(57)【要約】本発明は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする相同組込み遺伝子および標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子を含む宿主細胞にて標的タンパク質を生産するための発現系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｌａｃプロモーターの制御下に相同的に組込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む宿主細胞。
【請求項２】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が溶原性ファージを用いることなく宿主細胞染色体に組込まれている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
ｌａｃプロモーターがｌａｃＵＶ５プロモーターである、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が宿主染色体のガラクトースオペロンに組込まれている、請求項２または３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が、pHMM209、pHMM22、pHMM223およびpHMM228からなる群から選択される組込みプラスミド由来のガラクトースオペロンに組込まれている、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードしている非組込み遺伝子をさらに含む、請求項２〜５のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項７】
標的タンパク質が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＰＴＨがＮ末端断片１−８４である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
Ｎ末端断片が１−３４である請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
標的タンパク質がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１類似体あるいは誘導体である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞の非必須遺伝子に相同的に組込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、およびＴ７ｌａｃプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子を有する宿主細胞を含む、ファージを含まない発酵ブロスにて標的タンパク質を生産するための発現系。
【請求項１２】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が宿主染色体のガラクトースオペロンに組込まれている、請求項１１に記載の発現系。
【請求項１３】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が、pHMM209、pHMM22、pHMM223およびpHMM228からなる群から選択される組込みプラスミド由来のガラクトースオペロンに組込まれている、請求項１２に記載の発現系。
【請求項１４】
標的タンパク質が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である、請求項１３に記載の発現系。
【請求項１５】
ＰＴＨがＮ末端断片１−８４である請求項１４に記載の発現系。
【請求項１６】
Ｎ末端断片が１−３４である請求項１５に記載の発現系。
【請求項１７】
標的タンパク質がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１類似体あるいは誘導体である、請求項１３に記載の発現系。
【請求項１８】
ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を宿主の非必須遺伝子中に相同的に組込む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を誘導しても発酵ブロスがファージを含むことがない、当該宿主細胞を調製する方法。
【請求項１９】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をガラクトースオペロンに組込む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、pHMM209、pHMM22、pHMM223およびpHMM228からなる群から選択される組込みプラスミド由来のガラクトースオペロンに組込む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を宿主細胞の非必須遺伝子中に相同的に組込み、当該宿主細胞を調製し、
ｂ．標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子で該宿主細胞を形質転換し（ここに、非組込み遺伝子はＴ７ｌａｃプロモーターの制御下にある）、
ｃ．得られた宿主細胞を誘導し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生させ、
ｄ．Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが標的タンパク質を生産するために充分な時間発酵ブロスにて該宿主細胞をインキュベートすること（ここに、発酵ブロスはファージを含まない）、
を包含する標的タンパク質を調製するための方法。
【請求項２２】
標的タンパク質が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＴＨがＮ末端断片１−８４である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｎ末端断片が１−３４である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的タンパク質がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１類似体あるいは誘導体である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質を生産するための発現系に有用な新規宿主細胞に関する。
【０００２】
多くの発現系が、細菌宿主細胞にて標的タンパク質を生産するために利用される。これらの系の多くは、大腸菌のラクトース（ｌａｃ）およびトリプトファン（ｔｒｐ）オペロンのような、天然に存在する内生調節系に由来する。ラムダファージのラムダプロモーター（ＰＬ）系のようなファージ発現調節ネットワークの構成要素を利用する系もいくつかある。
【０００３】
しかし、実験室レベルで大腸菌にて組換え標的タンパク質を発現するために最も広く常用される系の１つは、バクテリオファージＴ７発現系である。この発現系はNovagen，Inc．（Madison WI）から市販されており、米国特許番号４，９５２，４９６に記載されている。前記発現系は、組込まれている溶原性ファージを含む宿主細胞を利用する。次にこの宿主細胞は、選択する標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子によりファージプロモーターの制御下に形質転換される。
【０００４】
溶原性ラムダＤＥ３は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンを有する組換えファージである。溶原性ラムダＤＥ３は、ラムダＤＥ３ファージ溶解物、ヘルパーファージ溶解物および選択ファージ溶解物で宿主細胞を共感染することによって調製される。共感染の結果、ラムダＤＥ３ファージが染色体に組込まれた宿主細胞が生じる。ラムダＤＥ３ファージは、宿主染色体のラムダ組込み部位に組込まれるが、その溶解力は不完全である。よって、溶原性ＤＥ３は安定には違いないが、感染性ファージを生産する程に十分に細胞を溶解しないはずである。発現系を誘導すると、宿主細胞は溶原性ＤＥ３からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産する。その後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、非組込み標的遺伝子のファージプロモーターに結合し、標的タンパク質の合成を開始させる。
【０００５】
Ｔ７発現系は、標的タンパク質の発現に非常に適する多くの利点を有している。例えば、標的遺伝子のＴ７またはＴ７ｌａｃプロモーターは、ファージに特有のファージプロモーターであり、宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼによって認識されない。つまり、標的タンパク質の発現は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが存在する場合にのみ開始される。このことは、誘導前に標的タンパク質が発現する可能性を減少させる。誘導前の標的タンパク質の発現は、標的タンパク質の中には宿主細胞の増殖に悪影響を及ぼすものがあり、よって標的タンパク質の最大生産を減少するために望ましくない。
【０００６】
Ｔ７発現系を標的タンパク質の発現に適したものにする他の例は、Ｔ７プロモーターが改変されてラクトースオペレーター（ｌａｃＯ）を含む点である。ｌａｃＯは、ラクトースオペロンリプレッサーの結合部位である。ラクトースリプレッサーはｌａｃＯに結合し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ｌａｃプロモーターへ結合することを阻害し、それにより標的タンパク質の発現を効果的に抑制する。この抑制は宿主細胞に誘導物質を加えることで解除できる。誘導物質は、ｌａｃＯからラクトースリプレッサーを外し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ｌａｃプロモーターへ結合することを可能にし、そして標的タンパク質の発現を開始させる。ｌａｃＯを含むことは、標的タンパク質の発現開始を１０倍近く厳密にさせる。このこともまた、標的タンパク質のいくつかが宿主細胞の増殖に悪影響を及ぼし最大標的タンパク質生産を減少させるといった、誘導前の標的タンパク質の発現可能性を減少させることに役立つ。ラクトースリプレッサーは、ｌａｃＩと呼ばれる内生宿主細胞遺伝子から産生される。しかしｌａｃＩ遺伝子を有する宿主株は、標的タンパク質の発現を効果的に抑制するために十分なラクトースリプレッサーを生産できない。よって標的タンパク質の適切な調節を行うためには、宿主株が過剰なｌａｃＩ遺伝子をも含むか、またはｌａｃＱ１プロモーターを包含する過剰発現宿主細胞を用いなければならない。
【０００７】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼよりも約１２倍伸長性があるという事実は、この発現系の唯一の最も有利な特性であろう。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの高伸長性が細胞の全タンパク質の６０％以上を標的タンパク質として生成することを可能とし、それが、利用できる最も効果的な発現系の１つとしている。
【０００８】
しかし本発明は、標的タンパク質が多量に生産されるた場合、発酵ブロス中に感染性ファージが検出されるという発見が基礎となっている。この発見はＤＥ３ファージが溶解能を回復することを示唆する。発酵中に高細胞密度に達すると、低レベルの組換えまたは非正統的組換え（復帰）を介して感染性ファージが生じ、溶原性ファージが切出されるのかもしれない。いずれにせよ承認機関は、検出されうるレベルのファージ粒子を有する医薬品として用いられる標的タンパク質を含む発酵ブロスの工程進行を禁じている。
【０００９】
本問題を踏まえて、本発明は改善されたＴ７発現系を提供する。本発明にてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、異なる組込みメカニズムを用いて宿主細胞の染色体に組込まれる。本発明は、不完全ファージの宿主細胞への感染の代わりに相同組換えによって宿主細胞染色体の非必須部位にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のコピーを組込む。宿主細胞はさらに、選択した標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする組込み遺伝子は宿主細胞の内生調節系の制御下にあるが、標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子はファージ調節系の制御下にある。宿主細胞が誘導されると、宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼが宿主細胞プロモーターに結合しＴ７ＲＮＡポリメラーゼの合成を開始できる。新しく合成されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７またはＴ７ｌａｃプロモーターに結合し標的タンパク質の合成を開始するのに利用される。結果、標的タンパク質を含むファージ不含の発酵ブロスが得られる。
【００１０】
本発明は、宿主染色体に組込まれるｌａｃプロモーターの制御下に相同組換えされるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む宿主細胞を提供する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは溶原性ファージを用いることなく宿主細胞染色体に組込まれ、付加的なファージＤＮＡの混入を生じない。相同組換えは選択するいずれの非必須遺伝子でも起こり得るが、溶原性ファージは感染工程によってもたらされる部位にのみ組込まれる。プロモーターは、野生型ｌａｃプロモーターまたは修飾されたｌａｃプロモーター、例えばｌａｃＵＶ５であり得る。
【００１１】
宿主細胞はさらに、標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子を含むことができ、ここで非組込み遺伝子はＴ７またはＴ７ｌａｃプロモーターの制御下にある。好ましいＴ７プロモーターはＴ７ｌａｃである。好ましい標的タンパク質は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（１−８４）またはＮ末端断片１−３４、１−３１、１−２８などのその活性断片、またはその類似体あるいは誘導体である。もう一つの態様では、標的タンパク質はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその類似体あるいは誘導体である。
【００１２】
本発明はさらに、標的タンパク質を含むファージ不含の発酵ブロスを生産するための発現系を提供し、ここで前記発現系は、宿主細胞の染色体上の非必須遺伝子内に相同的に組込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子および標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子を有する宿主細胞を含む。
【００１３】
本発明はさらに、相同的に組込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む宿主細胞を調製するための方法を提供する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は宿主染色体の非必須遺伝子、好ましくは宿主染色体のガラクトースオペロンに組込まれる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、pHMM209、pHMM220、pHMM223およびpHMM228からなる群から選択されるプラスミド由来のガラクトースオペロンに組込むことができる。
【００１４】
本発明はさらに、相同的に組込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む宿主細胞にて標的タンパク質を発現することを包含する、ファージを含まない標的タンパク質を調製するための方法を提供する。好ましい標的タンパク質は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（１−８４）またはＮ末端断片１−３４、１−３１、１−２８などのその活性断片、またはその類似体あるいは誘導体である。もう１つの態様にて標的タンパク質は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその類似体あるいは誘導体である。
【００１５】
本明細書に開示し特許請求の範囲に記載している本発明に沿って、以下の一般的な分子生物学用語および略語を、次の通り定義する。本明細書にて用いる用語および略語は、特に別段の指定がなければその通常の意味を有する。アミノ酸の略語は、37 C.F.R. § 1.822 （b）（2）（1994）に規定のものである。
【００１６】
本明細書にて用いる「塩基対」または「ｂｐ」とは、ＤＮＡを意味する。略語Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはそれぞれ、ＤＮＡ分子中に存在する場合、（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）グアノシンおよびチミジンといったデオキシリボヌクレオシドの５’モノリン酸型に相当する。二本鎖ＤＮＡ中にて塩基対とは、ＡとＴまたはＣとＧの組を示しうる。「キロベース」または「ｋｂ」とは、１千（１０００）塩基対を示す。
【００１７】
「プラスミド」とは、核酸を含む染色体外遺伝要素を示す。プラスミドは一般に、小文字の「ｐ」に続く文字および／または数字によって表される。本明細書における開始プラスミドは市販されているか、制限なく公的に入手可能であるか、あるいは公開された手法に従って利用可能なプラスミドから構築することができる。さらに本明細書に記載のものと等価なプラスミドは当業者に既知であり、通常の知識を有する者に明白である。プラスミドは、１つまたはそれ以上の付加的ＤＮＡセグメントが付加し得るか、付加しているＤＮＡ分子を含む。いくつかのプラスミドは温度感受性であり、他は温度感受性ではない。このことは、許容温度にていくつかのプラスミドが自己複製し、そして非許容温度にていくつかのプラスミドが自己複製しないことを意味する。
【００１８】
本明細書にて用いる「発現プラスミド」とは、挿入されるＤＮＡの転写を制御するためのプロモーターが組込まれている非温度感受性プラスミドを示す。Ｔ７発現プラスミドは、標的タンパク質をコードする標的遺伝子の発現を制御するＴ７またはＴ７ｌａｃプロモーターを含む。Ｔ７発現プラスミドは、当業者に周知である。Ｔ７発現プラスミドは、Novagen, Inc.（Madison WI）から市販されており、これには発現プラスミドのｐＥＴシリーズがあるが、これに限定されない。
【００１９】
本明細書にて用いる「組込みプラスミド」とは、挿入されるＤＮＡの転写を制御するためのプロモーターが組込まれている温度感受性プラスミドを示す。さらに、組込みプラスミドは、細胞の染色体に特定のＤＮＡセグメントを挿入する。組込みプラスミドは、pMAK700およびpMAK705から誘導される。pMAK700およびpMAK705は、引用により本明細書に完全に包含されるHamilton, et al., J. Bacteriol. 171:4617-4622, （1989）に記載のように作成される。本発明の組込みプラスミドであるpHMM228、pHMM209、pHMM220およびpHMM223は以下にその詳細を述べる。これらの組込みプラスミドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を制御するｌａｃプロモーターを含む。
【００２０】
「形質転換」とは、染色体外要素としてか染色体組込みのどちらかによって、プラスミドが複製可能となるように生物体へプラスミドを導入することを示す。細菌および真核生物宿主を形質転換する方法は当業者に周知であり、その多くの方法がJ. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, （1989）にまとめられている。プラスミドの働きの表示が宿主細胞内に生じる場合に、一般に形質転換の成功として認識される。例えば、感受性宿主細胞が耐性をもたらすプラスミドでトランスフェクトされると、その宿主細胞は選択物質に対して耐性を有するようになる。
【００２１】
「許容温度」とは、宿主細胞への形質転換後のプラスミドが細胞複製と無関係に自己複製できる温度である。本発明にて定義する許容温度は、典型的には４４℃より低い温度、一般的には約２０℃と約４０℃の間、好ましくは約２５℃と４０℃の間、より好ましくは約２５℃と３５℃の間、最も好ましくは約３０℃である。
【００２２】
「非許容温度」とは、宿主細胞へ形質転換後のプラスミドが細胞複製と無関係に自己複製できない温度である。本発明にて定義する非許容温度は、典型的には４０℃より高い温度、一般的には約４０℃と約５０℃の間、好ましくは約４４℃である。
【００２３】
「転写」とは、ＤＮＡヌクレオチド配列中に含まれる情報がＲＮＡポリメラーゼによって相補的ＲＮＡ配列に写される過程を示す。例えば大腸菌ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を相補的ＲＮＡ配列に写し、その後相補的ＲＮＡ配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼに翻訳される。同様に、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼは標的遺伝子を相補的ＲＮＡ配列に写し、その後相補的ＲＮＡ配列は標的タンパク質に翻訳される。
【００２４】
本明細書にて用いる「翻訳」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の遺伝情報を使用し、ポリペプチド鎖の合成を特定し行わせる過程を示す。
【００２５】
「単離されたアミノ酸配列」とは、あらゆるアミノ酸配列を意味するが、それは構築または合成されたものであり、天然に存在する配列とは位置的に区別されているアミノ酸配列である。
【００２６】
「単離されたＤＮＡ化合物」とは、あらゆるアミノ酸配列を意味するが、それは構築または合成されたものであり、ゲノムＤＮＡにおけるその天然の部位とは位置的に区別されているＤＮＡ化合物である。
【００２７】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼに結合するＤＮＡ配列を示し、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を導く。本明細書にて用いるプロモーターの例としては、lac、lacUV5、T7、T7lac、lacIQ1がある。
【００２８】
「ＰＣＲ」とは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる周知のポリメラーゼ連鎖反応を示す。
【００２９】
「プライマー」とは、ＰＣＲにて酵素的または合成的伸長のための開始基質として機能する核酸断片を示す。
【００３０】
「親細胞」とは、溶原性ファージを含まず、インビトロにて自己複製可能な細胞を示す。親細胞はまた、測定可能であり宿主細胞染色体にて約２ｋｂの長さであるＤＮＡ配列を有していなければならない。この配列はさらに、宿主細胞の非必須領域になければならない。好ましい親細胞は細菌である。親細胞は好ましくは、ガラクトースオペロンのＤＮＡ配列またはその断片を含む。好ましい親細胞は大腸菌である。好ましい大腸菌親細胞は、Novagen, Inc. （Madison WI）のようないくつかの業者から市販されており、それにはBL21、AD494、BLR、HMS174、OrigamiおよびTunerがあるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明における「宿主細胞」とは、ｌａｃプロモーターの制御下にある相同的に組込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む親細胞を示す。このプロモーターは、野生型ｌａｃプロモーターまたは修飾されたｌａｃプロモーター、例えばｌａｃＵＶ５であり得る。宿主細胞はさらに、Ｔ７プロモーターの制御下にある非組込み遺伝子を含むことができる。このプロモーターは、野生型Ｔ７プロモーターまたは修飾されたＴ７プロモーター、例えばＴ７ｌａｃであり得る。非組込み遺伝子は、選択した標的タンパク質をコードする。宿主細胞の誘導でＴ７ＲＮＡポリメラーゼが調製される。次いで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ファージ不含の発酵ブロスにて標的タンパク質を生産するのに利用される。
【００３２】
「ファージ不含（ファージを含まない）」とは、発酵ブロスとともにインキュベートした場合、細菌芝上にプラークが観察されないことを意味する。ファージ混入の試験に用いられる分析は、当業者に周知である。
【００３３】
「相同的に組込まれている遺伝子」とは、相同組換え法によって宿主細胞の染色体に組込まれている遺伝子を示す。相同組換え法は、宿主細胞の染色体上のＤＮＡ配列と形質転換後の細胞内に存在する組込みプラスミドに担持される相補的配列との間で起こる。好ましくは、相同組換え法は、引用により本明細書に組込まれるHamilton, et al. in New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171:4617-4622, 1989による説明のように行う。
【００３４】
本明細書にて用いる「相補的」とは、二本鎖核酸中で水素結合を介して会合する塩基（プリンおよびピリミジン）の対合を示す。塩基対：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシルは、相補的である。
【００３５】
本発明において相同組換えによって組込まれる遺伝子は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はＴ７バクテリオファージから得られ、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。この遺伝子は、プラスミドpAR1219（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号３９５６３、米国特許番号４，９５２，４９６）から入手できる。pAR1219内のＢａｍＨＩ断片は、ＩＰＴＧ誘導ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子およびその天然のプロモーターの制御下にあるｌａｃＩ遺伝子を含有するＴ７発現カセットを含む。
【００３６】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は当業者に周知であるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしており、引用により本明細書に組込まれる米国特許番号ＵＳ４９５２４９６に詳細に記載されている。宿主細胞が誘導されると、宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼはｌａｃＵＶ５プロモーターに結合し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの合成を開始できる。
【００３７】
「非組込み遺伝子」とは、宿主細胞の染色体に組込まれないが発現プラスミドに担持される遺伝子を示す。発現プラスミドは、通常の一般的な形質転換方法によって宿主細胞に導入され、許容温度にて宿主細胞内で自律的に複製できる。こうしてプラスミドは、宿主細胞複製の不存在下に宿主細胞内でそれ自身が複製し得る。発現プラスミドに担持される非組込み遺伝子は、目的の標的タンパク質をコードする。非組込み遺伝子は、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導Ｔ７またはＴ７ｌａｃプロモーターの制御下にある。組込まれた遺伝子から新しく合成されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７またはＴ７ｌａｃプロモーターに結合し、標的タンパク質の合成を開始できる。
【００３８】
「標的タンパク質」とは、宿主細胞にて合成され得るタンパク質を示す。好ましい標的タンパク質は、宿主細胞タンパク質と異種（ヘテロローガス）である。タンパク質の例としては、カルシトニン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ファクターＩＸ、ファクターＶＩＩＩ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ケモカイン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、成長ホルモン、インスリン、レプチン、インターフェロン、インターロイキン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ソマトスタチン、バソプレッシン、アミリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、エキセンディン−３，エキセンディン−４およびアルファ−１抗トリプシンがあるが、これらに限定されない。本発明の標的タンパク質は、任意に前駆タンパク質またはプロタンパク質であり得る。前駆タンパク質またはプロタンパク質の例としては、プロインスリンおよびＧＬＰ−１（１−３７）があるが、これらに限定されない。
【００３９】
組込み構築物：
有用なプラスミドを構築し、所望の宿主細胞の染色体に組換え標的遺伝子を相同組換えによって組込むことができる。この組込みは、修飾されたpMAK構築物を用いて行われ得る。好ましくは、出発pMAK構築物はpMAK700およびpMAK705である。より好ましくは、出発pMAK構築物はpMAK705である。pMAK構築物は温度感受性の複製起点を含む。これにより、この構築物は３０℃のような許容温度で複製できるが、４４℃のような非許容温度では複製しない。pMAK構築物はクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）遺伝子も含む。故に、Ｃｍｒ遺伝子を含むプラスミドを包含する宿主細胞はクロラムフェニコールに耐性であり、許容温度でクロラムフェニコールの存在下にて複製する。
【００４０】
pMAK構築物は、宿主細胞の染色体に見いだされる核酸配列と相同的な核酸配列の挿入によって修飾される。宿主細胞の染色体に見いだされる相同的な核酸配列が挿入されているpMAK構築物を、本発明ではpHMM構築物と称する。pHMM構築物の相同配列は、ガラクトースオペロン（ｇａｌＥＴＫ）の種々の断片を含む。ガラクトースオペロンは当業者に周知である。pHMM構築物および宿主細胞の相同配列は、互いにハイブリダイズし、組換えを受けるに十分な長さを有する。ハイブリダイゼーションは一般に、組込み構築物由来の相補鎖が宿主細胞のような環境に存在する場合に、変性された染色体ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。好ましくは、相同配列は約１ｋｂより長い。より好ましくは、相同配列は約１ｋｂと約１０ｋｂとの間である。さらに好ましくは、相同配列は約１ｋｂと約４ｋｂとの間である。最も好ましくは、相同配列は約２ｋｂである。宿主細胞の相同配列は、組換えにより配列が有用でなくなるように破壊されることがあるため、宿主細胞に必須でない配列である。例えば、相同配列が細胞壁の合成に関わる遺伝子内にある場合、宿主細胞のこの配列への組込みプラスミドの組換えは、タンパク質を含む細胞壁の合成を中断し、結果として生育不可能な宿主細胞を生じさせる。
【００４１】
pHMM構築物はさらに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターを挿入することによって修飾できる。ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、プラスミドpAR1219（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号３９５６３、米国特許番号４，９５２，４９６）から得ることができる。
【００４２】
好ましくは、pMAKプラスミドの元のｌａｃプロモーターは、pHMM構築物へのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターのクローニングによって取り除かれる。ｌａｃプロモーターの重複は、結果として二次構造形成の可能性を生じ、このことは配列決定にとって問題となり相同組換えを妨げる可能性を生じる。
【００４３】
任意にpHMM構築物はさらに、pHMM構築物へのｌａｃＩ遺伝子の挿入によって調整されうる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターに加えて、pAR1219プラスミドはさらに、その天然のプロモーターの制御下にｌａｃＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を包含する。発現系におけるｌａｃＩ遺伝子の複製は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび標的タンパク質の発現を共に制御するのに役立つラクトースリプレッサーのさらなる発現を提供し得る。
【００４４】
任意にＴ７発現カセット由来のｌａｃＩ遺伝子は、ｌａｃＱＩプロモーターによって動かされる。ｌａｃＱＩプロモーターは、当業者に周知である。ｌａｃＱＩプロモーターは、ｌａｃＩ遺伝子を過剰発現するように調整される。その結果、その元のプロモーターによってもたらされるｌａｃＩ遺伝子に比べてｌａｃＩリプレッサーを約１００倍製造する。
【００４５】
pHMM構築物はさらに、二次耐性遺伝子を含む。好ましい二次耐性遺伝子は、カナマイシン（Ｋｍｒ）である。故に、Ｋｍｒ遺伝子を含むプラスミドを包含する宿主細胞はカナマイシンに耐性であり、カナマイシンの存在にて複製する。好ましくは二次耐性遺伝子は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと反対の向きである。カナマイシン耐性遺伝子は、独自に宿主細胞を識別する付加的手段を提供する。カナマイシン耐性遺伝子は、プラスミドpACYC177から得ることができる。pACYC177は、「Stratagene Cloning Systems社」カタログ（１９９３）（Stratagene, La Jolla, Calif.）から市販されている。pACYC177由来のカナマイシン耐性遺伝子は、Ｔｎ９０３逆向き反復配列（ＩＲ）を含む。これらの逆向き反復配列の存在による転位を介した潜在的不安定性のために、カナマイシン耐性遺伝子を含むカセットは好まれるが、逆向き反復配列は好まれない。
【００４６】
組込み：
組込み構築物を従来の手法により所望の宿主株へ形質転換することが可能であり、個々のコロニーを選択物質、例えばＣｍまたはＫｍの存在下に液体増殖培地中にて許容温度で一晩増殖させる。生じた一晩培養液を、選択物質の存在する液体増殖培地中に希釈し非許容温度、例えば４４℃で対数増殖期までインキュベートする。その後培養液を、選択物質を含む寒天平板へプレートし、共組込み形成を選択するために非許容温度で一晩インキュベートする。共組込み形成は相同組換えにおける第一段階であり、組込み構築物が宿主染色体に組込まれると起こる。組込みプラスミドは非許容温度にて自己複製ができず、培養液は選択物質を含むため、宿主細胞染色体へ組込み構築物が組込まれた宿主細胞のみがこれらの条件下にて生き残る。生じた培養液を選択物質を含む寒天平板へプレートし、共組込み体を選択するために非許容温度にて一晩インキュベートする。
【００４７】
共組込みコロニーのプールを採取し液体増殖培地へ移し、そして共組込み体を分離するために許容温度にて一晩インキュベートする。分離は、組込みプラスミドが染色体から切り出され、宿主細胞内で再形成される二次組換え事象を起こす手段を提供する。切り出され宿主細胞内へ再形成された組込みプラスミドは、全体が元の組込みプラスミドであるか、宿主細胞染色体に組込まれたままのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを欠く元の組込みプラスミドのどちらかである。二次組換え事象の目的は、宿主細胞染色体由来の複製起点を含む組込みプラスミドの部分を切り出すことであり、ただ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは宿主細胞の染色体に組込まれた状態にしておく。この工程の概略図を図１に示す。組込みプラスミドがさらに他の遺伝子、例えばｌａｃＩまたはＫｍを含む場合は、二次組換え事象の目的は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび他の遺伝子、例えばｌａｃＩまたはＫｍを宿主細胞の染色体に組込まれた状態にしつつ、宿主細胞染色体由来の複製起点を含む組込みプラスミドの一部を取り除くことである。組込まれた複製起点は宿主細胞に有害となりうるため、組込みプラスミドの複製起点の除去が望まれる。この切り出し工程は、選択物質と共に二次培養し、許容温度に維持することによって、任意に数日間続行することができる。好ましくは、二次培養および温度維持は３日以内で行い、より好ましくは、二次培養および温度維持は２日間続行する。
【００４８】
その後培養液を、選択物質なしの液体増殖培地を含む前もって温めたフラスコに非許容温度にて希釈し、宿主細胞染色体から望ましくないプラスミド配列を切り出すことにより組込みの矯正（キュアリング）を開始する。培養液を、選択物質を含む寒天平板へプレートし、許容温度にて増殖する。当業者に周知の手段、例えばＰＣＲおよびサザンブロッティングを用い、コロニーを組込み事象の存在に関してスクリーニングする。組込み体を含むコロニーを液体培地培養物の植菌に用い、続いて非許容温度にて継続して数日間増殖し、キュアリングを促進させる。その後、培養液を寒天平板へプレートし、許容温度にて一晩インキュベートすればよい。続いて個々のコロニーを、任意に両方の選択物質、例えばＣｍおよびＫｍを含むことができる寒天平板へ写せばよい。個々のコロニーをさらに、二次選択物質、例えばＫｍのみを含む寒天平板へ写すことができる。組込み配列を有する所望のクローンは、Ｃｍ感受性かつＫｍ耐性である。
【００４９】
他の態様にて、組込みプラスミドは好ましくは宿主細胞のガラクトースオペロンに組込む。さらに好ましくは、組込みプラスミドは宿主細胞のｇａｌＥ部位へ組込む。ｇａｌＫ部位へ組込むためのいくつかの試みがなされたが、理想的な組込みは成功しなかった。
【００５０】
標的タンパク質：
本発明の発現系にて用いられる組換え標的タンパク質をコードする非組込み遺伝子は、分子生物学分野における当業者に利用可能な手法によって得られる。基本的な工程は次の通りである：
ａ）天然のＤＮＡ配列を単離し、または合成あるいは半合成ＤＮＡ配列を構築し、（ここに、いずれのＤＮＡ配列も目的の標的タンパク質をコードする標的遺伝子を含む）
ｂ）標的タンパク質の発現に適する手法により、利用可能なＴ７発現プラスミドにＤＮＡ配列をクローニングし、
ｃ）本発明の前述した発現宿主を目的の標的遺伝子を含むＴ７発現プラスミドで形質転換し、
ｄ）形質転換した発現宿主を非誘導状態で一定期間培養し、次いで誘導状態で一定期間培養し、そして、
ｅ）標的タンパク質を回収して精製する。
【００５１】
好ましくは、標的タンパク質は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。さらに好ましいＰＴＨは、ヒトＰＴＨである。ＰＴＨは８４アミノ酸のタンパク質として当業者に周知であり、米国特許番号５，４９６，８０１に記載がある。ＰＴＨのＮ末端断片も当業者に周知であり、１−３４、１−３１および１−２８を含むがこれに限定されない。また、ＰＴＨの類似体および誘導体とＰＴＨ断片についても検討した。ＰＴＨ断片、類似体および誘導体の例としては、WO99／29337，US20020132973，米国特許番号US 5,556,940；US6,472,505およびUS6,417,333に記載がある。
【００５２】
他の態様にて、標的タンパク質はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその類似体あるいは誘導体である。ＧＬＰ−１類似体および誘導体の例は当業者に周知であり、WO01／98331および米国特許番号US6,268,343；US5,977,071；US 5,545,618；US 5,705,483およびUS 6,133,235に記載がある。ＧＬＰ−１類似体はWO99／07404、WO99／25727、WO99／25728、WO99／43708、 WO00／66629およびUS2001／0047084A1に記載のようなエキセンディン−３およびエキセンディン−４類似体も含む。
【００５３】
修飾：
単離した標的タンパク質は、治療タンパク質として有用である。任意に標的タンパク質は宿主細胞外にてさらに修飾し、治療タンパク質として有用な物理特性を標的タンパク質に付与できる。修飾とは、酵素的または化学的切断、アシル化、結晶化、塩の付加などを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
調製：
液体増殖培地はＴブロスである。
Ｔブロス＝（１Ｌにつき）１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、１０ｇＮａＣｌ、ｐＨ７．５。
Ｔ寒天平板＝Ｔブロスに１５ｇ／Ｌ寒天を添加。
ＳＭ緩衝液＝（１０×溶液１００ｍＬにつき）２０ｍＬ １Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＬ ５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＬ １Ｍ ＭｇＳＯ４。
エタノール中にクロラムファニコール（Ｃｍ）（２５ｕｇ／ｍＬ）
水中にカナマイシン（Ｋｍ）（１５−５０ｕｇ／ｍＬ）
ＮａＯＨ中にナリジクス酸（２０ｕｇ／ｍＬ）
水中にストレプトマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）
【００５５】
組込みプラスミドpHMM209：
組込みプラスミドpHMM209は、pMAK705誘導体である。pHMM209コンストラクションの第一段階では、pMAK705骨格へBamHIからClaIまでのオリゴヌクレオチドアダプターをクローンする。このアダプターは、生じる構築物に固有のStuI部位を含む。pHMM骨格となるSalIからXbaI挿入物として、ｇａｌＫフランクをpMAK705骨格へクローンする。pHMM骨格は、ｇａｌＫフランク（ｆｌａｎｋ）における固有のBamHIおよびClaI部位を含む。その後、元来のプロモーター配列の発現下におけるｌａｃＩ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むpAR1219由来のＴ７発現カセットを、pHMM骨格へBamHI断片としてクローンする。Ｔ７発現カセットの向きはｇａｌＥＴＫオペロンと逆であり、ｇａｌＥ上流配列からの一連の転写を阻害する。次にカナマイシン耐性遺伝子を、前述のpMAK705骨格へクローンしたアダプターのStuI部位にpACYC177由来のStuI断片としてクローンする。カナマイシン遺伝子の向きは、Ｔ７発現カセットのそれと逆である。生じた組込みプラスミドがpHMM209である。
【００５６】
組込みプラスミドpHMM220：
組込みプラスミドpHMM220は、pMAK705誘導体である。pHMM220コンストラクションの第一段階では、pMAK705骨格へBamHIからClaIまでのオリゴヌクレオチドアダプターをクローンする。このアダプターは、生じる構築物に固有のStuI部位を含む。pHMM骨格となるSalIからXbaI挿入物として、ｇａｌＫフランク（ｆｌａｎｋ）をpMAK705骨格へクローンする。pHMM骨格は、ｇａｌＫフランク（ｆｌａｎｋ）における固有のBamHIおよびClaI部位を含む。その後、元来のプロモーター配列の発現下におけるｌａｃＩ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＴ７発現カセットを、pHMM骨格へpAR1219由来のBamHI断片としてクローンする。Ｔ７発現カセットの向きはｇａｌＥＴＫオペロンと逆であり、ｇａｌＥ上流配列からの一連の転写を阻害する。次に、StuI断片としてのカナマイシン耐性遺伝子をＰＣＲによって得る。耐性遺伝子の増幅に用いられるＰＣＲプライマーは、pACYC177テンプレートであるカナマイシン遺伝子に存在する逆向き反復配列内にて設計される。ＰＣＲプライマーはその末端にStuI制限部位を含み、それらは増幅反応に用いられる。生じる約１ＫｂのＰＣＲ産物を、ＰＣＲクローニングプラスミドに直接クローンし、カナマイシンを含むＴ寒天平板へ直接プレートすることによって推定クローンを選択する。生じるカナマイシン耐性遺伝子を前述のpMAK705骨格へクローンされたアダプターのStuI部位にStuI断片としてサブクローンする。カナマイシン遺伝子の向きは、Ｔ７発現カセットのそれと逆である。生じたプラスミドがpHMM220である。
【００５７】
組込みプラスミドpHMM223：
組込みプラスミドpHMM223は、pHMM220と同様に構成される。次に、ｌａｃＩ遺伝子が宿主染色体のｌａｃＩ部位に組込まれる可能性を有するため、pHMM220におけるＴ７発現カセットのｌａｃＩ遺伝子を取り除く。ｌａｃＩ遺伝子を、BglIを用いたプラスミドの切出しによってpHMM220から取り除く。合成したＤＮＡアダプターをBglI部位にクローンし、BglI切出し工程にて取り除くｌａｃＵＶ５プロモーターを再構成する。生じたクローンをシークエンスし、２つのヌクレオチド変換を除いた所望のｌａｃＵＶ５配列を含むことを確認する。これらの変換はＴ７発現カセットの５’非翻訳領域に存在し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現には重要ではない。次に、pHMM220に存在するｌａｃＩプロモーターを取り除く。これは、lacIプロモーター配列を完全に置換するPstIからAseIまでのアダプターの挿入によって行われる。
【００５８】
pHMM220のBglI切出しは、下流のgalKフランク（ｆｌａｎｋ）も除く。この部位を再構築し、逆方向反復なしのカナマイシン耐性遺伝子を組込むため、BamHIからXbaI断片を、組込みプラスミドのBglIIからXbaI部位へサブクローンする。この結果、lacI遺伝子のコピーのないＴ７発現カセットおよびlacIプロモーター、逆方向反復のないカナマイシン耐性遺伝子および完全なgalKフランク（ｆｌａｎｋ）を含む組込みプラスミドである所定のpHMM223となる。pHMM223は、染色体のgalK部位へ組込むための試みに用いられる。
【００５９】
組込みプラスミドpHMM228：
組込みプラスミドpHMM228は、pMAK705誘導体である。pHMM228コンストラクションの第一段階では、pMAK705骨格へPstIからEagIのオリゴヌクレオチドアダプターをクローンする。このアダプターは、固有のSalIおよびXbaI部位を含む。約２ｋｂのgalE遺伝子は、pHMM骨格となるSalIからXbaI挿入物としてpMAK705骨格へクローンされる。pHMM骨格は、遺伝子において固有のBamHIおよびClaI部位を含む。その後、元来のプロモーター配列の発現下におけるlacI遺伝子およびlacUV5プロモーターの制御下におけるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＴ７発現カセットを、pHMM骨格へpAR1219由来のBamHI断片としてクローンする。Ｔ７発現カセットの向きはgalETKオペロンのそれとは逆であり、galE上流配列からの一連の転写を阻害する。
【００６０】
次に、StuI断片としてカナマイシン耐性遺伝子をＰＣＲによって得る。耐性遺伝子の増幅に用いられるＰＣＲプライマーは、pACYC177テンプレートであるカナマイシン遺伝子に存在する逆向き反復配列内にて設計される。ＰＣＲプライマーはその末端にStuI制限部位を含み、それらは増幅反応に用いられる。生じる約１ｋｂのＰＣＲ産物を、ＰＣＲクローニングプラスミドに直接クローンし、カナマイシンを含むＴ寒天平板に直接プレートすることによって推定クローンを選択する。生じるカナマイシン耐性遺伝子を、前述したpMAK705骨格へクローンされたアダプターのStuI部位にStuI断片としてサブクローンする。カナマイシン遺伝子の向きは、Ｔ７発現カセットのそれと逆である。
【００６１】
最後に、Ｔ７発現カセットのｌａｃＩ遺伝子をpHMM223に記載のようにほとんど取り除く。ｌａｃＩ遺伝子を、BglIを用いるプラスミドの切出しによって取り除く。合成ＤＮＡアダプターをBglI部位へクローンしBglI切出し工程にて取り除き、ｌａｃＵＶ５プロモーターを再構成する。次に、ｌａｃＩプロモーターを、ｌａｃＩプロモーター配列を完全に置換するPstIからAseIアダプターの挿入によって取り除く。BglI切出しは、下流のｇａｌＥフランク（ｆｌａｎｋ）も除く。この部位を再構築し、逆向き反復配列なしにカナマイシン耐性遺伝子を組込むため、BamHIからXbaI断片を組込みプラスミドのBglIIからXbaI部位へサブクローンする。この結果、lacI遺伝子およびlacIプロモーター、逆方向反復のないカナマイシン耐性遺伝子および完全なgalKフランク（ｆｌａｎｋ）のコピーのないＴ７発現カセットを含む組込みプラスミドである所定のpHMM228となる。pHMM228は、染色体のgalE部位へ組込むための試みに用いられる。
【００６２】
pHMM209の組込み／スクリーニング：
組込みプラスミドpHMM209を、ガラクトースオペロンを含む大腸菌親細胞株へ形質転換し、Ｃｍを含むＴ寒天平板へプレートし、一晩３０℃にてインキュベートした。採取したコロニーをＣｍを含むＴ培地へ移し一晩３０℃にて増殖した。生じた一晩培養液をＣｍの存在するＴ培地に希釈し、培養物が対数増殖期に達するまで４４℃にてインキュベートした。その後、培養物をＣｍを含むＴ寒天平板へプレートし、同時組込み形成を誘導するために一晩４４℃にてインキュベートした。同時組込みコロニーのプールを採取し、Ｃｍを含むＴ培地２５０ｍＬに移し、切り出しおよび分離のために一晩３０℃にてインキュベートした。この培養液をＣｍを含むＴ培地で５００（１：５００）倍希釈してサブカルチャーし、３０℃にてフラスコをインキュベートすることによって２日以上維持した。４日目に培養液を、４４℃にて前もって温めたＴ培地入りのフラスコにサブカルチャーした。この培養液を増殖し、pHMM209プラスミドのキュアリングを促進するために４４℃で３日間連続してサブカルチャーした。その後、仮組込み、削除およびキュアリングしたカルチャーを、Ｋｍを含むＴ寒天平板へプレートし、一晩３０℃にてインキュベートした。続いて個々のコロニーをＣｍおよびＫｍを含むＴ寒天平板へ移し、その後Ｋｍを含むＴ寒天平板へ移し、次にＴ寒天平板へ移した。組込み陽性体はＣｍｓおよびＫｍｒである。
【００６３】
約１０００個のコロニーを試験し、たった１つの組込み体が形成された。この組込み体を、RQ209と名付けた。RQ209株がＩＰＴＧの付加によって誘導される機能的Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを有するということがさらなる分析により示された。しかしながら、ＰＣＲマッピングがRQ209株にて行われた時、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは染色体のｇａｌＫまたはｌａｃＩ部位に特異的に組込まれないことが分かった。
【００６４】
pHMM228の組込み／スクリーニング：
組込み実験を、上述のpHMM209の組込み／スクリーニングに記載のようにして行った。同時組込み形成体の数を以下の表に示す。
【表１】
2006502691.tif 000002
【００６５】
４４℃平板上に増殖したコロニーを、続いて４４℃でＴブロスにて増殖した。プレート全体の約１／２に相当するコロニーからプールされた1つの培養物に加え、９個の単離体が増殖した。これら１０の培養物を４４℃にてＣｍ選択の下で一晩振盪した（３１５ｒｐｍ）。次の日、次のＰＣＲ分析のため、試料１００μＬを各々から遠心分離によって集めた。さらに、前もって４４℃に温めた平板を、これらの培養物からの個々の単離体のストリーク（画線）に用い、一晩４４℃にてインキュベートした。ＰＣＲおよび制限酵素マッピングの結果により、１０個の液体培養物のほとんどすべてが予期された組込み事象を伴った増幅産物を含むことが示された。
【００６６】
個々のクローンを、４４℃における再パッチによってスクリーニングした。単離体＃２を、Ｃｍを含むＴブロスにて３０℃で一晩増殖し、pHMM228の切出しを促進させた。一晩増殖後、細胞試料１００μＬを収集し、ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。増殖のみでpHMM228の切り出し体となるように、ｇａｌＥフランク（ｆｌａｎｋ）の外側からプライマーを選んだ。よって切出し事象がpHMM228を再生すると、約７ｋｂのＰＣＲ産物になると予想される。しかし、切出しが二次交差事象に起因しＴ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体に残すと、約１．５ｋｂのＰＣＲ産物になると予想される。予想通り、切出し産物の混合物が観察される。続いて切出し培養物を画線培養して個々の単離体を得、これを１．５ｋｂＰＣＲ産物の存在についてスクリーニングする。
【００６７】
次いで、３つの単離体をＴブロス中にて４４℃で選択なしに一晩増殖し、切出されたpHMM228のキュアリングを促進した。一晩４４℃にて増殖後、画線培養したＴ寒天平板から単一のコロニーを単離し、３つの元の単離体のそれぞれから７２個をＣｍを含むＴ平板、Ｋｍを含むＴ平板およびＴ平板に写し、切り出されたpHMM228のキュアリングが成功しているか判定した。以下の表にこれらの実験の結果を詳述する。
【表２】
2006502691.tif 000003
【００６８】
つづいて、RQ228と命名した単一のＣｍ感受性個体を単離体＃１から選択し、２度の画線培養により精製し、表現型を確認した。以下の表に表現型分析の結果を示す。
【表３】
2006502691.tif 000004
【００６９】
その後表現型を確認したRQ228株のコロニーを選択し、１０ｍＬ培養液を一晩増殖させ、さらに局所保存および長期保存し、そしてコンピテント細胞ロット（単位）を作製するために用いた。この同じコロニーを、組込み完全ＰＣＲマッピングに用いた。
【００７０】
Ｔ７活性および調節分析：
表現型特性および組込み事象の完全性の確認に加えて、RQ228株が機能的Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する能力についても試験し、さらにその発現が調節を受ける能力も試験した。不完全Ｔ７テスターファージを補助するRQ228株の能力を、以下に記載のように試験した。
【００７１】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ分析：
RQ209株またはRQ228株が機能的なＴ７ＲＮＡポリメラーゼを有するかどうかを測定するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性分析を用いた。RQ209株またはRQ228株を、０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加したＴブロスにて約３７℃で一晩増殖した。一晩培養物を、ＯＤ６００＝０．０５になるように０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加したＴブロスで希釈し、ＯＤ６００＝０．５まで撹拌しながら増殖し、それぞれの細菌培養液１００μＬに１０−６希釈のＴ７テスターファージＳＭ緩衝液１００μＬを付加した。試料をタッピングによってゆっくり混合し、２０分間３７℃にてインキュベートし、ファージを吸着させた。その後０．４％Ｔトップアガロース（０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４添加）３ｍＬを試料に加え、ボルテックスし、前もって温めておいたＴ寒天平板に注いだ。１つをＴ寒天平板にプレートし、もう１つを４００μＭＩＰＴＧを含むＴ寒天平板にプレートしうるように、試料を２つずつ調製した。Ｔ７テスターファージは細胞に付着することができるが、利用できる機能的Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを有するファージが感染する細胞のみが複製および溶解することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現がｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下であるため、誘導物質であるＩＰＴＧの存在にてのみ発現する。ＩＰＴＧを含む平板上のプラークおよびＩＰＴＧなしの平板上の無プラークが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの制御された発現の陽性表示を構成する。
【００７２】
組込み完全性の最終ＰＣＲ確認：
RQ228株を分析し、組込み現象の完全性／特異性を確認した。ＰＣＲ増幅をgalE標的した組込み現象の結合を検討するために行い、さらに組込みカセット全体のサイズの確認を行った。
【００７３】
RQ228を用いたＰＴＨ発現：
ＰＴＨをコードする遺伝子を含む発現プラスミドを、一般的な方法を用いてRQ228または DE3宿主細胞のどちらかに形質転換する。両株を、テトラサイクリンを含むＴブロスにて３７℃で増殖し、１０μＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導した。培養液を６時間インキュベートし続ける。培養試料が、両宿主細胞がＰＴＨを発現することを示す。しかしながら、RQ228宿主細胞にて生産されるＰＴＨのみがファージを含まないであり、ＤＥ３宿主細胞にて生産されるＰＴＨは発酵ブロスにかなりの量のファージを有する。
【００７４】
大腸菌を、０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加したＴブロスにて３７℃で一晩飽和状態まで増殖する。一晩培養液をＯＤ６００＝０．０５になるように０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加したＴ培地で希釈し、ＯＤ６００＝０．５まで撹拌しながら増殖し、大腸菌培養液１００μＬに発酵ブロス１００μＬを付加する。試料をタッピングによってゆっくり混合し、２０分間３７℃にてインキュベートし、ファージを吸着させる。０．４％Ｔトップアガロース（０．２％マルトースおよび１０ｍＭＭｇＳＯ４添加）３ｍＬを試料に加え、ボルテックスし、前もって温めておいたＴ寒天平板に注いだ。平板を約１２時間３７℃でインキュベートする。ファージを含まない発酵ブロスを、観察されるプラークがないように調製する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、宿主染色体における組込みプラスミドpHMM228由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの相同組換えの略図を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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