(57)【要約】ＧＳＫ−３の活性を阻害することができる新規なコンジュゲート、その製造方法、かかるコンジュゲートを含む医薬組成物、及びＧＳＫ−３によって媒介された状態の治療におけるその使用方法が開示される。さらに、ＧＳＫ−３阻害剤を使用して情動障害を治療する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の活性を阻害することができるコンジュゲートであって、以下のものを含む、コンジュゲート：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド：
2006514104.tif 000029
式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である；および
（ｂ）前記ポリペプチドに結合した少なくとも１つの疎水性成分。
【請求項２】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端に結合する請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｚはアラニン残基である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
ｎは１〜１５の整数である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ｎは１〜１０の整数である請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
活性な成分としての請求項１のコンジュゲートと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１６】
ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態の治療における使用のために、包装用材料に詰められ、包装用材料の表面またはその中での活字で識別される請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記生物学的状態は肥満、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性状態、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および精神病的な疾患または障害からなる群から選択される請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記情動障害は単極型障害および双極性障害からなる群から選択される請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記単極型障害がうつ病である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記双極性障害が躁うつ病である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記神経変性障害は脳虚血、発作、外傷性脳傷害および細菌感染からなる群から選択される事象から生じる請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記神経変性障害は慢性の神経変性障害である請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記慢性の神経変性障害はアルツハイマー病、ハンチングトン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＭＬ）および多発性硬化症からなる群から選択される疾患から生じる請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分をさらに含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記さらなる活性な成分はインスリンである請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の活性を阻害することができる請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３阻害剤、リチウム、バルプロ酸およびリチウムイオンからなる群から選択される請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記さらなる活性な成分はポリヌクレオチドである請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドは細胞内でのＧＳＫ−３  ｍＲＮＡの分解を生じさせるために向けられた小さい干渉性ポリヌクレオチド分子である請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記小さい干渉性ポリヌクレオチド分子はＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子およびＤＮＡザイム分子からなる群から選択される請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
エアロゾル、水溶液、ボーラス剤、カプセル、コロイド、遅延放出剤、デポー剤、溶解可能な粉末、滴剤、エマルション、侵食性インプラント、ゲル、ゲルカプセル、顆粒剤、注射液、摂取可能な溶液、吸入可能な溶液、ローション、オイル溶液、ピル、坐薬、膏薬、懸濁物、持続放出剤、シロップ、錠剤、チンキ剤、局所用クリーム、経皮送達形態からなる群から選択される送達形態物に配合される請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端に結合する請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
Ｚはアラニン残基である請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
ｎは１〜１５の整数である請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
ｎは１〜１０の整数である請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記コンジュゲートは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
ＧＳＫ−３を発現する細胞を請求項１のコンジュゲートの効果的な量と接触させることを含むＧＳＫ−３の活性を阻害する方法。
【請求項４７】
前記活性はリン酸化活性および／または自己リン酸化活性である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞を接触させることはインビトロで達成される請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞を接触させることはインビボで達成される請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端に結合する請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
Ｚはアラニン残基である請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
ｎは１〜１５の整数である請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
ｎは１〜１０の整数である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記コンジュゲートは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
ＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分を前記細胞と接触させることをさらに含む請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記さらなる活性な成分はインスリンである請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の活性を阻害することができる請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３阻害剤、リチウム、バルプロ酸およびリチウムイオンからなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記さらなる活性な成分はポリヌクレオチドである請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリヌクレオチドは細胞内でのＧＳＫ−３  ｍＲＮＡの分解を生じさせるために向けられた小さい干渉性ポリヌクレオチド分子である請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記小さい干渉性ポリヌクレオチド分子はＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子およびＤＮＡザイム分子からなる群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
インスリン応答性細胞を請求項１のコンジュゲートの効果的な量と接触させることを含む、インスリンシグナル伝達を強化する方法。
【請求項７２】
前記細胞をインスリンと接触させることをさらに含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞を接触させることはインビトロで達成される請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞を接触させることはインビボで達成される請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端に結合する請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
Ｚはアラニン残基である請求項７１に記載の方法。
【請求項８５】
ｎは１〜１５の整数である請求項７１に記載の方法。
【請求項８６】
ｎは１〜１０の整数である請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記コンジュゲートは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項７１に記載の方法。
【請求項８８】
必要性のある対象に請求項１のコンジュゲートの治療効果的な量を投与することを含む、ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態を治療する方法。
【請求項８９】
前記生物学的状態は肥満、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性状態、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および精神病的な疾患または障害からなる群から選択される請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記情動障害は単極型障害および双極性障害からなる群から選択される請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記単極型障害がうつ病である請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記双極性障害が躁うつ病である請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記神経変性障害は脳虚血、発作、外傷性脳傷害および細菌感染からなる群から選択される事象から生じる請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記神経変性障害は慢性の神経変性障害である請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記慢性の神経変性障害はアルツハイマー病、ハンチングトン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＭＬ）および多発性硬化症からなる群から選択される疾患から生じる請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記精神病的障害は統合失調症である請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
ＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分を前記対象に共投与することをさらに含む請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
前記さらなる活性な成分はインスリンである請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の活性を阻害することができる請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３阻害剤、リチウム、バルプロ酸およびリチウムイオンからなる群から選択される請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記さらなる活性な成分はポリヌクレオチドである請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ポリヌクレオチドは細胞内でのＧＳＫ−３  ｍＲＮＡの分解を生じさせるために向けられた小さい干渉性ポリヌクレオチド分子である請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記小さい干渉性ポリヌクレオチド分子はＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子およびＤＮＡザイム分子からなる群から選択される請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項８８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端に結合する請求項８８に記載の方法。
【請求項１０７】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項８８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項８８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項８８に記載の方法。
【請求項１１４】
Ｚはアラニン残基である請求項８８に記載の方法。
【請求項１１５】
ｎは１〜１５の整数である請求項８８に記載の方法。
【請求項１１６】
ｎは１〜１０の整数である請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記コンジュゲートは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項８８に記載の方法。
【請求項１１８】
ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の治療効果的な量を必要性のある対象に投与することを含む、情動障害を治療する方法。
【請求項１１９】
前記情動障害は単極型障害および双極性障害からなる群から選択される請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記単極型障害がうつ病である請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記双極性障害が躁うつ病である請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記化合物が下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１１８に記載の方法：
2006514104.tif 000030
式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である。
【請求項１２３】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
Ｚはアラニン残基である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
ｎは１〜１５の整数である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
ｎは１〜１０の整数である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ポリペプチドはポリペプチドに結合する少なくとも１つの疎水性成分をさらに含む請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端に結合する請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３８】
Ｚはアラニン残基である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３９】
ｎは１〜１５の整数である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４０】
ｎは１〜１０の整数である請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記化合物が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４２】
ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の効果的な量を対象に投与することを含む、対象の海馬におけるβ−カテニンの濃度をアップレギュレーションする方法。
【請求項１４３】
前記化合物が下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１４２に記載の方法：
2006514104.tif 000031
式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である。
【請求項１４４】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
Ｚはアラニン残基である請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
ｎは１〜１５の整数である請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
ｎは１〜１０の整数である請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ポリペプチドはポリペプチドに結合する少なくとも１つの疎水性成分をさらに含む請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５０】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記少なくとも１つの疎水性成分はポリペプチドのＮ末端に結合する請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記脂肪酸はミリスチン酸である請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
Ｘ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５９】
Ｚはアラニン残基である請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６０】
ｎは１〜１５の整数である請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６１】
ｎは１〜１０の整数である請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記化合物は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６３】
以下の工程を含む、請求項１のコンジュゲートを製造するプロセス：
前記ポリペプチドを提供すること；
前記少なくとも１つの疎水性成分を提供すること；および
前記少なくとも１つの疎水性成分と前記ポリペプチドとをコンジュゲート化すること。
【請求項１６４】
前記ポリペプチドを提供することは、前記ポリペプチドを化学合成することによって達成される請求項１６３に記載のプロセス。
【請求項１６５】
前記ポリペプチドを提供することは、前記ポリペプチドを組換え製造することによって達成される請求項１６３に記載のプロセス。
【請求項１６６】
前記コンジュゲートは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を阻害するための新規なコンジュゲート、およびＧＳＫ−３活性により媒介される生物学的状態の調節におけるその使用に関し、より具体的には、ＩＩ型糖尿病、神経変性障害および神経変性疾患、ならびに情動障害などの生物学的状態の治療におけるかかるコンジュゲートの使用に関する。本発明はさらに、ＧＳＫ−３阻害剤を使用して情動障害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、タンパク質基質をリン酸化する酵素であり、細胞外の事象を細胞質および核にシグナル伝達する際に重要な役割を果たすものであり、有糸分裂、分化およびアポトーシスを含む、細胞の生死に関係する事実上すべての事象に関与している。そのため、プロテインキナーゼは、これまで長い間、好都合な薬物標的であった。プロテインキナーゼの活性は細胞の満足すべき状態にとって極めて重要であるが、その一方で、その阻害は、多くの場合、細胞死をもたらすので、薬物標的としてのその使用は限られている。細胞死は、抗ガン薬物のための望ましい効果ではあるが、ほとんどの他の治療剤のためには大きな欠点である。
【０００３】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）はプロテインキナーゼファミリーのメンバーであり、インスリンのシグナル伝達および代謝調節、および同様に、胚発達時におけるＷｎｔシグナル伝達および細胞運命スキームに関与する細胞質セリン−トレオニンキナーゼである。ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βと呼ばれるこの酵素の２つの類似するイソ型が同定されている。
【０００４】
ＧＳＫ−３は、典型的にはシグナル伝達経路によって活性化される他のプロテインキナーゼとは異なり、通常、休止細胞において活性化され、その活性は、インスリンがその細胞表面受容体に結合することにより生じるシグナル伝達経路などの特定のシグナル伝達経路の活性化によって弱められるので、これまで長い間、プロテインキナーゼファミリーの中で好都合な薬物標的であると見なされてきた。インスリン受容体の活性化はプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、これはまたＡｋｔとも呼ばれる）の活性化をもたらし、プロテインキナーゼＢの活性化は次にＧＳＫ−３をリン酸化し、それによりＧＳＫ−３を不活性化する。ＧＳＫ−３の阻害はグリコーゲン合成の活性化をもたらすと推定される。複雑なインスリンシグナル伝達経路は、セリン残基においてインスリン受容体基質−１をリン酸化するＧＳＫ−３自身によるインスリンシグナル伝達の負のフィードバック調節によってさらに複雑になっている（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９７）。
【０００５】
従って、合成されたＧＳＫ−３阻害剤は、ＧＳＫ−３経路を使用する特定のホルモンおよび増殖因子（例えば、インスリンなど）の作用を模倣し得る。ある種の病理学的状態では、このスキームは、欠陥のある受容体、またはシグナル伝達機構の別の誤った成分の迂回を可能にし、その結果、インスリン非依存性ＩＩ型糖尿病の場合のように、シグナル伝達カスケードのいくつかの上流側の関与体が正常でないときでさえ、生物学的シグナルが効力を生じるようにすることができる。
【０００６】
細胞におけるグリコーゲン異化作用の調節は、ホルモンのインスリンを含む様々なシグナル伝達要素の複雑な配置を包括する極めて重要な生物学的機能である。様々な媒介因子を介して、インスリンは、グリコーゲンシンターゼ（ＧＳ）によるグリコーゲンの合成を増大させることによってその調節作用を発揮する。インスリン作用における重要な事象は、多数のチロシン残基におけるインスリン受容体基質（ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２）のリン酸化であり、その結果、ＰＩ３キナーゼを含む数個のシグナル伝達成分の同時活性化がもたらされる（Ｍｙｅｒｓ他、１９９２）。同様に、グリコーゲンシンターゼの活性はそのリン酸化によって抑制される。ＩＩ型糖尿病患者の筋肉におけるグリコーゲンシンターゼ活性およびグリコーゲン濃度の顕著な低下が認められている（Ｄａｍｓｂｏ他、１９９１；Ｎｉｋｏｕｌｉｎａ他、１９９７；Ｓｈｕｌｍａｎ他、１９９０）。
【０００７】
ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の発症に関連する最も初期の変化の１つはインスリン耐性である。インスリン耐性は、高インスリン血症および高血糖によって特徴づけられる。インスリン耐性を生じさせる正確な分子機構は不明であるが、インスリンシグナル伝達経路の下流側成分の欠陥が原因であると考えられている。
【０００８】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）はインスリンシグナル伝達経路の下流側成分の１つである。ＧＳＫ−３の大きな活性は、インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）のセリン残基をリン酸化することによって、無傷の細胞においてインスリンの作用を損なうことが見出され（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９７）、また同様に、細胞において発現する増大したＧＳＫ−３活性はグリコーゲンシンターゼ活性の抑制をもたらすことが見出された（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９６）。これに関連して行われたさらなる研究により、ＧＳＫ−３活性が糖尿病マウスの精巣上体脂肪組織において著しく増大していることが明らかにされた（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９９）。その後、増大したＧＳＫ−３活性がＩＩ型糖尿病患者の骨格筋において検出された（Ｎｉｃｋｏｕｌｉｎａ他、２０００）。さらなる近年の研究では、グリコーゲン代謝およびインスリンシグナル伝達におけるＧＳＫ−３の役割がさらに明らかにされた（総説については、Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、２００２；ＧｒｉｍｅｓおよびＪｏｐｅ、２００１；Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、２００１を参照のこと）。それにより、ＧＳＫ−３活性の阻害は、インスリン活性をインビボで増大させる方法であり得ることが示唆された。
【０００９】
ＧＳＫ−３はまた、アルツハイマー病の病理発生における重要な関与体であると考えられている。ＧＳＫ−３が、対らせんフィラメント（ＰＨＦ）の形成（アルツハイマー病の初期の特徴）に関与するタウ（微小管結合タンパク質）をリン酸化するキナーゼの１つとして同定された。外見的には、タウの異常な過剰リン酸化は、微小管の脱安定化およびＰＨＦ形成に対する原因である。いくつかのプロテインキナーゼは、タウのリン酸化を促進することが示されたという事実にもかかわらず、ＧＳＫ−３のリン酸化のみが、微小管の自己アセンブリーを促進するタウの能力に直接的な影響を及ぼすことが見出された（Ｈａｎｇｅｒ他、１９９２；Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ他、１９９２；Ｍｕｌｏｔ他、１９９４；Ｍｕｌｏｔ他、１９９５）。この点におけるＧＳＫ−３の役割に対するさらなる証拠が、ＧＳＫ−３を過剰発現する細胞の研究からもたらされ、また、ＧＳＫ−３を脳において特異的に発現する遺伝子組換えマウスからもたらされた。両方の場合において、ＧＳＫ−３はＰＨＦ様エピトープのタウの生成をもたらした（Ｌｕｃａｓ他、２００１）。
【００１０】
ＧＳＫ−３は、細胞のアポトーシスにおけるその役割によってアルツハイマー病とさらに関係づけられる。インスリンはニューロンの生存因子であるという事実（Ｂａｒｂｅｒ他、２００１）、インスリンはＰＩ３キナーゼおよびＰＫＢの活性化によりその抗アポトーシス作用を開始するという事実（Ｂａｒｂｅｒ他、２００１）から、これらのシグナル伝達成分による負の調節を受けるＧＳＫ−３はニューロンのアポトーシスを促進することが示唆された。いくつかの研究では、実際にこの見解が確認され、ＧＳＫ−３が生死の決定において極めて重要であることが示された。その上、そのアポトーシス機能は、ＰＩ３キナーゼとは独立していることが示された。ＰＣ１２細胞におけるＧＳＫ−３の過剰発現はアポトーシスを引き起こした（Ｐａｐ他、１９９８）。小脳顆粒ニューロンにおけるＧＳＫ−３の活性化は遊走および細胞死を媒介した（Ｔｏｎｇ他、２００１）。ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ＧＳＫ−３の過剰発現は、スタウロアポリン誘導の細胞アポトーシスを促進させた（Ｂｉｊｕｒ他、２０００）。
【００１１】
ＧＳＫ−３阻害と、細胞死の防止との関係が、Ｆｒａｔ１（ＧＳＫ−３β阻害剤）の発現が、ＰＩ３キナーゼの阻害により誘導される死からニューロンを救うために十分であることを示した研究によってさらに明らかにされている（Ｃｒｏｗｄｅｒ他、２０００）。
【００１２】
ＧＳＫ−３の別の関わりが情動障害（すなわち、双極性障害および躁うつ病）に関連して検出された。このつながりは、リチウム（双極性疾患において頻繁に使用される最初の気分安定化剤）が、臨床において使用される治療的濃度範囲でＧＳＫ−３の強い特異的な阻害剤であるという知見（Ｋｌｅｉｎ他、１９９６；Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ他、１９９６；Ｐｈｉｅｌ他、２００１）に基づいていた。この発見は、リチウムが細胞プロセスにおいてＧＳＫ−３活性の喪失を模倣し得るかを明らかにするために始められた一連の研究に至った。実際に、リチウムは、グリコーゲン合成の活性化（Ｃｈｅｎｇ他、１９８３）、β−カテニンの安定化および蓄積（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ他、１９９６）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚における軸複製の誘導（Ｋｌｅｉｎ他、１９９６）、ならびにニューロン死の保護（Ｂｉｊｕｒ他、２０００）を引き起こすことが示された。バルプロ酸（別の一般に使用されている気分安定化剤）もまた、効果的なＧＳＫ−３阻害剤であることが見出されている（Ｃｈｅｎ他、１９９９）。まとめると、これらの研究は、ＧＳＫ−３がリチウムおよびバルプロ酸の主要なインビボ標的であり、従って、情動障害の新規な治療的治療において重要な意味を有することを示している。
【００１３】
リチウムおよび他のＧＳＫ−３阻害剤が、双極性障害を治療するために作用し得る１つの機構は、神経伝達物質のグルタミン酸によって誘導される異常に高いレベルの興奮にさらされたニューロンの生存を増大させることである（Ｎｏｎａｋａ他、１９９８）。グルタミン酸によって誘導されるニューロンの興奮性はまた、脳虚血、外傷性脳傷害および細菌感染などにおける急性損傷に伴う神経変性の主要な原因であると考えられている。その上、グルタミン酸の過度なシグナル伝達は、アルツハイマー病、ハンチングトン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＭＬ）および多発性硬化症（ＭＳ）などの疾患において見られる慢性的なニューロン損傷における一因であると考えられている（Ｔｈｏｍａｓ、１９９５）。
【００１４】
結果として、ＧＳＫ−３阻害剤は、これらの神経変性障害および他の神経変性障害における有用な処置であると考えられる。実際に、ＧＳＫ−３活性の調節異常が、近年、統合失調症（精神分裂病）（Ｂｅａｓｌｅｙ他、２００１；Ｋｏｚｌｏｖｓｋｙ他、２００２）、発作およびアルツハイマー病（ＡＤ）（ＢｈａｔおよびＢｕｄｄ、２００２；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ他、２００２；Ｌｕｃａｓ他、２００１；Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ他、１９９２）を含むいくつかのＣＮＳ障害および神経変性疾患に関係している。
【００１５】
近年の研究では、ＧＳＫ−３が、発達（Ｈｅ他、１９９５）、腫瘍形成（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ他、１９９６）およびタンパク質合成（Ｗｅｌｓｈ他、１９９３）を含むさらなる細胞応答に関与していることがさらに明らかにされている。重要なことは、ＧＳＫ−３はこれらの経路において負の役割を果たしている。このことはさらに、ＧＳＫ−３がシグナル伝達経路における細胞阻害剤であることを示唆している。
【００１６】
様々なシグナル伝達経路におけるＧＳＫ−３の広範囲な関わりに照らして、ＧＳＫ−３の特異的な阻害剤の開発は、基礎研究においてだけでなく、様々な治療的介入において重要な意味を有する。
【００１７】
上記で述べられるように、一部の気分安定化剤は、ＧＳＫ−３を阻害することが見出されていた。しかしながら、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）によるＧＳＫ−３の阻害（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／４１８５４）およびプリン系阻害剤によるＧＳＫ−３の阻害（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９８／１６５２８）の両方が報告されているが、これらの阻害剤はＧＳＫ−３について特異的ではない。実際に、これらの薬物は多数のシグナル伝達経路に影響を及ぼし、イノシトールモノホスファターゼ（ＩＭｐａｓｅ）およびヒストンデアセチラーゼなどの他の細胞標的を阻害することが示された（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ他、１９８９；ＰｈｉｅｌおよびＫｌｅｉｎ、２００１）。
【００１８】
同様に、処理されたｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）（ＧＳＫ−３の知られている基質）が、他の潜在的なＧＳＫ−３ペプチド阻害剤（Ｆｉｏｌ他、１９９０）に加えて記載されている（Ｆｉｏｌ他、１９９４）。しかしながら、これらの基質もまた、ＧＳＫ−３活性を表面的に阻害しているにすぎない。
【００１９】
他のＧＳＫ−３阻害剤が最近になって報告された。ＧＳＫ−３を特異的に阻害する２つの構造的に関連する小分子（ＳＢ−２１６７６３およびＳＢ−４１５２８６）（Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が開発され、これらは、グリコーゲン代謝および遺伝子転写を調節すること、ならびに、ＰＩ３キナーゼ活性の低下により誘導されるニューロン死から保護することが示された（Ｃｒｏｓｓ他、２００１；Ｃｏｇｈｌａｎ他、２０００）。別の研究では、インジルビン（慢性骨髄性白血病に対する漢方の有効成分）がＧＳＫ−３阻害剤であることが示された。しかしながら、インジルビンはまた、サイクリン依存性プロテインキナーゼ−２（ＣＤＫ−２）を阻害する（Ｄａｍｉｅｎｓ他、２００１）。これらのＧＳＫ−３阻害剤はＡＴＰ競合性であり、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングによって同定された。ＡＴＰ競合性阻害剤の大きな欠点はその限られた特異性であることが一般に受け入れられている（Ｄａｖｉｅｓ他、２０００）。
【００２０】
従って、サイズが小さく、特異性が大きく、かつ、非常に効果的なＧＳＫ−３のペプチド阻害剤であって、ＧＳＫ−３活性に関連する状態（例えば、ＩＩ型糖尿病、神経変性障害および情動障害など）を治療することにおいて有用である、上記の制限を有さない阻害剤が必要であることが広く認識されており、従って、そのようなＧＳＫ−３阻害剤を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２１】
本発明を考案しているとき、ＧＳＫ−３の基質に由来するポリペプチド（好ましくは、短いポリペプチド）と、疎水性成分とのコンジュゲートが、ＧＳＫ−３の特異的かつ効果的な阻害を発揮し、また、増強された細胞透過性によってさらに特徴づけられることが仮定された。
【００２２】
本発明を実行に移す際、本明細書で下記において詳しく記載されるように、そのようなコンジュゲートはＧＳＫ−３活性を特異的かつ効果的に阻害し、その結果として、様々な治療的活性を発揮することが実際に見出された。
【００２３】
従って、本発明の１つの態様によれば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の活性を阻害することができるコンジュゲートが提供される。この場合、コンジュゲートは、
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含む：
2006514104.tif 000002
式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である。
【００２４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの疎水性成分がポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合し、好ましくはポリペプチドのＮ末端に結合する。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含み、それにより、疎水性ペプチド配列は、好ましくは、アラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの疎水性成分は、少なくとも１つのアミノ酸残基に好ましくは結合する脂肪酸を含む。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、脂肪酸は、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択され、好ましくはミリスチン酸である。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｘ３は、グルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基であり、Ｚはアラニン残基であり、かつ／または、ｎは１〜１５の整数であり、好ましくは１〜１０の整数である。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、ＧＳＫ−３の活性を阻害する方法であって、ＧＳＫ−３を発現する細胞を本明細書中上記で記載されたコンジュゲートの効果的な量と接触させることを含む方法が提供される。
【００３１】
活性はリン酸化活性および／または自己リン酸化活性である。細胞を接触させることはインビトロまたはインビボで達成することができる。
【００３２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法はさらに、前記細胞を、ＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分と接触させることを含む。
【００３３】
さらなる活性な成分はインスリンであり得るか、または、ＧＳＫ−３の活性を阻害することができる任意の活性な成分、例えば、限定されないが、リチウム、バルプロ酸およびリチウムイオンなどであり得る。
【００３４】
あるいは、さらなる活性な成分は、ＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる活性な成分、例えば、ポリヌクレオチド、より好ましくは、細胞内でのＧＳＫ−３  ｍＲＮＡの分解を生じさせるために向けられた小さい干渉性ポリヌクレオチド分子などであり得る。
【００３５】
小さい干渉性ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、リボザイム分子およびＤＮＡザイム分子からなる群から選択することができる。
【００３６】
本発明のさらに別の態様によれば、インスリンシグナル伝達を強化する方法であって、インスリン応答性細胞を本明細書中上記で記載された本発明のコンジュゲートの効果的な量とインビトロまたはインビボで接触させることを含む方法が提供される。
【００３７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法はさらに、前記細胞をインスリンと接触させることを含む。
【００３８】
本発明のさらに別の態様によれば、ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態を治療する方法であって、その必要性のある対象に本発明のコンジュゲートの治療効果的な量を投与することを含む方法が提供される。
【００３９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、生物学的状態は、肥満、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性状態、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および精神病的な疾患または障害からなる群から選択される。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、情動障害は、単極型障害（例えば、うつ病）および双極性障害（例えば、躁うつ病）からなる群から選択される。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、神経変性障害は、脳虚血、発作、外傷性脳傷害および細菌感染からなる群から選択される事象から生じる。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、神経変性障害は慢性の神経変性障害であり、好ましくは、アルツハイマー病、ハンチングトン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＭＬ）および多発性硬化症からなる群から選択される疾患から生じる慢性の神経変性障害である。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、精神病的障害は統合失調症である。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明のこの態様による方法はさらに、本明細書中上記で記載されるようにＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分を対象に同時投与することを含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、活性な成分としての本発明のコンジュゲートと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物はさらに、本明細書中上記で記載されるようにＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分を含むことができる。
【００４６】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、本明細書中上記において詳しく記載されるように、ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態の治療における使用のために、包装用材料に詰められ、包装用材料の表面またはその中での活字で識別される。
【００４７】
特許請求される医薬組成物は、エアロゾル、水溶液、ボーラス剤、カプセル、コロイド、遅延放出剤、デポー剤、溶解可能な粉末、滴剤、エマルション、侵食性インプラント、ゲル、ゲルカプセル、顆粒剤、注射液、摂取可能な溶液、吸入可能な溶液、ローション、オイル溶液、ピル、坐薬、膏薬、懸濁物、持続放出剤、シロップ、錠剤、チンキ剤、局所用クリーム、経皮送達形態からなる群から選択される送達形態物に配合することができる。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書中上記で記載されたコンジュゲートを製造するプロセスであって、本明細書中上記で記載されたポリペプチドを提供すること、本明細書中上記で記載された少なくとも１つの疎水性成分を提供すること、および、少なくとも１つの疎水性成分とポリペプチドとをコンジュゲート化することを含むプロセスが提供される。
【００４９】
ポリペプチドを提供することは、ポリペプチドを化学合成することによって、または、ポリペプチドを組換え製造することによって達成することができる。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、情動障害を治療する方法であって、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の治療効果的な量をその必要性のある対象に投与することを含む方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらなる態様によれば、対象の海馬におけるβ−カテニンの濃度をアップレギュレーションする方法であって、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の効果的な量を対象に投与することを含む方法が提供される。
【００５２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、化合物は、本明細書中上記で記載されるようなアミノ酸配列
2006514104.tif 000003
を有するポリペプチドである。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ポリペプチドはさらに、本明細書中上記で記載されるように、ポリペプチドに結合する少なくとも１つの疎水性成分を含む。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、化合物は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５６】
本発明は、ＧＳＫ−３活性を非常に特異的かつ効果的な様式で阻害することができ、従って、様々な生物学的状態の治療において効率的に使用することができる新規なコンジュゲートを提供することによって、現在知られている形態の欠点を対処することに成功している。
【００５７】
別途に定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００５８】
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図面の簡単な記述
図１はリン酸化ペプチド阻害剤のＨＺ１３（図１ａ）、ｐＡＨＳＦおよびＬ８０３（図１ｂ）のＧＳＫ−３阻害活性を明らかにするプロットを示す。ＰＧＳ−１ペプチド基質をリン酸化するＧＳＫ−３の能力が、示された濃度のペプチド阻害剤の存在下で測定された。結果は、ペプチド阻害剤が省かれたコントロールのインキュベーションでのＧＳＫ−３活性の百分率を表す。結果は、それぞれの点が三連で測定された３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
図２は示された濃度におけるＬ８０３によるＧＳＫ−３の阻害を表し、このＧＳＫ−３ペプチド阻害剤が競合的かつ特異的な阻害剤であることを明らかにするラインウィーバー・バークプロットである。結果はＰＧＳ−１ペプチド基質へのリン酸取込み（ＣＰＭ）を表す。結果は４つのうちの１つの代表的な実験を示す。それぞれの点は二連サンプルの平均値である。計算されたＫｉは７０±１０μＭである。
図３はＬ８０３−ｍｔｓ（本発明によるコンジュゲートの代表例）の速度論的分析を明らかにするプロットを示す（図３ａ〜図３ｂ）。図３ａは、Ｌ８０３−ｍｔｓのＧＳＫ−３阻害活性を明らかにするプロットを示す。ＰＧＳ−１ペプチド基質をリン酸化するＧＳＫ−３の能力が、示された濃度のＬ８０３−ｍｔｓの存在下で測定された。結果は、ペプチド阻害剤が省かれたコントロールのインキュベーションでのＧＳＫ−３活性の百分率を表す。結果は、それぞれの点が三連でアッセイされた２回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。図３ｂは、示された濃度におけるＬ８０３−ｍｔｓによるＧＳＫ−３の阻害を表すラインウィーバー・バークプロットを示す。結果はＰＧＳ−１ペプチド基質へのリン酸取込み（ＣＰＭ）を表す。結果は３つのうちの１つの代表的な実験を示す。それぞれの点は二連サンプルの平均値である。
図４はインビトロでのＧＳＫ−３活性に対するＬ８０３−ｍｔｓおよびｃｐＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする比較プロットを示す。ＰＧＳ−１ペプチド基質をリン酸化する精製された組換えＧＳＫ−３βの能力が、示された濃度のＬ８０３−ｍｔｓ（黒丸）または変性処理コントロールペプチドｃｐＬ８０３−ｍｔｓ（ｃｐ、白丸）の存在下で測定された。結果はペプチド阻害剤の非存在下でのＧＳＫ−３活性の百分率を表す。結果は、それぞれの点が三連でアッセイされた３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
図５は無傷の細胞におけるＬ８０３−ｍｔｓのＧＳＫ−３阻害活性を明らかにする比較プロットおよび棒グラフを示す（それぞれ、図５ａ〜図５ｂ）。ＨＥＫ２９３細胞が、示された濃度で２．５時間、Ｌ８０３−ｍｔｓまたはコントロールペプチドのＬＥ８０３−ｍｔｓもしくはＬＳ８０３−ｍｔｓで処理され、その後、溶解物上清がグリコーゲンシンターゼ活性についてアッセイされた。ビヒクルのみ（０．１％ＤＭＳＯ）で処理された細胞におけるグリコーゲンシンターゼの活性が１ユニットに正規化され、Ｌ８０３−ｍｔｓで処理された細胞（黒丸）、ならびに、そのそれぞれのコントロールのＬＥ８０３−ｍｔｓで処理された細胞（白丸）およびＬＳ８０３−ｍｔｓで処理された細胞（ｘ付き丸）において観測されたグリコーゲンシンターゼ活性に対する値が、ビヒクルのみで処理された細胞に対する刺激倍数として図５ａに示される。データは、それぞれの点が二連でアッセイされた３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。＊は、コントロールペプチドで処理された細胞において得られた値よりも有意に大きい値であることを示す。図５ｂは、ＬＥ８０３−ｍｔｓおよびＬＳ８０３−ｍｔｓ（それぞれ５０μＭ）の阻害活性と比較して、Ｌ８０３−ｍｔｓによる精製ＧＳＫ−３βの阻害活性を示す。
図６はインスリンの非存在下（図６ａ）および存在下（図６ｂ）におけるグルコース取り込みに対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにするプロットを示す。脂肪細胞をマウスの精巣上体脂肪組織から得て、Ｌ８０３−ｍｔｓと７５分間インキュベーションした。細胞内へのグルコース取り込みが、［３Ｈ］２−デオキシグルコースを用いてアッセイされた。コントロールペプチドＬＥ８０３−ｍｔｓで処理された脂肪細胞において観測された相対的な［３Ｈ］２−デオキシグルコース取り込みが１ユニットに正規化された。ＬＥ８０３−ｍｔｓで処理された脂肪細胞における［３Ｈ］２−デオキシグルコースについて得られた値が、コントロールペプチドで処理された細胞に対する活性化倍率として図６ａに示され、値は、それぞれの点が三連でアッセイされた５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。＊は、得られた値がコントロールよりも有意に大きいことを示す。別の実験において、脂肪細胞が、示された濃度で３０分間、Ｌ８０３−ｍｔｓの存在下または非存在下処理され、その後、インスリン（５ｎＭ）がさらに１時間加えられた。細胞内へのグルコース取り込みが、［３Ｈ］２−デオキシグルコースを用いてアッセイされた。結果が、インスリンで処理された細胞（１ユニットに正規化された）に対するＬ８０３−ｍｔｓで処理された細胞におけるグルコース取り込みの活性化倍率として図６ｂに示され、値は、それぞれの点が三連でアッセイされた４回の実験の平均値±ＳＥＭである。＊は、得られた値が、インスリンのみで処理された細胞よりも有意に大きいことを示す。
図７は糖耐性に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする比較プロットを示す。絶食させたマウスに、Ｌ８０３−ｍｔｓまたはＬＥ８０３−ｍｔｓがグルコース注射の１時間前に腹腔内注射された。血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）濃度が、示された時点で測定された。結果は、Ｌ８０３−ｍｔｓで処置された１２匹の動物の平均値±ＳＥＭ（黒丸）、またはコントロールペプチドＬＥ８０３−ｍｔｓで処置された９匹の動物の平均値±ＳＥＭ（白丸）である。＊は、得られた値が、コントロールペプチドで処置された動物の糖耐性よりも有意に低いことを示す。
図８は糖尿病マウスにおける糖耐性に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする比較プロットを示す（図８ａ〜図８ｂ）。６時間絶食させた後、ＨＦマウスに、Ｌ８０３−ｍｔｓ（黒丸）またはＬＥ８０３−ｍｔｓ（白丸）がグルコース注射（１ｍｇ／ｋｇ）の９０分前に腹腔内注射され、血中グルコース濃度が、示された時点で測定された（図８ａ）。結果は１０匹の動物の平均値±ＳＥＭを表す。＊は、得られた値が、コントロールペプチドで処置された動物よりも有意に低いことを示す。各群におけるグルコース注射時（時間＝０）に測定された血中グルコース濃度の百分率が図８ｂに示される。
図９は強制された泳ぎ試験における動物の行動に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を、示されるようなＬ８０３−ｍｔｓまたはｓｃＬ８０３−ｍｔｓ（ｃｐ）の投与後の１時間、３時間および１２時間における、強制された泳ぎ試験に供された動物の示された数から得られた不動性の平均値±ＳＥとして明らかにするグラフである。＊ｐ＜０．０５。
図１０はＬ８０３−ｍｔｓまたはｓｃＬ８０３−ｍｔｓ（ｃｐ）の投与後の１時間、３時間および１２時間においてマウス海馬におけるβ−カテニン濃度に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする棒グラフを示す。海馬組織抽出物を、下記に記載されるように調製し、等量のタンパク質アリコートをゲル電気泳動に供し、β−カテニンに対する抗体を用いて免疫ブロットした。棒グラフは、示された数の海馬から得られたβ−カテニンのデンシトメトリー分析を示し、平均値±ＳＥを表す。＊はｐ＜０．０５を示す。それぞれの時点において、ｃｐ治療動物（レーン１〜４）またはＬ８０３−ｍｔｓ治療動物（レーン５〜８）から得られたβ−カテニンの代表的なゲルが示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本発明は、ＧＳＫ−３活性を阻害することができ、従って、ＧＳＫ−３により媒介される生物学的状態の治療において使用することができる新規なコンジュゲートに関する。具体的には、本発明は、（ｉ）ポリペプチド成分および疎水性成分を含むコンジュゲート、（ｉｉ）前記コンジュゲートを製造するプロセス、（ｉｉｉ）前記コンジュゲートを含有する医薬組成物、（ｉｖ）ＧＳＫ−３活性を阻害するために、インスリンシグナル伝達を強化するために、また、海馬におけるβ−カテニンの濃度をアップレギュレーションするために前記コンジュゲートを使用する方法、（ｖ）肥満、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性状態、情動障害、神経変性疾患および神経変性障害、ならびに精神病的な疾患または障害（これらに限定されない）などの生物学的状態の治療において前記コンジュゲートを使用する方法に関する。
【００６０】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良く理解され得る。
【００６１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００６２】
本発明は、ＧＳＫ−３の認識モチーフに由来する比較的短いペプチドが酵素阻害剤として役立ち得るという考えに基づいている。この考えはまた、国際特許出願公開ＷＯ０１／４９７０９および米国特許出願公開第２００２０１４７１４６Ａ１号（これらは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）に広く教示されるように、ＧＳＫ−３が特異な認識モチーフを有し、従って、このモチーフを参照して設計される短いペプチドは非常に特異的なＧＳＫ−３阻害剤であるという知見に基づいている。
【００６３】
ＧＳＫ−３の特異な認識モチーフは、配列番号１９に示されるが、ＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｓ（ｐ）［式中、Ｓはセリンまたはトレオニンであり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれが任意のアミノ酸であり、Ｓ（ｐ）はリン酸化セリンまたはリン酸化トレオニンである］である。この認識モチーフに基づいて、様々なパラメーター（例えば、長さ、リン酸化、配列など）が互いに異なる１組のペプチドが設計され、合成され、ＧＳＫ−３の基質または阻害剤のいずれかとしてのそれらの活性について試験された（例えば、下記の実施例の節における表３および付随する説明を参照のこと）。
【００６４】
これらの実験に基づいて、ペプチドを効率的なＧＳＫ−３阻害剤にする数多くの特徴が明らかにされている。例えば、モチーフにおけるリン酸化されたセリン残基またはトレオニン残基は結合のために必要であることが見出された。この残基がない場合、ペプチドは基質または阻害剤のいずれでもない。リン酸化されたセリン残基（またはトレオニン残基）の上流に存在するセリン残基（またはトレオニン残基）が３つのさらなる残基によって隔てられる場合、ペプチドはＧＳＫ−３の基質になり、これに対して、このセリン残基またはトレオニン残基が任意の他のアミノ酸（好ましくは、アラニン）によって置換されると、基質はＧＳＫ−３の阻害剤に変換されることがさらに明らかにされた。これら３つのアミノ酸（上記配列においてＸ１Ｘ２Ｘ３として示される）の性質はまた、本明細書中下記の実施例の節において詳しく記載されるように、ペプチドの阻害活性に影響することが見出された。１つの具体的な例では、Ｘ３残基としてグルタミン酸の存在は、多くのＧＳＫ−３基質において検出されるが、ペプチドの阻害活性を低下させ、従って、グルタミン酸以外の任意のアミノ酸をＸ３位置に有することが好ましいことが見出された。認識モチーフの外側におけるさらなる残基の数はペプチドの阻害能に影響し、その結果、例えば、７個〜５０個（好ましくは７個〜２０個、より好ましくは１０個〜１３個）のアミノ酸残基の総数が好ましいことがさらに見出された。
【００６５】
従って、下記の実施例の節においてさらに記載および説明されるように、下記のアミノ酸配列：
2006514104.tif 000004
（式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である）
を有するポリペプチドは、ＧＳＫ−３の非常に効率的かつ特異的な阻害剤であることが見出された。
【００６６】
好ましいポリペプチドは、アラニン残基をＺ位に有し、グルタミン酸以外の任意のアミノ酸残基をＸ３として有し、かつ／または、ｎが１〜１５（好ましくは１〜１０）に等しいように、７個〜２０個のアミノ酸残基（好ましくは１０個〜１３個のアミノ酸残基、より好ましくは１０個〜１１個のアミノ酸残基）を有するポリペプチドであることがさらに見出された。
【００６７】
これらのポリペプチド阻害剤の効力および特異性は、これまでのところ、インビトロ試験において明らかにすることに成功している。しかしながら、これらの阻害剤の効力をインビボ試験において評価することを目指しているとき、上記のポリペプチドに疎水性成分を結合することにより、その膜透過性が高まることが、本発明者によって仮説として考えられた。この仮説を実行に移しているとき、驚くべきことに、上記のポリペプチド阻害剤と、ポリペプチドのＮ末端において結合した、疎水性成分としての脂肪酸とのコンジュゲートが、疎水性成分を有しない対応するポリペプチドよりも大きい、ＧＳＫ−３活性の阻害を発揮することが、インビトロ試験およびインビボ試験の両方において見出された。
【００６８】
従って、本発明の１つの態様によれば、ＧＳＫ−３の活性を阻害することができる本明細書中上記で記載されたポリペプチドと、疎水性成分とのコンジュゲートが提供される。
【００６９】
より具体的には、本発明のコンジュゲートは、
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド：
2006514104.tif 000005
（式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である）、および
（ｂ）ポリペプチドに結合している１つまたは複数の疎水性成分
を含む。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、全長タンパク質またはその一部分を含めて任意の長さのアミノ酸配列を示し、この場合、アミノ酸残基は共有結合のペプチド結合によって連結される。好ましくは、本発明のポリペプチドは、７個〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは７個〜２０個のアミノ酸残基、より好ましくは１０個〜１３個のアミノ酸残基）を有する比較的短いポリペプチドであり、従って、本明細書中では交換可能に「ペプチド」と呼ばれる。
【００７１】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」は、天然型ペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチド、または組換えペプチドのいずれか）およびペプチド模倣体（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、ならびに、ペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイド（これらは、例えば、体内に存在している間はペプチドをより安定にする修飾、または、細胞内に浸透することをより可能にする修飾を有し得る）を包含する。そのような修飾には、限定されないが、Ｎ末端での修飾、Ｃ末端での修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれる。ペプチド模倣体化合物を調製するための様々な方法がこの分野では広く知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．、第１７．２章、Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるかのように参考として組み込まれる）。これに関連してさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【００７２】
好ましくは、本発明のペプチドは、合成的に合成されたペプチドである。
【００７３】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキルであり、例えば、メチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン性二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、自然の状態では炭素原子上に存在する「通常の」側鎖である）によって置換することができる。
【００７４】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに同時に数個（２個〜３個）でさえも、存在させることができる。
【００７５】
本明細書中で使用される表現「アミノ酸残基」は、本明細書中では交換可能に「アミノ酸」とも呼ばれるが、ポリペプチド鎖内のアミノ酸ユニットを記載する。本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残基は天然アミノ酸残基または修飾アミノ酸残基（これらの表現は本明細書中下記で定義される）のいずれでも可能である。
【００７６】
本明細書中で使用される表現「天然アミノ酸残基」は、自然界に見出される２０個のアミノ酸のいずれかを含むアミノ酸残基（この用語は本明細書中上記で定義される）を記載する。
【００７７】
本明細書中で使用される表現「修飾アミノ酸残基」は、その側鎖での修飾を受けた天然アミノ酸を含むアミノ酸残基（この用語は本明細書中上記で定義される）を記載する。そのような修飾はこの分野では広く知られており、これらには、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基およびリン酸基（これらに限定されない）などの機能性基の側鎖内における取り込みが含まれる。従って、この表現は、別途具体的に示されない限り、アミノ酸アナログ（例えば、ペニシラミン、３−メルカプト−Ｄ−バリンなど）を含む化学修飾されたアミノ酸、天然に存在するタンパク質非形成性のアミノ酸（例えば、ノルロイシンなど）、および、アミノ酸の特徴であることがこの分野で知られている性質を有する化学合成された化合物が含まれる。用語「タンパク質非形成性」は、アミノ酸が、広く知られている代謝経路によって細胞においてタンパク質に取り込まれ得ないことを示す。
【００７８】
従って、本明細書中で使用される用語「アミノ酸（“ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ”または“ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ”）」は、２０個の天然に存在するアミノ酸；多くの場合にはインビボで翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（これらには、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンが含まれる）；および他の非通常型アミノ酸（これには、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない）を包含することが理解される。さらに、用語「アミノ酸」は、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つのさらなるアミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログによって連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を包含する。
【００７９】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸（表１）、および非通常型アミノ酸または修飾アミノ酸（表２）が示される
【表１】
2006514104.tif 000006
【表２】
2006514104.tif 000007
2006514104.tif 000008
2006514104.tif 000009
【００８０】
本発明のペプチドは好ましくは線状形態で利用される。しかし、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合には、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。
【００８１】
環状ペプチドは環状形態で合成することができ、または、所望される条件（例えば、生理学的条件）のもとで環状形態を取るようにすることができる。
【００８２】
例えば、本発明の教示によるペプチドは、コアペプチド配列の両側に存在する少なくとも２つのシステイン残基を含むことができる。この場合、環化を、これら２つのＣｙｓ残基の間におけるＳ−Ｓ結合を形成することによって生じさせることができる。側鎖対側鎖の環化はまた、式−（−ＣＨ２−）ｎ−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ−（式中、ｎ＝１または２）の相互作用結合の形成によって生じさせることができ、これは、例えば、ＣｙｓまたはホモＣｙｓを取り込み、そのフリーのＳＨ基を、例えば、ブロモアセチル化されたＬｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｂまたはＤａｐと反応することによって可能である。さらに、環化は、例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）を鎖内の様々な位置に取り込むことによる、例えば、アミド結合の形成（−ＣＯ−ＮＨ−結合または−ＮＨ−ＣＯ−結合）によって得ることができる。骨格対骨格の環化もまた、式Ｈ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨまたは式Ｈ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＮＨ２）（式中、ｎ＝１〜４であり、さらに、Ｒはアミノ酸の任意の天然側鎖または非天然側鎖である）の修飾アミノ酸を取り込むことによって得ることができる。
【００８３】
本発明のペプチドは、好ましくは、非常に重要なアミノ酸モチーフＺＸ１Ｘ２Ｘ３Ｓ（ｐ）の構造的特徴を模倣するペプチド模倣体（この用語は本明細書中上記で定義される）である。
【００８４】
タンパク質のリン酸化は細胞活動の生化学的制御において極めて重要な役割を果たしている。リン酸化は、通常、リン酸（ＰＯ４）基と、ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有するアミノ酸（チロシン、セリンおよびトレオニン）との間でのリン酸エステル結合の形成を意味する。タンパク質における多くのリン酸化部位が、他のタンパク質に結合するための認識エレメントとして作用し、そのような結合事象により、シグナル伝達および他の経路が活性化または脱活性化される。従って、タンパク質のリン酸化は、生化学的なシグナル伝達をオンおよびオフするためのスイッチとして作用する。
【００８５】
ホスホペプチド模倣体は、リン酸化されたチロシン、セリンおよびトレオニンのアナログを含有するペプチド模倣体のサブクラスである。リン酸エステルは、様々な酵素によって加水分解され得るので、リン酸化シグナルを止める。しかしながら、ホスホペプチド模倣体は、通常、不活性化を妨げるために非加水分解性のアナログを含有する（Ｂｕｒｋｅ他、１９９４ａ；Ｂｕｒｋｅ他、１９９６ａ；Ｃｈｅｎ他、１９９５；Ｗｉｅｍａｎｎ他、２０００；Ｓｈａｐｉｒｏ他、１９９７；Ｏｔａｋａ他、１９９５；Ｏｔａｋａ他、２０００）。この分野におけるホスホペプチド模倣体の一般的な例には、ＳＨ２ドメインアナログ（Ｂｕｒｋｅ他、１９９４ａ；Ｆｕ他、１９９８；Ｇａｏ他、２０００；Ｍｉｋｏｌ他、１９９５；Ｙｅ他、１９９５）、転写因子ＮＦ−（κ）Ｂアナログ（ＭｃＫｉｎｓｅｙ他、１９９７）、Ｐ５３アナログ（Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ他、２０００）、および、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤（Ｂｕｒｋｅ他、１９９４ｂ；Ｂｕｒｋｅ他、１９９６ｂ；Ｇｒｏｖｅｓ他、１９９８；Ｋｏｌｅ他、１９９５；Ｋｏｌｅ他、１９９７；Ｒｏｌｌｅｒ他、１９９８）が含まれる。
【００８６】
市販のソフトウエアパッケージを、ホスホセリンまたはホスホトレオニンのアナログ（好ましくは、非加水分解性のアナログ）を含有する小さいペプチドおよび／またはペプチド模倣体を特異的なアンタゴニスト／阻害剤として設計するために使用することができる。結晶構造を分析し、小さいペプチドおよびペプチド模倣体を設計および最適化するための好適な市販のソフトウエアには、高分子Ｘ線結晶学ＱＵＡＮＴＡ環境（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；ＴｅＸｓａｎ、ＢｉｏｔｅＸおよびＳＱＵＡＳＨ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；およびＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｃｒｙｏｓｔｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明によるペプチドにはさらに、ペプチドの塩および化学的誘導体を含むことができる。本明細書中で使用される表現「化学的誘導体」は、１つまたは複数の残基が側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化されている本発明のポリペプチドを記載する。そのような誘導体化された分子には、例えば、フリーのアミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように誘導体化されているそのような分子が含まれる。フリーのカルボキシル基を、塩、メチルエステルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルあるいはヒドロラジドを形成するように誘導体化することができる。フリーのヒドロキシル基を、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化することができる。化学的誘導体としてまた、２０個の標準的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体の１つまたは複数を含有するそのようなペプチドが含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに使用することができる；５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに使用することができる；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに使用することができる；ホモセリンをセリンの代わりに使用することができる；オルニチンをリシンの代わりに使用することができる。化学的誘導体には、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に変える、官能基における変化は含まれない。
【００８８】
本明細書中上記で述べられるように、いくつかの有用な修飾が、溶液中におけるペプチドの安定性を増大させるために設計され、従って、溶液中におけるペプチドの半減期、特に、血液中でのタンパク質分解活性を阻止することによって、生物学的流体、例えば、血液、血漿または血清などにおけるペプチドの半減期を延ばすために役立つ。従って、本発明のペプチドは安定化基を一方の末端または両方の末端に有することができる。典型的な安定化基には、アミド、アセチル、ベンジル、フェニル、トシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ベンジルオキシカルボニルおよび同様な末端基修飾が含まれる。さらなる修飾には、「Ｌ」アミノ酸を末端において「Ｄ」アミノ酸の代わりに使用すること、ペプチド阻害剤の環化、および、エキソペプチダーゼ活性を阻害するための、アミノ末端またはカルボキシ末端ではなくアミド末端が含まれる。
【００８９】
本発明のペプチドはグリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されなくてもよい。本発明のペプチドは、例えば、ペプチド合成技術によって直接的に合成されるとき、または、組換えポリヌクレオチドで形質転換された原核生物細胞において産生されるときにはグリコシル化されない。真核生物により産生されるペプチド分子は典型的にはグリコシル化される。
【００９０】
本発明によるペプチドの非限定的な例には、リン酸化セリンまたはリン酸化トレオニンから上流側４番目の位置（上記のアミノ酸配列においてＺとして示される）に存在するセリンまたはトレオニンの置換を除いて既知のＧＳＫ−３基質の配列を維持するペプチドが含まれる。好ましくは、Ｚはアラニンである。阻害剤が由来する既知の基質がＣＲＥＢタンパク質であるとき、ペプチドの最小サイズは１０残基であり、この場合、さらなる３つの残基はすべてがＺの上流側に存在する。同様に、ペプチドが由来する基質が熱ショック因子−１（ＨＳＦ−１）であるとき、ペプチドにおける最少残基数は７よりも大きくなければならない。また、本発明による好ましいペプチドはＸ３位にグルタミン酸を含まない。
【００９１】
本発明による好ましいポリペプチドは、配列番号５、配列番号８または配列番号９に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００９２】
本明細書中で使用される表現「疎水性成分」は、疎水性によって特徴づけられる任意の物質またはその残基を示す。この分野では広く受け入れられているように、用語「残基」は、別の物質（本明細書中では、本明細書中上記で記載されるポリペプチド）に共有結合的に連結される物質の主要な部分を記載する。
【００９３】
従って、本発明による疎水性成分は、好ましくは、疎水性物質の残基であり、本明細書中上記で記載されるポリペプチドに共有結合的に結合する。しかしながら、本発明の疎水性成分は任意の他の相互作用（例えば、静電的相互作用およびファンデルワールス相互作用など）によってポリペプチドに結合し得ることが理解される。
【００９４】
本発明の疎水性成分が由来し得る疎水性物質の代表的な例には、限定されないが、置換および非置換の飽和および不飽和の炭化水素（この場合、炭化水素は、脂肪族化合物、脂環族化合物または芳香族化合物であり得るし、好ましくは少なくとも４個の炭素原子、より好ましくは少なくとも８個の炭素原子、より好ましくは少なくとも１０個の炭素原子を含む）が含まれる。好ましくは、炭化水素は、アミノ酸残基へのその結合を可能にする官能基を有する。そのような官能基の代表的な例には、限定されないが、フリーのカルボン酸（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、フリーのアミノ基（ＮＨ２）、エステル基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、アシルハリド基（Ｃ（＝Ｏ）Ａ、式中、Ａは、フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージドである）、ハリド（フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージド）、ヒドロキシル基（ＯＨ）、チオール基（ＳＨ）、ニトリル基（Ｃ≡Ｎ）、フリーのＣ−カルバミン酸基（ＮＲ”−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれは独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、フリーのＮ−カルバミン酸基（ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’−、式中、Ｒ’は上記で定義される通りである）、チオニル基（Ｓ（＝Ｏ）２Ａ、式中、Ａは、上記で定義されるようなハリドである）などが含まれる。
【００９５】
従って、本発明の疎水性成分は、本明細書中上記で記載された疎水性物質の残基を含むことができる。
【００９６】
本発明の疎水性成分は、好ましくは、１つまたは複数の脂肪酸残基を含む。
【００９７】
本発明に関連して使用可能である好ましい脂肪酸には、１０個を超える炭素原子（好ましくは１２個〜２４個の炭素原子）を有する飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸が含まれ、例えば、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸など（これらに限定されない）が含まれ、ミリスチン酸が現在最も好ましい。
【００９８】
本発明による疎水性成分は、本質的には、上記に記載されるような脂肪酸残基または疎水性物質の任意の他の残基にすることができ、その結果、脂肪酸または任意の他の疎水性成分が（例えば、エステル結合またはアミド結合を介して）ポリペプチドのアミノ酸残基に直接、共有結合により結合するようになる。あるいは、疎水性成分は、本明細書中上記に記載されるような脂肪酸残基または疎水性物質の任意の他の残基を含むように修飾されているアミノ酸残基にすることができ、その結果、この修飾されたアミノ酸残基が、本明細書中上記に記載されるようにペプチド結合または置換ペプチド結合を介してポリペプチドに結合するようになる。さらにあるいは、疎水性成分は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、本明細書中上記に記載されるような脂肪酸残基または疎水性物質の任意の他の残基を含むように修飾されている短いペプチドにすることができる。そのようなペプチドは、好ましくは、２個〜１５個のアミノ酸残基を含み、本明細書中上記に記載されるようにペプチド結合または置換ペプチド結合を介してポリペプチドに結合する。
【００９９】
上記の疎水性成分の代わりとして、または、上記の疎水性成分との組合せで、本発明による疎水性成分は、疎水性ペプチド配列を含むことができる。本発明による疎水性ペプチド配列は、好ましくは２個〜１５個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは２個〜１０個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは２個〜５個のアミノ酸残基を含み、この場合、少なくとも１つのアミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基である。
【０１００】
疎水性アミノ酸残基の代表的な例には、限定されないが、本明細書中上記に記載されるように、アラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基、または、それらの任意の修飾体が含まれる。
【０１０１】
あるいは、疎水性アミノ酸残基は、それに対する疎水性成分の取り込みによって修飾されている任意の他のアミノ酸残基を含むことができる。
【０１０２】
いずれの場合でも、１つまたは複数の疎水性成分と、ポリペプチドとは、好ましくは、本発明の得られるコンジュゲートが７個〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは７個〜２０個のアミノ酸残基、より好ましくは１０個〜１３個のアミノ酸残基）を含むように選択される。
【０１０３】
本発明の疎水性成分（１つまたは複数）は、好ましくは、ポリペプチドの１つまたは複数の末端に、すなわち、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する。しかしながら、本明細書中上記で議論されるように、ポリペプチドのＣ末端は、酵素に対する結合において非常に重要な役割を果たしているリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基を含むので、疎水性成分をポリペプチドのＮ末端に結合することが好ましいと仮定された。
【０１０４】
実際に、下記の実施例の節において明らかにされるように、疎水性成分が本発明のポリペプチドのＮ末端に結合しているコンジュゲートは、非常に強力なＧＳＫ−３阻害剤であることが見出された。
【０１０５】
これらの結果は、Ｄａｊａｎｉ他（２００１）によって記載される、ＧＳＫ−３の最近発表された結晶化データによって説明することができる。Ｄａｊａｎｉ他の結晶化データは、ＧＳＫ−３が二量体として結晶化されることを示した。このことは、この二量体化が生物学的関連性を有することを示唆している。一方の単量体（ａ）の触媒作用領域（残基２１６〜２２０）が、もう一方の単量体（ｂ）のα−らせん（残基２６２〜２７３）のＮ末端と相互作用するようである。これら２つの単量体（ａ）および（ｂ）のこの相互作用は単量体（ｂ）において疎水性パッチを形成する。
【０１０６】
この結晶化データ、および、本発明者による驚くべき発見に基づいて、何らかの特定に理論に拘束されないが、本発明のコンンジュゲートの疎水性成分は単量体（ｂ）におけるこの疎水性パッチと相互作用し、その結果、ペプチド阻害剤とＧＳＫ−３との相互作用を改善し、これにより、増強された阻害効果を生じさせると考えられる。
【０１０７】
従って、本発明によれば、上記の疎水性成分のほかに、ＧＳＫ−３二量体の単量体（ｂ）における疎水性パッチと相互作用するために構造的に好適である任意の他の疎水性成分を上記のポリペプチドに結合することができる。
【０１０８】
下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明のコンジュゲートは、ＧＳＫ−３に対する大きい特異性および阻害効果の両方を示す。
【０１０９】
本明細書中上記で議論されるように、これらのコンジュゲートの特異性は、他のキナーゼとは異なり、リン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基を含むＧＳＫ−３の特異な認識モチーフに由来し、かつ、そのポリペプチド部分の配列がこの認識モチーフに基づくという事実に由来する。下記の実施例の節において明らかにされるように、この特徴により、本発明のコンジュゲートは基質競合性の阻害剤になり、従って、典型的なＡＴＰ競合性化合物である他のプロテインキナーゼ阻害剤と比較したとき、より特異的になる。
【０１１０】
本発明のコンジュゲートの大きい阻害活性は、Ｚ位におけるリン酸化残基の非リン酸化残基による置換（これにより、酵素はリン酸化において不活性になる）と、疎水性成分の取り込み（これは、コンジュゲートのより良好な膜透過性、ならびに、酵素の疎水性パッチとの良好な相互作用をもたらす）との両方に由来する。
【０１１１】
従って、本発明の別の態様によれば、ＧＳＫ−３の活性を阻害する方法が提供され、この方法は、ＧＳＫ−３を発現する細胞を本発明のコンジュゲートの効果的な量と接触させることによって達成される。
【０１１２】
本明細書中で使用される用語「効果的な量」は、ＧＳＫ−３の活性を阻害するために十分である、この分野で知られているような検討事項によって決定される量である。
【０１１３】
下記の実施例の節において明らかにされるように、代表例の本発明によるコンジュゲートは、ＧＳＫ−３を強く阻害し、インビトロでのキナーゼアッセイによって測定されたとき、約４０μＭのＩＣ５０値を有する。
【０１１４】
従って、本発明のコンジュゲートの効果的な量は、好ましくは、約１マイクロモル濃度〜約１００マイクロモル濃度の範囲であり、より好ましくは約１マイクロモル濃度〜約５０マイクロモル濃度の範囲であり、最も好ましくは約１マイクロモル濃度〜約２０マイクロモル濃度の範囲である。
【０１１５】
本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。
【０１１６】
下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように、本発明のコンジュゲートの阻害活性はインビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方において試験された。従って、本発明のこの態様による方法は、細胞をインビトロおよびインビボでコンジュゲートと接触させることによって達成することができる。
【０１１７】
本発明のコンジュゲートは、要求されるリン酸化残基を（Ｚ位に）含まないので、ＧＳＫ−３は、コンンジュゲートに結合している間、リン酸化反応において不活性にされる。従って、本発明のこの態様による方法は、好ましくは、ＧＳＫ−３のリン酸化活性および／または自己リン酸化活性の阻害に関する。
【０１１８】
本発明のこの態様による方法はさらに、本明細書中上記で記載されるように、細胞を、ＧＳＫ−３の活性を変化させることができるさらなる活性な成分と接触させることによって達成することができる。
【０１１９】
ＧＳＫ−３活性の阻害は、インスリン活性をインビボで増大させるための１つの方法である。ＧＳＫ−３の大きい活性は無傷の細胞におけるインスリン作用を弱める（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９７）。この低下は、インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）のセリン残基がＧＳＫ−３によりリン酸化されることから生じている。ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）患者において行われた研究では、グリコーゲンシンターゼ活性がこれらの患者では顕著に低下していること、および、インスリンによるプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（ＧＳＫ−３の上流側の調節因子）の低下した活性化もまた検出されることが示される（Ｓｈｕｌｍａｎ他（１９９０）；Ｎｉｋｏｕｌｉｎａ他（１９９７）；Ｃｒｏｓｓ他（１９９５））。高脂肪食により誘導される糖尿病および肥満に罹りやすいマウスは、精巣上体の脂肪組織におけるＧＳＫ−３活性が著しく増大している（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９９）。増大したＧＳＫ−３活性が細胞において発現することにより、グリコーゲンシンターゼ活性の抑制が生じていた（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、１９９６）。
【０１２０】
従って、ＧＳＫ−３活性の阻害は、インスリン依存性の状態においてインスリン活性を増大させるための有用な方法を提供する。この特徴は、本発明のコンジュゲートを用いた治療により、改善されたグルコース取り込みおよび糖耐性がもたらされたことを示す下記の実施例の節においてさらに明らかにされる。
【０１２１】
従って、本発明の別の態様によれば、インスリンシグナル伝達を強化する方法が提供され、この方法は、インスリン応答性細胞を、本発明のコンジュゲートの、本明細書中上記で定義されるような効果的な量と接触させることによって達成される。
【０１２２】
本明細書中で使用される表現「インスリンシグナル伝達を強化する」には、インスリン受容体の下流側成分のリン酸化の増大、および、非治療の対象または細胞におけるグルコース取り込みと比較されるようなグルコース取り込み速度の増大が含まれる。
【０１２３】
これに関連して行われた実験において（本明細書中下記における実施例の節を参照のこと）、次善最適な濃度のインスリンで処置された細胞において本発明のコンジュゲートの用量依存的な効果が存在することがさらに見出された。このことは、インスリンによるＧＳＫ−３阻害剤の潜在的な付加的な効果を示している。
【０１２４】
従って、本発明のこの態様による方法は、好ましくは、細胞をインビトロまたはインビボにおいて本発明のコンジュゲートとインスリンとの両方と接触させることによって達成される。
【０１２５】
本発明のコンジュゲートの投与から生じるインビボでのインスリンシグナル伝達の強化は、臨床的な終点としてモニターすることができる。原理的には、患者におけるインスリン強化を観察するための最も容易な方法は、グルコース負荷試験を行うことである。絶食後、グルコースが患者に与えられ、血液循環からのグルコースの消失（すなわち、細胞によるグルコース取り込み）が、この分野で広く知られているアッセイによって測定される。グルコースクリアランスの遅い速度（健康な対象と比較したとき）により、インスリン耐性が示される。インスリン耐性患者に対するＧＳＫ−３阻害剤（例えば、本発明によるコンジュゲートなど）の投与は、非治療の患者と比較したとき、グルコース取り込み速度を増大させる。コンジュゲートは、より長い期間にわたってインスリン耐性患者に投与することができ、血液循環におけるインスリン濃度、グルコース濃度およびレプチン濃度（通常、これらは高い）が測定され得る。グルコース濃度の低下は、コンジュゲートがインスリン作用を強化したことを示す。インスリン濃度およびレプチン濃度の低下は単独では、インスリン作用の強化を必ずしも示さないことがあるが、むしろ、他の機構による疾患状態の改善を示す。
【０１２６】
ＧＳＫ−３活性を強く阻害し、かつインスリンシグナル伝達を強化することによって、本発明のコンジュゲートは、ＧＳＫ−３に関連する任意の生物学的状態を治療するために効果的に利用することができる。
【０１２７】
従って、本発明の別の態様によれば、ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態を治療する方法が提供される。本発明のこの態様によるこの方法は、本明細書中上記で記載される本発明のコンジュゲートの治療効果的な量をその必要性のある対象に投与することによって達成される。
【０１２８】
本明細書中で使用される表現「ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態」は、正常なレベルまたは異常なレベルであっても、効果的なＧＳＫ−３活性が同定される任意の生物学的または医学的な状態または障害を包含する。そのような状態または障害は、ＧＳＫ−３活性によって引き起こされ得るか、または、ＧＳＫ−３活性によって単に特徴づけられ得る。状態がＧＳＫ−３活性に関連するということは、その状態の何らかの態様がＧＳＫ−３に活性に突き止められ得ることを意味する。
【０１２９】
本明細書中において、用語「治療する」は、状態または障害の進行を妨げること、実質的に阻害すること、遅くすること、または逆向きにすること、あるいは、状態または障害の臨床的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態または障害の臨床的症状の出現を実質的に妨げることを包含する。これらの効果は、本明細書中下記において詳しく記載されるように、例えば、ＩＩ型糖尿病に関してグルコース取り込み速度の低下によって、または、神経変性障害に関してニューロン細胞死を停止させることによって明らかにされ得る。
【０１３０】
本明細書中で使用される用語「投与する」は、本発明のコンジュゲートと、状態または障害によって影響を受けた細胞とを、コンジュゲートがこれらの細胞におけるＧＳＫ−３活性に影響を及ぼし得るような様式で一緒にするための方法を記述する。本発明のコンジュゲートは、医学的に許容され得る任意の経路によって投与することができる。投与経路は、治療されている疾患、状態または傷害に依存し得る。可能な投与経路には、注射、非経口経路、例えば、血管内、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、心室内、上皮内または脳室内などの経路、ならびに、経口、鼻腔、眼、直腸または局所的な経路よるもの、または吸入によるものが含まれる。持続放出投与もまた、デポー剤注射または侵食性インプラントのような手段によって、本発明において特に含まれる。投与はまた、関節内、直腸内、腹腔内、筋肉内、皮下であり得るか、またはエアロゾル吸入剤によって行われ得る。治療が全身的であるとき、コンジュゲートは、本明細書中下記において詳しく記載されるように、標的細胞内へのコンジュゲートの導入を達成するために好適な組成物で提供される限り、経口的または非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内または槽内など）に投与することができる。
【０１３１】
本明細書中で使用される表現「治療効果的な量」は、ＧＳＫ−３活性に関連する状態の進行を妨げるか、実質的に阻害するか、遅くするか、または逆向きにするために、あるいは、そのような状態の臨床的症状を実質的に改善するために、あるいは、そのような状態の臨床的症状の出現を実質的に妨げるために十分である、個体に投与される量を記述する。ＧＳＫ−３活性はＧＳＫ−３キナーゼ活性であり得る。阻害量は、ＧＳＫ−３活性の阻害を測定することによって直接的に決定することができ、または、例えば、所望される効果が、ＧＳＫ−３を含む経路におけるＧＳＫ−３活性の下流側の活性に対する効果である場合、阻害は、下流側の効果を測定することによって測定することができる。従って、例えば、ＧＳＫ−３の阻害がグリコーゲンシンターゼのリン酸化の停止を生じさせる場合、コンジュゲートの効果には、インスリン依存的経路またはインスリンに関係した経路に対する効果が含まれることがあり、コンジュゲートは、グルコース取り込みが最適なレベルに増大するところに対して投与することができる。また、ＧＳＫ−３の阻害が、さらなる生物学的活性のために要求されるタンパク質（例えば、タウタンパク質）のリン酸化の非存在を生じさせる場合、コンジュゲートは、リン酸化されたタウタンパク質の多量体化が実質的に停止されるまで投与することができる。従って、ＧＳＫ−３活性の阻害は、部分的には、ＧＳＫ−３活性を伴う阻害された経路またはプロセスの性質に依存し、また、ＧＳＫ−３活性の阻害が特定の生物学的状況において有する効果に依存する。
【０１３２】
阻害量を構成するコンジュゲートの量は、コンジュゲートおよびその効力、体内におけるコンジュゲートの半減期、治療されている疾患または生物学的状態の進行速度、治療用量または投与パターンに対する状態の応答性、配合、医学的状況の主治医による評価、および他の関連要因、ならびに一般には、患者の健康状態、および他の検討事項（例えば、他の治療剤の以前の投与、または、コンジュゲートの阻害活性に対する影響を有する何らかの治療剤の同時投与、または、ＧＳＫ−３活性に対する影響を有する何らかの治療剤の同時投与、またはＧＳＫ−３活性により媒介される経路など）のようなパラメーターに依存して変化する。
【０１３３】
阻害量は、日常的な試験によって決定され得る比較的広い範囲に含まれることが予想されるが、本発明による好ましい治療効果的な量は、約１０ｎｍｏｌ〜約１００ｎｍｍｏｌ（好ましくは約１０ｎｍｏｌ〜約５００ｎｍｏｌ、より好ましくは約１００ｎｍｏｌ〜約４００ｎｍｏｌ）の範囲にあるコンジュゲートの量を治療部位において達成するように選択される。
【０１３４】
本明細書中上記において詳しく議論されるように、ＧＳＫ−３は様々な生物学的経路に関与しており、従って、本発明のこの態様による方法は、本明細書中下記において詳しく記載されるように、様々な生物学的状態の治療において使用することができる。
【０１３５】
ＧＳＫ−３はインスリンシグナル伝達経路に関与しており、従って、一例において、本発明のこの態様による方法は、何らかのインスリン依存性の状態を治療するために使用することができる。
【０１３６】
ＧＳＫ−３阻害剤は、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を阻害することが知られているので、別の例では、本発明のこの態様による方法は、肥満を治療するために使用することができる。
【０１３７】
さらに別の例において、本発明のこの態様による方法は、糖尿病を治療するために、特にインスリン非依存性糖尿病を治療するために使用することができる。
【０１３８】
糖尿病は、インスリン不足またはインスリン耐性または両者を一般には伴う多数の発症要因による炭水化物代謝の不均一な一次障害である。Ｉ型（若年性）インスリン依存性糖尿病が、内因性インスリン分泌能力をほとんど有しない患者に存在する。これらの患者は極端な高血糖症を発症し、差し迫った生存のための外因性インスリン治療に完全に依存している。ＩＩ型または成人発症型またはインスリン非依存性の糖尿病が、ある程度の内因性インスリン分泌能力を保持する患者に存在する。しかし、その大多数はインスリン欠乏性およびインスリン耐性の両方である。合衆国における全糖尿病患者の約９５％はインスリン非依存性のＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を有しており、従って、これは、医学的問題の大部分を占める糖尿病形態である。インスリン耐性はＮＩＤＤＭの根本的な特有の特徴であり、この代謝性欠陥により、糖尿病症候群がもたらされる。インスリン耐性は、インスリン受容体の不十分な発現、低下したインスリン結合親和性、またはインスリンシグナル伝達経路に沿ったいずれかの段階における何らかの異常のためであり得る（米国特許第５８６１２６６号を参照のこと）。
【０１３９】
本発明のコンジュゲートは、下記のように、ＩＩ型糖尿病患者においてＩＩ型糖尿病を治療するために使用することができる。この場合、治療効果的な量のコンジュゲートが患者に投与され、臨床的マーカー（例えば、血糖濃度）がモニターされる。本発明のコンジュゲートはさらに、下記のように、対象においてＩＩ型糖尿病を防止するために使用することができる。この場合、予防効果的な量のコンジュゲートが患者に投与され、臨床的マーカー（例えば、ＩＲＳ−１のリン酸化）がモニターされる。
【０１４０】
糖尿病の治療は標準的な医学的方法によって決定される。糖尿病治療の目標は、糖濃度を、安全に可能であるように正常値の近くに低下させることである。一般に設定されている目標は、食事前において８０〜１２０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）であり、かつ、就寝前において１００〜１４０ｍｇ／ｄｌである。特定の医師は、他の要因、例えば、患者がどのくらいの頻度で低血糖反応を有するかなどに依存して、患者について異なる目標を設定することがある。有用な医学的検査には、血糖濃度を測定するための患者の血液および尿に対する検査、グリケート化ヘモグロビン濃度（ＨｂＡ１ｃ；過去２ヶ月〜３ヶ月にわたる平均血中グルコース濃度の指標、正常範囲は４％〜６％である）に対する検査、コレステロールおよび脂肪の濃度に対する検査、ならびに、尿タンパク質濃度に対する検査が含まれる。そのような検査は、当業者に知られている標準的な検査である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｏｃｃｉａｔｉｏｎ（１９９８）を参照のこと）。成功する治療プログラムはまた、糖尿病性の眼疾患、腎臓疾患または神経疾患に関するプログラムを受けている患者がほとんどいないことによって決定され得る。
【０１４１】
従って、本発明のこの態様による方法の１つの特定の実施形態において、インスリン非依存性糖尿病を治療する方法が提供される。この場合、患者はインスリン非依存性糖尿病の初期段階において診断される。本発明のコンジュゲートは腸溶性カプセルに配合される。患者は、インスリンシグナル伝達経路を刺激する目的のために一錠の錠剤を各食後に服用することが指示され、それにより、グルコース代謝が、外因性インスリンの投与が必要な状態を未然に防止するレベルに制御される。
【０１４２】
本明細書中上記でさらに議論されるように、ＧＳＫ−３阻害は情動障害に関連することが示唆されている。従って、別の例において、本発明のこの態様による方法は、単極型障害（例えば、うつ病）および双極性障害（例えば、躁うつ病）などの情動障害を治療するために使用することができる。本明細書中下記において詳しく記載されるように、本発明のコンジュゲートの抗うつ効果、ならびに、β−カテニン濃度のアップレギュレーションに対するその効果が明らかにされており、従って、このことは、ＧＳＫ−３阻害剤と情動障害との直接的なつながりを初めて示している。
【０１４３】
ＧＳＫ−３はまた、神経変性障害および神経変性疾患の病理発生における重要な関与体であると考えられるので、本発明のこの態様による方法はさらに、様々なそのような障害および疾患を治療するために使用することができる。
【０１４４】
一例において、ＧＳＫ−３の阻害は、ニューロン細胞死を停止させることをもたらすので、本発明のこの態様による方法は、ニューロン細胞死を引き起こす事象から生じる神経変性障害を治療するために使用することができる。そのような事象は、例えば、脳虚血、発作、外傷性脳傷害または細菌感染であり得る。
【０１４５】
別の例では、ＧＳＫ−３活性は様々な中枢神経系の障害および神経変性疾患に関係しているので、本発明のこの態様による方法は、様々な慢性の神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチングトン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＭＬ）および多発硬化症（これらに限定されない）などを治療するために使用することができる。
【０１４６】
本明細書中上記で議論されるように、ＧＳＫ−３活性はアルツハイマー病の病理発生に特に関係している。従って、本発明のこの態様による方法の１つの代表的な実施形態において、アルツハイマー病患者を治療する方法が提供される。この場合、アルツハイマー病と診断された患者に、ＧＳＫ−３により媒介されるタウの過剰リン酸化を阻害する本発明のコンジュゲートが、血液脳関門（ＢＢＢ）を超える配合物に調製されて投与される。患者は、患者の脳細胞から単離されたタンパク質を、疾患の存在および進行を特徴づけるために知られているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのタウのリン酸化形態の存在について定期的に分析することによって、タウのリン酸化多量体についてモニターされる。コンジュゲートの投薬量は、タウタンパク質のリン酸化形態の存在を減少させるために必要に応じて調節される。
【０１４７】
ＧＳＫ−３はまた、統合失調症などの精神病的障害に関しても関係している。従って、本発明のこの態様による方法はさらに、統合失調症などの精神病的な疾患または障害を治療するために使用することができる。
【０１４８】
本発明のコンジュゲートは、ＧＳＫ−３の増強された阻害活性および増強された膜透過性のほかに、コンジュゲート内に疎水性成分を含むことにより、コンジュゲートの増強された親油性がさらにもたらされ、その結果として、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する増強された透過性がもたらされることが仮定されるので、情動性および神経変性性の疾患または障害の治療において特に好都合であることに留意しなければならない。この増強された透過性は、阻害剤を脳室内（ｉｃｖ）に投与する必要が回避されるようにコンジュゲートの局所的な投与ではなく、全身的な投与を可能にし得る。
【０１４９】
本発明のこの態様による方法はさらに、ＧＳＫ−３の活性を変化させることができる１つまたは複数のさらなる活性な成分を対象に同時投与することによって達成することができる。
【０１５０】
本明細書中で使用される「同時投与する」は、本発明によるコンジュゲートを、さらなる活性な成分（これはまた、活性な薬剤または治療剤として本明細書中では示される）との組合せで投与することを記述する。さらなる活性な薬剤は、患者の状態を治療するために有用である任意の治療剤であり得る。同時投与は、例えば、コンジュゲートおよび治療剤の混合物を投与することによって同時的であり得るか、または、コンジュゲートおよび活性な薬剤を短い期間内などで別々に投与することによって達成することができる。同時投与にはまた、コンジュゲートと、別の治療剤の１つまたは複数との連続した投与が含まれる。さらなる治療剤（１つまたは複数）はコンジュゲートの前または後に投与することができる。投薬治療は単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【０１５１】
本明細書中上記で議論されるように、また、下記の実施例の節においてさらに明らかにされるように、本発明のコンジュゲートおよびインスリンを用いた細胞の同時治療はグルコース取り込みに関して付加的な効果をもたらし、従って、さらなる活性な成分はインスリンであり得る。
【０１５２】
好ましくは、さらなる活性な成分は、本発明によるさらなる活性な成分が、本発明のコンジュゲートとは異なる任意のＧＳＫ−３阻害剤（例えば、リチウム、バルプロ酸およびリチウムイオン）であり得るように、ＧＳＫ−３の活性を阻害することができる。
【０１５３】
あるいは、さらなる活性な成分は、ＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる活性な成分であり得る。
【０１５４】
ＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションする薬剤は、ｍＲＮＡの濃度またはタンパク質の濃度のいずれかにおいてＧＳＫ−３合成に影響を及ぼす（減速させる）か、またはＧＳＫ−３分解に影響を及ぼす（促進させる）任意の薬剤を示す。例えば、ＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションするために設計される小さい干渉性ポリヌクレオチド分子を、本発明の好ましい実施形態によるさらなる活性な成分として使用することができる。
【０１５５】
ＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる小さい干渉性ポリヌクレオチド分子についての一例が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の以前に記載された機構（ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２：２２５〜２３２）を介してｍＲＮＡの配列特異的な分解を行わせる二重鎖オリゴヌクレオチドを含む、例えば、Ｍｕｎｓｈｉ他（Ｍｕｎｓｈｉ  ＣＢ、Ｇｒａｅｆｆ  Ｒ、Ｌｅｅ  ＨＣ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００２（Ｄｅｃ、２０）：２７７（５１）：４９４５３〜８）によって記載されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの小さい干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。
【０１５６】
本明細書中で使用される表現「二重鎖オリゴヌクレオチド」は、１つの自己相補性核酸鎖または少なくとも２つの相補的な核酸鎖のいずれかによって形成されるオリゴヌクレオチド構造またはその模倣体を示す。本発明の「二重鎖オリゴヌクレオチド」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、単離されたＲＮＡ（すなわち、部分精製されたＲＮＡ、本質的には純粋なＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、および組換え産生ＲＮＡから構成され得る。
【０１５７】
好ましくは、本発明の特異的な小さい干渉性二重鎖オリゴヌクレオチドは、リボ核酸から主に構成されるオリゴヌクレオチドである。
【０１５８】
ＲＮＡ干渉を媒介することができる二重鎖オリゴヌクレオチドを作製するための説明がｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍに示される。
【０１５９】
従って、本発明による小さい干渉性ポリヌクレオチド分子はＲＮＡｉ分子（ＲＮＡ干渉分子）であり得る。
【０１６０】
あるいは、小さい干渉性ポリヌクレオチド分子は、本明細書中下記においてさらに記載されるＧＳＫ−３特異的なアンチセンス分子またはリボザイム分子などのオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１６１】
アンチセンス分子は、それぞれが少なくとも１個のヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞取り込み、および／または、標的ポリヌクレオチドに対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも１つの領域を典型的には含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素のための基質として役立ち得る。そのような酵素についての一例が、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＨである。従って、ＲＮａｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。その結果として、匹敵し得る結果を、多くの場合、キメラなオリゴヌクレオチドが使用されたとき、同じ標的領域にハイブリダイゼーションするホスホロチオアートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドを用いて得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また、必要な場合には、この分野で知られている会合核酸ハイブリダイゼーション技術によって、常法により検出することができる。
【０１６２】
本発明のアンチセンス分子は、上記で記載されたように、２つ以上のオリゴヌクレオチド（すなわち、修飾されたオリゴヌクレオチド）の複合構造体として形成され得る。そのようなハイブリッド構造体の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、米国特許第５０１３８３０号、同第５１４９７９７号、同第５２２０００７号、同第５２５６７７５号、同第５３６６８７８号、同第５４０３７１１号、同第５４９１１３３号、同第５５６５３５０号、同第５６２３０６５号、同第５６５２３５５号、同第５６５２３５６号および同第５７００９２２号が含まれる（これらのそれぞれは全体が本明細書中に参考として組み込まれる）。
【０１６３】
リボザイム分子は、ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている。数個のリボザイム配列を本発明のオリゴヌクレオチドに融合することができる。これらの配列には、限定されないが、凝固経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−Ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害するＡＮＧＩＯＺＹＭＥ、および、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するために設計されたリボザイムのＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（Ｒｙｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＷＥＢホームページ）が含まれる。
【０１６４】
さらにあるいは、本発明による小さい干渉性ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡザイムであり得る。
【０１６５】
ＤＮＡザイムは一本鎖の触媒作用核酸分子である。ＤＮＡザイムについての一般的なモデル（“１０−２３”モデル）が提案されている。“１０−２３”ＤＮＡザイムは、それぞれが７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインが隣接する、１５個のデオキシリボヌクレオチドからなる触媒作用ドメインを有する。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２：４：１１９〜２１を参照のこと）。
【０１６６】
一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する操作された合成ＤＮＡザイムの構築および増幅の例が米国特許第６，３２６，１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に向けられた類似する設計のＤＮＡザイムが、最近、ウロキナーゼ受容体の発現を阻害し、結腸ガン細胞の転移をインビボで阻害することに成功したことが観測された（Ｉｔｏｈ他、２００２、アブストラクト４０９、Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ、ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂｌガン遺伝子に対して相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞におけるガン遺伝子の発現を阻害し、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合において自家骨髄移植における再発率を小さくすることに成功した。
【０１６７】
本発明の教示に従って設計されたオリゴヌクレオチドは、この分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成法（例えば、酵素合成または固相合成など）に従って作製することができる。固相合成を実行するための器具および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる。オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６８】
本発明のコンジュゲートの阻害活性を評価し続けている一方で、様々な実験が、情動障害に対するこれらのコンジュゲートの治療効果に関して行われた。下記の実施例の節において詳しく記載され、また明らかにされるように、これらの実験のときに、驚くべきことに、本発明のコンジュゲートは抗うつ活性を明瞭に示すことが見出された。
【０１６９】
これまで、ＧＳＫ−３と情動障害との間における唯一のつながりは、一部の気分安定化剤（例えば、リチウムなど）がＧＳＫ−３阻害剤であるという知見に基づいていた。しかしながら、情動障害とＧＳＫ−３活性との間における直接的な関係を明らかにするつながりまたは証拠は示されていない。その上、リチウムは、他の気分安定化剤と同様に、多数のシグナル伝達経路に影響を及ぼし、他の細胞標的を阻害すること（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ他、１９８９；ＰｈｉｅｌおよびＫｌｅｉｎ、２００１）、従って、本発明のコンジュゲートとは対照的に、ＧＳＫ−３の特異的な阻害剤でないことが知られている。従って、本発明の知見は、ＧＳＫ−３の特異的な阻害剤が、情動障害を治療するための強力かつ効果的な薬剤として役立ち得ることを初めて示している。
【０１７０】
従って、本発明のこの態様によれば、その必要性のある対象において情動障害を治療する方法が提供され、この場合、この方法は、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる１つまたは複数の化合物の治療効果的な量を対象に投与することによって達成される。
【０１７１】
これに関連して行われた実験では、特異的なＧＳＫ−３阻害剤（例えば、本発明のコンジュゲートなど）の投与は、治療された動物の海馬におけるβ−カテニン濃度のアップレギュレーションをもたらしたことがさらに明らかにされた。
【０１７２】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、対象の海馬におけるβ−カテニンの濃度をアップレギュレーションする方法が提供され、この場合、この方法は、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる１つまたは複数の化合物の効果的な量を対象に投与することによって達成される。
【０１７３】
本明細書中で使用される表現「特異的に阻害する」は、ＧＳＫ−３に対してだけ大きい親和性によって特徴づけられ、従って、たとえ存在するとしても、他のキナーゼに対する低下した親和性を有する化合物を示す。
【０１７４】
本明細書中上記で記載されるように、ＧＳＫ−３の認識モチーフに基づくポリペプチドは非常に特異的なＧＳＫ−３阻害剤である。下記の実施例の節において表４に示される結果は、代表例のそのようなポリペプチドはＧＳＫ−３以外のプロテインキナーゼを阻害する能力がないことを明瞭に明らかにしている。
【０１７５】
従って、本発明のこの態様による方法は、好ましくは、本明細書中上記に詳しく記載されるように、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド：
2006514104.tif 000010
（式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である）
を使用して達成される。
【０１７６】
より好ましくは、化合物は本発明のコンジュゲートである。
【０１７７】
非常に効率的な治療剤である一方で、また、治療的適用では、多くの場合、効果的な量の活性な成分を治療されている個体に投与することが要求されるので、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、治療されている個体に対するコンジュゲートの投与を容易にするために、また、おそらくは、標的化された組織または細胞への活性な成分の進入を容易にするために医薬的に許容され得るキャリアをさらに含む医薬組成物において、有効成分として含まれる。
【０１７８】
従って、本発明のさらなる態様によれば、有効成分としての本発明のコンジュゲートと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【０１７９】
以降、表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。キャリアの非限定的な例には、ポリエチレングリコール、生理的食塩水、有機溶媒と水とのエマルションおよび混合物がある。
【０１８０】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１８１】
医薬的に許容され得るキャリアにはさらに、他の薬剤、例えば、吸収遅延剤、抗菌剤、抗真菌剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝化剤、増量剤、カチオン性脂質剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、分散剤、乳化剤、賦形剤、矯味矯臭剤、滑剤、等張剤、リポソーム、マイクロカプセル、溶媒、甘味剤、粘度改変剤、湿潤化剤および皮膚浸透増強剤など（これらに限定されない）が含まれ得る。
【０１８２】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１８３】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経皮送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１８４】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１８５】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物へのコンジュゲートの加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。組成物は、エアロゾル送達形態物、水溶液、ボーラス剤、カプセル、コロイド、遅延放出、デポー剤、溶解可能な粉末、滴剤、エマルション、侵食性インプラント、ゲル、ゲルカプセル、顆粒剤、注射溶液、摂取可能な溶液、吸入可能な溶液、ローション、オイル溶液、ピル、坐薬、膏薬、懸濁物、持続放出、シロップ、錠剤、チンキ剤、局所用クリーム、経皮送達形態物などの送達形態物で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１８６】
注射の場合、本発明のコンジュゲートは、有機溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）を伴うか、または伴わない水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１８７】
経口投与の場合、コンジュゲートは、コンジュゲートをこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、本発明のコンジュゲートが、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１８８】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性な成分の量を明らかにするために、または活性な成分の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１８９】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１９０】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１９１】
吸入による投与の場合、本発明によるコンジュゲートは、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器において使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、成分および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１９２】
本明細書中に記載されるコンジュゲートは、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１９３】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態でのコンジュゲートの水溶液が含まれる。また、コンジュゲートの懸濁物を適切な油性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために活性な成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１９４】
あるいは、コンジュゲートは、好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェン非含有水）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１９５】
本発明のコンジュゲートはまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１９６】
本明細書中に記載される医薬組成物はまた、ゲル相キャリアまたは賦形剤の好適な固体を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９７】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、コンジュゲートが、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、治療されている対象の状態の症状に影響を及ぼすために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、コンジュゲートの量を意味する。
【０１９８】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９９】
本発明の方法において使用される任意の活性な成分について、治療効果的な量または用量は、最初は細胞培養物および動物における活性アッセイから推定することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０２００】
投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。
【０２０１】
本発明の組成物は、所望される場合には、コンジュゲートを含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明のコンジュゲートを含む組成物はまた、適応状態を治療するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。ラベルに示される好適な状態には、例えば、本明細書中上記で示される、ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態のいずれかが含まれ得る。
【０２０２】
従って、本発明の医薬組成物は、ＧＳＫ−３に関連する生物学的状態の治療または防止における使用のために、包装用材料に詰められ、包装用材料の表面またはその中での活字で識別され得る。
【０２０３】
本発明の医薬組成物はさらに、本明細書中上記で記載されるように、ＧＳＫ−３の活性を妨害することができるさらなる活性な成分を含むことができる。
【０２０４】
さらに、本発明によれば、本発明のコンジュゲートを調製するプロセスが提供される。この場合、このプロセスは、本明細書中上記で記載されたポリペプチドを提供すること、本明細書中上記で記載されるような１つまたは複数の疎水性成分を提供すること、および、前記疎水性成分（１つまたは複数）と前記ポリペプチドとをコンジュゲート化することを含む。
【０２０５】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｄｕｇａｓ他（１９８１）によって記載されるように、広く知られている化学的手法を使用して、例えば、溶液ペプチド合成または固相ペプチド合成、あるいは、従来の溶液法によりカップリングされたタンパク質フラグメントを用いて開始される溶液での半合成などを使用して化学合成によって提供される。本発明のポリペプチドは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ他（１９６４）の固相ペプチド合成によって化学合成することができる。あるいは、本発明のペプチド阻害剤は、標準的な溶液法を使用して合成することができる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）を参照のこと）。新しく合成されたペプチドは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製することができ、例えば、質量分析法またはアミノ酸配列分析を使用して特徴づけることができる。
【０２０６】
あるいは、本発明のポリペプチドは組換えにより提供され得る。本発明のポリペプチドをクローン化および発現するためのシステムには、組換え技術において広く知られている様々な微生物および細胞が含まれる。これらには、例えば、大腸菌、バチルス属、ストレプマイセス属およびサッカロマイセス属の様々な菌株、ならびに、哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞が含まれる。本発明のポリペプチドはペプチドまたは融合タンパク質として産生させることができる。ペプチド阻害剤を産生させるための様々な好適なベクターが知られており、それらは民間および公立の研究所および寄託機関から得ることができ、また、商業的供給者から得ることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）を参照のこと。遺伝子産物を発現させることができるレシピエント細胞が、その後、トランスフェクションされる。トランスフェクションされたレシピエント細胞は、組換え遺伝子産物の発現を可能にする条件のもとで培養され、その後、組換え遺伝子産物が培養から回収される。様々な宿主哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ−１細胞などを使用することができる。これらの宿主は、ワクシニアまたは豚痘などのポックスウイルスベクターとともに使用することができる。合成遺伝子を宿主の細胞の中に運ぶために操作され得る好適な非病原性ウイルスには、種々のポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどが含まれる。多数のそのような非病原性ウイルスが、ヒトの遺伝子治療のために、また、他のワクチン因子のためのキャリアとして一般に使用され、当業者によって知られており、選択可能である。他の好適な宿主細胞の選択、形質転換、培養、増幅、スクリーニング、ならびに生成物の産生および精製のための方法の選択を、様々な知られている技術（例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇ他、１９８１）を参照することによって当業者は行うことができる。
【０２０７】
ポリペプチドが提供されると、疎水性成分（１つまたは複数）を、一般に使用されている技術によってポリペプチドにコンジュゲート化することができる。例えば、疎水性成分が脂肪酸である場合、脂肪酸（例えば、ミリスチン酸）をポリペプチド配列内のアミノ酸残基に付加するための技術が使用される。あるいは、アミノ酸残基が、本明細書中上記で記載されるように、脂肪酸などの疎水性成分を含むように改変され、その後で、知られている化学的手法によってポリペプチドに結合させられる。
【０２０８】
疎水性成分が疎水性ペプチド配列を含む場合、疎水性ペプチドを、本明細書中上記で記載された方法を使用して調製することができ、その後でポリペプチドにコンジュゲート化することができる。あるいは、コンジュゲートを、本発明のポリペプチドとそのような疎水性ペプチド配列とを含む融合ポリペプチドをクローン化および発現するために、本明細書中上記で記載されるようなシステムを使用して組換えにより調製することができる。
【０２０９】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。また、本明細書中上記で説明され、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれが、下記の実施例において実験的裏付けが見出される。
【実施例】
【０２１０】
次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する。
【０２１１】
材料および実験方法
材料：
ペプチドはすべて、疎水性成分がペプチドに結合しているコンジュゲートを含めて、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって合成された。
【０２１２】
放射性物質はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｔｄ．から購入された。
【０２１３】
サイクリン依存性プロテインキナーゼ（ｃｄｃ２）、カゼインキナーゼ−２（ＣＫ−２）、ＣＫ−２ペプチド、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の触媒活性サブユニット、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入された。
【０２１４】
他の試薬はすべて、Ｓｉｇｍａ（イスラエル）から得られた。
【０２１５】
ペプチド阻害剤は５０ｍＭのＨＥＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解された。
【０２１６】
ミリストイル化ペプチド（ｍｔｓ）は０．１％ＤＭＳＯ緩衝液溶液に溶解された。
【０２１７】
インビトロ研究：
インビトロ阻害アッセイ：精製された組換えウサギＧＳＫ−３β（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｌｅｌｍａｎ他、１９９６）を、示された濃度でペプチド基質ＰＧＳ−１（ＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＳＱＳ（ｐ）ＥＤＥＥＥ）（配列番号１５）およびペプチド阻害剤とインキュベーションした。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ＝７．３）、１０ｍＭのＭｇＡｃ、３２Ｐ［γ−ＡＴＰ］（１００μＭ）、０．０１％のβ−メルカプトエタノールを含む反応混合物を、３０℃で１０分間インキュベーションした。反応液を、（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｌｅｌｍａｎ他（１９９６）に記載されるように）ホスホセルロース紙（ｐ８１）にスポットし、１００ｍＭリン酸で洗浄し、放射能について計数した。
【０２１８】
他のプロテインキナーゼにおけるＬ８０３（２００μＭ）の影響を、Ｃｄｃ２（１ユニット）を、本明細書中上記で記載された反応混合物と類似し、ヒストンＨ１基質（５μｇ）を含有する反応混合物とインキュベーションすることによって調べた。反応液をＳＤＳサンプル緩衝液とともに煮沸し、ゲル電気泳動で分離して、オートラジオグラフにした。
【０２１９】
ＭＡＰＫ、ＰＫＡおよびＣＫ−２の活性を、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｚｖｉ  Ｎａｏｒからの譲渡物）、ｐ９ＣＲＥＢ（表３）およびＣＫ−２ペプチドが基質としてそれぞれ使用されたことを除いて類似する条件において調べた。
【０２２０】
プロテインキナーゼＣ−δが、特異的な抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いて脂肪組織抽出物から免疫沈殿され、その活性を、脂質補因子のホスファチジルセリン（４０μＭ）が基質としてのヒストンＨＩと一緒にインキュベーションされたことを除いて類似する条件において測定した。
【０２２１】
プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）を、血清刺激のＮＩＨ／３Ｔ３細胞の抽出物から、特異的な抗体（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ）を用いて免疫沈殿し、キナーゼアッセイを、ＭＢＰが基質として使用されたことを除いて類似する条件において行った。
【０２２２】
ＨＥＫ２９３細胞におけるグリコーゲンシンターゼ活性：無傷の細胞における本発明のコンジュゲートの影響を調べるために、膜透過性Ｌ８０３阻害剤のＬ８０３−ｍｔｓ（Ｎ−ミリストル−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳ（ｐ）Ｐ）（配列番号１６）、ならびに２つの同様に修飾されたそれぞれのコントロールのＬＥ８０３−ｍｔｓ（Ｎ−ミリストル−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳＥＰ）（配列番号１７）およびＬＳ８０３−ｍｔｓ（Ｎ−ミリストル−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳＰ）（配列番号１８）（これらにおいて、リン酸化セリンがグルタミン酸（これは通常、リン酸化された基を模倣する）またはセリン残基によってそれぞれ置換された）を設計し、合成した。インビトロアッセイが、これら２つのコントロールコンジュゲート（ＬＥ８０３−ｍｔｓおよびＬＳ８０３−ｍｔｓ）をＧＳＫ−３を阻害しないことを確認するために行った（データは示されず）。
【０２２３】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて１０ｃｍプレートにおいて成長させた。実験当日に、細胞を、０．５％ＦＳＣが補充された低グルコース培地で１時間インキュベーションし、その後、コンジュゲートＬ８０３−ｍｔｓまたはそのそれぞれのコントロール（ＬＥ８０３−ｍｔｓおよびＬＳ８０３−ｍｔｓ）を様々な濃度でさらに２．５時間加えた。ＤＭＳＯのビヒクルコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）もまた調べた。その後、細胞を、Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他（１９９６）に記載されるように、氷冷のＧＳ緩衝液（下記のプロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ：２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのベンズアミジン）で２回洗浄し、同じ緩衝液とともに掻き取り、液体窒素で凍結した。グリコーゲンシンターゼ活性が、ウリジン５−二リン酸［１４Ｃ］グルコース（ＵＤＰＧ）のグリコーゲンへの取り込みに基づくＴｈｏｍａｓ他（１９８６）の方法に従ってアッセイした。細胞溶解物の一部（１５μｌ）を、Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他（１９９６）に記載されるように、１５μｌの反応混合物（６６．６ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）、３２．５ｍＭのＫＦ、０．８μＣｉ／μｌの［１４Ｃ］−ＵＤＰＧ（４００μＭ）、１３ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン（ウサギ肝臓、Ｓｉｇｍａ））と３０℃で２０分間インキュベーションした。その後、反応液をＥＴ３１（Ｗｈａｔｍａｎ）紙にスポットし、６６％の氷冷エタノールで洗浄し、放射能について計数した。グリコーゲンシンターゼアッセイを、０．１ｍＭのグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）の存在下で測定した。Ｇ６Ｐがアッセイに存在しないとき、類似する結果が得られた（データは示されず）。
【０２２４】
単離された脂肪細胞におけるグルコース取り込み：マウス脂肪細胞を、以前の記載（Ｌａｗｒｅｎｃｅ他、１９７７）のように、０．８ｍｇ／ｍｌのコラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いた消化によって精巣上皮脂肪パッドから単離した。消化された脂肪パッドをナイロンメッシュに通し、細胞を、１％のウシ血清アルブミン（第Ｖ画分、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）、５ｍＭのグルコースおよび２００ｎＭのアデノシンを含有するＫｒｅｂｓ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した。細胞を、示された濃度で１時間、Ｌ８０３−ｍｔｓまたはＬＥ８０３−ｍｔｓとインキュベーションし、その後、２−デオキシ［３Ｈ］グルコース（０．５μｃｉ／バイアル）を１０分間加えた。アッセイを、ジノニルフタラート（ＩＣＮ、米国）による細胞の遠心分離によって終了させた。その後、３Ｈを液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）によって定量した。２−デオキシ−［３Ｈ］グルコースの非特異的な取り込みを、放射能物質の添加の３０分前にサイトカラシンＢ（５０μＭ）を加えることによって測定した。
【０２２５】
別の１組の実験において、脂肪細胞を、次善最適な濃度のインスリン（５ｎＭ）の添加の１時間前に様々な濃度のＬ８０３−ｍｔｓで処理した。グルコース取り込みは上記のように測定した。
【０２２６】
インビボ研究：
動物における高脂肪食誘導による糖尿病：４週齢のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスに、以前の記載（Ｓｕｒｗｉｔ他、１９８８）のように、５５％のカロリーが脂肪からである３５％ラード含有の高脂肪食（Ｂｉｏｓｅｒｖｅ、Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、ＮＪ）を与えた。動物は、１２時間の明暗周期を有する温度制御施設において、自由に水を摂取させながら個別ケージで飼育した。動物は、１６週間の給餌後、肥満、高血糖症および高インスリン血症を発症した（Ｉ．Ｔａｌｉｏｒ、未発表の結果）。
【０２２７】
グルコース負荷試験：グルコース負荷試験が、一晩絶食させたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（１２時間）において行われた。Ｌ８０３−ｍｔｓまたはＬＥ８０３−ｍｔｓをマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し（４００ｎｍｏｌのペプチド）、グルコース（１グラム／ｋｇ）をその１時間後に１．ｐ．注射し、血液サンプルを尾静脈から様々な時点で採取した。血中グルコース濃度を、Ｓｕｇａｒ  Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ  Ｓｅｎｓｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）によって直ちに測定した。
【０２２８】
マウスを投与前の６時間、絶食させ、Ｌ８０３−ｍｔｓをグルコース注射の９０分前に注射した以外は同様な実験を、本明細書中上記で記載されるように高脂肪食が１６週間にわたって与えられた糖尿病Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスにおいて行った。
【０２２９】
強制泳ぎ試験（ＦＳＴ）：Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、１２時間の明暗周期を有する温度制御施設において、自由に水を摂取させながら個別ケージで飼育した。１４週齢〜１６週齢の動物を使用した。それぞれの実験群は、無作為に選ばれた１０匹〜２０匹からなった。１日目に、マウスをプレＦＳＴ（下記参照）に供した。２日目に、マウスをハロタンで麻酔し（吸入）、Ｌ８０３−ｍｔｓまたは変性されたコントロールペプチド（ｃｐＬ８０３−ｍｔｓ）を片側の脳室内に注射した（ｉ．ｃ．ｖ．、２５ｍＭストック溶液の１μｌ）。動物は、試薬が投与された後の１時間、３時間および１２時間において１回のＦＳＴに供した。使用されたＦＳＴ法は、Ｐｏｒｓｏｌｔ他（１９７７）によって初めて記載された手法と類似した。簡単に記載すると、動物を、１日目に、２５℃の水が入った大きな円筒容器（３０ｃｍｘ４５ｃｍ）に１５分間入れた。２日目（２４時間後）、処置された動物を、水の入った大きな円筒容器に６分間入れた。不動性の持続期間が６分の試験の最後の４分間モニターされた。不動性の期間は、もがくことなく動物が水に浮き、その頭を水面上に保つために必要なそのような動きのみを行うことによって費やされた時間として定義した。すべての試験を１１：００〜１５：００の間に行った。ＦＳＴが完了した後、マウスを屠殺し、海馬を取り出し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。動物の管理は動物の管理および使用の施設内委員会に従った。
【０２３０】
海馬抽出物：海馬組織を氷冷の緩衝液Ｈ（５０ｍＭのβ−グリセロホスファート（ｐＨ＝７．３）、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのＮａＰＰｉ、２５μｇ／ｍｌのロイペプチン、２５μｇ／ｍｌのアプロチニン、５００ｎＭのミクロシスチンＬＲ、および１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００）とともにホモジネートした。抽出物を１５，０００Ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を集めた。等量のタンパク質（３０μｇ）（これはＢｒａｄｆｏｒｄ分析（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）によって測定された）をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液とともに煮沸して、ゲル電気泳動（１０％ポリアクリルアミドゲル）に供し、ニトロセルロースメンブランに転写して、β−カテニンに対する特異的なモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を用いて免疫ブロットした。
【０２３１】
統計学：
グラフ処理および統計学的分析を、Ｏｒｉｇｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ６．０を使用する１因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。データは、Ｐ＜０．０５であるとき、有意であると見なされた。データは、標準誤差を伴う群平均として表される。
【０２３２】
実験結果
インビトロ研究：
インビトロ阻害アッセイ：
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／００１２３に示される理論に基づいて、１組のリン酸化ペプチド阻害剤が設計され、合成され、それらの活性が上記のインビトロ分析によって評価された。１組の阻害剤ならびに分析結果が下記の表３に示される。
【表３】
2006514104.tif 000011
2006514104.tif 000012
【０２３３】
これらの結果は、ＧＳＫ−３基質、すなわち、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質）およびＨＳＦ−１（熱ショック因子−１）に由来する２つの知られているペプチド配列におけるアラニンによるＳ１の置換により、基質が阻害剤に変換されたことを示している（表３、５および８）。ｐＡＨＳＨペプチドにおけるＳ１の上流側に存在するグルタミン酸の置換により、阻害効力が改善された（Ｌ８０３、表３、ペプチド９）。
【０２３４】
Ｓ２（ｐ）をグルタミン酸（これは多くの場合、リン酸化された基を模倣する）またはセリンそのもののいずれかで置換すること（表３、それぞれ、ペプチド１０およびペプチド１１）により、これらのペプチドは不活性な阻害剤になった。従って、このことは、リン酸化セリンがペプチド阻害剤のための絶対的な必要条件であることを示している。ｐ９ＣＲＥＢペプチド基質におけるＳ２（ｐ）のグルタミン酸またはリン酸化チロシンによる置換（表３、それぞれ、ペプチド３およびペプチド４）により、これらのペプチドをリン酸化するＧＳＫ−３の能力が失われた。従って、このことは、基質に対する同じ必要条件を示している。その上、ペプチドの長さをＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｓ（ｐ）（配列番号１９）の最小配列に減少させることによってもまた、ペプチドの阻害能力が失われた（表３、ペプチド６およびペプチド１２〜１４）。このことは、このモチーフに隣接するさらなる残基（外見的には、各末端において少なくとも１個〜２個）がペプチド阻害剤では含まれなければならないことを示している。特筆すべきことに、Ｓ１の上流側に位置するグルタミン酸がアラニンで置換されたとき、阻害が改善された（ペプチド９（ＬＥ８０３）対ペプチド８（ｐＡＨＳＦ）を参照のこと）。外見的には、グルタミン酸残基が、ｅＩＦ２Ｂ、ＣＲＥＢ、ｃ−ＭｙｃおよびＤ−Ｊｕｎを含む（すべてではないが）一部のＧＳＫ−３基質において類似する位置に見出される（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、２００１）。これは、酵素／基質の相互作用および／または解離におけるこの残基についての極めて重要な役割を示し得る特徴である。
【０２３５】
図１ａおよび図１ｂは、試験されたペプチド阻害剤のうちの３つの阻害曲線を示す（表３、ペプチド５、ペプチド８およびペプチド９）：Ｈｚ１３（図１ａ）、ｐＡＨＳＦおよびＬ８０３（図１ｂ）。これらの阻害剤およびそれ以外の試験された阻害剤（データは示されず）について得られたＩＣ５０値は１５０μＭ〜３３０μＭの範囲にあり、Ｌ８０３が１５０μＭの最も有望なＩＣ５０値を有していた。
【０２３６】
ペプチド阻害剤の速度論的性質が、いくつかの阻害剤濃度における基質濃度の関数として初速度を測定することによって研究された。これらの阻害剤によるＧＳＫ−３阻害のラインウィーバー・バークプロットにより、これらは基質競合性阻害剤であるという仮定が確認された（データは示されず）。図２は、例示的な阻害剤としてのＬ８０３によるＧＳＫ−３阻害のラインウィーバー・バークプロットを示す。
【０２３７】
Ｌ８０３は、ＧＳＫ−３に対する最も強力な阻害剤であることが見出されたので、さらなる研究のための代表的なペプチド阻害剤として選択された。
【０２３８】
従って、Ｌ８０３の特異性が、このペプチド阻害剤の存在下でのその基質をリン酸化するいくつかのプロテインキナーゼの能力を調べることによって試験された。結果が、阻害剤の非存在下で測定された活性の百分率として表４に示される。表４は、（２００μＭの濃度で）Ｌ８０３は、ＧＳＫ−３以外の選択されたプロテインキナーゼを著しく阻害することができないことを示している。特筆すべきことに、ＧＳＫ−３に最も近い関係にあるプロテインキナーゼのサイクリン依存性プロテインキナーゼ（ｃｄｃ２）でさえも、Ｌ８０３によって阻害されなかった。このことは、本発明者らの阻害剤の特異性をさらに裏付けている。
【表４】
2006514104.tif 000013
【０２３９】
ペプチド阻害剤と、それに共有結合的に連結された疎水性成分とを含む代表例のコンジュゲートの阻害速度論が、Ｌ８０３−ｍｔｓと名付けられたミリストル化Ｌ８０３（ミリスチン酸がそのＮ末端に結合しているＬ８０３−ｍｔｓ阻害剤）を用いて上記アッセイを行うことによって評価された。
【０２４０】
図３ａおよび図３ｂに示されるように、この修飾は阻害剤のＩＣ５０値を４０μＭに実質的に減少させた。このことは、ＧＳＫ−３阻害剤に対する疎水性成分の付加は阻害の改善をもたらすことを示唆している。
【０２４１】
比較のためのＧＳＫ−３β阻害アッセイが、Ｌ８０３−ｍｔｓと、ｃｐＬ８０３−ｍｔｓと名付けられた変性コントロールペプチドとを使用して上記のように行われた。図４に示されるように、Ｌ８０３−ｍｔｓはＧＳＫ−３βを阻害した（ＩＣ５０＝４０μＭ）。対照的に、ｃｐＬ８０３−ｍｔｓは、試験された濃度範囲（０〜３００μＭ）でＧＳＫ−３β活性を阻害しなかった。
【０２４２】
ＨＥＫ２９３細胞におけるグリコーゲンシンターゼ活性：
無傷の細胞および動物におけるミリストル化ペプチドの生物学的影響を調べるために、Ｌ８０３−ｍｔｓおよび２つの同様に修飾されたそれぞれのコントロール（ＬＥ８０３−ｍｔｓおよびＬＳ８０３−ｍｔｓ）を使用した。ＧＳＫ−３の知られている生理学的標的（グリコーゲンシンターゼ、これは、ＧＳＫ−３によるリン酸化のときに阻害される（Ｗａｎｇ他、１９９３；Ｗｏｏｄｇｅｔｔ他、１９８４））に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を最初に研究した。
【０２４３】
これらの研究で得られた結果が図５ａおよび図５ｂに示され、これらは、Ｌ８０３−ｍｔｓが、ＬＥ８０３−ｍｔｓまたはＬＳ８０３−ｍｔｓのいずれかで処理された細胞と比較して、グリコゲンシンターゼ活性を２．５倍増大させたことを示している。これらの結果はさらに、Ｌ８０３−ｍｔｓが内因性ＧＳＫ−３を比較的低い濃度（１０μＭ〜４０μＭ）で阻害することを明らかにしている。
【０２４４】
単離された脂肪細胞におけるグルコース取り込み：
単離された脂肪細胞におけるグルコース取り込みに対する本発明のコンジュゲートの影響を、［３Ｈ］−２−デオキシグルコースの取り込みを測定する１時間前にマウス脂肪細胞をＬ８０３−ｍｔｓまたはＬＳ８０３−ｍｔｓまたはＬＥ８０３−ｍｔｓとインキュベーションすることによって調べた。図６ａに示されるように、Ｌ８０３−ｍｔｓは、ＬＥ８０３−ｍｔｓまたはＬＳ８０３−ｍｔｓで処理された細胞と比較して、２−デオキシグルコースの取り込みを約２．５倍増大させた。この値は、これらのマウス脂肪細胞において３倍である、インスリン（１０ｎＭ）による最大刺激によって得られる値と匹敵する（データは示されず）。
【０２４５】
本発明のコンジュゲートＧＳＫ−３阻害剤がインスリンと協奏して機能し得るかどうかを明らかにするために、脂肪細胞を様々な濃度のＬ８０３−ｍｔｓ（１μＭ〜１０μＭ）で最初に処理し、その後、次善最適な濃度のインスリン（５ｎＭ）が添加された。図６ｂに示されるように、Ｌ８０３−ｍｔｓ処理細胞におけるグルコース取り込みの活性化がインスリン処理細胞においてさらに増大した。このことは、Ｌ８０３−ｍｔｓがインスリン誘導のグルコース取り込みに対する付加的な効果を有することを示している。
【０２４６】
インビボ研究：
グルコース負荷試験：
Ｌ８０３−ｍｔｓのインビボでの機能を、本明細書中上記に記載されるように、一晩絶食させたＣ５７Ｂ１／６ＪマウスにおいてＬ８０３−ｍｔｓの腹腔内投与後の糖耐性を測定することによって調べた。結果が図７に示され、結果は、より良好な糖耐性が、コントロールペプチドで処置されたマウスと比較した場合、ＧＳＫ−３阻害剤のＬ８０３−ｍｔｓで前処理された絶食マウスにおいて観測されたことを明らかにしている。図７に示されるように、Ｌ８０３−ｍｔｓによる治療は、グルコース投与後の１時間および２時間において、血中グルコース最大値、ならびにその後のグルコース濃度における２０％の低下をもたらした。
【０２４７】
次に、糖尿病（ＨＦ）マウスにおける糖耐性に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を調べた。図８ａおよび図８ｂに示されるように、Ｌ８０３−ｍｔｓで前処理されたＨＦマウスは、コントロールペプチドのＬＥ８０３−ｍｔｓで処置されたマウスと比較した場合、グルコース負荷試験および血中グルコースクリアランスにおける著しく改善された成績をもたらした。これらの結果は、グルコース取り込みを高めるＬ８０３−ｍｔｓの能力と一致しており、インスリン耐性およびＩＩ型糖尿病におけるＧＳＫ−３の役割を強く裏付けている。
【０２４８】
強制泳ぎ試験による研究：
Ｌ８０３−ｍｔｓを、ＦＳＴの１時間前、３時間前または１２時間前にｉ．ｃ．ｖ．注射した。結果が図９に示され、結果は、Ｌ８０３−ｍｔｓによる前治療により、不動性時間の持続期間が、泳ぎの短い持続期間の後で動かなくなったコントロール治療マウスと比較して、３７％±３．７％（１時間）、４４％±５．７％（３時間）、および１６％±０．６％（１２時間）著しく短くなったことを示している（すべてについて、ｐ＜０．０５）。
【０２４９】
強制泳ぎ試験は、抗うつ活性を評価するための動物モデルとして広く使用されている行動試験であるので、これらの結果は、ＧＳＫ−３のインビボ阻害が抗うつ様活性を誘発することを初めて明らかにしている。従って、このことは、特異的なＧＳＫ−３阻害剤は、動物モデルにおいてうつ的行動を変化させることができ、有望な新しいクラスの抗うつ剤および／または気分安定化剤として役立ち得ることを示している。
【０２５０】
Ｌ８０３−ｍｔｓ治療マウスの海馬におけるβ−カテニン：
β−カテニンはＧＳＫ−３の知られている基質であり、最近では脳の発達および認知活動に関係した（Ｃｏｙｌｅ−Ｒｉｎｋ他、２００２）、多機能性タンパク質である（ＭｉｌｌｅｒおよびＭｏｏｎ、１９９６；ＰｅｉｆｅｒおよびＰｏｌａｋｉｓ、２０００）。ＧＳＫ−３によるβ−カテニンのリン酸化はそのプロテオソーム分解を高め、ＧＳＫ−３の阻害は細胞質における低リン酸化β−カテニンの蓄積をもたらす（Ａｂｅｒｌｅ他、１９９７；Ｉｋｅｄａ他、１９９８；Ｙｏｓｔ他、１９９６）。安定化されると、β−カテニンは核に輸送され、核において、Ｌｅｆ／Ｔｃｆファミリーの転写因子と会合して、遺伝子発現を刺激する（Ｂｅｈｒｅｎｓ他、１９９６）。
【０２５１】
従って、マウスの海馬におけるβ−カテニン濃度に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を調べた。海馬組織の抽出物を、モノクローナル抗β−カテニン抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。図１０に示されるように、Ｌ８０３−ｍｔｓ治療は海馬抽出物における抗β−カテニンの量を時間依存的な様式で増大した。β−カテニン濃度の２０％および３０％の増大が、Ｌ８０３−ｍｔｓによる治療の１時間後および３時間後にそれぞれ観測された（両方について、ｐ＜０．０５）。それにより、５０％の増大がＬ８０３−ｍｔｓの投与後１２時間において観測された。
【０２５２】
ＧＳＫ−３の不活性化の結果としてのβ−カテニンのアップレギュレーションは、Ｗｎｔ、リチウムまたはバルプロ酸で処理された様々な培養細胞を使用する数多くの研究において関係している（Ｃｈｅｎ他、１９９９；Ｉｋｅｄａ他、１９９８；Ｓａｋａｎａｋａ他、１９９８；Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ他、１９９６）。また、ＧＳＫ−３の発現は、脳内のβ−カテニン濃度と逆相関することが示され（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ他、２００２；Ｌｕｃａｓ他、２００１）、β−カテニンのシグナル伝達は脳の発達および認知活動においてさらに関係していた（Ｃｏｙｌｅ−Ｒｉｎｋ他、２００２）。
【０２５３】
しかしながら、ＦＳＴ研究および海馬抽出物研究の結果は、β−カテニンのアップレギュレーションが、Ｌ８０３−ｍｔｓによる治療に対する応答における不動性の持続期間の低下に関連することを示している。不動性に対する阻害剤の影響が低下していたとしても、β−カテニンの増大がＬ８０３−ｍｔｓ治療後１２時間持続したことは注目に値する。おそらくは、核に蓄積すると、β−カテニンは、細胞質において主に生じるプロテオソーム分解およびＧＳＫ−３によるリン酸化から保護される。これらの結果は、これらの実験で検出されたβ−カテニンのアップレギュレーションが、ＧＳＫ−３阻害剤Ｌ８０３−ｍｔｓにより誘発される抗うつ的性質に少なくとも部分的に関与することを示唆し得る。
【０２５４】
わかりやすいように個別の態様として説明した本発明のいくつかの特徴を１つの態様に組み合わせて提供できることは理解されるだろう。逆に、簡潔に説明するために１つの態様として説明した本発明の様々な特徴を個別に提供するか、一部を適当に組み合わせて提供することもできる。
【０２５５】
本発明をその特定態様に関して説明したが、多くの代替、変更および変形態様が当業者にとって明白であることは明らかである。したがって、特許請求の範囲の精神およびその広い範囲に包含されるそれらの代替、変更および変形態様は、全て本発明に包含されるものとする。本明細書で言及した刊行物、特許および特許出願は全て、具体的かつ個別的な表示の有無にかかわらず、参照により完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。また、本願で行う参考文献の引用および記載は、当該参考文献を本発明に対する先行技術として利用できるとの自認ではないと解釈されるものとする。
【０２５６】
2006514104.tif 000014
2006514104.tif 000015
2006514104.tif 000016
2006514104.tif 000017
2006514104.tif 000018
2006514104.tif 000019
2006514104.tif 000020
2006514104.tif 000021
2006514104.tif 000022
2006514104.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】リン酸化ペプチド阻害剤のＨＺ１３（図１ａ）、ｐＡＨＳＦおよびＬ８０３（図１ｂ）のＧＳＫ−３阻害活性を明らかにするプロットを示す。
【図２】示された濃度におけるＬ８０３によるＧＳＫ−３の阻害を表し、このＧＳＫ−３ペプチド阻害剤が競合的かつ特異的な阻害剤であることを明らかにするラインウィーバー・バークプロットである。
【図３】Ｌ８０３−ｍｔｓ（本発明によるコンジュゲートの代表例）の速度論的分析を明らかにするプロットを示す（図３ａ〜図３ｂ）。
【図４】インビトロでのＧＳＫ−３活性に対するＬ８０３−ｍｔｓおよびｃｐＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする比較プロットを示す。
【図５】無傷の細胞におけるＬ８０３−ｍｔｓのＧＳＫ−３阻害活性を明らかにする比較プロットおよび棒グラフを示す（それぞれ、図５ａ〜図５ｂ）。
【図６】インスリンの非存在下（図６ａ）および存在下（図６ｂ）におけるグルコース取り込みに対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにするプロットを示す。
【図７】糖耐性に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする比較プロットを示す。
【図８】糖尿病マウスにおける糖耐性に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする比較プロットを示す（図８ａ〜図８ｂ）。
【図９】強制された泳ぎ試験における動物の行動に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を、示されるようなＬ８０３−ｍｔｓまたはｓｃＬ８０３−ｍｔｓ（ｃｐ）の投与後の１時間、３時間および１２時間における、強制された泳ぎ試験に供された動物の示された数から得られた不動性の平均値±ＳＥとして明らかにするグラフである。
【図１０】Ｌ８０３−ｍｔｓまたはｓｃＬ８０３−ｍｔｓ（ｃｐ）の投与後の１時間、３時間および１２時間においてマウス海馬におけるβ−カテニン濃度に対するＬ８０３−ｍｔｓの影響を明らかにする棒グラフを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２５８】
配列番号１〜１９は合成ペプチドが配列を表わす。
【配列表】
2006514104.tif 000024
2006514104.tif 000025
2006514104.tif 000026
2006514104.tif 000027
2006514104.tif 000028
【図１】
2006514104.tif 000032
【図２】
2006514104.tif 000033
【図３】
2006514104.tif 000034
【図４】
2006514104.tif 000035
【図５】
2006514104.tif 000036
【図６】
2006514104.tif 000037
【図７】
2006514104.tif 000038
【図８】
2006514104.tif 000039
【図９】
2006514104.tif 000040
【図１０】
2006514104.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月16日(2005.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の活性を阻害することができるコンジュゲートであって、以下のものを含む、コンジュゲート：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド：
2006514104.tif 000042
式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である；および
（ｂ）前記ポリペプチドに結合した少なくとも１つの疎水性成分であって、（ｉ）良好な膜透過性、および／または（ｉｉ）ＧＳＫ−３の疎水性パッチとの良好な相互作用をコンジュゲートにもたらす疎水性成分。
【請求項２】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも５つの連続したアミノ酸残基を含む請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
Ｙ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｚはアラニン残基である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ｎは１〜１５の整数である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
活性な成分としての請求項１のコンジュゲートと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１３】
ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態の治療における使用のために、包装用材料に詰められ、包装用材料の表面またはその中での活字で識別される請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記生物学的状態は肥満、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性状態、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および精神病的な疾患または障害からなる群から選択される請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＧＳＫ−３の活性を変化させることができる少なくとも１つのさらなる活性な成分をさらに含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記さらなる活性な成分はインスリンである請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の活性を阻害することができる請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＧＳＫ−３の活性を阻害するための請求項１に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２０】
前記活性はリン酸化活性および／または自己リン酸化活性である請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態を治療するための請求項１に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２２】
ＧＳＫ−３活性に関連する生物学的状態の治療用薬剤の調製のための請求項１に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２３】
前記生物学的状態は肥満、インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性状態、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および精神病的な疾患または障害からなる群から選択される請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記情動障害は単極型障害および双極性障害からなる群から選択される請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記神経変性障害は脳虚血、発作、外傷性脳傷害および細菌感染からなる群から選択される事象から生じる請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記神経変性障害は慢性の神経変性障害である請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
前記慢性の神経変性障害はアルツハイマー病、ハンチングトン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＭＬ）および多発性硬化症からなる群から選択される疾患から生じる請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記精神病的障害は統合失調症である請求項２３に記載の使用。
【請求項２９】
前記コンジュゲートが少なくとも１つのさらなる活性な成分との組み合わせで使用され、前記少なくとも１つのさらなる活性な成分はＧＳＫ−３の活性を変化させることができる請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
前記さらなる活性な成分はインスリンである請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の活性を阻害することができる請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記さらなる活性な成分はＧＳＫ−３の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも５つの連続したアミノ酸残基を含む請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項３７】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
Ｙ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
Ｚはアラニン残基である請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項４１】
ｎは１〜１５の整数である請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項４２】
前記コンジュゲートは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項１９，２１および２２のいずれかに記載の使用。
【請求項４３】
情動障害の治療のための、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項４４】
情動障害の治療用薬剤の調製のための、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項４５】
前記情動障害は単極型障害および双極性障害からなる群から選択される請求項４３または４４に記載の使用。
【請求項４６】
対象の海馬におけるβ−カテニンの濃度をアップレギュレーションするための、ＧＳＫ−３の活性を特異的に阻害することができる少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項４７】
前記化合物が下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項４３，４４および４６のいずれかに記載の使用：
2006514104.tif 000043
式中、ｍは１または２に等しい；ｎは１〜５０の整数である；Ｓ（ｐ）はリン酸化セリン残基またはリン酸化トレオニン残基である；Ｚは、セリン残基またはトレオニン残基を除く任意のアミノ酸残基である；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ１〜ＹｎおよびＷ１〜Ｗｍは、それぞれが独立して、任意のアミノ酸残基である。
【請求項４８】
Ｙ３はグルタミン酸残基を除く任意のアミノ酸残基である請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
Ｚはアラニン残基である請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
ｎは１〜１５の整数である請求項４７に記載の使用。
【請求項５１】
前記ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４７に記載の使用。
【請求項５２】
前記ポリペプチドはポリペプチドに結合する少なくとも１つの疎水性成分をさらに含む請求項４７に記載の使用。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの疎水性成分は前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合する請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの疎水性成分は疎水性ペプチド配列を含む請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
前記疎水性ペプチド配列はアラニン残基、システイン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、プロリン残基およびトリプトファン残基からなる群から選択される少なくとも５つの連続したアミノ酸残基を含む請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの疎水性成分は脂肪酸を含む請求項５２に記載の使用。
【請求項５７】
前記脂肪酸は少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記脂肪酸はミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸からなる群から選択される請求項５６に記載の使用。
【請求項５９】
前記化合物が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する請求項５２に記載の使用。
【請求項６０】
以下の工程を含む、請求項１のコンジュゲートを製造するプロセス：
前記ポリペプチドを提供すること；
前記少なくとも１つの疎水性成分を提供すること；および
前記少なくとも１つの疎水性成分と前記ポリペプチドとをコンジュゲート化すること。
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月16日(2005.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸（表１）、および非通常型アミノ酸または修飾アミノ酸（表２）が示される。
【表１】
2006514104.tif 000044
【表２】
2006514104.tif 000045
2006514104.tif 000046
2006514104.tif 000047
【国際調査報告】
2006514104.tif 000048
2006514104.tif 000049
2006514104.tif 000050
2006514104.tif 000051
2006514104.tif 000052