(57)【要約】任意の被子植物細胞の色素体ゲノム中の異種遺伝子を安定的に挿入し発現するＤＮＡベクターを提供する。本ベクターでは、異なる分類の植物（双子葉植物及び単子葉植物）に属するａｔｐＢオペロンとｒｂｃＬオペロンの組み合わせから得られた人工遺伝子間領域に位置する多重クローニング部位に外来遺伝子を挿入することができる。ベクターのａｔｐＢ及びｒｂｃＬボーダー配列と対応する色素体ゲノムの相同領域との間の相同組換えによって、色素体ゲノムにこの発現カセットを挿入する。かかる方法により、目的の２種以上の遺伝子が、ａｔｐＢ遺伝子をコードするボーダー領域に隣接するｒｂｃＬプロモーターの転写調節下で発現可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素体における遺伝子の安定した形質転換及び発現に有用なＤＮＡベクターであって、発現される前記遺伝子が、転写が逆方向に自然に生じ、且つ異なる分類又は門の植物に属する、色素体遺伝子の２つの５’非翻訳領域の組み合わせによって構築された人工遺伝子間の領域に挿入されるベクター。
【請求項２】
以下の特徴：
ａ）非色素体起源の転写ターミネーター配列を用いて、色素体におけるその転写及び翻訳に好適なシグナル下で、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入することが可能な人工遺伝子間領域を含有する、
ｂ）人工遺伝子間領域は、転写が色素体ゲノムにおいて逆方向に自然に生じ、且つヌクレオチド配列が、異なる分類（双子葉植物及び単子葉植物）の被子植物の色素体に属するａｔｐＢ遺伝子及びｒｂｃＬ遺伝子のコード配列と同一である、２つの遺伝子に隣接している、
ｃ）人工遺伝子間領域が、ａｔｐＢ遺伝子及びｒｂｃＬ遺伝子の転写及び翻訳に関する５’制御配列と、目的の遺伝子に続けて非色素体起源の転写ターミネーターを挿入するための制限部位と、前記ｒｂｃＬ遺伝子の分類とは異なる分類の植物由来の被子植物色素体に属するｒｂｃＬ遺伝子の転写及び翻訳に関する第２の５’制御領域とから構成されている、
を有する、被子植物の色素体において遺伝子の高頻度の安定した形質転換及び発現を達成するのに有用な請求項１記載のＤＮＡベクター。
【請求項３】
タバコ又はコメ由来の色素体ｒｂｃＬ遺伝子の配列に相同なボーダーＤＮＡ配列を含む、請求項２記載のＤＮＡベクター。
【請求項４】
前記ｒｂｃＬ遺伝子に相同な前記ＤＮＡ配列が、前記タバコｒｂｃＬ遺伝子の、翻訳開始コドンから始まる、位置−２９１から位置＋１２３３のヌクレオチド配列の断片を少なくとも含む、請求項３記載のＤＮＡベクター。
【請求項５】
前記ｒｂｃＬ遺伝子に相同な前記ボーダー配列が配列番号４を含む、請求項４記載のＤＮＡベクター。
【請求項６】
コメ又はタバコ由来の色素体ａｔｐＢ遺伝子の配列に相同なボーダーＤＮＡ配列を含む、請求項２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７】
前記ａｔｐＢ遺伝子に相同な前記ＤＮＡ配列が、前記コメａｔｐＢ遺伝子の、翻訳開始コドンから始まる、位置−６５４から位置＋１２１１のヌクレオチド配列の断片を少なくとも含む、請求項６記載のＤＮＡベクター。
【請求項８】
前記ａｔｐＢ遺伝子に相同な前記ボーダー配列が配列番号８を含む、請求項７記載のＤＮＡベクター。
【請求項９】
前記人工遺伝子間領域に存在する非色素体起源の前記転写ターミネーターが、大腸菌由来の双方向ターミネーターｒｒｎＢＴ１Ｔ２又はその相同体である、請求項２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０】
遺伝子導入植物を選択することができる、人工遺伝子間領域に挿入された遺伝子を有する、請求項２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１】
前記選択遺伝子を、前記遺伝子に接する直接反復ＤＮＡ配列間の相同組換えによって除去することができる、請求項１０記載のＤＮＡベクター。
【請求項１２】
前記選択遺伝子が、抗菌性化合物の存在下で植物細胞の生存を可能にするタンパク質をコードする、請求項１１記載のＤＮＡベクター。
【請求項１３】
前記抗菌性化合物がアミノグリコシド抗生物質の群に属する、請求項１２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１４】
前記抗菌性化合物がヒグロマイシンＢである、請求項１３記載のＤＮＡベクター。
【請求項１５】
前記抗菌性化合物がスペクチノマイシンである、請求項１３記載のＤＮＡベクター。
【請求項１６】
前記抗菌性化合物がスルホンアミドの群に属する、請求項１２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１７】
前記抗菌性化合物がスルファジアジンである、請求項１６記載のＤＮＡベクター。
【請求項１８】
前記選択遺伝子が、除草剤化合物の存在下で植物細胞が生存することを可能にするタンパク質をコードする、請求項１０記載のＤＮＡベクター。
【請求項１９】
前記除草剤化合物がグルタミン合成酵素阻害剤の群に属する、請求項１８記載のＤＮＡベクター。
【請求項２０】
前記除草剤化合物がグルホシネート（ホスフィノトリシン）である、請求項１９記載のＤＮＡベクター。
【請求項２１】
前記除草剤化合物がビアラホスである、請求項１９記載のＤＮＡベクター。
【請求項２２】
前記除草剤化合物が、５−エノルピルビル−シキメート−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害剤の群に属する、請求項１８記載のＤＮＡベクター。
【請求項２３】
前記除草剤化合物がグリホサート（Ｎ−ホスホメチルグリシン）である、請求項２２記載のＤＮＡベクター。
【請求項２４】
前記除草剤化合物が、葉酸合成阻害剤の群に属する、請求項１８記載のＤＮＡベクター。
【請求項２５】
前記除草剤化合物が、アシュラム（メチル−（４−アミノベンセノスルホニル）−カルバメート）である、請求項２４記載のＤＮＡベクター。
【請求項２６】
前記除草剤化合物が、アセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）阻害剤の群に属する、請求項１８記載のＤＮＡベクター。
【請求項２７】
前記除草剤化合物がスルホニル尿素である、請求項２６記載のＤＮＡベクター。
【請求項２８】
前記除草剤化合物がイミダゾリノンである、請求項２６記載のＤＮＡベクター。
【請求項２９】
前記除草剤化合物が光化学系ＩＩ阻害剤の群に属する、請求項１８記載のＤＮＡベクター。
【請求項３０】
前記除草剤化合物が、ブロモキシニル（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリルである、請求項２９記載のＤＮＡベクター。
【請求項３１】
前記選択遺伝子が、有毒化合物の存在下で植物細胞の生存を可能にするタンパク質をコードする、請求項１０記載のＤＮＡベクター。
【請求項３２】
前記有毒化合物がベタインアルデヒドである、請求項３１記載のＤＮＡベクター。
【請求項３３】
図１−Ａに記載の一般構造又はその変異体を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３４】
図１−Ｂに記載の一般構造又はその変異体を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３５】
図１−Ｃに記載の一般構造又はその変異体を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３６】
図１−Ｄに記載の一般構造又はその変異体を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３７】
図１−Ｅに記載の一般構造又はその変異体を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３８】
図１−Ｆに記載の一般構造又はその変異体を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項３９】
ｒｂｃＬ遺伝子の第２の５’非翻訳領域中に、大腸菌ｌａｃＩリプレッサーの結合部位に機能的に相同な配列を有する、請求項２記載のＤＮＡベクター。
【請求項４０】
任意の宿主におけるベクターの維持及び増幅を提供するために、ｒｂｃＬ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に、非誘導条件下で前記遺伝子の転写を抑制可能なＤＮＡ配列を有するＤＮＡベクター。
【請求項４１】
ｒｂｃＬ遺伝子の５’非翻訳領域中に、大腸菌ｌａｃＩリプレッサーの結合部位に機能的に相同な配列を有する、請求項４０記載のＤＮＡベクター。
【請求項４２】
前記ｌａｃＩ結合部位のヌクレオチド配列が、配列番号３に記載の配列に少なくとも部分的に一致する、請求項４１記載のＤＮＡベクター。
【請求項４３】
１種又は複数の色素体機能的プロモーター下の１種又は複数のモノシストロン性又はポリシストロン性転写ユニットが人工遺伝子間領域中に挿入されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項４４】
１種又は複数の色素体機能的プロモーター下の１種又は複数のモノシストロン性又はポリシストロン性転写ユニットが人工遺伝子間領域中に挿入されている、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項４５】
１種又は複数の色素体機能的プロモーター下の１種又は複数のモノシストロン性又はポリシストロン性転写ユニットが人工遺伝子間領域中に挿入されている、請求項１８〜３８のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター。
【請求項４６】
前記色素体機能性プロモーターの少なくとも１つが、人工遺伝子間領域のｒｂｃＬプロモーターである、請求項４３、４４又は４５に記載のＤＮＡベクター。
【請求項４７】
色素体機能性プロモーターが、配列番号８に含まれている前記コメｒｂｃＬプロモーターである、請求項４６記載のＤＮＡベクター。
【請求項４８】
前記色素体機能性プロモーターの少なくとも１つが、配列番号１６に含まれているｐｓｂＡ＊プロモーター又はその変異体である、請求項４３、４４又は４５に記載のＤＮＡベクター。
【請求項４９】
前記ｐｓｂＡ＊プロモーターに機能的に連結されているミニシストロンを含む、請求項４８記載のＤＮＡベクター。
【請求項５０】
前記ミニシストロンが、配列番号１７に記載の配列に相同なヌクレオチド配列又はその変異体を含む、請求項４９記載のＤＮＡベクター。
【請求項５１】
遺伝子導入植物へ導入された遺伝子の発現の向上にミニシストロンを使用している、色素体における遺伝子の安定導入と発現のためのＤＮＡベクター。
【請求項５２】
農業、獣医学、薬学、食品又は産業上の目的の少なくとも１つの遺伝子が、前記転写ユニットの成分である、請求項４３、４４又は４５に記載のＤＮＡベクター。
【請求項５３】
農業上の目的の前記遺伝子が、殺虫剤活性を有するタンパク質をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項５４】
前記殺虫剤タンパク質が、バチルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のＣｒｙタンパク質のファミリーに属する、請求項５３記載のＤＮＡベクター。
【請求項５５】
前記殺虫剤タンパク質がプロテアーゼ阻害剤である、請求項５３記載のＤＮＡベクター。
【請求項５６】
農業上の目的の前記遺伝子が、抗菌活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが、病原性関連の植物タンパク質（ＰＲタンパク質）の群の１つに属する、請求項５６記載のＤＮＡベクター。
【請求項５８】
前記ＰＲタンパク質がグルカナーゼである、請求項５７記載のＤＮＡベクター。
【請求項５９】
前記ＰＲタンパク質がキチナーゼである、請求項５７記載のＤＮＡベクター。
【請求項６０】
前記ＰＲタンパク質がタウマチン様タンパク質である、請求項５７記載のＤＮＡベクター。
【請求項６１】
前記ポリペプチドがリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である、請求項５６記載のＤＮＡベクター。
【請求項６２】
農業上の目的の前記遺伝子が、非生物的ストレスに対する耐性を付与するタンパク質をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項６３】
前記タンパク質がコリンオキシダーゼ活性を有する、請求項６２記載のＤＮＡベクター。
【請求項６４】
農業上の目的の前記遺伝子が、植物生産力を向上するのに寄与するタンパク質をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項６５】
前記タンパク質が、植物の光合成能の改善に関与する、請求項６４記載のＤＮＡベクター。
【請求項６６】
前記タンパク質が、フルクトース−１，６−ビスホスフェートホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ）活性を有する、請求項６５記載のＤＮＡベクター。
【請求項６７】
前記タンパク質が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＲＯＴＯＸ）活性を有する、請求項６５記載のＤＮＡベクター。
【請求項６８】
前記タンパク質が、リブロース−１−５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）活性を有する、請求項６５記載のＤＮＡベクター。
【請求項６９】
前記タンパク質が、植物の炭素固定過程に直接的又は間接的に関与する、請求項６５記載のＤＮＡベクター。
【請求項７０】
農業上の目的の前記遺伝子が、植物生産物のポストハーベスト保存を高めるように寄与するタンパク質をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７１】
食品上の目的の前記遺伝子が、植物生産物の栄養価の改良に寄与するタンパク質をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７２】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、サイトカインをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７３】
前記サイトカインがインターフェロンのファミリーに属する、請求項７２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７４】
前記サイトカインがインターロイキンのファミリーに属する、請求項７２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７５】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、免疫応答の制御活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７６】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、ホルモン活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項７７】
ホルモン活性を有する前記ポリペプチドがインシュリンである、請求項７６記載のＤＮＡベクター。
【請求項７８】
ホルモン活性を有する前記ポリペプチドが成長ホルモンである、請求項７６記載のＤＮＡベクター。
【請求項７９】
ホルモン活性を有する前記ポリペプチドがソマトトロピンホルモンである、請求項７６記載のＤＮＡベクター。
【請求項８０】
ホルモン活性を有する前記ポリペプチドが生殖腺刺激ホルモンである、請求項７６記載のＤＮＡベクター。
【請求項８１】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、細胞増殖因子をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項８２】
前記細胞増殖因子が表皮増殖因子（ＥＧＦ）である、請求項８１記載のＤＮＡベクター。
【請求項８３】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、造血活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項８４】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、細胞受容体をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項８５】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、プロテアーゼ阻害剤をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項８６】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、血栓溶解活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項８７】
前記ポリペプチドがストレプトキナーゼである、請求項８６記載のＤＮＡベクター。
【請求項８８】
前記ポリペプチドが組織のプラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）である、請求項８６記載のＤＮＡベクター。
【請求項８９】
獣医学又は薬学上の目的の前記遺伝子が、ワクチン抗原をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項９０】
前記ワクチン抗原がウイルスに属する、請求項８９記載のＤＮＡベクター。
【請求項９１】
前記ワクチン抗原が肝炎ウイルスに属する、請求項９０記載のＤＮＡベクター。
【請求項９２】
前記ワクチン抗原がＢ型肝炎表面抗原である、請求項９１記載のＤＮＡベクター。
【請求項９３】
前記ワクチン抗原がＡ型肝炎ウイルスに属する、請求項９１記載のＤＮＡベクター。
【請求項９４】
前記ワクチン抗原がＣ型肝炎ウイルスに属する、請求項９１記載のＤＮＡベクター。
【請求項９５】
前記ワクチン抗原が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に属する、請求項９０記載のＤＮＡベクター。
【請求項９６】
前記ワクチン抗原がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に属する、請求項９０記載のＤＮＡベクター。
【請求項９７】
前記ワクチン抗原が細菌に属する、請求項８９記載のＤＮＡベクター。
【請求項９８】
前記ワクチン抗原が原生動物に属する、請求項８９記載のＤＮＡベクター。
【請求項９９】
前記遺伝子が、免疫グロブリンの可変領域のフラグメントをコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１００】
前記遺伝子が、多重結合タンパク質をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０１】
前記多重結合タンパク質が免疫グロブリンである、請求項１００記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０２】
前記多重結合タンパク質がホルモンである、請求項１００記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０３】
前記多重結合タンパク質がワクチン抗原である、請求項１００記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０４】
前記多重結合タンパク質が酵素である、請求項１００記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０５】
前記多重結合タンパク質が細胞受容体である、請求項１００記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０６】
産業上の目的の前記遺伝子が、生体高分子のタンパク質成分をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０７】
産業上の目的の前記遺伝子が酵素をコードする、請求項５２記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０８】
前記酵素がプロテアーゼである、請求項１０７記載のＤＮＡベクター。
【請求項１０９】
前記酵素がリパーゼである、請求項１０７記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１０】
前記酵素がイソメラーゼである、請求項１０７記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１１】
前記酵素がグリコシルヒドロラーゼ活性を有する、請求項１０７記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１２】
グリコシルヒドロラーゼ活性を有する前記酵素がレバンスクラーゼである、請求項１１１記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１３】
グリコシルヒドロラーゼ活性を有する前記酵素がインベルターゼである、請求項１１１記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１４】
グリコシルヒドロラーゼ活性を有する前記酵素がレバナーゼである、請求項１１１記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１５】
グリコシルヒドロラーゼ活性を有する前記酵素がデキストラナーゼである、請求項１１１記載のＤＮＡベクター。
【請求項１１６】
請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の任意のＤＮＡベクターを植物細胞に導入する前の、遺伝子導入植物の産生の頻度を高めるためのサイトカイニンの存在下での植物細胞の培養。
【請求項１１７】
請求項１１６記載のカイネチンの使用。
【請求項１１８】
請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の任意のＤＮＡベクターで安定的に形質転換した被子植物遺伝子導入植物。
【請求項１１９】
請求項１１８記載の遺伝子導入植物の後代。
【請求項１２０】
形質転換に使用したＤＮＡベクター中に存在する遺伝子の少なくとも１つを安定的に発現する請求項１１８又は１１９に記載の遺伝子導入植物。
【請求項１２１】
ハイブリッドａｔｐＢタンパク質及び／又はｒｂｃＬタンパク質を含む、請求項１１８又は１１９に記載の遺伝子導入植物。
【請求項１２２】
請求項１２０記載の遺伝子導入植物の培養。
【請求項１２３】
請求項１２０記載の遺伝子導入植物細胞の培養。
【請求項１２４】
前記１種又は複数の遺伝子の発現の結果として請求項１２０記載の遺伝子導入植物の細胞を産生する１種又は複数のタンパク質の精製及び使用。
【請求項１２５】
被子植物である、請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の遺伝子導入植物。
【請求項１２６】
双子葉植物である、請求項１２５記載の遺伝子導入植物。
【請求項１２７】
ナス科である、請求項１２６記載の遺伝子導入植物。
【請求項１２８】
タバコ、トマト又はジャガイモのうちの１つの種に属する、請求項１２７記載の遺伝子導入植物。
【請求項１２９】
単子葉である、請求項１２５記載の遺伝子導入植物。
【請求項１３０】
イネ科である、請求項１２９記載の遺伝子導入植物。
【請求項１３１】
コメ、サトウキビ、トウモロコシ、小麦又は大麦のうちの１つの種に属する、請求項１３０記載の遺伝子導入植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のバイオテクノロジーの分野、より詳しくは植物の遺伝子工学の分野に関する。特に、本発明は、被子植物色素体における外来遺伝子の有効な導入と発現に有用なＤＮＡ構築物を提供する。非相同性のタンパク質、特に医薬用途のワクチン抗原及びタンパク質を発現する遺伝子導入植物を効率良く得るためのこれらの遺伝学的構築物の有用性を説明する。
【背景技術】
【０００２】
植物の遺伝子工学は、新しい生物工学産物の基礎研究及び商業生産において非常に生産的であることが明らかにされてきた技術である（Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、２４０：１−１９；Ｓｉｍｏｅｎｓ  Ｃ．及びＶａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ  Ｍ．、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ、１９９５、１：５２３−５４２）。
【０００３】
数年前まで、直接的形質転換方法又はアグロバクテリウム属を介した形質転換方法によるトランスジェニック植物の産物については、植物細胞の核へモザイク遺伝子を安定的に挿入することが注目されていた（Ｈａｎｓｅｎ  Ｇ．及びＣｈｉｌｔｏｎ  Ｍ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２４０：２１−５７；Ｎｅｗｅｌｌ  Ｃ．Ａ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０００、１６：５３−６５を参照されたい）。しかし、核形質転換を行う上で、いくつかの不利な点を克服するのは、植物細胞器官中へ新しい遺伝子を選択的に導入することによってのみ可能である（Ｂｏｇｏｒａｄ  Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１８：２５７−２６３；Ｈｅｉｆｅｔｚ  Ｐ．Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、２０００、８２：６５５−６６６を参照）。特に、色素体で異種遺伝子を発現させる場合には、核発現に関する以下の利点が得られる：１）細胞１個当たりの色素体ゲノムのコピー数が多いことから、遺伝子組換えの発現レベルが、核内の場合に比べ１０から５０倍である；２）相同組換えによる新しい遺伝子の挿入は部位特異的であり、その結果、位置的な作用、遺伝子サイレンシング、及び植物核へ導入された遺伝子の発現に影響を及ぼす他の不適当な現象が回避される；３）ポリシストロン性遺伝子発現は可能であり、代謝経路の遺伝子操作をしようとする場合、又は多重遺伝子の特性を改変する場合に非常に望ましい；４）色素体遺伝子情報は、主として母系的に受け継がれ、その結果、環境中で、花粉によるキメラ遺伝子の拡散が原因となる自然破壊の可能性のリスクが低減される。さらに、色素体における遺伝子発現は、新しい微小環境中に非相同性タンパク質を蓄積する可能性を提示するものであり、それにより、より高い安定性を提供し、且つ／又は精製工程をより容易することができる。
【０００４】
藻類と高等植物の色素体中へ遺伝子を導入することに関しては、すでに異なった方法が報告されている。特に、一般的には、ＤＮＡで覆われた加速微粒子を用いたボンバードメント（Ｂｏｙｎｔｏｎ  Ｊ．Ｅ；Ｇｉｌｈａｍ  Ｅ．Ｈ；Ｈｏｓｌｅｒ  Ｊ．Ｐ；他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４０：１５３４−１５３８；Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ；Ｖｉｖｅｋａｎａｎｄａ  Ｊ；Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｂ；他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０、８７：８８−９２；Ｓｖａｂ  Ｚ；Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  Ｐ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０、８７：８５２６−８５３０）が用いられている。また、わずかながら、ＰＥＧによる植物原形質体の形質転換（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  Ｃ；Ｈｏｒｖａｔｈ  Ｇ．Ｖ；Ｈｏｒｖａｔｈ  Ｅ；他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９３、３：７２９−７３８；Ｇｏｌｄｓ  Ｔ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ；Ｋｏｏｐ  Ｈ−Ｕ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３、１１：９５−９７）と、マイクロインジェクション（Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ  Ｍ；Ｈｉｂｂｅｒｄ  Ｊ．Ｍ；Ｇｒａｙ  Ｊ．Ｃ；ｖａｎ  Ｂｅｌ  Ａ．Ｊ．Ｅ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１７：９０６−９０９）も用いられている。
【０００５】
多くの場合、色素体ゲノム中への導入ＤＮＡ配列の安定的挿入は、これらの細胞器官内で自然に生じる相同組換えの有効な機構を利用することにより達成されている（Ｂｌｏｗｅｒｓ  Ａ．Ｄ；Ｂｏｇｏｒａｄ  Ｌ；Ｓｈａｒｋ  Ｋ．Ｂ．；Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｊ．Ｃ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１９８９、１：１２３−１３２；Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１９９２、４：３９−４５；Ｋａｖａｎａｇｈ  Ｔ．Ａ；Ｔｈａｎｈ  Ｎ．Ｄ；Ｌａｏ  Ｎ．Ｔ；他、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９９、１５２：１１１１−１１２２）。相同性のあるＤＮＡ領域が大きいほど、組換え現象の頻度は高くなり、相同領域が１３７ｂｐ未満である場合には、組換え現象は無視され得ることは重視すべきことである（Ｚｏｕｂｅｎｋｏ  Ｏ．Ｖ；Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｌ．Ａ；Ｓｖａｂ  Ｚ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１９９４、２２：３８１９−３８２４）。
【０００６】
植物色素体中にキメラ配列を挿入することに関して、好適な組換え部位として、以下の多数の領域が提案されている：ｒｂｃＬ−ａｃｃＤ、ｐｓｂＥ−ｐｅｔＡ、ｔｒｎＶ−１６ＳｒＲＮＡオペロン、ｐｓｂＡ−ｔｒｎＨ、ｔｒｎＡ−ｔｒｎＩ、２３ＳｒＲＮＡ領域等（Ｓｖａｂ  Ｚ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９３、９０：９１３−９１７；Ｚｏｕｂｅｎｋｏ  Ｏ．Ｖ；Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｌ．Ａ；Ｓｖａｂ  Ｚ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１９９４、２２：３８１９−３８２４；Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ；Ｄａｔｔａ  Ｒ；Ｖａｒｍａ  Ｓ；他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８、１６：３４５−３４８；米国特許第５，８７７，４０２号；ＷＯ第９９１０５１３号）。しかし、これらの領域のいくつかが、種々の植物種の色素体ゲノムにおける外来ＤＮＡ配列の組込みにあたって「万能なもの（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｓ）」として提示されてきたにもかかわらず、これらの万能性には、以下の１つ又は複数の理由から不利な点が明らかとなっている：１）これらの配列及び／又は構造は、異なる植物種の色素体ゲノム中に高度に保存されない；２）これらは、保存の程度が低いイントロン又は他の領域に続いている、或いは前記イントロン又は領域によって中断されている、相同性の高い非常に短い領域を有する（このことは、相同組換え頻度を低下させ、従って、トランスジェニック色素体を保持する植物（遺伝子導入体）の取得が低下する）；３）これらは、場合により、色素体オペロンの形成されている部分に位置しており、これらの構造内部の改変が、各オペロン遺伝子の野生型転写レベル又はポリシストロン性ＲＮＡの適正なプロセッシングに影響を及ぼし（Ｏｈｍｅ  Ｍ；Ｋａｍｏｇａｓｈｉｒａ  Ｔ；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  Ｋ；Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１９８５、１３：１０４５−１０５６）、これが色素体代謝に影響する良くない結果をもたらすことが知られている。実際、同分野の研究者の文献では、組換え部位として上述されている領域を含有するベクターを用いた場合、タバコ由来（Ｓｖａｂ  Ｚ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９３、９０：９１３−９１７）、ジャガイモ由来（Ｓｉｄｏｒｏｖ  Ｖ．Ａ；Ｋａｓｔｅｎ  Ｄ；Ｐａｎｇ  Ｓ．Ｚ；他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９９、１９：２０９−２１６）、及びトマト由来（Ｒｕｆ  Ｓ；Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｍ；Ｂｅｒｇｅｒ  Ｉ．Ｊ；他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１９：８７０−８７５）の遺伝子導入植物の産生が報告されているにすぎないということは偶然ではなく、ナス科の遺伝子導入されたすべての植物は、進化的論的且つＤＮＡ一次構造レベルで非常に近いものである。さらに、これらの組換え領域を用いるベクターでは、恐らく、これらのベクターが１７４ｂｐよりも大きな色素体起源のプロモーター領域とターミネーター領域の使用を含んでいることから、ホモプラスミー遺伝子導入植物（均質に形質転換されたそれらのすべての色素体ゲノムを有する植物）の産生頻度が低いことは明らかである（ｌａｍｔｈａｍ  Ｓ．及びＤａｙ  Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０００、１８：１１７２−１１７６）。これにより、これらのベクター要素と色素体ゲノムの相同領域の間の組換えが原因で多くの形質転換現象が失敗し、その結果、生育不能な色素体が生じる（Ｓｖａｂ  Ｚ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９３、９０：９１３−９１７；Ｋａｎｅｖｓｋｉ  Ｉ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ；Ｒｈｏａｄｅｓ  Ｄ．Ｆ；Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  Ｓ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９９、１１９：１３３−１４１）。
【０００７】
被子植物間の構造及びヌクレオチド配列によって普遍的に保存されている色素体ゲノム領域は、分かれて転写されるｒｂｃＬオペロン及びａｔｐＢオペロンにより構成されているものである。事実、これらの遺伝子は、異なる分類（双子葉植物又は単子葉植物）に属する植物の色素体間では８５％を超えるヌクレオチド相同性と、同じ分類の植物を分析した場合には９１％を超えるヌクレオチド相同性を有する、１５００ｂｐより大きなＤＮＡセグメントを含有する（表１を参照）。一方、これらのオペロン間の遺伝子間領域は、双子葉植物及び単子葉植物の色素体ゲノム中ではヌクレオチド相同性が非常に低い（５０％未満）ことが示されている。
【表１】
2006500037.tif 000002
【０００８】
リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の大型サブユニットは、色素体遺伝子ｒｂｃＬにより体系化される。ｒｂｃＬサブユニットのカルボキシル末端領域が、このタンパク質の第８α−ヘリックスを形成すること、及びこの領域が、核内遺伝子ｒｂｃＳによって体系化されている、この酵素の小型サブユニットとの相互作用に関係することは、実験的に測定されている（Ｋｎｉｇｈｔ  Ｓ；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｉ；Ｂｒａｎｄｅｎ  Ｃ−Ｉ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０、２１５：１１３−１６０；Ｃｕｒｍｉ  Ｐ．Ｍ．Ｇ；Ｃａｓｃｉｏ  Ｄ；Ｓｗｅｅｔ  Ｒ．Ｍ；他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、２６７：１６９８０−１６９８９）。これらのデータ及び別のデータ（Ｋａｎｅｖｓｋｉ  Ｉ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ；Ｒｈｏａｄｅｓ  Ｄ．Ｆ；Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  Ｓ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９９、１１９：１３３−１４１）から、さらに異なる植物種に属する色素体ｒｂｃＬタンパク質のＣ末端領域間のわずかな保存程度を考慮すると、ｒｂｃＬの第８α−ヘリックスは、Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素の両サブユニット間の相互作用における種特異性を決定するものであるという仮説が得られた。ｒｂｃＬプロモーターの転写開始の近位の（転写開始からの位置＋１〜＋２６）ループ状構造によって、生成されたメッセンジャーＲＮＡが安定するようになる可能性があること、それによって、暗条件下でのこのプロモーターの転写活性の低下を補うことが明らかにされている（Ｓｈｉｉｎａ  Ｔ；Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｌ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１９９８、１０：１７１３−１７２２）。同様に、このプロモーターの構造領域の近位に、又はその領域の内部に位置している配列の様々なセグメントは、葉緑体ＤＮＡ結合因子（ＣＤＦ）の配列に類似し、且つｒｂｃＬプロモーターの転写調節に重要な機能を果たし得る。
【０００９】
ａｔｐＢ−ａｔｐＥオペロン（葉緑体ＡＴＰ合成酵素のβ及びεサブユニットをコードする）の転写／翻訳を特徴づける特性がいくつか報告されている（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  Ｋ；Ｄｅｎｏ  Ｈ；Ｋａｔｏ  Ａ；Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍ．、Ｇｅｎｅ、１９８３、２４：１４７−１５５；Ｇａｔｅｎｂｙ  Ａ．Ａ；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｓ．；Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９８９、８６：４０６６−４０７０；Ｋａｐｏｏｒ  Ｓ；Ｗａｋａｓｕｇｉ  Ｔ；Ｄｅｎｏ  Ｈ；Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９４、２６：２６３−２６８）。これらの２つの遺伝子はオーバーラップしている。また、これらの遺伝子が、オープンリーディングフレームのフレームシフトと、ａｔｐＥに関する可能性のあるプロモーター（コメ、タバコ等のａｔｐＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列の位置＋１０２７〜＋１０６４）を含むａｔｐＢコード配列の内部の保存領域に基づいていることから、特に、ａｔｐＥの翻訳上の特性に注意されたい。「インビボにおける」このプロモーターの機能性は証明されていないが、ａｔｐＥ発現の転写調節において一部機能を果たし得ることは退けられてはいない。
【００１０】
色素体における外来遺伝子の挿入の標的として使用可能なａｔｐＢ−ｒｂｃＬの遺伝子間領域は、ヨーロッパ特許出願第０２５１６５４号でＣａｎｎｏｎ  Ｍ．Ｃ．及びＣａｎｎｏｎ  Ｆ．Ｃによって記載されているのみであった。しかし、この特許では、分かれて転写される２つのオペロン間の遺伝子間領域内に外来遺伝子を導入する担体分子として、細菌性トランスポゾンの使用が提案されている。この遺伝子間領域におけるトランスポゾンの挿入は、報告されているａｔｐＢとｒｂｃＬのプロモーター間の相互作用（Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏｗｄｏｉｎ  Ｌ．及びＣｈｕａＮ−Ｈ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９、２１５：２１７−２２４）を阻害するだけでなく、（例えば、トウモロコシ及びコメに対する場合）ｒｂｃＬ遺伝子の５’非翻訳領域の内部に位置するＮＥＰプロモーター（核ポリメラーゼ依存性プロモーター）からのａｔｐＢ遺伝子の転写を遮断する（Ｗｅｌｈｅ  Ａ．及びＢｏｎｅｒ  Ｔ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、４：１６９−１７０）ことから、Ｃａｎｎｏｎ  Ｍ．Ｃ．及びＣａｎｎｏｎ  Ｆ．Ｃ．は遺伝子導入植物を得ることに成功しなかったのは偶然ではない。これらのオペロンによって体系化された生成物の発現の正確な転写及び調節が、色素体の適正な機能性及び存続可能性に必要不可欠であることは明白である。さらに、Ｃａｎｎｏｎ  Ｍ．Ｃ．及びＣａｎｎｏｎ  Ｆ．Ｃ．によって記載されている発現ベクターは、色素体で適切な遺伝子発現に不可欠な要素である転写ターミネーターを含有していない（Ｓｔｅｒｎ  Ｄ．Ｂ．及びＫｉｎｄｌｅ  Ｋ．Ｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９３、１３：２２７７−２２８５；Ｃｈｅｎ  Ｈ．Ｃ．及びＳｔｅｍ  Ｄ．Ｂ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９１、１１：４３８０−４３８８）。
【００１１】
転写ターミネーター領域（細菌起源であってよい（Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｊ．及びＯｒｏｚｃｏ  Ｅ．Ｍ．、Ｊｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９８８、１６：８４１１−８４３１））の他に、この細胞器官における機能的プロモーターの調節下で色素体へ導入される遺伝子を入れることが必要である。トランスジェニック色素体中の遺伝子を発現する最も利用され得るプロモーターには、１６ＳｒＲＮＡの強力プロモーターＰｒｒｎ（Ｓｖａｂ  Ｚ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９３、９０：９１３−９１７）と、ＰｓｂＡ（Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、６２：４６３−４８９）がある。Ｐｒｒｎプロモーターは構成的であり、一方、ＰｓｂＡプロモーターによって生じるＲＮＡの転写／翻訳は、光によって誘導され、且つ５’非翻訳領域に依存する。ｐｓｂＡ遺伝子の５’非翻訳領域を除去するとそのｍＲＮＡ発現は光非依存性になるが、翻訳に影響を及ぼす（Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９４、６：５４７−５５３；Ｅｉｂｉ  Ｃ；Ｚｏｕ  Ｚ；Ｂｅｃｋ  Ａ；他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９９、１９：３３３−３４５）。これらのプロモーターは、細菌性プロモーターについて記載されているものに対して相同の−３５及び−１０コンセンサス配列を有しており、これらの転写は、色素体ゲノム（ＰＥＰ）によって体系化されたポリメラーゼに依存している（Ｈｅｓｓ  Ｗ．及びＢｏｒｎｅｒ  Ｔ．、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．、１９９９、１９０：１−５９）。
【００１２】
特に、色素体と細菌の転写／翻訳機構は類似しており、タバコ色素体中ではポリシストロンｍＲＮＡが発現され、効率的に翻訳され得ること（Ｓｔａｕｂ  Ｊ．Ｍ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９５、７：８４５−８４８）；葉緑体中ではシャイン−ダルガノ様配列を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に機能的であること（Ｓｔｅｒｎ  Ｄ．Ｂ；Ｈｉｇｇｓ  Ｄ．Ｃ；Ｙａｎｇ  Ｊ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、１９９７、２：３０８−３１５）が証明されている。
【００１３】
遺伝子導入植物の選択を容易にするために、特に、カナマイシン（Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、６２：４６３−４８９）、又は最も一般的に用いられているスペクチノマイシン（Ｓｖａｂ  Ｚ；Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  Ｐ；Ｍａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０、８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ  Ｚ．及びＭａｌｉｇａ  Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９３、９０：９１３−９１７）等の陽性選択マーカーの使用の代案が提案されている。この目的において、選択薬剤に対する耐性を付与する遺伝子は、色素体でのその適正な発現に関する適当なコントロールシグナル下、形質転換ベクター中にクローン化する。
【００１４】
自然を保護するため、環境中に出される植物から選択マーカーをコードする遺伝子を除去することができる「クリーン」テクノロジーが設計されてきた。遺伝子導入植物の産生に好適に用いられているこれらの技術には、以下の２つがある：２つのベクターによる同時形質転換後、選択マーカーを保有する個体を分離及び除去すること（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｎ；Ｓｔａｍｐａｃｃｈｉａ  Ｏ；Ｒｅｄｄｉｎｇ  Ｋ；Ｒｏｃｈａｉｘ  Ｊ．Ｄ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６、２５１：３７３−３８０）、発現カセットの２つの直接反復配列の間へマーカー遺伝子を挿入した後、非選択的培地における培養サイクル中、相同組換えによりこれらの遺伝子を除去できるようにすること（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｎ；Ｓｔａｍｐａｃｃｈｉａ  Ｏ；Ｒｅｄｄｉｎｇ  Ｋ；Ｒｏｃｈａｉｘ  Ｊ．Ｄ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６、２５１：３７３−３８０；Ｉａｍｔｈａｍ  Ｓ．及びＤａｙ  Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、１８：１１７２−１１７６）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明を明示する被子植物色素体中の異種遺伝子を安定的に形質転換及び発現するためのベクターは、それを特徴づける次のような独自のいくつかの特性を含んでいる：１）色素体ゲノム中へＤＮＡ断片を挿入するにあたり、トランスポゾンを使用しない；２）ａｔｐＢとｒｂｃＬのボーダー領域は異なる分類の被子植物に属しており、人工遺伝子間領域を形成する；３）転写的に不活性な人工遺伝子間領域中の多重クローニング部位は、適正な転写、ｍＲＮＡ処理、並びにａｔｐＢ及びｒｂｃＬの遺伝子発現に影響を及ぼすことなく、１種又は複数の異種遺伝子を挿入することができる；４）このベクターの設計では、タンパク質をコードしている配列がリボソーム結合部位の前にある場合、プロモーター領域とターミネーター領域を保持する必要なく、導入遺伝子を発現させることができる（これは、好ましくない組換え現象を低下させ、且つ色素体から代謝供給源をセーブするのに役立ち、導入された非相同性ＤＮＡ断片の安定性を高め、且つホモプラスミー植物の取得頻度を上昇させる）；５）本発明が明示したボーダー領域の構造及び配列は、ベクターの万能性を保証する。また、ホモプラスミー遺伝子導入植物が得られた場合、本明細書で提供されているベクターは、直接反復配列間の相同組換えにより選択マーカーを除去可能な設計に基づく、作物への遺伝子導入用「クリーン」ツールを成す。
【００１６】
その人工遺伝子間領域を含む、ａｔｐＢ−ｒｂｃＬ領域の設計及び伸長は、機能的改変をもたらすことなく、有効且つ安定的な方法で任意の種の被子植物の色素体ゲノムに遺伝子とオペロンを挿入することができるため、本発明の目的の基礎を成している。
【００１７】
人工遺伝子間領域の設計については、ｒｂｃＬプロモーターとａｔｐＢプロモーターの間の相互作用と、それらの野生の転写レベルに影響を及ぼすことなく、この領域内への外来遺伝子の導入で報告されている問題を解決することが必要であった。
【００１８】
一方、ａｔｐＢとｒｂｃＬの遺伝子産物が、色素体と植物を維持する生体機能を持つ酵素のサブユニットを構成することも考慮する必要があった。この問題では、これらのタンパク質の特定のドメインがタンパク質間相互作用に関与していることと、これらの酵素の異なるサブユニット間の認識の特異性、及びこれらの適正な折り重なりと機能を測定可能であることが望ましいことから、組換えでボーダーとして選択する断片の長さに制限が加わる。
【００１９】
異なる植物種の色素体における外来遺伝子挿入の組換え部位としてａｔｐＢ−ｒｂｃＬ領域を使用することについては、ハイブリッドタンパク質を産生することを考慮することが重要であり、従って、上述した事項に格別の注意を払う必要がある。本方法では、ハイブリッドＲｕｂｉｓｃｏの適切な折畳と機能の支障を回避するため、組換え現象中に、第８αヘリックスをコードするｒｂｃＬ遺伝子領域が改変されないように維持することにした。従って、本発明の目的のベクターの設計時に、相同組換えによる色素体形質転換用のＤＮＡ断片（翻訳可能なｒｂｃＬ遺伝子配列（ｒｂｃＬ−ボーダーとも呼称する）の一部を含有する）を、第８αヘリックスのＮ末端領域まで、より詳しくは、被子植物由来のｒｂｃＬタンパク質中のこの位置に高度に保存されているトリプトファン（Ｔｒｐ−４１１）まで伸長すべきであるということを定めた。
【００２０】
ａｔｐＢ遺伝子をコードしている領域に関しては、異なる植物種の色素体由来のタンパク質配列を比較した場合、際立った多様性を有するドメインは全く発見されていない。しかし、ＤＮＡ断片を選択するにあたっては、相同組換えによって色素体へ外来遺伝子を組み込むための翻訳可能ａｔｐＢ遺伝子配列（ａｔｐＢ−ボーダーとも呼称する）の一部を含有する、ａｔｐＢ−ａｔｐＥオペロンの転写／翻訳特性を考慮した。
【００２１】
ａｔｐＢ及びｒｂｃＬの転写率に影響を及ぼすことなく、色素体へ新しい遺伝子を挿入することができる人工遺伝子間領域を設計するため、本発明者らは、異なる種の被子植物に属する色素体配列を比較した場合、これらのオペロン間の領域を示すヌクレオチドレベルにおける低相同性を利用した。
【００２２】
本発明の目的の遺伝学的構築物においては、ｒｂｃＬ−ボーダーは、遺伝子の一部と全５’制御領域を保持するＤＮＡ断片を含んでいなければならない。この断片は、１）それに関連したＣＤＦ配列を含むｒｂｃＬ遺伝子ＰＥＰプロモーター（ポリメラーゼをコードする色素体依存）；２）５’ｒｂｃＬ遺伝子の非翻訳領域、及び、３）第８αヘリックスのＮ末端に対応する領域までのｒｂｃＬタンパク質をコードする配列を含んでいる。従って、本発明の目的のベクター中のｒｂｃＬ−ボーダーは、タバコ中のこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の位置−２９１から、この遺伝子の翻訳開始コドンから始まる位置＋１２３３（このアミノ酸配列内のＴｒｐ−４１１）に及ぶＤＮＡ断片を含む。ｒｂｃＬ−ボーダーのクローニングを試みる場合、それ自体のプロモーターにより開始されるｒｂｃＬ遺伝子の発現が大腸菌に有毒であることを本発明者らは発見していることを指摘しなければならない。従って、この遺伝子の５’非翻訳領域由来のわずかに保存されている断片を「理想」ｌａｃオペレーター（Ｓｉｍｏｎｓ  Ａ；Ｔｉｌｓ  Ｄ；ｖｏｎ  Ｗｉｌｃｋｅｎ−Ｂｅｒｇｍａｎｎ  Ｂ；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ  Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９８４、８１：１６２４−１６２８）に置換すること、また、ｌａｃｌｑ大腸菌株（例えば、ＸＬ−１ブルー、ＪＭ１０１等）内で増殖する低コピー数のプラスミドベクター（ｐＢＲ３２２）にこのキメラボーダーをクローニングすることが必要であった。
【００２３】
本発明の目的の遺伝学的構築物においては、ａｔｐＢ−ボーダーとして、１）隣接するｒｂｃＬプロモーター、及びこのプロモーターによって作製されるｍＲＮＡを安定化する、転写開始点に近接したステムループ形成配列；２）そのＮＥＰプロモーターをはじめとする、ａｔｐＢ遺伝子のプロモーター；３）ａｔｐＢ遺伝子の５’非翻訳領域、及び、４）この遺伝子の停止コドンの３００ｂｐ前までのａｔｐＢをコードする配列、を含むＤＮＡ断片を利用することを決定した。本方法では、本発明の目的のベクターを設計する場合、ａｔｐＢ−ボーダーは、コメのこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の位置−６５４から、この遺伝子の翻訳開始コドンから始まる位置＋１２１１に及んでいる。
【００２４】
ａｔｐＢ−ボーダーでは、ａｔｐＢ遺伝子に隣接するｒｂｃＬプロモーターは、ａｔｐＢ−ａｔｐＥオペロンの転写の反対方向に、目的の遺伝子を安定して転写及び発現させることができる。利用者の都合により、このｒｂｃＬプロモーター下では、色素体中の機能的プロモーターによって調節される１種又は複数の外来遺伝子を含有する遺伝学的カセットをクローニングすることができる。その結果、これらの遺伝子の発現は、縦列の２つのプロモーターから始まる転写によって向上する。前述のボーダー領域は、大腸菌内で維持し増殖させるプラスミドベクターに導入し、色素体ゲノムへさらに導入する異種遺伝子の挿入に有用な、多重クローニング部位を含有するＤＮＡセグメント（ＭＣＳ１、図１−Ａを参照）により単離する。この構造に従って、ａｔｐＢ遺伝子及びｒｂｃＬ遺伝子は分かれて転写され、且つｒｂｃＬプロモーター領域に基づいて複写された場合、２つの直接反復ＤＮＡ断片は、クローニング部位を含有する領域に隣接して得られる。しかし、異なる被子植物種由来の色素体ゲノム間ではこの遺伝子間領域のヌクレオチドレベルにおける相同性が低い結果、９０ｂｐの小さな断片しか高い相同性を有さないので、本発明者らの構築物における組換え現象は全く予測されるものではない。前述の構築物は、本発明の目的のベクターのベースであり、ホモプラスミー遺伝子導入植物が得られたならば、形質転換細胞の陽性選択ができる選択可能マーカーをコードする遺伝子は、相同組換えによるマーカー遺伝子の移動を可能にする直接反復ＤＮＡ配列に隣接するＭＣＳ１へ導入される（ｒｂｃＬ−ボーダーの方向、ａｔｐＢ−ボーダーのｒｂｃＬプロモーターから開始）。マーカー遺伝子又はＭＣＳ１へ導入された他の遺伝子の転写終結は、ｒｂｃＬ−ボーダーの５’末端に隣接する細菌性ターミネーター（好ましくは、大腸菌のｒｎｎＢオペロンのｒｒｎＢＴ１Ｔ２双方向ターミネーター（Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ；Ｄｕｌｌ  Ｔ．Ｊ；Ｓｌｅｅｔｅｒ  Ｄ．Ｄ；Ｎｏｌｌｅｒ  Ｈ．Ｆ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８１、１４８：１０７−１２７））によって実施される。その結果、挿入遺伝子の転写が、ｒｂｃＬ−ボーダープロモーターの正常機能を妨げることは回避される。
【００２５】
本方法では、本発明の目的のベクターの一般的な構造は図１−Ｂに示すとおりであり、ここで、目的の１つの又は複数の遺伝子は、ａｔｐＢ−ボーダーのｒｂｃＬプロモーター下に挿入されてモノシストロン又はポリシストロン転写ユニットを形成するか（図１−Ｃ）、或いは、縦列の２つのプロモーター下、例えば、ポリシストロンユニットを取得可能な他の色素体の機能性プロモーター下に挿入されるか（図１−Ｄ）、或いは、異なるプロモーター領域の組み合わせの下で、２つの非依存性転写ユニット下に挿入される（図１−Ｅ及び図１−Ｆ）。
【００２６】
遺伝子導入植物の選択を容易にするため、選択マーカーとしてヒグロマイシンを用いた。この抗生物質はタバコなどの双子葉植物に非常に有毒であるため、注意深く使用しなければならないが、遺伝子組換え色素体を保持する単子葉植物を取得するための選択薬剤として有効な結果が得られる。本方法では、好適なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ領域をはじめとする、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のヒグロマイシンＢ耐性をコードするｈｇｈ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ  Ｌ．及びＤａｖｉｅｓ  Ｊ．、Ｇｅｎｅ、１９８３、２５：１７９−１８８）をａｔｐＢ−ボーダーのｒｂｃＬプロモーター下のＭＣＳ１へクローニングした（図１−Ｂ）。
【００２７】
生態学上のツールを提供する目的を持つ本発明の目的のベクターにおいては、マーカー遺伝子は、すでにホモプラスミー遺伝子導入植物が得られている場合に選択薬剤を培地から除くと、相同組換えによってそれを取り除くことができる、２つの直接反復ＤＮＡ配列に隣接して導入した（図１−Ｂ）。本構築物中で用いられる反復配列は、Ｔ７ファージのｓ１０タンパク質をコードするＤＮＡ領域から得た（Ｄｕｎｎ  Ｊ．Ｊ．及びＳｔｕｄｉｅｒ  Ｆ．Ｗ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３、１６６：４７７−５３５）。これらのベクターは、マーカー遺伝子のみを除去する特色を持っている。その結果、オペロン制御配列の残りの部分は変わりなく維持される（図１−Ｃ、１−Ｄ、１−Ｅ及び１−Ｆ）。従って、マーカー遺伝子に転写的に融合されている任意の遺伝子は、ベクター源を効率的に使用するこのような方法で、その発現を不変的に継続する。この構造は、本発明の目的のベクターを、色素体の形質転換用のビヒクルとして記載されている他の系との違いを示すもう１つの特性である。
【００２８】
また、スペクチノマイシン（Ｃｈｉｎａｕｌｔ  Ａ．Ｃ；Ｂｌａｓｋｅｌｅｙ  Ｖ．Ａ；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ  Ｅ；Ｗｉｌｌｉｓ  Ｄ．Ｇ；他、Ｐｌａｓｍｉｄ、１９８６、１５：１１９−１３１）又はスルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  Ｆ．及びＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ  Ｐ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１９８９、１７：４３７０）に関する抗生物質耐性を付与する他の遺伝子を用いて、遺伝子導入植物を選択することができることは明らかである。同様に、グリホサート（Ｓｈａｈ  Ｄ．Ｍ；Ｈｏｒｓｃｈ  Ｒ．Ｂ；Ｋｌｅｅ  Ｈ．Ｊ；Ｋｉｓｈｏｒｅ  Ｇ．Ｍ；他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３３：４７８−４８１；Ｃｏｍａｉ  Ｌ；Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ  Ｄ；Ｈｉａｔｔ  Ｗ．Ｒ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｇ；他、Ｎａｔｕｒｅ、３１７：７４１−７４４）、グルホシネート（ｇｌｕｐｈｏｓｉｎａｔｅ）（ＤｅＢｌｏｃｋ  Ｍ；Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ  Ｊ；Ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ  Ｍ；Ｄｏｃｋｘ  Ｊ；他、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８７、６：２５１３−２５１８）、アシュラム（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  Ｆ；Ｂｒｏｏｋｓ  Ｌ；Ｍｅａｄｏｗｓ  Ｊ；Ｌｕｃｙ  Ａ；他、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９０、１５：１２７−１３６）、ブロモキニル（ｂｒｏｍｏｘｉｎｉｌ）（Ｓｔａｌｋｅｒ  Ｄ．Ｍ．及びＭｃＢｒｉｄｅ  Ｋ．Ｅ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８７、１６９：９５５−９６０）、スルホニルレアス（ｓｕｌｐｈｏｎｉｌｕｒｅａｓ）及びイミダゾリノン（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）（ＬａＲｏｓｓａ  Ｒ．Ａ及びＳｍｕｌｋｙ  Ｄ．Ｒ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８４、１６０：３９１−３９４）等の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を人工遺伝子間領域にクローニングし、除草剤耐性が栽培上望ましい形質であるという利点を持つ選択マーカーとして用いることができる。
【００２９】
当技術分野及び遺伝子工学技術における当業者であれば、本明細書に記載されている内容は、ボーダー領域が異なる分類の被子植物（単子葉植物又は双子葉植物）の色素体から得られる限り、色素体ゲノム中へ遺伝子を組み込むためのボーダー領域として、記載されている特徴の全部又は一部を有するａｔｐＢ領域とｒｂｃＬ領域の任意の組み合わせで使用可能であることは明らかである。同様に、同義遺伝子、選択マーカー、シストロン及びオペロンの組み合わせを本発明の目的であるベクターの人工遺伝子間領域のＭＣＳ１にクローニングして（図１−Ａ）、任意の被子植物の色素体中にそれらを安定的に挿入し発現させることができる。
【００３０】
微生物の寄託
プラスミドベクターｐＶＴＰＡ−ＨＢ−ａａｄＡ、ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ及びｐＶＩＥＰは、ブダペスト条約法則に基づいて、ベルギー微生物寄託当局（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）ＢＣＣＭ、ＬＭＢＰ−ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮに、それぞれＬＭＢＰ４６３５、ＬＭＢＰ４６３６及びＬＭＢＰ４６３７の番号で２００２年９月２４日に寄託した。
【実施例１】
【００３１】
被子植物の色素体における異種遺伝子を安定的に形質転換及び発現するためのベクターの構築。
ａ）ｒｂｃＬ−ボーダーの取得。
ｒｂｃＬ−ボーダー断片は、タバコｒｂｃＬタンパク質をコードする遺伝子に対応する１５２４ｂｐのＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅で、配列番号１及び配列番号２に記載したオリゴヌクレオチドを用いて取得した。ＰＣＲでは、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）ｖａｒ．ＳＲ１の葉から精製した葉緑体ＤＮＡを使用した。予め制限酵素ＳｐｅＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＥｃｏＲＶで消化したｐＢスクリプトＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）に増幅したＤＮＡ断片をクローニングし、ｐＢＳｒｂｃＬクローンを得た。陽性クローンの一部を完全にシーケンシングした。ＰＣＲ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を実施したところ、高い信頼性のＤＮＡポリメラーゼを用いたにもかかわらず、全てのクローンで突然変異を示すことが明らかとなった。この事実と本発明に関連のない別の証拠から、タバコのｒｂｃＬタンパク質は、それ自体のプロモーターから発現された場合、大腸菌に対して有毒であることがわかった。このため、ｒｂｃＬ遺伝子の低度に保存されている５’非翻訳領域のＤＮＡ断片を、ｌａｃＩ＋大腸菌株中のこのボーダー断片をクローニング可能な「理想」ｌａｃオペレーターを含有するＤＮＡ断片と置換することに決めた。この突然変異誘発を行うため、ｐＢＳｒｂｃＬ１３クローン（クローニングしたｒｂｃＬ遺伝子のＳａｃＩＩ／ＢａｍＨＩ断片中に突然変異を含有するもの）を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩを用いてそれぞれ位置−１６２及び位置−２９で消化し、この断片を、ｒｂｃＬ遺伝子（配列番号３）の−１２４〜−９７領域に挿入されている「理想」ｌａｃオペレーターを保持する合成ＤＮＡ断片と置換した。
【００３２】
ｌａｃオペレーターがｐＢＳｒｂｃＬ１３クローンに挿入されたならば（これよりｐＢＳｒｂｃＬ１３ｌａｃＯｐと称する）、制限酵素ＸｂａＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＳａｌＩによりｒｂｃＬ断片を切断し、予め制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＶで消化した低コピー数ベクターｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）へそれをクローニングし（ＸｂａＩ部位は修復される）、プラスミドｐＢＲ３２２ｒｂｃＬ１３１ａｃＯｐを得た。この場合、ｒｂｃＬ遺伝子転写はＳａｌＩ／ＸｂａＩ方角で生じる。
【００３３】
次いで、ｐＢＲ３２２ｒｂｃＬ１３１ａｃＯｐのＳａｃＩＩ／ＢａｍＨＩ断片を、別にシークエンシングしたｐＢＳｒｂｃＬクローンから得た突然変異のないＳａｃＩＩ／ＢａｍＨＩ断片と置換し、本発明者らはｒｂｃＬ１３クローン中に存在する突然変異を除去した。このようにして、ｒｂｃＬ−ボーダー（配列番号４）を含有するプラスミドｐＢＲ３２２ｒｂｃＬＯＫを得た。
【００３４】
ｂ）ａｔｐＢ−ボーダーの取得。
ａｔｐＢ−ボーダー断片は、コメ色素体ａｔｐＢタンパク質をコードする遺伝子に対応する１７５４ｂｐのＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅で、配列番号５及び配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを用いることにより取得した。ＰＣＲについては、コメ（Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ）ｖａｒ．ＩＡＣ−１８葉緑体から精製したＤＮＡを使用した。増幅ＤＮＡ断片は、予め制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＢＳｃｒｉｐｔ  ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）へクローニングし（ＨｉｎｃＩＩ（ＳａｌＩ）制限部位は、クローニング断片の５’領域で修復される）、ｐＢＳａｔｐＢクローンを得た。陽性クローンの一部をシークエンスし、完全な適正クローンを選択した。
【００３５】
新たな制限部位とＮＥＰプロモーター（配列番号７）を含有するコメａｔｐＢ遺伝子の５’非翻訳領域の一部を保持する合成ＤＮＡ断片をクローニングするため、適正ｐＢＳａｔｐＢクローンを断片の５’端で制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化し（クローニング後にオリジナル配列は修復され、ＳａｌＩ部位は消失する）、プラスミドｐＢＳａｔｐＢｃｏｍｐｌｅｔｅを得た。このベクターでは、ａｔｐＢ遺伝子の転写は、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏＩの方向で生じる。構築したａｔｐＢ−ボーダーのヌクレオチド配列を配列番号８に示す。
【００３６】
ｃ）反復ボーダーを含む選択カセットの取得。
ヒグロマイシン耐性（ｈｇｈ）をコードする遺伝子を含む１ｋｂのＤＮＡ断片は、配列番号９及び配列番号１０に記載したオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅によって、プラスミドｐＢＳＢａｒから取得した。これは、遺伝子翻訳開始７ｂｐ前のシャイン−ダルガルノ配列と、この断片の操作を容易にする制限部位を導入している。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、ＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化ｐＵＣ１９ベクターへクローニングし（クローニング後、ＳｍａＩ部位は修復される）、プラスミドｐＵＣ１９Ｈｙｇを得た。続いて、得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩで消化し、さらに遺伝子操作に有用な制限部位を含む合成ＤＮＡ断片（配列番号１１）を導入した。得られたプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９−リンカー−Ｈｙｇと命名した。
【００３７】
ホモプラスミー遺伝子導入植物が得られた場合、相同組換えによりマーカー遺伝子を除去する反復ＤＮＡ断片は、ｐＥＴ３ｘｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）中に存在する、Ｔ７ファージのｓ１０タンパク質をコード化するＤＮＡ断片から得た。最初に、ｐＥＴ３ｘｂベクターをＢａｍＨＩとＮｄｅＩで消化し、得られた７８０ｂｐのＤＮＡ断片をＴａｑＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）及びＫｐｎＩで再消化して約３１０ｂｐのＤＮＡ断片を得て、これをＳｍａＩ／ＫｐｎＩで消化したｐＵＣ１９ベクターへクローニングし、プラスミドｐＵＣ−Ｓｐａｃｅｒを得た。
【００３８】
ｐＵＣ１９−Ｓｐａｃｅｒ由来の３１０ｂｐのｓ１０遺伝子断片は、予めＥｃｏＲＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＫｐｎＩで消化したｐＵＣ１９−リンカー−Ｈｙｇプラスミド中のＸｂａＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＫｐｎＩ断片としてのｈｇｈ遺伝子の下流にクローニングし、ｐＵＣ１９−リンカー−Ｈｙｇ−スペーサーを得た。
【００３９】
予め制限酵素ＳｍａＩ及びＢｇｌＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９−リンカー−Ｈｙｇ−スペーサー中、ＥｃｏＲＩ（ｋｌｅｎｏｗ）／ＢａｍＨＩ断片としての第２の３１０ｂｐの反復断片をｈｇｈ遺伝子に上流にクローニングし、プラスミドｐＵＣ−リンカー−スペーサー−Ｈｙｇ−スペーサーを得た。大腸菌由来の双方向ターミネーターｒｒｎＢＴ１Ｔ２は、ＢｓｐＨＩによる消化、大豆（Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる処理、及びＨｉｎｄＩＩＩ消化によってｐＴｒｃＨｉｓＢ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）から取得し、予め制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩで消化したｐＢＳｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中にその４７０ｂｐのターミネーター断片をクローニングし、プラスミドｐＢＳ−ｒｒｎＢＴ１Ｔ２を得た。
【００４０】
最後に、予めＢａｍＨＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ−リンカー−スペーサー−Ｈｙｇスペーサー中のｈｇｈ遺伝子に連続するスペーサー断片の下流に、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＸｂａＩ断片として、ｒｒｎＢＴｌＴ２ターミネーターを含有するＤＮＡ断片をクローニングし、プラスミドｐＵＣ−リンカー−スペーサー−Ｈｙｇ−スペーサー−ｒｒｎＢＴｌＴ２を得た。リンカーからｒｒｎＢＴ１Ｔ２までを含有するこのカセットをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片として前述の構築物から切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化したｐＢＳｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター中にクローニングして、反復ボーダー、ｐＢＳ−リンカー−スペーサー−Ｈｙｇ−スペーサー−ｒｒｎＢＴ１Ｔ２を含む選択カセット（配列番号１２）を有するプラスミドを得た。
【００４１】
ｄ）被子植物色素体において異種遺伝子を安定的に形質変換し、発現するためのベクター（ｐＶＴＰＡ−ｆ）の構築。
本発明が提案する、被子植物色素体における異種タンパク質の安定的形質転換及び発現のためのベクターは、以下のようにして構築した。予めＥｃｏＲＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＳａｌＩで消化したベクターｐＢＲ３２２で、リンカー−スペーサー−Ｈｙｇ−スペーサー−ｒｒｎＢＴ１Ｔ２を含む選択カセットを、ＮｏｔＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＳａｌＩ断片としてクローニングし、プラスミドｐＢＲ３２２−ｓｐ−Ｈｙｇ−ｓｐ−Ｔ−を得た。続いて、ＢａｍＨＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＸｂａＩで消化したプラスミドｐＢＲ３２２−ｓｐ−Ｈｙｇ−ｓｐ−Ｔで、プラスミドｐＢＲ３３２ｒｂｃＬＯＫ由来のｒｂｃＬ−ボーダーのＨｉｎｄＩＩＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＸｂａＩ断片としてクローニングし、構築物ｐＢＲ−ｓｐ−Ｈｙｇ−ｓｐ−Ｔ−ｒｂｃＬを得た。最後に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化したｐＢＲ−ｓｐ−Ｈｙｇ−ｓｐ−Ｔ−ｒｂｃＬで、プラスミドｐＢＳａｔｐＢｃｏｍｐｌｅｔｅ由来のａｔｐＢ−ボーダーを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片としてクローニングした。この方法によって、ｐＶＴＰＡ−ｆと命名した、図１−Ｂに記載の構造を持つベクターが得られる（図２の地図を参照）。ｐＶＴＰＡ−ｆ由来のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（ｐＢＲ３２２担持ベクターの位置＋６５１（ＳａｌＩ部位）と位置＋１（ＥｃｏＲＩ部位）の間の配列）は、配列番号１３に示す。
【００４２】
ｐＶＴＰＡ−ｆベクターの特徴は、被子植物色素体を安定的に形質転換できることと、本ベクター中にクローニングされた遺伝子が、それらの翻訳開始コドンからの適切な距離にリボソーム結合部位を含んでいる場合には、前記遺伝子によってコードされている組換えタンパク質を発現する遺伝子導入植物が取得できることである。
【００４３】
ｅ）ベクターｐＶＴＰＡ：独立転写性ユニットとしての複数の遺伝子を色素体へ挿入し、発現させることができるベクターｐＶＴＰＡ−ｆの変異体。
独立転写性ユニットとしての複数の遺伝子を色素体へ挿入し、発現させることができるベクターｐＶＴＰＡ−ｆの変異体は、色素体内の転写の促進と転写の停止を可能にするｐＶＴＰＡ−ｆベクターＤＮＡ配列をクローニング部位へ挿入することにより得た（図１−Ｅを参照）。実施例としてのこの目的においては、色素体リボソームＲＮＡ（Ｐｒｒｍ）の１６Ｓサブユニットのプロモーター（配列番号１４）を含み、且つ遺伝子操作を容易にするクローニング部位を含有する合成ＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫのＥｃｏＲＩ制限部位とＳｍａＩ制限部位の間に挿入し、プラスミドｐＢＳＰｒｎｎを得た。続いて、プラスミドｐＶＴＰＡ−ｆで、Ｐｒｒｎプロモーターを含有するこのＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＭｌｕＩ断片としてクローニングし、構築物ｐＶＴＰＡを得た（図３及び配列番号１５の配列を参照）。
【実施例２】
【００４４】
タバコ遺伝子導入植物（ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ）における異種モノシストロニックユニットの発現
ベクターｐＶＴＰＡ−ｆを使用して遺伝子導入植物で異種遺伝子を発現するためには、この遺伝子が、その翻訳開始コドンの約５〜１５ｂｐ上流にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を保持している必要がある。この理由から、さらに本発明者らのベクターでの外来遺伝子のクローニングを促進する目的で、目的遺伝子をベクター内へ挿入し、その後、ベクターｐＶＴＰＡ又はｐＶＴＰＡにおけるクローニング前に、制限消化によりそれらを切断することができる、仲介ベクター（ｐＶｌＥＰ）を設計した。ｐＶｌＥＰベクターにおける遺伝子のクローニングは、それらに対してＲＢＳを導入し、同時に、転写性ターミネーター、又は本発明の目的のベクターでの正確な発現のための補足プロモーターを追加することができる。
【００４５】
ベクターｐＶｌＥＰの構築においては、光による遺伝子の翻訳調節を回避するためにその５’未翻訳領域の一部を除去したタバコｐｓｂＡ遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片（翻訳開始位置からの位置−６８と−２５の間）（ＰｐｓｂＡ＊、配列番号１６）を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫで、ＥｃｏＲＩ／Ｓｍａｌ断片としてクローニングし、プラスミドｐＢＳＰｐｓｂＡ＊を得た。続いて、（ｍＲＮＡを安定化し、且つその翻訳を助ける）ミニシストロンを含有する合成ＤＮＡ断片、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及び多重クローニング部位（配列番号１７）をプラスミドｐＢＳＰｐｓｂＡ＊で、ＮｄｅＩ／ＳａｃＩ断片としてＰｐｓｂＡ＊プロモーターの下流にクローニングし（クローニング後、Ｓａｄ部位はなくなる）、プラスミドｐＢＳＰｐｓｂＡ＊−リンカーを得た。
【００４６】
最後に、ＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩで消化したプラスミドｐＢＳＰｐｓｂＡ＊−リンカーで、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ消化によってプラスミドｐＥＴ３ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）から取得した、Ｔ７ファージ（Ｔφ）転写ターミネーターを挿入することにより、ｐＶｌＥＰベクターを得た。配列番号１８の配列は、ＫｐｎＩと第２ＳａｌＩ部位の間のｐＶｌＥＰベクターの一次構造（図４を参照）に一致する。ＰｐｓｂＡ＊プロモーターとミニシストロンを持たない仲介ベクターｐＶｌＥＰの変種は、ＥｃｏＲＩ（大豆ヌクレアーゼ）／ＳｎａＢＩでｐＶｌＥＰを消化し、再結合することによって生じ、構築物ｐＶＩＥＰ−２が得られた。
【００４７】
遺伝子導入植物中の異種モノシストロニックユニットを発現するには、ｕｉｄＡ遺伝子（ｇｕｓ）をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで消化することによりプラスミドｐＤＭＣ２００（ＣＡＭＢＩＡ）から取得し、これをＮｃｏＩ／ＳｍａＩ消化のｐＶＩＥＰ−２ベクターへ結合させて、プラスミドｐＶＩＥＰ−ＧＵＳを得た。ＭｌｕＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）／ＨｉｎｄＩＩＩ消化の色素体形質転換ベクターｐＶＴＰＡ−で、プラスミドｐＶＩＥＰ−ＧＵＳから得たＲＢＳに結合しているｕｉｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｍａｌ断片としてコメｒｂｃＬプロモーターの下流にクローニングし、構築物ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ（配列番号１９）を得た。ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳベクターで形質転換した遺伝子導入植物は、ｒｂｃＬプロモーターの転写調節下、ジシストロンユニットとしてｈｇｈ遺伝子及びｕｉｄＡ遺伝子を発現するとともに、形質転換段階中、選択が維持される。しかし、非選択条件で遺伝子導入植物を栽培した場合、相同組換えによりマーカー遺伝子は除去されるであろうし、モノシストロニック発現ユニット由来のｕｉｄＡ遺伝子の発現は、さらに保持されたままであろう。この構築物の機能は、下記方法に従って、タバコ遺伝子導入植物を取得することにより証明した。
【００４８】
インビトロで成長させた４〜６週間齢のタバコ植物（ｖａｒ．ＳＲ１）の葉を、２〜４時間の浸透前処理用の、マンニトール０．４Ｍ補充苗条誘導培地（ＳＩ：ＭＳ塩類及びビタミン（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ、Ｓｋｏｏｇ  Ｆ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１９６２、１５：４９３−４９７）、ＢＡＰ１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ、スクロース２５ｇ／Ｌ、フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）４ｇ／Ｌ、ｐＨ５．７）上に背軸面で置いた。報告に基づいて（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｒ．、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｋ．Ｍ．、Ｂａｔｈｅ  Ｊ．Ｈ．他、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、１９９３、１２：１６５−１６９）、０．６μｍの金粒子（ＢｉｏＲａｄ）をボンバードメント用にＤＮＡで被覆した。形質転換は、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅの遺伝子銃（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、１１００ｐｓｉの圧力、６ｃｍ発射距離、１枚の葉のサンプルにつきショット１回の条件で行った。ボンバード処理した葉を等浸透圧の培地上で１４〜１６時間維持し、その後、２日間ＳＩ培地上に置いた。続いて、葉を切片（３ｍｍ×３ｍｍ）に切り分け、ヒグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ、オランダ）５ｍｇ／Ｌを含有するＳＩ培地に背軸面で移した。耐性のある緑色のシュートとカルスが５〜８週間の培養で出現した。濃度を高めたヒグロマイシンＢ（１０ｍｇ／Ｌ及び１５ｍｇ／Ｌ）を使用して第２選択及び第３選択を行うために、緑色のカルスと芽を同一の選択培地上に移した。最後に、ヒグロマイシンＢ１５ｍｇ／Ｌ補充ＭＳ培地（ＭＳ塩類及びビタミン、ショ糖３０ｇ／Ｌ、フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）４ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）上に耐性を有する芽を植え付け、植物を得た。すべての培養段階は光条件で１６時間と暗条件で８時間の管理下で実施した。
【００４９】
ヒグロマイシンＢに耐性のある一部のクローンのＧＵＳ活性は、ＪｅｆｆｅｒｓｏｎによるＸ−ｇｌｕｃを用いて、組織化学的アッセイによって分析した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｒ．Ａ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、１９８７、５：３８７−４０５）。３種類の形質転換実験とそれらのコントロールの結果を表２に示す。
【表２】
2006500037.tif 000003
【００５０】
さらに、任意に選択した一部のクローンについては、ＰｓｔＩ制限酵素で消化した、ショ糖勾配精製の葉緑体ＤＮＡのサザンブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により、キメラＤＮＡ断片の葉緑体ゲノムへの組込みを明らかにした。また、プローブとしてはｒｂｃＬ遺伝子の標識化断片を使用した（図５）。分析したすべての陽性クローンでは、予想していた約６．８ｋｂのバンドが得られ、ネガティブコントロール（非形質転換植物）では、予想していた２１．５ｋｂのバンドが得られた。遺伝子導入クローンの一部を非選択的培地で増殖させた場合、サザンブロットにより、これらのクローンでは５．５ｋｂのハイブリダイズバンドが得られた。このことから、遺伝子に接する直接反復配列間の相同組換えによって、マーカー遺伝子（ｈｇｈ）が除去されていることが明らかである。
【００５１】
自家受粉により種子を得るため、植え付けた遺伝子導入クローンの一部を温室へ移した。集めた種子をＭＳ培地、及びヒグロマイシンＢ１５ｍｇ／Ｌ補充ＭＳ培地で発芽させたところ、これらのクローン中のマーカー遺伝子の除去が確認されたが、ＧＵＳ活性は維持されていた。これによって、遺伝子導入植物のホモプラスミー状態が確認された。
【００５２】
さらに、本発明者らの実験において、選択薬剤としてヒグロマイシンＢを使用した場合、色素体形質転換実験で選択薬剤としてスペクチノマイシンを使用した場合に得られた結果とは異なって、自然発生的突然変異体は得られなかったことに注意されたい。しかし、遺伝子導入植物の再生に選択薬剤の適当な濃度を設定することは必要であった。
【００５３】
これらの実験データから、本発明の目的のベクターの機能性、及び任意の供給源由来の目的の遺伝子を発現する遺伝子導入植物の取得に関する有用性が明らかである。
【実施例３】
【００５４】
２種類の色素体機能性プロモーター（ｐＶＴＰＡ−ａａｄＡ）の調節下でのタバコ遺伝子導入植物における非相同性モノシストロニックユニットの発現。
ｐＶＴＰＡベクターを用いることによって、Ｐｒｒｎプロモーター及びコメｒｂｃＬプロモーターの調節下、色素体において遺伝子を発現させることが可能である。この目的においては、配列番号２０及び配列番号２１に記載したオリゴヌクレオチドを用いて、酵素アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａａｄＡ、抗生物質ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンに対する耐性を付与する）をベクターｐＤＥ１００１（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｇｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ベルギー）からＰＣＲによって増幅した。上述の２種類のプロモーターの転写調節の下、増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）消化のベクターｐＶＴＰＡへクローニングし、構築物ｐＶＴＰＡ−ａａｄＡ（配列番号２２）を得た。タバコ遺伝子導入植物は、実施例２に記載した方法に従って得たが、第１の選択サイクルでスペクチノマイシン（５００ｍｇ／Ｌ）を用い、第２の選択サイクルでストレプトマイシン（５００ｍｇ／Ｌ）を用いて遺伝子導入クローンを選択するという点を変更した。遺伝子導入植物の取得頻度を特徴の異なるベクターを用いて比較するため、本発明者らは、ベクターｐＶＳＲ３２６ＭＯＤ（ＩＣＧＩＢ、Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ、インド）を用いていくつかの形質転換実験を実施した。このベクターは、タバコｒｂｃＬと、ｐｓｂＡ遺伝子プロモーター及びターミネーター調節下のｇｕｓ遺伝子；Ｐｒｒｎプロモーター及びｒｂｃＬ遺伝子のターミネーター調節下のａａｄＡ遺伝子を含むａｃｃＤ遺伝子２発現カセットとの間に挿入した。２回の再生／選択サイクルと、選択無しのインビトロ培養における３回のサイクルの後のこれらの形質転換実験の結果を表３に示す。
【表３】
2006500037.tif 000004
【００５５】
得られた実験結果から、色素体起源のターミネーター配列を保持していない本発明の目的のベクターは、遺伝子導入植物を高頻度で産生するという本発明者らの仮説が確かめられた。さらに、縦列２種類のプロモーター（ＰｒｂｃＬ及びＰｒｒｎ）の転写調節下における外来遺伝子（この場合、ａａｄＡ遺伝子）の発現に、本ベクターが提供できる可能性も明らかとなった。
【実施例４】
【００５６】
トマト遺伝子導入植物における非相同性ジシストロンユニットの発現（ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ−ａａｄＡ）
本発明の目的のベクターは、ポリシストロンユニット形態の複数の遺伝子を発現する可能性を示す。この可能性を説明する目的で、ベクターｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ（実施例２を参照）で、ｇｕｓ遺伝子の下流にａａｄＡ遺伝子を挿入し、トリシストロンユニットを形成した（ｈｇｈマーカー遺伝子は、ｒｂｃＬプロモーターから生じたｍＲＮＡの一部として発現されると考えられる）。これは、相同組換えによるｈｇｈ選択マーカー除去後、β−グルクロニダーゼ及びアミノグリコシド３’−アデニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子だけを発現する。
【００５７】
ａａｄＡ遺伝子を実施例３に記載したＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳのＡｐａＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗ平滑化）にクローニングし、ベクターｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ−ａａｄＡ（配列番号２３）を得た。この新しいベクターを用い、以下に記載した方法に従って、トマト遺伝子導入植物を得た。
【００５８】
滅菌トマト種子（ｖａｒ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−２８）を１／２希釈したＭＳＯ媒体（ＭＳ塩類、Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５ビタミン、ショ糖３０ｇ／Ｌ、ｐｈｙｔｏａｇａｒ  ８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）上に１２日間播種し、子葉をＭＳＯ液体培地中で回収し、４時間、予備浸透処理するために、ゼアチン１ｍｇ／Ｌ及びマニトール０．４Ｍを補充したＭＳＯ固形培地を入れたペトリ皿に背軸面で培養した。形質転換は、タバコに関する実施例２に記載した遺伝子銃法によって行った。ボンバード処理した子葉を同じ培地中で１４〜１６時間保持した後、ゼアチン１ｍｇ／Ｌ補充のＭＳＯ培地上に背軸面で２日間置いた。続いて、ボンバード処理した子葉を、ゼアチン１ｍｇ／Ｌ及びヒグロマイシンＢ５ｍｇ／Ｌ（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を補充したＭＳＯ培地に背軸面で移した。耐性を有する緑色のシュートとカルスが培養３〜６週間で出現し、１０ｍｇ／ＬのヒグロマイシンＢ濃度を含む第２の選択サイクルの同一選択培地に移した。３〜４週後、耐性のある緑色のシュートとカルスをゼアチン０．１ｍｇ／Ｌ及びヒグロマイシンＢ１５ｍｇ／Ｌを含むＭＳＯ培地に移し、３週間後、ヒグロマイシンＢ１５ｍｇ／Ｌを補充したＭＳＯ培地上に根付かせた。すべての培養段階は、光条件１６時間、暗条件８時間の管理下で行った。得られたクローンについて、スペクチノマイシン（Ｓｐｃｒ）５００ｍｇ／Ｌに対する耐性とＧＵＳ遺伝子発現（組織化学的アッセイによる）を評価した。３つの形質転換実験の結果を以下の表に示す。
【表４】
2006500037.tif 000005
【００５９】
植物を温室条件下で培養した場合、トマトの遺伝子導入植物と非形質転換植物の間に表現型の差は認められなかった。従って、ハイブリッドａｔｐＢタンパク質及びｒｂｃＬタンパク質の機能と、これらのタンパク質を遺伝学的に操作して色素体の代謝活性を改良する実現可能性が確認された。
【００６０】
本実施例は、本発明の目的のベクターについて、同一ｍＲＮＡの一部として種々の遺伝子を発現する能力を示しているだけでなく、色素体ゲノムへ非相同性ＤＮＡを組み込むためにボーダー配列のドナーとして用いられている植物とは異なる遺伝子導入被子植物を取得するためのビヒクルとして、これらのベクターが万能であることが確認された。
【実施例５】
【００６１】
タバコ遺伝子導入植物における２つの非依存性転写ユニットの発現（ｐＶＴＰＡ−ＨＢ−ａａｄＡ）。多重結合ワクチン抗原を発現する遺伝子導入植物の取得。
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｐ；Ｇｒａｙ  Ｐ；Ｑｕｉｒｏｇａ  Ｍ；Ｚａｌｄｉｖａｒ  Ｊ；Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｈ．Ｍ；Ｒｕｔｔｅｒ  Ｗ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９７９、２８０：８１５−８１９）をコードする遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（Ｋｌｅｎｏｗ平滑化）／ＮｃｏＩの消化によるプラスミドｐＳＡ０５０３（ＣＩＧＢ、キューバ）から取得し、ＨＢｓＡｇ翻訳開始コドンの上流のリボソーム結合部位に融合させるためにＮｃｏＩ／ＳｍａＩ消化のｐＶＩＥＰ−２ベクター（実施例２を参照）に挿入し、プラスミドｐＶＩＥＰ−２−ＨＢを得た。Ｂ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子を含む８２０ｂｐのＤＮＡ断片は、ＸｈｏＩの消化によるプラスミドｐＶＩＥＰ−２−ＨＢから取得し、ＳａｌＩで消化したｐＶＴＰＡ−ａａｄＡベクター（実施例３を参照）でａａｄＡ遺伝子の上流にクローニングし、ベクターｐＶＴＰＡ−ＨＢ−ａａｄＡ（配列番号２４）を得た。これは、コメｒｂｃＬプロモーターの転写調節下の適切な方向にＨｂｓＡｇ遺伝子を有しており、且つＰｒｒｎプロモーター下でマーカー遺伝子ａａｄＡ及びｈｇｈを発現する。
【００６２】
実施例２に記載した形質転換プロトコルに従って、ベクターｐＶＴＰＡ−ＨＢ−ａａｄＡを用い、Ｂ型肝炎表面抗原を発現するタバコ遺伝子導入植物を得た。遺伝子導入植物の選択は、最初にヒグロマイシンＢ１０ｍｇ／Ｌを用いて行い、最後に、スペクチノマイシン５００ｍｇ／Ｌに対する耐性、並びにＥＬＩＳＡ特異的アッセイ（ＣＩＧＢ、キューバ）及びウェスタンブロット（図６）によるＨｂｓＡｇの発現を確認した。得られた結果を表５に示す。
【表５】
2006500037.tif 000006
【００６３】
これらの結果から、本発明の目的のベクターは、２つ以上の遺伝子を発現する遺伝子導入植物ゲノム中の非依存性転写ユニットとして有用性があることが明らかである。さらに、多重結合複合体を形成する有用タンパク質をコードする色素体遺伝子の発現に本ベクターが有用であることも明らかであった。特に、本発明者らは、Ｂ型肝炎ウイルス表面多重結合抗原の発現を達成した。本明細書に記載したものは他のワクチン抗原に適用可能であり、且つ植物細胞中で発現されるものは、ヒト又は動物に提供した場合にこれらの感染因子に対する免疫を誘導することができる調製物として製剤化可能であることは明らかである。本ベクターによって発現可能な別の多重結合性タンパク質は免疫グロブリンである。
【実施例６】
【００６４】
２つのプロモーター及び１つのミニシストロンの調節下の色素体における異種遺伝子の発現（ｐＶＴＰＡ−ＧＵＳ１−ａａｄＡ及びｐＶＴＰＡ−ＧＵＳ３−ａａｄＡ）。
【００６５】
本発明の目的のベクターの遺伝子クローニング及び遺伝子発現ための仲介ベクターｐＶｌＥＰ（実施例２を参照）は、ＰｐｓｂＡ＊プロモーターと、生成ｍＲＮＡの翻訳の安定性向上と促進を図るように設計したミニシストロンの調節下で遺伝子をクローニングすることができる。実施例２に記載したｕｉｄＡ遺伝子のクローニングにこれを用い、プラスミドｐＶＩＥＰ−ＧＵＳ１を得た。
【００６６】
ミニシストロンの機能性を確認するため、ミニシストロンをＳｎａＢＩとＮｄｅＩ消化によりプラスミドｐＶＴＥＰから切断し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理で平滑化し、再連結し、ｐＶＩＥＰ−３ベクターを得て、遺伝学的構築物を作製した。ここで、ｕｉｄＡ遺伝子は前述のようにしてクローニングし、プラスミドｐＶＩＥＰ−３を得た。ｇｕｓ遺伝子を含有する両発現カセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ消化により仲介ベクターから取得し、ｐＶＴＰＡ−ａａｄＡベクターにクローニングした。最終的に得られたこの構築物は、コメｒｂｃＬプロモーター及びＰｐｓｂＡ＊プロモーターの調節下のｇｕｓ遺伝子を含有しており、それらをそれぞれｐＶＴＰＡ−ＧＵＳ１−ａａｄＡ及びｐＶＴＰＡ−ＧＵＳ３−ａａｄＡと命名した。これらのプラスミドにより、タバコ植物色素体を実施例２に記載のようにして形質転換した。
【００６７】
両構築物により遺伝子導入植物を取得し、本発明者らは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ記述によるプロトコルに従って（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｒ．Ａ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、１９８７、５：３８７−４０５）、４−ＭＵＧを用いた蛍光測定法により各構築物由来の５つのクローンについてＧＵＳ発現レベルの比較を行った。結果を表６に示す。
【表６】
2006500037.tif 000007
【００６８】
前述の表から明らかなように、縦列のコメｒｂｃＬプロモーター及びＰｐｓｂＡ＊プロモーター調節下のｕｉｄＡ遺伝子を発現する両構築物により、高レベルのＧＵＳ活性が得られた。さらに、ミニシストロンを含有する遺伝学的構築物を含む形質転換植物におけるＧＵＳ活性平均値が有意に高いことが明らかであった。従って、色素体中のこの遺伝学的エレメントの機能性と、この植物細胞器官における遺伝子発現を高めるツールとしての有用性が証明された。
【実施例７】
【００６９】
構築物ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ−ａａｄＡによるコメ遺伝子導入植物の取得。
コメ遺伝子導入植物は、以下のプロトコルを用いて取得した。コメ胚形成カルスは、Ｎ６−２培地（Ｎ６−２培地の塩類及びビタミン（Ｃｈｕ  Ｃ．Ｃ；他、Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｓｉｎｉｃ、ｌ９７５、１８：６５９）；ミオイノシトール０．１ｇ／Ｌ；カゼイン加水分解物１ｇ／Ｌ；２，４Ｄ  ２ｍｇ／Ｌ；ショ糖３０ｇ／Ｌ；ｐｈｙｔａｇｅｌ  ３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．７）で２１日間培養した滅菌コメ成熟種子から得た。これらのカルスを５日間新しいＮ６−２培地で前培養した後、暗条件にて４８〜７２時間、カイネチン３ｍｇ／Ｌ補充Ｎ６−２培地に置いた。ボンバードメント前に、浸透前処理用のマニトール０．４Ｍ補充の同じ培地中で胚形成カルスを前培養する。約３０個のカルスをペトリ皿上に置き、実施例２に記載のように、プラスミドｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ−ａａｄＡで被覆した金粒子（０．６μｍ）をボンバードメントに用いた。ボンバード処理したカルスを暗条件で同じ浸透培地中に１６時間保持した後、続いて、同じ条件下で２日間Ｎ６−２培地中にて前培養する。その後、ヒグロマイシンＢを２０ｍｇ／Ｌ補充したＮ６−２培地にカルスを移す。１０日後、１０日間の第２選択サイクルを行うために、新しい同じ培地に抗生物質耐性カルスを移す。最後に、ヒグロマイシンＢ  ３０ｍｇ／Ｌを補充した改変ＫＩＢＡＮ再生培地（ＭＳ培地の塩類及びビタミン；カイネチン３ｍｇ／Ｌ；ＢＡＰ  ０．５ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ  １ｍｇ／Ｌ；マルトース３０ｇ／Ｌ；ｐｈｙｔａｇｅｌ  ４．５ｇ／Ｌ；ｐＨ５．８）に耐性カルスを移し、明条件１６時間、暗条件８時間の光周期で３〜４週間培養した後、得られた約２ｃｍの緑色シュートをヒグロマイシンＢ２０ｍｇ／Ｌを含む改変ＭＳ液体培地（ＭＳ培地の塩類及びビタミン；ショ糖３０ｇ／ｌ；ＢＡＰ  ５ｍｇ／Ｌ；ｐＨ５．７）中のミクロ増殖サイクルに移した。この液体培地５０ｍＬを含む三角フラスコにシュートを入れ、１５０ｒｐｍで撹拌を行いながら、明条件１６時間、暗条件８時間の光周期で２８℃にてインキュベートした。７日間のインキュベーション後、インキュベートしたそれぞれのシュートにつき、約７個の新しいシュートを取得し、ショ糖３０ｇ／ＬとヒグロマイシンＢ  ３０ｍｇ／Ｌを含むＭＳ固体培地上に植え付けた。
【００７０】
得られた遺伝子導入クローンについて、スペクチノマイシン耐性（５００ｍｇ／Ｌ）、並びに組織化学的アッセイによるｇｕｓ遺伝子の発現について評価した。さらに、ボンバード処理前にサイトカイニンで細胞を前処理すると、遺伝子導入植物の産生の頻度が有意に増加することが明らかとなった。これらの形質転換実験の結果を表７に示す。
【表７】
2006500037.tif 000008
【００７１】
本実施例では、単子葉植物種の形質転換による、本発明の目的のベクターの万能性と機能性が確認された。
【実施例８】
【００７２】
構築物ｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ−ａａｄＡによるサトウキビ遺伝子導入植物の取得。
サトウキビ遺伝子導入植物の取得は、以下の記載のようにして行った。６か月齢の圃場植物（ｖａｒ．Ｊａ６０−５）から、茎の根元から出ている若いサトウキビの葉の部分を０．５×１ｃｍ切片に切り出し、滅菌し、カイネチン３ｍｇ／Ｌ補充のＰ＋５固形培地（ＭＳの塩類及びビタミン；ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ；カゼイン水解物５００ｍｇ／Ｌ；ショ糖２０ｇ／Ｌ；２，４Ｄ  ５ｍｇ／Ｌ；ｐｈｙｔａｇｅｌ  ４ｇ／Ｌ；ｐＨ５．７）上で４８時間、光条件で培養した。その後、ボンバード処理前の事前浸透処理を行うため、マニトール０．４Ｍ補充の同一培地上に組織片を６〜８時間、光条件下に置いた。プラスミドｐＶＴＰＡ−ｆ−ＧＵＳ−ａａｄＡで金粒子（０．６μｍ）を被覆し、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、実施例２に記載したようにボンバードメントを行った。ボンバード処理した組織片を暗条件にて２４時間、同一培地上で保持した後、２日間Ｐ＋５培地上に置き、その後暗条件にて、ヒグロマイシンＢを１５ｍｇ／Ｌ補充したＰ＋５培地中で培養した。ヒグロマイシン耐性カルスが培養４週間で出現し、光条件下における再生のため、ヒグロマイシンＢを含むＰ−固形培地（２，４Ｄ非含有のＰ＋５培地）上に移した。耐性のある再生シュートを単離し、ヒグロマイシンＢを２０ｍｇ／Ｌを含むＰ−培地上に植え付けた。
【００７３】
得られたサトウキビのクローンについて、スペクチノマイシン（５００ｍｇ／Ｌ）耐性及びｇｕｓ遺伝子の発現（組織化学的アッセイによる）を評価した。２つの形質転換実験の結果を表８に示す。
【表８】
2006500037.tif 000009
【００７４】
本実施例では、被子植物とは異なった遺伝子導入被子植物の取得用ビヒクルとして、本発明の目的のベクターが万能であることが再確認された。本ベクターは、色素体ゲノムへ非相同性ＤＮＡを組み込むための組換えボーダーとして用いられる配列のドナーとして有用である。
【実施例９】
【００７５】
望ましい農業形質を保持する遺伝子導入植物の取得。
新しく組み込まれた農業形質を持つ遺伝子導入植物の取得は、環境に新しい遺伝子を拡散するリスクなく、害虫、病気及び雑草対策、収率の向上、コストの低減及び良質の農産物を達成する上での重点目標である。
【００７６】
ホスフィノトリシン（ＢＡＳＴＡ（登録商標）除草剤の有効成分）アセチルトランスフェラーゼをコードしている、ストレプトマイセスヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）の遺伝子ｐａｔ（ｂａｒ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｃ．Ｊ；Ｍｏｖｖａ  Ｎ．Ｒ；Ｔｉｚａｒｄ  Ｒ；Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｒ；Ｄａｖｉｅｓ  Ｊ．Ｅ；他、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８７、６：２５１９−２５２３）は、ＸｂａＩ（ＳＩヌクレアーゼ平滑化）及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢＳ−Ｂａｒ（Ｃ．Ｉ．Ｇ．Ｂ）から取得し、ＮｃｏＩ（ＳＩヌクレアーゼ平滑化）及びＢａｍＨＩ消化により処理したベクターｐＶＩＥＰ−２（実施例２を参照）へクローニングし、プラスミドｐＶＩＥＰ２−Ｂａｒを得た。ＸｈｏＩ消化によりｐＶＩＥＰ２−Ｂａｒから得られたＲＢＳとともにｐａｔ遺伝子を含有する６７０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＶＴＰＡベクターへクローニングし、構築物ｐＶＴＰＡ−Ｂａｒを得た（配列番号２５）。タバコ遺伝子導入植物は実施例２に記載したプロトコルに従って取得し、培地中のホスフィノトリシン（Ｄｕｃｈｅｆａ、オランダ）５ｍｇ／Ｌに対する耐性によって形質転換体を同定した。得られた結果を表９に示す。
【表９】
2006500037.tif 000010
【００７７】
本発明の目的のベクターにおける、除草剤（グリホサート、アシュラム、スルホニル尿素、イミダゾリノン及びブロモキシニル等）耐性を付与する他の遺伝子のクローニングと発現により、これらの化学薬品に耐性のある遺伝子導入植物が得られることが明らかであった。同様に、本発明の目的のベクターの使用により、害虫及び病気への耐性を付与する遺伝子導入植物遺伝子、例えば、バチルススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のタンパク質結晶をコードする遺伝子、又はキチナーゼ及びグルカナーゼ等の抗真菌活性、若しくはコリンオキシダーゼ等の抗非生物ストレス特性を有するタンパク質をコードする遺伝子のクローニングと発現が実施可能である。光合成能力又は植物生産物の質を高める遺伝子の改変又は導入は、本発明が明示する被子植物色素体形質転換の万能ベクターを使用して改良することができる植物機能の一部である。
【実施例１０】
【００７８】
色素体における非栽培的用途のタンパク質の発現。
実施例５において、本発明者らは、被子植物色素体中の多重結合タンパク質をコードする遺伝子を安定導入し発現させる本発明の目的のベクターの有用性を説明した。医学用、獣医学用又は工業用用途の他のタンパク質も同様に、本発明者らの形質転換／発現ベクター系による遺伝子導入植物中で産生することが実現可能である。
【００７９】
血栓症と心臓発作の治療に非常に有用な線維素溶解薬ストレプトキナーゼを葉緑体中で発現するために、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ）の成熟タンパク質ＳＫＣ−２をコードする１２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ（ＳＩヌクレアーゼ平滑化）及びＢａｍＨＩ消化によりｐＥＫＧ−３ベクター（Ｅｓｔｒａｄａ  Ｍ．Ｐ；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｌ；Ｐｅｒｅｚ  Ａ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐ；Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｒ；Ｒｕｂｉｅｒａ  Ｒ；Ｐｅｄｒａｚａ  Ａ；他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２、１０：１１３８−１１４２）から切り出し、ＮｃｏＩ（ＳＩヌクレアーゼ平滑化）／ＢａｍＨＩ消化のベクターｐＶＩＥＰ（実施例２を参照）に挿入し、プラスミドｐＶＩＥＰ−Ｓｔｒｅｐを得た。ＰｐｓｂＡ＊プロモーター及びミニシストロン調節下の色素体中のストレプトキナーゼ遺伝子発現用のカセットは、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化によりプラスミドｐＶＩＥＰ−Ｓｔｒｅｐから取得し、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＶＴＰＡベクター（実施例１を参照）へクローニングし、プラスミドｐＶＴＰＡ−Ｓｔｒｅｐ（配列番号２６）を構築した。
【００８０】
実施例２に記載したベクターｐＶＴＰＡ−Ｓｔｒｅｐによりタバコ植物色素体を形質転換した。得られた結果を表１０に示す（一部のクローンで産生されたストレプトキナーゼの繊溶活性は、カゼイン／プラスミノゲンプレート法によって測定した（Ｅｓｔｒａｄａ  Ｍ．Ｐ；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｌ；Ｐｅｒｅｚ  Ａ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｐ；Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｒ；Ｒｕｂｉｅｒａ  Ｒ；Ｐｅｄｒａｚａ  Ａ；他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２、１０：１１３８−１１４２）。
【表１０】
2006500037.tif 000011
【００８１】
これらの結果によれば、色素体中の有用なタンパク質、特に、血栓溶解薬、インターフェロン、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、抗原、細胞受容体等の医薬用途又は獣医学用途のタンパク質をコードする遺伝子の発現において、本発明の目的のベクターが有用であることが確認された。本明細書で例示したものは、本明細書に記載している形質転換／発現ベクターを用いることによって、工業用途の別の酵素及びタンパク質（リパーゼ、プロテアーゼ等）の色素体における発現にも適用することができることは明らかである。
【実施例１１】
【００８２】
色素体における免疫グロブリンの発現。
ＨｂｓＡｇ特異的ＣＢ−Ｈｅｐ．１モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ断片は、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ消化によりプラスミドｐＨＥＳΩＨＢｓＡｇＣＬ及びｐＨＥＳΩＨＢｓＡｇＣＨ（Ｎａｄｉａ  Ｒａｍｉｒｅｚ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．）：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、ＰｈＤ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｃ．Ｉ．Ｇ．Ｂ．、２００２）からそれぞれ取得し、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩで消化したｐＶｌＥＰベクターに挿入し、プラスミドｐＶＩＥＰ−Ｈｃ及びｐＶｌＥＰ−Ｌｃを得た。続いて、軽鎖をコードするＤＮＡ断片をＳｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ消化によりｐＶＩＥＰ−Ｌｃプラスミドから切り出し、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＶＩＥＰ−Ｈｃプラスミドに挿入し、ジシストロン構築物ｐＶＩＥＰ−ＨｃＬｃを得た。さらに、重鎖及び軽鎖（それぞれＲＢＳに結合されているもの）を含む発現カセットをＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＶＴＰＡ−ｆベクターへクローニングし、それによってプラスミドｐＶＴＰＡ−ｆ−ＨｃＬｃを得た。このプラスミドを実施例２に記載したタバコ色素体の形質転換に用いた。
【００８３】
ウェスタンブロットにより得られた遺伝子導入植物を分析し、ＣＢ−Ｈｅｐ．１モノクローナル抗体の両鎖の存在を検出した（図７）。さらに、遺伝子導入植物から得たタンパク質抽出物を用いて製造した組換え免疫グロブリンの機能は、ＥＬＩＳＡ（アルカリフォスファターゼに結合したウサギ抗マウスポリクローナル抗体で示す）おいて、ＨｂｓＡｇの存在が明らかであることが証明された。
【００８４】
この実験から、本発明者らの形質転換／発現ベクターを用いることにより、遺伝子導入植物における機能抗体を十分に産生できる可能性が明らかとなった。また同時に、本発明者らは、色素体において多重結合タンパク質が発現し、確実に集積される可能性があることを再確認した。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１−Ａは、異なる分類の被子植物（単子葉植物又は双子葉植物）に属する、ａｔｐＢボーダー（斜線で示す）及びｒｂｃＬボーダー（格子線で示す）によって限定される、多重クローニング部位（ＭＣＳ１）を含有する領域を示す本発明の目的のベクターを構築するための基本構造である。  図１−Ｂは、本発明の目的のベクターに関する一般構造（ｒｂｃＬｐｒはｒｂｃＬ遺伝子のプロモーターであり、ａｔｐＢｐｒはａｔｐＢ遺伝子のプロモーターであり、Ｔｅｒｍは非色素体起源の転写ターミネーターであり、マーカーは選択マーカー遺伝子であり、Ｒ１、Ｒ２は相同組換えによりマーカー遺伝子を除去することができる直接反復配列である）である。  図Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆは、本発明の目的のベクターの変異体であり、１種（Ｃ、Ｅ、Ｆ）又は複数（Ｄ、Ｆ）の色素体機能性プロモーター（Ｐｒ、Ｐｒ１、Ｐｒ２）の調節下の、モノシストロニックユニット（Ｅ、Ｆ）、ジシストロニック（Ｃ、Ｅ、Ｆ）又はトリシストロニック（Ｄ）としての１種又は複数の目的の遺伝子（遺伝子、遺伝子１、遺伝子２）が発現する可能性を示している。
【図２】被子植物の色素体の形質転換体ｐＶＴＰＡ−ｆのベクターの地図である。
【図３】被子植物の色素体の形質転換体ｐＶＴＰＡのベクターの地図である。
【図４】色素体中の遺伝子発現の仲介ベクターｐＶｌＥＰ（Ｓ／Ｄは、シャイン−ダルガノ配列である）の地図である。
【図５】ＰｓｔＩで消化し、プローブとして３２Ｐ標識化ｒｂｃＬ遺伝子の５’断片を使用した、ショ糖勾配精製による葉緑体ＤＮＡ１０μｇのサザンブロットである。レーン１は非形質転換植物であり；レーン２〜６は形質転換植物（植物すべてがホモプラスミーであることが認識可能である）であり；レーン７及び８はインビトロ組織培養の最後のサイクル中、選択薬剤の不在下で増殖させた形質転換植物（マーカー遺伝子が全く除去されていないレーン７に注目されたい）である。
【図６】葉緑体におけるＢ型肝炎表面抗原の発現に本発明の目的の形質転換ベクターを使用することを説明するためのウェスタンブロットを示す。全１０μｇの葉タンパク質を各レーンに使用した。レーン１は非形質転換植物であり；レーン２〜５はＨｂｓＡｇを発現する遺伝子導入植物（２５ｋＤａの想定分子量のＢ型肝炎ウイルスに対する抗体によりシグナルが現れたことを確認することができる）である。
【図７】モノクローナル抗体に適合する重鎖及び軽鎖の色素体での発現に本発明の目的の形質転換ベクターを使用することを説明するウェスタンブロットである。全１０μｇの葉タンパク質を各レーンに使用した。レーン１は非形質転換植物であり；レーン２〜５は組換え抗体ＣＢ−Ｈｅｐ．１を発現する遺伝子導入植物（免疫グロブリンの重鎖（５０ｋＤａ）及び軽鎖（２５ｋＤａ）に対応するシグナルを確認することができる）である。
【図１−１】
2006500037.tif 000012
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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