリルビン、アルブミンおよび全血清タン白質を含むべきである。
【０１１８】
臨床反応は、実験室の数値で認容できる尺度または変化、例えば、腫瘍マーカーにより定義してもよい。例えば、完全な反応は、測定可能な全ての疾患が少なくとも１ヶ月間消失することにより定義される。それに対して、局所反応は５０％またはそれ以上の減少により定義してもよい。
【０１１９】
本明細書中に開示され、請求されている全ての組成物と方法は、本発明の開示を鑑みて、必要以上の実験を行うことなく製造かつ実施することができる。本発明の組成物と方法を有利な実施態様の点から記載してきたが、本発明のコンセプト、意図および範囲から離れることなく、本明細書に記載されている組成物、方法および工程または方法の工程の順序に対して、バリエーションが適用できることが当業者には明らかである。さらには、化学および生理学的に関連する特定の薬物を、同様または類似した結果が得られる限りにおいて本明細書中に記載されている薬物の代わりに用いることができることも明らかとなるであろう。当業者に明らかなこのような全ての類似した置き換えと変性は従属請求項に定義されているような本発明の意図、範囲およびコンセプトの範囲内であると考えられる。
【０１２０】
用量におけるバリエーションは、治療される対象の症状に応じて必然的に生じるであろう。投与の責任を負う人物は、少なくとも各対象に対して適切な用量を測定するであろう。さらに、ヒトの投与については、調製物がFDA から要求されているような生物学的基準の無菌状態、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たしているべきである。
【０１２１】
投与と用量
本発明は、製剤学的に有効量の本発明の調製物または活性化合物を有しているリポソーム懸濁液を、これを必要とする対象の血管新生の血管標的部位に輸送する方法を包含する。“これを必要とする対象”とは、この場合にホ乳類、例えば、ヒトを意味する。
【０１２２】
投与の経路は、腹膜、非経口または局所適用を含み、調製物は溶液注入剤、薬物放出カプセルなどのような種々の剤形で容易に投与される。
【０１２３】
本発明で使用されている、これを必要とする対象（血管新生を受けている内皮細胞のある循環器系を有するいずれかの動物）に投与される化合物の“薬理学的に有効量”という用語は、広い範囲のファクターに依存して変化する。例えば、小動物よりもヒトには実質的に多い用量を提供する必要があるであろう。化合物の量は、患者の大きさ、年齢、性別、体重および症状ならびに投与された物質の効力に依存する。用量に関して相当の多様性があることを記載してきたが、当業者は本発明の開示を使用して、はじめに極めて少量の用量を投与し、所望の結果が得られるまで徐々に増大させることによって適切な用量を容易に決定することができると考えられる。用量が上記のファクターに基づいて大きく変化するにもかかわらず、周囲の組織を標的とする、例えば、腫瘍細胞自体を標的とするデリバリーシステムと比較して、本発明は事実上少量の物質の投与を可能にする。
【０１２４】
本明細書中に開示されている治療薬の製剤学的に有効量とは、薬物作用の種類とタイプに左右される。ここで述べる例として、ヒトでは約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。パクリタキセル誘導体ならびにカンプトテシンに関しては、通常５ｍｇ／ｋｇのオーダーの用量が適用される。
【０１２５】
本明細書中で開示されているような診断薬の製剤学的に有効量とは、診断薬のタイプに左右される。正確な用量は化合物の分子量、検出されるシグナルのタイプと強度に応じる。例えば、ここで挙げられる例として、（蛍光染料としてのフルオロセイン、MRIマーカーとしてのガドリニウム錯体）、適用される用量は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってよい。最も頻度の高い用量は、約５ｍｇ／ｋｇのオーダーである。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、単相溶剤蒸発による本発明の調製物を製造するためのスキームを表す図である。
【図２】図２は、約２５０mg／g（w/w）の濃度での、水中のDOTAP含有の濃縮調製物を表す図である。
【図３】図３は、種々のリポソーム調製物中の遊離カンプトテシン（CPT）の測定値を表す図である。
【図４】図４は、リポソーム調製物中での粒度分布を測定するための超遠心分離の分析測定値を表す図である。
【図５】図５は、リポソーム懸濁液と本発明の非小胞性調製物の濁度を比較するUV-vis分光分析法による測定値を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【国際調査報告】
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