(57)【要約】本発明は、中和抗ウイルス抗体を誘発せず、該ウイルス感染を増加させる“促進”抗体を誘発する、抗原または上述のエピトープを使用しての、抗原−抗体認識タイプの免疫学的反応の顕在化に基づく、エンテロウイルスについてのインビトロ診断テストに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原−抗体認識タイプの免疫学的反応を明らかにすることに基づくエンテロウイルスのインビトロ診断アッセイであって、抗ウイルス中和抗体を誘発せず、該ウイルス感染を増強させる“促進”抗体を誘発する、抗原またはそのエピトープを使用することを特徴とする、診断アッセイ。
【請求項２】
本発明のアッセイが支持体上に固定された対応の抗原による前記“促進”抗体の検出からなる場合には、標識された抗−種抗体によって、あるいは、本発明のアッセイが支持体上に固定された対応の“促進”抗体による抗原の検出からなる場合には、標識された抗−ウイルス抗体によって、または抗−ウイルス抗体、次いで標識された二次抗−種抗体によって、前記抗原−抗体認識タイプの免疫学的反応が明らかにされることを特徴とする、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項３】
前記標識された抗体が、酵素、放射性同位体、化学発光化合物、生物発光化合物または金属キレートタイプの標識を有することを特徴とする、請求項２に記載の診断アッセイ。
【請求項４】
前記抗ウイルス“促進”抗体を誘発する抗原が、ウイルス内部蛋白質であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項５】
前記ウイルス内部蛋白質が、全長蛋白質またはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項４に記載の診断アッセイ。
【請求項６】
前記ウイルス内部蛋白質またはそのフラグメントが、該ウイルスからの精製によって得られるか、または同一の免疫原性を示す組換え蛋白質であるか、あるいは化学的に合成されそして同一の免疫原性を示すことを特徴とする、請求項４または５に記載の診断アッセイ。
【請求項７】
前記ウイルス内部蛋白質が、構造蛋白質ＶＰ４またはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項８】
前記構造蛋白質ＶＰ４のフラグメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５の配列のペプチドから取られることを特徴とする、請求項７に記載の診断アッセイ。
【請求項９】
前記構造蛋白質ＶＰ４のフラグメントが、配列番号２の配列のペプチドであることを特徴とする、請求項７に記載の診断アッセイ。
【請求項１０】
前記診断されるエンテロウイルスが、ＡまたはＢタイプのコクサッキーウイルスであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項１１】
アッセイの実施が、以下の工程の連続：
ａ−前記“促進”抗体または前記“促進”抗体を誘発するウイルス蛋白質、あるいはそのフラグメントの、支持体上への固定化
ｂ−コントロール抗体、コントロール蛋白質、またはそのフラグメントの、支持体上への固定化
ｃ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄
ｄ−無関係の蛋白質の緩衝溶液での該被覆されていない支持体表面の飽和
ｅ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄
ｆ−該飽和緩衝液中の異なる希釈での研究される試料の添加
ｇ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄
ｈ−標識された抗体の適用による該応答の増幅
ｉ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄
ｊ−標識強度の読み取り、
を包含することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項１２】
前記抗原または対応の“促進”抗体が、マイクロタイトレーションのためのマルチ−ウエルプレートタイプ支持体上に固定されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項１３】
前記抗原または対応の“促進”抗体が、チップタイプの支持体上に固定されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項１４】
以下：
−  抗原または“促進”抗体、
−  抗原−抗体反応を行うために好ましい培地の構成に必要とされる試薬、
−  形成される複合体の検出を可能にする試薬、
を備える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のエンテロウイルスのインビトロでの診断アッセイを行うためのボックスまたはキット。
【請求項１５】
エンテロウイルス感染に関連するヒトまたは動物慢性病理の開始の予測のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【請求項１６】
前糖尿病患者における１型糖尿病の開始の予測のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【請求項１７】
エンテロウイルス感染に関連する慢性ヒトまたは動物病理の段階の定義のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【請求項１８】
ＣＶＢ感染に関連する慢性ヒトまたは動物病理の段階の定義のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【請求項１９】
急性ヒトまたは動物感染の原因であるエンテロウイルス血清型の測定のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【請求項２０】
所定のヒトまたは動物母集団における血清型によるエンテロウイルス感染の分布の測定のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【請求項２１】
抗ウイルス剤のウイルス標的のインビトロでの測定のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原−抗体認識タイプの免疫学的反応を明らかにすることに基づくエンテロウイルスのインビトロ診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロウイルス（Enteroviruses）は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属（gender）に属する。これらのウイルスは、直径２５〜３０ｎｍのものであり、被覆されておらず、そして正二十面体シンメトリーを有し、そして一本鎖で線形の、フラグメント化されていない、かつポジティブのＲＮＡ（リボ核酸）である。
【０００３】
被覆の欠如は、物理化学剤に対する耐性およびｐＨ３〜１０の範囲内での安定性をそれらに与える。これに反して、エンテロウイルスは、４５℃（そして二価カチオンの存在下では５０℃でさえ）より高い温度での熱によって、ならびに主要な殺菌剤（disinfectants）および防腐剤（antiseptics）（ヨウ化プロビドン（ioded providone）、次亜塩素酸ナトリウム、アルデヒド類）によって不活性化される。
【０００４】
エンテロウイルスの６４の血清型が存在する：３ポリオウイルス、２３コクサッキーウイルスＡ（ＣＶＡ）、６コクサッキーウイルスＢ（ＣＶＢ）、２８エコーウイルス（ＥＶ）および４の分類されていないエンテロウイルス。
【０００５】
約７５００ヌクレオチドのエンテロウイルスゲノムのうち８０％超は、５’および３’の２つの非コーディング領域によって挟まれた唯一のリーディングフレームから構成される。このリーディングフレームによってコードされる嵩高い蛋白質は、４つの成熟構造蛋白（mature structural proteins）ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４（ＶＰ＝ウイルス蛋白質（viral protein））ならびに非構造蛋白質（例えば、プロテアーゼおよびウイルスＲＮＡポリメラーゼ）に切断される。僅かな動物エンテロウイルスゲノムが配列決定された。にもかかわらず、配列決定されたものは、ヒトエンテロウイルスと非常に高い相同性を示す。
【０００６】
エンテロウイルスは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼの転写エラー（これは、規則的な突然変異の源である）および種々のウイルスゲノム間の組換えに起因して、非常に高い遺伝的多様性である。この多様性は、エンテロウイルスの病理学的スペクトルおよび組織的屈性の多様性に寄与する。
【０００７】
口−糞経路（oral-faecal route）は、同種の２個体の接触によるかあるいは水または汚染された食物を介してのヒトからヒトへのエンテロウイルスの伝染の主要な様式である。いくつかの血清型は、呼吸または皮膚−粘膜様式で伝染する。消化管を介して浸透するエンテロウイルスは、まず腸管において増殖し（従って、用語エンテロウイルス（enterovirus））、その後、血流を介して標的器官（中枢神経系、横紋筋、皮膚、．．．）へと体中に広がる。明白でない（non-apparent）感染は、エンテロウイルスの最も重要な部分である。急性感染および持続性感染は、症状形態の中でも顕著である。
【０００８】
ヒト急性感染は、非常に多型性である。エンテロウイルスは、中枢神経系感染（リンパ球性髄膜炎、髄膜脳炎、灰白髄炎型の麻痺）の原因である最も頻繁な感染因子である。それらは、多数の他の呼吸性病理学的感染（鼻炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎）、心臓感染（心膜炎、心筋炎）、筋炎、斑丘疹（maculo-papulous）、または紫斑発疹（purpureous eruptions）、熱性症候群（febrile syndroms）、および、よりめったにないが、肝炎、腎炎、精巣炎または関節炎に関与する。臨床症状は、エンテロウイルスに対して、そしていくつかの血清型に対してさえ非常に特異的である；胸膜痛またはボーンホールム病（ＣＶＢ）（痛覚過敏（hyperalgic）インフルエンザの類に対応する）、ヘルパンギナタイプの小胞発疹または手−足−口症候群（hand-foot-mouth syndrome）（ＣＶＡ、ＣＶＢ、エンテロウイルス７０）、出血性結膜炎（ＣＶＡ−２４、エンテロウイルス７０）。
【０００９】
エンテロウイルスによって感染される動物は、ウシ、ブタおよびトリである。これらのエンテロウイルス感染の大部分は、明白でなく（not apparent）、そしてブタおよびトリエンテロウイルスのみが、経済的に重要な疾患の原因である。ブタエンテロウイルスのいくつかの株は、ブタのポリオ脳脊髄（porcine polio-encephalomyelitis）の原因である。ＳＶＤＶ（ブタの小胞性疾患ウイルス；swine vesicular disease virus）は、ブタの小胞性疾患を引き起こす。一般的に、該疾患自体は重篤ではなく、そして動物の大部分が生き残る。
【００１０】
少なくとも４つの慢性ヒト病理学が、エンテロウイルスに関連しているとみなされている：慢性髄膜脳炎（chronic meningo-encephalitis）、灰白髄炎後症候群（post-poliomyelitic syndroma）、心疾患およびインスリン依存性糖尿病。実際に、インスリン依存性真性糖尿病（insulin-dependent diabetes mellitus；ＩＤＤＭ）または１型糖尿病におけるコクサッキーウイルスＢ関与に賛成する強力な議論が存在する。数人の権威者は、該疾患の臨床的症状発現の初期でのＩＤＤＭ患者の末梢血中のＣＶＢとの高い相同性を示すエンテロウイルスＲＮＡの存在を検出した（Clements and al., 1995 ; Andreoletti and al., 1997 ; Nairn and al., 1999 ; Lonnrot and al., 2000）。最近、本出願人は、血漿中のインターフェロンα（ＩＦＮα）の高い割合が、その場合の５０％において、１型糖尿病の成人および子供の循環血中のエンテロウイルス配列（特に、ＣＶＢ３およびＣＶＢ４）の存在に相関していることを示した（Chehadeh and al., 2000）。本出願人はまた、ＣＶＢ４が、循環するＩｇＧ抗体または関連する細胞との相互作用よって、ＩＤＤＭ患者の末梢血単核細胞（peripheric blood mononuclear cells；PBMC）によるＩＦＮαの高い産生を誘発し得ることを示した（Hober and al., J. Gen. Virol., vol. 83, n°9, September 2002）。インターフェロンα産生は、ウイルス感染のマーカーである。この産生は、ウイルス感染を促進するいわゆる“促進”抗体の存在下以外では、ＣＶＢ４によって弱く誘発される。従って、ＣＶＢ４は、該ウイルス、抗ウイルス抗体および該細胞表面上の特異的受容体（ＣＡＲ、Ｆｃγ ＲＩＩ、Ｆｃγ ＲＩＩＩ）の相互作用を介しての抗体依存機構によって、単核細胞（大部分は、ＣＤ１４＋）に感染し得、ＩＦＮα産生が生じる。抗−ＣＶＢ４ ＩｇＧによって誘発されるＩＦＮαのこの合成は、ウイルス複製ではなく該単核細胞へのＣＶＢ４の浸透を反映し、そして該細胞中のＣＶＢ４ ＲＮＡの存在を必要とする。これら抗−ＣＶＢ４ ＩｇＧによって誘発されるＩＦＮα産生がブロックされると、ＰＢＭＣによって産生されるウイルス粒子が検出され得る（Chehadeh and al., J. Gen. Virol., vol.82, n°8, August 2001）。その上、ＣＶＢ４と共にプレインキュベートされその後健康な被験体の単離ＰＢＭＣへ添加されたＩＤＤＭ患者の血漿ＩＦＮαの誘発活性は、健康な被験体からの血漿のそれと比較して高い（Hober and al., J. Gen. Virol., vol. 83, n°9, September 2002）。ＩＤＤＭ患者は、コントロールと比較して、ＣＶＢ誘発化ＩＦＮα合成を増強する、“促進”と呼ばれる、抗−ＣＶＢ抗体のより高い有病率を有する。従って、エンテロウイルスに感染した患者の血漿は、該ウイルスを“固定化し（immobilise）”そして構造表面蛋白質ＶＰ１のエピトープに大部分は指向される既に知られている中和抗体に加えて、ウイルス感染を好む“促進”抗体を含有する。
【００１１】
エンテロウイルスの診断について現在使用されている診断手段は、直接的な手段：細胞培養、新しく生まれたマウスへの接種、ゲノムの非コーディング５’領域におけるプライマーを使用してのゲノム増幅、ならびに間接的な手段：血清中和（sero-neutralisation）および免疫酵素技術である。
【００１２】
細胞培養および血清中和は、全てのコクサッキーウイルスＡに適用可能でなく、血清型Ａ１、Ａ１９およびＡ２２には培養可能でない。実際に、ＣＶＡの大部分は、ＣＶＡ９を除いて容易には培養され得ない。
【００１３】
新しく生まれたマウスへの接種は、コクサッキーウイルス感染を診断しそしてＣＶＡ（弛緩性麻痺）とＣＶＢ（痙攣性麻痺）とを区別することを可能にする、扱いにくくそして時間のかかる技術である。
【００１４】
分子生物学の技術、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるゲノム増幅は、高度に保存された領域におけるプライマーの使用によって少量のエンテロウイルスを検出することを可能にした。しかし、それらは、全てのエンテロウイルス感染を検出することを可能とせず、特に、感染が局在化しておりそしてウイルス複製率が低い場合、互いに血清型を区別することを可能にしない。免疫−酵素技術もまた、せいぜいグループを区別し、そして中和抗体の検出に基づいて、それらは、エンテロウイルスで共通の抗原の非存在の問題に直面する。
【００１５】
従って、これらの試験の中には、血清型または変異体を非常に細かいスケールで検出するための技術も（野生株とワクチン株との区別）、あるいは、感染された個体におけるウイルス負荷（viral load）を定量化する方法も存在しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この欠陥を満たすために、本出願人は、エンテロウイルスについての特異的かつ定量的なインビトロ診断アッセイを開発した。このアッセイは、ウイルス感染を“促進する”抗体を誘発しそして中和抗体を誘発しない抗原の存在に基づいている。
【００１７】
実際に、本出願人は、コクサッキーウイルスＢ３およびＢ４感染の場合に“促進”抗体によって認識されるエピトープを提示するウイルス蛋白質を同定した。この蛋白質は、構造内部蛋白質ＶＰ４（structural internal protein VP4）であり、そしてその実証が以下の通りに与えられた：
ａ）先ず、ウイルスＣＶＢ３およびＣＶＢ４ Ｅ２を培養しそして精製し、
ｂ）次いで、一方で蛋白質ＶＰ４、そして他方でＨ抗原（“アーティフィシャルエンプティーカプシド（artificial empty capsids）”のためにＡＥＣとも呼ばれる）を、解離させたウイルスＣＶＢ３およびＣＶＢ４ Ｅ２から単離しそして精製し、
ｃ）最後に、ＶＰ４蛋白質は、ＣＶＢ／血漿カップル誘発化ＩＦＮα産生の増強を阻害することが示された。実際に、ＣＶＢを添加する前に血漿と共にＶＰ４がプレインキュベートされる場合、ＶＰ４は抗−ＶＰ４抗体に結合し、そして、従って、ＣＶＢへ結合しそしてＰＢＭＣのインビトロ感染およびそれらによるＩＦＮα産生の増強を促進する抗−ＶＰ４抗体はほとんど残っていない。これは、“促進”抗体が抗−ＶＰ４抗体であることを証明している。
【００１８】
他方で、抗−ＶＰ４ＣＶＢ３抗体と抗−ＶＰ４ＣＶＢ４抗体との間で、交差反応は観察されなかった。ＶＰ４ＣＶＢ４がＣＶＢ３の添加前に血漿とプレインキュベートされた場合、ＰＢＭＣ培養物中のＣＶＢ３誘発化ＩＦＮαレベルの変化は観察されなかった。ＣＶＢ３から解離されたＶＰ４蛋白質も、ＣＶＢ４誘発化ＩＦＮαレベルに影響を与えない。従って、ＶＰ４蛋白質によって提示されるこれら２つの血清型のエピトープは、十分に異なっており、その結果、“促進”抗体は、１または別の血清型に対して特異的である。
【００１９】
この結果は、他のＣＶＢ、ＣＶＢ１〜ＣＶＢ５血清型で立証された。抗−ＶＰ４ＣＶＢ４Ｅ２抗体は、他の血清型のＣＶＢウイルスを認識しない（実施例３）。
【００２０】
用語“促進抗体”（facilitating antibodies）は、ウイルス感染を促進しそしてウイルス血清型（ここに抗原が由来する）に特異的である非中和抗体を意味する。
【００２１】
本出願人は、この実証を利用して、抗ウイルス中和抗体を誘発しないが、ウイルス感染を増加させる“促進”抗体を誘発する、抗原またはそのエピトープを使用することを特徴とする、抗原−抗体認識タイプの免疫学的反応を明らかにすること（revelation）に基づくエンテロウイルスのインビトロ診断アッセイを開発した。
【００２２】
本発明の課題は、抗原が対応の“促進”抗体の検出のために支持体上に固定されているか、あるいは“促進”抗体が対応の抗原の検出のために支持体上に固定されていることを特徴とする、エンテロウイルスの診断アッセイに関する。支持体は、マルチウエルマイクロタイトレーションプレート（multi-well microtitration plate）または“チップ”タイプのものであるか、あるいは任意の他の支持体である。用語“チップ”は、無機または有機固体材料（例えば、ガラス、シリコンまたは合成ポリマー）の小型フラット支持体（miniaturised flat support）を意味し、この上に、共有結合または非共有結合によってポリペプチドが結合される。
【００２３】
本発明のアッセイが、支持体上に固定された対応の抗原による“促進”抗体の検出を目的とする場合、反応は、標識された二次抗−種抗体（labelled secondary anti-species antibody）（例えば、抗−ヒト）によって明らかにされる。
【００２４】
本発明のアッセイが、支持体上に固定された対応の“促進”抗体による抗原の検出を目的とする場合、反応は、標識された抗−ウイルス抗体によって、あるいは抗−ウイルス抗体（例えば、ヒト）、次いで標識された二次抗−種抗体（例えば、抗−ヒト）によって明らかにされる。
【００２５】
該二次抗体のマーカーは、好ましくは、酵素、例えばその基質との着色化またはルミネッセント反応を示すＨＲＰ（“ホースラディシュペルオキシダーゼ”；horseradish peroxydase）、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物（chemiluminescent compound）、生物発光化合物（bioluminescent compound）または金属キレートである。
【００２６】
“促進”抗−ウイルス抗体を誘発する抗原として、全長ウイルス内部蛋白質またはそのフラグメントを使用することが好ましい。この蛋白質は、ウイルスから精製され得るか、同一の免疫原性を示す組換え蛋白質であり得るか、あるいは化学的に合成され得そして同一の免疫原性を示し得る。
【００２７】
特に、該ウイルス内部蛋白質が、構造蛋白質ＶＰ４であることが好ましい。
【００２８】
特に好ましい様式において、本発明の診断アッセイにおいて使用される“促進”抗ウイルス抗体を誘発する抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５の配列のペプチド（好ましくは、配列番号２の配列のペプチド）から取られるＶＰ４蛋白質のペプチドフラグメントである。
【００２９】
このアッセイは、特に、コクサッキーウイルスタイプＡまたはＢ感染を診断することを可能にする。
【００３０】
このアッセイは、以下の工程を包含する：
ａ−前記“促進”抗体または前記“促進”抗体を誘発するウイルス蛋白質、あるいはそのフラグメントの、支持体上への固定化、
ｂ−コントロール抗体、コントロール蛋白質、またはそのフラグメントの、支持体上への固定化、
ｃ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄、
ｄ−無関係の蛋白質の緩衝溶液での該被覆されていない支持体表面の飽和、
ｅ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄、
ｆ−該飽和緩衝液中の異なる希釈での研究される試料の添加、
ｇ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄、
ｈ−標識された抗体の使用による該応答の増幅、
ｉ−低濃度で洗浄剤が補充されたまたはされていない生理食塩水緩衝溶液での洗浄、
ｊ−標識強度の読み取り。
【００３１】
特に、本発明のアッセイは、以下：
−  本発明の抗原または“促進”抗体、
−  抗原−抗体反応を行うために好ましい培地の構成に必要とされる試薬、
−  形成される複合体の検出を可能にする試薬、
を備えるボックスまたはキットの使用によって行われ得る。
【００３２】
本発明によれば、該アッセイは、支持体上に固定された精製ＶＰ４蛋白質でそれらを捕捉することによる抗−ＶＰ４抗体の検出および用量決定（dosage）による、ＣＶＢ３またはＣＶＢ４あるいは任意の他のＣＶＢ感染の診断に、特に適用され得る。実際に、血漿と共にプレインキュベートされたＶＰ４蛋白質の量とＩＦＮα産生のレベルとの間に、用量−応答関係（dose-response relation）が存在することが、明らかにされた。従って、血漿の抗−ＶＰ４抗体は、血漿と共にプレインキュベートされたＶＰ４蛋白質によって捕捉される。このアッセイにおいてＶＰ４蛋白質の量が増加するほど、ＣＶＢを認識する遊離の“促進”抗−ＶＰ４抗体の量が減少し、ＩＦＮα産生が低くなる。その上、用量−依存相関関係が、ＰＢＭＣへ添加する前にＣＶＢ３またはＣＶＢ４と共にプレインキュベートされた抗−ＶＰ４抗体の量と、ＩＦＮα産生のレベルとの間に見られた。ＩＦＮαの産生は、抗−ＶＰ４抗体が枯渇した血漿の存在下または無関係の抗体の存在下では検出されない。
【００３３】
本発明のアッセイ主題は、“促進”抗体、あるいはこれらの抗体によって認識されるエピトープを有するウイルス蛋白質の用量決定を可能にして、ウイルス感染に対する細胞の応答（例えば、ＩＦＮαの産生）を測定することを可能にする。
【００３４】
上述のアッセイは、異なるウイルスによって引き起こされる感染のスクリーニングを行うために、他のエンテロウイルスの他のＶＰ４蛋白質を用いて行われ得る。
【００３５】
このアッセイは、該疾患の開始の予測値を確立することを目的とする、エンテロウイルス感染に関連した慢性疾患の場合に使用され得る。より詳細には、このアッセイは、ＣＶＢ感染に関連した１型糖尿病を有する前糖尿病患者における開始を予測するために使用され得る。
【００３６】
このアッセイはまた、検出される“促進”抗体の量と疾患の段階とを相互に関連付けるために使用され得る。より詳細には、このアッセイは、ＣＶＢ感染に関連した１型糖尿病の段階を評価することを可能にする。
【００３７】
本発明に従う診断アッセイは、急性ヒトまたは動物感染の原因であるエンテロウイルス血清型の決定（determination）のために使用され得る。実際に、“促進”抗体およびその抗原は、所定のエンテロウイルス血清型に特異的であり、そして本発明のアッセイは、多くの血清型によって拡大され得る。この効果のために、血清型と同じだけ多くの支持体が使用され得るか、あるいは“促進”抗体または対応の抗原を、各血清型について、小型化支持体（例えば、“チップ”）上に固定する。
【００３８】
従って、本発明の診断アッセイはまた、所定のヒトまたは動物母集団における血清型によるエンテロウイルス感染の分布の測定のために使用され得る。
【００３９】
本発明の更なる実施形態において、該診断アッセイは、抗ウイルス剤のウイルス標的の決定のために使用され得る。実際に、“促進”抗体を誘発する抗原が、１以上の支持体上に対応の“促進”抗体を固定することにより、本発明の診断アッセイによって各ウイルス血清型について測定および用量決定され（dosed）得る。従って、ほぼ重要な濃度の抗ウイルス剤の存在下または非存在下で培養可能なウイルスの細胞のインビトロ伝染力が、測定され得る。これはまた、測定され得る抗ウイルス剤のいくつかの血清型および標的について行われ得る。この実施形態において、本発明の診断アッセイは、ウイルス力価および抗ウイルス剤の濃度に依存する、インビトロでの細胞死の長く退屈な測定を置換することを可能にする。
【００４０】
以下の実施例は、その範囲を限定することなく、本発明を例示する。
【実施例】
【００４１】
実施例１：抗ＣＶＢ３または抗ＣＶＢ４“促進”抗体を誘発するＣＶＢ３またはＣＶＢ４のウイルス蛋白質の顕在化：
ａ）ＣＶＢ３およびＣＶＢ４ウイルスの培養および精製
ＣＶＢ３（Americain Type Culture Collection, Manassas, USA）および糖尿病誘発性ＣＶＢ４ Ｅ２（Ji-Won Yoon, Julia McFarlane Diabetes Research Center, Calgary, Alberta. Canadaにより供給）を、熱で不活性化させたウシ胎児血清（Gibco BHL）１０％およびＬ−グルタミン（Eurobio, France）１％を補充した、イーグル最小必須培地（Gibco BRL, Eragny, France）中、Ｈｅｐ−２細胞（Biowhittaker, Verviers, Belgium）において増殖させた。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間のインキュベート後、該細胞懸濁液を３回凍結および解凍し、そして２０００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みから得られたウイルスを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ−１００．４ローター中、４℃で３時間、５００ ０００×ｇでの遠心分離によりペレット化した。該ペレットを、０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含有する、３ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０１Ｍ  ｐＨ７．２中に再懸濁させ、４℃で２０分間インキュベートし、ホモジナイズし、そして４０００×ｇで遠心分離して、不溶性残渣を除去した。僅か０．５ｍｌの精製したウイルス懸濁液を、０．５ｍｌのスクロース（３０％、ｗｔ／ｖ）および３ｍｌ ＣｓＣｌ（４０％、ｗｔ／ｖｏｌ）上に重ねた。４時間、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ−１００．４ローター中、４℃で３４８，０００×ｇでの遠心分離後、勾配フラクション（gradient fractions）を回収し、そして勾配フラクション中のウイルス力価を、Ｈｅｐ−２細胞のコンフルエント培養物上での５０％組織培養物感染用量（50% tissue culture infectious dose；ＴＣＩＤ５０）によって測定した。ピーク感染能力価（peak infectivity titers）を含有するフラクションを、プールし、透析し、そしてＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０１Ｍ  ｐＨ７．２を用い、３００Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ；molecular weight cutoffs）でのＭａｃｒｏｓｅｐＴＭ膜（Pall Filtron Corporation, Saint Germain en Laye, France）における４０００×ｇでの遠心分離で平衡化した。−８０℃で凍結させたアリコートを保存した。Ｍｏｃｋ調製物（mock preparation）を、Ｈｅｐ−２細胞をウイルス溶媒のみで感染させた以外は同一のプロトコルによって得た。
【００４２】
ｂ）ＣＶＢ３およびＣＶＢ４ウイルスのＶＰ４天然蛋白質およびＨ抗原の精製
ＶＰ４蛋白質およびＨ抗原を、ポリオウイルスについて他で記載されたように（Maizel and al., 1967）、完全ウイルスＣＶＢ３およびＣＶＢ４から解離させた。簡潔に言えば、精製しそして濃縮したＣＶＢウイルス粒子（〜１ｍｇ）を、０．５ｍｌナトリウム緩衝液（ＮａＣｌ  ０．１Ｍ、クエン酸ナトリウム０．００５Ｍ、ｐＨ７．０）中、５分間、５６℃でインキュベートした。この処理によって、ウイルスＲＮＡ、ＶＰ４およびＨ抗原での該ウイルスの解離が生じる。次いで、ＶＰ４蛋白質を、１００ＫｄのＭＷＣＯでの、ＭａｃｒｏｓｅｐＴＭ膜上における、４０００×ｇでの遠心分離によって、該混合物から分離させた。Ｈ抗原およびＲＮＡは該膜によって保持され、そしてＶＰ４は該膜を通過した。ＲＮＡを、０．０５ｍｇのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）を添加し、そして１０分間３７℃でインキュベートすることによって分解させた。Ｈ抗原およびＶＰ４を脱塩しそしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２を用いて、それぞれ１００Ｋｄおよび３ＫｄのＭＷＣＯでのＭａｃｒｏｓｅｐＴＭ膜上における４０００×ｇでの遠心分離により、平衡化させた。Ｈ抗原およびＶＰ４を、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ＳＶＣ１００Ｈ（Global Medical Instrumentation, Minnesota, USA）を使用して濃縮した。Ｍｏｃｋ解離もまた、上述のように精製した非感染のＨｅｐ−２細胞の上澄みを用いて行い、そして以下のためにｍｏｃｋ蛋白質を生成した。蛋白質の濃度を、１ｍｇ／ｍｌの吸光係数を想定して、２８０ｎｍでの吸光度から算出した。
【００４３】
ｃ）ＶＰ４蛋白質によるＣＶＢ／血漿カップル誘発化ＩＦＮα産生の阻害
ＶＰ４、Ｈ抗原またはｍｏｃｋ蛋白質を、最適な希釈（１／１０または１／１００）で希釈した５人の健康な被験体からの血漿と共に、異なる濃度で、３７℃で１時間、プレインキュベートした。次いで、ＣＶＢ３またはＣＶＢ４を、１時間添加し、その後、ＰＢＭＣと共にインキュベートした。図１に示されるように、ＣＶＢ３／血漿誘発化ＩＦＮα産生の用量依存減少が、ＶＰ４ＣＶＢ３蛋白質の存在下で観察され、一方、Ｈ抗原の存在下では、ＩＦＮα産生の用量依存減少は観察されなかった（図１ａおよび１ｂ）。同様のパターンの結果が、システムＣＶＢ４／血漿においてＶＰ４ＣＶＢ４で得られた（図１ｃおよび１ｄ）。他方、非感染のＨｅｐ−２細胞から単離されたｍｏｃｋ蛋白質は、ＩＦＮα産生に対して影響を有さなかった。
【００４４】
実施例２  抗−ＶＰ４抗体の検出によるＣＶＢ３またはＣＶＢ４感染の診断  −  
ＣＶＢ３およびＣＶＢ４の抗ＶＰ４抗体の検出と１型糖尿病との関係
ドナー血漿中の抗−ＶＰ４抗体を検出するために、９６ウエルのマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中５μｇ／ｍｌで、ＣＶＢ３またはＣＶＢ４から解離させたＶＰ４蛋白質と共に、室温で一晩インキュベートした。同一の様式で、マイクロタイタープレートをｍｏｃｋ蛋白質と共にインキュベートした。次いで、該ウエルを、洗浄溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、飽和緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、２．５％スキムミルク、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３７℃で１時間飽和し、そして再度４回洗浄した。次いで、最適な希釈（１／５０）で飽和緩衝液中に希釈した０．１ｍｌのサンプルを、マイクロウエルへ添加した。室温で２時間インキュベートした後、該ウエルを４回洗浄し、そして１／１００００で希釈された、ＨＲＰ（“ホースラディシュペルオキシダーゼ”）で標識された、０．１ｍｌのＩｇＡ、Ｇ、Ｍ 抗−ヒト抗体混合物を添加し、そして１時間インキュベートした。４洗浄サイクル後、０．１ｍｌの基質溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン、リン酸クエン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．０）中０．０１２％Ｈ２Ｏ２）を３０分間添加した。反応を、２５μｌの２Ｎ硫酸の添加によって停止する。吸光度測定を、マイクロプレートリーダーＤｙｎｅｘ  ＭＲＸ（登録商標）（Thermo Life Science, Cergy-Pontoise, France）において、４９０ｎｍで行った。免疫学的アッセイカットオフ値（The immunologic assay cut-off value）を、ＶＰ４プレート上のブランクのものに対してｍｏｃｋプレートにおける試料吸光度を加えることによって測定した。１．０を超える指数（試料／カットオフ値比）を有する試験試料を、抗−ＶＰ４抗体の存在について陽性であるとみなした。
【００４５】
このアッセイは、健康なドナーおよびＩＤＤＭ患者由来の血漿中の抗−ＶＰ４抗体の検出および用量決定（dosage）のために使用した。４０人の健康な被験体のうち１４人（３５％）、そして４０人のＩＤＤＭ患者のうち２５人（６２．５％）が、抗−ＶＰ４ＣＶＢ３抗体について陽性であった。４０人の健康な被験体のうち６人（１５％）、そして４０人のＩＤＤＭ患者のうち３２人（８０％）が、抗−ＶＰ４ＣＶＢ４抗体について陽性であった。得られた平均指数値は、健康な被験体の群において得られたものよりも有意に高かった（図２）。
【００４６】
この実施例で明らかにされたアッセイは、抗−ＶＰ４抗体の検出および用量決定が、コクサッキーウイルス感染に関連する病理の診断のために使用され得ることを示す。実際に、ＩＤＤＭ患者は、健康な被験体よりも抗−ＶＰ４抗体のより高い有病率およびこれらの抗体のより多い量を示す。
【００４７】
いくらかの患者は、該実施例のアッセイの検出閾値未満の抗−ＶＰ４抗体の割合を示したが、実際に、それは、それらの疾患がＣＶＢ３またはＣＶＢ４以外のウイルス（例えば、ＣＶＢ２）に関連しているという事実によって説明され得る。
【００４８】
実施例３：血清型レベルでの“促進”抗体の特異性の研究：
Ａ）材料および方法
１−培養物におけるＰＢＭＣによるＩＦＮαの産生
全ヘパリン化血（whole heparinated blood）から分離されたＰＢＭＣを、ウエルごとに１００μｌの補充化ＲＰＭＩ培地中５〜８．１０５細胞の割合で、マイクロウエル（９６ウエルのプレート）へ分散させた。ＰＭＢＣの感染を、各ウエルにおいて、最終容量１００μｌの調製物で行う。５％ＣＯ２雰囲気および９０％湿度下、３７℃で、４８時間のインキュベーション後、上澄みを収穫し、そして直ぐにＩＦＮα用量決定のために使用するか、あるいは１８０×ｇで１０分間遠心分離により清澄化し、そして産生されるＩＦＮαの用量決定まで−８０℃で保存する。
【００４９】
産生されるＩＦＮαの濃度を、感度が高くそして特異的な技術、ＤＥＬＦＩＡ法（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroImmmo Assay）（Ronnblom and al 1997）で測定する。
【００５０】
２ − 産生されたＩＦＮαの顕在化：イムノフルオロメトリック法（immunofluorometric method）ＤＥＬＦＩＡ
ＩＦＮαの用量決定を、ユーロピウムで標識されたＩＦＮαを結合する抗体を使用する遅延フェーズ法（retarded phase method）における免疫蛍光に基づく、ＤＥＬＦＩＡ原理（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroImmunoAssay）に従って行う。活性化溶液（activation solution）の使用は、抗体と複合体化したユーロピウムを放出させ、そして産生されたＩＦＮαの量に比例して蛍光を放出し、そしてフルオロメーターで測定される（fluorometer LKB Wallac 1230 ARCOS（登録商標）, Turku, Finlande）。
【００５１】
Ｇｕｎａｒ  Ａｌｍ博士（Uppsala, Sweden）によって供給されたモノクローナル抗−ＩＦＮα抗体ＬＴ２７３（５．４ｍｇ／ｍｌ）およびＬＴ２９３（４．８ｍｇ／ｍｌ）を、室温で１２時間インキュベーション後、ウエルの底へコーティングする。これらのプレートは、４℃の緩衝液中で保存され得るか、または直ぐに使用される。ヒトＩＦＮαの標準サンプルを、“無関係の（irrelevant）”モノクローナルマウス抗体ＩｇＧ１で調製して、リファレンス曲線（reference curve）を確立する（１０測定）。分析される他のサンプルを、希釈緩衝液および“無関係の”抗体を有する各ウエルに添加して（１００μｌ）、そして室温で穏やかに撹拌しながら２時間インキュベートする。ウエルを洗浄溶液で３回洗浄する。ユーロピウムへ結合された抗体（２００μｌ）を各ウエルへ添加し、穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートするために放置する。プレートを洗浄溶液で６回洗浄する。洗浄後直ぐに添加されそして該ウエル中でのインキュベーションのために２０〜３０分放置された、活性化溶液（２００μｌ）は、ＩＦＮαへ固定された抗体へ結合されたユーロピウムの切断を生じさせ、蛍光リーダーで測定される蛍光を放射する（LKB Wallac 1230 ARCUS（登録商標））。ＩＦＮα濃度を、Ｇｒａｐｈｐａｄプログラム（San Diego, USA）によって、測定された蛍光の値から算出する。ＩＦＮαの検出閾値は、０．５ＩＵ／ｍｌである。
【００５２】
Ｂ）結果
１ − 血漿の存在下でのＰＢＭＣによるＩＦＮα産生およびコクサッキーＢの各血清型についての評価
ドナー血漿（１／１０ｔｈまたは１／１００ｔｈでの最適希釈）を、１／１０ｔｈで希釈したコクサッキーウイルスＢの異なる血清型（ＣＶＢ１〜ＣＶＢ６）と共に、３７℃で１時間プレインキュベートする。次いで、末梢血単核細胞（peripheric blood mononuclear cells；PBMC）を感染させる。得られたＩＦＮα産生の顕在化を、ＰＢＭＣの４８時間感染後、ＤＥＬＦＩＡイムノフルオロメトリック法（DELFIA immunofluorometric method）によって行う。同一の血漿を、血清型ごとに、ＩＦＮα産生の研究のために同一希釈で使用する。ＰＢＭＣの量は、５．１０８〜７．１０５／ウエルで変化する。４人の異なる健康なドナーからの血漿を使用した。
【００５３】
各ＣＶＢ血清型は、血漿の存在下で、インターフェロンアルファ産生を生じさせる（図３を参照のこと）。ＩＦＮα産生は、実験において、血漿の非存在下で観察されない。１／１０ｔｈでの血漿希釈は、１／１００ｔｈでの希釈よりも高い平均でのＩＦＮα産生を生じさせる（ＣＶＢ６を除く）。他方で、ＣＶＢ１ウイルスは、血漿の存在下で、ＩＦＮαの弱い誘導物質（inductor）のままである。
【００５４】
２ − ＶＰ４−ＣＶＢ４Ｅ２の存在下での異なるＣＶＢ血清型によるＰＢＭＣの感染の間のＩＦＮα産生の研究についての促進抗体特異性の評価
各ＣＶＢ血清型を、１／１０ｔｈで希釈した血漿のみと共に、あるいは１／１０ｔｈで希釈されたＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４組換え蛋白質（実施例４を参照）と共に（またはＭＥＭと共に）１時間前もってインキュベートされた１／１０ｔｈで希釈された血漿と共に、１時間インキュベートした。
【００５５】
結果は、前述のように、血漿の存在下でのＰＢＭＣの感染の間のＩＦＮα産生を示す。ＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４蛋白質での血漿のプレインキュベーションによって、ＩＦＮαのこの産生は、ＣＶＢ４Ｅ２の存在下（ここで、ＩＦＮα産生は急落した）を除いて、以前に得られた結果と比較して高くかつ安定のままである。ＣＶＢ４Ｅ２によるＩＦＮαの誘発を促進する抗体は、ＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４蛋白質に特異的に指向されるようである（図４を参照のこと）。
【００５６】
３−ＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４またはＣＶＢ３のＶＰ４の存在下でのＰＢＭＣのＣＶＢ４Ｅ２またはＣＶＢ３感染の間のＩＦＮα産生を研究することによる、促進抗体特異性の評価：
健康なドナーからの血漿（最適希釈１／１０ｔｈまたは１／１００ｔｈ）を、ＣＶＢ４Ｅ２の組換えＶＰ４蛋白質（１μｇ／ｍｌでの最適濃度）と共に、３７℃で１時間プレインキュベートする。全体を、再度、ＣＶＢ４Ｅ２ウイルスの存在下、３７℃で１時間インキュベートし（１／１０ｔｈまたは１／１００ｔｈでの希釈、１０１３  ＴＣＩＤ５０／ｍｌでのウイルス力価）、次いで該ＰＢＭＣへ適用し（５．１０５／ウエル）、４８時間インキュベートする。ＰＢＭＣによるＩＦＮα産生を、４８時間のインキュベーション後、ＤＥＬＦＩＡフルオロメトリック法によって明らかにする。
【００５７】
同一の実験を、血漿（最適希釈）の同一のバッチ、ＣＶＢ３の天然蛋白質ＶＰ４（１／１０ｔｈで希釈）およびＣＶＢ３ウイルス（１／１０ｔｈおよび１／１００ｔｈの希釈、１０１３ ＴＣＩＤ５０／ｍｌでのウイルス力価）で行う。ＰＢＭＣによって産生されるＩＦＮα量の測定をまた、ＤＥＬＦＩＡ法によって、４８時間で行う。
【００５８】
交差反応を、感染促進抗体の特異性を評価するための同一原理において行う。１時間プレインキュベートした血漿およびＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４の混合物を、ＣＶＢ３でインキュベートし、その後、４８時間ＰＢＭＣ上へ適用する。
【００５９】
同一の様式で、１時間プレインキュベートした血漿調製物およびＣＶＢ３のＶＰ４を、ＣＶＢ４Ｅ２と共に１時間インキュベートし、その後、４８時間ＰＢＭＣを感染させ、そして産生されたＩＦＮαの量を測定する。
【００６０】
血漿の存在下でウイルス（ＣＶＢ４Ｅ２またはＣＶＢ３）感染されたＰＢＭＣは、この実験の陽性コントロールとしてみなす。陰性コントロールは、ＰＢＭＣのみの１つのウエル、ウイルスＣＶＢ４Ｅ２のみの１つのウエル、およびＣＶＢ３のみの１つのウエルで得られる。
【００６１】
健康なドナーからの血漿と共に１時間インキュベートしたＰＢＭＣのウイルスＣＶＢ３感染は、３２３  ＩＵ／ｍｌ（陽性コントロール）のＩＦＮα産生へ導く。健康なドナーからの同一の血漿をＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４蛋白質と共に１時間プレインキュベートして、その後ＣＶＢ３ウイルスの存在下に１時間置かれる場合、ＩＦＮα産生に差異は見られない（３０８ ＩＵ／ｍｌ）。他方、同一の血漿を、先ず、ＣＶＢ３に特異的なＶＰ４蛋白質と共に１時間プレインキュベートし、その後、ＣＶＢ３へ添加する場合、ＩＦＮα産生は６．４ ＩＵ／ｍｌまで減少し、これは、その初期値の２％である（図５を参照のこと）。
【００６２】
健康なドナーからの血漿と共に１時間インキュベートしたＰＢＭＣのＣＶＢ４Ｅ２ウイルス感染は、１４８ ＩＵ／ｍｌのＩＦＮα産生へ導く（陽性コントロール）。健康なドナーからの同一の血漿を、ＣＶＢ３のＶＰ４蛋白質と共に１時間プレインキュベートし、その後、ウイルスＣＶＢ４Ｅ２の存在下に置かれる場合、ＰＢＣＭによるＩＦＮαの高い産生が見られた（８７ ＩＵ／ｍｌ）。他方、同一の血漿を、先ず、ＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４蛋白質と共に１時間プレインキュベートし、その後ＣＶＢ４Ｅ２ウイルスを添加する場合、ＰＢＭＣによるＩＦＮα産生は低い（８．５ ＩＵ／ｍｌ）。
【００６３】
コントロールウイルスのみ（ＣＶＢ４Ｅ２またはＣＶＢ３）、ＣＶＢ３またはＣＶＢ４Ｅ２の蛋白質ＶＰ４のみ、ＭＥＭまたは血漿のみは、ＰＢＭＣによるＩＦＮα産生へ導かない。
【００６４】
実施例４：ＣＶＢ４Ｅ２の組換えＶＰ４蛋白質の合成
Ａ）組換えＶＰ４の産生
１−使用した細菌
コンピテントな大腸菌（Escherichia coli bacteria）JM 109（Promega, Madison, United-States）を使用した。
【００６５】
２−使用したプラスミド
コンピテントな細菌の形質転換のために使用したプラスミドは、Ｄｏｃｔｏｒ  Ｒｕｂｅｎ  Ｖａｌｅｒａ  Ｃａｌｖｉｎｏによって供給される、ｐＭＡＬ−ｃ２（Valera-Calvino and al., 2000）、ベータ−ラクタマーゼ［従って、アンピシリン含有培地上で該プラスミドを受容した細菌の選択］をコードしそしてＭＢＰ蛋白質［これは、ＩＰＴＧ誘導プロモーター（Promega, Madison, United-States）のコントロール下で、ＶＰ４蛋白質と結合された］をコードするプラスミドである（図６を参照のこと）。
【００６６】
３−使用した培地
α．ＳＯＣ培地
この培地は、１リットル当たり、２０ｇのＢａｃｔｏＴＭトリプトン（DIFCO-BECTON DICKINSON, United-States）、５ｇの酵母抽出物（DIPCO, Detroit, United-States）、１０ｍｌのＮａＣｌ １Ｍ、２．５ｍｌのＫＣｌ１Ｍ、１０ｍｌのＭｇＣｌ２ １Ｍ／ＭｇＳＯ４１Ｍおよび１０ｍｌのグルコース ２Ｍを含有し、ｐＨは７に調節する。
【００６７】
β．ＬＢ培地
この培地は、１リットル当たり、１０ｇのトリプトン（DIFCO-BBCTOM DICKINSON, United-States）、５ｇの酵母抽出物（DIPCO, Detroit, United-States）、５ｇのＮａＣｌを含有し、ｐＨ値を７．２に調節する。ＬＰ培地の皿について、この培地はまた、１５ｇのアンピシリン含有寒天（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）を含む。組換え蛋白質の産生のために使用されるＬＢ培地は、１リットル当たり２ｇのグルコースの添加で富化され、そして１リットル当たり１００μｇのアンピシリンを含む。
【００６８】
４−使用した緩衝液
α．カラム緩衝液
この溶液は、１リットル当たり、２０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Q.Biogene, United-States）１ＭｐＨ７．４、１１．７ｇのＮａＣｌ、２ｍｌのＥＤＴＡ  ０．５Ｍ（Sigma-Aldrich, United-States）を含む。ＭＰＢ−ＶＰ４蛋白質の溶出のために、３．６ｇのマルトース（Sigma-Aldrich, United-States）（１０ｍＭ）を該カラム緩衝液へ添加し、溶出緩衝液と呼ぶ。
【００６９】
β．消化緩衝液
この溶液は、１リットル当たり、３．２ｇのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Q.Biogene）（０．２Ｍ）、５．８４ｇのＮａＣｌ（１００ｍＭ）および０．２２ｇのＣａＣｌ２を含み、ｐＨは８へ調節される。
【００７０】
５−細菌の形質転換
コンピテントな細菌のアリコートを氷中で解凍し、次いで、１〜２μｌのプラスミドを添加し、そして氷中で３０分間該細菌と共にインキュベートする。次いで、該細菌を熱ショックへ供し：それらを４２℃で３０秒間放置し、その後、氷中へ１〜２分間戻す。室温へもっていた２５０μｌのＳＯＣ培地を添加し、チューブを撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートする。２０〜１００μｌの細菌懸濁液を、形質転換された細菌の選択のためにアンピシリン含有培地の皿の上に広げ、該皿を３７℃で一晩インキュベートする。
【００７１】
種々の容量の細菌懸濁液を、種々の皿上に広げて、コロニーが単離されている少なくとも１つの皿を得る。コロニーを有する皿を４℃で保存する。
【００７２】
６−組換えＭＢＰ−ＶＰ４蛋白質の産生
１０ｍｌのリッチなＬＢ培地に、チューブＦａｌｃｏｎ（登録商標）１５ｍｌ中、形質転換された細菌のコロニーを接種し、これを、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、２．５リットルのフラスコ中１リットルのリッチなＬＢ培地に、これら１０ｍｌを接種し、次いで、そのＯ．Ｄ．（光学密度）が０．５〜０．６の範囲内の値を達成するまで、撹拌しながら３７℃でインキュベートする。次いで、ＭＢＰ−ＶＰ４産生を、該フラスコ中に３ｍｌのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を添加することにより誘発し、これを、撹拌しながら３７℃で少なくとも３時間インキュベートする。
【００７３】
７−ＭＢＰ−ＶＰ４蛋白質の回収および取得
細菌の培養物を、４℃、４０００×ｇで２０分間遠心分離する。次いで、上澄みを捨て、そして細菌ペレットを５０ｍｌのカラム緩衝液中に取り（taken up）、そして−２０℃で一晩凍結させ、その後、冷水中で解凍し、そして翌朝氷中へ配置する。細菌を、１５秒間の８の連続の超音波処理によって溶解させる。細菌溶解物を、４℃、９００×ｇで３０分間の遠心分離により清澄化して、上澄みを回収する。別に、５ｍｌのアミロース樹脂（NEW ENGLAND BioLabs, United-States）を、クロマトグラフィーカラム中へ配置し、次いで、４０ｍｌのカラム緩衝液で洗浄する。融合蛋白質ＭＢＰ−ＶＰ４を含有する細胞抽出物を、１時間当たり２５．６ｍｌのフローで該カラムへ注入する。該樹脂を、６０ｍｌのカラム緩衝液で洗浄する。ＭＢＰ−ＶＰ４蛋白質を溶出緩衝液で溶出し、フラクションを１フラクション当たり１ｍｌの割合で回収する。２８０ｎｍで最大Ｏ．Ｄ．を示すフラクションをプールする。該蛋白質を、透析によりＰＢＳに対して脱塩し、そして１０ＫｄでフィルターＭａｃｒｏｓｅｐＴＭフィルター膜（PALL, Life Sciences, United-States）上において、少なくとも３０分間、４℃、５０００×ｇでの遠心分離によって濃縮する。
【００７４】
得られたＭＢＰ−ＶＰ４蛋白質を、第Ｘａ因子（NEW ENGLAND） BioLabs United-States）によって切断し、この最適濃度は、溶出緩衝液または消化緩衝液中の該融合蛋白質のものの２％である（２８０ｎｍでの吸光度でＵ．Ｖ．分光器により測定）。
【００７５】
ＭＢＰ蛋白質、切断されていないＭＢＰ−ＶＰ４およびＸａ因子を、ＶＰ４蛋白質に対してのみ透過性の１０ＫｄでのＭａｃｒｏｓｅｐＴＭフィルター膜上における遠心分離 により除去する。濾液を、３ＫｄでのＭａｃｒｏｓｅｐＴＭフィルター膜（PALL, Life Sciences, United-States）における遠心分離により回収および濃縮する。濃縮したＶＰ４蛋白質を−８０℃で保存する。
【００７６】
健康な被験体からの血漿の存在下で予めインキュベートしたＰＢＭＣの培養物中でのＣＶＢ４Ｅ２誘発化ＩＦＮα産生を測定した。ＩＦＮα産生レベルを、４８時間後回収した培養上澄み中で、ＤＥＬＦＩＡ法により測定する。各培養条件は、１ウエル当たり２．１０５細胞、およびＣＶＢ４Ｅ２について１のｍ．ｏ．ｉを必要とする。血漿の試料は、ＲＰＭＩ培地中１／１０  １０倍（1/10 tenfold）に希釈し、そして３７℃でＣＶＢ４Ｅ２と共に１時間インキュベートした。組換えＶＰ４蛋白質を、ＣＶＢ４Ｅ２と共のインキュベーション前に３７℃で１時間、血漿の存在下に置く。結果は、３つの異なるドナーで行われた３つの独立した実験の平均および標準偏差を示す（図７を参照のこと）。
【００７７】
種々の量の血漿（１０、１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした組換えＶＰ４蛋白質は、該ウイルスと共の血漿のプレインキュベーションによってＰＢＭＣのＣＶＢ４Ｅ２と共のインキュベーションに対して発せられる効果に対する、組換えＶＰ４蛋白質の用量−応答効果に注目することを可能にする。従って、０．０１μｇ／ｍＬの割合の該蛋白質で１８９．５＋／−２１．６ＩＵ／ｍＬのＩＦＮα産生、０．１μｇ／ｍｌの割合で１０４．７＋／−４．５ＩＵ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌの割合で４４．１＋／−２４．３ＩＵ／ｍＬのＩＦＮαが得られ、そして１０μｇ／ｍｌの割合で１５．３＋／−７．９ＩＵ／ｍＬが得られる。従って、血漿と共にインキュベートされた組換えＶＰ４の用量が高いほど、ＩＦＮαの値がより低くなる（図７を参照のこと）。
【００７８】
実施例５：ＣＶＢ４Ｅ２全長のＶＰ４蛋白質の生物学的活性を模倣するＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４蛋白質のペプチドフラグメントの研究
Ａ）材料および方法（ＥＬＩＳＡアッセイ）
１−アッセイした血清および血漿：
非糖尿病患者からの４０血漿および糖尿病患者からの４０血漿または血清をアッセイした。
【００７９】
２−ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用したＶＰ４ペプチド
使用した５つのＶＰ４ペプチドは、ＣＶＢ４−Ｅ２ウイルスのＶＰ４蛋白質の配列（配列のＮＣＢＩデータバンクアクセッションナンバーに列挙される：Ｑ８６８８７）に基づいて、EPYTOPE Company (Nimes)によって合成された。ＣＶＢ４Ｅ２ウイルスのＶＰ４蛋白質の配列上のそれらの位置ならびにそれらの配列を下記の表１に示す。それらは重複しており、そしてＶＰ４の配列の全体をカバーしている。
【００８０】
【表１】
2006518844.tif 000002
【００８１】
３−使用した緩衝液の組成
−ＰＢＳ緩衝液：（１リットルについて）：
＊ＮａＣｌ                ８．０ｇ
＊ＫＣｌ                  ０．２ｇ
＊ＫＨ２ＰＯ４            ０．３ｇ
＊Ｎａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ  １．４４ｇ
ｐＨを７．４へ調節
−洗浄溶液
ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する
−飽和および希釈緩衝液：
水中に１／２０ｔｈで希釈した濃縮ミルク希釈液／ブロッキング溶液（ＫＰＬ）（Concentrated milk diluent/blocking solution）
−ポスト−コーティング緩衝液（Post-coating buffer）：
リン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ＝４．５、以下を含有：
＊Ｄ−ソルビトール        ６％
＊ＮａＣｌ                ０．９％
＊ＢＳＡ                  ０．１％
＊ＣＡＣｌ２／２ Ｈ２Ｏ   ０．１ｍＭ
＊ＥＤＴＡ                ４μＭ
＊ＮａＮ３                ０．００５％
ｐＨを４．８に調節
−  二次抗体溶液：
希釈緩衝液中に１／１００００ｔｈへ希釈されたペルオキシダーゼに結合された抗−ＩｇＧ．Ａ．Ｍ抗体（Ｈ＋Ｌ）ヒト（Bio-Rad）
−  顕在化緩衝液（Revealing buffer）
蒸留水１００ｍｌにリン酸クエン酸緩衝液（Sigma）のカプセルを溶解させる（Ｃｆ＝０．０５Ｍ、ｐＨ５．０）。この緩衝液２５ｍｌを取り、そしてアルミニウムに包まれた５０ｍｌのボトル中へ配置する。１０ｍｇのＯＤＰパステル（pastille）（Sigma）を取り、そしてこれら２５ｍｌ中に溶解する（Ｃｆ＝０．４ｍｇ／ｍｌ）。ボルテックスを使用して混合する。使用直前に、１０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を添加する。
【００８２】
４−  ＥＬＩＳＡプレートの調製
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に５μｇ／ｍｌで希釈したＶＰ４蛋白質または５つのＶＰ４ペプチドを、１００μｌ／ウエルの割合で、９６ウエルのマイクロプレート（FluoroMunc, MaxiSorp surface, NUNC, Danemark）のウエルにコーティングする。プレートを、湿潤雰囲気下３７℃で１時間インキュベートし、次いで、室温で２４時間放置する。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、ウエルを、湿潤雰囲気下３７℃で１時間、飽和緩衝液３００μｌで飽和し、その後、洗浄緩衝液で３回洗浄する。次いで、２５０μｌのポスト−コーティング緩衝液（post-coating buffer）を各ウエルに添加し、そしてプレートを室温で２４時間インキュベートし、次いで使用まで４℃で保存する。
【００８３】
５−  用量決定ＥＬＩＳＡ：
ＶＰ４蛋白質または種々のペプチドＶＰ４でコーティングされたウエルを、洗浄緩衝液で３回洗浄して、ポスト−コーティング溶液を除去する。次いで、希釈緩衝液中に１／５０ｔｈへ希釈された血漿または血清１００μｌを、種々のウエルへ添加し、そしてプレートを、湿潤雰囲気下３７℃で１時間インキュベートする。同時に、１００μｌの希釈緩衝液を含有するネガティブコントロールウエルを行う。次いで、ウエルを洗浄溶液で３回洗浄し、そして１００μｌの二次抗体溶液を各ウエルへ添加する。湿潤雰囲気下３７℃で１時間インキュベーション後、ウエルを洗浄溶液で５回洗浄し、そして１００μｌの基質溶液を各ウエルへ添加する。プレートを、室温および暗所中で、３０分間インキュベートする。着色反応を、１ウエル当たり２５μｌのＨ２ＳＯ４  ２Ｎ（１Ｍ）の添加によって停止させ、そしてプレートを、４９０ｎｍの波長でプレートリーダーにおいて読み取る。
【００８４】
Ｂ）ＶＰ４蛋白質およびペプチドＶＰ４−Ｐ１、ＶＰ４−Ｐ２、ＶＰ４−Ｐ３、ＶＰ４−Ｐ５、ＶＰ４−Ｐ６の比較からのＥＬＩＳＡによって得られた結果：
ＶＰ４蛋白質および種々のペプチドＶＰ４で各血清について得られたＯＤを、ネガティブコントロールで得られたＯＤで割る。下記の表は、アッセイされた血清の２つのシリーズで得られたＯＤの割合の平均＋／−標準偏差を示す（患者＝糖尿病患者、コントロール＝糖尿病でない）。（図８〜１０を参照のこと）。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
【表３】
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【００８７】
【表４】
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【００８８】
図８〜１０は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図示する。
【００８９】
ペプチドＶＰ４−Ｐ１（配列番号１）およびＶＰ４−Ｐ２（配列番号２）は、患者からの４０の血清でのＥＬＩＳＡアッセイにおいてＶＰ４蛋白質に匹敵するＯＤ示す（図８を参照のこと）。
【００９０】
特に、ペプチドＶＰ４−Ｐ２（配列番号２）は、患者からの４０血清および非糖尿病患者からの４０血清のＯＤを比較するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＶＰ４と同一の挙動を示す（図９および１０を参照のこと）。従って、ペプチドＶＰ４−Ｐ２（配列番号２）は、ＶＰ４と同様に、非糖尿病でよりも糖尿病でより高レベルの抗体を認識する。
【００９１】
Ｃ）ＶＰ４蛋白質およびペプチドＶＰ４−Ｐ２の比較からの生物学的試験の結果（ＰＢＭＣによるＩＦＮα産生）：
培養物中におけるＰＢＭＣによるＩＦＮα産生のためおよび産生されるＩＦＮαをＤＥＬＦＩＡ法により明らかにするための、材料および方法は、実施例３と同一である。
【００９２】
ペプチドＶＰ４−Ｐ２（配列番号２）は、血漿の存在下でのＰＢＭＣの感染の間の用量依存ＩＦＮα産生の減少を示す（図１１、トラック７〜９を参照のこと）。
【００９３】
従って、ペプチドＶＰ４−Ｐ２は、この生物学的アッセイにおいてＶＰ４蛋白質を模倣する。
【００９４】
ＥＬＩＳＡアッセイによって裏付けられたこれらの結果（ポイントＢ）は、ペプチドＶＰ４−Ｐ２（配列番号２）が、“促進”抗−ＶＰ４抗体によって認識される１または数個のエピトープを提示することを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１：５人の健康な被験体からのＣＶＢ／血漿誘発化ＩＦＮα産生に対する、ＶＰ４蛋白質またはＨ抗原の効果。
【００９６】
図１ａ：ＶＰ４ＣＶＢ３蛋白質の存在下での用量−依存ＣＶＢ３／血漿誘発化ＩＦＮα産生の減少。
【００９７】
図１ｂ：Ｈ抗原の存在下での用量−依存ＣＶＢ３／血漿誘発化ＩＦＮα産生の増加。
【００９８】
図１ｃ：ＶＰ４ＣＶＢ４蛋白質の存在下での用量−依存ＣＶＢ４／血漿誘発化ＩＦＮα産生の減少。
【００９９】
図１ｄ：Ｈ抗原の存在下での用量−依存ＣＶＢ４／血漿誘発化ＩＦＮα産生の増加。
【図２】図２：健康な被験体およびＩＤＤＭ患者の抗−ＶＰ４抗体の平均指数値の比較。
【図３】図３：健康なドナーからの血漿との種々のＣＶＢ血清型のインキュベーション後のＰＢＭＣによる平均ＩＦＮ−アルファ産生。
【図４】図４：ＤＥＬＦＩＡ法を使用しての、健康なドナーから得られた血漿の存在下での（黒）、またはＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４と共にプレインキュベートした血漿の存在下での（斜線）、ウイルスの種々の血清型でのＰＢＭＣの感染の間のＩＦＮα産生を測定することによる、活性化抗体の特異性の評価。
【図５】図５：ＣＶＢ４Ｅ２のＶＰ４またはＣＶＢ３のＶＰ４の存在下での、ＣＶＢ４Ｅ２またはＣＶＢ３でのＰＢＭＣの感染の間のＩＦＮα産生。
【図６】図６：プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２。
【図７】図７：健康な被験体の血漿および必要に応じて組換えＶＰ４の存在下で予めインキュベートしたＣＶＢ４Ｅ２でのＰＢＭＣの感染の間のＩＦＮα産生。
【０１００】
図７の凡例
１．RPMI培地
２．血漿
３．CVB4E2
４．VP4 1 μg/ml
５．血漿＋VP4
６．血漿＋CVB4E2
７．血漿＋VP4 0.01 μg/ml＋CVB4E2
８．血漿＋VP4 0.1 μg/ml＋CVB4E2
９．血漿＋VP4 1 μg/ml＋CVB4E2
１０．血漿＋VP4 10μg/ml＋CVB4E2。
【図８】図８：ＶＰ４およびペプチドVP4-P1、VP4-P2、VP4-P3、VP4-P5、VP4-P6の比較ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図９】図９：ＶＰ４およびペプチドＶＰ４−Ｐ２の比較ＥＬＩＳＡアッセイ（患者＝糖尿病患者からの４０血清の平均、コントロール＝非糖尿病患者からの４０血清の平均）。
【図１０】図１０：組換えＶＰ４、ＶＰ４およびペプチドＶＰ４−Ｐ２の比較ＥＬＩＳＡアッセイ（患者＝糖尿病患者からの４０血清の平均、コントロール＝非糖尿病患者からの４０血清の平均）。
【図１１】図１１：健康な被験体からの血漿および必要に応じてＶＰ４の存在下で予めインキュベートしたＣＶＢ４Ｅ２でのＰＢＭＣの感染の間のＩＦＮα産生。
【０１０１】
図１１の凡例：
１：培地
２：P2 (1μg/ml)
３：血漿 1/100th
４：CVB4E2
５：CVB4E2＋血漿1/100th＋培地
６：CVB4E2＋血漿1/100th＋VP4(1μg/ml)
７：CVB4E2＋血漿1/100th＋VP4-P2(1mg/ml)
８：CVB4E2＋血漿1/100th＋VP4-P2(0.1mg/ml)
９：CVB4E2＋血漿1/100th＋VP4-P2(0.01mg/ml)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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