(57)【要約】本発明は、個体における癌のスクリーニングおよび／または検出および／またはモニタリング方法であって、個体からの少なくとも１の排出物、例えば、唾液中のＴＩＭＰ−１の濃度により示される第１のパラメーターを決定すること特徴とする方法に関する。本発明は、血液試料を使用せずに、個体における癌の早期診断、癌の再発のモニタリング、および／または癌または癌治療の状態のモニタリングを容易ならしめることに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における癌の検出および／またはスクリーニングおよび／またはモニタリング方法であって、個体からの少なくとも１の排出物、例えば、唾液中のＴＩＭＰ−１の濃度により示される第１のパラメーターを決定すること特徴とし、前もって決められた識別値よりも大きい第１のパラメーターの存在が、個体が癌または癌の進行を有する可能性が高いことを示すものである方法。
【請求項２】
癌が乳癌、前立腺癌、大腸癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、外陰部の癌、および幹細胞カルシノーマ、最小残存性疾患ならびに再発性の癌からなる群より選択されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
排出物が唾液である上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４】
第１のパラメーターがＴＩＭＰ−１の全濃度である請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
第１のパラメーターが全ＴＩＭＰ−１の濃度と遊離ＴＩＭＰ−１の濃度との組み合わせである請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
組み合わせが記号論理学的回帰分析により行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
健康な対照集団および癌を有することが知られている集団の両方における少なくとも１の排出物中のＴＩＭＰ−１の全濃度を決定することにより識別値が決定され、そのことにより、前もって決定された特異性または前もって決定された感度にて癌の集団を同定する識別値が決定される、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
個体からの排出物中のいずれかの形態のＴＩＭＰ−１とは異なる癌のマーカーの濃度を示す少なくとも１つの第２のパラメーターを決定することをさらに特徴とする、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
第１および第２のパラメーターが組み合わされて組み合わされたパラメーターが得られ、前もって決定された識別値よりも大きい組み合わされたパラメーターの濃度の存在が、個体が癌を有する高い可能性を有することあるいは癌を進行させている高い可能性を有することを示すものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
健康な対照集団および大腸癌を有することが知られている集団の両方における少なくとも１の排出物中の組み合わされたパラメーターを決定することにより識別値が決定され、そのことにより、前もって決定された特異性または前もって決定された感度にて癌の集団を同定する識別値が決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１および第２のパラメーターの組み合わせが記号論理学的回帰分析により行われる請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの第２のパラメーターが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の濃度である請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
濃度の決定がイムノアッセイまたは活性のアッセイにより行われる上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１４】
イムノアッセイがＥＬＩＳＡである上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１５】
活性のアッセイがザイモグラフィーである上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１６】
初期段階の癌を検出するための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１７】
初期段階の大腸癌を検出するための請求項１６に記載の方法の使用。
【請求項１８】
転移性の乳癌を検出するための請求項１６に記載の方法の使用。
【請求項１９】
癌の治療に対する応答をモニターするための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
癌の再発をモニターするための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２１】
ＴＩＭＰ−１に特異的な抗体を含む第１の色表示ゾーンを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を行うためのディップスティック。
【請求項２２】
第１のゾーンが少なくとも１つの試薬をさらに含み、該試薬が少なくとも１の排出物中のＴＩＭＰ−１濃度に依存してゾーン中の可視的な色の変化を生じうるものである、請求項２１記載のディップスティック。
【請求項２３】
排出物中に通常存在する少なくとも１種の物質と反応することができ、そのことにより、スティックが正当に使用されることをコントロールするためにゾーン中に可視的な色の変化を提供する第２の色表示ゾーンをさらに含む、請求項２１または２２に記載のディップスティック。
【請求項２４】
ＣＥＡに特異的な抗体を含む第３の色表示ゾーンをさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のディップスティック。
【請求項２５】
第１のゾーンが、少なくとも１の排出物中のＣＥＡ濃度に依存してゾーン中の可視的な色の変化を生じうる少なくとも１の試薬をさらに含むものである、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、個体における癌の早期検出、スクリーニングおよび／またはモニタリング方法に関する。
【０００２】
癌患者の長期の生存に影響する重要な因子は、癌が検出される段階である。かかる患者の治癒率および長期生存により示されるように、早期検出によって転移が起こる前に迅速かつ完全な悪性物の除去が可能となる。
【０００３】
さらにそのうえ、癌が検出された場合に、癌の拡大の早期検出、治療後の癌の再発ならびに治療に対する応答は癌患者の生存にとり重要である。
【０００４】
早期検出の最良の方法は、危険性があると考えられる患者の日常的なスクリーニングである。しかしながら、現在のスクリーニング方は成功率がばらついている。それらは費用がかかりすぎ、そして／あるいは広く用いるには信頼性がないという可能性がある。いずれの場合においても、多くの癌に関し、利用可能な実用的な検出方法はない。ある種の癌、例えば胃癌および大腸癌はずっと多くの通常の悪性でない病気と矛盾しない徴候を示すという事実を考え合わせると、この問題は、初期段階での検出を困難なものとしている。
【０００５】
大腸癌（ＣＲＣ）は現在米国で４番目にありふれた癌であり、癌に関連した死亡の第２位の原因である。大腸癌の疾病率および死亡率の低下は、初期段階の大腸癌の検出および治療ならびに大腸癌の前駆体である腺腫様ポリプの同定および除去により成し遂げられ得るという証拠がある。
【０００６】
現在、大腸癌を診断するための唯一の方法は大腸内視鏡を用いることであるが、一般的に適用されるスクリーニング手法としては実用的でない。さらにそのうえ、疾病はやはり主として外科的切除により管理されるので、スクリーニングに大きな興味が持たれている。
【０００７】
多くのヘルスケア機関により日常的なものとして推奨されている大腸癌用の既知のスクリーニング試験は便潜血試験（ＦＯＢＴ）であり、それは大便中の血液を検出するための種々の方法を用いるものである。しかしながら、その試験は高い特異性を有しているが、この方法は中程度の感度を有しており、擬陽性または擬陰性の結果をしばしば生じ、それゆえ、癌に対する不当な心配や不必要な検査を生じさせ、あるいは初期段階での疾病を見逃す可能性もある。
【０００８】
それゆえ、American Society of Clinical Oncology（ＡＳＣＯ）は、大腸癌通常の術後モニタリングのための手段として便潜血試験の使用を推奨しなかった（Benson et al, JCO, 2000）。ＡＳＣＯはまた、大腸癌発症の検出のための新しい調査方法が必要であることも強調している（Benson et al, JCO, 2000）。
【０００９】
転移性疾患はガン患者の疾病率および死亡率の主な原因であるので、腫瘍の侵入および転移の調節に関与する分子は可能性のあるスクリーニング／検出／モニタリングの標的として魅力あるものである。癌細胞または腫瘍支質により産生される蛋白分解酵素が細胞外組織の分解に関与しており、癌細胞の侵入および転移を導くことが十分に確認されている。多くの酵素がこのプロセスに関与しており、最も完全に調査されているのはコラゲナーゼおよびストロメリシンのごとき金属プロテイナーゼ、ならびにプラスミンのごときセリンプロテアーゼである。最近になって、これらの分子が遊離状態であれ、複合体において結合した状態であれ、腫瘍組織から放出され、循環系中に至る経路を見出すものであるというデータが公表された。
【００１０】
腫瘍細胞の攻撃性とマトリックスの金属プロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）の発現との間の正の相関関係が十分に示されている。ＭＭＰｓは、腫瘍の侵入、血管新生および転移における必須段階である結合組織リモデリングおよび細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解に関与する亜鉛結合エンドペプチダーゼの１のグループである（Aznavoorioan et al, 1993にレビューされている）。
【００１１】
しかしながら、マトリックスの金属プロテイナーゼ酵素活性は高度に調節されている。ＭＭＰ遺伝子発現のモジュレーション、プロ酵素の細胞外活性化、金属プロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰＳ）との関連による活性化および酵素活性の抑制を包含する多くのレベルで調節が起こる（Matrisian, 1990）（Mauviel, 1993）（Birkedal-Hansen, 1993）。
【００１２】
ＴＩＭＰｓは潜在的および活性のあるＭＭＰｓとともに化学量論的複合体を形成し（Welgus et al., Kleiner et al., 1993）、そのことによりこれらの酵素の触媒活性を阻害する（Stetler-Stevenson et al., 1996; Goldberg et al., 1992; Birkedal-Hansen et al., 1993）。
【００１３】
ＴＩＭＰｓはユビキタスな蛋白のファミリーである。現在、ＴＩＭＰファミリーの４つのメンバーが同定されている。ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２は腫瘍の増殖、侵入、および転移を抑制しうることがわかっている（Liotta, et al., 1991 and Khokha et al., 1989）。しかしながら、最近の臨床研究は、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２は予後の乏しい患者において有意に過剰発現されることが見出されているので、それらはむしろ腫瘍促進分子であると述べている（McCarthy et al, 1999; Remacle et al, 2000）。
【００１４】
血漿中のＴＩＭＰ−１が、大腸癌を有する高い危険性のある患者の同定のための非常に高感度で特異的なスクリーニングマーカーであることが研究により示されている（Holten-Andersen et al., 1999 および Holten-Andersen et al. 2002）。
【００１５】
この情報を使用する方法はＷＯ００／６２０７０に開示されており、参照によりその全開示を本明細書に一体化させる。該文献において、血漿試料中のＴＩＭＰ−１濃度を測定することにより個体を大腸癌に関してスクリーニングできることが見出されている。
【００１６】
しかしながら、その方法は、血液試料を各個体から採取しなければならないという欠点を有する。このことは、大きな集団において癌を検出しモニタリングする場合、極端に費用がかかり、問題が多く、例えば発展途上国において時々不可能でさえある。
【００１７】
さらにそのうえ、例えば発展途上国における特定の集団のＢ型肝炎およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の高い感染可能性のため、熟練したスタッフが採血しなければならず、試料に特別な注意を払わなければならない。
【００１８】
これらの問題に基づいて、蛋白を包含する物質の定性的および定量的測定のための伝統的な生物学的試料であることから、ＷＯ／００６２０７０に列挙された他の液体、例えば尿および血清が血漿のかわりに評価されている。
【００１９】
しかしながら、血清の研究により、大腸癌を有する個体由来の血清試料中の全ＴＩＭＰ−１濃度と健康なドナー由来のそれとの間に有意差がないことが示されている。その最も正当な理由としては、血小板がインビトロでの凝固の間にＴＩＭＰ−１を漏出することがある（Cooper et al, 1985; Jung et al, 1996）。さらにそのうえ、他の研究において、ＴＩＭＰ−１はそれ自体膵臓癌のスクリーニングのための血清マーカーとしては不十分であることが証明されている（Zhou et al, 1998）。
【００２０】
同じ大腸癌患者からの尿および血漿中のＴＩＭＰ−１の濃度もまた評価されているが、尿中のＴＩＭＰ−１上昇が見られないので、注目すべき相関関係は見出されていない（Bruenner,未公表データ）。
【００２１】
ホルモン、免疫グロブリン、酵素、蛋白、ＤＮＡおよびウイルスのごとき血漿のすべての有機化合物が唾液中に痕跡量検出されうることが当業者に知られている（Vining and McGinley, 1985）。しかしながら、唾液中に見出される濃度は尿中の濃度よりも低く、尿中の濃度は血漿中に見出される濃度よりもさらに低いということは十分に確立された知識である。
【００２２】
唾液中の低い濃度は多くの因子に起因する。例えば、唾液は消化酵素を含有し、唾液中の全蛋白濃度は血漿中の蛋白の１％未満なので無視できることが挙げられる（Breimer and Danhof, 1980）。さらにそのうえ、これらの痕跡量の主なソースが歯肉凹部（歯／歯茎の境界）の液体である可能性がある（Cimasoni, 1974）。
【００２３】
それゆえ当業者は、全く検出できない場合には、唾液中のプロテアーゼのごとき天然の酵素がこれらの無視できる蛋白を消化し、例えば唾液中に見出されるこれらの濃度を無視できる濃度にまで低下させると考えるであろう。
【００２４】
血清／血漿中よりも尿中で低い濃度を有し、さらに唾液中でも低い濃度を有する多くの蛋白の例の１つは前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）であり、それは前立腺癌のスクリーニングのために最も通常に使用されている血清マーカーである（Balk et al, 2003）。ＰＳＡは血清および血漿中に高濃度に存在し、尿中に低濃度で存在し、ある研究では唾液中に検出可能なＰＳＡは全く見られなかった（Lovgren et al, 1999）。さらにそのうえ、別の研究により、前立腺癌と良性前立腺肥大との区別を改良し簡略化するには唾液中の遊離および全ＰＳＡは血清の代替的測定値として使用するに適さないことが示されている（Turan et al, 2000）。
【００２５】
したがって、ＴＩＭＰ−１の上昇したレベルが健康な血液ドナーあるいは大腸癌患者のいずれの尿にも見出すことができないので、当業者は、唾液中の蛋白濃度は常に尿および血漿中よりも低いであろうという共通の一般的知識に基づいて、ＴＩＭＰ−１の検出のための可能な体液としての唾液を調べることは思い付かないであろう。
【００２６】
この点において、ＴＩＭＰ−１が喘息および慢性気管支炎の患者の痰中に見出されうる（Vigonola et al, 1998）が、ＴＩＭＰ−１はこのような場合において例えば肺組織の小さな傷害からの血液に由来することに注意すべきである。
【００２７】
かくして、現在利用可能な大腸癌のスクリーニング方法は血液または糞便試料に基づくものなので、血液または糞便試料を用いることなく大きな集団に適用可能な癌の検出、スクリーニングおよびモニタリング方法に対する必要性が長い間感じられている。
【００２８】
それゆえ、血液または糞便試料を用いる必要なく癌の早期診断を容易化するのに適したスクリーニング方法を提供することが本発明の１の態様である。
【００２９】
血液または糞便試料を用いる必要なく個体における癌の再発、癌の状態または癌の治療効果をモニタリングする方法を提供することが本発明のもう１つの態様である。
【００３０】
単純で費用のかからない設計の、迅速かつ簡単に用いることができ、専門家の助けあるいは特別な機器を必要としない、本発明の方法を実施するためのデバイスを提供することが本発明の第３の態様である。
【００３１】
驚くべきことに、唾液のごときヒト排出物中において、血漿中のＴＩＭＰ−１濃度に関して意外な高濃度でＴＩＭＰ−１蛋白を検出できることが本発明者らにより見出されたので、本発明によりこのことを達成することができる。
【００３２】
これにより本発明者らは、蛋白が尿中に検出されなかった場合には唾液中において検出され得ないという通常の偏見に打ち勝つ。前述のごとく、初期の研究により、検知できる濃度のＴＩＭＰ−１蛋白が尿中に検出できないことが示されていたので、唾液中のＴＩＭＰ−１を検出することは当業者に示されていなかった。
【００３３】
さらにそのうえ、非侵襲的方法としての排出物の収集および分析は、損傷または血栓のある静脈のために日常的な採血が困難である高い危険性のある患者集団にとり特に魅力的である。
【００３４】
さらに、このことは、例えば唾液がＨＩＶ感染性を抑制しうるので（Wolff and Hay, 1991）、患者（採血量が減る）および患者試料を扱う者（病院および研究室のスタッフ）の両方にとり有益であろう。
【００３５】
それゆえ、本発明によれば、試料の収集に非侵襲的方法を用いる、個体または大集団における癌の早期検出およびモニタリングのための簡単で費用のかからない方法が提供される。
【００３６】
擬陽性の結果を得ないために、癌を有する可能性の高い者と低いものに試験個体を分ける識別値を決定することが重要である。
【００３７】
本発明の１の具体例において、ＴＩＭＰ−１の全濃度が測定されること、すなわち、遊離形態および複合体形態のＴＩＭＰ−１の合計が測定されることがわかる。当業者は、正確な濃度以外の表現が、例えば因子を乗じた濃度のごとき濃度を表すものであってもよく、対応する修正が行われる場合には、かかる他の表現を本発明の目的に十分に同等に用いることができるということを理解するであろう。
【００３８】
健康な対照集団および既知の癌を有する集団の両方におけるＴＩＭＰ−１の全濃度を測定し、それにより識別値を決定することにより、識別値が確立される。識別値は、前もって決定された特異性または前もって決定された感度あるいはそれらの両方でもって癌の集団を同定するものであり、健康な対照集団および癌患者集団の濃度の値と既知の臨床データとの間の関連性の分析に基づくものである。
【００３９】
このようにして決定された識別値は、将来の個々の試験における同じ実験のセットアップに関して信頼性がある。
【００４０】
特異性は、前もって定義されたレベルよりも低い排出物中のＴＩＭＰ−１のごときマーカーの濃度を示すパラメーターを有する非疾病個体の割合として定義される。
【００４１】
感度は、前もって定義されたレベルよりも高い排出物中のＴＩＭＰ−１のごときマーカーの濃度を示すパラメーターを有する大腸癌患者の割合として定義される。
【００４２】
上昇しているＴＩＭＰ−１の値は、患者が癌の負の発達を有している可能性を示唆しうるものなので、本発明の方法は、治療に対する応答のモニタリングおよび癌の進行に十分に等しく用いることができる。かかる場合において、識別値は各個体に関して個別にセットされる。
【００４３】
全ＴＩＭＰ−１濃度と遊離ＴＩＭＰ−１濃度とを組み合わせた場合に、検出およびモニタリングの値の増加を得ることができ、それにより個体の癌を検出、スクリーニングおよびモニタリングするための非常に選択的で感度の良い方法が得られるということが、研究により示されている。
【００４４】
かかる癌は、例えば乳癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮癌、幹細胞カルシノーマ、最小残存性疾患（minimal residual disease）および再発性の癌でありうる。
【００４５】
本発明の方法の感度を向上させるために、さらなるマーカーを用いてもよい。好ましくは、該マーカーは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、それは通常には胎児の発達中にのみ見られるが，ある種のタイプの癌、主に消化器系の癌を発症している成人において再出現しうる。しかしながら、可溶性ｕ−ＰＡＲのごとき当業者に知られた大腸癌の他のマーカーを同様に用いてもよい。
【００４６】
好ましくは、全ＴＩＭＰ−１の濃度と遊離ＴＩＭＰ−１の濃度との組み合わせあるいは癌マーカー（ＣＥＡ）とＴＩＭＰ−１との組み合わせを用いた場合に記号論理学的回帰分析を用いることができる。
【００４７】
ＣＥＡをさらなるマーカーとして加えることにより、血漿中の全ＴＩＭＰ−１の感度が向上し、非常に高い特異性が維持されうることが、データにより示されている。かくして、ＣＥＡとＴＩＭＰ−１の濃度の組み合わせが、癌を有する危険性の高い患者の同定方法において有用でありうる。
【００４８】
本発明の方法を、個体および集団全体の両方に用いてよいが、より適切には、癌の発症の危険性が高まっているとすでに同定されている集団、例えば、遺伝学的素因のある個体、発癌性物質に曝露された個体、あるいは癌になりやすい非悪性疾患を有する個体に用いてよい。
【００４９】
一例として、これは例えば前ポリープ（prior polyp）を有する個体、クローン病または潰瘍性大腸炎を有する個体、１人またはそれ以上の家族が大腸癌である個体、初期大腸癌の切除前の個体でありうる。
【００５０】
個体がその排出物中に高いＴＩＭＰ−１レベルを有することが確認されている場合、その個体をさらに検査すべきである。癌が見つかれば、癌を治療する目的で手術、放射線またはアジュバント抗新生物治療をその患者に施すことができる。
【００５１】
さらに本発明は、排出物中のＴＩＭＰ−１のみ、あるいはＣＥＡと組み合わせたＴＩＭＰ−１の濃度を測定するためのディップスティックに関する。
【００５２】
かかるディップスティックは使用が極端に簡単で迅速であり、各個体は専門スタッフあるいは特別な機器を必要とせずに試験を行うことができる。
【００５３】
例えば潰瘍性大腸炎を有する個体あるいは早期検出された癌を有していて生じうる癌の再発をモニターしたい個体のごときある程度の高い危険性を有するグループ中の個体は、所望頻度で自分でスクリーニング／モニタリングすることができる。
【００５４】
さらにそのうえ、各個体は専門家や特別な機器を必要とせずに治療に対する応答および癌の拡張をモニターするための機会を有しているので、ディップスティックは貴重なツールである。
【００５５】
好ましくは、ディップスティックは、ラテラルフロー形式（lateral flow format）のツー−サイト方向性ラベルアッセイ（two-sited direct label assay）である。
【００５６】
第１の具体例において、ディップスティックはキャピラリー材料からできていてもよく、ＴＩＭＰ−１に特異的な抗体および試験排出物中のＴＩＭＰ−１の濃度に依存してゾーンの色の変化を可視的に示すことのできる少なくとも１の試薬を含む第１のゾーンを含む。
【００５７】
さらにディップスティックは、排出物中に通常に存在する少なくとも１の物質と反応しうる第２の色表示ゾーンを含み、それによりスティックが正当に使用されることをコントロールするためにゾーン中に可視的な色の変化が提供される。
【００５８】
本発明のディップスティックのもう１つの具体例において、ディップスティックはさらに第３の色表示ゾーンを含み、該ゾーンはＣＥＡに特異的な抗体および排出物中のＴＩＭＰ−１の濃度に依存してゾーンの色の変化を可視的に示すことのできる少なくとも１の試薬を含み、より信頼できるスクリーニング法を確実なものとする。
【００５９】
好ましくは、ディップスティックとの組み合わせにおいて、個々の排出物に関する識別値を示す色見本が提供される。
【００６０】
使用者が癌を有する可能性を試験する場合、先ず、ディップスティックを試験すべき排出物と接触させる。例えば、使用者はディップスティックを口中に入れ、そのことによりそれを患者の唾液と接触させることができる。
【００６１】
ディップスティック上の個々の試薬により決定される一定の反応時間経過後、使用者はスティックを色見本スケールと比較し、患者を、癌を有する可能性の高いグループと低いグループに分けることができる。
【００６２】
例えばＲＩＡまたは酵素アッセイに基づく既知の検出理論に基づくディップスティックは本発明の範囲内でありうる。
【００６３】
当業者は、ディップスティックが唾液のごとき排出物中のＴＩＭＰ−１を検出できるものの一例にすぎないことを認識するであろう。本発明の範囲内の他のオプションは、例えば活性アッセイ（ザイモグラフィーのごとき）、免疫学的アッセイまたは呈色反応キットである。
【００６４】
以下において、図面を参照するだけで実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００６５】
実施例：
以下の実施例において、血漿および唾液中両方におけるＴＩＭＰ−１の濃度を１体積の血漿または唾液あたりのＴＩＭＰ−１のｎｇ数で表す場合であっても、それは例えば１ユニットまたは１グラムの既知のリファレンス分子あたりのユニットまたはグラム数として表されるのと同様でありうることを、最初に述べておくべきである。
【００６６】
ドナー／患者
コレクション（Ｉ）において、４人の明らかに健康なボランティア血液ドナーから唾液を得た。
【００６７】
コレクション（ＩＩ）において、４人の明らかに健康なボランティア血液ドナーから唾液を得た。唾液収集と同時に各個体から血漿試料を得た。
【００６８】
コレクション（ＩＩＩ）において、結腸または直腸癌を有する３人の患者から唾液を得た。唾液収集と同時に各個体から血漿試料を得た。
【００６９】
すべてのドナー／患者からインフォームドコンセントを得て、地域の倫理委員会の許可を得た。
【００７０】
唾液の収集
コレクション（Ｉ）において、収集直前に水道水で口をすすぐよう指導された健康な血液ドナーから唾液を収集した。収集時間は５分間であり、この時間中にドナーは約５個の試料を５０ｍｌのＮｕｎｃ試験管中に入れた。唾液を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、上清を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００７１】
コレクション（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、唾液を口中の綿栓中に３分間収集した。次いで、栓を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して唾液を抽出した。その後、唾液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００７２】
得られた上清をすべての場合において、使用するまで−２０℃で凍結した。
【００７３】
採血および血漿分離
最小限の血行静止（必要ならば止血帯を用いて最大＋２ｋＰａで最長２分の血行静止を行うことができた）を用い、末梢血を、前もって冷却しておいたシトレート、ＥＤＴＡ、またはヘパリン収集チューブ中に入れ（Becton-Dickinson, Mountain View, CA）、５回倒置することにより混合し、即座に氷冷した。きるだけ早く（収集後１．５時間よりも早くに）４℃で１２００ｘｇ、３０分の遠心分離により血漿および血液細胞を分離し、アッセイ前に−８０℃で凍結保存をした。少なくとも１０人のドナーからの新鮮な収集試料を用いて血漿プールを作成し、その一部を取り、−８０℃で凍結保存した。分析用のために、試料を３７℃のウォーターバスで素早く融解させ、必要となるまで氷上に置いた。
【００７４】
実施例１：唾液中の全ＴＩＭＰ−１濃度の測定
ヒト血漿中の全ＴＩＭＰ−１濃度を定量するためのＥＬＩＳＡの調製
Strangeways Laboratoriesで作成されたＴＩＭＰ−１抗体（Hembry et al, 1985）を用いて、高感度で特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを調製した。ヒツジポリクローナル抗ＴＩＭＰ−１抗血清（Hembry et al, 1985; Murphy et al, 1991）を抗原捕捉に使用し、ネズミモノクローナル抗ＴＩＭＰ−１ ＩｇＧ１（ＭＡＣ−１５）（Cooksley et al, 1990）を抗原検出に使用した。
【００７５】
ウサギ抗マウス免疫グロブリン／アルカリ性ホスファターゼ抱合体（Catalog number D0314, Dako, Glostrup, Denmark）は２次検出試薬であった。この後者の抱合体はヒトＩｇＧに前もって吸着された状態で供給され、かくして、試料中のＩｇＧとの交差反応が除去された。
【００７６】
モノクローナル検出抗体ＭＡＣ−１５は遊離のＴＩＭＰ−１およびＭＭＰｓとの複合体中のＴＩＭＰ−１の両方を認識するので（Cooksley et al, 1990）、ヒツジポリクローナル抗ＴＩＭＰ−１抗血清により捕捉された全ＴＩＭＰ−１量をＥＬＩＳＡにより定量した。
【００７７】
９６ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp, Nunc, Roskilde, Denmark）を、１００μＬ／ウェルの０．１ｍｏｌ／Ｌカーボネートバッファー，ｐＨ９．５中のポリクローナルヒツジ抗ＴＩＭＰ−１（４ｍｇ／Ｌ）にて、３７℃で１時間被覆した。次いで、ウェルを、ホスフェート緩衝化セイライン（ＰＢＳ）で１：１に希釈されたSuperBlockJ溶液（Pierce Chemicals, Rockford, IL）２００μＬ／ウェルにて２回すすいだ。マイクロタイタープレートを−２０℃で１４日目まで保存した。分析の日に、プレートを室温で融解させ、１ｇ／ＬのTweenを含有するＰＢＳで５回洗浄した。
【００７８】
一連の精製された組み換え型ヒトＴＩＭＰ−１標準物質を用いて各プレートをキャリブレーションした。精製ＴＩＭＰ−１のストック溶液を系列希釈することにより標準物質を調製した。標準物質の濃度は５、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、０ｎｇ／ｍＬであった。試料希釈バッファーのみを含むブランク、および１：１００希釈されたシトレート血漿プールから作成された２つの対照を各プレートに付けた。１の対照はプレート上の最初の試料として付けられ、次の対照は最後の試料として付けられた。
【００７９】
すべての試料を、５０ｍｏｌ／Ｌホスフェート，ｐＨ７．２、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ，Boehringer-Mannheim, Penzberg, Germany)、および１ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ２０からなる試料バッファー中１：１００ないし１：５１に希釈した。
【００８０】
合計１００μＬ／ウェルの各標準物質、ブランク、対照、および患者試料をプレート上で３０℃で１時間インキュベーションした。すべての標準物質、ブランク、対照、および試料を、各アッセイにつき各プレート上３系（triplicate）で分析した。
【００８１】
１次インキュベーション後、ウェルを５回洗浄し、次いで、試料希釈バッファー中の精製ＭＡＣ−１５モノクローナル抗体（０．５ｍｇ／Ｌ）１００μＬ／ウェルで、３０℃で１時間処理した。さらに５回洗浄後、試料希釈バッファー中１：２０００に希釈された１００μＬ／ウェルのウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）／アルカリ性ホスファターゼ抱合体とともに３０℃で１時間、ウェルをインキュベーションした。
【００８２】
洗浄溶液で５回洗浄し、蒸留水で３回洗浄した後、１００μＬの新たに作成したリン酸ｐ−ニトロフェニル（Sigma, St. Louis, MO）基質溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，ｐＨ９．５，０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２中１．７ｇ／Ｌ）を各ウェルに添加した。
【００８３】
プレートを２３℃のCeres 900J プレートリーダー (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)中に置き、黄色の発色を自動的にモニターした。１０分ごとに１時間、空気ブランクに対する４０５ｎｍの値を読んだ。ＫｉｎａｔｉＣａｌｃ ＩＩソフトウェアを用い、各ウェルの発色速度を計算することによりデータを分析し（線形回帰分析）、４−パラメーター適合標準曲線を得て、各試料中のＴＩＭＰ−１濃度を計算した。
【００８４】
回収の実験
試料希釈バッファー中の０．５％および１％唾液プールのパネルに精製ＴＩＭＰ−１の濃度を増加させつつ添加し、次いで、シグナルを測定することにより、ＴＩＭＰ−１シグナルの回収を測定した。
【００８５】
精製ＴＩＭＰ−１を唾液プールの希釈系列に添加して、０ないし５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度とした。
【００８６】
各場合において濃度の関数としてのＴＩＭＰ−１シグナルを示す線の勾配から回収率を計算した。ここに１００％の回収率を、ＴＩＭＰ−１を試料希釈バッファーで希釈した場合に得られた勾配として定義した。
【００８７】
０．５％唾液中の回収率は１００．２％であり、１％唾液中の回収率は１００．９％であった（図１）。かくして、内部標準からのＴＩＭＰ−１ソグナルの回収率はすべての唾液調合物に関して優秀であり、唾液試料はすべて希釈率の関数としてのシグナルの直線性が良好であった。
【００８８】
コレクション（Ｉ）における全ＴＩＭＰ−１濃度の測定
コレクション（Ｉ）からの唾液試料をプールし、３９個の希釈物を、ＥＬＩＳＡにより全ＴＩＭＰ−１濃度に関してアッセイした（図２）。唾液中の平均ＴＩＭＰ−１濃度は７２．８１ｎｇ／ｍＬ±３．３３であり、リファレンス範囲は６７．２９ないし７９．４９ｎｇ／ｍＬであった。
【００８９】
コレクション（Ｉ）ならびに試料のプールからの各唾液試料を、ＥＬＩＳＡにより全ＴＩＭＰ−１濃度に関してアッセイした。唾液中の平均ＴＩＭＰ−１濃度は７９．６６ｎｇ／ｍＬ±３．７７であり、リファレンス範囲は７６．９６ないし８３．９６ｎｇ／ｍＬであった。
【００９０】
コレクション（ＩＩ）における全ＴＩＭＰ−１濃度の測定
コレクション（ＩＩ）において、健康な血液ドナーからの唾液試料および血漿試料の両方を、ＥＬＩＳＡにより全ＴＩＭＰ−１濃度に関してアッセイした。結果を表１に示す。
【表１】
2006500574.tif 000002
【００９１】
議論
上記アッセイはヒト唾液試料中の全ＴＩＭＰ−１の正確な測定を可能にする。迅速ブロッキング剤および高い緩衝能を有する希釈バッファーの使用は再現性のあるアッセイにも貢献した。これらすべての要素を最終アッセイに含めることにより、感度、特異性、安定性、および内部標準物質の良好な回収率という必要事項が満たされた。
【００９２】
健康なドナーからの唾液における定量的研究により、唾液試料がＴＩＭＰ−１測定に適したものであることが示された。
【００９３】
これらの研究により、コレクション（Ｉ）のＴＩＭＰ−１に関して唾液中のレベル（平均７２〜７９ｎｇ／ｍＬ）が血漿中のＴＩＭＰ−１レベル（平均６５〜７０ｎｇ／ｍＬ）（国際特許出願ＷＯ００／６２０７０参照）に対応することが示された。コレクション（ＩＩ）において健康なドナーから同様の結果が得られた。
【００９４】
実施例２：大腸癌患者における全ＴＩＭＰ−１の検出値
３人の大腸癌患者からの血漿および唾液の両方（コレクション（ＩＩＩ））における全ＴＩＭＰ−１レベルを、実施例１記載のＴＩＭＰ−１アッセイを用いて測定した。ＴＩＭＰ−１値を分析し、標準的な生物統計学的（biostatistical）パラメーターを用いて比較した。
【００９５】
患者
病理学的に確認された大腸癌に対する選択的な手術を受けている３人の患者を研究に含めた。すべての患者からヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得て、the local Ethical Committee of Hvidovre Hospital, Denmarkから許可を得て、術前に血液および唾液試料を得た。すべての患者は結腸および直腸のアデノカルシノーマであることが病理学的に証明されていた。
【００９６】
コレクション（ＩＩＩ）における全ＴＩＭＰ−１濃度の測定
コレクション（ＩＩＩ）において、大腸癌患者からの唾液試料および血漿試料の両方を、ＥＬＩＳＡにより全ＴＩＭＰ−１濃度に関してアッセイした。結果を表２に示す。
【表２】
2006500574.tif 000003
【００９７】
議論
このデータは、健康個体のみならず大腸癌患者に関しても同様の唾液／血漿ＴＩＭＰ−１濃度が見出されることを証明した。
【００９８】
さらにそのうえ、３人の大腸ガン患者はすべて上昇した（健康な血液ドナーの血漿レベルよりも約９５パーセンタイル上昇）唾液および血漿ＴＩＭＰ−１レベルを有していた。それゆえ、大腸癌患者と健康な血液ドナーとの間の全唾液ＴＩＭＰ−１値における非常に統計学的な相違が存在する。
【００９９】
健康な血液ドナーと比較すると結腸癌および直腸癌の患者間における全血漿ＴＩＭＰ−１値に非常に統計学的な相違があるということが以前に見出されている。さらにそのうえ、対応する濃度の全ＴＩＭＰ−１が唾液および血漿中に存在することが上記実施例において示されている。それゆえ、当業者はこれらの知見に基づいて、唾液からの全ＴＩＭＰ−１についても結腸癌および直腸癌の患者間に同じ統計学的相違が観察されるであろうと考えるであろう。
【０１００】
同様の根拠により、当業者は、健康なドナーおよび大腸癌患者からの唾液中の測定された全ＴＩＭＰ−１レベルを用いることができ、Receiver Operating Characteristics（ＲＯＣ）曲線を得て全ＴＩＭＰ−１の診断レベルを評価することができる。参照により本明細書に一体化されるＷＯ００／６２０７０において確認されたように、かかる曲線は、大腸癌のマーカーとしての血漿中の全ＴＩＭＰ−１の高い感度と特異性を確認するものである。上記知見に基づけば、唾液中の全ＴＩＭＰ−１に関しても同様の結果が期待される。
【０１０１】
このデータは、唾液中の全ＴＩＭＰ−１の測定値をスクリーニング手順として用いて、大腸癌を有する高い危険性のある患者を同定する助けにすることができるということを示唆するものである。
【０１０２】
詳細には、血漿中の全ＴＩＭＰ−１はＷＯ００／６２０７０において、初期の癌（Dukeの段階Ａ＋Ｂ）を有する患者の同定ならびにより進行した疾病を有する患者の同定において有効であることが証明されている。本発明における知見に基づけば、唾液中の全ＴＩＭＰ−１濃度に関して同様の結果が期待されるであろう。同様に、血漿中の全ＴＩＭＰ−１は初期段階の右側の結腸癌の患者の同定においてより有効であるので、唾液中の全ＴＩＭＰ−１に関しても同じことが期待されるであろう。右側の大腸癌は、標準的な大腸癌スクリーニング法である柔軟なシグモイドスコピーによっては可視化され得ない。それは左側の傷害よりも潜行性であり、臨床的徴候は疾病の後期段階にのみ現れる。右側の大腸癌の早期診断はこの疾病の死亡率を低下させる潜在能力を有する。
【０１０３】
悪性組織と正常組織とを識別するための唾液中のＴＩＭＰ−１に関する最適な識別値を、かかるＲＯＣ曲線に基づいて決定することができる。なぜなら曲線上のポイントは特異性と感度の最適な組み合わせを示すものであり、診断精度が最大化されているからである。８７０人の健康な血液ドナーに基づく血漿中の全ＴＩＭＰ−１に関する識別値が決定されており（Bruenner, 未公表データ）、上記知見に基づいて唾液中の全ＴＩＭＰ−１に関しても同様の結果が期待される。
【０１０４】
実施例３：唾液中のＴＩＭＰ−１：ＭＭＰ−９複合体および遊離ＴＩＭＰ−１の全濃度の測定
実施例１に示したように、唾液中の全ＴＩＭＰ−１濃度は血漿中の全ＴＩＭＰ−１濃度に非常に正確に対応している。血漿および唾液間に相関関係が存在することが見出されたので、唾液中のＴＩＭＰ−１：ＭＭＰ−９複合体の全濃度および遊離ＴＩＭＰ−１濃度を試験することも当業者に明かであろう。適切な方法および材料は、参照により本明細書に一体化されるＷＯ００／６２０７０の同様の実施例に記載されている。実施例１における知見から、ＴＩＭＰ−１：ＭＭＰ−９複合体および遊離ＴＩＭＰ−１それぞれの全濃度に関しても同様の結果が得られることが期待されよう。
【０１０５】
実施例４：大腸癌患者におけるＣＥＡと組み合わせられた全ＴＩＭＰ−１の検出値
ＷＯ００／６２０７０の実施例は、さらなるマーカーを添加することにより、９８％という高い特異性を維持しつつ血漿中の全ＴＩＭＰ−１の診断感度が改善されることを示した。かくして、対応データが血漿および唾液中の全ＴＩＭＰ−１に関して得られるという仮定に基づけば、唾液中のＣＥＡおよびＴＩＭＰ−１の組み合わせは、大腸癌を有する危険性の高い患者を同定するためのスクリーニング法として有用でありうる。
【０１０６】
実施例５：初期（段階ＩおよびＩＩ）の乳癌患者の唾液中の全ＴＩＭＰ−１の検出値
実施例１に記載の全ＴＩＭＰ−１アッセイを用いて、初期乳癌の３２２人の患者からの術前血漿試料中の全ＴＩＭＰ−１レベルを、健康な血液ドナーからの１０８個の血漿試料と比較した。参照により本明細書に一体化されるＷＯ００／６２０７０に示されたデータは、当該２つのグループ間の全ＴＩＭＰ−１血漿レベルにおける統計学的な有意差を示さなかった（Mann-Whitney, p=0.87）。かくして、このデータは、大腸癌患者の診断におけるＴＩＭＰ−１の測定値の特異性を支持するものである。同様のドナーからの唾液試料中の全ＴＩＭＰ−１レベルが測定されれば、同様の結果が期待される。
【０１０７】
実施例６：転移性（段階ＩＶ）乳癌を有する患者における唾液全ＴＩＭＰ−１の検出値
段階ＩＶの疾病を有する１９人の乳癌患者において全ＴＩＭＰ−１レベルが測定されたＷＯ００／６２０７０からの情報に基づいて、実施例１に記載のアッセイを用いてすべてのＥＤＴＡ血漿試料を調べた。これらのレベルを、８７人の健康な女性ドナーにおける全ＴＩＭＰ−１血漿レベルと比較した。Wald-Wolfowitz検定により、患者の全ＴＩＭＰ−１レベルと健康なドナーのそれらとの間に非常に有意な差（ｐ＜０．０００１）が示された。対応する全ＴＩＭＰ−１のレベルが血漿および唾液中に存在するということが確認されたので、これらのデータは、唾液のＴＩＭＰ−１測定値を用いて乳癌患者を疾病の再発に関してモニターできることを示すものである。
【０１０８】
実施例７：大腸癌患者の唾液中の遊離ＴＩＭＰ−１の検出値
ＷＯ００−６２０７０には、血漿中の遊離ＴＩＭＰ−１のみでは、大腸癌を有する高い危険性を有する患者を同定するためのスクリーニングマーカーとしては役に立ちそうもないことが示されていた。本願中に示された結果に基づいてすでに述べたように、唾液中の遊離ＴＩＭＰ−１について同様の結果が期待される。
【０１０９】
実施例８：唾液中のＴＩＭＰ−１の検出のためのディップスティックのスクリーニング値
手順
本発明の方法の実施のためにコロイド状金／抗体抱合体を得た。２００ｍｌの０．０１％塩化金（ＨＡｕＣｌ  ４．３Ｈ２Ｏ）（Fisher Scientific, G-54-1）を沸騰させ、２ｍｌの１％クエン酸ナトリウム溶液を添加し、溶液の色がうす黄色から紫そして赤に変化するまで５分間沸騰を継続している間シリコナイズされたガラス器具（Sigma silicote）を使用した。炭酸カリウム溶液（０．０２Ｍ）を懸濁液に添加してｐＨを７．６に調節し、次いで、ウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−９抗体（１ｍｇ／ｍｌ）（Novus Biological Product）を添加して、１ｍｌの金懸濁液あたり約１０μｇのＩｇＧを添加するようにした（０．０１％の金）。
【０１１０】
室温で１分間インキュベーションした後、０．１ｍｌの水中３０％ウシ血清アルブミン溶液を１０ｍｌの金懸濁液に添加した。Sorval RC5C遠心器にてＳＳ３４ローター中３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより凝集物を除去した。上清を、６０００ｒｐｍ、１時間のさらなる遠心分離工程に付した。ペレットになったコロイド状金抱合体をＰＢＳ（０．９％ ＮａＣｌ中０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．４）中２％ウシ血清アルブミン中に再懸濁し、液体での保存に好ましい条件は４℃であった。カゼイン溶液を添加して１％カゼイン濃度とし、その直後に膜に適用した。次いで、抱合体を乾燥状態で長期保存したが、３７℃の乾燥状態で６ヶ月保存後も活性は失われなかった。
【０１１１】
この実施例に従って、ＴＩＭＰ−１検出用にサンドイッチ型のイムノアッセイデバイスを構築し、使用した。厚さ約０．１ｍｍで平均孔サイズ５μｍの微小多孔性ニトロセルロース材料をマイラーおよび接着剤（Monokote, Top Flite Models, Inc., Chicago, Ill.）とともにラミネートした。１ｃｍ ｘ ３．５ｃｍの片を切り取った。マウスモノクローナル抗体ＭＡＣ１９（ＷＯ００／６２０７０参照）０．２μｌを片の捕捉ゾーンに適用し、そこでそれを固定化し、風乾した。次いで、クロマトグラフィー片材料の非特異的結合部位を、水中ＬＢゼラチン（Inotech, Wohlen, Switzerland）の０．１％溶液とともに室温で１０分間インキュベーションすることによりブロックし、片を空気の流れの下で乾燥させた。次いで、説明されたように製造された抗凝集バッファー中の金粒子で標識されたウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−９抗体１μｌを各片の第１ゾーンに適用し、乾燥させた。
【０１１２】
ディップスティック上の唾液試料中のＴＩＭＰ−１濃度の検出
コレクション（ＩＩ）および（ＩＩＩ）、健康な血液ドナーならびに大腸癌患者のぞれぞれからの唾液試料を、先ず、第１ゾーンと第３ゾーンとの間の第２ゾーンに適用した。
【０１１３】
次いで、片の一端を、ＴＢＳおよび１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）を含むクロマトグラフィー移動相溶媒中に浸した。液の先端は、約２．５分の時間をかけてデバイスのもう一方の端に達し、試料物質および金標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを第３ゾーンに移動させた。
【０１１４】
大腸癌患者からの試料（コレクション（ＩＩＩ））および標識された第１の試薬の固定化は、第３ゾーンに赤色スポットを生じさせた。健康な血液ドナーからの試料、コレクション（ＩＩ）を試験した片は、第３ゾーンにシグナルを生じさせなかった。
【０１１５】
議論
これらの試験により、唾液中のＴＩＭＰ−１を測定できること、そしてかかるディップスティックをスクリーニング法に用いて、大腸癌を有する危険性の高い患者の同定の一助とできることが確認された。さらにそのうえ、ディップスティックを用いて、特別な装備を必要とせずに治療に対する応答および癌の拡散をモニターすることができる。
【０１１６】
結論
当業者は、血漿中の全ＴＩＭＰ−１レベルおよび唾液中の全ＴＩＭＰ−１レベル間の類似性が本願実施例に限定されないことを、本発明から理解するであろう。実際、驚くべきことに、血漿試料中で測定されたいずれのＴＩＭＰ−１値に関しても、対応する値が唾液中のＴＩＭＰ−１に関して確認されうることが、今回期待される。
【０１１７】
このことは、本願またはＷＯ００／６２０７０に述べられた実施例に関してのみならず、血漿について得られた他の既知の結果についてもあてはまる。
【０１１８】
本願に示したデータは、ＴＩＭＰ−１をマーカーとして用いて初期段階の大腸癌または転移性乳癌をスクリーニング、モニタリングおよび検出する場合における唾液を試験することのユニークな価値を支持するものである。本発明の初期大腸癌を有する患者の同定方法は非常に特異的であり、炎症性腸疾患のごとき非悪性症状を有する患者は検出されない。さらにそのうえ、治療に対する応答および癌の進行をモニタリングする場合にも唾液は適したものである。
【０１１９】
主にヒトの排出物について説明したが、排出物が動物、例えばイヌ、ネコまたはウシからのものであることも本発明の範囲内である。
【０１２０】
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【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、試料希釈バッファー中の０．５％および１％唾液プールのパネルに精製ＴＩＭＰ−１の濃度を増加させながら添加した後に測定された、ＴＩＭＰ−１シグナルの回収を示す。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡによりアッセイされたコレクション（Ｉ）からの唾液プールの３９個の希釈物からの全ＴＩＭＰ−１濃度を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにより測定されたコレクション（Ｉ）からの各唾液試料中のＴＩＭＰ−１濃度を示す。
【図１】
2006500574.tif 000004
【図２】
2006500574.tif 000005
【図３】
2006500574.tif 000006
【国際調査報告】
2006500574.tif 000007
2006500574.tif 000008
2006500574.tif 000009