(57)【要約】【課題】  カンセプトシン及びフルオロピリミジンの両薬剤の併用において、治療効果を高めるために疾患部位に効率的に両薬剤を送達可能な組成物を提供する。【解決手段】  特定のモル比のカンセプトシン及びフルオロピリミジンと安定的に会合したリポソームを含む組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの水溶性カンプトセシン及び少なくとも一つのフルオロピリミジンと安定に会合したリポソームを含む組成物であって、カンプトセシン／フルオロピリミジンのモル比が、適切な（relevant）細胞又は癌細胞ホモジネートに対して所望の細胞障害性、細胞分裂停止性、又は、生物学的効果を有する組成物。
【請求項２】
前記の適切な細胞又は癌細胞ホモジネートに対する所望の細胞障害性、細胞分裂停止性、又は、生物学的効果が、非拮抗的であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記フルオロピリミジンを安定化させるのに十分なロイコボリンを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記フルオロピリミジンを安定化させるのに十分なロイコボリンを更に含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記水溶性カンプトセシンが、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、トポテカン、９−アミノカンプトセシン、又は、ルルトテカンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記水溶性カンプトセシンが、水不溶性カンプトセシンの水溶性塩であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記水溶性カンプトセシンが、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）又はトポテカンであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記フルオロピリミジンが、フロキスウリジン、フルオロウラシル、又は、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記リポソームがフォスファチジルコリン含有脂質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記フォスファチジルコリン含有脂質がＤＳＰＣ又はＤＡＰＣであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リポソームが、ホスファチジルグリセリン又はホスファチジルイノシトールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ホスファチジルグリセリンが、ＤＳＰＧ又はＤＭＰＧであることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが、ステロールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ステロールが、コレステロールであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記コレステロールが２０モル％より少なく存在することを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームが金属イオン溶液を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記金属イオンが銅であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記金属イオン溶液が、グルコン酸銅又は硫酸銅であることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記水溶性カンプトセシン及びフルオロピリミジンが共封入されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水溶性カンプトセシンがイリノテカン又はトポテカンであり且つ前記フルオロピリミジンがフロキスウリジン又は５−ＦＵであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記リポソームが、ＤＳＰＣを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記リポソームが、ＤＳＰＧを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リポソームが、コレステロールを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リポソームが、グルコン酸銅又は硫酸銅を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リポソームが、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
被検体に投与された場合に、前記カンプトセシン及び前記フルオロピリミジンがリポソームと安定結合せずに同一の比率で投与された場合の治療活性よりも大きな治療活性を実現することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、三番目の薬剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
非拮抗的モル比で安定に会合した少なくとも一つの水溶性カンプトセシン及び一つのフルオロピリミジンとを有するリポソームを含む組成物を調製する方法であって、
ａ） 生物学的活性について、適切な細胞培養アッセイ、無細胞アッセイ、又は、癌細胞ホモジネートにおいて、該比率の薬剤による影響を受けた細胞が１％より多い（ｆａ＞０．０１）濃度範囲のうち少なくとも５％の範囲において非拮抗的である該水溶性カンプトセシンとフルオロピリミジン剤のモル比を判定すること、及び
ｂ） ステップａ）で非拮抗的であると判定されたモル比の水溶性カンプトセシン／フルオロピリミジンを該リポソーム内に封入すること
を含む方法。
【請求項２９】
被検体における疾病状態を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする被検体に治療上有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項３０】
前記被検体にロイコボリンを投与することを更に含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記被検体が、ヒトであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被検体が、非ヒト哺乳動物又は鳥類であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
一番目の送達媒体と安定に会合したフルオロピリミジン及び二番目の送達媒体と安定に会合した水溶性カンプトセシンの投与により、治療上有効量のフルオロピリミジン／水溶性カンプトセシンの薬剤組み合わせを送達する方法であって、投与されるフルオロピリミジン／水溶性カンプトセシンの比率が非拮抗的である方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、アメリカ合衆国特許法１１９条（ｅ）項により、２００３年４月２日に出願された第６０／４６０，１６９に基づく恩恵を主張し、該出願は参照により本書に組み込む。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、治療薬の組み合わせの改良された送達のための、組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、ピリミジン及びカプトセシン剤及びそれらの誘導体の組み合わせを提供する送達システムに関わる。
【背景技術】
【０００３】
癌、エイズ、感染症、免疫疾患、及び、心血管系障害などの生命を脅かす多くの疾病の進行は、複数の分子機構により影響を受けている。この複雑性のゆえ、単一の薬剤による治療の成功には限界がある。よって、しばしば、疾病との戦い特に癌の治療においては、薬剤の併用が用いられてきた。投与された薬剤の数とリンパ球白血病及び転移性結腸直腸癌のような癌の治癒率との間には強い相関が見られる(Frei, et al., Clin. Cancer Res. (1998) 4:2027-2037; Fisher, M. D., Clin Colorectal Cancer (2001) Aug; 1(2):85-86)。詳細には、ピリミジン類似体とカンプトセシン誘導体の併用（組み合わせ）は胃及び結腸直腸癌をよく治療するために使用されてきており、また、食道癌への効果について調べられている。ピリミジン類似体のフルオロウラシル（５‐ＦＵ）をカンプトセシン（イリノテカン）及びロイコボリンと共に用いた臨床試験により、進行性の結腸直腸癌に対する５‐ＦＵ単独治療を上回る延命効果が証明された（Fisher, M. D. (supra)；及び、米国特許第６，４０３，５６９）。Fisherはまた、５‐ＦＵの最初の投与の後に５‐ＦＵ抵抗性になった患者で、５‐ＦＵ、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）及びロイコボリンの併用により生存率の増加が示されており、そのため、薬剤耐性の克服においてこれらの薬剤併用の別の潜在的使用法が証明された。
【０００４】
カンプトセシンは、中国のｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ樹及びアジアのｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ樹の樹皮から発見されたキノリンを基礎とするアルカロイド（植物塩基）である。トポテカン及びイリノテカンのような、準合成又は合成誘導体を含むカンプトセシンの多くの誘導体は、トポイソメラーゼＩを抑制する独特の能力を有しており、そして、高い反応性の細胞殺傷剤が作成される。トポイソメラーゼＩは、ＤＮＡの巻き付きと巻き付きの解消の反応に関わる細胞酵素である。仮にＤＮＡの巻き付きが解消されなければ、ＤＮＡメッセージの転写が起こらず、タンパク質の合成がなされず、その結果、細胞死が起こる。癌細胞のような速い速度で分裂している細胞は、娘細胞が複製されるために絶えずＤＮＡの巻き付きの解消が起きているので、特にカンプトセシン誘導体に感受性がある。開いた状態において、ＤＮＡはカンプトセシン剤の挿入に脆弱であり、その結果、ＤＮＡの損傷と細胞死が見られることになる。
【０００５】
５‐ＦＵ及びシタラビン（シトシン アラビノシド又はａｒａＣ）のようなピリミジン類似体は、ピリミジンヌクレオチドに似た代謝拮抗剤である。ほとんどの代謝拮抗剤は異なる作用様式を有している。例えば、５‐ＦＵは、チミジル酸合成酵素の自殺失活剤（suicide inactivator）として作用するが、酵素活性部位を共有結合的に修飾する。ＤＮＡの新規合成における律速の非可逆的なステップであるチミジル酸合成酵素は、ｄＵＭＰのｄＴＭＰへの変換を触媒する。このステップの一時的な遮断は細胞死をもたらす。対照的に、シタラビンは細胞内酵素によってａｒａＣＭＰへと生理活性化されるが、それはＤＮＡポリメラーゼの代替基質としてＣＴＰと拮抗することが可能となる。ａｒａＣＭＰはＤＮＡ鎖そのものの中に組み込まれることにより、更なるＤＮＡ鎖の伸長合成を阻害する。急速な細胞分裂がこれらの薬剤に強く影響されるため、このような抗増殖性の特性は、大腸、乳房、頭部、首、胃及び膵臓の癌を代謝拮抗剤により効果的に治療できる。
【０００６】
約４０年前に５‐ＦＵが治験に導入されたにもかかわらず、１９９０年代初頭になるまでカンプトセシン誘導体とピリミジン類似体の併用については研究されてこなかった(Furuta, T., and Yokokura, T., Gan To Kagaku Ryoho (1991) Mar; 18(3):393-402)。何年もの間、数多くのピリミジン／カンセプトシンを組み合わせた遊離薬剤カクテルの投与によって有望な改善が証明され続けてきた（ＰＣＴ特許出願 第ＷＯ ００／６６１２５及びＷＯ ０１／６２２３５）。ピリミジン／カンセプトシン剤カクテルの使用は利点があるものの、治療的使用を制限する種々の問題点がある。例えば、遊離薬剤カクテルの投与の結果、しばしば癌部位に到達する前に１又は全ての薬剤の急速なクリアランスが起きてしまう。このため、血流からのクリアランスがもたらされる機序から薬剤を「保護」するように設計された送達媒体内に、多くの薬剤が組み込まれてきた。
【０００７】
リポソームがこの「保護」作用を実現する能力を有し、そのため治療薬の半減期を伸ばせることは、よく知られている。よく設計された送達媒体中への封入（encapsulation）はまた、封入された薬物の調整された薬物動態をもたらす。送達媒体中の特定の薬剤又は１以上の薬剤の製剤は、しばしば、媒体の脂質成分が個々の薬剤の薬物動態に異なる影響を及ぼすため困難であることが証明されている。というのは、一つの薬剤の保持及び放出に好適な組成物が、２番目の薬剤の保持及び放出に好適ではないかもしれないからである。治験において幸運にも利用できる活性のあるピリミジン／カンセプトシン剤の組み合わせが多く存在するにもかかわらず、双方の薬剤の薬物動態を制御しそれにより癌への送達を制御するように設計された医薬製剤については記述が無い。例えば、Ｗ．Ａｃｈｔｅｒｒａｔｈによる２００２年６月１１日に発行された米国特許は、相乗的な量のカンプトセシン誘導体、５−ＦＵ、及びロイコボリン（ビタミンの葉酸関連化合物であり、５−ＦＵ治療の間の標準的な治療である）の投与（少なくとも２００ｍｇ／ｍ２のロイコボリンが存在するよう）によって癌を治療する方法を主張しているが、しかし、これらの薬剤の送達を確実化し、及び／又は、循環半減期を増大するように設計された医薬製剤についての示唆は無い。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の研究者らは、ピリミジンとカンプトセシン誘導体との組み合わせに適応し、その結果、各薬剤の装填及び徐放性放出に優れた特異的な送達媒体製剤を同定した。彼らは更に、リポソームに封入された場合、相乗的な比率のこれらの薬剤が、血液区画中の滞留時間を維持し、その結果、遊離薬剤カクテルと比較すると高い効力があることを証明した。
【０００９】
本発明は、効果的な量のフルオロピリミジン／カンセプトシン剤の組み合わせを、リポソーム媒体（該リポソーム媒体は、少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンと安定的に会合している）を用いて投与するための組成物及び方法に関する。これらの組成物は２以上の薬剤を調整された様式において患部に送達することを可能とし、それにより、該薬剤を所望の比率で患部に存在させることを確実にする。前記薬剤を脂質ベース送達媒体中に共封入するか、又は、別々に脂質ベース送達媒体（患部まで所望の比率が維持されるように送達される）中に封入することにより、この結果が達成される。組成物の薬物動態（ＰＫ）は、調整された送達が達成されるように（送達システムのＰＫは比較できるように提供される）脂質ベース送達媒体によって制御される。
【００１０】
そのため、一つの側面において、本発明は、治療的に有効な比率で、リポソームと会合している少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンとを含む、非経口的な投与のためのリポソーム組成物を提供することであり、該組成物は所望の好ましくは非拮抗的作用を及ぼすことが出来る。治療的に有効な薬剤の比率の決定は、適切な細胞培養系若しくは無細胞系及び個々の患者の生検からの癌細胞ホモジネートにおいて、薬剤の生物学的活性又は効果を、一定の濃度範囲において評価することによって行う。好ましい組み合わせは、イリノテカンとフルオロウラシル（５−ＦＵ）、又は、イリノテカンとフルオロデオキシウリジン（ＦＵＤＲ）である。薬剤の比率を決定する任意の方法（但し、該薬剤は所望の治療的効果を維持する）が、使用し得る。
【００１１】
前記組成物は、少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンとを、適切な細胞培養系若しくは無細胞系及び個々の患者の生検からの癌細胞ホモジネートにおいて所望の好ましくは非拮抗的な生物学的効果が発揮されるようなフルオロピリミジンと水溶性カンプトセシンのモル比において、含む。「適切な」細胞において、出願人は、所望の生物学的効果を調べるのに適当な少なくとも一つの細胞又は細胞株に言及する。これらの薬剤が抗悪性腫瘍薬として使用されることから、「適切な」細胞とは、抗がん剤発見プログラムとして有用な国立癌研究所（ＮＣＩ）／国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＴＰ）によって同定されるような細胞株である。現在、ＤＴＰスクリーンは６０の異なるヒト癌細胞株を利用している。そのような細胞株の少なくとも一つにおける所望の活性が、証明されることが必要である。「癌細胞ホモジネート」において、出願人は、患者生検又は癌から機械的又は化学的分散によってホールセル試料を生成した細胞に言及する。癌全体又は癌生検は、医師による標準的な医学技術により評価可能であり、組織から単一のホールセルへの均質化は、当業者既知の多くの方法により実験室で行い得る。
【００１２】
もう一つの側面において、本発明は、本発明の組成物を投与することにより、所望の標的に治療的に効果的な量のフルオロピリミジン／水溶性カンプトセシンの組み合わせを送達する方法を指向する。
【００１３】
本発明はまた、一つ目の送達媒体と安定に会合したフルオロピリミジンと二つ目の送達媒体と安定に会合した水溶性カンプトセシンを投与することにより、所望の標的に治療的に効果的な量のフルオロピリミジン／水溶性カンプトセシン薬剤の組み合わせを送達する方法をも指向する。一つ目と二つ目の送達媒体は別々の容器に入れられていてもよく、該容器の中身は患者に同時に又は連続的に投与される。一つの実施態様において、投与されるフルオロピリミジンと水溶性カンプトセシンとの比率は非拮抗的である。
【００１４】
本発明のもう一つの側面において、生体内でのフルオロピリミジンの安定のために、ロイコボリン（葉酸関連化合物）を本発明の組成物と共に投与する。
【００１５】
もう一つの側面において、本発明は、少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンとを所望の治療効果を提供する比率で含有するリポソームを含む治療用組成物を調製する方法を指向し、ここで、該方法は、少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンとのパネル（該パネルは少なくとも一つの好ましくは多様な比率の該薬剤を含む）の提供、一定の濃度範囲において適切な細胞培養系若しくは無細胞系及び癌細胞ホモジネートにおけるパネルのメンバーの薬剤の生物学的効果を発揮する能力の試験、該細胞培養系若しくは無細胞系にて適切な濃度範囲において所望の治療的効果を提供する比率のパネルのメンバーを選択、及び、成功したパネルのメンバーによって表される比率の薬剤の脂質ベース送達媒体への安定な会合、を含む。好ましい実施形態においては、上述の所望の治療的効果は、非拮抗的である。
【００１６】
更に以下に記述するように、好ましい実施形態においては、上述の方法に従った適切な組み合わせの設計において、前記非拮抗的な比率は、組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）が１．１以下のものとして選択される。さらなる実施形態において、適当なリポソーム製剤は効果的な量のフルオロピリミジン／水溶性カンプトセシンの組み合わせを安定的に組み込み、及び、両薬剤が生体内で徐放性に放出されるように設計される。好ましい製剤は、少なくとも一つのホスファチジルグリセロールのような負に荷電した脂質を含み、少なくとも一つのコレステロールのようなステロールを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
略語
ＤＳＰＣ:ジステアロイルホスファチジルコリン； ＰＧ:ホスファチジルグリセリン； ＤＳＰＧ：ジステアロイルホスファチジルグリセリン; ＰＩ：ホスファチジルイノシトール； Ｃｈｏｌ：コレステロール； ＣＨ又はＣＨＥ：コレステリル ヘキサデシル エーテル； ＤＡＰＣ：ジアラキドノイルホスファチジルコリン； ＳＵＶ：小単層小胞； ＬＵＶ：大単層小胞； ＭＬＶ：多層膜小胞； ＭＴＴ:３‐（４,５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２,５‐ジフェニル‐２Ｈテトラゾリウム ブロミド； ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸； ＨＥＰＥＳ：Ｎ‐［２‐ヒドロキシルエチル］‐ピペラジン‐Ｎ‐［２‐エタンスルホン酸］； ＨＢＳ：ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）； ＳＨＥ：３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ EDTA； ＴＥＡ：トリエタノールアミン； ＣＩ：組み合わせ指数； ｆａ：影響を受けた割合（fraction affected）。
【００１８】
本発明は、少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンと安定に会合したリポソームを含む組成物（但し、適切な細胞又は癌細胞ホモジネートに対し所望の細胞毒性、細胞分裂停止又は生物学的効果を現すフルオロピリミジン／カンセプトシンのモル比においてフルオロピリミジンと水溶性カンプトセシンが存在する）を提供する。
【００１９】
好ましくは、本書で提供されるリポソーム組成物は、適切な細胞又は癌細胞ホモジネートに対し比拮抗的作用を現すフルオロピリミジン／カンセプトシンのモル比において、少なくとも一つのフルオロピリミジンと少なくとも一つの水溶性カンプトセシンと安定に会合したリポソームを含む。
【００２０】
好ましくは、本書発明のリポソーム組成物は、５‐ＦＵ又はＦＵＤＲのどちらかとイリノテカンと安定に会合したリポソームを含む。より好ましくは５‐ＦＵ又はＦＵＤＲとイリノテカンは、本発明の組成物中に、１００：１と１：１００の間の５‐ＦＵ（又はＦＵＤＲ）：イリノテカン モル比で存在し、より好ましくは５‐ＦＵ又はＦＵＤＲとイリノテカンは１０：１と１：１の間のモル比で存在する。
【００２１】
本発明の更なる実施形態においては、上述の脂質ベ−ス送達媒体は３つ目又は４つ目の薬剤を含む。任意の治療用、診断用、又は、美容用薬剤が含まれてよい。
【００２２】
本発明のもう一つの側面においては、ステロールを含むリポソームが提供される。好ましくは、ステロールはコレステロールである。
【００２３】
本発明の脂質ベ−ス送達媒体は、非経口的投与だけでなく、局所的、鼻、皮下、腹腔内、筋肉内、エアロゾル若しくは経口 送達、又は、送達媒体への適用によって、又は、治療若しくは医用画像化のために標的部位に若しくはその近くに天然若しくは合成の埋め込み可能な装置の中などで使用してもよい。好ましくは、本発明の脂質ベース送達媒体は、非経口投与で、より好ましくは静脈内投与により使用される。もう一つの実施形態においては、生体内でのフルオロピリミジンの安定性を高めるために、ロイコボリンを本発明の組成物と共に投与する。
【００２４】
本書に記載した好ましい実施態様は、厳格な開示された形式で、本発明の範囲を網羅又は限定することを意図していない。これらは、当業者が理解可能なように本発明の原理及びその応用及び実際的使用を最もよく説明するために選択され記載されている。
【００２５】
水溶性カンプトセシン
カンプトセシンは高活性の部類の抗癌剤である。これらの薬剤のほとんどは、中国のｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ樹及びアジアのｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ樹の樹皮から発見された天然の「カンプトセシン」の準合成又は合成誘導体である。カンプトセシンは、トポイソメラーゼＩ（ＤＮＡの合成、複製に関わる細胞内で見出された酵素）の作用を抑制することによって、作用することが報告されている。正常細胞と比較して多くの型の癌細胞において、前記酵素が有意に高い量で、また非常にゆっくりと分解されることが見出されている。カンプトセシンの臨床使用は、その作用機序が完全に分かっていないことや水溶性に乏しいことから限定されてきた。ほぼ全ての天然カンプトセシンは水溶性に乏しく、この特性のため臨床使用を困難にさせており、多くの場合、製剤化及び投与が不可能である。結果として、市販されている又は開発中のカンプトセシンの多くは、水溶性に作られている。生理的ｐＨに荷電したカンプトセシン誘導体を含む水溶性カンプトセシンが一般に当業者に既知である。例えば、カンプトセシンＡ環の９、１０又は１１位で、親水性ヒドロキシル基又は窒素基の付加により、効果的に水溶性を高めることができる。同様に、正に荷電したジメチルアミノメチル基の９位への付加により水溶性が高まることが証明されている。
【００２６】
カンプトセシンの水溶性誘導体はヒト癌に対し、幅広い領域で活性を示している。このため、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ヒトの臨床使用に対して、水溶性カンプトセシン製剤のイリノテカン、トポテカン、及び、ルルトテカンを承認してきた。イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）で証明された抗癌活性は、その代謝産物であるＳＮ‐３８を介していると考えられている。
【００２７】
本発明の「水溶性カンプトセシン」は、十分に水に溶解するカンプトセシン誘導体又はそれらの製剤を言う。水溶性カンプトセシンは、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、ＳＮ‐３８、トポテカン、９−アミノカンプトセシン、及び、ルルトテカン、及び、これらのプロドラッグ, 前駆物質、代謝産物、並びに、カンプトセシンの親化合物のナトリウム塩のような水に不溶性のカンプトセシンの親水性塩誘導体を含むが、これらに限定するものではない。本発明における使用のための水溶性カンプトセシンは、好ましくは、イリノテカン、トポテカン、９−アミノカンプトセシン、又は、ルルトテカンである。最も好ましい水溶性カンプトセシンは、イリノテカンである。
【００２８】
フルオロピリミジン
ウラシル、シトシン又はチミンのフルオロピリミジン類似体、及びそれに相当するヌクレオシドは、抗癌剤として良く知られている。そのような多くのピリミジン類似体または誘導体は、必須の代謝産物に非常に似た代謝拮抗剤として作用し、そのためそれに関連した生理的反応を干渉する。ピリミジン類似体の共通の作用機序は、チミジル酸合成酵素の阻害である。この阻害は、ｄＵＭＰ（デオキシウリジン一リン酸）のメチル化と続くジヒドロ葉酸及びチミジル酸（ＤＮＡ合成における必須の前駆物質）の産生を妨げる。この干渉の結果、ＤＮＡ生合成が阻害される。デオキシヌクレオチド合成におけるチミジル酸合成酵素の前記役割は、チミジル酸合成酵素を癌の化学療法における重要な標的酵素とする（結腸直腸癌及びその他の新生物にほとんど特異的である）。フルオロウラシル（５―ＦＵ）及びフルオロデオキシウリジン（フロキスウリジン又はＦＵＤＲ）（ヒトで有意な抗癌活性が示されている）のようなフッ化ピリミジン類似体又は「フルオロピリミジン」を、特に対象としている。
【００２９】
「フルオロピリミジン」は、その名前が暗示するように、フッ素原子により誘導体化されたピリミジン類似体を言う。本発明のフルオロピリミジンは、５―ＦＵ又はＦＵＤＲに等価であるものと当業者には認識されているが、ＵＦＴ（ウラシル‐テガフール）、カペシタビン（Capecitabine）、フトラフール（ＦＴ―２０７）、及び、ＦｄＵＭＰ（５ フルオロ―デオキシウリジン 一リン酸）及びＦＵＴＰ（フルオロ-ウリジン三リン酸）などの５―ＦＵ又はＦＵＤＲのプロドラック、前駆体、代謝産物を含むが、これらに制限されるものではない。
【００３０】
ウラシルとテガフール（ＵＦＴ）の組み合わせは、２０年間に渡り癌治療の臨床試験で使用されてきた。テガフールが生体内で５−ＦＵへと代謝される一方、ウラシルがテガフールと相互作用して５−ＦＵの分解を阻害する。幾つかの場合にＵＦＴの経口投与は、活性の増加と毒性の減弱としばしば関連しているため、５−ＦＵ治療に代替し得る魅力的なものであった。
【００３１】
カペシタビンは、チミジンホスホリラーゼにより、その細胞毒性部分であるフルオロウラシルに癌選択的に活性化されるプロドラックである。フルオロウラシルは、更に、２つの活性代謝産物、すなわち、5-フルオロ-2-デオキシウリジン一リン酸（ＦｄＵＭＰ）及び5-フルオロウリジン三リン酸（ＦＵＴＰ）に正常及び癌細胞中で代謝される。ＦｄＵＭＰが正常チミジン産生の減弱によりＤＮＡ合成を阻害するのに対し、ＦＵＴＰはウリジン３リン酸と競合することにより、ＲＮＡ及びタンパク質の合成を阻害する。
【００３２】
好ましくは、本発明で使用されるためのフルオロピリミジンは、５‐ＦＵ、ＦＵＤＲ、又は、テガフール／ウラシルである。より好ましくは、フルオロピリミジンはＦＵＤＲ又は５‐ＦＵである。より好ましくは、フルオロピリミジンはＦＵＤＲである。ロイコボリンを本発明の組成物と組み合わせて投与してもよい。ロイコボリンは抗新生物活性を有していないが、５−ＦＵで患者を治療する場合に５−ＦＵの寿命の有意な増加をもたらすので、ＦＤＡの標準治療方法となっている。５‐ＦＵ（及びＦＵＤＲ）の標的酵素チミジル酸合成酵素への結合を安定化することにより、ロイコボリンは作用し、そのため、血液からのそのクリアランスを導く機序から保護する。フルオロピリミジンのクリアランスが減少することにより、より高い細胞障害効果を現すことが可能となる。
【００３３】
本発明のリポソーム内へのカンプトセシン及びピリミジンの組み合わせの効果は、少なくともトポイソメラーゼＩとチミジル酸合成酵素の両者を阻害する作用であり、そのため、癌のような過増殖性疾患の治療に対し重要な意味を持つＤＮＡ合成の阻害増加をもたらす。
【００３４】
インビトロにおける非拮抗的なカンプトセシン／フルオロピリミジン比率の決定
本発明の更なる局面において、カンプトセシン及びフルオロピリミジンは、相乗的又は相加的な比率（すなわち非拮抗的な比率）においてリポソーム中に封入されるであろう。相乗的又は相加的効果を示す治療剤の割合の決定は、後述する実験データのタイプに基づき、種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。これらの方法としては、例えば、アイソボログラム法（Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3:285-290；Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5:27-55）、フラクショナルプロダクト（fractional product）法（Webb, Enzyme and Metabolic Inhibitors (1963) Vol.1, pp.1-5. New York: Academic Press）、モンテカルロシミュレーション法、CombiTool、ComboStat、並びに、Chou, J Theor. Biol. (1976) 39:253-76及びChou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247に記載された１つの方程式に基づくChou-Talalay median-effect法がある。それ以外の方法としては、例えば、生存率（surviving fraction）（Zoli, et al., Int. J. Cancer (1999) 80:413-416）、対照と比較された顆粒球／マクロファージコロニー形成単位に対するパーセント応答（Pannacciulli, et al., Anticancer Res. (1999) 19:409-412）、及び、その他（Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41:93-141；Greco, et al., Pharmacol Rev. (1995) 47:331-385）がある。
【００３５】
中でも好ましいのは、Chou-Talalay median-effect法である。この分析法は、１つの方程式を使用する。この方程式では、特定の効果を引き起こす用量ｆａは以下のように表される：
Ｄ＝Ｄｍ［ｆａ／（１−ｆａ）］１／ｍ
ここで、Ｄは使用される薬剤の用量、ｆａは当該用量によって影響を受ける細胞の割合、Ｄｍは有効性を示す中央値効果（median effect）のための用量、ｍは用量‐効果曲線の形状を示す係数（一次反応に対してはｍは１）である。
【００３６】
この方程式を更に操作して、 Chou and Talalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22:27-55及びChou, et al., in: Synergism and Antagonism in Chemotherapy, Chou and Rideout, eds., Academic Press: New York 1991:223-244に記載されたような多薬剤効果（multiple drug-effect）方程式に基づいて組み合わせ指数（ＣＩ）を計算することができる。この計算のためのコンピュータプログラム（CalcuSyn）は、Chou and Chou（"Dose-effect analysis with microcomputers: quantitation of ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics": CalcuSyn Manual and Software; Cambridge: Biosoft 1987）において見出される。
【００３７】
組み合わせ指数方程式は、酵素動態学モデルに由来するChou-Talalayの多薬剤効果方程式に基づいている。（１つの）方程式は、相乗性及び拮抗性より、正確には、相加性のみを決定する。しかしながら、CalcuSynプログラムによれば、相乗性は、期待される相加的効果より大きいものとして定義され、拮抗性は期待される相加的効果よりも小さいものとして定義される。ChouとTalalayは、１９８３年に、ＣＩ＝１の指定を相加的効果とすることを提唱した。従って、２つの薬剤の多薬剤効果方程式から次式が得られる：
同一又は類似の作用機序を有する相互排他的な薬剤に対しては、
ＣＩ＝（Ｄ）１/（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２/（Ｄｘ）２      ［式１］
更に、完全に相互に独立した作用機序を有する相互非排他的薬剤に対しては次式が提案される：
ＣＩ＝（Ｄ）１/（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２/（Ｄｘ）２＋（（Ｄ）１）（Ｄ）２）/（Ｄｘ）１（Ｄｘ）２    ［式２］
ＣＩ＜１、＝１及び＞１は、それぞれ相乗作用、相加作用および拮抗作用を示す。式１又は式２は、併用した薬剤１、（Ｄ）１、及び、薬剤２、（Ｄ）２（分数の分子にあるもの）が、実際の実験において、ｘ％を阻害することを指示している。このため、実験的に観察される阻害率ｘ％は、概数ではなくて小数部を有する可能性が高い。式１及び２の（分母の）（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は、それぞれ薬剤１及び薬剤２が、単独でｘ％を阻害するための用量である。
【００３８】
単純化のため、通常、２より多い薬剤が併用に関わる場合、相互に排他性であると想定される（CalcuSyn Manual and Software ; Cambridge: Biosoft 1987）。
【００３９】
二薬剤の組み合わせを、更に、３番目の薬剤との相乗作用又は相加作用を判定するために、一つの医薬単位として使用してもよい。さらに、三薬剤の組み合わせを、一つの単位として、４番目の薬剤などとの非拮抗的相互作用を判定するために使用してもよい。
【００４０】
基礎をなす実験データは、一般的には、培養系の細胞又は無細胞系を用いてインビトロで決定する。組み合わせ指数（ＣＩ）は、図５−Ａから５−Ｃに示されているように、上に説明した通りに濃度範囲の代用パラメーターである影響を受けた細胞の割合（ｆａ）の関数としてプロットすることが好ましい。好ましい薬剤の組み合わせは、ｆａ値の相当範囲にわたって相乗作用または相加作用を示すものである。細胞の１％超が影響を受ける濃度範囲（すなわちｆａが０．０１を上回る範囲）の少なくとも５％にわたって相乗作用を示す薬剤の組み合わせを選択する。全濃度のうちより多くの割合、例えば、ｆａが０．２〜０．８である範囲の５％が、好都合なＣＩを示すことが好ましい。より好ましくは、この範囲の１０％が好都合なＣＩを示す。さらにより好ましくは、ｆａが０．２〜０．８である範囲の、２０％のｆａ範囲が、好ましくは５０％超が、最も好ましくは少なくとも７０％超が、組成物において用いられる。ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用を示す組み合わせについて、非拮抗的相互作用の強度を高め相乗作用が観察されるｆａの範囲を拡大させる最適な比を定めるために、種々の薬剤比において再評価してもよい。
【００４１】
細胞が影響を受ける濃度範囲全体にわたって相乗性を有することが望ましいであろうが、多くの事例では、０．２〜０．８のｆａ範囲において結果の信頼性が極めて大きいことが観察されている。従って、本発明の組み合わせによって示される相乗性は０．０１又はそれ以上の広い範囲内で存在することは説明しておくが、相乗性は０．２〜０．８のｆａ範囲で確立されることが好ましい。しかしながら、他のより高感度なアッセイ例えば生物発光又はクローン原性アッセイを、０．８より大きなｆａ値において相乗性を評価するのに使用可能である。
【００４２】
最適の組み合わせ比率は、更に、３番目の薬剤との相乗的又は相加的相互作用を決定するために単一の医薬単位として用いてもよい。さらに、三薬剤の組み合わせを４番目の薬剤などとの非拮抗的相互作用を決定するために一つの単位として使用してもよい。
【００４３】
上で説明したように、細胞培養系におけるインビトロ研究は、「適切な（ないし関連した）（ｒｅｌｅｖａｎｔ）」細胞で行う。細胞の選択は、薬剤の意図される医薬的使用法に依存する。最適の一つの適切な細胞株又は細胞培養型が、組成の基礎が本発明の範囲に入るために要求される非拮抗的効果を示す必要がある。
【００４４】
例えば、本発明の好ましい実施形態の一つにおいては、前記薬剤の組み合わせは、抗癌療法を意図したものである。そして、適切な選択は、試験される細胞と試験の性質から成る。とりわけ癌細胞株は、好適な対象であり、細胞死又は細胞分裂停止の測定は適切なエンドポイントである。以下に更に議論するように、好適な組み合わせを発見するための試みにおいては、細胞障害性又は細胞分裂停止とは違う徴候、標的細胞、及び、判定基準について、用いることが出来る。
【００４５】
抗癌剤に関する判定のために、細胞株は、標準的な細胞株貯蔵所（例えばＮＣＩ又はＡＴＣＣ）から、学術的機関又は商業的供給源を含むその他の組織から、得てもよい。好ましい細胞株は、ＮＣＩ／ＮＩＨのDevelopmental Therapeuticsプログラムによって同定された細胞株から選択される１又はそれ以上を含む。このプログラムによって使用される癌細胞株スクリーンは、現在、白血病、黒色腫、並びに、肺、大腸、脳、卵巣、乳房、前立腺及び腎臓の癌を代表する６０の異なる癌細胞株を同定している。所望の濃度範囲における要求される非拮抗的効果は最適の一つの細胞型で示される必要があるが、好ましくはこの効果を少なくとも二つの細胞株で、より好ましくは三つの細胞株で、より好ましくは五つの細胞株で、及び、より好ましくは十の細胞株で示されることである。前記細胞株は、確立された癌細胞株又は患者試料から得られた初代培養でよい。前記細胞株は任意の種からのものでよいが、好ましい供給源は哺乳類とりわけヒトである。前記細胞株は、種々の実験条件下での選別により、及び／又は、外来性遺伝物質の付加又は欠失により、遺伝的に改変されてもよい。細胞株は、任意の遺伝子移入技法―ウイルス又はプラスミドに基づく形質移入法を含むがこれに限定されない―により形質移入されてもよい。この修飾は、特異的タンパク質若しくはペプチドの発現をコード化するｃＤＮＡ、プロモーター若しくはエンハンサー配列のような調節エレメント、又は、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡの移入を含んでもよい。遺伝的に操作された組織培養細胞株は、癌抑制遺伝子すなわちｐ５３、ｐＴＥＮ及びｐ１６を有する又は有しない細胞株、並びに、ドミナントネガティブ法、遺伝子挿入法、及び、他の選別法を用いて創製した細胞株を含んでよい。細胞の生存率を定量するために、好ましい組織細胞株を―例えば、抗癌剤の試験のためにＨ４６０、ＭＣＦ‐７、ＳＦ‐２６８、ＨＴ２９、ＨＣＴ‐１１６、ＬＳ１８０、Ｂ１６‐Ｆ１０、Ａ５４９、Ｃａｐａｎ膵臓、ＣＡＯＶ‐３、ＩＧＲＯＶ１、ＰＣ‐３、ＭＸ‐１及びＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１が含まれるがこれに制限されない―を使用してもよい。
【００４６】
一つの好ましい実施形態において、所定の影響（ｆａ）とは、細胞培養物に対する細胞障害性物質の適用後の細胞死又は細胞分裂停止のことを言う。細胞の死又は生存率は、例えば以下の方法を用いて測定してもよい（細胞障害性アッセイとその引用文献）：
ＭＴＴアッセイ法（Mosmann, J. Immunol. Methods (1983) 65(1-2): 55-63）；トリパンブルー色素排除（Bhuyan, et al., Experimental Cell Research (1976) 97: 275-280）；放射性トリチウム（３Ｈ）‐チミジン取り込み又はＤＮＡインターカレートアッセイ法（Senik, et al., Int. J. Cancer incorporation or DNA intercalating assay (1975) 16(6): 946-959）；放射性クロム-５１遊離アッセイ法（Radioactive chromium-51 release assay Brunner, et al., Immunology (1968) 14: 181-196）；グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、及び、乳酸脱水素酵素漏出（Mitchell, et al., J. of Tissue Culture Methods  (1980) 6(3&4): 113-116）；ニュートラルレッド取り込み（Borenfreund and Puerner, Toxicol. Lett. (1985) 39: 119-124）；アルカリフォスファターゼ活性（Kyle, et al., J. Toxicol. Environ. Health (1983) 12: 99-117）；ヨウ化プロピジウム染色（Nieminen, et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. (1992) 115: 147-155）；ビス‐カルボキシエチル‐カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）保持（Kolber, et al., J. Immunol. Methods retention (1988) 108: 255-264）；ミトコンドリア膜電位（potential Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 990-994）；クローン原性試験（Puck, et al., J. of Experimental Medicine (1956) 103: 273-283）；生存／死 生存率／細胞障害性アッセイ（Morris, Biotechniques (1990) 8: 296-308）；及び、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ法（Rubinstein, et al., J. Natl. Cancer Instit. (1990) 82: 1113-1118）。
【００４７】
ＭＴＴアッセイが好ましい。
【００４８】
癌以外の適応疾患についても２種類またはそれ以上の薬剤の非拮抗的な比率を決定することができ、この情報を、これら疾患の治療のために２種類またはそれ以上の薬剤の治療的製剤を調製する目的で用いることができる。インビトロアッセイ法に関しては、薬物の相乗作用を明確化するために計測可能なさまざまなエンドポイントを、そのエンドポイントがその特定の疾患に対して治療的に関連しているという条件付きで選択することができる。
【００４９】
上記の通り、細胞培養物に対するインビトロ試験は、「適切な」細胞を用いて行われると考えられる。細胞の選択は、薬剤の意図した治療用途に依存すると考えられる。患者個体の生検又は全癌におけるインビトロ研究は、癌試料の機械的又は化学的分散により単一の細胞全体（whole cells）を生成させた「癌細胞ホモジネート」で、行う。
【００５０】
好ましい一実施形態では、所与の効果（ｆａ）とは、「適切な」細胞培養又は「癌細胞ホモジネート」に細胞傷害剤を投与した後の細胞死又は細胞分裂停止を言う（実施例４を参照）。細胞死又は細胞生存度は、技術分野で既知の多くの方法により測定してよい。実施例４で詳述する「ＭＴＴ」アッセイ（Mosmann, J. Immunol. Methods (1983) 65(1-2):55-63）が好ましい。
【００５１】
脂質ベース送達媒体（Lipid-Based Delivery Vehicles）の調製
本発明で使用するための好ましい脂質キャリアーはリポソームである。リポソームは、Liposomes: Rational Design (A. S. Janoff編集、Marcel Dekker, Inc、New York、N.Y.)に記載されたように、又は、当業者既知の別の技術によって、調製し得る。本発明で使用する好適なリポソームには、大単層小胞（ＬＵＶｓ）、多層膜小胞（ＭＬＶｓ）、小単層小胞（ＳＵＶｓ）、及び、嵌合した融合リポソームを含む。
【００５２】
本発明で使用するリポソームは、「低コレステロール」から調製されてもよい。そのようなリポソームは、「コレステロールが除かれた」、又は、「実質的に非コレステロール」若しくは「本質的に非コレステロール」を含む。リポソームとの関係で本書にて使用する用語「コレステロールが除かれた」とは、リポソームがコレステロール不存在で調製されることを意味する。用語「実質的に非コレステロール」は、リポソームの相転移特性を有意に変えるのに十分な量のコレステロール（典型的には２０ｍｏｌ％より少ないコレステロール）の存在を許容する。２０ｍｏｌ％より少ないコレステロールの含有は、リポソームが２０ｍｏｌ％より多いコレステロールで調製された場合に最適に保持されない薬剤の保持を可能とする。好ましくは、本発明のリポソームは幾らかのコレステロールを含む。更に、２０ｍｏｌ％より少ないコレステロールで調製されたリポソームは、狭い相転移温度すなわち温度処理により封入された薬剤を放出するリポソーム（温度感受性リポソーム）の調製に利用してもよい特性を示す。本発明のリポソームは治療用脂質を含んでいても良く、例えば、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホン酸塩、セラミド及びセラミド類似体、スフィンゴシン及びスフィンゴシン類似体、並びに、セリン含有‐脂質を含む。
【００５３】
リポソームは、循環寿命を長くするために、ポリエチレングリセロール−ＤＳＰＥのような表面安定化親水性重合体−脂質コンジュゲートを用いて調製してもよい。担体の循環寿命を長くするために、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のような負荷電脂質の組み込みを、リポソーム製剤に加えてもよい。これらの脂質を、表面安定化剤としての親水性重合体−脂質コンジュゲートを置換するために採用してもよい。本発明の好ましい実施形態では、凝集阻止によって担体の血中残留時間が増大するように、ＰＧ又はＰＩを含有する低コレステロールリポソームを使用してもよい。
【００５４】
一つの実施形態において、本発明によるリポソーム組成物は、好ましくは、５‐ＦＵ耐性結腸直腸癌のような多薬剤耐性癌を含む癌を治療するのに用いられる。封入された薬剤の癌部位への送達は、本発明のリポソームの投与によって達成される。好ましくはリポソームは３００ｎｍより小さい直径を有する。より好ましくは、リポソームは２００ｎｍより小さい直径を有する。癌の脈管構造は一般的には、内皮の開窓又は間隙のため、正常の脈管構造よりも漏出性である。このことは、直径が２００ｎｍ又はそれ以下の送達媒体が、癌に血液を供給する血管の周囲の不連続な内皮細胞層及び基底膜を貫通するのを許容する。血管外遊走に続く送達媒体の癌部位への選択的な累積は、抗癌剤の送達及び治療有効性の増加をもたらす。
【００５５】
種々の方法を、リポソーム内に活性薬剤を封入するために利用してよい。「封入」には、脂質ベース送達媒体と薬剤との共有結合性の又は非共有結合性の会合を含む。例えば、これは、リポソームの外層若しくは層と薬剤との相互作用、又は、リポソーム内への薬剤の捕捉ないし封入、リポソームの異なる部分間で達成される平衡により、可能となる。そのような薬剤の封入は、脂質成分との共有結合性の若しくは非共有結合性の相互作用を介したリポソームの二重層との相互作用による薬剤の会合、又は、リポソームの内部水内若しくは内部水相と二重層との間の平衡内への捕捉により可能となる。「装填」とは、送達媒体内への１又はそれ以上の薬剤の封入の作用を言う。
【００５６】
所望の組み合わせの封入は、別々の送達媒体に封入することによっても、同一の送達媒体に封入することによっても達成することができる。別々のリポソームへの封入が望まれる場合は、個々のリポソームの脂質組成（物）は、調整された薬物動態が可能となるように全く異なったものであってもよい。送達媒体組成（物）を変化させることにより、封入された（複数）薬剤の放出速度が、所望の比率の薬剤が腫瘍部位に送達されるようにマッチングさせることが可能である。放出速度の変更方法としては、薬剤貯留を改善するための小胞形成脂質のアシル鎖の長さを増大すること、リポソーム膜からのＰＥＧのような表面グラフト親水性重合体の置換を制御すること、及び、ステロール又はスフィンゴミエリンのような膜強化剤を膜内に導入することを含む。第１の薬剤と第２の薬剤が特異的薬剤比率で投与されることが望まれ且つ第１の薬剤のリポソーム組成物（例えばＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）の内部における第２の薬剤の保持が乏しい場合には、アシル鎖の長さが伸長された脂質を有するリポソーム組成物（例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ）内に第２の薬剤を封入することによって、改善された薬剤動態が達成され得ることは、当業者には明白であろう。別個のリポソームに封入する場合には、最適な治療活性を実現するように患者特異性に基づいて決定された水溶性カンプトセシン／フルオロピリミジン比率が、投与に先立ってリポソームに封入される適当量の各薬剤を組み合わせることによって各患者のために生成されていることが、容易に認められるべきである。或いは、２又はそれ以上の薬剤を同じ送達媒体の内部に封入してもよい。
【００５７】
封入技法は、送達媒体の性質に依存する。例えば、治療剤は、能動的装填法及び受動的装填法の両者を用いてリポソーム内に装填してよい。リポソーム中へ活性剤を封入する受動的技法は、リポソームの調製中の薬剤封入に関するものである。これには、Bangham, et al., J. Mol. Biol. (1965) 12:238によって記載された受動的封入法を含む。この方法では、多層膜小胞（ＭＬＶ）が生成し、該ＭＬＶは、押し出し（extrusion）法を用いることにより、大単層小胞（ＬＵＶ）又は小単層小胞（ＳＵＶ）に変換することができる。その他の好適な受動的封入方法には、Deamer and Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976)443:629によって記載されたエーテル注入技法、及び、Szoka and Papahadjopoulos, P.N.A.S. (1978) 75:4194によって記載された逆相蒸発（ＲＥＶ）法が含まれる。
【００５８】
能動的封入法には、米国特許第５，６１６，３４１、５，７３６，１５５、及び、５，７８５，９８７に記載されたｐＨ勾配装填技術並びに能動的金属装填を含む。好ましいｐＨ勾配装填法は、内部緩衝液としてのクエン酸塩及び中性外部緩衝液を用いる、クエン酸塩ベース装填法である。リポソームの内外にｐＨ勾配を確立し維持するのに用いられる他の方法には、リポソーム膜に挿入され得るイオノフォア及びプロトンの交換において膜を横断する輸送イオンを用いることが含まれる（米国特許第５，８３７，２８２）。イオノフォア不存在下で複合体生成（錯体化）を介する遷移金属によるリポソーム内への薬剤取り込みの駆動も、使用してもよい。この技法は、薬剤取り込みを駆動するｐＨ勾配の確立より、むしろ薬剤−金属複合体の形成に依存する。
【００５９】
金属ベース装填法は、典型的には、受動的に金属イオンが封入されたリポソーム（該リポソームは受動的に装填された治療剤を伴うか又は伴わない）を使用する。種々の金属イオン塩が使用されるが、該塩は医薬的に許容され得て且つ水溶性溶液に可溶性であることが想定される。能動的に装填される薬剤は、金属イオンとの錯体を形成し得るが、そして、それゆえ、そのように錯体を形成した場合はリポソーム内部で保持されるが、しかし錯体を形成しなかった場合もリポソーム内に装填され得るという性質に基づいて選択される。金属イオンと配位し得る薬剤は、典型的には、アミン、カルボニル基、エーテル、ケトン、アシル基、アセチレン、オレフィン、チオール、ヒドロキシル基若しくはハロゲン化物基、又は、金属イオンに電子を供与し得てそれにより金属イオンとの錯体形成をするのに好適なその他の基などの配位部位を含む。金属と結合する能動的薬剤の例は、フルオロキノロンのようなキノロン；ナリジクス酸のようなキノロン；ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシンのようなアントラサイクリン；カナマイシンのようなアミノグリコシド；並びに、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ及びテトラサイクリンのようなその他の抗生物質；並びに、シクロホスフアミド、チオセミカルバゾン、インドメタシン及びニトロプルッシドのようなナイトロジェンマスタード；トポテカン、イリノテカン、ルルトテカン、９‐アミノカンプトテシン、９‐ニトロカンプトテシン及び１０‐ヒドロキシカンプトテシンのようなカンプトテシン；並びに、エトポシドのようなポドフィロトキシンが含まれるが、これに限定されるものではない。薬剤の取り込みは、薬剤を外部媒体に添加した後に混合物を適した温度でインキュベートすることによって達成し得る。リポソームの組成、内部媒質の温度及びｐＨ、並びに、薬剤の化学的性質に応じて、薬剤の取り込みは数分で起こることも数時間かかることもある。リポソーム内部で薬剤と金属との間に配位結合が生じたか否かを判定する方法には、分光光度分析、及び、当業者既知のその他の従来技法が含まれる。好ましくは、本発明のリポソームは金属イオン溶液を含む。好ましくは、金属イオンは銅である。
【００６０】
捕捉のための受動的及び能動的方法は、１つ以上の封入された薬剤を含むリポソーム製剤を調製するために連関させてもよい。
【００６１】
本発明の組成物のin vivoでの投与
上述のように、本発明の送達媒体組成物は、人間等の温血動物及び家禽類に投与してもよい。人間の疾患を治療するために、有資格の医師であれば、確立されたプロトコールを用いて、投与の用量、スケジュール及び経路に関して、どのように本発明の組成物を使用すべきかについて決定することができる。本発明の送達媒体組成物に封入された剤が被検体の健康な組織に対して示す毒性が低減されるべき場合は、そのような適用には用量増大を使用することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、非経口的投与、すなわち、動脈内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又は筋肉内投与をするのが好ましい。医薬組成物は、大量瞬時投与により、静脈内又は腹腔内投与されるのがより好ましい。例えば、Rahman, et al.の米国特許第３，９９３，７５４号；Searsの米国特許第４，１４５，４１０号；Papahadjopoulos, et al.の米国特許第４，２３５，８７１号；Schneiderの米国特許第４，２２４，１７９号；Lenk, et al.の米国特許第４，５２２，８０３号及びFountain, et al.の米国特許第４，５８８，５７８号参照するべきであり、これらは引用をもって本書に繰み込む。
【００６３】
その他の方法では、本発明の医薬又は美容調製物は、組織に調製物を直接投与することによってターゲット組織と接触させることができる。投与は、局所的、「開放型」、又は、「閉鎖型」方法によって行ってもよい。「局所的」とは、皮膚、中咽頭、外耳道等のような、環境に曝された組織に対する多剤調製物の直接的投与をいうものとする。「開放型」方法とは、患者の皮膚を切開すること及び医薬調製物が投与される深層の組織を直接露出することを含むような方法をいう。これは、通常、肺にアクセスするための開胸術、腹部の臓器にアクセスするための開腹術、又は、その他ターゲット組織に対する直接的な外科的アプローチのような、外科的方法によって達成される。「閉鎖型」方法とは、内部のターゲット組織が直接的には露出されないが、皮膚の小さな創傷に通した挿入装置によってアクセスされるような侵襲的方法をいう。例えば、調製物は、ニードル洗浄（needle lavage）によって腹膜に投与することができる。或いは、調製物は、内視鏡装置によって投与することもできる。
【００６４】
本発明の送達媒体を含む医薬組成物は、標準的な方法に従って調製されるが、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロース等を含有してもよく、更に、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等のような安定性増大のための糖タンパク質を含有してもよい。これらの組成物は、常套の既知滅菌方法により滅菌してもよい。生成した水性溶液は、使用のために包装してもよく、無菌条件下で濾過し及び凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌水性溶液と混合される。組成物は、生理的条件に近づける必要がある場合、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等のようなｐＨ調節及び緩衝剤、張性調節剤等のような医薬的に許容可能な補助物質を含有してもよい。更に、送達媒体懸濁液は、保存中のフリーラジカル及び脂質過酸化のダメージから脂質を保護するための脂質保護剤を含んでいてもよい。α−トコフェロールのような親油性フリーラジカル失活剤及びフェリオキサミンのような水溶性イオン特異的キレーターは好適である。また、投与されたフルオロピリミジンの寿命を長くするために、標準的な方法により、本発明の組成物と共にロイコボリンを投与してもよい。
【００６５】
医薬製剤中の送達媒体の濃度は、凡そ０．０５重量％以下より、通常は凡そ２〜５重量％又は少なくとも凡そ２〜５重量％で、そして凡そ１０〜３０重量％まで、のように広範に変えることが可能であり、また、選択された特定の投与様式に応じて、主に、液量、粘性等によって選択される。例えば、治療に関連する液体負荷を軽減させるため濃度を高くしてもよい。あるいは、刺激性脂質から構成される送達媒体は、投与部位における炎症を少なくさせるため、希釈して濃度を低くしてもよい。診断に関しては、送達媒体の投与量は、使用される特定のラベル、診断される疾患状態、及び、医師の判断に依存するであろう。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、静脈内投与されるのが好ましい。送達媒体製剤の用量は、薬剤／脂質の比率、並びに、患者の年齢、体重及び状態に関する投与を行う医師の判断に依存するであろう。
【００６７】
医薬組成物以外にも、獣医学的使用のために好適な製剤を調製し、被検体に対し好適な方法で投与してもよい。好ましい獣医学的被検体には、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ）、及び、家禽を含む。被検体として、実験動物、例を挙げると、とりわけ、ラット、ウサギ、マウス、及び、モルモットを含んでもよい。
【００６８】
キット
本発明の組成物における治療剤は、個々の組成物中に別個に製剤化してもよく、その各々の治療剤は適切な送達媒体と安定に会合する。投与される治療剤の比率が治療標的において維持されるように、送達媒体の薬物動態が協調的である限りにおいて、これらの組成物を別々に被検体に投与することが可能である。よって、別々の容器に、一番目の治療剤と安定に会合した送達媒体を含む少なくとも一つの一番目の組成物、及び、二番目の容器に二番目の治療剤と安定に会合した送達媒体を含む少なくとも一つの二番目の組成物とを、含むキットを構築するのは有用である。それからキットの中に、容器をパッケージすることも可能である。
【００６９】
前記キットは、少なくとも投与されるべき各組成物量の比率の記載を含む、組成物の被検体への投与の様式に関する使用説明書も含む。あるいは、又は付加的に、前記キットは、組み合わせにおける一つの容器の含量が他の容器のそれと正しい比率になるように、各容器内の組成物量が予め測定されるように構築される。あるいは、又は付加的に、前記容器は、目に見えるはかりにより適当量の分配が可能なように測定はかりで標識してもよい。前記容器それ自体を投与において使用出来るようにしていても良く、例えば、前記キットは別個のシリンジ中に各組成物の適当量を含んでいてもよい。予め製剤化された正しい比率の治療剤を含む製剤は、キット中に予めパッケージされたシリンジから直接、該製剤を投与するような方法で、パッケージされていてもよい。
【００７０】
以下の実施例は説明のために提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７１】
大単層小胞の調製法
別に特定していなければ、脂質はクロロホルム溶液に溶解し、次いで、窒素ガス流下で乾燥させ、溶媒を除去するために真空ポンプ内に置いた。微量濃度の放射性脂質１４Ｃ−ＣＨＥを脂質の定量のため添加した。得られた脂質薄膜を最低２時間高減圧下に置いた。前記脂質薄膜は、多層膜小胞（ＭＬＶｓ）を形成するために指定の溶液中で水和せた。８０から１５０ｎｍの平均リポソームサイズを得るために、押し出し装置（extrusion apparatus）(Lipex Biomembranes, Vancouver, BC)で積み重ねたポリカーボネートフィルターに１０回通し、押し出させた。リポソームの全ての構成物質はモル％で示す。
【００７２】
薬剤装填の定量法
薬剤の装填開始後の種々の時点で、一定量を取り除き封入されていない薬剤を分離するためセファデックスＧ−５０スピンカラムに通した。指定容量の溶出液に対し、トライトンＸ−１００又はＮ−オシルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）をリポソームの可溶化のために添加した。界面活性剤の添加に続いて、混合液を該界面活性剤の曇点まで加熱し、そして、吸光度又は蛍光測定の前に、室温まで冷却した。薬剤濃度を検量線との比較により算出した。脂質濃度は液体シンチレーション計数により測定した。
【００７３】
実施例１Ａ
ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲはリポソーム内へ二重装填され得る（脂質薄膜法）
水溶性カンプトセシンとフルオロピリミジンの両方を含む機能的リポソームを生成し得るか判別するために、受動的にＦＵＤＲを封入されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比）リポソームにＣＰＴ−１１を能動的に装填した。
【００７４】
脂質薄膜は、ＤＳＰＣを５０ｍｇ／ｍｌクロロフォルム中に、コレステロールを５０ ｍｇ／ｍｌクロロフォルム中に、及びＤＳＰＧを２５ｍｇ／ｍｌクロロフォルム／メタノール／水（５０／１０／１）中に、溶解することにより調製した。それから前記脂質を組み合わせ、そして次いで溶媒を除去し、得られた脂質薄膜を７０℃で１００ｍＭグルコン酸銅（Ｃｕ（グルコン酸）２）、２２０ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び３０ｍｇ／ｍＬ（１２２ｍＭ）のＦＵＤＲ（微量の３Ｈ−ＦＵＤＲ）から成る溶液で水和させた。得られたＭＬＶｓは、ＬＵＶｓを生成するために７０℃で押し出させた。得られたリポソームの平均直径をＱＥＬＳ(準弾性光散乱)解析により測定したところ、凡そ１００nm＋／−２０nmであった。それから、前記リポソームは、携帯型接線流(接線流)カラムを用いて、３００ｍＭ ＳＨＥ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４へと緩衝液の交換を行い、そして、生理的食塩水へと交換し、それから未封入のＦＵＤＲとグルコン酸銅を除去した。
【００７５】
ＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１モル比が１：１になるように、ＣＰＴ−１１をこれらのリポソームに添加した。０．１：１のＣＰＴ−１１／脂質初期比率でリポソーム中へのＣＰＴ−１１の装填を、試料を５０℃で１０分間インキュベートすることにより促進した。装填後に室温まで冷却し、ＥＤＴＡ及び封入されなかった薬剤を除去するため、接線流透析により、試料を、生理的食塩水（０．９％塩化ナトリウム注入、ＵＳＰ；ｐＨ ５．５、Ｂａｘｔｅｒ）中に入れ換えた。装填したＣＰＴ−１１含量を、検量線に対する３７０ｎｍの吸光度を用い測定した。各時点の薬剤／脂質比率は、脂質濃度（１４Ｃ−ＣＨＥ）及びＦＵＤＲ濃度（３Ｈ−ＦＵＤＲ）の測定のために液体シンチレーション計数を用いて導出した。
【００７６】
図１は、ＣＰＴ−１１の５０℃での装填の時間経過における薬剤／脂質比率（＋／−標準偏差）を示したグラフである。図１から明らかなように、ＣＰＴ−１１／脂質 初期比率０．１：１で添加されたＣＰＴ−１１は、能動的にＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比）リポソーム（受動的にＦＵＤＲが封入されている）中に装填され、最終的にはＣＰＴ−１１／脂質 比率は凡そ０．８：１になった。そして、これらの結果より、ＦＵＤＲが封入されているＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比）リポソームは、効率的にＣＰＴ−１１を封入し得ることが証明された。
【００７７】
実施例１Ｂ
有機エマルジョン法により、ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲが装填されたリポソームを調製する
必要量の脂質ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／コレステロール（７０：２０：１０）を秤量し、ジクロロメタン／メタノール／水混合液（９３／５／２）中に最終濃度１２５ｍｇ／ｍＬになるように溶解する。溶解された脂質をガラスのアプリコン バイオリアクター中に置き、混合液中で窒素を穏やかに泡立てる。７５ｍｇ／ｍＬの最終脂質濃度を得るために、アプリコン バイオリアクター中に１００ｍＭグルコン酸銅／１８０ｍＭ ＴＥＡ緩衝液をくみ入れる。銅緩衝液をバイオリアクターにくみ入れながら、継続的な窒素噴霧の９０分間、混合液全体を激しいボルテックスにより攪拌する。バイオリアクターの外側に取り付けたウォーターバスにより、全過程においてバイオリアクターの温度を７０℃に保った。
【００７８】
リポソームの形成の後、温度及び混合液の外観の検査、順序としては、油中に水のエマルジョン、「プディング（pudding）」相、プディング相の「崩壊」、及び、均一なリポソーム懸濁液の確立、を行う。そして、粗リポソームは、リポソームの平均サイズが１５０ｎｍより小さく、好ましくは２００ｎｍより小さくて９０％が１１０と１２５ｎｍの間になるように（動的光分散による解析）、７０℃の加圧下で０．１μｍ孔径のフィルターに通し押し出させる。外の銅を除くための濾過を、１０容積のスクロース リン酸ＥＤＴＡ緩衝液に対し、接線流ホローファイバーフィルターを用い、室温で行う。
【００７９】
フロキスウリジン及びイリノテカン塩酸三水和物の共装填は、ｐＨ７．０でスクロース リン酸ＥＤＴＡ緩衝液にフロキスウリジンを溶解し、イリノテカン塩酸三水和物をフロキスウリジンに激しく混和し溶解するが、溶解に必要であれば５０℃に加熱する。緩衝液中に溶解した薬剤は、ガラス容器中で、必要とされる濃度でリポソームに添加される。装填は、５０℃で１時間、全体を継続的に混合させながら進む。リポソーム‐薬剤混合物は、濾過する前に、室温まで冷却される。未封入薬剤の除去のための濾過を、１０容積のスクロース リン酸緩衝液に対し、接線流ホローファイバーフィルターを用い、室温で行う。
【００８０】
薬剤を封入されたリポソームは、フロキシウリジンと１：１モル比のイリノテカン塩酸三水和物が５ｍｇ／ｍＬになるように、スクロース リン酸緩衝液で希釈する。希釈後、０．２μｍフィルターを通し滅菌する。
【００８１】
実施例２
二重装填リポソームは組成を変えたリポソーム内溶液を用いて調製され得る
二重装填におけるリポソーム内部溶液の効果を調べるため、種々の銅溶液を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比）リポソームを調製した。ＦＵＤＲを受動的に封入させ、ＣＰＴ−１１装填含量を測定した。
【００８２】
脂質薄膜を、脂質薄膜が凡そ２５ｍｇ／ｍｌ ＦＵＤＲ（微量の３Ｈ‐ＦＵＤＲを含む）を含有する、１ｍｌの、１００ｍＭグルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、２６５ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４；又は、１５０ｍＭ酒石酸銅、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４ の何れかで水和されていることを除き上述のように、調製した。得られたＭＬＶｓは７０℃で押し出させた。各試料の平均直径をＱＥＬＳ(準弾性光散乱)解析により測定したところ、凡そ１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。それから、前記リポソームは、携帯型接線流カラムを用いて、ＳＨＥ、ｐＨ７．４へと緩衝液の交換を行い、そして、ＨＢＳ、ｐＨ７．４へと交換した。
【００８３】
ＣＰＴ−１１の取り込み実験は、前述したように実施した。ＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１モル比が１：１になるように、ＣＰＴ−１１をリポソームに添加した。事前に試料を５０℃で１分間インキュベートすることにより、装填を促進した。各時点の薬剤／脂質比率は、脂質濃度（１４Ｃ−ＣＨＥ）及びＦＵＤＲ濃度（３Ｈ−ＦＵＤＲ）の測定のために液体シンチレーション計数を用いて導出した。ＣＰＴ−１１濃度を測定するために、検量線に対する３７０ｎｍの吸光度を用いた。
【００８４】
図２−Ａは、受動的にＦＵＤＲを封入されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比）リポソームは、リポソーム内溶液がグルコン酸銅又は硫酸銅において、十分なＣＰＴ−１１の装填が起こることを示している。しかし、グルコン酸銅は、ＣＰＴ−１１のリポソーム内への能動的装填において、僅かに、より効率的な溶液であるように見える。同様に、これらの二重装填リポソームからのＦＵＤＲ放出の時間経過を、グルコン酸銅又は硫酸銅の何れかと共に調製されたリポソームにおいて比較すると（図２Ｂ）、両者は徐放性の薬剤放出を示している。
【００８５】
図３に示すように、酒石酸銅のみでは、ＦＵＤＡ含有リポソーム内にＣＰＴ−１１を二重装填するためのリポソーム内溶液として適切ではない。ＦＵＤＲ及び１５０ｍＭ酒石酸銅を受動的に含有したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌリポソーム内へのＣＰＴ−１１の装填は不可能であることが、図３のグラフから明白であることが直ちに分かる。
【００８６】
実施例３
コレステロールの存在はＣＰＴ‐１１及びＦＵＤＲの血清濃度に影響する
相転移が生じる温度範囲の広幅化、脂質凝集の減弱、及び、たぶん送達媒体の循環寿命を変えるために、コレステロール及びその他のステロールがリポソームのような送達媒体調製品においてルーチン的に使用されていることは当業者において既知である。一般に、リポソーム調製品において本ステロールの利益を達成するためには３０ｍｏｌ％よりも多いコレステロールが必要であると信じられている。二重装填リポソームの薬剤保持及び薬物動態におけるコレステロール含量の影響を研究するため、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌリポソームをコレステロールの量を変えて調製した。まず、各リポソーム セット内にフルオロピリミジンを受動的に封入させ、続いて、水溶性カンプトセシンを能動的に装填した。経時的な各組成物についての生体内でのリポソームの薬物保持の程度を測定するため、Ｂａｌｂ／ｃマウス血漿中の各薬剤における薬剤／脂質比率を決定した。
【００８７】
脂質薄膜は、クロロホルム／メタノール／水（１６／８／１）中のクロロホルムとＤＳＰＧに、ＤＳＰＣとコレステロールを溶解することによって調製した。脂質は、リポソーム脂質 マーカーとして微量の１４Ｃ‐ＣＨＥを加えて、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＧ（７５：５：２０）、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＧ（７０：１０：２０）、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＧ（６５：１５：２０）、及び、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＧ（６０：２０：２０）のモル比で、組み合わせた。溶媒を除去した後、２５ｍｇ／ｍｌ ＦＵＤＲ(微量の３Ｈ‐ＦＵＤＲを含む)を含有する２５０ｍＭ ＣｕＳＯ４中で水和した。得られたＭＬＶｓを７０℃で押し出させた（extrude）。各試料の直径はＱＥＬＳ(準弾性光散乱)解析により測定したところ、凡そ１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。それから、リポソームは、携帯型接線流カラムを用いて、ＳＨＥ、ｐＨ７．４へと緩衝液の交換を行った。
【００８８】
リポソームには、前記と同様に、５０℃、５分間でＣＰＴ−１１が装填された。ＣＰＴ−１１、ＦＵＤＲ及び脂質 濃度は、実施例１に記載したように決定した。ＣＰＴ−１１を装填し室温まで冷却した後、３４０μｍｏｌ 脂質／ｋｇ、３４μｍｏｌ ＦＵＤＲ／ｋｇ、及び、３４μｍｏｌ ＣＴＰ−１１／ｋｇの一定分量の試料をメスＢａｌｂ／ｃマウスの静脈に注入した。静脈投与の１、４、及び２４時間後に、心臓穿刺により収集し、ＥＤＴＡで被覆した微小容器内に入れた。各時点で３個体のマウスを用いた。試料は血漿を分離するため遠心し、そして血漿を注意深く別のチューブに移した。血漿の脂質及びＦＵＤＲ濃度は、液体シンチレーション計測により決定し、及び、血漿のＣＰＴ−１１濃度は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により決定した。
【００８９】
図４−Ａは、ＣＰＴ−１１／脂質 比率（＋／−標準偏差）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲを封入させたリポソームの静脈投与後の時間の関数として図示したものである。上記グラフは、リポソームのコレステロール濃度が増加するにつれ、２０モル％コレステロール（１５モル％と比較するとＣＰＴ−１１濃度が速く減少し、早く放出されている）を除いて、リポソームのＣＰＴ−１１保持が増加していることを証明している。図４−Ｂの結果は、ＦＵＤＲ／脂質 比率（＋／−標準偏差）を特定の時間にプロットしたものであり、コレステロール含量が５から２０モル％に増加するにつれ、ＦＵＤＲの生体内での保持が有意に減少することを示しており、１０モル％コレステロールは５モル％よりも良好な保持を示している。そして、ＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌリポソームは、凡そ１５モル％コレステロール使用の場合に最適なＣＰＴ−１１血漿濃度を示し、また、凡そ１０モル％コレステロール使用の場合に最適なＦＵＤＲ血漿濃度を示すことが、これらの結果から示された。従って、癌部位へのＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の高濃度での送達を高めるＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ共製剤のためには、凡そ１０−１５モル％のコレステロールがＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の各々について好適な薬剤保持及び徐放性薬剤放出のために必要である。
【００９０】
実施例４
ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲの併用は非拮抗的及び拮抗的効果の両方を示す
２又はそれ以上の薬剤の併用は多くの場合、相乗的な効果を示し得る。同様に、その同じ２又はそれ以上の薬剤の併用は、使用する薬剤濃度に依存して相加的又は拮抗的相互作用を示し得る。相乗的な水溶性カンプトセシン／フルオロピリミジンの比率を同定するために、種々の組み合わせのＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１についてin vitroの細胞毒性効果を試験した。より具体的には、広い薬剤濃度幅に渡って相乗性が示される組み合わせを同定した。
【００９１】
相加的、相乗的、又は、拮抗的効果の測定を、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌、Ｈ４６０ヒト大型細胞悪性腫瘍、及び、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸直腸腺癌細胞において、１０：１、５：１、１：１、１：５及び１：１０のモル比のＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１を用いて行った。標準テトラゾリウム‐ベース比色定量ＭＴＴ生存度アッセイプロトコール（Mosmann, et al., J. Immunol Methods (1983) 65(1-2):55-63）を、影響を受けた細胞の割合（the fraction of cells affected）の読み出しを決定するために用いた。簡潔に言うと、生存している細胞は、テトラゾリウム塩の3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-２Ｈ臭化テトラゾリウムを青色のホルマザン（該ホルマザンは分光光度的に読み取り可能）に還元する。本書で使用されたＨＴ−２９細胞株のような細胞は、２５ｃｍ２フラスコで増殖させ、継代し（継代数２０以下）、新鮮な培養液に懸濁し９６ウエル細胞培養プレートに１０００細胞／ウェルの密度で１００μｌを添加する。それから、細胞を、２４時間、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。これらのような単一細胞調製物（single-cell preparations）は、既知技術により患者癌又は生検から組織ホモジネートによって調製してもよい。翌日、段階希釈した薬剤を１２ウェル細胞培養プレート中で調製する。種々の溶液中で前もって調製された薬剤は、新鮮な細胞培養液で希釈する。薬剤を、単一薬剤（２０μｌ）及び特定の固定比率の２薬剤の組み合わせ（２０μｌ区切り）で、適当な又は特定のウェルに、ラテンスクエアデザイン又は「チェッカーボード（checkerboard）」希釈法を用いて、投与した。ウェルの総容量を、新鮮培養液により２００ｍｌにする。薬剤暴露は７２時間である。
【００９２】
薬剤暴露に続いて、ＭＴＴ試薬（ＲＰＭＩ中に１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルにウェル当たり５０μｌの容量で添加し、３−４時間インキュベートする。ウェルの内容物を吸引し、細胞を破壊し細胞内の沈殿物をホルマザンに可溶化させるために１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加する。９６ウェルプレートをプレートシェーカーで震盪し、５７０ｎｍの波長でマイクロプレート分光光度計セットにより読み取る。読み取った吸光度（ＯＤ）は記録し、ブランク ウェル（培養液のみを含む）のＯＤ値を全ての細胞含有ウェルから差し引く。薬剤曝露後の細胞の生存率は、対照ウェル（薬剤に暴露していない細胞）のパーセンテージとして基礎付ける。全てのウェルについて３回行い、平均値を算出する。
【００９３】
Calcusyn（ChouとTalalayの用量‐効果 解析理論、ここでは「median-effect方程式」が生化学的な方程式を計算するために使用され、これは当業者に広く使用されている）を用いて、組み合わせ指数を、各ＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１用量に対して決定した。この方程式の誘導は、組み合わせ指数（ＣＩ）を計算するために使用するような、より高次の方程式を生じる。前に言及したように、ＣＩは、１より多い薬剤の組み合わせ及び各組み合わせの種々の比率が拮抗的（ＣＩ＞１．１）か、相加的（０．９≦ＣＩ≧１．１）か、又は、相乗的（ＣＩ＜０．９）か、を決定するのに使用し得る。ＣＩプロットは、典型的には、ｙ軸でＣＩを表し、これに対し、ｘ軸で影響を受けた細胞の割合又は影響を受けた割合（ｆａ）を示す。図５のデータはＣＩ 対 影響を受けたＨＴ−２９細胞の割合としてプロットされており、ＦＵＤＲとＣＰＴ−１１との特定の組み合わせが拮抗的であるのに対し、その他の組み合わせが相乗的又は相加的であることを明瞭に図示している。５：１又は１：１のＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１比率において、影響を受けた割合値の全範囲（０．２−０．８）で相乗的であることが観察された。この事は、５：１又は１：１比率は、使用した各薬剤濃度と無関係に相乗的である。しかしながら、１０：１比率は０．７６以下のｆａ値で非拮抗的であり、１：５モル比のＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１では０．６２以下のｆａ値で非拮抗的であることから、これらの比率で観察された相乗性は使用された薬剤濃度に依存していることが証明される。ＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１が１：１０比率では、相当範囲のｆａ値（５０％以上）に渡って拮抗的である。
【００９４】
最適薬剤比率の同定に使用される更なる説明が、相対的相乗作用プロットである（図５−Ｄ）。本解析法は、多くの型の細胞から共通する相乗的な薬剤：薬剤 比率を同定するのに有用である。図５−Ｄは、縦軸に示すような種々の型の細胞からの１：５、１：１、及び１：１０モル比率でのデータ集合をまとめたものである。横軸に示された相対的相乗作用値は、CalcuSynから得たＣＩ値を計算したものであり、元のＣＩ値から１を減算する事により０に正規化しており、すなわち０、１又は２のＣＩ値は−１、０又は１の相対的相乗作用値と各々等価である。このデータ形式により、評価を行った比率について、幾つかの型の細胞においては相乗性が観察された（左向きのバー）一方で、他では拮抗的であった（右向きのバー）。更に、本解析法は、１：１比率で同様の相乗性反応を示す癌細胞の型を同定するのに有益であり、例えば、同様の相対的相乗作用レベルが結腸直腸細胞株のｃｏｌｏｎ−２６、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、及び、ＬＳ１８０で観察されている。これらの結果に基づいて、この比率が濃度非依存的に相乗作用効果があることが証明されたので、ＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１の１：１比率を、以下の実施例で記載する薬物動態及び有効性の研究のために選択した。この事は、薬物濃度が投与後の生体内で変化する可能性が高いことから重要である。
【００９５】
実施例５
生体内における薬剤比率の維持
生体内で、二重装填リポソーム中の水溶性カンプトセシンとフルオロピリミジンの相乗的比率が維持され得るかを判定するため、封入されたＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌリポソームをマウスに静脈投与し、血漿中の薬剤／薬剤比率を経時的にモニターした。
【００９６】
相乗的であるとして実施例４で同定した１：１比率で、上述のようにＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１をＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０:１０モル比率）リポソーム内に製剤化した。脂質薄膜を、１００ｍＭ グルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４及び３０ｍｇ／ｍＬのＦＵＤＲ（微量の３Ｈ‐ＦＵＤＲと共に）から成る溶液中で水和させた。得られたＭＬＶｓを次いで７０℃で押し出させ（extrude）、それから、リポソームは、接線流透析を用いて、ＳＨＥ、ｐＨ７．４へと緩衝液の交換を行い、それにより封入されていないＦＵＤＲ及びグルコン酸銅を除去した。
【００９７】
これらのリポソームに、０．１２：１（ＣＰＴ−１１：脂質）の初期比率で、ＣＰＴ−１１を添加した。リポソーム内へのＣＰＴ−１１の装填は、試料を５０℃で１０分間インキュベートして促進した。装填後、ＥＤＴＡ及び封入されなかった薬剤を除去するため、接線流透析により、試料は、生理的食塩水（０．９％塩化ナトリウム注入、USP；ｐＨ ５．５、Baxter）内に入れ替えられた。ＣＰＴ−１１装填含量は、検量線に対して３７０ｎｍの吸光度を用いて測定した。ＦＵＤＲ及び脂質の濃度は液体シンチレーションを用い測定した。
【００９８】
調製物は、ＣＤ‐１１又はＳＣＩＤ‐Ｒａｇ２Ｍマウスの何れかに、尾静脈を介して、静脈注射した。リポソーム製剤の用量は、８．３８ ｍｇ／ｋｇのＦＵＤＲ及び２０ ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ‐１１であった。ＦＵＤＲ及びＣＰＴ‐１１が１：１比率の遊離薬剤カクテルの二重装填リポソームとの比較を、ＣＤ−１マウスに対して行った。マウスに投与する前に、遊離薬剤カクテルを生理的食塩水で希釈した。静脈投与後の図示した時点で、心臓穿刺により血液を収集し（各時点毎に３個体のマウス）、ＥＤＴＡで被覆した微小容器内に入れた。血漿を分離するために試料を遠心し、血漿を別の容器に移した。血漿中の放射標識された脂質及びＦＵＤＲを定量するために液体シンチレーション計数を用いた。ＣＰＴ−１１血漿濃度はＨＰＬＣで定量した。
【００９９】
図６−Ａは、ＣＤ−１マウスへの静脈注射後の種々の時点におけるＦＵＤＲの血漿濃度がＣＰＴ−１１のそれにほぼ等しいように（但し、それらが上述のリポソーム中で投与された場合）、ＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の血漿濃度が１：１モル比に効果的に維持されていることを示している。対照的に、ＦＵＤＲ／ＣＰＴ‐１１の遊離薬剤カクテルは、投与後の当初の１：１モル比から急速に変化した。図６−Ｂは、ＳＣＩＤ‐Ｒａｇ２Ｍマウスに投与後のＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の血漿濃度が、時間経過しても１：１で維持されていたことを示している。データの点は、特定の時点における血漿中の測定されたＣＰＴ‐１１／ＦＵＤＲモル比（＋／−標準偏差）を表している。遊離薬剤カクテルが癌細胞を相乗的に殺傷する最適 薬剤／薬剤比率から、急速かつ非管理的に変化するのに対し、本発明のリポソーム内にＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１のある製剤は、時間経過しても血漿中のこれら薬剤の相乗的比率が維持されることが、これらの結果から明瞭に証明された。それゆえ、好適比率のＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の個体への送達において、脂質ベース送達媒体へのこれらの薬剤の製剤化が理想的であることが判明した。
【０１００】
実施例６
ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲの同時封入
ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲの共封入のための代替的方法が開発されており、両薬剤の同時装填を可能としている。ＤＳＰＧ及びコレステロールを別々にクロロホルム中に５０ｍｇ／ｍｌで、そしてＤＳＰＧをクロロホルム／メタノール／水（５０／１０／１）中に２５ｍｇ／ｍｌで、溶解することにより、脂質薄膜を調製した。これらの脂質薄膜は、それから、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比）混合物を生成するように適当量を一緒に組み合わせ、そして、１４Ｃ‐ＣＨＥで標識した。ごく少量の溶媒が残るまで、Ｎ２ガス流下で溶媒を除去した。そして、幾らか残った溶媒を除去するため終夜、真空ポンプの減圧下に放置した。脂質薄膜は、７０℃の４ｍＬ １００ｍＭ グルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４中で再水和させ、得られたＭＬＶｓを７０℃で２層の１００ｎｍフィルターに合計８回通し、押し出させた。一定分量を脂質調製物の特異活性を判定するために、押し出す前に取り出した。各試料の平均直径をＱＥＬＳ（準弾性光散乱）解析により測定したところ、１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。リポソームは、それから、携帯型接線流カラムを用い、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ）へと緩衝液交換した。
【０１０１】
ＣＰＴ‐１１／ＦＵＤＲ取込実験を以下のように実施した：２５μモルの脂質、３μモルのＣＰＴ−１１、及び、６０μモルのＦＵＤＲ（幾らかの３Ｈ‐ＦＵＤＲを含有）を別々に５０℃でインキュベートし、そして、総容量５００ｍｌとして組み合わせた。混合後の種々の時点で、一定分量を取り出し、外のリポソーム溶液を１ｍＬのセファデックスＧ‐５０カラムを用い、生理的食塩水に交換した。溶出液についての薬剤／脂質比率は、脂質及びＦＵＤＲ濃度を測定するために二重標識液体シンチレーション測定を用いて算出した。ＣＰＴ−１１は検量線に対するその３７０ｎｍの吸光度により定量した。ＣＰＴ‐１１ ＵＶアッセイの条件は以下の通りである：１００μｌ分割量の各リポソーム試料を、１００μｌの１０％トライトンＸ−１００ ＋ ８００μｌの５０ｍＭ クエン酸三ナトリウム／クエン酸、１５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５中に溶解し、それから、濁ってくるまで、沸騰水を用い１００℃に加熱した。吸光度の読み取りを行う前に、試料を室温まで冷却した。図７にＣＰＴ‐１１及びＦＵＤＲの同時装填について示す。
【０１０２】
実施例７
薬剤封入リポソームは相乗的薬剤カクテルを上回る高効率を示す
今日、多くの療法、とりわけ併用化学療法は、遊離薬剤カクテルの投与に頼っている。本研究者らは、本書で、リポソーム封入薬剤併用が同じ組み合わせの遊離薬剤カクテルと比較して、増強効果が観察されるかどうかを立証したいと考えた。二重装填リポソームの有効性を、各薬剤を別々に同様のリポソームに装填した場合の治療効果とも比較した。
【０１０３】
ＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１が１：１の相乗的モル比で共封入されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比率）リポソームを、実施例１に記載したように調製した。また、ＦＵＤＲ又はＣＰＴ−１１のどちらかを含有するＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比率）リポソームを、前述した各装填方法を用いて、リポソーム毎に一つの薬剤のみであることを除いて実施例１のように調製した。脂質薄膜は、１００ｍＭ グルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４中で水和させた。水和後、リポソーム外側の緩衝液を、ＳＨＥ、ｐＨ７．４へと緩衝液の交換を行い、続いてＣＰＴ−１１の装填し、外側緩衝液を再び０．９％生理食塩水に交換した。
【０１０４】
簡潔に説明すると、マウスにおける癌研究を行うため、動物に癌細胞を播種し、それから該癌細胞が十分な大きさに増殖まで放置しておいた。注射針を用い、マウスに、１−２×１０６の癌細胞を５０μｌの容量で（１播種／マウス）で日数０に皮下に播種した。
【０１０５】
癌が凡そ１００ｍｍ３から２００ｍｍ３の既定の大きさに到達したら、処置の１日前又は処置の当日に全ての癌を測定した。適切な癌のサイズを選択後、小さ過ぎる又は大き過ぎる癌を除外し、癌を無作為に分布させ（ｎ＝６）、そして、グループの癌容積平均値を決定する。マウスを、例えば生理食塩水対照、リポソーム対照、陽性対照、及び、種々の希釈された被検物のような、対照及び処置群から成る適切な処理群に組織化する。
【０１０６】
個々のマウスの体重に基づいて、動物に前述した用量（示したように１０μｇ／ｇ）を投与するために必要容量の試料を静脈注射する。
【０１０７】
バーニアノギスを用いて、処置開始日より癌増殖測定をモニターする。癌の長さの測定（ｍｍ）は最も長い軸からなり、そして、幅の測定（ｍｍ）はこの軸と垂直になる。長さと幅の測定から、癌容積（ｃｍ３）を式（Ｌ×Ｗ２／２）に基づいて計算する。癌測定時に、動物の体重及び生存についての所見を収集する。
【０１０８】
死亡率及び罹患率について、処置前及び処置中に、全ての動物は最低１日１回、必要と判断されたならば更に観察される。とりわけ、病気か健康かの徴候は、体重減少、食欲の変化、粗い毛並み、グルーミングの欠如、変化した歩調のような行動変化、傾眠、及び、ストレスの荒い徴候に基づく。重度の毒性又は癌関連疾患の徴候が見られた動物は、安楽死（ＣＯ２窒息）させ、他の毒性徴候を探すため剖検にかける。死にかけている動物は人為的に絶命させるが、絶命の決定は研究ディレクター／マネージャー及び動物管理技術者の判断による。これらの何らかの及び全ての所見は生データとして記録され、死亡時間はその次の日として書き込まれる。
【０１０９】
本研究においては上述のように実施され、有効性実験は、雌性ＳＣＩＤ‐Ｒａｇ２Ｍマウスを用いて実行され、該マウスは脇腹の皮下に、２×１０６のヒトＨＴ−２９若しくはＨＣＴ１１６結腸腺癌、２×１０６のヒトＣａｐａｎ‐１膵臓癌細胞、又は、１×１０６マウス Ｃｏｌｏｎ‐２６腺癌を播種されている。異種移植片癌は大きさ凡そ１５０ｍｇ（１５０ｍｍ３）に測定されるまで増殖させておき、マウス癌は凡そ１００ｍｇ（１００ｍｍ３）まで成長させ、この時点で、示す製剤を注射する。癌の増殖は、直接ノギス測定により測定する。マウスは、単一薬剤装填リポソーム（「リポソームＦＵＤＲ」及び「リポソームＣＰＴ−１１」）と二重装填リポソーム（「リポソームＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲ」）とを比較するために、生理的食塩水、１：１モル比率の遊離薬剤カクテル、個々の遊離薬剤、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１、１：１０、及び、１０：１モル比率のリポソーム製剤、及び、ＦＵＤＲとＣＰＴ‐１１がリポソームで別個に投与されるものの複数投薬スケジュール（図８−Ａ、８−Ｂ及び８−Ｃ中の矢印は処置日を示す）にて処置した。抗癌活性は、癌増殖遅延のパーセント及びログ細胞殺傷を計算することにより、定量した。癌増殖遅延のパーセントは、治療された癌が特定の評価サイズに到達するのに要する日数における時間として定義され、対照パーセント（Ｔ−Ｃ／Ｃ×１００）（ここで、Ｔは処置された癌における日数であり、Ｃは対照癌における日数である）である。ログ細胞殺傷は、処置の終わりにおける殺傷された細胞のｌｏｇ１０単位数の推定量であり、［Ｔ−Ｃ／（３．３２）（Ｔｄ）］（ここで、Ｔ−Ｃは癌の特定評価サイズへの到達の処置による遅延であり、Ｔｄは１日における癌が倍化する回数）として定義される。ログ細胞殺傷が０は、処置の終わりにおける細胞数が処置開始時と同じであることを示している。ログ細胞殺傷が＋６は、細胞数における減少が９９．９９９９％であることを示している。
【０１１０】
図８−Ａに表した結果は、２５：９．２５ｍｇ／ｋｇ（２７８ｍｇ／ｋｇリポソーム用量に相当）の用量で１：１モル比率でＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０）リポソームに封入されたリポソームＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲの投与が、２５：９．２５ｍｇ／ｋｇで用量を合わせた及び１００：３７ｍｇ／ｋｇの最大限許容用量（ＭＴＤ）遊離薬剤カクテル、又は、生理的食塩水の何れかを処理した動物と比較して、有意に、より良好な治療活性を実現すること（ヒト結腸ＨＴ−２９癌サイズの減少）を示している。図８−Ｂのグラフは２５：９．２５ｍｇ／ｋｇ（２７８ｍｇ／ｋｇリポソーム用量に相当）の用量で１：１モル比率でＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０）リポソームに封入されたリポソームＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲの投与が、１００：３７ｍｇ／ｋｇの最大限許容用量（ＭＴＤ）遊離薬剤カクテル、又は、生理的食塩水の何れかを処理した動物と比較して、有意に、より良好な治療活性を実現する（ヒト結腸直腸ＨＣＴ１１６癌サイズの減少）ことを、図示している。図８−Ａの結果と同様に、図８−Ｃのグラフは、ヒトＣａｐａｎ−１膵臓癌細胞由来の癌のマウスにおいて、１：１比率でＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０）リポソームに封入されたリポソームＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲにより、ＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲの遊離薬剤カクテル又は生理的食塩水の何れよりも大きな程度で、癌の大きさが減少することを証明している。データの点は、癌の大きさの平均値＋／−標準誤差（ＳＥＭ）を表している。併せてみると、これらの結果から、フルオロピリミジン及び水溶性カンプトセシンの良く設計された送達媒体への封入が、最適な治療活性を達成するために要求されることが強く示された。
【０１１１】
下の表１−Ａは、ヒトＨＴ‐２９結腸直腸 異種移植モデルにおいて、１：１及び１０：１モル比のリポソームＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲ、リポソームＦＵＤＲ、リポソームＣＰＴ‐１１、１０：１モル比の遊離薬剤カクテルＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲ、及び、ＣＰＴ‐１１の遊離薬剤、及び、遊離のＦＵＤＲを投与した際の定量的な抗癌効果のデータの表である。
【０１１２】
【表１−Ａ】
2006522026.tif 000002
【０１１３】
表１−Ａに示されている結果は、示した処置群におけるＨＴ‐２９抗癌活性の治療的解析を示している。用量１８．５ｍｇ／ｋｇでのリポソームＦＵＤＲ（Ｌ‐Ｆｌｏｘ）の投与後、１２％のみの癌増殖遅延と０．１４のログ細胞殺傷が見られた。用量５０ｍｇ／ｋｇでのリポソームＣＰＴ‐１１（Ｌ‐Ｉｒｉｎｏ）では、１２７％の癌増殖遅延と１．５１のログ細胞殺傷と非常に高活性であった。ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０）リポソーム内にＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲを１：１モル比で封入されたリポソーム（ＣＰＸ‐１）の用量５０：１８．５ｍｇ／ｋｇ（脂質用量５５６ｍｇ／ｋｇに相当）での投与は、１４２％の癌増殖遅延と１．７１のログ細胞殺傷と最も効率的であった。ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０）リポソーム内にＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲを１０：１モル比で封入されたリポソーム（拮抗的）の用量５０：１．８５ｍｇ／ｋｇ（脂質用量５５６ｍｇ／ｋｇに相当）での投与は、１２３％の癌増殖遅延と１．４８のログ細胞殺傷と１：１モル比よりも低効率であった。最大許容用量（ＭＴＤ）の１００：３７ｍｇ／ｋｇでの遊離薬剤カクテルは、１９％の癌増殖遅延と０．２３のログ細胞殺傷を示した。各々用量１００及び２５０ｍｇ／ｋｇの遊離ＣＰＴ−１１及び遊離ＦＵＤＲの両者は、８％の癌増殖遅延と０．０９のログ細胞殺傷を示した。
【０１１４】
表１−Ｂは、ヒトＣａｐａｎ‐１膵臓 異種移植モデルにおいて、１：１及び１：１０モル比のリポソームＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲ、リポソームＦＵＤＲ、リポソームＣＰＴ‐１１、及び、ＣＰＴ‐１１の遊離薬剤、及び、遊離のＦＵＤＲを投与した際の定量的な抗癌効果のデータの表である。
【０１１５】
【表１−Ｂ】
2006522026.tif 000003
【０１１６】
表１−Ａと同様に、表１−Ｂで表にまとめた結果は、リポソームＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲ（ＣＰＸ‐１）が、ヒトＣａｐａｎ‐１膵臓 異種移植モデルで２５：９．２５ｍｇ／ｋｇの用量（脂質用量２７８ｍｇ／ｋｇ）において９８％の癌増殖遅延と１．９８のログ細胞殺傷にて優れた抗癌活性があることを示しており、これは、リポソームＣＰＴ‐１１（２５ｍｇ／ｋｇ）（Ｌ‐Ｉｒｉｎｏ）及びリポソームＦＵＤＲ（９．２５ｍｇ／ｋｇ）（Ｌ‐Ｆｌｏｘ）（各々７９％と１６％の癌増殖遅延と１．４６と０．３０のログ細胞殺傷）と比較して統計的に有意であった。
【０１１７】
表１−Ｃは、マウスＣｏｌｏｎ‐２６モデルにおいて、１：１モル比のリポソームＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲ、リポソームＦＵＤＲ、リポソームＣＰＴ‐１１を投与した際の定量的な抗癌効果のデータの表である。
【０１１８】
【表１−Ｃ】
2006522026.tif 000004
【０１１９】
表１−Ｃは、リポソームＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲ（ＣＰＸ‐１）が、マウスＣｏｌｏｎ‐２６結腸直腸モデルで２０：７．４ｍｇ／ｋｇの用量（脂質用量１６０ｍｇ／ｋｇ）において５３％の癌増殖遅延と２．４７のログ細胞殺傷にて優れた抗癌活性があることを示している。リポソームＣＰＴ‐１１（２０ｍｇ／ｋｇ）（Ｌ‐Ｉｒｉｎｏ）及びリポソームＦＵＤＲ（７．４ｍｇ／ｋｇ）（Ｌ‐Ｆｌｏｘ）は、各々、１３．９％と１４．８％の癌増殖遅延と０．６５と０．６９のログ細胞殺傷であった。両単一装填リポソームは、生理的食塩水の対照よりも、より活性があり、そして、予想されたようにリポソームＣＰＴ−１１：ＦＵＤＲは、最も効果的な癌サイズの縮小を示し、これは、リポソームＣＰＴ‐１１及びリポソームＦＵＤＲと比較して統計的に有意であった。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】１００ｍＭ グルコン酸銅、２２０ ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４及び受動的に封入されたＦＵＤＲを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比率）リポソーム中へのイリノテカン（ＣＰＴ−１１）の５０℃での装填の時間経過を示したグラフ。
【図２−Ａ】１００ｍＭグルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４、又は、１００ｍＭ ＣｕＳＯ４、２６５ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４の何れか；並びに、受動的に封入されたＦＵＤＲを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比率）リポソーム中へのＣＰＴ−１１の５０℃での装填の時間経過を比較したグラフ。
【図２−Ｂ】ＨＢＳ、ｐＨ７．４の外側緩衝液溶液で、１００ｍＭグルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４、又は、１００ｍＭ ＣｕＳＯ４、２６５ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４の何れか；並びに、受動的に封入されたＦＵＤＲを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比率）リポソーム中のＦＵＤＲ保持の時間経過（ＣＰＴ−１１装填後）を、比較したグラフである。
【図３】ＨＢＳ、ｐＨ７．４の外側緩衝液溶液で、１００ｍＭグルコン酸銅、２２０ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７．４、又は、１５０ｍＭ 酒石酸銅、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４の何れか；並びに、受動的に封入されたＦＵＤＲを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０モル比率）リポソーム中へのＣＰＴ−１１の装填の時間経過を比較したグラフ。
【図４−Ａ】リポソームコレステロールを５モル％から２０モル％に増加させた際の、ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌリポソーム中のＣＰＴ−１１保持の時間経過を、比較したグラフである。２５０ｍＭ ＣｕＳＯ４を含むリポソーム内にＦＵＤＲを受動的に封入し、そして投与する前にＣＰＴ−１１を能動的に装填し、ＣＰＴ−１１濃度を測定した。
【図４−Ｂ】リポソームコレステロールを５モル％から２０モル％に増加させた際の、ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌリポソーム中のＦＵＤＲ保持の時間経過を、比較したグラフである。２５０ｍＭ ＣｕＳＯ４を含むリポソーム内にＦＵＤＲを受動的に封入し、そして投与する前にＣＰＴ−１１を能動的に装填し、ＦＵＤＲ濃度を測定した。
【図５−Ａ】種々のモル比率：１０：１（黒塗り四角）；５：１（黒塗り丸）；１：１（黒塗り三角）；１：５（黒塗り逆三角）；及び１：１０（白塗り丸）のＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１の組み合わせによる組み合わせ指数（ＣＩ）を、影響を受けたＨＴ−２９ヒト結腸直腸細胞の割合の関数としてプロットしたグラフである。
【図５−Ｂ】種々のモル比率：１０：１（黒塗り四角）；５：１（黒塗り丸）；１：１（黒塗り三角）；１：５（黒塗り逆三角）；及び１：１０（白塗り丸）のＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１の組み合わせによる組み合わせ指数（ＣＩ）を、影響を受けたＨ４６０ヒト大細胞悪性腫瘍細胞の割合の関数としてプロットしたグラフである。
【図５−Ｃ】種々のモル比率：１０：１（黒塗り四角）；５：１（黒塗り丸）；１：１（黒塗り三角）；１：５（黒塗り逆三角）；及び１：１０（白塗り丸）のＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１の組み合わせによる組み合わせ指数（ＣＩ）を、影響を受けたＨＣＴ−１１６ヒト結腸腺癌細胞の割合の関数としてプロットしたグラフである。
【図５−Ｄ】種々の型の細胞からのまとめられたデータ集合を、ＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１が１：５、１：１、及び１：１０モル比率での相対的相乗作用値の関数として示したものである。
【図６−Ａ】ＣＰＴ−１１及びＦＵＤＲ二重装填リポソーム並びに遊離薬剤カクテルとして、ＣＤ−１マウスに静脈投与後の時間の関数としての血漿中のＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１比率（モル／モル）のグラフである。
【図６−Ｂ】ＣＰＴ−１１／ＦＵＤＲ二重装填リポソームのＳＣＩＤ‐Ｒａｇ２Ｍマウスに静脈投与後の時間の関数としての血漿中のＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１比率（モル／モル）のグラフである。
【図７】ＣＰＴ‐１１（黒塗り丸）及びＦＵＤＲ（白塗り丸）の、グルコン酸銅を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１）リポソーム中への同時封入を示したグラフである。両薬剤は、５０℃で、リポソーム存在下の薬剤混合液を加熱することにより装填した。装填について、２時間の時間経過をモニターした。
【図８−Ａ】癌重量 対 ヒトＨＴ‐２９大腸腺癌細胞により癌細胞播種（続いて、生理的食塩水（対照；黒塗り丸）、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１相乗的比率の遊離薬剤カクテル（白塗り四角、黒塗り三角）、及び、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１相乗的比率のリポソーム製剤（白塗り逆三角）の投与を行った）後の時間のグラフである。
【図８−Ｂ】癌重量 対 ヒトＨＣＴ１１６大腸腺癌細胞により癌細胞播種（続いて、生理的食塩水（対照；黒塗り丸）、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１相乗的比率の遊離薬剤カクテル（黒塗り三角）、及び、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１相乗的比率のリポソーム製剤（白塗り四角）の投与を行った）後の時間のグラフである。
【図８−Ｃ】癌重量 対 ヒトＣａｐａｎ‐１膵臓癌細胞により癌細胞播種（続いて、生理的食塩水（対照；黒塗り丸）、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１相乗的比率の遊離薬剤カクテル（黒塗り四角、黒塗り逆三角）、及び、ＣＰＴ‐１１：ＦＵＤＲが１：１相乗的比率のリポソーム製剤（白塗り四角）の投与を行った）後の時間のグラフである。
【図１】
2006522026.tif 000005
【図２−Ａ】
2006522026.tif 000006
【図２−Ｂ】
2006522026.tif 000007
【図３】
2006522026.tif 000008
【図４−Ａ】
2006522026.tif 000009
【図４−Ｂ】
2006522026.tif 000010
【図５−Ａ】
2006522026.tif 000011
【図５−Ｂ】
2006522026.tif 000012
【図５−Ｃ】
2006522026.tif 000013
【図５−Ｄ】
2006522026.tif 000014
【図６−Ａ】
2006522026.tif 000015
【図６−Ｂ】
2006522026.tif 000016
【図７】
2006522026.tif 000017
【図８−Ａ】
2006522026.tif 000018
【図８−Ｂ】
2006522026.tif 000019
【図８−Ｃ】
2006522026.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月30日(2005.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの水溶性カンプトセシン及び少なくとも一つのフルオロピリミジンと安定に会合したグルコン酸銅含有リポソームを含む組成物であって、カンプトセシン／フルオロピリミジンのモル比が、適切な（relevant）細胞又は癌細胞ホモジネートに対して所望の細胞障害性、細胞分裂停止性、又は、生物学的効果を有する組成物。
【請求項２】
前記の適切な細胞又は癌細胞ホモジネートに対する所望の細胞障害性、細胞分裂停止性、又は、生物学的効果が、非拮抗的であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記水溶性カンプトセシン及びフルオロピリミジンが共封入されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記フルオロピリミジンを安定化させるのに十分なロイコボリンを更に含むことを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項５】
前記水溶性カンプトセシンがイリノテカン（ＣＰＴ‐１１）、トポテカン、９−アミノカンプトセシン、若しくは、ルルトテカンであるか、又は、前記水溶性カンプトセシンが水不溶性カンプトセシンの水溶性塩であることを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項６】
前記水溶性カンプトセシンが、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）又はトポテカンであることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記フルオロピリミジンが、フロキスウリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、又は、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）であることを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項８】
前記水溶性カンプトセシンがイリノテカンであり且つ前記フルオロピリミジンがフロキスウリジン又は５−ＦＵであることを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項９】
前記リポソームがフォスファチジルコリン含有脂質を含むことを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項１０】
前記フォスファチジルコリン含有脂質がＤＳＰＣ又はＤＡＰＣであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リポソームが、ホスファチジルグリセリン又はホスファチジルイノシトールを含むことを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項１２】
前記ホスファチジルグリセリンが、ＤＳＰＧ又はＤＭＰＧであることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが、ステロールを含むことを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項１４】
前記ステロールが、コレステロールであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記コレステロールが２０モル％より少なく存在することを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームが、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、及び、コレステロールを
含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リポソームが、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）を含むことを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項１８】
被検体に投与された場合に、リポソームと安定結合せずに前記カンプトセシン及び前記フルオロピリミジンが前記比率と同一で投与された場合の治療活性よりも大きな治療活性を実現することを特徴とする、請求項１−３の何れか一つに記載の組成物。
【請求項１９】
請求項２に記載の組成物を調製する方法であって、
ａ）  生物学的活性について、適切な（relevant）細胞培養アッセイ、無細胞アッセイ、又は、癌細胞ホモジネートアッセイにおいて、該比率の薬剤による影響を受けた細胞が１％より多い（ｆａ＞０．０１）濃度範囲のうち少なくとも５％の範囲において非拮抗的である該水溶性カンプトセシンとフルオロピリミジン剤のモル比を判定すること、及び
ｂ）  ステップａ）で非拮抗的であると判定されたモル比の水溶性カンプトセシン／フルオロピリミジンを該リポソーム内に封入すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記ステップｂ）の封入が、前記カンプトセシンの取り込みを達成するために、グルコン酸銅及び少なくとも一つのフルオロピリミジンとを含むリポソームを、少なくとも一つの前記水溶性カンプトセシンに接触させる事を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップｂ）の封入が、前記カンプトセシン及びフルオロピリミジンの取り込みを達成するために、グルコン酸銅を含むリポソームを、少なくとも一つの前記水溶性カンプトセシン及び少なくとも一つの前記フルオロピリミジンに接触させる事を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
被検体における疾病状態を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする被検体に治療上有効量の請求項１−３の何れか一つに記載の組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項２３】
前記被検体にロイコボリンを投与することを更に含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2006522026.tif 000021
2006522026.tif 000022
2006522026.tif 000023