(57)【要約】本発明は、同族のリガンドの強力な阻害剤である３量体の腫瘍壊死因子受容体の製造方法を供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）膜貫通性活性化因子かつＣＡＭＬ（カルシウム信号変調シクロフィリンリガンド）相互作用因子（ＴＡＣＩ）の細胞外ドメイン、および（２）３量体化ポリペプチド、を含んで成る単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを含んで成るホモ３量体タンパク質の複合体。
【請求項３】
ＴＡＣＩの細胞外ドメインが、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基３０から１１０、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基１から１１０、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基３０から１５４、および（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基１から１５４、から成る群から選択される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
３量体化ポリペプチドが、ヒトのコラーゲンＸのＮＣ-１断片を含んで成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
３量体化ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を含んで成る、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
ＴＡＣＩの細胞外ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基３０から１１０を含んで成る、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチドを含んで成る、ホモ３量体タンパク質の複合体。
【請求項８】
３量体化ポリペプチドが、熱ショック結合タンパク質-１の３量体化断片である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
３量体化ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
ＴＡＣＩの細胞外ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基３０から１１０を含んで成る、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドを含んで成る、ホモ３量体タンパク質の複合体。
【請求項１２】
以下の機能するように結合した因子：
転写プロモーター；
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列および
転写ターミネーター、
を含んで成る、発現ベクター。
【請求項１３】
上記請求項に記載のポリペプチドを発現する、請求項１２に記載の発現ベクターを導入した培養細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞の培養、および上記請求項に記載のポリペプチドを含んで成るホモ３量体タンパク質の複合体を回収する工程を含んで成る、ホモ３量体タンパク質の複合体の生産方法。
【請求項１５】
（１）ＴＡＣＩの細胞外ドメインおよび（２）３量体化ポリペプチドを含んで成るポリペプチドを含んで成るホモ３量体タンパク質の複合体への、Ｂ細胞の暴露を含んで成る、ＴＮＦ４誘発式Ｂ細胞増殖の阻害方法。
【請求項１６】
上記請求項に記載のホモ３量体の複合体が請求項７に記載の複合体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記請求項に記載のホモ３量体の複合体が請求項１１に記載の複合体である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーは、宿主の防衛、炎症、および自己免疫に関する分子のラージファミリーであり、そしてヒトの疾患に関与している。ＴＮＦの阻害を狙った治療薬剤は、炎症性疾患、例えば、リューマチ性関節炎および炎症性腸炎の制御において有効である。追加的なＴＮＦ/ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーは、現在のところ、自己免疫疾患、アテローム硬化、骨粗鬆症、移植拒絶反応および癌に対する治療を対象としている。
【０００２】
ＴＮＦおよびＴＮＦ受容体ファミリーはともに、自己組織化３量体として活性であるが、機能上、２量体分子、例えば、抗体または受容体ＩｇＧ融合物だけが治療薬剤として使用されてきた。ＴＮＦスーパーファミリー中のリガンドおよび受容体の両方により表される３回回転対称は、拮抗物質に基づく３量体の受容体が増加した結合活性を表すはずであり、このため、２量体分子と比較して増加した有効性を示す。
【０００３】
したがって、安定な３量体としてのＴＮＦリガンドおよびＴＮＦ受容体の簡単な発現方法のための必要性は依然として存在する。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、２量体の受容体分子と比較した場合、それらの同種のリガンドの生物学的活性のより効力のある阻害剤である、３量体のＴＮＦ受容体の生産方法を供する。
【０００５】
以下に説明するように、本発明は、（１）膜貫通性活性化因子かつＣＡＭＬ（カルシウム信号変調シクロフィリンリガンド）相互作用因子（ＴＡＣＩ）の細胞外ドメイン、および（２）３量体化ポリペプチド、を含んで成るポリペプチドを供する。適当なＴＡＣＩの細胞外ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基３０から１１０、および（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基１から１１０、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基３０から１５４、および（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基１から１５４、を含む。実例となる３量体化ポリペプチドは、ヒトのコラーゲンＸのＮＣ-１断片および熱ショック結合タンパク質-１（Heat Shock Binding Protein-1）の３量体化断片を含む。本発明はさらに、ＴＡＣＩの細胞外ドメインおよび３量体化ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質のホモ３量体の複合体を供する。
【０００６】
本発明のこれらおよび他の観点は、以下の詳細な説明および図の参酌により明らかとなるであろう。付け加えると、様々な引用を以下に示し、そして、それら全体における引用により組み入れられている。
【０００７】
発明の簡単な説明
１．定義
以下の説明において、番号の語は広範囲に使用される。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を与える。
【０００８】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」はポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連反応（ＰＣＲ）により生成された断片、および何らかの連結、切断、エンドヌクレアーゼの作用およびエキソヌクレアーゼの作用により生成された断片を意味する。核酸分子は、自然に発生するヌクレオチドの単量体（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、自然に発生するヌクレオチドの類似体（例えば、自然に発生するヌクレオチドのα-光学異性体）、または両方の組み合わせである単量体で構成されてよい。修飾されたヌクレオチドは、糖の一部および/またはピリミジンもしくはプリン塩基の一部において変化を有してもよい。糖修飾は、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基での１以上のヒドロキシル基の置換を含み、あるいは、糖はエーテルまたはエステルとして官能性を持たせることができる。さらに、すべての糖の部分は、立体配置的および電子的に類似した構造体、例えば、アザ糖および炭素環式糖の類似体により置換してもよい。塩基部分の修飾の例は、アルキル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環の置換を含む。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこれらの類似体の結合により連鎖させることができる。ホスホジエステル類似体の結合は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート等を含む。「核酸分子」の語もまた、自然に発生し、あるいは修飾された、ポリアミドの主軸を形成する核酸塩基を含んで成るいわゆる「ペプチド核酸」を含む。核酸は１本鎖または２本鎖のいずれかでよい。
【０００９】
「核酸分子の補体」の語は、相補ヌクレオチド配列および関連するヌクレオチド配列と比較して逆配向を有する核酸分子を意味する。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に相補的である。
【００１０】
「コンティグ」の語は、他の核酸分子と同一または相補的な配列の連続鎖を有する核酸分子を意味する。コンティグ配列は、核酸分子の所定の鎖と当該核酸分子の全部または部分的な伸展のいずれかにおいて、「オーバーラップ」と言われる。例えば、ポリヌクレオチド５’ＡＴＧＧＡＧＣＴＴ３’に対する代表的なコンティグは５’ＡＧＣＴＴgagt３’および３’tcgacＴＡＣＣ５’である。
【００１１】
「構造遺伝子」の語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写される核酸分子を意味し、それから特異的なポリペプチドのアミノ酸配列に特徴的に翻訳される。「注目の遺伝子」は構造遺伝子であってよい。
【００１２】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は逆転写酵素によりｍＲＮＡの鋳型から形成される１本鎖ＤＮＡ分子である。一般的に、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーは逆転写の最初に必要とされる。また、これらの当業者はこれらの１本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖からなる２本鎖ＤＮＡを意味して「ｃＤＮＡ」を使用する。「ｃＤＮＡ］の語はまた、ＲＮＡの鋳型から合成されるｃＤＮＡ分子のクローンも意味する。
【００１３】
「単離核酸分子」は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された成長因子をコードするＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の他の例は、生物のゲノムに組み込まれない化学合成した核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子はその種由来の染色体の完全ＤＮＡ分子よりも小さい。
【００１４】
「核酸分子作成物」は天然には存在しない配列に混合あるいは配列した核酸のセグメントを含ませるために、人工的に修飾された１本鎖または２本鎖のいずれかの核酸分子である。
【００１５】
「直鎖状ＤＮＡ」は、非環状の５’および３’末端を有する非環状ＤＮＡ分子を意味する。直鎖状ＤＮＡは、酵素消化または物理的な破壊により、閉環状ＤＮＡ分子、例えば、プラスミドから調製できる。
【００１６】
「プロモーター」は構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。一般的に、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域、すなわち、構造遺伝子の転写開始部位の近くに存在する。転写の開始に作用するプロモーター中の配列因子は、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。これらのプロモーター因子は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的因子（McGehee et al., Mol.Endocrinol.7:551(1993))、サイクリックＡＭＰ応答因子、血清応答因子（Treisman,Seminars in Cancer Biol.1:47(1990))、グルココルチコイド応答因子および他の転写因子の結合部位、例えば、ＣＲＥ/ＡＴＦ（O'Reilly et al.,J.Boil.Chem.267:19938(1992))、ＡＰ２（Ye et al.,J.Boil.Chem.269:25728(1994))、ＳＰ１、タンパク質結合ｃＡＭＰ応答因子（Loeken,Gene Exper.3:253(1993))およびオクタマー因子(一般に、Watson et al.,eds.,Molecular Biology of the Gene,4th ed.(The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.1987)およびLemaigre and Rousseau,Biochem.J.303:1(1994)参照）を含む。仮にプロモーターが誘導性プロモーターであれば、転写の割合は誘発剤に対する応答において増加する。反対に、仮にそのプロモーターが、恒常的プロモーターであれば、転写の割合は誘発剤によって調節されない。また、制止プロモーターも知られる。
【００１７】
「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写の開始点を含む、プロモーターの機能に不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義により、コアプロモーターは、活性を増強し、あるいは組織に特異的な活性を与えるであろう特異的な配列の欠如において、検知可能な活性を有しても、あるいは有さなくてもよい。
【００１８】
「調節因子」はコアプロモーターの活性を変化させるヌクレオチド配列である。例えば、調節因子は、排他的に、あるいは選択的に、特に、細胞、組織、またはオルガネラでの転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含んでよい。これらの調節因子のタイプは通常、「細胞に特異的な」、「組織に特異的な」あるいは「オルガネラに特異的な」方法において発現する遺伝子に関係する。
【００１９】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向に関係なく、転写の効率を増大させることができる型の調節型因子である。
【００２０】
「異種ＤＮＡ」とは、与えられた宿主細胞中に天然には存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子群を意味する。宿主のＤＮＡが非宿主のＤＮＡと結合している限り、特定の宿主細胞に対する異種ＤＮＡ分子は、宿主細胞種（即ち、内生ＤＮＡ）から派生したＤＮＡを含んでもよい。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主のＤＮＡセグメントと機能するように結合したポリペプチドをコードする非宿主のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子と考えられる。反対に、異種ＤＮＡは、非宿主の遺伝子から派生するプロモーターと機能するように結合する内生遺伝子を含んで成ってよい。他の説明によれば、野生型遺伝子が欠失した突然変異細胞にＤＮＡ分子を導入するとすれば、野生型細胞由来の遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子は異種ＤＮＡと考えられる。
【００２１】
「ポリペプチド」は、天然的にあるいは合成的に生成されようとも、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基のポリマーである。約１０以下のアミノ酸残基のポリペプチドは一般に、「ペプチド」を意味する。
【００２２】
「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖を含んで成る巨大分子である。また、タンパク質は、非ペプチド成分、例えば糖群を含んで成ってよい。糖および他の非ペプチド置換物は、タンパク質を生産する細胞によりタンパク質に加えてもよく、細胞のタイプで変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸の主鎖構造として本明細書において定義される。置換基、例えば炭水化物基は、一般に、具体的に挙げられていないが、存在してもよい。
【００２３】
細胞中で、異種核酸分子から合成されたペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００２４】
「組み込まれた遺伝子因子」は、宿主細胞の染色体に組み入れたＤＮＡセグメントであり、その後、因子は人工的に細胞に導入される。本発明中、もっとも一般的には、組み込まれた遺伝子因子は、電気穿孔法または他の技術により細胞に導入した線状プラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子因子は、親の宿主細胞からその子孫に受け継がれる。
【００２５】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において、独立して自己複製する能力を有する核酸分子、例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージである。一般的に、クローニングベクターは、ベクターの必須の生物学的機能を失わない測定可能な方法において核酸分子の挿入を許容する１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びに、クローニングベクターで形質転換した細胞の識別および選択における使用に適当であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は、一般的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を供する遺伝子を含む。
【００２６】
「発現ベクター」は宿主細胞中で発現する遺伝子をコードする核酸分子である。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含んで成る。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下におかれ、そしてこれらの遺伝子は、プロモーターと「機能するように結合」するべきとされる。同様に、調節因子がコアプロモーターの活性を変化させた場合、調節因子およびコアプロモーターは機能するように結合している。
【００２７】
「組み換え宿主」は、異種核酸分子、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む細胞である。
【００２８】
「組み込み形質変換体」は、異種ＤＮＡを細胞のゲノムＤＮＡに組み入れた組み換え宿主細胞である。
【００２９】
「発現」の語は、遺伝子生産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１以上のペプチドへの翻訳を含む。
【００３０】
「分泌シグナル配列」は、細胞の分泌経路を通して、より大きなポリペプチドペプチドがそこで合成されることを導く、より大きなポリペプチドの成分としてのペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を意味する。
【００３１】
「単離ポリペプチド」は夾雑している細胞成分、例えば、糖、脂質、または天然にタンパク質に会合する他のタンパク質不純物を本質的に含まないポリペプチドである。一般的に、単離ポリペプチドの調製は、高純度、すなわち、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、９５％以上の純度または９９％以上の純度のポリペプチドを含む。特定のタンパク質の調製が単離ポリペプチドを含むことを示す一つの方法は、タンパク質の調製のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）-ポリアシルアミドゲル電気泳動およびそのゲルのクマシーブリリアントブルー染色後の一本のバンドの出現によるものである。しかしながら、「単離」の語は、他の物理的形態、例えば、２量体、あるいは、グリコシル化または誘導体化の形態における同一のポリペプチドの存在を除外するわけではない。
【００３２】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」はポリペプチド中の位置を示すために本明細書において使用する。文脈が許す場合、これらの語は、近接のまたは相対位置を示すためのポリペプチドの特定の配列または部分に対する引用とともに使用する。例えば、ポリペプチド中の関連する配列に対するカルボキシル末端に位置する配列は、関連する配列のカルボキシルの終端に対して近接するが、完全ポリペプチドのカルボキシルの終端にある必要はない。
【００３３】
「融合タンパク質」は、２以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現した雑種タンパク質である。このように、融合タンパク質は、天然には互いに会合しない２以上のアミノ酸配列を含んで成る。
【００３４】
発現ベクターの成分を説明するために使用する場合、「遺伝子または遺伝子断片」はポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。その遺伝子または遺伝子断片は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはin vitro 合成技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、化学合成等）により得ることができる。
【００３５】
「アフィニティタグ」の語は、本明細書において、２番目のポリペプチドの精製または検出を供するため、あるいは、基質に対する２番目のポリペプチドの結合のための部位を供するために２番目のポリペプチドと結合できるポリペプチドセグメントを意味する。原則として、抗体または他の特異的な結合剤として入手可能ないかなるペプチドまたはタンパク質もアフィニティタグとして使用できる。アフィニティタグは、ポリヒスチジン系、プロテインＡ（Nilsson et al.,EMBO J.4:1075(1985);Nilsson et al.,Method Enzymol.198:3(1991))、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson,Gene 67:31(1988))、Ｇｌｕ-Ｇｌｕアフィニティタグ（Grussenmeyer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952(1985))、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧペプチド（Hopp et al.,Biotechnology 6:1204(1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインを含む。一般には、Ford et al.,Protein Expression and Purification 2:95(1991)を参照のこと。アフィニティタグをコードするＤＮＡ分子は、商業者から入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
【００３６】
本明細書で使用する、「免疫調節因子」は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、共-刺激分子、造血因子、およびこれらの分子の合成類似体を含む。免疫調節物質の例は、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、幹細胞成長因子、エリトロポイエチンおよびトロンボポイエチンを含む。
【００３７】
「免疫グロブリン部分」は、免疫グロブリンの定常部を含んで成るポリペプチドを意味する。例えば、免疫グロブリン部分はＨ鎖の定常部を含んで成ってよい。
【００３８】
「補体/抗補体の対」は、非共有結合的に結合した、非同一部分であり、適当な条件下で安定な対を意味する。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は補体/抗補体の対のプロトタイプメンバーである。他の例としての補対/抗補体の対は、受容体/リガンドの対、抗体/抗原の対（または、ハプテンもしくはエピトープ）の対、センス/アンチセンスポリヌクレオチドの対等を含む。
【００３９】
「抗体断片」は、抗体、例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等の一部である。構造に関わらず、抗体断片は、無処置の抗体により認識される同じ抗原と結合する。
【００４０】
また、「抗体断片」は、特異的な抗原と結合する、合成の、あるいは遺伝子改変したポリペプチド、例えば、Ｌ鎖可変部からなるポリペプチド、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変部から成る「Ｆｖ」断片、その中のＬ鎖およびＨ鎖の可変部がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により結合される組み換え１本鎖ポリペプチド分子、および高頻度可変部を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニットを含む。
【００４１】
「検出標識」は、結合しているポリペプチドのパートナーを発現する細胞を識別するための有用な分子を生成するためにポリペプチドと接合できる分子または原子である。検出標識の例は、キレート剤、感光剤、放射性同位体、蛍光試薬、常磁性イオンまたは他のマーカー部分を含む。
【００４２】
標準的な分析方法の不正確さにより、ポリマーの分子量および長さは、おおよその値として理解される。これらの値が「およそ」Ｘまたは「約」Ｘとして表現している場合、記載されたＸの値は、正確には±１０％として理解すべきであろう。
【００４３】
２．ホモ３量体ペプチドの生産のための発現ベクター
本発明はホモ３量体タンパク質の生産方法を供する。それぞれのホモ３量体のタンパク質は注目のポリペプチドおよび３量体化アミノ酸配列を含んで成る融合タンパク質である。注目のポリペプチドは受容体の細胞外ドメインを含み、それはそれらの同属のリガンドと結合するために使用できる。適当な受容体は腫瘍壊死因子受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（また、「ｐ５５」、「ＴＮＦＲ-６０」および「ＴＮＦ-Ｒ」と称される。例えば、Genbank No.M75866 を参照のこと）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（また、「ｐ７５」、および「ＴＮＦＲ２」と称される。例えば、Genbank No.M32315 を参照のこと）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（「ＴＡＣＩ」としても知られる）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（「ＢＡＦＦＲ」および「Ｚｔｎｆｒ１２」としても知られる。例えば、Genbank No.AF373846 を参照のこと)、ＴＮＦＲＳＦ１７（「ＢＣＭＡ」としても知られる。例えば、Genbank No.Z29574 を参照のこと)等を含む。他の有用な腫瘍壊死因子受容体は当業者に知られている。
【００４４】
本実施例は、膜貫通性活性化因子かつＣＡＭＬ（サイクロフィリンリガンドを変調するカルシウムシグナル）相互作用因子（ＴＡＣＩ）の細胞外ドメインを含んで成る融合タンパク質の作成を示す。ＴＡＣＩ核酸およびアミノ酸配列は、Bram and Gotz、米国特許番号5,969,102号により説明され、そして本明細書において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３および４として含まれる。説明のＴＡＣＩ細胞外ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の３０から１１０のアミノ酸残基、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１から１１０のアミノ酸残基、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の３０から１５４のアミノ酸残基、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１から１１０のアミノ酸残基を含んで成るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００４５】
また、本実施例は、２つのタイプの３量体化アミノ酸配列の使用を示す。：カルボキシ末端、ヒトのコラーゲンＸの１５１アミノ酸のＮＣ-１領域、およびタンパク質ＨＳＢＰ-１と結合しているヒトの熱ショック因子の１から６５アミノ酸。ＮＣ-１ドメインは、Frischholz et al.,J.Biol.Chem.273:4547(1998)により説明されている。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９および２０として供されている。ＨＳＢＰ-１は、Tai et al.J.Biol.Chem.277:735(2002)により説明されている。ＨＳＢＰ-１の有用な断片のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１および２２として供されている。
【００４６】
３量体化アミノ酸配列に加えて、融合タンパク質は、さらに、そのタンパク質を可溶にするために、免疫グロブリン部分を含んで成ることができる。その免疫グロブリン部分は、Ｈ鎖定常部、例えば、ヒトのＨ鎖定常部を含んで成ってよい。ＩｇＧ１Ｈ鎖定常部は、適当なＨ鎖定常部の一例である。説明のＩｇＧ１Ｈ鎖定常部はＣH2およびＣH3ドメインを含んで成るＩｇＧ１Ｆｃ断片である。そのＩｇＧ１Ｆｃ断片は、野生型のＩｇＧ１Ｆｃ断片または突然変異されたＩｇＧ１Ｆｃ断片であってよい。
【００４７】
発現ベクターは注目のポリペプチドおよび３量体化アミノ酸配列を含んで成る融合タンパク質をコードするように作成できる。真核細胞におけるタンパク質の生産のために適当な発現ベクターは、一般的に（１）細菌の複製開始点並びに細菌宿主中の発現ベクターの成長および選択を供するための抗生物質耐性マーカーをコードする原核生物のＤＮＡ因子；（２）転写の開始を制御する真核生物のＤＮＡ因子、例えば、プロモーター；および（３）転写のプロセッシングを制御するＤＮＡ因子、例えば、転写終了/ポリアデニル化シグナル配列、を含む。
【００４８】
遺伝子を発現するため、タンパク質をコードする核酸分子を転写の発現を制御する調節配列と機能するように結合させ、それから宿主細胞に導入しなければならない。転写調節配列、例えば、プロモーターおよびエンハンサーに追加して、発現ベクターは転写および翻訳調節配列を含むことができる。説明のように、哺乳類宿主に適当なその転写および翻訳調節シグナルは、ウイルス源、例えば、アデノウイルス、ウシのパピローマウイルス、サルのウイルス等に由来してもよく、その調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。適当な転写および翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えば、アクチン、コラーゲン、ミヨシンおよびメタロチオネインの遺伝子から得てもよい。
【００４９】
適当な転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。説明の真核生物のプロモーターはマウスのメタロチオネインＩ（metallothionein Ｉ）遺伝子のプロモーター（Hamer et al.,Molec.Appl.Genet.1:273(1982))、ヘルペス（Herpes)ウイルスのＴＫプロモーター（McKnight,Cell 31:355(1982))、ＳＶ４０アーリープロモーター（Benoist et al.,Nature 290:304(1981))、ラウス（Rous)肉腫ウイルスプロモーター（Gorman et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 79:6777(1982))、サイトメガロウイルスプロモーター（Foecking et al.,Gene 45:101(1980))、およびマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（一般的に、Etcheverry,"Expression of Engeered Proteins in Mammalian Cell Culture,"in Protein Engineering:Principles and Practice,Cleland et al.(eds.),ページ163-181（John Wiley＆Sons,Inc.1996)参照)を含む。
【００５０】
一方、仮に、原核生物のプロモーターが真核生物のプロモーターにより調節される場合、原核生物のプロモーター、例えば、バクテリオファージ（bacteriophage)Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは哺乳類細胞中の注目の遺伝子の発現を制御するために使用できる（Zhou et al.,Mol.Cell.Biol.10:4529(1990)、およびKaufman et al.,Nucl.Acids Res.19:4485(1991))。
【００５１】
アフィニティタグの包含は、融合タンパク質を示す細胞の認識または選択のために有用である。アフィニティタグの例は、ポリヒスチジンタグ（ニッケルキレート化樹脂と親和性を有する）、抗-ｍｙｃ抗体で検出されるｃ-ｍｙｃタグ（例えば、ＥＱＫＬＩ ＳＥＥＤＬ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリンアフィニティクロマトグラフィーで単離される）、サブスタンスＰ、ＲＹＩＲＳタグ（抗-ＲＹＩＲＳ抗体と結合する）、抗体で検出される赤血球凝集素Ａエピトープタグ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｇｌｕ-ＧｌｕタグおよびＦＬＡＧタグ（抗-ＦＬＡＧ抗体と結合する）を含む。例えば、Luo et al.,Arch.Biochem.Biophys.329:215(1996)、Morganti et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.23:67(1996)、およびZheng et al.,Gene 186:55(1997)を参照のこと。これらのペプチドタグをコードする核酸分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis,MO)から入手できる。
【００５２】
クローニング部位はマルチクローニング部位であってよい。いかなるマルチクローニング部位も使用でき、そして多くが商業的に入手可能である。特に有用なマルチクローニング部位は、３つのすべての読み枠において遺伝子または遺伝子断片のクローニングを許容する。
【００５３】
発現ベクターは、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。広範な種々の選択マーカー遺伝子は入手可能である（例えば、Kaufman,Meth.Enzymol.185:487(1990);Kaufman,Meth.Enzymol.185:537(1990)参照のこと）。例えば、１つの適当な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンへの耐性を供する遺伝子である。この場合、選択はネオマイシン型の薬剤、例えば、Ｇ-４１８等の存在中で行われる。ブレオマイシン耐性遺伝子、例えば、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子もまた、今説明の方法に有用な選択マーカー遺伝子である。これらの遺伝子はブレオマイシン/フレオマイシン型薬剤、例えば、ＺＥＯＣＩＮの活性を阻害するタンパク質を生産する（Gatignol et al.,Mol.Gen.Genet.207:342(1987);Drocourt et al.,Nucl.Acids Res.18:4009(1990)。ＺＥＯＣＩＮは、細菌、真菌、植物、トリ、昆虫および哺乳類の細胞を含む細胞の広範囲における毒素である。追加的な選択マーカーはヒグロマイシンＢ-ホスホトランスフェラーゼ、ＡＵＲ１遺伝子生産物、アデノシンデアミナーゼ、アミノグルコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロホレートレダクターゼ、チミジンキナーゼ、およびキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む（例えば、Srivastava and Schlessinger,Gene 103:53(1991);Romanos et al.,"Expression of Cloned Genes in Yeast,"in DNA Cloning 2:Expression Systems,2nd Edition,ページ123-167（IRL Press 1995);Markie,Methods Mol.Biol.54:359(1996);Pfeifer et al.,Gene 188:183(1997);Tucker and Burke,Gene 199:25(1997);Hashida-Okado et al.,FEBS Letters 425:117(1998)を参照）。選択マーカー遺伝子は、公表されたヌクレオチド配列を使用してクローンされ、あるいは合成されてもよく、あるいは、マーカー遺伝子は商業的に入手可能である。
【００５４】
発現ベクターはＳＶ４０開始点を含んでもよい。この因子は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞株中でエピソームの複製および救出のために使用できる。
【００５５】
発現ベクターへの挿入に適当な遺伝子または遺伝子断片はｃＤＮＡから得ることができる。それは、いかなる公知技術方法によっても調製される。例えば、ｃＤＮＡ分子は、ランダムプライミングにより合成できる。さらに、このようなプライマーは、ベクターにおいて発見される制限エンドヌクレアーゼ部位と結合できる。あるいは、ｃＤＮＡ分子はオリゴｄ（Ｔ）プライミングにより調製できる。また、遺伝子または遺伝子断片は、ゲノムＤＮＡから、あるいは化学合成により得ることができる。適当な遺伝子または遺伝子断片の調製のための標準的な方法は、当業者に知られている（例えば、Ausubel et al.(eds.),Short Protocols in Molecular Biology,3rd Edition(John Wiley＆Sons 1995)["Ausubel 1995"]）。
【００５６】
発現ベクターを作成後、核酸ポリマーの産生のための核酸分子の合成のために、宿主細胞中でそのベクターを増殖させることができる。しばしば「シャトルベクター」と称するベクターは、２以上の無関係な発現系において複製することができる。このような複製を促進するため、そのベクターは、各複製系において各々が有効な、２以上の複製開始点含むべきである。一般的に、シャトルベクターは真核生物系および原核生物系において複製することが可能である。これは真核生物の宿主である「発現細胞型」中のタンパク質の発現の検出および原核生物の宿主である「増幅細胞型」中のベクターの増幅を可能にする。説明のように、一方の複製開始点はＳＶ４０に由来してよく、他方の複製開始点はｐＢＲ３２２に由来してよい。当業者は、多数の適当な複製開始点を知っている。
【００５７】
ベクターの増殖は、原核生物の宿主細胞、例えば、大腸菌（E.coli)または枯草菌（Bacillus subtilus)中で簡単に行うことができる。適当な大腸菌（E.coli)株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ'、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ/ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、およびＥＲ１６４７を含む（例えば、Brown(ed.),Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991)参照のこと）。適当な枯草菌（Bacillus subtilus）株は、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０、およびＢ１７０を含む（例えば、Hardy,"Bacillus Cloning Methods,"in DNA Cloning:A Practical Approach,Glover(ed.)(IRL Press 1985)参照のこと）。原核生物の宿主中のベクターの増殖のための標準的な技術は、当業者にとって周知である（例えば、Ausubel 1995;Wu et al.,Methods in Gene Biotechnology(CRC press,Inc.1997)を参照のこと）。
【００５８】
３．宿主細胞による組み換えタンパク質の生産
発現ベクターは、いかなる真核生物細胞、例えば、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、トリの細胞、真菌の細胞等にも導入することができる。適当な哺乳動物の宿主細胞の例は、アフリカミドリザルの腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）、ヒト胎児の腎臓細胞（２９３-ＨＥＫ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、ベビーハムスターの腎臓細胞（ＢＨＫ-２１、ＢＨＫ-５７０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５４４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０３１４）、イヌの腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、中国ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ-Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１；ＣＨＯ ＤＧ４４（Chasin et al.,Som.Cell.Molec.Genet.12:555(1986))、ラットの下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２．２）、ラットの肝臓細胞（Ｈ-４-II-Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＳＶ４０-形質転換化したサルの腎臓細胞（ＣＯＳ-１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）およびマウス胎児の細胞（ＮＩＨ-３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）を含む。
【００５９】
バキュロウイルス系は、クローン化した注目の遺伝子を昆虫の細胞中に導入するために有効な手段を供する。適当な発現ベクターはオートグラファ・カリフォルニカ・マルチプルヌクレアポリヘドロシスウイルス（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)（ＡｃＭＮＰＶ）に基づき、そして周知のプロモーター、例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）の熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）の７０プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアポリヘドロシスウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)の前初期遺伝子のプロモーター（ｉｅ-１)および遅延性の初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスのｐ１０プロモーター、およびショウジョウバエのメタロチオネイン（Drosophila metallothionein)プロモーターを含む。組み換えバキュロウイルスを生成する２つ目の方法は、Luckow（Luckow,et al.,J.Virol.67:4566(1993))により説明されるトランスポゾン基準系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系はＢＡＣ-ｔｏ-ＢＡＣキットとして販売されている（Life Technologies,Rockville,MD)。この系は、遺伝子または遺伝子断片を、「バクミド」と呼ばれる巨大プラスミドとして大腸菌（E.coli）中に維持されるバキュロウイルスのゲノムに移動させるために、トランスファーベクターであるＴｎ７トランスポソンを含むＰＦＡＳＴＢＡＣ（Life Technologies)を利用する。Hill-Perkins and Possee,J.Gen.Virol.71:971(1990)、Bonning,et al.,J.Gen.Virol.75:1551(1994)、およびChazenbalk,and Rapoport,J.Biol.Chem.270:1543(1995)を参照のこと。これらのベクターは上記の説明に従い改変できる。
【００６０】
組み換えウイルスまたはバクミドは、宿主細胞にトランスフェクションするために使用される。適当な昆虫宿主細胞は、ＩＰＬＢ-ｓｆ-２１由来の細胞株、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞株、例えば、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ、およびＳｆ２１（Invitrogen Corporation;San Diego,CA)、並びにショウジョウバエのシュナイダー２（Drosophila Schneider-2）細胞、およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来のＨＩＧＨＦＩＶＥＯ細胞株（Invitrogen)（米国特許番号5,300,435号）を含む。商業的に入手可能な無血清培地は細胞を成長させるため、および維持するために使用できる。適当な培地は、Ｓｆ９細胞にはＳｆ９００IITM（Life Technologies）またはＥＳＦ９２1TM（Expression Systems)；そしてＴ．ｎｉ細胞にはＥｘ-ｃｅｌｌＯ４０５TM（JPH Biosciences,Lenexa,KS)またはＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯTM（Life Technologies）である。組み換えウイルスを使用する場合、その細胞は、約２-５×１０5の細胞密度から１-２×１０6の細胞密度に成長させる。その場合、組み替えウイルスのストックは、０．１から１０の多重感染度（ＭＯＩ）、さらに一般的には３付近で加えられる。
【００６１】
バキュロウイルス系中の組み換えタンパク質を生産するための確立された技術は、Bailey et al.,"Manipulation of Baculovirus Vector,"in Methods in Molecular Biology,Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols,Murray(ed.),ページ147-168(The Humana Press,Inc.1991),by Patel et al.,"The baculovirus expression system,"in DNA Cloning 2:Expression Systems,2nd Edition,Glover et al.(eds.), ページ205-244(Oxford University Press 1995),by Ausubel(1995) ページ16-37から16-57,by Richardson (ed.),Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press,Inc.1995),and by Lucknow,"Insect Cell Expression Technology,"in Protein Engineering:Principles and Practice,Cleland et al., ページ183-218(John Wiley＆Sons,Inc.1996)により供される。
【００６２】
また、本明細書において説明する発現ベクターは、酵母菌の細胞を含む真菌類細胞にトランスフェクションするために使用できる。この点に関して特に注目の酵母菌種は、出芽酵母（Saccharomyces cervisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）を含む。酵母菌中の発現に適当なプロモーターは、ＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）等由来のプロモーターを含む。多くの酵母菌クローニングベクターは容易に入手可能であり、そして上記の説明に従い改変できる。これらのベクターは、ＹＩｐ系ベクター、例えば、ＹＩｐ５、ＹＲｐベクター、例えば、ＹＩｐ１７、ＹＥｐベクター、例えば、ＹＥｐ１３およびＹＣｐベクター、例えば、ＹＣｐ１９を含む。外来性ＤＮＡでの出芽酵母（S.cerevisiae）の形質転換およびそれからの組み替えポリペプチドの生成方法は、例えば、Kawasaki、米国特許番号4,599,311号、Kawasaki et al.、米国特許番号4,931,373号、Brake、米国特許番号4,870,008号、Welch et al.、米国特許番号5,037,743号、およびMurray et al.、米国特許番号4,845,075号により開示されている。形質転換化細胞は、選択マーカーにより決定される表現型、一般的に、薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の不在における成長能により選択される。出芽酵母（Saccharomyces cervisiae）中の使用のための好ましいベクター系は、Kawasaki et al.（米国特許番号4,931,373)により開示されたＰＯＴ１ベクター系であり、それは、形質転換化細胞がグルコース含有媒地における成長により選択されることを許容する。酵母菌での使用のための追加的な適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許番号4,599,311号、Kawasaki et al.、 米国特許番号4,615,974号およびBitter、米国特許番号4,977,092号を参照のこと）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを含む。また、米国特許番号4,990,446号、5,063,154号、5,139,936号、および4,661,454号を参照のこと。
【００６３】
ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、スキゾサッカロマイセス・プロムベ(Schizosaccharomyces prombe)、クルイベロマイセス・ラクチス( Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、ウスチラゴ・マイジス(Ustilago maydis)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・グイレルモンジイ(Pichia guillermondii)、およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含む他の酵母菌のための形質転換系は、当業界において知られている。例えば、Gleeson et al.,J.Gen.Microbiol.132:3459(1986)、およびGregg,米国特許番号4,882,279号を参照のこと。アスペルギルス(Aspergillus)細胞は、McKnight et al.、米国特許番号4,935,349号の方法に従い利用できる。アクレモニウム・クリソゲヌム(Acremonium chrysogenum)の形質転換の方法は、Sumino et al.、米国特許番号5,162,228号により開示されている。ネウロスポラ（Neurospora)の形質転換の方法は、Lambowitz、米国特許番号4,486,533号により開示されている。
【００６４】
例えば、組み換えタンパク質の生産のための宿主としてのピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)の使用は、Raymond、米国特許番号5,716,808号、Raymond、米国特許番号5,736,383号、Raymond et al.,Yeast 14:11-23(1998)、および国際公開番号ＷＯ97/17450、ＷＯ97/17451、ＷＯ98/02536、およびＷＯ98/02565により開示されている。ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)の形質転換に使用のＤＮＡ分子は、一般的に２本鎖の環状プラスミドとして調製されるものと思われ、好ましくは形質転換の前に直線化される。Ｐ・メタノリカ(P methanolica)におけるポリペプチドの生産のために、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、Ｐ・メタノリカ(P methanolica)遺伝子のもの、例えば、Ｐ・メタノリカ(P methanolica)アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）であることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、およびカタラーゼ（ＣＡＴ）のものを含む。宿主染色体へのＤＮＡの組み込みを促進するため、宿主のＤＮＡ配列により両末端に隣接するプラスミドのすべての発現セグメントを有することが好ましい。メタノールの使用を最小化することが望ましい大規模な工業的工程には、そこに両方のメタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が欠失した宿主細胞を使用することが好ましい。選択されたタンパク質の生産には、液胞においてプロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）が欠乏した宿主細胞が好ましい。注目のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの、Ｐ・メタノリカ(P methanolica)の細胞への導入を促進するために電気穿孔法が使用される。Ｐ・メタノリカ(P methanolica)の細胞は、電界強度が、２．５から４．５ｋＶ/ｃｍ、好ましくは約３．７５ｋＶ/ｃｍ、および時定数（ｔ）が１から４０ミリ秒、最も好ましくは約２０ミリ秒である、指数関数的に減衰する電場を使用した電気穿孔法により形質転換することができる。
【００６５】
発現ベクターは、カラムホスフェイトトランスフェクション、リポソーム性トランスフェクション、微粒子性伝達、電気穿孔法等を含む種々の標準的な技術を使用して宿主細胞へと導入できる。
【００６６】
発現ベクターを哺乳動物、酵母菌、および昆虫の細胞へ導入するための標準的な方法は、例えば、Ausubel(1995)により供される。哺乳動物の細胞系により生産された外来タンパク質の発現および回収方法は、例えば、Etcheverry,"Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,"in Protein Engineering：Principles and Practice、Cleland et al.(eds.)、ページ163（Wiley-Liss,Inc.1996)により供される。バキュロウイルス系から組み換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson(ed.)、Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press,Inc.1995)により説明されている。
【００６７】
発現ベクターは、注目のポリペプチドを生産する細胞から単離することができる。所望すれば、発現ベクターを同定可能なポリペプチドの発現に基づく選択の他の部分に服従させることあるいは増幅細胞にトランスフェクションすることができる。それから、トランスフェクションした増幅細胞を選択マーカーにより選択し、そのベクターを精製し、そして、当業界におけるいかなる既知の方法により遺伝子または遺伝子断片のヌクレオチド配列を配列決定する。仮にヌクレオチド配列が完全ポリペプチド部分のみをコードするならば、そのヌクレオチド配列は、その全遺伝子を検索するために当業界における既知の方法によりプローブとして使用することができる。
【００６８】
本発明、このように一般的な説明は、以下の実施例を参照により、さらに容易に理解されるだろう。これらは説明の方法により供され、そして、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００６９】
ＴＡＣＩ-ＮＣ１の作成
発現ベクターは、膜貫通性活性化因子かつ（カルシウム信号変調シクロフィリンリガンド）相互作用因子（ＴＡＣＩ）のタンパク質の細胞外ドメインおよびヒトのコラーゲンＸのＮＣ１ドメインを含んで成る融合物をコードするように作成する。ＴＡＣＩの核酸配列は、Bram and Gotz,米国特許番号5,969,102号により説明され、そして本明細書中にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３および４として含まれる。ＮＣ-１ドメインは、Frischholz et al.,J.Biol.Chem.273:4547(1998)により説明される。：ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書中、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９および２０として供される。本作成において、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを、ｃ-終端におけるＧｌｕ-ＧｌｕタグおよびＴＡＣＩとＮＣ１の間に設計された８つのアミノ酸のＧｌｙ-ＳｅｒスペーサーでＮＣ１と融合した。
【００７０】
ＮＣ１は、オリゴヌクレオチド ｚｃ４０２１９（５’ＧＧＧＣＣＴＣＣＡＧ ＧＣＣＣＡＣＣＡＧＧ Ｔ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびｚｃ４０２０５（５’ＴＣＡＣＡＴＴＧＧＡ ＧＣＣＡＣＴＡＧＧＡ Ａ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を使用してヒトのゲノムＤＮＡ（Clontech)からＰＣＲにより増幅した。ＴＡＣＩの細胞外の部分は、９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で２分の３０サイクルの条件で、オリゴヌクレオチドｚｃ４０９１５（５’ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣ ＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡ ＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧ ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡ ＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧ ＡＧＡＧＧＧ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびｚｃ４０９１７（５’ＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣ ＡＴＣＧＡＡＣＣＣＧ ＡＡＣＣＣＧＡＡＣＣ ＧＧＡＴＣＣ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）でＴＡＣＩ免疫グロブリン融合タンパク質をコードするクローンからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生産物を沈殿させ、そして１０μｌの水に再懸濁し、それから出芽酵母（S.cerevisiae）中のＢｇｌIIで消化したｐＺＭＰ２１へ組み換えた。その組み換え結果の大腸菌（E.coli)のクローンを、適切な組み入れのために、ＡｓｃＩ消化によりスクリーニングし、そして配列決定のために３つのポジティブクローンを使用した。１つのクローンをさらなる実験のために選択した。このクローンは、ＮＣ１中でグリシンからアルギニンへの突然変異を含み、Ｃ末端のＧｌｕ-Ｇｌｕタグから４つのアミノ酸が欠失していた。
【００７１】
ＴＡＣＩ/ＮＣ１-ＥＥをコードするベクターは、電気穿孔のために、２０μｇのQiagen精製化ＤＮＡをＰｖｕＩで消化することより直線化した。この直線化ＤＮＡをＰＦ-ＣＨＯ細胞中で電気穿孔した。その細胞を、１０日間のＨＴ培地における栄養素の選択の前に２４時間回復させた。栄養素の選択から回復後、細胞をさらに１０日間、５０ｎｍのメトトリキサート（methotrexate)選択に移動した。
【００７２】
トランスフェクションした細胞を細胞工場（cell factories)に播種し、そして２リットルの工場調整培地（ＣＭ）を単離した。ＣＭを１．５ｍｇの抗-ＴＡＣＩモノクローナル抗体と混合し、４℃で一昼夜インキュベートした。ＣＭ-抗体混合物を、流速２ｍＬ/ｍｉｎで１．６ｍＬの総容積のＰＯＲＯＳ Ａ５０カラムに適用した。加えた後、カラムを１００カラム容量のｐＨ７．２のＰＢＳで洗浄した。その結合タンパク質をそれから直接、ｐＨ８．０の２ＭのトリスとｐＨ２．５の２００ｍｌのグリシンへと溶出した。１ミリリットルのフラクションを収集した。ウェスタンブロット分析に基づき、ＴＡＣＩ-ＮＣ１を含むフラクションを貯蔵した。その貯蔵したフラクションを３００μｌに濃縮し、そして、バッファーをｐＨ７．２の１４ｍＬのＰＢＳで３回交換し、それから３交換のｐＨ７．２の４ＬのＰＢＳに対して透析した。
【実施例２】
【００７３】
哺乳動物細胞中のＴＡＣＩ-ＨＳＢ１の発現
ＨＳＢ１遺伝子の合成
ヒトの熱ショック結合タンパク質（ＨＳＢＰ-１）はTai et al.J.Biol.Chem.277:735(2002)により説明されている。ＨＳＢＰ-１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１および２２として供される。４つのオーバーラップしているオリゴヌクレオチド（ヒトの熱ショック結合タンパク質（ＨＳＢＰ-１）のセンスおよびアンチセンス鎖の両方をコードした）を以下のプライマーを使用して固相合成により合成した。：５’ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＧＣＣＧＡＡＡ ＣＴＧＡＴＣＣＴＡＡ ＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡ ＧＡＣＣＴＴＡＣＣＡ ＧＣＧＴＡＧＴＣＣＡ ＧＡＣＧＣＴＣＣＴＧ ＣＡＡＧＡＧＡＴＣＧ ＡＡＧＡＴＡＡＧＴＴ ＴＣＡＧＡＣＴＡＴＧ ＡＧＣＧＡＣＣＡＡＡ ＴＣＡＴＴＧＡＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；５’ＡＧＡＡＴＧＣＡＴＧ ＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣ ＣＡＧＧＡＴＡＧＡＴ ＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡ ＡＡＡＡＴＡＴＡＧＣ ＡＧＡＴＴＴＡＡＴＧ ＡＣＧＣＡＡＧＣＴＧ ＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡ ＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡ ＡＧＴＧＧＴＴＣＴＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；５’ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣ ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣ ＣＡＡＣＴＣＴＴＣＣ ＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴ ＧＣＧＴＣＡＴＴＡＡ ＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡ ＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡ ＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴ ＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣ ＡＴＧＴＣＡＴＣＧＡ ＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；および５’ＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ ＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴ ＧＡＡＡＣＴＴＡＴＣ ＴＴＧＣＡＴＣＴＣＴ ＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧ ＴＣＴＧＧＡＣＴＡＣ ＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧ ＴＣＴＴＧＡＡＣＴＧ ＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣ ＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣ ＡＴＧＧＡＴＣＣ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。各オリゴヌクレオチドの５末端は、１２０ｐモルの各オリゴヌクレオチド、１．６μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、３４μｌの５×Ｔ４-キナーゼバッファー（Life Technologies,Bethesda,MD)、６．４μｌの水、および１μｌのＴ４-ポリヌクレオチドキナーゼ（Life Technologies）の混合によりリン酸化し、そして３７℃で２０分間インキュベートした。そのリン酸化反応は、沸騰したウォーターバス中に置いて、それから、アニーリングを促進させるためにゆっくりと２５℃まで冷却した。その断片を２０μｌの１０×Ｔ４-リガーゼバッファー（Life Technologies）、０．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、および２μｌのＴ４-ＤＮＡリガーゼ（Life Technologies）を加えることにより連結させ、そして、１６℃で一昼夜インキュベートした。連結後、そのＤＮＡをアルコール沈殿により採取した。その単離ＤＮＡを、３．２μｌのＢ制限バッファー（Promega,Madison,WI)、２６．８μｌの水、１．５μｌのＢｇｌII（Life Technologies）、および１．５μｌのＡｓｐ７１８（Life Technologies）中で再懸濁し、そして、３７℃で２時間インキュベートした。そのリガーゼ反応生成物を１５％アガロースゲル上で分画し、そして、ヒトのＨＳＢＰ-１をコードする２２０ヌクレオチド断片を、製造業者の手順（Quiagen）に従い Quiagen ゲル単離キットを使用して単離した。ヒトのＨＳＢＰ-１をＴ４-ＤＮＡリガーゼおよび製造業者のガイドライン（Life Technologies）を使用してＡｓｐ７１８-ＢａｍＨＩの切断したベクターに挿入した。
【００７４】
ＴＡＣＩの細胞外ドメインをコードする断片を、オリゴヌクレオチドｚｃ４１７１２（５’ＣＡＣＡＣＧＴＡＣＧ ＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧ ＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧ ＡＧＧ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）およびｚｃ４１６３８（５’ＧＧＴＴＡＧＡＴＣＴ ＣＧＡＡＣＣＣＧＡＡ ＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を使用してｐＴＡＣＩ-ＮＣ１ベクターから増幅させた。そのＰＣＲ生成物をＢｓｉＷ１およびＢｇｌIIで切断し、そして１．５％アガロースゲル上で、増幅させたＤＮＡを分画し、それから、製造業者の手順（Quiagen）に従い Quiagen ゲル単離キットを使用して単離した。その単離したＤＮＡを、製造業者のガイドラインに従い（Life Technologies）、Ｔ４-ＤＮＡリガーゼを使用してＨＳＢＰ-１をコードする配列を含むＡｓｐ７１８-ＢｇｌIIの切断したベクターに挿入した。ＤＮＡの配列決定により予想したベクターの配列を確認し、それを「ｐＨＺＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ．９」と命名した。
【００７５】
Ｂ．ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１の発現および精製
ｐＨＺＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ．９ベクターを、TransTransfected を使用してＢＨＫ５７０中にトランスフェクションし、そして、トランスフェクタント耐性のために培養液を１０μＭのメトトレキサートに選択した。耐性コロニーを組織培養皿に移動し、拡大させ、そして抗-Ｈｉｓ（Ｃ-末端）抗体（Invitrogen,Carlsbad,CA)でのウェスタンブロット分析によりＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-Ｈｉｓ6の分泌を分析した。生じた細胞株「ＢＨＫ．ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ．２」を拡大した。
【００７６】
ＢＨＫ．ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ．２細胞を、細胞工場中に播種し、そして１２リットルの工場-条件培地を単離した。その培地を、流速２ｍｌ/ｍｉｎで２５ミリリットルの総容積のＮｉ-ＮＴＡ（Invitrogen)に適用した。追加後、カラムをｐＨ７．２の５０カラム容量のＰＢＳおよび２０カラム容量のリン酸緩衝食塩水、ｐＨ６．０の５０ｍＭのイミジゾールで洗浄した。それから、その結合タンパク質を、ｐＨ６．０のＰＢＳ中、５０ｍＭから８００ｍＭへのイミジゾール濃度の増加の直線勾配で、１ｍｌ/ｍｉｎで６０分間溶出した。１ミリリットルの分画を採取した。ウェスタンブロット分析に基づき、ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１を含む分画を貯蔵した。その貯蔵した分画を３００μｌに濃縮し、そしてバッファーを１４ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で３回交換し、それから３交換の４リットルのｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水に対して透析した。ウェスタンブロット分析およびクマシー染色ゲルは７５％以上の純度および２０ｋＤａの単量体の分子量を示した。
【実施例３】
【００７７】
ＴＡＣＩ融合タンパク質のための増殖アッセイ
アフェレーシス由来の末梢血の単核細胞を、Ficol-Hypaque における密度勾配遠心分離により単離し、そしてリン酸緩衝食塩水中で洗浄した。一般的に、１ドナーから約１０10の末梢血の単核細胞を単離することができる。１バイアル当たり約１０8の細胞を９０％のウシ胎児血清および１０％のジメチルスルホキド中で凍結させた。
【００７８】
複数のバイアルを解凍し、細胞の生存度を測定した。Ｂ細胞を、ＣＤ１９磁気ビーズおよび VarioMacs 磁気分離システム（Miltenyi Biotec;Aubum,CA)を使用して末梢血の単核細胞から単離した。丸底９６ウェルプレートをリン酸緩衝食塩水中の５μｇ/ｍｌのヤギ抗-ヒトＩｇＭで、４℃で２４時間にわたり、前コーティングした（Southern Biotechnology Assoc.Inc.;Birmingham AL)。１０ｎｇ/ｍＬのヒトのＩＬ-４（Pharmingen)および２０ｎｇ/ｍＬのｚＴＮＦ４（ＴＡＣＩと結合するリガンド）の存在下において、１ウェル当たり精製したＢ細胞を１０5培養した。ｚＴＮＦ４が刺激したＢ細胞の増殖を阻害する能力を比較するために、１μｇ/ｍｌで開始したＴＡＣＩ-Ｆｃ融合タンパク質、ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１またはＴＡＣＩ-ＮＣ１の３倍希釈系を含ませた。その細胞を、ｚＴＮＦ４、ヒトＩＬ-４の存在下、および阻害因子アリまたはナシで、４日間インキュベートし、それから１ウェル当たり１μＣｉのＨ３チミジン（Amersham)で、一昼夜パルスした。プレートはPackardプレートハーベスターを使用して収集し、そして、Packardリーダーを使用してカウントした。本アッセイにおいて、ｚＴＮＦ４が刺激したヒトのＢ細胞の増殖の阻害で、ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１は３倍以上の有効性し、そしてＴＡＣＩ-ＮＣ１は１０倍以上の有効性を示した。図２において示すように、ＴＡＣＩ-ＮＣ１は、同じ濃度のＴＡＣＩ-Ｆｃ５よりもＴＮＦ４が誘発したＢ細胞の増殖を大きく減少させた。この違いは、１．１ｎｍの値を有するＴＡＣＩ-Ｆｃ５および５７ｐＭの値を有するＴＡＣＩ-ＮＣ１により、図中に示されたＥＣ50値において表され、ＴＡＣＩ-ＮＣ１が約１９倍有効であることを示している。
【実施例４】
【００７９】
細菌の細胞中のＴＡＣＩ-ＨＳＢ１の発現
ヒトのＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１をコードするヌクレオチド配列を含む発現プラスミドを酵母菌のホモログ組み換えを介して、Ｇ１０エンハンサー配列の後ろに挿入した。ヒトのＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１のＤＮＡ断片はＰＣＲを使用して単離した。ＰＣＲ反応中のヒトのＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１の生産において２つのプライマーを使用した。ベクターのフランキング配列の４０塩基対を含むプライマーｚｃ４２，７２８（５’ＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡ ＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡ ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧ ＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡ ＴＡＴＧＧＣＴＡＴＧ ＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）は、Ｇ１０エンハンサー配列およびヒトのＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１のアミノ終端に対応する２４塩基対から成った。プライマーｚｃ４２，７３１（５’ＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧ ＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣ ＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣ ＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡ ＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧ ＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴ ＧＧＣＣ３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）はベクターのフランキング配列の４０塩基対およびＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１配列のカルボキシル終端に対応する２４塩基対を含んだ。その鋳型はｐＨ２-ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ９であった。そのＰＣＲ反応条件は以下とした。：９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で1分間の２５サイクル；続いて４℃で浸漬した。分析のために、２から４μｌ容量のＰＣＲ試料を１×ＴＢＥバッファーを伴う１％アガロースゲル上に流し、そして約５５０塩基対断片の予想したバンド
【化１】
2006502715.tif 000002
を観察した。１００μｌの残留容量の反応物を無水エタノールで沈殿させた。そのペレットを、ＳｍａＩ-切断化レシピエントベクターｐＴＡＰ２３８への組み込みに使用するために１０μｌの水に再懸濁し、ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１をコードする作成物を生成した。
【００８０】
１００マイクロリットルの形質転換受容性酵母菌細胞（S.cerevisiae)を、約１μｇのヒトのＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１フラグメント（ＰＣＲ生成物）および１００ｎｇのＳｍａＩ-切断化ｐＴＡＰ２３８ベクターを含む１０μｌの混合物と混合し、そして０．２ｃｍの電気穿孔キュベットに移動した。その酵母菌/ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ/ｃｍ）、無限オーム、２５μＦにセットした機器を使用して電気パルスし、それから６００μｌの１．２Ｍソルビトールをキュベットに加えた。それからその酵母菌を、２つの３００μｌのＵＲＡ Ｄ（ウラシル欠乏グルコース-含有培地）プレート上で培養し、３０℃でインキュベートした。およそ４８時間後、１つのプレート由来のＵｒａ＋酵母菌の形質転換体を１ｍｌの水中で再懸濁し、細胞をペレットにするために素早くスパンした。その細胞ペレットを１ｍｌの溶解バッファー中で再懸濁した。ＤＮＡを上記に開示したように回収した。そのＤＮＡペレットを１００μｌの水中で再懸濁した。
【００８１】
４０μｌの電気形質転換受容性大腸菌（E.coli)のＭＣ１０６１細胞を1μｌの酵母菌ＤＮＡで形質転換した。その細胞は２．０ｋＶ、２５μＦおよび４００オームで電気パルスした。電気穿孔後、０．６ｍｌのＳＯＣ（２％ BactoTM Tryptone(Difco,Detroit,MI)、０．５％酵母菌抽出物(Difco）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２０ｍＭのグルコース）を細胞に加えた。その細胞を３７℃で1時間回復させ、それから、ＬＢ＋カナマイシンプレート（ＬＢブロス（Lennox)、１．８％ BactoTM Ａｇａｒ（Difco)、３０ｍｇ/Ｌのカナマイシン）上で培養した。
【００８２】
ヒトのＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１のための正しい発現作成物を宿す個々のクローンは、プラスミドＤＮＡの特徴的な消化により認識される。細胞は３０μｇ/ｍｌのカナマイシンを伴うSuper Broth II（Becton Dickinson)中で一昼夜成長させた。翌日、その細胞を採取し、そしてプラスミドＤＮＡを、スピンカラム（QIAprep（登録商標）Spin Miniprep Kit;Quiagen Inc.,Valencia,CA)を使用して調製した。それから、そのＤＮＡをＮｏｔＩおよびＸｂａＩで切断した。その正しい制限パターンを伴うクローンをｐＴＡＰ４１５と命名し、そして配列決定した。ｐＴＡＰ４１５中のＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１のポリヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示す。
【００８３】
１０マイクロリットルのｐＴＡＰ４１５を、３μｌの商業的に入手可能なバッファー（バッファー３；New England Biolabs) および１５μｌの水中の２マイクロリットルのＮｏｔＩで３７℃、１時間で切断した。７マイクロリットルの反応混合物を２マイクロリットルの５×Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー（Life Technologies;Gaitherburg,MD)および１マイクロリットルのＴ４ＤＮＡリガーゼと混合し、室温で１時間インキュベートした。１マイクロリットルのそのライゲージョン混合物を、大腸菌（E.coli)株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）を形質転換するために使用した。その細胞を２．０ｋＶ、２５μＦ、および４００オームで電気パルスした。電気穿孔後、０．６ｍｌのＳＯＣを細胞に加えた。その細胞を３７℃で１時間成長させ、それからＬＢ＋カナマイシンプレート上で培養した。
【００８４】
個々のクローンを採取し、成長させた。スピンカラムを使用してプラスミドＤＮＡを調製した。酵母菌のＵＲＡ３およびＣＥＮ/ＡＲＳ因子の減少を確認するため、そのＤＮＡを、特異的にＰｖｕIIおよびＨｉｎｄIII で切断した。個々のコロニーを採取した。細胞を３０μｇ/ｍｌのカナマイシンを含むSuperbrothII（Becton Dickinson)で一昼夜成長させた。３０μｇ/ｍｌのカナマイシンを含む２ミリリットルの新鮮なSuperbrothIIを接種するために、１００マイクロリットルの一昼夜培養液（overnight culture)を使用した。培養液は１５ｍｌのコニカルチューブ中で約２時間振りながら３７℃で成長させた。１ｍｌの培養液を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。２時間１５分後、同量の培養液を５％のβＭＥを伴う２５０μｌの Thorner バッファー（８Ｍの尿素、ｐＨ７．０で１００ｍＭのトリス、１０％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ）と混合し、そして、染色した。試料は５分間沸騰させた。２０μｌの試料を４％-１２％ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）に充填した。１×ＭＥＳバッファー中でゲルを流した。発現はクマシーブルー染色により分析した。
【００８５】
細菌細胞をフレンチプレスを使用して溶解し、そして細胞の溶菌液中の封入体を、低速の遠心分離によりペレットにした。細胞膜および細胞壁材料を含む夾雑物を除去するために、ペレット分画を２Ｍの尿素で洗浄した。それから、ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１大腸菌（E.coli)の封入体を、０．１Ｍの硫酸ナトリウムおよび０．０５Ｍのナトリウムテトラチオネートを含むｐＨ８の５０ｍＭのトリス中の７ＭのグアニジンＨＣｌ中、４℃で撹拌しながら一昼夜抽出した。変性剤/亜硫酸分解剤を同時に伴う抽出物は、タンパク質-タンパク質相互作用を分解し、還元状態およびスルホン化状態において、タンパク質をスルフドリル基を伴う単量体に展開する。再度の折りたたみの前に、試料を３５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、そして０．２μｍのフィルターでろ過した。濃度をＲＰ ＨＰＬＣアッセイにより測定した。
【実施例５】
【００８６】
ＴＡＣＩ融合タンパク質の生物学的アッセイ
ｚＴＮＦ４活性を制するための様々な３量体化ＴＡＣＩ作成物の能力を試験するために、ヒトのＴＡＣＩおよびＫＺ１４２ルシフェラーゼでトランスフェクションした Jurkat 細胞株を使用した。その Jurkat ＴＡＣＩ ＫＺ１４２ルシフェラーゼ細胞を成長させ、そして育成培地（Ｌ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、０．５ｍｇ/ｍｌのＧ４１８、および２μｇ/ｍｌのプロマイシンを伴うＲＰＭＩ/１０％ＦＢＳ）においてアッセイした。これらの細胞は１００μｌの育成培地において、４０，０００細胞/９６ウェルで培養した。１００ｎｇ/ｍｌのｚＴＮＦ４の存在下において、１ウェル当たり１００マイクロリットルの３量体阻害因子を加えた。
【００８７】
アッセイ細胞株は、１０００ｎｇ/ｍｌのｚＴＮＦ４に対して最大約１８倍のルシフェラーゼ応答性を示した。バックグランドのコントロールウェルと比較して、１ミリリットル当たり１００ナノグラムのｚＴＮＦ４は約１０倍のルシフェラーゼ応答性を与えた。総量２００μｌの育成培地中のｚＴＮＦ４および阻害物質の組み合わせを５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で６時間インキュベートした。それから、Beckman GS-6KR 遠心分離機において、９６ウェルプレートを２０００×ｇで遠心分離し、そして、プレートを反転させることにより培地を廃棄した。２５マイクロリットルの溶解バッファー（Promega E153A)を各ウェルに加え、そして室温で１５分間インキュベートした。それから、照度系を読むために、その溶解した細胞を不透明な９６ウェルプレートに移動した。１本のルシフェラーゼアッセイバッファー（Promega 152A)を、１本のルシフェラーゼアッセイ基質（Promega E151A)に加え、そして４０μｌのこの組み合わせを各ウェルに加えた。５秒に統一して、照度計（EG＆EG Berthold Microlumat Plus)により各ウェルを読んだ。
【００８８】
図１に示すように、コントロール免疫グロブリン融合タンパク質（ｈｗｓｘ１１-ＩｇＧ）はｚＴＮＦ４誘発ルシフェラーゼ活性においてほとんど有効性を持たなかった。ＴＡＣＩ-Ｆｃ免疫グロブリン融合タンパク質（ＴＡＣＩ-ＩｇＧ）はルシフェラーゼ活性を阻害したが、より大きな阻害は、哺乳動物細胞または大腸菌（E.coli)中で生産されたＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１タンパク質で達成された。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＴＡＣＩ-Ｆｃ融合タンパク質（「ＴＡＣＩ-ＩｇＧ」）、哺乳動物細胞中で生産されたＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１タンパク質（「ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ（哺乳動物）」）、大腸菌（E.coli)中で生産されたＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ-１タンパク質（「ＴＡＣＩ-ＨＳＢＰ（大腸菌）」）による、並びに、免疫グロブリン融合タンパク質（「ｈｗｓｘ１１-ＩｇＧ」）の制御によるｚＴＮＦ４誘発化ルシフェラーゼ活性の阻害を示す。
【図２】図２は、3Ｈ-チミジン、ＴＡＣＩ-ＮＣ１３量体およびＴＡＣＩ-Ｆｃ融合タンパク質（「ＴＡＣＩ-Ｆｃ５」）の組み入れを通して、Ｂ細胞の増殖の阻害を示す。ＴＡＣＩ-Ｆｃ５は、ＴＡＣＩ-ＦｃまたはＴＡＣＩ-ＩｇＧのもう１つの名前である。また、この図において示すものは２分子のＥＣ５０値である（すなわち、５０％のコントロールの指標を阻害する濃度）。
【図１】
2006502715.tif 000003
【図２】
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【配列表】
2006502715000001.app
【国際調査報告】
2006502715.tif 000005
2006502715.tif 000006