(57)【要約】本明細書に記載した発明は、抗原ホスホリパーゼA2（PLA2）に対する抗体及びその抗体の使用に関する。特に、本発明の幾つかの実施態様にしたがって、抗原PLA2に対する完全なヒトモノクローナル抗体が供給される。重鎖及び軽鎖イムノグロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、及びそれらを含むアミノ酸配列、特に、フレームワーク領域及び/又は相補性決定領域（CDR）にわたる連続する重鎖及び軽鎖配列に対応する配列（具体的には、FR1からFR4又はCDR1からCDR3）が供給される。このようなイムノグロブリン分子及びモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ又は他の細胞ラインも供給する。
2006517188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼA2（PLA2）に結合し、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含むヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を更に含む、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記重鎖が配列番号３の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号４の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記重鎖が配列番号５の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号６の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記重鎖が配列番号７の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号８の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記重鎖が配列番号９の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１０の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記重鎖が配列番号１１の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１２の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記重鎖が配列番号１３の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１４の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記重鎖が配列番号１５の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１６の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記重鎖が配列番号１７の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号１８の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記重鎖が配列番号１９の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号２０の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記重鎖が配列番号２１の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号２２の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記重鎖が配列番号２３の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号２４の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記重鎖が配列番号２５の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号２６の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記重鎖が配列番号２７の配列を含むアミノ酸配列を有し、前記軽鎖が配列番号２８の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１６】
不溶性マトリクスに固定した、請求項２記載の抗体。
【請求項１７】
患者サンプル中のホスホリパーゼA2（PLA2）のレベルをアッセイする方法であって、患者サンプルのアッセイにおいて、PLA2のレベルの検出のために請求項２記載の抗-PLA2抗体の使用を含む方法。
【請求項１８】
前記患者サンプルが血液である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項２記載の抗体、又はその結合断片、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項２０】
効果的に炎症性疾患を治療する方法であって：
炎症性疾患の治療が必要な動物を選択する工程；及び
前記動物に、治療上効果的な用量の、ホスホリパーゼA2（PLA2）に特異的に結合する抗体、又はその結合断片を投与する工程；
を含む方法。
【請求項２１】
前記動物がヒトである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、完全なヒトモノクローナル抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症性疾患が、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患、関節炎、乾癬、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、並びに再狭窄から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が請求項２記載の抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
再狭窄を効果的に治療する方法であって：
炎症性疾患の治療が必要な動物を選択する工程；及び
前記動物に、治療上効果的な用量の、ホスホリパーゼA2（PLA2）に特異的に結合する抗体、又はその結合断片を投与する工程；
を含む方法。
【請求項２６】
前記動物がヒトである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、完全なヒトモノクローナル抗体である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が請求項２記載の抗体である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
動物の炎症性疾患の効果的な治療のための医薬の製造における、完全なヒト抗体、又はその結合断片の使用であって、前記モノクローナル抗体、又はその結合断片がホスホリパーゼA2（PLA2）に結合する使用。
【請求項３０】
前記動物がヒトである、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
前記炎症性疾患が、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患、関節炎、乾癬、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、並びに再狭窄から選択される、請求項２９記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体が請求項２記載の抗体である、請求項２９記載の使用。
【請求項３３】
動物の再狭窄の効果的な治療のための医薬の製造における、完全なヒト抗体、又はその結合断片の使用であって、前記モノクローナル抗体、又はその結合断片がホスホリパーゼA2（PLA2）に結合する使用。
【請求項３４】
前記動物がヒトである、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
前記抗体が請求項２記載の抗体である、請求項３３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で記載する発明は、抗原ホスホリパーゼA2（PLA2）に対する抗体、及び、このような抗体の使用に関する。特に、本発明の幾つかの実施態様にしたがって、抗原PLA2に対する、完全なヒトのモノクローナル抗体が供給される。重鎖及び軽鎖イムノグロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、及び重鎖及び軽鎖イムノグロブリン分子を含むアミノ酸配列、具体的には、フレームワーク領域及び/又は相補性決定領域（CDR）にわたって連続する重鎖及び軽鎖配列（特に、FR4からFR1又はCDR3からCDR1）に対応する配列を供給する。このようなイムノグロブリン分子を発現するハイブリドーマ又は他の細胞ライン、及び、モノクローナル抗体も供給する。
【背景技術】
【０００２】
分泌したホスホリパーゼA2（PLA2）酵素は、広範に分布する、小さくて、ジスフフィド結合を含有する、カルシウム依存性の酵素のファミリーであって、リン脂質のsn-2エステル結合の加水分解を触媒し、リゾリン脂質及びフリーの脂肪酸生成物を遊離させる。E.A. Dennis, TBE Enzymes, Vol 16, Academic Press, New York (1983)を参照せよ。PLA2のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１及び配列番号２で示す。2つの保存残基、ヒスチジン及びアスパラギン酸の側鎖が、触媒部位に加わる。
【０００３】
特に、PLA2は、L-1,2,ジアシルフォスファチドの2-アシル基を加水分解し、アラキドン酸のようなフリーの脂肪酸とリゾリン脂質を生じさせる。リゾリン脂質が、細胞及び膜に損傷を与える能力を有している一方で、膜のリン脂質からのアラキドン酸の合成は、痛み、熱及び炎症に関与するエイコサノイドの4つの主要なクラス（プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサン及びロイコトリエン）の生合成における律速工程である。アラキドン酸は、2つの酵素経路によって代謝され、その後に、ロイコトリエン（リポオキシゲナーゼ活性を介して）、トロンボキサン及びプロスタグランジン（両方ともシクロオキシゲナーゼ活性を介して）を含む炎症誘発性の物質へと変換される。これらの化学伝達物質は、免疫系の細胞及び補体カスケードを増強し、過剰な炎症反応を引き起こす。更にその上、ロイコトリエン-B4は、更にPLA2活性を増すフィードバックループの機能を有することが知られている（Wijkander, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:26543-26549）。
【０００４】
80を超えるPLA2酵素が、構造的に特徴付けられ、高い配列相同性を示している(J.Chang, et al., Biochem. Pharma. 36:2429-2436 (1987); F.F.Davidson and E.A.Dennis, J. of Molecular Evolution 31:228-238 (1990))。PLA2酵素の中で最も良く特徴付けられている種類は、生物学的物質の分解を助ける細胞外の環境へと放出される、分泌型である。分泌型は、約12-15kDaの分子量を有している(前記のDavidson and Dnnis)。
【０００５】
グループI（膵臓）、グループIIA及びIIC（炎症性）並びにグループV（心臓で発現されている）を含む、PLA2の少なくとも4つの異なるグループが、哺乳類細胞において特徴付けられている。グループIのPLA2酵素は、食べ物のリン脂質を分解する機能を有しており、細胞増殖、滑らかな筋収縮、及び急性肺損傷に関与していると考えられている。グループIIのPLA2酵素は、炎症工程の潜在的な伝達物質であり、炎症性疾患の患者の血清及び滑液に多く発現している。これらの酵素は、アッセイされる大部分のヒトの細胞タイプに存在しており、様々な病理学的過程（敗血症ショック、腸癌、関節リューマチ及び表皮過形成等）において発現している。グループVのPLA2酵素は、脳組織からクローン化され、心臓組織において多く発現されている。他のPLA2酵素は、様々なヒトの組織及び細胞ラインからクローン化され、PLA2酵素が非常に多様性に富むことを示唆している。ヒトのPLA2が、最近、胎児肺からクローン化され、その構造特性に基づいて、哺乳類のPLA2酵素の新規のグループの最初のメンバーであると考えられている（Chen J. eta al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 2365-2368; Kennedy, B.P., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 22378-22385; Komada, M., et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1059-1065; and Cuplillard, L. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 15745-15752）。
【非特許文献１】E.A. Dennis, TBE Enzymes, Vol 16, Academic Press, New York (1983)
【非特許文献２】Wijkander, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:26543-26549
【非特許文献３】J.Chang, et al., Biochem. Pharma. 36:2429-2436 (1987)
【非特許文献４】F.F.Davidson and E.A.Dennis, J. of Molecular Evolution 31:228-238 (1990)
【非特許文献５】Chen J. eta al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 2365-2368
【非特許文献６】Kennedy, B.P., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 22378-22385
【非特許文献７】Komada, M., et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1059-1065
【非特許文献８】Cuplillard, L. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 15745-15752
【非特許文献９】Schnabel, Science 260: 1719-1720 (1993)
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【非特許文献１１】Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))
【非特許文献１２】La Planche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)
【非特許文献１３】Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)
【非特許文献１４】Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)
【非特許文献１５】Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991)
【非特許文献１６】Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、pp.87〜108 (F.Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))
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【非特許文献１８】Dayhoff,M.O, in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp101〜110 and Supplement 2 to Vol. 5, 1-10 (National Biomedical Research Foundation(1972))
【非特許文献１９】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)
【非特許文献２０】Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)
【非特許文献２１】Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 85:2444 (1988)
【非特許文献２２】Immunology-A Synthesis (2nd Ed, Golub, E.S. and Gren, D.R. eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))
【非特許文献２３】Bowie et al., Science 253:164 (1991)
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【非特許文献２８】Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)
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【非特許文献３３】Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (1987))
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【非特許文献３５】Chothia et al., Nature 342:878〜883 (1989)
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【非特許文献３８】Green et al. Nature Genetics 7:13〜21 (1994)
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【特許文献１】米国特許第5,151,510号
【特許文献２】米国特許第4,275,149号
【特許文献３】米国特許出願番号08/759,620
【特許文献４】米国特許出願第60/334,508
【特許文献５】米国特許出願第07/466,008号
【特許文献６】米国特許出願第07/610,515号
【特許文献７】米国特許出願第07/919,297号
【特許文献８】米国特許出願第07/922,649号
【特許文献９】米国特許出願第08/031,801号
【特許文献１０】米国特許出願第08/112,848号
【特許文献１１】米国特許出願第08/234,145号
【特許文献１２】米国特許出願第08/376,279号
【特許文献１３】米国特許出願第08/430,938号
【特許文献１４】米国特許出願第08/464,584号
【特許文献１５】米国特許出願第08/464,582号
【特許文献１６】米国特許出願第08/463,191号
【特許文献１７】米国特許出願第08/462,837号
【特許文献１８】米国特許出願第08/486,853号
【特許文献１９】米国特許出願第08/486,857号
【特許文献２０】米国特許出願第08/486,859号
【特許文献２１】米国特許出願第08/462,513号
【特許文献２２】米国特許出願第08/724,752号
【特許文献２３】米国特許出願第08/759,620号
【特許文献２４】米国特許第6,162,963号
【特許文献２５】米国特許第6,150,584号
【特許文献２６】米国特許第6,114,598号
【特許文献２７】米国特許第6,075,181号
【特許文献２８】米国特許第5,939,598号
【特許文献２９】日本国特許3068180B2号
【特許文献３０】日本国特許3068506B2号
【特許文献３１】日本国特許3068507B2号
【特許文献３２】欧州特許EP0463151B1号
【特許文献３３】国際特許出願WO94/02602号
【特許文献３４】国際特許出願WO96/34096号
【特許文献３５】WO98/24893
【特許文献３６】WO00/76310
【特許文献３７】米国特許第5,545,807号
【特許文献３８】米国特許第5,545,806号
【特許文献３９】米国特許第5,625,825号
【特許文献４０】米国特許第5,625,126号
【特許文献４１】米国特許第5,633,425号
【特許文献４２】米国特許第5,661,016号
【特許文献４３】米国特許第5,770,429号
【特許文献４４】米国特許第5,789,650号
【特許文献４５】米国特許第5,814,318号
【特許文献４６】米国特許第5,877,397号
【特許文献４７】米国特許第5,874,299号
【特許文献４８】米国特許第6,255,458号
【特許文献４９】米国特許第5,591,669号
【特許文献５０】米国特許第6,023.010号
【特許文献５１】米国特許第5,612,205号
【特許文献５２】米国特許第5,721,367号
【特許文献５３】米国特許第5,789,215号
【特許文献５４】米国特許第5,643,763号
【特許文献５５】米国特許出願第07/574,748号
【特許文献５６】米国特許出願第07/575,962号
【特許文献５７】米国特許出願第07/810,279号
【特許文献５８】米国特許出願第07/853,408号
【特許文献５９】米国特許出願第07/904,068号
【特許文献６０】米国特許出願第07/990,860号
【特許文献６１】米国特許出願第08/053,131号
【特許文献６２】米国特許出願第08/096,762号
【特許文献６３】米国特許出願第08/155,301号
【特許文献６４】米国特許出願第08/161,739号
【特許文献６５】米国特許出願第08/165,699号
【特許文献６６】米国特許出願第08/209,741号
【特許文献６７】欧州特許0546073B1号
【特許文献６８】国際特許出願WO92/03918
【特許文献６９】WO92/22645
【特許文献７０】WO92/22647
【特許文献７１】WO92/22670
【特許文献７２】WO93/12227
【特許文献７３】WO94/00569
【特許文献７４】WO94/25585
【特許文献７５】WO96/14436
【特許文献７６】WO97/13852
【特許文献７７】WO98/24884
【特許文献７８】米国特許第5,981,175号
【特許文献７９】WO 00/76310
【特許文献８０】欧州特許出願第773288号
【特許文献８１】欧州特許出願第843961号
【特許文献８２】米国特許第5,476,996号
【特許文献８３】米国特許第5,698,767号
【特許文献８４】WO 92/02190
【特許文献８５】米国特許第5,530,101号
【特許文献８６】米国特許第5,585,089号
【特許文献８７】米国特許第5,693,761号
【特許文献８８】米国特許第5,693,792号
【特許文献８９】米国特許第5,714,350号
【特許文献９０】米国特許第5,777,085号
【特許文献９１】米国特許第4,683,195号
【特許文献９２】米国特許第4,683,202号
【特許文献９３】米国特許第5,733,743号
【特許文献９４】米国特許第5,703,057号
【特許文献９５】米国特許第4,816,397号
【特許文献９６】米国特許第5,916,771号
【特許文献９７】米国特許第6,207,418号
【特許文献９８】米国特許第4,681,581号
【特許文献９９】米国特許第4,735,210号
【特許文献１００】米国特許第5,101,827号
【特許文献１０１】米国特許第5,102,990号
【特許文献１０２】米国特許第5,648,471号
【特許文献１０３】米国特許第5,697,902号
【特許文献１０４】国際特許出願WO94/294
【特許文献１０５】国際特許出願WO97/38137
【特許文献１０６】米国特許第3,773,919号
【特許文献１０７】EP58,481
【特許文献１０８】EP133,988
【特許文献１０９】米国特許第DE3,218,121号
【特許文献１１０】EP52,322
【特許文献１１１】EP36,676
【特許文献１１２】EP88,046
【特許文献１１３】EP143,949
【特許文献１１４】日本国特許出願83-118008
【特許文献１１５】米国特許第4,485,045号
【特許文献１１６】米国特許第4,544,545号
【特許文献１１７】EP102,324
【特許文献１１８】米国特許出願第10/309,419号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の実施態様は、PLA2に対する抗体に関する。抗原PLA2に対する抗体は、例えば、アテローム性動脈硬化及び再狭窄の治療における脂質低減剤として有用である。このような抗体は、また、炎症性疾患の診断、予防及び治療においても有用である。炎症性疾患及び変性疾患は、衰弱性機能障害の主な原因である。アテローム性動脈硬化、関節炎、乾癬及び喘息のような炎症性の状態は、関節、皮膚及び血管における炎症反応が原因である。加えて、最近の研究により、アルツハイマー病の病状の主な構成要素が慢性性炎症であり、非ステロイド系の抗炎症剤の投与が、アルツハイマー病の進展を示すと考えられることが指摘された（Schnabel, Science 260: 1719-1720 (1993)）。
【０００７】
炎症反応の緩和又は除去は、これらの病気の治療の解決の鍵であろう。したがって、本明細書で開示される抗体は、膜リン脂質からのアラキドン酸の放出を防ぎ、アラキドン酸カスケードの全体を停止させ、それにより炎症性工程による破壊を止めるために、PLA2の阻害剤として機能する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施態様は、また、PLA2に結合し、PLA2機能に影響を及ぼすモノクローナル抗体を含む。したがって、本発明の実施態様により、診断及び治療の観点から望ましい特性を有するヒトの抗PLA2抗体、及び、抗PLA2抗体調製物が供給される。特に、本発明の1つの実施態様により、例えば、これに制限するわけではないが、PLA2に対する強い結合力、in vitroにおけるPLA2機能を中和する能力、及びin vivoにおけるPLA2機能を長い期間中和する能力を含む、治療上の有用性を付与する特性を有する抗体が供給される。
【０００９】
本発明の1つの実施態様は、PLA2に結合し、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０及び３１からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列を有する完全なヒトのモノクローナル抗体である。1つの実施態様においては、抗体が、更に、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、PLA2に結合し、表３及び４に示されるCDR配列を有する重鎖アミノ酸配列を有する完全なヒトのモノクローナル抗体である。CDR決定は、当分野の当業者によって容易に達成することができることが知られている。一般的に、本明細書で開示される発明においては、CDRは、Kabat et al., in Sequences of Proteins of Immunological Interest vols. 1-3 (Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD 1991)によって定義されるものとして提示する。
【００１１】
本発明の更なる他の実施態様は、PLA2に結合し、表５及び６に示されるCDR配列を有する軽鎖アミノ酸配列を含む完全なヒト抗体である。
【００１２】
本発明の更なる実施態様は、PLA2に結合し、表３及び４に示される配列を含むCDRを有する重鎖アミノ酸、並びに、表５及び６に示される配列を含むCDRを有する軽鎖アミノ酸配列を含む完全なヒト抗体である。
【００１３】
本発明の更なる実施態様は、本発明の完全なヒト抗体とPLA2との結合でクロス競合する抗体である。本発明の他の実施態様においては、完全なヒト抗体は、抗-PLA2 mAb 2.12又は抗-PLA2 mAb 2.25である。
【００１４】
本明細書で記載されている本発明の実施態様は、PLA2に特異的に結合する単離された抗体の産生及び同定に基づく。前記したように、PLA2は、炎症性疾患及び関連する病状において、上昇したレベルで発現する。それゆえ、PLA2の生物学的活性を阻害することにより、このような疾患及び病気によって引き起こされる症状の進展を遅らせることができる。例えば、この疾患及び病気は、限定するわけではないが、関節炎、乾癬、喘息及びアルツハイマー病（最も好ましくはアテローム性動脈硬化及び再狭窄）を含む、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患である。
【００１５】
したがって、本明細書で記載されている本発明の1つの実施態様は、PLA2に結合する単離された抗体、又はこれら抗体の断片を提供することである。当分野で知られているように、例えば、抗体は、有利なことには、モノクローナル、キメラ及び/又はヒト抗体とすることができる。本明細書で記載されている本発明の実施態様は、また、これらの抗体を産生する細胞を提供することである。
【００１６】
本発明の実施態様が、如何なる特定の抗-PLA2抗体、又は抗体の任意の特定の形態に制限されないことは明らかであろう。例えば、抗-PLA2抗体は、完全長の抗体（例えば、インタクトなヒトFc領域）又は抗体断片（例えば、Fab、Fab’又はF(ab’)2）とすることができる。加えて、抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、又は、抗体をコードする遺伝子又は遺伝子群で形質転換又はトランスフェクトした組換え体産生細胞から製造することができる。
【００１７】
好ましい実施態様においては、本発明は、限定することなしに、関節炎、乾癬、喘息及びアルツハイマー病（最も好ましくはアテローム性動脈硬化及び再狭窄）を含む、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患を（限定するわけではないが）含む、ヒトにおける炎症性疾患及び関連する病状の治療を含む。
【００１８】
1つの実施態様においては、抗-PLA2抗体は、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と混合された、有効量の抗体、又はその断片を含む医薬組成物を形成する。他の実施態様においては、抗-PLA2抗体又はその断片を、治療剤に結合させる。治療剤は、例えば毒素又は放射性同位体であってよい。好ましくは、このような抗体は、限定するわけではないが、関節炎、乾癬、喘息及びアルツハイマー病（最も好ましくはアテローム性動脈硬化及び再狭窄）を含む、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患のような、病気の治療に使用することができる。
【００１９】
他の実施態様においては、本発明は、患者においてPLA2の発現と関連した病気又は病状を、患者に効果的な量の抗-PLA2抗体を投与することによって治療する方法を含む。前記患者は、哺乳類の患者、好ましくはヒト患者である。前記病気又は病状は、例えば、限定するわけではないが、関節炎、乾癬、喘息及びアルツハイマー病（最も好ましくはアテローム性動脈硬化及び再狭窄）を含む、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患とすることができる。更なる実施態様には、炎症性疾患の治療が必要な哺乳類を同定し、治療上効果的な量の抗-PLA2抗体をその哺乳類に投与することによる、哺乳類のPLA2の発現に関連した病気又は病状の治療方法を含む。
【００２０】
代わりに、制限するわけではないが、炎症性疾患又は関連する病状を含む、PLA2の発現に関連した病気又は疾患に哺乳類がかかるのを防ぐために、抗-PLA2抗体を投与することができる。好ましくは、抗-PLA2抗体は、完全なヒト抗体である。病気又は病状は、例えば、限定するわけではないが、関節炎、乾癬、喘息及びアルツハイマー病（最も好ましくはアテローム性動脈硬化及び再狭窄）を含む、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患とすることができる。
【００２１】
他の実施態様においては、本発明は、抗-PLA2抗体を含む組成物を有する容器、及び、前記組成物がPLA2の発現によって特徴づけられる病状を治療するのに使用することができることを示す添付書類又はラベルを含む製造品である。好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトが、抗-PLA2抗体を受け取る。好ましい実施態様においては、ヒトにおける炎症性疾患及び関連する病状を治療する。
【００２２】
他の実施態様は、抗-PLA2抗体を用いたPLA2の存在を同定することを含む、病気の危険因子を同定する方法、病気を診断する方法及び病気の病期診断である。
【００２３】
1つの実施態様においては、本発明は、細胞を抗-PLA2抗体と接触させて、PLA2の存在を検出することによる、細胞中においてPLA2の発現に関連した病状を診断する方法を含む。
【００２４】
更にもう1つ実施態様においては、本発明は、ヒトにおける炎症性の疾患及び関連する病状をスクリーニングするための哺乳類組織又は細胞においてPLA2を検出するアッセイキットを含む。前記キットは、PLA2に結合する抗体、及び、もし存在するならばPLA2と抗体の反応を示す方法を含む。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。1つの実施態様においては、PLA2に結合する抗体は標識されている。好ましくは、抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種、及び放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。もう1つの実施態様においては、抗体は、標識されていない第一の抗体であり、前記反応を示す手段は、標識した抗-イムノグロブリン抗体である。
【００２５】
更にもう1つの実施態様は、炎症性疾患及び関連する病状の治療ための医薬の調製における抗-PLA2抗体の使用である。1つの実施態様においては、前記病気は、限定するわけではないが、関節炎、乾癬、喘息及びアルツハイマー病（最も好ましくはアテローム性動脈硬化及び再狭窄）を含む、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患を含む群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の1つの実施態様は、抗原PLA2に対する抗体、及び、そのような抗体の使用に関する。例えば、PLA2に対する抗体は、炎症性疾患及び関連する病状を効果的に予防する、治療する、診断する及び/又は病期診断する方法に使用することができる。この病状は、例えば、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応、アテローム性動脈硬化、関節炎、乾癬、喘息、再狭窄、並びにアルツハイマー病を含む。1つの具体的な実施態様においては、抗-PLA2抗体の治療的に有効な量を、炎症性疾患及び関連する病状のための治療として投与する。好ましい実施態様においては、前記抗体は、抗原PLA2に対する完全なヒトのモノクローナル抗体である。
【００２７】
本発明の他の実施態様は、in vivoで炎症を減少させる他の化合物に関する。それゆえ、PLA2のレベルを下げる化合物は、炎症性疾患の治療に有用であろう。PLA2核酸、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、及び他の関連する化合物の使用を、より完全に以下に開示する。
【００２８】
加えて、本発明の核酸、並びにその断片及びバリアントを、(a)対応するコードタンパク質、ポリペプチド、断片及びバリアントの、組換え体又は異種遺伝子産物としての生合成を指示するため、(b)本明細書で開示されている核酸を検出及び定量するためのプローブとして、(c)アンチセンス分子を調製するための配列鋳型としてなどの、非制限的な例で使用することができる。このような使用は、以下の開示中でより完全に記載する。
【００２９】
さらに、前記タンパク質及びポリペプチド、並びにその断片及びバリアントは、(a)抗-PLA2抗体の産生を刺激するための免疫原として働かせること、(b)このような抗体の免疫原性アッセイにおける捕捉抗原、(c)本発明のPLA2に結合する物質のスクリーニングの標的として、及び(d)抗体を用いた治療が炎症性の応答を阻害するような、PLA2特異的抗体の標的を含めた方法で使用することができる。PLA2核酸、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、及び他の関連する化合物の使用の有用性及び他の有用性を、以下により完全に開示する。その炎症調節の強い効果の観点から、PLA2ポリペプチドの発現及び活性の増加は、炎症を促進するのに使用することができる。反対に、PLA2ポリペプチド発現の減少は、炎症を減少させるのに使用することができる。
【００３０】
（配列表）
代表的なヒト抗-PLA2抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列表において提供する。その中身を、以下の表１にまとめる。
【００３１】
【表１】
2006517188.tif 000003
【００３２】
（定義）
他に定義しない限り、本明細書に記載されている本発明に関連して用いられている科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている、細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチドの化学的性質及びハイブリダイゼーションに関して使用される命名、及びこれらの技法は、当分野でよく知られており一般的に使用されるものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換(例えばエレクトロポレーション、リポフェクション)用に、標準的技法を使用する。酵素反応及び精製技法は、製造者の仕様書に従い、あるいは当分野で一般的に実施されているように、あるいは本明細書に記載するように行う。前述の技法及び手順は、当分野でよく知られている従来の方法に従い、本明細書中に引用し論じている、様々な一般的でより具体的な参照文献中に記載されているのと同様に一般的に行う。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))を参照のこと。本明細書に記載する、分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び薬剤化学に関して使用される命名、並びにこれらの実験手順及び技法は、当分野でよく知られており一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬品調製物、配合物、及びデリバリー、及び患者の治療用に、標準的技法を使用する。
【００３３】
本明細書において提供される実施態様により使用されるように、以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有すると理解されたい:
【００３４】
本明細書で使用する用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA、あるいは合成起源又はそのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源によって、「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見られるポリヌクレオチドの全て又は一部分と関連しておらず、(2)天然では結合しないポリヌクレオチドに操作可能に連結している、あるいは(3)より大きな配列の一部分として天然には存在しない。
【００３５】
本明細書で述べる用語「単離されたタンパク質」は、cDNA、組換えRNA、あるいは合成起源又はそのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源、又は誘導源によって、「単離されたタンパク質」は、(1)天然で見られるタンパク質に関連していない、(2)同じ源由来の他のタンパク質を含まない、例えばマウスタンパク質を含まない、(3)異なる種由来の細胞によって発現される、あるいは(4)天然には存在しない。
【００３６】
用語「ポリペプチド」は、ネイティブなタンパク質、断片、又はポリペプチド配列のアナログを指すための一般用語として本明細書で使用する。それ故、ネイティブなタンパク質、断片、及びアナログは、ポリペプチド属の種である。本発明の好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖イムノグロブリン分子及びヒトkappa軽鎖イムノグロブリン分子、並びに重鎖イムノグロブリン分子と、kappa軽鎖イムノグロブリン分子などの軽鎖イムノグロブリン分子、及びこの逆を含む組合せによって形成される抗体分子、並びにこれらの断片及びアナログを含む。
【００３７】
本明細書で使用し、物体に適用する用語「天然に存在する」は、物体を天然中で見ることができるという事実を指す。例えば、天然源から単離することができる(ウィルスを含めた)生物中に存在し、研究室又はそれ以外で人間によって故意に改変されていない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００３８】
本明細書で使用する用語「操作可能に連結した」は、コンポーネントをその目的とする方法で機能させることができる関係にあると記載される、コンポーネントの位置を指す。例えば、コード配列と「操作可能に連結した」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合性のある条件下で達成されるような方法で連結している。
【００３９】
本明細書で使用する用語「コントロール配列」は、それらが連結するコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えるのに必要な、ポリヌクレオチド配列を指す。このようなコントロール配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物では、このようなコントロール配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終了配列を含み、真核生物では、一般に、このようなコントロール配列は、プロモーター及び転写終了配列を含む。用語「コントロール配列」は、最小限で、その存在が発現及びプロセシングに必要不可欠な、すべてのコンポーネントを含むことが意図され、その存在が有利である他のコンポーネント、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列(fusion partner sequence)も含むことができる。
【００４０】
本明細書で述べる用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも10塩基長のヌクレオチドの、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの、あるいは修飾した形態のいずれかのタイプのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は、DNAの一本鎖及び二本鎖形態を含む。
【００４１】
本明細書で述べる用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチド、及び、天然に存在するオリゴヌクレオチドと、非天然オリゴヌクレオチドの結合によって1つに結合した修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、200塩基長さ以下を一般に含むポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは10〜60塩基長であり、最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、又は20〜40塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブ用に一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体の構築において使用するために、二本鎖であってよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００４２】
本明細書で述べる用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で述べる用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾又は置換された糖基などを有する、ヌクレオチドを含む。本明細書で述べる用語「オリゴヌクレオチド結合」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート、その他などの、オリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、La Planche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、pp.87〜108 (F.Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., 米国特許第5,151,510号; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、望むならば、検出用の標識を含むことができる。
【００４３】
本明細書で述べる用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びそれらの断片は、非特異的核酸が検出される結合量を最小限にするハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を使用して、当分野で知られており本明細書で論じる、選択的ハイブリダイゼーション条件を得ることができる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は抗体断片と、対象核酸配列の間の核酸配列相同性は、少なくとも80%、より典型的には、少なくとも85%、90%、95%、99%、及び100%の高い相同性であることが好ましい。2つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的又は完全な同一性が存在する場合、「相同的」である。例えば、85%の相同性は、2つの配列が最大にマッチするアラインメントをとるとき、85%のアミノ酸が同一であることを意味する。(マッチさせた2つの配列のいずれかにおける)ギャップが、マッチングを最大にする際に与えられ、5以下のギャップ長が好ましく、2以下がより好ましい。あるいは好ましくは、2つのタンパク質配列(又は少なくとも約30アミノ酸長のタンパク質配列に由来するポリペプチド配列)は、6以上のギャップペナルティー及び変異データマトリクスを用いるプログラムALIGNを使用して、これらの配列が(標準偏差単位で)5を超えるアラインメントスコアを有する場合、本明細書でこの用語を使用するように、相同的である。Dayhoff,M.O, in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp101〜110 and Supplement 2 to Vol. 5, 1-10 (National Biomedical Research Foundation(1972))を参照のこと。2つの配列又はその一部分は、ALIGNプログラムを使用して最適にアラインメントをとるとき、それらのアミノ酸が50%以上同一である場合、相同的であることがより好ましい。用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が、リファレンスポリヌクレオチド配列の全体又は一部分と相同的であること(すなわち、同一であるが、厳密には進化上関係がない)、あるいはポ
リペプチド配列が、リファレンスポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書で使用する。対照的に、用語「と相補的」は、相補配列がリファレンスポリヌクレオチド配列の全体又は一部分と相同的であることを意味するために、本明細書で使用する。例示のため、ヌクレオチド配列「TATAC」はリファレンス配列「TATAC」に対応し、リファレンス配列「GTATA」と相補的である。
【００４４】
以下の用語:「リファレンス配列」、「比較ウインドウ(comparison window)」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、及び「実質的同一性」は、2つ以上のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の、配列の関係を記載するために使用する。「リファレンス配列」は、配列比較の基盤として使用される明確な配列である。リファレンス配列は、より大きな配列のサブセット、例えば配列表中に与えられる完全長cDNA又は遺伝子配列のセグメントなどであってよく、あるいは完全cDNA又は遺伝子配列を含むことができる。一般に、リファレンス配列は、少なくとも18ヌクレオチド又は6アミノ酸長、しばしば少なくとも24ヌクレオチド又は8アミノ酸長、しばしば少なくとも48ヌクレオチド又は16アミノ酸長である。2つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列は、(1)2分子間の類似した配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の一部分)をそれぞれ含むことができ、(2)2つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の間で異なる配列をさらに含むことができるので、2つ(あるいはそれより多くの)分子間の配列比較は典型的には、「比較ウインドウ」で2分子の配列を比較して、局所領域の配列類似性を同定し比較することによって行う。本明細書で使用する「比較ウインドウ」は、少なくとも約18の隣接ヌクレオチド位置又は約6アミノ酸の概念上のセグメントを指し、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、少なくとも18個の隣接ヌクレオチド又は6個のアミノ酸配列のリファレンス配列と比較し、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適アラインメント用のリファレンス配列(付加又は欠失を含まない)と比較して、20パーセント以下の付加、欠失、置換など(すなわちギャップ)を含むことができる。比較ウインドウにアラインメントをとらせるための、配列の最適アラインメントは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A
) 85:2444 (1988)の類似性探求法によって、これらのアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中(Genetics Computer Group、575 Science Dr、Madison、Wis)、GENEWORKS(商標)、又はMACVECTOR(登録商標)ソフトウェアパッケージ)のコンピュータによる実施によって、あるいは調査によって行うことができ、様々な方法によって生じた最良のアラインメント(すなわち、比較ウインドウで最高の割合の相同性をもたらす)を選択する。
【００４５】
用語「配列同一性」は、2つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列が、比較ウインドウで同一であること(すなわち、ヌクレオチド毎あるいは残基毎の単位で同一であること)を意味する。用語「配列同一性の割合」は、以下の一連の方法、すなわち、比較ウインドウで2つの最適にアラインメントをとる配列を比較し、同一の核酸塩基(例えばA、T、C、G、U又はI)又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を求めてマッチした位置の数を決定し、比較ウインドウ中の位置の合計数(すなわちウインドウの大きさ)でマッチした位置の数を割り、その結果に100を掛けて配列同一性の割合を求めることによって、計算される。本明細書で使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸が、少なくとも18ヌクレオチド(6アミノ酸)の位置の比較ウインドウ、しばしば少なくとも24〜48ヌクレオチド(8〜16アミノ酸)位置のウインドウでリファレンス配列と比較した場合に、少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特徴を示し、配列同一性の割合は、比較ウインドウでリファレンス配列の合計20パーセント以下の欠失又は付加を含むことができる配列と、リファレンス配列を比較することによって計算される。リファレンス配列は、大きな配列のサブセットであってよい。
【００４６】
本明細書で使用するように、20種の一般的なアミノ酸及びそれらの略称は、従来の使用に従う。Immunology-A Synthesis (2nd Ed, Golub, E.S. and Gren, D.R. eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照のこと。20種の一般的なアミノ酸、α-、α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸、及び他の一般的ではないアミノ酸の立体異性体(例えばD-アミノ酸)も、本明細書に記載された本発明のポリペプチドに適したコンポーネントとすることができる。一般的ではないアミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、σ-N-メチルアルギニン、及び他の類似のアミノ酸及びイミノ酸(例えば4-ヒドロキシプロリン)がある。本明細書で使用するポリペプチドの表記では、標準的使用及び慣習に従い、左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方向である。
【００４７】
同様に、他に指定しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が5'末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を5'方向と呼ぶ。新生RNA転写物の5'から3'の付加方向を転写方向と呼び、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物5'末端までの5'側であるDNA鎖上の配列領域を「上流配列」と呼び、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の3'末端までの3'側であるDNA鎖上の配列領域を「下流配列」と呼ぶ。
【００４８】
ポリペプチドに適用すると、用語「実質的同一性」は、2つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重値(default gap weights)を使用しプログラムGAP又はBESTFITなどによって、最適にアラインメントをとらせると、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。同一ではない残基の位置は、保存型アミノ酸置換とは異なることが好ましい。保存型アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存型アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、及びアスパラギン-グルタミンである。
【００４９】
本明細書で論じるように、抗体又はイムノグロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変化は、本明細書に記載する本発明により含まれるものとして企図される。ただし、アミノ酸配列の変化が、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、90%、95%、及び最も好ましくは99%の配列同一性を保つものとする。特に、保存型アミノ酸置換が企図される。保存型の置換は、関連した側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般に、いくつかのファミリーに分けられる:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン;(3)無極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;及び(4)非帯電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは:セリン及びスレオニンは、脂肪族-ヒドロキシファミリーであり、アスパラギン及びグルタミンは、アミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり、かつフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンとイソロイシン又はバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンの単離置換、又はあるアミノ酸とそれと構造的に関係があるアミノ酸の類似の置換が（置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に含まれない場合は特に）、得られる分子の結合機能又は性質に対して重大な影響を有することはないと予期されることは理にかなっている。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって、容易に決定することができる。アッセイは、本明細書に詳細に記載する。抗体又はイムノグロブリン分子の断片又はアナログは、当分野の当業者により容易に調製することができる。断片又はアナログの好ましいアミノ及びカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界近くに存在する。構造及び機能性ドメインは、ヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列データと、公又は占有の配列のデータベースを比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピュータによる比較法を使用して、既知の構造及び/又は機能の他のタンパク質中に存在する、配列モチーフ又は予想されるタンパク質の立体配座ドメインを同定する。既知の三次元構造に折りたたまれているタンパク質の配列を、同定するための方法は知られている。Bowie et al., Science 253:164 (1991)。したがって、前述の例は、当分野の当業者が、本発明による構造及び機能ドメインを定義するために使用することができる配列モチーフ及び構造の立体配座を理解することができることを実証する。
【００５０】
好ましいアミノ酸置換は、(1)タンパク質分解されやすさを低下させる、(2)酸化されやすさを低下させる、(3)タンパク質複合体形成に関する結合親和性を変える、(4)結合親和性を変える、及び(4)このようなアナログの他の物理化学的又は機能的性質を与えるかあるいは改変する置換である。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の、様々なムテインの配列を含むことができる。例えば、1つ又は複数のアミノ酸置換(好ましくは保存型アミノ酸置換)は、天然に存在する配列中(好ましくは、分子間の接触部位を形成するドメイン外のポリペプチドの部分中)で行うことができる。保存型アミノ酸置換が、親配列の構造特性を実質的に変えることはないはずである(例えば、置換アミノ酸が、親配列中に存在するヘリックスを破壊する、あるいは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向はないはずである)。当分野で認められているポリペプチドの二次構造及び三次構造の例は、Proteins., Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W.H.Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Branden, C. and Tooze, J. eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et al., Nature 354:105 (1991)中に記載されている。
【００５１】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、天然に存在する配列、例えば完全長cDNA配列から推定される配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は典型的には、少なくとも5、6、8又は10アミノ酸長、好ましくは少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長、通常は少なくとも50アミノ酸長、及びさらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。本明細書で使用する用語「アナログ」は、推定アミノ酸配列の一部分と実質的同一性を有し、以下の性質:(1)適切な結合条件下でのPLA2との特異的結合、(2)適切なPLA2結合を阻害する能力、又は(3)in vitro 又はin vivoで生育する細胞でのPLA2発現を阻害する能力の少なくとも1つを有する、少なくとも25アミノ酸のセグメントからなる、ポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列に関する、保存型アミノ酸置換(あるいは付加又は欠失)を含む。アナログは、典型的には少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも50アミノ酸長以上であり、しばしば可能な限り完全長の天然に存在するポリペプチドとすることができる。
【００５２】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの性質と類似した性質を有する非ペプチド薬剤として、医薬産業において一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」又は「模倣ペプチド」と呼ばれる。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987)。このような化合物は、コンピュータによる分子のモデル化によって開発されることが多い。治療上有用なペプチドと構造的に類似している、模倣ペプチドを使用して、同等の治療又は予防効果を生み出すことができる。一般に模倣ペプチドは、ヒト抗体などの、範例ポリペプチド(すなわち、生化学的性質又は薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、当分野でよく知られている方法によって、--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--(シス及びトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、及びCH2SO--からなる群から選択される結合によって場合によっては置換される、1つ又は複数のペプチド結合を有する。同じタイプのD-アミノ酸と、同じ配列の1つ又は複数のアミノ酸の全体的置換を使用して(例えばL-リシンの代わりにD-リシン)、より安定したペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列又はほぼ同一のコンセンサス配列の変形を含む制約されたペプチド(constrained peptide)は、当分野で知られている方法によって(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochetn. 61:387 (1992));例えばペプチドを環状にする分子間ジスルフィド架橋を形成することができる、内部システイン残基を加えることによって、生成することができる。
【００５３】
「抗体」又は「抗体ペプチド」は、インタクトな抗体、又は特異的結合に関してインタクトな抗体と競合する、その結合断片を指す。結合断片は、組換えDNA技法によって、あるいはインタクトな抗体の酵素又は化学的切断によって生成される。結合断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体がある。「二重特異性」又は「二重機能性」抗体以外の抗体は、それぞれのその結合部位が同一であると理解される。過剰の抗体が、カウンターレセプターと結合するレセプターの量を、(in vitroの競合結合アッセイで測定して)少なくとも約20%、40%、60%又は80%、及びさらに通常は約85%を超えて低下させるとき、抗体はレセプターとカウンターレセプターの接着を実質的に阻害する。
【００５４】
用語「エピトープ」は、イムノグロブリン又はT細胞レセプターと特異的に結合することができる任意のタンパク質抗原決定基を含む。エピトープ抗原決定基は通常、アミノ酸又は糖鎖などの分子の化学的に活性がある表面基からなり、特異的な三次元構造特性、及び特異的な電荷特性を通常有する。解離定数が1μM以下、好ましくは100nM以下、及び最も好ましくは10nM以下であるとき、抗体は抗原と特異的に結合すると言える。
【００５５】
用語「物質」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的マクロ分子、又は生物学的物質から調製した抽出物を示すために、本明細書で使用する。
【００５６】
本明細書における目的のための「活性がある」又は「活性」は、ネイティブな又は天然に存在するPLA2ポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPLA2ポリペプチドの形態を指し、「生物学的」活性は、ネイティブな又は天然に存在するPLA2ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、ネイティブな又は天然に存在するPLA2ポリペプチドによって引き起こされる生物学的機能（阻害性又は刺激性のいずれか）を指し、「免疫学的」活性は、ネイティブな又は天然に存在するPLA2ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指す。
【００５７】
「治療」は、治療上の処置及び予防的な又は予防手段を指し、治療により、対象者が標的病態又は疾患を予防する、又は遅らせる（緩和する）ことができる。治療が必要な対象者は、すでに疾患を有する対象者だけではなく、疾患にかかりやすい対象者又は疾患を予防している対象者を含む。
【００５８】
「哺乳類」は、ヒト、他の霊長類（サル、チンパンジー及びゴリラ等）、家畜及び農業用家畜、並びに、動物園にいる動物、研究用動物、又はペット動物（イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、げっ歯類等）等を含む、哺乳類に分類される任意の動物を指す。治療の目的のためには、哺乳類は、ヒトであることが好ましい。
【００５９】
本明細書に使用される「担体」は、使用する用量及び濃度で細胞又は哺乳類に対して非毒性である、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤を含む。たびたび、生理学的に許容可能な担体は、水溶性のpH緩衝溶液である。生理学的に許容可能な担体の例には、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸塩などのバッファー;アスコルビン酸などの抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)ペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又はイムノグロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニンなどのアミノ酸;単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含めた他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン、及び/又はTWEEN（商標）、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS（商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００６０】
抗体のパパイン消化によって、「Fab」断片としても知られている2つの同一の抗原結合部位断片（それぞれが1つの抗原結合部位を有する）、及び、残りの「Fc」断片（結晶化する能力を有することから命名された）を産生する。ペプシン処理によって、2つの抗原結合部位を含み、抗原を架橋させる能力を有する「F(ab')2」断片が生成する。
【００６１】
「Fv」は、抗体の完全な抗原認識部位と抗原結合部位を保持している、抗体の最小断片を指す。この領域は、タイトで共有結合ではなくて会合している、1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。それぞれの可変ドメインの3つのCDRが相互作用し、VH-VLダイマーの表面の抗原結合部位を規定しているのは、この立体配置においてである。正確には、6つのCDRにより、抗体に、抗原結合特異性が付与される。しかしながら、例えば、1つの可変領域（例えば、FvダイマーのVH又はVL部分、又は、抗原に特異的な3つのCDRだけを含む、半分のFv）でさえも、抗原を認識して結合する能力を有している。しかしながら、おそらく、完全な結合部位よりも低い親和性であろう。
【００６２】
Fab断面は、また、軽鎖ドメインと、重鎖の第一定常ドメイン（CH1）も含む。Fab断片は、抗体のヒンジ領域からの1つ又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されていることによって、Fab’断片とは異なる。F(ab’)抗体断片は、元来、ヒンジシステインを有するFab’のペアとして産生されてきた。他の抗体断片を化学的に結合させることも知られている。
【００６３】
「固相」は、本明細書に開示されている抗体が吸着することができる非水溶性のマトリクスを意味する。本明細書に含まれる固相の例には、部分的に又は全体的にガラス（例えば、多孔性の球状ガラスビーズ）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成される固相が含まれる。特定の実施態様においては、文脈に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを含みうる；他には、精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）がある。この用語は、また、米国特許第4,275,149号に記載されているような、分離した粒子の不連続固相を含む。
【００６４】
用語「リポソーム」は、薬剤（PLA2ポリペプチド又はPLA2ポリペプチドに対する抗体等）を哺乳類にデリバリーするのに有用な様々なタイプの脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤から構成される小胞を示すのに、本明細書では使用される。リポソームのコンポーネントは、一般的に、生物の膜の脂質の配置に類似した、二重膜形態で配列している。
【００６５】
用語「小分子」は、約500ダルトンより小さい分子量を有する分子を示すのに、本明細書では使用される。
【００６６】
本明細書で使用する、「標識」又は「標識された」は、例えば、放射線標識アミノ酸の導入、又は標識アビジンによって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの結合（例えば、蛍光マーカー、又は、光学的方法又は比色方法によって検出することができる酵素活性を有するストレプトアビジ）による、検出可能なマーカーの導入を指す。特定の場合、標識又はマーカーは、治療用とすることができる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が、この業界で知られており、使用することができる。ポリペプチドの標識の例には、制限するわけではないが、以下のものを含む：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、リン光発光性ランタノイド）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチン基、第二のレポーターによって認識されるあらかじめ決められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含むことができる。幾つかの実施態様においては、標識は、立体障害を減じるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合させる。
【００６７】
本明細書で使用する用語「医薬物質又は薬」は、患者に適切に投与したときに、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物又は組成物を指す。本明細書の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker,S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985))により例示されるのと同様に、当分野での従来の使用に従い使用する。
【００６８】
本明細書で使用する、「実質的に純粋」は、対象種が存在する主要な種であることを意味し(すなわち、モル単位で、その種が組成物中の任意の他の個々の種より多量に存在する)、好ましくは、実質的に純粋な分画は、対象種が存在するすべてのマクロ分子種の少なくとも約50パーセントを(モル単位で)構成する、組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべてのマクロ分子種の約80パーセントより多くを、より好ましくは、約85%、90%、95%、及び99%より多くを構成する。対象種が、ほぼ均質になるまで精製される(一般的な検出法によっては、組成物中のコンタミ物質種を検出することができない)ことが最も好ましく、この場合組成物は、1種のマクロ分子種から本質的になる。
【００６９】
用語「患者」は、ヒト及び獣被験体を含む。
【００７０】
（抗-PLA2抗体）
抗体、又は、その部分、断片、模倣体、又は誘導体は、PLA2を認識する抗体又は部分の任意のタイプとすることができる。特定の実施態様においては、抗体、又はその部分が、PLA2を中和できることが好ましい。更なる実施態様においては、抗体、又はその部分が、制限するわけではないが、炎症、体液うっ体、組織腫脹、肥満、高血圧及び脳腫脹を含む、炎症性疾患に関連した症状を減じることができることが好ましい。
【００７１】
（抗体構造）
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一のペアから構成され、それぞれのペアは、1本の「軽鎖」(約25kDa)及び1本の「重鎖」(約50〜70kDa)を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、kappa及びλ軽鎖として分類される。重鎖はmu、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgA、及びIgEとして、抗体のイソ型を定義する。軽鎖及び重鎖内では、可変領域と定常領域が、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって結びつき、重鎖は約10以上のアミノ酸の「D」領域も含む。Fundamental Immunology Ch.7 (Paul,W., ed. 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を一般的に参照のこと。それぞれの軽鎖/重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は2つの結合部位を有する。二重機能性又は二重特異性抗体中以外は、2つの結合部位は同一である。
【００７２】
これらの鎖はいずれも、相補性決定領域すなわちCDRとも呼ばれる、3つの超可変領域によって結合した、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同じ一般的な構造を示す。それぞれのペアの2本の鎖由来のCDRは、フレームワーク領域によって整列しており、特異的エピトープとの結合を可能にする。N末端からC末端に、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (1987))、or Chothia and Leak,  J. Mol. Biol. 196:901〜917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878〜883 (1989)の定義に従う。
【００７３】
二重特異性抗体又は二重機能性抗体は、2本の異なる重鎖/軽鎖ペア、及び2つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はFab'断片の結合を含めた、様々な方法によって生成することができる。例えば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315〜321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547〜1553 (1992)を参照のこと。二重特異性抗体の生成は、従来の抗体の生成と比較すると、比較的骨の折れるプロセスである可能性があり、収率及び純度は二重特異性抗体に関しては一般に低い。二重特異性抗体は、1つの結合部位を有する断片の形態では存在しない(例えばFab、Fab'、及びFv)。
【００７４】
このような二重特異性又は二重機能性抗体は、本発明により企図され、包含されることは明らかであろう。
【００７５】
（ヒト抗体及び抗体のヒト化）
本明細書に記載された本発明の実施態様は、ヒト抗体も企図してこれを含む。ヒトの治療のために、ヒト抗体は、マウス又はラットの可変及び/又は定常領域を有する抗体に関するいくつかの問題を回避する。このようなマウス又はラット由来のタンパク質が存在することによって、抗体の迅速な除去がもたらされる可能性があり、あるいは患者による抗体に対する免疫応答の発生がもたらされる可能性がある。マウス又はラット由来の抗体の使用を回避するために、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するように、ヒト抗体の機能をげっ歯類に導入することによって、完全ヒト抗体を作製することができる。
【００７６】
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体を作製するための1つの方法は、ヒト重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそのゲノムに含むように遺伝子操作された、XenoMouse(登録商標)系統のマウスを使用することによる。例えば、ヒトの重鎖遺伝子座及びkappa軽鎖遺伝子座の2245kb及び190kbの大きさの生殖細胞系形状断片を含んでいる、XenoMouse(登録商標)マウスが、Green et al. Nature Genetics 7:13〜21 (1994)に記載されている。ヒト重鎖遺伝子座及びkappa軽鎖遺伝子座それぞれのメガ塩基対サイズの生殖細胞形状YAC断片を利用することにより、Green et al.の成果は、ヒト抗体レパートリーの約80％より多くを導入することに拡張された。Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56 (1997)及び1996年12月3日に出願された米国特許出願番号08/759,620を参照せよ。更に、完全なラムダ軽鎖遺伝子座を含むXenoMouse(登録商標)マウスが生成された（2001年11月30日に出願された米国特許出願第60/334,508）。そして、複数のイソ型を生成するXenoMouse(登録商標)マウスが産生された（例えば、WO 00/76310を参照せよ）。XenoMouse(登録商標)系統は、Abgenix,Inc.(Fremont、CA)から入手可能である。
【００７７】
XenoMouse(登録商標)の生成は、1990年1月12日に出願された米国特許出願第07/466,008号、1990年11月8日に出願された米国特許出願第07/610,515号、1992年7月24日に出願された米国特許出願第07/919,297号、1992年7月30日に出願された米国特許出願第07/922,649号、1993年3月15日に出願された米国特許出願第08/031,801号、1993年8月27日に出願された米国特許出願第08/112,848号、1994年4月28日に出願された米国特許出願第08/234,145号、1995年1月20日に出願された米国特許出願第08/376,279号、1995年8月27日に出願された米国特許出願第08/430,938号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,584号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,582号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/463,191号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,837号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,853号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,857号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,859号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,513号、1996年10月2日に出願された米国特許出願第08/724,752号、及び1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、並びに米国特許第6,162,963号、米国特許第6,150,584号、米国特許第6,114,598号、米国特許第6,075,181号、及び米国特許第5,939,598号、並びに日本国特許3068180B2号、日本国特許3068506B2号、及び日本国特許3068507B2号中に、さらに論じられ示されている。Mendez et al. Nature Genetics 15:146〜156 (1997)、並びにGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483〜495 (1998)も参照のこと。1996年6月12日に付与公開された欧州特許EP0463151B1号、1994年2月3日に公開された国際特許出願WO94/02602号、1996年10月31日に公開された国際特許出願WO96/34096号、1998年6月11日に公開されたWO98/24893、2000年12月21日に公開されたWO00/76310も参照のこと。
【００７８】
他の手法では、GenPharm International,Inc.を含めた他者は、「小遺伝子座」手法を使用してきている。小遺伝子座手法では、Ig遺伝子座由来の数片(個々の遺伝子)を含ませることによって、外因性のIg遺伝子座を模倣する。したがって、1つ又は複数のVH遺伝子、1つ又は複数のDH遺伝子、1つ又は複数のJH遺伝子、mu定常領域、及び第2の定常領域(好ましくはγ定常領域)を、動物中に挿入するための構築体に成形する。この手法は、Surani他への米国特許第5,545,807号、並びにそれぞれLonberg及びKayへの、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,625,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,877,397号、米国特許第5,874,299号、及び米国特許第6,255,458号、Krimpenfort及びBernsへの米国特許第5,591,669号及び米国特許第6,023.010号、Berns他への米国特許第5,612,205号、米国特許第5,721,367号、及び米国特許第5,789,215号、並びにChoi及びDunnへの米国特許第5,643,763号、並びに1990年8月29日に出願されたGenPharm Internationalの米国特許出願第07/574,748号、1990年8月31日に出願された米国特許出願第07/575,962号、1991年12月17日に出願された米国特許出願第07/810,279号、1992年3月18日に出願された米国特許出願第07/853,408号、1992年6月23日に出願された米国特許出願第07/904,068号、1992年12月16日に出願された米国特許出願第07/990,860号、1993年4月26日に出願された米国特許出願第08/053,131号、1993年7月22日に出願された米国特許出願第08/096,762号、1993年11月18日に出願された米国特許出願第08/155,301号、1993年12月3日に出願された米国特許出願第08/161,739号、1993年12月10日に出願された米国特許出願第08/165,699号、1994年3月9日に出願された米国特許出願第08/209,741号中に記載されている。欧州特許0546073B1号、国際特許出願WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852、及びWO98/24884、並びに米国特許第5,981,175号も参照のこと。Taylor他、1992、Chen他、1993、Tuaillon他、1993、Choi他、1993、Lonberg他、(1994)、Taylor他、(1994)、及びTuaillon他、(1995)、Fishwild他、(1996)をさらに参照のこと。
【００７９】
Kirinは、マウスからのヒト抗体の作製も実証しており、その中では、ミクロ細胞の融合によって、大きな染色体の数片、又は染色体全体を導入している。欧州特許出願第773288号及び欧州特許出願第843961号を参照のこと。
【００８０】
Lidak Pharmaceutical（現在はXenorex）が、ヒトドナーからの悪性でない成熟末梢リンパ球の注入によって改変されたSCIDマウスにおけるヒト抗体の産生を実証してきた。改変したマウスは、免疫源での刺激によって、ヒト抗体の産生からなるヒトドナーの免疫応答特性を示す。米国特許第5,476,996号及び5,698,767号を参照せよ。
【００８１】
ヒト抗マウス抗体(HAMA)の応答によって、業界はキメラ抗体又はそれ以外の場合はヒト化抗体の調製に向かっている。キメラ抗体はヒト定常領域及びマウス可変領域を有するが、いくつかのヒト抗キメラ抗体(HACA)の応答が、特に抗体の慢性的又は多用量の使用において、観察されるであろうことが予想される。したがって、PLA2に対する完全ヒト抗体を与えて、HAMA又はHACA応答の懸念及び/又は影響を無効にすることが望ましいと思われる。
【００８２】
（ヒト化及びディスプレイ技法）
ヒト抗体の産生に関する前記記載のように、減少した免疫原性を有する抗体の産生には利点がある。ある程度は、これは、適切なライブラリーを用いたヒト化及びディスプレイ技法により達成することができる。マウス抗体又は他の種の抗体が、当分野に既知の技法を用いてヒト化できる。Winter and Harris, Immunol Today 14:43-46 (1993)及びWright et al., Crit, Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992)を参照せよ。対象抗体は、組換えDNA技法によって遺伝子組換えを行い、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、及び/又はフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換することができる（WO 92/02190及び米国特許第5,530,101号、5,585,089号、5,693,761号、5,693,792号、5,714,350号及び5,777,085号を参照せよ）。キメライムノグロブリンの構築のためのIg cDNAの使用も当分野に知られている（Liu et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987)及びJ. Immunol. 139:3521 (1987)）。mRNAをハイブリドーマ又は抗体を産生する他の細胞から単離し、cDNAを産生するのに用いる。対象のcDNAは、特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第4,683,195号及び4,683,202号）。代わりに、対象配列を単離するために、ライブラリーを調製し、スクリーニングすることができる。その後、抗体の可変領域をコードするDNA配列を、ヒトの定常領域配列に融合する。ヒトの定常領域遺伝子の配列は、Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest” N.I.H. publication no. 91-3242 (1991)に開示されている。ヒトのC領域遺伝子は、既知のクローンから容易に購入できる。イソ型の選択は、補体結合、又は抗体依存性細胞毒性の活性のような、望むエフェクター機能によって導かれるだろう。好ましいイソ型は、IgG1、IgG3及びIgG4である。ヒトの軽鎖定常領域、kappa又はlambdaのいずれかを使用することができる。その後、キメラのヒト化抗体を一般的な方法によって発現させる。
【００８３】
Fv、F(ab’)2及びFabのような抗体断片は、インタクトなタンパク質の切断によって（例えば、プロテアーゼ又は化学切断によって）調製することができる。代わりに、切断した遺伝子がデザインされる。例えば、F(ab’)2断片の部分をコードするキメラ遺伝子は、CH1ドメイン及びH鎖のヒンジ領域、その後に切断した分子を産生するための翻訳停止コドンをコードするDNA配列を含む。  
【００８４】
重鎖及び軽鎖J領域のコンセンサス配列は、後にヒトのC領域セグメントにV領域セグメントを結合するために、J領域へ有用な制限酵素部位を導入するプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドをデザインするために用いることができる。C領域cDNAは、部位特異的変異導入によって修飾し、ヒト配列の類似部位に制限酵素部位を配置することができる。
【００８５】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウィルス、YAC、EBVに由来するエピソーム等が含まれる。便利なベクターは、任意のVH又はVL配列を容易に挿入して発現できるように人工的に組み込んだ適切な制限酵素部位を有する、機能的に完全なヒトCH又はCLイムノグロブリン配列をコードするベクターである。このようなベクターにおいては、スプライシングは、通常、挿入されたJ領域中のスプライスドナー部位とヒトのC領域の上流のスプライスアクセプター部位の間、及び、ヒトのCHエキソン内で生じるスプライス領域で生じる。ポリアデニル化及び転写終結は、コード領域の下流のネイティブな染色体部位で生じる。得られたキメラ抗体は、レトロウィルスLTR、例えばSV-40 earlyプロモーター（Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)）及びマウス白血病ウィルスLTR(Grosschedl et al., Cell 41:885 (1985))を含む任意の強力なプロモーターに連結することができる。また、明らかなように、ネイティブなIgプロモーター等を使用することができる。
【００８６】
更に、ヒト抗体又は他の種からの抗体は、制限するわけではないがファージディスプレイ、レトロウィルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び他の技法を含む、ディスプレイタイプの技法によって、当分野に良く知られた手法を用いて産生することができ、得られた分子は、当分野に良く知られた手法により、アフィニティ成熟等の更なる成熟に供することができる。Wright and Harris, supra., Hanes andPlucthau, PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (リボソームディスプレイ)、Parmley and Smith, Gene 73:305-318 (1988)（ファージディスプレイ）、Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990)、Russel et al., Nucl. Acids Res. 21:1081-1085 (1993)、Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)、Chiswell and McCafferty, TIBTECH 10:80-84 (1992)、及び米国特許第5,733,743号。ディスプレイ技法を利用してヒトでない抗体を産生するならば、このような抗体は、前記したようにヒト化することができる。
【００８７】
これらの技法を用いて、抗体を、PLA2発現細胞、PLA2それ自体、PLA2の形態、これらのエピトープ又はペプチド、及び、前記した活性により前記したスクリーニングを行うことができるこれらの発現ライブラリー（米国特許第5,703057号参照）により、産生することができる。
【００８８】
（抗体の調製）
XenoMouse(登録商標)技術を使用することによって、PLA2に特異的な完全なヒトのモノクローナル抗体を調製した。本質的には、XenoMouse(登録商標)系のマウスをPLA2又はその断片で免疫処置し、リンパ細胞(B細胞など)を、抗体を発現したマウスから回収し、回収した細胞系を骨髄型の細胞系と融合させて、不死化したハイブリドーマ細胞系を作製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニング及び選択して、PLA2に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞系を同定する。さらに、このような抗体の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列分析を含めた、このような細胞系によって生じる抗体の特徴を本明細書に記載する。
【００８９】
あるいは、骨髄細胞と融合させてハイブリドーマを作製する代わりに、免疫処置したXenoMouse(登録商標)系のマウスから単離した回収細胞を、最初の抗原、好ましくはPLA2タンパク質に対する反応性に関してさらにスクリーニングする。このようなスクリーニングには、PLA2-Hisタンパク質を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、対象抗原と結合する既知の抗体を用いる競合アッセイ、及び完全長PLA2を発現する一過的にトランスフェクトされたCHO細胞とのin vitroでの結合が含まれる。その後、対象抗体を分泌する単一B細胞は、PLA2特異的溶血プラークアッセイ(Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、i93:7843〜7848 (1996))を使用して単離される。溶解の標的とされる細胞は、PLA2抗原でコーティングされた、ヒツジ赤血球細胞(SRBC)であることが好ましい。当該のイムノグロブリン及び補体を分泌するB細胞培養物の存在下では、プラークの形成は、標的細胞の特異的なPLA2仲介の溶解を示す。プラークの中心の単一抗原特異的プラズマ細胞は単離することができ、抗体の特異性をコードする遺伝情報は、単一プラズマ細胞から単離する。逆転写酵素PCRを使用して、分泌される抗体の可変領域をコードするDNAを、クローニングすることができる。その後、このようなクローニングされたDNAは、適切な発現ベクター、好ましくはpcDNAなどのベクターカセット、より好ましくはイムノグロブリン重鎖及び軽鎖の定常ドメインを含むようなpcDNAベクター、中に、さらに挿入することができる。その後、作製したベクターを、宿主細胞、好ましくはCHO細胞にトランスフェクトし、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、あるいは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変した、一般的な栄養培地中で培養することができる。さらに、抗-PLA2抗体の特異性をコードする遺伝物質を単離し、適切な発現ベクター中に導入し、その後、これを宿主細胞にトランスフェクトする。
【００９０】
一般に、前述の細胞系によって産生した抗体は、完全ヒトIgG2重鎖とヒトkappa軽鎖、又は、IgG4重鎖とヒトkappa軽鎖のいずれかを有していた。前記抗体は高親和性を有しており、固相及び溶液相のいずれかによって測定すると、典型的には約10-6〜約10-11MのKdを有していた。
【００９１】
抗-PLA2抗体の治療的な有用性における親和性の重要性に関して、例えば組み合わせて、抗-PLA2抗体を産生し、結合親和性でこのような抗体を評価することができることは理解されよう。利用することができる1つのアプローチは、前記したように調製し、PLA2に対して良好な親和性を有することがわかっている抗体から重鎖cDNAを取り出し、これを、前記したように調製し、同じようにPLA2に対して良好な親和性を有することがわかっている第二の抗体の軽鎖cDNAと組み合わせて、第三の抗体を産生することである。得られた第三の抗体の親和性は、本明細書に記載されているように測定することができ、望ましい解離定数を有する抗体を単離し、特徴付ける。代わりに、前記した任意の抗体の軽鎖を、その軽鎖とペアにした時に、PLA2に対して高い親和性を示すであろう重鎖の生成を補助するツールとして使用することができ、又は、その逆も可能である。このライブラリー中のこれらの重鎖可変領域は、動物から単離することができ、過免疫の動物から単離することができ、CDR領域が異なる可変重鎖配列を含むライブラリーから人工的に調製することができ、又は、任意の重鎖可変領域遺伝子のCDR領域に多様性を持たせることができる任意の他の方法（ランダム変異又は部位特異的変異）によって調製することができる。これらのCDR領域、特にCDR3は、元の抗体と最初にペアであった重鎖と、著しく異なる長さ又は配列一致性とすることができる。その後、得られたライブラリーを、PLA2への高親和性結合の点でスクリーニングすることができ、元の抗体と類似の特性を有する治療に適切な抗体分子（高い親和性及び中和化）を産生することができる。重鎖又は重鎖可変領域を用いた類似の方法を使用して、特徴的な軽鎖可変領域を有する治療に適切な抗体分子を産生することができる。更にその上、新規の重鎖可変領域、又は軽鎖可変領域は、前記と同じ方法に使用して、新規の軽鎖可変領域、又は重鎖可変領域を同定することができ、これらにより、新規の抗体分子を産生することができる。
【００９２】
利用することができるもう1つの組み合わせアプローチは、本明細書に記載した本発明による抗体において利用できることが実証された、生殖細胞系重鎖及び/又は軽鎖上、特に相補性決定領域（CDR）で変異を起こさせることである。得られた抗体の親和性は、本明細書に記載したように測定することができ、望む解離定数を有する抗体を単離し、特徴付ける。好ましいバインダーの選択において、同じものをコードする1つ又は複数の配列を使用して、前記したような組換え抗体を産生することができる。オリゴヌクレオチド上で変異を行う適切な方法は、当分野の当業者に知られており、例えば亜硫酸ナトリウムを用いた、化学的な変異、酵素を用いた誤りの導入、及び紫外線照射への暴露を含む。本明細書に記載の本発明は、変異又は他の任意の方法により産生されたか否かによらず、本明細書に定義したような実質的な一致性を、本明細書に明白に示した抗体に対して有する抗体を含む。更に、本明細書で定義したような保存型又は非保存型アミノ酸置換を有する抗体（本明細書に明白に示した抗体により調製された）は、本明細書で記載した本発明の実施態様に含まれる。
【００９３】
使用することができるもう1つの組み合わせアプローチは、前記した抗体のCDR領域、特にCDR3を、他の可変領域遺伝子に由来するフレームワーク領域と関連して発現させることである。例えば、抗-PLA2抗体の重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3を、他の重鎖可変領域のフレームワーク領域と関連して発現させることができる。同じように、抗-PLA2抗体の軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3を、他の軽鎖可変領域のフレームワーク領域と関連して発現させることができる。加えて、これらCDRの生殖細胞系配列（germline sequence）を、他の重鎖又は軽鎖可変領域遺伝子と関連して発現させることができる。得られた特異性は、特異性及び親和性によってアッセイすることができ、新規の抗体分子を産生することができる。
【００９４】
理解されているように、本発明の実施態様による抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系中で発現させることができる。特定の抗体をコードする配列を、適切な哺乳類宿主細胞の形質転換用に使用することができる。形質転換は、米国特許第4,399,216号、米国特許第4,912,040号、米国特許第4,740,461号、及び米国特許第4,959,455号によって例示されるような、例えばウィルス中(又はウィルスベクター中)にポリヌクレオチドをパッケージ化すること、及びウィルス(又はベクター)を宿主細胞に導入すること、又は当分野で知られているトランスフェクション手順による方法を含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための、任意の知られている方法によるものであってよい。使用する形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞中に導入するための方法は、当分野ではよく知られており、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの被包、及びDNAの核中への直接のマイクロインジェクションを含む。
【００９５】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当分野ではよく知られており、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、幼若ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHepG2)、及びいくつかの他の細胞系だけには限られないがこれらを含めた、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有し、構成的PLA2結合性を有する抗体を産生するかどうかを、決定することによって選択する。
【００９６】
本発明の実施態様による抗体は、PLA2に結合することができる。更に、本発明の抗体は、患者サンプル中のPLA2を検出する際に有用であり、したがって本明細書に記載する病状の診断物質として有用である。さらに、炎症に対するPLA2の既知の関係に基づいて、このような抗体が、炎症の治療において治療効果を有していることが予期される。
【００９７】
（抗体療法の更なる方法）
本明細書で論じるように、PLA2抗体の機能は、その操作形式の少なくとも一部分に対して重要であるようである。機能とは、例えばPLA2抗原に応答するPLA2抗体の活性を意味する。したがって、いくつかの観点で、PLA2に対する治療候補としての抗体の作製に関して、補体依存性細胞毒性（CDC）及び抗体依存性細胞毒性（ADCC）を含む、エフェクター機能を有することができる抗体を調製することが望ましいであろう。以下のマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1、ヒトIgG3、及びヒトIgG4を非制限的に含めた、同じことができるいくつかのイソ型の抗体が存在する。作製される抗体は、このようなイソ型を最初に有している必要はなく、作製される抗体は、任意のイソ型を有することができ、当分野でよく知られている従来の技法を使用して、抗体のイソ型を後に変えることができることは理解されよう。このような技法には、特に、直接的な組換え技法の使用(例えば、米国特許第4,816,397号を参照)、細胞-細胞融合技法(例えば、米国特許第5,916,771号及び米国特許第6,207,418号を参照)がある。
【００９８】
細胞-細胞融合技法では、任意の望ましいイソ型を有する重鎖を有する、ミエローマ又は他の細胞系を調製し、軽鎖を有するもう1つのミエローマ又は他の細胞系を調製する。このような細胞は後に融合させることができ、インタクトな抗体を発現する細胞系を単離することができる。
【００９９】
例えば、本明細書で論じるPLA2抗体の1つのタイプは、ヒト抗-PLA2抗体である。このような抗体がPLA2分子との望ましい結合を有する場合、同じ可変領域(抗体の特異性及び抗体の親和性のいくらかを定義する)を依然として有しながら、容易にイソ型が変わり、ヒトIgM、ヒトIgG1、ヒトIgG3、又はヒトIgG4イソ型が生成する可能性がある。このような分子は、したがって、補体を固定しCDCに関与することができると思われる。
【０１００】
したがって、前に論じた所望の「構造」属性に見合う、抗体候補が作製されると、それらの抗体は一般に、イソ型の変更によって、少なくともいくらかの所望の「機能」属性を与えられる可能性がある。
【０１０１】
（エピトープマッピング）
PLA2に対する、本明細書で示される抗体の結合は、多くの方法によって調べることができる。例えば、PLA2をSDS-PAGEに供して、イムノブロッティングによって分析することができる。SDS-PAGEは、還元剤が存在していない条件下又は存在している条件下のいずれかで行うことができる。このような化学修飾により、システイン残基のメチル化がもたらされる。したがって、本明細書で記載したPLA2抗体がPLA2上の直線状のエピトープに結合するかどうかを求めることができる。
【０１０２】
（表面活性化レーザー脱着イオン化）
本明細書で記すPLA2抗体のエピトープのエピトープマッピングは、また、SELDIを用いて行うことができる。SELDI ProteinChip（登録商標）アレイは、タンパク質-タンパク質相互作用の部位を定義するために使用される。最初のインキュベーション及び洗浄によって、Protein Chipアレイの表面上に共有結合によって固定化した抗体に、特異的に抗原が捕捉される。結合した抗原は、レーザー誘導脱着工程によって検出し、直接その質量を分析することができる。このような結合抗原の断片は、タンパク質の「エピトープ」として呼ばれる。
【０１０３】
SELDI方法により、迅速で、高感度で拡張可能な方法で、複合的な分子組成物中の個々のコンポーネントを、直接検出し、他のコンポーネントと関連して定量的にマッピングすることができる。SELDIは、レーザー誘導脱着工程によって、多くの検出する個々のタンパク質分子を捕捉して提示するために、表面化学の多様性を有するアレイを利用する。SELDI方法の成功は、表面（「チップ」）上での複数の機能の小型化及び統合（それぞれは異なる技法に依存している）によって、部分的にもたらされた。SELDI BioChip及び他のタイプのSELDIプローブは、それらが、個々の標的分子（例えば、タンパク質）又は評価すべき分子群の捕捉、精製（分離）、提示、検出及び特徴づけの活性な関与物となるような、表面「活性化」である。
【０１０４】
オリジナルサンプルのみをロードした、1機のSELDI protein BioChipによって、何千回も読み込むことができる。LumiCyteのSELDI protein Bio Chipは、1平方センチメートル当り、10,000もの設定可能なタンパク質結合位置を保持している。それぞれの位置には、多数の個々のタンパク質が存在していることが明らかにされている。それぞれの位置からのタンパク質組成物の情報を比較し、特徴的な情報のセットを組み合わせた場合、得られた組成物マップにより、選択的に、特異的なパターン又は分子の「フィンガープリント」を求めるのに使用される特徴のセットを有するイメージが明らかにされる。異なるフィンガープリントは、健康の様々なステージ、病気の兆候、又は適切な治療の実施に関連した病気からの回復に関連させることができる。
【０１０５】
SELDI方法は、4つのパートで、更に詳細に記載することができる。最初は、1つ又は複数の対象タンパク質を、サンプル調製もサンプルの標識も無しに、オリジナル物質から直接、ProteinChip Array上に捕捉、すなわち「結合」させる。第二の工程においては、化学的及び生体分子「ノイズ」を減ずることによって、「シグナル対ノイズ」比を増幅させる。望まない物質を洗浄して取り除くことによって、チップ上に標的を選択的に保持させて、このような「ノイズ」を減少させる。さらに、捕捉された1つ又は複数の標的タンパク質は、標的についての直接的な情報（分子量）を供給する、迅速・高感度なレーザー誘導工程（SELDI）によって読み込まれる。最後に、アレイ内の1つ又は複数の位置の標的タンパク質は、1つ又は複数のチップ上での結合又は修飾反応を行うことによって、in situで特徴付け、タンパク質の構造及び機能を特徴付けることができる。
【０１０６】
（ファージディスプレイ）
線状ファージ上に提示した12残基のランダムペプチドのコンビナトリアルライブラリー（New England Biolabs）に、ProteinChip Arrayを適用することによって、本明細書で記載するPLA2抗体のエピトープを求めることができる。
【０１０７】
ファージディスプレイは、ペプチドをバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として発現させて、ウィルス粒子の表面に融合タンパク質を提示させる選択方法である。標的でコートしたプレート又はチューブを用いて、ペプチドを提示するファージのライブラリーをインキュベートし、結合しないファージを洗浄して取り除き、特異的に結合したファージを溶出させることによって、パニングを行う。その後、溶出したファージを増幅し、更なる結合及び増幅サイクルを通して、好ましい結合配列を有するプールを増幅する。3ラウンド又は4ラウンド後、個々の結合クローンを、抗体をコートしたウェル上で行うファージELISAアッセイによって結合試験を行い、ポジティブクローンの特異的DNA配列を求める。
【０１０８】
本明細書に記載するPLA2抗体に対するパニングを複数回行った後、結合ファージを溶出し、結合ペプチドの同定及び特徴のための更なる研究に供することができる。
【０１０９】
（PLA2アゴニスト及びアンタゴニスト）
本明細書に記載する本発明の実施態様は、また、PLA2アゴニスト（模倣体）又はPLA2アンタゴニストのいずれかとして機能するPLA2タンパク質のバリアントにも関連している。PLA2タンパク質のバリアントは、変異によって、例えば、分離した点変異又はPLA2タンパク質の切断によって生成することができる。PLA2タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のPLA2タンパク質の生物活性と、又はその一部と、同じ活性を実質的に保持することができる。PLA2タンパク質のアゴニストは、例えば、PLA2タンパク質を含む細胞内シグナル伝達カスケードの下流又は上流の構成メンバーに競合的に結合することによって、天然に存在する形態のPLA2タンパク質の1つ又は複数の活性を阻害することができる。それゆえ、特異的な生物効果は、制限された機能のバリアントを用いた治療によって除去することができる。1つの実施態様において、天然に存在する形態のタンパク質の生物活性の一部を有するバリアントによる患者の治療によって、天然に存在する形態のPLA2タンパク質と比較して、患者への副作用を少なくすることができる。
【０１１０】
PLA2アゴニスト（模倣体）又はPLA2アンタゴニストのいずれかとして機能するPLA2タンパク質のバリアントは、アゴニスト又はアンタゴニスト活性により、PLA2タンパク質の変異体（例えば、切断変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。1つの実施態様においては、PLA2バリアントの変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異によって調製され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされている。例えば、潜在的なPLA2配列のディジェネレートセットが、個々のポリペプチドとして、又はその代わりに、PLA2配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）として発現することができるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列へと酵素を用いてライゲーションさせることによってPLA2バリアントの変化に富んだライブラリーを調製することができる。ディジェネレートオリゴヌクレオチド配列から潜在的なPLA2バリアントのライブラリーを調製するのに使用することができる様々な方法が存在する。オートマチックDNA合成機によって、ディジェネレート遺伝子配列を化学的に合成することができ、その後、合成遺伝子を、適切な発現ベクターへライゲーションさせる。遺伝子のディジェネレートセットの使用により、1つの混合物中で、潜在的なPLA2バリアント配列の望むセットをコードする全ての配列の提供が可能となる。ディジェネレートオリゴヌクレオチドを合成する方法は、当分野において既知である（例えば、Narang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura et al., Annu Rev. Biochem. 53:323 (1984); Itakura et al., Science 198:1056 (1984); Ike et al., Nucl. Acid. Res. 11:477 (1983)を参照せよ）。
【０１１１】
（他の療法の設計及び作製）
更にその上、PLA2に関して本明細書において産生及び特徴づけを行った抗体の活性に基づいて、抗体要素を超える他の治療的物理療法の設計が容易になる。このような物理療法には、非制限的に、二重特異性抗体などの最新の抗体療法、免疫毒素、及び放射標識療法、ペプチド療法剤、遺伝子療法剤、特に細胞内発現抗体、アンチセンス療法剤、及び小分子の作製がある。
【０１１２】
最新の抗体療法剤の作製に関しては、補体固定が望ましい属性である場合、例えば二重特異性抗体、免疫毒素、又は放射標識を使用することによって細胞を殺傷するために、補体への依存性を取り除くことができる可能性がある。
【０１１３】
例えば、二重特異性抗体に関しては、(i)2つの抗体であって、1つはPLA2に対する特異性を有し、他方は第2の分子に対する特異性を有し、それらが結合している抗体、(ii)PLA2に特異的な1本の鎖、及び第2の分子に特異的な第2の鎖を有する1つの抗体、又は(iii)PLA2及び他の分子に対する特異性を有する一本鎖抗体を含む、二重特異性抗体を作製することができる。このような二重特異性抗体は、よく知られている技法を使用して作製することができ;例えば、(i)及び(ii)に関しては、例えば、Fanger et al., Immunol Methods 4:72-81 (1994)、並びにWrigh and Harris, supra.、(iii)に関しては、例えば、Trauneeker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51〜52 (1992)を参照のこと。それぞれの場合、第2の特異性を、CD16又はCD64(例えば、Deo et al. 18:127 (1997)を参照のこと)又はCD89(例えば、Valerius et al. Blood 90:4485〜4492 (1997)を参照のこと)を非制限的に含めた、重鎖活性化レセプターに施すことができる。前述の事項に従い調製した二重特異性抗体は、PLA2を発現する細胞、特に本発明のPLA2抗体が効果的であるこれらの細胞を殺傷する可能性があると思われる。
【０１１４】
免疫毒素に関しては、当分野でよく知られている技法を使用して、抗体を修飾して免疫毒素として働かせることができる。例えば、Vitetta Immunol Today 14:252(1993)を参照のこと。米国特許第5,194,594号も参照のこと。放射標識抗体の調製に関しては、当分野でよく知られている技法を使用して、このような修飾型抗体を容易に調製することもできる。例えば、Junghans et al. Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655〜686(2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))中を参照のこと。米国特許第4,681,581号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,102,990号(RE35,500)、第5,648,471号、及び第5,697,902号も参照のこと。それぞれの免疫毒素及び放射標識分子は、PLA2を発現する細胞、特に本発明のPLA2抗体が効果的であるこれらの抗体を殺傷する可能性があると思われる。
【０１１５】
ペプチド療法剤に関しては、PLA2及びその抗体、例えば本明細書で記載の抗体（小分子に関して以下で論じるように）に関する構造の情報を利用して、又はペプチドライブラリーのスクリーニングを利用して、PLA2に対するペプチド療法剤を生成することができる。ペプチド療法剤のデザイン及びスクリーニングは、Houghten et al., Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten, PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al., Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis, BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)に関連して論ずる。免疫毒性及び放射線標識分子も、抗体に関する前記で論じたペプチド部分に関連した、類似の方法で調製することができる。
【０１１６】
PLA2分子（又はスプライシングバリアントのような形態又は代替形態）が病気工程において機能的に活性であるならば、一般的な技法により、遺伝子治療剤及びアンチセンス治療剤をデザインすることができるであろう。このような方法は、PLA2の機能を調節するために利用することができる。それと関連して、本明細書に記載した抗体は、関連する機能アッセイのデザイン及び使用が容易である。アンチセンス治療剤のためのデザイン及び方法は、国際特許出願WO94/2944において詳細に論じられている。遺伝子治療のためのデザイン及び方法は、良く知られている。しかしながら、特に、生体内を含む遺伝子治療技法の使用は、特に有用であると証明されている。例えば、Chen et al., Human Gene Therapy 5:595-601 (1994)及びMarasco, Gene Therapy 4:11-15 (1997)を参照せよ。遺伝子治療剤の一般的なデザイン及び知見は、また、国際特許出願WO97/38137を参照せよ。
【０１１７】
小分子治療剤も予期される。治療剤は、本明細書に記載したように、PLA2の活性を調節するようにデザインされている。本明細書に記載したような、PLA2分子の構造及び他の分子（本明細書で記載された抗体等）との相互作用から集められた知見により、更なる治療剤を合理的にデザインするのに利用することができる。この観点において、X線結晶解析、コンピューターによる分子モデリング（CAMM）、定量又は定性的構造活性相関（QSAR）、及び類似の手法のような合理的治療剤設計を、薬の発見の試みに焦点をあてるために利用することができる。合理的な設計により、分子又はその特異的な形態と相互作用することができるタンパク質又は合成構造の予期が可能になり、PLA2の活性を修飾又は調節するのに使用することができる。このアプローチは、Capsey et al., Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))にレビューされている。さらに、コンビナトリアルライブラリーをデザインして合成し、ハイスループットスクリーニングのようなスクリーニングプログラムで使用することができる。
【０１１８】
（治療的投与及び配合物）
抗-PLA2化合物（制限するわけではないが、抗体及びその断片を含む）は、PLA2を調節する化合物が必要な生物を治療する医薬品に導入するのに適している。これら医薬的に活性な化合物は、製剤学の一般的な方法に従って加工し、生物、例えば動物及びヒトを含む哺乳類に投与するための医薬治療剤を調製することができる。特定の実施態様においては、活性成分を、修飾して又は修飾せずに、医薬製品へと導入することができる。更なる実施態様には、複数の経路により、本明細書で記載した医薬的に活性な化合物をデリバリーする医薬品又は医薬治療剤の調製が含まれる。例えば、制限するわけではないが、DNA、RNA、及び抗体又はその断片をコードする配列を有するウィルスベクターが、特定の実施態様において使用することができる。加えて、抗体又はその断片をコードする核酸は、単独で、又は、他の活性成分と組み合わせて投与することができる。
【０１１９】
本明細書に記載の治療剤の投与は、適した担体、賦形剤、安定化剤、及び転移、デリバリー、耐性等を改良するために調製物に挿入される他の剤との混合物で投与される。医薬的に許容可能な担体は、非経口、経腸（例えば経口）又は局所適用に適した、本発明の医薬的に活性な成分と悪影響に反応しない有機又は無機担体を含む。適した医薬的に許容可能な担体は、制限するわけではないが、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース又はスターチのような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれる。更なる担体、賦形剤、及び安定化剤は、TRIS HCl、リン酸、クエン酸、酢酸、及び他の有機酸塩などのバッファー;アスコルビン酸などの抗酸化剤;ポリアルギニンなどの低分子量(約10残基未満)ペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又はイムノグロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニンなどのアミノ酸;単糖、二糖、及びセルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含めた、他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどのカウンターイオン、及び/又はTWEEN、PLURONICS又はポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含む。多くのより適したベヒクルは、Remmington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton: Mack Publishing Company, pages 1405-1412 and 1461-1487 (1975)及びThe National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975)に開示されている。
【０１２０】
抗体投与の経路は、例えば、制限するわけではないが、局所的、非経口、胃腸、経気管支、経肺を含む、既知の方法によることができる。投与の非経口経路は、制限するわけではないが、中心静脈ラインへの直接注入のような電気的又は直接注入又は投入、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、クモ膜下、吸入又は病巣内経路を含む。抗体は、好ましくは、連続した注入により、静脈内ボーラス、又は以下に示す徐放システムによって投与する。好ましい実施態様においては、抗体は、腎動脈を介して投与する。投与の胃腸経路には、制限するわけではないが、摂取及び直腸を含む。投与の経気管支及び経肺経路は、制限するわけではないが、口又は鼻腔のいずれかを介した吸入が含まれる。
【０１２１】
in vivo投与用に使用するとき、抗体配合物は滅菌済みでなければならない。凍結乾燥及び再溶解の前又は後に、滅菌済み濾過膜を介した濾過によって、これは容易に実施される。抗体は通常、凍結乾燥形態又は溶液中に保存されるであろう。さらに、治療用組成物は、発熱物質を含まず、pH、等張性、及び安定性に関して適切な事項を有する、非経口的に許容可能な溶液中に存在しなければならない。治療用抗体組成物は一般に、滅菌済みアクセスポートを有する容器、例えば静脈内注射溶液用の袋又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル中に置かれる。
【０１２２】
注射用の滅菌済み組成物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed., MackPublishing Company, Easton, PA (1990))中に記載されたのと同様の、従来の薬剤習慣に従って配合することができる。医薬調製物は安定化することができ、もし望むならば、活性化合物と悪影響に反応しない補助剤、例えば潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、抗酸化剤、着色剤、芳香剤及び/又は芳香基質等と混合することができる。例えば、水、又はゴマ、ピーナッツ、又は綿花油などの天然に存在する植物油などのベヒクル、あるいはオレイン酸エチルのような合成脂肪酸ベヒクル等に、活性化合物を溶解又は懸濁させることは、望ましい可能性がある。
【０１２３】
非経口投与に適した本発明の医薬的に活性な化合物を有する組成物は、制限するわけではないが、医薬的に許容可能な滅菌された等張溶液を含む。このような溶液は、制限するわけではないが、中心静脈ラインへの注入、静脈内筋肉内、腹腔内、皮内、又は皮下注入のための生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水を含む。
【０１２４】
胃腸投与に適した本発明の医薬的に活性な化合物を有する組成物は、制限するわけではないが、医薬的に許容可能な粉末、錠剤又は消化のための液体、及び直腸投与のための座薬を含む。
【０１２５】
徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透過性物質があり、これらの物質は、成形品、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性物質の例には、ポリエステル、Langer et al., J.Biomed Mater.Res., 15:167-277 (1981)及びLanger et al., Chem.Tech., 12:98-105 (1982)によって記載されたヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートの固ポリマー(Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983))、非分解性エチレン-酢酸ビニルのコポリマー(Langer他、上記)、LUPRON Depot(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸リュープリドから構成される注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸(EP133,988)がある。
【０１２６】
エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間の間分子を放出することができるが、いくつかのヒドロゲルは、さらに短期間タンパク質を放出する。被包されたタンパク質が身体中に長時間留まると、37℃における湿気に対する露出の結果として、タンパク質が変性又は凝集する可能性があり、生物学的活性の消失及び免疫原性の考えられる変化がもたらされる。関与する機構に応じて、タンパク質を安定させるための、合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、湿気含有率の調節、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって、安定化を行うことができる。
【０１２７】
徐放性組成物は、リポソームに捕捉された本発明の抗体も含む。このような抗体を含むリポソームは、それ自体が知られている方法によって調製される:米国特許第DE3,218,121号;Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwanget al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143,949; 142,641; 日本国特許出願83-118008; 米国特許第4,485,045号及び米国特許第4,544,545号; 及びEP102,324。
【０１２８】
治療上使用される、本明細書に記載する抗体の有効量は、例えば治療目的、投与の経路、及び患者の状態に依存する。所与の患者用の抗体配合物の用量は、疾患の重症度及びタイプ、体重、性別、食事、投与の時間及び経路、他の投薬、及び他の関連する臨床的要因を含めた、薬剤の作用を変えることが知られている様々な要因を考慮に入れて、主治医により決定される。したがって、セラピストは、最適な治療効果を得るのに必要な用量を決定し、投与の経路を変えることが必要である。典型的には、臨床医は、所望の効果を得る用量に達するまで、治療抗体を投与する。治療上有効な用量は、in vitro又はin vivoいずれかの方法によって、決定することができる。この治療の進行は、従来のアッセイによって、あるいは本明細書に記載するアッセイによって、容易にモニターされる。
【０１２９】
このような化合物の治療効果及び毒性は、細胞培養液又は実験用動物による標準的な医薬手法、例えば、ED50（50％の対象者に治療上効果的な用量）によって求めることができる。動物モデル又は代替モデルの治療から得られたデータは、ヒトを含む他の生物での使用ための投与量の範囲を策定するのに使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性を有さないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、エベクチン、ハイブリッド、結合パートナー、又はその断片のタイプ、使用する投与形態、生物の感受性、及び投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【０１３０】
様々な抗体又はその断片の通常の投与濃度は、約0.1から100mg/kgで変化させることができる。望ましい投与濃度は、例えば、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg又はそれ以上を含む。1つの好ましい投与量は1から10mg/kgである。
【０１３１】
いくつかの実施態様においては、抗体又はその断片の投与量は、約0.1μMから500mM、好ましくは約1から800μM、及びより好ましくは約10μMから約500μMより濃い濃度から、組織又は血液濃度又はその両方を生じさせる。好ましい投与量は、例えば、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、145μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、220μM、240μM、250μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM、及び500μMの組織又は血液濃度又はその両方を達成するするのに必要な量である。他の実施態様においては、800μMより濃い組織濃度を生じさせる投与量を使用することができる。抗体、ハイブリッド、結合パートナー、又はその断片の持続的な投与も、血液レベルによって測定される組織の安定な濃度を維持するように、供給することができる。
【０１３２】
投与及び投与量は、活性部分を十分なレベルで供給するために、又は、望む効果を維持するために、調整することができる。本明細書の実施態様には、短期作用及び長期作用医薬組成物の両方を含む。したがって、実施態様には、医薬組成物を、おおよそ1、2、3、4、5、又は6日ごとに、毎週、2週間ごと、3週間ごと、4週間ごと、5週間ごと、6週間ごと、7週間ごと、又は8週間ごとに投与する。特定の調合物の半減期及びクリアランス速度に依存して、本明細書に記載された医薬組成物は、一日に約1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、及び10回又はそれ以上投与することができる。
【０１３３】
付加的な治療薬を、抗-PLA2抗体の投与時に組み合わせて、投与前に又は投与後に、投与することができる。これらの治療薬は、病気の徴候を治療するのに使用することができ、又は、抗-PLA2抗体の副作用を減ずることができる。それらは、抗-PLA2抗体の活性を増すのにも使用することができる。制限するわけではないが、例えば、抗生物質、利尿剤、麻酔剤、鎮痛剤、抗炎症剤、及びインシュリンを含む、任意の治療薬を使用することができる。炎症を治療するのに典型的に使用される剤、及び、抗体と組み合わせて使用することができる剤の例には、コルチゾンのようなステロイド系抗炎症剤、アセトアミノフェンのような非ステロイド系抗炎症剤、アスピリン、イブプロフェン、及びナプロキセン等を含む。
【０１３４】
（診断的使用）
本発明の実施態様には、また、アッセイに、特にin vitro診断アッセイに、例えば、患者サンプル内のPLA2のレベルを求めるための使用に有用である。このようなアッセイは、PLA2の過発現と関連した病気を診断するのに有用であろう。いくつかの実施態様においては、病気は、炎症性疾患である。患者サンプルは、例えば、体液、特に血液、より好ましくは血液血清、滑液、組織溶解液、及び病気の組織から調製した抽出液とすることができる。本発明の他の実施態様は、炎症性疾患及び関連する病状の診断及び病期診断に有用である。PLA2のレベルのモニターリングは、治療に応答する患者の代替的測定として、及び、患者における病気の重症度をモニターする方法として使用することができる。他の可溶性マーカーと比較してPLA2のレベルが上昇することは、炎症が存在していることを示す。患者サンプル中のPLA2抗原の濃度は、存在する抗原の量を特異的に求める方法を使用して求めることができる。このような方法には、例えば、本発明の抗体が好都合なことに不溶性のマトリクス（例えばポリマーマトリクス）上で固定化されているELISA法を含む。代わりに、抗-PLA2抗体を用いた組織免疫染色アッセイを、サンプル中のPLA2のレベルを求めるのに使用することができる。進展又は治療の各段階の統計的に有意な結果を付与するサンプル群を使用して、病気の各段階の特性とみなすことができる抗原の濃度の範囲を明示することができる。
【０１３５】
1つの実施態様においては、研究の対象者の病気の段階を評価し、又は、治療中の対象者の応答を特徴付けるために、血液サンプルを対象者から採取し、サンプル中に存在するPLA2抗原の濃度を求める。このように得られた濃度は、値が低下する濃度範囲を同定するのに使用される。このように同定された範囲は、病気の進展の段階、又は、診断する対象者の様々な群において同定された治療段階と関連があり、研究対象者の段階を供給する。
【０１３６】
サンプル中の遺伝子増幅及び/又は発現は、例えば、一般的なサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するノザンブロッティング(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、ドットブロッティング（DNA分析）、又は、本明細書において供給される配列に基づく適切に標識したプローブを用いたin situ ハイブリダイゼーションによって、直接測定することができる。代わりに、DNA二本鎖、RNA二本鎖、及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク質複合体を含む特異的な二本鎖を認識することができる抗体を使用することができる。前記抗体は、次に、標識することができ、表面上での二本鎖の形成において、二本鎖に結合した抗体の存在が検出できるように、二本鎖が表面に結合したアッセイを行うことができる。
【０１３７】
例えば、抗体断片を含む抗体は、PLA2タンパク質の発現を定性的に又は定量的に検出するのに使用することができる。前記したように、抗体は、好ましくは、検出可能な、例えば蛍光標識を備えており、結合を、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又は当分野で既知の他の技法によってモニターすることができる。増幅した遺伝子が細胞表面タンパク質、例えば増殖因子をコードするならば、これらの技法は、特に適切である。当分野で知られているように、このような結合アッセイが好ましい。
【０１３８】
例えば、免疫蛍光顕微鏡又は免疫電子顕微鏡によって、PLA2抗体に結合する抗体のin situ検出を行うことができる。この目的のために、組織標本を患者から取り出し、標識抗体を、好ましくは生物サンプル上に抗体を重ねることによって、アプライする。この手法により、また、試験する組織中でマーカー遺伝子産物の分布を求めることができる。当分野の当業者にとっては、様々な組織学的手法は、in situ検出のために容易に利用できることは明らかであろう。
【０１３９】
異なる遺伝子発現を定量するための、最も高感度で最もフレキシブルな定量法の1つは、RT-PCRである。RT-PCRは、薬剤処理を行った又は行っていない通常組織及び腫瘍組織中の異なるサンプル群のmRNAレベルを比較し、遺伝子発現のパターンを特徴づけし、密接に関連したmRNA間を区別し、RNA構造を分析するのに使用することができる。
【０１４０】
その最初の工程は、標的サンプルからmRNAを単離することである。開始物質は、典型的には、病気組織及び対応する通常組織からそれぞれ単離した全RNAである。それゆえ、例えば、同じタイプの通常組織と比較するために、病気組織の凍結又はパラフィン包埋して固定化した（例えばホルマリン固定）サンプルからmRNAを抽出することができる。mRNAを抽出する方法は、当分野で良く知られており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Jon Wiley and Sons (1997)を含む、分子生物学の通常のテキストに開示されている。パラフィン包埋組織からのRNA抽出方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest., 56:A67 (1987)、及びDe Andres et al., BioTechniques, 18:42044 (1995)に開示されている。特に、RNA単離は、製造者（Qiagen等）からの精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用いて、製造者の取扱説明書にしたがって行うことができる。例えば、培養液中の細胞からの全RNAは、Qiagen RNeasy mini-columnを用いて単離することができる。組織サンプルからの全RNAは、RNA Stat-60 (Tel-Test)を用いて単離することができる。
【０１４１】
RNAはPCRの鋳型として働くことはできないので、RT-PCRによるディファレンシャルな遺伝子発現分析の最初の工程は、cDNAへのRNA鋳型の逆転写であり、その後、PCR反応による指数的増幅を行う。2つの最も一般的に用いられる逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素（AMV-RT）及びマウス白血病ウィルス逆転写酵素（MMLV-RT）である。発現プロファイリングの状況及び目標に応じて、逆転写工程は、典型的には、特異的なプライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴ-dTプライマーを用いて行う。例えば、抽出したRNAは、製品の取扱説明書にしたがって、GeneAmp RNA PCR kit(Perkin Elmer, CA, USA)を用いて逆転写することができる。その後、得られたcDNAを、その後のPCR反応の鋳型として用いることができる。
【０１４２】
PCR工程には、様々な熱安定DNA依存性DNAポリメラーゼが使用できるにもかかわらず、典型的には、5’-3’ヌクレアーゼ活性を有するが3’-5’エンドヌクレアーゼ活性が欠如したTaq DNAポリメラーゼを使用する。それゆえ、TaqMan PCRでは、典型的には、Taq又はTthポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性を利用して、標的増幅産物に結合したハイブリダイズプローブを加水分解する。しかし、同等の5’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、PCR反応の増幅産物を得るために使用される。第三のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、2つのPCRプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するようにデザインされる。前記プローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸張せず、レポーター蛍光色素及び蛍光クエンチャー色素で標識する。レポーター色素からの任意のレーザー誘導蛍光は、2つの色素がプローブ上に存在する時に互いに近接に位置する場合、クエンチャー色素によって消光する。増幅反応の間、Taq DNAポリメラーゼ酵素は、鋳型に依存して、プローブを切断する。結果として生じたプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたリポーター色素からのシグナルが、第二の蛍光色素の消光効果の影響を受けなくなる。新たな分子が合成されるごとに、リポーター色素の一分子が遊離し、消光されないリポーター色素の検出により、データの定量的解析がもたらされる。
【０１４３】
TaqMan RT-PCRは、市販の装置、例えば、ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SystemTM (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、又はLightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germary)等を用いて行うことができる。好ましい実施態様においては、5’ヌクレアーゼ手法は、ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SystemTMのようなリアルタイム定量PCR装置で行う。前記システムは、サーマルサイクラー、レーザー、電荷結合素子（CCD）カメラ及びコンピューターからなる。前記システムにより、サーマルサイクラーで、96穴フォーマットのサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光シグナルが、96穴全てのための光ファイバーケーブルによりリアルタイムに集められ、CCDで検出される。前記システムは、装置を操作するソフトウェア及びデータを分析するソフトウェアを含む。
【０１４４】
5’ヌクレアーゼアッセイのデータは、最初は、Ct、すなわちスラッシュホールドサイクルとして表現される。前記で論じたように、蛍光の値は各サイクルの間で記録され、増幅反応におけるその時点までの増幅産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的有意差で最初に記録された時が、スラッシュホールドサイクル（Ct）である。ΔCt値は、通常の細胞のRNAの発現と、病気組織の細胞のRNA発現を比較する場合に、核酸サンプルにおける特定の標的配列の最初の相対的なコピー数の定量的な測定値として使用される。
【０１４５】
エラー及びサンプル間の変化を最小にするために、RT-PCRは、通常、内部標準を用いて行う。理想的な内部標準は、異なる種間でも一定のレベル発現し、実験処理によっては影響を受けない。遺伝子発現のパターンを標準化するのに最も頻度高く使用されているRNAは、ハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）及びβ‐アクチンのmRNAである。
【０１４６】
マイクロアレイ技法を用いて、ディファレンシャルな遺伝子発現を同定し、確認することができる。この方法においては、対象物のヌクレオチド配列を、マイクロチップ基板上にのせ、又は配置する。その後、配置した配列を、対象細胞又は組織に由来する特異的なDNAプローブとハイブリダイズさせる。
【０１４７】
マイクロアレイ技法の特異的な実施態様においては、cDNAクローンのPCRで増幅した挿入物を、密集したアレイの基板にアプライする。好ましくは、少なくとも10,000ヌクレオチド配列を基板にアプライする。それぞれ10,000エレメントでマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするのに適している。蛍光で標識したcDNAを、対象組織から抽出されたRNAの逆転写によって、蛍光ヌクレオチドを挿入して産生する。チップにアプライする標識したcDNAプローブは、アレイ上のDNAの各スポットに選択的にハイブリダイズする。非特異的に結合しているプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、チップを、共焦点レーザー顕微鏡によってスキャンする。それぞれのアレイエレメントのハイブリダイゼーションの定量によって、対応するmRNAの存在量を評価することができる。二色蛍光を用いた、2つの異なるRNAから生成した別々に標識したcDNAプローブは、アレイに対合してハイブリダイズする。それゆえ、それぞれ特異的な遺伝子に対応する2つのRNAからの転写産物の相対量が同時に求まる。ハイブリダイゼーションの小型スケールにより、多くの遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価が可能になった。このような方法は、細胞当り数コピー発現する珍しい転写産物を検出するのに必要な感度を有しており、少なくとも約2倍異なる発現レベルを再現性をもって検出できることが示されている(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(20) L106-49)。核酸のハイブリダイゼーション方法及びマイクロアレイ技法は、当分野で良く知られている。
【０１４８】
（モノクローナル抗体の特徴づけ）
モノクローナル抗体は、機能的な特性と特異的な構造決定因子を関連付ける高度に特異的なプローブとして、様々なアッセイに使用でき、mAbは、標的薬剤を有効にするための重要なツールとなる。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、及び免疫組織化学によるAb試薬を用いたタンパク質発現パターンの特徴づけは、標準的な方法である。細菌及びウィルス種の血清型決定(Bash, M.C. et al., “Genetic and immunologic characterization of a novel serotype 4, 15 strain of Neisseria meningitidis”FEMS Immunol Med Microbiol 29, 169-176 (2000); Jensen, T.H. et al., “probing the structure of HIV-1 Rev by protein footprinting of multiple monoclonal antibody-binding sites” FEBS Lett 414, 50-54 (1997)) 、タンパク質の特異的な翻訳後バリアントの検出(Martegani, et al., “A Structural variability of CD44v molecules and reliability of immunodetection of CD44 isoforms using mAbs specific for CD44 variant exon products” Am J Pathol 154, 291-300 (1999))、及び異なる構造を有するタンパク質の区別（Drbal et al., “A novel anti-CD18 mAb recognizes an activation-related epitope and induces a high-affinity conformation in leukocyte integrins”Immunobiology 203, 687-698 (2001)）によって明らかであるように、mAbの極めて高い特異性は、密接に関連する分子を区別することができる。結合エピトープの多様性により、更に、同じ標的に対する2つの異なるmAbが非常に異なる機能活性を有すること（例えば、1つのmAbがアンタゴニストであるのに対してもう1つが活性を有していないこと）を明らかにすることができる。Sattentau et al. “Epitopes of the CD4 antigen and HIV infection” Science 234, 1120-1123 (1986); Pierres et al., “Clonal analysis of B- and T-cell responses to Ia antigen. I. Topolygy of epitope regions on I-Ak and I-Ek molecules analyzed with 35 monoclonal aaloantibodies” Immunogenetics 14, 481-495 (1981)。重要なことに、mAbは、試薬としての有用性だけでなく、ヒトの病気の治療剤としての有用性が増していることがわかっている。Spigel et al. “HER2 overexpressing metastatic breast cancer” Curr Treat Options Oncol 3, 163-174 (2002); Sandborn, et al., “Biologic therapy of inflammatory bowel disease” Gastroenterology 122, 1592-1608 (2002)。
【０１４９】
現在、mABを産生するための多くのアプローチが存在している。げっ歯類（典型的には標準的な種の実験用マウス）に適用する標準的なハイブリドーマ技法により、げっ歯類のアミノ酸配列の10から1000のmAbパネルを産生する。試薬として有用であるとしても、げっ歯類誘導mABは、典型的には、予想される免疫原性によって、ヒトの治療薬としては有用ではない。キメラ化又はヒト化による人工的に操作した抗体により、ヒトに由来する中身が多く、ヒトにおける免疫応答を惹起する可能性が低いAbを産生することができるが、たびたび開発の可能性又は速度を犠牲にしなければならない。ヒト治療薬として適切なmAbを産生するより高価な方法は、完全にヒトである抗原特異的mAbを誘導することである。重要なことに、このような完全なヒトmAbは、標的確認試薬及び治療薬候補の両方としての機能を果たす。完全なヒトAbを産生するための2つの最も主流の技法は、ファージディスプレイと遺伝子組み換えマウスである。様々なディスプレイ技法を用いて発現させた未処置のヒトAbライブラリーを、抗原特異的Ab断片のソースとすることができる。しかしながら、断片は、典型的には、その後、治療薬mAbに必要な活性基準を満たすように、in vitro組換えが必要である。Watkins et al., “Introduction to antibody engineering and phage display” Vox Sang 78, 72-79 (2000)。完全なヒトAbを産生する遺伝子組み換えマウスを操作することによって、試薬及び治療薬として適した親和性が成熟した抗原特異的mAbは、ハイブリドーマ手法を用いて直接回収することができる。Mendez et al., “Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice” Nat Genet 15, 146-156 (1997); LaRochelle et al., “Platelet-derived growth factor D: tumorigenicity in mice and dysregulated expression in human cancer” Cancer Res 62, 2468-2473 (2002); Ishida et al., “production of Human Monoclonal and Polyclonal Antibodies in TransChromo Animals” Cloning Stem Cells 4, 91-102 (2002); Davis et al., “Transgenic mice as a source of fully human antibodies for the treatment of cancer” Cancer Metastasis Rev 18, 421-425 (1999)。
【０１５０】
Abの最初のプールを産生するために取られるアプローチについては、有限数の結合特異性が存在する。完全なAbパネルをハイスループットの機能的スクリーニングに使用するか、あるいは、キャパシティー制限により機能的なアッセイでスクーリングすることができるAbの数が制限されるかにかかわらず、Abプール内で過剰な結合特異性を特徴づけ、その後に減ずることは有用であろう。また、異なる結合特異性を有するAbを十分に選択する方法は、機能的な活性を、競合結合に基づくビンへとマップするのに使用ことができる。
【０１５１】
抗体の結合特異性を特徴付ける一般的なアプローチは、エピトープマッピングである。Baerga-Ortiz et al., “Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein” Protein Sci 11, 1300-1308 (2002; McCullough et al., “Immune protection against foot-and-mouth disease virus studied using virus-neutralizing and non-neutralizing concentrations of monoclonal antibodies” Immunology 58, 421-428 (1986)。この技法は、高い分析力で、それぞれのAbが抗原に結合する部位を同定することができるが、この方法は時間を要し、手間がかかり、低いスループットでしか行うことができない。これまで、ELISAの基づいた、過剰量の非標識Abによる抗原に対する標識Abの結合の競合を、2つの抗体が競合するかどうかを求めるために使用してきた。McCullough et al., supra (1986)。ELISAに基づく競合アッセイは、エピトープマッピングの正確性は欠如しているが、容易に行うことができ、1日又は2日間で終了することができる。しかしながら、このアッセイは、多くの量のサンプルを用いる場合はわずらわしく、大量の精製したAbが必要である。
【０１５２】
最後に、新規な方法である、少量の抗体及び抗原にのみ使用するハイスループットMultiplexed Competitive Antibody Binning (MCAB)が開発された。MCAB方法により、抗原に対する抗体の競合結合に基づくAbパネルのビニングが可能となり、Abのスクリーニング及び特徴づけのために、一般的に成功して使用されている。このアッセイは、標的分子上のAbの競合結合パートナーの類似性に基づいており、ビーズを光学的にエンコードするLuminex（登録商標）及びアッセイを高度に多重化する検出技法を使用する。MCABアッセイは、ハイスループット形式での、少量のAbを有する初期段階のハイブリドーマからのAbのスクリーニング及び特徴付けに使用するのに十分な感度である。このアッセイは、また、ディスプレイ技法を用いて産生した組換えAb断片に適用することができる。
【０１５３】
この方法により、モノクローナル抗体の大きくて複合的なパネルを、抗原結合によるクロス競合に基づいた異なるビンへと分類することができる。いくつかの実施態様においては、MCAB方法は、抗原ポジティブAbの同定後、直接適用することができ、Ab候補を更なる試験へと進ませるのに有用な情報を供給する。代わりに、MCABアッセイは、機能的な活性によりスクリーニングした後で、Abを結合グループに分類するのに使用することができる。
【０１５４】
MCAB方法は、XenoMouse（登録商標）G2及びG4マウス（完全なヒトIgG2κ及びIgG4κAbをそれぞれ作製するヒトAb遺伝子座の遺伝子組み換えマウス種）に由来する完全なヒトmAbで開発された。これらのマウスをタンパク質抗原で免疫し、その後ハイブリドーマを産生することにより、通常、100より多い抗原特異的で、高い親和性を有するmAbを得ることができる。本明細書で記載されるMCAB方法により、Luminex（登録商標）（Fulton et al, supra）及び特異的な捕捉体及び検出試薬によりもたらされる、抗体（Ab）競合を検出するビーズに基づく技法を使用する多重化ストラテジーが導入される。同時に、100の市販のビーズからの特徴的な光学的にエンコードされているビーズと各mAbの会合により、1つの溶液相の多重アッセイにおいて、99までの他のmAbに対する各mAbの競合が可能である。この方法は、精製無しにハイブリドーマの上清を使用することができ、抗体生成工程の初期に挿入することができる。
【０１５５】
MCAB方法は、モノクローナル抗体そのものを、ゲノミクス又はプロテオミクスによる発見の試みからの標的細胞の評価のためのツールとして使用する場合、特に、価値がある。Quinn-Senger et al., supra (200); Walke et al., supra (2001)。これらの場合において、第一の及び第二の結合スクリーニング後に、何十又は何百の抗原特異的Abの間から候補を促進するのに使用することができる、如何なる洗練された機能的なアッセイも存在しない。任意のAbの生物学的機能は、標的分子上で結合するエピトープに依存しているから(Blanpain et al., “Multiple active states and oligomerization of CCR5 revealed by functional properties of monoclonal antibodies” Mol Biol Cell 13, 723-737 (2002); Corada et al., “Monoclonal antibodies directed to different regions of vascular endothelial cadherin extracellular domain affect adhesion and clustering of the protein and modulate endothelial permeability” Blood 97, 1679-1684 (2001))、抗体を結合競合に基づくビンにグループ分けし、その後、各ビンのAbのサブセットを機能的アッセイに進ませることが有用である。非競合のビンを明確にすることにより、相乗的活性のため、試験に供すべき抗体の組み合わせが可能である。Kawashima et al, “The multi-epitope approach for immunotherapy for cancer: identification of several CTL epitopes form various tumour-associated antigens expressed on solid epithelial tumors” Hum Immunol 59, 1-14 (1998)。
【０１５６】
前記抗体及び方法の選択した実施態様を以下の実施例において説明する。
【実施例】
【０１５７】
実施した実験及び得られた結果を含めた、以下の実施例は、例示目的のみで与え、本明細書で記載した本発明の実施態様を制限するものとして解釈すべきではない。
【０１５８】
（実施例１：PLA2抗原調製）
グルタチオンを含むアフィニティーマトリクスを使用し、ベクター発現大腸菌からの精製を容易にするために、組み換え体PLA2に融合させた26kDaタグ（グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST））を用いて組換えPLA2タンパク質を調製した。精製タンパク質の溶出は、当分野で良く知られた穏やかで非変性の条件下で行った。精製後に酵素活性が保持されているかを調べる更なる試験を行った。以下にまとめる。前記タグを、タグと組換えPLA2の間にエンドペプチダーゼ切断部位配列を挿入することにより、取り除いた。
【０１５９】
（実施例２：抗-PLA2抗体）
実質的にPLA2に結合するモノクローナル抗体を、XenoMouseマウス（登録商標）(Abgenix Inc, Fermont, CA)をGST-PLA2融合タンパク質で免疫し、免疫応答を刺激することによって調製した。マウスの2種、hlgG2種（グループ1）及びhlgG4種（グループ2）を、足蹠に、約0.6mg/mlの、エンドトキシンフリーの、GST-PLA2（ベクター発現大腸菌から精製）で免疫した。10匹のマウスの2つのグループについて、30日間にわたって計8回免疫し、15、22及び30日目に採血した。表２を参照せよ。アジュバンドとして、最初の免疫ではTitermax Gold Adjuvant (Catalog #T-2684, lot #12K1599, Sigma, 50/50 by volume)を用い；2回目から7回目の免疫ではAluminum Phosphate Gel Adjuvant (Catalog #1452-250, Batch 8919, Superfos Biosector, 5μl/mouse)及びCpG (ODN 1826, 2mg/ml in D-PBS, 10μg/mouse)を用い；最後の免疫にはD-PBSを用いた。PLA2タンパク質断片に対するモノクローナル抗体は、標準的な方法による、PLA2タンパク質断片で免疫したXenoMouse（登録商標）動物を用いたハイブリドーマ技法によって調製した。
【０１６０】
【表２】
2006517188.tif 000004
【０１６１】
（実施例３：ELISA実施例）
抗-PLA2抗体のタイターを求めるために、PLA2抗原をビオチン化して、さらにELISAを行うためにプレート上にコーティングした。簡単に記載すると、15−500μgのPLA2抗原を、pH8.6の1ml PBSで希釈した。10μlの10mg/ml sulfo-HHS-ビオチン(DMSO中のビオチンストック)を1mlのPLA2抗原溶液に加え、室温で攪拌しながら1時間インキュベートした。インキュベーション後、100μlの飽和Trisで反応を停止させ、遠心分離に供し、ビオチン化PLA2抗原から、結合していないビオチンを取り除くために4回洗浄した。ビオチン化PLA2（1μg/ml）をSigma Streptavidinプレート上に、1時間室温でコーティングした。コントロールStreptavidinプレートは、コントロールとして用いるために、コーティングを行わないままとした。
【０１６２】
前記プレートを、蒸留水で5回洗浄した。ハイブリドーマ培養液の上清を、2％ Milk/PBS (1:2希釈)を用いて、2サンプルずつ、最初の希釈率を1：100としてタイターを求めた。最後のウェルは、コントロールとしてブランクのままとした。ストレプトアビジンプレートを蒸留水で5回洗浄した。HRP結合ヤギ抗‐ヒトIgG Fc特異的抗体を、最終濃度1μg/mlで、1時間室温で加えた。蒸留水で5回洗浄後、ストレプトアビジンプレートに30分間TMBを加え、1Mリン酸を加えることによってELISAを停止させた。ハイブリドーマ培養液の上清の具体的なタイターは、450nm吸光度から求めた。
【０１６３】
（実施例４：PLA2に対する完全ヒト抗体のための2回目のスクリーニング）
（Lumines（登録商標）アッセイ）
完全なヒト抗-PLA2抗体の産生を更に確認するために、複合分析物バイオアッセイ検出のためのLuminex（登録商標）ビーズ（MiraiBio, Inc., Alamed, CA）の表面に、PLA2抗原をコーティングした。
【０１６４】
簡単に記載すると、50μl/ウェルのコンジュゲートビーズ混合物をフィルタープレートに加えて、吸引した。吸引後、50μl/ウェルのサンプル及びコントロールをフィルタープレートに加え、暗所でプレートシェーカー上で20分間インキュベートした。インキュベーション後、フィルタープレートを100ml/ウェルの洗浄バッファーで2回洗浄した。最後に、80μl/ウェルの検出抗体混合液を加え、暗所でプレートシェーカー上で20分間インキュベートした。
【０１６５】
コーティングしたビーズを、ヒトガンマ、ヒトカッパ、ヒトラムダ、ヒトIgM、マウスガンマ、及びマウスラムダからなる群から選択される標識抗体でプローブした。その後、ビーズストックを穏やかにボルテックスし、必要なビーズ混合液の容量を、以下の式：(n+6)×50μl (n=サンプル数)を用いて計算した。次に、ビーズをブロッキングバッファーで、ウェル当り2500の濃度の各ビーズ、すなわち0.5×105/mlに希釈した。フィルタープレートを、ウェル当り200μlの洗浄バッファーを加えてあらかじめウェットにしておき、吸引した。
【０１６６】
インキュベーション後、1つのファイル内でビーズを整列させるマイクロフロイルディスク、並びに、各ビーズの内部及び表面の色を照射するレーザーを用いるLuminex（登録商標）マシーンを用いて、プレートを読み込んだ。ビーズに結合して、完全にヒトであることが判明した抗体を、更なる分析のために選択した。
【０１６７】
（実施例５：抗-PLA2抗体の構造解析）
完全にヒトであり、PLA2に結合する抗体の構造解析を行うために、抗体を産生する重鎖及び軽鎖断片をコードする遺伝子を、対応するハイブリドーマからクローン化した。遺伝子クローニング及び配列決定は、以下のように行った：
【０１６８】
Poly(A)+ mRNAを、Fast-Track kit（Invitrogen）を用いて、免疫したXenoMouse（登録商標）マウスに由来する約2×105のハイブリドーマ細胞から単離した。ランダムcDNAの産生をPCRによって行った。ヒトVH又はヒトHκファミリー特異的な可変領域プライマー(Marks et al., 1991)又はユニバーサルヒトVHプライマー、MG-30(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG  配列番号３２)を、以下のヒト特異的なプライマー：
Cγ2定常領域（MG-40d；5’GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA 3’配列番号３３）
Cγ1定常領域（HG1；5’CAC ACC GCG GTC ACA TGG C 3’配列番号３４）；又は
Cγ3定常領域（HG3；5’CTA CTC TAG GGC ACC TGT CC 3’配列番号３５）；
又はヒトCκ定常領域（hκP2；Green et al., 1994に以前に記載）とともに使用した。
前記のプライマーを用いた、poly(A+) RNAから生成したPCR産物の直接配列決定により、ハイブリドーマからのヒトmAb由来重鎖及びカッパ鎖転写産物の配列を得た。PCR産物は、また、TAクローニングキット（Invitrogen）を用いて、プラスミドPCRIIへとクローン化した。加えて、Prism dye-terminator sequencing kit及びABI377配列決定マシーンを用いて、両方の鎖の配列を決定した。全ての配列を、Mac Vector及びGeneworksソフトウェアを用いて、”V BASE sequence directory” (Tomlinson et al., MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK)にアライメントして分析した。
【０１６９】
抗体クローン及びCDR領域の配列を、以下の表３から７にまとめる。
【０１７０】
【表３】
2006517188.tif 000005
2006517188.tif 000006
【０１７１】
【表４】
2006517188.tif 000007
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【０１７２】
【表５】
2006517188.tif 000009
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【０１７３】
【表６】
2006517188.tif 000011
2006517188.tif 000012
【０１７４】
【表７】
2006517188.tif 000013
【０１７５】
（実施例６：PLA2酵素の機能的阻害剤のスクリーニング）
PLA2の機能的活性をブロックする抗体を同定するために、96穴プレートで酵素活性をアッセイするための基本的なプロトコールを、384ウェルプレートでのスクリーニングのために改変した。ELISAにおいて酵素結合をブロックすることが以前から解っている58の抗体候補をスクリーニングした。PLA2の機能的活性をブロックする幾つかの抗体を同定した。
【０１７６】
（基本的な酵素アッセイ）
簡単に記載すると、以下の3つのコンポーネントを黒色の384穴プレート内で混合した：（１）20μl dIH2O又はKLH上清又はテスト培地；（２）20μl dIH2O希釈酵素；及び（３）20μl 3×アッセイバッファーで希釈したBis-BODIPY（登録商標）-FLC11-PC基質。前記プレオートをカバーし、室温で特定の時間インキュベートした。インキュベーション後、20μl 40mM EDTAを反応を止めるために任意に加え、プレートをFITCフィルター, top read (励起＝485nm；蛍光＝530nm)を用いて、α-Fusion (Packard)上で読み込んだ。
【０１７７】
（アッセイ構築）
KLH排出上清の効果及び基質の検出限界を試験するために、初期実験を行った。基質を試験するためのポジティブコントロールとして、市販のブタPLA2を使用し、図１Ａは、0.5ユニット酵素でインキュベートして基質を漸増させた場合の用量依存曲線を示す。KLH上清の効果を試験するために、ウェル当り、0.5ユニット酵素、130nM基質、及び20μl（又はそれ以上）のKLH上清をインキュベートした。複数の時間で読み込み、30分インキュベートした時のデータを図１Ｂに示す。KLH上清は、前記アッセイにおいて最小の効果しか及ぼさなかった。
【０１７８】
（細菌発現PLA2）
細菌発現酵素は、切断前より、Fxa切断後には活性が約4倍になった（データは示さず）。細菌発現GST-酵素融合タンパク質から、Fxaを用いて、GSTタグを切断した。簡単に記載すると、GST-酵素融合タンパク質を、1×Fxaバッファー中で、一晩室温で、1ユニットのFxaを用いてインキュベートした。
【０１７９】
Fxa切断細菌発現酵素を、400nm Bio-BODIPY（登録商標）基質でインキュベートした。複数の時間で読み込み、10分インキュベートした時のデータを図２Ａに示す。KLH上清の効果を試験するために、ウェル当り、0.4μgのFxa切断酵素、400nM基質及び20μl（又はそれ以上）のKLH上清をインキュベートした。酵素活性は、20μl/ウェルの、G2及びG4のKLH排出上清によってわずかに阻害された。10分間のインキュベーションを示す。
【０１８０】
（競合アッセイ）
阻害剤を検出するためのアッセイの能力は、競合アッセイを用いて試験した。簡単に記載すると、20μl/ウェルのテストハイブリドーマ上清を加え、その後、20μlのdIH2O希釈酵素を加えた。プレートをカバーし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、20μl Bis-BODIPY（登録商標）FLC11 PC基質を加えた。その後、プレートをカバーし、室温で60分間インキュベートした。インキュベーション後、20μlの40mM EDTAを加えて反応を停止し、プレートをFITCフィルターを用いてα-Fusionで読み込んだ。
【０１８１】
免疫したマウスのマウス血清を、二重サンプルで試験した。血清（20μl又は無し）を、ウェルあたり、0.2μg Fxa切断細菌発現酵素及び0.4μM基質とともにインキュベートした。前記プレオートを、インキュベーション後30分で読み込んだ。G2及びG4血清の両方が、酵素活性を阻害することが判明した。他の時間においての測定では、類似の結果が得られた。
【０１８２】
（確認スクリーニング）
1枚の384ウェルプレートに、哺乳類PLA2酵素だけでなく、Fxa切断細菌PLA2酵素を用いて、58のハイブリドーマ上清をアッセイした。哺乳類酵素は、二重サンプルでアッセイし、細菌酵素は1つの点でアッセイした。コントロールウェルも、それぞれの酵素でインキュベートした。
【０１８３】
両方の酵素（哺乳類及び細菌発現）により、コントロールウェルにおいて、良好なアッセイウィンドウが付与された。Fxa切断細菌細胞においては、150ng酵素を400nM基質とともにインキュベートした。哺乳類酵素においては、0.5μl CHO上清を400nM基質とともにインキュベートした。
【０１８４】
ハイブリドーマ上清を、酵素活性の阻害について試験した。ハイブリドーマ上清(20μl/ウェル)を、0.5μl CHO-sup又は150ng Fxa切断酵素酵素とともに、一晩インキュベートした。基質を、最終400nMで加えて、プレートをインキュベートし、30分及び60分で読み込んだ。EDTAを60分後に加え、再度読み込んだ。EDTA添加後60分のデータを示す。表８は、哺乳類及び細菌発現酵素の阻害が成功していることを示す。酵素活性をブロックすることにより、20から74％阻害がもたらされた。哺乳類及び細菌のPLA2の機能的な活性をブロックする複数の抗体が同定された。
【０１８５】
【表８】
2006517188.tif 000014
【０１８６】
（実施例７：蛍光アッセイによるPLA2活性の測定）
蛍光アッセイは、Ca+2依存分泌性PLA2を測定するために最適化した。Bis-BODYIPY（登録商標）FLC11-PC(Molecular Probes, Euguen, OR)を基質として用いた。近接するアシルリン脂質鎖上のBis-BODYIPY（登録商標）FLフルオロフォアが接近していることによって、蛍光の自己消光が生じるが、これは、ホスホリパーゼA1又はA2が触媒するBODIPY（登録商標）Fl標識脂肪酸の放出によって軽減する。PLA2活性は、フルオロメーターのフルオレセインフィルター(485nm励起及び535nm蛍光)を用いて、増加した蛍光を測定することによって試験される。
【０１８７】
簡単に記載すると、1.33×アッセイバッファー中の0.532μM基質を75μl/ウェルで、96穴プレートに加えた。20％DMSO中の試験化合物を5μl/ウェルで加え、その後、pH7.6, Tris-Clバッファー中の5×PLA2酵素を20μl加えた。その後インキュベーションし、5分後に室温で、反応混合液に10μlのEDTAを最終濃度10mMになるように加えて反応を停止した。蛍光を、フルオレセインフィルター（485nm励起及び535n蛍光）を用いて、マイクロプレートフルオロメーターで測定した。測定は、EDTAによって反応を停止して15から30分以内に行った。
【０１８８】
（実施例８：抗-PLA2 mAbの機能アッセイ）
以前にPLA2に結合し、PLA2酵素活性をブロックすることが同定されている、精製抗体を、前記に記載した機能的PLA2アッセイを用いて更に特徴付けした。4つの抗体(mAb 1.18、 2.4、2.25、及び2.9)が、IC50<2nMでPLA2の機能を阻害することが示された。全ての抗体は、哺乳類及び細菌で発現した酵素をブロックする。  
【０１８９】
PLA2酵素をブロックすることが判明している抗体を、その後、哺乳類CHO細胞（CHO-PLA2-MTX）内で発現させた。
【０１９０】
（IC50に基づく親和性の順序）
2つの別々の実験、6点投与量カーブ及び12点投与量カーブを行い、抗体の親和性を順序付けした。2つの投与カーブからのデータが生じる。12点投与カーブからのデータを表９に示す。
【０１９１】
【表９】
2006517188.tif 000015
【０１９２】
（実施例９：抗-PLA2 mAbのBiacore（登録商標）結合
どの抗体が最も高い親和性で抗原PLA2に結合するかを同定するために、25℃で、研究グレードのCM5センサーチップを装備したBiocore（登録商標）2000 biosensor (Biacore, Piscataway, NJ)を用いて解析を行った。固定においては、HBS-Pをランニングバッファーとして用いた；結合実験においては、12mg/mlのそれぞれBSA及びデキストランを含むHBS-Pを、サンプル及びランニングバッファーとして用いた。
【０１９３】
簡単に記載すると、抗体上清を1/10で希釈し、抗体を個々にIgG表面上で捕捉した。1分間の洗浄工程の後、バッファー及びPLA2(300nM)を、それぞれの表面に連続してインジェクトした（1分間会合、5分間解離）。捕捉レベルは、-20から0秒で測定し、表面を100mM H3PO4の6秒パルスで再生した。
【０１９４】
最初のスクリーニングにより、上清は、以下の3つのクラスに分けることができた：（１）高い抗体タイター、高い抗原認識（>50 RU 捕捉Ab、>10 RU Ag応答）；（２）高い抗体タイター、低い抗原認識（>50 RU 捕捉Ab、<10 RU Ag応答）；（３）低い抗体タイター、低い又は可変の抗原認識（<50 RU 捕捉Ab、<10 RU Ag応答）。それぞれの抗体の捕捉レベル及び結合応答を表１０に示す。
【０１９５】
【表１０】
2006517188.tif 000016
2006517188.tif 000017
【０１９６】
抗体クラスII（太字で示す）及びクラスIII（斜体で示す）の上清を、クラスIIは1/10希釈及びクラスIIIは1/2希釈で用いて再スクリーニングした。捕捉時間を増し、750nM PLA2を結合を検出するためにインジェクトした。これらの条件下で得られる捕捉レベル及び結合応答を、表１１に示す。>10 RUのPLA2結合応答を提示する上清のみが、高分解能解析のための実行可能な候補であると考えられる。
【０１９７】
【表１１】
2006517188.tif 000018
【０１９８】
データは、個々の抗体捕捉レベルに基づいて標準化され、グローバルに1:1相互作用モデルにフィットされる。抗体1.1、1.10、1.16、2.18、2.19及び2.20は、高い親和性の抗体であることが判明した。求めた速度定数を表１２にまとめる。
【０１９９】
親和性は、解離速度と会合速度の比から計算した。下線部を引いた解離速度を、データフィッティング方法でフロートした。中間分解能で選択した上清は、表１２においては太字で示す。
【０２００】
【表１２】
2006517188.tif 000019
2006517188.tif 000020
【０２０１】
（実施例１０：Multiplexed Competitive Antibody Binning (MCAB)アッセイ）
mAbを、Multiplexed Competitive Antibody Binning (MCAB)アッセイを用いて抗原結合のクロス-競合に基づく異なるビンへと分類わけした。MCABアッセイは、1つの抗原分子上の1つのエピトープへの2つのAbの競合結合に基づく。2002年12月2日に出願した米国特許出願第10/309,419号, entitled“Antibody Characterization Based on Binding Characteristcs”Publication No. US-2003-0157730-A1。MCAB方法に適用する前に、第一のハイブリドーマ培養液からの上清の抗体を、ELISA又は他の方法による抗原反応性で、同定し確認した。それぞれの抗原-免疫反応性Abを使用して、抗体-抗原複合体を形成させる。この抗体を「リファレンス」Abとする。加えて、それぞれの抗体を、「プローブ」Abとして使用して、競合に基づくビンを求める。Luminex（登録商標）手法により、プローブ抗体を、同時に全てのリファレンス抗体-抗原複合体と競合させ、アッセイに多重化能力を付与する。
【０２０２】
（Luminex（登録商標）ビーズに対するマウス抗-hIgGモノクローナル抗体の結合）
簡単に記載すると、抗原反応性ハイブリドーマのパネルから各ハイブリドーマの上清（リファレンスAbとして）のアリコートを、Luminex（登録商標）100 User’s Manual, Version 1.7に記載された、マウス抗-hIgGモノクローナル抗体に結合した光学的に特徴的なコードビーズとともに、インキュベートした。活性化に続き、前記ビーズを、マウス抗-hIgG mAb (Pharmingen, San Diego, CA)に結合し、2時間室温で又は4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コートビーズをブロックし、その後、培養細胞カウンターを用いてカウントした。
【０２０３】
（エピトープビニング）
ビーズ結合リファレンスAbを、その後、混合し、96穴プレートのウェルへと等分した。抗原-抗体複合体を形成するために、抗原を各ウェルに加えた。上清中の各抗体（ここではプローブAb）を個々のウェルに加えた。最後に、ビオチン化したマウス抗-hIgG mAbを加え、その後、ストレプトアビジン-PEを加えてプローブAbの結合を検出した。
【０２０４】
簡単に記載すると、ビーズ-マウス抗-hIgG複合体の各セットを別々に、回転子上で4℃で一晩、レファレンスAbとインキュベートした。リファレンスAbを補足した後、ビーズ-タグ マウス抗-hIgG-リファレンスAb複合体を一緒にプールし、96穴フィルタープレートの各ウェルに直接加えて、吸引した。次に、50ng抗原を各ウェルに加えて、1時間、室温でインキュベートした。洗浄後、100から500ng/mlのプローブAbを各ウェルに加え、2時間、室温でインキュベートした。結合したプローブAbを、リファレンスAbを補足するために使用する同じモノクローナルマウス抗-hIgGのビオチン化バージョン1μg/mlを用いて検出した。最後に、0.5μg/mlストレプトアビジン-PEを加え、30分間室温でインキュベートした。
【０２０５】
同時に行った、抗原を用いないアッセイセットも、各mAb組み合わせのバックグラウンドコントロールとして実施した。その後、各ウェルのビーズの回収物をLuminex（登録商標）100を用いてスキャンし、多重化抗原-リファレンスAb-ビーズ複合体のそれぞれへの、既定のプローブAbの結合程度を定量した。相対的蛍光ユニットとして表現されるポジティブシグナルは、プローブAbがリファレンスAbに結合した抗原を結合することができ、それゆえ、Abペアが結合に競合しないことを示していた。バックグラウンドと同等なシグナルは、プローブAbがリファレンスAｂに結合した抗原に結合せず、Abペアが結合と競合し、それゆえ同じビンであることを示していた。同じビンの抗体は、同じ又は重複するエピトープを有している。
【０２０６】
17の有力な中和抗体が、in vitroアッセイにおいて、PLA2に対する抗体パネルから同定された。MCABアッセイを行うことにより、中和抗体の2つのビンを同定した。（表１３を参照）。ビン1は14つの抗体を含み、ビン2は3つの抗体を含んでいた。PLA2の活性を中和する17の個々の抗体は、2つの生殖細胞系列VH遺伝子を産生している。最も頻度の高い遺伝子、VH5-51生殖細胞系列遺伝子が、解析した17つの抗体のうち14に発現しており、ビン1に制限されていた。機能的抗体及びビニングを選択することにより、特定のビンにおける抗体が、同じIgVHを発現し、そして同じ場合に、同じVHDJH再構成を発現することが示された。
【０２０７】
【表１３】
2006517188.tif 000021
【０２０８】
（分解能が良好なエピトープマッピング）
2つのビンのそれぞれからの2つの特徴的な抗体を、分解能が良好なエピトープマッピングを行い、結合結果を確かめた。SPOT技法（Sigma Genosys, Inc.）を用いたエピトープマッピングのために、重複ペプチドのペプチドスキャンを用いた。簡単に記載すると、PLA2の完全な157アミノ酸配列を、重複する12-merオリゴペプチドとし、2つの残基をオフセットとしてカスタム合成し、それによって、ナイロンメンブレン（Sigma Genosys, Inc.）上に、アレイ化した重複ペプチドのライブラリーを調製した。抗体は、ウェスタンブロッティングのための標準的な条件を使用して、アレイ化したオリゴペプチドへの結合により試験した。HRP結合二次抗体を用い、その後に、高感度化学発光（ECL）を用いて、メンブレン結合ペプチドへのmAbの結合をELISAによって評価した。結合を示したスポットは、エピトープを含むオリゴペプチドに対応していた。抗-PLA2 mAb 2.12、2.25、2.15、及び2.23は、ドットブロットにより直線状のエピトープを認識することが示された。
【０２０９】
抗-PLA2 mAb 2.15.1及び2.23.1は、ビン2に位置づけられ、両方とも同じ直線状エピトープ、GPAENK（配列番号２のアミノ酸119-124）に結合した。抗-PLA2 mAB 2.12.1及び2.25.1は、両方ともビン1に位置づけられた。抗-PLA2 mAb 2.12.1は大きなエピトープ、PQFLCEPD（配列番号２のアミノ酸153-160）に位置づけられたにもかかわらず、抗-PLA2 mAb 2.25.1は最小のエピトープPPQFL（配列番号２のアミノ酸153-156）に位置づけられ、このエピトープが抗-PLA2 mAb 2.21.1のエピトープに含まれていることにより、MCABアッセイの結果の基礎をなす分子基盤が確かめられた。ビン1及び2の抗-PLA2 mAbは、保存されたVH遺伝子使用を有していた。例えば、ビン1の抗体は、全て、VH5-51を使用するが、異なるCDR3配列及び軽鎖組成を有する。ビン2の抗体は、全て、VH3-33を使用し、異なるCDR3及び軽鎖組成を有する。相関関係が、結合競合に基づくビン、機能的アッセイによる抗体活性、及び他の、しかし全てではない抗原標的のための可変領域の組成の間で見出された（データは示さず）。
【０２１０】
生殖細胞系列のレパートリーのほんの数個が、対応する抗原結合部位を形成するのに使用され、それぞれの抗原エピトープにおいては、制限された数のL-及びH-鎖遺伝子がペアを形成し、特異的な抗原結合部位を形成していることは明らかである。ビン1のmAbは、同じ重鎖及び軽鎖遺伝子使用を共有していることが判明した。軽鎖においてはCDR3及びFR2の長さが異なるが、両方は重複したエピトープを結合した。ビン2のmAbは、同じ重鎖及び軽鎖遺伝子使用を共有している。軽鎖においてはCDR3及びFR2の長さが異なるが、両方は同じエピトープを結合した。
【０２１１】
（実施例１１：抗-PLA2 mAb 12.2を用いたファージディスプレイランダムペプチドライブラリーのパニング）
M13ファージのマイナーコートタンパク質(pIII)に融合したランダムペプチド12-merのPh.D.-12（商標）ファージディスプレイライブラリー（New England BioLabs）を、抗-PLA2 mAb 2.12に対して用いた。特異的なバインダーをELISAによって選択し、配列を決定した。特異的なバインダーのためのペプチド配列を、その後、PLA2抗原配列と配列比較した。抗-PLA2 mAb 2.12の特異的なバインダーのペプチド配列のアライメントを図４で示す。コンセンサス配列PXFLが、配列番号２で示すPLA2配列の残基153-156に対応することが求まった。
【０２１２】
（実施例１２：in vitro転写/翻訳）
4つのモノクローナル抗体について、Luminex（登録商標）ビーズに結合したin vitro転写（IVT）産物への結合を試験した。全てのコンストラクトが、6Xhisタグ融合タンパク質として発現された。完全長のIVT産物が観察されたが、断片1-36PLA2His及び断片1-63PLA2Hisへの如何なる結合も観察されなかった。このことは、エピトープが分子のアミノ酸63を超える部位及びC末端領域に存在することを示す。
【０２１３】
【表１４】
2006517188.tif 000022
【０２１４】
【表１５】
2006517188.tif 000023
【０２１５】
（実施例１３：抗-PLA2抗体及び結合抗体の炎症治療のための使用）
抗-PLA2抗体のようなPLA2抗原に特異的な抗体は、例えば、アテローム性動脈硬化及び再狭窄の治療における脂質低減剤として、このような抗原を発現する心臓血管細胞を標的とするのに有用である。
【０２１６】
（抗-PLA2抗体を用いたマウスの治療）
心臓血管損傷の治療における抗-PLA2抗体のin vivoでの効果を求めるために、血管外傷モデルのノックアウトマウスに、あらかじめ求めた期間にわたって、効果的な量の抗-PLA2抗体を注入する。頚動脈周辺にカフを設置することによって、マウスに血管外傷は誘導し、それによって、PLA2の炎症性浸潤を引き起こし、アテローム性動脈硬化及び再狭窄の患者に見られる症状と似た、炎症及び頚動脈の壁肥大が引き起こされる。抗-PLA2抗体を用いた治療の間の周期的な時期に、マウスをモニターし、血管外傷の状態を求める。血管外傷の顕著な減少に注意する。
【０２１７】
（実施例１４：抗-PLA2抗体を用いたヒトの治療）
アテローム性動脈硬化及び再狭窄のような炎症性疾患のヒト患者における抗-PLA2抗体治療のin vivoでの効果を求めるために、このようなヒト患者に、あらかじめ求めた期間にわたって、効果的な量の完全なヒト抗-PLA2抗体を注入する。治療の間の周期的な時期に、ヒト患者をモニターし、炎症が顕著な減少を示すかどうかを求める。
【０２１８】
抗-PLA2抗体で治療したアテローム性動脈硬化の患者が、非治療の患者及び/又はコントロール抗体で治療した患者よりも低い脂質レベルを示すことが判明する。使用するコントロール抗体は、試験した抗-PLA2抗体と同じイソ型であり、更にはPLA2に結合する能力を有していない抗体を含む。
【０２１９】
（実施例１５：抗-PLA2抗体結合物を用いた治療）
抗-PLA2抗体結合物のin vivoでの効果を求めるために、炎症性疾患を示すヒト患者又は動物に、あらかじめ求めた期間にわたって、効果的な量の抗-PLA2抗体結合物を注入する。1つの実施態様においては、投与された抗-PLA2抗体結合物は、マイタンシン-抗-PLA2抗体結合物又は放射線同位体-抗-PLA2抗体結合物である。治療の間の周期的な時期に、ヒト患者又は動物をモニターし、炎症が減少するかどうか、特に、血管外傷の顕著な減少を示すかどうかを求める。
【０２２０】
マイタンシン-抗-PLA2抗体又は放射線同位体-抗-PLA2抗体結合物のいずれかで治療を行った、アテローム性動脈硬化又は再狭窄のヒト患者又は動物が、コントロール抗体結合物（コントロール マイタンシン-抗体又はコントロール 放射線同位体-抗体等）で治療を行ったアテローム性動脈硬化又は再狭窄のコントロール患者又は動物と比べて、低い血管外傷及び炎症レベルを示すことが判明する。使用したコントロール マイタンシン-抗体は、抗-PLA2抗体の同じイソ型の抗体に結合したマイタンシンを含むが、より具体的には、PLA2抗原に結合する能力を有しない結合物を含む。使用したコントロール 放射線同位体-抗体は、抗-PLA2抗体の同じイソ型の抗体に結合した放射線同位体を含むが、より具体的には、PLA2抗原に結合する能力を有しない結合物を含む。
【０２２１】
（実施例１６：診断薬としての抗-PLA2抗体の使用）
（サンプル中のPLA2抗原の検出）
サンプル中のPLA2抗原を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を開発する。前記アッセイにおいては、96穴プレートマイクロタイタープレート又は384穴マイクロタイタープレートのようなマイクロタイタープレートのウェルに、前記抗原に対する完全なヒトモノクローナル一次抗体を吸着させる。固定化された抗体は、テスタサンプル中に存在するであろう任意の抗原の捕捉抗体として機能する。前記ウェルを、乳タンパク質又はアルブミンのようなブロッキング剤でリンス及び処理して、分析物の非特異的吸着を防ぐ。
【０２２２】
続いて、前記ウェルを、抗原を含む可能性のあるテストサンプル又は標準量の抗原を含む溶液で処理する。このようなサンプルは、例えば、病態の診断と考えられている循環抗原のレベルを有すると考えられる対象者からの血清サンプルとすることができる。
【０２２３】
テストサンプル又はスタンダードをリンスして除去した後、ウェルを、ビオチンと結合して標識した完全なヒトモノクローナル二次抗-PLA2抗体で処理する。標識抗-PLA2抗体は、検出抗体として機能する。過剰な二次抗体をリンスして除去した後、ウェルをアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）及び適した発色基質で処理する。テストサンプル中の抗原濃度は、スタンダードサンプルから得られたスタンダードカーブと比較して求める。
【０２２４】
このELISAアッセイによって、テストサンプル中のPLA2抗原を検出するための、特異性が高く、感度が非常に高いアッセイが供給される。
【０２２５】
（患者内のPLA2抗原濃度の決定）
ヒト血清中のPLA2レベルを定量するために、サンドイッチELISAを開発する。サンドイッチELISAに用いる2つの完全なヒトモノクローナル抗-PLA2抗体は、PLA2分子上の異なるエピトープを認識する（データは示さず）。ELISAは以下のように行う：
コーティングバッファー（0.1M NaHCO3, pH9.6）中2μg/mlの濃度の捕捉抗-PLA2抗体を50μl、ELISAプレート（Fisher）にコーティングする。4℃で一晩インキュベーション後、プレートを200μlのブロッキングバッファー（PBS中、0.5% BSA、0.1% Tween20、0.01% チメロサール）で、1時間25℃で処理する。プレートを、0.05% Tween 20を溶かしたPBS（洗浄バッファー、WB）を用いて洗浄する（3回）。通常のヒト又は患者の血清（Clinomics, Bioreclaimation）を50%ヒト血清を含むブロッキングバッファーで希釈する。プレートを、血清サンプルで、一晩4℃でインキュベートし、WBで洗浄し、その後、100μl/ウェルのビオチン化検出抗-PLA2抗体で、1時間25℃でインキュベートする。洗浄後、プレートを、HRP-ストレプトアビジンで15分間インキュベートし、前と同じように洗浄し、その後、発色生成のために、100μl/ウェルのH2O2に溶かしたo-フェニレンジアミンで処理する。反応を、50μl/ウェルのH2SO4(2M)で停止させ、ELISAプレートリーダーを用いて492nmで分析する。血清サンプル中のPLA2抗原の濃度は、four-parameter curve fitting programを用い、精製したPLA2抗原の希釈液の比較によって計算される。
【０２２６】
（患者の炎症性疾患の病期診断）
前記実施例で示し論じてきた結果に基づいて、本発明の実施態様から、PLA2抗原の発現レベルにより対象者の心臓血管損傷の病期を診断することは可能であると理解されるであろう。損傷のタイプに基づいて、血液サンプルを、病気の進展の様々な段階及び/又は病気の治療処置の様々な段階であると診断された患者から採取する。血液サンプル中に存在するPLA2抗原の濃度を、存在する抗原量を特異的に求める方法を用いて求める。このような方法は、前記実施例で示した方法のようなELISA方法を含む。それぞれ進展段階又は治療段階において統計的に有意な結果が得られるサンプル群を用いて、各段階の特徴であると考えられる抗原濃度の範囲が指定される。
【０２２７】
研究している対象者の病気の進展を診断するために、又は治療中の対象者の応答を特徴付けるために、血液サンプルを対象者から採取し、サンプル中に存在するPLA2抗原の濃度を求める。このようにして得られた濃度を使用して、前記値がどんな濃度範囲に収まるかを同定する。このようにして求めた範囲は、診断対象者群において同定した進展段階又は治療段階と相関関係があり、それにより、研究している対象者の病期診断が行われる。
【０２２８】
前記した明細書は、当分野の当業者が本発明を実施するには十分であると考えられる。本明細書に記載された本発明の実施態様は、挿入された構成概念による範囲に制限されない。なぜならば、挿入された実施態様は、本発明の特定の側面の1つの例示として意図されたものであり、機能的に均等である任意の構成概念は本発明の範囲内であるからである。本明細書における、最良の形態を含む構成要素の挿入は、本明細書に含まれる記載が本発明の任意の側面を実施するのに不十分であるとの認可を構成するものではなく、表される特定の例示に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきでない。
【０２２９】
（均等物）
前記した記載事項及び実施例は、本発明の好ましい特定の実施態様を詳細に述べ、本発明によって企図される最良の形態を記載する。しかしながら、詳細な前記記載事項がテキスト中にどのように表れようとも、本発明は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物にしたがって、本発明が解釈されるべきであることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１Ａ】図１Ａは、0.5ユニットのPLA2酵素とインキュベートした基質の量を徐々に増やした場合の用量反応曲線を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、KLHがアッセイにおいて最小の効果を有していることを示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、400nM Bis-BODIPY（登録商標）基質とインキュベートしたFxa切断した細菌発現酵素の量を徐々に増やした場合を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、G2及びG2に由来する20μl/ウェルのKLH排出上清によってわずかに阻害された細菌発現PLA2の酵素活性を示す棒グラフである。
【図３】図３は、それぞれの抗体でテストした最も高い投与量での阻害率を示す線グラフである。
【図４】図４は、mAb 2.12の特異的なバインダーのペプチドコンセンサス配列のアライメントである。
【図１Ａ】
2006517188.tif 000024
【図１Ｂ】
2006517188.tif 000025
【図２Ａ】
2006517188.tif 000026
【図２Ｂ】
2006517188.tif 000027
【図３】
2006517188.tif 000028
【図４】
2006517188.tif 000029
【配列表】
2006517188000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月2日(2005.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼA2（PLA2）に結合し、PLA2活性を中和する、完全なヒトモノクローナル抗体、又はその結合断片。
【請求項２】
前記抗体が完全抗体である、請求項１記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記断片がFab’断片を含む、請求項１記載の結合断片。
【請求項４】
前記抗体、又はその結合断片が、23nM以下のKDでPLA2に結合する、請求項１記載の完全なヒトモノクローナル抗体、又はその結合断片。
【請求項５】
請求項４記載の抗体と結合が競合する抗体。
【請求項６】
前記抗体が抗-PLA2 mAb 2.25である、請求項４記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記抗体、又はその結合断片が、15nM以下のKDでPLA2に結合する、請求項１記載の完全なヒトモノクローナル抗体、又はその結合断片。
【請求項８】
前記抗体が抗-PLA2 mAb 2.12である、請求項７記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体、又はその結合断片が、10nM以下のKDでPLA2に結合する、請求項１記載の完全なヒトモノクローナル抗体、又はその結合断片。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３０及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項１記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を更に含む、請求項１０記載の完全なヒト抗体。
【請求項１２】
前記重鎖が配列番号１９の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖を更に含む、請求項１２記載の抗体。
【請求項１４】
前記重鎖が配列番号２７の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項１１記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１５】
配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖を更に含む、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、VH5-51生殖細胞遺伝子、又はその保存的バリアントを含む、請求項１記載の抗体。
【請求項１７】
JH3B生殖細胞遺伝子、又はその保存的バリアントを更に含む、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体、又はその結合断片が、PLA2のアミノ酸153-156の間のエピトープに結合する、請求項１記載の抗体、又はその結合断片。
【請求項１９】
前記抗体、又はその結合断片が、PLA2のアミノ酸153-160の間のエピトープに結合する、請求項１記載の抗体、又はその結合断片。
【請求項２０】
前記抗体が完全抗体である、請求項１８記載の完全なヒトモノクローナル抗体。
【請求項２１】
前記抗体、又はその結合断片が、23nM以下のKDでPLA2に結合する、請求項１８記載の完全なヒトモノクローナル抗体、又はその結合断片。
【請求項２２】
前記抗体、又はその結合断片が、15nM以下のKDでPLA2に結合する、請求項１８記載の完全なヒトモノクローナル抗体、又はその結合断片。
【請求項２３】
不溶性マトリクスに固定した、請求項１記載の抗体。
【請求項２４】
患者サンプル中のホスホリパーゼA2（PLA2）のレベルをアッセイする方法であって、前記患者サンプルを請求項１記載の抗-PLA2抗体と接触させる工程、及び、その後の、前記患者サンプルへの前記抗体の結合を測定する工程を含む方法。
【請求項２５】
前記患者サンプルが血液である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１記載の抗体、又はその結合断片、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項２７】
動物の炎症性疾患の効果的な治療のための医薬の製造における、完全なヒト抗体、又はその結合断片の使用であって、前記モノクローナル抗体、又はその結合断片がホスホリパーゼA2（PLA2）に結合し、PLA2活性を中和する使用。
【請求項２８】
前記動物がヒトである、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記炎症性疾患が、関節、皮膚、及び血管における炎症性反応から生じる炎症性及び変性疾患、関節炎、乾癬、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、並びに再狭窄から選択される、請求項２７記載の使用。
【請求項３０】
前記抗体が請求項４記載の抗体である、請求項２７記載の使用。
【請求項３１】
動物の再狭窄の効果的な治療のための医薬の製造における、完全なヒト抗体、又はその結合断片の使用であって、前記モノクローナル抗体、又はその結合断片がホスホリパーゼA2（PLA2）に結合し、PLA2活性を中和する使用。
【請求項３２】
前記動物がヒトである、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
前記抗体が請求項４記載の抗体である、請求項３１記載の使用。