(57)【要約】本発明は、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓＢＣＧ株に関する。前記核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ活性、グルタミンシンテターゼ活性またはセリンデヒドラターゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
2006508633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニンデヒドロゲナーゼ活性、グルタミンシンテターゼ活性またはＬ−セリンデヒドラターゼ活性を示す少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする発現可能な核酸を含む、生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株。
【請求項２】
アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１から配列番号２）、グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）およびＬ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５から配列番号６）から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする発現可能な核酸、を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株。
【請求項３】
配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３から成る群から選択される少なくとも１つの核酸分子の全部または一部を含む発現可能な核酸、を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株。
【請求項４】
配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３から成る群から選択される少なくとも１つの核酸分子と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む発現可能な核酸、を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株。
【請求項５】
前記核酸分子が改変を受けている請求項３または４の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株。
【請求項６】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｍｏｒｅａｕ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｓｗｅｄｅｎ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒから成る群から選択される請求項１、２、３、４または５の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５または６の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５または６の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含む、マイコバクテリアによる攻撃に対し哺乳類を治療または予防するワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項９】
前記がマイコバクテリアがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである請求項８のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１０】
医薬的に許容できる担体をさらに含む請求項８または９のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１１】
さらにアジュバントを含む請求項８、９または１０のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１２】
１つ以上の他の病源体に由来する免疫原性物質をさらに含む請求項８、９、１０または１２のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１、２、３、４、５または６の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を哺乳類に投与することを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓによる攻撃に対し前記哺乳類を治療または予防する方法。
【請求項１４】
前記哺乳類が牛である請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類がヒトである請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物がアジュバントの存在下で投与される請求項１３の方法。
【請求項１７】
請求項１、２、３、４、５または６の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を哺乳類に投与することを含む、癌に対して前記哺乳類を治療または予防する方法。
【請求項１８】
前記ワクチンまたは免疫原性組成物がアジュバントの存在下で投与される請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記癌が膀胱癌である請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
請求項１、２、３、４、５または６の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含む検査キット。
【請求項２１】
増殖のための唯一の窒素源としてアラニンを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧの増殖を阻害する培地組成物。
【請求項２２】
増殖のための唯一の窒素源としてセリンを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧの増殖を阻害する培地組成物。
【請求項２３】
さらに（ａ）炭素源、（ｂ）鉄、（ｃ）マグネシウムおよび（ｄ）ＳＯ4を含む請求項２１または２２の培地組成物。
【請求項２４】
前記炭素源がグリセロール、デキストロース、クエン酸塩およびグルコースから成る群から選択される請求項２３の培地組成物。
【請求項２５】
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含むサンプルを入手し、さらに（ｂ）前記サンプルを選択的培地で培養することを含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧの増殖を阻害する方法。
【請求項２６】
前記選択的培地が増殖のための唯一の窒素源としてアラニンを含む請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記選択的培地が増殖のための唯一の窒素源としてセリンを含む請求項２５の方法。
【請求項２８】
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのサンプルを入手し、さらに（ｂ）前記サンプルを確認培地で培養することを含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧを培養する方法。
【請求項２９】
前記確認培地がヒスチジンを含む請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は結核のワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、感染性因子、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによってひき起こされる致死的な伝染性疾患である。結核によって毎年２百万人が死亡している。世界保健機構（ＷＨＯ）の２００１年の年次報告では、１９９９年には８．４百万人の新規結核症例が存在すると概算され、１９９７年の８．０百万人から上昇している。現在の傾向が続くならば、２０００年から２０２０年の間にほぼ１０億人が新たに感染し、２億人が発症し、さらに３千５百万人が結核で死亡するであろう。ＨＩＶ／エイズの蔓延および多剤耐性結核の出現はこの疾患の影響を悪化させた。Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓの弱毒株は、結核の予防に現在のところ利用可能な唯一のワクチンである。動物の感染モデルでは、ＢＣＧのワクチン接種はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの攻撃に対し防御免疫を誘導することを示した（Ｂａｌｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ヒトでは、ＢＣＧワクチン接種は結核の小児型（特に髄膜炎）に対して一貫した防御を示した。しかしながらＢＣＧワクチン接種は、成人の肺結核の防御に対するその有効性のばらつきのために矛盾を呈している（Ｆｉｎｅ，  １９８９：  Ｃｏｌｄｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｓｔｅｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。先進国（例えば英国、デンマークおよび北アメリカ）で１９４０年代および１９５０年代に実施された試験では前記ワクチンは有効であることが示された（７０−８０％）。しかしながら、インドで１９７０年代に実施され、２６５，０００人を超える人々を対象とした１つの最大の臨床試験では、ＢＣＧワクチン接種は肺結核に対し検出可能な防御を示さなかった。したがって、ＢＣＧの代替となり結核を予防する改良ワクチンを作製する差し迫った必要性が存在する。
【０００３】
ＢＣＧの防御効能におけるばらつきに対していくつかの説明が提唱されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  ２００１）。もっとも有名な仮説は、周囲環境に存在するマイコバクテリアに暴露されることによってホストは一般的なマイコバクテリアに対して感作され、それによってＢＣＧワクチン接種の潜在的利益を曖昧にさせる異種免疫が提供されるということである（Ｆｉｎｅ，  １９９５；  Ｆｉｎｅ  ＆  Ｖｙｎｎｙｃｋｙ，  １９９８）。さらにまた、最近の研究によって、ＢＣＧの増殖は周囲環境のマイコバクテリアで感作された動物で阻害され、結果としてＢＣＧワクチン接種は一過性免疫反応しか誘導できず、結核に対する感染防御免疫を提供できないことが示された（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。前記実験はまた、結核に対する免疫の誘導にはＢＣＧの増殖性感染が必要であるという長期的観察を支持している。ＢＣＧは生ワクチンである。死菌ＢＣＧは防御を提供しない。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のように、ＢＣＧは、感染ホストで多様な組織に肉芽腫および膿瘍を形成することができる（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。肉芽腫内（栄養物へのアクセスが制限され酸素圧が低い敵対的環境である）で生存し持続することができるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株の能力は、炭水化物、窒素およびエネルギーの利用可能な供給源に対して前記細菌がその代謝能力を適応させる能力に依存しているようである（Ｂａｒｃｌａｙ  ＆  Ｗｈｅｅｌｅｒ，  １９９８）。最近の研究によって、脂肪酸は炭水化物の供給源として機能し、マウスおよび活性化マクロファージ内でのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの生存維持のために必要であることが明らかにされた（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。免疫能力を有する個体へのワクチン接種後、ＢＣＧはホストから排除されるまで一定期間生存し続けることができる（Ｄｕｎｎ  ＆  Ｎｏｒｔｈ，  １９９５；  Ｌａｇｒａｎｄｅｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｍｏｉｓａｎ  ｅｔ    ａｌ．，  ２００１）。
【０００４】
新規で有効な結核ワクチンの開発に重要なことは長期の防御を提供することである（Ｏｒｍｅ，  ２００１；  Ｙｏｕｎｇ，  ２０００）。現在のＢＣＧワクチンは小児の結核の症状に対して防御を付与するが、おそらくＢＣＧによって誘導される防御免疫が徐々に失われるために、その効能は１０から１５年かけて衰える（Ｏｒｍｅ，  ２００１）。改良されたワクチンを開発する新規な方法には弱毒マイコバクテリア、サブユニットワクチンおよびＤＮＡワクチンの使用が含まれる（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  ２００１）。しかしながら、これらの方法はいずれもＢＣＧよりも強力ではなく、または同程度の有効性すらもたないことが確認された。Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株の生存および増殖は防御免疫の誘導に必要である。杆菌の増殖阻害のためのイソニアジドによる感染マウスの早期治療は後天的抵抗性の発達を妨げることが示された。ホスト内で長期間生存し続けるＢＣＧ株が、より有効なワクチンを得るために必要である。したがって、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎの新規なリコンビナント株が希求される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、ＢＣＧ株が有する増殖の窒素源として天然に存在するアミノ酸を使用する能力に対する限定を乗り越えるワクチンを提供する。さらにまた、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンまたはＬ−セリンは、アンモニウムが存在しているときでさえＢＣＧ株の増殖を阻害する。機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）のＢＣＧ株での発現はアラニンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する。同様に、機能的Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）のＢＣＧ株での発現はＬ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する。そのような阻害のメカニズムはグルタミンシンテターゼの阻害から生じる。グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）のＢＣＧでの過剰発現はアラニンおよびＬ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する。機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）および／またはグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）を発現（または過剰発現）するリコンビナントＢＣＧ株はホストの体内でより長期間生存し続けて結果として長期の防御免疫を誘導する。そのような持続的リコンビナントＢＣＧ株は、結核および他のマイコバクテリア感染の予防のためのより有効なワクチンを提供する。
【０００６】
本発明はリコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧに関し、このリコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧは、アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）および／またはグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）をコードするＤＮＡを発現する。我々は、機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号３；配列番号４）を欠くために、ＢＣＧは、増殖のための唯一の窒素源としてアラニン（Ｌ−アラニンまたはＤ−アラニン）を利用することができないということを発見した。我々はさらに、アラニン（Ｌ−アラニンまたはＤ−アラニン）は全てのＢＣＧワクチン株の増殖を阻害することを見出した。前記阻害は、機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）をＢＣＧで発現させることによって軽減される。同様に、ＢＣＧは、増殖のための唯一の窒素源としてＬ−セリンを利用することができず、ＢＣＧの増殖はＬ−セリンによって阻害される。Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）のＢＣＧ株での発現はＬ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する。
【０００７】
アラニン（Ｌ−アラニンまたはＤ−アラニン）およびＬ−セリンは、おそらくグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）の活性を阻害することによってＢＣＧの増殖を阻害する。グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）のＢＣＧでの過剰発現はアラニンおよびＬ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する。グルタミンシンテターゼは、グルタメートシンターゼと連係してグルタミンおよびグルタメートを提供する。グルタミンおよびグルタメートは全てのアミノ酸、タンパク質、プリンおよびピリミジンの生合成に必須である。グルタミンシンテターゼの阻害は細胞増殖を停止させる。グルタメートに変換させることができるアミノ酸（例えばＬ−グルタミン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−アスパルテートおよびＬ−アスパラギン）の供給はそのような阻害を軽減させることができる。実際のところ、我々のデータは、アラニン（Ｌ−アラニンまたはＤ−アラニン）またはＬ−セリンによるＢＣＧ増殖の阻害はＬ−グルタミン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−アスパルテートまたはＬ−アスパラギンを増殖培地に補充することによって軽減されることを示している。
【０００８】
ＢＣＧは生ワクチンであるので、機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）および／またはグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）を発現または過剰発現するリコンビナントＢＣＧ株はヒトホスト体内でより長期間生存し、続いて長期にわたる記憶免疫を誘導する。これらのリコンビナントＢＣＧ株は極めて有用なワクチンを提供する。
【０００９】
本発明は、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株に関し、その核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ活性（配列番号１；配列番号２）、グルタミンシンテターゼ活性（配列番号７から配列番号１４）またはＬ−セリンデヒドラターゼ活性（配列番号５；配列番号６）を示す少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００１０】
本発明はまた、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株に関し、その核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）およびＬ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００１１】
本発明はさらに、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株に関し、その核酸は、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）、（配列番号８）、（配列番号９）、（配列番号１０）、（配列番号１１）、（配列番号１２）、（配列番号１３）、（配列番号１４）から成る群から選択される少なくとも１つの核酸分子の全部または一部を含む。
【００１２】
ある実施態様では、生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｍｏｒｅａｕ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｓｗｅｄｅｎ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒから成る群から選択される。
【００１３】
本発明のまた別の側面は、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含む医薬組成物であり、前記核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ活性（配列番号１；配列番号２）、グルタミンシンテターゼ活性（配列番号７から配列番号１４）およびＬ−セリンデヒドラターゼ活性（配列番号５；配列番号６）を示す少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００１４】
本発明はまた、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株に関し、前記核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）およびＬ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００１５】
本発明のさらに別の特徴では、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含む医薬組成物が提供される。前記核酸は、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）、（配列番号８）、（配列番号９）、（配列番号１０）、（配列番号１１）、（配列番号１２）、（配列番号１３）、（配列番号１４）から成る群から選択される少なくとも１つの核酸分子の全部または一部を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の側面では、マイコバクテリアによる攻撃に対し哺乳類を治療または予防するワクチンもしくは免疫原性組成物が提供される。前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含み、前記核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ活性（配列番号１；配列番号２）、グルタミンシンテターゼ活性（配列番号７から配列番号１４）またはＬ−セリンデヒドラターゼ活性（配列番号５；配列番号６）を示す少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００１７】
本発明のまた別の側面では、マイコバクテリアによる攻撃に対し哺乳類を治療または予防するワクチンもしくは免疫原性組成物が提供される。前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含み、前記核酸は、アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）およびＬ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００１８】
本発明のさらに別の側面では、マイコバクテリアによる攻撃に対し哺乳類を治療または予防するワクチンもしくは免疫原性組成物が提供される。前記ワクチンまたは免疫原性組成物は、発現可能な核酸を含む生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含み、前記核酸は、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）、（配列番号８）、（配列番号９）、（配列番号１０）、（配列番号１１）、（配列番号１２）、（配列番号１３）、（配列番号１４）から成る群から選択される少なくとも１つの核酸分子の全部または一部を含む。好ましい実施態様では、前記ワクチンまたは免疫原性組成物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓによる攻撃に対し哺乳類を治療または予防するためのものである。別の好ましい実施態様では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物はさらに医薬的に許容できる担体を含む。さらに別の好ましい実施態様では、前記ワクチンまたは免疫原性組成物はさらにアジュバントを含む。また別の好ましい実施態様では、前記ワクチンまたは免疫原性組成物はさらに１つまたは２つ以上の他の病源体に由来する免疫原性物質を含む。
【００１９】
本発明のまた別の側面は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｕｃｌｏｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓによる攻撃に対し哺乳類を治療または予防する方法に関し、前記方法は、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を哺乳類に投与することを含む。ある実施態様では前記哺乳類は牛である。別の実施態様では、前記哺乳類はヒトである。さらに別の実施態様では、前記ワクチンまたは免疫原性組成物はアジュバントの存在下で投与される。
【００２０】
本発明のさらに別の側面は癌に対して哺乳類を治療または予防する方法であり、前記方法は本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を哺乳類に投与することを含む。ある実施態様では、前記癌は膀胱癌である。別の実施態様では、前記ワクチンまたは免疫原性組成物はアジュバントの存在下で投与される。
【００２１】
本発明はまた、本発明の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を含む検査キットに関する。
【００２２】
本発明はさらに、増殖のための唯一の窒素源としてアラニンを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧの増殖を阻害する培地組成物に関する。ある実施態様では、増殖のための唯一の窒素源はセリンである。別の実施態様では、本発明の培地組成物はさらに炭素源、鉄、マグネシウムおよびＳＯ4を含む。ある実施態様では、前記炭素源はグリセロール、デキストロース、クエン酸塩およびグルコースから成る群から選択される。
【００２３】
本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧの増殖を阻害する方法に関し、前記方法は、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含むサンプルを入手し、さらに（ｂ）前記サンプルを選択的培地で培養することを含む。ある実施態様では、前記選択的培地は、唯一の窒素源としてアラニンを含む。さらに別の実施態様では、前記選択的培地は唯一の窒素源としてセリンを含む。
【００２４】
本発明の別の側面は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ株を培養する方法に関し、前記方法は、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含むサンプルを入手し、さらに（ｂ）前記サンプルを確認培地で培養することを含む。ある実施態様では、前記確認培地はヒスチジンを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
ＢＣＧワクチン株は増殖のための窒素源としてアミノ酸を利用する能力が限られている。さらにまた、天然に存在するアミノ酸Ｌ−アラニンおよびＬ−セリンはＢＣＧ株の増殖を阻害することを我々は発見した。ＢＣＧでの機能的Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）の発現はアラニンによる増殖阻害を軽減する。ＢＣＧでの機能的Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）の発現はＬ−セリンによる増殖阻害を軽減する。同様に、グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）の過剰発現は、アラニンおよびセリンによる増殖阻害を軽減させる。これらの新規な発見は重要である。なぜならば、機能的なアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）および／またはグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）を発現（または過剰発現）するリコンビナントＢＣＧ株はヒトホストの体内でより良好に生存し、長期の記憶免疫を誘導し、結核予防のためのより有効なワクチンを提供し、特に成人の肺結核を防ぐからである。
【００２６】
死菌ＢＣＧ株の投与は弱い一過性の免疫反応をもたらすことは長い間知られている。防御免疫は、ワクチンを接種されたホストでのＢＣＧの生存および複製を必要とする。この概念は、周囲環境に存在する生ＢＣＧにあらかじめ暴露されることによってＢＣＧの増殖が感染マウスで阻害されることを示した最近の動物感染モデルの研究によって補強された。結果としてＢＣＧは、結核に対し防御免疫を提供することができない一過性の免疫反応を誘導しただけであった（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。生ＢＣＧは持続的に多くの異なる抗原を分泌し、これらはおそらく防御免疫の誘導に重要であろう。増殖するＢＣＧによる多数の抗原の持続的産生は、いくつかの抗原を一過性に産生するサブユニットまたはＤＮＡワクチンを凌ぐ利点を生ワクチンに与える。したがって、ＢＣＧがホストの体内で増殖し生存し続ける能力はＢＣＧの有効性の重要な決定要素である。
【００２７】
ホストの体内で増殖し生存し続けるために、ＢＣＧはホストの体内で利用可能な栄養物を利用できなければならない。イソシトレートリアーゼ（脂肪酸の異化に必須の酵素）は感染の慢性期におけるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの生存維持に必要であり、さらに前記必要はホストの完全な免疫反応に依存することが示された（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。別の研究では、嫌気的ナイトレートレダクターゼ（硝酸塩呼吸に必須の酵素）を欠くＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株は、免疫能力をもつマウスの肺、肝および腎臓で生存し続けることができなかった（Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ＢＣＧ株は増殖のための窒素源として数タイプのアミノ酸しか利用せず、さらに全てのＢＣＧ株の増殖は天然に存在するＬ−アラニンおよびＬ−セリンによって阻害されるという我々の発見は、ホストの体内で増殖し生存し続けるＢＣＧの能力が限られていることを示唆する。ヒトの体内で増殖するＢＣＧが利用しうるＬ−アラニンの濃度は０．３３−０．４２ｍＭと概算され（Ｂａｒｃｌａｙ  ＆  Ｗｈｅｅｌｅｒ，  １９８９）、前記濃度は、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒまたはＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒの増殖の阻害、およびＢＣＧ−Ｊａｐａｎの増殖の顕著な低下に十分な濃度である（図４）。ホストの細胞外液に存在するＬ−セリンの濃度はおよそ０．１ｍＭであり（Ｂａｒｃｌａｙ  ＆  Ｗｈｅｅｌｅｒ，  １９８９）、前記濃度はＢＣＧの増殖の顕著な阻害をひき起こすことができる。ＢＣＧの増殖は防御免疫の発生のために必要であるので、ホスト体内でのアミノ酸によるそのような阻害は長期防御免疫の発達を妨げ、したがって成人における肺結核に対する防御の欠如をもたらすであろう。
【００２８】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓＢＣＧはまた膀胱癌の治療に用いられる。多数の任意抽出管理臨床試験は、ＢＣＧの膀胱内投与によって腫瘍の再発を予防または遅らせることができることを示した（Ｌａｍｍ（２０００）の概説；Ｌｏｃｋｅｒ  ＆  Ｇｉｌｌａｔｔ，  ２００１）。どのようにしてＢＣＧがこの作用を及ぼすかについての詳細は未確定である。しかしながら、抗腫瘍反応は完全なＴ細胞反応を要求し、Ｔｈ１−型サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ−６を含む）の発現の増加を必要とする（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）の概説）。もっとも有効な治療計画には複数回のＢＣＧの適用が含まれ、長期にわたる前記細菌への暴露が必要であることが示唆される。同様に、ＢＣＧを食菌する能力を有する腫瘍は前記の治療に対して最も感受性が高く（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）、細菌と腫瘍との相互作用が重要であることを示している。したがって、増強された生存維持を示すＢＣＧ株は抗腫瘍活性の強化を提供することができる。
【００２９】
機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）が存在しないことが、ＢＣＧ株がアラニン（Ｌ−アラニンまたはＤ−アラニン）を唯一の窒素源として利用できない原因であることを我々は示す。Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）（配列番号１）をコードする遺伝子（Ｒｖ２７０８）がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムで特定された。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のこの酵素の活性はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生化学的に示された。ａｌｄはＬ−アラニンをピルベートおよびアンモニアに変換し、Ｌ−アラニンに高度に特異的である（Ｈｕｔｔｅｒ  ＆  Ｓｉｎｇｈ，  １９９９）。この酵素はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの培養上清分画で検出されるが、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ−ＪａｐａｎおよびＢＣＧ−Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎではこの遺伝子の存在がＤＮＡサザンブロットで示されたにもかかわらず検出されなかった（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。同様に、我々は本報告に挙げた１２のＢＣＧ株のいずれにおいてもアラニンデヒドロゲナーゼ活性を検出しなかった（データは示されていない）。ＢＣＧ株におけるこの機能的アラニンデヒドロゲナーゼの欠如はおそらくａｌｄ遺伝子（配列番号３）内における変異によって惹起され、おそらく初期のＭ．ｂｏｖｉｓ株から由来している。フレームシフト変異が公開されたＭ．ｂｏｖｉｓのゲノム配列のａｌｄ遺伝子内で見つかった（図９）（配列番号３）。結果として、完全長のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼタンパク質（配列番号２；配列番号４）はＢＣＧ株では産生されず、したがってＢＣＧはアラニンを異化することができない。同様に、唯一の窒素源としてＬ−セリンをＢＣＧが利用できないことは、おそらくｓｄａＡ遺伝子（配列番号５；配列番号６、Ｌ−セリンデヒドラターゼをコードする）の変異または発現の変化によるものである。ＢＣＧでのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｓｄａＡ（配列番号５；配列番号６）の発現は、ＢＣＧ株が唯一の窒素源としてＬ−セリンを用いて増殖することを可能にし、Ｌ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する（図８）。アラニンおよびセリンによるＢＣＧ増殖阻害は、グルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）の阻害によって生じる。ＢＣＧでのグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）の過剰発現は、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニンおよびＤ−アラニンによる増殖阻害を軽減する。
【００３０】
ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒは、おそらくグルタミンシンテターゼの発現レベルまたは活性における違いのためにアラニンによる阻害に対しＢＣＧ−Ｊａｐａｎよりも感受性が高い。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎは、ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒまたはＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒと遺伝的に異なる（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。Ｃａｌｍｅｔｔｅ  ＆  Ｇｕｅｒｉｎは、Ｍ．ｂｏｖｉｓ単離菌をｉｎ  ｖｉｔｒｏで１３年および２３０継代後に１９２１年にＢＣＧワクチンを開発した。１９２４年から、ＢＣＧロットは世界中の研究室に配布された。それらの研究室は、種々のレシピおよびプロトコルを用い、凍結乾燥された種菌が確立される１９６１年までｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記細菌の継代が続けられた。そのような作業の結果として、生化学的および遺伝的に異なる種々のＢＣＧ子孫株が作製された（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。我々のデータは、窒素源としてアミノ酸を利用するＢＣＧ株の能力は様々であることを示している。例えば、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎは陽イオン性アミノ酸（Ｌ−アルギニンおよびＬ−リジンを含む）で増殖することができるが、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒは増殖できない。これらの相違はまた種々の臨床試験におけるＢＣＧの有効性の相違に寄与しているであろう。
【００３１】
要約すれば、我々は、機能的アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）、Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）および／またはグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）を発現するリコンビナントＢＣＧ株を、結核および他のマイコバクテリア感染を予防するワクチンとして使用する。これらのリコンビナントＢＣＧワクチンは結核に対し長期の防御免疫を誘導するであろう。
【００３２】
核酸分子の多様性
改変
本明細書に開示した核酸分子のＤＮＡ配列に多くの改変を加えることができる。そのような改変は当業者には明白であろう。本発明は、細菌または哺乳類細胞で発現を指令可能な、本明細書に開示した配列（またはそのフラグメント）のヌクレオチド改変を含む。改変にはヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失、またはヌクレオチドの相対的位置もしくは順序の変更が含まれる。
【００３３】
核酸分子は、アラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼにおける保存的アミノ酸改変をコードすることができる。本発明は、アラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼ内に保存的アミノ酸改変をコードし、アラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼ内にサイレントアミノ酸変化を生じる機能的に等価の核酸分子を含む。経験的に保存されたアミノ酸置換群を特定する方法は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｗｕ，  "Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ""）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝８８７７５２３＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓｔｒａｃｔ）。
【００３４】
核酸分子はまた、アラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼ内に非保存的アミノ酸置換、付加または欠失をコードすることができる。本発明は、配列番号２、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列内に非保存的アミノ酸変化をコードする機能的に等価の核酸分子を含む。機能的に等価の核酸分子には、ＤＮＡおよびＲＮＡであって、非保存的アミノ酸置換（好ましくは化学的に類似するアミノ酸の置換）、付加または欠失を有するペプチドまたはタンパク質をコードするが、配列番号２に示したアラニンデヒドロゲナーゼ、配列番号８、１０、１２もしくは１４に示したグルタミンシンテターゼ、または配列番号６に示したＬ−セリンデヒドラターゼと同じまたは類似のアラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼ活性を保持する、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。前記ＤＮＡまたはＲＮＡはアラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼのフラグメントまたは変種をコードすることができる。フラグメントは免疫原として、さらに免疫原性組成物として有用である。そのようなフラグメントおよび変種のアラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼまたはＬ−セリンデヒドラターゼ様活性は、下記に記載するアッセイによって特定される。
【００３５】
配列同一性
本発明の核酸分子はまた、本発明の核酸分子に対して少なくとも約６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、またはもっとも好ましくは少なくとも９９％または９９．５％の同一性を有し、細菌または哺乳類細胞で核酸分子発現可能な核酸分子（またはそのフラグメント）を含む。同一性とは、最高の順序適合が得られるようにアラインメントを実施した２つのヌクレオチド配列の類似性を指す。同一性は当業界で公知の方法にしたがって計算される。例えば、あるヌクレオチド配列（“配列Ａ”と呼ぶ）が配列番号１の一部分と９０％同一性を有する場合、配列Ａは配列番号１の照合された部分の各１００ヌクレオチドにつき１０個までの点変異（例えば他のヌクレオチドをもつ置換）を含みうることを除けば配列Ａは配列番号１の照合された部分と同一である。
【００３６】
配列同一性（各構築物は好ましくはコード核酸分子の挿入物を含まない）は、配列番号１から配列番号１４またはその相補性配列に対し好ましくは少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、またはもっとも好ましくは少なくとも９９％または９９．５％の同一性とされる。配列同一性は好ましくはバイオインフォーマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＧＣＧプログラムを用いて計算される。他のプログラムもまた配列同一性の計算に利用することができる。例えば以下のようなプログラムを利用することができる：Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  プログラム（好ましくはデフォルトパラメーターを用いる；ＪＤ  Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０）；ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｘアルゴリズム；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ＢＬＡＳＴＮ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：ｔｉｇｒｂｌａｓｔ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／））；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍ．Ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  （Ｐａｓｔｅｕｒ）、Ｍ．  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．  ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＢＬＡＳＴＮ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍｉｃｒｏｂｅｓ／））；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＢＬＡＳＴサーチ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｒｕｒ（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓｔ）ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／）；Ｍ．ｌｅｐｒａｅＢＬＡＳＴサーチ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｒｕｒ（Ｌｅｐｒｏｍａ）ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／Ｌｅｐｒｏｍａ／）；Ｍ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＢＬＡＳＴＮ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｃ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｓ／Ｐｔｂ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｃ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｓ／ＡＧＡＣ／Ｍｐｔｂ／Ｍｐｔｂｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）、種々のＢＬＡＳＴサーチ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ＵＳＡ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／））およびゲノムネット（ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ）の種々のＢＬＡＳＴサーチ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／））。
【００３７】
遺伝暗号は縮退性であるので、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる配列は配列番号１の核酸配列のみではなく、グルタミンシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる配列は配列番号７、９、１１および１３の核酸配列のみではなく、さらにＬ−セリンデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる配列は配列番号５の核酸配列のみではない。本発明は、配列番号１、５、７、９、１１および１３に記載された核酸分子と同一の主要遺伝情報をもつ核酸分子を含む。本明細書に記載した配列と比較して１つまたは２つ以上の核酸の変更を有する核酸分子（ＲＮＡを含む）であって、配列番号２、６、８、１０、１２および１４に示したポリペプチドの生成をもたらす核酸分子は本発明の範囲内に包含される。他の機能的な等価の形態のアラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼおよびＬ−セリンデヒドラターゼをコードする核酸も通常のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて単離することができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーション
本発明は、本明細書に記載された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするために十分な同一性を有する配列をもつＤＮＡを含む（ハイブリダイゼーション技術は当業界では周知である）。本発明はまた配列番号１から配列番号１４の配列またはその相補性配列の１つまたは２つ以上とハイブリダイズする核酸分子を含む。そのような核酸分子は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする（以下を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｍｏｓｔ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）。高度にストリンジェントな洗浄は好ましくは低塩濃度（好ましくは約０．２％のＳＳＣ）および約５０−６５℃の温度を有する。
【００３９】
ワクチン
当業者には生リコンビナントワクチンの製造は公知である。典型的にはそのようなワクチンは注射可能な溶液または懸濁液として製造される。注射前に液体となる溶液または懸濁液に適した固体形態に製造してもよい。前記調製物はまた乳化されてもよく、またはタンパク質をリポソームに被包化してもよい。生の免疫原性成分は、医薬的に許容され活性成分と適合する賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはその組み合わせなどである。さらにまた、所望の場合には、本ワクチンは微量の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／またはワクチンの有効性を高めるアジュバントを含むことができる。有効でありうるアジュバントの例には以下が含まれるがこれらに限定されるものではない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'−２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＥ−ＰＥと称される）およびＲＩＢＩ（細菌から抽出された３つの成分（モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ））を２％スクォレン／トゥイーン８０（登録商標）乳液中に含む）。
【００４０】
アジュバントの有効性は、生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧワクチン（種々のアジュバントをまた含む）の投与により生じた、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原性配列を含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定することができる。
簡便には、前記ワクチンは非経口的に、例えば注射（皮下または筋肉内）によって投与される。他の投与態様に適したさらに別の製剤には座薬および、いくつかの事例では経口製剤が含まれる。座薬のためには、伝統的な結合剤および担体には例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれるであろう。そのような座薬は、０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲の活性成分を含む混合物から成形されるであろう。経口製剤には通常用いられる賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース炭酸マグネシウムなどが含まれる。これらの製剤は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をもち、１０％から９５％、好ましくは２５％から７０％の活性成分を含む。
【００４１】
ワクチンは予防的および／または治療的に有効な量で剤形に適合する態様で投与される。
【００４２】
ワクチンは単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールで投与することができる。複数回投与スケジュールは、初期コースでは１から１０回の独立した投与と、免疫反応の維持および／または補強に要求される時間間隔で与えられる別の投与がその後に続く（例えば第二回目の投与のためには１−４ヶ月、必要な場合には数ヵ月後にさらに次の投与が続く）。投薬スケジュールはまた、少なくとも部分的には各個体の必要によって決定され、医師の判断に左右されるであろう。
【００４３】
さらにまた、生のリコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧワクチンは、他の免役調節物質（例えば免疫グロブリン）と併用して投与される。本発明の目的はまた多価ワクチン製剤であり、混合物としてまたは混合されるべきものとして、上記で定義した生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧを別のワクチン、特に上記に定義した別の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧワクチンとともに含む。これらのワクチンは別々の挿入配列を含む。
【００４４】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓによる攻撃に対して哺乳類を治療または予防するために用いられる。本発明の医薬組成物はまた、変性疾患、障害または異常な身体状態（例えば癌）をもつ患者の治療に用いられる。
【００４５】
前記医薬組成物は、例えば錠剤、エアゾル投与、膀胱内点滴および静脈内注射のような方法によってヒトまたは動物に投与することができる。
【００４６】
培地組成物
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧの増殖を阻害する本発明の培地組成物は唯一の窒素源としてアラニンまたはセリンを含む。アラニンが唯一の窒素源であるときアラニンは０．０３ｍＭ以上の量で存在し、セリンが唯一の窒素源であるときセリンは０．０３ｍＭ以上の量で存在する。
【００４７】
前記培地組成物はさらに約１．３５ｇ／Ｌから約１．６５ｇ／Ｌの量、好ましくは少なくとも１．５ｇ／Ｌの量の炭素；約０．０４５ｇ／Ｌから約０．０５５ｇ／Ｌの量、好ましくは少なくとも０．０５ｇ／Ｌの量の鉄；約０．４５ｇ／Ｌから約０．５５ｇ／Ｌの量、好ましくは少なくとも０．５ｇ／Ｌの量のマグネシウム；および約０．０４５ｇ／Ｌから０．０５５ｇ／Ｌの量、好ましくは少なくとも０．０５ｇ／Ｌの量のＳＯ4を含むことができる。
【００４８】
キット
免疫診断に適し、適切な標識試薬を含むキットは、本発明の生リコンビナントＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓＢＣＧ株を含む適切な材料を適切な容器に残りの試薬およびアッセイの実施に必要な材料並びに適切なアッセイ使用説明書セットとともに包装することによって構築される。いかなる免疫学的検査様式も意図され（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、サンドイッチアッセイなど）、それらは当業者に周知である。
【００４９】
材料と方法
細菌株および培養条件：１２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓＢＣＧ株：ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａ、ＢＣＧ−Ｍｏｒｅａｕ、ＢＣＧ−Ｓｗｅｄｅｎ、ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ、ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ、ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ、ＢＣＧ−Ｄｅｎｍａｒｋ、およびＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅを本実験に用い、それらはマーセル＝ベーア博士（Ｄｒ．  Ｍａｃｅｌ  Ｂｅｈｒ，  ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。前記の株の特性については以前に詳細に記載された（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。ミドルブルック７Ｈ９培地（Ｍｉｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９，  Ｄｉｆｃｏ）は１リットル当たり以下を含む：硫酸アンモニウム、０．５ｇ；Ｌ−グルタメート、０．５ｇ；クエン酸ナトリウム、０．１ｇ；ピリドキシン、１ｍｇ；ビオチン、０．５ｍｇ；リン酸二ナトリウム、２．５ｇ；リン酸一カリウム、１ｇ；クエン酸第二鉄アンモニウム、４０ｍｇ；硫酸マグネシウム、５０ｍｇ；塩化カルシウム、０．５ｍｇ；硫酸亜鉛、１ｍｇ；硫酸銅、１ｍｇ；およびグリセロール２ｍＬ（前記の他に５ｇのアルブミン（ウシ、Ｖ分画）、デキストロース２ｇおよび０．０５％トゥイーン８０を滅菌後に添加）。Ｓａｕｔｏｎ培地は１リットル当たり以下を含む：Ｌ−アスパラギン、４ｇ；硫酸一カリウム、０．５ｇ；硫酸マグネシウム、０．５ｇ；クエン酸第二鉄アンモニウム、５０ｍｇ；クエン酸、２ｇ；硫酸亜鉛、１ｍｇ；およびグリセロール、６０ｍＬ（０．０５％トゥイーン８０を滅菌後に添加）。グリセロール−アラニン−塩類（ＧＡＳ）培地は１リットル当たり以下を含む：塩化アンモニウム、２ｇ；Ｌ−アラニン、１ｇ；バクトカシトーン（Ｂａｃｔｏ  Ｃａｓｉｔｏｎｅ，  Ｄｉｆｃｏ）、０．３ｇ；二塩基性リン酸カリウム、４ｇ；クエン酸、２ｇ；クエン酸第二鉄アンモニウム、５０ｍｇ；塩化マグネシウム６水和物、１．２ｇ；硫酸カリウム、０．６ｇ；１０Ｍの水酸化ナトリウム、１．８ｍＬ；および１０ｍＬのグリセロール。トゥイーン８０を滅菌後に０．０５％添加した。ＢＣＧ培養は３７℃で定常的に振盪しながら３−４週間増殖させた。
【００５０】
ａｌｄのクローニング：ａｌｄ（配列番号１）のクローニングは二工程で実施した（図１）。先ず初めに、ａｌｄを含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの４．５ｋｂ、ＳｃａＩフラグメントをＥｃｌ１３６ＩＩで直鎖化させたｐＵＣ１９に連結してｐＵＣ−ＡＬＤを作製した。続いて、ａｌｄ遺伝子（配列番号１）を含む１．９ｋｂのＫｐｎＩフラグメントをＫｐｎＩで直鎖化させたｐＭＤ３１（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）に連結することによって、マイコバクテリアプラスミドｐＡＬＤを作製した。前記プラスミドｐＡＬＤをエレクトロポレーションによってＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株に導入し、リコンビナントＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株を、１０％オレイック／アルブミン／デキストロース／カタラーゼ（ＯＡＤＣ）濃縮物および２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したミドルブルック７Ｈ９寒天（Ｄｉｆｃｏ）で選別した。
【００５１】
ｓｄａＡのクローニング：ｓｄａＡ（配列番号５）のクローニングは二工程で実施した。先ず初めに、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡの９．５ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをＢａｍＨＩ−直鎖化ｐＭＤ３１に連結してｐＳＤＡ１を作製した。プラスミドｐＳＤＡ１をＰｓｔＩで切断し、続いて１０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメントの自己連結によってプラスミド、ｐＳＤＡＡを作製した。前記のプラスミドｐＳＤＡＡをエレクトロポレーションによってＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株に導入し、リコンビナントＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株を、１０％オレイック／アルブミン／デキストロース／カタラーゼ（ＯＡＤＣ）濃縮物および２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したミドルブルック７Ｈ９寒天（Ｄｉｆｃｏ）で選別した。
【実施例１】
【００５２】
グリセロール−アラニン−塩類（ＧＡＳ）培地でのＢＣＧ株の増殖：実験過程で、我々は、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ株は７Ｈ９培地の場合よりも遅いがＧＡＳ培地でも増殖できることを発見した。ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒは、長期間インキュベートした後（２ヶ月）でもＧＡＳ培地では増殖できなかった。他のＢＣＧ株のＧＡＳ培地での増殖も調べた。表１にその結果をまとめた。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａ、ＢＣＧ−Ｍｏｒｅａｕ、ＢＣＧ−ＳｗｅｄｅｎおよびＢＣＧ−ＢｉｒｋｈａｕｇはＧＡＳ培地で増殖できたが、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ、ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ、ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ、ＢＣＧ−ＤｅｎｍａｒｋおよびＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅは増殖できなかったことが示されている。これは興味深い観察である。なぜならば、上記に挙げた１２のＢＣＧ株の全てが７Ｈ９およびＳａｕｔｏｎの両培地で増殖できたからである（表１）。なぜある種のＢＣＧ株がＧＡＳ培地で増殖できないかを知るために、ＧＡＳ、７Ｈ９およびＳａｕｔｏｎ培地の化学的組成を比較した。ＺｎＳＯ4（１ｍｇ／Ｌ）（７Ｈ９およびＳａｕｔｏｎ培地には存在するが、ＧＡＳ培地には存在しない）またはピルビン酸ナトリウム（０．５％）（Ｍ．ｂｏｖｉｓの大型コロニーの増殖に必要）の補充はＧＡＳでのＢＣＧ株の増殖を支えなかった（データは示されていない）。次に窒素源を比較した。Ｌ−アスパラギン（４ｍｇ／Ｌ）はＳａｕｔｏｎ培地では唯一の窒素源であるが、塩化アンモニウム（２ｇ／Ｌ）およびＬ−アラニン（１ｇ／Ｌ）がＧＡＳでの主要な窒素源である。Ｌ−アスパラギンをＧＡＳ培地に（４ｇ／Ｌで）添加したとき、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ、ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ、ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ、ＢＣＧ−ＤｅｎｍａｒｋおよびＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅは迅速に増殖できた（表１）。Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタメートのＧＡＳ培地への補充はこれらのＢＣＧ株の増殖を支えたが、他のタイプのアミノ酸の補充は増殖を支えなかった（表１）。これらの結果は、ある種のＢＣＧ株のＧＡＳ培地での増殖できなかったことは、そこに存在する窒素源をそれらのＢＣＧ株が利用できないことによって生じることを示している。
【実施例２】
【００５３】
ＢＣＧ株の増殖のための窒素源としてのアミノ酸：上記の結果から我々はＢＣＧ株が種々のタイプのアミノ酸を唯一の窒素源として利用する能力を調べることを計画した。ＧＡＳ培地は少量のＢａｃｔｏ  Ｃａｓｉｔｏｎｅ（０．３ｇ／Ｌ）（Ｂａｃｔｏ  Ｃａｓｉｔｏｎｅは種々のアミノ酸およびペプチドの複雑な混合物である）を含むので、前記の目的のために我々は（確定した培地である）Ｓａｕｔｏｎ培地を選択した。Ｓａｕｔｏｎ培地の本来の成分中のＬ−アスパラギンを同濃度（２７ｍＭ）の各タイプのアミノ酸で個々に置換え、ｐＨは７．０に調節した。２７ｍＭまたは１ｍＭの塩化アンモニウムを唯一の窒素源とした場合もテストした。表２は３つの代表的なＢＣＧ株（ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ）についての結果をまとめている。表１の結果と同様に、唯一の窒素源としてＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタメートが用いられたとき、３つのＢＣＧ株全てが迅速に増殖した。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎは陽イオン性アミノ酸（例えばＬ−アルギニン、Ｌ−リジン）で増殖することができたが、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒはそのような条件では増殖できなかった。より興味深いことには、いずれのＢＣＧ株も唯一の窒素源としてＬ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−グリシンを利用することができないが、他の種のマイコバクテリア（病原性を有するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ａｖｉｕｍ、並びに非病原性のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含む）は、これらのアミノ酸で増殖することができた。これらの結果は、ＢＣＧワクチン株は限られた種類のアミノ酸を増殖のための窒素源として利用し、いくつかのＢＣＧ株（例えばＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒまたはＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ）は４種のアミノ酸で増殖することができるだけであることを示している（表２）。そのような制限はｉｎ  ｖｉｖｏ（ホストの体内）でのＢＣＧの増殖および生存維持能力をおそらく制限するであろう。
【実施例３】
【００５４】
Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンまたはＬ−セリンはＢＣＧの増殖を抑制する：上記の実験からの驚くべき発見は、全てのＢＣＧ株は低濃度（１ｍＭ）の塩化アンモニウムが唯一の窒素源として存在する場合、および高濃度（２７ｍＭ）の塩化アンモニウムが唯一の窒素源として存在する場合のどちらにおいても増殖することができるということであった（表２）。これはＧＡＳ培地で得られた結果（３７ｍＭの塩化アンモニウムはＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒの増殖を支えない）と矛盾する（表１）。ＧＡＳ培地はまたＬ−アラニンを含み、ＢＣＧ株はＬ−アラニンを増殖に利用しないので（表２）、ただ１つの可能な説明は、Ｌ−アラニンは実際にＢＣＧ株の増殖を阻害するということである。このことを証明するために、改変ＧＡＳ培地（Ｌ−アラニン抜き）を作製し、前記培地でのＢＣＧ株の増殖を調べた。予想したように、Ｌ−アラニンを含む本来のＧＡＳ培地では増殖できないＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒはＬ−アラニンを含まないＧＡＳで迅速に増殖した（図３）。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎもまた本来のＧＡＳ培地よりもこのＬ−アラニン非含有培地でより迅速に増殖した（図３）。同様の結果が本明細書に挙げた他の９つのＢＣＧ株についても得られた。
【００５５】
この結果をさらに確認するために、Ｌ−アラニンを濃度を増加させながら塩化アンモニウム含有（５ｇ／Ｌ）Ｓａｕｔｏｎ培地に添加し、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒの増殖を決定した（図４）。驚くべきことに、非常に低い濃度（０．２５ｍＭ）ですら、Ｌ−アラニンはＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒの増殖を完全に阻害した。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎの増殖阻害は幾分前記２つのＢＣＧ株よりは弱いが、０．５ｍＭのＬ−アラニンはその増殖を顕著に低下させ、８−１６ｍＭでは増殖は完全に抑制された（図４）。総合すれば、これらの結果はＬ−アラニンがＢＣＧ株の増殖を阻害することを明瞭に示している。我々はさらに、Ｄ−アラニンもＢＣＧ株の増殖を阻害することを見出した。ＧＡＳ培地におけるＤ−アラニンの存在は、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒの増殖を停止させ、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎの増殖を顕著に低下させた（図５）。同様に、ＧＡＳ培地におけるＬ−セリンの存在はＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒの増殖を顕著に阻害した（図７）。
【実施例４】
【００５６】
ＢＣＧでのＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）の発現はＬ−アラニンおよびＤ−アラニンによるＢＣＧ増殖の阻害を軽減する：アラニンは、多くのマイコバクテリア種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含む）にとって優れた窒素供給源である。Ｄ−アラニンの分解はＬ−アラニンへのラセミ化で開始し、Ｌ−アラニンは続いてＬ−アラニンデヒドロゲナーゼによってアンモニウムとピルベートに分解する。興味深いことには、機能的Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓで検出されるが、ＢＣＧ−ＪａｐａｎまたはＢＣＧ−Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎでは検出されなかった（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２；  Ｈｕｔｔｅｒ  ＆  Ｄｉｃｋ，  １９９８）。我々は、この実験で示したＢＣＧ株のいずれについてもＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を検出しなかった（データは示されていない）。ＢＣＧ株がＬ−またはＤ−アラニンを増殖のための唯一の窒素源として利用することができないのは機能的Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを欠くためである。このことを証明するために、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号２）をコードするａｌｄ遺伝子（配列番号１）をシャトルベクターにクローニングし、ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒを形質転換した。得られたリコンビナントＢＣＧ株をＬ−アラニンまたはＤ−アラニンを含むＧＡＳ培地で増殖する能力について調べた。両リコンビナント株（ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ／ａｌｄおよびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ／ａｌｄ）はＬ−アラニンまたはＤ−アラニンのどちらを含むＧＡＳ培地でも迅速に増殖し（図６）、一方、クローニングベクターのみを含む株は増殖しなかった。この結果は、機能的Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１；配列番号２）のＢＣＧ株での発現はＬ−アラニンおよびＤ−アラニンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減することを示している。
【実施例５】
【００５７】
ＢＣＧでのＬ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５；配列番号６）の発現はＬ−セリンによるＢＣＧ増殖の阻害を軽減する：Ｌ−セリンは、増殖のための唯一の窒素としてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに利用されるが、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株には利用されない。ＢＣＧ株がＬ−セリンを増殖のための唯一の窒素源として利用することができないのは、ＢＣＧ中のＬ−セリンデヒドラターゼをコードする遺伝子、ｓｄａＡ（配列番号５）の変異または発現の改変がおそらく原因であろう。ＢＣＧでのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＳｄａＡ（配列番号５；配列番号６）の発現は、ＢＣＧ株が唯一の窒素供給源としてＬ−セリンを用いて増殖することを可能にし、さらにＬ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を軽減する（図８）。
【実施例６】
【００５８】
Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンおよびＬ−セリンによるＢＣＧ増殖の阻害はおそらくグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）の活性の阻害によって生じる：グルタミンシンテターゼは細菌の窒素代謝で中心的な役割を果す（Ｒｅｉｔｚｅｒ，  １９９６）。グルタメートシンターゼとタンデムに機能しながら、グルタミンシンテターゼはグルタミンおよびグルタメートの合成を触媒する。グルタミンおよびグルタメート両者でほとんど全てのアミノ酸、タンパク質およびヌクレオチドのための窒素を提供する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓでは、グルタミンシンテターゼはフィードバック阻害下にあり、精製グルタミンシンテターゼはＬ−アラニン、Ｌ−セリンおよびグリシンによって阻害される（Ｒｅｉｔｚｅｒ，  １９９６）。グルタミンシンテターゼはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧでは細胞外タンパク質として同定された（Ｈａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４）。未分解Ｌ−アラニンはグルタミンシンテターゼを阻害し、続いてＢＣＧの増殖を妨げる可能性が高い。これが正しければ、Ｌ−セリン（増殖のためにＢＣＧによって代謝されない）（表１）は同じメカニズムでＢＣＧの増殖を阻害するであろう。この仮説を支持するように、窒素供給源として塩化アンモニウムのみを含むＧＡＳ培地へのＬ−セリンの添加は、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒまたはＢＣＧ−Ｊａｐａｎの増殖を阻害する（図７）。さらにまた、グルタミンシンテターゼがＬ−アラニンおよびＬ−セリン阻害の標的であるならば、Ｋ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓで示されたように（Ｊａｎｅｓ  ＆  Ｂｅｎｄｅｒ，  １９９８）、グルタメートに変換されえるアミノ酸の補充はまたそれらの影響を軽減させるであろう。実際、Ｌ−グルタメートおよび代謝によってグルタメートを生じるアミノ酸（Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−アスパルテート）の添加によって、アラニンの存在下でもＢＣＧ株は増殖するが（表１）、代謝によってグルタメートを生じないアミノ酸（例えばＬ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン）はＢＣＧ株を増殖させることができない。ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒはＢＣＧ−Ｊａｐａｎよりもアラニンおよびセリンによる阻害により敏感で、これはグルタミンシンテターゼ（配列番号７から配列番号１４）の発現レベルまたは活性における違いのためである。すなわち、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎは、ＢＣＧ−ＦｒａｐｐｉｅｒまたはＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒよりも多くのグルタミンシンテターゼを産生するか、またはより強い活性をもつグルタミンシンテターゼを産生する。
【００５９】
本発明を詳細にかつ好ましい実施態様の具体的な引用とともに述べてきたが、当業者には本発明の精神と範囲から逸脱することなく改変を実施できることは理解できよう。例えば本出願がタンパク質に言及している場合、ペプチドおよびポリペプチドをしばしば用いることができよう。同様に本出願で遺伝子が記載されている場合、核酸または遺伝子フラグメントもしばしば用いることができることは明瞭である。
【００６０】
各刊行物、特許、特許出願が具体的に個別に全体を取り込まれた場合と同様な程度に、全ての刊行物（ＧｅｎＢａｎｋエントリーを含む）、特許および特許出願は参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００６１】
【表１】
2006508633.tif 000003
【００６２】
【表２】
2006508633.tif 000004
【００６３】
参考文献：
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Ｆｉｎｅ，Ｐ．Ｅ．１９９５．「Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＢＣＧ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．」  Ｌａｎｃｅｔ  ３４６：  １３３９−４５．
Ｆｉｎｅ，Ｐ．Ｅ．１９８９．「Ｔｈｅ  ＢＣＧ  ｓｔｏｒｙ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｓｔ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．」  Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１：Ｓ３５３−９．
Ｆｉｎｅ，Ｐ．Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｅ．Ｖｙｎｎｙｃｋｙ．１９９８．「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｕｐｏｎ  ｔｈｅ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  （ｅ．ｇ．ＢＣＧ）  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：  １９２３−８．
Ｆｒｉｔｚ，Ｃ．Ｆ．，  Ｓ．Ｆ．Ｍａａｓｓ，Ａ．Ｆ．Ｋｒｅｆｔ，ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．Ｂａｎｇｅ．  ２００２．  「Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｏｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ．」  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７０：２８６−９１．
Ｈａｒｔｈ，  Ｇ．Ｆ．，  Ｐ．Ｃ．Ｆ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，  Ｊ．Ｙ．Ｆ．Ｔａｎｇ，  Ｄ．  Ｆ．Ｔａｂａｔａｄｚｅ，  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｈｏｒｗｉｔｚ．  ２０００．  「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ／ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：４１８−２３．
Ｈａｒｔｈ，  Ｇ．Ｆ．，  Ｄ．Ｌ．Ｆ．Ｃｌｅｍｅｎｓ，  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｈｏｒｗｉｔｚ．  １９９４．  「Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ：  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：  ９３４２−６．
Ｈｏｇａｎ，  Ｌ．Ｈ．Ｆ．，  Ｗ．Ｆ．Ｍａｒｋｏｆｓｋｉ，  Ａ．Ｆ．Ｂｏｃｋ，  Ｂ．  Ｆ．Ｂａｒｇｅｒ，  Ｊ．Ｄ．Ｆ．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｓａｎｄｏｒ．  ２００１．  「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ＣＤ２８．」  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６９：２５９６−  ６０３．
Ｈｕｔｔｅｒ，Ｂ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｓｉｎｇｈ．  １９９９．  「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４０  ｋＤａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ３４３：６６９−７２．  
Ｈｕｔｔｅｒ，Ｂ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｔ．  Ｄｉｃｋ．  １９９８．  「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｌａｎｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ．」  ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １６７：７−１１．
Ｊａｎｅｓ，  Ｂ．Ｋ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｂｅｎｄｅｒ．  １９９８．  「Ａｌａｎｉｎｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄａｄＡＢ  ｏｐｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８０：５６３−７０．
Ｌａｇｒａｎｄｅｒｉｅ，  Ｍ．Ｒ．  Ｆ．，  Ａ．Ｍ．Ｆ．Ｂａｌａｚｕｃ，  Ｅ．Ｆ．Ｄｅｒｉａｕｄ，  Ｃ．Ｄ．Ｆ．Ｌｅｃｌｅｒｃ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｇｈｅｏｒｇｈｉｕ．  １９９６．  「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．」  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６４：１−９．
Ｌａｍｍ，  Ｄ．Ｌ．２０００．  「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．」  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ３１  （Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ８６−９０．
Ｌｏｃｋｙｅｒ，  Ｃ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｇｉｌｌａｔｔ，Ｄ．Ａ．  ２００１．  「ＢＣＧ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．」  Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．９４：１１９−２３．
ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｊ．Ｄ．Ｆ．，  ｚ．Ｂ．Ｈｏｎｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｆ．Ｍｕｎｏｚ−Ｅｌｉａｓ，  Ａ．Ｆ．Ｍｉｃｚａｋ，  Ｂ．Ｆ．Ｃｈｅｎ，  Ｗ．Ｔ．Ｆ．Ｃｈａｎ，  Ｄ．  Ｆ．Ｓｗｅｎｓｏｎ，  Ｊ．Ｃ．Ｆ．Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，  Ｗ．Ｒ．Ｊ．Ｊａｃｏｂｓ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｒｕｓｓｅｌｌ．  ２０００．  「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｓｈｕｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ．」  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７３５−８．
Ｍｏｉｓａｎ，Ｊ．Ｆ．，  Ｗ．Ｆ．Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｓｋｉ，  Ｃ．Ｆ．Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，  Ｃ．Ｆ．Ｌａｃｈａｎｃｅ，  Ｓ．Ｄｉ  Ｍａｒｃｏ，  Ｅ．Ｆ．Ｓｋａｍｅｎｅ，  Ｇ．Ｆ．Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｒａｄｚｉｏｃｈ．  ２００１．  「Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｓ２８４６３（Ｒ−８４８），  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｎｒａｍｐ  １  （ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｌｌｅｌｅ）．」−Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５：３０５９−６４．
Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ｆ．，  Ｍ．Ｆ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，  Ａ．Ｆ．Ｌａｄｅｆｏｇｅｄ，Ｋ．Ｆ．Ｈａｓｌｏｖ，  ａｎｄ  Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ．  １９９９．  「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｖａｃｃｉｎｅ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｇｅｎｅａｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅｅ．」  Ｔｕｂｅｒ．  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ．  ７９：２４３−５０．
Ｏｒｍｅ，Ｉ．Ｍ．  ２００１．  「Ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．」  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．
７０：１−１０．
Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｓ．，  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，  Ｈａｗｋｙａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，Ａｌｅｘａｎｄｒｏｆｆ，Ａ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｋ．  ２０００．  「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｂａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ：  ｌｏｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．」  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ３１（Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ９１−３．
Ｒｅｉｔｚｅｒ，Ｌ．Ｊ．  １９９６．「  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，  ｇｌｕｔａｍａｔｅ，  ａｓｐａｒｔａｔｅ，  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，  Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ，  ａｎｄ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ」，  ｐ．３８０−３９０．  Ｉｎ  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｆ．Ｃ．  （ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｒｎｏｎｅｌｌａ，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｃ．
Ｓｔｅｒｎｅ，Ｊ．Ａ．，  Ｌ．Ｃ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｇｕｅｄｅｓ．  １９９８．  「Ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｔｉｍｅ  ｓｉｎｃｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ？」  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＆  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ２：２００−２０７．
Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｂ．  ２０００．  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  ３０：  Ｓ２５４−６．
Ｙｕ，Ｓ．Ｆ．，  Ｅ．Ｆ．Ｆｉｓｓ，  ａｎｄ  Ｗ．Ｒ．Ｊ．Ｊａｃｏｂｓ．  １９９８．  「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｏｃｈｅｌｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ：  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅｓ  ｈａｖｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔ
ｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ．」  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０：４６７６−８５．
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ａｌｄ遺伝子のクローニングを示す。先ず初めに、Ａｌｄ遺伝子（配列番号１）を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡの４．５ｋｂのＳｃａＩフラグメントをＥｃｌ１３６ＩＩで直鎖化させたｐＵＣ１９に連結してｐＵＣ−ＡＬＤを作製した。続いて、ａｌｄ遺伝子（配列番号１）を含む１．９ｋｂのＫｐｎＩフラグメントをＫｐｎＩで直鎖化させたｐＭＤ３１に連結することによって、マイコバクテリアプラスミドｐＡＬＤを作製した。
【図２】ｓｄａＡ遺伝子のクローニングを示す。ｓｄａＡ（配列番号５）のクローニングは二工程で達成した。先ず初めに、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡの９．５ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをＢａｍＨＩ−直鎖化ｐＭＤ３１に連結してｐＳＤＡ１を作製した。ｐＳＤＡ１をＰｓｔＩで切断し、続いて１０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメントの自己融合によってプラスミド、ｐＳＤＡＡを作製した。
【図３】ＧＡＳでのＬ−アラニンによるＢＣＧの増殖阻害を示す。７Ｈ９／ＡＤＣ／グリセロール／トゥイーン−８０液体培地で定常期まで増殖させたＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒを５ｍＬの培養容積のＧＡＳ、Ｌ−アラニンを含まないＧＡＳ、および２７ｍＭのＬ−アスパラギン補充ＧＡＳに、各サンプル２つづつになるよう細胞濃度２×１０7細胞／ｍＬで接種した。培養を定常的に振盪しながら１６日間３７℃でインキュベートし、続いて細胞培養の部分標本２ｍＬを遠心し、細胞ペレットを凍結乾燥させて細胞の乾燥重量を決定した。
【図４】ＮＨ4Ｃｌ（５ｇ／Ｌ）含有Ｓａｕｔｏｎ中でＬ−アラニンの濃度を増加させることによるＢＣＧの増殖阻害を示す。ａ）ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ｂ）ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒおよびｃ）ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒを７Ｈ９／ＡＤＣ／グリセロール／トゥイーン−８０液体培地で定常期まで増殖させた。細胞を洗浄し、Ｓａｕｔｏｎ基本培地（窒素源なし）に再懸濁させた。各株の再懸濁細胞を５ｍＬ培養容積のＮＨ4Ｃｌ補充Ｓａｕｔｏｎ培地に各サンプル２つづつになるように接種し、Ｌ−アラニン濃度を増加させた。培養を定常的に振盪しながら３０日間３７℃でインキュベートし、さらに細胞乾燥重量を決定した。
【図５】ＧＡＳでのＤ−アラニンによるＢＣＧの増殖阻害を示す。７Ｈ９／ＡＤＣ／グリセロール／トゥイーン−８０液体培地で定常期まで増殖させたＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒを、各々５ｍＬの培養容積のＧＡＳ（Ｌ−アラニンがＤ−アラニンで置換されている）、Ｌ−アラニンを含まないＧＡＳ、および２７ｍＭのＬ−アスパラギンを補充したＧＡＳ（Ｄ−アラニン含有）に、細胞濃度２ｘ１０7細胞／ｍＬで接種した。培養を定常的に振盪しながら１３日間３７℃でインキュベートし、さらに細胞乾燥重量を決定した。
【図６】アラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号１）を発現するリコンビナントＢＣＧ株のＧＡＳ培地での増殖を示す。ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ／ａｌｄ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ／ａｌｄ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ／ｐＭＤ３１、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ／ｐＭＤ３１、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒの増殖を比較した。７Ｈ９／ＡＤＣ／グリセロール／トゥイーン−８０液体培地で定常期まで増殖させた各株の細胞を洗浄し、Ｓａｕｔｏｎ基本培地（窒素源なし）に再懸濁させた。再懸濁細胞を５ｍＬの培養容積のＬ−アラニンを含まないＧＡＳ、Ｌ−アラニンを含むＧＡＳ、およびＬ−アラニンがＤ−アラニンで置換されているＧＡＳに各サンプル２つづつとなるように接種した。培養を定常的に振盪しながら１５日間３７℃でインキュベートし、続いて細胞乾燥重量を決定した。
【図７】ＧＡＳ中でのＬ−セリンによるＢＣＧの増殖阻害を示す。７Ｈ９／ＡＤＣ／グリセロール／トゥイーン−８０液体培地で定常期まで増殖させたＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒを５ｍＬの培養容積のＧＡＳ（Ｌ−アラニンがＬ−セリンで置換されている）、Ｌ−アラニンを含まないＧＡＳ、および２７ｍＭのＬ−アスパラギンを補充したＧＡＳ（Ｌ−セリン含有）に、各サンプル２つづつとなるように細胞濃度２×１０7細胞／ｍＬで接種した。培養を定常的に振盪しながら１５日間３７℃でインキュベートし、さらに細胞乾燥重量を決定した。
【図８】Ｌ−セリンデヒドラターゼ（配列番号５）を発現するリコンビナントＢＣＧ株のＬ−セリン含有ＧＡＳ培地での増殖を示す。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ｓｄａＡ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ／ｓｄａＡ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ／ｓｄａＡ、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒの増殖を比較した。７Ｈ９／ＡＤＣ／グリセロール／トゥイーン−８０液体培地で定常期まで増殖させた各株の細胞を洗浄し、Ｓａｕｔｏｎ基本培地（窒素源なし）に再懸濁させた。再懸濁細胞を５ｍＬの培養容積のＬ−アラニン非含有ＧＡＳ、Ｌ−アラニンがＬ−セリンで置換されているＧＡＳ、および２７ｍＭのＬ−アスパラギンを補充したＧＡＳ（Ｌ−セリン含有）に各サンプル２つづつになるように接種した。培養を定常的に振盪しながら１５日間３７℃でインキュベートし、続いて細胞乾燥重量を決定した。
【図９】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｂ）のａｌｄ遺伝子（配列番号１；配列番号２）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（Ｍ．  ｂｏｖｉｓ）のａｌｄ遺伝子（配列番号３；配列番号４）のＡ）ヌクレオチドおよびＢ）アミノ酸配列のアラインメントを示す。Ｍ．  ｂｏｖｉｓのａｌｄ（配列番号３）でフレームシフトを生じる点欠失変異は矢印で示されている。この変異によって影響を受けるヌクレオチドコドンおよびアミノ酸がハイライトされている。
【配列表】
2006508633.tif 000005
2006508633.tif 000006
2006508633.tif 000007
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2006508633.tif 000042
【国際調査報告】
2006508633.tif 000043
2006508633.tif 000044
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