(57)【要約】本発明は、VEGF-B及びPDGF治療、特に幹細胞集積、増殖及び／又は分化を対象とする治療のための材料及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄抑制を治療する、予防する又は軽減するために、幹細胞の集積、増殖又は分化を必要とする哺乳動物被験体を特定すること、及び
血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）生成物を含有する組成物を、前記被験体において骨髄形成を刺激するために有効な量で、前記哺乳動物被験体に投与すること
を含む、骨髄形成を刺激するために幹細胞の集積、増殖又は分化を刺激する方法。
【請求項２】
前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記特定が、抗腫瘍化学療法を受けている被験体を選択することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記投与が、前記抗腫瘍化学療法剤を投与するのと同時に又はその後に前記組成物を投与することを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記特定が、骨髄移植被験体を選択することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項６】
前記投与が、骨髄移植と同時に又はその後に前記組成物を投与することを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記特定が、抗腫瘍放射線療法を受けている被験体を選択することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、放射線療法を実施するのと同時に又はその後に前記組成物を投与することを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記特定が、
骨髄抑制に関してスクリーニングするために被験体において循環白血球又は骨髄由来幹細胞を測定すること
を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定が、CD34＋幹細胞を測定することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定が、造血肝細胞を測定することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記組成物の投与後に循環白血球又は骨髄由来幹細胞の数を観測することをさらに含む、請求項1乃至11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記観測が、VEGFR-1、VEGFR−2及びCD34から成る群より選択される少なくとも1つの細胞表面マーカーの検出を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
（a）顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、インターロイキン3（IL-3）、幹細胞因子（SCF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血小板由来増殖因子A（PDGF-A）、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）、血小板由来増殖因子D（PDGF-D）及び胎盤増殖因子（PlGF）；
（b）（a）のいずれかの成員をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（c）それらの組合せ
から成る群より選択される物質を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物被験体において骨髄抑制を治療する、予防する又は軽減するための薬剤を製造するためのVEGF-B生成物の使用。
【請求項１６】
前記VEGF-B生成物が、前記被験体において循環白血球又は骨髄由来幹細胞の数を増加させるために有効な量で前記薬剤中に含有される、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤が、
（a）顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、インターロイキン3（IL-3）、幹細胞因子（SCF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血小板由来増殖因子A（PDGF-A）、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）、血小板由来増殖因子D（PDGF-D）及び胎盤増殖因子（PlGF）；
（b）（a）のいずれかの成員をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（c）それらの組合せ
から成る群より選択される物質をさらに含有する、請求項15又は16に記載の使用。
【請求項１８】
哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得ること、及び
前記幹細胞を、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）生成物を含有する組成物と接触させること
を含む、幹細胞の増殖又は分化を刺激する方法。
【請求項１９】
前記試料を得た後及び前記接触工程の前に、前記幹細胞を精製し、単離する工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触工程の後に、前記幹細胞を精製し、単離する工程をさらに含む、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
前記精製幹細胞がVEGFR-1＋幹細胞を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記精製幹細胞がCD34＋幹細胞を含む、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２３】
前記精製幹細胞がCD133＋幹細胞を含む、請求項20乃至22のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記接触が、VEGF-B生成物を含む培養中で前記幹細胞を培養することを含む、請求項18乃至23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞を前記哺乳動物被験体に戻す工程をさらに含む、請求項18乃至24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞を異なる哺乳動物被験体に移植する工程をさらに含む、請求項18乃至25のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞をエキソビボで組織、器官又は人工マトリックスに接種し、前記組織、器官又は人工マトリックスを前記哺乳動物被験体に結合する、埋没する又は移植する、請求項25又は26に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項18乃至27のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒト被験体が抗腫瘍化学療法を必要とする、請求項18乃至28のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的試料を化学療法剤の用量を投与する前に入手し、前記幹細胞を、接触後及び化学療法剤の投与後に前記ヒト被験体に戻す、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
幹細胞の増殖又は分化を刺激するための薬剤を製造するための血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）生成物の使用。
【請求項３２】
前記VEGF-B生成物がVEGF-Bポリペプチドを含む、請求項1乃至14及び18乃至30のいずれかに記載の方法又は請求項15乃至17及び31のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前記VEGF-Bがグリコシル化されている、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記VEGF-B生成物が、VEGF-Bポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1乃至14及び18乃至30のいずれかに記載の方法又は請求項15乃至17及び31のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
前記VEGF-B生成物が、前記ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む、請求項34に記載の方法又は使用。
【請求項３６】
前記ベクターが、複製欠損アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを含む、請求項35に記載の方法又は使用。
【請求項３７】
前記VEGF-Bポリペプチドが、配列番号2、配列番号4のアミノ酸配列又はVEGFR-1に結合するそのフラグメントを含む、請求項32乃至36のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項３８】
前記VEGF-Bポリペプチドが、ヘテロ二量体としてVEGFポリペプチドと結合している、請求項32又は33に記載の方法又は使用。
【請求項３９】
前記VEGF-BポリペプチドがVEGFR-1に結合し、配列番号1又は3のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1乃至38に記載の方法又は使用。
【請求項４０】
前記VEGF-B生成物が、製薬上許容される担体をさらに含む、請求項1乃至39のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項４１】
虚血を治療する、又は予防するために幹細胞の集積、増殖又は分化を必要とする哺乳動物被験体を特定すること、及び
血小板由来増殖因子（PDGF）生成物を含有する組成物を前記被験体に投与すること
を含む、幹細胞の集積、増殖又は分化を刺激する方法。
【請求項４２】
前記被験体がヒトである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳動物被験体において内皮細胞前駆細胞を末梢血に動員するための薬剤の製造における、少なくとも1つの血小板由来増殖因子（PDGF）生成物の使用。
【請求項４４】
前記PDGF生成物が、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-D生成物から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項41又は42に記載の方法又は請求項43に記載の使用。
【請求項４５】
前記PDGF生成物がPDGFR−αに結合する、請求項41又は42に記載の方法又は請求項43に記載の使用。
【請求項４６】
前記PDGF生成物が、少なくとも1つのPDGF-C生成物を含む、請求項41又は42に記載の方法又は請求項43に記載の使用。
【請求項４７】
前記PDGF生成物がPDGFポリペプチドを含む、請求項41又は42に記載の方法又は請求項43に記載の使用。
【請求項４８】
前記PDGF生成物が、PDGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項41又は42に記載の方法又は請求項43に記載の使用。
【請求項４９】
前記PDGF生成物が、前記ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む、請求項48に記載の方法又は使用。
【請求項５０】
前記ベクターが、複製欠損アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを含む、請求項49に記載の方法又は使用。
【請求項５１】
前記PDGFポリペプチドが、PDGFR−α又はPDGFR−βに結合するために有効な、配列番号7又は9に示すアミノ酸配列の一部を含む、請求項47乃至50のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５２】
前記PDGFポリペプチドがPDGFR−α又はPDGFR−βに結合し、配列番号6又は8のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項47乃至50のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５３】
前記PDGFポリペプチドが、PDGF-Aポリペプチド、PDGF-Bポリペプチド、PDGF-Cポリペプチド、PDGF-Dポリペプチド、それらの組合せ、又はPDGF受容体α及びβ（PDGFR−α、PDGFR−β）の少なくとも1つに結合するそれらのフラグメントから成る群より選択される成員を含む、請求項41乃至43のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５４】
前記PDGFポリペプチドが、PDGF-C又はPDGF-Dポリペプチド、又はPDGF受容体α及びβ（PDGFR−α、PDGFR−β）の少なくとも1つに結合するそのフラグメントを含む、請求項41乃至43のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が、製薬上許容される担体をさらに含有する、請求項41乃至54のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５６】
（a）顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、インターロイキン3（IL-3）、幹細胞因子（SCF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血小板由来増殖因子A（PDGF-A）、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）、血小板由来増殖因子D（PDGF-D）及び胎盤増殖因子（PlGF）；
（b）（a）のいずれかの成員をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（c）それらの組合せ
から成る群より選択される物質を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項41乃至55のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５７】
哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得ること、及び
前記幹細胞を、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）生成物又は血小板由来増殖因子D（PDGF-D）生成物を含有する組成物と接触させること
を含む、幹細胞の増殖又は分化を刺激する方法。
【請求項５８】
哺乳動物幹細胞の増殖又は分化を刺激するための薬剤を製造するための、PDGF-C生成物又はPDGF-D生成物の使用。
【請求項５９】
前記細胞を、PDGF-A生成物、PDGF-B生成物、PDGF-C生成物及びPDGF-D生成物から成る群より選択される少なくとも1つの付加的なPDGF生成物と接触させることをさらに含む、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
前記試料を得た後及び前記接触工程の前に、前記幹細胞を単離する工程をさらに含む、請求項57に記載の方法。
【請求項６１】
前記接触工程の後に、前記幹細胞を精製し、単離する工程をさらに含む、請求項57に記載の方法。
【請求項６２】
前記精製幹細胞が、PDGFR−αを発現する細胞を含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記精製幹細胞がCD34＋幹細胞を含む、請求項61又は62に記載の方法。
【請求項６４】
前記接触が、PDGF-C生成物又はPDGF-D生成物を含む培養中で前記幹細胞を培養することを含む、請求項57及び59乃至63のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記接触工程後に前記幹細胞を前記哺乳動物被験体に戻す工程をさらに含む、請求項57及び59乃至64のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記接触工程後に前記細胞を異なる哺乳動物被験体に移植する工程をさらに含む、請求項57及び59乃至64のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞をエキソビボで組織、器官又は人工マトリックスに接種し、前記組織、器官又は人工マトリックスを前記哺乳動物被験体に結合する、埋没する又は移植する、請求項65又は66に記載の方法。
【請求項６８】
前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項57及び59乃至67のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記ヒト被験体が抗腫瘍化学療法を必要とする、請求項57及び59乃至68のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記生物学的試料を化学療法剤の用量を投与する前に入手し、前記幹細胞を、接触後及び化学療法剤の投与後に前記ヒト被験体に戻す、請求項68に記載の方法。
【請求項７１】
前記PDGF-C生成物又はPDGF-D生成物が、PDGF-Cポリペプチド又はPDGF-Dポリペプチドを含む、請求項57乃至68のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７２】
前記生成物が、PDGF-Cポリペプチド又はPDGF-Dポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項57乃至68のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７３】
前記生成物が、前記ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む、請求項72に記載の方法又は使用。
【請求項７４】
前記ベクターが、複製欠損アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを含む、請求項73に記載の方法又は使用。
【請求項７５】
前記ポリペプチドが、PDGFR−α又はPDGFR−βに結合するために有効な、配列番号7又は9に示すアミノ酸配列の一部を含む、請求項71乃至74のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７６】
前記PDGFポリペプチドがPDGFR−α又はPDGFR−βに結合し、配列番号6又は8のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項71乃至74のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７７】
前記組成物が、製薬上許容される担体をさらに含有する、請求項57及び59乃至76のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
（a）顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、インターロイキン3（IL-3）、幹細胞因子（SCF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血小板由来増殖因子A（PDGF-A）、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）、血小板由来増殖因子D（PDGF-D）及び胎盤増殖因子（PlGF）；
（b）（a）のいずれかの成員をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（c）それらの組合せ
から成る群より選択される物質を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項57及び59乃至77のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記単離が、前記生物学的試料からAC133＋／CD34＋細胞を単離することを含む、請求項60に記載の方法。
【請求項８０】
前記接触が、幹細胞がCD144＋細胞に分化するまで前記幹細胞を前記組成物に接触させることを含む、請求項57及び59乃至79のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記接触が、幹細胞がSMA+/CD144−／CD31−／CD34−細胞に分化するまで前記幹細胞を前記組成物に接触させることを含む、請求項57及び59乃至79のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記組成物がVEGF-A生成物をさらに含有する、請求項57及び59乃至79のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記接触が、PDGF-C生成物を含む培養中で前記幹細胞を培養することを含む、請求項57及び59乃至82のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記接触工程後に前記幹細胞を前記哺乳動物被験体に戻す工程をさらに含む、請求項57及び59乃至83のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞をエキソビボで組織、器官又は人工マトリックスに接種し、前記組織、器官又は人工マトリックスを前記哺乳動物被験体に結合又は移植する、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
前記接触工程後に前記細胞を異なる哺乳動物被験体に移植する工程をさらに含む、請求項57及び59乃至83のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞をエキソビボで組織、器官又は人工マトリックスに接種し、前記組織、器官又は人工マトリックスを異なる哺乳動物被験体に結合又は移植する、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項57及び59乃至83のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記ヒト被験体が虚血状態を有する、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
前記ポリペプチドが、配列番号7又は9に少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含み、PDGFR−α及びPDGFR−βから選択される少なくとも1つの受容体に結合する、請求項71に記載の方法又は使用。
【請求項９１】
前記ポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列に少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含み、PDGFR−α／α及びPDGFR−α／βから選択される少なくとも1つの受容体に結合する及び／又は少なくとも1つの受容体を活性化する、請求項71に記載の方法又は使用。
【請求項９２】
前記PDGF-Cポリペプチドが、PDGFR−αに結合し、配列番号6のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項90又は91のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項９３】
前記ポリペプチドが、PDGFR−α又はPDGFR−βに結合し、配列番号6又は8のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項71に記載の方法又は使用。
【請求項９４】
哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得ること；
前記幹細胞の第一アリコートを、PDGF-B生成物及びPDGF-C生成物から選択される第一増殖因子生成物を含有する第一組成物と接触させること；及び
前記幹細胞の第二アリコートを、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPlGF生成物から成る群より独立して選択される第二増殖因子生成物を含有する第二組成物と接触させること
を含み、前記第一と第二増殖因子生成物が同じではない、幹細胞の増殖又は分化を刺激する方法。
【請求項９５】
前記第一増殖因子生成物がPDGF-C生成物であり、前記第二増殖因子生成物がVEGF-A生成物である、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得ること；及び
前記細胞を内皮細胞と平滑筋細胞の両方に分化させるのに十分な量及び時間で、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）生成物を含有する組成物に前記細胞を接触させること
を含む、幹細胞の内皮細胞及び平滑筋細胞の両方への分化を促進する方法。
【請求項９７】
前記接触後に前記細胞を前記哺乳動物被験体に戻すことをさらに含む、請求項94乃至96のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記ヒト被験体が虚血状態を有する、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
（a）虚血状態を有する哺乳動物被験体を診断すること；
（b）前記哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を単離すること；
（c）前記細胞を内皮細胞と平滑筋細胞の両方に分化させるのに十分な量及び時間で、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）生成物を含有する組成物に前記細胞を接触させること；及び
（d）前記細胞を前記哺乳動物被験体に戻すこと
を含む、虚血状態を改善する方法。
【請求項１００】
前記の戻すことが、前記細胞を前記哺乳動物被験体の虚血組織内又は虚血組織の近くに移植する又は注入することを含む、請求項99に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それらの全体が参照して本明細書中に組み込まれる、2003年2月4日出願の米国特許仮出願第60／445,021号及び2003年5月16日出願の米国特許仮出願第60／471,412号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
血小板由来増殖因子（PDGF）タンパク質及びそれらの受容体（PDGFR）は、いくつかの細胞型の細胞増殖、生存及び移動の調節に関与する。血管内皮細胞増殖因子（VEGF）タンパク質及びそれらの受容体（VEGFR）は、初期分化内皮細胞からの胚血管系の発生である血管形成、及び既存の血管から新しい血管を形成する過程である血管新生の両方において重要な役割を果たす［Risauら、Dev. Biol. 125:441-450 (1988); Zachary, Intl. J Biochen. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998); Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999); Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)]。2つの過程は、厳密に制御された内皮細胞増殖、移動、分化及び生存に依存する。内皮細胞調節系の機能不全は、癌、及び増殖性網膜症、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ及び乾癬などの異常血管新生に関連するいくつかの疾患の鍵となる特徴である。内皮細胞を調節することに関与するキープレイヤーの特定生物学的機能の理解は、そのような疾患を治療するためのより有効な治療適用へと導くであろう［Zachary, Intl. J. Biochem. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998); Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999); Ferrara, J Mol. Med. 77:527-543 (1999)］。
【０００３】
PDGF／VEGFファミリーの成員は、配列：P-[PS]-C-V-X(3)-R-C-[GSTA]-G-C-C［式中、角型括弧は、その括弧内がいずれのアミノ酸であってもよい可変位置を示す］によって規定される保存されたPDGFモチーフを含む多くの構造モチーフによって特徴付けられる。括弧内に含まれる数字は、「V」残基と「R」残基を分けるアミノ酸の数を示す。この保存されたモチーフは、一部には、分子間及び分子内ジスルフィド結合を形成する8個の高度に保存されたシステイン残基によって規定される、70−150アミノ酸の大きなドメインに属する。このドメインは、2本の隣接するβ鎖の間で共有結合環構造を形成する2つのジスルフィド結合、及び他のシステインノット増殖因子、例えばトランスフォーミング増殖因子β（TGF−β）で認められるものに類似した、環を貫通する3番目のジスルフィド結合［例えばMuller ら、Structure 5:1325-1338 (1997)の中の図1参照］から成るシステインノットモチーフを形成する。VEGF−Eを除く、すべての公知のPDGF／VEGFタンパク質のアミノ酸配列はPDGFドメインを含む。PDGF／VEGFファミリータンパク質は、主として、そのサブユニットが逆平行的に配列するジスルフィド結合又は非共有結合ホモ又はヘテロ二量体を形成する分泌糖タンパク質である［StackerとAchen, Growth Factors 17:1-11 (1999); Mullerら、Structure 5:1325-1338 (1997)］。
【０００４】
血小板由来増殖因子（PDGF）サブファミリーは、今までのところ、4つのファミリー成員：PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-Dを含む。これらのリガンドは、異なる選択性で、受容体チロシンキナーゼPDGFR−α及びPDGFR−βの二量複合体に結合し、それらを活性化する。［Heldin, C.H. とWestermark, B. Physiol Rev 79, 1283-1316 (1999)。］心臓血管内皮細胞でのPDGFR−α発現は、心臓内の異なる細胞間の局所連絡に関与することが報告されている[Edelbergら、J Clinical Inves. 102:837-43 (1998)]。PDGFは、インビトロで多くの細胞型の細胞増殖、細胞生存及び走化性を調節する（ [Heldinら、Biochimica et Biophysica Acta 1378:F79-113 (1998); Carmeliet Pら、Nature 380, 435-9 (1996); Hellstrom, M.ら、J Cell Biol 153, 543-53. (2001)]の中で総説されている）。インビボでは、PDGFタンパク質は、しばしばPDGF受容体を発現する間充織に密接に並列する上皮（PDGF-A）又は内皮（PDGF-B）細胞において発現されるので、パラクリン的にそれらの作用を及ぼす［Alitaloら、Int Rev Cytology 172:95-127 (1997)に総説されている］。PDGFの過剰発現は、悪性疾患、アテローム性動脈硬化症及び線維増殖性疾患を含むいくつかの病的状態において認められてきた。インビトロで増殖させた腫瘍細胞及び細胞系統において、PDGFとPDGF受容体の共発現は、細胞トランスフォーメーションにとって重要な、オートクリンループを生成する［Betsholtzら, Cell 39:447-57 (1984); Keatingら, Science 239:914-6 (1988)］。PDGFR-αは、広い発現パターンを有する［Heldin, C.H.とWestermark, B. Physiol. Rev. 79:1283-1316 (1999)］。
【０００５】
細胞増殖及び細胞生存の調節因子としてのPDGFの重要性は、最近のマウスにおける遺伝子ターゲティング試験によって広く例証されている。PDGF-A又はPDGF-Bのいずれかに関するホモ接合ヌル突然変異はマウスにおいて致死的である。ホモ接合PDGF-A欠損マウスの約50％が早期致死表現型を有するが、生存動物は、肺胞間中隔形成不全による肺気腫を有する複雑な生後表現型、及び薄い真皮、毛胞奇形及び細くて薄い毛によって特徴付けられる皮膚表現型を有する。PDGF-Aはまた、希突起神経膠細胞の正常な発達及びその後の中枢神経系の髄鞘形成のためにも必要である。PDGF-B欠損マウスは、腎、血液学的及び心臓血管異常を発現する；腎及び心臓血管障害の場合は、少なくとも一部には、血管への壁細胞（血管平滑筋細胞、血管周囲細胞又は血管間膜細胞）の適切な集積の欠如によるものである。
【０００６】
PDGF-A及びPDGF-Bは、3つの異なるアイソフォーム：PDGF-AA、PDGF-AB又はPDGF-BBを生成するためにホモ二量化又はヘテロ二量化することができる。PDGF-Aは、PDGFα−受容体（PDGR−α／αホモ二量体を含むPDGFR−α）だけに結合することができる。PDGF-Bは、PDGFR−α及び第二のPDGF受容体（PDGFR−β）の両方に結合することができる。より詳細には、PDGF-Bは、PDGFR−α／α及びPDGFR−β／βホモ二量体、並びにPDGFR−α／βへテロ二量体に結合することができる。PDGF-Cは、PDGR−α／αホモ二量体に結合し、PDGF-DはPDGFR−β／βホモ二量体に結合し、両方がPDGFR−α／βへテロ二量体に結合することが報告されている。
【０００７】
PDGF-AA及び−BBは間充織由来の細胞のための主要なマイトジェン及び誘引物質であるが、PDGFR−α及び−βの両方が内皮細胞（EC）で発現されるにもかかわらず、内皮細胞系統の細胞には全く若しくはほとんど作用を及ぼさない。PDGF-BB及びPDGF-ABは、新たに形成された脈管の安定化／成熟に関与することが示された［Isner, J.M. Nature 415, 234-9. (2002); Vale, P.R., Isner, J.M.とRosenfield, K. J lnterv Cardiol 14, 511-28 (2001); Heldin, C.H.と Westermark, B. Physiol Rev 79, 1283-1316 (1999); Betsholtz, C., Karlsson, L.及びLindahl, P. Bioessays 23, 494-507.(2001)］。他のデータは、しかしながら、PDGF-BB及びPDGF-AAがPDGFR−αシグナル伝達を通してのインビボでのbFGF誘導の血管新生を阻害することを示した。PDGF-AAは間充織細胞移動の最も強力な刺激の1つであるが、EC移動は刺激しないか若しくはごくわずかしか刺激しない。ある条件では、PDGF-AAでさえEC移動を阻害する［Thommen, J Cell Biochem. 1997 Mar 1;64(3):403-13; De Marchis, F.ら、Blood 99:2045-53 (2002); Cao, R.ら、FASEB. J. 16:1575-83 (2002)］。さらに、PDGFR−αは、PDGFR−β誘導のSMC移動に拮抗することが示されており［Yu, J.ら、Biochem. Biophys. Res. Cornmun. 282:697-700 (2001)］、またPDGF-AAに対する中和抗体は平滑筋細胞（SMC）移動を増強する(Palumbo, R.ら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22:405-11 (2002))。それ故、特にPDGFR−αを通してシグナル伝達されるとき、PDGFの血管新生／動脈新生活性は議論の余地があり、不可解であった。
【０００８】
PDGF-AA及び−BBは、心臓血管及び神経幹／前駆細胞の両方の増殖と分化において重要な役割を果たすことが報告されている。PDGF-BBは、Flk1＋胚幹細胞の血管壁細胞への分化を誘導し［Carmeliet, P., Nature, 2000, 408:43-45; Yamashitaら、Nature 408:92-6 (2000)］、ニューロスフェア由来のニューロンの生存率を強力に上昇させた［Caldwell, M. A.ら、Nat Biotechnol, 2001, 19:475-479］；一方PDGF-AAは、αvβ3インテグリンを通して希突起神経膠細胞前駆体の増殖を刺激した［Baronら、Embo. J. 21:1957-66 (2002)］。
【０００９】
発達の間、PDGF-Cは、心臓、肺及び腎臓を含む大部分の器官で筋前駆細胞及び分化した平滑筋細胞において発現される［Aase, K.ら、Mech. Dev. 110:187-91 (2002)］。成体期には、PDGF-Cは大部分の器官において広く発現され、心臓と腎臓で発現レベルが最も高い［Li, X.ら、Nat. Cell. Biol. 2:302-09 (2000)］。PDGF-CCは、約95kDの不活性ホモ二量体として分泌される。CUBドメインのタンパク質分解性除去後、PDGF-CCはその受容体であるPDGFR−αに結合し、それを活性化することができる［Li, X. とEriksson, U., Cytokine & Growth Factor Reviews 244:1-8 (2003)］。PDGFR−αと−βの両方を共発現する細胞では、PDGF-CCはPDGFR−α／βヘテロ二量体も活性化しうるが、PDGFR−β／βホモ二量体は活性化しない［Cao, R.ら、FASEB. J 16:1575-83. (2002); Gilbertson, D.G.ら、J. Biol. Chem. 10:10 (2001)］。
【００１０】
活性PDGF-CCは、線維芽細胞及び血管平滑筋細胞のための強力なマイトジェンである［Liら、Nat. Cell. Biol. 2:302-09 (2000); Caoら、FASEB. J. 16:1575-83 (2002); Uutelaら、Circulation 103:2242-7 (2001)］。PDGF-AA及びPDGF-CCの両方がPDGFR−αに結合するが、PDGF-CCだけがマウス角膜ポケット及びヒヨコ絨毛尿膜（CAM）アッセイにおいて血管新生を強力に刺激する［Caoら、FASEB. J. 16:1575-83 (2002)］。PDGF-CCはまた、組織の血管新生を刺激することによって創傷治癒を促進する［Gilbertsonら、J. Biol. Chem. 10:10 (2001)］。しかし、これらの試験は、PDGF-CCが内皮又は平滑筋細胞に影響を及ぼすことによって脈管増殖を刺激したかどうかは明らかにしておらず、またPDGF-CCが新たに形成された脈管の成熟（血管形成、血管新生、新生血管形成及び動脈新生を含む）を促進したかどうかは検討しなかった。
【００１１】
VEGFサブファミリーは、配列：C−X（22−24）−P−［PSR］−C−V−X（3）−R−C−［GSTA］−G−C−C-X（6）−C−X（32−41）−Cによって特徴付けられるVEGF相同性ドメイン（VHD）を共有する成員から成る。VEGFサブファミリー成員の分析を通して決定されたVHDドメインは、PDGFモチーフを含むが、より特異的である。増殖因子及び受容体のVEGFサブファミリーは、血管内皮系の発生と成長を調節する。VEGFファミリー成員は、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及びPlGFを含む［Li, X. とU. Eriksson, “Novel VEGF Family Members: VEGF-B, VEGF-C and VEGF-D,” Int. J Biochem. Cell. Biol., 33(4):421-6 (2001)］。
【００１２】
VEGF-A（又はVEGF）は、内皮細胞に対するそのマイトジェン活性に基づいて、及びまた微小血管透過性を誘導するその能力によって、最初にいくつかのソースから精製され、それ故血管透過因子（VPF）とも呼ばれる。VEGF-Aはその後、細胞内カルシウムの動員、プラスミノーゲン活性化因子及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子−1の合成の誘導、インビトロでの単球移動の促進、ヒト内皮細胞における抗アポトーシスタンパク質発現の誘導、内皮細胞における開窓の誘導、内皮細胞における細胞接着分子発現の促進及び酸化窒素媒介性血管拡張及び血圧低下の誘導を含む、多くの生物学的過程を誘導することが示された［Ferrara, 3. Mol. Med. 77: 527-543 (1999); Neufeldら、FASEB. J 13:9-22 (1999); Zachary, Intl. J. Biochem. Cell. Bio. 30:1169-74 (1998)］。
【００１３】
VEGF-Aは、23kDサブユニットから成るジスルフィド結合ホモ二量体分泌糖タンパク質である。別々のmRNAスプライス変異体によってコードされる、121、145、165、189又は206アミノ酸の長さの5個のヒトVEGF-Aアイソフォーム（VEGF121−VEGF206）が記述されており、そのすべてが内皮細胞における有糸分裂誘発を刺激することができる。しかし、各々のアイソフォームは、生物活性、受容体特異性、及びVEGF-Aについての低親和性受容体として行動する、細胞表面及び細胞外マトリックス関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンについての親和性が異なる。VEGF121はヘパリン又はヘパラン硫酸のいずれにも結合しない；VEGF145及びVEGF165（GenBankアクセッション番号M32977）はどちらもヘパリンに結合することができる；そしてVEGF189及びVEGF206は、ヘパリン及びヘパラン硫酸に最も強い親和性を示す。VEGF121、VEGF145及びVEGF165は可溶性形態で分泌されるが、VEGF165の大部分は細胞表面及び細胞外マトリックスプロテオグリカンに限局され、一方VEGF189及びVEGF206は細胞外マトリックスに結合したままである。VEGF189とVEGF206はどちらも、ヘパリン又はヘパリナーゼでの処理によって放出させることができ、これらのアイソフォームがプロテオグリカンによって細胞外マトリックに結合していることを示す。細胞結合VEGF189はまた、プラスミンなどのプロテアーゼによっても切断することができ、活性な可溶性VEGF110の放出を生じる。VEGFを発現する組織の大部分は、いくつかのVEGFアイソフォームを同時に発現することが認められるが、VEGF121及びVEGF165が主要な形態であり、VEGF206はまれにしか検出されない［Ferrara, J. Mol. Med, 77:527-543 (1999)］。VEGF145は、主として生殖器官に由来する細胞において発現される点が異なる［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)］。
【００１４】
VEGF-A発現のパターンは、正常血管系の発達と維持、及び腫瘍増殖及び慢性関節リウマチなどの他の病的状態に関連する血管新生へのその関与を示唆する。VEGF-Aは、発生中の血管系に関連する胚組織において発現され、数多くの腫瘍細胞系統によって分泌される。標的遺伝子破壊によってVEGF-Aがノックアウトされたマウスの分析は、VEGF-Aが生存のために必須であること、及び心臓血管系の発生はVEGF-A濃度勾配に対して高度に感受性であることを指し示す。1コピーのVEGF-Aを欠損するマウスは、妊娠11日目から12日目までに死亡する。これらの胚は、成長障害及び発生中の心臓血管系の欠損を含むいくつかの発育異常を示す。VEGF-Aはまた、生後に、成長、器官の発達、成長板の形態形成及び軟骨内性骨形成の調節のためにも必要である。VEGF-Aの必要性は年齢と共に、特に生後4週間目から低下する。成熟動物では、VEGF-Aは主として、創傷治癒及び黄体の発生などの過程における活発な血管新生のために必要である［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999); Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)］。VEGF-A発現は、主として低酸素症、及び上皮増殖因子（EGF）、TGF−β及び様々なインターロイキンを含む多くのホルモン及びサイトカインによって影響される。調節は転写時に起こり、またmRNA安定性の上昇などによって転写後にも起こる［Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)］。
【００１５】
単一VEGF（VEGF-A）対立遺伝子の欠如は胚致死をもたらす(Carmeliet, P.ら、Nature, 380(6573):435-39 (1996);及びFerrara, N.ら、Nature, 380(6573):439-42 (1996))。VEGF-Aは4つの受容体、VEGFR-1、VEGFR−2、ニューロピリン−1及びニューロピリン−2に結合する（Poltorak, Z., T. CohenとG. Neufeld, Herz., 25(2):126-9 (2000)）。
【００１６】
VEGFサブファミリーのもう1つの成員であるPlGFは、一般にVEGF-Aと比較すると血管新生及び内皮細胞増殖の劣等な刺激因子であり、PlGFのインビボでの役割はよく理解されていない。選択的mRNAスプライシングによって生成されるPlGFの3つのアイソフォームが記述されている［Hauserら、Growth Factors 9:259-268 (1993); Maglioneら、Oncogene 8:925-931 (1993)]。PlGFは、ジスルフィド結合ホモ二量体及びVEGF-Aとのヘテロ二量体の両方を形成する。PlGF−VEGF-Aへテロ二量体は、内皮細胞増殖及び血管新生を誘導する上でPlGFホモ二量体よりも有効である。PlGFは主として胎盤で発現され、また初期胚形成の間、壁側卵黄嚢の栄養膜巨細胞 においてVEGF-Aと共発現される［StackerとAchen, Growth Factors 17:1-11 (1999)］。
【００１７】
一時、血管増殖の制御に関する研究はVEGFとVEGFR−2に集中していたが、最近になってVEGFR-1、及びPlGF及びVEGF-Bを含む、VEGF以外のそのリガンドに、より注目が集まってきた。［ErikssonとAlitalo, Nat. Med. 8:775-777 (2002)。］PlGFノックアウトマウスは胚血管新生において有意の異常を経験しない。しかし、マウスにおけるPlGF欠損は、虚血、炎症、創傷治癒及び癌の間、血管新生、血漿の血管外遊出及び側副枝増殖を損なうことが報告された。［Carmelietら、Nat. Med. 7:575-83 (2001)。］Hattoriらは、PlGFが、VEGFR-1＋造血幹細胞を休止から増殖性骨髄微小環境へと集積するのを促進し、造血に寄与することを報告した。［Nat. Med. 8:841-49 (2002)。]Luttunと共同研究者たちは、PlGFが、虚血心臓及び四肢において、VEGFを上回らないまでも同等の効率で血管新生及び側副枝増殖を刺激することを報告した。［Nat. Med. 8:831-40 (2002)。］
ヒト及びマウスVEGF-Bについてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む、VEGF-Bの単離と特性決定が、Ludwig Institute for Cancer Research and Helsinki University Licensing Ltd. OyによるPCT／US96／02957及び米国特許第5,840,693号及び同第5,607,918号及びOlofssonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581 (1996)の中で詳細に述べられている。ヒトVEGF-Bをコードするヌクレオチド配列はまた、GenBankアクセッション番号U48801でも認められる。国際特許出願PCT／US97／14696（WO 98／07832）、米国特許第5,840,693号及び同第5,607,918号の開示全体が参照して本明細書中に組み込まれる。
【００１８】
VEGF-Bは心臓において非常に強く発現され、肺では弱く発現されるだけであるが、VEGF-Aについてはその逆である。RT−PCRアッセイは、黒色腫、正常皮膚及び筋肉におけるVEGF-B  mRNAの存在を明らかにした。これは、VEGF-AとVEGF-Bが、それらが多くの組織で共発現されるという事実にもかかわらず、機能的相違を有することを示唆する。PDGF／VEGFファミリーの増殖因子の比較は、VEGF-Bの167アミノ酸アイソフォームが、全くグリコシル化を有さない唯一のファミリー成員であることを示す。遺伝子ターゲティング試験は、VEGF-B欠損が軽度の心臓性表現型及び冠状動脈血管系障害を生じさせることを示した（Bellomoら、Circ. Res., 86:E29-35 (2000)）。
【００１９】
VEGF-Bについてのヒト及びマウス遺伝子はほとんど同一であり、どちらも約4kBのDNAにわたる。それらの遺伝子は7個のエクソンから成り、エクソン−イントロン構成はVEGF-A及びPlGF遺伝子のものに類似する。［Grimmondら、Genome Res., 6:124-131 (1996); Olofssonら、J. Biol. Chem., 271:1931 0-17 1996］; Townsonら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 220:922-928 (1996)。］VEGF-BはVEGFR-1及びニューロピリン−1に特異的に結合する。[Olofsson, B.ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 93(6):2576-81 (1996); Olofsson, B.ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95(20):11709-14 (1998)。]
VEGF-Bは他のVEGFファミリー成員と比べてユニークな発現パターンを示し、心筋細胞における発現レベルが最も高いが［Aase, K.ら、Developmental Dynamics, 215(1):12-25 (1999)］、一方VEGFR-1はその隣接内皮細胞において発現され［Aase, K.ら、Developmental Dynamics, 215(1):12-25 (1999)］、ニューロピン−1（NP−1）は、発生の間、内皮及び心筋細胞の両方で発現される[Makinen, T.ら、Journal of Biological Chemistry, 274(30):21217-22 (1999);及びKitsukawa, T.ら、Development, 121(12):4309-18 (1995)]。VEGF-Bとその受容体の時間的−空間的発現パターンは、心臓におけるVEGF-Bのオートクリンとパラクリンの両方の役割を示唆する。
【００２０】
VEGF-BとPlGFはいずれも、ヘパリンについての親和性が異なる2つの選択的スプライシング形態で存在し、どちらの増殖因子もVEGFとヘテロ二量体を形成することができる。Olofssonら、Cell Biol., 95:11709-11714 (1998)。VEGF-BとPlGFの両方がVEGFR-1と独占的に結合すると思われ、VEGFR−2又はVEGFR−3とは結合しないが、これら2つの増殖因子は異なる機能を有すると思われる。例えばHattoriらは、PlGFが、VEGFR-1に結合することによって及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−9の発現を誘導することによって造血回復に影響を及ぼすことを報告した。[Nat. Med. 8:841-49 (2002)。]Carmelietらは、VEGF-BがPlGF欠損マウスにおける発生を救済しなかったことを報告した。[Nat. Med., 7:575-83 (2001)。]VEGF-BとPlGFの発現も実質的に異なっており、VEGF-Bは、PlGFと異なって、広く発現され、心臓及び骨格筋において最も顕著である。さらに、VEGFR-1結合に関与するVEGF残基は、PlGFよりもVEGF-Bにおいてより高度に保存されている [Olofssonら、Cell Biol. 95:11709-11714 (1998)。]以下で論じるVEGF-Bアイソフォーム、VEGF-B186がNP−1と結合するにはタンパク質分解プロセシングが必要であるが、PlGFがNP−1と結合するのにそのようなプロセシングは必要ない。
【００２１】
選択的mRNAスプライシングによって生成される2つのVEGF-Bアイソフォーム、VEGF-B186及びVEGF-B167が存在し、最初のアイソフォームが総VEGF-B転写産物の約80％を占める。[Li, X.ら、Growth Factor, 19:49-59 (2001)。][Grimmondら、Genome Res., 6:124-131 (1996); Olofssonら、J. Biol. Chem., 271:19310-19317 (1996)。]前記アイソフォームは、シグナル配列を除き、115アミノ酸残基の同一のN末端ドメインを有する。共通のN末端ドメインはエクソン1−5によってコードされる。残りのエクソン6A、6B及び7の異なる用途が2つのスプライスアイソフォームを生じる。エクソン6内の選択的スプライス受容部位の使用により、101bpの挿入はフレームシフトとVEGF-B167  cDNAのコード領域の終結を導入する。それ故、2つのVEGF-Bアイソフォームは異なるC末端ドメインを有する。
【００２２】
2つのVEGF-Bアイソフォームはそれらのカルボキシ末端が異なり、ニューロピリン−1に結合する異なった能力を示す。[Makinenら、J. Biol. Chem., 274(30):21217-22 (1999)。]さらに、VEGF-B186は遊離状態で分泌され、一方VEGF-B167は分泌されるが主として細胞結合しており、2つのアイソフォームの機能特性が異なりうることを示唆する。どちらのアイソフォームも細胞外マトリックス、テネイシン−Xに結合し、VEGF受容体−1（VEGFR-1）を通して内皮細胞増殖を刺激する[Ikutaら、Genes Cells, 5(11):913-927 (2000)。]
VEGF-Bの2つのスプライスアイソフォームの異なるC末端ドメインは、それらの生化学的及び細胞生物学的性質に影響を及ぼす。VEGF-B167のC末端ドメインはVEGF内の対応する領域に構造的に関連し、いくつかの保存されたシステイン残基と一連の塩基性アミノ酸残基を有する。それ故、このドメインは高度に親水性で塩基性であり、従って、VEGF-B167は、生じる細胞をヘパリン又は高い塩濃度で処理しない限り、分泌時に細胞結合したままである。VEGF-B167に結合する細胞結合分子は、細胞表面又は細胞周囲ヘパリン硫酸プロテオグリカンであると考えられる。このアイソフォームの細胞結合は、そのユニークな塩基性C末端領域を通して起こる可能性が高い。VEGF-B186の疎水性C末端ドメインは、データベースの公知のアミノ酸配列と有意の類似性を有さない。VEGF-B186は細胞から遊離して分泌され[(Olfssonら、J.Biol.Chem.,271:19310-19317 (1996))、このアイソフォームがタンパク質分解性にプロセシングされて、タンパク質の生物学的性質を調節することを示す証拠が存在する。[Olofssonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:11709-11714 (1998)。]
VEGF-Bアイソフォームの間のさらなる相違は、VEGF-Bアイソフォームのグリコシル化に認められる。VEGF-B167は全くグリコシル化されないのに対し、VEGF-B186はO-グリコシル化されるが、N−グリコシル化されない。
【００２３】
VEGF-Bの両方のアイソフォームが、PDGF様タンパク質の分子間及び分子内ジスルフィド結合に関与する8個のシステイン残基の保存と一致して、VEGFとヘテロ二量体を形成することができる。さらに、多くの組織におけるVEGF-BとVEGFの共発現は、VEGF-B−VEGFヘテロ二量体が天然で生じることを示唆する。VEGF-B167−VEGFのヘテロ二量体は細胞結合したままである。これに対し、VEGF-B186とVEGFのへテロ二量体は培地中で細胞から遊離して分泌される。VEGFはまた、PlGFとヘテロ二量体を形成する。[DiSalvoら、J. Biol. Chem. 270:7717-7723 (1995)]。このファミリーの増殖因子の成員間でのヘテロ二量複合体の生成は、血管新生又は調節分子の多様なアレイのための基礎を提供しうる。Enholmら、国際特許公開番号WO02／36131は、血管新生活性を刺激するために、VEGF-Bをコードする第一ベクターをもう1つ別の血管内皮細胞増殖因子をコードする第二ベクターと共に使用するアデノウイルス遺伝子治療を報告している。
【００２４】
VEGFサブファミリーの4番目の成員であるVEGF-Cは、VEGF-Aとアミノ酸レベルで約30％同一であるVHDを含む。VEGF-Cは最初に、VHDに隣接する大きなアミノ及びカルボキシ末端ペプチド配列を有し、C末端ペプチドがバルビアニ環3タンパク質の典型的なモチーフで縦列反復されるシステイン残基を含む、より大きな前駆体タンパク質、プレプロVEGF-Cとして発現される。プレプロVEGF-Cは、シグナルペプチド、C末端プロペプチド及びN末端プロペプチドの連続的な切断を含む広汎なタンパク質分解性成熟を受ける。分泌されるVEGF-Cタンパク質は、各々の単量体がVHDを含む、非共有結合ホモ二量体から成る。部分的タンパク質分解プロセシングによって生成されるVEGF-Cの中間体はVEGFR−3受容体に高い親和性を示し、成熟タンパク質はVEGFR−2受容体にも結合することができる。[Joukovら、EMBO J., 16(13):3898-3911 (1997)]。また、156位の1個のシステインが別のアミノ酸によって置換されるか又は欠失した突然変異型VEGF-Cは、VEGFR−2に結合する能力を喪失するが、依然としてVEGFR−3に結合してそれを活性化することができることも明らかにされた[国際特許公開番号WO98／33917]。マウス胚において、VEGF-C mRNAは尿膜、頚静脈領域、および後腎に最初に発現される。[Joukovら、J Cell. Physiol. 173:211-15 (1997)]。
【００２５】
VEGF-Cは、リンパ組織血管新生の調節に関与する：VEGF-Cがトランスジェニックマウスの皮膚において過剰発現されたとき、リンパ管ネットワーク過形成が認められ、VEGF-Cがリンパ増殖を誘導することを示唆した[Jeltschら、Science, 276:1423-1425 (1997)]。生体における持続的なVEGF-Cの発現も、分化したリンパ内皮の維持における役割を指し示す[Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)]。加えて、VEGF-Cは血管新生特性を示す：VEGF-Cは、コラーゲン中のウシ毛細管内皮（BCE）細胞の移動を刺激し、ヒト内皮細胞の増殖を促進することができる。[例えば、参照して本明細書中に組み込まれる、国際特許公開番号WO98／33917参照。]
VEGF-Dは、構造的及び機能的にVEGF-Cに最も密接に関連する。[参照して本明細書中に組み込まれる、国際特許公開番号WO98／07832参照]。VEGF-Cと同様に、VEGF-Dは最初、N末端及びC末端タンパク質分解プロセシングを受けるプレプロペプチドとして発現され、非共有結合二量体を形成する。VEGF-Dは、インビトロで内皮細胞におけるマイトジェン応答を刺激する。胚形成の間、VEGF-Dは複雑な時間的・空間的パターンで発現され、成体では心臓、肺及び骨格筋においてその発現が存続する。VEGF-DΔNΔCと称されるVEGF-Dの生物活性フラグメントの単離が、参照して本明細書中に組み込まれる、国際特許公開番号WO98／07832に述べられている。VEGF-DΔNΔCは、アフィニティータグペプチドFLAG（登録商標）に結合したVEGF-Dのアミノ酸残基93−201から成る。
【００２６】
VEGFサブファミリーの4つの付加的な成員が、ヒト、ヒツジ及びヤギに感染するポックスウイルスにおいて特定された。orfウイルスをコードするVEGF−E及びNZ2 VEGFは強力なマイトジェン及び透過促進因子である。どちらも哺乳動物VEGF-Aと約25％のアミノ酸同一性を示し、ジスルフィド結合ホモ二量体として発現される。これらのウイルスによる感染は、これらのウイルスVEGFタンパク質によって誘導される内皮細胞増殖及び血管透過性ニ関与しうる膿疱性皮膚炎によって特徴付けられる。[Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999); StackerとAchen, Growth Factors 17:1-11 (1999)]。VEGF様タンパク質はまた、orfウイルスの2つの付加的な株、D1701[ GenBankアクセッション番号AF106020;Meyerら、EMBO. J 18:363-374 (1999)に述べられている]及びNZ10[参照して本明細書中に組み込まれる、国際特許出願PCT／US99／25869に述べられている]からも特定された。これらのウイルスVEGF様タンパク質は宿主内皮に存在するVEGFR−2に結合することが示されており、この結合は、感染の発現及び血管新生のウイルス性誘導にとって重要である[[Meyerら、EMBO. J 18:363-74 (1999);国際特許出願PCT／US99／25869。]
PDGF／VEGFファミリー成員と相互作用する7つの細胞表面受容体が特定されている。これらは、PDGFR−α[例えばGenBankアクセッション番号NM006206参照]、PDGFR−β[例えばGenBankアクセッション番号NM002609参照]、VEGFR-1／Flt−1（fms様チロシンキナーゼ−1）[GenBankアクセッション番号X51602；De Vriesら、Science 255:989-991 (1992)]； VEGFR−2／KDR／F1k−1 (受容体／胎児肝キナーゼ−1を含むキナーゼインサートドメイン) [GenBankアクセッション番号X59397 （Flk−1）及びL04947 （KDR）; Termanら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-1586 (1992); Matthewsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030 (1991)]; VEGFR−3／Flt4 （fms様チロシンキナーゼ4）［米国特許第5,776,755号及びGenBankアクセッション番号X68203 及びS66407; Pajusolaら、Oncogene 9:3545-3555 (1994)］；ニューロピリン−1 [Gen Bankアクセッション番号NM003873]及びニューロピリン-2［Gen Bankアクセッション番号NM003872］を含む。前記の2つのPDGF 受容体は、ここで述べるPDGFのシグナル伝達を仲介する。VEGF121、VEGF165、VEGF-B、P1GF−1及びP1GF−2はVEGF−R1に結合する；VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF-C、VEGF-D、VEGF−E及びNZ2  VEGFはVEGF−R2に結合する；VEGF-C及びVEGF-DはVEGFR−3に結合する；VEGF165、P1GF−2及びNZ2 VEGFはニューロピリン−lに結合する；そしてVEGF165はニューロピリン−2に結合する。[Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999); StackerとAchen, Growth Factors 17:1-11 (1999); Ortegaら、Fron. Biosci. 4:141-152 (1999); Zachary, Intl. J. Biochem. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998); Petrovaら、Exp. Cell. Res. 253:117-130 (1999)]。
【００２７】
PDGF受容体（PDGFR−α／α、PDGFR−α／β及びPDGFR−β／βを含む）は、それらの細胞外ドメインの各々に5つの免疫グロブリン様ループを含むタンパク質チロシンキナーゼ受容体（PTK）である。VEGFR-1、VEGFR−2及びVEGFR−3は、それらの細胞外ドメインにおける7つのIgドメインの存在及び細胞質領域内のスプリットキナーゼドメインの存在によって識別されるPTKを含む。ニューロピリン−1及びニューロピリン−2はいずれも非PTK  VEGF受容体である。NP−1は、MAMドメイン；凝固因子V及びVIII、MFGP及びDDRチロシンキナーゼに相同な領域；及び2つのCUB様ドメインを含む、細胞外部分を有する。
【００２８】
VEGF受容体のいくつかは、2以上のアイソフォームとして発現される。7番目のIg様ループ、膜貫通ドメイン及び細胞質領域を欠くVEGFR-1の可溶性アイソフォームは、ヒト臍静脈内皮細胞において発現される。このVEGFR-1アイソフォームは高い親和性でVEGF-Aに結合し、VEGF-A誘導のマイトジェン応答を防ぐことができる［Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999); Zachary, Intl. J. Biocheni. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998)］。VEGFR−2のC末端トランケート形態も報告されている［Zachary, Intl. J. Biochem. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998)］。ヒトでは、C末端の長さが異なる、VEGFR−3タンパク質の2つのアイソフォームが存在する。試験は、より長いアイソフォームがVEGFR−3の生物学的性質の大部分の責任を担うことを示唆する。
【００２９】
PDGFについての受容体、PDGFα受容体（PDGFR−α）及びβ受容体（PDGFR−β）は、多くのインビトロ増殖細胞系統によって発現され、インビボでは主として間充織細胞によって発現される。
【００３０】
マウスにおける遺伝子ターゲティング試験は、PDGFRの重複するリガンド特異性にもかかわらず、PDGF受容体についての異なる生理的役割を明らかにした［Rosenkranzら、Growth Factors 16:201-16 (1999)］。2つのPDGF受容体のいずれかに関するホモ接合ヌル突然変異は致死的である。PDGFR−β欠損マウスは、10日目に胚形成中に死亡し、不完全な頭閉鎖、神経堤発達障害、心臓血管欠損、骨格欠損及び水腫を示す。PDGFR−β欠損マウスは、腎臓、血液学的及び心臓血管異常によって特徴付けられる、PDGF-B欠損動物に類似した表現型を発現する；前記腎及び心臓血管欠損は、少なくと一部には、血管への壁細胞（血管平滑筋細胞、血管周囲細胞及び血管間膜細胞）の適切な集積の欠如によるものである。
【００３１】
VEGFR-1の発現は主として血管内皮細胞において起こるが、一部は単球、栄養膜細胞及び腎血管間膜細胞にも存在しうる［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)］。高レベルのVEGFR-1 mRNAは成体器官においても検出され、VEGFR-1が細胞増殖には関連しない成熟血管の静止状態内皮において機能を有することを示唆する。VEGFR-1−／−マウスは8.5日から9.5日の間に子宮内で死亡する。これらの動物において内皮細胞は発生したが、機能的血管の形成は深刻に損なわれており、VEGFR-1が細胞移動に関連する細胞−細胞又は細胞−マトリックス相互作用に関与しうることを示唆した。最近、チロシンキナーゼドメインだけが失われた突然変異型VEGFR-1を発現するマウスが正常な血管新生及び生存を示すことが明らかにされ、VEGFR-1のシグナル伝達能力が必須ではないことを示唆した［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999); Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)］。
【００３２】
VEGFR−2発現は、血管内皮において広く発現されるという点でVEGFR-1に類似するが、VEGFR−2は造血幹細胞、巨核球及び網膜前駆細胞にも存在する［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)］。VEGFR-1とVEGFR−2の発現パターンは広汎に重複するが、データは、大部分の細胞型において、VEGFR−2が、ほとんどのVEGFがそれを通して生物活性を及ぼす主要受容体であることを示唆する。VEGFR−2を欠損したマウス胚の検討は、この受容体が内皮細胞分化と造血細胞の発生の両方に必要であることをさらに指し示す[Joukovら、J Cell. Physiol. 173:211-215 (1997)]。
【００３３】
VEGFR−3は、初期胚形成の間、内皮細胞において広く発現される。発生の後期には、VEGFR−3の発現は発達中のリンパ管に限定されるようになる［Kaipainen, A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3566-70 (1995)］。成体では、リンパ内皮及び一部の高内皮性小静脈がVEGFR−3を発現し、転移性リンパ節及びリンパ管腫におけるリンパ洞で高い発現が起こる。VEGFR−3はまた、過剰発現試験によって明らかにされたVEGF-Cの骨髄造血活性を仲介しうるCD34＋造血細胞のサブセットにおいても発現される［国際特許公開番号WO98／33917］。マウス胚におけるVEGFR−3遺伝子の標的破壊は、一次血管網のリモデリングの失敗及び胚9.5日目以後の死亡を導く［Dumontら、Science 282:946-49 (1998)］。これらの試験は、胚血管系の発生における、そしてまたリンパ管形成の間の、VEGFR−3の不可欠の役割を示唆する。
【００３４】
VEGF受容体の構造分析は、VEGFR-1及びVEGFR−2上のVEGF-A結合部位が2番目及び3番目のIg様ループ内に位置することを示す。同様に、VEGFR−2及びVEGFR−3上のVEGF-C及びVEGF-D結合部位も2番目のIgループ内に含まれる［Taipaleら、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237:85-96 (1999)］。2番目のIg様ループはまた、ドメイン交換実験によって示されたようにリガンド特異性を付与する［Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)］。受容体−リガンド試験は、VEGFファミリータンパク質によって形成される二量体は2つのVEGF受容体分子に結合することができ、それによってVEGF受容体を二量化することを示す。VEGFR-1上の、そしておそらくVEGFR−2上でも、4番目のIg様ループは、受容体がリガンド二量体に結合するときに2つの受容体分子を連結する、受容体二量化ドメインとして働く［Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543 (1999)］。VEGFR-1及びVEGFR−2に結合するVEGF-Aの領域は大きく重複するが、VEGFR-1又はVEGFR−2のいずれかと相互作用するVEGF-A内の2つの別々のドメイン、並びにリガンド−受容体相互作用にとって決定的に重要なこれらのドメイン内の特定アミノ酸残基が試験で明らかにされた。1つの特定VEGF受容体への結合を特異的に妨げる、どちらかのVEGF受容体特異的ドメイン内の突然変異も回復された［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)］。
【００３５】
VEGFR-1とVEGFR−2は構造的に類似し、共通のリガンド（VEGF121及びVEGF165）を共有し、発生の間類似の発現パターンを示す。しかし、同じリガンドによってVEGFR-1及びVEGFR−2を通して伝達されるシグナルはわずかに異なると思われる。VEGFR−2はVEGF-Aに応答して自己リン酸化を受けることが示されているが、同じ条件下でVEGFR-1のリン酸化はかろうじて検出可能であった。VEGFR−2媒介性シグナルは、組換えによってこの受容体を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の形態の著しい変化、アクチン再編成及び膜ラッフリングを引き起こす。これらの細胞において、VEGFR−2はまた、リガンド誘導の走化性及び有糸分裂誘発性も媒介した；一方VEGFR-1でトランスフェクトした細胞はVEGF-Aに対するマイトジェン応答を示さなかった。VEGFR−2への結合を分断するVEGF-A内の突然変異は、内皮細胞の増殖を誘導することができないが、VEGFR-1への結合を欠損するVEGF-A突然変異体は、まだ内皮細胞増殖を促進することができる。同様に、VEGFR−2だけを発現する細胞のVEGF刺激はマイトジェン応答を導くが、VEGFR-1だけを発現する細胞の同等の刺激は、同じく細胞移動を生じさせるが、細胞増殖は誘導しない、加えて、VEGFR-1及びVEGFR−2と共沈するリンタンパク質は異なっており、異なるシグナル伝達分子が受容体特異的分子内配列と相互作用することを示唆する。
【００３６】
血管新生におけるVEGFR-1の主要機能は、VEGF-Aに結合し、VEGFR−2とのその相互作用を妨げることによってVEGF-Aの活性を負に調節することであると考えられるが、一方VEGFR−2は、内皮細胞におけるVEGF-Aシグナルの主たるトランスデューサーであると思われる。この仮説の裏づけとして、VEGFR-1欠損マウスは胚で死亡するのに対し、VEGF-Aに結合することができるVEGFR-1受容体を発現するが、チロシンキナーゼドメインを欠くマウスは生存し、胚発生又は血管新生の異常を示さない。加えて、VEGFR−2だけに結合するVEGF-A突然変異体の分析は、それらが内皮細胞においてマイトジェン応答を誘導する能力を保持することを示す。しかし、VEGF仲介性の単球移動はVEGFR-1に依存し、この受容体を通してのシグナル伝達が少なくとも1つの生物学的機能にとって重要であることを指し示す。さらに、VEGF-Aが樹状細胞の成熟を妨げる能力もVEGFR-1シグナル伝達に関連し、VEGFR-1が内皮細胞以外の細胞型においても機能しうることを示唆する［Ferrara, J Mol. Med. 77:527-543 (1999); Zachary, Intl. J Biochem. Cell. Bio. 30:1169-1174 (1998)］。
【００３７】
ニューロピリン−1は、最初は、軸索誘導に関与するコラプシン／セマフォリンファミリーのタンパク質についての受容体としてクローン化された［StackerとAchen, Growth Factors 17:1-11 (1999)］。ニューロピリン−1は、胚発生の間、内皮及び特定サブセットのニューロンの両方で発現され、発生中の神経及び血管系を調整することに関与すると思われる。ニューロピリン−1の活性化は、VEGFファミリーのチロシンキナーゼ受容体の不在下では生物学的応答を誘発しないと思われるが、細胞上にそれらが存在することは、より効率的なVEGF165の結合及びVEGFR−2媒介性応答を導く［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)］。ニューロピリン−1を欠くマウスは、発生中の肺心臓血管系の異常を示す［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)］。
【００３８】
ニューロピリン−2は発現クローニングによって特定され、ニューロピリン−1に密接に関係するコラプシン／セマフォリン受容体である。ニューロピリン−2は、VEGF165だけに結合するという点でアイソフォーム特異的VEGF受容体である。ニューロピリン−1と同様に、ニューロピリン−2は内皮と特定ニューロンの両方で発現され、その比較的短い細胞内ドメインの故に独立して機能しないと予測される。血管発生におけるニューロピリン−2の機能は不明である［Neufeldら、FASEB. J. 13:9-22 (1999)；国際特許公開番号WO99／30157］。
【００３９】
前駆細胞とも称される幹細胞は、胚幹細胞と成体幹細胞の両方を包含する。成体幹細胞は、神経幹細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞及び上皮幹細胞を含むが、これらに限定されない。Tepperら、Plastic and Reconstructive Surgery, 111:846-854 (2003)参照。内皮前駆細胞は血液中を循環し、損傷内皮によって特徴付けられる領域へと移動する。Kaushalら、Nat. Med., 7:1035-1040 (2001)。種々の造血ソースからのヒトCD34（＋）CD133（＋）幹細胞の小さなサブ個体群はVEGFR−3を共発現する（Salvenら、Blood, 101(1):168-72 (2003)）。これらの細胞はまた、インビトロでリンパ及び／又は血管内皮細胞へと分化する能力を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
骨髄抑制は、化学療法及び骨髄移植を受ける被験体が経験する問題である。骨髄抑制を治療する新しい方法が当技術分野において求められている。
【００４１】
VEGF-B及びPDGF又はVEGF-B及びPDGFの拮抗物質を用いる新しい治療法の必要性が、依然として当技術分野に存在する。また当技術分野では、血管幹／前駆細胞の動員、幹細胞接着／生存度の上昇、及び治療における使用のための幹細胞分化の促進を生じさせることができる増殖因子を特定することが求められている。
【００４２】
虚血組織の治療的血管再生が成功するためには、新たに形成された脈管が成熟しており、耐久性があって、機能性でなければならない。これらの必要条件は、新しい内皮系統脈管が発芽しなければならない（「血管新生」）ということだけでなく、血管前駆細胞と多数の心臓血管細胞型の分化細胞の両方の関与を必要とする過程である、これらの新生脈管が血管周囲平滑筋細胞及び／又は線維芽細胞によって覆われること（「動脈新生」）も意味する。新生血管形成及び脈管形成も関係する。成体脈管形成を含む脈管形成は、血管前駆細胞が分化して、活発な脈管増殖部位へと動員される過程である。血管／動脈新生は候補遺伝子の不活性化によって容易に調節不全に陥る［Carmeliet, P.ら、Nature 380:435-39 (1996); Hellstrom, M.ら、J Cell. Biol. 153:543-53 (2001)］が、機能的に適切にこれらの過程を刺激することは、予想されたよりもはるかに大きな難問であることが明らかになった。この目標に到達するための試験材料と方法、好ましくは内皮と平滑筋の両方の細胞系統の血管前駆細胞及び分化血管細胞の両方に多面作用を有するものが必要とされている。
【００４３】
VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB、TGF−β、bFGF又はPlGFのいずれもが、成体骨髄由来前駆細胞においてSMC遺伝子の発現を誘導することは記述されておらず、ごくわずかな分子が、成体骨髄（BM）幹細胞由来のSMC前駆細胞の分化と機能を調節することが発見されている［Hirschi, K.K.とGoodell, M.A., Gene Ther. 9:648-52 (2002)］。PDGF-BBは、胚血管前駆細胞がSMC表現型を獲得することを刺激するが[Hirschi, K.K.とGoodell, M.A., Gene Ther. 9:648-52 (2002); Carmeliet, P., Nature 408:43, 45 (2000); Yamashita, J.ら、Nature 408:92-6 (2000)]、成体骨髄由来前駆細胞に同様の作用を及ぼすかどうかは不明である。それ故、診断、薬剤製造及び治療における使用のための、成体骨髄由来前駆細胞に影響を及ぼすことができる分子を特定し、特性決定することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００４４】
本発明は、前駆細胞の集積、増殖及び／又は分化を調節する新しい方法に関し、一部には、VEGF-B及びPDGF-Cが幹細胞の集積、増殖及び／又は分化を刺激するという発見に基づく。これらの増殖因子の各々は、単独で又はここで述べる他の増殖因子と組み合わせて使用しうる。
【００４５】
本発明の1つの局面では、造血前駆細胞及び内皮前駆細胞を含む、幹細胞の集積、増殖及び／又は分化を刺激するためにVEGF-Bを使用する。1つの実施形態では、幹細胞の集積、増殖又は分化を必要とするヒト被験体を特定すること、及び血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）生成物を含有する組成物を前記ヒト被験体に投与することを含む、幹細胞の集積、増殖又は分化を刺激する方法が提供される。「幹細胞集積」という用語は、幹細胞の動員（例えば骨髄から循環中への）を指す。「増殖」という用語は、有糸分裂による複製を指す。「分化」という用語は、多分化能又は多能性幹細胞が他の細胞型へと発育する過程を指す。分化は、多分化能の細胞型と完全に分化した細胞型との間の多くの段階を含むと考えられ、1段階だけを通しての刺激も分化の刺激とみなされる。「増殖」及び「分化」という用語は、インビボとエキソビボ治療の両方に関連する。集積、増殖及び分化はすべて、白血球の形成と発達を含む骨髄造血の過程に関連する。
【００４６】
前記特定工程は、幹細胞の集積、増殖又は分化から恩恵を受ける疾患又は状態に罹患している被験体を特定するための医学的診断を含む。例えば、白血球数の減少によって特徴付けられ、幹細胞からの又は骨髄起源のそのような細胞の産生低下によるものと考えられる骨髄抑制は、多くの癌化学療法剤の深刻な副作用であることが知られている。そこで、1つの変法では、前記特定工程は、抗腫瘍化学療法を受けているヒト被験体を選択することを含む。そのような被験体へのVEGF-B生成物の投与は、化学療法剤の投与の前、投与中又は投与後に実施することができる。VEGF-B生成物の投与は、抗腫瘍化学療法剤の投与と同時か又は投与後が好ましい。VEGF-B生成物は、好ましくは骨髄形成を促進する投与レジメンで投与される。
【００４７】
健常白血球数の再確立は、放射線療法を受ける患者のための重要な臨床的配慮事項である。それ故、もう1つの変法では、前記特定は、VEGF-B治療のための候補として放射線療法を受けている被験体を選択することを含む。VEGF-B生成物は、好ましくは放射線療法と同時か又は放射線療法後に投与される。
【００４８】
同様に、健常白血球数の再確立は骨髄移植患者にとって決定的に重要である。それ故、もう1つの変法では、前記特定は、VEGF-B治療のための候補として骨髄移植被験体を選択することを含む。VEGF-B生成物は、好ましくは骨髄移植と同時か又は移植後に投与される。他の患者個体群は、何らかの理由で、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV、AIDS）の感染により、免疫抑制状態にある個体を含む。
【００４９】
血管内皮細胞増殖因子（VEGF-B）は、ヒト／動物ゲノム内の遺伝子によってコードされる、ヒト及び他の動物において天然に生じるタンパク質である。VEGF-Bは、受容体VEGFR-1に結合し、下記で詳細に述べる。「VEGF-B生成物」という用語は、下記で詳述するVEGF-Bポリペプチド物質及びVEGF-Bポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を包含する。
【００５０】
そこで、1つの変法では、VEGF-B生成物はVEGF-Bポリペプチドを含む。本発明のために、VEGF-B（VEGF関連因子（VRF）としても知られる）は、天然に生じるVEGF-Bタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質、及びまだVEGFR-1結合親和性を保持するフラグメント、類似体又は配列変異を有する変異体を指す。1つの変法では、VEGFポリペプチドはグリコシル化されている。例示的なグリコシル化VEGF-B形態は、すべて参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2002/0068694号及び米国特許第5,607,918号、同第5,840,693号及び同第5,928,939号に述べられている。好ましい実施形態では、VEGF-Bポリペプチドは、天然ヒトVEGF-B配列に少なくとも85％又は90％同一のアミノ酸配列を有する。天然に生じるヒトVEGF-B配列とアミノ酸配列レベルで91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％同一であるポリペプチドがさらに一層好ましい。例示的なヒトVEGF-Bアイソフォームは、分泌成熟形態がアミノ酸1位から始まる、配列番号2及び4に示す配列を含む。VEGF-Bについてのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列は、アクセッション番号U48801の下にGenBankに寄託されている。
【００５１】
考慮される配列変異はまた、VEGF-Bポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによっても定義されうる。例えばVEGF-BポリペプチドはVEGFR-1に結合し、好ましくは、どちらもヒトVEGF-B配列に対応する配列番号1又は3のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。例示的なストリンジェント条件は下記で述べる。
【００５２】
本発明のもう1つの変法では、VEGF-B生成物は、VEGF-Bポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドはまた、レシピエント生物の標的細胞においてコードされるVEGF-Bタンパク質の発現を促進するためのプロモーター及び／又はエンハンサー、並びに終結コドン、ポリアデニル化シグナル配列、及び発現を容易にするための他の配列も含む。好ましい実施形態では、VEGF-B生成物は、VEGF-Bをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。複製欠損アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルス、レンチウイルス及びそれらのハイブリッドなどの、ウイルスベクターが好ましい。これや他の実施形態において、そのようなベクター及び発現修飾エレメントを使用して、他の増殖因子をコードするポリヌクレオチドも投与又は同時投与しうる。
【００５３】
好ましい実施形態では、VEGF-B生成物を含有する組成物は、製薬上許容される担体をさらに含む。
【００５４】
幹細胞の集積、増殖及び分化を調節しうる他のポリペプチド因子は公知であり、VEGF-Bの集積、増殖及び分化作用を増強又は調節するためにVEGF-Bと同時投与しうる。そこで、1つの好ましい変法では、前記方法は、
（a）顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、インターロイキン3（IL-3）、幹細胞因子（SCF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF又はVEGF-A）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血管内皮細胞増殖因子E（VEGF−E）、胎盤増殖因子（PlGF）、血小板由来増殖因子A（PDGF-A）、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）及び血小板由来増殖因子D（PDGF-D）、NZ2  VEGF、D1701  VEGF様タンパク質、NZ10  VEGF様タンパク質（国際特許出願PCT／US99／25869に述べられている）、及びファロテイン（fallotein）；
（b）（a）のいずれかの成員をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（c）これらのポリペプチド又はポリヌクレオチドの1つ又はそれ以上の組合せ
から成る群より選択される骨髄形成物質を被験体に投与することをさらに含む。
【００５５】
これらの増殖因子はすべて、以下を含む文献中に記述されている：
顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、Swiss−Prot番号：P09919、Nagataら、"Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor," Nature 319:415-418(1986)。 G-CSF Genbankアクセッション番号: S69115、Shimaneら、"Molecular Cloning and Characterization of G-CSF Induced Gene cDNA," Biochem, Biophys. Res. Common., 199(1):26-32 (1994)。
【００５６】
インターロイキン3（IL-3）、Swiss-Prot番号：P26951、Kitamuraら、"Expression cloning of the human 1L-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors," Cell, 66:1165-74(1991)。IL-3、Gen Bankアクセッション番号M33135、Phillipsら、"Synthesis and expression of the gene encoding human interleukin-3," Gene, 84(2):501-507 (1989)。
【００５７】
マクロファージ−CSF（M-CSF）、Swiss-Prot番号：P09603、Kawasakiら、"Molecular cloning of a complementary DNA encoding human macrophage-specific colony-stimulating factor (CSP-1)," Science 230:291-296(1985)。M-CSF Genbankアクセッション番号M64592、Cerrettiら、"Human Macrophage-Colony Stimulating Factor: Alternative RNA and Protein Processing From a Single Gene," Mol. Immunol. 25 (8):761-770 (1988)。
【００５８】
幹細胞因子（SCF）、Swiss Prot番号P21583、Martinら、"Primary structure and functional expression of rat and human stem cell factor DNAs," Cell 63:203-211(1990)。 SCF、Genbankアクセッション番号M59964、Martinら、"Primary Structure and Functional Expression of Rat and Human Stem Cell Factor DNAs," Cell 63 (1):203 -211 (1990)。
【００５９】
顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、Swiss-Prot番号P04141, Leeら、"Isolation of cDNA for a human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by functional expression in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360-4364(1985)。
【００６０】
血管内皮細胞増殖因子（例えば、明確さのためにVEGF-Aとして又は特定アイソフォームによってここで言及されるGenBankアクセッション番号Q16889参照）、Swiss Prot番号：P15692、Leungら、"Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen," Science 246:1306-09(1989)。VEGFクローン（bp57−638をカバーする581bpのcDNA 、Genbankアクセッション番号15997）。VEGF-Aポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号11及び12に示されている。
【００６１】
血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、Swiss-Prot番号：P49767、Joukovら、"A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the F1t4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases," EMBO. J. 15:290-298(1996), EMBO J. 15:1751-1751(1996)。VEGF-C （例えばGenBankアクセッション番号X94216参照；VEGF関連タンパク質（VRP）としても知られる）。VEGF-C cDNAインサート（Genbankアクセッション番号X94216）、米国特許第6,361,946号も参照のこと。VEGF-Cポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号13及び14に示されている。
【００６２】
血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D（c−fos誘導性増殖因子（FIGF）としても知られる；例えばGenbankアクセッション番号AJ000185参照））、Swiss-Prot番号： O43915、Yamadaら、"Molecular cloning of a novel vascular endothelial growth factor, VEGF-D," Genomics 42:483-488(1997)。VEGF-D、Gen Bankアクセッション番号D89630、Yamadaら、"Molecular Cloning of a Novel Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF-D," Genomics, 42(3):483-488 (1997)。VEGF-Dポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号17及び18に示されている。
【００６３】
血管内皮細胞増殖因子E（VEGF-E）（NZ7  VEGF又はOV  NZ7としても知られる；例えばGenBankアクセッション番号S67522）。VEGF−Eポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号19及び20に示されている。
【００６４】
胎盤増殖因子（PlGF）、Maglioneら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(20):9267-71 (1996) （P1GF、GenBankアクセッション番号X54936）。PlGFのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号15及び16に示されている。
【００６５】
血小板由来増殖因子A（PDGF-A）（例えばGenBankアクセッション番号X06374参照）などの血小板由来増殖因子。PDGF-Aポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号23及び24に示されている。血小板由来増殖因子B（PDGF-B）（例えばGenBankアクセッション番号M12783参照）などの血小板由来増殖因子。PDGF-Bポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号25及び26に示されている。血小板由来増殖因子C（PDGF-C）ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号6及び7に示されている。血小板由来増殖因子D（PDGF-D）ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号8及び9に示されている。
【００６６】
他のVEGF/PDGFファミリー成員又はNZ2  VEGF（OV NZ2としても知られる；例えばGenBankアクセッション番号S67520参照）などの、それらに相同性を有する分子。NZ2  VEGFポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号21及び22に示されている。D1701 VEGF様タンパク質（例えばGenBankアクセッション番号AF106020；Meyerら、EMBO J 18:363-374参照）。D1701  VEGF様ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号29及び30に示されている。NZ10  VEGF様タンパク質（国際特許出願PCT／US99／25869に述べられている）［StackerとAchen, Growth Factors 17:1-11 (1999); Neufeldら、FASEB J 13:9-22 (1999); Ferrara, J Mol Med 77:527-543 (1999)］。PDGF／VEGFファミリーの増殖因子の構造特徴を有する、ENBLデータベース（アクセッション番号AF091434）に開示されているファロテイン。ファロテインポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号27及び28に示されている。
【００６７】
上記に列挙した増殖因子は網羅的リストであることを意図しない。幹（前駆）細胞を刺激することができるいかなる増殖因子の使用も本発明の一部として考慮される。
【００６８】
本発明を実施するために、これらのポリペプチド及び変異体（例えば野生型形態に少なくとも90％又は95％の同一性を有する変異体又はその活性フラグメント）の生物活性フラグメントは、前記ポリペプチド自体の等価物とみなされる。そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関しては同じ分析が適用される。薬剤を製造するときに使用するためのものを含む、1又はそれ以上の増殖因子生成物を含有する組成物も考慮される。本発明の方法において使用する組成物は、それら自体が本発明の一部とみなされる。
【００６９】
本発明のもう1つの実施形態は、哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得ること、及び前記幹細胞を、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）生成物を含有する組成物と接触させること、を含む、幹細胞の増殖又は分化を刺激する方法である。この方法では、VEGF-Bの有益な作用を、ヒト又は他の動物被験体の体外で、ヒト又は動物被験体からの細胞に与える。そのような治療法は、VEGF-Bの副作用を回避するため、又は医学処置における使用のために処理細胞試料を調製するために望ましいと考えられる。
【００７０】
前記生物学的試料は、そこから幹細胞が見出される組織又は体液試料でありうる。血液及び骨髄は、臍帯血と同様に、生物学的試料のための好ましいソースである。
【００７１】
好ましい実施形態では、幹細胞を精製又は単離するために生物学的試料を少なくとも何らかの精製及び／又は単離手順に供する。例えば、血液試料からの赤血球の除去は1つのレベルの精製／単離を構成する。例えばCD34＋及び／又はVEGFR-1＋である有核細胞を選択するために、VEGF-B処置の前にさらなる精製を実施しうる。好ましい実施形態では、精製幹細胞は、VEGFR-1＋又はCD34＋又はCD133＋幹細胞を含む。これらのマーカーの2又はそれ以上を含む幹細胞はさらに一層好ましい。
【００７２】
同様に、本発明の一部の変法では、VEGF-B処置に応答して増殖又は分化した細胞を選択するために、VEGF-B処置後に幹細胞を精製又は単離することが望ましい。
【００７３】
1つの変法では、前記接触工程は、VEGF-B生成物を含む培養中で幹細胞を培養することを含む。1−10μgタンパク質／ml増殖培地は最大の増殖刺激を与える。さらにもう1つの変法では、前記接触は、幹細胞をVEGF-B導入遺伝子で形質転換又はトランスフェクトすることを含む。
【００７４】
好ましい変法では、前記方法は、幹細胞を、それらが最初に取り出された哺乳動物被験体に戻す工程をさらに含む。あるいは、前記方法は、細胞を異なる哺乳動物被験体に移植する工程を含む。ヒト被験体が好ましい。好ましい実施形態では、細胞ドナーはごく近い親類であるか、又は実質的に同一のヒト白血球抗原（HLA）プロフィールを有する。
【００７５】
そのようなエキソビボ治療は様々な状況において有用である。例えば、抗腫瘍放射線療法又は化学療法を必要とするヒト被験体に関して、放射線又は化学療法の前に健康な幹細胞を取り出し、本発明に従って培養して、放射線又は化学療法後に戻すことができる。それ故、化学療法剤の投与又は放射線を実施する前に生物学的試料を入手し、接触工程後及び化学療法剤の投与又は放射線の実施後に幹細胞をヒト被験体に戻す。
【００７６】
本発明の方法はまた、自家又は異種骨髄移植のために有用である。同様に、本発明の方法に従って処理した幹細胞は、器官又は組織移植及び移植片接合の成功率を改善し、副作用を低減すると予想される。1つの変法では、前記細胞をエキソビボで組織、器官又は人工マトリックスに接種し、前記組織、器官又は人工マトリックスを前記哺乳動物被験体に結合する、埋没する又は移植する。
【００７７】
本発明のこの実施形態についての「VEGF-B生成物」という用語は、前述したのと同じ意味を有する。
【００７８】
細胞をVEGF-Bに接触させることの有益な作用は、細胞をここで述べるような1又はそれ以上の付加的な骨髄形成剤と接触させることによってさらに増強することができる。これらの付加的な薬剤は、VEGF-B生成物と同時に又はいかなる順序でも連続的に使用することができる。
【００７９】
エキソビボでの実施形態では、個々の増殖因子の活性形態を細胞に接触させることが好ましい。例えば、十分に活性ではないプレタンパク質、プレプロタンパク質又は他のプレ修飾形態として天然で合成されるタンパク質を、好ましくは、活性なプロセシングされた又は修飾された形態で投与する。エキソビボ治療における使用のためのポリヌクレオチドは、好ましくは、ポリヌクレオチドレベルで、プロペプチドをコードする配列又は最適活性のためにその除去が必要な他のドメインを除去することにより、「組換えプロセシングされた」形態のポリペプチドを生成するように操作される。あるいは、不活性増殖因子を適用する場合は、増殖因子の活性化を生じさせる物質を同時投与しうる。例えばCUBドメインを切断してタンパク質を活性化するために、プロテアーゼをPDGF-Cと同時投与することができる。「活性化」とは、増殖因子がその受容体に結合する及び／又は受容体を活性化することができるための増殖因子のプロセシングと理解される。
【００８０】
本発明のもう1つの実施形態は、幹細胞の集積、増殖又は分化を必要とするヒト被験体を特定すること、及び血小板由来増殖因子（PDGF）生成物を含有する組成物を前記ヒト被験体に投与することを含む、幹細胞の集積、増殖又は分化を刺激する方法を提供する。この実施形態及びその数多くの変法は、この実施形態ではPDGF生成物を使用するということを除いて、VEGF-Bに関して前述した実施形態と同様である。ここで詳細に述べるように、PDGFの生物活性、特にPDGF-Cは、そのような方法を、虚血状態を治療するために特に有用なものにする。
【００８１】
1つの実施形態では、PDGF生成物はPDGFポリペプチドを含む。天然に生じるPDGFポリペプチドが好ましく、ヒトPDGFポリペプチドが極めて好ましい。少なくとも4つの異なるPDGFファミリー成員：PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-Cが特定されている。
【００８２】
PDGF-A及びPDGF-Bが最初に文献において特性決定され、それ故より多大な研究・開発の対象となってきた。これらのポリペプチドとのホモ及びヘテロ二量体が形成されており、変化したアミノ酸配列を有するが、まだ同じ又は類似の受容体結合特性を保持する変異体が記述されている。本発明における使用のための例示的なPDGF-A及び−Bポリペプチドは、米国特許第5,605,816号(PDGF-A及びA／B ヘテロ二量体)；同第4,889,919号（PDGF-A ホモ二量体）；同第5,759,815号（原核生物におけるPDGF-A又は−Bの組換え生産及び様々な二量体の形成）；同第5,889,149号（PDGF-ABアイソフォーム）；同第4,845,075号及び同第5,428,010号及び同第5,516,896号（PDGF-BBホモ二量体）；同第5,272,064号及び同第5,512,545号（PDGF-B類似体）；同第5,905,142号（プロテアーゼ抵抗性PDGF-B類似体）；及び同第 5,128,321号及び同第5,498,600号及び同第5,474,982号（PDGF-AJB モザイク）の中に述べられている。前記の特許資料に加えて、PDGF-A及び−Bタンパク質を記述し、特性決定する多大の学術文献が存在する。
【００８３】
好ましい実施形態では、PDGFポリペプチドはPDGF-C及びPDGF-Dポリペプチドを含む。PDGF-Cポリペプチド及びポリヌクレオチドは、国際特許公開番号WO 00/18212、米国特許出願公開第2002/0164687 Al号及び米国特許出願第10/303,997号［米国特許公開第2003/0211994号として公開］の中でErikssonらによって特性決定された。PDGF-Dポリヌクレオチド及びポリペプチドは、国際特許公開番号WO 00/27879及び米国特許出願公開第2002/0164710 Al号においてErikssonらによって特性決定された。これらの資料はすべて、それらの全体が参照して本明細書中に組み込まれる。ここで述べるように、PDGF-C及び-DはそれぞれPDGF受容体α及びβに結合する。しかし、これらのペプチドとPDGF-A及びPDGF-Bとの間の注目すべき相違は、PDGF-C及び-Dの各々が、タンパク質分解によって切断されて、他のPDGFファミリー成員と配列相同性を有する生物活性（受容体結合）カルボキシ末端ドメインを生じることができる、アミノ末端CUBドメインを有することである。参考のため、例示的なPDGF-C及び-Dポリヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を配列番号6−9として本明細書に添付した。
【００８４】
好ましい形態のPDGF-Cは、PDGF-CのPDGF／VEGF相同性ドメイン（PVHD）を含み、受容体結合及び活性化機能を保持する。その最小ドメインは、およそ配列番号7の残基230-345である。しかし、このドメインはN末端の方向に残基164まで伸長しうる。PDGF-CのPVHDはまた、トランケートPDGF-Cとも称される。トランケートPDGF-Cは、PDGF-Cの活性化形態である。PDGF-C内の推定上のタンパク質分解部位は、二塩基性モチーフである、配列番号7の残基231-234に認められる。推定上のタンパク質分解部位はまた、PDGF-A、PDGF-B、VEGF-C及びVEGF-Dにおいても認められる。これら4つのタンパク質において、推定上のタンパク質分解部位はまた、PDGF／VEGF相同性ドメインについての最小ドメインの直前に認められる。PDGF-CのCUBドメインは、およそ配列番号7のアミノ酸残基23−159である。米国特許出願公開第2002/0164687号。
【００８５】
PDGF-Cと同様に、PDGF-Dは、N末端CUBドメイン（およそ配列番号9の残基67−167又は54−171として表わされる）とC末端PDGF／VEGF相同性ドメイン（PVHD）を有する2ドメイン構造を持つ。PDGF-D内の推定上のタンパク質分解部位は、配列番号9の残基255-258に認められる。好ましいPDGF-Dポリペプチドは、PDGF-DのPDGF／VEGF相同性ドメイン（PVHD）を含み、受容体結合及び活性化機能を保持する。PDGF-Dの最小ドメインは、およそ配列番号9の残基272-362又は255-370である。しかし、PDGF-DのPVHDはN末端の方向に配列番号9の残基235まで伸長する。トランケートPDGF-Dは、PDGF-Dの推定上の活性化形態である。米国特許出願公開第2002/0164710号。
【００８６】
本明細書中、別の箇所で詳細に述べたように、PDGF／VEGFファミリーの成員はホモ二量体（及び時としてヘテロ二量体）を形成する。ここでは時として文脈から又は明確さのために特定二量体形態（例えばPDGF-Cホモ二量体についてのPDGF-CC）に言及する。ポリペプチド形態（例えばPDGF-C）への言及は、特に記載がない限り、単量体又は二量体又は他の形態のポリペプチド組成物に関するいかなる事柄も示唆しない。
【００８７】
天然に生じるPDGFポリペプチドに加えて、まだそれぞれのPDGF受容体（受容体のホモ二量体及びヘテロ二量体を含む）に結合する及び／又はそれを活性化する変異体形態も、ここで述べる本発明において使用しうる。天然に生じるヒトPDGF-A、−B、−C又は-Dポリペプチドに少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する変異体が好ましい。少なくとも92％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するものがさらに一層好ましい。そこで、もう1つの変法では、PDGFポリペプチドは、PDGFR−α及び／又はPDGFR−βに結合するために有効な、配列番号24、26、7又は9に示すアミノ酸配列の一部を含む。さらにもう1つの変法では、PDGFポリペプチドは、PDGFR−α及び／又はPDGFR−βに結合し、配列番号23、25、6又は8のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。
【００８８】
一部の実施形態では、PDGF-Cポリペプチドは、配列番号7の残基230-345に少なくとも90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、PDGF-Dポリペプチドは、配列番号9の残基272-362に少なくとも90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する。
【００８９】
もう1つの変法では、PDGF生成物は、PDGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。標的前駆細胞内又はその近くでの前記ポリヌクレオチドの発現は、有効量のPDGFポリペプチドの生産を生じさせる。そこで、好ましい変法では、PDGF生成物は、前記ポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクターなどのベクターを含む。例示的なベクターは、複製欠損アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクター、並びにレトロウイルス及びレンチウイルスを含む。しかし、標的細胞へのPDGFポリヌクレオチドの送達のために有効ないかなるベクターも考慮される。
【００９０】
さらにもう1つの変法では、PDGF生成物を、標的細胞の集積、増殖及び／又は分化を望ましいように共に刺激する、1又はそれ以上の付加的な骨髄形成剤と同時投与する。PDGF生成物との同時投与のための例示的な薬剤は、VEGF-Bとの同時投与と同様に、VEGF-B治療に関して前述した増殖因子及び他の薬剤を含む。そのような増殖因子は、（a）顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）、インターロイキン3（IL-3）、幹細胞因子（SCF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）及び胎盤増殖因子（PlGF）；（b）（a）のいずれかの成員をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び（c）それらの組合せ、を含む。列挙されていない他の増殖因子も使用しうる。
【００９１】
本発明はまた、PDGF-CC（PDGF-C二量体）が心臓及び四肢において虚血後の血管再生を増強し、明らかに内皮及び平滑筋細胞／線維芽細胞系統の両方の血管前駆細胞及び成熟細胞に作用を及ぼすという発見に基づく。虚血状態となった脳、心臓、四肢及び他の組織の血管再生が考慮される。ここで詳述するように、データは、PDGF-CCが内皮前駆細胞を動員し、骨髄細胞の内皮細胞への分化を誘導し、内皮細胞の移動を刺激し、そしてVEGFの発現を上方調節することを示す。さらに、PDGF-CCは、骨髄細胞の平滑筋細胞（SMC）への分化を誘導し、脈管発芽の間SMCの増殖と移動を刺激する。内皮及び平滑筋細胞／線維芽細胞系統の両方の血管前駆細胞及び成熟細胞へのPDGF-CCのこの多面作用は、その安全性プロフィール（血管腫形成、水腫又は線維症がないこと）及び一定の活性が虚血状態に限定されるというデータと共に、虚血疾患を治療するためのインビボ及びエキソビボでのPDGF-C生成物の新しい治療指標を提供する。
【００９２】
1つの実施形態は、幹細胞の増殖又は分化を刺激する方法を含む。哺乳動物被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得る。次に、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）生成物を含有する組成物に前記幹細胞を接触させる。AC133＋／CD34＋細胞を生物学的試料から単離する変法を含む、1つの変法では、接触工程の前に幹細胞を生物学的試料から単離する。一部の変法では、幹細胞個体群において特定細胞表面マーカーが出現する（より著明になる）まで及び／又は特定マーカーが幹細胞個体群から消失する（より著明でなくなる）まで、幹細胞をPDGF-C生成物と接触させる。1つの変法では、幹細胞がCD144＋細胞に分化するまで接触を継続し、その時点でPDGF-C処置を停止する。もう1つの変法では、幹細胞がSMA＋／CD144−／CD31−／CD34−細胞に分化するまで接触を継続する。一部の実施形態では、細胞に接触させるためにPDGF-C生成物に加えてVEGF-A生成物を使用する。
【００９３】
前記方法の実施から考慮されるPDGF-C生成物は、PDGF-Cポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド又はそれらの組合せを含む。PDGF-C生成物がPDGF-Cポリペプチドを含む場合、そのPDGF-Cポリペプチドは、好ましくは配列番号10のアミノ酸配列に少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含み、PDGFR−α／αホモ二量体又はPDGFR−α／βヘテロ二量体受容体のいずれかに結合する。1つの実施形態では、前記ポリペプチドはホモ二量体（PDGF-CC）として組成物中に存在する。一部の変法では、PDGF-Cポリペプチドは、配列番号6のポリヌクレオチドの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９４】
本発明のエキソビボ治療の1つの実施形態は、患者からの前駆細胞の2又はそれ以上のアリコートを、各レジメンにつき1又はそれ以上の増殖因子から成る2又はそれ以上の異なる増殖因子レジメンで別々に治療することを含む。このようにして、2又はそれ以上の異なる細胞個体群への分化が達成される。これらの異なる細胞個体群は、好ましくは、患者に再投与したとき改善された治療効果を達成するためにインビボで互いに補い合う。1つの実施形態では、最初に、哺乳動物被験体から幹細胞を含む生物学的試料を得ることによって幹細胞の増殖又は分化を実施する。前記幹細胞の第一アリコートを、VEGF-B生成物及びPDGF-C生成物から選択される第一増殖因子生成物を含有する第一組成物と接触させる。前記幹細胞の第二アリコートを、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPlGF生成物から成る群より独立して選択される第二増殖因子生成物を含有する第二組成物と接触させる。そのような実施形態では、前記第一と第二増殖因子生成物は一般に同じではない。一部の変法では、前記第一増殖因子生成物はPDGF-C生成物であり、前記第二増殖因子生成物はVEGF-A生成物である。
【００９５】
もう1つの実施形態では、哺乳動物被験体から幹細胞を含む生物学的試料を得ることによって、幹細胞の内皮細胞及び平滑筋細胞の両方への分化を促進する。得られた細胞を、次に、前記細胞を内皮細胞と平滑筋細胞の両方に分化させるのに十分な量及び時間で、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）生成物を含有する組成物と接触させる。一部の変法では、接触させた細胞を前記哺乳動物被験体に戻す。一部の変法では、細胞を受容する哺乳動物被験体は、心臓（例えば梗塞）、脳（例えば卒中）又は四肢（例えば末梢血餅）の組織を冒すものを含む、虚血状態を有する。
【００９６】
もう1つの実施形態では、最初に（場合により）虚血状態を有する哺乳動物被験体を診断することによって虚血状態を改善する。そのように診断された被験体から、幹細胞を含む生物学的試料を得る。得られた細胞を、前記細胞を内皮細胞と平滑筋細胞の両方に分化させるのに十分な量及び時間で、血小板由来増殖因子C（PDGF-C）生成物を含有する組成物と接触させる。接触させた細胞を、その後、前記哺乳動物被験体に戻す。一部の実施形態では、細胞を哺乳動物被験体の虚血組織に移植する又は注入することによって前記細胞を戻す。
【００９７】
本発明のさらにもう1つの実施形態は、哺乳動物被験体から幹細胞を含む生物学的試料を得ること、及び前記幹細胞を、血小板由来増殖因子（PDGF）生成物を含有する組成物と接触させることを含む、幹細胞の増殖又は分化を刺激する方法である。この方法及びその変法は、VEGF-Bに関して上記で要約した実施形態と同様である。好ましい変法では、前記接触は、PDGF生成物を含む培地中で幹細胞を培養することを含む。
【００９８】
1つの変法では、前記試料を得た後及び幹細胞をPDGF生成物と接触させる前に、前記幹細胞を精製し、単離する。1つの変法では、前記接触工程においてPDGF生成物で処置した後に、前記幹細胞を精製し、単離する。精製のための幹細胞の好ましい個体群は、それらの細胞表面上に以下の受容体／マーカー：PDGFR−α、PDGFR−β及びCD34の1つ又はそれ以上を発現するものを含む。
【００９９】
本発明の様々なエキソビボ実施形態に従って調製した前駆／幹細胞は、試料を最初に入手した宿主に戻す又は異なる宿主に移植する、多くの治療状況において有用である。細胞は、静脈内経路で又は注射によって血流又は骨髄中に戻すことができ、あるいはエキソビボで組織、器官又は人工マトリックスに接種し、前記組織、器官又は人工マトリックスを哺乳動物被験体に結合する、埋没する又は移植することができる。
【０１００】
1つの好ましい実施形態では、前記細胞を、抗腫瘍化学療法を必要とするヒト被験体を治療するために使用する。例えば、化学療法剤の用量を投与する前に前記生物学的試料を入手し、接触後及び化学療法剤の投与後に前記幹細胞を前記ヒト被験体に戻す。
【０１０１】
1つの好ましい実施形態では、糖尿病に関連する血管合併症を含む、心臓血管疾患と診断されたヒト被験体を治療するために前記細胞を使用する。I型（インスリン依存性）又はII型（インスリン非依存性）糖尿病に罹患しているヒト被験体、並びに心臓血管疾患に罹患している非糖尿病ヒト被験体が考慮される。数百万人の患者が組織、特に心臓、脳及び脚への血液供給不全に罹患している。増加しつつある糖尿病患者群は、心臓発作及び卒中の危険性と同様に、これらの生命を脅かす状態を特に発症しやすい。治療的血管新生／動脈新生因子は、それ故、新しい血管を誘導することによってそのような合併症を軽減するために興味深い。新しい安定で機能的な脈管の構築は、血管前駆細胞及び分化した内皮及び平滑筋細胞の協調された作用に依存する。治療的血管新生は、それ故、両方の系統に影響を及ぼす因子の同時投与を必要としうる。あるいは、両方の系統に多面作用を有する分子は魅力的であるが、これまでのところごくわずかしか特定されていない。
【０１０２】
他の治療状況では、前駆／幹細胞の集積、増殖又は分化を抑制することが望ましい場合がある。本発明のさらなる実施形態は、前述したVEGF-B又はPDGF生成物に特異的な阻害因子に細胞を接触させる（インビボ又はエキソビボで）ことによって、前駆／幹細胞の集積、増殖又は分化を阻害する／抑制する方法である。抗体、アンチセンス分子及びアプタマーを含む例示的阻害因子は、以下でより詳細に説明する。
【０１０３】
本発明の多くの局面が様々なポリヌクレオチド及びタンパク質生成物の新しい使用に関することは明白である。さらにもう1つの変法では、本発明は、幹細胞の集積、増殖及び／又は分化を刺激するための薬剤、あるいは幹細胞の集積、増殖及び／又は分化から恩恵を受ける疾患又は状態の治療のための薬剤の製造における、前記生成物のいずれかの使用を提供する。
【０１０４】
同様の、前述した特異的阻害因子は、幹細胞の集積、増殖及び／又は分化の阻害のための薬剤、あるいは幹細胞の集積、増殖及び／又は分化の阻害から恩恵を受ける（一過性であっても）疾患又は状態の治療のための薬剤の製造において有用である。
【０１０５】
非機能性毛細管、あるいは水腫又は血管腫形成を含む有害な副作用を導く1つの細胞型への単一活性は、しばしば、治験中の治療的脈管形成、血管／動脈新生及び新生血管形成剤にとって中心的な問題である。多数の血管細胞あるいは脈管形成、血管／動脈新生及び新生血管形成の段階に影響を及ぼす多面作用を有するが、副作用が極めて少ない分子は、それ故、組織虚血を治療するための魅力的な手段となる。そのような分子を選択することには、1つのエフェクター分子の単一送達によって多数の血管細胞及び機能的脈管を形成するために必要な分子を動員すること、及び1つの治療的介入による脈管形成、血管／動脈新生及び／又は新生血管形成の複雑なカスケードの同時調節を含む、多大の潜在的利点が存在する。これは、組織虚血を治療する上でより生理的な機能特性を備えた機能性脈管を育成するための新しい薬剤の有望な範例である。
【０１０６】
本発明のさらなる特徴及び変法は、詳細な説明を含む本出願全体から当業者には明白であり、すべてのそのような特徴は本発明の局面とみなされる。
【０１０７】
同様に、ここで述べる本発明の特徴は、特徴の組み合わせが本発明の局面又は実施形態として上記で特定して言及されているか否かに関わらず、同じく本発明の局面とみなされる付加的な実施形態へと組み合わせることができる。また、本発明にとって必須であるとここで述べる限定だけがそのようなものとみなされるべきである；ここで必須であると記述していない特徴を欠く本発明の変法は、本発明の局面とみなされる。
【０１０８】
1つのセット又は1つの属として述べた本発明の局面に関して、そのセット又は属のあらゆる個々の成員が、個別に本発明の1つの局面とみなされる。
【０１０９】
上記に加えて、本発明は、付加的な局面として、いかなる意味においても上記で特定して言及した変法よりも狭い範囲の本発明のすべての実施形態を包含する。出願人は、本明細書に付属する特許請求の範囲すべてを発明したが、本明細書に付属する特許請求の範囲は、他の研究者達の先行技術をそれらの範囲内に包含することを意図しない。それ故、特許請求の範囲内の法に抵触する先行技術が特許庁又は他の機関又は個人によって出願人に提示された場合、出願人は、そのような法に抵触する先行技術又は法に抵触する先行技術の明白な変法をそのような特許請求の範囲から特定して排除するように特許請求の内容を再定義するための、適用特許法の下での補正権を行使する権利を留保する。そのような補正特許請求の範囲によって定義される本発明の変法もまた、本発明の局面とみなされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１０】
本発明において使用する「VEGF-B」という用語は、その全体が参照して本明細書中に組み込まれる米国特許第6,331,301号並びに米国特許出願公開第2003/0008824号においてVEGF-Bとして特定されているポリペプチドを包含する。
【０１１１】
VEGF-Bは、VEGF-B167及び／又はVEGF-B186アイソフォームの両方、あるいはVEGFR-1に結合する能力を有するそのフラグメント又は類似体を含むが、これらに限定されない。活性類似体は、BLAST分析によって判定したとき、天然VEGF-Bポリペプチドに少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも95％の配列同一性、極めて好ましくは少なくとも98％の配列同一性を示すべきである。活性物質は、典型的には、VEGF-Bの特徴であるアミノ酸配列Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys（Xaaはどのアミノ酸でもよい）（配列番号5）を含む。
【０１１２】
保存的置換、挿入及び／又は欠失で修飾されているが、まだVEGF-Bの生物活性を保持するVEGF-B配列を含むポリペプチドの使用は、本発明の範囲内である。VEGF-Bポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発又は特異的酵素切断と連結を含む標準的方法が、そのようなポリペプチドを生成するために容易に使用できる。同様に、ペプチドミメティック化合物あるいは1又はそれ以上のアミノ酸残基が非天然に生じるアミノ酸又はVEGF-Bの生物活性の必要な局面を保持するアミノ酸類似体によって置換されている化合物の使用が考慮される。
【０１１３】
PDGFという用語は、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-D、あるいはPDGF受容体に結合する能力を有するそれらのフラグメント又は類似体を含むが、これらに限定されない。PDGF-Aは、PDGFR−α／αホモ二量体に結合しうる及び／又はそれらを活性化しうる。PDGF-Bは、PDGFR−α／αホモ二量体、PDGFR−α／βヘテロ二量体及びPDGFR−β／βホモ二量体に結合しうる及び／又はそれらを活性化しうる。PDGF-Cは、PDGFR−α／αホモ二量体に結合しうる及び／又はそれらを活性化しうる。PDGF-Cはまた、PDGFR−α結合を通してPDGFR−α／βヘテロ二量体に結合しうる及び／又はそれらを活性化しうる。PDGF-Dは、PDGFR−β／βホモ二量体に結合しうる及び／又はそれらを活性化しうる。PDGF-Dはまた、PDGFR−β結合を通してPDGFR−α／βヘテロ二量体に結合しうる及び／又はそれらを活性化しうる。活性類似体は、BLAST分析によって判定したとき、天然PDGFポリペプチドに少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも95％の配列同一性、極めて好ましくは少なくとも98％の配列同一性を示すべきである。
【０１１４】
保存的置換、挿入及び／又は欠失で修飾されているが、まだPDGFの生物活性を保持するPDGF配列を含むポリペプチドの使用は、本発明の範囲内である。PDGFポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発又は特異的酵素切断と連結を含む標準的方法が、そのようなポリペプチドを生成するために容易に使用できる。同様に、ペプチドミメティック化合物あるいは1又はそれ以上のアミノ酸残基が非天然に生じるアミノ酸又はPDGFの生物活性の必要な局面を保持するアミノ酸類似体によって置換されている化合物の使用が考慮される。
【０１１５】
加えて、VEGF-B又はPDGFをコードする核酸配列の選択的スプライシング及び天然に生じる対立遺伝子変異から生じうるVEGF-B又はPDGFポリペプチドの変異体形態は、本発明において有用である。対立遺伝子変体は当技術分野において周知であり、1又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を含むが、コードされるポリペプチドの実質的な機能的変化をもたらさない選択的形態又は核酸配列である。
【０１１６】
VEGF-B又はPDGFの変異体形態は、VEGF-B又はPDGFポリペプチドの可欠領域を修飾のために標的することによって作製できる。これらの可欠領域は、VEGF/PDGFファミリーの増殖因子の強く保存された領域の外側にあると予想される。特に、VEGF-B及びPDGFを含むPDGF／VEGFファミリーの増殖因子は二量体であり、少なくともVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A及びPDGF-Bは、N末端ドメイン、すなわちPDGF／VEGF様ドメイン内に8個のシステイン残基の完全な保存を示す［Olofssonら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581 (1996); Joukovら, EMBO J., 15:290-298 (1996)］。これらのシステインは、分子間及び分子内ジスルフィド結合に関与すると考えられる。また、さらに強いが不完全に保存されたシステイン残基がC末端ドメインに存在する。各サブユニットのループ1、2および3は、分子間ジスルフィド結合によって形成され、増殖因子のPDGF／VEGFファミリーの受容体への結合に関与する［Anderssonら, Growth Factors 12:159-64 (1995)］。
【０１１７】
これらの保存されたシステイン残基は、好ましくは提案されるいかなる変異体形態においても保存されるが、1又はそれ以上のシステインが保存されていない受容体結合VEGF-B類似体が知られているので、例外はありうる。同様に、ループ1、2及び3に存在する活性部位も保存されるべきである。該分子の他の領域は生物学的機能にとっての重要性がより低いと予想でき、それ故修飾のための適切な標的を提供する。修飾ポリペプチドは、下記で述べる実施例に基づき、VEGFR-1結合アッセイ又は幹細胞増殖アッセイなどの常套的活性試験手順によってVEGF-B又はPDGFの生物活性を示す能力に関して容易に試験することができる。
【０１１８】
好ましくは、アミノ酸置換を使用する場合、その置換は保存的である、すなわち1個のアミノ酸が同様の大きさ及び同様の電荷特性を有するアミノ酸によって置換される。
【０１１９】
本明細書で使用するとき、「保存的置換」という用語は、もう1つ別の生物学的に類似の残基による1個のアミノ酸残基の置換を表わす。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン又はメチオニンなどの1個の疎水性残基によるもう1つ別の残基の置換、あるいはアルギニンによるリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、グルタミンによるアスパラギンの置換等のような、1個の極性残基によるもう1つ別の残基の置換を含む。もう1つ別の残基を置換することができる中性親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン及びトレオニンを含む。「保存的置換」という用語はまた、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含む。
【０１２０】
あるいは、保存的アミノ酸は、以下に示すように、Lehninger（Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY, pp. 71-77 (1975)の中で述べられているように分類することができる：非極性（疎水性）A。脂肪族：A、L、I、V、P、B。芳香族：F、W、C。含硫：M、D。ボーダーライン：G。無電荷−極性：A。ヒドロキシル：S、T、Y、B。アミド：N、Q、C。スルフヒドリル：C、D。ボーダーライン：G。正電荷（塩基性）：K、R、H。負電荷（酸性）：D、E。
【０１２１】
VEGF-B又はPDGFタンパク質は、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によってあるいは酸付加塩、アミド、エステル、特にC末端エステル及びN−アシル誘導体の生成によって、修飾することができる。前記タンパク質はまた、他の成分と共有結合又は非共有結合複合体を形成することによってペプチド誘導体を生成するように修飾することができる。共有結合複合体は、ペプチドを含むアミノ酸の側鎖上の官能基にあるいはN又はC末端に化学成分を連結することによって作製できる。
【０１２２】
VEGF-B及びPDGFタンパク質は、放射性標識、蛍光標識、酵素（例えば比色定量又は蛍光定量反応を触媒するもの）、基質、固体マトリックス又は担体（例えばビオチン又はアビジン）を含むがこれらに限定されない、レポーター基に結合することができる。
【０１２３】
VEGF-B類似体の例は、どちらも参照して本明細書中に組み込まれる、国際特許公開番号WO 98／28621及びOlofssonら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95:11709-11714 (1998)に述べられている。PDGF類似体の例は、米国特許第5,512,545号及び同第5,474,982号；米国特許出願第 20020164687号及び同第20020164710号に述べられている。
【０１２４】
VEGF-B及びPDGFポリペプチドは、好ましくは、配列番号1及び3に対応するDNA、又は配列番号1及び3の相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNAなどの、それらをコードするDNA配列の発現によって生産される。適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば42℃で一晩の50％ホルムアミド、5×SSPE緩衝液、5×デンハルト溶液、0.5％SDS及び100μg/mlのサケ精子DNA、次いで2×SSC中55℃で2×30分間の洗浄を含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、本発明の1又はそれ以上の増殖因子をコードするいずれのポリヌクレオチドにも適用できる。
【０１２５】
本発明はまた、前記DNAのいずれか1つに対応する又はいずれか1つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする、単離及び／又は精製DNAを対象とする。
【０１２６】
本発明における使用のためのVEGF-Bタンパク質及びポリペプチドは、アミノ酸配列Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys（配列番号5）、及び造血前駆細胞及び内皮前駆細胞を含む幹細胞の集積、動員又は増殖を刺激する性質を有することによって特徴付けられ、前記タンパク質は、配列番号2及び4のアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸の配列を含む。VEGF-B二量体は、同一配列のVEGF-Bポリペプチド、異なるVEGF-BアイソフォームのVEGF-Bポリペプチド又は他の異種VEGF-B分子を含みうる。
【０１２７】
本発明に従った使用のためのVEGF-Bは、VEGF-Bタンパク質を含むタンパク質二量体、特にジスルフィド結合二量体の形態で使用できる。本発明のタンパク質二量体は、VEGF-Bのホモ二量体、及びVEGF-BとVEGFポリペプチド並びにVEGFR-1（flt−1）に結合することができる、胎盤増殖因子（PlGF）を含むがこれに限定されない他のVEGFファミリー増殖因子とのヘテロ二量体の両方を包含する。本発明のVEGF-Bはまた、その全体が参照して本明細書中に組み込まれる、Jeltschら、国際特許公開番号WO 02／07514に述べられているようなN−グリコシル化部位を含むように構築されたVEGF-Bポリペプチドを含む。
【０１２８】
本明細書で使用する、「生物活性」という用語は、VEGF-Bに関連して使用するとき、完全長VEGF-Bと実質的に同様にVEGFR-1（flt−1としても知られる）に結合する、及び／又は哺乳動物幹細胞個体群の移動、増殖及び／又は分化を刺激するVEGF-Bポリペプチドを指す。本明細書で使用する、「生物活性」という用語は、PDGFに関連して使用するとき、天然PDGFと実質的に同様にその天然PDGF受容体（前述したPDGF−α及び／又はPDGF−β）に結合する、及び／又は哺乳動物幹細胞個体群の移動、増殖及び／又は分化を刺激するPDGFポリペプチドを指す。
【０１２９】
「ベクター」という用語は、プラスミド又はウイルスDNA系の形態の核酸分子の増幅、複製及び／又は発現媒体を指し、前記プラスミド又はウイルスDNAは、細菌、酵母、無脊椎動物及び／又は哺乳動物宿主細胞に関して機能性でありうる。ベクターは、宿主細胞のゲノムDNAから独立したままであるか、あるいは全体的又は部分的に前記ゲノムDNAと共に組み込まれうる。ベクターは、それが適合性であるいかなる宿主細胞においても機能性であるようにすべての必要なエレメントを含む。このようなエレメントを以下に示す。
【０１３０】
VEGF-Bの作製は、その全体が参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,331,301号に述べられている。
【０１３１】
（VEGF-B又はPDGFポリペプチドをコードするDNAの作製）
VEGF-B又はPDGFをコードする核酸分子は、限定を伴わずに、化学合成、cDNA又はゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング及び／又はcDNAのPCR増幅を含む様々な方法で容易に入手できる。これらの方法やそのようなDNAを単離するために有用な他の方法は、例えばSambrookら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、Ausubelら編集、"Current Protocols In Molecular Biology," Current Protocols Press (1994)及び BergerとKimmel, "Methods In Enzymology: Guide To Molecular Cloning Techniques," vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.(1987)に述べられている。VEGF-B又はPDGFをコードする好ましい核酸配列は、哺乳動物核酸配列である。VEGF-B又はPDGFをコードする最も好ましい核酸配列は、ヒト、ラット及びマウスである。
【０１３２】
VEGF-B又はPDGF核酸分子の化学合成は、Engelsら、Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989)に述べられているような、当技術分野で周知の方法を用いて実施できる。これらの方法は、中でも特に、核酸合成のホスホトリエステル、ホスホルアミダイト及びH−ホスホネート法を含む。典型的には、完全長VEGF-Bポリペプチドをコードする核酸分子は数百塩基対（bp）又はヌクレオチドの長さである。長さが約100ヌクレオチドより大きい核酸は、各々のフラグメントが約100ヌクレオチドまでの長さであるいくつかのフラグメントとして合成することができる。次にそれらのフラグメントを以下で述べるように一緒に連結して、VEGF-B又はPDGFポリペプチドをコードする完全長核酸を形成することができる。好ましい方法は、標準ホスホルアミダイト化学を使用するポリマー支持合成である。
【０１３３】
あるいは、VEGF-B又はPDGFポリペプチドをコードする核酸は、前記ポリペプチドを発現する1又はそれ以上の組織ソースから作製した適切なcDNAライブラリー又は何らかの亜種からのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって入手しうる。ゲノムライブラリーのソースは、VEGF-B又はVEGF-B同族体あるいはPDGF又はPDGF同族体をコードする遺伝子を保持すると考えられる哺乳動物又は他の種からの1又はそれ以上の組織でありうる。
【０１３４】
前記ライブラリーを、そのライブラリー内に存在するVEGF-B又はVEGF-B同族体cDNA又は遺伝子と選択的にハイブリダイズする1又はそれ以上の核酸プローブ（VEGF-B又はVEGF-B同族体cDNA又はクローン化すべき遺伝子に許容されるレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、cDNA又はゲノムDNAフラグメント）を使用して、VEGF-B  cDNA／遺伝子の存在に関してスクリーニングすることができる。プローブは、好ましくは、ライブラリーが作製された種と同じか又は類似の種からのVEGF-B  DNA配列の小さな領域に相補的であるか又は前記の小さな領域をコードする。あるいは、プローブは、下記で論じるように、縮重していてもよい。
【０１３５】
前記ライブラリーはまた、そのライブラリー内に存在するPDGF又はPDGF同族体cDNA又は遺伝子と選択的にハイブリダイズする1又はそれ以上の核酸プローブ（PDGF又はPDGF同族体cDNA又はクローン化すべき遺伝子に許容されるレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、cDNA又はゲノムDNAフラグメント）を使用して、PDGF  cDNA／遺伝子の存在に関してスクリーニングすることができる。プローブは、好ましくは、ライブラリーが作製された種と同じか又は類似の種からのPDGF  DNA配列の小さな領域に相補的であるか又は前記の小さな領域をコードする。あるいは、プローブは、下記で論じるように、縮重していてもよい。
【０１３６】
DNAフラグメント（cDNAなど）をプローブとして使用する場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、例えばAusubelら編集、前出に述べられているものである。ハイブリダイゼーション後、ライブラリーを含むブロットを、プローブの大きさ、クローニングするプローブの予想される相同性、スクリーニングするライブラリーのタイプ、スクリーニングするプローブの数等のようないくつかの因子に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄する。ストリンジェント洗浄液（通常はイオン強度が低く、比較的高い温度で使用される）の例は以下の通りである。1つのそのようなストリンジェント洗浄液は、55−65℃の0.015M  NaCl、0.005Mクエン酸ナトリウム及び0.1％SDSである。もう1つのそのようなストリンジェント緩衝液は、約40−50℃の1mM  Na2EDTA、40mM  NaHPO4、pH7.2及び1％SDSである。1つの他のストリンジェント洗浄液は、約50−65℃の0.2×SSC及び0.1％SDSである。そのようなハイブリダイゼーション条件は、本発明の1又はそれ以上の増殖因子をコードするいかなるポリヌクレオチドにも適用できる。
【０１３７】
VEGF-B又はPDGFポリペプチドをコードする核酸を得るためのもう1つの適切な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。この方法では、VEGF-B又はPDGFを発現する組織（リンパ系組織など）からポリ（A）＋RNA又は全RNAを抽出する。次に逆転写酵素を使用して前記RNAからcDNAを作製する。次に、典型的にはVEGF-B  cDNA又はPDGF  cDNAの2つの別々の領域に相補的な2個のプライマー（オリゴヌクレオチド）を、Taqポリメラーゼなどのポリメラーゼと共に前記cDNAに添加して、前記ポリメラーゼが2個のプライマーの間のcDNA領域を増幅する。
【０１３８】
（VEGF-B又はPDGF発現のためのベクターの作製）
クローニング後、VEGF-B又はPDGFポリペプチド又はそのフラグメントをコードするcDNA又は遺伝子を単離し、それを、好ましくは、前記遺伝子のコピー数を上昇させるため及び／又は適切な宿主細胞において前記ポリペプチドを発現させるため及び／又は細胞を標的生物に形質転換するため（インビボでVEGF-B又はPDGFを発現するため）に増幅及び／又は発現ベクターに挿入する。数多くの市販のベクターが適するが、「あつらえ」ベクターも使用しうる。ベクターは、特定宿主細胞又は宿主組織において機能性であるように選択される（すなわちVEGF-B又はPDGF遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こりうるように、ベクターは宿主細胞機構と適合性である）。VEGF-B又はPDGFポリペプチド又はそのフラグメントは、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）及び／又は真核生物宿主細胞において増幅／発現しうる。宿主細胞の選択は、少なくとも一部には、VEGF-B又はPDGFポリペプチド又はそのフラグメントをグリコシル化すべきかどうかに依存する。グリコシル化する場合は、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞が好ましい；酵母細胞は、VEGF-B又はPDGFアミノ酸配列上にグリコシル化部位が存在する場合はポリペプチドをグリコリシル化する。
【０１３９】
典型的には、いずれかの宿主細胞において使用されるベクターは、5’隣接配列、そしてまたエンハンサー、複製起点エレメント、転写終結エレメント、スプライス供与及び受容部位を含む完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域及び選択マーカーエレメントなどの他の調節エレメントを含む。場合により、ベクターは「タグ」配列、すなわちポリHis（ヘキサHisなど）をコードするVEGF-B又はPDGFコード配列の5’又は3’末端に位置するオリゴヌクレオチド配列あるいはもう1つ別の小さな免疫原性配列を含みうる。このタグは、タンパク質と共に発現されて、宿主細胞からVEGF-B又はPDGFポリペプチドを精製するためのアフィニティータグとして使用できる。場合により、前記タグは、その後、例えば選択ペプチダーゼの使用などの様々な手段によって精製されたVEGF-B又はPDGFポリペプチドから除去することができる。
【０１４０】
ベクター／発現構築物は、場合により、5’隣接配列、複製起点、転写終結配列、選択マーカー配列、リボソーム結合部位、シグナル配列、及び1又はそれ以上のイントロン配列などのエレメントを含みうる。5’隣接配列は、同種（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は系統から）、異種（すなわち宿主細胞の種又は系統以外の種から）、雑種（2以上のソースからのp5’隣接配列の組合せ）、合成であるか、あるいは天然VEGF-B又はPDGF  5’隣接配列でありうる。それ自体、5’隣接配列のソースは、その5’隣接配列が宿主細胞機構において機能性であり、且つ宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる単細胞原核又は真核生物、脊椎又は無脊椎動物、又は植物であってもよい。
【０１４１】
複製起点は、典型的には市販の原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。一定コピー数へのベクターの増幅は、一部の場合、VEGF-B又はPDGFポリペプチドの最適発現のために重要でありうる。選り抜きのベクターが複製起点部位を含まない場合は、公知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結しうる。
【０１４２】
転写終結エレメントは、典型的にはVEGF-B又はPDGFポリペプチドコード配列の末端に対して3’側に位置し、VEGF-B又はPDGFポリペプチドの転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結エレメントは、G−Cに富むフラグメントとそれに続くポリT配列である。そのようなエレメントは、ライブラリーからクローニングする、ベクターの一部として市販されているものを購入する、及び容易に合成することができる。
【０１４３】
選択マーカー遺伝子は、選択培地で増殖させる宿主細胞の生存と増殖のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（a）抗生物質又は他の毒素、例えば原核生物宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン、に対する耐性を与える、（b）細胞の栄養素要求性を補う、又は（c）複合培地からは得られない必須栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【０１４４】
一般にシャイン‐ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）と呼ばれるリボソーム結合エレメントは、mRNAの翻訳開始のために必要である。このエレメントは、典型的にはプロモーターの3’側及び合成されるポリペプチドのコード配列の5’側に位置する。シャイン‐ダルガーノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち高いA−G含量を有する）。多くのシャイン‐ダルガーノ配列が特定されており、それらの各々は前述した方法を用いて容易に合成できる。
【０１４５】
前述したすべてのエレメント並びに本発明において有用な他のエレメントは、当業者に周知であり、例えばSambrookら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及びBergerら編集、"Guide To Molecular Cloning Techniques," Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987)に述べられている。
【０１４６】
組換えVEGF-B又はPDGFが分泌されねばならない本発明の実施形態に関しては、好ましくは、それが合成される細胞からの分泌を指令するためにシグナル配列が含まれる。典型的には、シグナル配列は、コード領域の5’末端の方向への又は5’末端での導入遺伝子のコード領域内に位置する。多くのシグナル配列が特定されており、導入遺伝子組織において機能性であるそれらのいずれもが導入遺伝子との結合に使用しうる。それ故、シグナル配列は導入遺伝子と同種又は異種でありえ、またトランスジェニック哺乳動物と同種又は異種でありうる。加えて、シグナル配列は前述した方法を用いて化学合成しうる。しかし、ここでの目的のためには、好ましいシグナル配列は導入遺伝子と共に天然で生じるもの（すなわち導入遺伝子と同種）である。
【０１４７】
多くの場合、ベクター上に1又はそれ以上のイントロンが存在することによって遺伝子転写が上昇する。イントロンは、特に導入遺伝子が完全長ゲノムDNA配列又はゲノムDNA配列のフラグメントである場合、導入遺伝子配列内で天然に生じうる。イントロンがDNA配列内で天然に生じない場合（大部分のcDNAに関して）、もう1つ別のソースからイントロンを入手しうる。イントロンは、導入遺伝子及び／又はトランスジェニック哺乳動物と同種又は異種でありうる。イントロンは有効に転写されねばならないので、プロモーター及び導入遺伝子に対するイントロンの位置は重要である。そこで、導入遺伝子がcDNA配列である場合、イントロンについての好ましい位置は、転写開始部位に対して3’側及びポリA転写終結配列に対して5’側である。好ましくはcDNA導入遺伝子に関しては、イントロンは、導入遺伝子配列を中断しないように導入遺伝子配列の一方の側又は他方の側（すなわち5’側又は3’側）に位置する。あらゆるウイルス、原核及び真核（植物又は動物）生物を含むいかなるソースからのいかなるイントロンも、それが挿入される宿主細胞と適合性であることを条件として、VEGF-B又はPDGFを発現するために使用しうる。合成イントロンもここに包含される。場合により、2つ以上のイントロンをベクター内で使用しうる。
【０１４８】
VEGF-B又はPDGFタンパク質の組換え発現のための好ましいベクターは、細菌、昆虫及び哺乳動物宿主細胞と適合性であるものである。そのようなベクターは、中でも特に、pCRII（Invitrogen Company, San Diego, Calif.）、pBSII（Stratagene Company, La Jolla, Calif.）及びpETL（BlueBacII；Invitrogen）を含む。
【０１４９】
ベクターを構築し、VEGF-B又はPDGF核酸をベクターの適切な位置に挿入した後、完成したベクターを増幅及び／又はVEGF-B又はPDGFポリペプチド発現のために適切な宿主細胞に挿入しうる。典型的に使用される宿主細胞は、限定を伴わずに、グラム陰性細胞又はグラム陽性細胞などの原核細胞、すなわち大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス属、サッカロミセス属、サルモネラ属等の何らかの菌株；CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ヒト腎293細胞、COS−7細胞などの真核細胞；Sf4、Sf5、Sf9及びSf21及びHigh5（すべてInvitrogen Company, San Diego, Calif.より）などの昆虫細胞；及びサッカロミセス属及びPichiaなどの様々な酵母細胞を含む。
【０１５０】
選択宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」又は「トランスフェクション」とも称される）は、塩化カルシウム法、電気穿孔、微量注入、リポフェクション又はDEAE−デキストラン法のような方法を用いて実施しうる。選択する方法は、一部には、使用する宿主細胞の種類に依存する。これらの方法や他の適切な方法は当業者に周知であり、例えばSambrookら、前出に述べられている。
【０１５１】
ベクターを含む（すなわち形質転換又はトランスフェクト）宿主細胞は、当業者に周知の標準培地を使用して培養しうる。培地は通常、前記細胞の増殖と生存のために必要なすべての栄養組成物を含む。大腸菌を培養するための適切な培地は、例えばルリア肉汁（LB）及び／又はテリフィック肉汁（TB）である。真核細胞を培養するための適切な培地は、RPMI 1640、MEM、DMEMであり、そのすべてが、培養する特定細胞系統によって必要とされる血清及び／又は増殖因子を添加しうる。昆虫培養のための適切な培地は、必要に応じてイーストレート、ラクトアルブミン水解物及び／又はウシ胎仔血清を添加したグレース培地である。
【０１５２】
典型的には、形質転換細胞だけの選択的増殖のために有用な抗生物質又は他の化合物を、補足として培地に添加する。使用する化合物は、それによって宿主細胞が形質転換された、プラスミド上に存在する選択マーカーエレメントによって決定される。例えば選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培地に添加する化合物はカナマイシンである。
【０１５３】
宿主細胞において生産されるVEGF-B又はPDGFポリペプチドの量は、当技術分野において公知の標準方法を用いて評価できる。そのような方法は、限定を伴わずに、ウエスタンブロット分析、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、HPLC分離、免疫沈降法、及び／又はVEGFR-1、PDGFR−α又はPDGFR−β結合アッセイ又は細胞刺激アッセイなどの活性アッセイを含む。
【０１５４】
（VEGF-B又はPDGFポリペプチドの精製）
VEGF-Bポリペプチドは、好ましくは、参照して本明細書中に組み込まれる米国特許第6,331,301号に述べられているように発現され、精製される。
【０１５５】
VEGF-B又はPDGFポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されていれば、ポリペプチドの大部分は培地中で見出される可能性が高い。しかし、VEGF-B又はPDGFポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合は、細胞質（真核生物、グラム陽性菌及び昆虫宿主細胞に関して）又は周辺質（グラム陰性菌宿主細胞に関して）に存在する。
【０１５６】
細胞内VEGF-B又はPDGFについては、最初に宿主細胞を機械的に又は浸透圧によって破壊し、細胞質内容物を緩衝液中に放出させる。次にこの溶液からポリペプチドを単離する。
【０１５７】
溶液からのVEGF-B又はPDGFポリペプチドの精製は様々な手法を用いて実施できる。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（VEGF-B／ヘキサHis又はPDGF／ヘキサHis）又は他の小ペプチドのようなタグをそのカルボキシル又はアミノ末端のいずれかに含むように合成されていれば、基本的には、カラムマトリックスがタグに対して又は直接ポリペプチドに対して（すなわちVEGF-B又はPDGFを特異的に認識するモノクローナル抗体）高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通過させることによって1段階工程で精製しうる。例えばポリヒスチジンは高い親和性と特異性でニッケルに結合し、それ故ニッケルのアフィニティーカラム（Qiagenニッケルカラムなど）がVEGF-B／ポリHis又はPDGF／ポリHisの精製のために使用できる。（例えばAusubelら編集、"Current Protocols In Molecular Biology," Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)参照）。
【０１５８】
その受容体VEGFR-1に対するVEGF-Bの強い親和性は、VEGFR-1細胞外ドメインを含むアフィニティーマトリックスを使用したVEGF-Bのアフィニティー精製を可能にする。PDGF受容体−αに対するPDGF-Aの強い親和性、PDGF受容体−βに対するPDGF-Bの強い親和性、PDGF受容体−αに対するPDGF-Cの強い親和性及びPDGF受容体−βに対するPDGF-Dの強い親和性は、PDGF受容体−α及びβ細胞外ドメインを使用したこれらのPDGFのアフィニティー精製を可能にする。加えて、VEGF-B又はPDGFポリペプチドがタグを有さず、抗体も入手可能でない場合は、精製のための他の周知の手順が使用できる。そのような手順は、限定を伴わずに、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、HPLC、ゲル溶出と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、及び分取等電点電気泳動（「Isoprime」機器／手法、Hoefer Scientific）を含む。一部の場合には、高い純度を達成するためにこれらの手法の2又はそれ以上を組み合わせてもよい。精製のための好ましい方法は、ポリヒスチジンタグ及び分取等電点電気泳動と組み合わせたイオン交換クロマトグラフィーを含む。
【０１５９】
プロセシングされたポリペプチドがそのような複合体を形成する場合は封入体（細菌）を含む、周辺質又は細胞質の内容物である、細菌の細胞周辺腔又は真核細胞の細胞質に認められるVEGF-B又はPDGFポリペプチドは、当業者に既知の何らかの標準手法を用いて宿主細胞から抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解して、フレンチプレス、均質化及び／又は音波破砕によって周辺質の内容物を放出させることができる。次にそのホモジネートを遠心分離することができる。
【０１６０】
VEGF-B又はPDGFポリペプチドが周辺質において封入体を形成している場合、その封入体はしばしば内及び／又は外細胞膜に結合することができ、それ故、遠心分離後に主としてペレット物質中に見出される。その後ペレット物質をグアニジン又は尿素などのカオトロピック試薬で処理して、封入体を放出させ、ばらばらに破壊して、可溶化することができる。今や可溶性形態であるVEGF-B又はPDGFポリペプチドを、次に、ゲル電気泳動、免疫沈降などを用いて分析することができる。VEGF-B又はPDGFポリペプチドを単離することを所望する場合は、下記及びMarstonら、Meth. Enz., 182:264-275 (1990)に述べられているような標準方法を用いて単離を実施しうる。
【０１６１】
VEGF-B又はPDGFポリペプチド封入体が宿主細胞の周辺質において有意な程度に形成されない場合は、VEGF-B又はPDGFポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離後主として上清中に見出され、以下で述べるような方法を用いて上清からVEGF-B又はPDGFポリペプチドを単離することができる。
【０１６２】
VEGF-B又はPDGFポリペプチドを部分的に又は完全に単離することが好ましい状況では、当業者に周知の標準方法を用いて精製を実施することができる。そのような方法は、限定を伴わずに、電気泳動とそれに続く電気溶出、様々なタイプのクロマトグラフィー（免疫アフィニティー、分子ふるい及び／又はイオン交換）、及び／又は高圧液体クロマトグラフィーによる分離を含む。一部の場合には、完全な精製のためにこれらの方法の2つ以上を使用することが好ましいと考えられる。
【０１６３】
（抗VEGF-B又は抗PDGF治療化合物）
以下で論じるような抗VEGF-B又は抗PDGF治療は、抗体、アプタマー、アンチセンス及び干渉RNA手法及び治療を含むが、これらに限定されない。これらの治療は、骨髄形成の代わりに骨髄抑制を対象とする。骨髄抑制はしばしば治療対象であるが、白血病及びリンパ腫などの一部の状況及び疾患状態に関しては、骨髄抑制が望ましいと考えられる。
【０１６４】
（治療的抗VEGF-B又は抗PDGF抗体）
米国特許第6,331,301号に述べられている抗VEGF-B抗体も、本発明を実施するときの使用に関して考慮される。そのような抗体は、前述したようにVEGF-B精製のため又はVEGF-Bの阻害が望ましい場合に（例えば骨髄抑制作用を達成するため）治療的に使用することができる。
【０１６５】
本発明を実施する上で有用なポリクローナル又はモノクローナル治療的抗VEGF-B又は抗PDGF抗体は、実験動物において又は以下の方法を用いて組換えDNA手法によって作製しうる。VEGF-B又はPDGF分子又は標的アミノ酸配列を含むそのフラグメントに対するポリクローナル抗体は、一般に、フロイントアジュバント（完全又は不完全）などのアジュバントと組み合わせたVEGF-B又はPDGF分子の多回皮下（sc）又は腹腔内（ip）注射により動物において惹起される。免疫原性を増強するために、最初にVEGF-B又はPDGF分子又は標的アミノ酸配列を含むそのフラグメントを、二官能性又は誘導体化試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシニミドエステル（システイン残基を通して複合）、N−ヒドロキシスクシニミド（リシン残基を通して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl、又はR1N＝C＝NR［式中、R及びR1は異なるアルキル基である］を使用して、免疫する種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害因子に複合することは有用であると考えられる。あるいは、VEGF-B免疫原性コンジュゲートを組換えによって融合タンパク質として生産することができる。
【０１６６】
コンジュゲート約1mg又は約1μg（それぞれウサギ又はマウスについて）を約3容のフロイント完全アジュバントと組み合わせて、その溶液を多数の部位に皮内注射することにより、動物を免疫原性VEGF-B又はPDGFコンジュゲート又は誘導体（標的アミノ酸配列を含むフラグメントなど）に対して免疫する。約7−14日後、動物から採血し、血清を抗VEGF-B又はPDGF力価について検定する。力価がプラトーに達するまで繰り返し抗原で動物を追加免疫する。好ましくは、初期免疫のために使用したのと同じであるが、異なるタンパク質に複合した及び／又は異なる架橋剤を通して複合した、VEGF-B又はPDGF分子又はそのフラグメントで動物を追加免疫する。加えて、免疫応答を増強するためにミョウバンなどの凝集剤を注射溶液中で使用する。
【０１６７】
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾細胞を回収し、それらの細胞を従来のように、例えば骨髄腫細胞との融合により、不朽化することによって作製され得る。次にクローンを、所望抗体を発現するものに関してスクリーニングする。モノクローナル抗体は、好ましくは他のVEGF又はPDGFファミリー成員と交差反応しない。
【０１６８】
ファージミドディスプレイ法などの組換えDNA法を使用した抗体の作製は、例えばPharmacia（Uppsala, Sweden）から入手可能なRecombinant Phagemid Antibody System又はSurfZAP（登録商標）ファージディスプレイシステム（Stratagene Inc., La Jolla, Calif.）のような市販のキットを用いて実施しうる。
【０１６９】
好ましくは、ヒトに投与するための抗体は、マウスなどの実験動物において作製されるが、「ヒト化する」か又はキメラにする、すなわちヒト患者が抗体に対する免疫応答を発現しないようにヒト免疫系と適合性であるようにする。さらに一層好ましくは、今や、例えばLonbergら、Nature Genetics, 7:13-21 (1994)に述べられているような方法を用いて作製できるヒト抗体が、患者への治療的投与のために好ましい。
【０１７０】
A．抗VEGF-B又は抗PDGFモノクローナル抗体のヒト化
VEGF-B中和抗体は、VEGF-B拮抗物質として有用な1つのクラスの治療薬を含む。PDGF中和抗体は、PDGF拮抗物質として有用な1つのクラスの治療薬を含む。下記は、モノクローナル抗体を、それらの血清半減期を改善し、ヒト宿主における免疫原性を低下させるために（すなわち非ヒト抗VEGF-B又は非ヒト抗PDGF抗体に対するヒト抗体応答を予防するために）「ヒト化すること」により、ヒトにおける治療薬としての抗VEGF-Bモノクローナル抗体の有用性を改善するためのプロトコールである。
【０１７１】
ヒト化の原理は文献中に記述されており、抗体タンパク質のモジュラー処理（modular arrangement）によって容易になる。補体に結合する可能性を最小限に抑えるために、IgG4アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。
【０１７２】
例えば、本明細書で述べる抗VEGF-Bモノクローナル抗体などの、対象とする非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインと、ヒト抗体分子の定常ドメインを含むキメラ抗体を作製することによって一定レベルのヒト化が達成される。（例えばMorrisonとOi, Adv. Immnunol., 44:65-92 (1989)参照）。VEGF-B中和抗VEGF-B抗体の可変ドメインを、B細胞ハイブリドーマのゲノムDNAから又は対象ハイブリドーマより単離したmRNAから生成したcDNAからクローニングする。V領域遺伝子フラグメントを、ヒト抗体定常ドメインをコードするエクソンに連結し、生じた構築物を適切な哺乳動物宿主細胞（例えば骨髄腫又はCHO細胞）において発現させる。
【０１７３】
さらに高いレベルのヒト化を達成するためには、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の抗原結合相補性決定領域（「CDR」）をコードする可変領域遺伝子フラグメントの部分だけをヒト抗体配列にクローニングする。（例えばJonesら、Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら、Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenら、Science, 239:1534-36 (1988);及びTempestら、Bio/Technology, 9:266-71 (1991)参照）。必要に応じて、CDR3領域の周囲のヒト抗体のβシート骨格も、もとのモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造をより厳密に反映するように修飾する。（Kettleboroughら、Protein Engin., 4:773-783 (1991);及びFooteら、J. Mol. Biol., 224:487-499 (1992)参照）。
【０１７４】
選択的アプローチでは、対象非ヒトモノクローナル抗体の表面を、内部の残基はすべて保持しつつ、非ヒト抗体の残基に接触させながら、例えば部位特異的突然変異誘発によって、非ヒト抗体の選択表面残基を変化させることによってヒト化する。Padlan, Molecular Immunol., 28(4/5):489-98 (1991)参照。
【０１７５】
前記のアプローチは、VEGF-B中和抗VEGF-Bモノクローナル抗体とそれらを生産するハイブリドーマを使用して、VEGF-B発現が有害である状態を治療又は緩和するための治療薬として有用なヒト化VEGF-B中和抗体を作製するために用いられる。
【０１７６】
前記アプローチは、PDGF中和抗PDGFモノクローナル抗体とそれらを生産するハイブリドーマを使用して、PDGF発現が有害である状態を治療又は緩和するための治療薬として有用なヒト化PDGF中和抗体を作製するために用いられる。
【０１７７】
B．ファージディスプレイからのヒトVEGF-B中和又はヒトPDGF中和抗体
ヒトVEGF-B中和又はPDGF中和抗体は、すべて参照して本明細書中に組み込まれる、Aujameら、Human Antibodies, 8(4):155-168 (1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15:62-70 (1997);及びRaderら、Curr. Opin. Biotechnol., 8:503-508 (1997)に述べられているようなファージディスプレイ手法によって作製される。例えば、Fabフラグメントの形態又は一本鎖Fvフラグメントに結合した抗体可変領域を、糸状ファージマイナーコートタンパク質pIIIのアミノ末端に融合する。融合タンパク質の発現及び成熟ファージ外被へのそれらの組込みは、それらの表面に抗体を提示し、前記抗体をコードする遺伝物質を含むファージ粒子を生じさせる。そのような構築物を含むファージライブラリーを細菌において発現させ、標識又は固定化VEGF-B又はPDGFをそれぞれ抗原プローブとして使用して、前記ライブラリーをVEGF-B特異的又はPDGF特異的ファージ抗体に関してパニング（スクリーニング）する。
【０１７８】
C．トランスジェニックマウスからのヒトVEGF-B中和又はヒトPDGF中和抗体
ヒトVEGF-B中和抗体は、基本的にBruggemannと Neuberger, Immunol. Today, 17(8):391-97 (1996)及びBruggemann とTaussig, Curr. Opin. Biotechnol., 8:455-58 (1997)が述べたようにトランスジェニックマウスにおいて作製される。生殖細胞系構造にヒトV遺伝子セグメントを担持し、これらの導入遺伝子をそのリンパ系組織において発現するトランスジェニックマウスを、従来の免疫プロトコールを使用してVEGF-B又はPDGF組成物で免疫する。従来のプロトコールを用いて、免疫したマウスからB細胞を使用してハイブリドーマを生成し、抗VEGF-B又は抗PDGFヒト抗体を分泌するハイブリドーマ（例えば前述したような）を特定するためにスクリーニングする。
【０１７９】
D．二重特異性抗体
1つのタンパク質（例えばVEGF-B又はPDGF）に特異的に結合し、且つ疾患及び／又は治療に関連する他の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を、文献に述べられている標準手順を用いて生産し、単離し、試験する。例えば、それらのすべてが全体として参照して本明細書中に組み込まれる、PluckthunとPack, Immunotechnology, 3:83-105 (1997); Carterら、J, Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); RennerとPfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, No. 145, pp. 179-209; Pfreundschuh、米国特許第5,643,759号；Segalら、J. Hematotherapy, 4: 377-382 (1995); Segalら、Immunobiology, 185: 390-402 (1992);及びBolhuisら、Cancer Immunol. Immunother., 34: 1-8 (1991)参照。
【０１８０】
（抗VEGF-B及び抗PDGFアプタマー）
コンビナトリアル科学の分野における最近の進歩により、所与の標的に高い親和性と特異性を有する短いポリマー配列が特定された。例えば、SELEXテクノロジーを使用して、哺乳動物抗体に匹敵する結合特性を備えたDNA及びRNAアプタマーが特定され、免疫学の分野は、無数の化合物に結合する抗体又は抗体フラグメントを作製して単離し、またファージディスプレイを利用して、非常に有望な結合特性を備えた新しいペプチド配列が発見された。これらの分子進化手法の成功に基づき、いかなる分子に結合するリガンドも創造できることは確実である。不思議なことに、各々の場合に、以下の場合のように所望結合特性を提供することにループ構造がしばしば関与する：相補的塩基対合なしに短い領域から創造されるヘアピンループをしばしば利用するアプタマー、ループ状超可変領域のコンビナトリアル配置を利用する天然由来の抗体、及び線状ペプチドファージディスプレイの結果と比較したとき改善された結果を示した、環状ペプチドを使用する新しいファージディスプレイライブラリー。それ故、コンビナトリアル分子進化手法によって高親和性リガンドを創造し、特定できることを示唆する十分な証拠が生成されてきた。本発明のために、抗VEGF-B抗体に関して前述したのと同じように使用される、VEGF-Bに特異的なリガンドを単離するために分子進化手法が使用できる。アプタマーに関する詳細については、一般に、Gold, L., Singer, B., He, Y.Y., Brody. E., "Aptamers As Therapeutic And Diagnostic Agents," J. Biotechnol. 74:5-13 (2000)参照。
【０１８１】
（アンチセンス分子及び治療）
本発明において有用なもう1つのクラスのVEGF-B又はPDGF阻害因子は、VEGF-B又はPDGFヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、類似体又は誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる又は前記核酸分子に相補的な、単離されたアンチセンス核酸分子である。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な（例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な又はmRNA配列に相補的な）ヌクレオチド配列を含む。特定局面では、VEGF-B又はPDGFコード鎖の少なくとも約10、25、50、100、250又は500ヌクレオチド又はコード鎖全体に相補的な配列、又はその一部だけに相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。付加的に、VEGF-B又はPDGFのフラグメント、同族体、誘導体及び類似体をコードする核酸分子、あるいはVEGF-B又はPDGF核酸配列に相補的なアンチセンス核酸が提供される。
【０１８２】
1つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、VEGF-B又はPDGFタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」にアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう1つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、VEGF-B又はPDGFタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コンシーディング領域（conceding region）」にアンチセンスである。「コンシーディング領域」という用語は、コード領域に隣接し、アミノ酸に翻訳されない5’及び3’配列を指す（すなわち5’及び3’非翻訳領域とも称される）。
【０１８３】
本明細書で開示するVEGF-B又はPDGFタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮して、ワトソン・クリック型又はフーグスティーン型塩基対の法則に従って本発明のアンチセンス核酸を設計することができる。前記アンチセンス核酸分子は、VEGF-B又はPDGF mRNAのコード領域全体に相補的でありうるが、より好ましくはVEGF-B又はPDGF mRNAのコード又は非コード領域の一部だけにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、VEGF-B mRNAの翻訳開始部位付近の領域に相補的でありうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45又は50ヌクレオチドの長さでありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を用いた化学合成又は酵素連結反応を使用して構築することができる。例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、あるいは該分子の生物学的安定性を高めるように又はアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを使用して（例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる）、化学合成することができる。
【０１８４】
アンチセンス核酸を作製するために使用できる修飾ヌクレオチドの例は：5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2，2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β-D−マンノシルクエオシン、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、5−メチル−2−チオウラシル、3−（3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、及び2，6−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して（すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向である、以下の項でさらに説明する）生物学的に生産することができる。
【０１８５】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、VEGF-B又はPDGFをコードする細胞mRNA及び／又はゲノムDNAとハイブリダイズして又は結合して、それによって前記タンパク質の発現を阻害するように（例えば転写及び／又は翻訳を阻害することによって）、被験体に投与されるか又はインサイチュで生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってであるか、又は例えばDNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主溝における特異的相互作用を通してでありうる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は、組織部位における直接注射を含む。あるいは、選択細胞を標的するようにアンチセンス核酸分子を修飾し、その後全身的に投与することができる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子を、選択細胞表面で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように修飾することができる（例えばアンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することによって）。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書で述べるベクターを使用して細胞に送達することができる。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子が強力なpol II又はpol IIIプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【０１８６】
さらにもう1つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のαユニットと異なり、鎖が互いに平行に走る相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する。例えばGaultierら、Nucl. Acids Res., 15:6625-6641 (1987)参照。アンチセンス核酸分子はまた、2’−o−メチルリボヌクレオチド（例えばInoueら、Nucl. Acids Res., 15:6131-6148 (1987)参照）又はキメラRNA-DNA 類似体（例えばInoueら、FEBS Lett., 215:327-330 (1987)参照）。
【０１８７】
アンチセンス分子の生産と送達は、VEGF-B又はPDGF  DNA配列の少なくとも一部に相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を含むベクターを提供することによって容易になる。本発明のさらなる局面によれば、アンチセンス配列を含むそのようなベクターは、VEGF-B又はPDGF発現を阻害するため又は少なくとも低減するために使用しうる。VEGF-B又はPDGF発現を阻害するためのこの種のベクターの使用は、VEGF-B又はPDGF発現が特定疾患状態に関連する場合に有益である。
【０１８８】
（抗VEGF-B又は抗PDGF  RNA干渉）
VEGF-B又はPDGF発現を不活性化する又は調節するためのRNA干渉の使用も本発明によって考慮される。RNA干渉は、米国特許出願第2002−0162126号及びHannon, G., J. Nature, 11:418:244-51 (2002)に述べられている。「RNA干渉」、「翻訳後の遺伝子サイレンシング」、「クエリング（quelling）」―これらの用語はすべて、導入遺伝子の過剰発現又は誤発現から、あるいは細胞への二本鎖RNAの意図的な導入から生じる同様の作用を表わすために使用されてきた（すべてが参照して本明細書中に組み込まれる、Fire, A., Trends Genet 15:358-363 (1999); Sharp, P.A., Genes Dev., 13:139-141 (1999); Hunter, C., Curr. Biol., 9:R440-R442 (1999); Baulcombe, D.C., Curr. Biol. 9:R599-R601 (1999); Vaucheretら、Plant J. 16:651-659 (1998)に総説されている）。一般にRNAiと称されるRNA干渉は、クローン化された遺伝子を特異的に且つ強力に不活性化する方法を提供する。
【０１８９】
（治療組成物及び投与）
VEGF-Bポリペプチド、ポリヌクレオチド又は抗体などの本発明を実施する上で有用な組成物の治療製剤は、所望する度合の純度を有する選択組成物を任意の生理的・製薬的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Genmaro編集、Mack Publishing Company (1990)）を凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で混合することによって保存用に調製しうる。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、受容者に非毒性であり、好ましくは使用する用量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸又は他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；EDTAなどのキレート化剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTween、プルロニック又はポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９０】
インビボ投与に使用される組成物は無菌であるべきである。これは、凍結乾燥及び再溶解の前又は後に、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。非経口投与用の組成物は通常、凍結乾燥形態又は溶液として保存される。
【０１９１】
治療組成物は一般に、無菌アクセス口を有する容器、例えば皮下注射針によって貫通できる栓を有する静脈注射用溶液のバッグ又はバイアルに収められる。組成物の投与経路は公知の方法、例えば経口、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路による注射又は注入、あるいは持続放出システム又は移植装置による方法に従う。所望する場合は、組成物を、持続注入、ボーラス注射によって又は移植装置によって持続的に投与しうる。
【０１９２】
持続放出製剤の適切な例は、成形製品、例えば薄膜又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号、欧州特許第58,481号）、L−グルタミン酸とγエチル−L−グルタメートのコポリマー（Sidmanら、Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、ポリ（2−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Langerら、J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（Langerら、前出）又はポリ-D（−）−3−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第133,988号）を含む。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法（例えばドイツ特許第3,218,121号；Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); 欧州特許第52,322号；同第36,676号；同第88,046号；同第143,949号）のいずれかによって作製できるリポソームを含みうる。
【０１９３】
治療的に使用する組成物の有効量は、例えば治療目的、投与経路及び患者の状態に依存する。従って、治療者は、最適治療効果を得るために必要に応じて用量を調節し、投与経路を修正する必要がある。典型的な一日用量は、前述した因子に依存して、約1μg／kgから100mg/kgまで又はそれ以上の範囲をとりうる。典型的には、臨床医は、所望効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。この治療の経過は、骨髄抑制又は特定被験体における特定対象状態を評価するために設計された従来のアッセイによって容易に監視される。
【０１９４】
医薬組成物は、製薬的に有効な量のVEGF-Bタンパク質を、水、鉱物油、ポリエチレングリコール、デンプン、滑石、ラクトース、増粘剤、安定剤、懸濁化剤等のような1又はそれ以上の適切な担体又はアジュバントと混合することによって生産しうる。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、クリーム、軟膏（salves、ointments）の形態又は他の従来の形態でありうる。
【０１９５】
VEGF-B又はPDGFは、本発明の材料及び方法を実施するために直接使用できるが、好ましい実施形態では、化合物を、製薬上許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤又は担体と共に製剤する。「製薬上又は薬理的に許容される」という語句は、例えば経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸入スプレーによって、膣経路、直腸経路、又は頭蓋内注射によって、動物又はヒトに投与したとき有害反応、アレルギー反応又は他の好ましくない反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。（本明細書で使用する非経口的という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、槽内注射、又は注入手法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、クモ膜下腔内、眼球後、肺内注射及び／又は特定部位における外科的移植による投与も考慮される）。一般に、これはまた、発熱物質ならびにヒト又は動物に有害でありうる他の不純物を基本的に含まない組成物を製造することを包含する。「製薬上許容される担体」という用語は、あらゆる溶媒、分散媒質、被覆物、抗菌及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。製薬的活性物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当技術分野において周知である。
【０１９６】
注射用製剤に適する製薬形態は、無菌水溶液又は分散及び無菌注射用溶液又は分散の即時調製のための無菌粉末を含む。すべての場合に、前記形態は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度に流動性でなければならない。製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されねばならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒質でありうる。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆物の使用によって、分散の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等、によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによって達成できる。
【０１９７】
（ポリヌクレオチドに基づくVEGF-B又はPDGF治療）
1つの実施形態では、幹細胞の集積、増殖及び／又は分化へのVEGF-B又はPDGFの治療作用は、VEGF-B又はPDGFから恩恵を受ける被験体への、VEGF-B又はPDGFをコードするポリヌクレオチド（そのようなポリヌクレオチドを含むベクターを包含する）の投与によって達成される。
【０１９８】
これらの実施形態に関して、例示的な発現構築物は、ウイルス又はウイルスゲノムから誘導される操作された構築物を含む。発現構築物は一般に、発現すべき遺伝子をコードする核酸及びまた、投与される細胞において遺伝子の発現を生じさせる付加的な調節領域を含む。そのような調節領域は、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含む。
【０１９９】
様々なウイルスベクターを使用してDNAを細胞に導入しうることは今や広く認識されている。そのような実施形態において、対象遺伝子を含むウイルスベクターを含む発現構築物は、アデノウイルス（例えば、各々が参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,824,544号；同第5,707,618号；同第5,693,509号；同第5,670,488号；同第5,585,362号参照）、レトロウイルス（例えば、各々が参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,888,502号；同第5,830,725号；同第5,770,414号；同第5,686,278号；同第4,861,719号参照）、アデノ関連ウイルス（例えば、各々が参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,474,935号；同第5,139,941号；同第5,622,856号；同第5,658,776号；同第5,773,289号；同第5,789,390号；同第5,834,441号;同第5,863,541号；同第5,851,521号；同第5,252,479号参照）、アデノ関連ウイルスハイブリッド（例えば、参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,856,152号参照）又はワクシニアウイルス又はヘルペスウイルス（例えば、各々が参照して本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,879,934号；同第5,849,571号；同第5,830,727号；同第5,661,033号；同第5,328,688号参照）ベクターでありうる。
【０２００】
他の実施形態では、非ウイルス送達が考慮される。これらは、リン酸カルシウム沈殿（GrahamとVan Der Eb, Virology, 52:456-467 (1973); ChenとOkayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, (1987); Rippeら、Mol. Cell Biol., 10:689-695 (1990)）、DEAE−デキストラン（Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)）、電気穿孔(Tur-Kaspaら、Mol. Cell Biol., 6:716-718, (1986); Potterら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, (1984))、直接微量注入（HarlandとWeintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099 (1985)）、DNA負荷リポソーム (NicolauとSene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979); Felgner, Sci. Am., 276(6):102-6 (1997); Felgner, Hum. Gene Ther., 7(15):1791-3, (1996))、細胞超音波処理(Fechheimerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467 (1987))、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子パーティクルガン(Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9568-9572 (1990))、及び受容体を介したトランスフェクション（WuとWu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); WuとWu, Biochemistry, 27:887-892 (1988); WuとWu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167 (1993)）を含む。
【０２０１】
本発明の特定実施形態では、発現構築物（又は実際には上記で論じたペプチド）をリポソーム内に捕捉しうる。リポソームは、リン脂質二重層の膜と内部の水性媒質によって特徴付けられる小胞構造である。多重層リポソームは、水性媒質によって分けられた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁したとき自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水と溶けた溶質を捕捉する（GhoshとBachhawat, "In Liver Diseases, Targeted Diagnosis And Therapy Using Specific Receptors And Ligands," Wu, G., Wu, C.編集、New York: Marcel Dekker, pp. 87-104 (1991)）。カチオン性リポソームは、リポソームから光学的に複屈折性の液晶凝縮小球への位相遷移を生じさせる（Radlerら、Science, 275(5301):810-4, (1997)）。これらのDNA−脂質複合体は、遺伝子治療及び送達における使用のための潜在的非ウイルスベクターである。
【０２０２】
インビトロでのリポソームを介した核酸送達及び異種DNAの発現は非常に成功を収めてきた。「リポフェクション」テクノロジーを含む様々な商業的アプローチも本発明において考慮される。本発明の一部の実施形態では、リポソームを赤血球凝集ウイルス（HVJ）と複合しうる。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソーム被包DNAの細胞への侵入を促進することが示された（Kanedaら、Science, 243:375-378 (1989)）。他の実施形態では、リポソームを核内非ヒストン染色体タンパク質（HMG−1）と複合しうる又は同時に使用しうる（Katoら、J. Biol. Chem., 266:3361-3364 (1991)）。さらなる実施形態では、リポソームをHVJ及びHMG−1と複合しうる又は同時に使用しうる。そのような発現構築物はインビトロ及びインビボでの核酸の導入と発現において成功裏に使用されてきたので、それらは本発明に適用しうる。
【０２０３】
治療的遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために使用できる他のベクター送達システムは、受容体を介した送達媒体を含む。これらは、ほとんどすべての真核細胞における、受容体仲介性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取込みを利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布の故に、前記送達は高度に特異的でありうる（WuとWu(1993)、前出）。
【０２０４】
受容体仲介性遺伝子ターゲティング媒体は一般に2つの成分：細胞受容体特異的リガンド及びDNA結合物質から成る。いくつかのリガンドが受容体を介した遺伝子導入のために使用されてきた。最も広く特性決定されているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）（WuとWu(1987)、前出）及びトランスフェリン（Wagnerら、Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 87(9):3410-3414 (1990)）である。最近になって、ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達媒体として使用され（Ferkolら、FASEB. J., 7:1081-1091 (1993); Peralesら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA91:4086-4090 (1994)）、また上皮増殖因子（EGF）も、遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するために使用された（Myers、欧州特許第0273085号）。
【０２０５】
他の実施形態では、送達媒体はリガンドとリポソームを含みうる。例えばNicolauら、Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)は、ガラクトース−ターミナルアシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドを使用して、リポソームに組み込み、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みの上昇を認めた。そこで、治療的遺伝子をコードする核酸も、リポソームと共に又はリポソームなしで、多くの受容体−リガンドシステムによって特定細胞型に特異的に送達することが可能である。
【０２０６】
本発明のもう1つの実施形態では、発現構築物は単に、裸の組換えDNA又はプラスミドで構成されうる。構築物の導入は、物理的又は化学的に細胞膜を透過性にする、前述した方法のいずれかによって実施しうる。これは特にインビトロでの導入に適用できるが、インビボでの使用にも適用しうる。Dubenskyら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533 (1984)は、CaPO4沈殿物の形態のポリオーマウイルスDNAを成体及び新生児マウスの肝臓と脾臓に注入することに成功し、活発なウイルス複製と急性感染を明らかにした。BenvenistyとNeshif, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555 (1986)も、CaPO4沈殿させたプラスミドの直接腹腔内注入がトラスフェクト遺伝子の発現を生じさせることを明らかにした。
【０２０７】
裸のDNA発現構築物を細胞に導入するための本発明のもう1つの実施形態は、パーティクルガンを含みうる。この方法は、DNA被覆したマイクロプロジェクタイルを、細胞膜を貫通できる高速まで加速し、細胞を死滅させずに細胞内に侵入させる能力に依存する（Kleinら、Nature, 327:70-73 (1987)）。小さな粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置の1つは、電流を生成し、それが次に起動力を提供する、高圧放電に基づく(Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572 (1990)。使用されたマイクロプロジェクタイルは、タングステン又は金ビーズなどの生物学的に不活性の物質から成った。
【０２０８】
当業者は、遺伝子送達をインビボ及びエキソビボ状況でどのように適用するかを十分に認識している。ウイルスベクターについては、一般にウイルスベクターストックを作製する。ウイルスの種類及び達成可能な力価に基づいて、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011又は1×1012の感染性粒子を患者に送達する。相対的取込み効率を比較することによって同様の数字をリポソーム又は他の非ウイルス製剤に外挿しうる。医薬的に許容される組成物としての製剤を以下で論じる。
【０２０９】
様々な細胞型について様々な経路が考慮される。実際上いかなる細胞、組織又は器官タイプについても、全身送達が考慮される。他の実施形態では、様々な直接、局所的及び限局的アプローチを実施しうる。例えば細胞、組織又は器官に発現ベクター又はタンパク質を直接注入しうる。
【０２１０】
本発明における使用のための遺伝子治療用の好ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター／エンハンサー、レトロウイルスのロングターミナルリピート（LTR）、ケラチン14プロモーター、及びαミオシン重鎖プロモーターを含む。
【０２１１】
異なる実施形態では、エキソビボ遺伝子治療が考慮される。エキソビボ実施形態では、患者からの細胞を取り出し、少なくとも一定の期間体外で保持する。この期間中に、治療を送達し、その後細胞を患者に再導入する；好ましくは、試料中の腫瘍細胞は死滅されている。
【０２１２】
VEGF-B及びPDGFについて本明細書で概説した手法、手順及び方法は、本発明のあらゆる増殖因子に適用できる。
【０２１３】
以下の実施例を参照することによって本発明をより容易に理解しうる。以下の実施例は本発明を例証するために提示するものであり、いかなる意味においてもその範囲を限定することを意図しない。
〔実施例１〕
VEGF-B又はVEGF-C遺伝子治療の白血球数への作用
VEGF-B及びその受容体VEGFR-1を含む一部の増殖因子及びそれらの受容体の造血前駆細胞に関する役割を明らかにするために、以下の手順を実施した。
【０２１４】
NMRI  nu/nuマウス（ヌードマウス）に、以下のタンパク質の1つをコードするアデノウイルスを静脈内注射した：β−ガラクトシダーゼ（1×109pfu）、VEGF-C（3×108pfu）、VEGF-C156S（突然変異形態のVEGF-C；3×108pfu、米国特許第6,361,946号参照）、可溶性形態のVEGFR−3細胞外ドメイン（VEGFR−3−Ig融合タンパク質；1×109pfu）、又はVEGF-B（VEGF-B167とVEGF-B186の50：50混合物）（1×109pfu）。β−ガラクトシダーゼを陰性対照として使用した。
【０２１５】
注射の4日後にマウスを屠殺し、血液を採取して、フローサイトメトリーを用いて末梢血からの白血球（WBC）数を測定した。加えて、血液のWBCを抗VEGFR−3抗体で処理し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析のためにフィコエリスリン複合ラット抗マウスIgG2Aで染色した。緩衝塩化アンモニウム／カリウム（ACK）溶解液によって赤血球を溶解し、各試料につき1×105の白血球を使用した。
【０２１６】
白血球を、2％ウシ胎仔血清を含むPBSで洗浄し、Fc Block（BD Pharmingen）と共に5分間インキュベートし、次いで複合抗体と共に氷上で30分間インキュベートした。陰性アイソタイプ対照として、バックグラウンドシグナルを測定するためにフィコエリスリン複合ラットIgG2A（BD Pharmingen）を同じ濃度で使用した。細胞を洗浄し、LSR血球計算器（Becton Dickinson）で分析した。フローサイトメトリーにおいて使用した他のPE又はFITC標識抗体は、抗VEGFR-1、抗Tie−2、抗VEGFR−2、抗CD34、抗CD117、抗CD11b及び抗Ly−6G/Cであった。
【０２１７】
Ad−VEGF-C156Sで処置したマウスにおいて、VEGFR-1、VEGFR−2及びVEGFR−3を発現する造血細胞の末梢血への明らかな動員が見られた。さらに、血液循環中のCD34＋細胞のパーセンテージは、Ad−LacZ処置マウスに比べてより高かった。
【０２１８】
Ad−VEGF-C及びAd−VEGF-B群では高い数のVEGFR-1＋細胞も存在した（図3a-d）。これらの結果は、VEGF-C、特にそのVEGFR−3特異的変異体形態であるVEGF-C156S、並びにVEGF-Bが、骨髄からの内皮／造血前駆細胞を動員できることを示している。
〔実施例２〕
化学療法誘導性骨髄抑制からの回復
骨髄回復の間の造血を検討するために、FVB又はNMRI野生型マウス（6−10週齢）を、循環造血細胞の大部分を一次的に枯渇させる、細胞傷害性5−フルオロウラシル（5−FU、300mg/kg、Pharmacia）の単回i.v.注射で処置した。様々な外因性増殖因子処置による又は処置なしでの回復を検討した。実施例1で述べたようにWBCを分析した。
【０２１９】
最初の実験では、5−FU単独の作用を検討した。骨髄抑制処置前には、末梢血はVEGFR−3染色陽性の約4.1％の白血球（WBC）を含んでいた。血液中のVEGFR−3＋細胞のパーセンテージは5−FU処置後5日目から上昇し始め、16日目にその数は23.7％であった（図1a）。また、大腿骨の骨髄において、VEGFR−3陽性細胞のパーセンテージは5−FU処置後明らかに上昇した（図1b）。
【０２２０】
第二セットの実験では、5−FU処置マウスに、以下のタンパク質の1つをコードするアデノウイルスの静脈内注射を同時に実施した：β−ガラクトシダーゼ（1×109pfu）、VEGF-C（3×108pfu）、VEGF-C156S（3×108pfu）又は可溶性VEGFR−3細胞外ドメイン（VEGFR−3−Ig融合タンパク質；1×109pfu）。
【０２２１】
実施例1で述べた手法を用いて2又は4日後に末梢血からの白血球数（WBC）を測定した。Ad−VEGF-C処置マウスでは、最初の4日間、WBCの数がより高かったが（4日目に＋43％）、AdVEGFR−3−Ig処置マウスでは、Ad−LacZ処置マウスと比較してWBC数がより迅速に低下した（2日目に−27％、4日目に−12％）（図2a）。さらに、VEGFR−3だけを活性化するVEGF-Cの突然変異形態、VEGF-C156Sをコードするアデノウイルスの注入も、同じ5−FUモデルにおいて末梢血中のWBC数を上昇させた（図2b）。
【０２２２】
マウスに、VEGF-C又はVEGFR−3−Igをコードするアデノウイルスの2回目の注射を10日目に実施した。VEGFR−3−Ig処置マウスにおいて、VEGFR−3経路の遮断は骨髄の回復及びWBC数の上昇を阻害した（図2c）。
〔実施例３〕
白血球数へのVEGF-B又はPDGF遺伝子治療の作用
VEGF-Bとその受容体VEGFR-1、及びPDGFとそれらのそれぞれの受容体を含む、一部の増殖因子及びそれらの受容体の造血前駆細胞に関する役割を明らかにするために、以下の手順を実施する。
【０２２３】
NMRI  nu/nuマウス（ヌードマウス）、VEGF-B欠損マウス（Aaseら、Circulation, 104:358-64 (2001)及びWanstallら、Card. Res., 55:361-368 (2002)に述べられているVEGF-Bノックアウトマウス）、又はPDGF（PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C又はPDGF-D）欠損マウスに、以下のタンパク質の1又はそれ以上をコードするアデノウイルスの静脈内注射を8×107−6×109pfuの濃度で実施する：β−ガラクトシダーゼ、VEGF-B167、VEGF-B186、VEGF-B  N−アセチル化変異体、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-D。β−ガラクトシダーゼを陰性対照として使用する。
【０２２４】
ウイルス注射の4日後、マウスを屠殺し、血液を採取して、フローサイトメトリーを用いて4日後に末梢血からの白血球（WBC）数を測定した。緩衝塩化アンモニウム／カリウム（ACK）溶解液によって赤血球を溶解し、各試料につき105の白血球を使用する。白血球を実施例1におけるように免疫分析し、さらに抗PDGF受容体α及び抗PDGF受容体β抗体に関して分析する。
【０２２５】
幹細胞を示す様々な細胞表面マーカーを発現する白血球の相対的な数を対照と実験マウスの間で比較して、幹細胞集積、分化及び増殖のレベルを評価する。
〔実施例４〕
骨髄抑制及びVEGF-B及びPDGFによる回復
骨髄回復の間の造血を検討するために、FVB又はNMRI野生型マウス（6−10週齢）、VEGF-B欠損マウス又はPDGF（PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C又はPDGF-D）欠損マウスを、循環造血細胞の大部分を一次的に枯渇させる、細胞傷害性5−フルオロウラシル（5−FU、300mg/kg、Pharmacia）の単回i.v.注射で処置する。様々な外因性増殖因子処置による又は処置なしでの回復を検討する。WBCを実施例1で述べたように分析し、さらに抗PDGF受容体α及び抗PDGF受容体β抗体に関して分析する。
【０２２６】
最初の実験では、5−FU単独の作用を検討する。骨髄抑制処置前に、末梢血を実施例2に従って、そしてさらに抗PDGF受容体α及び抗PDGF受容体β抗体に関して分析する。
【０２２７】
第二セットの実験では、マウスを、5−FUと以下のタンパク質の1又はそれ以上をコードする導入遺伝子を含むアデノウイルス（8×107−6×109pfuの濃度）で同時に処置する：β−ガラクトシダーゼ、VEGF-B167、VEGF-B186、VEGF-B  N−アセチル化変異体、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-D。加えて、可溶化PDGF受容体細胞外ドメイン／IgG融合をコードするアデノウイルスを試験する。
【０２２８】
実施例2で述べた手法を用いて2又は4日後に末梢血からの白血球数（WBC）を分析し、さらに抗PDGF受容体α及び抗PDGF受容体β抗体に関して分析する。
【０２２９】
幹細胞を示す様々な細胞表面マーカー（例えばAC133、VEGFR−2又は−1、c−kit）を発現する白血球の相対的な数を対照と実験マウスの間で比較して、各々のタンパク質の幹細胞集積、分化及び増殖への作用を評価する。
〔実施例５〕
骨髄形成タンパク質治療
VEGF-Bとその受容体VEGFR-1、及びPDGFとそれらのそれぞれの受容体を含む、一部の増殖因子及びそれらの受容体の造血前駆細胞に関する役割を明らかにするために、以下の手順を実施する。
【０２３０】
NMRI  nu/nuマウス（ヌードマウス）、VEGF-B欠損マウス（Aaseら、Circulation, 104:358-64 (2001)及びWanstallら、Card. Res., 55:361-368 (2002)に述べられているVEGF-Bノックアウトマウス）、又はPDGF（PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C又はPDGF-D）欠損マウスに、対照タンパク質あるいは以下の増殖因子の1又はそれ以上を投与する：VEGF-B167、VEGF-B186、VEGF-B  N−アセチル化変異体、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-D。あるいは、可溶性受容体細胞外ドメインタンパク質製剤（例えばVEGFR-1−Ig、PDGFR−α−Ig又はPDGFR−β−Ig）をマウスに投与する。タンパク質組成物を投与する前に、基線白血球を実施例1で述べたように特性決定する。マウスに増殖因子又は対照タンパク質の初回静脈内（IV）ボーラス用量を60分間かけて投与する。48時間の観察期間後、マウスに増殖因子又は対照タンパク質の14日間の持続的IV注入のコースを実施する。様々なタンパク質濃度を試験する。例えば、マウスに0.5、1.0、2.0、4.0又は8.0μg／kgの総用量を投与する。2、6、11、16又は24日目に、白血球を実施例1で述べたように特性決定する。
【０２３１】
幹細胞を示す様々な細胞表面マーカーを発現する白血球の相対的な数を対照と実験マウスの間で比較して、各々のタンパク質の幹細胞集積、分化及び増殖への作用を評価する。
〔実施例６〕
VEGF-B又はPDGFで処置した被験体から誘導した内皮前駆細胞のエキソビボ増殖
VEGF-B及び／又はPDGF治療が組織、器官又は人工器官移植又はインプラントの効果及び治癒を改善する能力を明らかにするために以下の実験を実施する。この実験は、その全体が参照して本明細書中に組み込まれる、Kaushalら、"Functional Small-Diameter Neovessels Created Using Endothelial Progenitor Cells Expanded Ex Vivo," Nat. Med., 7:1035-1040 (2001)の方法に基づく。被験体を以下の1つ又はそれ以上で処置する：直接タンパク質形態の又は組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）、プラスミド又は他のベクター、又はVEGF-B、PDGF又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む裸のDNAなどの、遺伝子治療ベクターの一部としてポリヌクレオチドによってコードされる、VEGF-B167、VEGF-B186、VEGF-B  N−アセチル化変異体、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-Dあるいは対照。1つの変法では、移植可能なミニ浸透圧ポンプを用いてVEGF-B及び／又はPDGFタンパク質を投与する。循環内皮前駆細胞（EPC）の量を増加させるためにVEGF-B又はPDGF治療を実施する。
【０２３２】
前述した処置の2、4、6、8、12又は14日後、血液をヘパリン化チューブに採取し、Accuspinチューブ（Sigma）を用いて1000gで30分間、Histopaque密度勾配（Sigma）で白血球を単離する。白血球を、20％ウシ胎仔血清を添加した増殖培地（例えばEBM−2培地（Clonetics, San Diego））に再懸濁し、フィブロネクチン被覆平板に塗布する。次に接着細胞を増殖させる（好ましくはVEGF-B又はPDGF、1−10μg/ml増殖培地の存在下で）。好ましくは、細胞からの試料を、未分化及び分化前駆細胞を示す細胞表面分子に関して分析する。
【０２３３】
被験体を、偽手術、あるいは人工器官または皮膚、骨、靭帯、腱、軟骨、静脈もしくは動脈移植片などの組織又は器官移植片を埋没するか又は移植する手術のために2群に分ける。Tepperら、"Endothelial Progenitor Cells: The Promise Of Vascular Stem Cells For Plastic Surgery," Plastic and Reconstructive Surgery, 111:846-854 (2003)参照。実験群については、増殖した前駆細胞を平板から単離し、手術創傷又は移植片（組織工学を用いた合成移植片を含む）に接種するか、又は静脈内経路で循環血中に再導入する。対照動物には、細胞治療を行わないか、又は前述したように単離するが、増殖因子前処置を伴わず、増殖因子添加培養を行わない有核細胞を用いて細胞治療を実施する。
【０２３４】
様々な時点で動物を検査するか又は屠殺して、創傷が治癒する速度及び／又は身体が移植片を受け入れる成功度を評価する。
〔実施例７〕
VEGF-B、化学療法、骨髄移植試験
試験動物の4つの群を確立し、1群には化学療法も骨髄移植も実施せず、1群には以下で述べる化学療法剤の1つ又はそれ以上を使用した化学療法を実施し、1群には骨髄移植を実施し、そして1群には化学療法と骨髄移植の両方を実施する。各々の群の被験体に以下の1つ又はそれ以上を投与する：VEGF-B167、VEGF-B186、VEGF-B  N−アセチル化変異体、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C及びPDGF-Dあるいは対照タンパク質。化合物を投与する前に、実施例1で述べた白血球の特性決定のため、そしてさらに抗PDGF受容体α及び抗PDGF受容体β抗体に関する特性決定のために血液試料を採取する。
【０２３５】
使用する化学療法剤は、シクロホスファミド（5,725mg/m2）、シスプラチン（165mg/m2）及びカルムスチン（BCNU）（600mg/m2）を含み、4日間にわたって投与する。骨髄再注入の3時間後に、特定増殖因子生成物又は対照プロトコールの投与を、14−20日間の皮膚静脈内（IV）持続注入として、又は21日間までの1日当り4時間の注入として投与する第二投与スケジュールとして開始する。増殖因子生成物又は対象タンパク質は、0.1−100μg／kg／日の用量で投与する。
【０２３６】
2−3日ごとの血液採取（実施例1で述べた白血球及びさらに、使用する抗PDGF受容体α及び抗PDGF受容体β抗体に関する特性決定と共に）に加えて、骨髄生検及び骨髄前駆細胞アッセイを5日の間隔で実施し、注入の前、注入の間、及びもし異常があれば、注入後に、白血球の機能的特徴を観測する。
〔実施例８〕
PDGF-CCはインビボでの組織虚血時に内皮前駆細胞を動員する
PDGF-CC（PDGF-CCはPDGF-Cのホモ二量体を指す）が血管の増殖及び成熟を刺激する機構を検討するために、血管内皮前駆細胞（EPC）へのPDGF-CCの作用を測定した。
【０２３７】
EPC動員アッセイのために、マウスを、大腿（後肢）動脈結紮直後に皮下移植ミニ浸透圧ポンプ（Alzet、2001型）を使用してPDGF-CCタンパク質（4.5μg／日：30μg／週に基づく概算）で処置した。2又は5日後に、マウスを屠殺し、以前に述べられている手順［Dimmeler, S.ら、J. Clin. Invest. 108:391-97 (2001); Asahara, T.ら、Circ. Res. 85:221-8 (1999)］を用いたEPC分析のために脾臓を採取した。注射器ピストンを使用して脾臓を機械的に細かく切断し、フィコール上に置いて脾細胞を単離する。脾細胞を、フィブロネクチン被覆した24穴平板の0.5ml  EBM培地に接種した。3週間の培養後、接着細胞をDil−Ac−LDL／レシチンに関して染色し、陽性細胞の数を計数した。後期増殖EPC（3週間の培養後）を、DiI−アセチル化LDL（Molecular Probes）の代謝取込み及びAlexa 488標識イソレクチンB（Molecular Probes）の陽性染色によって特定した。EPC密度の定量を200x倍率で5つの顕微鏡視野における共焦点顕微鏡検査によって実施し、平均EPC密度を算定した。
【０２３８】
詳細には、脾単核細胞の3週間の平板培養後にacLDL-DiI／イソレクチン−IB4陽性内皮細胞の数を計数することによってEPC動員を定量した。3週間後にだけ評価することにより、生存沈積（sludged-off）内皮細胞ではなく後期増殖EPCだけを選択的に測定する［Lin, Y.ら、J. Clin. Invest. 105:71-7. (2000); Rafli, S., J. Clin. Invest. 105:17-9 (2000)］。基線状態では、PDGF-CCはEPCの動員に影響を及ぼさなかった（EPC/mm2：対照での139±26に対し、PDGF-CC後は134±14、各群につきn＝6、P＝0.9、図4）。
【０２３９】
虚血条件下でのPDGF-CCの作用を調べるため、大腿動脈を結紮した。マウスにおける2日間のPDGF-CCタンパク質による処置（ミニポンプによる4.5μg／日）は、後肢虚血後2日目から5日目まで、対照群で認められたレベルよりも約4倍、EPC動員を上昇させた（EPC/mm2：対照での155±47に対し、PDGF-CC後は641±207、n＝9、10、“＊”P＜0.05、図4；数値は10匹のマウスの平均±SEMで示している）。この上昇は、より低いレベルであったが（EPC/mm2：対照での249±42に対し、PDGF-CC後は528±157、各群につきn＝10、P＝0.1、図4）、5日目まで存続した。それ故、PDGF-CC処置は組織虚血におけるEPC動員を増強し、それによって虚血組織の血管再生のために必要なECのソースを提供した。
【０２４０】
PDGF-CCを介したEPC動員は、組織虚血後早期に且つ持続的に起こる事象であり、虚血後2日目から始まって、その後継続する。この時間ウインドウは虚血誘導性血管新生の開始と平行しており、それ故十分な量のEPCを供給することによって効率的な血管新生の開始の可能性を導く。前記データは、PDGF-CCが、虚血組織の活発な血管再生の時点でEPCを動員するために使用できることを明らかにする。これらの実験において、PDGF-CCが誘導するEPC動員は虚血依存性であった。後肢虚血を有するマウスではPDGF-CCによってEPC動員が増加したが、正常マウスではEPC動員は増加せず、PDGF-CCが他の虚血依存性因子と協力してその機能を及ぼすことを示唆する。
【０２４１】
前述した後肢結紮及びEPC移動アッセイを、PDGF-AA、PDGF-BB及びPDGF-CC並びに対照媒体を使用して反復した。使用したモデルは、Luttunら、Nat. Med. 8:831-40 (2002)に述べられているBalb／c後肢虚血モデルであった。前述した手順に以下の修正を加えた：タンパク質の濃度は各々の因子について4.3μg／日であり、分析は2日後に実施した。媒体はPBSであった。連続7日間作動するミニポンプ2001の代わりに、連続2日間作動するAlzetミニポンプ1003Dを使用した。ポンプ速度／薬剤送達は厳密に同じであり、薬剤負荷は、7日間で30μgの方針に合致するように算定して実施した。EPC動員は、結紮マウスにおいて結紮後2日目に測定した；ミニ浸透圧ポンプによって継続的に処置を与え、盲検分析を実施した。EPC動員を密度／mm2で表している：媒体（n＝1）：119；PDGF-AA（n＝7）：1052±177；PDGF-BB（n＝8）：858±195；及び PDGF-CC（n＝3）：1328±228。これらの結果は前記の結果を確認し、またEPCを動員する上でのPDGF-AA及びPDGF-BBに対するPDGF-CCの優越性を明らかにする。
〔実施例９〕
PDGF-CCは、骨髄前駆細胞の内皮細胞及び平滑筋細胞の両方への分化を増強する
増殖因子又はサイトカインによって刺激するとき、骨髄幹／前駆細胞はEC及びSMCに分化することができ、それによって血管／動脈新生に寄与しうる［Orlic, D.ら、Nature 410:701-5 (2001); Kawamoto, A.ら、Circulation 103:634-7 (2001); Asahara, T.ら、Circ. Res. 85:221-8 (1999)］。骨髄幹／前駆細胞の血管細胞への分化におけるPDGF-CCの潜在的役割を以下のように検討した。
【０２４２】
A.接着アッセイ
PDGF-CCのこの潜在的役割を検討するために、最初に接着アッセイを実施した。105/mlの濃縮ヒトBM由来AC133＋CD34＋細胞―幹／前駆細胞に富む個体群［Miraglia, S.ら、Blood 90:5013-21 (1997); Yu, Y.ら、AC133-2, J Biol. Chem. 277:20711-6 (2002); Donnelly, D.S. & Krause, D.S., Leuk Lymphoma 40:221-34 (2001)］― （Clonetics）を105／mlで、6穴平板（Becton Dickinson）においてHPGM(Clonetics)中で3日間培養した。［Miraglia, S.ら、Blood 90:5013-21 (1997); Yu, Y.ら、AC133-2, J. Biol. Chem. 277:20711-6 (2002); Donnelly, D.S. & Krause, D.S., Leuk. Lymphoma 40:221-34 (2001)］。次に細胞を、4％FCS及びVEGF165（R & D Systems）又はPDGF-CC（各々50ng/ml）を含むEBM(Clonetics)培地においてコラーゲン被覆12穴平板に接種した。RT−PCRによって分析したとき、これらの細胞はPDGFR−αを発現した（示していない）。2日ごとに増殖因子を添加し、4日ごとに培地の75％を交換した。
【０２４３】
接着アッセイのために、2.5×104の非接着細胞／mlを、コラーゲンで被覆したチェンバースライド上で又はPBS中0.3％ゼラチンで被覆した96穴平板において、同じ条件下で培養した。次に、チェンバースライド（Becton Dickinson）上での2週間の培養後に、細胞をPBSで3回洗い、固定して、メイ-グリュンバルトギームザ（Sigma）で染色した。cellTiter-glo発光細胞生存率アッセイ（Promega）を製造者の指示に従って使用して、ATP定量によって生存可能細胞の数を評価した。
【０２４４】
2週間の刺激後、PDGF-CC及びVEGFの両方が、足場依存性細胞増殖、分化、移動及びアポトーシスの予防のために必要条件である細胞接着を増強した［Assoian, R.K. J Cell Biol 136, 1-4. (1997); Asahara, T. ら、Science 275, 964-7. (1997)］（図5；＊：P＜0.05。数値は平均±SEMで示している）。
【０２４５】
B.細胞分化アッセイ
細胞分化アッセイは細胞表面マーカー染色を含み、コラーゲン被覆培養スライド上で2、3及び4週間培養した細胞（2×104／穴）を、Intrastain Kit（DAKO）を用いて固定し（45分間、25℃）、透過化して（45分間、25℃）、次にCD31 FITC（Becton Dickinson）、CD144 FITC（Pharmingen）、CD34 FITC（Becton Dickinson）又はSMC−Actin CY3（Sigma）で標識した。単一又は二重標識細胞を、レーザー共焦点免疫蛍光顕微鏡検査を用いて分析した。接着アッセイに関して「A」の部分で述べたのと同じ種類の細胞及び条件を細胞分化アッセイに関しても使用した。
【０２４６】
結果は、PDGF-CCとVEGFが、内皮又は平滑筋細胞系統のいずれかへのこれらの幹細胞の運命付けを誘導する能力において著明に異なることを示した。2週間の刺激後、PDGF-CC及びVEGFの両方がEC表面マーカーCD144（VE−カドヘリン）及びCD31（PECAM）の発現を誘導し、これらの増殖因子が特徴的な内皮細胞表現型を誘導することを示唆した。媒体処置（対照）細胞はこれらのマーカーに関して陰性のままであった。PDGF-CCだけが付加的に、これらの細胞の画分において平滑筋細胞マーカーSMAの発現を誘導し、これらの細胞が特徴的なSMC表現型を獲得していたことを示した。VEGF処置細胞は、バックグラウンドに比べてSMA陽性にならなかった（対照も同様であった）。二重標識実験は、PDGF-CCがしばしば同じ細胞においてCD31とSMAの発現を誘導することを明らかにした。
【０２４７】
4週間目までに、大部分の（＞95％）PDGF-CC処置細胞がSMA陽性となり、CD144及びCD31の発現を喪失した。これに対し、VEGF処置細胞はまだCD144及びCD31陽性であり、SMA陰性のままであった。それ故、PDGF-CCは、最初は骨髄前駆細胞が内皮又は平滑筋細胞の両方の特徴を有する細胞型へと分化するのを誘導し、最終的には、長期的な処置後、SMC様表現型を有する細胞を生じた。長期的な処置後であっても、VEGFだけが骨髄前駆細胞にEC特異的マーカーを獲得させたので、PDGF-CCは、それ故、VEGFとは異なっていた。
【０２４８】
PDGF-CCが血管幹／前駆細胞を動員し、幹細胞接着／生存能を上昇させ、幹細胞分化を促進するという所見の重要性の検討を継続することから、PDGF-CCを介したBM細胞分化が二方向性である、すなわちEPCとSMCの両方を指向するという今回の発見に至る。幹細胞の最終的な目的地はおそらく細胞環境に依存し、他の増殖因子又はサイトカインによって共調整される必要がある。しばしば組織虚血の徴候であるVEGFの存在下で、BM細胞はそれらのECへの運命をより良好に指向し、血管新生−毛細管形成の初期段階に寄与すると考えられる。PDGF-CCは、SMCを毛細管に提供し、安定した機能的血管系を導くことによって血管新生の第二段階―血管成熟をさらに強化しうる。高レベルのVEGFが存在しなければ、すなわち酸素正常状態では、PDGF-CCは最終的にBM細胞をSMCに分化させ、それによって血管腫形成の可能性を回避する（血管腫形成は、Carmeliet, P. Nat Med 6, 1102-3. (2000)の中で論じられている）。合わせて考慮すると、PDGF-CCによってもたらされる早期の虚血依存性EPC動員及び二方向性BM細胞分化は、虚血性疾患を治療するために新しい血管を確立する上での増殖因子のインビボ治療用途のために、効率と安全性の両方の貴重な特性を提供する。
【０２４９】
さらに、PDGF-CCの血管／動脈新生作用は、血管前駆細胞の動員と分化、分化したEC及びSMCへの走化作用、血管周囲細胞の増殖と移動、及びVEGF発現の上方調節を含む、いくつかの機構に関わる。それ故、その血管作用がそれぞれ主としてEC又はSMC／線維芽細胞に限定されるVEGF又はPDGF-AA及び−BBとは対照的に、血管系へのPDGF-CCの作用はより多面的であり、それ故、機能的血管を確立するために必要な、種々の細胞型のより同調した普遍的な作用を可能にする。
【０２５０】
血管前駆細胞の内皮及び平滑筋細胞への分化を促進することによってPDGF-CCが、血管前駆細胞を動員し、これらの分化した血管細胞を刺激する能力は、PDGF-CCが、成熟した耐久性のある機能的血管を確立する複雑な過程をインビトロ及びインビボで調整する上で有用であることを指し示す。
〔実施例１０〕
PDGF-CCは内皮細胞移動及び微小血管出芽を促進する
この実施例では、EC移動及び増殖へのPDGF-CCの作用を、VEGF（主として内皮細胞に影響を及ぼす）［Senger, D.R.ら、Am. J. Pathol. 149:293-305. (1996)］及びPDGF-AA及び−BB （主として線維芽細胞及び平滑筋細胞に影響を及ぼす［Heldin, C.H. & Westennark, B. Physiol. Rev. 79:1283-1316 (1999)］）の作用と比較した。移動、増殖及び大動脈環アッセイを実施した。
【０２５１】
A.細胞移動アッセイ
増殖停止集密HMVEC又はBAEC細胞に関する細胞移動アッセイを実施した。細胞単層をラバーポリスマンで傷つけ、無血清培地で洗った。次に、VEGF165、PDGF-AA、−BB（R & D Systems, Minneapolis USA）又はPDGF-CCを含む無血清培地中で皿を20時間インキュベートした。各々のアッセイは、各条件につき2枚の皿を含み、独立して3回反復した。細胞を40xの倍率で写真撮影し、移動パーセンテージは細胞の面積と創傷の総面積の比に相当した（Biocom visiol＠b 2000、バージョン4.52、San Diego）。細胞移動アッセイに関しては、ANOVAダネット検定をデータ解析のために使用し、P＜0.05を統計的に有意とみなした。データは平均±SEMで示している。
【０２５２】
ヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）でのPDGFR−α発現が、SMCと比べるとより低いレベルであるが（示していない）、ウエスタンブロットによって確認された。VEGF及びPDGF-CCはヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）及びウシ大動脈内皮細胞（BAEC）の移動を刺激したが、PDGF-AA又はPDGF-BBは移動を刺激しなかった（図6a）。
【０２５３】
B.増殖アッセイ
HMVEC増殖アッセイのために、細胞を96穴平板に接種し（各条件につき5穴）、血清飢餓後、PDGF-AA、PDGF-BB又はPDGF-CC（50ng/ml）と共にインキュベートした。7日後、cellTiter-glo発光細胞生存率アッセイ（Promega）を使用して生存細胞を計数した。NIH-3T3及びhSMC増殖アッセイに関しては、96穴平板で培養した細胞を一晩血清飢餓させ、その後種々の濃度の増殖因子で処置した。2日後に、細胞数を数え、10％血清を含む培地で培養した細胞を対照として使用して、増殖パーセンテージを算定した。
【０２５４】
移動結果と異なり、PDGFR−αがECにおいてマイトジェンシグナルを伝達しないというこれまでの所見［Marxら、J Clin. Invest. 93:131-9 (1994)］と一致して、いずれのPDGFもEC増殖に影響を及ぼさなかったが（図6b）、VEGFはEC増殖を劇的に誘導した（図6b；*：P＜0.05。数値は平均±SEMで示している）。
【０２５５】
C.大動脈環アッセイ
大動脈環アッセイは、インビトロで無傷血管からの微小血管の増殖を評価する手段である［Blacher, S.ら、Angiogenesis 4:133-42 (2001)］。このアッセイを［Blacher, S.ら、Angiogenesis 4:133-42 (2001)］に述べられているように実施した。簡単に言うと、1mmの長大動脈環をラットの尾間質コラーゲンのゲルに包埋し、37℃で培養して、種々の増殖因子（50ng/ml）を添加した。実験は、各条件につき3つの外植片を含み、少なくとも2回反復した。大動脈環を25x倍率で写真撮影した。
【０２５６】
培養後9日目に、微小血管と大動脈環からのそれらの伸長の距離を定量し、スチューデントt検定を用いて評価した。詳細には、両側スチューデントt検定をデータ解析に使用し、P＜0.05を統計的に有意とみなした。細胞移動アッセイについては、ANOVAダネット検定をデータ解析のために使用し、P＜0.05を統計的に有意とみなした。微小血管出芽及び血管周囲線維芽細胞の成長の定量は、コンピュータ援用形態計測を用いて実施した。
【０２５７】
基線条件では、少数の微小血管だけが大動脈環から出芽し、それらの大部分は非常に短い距離であり（大動脈環から0.25mm）、小さな画分（＜5％）だけがより長い距離にわたって成長した（大動脈環から＞0.5mm）。VEGFは微小血管成長に最も強力な作用を及ぼした。VEGFは出芽微小血管の数を増加させただけでなく（対照に比べてすべての濃度でP＜0.001）、それらが伸長する距離も増加させた（対照に比べてすべての濃度でP＜0.05；図7a、b）。
【０２５８】
PDGF-CCは、微小血管の出芽及び線維芽細胞様細胞の両方の成長を増強した。5−10ng/mlで、PDGF-CCは血管周囲線維芽細胞様細胞を最大に刺激し、それらが大動脈環からはるかに大きい距離にわたって移出した。高濃度（30−50ng/ml）では、PDGF-CCはまだ線維芽細胞様細胞増殖と移出を刺激したが、おそらく血管周囲細胞が出芽微小血管によって動員されたために、低濃度での刺激ほど有意ではなかった。
【０２５９】
30ng/mlのPDGF-CCは、微小血管の数を増加させ（対照に比べてP＜0.001、図7a、7b）、5ng/mlで血管伸長の距離を増加させた（対照に比べてP＜0.01；図7a、7b）。血管周囲線維芽細胞様細胞に無効であったVEGFと異なり、PDGF-CCは、大動脈環からはるかに大きな距離にわたって血管周囲細胞の数と移動を増加させたが、PDGF-AAは中間的な作用を有する。見かけ上、PDGF-CCは30ng/mlで微小血管出芽に最大の作用を及ぼし、50ng/mlの濃度ではそれほど強力ではなく、大動脈環アッセイにおけるPDGF-CCの用量−反応関係が鐘形であることを示した。同様の鐘形用量−反応関係は、VEGF/PDGFスーパーファミリーの他の成員についても記述されている［Jin, K.L.ら、J Mol. Neurosci. 14:197-203 (2000)］。
【０２６０】
PDGF-AA及び−BBは、どちらも種々の濃度で血管成長の距離を増加させたが（図7a）、微小血管の数には影響を及ぼさなかった（それぞれPDGF-AAについては5ng/ml及びPDGF-BBについては20−50ng/ml、対照に比べてP＜0.01、図7a）。それ故、PDGF-CCは、培養細胞においてEC移動を動員し、大動脈環アッセイにおいて微小血管出芽を促進した。他のPDGFが間充織細胞移動の最も強力な刺激の1つであるのに対し、PDGF-CCはEC移動をごくわずかしか刺激しないので、ECへのPDGF-CCのこの走化作用は意外である。一部の条件下では、それらはEC移動を阻害することさえある［Thommen, J Cell Biochem. 1997 Mar 1;64(3):403-13; De Marchis, F.ら、Blood 99:2045-2053 (2002)］。
〔実施例１１〕
PDGF-CCは平滑筋細胞及び血管周囲線維芽細胞様細胞に対して走化性であり、有糸分裂誘発性である
この実施例は、SMC及び血管周囲線維芽細胞様細胞へのPDGF-CCの有糸分裂誘発及び走化作用を述べ、種々の細胞環境における―培養細胞と大動脈環アッセイにおける、VEGF、PDGF-AA及びPDGF-BBと比較した、そのような細胞へのPDGF-CCの作用を比較する。
【０２６１】
A.細胞移動アッセイ
細胞移動アッセイを実施例10で述べたように実施した。細胞培養アッセイにおいて、3つのPDGFすべてが同等の効力でhSMC移動を刺激したが、VEGFはSMC移動に影響を及ぼさなかった（図6a）。それ故、興味深いことに、VEGFはEC移動だけを刺激し、PDGF-AA、-BBはSMCだけを刺激したのに対し、PDGF-CCはECとSMCの両方の移動を促進した。この所見は、PDGF-CCは微小血管成長を刺激したが、PDGF-AA及び-BBはそれほど有効ではなかった、大動脈環アッセイと一致する。
【０２６２】
B.大動脈環アッセイ
大動脈環アッセイ（実施例10で述べたアッセイ）では、無傷血管からの血管周囲線維芽細胞の増殖と移出を、種々の濃度の種々のPDGFによる処置後にコンピュータ援用画像解析を用いて定量した。
【０２６３】
基線条件では、個々の血管周囲線維芽細胞（出芽微小血管と結合していない、単離細胞として特定される）はまばらであり、大動脈環からごく短い距離だけ移動した。PDGF-CCは、試験した種々の濃度すべてで、線維芽細胞様血管周囲細胞の増殖と移動を劇的に促進し、最適濃度は5−10ng/mlであった。PDGF-CCの有糸分裂誘発作用は、PDGF-AA及び−BBの作用よりもはるかに大きかった。VEGFは線維芽細胞様細胞への有糸分裂誘発作用を有していなかった。PDGF-CCは線維芽細胞の数を有意に上昇させ、線維芽細胞はまた、大動脈環からはるかに大きな距離にわたって移動した（対照に比べてすべての濃度でP＜0.001、図7b）。高濃度（30−50ng/ml）では、PDGF-CCはまだ線維芽細胞増殖と移出を刺激したが、おそらくその作用が用量依存性であるため（前記参照）及び／又は血管周囲細胞が出芽微小血管を取り巻いたために、低濃度での刺激ほど有意ではなかった。PDGF-AAは中間的な作用を有していた（対照に比べて種々の濃度でP＜0.05、図7b）。これに対し、VEGFは全く作用を及ぼさず、PDGF-BBは50ng/mlの濃度でのみ血管周囲線維芽細胞の増殖及び移出に作用を及ぼした（対照に比べてPDGF-BBではP＜0.05；図7b）。それ故、すべてのPDGF同族体のうちで、PDGF-CCは、大動脈環アッセイ―インビボでの状況をより密接に反映すると考えられ、種々の血管細胞型の間の協力的相互作用を可能にするアッセイ―において血管周囲細胞の移動と増殖を最も有意に刺激した［Hartlapp, I.ら、Faseb J, 2001, 15: 2215-24; Blacher, S.ら、Angiogenesis 4:133-42 (2001); Nehls, V.ら、Cell Tissue Res. 270:469-74 (1992); Tille, J.C. & Pepper, M.S., Exp. Cell. Res. 280:179-91. (2002)］。
【０２６４】
C.ウエスタンブロット及び受容体活性化アッセイ
ウエスタンブロットアッセイのために、集密未満（subconfluent）細胞を、5g/mlの抗プロテアーゼカクテルを添加した低温PBSで洗い、RIPA緩衝液に溶解して、還元条件下に10％アクリルアミドSDS PAGEで分析した。PDGFR−αに対する2つの抗体（ウサギポリクローナル抗体、希釈：1/500、Santa Cruz、sc431；及びモノクローナルペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体、希釈：1/2500、Sigma、A−2074）をタンパク質検出のために使用した。Supersignal System（Pierce）を用いて膜を展開した。受容体活性化のために、ウサギ抗PDGFR−α抗体を用いて組織／細胞溶解産物を免疫沈降に供した。沈降物をSDS−PAGEで分析し、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体（PY99、Santa Cruz）を用いて免疫ブロットした。PDGF-CCは、hSMC及びNIH3T3細胞の増殖を誘導したが、ECの増殖は誘導しなかった。培養したhSMC及びNIH3T3線維芽細胞では、PDGFR−αが高発現され、活性化される（図8A；PDGFR−αがhSMC及びNIH3T3細胞において高発現され（ウエスタンブロット、上のレーン―抗PDGFR−α）、活性化／リン酸化された（下のレーン―抗ホスホチロシン）。細胞培養系において、PDGF-CCはhSMC及びNIH3T3線維芽細胞の増殖を誘導した。3つのPDGFすべてがほぼ同じ程度の有糸分裂誘発作用を示し、hSMCへのPDGF-CCの作用がわずかにより著明であった（図8b）。
〔実施例１２〕
PDGF-CCはVEGF発現を上方調節する
前記のデータは、PDGF-CCがある程度のVEGF様作用を誘導することを指し示したので、PDGF-CCがVEGFの発現を上方調節する能力を検討した。（LAD結紮を用いた梗塞組織の）初期結果は、梗塞を取り巻く境界域においてPDGF-CC処置後に対照よりも著明なVEGF免疫反応性を示したので、そのような作用を示唆した。
【０２６５】
初期結果をさらに確認するために、NIH-3T3線維芽細胞においてPDGF-Cを過剰発現させ、VEGF発現をRNA及びタンパク質レベルで測定した。PDGF-C過剰発現のために、マウス完全長PDGF-C  cDNAをpcDNA3.1／zeo（＋）哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）にクローニングし、その構築物を塩基配列決定によって確認した。Lipofectamineプラス試薬を製造者のプロトコール（Life Technology）に従って使用して、プラスミドDNAを半集密細胞にトランスフェクトした。700μg/mlのZeocin（Invitrogen）で3週間、安定なトランスフェクタントを選択した。抵抗性コロニーをプールし、300μg/mlのZeocinを添加した培地中に維持した。
【０２６６】
PDGF-Cの過剰発現をウエスタンブロット法によって確認した（図8c、左下のパネル）。PDGF-CCウエスタンブロットアッセイのために、細胞を無血清培地中で一晩飢餓させた。順化培地（一晩）を収集し、タンパク質濃度を測定した（Bradford, 1976）。タンパク質35μgをトリクロロ酢酸（TCA）沈殿させ、PDGF-CCに対するアフィニティー精製ポリクローナルウサギ抗体を用いたウエスタンブロットに供した［Liら、Nat. Cell. Biol. 2:302-09 (2000)］。すべての試料を3組ずつ用意し、実験を2回反復した。Quantikine免疫測定キット（R & D System）を製造者のプロトコールに従って使用して、分泌VEGFタンパク質を定量した。
【０２６７】
mRNAレベルでの遺伝子発現を調べるために、RNアーゼプロテクション分析（RPA）を製造者のプロトコール（Ambion）に従って実施した。RNAポリメラーゼ（Promega）及び32P−UTP（Amersham）を使用してリボプローブを作製した。マウスβ−アクチンcDNA（250bp、Ambion）を内部対照として使用した。VEGF  mRNAレベルは、RPAアッセイにより、ベクター形質導入細胞と比較してPDGF-CC過剰発現（NIH-3T3）細胞において有意に上方調節された（図8c、左上のパネル）。
【０２６８】
ELISAアッセイは、無血清PDGF-CC過剰発現細胞順化培地における分泌VEGFタンパク質レベルが、ベクター形質導入（偽トランスフェクト細胞順化）培地のレベルに比べて有意に高いことをさらに確認した（VEGF（pg/ml）：PDGF-CC中1140±96に対し、対照中585±80、n＝6、P＜0.01、図8c、右側のパネル。＊：P＜0.05。数値は平均±SEMとして示している。）。VEGFを上方調節するPDGF-CCの作用は、少なくとも部分的には、その血管新生作用の一部を説明すると考えられる。
〔実施例１３〕
PDGF-CCは虚血心臓において血管新生及び動脈新生を刺激する
これまでに確立されている心筋梗塞のマウスモデルを使用して、PDGF-CCが虚血心筋の血管再生を刺激することができるかどうかを評価した。冠状動脈結紮後、新しい脈管はその周囲の境界領域から虚血コアを血管再生する。
【０２６９】
RNアーゼプロテクション分析は、PDGF-C受容体（PDGFR−α）についてのPDGFR−α転写産物が正常心筋において検出可能であることを明らかにした。β−アクチンを内部対照として使用した。さらに、等量のタンパク質抽出物を使用した免疫沈降及びその後のウエスタンブロット法は、梗塞を取り巻く虚血境界域、すなわち脈管増殖が最も活発である領域では、残りの正常心筋に比べてPDGFR−αタンパク質レベルが有意に上方調節されることを明らかにした。PDGFR−αは、心臓の正常（非虚血）領域よりも境界域において、そしてPDGF-CC処置後に最大に活性化された。PDGFR−αは、免疫沈降後にリン酸化チロシン残基のウエスタンブロット法によって評価したとき、梗塞を取り巻く境界域において高度に活性化された。
【０２７０】
以前に記述されている［Luttun, A.ら、Nat. Med. 8:831-40 (2002); Heymans, S.ら、Nat Med 5, 1135-42 (1999)］急性心筋虚血及び後肢虚血マウスモデルを実験において使用した。皮下移植したミニ浸透圧ポンプ（Alzet、2001型）を7日間の持続的タンパク質送達のために使用した。ヒトPDGF-CCコアドメインタンパク質を記述されているように［Li, X.ら、Nat Cell Biol 2, 302-309 (2000)］生産した。血流測定のために最大血管拡張（ニトロプルシドナトリウム、50ng/ml、Sigma）後に蛍光又は色素染料ミクロスフェア（黄色、15μm、Molecular Probes）を投与し、記述されているように［Carmeliet, P.ら、Nat Med 5, 495-502. (1999)］流量を算定した。組織学的検査のために、LAD（左前室間冠状動脈）結紮の7日後に心臓を取り出し、縦断切片（6μm）を作製した。トロンボモジュリン（ウサギ抗TM、すべての血管について）及び平滑筋α−アクチン（マウス抗SMA、成熟SMCで覆われた血管について、Dako）を用いた免疫組織化学染色後、梗塞領域を形態学的に検査し、血管密度を算定した。大腿動脈結紮後に腓腹筋の横断切片を作製し、H ＆ E又はECマーカーCD31（PECAM、ラット抗CD31、Pharmingen）による免疫染色後に分析した。腓腹筋における血管密度及び組織壊死／再生を、KS300画像解析ソフトウエア（Zeiss）を用いて形態計測的に分析した。大腿結紮後の後肢上部における側副血管のリモデリングを、報告されているように［Luttun, A.ら、Nat. Med. 8:831-40 (2002)]定量した。ウサギポリクローナルVEGF抗体（Santa Cruz、sc-152）を免疫組織化学染色のために使用した。
【０２７１】
PDGF-CCが虚血心筋の血管再生を刺激しうるかどうかを調べるために、組換えヒトPDGF-CCコアドメインタンパク質を、冠状動脈結紮後1週間にわたって持続的に、ミニポンプを用いて送達した。PDGF-CCタンパク質処置は、梗塞領域において血管密度を用量依存的に上昇させた。対照と比較して、PDGF-CCはまた、境界領域における活性PDGFR−αの量も上昇させた。7日後、トロンボモジュリン（TM）による免疫標識後に虚血領域における内皮細胞（EC）系統血管の数を計数することによって血管新生を定量した。平滑筋細胞β−アクチン（SMA）に関して免疫反応性の細動脈を計数することによって血管成熟（動脈新生）を評価した。1.5μg／日で、PDGF-CCはTM陽性血管密度にごくわずかに影響を及ぼした（血管／mm2：対照での175±8、n＝21に対し、PDGF-CC  10μg後には190±13、n＝7；P＝NS）が、SMA陽性細動脈の数を1.36倍に上昇させた（血管／mm2：対照での40±9、n＝21に対し、PDGF-CC  10μg後には54±4、n＝7；P＜0.05）。3倍高い用量（4.5μg／日）を使用したとき、PDGF-CCは、血管新生（TM陽性血管／mm2：対照での175±8に対し、PDGF-CC後には230±22、n＝10−21；P＜0.05）及び動脈新生（SMA陽性血管／mm2：対照での40±9に対し、PDGF-CC後には58±7、n＝10−21；P＜0.05）を有意に刺激した。
【０２７２】
PDGF-CC処置心臓において出血、浮腫又は線維症の徴候は認めなかった。虚血心筋領域の灌流が1.4−1.7倍に有意に上昇したので（ml／分／gでの血流：梗塞：対照での1.6±0.2に対し、PDGF-CC  30μg後には2.2±0.2；n＝7−9；P＜0.05；梗塞心臓の正常部分：対照での2.0±0.2に対し、PDGF-CC  30μg後には3.3±0.5；n＝7−9；P＜0.05。30μgがおよそ4.5μg／日であるような血流：対照での1.6±0.2ml／分／gに対し、PDGF-CC後には2.2±0.2ml／分／g；n＝7−9；P＜0.05）、これらの新しい血管は機能性であった。他の器官における血管密度には差を認めなかったので（ml／分／gでの左及び右腎臓の平均血流：対照での5.2±0.4に対し、PDGF-CC  30μg後には5.7±0.5；n＝7−9；P＝0.5）、血管再生を刺激するPDGF-CCの作用は虚血心臓に限定されると思われた。
【０２７３】
PDGF-CCによって誘導される虚血心筋の血管再生の程度は、VEGF及びPlGFと同等である。マウスはPDGF-CC処置を問題なく認容し、健康であると思われ、毒性の徴候（体重減少、不活動性）は有していなかった。それ故、PDGF-CCタンパク質処置は、血管新生（より多くの血管）及び動脈新生（より多くのSMC被覆）の増強を通して心臓虚血における機能的血管再生を促進した。その他のPDGFR−αリガンド、PDGF-AAがほとんど血管形成性ではなく、あるいは血管新生を抑制することさえあるので、心臓虚血におけるPDGF-CCの血管／動脈新生作用は意外である。
〔実施例１４〕
虚血四肢におけるPDGF-CCによる治療的血管新生：PDGF-CCは虚血四肢において血管新生を刺激する
インビボでのPDGF-CCの血管／動脈新生作用をさらに確認するために、後肢虚血の確立されたマウスモデルにおけるPDGF-CCの作用も検討した。前記モデルについては、Luttun, A.ら、Nat. Med. 8:831-40 (2002)参照。ヒトにおける一般的な疾患である、四肢虚血に関する詳細については、J Control Release 78, 285-94. (2002); Beckman, J.A., Creager, M.A. & Libby, P. Jama 287,2570-81. (2002)参照。PDGFR−α発現を、最初に、大腿動脈の結紮後高度に虚血となる腓腹筋において、β−アクチンを内部対照として使用して（PDGFR−αレベルの割合をβ−アクチン対照に基準化した）、RNアーゼプロテクション分析によって定量した。［Deindl, E.ら、Circ Res 89, 779-86. (2001); Couffinhal Tら、American Journal of Pathology 152, 1667-1679 (1998)。］大腿動脈結紮の2日後、筋細胞の分画が虚血壊死のために死亡したとき、PDGFR−α転写産物レベルは正常筋で認められるレベルの76％に低下した（PDGFR−α／β−アクチン転写産物レベル：正常筋での1.27±0.06に対し、結紮後は0.96±0.05、n＝9、10；P＜0.01）。しかし、媒体と比較すると、PDGF-CC  4.5μgによる毎日の処置は、結紮後2日目にPDGFR−α発現を上方調節し、その発現レベルを非結紮対照筋で認められるレベルまでほぼ完全に回復した（PDGFR−α／β−アクチン転写産物レベル：PDGF-CC後の1.16±0.08に対し、未処置では0.96±0.05、各々の群についてn＝10；P＜0.05）。
【０２７４】
再生筋が壊死性無血管筋に置き換わった領域でのみ起こった虚血腓腹筋の血管再生を、大腿動脈結紮後1週間、PDGF-CC  4.5μgのミニ浸透圧ポンプによる持続的送達後に採点した。PDGF-CCタンパク質処置は、虚血腓腹筋においてPECAM＋毛細管及びSMA＋細動脈密度を上昇させた。PDGF-CCタンパク質処置は、大腿動脈結紮後7日目に、筋壊死を低下させ、腓腹筋における筋再生を上昇させた。壊死した筋線維を、核を持たず、ヒアリンサイトゾルを含む幽霊細胞として特定した；再生筋細胞は、中心核を有する小型細胞として特定した。面積を総筋面積のパーセンテージで表わしている。大腿動脈結紮後のPDGF-CCによる処置は、血管新生を上昇させただけでなく（例えば毛細管密度；PDGFR−α／β−アクチン転写産物レベル：PDGF-CC後の1.16±0.08に対し、未処置では0.96±0.05、各々の群についてn＝10；P＜0.05）、動脈新生も増強した（例えばSMA＋血管の密度；SMA陽性血管／mm2：PDGF-C後の53.1±3.7に対し、食塩水後では38.6±4.8、n＝15、16；P＝0.02）。さらに、PDGF-CCは骨格筋再生を増強し（再生／総筋肉面積：対照での14±3％に対し、PDGF-CC後は27±4％、n＝15、16；P＜0.05）、結果として、虚血筋の壊死の割合も低下させ（壊死／総筋肉面積：対照での80±3％に対し、PDGF-CC後は65±5％、n＝15、16；P＜0.05）、筋肉再生と血管新生が関連することを示唆した。PDGF-CCはまた、内転筋において第二世代側副枝を増大させた（食塩水後の680±40μm3に対し、PDGF-CC後は920±100μm3、n＝10；P＝0.05）。PDGF-CC処置四肢において出血、浮腫又は線維症の徴候は認めなかった。筋再生は活発な血管新生の部位において最大であり、両方の過程が関連することを示唆した。おそらくPDGF-CCの潜在的な虚血依存性作用の故に、この領域は大腿動脈結紮後虚血状態にならないので、PDGF-CCは内転筋において側副血管のリモデリングにごくわずかしか影響を及ぼさなかった。［Deindlら、Circ Res 89, 779-86 (2001); Puら、J Invest Surg., 7(l): 49-60 (1994)］。それ故、PDGF-CCは心臓及び四肢虚血の両方のマウスモデルにおいて血管再生を刺激する。
【０２７５】
PDGF-CCは、SMCで覆われた冠状血管（大量の血流を提供する）だけでなく内皮系統毛細管（血流を個々の心筋細胞に分配する）に関しても心筋を血管再生することによって虚血心筋の灌流を上昇させることが認められた。虚血四肢では、PDGF-CCはまた、血管新生と動脈新生の両方を刺激することが認められた。さらに、PDGF-CCが活発な血管再生の領域において筋再生も増強するという所見は、新しい血管が機能性であり、灌流されていることをさらに強調する。PDGF-CCの多面作用はまた、VEGF投与後の観察されてきた血管腫形成や浮腫形成の副作用が、なぜPDGF-CC処置後には認められないのかも説明すると考えられる。
【０２７６】
PDGF-CC処置は、虚血心臓及び四肢において内皮前駆細胞を動員し、血管密度と血液灌流を上昇させたが、他の器官における静止細胞には影響を及ぼさなかった。PDGF-CCは内転筋における側副血管の第二世代側枝を増大させたが、この増殖因子は、全体としては、例えばbFGF、PlGF又はGM-CSFほどには、大腿動脈結紮後の上肢領域における既存側副枝のリモデリングに劇的な作用を及ぼさない。しかし、側副血管の増殖の分子及び細胞機構は、新しい毛細管の形成及び平滑筋細胞で覆うことによるそれらの成熟を決定する機構とは全く異なる。特に、虚血ではなく、ずれ応力が誘導する単球／マクロファージの集積が後肢上部において側副枝増殖を開始させる上で決定的な役割を果たすことは周知であり、PDGF-CCはそれらの集積には影響を及ぼさない（データは示していない）。大腿動脈結紮後は下肢だけが虚血となり、上肢は虚血しないので、PDGF-Cは、ずれ応力誘導性側副枝リモデリングよりも虚血依存性血管新生により強く関与すると思われる。
【０２７７】
大腿動脈結紮後、特に血管再生も最大であった領域において、筋再生がPDGF-CCによって改善された。
【０２７８】
前記の説明及び実施例は単に本発明を例示するために提供するものであり、限定を意図しない。当業者には、本発明の精神と物質を組み込んだ開示実施形態の修正が想起されうるので、本発明は、付属の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内のあらゆるものを包含すると解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１ａ】5−フルオロウラシルで処置したFVBマウス（n＝4）の血液中の、総白血球と比較したVEGFR-3＋細胞（％）を示す。
【図１ｂ】FVBマウスの5−FU処置後の骨髄中のVEGFR-3＋細胞（％）を示す。
【図２ａ】5−FU及びアデノウイルス処置マウスにおける血液の白血球数を示す。
【図２ｂ】5−FU及びアデノウイルスで処置したNMRIマウスにおける血液の白血球数を示す。
【図２ｃ】FVBマウスにおける5−FU処置及び10日目のアデノウイルス処置後の血液の白血球数を示す。
【図３ａ】LacZ、VEGF-C、VEGF-C156S 又はVEGF-B導入遺伝子を含むアデノウイルスで処置したヌードマウスにおける白血球のVEGFR-1＋細胞（％）を示す。
【図３ｂ】LacZ、VEGF-C、VEGF-C156S 又はVEGF-B導入遺伝子を含むアデノウイルスで処置したヌードマウスにおける白血球のVEGFR-2＋細胞（％）を示す。
【図３ｃ】LacZ、VEGF-C、VEGF-C156S 又はVEGF-B導入遺伝子を含むアデノウイルスで処理したヌードマウスにおける白血球のVEGFR−3＋細胞（％）を示す。
【図３ｄ】LacZ、VEGF-C、VEGF-C156S 又はVEGF-B導入遺伝子を含むアデノウイルスで処理したヌードマウスにおける白血球のCD34＋細胞（％）を示す。
【図４】対照又はPDGF-CCのいずれかで処置したマウスにおける内皮前駆細胞数／mm2を示す。3セットの対照及び実験動物が存在した：非虚血マウス、2日後に屠殺した虚血マウス及び5日後に屠殺した虚血マウス。
【図５】対照細胞、VEGFで処置した細胞及びPDGF-CCで処置した細胞の骨髄細胞接着アッセイの結果を示す。
【図６ａ】3つの細胞型―ウシ大動脈内皮細胞（BAEC）、ヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）及び平滑筋細胞（SMC）―の移動アッセイの結果及びその移動が様々な増殖因子―VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB及びPDGF-CCの不在又は存在によってどのような影響を受けるかを示す。
【図６ｂ】様々な増殖因子―VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB及びPDGF-CCの不在又は存在によって影響されたHMVECの増殖アッセイの結果を示す。
【図７ａ】大動脈環アッセイからの結果、特に様々な増殖因子―VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB及びPDGF-CCの不在又は存在によって影響される微小血管の成長を示す。
【図７ｂ】大動脈環アッセイからの結果、特に様々な増殖因子―VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB及びPDGF-CCの不在又は存在によって影響される線維芽細胞の増殖及び移動を示す。
【図８ａ】上のパネルに、抗PDGFR−α抗体を使用してヒト平滑筋細胞（hSMC）及びNIH-3T3細胞（線維芽細胞系統）の溶解産物から免疫沈降させたタンパク質のウエスタンブロットを示す。下のパネルには、抗ホスホチロシン抗体を使用したヒト平滑筋細胞（hSMC）及びNIH-3T3細胞からのタンパク質のウエスタンブロットが示されている。
【図８ｂ】様々なPDGFホモ二量体によって影響されたNIH-3T3細胞及びhSMC細胞の増殖を示す。
【図８ｃ】対照（ベクター）NIH-3T3細胞又はPDGF-Cを過剰発現するNIH-3T3細胞のRNAプロテクションアッセイ（RPA）（上のパネル）及びウエスタンブロット（下のパネル）の両方からの結果を左側に示す。右側は、対照（ベクター）NIH-3T3細胞又はPDGF-Cを過剰発現するNIH-3T3細胞のELISAの結果を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図８ｂ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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