(57)【要約】本発明は、マラリアに対して被験体を防御する新規方法を包含する。本発明の方法は、弱毒化スポロゾイトを用いた接種を包含し、その方法は、特に、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、粘膜投与、粘膜下投与、および皮膚投与を含むが、これらに限定されない。本出願は、一種以上のマラリア原因病原体に対して、ヒトおよび動物を免疫するための方法を提供する。この方法は、弱毒化スポロゾイトの初回ワクチンを投与することにより、ヒトまたは動物における免疫応答を惹起して、感染性プラスモジウム種の寄生生物に対する完全な防御免疫または部分的な防御免疫を提供する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種以上のマラリア原因病原体に対して、ヒトおよび動物を免疫するための方法であって、弱毒化スポロゾイトの初回ワクチンを投与することにより、ヒトまたは動物における免疫応答を惹起して、感染性プラスモジウム種の寄生生物に対する完全な防御免疫または部分的な防御免疫を提供する工程を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記免疫応答は、一以上のさらなるワクチン投与量の弱毒化スポロゾイトを引き続き投与することにより追加免疫され、感染性プラスモジウム種の寄生生物に対する前記レシピエントでの増強された防御免疫応答または長期的防御免疫応答が提供される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで弱毒化スポロゾイトの前記初回刺激投与量および前記追加免疫投与量は、前記レシピエントの皮下組織、真皮組織、筋肉内組織、表皮組織、粘膜組織、粘膜下組織、または皮膚組織の内部あるいは上部に送達される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年１１月２０日に出願された米国仮出願第６０／４２７，９１１号の利点に基づき、そしてその利点を請求する。この仮出願の全体の開示は、本明細書中にて依拠され、そして参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、ワクチンを投与することによりマラリアを予防することに関する。さらに具体的には、本発明は、マラリア感染に対するワクチンに関するものであり、本発明は、ヒトまたは動物への弱毒化スポロゾイトの投与を包含する。
【背景技術】
【０００３】
（先行技術の紹介および説明）
マラリアは、３〜５億人に罹患する疾患であり、毎年百万人〜三百万人の個体を死亡させ、そして発展途上世界の人々（特に、サハラ以南のアフリカにおける人々）に巨大な経済的影響をもたらす［１、２］。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、世界中でマラリアによる死亡の大多数を占める。世界観光機関は、２０００年に世界中で記録された約７億人の国際観光客の到来のうち、約９百万人は西アフリカ、中央アフリカ、または東アフリカ行きであり、３千７百万人は東南アジア行きであり、６百万は南アジア行きであり、１千万人は大洋州行きであったことを報告した［３］。一年当たり、北アメリカ、ヨーロッパ、および日本からの１０，０００人より多くの旅行者が、マラリアに感染すると見積もられる。マラリアが伝染される場所で行われたあらゆる軍事行動の際、１００年より長きにわたり、米国部隊は、敵対火よりも多くのマラリアによる死傷者を出している。推定１２，０００，０００人の人生が、マラリアにより、第二次世界大戦の際に失われ、１２０万人の人生が、マラリアにより、ベトナム紛争の際に失われた［４］。
【０００４】
寄生生物Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリアを引き起こす原生動物の寄生生物）の伝染は、感染された雌性Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の刺咬を介して発生し、その蚊は夕方から明け方に活動する。スポロゾイトは、刺咬部位から血流を通じて肝臓に移動し、ここでスポロゾイトは肝細胞内で増殖し、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの場合、一感染細胞当たり１０，０００〜４０，０００個の子孫を産む。これら肝臓段階の寄生生物は、スポロゾイトにおいては発現されない一組の抗原を発現する。寄生生物のこの新しい世代は、メロゾイトとして血流に再入し、スポロゾイトおよび初期肝臓段階の際に発現される抗原とは異なる一組の抗原を発現する。そして、赤血球に侵入し、ここで、さらなる増殖が、寄生生物数を、４８時間ごとに約１０〜２０倍に増加させる。いかなる疾病の症状も疾病の徴候も誘導しない、肝臓における上記の五〜十日の発生とは異なり、未処理の血液段階感染は、溶血、悪寒戦慄、高熱、および衰弱を引き起こす。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（人に感染する四種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍのうち最も危険なもの）の場合、その疾患は、重要な器官（脳、腎臓、および肺など）における微小循環性血流の途絶および代謝変化の途絶により複雑になり、緊急に処置されない場合は、しばしば死に至る。
【０００５】
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアに対する有効なワクチンは、依然、医学への偉大な挑戦の一つである。百年間を超える努力、数億ドルの研究費、医師および科学者から捧げられた人生の犠牲、および多くの有望な試験的なワクチンにもかかわらず、人類の巨大な感染性の惨害を軽減するための市販ワクチンはない。一世代前、クロロキン、ＤＤＴ、および媒介動物制御計画を使用する公衆衛生の提唱は、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアを世界規模の脅威としては取るに足りないものとするために熟慮されたようであった。有効なワクチンの欠如は、これらの試みを複雑にしたが、継続維持可能な制御は目前であるようであった。
【０００６】
差し迫った成功の見込みは、短命に終わった。その失敗の理由は、複数の要因によるものであった。寄生生物は、非常に効果的で手頃な価格の抗マラリア投薬に対してますます耐性となり、媒介動物制御の手段は無効となり、そして移住、戦争、および経済崩壊は、発展途上世界の風土地方においてますます一般的になった。結果として、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアは再起しており、毎年、２５億の人間が危険に曝され、これにより３〜９億人が感染し、百万人〜３百万人の人々を死亡させている。発展途上世界を苦しめる多くの社会問題、経済問題、環境問題、政治問題の中で、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアは、これらの不公正の根本的原因および残酷な結果の両方であるとますます思われ、そしてこれらの複雑な問題を解決するための唯一の障害である。発展途上世界においてｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアを制御することは、有効なワクチンなしで可能であり得る。実際、社会的状勢、政治的状勢、および経済的状勢を仮定すると、本発明者らは、ワクチンが継続可能な制御プログラムの必須成分であり得、世界的根絶キャンペーンにとって必要あると、考える。
【０００７】
このように、マラリアワクチン開発の近代は、もどかしい状況の中にあった。１９８０年代初期から、分子生物学および医学における驚異的な技術的進歩が起きている。これらの進歩は、段階特異的Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質および段階特異的Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍエピトープ、ならびに宿主免疫機構および宿主免疫応答の同定を加速させた。この知見は、一定範囲の新規ワクチン候補に変えられた［５、６］。ある意味では、この近代は、マラリアワクチン研究およびヒト試験の黄金時代であった。しかしながら、マラリア研究者の超人的努力にもかかわらず、これらのワクチンの大多数は、レシピエントの４０％〜７０％において、ヒトにおけるいかなる防御免疫も提供できておらず、１つのワクチンが、感染に対する再現性のある短期的防御を実証しているにすぎない。［７〜９］。
【０００８】
十分な時間および資源があれば、これらのワクチン戦略、またはまだ開発されていない他の戦略は、強いワクチンを究極的には導き得る。しかしながら、最近のキーストンミーティング「Ｍａｌａｒｉａ’ｓ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ：Ｆｒｏｍ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｔｏ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」［６］で、参加者が、いつマラリアワクチンが市販品として「売り出され」得ると考えるかについて、投票調査された。その部屋にいた者の多くは、最初のワクチンは２０１６〜２０２５年まで売り出されないと参加者が考えていることを示した。組換えＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）ワクチンを開発するＧｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ（ＧＳＫ）の活動のリーダーは、最も楽観主義を表明した。全て順調に進んだ場合、この単一タンパク質ワクチンは、７〜８年（２００９〜２０１０）以内に「売り出され」得ることが示された。ＧＳＫおよび米陸軍は、ＰｆＣＳＰのクローニングをした１９８４年から、組換えタンパク質ＰｆＣＳＦワクチンに関して研究している［１０］こと、ならびに多くのマラリア学者が、単一タンパク質ワクチンがマラリアを持続的に制御するのに十分であるか否かについての不安を表していることを考えると、単一タンパク質の開発のための２５年より長いスケジュールは、この疾患の苦しみを真に軽減するワクチン開発の可能性に対して寒気のする現実的な見込みを与える。
【０００９】
（放射線照射弱毒化スポロゾイトを用いた免疫後の防御免疫）
１９６７年、Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇは、Ａ／Ｊマウスへの放射線照射弱毒化Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトの静脈内投与が、感染性Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを用いたチャレンジに対してマウスを防御したことを報告した［１１］。これらのげっ歯類の研究は、ヒトの研究についての推進力を提供した。１９７０年代初期までに、２つのグループが、唾液腺にＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを保有する照射した蚊に刺咬させてヒトのボランティアを免疫すると完全に感染性のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを用いたチャレンジに対してボランティアを防御し得ることを、確立した［１２〜１９］。これらの研究は、滅菌防御免疫を提供するマラリアワクチンが可能であることを実証した。しかしながら、当時スポロゾイトを生産する唯一の方法は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍをボランティアに感染させ、この寄生生物を抑制するが除去しない用量のクロロキンでそのボランティアを処置し、生殖母細胞を発達させ、そしてさらに、蚊にこれらのボランティアをえさとして与えることであった。たとえこの方法により十分な数のスポロゾイトを生産し得たとしても、照射したスポロゾイトワクチンでヒトを免疫することは、臨床的に、技術的に、かつ論理的に非現実的であると考えられた。大部分において、この理由は、感染した蚊の刺咬、またはマウスで行われたような静脈内注射のいずれかによってスポロゾイトが生きたまま送達されなければならないからであった。当該分野で活動する科学者は、他の免疫経路が、静脈内注射または感染した蚊の刺咬による免疫と比べて、十分な防御も比較可能な防御も提供しないと結論づけた；このことは、この科学者の見込みから弱毒化スポロゾイトのワクチンとしての使用を、本質的に禁止した。幾人かのこのような科学者の発表された意見を、以下に引用する。
【００１０】
「この知見は、以前の報告（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ、およびＭｏｓｔ、１９６７年および１９６９年）を実証し、そして彼らの発見を拡大する。他の非経口的経路（ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｃ）により免疫されたマウスの群は、ｉ．ｖ．免疫されたマウスより、かなり低い全体的防御レベルを示した。」［２０］。
【００１１】
「これらの研究は、スポロゾイト誘導性マラリアに対してマウスを防御的に免疫することにおいて、筋肉内注射されるＰ．ｂｅｒｇｈｅｉの照射スポロゾイトが、静脈内注射される照射スポロゾイトよりもかなり低い有効性しかないことを実証した以前の報告を確証している。ヒト試験への拡大を阻止する主要な制限は、受容不可能な医学的危険を生じる手順である静脈内免疫の必要性であった。」（この引用において言及される研究において、筋肉内経路による防御は、１１％と４２％との間の範囲に及び、そして皮下経由による防御は、０％であった）［２１］。
【００１２】
「げっ歯類におけるワクチン接種の試みにおいて使用される種々の免疫経路（ｉ．ｍ．、ｉ．ｖ．、皮下、経口など）の中で、静脈内経路は、最も高い防御の度合い、および最も再現性のある結果を生じることが、さらに示された。他の唯一の非常に有効な免疫経路は、感染した照射された蚊の刺咬によるものである。」［２２］。この１９８０年の概説（「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｏｆ  Ｍａｌａｒｉａ，」）において、Ｄｒ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇは、スポロゾイトマラリアワクチンを開発する可能性の議論を始め、「結論として、最近の発見は、我々が現在、スポロゾイト誘導性免疫の機構を明らかにするための手段、および防御抗原を単離するための手段を提供すべき必要な強力な手段を有することを、指し示すようである。これらの状況下において、マラリア用のスポロゾイトワクチン開発に対する種々の障壁は、それほど遠くない将来に希望をもって克服可能であるようである。」と結論づけた。Ｄｒ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇは、妥当な選択肢として、弱毒化スポロゾイト全体ワクチンを利用するという考えを議論せず、スポロゾイト段階に対する免疫を誘導するワクチン成分を提供するためのスポロゾイトの使用のみを議論する。
【００１３】
照射スポロゾイトワクチンモデルに従事して約１５年後の１９８０年に、この分野の疑う余地のないほどのリーダー（Ｄｒ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ）によって、ワクチンの経路は、近代科学にずっと存在することが結論づけられた；防御の免疫学的機構およびそれらの防御免疫応答の抗原性標的を理解すること、ならびに「サブユニット」スポロゾイトワクチンを構築すること。それ以降、ヒト用の実用的ワクチンとして、弱毒化した寄生生物スポロゾイト全体のワクチンの開発を試みる文献においては、多くの理由から、本質的には、言及も議論もない。それらの理由のうちで重要なのは、これらの１５年の研究にもかかわらず、静脈内投与または感染した蚊の刺咬以外によりスポロゾイトを投与する適切なアプローチを発見した科学者がいないことである。
【００１４】
弱毒化スポロゾイトワクチンの開発のさらなる研究もまたなかった。なぜなら、スポロゾイトは、無菌の蚊において作られ、無菌的に精製され、そして適切に保存され、かつ投与前に再構成されなければならず、そして、このような処理後に、そのスポロゾイトは、投与されたときに、依然として、防御免疫応答を惹起し得なくてはならないからである。
【００１５】
生産問題の一部についての可能性のある解決法は、弱毒化スポロゾイトワクチンの開発に関係するとは、当時認められなかったが、報告はされていた。１９７５年、インビトロでＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを培養する方法が、報告され［２３、２４］、続いて、１９８２年に、これらの培養物から生殖母細胞を生産する方法が報告された［２４］。１９８６年には、インビトロ培養物においてヒトをえさとして与えた蚊において生産されたスポロゾイトによって、ヒトが、感染され得ることが報告された［２６］。従って、ヒトにおいて、生殖母細胞のインビボ生産の困難性なくしてスポロゾイトを生産する方法があった。これらのスポロゾイトの開発自体は、弱毒化スポロゾイトワクチンの開発に対する障壁の全てを克服するには十分でなかった。十分なスポロゾイトを生産する方法も規制標準に合う条件下でのスポロゾイトの生産および処理する方法もなかった。さらに、適切に生産され処理されたスポロゾイトが、臨床的に受容可能で実用的な様式において、首尾よく投与され得たことを指し示すデータはなかった。
【００１６】
従って、マラリア科学界が、高レベルの防御を達成するために十分な弱毒化スポロゾイトを臨床的に受容可能で実用的な様式にて送達する方法を発見できなかった後、弱毒化スポロゾイトワクチンは、臨床的な検討材料から外され、そして、上記科学界は、Ｄｒ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ（上記の段落）により予測されたように、ワクチン開発を望んで現代の分子科学を採用した。いくつかの見込みのある開発が、近代のマラリアサブユニットワクチン開発を始めた。スポロゾイトの主要表面タンパク質に対するモノクローナル抗体（スポロゾイト周囲（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質（ＣＳＰ））が生産され、これは受動伝達実験においてマウスを防御することが示された［２７］。さらに、ＰｆＣＳＰタンパク質をコードする遺伝子がクローン化され、配列決定された［１０］。同時に、最初の精製組換えタンパク質ワクチン（Ｂ型肝炎表面抗原ワクチン）が、開発され、市販された［２８］。ワクチン科学における証拠および流行の重みは、マラリア研究者に、ヒトマラリアワクチンを急速に開発するためのロードマップを提供したようであった。スポロゾイトワクチンを生産しそして投与することは、非現実的であると考えられたので、弱毒化寄生生物全体ワクチンに戻ることは、不必要であり、時代遅れのようであり、その後の全ての努力は、サブユニットワクチンの期待に集中した。
【００１７】
最初の組換えタンパク質［２９］ワクチンおよび合成ペプチド［３０］ワクチンが、予想通りに防御的であることを証明しなかった１９８７年に、生産そして投与することが不可能であると考えられた弱毒化スポロゾイトワクチンの開発を考慮する代わりに、科学者達は、防御免疫を担う免疫機構、およびこれらの防御免疫応答の抗原性標的を理解すること、ならびにサブユニットワクチンおよびこのような防御を誘導するワクチン送達系を開発することに集中した。この基礎研究の多くは、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉげっ歯類モデル系およびＰ．ｙｏｅｌｉｉげっ歯類モデル系において行なわれた。このげっ歯類のマラリア研究は、免疫学的機構および照射スポロゾイトワクチン誘導性防御の抗原性標的への重要な洞察を提供して多くの候補ワクチンの開発を導いた［３１〜３３］。１９８４年から２０００年終わりにおける、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）をコードする遺伝子のクローニング後に行われたこれらの研究は、ヒトの照射スポロゾイト全体ワクチンを開発する可能性を全く示唆しなかった。なぜなら、研究者の誰もが、実用的な様式においてこのようなワクチンを生産または投与することが可能であると考えなかったからであった。興味深いことに、サブユニット（組換えタンパク質、合成ペプチド、組換えウイルス、ＤＮＡプラスミド）ワクチン処方物は、マウスにおいて優れた防御を生じることが示されているが、ヒトにおいては、匹敵することは示されていなかった。対照的に、照射スポロゾイトの静脈内投与によるマウスにおける防御は、ヒトの研究を導き［１１］、この研究は、唾液腺にＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを含む照射した蚊の刺咬への暴露が、防御を誘導することを実証した［３４］。
【００１８】
１９８９年に、サブユニットＰｆＣＳＰワクチンの多くの失望させる臨床試験の後、唾液腺にＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを保有する蚊の刺咬によるボランティアの免疫化、その後のインビボでのγ放射線への暴露による弱毒化が、Ｎａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、後のＮａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＭＲＩ、後のＮＭＲＣ）およびＷａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ａｒｍｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＲＡＩＲ）で始められた。この研究の目的は、照射スポロゾイトワクチンでヒトを防御することを導く臨床的特徴および臨床的必要性をより良く示すことであり、ヒトにおいて惹起される防御免疫応答を評価することであり、そして、ヒトにおける免疫応答を惹起したそれらのタンパク質上の抗原およびエピトープを同定することであった。なぜなら、このようなワクチンの生産すること、およびこのようなワクチンの投与することが、完全に実用不可能で技術的に実行不可能であると考えられたからである。ヒトワクチンとして照射スポロゾイトを開発することは決して考慮されなかった。これらの研究からの予備的臨床結果および広範な免疫学的アッセイ結果が、公開された［３５〜４１］。この対象に関する他の研究［４２〜４８］と組み合わされたこれらの免疫学的研究は、放射線照射弱毒化Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトで免疫されたヒトにおける免疫学的応答についての本発明者らの理解を増大させた。しかしながら、弱毒化スポロゾイトワクチンを開発することを試みる考慮も言及もなかった。
【００１９】
これらの免疫化およびチャレンジを用いる最初の１０年間の臨床的経験の結果が、最近報告され、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９７０年代、１９８０年代後半、および１９９０前半）および１９７０年代におけるｔｈｅ  Ｒｕｓｈ−Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ−Ｓｔ  Ｌｕｋｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｃａｇｏおよびｔｈｅ  Ｎａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［１２〜１９、３４］からの、照射Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスプロゾイトでヒトを免疫する［３４］全ての公表された臨床報告と組み合わされた。多くの知見が、行われた解析から生じた。
【００２０】
Ａ）５〜１４匹の感染した蚊の刺咬によりチャレンジされたボランティアの間の防御免疫に関して用量応答が存在した。１０００匹を超える感染した照射した蚊の刺咬により免疫された１４人のボランティアのうち１３人（９３％）が、彼らの最後の一次免疫の１０週間以内にチャレンジされた場合、血液段階のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染の発症に対して防御された。これらのボランティアの３５のチャレンジがあり、そして３５のチャレンジのうち３３（９４％）において血液段階感染の発症に対し、完全な防御が存在した。２００を超え１０００未満の感染し照射した蚊の刺咬によって免疫された１０人のボランティアのうちの４人（４０％）が、彼らの最後の一次免疫の１０週間以内にチャレンジされた場合、血液段階のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染の発症に対し、防御された（＞１０００回の感染性刺咬により免疫されたボランティア間より有意に低レベルの防御免疫（ｐ＝０．００８８、フィッシャーの直接確率検定、両側）。１０００未満の感染性刺咬により免疫されたボランティアの１５のチャレンジがあり、１５のチャレンジのうちの５（３３％）において血液段階の感染の発症に対し、完全な防御が存在した（＞１０００回の感染性刺咬により免疫されたボランティア間より有意に低いレベルの防御免疫（ｐ＝０．００００１５、フィッシャーの直接確率検定、両側）。
【００２１】
Ｂ）防御免疫は、少なくとも４２週間（１０．５ヵ月間）にわたり存続した。彼らの最後の一次免疫または二次免疫の２３〜４２週間（２３週間、３６週間、３９週間、４１週間、および４２週間）後にチャレンジされた場合、上記の１４人のボランティアのうちの６人のうちの５人が実験的チャレンジに対し防御された。最後の（防御されない）免疫の５年後、１人のボランティアの単回チャレンジを除いて、長期の防御免疫を評価する他のチャレンジは存在しなかった。
【００２２】
Ｃ）防御は、種特異的ではなかった。４人のボランティアが、彼らが免疫された単離体とは異なるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの単離体でチャレンジされた。その４人のボランティアは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの異なる単離体を用いた７回のそのようなチャレンジのうちの７回において、完全に防御された。
【００２３】
Ｄ）免疫記憶は、少なくとも５年は存続する。１６０１匹の照射した感染した蚊の刺咬に暴露され、最後の暴露の９週間後および４２週後にチャレンジされた場合に防御されたたボランティアは、照射し感染した蚊への最後の暴露の５年後に再チャレンジされた場合は、防御されなかった。彼は、彼のマラリアについて処置され、１４７匹の照射し感染した蚊への暴露により追加免疫され、そしてＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトで感染した５匹の非照射の蚊の刺咬への暴露により再チャレンジされた。このボランティアは、その感染性チャレンジに対して防御された［３４］。このことは、この防御免疫が、照射スポロゾイトへの単回の暴露で追加免疫可能であることを実証した。
【００２４】
従って、防御は、１０００回を超える蚊の刺咬の後のチャレンジ実験の９０％より多くにて達成され、少なくとも１０．５ヵ月間存続し、そしてＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ単離体（株）特異的ではなかった。
【００２５】
ヒトの被験体におけるこのレベルの防御的効力を実証する「サブユニット」ワクチンは、主要なブレークスルーとして認識される。防御がこの実験的照射スポロゾイトワクチンから生じることが、慣例的に観察されたが、弱毒化スポロゾイトの優れた力は、この報告を公開するために必要な慎重な分析が完了した後まで、認識されないままであった。興味深いことに、これらの結果が、２００２年３月のキーストンミーティング「Ｍａｌａｒｉａ’ｓ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ：Ｆｒｏｍ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｔｏ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，」で、本発明者らの１人（ＳＬＨ）によって示されたとき、これらの結果は興味深いと考えられたが、聴衆の中で誰も、このアプローチは生きたマラリアワクチンとして追求されるべきであるという考えを提起さえしなかった。なぜなら、全ての人が、このワクチンは、生産するには非実用的であり、そして投与することも不可能であると考えたからである。この観点は、科学界において未だ広く、保持されている。Ｎａｔｕｒｅ誌（２００３年１０月２日）の最近の刊行物［４９］において、ｔｈｅ  Ｎａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｐｒｏｇｒａｍで臨床試験の指導者が、「障壁は、十分に手ごわく、誰もそれに挑戦する意思のあるものはいないようである」と述べ、そして英国のｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄからのマラリアワクチン専門家は、「これは、望みが薄い。試みは価値あるけれども、成功する見込みは非常に低い」と述べた。対照的に、本発明者らは、このようなワクチンを作製することは可能であるが、ｃＧＭＰ製造および臨床試験に移行する前に、解答しなければならないいくつかの重大な問題があると考えた。これらは、最近の刊行物［５０］において概要が述べられている。最も重大な問題の１つは、ヒトのワクチンにとって実用的な経路により弱毒化スポロゾイトを投与し得るか否かであった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（発明の要旨）
これまで、弱毒化プラスモジウム種スポロゾイトを用いてヒトを免疫することは、非実用的であると考えられていた。なぜなら、このスポロゾイトを、免疫化のために感染した照射した蚊の刺咬、または静脈内投与によって送達しなければならなかったからである。これは、ヒトおよびマウスでそれぞれ、以前になされていたものであり、高レベルの防御免疫を達成するための唯一の方法として、科学界により受け入れられたものであった。
【００２７】
適切に照射したスポロゾイトが、蚊の刺咬または静脈内注射によって送達される場合、これらのスポロゾイトは、血流を通じて肝臓へ移動し、肝細胞に侵入し、部分的に発達し、その後に発達を停止するが、成熟した肝臓分裂体（これは、破裂して、赤血球感染、およびマラリアとして公知の疾患の原因であるメロゾイトを放出する）までは、決して発達しないと理論づけられていた。従って、これらのスポロゾイトは、弱毒化される。データは、十分な防御免疫応答を惹起するためには、この寄生生物が、肝細胞に侵入し、部分的に発達し、そして防御免疫応答（特にＣＤ８  Ｔ細胞）の標的である新しいタンパク質を発現することを示す。
【００２８】
本発明者らは、非照射のスポロゾイト調製物の感染力とスポロゾイトが弱毒化された場合に防御免疫を惹起する能力との間に、直接的相関／関連があると理論づけた。さらに本発明者らは、ある特定の方法で投与される場合の非照射のスポロゾイトの感染力と、照射され、そして防御免疫を惹起するためにこの方法によって送達される場合のこれらのスポロゾイトの能力との間に、直接的相関／関連があると理論づけた。
【００２９】
本明細書中に記載された本発明は、ヒトワクチンにとって実用的な経路によって弱毒化スポロゾイトを投与し得るか？という疑問に答えることに応じて発見された。
【００３０】
この疑問は、上記で引例された全報告（１１、２０〜２２）で以前に研究されたＰ．ｂｅｒｇｈｅｉげっ歯類マラリア寄生生物ではなく、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉげっ歯類マラリア寄生生物を用いて取り組まれた。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉモデル系は、照射スポロゾイトが、Ａ／Ｊマウスを防御することを確立するために使用され、そしてこれは、照射されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが感染した蚊への暴露は、ヒトを防御することを実証するヒトの研究を導いた。そのＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ系はまた使用されて、照射スポロゾイト投与の筋肉内経路、皮下経路および他の非静脈内経路が、マウスにおいて十分には防御的でないことを科学界に証明した（２０〜２２）。実際、放射線照射弱毒化スポロゾイトを皮下投与した後、防御は、０％であった［２１］。Ａ／Ｊマウスで主に行われたこれらの研究は、ヒトにとって実用的かつ臨床的に適切なマラリアワクチンとして、照射スポロゾイトを開発させることは、可能ではないという結論を導いた。１９８０年代初期〜中期において、ｔｈｅ  Ｎａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙは、Ａ／ＪマウスにおけるＰ．ｂｅｒｇｈｅｉを用いる研究から、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＰ．ｙｏｅｌｉｉを用いる研究に切り換えた。これは、ｔｈｅ  Ｎａｖａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの科学者達が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける静脈内投与されたＰ．ｙｏｅｌｉｉは、静脈内投与されたＰ．ｂｅｒｇｈｅｉよりも、ヒトにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染の前兆となると考えたからであった。これは、主に、静脈内投与されたＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトは、静脈内投与されたＰ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトよりも、マウスに対して大いに感染性であるからであった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける静脈内投与されたＰ．ｙｏｅｌｉｉのマウスに対する５０％感染用量は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＰ．ｂｅｒｇｈｅｉの５０％感染用量の約１００分の１〜１０００分の１の低さであり、そしてＰ．ｂｅｒｇｈｅｉよりも、霊長類におけるプラスモジウム種の寄生生物（サルにおけるＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉおよびヒトにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍなど）の５０％感染用量に対してほぼ確実に匹敵する。１９９０年代初期（ＮａｖｙのグループがＰ．ｂｅｒｇｈｅｉの代わりにＰ．ｙｏｅｌｉｉを用いて研究を始めた約１０年後）に、Ｎａｖｙのグループの科学者達からの論文を読み、そして発表を聴聞した後、Ｄｒ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇは、本発明者らの１人（ＳＬＨ）から、Ｎａｖｙの研究室で使用されるＰ．ｙｏｅｌｉｉ寄生生物を要求し、げっ歯類マラリアに関するＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙでの彼女のグループの研究から、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉモデル系（主にＢＡＬＢ／ｃを用いる研究）に、本質的に切り換えた。
【００３１】
ほぼ確実に、上記で記載されたＰ．ｂｅｒｇｈｅｉモデル系における以前の研究［１１、２０〜２２］が原因で、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉを用いる全ての研究は、静脈内注射または蚊の刺咬による投与に焦点を当てていることは、注目すべき重要なことである。さらに、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉモデル系におけるこの研究が原因で、弱毒化スポロゾイト全体ワクチンを開発させるためのモデルとして、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ系において、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ系を使用するよう試みようとは、誰も実験をしていない。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉげっ歯類マラリア系における照射スポロゾイトを用いる免疫は、Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇによって１９８０年に記載された同一の科学的目的（防御免疫の免疫機構およびこれらの防御免疫応答の寄生生物上の抗原性標的を同定すること）のために、科学者達によって使用されていた［２２］。こうした理由で、スポロゾイトの静脈内投与または蚊の刺咬による投与だけが、照射スポロゾイトモデルをそのように有効にさせる１００％の防御免疫を提供することが、２５年間を超える時間にわたり「公知」であったので、これらは、この系において研究する科学者達によって使用される投与経路であった。照射スポロゾイトを、臨床的に実用的かつ受容可能にさせることが要求される他の経路（例えば、皮下経路、筋肉内経路、皮内経路および他の経路）は、使用されていない。
【００３２】
本発明者らは、マラリアに対して被験体を免疫するための方法を発見した。その方法は、比較的短時間に弱毒化スポロゾイトで多数の被験体をワクチン接種することを可能とし、感染に蚊よる以前の刺咬方法の非実用性および潜在的な危険性、またはマウスの場合の皮下注射による非実用性および潜在的な危険性を回避し、そしてこれらの先行方法により達成された防御に匹敵する防御を提供する。
【００３３】
さらに具体的には、本発明者らは、マラリアに対する有効な防御が、一定量の弱毒化スポロゾイトを、被験体に、静脈内注射以外の経路（皮下経路、筋肉内経路、皮内経路、粘膜経路、粘膜下経路、表皮経路、および皮膚経路が挙げられるが、これらに限定されない）によって非経口的に投与することにより得られ得ることを、発見した。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒト、哺乳動物、鳥類、および他の関連する種において、実用的にする、弱毒化プラスモジウム種スポロゾイトを投与するための新しい臨床的に関連するかつ受容可能な方法を提供する。
【００３５】
以前の弱毒化スポロゾイトの標準的投与方法（静脈内注射または感染した蚊の刺咬による投与）を上回る本発明の重大な改良は、本発明が、以前の標準的方法に匹敵する防御を提供するワクチンを投与する臨床的に実用的かつ安全な方法を可能とすることである。感染した蚊の刺咬による投与は、明白な理由により、決してワクチンとして使用され得ない。そして静脈内注射による投与は、いかなるワクチンについても一般的に使用されない方法である。なぜなら、特に若い子供において、技術的に困難な投与方法であり、そして血流内への直接投与であることが原因で、潜在的に危険であるからである。
【００３６】
本発明を用いると、非経口的投与は、皮膚に（経皮的、表皮、皮内）、皮下組織に（皮下）、筋肉に（筋肉内）、粘膜を介して、または粘膜下組織に投与され得る。好ましくは、その投与は、皮下、経皮内、または筋肉内にされる。
【００３７】
弱毒化の目的は、寄生生物を弱らせることであり、それにより、その寄生生物は、宿主細胞に侵入し新しいタンパク質を産生させるのに十分生存可能であるが、疾患の原因である複製する無性生殖血液段階感染を生じることはできない。弱毒化は、複数の方法で起こり得る。例えば、これは、寄生生物を接種したスポロゾイトが、宿主細胞へ侵入し得、これらの細胞内で部分的に発達し得、そして、破裂して赤血球へ侵入して疾患の原因となるメロゾイトを放出し得る、成熟した肝臓段階寄生生物に匹敵する段階に達する前で発達を停止するように弱毒化することによって、起こり得る。この型の弱毒化寄生生物は、代謝的に活性な非複製型寄生生物と呼ばれ得る。弱毒化はまた、宿主細胞に侵入して成熟した肝臓段階の寄生生物に匹敵する段階まで正常に発達し得、宿主細胞から破裂し得るが、しかし、これらが疾患を引き起こすことを必要とされる程度までは、赤血球においては発達不可能な寄生生物を生成することによって、起こり得る。この弱毒化はまた、宿主細胞中に侵入して成熟した肝臓段階の寄生生物に匹敵する段階まで正常に発達し得、宿主細胞から破裂し得るが、赤血球で、これらが重大な疾患を引き起こすために必要とされる程度までの発達は不可能であるようにその寄生生物を弱毒化することによって、起こり得る。この弱毒化はまた、スポロゾイトが、部分的に発達して新しいタンパク質を産生するが、破裂して赤血球へ侵入して疾患の原因となるメロゾイトを放出し得る、成熟した肝臓段階の寄生生物に匹敵する段階に達する前で発達を停止するように寄生生物を弱毒化することによって、起こり得る。
【００３８】
多くの弱毒化方法が使用され得るが、本発明者らは、照射による弱毒化が、代謝的に活性な非複製型寄生生物を生成するために、現在好ましいことを見出した。スポロゾイトの弱毒化は、多投与レジメンを含む複数の方法で、達成され得る。その弱毒化は、スポロゾイトが未だ蚊の中にいる間に達成され得るか、スポロゾイトが蚊から単離された後で操作（凍結保存など）する前に達成され得るか、または、スポロゾイトが蚊から単離された後操作（凍結保存など）された後に達成され得る。以前の経験に基づく現在の照射線量は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトについては、一般に１２，０００Ｒａｄ（ｃＧｙ）よりも大きく、２３，０００Ｒａｄ（ｃＧｙ）よりも小さく、１５，０００Ｒａｄ（ｃＧｙ）が、最も一般に使用される［３４］。当業者は、この線量は、種間または株間で異なり得ること、スポロゾイトを照射するために使用される装置および技術によって異なり得ることを認識する。当業者は、その照射は、多くの方法（γ線、ｘ線、紫外線、または他の亜原子粒子（例えば、電子、陽子、またはこれらの方法の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて達成され得ることを認識する。
【００３９】
将来、上記の段落で記載されるような弱毒化［３９］は、ワクチンのレシピエントに導入される前に、寄生生物の遺伝子操作によって達成され得る。
【００４０】
弱毒化はまた、スポロゾイトに暴露する前または後に、この寄生生物の発達を防ぐ薬物で個体を処理してこの寄生生物が、肝細胞で複製し得るようにすることによって達成され得る。
【００４１】
弱毒化はまた、スポロゾイトに暴露する前または後に、その寄生生物の発達を防ぐ薬物で個体を処理してその寄生生物が、赤血球で複製し得るようにすることによって達成され得る。
【００４２】
弱毒化はまた、スポロゾイトを、その寄生生物を弱毒化する化学薬品を用いて処理することによって達成され得る。
【００４３】
投与手段は、蚊の刺咬または静脈内投与以外の任意の接種方法（一本針およびシリンジ、複数針およびシリンジアレイを用いる注射、１個〜数百個〜数千個〜数十万個の細孔を有する微小針を用いる注射、弾道技術による針を用いない注射などであるが、これらに限定されない）であり得る。弱毒化スポロゾイトはまた、経皮的パッチにより、または特定の物質（例えば、金ビーズ）上で、送達され得る。単回接種により一定レベルの防御に達成することは可能であるが、一連の２回以上の接種または暴露を行うことが好ましい。
【００４４】
好ましい接種物は、マラリア免疫に有効な量の弱毒化されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトまたは他のプラスモジウム種スポロゾイトである。１回の接種当たりのヒトにおける投薬量は、約１，０００〜１０，０００，０００の範囲であり得るが、これは開業医による評価または弱毒化スポロゾイト調製物の免疫原性／効力に依存して、異なり得る。
【００４５】
任意のプラスモジウム種寄生生物が、たとえ、遺伝学的に変化したとしても、本発明の方法で使用され得る。一実施形態では、寄生生物はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。他の実施形態では、例えば、寄生生物はＰ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、またはＰ．ｍａｌａｒｉａｅであり得る。他の実施形態では、寄生生物はこれらの寄生生物の混合物であり得る。他の実施形態では、寄生生物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ、または他のプラスモジウム種寄生生物であり得る。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、シリンジのような送達装置の中に弱毒化スポロゾイトを含む、薬学的キットを提供する。
【００４７】
他の実施形態では、本発明は、バイアル（凍結した弱毒化スポロゾイトを含むバイアルが挙げられるが、これに限定されない）のような容器、弱毒化スポロゾイトを希釈するための液体を含むバイアルのような容器、ならびにシリンジおよび針のような実際の送達デバイスを含む、キットを提供する。
【００４８】
他の実施形態では、本発明は、バイアル（凍結乾燥した（凍結乾燥した）弱毒化スポロゾイトを含むバイアルが挙げられるが、これに限定されない）のような容器、弱毒化スポロゾイトを希釈するための液体を含むバイアルのような容器、ならびにシリンジおよび針のような実際の送達デバイスを含む、キットを提供する。
【００４９】
他の実施形態では、本発明は、バイアル（保温された弱毒化スポロゾイトを含むバイアルが挙げられるが、これに限定されない）のような容器、弱毒化スポロゾイトを希釈するための液体を含むバイアルのような容器、ならびにシリンジおよび針のような実際の送達デバイスを含む、キットを提供する。
【００５０】
本発明は、マラリアの予防、またはマラリアの重篤度の軽減のためのワクチン投与における本明細書中で記載されるような弱毒化プラスモジウム種スポロゾイトの非経口的投与の使用をさらに提供する。
【００５１】
本発明は、マラリアの原因である病原体に以前に暴露されていないヒト、または暴露されたが完全には防御されていないヒトの、部分的防御、増強した防御、または完全防御を提供する。本発明はまた、使用され得る。マラリア感染の発症の機会を減らすため、感染した場合に疾患になる機会を減らすため、感染した場合にその疾患の重篤度（熱など）を軽減するため、感染した人間における寄生生物の濃度を低下させるため、またはマラリア寄生生物に暴露された場合にマラリアによる死亡率を低下させるために、使用され得る。多くの場合、部分的な防御ですら、有益である。例えば、集団の約３０％にこれらの恩恵のうちのいくらかをもたらすワクチン処置戦略は、共同社会の健康およびその共同社会に存在する個体の健康に対して重大な衝撃を有し得る。
【００５２】
「ワクチン」は、疾病から人間を防御する免疫応答を、その薬剤に起因して刺激するために投与される、感染因子またはその成分を含む調製物を包含する組成物である。治療（処置）ワクチンは、感染後に与えられ、疾患進行を減少させるまたは阻止することが意図される。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））ワクチンは、初期感染を防ぐことを意図する。ワクチンで使用される因子は、全体が死滅されていても（不活性）、生存状態での弱毒化されていても（減らされている）、または人工的に操作されていてもよい。ワクチンは、当業者に容易に理解されるように、希釈液、アジュバント、キャリア、またはこれらの組み合わせをさらに含み得る。
【００５３】
ワクチンは、別個の成分から構成され得る。本明細書中で使用される場合、「別個の成分」とは、用語ワクチンが、被験体に別々に投与されるべき２つの別個のワクチンを実際に含む状況を言う。その意味で、別個の成分から構成されるワクチンは、別個のワクチン成分を含むキットまたはパッケージとして考えられ得る。例えば、本発明との状況で、パッケージは、弱毒化スポロゾイト成分、および組換えサブユニットワクチン成分（組換えタンパク質、組換えウイルス、組換え細菌、組換え寄生生物、ＤＮＡワクチン、またはＲＮＡワクチンが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。
【００５４】
「有効な」免疫投与量は、１０００スポロゾイトと１千万スポロゾイトとの間の範囲に及び得るが、ワクチンの免疫原性／効力が増大する場合は、より低量であり得る。ワクチンは、複数回で投与され得る。「有効な」接種回数は、１年間で１回投与と６回投与との間の、そしてその後の年の「追加免疫」投与の範囲に及び得る。
【００５５】
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも、例示および説明に過ぎず、特許請求されるような本発明を制限するものではない。さらに、本発明は、記載されている特定の実施形態に限定されず、従って当然変化し得る。さらに、特定の実施形態を記載するために使用される用語法は、限定的であることを意図しない。なぜなら、本発明の範囲は、その特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【００５６】
値の範囲に関して、本発明は、脈絡が明白に他のように示さない限り、その範囲の上限と下限との間の各々の介在値から、その下限の単位の少なくとも１０分の１まで含む。さらに、本発明は、記載されている他の任意の介在値を含む。さらに、本発明はまた、記載された範囲から具体的に除外されない限り、その範囲の上限および下限のいずれかまたは両方を除いた範囲を含む。
【００５７】
他のように規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語の意味は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味である。当業者はまた、本明細書中で記載されたものと同様または等価の任意の方法および物質もまた、本発明を実施または試験するために使用され得ることを理解する。さらに、本明細書中で言及される全ての刊行物は、参考として援用される。
【００５８】
文脈が明白に他のように指示しない限り、本明細書中で使用される場合、および添付された特許請求の範囲において、単数形「一つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数の言及物を含むことは、注意されなければならない。従って、例えば、「弱毒化スポロゾイトワクチン（ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）」への言及は、複数のこのようなスポロゾイトを含み、「その因子（ｔｈｅ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、一以上の因子および当業者に公知のその等価物への言及を含み、などである。
【００５９】
さらに、他のように示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分量、反応条件、純度％などを表す全ての数は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」によって修飾される。従って、本明細書および特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明の望ましい性質に依存して変化し得る近似値である。最低限でも、特許請求の範囲の範囲に均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、通常の丸め技術を適用しつつ、報告された有効数字の数を考慮して少なくとも解釈されるべきである。それにもかかわらず、具体的実施例に示される数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、どの数値も、その実測値の標準偏差からの特定の誤差を固有に含む。
【００６０】
明らかに、本発明の多くの改変および変化が、上記の技術を考慮して可能である。従って、添付された特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に記載されているのとは異なるように実施され得ることが理解されるべきである。
【００６１】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の特定の実施形態の種々の有益な性質を開示するに過ぎない。これらの実施例は、本発明を限定することものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（スポロゾイトの皮内注射、筋肉内注射、皮下注射、および静脈内注射の比較感染力）
皮内（ＩＤ）送達、筋肉内（ＩＭ）送達、皮下（ＳＱ）送達または静脈内（ＩＶ）送達された新しく切開した、スポロゾイトの比較感染力を調べるために、研究を行った。ＩＶ投与は、感染を達成するために最も信頼性の高い方法であると考えられていることに注意すること。
【００６３】
（方法）
手での切開した唾液腺からのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを、ＩＤ投与、ＩＭ投与、ＳＱ投与、またはＩＶ投与によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、感染させた。投与後、１日目から１４日目まで厚層血液塗抹標本を評価することによって、感染レベルを決定した。この結果を表Ｉに示す。
【００６４】
【表１】
2006508988.tif 000002
これらのデータは、スポロゾイトの送達によって、皮膚組織、筋肉組織または皮下組織でＢＡＬＢ／ｃマウスに慣習的に感染させることが可能であることを実証する。
【００６５】
（実施例２）
（皮内投与、筋肉内投与、皮下投与または静脈内投与した複数回投与のスポロゾイトの比較感染力）
実施例１で使用した数よりも少数の新しく切開したスポロゾイトを用いて比較感染力を評価するために、研究を行った。
【００６６】
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、複数の経路［皮内（ＩＤ）経路、筋肉内（ＩＭ）経路、皮下（ＳＱ）経路または静脈内（ＩＶ）経路］によって、手で切開した唾液腺からのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを感染させた。注射後、１日目から１４日目まで厚層血液塗抹標本を評価することによって、感染を決定した。この結果を表ＩＩに示す。
【００６７】
【表２】
2006508988.tif 000003
これらのデータは、ＩＤ経路、ＩＭ経路、またはＳＱ経路による、手で切開した唾液腺からの少数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトの投与が、マウスにおいて、ＩＶ経路とほぼ同一の効率で感染を導くことを示す。本発明者らは、特定の方法により投与された場合の非照射スポロゾイトの感染力と、照射されその方法により送達された場合のこれらのスポロゾイトが防御免疫を惹起する能力との間に、直接的相関性／関連性があると理論づけるので、これらのデータは、ＩＤ経路、ＩＭ経路、およびＳＱ経路、ならびに標準的なＩＶ経路によって、首尾よく免疫することが実現可能であることを示唆する。
【００６８】
（実施例３）
（皮内経路、筋肉内経路、または静脈内経路によって投与された単回投与の照射スポロゾイトの防御効力）
単回投与の１５０，０００個の放射線照射弱毒化スポロゾイトを用いた免疫によって提供される比較防御を調べるために、研究を行った。
【００６９】
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＩＤ経路、ＩＭ経路、またはＩＶ経路によって、単回投与の１５０，０００個の放射線照射弱毒化（１０，０００Ｒａｄｓ／ｃＧｙ）Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを接種した。密度勾配遠心分離によって、免疫用のスポロゾイトを得た。１０日後、手で切開した唾液腺からの１００個のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトの注射によって、この接種したマウスをチャレンジした。チャレンジして１４日後までに厚層血液塗抹標本よって、この感染を評価した。感染レベルを１＋（ほとんど検出不可能）から４＋（重い感染）までの尺度で評価した。コントロール群は、免疫接種を受けなかった。この結果を表ＩＩＩに示す。
【００７０】
【表３】
2006508988.tif 000004
これらのデータは、ＩＤ経路およびＩＭ経路による単回投与の照射スポロゾイトの投与が、ＩＶ経路による単回投与量の照射スポロゾイトの投与後に見られる防御に匹敵するスポロゾイトチャレンジを提供する防御免疫を惹起することを実証する。この発見は、上記の実施例１および実施例２において実証された感染力によって、予測された。ＩＭ方法およびＩＤ方法は、多数の人々でＩＶ投与よりも容易に使用され、この投与は、ＩＶ投与よりも、さらに安全かつ簡単に実行され得るので、本発明は、これまでに実証されたよりも容易な様式で、弱毒化スポロゾイトを用いたかなりの集団の有効な免疫を可能にさせる。実際、本発明は、初めて、実用的な弱毒化スポロゾイトワクチンの計画を考えることを可能とする。単回投与の照射スポロゾイトの投与は、チャレンジしたマウスにおける寄生生物負荷の劇的な減少（レシピエントにおけるマラリアの罹患率および死亡率を顕著に低下させるために潜在的に十分であると多くのマラリアワクチン学者によって考えられる効果）を導いた。しかしながら、これは感染に対して完全には防御しなかった。
【００７１】
（実施例４）
（皮下経路または静脈内経路によって投与される３回投与の照射スポロゾイトの防御効力）
ＩＤ経路またはＩＶ経路による３回投与の放射線照射弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトの標準的レジメン（スポロゾイトチャレンジに対する完全な防御を惹起することを期待されるレジメン）を用いた免疫により提供される比較防御を評価するために、研究を行った。
【００７２】
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＳＱ経路またはＩＶ経路によって、第１回の投与の５０，０００個の放射線照射弱毒化（１０，０００ＲＡＤＳ／ｃＧｙ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを、接種した。このマウスには、２回の追加投与の３０，０００個の照射スポロゾイトを与えた（３回の投与に分けられた合計１１０，０００個のスポロゾイト）を受けた。密度勾配遠心分離によって、免疫用のスポロゾイトを得た。最後の追加免疫投与の１４日後、手で切開した唾液腺からの１００個のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを用いて、この接種されたマウスにチャレンジした。チャレンジ後１４日目まで、厚層血液塗抹標本よってこの感染を評価した。感染を、あるかないかで評価した。この結果を表ＩＶに示す。
【００７３】
【表４】
2006508988.tif 000005
表ＩＶのデータは、スポロゾイトの皮下投与（ＳＱ）による感染に対する１００％の防御を達成し得ることを明白に実証する。これらの結果は、実施例１、実施例２、および実施例３で示される研究結果によって予測されたが、しかしこの結果は、世界で初めて、この実験において実証された。ＳＱ経路、ＩＤ経路、およびＩＭ経路による感染（実施例２）における比較性を仮定すると、これらの経路によるスポロゾイトの投与が匹敵する防御を提供することは明らかのようである。実施例４において報告された１００％防御は、以前に報告された放射線照射弱毒化Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを用いたＡ／Ｊマウスの皮下免疫での０％防御［２１］とは著しく対象的である。上で記載されるように、本発明者らは、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ−ＢＡＬＢ／ｃモデルは、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ−Ａ／Ｊマウスモデル系よりも、ヒトにおけるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに関連性があるという本発明者らの認識によって、本発明者らの発明は可能になったと考える。
【００７４】
（実施例５）
（静脈内経路によって投与された場合の手での唾液腺の切開によるスポロゾイト感染力と比較した、密度勾配遠心分離によって単離されたスポロゾイトの感染力）
実施例３および実施例４において、密度勾配遠心分離によって単離した照射スポロゾイトの投与によって、マウスを免疫した。蚊の頭部および胸郭の密度勾配遠心分離によって単離したスポロゾイトが、手で切開した唾液腺からのスポロゾイトよりも、感染性が低いことは、本発明者らの仮説であった。そうであれば、そしてスポロゾイトの感染力と上記で述べられたように防御免疫を惹起するスポロゾイトの能力との間に直接的な関連があるとすると、防御免疫を達成するためには、密度勾配遠心分離によって単離されたスポロゾイトより、はるかに少ない手で切開した唾液腺からのスポロゾイトしか必要としないはずである。従って、本発明者らは、まず、密度勾配遠心分離により単離されたＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトの感染力を、手での切開による唾液腺からの単離したスポロゾイトと比較する実験を行った。
【００７５】
（方法）
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを、密度勾配遠心分離によって、または手での唾液腺の切開によって、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊から単離した。種々の数のスポロゾイトを用いて、静脈内注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。厚層血液塗抹標本によって、チャレンジ１４日後まで、この感染を評価した。感染を、あるかないかで評価した。この結果を表Ｖに示す。
【００７６】
【表５】
2006508988.tif 000006
表Ｖにおけるデータは、手での切開による唾液腺からのスポロゾイトが、密度勾配遠心分離により単離されたスポロゾイトよりも感染性であることを明白に実証する。この５０％感染用量は、密度勾配遠心により単離されたスポロゾイトに対して８０倍を超えて大きい。多くの弱毒化スポロゾイトの防御効力が、弱毒化された前のそのスポロゾイト群の感染力と直接的に関連するという仮説が正しい場合、これらのデータは、防御を達成するために必要な弱毒化スポロゾイトの数は、密度勾配遠心分離により単離されるスポロゾイトと比較して、手での唾液腺の切開により単離されるスポロゾイトについて実質的に少ないことを示す。この密度勾配遠心分離は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ−ＢＡＬＢ／ｃマウスモデル系における免疫研究にとって、スポロゾイト単離するための標準的な方法となっている。
【００７７】
（実施例６）
（静脈内経路により投与される場合に、手での切開により単離されたスポロゾイトと比較した密度勾配遠心分離により単離したスポロゾイトの防御効力）
実施例５における感染力実験の結果に基づき、防御効力実験を計画した。９０％防御を生じることが以前の実験に基づいて、公知である、密度勾配遠心分離により単離した照射スポロゾイトのレジメンの防御効力を、手での唾液腺の切開により単離されたかなりより少ない量の照射スポロゾイトが防御免疫を達成する能力と比較した。
【００７８】
（方法）
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを感染させたＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊に１０，０００Ｒａｄｓ／ｃＧｙで照射した。密度勾配遠心分離により、または手での唾液腺の切開により、スポロゾイトを単離した。照射したＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトの３回投与の静脈内注射によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスに２週間隔で接種した。グループ１には、密度勾配遠心分離により単離した照射スポロゾイトを与えた（第１回投与、第２回投与、および第３回投与について、それぞれ、２４，０００個、８，０００個、および８，０００個）。グループ２〜５には手での唾液腺の切開によって単離されたスポロゾイトを与えた。グループ６には、免疫をしなかった。グループ１〜６のマウスを、第３回目の免疫投与の１４日後に、手での唾液腺の切開によって単離した１００個のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを用いてチャレンジした。チャレンジして１４日後まで、厚層血液塗抹標本によって、この感染を評価した。感染を、あるかないかで評価した。この結果を表ＶＩに示す。
【００７９】
【表６】
2006508988.tif 000007
表ＶＩのデータは、密度勾配遠心分離により単離された合計４０，０００個の照射Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイト（２４０００個、８０００個、８０００個）を用いて免疫されたマウスが、９０％の防御を有したことを実証する。手での唾液腺の切開により単離された合計７５００個の照射スポロゾイト（４５００個、１５００個、１５００個）を用いて免疫されたマウスは、１００％の防御を有した。これらのデータは、実施例５のデータと合わせた場合、スポロゾイト調製物の感染力と、そのスポロゾイトが惹起し得る防御効力との間に直接的な関連があることを示す。実際、手で切開された照射スポロゾイトの量の点で、どれくらい低い用量で行って、なお９０％〜１００％の防御効力を達成し得るかは未だ明白でない。これらのデータは、少ない投与量の照射スポロゾイトを用いて免疫することは、ＩＶ経路によるか、ＩＤ経路によるか、ＩＭ経路によるか、またはＳＱ経路によるかに関わりなく、防御効力をもたらすことを示す。
【００８０】
これらのデータはまた、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ−ＢＡＬＢ／ｃモデル系が、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ系におけるかなりより高いスポロゾイトの感染力が部分的には原因で、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを用いてヒトで起きることをＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ−Ａ／Ｊマウスモデル系よりも厳密に予想するという仮説を支持する。ヒトは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが感染した１０００匹の照射蚊の刺咬によって、完全に免疫され得る［３４］。一匹の蚊は、その蚊がえさを食べると１０個より多くのスポロゾイトを接種すると考えられる［５１］。そうであるとすると、完全に免疫され防御されたヒトは、おそらく、たった１０，０００個のスポロゾイトを接種される［５０］。対照的に、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ−Ａ／Ｊマウスモデル系において、手で切開した唾液腺から単離された１００，０００個より多くのスポロゾイトが、防御を達成するために、静脈内投与によって使用され、そしてこの免疫投与レジメンは、皮下投与された場合は、防御を提供しなかった［２１］。実施例６において、手での唾液腺の切開により単離された７５００個のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトのＢＡＬＢ／ｃマウスへの投与は、１００％の防御を提供したことが実証される。弱毒化Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを用いて免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスおよび弱毒化Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを用いて免疫されたヒトは、同様の数の弱毒化スポロゾイトへの暴露後に防御され、そしてＰ．ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを用いて免疫されたＡ／Ｊマウスは、その量の１０倍よりも多くのスポロゾイトを用いて免疫されるという事実は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ−ＢＡＬＢ／ｃモデルは、ヒトにおいて起きることを、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ−Ａ／Ｊモデル系よりも、により予測するという本発明者らの仮説を支持する。
【００８１】
（結論）
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ様感染に対する有効的で継続維持可能なワクチンを開発するプロセスは、予想されるよりも、遅く、難しく、そして複雑であることが証明されている。認可されたマラリアワクチンは存在しないが、１０００匹より多くの感染された蚊の刺咬による、放射線照射弱毒化Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを用いた免疫は、世界中からのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの複数の単離体に対して、免疫された個体のうちの９０％より多くにおいて、少なくとも１０．５ヵ月にわたって滅菌防御免疫を提供することが、現在公知である。この免疫レジメンをヒト用のワクチンにするための主要な障害の一つは、感染された蚊の刺咬によって多数の個体に調節されたワクチンを提供することは、可能ではないという事実である。さらに、多くの科学者による研究は、優れた防御が、弱毒化スポロゾイトの静脈内投与（標準的な投与方法よりも技術的に難しく潜在的に難しいので、概して、ワクチン接種に使用されない投与方法）によってマウスモデル系においてのみ達成され得ることを示した。従来ヒトにおいて使用されている免疫のための投与方法（例えば、皮下接種および筋肉内接種）は、このマウスモデル系において十分な防御免疫を導かなかったので、これまで、ヒト用の弱毒化スポロゾイトワクチンを開発することは可能であると考えられなかった。以前の研究者によって使用されたものとは異なるモデル系を利用することによって、本発明者らは、高レベルの防御を導き、そして実用的であり、安全であり、許容される、スポロゾイト投与方法を発見した。本発見は、この弱毒化スポロゾイト投与方法の利用を容易にし、実用的かつ大量送達される弱毒化スポロゾイトマラリアワクチンを開発し、提供する。
【００８２】
以下の刊行物および本出願中のどこかで言及された刊行物は、本明細書で具体的に参考として援用される：
【００８３】
【表７】
2006508988.tif 000008
【００８４】
【表８】
2006508988.tif 000009
【００８５】
【表９】
2006508988.tif 000010
【００８６】
【表１０】
2006508988.tif 000011
【００８７】
【表１１】
2006508988.tif 000012
【００８８】
【表１２】
2006508988.tif 000013
本発明の他の実施形態は、明細書および本明細書中に開示されると考慮し、発明を実施することから、当業者にとって明らかである。本明細書および実施例は、単なる例示として解釈されること意図され、本発明の真の範囲および精神は、添付の請求項の範囲によって示される。
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月25日(2005.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非経口的非静脈内接種により哺乳動物宿主およびヒト宿主において免疫応答を刺激するための薬学的組成物であって、該組成物は、代謝的に活性な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトとキャリアとを含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記スポロゾイトは、手で切開されたＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の唾液腺から得られる、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種は、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトと、少なくともさらに１種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍとを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記弱毒化スポロゾイトは、後に細胞破裂することなく前記宿主の肝臓に侵入することが可能である、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記弱毒化スポロゾイトは、前記宿主の血液段階感染することなく、宿主肝臓に侵入した後に細胞破裂することが可能である、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、放射線により弱毒化したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む、組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の薬学的組成物であって、弱毒化放射線の線量は、少なくとも１２，０００ｃＧｙでありかつ２３，０００ｃＧｙ以下である、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の薬学的組成物であって、前記線量は、１５，０００ｃＧｙに近い、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１，０００個のスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１０，０００個のスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１００，０００個のスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１，０００，０００個のスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１０，０００，０００個のスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１５】
哺乳動物宿主およびヒト宿主において免疫応答を刺激するための薬学的ワクチン接種キットであって、該キットは、代謝的に活性な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトと、キャリアと、非経口的非静脈内接種のための手段とを備える、キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、針である、ワクチン接種キット。
【請求項１７】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、微小針である、ワクチン接種キット。
【請求項１８】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、微小針アレイである、ワクチン接種キット。
【請求項１９】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、針を用いない弾道技術による注射器である、ワクチン接種キット。
【請求項２０】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、針を用いない粒子注射器である、ワクチン接種キット。
【請求項２１】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、経皮パッチである、ワクチン接種キット。
【請求項２２】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種は、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、ワクチン接種キット。
【請求項２３】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトと、少なくともさらに１種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍとを備える、ワクチン接種キット。
【請求項２４】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記弱毒化スポロゾイトは、後に細胞破裂することなく前記宿主の肝臓に侵入することが可能である、ワクチン接種キット。
【請求項２５】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、前記弱毒化スポロゾイトは、前記宿主の血液段階感染することなく、宿主肝臓に侵入した後に細胞破裂することが可能である、ワクチン接種キット。
【請求項２６】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、放射線により弱毒化したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む、ワクチン接種キット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のワクチン接種キットであって、弱毒化放射線の線量は、少なくとも１２，０００ｃＧｙでありかつ２３，０００ｃＧｙ以下である、ワクチン接種キット。
【請求項２８】
請求項２７に記載のワクチン接種キットであって、前記放射線弱毒化線量は、１５，０００ｃＧｙに近い、ワクチン接種キット。
【請求項２９】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１，０００個のスポロゾイトを含む、ワクチン接種キット。
【請求項３０】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１０，０００個のスポロゾイトを含む、ワクチン接種キット。
【請求項３１】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１００，０００個のスポロゾイトを含む、ワクチン接種キット。
【請求項３２】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１，０００，０００個のスポロゾイトを含む、ワクチン接種キット。
【請求項３３】
請求項１５に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１０，０００，０００個のスポロゾイトを含む、ワクチン接種キット。
【請求項３４】
一種以上のマラリア原因病原体に対して、哺乳動物宿主およびヒト宿主において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、初回ワクチンの非経口的非静脈内投与を包含し、該ワクチンは、代謝的に活性な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含み、該投与の際に、該スポロゾイトは、宿主細胞に侵入して免疫応答を誘導する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記免疫応答は、１以上の前記ワクチン投与量を後に投与することによって追加免疫される、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記免疫応答は、宿主のマラリア感染に対して治療的である、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、前記免疫応答は、マラリアに対する部分免疫を提供する、方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法であって、前記免疫応答は、マラリアに対する完全免疫を提供する、方法。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法であって、前記投与は、皮下組織、真皮組織、筋肉組織、表皮組織、粘膜組織、粘膜下組織、および皮膚組織からなる群より選択される宿主組織への接種である、方法。
【請求項４０】
請求項３４に記載の方法であって、前記スポロゾイトは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅからなる群より選択される１つの種である、方法。
【請求項４１】
請求項３４に記載の方法であって、前記スポロゾイトは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅからなる群より選択される少なくとも２つの種である、方法。
【請求項４２】
請求項３４に記載の方法であって、前記弱毒化スポロゾイトは、後に細胞破裂することなく宿主の肝細胞に侵入する、方法。
【請求項４３】
請求項３４に記載の方法であって、前記弱毒化スポロゾイトは、宿主肝細胞に侵入し、その後の宿主細胞破裂を誘導するが、該宿主の血液段階感染は誘導しない、方法。
【請求項４４】
請求項３４に記載の方法であって、放射線により弱毒化したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、弱毒化放射線の線量は、少なくとも１２，０００ｃＧｙでありかつ２３，０００ｃＧｙ以下である、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記放射線弱毒化線量は、１５，０００ｃＧｙに近い、方法。
【請求項４７】
請求項３４に記載の方法であって、少なくとも１，０００個のスポロゾイトを含む、方法。
【請求項４８】
請求項３４に記載の方法であって、少なくとも１０，０００個のスポロゾイトを含む、方法。
【請求項４９】
請求項３４に記載の方法であって、少なくとも１００，０００個のスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５０】
請求項３４に記載の方法であって、少なくとも１，０００，０００個のスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５１】
請求項３４に記載の方法であって、少なくとも１０，０００，０００個のスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５２】
請求項１〜１４に記載の薬学的組成物であって、哺乳動物宿主およびヒト宿主への該組成物の投与によって、その後、蚊の刺咬により該宿主が前記スポロゾイトに暴露された後のマラリアの症状の出現が防止される、組成物。
【請求項５３】
請求項１５〜３３に記載の薬学的ワクチン接種キットであって、哺乳動物宿主およびヒト宿主への前記組成物の投与によって、その後、蚊の刺咬により該宿主が前記スポロゾイトに暴露された後のマラリアの症状の出現が防止される、ワクチン接種キット。
【請求項５４】
請求項３４〜５１に記載の方法であって、哺乳動物宿主およびヒト宿主への投与によって、その後、蚊の刺咬により該宿主が前記スポロゾイトに暴露された後のマラリアの症状の出現が防止される、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月8日(2005.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非経口的非静脈内接種により哺乳動物宿主およびヒト宿主において免疫応答を刺激するための薬学的組成物であって、該組成物は、代謝的に活性な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト寄生生物とキャリアとを含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記スポロゾイトは、手で切開されたＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の唾液腺から得られる、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の種は、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトと、少なくともさらに１種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトとを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記弱毒化スポロゾイト寄生生物は、前記宿主の細胞に侵入する、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の薬学的組成物であって、前記細胞は、肝臓細胞を含み、前記寄生生物は、後に肝臓細胞の破裂を誘導しない、組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の薬学的組成物であって、前記細胞は、肝臓細胞を含み、前記寄生生物は、肝臓細胞の破裂を誘導し、該寄生生物は、後に宿主の赤血球内において発達することが不可能である、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記弱毒化は、遺伝子改変のための手段によって達成される、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の薬学的組成物であって、前記改変手段は、放射線照射、遺伝子操作、および化学物質によるスポロゾイトの処理からなる群より選択される、組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の薬学的組成物であって、放射線により弱毒化したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の薬学的組成物であって、弱毒化放射線の線量は、少なくとも１２，０００ｃＧｙでありかつ２３，０００ｃＧｙ以下である、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の薬学的組成物であって、前記線量は、１５，０００ｃＧｙに近い、組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１，０００個であるが１０，０００，０００個以下であるスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の薬学的組成物であって、少なくとも５，０００個であるが１００，０００個以下であるスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１０，０００個であるが５０，０００個以下であるスポロゾイトを含む、組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、該組成物を哺乳動物宿主またはヒト宿主に投与すると、該宿主中に後に感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが導入された後に、該宿主においてマラリア特異的病理状態を予防する、組成物。
【請求項１７】
哺乳動物宿主およびヒト宿主において免疫応答を刺激するための薬学的ワクチン接種キットであって、該キットは、代謝的に活性な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト寄生生物とキャリアとを含む薬学的組成物、および非経口的非静脈内接種のための手段を備える、キット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、針である、キット。
【請求項１９】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、微小針アレイである、キット。
【請求項２０】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、針を用いない弾道技術による注入器である、キット。
【請求項２１】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段は、針を用いない粒子注入器である、キット。
【請求項２２】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種は、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、キット。
【請求項２３】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記弱毒化スポロゾイト寄生生物は、前記宿主の細胞に侵入する、キット。
【請求項２４】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記弱毒化は、遺伝子改変のための手段によって達成される、キット。
【請求項２５】
請求項２４に記載のワクチン接種キットであって、前記改変手段は、放射線照射、遺伝子操作、および化学物質によるスポロゾイトの処理からなる群より選択される、キット。
【請求項２６】
請求項２５に記載のワクチン接種キットであって、放射線により弱毒化したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む、キット。
【請求項２７】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１，０００個であるが１０，０００，０００個以下であるスポロゾイトを含む、キット。
【請求項２８】
請求項２７に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも５，０００個であるが１００，０００個以下であるスポロゾイトを含む、キット。
【請求項２９】
請求項２８に記載のワクチン接種キットであって、少なくとも１０，０００個であるが５０，０００個以下であるスポロゾイトを含む、キット。
【請求項３０】
請求項１７に記載のワクチン接種キットであって、前記接種手段によって前記該組成物を哺乳動物宿主またはヒト宿主に投与すると、該宿主中に後に感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが導入された後に、該宿主においてマラリア特異的病理状態を予防する、キット。
【請求項３１】
一種以上のマラリア原因病原体に対して、哺乳動物宿主およびヒト宿主において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、
ａ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト寄生生物の弱毒化；
ｂ）弱毒化スポロゾイトの単離；
ｃ）該宿主への初回ワクチン投与量の非経口的非静脈内投与
を包含し、該投与量は、代謝的に活性な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト寄生生物とキャリアとの薬学的組成物を含み、該スポロゾイトは、該免疫応答を誘導する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、１以上のワクチン追加免疫投与量を前記宿主にその後投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、ネイティブタンパク質、組換えタンパク質、組換えウイルス、組換え細菌、組換え寄生生物、ＤＮＡワクチン、およびＲＮＡワクチンからなる群より選択されるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的サブユニット成分の投与をさらに包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記免疫応答は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトに感染した宿主について治療的である、方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、前記投与は、前記宿主におけるマラリア特異的病理状態を緩和し、該病理状態は、前記ワクチン投与後に感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが該宿主に導入されることから生じる、方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法であって、前記投与は、前記ワクチン投与後に感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが前記宿主に導入された後に、該宿主においてマラリア特異的病理状態を予防する、方法。
【請求項３７】
請求項３１に記載の方法であって、前記投与は、皮下組織、真皮組織、筋肉組織、表皮組織、粘膜組織、粘膜下組織、および皮膚組織からなる群より選択される宿主組織への接種である、方法。
【請求項３８】
請求項３１に記載の方法であって、前記スポロゾイトは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅからなる群より選択される１つの種である、方法。
【請求項３９】
請求項３１に記載の方法であって、前記スポロゾイトは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅからなる群より選択される少なくとも２つの種である、方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載の方法であって、前記スポロゾイト寄生生物が宿主細胞に侵入することをさらに包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記宿主細胞は、肝臓細胞であり、前記寄生生物は、後に肝臓細胞の破裂を誘導しない、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、前記宿主細胞は、肝臓細胞であり、該方法は、前記寄生生物が肝臓細胞の破裂を誘導することをさらに包含し、該寄生生物は、後に宿主の赤血球内において発達することが不可能である、方法。
【請求項４３】
請求項３１に記載の方法であって、スポロゾイトの弱毒化は、該スポロゾイトの遺伝子改変のための手段によって達成される、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記遺伝子改変手段は、放射線照射、遺伝子操作、および化学物質によるスポロゾイトの処理からなる群より選択される、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、放射線により弱毒化したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含む、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記スポロゾイトは、蚊の内部で放射線照射される、方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、前記弱毒化放射線の線量は、少なくとも１２，０００ｃＧｙでありかつ２３，０００ｃＧｙ以下である、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記放射線弱毒化線量は、１５，０００ｃＧｙに近い、方法。
【請求項４９】
請求項３１に記載の方法であって、少なくとも５，０００個であるが５０，０００個以下であるスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５０】
請求項３２に記載の方法であって、前記１以上の追加免疫投与量は、少なくとも１０００個であるが１０，０００，０００個以下であるスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、前記１以上の追加免疫投与量は、少なくとも５０００個であるが１００，０００個以下であるスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記１以上の追加免疫投与量は、少なくとも１０，０００個であるが５０，０００個以下であるスポロゾイトを含む、方法。
【請求項５３】
請求項３２に記載の方法であって、前記１以上の追加免疫投与量は、ネイティブタンパク質、組換えタンパク質、組換えウイルス、組換え細菌、組換え寄生生物、ＤＮＡワクチン、およびＲＮＡワクチンからなる群より選択されるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的サブユニット成分をさらに含む、方法。
【国際調査報告】
2006508988.tif 000014
2006508988.tif 000015