(57)【要約】本発明の遺伝子ターゲッティングは細胞のゲノム中の１以上の特定位置へ遺伝子変化を導入する技術に関する。例えば、遺伝子ターゲッティングで、ターゲット遺伝子又は他の染色体ＤＮＡを修飾、修復、減衰又は不活性化することにより遺伝子変化を導入できる。又、本発明は、高い効率の細胞中遺伝子ターゲッティング法及び組成物に関する。本発明は又、それが必要な患者の遺伝病の治療及び予防方法に関する。更に本発明は、キメラヌクレアーゼをエンコードするキメラヌクレアーゼ及びベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)ＤＮＡ結合ドメイン；(ii)切断（制限）ドメイン；及び(iii)核局在化シグナルを含有するキメラヌクレアーゼ。
【請求項２】
上記ＤＮＡ結合ドメインは少なくとも６の指定ヌクレオチドを含有する認識配列へ結合する請求項１のキメラヌクレアーゼ。
【請求項３】
上記ＤＮＡ結合ドメインは少なくとも１のジンクフィンガードメインを含有する請求項１のキメラヌクレアーゼ。
【請求項４】
上記ＤＮＡ結合ドメインは３以上のジンクフィンガードメインを含有する請求項１のキメラヌクレアーゼ。
【請求項５】
上記切断ドメインはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有する請求項１のキメラヌクレアーゼ。
【請求項６】
上記切断ドメインはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有する請求項１のキメラヌクレアーゼ。
【請求項７】
上記ＤＮＡ結合ドメインは３ジンクフィンガードメインを含有し、９指定ヌクレオチドを含有する認識配列へ結合し、上記切断ドメインはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインである請求項１のキメラヌクレアーゼ。
【請求項８】
（ａ）切断ドメイン；及び（ｂ）少なくとも３のジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメイン，を含有するキメラヌクレアーゼであり；上記ＤＮＡ結合ドメインは、哺乳類ゲノム中の１つの位置で、少なくとも５００塩基対の、遺伝子障害の原因となる対立遺伝子内に起こる認識配列へ結合し、上記認識配列は少なくとも９ヌクレオチドを含有する；キメラヌクレアーゼ。
【請求項９】
第一キメラヌクレアーゼ及び第二キメラヌクレアーゼを含有する複合体であり；上記第一キメラヌクレアーゼは切断ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含有し、上記第二キメラヌクレアーゼは切断ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含有する；複合体。
【請求項１０】
上記第一キメラヌクレアーゼは少なくとも３のジンクフィンガードメインを含有し、少なくとも９指定ヌクレオチドを含有する配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを含有する請求項９の複合体。
【請求項１１】
上記第二キメラヌクレアーゼは少なくとも３のジンクフィンガードメインを含有し、少なくとも９指定ヌクレオチドを含有する配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを含有する請求項１０の複合体。
【請求項１２】
上記第一キメラヌクレアーゼ及び／又は第二キメラヌクレアーゼは更に核局在化シグナルを含有する請求項９の複合体。
【請求項１３】
(i)ＤＮＡ結合ドメイン；(ii)切断ドメイン；及び(iii)核局在化シグナル（ＮＬＳ）、を含有するキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３の核酸を含有するベクター。
【請求項１５】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸は、哺乳類細胞中の発現のためにプロモーターへ実施上結合している請求項１４のベクター。
【請求項１６】
上記プロモーターは誘起（開始）可能なプロモーターである請求項１５のベクター。
【請求項１７】
上記ベクターはウィルスベクターである請求項１４のベクター。
【請求項１８】
（ａ）切断ドメイン；及び（ｂ）少なくとも３のジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメイン、を含有するキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸であり：
上記ＤＮＡ結合ドメインは、哺乳類ゲノム中の１つの位置で、少なくとも５００塩基対の、遺伝子障害の原因となる対立遺伝子内に起こる認識配列へ結合し、上記認識配列は少なくとも９ヌクレオチドを含有する、核酸。
【請求項１９】
請求項１８の核酸を含有するベクター。
【請求項２０】
（ａ）第一キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、及び（ｂ）第二キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、を含有するベクターであり；上記第二キメラヌクレアーゼは上記第一キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成する、ベクター。
【請求項２１】
下記（１）および（２）を含有するベクター：
（１）(i)ＤＮＡ結合ドメイン；及び(ii)切断ドメイン、を含有するキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸；並びに
（２）(i)染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に対応する側面に存在する(franking)領域と実質的に同じ核酸配列；及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含む修復基質を含有する核酸。
【請求項２２】
上記キメラヌクレアーゼは更に核局在化シグナルを含有する請求項２１のベクター。
【請求項２３】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸は、プロモーターへ実施上結合している請求項２１のベクター。
【請求項２４】
上記プロモーターは誘起可能なプロモーターである請求項２３のベクター。
【請求項２５】
上記ベクターはウィルスベクターである請求項２３のベクター。
【請求項２６】
更に第二キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を含有し、上記第二キメラヌクレアーゼは上記キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成する請求項２１のベクター。
【請求項２７】
請求項１４のベクターを含有する細胞。
【請求項２８】
（ａ）キメラヌクレアーゼ及び（ｂ）修復基質を含有する哺乳類細胞であり；
上記キメラヌクレアーゼは(i)ＤＮＡ結合ドメイン及び(ii)切断ドメイン、を含有し：
上記修復基質は(i)染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含む；哺乳類細胞。
【請求項２９】
上記細胞はベクターを含有し、上記ベクターは（ａ）キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、及び（ｂ）修復基質をエンコードする核酸を含有する、請求項２８の細胞。
【請求項３０】
上記修復基質はベクター内のプロモーターへ実施上結合している請求項２８の細胞。
【請求項３１】
上記キメラヌクレアーゼはベクター内のプロモーターへ実施上結合している核酸によりエンコードされる請求項２８の細胞。
【請求項３２】
上記プロモーターは誘起可能なプロモーターである請求項３０の細胞。
【請求項３３】
上記プロモーターは誘起可能なプロモーターである請求項３１の細胞。
【請求項３４】
上記キメラヌクレアーゼは、更に核局在化シグナルを含有する請求項２８の細胞。
【請求項３５】
上記キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有する請求項２８の細胞。
【請求項３６】
上記切断ドメインはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有する請求項２８の細胞。
【請求項３７】
上記切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含有する請求項３６の細胞。
【請求項３８】
上記哺乳類細胞はヒト細胞である請求項２８の細胞。
【請求項３９】
上記細胞はin vitro細胞である請求項２８の細胞。
【請求項４０】
キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質を含有する核酸を含有する哺乳類細胞であり；上記キメラヌクレアーゼは(i)ＤＮＡ結合ドメイン及び(ii)切断ドメイン、を含有し；上記修復基質は(i)染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含む；哺乳類細胞。
【請求項４１】
(i)請求項１４のベクター、及び(ii)上記ベクターを細胞へデリバリーし、上記細胞を上記ベクターでトランスフェクトさせる遺伝子デリバリー組成物、を含有する組み換え型トランスフェクションシステム。
【請求項４２】
上記遺伝子デリバリー組成物は組み換え型ウィルス粒子、リポソーム、及びポリカチオン性核酸結合剤の群から選ばれる請求項４１の組み換え型トランスフェクションシステム。
【請求項４３】
下記（ａ）及び（ｂ）を含有する哺乳類細胞のゲノムＤＮＡ中のターゲット配列の変異導入方法であり、上記ターゲット配列は組み換えにおいて修復基質により変異導入される方法；
（ａ）キメラヌクレアーゼ、又はキメラ核酸をエンコードする核酸を細胞へ導入するステップ、但し上記キメラヌクレアーゼは(i)ＤＮＡ結合ドメイン及び(ii)切断ドメインを含有する；並びに
（ｂ）修復基質を上記細胞へ導入するステップ、但し上記修復基質は(i)ターゲット配列の周囲の領域と実質的に同じである核酸配列及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を変異導入する核酸配列を含有する。
【請求項４４】
上記ターゲット配列は、修復基質により修復される、病気の原因となる対立遺伝子を含有する請求項４３の方法。
【請求項４５】
上記ターゲット配列は修復基質により修飾される請求項４３の方法。
【請求項４６】
上記ターゲット配列は、修復基質により減衰されるか不活性化される遺伝子中に位置する請求項４３の方法。
【請求項４７】
上記ターゲット配列は修復基質中の非相同配列により置換される請求項４３の方法。
【請求項４８】
上記非相同配列は導入遺伝子のコード配列を含有する請求項の４７の方法。
【請求項４９】
上記ターゲット配列は導入遺伝子のコード配列は転写活性な部位で挿入されるように選択される請求項の４７の方法。
【請求項５０】
上記修復基質は、ベクター内のプロモーターへ実施上結合している請求項４３の方法。
【請求項５１】
上記キメラヌクレアーゼを細胞へ挿入するステップは、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を細胞へ挿入することを含有し、そのキメラヌクレアーゼは細胞中で生成される請求項４３の方法。
【請求項５２】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質は、細胞内へ導入される単一のベクター内に存在する請求項５１の方法。
【請求項５３】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸は、ベクター内のプロモーターへ実施上結合している請求項５１の方法。
【請求項５４】
上記プロモーターは誘起可能なプロモーターである請求項５３の方法。
【請求項５５】
上記キメラヌクレアーゼ蛋白質は蛋白質として細胞中に導入される請求項４３の方法。
【請求項５６】
上記キメラヌクレアーゼは、更に核局在化シグナルを含有する請求項４３の方法。
【請求項５７】
上記キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有する請求項４３の方法。
【請求項５８】
上記切断ドメインは制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有する請求項４３の方法。
【請求項５９】
上記切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含有する請求項５８の方法。
【請求項６０】
上記キメラヌクレアーゼは２つの同一のキメラヌクレアーゼのホモダイマーを形成する請求項４３の方法。
【請求項６１】
上記キメラヌクレアーゼは２つの異なるキメラヌクレアーゼのヘテロダイマーを形成する請求項４３の方法。
【請求項６２】
上記ターゲット配列は遺伝子ターゲッティングにより治癒される病気の原因に関与する対立遺伝子を含有する請求項４３の方法。
【請求項６３】
上記哺乳類細胞はin vitroヒト細胞である請求項４３の方法。
【請求項６４】
上記細胞はin vitro細胞である請求項４３の方法。
【請求項６５】
それが必要な個体中の、一部又は全部で遺伝子ターゲット配列により引き起こされた病気の改善、治療及び予防方法であり、上記方法は下記（ａ）及び（ｂ）を含有し、上記ターゲット配列は細胞中で変化させられ、病気が改善、治療又は予防される方法：
（ａ）キメラヌクレアーゼを細胞へ導入するステップであり、上記キメラヌクレアーゼは(i)ＤＮＡ結合ドメイン、及び(ii)切断ドメインを含有するステップ、並びに
（ｂ）修復基質を上記細胞へ導入するステップであり、上記修復基質は(i)染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含む、ステップ。
【請求項６６】
上記細胞は個体から得られたin vitro細胞であり、細胞又はその子孫はターゲット配列が変化した後に個体へ再び導入される請求項６５の方法。
【請求項６７】
上記細胞は幹細胞又は幹細胞を含有する細胞集団である請求項６５の方法。
【請求項６８】
上記細胞はドナーから得られたin vitro細胞である請求項６５の方法。
【請求項６９】
上記細胞はターゲット配列が変化した後に個体へ再び導入される請求項６８の方法。
【請求項７０】
上記細胞は幹細胞又は幹細胞を含有する細胞集団である請求項６８の方法。
【請求項７１】
上記細胞は個体中のin vivo細胞である請求項６５の方法。
【請求項７２】
上記キメラヌクレアーゼを細胞へ導入するステップは、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含む請求項７１の方法であり、キメラヌクレアーゼは細胞中で生成される方法。
【請求項７３】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質は、細胞内へ導入される単一のベクター内に存在する請求項７２の方法。
【請求項７４】
上記修復基質は、ベクター内のプロモーターへ実施上結合している請求項６５の方法。
【請求項７５】
上記キメラヌクレアーゼを細胞へ挿入するステップは、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を細胞へ挿入することを含む請求項６５の方法であり、キメラヌクレアーゼは細胞中で生成される方法。
【請求項７６】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸はベクター内のプロモーターへ実施上結合している請求項６５の方法。
【請求項７７】
上記プロモーターは誘起可能なプロモーターである請求項７６の方法。
【請求項７８】
上記キメラヌクレアーゼは蛋白質として個体の細胞中へ直接導入される請求項６５の方法。
【請求項７９】
上記キメラヌクレアーゼは、更に核局在化シグナルを含有する請求項６５の方法。
【請求項８０】
上記キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有する請求項６５の方法。
【請求項８１】
切断ドメインは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有する請求項６５の方法。
【請求項８２】
上記切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含有する請求項８１の方法。
【請求項８３】
上記キメラヌクレアーゼは２つの同一のキメラヌクレアーゼのホモダイマーを形成する請求項６５の方法。
【請求項８４】
上記キメラヌクレアーゼは２つの異なるキメラヌクレアーゼのヘテロダイマーを形成する請求項６５の方法。
【請求項８５】
上記個体はヒトである請求項６５の方法。
【請求項８６】
上記病気は重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、及び血友病の群から選ばれる請求項６５の方法。
【請求項８７】
上記病気は感染症であり、遺伝子ターゲット配列は感染症に対する個体の罹患性に影響する請求項６５の方法。
【請求項８８】
上記感染症はＨＩＶ感染であり、遺伝子ターゲット配列はＨＩＶによる細胞侵入に関与する細胞表面蛋白質のための遺伝子の少なくとも一部であり、ターゲット配列を変異導入してＨＩＶによる細胞侵入を阻止する請求項８７の方法。
【請求項８９】
上記細胞はＴ細胞又はＴ前駆細胞である請求項８８の方法。
【請求項９０】
下記ステップを含有する、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸の設計方法：
（ａ）遺伝子ターゲッティング用に哺乳類ターゲット配列を選択するステップ；
（ｂ）ターゲット配列の実行可能な近傍内の可能なＤＮＡ結合配列を特定するステップ；
（ｃ）上記（ｂ）で特定されたＤＮＡ結合配列へ結合するＤＮＡ結合ドメインをエンコードする核酸を設計するステップ；及び
（ｄ）上記（ｃ）のＤＮＡ結合ドメインをエンコードする核酸を、切断ドメインをエンコードする核酸とカップリングして、キメラヌクレアーゼのコード配列を含有する核酸を作成するステップ。
【請求項９１】
更に核局在化シグナルをエンコードする核酸を、キメラヌクレアーゼのコード配列を含有する核酸とカップリングする請求項９０の方法。
【請求項９２】
上記ＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガー結合ドメインを含有する請求項９０の方法。
【請求項９３】
上記切断ドメインはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有する請求項９０の方法。
【請求項９４】
切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含有する請求項９３の方法。
【請求項９５】
更に下記ステップを含有する請求項９０の方法：
（ｅ）ターゲット配列の実行可能な近傍にあり、第二の、可能なＤＮＡ結合配列へ結合したキメラヌクレアーゼが上記（ｂ）の可能なＤＮＡ結合配列へ結合したキメラヌクレアーゼと協同的に作用するような位置にある、第二の可能なＤＮＡ結合配列を選択するステップ；及び
（ｆ）第二の、可能なＤＮＡ結合配列へ結合し、上記（ｄ）の核酸によりエンコードされたキメラヌクレアーゼと協同的に作用するキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を生成するステップ。
【請求項９６】
更に、細胞中のキメラ酵素の毒性を試験するステップを含有する請求項９０の方法。
【請求項９７】
更にキメラ酵素の切断部位特異性を試験するステップを含有する請求項９０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願；
本出願は米国予備出願番号６０／４０８４５４、２００２年９月５日出願、６０／４１９３４１、２００２年１０月１７日出願及び６０／４８４７８８、２００３年７月３日出願の優先権を主張する。上記３つの出願の明細書はその全てを資料として使用する。
資金援助；
本発明は国立衛生研究所認可番号第ＲＯ１−ＧＭ３９４５８により支援された。米国政府は本発明の所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子ターゲッティングは遺伝子変化を特定位置細胞のゲノム中へ導入する技術である。目的とする遺伝子変化の導入は、強力な実験的アプローチ及び病気の遺伝面での改善治療技術として使用できる。遺伝子ターゲッティングは、多くのプロセスの遺伝子制御への研究を促進するため、ネズミ胚幹細胞（ＥＳ細胞）及びニワトリＢ−セルラインＤＴ４０等のある種の又は他の特殊化したセルタイプにおいて広く使用されている。遺伝子ターゲッティングは又、可能性のある遺伝子治療の強力な実行方法を示す。例えば、血友病、テイ‐サックス病、デュシェーヌ筋ジストロフィー病デュシェーヌ筋ジストロフィー病、ハンティングトン病、アルファ地中海貧血、レッシュ−ナイハン症候群等の３０００以上の病気が、突然変異により引き起こされる。これらの病気の多くは医学的に治療できる。遺伝子ターゲッティングがヒト用に利用できれば、これらの遺伝病の多くを治癒するために使用できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
哺乳類細胞へ導入された遺伝子は、主に非相同部位で細胞のＤＮＡ中に統合されることが知られている。従って、突然変異された遺伝子を置換する代わりに、野生種コピーがＤＮＡ中の別の座（部位）へ導入されてしまう。遺伝子治療に使用されてきたセルタイプでは、遺伝子ターゲッティングの確率は非常に低い。従って、遺伝子ターゲッティングの効率を上昇させ、それがセルタイプ中で遺伝子治療を含む実験的及び治療的目的で使用できるようにする技術の発展が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一部は、細胞内の、及び特に哺乳類細胞中の遺伝子ターゲッティング法及びその組成物の発見に基礎を置く。本発明の方法及び組成物は、例えば変異導入する細胞のゲノム中の１以上の選択した配列を変異導入するために使用できる。変異導入として、１以上の塩基対中の削除、挿入（全遺伝子も可能）又は交換、並びに数個の異なる交換の組み合わせが挙げられる。変異導入は種々の可能な目的の達成のためになされ、例えば、対象患者の遺伝子障害の改善、対象患者又は細胞への望ましい遺伝子型の提供、患者又は細胞中の有益なポリペプチドの生成又は活性化の増加、患者又は細胞中の望ましくないポリペプチド生成又は活性化の減少、及び非ヒト有機体又はセルタイプ中の遺伝子変化の効果の研究が挙げられる。
【０００５】
例えば、本発明は、哺乳類細胞等の細胞のゲノムＤＮＡ中のターゲット配列の交換方法を提供する。これらの方法は下記を含有する：
（ａ）キメラヌクレアーゼを細胞へ導入するステップであり、上記キメラヌクレアーゼは：（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｉｉ）切断ドメインを含有する；並びに
（ｂ）修復基質を上記細胞へ導入するステップであり、上記修復基質は（ｉ）ターゲット配列の片側又は両側領域と実質的に同じ核酸配列及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を変異導入する核酸配列を含み、ターゲット配列は組み換えにおいて修復基質により交換される。任意で、ターゲット配列は遺伝病等の病気の原因となる対立遺伝子を含み、ターゲット配列が修復基質により修復されるように選ばれてもよい。しかし、本発明の方法は又ゲノム配列中の本質的に望ましい交換を導入するために使用でき、例えば、発現用の導入遺伝子等の新規な配列の導入、遺伝子の不活性化又は減衰、及び改良されたフェノタイプを提供する配列交換の導入が挙げられる。例えば、細胞はin vitro細胞でもよい。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【０００６】
例えば、本発明の方法でターゲット配列は、修復基質により修飾される。例えば、ターゲット配列中で病気の原因となるターゲット配列中の対立遺伝子は、修復基質により修復できる。又、本発明の方法でターゲット配列は修復基質により減衰され又は不活性化される。例えば、ターゲット配列は、遺伝子の一部中に位置しており、配列の変異導入は、遺伝子発現を減少させ又は遺伝子生成物の活性又は安定性を減少させる。又、本発明の方法で好ましくは、ターゲット配列は、非相同配列（修復基質中）で置換され、又はそれを中に挿入されてもよい。例えば、非相同配列は細胞中の発現を目的とする導入遺伝子でもよい。変異導入配列中の挿入、削除、又は交換の形、又はそれらの混合中でもよい。任意で、本発明のキメラヌクレアーゼ及び修復基質は、単一の細胞内へ導入されるベクターによりエンコードされてもよい。特に好ましくは、本発明の方法のキメラヌクレアーゼは更に核局在化シグナルを含有してもよい（ＮＬＳ）。
【０００７】
又、本発明の方法の修復基質はベクター内のプロモーターへ実施上結合されていてもよい。又、本発明の方法のキメラヌクレアーゼは、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸の導入により細胞へ導入してもよい。任意で、上記核酸はプロモーターへ実施上結合されてもよい。好ましくは、上記プロモーターは誘起（開始）可能なプロモーターである。任意で、ベクターはウィルスベクターであり、個体（患者）中へ導入するよう設計されたベクターでもよい。好ましくは、本発明の方法は、キメラヌクレアーゼ蛋白質又はキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸のいずれかを細胞中へ導入することを目的とする。
【０００８】
又、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有してもよい。特に、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは２又は３以上のジンクフィンガードメインを含有してもよい。又、キメラヌクレアーゼの切断ドメインは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメイン）の切断ドメイン等の制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい。任意で、本発明の方法のキメラヌクレアーゼは、２つの同一のキメラヌクレアーゼのホモダイマー又は２つの異なるキメラヌクレアーゼのヘテロダイマーを形成してもよい。好ましくは、本発明の方法は、更に第二キメラヌクレアーゼをエンコードし、上記第二キメラヌクレアーゼは上記キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成する核酸の使用方法を目的とする。
【０００９】
例えば、本発明の方法は患者を感染症に罹患しやすくしている遺伝子ターゲット配列を変異導入するために使用できる。例えば、多くのウィルス及び病原菌は、細胞表面及び細胞内蛋白質の一定の組み合わせへ結合し利用することにより細胞中に侵入する。遺伝子ターゲッティングはこれら結合部位又は侵入機構を排除又は減衰するために使用されてもよい。ターゲット遺伝子は、例えばＴ細胞中へのＨＩＶ侵入に関与するＣＣＲ５遺伝子である。ＨＩＶに罹患しているかＨＩＶ感染に罹患しやすい個体の細胞は、ＨＩＶの細胞侵入能力を減少させるように治療することができる。例えば、細胞は造血幹細胞等のＴ細胞又はＴ前駆細胞でもよい。
【００１０】
又、本発明の方法は、遺伝子を細胞中で発現させるために導入するためにも使用できる。例えば、必要な遺伝子生成物のレベルの減少により引き起こされた遺伝病は、必要とされた遺伝子生成物を発現する遺伝子の導入の提供により治療され又は改善される。導入遺伝子は、内因性遺伝子の位置、又は異なる位置をターゲットとしてもよい。本発明の方法では、好ましくは目的の部位は染色体中の転写活性のある位置、又は「オープン位置」である。本発明の「オープン位置」は転写をサポートすることが知られている特定の染色体位置を言う。
【００１１】
又、本発明は、その病気が遺伝子ターゲット配列により一部又は全部で引き起こされた個体中の病気の改善、治療及び予防方法を提供する。これらの方法は下記を含有する方法であり、遺伝病が改善、治療又は予防される方法である：
（ａ）キメラヌクレアーゼを細胞へ導入するステップであり、上記キメラヌクレアーゼは（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｉｉ）切断ドメインを含有するステップ；並びに
（ｂ）修復基質を目的の部位へ導入するために適切な条件下で、修復基質を細胞へ導入するステップであり、上記修復基質は（ｉ）染色体ＤＮＡ中のターゲット配列の近位又はそれに対応する側面に存在する１以上の領域と実質的に同じ核酸配列及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含む、ステップ。好ましくは、個体はヒトである。例えば、キメラヌクレアーゼは更に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有してもよい。
【００１２】
例えば、本発明の細胞は個体から得られたin vitro細胞でもよい。「得られた」とは、本発明の細胞は厳密に、個体又はそれから得られた細胞から、有糸分裂、細胞融合、細胞分化等を通して取り出された細胞であることを言う。任意で、本発明の方法は更に、キメラヌクレアーゼ及び修復基質で治療された細胞は再び個体へ導入されることを含む。又、細胞は幹細胞又は幹細胞を含有する細胞集団である。
好ましくは本発明の方法では、遺伝病は重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、及び血友病の群から選ばれる．
【００１３】
特に好ましくは、本発明の方法の細胞はドナーから得られたin vitro細胞でもよい。任意で、本発明の方法は更にキメラヌクレアーゼ及び修復基質で治療された細胞が個体へ再び導入されることを含んでもよい。又、細胞は幹細胞又は幹細胞を含有する細胞集団でもよい。
又、本発明の方法の細胞は個体中のin vivo細胞でもよい。任意で、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質は細胞を含有するターゲット組織へ直接導入されてもよい。
例えば本発明の方法では、キメラヌクレアーゼ及び修復基質は、単一の細胞内へ導入されるベクターによりエンコードされてもよい。
又、本発明の方法の修復基質は、ベクター内のプロモーターへ実施上結合されてもよい。
【００１４】
又、本発明の方法のキメラヌクレアーゼは、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸の導入により細胞中へ導入されてもよい。
任意で、本発明の核酸はプロモーターへ実施上結合されてもよい。好ましくは、これらプロモーターは誘起可能なプロモーターでもよい。任意で、ベクターはウィルスベクターでもよい。好ましくは、本発明の方法は、キメラヌクレアーゼ蛋白質又はキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を細胞中へ導入することを目的とする。
又、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有してもよい。特に、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、２、３以上のジンクフィンガードメインを含有してもよい。又、キメラヌクレアーゼの切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメイン等の制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい。任意で、本発明の方法のキメラヌクレアーゼは、２つの同一のキメラヌクレアーゼのホモダイマー又は２つの異なるキメラヌクレアーゼのヘテロダイマーを形成してもよい。好ましくは、本発明の方法は、更に第二キメラヌクレアーゼをエンコードし、上記第二キメラヌクレアーゼは上記キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成する核酸の使用方法を目的とする。
【００１５】
又、本発明は、キメラヌクレアーゼ又はキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸の設計方法を提供する。これら方法は、下記ステップを含有してもよい：（ａ）遺伝子ターゲッティング用に哺乳類ターゲット配列を選択するステップ；（ｂ）ターゲット配列の実行可能な近傍内の可能なＤＮＡ結合配列（ターゲット配列中の可能な結合部位を含む）を特定するステップ；（ｃ）上記（ｂ）で特定されたＤＮＡ結合配列へ結合するＤＮＡ結合ドメインを設計するステップ；及び（ｄ）上記（ｃ）のＤＮＡ結合ドメインを切断ドメインとカップリングして、キメラヌクレアーゼを作成するステップ。任意で、上記カップリングは、ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインを含有する融合蛋白質をエンコードする核酸の生成により達成されてもよい。例えば、本発明の方法は更にキメラヌクレアーゼへのカップリング核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有してもよい。
【００１６】
又、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有してもよい。キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは３以上のジンクフィンガードメインを含有してもよい。又、キメラヌクレアーゼの切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメイン等の制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい。任意で、本発明の方法のキメラヌクレアーゼは、２つの同一のキメラヌクレアーゼのホモダイマー又は２つの異なるキメラヌクレアーゼのヘテロダイマーを形成してもよい。好ましくは、本発明の方法は、更に第二キメラヌクレアーゼをエンコードし、上記第二キメラヌクレアーゼは上記キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成する核酸の使用方法を目的とする。
好ましくは、本発明の方法は更に細胞中のキメラ酵素の毒性の試験するステップを含有してもよい。特に好ましくは、本発明の方法は更にキメラ酵素の切断部位特異性の試験するステップを含有してもよい。
【００１７】
例えば、本発明は新規なキメラヌクレアーゼ及び２以上のキメラヌクレアーゼを含有する複合体に関する。例えば、本発明は（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン；（ｉｉ）切断ドメイン；及び（ｉｉｉ）核局在化シグナルを含有するキメラヌクレアーゼを提供する。任意で、キメラヌクレアーゼは、３、６、９以上の指定ヌクレオチドを含有する認識配列へ結合するＤＮＡ結合ドメインを含有してもよい。任意で、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、１、２、３以上のジンクフィンガードメインを含有してもよい。キメラヌクレアーゼの切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメイン等のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい。キメラヌクレアーゼの好ましいタイプの例として、核局在化シグナル、３ジンクフィンガードメインを含有し、９指定ヌクレオチドを含有する認識配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを含有し、更にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有するキメラヌクレアーゼが挙げられる。
【００１８】
例えば、本発明は、（ａ）切断ドメイン及び（ｂ）少なくとも３のジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラヌクレアーゼを提供し、上記ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも５００塩基対内、好ましくは少なくとも２００塩基対内、更に好ましくは少なくとも１００塩基対内の、遺伝子障害の原因となる対立遺伝子の哺乳類ゲノム中の位置で起こる認識配列へ結合し、上記認識配列は少なくとも９ヌクレオチドを含有する。
【００１９】
例えば、本発明は、協同的に作用するキメラヌクレアーゼも遺伝子ターゲッティングに有利に使用できるという発見に関する。従って例えば、本発明は、第一キメラヌクレアーゼ及び第二キメラヌクレアーゼを含有する複合体であり、第一及び第二キメラヌクレアーゼは協同的に作用して遺伝子ターゲッティングを促進する複合体を提供する。任意で、第一及び第二キメラヌクレアーゼは同一でもよい。例えば、１又は両方の第一及び第二キメラヌクレアーゼが核局在化シグナルを含有してもよい。
【００２０】
例えば、本発明は、本発明のキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、及びその核酸を含有するベクターを提供する。ベクターは、例えばin vitro細胞で使用するために、又は有機体の一部である細胞中へ導入するために設計される。例えば、本発明は、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質をエンコードする核酸を含有するベクターを提供し；上記キメラヌクレアーゼは（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｉｉ）切断ドメインを含有し；及び上記修復基質は（ｉ）染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に近位の又は対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含有するベクターする。
【００２１】
又、上記ベクター内の修復基質はプロモーターへ実施上結合されていてもよい。同様に、ベクター内のキメラヌクレアーゼは、プロモーターへ実施上結合している核酸によりエンコードされてもよい。好ましくは、プロモーターは、誘起可能なプロモーターでもよい。任意で、ベクターはウィルスベクターである。
更に、本発明のベクターは、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質を含有する核酸の両方を含有してもよい。
又、ベクター内でエンコードされるキメラヌクレアーゼは、更に核局在化シグナルを含有する（ＮＬＳ）。
【００２２】
例えば、本発明は、上記キメラヌクレアーゼ蛋白質、エンコード核酸及びベクターのいずれかを含有する細胞を提供する。例えば、キメラヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ、及び修復基質を含有する哺乳類細胞である。上記キメラヌクレアーゼは、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ｉｉ）切断ドメインを含有してもよい。上記修復基質は、（ｉ）染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に近位の又は対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含有してもよい。任意で、染色体ＤＮＡ中のターゲット配列を突然変異を含有してもよい。例えば、哺乳類細胞はin vitro細胞でもよい。好ましくは、哺乳類細胞はヒト細胞である。例えば、哺乳類細胞は、比較的短い間、好ましくは目的の遺伝子変化が効果を奏するのに充分であるが細胞の生存能力を損なうほど長くない期間、キメラヌクレアーゼ及び修復基質を含有する。
【００２３】
又、哺乳類細胞中の修復基質は、ベクター内のプロモーターへ実施上結合していても、同様に、哺乳類細胞中のキメラヌクレアーゼがベクター内のプロモーターへ実施上結合している核酸によりエンコードされてもよい。好ましくは、プロモーターは誘起可能なプロモーターであるが、他のプロモーターを使用してもよい。任意で、ベクターはウィルスベクターである。
例えば、本発明の哺乳類細胞は、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質をエンコードする核酸を含有するベクターを含有してもよい。
又、哺乳類細胞中のキメラヌクレアーゼは核局在化シグナルを含有してもよい（ＮＬＳ）。
又、本発明は、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質を含有する哺乳類細胞であり、上記キメラヌクレアーゼは（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｉｉ）切断（制限）ドメインを含有し：上記修復基質は（ｉ）染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に近位の又は対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列、及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含有する哺乳類細胞を提供する。
【００２４】
又、本発明は、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）切断ドメイン、及び（ｉｉｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を提供する。好ましくは、本発明は、上記核酸を含有するベクターを提供する。又、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸は、哺乳類細胞中の発現のためにプロモーターへ実施上結合されていてもよい。好ましくは、上記プロモーターは誘起可能なプロモーターである。任意で、上記ベクターウィルスベクターである。
又、本発明のベクターのキメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガードメインを含有してもよい。特に、キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、２、３以上のジンクフィンガードメインを含有してもよい。又、キメラヌクレアーゼの切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメイン等の制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい。任意で、ベクター内のキメラヌクレアーゼは、２つの同一のキメラヌクレアーゼのホモダイマー又は２つの異なるキメラヌクレアーゼのヘテロダイマーを形成してもよい。好ましくは、本発明のベクターは、更に第二キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸であり、上記第二キメラヌクレアーゼは上記キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成してもよい。
【００２５】
又、本発明は、in vitro哺乳類細胞を提供する。これら哺乳類細胞は、キメラヌクレアーゼをエンコードする本発明の核酸ベクターを含有してもよい。キメラヌクレアーゼは（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）切断ドメイン、及び（ｉｉｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有してもよい。好ましくは、上記in vitro哺乳類細胞はヒト細胞である。
又、本発明は、in vitro哺乳類細胞を提供する。上記哺乳類細胞は、本発明のキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質をエンコードする核酸を含有する核酸ベクターを含有してもよく、上記キメラヌクレアーゼは（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｉｉ）切断ドメインを含有し；上記修復基質は（ｉ）染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に近位の又は対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列を含有する。好ましくは、上記in vitro哺乳類細胞はヒト細胞である。
【００２６】
又、本発明は、組み換え型トランスフェクションシステムを提供する。上記トランスフェクションシステムは、（ｉ）上記本発明のベクター、及び（ｉｉ）上記ベクターを細胞へデリバリーし、細胞をベクターでトランスフェクトする遺伝子デリバリー組成物を含有する。好ましくは、遺伝子デリバリー組成物は、組み換え型ウィルス粒子、リポソーム、及びポリカチオン性核酸結合剤の群から選ばれる。
【００２７】
例えば、本発明は遺伝子ターゲッティングサービス業を行う方法を提供する。本発明の方法は、例えば、特定の遺伝子又はゲノム領域中の交換を起こすためキメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質の顧客要求を受領することを含む。上記要求の受領において、サービス供給者は、キメラヌクレアーゼにより認定されることの可能な目的とする領域中の配列を特定し、適切なヌクレアーゼをエンコードする核酸を設計し、キメラヌクレアーゼ、エンコードする核酸（好ましくは発現ベクター内）及びエンコードする核酸の配列のいくつか又は全てを顧客（患者）へ伝達する。同様に、サービス供給者は、顧客用の修復基質を設計し、創造してもよい。任意で、本発明の方法は、効果的なキメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質を選択するために、１以上の試験遺伝子ターゲッティング試行を実行することを含んでもよい。任意で、サービス供給者は遺伝子ターゲッティングを行い、１以上の変異導入された細胞を含有する変異導入された細胞又は有機体全体を顧客中へ供給してもよい。
【００２８】
例えば、本発明は遺伝子ターゲッティング用キットを提供する。上記キットは修復基質カセットベクター、例えば制限酵素認識部位又はクローニングを促進する他の部位（例えば、リコンビナーゼ、トポイソメラーゼ又はインテグラーゼにより作用される部位）が側面に存在する１、２以上のマーカー遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカー）を含有するベクターを含有してもよい。キットは又、キメラヌクレアーゼカセットベクター、例えば分離されて別々に修飾可能なヌクレアーゼ及び認識ドメインを含有するヌクレアーゼ用遺伝子を含有するベクターを含有してもよい。任意で、上記認識ドメインは、認識ドメインの交換の促進のために制限酵素認識部位（好ましくは最低限目的のアミノ酸配列に影響するもの）を含むように設計される。キットは適切なキメラヌクレアーゼの構成方法及び／又は遺伝子ターゲッティングの実施方法を説明した詳細な指示書を含有してもよい。
本発明の態様及び実施、他の態様及びその構成、特徴は、明細書、図面及び請求の範囲により明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
Ｉ．概説
例えば、本発明は、哺乳類細胞での改良された効率を有する。遺伝子ターゲッティング法及び組成物を提供する。
遺伝子ターゲッティングは、予定したゲノム部位のヌクレオチド配列が目的とした配列を有する外因性の核酸を導入して選択的に変異導入されるプロセスである。特定の機構に規定することで本発明を限定するものではないが、一般的に選択的修飾は相同組み換えにより起こると考えられる。部分的遺伝子重複、遺伝子置換、及び遺伝子ノックアウト（手段）がこの技術により創造され、修飾された遺伝子はその正常な染色体座に存在する長所を有する（Ｔｈｏｍａｓら、１９８７、細胞、５１：５０３−５１２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２８８−１２９２；Ｋｏｌｌｅｒら、１９９２、ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ、１０：７０５−７３０）。高等生物中、及び特に哺乳類細胞中では、非常に低頻度、通常細胞当たり１０-6の範囲の結果しか達成できなかった。更に、遺伝子ターゲッティングは、通常の１００〜１０００倍である、外因性の核酸配列がゲノム上の非選択的位置で挿入されたことを示す非相同結果の従来技術に対して発生した（Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８−３５２）。
【００３０】
近年ターゲット遺伝子中のＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）の発生は、ダイレクトリピート組み換え及び遺伝子ターゲッティングの両方の頻度を数千倍増加できることが発見された（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３：３６０８−３６１２；Ｃｈｏｕｌｉｋａら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９６８−１９７３；Ｄｏｎｏｈｏら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４０７０−４０７８；Ｒｏｕｅｔら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−８１０６；Ｓａｒｇｅｎｔら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２６７−２７７；Ｓｍｉｈら、１９９５、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：５０１２−５０１９；Ｔａｇｈｉａｎら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：６３８６−６３９３）。本発明で記載したように、発明者は、条件がＤＳＢ−仲介遺伝子ターゲッティング用に最適化された時、遺伝子ターゲッティングの頻度は、３〜５％に達することを発見した（同様に、Ｐｏｒｔｅｕｓら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００：７６３参照）。従って、ＤＳＢは、遺伝子ターゲッティング機構の中心構成要素であると思われる。目的の部位での二重鎖切断（開裂）は、ヌクレアーゼ、又は目的の部位を認識して切断する化学的成分により達成されることができる。目的の部位を認識して切断する化学的成分の例は、Ｄｅｒｖａｎらが記載しており、例えば米国特許番号第４６６５１８４、４９４２２２７、４７９５７００、及び５７８９１５５が挙げられ、その全てを資料として使用する。目的の部位での二重鎖切断は又、キメラヌクレアーゼによっても本発明のように達成できる。
【００３１】
ＩＩ．定義
便宜上、明細書、実施例、及び請求の範囲に記載された特定の用語をここに集めた。これら及び他の用語は、この記載中定義され記載される。特記しない限り、ここで記載される技術的及び科学的用語は当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
ここで使用される「対立遺伝子」は、同一種のメンバー間で変化できる配列のいずれをも言う。例えば、対立遺伝子は、単一のヌクレオチド多型、大又は小削除、大又は小挿入、大又は小逆位又はその組み合わせでもよい。
ここで使用される、本発明の方法で治療される「患者」、「個体」又は「対象患者」はヒトでも非ヒト動物でもよい。
【００３２】
「エンコードする」は、その用語が通常使用される場合は、文脈から明らかでない限りポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列、又は、抑制的アンチセンス分子へ転写されたＤＮＡ配列を含むことを意味する。
遺伝子配列に関する「発現」は、得られたｍＲＮＡ転写の蛋白質への適切な翻訳としての遺伝子の転写を言う。
従って、本発明では蛋白質コード配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳から得られる。
ここで使用される「ヌクレアーゼ」は、ポリペプチド、又はポリペプチドを含有する複合体であり、ゲノムＤＮＡ中に二重鎖切断を生成できるものをいう。
ヌクレアーゼの例として、制限エンドヌクレアーゼ、キメラヌクレアーゼ並びにある種のトポイソメラーゼ及びリコンビナーゼが挙げられる。
ここで使用される「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、適切な場合はリボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチドを言う。この用語は例えば、記載された態様に適用可能である、単鎖（センス又はアンチセンス等）及び二重鎖ポリヌクレオチドを示す。この用語は、天然由来ヌクレオチド及び人工的に修飾されたヌクレオチドの両方が含まれる。
【００３３】
２つのＤＮＡ領域の間の関係に関して記載された「実施上結合している」とは、単にそれらが互いに機能的に関連（結合）していることを意味する。例えば、プロモーター又は他の転写調節塩基配列は、それがコード配列の転写を調節する場合には、コード配列へ実施上結合している。
ここで使用される「目的の部位」及び「特定の部位」は、そこに二重鎖切断（開裂）が導入され、それによりその座において高度に効率的組み換え事象へ導く細胞修復機構を誘起する、区別された染色体位置を言う。
【００３４】
ここで使用される「ターゲット配列」及び「ターゲット遺伝子」は、遺伝子ターゲッティングによる変異導入用に選ばれた染色体中のポリヌクレオチド配列又は遺伝子を言う。言い換えると、ヌクレオチド交換は、遺伝子又はゲノム配列の一部ではない部位のいずれかに導入される。又、ターゲット配列／遺伝子は、修復された又は置換される必要のある突然変異を含有する。又、ターゲット遺伝子は、非相同配列／遺伝子により減衰され、不活性化され、又は置換される必要がある。本発明の高い確率の遺伝子ターゲッティングを達成するために、ターゲット配列の実行可能な近傍又はターゲット配列中の目的の部位は、酵素がこの部位又はその近傍で二重鎖切断を行えるように、キメラヌクレアーゼにより認識可能なＤＮＡ結合配列を含有する。
「転写調節塩基配列」は本明細書中で使用される遺伝子的用語であり、それらが実施上結合している、コード配列の転写を誘起（開始）又は調節する、開始シグナル、エンハンサー、及びプロモーター等のＤＮＡ配列を表す。
【００３５】
ここで使用される「形質導入」及び「トランスフェクション」は、当業者に理解されるとおり、核酸仲介遺伝子導入による、レシピエント細胞への発現ベクター等の核酸の導入を意味する。ここで使用される「形質転換」は、外因性のＤＮＡ又はＲＮＡの細胞による取り込みの結果として細胞の遺伝子型が交換されるプロセスを言う。細胞は、核酸構成が娘細胞により遺伝出来る場合、核酸構成と共に「安定してトランスフェクト」されたといえる。「一過性トランスフェクション」は、外因性のＤＮＡがトランスフェクトされた細胞のゲノム中に統合されない場合を言う。例えば、エピソーム性ＤＮＡがｍＲＮＡ中に転写され、蛋白質中に翻訳される場合が挙げられる。
【００３６】
ＩＩＩ．ヌクレアーゼ
例えば、本発明は、染色体ＤＮＡ中のターゲット配列細胞中の目的の部位で二重鎖切断を生成するために使用できる、ヌクレアーゼ、及び特にキメラヌクレアーゼを提供する。
キメラヌクレアーゼは、染色体中の１以上の選ばれた部位で二重鎖切断を形成するために設計されたキメラ蛋白質である。本発明のキメラヌクレアーゼは、１以上の特定のＤＮＡ結合ドメイン及び１以上の「切断」ドメインを含有する。上記ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合特異性を提供し、一方切断ドメインは二重鎖切断活性を提供する。キメラヌクレアーゼは、融合蛋白質として、又はＤＮＡ結合ドメインを切断ドメインへ結合することにより製造できる。
【００３７】
種々のＤＮＡ結合ドメインは当分野で公知であり、充分な特異性を有する目的部位を認識するＤＮＡ結合ドメインならいずれも使用できる。本発明のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー結合ドメインでもよい。
切断ドメインは、ＤＮＡ切断活性を有するヌクレアーゼから得られてもよい。切断ドメインを有する蛋白質タイプの例として、制限酵素、トポイソメラーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ及びＤＮＡアーゼが挙げられる。キメラヌクレアーゼの構成は、切断ドメインが配列認識及びＤＮＡ切断用の分離されたドメインを有するヌクレアーゼから得られた場合には、一般的に単純化される。例えば、切断ドメインは、ＦｏｋＩ制限酵素（「Ｆｎ」）の切断ドメイン等のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼから得られてもよい。このグループの酵素は一般的に、分離された切断及び配列認識ドメインを有する。従って、好ましくは、キメラヌクレアーゼは、特定のジンクフィンガー結合ドメイン及びＦｏｋＩ制限酵素の切断ドメイン（ここで同様にＦｏｋＩ切断ドメインという）を含有する融合蛋白質である。
【００３８】
Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2ジンクフィンガーは、本発明において特に重要である。その場合、それぞれのフィンガーは、一定の形式のＤＮＡの主要な３個の連続する塩基対と接触する（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：８０９−８１７；Ｂｅｒｇら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：１０８１−１０８５）。フィンガーの数及びＤＮＡへ直接的に接触している重要なアミノ酸残基の性質を変更することにより、新規な特異性を有する結合ドメインが発生し、選ばれる（参照、例えば、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：７３４５−７３４９；Ｒｅｂａｒら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：６７１−６７３；Ｇｒｅｉｓｍａｎら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：６５７−６６１；Ｓｅｇａｌら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：２７５８−２７６３）。原則として、非常に広い範囲のＤＮＡ配列がジンクフィンガー蛋白質の特定の認識ターゲットとして作用することが出来る。ジンクフィンガー認識に基づく幾つかの異なる特異性を有するキメラヌクレアーゼが既に構成され、特定されている（参照、例えば、Ｈｕａｎｇら、１９９６、Ｊ．蛋白質Ｃｈｅｍ．１５：４８１−４８９；Ｋｉｍら、１９９８、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４８９−４９５）。
【００３９】
本発明は又、天然及び転写因子等の合成ＤＮＡ結合蛋白質から得られるＤＮＡ結合ドメインと、ＦｏｋＩ切断ドメイン又は他の非特定の切断ドメインとを結合するキメラヌクレアーゼを目的とする。これらキメラヌクレアーゼでは、ＤＮＡ切断は部位結合ドメインにより認識された部位を対象とし、従ってターゲット特異性の操作が可能となる。これらキメラヌクレアーゼの製造方法は当分野で開示されている（参照、例えば、Ｋｉｍら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９１：８８３−８８７；Ｈｕａｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１５：４８１−４８９；Ｋｉｍら、１９９８、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４８９−４９５；Ｎａｈｏｎら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１２３３−１２３９；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００１、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２１：２８９−２９７）。
好ましくは、本発明のキメラヌクレアーゼは、キメラヌクレアーゼの核移行（転移）を促進する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する。合成されるか天然由来ＮＬＳとして特定されるかを問わず、ＮＬＳがターゲット有機体と適合するものである限りいずれのＮＬＳも本質的に使用できる。天然由来哺乳類核局在化シグナルは、一般的に４以上の塩基性アミノ酸（リシン又はアルギニン）の１の(monopartite)又は２の(bipartite)集団であると特定された短い配列である（参照、例えば、Ｇｏｒｌｉｃｈら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：１５１３−１５１８；Ｍａｔｔａｊら、１９９８、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２３：２６５−３０６）。他の種類の核局在化シグナルは、例えば酵母Ｍａｔα２−ｌｉｋｅＮＬＳ等の、植物又は酵母核局在化シグナル等として当分野で公知である（参照、例えば、Ｈｉｃｋｓら１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７：１０５５−５８）。ＳＶ４０巨大Ｔ抗原ＮＬＳは、植物及びほ乳類分野で公知である。
【００４０】
例えば、本発明のキメラヌクレアーゼはダイマーを形成し（例えば、ターゲット配列中の２つの同種のＤＮＡ結合部位への結合を通して）、ある条件下では二量体化したキメラヌクレアーゼは、遺伝子ターゲッティングを刺激してその効率を増加させる。例えば、キメラヌクレアーゼは、２つの同一のキメラヌクレアーゼ間でホモダイマーを形成できる（例えば、ターゲット配列中の２つの同一のＤＮＡ結合部位への結合を通して）。又、キメラヌクレアーゼは、２つの異なるキメラヌクレアーゼ間のヘテロダイマーも形成できる（例えば、ターゲット配列中の２つの異なるＤＮＡ結合部位への結合を通して）。
【００４１】
例えば、本発明は、遺伝子ターゲッティング法の使用に特に効果的なキメラヌクレアーゼを提供する。ある種の遺伝子ターゲッティングプロトコル中、ゲノムの他の部分で発生する切断の数の限界を保ちつつ、ターゲット配列で又はその近傍でのＤＮＡ切断を起こすことが望ましい。従って、変異導入されるゲノム中で稀に又は一義的に発生する認識配列を有する、キメラヌクレアーゼ又は協同的に作用するキメラヌクレアーゼの組を使用することが望ましい。原則的に、認識配列が大きいと、これらの配列が変異導入される目的のゲノム中に発生する頻度は少なくなる。単純な確率計算ではｎ個の特定ヌクレオチドを有する認識配列は、４nヌクレオチド中の１の確率で発生する。この単純化予想モデルによると、１１ヌクレオチドの認識配列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉバクテリアのゲノム中に１回発生する確率となる（約４．５百万塩基のゲノムサイズ）。ヒトゲノムは、３０億塩基対のサイズであると推定されるため、１６ヌクレオチド認識配列を有するキメラヌクレアーゼは、たった一つの配列を認識する確率が最も高い。単純統計モデルは、ターゲット有機体中の、ＧＣバイアス、反復配列、及び異質性等の因子を考慮して調整される（例えばヒトは互いに約１％異なり、これら追加的変動も考慮に入れることができる）。更に、認識配列は、ターゲット有機体の公知のゲノム配列の配列の実際の事実の追求によって評価される。認識配列は、連続していてもよく（特定のヌクレオチドのとぎれのない配列、例えば、５’−ＧＡＴＧＴＴＧＣＴ−３’）、連続しなくてもよく（不特定のヌクレオチドにより中断されている、例えば、５’−ＧＡＴＧ・・・Ｎ6・・・ＴＴＧＣＴ−３’）、どちらの場合でも、発生頻度は同一の方法で概算できる。
【００４２】
同じサイズのゲノムを有する、ヒト又は他の有機体のゲノム中の遺伝子ターゲッティングにおいて、キメラヌクレアーゼ、又は２以上の協同的に作用するキメラヌクレアーゼは、好ましくは少なくとも１６の長さの特定されたヌクレオチド、及び任意で１７、１８、１９以上のヌクレオチドである認識配列を有する。上記のとおり、より短い配列が使用できるが、遺伝子ターゲッティングの実施には効果的ではない。「協同的に作用する」は結果を考慮した用語として使用され、協同的に作用するキメラヌクレアーゼはそれぞれのヌクレアーゼ単独よりも高い効率で遺伝子ターゲッティングを引き起こすことを意味する。例えば、本発明は、協同的に作用する一対が少なくとも１６、１７、１８、１９以上のヌクレオチドの複合認識配列を認識するように、それぞれ切断ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを含有する、協同的に作用する１対のキメラヌクレアーゼを提供する。任意で、それぞれの対のメンバーは３ジンクフィンガードメインを含有し、９ヌクレオチドの配列を認識する。任意で、その１対は、ホモダイマーを形成する単一のキメラヌクレアーゼである。例えば、本発明は第一キメラヌクレアーゼをエンコードする配列、及び第二キメラヌクレアーゼをエンコードする配列を含有する、ベクター等の核酸を提供し、第一及び第二キメラヌクレアーゼは協同的に作用して、少なくとも１６、１７、１８、１９以上のヌクレオチドの複合認識配列を認識する。任意で第一及び第二キメラヌクレアーゼはそれぞれ３ジンクフィンガードメインを含有し、９ヌクレオチドの配列を認識する。例えば、本発明は、少なくとも１６、１７、１８、１９以上のヌクレオチドの複合認識配列を認識する、協同的に作用する第一及び第二キメラヌクレアーゼを含有する蛋白質複合体を提供する。本発明の原則によると、より小さなゲノムを有する有機体中では、正確な遺伝子ターゲッティングのためにより小さな認識配列が非常に効果的であることが明らかである。従って、例えば、本発明は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のヌクレオチドの部位を認識する、キメラヌクレアーゼ、又は協同的に作用するキメラヌクレアーゼの組み合わせを提供する。任意でＤＮＡ結合ドメインは、それぞれ３ヌクレオチドの認識を提供する１以上のジンクフィンガードメインを含有してもよい。任意で、切断ドメインは、第二切断ドメインと協同的に作用する場合よりも単独で作用する場合のほうがより効果が低くなるように選ばれてもよい。複数の協同的に作用するキメラヌクレアーゼの使用は又、特定の座をターゲットすることを仲介する１のヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの組み合わせの生成プロセスを促進する。
【００４３】
特に、ヒト細胞において、キメラヌクレアーゼ用のＤＮＡ結合部位が６ヌクレオチドにより分離された逆方向反復として方向付けられた場合に、キメラヌクレアーゼの効率が改良されることを発見された。本発明において、２つのＤＮＡ結合部位（例えば、２つの逆方向反復）間のヌクレオチドスペーサーの長さは変えることができる。好ましくは、ヌクレオチドスペーサーは長さ０〜２０ｂｐ（例えば、０、２、４、６、８、１０、１５、又は２０ｂｐ）である。更に、ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメイン間のアミノ酸リンカーの長さも変えることができる。好ましくは、アミノ酸リンカーは長さ０〜３０アミノ酸である（例えば、０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、又は３０アミノ酸）。又、効率的な遺伝子ターゲッティング確率を達成するために、アミノ酸リンカーの最適長さは、ヌクレオチドスペーサーの長さと相互関係を有してもよい。
【００４４】
又、本発明は、遺伝子ターゲッティングに使用されるキメラヌクレアーゼの設計方法に関する。これらの方法は、下記ステップを含有する：（ａ）予定する哺乳類ターゲット配列の実行可能な近傍内の可能なＤＮＡ結合配列を特定するステップ；（ｂ）上記（ａ）で特定されたＤＮＡ結合配列へ結合するＤＮＡ結合ドメインを設計するステップ；及び（ｃ）上記（ｂ）のＤＮＡ結合ドメインを、切断ドメインとカップリングして、キメラヌクレアーゼを作成するステップ。哺乳類のターゲット配列は、目的とした遺伝子ターゲッティングの効果に応じて選ばれてもよい。障害の原因となっているゲノム配列の修復に使用されるキメラヌクレアーゼを得る目的の場合には、一般的にターゲット配列は、交換されるべき配列である。例えば、特にヒトにおける遺伝子障害の原因として公知の種々の対立遺伝子をターゲット配列として選ぶことができる。特定の遺伝子の不活性化又は減衰を目的とする場合、ターゲット配列は、導入された交換が、例えばコード配列の初期に停止コドンを導入し、プロモーターを破壊し、又は開始メチオニンコドンを破壊するように選ばれる。遺伝子によりエンコードされるポリペプチドの活性を変更することを目的とする場合、ターゲット部位は、特定の部位に導入される交換部分の活性に対する公知の又は予測される効果に基づき選ばれる。非相同配列をゲノム中に導入することを目的とする場合、好ましくは非相同配列に対する位置の効果が考慮される。例えば、それが元からのプロモーターにより発現される配列である場合、ターゲット配列は、元からのプロモーターが効果的に非相同配列の発現を調節するゲノムの領域中で選ばれる。
【００４５】
種々のＤＮＡ認識配列を有するキメラヌクレアーゼの種々の設計方法が当分野で公知である。例えば、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上のジンクフィンガードメイン（又はジンクフィンガーと見なされるもの）を含有してもよい。ジンクフィンガーは、ターゲット配列中の選ばれたターゲット部位を認識する様に設計できる。上記のように、Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2蛋白質は、広い種類の部位を認識するように設計できる。他の例として、ジンクフィンガーはポリペプチド表示ライブラリーを使用して選ばれてもよい。ターゲット部位は、ターゲット部位へ結合する種々のフィンガーを選択するための親和性選択ステップ中で、ポリペプチド表示ライブラリーと共に使用されてもよい。一般的に、定まったジンクフィンガー及びランダム化されたフィンガーが、ＳＰ−１、ＳＰ−１Ｃ、ＴＦＩＩＩＡ、ＧＬＩ、Ｔｒａｍｔｒａｃｋ、ＹＹ１、又はＺＩＦ２６８等の適切なＣ2Ｈ2ジンクフィンガー蛋白質から製造できる（参照、例えば、Ｊａｃｏｂｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４５０７（１９９２）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：２２５６−２２６０（１９９３））。選択された種々のランダム化されたフィンガー、及び、選択ステップに応じて１又は２の一定のフィンガー、を含有する種々のジンクフィンガー蛋白質をエンコードするポリペプチド表示ライブラリーが、当分野で公知の方法に従い構成できる。任意でライブラリーは、一定のフィンガーの除去の容易性、及びランダムなフィンガーを加えるために設計される制限部位を含有する。フィンガーは例えば変質オリゴヌクレオチド、突然変異促進性カセット、又は変異性ＰＣＲを使用してランダム化されてもよい。例えば米国特許番号第６３２６１６６、６４１０２４８、及び６４７９６２６参照。好ましくは、上記方法で設計されたキメラヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインに加えて更に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する。
【００４６】
可能な認識配列のスペクトルをターゲット配列の実行可能な近傍にある領域と比較した。遺伝子ターゲッティングを効果的にするために、ＤＮＡ結合ドメインはターゲット配列の実行可能な近傍内で切断するように結合されるだけでよい切断ドメインとカップリングされることが必要である。「実行可能な近傍」とは、遺伝子ターゲッティングを促進する距離内を言う。例えば、実行可能な近傍は、交換される最も遠位のターゲット配列の少なくとも５００塩基対以内、好ましくは２００塩基対以内及び最も好ましくは交換される最も遠位のターゲット配列の１００又は５０塩基対以内である。任意で、ＤＮＡ結合ドメインはターゲット配列を含む。ターゲット配列が変異導入される配列として定義される場合、ターゲット配列は、複数のヌクレオチド上に延びる。この場合、ＤＮＡ結合ドメインはもちろんターゲット配列内で結合され、「実行可能な近傍」とはこの条件を含むように意図される。ＤＮＡ結合部位の選択は、又特定の認識配列がゲノム中のどこかで発生する確率の評価を含み、そうするための方法は上記に記載されている。下記例に記載のとおり、種々のキメラジンクフィンガーヌクレアーゼが生成される。これら蛋白質のファミリーは、５’ＧＮＮＧＮＮＧＮＮ３’配列（５’ＮＮＣＮＮＣＮＮＣＮＮＮＮＮＮＧＮＮＧＮＮＧＮＮ３’を認識できるダイマー）等のある種のコンセンサス配列を結合しやすい（ゲノム中の４０９６塩基当たり約１回発生すると予測される）。従って、ターゲット領域は、実行可能なコンセンサス認識配列用にスキャンされ、次に特定の配列を認識するジンクフィンガーが設計される。ターゲット領域をサーチしてコンセンサス配列を探すことにより、次に適切な特定のキメラヌクレアーゼを設計する。このアプローチの実施可能性は実施例３に示され、このような技術は他のジンクフィンガーヌクレアーゼ及び他の一般的キメラヌクレアーゼへ適用できる。
【００４７】
任意で、遺伝子ターゲッティングで使用するためのキメラヌクレアーゼの設計方法は、細胞へのキメラヌクレアーゼの毒性の試験プロセスを含有する。これらプロセスは、細胞中の発現、又は他の細胞、キメラヌクレアーゼ中への導入、及び成長速度又は死亡率、任意でコントロールと比較した細胞の評価を含む。任意で、遺伝子ターゲッティングに使用するキメラヌクレアーゼの設計方法は、ＤＮＡ切断の特異性の評価プロセスを含有する。ゲノム中の１以上の位置で切断するキメラヌクレアーゼの傾向は、in vitro切断アッセイで評価でき、次にある型の電気泳動（例えばパルスフィールドゲル電気泳動法が非常に巨大なフラグメントを解析するために使用できる）及び、任意である種のプローブ法又はサザンブロット法を行う。この場合、当業者は切断特異性用の他の試験を利用、創作できる。
【００４８】
キメラヌクレアーゼは、本発明の記載を考慮して、一般的に公知な方法に従い調製できる。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインは、分離された「構成要素」として製造して次に公知の方法を使用して結合（リンク）されてもよく、又は単一の連続ユニット（例えば融合蛋白質）としても製造できる。例えば、キメラヌクレアーゼは、化学的合成により、又は組み換え型ＤＮＡ／ＲＮＡ技術（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９８）により融合蛋白質として製造できる。好ましくは、病気対立遺伝子に特異的な特定のＤＮＡ配列を認識できるキメラヌクレアーゼが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの制限エンドヌクレアーゼの切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメイン）への結合により生成できる。
【００４９】
好ましくは、本発明は、β−グロブリン遺伝子での遺伝子ターゲッティング用の２つのキメラヌクレアーゼ、ＨＢＧＺＦ１及びＨＢＧＺＦ４（それぞれ図５及び７中に示す）を提供する。好ましくは、β−グロブリン遺伝子から由来する配列への遺伝子ターゲッティングの促進において、ＨＢＧＺＦ１又はＨＢＧＺＦ４は別のキメラヌクレアーゼＺｉｆ−Ｌ３−Ｆｎ（ここで同様にというＺＩＦ２６８）と共にヘテロダイマーを形成できる。
特に好ましくは、本発明は、ヒト共通γ鎖遺伝子での遺伝子ターゲッティング用のキメラヌクレアーゼＨＣＧＣＺＦ２（図１０に示す。）を提供する。好ましくは、ヒト共通γ鎖遺伝子から由来する配列への遺伝子ターゲッティングの促進において、ＨＣＧＣＺＦ２は別のキメラヌクレアーゼＺｉｆ−Ｌ３−Ｆｎと共にヘテロダイマーを形成できる。
【００５０】
例えば、キメラヌクレアーゼは直接的に細胞中へ導入されてもよい。ポリペプチドの細胞内への直接導入方法として、本発明を限定するものではないが、例えば顕微（鏡下）注射、蛋白質形質導入、及び蛋白質療法が挙げられる。例えば、蛋白質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）はキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸と融合させることができ、得られた融合蛋白質は圧出され（発現され）精製される。ＰＴＤを含有する融合蛋白質は、細胞膜を通過可能であり、従って細胞は直接的に融合蛋白質と接触できる（Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９：１０４４４−１０４５０；Ｈａｎら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ、６：７２８−７３２；Ｈａｌｌら、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６：５８０−５８７；Ｔｈｅｏｄｏｒｅら、１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１５：７１５８−７１６７）。又、キメラヌクレアーゼは促進剤蛋白質（例えば、ｔａｔ、ＨＳＶＶＰ２２、及び炭疽毒素）とカップリングできる。蛋白質の促進剤蛋白質へのカップリングは、当分野で公知の方法を使用して達成できる。
【００５１】
幾つかの蛋白質形質導入ベースの方法は、目的のポリペプチドの、蛋白質の細胞への導入を仲介する配列との融合に依存する一方、他の蛋白質形質導入方法は目的の蛋白質の形質導入ドメインとの共有結合を必要としない。蛋白質の共有結合修飾なしに蛋白質形質導入を仲介する少なくとも２つの市販の試薬がある（「Ｃｈａｒｉｏｔ」商標、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社製；及び「Ｂｉｏｐｏｒｔｅｒ」商標、蛋白質デリバリー試薬、遺伝子治療システム社製）。
又、細胞中へ導入されるキメラヌクレアーゼは、しばしばベクターの形の核酸によりエンコードされる。任意で、キメラヌクレアーゼは、プロモーター等の転写調節要素へ実施上結合している。好ましくは、キメラヌクレアーゼは、酵素の発現が細胞中で調節できるように誘起可能なプロモーターの調整下で構成される。更に修復基質を含有するある種のベクターの説明は、下記セクションＶ中に記載されている。
【００５２】
キメラヌクレアーゼの細胞へのそれぞれのデリバリー方法には利点と欠点がある。キメラヌクレアーゼが核酸の導入によりデリバリーされた場合、蛋白質の発現前に、細胞により転写され翻訳されるための目的とする核酸のエンコードが達成される。これは、核酸のデリバリー及び蛋白質の発現間の時間的ずれを生じる。蛋白質の直接デリバリーは、この遅延を減少させる。蛋白質は細胞中での限定された半減期を有するために、蛋白質の直接デリバリーはしばしば蛋白質細胞中の一過性作用をもたらす。しかし、核酸と一緒のデリバリーは、細胞透過性化の後本質的にいつでもキメラヌクレアーゼの発現を可能とし、より大きな時間適応性を与え、核酸は又キメラヌクレアーゼの一過性発現を可能とする。
【００５３】
本発明は、転写レベルでのヌクレアーゼの発現の調節（例えば、誘起可能なプロモーターの使用による）以外に、ヌクレアーゼ蛋白質の活性の調節を目的とする。好ましくは、キメラヌクレアーゼは、キメラヌクレアーゼの活性がタモキシフェンの導入により調節できるように（例えば、投薬量依存形式で）、エストロゲンレセプタのホルモン結合ドメインと融合させることができる。エストロゲンレセプタのホルモン結合ドメインとの蛋白質融合体製造法は、当分野で公知である（例えば、Ｓｗｅｎａｒｃｈｕｋら、１９９９、Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４５：４８０−４９０；Ｈｅｙｗｏｒｔｈら、１９９９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１３：１８４７−１８６０；Ｒｏｎｃｈｉｎｉら、２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９：３９１４−３９２４）。
【００５４】
例えば、キメラヌクレアーゼではないヌクレアーゼも遺伝子ターゲッティングを誘発するために使用できる。本発明では、ＳｃｅＩ等の天然制限エンドヌクレアーゼ（例えば、天然由来、又はその実質的に変異導入した形）も使用できる。ヒトでの天然制限エンドヌクレアーゼの使用の大部分は、天然エンドヌクレアーゼの認識部位が、遺伝子ターゲッティングを刺激するのに充分にターゲット配列に近位の位置にあるような場合に限られることが予想される。更に、比較的小さい認識配列を有する天然制限エンドヌクレアーゼ（例えば、５塩基対配列を認識する天然ＦｏｋＩ、又は６塩基対配列を認識するＥｃｏＲＩ）は、細胞のゲノム中に大きな数の二重鎖切断を生成することが予想され、注意して、又は切断個数の減少手段と共に使用されなければならない。好ましい天然制限エンドヌクレアーゼは、目的とする細胞のゲノム中の約５以下の位置、好ましくは１又は２の位置で切断されることが予測される認識部位を有するものである。このような天然制限エンドヌクレアーゼの例として、ホーミングエンドヌクレアーゼファミリーのメンバー、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＰｓｐＩが挙げられる。修飾が制限エンドヌクレアーゼを使用に適用させるためになされてもよい。例えば、ＤＮＡ結合を仲介する制限エンドヌクレアーゼの一部は、認識部位へ変異導入するために修飾されてもよい。好ましくは上記修飾は、ターゲット配列の有効な近接位置にある部位を認識する変異導入したヌクレアーゼを生成しても良い。ＦｏｋＩ及び他のタイプＩＩ制限酵素等の、分離された切断及び認識ドメインを有する酵素には、特にこれら修飾を適用できる。制限酵素の修飾の代わりに、又はそれと組み合わせて、ターゲット配列に近位の配列は、天然制限エンドヌクレアーゼ用の認識部位の導入のために、変更することが出来る。これは、例えばキメラヌクレアーゼを使用する最初の遺伝子ターゲッティングステップにより達成できる。本発明のヌクレアーゼはいずれも、対象セルタイプに適切な核局在化シグナルと融合されてもよい。
【００５５】
ＩＶ．修復基質
例えば、本発明は、遺伝子ターゲッティング用修復基質に関する。本発明の「修復基質」は一般的に、染色体ＤＮＡ中のターゲット配列を変異導入するための細胞中への核酸導入をいう。「修復基質」は便宜上使用され、明細書に記載のように、修復基質はターゲット配列の「修復」の目的には限定されない。修復基質は、ターゲット配列の修飾、置換、減衰又は不活性化等の他の目的に使用できる。修復基質は又、特定の位置での新しい配列の大きな伸張の挿入に使用できる。例えば「トランスジェネシス」というプロセス中では、目的とした遺伝子配列は、治療的に効果的なレベルで遺伝子の発現を供給すると予想される位置で挿入される。修復基質として下記が挙げられる：（ｉ）ターゲット配列に近位の又は対応する側面に存在する領域と実質的に同じポリヌクレオチド配列；及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換するポリヌクレオチド配列。
【００５６】
修復基質は、ターゲット遺伝子（ターゲット配列）と実質的に同じであるポリヌクレオチド配列を含有するように設計できる。又、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも数百塩基対長であり、修復基質の左及び右「ａｒｍ」として指定できるターゲット配列のいずれかの側に部分を有してもよい。
本発明の「実質的に同一」は、上記ポリヌクレオチド配列は、染色体中の修復基質及びターゲット遺伝子間の相同組み換えを仲介するのに充分であることを意味する。例えば、上記ポリヌクレオチド配列は、対応するターゲット配列と、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同じでもよい。好ましくは、このポリヌクレオチド配列内の配列変動は、アミノ酸交換を起こさない（例えばウォッブル突然変異）か、又は保存的アミノ酸置換のみを生じる。保存的置換は、それらの側鎖と関連するアミノ酸のファミリー中で起こる（参照、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、二版、Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ編集、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．１９８１）。例えば、当然予測されるが、ロイシンをイソロイシン又はバリンで、アスパルテートをグルタメートで、スレオニンをセリンで単独置換すること、又はアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での類似置換（例えば、保存的突然変異）は、得られた分子の生化学的活性への主要効果を有さない。
【００５７】
例えば、ターゲット配列中の対応する相同ヌクレオチド配列は、目的とした配列の、切断用の特定部位及び／又は交換導入用の特定部位に対応する側面に存在する。特定の切断部位及び相同ヌクレオチド配列間の距離は（例えば、それぞれのａｒｍ）は、数百ヌクレオチドでもよい。好ましくは、それらの間の距離は２００ヌクレオチド以下（例えば、０、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、及び２００ヌクレオチド）である。多くの場合、より短い距離は、遺伝子ターゲッティング確率をより高くする。好ましくは、修復基質は、その導入される配列交換を除く完全長にわたって、特定の切断部位及び変異導入される配列の部分の両方を含むゲノム部分と実質的に同じである。
【００５８】
修復基質は又、ゲノム中へ導入されるポリヌクレオチド配列を含有する。特に、このポリヌクレオチド配列は、修復基質及びターゲット遺伝子間の相同組み換えにおいてターゲット遺伝子を修復、修飾、置換、減衰又は不活性化するために使用される。任意で、配列交換は、ターゲット遺伝子中に導入される非相同配列（例えば、突然変異）を含有してもよい。一般的に、このポリヌクレオチド配列には、相同組み換えを仲介するために使用されるポリヌクレオチド配列の両末端が側面に存在する。
【００５９】
好ましくは、修復基質は、キメラヌクレアーゼとのＤＮＡ結合部位中にウォッブル突然変異を含有するように設計され（例えばエンコードされるアミノ酸を交換しないコドンの第３位置中の突然変異）、遺伝子ターゲッティング発生後、キメラヌクレアーゼが新しいターゲット遺伝子に結合できないようにできる。
例えば、細胞中へ導入される修復基質は、ベクター内に挿入できる。任意で、修復基質は、プロモーター等の転写調節塩基配列へ実施上結合している。修復基質をエンコードするベクターの詳細は下記セクションＶで説明する。
好ましくは、修復基質及びキメラヌクレアーゼは、細胞中の単一のベクター上へ導入できる。単一のベクター配置は、遺伝子ターゲッティングの効率を増加できる。
【００６０】
Ｖ．ベクター
上記のように、細胞中へ導入される修復基質及びヌクレアーゼは、ベクター内に挿入でき、任意で修復基質及びキメラヌクレアーゼは単一のプラスミド上でエンコードされる。ここで使用される「ベクター」として、核酸ベクター、例えばＤＮＡベクター（例えば、プラスミド）、ＲＮＡベクター、ウィルス又は他の適切なレプリコン（例えば、ウィルスベクター）が挙げられる。本発明のベクターは、スーパーコイル形又は直線形でもよい。
キメラヌクレアーゼが蛋白質として供給される場合、組み換え型キメラヌクレアーゼはクローン遺伝子、又はその一部を原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫又は哺乳類）、又はその両方中で適切に発現するために、ベクター内にライゲーションして生成できる。組み換え型キメラヌクレアーゼの生成用発現媒体として、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、キメラヌクレアーゼの発現用に適切なベクターとして、特定の種類のプラスミド：Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞中の発現用の、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。
【００６１】
哺乳類発現ベクターは、バクテリア中のベクターの伝播を促進する原核細胞配列と、真核細胞中で発現する１以上の真核細胞転写ユニットとの両方を含有してもよい。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適当な哺乳類発現ベクターの例である。これらベクターは、原核細胞及び真核細胞の両方で複製及び薬耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２等のバクテリアプラスミドからの配列で修飾されてもよい。又、ウシ乳頭しゅウィルス（ＢＰＶ−１）、又はエプスタイン−バーウィルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）等のウィルスの誘導体は、真核細胞中の蛋白質の一過性発現用に使用できる。他のウィルス（レトロウィルス等）発現システムの例を下記に示す。プラスミドの調製及びホスト有機体の形質転換に使用できる種々の方法は公知である。原核細胞及び真核細胞用の他の適切な発現システム、並びに遺伝子的組み換え操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）第１６及び１７章参照。
【００６２】
種々のウィルスベクターは、キメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質を細胞内へ導入するために使用できる。これらウィルスベクターとして、レトロウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス（例えば、アデノ関連ウィルス）、コロナウィルス、オルトミクソウィルス等の負鎖ＲＮＡウィルス（例えば、インフルエンザウィルス）、ラブドウィルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウィルス（例えば麻疹及びセンダイウィルス）、ピコルナウィルス及びアルファウィルス等の正鎖ＲＮＡウィルス；及びアデノウィルス、ヘルペスウィルス（例えば、単純ヘルペスウィルスタイプ１及び２、エプスタイン−バーウィルス、サイトメガロウィルス）、及びポックスウィルス（例えば、種痘疹、鶏痘及びカナリア痘）等の二重鎖ＤＮＡウィルスが挙げられる。他のウィルスとして、例えばノーウォークウィルス、トガウィルス、フラビウィルス、レオウィルス、パポバウィルス、ヘパドナウィルス；及び肝炎ウィルスも挙げられる。
例えば、レトロウィルスベクターはネズミ又は鳥類レトロウィルスの誘導体でもよい。単一の外来性遺伝子が挿入できるレトロウィルスベクターの例として、本発明を限定するものではないが例えば：モロニーネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウィルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳腺ガンウィルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）が挙げられる。対象患者がヒトの場合、テナガザル白血病ウィルス（ＧａＬＶ）等のベクターが使用できる。
【００６３】
ベクターは、形質導入した細胞が特定され生成されるために選択可能なマーカー用遺伝子を伝達又は組み込むことができる。例えば選択可能なマーカーは、マーカーを含む細胞の排除を促進する対抗選択可能なマーカーでもよい。目的の配列を、特定のターゲット細胞上のレセプタ用のリガンドをエンコードする別の遺伝子と共にウィルスベクター内に挿入することにより、例えば、ベクターはターゲットへ特定されている。ウィルスベクターは、例えば、糖、糖脂質又は蛋白質を接着することによりターゲットへ特定されて製造できる。当業者は、ターゲットへ特定されたウィルスベクターのデリバリーを可能とするために、ウィルスゲノム中へ挿入、又はウィルスエンベロープへ接触できる特定のポリヌクレオチド配列を知っており、又は不必要な実験無しに容易に確認できる。ウィルスベクターの例は当分野で公知であり（例えば、Ｃｏｆｆｉｎ、Ｊ．Ｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：「ウィルス及びその複製」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、三版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら、Ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）、例えばＭｃＶｅｙら、米国特許番号第５８０１０３０に記載されており、その全てを資料として使用する。．
【００６４】
キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を含有するベクターは、１以上の転写調節塩基配列へ実施上結合している、キメラヌクレアーゼのコード配列の全部又は一部を含み、そのコード配列はキメラヌクレアーゼの生成又は合成を可能とするために転写シグナルで調節されている。上記転写調節塩基配列として、プロモーター配列、エンハンサー、及び転写結合部位が挙げられる。構成的プロモーターの例として、本発明を限定するものではないが、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶ）、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、及びニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡ）が挙げられる。更に調節するには、キメラヌクレアーゼは誘起可能なプロモーターで調節されてもよい。誘起可能なプロモーターの例として、本発明を限定するものではないが、Ｚｎ2+メタロチオネインプロモーター、メタロチオネイン−１プロモーター、ヒトメタロチオネインＩＩＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃｏプロモーター、マウス乳腺ガンウィルス初期プロモーター、マウス乳腺ガンウィルスＬＴＲプロモーター、トリオースデヒドロゲナーゼプロモーター、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーター、シミアンウィルス４０初期プロモーター、及びレトロウィルス骨髄増殖性肉腫ウィルスプロモーターが挙げられる。有用な別の誘起可能なシステムとして、Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄにより最初に開発された（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−９）「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」商標又は「Ｔｅｔ−Ｏｎ」商標システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。このシステムは又、テトラサイクリン又はドキシサイクリン等のテトラサイクリン誘導体に応答するように調節される遺伝子発現の高いレベルを可能とする。プロモーターの選択は、一般的にキメラヌクレアーゼの発現のために目的とした経路に依存する。
【００６５】
他のタイプのヌクレアーゼをエンコードする核酸を含有するベクターも又、上記のように選択され設計されてもよい。例えば本発明は、修復基質及びヌクレアーゼをエンコードする核酸を含有するベクターを提供する。ここで記載されるように、ヌクレアーゼは、任意のキメラヌクレアーゼでもよく、別のタイプのヌクレアーゼでもよい。ベクターは、２以上のヌクレアーゼ、及び特にキメラヌクレアーゼを含有する配列を含有してもよい。好ましいベクターは、協同的に作用して遺伝子ターゲッティングを促進する２つのキメラヌクレアーゼをエンコードする。
【００６６】
ヌクレアーゼ及び／又は修復基質を含有するベクターの構成方法は公知である（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９７））。例えば、核酸要素は、（例えば、化学的合成又は組み換え型ＤＮＡ／ＲＮＡ技術により）天然配列から修飾された、又は製造されたデノボから修飾された、天然物から単離できる。これら要素は単離され、適合性のあるクローニング又は制限部位の実施及び製造等の公知の方法により一緒にライゲーションされてもよい。
【００６７】
キメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質を含有するベクターは、種々の方法（例えば、リポソームを使用した、形質転換、トランスフェクション、直接取り込み、発射ボンバード）により細胞中へ導入できる。細胞のトランスフェクト又は形質転換の適切な方法の例として、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔法、顕微（鏡下）注射、感染、リポフェクション及び直接取り込みが挙げられる。これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９８）に詳細に記載され、その全てを資料として使用する。又、キメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質を含有するベクターは、ベクターの細胞膜リン脂質へのターゲットにより細胞中へ導入されることができる。例えば、本発明のベクターのターゲットは、ベクター分子をＶＳＶ−Ｇ蛋白質（全ての細胞膜リン脂質への親和性を有するウィルス蛋白質）へリンクさせることにより達成できる。これら構成は、当分野で公知の方法を使用して製造できる。
【００６８】
ＶＩ．細胞
本発明の細胞とは、原核細胞（例えば、バクテリア細胞）又は真核細胞（例えば、動物、植物又は酵母細胞）を言う。動物又は植物起源の細胞は、幹細胞又は体細胞でもよい。適切な動物細胞は、例えば哺乳類、鳥類又は無脊椎動物起源でもよい。哺乳類細胞の例として、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ（ネズミ胚幹細胞等）、ウサギ及びサルが挙げられる。細胞は、胚細胞、骨髄幹細胞又は他の前駆細胞でもよい。細胞が体細胞の場合、細胞は、例えば上皮細胞、線維芽、平滑筋細胞、血液細胞（造血細胞、赤血球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、樹状細胞、ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はアストログリア）、又は病原体感染した細胞（例えば、バクテリア、ウィルス、ウィルソイド、寄生体、又はプリオンに感染したもの）でもよい。好ましい細胞はヒト細胞である。植物細胞の場合、全ての植物は、例えばカルス再生技術により遺伝子的に変異導入された細胞から再生できる。
【００６９】
本発明の細胞として培養された細胞及びセルラインも挙げられる。細胞はin vitro細胞（例えば、動物の体の外側）でも、in vivo細胞（例えば、動物体内）でもよい。細胞は、市場若しくは寄託機関から得られ、又は生検等の直接的に個体から得られる。細胞を対象個体から得て、細胞をin vitroで修飾してからその個体へ細胞を再導入してもよい。又、細胞は、同一の又は異種である別の異なる個体（ドナー）から得られてもよい。例えば、ブタ細胞等の非ヒト細胞は、ＤＮ構成を含むようにin vitroで修飾され、次にヒト中へ導入されることができる。又、個体から分離できない細胞の場合、例えば個体の細胞へin vivo遺伝子治療用にベクターをデリバリーすることが望ましい。
【００７０】
例えば、本発明は、キメラヌクレアーゼ及び修復基質を含有する細胞を提供する。例えば、本発明は、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質を含有する細胞を提供する。好ましくは細胞は哺乳類細胞、更に好ましくはヒト細胞である。細胞はキメラヌクレアーゼ及び修復基質を安定して含有するように設計される必要はなく、その代わり、細胞はキメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質を短時間含有してもよい。本発明のヌクレアーゼの作用持続された発現は細胞の生存能力を損うため、遺伝子ターゲッティングを有効にするために必要な時間長のみ、ヌクレアーゼが細胞中に存在し、又は活性であることが好ましい。キメラヌクレアーゼの細胞中への一過的性存在は、例えば、蛋白質の直接導入により、キメラヌクレアーゼをエンコードする非統合ベクターを使用した一過性トランスフェクションにより、誘起可能な又は制御されたプロモーターの調節下でキメラヌクレアーゼを発現する核酸の一過性又は非一過性トランスフェクションにより、達成できる。細胞中のヌクレアーゼの一過的活性は、上記のようにヌクレアーゼを、エストロゲンレセプタのタモキシフェン応答性部位等のポリペプチドとカップリングさせることにより達成できる。
【００７１】
ＶＩＩ．遺伝子ターゲッティング法
本発明は又、哺乳類細胞中の遺伝子ターゲッティングを使用して染色体ＤＮＡ中のターゲット配列を変異導入する方法に関する。好ましくは、本発明の方法は、ターゲット配列の修飾に使用できる。又好ましくは、本発明の方法は、ターゲット配列の修復に使用できる。又好ましくは、本発明の方法は、ターゲット配列／遺伝子の減衰又は不活性化に使用できる。本発明の方法は又、染色体中の目的の部位中への非相同配列の導入に使用できる。
上記方法は下記のステップを含有する：（ａ）キメラヌクレアーゼを細胞へ導入するステップ、但し上記キメラヌクレアーゼは（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン及び（ｉｉ）切断ドメインを含有する；並びに（ｂ）修復基質を上記細胞へ導入するステップ、但し上記修復基質は（ｉ）ターゲット配列の片側又は両側領域と実質的に同じポリヌクレオチド配列及び（ｉｉ）修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を交換するポリヌクレオチド配列を含む。修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいて、ターゲット配列は修復基質に適合するように交換される。任意で、この遺伝子ターゲッティング法中、キメラヌクレアーゼ及び修復基質は、単一のベクター上で細胞中へ導入されてもよい。好ましくは、上記方法で使用されるキメラヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン及び切断ドメインに加えて更に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する。
例えば、修復基質及び／又はキメラヌクレアーゼは、ベクター内のプロモーターへ実施上結合していてもよい。任意で、プロモーターは誘起可能なプロモーターである。ベクター並びにキメラヌクレアーゼ及び／又は修復基質の細胞中への導入方法の詳細は上記に記載されている。
【００７２】
遺伝子ターゲッティング法は、発現用導入遺伝子の細胞中への導入に使用できる（トランスジェネシス）。例えば、必要な遺伝子生成物の濃度低下により発生する遺伝病は、必要な遺伝子生成物を発現する導入遺伝子を提供することにより治療され、又は改善される。導入遺伝子は、内因性遺伝子の位置、又は異なる位置を目的としてもよい。好ましい本発明の方法では、目的の部位は、染色体中の転写活性位置又は「オープン位置」である。本発明の「オープン位置」とは、転写をサポートする公知の特定の染色体位置をいう。オープン位置に挿入された非相同遺伝子は、他の場所に挿入された非相同遺伝子よりもより効果的に発現されることを示す多くの証拠がある。
【００７３】
好ましくは、本発明は、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路の抑制因子の存在での遺伝子ターゲッティングの誘起を目的とする。一方で、上記抑制因子は、遺伝子ターゲッティングの確率を増加させる。他方で、上記抑制因子は、目的外の非相同組み換え事象の確率を減少させる。ゲノム完全性を維持するために、高等真核生物は、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）等の細胞中の二重鎖切断（ＤＳＢ）の修復用の複数の経路を進化させてきたことが公知である。ＮＨＥＪは、それらが修飾された後に二重鎖ＤＮＡ末端を接合し、特に細胞周期のＧ0及びＧ1期中では、無脊椎動物におけるＤＳＢ修復用の主要機構であると考えられる（Ｋｈａｎｎａら、２００１、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２４７−２５４）。
【００７４】
ＮＨＥＪ経路の抑制因子の例として、ＮＨＥＪ経路中の蛋白質構成要素の発現又は活性を阻害又はブロックする化合物（薬剤）が挙げられる。ＮＨＥＪ経路の蛋白質構成要素として、本発明を限定するものではないが、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ蛋白質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、Ｒａｄ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ１、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及びＸＲＣＣ４が挙げられる。抑制因子の例として、ＮＨＥＪ経路の少なくとも１の蛋白質構成要素（例えば、ＤＮＡ−ＰＫ）を阻害するウォルトマニンが挙げられる。
【００７５】
これら抑制因子別の例は、ＮＨＥＪ経路の蛋白質構成要素（例えば、ＤＮＡ−ＰＫ又はＤＮＡリガーゼＩＶ）の発現をブロックするＲＮＡｉ構成でもよい。ここで使用される「ＲＮＡｉ構成」は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ及び他のＲＮＡ又はＲＮＡ：in vivoで切断又は分離されｓｉＲＮＡを形成できるＤＮＡ種等を含む遺伝子的用語である。ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）がin vitro又はin vivoでの遺伝子発現の有用な阻害方法を提供することは公知である。哺乳類細胞中では細胞免疫反応の誘発を回避するためにより短いＲＮＡｉ構成が好ましいが、ＲＮＡｉ構成は、ターゲット核酸配列と同一又は実質的に同じｄｓＲＮＡの長い伸張、又はターゲット核酸配列の領域のみと同一又は実質的に同じｄｓＲＮＡの短い伸張を含有する。例えば１８〜３０ヌクレオチド長さ、好ましくは１８〜２５ヌクレオチド長さを有するＲＮＡｉ構成を有するＲＮＡｉ構成が使用できる。ここでＲＮＡｉ構成は又、細胞内でｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを形成する転写、及び／又は、in vivoでｓｉＲＮＡを生成する転写を引き起こすことのできる、発現ベクターでもよい。ＲＮＡｉ構成の製造方法及び使用方法は、公開された米国特許出願番号第ＵＳ２００２００８６３５６、ＵＳ２００２０１６２１２６、ＵＳ２００３００８４４７１、及びＵＳ２００３０１０８９２３に記載されている。ＲＮＡｉ構成は、核酸そのもの、又は種々のカチオン性成分又は脂質との複合体の形で投与できる。
【００７６】
非相同組み換えを減少するための方法論は特に、遺伝子治療による重症複合型免疫不全の患者の治療の最近の報告結果を考慮する必要がある。最近の遺伝子治療の実施では、治癒的遺伝子が非相同組み換えにより導入された。まれに、遺伝子は癌遺伝子を活性化するように組み込まれてしまい、レシピエントは最初は良い効果を示しても、多くの場合患者は白血病に罹患する。このように、ＮＨＥＪ抑制因子は非相同統合の発生数を減少させる。生体外の場合には、その中で非相同組み換え事象が起こった細胞の排除又は選択（除去）が可能である。例えば、キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、修復基質、又はベクターの一部又は全て等の導入された核酸はいずれも、遺伝子ターゲッティングの対象である細胞のゲノム中に非相同的に組み込まれる。非相同的に組み換えされた材料を含有する細胞は、種々の方法で排除される。例えば、細胞中へ導入される核酸は、ウィルス性チミジル酸キナーゼ遺伝子（例えばＨＳＶ−ｔｋ）等の対抗選択可能なマーカーを含有するように設計され、これらマーカーを含有する細胞の排除を可能とする。この場合、相同組み換えのみが発生すれば、修復基質配列のみがゲノム中へ挿入される。非相同組み換えが発生する場合、対抗選択可能なマーカーを含有する完全な構成はゲノム中へ組み込まれやすい。これらマーカーを含有する細胞は対抗選択治療により排除され、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の場合、それは一般的に抗ウィルス薬剤ガンシクロビルで治療される。マーカーは又、蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）等のプロセスを使用した。急速ソーティングを可能とするものであり、蛍光蛋白質マーカー（例えば、緑色蛍光蛋白質等）等が挙げられる。
【００７７】
例えば、本発明は、遺伝子ターゲッティングによる個体の病気の改善、治療及び予防方法を提供する。例えば対立遺伝子は、個体の病気に対する罹患性を増加させることにより又は病気の直接原因となる一因となることにより病気を発生させる。従って、対立遺伝子の配列を変更することにより、病気は改善、治療又は予防される。個体は哺乳動物又は他の動物でもよい。好ましい個体はヒトである。
鎌状赤血球貧血、血友病、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、テイ−サックス病、デュシェーヌ筋ジストロフィー病、ハンティングトン病、アルファ地中海貧血及びレッシュ−ナイハン症候群等の３０００以上の病気が突然変異により引き起こされる。従って、これら遺伝病の全ては本発明の目的の範囲内である。
特に、本発明は例えば、遺伝子ターゲッティングにより修復された細胞が、突然変異細胞に対して顕著な優先的長所を有する病気に特に適切である。これら病気の例としてヒト共通γ鎖中の突然変異により主に発生する重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）が挙げられる。３〜５％の遺伝子ターゲッティング確率（本発明で示された）は、この種が病気を治癒しやすいことを示す。
【００７８】
本発明は又例えば、遺伝子ターゲッティングにより治癒された細胞が突然変異細胞に対して顕著な優先的長所を有さない病気にも適切である。これら病気の２つの例は、β−グロブリン遺伝子中のたった一個のヌクレオチド置換により発生する鎌状赤血球症、及び主に因子ＶＩＩＩ又は因子ＩＸ中の突然変異から発生する血友病である。修復された細胞の小さい割合でも劇的な効能を有するため、３〜５％の遺伝子ターゲッティング確率（本発明で示された）は、この病気を改善又は治癒するのに充分であると予測される。
【００７９】
例えば、本発明の方法は、患者を感染症に罹患しやすくさせる遺伝子ターゲット配列へ変異を導入するために使用されてもよい。例えば、多くのウィルス及び病原菌は、細胞表面及び細胞内蛋白質の一定の組み合わせへ結合し利用することにより細胞中に侵入する。遺伝子ターゲッティングはこれら結合部位又は侵入機構を排除又は減衰するために使用されてもよい。ターゲット遺伝子は、例えばＴ細胞中へのＨＩＶ侵入に関与するＣＣＲ５遺伝子である。ＨＩＶに罹患しているかＨＩＶ感染に罹患しやすい個体の細胞は、ＨＩＶの細胞侵入能力を減少させるように治療できる。例えば、細胞は造血幹細胞等のＴ細胞又はＴ前駆細胞でもよい。
本発明の方法は例えば、in vitroで細胞に適用され又は対象へ適用され、その後in vivoで遺伝子ターゲッティング作用を起こすこともできる。
【００８０】
本発明のキメラヌクレアーゼ及びベクターは、一般的には公知の投与経路を使用して個体中へ導入できる（例えば、腸管外（非経口）、粘膜性、経鼻、注射、全身性、埋め込み、腹腔内、経口、皮内、経皮、筋肉内、注入点滴及び／又はボーラス注入を含む静脈内、皮下、局所的（軟膏的）、硬膜外、バッカル内、直腸内、経膣等）。
例えば、本発明のキメラヌクレアーゼ及びベクターは、食塩水、減菌水、デキストロース、グリセロール、エタノール、リンガー液、生理食塩水及びそれらの組み合わせ等の適切な医薬的許容できるキャリア（賦形剤）と組み合わせて配合できる。配合は投与方式に適合され、当分野の技術範囲内で行われる。投与方式は、ターゲット細胞の位置が好ましい。
【００８１】
本発明のキメラヌクレアーゼ及びベクターは、個体、単独で又は他の治療的薬剤と組み合わせて投与できる。これら異なる種類の治療的薬剤は、同一の単独配合でも数種の分離配合でも投与できる。
本発明のキメラヌクレアーゼ又はベクターの個体へ投与される、投与頻度を含む投薬量は、投与形式及び経路を含む種々の因子に応じて変化できる；レシピエントの、サイズ、年齢、性別、健康、体重及び飲食物；治療される病気又は障害の性質及び症状の範囲；同時に行われる治療の種類、治療の頻度、及び目的とした効果；配合の性質；及び治療者の判断。これら投薬量レベルの変動は、当業者に公知の最適化のための標準的経験的手順を使用して調節できる。
【実施例】
【００８２】
本発明は、下記に具体的に示されるが、下記実施例は本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１：哺乳類細胞中の遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼ
遺伝子ターゲッティングは真核細胞のゲノム内へ遺伝子変化を導入する強力な技術である。この技術の効力を増強するために、遺伝子ターゲッティングを調節する変数因子が組織的に調査された。局所的二重鎖ＤＮＡ切断は遺伝子ターゲッティングの強力な刺激であることは明らかである。従って、広い種類のＤＮＡ配列を認識するように設計された蛋白質融合体であるキメラヌクレアーゼを、遺伝子ターゲッティングを誘発するためにヒト体細胞中で治療的及び実験的に有用なレベルまで適用した。これは、キメラヌクレアーゼの使用方法における第一遺伝子ターゲッティングとして示される。
【００８３】
鎌状赤血球貧血は単一の塩基対突然変異により引き起こされることが発見されたので、突然変異を修復することによるこの病気の治癒が従来技術で目標であった。多量の病気が単一の遺伝子中の類似する小さい突然変異により引き起こされることが理解され、遺伝子修復によりこれら病気を治癒できることの重要性がようやく認識された。理論的には、遺伝子修復のひとつの方法は、ネズミ胚幹細胞（ＥＳ）細胞中に遺伝子変化を生成し、それをヒト体細胞中に使用する遺伝子ターゲッティング手順を適用することである（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２８８−１２９２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：５７６−８）。このような手順は、ＤＮＡがヒト体細胞中へ導入された場合に遺伝子ターゲッティングが非常に低い自発的確率であるため採用されない（Ｓｅｄｉｖｙら、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６：２２７−２３１）。しかし、ゲノムターゲット中のＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）の発生は目的のプロセスを千倍以上の確率で誘発できることが知られている（ＤＳＢ誘起した遺伝子ターゲッティング又はＤＳＢ−ＧＴ）（Ｃｈｏｕｌｉｋａら、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５：１９６８−１９７３；Ｓｍｉｈら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２３：５０１２−９；Ｄｏｎｏｈｏら、１９９８、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１８：４０７０−８；Ｓａｒｇｅｎｔら、１９９７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７：２６７−７７；Ｂｒｅｎｎｅｍａｎら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９３：３６０８−１２）。ＤＳＢ誘起した遺伝子ターゲッティングを調節する因子を組織的に調査する方法を下記に示す。発明者はこのシステムを、キメラヌクレアーゼがヒト体細胞のゲノムの遺伝子ターゲッティングの可能な誘発剤であることを示すために使用した。
【００８４】
遺伝子ターゲッティングを研究するために使用されたシステムは、図１に示され、突然変異された緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子の修復に基づく（ＧＦＰ遺伝子ターゲッティングシステム）。人工遺伝子ターゲット（Ａ６５８）の単一の複製は、安定して２９３細胞のゲノム中に統合され、最大数のＧＦＰポジティブ細胞がトランスフェクション後２．５〜３日で発生し、少なくとも２週間安定して生存したことが観察された（図１Ｄ）。従って、遺伝子ターゲッティング反応は、トランスフェクション後比較的急速に発生し、安定した遺伝子変化を生成した。最後に、蛍光発色セルソーティングにより単一のＧＦＰポジティブ細胞を精製し、遺伝子ターゲッティング後のＧＦＰ遺伝子の配列を決定した。試験された９個のＧＦＰポジティブ細胞中で、ＧＦＰ遺伝子の配列は野生種であり、遺伝子ターゲッティングが起こったことを示した（データは示されていない）。ネズミ３Ｔ３及びヒトＳａＯＳ−２細胞中のＤＳＢ−ＧＴ割合は、２９３細胞中のものと類似していた（データは示されていない）。更に、ＤＳＢ−ＧＴ割合は、試験されたＡ６５８用の単一の挿入部位において、細胞プール（図３Ｂ）又はクローンセルライン（図１Ｃ）のいずれも類似した。従って、細胞タイプ又は統合部位依存性は示されなかった。
【００８５】
発明者は次にＤＳＢ−ＧＴの割合を調節する変数因子を調査した。その結果、トランスフェクトされた基質（ＲＳ２１００）量の増加は、ＤＳＢ−ＧＴの割合を安定水準に達するまで増加させたことが発見された（図２Ａ）。この結果は、遺伝子ターゲッティングは利用可能な修復基質の量に依存することを示した。修復基質及びターゲット間の相同な長さの増加は、ＤＳＢ−ＧＴの割合を直線的に増加させることを発見された（図２Ｂ）。実験中、５’相同性の量を２９０塩基対（ｂｐ）で一定に維持し、３’相同性の量を５００ｂｐから３７００ｂｐへ変化させた。この結果は、自発的遺伝子ターゲッティングが対数的に相同長さに依存する一方（Ｄｅｎｇら、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２：３３６５−３３７１）、ＤＳＢ−ＧＴは相同長さに直線的に依存することを示した．いずれの場合も、損傷したターゲット及び修復基質間の相同長さの増加は、細胞が遺伝子ターゲッティングを受ける頻度を増加させた。図２Ｃは、ＤＳＢ−ＧＴ割合はトランスフェクトされたＰＧＫ−Ｓｃｅ量に直線的に依存することを示した。ＤＳＢ−ＧＴ割合は安定て一定の水準であったが、より多い量のＣＢＡ−Ｓｃｅがトランスフェクトされた（図２Ｃ）。このデータは、ＤＳＢ−ＧＴは遺伝子ターゲッティングを開始するＤＳＢの発生に依存するが、発生はしだいに飽和状態になることを示す。修復基質の転写状態を操作すると遺伝子ターゲッティングの確率に影響することが発見された。ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−ＲＳ２１００）による短縮された修復基質の転写は、ＤＳＢ−ＧＴの割合を５０％増加させた（図２Ｄ）。ＲＳ２１００の場合と同様に、ＣＭＶ−ＲＳ２１００の２９３−０細胞中へのトランスフェクトは、ＧＦＰポジティブ細胞を生成しなかった（データは示されていない）。ＤＳＢ−ＧＴの割合は、Ｓｃｅ発現がＣＢＡプロモーターにより行われた場合に最も高く、ＣＭＶプロモーターでは中間で、ＰＧＫプロモーターでは最も低かった（図２Ｅ）。この結果は多分、それぞれプロモーターからの異なるレベルのＳｃｅ発現を反映する。図２Ｅは又、修復基質をＳｃｅ発現カセットとしての同一のプラスミド上に配置する方が、２つのプラスミドの共トランスフェクトの場合よりも、ＤＳＢ−ＧＴの割合は増加することを示す。ＤＳＢ−ＧＴプロセスが、ＣＢＡプロモーターがＳｃｅを発現するために使用された場合と同程度の飽和状態である場合には、誘発は失われる。上記変数因子を最適化した場合には、遺伝子ターゲッティング確率３〜５％が達成された（図２Ｅ、ＣＢＡプロモーター）。
【００８６】
ＧＦＰ遺伝子ターゲッティングシステム中では、ＤＳＢの導入はＧＴを２０００倍を超える確率で誘発し、遺伝子ターゲッティングの全割合は条件が最適化された場合に３〜５％に達した。しかし、このようなシステムは、Ｓｃｅ部位のターゲット遺伝子内への事前導入が必要であるため、内因性遺伝子では使用できない。遺伝子ターゲッティングを内因性遺伝子で誘発するために、これら遺伝子中に特定のＤＳＢ配列を生成する方法が開発される必要があった。キメラヌクレアーゼはこの機能を有している（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎら、１９９９、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、３８０：８４１−８）。ジンクフィンガー結合ＤＮＡ結合ドメイン及びＦｏｋＩ制限酵素（Ｆｎ）のエンドヌクレアーゼドメイン間のキメラヌクレアーゼ−融合は、in vitroで裸のＤＮＡを（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎら、１９９９、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、３８０：８４１−８）、アフリカツメガエル卵母細胞中で過剰染色体ＤＮＡを（Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００１、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２１：２８９−９７）、ショウジョウバエ中で染色体ＤＮＡを（Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００２、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６１：１１６９−７５）特定部位で切断できる。この方法をヒト体細胞中の遺伝子ターゲッティングを誘発するために適用した（図３）。図３Ａはキメラヌクレアーゼ実験での発現プラスミドの構造及びターゲット部位を示す。３個の異なるキメラヌクレアーゼを設計し、それぞれはＣＭＶプロモーターにより作動され、そのアミノ末端に核局在化シグナルを含有する（図３Ａ）。２個の構成（ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎ及びＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎ）中に、ＤＮＡ結合特異性が、ナノモル的親和性で配列５’ＧＧＧＧＡＡＧＡＡ３’へ結合する人工ＱＱＲ３ジンクフィンガードメインにより提供された（Ｓｈｉら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：２８２−２８４）。これら２個の構成は、ジンクフィンガー及びＦｎドメイン間のアミノ酸リンカーの長さが異なる。アミノ酸リンカーはＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎ中で１８アミノ酸であり、一方ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎ中ではアミノ酸リンカーは存在しない。ＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎは、２つのドメイン間の３アミノ酸リンカーでＺｉｆ２６８からＦｎドメインまで３個のジンクフィンガーを融合した。Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガードメインは、サブナノモル的親和性で配列５’ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ３’を認識する（Ｅｌｒｏｄ−Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、１９９９、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：１９２８１−５）。対応する遺伝子ターゲット（ＱＱＲ８、ＱＱＲ６、及びＱＱＲＺＩＦ６）で、３個のセルラインを（２９３／ＱＱＲ８、２９３／ＱＱＲ６、２９３／ＱＱＲＺＩＦ６）構成した。ＱＱＲ８及びＱＱＲ６は、Ｓｃｅ認識部位の隣に挿入されたＱＱＲ結合部位の逆方向反復を有する（図３Ａ）。ＱＱＲ８及びＱＱＲ６は反復は、ＱＱＲ８中では８ｂｐで、ＱＱＲ６中では６ｂｐで分離されている点で異なる。先行技術は、逆転されたＤＮＡ結合部位が６ｂｐにより分離された場合にアミノ酸リンカーのない精製したＱＱＲ−Ｆｎ蛋白質（ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎと均等）は最も効率的にＤＮＡを切断し、一方、結合部位が６又は８ｂｐのいず���かで分離された場合に１８アミノ酸リンカーを有する精製したＱＱＲ−Ｆｎ蛋白質（ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎと均等）はＤＮＡを切断することを示した（Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００２、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６１：１１６９−７５；Ｓｍｉｔｈら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２８：３３６１−９）。全てのキメラヌクレアーゼ遺伝子ターゲッティング試験で、キメラヌクレアーゼを修復基質ＲＳ２７００で共トランスフェクトした（図１Ａ）。
【００８７】
ＱＱＲキメラヌクレアーゼはＤＳＢ−ＧＴを誘発することが発見された（図３Ｂ）。２９３細胞中の自発的遺伝子ターゲッティングのバックグラウンド割合が百万トランスフェクトされた細胞当り０．７１回（図１Ｃ）である一方、ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎキメラヌクレアーゼは遺伝子ターゲッティングをターゲットＱＱＲ６で１７倍、ターゲットＱＱＲ８で６０倍誘発した（図３Ｂ）。更に顕著には、ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎは遺伝子ターゲッティングをターゲットＱＱＲ８では誘発しなかったが、遺伝子ターゲッティングをターゲットＱＱＲ６で２０００倍以上の確率で誘発した（図３Ｂ）。従って、ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−ＦｎはＱＱＲ６よりもより高い選択性をＱＱＲ８へ示し、一方ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−ＦｎはＱＱＲ８よりも劇的な選択性をＱＱＲ６へ示した。従って、これら結果は、ジンクフィンガー及びヌクレアーゼドメイン間のアミノ酸リンカーの除去は融合蛋白質の活性及び特異性の両方を増加させたことを示す。更に、ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−ＦｎはターゲットＱＱＲ６への遺伝子ターゲッティングの誘発ではＳｃｅと同様に効率的である。キメラヌクレアーゼが核局在化シグナルを有さない場合、遺伝子ターゲッティングを誘発できない（データは示されていない）。それらは又、逆方向反復結合部位よりもむしろ単一のジンクフィンガー結合部位がある場合に遺伝子ターゲッティングを誘発できない（データは示されていない）。ＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎは２９３／ＱＱＲ８又は２９３／ＱＱＲ６セルラインのいずれでも遺伝子ターゲッティングを誘発できず、誘発は、ターゲット遺伝子中に同種のＤＮＡ結合部位を有することに依存することを示す（データは示されていない）。全体から、これら結果は、キメラヌクレアーゼのホモダイマーはヒト体細胞のゲノム中での遺伝子ターゲッティングの非常に効能のある誘発剤であることを示す。
【００８８】
キメラヌクレアーゼで誘起されるＤＳＢ−ＧＴの特異性及び効率を更に探求するために、キメラヌクレアーゼのヘテロダイマーが遺伝子ターゲッティングを誘発するかを試験した。セルライン２９３／ＱＱＲＺＩＦ６中で、ターゲットＧＦＰ遺伝子は、６ｂｐで分離されたＱＱＲ及びＺｉｆ２６８ジンクフィンガーの逆転された結合部位により破壊された。ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎ又はＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎそれぞれ単独のトランスフェクションは、遺伝子ターゲッティングの顕著な誘発を引き起こさなかった（図３Ｃ）。しかし両方のキメラヌクレアーゼを共トランスフェクトした場合に、遺伝子ターゲッティングを５０００倍以上の確率で誘発することができ、誘発はＳｃｅと同様に効率的であった（図３Ｃ）。従って、キメラヌクレアーゼのヘテロダイマーは、遺伝子ターゲット配列を切断でき、遺伝子ターゲッティングを数千倍の確率で誘発した。
【００８９】
遺伝子ターゲッティングの誘発におけるＳｃｅ及びキメラヌクレアーゼ間の１個の重要な相違が発見された。遺伝子ターゲッティングを誘発するためにＳｃｅを使用した場合、ＧＦＰポジティブ細胞の数は、３日で最大値に達し、次に安定して存在した（図１Ｄ）。しかし、遺伝子ターゲッティングを誘発するためにキメラヌクレアーゼを使用した場合、ＧＦＰポジティブ細胞の数は、３日後時間の経過と共に減少したことが発見された（図３Ｄ）。ＧＦＰポジティブ細胞の減少は、これらヌクレアーゼ、例えば非常に特定の結合部位を有するもの（Ｚｉｆ２６８）の連続的発現は細胞に毒性を与えることを示した。
【００９０】
遺伝子ターゲッティングによる突然変異の修復する能力は、ヒト体細胞中のその低い確率により排除された遺伝子治療の理論的に洗練された形である。ＤＳＢ−ＧＴは、ゲノムターゲット及び修復基質間の間の相同長さ、細胞中の修復基質の量、ターゲットでのＤＳＢの頻度、及び修復基質の転写状態に依存するプロセスであることが発見された。これら変数因子が最適化された場合、遺伝子ターゲッティング確率３〜５％が達成される。遺伝子ターゲッティングのこれら確率は、治療的、実験的に有用な程度である。重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）等の、修復された細胞が強力な優先的長所を突然変異細胞に対して有する病気中では、３〜５％の遺伝子修復確率は、ほとんど確実に治癒的である。鎌状赤血球症等の、修復された細胞の優越的利点は複製後細胞中に挿入されることのみである他の病気では、３〜５％の修復確率は、それら病気を改善するに留まる。最後に、血友病等の、修復された細胞の優越的利点がないが小量の修復された細胞は劇的効能を有する病気では、３〜５％のターゲッティング確率は、改善に充分であり、治癒にさえ充分である。
【００９１】
発明者はＧＦＰシステムを使用して、キメラヌクレアーゼをヒト体細胞中の遺伝子ターゲッティングを少なくとも数千倍誘発できることを示した。この結果は、強力な示唆を含む。本発明のキメラヌクレアーゼは本来ジンクフィンガードメイン中に存在するＤＮＡ結合特異性を有する。ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性の修飾により、特に広い種類の９ｂｐ配列に結合するように設計され、最適化されることができる（Ｒｅｂａｒら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：６７１−３；Ｗｏｌｆｅら、２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）、９：７１７−２３；Ｓｅｒａ及びＵｒａｎｇａ、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：７０７４−８１）。従って、選択した座の遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼを設計することができる。本発明のデータは、キメラヌクレアーゼのダイマー、例えばヘテロダイマーがＤＮＡの切断を協同する場合に、遺伝子ターゲッティングの最も高い効率での誘発が得られることを示した。１対の３フィンガーキメラヌクレアーゼを使用すると、全体の認識配列は、３０億ｂｐゲノム中で統計学的に特異である１８ｂｐ長さである。どの配列でも切断する対のキメラヌクレアーゼを設計することは不可能かもしれない。しかし、Ｅｌｌｉｏｔら（１９９８）は、遺伝子転換経路長さは、配列異常発生があっても１００塩基対以下の長さでもよいことを示した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９８、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１８：９３−１０１）。遺伝子転換経路の長さにより供給されたウィンドウ、並びに、９ｂｐ結合部位の広い配列を認識するトリプレットジンクフィンガーを選択し設計する能力の両方がある場合、キメラヌクレアーゼはゲノム中のいずれの配列でも遺伝子ターゲッティングを誘発するように設計できる。本研究では、キメラヌクレアーゼは２９３細胞中で連続的に過剰発現された場合にいくらか毒性を有することが発見された。in vitro選択によるジンクフィンガーの特異性の改良により（Ｗｏｌｆｅら、２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）、９：７１７−２３）又はキメラヌクレアーゼを更に調節されたコントロール下におくことでキメラヌクレアーゼの毒性を減少できる。結論として、この研究は、実験的目的での哺乳類体細胞中の効率的な、部位特定的ゲノム操作の基礎を確立した。多分更に重要であるが、この研究は治療的目的用のヒト体細胞中の遺伝子ターゲッティングによる突然変異の修復の実例を確立した。
【００９２】
実施例２：キメラヌクレアーゼでのゲノムの部位特定的操作
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、広い種類のヌクレオチドトリプレットを認識するように設計できるモジュラー蛋白質ユニットである（Ｗｏｌｆｅら、２０００、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ、２９：１８３−２１２）。例えば、in vitro選択技術を使用して、幾つかの研究グループは、高い特異性で全ての１６の異なるＧＮＮヌクレオチドトリプレットへ結合できるジンクフィンガーを設計した（Ｌｉｕら、２００２、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：３８５０−３８５６；Ｓｅｇａｌら、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：２７５８−２７６３）。ある研究グループは全ての１６の異なるＡＮＮヌクレオチドトリプレットへ結合できるジンクフィンガードメインの類似する性質を報告した（Ｄｒｅｉｅｒら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６：２９４６６−２９４７８）。最後に、他の研究者は全てのヌクレオチドトリプレット用の認識コードを提案した（Ｓｅｒａ及びＵｒａｎｇａ、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：７０７４−７０８１；Ｗｏｌｆｅら、２０００、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ、２９：１８３−２１２）。これらコードは、公知のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの認識配列及び結晶構造を基礎にして発達された。発明者の技術は、どのようなトリプレットも認識するためのジンクフィンガーＤＮＡドメインの合理的設計の基礎を確立した。
【００９３】
突然変異された場合に遺伝病を引き起こす遺伝子中の内因性配列を認識するジンクフィンガードメインを設計するために、発明者は、３フィンガージンクフィンガードメインを製造するＰＣＲベースの手順を使用し、３フィンガードメインをＦｏｋＩ制限酵素のエンドヌクレアーゼドメインへ融合した。新しいキメラヌクレアーゼが遺伝子ターゲッティングを誘発できるかを試験するために、細胞のゲノム中の単一の複製として統合された人工遺伝子ターゲットを生成した。人工遺伝子ターゲットは、９ｂｐ内因性ターゲット配列の逆方向反復を有し、Ｚｉｆ２６８用の９ｂｐ認識配列と適合するＧＦＰ遺伝子から構成される。発明者は、以前Ｚｉｆ２６８３−フィンガードメインを有するキメラヌクレアーゼ（ＣＭＶ−Ｚｉｆ−Ｌ３−Ｆｎ）はヘテロダイマーとして遺伝子ターゲッティングを誘発できることを示した。遺伝子ターゲッティングが発生する場合、突然変異されたＧＦＰ遺伝子は、野生種へ転換し、細胞はＧＦＰポジティブとなる。遺伝子ターゲッティングの効率は、フロー血球計算法によりＧＦＰポジティブ細胞の数を測定して決定した。
【００９４】
発明者は、ヒトβ−グロブリン遺伝子及びヒト共通γ鎖から由来するターゲット配列を切断するキメラヌクレアーゼを設計することにより、重要な病気を発生する遺伝子から得られた内因性配列への遺伝子ターゲッティングを誘発するために、キメラヌクレアーゼを使用できる証拠及び原則を示した。ヒトβ−グロブリン遺伝子中の点突然変異は、鎌状赤血球貧血及び、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）へ導く共通γ−鎖中の種々の突然変異を引き起こす。
鎌状赤血球貧血を引き起こす、コドンを取り巻き、突然変異されたヒトβ−グロブリン遺伝子の配列（赤）を図４に示す。２対の可能性のあるキメラヌクレアーゼ（ＨＢＧＺＦ１及びＨＢＧＺＦ２；ＨＢＧＺＦ３及びＨＢＧＺＦ４）が示される。キメラヌクレアーゼ用結合部位は、大文字でハイライトされている。
【００９５】
図５は、ＨＢＧＺＦ１用の結合部位、並びに、Ｌｉｕら（２００２）及びＳｅｇａｌｌら（１９９９）からの、単一の文字コードを使用してそれぞれトリプレットを認識するジンクフィンガードメインを示す。星で表されるフィンガー１〜３用のアミノ酸を使用してキメラヌクレアーゼ（ＨＢＧＺＦ１）を製造し、ＣＭＶプロモーターの調節下でキメラヌクレアーゼ配置した。次に２９３細胞を人工ＧＦＰ遺伝子ターゲットでトランスフェクトした（２９３／１１０４細胞）。図６に示すように、ＧＦＰ遺伝子は挿入された突然変異を含有することが発見された。ＣＭＶ−ＨＢＧＺＦ１又はＣＭＶ−Ｚｉｆ−Ｌ３−Ｆｎいずれかのトランスフェクトは、遺伝子ターゲッティングを顕著に誘発しなかった（図６）。しかし、２つのヌクレアーゼを一緒にトランスフェクトした場合、遺伝子ターゲッティングの顕著な誘発（４０００倍以上）が得られ、遺伝子ターゲッティング確率は、ほとんどＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼと同じ高さだった（図６）。遺伝子ターゲッティングのこの誘発は、キメラヌクレアーゼは内因性遺伝子配列を認識するように設計でき、そしてこれらヌクレアーゼはこれら配列において遺伝子ターゲッティングを誘発できることを示す。
【００９６】
ＨＢＧＺＦ４のターゲット部位の設計を図７に示す。図８の上部は、ＨＢＧＺＦ４がＺＩＦ２６８結合部位に対して逆方向反復として配置された人工ＧＦＰ遺伝子ターゲットを示す。この遺伝子ターゲットの単一の複製を含有するセルライン２９３／１１１４を使用して、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを使用した優れた遺伝子ターゲッティング誘発が得られたが、ＣＭＶ−ＨＢＧＺＦ４及びＣＭＶ−Ｚｉｆ−Ｌ３−Ｆｎを一緒に使用した場合はわずかな誘発のみであった（〜６０倍）。両方のヌクレアーゼでの誘発は、ＣＭＶ−ＨＢＧＺＦ４単独を使用して得られるものより顕著に優れていなかった（〜３０倍）。ヒト共通γ−鎖中の突然変異は、ＳＣＩＤの最も一般的な原因であることは公知である（Ｎｏｔａｒａｎｇｅｌｏら、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１７８：３９−４８）。図９はヒト共通γ−鎖の構造及びＳＣＩＤへ導く遺伝子中の突然変異の位置を示す。図９の下部はエクソン５の配列及びキメラヌクレアーゼＨＣＧＣＺＦｌ及びＨＣＧＣＺＦ２の予定する結合部位を示す。
【００９７】
図１０は、ＨＣＧＣＺＦ２の結合部位並びに、Ｓｅｒａ及びＵｒａｎｇａ（２００２）からのジンクフィンガーコードに由来するジンクフィンガー１〜３用アミノ酸を使用したＨＣＧＣＺＦ２の構造を示す。図１１の上部は、ＧＦＰ遺伝子中に挿入された人工ハイブリッドＨＣＧＣＺＦ２／Ｚｉｆ２６８結合部位を示す。
ＣＭＶ−ＨＣＧＣＺＦ２又はＣＭＶ−Ｚｉｆ−Ｌ３−Ｆｎ単独のトランスフェクトは、遺伝子ターゲッティングを顕著に誘発しなかった。しかしキメラヌクレアーゼを一緒に使用すると、遺伝子ターゲッティングの顕著な誘発が得られた（２００倍以上）（図１１）。しかし一緒の２つのヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼほど効率的ではなかった（図１１）。それにも拘わらず、ＨＣＧＣＺＦ２はヒト体細胞のゲノム中の遺伝子ターゲッティングを誘発できる内因性９ｂｐ配列を認識するキメラヌクレアーゼの経験的設計の第２例を提供する。
【００９８】
実施例３．内因性配列の遺伝子ターゲッティング
実施例２中、内因性遺伝子（β−グロブリン遺伝子及び共通γ−鎖遺伝子）由来配列で切断するキメラヌクレアーゼ（この実施例中のジンクフィンガーヌクレアーゼ）の設計が示された。特に、下記のコンセンサス配列を有するターゲット部位で切断するキメラヌクレアーゼの設計は１００％成功した：５’ＧＮＮＧＮＮＧＮＮ３’、但し、Ｇはグアニンを示し、Ｎはヌクレオチドを表す。従って、その遺伝子が６ヌクレオチドで分離された反復を有する（例えば５’ＮＮＣＮＮＣＮＮＣＮＮＮＮＮＮＧＮＮＧＮＮＧＮＮ３’）上記コンセンサス配列の逆方向反復を含有する場合には、天然遺伝子中の遺伝子ターゲッティングを誘発する１対のジンクフィンガーヌクレアーゼを経験的に設計できることが予測される。ＧＦＰ遺伝子及びヒトＣＤ８α遺伝子の両方共これら配列を含有する。
この例では、これら遺伝子の両方中の遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼの設計を示す。
【００９９】
ＧＦＰキメラヌクレアーゼを使用したＧＦＰの遺伝子ターゲッティング
ＧＦＰの配列の探求により下記配列が特定された：５’ＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣ３’。この配列は、上記記載の逆方向反復コンセンサス配列に適合する。配列は遺伝子のコード配列のｂｐ２９２〜３１５から始まる。一部、Ｌｉｕら（２００２）による手引きを使用して、ターゲット配列５’ＧＡＡＧＡＴＧＧＴ３’を認識するためのＧＦＰ−ＣＮ１、及び、ターゲット配列５’ＧＡＣＧＡＣＧＧＣ３’を認識するためのＧＦＰ−ＣＮ２を製造した。上記を製造するためにＺｉｆ−Ｆｎからのキメラヌクレアーゼ主鎖を使用し、上記実施例１で記載されたＧＦＰ遺伝子ターゲッティングシステムを使用してＧＦＰ−ＣＮを試験した。ＧＦＰ−ＣＮ用のターゲット結合部位は、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位のＧＦＰ遺伝子中への挿入に近接して存在する。簡潔に言うと、これら細胞中では突然変異されたＧＦＰ遺伝子は、２９３細胞のゲノム中に単一の複製として統合された。ＧＦＰ−ＣＮは、修復基質と共に共トランスフェクトされた場合に、遺伝子ターゲッティングを１０００倍で誘発できる（図１２）。ＧＦＰ−ＣＮは、遺伝子ターゲッティングの誘発においてＩ−ＳｃｅＩと同様に効率的ではなかった（図１２）。
結果的に、この実施例は、キメラヌクレアーゼが、遺伝子がヒト体細胞のゲノム中に統合されたとしても、天然遺伝子の位置に遺伝子ターゲッティングを誘発するために生成できることを示す。
【０１００】
キメラヌクレアーゼを使用したヒトＣＤ８遺伝子の遺伝子ターゲッティング
ＧＦＰ遺伝子ターゲッティングシステム中で、突然変異されたＧＦＰ遺伝子を含有するbicistronic転写なしのヒトＣＤ８α遺伝子を発現した。セルライン２９３／１００４中で、例えば９５％の細胞がＣＤ８ポジティブである。ヒトＣＤ８α遺伝子の塩基対４４１〜４６８をスパンし、上記記載の逆方向反復コンセンサスに適合する下記の配列５’ＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣ３’が発見された。５’ＧＴＧＧＧＣＧＣＣ３’を認識するためのＣＤ８ＣＮ１及び５’ＧＴＣＧＣＡＧＣＣ３’を認識するためのＣＤ８ＣＮ２を構成した。その中のピューロマイシン耐性カセットには、ＣＤ８遺伝子（「ＣＤ８ノックアウトプラスミド」という）に対して、５’相同性の４４０塩基及び３’相同性の２２０塩基が側面に存在するＣＤ８ｃＤＮＡノックアウトプラスミドも又構成した。次にＣＤ８キメラヌクレアーゼと共に又はそれ無しのＣＤ８ノックアウトプラスミドを、セルライン２９３／１１０４中にトランスフェクトし、ピューロマイシン選択後の細胞集団中のＣＤ８ポジティブ細胞の割合を測定した（図１３）。ＣＤ８ノックアウトプラスミドのトランスフェクトは、予測されたようにＣＤ８ネガティブ細胞の数を母集団から（両方とも５％ＣＤ８ネガティブ）変更しなかった。ＣＤ８キメラヌクレアーゼのＣＤ８ノックアウトプラスミドとの共トランスフェクション後に、２０％以上の細胞がＣＤ８ネガティブであった。これは、ピューロマイシンノックアウトプラスミドの遺伝子中への挿入の刺激により、キメラヌクレアーゼがＣＤ８αｃＤＮＡ中の遺伝子ターゲッティングを誘発できることを示す。
【０１０１】
この実施例は、対のキメラヌクレアーゼが天然遺伝子中の遺伝子ターゲッティングの誘発をするために設計できることを示す。第一例の場合、キメラヌクレアーゼの設計方法、可能性のある遺伝子治療適用中での使用方法モデルとして、上記キメラヌクレアーゼはＧＦＰ遺伝子の修復を誘発するために使用できることが示された。
第二例の場合、キメラヌクレアーゼの設計方法、可能性のある体細胞遺伝子適用中での使用方法モデルとして、上記キメラヌクレアーゼは遺伝子ターゲッティング及びＣＤ８遺伝子のノックアウトを誘発できることが示された。更に、ＣＤ８遺伝子のノックアウトは巨大マーカー遺伝子のＣＤ８座中への挿入を含み、本発明の技術は「トランスジェネシス」、例えばゲノムの目的部位中への導入遺伝子の挿入、のために使用できることを示した。
【０１０２】
均等物；
本発明の特定の実施態様が明白にここで示されているが、上記記載は具体例であり限定的なものではない。当業者に明らかな本発明の多くの改変も本発明の範囲内である。本発明の範囲は、特許請求の範囲に基づいて定められ、その均等物をも含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、全て緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子ターゲッティングシステムを示す。図１Ａは、ＧＦＰ遺伝子ターゲッティングシステムを示す。人工遺伝子ターゲット（Ａ６５８）は、コード配列の塩基対３２７での、停止コドン及びＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｓｃｅ）の認識部位（５’ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ３’）を含有する３５塩基対挿入により突然変異されたＧＦＰ遺伝子から構成される。ＧＦＰ遺伝子は、ハイブリッドサイトメガロウィルスエンハンサー／ニワトリβ３−アクチンプロモーター（「ＣＭＶ／ＣＢＡ」又は「ＣＢＡ」）により作動される。ＧＦＰ遺伝子は、内部のリボソームの侵入部位（ＩＲＥＳ）がヒトＣＤ８α遺伝子（ＣＤ８）の翻訳を可能とするbicistronic転写の一部である。bicistronicメッセージは、メッセンジャーＲＮＡレベルを増加させるウッドチャック転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含有した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：２８８６−９２）。最後に、上記座は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を作動させて抗生物質Ｇ４１８による選択を可能とするホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）を有する遺伝子を含有した。修復基質ＲＳ２１００及びＲＳ２７００も又表現された。それらはコード配列の塩基対３７で短縮されたＧＦＰ遺伝子から構成され、従って開始コドン（ｔｒｕｎｃＧＦＰ）を有さない。短縮されたＧＦＰ遺伝子の次に、Ａ６５８内のようにＲＳ２１００用のＩＲＥＳ−ＣＤ８又はＲＳ２７００用のＩＲＥＳ−ＣＤ８−ＷＰＲＥが連続した。２×１０6細胞を１０μｇのスーパーコイルＡ６５８プラスミドＤＮＡで電気穿孔して、Ａ６５８遺伝子ターゲットを２９３細胞中に導入した。細胞を５００μｇ／ｍｌＧ４１８中２週間で選択操作を行なった。個体コロニーを採集し、フィコエリトリン結合抗−ＣＤ８抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）で染色して高い表面ＣＤ８発現を示したものを特定してモノクローンセルラインを作成した（２９３細胞、通常ＣＤ８を発現しない）。ポリクローンセルラインを「Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗−ＣＤ８マイクロビーズ」商標及び「ＭＡＣＳミニカラム」商標（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して細胞集団を精製して製造した。２９３／Ａ６５８細胞をＳｃｅ発現プラスミドと共に又はそれ無しのＲＳ２１００で、調節プラスミド（ｐＯＮ４０５）と共にトランスフェクトしてトランスフェクション効率を決定し、遺伝子ターゲッティングを測定した。Ｓｃｅ発現の作動のために下記３種の異なるプロモーターを使用した：ＰＧＫ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）及びＣＢＡ。細胞を次に３日間培養し、ＧＦＰポジティブ細胞の割合をＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）を使用してフロー血球計算法により測定した。遺伝子ターゲッティング確率を、ＧＦＰポジティブ細胞のトランスフェクション効率に対する測定された割合を標準化して決定した。
【図１Ｂ】遺伝子ターゲッティングの代表的フロー血球計算法プロットを示す。ＧＦＰポジティブ細胞は左のフロープロットに示された領域「Ｒ２」中で定量化された。それは、Ｓｃｅ発現プラスミド単独でトランスフェクション後の２９３／Ａ６５８細胞を示す。ＧＦＰポジティブ細胞は存在しなかった。真ん中のプロット「Ｓ−ＧＴ」は、ＲＳ２１００単独でトランスフェクション後の２９３／Ａ６５８細胞を示す。２つのＧＦＰポジティブ細胞が丸くなり自発的遺伝子ターゲッティング減少を示した。右のプロット「ＤＳＢ−ＧＴ」はＲＳ２１００及びＣＢＡ−Ｓｃｅでの共トランスフェクション後の２９３／Ａ６５８細胞を示す。このプロット中、領域Ｒ２中に多量のＧＦＰポジティブ細胞があった。
【図１Ｃ】２９３細胞中の遺伝子ターゲッティング確率を示す。結果はトランスフェクトされた細胞百万当たりの両方の遺伝子ターゲッティング事象の数（「事象／１０6細胞」）±１標準偏差として、及び全体の確率として示される。結果を４種の異なる遺伝子ターゲットとして示す。「１ｂｐ突然変異」ターゲット中、ナンセンス突然変異が機能性ＧＦＰ発現を排除するコード領域のｂｐ３２１位でＧＦＰ遺伝子中に生成した。「７ｂｐ挿入」ターゲット用に、７ｂｐ配列がＧＦＰコード領域のｂｐ３２７位に挿入された。「３５ｂｐ挿入」用遺伝子ターゲットはＡ６５８であり、「６６ｂｐ挿入」用ターゲットはＱＱＲ８であった（図３Ａに図解する）。「Ｓｃｅ」と表示した列は、Ｓｃｅが共トランスフェクトされたかされないかを示す。「Ｓｃｅ誘起したＤＳＢによるＦｏｌｄ誘発」と表示した行は、Ｓｃｅの発現により誘起したターゲットＡ６５８上の遺伝子ターゲッティング確率の誘発である。
【図１Ｄ】遺伝子ターゲッティングの時間的経過を示す。ＤＳＢ−ＧＴの相対速度は第３日に標準化した。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｅは、ＤＳＢ誘起した遺伝子ターゲッティングの確率を調節する変数因子を示す。実験中、トランスフェクションは２４ウェルプレート中でリン酸カルシウム技術で行われた。図２Ａ〜２Ｄ中、遺伝子ターゲッティングの確率は、２００ｎｇのＲＳ２１００及び２００ｎｇのＰＧＫ−Ｓｃｅを使用した標準条件に標準化された。トランスフェクトされた構成要素の量を変化させた実験中、合計ＤＮＡ量はｐＢＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ社製、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を添加して一定に維持した。  図２Ａは遺伝子ターゲッティング確率に対する基質量を示す。結果は、２００ナノグラム（ｎｇ）のＲＳ２１００をトランスフェクトした後に得られた遺伝子ターゲッティングの確率に標準化された。
【図２Ｂ】遺伝子ターゲッティング確率に対する相同長さを示す。結果はプラスミドＲＳ２１００で得られた確率に標準化された。８００ｂｐの相同性（ＲＳ８００）を有するプラスミドはＲＳ２１００のＩＲＥＳ−ＣＤ８構成要素を失った。２７００ｂｐの相同性（ＲＳ２７００）を有するプラスミドは、図１Ａに示される。４２００ｂｐの相同性（ＲＳ４２００）を有するプラスミドは、ＲＳ２１００の３’末端へのＷＰＲＥ及びＰＧＫ−ＮＥＯ構成要素の両方の添加を有した。一定量（２００ｎｇ）のそれぞれの修復基質がトランスフェクトされたが、ＤＳＢ−ＧＴの相対速度がトランスフェクトされたモル量に標準化された。
【図２Ｃ】遺伝子ターゲッティング確率に対するトランスフェクトされたＳｃｅ発現プラスミドの量を示す。結果は、２００ｎｇのＰＧＫ−Ｓｃｅがトランスフェクトされた時に得られた遺伝子ターゲッティングの確率に標準化された。
【図２Ｄ】遺伝子ターゲッティング確率に対する修復基質の転写状態を示す。「非転写」とは、ＲＳ２１００を使用したＤＳＢ−ＧＴの割合である。「転写」とは、ＲＳ２１００のセンスストランドがＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−ＲＳ２１００）を使用して転写された時のＤＳＢ−ＧＴの割合である。割合はＲＳ２１００を使用して得られた遺伝子ターゲッティングの確率に標準化された。
【図２Ｅ】遺伝子ターゲッティングの最適化を示す。「１」と表示した行は、Ｓｃｅ及びＲＳ２１００が同一プラスミド上の場合であり「２」と表示した行は、Ｓｃｅ及びＲＳ２１００が分離されたプラスミド上の場合である。トランスフェクトされた細胞百万当たり３００００ＧＦＰポジティブ細胞は、遺伝子ターゲッティング確率の３％に相当する。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、キメラヌクレアーゼ誘起された遺伝子ターゲッティングを示す。それぞれの実験中、遺伝子ターゲッティングの確率を適切なヌクレアーゼ及び修復基質ＲＳ２７００で共トランスフェクトして測定した（図１Ａ）。  図３Ａはキメラヌクレアーゼ及びキメラヌクレアーゼターゲットの概略図を示す。遺伝子ターゲットは、挿入部位を延長する追加的配列がＳｃｅ認識部位（Ｓｃｅ部位）の近傍のＧＦＰ遺伝子中に挿入された以外はＡ６５８と同じである。ＱＱＲ８及びＱＱＲ６中に、ＱＱＲジンクフィンガートリプレット（５’ＧＧＧＧＡＡＧＡＡ３’）用の結合部位（ＱＱＲ部位）の逆方向反復を、６ｂｐスペーサー「６」（ＱＱＲ６）又は８ｂｐスペーサー「８」（ＱＱＲ８）のいずれかと共に挿入した。ＱＱＲＺＩＦ６中で、Ｚｉｆ２６８トリプレットフィンガー（Ｚｉｆ部位）（５’ＧＣＧＴＧＧＴＣＧ３’）用の結合部位を、部位間に６ｂｐスペーサー（６）を有するＱＱＲ部位に対し逆転配置で挿入した。ポリクローナル２９３セルラインをＱＱＲ８、ＱＱＲ６、及びＱＱＲＺＩＦ６から図１に示されるように作成した。キメラヌクレアーゼをＣＭＶプロモーターＣＭＶにより作動した。それぞれは標準開始コドン「ＡＴＧ」を有しその後ろに核局在化シグナル「Ｎ」がアミノ末端に続いた。トリプレットジンクフィンガードメイン、ＱＱＲジンクフィンガートリプレット用のいずれかの「ＱＱＲ」（Ｓｈｉら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：２８２−２８４）又は、Ｚｉｆ２６８トリプレット用の「Ｚｉｆ」（Ｗｏｌｆｅら、２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）、９：７１７−２３）は核局在化シグナルの次に続いた。次に変数因子アミノ酸リンカー、１８アミノ酸（Ｌ１８）がＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎ中に、ゼロアミノ酸（Ｌ０）がＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ０−Ｆｎ中に、又は３アミノ酸（Ｌ３）がＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎ中に、ＦｏｋＩ制限酵素（「ヌクレアーゼ」又は「Ｆｎ」）のエンドヌクレアーゼドメイン前に存在する（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎら、１９９９、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、３８０：８４１−８）。ＣＭＶ−ＺＩＦ−Ｌ３−Ｆｎが新規な一方、ＣＭＶ−ＱＱＲ−Ｌ１８−Ｆｎ及びＣＭＶ−ＱＱＲ−ＬＯ−Ｆｎは、予め特徴づけられた融合蛋白質からのクローンである（Ｓｍｉｔｈら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２８：３３６１−９）。
【図３Ｂ】キメラヌクレアーゼホモダイマーを使用した遺伝子ターゲッティングを示す。
【図３Ｃ】キメラヌクレアーゼヘテロダイマーを使用した遺伝子ターゲッティングを示す。
【図３Ｄ】キメラヌクレアーゼを使用した遺伝子ターゲッティングの時間的経過を示す。
【図４】鎌状赤血球貧血を引き起こすように突然変異されたコドン（赤）の周囲のヒトβ−グロブリン遺伝子の配列を示す。２対の可能性のあるキメラヌクレアーゼ（ＨＢＧＺＦ１及びＨＢＧＺＦ２；ＨＢＧＺＦ３及びＨＢＧＺＦ４）が示される。キメラヌクレアーゼ用の結合部位が、大文字でハイライトされている。
【図５】単一の文字コードを使用して、それぞれトリプレットを認識する、ＨＢＧＺＦ１及びジンクフィンガードメインの結合部位を示す。
【図６】ＨＢＧＺＦ１の遺伝子ターゲッティング及び、人工ハイブリッドＨＢＧＺＦ１／Ｚｉｆ２６８結合部位を含有するＧＦＰ遺伝子ターゲットの結果を示す。
【図７】ＨＢＧＺＦ４用の設計及びターゲット部位を示す。
【図８】ＨＢＧＺＦ４の遺伝子ターゲッティング及び人工ハイブリッドＨＢＧＺＦ４／Ｚｉｆ２６８結合部位を含有するＧＦＰ遺伝子ターゲットの結果を示す。
【図９Ａ】ヒト共通γ−鎖の構造及び、Ｎｏｔａｒａｎｇｅｌｏら、２００２から由来するＳＣＩＤへ導く遺伝子中の突然変異の位置を示す。
【図９Ｂ】エクソン５の配列並びにキメラヌクレアーゼＨＣＧＣＺＦｌ及びＨＣＧＣＺＦ２用の予定結合部位を示す。
【図１０】ＨＣＧＣＺＦ２の結合部位並びに、Ｓｅｒａ及びＵｒａｎｇａ（２００２）からのジンクフィンガーコードに由来するジンクフィンガー１〜３用アミノ酸を使用したＨＣＧＣＺＦ２の構造を示す。
【図１１】ＨＢＧＺＦ２の遺伝子ターゲッティング及び人工ハイブリッドＨＣＧＣＺＦ２／Ｚｉｆ２６８結合部位を含有するＧＦＰ遺伝子ターゲットの結果を示す。
【図１２Ａ】図１２はＧＦＰキメラヌクレアーゼによる遺伝子ターゲッティングを示す。１２Ａは、ＧＦＰ遺伝子中のターゲット配列の配列、及びＧＦＰ遺伝子を切断するように設計されたキメラヌクレアーゼを示す概略図を示す。ＧＦＰキメラヌクレアーゼターゲット部位は、丁度５’からＩ−ＳｃｅＩ認識部位（Ｓｃｅ部位）の挿入まで存在する。
【図１２Ｂ】実施例１に記載された修復基質Ａ７６７で表示ヌクレアーゼを共トランスフェクションした後の、２９３細胞中の遺伝子ターゲッティングの確率を示す。
【図１３Ａ】図１３はＣＤ８キメラヌクレアーゼによる遺伝子ターゲッティングを示す。１３Ａは、キメラヌクレアーゼ用のヒトＣＤ８α遺伝子中のターゲット配列を示す。
【図１３Ｂ】２９３／１１０４細胞の、ＣＤ８ノックアウトプラスミド単独（５％ＣＤ８ネガティブ細胞）又は、ＣＤ８ノックアウトプラスミド及びＣＤ８キメラヌクレアーゼ（２０％ＣＤ８ネガティブ）でのトランスフェクト後のフロー血球計算法プロットを示す。ＣＤ８発現の測定は、ピューロマイシン抵抗性コロニーの採集後、フィコエリトリン結合α−ＣＤ８モノクローン性抗体で染色して行った。
【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006502748.tif 000019
【図９Ａ】
2006502748.tif 000020
【図９Ｂ】
2006502748.tif 000021
【図１０】
2006502748.tif 000022
【図１１】
2006502748.tif 000023
2006502748.tif 000024
【図１２Ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月12日(2005.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)ＤＮＡ結合ドメイン；(ii)切断ドメイン；及び(iii)核局在化シグナル（ＮＬＳ）、を含有するキメラヌクレアーゼをエンコードする核酸。
【請求項２】
上記キメラヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインを含有する請求項１の核酸。
【請求項３】
上記切断ドメインはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有するものであり、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい請求項１の核酸。
【請求項４】
キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸であり；
上記キメラヌクレアーゼは（ａ）切断ドメイン及び（ｂ）少なくとも３のジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメインを含有し；
上記ＤＮＡ結合ドメインは、遺伝子障害の原因となる少なくとも５００塩基対の対立遺伝子内の、哺乳類ゲノム中の１つの位置で起こる認識配列へ結合し、上記認識配列は少なくとも９ヌクレオチドを含有する。
【請求項５】
上記切断ドメインはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有するものであり、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含有してもよい請求項４の核酸。
【請求項６】
キメラヌクレアーゼは核局在化シグナルを含有する請求項４の核酸。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項の核酸を含有するベクター。
【請求項８】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸は、哺乳類細胞中の発現のためにプロモーターへ実施上結合しているベクターであり、上記プロモーターは誘起（開始）可能なプロモーターでもよい請求項７のベクター。
【請求項９】
上記ベクターはウィルスベクターである請求項７のベクター。
【請求項１０】
上記ウィルスベクターは、アデノウィルスベクター、パルボウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター及びレトロウィルスベクターの群から選ばれる請求項９のベクター。
【請求項１１】
上記ウィルスベクターは、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクター及びレンチウイルスベクターの群から選ばれる請求項９のベクター。
【請求項１２】
更に第二キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸を含有する請求項７のベクターであり、上記第二キメラヌクレアーゼは上記キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成するベクター。
【請求項１３】
更に修復基質を含む核酸を含有する請求項７のベクターであり、上記修復基質は；
(i)染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に対応する側面に存在する(franking)領域と実質的に同じ核酸配列；及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列と置換する核酸配列；を含むものであるベクター。
【請求項１４】
上記組み換えにおいてターゲット配列と置換する核酸配列は、ターゲット配列と一個のヌクレオチドにより異なっている請求項１３のベクター。
【請求項１５】
請求項７のベクターを含有する細胞。
【請求項１６】
請求項１〜６いずれか１項の核酸を含有する細胞。
【請求項１７】
更に修復基質を含む請求項１６の細胞であり、上記修復基質は；
(i)染色体ＤＮＡ中のターゲット配列に対応する側面に存在する領域と実質的に同じ核酸配列；及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を置換する核酸配列；を含むものである細胞。
【請求項１８】
上記細胞は植物細胞又は哺乳類細胞である請求項１６の細胞。
【請求項１９】
上記細胞は単離されたヒト細胞である請求項１６の細胞。
【請求項２０】
(i)請求項７のベクター、及び(ii)上記ベクターを細胞へデリバリーして上記細胞を上記ベクターでトランスフェクトさせる遺伝子デリバリー組成物、を含有する組み換え型トランスフェクションシステム。
【請求項２１】
上記遺伝子デリバリー組成物は組み換え型ウィルス粒子、リポソーム、及びポリカチオン性核酸結合剤の群から選ばれる請求項２０の組み換え型トランスフェクションシステム。
【請求項２２】
（ａ）第一キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、及び（ｂ）第二キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸、を含有するベクターであり；上記第二キメラヌクレアーゼは上記第一キメラヌクレアーゼと共にヘテロダイマーを形成する、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２のベクターを含有する細胞。
【請求項２４】
(i)請求項２２のベクター、及び(ii)上記ベクターを細胞へデリバリーし、上記細胞を上記ベクターでトランスフェクトさせる遺伝子デリバリー組成物、を含有する組み換え型トランスフェクションシステム。
【請求項２５】
単離されたin vitro細胞のゲノムＤＮＡ中のターゲット配列の変異導入方法であり、下記（ａ）及び（ｂ）を含有し、該ターゲット配列は組み換えにおいて修復基質により変異導入される方法；
（ａ）請求項１〜６いずれか１項の核酸、又はそれによりエンコードされたキメラヌクレアーゼを細胞へ導入するステップ；並びに
（ｂ）修復基質を上記細胞へ導入するステップ、但し上記修復基質は(i)ターゲット配列の周囲の領域と実質的に同じである核酸配列及び(ii)修復基質及びターゲット配列間の組み換えにおいてターゲット配列を変更する核酸配列、を含有する。
【請求項２６】
上記ターゲット配列は、修復基質により修復される、病気の原因となる対立遺伝子を含有する請求項２５の方法。
【請求項２７】
上記ターゲット配列は、修復基質により減衰されるか不活性化される遺伝子中に位置する請求項２５の方法。
【請求項２８】
上記ターゲット配列は、修復基質中の非相同配列により置換される請求項２５の方法。
【請求項２９】
上記非相同配列は導入遺伝子のコード配列を含有する請求項の２８の方法。
【請求項３０】
上記ターゲット配列は、導入遺伝子のコード配列が転写活性な部位で挿入されるように選択される請求項の２９の方法。
【請求項３１】
上記導入遺伝子は、ベクター内のプロモーターへ実施上結合している請求項２９の方法。
【請求項３２】
上記細胞はキメラヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドと接触する請求項２５の方法。
【請求項３３】
上記キメラヌクレアーゼをエンコードする核酸及び修復基質は、単一のベクター内に存在する請求項２５の方法。
【請求項３４】
上記細胞は植物細胞である請求項２５の方法。
【請求項３５】
上記細胞はヒト細胞である請求項２５の方法。
【請求項３６】
上記細胞は幹細胞である請求項２５の方法。
【請求項３７】
上記細胞はドナーから得られた細胞である請求項２５の方法。
【請求項３８】
それが必要な個体中の、遺伝子ターゲット配列により一部又は全部で引き起こされた病気の改善、治療及び予防用医薬品の製造のための請求項７のベクターの使用。
【請求項３９】
上記個体はヒトである請求項３８の使用。
【請求項４０】
上記病気は重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、及び血友病の群から選ばれる請求項３８の使用。
【請求項４１】
上記病気は感染症であり、遺伝子ターゲット配列は感染症に対する個体の罹患性に影響する請求項３８の使用。
【請求項４２】
上記感染症はＨＩＶ感染であり、遺伝子ターゲット配列はＨＩＶによる細胞侵入に関与する細胞表面蛋白質のための遺伝子の少なくとも一部であり、ターゲット配列を変更してＨＩＶによる細胞侵入を阻止する請求項４１の使用。
【請求項４３】
上記細胞はＴ細胞又はＴ前駆細胞である請求項４２の使用。
【国際調査報告】
2006502748.tif 000028
2006502748.tif 000029
2006502748.tif 000030