(57)【要約】本発明は、抗体、抗体フラグメント、抗体および抗体フラグメントと細胞毒性物質とのコンジュゲート、ならびに抗体および抗体フラグメントを産生するハイブリドーマであって、抗体および抗体フラグメントが、細胞膜タンパク質の細胞外液中へリリースされない細胞外エピトープを認識するもの；ならびに抗体、抗体フラグメントおよびコンジュゲートを用いて、悪性疾患、たとえば胸部癌および卵巣癌を検出、モニタリングおよび処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放出型抗原の非放出−細胞外部分のエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６タンパク質の非放出−細胞外部分のエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
抗体が、組換え抗体、組換え抗体のフラグメント、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされた抗体よりなる群から選択される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、抗原の非放出−細胞外部分を免疫原性タンパク質キャリヤーに結合させたものを用いて調製された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、抗原の細胞外−非放出部分を含む組換え融合タンパク質による動物の免疫化により産生された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項７】
融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、抗原の組換え−非放出−細胞外部分を発現する細胞による動物の免疫化により産生された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項９】
エピトープの少なくとも一部が、Ｍｕｃ１の細胞外ドメインのカルボキシ末端アミノ酸９０個内に位置する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
エピトープの少なくとも一部が下記のアミノ酸配列内に位置する、請求項９に記載の抗体：
【化１】
2006502110.tif 000043
【請求項１１】
抗体が、下記よりなる群から選択される少なくとも１つのペプチドに結合する、請求項１０に記載の抗体：
【化２】
2006502110.tif 000044
【請求項１２】
エピトープの少なくとも一部が、Ｍｕｃ１６の細胞外ドメインのカルボキシ末端アミノ酸１１０個内に位置する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
エピトープの少なくとも一部が下記のアミノ酸配列内に位置する、請求項１２に記載の抗体：
【化３】
2006502110.tif 000045
【請求項１４】
抗体が、下記よりなる群から選択される少なくとも１つのペプチドに結合する、請求項１３に記載の抗体：
【化４】
2006502110.tif 000046
【請求項１５】
細胞毒性物質または細胞毒性物質プロドラッグに結合した、請求項１または２に記載の抗体を含むコンジュゲート。
【請求項１６】
細胞毒性物質が低分子薬物である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
細胞毒性物質がメイタンシノイド類、タキソイド類、またはＣＣ−１０６５類似体である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の抗体および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載のコンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項２０】
有効量の請求項１８に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項２１】
有効量の請求項１９に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項２２】
対象が癌を伴う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
対象が癌を伴う、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
癌を伴う疑いのある対象をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該対象からの組織試料を用意し；
（ｂ）請求項１に記載の抗体を用いて、該試料中の放出型抗原の非放出−細胞外部分の量を測定し；そして
（ｃ）その抗原の量を癌性対照および非癌性対照における該抗原の量と比較し、これにより該対象のスクリーニングを行う
ことを含む方法。
【請求項２７】
抗原がヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌が卵巣癌または胸部癌である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
表面抗原の非放出部分に特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）表面に抗原を発現している細胞への候補抗体の結合を測定し；
（ｂ）細胞から細胞外媒質中へ放出された抗原フラグメントへの候補抗体の結合を測定し；そして
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）の結合測定値を比較し、これにより該抗体をスクリーニングする
ことを含む方法。
【請求項３０】
表面抗原がＭｕｃ１またはＭｕｃ１６である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７０により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７０。
【請求項３２】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７１により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７１。
【請求項３３】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７２により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７２。
【請求項３４】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７３により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７３。
【請求項３５】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７０。
【請求項３６】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７１。
【請求項３７】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７２。
【請求項３８】
ＡＴＣＣに寄託番号ＨＢ− として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７３。
【請求項３９】
請求項３１、３２、３３または３４に記載のモノクローナル抗体の機能均等物である抗体であって、モノクローナル抗体、組換え抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ−グラフト抗体、ファージの表面にディスプレイされた抗体、およびそのフラグメントよりなる群から選択される抗体。
【請求項４０】
細胞毒性物質または細胞毒性物質プロドラッグに結合した、請求項３１、３２、３３または３４に記載の抗体を含むコンジュゲート。
【請求項４１】
細胞毒性物質が低分子薬物である、請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
細胞毒性物質がメイタンシノイド類、タキソイド類、またはＣＣ−１０６５類似体である、請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
請求項３１、３２、３３または３４に記載の抗体および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項４４】
請求項４０に記載のコンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項４５】
有効量の請求項４３に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項４６】
有効量の請求項４４に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項４７】
対象が癌を伴う、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
対象が癌を伴う、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
[01]  本発明は、細胞膜エピトープ指向性抗体に関する。詳細には本発明は、抗体、それらの抗体を産生するハイブリドーマ、および抗体を含有する組成物、ならびにその使用に関するものであり、これらの抗体は、細胞膜上に保持されており実質的に細胞外媒質中へ放出（ｓｈｅｄ）されていないタンパク質の細胞外部分にあるエピトープを認識する。本発明はさらに、そのような抗体および抗体含有組成物を、癌、たとえばＭｕｃ１および／またはＭｕｃ１６タンパク質レベルが変化した卵巣癌および胸部癌の検出、処置およびモニタリングに使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[02]  細胞表面抗原は、しばしばタンパク質分解開裂により細胞から放出される。生じたフラグメントは血液中に循環した状態でみられる。循環している放出抗原は疾病状態のモニタリングにはしばしば有用であるが、免疫療法の効果に対してはマイナスの影響をもつ可能性がある。このため、放出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）後も細胞会合（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）したままの細胞膜タンパク質の細胞外傍膜領域をターゲットとする抗体は、免疫療法にとって理想的である。
【０００３】
[03]  Ｍｕｃ１（エピシアリン（ｅｐｉｓｉａｌｉｎ）、多型性上皮ムチン、ＰＥＭ、ＰＵＭ、ＭＡＭ−６、ＰＡＳ−Ｏ、ＥＭＡ、ＮＰＧ、ＤＦ−３）およびＭｕｃ１６（ＣＡ−１２５）は、多様な悪性疾患においてアップレギュレーションされる細胞膜ムチンである（Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｂａｓｔ，１９８９；Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６は両方ともタイプＩ膜タンパク質であり、下記のものを含む：（ａ）短かい細胞質ドメイン（Ｍｕｃ１についてはアミノ酸６９個、Ｍｕｃ１６についてはアミノ酸３１個）、これは細胞内シグナル伝達機構と相互作用する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｆｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）；（ｂ）膜貫通ドメイン；および（ｃ）著しくグリコシル化された大きな細胞外ドメイン。両タンパク質の細胞外ドメインは大きなタンデム・リピート領域を含み、Ｍｕｃ１はアミノ酸２０個の長さのタンデム・リピート、Ｍｕｃ１６はアミノ酸１５６個の長さのタンデム・リピートを含む。Ｍｕｃ１が含むタンデム・リピートの数は変動する（対立遺伝子に応じて２５〜１００）（Ｄｅｖｉｎｅ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，１９９２；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。現在のところ、Ｍｕｃ１６の遺伝子多型性を支持する証拠はない。生じるＭｕｃ１およびＭｕｃ１６のペプチドコアは、それぞれ約１２５〜２００ｋＤａおよび２．５ＭＤａの分子量をもつ（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，２００２）。
【０００４】
[04]  Ｍｕｃ１は、共通前駆物質から誘導されるヘテロ二量体として上皮細胞上に発現する（Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。小胞体内でカリクレイン様プロテアーゼによる翻訳時タンパク質分解プロセシングが起きると思われる（Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。その細胞外サブユニットは、細胞内プロセシングおよび細胞表面への輸送に際して、膜貫通領域および細胞質テイルを含むサブユニットと非共有結合的に会合した状態を維持する。Ｍｕｃ１６が同様にタンパク質分解プロセシングされるかどうかはまだ分かっていない。しかしＭｕｃ１６は、膜貫通ドメインからアミノ酸約１００個離れた位置の細胞外ドメイン内に、保存されたフューリン開裂部位（ＲＸＫ／ＲＲ）をもつ（Ｂａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。フューリンは、細胞表面受容体を含めたいくらかのタンパク質のトランスゴルジ網タンパク質分解プロセシングに関与することが示唆されている（Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０００５】
[05]  Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６は両方とも、悪性疾患を診断し、処置の進行をモニタリングするための血清マーカーとして利用できる。たとえばＭｕｃ１抗体アッセイ法を用いて胸部癌を診断し、処置の進行をモニタリングすることができ（Ｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、一方、卵巣癌の場合は抗Ｍｕｃ１６抗体、たとえばＯＣ１２５およびＭ−１１を使用できる（Ｃａｎｎｉｓｔｒａ，１９９３）。放出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）（すなわち、これらのムチンまたはそれらのフラグメントが血液その他の細胞外液中へリリースされること）の機序は十分には分かっていない。Ｍｕｃ１６の場合、放出はＥＧＦ刺激に応答したＭｕｃ１６の細胞質ドメインのセリン／トレオニンリン酸化により調節されると思われる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｍｕｃ１もＥＧＦ刺激に応答してリン酸化されるが、現在のところＭｕｃ１の部分の放出機序におけるそのようなリン酸化の役割については証拠がない。放出されたＭｕｃ１部分が小胞体でのＭｕｃ１タンパク質の開裂により産生された細胞外サブユニットに対応するかどうか、あるいはストローマプロテアーゼがターゲットとする開裂部位がさらにあるかどうかも不明である。現在、Ｍｕｃ１６のプロセシングおよび放出に関しては、これよりさらに情報がない。配列情報から、Ｍｕｃ１６は潜在フューリン開裂部位のほかに、膜貫通ドメインからアミノ酸約５０個上流に位置する潜在ストロモライシン（ｓｔｒｏｍｏｌｙｓｉｎ）開裂部位（ＳＰＬＡ）をもち、その開裂によりＣＡ１２５のフラグメントがリリースされ、これにモノクローナル抗体ＯＣ１２５およびＭ−１１が結合することが示唆される。
【０００６】
[06]  毒性の高いメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）薬物およびプロドラッグにコンジュゲートした腫瘍細胞特異性モノクローナル抗体は、マウスモデルにおいて腫瘍の治療に有効であることが示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６タンパク質は、たとえば腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）と呼ぶことができるそのような抗体含有コンジュゲートの開発のための有望なエピトープ源である。これらのエピトープの発現が腫瘍においてしばしば増大するからである（前記を参照）。
【０００７】
[07]  しかし、Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６抗体を疾病状態のモニタリングに利用できる（前記を参照）ことにより証明されるように、腫瘍細胞が発現するＭｕｃ１またはＭｕｃ１６全体のうちの一部は、血流中へ放出される。種々のターゲット抗原に対する裸または薬物結合モノクローナル抗体を用いた臨床試験は、ある患者に存在する高濃度の循環抗原が問題であることを示唆している（Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。高濃度の循環抗原は抗体クリアランス速度を大幅に高め、その結果、腫瘍への抗体送達が低下する。さらに、放出された抗原を認識する薬物結合抗体の場合、クリアランス速度増大の結果、用量を制限する肝毒性が生じる。ある患者が比較的低いレベルの放出抗原を示す可能性はあるが、分子当たりのエピトープ数を増加させる可能性のあるＭｕｃ１およびＭｕｃ１６のようなムチンのタンデム・リピート性は、放出エピトープの絶対定量の達成を困難にする。したがって、これらの分子の放出部分に対する現在入手可能なＭｕｃ１およびＭｕｃ１６抗体では、患者の放出抗原レベルが抗体療法を妨害するほど高いかどうかについて信頼性をもって患者を評価することはできない。したがって、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６の非放出部分に含まれるエピトープに特異的であり、よってＭｕｃ１およびＭｕｃ１６の高濃度の循環放出フラグメントの存在下ですらそのような抗体の細胞毒性薬物コンジュゲートを効率的に腫瘍細胞へ向けることができる抗体が求められている。現在まで、放出型タンパク質の非放出−細胞外ドメインと反応すると規定された抗体は報告されていない。
【０００８】
[08]  本発明者らは、先行技術において確認された前記の欠点および問題点に対処する抗体、抗体フラグメント、およびそのような抗体またはフラグメントのコンジュゲート、そのような抗体の調製法およびスクリーニング法、診断スクリーニング法、ならびにそのような抗体およびコンジュゲートを用いた処置方法を開発した。本発明の多数の利点は、以下の開示内容を読むと当業者に明らかになるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
[09]  本発明者らは、放出型抗原の非放出−細胞外部分にあるエピトープを指向する抗体が、特定の悪性疾患の検出、モニタリングおよび処置のための改良された特性をもつことを見いだした。
【００１０】
[10]  第１態様において本発明は、放出型抗原の非放出−細胞外部分のエピトープに結合しうる単離されたモノクローナル抗体、およびその抗体を産生しうるハイブリドーマに関する。この態様は無傷抗体に限定されず、抗体フラグメント、および抗体フラグメントを含む組換え融合タンパク質をも包含する。抗体産生手段には特に制限はなく、動物の免疫化およびハイブリドーマの調製のほか、たとえば抗体または抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーのパニングによる組換え抗体フラグメントのスクリーニングも包含される。さらに本発明は、放出型抗原の細胞外−非放出部分を含む組換え融合タンパク質による動物の免疫化、または放出型抗原の組換え−非放出−細胞外ドメインを発現する細胞による動物の免疫化を包含する。
【００１１】
[11]  この態様の抗体は、放出型抗原の非放出−細胞外部分にあるエピトープを指向する。例示的な１態様において、放出型抗原はヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６である。好ましくは、Ｍｕｃ１エピトープの少なくとも一部はＭｕｃ１細胞外ドメインの最後の（したがってＭｕｃ１細胞外ドメインのカルボキシ末端の）アミノ酸９０個内に位置し、Ｍｕｃ１６エピトープの少なくとも一部はＭｕｃ１６細胞外ドメインの最後の（したがってＭｕｃ１６細胞外ドメインのカルボキシ末端の）アミノ酸１１０個内に位置する。
【００１２】
[12]  たとえば、Ｍｕｃ１の好ましいエピトープは、少なくとも一部が下記のアミノ酸配列：
【００１３】
【化１】
2006502110.tif 000002
【００１４】
内に位置し、Ｍｕｃ１６の好ましいエピトープは、少なくとも一部が下記のアミノ酸配列：
【００１５】
【化２】
2006502110.tif 000003
【００１６】
内に位置する。
[13]  しかしこの態様は、少なくとも一部がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す配列内に位置するエピトープを認識する抗体のみに限定されず、ヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６タンパク質の非放出−細胞外部分にあるすべてのエピトープを指向する抗体をも包含する。したがってこの態様は、放出型抗原の非放出−細胞外部分の多型（現在知られているもの、またはまだ見いだされていないもの）を含めたエピトープを指向する抗体または抗体フラグメントをも包含する。
【００１７】
[14]  第２態様において本発明は、細胞毒性物質または細胞毒性物質プロドラッグに共有結合した本発明抗体を含む、コンジュゲートに関する。好ましい態様において、細胞毒性物質はメイタンシノイド類、メイタンシノイド類の類似体、メイタンシノイド類のプロドラッグ、またはメイタンシノイド類の類似体のプロドラッグである。そのようなコンジュゲートは、腫瘍細胞特異的療法薬として有用である（参照：ＵＳＰ  Ｎｏ．６，３３３，４１０；５，４７５，０９２；５，５８５，４９９；および５，８４６，５４５）。さらに、好ましい細胞毒性薬物はタキサン（ｔａｘａｎｅ）類またはＣＣ−１０６５類似体である（参照：タキサン類についてはＵＳＰ  Ｎｏ．６，３４０，７０１および６，３７２，７３８、そしてＣＣ−１０６５類似体についてはＵＳＰ  Ｎｏ．５，８４６，５４５；５，５８５，４９９および５，４７５，０９２）。
【００１８】
[15]  第３態様において本発明は、放出型抗原の非放出−細胞外部分のエピトープに結合しうる抗体または該抗体のコンジュゲート（抗体フラグメントのコンジュゲートを含む）および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、組成物を提供する。
【００１９】
[16]  第４態様において本発明は、有効量の本発明の第２または第３態様の医薬組成物を投与することにより、処置を必要とする対象、たとえばヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６などの放出型抗原が増加している悪性疾患を伴う対象を処置する方法を提供する。好ましい態様においてこの処置は、卵巣癌または胸部癌を伴う対象に関する。
【００２０】
[17]  第５態様において本発明は、放出型抗原レベルが増大している状態について対象をスクリーニングする方法を提供する。この態様においては、現在知られているものまたはまだ開発されていないものを含めた任意の免疫学的方法に本発明の抗体を利用して、その状態を伴う疑いのある対象における放出型抗原レベルを測定することができる。放出型抗原の非放出−細胞外部分に結合する抗体を用いて、対象から得た組織試料中の放出型抗原の量を適切な対照試料中の量または既知のベースラインレベルと比較することにより、放出型抗原レベルが増大している状態について対象をスクリーニングする。
【００２１】
[18]  最後に第６態様において本発明は、抗体または抗体フラグメントのライブラリーから本発明の抗体をスクリーニングする方法を提供する。この態様においては、下記により抗体またはフラグメントが同定される：（１）Ｍｕｃ１および／またはＭｕｃ１６を発現している組織培養物または腫瘍検体に由来する細胞の使用により、放出型抗原の非放出−細胞外部分のエピトープが認識されること、ならびに（２）細胞外媒質、たとえば組織培養培地または癌患者の血液中へ放出されたヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６タンパク質が認識されないこと。この方法（任意の順序で適用）により、放出型タンパク質、たとえばヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６、の非放出−細胞外部分にあるエピトープを指向する抗体が同定される。
【００２２】
発明の詳細な説明
[38]  本発明を放出型抗原Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６に関して記載する。ただし、本発明がこれらに限定されるとみなすべきではない。
【００２３】
[39]  本発明は、放出型抗原、たとえばＭｕｃ１およびＭｕｃ１６、の非放出−細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体、ならびにその使用を提供する。
[40]  本発明を詳述する前に、下記の用語を定義するのは本発明の理解に有用であろう。
【００２４】
[41]  本明細書中で用いる用語”モノクローナル抗体”は、実質的に均一な抗体集団を表わす。すなわちその集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然に起きる変異を除いて、特異性および親和性において同一である。モノクローナル抗体組成物が１種類より多いモノクローナル抗体を含む可能性があることを留意されたい。したがって”モノクローナル”という修飾語は実質的に均一な抗体集団としての抗体の性質を表わし、いずれか特定の方法で抗体を産生する必要があると解釈すべきではない。
【００２５】
[42]  抗原、たとえばＭｕｃ１またはＭｕｃ１６、の”非放出−細胞外部分（ｎｏｎ−ｓｈｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｒｔｉｏｎ）”は、本明細書において、細胞外培地または血液中へ実質的にリリースされない抗原の細胞外部分と定義される。
【００２６】
[43]  本明細書中で用いる用語”傍膜（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）”は、放出型抗原、たとえばＭｕｃ１またはＭｕｃ１６、の膜貫通ドメイン（図１Ａおよび２Ａの二重下線ドメインを参照）とそのタンパク質の放出部分とでほぼ囲まれたアミノ酸部分を表わす。したがって放出型抗原の傍膜部分は、それらの非放出−細胞外部分に対応する。
【００２７】
[44]  本明細書中で用いる”コンジュゲート”は、細胞毒性物質に共有結合で連結した本発明抗体を表わす。共有結合にはジスルフィド結合などの開裂性結合を含めることができ、これらはターゲット細胞の還元性環境内で共有結合を有利に開裂させることができる。
【００２８】
[45]  本明細書中で用いる”プロドラッグ”は、活性化工程を経るまでは実質的に細胞毒性をもたない細胞毒性物質類似体を表わす。活性化工程には、酵素による開裂、化学的活性化工程、たとえば還元性物質への暴露、または物理的活性化工程、たとえば光分解を含めることができる。
【００２９】
[46]  本明細書中で用いる”細胞毒性物質”は、ターゲット細胞の増殖を阻害し、またはターゲット細胞を殺すことができる、いずれかの物質である。
[47]  ”発現ベクター”は、関心のあるポリペプチドをコードするセグメントがその転写をもたらす追加セグメントに機能可能な状態で連結したものを含む、線状または環状のＤＮＡ分子を表わす。そのような追加セグメントには、プロモーター配列およびターミネーター配列が含まれ、１以上の複製起点、１以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなども含めることができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し、あるいは両方の要素を含んでもよい。
【００３０】
[48]  タンパク質のアミノ酸配列の一部を番号で表わす場合、別途記載しない限り番号表示は配列のＮ末端から始まることを理解すべきである。
[49]  本発明のモノクローナル抗体は、合成または組換えペプチドを用いて放出型抗原の細胞外傍膜部分に対して産生させることができる。いずれかのモノクローナル抗体形成方法、たとえばファージディスプレイ技術によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生およびマウスなどの動物の免疫化によるｉｎ  ｖｉｖｏ産生を本発明に使用できる。これらの方法には下記に記載のものが含まれる：免疫学的方法：Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）、およびＣａｍｐｂｅｌｌ，”モノクローナル抗体技術、げっ歯類とヒトのハイブリドーマの作製と特性解明”，編者Ｂｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，アムステルダム（１９８５）；ならびに組換えＤＮＡ法：Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１２７５−１２８１（１９８９）。標準組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編者），”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク（１９９０）。
【００３１】
[50]  放出型抗原の傍膜領域は、常法により実験的に測定できる。放出型タイプＩおよびタイプＩＩ膜タンパク質抗原の開裂部位は、当該抗原の組換え−エピトープタグ付きｃＤＮＡを用いて、ＰａｒｒｙらがＭｕｃ１小胞体プロセシング開裂部位の同定に用いた方法の改変法により同定できる（Ｐａｒｒｙ，Ｓ．，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｓ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｋ．，Ｗｉｌｌｉｓ，Ａ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．（２００１）ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＵＣ１タンパク質分解開裂部位の同定，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８３，７１５−２０）。タイプＩ膜抗原の場合、エピトープタグをＣ末端（非放出フラグメント）に挿入する。次いでこの組換え抗原を適宜な細胞系において一過性発現または安定発現させる。エピトープタグ付き抗原を細胞溶解物から精製し、Ｎ末端配列決定を行う。得られた配列情報は、全長および開裂したエピトープタグ付き細胞会合抗原のＮ末端を構成するであろう。開裂抗原のＮ末端は、”傍膜”領域の境界を規定する。タイプＩＩ膜抗原の場合、エピトープタグをＮ末端（非放出フラグメント）に挿入する。エピトープタグ付き材料を細胞溶解物から精製し、質量分析を行って、細胞会合フラグメントの分子量を決定する。開裂部位は細胞会合フラグメントの分子量から外挿でき、この場合も、細胞会合した開裂抗原の”傍膜”領域の境界を推測できる。
【００３２】
[51]  あるいは、当該抗原の細胞内ドメインを指向するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて内因性の細胞会合抗原を精製し、タイプＩ膜タンパク質の場合はＮ末端配列決定に、タイプＩＩ膜タンパク質の場合は質量分析に使用できる。
【００３３】
[52]  ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のためには、ペプチドを好ましくは免疫原タンパク質キャリヤー、たとえばキーホール・リンペット・ヘモシニアン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせ、あるいは組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として調製および使用できる。よって、ペプチド自体を免疫原として使用してもよく、あるいはキャリヤータンパク質またはビーズのような他の物体、たとえばセファロースビーズ、に結合させてもよい。免疫化された動物が抗体を産生した後、抗体産生細胞、たとえば脾細胞、の混合物を単離する。モノクローナル抗体は、個々の抗体産生細胞を混合物から単離し、たとえばそれらを骨髄腫細胞などの腫瘍細胞と融合させて細胞を不死化することにより調製してもよい。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体発現を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。これらの好ましい骨髄腫細胞には下記のものに由来するものが含まれる：ネズミ骨髄腫細胞系、たとえばＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，米国カリフォルニア州サンディエゴから入手可能；およびＳＰ−２細胞、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国バージニア州マナッサスから入手可能；またはＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１ネズミ骨髄腫細胞（Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１，１（１９７８））。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生用として記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４））。得られたハイブリドーマを培養保存し、モノクローナル抗体を発現させ、培地から採集する。抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギおよびヒトを含めた任意の哺乳動物において調製させてもよい。抗体は下記の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、およびそのサブクラスのいずれかのメンバーであってよく、好ましくはＩｇＧ抗体である。サブクローンが分泌したモノクローナル抗体を培地、腹水または血清から一般的な免疫グロブリン精製法、たとえばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーにより適宜分離する。
【００３４】
[53]  本発明の抗Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６抗体の産生に用いる抗原は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６タンパク質の傍膜−細胞外−非放出部分に由来するペプチド抗原である（図１Ａおよび２Ａ）。Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６タンパク質は、特にＶＮＴＲ領域のタンデム・リピート数に関して多型性である。そのような多型性は、現在知られているものならびにまだ同定されていないＭｕｃ１およびＭｕｃ１６多型性のいずれも、本発明の範囲に含まれることは明らかである。たとえば、ＶＮＴＲリピートの数およびこれらのリピートに隣接する配列が異なる多型形のＭｕｃ１が知られている。たとえばＧＥＮＢＡＮＫ  寄託番号Ｊ０５５８２は、ＶＮＴＲ配列：
PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA                （SEQ ID NO:3）
の４０タンデム・リピートをもつヒトＭｕｃ１タンパク質であり、一方ＧＥＮＢＡＮＫ  寄託番号ＮＭ ００２４５６は、このＶＮＴＲ配列を１コピーだけもつヒトＭｕｃ１タンパク質である。ただし、傍膜配列はこれらの配列例間で保存されている。
【００３５】
[54]  図１Ａには、１つのＶＮＴＲタンデム・リピート（下線）および膜貫通領域（二重下線を施した領域）をもつＭｕｃ１配列の一例（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）（ＧＥＮＢＡＮＫ  寄託番号ＮＭ ００２４５６）を示す。細胞外ドメインはアミノ酸２４〜４２２からなり、細胞内ドメインはアミノ酸４４７〜５１５からなる。小胞体において表面へのトランスロケーション前に起きると思われる開裂部位（アミノ酸２３または２７におけるＮ末端シグナルペプチド開裂、およびアミノ酸３５７における翻訳後開裂部位）を示す。翻訳後開裂部位が放出部分を表わすか、あるいは翻訳後開裂部位に対するＮ末端またはＣ末端における第２開裂事象が放出抗原のリリースを引き起こすと思われる。
【００３６】
[55]  図１Ｂに、Ｍｕｃ１傍膜ドメイン−ＧＳＴ融合ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびＭｕｃ１の細胞外−非放出領域に対する抗体を産生するのに用いたＭｕｃ１傍膜配列からなる合成ペプチド（ペプチドａ〜ｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８〜１２）を示す。
【００３７】
[56]  同様に図２Ａに、ヒトＭｕｃ１６タンパク質配列の一例（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を示す。これは、そのＣ末端にＧＥＮＢＡＮＫ  寄託番号ＡＦ３６１４８６の翻訳配列（Ｙｉｎ，Ｂ．Ｗ．Ｔ．，Ｌｌｏｉｄ，Ｋ．Ｏ．（２００１）ＣＡ１２５卵巣癌抗原の分子クローニング，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，２７３７１−３７３７５）をもち、かつＧＥＮＢＡＮＫ  寄託番号ＡＦ４１４４４２から翻訳されるアミノ末端配列およびタンデム・リピート配列（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２，３４８−３６６；この参考文献にはＣＡ１２５の全配列が含まれるであろう）をもつ。図２Ａには、それぞれアミノ酸１５６個を含むタンデム・リピート単位の最初の２つのみを示す（／−／は、残りのタンデム・リピートが起きるギャップを示す；Ｍｕｃ１６はＭｕｃ１と異なり、同一のリピートを含まない）。これまでに４５の異なるタンデム・リピート配列が同定されたが、個々のリピートが１回より多く起きるので、Ｍｕｃ１６配列中に存在する数は最高６０の可能性がある。Ｏ’ＢｒｉｅｎらのＣ末端ドメインは、Ｙｉｎら（前掲）が発表したものと数個のアミノ酸が異なるにすぎない。本明細書に引用したＭｕｃ１の例の場合のように、本明細書中の２例のＭｕｃ１６の傍膜配列も保存されている。
【００３８】
[57]  Ｍｕｃ１６のＣ末端ドメイン内には下記の特色がある：
下記の配列をもつ膜貫通ドメイン
FWAVILIGLAGLLGLITCLICGVLV          (SEQ ID NO:4);
下記の配列をもつ潜在フューリン開裂部位
RNKR                                    (SEQ ID NO:5);
下記の配列をもつ潜在ストロモライシン部位
SPLA                                      (SEQ ID NO:6)。
【００３９】
[58]  フューリン開裂部位は小胞体において起きる翻訳後開裂の部位を表わすと思われ、一方ストロモライシン部位は放出型Ｍｕｃ１６の放出を生じる開裂であると思われる。
[59]  図２Ｂに、Ｍｕｃ１６傍膜ドメイン−ＧＳＴ融合ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、およびＭｕｃ１６の細胞外−非放出領域に対する抗体を産生するのに用いたＭｕｃ１６傍膜配列を含む合成ペプチド（ａ〜ｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４〜１８）を示す。Ｍｕｃ１６傍膜ドメイン−ＧＳＴ融合ペプチドおよび合成ペプチドが含む”傍膜”領域は、実際の非放出Ｍｕｃ１６細胞外ドメインより長くても、または短かくてもよい。
【００４０】
[60]  ヒトＭｕｃ１タンパク質の非放出−細胞外部分のエピトープに結合しうる本発明抗体は、たとえば膜貫通領域のＮ末端アミノ酸約９０個内の領域から選択した抗原ペプチドを用いて調製できる（図１Ａ）。好ましくは、抗原ペプチドはアミノ酸１０〜３０個の長さである。下記の合成ペプチド（図１Ｂ）：
【００４１】
【化３】
2006502110.tif 000004
【００４２】
は抗原として最も好ましいものであり、好ましくはキーホール・リンペット・ヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合している。
[61]  あるいは、ヒトＭｕｃ１タンパク質の非放出−細胞外部分のエピトープに結合しうる本発明抗体は、融合タンパク質、たとえばＭｕｃ１傍膜ドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質である抗原を用いて産生することもできる。たとえば下記の構築体が好ましい：
【００４３】
【化４】
2006502110.tif 000005
【００４４】
ここで”ＧＳＴ−”はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを表わす（図１Ｂ）。
[62]  ヒトＭｕｃ１６タンパク質の非放出−細胞外部分のエピトープに結合しうる本発明抗体は、たとえば膜貫通領域のＮ末端アミノ酸約１１０個内の領域から選択した抗原ペプチドを用いて調製できる（図２Ａ）。下記の合成ペプチド（図２Ｂ）：
【００４５】
【化５】
2006502110.tif 000006
【００４６】
は抗原として最も好ましいものであり、好ましくはＫＬＨに結合している。
[63]  あるいは、ヒトＭｕｃ１６タンパク質の非放出−細胞外部分のエピトープに結合しうる本発明抗体は、融合タンパク質、たとえばＭｕｃ１６傍膜ドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質である抗原を用いて産生することもできる。たとえば下記の構築体：
【００４７】
【化６】
2006502110.tif 000007
【００４８】
が好ましい（図２Ｂ）。
[64]  本発明の抗体は、たとえば図３に示す方法によりスクリーニングできる。この例においては、まずＭｕｃ１またはＭｕｃ１６を発現する細胞と反応する能力について抗体をスクリーニングする。後続または同時工程において、抗原発現細胞の組織培養培地中へ放出されたＭｕｃ１またはＭｕｃ１６エピトープと反応しない抗体を選択する。これにより、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６エピトープと反応はするが、組織培養培地中へ放出されたＭｕｃ１またはＭｕｃ１６エピトープとは反応しない抗体が同定される。これらの抗体を、卵巣癌患者からの血清との反応性について、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによりさらにスクリーニングする。この場合、捕獲抗体はスクリーニングすべき抗体であり、トレーサー抗体は放出抗原ドメインに含まれるエピトープを認識する抗体である。あるいはトレーサー抗体は、捕獲抗体の場合とは異なるが同様に傍膜ドメインに含まれるエピトープを認識する抗体であってもよい。そのような血清と反応しない抗体を、次いで免疫組織化学的染色法により正常組織および腫瘍組織に暴露する。腫瘍組織反応性をもつが血漿成分および正常組織に対しては実質的に非反応性であると同定された抗体は、癌の処置のための候補抗体である。所望により、そのような抗体を細胞毒性薬物、たとえばメイタンシノイドＤＭ１（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に結合させることができる。
【００４９】
[65]  あるいは、組換え放出型抗原またはその一部、たとえば非放出ドメインのみを含む部分を安定に発現する細胞で、哺乳動物を免疫化することができる。哺乳動物細胞における発現に適したベクターには、ＳＶ−４０、アデノウイルス、レトロウイルスに由来するＤＮＡ配列の周知の誘導体、ならびに機能性哺乳動物ベクター、機能性プラスミドおよびファージＤＮＡの組合わせにより得られるシャトルベクターが含まれる。他の真核細胞性発現ベクターが当技術分野で知られている（たとえばＰ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１（１９８２）；Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４−８６４（１９８１）；Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，”モジュラージヒドロ葉酸レダクターゼ相補的ＤＮＡ遺伝子と同時トランスフェクションした配列の増幅と発現”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６２１（１９８２）；Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６６４（１９８２）；Ｓ．Ｉ．Ｓｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，”チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるヒト免疫インターフェロンＤＮＡ遺伝子の発現と生成物の特性解明”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，４６５４−４６５９（１９８３）；Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０））。制御シグナル、および発現させるＤＮＡ、たとえば抗体または抗体均等物をコードするＤＮＡを含む適切なベクターを、発現のための宿主細胞に挿入する。
【００５０】
[66]  本発明には、本明細書に記載する抗体の機能均等物も含まれる。機能均等物は本発明の抗体のものに匹敵する結合特性をもち、たとえばキメラ抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体、ならびにそのフラグメントが含まれる。そのような機能均等物の調製方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９；欧州特許出願２３９，４００；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２；欧州特許出願３３８，７４５；および欧州特許ＥＰ３３２，４２４に開示されている。
【００５１】
[67]  機能均等物には、本発明の抗体の可変部または超可変部のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドが含まれる。本明細書においてアミノ酸配列に適用する”実質的に同一”とは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）によるＦＡＳＴＡ検索法によって判定して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列が他のアミノ酸配列と配列同一性をもつ配列であると定義される。
【００５２】
[68]  キメラ抗体は、実質的に、または専ら、ヒト抗体定常部に由来する定常部、および実質的に、または専ら、ヒト以外の哺乳動物の抗体可変部の配列に由来する可変部をもつことが好ましい。ヒト化型の抗体は、たとえばマウス抗体の相補性決定領域をヒト枠組みドメイン中へ置換することにより作製される；たとえばＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２６５３を参照。ヒト化抗体は、実質的に、または専ら、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の対応するヒト抗体領域に由来する定常部および可変部、ならびに実質的に、または専ら、ヒト以外の哺乳動物に由来するＣＤＲをもつことが好ましい。
【００５３】
[69]  機能均等物には、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として知られる一本鎖抗体フラグメントも含まれる。本発明の一本鎖抗体フラグメントは、非放出Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６エピトープを結合するが放出Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６エピトープを結合しない、組換えポリペプチドである。これらのフラグメントは、抗体可変部Ｌ鎖アミノ酸配列（ＶＬ）の少なくとも１つのフラグメントに、１以上の連結リンカーを介して、または介さずに連繋した、抗体可変部Ｈ鎖アミノ酸配列（ＶＨ）の少なくとも１つのフラグメントを含む。そのようなリンカーは、（ＶＬ）ドメインと（ＶＨ）ドメインが結合した場合にそれらの適正な三次元フォールディングが確実に起き、これにより一本鎖抗体フラグメントが由来した抗体全体のターゲット分子結合特異性が保持されるように選択された、短かいフレキシブルなペプチドであってよい。一般に（ＶＬ）または（ＶＨ）配列のカルボキシ末端はそのようなペプチドリンカーにより、相補的な（ＶＬ）および（ＶＨ）配列のアミノ酸末端に共有結合により連結してもよい。一本鎖抗体フラグメントは、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー、またはこれらに類する方法により得てもよい。これらのタンパク質を、真核細胞、または細菌を含めた原核細胞において産生させてもよい。
【００５４】
[70]  一本鎖抗体フラグメントは、本明細書に記載する抗体全体の可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つをもつアミノ酸配列を含むが、これらの抗体の定常ドメインの一部または全部を欠如する。これらの定常ドメインは抗原結合には必ずしも必要ないが、抗体全体の構造の主要な部分を構成する。したがって一本鎖抗体フラグメントは、定常ドメインの一部または全部を含む抗体の使用に伴う問題のうち若干を克服することができる。たとえば一本鎖抗体フラグメントは、生体分子とＨ鎖定常部の不都合な相互作用または他の目的外の生物活性を生じにくい。さらに、一本鎖抗体フラグメントは抗体全体よりかなり小さいので抗体全体より大き毛細血管透過性をもち、したがって一本鎖抗体フラグメントはより効率的にターゲット抗原結合部位へ局在して結合できる。また抗体フラグメントは原核細胞において比較的大規模に産生させることができ、このためそれらの生産が容易になる。さらに、比較的小さいサイズの一本鎖抗体フラグメントであるため、それらは抗体全体よりレシピエントにおいて免疫応答を誘発しにくい。
【００５５】
[71]  機能均等物にはさらに、抗体全体と同一または同等の結合特性をもつ抗体フラグメントが含まれる。そのようなフラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントのうち一方または両方を含んでもよい。好ましくは、抗体フラグメントは抗体全体の６つの相補性決定領域を全部含むが、全部より少ないそのような領域、たとえば３、４または５つのＣＤＲを含むフラグメントも機能性である。さらに、機能均等物は下記の免疫グロブリンクラスのいずれかのメンバーであってもよく、それらのメンバーを組み合わせてもよい：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、およびそのサブクラス。
【００５６】
コンジュゲート
[72]  本発明のコンジュゲートは、細胞毒性物質に結合した、本明細書に開示する抗体、フラグメント、およびそれらの類似体を含む。好ましい細胞毒性物質はメイタンシノイド類、タキサン類、またはＣＣ−１０６５の類似体である。コンジュゲートはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で調製できる。細胞毒性物質を抗体に連結させるために、連結基を用いる。適切な連結基は当技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。好ましい連結基はジスルフィド基およびチオエーテル基である。たとえば、コンジュゲートはジスルフィド交換反応を用いて、または抗体と細胞毒性物質の間にチオエーテル結合を形成することにより構築できる。
【００５７】
[73]  メイタンシノイド類およびメイタンシノイド類似体は、好ましい細胞毒性物質に含まれる。適切なメイタンシノイド類の列には、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が含まれる。適切なメイタンシノイド類はＵＳＰ  Ｎｏ．
【００５８】
【化７】
2006502110.tif 000008
【００５９】
に開示されている。
[74]  タキサン類も好ましい細胞毒性物質である。本発明に使用するのに適したタキサン類は、ＵＳＰ  Ｎｏ．６，３７２，７３８および６，３４０，７０１に開示されている。
【００６０】
[75]  ＣＣ−１０６５およびその類似体も、本発明に使用するのに好ましい細胞毒性物質である。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、ＵＳＰ  Ｎｏ．６，３７２，７３８；６，３４０，７０１；５，８４６，５４５および５，５８５，４９９に開示されている。
【００６１】
[76]  そのような細胞毒性コンジュゲートの調製に有望な候補はＣＣ−１０６５であり、これはストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された有効な抗腫瘍性抗生物質である。ＣＣ−１０６５は一般に用いられる抗癌薬、たとえばドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキセートおよびビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）よりｉｎ  ｖｉｔｒｏで約１０００倍有効である（Ｂ．Ｋ．Ｂｈｕｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４２，３５３２−３５３７（１９８２））。
【００６２】
[77]  細胞毒性薬物、たとえばメトトレキセート、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、マイトマイシンＣ、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）およびカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）も本発明のコンジュゲートの調製に適切であり、これらの薬物分子は中間キャリヤー分子、たとえば血清アルブミンを介して抗体に連結させることもできる。
【００６３】
診断用途
[78]  診断用途のためには、本発明の抗体を一般に検出可能な部分で標識する。検出可能な部分は、検出可能な信号を直接または間接的に発生できるいかなるものであってもよい。たとえば検出可能な部分は、放射性同位体、たとえば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉ；蛍光性もしくは化学発光性化合物、たとえばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン；または酵素、たとえばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼであってもよい。
【００６４】
[79]  抗体を検出可能な部分に結合させるための当技術分野で既知の方法をいずれも使用でき、これには下記に記載の方法が含まれる：Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）。
【００６５】
イムノアッセイ
[80]  本発明の抗体をいずれか既知のアッセイ法、たとえば競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイに使用できる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。
【００６６】
[81]  本発明の抗体はｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにも有用である。この場合、検出可能な部分、たとえば放射線不透性物質または放射性同位体で標識した抗体を、対象（好ましくは血流中）に投与し、受容者における標識抗体の存在および位置をアッセイする。このイメージング法は悪性疾患の病期判定および処置に有用である。抗体を、核磁気共鳴、放射線分析そのほか当技術分野で既知の手段で受容者において検出可能な部分により標識してもよい。
【００６７】
[82]  本発明の抗体はアフィニティー精製試薬としても有用である。この方法では、当技術分野で周知の方法により、適切な支持体、たとえばセファデックス樹脂または濾紙に抗体を固定化する。
【００６８】
療法用途
[83]  療法用途のためには、本発明の抗体またはコンジュゲートを医薬的に許容できる剤形で対象に投与する。それらをボーラスとしてまたは一定期間にわたる連続注入により静脈内に投与し、筋肉内、皮下、関節内、滑液内、クモ膜下、経口、局所または吸入経路で投与することができる。抗体は、全身療法効果と共に局所療法効果を及ぼすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病変部内または病変部周囲経路によっても投与してもよい。
【００６９】
[84]  医薬的に許容できる適切なキャリヤー、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状況に応じて当業者が決定できる。適切なキャリヤー、希釈剤および／または賦形剤の例には下記のものが含まれる：（１）ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ約７．４、１〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有、（２）０．９％生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖのＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース。
【００７０】
[85]  本発明方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施できる。
[86]  本発明方法は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６の発現が増大している癌のスクリーニングおよび／または処置に使用してもよい。少なくともＭｕｃ１が増加しているそのような癌の例には卵巣癌、胸部癌、肺癌、膵臓癌および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。少なくともＭｕｃ１６が増加しているそのような癌の例には卵巣の重篤な嚢腺腫、ならびに膵臓、肝臓または結腸の癌腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
[87]  抗体が凍結乾燥状態ではなく水性剤形である場合、一般に約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で配合されるが、これらの範囲外の広範な変更が可能である。
[88]  疾患の処置について抗体またはコンジュゲートの適切な用量は、上記に定義した処置すべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体を予防または治療のいずれの目的で投与するのか、それまでの療法の経過、患者の病歴および抗体への応答性、ならびに担当医の決定に依存するであろう。抗体は１回の処置で、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与する。
【００７２】
[89]  たとえば１回以上の個別の投与または連続注入のいずれであっても、疾患のタイプおよび重症度に応じて抗体約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ（患者体重）が患者に投与する初期候補用量である。症状に応じて数日以上にわたって反復投与するには、疾患の症状が目的どおりに抑制されるまで処置を反復する。しかし、他の用量方式が有用な可能性があり、それらが除外されることはない。
【実施例】
【００７３】
実施例
実施例１：Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６の細胞外−細胞会合ドメインに対するモノクローナル抗体の産生
[90]  ヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６の細胞外傍膜領域から選択した２０または２１個のアミノ酸を表わす合成ペプチド（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｉｎｃ．）でマウスを免疫化することにより、ヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６の推定非放出−細胞外エピトープ（１以上）に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）のパネルを作製した。具体的には、ＣＡ１２５（Ｍｕｃ１６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）の残基１１６４４〜１１６６３を表わすＭｕｃ１６ペプチドａ、ＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；Ｍｕｃ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）の残基３６２〜３８２を表わすＭｕｃ１ペプチドａ、ＱＬＴＬＡＦＲＥＧＴＩＮＶＨＤＶＥＴＱＦＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いて、モノクローナル抗体を産生した。
【００７４】
[91]  マウスにおける免疫応答性を高めるために、これらの合成ペプチドを、合成時にペプチドのアミノ末端に付加したシステイン残基を介してキャリヤータンパク質キーホール・リンペット・ヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合させ（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｉｎｃ．）、免疫化前に完全または不完全フロイントアジュバントと混合した。各ペプチドにつき２または３匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１匹当たり２０μｇの抗原を皮下注射し、続いて抗原−プラス−フロイントアジュバントで５回以上の追加免疫を行った。最終注射後３日目に、免疫化マウスを屠殺し、脾細胞調製のために無菌条件下でそれらの脾臓を摘出した。
【００７５】
[92]  ポリエチレングリコール−１５００を融合誘導剤（ｆｕｓｏｇｅｎ）として用い、標準プロトコル（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）を改変したものに従って、免疫化マウスからの脾細胞をマウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞と融合させ、ハイブリドーマクローンを作製した。細胞融合の後に細胞を９６ウェルプレート内のＨＡＴ選択培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。各抗原につき１回の細胞融合実験を行い、３８５個のＭｕｃ１６ハイブリドーマおよび６９２個のＭｕｃ１ハイブリドーマの上清が得られた。これらを、後記のようにペプチドＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーにより特異性抗体の存在についてスクリーニングした。両アッセイにおいて良好な反応性を示した幾つかのハイブリドーマクローンの上清を増殖させ、さらに特性解明した。ハイブリドーマは、１５％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）、５０単位／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を補充したＲＰＭＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中に維持した。
【００７６】
実施例２：Ｍｕｃ１およびＭｕｃ１６の細胞外−細胞会合ドメインに対するモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによるスクリーニング
[93]  ハイブリドーマ上清中のペプチド特異性抗体を、まず固相ペプチドＥＬＩＳＡによりスクリーニングした；その際、ＫＬＨコンジュゲートしていない特異的ペプチドのビオチニル化調製物（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｉｎｃ．）を捕獲抗原として用いた。Ｉｍｍｕｌｏｎ  Ｈ２Ｂ  ９６ウェルプレートを、ウェル当たり２５０ｎｇ（５μｇ／ｍｌのもの５０μｌ）のＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）［０．５Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０中］により、室温で４〜６．５時間、揺動しながらコーティングした。ウェルをウェル当たり３００μｌの洗浄用緩衝液（トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、ウェル当たり２００μｌのＴＢＳ／３％ＢＳＡにより室温で１時間、揺動しながらブロックした。ウェル当たり５０ｎｇ（１μｇ／ｍｌのもの５０μｌ）のビオチニル化ペプチドと共に室温で１時間（Ｍｕｃ１６）または４℃で一晩（Ｍｕｃ１）、揺動しながらインキュベートすることにより、ビオチニル化されたＭｕｃ１ペプチドａまたはＭｕｃ１６ペプチドａをＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで捕獲した。ウェルを３００μｌのＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄した後、２０μｌのＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１．５％ＢＳＡ（Ｍｕｃ１については１％ＢＳＡ）、および免疫化ペプチドに対応するハイブリドーマ上清３０μｌを添加し、プレートを４℃で一晩（Ｍｕｃ１６）または室温で１時間（Ｍｕｃ１）揺動した。ウェルを再び３００μｌのＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄した。第２抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１１５−０３５−０６２）を、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１．５％ＢＳＡ（Ｍｕｃ１については１％ＢＳＡ）中に１：３０００に希釈したもの１００μｌ（Ｍｕｃ１については５０μｌ）を添加し、揺動しながら室温に１時間おいた。ウェルをＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、０．０３％Ｈ２Ｏ２を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）中１ｍｇ／ｍｌの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）（Ｆｌｕｋａ）基質１００μｌで発色させ、１０〜２０分後、ＥＬ８０８  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりＡ４０５で発色を測定した。
【００７７】
Ｍｕｃ１６
[94]  Ｍｕｃ１６ペプチドａで免疫化したマウスに由来する３８５個の被験ハイブリドーマ上清のうち、２８個はペプチド抗原への結合について強い陽性、５４個は中等度に陽性であった。免疫化用ペプチドへの結合についてのハイブリドーマ上清中の抗体の特異性を、コンパニオンＥＬＩＳＡにより確認し、無関係なペプチド（Ｍｕｃ１６ペプチドｂ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；データは示されていない）への検出可能な結合はみられなかった。
【００７８】
Ｍｕｃ１
[95]  Ｍｕｃ１ペプチドａで免疫化したマウスに由来する６９２クローンのハイブリドーマ上清を、ビオチニル化型の免疫化用ペプチドへの結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。結果を表１にまとめる。７２％のクローンがこのペプチドへの結合を示し、これらのうち約２５％が強い結合を示した。
【００７９】
【表１】
2006502110.tif 000009
【００８０】
実施例３：Ｍｕｃ１の細胞外−細胞会合ドメインに対するモノクローナル抗体のフローサイトメトリーによるスクリーニング
[96]  ＥＬＩＳＡスクリーニングに加えて、ハイブリドーマ上清を抗原陽性腫瘍細胞系への結合についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。Ｍｕｃ１ハイブリドーマ上清をＣａＯＶ−３細胞によりスクリーニングし、Ｍｕｃ１６ハイブリドーマ上清をＯＶＣＡＲ−３細胞によりスクリーニングした。Ｍｕｃ１スクリーニングについては、ＣａＯＶ−３細胞を１５ｃｍの組織培養プレート上で、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）、５０単位／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を補充した完全培地ＲＰＭＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中において、３７℃、５％ＣＯ２中で、９５％集密度まで増殖させた。収穫の１日前に、細胞に３０ｍｌの新鮮な培地を供給した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３ｍｌのＣｅｌｌｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）と共に３７℃で１０分間インキュベートすることによりプレートから離脱させた。細胞を２０ｍｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＭＩ中２％のヤギ血清）で洗浄し、血球計数器で計数し、濃度をＦＡＣＳ緩衝液中１０６個／ｍｌに調整した。細胞を１０５個／ウェル（１００μｌ）で９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に接種した。３０μｌのハイブリドーマ上清を各ウェルに添加した後、プレートを氷上で約３時間インキュベートした。卓上遠心機で細胞をペレット化し（４００×ｇ，５分，４℃）、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１００μｌに再懸濁した。プレートをアルミニウム箔で覆い、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド１７５μｌで固定した。試料をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで走査および分析した。個数の変動するタンデム・リピート（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ，ＶＮＴＲ）ドメインを認識する市販のＭｕｃ１抗体ＣＭ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を、フローサイトメトリースクリーニングのための対照として含めた。
【００８１】
[97]  結果は、ＣＭ１が９８％以上のＣａＯＶ３細胞に結合することを示した。これに対し、ハイブリドーマ上清中の抗体はおおまかに２つのカテゴリーに属する結合を示した：全細胞集団に結合すると思われるもの、および細胞集団のサブセットに結合すると思われるもの。両カテゴリーを代表する合計１２のクローンを後続試験のために選択した（図４Ａおよび４Ｂならびに表２を参照）。これらのクローンを凍結用に増殖させ、サブクローニングした。
【００８２】
【表２】
2006502110.tif 000010
【００８３】
[98]  Ｍｕｃ１６ハイブリドーマスクリーニングのために、わずかに変更してＭｕｃ１と同様にフローサイトメトリーを実施した。Ｍｕｃ１６抗原の細胞表面発現を高めるために、ＯＶＣＡＲ−３細胞を１５ｃｍの組織培養プレート上で集密状態にまで増殖させ、２日間インキュベーションを続けた後、細胞を収穫した。ＦＡＣＳ緩衝液は、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２００μｌの１％ホルムアルデヒドで固定した。放出ドメインを認識するＭｕｃ１６抗体Ｍ１１（アーカンサス大学Ｄｒ．Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎからの贈与）を、フローサイトメトリースクリーニングのための対照抗体として用いた。
【００８４】
[99]  Ｍｕｃ１６ハイブリドーマスクリーニングから得た２４の代表クローンのヒストグラムを図５Ａに示す。このヒストグラムは一般に３つのカテゴリーに属する：細胞のサブ集団が蛍光シフトを示すヒストグラム、細胞の全集団が蛍光シフトを示すヒストグラム、細胞の２集団が異なる規模の蛍光シフトを示すヒストグラム。図５Ｂに、比較のためにＭｕｃ１６放出ドメインに対する抗体Ｍ１１のヒストグラムを示す。この場合、約１７％の細胞が蛍光シフトを示す。表３に、図５Ａおよび５Ｂに示した２４のヒストグラムについての相対蛍光単位（ＲＦＵ）、ヒストグラムに示すＭ１ゲートゾーンへシフトした細胞の％、および対応するＥＬＩＳＡ結果をまとめる。
【００８５】
[100]  これら２４のＭｕｃ１６ハイブリドーマクローンを増殖させ、下記に従って培養物上清中の抗体をさらに特性解明した。次いで２つのＭｕｃ１６ハイブリドーマ２Ｆ９および４Ｅ２をサブクローニングし、ＩｇＧ１κのイソタイプと判定した。これらのサブクローンからのモノクローナル抗体を細胞培養物上清からプロテインＡセファロースにより精製し、細胞ベースの実験でさらに特性解明した。
【００８６】
【表３】
2006502110.tif 000011
【００８７】
実施例４：抗体の精製
[101]  安定サブクローンのハイブリドーマ上清を用いて、Ｉｓｏｓｔｒｉｐイソタイプ判定ストリップ（Ｒｏｃｈｅ）により抗体イソタイプを判定した後、抗体を精製した。精製した抗体はすべてＩｇＧ／κであった。抗体精製のために、５％のＩｇＧ超低含量ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、５０単位／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、０．６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を補充したハイブリドーマ用無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中８×１０５個／ｍｌで、ハイブリドーマを１５ｃｍの組織培養プレートに接種した。細胞密度が１．８×１０６個／ｍｌに達した時点で培養物上清を収穫した。塩化ナトリウムをハイブリドーマ上清に添加して濃度を３Ｍにし、上清を０．２２ミクロンＭｉｌｌｅｘ  ＧＶ  ＰＶＤＦフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。１００ｍｌのハイブリドーマ上清から、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５）プラス２．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉＴｒａｐ組換えプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌにより抗体を精製した。カラムにハイブリドーマ上清を装入した後、カラムを１０ｍｌの平衡化用緩衝液で洗浄した。抗体を１００ｍＭ酢酸（ｐＨ２．８）プラス１５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶離した。ピーク画分を採集し、２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ１０）で中和し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。透析した抗体を０．２２ミクロンＭｉｌｌｅｘ  ＧＶ  ＰＶＤＦフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。
【００８８】
実施例５：哺乳動物細胞における組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質発現のためのプラスミドの構築
[102]  Ｍｕｃ１６の１形態を哺乳動物細胞において発現させるために、ＤＮＡプラスミドを構築した。本明細書において組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ（図６Ａおよび６Ｂ）と呼ぶこの形態は、Ｍｕｃ１６の野生型の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインと、この分子の非放出部分を含むと推定されるトランケートした細胞外ドメインを含んでいた。このｐｃＤＮＡ３ベースのプラスミド（ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３）は、Ｃ末端における３コピーのＭｙｃエピトープタグおよびＮ末端における１コピーのＦｌａｇエピトープでフランキングされたＭｕｃ１６アミノ酸１１５７６〜１１７２２をコードする。組換えタンパク質を小胞体および細胞表面へ指向させるために、Ｍｕｃ１シグナルペプチドを用いた。このプラスミドを構築するための各工程の詳細な記載を以下に示す。
【００８９】
ＰＣＲによるＭｕｃ１６のクローニング：
[103]  Ｍｕｃ１６／ＣＡ１２５  Ｇｅｎｂａｎｋ配列（Ｙｉｎ  ａｎｄ  Ｌｏｙｄ，２００１−寄託番号ＮＭ ０２４６９０）を再検討して、ＣＡ１２５遺伝子の３’末端の３．４ｋｂをクローニングするためのプライマーを設計した。下記のプライマー： 
【００９０】
【化８】
2006502110.tif 000012
【００９１】
を用いて、オーバーラップＰＣＲクローニング方式を考案した。
[104]  第１ラウンドのＰＣＲにより、３．４ｋｂ  ＣＡ１２５配列の５’末端（Ｍｕｃ−５ｋｏｚおよびＭｕｃ−ＢＧ１Ｒを使用）および３’末端（Ｍｕｃ−ＢＧ１ＲおよびＭｕｃ−３を使用）に対応する２つの１．７ｋｂ生成物が生成した。Ｏｒｉｇｅｎヒト卵巣ｃＤＮＡライブラリー（ロット＃３０１２−３）をＰＣＲ反応の鋳型として用いた（反応体積５０μｌ：５μｌの１０×増幅反応緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、４μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、０．５μｌの１００μＭ  左プライマー、０．５μｌの１００μＭ  右プライマー、１μｌのｃＤＮＡ、０．７５μｌの増幅ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および３８．２５μｌの２回蒸留水）。ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーにより下記のプログラムでＰＣＲ反応を実施した：１）９４℃で２分間、２）９４℃で２０秒間、３）５６℃で３０秒間、４）７２℃で１．５分間、５）工程２へ戻って３５回、６）７２℃で８分間、７）終了。ＰＣＲ生成物を１％低融点アガロースゲルに流し、陽性バンドを切り取り、６５℃で融解させ、第２ラウンドの反応のために３７℃に平衡化した。第１ラウンドと同様であるが、ただしＭｕｃ５ｅｎｄプライマーおよびＭｕｃ３ｅｎｄプライマーを用い、２．５μｌずつのゲル切片を鋳型として用い、伸長時間を７２℃で２分間に延長して、オーバーラップＰＣＲ反応を実施した。オーバーラップＰＣＲ反応物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１％低融点アガロースゲルに流し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクター中へライゲートさせた。このオーバーラップＰＣＲクローニング方式により、２ｋｂの３’末端配列のクローニングが可能になった。
【００９２】
ｓｔｕｍｐ発現ベクターのためのＣＡ１２５配列のクローニング：
[105]  クローニングしたＣＡ１２５配列は、その３’末端までの推定ＣＡ１２５  ｓｔｕｍｐ配列全体を含んでいたので、これらのクローンをＣＡ１２５  ｓｔｕｍｐ発現構築体の作製のための鋳型として用いた。ＣＡ１２５の５６７ｂｐ  ３’末端をＭｕｃ１シグナルペプチド、そしてＦｌａｇタグをその５’末端に、およびＭｙｃタグをその３’末端に、読み枠が一致するようにクローニングしてプライマーを設計した。最終的なクローニング方式には、後続の二重ライゲーションクローニングのための内部ＫｐｎＩ部位を利用する２回のＰＣＲ反応が含まれていた（下記のプライマーを参照）。
【００９３】
【化９】
2006502110.tif 000013
【００９４】
[106]  ＣＡＸｂａＦおよびＣＡＫｐｎＲプライマーを５’側半分のために用い、ＣＡＫｐｎＦおよびＣＡ３ｅｎｄＮｏｔプライマーを３’側半分のために用いた。ＰＣＲ反応ミックスを前記と同様に調製し、ただし５μｌの２０ｎｇ／μｌ  ＣＡ１２５クローンＤＮＡを鋳型として用い、Ｒｏｃｈｅ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を用いた。ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーにより下記のプログラムで反応を実施した：１）９４℃で１分間、２）９４℃で１５秒間、３）５５℃で１分間、４）７２℃で１分間、５）工程２へ戻って２９回、６）７２℃で４分間、７）終了。次いでＰＣＲ反応物をＫｐｎＩおよびＸｂａＩまたはＮｏｔＩで消化し、１％低融点アガロースゲルに流し、切り取り、ＸｂａＩ＋ＮｏｔＩ切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中へ一緒にライゲートした。陽性クローンを配列決定して、配列統合性を確認した。
【００９５】
ＲＴＰＣＲによるＭｕｃ１シグナルペプチドのクローニング：
[107]  Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｎｅａｓｙ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用い、キットプロトコルに従って全ＲＮＡをＴ４７Ｄ細胞から精製した。２．４μｇのＴ４７Ｄ  ＲＮＡを用い、供給されたランダムヘキサマープライマーの使用のためのＧｉｂｃｏ  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩプロトコルに従って、ＲＴ反応を実施した。示された反応条件（２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間）をＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーにより実施した。ＲＴ反応物から３７℃で１μｌ  ＲｎａｓｅＨ（Ｇｉｂｃｏ  ＳＳＩＩキット中に供給）と共にインキュベートすることによりＲＮＡを除き、次いで反応物をそのままＰＣＲ反応に用いた。
【００９６】
[108]  Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍｕｃ１配列（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３−寄託番号ＮＭ ００２４５６）に基づいて、Ｍｕｃ１シグナルペプチド配列をクローニングするためのプライマーを設計した。ターゲット配列は、シグナルペプチド全体およびその開裂部位を含めたＭｕｃ１配列の最初のアミノ酸３０個を発現する。５’末端プライマーはＢａｍＨＩクローニング部位をも含み、３’末端プライマーはＣＡ１２５配列の５’末端に読み枠を一致させてクローニングするように設計したＦｌａｇタグ配列およびＸｂａＩ部位を含んでいた（下記のプライマーを参照）。
【００９７】
【化１０】
2006502110.tif 000014
【００９８】
[109]  ＰＣＲ反応ミックスをＣＡ１２５  ｓｔｕｍｐについて記載したと同様に調製し、ただし２μｌのＲＴ反応物を鋳型として用いた。ＰＣＲ反応物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、１％低融点アガロースゲルに流し、切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中へライゲートした。陽性クローンを配列決定して、配列統合性を確認した。
【００９９】
最終発現構築体の組立て：
[110]  各片を構築して配列を確認したのち、簡単な制限消化およびｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ３発現プラスミド（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へのライゲーションにより、最終発現構築体を作製した。図６Ａの図は、最終的に組み立てた構築体の地図を示し、続いてその配列を図６Ｂに示す。このｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３プラスミドの模式図を図７に示す。
【０１００】
実施例６：モデルＭｕｃ１６抗原発現細胞系の作製
[111]  実施例５に記載したｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３プラスミドを用い、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション体およびＨｅＬａ細胞の安定なトランスフェクション体の両方を利用して、組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を発現させた（Ｑｉａｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬、製造業者のプロトコル）。１０％のウシ胎仔血清、１ｍＭのＬ−グルタミン、５０単位／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で２９３Ｔ細胞およびＨｅＬａ細胞を増殖させ、ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３プラスミドまたは空のベクタープラスミド対照でトランスフェクションした。一過性トランスフェクションした２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２５時間後にＰＢＳ中で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）フッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）、ペプスタチン（１μｇ／ｍｌ）およびロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）中で溶解することにより、ウェスタンブロット用に収穫した。組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を安定発現するＨｅＬａ細胞系を選択するために、トランスフェクション後に細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）の存在下で培養した。薬物耐性コロニーが出現すると、ＲＩＰＡ細胞溶解物を抗Ｍｙｃ  ＭＡｂ  ９Ｅ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でウェスタンブロットすることにより、Ｍｙｃタグ付き組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質の発現を確認した。最高発現を示す幾つかのＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３クローンをサブクローニングして、抗Ｍｕｃ１６ペプチドａモノクローナル抗体の特性解明に用いた。
【０１０１】
実施例７：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法
[112]  トランスフェクションした細胞からの細胞溶解物を試料用緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８；２％ｗ／ｖのＳＤＳ、１０％ｖ／ｖのグリセロール、０．００１％ｗ／ｖのブロモフェノールブルー、および５％ｖ／ｖのβ−メルカプトエタノールを含有）中で５分間煮沸することにより変性させ、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）の方法に従って４〜２０％アクリルアミド／２．６％ビス−アクリルアミド  トリス−グリシン−プレキャストミニゲル（Ｎｏｖｅｘ）に流した。３２．５ｍＭトリス／２５ｍＭグリシン／０．０３７％ＳＤＳ／２０％メタノール緩衝液中で２時間、ＳｅｍｉＰｈｏｒ  ＴＥ７０半乾燥トランスファーユニット（Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により、タンパク質をゲルから０．２μニトロセルロースフィルター（Ｎｏｖｅｘ）上へエレクトロブロットした。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ中で１時間、ブロットをブロックし（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、第１抗体と共に一晩インキュベートし、そして西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした第２抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の指示に従って用いて処理した。第１モノクローナル抗体を１〜２μｇ／ｍｌで使用した。
【０１０２】
[113]  使用した第１抗体は、抗Ｍｙｃタグ抗体（ＭＡｂ  ９Ｅ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）であった。図８から分かるように、抗Ｍｙｃ抗体または抗Ｆｌａｇ抗体のいずれによっても、二重試験培養物からのｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３トランスフェクションした細胞の溶解物中において約４２ｋＤの位置に泳動する単一バンドが検出された（列１、２）が、ｐｃＤＮＡ３空ベクターでトランスフェクションした対照細胞溶解物中には検出されなかった（列３）。
【０１０３】
[114]  同じｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、安定なトランスフェクション体をＧ４１８中で選択した。クローンは組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を発現することが細胞溶解物のウェスタンブロット法により示され、幾つかの高発現細胞系を増殖させてサブクローニングした。
【０１０４】
[115]  哺乳動物細胞において発現した組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質に関連して提示される適宜なエピトープを抗体が検出できるかどうかを判定するために、ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３で一過性トランスフェクションした２９３Ｔ細胞の溶解物を用いてウェスタンブロット法を実施した。図９に示すように、幾つかのハイブリドーマ上清中の抗体が、抗Ｍｙｃによる検出により同定された組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐバンドと共泳動する４２ｋＤバンドに結合した。
【０１０５】
実施例８：Ｍｕｃ１６ペプチドａに対するモノクローナル抗体の結合親和性−ペプチドＥＬＩＳＡによるＫＤの推定
[116]  ハイブリドーマ２Ｆ９および４Ｅ２を増殖させてサブクローニングした。すべてＩｇＧκサブタイプのモノクローナル抗体を、サブクローン２Ｆ９−１Ｅ８−１Ｄ７（以下、ＭＪ−１７３と呼ぶ）、２Ｆ９−１Ｆ８−１Ｃ１０（以下、ＭＪ−１７２と呼ぶ）、および４Ｅ２−２Ｄ１−１Ｂ１０（以下、ＭＪ−１７１と呼ぶ）の培養物上清から前記に従って精製した。２つの精製モノクローナル抗体について、ハイブリドーマ上清の初期スクリーニングについて記載したものと同様な固相ビオチニル化ペプチド捕獲プロトコルを用いるペプチドＥＬＩＳＡにより見掛けＫＤを判定した。ただし、ハイブリドーマ上清の代わりに、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／１％ＢＳＡ中に希釈した種々の濃度の精製抗体１００μｌを用いた。精製モノクローナル抗体とのインキュベーションを、室温で１時間行った。図１０から分かるように、ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１は合成ペプチド抗原に良好に結合し、両方のモノクローナル抗体が飽和結合を示し、最大の半分の結合を達成するのに要した抗体濃度から推定して３×１０−１０〜５×１０−１０Ｍの見掛けＫＤを示した。
【０１０６】
実施例９：Ｍｕｃ１ペプチドａに対するＭＪ−１７０の結合親和性−ペプチドＥＬＩＳＡによるＫＤの推定
[117]  ハイブリドーマクローン３Ａ３をサブクローニングして３Ａ３−２Ａ６（以下、ＭＪ−１７０と呼ぶ）を得た。ＭＪ−１７０ハイブリドーマからの抗体を前記に従って精製した。本質的にＥＬＩＳＡスクリーニング法に記載したように、ただしハイブリドーマ上清の代わりにＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ中に希釈した種々の濃度の精製抗体１００μｌを用いたＥＬＩＳＡによって、免疫化用ペプチドＭｕｃ１ペプチドへの精製ＭＪ−１７０の結合親和性を測定した。結果を図１１に示す。最大の半分の結合を達成するのに要した抗体濃度から、Ｍｕｃ１ペプチドａへのＭＪ−１７０結合について４．５×１０−１０Ｍの見掛けＫＤが推定され、この抗体は免疫化用ペプチドに対する高い親和性をもつことが示された。
【０１０７】
実施例１０：抗Ｍｕｃ１６ペプチドａモノクローナル抗体を用いた間接免疫蛍光法および吸着エンドサイトーシス
[118]  抗ペプチドモノクローナル抗体が細胞関連の抗原を認識する能力を、安定なＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３細胞系、サブクローン＃５４−１を用いる間接免疫化蛍光試験により評価した。細胞において発現した際にＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐが適正に局在していれば、Ｍｙｃタグは細胞内にあり、Ｍｕｃ１６ペプチドａエピトープ（１以上）は細胞外にあると予想される。第１実験では、サブクローン＃５４−１、または空のベクターでトランスフェクションした対照ＨｅＬａ細胞を、カバーガラス上、２４ウェルプレート内の培地に、８×１０４個／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で一晩付着させた。細胞単層をＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で２５分間固定し、洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ中で１０分間透過処理し、洗浄し、そして２．５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中で１時間ブロックした（すべて室温）。第１モノクローナル抗体を２．５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌに希釈し、単層と共に１時間４０分間、穏やかに揺動しながらインキュベートした。透過処理した細胞中の組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を検出するための陽性対照として、抗Ｍｙｃを用いた；陰性対照抗体としては、ＭＯＰＣ２１（Ｓｉｇｍａ）を用いた。ＰＢＳ中で５分間ずつ３回の洗浄により、非結合モノクローナル抗体を除去した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ−１１００１、２．５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中に１：２０００）を１時間添加して、細胞結合したモノクローナル抗体を検出した。第２抗体インキュベーションに際して添加したＨｏｅｃｈｓｔ  ＃３３２５８（Ｓｉｇｍａ）により、核を染色した。カバーガラスを３回洗浄し（５分間、ＰＢＳ）、ｖｉｎｏｌマウンティング媒質中にマウントした。Ｎｉｋｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸＡ顕微鏡により蛍光を観察し、Ｓｐｏｔデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）により撮影した。モノクローナル抗体ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１はＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３細胞を染色し、個々の細胞が広範な蛍光強度を示した。この不均一パターンは、抗Ｍｙｃによる染色後にも観察された。対照（組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐを発現しない）ＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３細胞においては、抗Ｍｕｃ１６ペプチドモノクローナル抗体についてかすかな細胞質染色がみられたが、抗Ｍｙｃについてはみられなかった。
【０１０８】
[119]  第２実験では、前記の間接免疫蛍光プロトコルの変法を用いて、生存細胞について吸着エンドサイトーシスを実施した。増殖中の細胞の培養培地に第１モノクローナル抗体を直接添加して最終濃度２μｇ／ｍｌにし、細胞単層と共に３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で時々揺動しながら１時間インキュベートした。モノクローナル抗体を細胞表面エピトープに結合させ、そしてこの抗原−抗体複合体をインターナリゼーションさせるためのこのインキュベーション期間の後、細胞単層をＰＢＳで速やかに３回洗浄し、次いで固定し、透析し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識した第２抗体およびＨｏｅｃｈｓｔで前記と同様に検査した。細胞外表面に存在し、速やかにインターナリゼーションしうると予想されるタンパク質を追跡するための陽性対照として、トランスフェリン受容体モノクローナル抗体（ＣＤ７１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃７３２７）を用いた。組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質上のＭｙｃエピトープタグは細胞内にあり、細胞外媒質に添加したモノクローナル抗体による結合に利用できないと予想されたので、この実験の陰性対照として抗Ｍｙｃを用いた。予想どおり、生存する対照ＨｅＬａ細胞においては抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体のみが細胞表面に結合して細胞内コンパートメント中へエンドサイトーシスされた。ＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３細胞の場合、抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体ならびにＭｕｃ１６モノクローナル抗体ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１がいずれも良好に結合し、インターナリゼーションされた。抗Ｍｙｃを生存細胞培養物に添加した場合には染色がみられず、細胞膜における組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質の配向が推定どおりであることが確認された。
【０１０９】
実施例１１：腫瘍細胞への精製Ｍｕｃ１６モノクローナル抗体の結合
[120]  精製Ｍｕｃ１６クローンＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１に由来する抗体の、種々の腫瘍細胞系への結合を、フローサイトメトリーにより分析した。Ｍｕｃ１６細胞表面発現を最適化するために、組織培養プレートの約５０％を覆う密度で細胞を接種した。消費された培地を交換せずに６〜８日間インキュベーションを続けた（Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）のち、細胞を収穫し、本質的には前記のスクリーニングについて記載したようにフローサイトメトリーを実施した。ただし、ハイブリドーマ上清の代わりに、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中のＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌ）中に種々の濃度で希釈した精製抗体１００μｌを用いた。最大の半分の結合を達成するのに要した抗体濃度の判定により、細胞に対する精製抗体の結合度（ａｖｉｄｉｔｙ）を推定した。Ｍｕｃ１６の放出タンデム・リピートドメインを認識する市販抗体（ＯＣ１２５；Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  ＣＭＣ２４２）の、ＷＩＳＨ細胞への結合を対照として含めた。
【０１１０】
[121]  結果を図１２および表４に示す。クローンＭＪ−１７１は数種類の腫瘍細胞系に対して飽和性結合を示した。ＯＶ９０細胞へのクローンＭＪ−１７３の結合は、実質的にクローンＭＪ−１７１の結合と識別できなかった。すべての場合、非放出ドメインのみを認識する抗体は、細胞周期依存性のエピトープ発現変化または到達可能性を示すと思われる細胞集団サブセットに結合した。これに対し、９５％のＷＩＳＨ細胞が、放出ドメインエピトープを認識するＯＣ１２５抗体に結合した。ＷＩＳＨ細胞の飽和結合時における蛍光シフトは、クローンＭＪ−１７１（４１ＲＦＵ）と比較してＯＣ１２５抗体については５倍より高かった（２４８ＲＦＵ）。これは、ＭＪ−１７１抗体に対して１つの傍膜エピトープがあるのと比較して、ＯＣ１２５抗体に対してはＭｕｃ１６分子当たり多数のタンデム・リピートエピトープがあることと一致した。卵巣細胞系ＯＶＣＡＲ３およびＰＡ−１は、最高のＲＦＵを示した。これは、これらの細胞系が高レベルの到達可能なＭｕｃ１６非放出エピトープを発現することを示唆する。種々の腫瘍細胞系に対するＭＪ−１７１およびＭＪ−１７３の推定見掛け結合度は、１〜９×１０−９の範囲であり、これは免疫化用ペプチドへの結合について測定した見掛けＫＤより低かった。
【０１１１】
【表４】
2006502110.tif 000015
【０１１２】
ａ  飽和結合における相対蛍光単位（ＲＦＵ）；
ｂ  最大の半分の結合を示す抗体濃度から推定；
ｃ  このＯＣ１２５抗体の純度が不明であるため、結合度を推定できない；
ｄ  この実験は異常に高いバックグラウンド蛍光（約２００ＲＦＵ）を示した。
【０１１３】
実施例１２：腫瘍細胞への精製Ｍｕｃ１モノクローナル抗体の結合
[122]  卵巣癌腫瘍細胞系ＣａＯＶ３への結合を、前記のＭｕｃ１６抗体スクリーニングについて記載したようにフローサイトメトリーにより分析した。ただし、ハイブリドーマ上清の代わりに、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中のＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌ）中に希釈した種々の濃度の精製抗体１００μｌを用いた。結果を図１３Ａに示す。あるサブセットの細胞集団が、抗体結合を示す蛍光シフトを示した。最大の半分の結合を達成するのに要した抗体濃度から、ＣａＯＶ３細胞に対するＭＪ−１７０の見掛け結合度が１．３×１０−８Ｍであると推定され、ＭＪ−１７０は細胞より免疫化用ペプチドに対して、より緊密に結合することが示唆された。図１３Ｂは、ＣａＯＶ３細胞へのＣＭ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、すなわちＭｕｃ１  ＶＮＴＲ抗体の結合を示す。予想どおり、ＣＭ１についてみられた最大相対蛍光は、ＭＪ−１７０のものよりかなり高い（約４０倍）。これは、Ｍｕｃ１分子当たり１つのＭＪ−１７０エピトープと対比して、Ｍｕｃ１分子当たり多数のＶＮＴＲエピトープがあることを反映する。
【０１１４】
実施例１３：ＨｅＬａ／組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ細胞およびヒト卵巣癌組織アレイの免疫組織化学的染色
[123]  ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ  ＃５４−１および対照ＨｅＬａ空ベクターでトランスフェクションした細胞を用いて、モノクローナル抗体ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１についての免疫組織化学的染色条件を最適化した。細胞を培養皿からＰＢＳ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中に取り出し、洗浄し、ペレット化し、１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト卵巣腫瘍外科検体の組織マイクロアレイをＩｍｇｅｎｅｘから購入した（ＩＭＨ−３４７）。モノクローナル抗体ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１を、ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ  ＃５４−１の最適染色およびＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３対照細胞ペレットの最小バックグラウンド染色を示す濃度で用いた。抗メイタンシンモノクローナル抗体（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．）をＩｇＧκイソタイプ対照として用いた。
【０１１５】
[124]  前記実験に用いた条件は下記のとおりであった。５μｍの細胞ペレット切片中または卵巣癌組織アレイ中に存在するＭｕｃ１６ペプチドエピトープを、高ｐＨ  ＢＯＲＧＤＥＣＬＯＡＫＥＲ中で、製造業者（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）の指示に従って１工程脱パラフィン／熱誘発抗原回復法により回復させた。すべての後続工程を室温で実施した。非特異的結合部位をＰＢＳ／［１×］Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）／１０％正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で２０分間ブロックした。第１モノクローナル抗体である抗Ｍｕｃ１６ペプチドおよび対照抗体をブロッキング緩衝液中に１μｇ／ｍｌに希釈し、切片と共に４５分間インキュベートした。次いでスライドをＰＢＳ中で５分ずつ３回洗浄した。ビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ第２抗体およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、続いてＤＡＢ基質クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）（Ｄａｋｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１０分間インキュベートすることにより、結合した第１抗体を検出した。切片をヘマトキシリン（Ｓｈａｎｄｏｎ）で対比染色した。スライドをマウントし、Ｎｉｋｏｎ  ＭｉｃｒｏＰｈｏｔ顕微鏡により明視野レンズ下で観察した。Ｓｐｏｔデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）により顕微鏡写真を作製した。
【０１１６】
[125]  前記の間接免疫蛍光実験と同様に、モノクローナル抗体ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１は不均一なＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３細胞染色を生じた。これは、広範な細胞−対−細胞範囲の抗原発現レベルを示す。対照ＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３細胞は、抗メイタンシンイソタイプ対照よりわずかに高い均一なバックグラウンド染色レベルを示したが、発現の強い抗原陽性ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ細胞にみられた染色レベルよりはるかに弱かった。
【０１１７】
[126]  モノクローナル抗体ＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１を用い、Ｉｍｇｅｎｅｘから購入した組織マイクロアレイ中のホルマリン固定ヒト卵巣癌試料を染色した。この実験の結果から、試験した５７の卵巣癌試料の約４２％においてＣＡ１２５ペプチドａ抗原を検出できることが示唆された。
【０１１８】
実施例１４：ＤＭ１への精製モノクローナル抗体のコンジュゲーション
[127]  Ｍｕｃ１６またはＭｕｃ１の細胞会合ドメインを認識する抗体が細胞毒性薬物の送達に適するかどうかを判定するために、メイタンシノイド薬物ＤＭ１をＭＪ−１７１（Ｍｕｃ１６）にコンジュゲートさせてＭＪ−１７１−ＤＭ１を形成し、またはＭＪ−１７０（Ｍｕｃ１）にコンジュゲートさせてＭＪ−１７０−ＤＭ１を形成した。Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）が記載した方法の変法により、精製抗体を細胞毒性メイタンシノイド薬物ＤＭ１にコンジュゲートさせた。要約すると、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  Ｐｌｕｓ−２０遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により抗体を１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭのＮａＣｌ／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）中へ透析した。抗体を二官能性リンカー、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＳＮＰＰ）で修飾して、ニトロジチオピリジル基を導入した。この抗体を、緩衝液Ａ中１２モル当量の（ＳＳＮＰＰ）プラス５％ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）と共に、周囲温度で撹拌しながら９０分間インキュベートした。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）で透析することにより未反応リンカーを除去した。３２５ｎｍにおける吸光度を測定することにより修飾度を判定した。３２５ｎｍにおけるＳＳＮＰＰの吸光係数１０，９６４Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、ニトロジチオピリジル基の濃度を計算した。２８０における吸光度を測定し、２８０ｎｍにおける吸光係数２２４，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、抗体濃度を判定した。分光測光法により、抗体は抗体当たり平均３〜６個のニトロジチオピリジル基で修飾されたことが示された。この修飾抗体をＮ２’−デアセチル−Ｎ−２’（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）にジスルフィド交換によりコンジュゲートさせた。ニトロジチオピリジル基当たり２当量のＤＭ１を、１〜３ｍｇ／ｍｌの修飾抗体と共に、緩衝液Ａプラス３％ＤＭＡ中、室温で３時間、撹拌しながらインキュベートした。遊離ＤＭ１を前記の透析によりコンジュゲートから除去し、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）の記載に従って分光測光法によりＤＭ１および抗体の濃度を測定した。得られたＭｕｃ１６コンジュゲート（ＭＪ−１７１−ＤＭ１）は、抗体分子当たり平均２．９８個のＤＭ１分子を含んでいた。得られたＭｕｃ１コンジュゲート（ＭＪ−１７０−ＤＭ１）は、抗体分子当たり平均１．２個のＤＭ１分子を含んでいた。
【０１１９】
実施例１５：細胞毒性アッセイ−ＭＴＴ
[128]  ＭＪ−１７１−ＤＭ１コンジュゲートおよびＭＪ−１７０−ＤＭ１コンジュゲートを２種類のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ法で試験した：標準ＭＴＴ細胞生存率アッセイおよびコロニー形成アッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ）。ＭＴＴアッセイに際しては、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）、５０単位／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を補充した完全培地ＲＰＭＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中において、３７℃、５％ＣＯ２中で、接着性腫瘍細胞系を培養した。細胞を組織培養プレートからトリプシン−ベルシン（Ｖｅｒｓｉｎ）（ＥＤＴＡ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）により脱離させ、血球計を用いて計数した。細胞を９６ウェル組織培養プレートに、１００μｌの完全培地中、２０００細胞／ウェルの密度で接種した。種々の濃度の抗体−ＤＭ１コンジュゲート（１００μｌ）を各ウェルに添加し、細胞を４〜５日間培養した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより、細胞生存率を評価した。要約すると、ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を完全培地中に１ｍｇ／ｍｌに希釈した。５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを各ウェルに添加し、プレートを３７℃のインキュベーターに戻した。３〜４時間後、各ウェルからＭＴＴおよび培地を慎重に除去し、１５０μｌのＤＭＳＯ（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いてＭＴＴ−ホルマザンを溶解させた。ＥＬ８０８  ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）により、５４０ｎｍのフィルターを用いて光学濃度を読み取った。
【０１２０】
[129]  ＭＪ−１７１−ＤＭ１コンジュゲートについての結果を図１４に示す。ＭＪ−１７１−ＤＭ１コンジュゲートがＷＩＳＨ細胞（図１４Ａ）に対して示す細胞毒性には限度があった。しかし卵巣腫瘍細胞系ＰＡ−１は約５×１０−９の推定ＩＣ５０で死滅した（図１４Ｂ）。同様にこのコンジュゲートはモデル細胞系ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ  ＃５４−１に対しても細胞毒性であり、ＰＡ−１細胞と類似のＩＣ５０を示した（図１４Ｃ）。コンジュゲートしていないＭＪ−１７１については死滅がみられなかったので、細胞毒性はＤＭ１コンジュゲートに依存していた。
【０１２１】
[130]  ＭＪ−１７０−ＤＭ１コンジュゲートについての結果を図１５に示す。ＩＣ５０は１．６×１０−９Ｍと推定される。
【０１２２】
実施例１６：細胞毒性アッセイ−コロニー形成
[131]  コロニー形成アッセイ法では、コンジュゲート暴露が腫瘍細胞系のプレーティング効率に及ぼす影響を測定する。腫瘍細胞系は、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を補充したＲＰＭＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖させた。ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ  ＃５４−１細胞は、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖させた。細胞を６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルの密度で接種した。種々の濃度のコンジュゲートを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２中で、コロニーが形成されるまで（７〜８日間）細胞をインキュベートした。培地を除去し、コロニーを固定し、１ｍｌのクリスタルバイオレット溶液（０．１％のクリスタルバイオレット、１０％のホルムアルデヒド、ＰＢＳ中）と共に室温で１５〜３０分間インキュベートすることにより染色した。ウェルを脱イオン水で３回洗浄し、乾燥させ、コロニーを計数した。コロニー数をウェル当たり接種した細胞数で割ることにより、プレーティング効率を計算した。
【０１２３】
[132]  その結果は、ＭＪ−１７２−ＤＭ１によりＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ  ＃５４−１細胞が選択的に１．９×１０−９Ｍの推定ＩＣ５０で死滅したことを示す（図１６）。対照ＨｅＬａ細胞系（空のベクターで安定にトランスフェクションされたもの）については細胞毒性がみられなかった。これらの結果は、Ｍｕｃ１６の非放出ドメインを認識する抗体が細胞毒性薬物、たとえばメイタンシノイド、ＤＭ１を効率的に腫瘍細胞へ送達して殺すことができることを示唆する。
【０１２４】
[133]  Ｍｕｃ１  ＭＪ−１７０−ＤＭ１コンジュゲートについて、結果は３．４×１０−１０と推定されるＩＣ５０を示した（図１７）。これらの結果は、Ｍｕｃ１の非放出ドメインを認識するクローンＭＪ−１７０が、細胞毒性薬物を効率的に腫瘍細胞へ送達して殺すことができることを示す。
【０１２５】
実施例１７：放出抗原アッセイ
[134]  ＭＪ−１７２およびＭＪ−１７３が卵巣癌患者の血流中へ放出されていないＭｕｃ１６ドメインを認識することを証明するために、これらの抗体とＸ３０６、すなわち放出されたＭｕｃ１６を認識する抗体を、それらがＣａｎＡｇ  ＣＡ１２５  ＥＩＡキット標準品または卵巣癌患者血清から放出されたＭｕｃ１６を捕獲する能力について、固相サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて比較した。
【０１２６】
[135]  ＭＪ−１７０が非放出Ｍｕｃ１ドメインを認識することを証明するために、これとＣＭ１、すなわちＭｕｃ１  ＶＮＴＲ抗体を、ＣａｎＡｇ  ＣＡ１５−３  ＥＩＡキット標準品または卵巣癌患者血清から放出されたＭｕｃ１を捕獲する能力について、固相サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて比較した。
【０１２７】
[136]  卵巣癌患者血清中の放出抗原を、ＣａｎＡｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからの酵素免疫測定キット（Ｍｕｃ１６についてはＣＡ１２５  ＥＩＡキット、Ｍｕｃ１についてはＣＡ１５−３  ＥＩＡキット）により、若干改変して測定した。Ｍｕｃ１６放出抗原スクリーニングのためには、Ｉｍｍｕｎｌｏｎ  Ｈ２Ｂの９６ウェルプレートを、５００ｎｇ／ウェル（５μｇ／ｍｌのもの１００μｌ）の、放出されたＭｕｃ１６を認識するＣＡ１２５様モノクローナル抗体Ｘ３０６（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）またはＭｕｃ１６−細胞会合ドメイン抗体（ＭＪ−１７１またはＭＪ−１７２）［０．５Ｍ  炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）中］により、４℃で一夜揺動しながらコーティングした。ウェルを３００μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液（トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ）により室温で２時間揺動しながらブロックした。次いで１２．５μｌのＣＡ１２５標準品（０、１０、４０、２００、５００Ｕ／ｍｌ）または患者血清試料（ブロッキング緩衝液中１：９に希釈）を５０μｌのブロッキング緩衝液と共に室温で２時間揺動しながらインキュベートした。ウェルを３００μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液で３回洗浄し、次いで４０μｌ／ウェルのトレーサー緩衝液（トレーサー希釈液中におけるＨＲＰコンジュゲート抗ＣＡ１２５の１：４０希釈液）と共に室温で１時間揺動しながらインキュベートした。次いでプレートを３００μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄し、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて発色させた。ＥＬ８０８  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により６３０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１２８】
[137]  ＭＪ−１７１およびＭＪ−１７２についてのＥＬＩＳＡ結果を表５に示す。標準品についての６３０ｎｍにおける吸光度を用いて標準曲線を作成し、これから血清ＣＡ１２５レベルを推定した。Ｘ３０６と対比して、ＭＪ−１７１およびＭＪ−１７２はバックグラウンド（０Ｕ／ｍｌのＣＡ１２５）を超える吸光度値を示さなかった。これは、これらの抗体がＭｕｃ１６放出抗原を捕獲できないことを示す。しかしＭＪ−１７１およびＭＪ−１７２は、同様な様式のＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチニル化Ｍｕｃ１６ペプチドａを容易に捕獲できる（データを示していない）。これらの結果から、ＭＪ−１７１およびＭＪ−１７２がＭｕｃ１６の放出ドメインではなく細胞会合ドメインを認識することが確認される。
【０１２９】
【表５】
2006502110.tif 000016
【０１３０】
[138]  Ｍｕｃ１については、Ｉｍｍｕｎｌｏｎ  Ｈ２Ｂの９６ウェルプレートを、２５０ｎｇ／ウェル（５μｇ／ｍｌのもの５０μｌ）の、放出されたＭｕｃ１を認識するＭｕｃ１  ＶＮＴＲモノクローナル抗体ＣＭ１（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）またはＭｕｃ１−細胞会合ドメイン抗体（ＭＪ−１７０）［０．５Ｍ  炭酸塩緩衝液中］でコーティングした。他の操作は本質的にＭｕｃ１６について記載したものに従い、ただし２５μｌのＣＡ１５−３標準品（０、１５、５０、１２５、２５０Ｕ／ｍｌ）を用いた。
【０１３１】
[139]  ＥＬＩＳＡ結果を表６に示す。ＣＡ１５−３標準品のＣＭ１捕獲による吸光度値を用いて標準曲線を作成し、これから血清試料についてＣＡ１５−３のＵ／ｍｌを計算した。ＭＪ−１７０は、ＣＡ１５−３標準品または患者血清のいずれにおいてもＭｕｃ１放出抗原を捕獲する能力の証拠を示さなかった。これは、この抗体が非放出Ｍｕｃ１ドメインを認識することを示す。
【０１３２】
【表６】
2006502110.tif 000017
【０１３３】
ハイブリドーマの寄託
[140]  前記に述べた４種類のハイブリドーマ（ＭＪ−１７０、ＭＪ−１７１、ＭＪ−１７２、ＭＪ−１７３）を、ブダペスト条約の条項に基づいてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＰＯ  Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８）に、２００３年６月２４、２４、２４および２６日に寄託した。これら４クローンの寄託番号は、それぞれ 、 、 および である。
【０１３４】
[141]  特定の特許および印刷刊行物を本明細書に引用したが、それらの教示内容はここでそれぞれの全体を本明細書に援用する。
[142]  本発明をその特定の態様について詳述したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなくそれらを多様に変更および改変できることは当業者には明らかであろう。
【０１３５】
【表７】
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【０１３６】
【表８】
2006502110.tif 000019
【０１３７】
【表９】
2006502110.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１−ａ】図１Ａは、Ｍｕｃ１タンパク質の一例（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）（ＧＥＮＢＡＮＫ  寄託番号ＮＭ ００２４５６）のアミノ酸配列および特色を示す；これは、１つのＶＮＴＲタンデム・リピート（下線）、推定シグナルペプチド開裂部位および翻訳後開裂部位（矢印で示す）、ならびに膜貫通領域（二重下線で示す）をもつ。
【図１−ｂ】図１Ｂは、Ｍｕｃ１傍膜ドメインＧＳＴ融合タンパク質の一例およびこの融合タンパク質に含まれるアミノ酸に由来する合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２−ａ】図２Ａは、Ｍｕｃ１６  ＧＳＴ−融合タンパク質の一例（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）（ＡＦ４１４４４２；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２，３４８−３６６）のアミノ酸配列および特色を示す。ＲＮＫＲは潜在フューリン部位、ＳＰＬＡは潜在ストロモライシン開裂部位であり、膜貫通領域には二重下線を引いてある。
【図２−ｂ】図２Ｂは、Ｍｕｃ１６傍膜ドメインＧＳＴ融合タンパク質の一例およびこの融合タンパク質に含まれるアミノ酸に由来する合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、癌療法薬候補としての抗体をスクリーニングするためのフローチャートを示す。所望により、これを用いて抗癌療法コンジュゲートを製造することができる（破線）。
【図４−ａ１】図４Ａおよび４Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１抗原陽性細胞系ＣａＯＶ３への結合を測定した。図４Ａ：後続試験のために選択した１２クローンのヒストグラム。
【図４−ａ２】図４Ａおよび４Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１抗原陽性細胞系ＣａＯＶ３への結合を測定した。図４Ａ：後続試験のために選択した１２クローンのヒストグラム。
【図４−ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１抗原陽性細胞系ＣａＯＶ３への結合を測定した。図４Ｂ：１×１０−７Ｍ濃度における、ＣａＯＶ３細胞への精製ＣＭ１モノクローナル抗体の結合のヒストグラム。ＣＭ１は、放出ＶＮＴＲドメイン内のＭｕｃ１エピトープを認識する。
【図５−ａ１】図５Ａおよび５Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１６ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１６抗原陽性細胞系ＯＶＣＡＲ３への結合を測定した。図５Ａ：後続試験のために選択した２４クローンのヒストグラム。図５Ｂ：６．７×１０−８Ｍ濃度における、ＯＶＣＡＲ３細胞への精製Ｍ１１の結合のヒストグラム。
【図５−ａ２】図５Ａおよび５Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１６ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１６抗原陽性細胞系ＯＶＣＡＲ３への結合を測定した。図５Ａ：後続試験のために選択した２４クローンのヒストグラム。
【図５−ａ３】図５Ａおよび５Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１６ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１６抗原陽性細胞系ＯＶＣＡＲ３への結合を測定した。図５Ａ：後続試験のために選択した２４クローンのヒストグラム。
【図５−ａ４】図５Ａおよび５Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１６ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１６抗原陽性細胞系ＯＶＣＡＲ３への結合を測定した。図５Ａ：後続試験のために選択した２４クローンのヒストグラム。
【図５−ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ハイブリドーマ上清スクリーニングによりＭｕｃ１６ペプチドから選択したクローンのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。３０μｌのハイブリドーマ上清を用いて、Ｍｕｃ１６抗原陽性細胞系ＯＶＣＡＲ３への結合を測定した。図５Ｂ：６．７×１０−８Ｍ濃度における、ＯＶＣＡＲ３細胞への精製Ｍ１１の結合のヒストグラム。
【図６】図６は、Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐプラスミド構築体の地図および配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を示す。Ｍｕｃ１６推定Ｓｔｕｍｐのヌクレオチド配列は、図２Ａに示したアミノ酸１１５７６〜１１７２２をコードする。
【図７】図７は、組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質発現のための発現プラスミドの模式図を示す。Ｍｕｃ１６／ＣＡ１２５のアミノ酸１１５７６〜１１７２２を表わすヌクレオチド配列を、Ｍｕｃ１由来の上流Ｆｌａｇエピトープタグおよびシグナルペプチド配列、ならびに３つのＭｙｃエピトープタグに対応する下流配列と読み枠を一致させて、ｐｃＤＮＡ３／Ｍｙｃ３哺乳動物発現ベクター内へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３と表示するこの構築体を、組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質の発現のために哺乳動物組織培養細胞のトランスフェクションに用いた。
【図８】図８は、組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を発現する２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。２９３Ｔ細胞をｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３またはｐｃＤＮＡ３空ベクターで一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの２５時間後、細胞単層をＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、溶解物の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により分析した。同じ試料をマウス抗Ｆｌａｇタグ抗体（ブロットの左半分）または抗−Ｍｙｃタグ抗体（ブロットの右半分）で検査した。列１および２：ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３でトランスフェクションした細胞からの溶解物の二重検体；列３：ｐｃＤＮＡ３空ベクターでトランスフェクションした細胞からの溶解物。矢印は、抗Ｆｌａｇ抗体および抗−Ｍｙｃ抗体の両方により検出された組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を指す。
【図９】図９は、組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質を発現する２９３Ｔ細胞を用いた、ハイブリドーマ上清の抗Ｍｕｃ１６ペプチドのウェスタンブロットスクリーニングを示す。ｐｃＤＮＡ３  Ｍｕｃ１ＦｌａｇＭｕｃ１６Ｍｙｃ３で一過性トランスフェクションした２９３Ｔ細胞から調製したＲＩＰＡ溶解物を、大型ウェルＳＤＳゲル上に流し、ニトロセルロース上にブロットし、種々のハイブリドーマ上清または陽性対照モノクローナル抗体であるマウス抗Ｍｙｃにより、Ｍｉｎｉｂｌｏｔｔｅｒ  ２８装置（Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓから）を用いて、ブロットを個別の列に分割した。”α−Ｍｙｃ”列中のバンドにより同定された組換えＭｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐタンパク質の位置を水平矢印で示す。ハイブリドーマ上清で検査して陽性と判定された列（２Ｆ９、４Ｅ２、９Ｇ４、１０Ｇ２）およびマウス抗Ｍｙｃで検査した列のみを表示する。
【図１０】図１０は、Ｍｕｃ１６ペプチドａへの精製Ｍｕｃ１６抗体の結合を示したペプチドＥＬＩＳＡの結果を示す。マウスの免疫化に用いたＭｕｃ１６ペプチドａのビオチニル化型を、９６ウェルプレートのウェル内に固定化した。種々の濃度の精製抗体ＭＪ−１７１（図１０Ａ）、ＭＪ−１７３（図１０Ｂ）、およびＭＪ−１７２（図１０Ｃ）をウェルに添加し（体積１００μｌで）、室温で１時間、揺動しながらインキュベートした。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧおよび基質ＡＢＴＳにより、抗体結合を検出した。４０５ｎｍで発色を測定した。最大結合の半分を達成するのに要した抗体濃度から、見掛けＫＤ値を推定した。
【図１１】図１１は、Ｍｕｃ１ペプチドａへの精製Ｍｕｃ１抗体ＭＪ−１７０の結合を示したペプチドＥＬＩＳＡの結果を示す。マウスの免疫化に用いたＭｕｃ１ペプチドａのビオチニル化型を、９６ウェルプレートのウェル内に固定化した。種々の濃度の精製ＭＪ−１７０（１００μｌ）をウェルに添加し、室温で１時間、揺動しながらインキュベートした。ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより基質ＡＢＴＳを用いて抗体結合を検出し、４０５ｎｍで発色を測定した。最大結合の半分を達成するのに要した抗体濃度から、見掛けＫＤ値を推定した。
【図１２−ａ】図１２は、腫瘍細胞系への抗Ｍｕｃ１６抗体結合のフローサイトメトリー分析を示す。結合曲線は、表４に示すようにゲートした細胞集団の平均相対蛍光を表わす。種々の濃度の精製Ｍｕｃ１６抗体を、指示した腫瘍細胞系と共に氷上で約３時間インキュベートした。抗体結合をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより検出し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。図１２Ａ：ＷＩＳＨ細胞への市販ＯＣ１２５の結合。ＯＣ１２５の純度が不明であったので、濃度ではなく系列希釈度を用いた。図１２Ｂ：ＷＩＳＨ細胞へのＭＪ−１７１の結合。図１２Ｃ：ＳｋＢｒ３細胞へのＭＪ−１７１の結合。図１２Ｄ：ＯＶ９０細胞へのＭＪ−１７３およびＭＪ−１７１の結合。
【図１２−ｂ】図１２は、腫瘍細胞系への抗Ｍｕｃ１６抗体結合のフローサイトメトリー分析を示す。結合曲線は、表４に示すようにゲートした細胞集団の平均相対蛍光を表わす。種々の濃度の精製Ｍｕｃ１６抗体を、指示した腫瘍細胞系と共に氷上で約３時間インキュベートした。抗体結合をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより検出し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。図１２Ｅ：ＰＡ−１細胞へのＭＪ−１７１の結合。図１２Ｆ：ＯｖＣａｒ３Ｈ細胞へのＭＪ−１７１の結合。図１２Ｇ：Ｔｏｖ１１２−Ｄ細胞へのＭＪ−１７１の結合。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂ。図１３Ａ：ＣａＯＶ３卵巣腫瘍細胞系への抗Ｍｕｃ１  ＭＪ−１７０抗体の結合のフローサイトメトリー分析。種々の濃度の精製ＭＪ−１７０を、ＣａＯＶ３細胞と共に氷上で約３時間インキュベートした。抗体結合をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより検出し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。図１３Ｂ：ＣａＯＶ３卵巣腫瘍細胞へのＭｕｃ１  ＶＮＴＲドメイン認識抗体ＣＭ１の結合のフローサイトメトリー分析。結合曲線は、ゲートした細胞集団（全体の約５％）の平均相対蛍光を表わす。
【図１４】図１４は、種々の腫瘍細胞系に対するＭＪ−１７１−ＤＭ１コンジュゲートの細胞毒性を示す。細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり２０００個の密度で接種した。種々の濃度のＭＪ−１７１−ＤＭ１コンジュゲートを添加し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。ＭＴＴを添加し、３．５時間インキュベーションを続けた。培養物上清を慎重に取り出し、ＭＴＴ−ホルマザン複合体をＤＭＳＯに溶解し、５４０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにより測定した。図１４Ａ）ＷＩＳＨ細胞。図１４Ｂ：ＰＡ−１細胞。図１４Ｃ：ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ＃５４−１。
【図１５】図１５は、ＣａＯＶ３細胞に対するＭＪ−１７０−ＤＭ１コンジュゲートの細胞毒性を示す。ＣａＯＶ３細胞を９６ウェル組織培養プレートにウェル当たり２０００個の密度で接種した。指示した濃度のコンジュゲートと共に細胞を４日間インキュベートし、その時点で図１４について記載したようにＭＴＴにより細胞生存率を評価した。
【図１６】図１６は、連続暴露コロニー形成アッセイにおけるＭＪ−１７２−ＤＭ１コンジュゲートの細胞毒性を示す。ＨｅＬａ／Ｍｕｃ１６  Ｓｔｕｍｐ＃５４−１またはＨｅＬａ／ｐｃＤＮＡ３（空のベクターでトランスフェクションしたもの）対照細胞を６ウェル組織培養プレートにウェル当たり１０００個の密度で接種した。種々の濃度のコンジュゲートを各ウェルに添加し、コロニーが樹立するまで（７〜８日間）細胞をインキュベートした。コロニーをクリスタルバイオレット／ホルムアルデヒド溶液で固定および染色し、計数した。
【図１７】図１７は、連続暴露コロニー形成アッセイにおけるＣａＯＶ３細胞に対するＭＪ−１７０−ＤＭ１コンジュゲートの細胞毒性を示す。細胞を６ウェル組織培養プレートにウェル当たり１０００個の密度で接種した。指示した濃度のコンジュゲートと共に７日間、細胞をインキュベートし、その時点でコロニーをクリスタルバイオレット／ホルムアルデヒド溶液で染色および固定し、計数した。
【配列表】
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2006502110.tif 000040
2006502110.tif 000041
2006502110.tif 000042
【図１−ａ】
2006502110.tif 000047
【図１−ｂ】
2006502110.tif 000048
【図２−ａ】
2006502110.tif 000049
【図２−ｂ】
2006502110.tif 000050
【図３】
2006502110.tif 000051
【図４−ａ１】
2006502110.tif 000052
【図４−ａ２】
2006502110.tif 000053
【図４−ｂ】
2006502110.tif 000054
【図５−ａ１】
2006502110.tif 000055
【図５−ａ２】
2006502110.tif 000056
【図５−ａ３】
2006502110.tif 000057
【図５−ａ４】
2006502110.tif 000058
【図５−ｂ】
2006502110.tif 000059
【図６】
2006502110.tif 000060
【図７】
2006502110.tif 000061
【図８】
2006502110.tif 000062
【図９】
2006502110.tif 000063
2006502110.tif 000064
【図１１】
2006502110.tif 000065
【図１２−ａ】
2006502110.tif 000066
2006502110.tif 000067
2006502110.tif 000068
【図１４】
2006502110.tif 000069
【図１５】
2006502110.tif 000070
【図１６】
2006502110.tif 000071
【図１７】
2006502110.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月29日(2004.4.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放出型抗原の非放出−細胞外部分のエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６タンパク質の非放出−細胞外部分のエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
抗体が、組換え抗体、組換え抗体のフラグメント、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされた抗体よりなる群から選択される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
抗体が、抗原の非放出−細胞外部分を免疫原性タンパク質キャリヤーに結合させたものを用いて調製された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、抗原の細胞外−非放出部分を含む組換え融合タンパク質による動物の免疫化により産生された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項７】
融合タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、抗原の組換え−非放出−細胞外部分を発現する細胞による動物の免疫化により産生された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項９】
エピトープの少なくとも一部が、Ｍｕｃ１の細胞外ドメインのカルボキシ末端アミノ酸９０個内に位置する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
エピトープの少なくとも一部が下記のアミノ酸配列内に位置する、請求項９に記載の抗体：
【化１】
2006502110.tif 000073
【請求項１１】
抗体が、下記よりなる群から選択される少なくとも１つのペプチドに結合する、請求項１０に記載の抗体：
【化２】
2006502110.tif 000074
【請求項１２】
エピトープの少なくとも一部が、Ｍｕｃ１６の細胞外ドメインのカルボキシ末端アミノ酸１１０個内に位置する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
エピトープの少なくとも一部が下記のアミノ酸配列内に位置する、請求項１２に記載の抗体：
【化３】
2006502110.tif 000075
【請求項１４】
抗体が、下記よりなる群から選択される少なくとも１つのペプチドに結合する、請求項１３に記載の抗体：
【化４】
2006502110.tif 000076
【請求項１５】
細胞毒性物質または細胞毒性物質プロドラッグに結合した、請求項１または２に記載の抗体を含むコンジュゲート。
【請求項１６】
細胞毒性物質が低分子薬物である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
細胞毒性物質がメイタンシノイド類、タキソイド類、またはＣＣ−１０６５類似体である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の抗体および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載のコンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項２０】
有効量の請求項１８に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項２１】
有効量の請求項１９に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項２２】
対象が癌を伴う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
対象が癌を伴う、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
癌を伴う疑いのある対象をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該対象からの組織試料を用意し；
（ｂ）請求項１に記載の抗体を用いて、該試料中の放出型抗原の非放出−細胞外部分の量を測定し；そして
（ｃ）その抗原の量を癌性対照および非癌性対照における該抗原の量と比較し、これにより該対象のスクリーニングを行う
ことを含む方法。
【請求項２７】
抗原がヒトＭｕｃ１またはＭｕｃ１６である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌が卵巣癌または胸部癌である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
表面抗原の非放出部分に特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）表面に抗原を発現している細胞への候補抗体の結合を測定し；
（ｂ）細胞から細胞外媒質中へ放出された抗原フラグメントへの候補抗体の結合を測定し；そして
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）の結合測定値を比較し、これにより該抗体をスクリーニングする
ことを含む方法。
【請求項３０】
表面抗原がＭｕｃ１またはＭｕｃ１６である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＰＴＡ−５２８６として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７０により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７０。
【請求項３２】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５２８７として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７１により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７１。
【請求項３３】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５２８８として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７２により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７２。
【請求項３４】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５３０２として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７３により産生される、単離されたモノクローナル抗体ＭＪ−１７３。
【請求項３５】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５２８６として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７０。
【請求項３６】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５２８７として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７１。
【請求項３７】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５２８８として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７２。
【請求項３８】
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ−５３０２として寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＪ−１７３。
【請求項３９】
請求項３１、３２、３３または３４に記載のモノクローナル抗体の機能均等物である抗体であって、モノクローナル抗体、組換え抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ−グラフト抗体、ファージの表面にディスプレイされた抗体、およびそのフラグメントよりなる群から選択される抗体。
【請求項４０】
細胞毒性物質または細胞毒性物質プロドラッグに結合した、請求項３１、３２、３３または３４に記載の抗体を含むコンジュゲート。
【請求項４１】
細胞毒性物質が低分子薬物である、請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
細胞毒性物質がメイタンシノイド類、タキソイド類、またはＣＣ−１０６５類似体である、請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
請求項３１、３２、３３または３４に記載の抗体および医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項４４】
請求項４０に記載のコンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含む組成物。
【請求項４５】
有効量の請求項４３に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項４６】
有効量の請求項４４に記載の組成物を対象に投与することを含む、その必要がある対象を処置する方法。
【請求項４７】
対象が癌を伴う、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
対象が癌を伴う、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
癌は、Ｍｕｃ１またはＭｕｃ１６が過剰発現した癌である、請求項４８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
ハイブリドーマの寄託
[140]  前記に述べた４種類のハイブリドーマ（ＭＪ−１７０、ＭＪ−１７１、ＭＪ−１７２、ＭＪ−１７３）を、ブダペスト条約の条項に基づいてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＰＯ  Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８）に、２００３年６月２４、２４、２４および２６日に寄託した。これら４クローンの寄託番号は、それぞれＰＴＡ−５２８６、ＰＴＡ−５２８７、ＰＴＡ−５２８８およびＰＴＡ−５３０２である。


【国際調査報告】
2006502110.tif 000077