(57)【要約】本発明は、完全長ニワトリＩＩ型コラーゲン(CCII)をコード化しているポリヌクレオチド配列、またはCCIIがコード化しているものと同様の同じ生物学的機能を有する、その断片を含んでいる配列番号1で表される核酸分子に関する。また、本発明は、CCIIを生産するための方法、及び関節リウマチ(RA)を治療および／または予防するための医薬の製造における、その使用に関する。特に、本発明は、本発明に記載される方法により調製されたCCIIを含有している、骨関節炎およびRAを治療および／または予防するための薬学的組成物に、食物または飲料の組成物に、および食品添加物の組成物に関する、また、遺伝子治療における本出願の核酸分子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全長CCIIをコード化しているポリヌクレオチド配列又はその断片（同じ生物学的機能を有する）を含む、配列番号1で表される単離された核酸分子。
【請求項２】
完全長CCIIをコード化している配列番号2で表されるポリヌクレオチド配列断片である、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項1記載の単離された核酸分子又はその断片（同じ生物学的機能を有する）によりコード化される、前記CCII又はその断片（同じ生物学的機能を有する）。
【請求項４】
請求項1または2記載の単離された核酸分子又はその断片（同じ生物学的機能を有する）を含む、組換え型発現ベクター。
【請求項５】
請求項4記載の組換え型発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、CCII又はその断片（同じ生物学的機能を有する）を発現できる宿主細胞。
【請求項６】
請求項3記載のCCIIを産生するための方法であって：  
i)適切な宿主細胞を請求項4記載の組換え型発現ベクターで形質転換することと；  
ii)前記宿主細胞を、適切な培養培地中で適切な培養条件下で培養することと；  
iii)前記培養培地または細胞から所望のタンパク質を分離すること及び精製することと；
を含む方法。
【請求項７】
請求項6記載の方法により調製されたCCIIの、RAを治療および／または予防するための医薬の製造における使用。
【請求項８】
骨関節炎およびRAを治療および／または予防するための薬学的組成物であって、請求項6記載の方法により調製された治療上効果的な量のCCII、および随意に薬学的に許容されるビヒクルを含有する薬学的組成物。
【請求項９】
食物または飲料の組成物であって、請求項6記載の方法により調製された特定量のCCIIを含有することにより特徴づけられる食物または飲料の組成物。
【請求項１０】
請求項6記載の方法により調製された特定量のCCIIを含有する食物添加物組成物。
【請求項１１】
RAを治療および／または予防するための方法であって、請求項1記載の核酸分子又はその断片（同じ生物学的機能を有する）を、それを必要とする被験者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、完全長ニワトリＩＩ型コラーゲン(CCII)をコード化しているポリヌクレオチド配列、またはCCIIがコード化しているものと同様の同じ生物学的機能を有する、その断片を含んでいる配列番号1で表される核酸分子に関する。また、本発明は、CCIIを生産するための方法、及び関節リウマチ(RA)を治療および／または予防するための医薬の製造における、その使用に関する。特に、本発明は、本発明に記載される方法により調製されたCCIIを含有している、骨関節炎およびRAを治療および／または予防するための薬学的組成物に、食物または飲料の組成物に、および食品添加物の組成物に関する、また、遺伝子治療における本出願の核酸分子の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
RA（高い発症率の自己免疫疾患）は、罹患した個体の健康を脅かす病気である。ＲＡの病因および病原に関して限定的な知識しかないため、炎症をコントロールすること、症状を緩和すること、および発症した関節の機能を維持することは、RAと診断された個体を治療する場合の主要な治療目標である。しかしながら、これらの治療は、関節傷害の予防の究極のゴールからは遠い。近年の新規の分子生物学技術によって、ＲＡの病原の理解に大きな前進がもたらされ、これにより新しい治療戦略への道が開かれている。
【０００３】
1993に、アメリカの科学者は、RA患者をCCIIを用いることにより成功裏に治療することを初めて報告した(Trentham DE，Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,et al. Science,1993,261: 1727-1730)、この発見は即座に世界中の注目を引いた。CCIIでの第III相臨床試験は、アメリカ、イギリス、およびフランスを含む、いくつかの先進国で進行している。我々は、公開された文献の広範囲の分析から、次の事項を結論づけた。その事項とは、新規の治療としての経口寛容アプローチ（oral tolerance approach）が、RAを治療することに関する我々の見込みを、その根本的原因および症状の双方を調査することにより、強化し得るということである(Trentham DE,Dynesius-Trentham RA,Orav EJ,et al.,Science,1993,261: 1727-1730)。
【０００４】
現在、これらの臨床試験は、終了まで未だ途中である。また、先進国の製薬会社は、困難な医薬承認プロセスを回避するために、CCIIを効果的な食品添加物に加工しはじめている。国際的に、天然のCCIIは、ＲＡに対する経口免疫寛容（oral immunological tolerance）の研究において投与されているが、この様式での使用は重篤な欠点を有する：1)取得されたCCIIの品質は、会社ごとに異なっている、同様に同じ会社のバッチ間で異なっている。これにより一貫した連続的な治療効果を保証することが困難となる；2)CCIIの継続的な抽出および調製は、時間がかかり、そして多量の供給源を必要とする。
【０００５】
発明者は、新しいアプローチを提唱する、具体的にはCCIIを産生することにより上記の問題を解決するための遺伝子工学方法である。我々は、CCOL2A1遺伝子をクローン化するための技術を開発した（それを組換え型CCIIを産生するために効率的に発現させることが可能である）。提唱される発明は、全長CCIIをコード化しているポリヌクレオチド配列-CCOL2A1 cDNAの成功裏の新規クローニングによるものである。
【発明の概要】
【０００６】
一側面において、本発明は、完全長CCIIをコード化しているポリヌクレオチド配列、または同じ生物学的機能を有する、その断片を含む、配列番号1で表される単離された核酸分子に関する。
【０００７】
別の側面において、本発明は、CCII、または同じ生物学的活性を有する、その断片に関し、これは上記の単離された核酸分子によりコード化される。
【０００８】
付加的に、本発明は、CCII、又はその断片（同じ生物学的機能を有する）をコード化している核酸分子を含有している組換え型発現ベクターに関する。
【０００９】
更に、本発明は、上述の組換え型発現ベクターで形質転換した宿主細胞を含む（これは、CCII、または同じ生物学的活性を有する、その断片を発現できる）。
【００１０】
更に、提唱される発明は、CCIIを産生するための方法を含み、該方法は以下の工程を含む：  
1)適切な宿主細胞を本発明の組換え型発現ベクターで形質転換することと；  
2)工程１で取得した宿主細胞を、適切な培養培地中で適切な培養条件下で培養することと；  
3)培養培地または細胞から所望のタンパク質を分離すること及び精製すること。
【００１１】
更に、本発明は、ＲＡを治療および／または予防するための医薬の製造における、提唱される発明により調製されたCCIIの使用に関する。
【００１２】
特に、本発明は、骨関節炎およびRAを治療および／または予防するための薬学的組成物に関し、これは本発明の方法により調製された、治療上効果的な量のCCII、および薬学的に許容されるビヒクルを含有する。  
また、本発明は、食物または飲料の組成物を含み、これは本発明に記載された方法により調製される、必要な量のCCIIを含有する。
【００１３】
また、本発明は、本発明の上述の方法により調製される、特定量のCCIIを含有している食品添加物組成物に関する。
【００１４】
更に、本発明は、遺伝子治療における、前記核酸分子及びその断片の使用を記載する。
【発明の詳細記載】
【００１５】
最近、経口寛容（特異的な免疫療法）は、自己免疫疾患の治療における、最も広範に研究された治療計画となっている。通常は、このプロセスには、タンパク質抗原の経口投与が含まれ、これは引き続いて非経口的な免疫化に使用され、これは次に穏やかな免疫応答を生じさせる。経口寛容の発生は、自己細胞抑制、クローンのアネルギーおよび欠失、および傍観者抑制（bystander suppression）を含む、幾つかの因子により媒介されると信じられている。治療の有効性を決定する付加的な因子には、用量、起源、抗原の特性、抗原の提示プロセス、および治療を受ける個体の遺伝および発育が含まれる。
【００１６】
我々は、公開された文献の包括的な分析から次のことを結論づけた：  
1)経口寛容は、ＲＡを処置するための新規の有望な方法を、その病因学および症状プロフィールを検査することにより開拓する;  
2)CCIIの経口寛容は、多くのRA患者において著しい治療効果を発揮する;  
3)CCIIは他種由来のCIIに対し、その治療効果において優れている、というのもCCIIはコンドロイチン硫酸Aおよびプロテオグリカンが豊富だからである。後者は、最大濃度のグルコサミン硫酸塩を有しており、これは強力な抗炎症性作用および軟骨を修復する能力を有する。特に、6から8週齢のニワトリは、最大のグルコサミン硫酸塩を有している;  
4)CCIIは、抗酸化活性を有するプロテオグリカンも豊富である(軟骨マトリックス糖タンパク質、CMGP、としても知られる)、これは軟骨細胞の酸化を減少させる；  
5)CCIIは、関節軟骨（arthroidal cartilage）のプロテオソーム消化を効果的に予防する、また傷害をうけた軟骨細胞およびサイトカインを回復させ、このようにして炎症の発生率を著しく低下させる；  
6)CCIIは、軟骨細胞およびプロテオグリカン双方の合成を促進し、関節における滑液およびヒアルロン酸の分泌を増加させる；  
7)CCIIは、強力な抗炎症剤および鎮痛剤である；  
8)CCIIは、安全で、毒性または副作用がない（特に現在利用可能な他のRA薬と比較した場合）。
【００１７】
現在、CCIIの経口投与により誘導される免疫寛容は、ＲＡに関する重要な新規の治療となっている。十分な量の高品質のCCIIを供給するために、我々は、遺伝子工学を用いて（天然物質からの伝統的な抽出および精製の代わりに）組換え型のCCIIを産生する。
【００１８】
提唱された発明は、CCOL2A1遺伝子のクローニングを含むものであり、これを発現させて組換え型のCCIIを産生した。このアプローチは、発現の成功以外においても、CCOL2A1遺伝子の我々の理解に同時に深く関わるものであった。現在まで、ヒト、イヌ、およびラット  COL2A1遺伝子が、首尾よくクローン化され、そして染色体上の位置が決定された、しかし、完全長CCOL2A1  ｃＤＮＡおよびゲノムDNAをクローン化し、染色体上の位置を同定し、多様な組織における構成的な発現を記載し、そして組換え型のCCOL2A1を誘導発現した研究はこれまでなかった。これらの報告（CCOL2A1のクローニングに関する）は、大きい薬用的、治療的、および経済的な価値を提供し得る。
【００１９】
CCIIをコード化しているcDNA配列は、相対的に長い。そのうえ、我々の前記遺伝子の機能的な領域についての理解は非常に限られている。それゆえ、CCIIの３重ラセン状領域をコードしているcDNAを取得することは、非常に重要である。この遺伝子を単離および増幅するためのＰＣＲの適用は次の事項から困難である。その事項とは、CIIが、複雑な二次構造、高度に反復性の配列、および高ＧＣ含量(平均ＧＣ含量>70%、いくつかでは80%程度高い）を有していることである(Nah DH,Upholt WB.,J Biol Chem,1991,266 34:23446-23452)。
【００２０】
それゆえ、CCII  3’ドメインにおけるｃＤＮＡ配列の制限酵素部位が解析された。この解析において、ｃＤＮＡを制限酵素で不完全に消化し、消化したｃＤＮＡのＣ末端ドメインのＰＣＲ増幅を適用した。CCIIをコード化しているｃＤＮＡ配列が長いとの理由から、我々は、前記ｃＤＮＡを５つの断片に分離した。そして各断片を別々にPCR増幅（少なくとも50bpオーバーラップさせて）することにより、SOE-PCRを用いた良好な末端連結が容認された。CCIIをコード化している遺伝子における高いGC含量のために、Taq酵素（この酵素は、特にGCリッチ内容物の増幅に特に適切である）が使用された。
【００２１】
取得した全長CCOL2A1  ｃＤＮＡは、4837bpであり、4260bpの翻訳領域(ORF)および520bpの3’非翻訳領域からなるものであった。前記ｃＤＮＡを、シークエンシングのためにpGEM-Ｔベクターに挿入した。その結果、前記ｃＤＮＡ配列がCCOL2A1に特異的であることが確認された（これはこれまで報告されていない）。前記配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース(AY046949)に登録された。
【００２２】
利用可能な文献により、次の事項が指摘される。その事項とは、CCIIゲノムDNAの構造は幾分複雑であるということであり、CCOL2A1ゲノムDNAにおける関連する如何なる研究も、現在でもなおこの事項を詳細に研究していない。このようなことから、全長CCOL2A1  ｃＤＮＡのクローニングの成功に続いて、我々は、CCOL2A1ゲノムDNAをクローン化し、解析した。それは、高いGC含有量、および頻繁に反復する配列、同様にプライマーに対する多くの非特異的な結合部位を含有するので、我々は、ニワトリ末梢血小体由来のDNAをPCRを介して増幅させたものから３’端の断片（5494bp）のみを最初に取得した(EDTAで抗凝固させた)、しかし、所望の遺伝子を取得することに失敗した（利用した、鋳型、プライマー、またはPCR増幅の条件とは関係なく）。さらにまた、我々は、ニワトリDNAライブラリから選抜したポジティブクローンを配列決定することにも失敗した（高いＧＣ含量およびPolyT構造が原因で）。
【００２３】
これを考慮して、我々は、既知のエキソン配列に基づいたシークエンシングに関する幾つかのプライマーを次に設計し、そしてCCOL2A1ゲノムDNAのシークエンシングに成功した。取得したDNA配列は、12003bp長であり、44イントロンにより隔てられた45エキソンを含有していた、これは（ＧｅｎＢａｎｋ探索で確認された）、CCOL2A1ゲノムに対してユニークであり、以前に報告されたことはなかった。同定された配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(アクセッションNo:AF452711）に提出されている。
【００２４】
CCOL2A1ゲノムDNAの配列解析は、次の事項を明らかに示した。その事項とは、イントロンまたはエキソンの何れかが、ニワトリＩ型およびIII型コラーゲンにおけるよりも著しく小さいということであり、これはUpholt(Ausar SF,Beltramo DM,Castagna LF,et al.,Rhematol Int.,2001,20 :138-144)により報告されたことと一貫しており;CIIは、進化を通して高度に保存され、そのアミノ酸は多様な種において92%相同であり、幾つかのものにおいては99%相同である。これに基づいて、我々は、イントロンの短い平均長（イントロンの全体数における減少よりも）によって、コンパクトなCCOL21遺伝子が説明されることを支持した。
【００２５】
CCOL2A1の関連する遺伝的なバイオインフォマティクスをよりよく理解するために、また、進化の特性における見識を得るために、クローン化されたCCOL2A1の完全長ｃＤＮＡの配列およびコードされるタンパク質の間で、および３重ラセン領域のｃＤＮＡおよびタンパク質の間で、それぞれイヌ(AF023169，AF242201)、ヒト(L10347)、ウグイ（speckled dace）(U23822)、およびラット(M65161)に関してMegAlign（Dnastarソフトウェアから）を用いて、相同性を解析した。これから、進化系統樹がGenedocを介して同定された。結果は次の事項を示していた。その事項とは、CCIIが、イヌCIIに対して最も相同性が高く(79.03%および94.77%、それぞれｃＤＮＡおよびアミノ酸に関して)、次にヒトCII(それぞれ、78.96%および93.89%)、そしてラットCII(それぞれ、77.38%および92.90%)であるということである。しかしながら、比較された５種の間で、ヒトおよびイヌのCIIは最大の相同性(91.89%および98.52%、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸に関して)を有し、ラットCIIは２番目に大きい相同性(それぞれ、88.63%および96.15%)を有している。
【００２６】
CCOL2A1  ｃＤＮＡおよびゲノムDNAの同定、同様に前記遺伝子の進化特性に続く、次の目的は染色体上のCCOL2A1遺伝子の正確な位置の同定であった。RHハイブリダイゼーション  マッピング（染色体上の遺伝子を位置決定する最も正確な方法として認識される）は、CCOL2A1遺伝子では不可能であった（ニワトリRHハイブリダイゼーション鋳型は、如何なる供給元からも利用可能ではなかったので）。細胞分裂期の間の染色体（ニワトリ末梢血小体に由来する）を、我々の染色体ＦＩＳＨ技術を用いて、ジゴキシン標識遺伝子断片（プローブとして機能する）でハイブリダイズした。統計分析により確認されたとおり、CCOL2A1をコードしている遺伝子は、ニワトリにおいて染色体4の短腕の第２領域内に位置し、ラットおよびヒトにおいて、それぞれ染色体8および12に位置していた(Barnett ML,Combitchi D,Trentham DE. Arthritis & Rheumatism,1996,39 4:623-628)。
コラーゲン（ＸＩ型およびII型のコラーゲンを除いて）が、多様な器官を通じて広く分布し、共有鎖を通常共有することが広く知られている。XI型コラーゲンは、ポリペプチドサブユニットα1、α2、およびα3を含有し、最後のものはα1(II)遺伝子発現の産物である;α3は、ＩＩ型コラーゲンのα1と水酸化リジンの含有量のみにおいて異なっている(Rousseau JC,Farjanel J,Boutillon MM、et al.,J Biol Chem,1996,271(39): 23743-8)。XIII型コラーゲンはＣＩＩの膜貫通タンパク質であり、そのゆえ彼らは、類似するポリペプチド残基から構成される(Snellman A,Keranen MR,Hagg PO,et al. J Biol Chem、2000,275(12):8936-44)。
【００２７】
ニワトリ胚の進化および発生におけるCCOL2A1の重要な役割を理解するために、RT-PCRおよびELISAを実施して、胚および成熟組織の双方におけるCCOL2A1の発現を包括的および系統的に解析した。我々の結果は、次の事項を示唆している。その事項とは、胚において、CCOL2A1 mRNAは、心臓、肝臓、硝子体、角膜、皮膚、胸筋、胸骨、小腸、関節軟骨、メニスカス、および頭蓋に発現しているが、しかし脾臓、胸腺、または精巣の何れにも発現していないということである。成体ニワトリにおけるCCIIタンパク質レベルの検出は、次の事項を示している。その事項とは、胸骨および関節軟骨における発現に加えて、CCIIタンパク質は脾臓および小腸の双方においても発現しており;最高レベルの発現は関節軟骨において認められている（次に胸骨が続く）。しかしながら、次の事項に注意することが重要である。その事項とは、CCII発現を検出するプロセスにおいて、ペプシンおよびエラスターゼにより消化した場合、CIIはα鎖短ペプチドを産生できるということである。この理由から、α1(II)鎖を含有しているコラーゲンは、CCIIのモノクローナル抗体と結合し、偽陽性標識化を生じる。結果として、我々がＸＩ型およびXII型コラーゲンを同時に検出した可能性は、排除されなかった。
【００２８】
CCOL2A1エキソンのスプライシングはかなり複雑であり得る（特にCIIエキソンＩＩ）ことを強調すべきである、というのもそのスプライシングは異なる組織において変化しているからである。我々は、高いＣＩＩ発現を有する軟骨組織からのＮ末端ドメインでのエキソン２のスプライシングを分析した（胸骨および関節軟骨、同様に、非軟骨組織、例えば、心臓、肝臓、胸筋、小腸、硝子体、および角膜を含む）。17日目のニワトリにおいて、エキソン2は、胸骨、メニスカス、および関節軟骨においてCCIIをコード化しているｃＤＮＡには存在していなかったが、しかし、非軟骨組織（例えば、心臓、肝臓、硝子体、角膜、小腸、筋肉、皮膚、および胸筋）には存在していた。しかしながら、RT-PCRの結果は、エキソン2  mRNAが硝子体および角膜には存在していないだろうことを指摘している。さらにまた、<14d胚からの硝子体は、第２エキソンのみを含有しており、これは発生学的な発生の17日目で明らかに非存在（notably absent）であった。これは、多様な組織におけるエキソン2の異なるスプライシングを最初に報告するものである。
【００２９】
前述の現象は、次の通り説明され得る。つまり、CCIIの第２エキソンは、軟骨組織には存在しないが、しかし、非軟骨組織（例えば、心臓、肝臓、角膜、小腸、筋肉、および皮膚）には存在している。加えて、制御配列がCIIコラーゲンに存在している；これは異なる組織において及び異なる発生段階においても、CIIの発現に干渉できる。CCII（内部組織全体に初期に広範に分布する）は、ニワトリの成長および発生の間に軟骨組織にのみ最終的には限定される。最終的に、大量のCCIIは、発生しているニワトリ胚の胸骨に認められ、これは軟骨の石灰化により徐々に減少する(Young MF,Vogeli G,Nunez AM,et al.,Nucleic Acids Res,1984,12 (10): 4207-4228; Marshall GE,Konstas AGP,Lee WR.,BrJ Ophthalmol,1993,77:515-524)。現在の見解は、CCIIが硝子体及び軟骨の双方において発現していることを支持しているが(Seery CM,Davision PF.，Invest Ophthalmol Vis Sci,1991,32:1540-1550；Huerre-Jeanpierre C,Mattei MG,Weil D,et al.，Am J Hum Genet,1986,38(1): 26-37)、しかし、この見解はCCIIが硝子体において検出不可能であるとの我々の発見とは矛盾している。
【００３０】
本発明の目的を達成するため、我々はCCIIをコード化しているｃＤＮＡのクローニングに成功し、本遺伝子の染色体の位置を決定した。また、我々は、遺伝子発現プロフィール、ゲノムDNAのクローニング、およびCCOL2A1のバイオインフォマティクスを分析した。特に、完全長CCIIをコード化しているｃＤＮＡのクローニングの成功は重要である、というのもそれにより本発明の強固な基礎（solid foundation）が提供されるからであり、これによって我々は、組換え型CCIIを、引き続いてRAを治療するための新規の薬剤を遺伝子工学アプローチを用いて産生することが可能である。
【００３１】
本発明は、CCIIをコード化している配列番号１のヌクレオチドを含む、全長ポリヌクレオチド配列、および／または同じ生物学的機能を有する断片に関する。
【００３２】
また、本発明は、単離された核酸分子によりコードされたCCII、および／または同じ生物学的機能を有する生じた断片、又はその保存された変異体に関する。
タンパク質またはポリヌクレオチドの「変異体」は、１以上の修飾されたアミノ酸またはヌクレオチドを有している同じものをコード化している、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。ここで修飾には、アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入、または置換が含まれる。変異体は保存された修飾を有していてもよい；ここでオリジナル配列は、類似する構造および化学的特性の別の１つによって置換される。係る変更には、例えば、イソロイシンに対するロイシンの置換、または非保存の変化（例えば、グリシンに対するトリプトファンの置換）が含まれてもよい。
【００３３】
「欠失」は、前記アミノ酸配列またはヌクレオチド配列における、１以上のアミノ酸またはヌクレオチドが削除されることを意味する。
【００３４】
「挿入」は、オリジナルのアミノ酸またはヌクレオチド配列に対する、１以上のアミノ酸またはヌクレオチドの付加を意味する。
【００３５】
「置換」は、1以上のアミノ酸またはヌクレオチドが多様なアミノ酸またはヌクレオチドで置き換わることを意味する。
【００３６】
「生理活性」は、タンパク質が、天然の分子と、同じ構造、制御的な又は生化学的な機能を有していることを意味する。
【００３７】
「類似度」は、対応するポジションにおけるアミノ酸残基が、同じであるか、または特定の類似の程度で保存されていることを意味する。保存された置換において使用されるアミノ酸には、次のものが含まれる：陰性に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む）；陽性に荷電したアミノ酸（リジンおよびアルギニンを含む）；電荷がなく且つ頭部基（head group）に類似する親水性（hydrophily）を有しているアミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリンを含む）；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；フェニルアラニンおよびチロシン。
【００３８】
「単離された」は、物質のそのオリジナルの環境からの除去を意味し、例えば、生きた動物における天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されていない。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、幾つかの又は全ての、天然のシステムにおける、その共存物質から分離できる。係るポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ベクターまたは組成物の部分であってもよく、これも単離される（彼らは、天然の環境のコンポーネントではないので）。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAとして存在してもよい。後者には、ｃＤＮＡ、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれる。DNAは、二重鎖またはシングル鎖(センス鎖および／またはアンチセンス鎖)であり得る。特定のポリペプチドをコード化しているポリヌクレオチド配列は、配列番号１と同じであってもよい、または冗長な遺伝暗号による異なる配列（これは配列番号２の成熟ポリペプチドをコードする）であってもよい。
【００４０】
更に、本発明は、配列番号２の、アミノ酸配列、ポリペプチド断片、およびアナログをコード化しているポリヌクレオチドの変異体に関する。これらには、ポリヌクレオチド変異体、天然の対立遺伝子変異体、または非天然のポリヌクレオチド変異体が含まれる。
【００４１】
発明されたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、特異的なフラッグ配列と同じ読み枠で融合させた（これによって前記ポリペプチドの精製を促進できる）。細菌宿主を用いた場合、前記フラッグ配列はpQEベクターのヒスチジンマーカーであってもよく（前記マーカーと融合させたポリペプチドの精製を促進するために）。また、前記フラッグ配列は、哺乳類宿主(例えば、サル腎臓線維芽細胞のCOS-7株化細胞)からの赤血球凝集素(HA)マーカーであってもよい。加えて、発明されたポリペプチドをコード化しているポリヌクレオチド配列は、特定の前記シグナルペプチドに対して同種性または異種性の配列からなるものであってもよく、これにより原核細胞または真核細胞の膜からの所望のタンパク質の分泌が援助される。このプロジェクトに関与する技術者は次の事項を認識している。その事項とは、前述のフラッグ配列およびシグナルペプチド配列を、組換え的方法により又は化学的なプロセスにより、前記ポリペプチドを発現するベクターに挿入できるということである。
【００４２】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードしているポリペプチド、その活性化断片、アナログ、および変異体に関する。
【００４３】
本発明は、配列番号２のポリペプチドアミノ酸配列および活性フラグメント、アナログ、および誘導体に関する。配列番号２  ポリペプチドと同じ生物学的活性を有する断片は、基本的に保存された生物学的な機能または活性を有する断片である。
【００４４】
本発明において調製されるCCIIは、組換え型タンパク質、ポリペプチドまたは断片、誘導体、およびアナログである。特に、配列番号2の、ポリペプチド断片、変異体、またはアナログは、次のものであってもよい:  
(i)保存された又は非保存のアミノ酸残基で置換された(保存されたアミノ酸残基が好ましい)、１もしくは数個のアミノ酸残基を有するポリペプチド；ここで置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号にコードされてもよく又はされなくてもよい。例えば、CCIIの突然変異体または均等物は、前記アミノ酸残基を挿入すること、置換すること、および／または欠失させることによって取得し得る。保存された置換は、アミノ酸残基の均等の電荷、溶解度、疎水性、および／または両親媒性に関連する類似性に基づく（それがCCIIの活性を維持する限り）；または  
(ii)置換された基を含有する１若しくは数個のアミノ酸残基を有する、ポリペプチド；または  
(iii)成熟ポリペプチドまたは他の機能的な化合物；例えば、前記ポリペプチドの半減期を増加させる能力を有する化合物(例えば、ポリエチレングリコール)により融合されたポリペプチド；または  
(iv)成熟ポリペプチドおよび他のアミノ酸配列と融合されているポリペプチド（これにより、前記成熟タンパク質の精製に有用なアミノ酸およびタンパク質の配列が与えられる）。精製に有用な構造には、NTAミールティーアフィニティークロマトグラフィー（例えば、固定化金属上での精製のためのヒスチジン-トリプトファンモジュール）；固定化免疫グロブリン精製の分野に関するプロテインＡ構造、およびFLAGSエクステンション／アフィリエーション精製システム(IMMUNEX社, シアトル, Wash)に関する分野の構造が含まれる。また、XAエンテロキナーゼに特異的なジャンクション配列は、タンパク質精製において有用である(Porath,J. et al. (1992)、Prot.Exp.Purif. 3:263-281)。
【００４５】
本発明のテキストにおいてCCIIは、配列番号2のCCII（即ち、成熟ポリペプチド）、配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも90%の類似度を有している（90%同一性が好ましい)ポリペプチド、および、より好ましくは少なくとも95%類似度を有している（95%同一性が好ましい）ポリペプチドを含む。それは、少なくとも30アミノ酸、好ましくは少なくとも50アミノ酸以上を有している、前記ペプチドの部分を含む。
【００４６】
前記ポリペプチド、その保存的変異体、及び生理活性断片及びその変異体は、ペプチドの通常の合成（例えば、ペプチドの固相合成）により調製できる(Merrifield J. (1963)、J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154; Roberge,J. Y. et al. (1995) Science,269:202-204)。タンパク質の合成は、手で又はApplied Biosystems431APerkin Elmerによって実施できる。本発明におけるCCIIは、天然のバイオマテリアルを分離および精製して取得し得るが、前記ポリヌクレオチドを用いたDNA組換えが好ましい。
【００４７】
通常のDNA組換えに基づいて、本発明のポリヌクレオチド配列を使用することにより、組換え型のCCIIを発現させた又は調製した。このように、本発明は、本発明のCCIIを産生するための方法に関する。前記方法は以下を含む:  
(1)CCII、又は前記ポリヌクレオチドを含んでいる組換えベクターをコード化しているポリヌクレオチド(又はその変異体)で、宿主細胞を形質転換すること  
(2)適切な条件下および適切な培養培地において、宿主細胞を培養すること  
(3)培養培地または細胞から所望のタンパク質を分離すること及び精製すること  
【００４８】
また、本発明は、ポリヌクレオチドを含んでいる組換えベクター、前記ベクターを含んでいる宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドの調製物に関する。
【００４９】
前記ポリヌクレオチドを使用することにより、多様な組換え技術を用いてポリペプチドを産生することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは前記ポリペプチドを発現させるために選択された任意のベクターに存在し得るものであり、染色体性、非染色体性、および合成されたＤＮＡ配列、例えば、SV40変異体、細菌性プラスミド、ファージDNA、類酵素プラスミド（zymoid plasmid）、プラスミドおよびファージDNAに由来するベクター、ウイルスDNA、バキュロウイルス、牛痘ウイルス、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、およびPRV、並びに、pQEシリーズ(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNHシリーズ(ストラタジーン)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(ファルマシア)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(ストラタジーン)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(ファルマシア)を含むが、これらに限定されない。しかしながら、どんなプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で再生および生存できる場合のみ使用できる。
【００５０】
また、本発明は、結果的に生じた、発明されたポリヌクレオチドを含有している組換え型の構築物を含み（これにはベクター、例えば、前述のプラスミドまたはウイルスベクターが含まれ）、これに前記ポリヌクレオチド配列がフォワードまたはリバースの配向に挿入される。また、前記構築物は、制御配列、例えば、前記ポリヌクレオチド配列(構成的および誘導性のプロモーターを含む)に効果的に連結されるプロモーターを含み、そして下流配列の転写を媒介する。前記プロモーターは、以下を含むが、これらに限定されない：λファージのPLプロモーター、バキュロウイルス多角体のタンパク質プロモーター；細菌プロモーター、例えば、LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、およびtrp;真核生物プロモーター、例えば、CMV早期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、早期および後期SV40  prプロモーター、レトロウイルスLTRおよびラットメタロチオネインIプロモーター;並びに植物ゲノムに由来するプロモーター、例えば、熱ショックタンパク質(HSP)およびRUBISCOプロモーター。
【００５１】
発現ベクターは、リボゾームに対する結合部位および翻訳の開始に必要な転写ターミネーター、並びに発現を促進するために適切な配列、例えば、プロモーターを刺激する、約10-300bpのエンハンサー（DNAに対するシス作動性因子）、例えば、SV40における複製起点後の100-270bpのエンハンサー、早期サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー、複製開始点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含有する。加えて、好ましいベクターは、１若しくは数個の選択的な耐性および／またはマーカー遺伝子を含み、これにより形質転換された宿主細胞のスクリーニングを促進するための表現型が提供される；選択遺伝子、例えば、trpBおよびhisDは、インドールまたはヒスチジノールを用いた場合に有用である(Hartman,S. C.,and R.C.Mulligan (1988) Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 85:8047-51)、ヘルペスウイルス  TKおよびAPRTはtk-またはaprt-細胞に対して(Wigler,M. et al. (1977) Cell 11:223-32) (Lowy,I. et al. (1980) Cell 22:817-23)；耐性遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFRはメトトレキセートに対する耐性を賦与する(Wigler,M. et al(1989),Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,77:3567-70)またはネオマイシンおよびG-418に耐性を賦与するnpt(Colbere-Garapin,F. et al. (1981) J.Mol.Biol.,150:1-14)、同様にテトラサイクリンおよびアンピシリンの耐性遺伝子。哺乳類の発現ベクターは、一般に、複製開始点、プロモーター、エンハンサー、およびリボゾームに対する必要な結合部位、ポリアデニル化部位、ドナーおよびレセプターを集合させるための部位、転写終結配列、および5’に隣接した非転写配列からなる。SV40由来の集合配列およびポリアデニル化部位のDNAは、必要な非転写遺伝要素を提供するだろう。加えて、ポリペプチドをコード化しているポリヌクレオチド配列を含んでいるベクターは、特定の前記シグナルペプチドの同種性または異種性の配列を含み得るだろう、これにより原核細胞または真核細胞の原形質膜からの所望のタンパク質の分泌が援助される。我々の技術者は、次の事項を認識している。その事項とは、前記ベクターおよび構築物におけるフラッグ配列およびシグナルペプチドを、前記ポリヌクレオチドに多様な組換え又は化学的な方法によって付加できるということである。
【００５２】
当業者は、どのように適切なベクターおよびプロモーターを選択するかについて精通している。細菌に関するベクターは、以下のように構築することが可能である:所望のタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列（翻訳の開始および終結シグナルと共に）が、プロモーターを含んでいる動作可能な読み枠に挿入される。前記ヌクレオチド配列、同様に転写および翻訳の制御因子を如何に構築するかについては、当業者に周知である。これらの方法には、インビトロDNA組換え、合成、およびインビボ遺伝的組換えが含まれる(Sambrook,J. (1989),Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor Press; Plainview,N.Y.;Ausubel,F.M. (1989) Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.)。
【００５３】
前述のDNA配列、プロモーター、または制御配列は、宿主を形質転換して、タンパク質を発現させるために適切である。
【００５４】
ベクターのカテゴリーおよび特性に基づいて、如何に適切な宿主を選択して、所望のタンパク質を発現させるかについても当業者の知識範囲内である。発現させるポリペプチドに適切な宿主は、以下を含むがこれらに限定されない：原核宿主、例えば、大腸菌、桿菌、ストレプトマイセス属；真核生物宿主、例えば、Saccharomyces、コウジカビ属；昆虫の細胞、例えば、ショウジョウバエS2およびヤガ科Sf9；動物細胞、例えば、CHOおよびCOS(Gluzman)(Cell 23:175,1981)および前記ベクターを発現可能な他の細胞株、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、Bowesメラノーマ細胞；植物の細胞、アデノウイルス、など。加えて、哺乳類細胞の多様な培養システムは、組換えタンパク質の発現に適切である。
【００５５】
組換え産物は、前述のヌクレオチド配列を含有している前記ベクターまたは構築物を、宿主細胞に挿入することにより取得できた；このことは、伝統的な方法、例えば、塩化カルシウムによる形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、粒子の衝突を用いること、または粒子銃を用いることにより行われ、訓練された個人により実施されるべきである(Sambrook,J.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor Press; Plainview,N.Y.; Ausubel,F.M. (1989) Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.; Hobbs,S. et al.,McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill,N.Y.191-196; Engelhard,E.K. et al,Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,91:3224-3227; Logan,J. et al,Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,81:3655-3659)。
【００５６】
形質転換された宿主の株または細胞は、適切な細胞密度にまで培養され。そして選択されたプロモーターが、適切な方法（例えば、温度を変更すること、および化学物質の添加）を用いて誘導される。前記細胞は、訓練された人物によってさらに培養される。
【００５７】
適切なプロモーターのコントロール下で、成熟タンパク質を、哺乳類細胞、酵母、細菌、および多様な他の細胞において同様に発現させることができる。それらをDNA構築物由来のRNAから、無細胞翻訳システムを用いることによって産生することも可能である(Sambrook,J. (1989),Molecular cloning: a laboratory manual,the 4th part,18th chapter,Cold Spring Harbor Press; Plainview,N.Y.)。
【００５８】
前記細胞および培養溶液は、一般的に遠心分離の手段で収穫される。所望のタンパク質が前記細胞内に含有される場合、任意の簡便な物理的、化学的、または酵素的な方法を使用することができる、これには反復性の凍結融解、超音波処理、機械的粉砕、細胞溶媒または特異的なよごれ細胞（smudge cells）を用いることが含まれる。この場合において、粗製の抽出物は、将来の精製のために保存される。所望のタンパク質が細胞から分泌される場合、ルーチンの方法を使用して、それらを上清から直接的に収穫することが可能である。前述の方法は、当業者の知識範囲内である。
【００５９】
前記ポリペプチドを組換え細胞の培養物から回収および精製するための方法には、硫酸アンモニウムおよびエタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、容量排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびフィトアグルチニンクロマトグラフィーが含まれる。タンパク質間のオーバーラップは、彼らに彼らの天然のコンホメーションを形成させるために必要である。通常、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびキャピラリー電気泳動法(CE)を、最終的な精製工程に使用することができる。
【００６０】
本発明は、ポリヌクレオチド配列から調製されたCCIIの、RAの治療および／または予防における薬学的な使用に関し、これには前記核酸分子のコード化領域または部分断片、例えば、全長配列、部分配列、および変異体が含まれ、その全てはCCII又はその機能的な断片を効率的に発現するだろう。
【００６１】
本発明は、骨関節炎およびRAを治療および／または予防するための薬学的組成物に関し、これは本発明に記載された方法により調製された、治療上効果的な量のCCII、および随意に薬学的に許容されるビヒクルを含有する。
【００６２】
また、本発明は、食物または飲料の組成物に関し、これは本発明に記載された方法により調製される、特定量のCCIIを含有することにより特徴づけられる。CCIIから作出された健康食品または添加物は、骨関節炎およびRAに有益なものであると判定されるだろう。
【００６３】
本発明は、食物添加物組成物に関し、これは本発明に記載された方法にしたがって調製される、特定量のCCIIを含有する。
【００６４】
また、本発明は、遺伝子治療における、前記核酸分子又はその断片の使用に関する。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例は、例示の目的で記載され、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６６】
包含される技術に関するプロトコール（分子生物学、生化学、および免疫学を含む）は、分子クローニング（Molecular Cloning, 2nd edition）のガイドに全てしたがった；制限酵素および緩衝剤に関する消化条件は、製造者の説明書にしたがって使用された。インキュベーション時間は、特に他で述べないかぎり1h、37℃であった、そして、このような場合においては、製造者の使用説明書にしたがって変化させた。
【００６７】
実施例1  ―  ニワトリ胚胸骨からのトータルRNA抽出  
卵を殺菌した後に、17日齢のSPFニワトリ胚(Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences)を、冷たい生理食塩水中に収穫および洗浄した。前記胸骨を、単離し、氷上TRIzol溶液中で粉砕し、1.5mlエッペンドルフチューブ中で室温で10minインキュベーションし、1000xgで10min、4℃で遠心分離した。  
上清をDEPC処理したエッペンドルフチューブに移した。各チューブに200μlクロロホルムを添加（次に抽出混合物）し、インキュベーションを室温で10min行い、そして遠心分離を1000xgで10min、4℃で行った。  
水相を、新しいエッペンドルフチューブに移した。各チューブに同じ容量のイソプロパノールを添加し、インキュベーションを室温で10min行い、遠心分離し、洗浄を75%エタノールで行い、ＲＮＡ分解酵素フリーの水に溶解し、そして-80℃で保存した（逆転写のために）。
【００６８】
ｃＤＮＡ合成  
ｃＤＮＡを、トータルRNAから、3’RACEキット(TAKARA)におけるオリゴT-3サイトアダプタプライマーをアンチセンスプライマーとして用いて合成した。逆転写に続いて、混合物を95℃で5minインキュベーションして、逆転写酵素を失活させた。ｃＤＮＡを-20℃で保存した（更なる実験のために）。
【００６９】
CCOL2A1  Ｃ末端プロペプチドをコード化しているｃＤＮＡのＰＣＲ増幅  
既知のCCOL2A1 Ｃ末端UTR配列にしたがって(Sandell LJ,Prentice HL,Kravis D,Upholt WB.,J Biol Chem,1984,259 (12) 7826-7834)、CCOL2A1 Ｃ末端プロペプチドをコード化している配列をcol2a1-2Fおよびcol2a1-2Rプライマーを用いて増幅した(表1)。PCR反応は、50μl最終溶液中で実施した（この溶液は、1μl(20pmol/μl)の各プライマー、10xPCR緩衝剤、5μlの25mM  MgCl2、1μlの10mM  dNTPs、2.5μlの100%グリセリン(終濃度5%)、2μlのｃＤＮＡ、および0.8μlのTaqポリメラーゼを含む）。  
PCR条件は  
96℃を10min、次に  
30サイクルの、96℃を1min、62℃を1min、72℃を3min  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。  
増幅した産物を、1%アガロースゲルで分離し、ゲル抽出キット(インビトロゲン)を用いて回収し、pGEM-T Easyベクター(プロメガ)にクローン化し、DH5α中に形質転換し、ABI377自動シークエンサーで配列決定した。
【００７０】
CCOL2A1 3’UTR  ｃＤＮＡクローニング  
既知のCCOL2A1遺伝子配列にしたがって、CCOL2A1 3’UTRセンスプライマーcol2a1-1F(表1)を設計し、増幅した。3’RACE戦略を用いて、対応する3部位のアダプタプライマー(col2a1-1R)を逆転写して3’UTRを増幅した。反応混合物は、PCR緩衝剤およびプライマーcol2a1-1R（3部位アダプタプライマーを有する）を含む。  
PCR条件は  
4サイクルの、96℃を1min、62℃を1min、72℃を30s  そして  
26サイクルの、96℃を30s、62℃を30s、72℃を20s  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。  
増幅した産物を、回収し、上記のとおり形質転換した。
【００７１】
C COL2A1  N-プロペプチド  ｃＤＮＡクローニング  
5’Nプロペプチドをコード化している遺伝子を、センスプライマーcol2a1-5Fおよびアンチセンスプライマーcol2a1-5Rを用いて増幅した。PCRを、PCR緩衝剤中で実施し、アニーリングおよび伸展工程を同じ温度で実施した。  
PCR条件は  
30サイクルの、96℃を5min、96℃を1min、72℃を50s  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。
【００７２】
組換え型プラスミドベクターの構築および配列決定  
プラスミド抽出、制限酵素消化、ゲル抽出、ライゲーション、形質転換、組換え型プラスミドの構築、および同定を分子クローニングにしたがって実施した(Molecular Cloning, 2nd edition Sambook J,Fritsch EF,Maniatis T. Molecular cloning:a laboratory manual. 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。構築されたCCOL2A1  cDNAフラグメント、SOEで連結したCCOL2A1 cDNAフラグメント、および完全長CCOL2A1を、pGEM-T(プロメガ)に挿入した。挿入物を、制限酵素消化し、配列決定した。
【００７３】
プラスミドの構築および調製  
PCR産物を、クイックゲル抽出キットを用いて回収し、電気泳動法（1%アガロースゲルにおいて）により分離した。増幅させたバンドをゲルから切り出し、標的遺伝子をクイックゲル抽出キットを用いて回収した。プロセスは以下の通り:
【００７４】
1)標的遺伝子を含有しているゲルを、エッペンドルフチューブに入れて、1mlのL1溶液剤を添加し、およびインキュベーション（ウォーターバス中、50℃で15min）し、前記ゲルを完全に溶解させた。  
2)溶解したゲルをカラムに入れて遠心分離（10000xg、2min）し、500μlのL1を添加し、インキュベーション（室温、1min）し、上記のように遠心分離した。  
3)700μlのL2を混合物に添加し、インキュベーション（室温、5min）し、上記のように遠心分離した。  
4)混合物を更に遠心分離（10000xg、2min）し、エタノールを揮発させた。  
5)カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し、30μlの熱い(~70℃)TE緩衝剤を添加し、インキュベーション（室温、2min）し、遠心分離（10000xg、2min）した。精製した標的DNAを、採集バイアルへと通過させた。ゲルから回収したDNAを、電気泳動法（1%アガロースゲル）により分離した。確認した濃度は、40μg/μlであった。
【００７５】
標的DNAおよびpGEMTベクターのライゲーション:10μｌのライゲーションシステム（5μｌの2xライゲーション緩衝剤、3μｌの標的DNA、1μｌのＴベクター、1μｌのT4  DNAリガーゼを含んでいる）を、混合し、インキュベーションした（4℃、一晩）。
【００７６】
コンピテントE.coli  DH5αを、分子クローニング（2nd edition）に記載のように調製した。  
組換え構築物を使用して、DH5αコンピテント細胞を形質転換した：4μlの上記で構築したベクター  pGEMT-col2a1-1（(2，3，4，5 etc.）)を、100μlの新たに調製したコンピテント細胞に添加し、氷上で30minインキュベーションし、熱ショックを42℃で90s施し、次にインキュベーションを氷水中で2-3min行い、900μlのLB（アンピシリンなし）を添加し、160rpmで45min振盪（37℃で）し、4μlの1M  IPTGおよび16μlの50mg/ml  X-galをLB/アンピシリン寒天プレートに添加した。E.coli（挿入物を含有する）を、前記プレート上に広げ、インキュベーション（37℃、16h）を適切なサイズのコロニーが出現するまで行った。
【００７７】
ポジティブ形質転換体のスクリーニング  
アンピシリンLBプレート（IPTG/X-galを有する）上の白色コロニーを、取り上げ、LB溶液（200μg/mlアンピシリンを有する）に播種し、インキュベーションを振盪させながら37℃(200rpm)で12h行い、次にプラスミド抽出を行った。  
工程6:選択された数個の白色コロニーの選抜  
【００７８】
上記に記載された方法を用いて、本発明は、pGEMT-col2a1-2、pGEMT-col2a1-1、pGEMT-col2a1-3、pGEMT-col2a1-(1+2)、pGEMT-col2a1-5、およびpGEMT-col2a1-4を作出した。
【００７９】
プラスミドをプロメガA7500キットを用いた20μlの消化系（1μlの10xNotＩおよびNcoＩ制限酵素、1μlの0.1%BSA、8μlのプラスミド、および8μlの水）で切断することにより、ポジティブコロニーを同定した。混合物を、インキュベーション（37℃で2h）し、次に電気泳動（1%アガロースゲル）し、配列決定（ABI377自動シークエンサーにより）した。
【００８０】
完全長ニワトリCCOL2A1  ｃＤＮＡのスプライスオーバーラップエクステンション-ポリメラーゼ連鎖反応  
完全長CCOL2A1 ｃＤＮＡを取得するために、本研究は構築に関してSOE-PCR戦略を使用した（(Horton RM,Hunt HD,Ho SN,et al.,Gene,1989,77:61-68）)。この手順は、４回必要とされた（PCRの４つの段階に必要）。  
第１のPCR反応は、pGEMT-col2a1-2、pGEMT-col2a1-1  PCR産物（テンプレートとして）、col2a-2Fおよびcol2a1-1R（センスおよびアンチセンスプライマーとして）、およびPfu  ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、産物を共に連結し、産物col2a1-(2+1)を得た。  
PCR条件は  
4サイクルの、96℃を5min、96℃を1min、60℃を1min、および72℃を150s、そして  
26サイクルの、96℃を30s、58℃を30s、72℃を130s  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。
【００８１】
第２のPCRは、プラスミドpGEMT-col2a1-3、pGEMT-col2a1-(1+2)  PCR（テンプレートとして）、col2a-3Fおよびcol2a1-1R（センスおよびアンチセンスプライマーとして）を使用した。  
PCR条件は  
4サイクルの、96℃を5min、96℃を1min、64℃を1min、および72℃を120s、そして  
26サイクルの、96℃を30s、62℃を1min、72℃を90s  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。
【００８２】
第３のPCRは、col2a-5Fおよびcol2a1-4R（センスおよびアンチセンスプライマーとして）、col2a1-5およびcol2a1-4プラスミドPCR産物（テンプレートとして）を使用した。PCR条件は  
4サイクルの、96℃を5min、96℃を1min、62℃を2min、72℃を120s、そして  
26サイクル、96℃を1min、60℃を1min、72℃を90s  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。
【００８３】
第4のPCRは、col2a-5Fおよびcol2a1-1R（センスおよびアンチセンスプライマーとして）、前の3回のPCR連結されたPCR産物(col2a1-5+4、col2a1 1+2+3)をテンプレートとして使用して、完全長col2a1  ｃＤＮＡを得た。  
PCR条件は  
4サイクルの、96℃を5min、96℃を1min、62℃を2min、72℃を210s、そして  
26サイクル、96℃を1min、62℃を1min、72℃を280s  および  
最終の伸長を72℃で7minであった。
【００８４】
完全長ニワトリCCOL2A1 ｃＤＮＡのクローニングに使用されたプライマーは、表1に示される。
【００８５】
【表１】
2006512063.tif 000002
【００８６】
本発明は、SOE-PCR戦略を利用することにより、完全長ニワトリCCOL2A1 ｃＤＮＡを取得した。ニワトリCCOL2A1遺伝子における高いＧＣ含量のため、高いＧＣ含量の増幅に適切な緩衝剤を増幅処理の間に使用した。増幅された産物は、高い特異性を有しており、そしてpGEM-Tベクターに挿入された。前記ベクターは、E.coli DH5中で複製され、制限酵素（プロメガから供給された）で消化され、形質転換され、配列決定された。上記のプライマーは、製造者（Shanghai Bioasia Biotech Co）により合成され、配列決定は、タカラ社が実施した(Takara Co., Dalian、中国)。結果は、配列表の配列番号1に示される。
【００８７】
実施例2  ―  ニワトリゲノムDNAの調製  
ニワトリゲノムDNAを、WizardゲノムDNA精製キット(プロメガ)を用いて抽出した（製造者の使用説明書に従った）。抽出したDNAの純度は、分光光度計(ベックマン、DU（登録商標）640)を用いて、1.6-1.8の260/280  OD値であった。
【００８８】
ニワトリCCOL2A1ゲノムDNAのPCRに基づくクローニングおよびライブラリスクリーニング  
PgFおよびPgRを、CCOL2A1 Ｃ末端クローニングのセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用した。プライマーの配列は、以下の通りであった:PgF 5’ CCA GGC AAG GAT GGC GCA CG 3’；PgR 5’CCT GAT CGG CTC CGC CAA TGT CCA TAG G 3’。CCOL2A1ゲノムDNAのPCRを、LA Taqポリメラーゼを用いて、GC緩衝剤中で実施した。PCR産物を0.8%アガロースゲル電気泳動で検査し、標的遺伝子断片をゲルスライスからゲル抽出キットを用いて回収し、pGEM-Tベクターに挿入した。挿入物を、制限酵素消化し、配列決定した。CCOL2A1ゲノムDNAの高いＧＣ含量およびpolyT構造のために、CCOL2A1ゲノム配列のＮ末端の断片クローニングをトータルDNA（全血から抽出された）を用いてSOE-PCR法で実施した。そしてスプライスして、ほとんど完全長のCCOL2A1ゲノムDNA配列を産生した。
【００８９】
最初に、我々は、末梢性ニワトリ血液から抽出したDNAをPCRを介して増幅することにより、5494bp断片（CCOL2A1 ３’末端）を得た。そして増幅した産物の特異性は、非常に高かった(図1-9)。前記断片を、pGEM-Ｔベクターに挿入し、pGEM-T/CCOL2A1を得て、そして配列決定して確認した。
【００９０】
配列決定の結果は次の事項を示した。その事項とは、ニワトリCCOL2A1ゲノムDNAの3’端が、部分的な三重ヘリックス形成領域、3’末端ペプチド、およびプロペプチドを含有していることである。クローン化されたゲノム領域は、19イントロンおよび20エキソンを含有していた。
【００９１】
しかしながら、３’末端をこえるゲノム配列のなかに、（使用した、テンプレート、プライマー、およびPCR条件にかかわらず）、標的遺伝子配列は取得できなかった。その後、ポジティブコロニー（ゲノムのニワトリDNAライブラリから選抜された）を、配列決定した。しかし、高いＧＣ含量およびPolyT構造により、配列決定のプロセスが制限され、配列決定シグナルの中断を生じた。
【００９２】
従って、我々は、既知のエキソン配列を利用して、多数のプライマーを設計して、CCOL2A1ゲノムDNA配列決定を完了した。最終的に、我々は、12523bp長のCCOL2A1ゲノムDNA配列を取得し、これは54エキソンおよび53イントロンを含有していた。前記エキソンおよびイントロンは、表2に示される。取得されたニワトリCOL2A1３’端  遺伝子の構造は、図2に示される。データーベースにアクセスした後に、次の事項が明らかとなった。その事項とは、前記ゲノムDNA配列が、CCOL2A1ゲノムに属すること、及び、これまで報告されていなかったことである。関連する遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(アクセッションNo:AF452711）に提出されている。
【００９３】
【表２−１】
2006512063.tif 000003
【表２−２】
2006512063.tif 000004
【００９４】
実施例3  ニワトリCCOL2A1α1（ＩＩ）  組織における特異的発現
ニワトリ胚におけるCCOL2A1発現スペクトル  
CCOL2A1 3’ UTRは、Blastデータベース検索を介して、CCOL2A1に属することが確認された。それゆえ、CCOL2A1  ｃＤＮＡ 3’UTRを増幅させる対象として使用して、発生しているニワトリ胚におけるα１（ＩＩ）発現を調査した。心臓、肝臓、硝子体、角膜、皮膚、胸筋、胸骨など（17日齢のニワトリ胚における）を、RT-PCRを用いて分析した。プライマーは、col2a1-1Fおよびcol2a1-1Rであった（表1にリストされる）。前記PCR産物を、pGEMT-easyベクターに挿入し、制限酵素消化の後に配列決定した。同時に、GAPDHを内部コントロールとしてプライマーPFGAPDH 5’ GC AGA GGT GCT GCC CAG AAC 3’；PRGAPDH 5’ TCA CTC CTT GGA TGC CAT GTG 3’を用いて増幅し、412bpのGAPDH断片を産生した。
【００９５】
17日齢ニワトリ胚CCOL2A1 3’ UTRのRT-PCRから取得された結果を用いた際に、ニワトリ胚CCOL2A1 mRNAは、心臓、肝臓、硝子体、角膜、皮膚、胸筋、胸骨、小腸、関節軟骨、メニスカス、および頭蓋骨に発現していたが、しかし脾臓、胸腺、および精巣(図3)では検出されなかった。
【００９６】
成体ニワトリＩＩ型コラーゲンの発現スペクトル  
4週齢ニワトリの心臓、肝臓、脾臓、腎臓、硝子体、角膜、皮膚、胸筋、メニスカス、膵臓、胸腺、小腸、胃、精巣、骨格筋、大脳、小脳、関節軟骨、胸骨、および肺におけるＩＩ型コラーゲンを、天然ＩＩ型コラーゲン検査キット(Chondrex)を用いたELISAにより分析した。各々の凍結サンプルの５mgを、ホモジナイズし、0.8mlの50mM酢酸-0.2M塩化ナトリウム(pH2.9-3.0)に溶解し、100μlの20mg/mlペプサーゼ(シグマ)で4℃で48h消化し、次に250μlの10xTSBを添加した。pHを1M NaOHを用いて8.0に調整し、サンプルを100μlの2mg/mlエラスターゼ(シグマ)中で4℃で一晩インキュベーションし、10000xgで5min（4℃で）遠心分離した。沈殿物を廃棄し、上清の容量を1mlに調整し、そして沈殿物を排出（discharging）し、上清を1mlに調整し、そして4℃で保存した（将来の実験のため）。
【００９７】
抽出されたニワトリＩＩ型コラーゲンを、サンドイッチELISAで分析した。ニワトリＩＩ型コラーゲン分子の異なるエピトープに対する、２つのモノクローナル抗体を使用した。一方はコーティング抗体として使用され、他方は酵素標識検出抗体として使用された。最初に、ELISAプレートを捕獲抗体で被覆した（4℃、一晩）、次に3回洗浄、サンプルの1:200希釈、被覆したELISAプレートへのサンプルおよび標準の充填、インキュベーション（37℃で2h）、洗浄（上記のように）、ビオチン標識抗ニワトリＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体の各ウェルへの添加、インキュベーション（37℃で2h）、洗浄（上記のように）、酵素抱合型ストレプトアビジンの添加、インキュベーション（37℃で、1h）、洗浄（激しく）、OPD溶液剤（37℃で）の発色のための添加、酵素反応の1.25M硫酸での停止、OD490値の分析を行った。詳細なプロトコールは、キットの説明書(The Arthrogen-CIA（登録商標）自然ＩＩ型コラーゲン検出キット(Chondrex))に記載されていた。
【００９８】
天然のII型コラーゲン分析（成体ニワトリの20器官における）の結果は次の事項を示した。その事項とは、ニワトリＩＩ型コラーゲンが胸骨、関節軟骨、膵臓、および小腸に発現するが、しかし、他の器官には発現しないということである(図4)。
【００９９】
ニワトリの天然ＩＩ型コラーゲンを標準として用いて、濃度  vs  吸光度の標準曲線を作成することにより、関連する陽性組織におけるニワトリＩＩ型コラーゲンの発現レベルを計算した(図5)。
【０１００】
標準曲線に基づいた、ニワトリＩＩ型コラーゲンの発現レベルは、0.4%（胸骨において）、1.5%(4週ニワトリの関節軟骨における最高レベル)、0.84%（膵臓において）、および0.2%（小腸において）であった。
【０１０１】
実施例4  ―  ニワトリCCOL2A1 5’ プロペプチドエキソン2のスプライシング分析  
CCOL2A1エキソン2（ニワトリ胚からの組織における）のスプライシング分析を、RT-PCRを用いて実施した。皮膚、肝臓、硝子体、角膜、胸筋、小腸、胸骨、関節軟骨などから抽出したmRNA、並びにcol2a1-5およびcol2a1-5R  センスおよびアンチセンスプライマー（表1にリストされる）をRT-PCR分析に使用した。PCR産物の特異性は、1%アガロースゲル電気泳動により決定された。RT-PCRの結果は、次の事項を示した。その事項とは、ニワトリCCOL2A1 5’ Nプロペプチドのエキソン2は、スプライスされ、心臓、肝臓、硝子体、角膜、胸筋、および小腸で転写されるが、しかし、軟骨組織（例えば、胸骨および関節軟骨）においては転写されないことである(図6)。
【０１０２】
実施例5  ―  ニワトリCCOL2A1遺伝子染色体のマッピング  
正確にCCOL2A1を染色体にマップするために、インサイチュー  ハイブリダイゼーション(ISH)およびキット(DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II、ロシュ)を用いて、3’-UTR ニワトリCCOL2A1遺伝子の遺伝子断片をジゴキシンをプローブとして標識し、中期染色体をハイブリダイズして染色体をマップした。統計分析の後、ニワトリCCOL2A1遺伝子が染色体4p2に局在することが示された(図7、8、および9)。
【０１０３】
実施例6  ―  ニワトリCCOL2A1相同比較  
ニワトリCCOL2A1のＩＩ型コラーゲン三重ラセン体形成領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の相同性を、ＧｅｎＢａｎｋから検索した多様な種〔例えば、イヌ(AF023169、AF242201)、ヒト(MM001844)、ゼブラフィッシュ(U23822)、およびマウス(M65161)〕のものと、DNASTAR Megalignソフトウェア(DNASTAR,Inc.)を用いて比較した。系統樹を、Genedocプログラムを用いて作図した(図10)。
【０１０４】
結果は次の事項を示している。その事項とは、ニワトリCCOL2A1のアミノ酸およびｃＤＮＡ配列が、それぞれ79.03%および94.77%の相同性をイヌCIIに対して有していること（このことは系統発生学において最大の相同性を有していることを示唆している）；次はニワトリおよびヒトの間で、78.96%および93.89%の同一性を示していることである。ヒトおよびイヌの間の相同性は、これら５種の間の最大同一性である、アミノ酸の91.89%同一性およびｃＤＮＡの98.52%同一性を示しており、次はヒトおよびマウスの間であり、それぞれ88.63%および96.15%同一性を示している。系統樹が、比較結果を示すため及び相同性を分析するため構築された。
【０１０５】
実施例7  ―  組換え型CCOL2A1  ｃＤＮＡの発現  
本実験に使用された材料、試薬、および器具は、以下に示される：  
発現ベクター  pPIC9K、pPIC9、pPICZαA、B、C、および酵母株、Pichia pastoris GS115およびX33、酵母およびPichiaのためのスフェロプラストキット、EasyCompTMを、インビトロゲンから購入した;リョクトウヌクレアーゼをNEBから購入した;ミニプロテアン2電気泳動法システムおよびセミドライ電気泳動転写は、バイオラドから；Gel-Proイメージ分析機器システムV3.1はMedia Cybemeticから；DU640  核酸およびタンパク質分析器はベックマンから購入した。
【０１０６】
1)真核生物性発現ベクターpPICZαB/CCOL2A1の構築  
真核生物性発現ベクターは、以下の通り構築された:PCRを、プライマー(配列25 5’GGT ACC TTG GTG GAA ACT TTG CGG 3’)および(配列26 5’GGT ACC GTT ACA AGA AGC AGA CTG 3’)、およびpGEM-T/CCOL2A1をテンプレートとして用いて実施した。PCR混合物は、25μlの2xGC緩衝剤Ｉ、4μlのdNTP(2.5mM)、0.5μlの20μMプライマーを含有していた。  
PCR条件は  
96℃を5min後、次に  
4サイクルを、96℃を1min、62℃を1min、72℃を3min  および  
26サイクルを、96℃を1min、65℃を30s、72℃を2.5min  および  
最終の伸長を72℃で5minであった。  
回収したPCR産物を、pPICZαB発現ベクターに挿入し、発現ベクターpPICZαB/CCOL2A1における挿入物の正確な方向性をBamHI消化により決定した。
【０１０７】
2）酵母発現ベクターpPIC9K/CCOL2A1の構築  
pPICZαB/CCOL2A1ベクターの酵母 P.pastorisにおける発現の安定性および量を改善させるために、CCOL2A1断片を高コピーベクターpPIC9Kに挿入することにより、pPIC9K/CCOL2A1を作出した。構築手順は、本願に添付される図面に示される。要約すると、pPICZαB/CCOL2A1を、KpnIで消化して直線化し、次にマングビーン（mung bean）ヌクレアーゼで消化してブラントエンドを生じさせる。同時に、pPIC9Kをブラントエンド酵素  SnaBIで消化した。２つの断片を、T4  DNAリガーゼで連結し、発現ベクターpPIC9K/CCOL2A1を生じさせ、オープンリーディングフレームをシークエンシングにより確認した。
【０１０８】
3)P.pastoris GS115調製プロトプラスト形質転換法  
前記酵母を前記プロトプラスト法を用いて形質転換した:  
a)P.pastoris GS115をYPDプレート上にストリーク接種により広げ、次にインキュベーションを30℃で2d処理し、5mlのYPD培地に選択したコロニーを播種し、インキュベーションを30℃で300rpmで撹拌して一晩行った。  
b)1:1000希釈した細胞懸濁液を、100mlのYPDに播種し、インキュベーションを30℃で行い、300rpmでOD600が0.2-0.3に達するまで撹拌し、次に1,500xgで5min遠心分離し、上清を排出した。  
c)前記細胞を、20ml滅菌水、20mlSED、および20ml  1Mソルビトールで１回洗浄し、次に遠心分離を1500xgで5min行った。上清を各洗浄の後に廃棄した。前記細胞を、20mlのSCEに再懸濁し、10mlを各々AおよびBチューブに分配した。  
d)800μlの15%SDSを各1.5mlエッペンドルフチューブに添加し、標識を0、2、4、5、6、8、9、10、15、18、20、25、30、35、40行い、これはZymolyaseにおいて細胞を良好に消化した時間を示している(min)。200μl細胞懸濁物をAチューブから取得し、Zymolyase消化時間のコントロールのために凍結した。7.5μlのZymolyase(2.25units)を、Aチューブに添加し、若干混合し、30℃で保持した。  
200μlの消化した細胞を、Aチューブから各時間に（標識にしたがって）採取し、800μlの5%SDSとエッペンドルフチューブ中で混合し、氷上に静置して酵素反応を停止させる。  
e)各時間ポイントで形成しているプロトプラストのパーセンテージを、次の式を用いて計算した：プロトプラスト%=100-[(OD800(min)/OD800(0min)x100)。この式を使用して、70%のプロトプラストが形成される時間(t、min)を計算した。7.5μlのZymolyaseをＢチューブに添加して、30℃でt時間保持した。  
f)前記プロトプラストを、750xgで10min遠心分離した。上清を廃棄し、プロトプラストをそれぞれ10mlの1Mソルビトールおよび10mlのCaSで洗浄し、上清を廃棄し、プロトプラストを0.6mlのCaSに形質転換のために再懸濁した。
【０１０９】
4)pPIC9K/CCOL2A1およびpPICZαB/CCOL2A1でのGS115プロトプラストの形質転換  
a)約10μgの直線化したpPICZαB/CCOL2A1およびpPIC9K/CCOL2A1を、100μlの新たに調製したプロトプラストと穏やかに撹拌し、次にインキュベーションを室温で10min行った。pPIC9K/GS115およびpPICZαB/GS11ブランクベクターを、ネガティブコントロールとして使用した。  
b)1mlの新たに作ったPEG/CaT(1:1)溶液を添加し、穏やかに撹拌し、次にインキュベーションを室温で10min行った。  
c)サンプルを750xgで10min遠心分離し、上清を出来る限り除去した。細胞を、150μlのSOSに再懸濁し、インキュベーションを20min行い、その後850μlの1Mソルビトールを添加した。  
d)各150μlの形質転換したプロトプラストを、10mlのRD寒天培地と混合し、RDBプレートの上方に広げ、インキュベーションを28-30℃で4-6d行い、その後に結果を取得した。  
5)pPICZαB/CCOL2A1/GS115およびpPIC9K/CCOL2A1/GS115ポジティブ形質転換体スクリーニング  
培養したpPIC9K/CCOL2A1/GS115およびpPICZαB/CCOL2A1/GS115は、RDBプレート上で約100形質転換体に成長した。高いコピー数を取得するために、各形質転換体を、多様な濃度のG418またはZeocin(G418濃度:0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml；Zeocin濃度:100μg/ml、200μg/ml)を含有しているプレートに移すことにより、高コピー数を選抜した。
【０１１０】
6)酵母ゲノムDNAの抽出、および酵母ゲノムにおける統合された標的遺伝子のPCRによる同定  
耐性形質転換体およびブランクベクターを、2mlのYPDに播種し、30℃での培養および300rpmでの振盪を2d行った。ゲノムDNAを抽出し、挿入物をCCOL2A1 ｃＤＮＡを特異的なプライマーとして用いたPCRで検出した（該プライマーは以下のものである）:F:5’GGTACC TTG GTG GAA ACT TTG CGG 3’, R:5’GGTACC GTT ACA AGA AGC AGA CTG 3’。  
PCR条件は  
96℃を5min、次に5サイクルの、96℃を1min、60℃を2min、72℃を3min、そして  
25サイクルの、96℃を1min、58℃を1min、72℃を2min  および  
最終の伸長を72℃で5minであった。
【０１１１】
7)pPICZαB/CCOL2A1/GS115およびpPIC9K/CCOL2A1/GS115メタノール誘導発現およびウエスタンブロット分析  
陽性と同定されたコロニーを30mlのBMGY培地に播種し、インキュベーション（28℃で）および振盪（300rpmで）した（2d）。細胞を、遠心分離で集め、1/10容量のBMMYで再懸濁し、次に更にインキュベーション（28℃で）および振盪（300rpmで）した。メタノールを、容量の1%まで添加した（24hのインターバルで）。上清および酵母を、4d誘導した培地から収穫した。上清を、透析し、脱塩し、凍結乾燥した。酵母からの細胞溶解産物を、1/4容量のガラスビーズでボルテックスすることにより調製し、次に遠心分離で収集した。誘導された細胞溶解産物および上清を、10%SDS-PAGE電気泳動法で分離し、ニトロセルロースフィルターへ転写した。フィルターを、20%FBSで（4℃、一晩）ブロックし、95D1Aに対するモノクローナル抗体(1:1000)でインキュベーションを室温2h実施し、TTBSで３回（各5min）洗浄した。フィルターを、ヤギ抗マウスAP抱合型2℃抗体で室温2hインキュベーションし、そして上記のとおり再び洗浄した。シグナルを、NBT/BCIP試薬キットを用いて検出した。
【０１１２】
結果：  
各々の誘導された発現ベクターからの上清（上記）を、脱塩し、濃縮し、10%SDS-PAGE電気泳動法およびウエスタンブロット分析で同定した。結果は次の事項を明らかにした。その事項とは、80KDバンド（CCOL2A1α鎖を示す）は、pPICZαB/CCOL2A1形質転換体の細胞質にのみ存在した(図11A)；CCOL2A1α鎖の完全な発現は、ウエスタンブロット分析により、pPIC9K/CCOL2Aの細胞質で検出されたが(図11B)、しかし、上清では検出されなかった。
【０１１３】
実施例8  ―  プロリル4-ヒドロキシラーゼαおよび／またはβサブユニットの構築  
1)プロリル4-ヒドロキシラーゼαサブユニット(P4Hα)  ｃＤＮＡクローニング  
ニワトリP4Hα遺伝子配列にしたがって、プライマーa:5’AGA TAC TGC TAC GAA AGA CCC CGA G 3’およびb:5’ CTC TCT TGG TTG TAG CCC TCA TCT G 3’を設計した。PCR系は、5μlの10ｘPCR緩衝剤、5μlの25mM  MgCl2、4μlの2.5mM dNTP Mix、0.5μlの20μMプライマー、1μlのｃＤＮＡ、0.5μl Taq、および水を最終的な容量の50μlまで含有した。PCR産物を、1%アガロース電気泳動法で検査した。  
PCR条件は  
96℃を5min、次に4サイクルの、96℃を1min、72℃を3min  および  
26サイクルの、96℃を1min、69℃を1min、72℃を2min  および  
最終の伸長を72℃で3minであった。
【０１１４】
2)pPIC9K/P4Hα真核生物性発現ベクターの構築  
上記のP4HαPCR産物をpGEM-Tと連結することにより、pGEM-T/P4Hαプラスミドが産生された。NotI制限部位は、PCRにより導入された。プライマーa:5’GCG GCC GCA GAT ACT GCT ACG AAA G 3’およびb:5’GCG GCC GCC TCT CTT GGT TGT AGG 3’、およびPfu ＤＮＡポリメラーゼをPCRに使用した。PCR産物は、ポリAテールを付与され、pGEM-Ｔベクターと連結され、配列決定された。標的断片を、pGEM-T/P4HαをNotIで消化した後に回収した。P4Hα遺伝子断片とpPIC9Kベクター（NotIで直線化された）とをT4 DNAリガーゼを用いて連結することにより、pPIC9K/P4Hα発現ベクターを産生した。挿入物の方向性を同定した。
【０１１５】
3)P4Hβ  ｃＤＮＡクローニングおよび組換え型発現ベクター構築  
既知のニワトリP4Hβサブユニット遺伝子配列にしたがって、プライマーF:5’GCG GCC GCA CAG CCC CTG GAG GAG 3’およびR:5’GCG GCC GCG GTG ATG TAG ATC AGT C 3’を設計し、NotI制限酵素認識部位を導入した。RNAを、17日齢ニワトリ胚の胸骨から抽出し、RT-PCRをした。1.5mM[Mg2+]を、PCRシステムに使用した。
PCR条件は  
96℃を5min、次に4サイクルの、96℃を1min、53℃を1min、72℃を2min  および  
26サイクルの、96℃を30s、51℃を30s、72℃を2min  および  
最終の伸長を72℃で5minであった。  
PCR産物を、配列決定のためにpGEM-Tに挿入した。正確な配列を有するコロニーを、pPIC9発現ベクターに挿入し、pPIC9/P4Hβ発現ベクターを産生した。
【０１１６】
実施例9  ―  pPIC9K/P4Hα、pPIC9/P4Hβ、およびpPICZαB/CCOL2A1の酵母GS115における共発現  
実施例7および8に記載された発現ベクターpPIC9K/P4Hα、pPIC9/P4Hβ、およびpPICZαB/CCOL2A1を、Bgl II、Sal I、およびPmel Iで直線化した。10μgの直線化したベクターでGS115を形質転換した。形質転換体を、MMプレート（G418およびZeocinを含有している）上で30℃で4-6d培養した。
【０１１７】
実施例10  ―  ダブル発現ベクターpPICZαA/P4Hα-βの構築  
pPIC9K/P4Hα、pPIC9/P4Hβ、およびpPICZαB/CCOL2A1の共発現の間、ポジティブクローンは不安定であった。上記の構築物の欠陥を克服するために、P4HαおよびP4Hβを同じ発現ベクターpPICZαAに構築し、pPICZαA/P4Hα-P4Hβダブル発現ベクターを作出した。
【０１１８】
実施例8および9におけるプラスミドpGEM-T/P4HαおよびpGEM-T/P4Hβをテンプレートとして用いて、PCRを実施した。プライマーの配列は、P4Hα:F:5’GCGGCCGC GAT ACT GCT ACG AAA G3’; R:5’GCGGCCGC CTC CAA CTC TGA TAA C 3’; P4Hβ:F:5’GCGGCCGC CAG CCC CTG GAG GAG -3’;およびR:5’ GCGGCCGC TTA ATC ATC ATC AGC 3’であった。  
PCR条件は  
96℃を5min、次に  
4サイクルの、96℃を1min、66℃を80s、72℃を90s  および  
26サイクルの、96℃を1min、64℃を40s、72℃を50s  および  
最終の伸長を72℃で5minであった。  
PCR産物は、1%アガロースゲル電気泳動法で検査した。特異的な標的断片を、回収し、pGEM-Teasyに挿入し、配列決定した。
【０１１９】
配列決定により確認されたpGEM-T/P4HαおよびpGEM-T/P4Hβを、Not Iで消化し、pPICZαAと連結し、組換え型発現ベクターpPICZαA/P4HαおよびpPICZαA/P4Hβを作出した。  
P4Hβ完全な発現単位を、pPICZαA/P4Hβから切り出し、pPICZαA/P4Hαに挿入した。Bgl IIおよびBam HIはアイソシゾマーなので、これらの部位はBgl IIで直線化されたpPICZαA/P4Hαと連結させることができ、これによりダブル発現ベクターpPICZαA/P4Hα-βが作出される。
P4Hβ発現単位は上流に位置するので、PCR使用して、P4Hαおよびβの方向性が一致しているかどうかを検査した。P4Hαを増幅するための上流プライマー(5’ GCGGCCGC CAG CCC CTG GAG GAG 3’)および下流プライマー(5’ GCGGCCGC CTC CAA CTC TGA TAA C 3’)をPCRに使用した。挿入物の方向性が正しい場合、4644bpのPCR産物が出現するだろう、そうでなければ、いかなる発現バンドも出現しないだろう。
【０１２０】
実施例11  ―  pPIC9K/CCOL2A1およびpPICZαA/P4Hα-βの共発現  
pPIC9K/CCOL2A1およびpPICZαA/P4Hα-βで、GS115を共形質転換し、３つの遺伝子の発現を研究した。プロトプラスト調製、ポジティブ形質転換体スクリーニング、PCR同定、およびメタノール誘導を、上記のように実施した。  
上清およびサイトライセート（cytolysates）における、誘導されたpPICZ(B/CCOL2A1/GS115およびpPIC9K/P4Hβ)共発現産物を、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析により同定した。図12は、完全長のCCOL2A1（鎖はサイトライセートにのみ発現していたが、しかし、上清にはなかった）を示している。
【参照文献】
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【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図1は、本発明におけるCCIIをコード化している遺伝子のPCRクローニングを示す。
【図２】図2は、本発明における全長CCIIの構造を示す。
【図３】図3は、ニワトリ胚からの、CCIIをコード化している遺伝子の3’非翻訳領域(UTR)のPCR結果を含む。
【図４】図4は、CCIIをコード化している遺伝子の組織特異性を示す。
【図５】図5は、CCII濃度-吸光度の標準曲線を示すグラフである。
【図６】図6は、CCIIをコード化している遺伝子のエキソンのスプライシングの分析を示す。
【図７】図7は、CCIIをコード化している遺伝子の染色体バンドを示す。
【図８】図8は、染色体の分裂期像を示す。
【図９】図9は、ISHハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１０】図10は、ヒト、イヌ、ラット、ニワトリ、およびウグイの間の進化系統樹の相同性比較を示す。
【図１１Ａ】図11は、pPIC9K/CCOL2A1(A)およびpPICZαB/CCOL2A1(B)により誘導された、上清および細胞質における発現産物のウエスタンブロット分析を示す。Mはタンパク質マーカー、1-5は陽性のバンド、および6はブランクベクターコントロールである。
【図１１Ｂ】図11は、pPIC9K/CCOL2A1(A)およびpPICZαB/CCOL2A1(B)により誘導された、上清および細胞質における発現産物のウエスタンブロット分析を示す。Mはタンパク質マーカー、1-5は陽性のバンド、および6はブランクベクターコントロールである。
【図１２】図12は、pPICZαB/CCOL2A1/GS115およびpPIC9K/P4Hα  pPIC9/P4Hβの共発現のWB分析である。Mはタンパク質マーカー、1-5は陽性のバンド、および6はブランクベクターコントロールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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