(57)【要約】ＩＤＡ遺伝子、そのホモログ、断片若しくは誘導体、又はその発現を改変することによって植物における器官脱離を減少させるための方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子がＩＤＡ遺伝子又はその模倣体である方法。
【請求項２】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子がＣ末端モチーフＰｐＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列を含む方法。
【請求項３】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子がＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む方法。
【請求項４】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子がＣ末端モチーフｖ／ｉＰｐＳａ／ｇＰＳＫ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列及びＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む方法。
【請求項５】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子がＡＹ０８７８８３、ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）から選択される方法。
【請求項６】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子が配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１又はそのいずれかの変異体又はそのいずれかのホモログのいずれか１つとして提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部であるか、或いはそれを有する方法。
【請求項７】
植物における遺伝子の発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、前記遺伝子が配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１のいずれか１つとして提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部であるか、或いはそれを有する方法。
【請求項８】
前記遺伝子を突然変異させることによって前記発現レベルを低下させる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子の調節領域を突然変異させることによって前記発現レベルを低下させる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子のプロモーター領域を突然変異させることによって前記発現レベルを低下させる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔ−ＤＮＡ挿入法の使用又は干渉性部分の使用により前記遺伝子のプロモーター領域を突然変異させることによって前記発現レベルを低下させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
改変された配列であるヌクレオチド配列であって、植物が前記改変されたヌクレオチド配列を有するか又はそれで形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
【請求項１３】
ＡＹ０８７８８３、ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）、Ｃ末端モチーフＰｐＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列を含むヌクレオチド配列、Ｎ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含むヌクレオチド配列、Ｃ末端モチーフｖ／ｉＰｐＳａ／ｇＰＳＫ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列及びＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含むヌクレオチド配列から選択される配列の全て又は一部であるヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が前記配列のいずれかに１つ又は複数の突然変異を有し、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか又はそれで形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記配列が配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１又はそのいずれかの変異体又はそのいずれかのホモログ又はそのいずれかの模倣体のいずれか１つであり、前記ヌクレオチド配列が前記配列のいずれかに１つ又は複数の突然変異を有する、請求項１２又は１３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
前記配列が配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のいずれか１つであり、前記ヌクレオチド配列が前記配列のいずれかに１つ又は複数の突然変異を有する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１、又はそのいずれかの模倣体のいずれか１つとして示される配列の突然変異であるヌクレオチド配列であって、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか又はそれで形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のいずれか１つとして示される配列の突然変異であるヌクレオチド配列であって、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか又はそれで形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１２から１７のいずれか一項に記載の発明を有する構築体。
【請求項１９】
請求項１２から１８のいずれか一項に記載の発明を有するベクター。
【請求項２０】
請求項１２から１９のいずれか一項に記載の発明を有する発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１２から２０のいずれか一項に記載の発明を有する形質転換ベクター。
【請求項２２】
請求項１２から２１のいずれか一項に記載の発明を有する宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１２から２２のいずれか一項に記載の発明を有する器官。
【請求項２４】
請求項１２から２３のいずれか一項に記載の発明を有する生物。
【請求項２５】
請求項１２から２４のいずれか一項に記載の発明を有する形質転換植物。
【請求項２６】
前記植物が顕花植物又は高木である、請求項２５に記載の形質転換植物。
【請求項２７】
請求項１２から２１のいずれか一項に記載の発明で植物を形質転換することを含む方法。
【請求項２８】
器官脱離を減少させるための、形質転換された植物の調製への請求項１２から２１のいずれか一項に記載の発明の使用。
【請求項２９】
ＩＤＡ遺伝子、そのホモログ、断片若しくは誘導体、又はその発現を改変することによる、植物における器官脱離を減少させる方法。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列であって、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか又はそれで形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示し、好ましくは前記ヌクレオチド配列が突然変異であるヌクレオチド配列。
【請求項３１】
異種コード配列を発現するための、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するプロモーター配列の使用。
【請求項３２】
前記異種コード配列が前記プロモーター配列と自然に関連するコード配列に対応した突然変異コード配列である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有する単離及び／又は精製されたヌクレオチド配列。
【請求項３４】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された構築体。
【請求項３５】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製されたベクター。
【請求項３６】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された発現ベクター。
【請求項３７】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換ベクター。
【請求項３８】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換細胞であって、前記細胞が天然細胞ではない形質転換細胞。
【請求項３９】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的である単離及び／又は精製されたヌクレオチド配列。
【請求項４０】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された構築体。
【請求項４１】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製されたベクター。
【請求項４２】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された発現ベクター。
【請求項４３】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換ベクター。
【請求項４４】
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換細胞。
【請求項４５】
配列番号３に示される配列若しくはそれと実質的に相同な配列又はその断片を有する単離されたアミノ酸配列。
【請求項４６】
植物細胞の分解を防止するか又は低下させるための形質転換植物の調製への請求項１２から２１のいずれか一項に記載の発明の使用。
【請求項４７】
本明細書において実質的に記載され、図のいずれか１つを参照した改変された植物。
【請求項４８】
本明細書において実質的に記載され、図のいずれか１つを参照した植物における器官喪失の防止法。
【請求項４９】
本明細書において実質的に記載され、図のいずれか１つを参照した、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項５０】
本明細書において実質的に記載され、図のいずれか１つを参照した、単離されたアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な植物遺伝子及び植物における器官脱離（organ abscission）の抑制へのそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、器官脱離の遅延を有する新規な植物にも関する。
【０００３】
詳細には、本発明は花又は葉を含めた他の装飾若しくは観賞器官が長持ちする植物を製造することに関する。
【０００４】
本発明に従う好ましい植物にはハス、チューリップ、バラ、ポインセチアなどの顕花植物又は例えばクリスマスツリーなどの高木がある。
【背景技術】
【０００５】
生理的に決定される細胞分離プログラムである器官脱離は、老化又は損傷した器官の除去、及び植物にとって望まれないか又はもはや機能を有さない器官の脱落を助ける（１）。このプロセスは脱落する器官の基部に離層帯（ＡＺ）が形成されることを必要とする（２）。ＡＺにおいて、酵素加水分解によって隣接する生細胞間の細胞壁の溶解が生じ、器官が脱離する（３）。花の目的は受粉を助長することであるので、受精後に花は通常脱離する。
【０００６】
エチレンは器官脱離の調節に長い間関連付けられており、多くの植物において器官脱離プロセスを加速することが示されている（４）。花の器官脱離の遅延に関する最近の報告、例えば富ロイシンリピート（ＬＲＲ）受容体様キナーゼ（ＰＬＫ）であるＨＡＥＳＡの蛋白質レベルに関する報告や、ＭＡＤＳドメイン因子であるＡＧＬ１５の過剰発現に関する別の報告（５、６）は、エチレンが分離を引き起こす遺伝子発現プログラムの唯一の誘導物質及び調節物質であるということに疑問を呈している。エチレン非感受性のアラビドプシス タリアナ（Arabidopsis thaliana）突然変異体ｅｔｒ１（７）及びｅｉｎ２（８）は花の器官脱離にかなりの遅れを示すが、比較研究はこれら突然変異体が野生型（ｗｔ）植物と事実上同じ発達進行を経ることを実証している（１、９）。
【０００７】
ＷＯ０２／０６１０４２は、アラビドプシスの第５染色体上の遺伝子（ＮＥＶＥＲＳＨＥＤ）及びＮＥＶＥＲＳＨＥＤ遺伝子のＡＲＦ  ＧＡＰドメインを突然変異させることによる花の器官脱離の防止法へのその使用について記載している。
【特許文献１】ＷＯ０２／０６１０４２
【発明の開示】
【０００８】
広い一態様において、本発明は、植物における遺伝子発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法に関する。
【０００９】
「遺伝子の発現レベルを低下させる」という用語は、
遺伝子のコード領域の発現を低下又は変更又は消失させること、
遺伝子のコード領域によりコードされるタンパク質の活性を低下又は変更又は消失させること、
遺伝子調節配列の影響を低下又は変更又は消失させ、すなわちそれらの配列が低下した活性を有するか、又は全く活性を有さないようにすること、及び
遺伝子プロモーター配列の影響を低下又は変更又は消失させ、すなわちその配列が低下した活性を有するか、又は全く活性を有さないようにすること
のうち１つ又は複数を含む。
【００１０】
好ましい一態様において、本発明は、植物における遺伝子発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法に関し、その遺伝子はＩＤＡ遺伝子又はその模倣体（ａ mimetic）である。
【００１１】
別の広い態様において、本発明は器官脱離の減少を示すことができる植物に関する。
【００１２】
別の広い態様において、本発明は植物に器官脱離の減少を示させることができる１つ又は複数の改変された遺伝子に関する。
【００１３】
「改変された遺伝子」という用語は、
遺伝子のコード領域の低下又は変更又は消失した発現を有する遺伝子、
遺伝子のコード領域によりコードされるタンパク質の低下又は変更又は消失した活性を有する遺伝子、
遺伝子調節配列の低下又は変更又は消失した影響を有し、すなわちそれらの配列が低下した活性を有するか、又は全く活性を有さない遺伝子、及び
遺伝子プロモーター配列の低下又は変更又は消失した影響を有し、すなわちその配列が低下した活性を有するか、又は全く活性を有さない遺伝子
のうち１つ又は複数を含む。
【００１４】
ここで、改変された遺伝子は、植物に器官脱離の減少を示させることができる突然変異遺伝子又はサイレンシングされた遺伝子であり得る。
【００１５】
本明細書において使用される「遺伝子」という用語は、１つ若しくは複数の調節配列及び／又は１つ若しくは複数のコード配列及び／又は１つ若しくは複数の非コード領域を有するヌクレオチド配列を意味する。
【００１６】
非常に好ましい態様において、「遺伝子」という用語は、少なくとも１つ又は複数の調節配列を有するヌクレオチド配列を意味する。
【００１７】
非常に好ましい態様において、「遺伝子」という用語は、少なくとも１つのプロモーター配列を有するヌクレオチド配列を意味する。
【００１８】
好ましくは、本発明は突然変異した遺伝子に関する。突然変異は、配列の１つ又は複数の置換、１つ又は複数の欠失、１つ又は複数の挿入のうち１つ又は複数であり得る。
【００１９】
好ましくは、突然変異は少なくとも１つの置換及び／又は少なくとも１つの欠失である。
【００２０】
突然変異は、調節領域及び／又はコード領域に存在し得る。
【００２１】
好ましくは、遺伝子における突然変異は、調節領域の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。
【００２２】
「調節配列」という用語は、プロモーター及びエンハンサー並びに他の発現調節シグナルを含む。
【００２３】
突然変異は、隣接領域及び／又は遠位領域の中に存在し得る。
【００２４】
突然変異は遺伝子の発現を低下させ、又消失させもする。この点で、突然変異はプロモーターがプロモーターとして作用することを抑制するようにプロモーター領域に存在し得る。その代わりに、かつ／又はさらに、突然変異はコード領域の発現を低下させ（又、消失させもし）、かつ／又は発現が非機能的な蛋白質をもたらすように、コード領域に存在し得る。ここで、「非機能的な」という用語は、非突然変異コード配列によりコードされるタンパク質と同じ種類及び／又は活性レベルを有さないタンパク質を意味する。好ましくは、「非機能的な」という用語は、活性を全く有さないタンパク質を意味する。
【００２５】
好ましい態様において、遺伝子における突然変異は、コード配列の非常に低い発現を起こすような、好ましくは発現を起こさないような、調節配列の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。
【００２６】
非常に好ましい態様において、遺伝子における突然変異は、プロモーター配列の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。
【００２７】
「プロモーター」という用語は、本技術分野の通常の意味、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位という意味で使用される。
【００２８】
非常に好ましい態様において、遺伝子における突然変異は、プロモーターを不活性化するようにプロモーター配列の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。「不活性化する」という用語は、プロモーターの活性を少なくとも低下させること、好ましくは活性を少なくとも実質的に不活性化することを意味する。さらに好ましい実施形態において、「不活性化する」という用語は、完全な不活性化を意味する。
【００２９】
別の広い態様において、本発明は植物に器官脱離の減少を示させることができるヌクレオチド配列を有するベクターに関する。
【００３０】
別の広い態様において、本発明は植物に器官脱離の減少を示させることができる突然変異した調節配列に関する。
【００３１】
別の広い態様において、本発明はＩＤＡ遺伝子、そのホモログ、断片、若しくは誘導体、又はその発現を改変することによって植物における器官脱離を減少させる方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明をこれから全体及び特定の実施形態に関して解説する。
【００３３】
以下の注解において、添付の配列を参照する。
配列番号１：ＩＤＡ遺伝子の配列である。このＤＮＡ配列はｉｄａ突然変異を相補するために使用された。ＩＤＡ遺伝子の開始コドン及び終止コドンを太字（及び大きな活字）で表示している。ＩＤＡのｍＲＮＡ配列の最初及び最後の塩基対（大きな活字）に下線を付す。
配列番号２：ＩＤＡのｃＤＮＡ配列（アクセッション番号ＡＹ０８７８８３）である。ｃＤＮＡにおけるコード配列は塩基対９８〜３３１であり、太字（及び大きな活字）の開始コドン（ａｔｇ）及び太字（及び大きな活字）の終止コドンを参照のこと。
配列番号３：ＩＤＡタンパク質のアミノ酸配列（アクセッション番号ＡＭ６５４３５）である。
配列番号４：ＡｔＩＤＬ２である。
配列番号５：ＡｔＩＤＬ３である。
配列番号６：ＡｔＩＤＬ４である。
配列番号７：ＡｔＩＤＬ５である。
配列番号８：ＩＤＡ遺伝子の上流部分を示す。この配列はプロモーター領域を有する。本発明の非常に好ましい態様において、突然変異は本配列のプロモーター部分に作られるか、又は存在する。
配列番号９：ＩＤＡ遺伝子の上流部分を示す。この配列はプロモーター領域を有する。プロモーターを増幅させるために使用した（離層帯における発現を実証するために使用した）プライマーに下線を付し、太字で示す。本発明の非常に好ましい態様において、突然変異は本配列のプロモーター部分に作られるか、又は存在する。
配列番号１０：ＩＤＡ遺伝子の上流部分を示す。この配列はプロモーター領域を有する。非常に好ましい態様において、Ｔ−ＤＮＡの挿入（図４）によりｉｄａ突然変異体に欠失しているプロモーターの断片を斜体及び太字で示す。
配列番号１１：ＩＤＡ遺伝子を示す。ＳＡＬＫ系１３３２０９（下記）におけるＴ−ＤＮＡの挿入位置は、コード領域に斜体及び太字で示し下線を付したａヌクレオチドとｔヌクレオチドの間である。
配列番号１２：開始コドン及び終止コドンを含むＩＤＡのコード配列である。
【００３４】
本発明の特定の態様には以下がある。
植物における遺伝子発現レベルを低下させることを含む、植物における器官脱離を減少させる方法であって、遺伝子がＩＤＡ遺伝子又はその模倣体である方法。
植物が前記改変されたヌクレオチド配列を有するか、又はその配列で形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示す、改変されたヌクレオチド配列。
ＡＹ０８７８８３、ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）、Ｃ末端モチーフＰｐＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列を含むヌクレオチド配列、Ｎ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含むヌクレオチド配列、Ｃ末端モチーフｖ／ｉＰｐＳａ／ｇＰＳＫ／ｒｋ／ｒＨＮ  に対するコード配列及びＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含むヌクレオチド配列から選択される配列の全て又は一部であるヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が前記配列のいずれかの突然変異であり、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか、又はその配列で形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１又はそのいずれかの模倣体のいずれか１つとして示される配列の突然変異であるヌクレオチド配列であって、植物が前記ヌクレオチド配列を含むか、又はその配列で形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のいずれか１つとして示される配列の突然変異であるヌクレオチド配列であって、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか、又はその配列で形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示すヌクレオチド配列。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する構築体。
本明細書において提示された態様に従う発明を有するベクター。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する発現ベクター。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する形質転換ベクター。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する宿主細胞。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する器官。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する生物。
本明細書において提示された態様に従う発明を有する形質転換植物。
本明細書において提示された態様に従う発明を植物に形質転換することを含む方法。
器官脱離を減少させるための形質転換植物の調製への、本明細書において提示された態様に従う発明の使用。
ＩＤＡ遺伝子、そのホモログ、断片、若しくは誘導体、又はその発現を改変することによって植物における器官脱離を減少させる方法。
ヌクレオチド配列、改変されたヌクレオチド配列であって、植物が前記ヌクレオチド配列を有するか、又はその配列で形質転換された場合に、前記植物が器官脱離の減少を示す配列。
異種コード配列を発現させるための配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するプロモーター配列の使用。
前記異種コード配列が前記プロモーター配列に自然に関連するコード配列に相当する突然変異コード配列である、請求項３１に記載の使用。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有する単離及び／又は精製されたヌクレオチド配列。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチドを有する単離及び／又は精製された構築体。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製されたベクター。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された発現ベクター。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換ベクター。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部を有するヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換細胞。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的である単離及び／又は精製されたヌクレオチド配列。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された構築体。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製されたベクター。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された発現ベクター。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換ベクター。
配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるか、或いはそれと相補的であるヌクレオチド配列を有する単離及び／又は精製された形質転換細胞であって、前記細胞が天然細胞ではない形質転換細胞。
【００３５】
「模倣体」という用語は、基準配列（例えばＩＤＡ遺伝子）の変異体及び類似した機能を有する他の配列を含み、これらの他の配列は基準遺伝子の配列に近い配列同一性を有し得る（例えばＩＤＡ遺伝子、配列番号１参照）。ＩＤＡ遺伝子及びその模倣体に関して、本明細書において模倣体配列を「ＩＤＡ様」又は「ＩＤＬ」であると呼ぶ。
【００３６】
上に指摘したように、遺伝子における突然変異は、コード配列の非常に低い発現を起こすような、好ましくは発現を起こさないような調節配列の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。非常に好ましい態様において、遺伝子における突然変異はプロモーター配列の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。
【００３７】
非常に好ましい態様において、遺伝子における突然変異は、配列番号１に示すヌクレオチド配列、又はその変異体、ホモログ、断片若しくは誘導体のプロモーター配列の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。ここで、突然変異したヌクレオチド配列により、（その発現などによって）植物は器官脱離の減少を示す。
【００３８】
非常に好ましい態様において、遺伝子における突然変異は、配列番号１、８若しくは９に示すプロモーター配列、又はその模倣体の部分に少なくとも１つの突然変異を有する。模倣体という用語は、配列相同性又は配列同一性が類似し、突然変異した配列と同じ影響を有することができる、すなわち同一配列で形質転換された植物に器官脱離の減少をもたらすことができる配列を意味する。
【００３９】
本明細書において記載した特定の実施形態において、突然変異は遺伝子のプロモーター領域へのＴ−ＤＮＡの挿入を介して導入される。しかし、明らかとなるであろうように、突然変異を作り出す他の方法が当業者にすぐに明らかとなるであろう。Ｔ−ＤＮＡ挿入法を用いるのとは対照的に、例えば組換えＤＮＡ法を用いて突然変異遺伝子をｄｅ  ｎｏｖｏ調製できることも理解できる。
【００４０】
本明細書において記載した特定の実施形態において、突然変異は遺伝子Ａｔｇ６８７６５に導入される。しかし、明らかとなるように他の遺伝子も使用できる。
【００４１】
本明細書において記載した非常に特定の実施形態において、突然変異はａｔｇ開始コドンの上流に位置し欠失を発生する。しかし、明らかとなるように他の突然変異も使用できる。
【００４２】
本明細書において記載した非常に特定の実施形態において、突然変異は遺伝子Ａｔｇ６８７６５のプロモーターへのＴ−ＤＮＡの挿入を介して導入される。これは図４に概略で示され、ａｔｇ開始コドンの３９２ｂｐ上流に挿入ｉが位置し７４ｂｐの欠失が発生したことが示されている。さらに、配列番号１は斜体で欠失を、例えば挿入位置を示している。挿入はプラスミドｐＭＨＡ２のＴ−ＤＮＡ及びこのプラスミドの１２３９ｂｐのベクターバックボーン配列から成る。しかし、明らかとなるように他の突然変異及び／又は他の遺伝子を使用できる。
【００４３】
代替及び／又は追加の態様において、遺伝子における突然変異はコード領域の部分に少なくとも１つの突然変異を有し、コード領域の発現は低下又は消失し、突然変異したヌクレオチド配列により（その発現などによって）植物は器官脱離の減少を示す。
【００４４】
代替及び／又は追加の態様において、コード配列の発現はアンチセンスＤＮＡなどの干渉性部分の使用によって低下又は消失する。別の例はＲＮＡ干渉法である。ここで、干渉性部分により植物は器官脱離の減少を示す。
【００４５】
好ましくは前記遺伝子は、Ｃ末端モチーフＰｐＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列を含む。
【００４６】
好ましくは前記遺伝子は、Ｎ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む。
【００４７】
好ましくは前記遺伝子は、Ｃ末端モチーフｖ／ｉＰｐＳａ／ｇＰＳＫ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列及びＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む。
【００４８】
好ましくは前記遺伝子は、ＡＹ０８７８８３、ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）から選択される。
【００４９】
好ましくは前記遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１又はその任意の変異体若しくはその任意のホモログのいずれか１つとして提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部であるか、或いは全て又は一部を有する。
【００５０】
好ましくは前記遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のいずれか１つとして提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部であるか、或いは全て又は一部を有する。
【００５１】
発現レベルは、分断する配列の挿入及び／又は重要な配列領域の欠失及び／又は領域の改変及び／又は遺伝子の発現レベルに影響する部分の使用によるような任意の適当な手段により、低下し得る。
【００５２】
好ましくは前記発現レベルは、前記遺伝子を突然変異させることにより低下する。
【００５３】
好ましくは前記発現レベルは、前述の前記遺伝子の調節領域を突然変異させることにより低下する。
【００５４】
好ましくは前記発現レベルは、前述の前記遺伝子のプロモーター領域を突然変異させることにより低下する。
【００５５】
好ましくは前記発現レベルは、Ｔ−ＤＮＡ挿入法の使用により前述の前記遺伝子のプロモーター領域を突然変異させることにより低下する。
【００５６】
好ましくは前記配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１、又はその任意の変異体若しくはその任意のホモログ若しくはその任意の模倣体のいずれか１つとして提示された配列の突然変異体である。
【００５７】
好ましくは前記配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のいずれか１つとして示される配列の突然変異体である。
【００５８】
本発明の技術的態様は、本明細書において明らかとなるであろうが、特定の植物の種類に制限されない。
【００５９】
好ましくは前記植物は顕花植物又は高木である。
【００６０】
プロモーター配列は自然に関連したコード領域又は前記プロモーターと自然に関連しないコード領域の一方と作動可能に連結され得る。
【００６１】
「作動可能に連結される」という用語は、記載された構成要素がそれらの意図したように機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列と「作動可能に連結される」調節配列は、コード配列の発現が対照配列と適合性の条件で達成される方法で連結する。
【００６２】
本発明に関して使用される、「産生する」、「産生している」、「産生された」、「産生可能な」という用語は「調製する」、「調製している」、「調製された」、「発生した」及び「調製可能な」というそれぞれの用語と同義である。
【００６３】
本発明に関して使用される、「発現」、「発現する」、「発現された」及び「発現可能な」という用語は「転写」、「転写する」、「転写された」及び「転写可能な」というそれぞれの用語と同義である。
【００６４】
本発明に関して使用される、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、宿主、宿主細胞、組織又は器官に核酸配列を導入する方法を指す。
【００６５】
本発明に使用され得るヌクレオチド配列に関する他の態様には、本発明の配列を有する構築体、本発明に使用するための配列を有するベクター、本発明に使用するための配列を有するプラスミド、本発明に使用するための配列を有する形質転換細胞、本発明に使用するための配列を有する形質転換組織、本発明に使用するための配列を有する形質転換器官、本発明に使用するための配列を有する形質転換宿主、本発明に使用するための配列を有する形質転換生物がある。本発明は、宿主細胞における発現のように、それを用いた本発明に使用するためのヌクレオチド配列を発現させる方法も包含し、それを輸送する方法を含む。本発明は、宿主細胞から単離するような、ヌクレオチド配列の単離法をさらに包含する。
【００６６】
本発明者らは、新規なアラビドプシス遺伝子INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION（ＩＤＡ） による花の器官脱離の制御を検討した。本発明者らはたとえ花の離層帯が発生しても、成熟した種子の脱落後に花器官が植物体への付着を維持するアラビドプシス突然変異体inflorescence deficient in abscission（器官脱離欠損花序）(ｉｄａ)を同定した。対照的に、ｉｄａ突然変異体であるｅｔｒ１及びｅｉｎ２はエチレンに感受性である。突然変異を相補するＩＤＡ遺伝子はＮ末端輸送シグナルを有する小さなタンパク質をコードする。これはＩＤＡタンパク質が受容体のリガンドであることを示唆しており、その受容体は花の器官脱離の発生制御に関与し得る。ＩＤＡ遺伝子は本発明者らによって多数の商業的に意味のある植物種から発見された（これらを本明細書における実施例ではＩＤＡ様又はＩＤＬと呼ぶ）。本発明者らは植物が器官脱離の減少を示すように植物のＩＤＡ遺伝子の遺伝子改変を改変できることを発見した。
【００６７】
したがって、一態様において本発明は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列又はその変異体、ホモログ、断片若しくは誘導体を有する改変された植物を提供し、このとき前記配列又はその発現は改変されており、その植物は器官脱離の減少を示す。
【００６８】
改変のための好ましい配列は、（ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５）、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０）、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）から選択される。
【００６９】
好ましくはヌクレオチド配列は、Ｃ末端モチーフＰｐＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列若しくはＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含むか、又さらに好ましくはＣ末端モチーフｖ／ｉＰｐＳａ／ｇＰＳＫ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列及びＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む。
【００７０】
好ましい配列は配列番号２（ＡＹ０８７８８３）である。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、減少した器官脱離は花又はその一部であるか、それに関係する。好ましくは植物は顕花植物又は高木であり、例えばアラビドプシス タリアナ（Arabidopsis thaliana）である。
【００７２】
特に好ましい植物にはクロッカス（クロクス種（crocus spp.））、チューリップ（例えばヘマンツス種（Haemanthus spp.））、シクラメン（シクラメン種（cyclamen spp.））、ポインセチア（ユーホルビア プルケリマ（Euphorbia Pulcherrima））、ハス（例えばネルンボ属（Nelumbo）)及びバラ（ロザ種（Rosa spp.））などの花、並びにポプラ（ポプルス属（populus）及びクリスマスツリー（例えばブランドフォルディア グランディフロラ（Blandfordia grandiflora）、ヌイトシア フロリブンダ（Nuytsia floribunda）、ピカ アビエス（Pica abies））などの高木がある。
【００７３】
さらなる態様において、本発明は種子若しくは他の繁殖材料、又は本発明に従う植物からの花を提供する。
【００７４】
好ましい態様において、本発明は上に定義した配列又は配列の発現を改変することを含む、植物における器官喪失を防止する方法を提供する。適当には改変の方法は突然変異又は欠失による。改変はプロモーター又は他の調節配列の改変であり得る。適当には改変はアンチセンス構築体又はＲＮＡ干渉構築体の使用により達成される。 
【００７５】
本発明は、植物器官脱離の制御への、請求された発明に従う組換え又は単離されたヌクレオチド配列の使用も提供する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は配列番号１に示される配列、又はその変異体、ホモログ、断片若しくは誘導体を有する単離されたヌクレオチド配列も提供する。
【００７７】
好ましくは配列は、配列番号２［ＡＹ０８７８８３］並びにＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）を含めた表１に挙げる配列から選択される。配列番号２［ＡＹ０８７８８３］を有する配列が特に好ましい。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は本発明のヌクレオチド配列に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列を提供する。アンチセンス法は以前に、例えばトマトのような果実の成熟の制御に使用された。
【００７９】
好ましい態様において、本発明は植物の器官脱離の制御への本明細書において定義される単離されたヌクレオチド配列の使用を提供する。
【００８０】
「単離された」という用語は、自然界で通常関連し、自然界でみられるような少なくとも１つの他の構成要素がその配列に少なくとも実質的に存在しないことを意味する。
【００８１】
一態様において、好ましくは配列は精製された状態で存在する。「精製された」という用語は、その配列が相対的に純粋な状態、例えば少なくとも約９０％純粋であるか、又は少なくとも約９５％純粋であるか、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【００８２】
本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びに（その一部分のような）その変異体、ホモログ、断片及び誘導体を指す。ヌクレオチド配列はゲノム起源又は合成起源又は組換え起源であり得、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを意味するにせよ二本鎖又は一本鎖であり得る。
【００８３】
本発明に関係して「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。好ましくはヌクレオチド配列はＤＮＡを意味する。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の本質的な範囲に関係する場合及びその範囲に包含される場合のヌクレオチド配列は、自然の環境にある場合、及び同様に自然の環境にある自然に関連した配列と連鎖している場合の本発明に従う天然ヌクレオチド配列を含まない。参照し易いように、この好ましい実施形態を「非天然ヌクレオチド配列と」呼ぶ。
【００８５】
概して、本発明の範囲に包含されるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ法（すなわち組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかし、本発明の代替的な実施形態において、ヌクレオチド配列の全体又は部分を当技術分野で十分公知である化学法を用いて合成できよう（Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232）。 
【００８６】
本明細書において定義されるような特定の性質を有するヌクレオチド配列又は改変に適した配列を、任意の細胞若しくは生物から同定及び／又は単離及び／又は精製できる。ヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製には種々の方法が当技術分野で十分に公知である。一例として、いったん適当な配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されたならば、１つを超える配列を調製するためのＰＣＲ増幅法を使用できる。
【００８７】
さらなる一例として、適当な生物からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築できる。別の公知の遺伝子と相同の配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプローブを、適当なクローンの同定に使用できる。後者の場合、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件が使用される。
【００８８】
代わりに、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡ断片を挿入すること、生じたゲノムＤＮＡライブラリーで酵素陰性細菌を形質転換すること、及び次にクローンを同定することが可能な基質を含有する寒天平板上で形質転換された細菌を平板培養することにより適当なクローンを同定できる。
【００８９】
なお、さらなる代わりに、確立された標準法、例えばBeucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されたホスホロアミダイト法又はMatthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載された方法によってヌクレオチド配列を合成調製できる。ホスホロアミダイト法では、例えば自動ＤＮＡ合成装置でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングし、連結し、適当なベクターにクローニングする。
【００９０】
標準法に従って、ヌクレオチド配列は（必要に応じて）合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源の断片を連結することによって調製される、混合されたゲノム起源及び合成起源、混合された合成起源及びｃＤＮＡ起源、又は混合されたゲノム起源及びｃＤＮＡ起源であり得る。連結した断片のそれぞれはヌクレオチド配列全体の様々な部分に相当する。ＤＮＡ配列を、例えばＵＳ４６８３２０２又はSaiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491)に記載されたように特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても調製できる。
【００９１】
遺伝暗号における縮重のため、本来のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸の一部又は全てについて、トリプレットコドンの利用が変化することによって本来のヌクレオチド配列と低い相同性を有するが、本来のヌクレオチド配列によりコードされるものと同一の、又は変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を容易に産生させることができる。例えば、大部分のアミノ酸について遺伝暗号の縮重はトリプレットコドンの３字目（ゆらぎ位置）で起こる（Stryer, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7参照）ので、全てのトリプレットコドンが３字目で「ゆらぎ」を起こしたヌクレオチド配列は本来のヌクレオチド配列と約６６％相同であろうが、改良されたヌクレオチド配列は本来のヌクレオチド配列と同一の、又は変異体のアミノ酸一次配列をコードする。
【００９２】
したがって、本発明はトリプレットコドンがコードする少なくとも１つのアミノ酸について代替的トリプレットコドン使用を有するが、本来のヌクレオチド配列がコードするポリペプチド配列と同一の、又は変異体のポリペプチド配列をコードする任意のヌクレオチド配列にさらに関する。
【００９３】
さらに、特定の生物はアミノ酸をコードするためにどのトリプレットコドンを使用するかに関して概して偏りを有する。好ましいコドン使用表が広く入手でき、コドンを最適化した遺伝子の調製に使用できる。そのようなコドン最適化法は異種宿主における導入遺伝子の発現を最適化するために日常的に使用される。
【００９４】
本発明のヌクレオチド配列と少なくとも７５、８０、８５又は９０％同一で、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むように相同配列を取得できる。
【００９５】
本発明に関係して「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。好ましくはヌクレオチド配列は本発明をコードするＤＮＡ、さらに好ましくはｃＤＮＡ配列を意味する。
【００９６】
本発明に使用するためのヌクレオチド配列は、配列内に合成又は改変ヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる種類の改変が当技術分野で公知である。これらにはメチルホスホン酸バックボーン及びホスホロチオエートバックボーン並びに／又は分子の３’及び／若しくは５’末端へのアクリジン若しくはポリリシン鎖の付加がある。本発明の目的として、本明細書において記載されたヌクレオチド配列は当技術分野において利用できる任意の方法により改変され得ることを理解すべきである。本発明のヌクレオチド配列のｉｎ  ｖｉｖｏ活性又は寿命を増やすためにそのような改変を行ってもよい。
【００９７】
本発明は、本明細書において提示された配列に相補的であるヌクレオチド配列、又はその任意の誘導体、断片若しくは誘導体の使用も包含する。配列がその断片に相補的であるならば、他の生物などにおける類似のコード配列を同定するためのプローブとしてその配列を使用できる。
【００９８】
本発明の配列と１００％相同ではないが、本発明の範囲内に入るポリヌクレオチドを多数の方法で得ることができる。本明細書において記載された配列の他の変異体を、例えば一連の起源から作製したＤＮＡライブラリーを探査することにより得ることができる。さらに、他のホモログも得ることができ、そのようなホモログ及びその断片は、総じて本明細書における配列リストに示す配列と選択的にハイブリダイズできるであろう。他の種から作製されたｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーを探査すること、及び中から高ストリンジェントな条件で添付の配列リストにおける任意の１つの配列の全て又は一部を有するプローブでそのようなライブラリーを探査することによりそのような配列を得ることができる。類似の考察は、本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種ホモログ及び対立遺伝子変異体を得ることに適用される。
【００９９】
本発明の配列内に保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及びホモログ内の配列をターゲティングするために設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いても変異体及び株／種ホモログが得られる。例えばいくつかの変異体／ホモログからアミノ酸配列のアライメントを作成することにより、保存された配列を予測できる。当技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて配列アライメントを行うことができる。例えばＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。
【０１００】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは１つ又は複数の縮重位置を含み、公知の配列に対する単一配列プライマーで配列をクローニングするために使用されるよりも低ストリンジェントな条件で使用される。
【０１０１】
代わりに、キャラクタリゼーション済みの配列の部位特異的突然変異形成によりそのようなポリヌクレオチドを得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列を発現させようとする特定の宿主細胞に対するコドン選択を最適化するために、コドン配列のサイレント変化が必要である場合に、有用であり得る。制限酵素認識部位の導入又はポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの性質又は機能の変更のために、他の配列変化が望ましいこともある。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を例えばＰＣＲプライマーであるプライマー、代替の増幅反応用のプライマー、例えば放射性若しくは非放射性標識を用いて通常の手段により明示性の標識で標識されたプローブを産生するために使用でき、又は、ポリヌクレオチドをベクターにクローニングできる。そのようなプライマー、プローブ及び他の断片は長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチドであり、本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語によっても包含される。
【０１０３】
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチド及び本発明に従うプローブを、組換え産生、合成産生、又は当業者に利用できる任意の手段により産生できる。それらを標準法によりクローニングすることもできる。
【０１０４】
総じて、プライマーは望みの核酸配列の段階的製造を伴う合成手段により一度に１つのヌクレオチドというように産生される。自動化法を用いたこれに付随する方法は、当技術分野で容易に利用できる。
【０１０５】
さらに長いポリヌクレオチドは組換え手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング法を用いて総じて産生される。増幅したＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローニングできるように、適当な制限酵素認識部位を含むプライマーを設計できる。
【０１０６】
上に定義されるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列又はその断片も本発明に有用である。例えば、器官脱離に関与する類似の遺伝子を求めて目的の植物の遺伝子ライブラリーを探査するために断片が有用である。典型的なプローブは長さ１１〜１３ヌクレオチドである。そのような配列の例は、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列である。そのような配列のさらなる例は、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１として提示されたヌクレオチド配列の全て又は一部と相補的なヌクレオチド配列である。
【０１０７】
好ましい態様において、本発明はプロモーター又は他の調節配列である配列を提供する。
【０１０８】
好ましくは、ヌクレオチド配列はベクターの形態であり得る。ベクターは、例えばプラスミド又はコスミドであり得る。ベクターはファージであり得る。好ましいプラスミドはＴｉプラスミドである。好ましくは、ベクターは形質転換又はトランスフィックスされた細胞を同定できる選択マーカーを含む。
【０１０９】
好ましい態様において、本発明は本明細書に記載されたヌクレオチド配列をトランスフェクトされたか、又はその配列で形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１１０】
さらなる態様において、本発明は本明細書において請求されたヌクレオチド配列を含む植物細胞を提供する。
【０１１１】
植物細胞を形質転換するために適した方法は、植物分子生物学の領域の専門家に公知である任意の方法の使用による。例えばアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴｉプラスミドを用いて、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクション（バイオリスティクス）、リポソームを用いて植物細胞に配列を導入できる。ベクターの選択及び形質転換の方法は形質転換する植物細胞に依存する。
【０１１２】
例えば、チューリップの形質転換法は、Plant Cell Tissue and Organ Culture (1999) 58 (3) 213 - 217, Chauvin et al.(Effects of gelding agents on in vitro regeneration and kanamycin efficiency as a selective agent in plant transformation procedures、及びPlant Cell reports (1992) 11 (2) 76- 80, Wilmink et al., Expression of the Gus-gene in the monocot tulip after introduction by particle bombardment and Agrobacteriumに見出すことができる。
【０１１３】
本発明は、本明細書において請求された細胞を有する植物又はその一部も提供する。
【０１１４】
さらなる態様において、本発明は配列番号３に示される配列若しくはそれと実質的に相同の配列又はその断片を有する単離されたアミノ酸配列を提供する。
【０１１５】
ここで、「ホモログ」という用語は、ある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同」という用語は「同一」と同等とみなすことができる。適当には、主題配列と少なくとも７５、８０、８５又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むように相同配列が採用される。
【０１１６】
ホモログは主題配列と同一の活性部位などを概して有する。相同性を類似性（すなわち類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）によっても考慮できるが、本発明に関連しては配列同一性によって相同性を表現することが好ましい。
【０１１７】
ホモログは、活性部位などをコードする、主題配列と同一の配列を概して有する。相同性を類似性（すなわち類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）によっても考慮できるが、本発明に関連しては配列同一性によって相同性を表現することが好ましい。相同性の比較を眼、又はさらに通常は容易に入手できる配列比較プログラムの援助で行うことができる。これらの商業的に入手できるコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同率（％）を計算できる。
【０１１８】
連続する配列にわたって相同率（％）が計算できる、すなわち一方配列をもう一方の配列と整列させ、一方の配列の各アミノ酸をもう一方の配列の対応するアミノ酸と一度に１残基というように直接比較する。これを「ギャップなし」アライメントと呼ぶ。そのようなギャップなしアライメントは比較的小さな数の残基でのみ概して実施される。
【０１１９】
これは非常に単純で着実な方法であるが、例えば他の点では同一の配列対において、１つの挿入又は欠失によりそれ以後のアミノ酸残基がアライメントから追い出され、このように全体的なアライメントが実施された場合に相同率（％）が潜在的に大きく低下するということを考慮していない。したがって、大部分の配列比較法は、総合的相同スコアに過度な不利をもたらすことなしに可能性のある挿入及び欠失を考慮して最適のアライメントを作り出すように設計されている。局所相同性を最大化しようと配列アライメントに「ギャップ」を挿入することによりこれは達成される。
【０１２０】
しかし、これらのさらに複雑な方法は、アライメントにおいて発生する各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り振り、同数の同一アミノ酸について（比較された２つの配列間の関連性がより高いことを反映して）、できるだけ少ないギャップを有する配列アライメントが、多数のギャップを有するものよりも高いスコアを達成するようにする。ギャップの存在に相対的に高いコストを課し、ギャップにおけるそれぞれ次の残基に比較的小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が概して使用される。これが最も一般に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティはもちろんギャップの少ない最適なアライメントを作り出す。大部分のアライメントプログラムではギャップペナルティの改変が可能である。しかし、配列比較にそのようなソフトウェアを使用する際にはデフォルトの値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Wisconsin Bestfitパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、ギャップ１つについて−１２であり、各伸長について−４である。
【０１２１】
したがって、最大相同率（％）の計算は、ギャップペナルティを考慮した最適のアライメントを作り出すことをまず必要とする。そのようなアライメントの実施に適したコンピュータプログラムはＧＣＧ  Wisconsin Bestfitパッケージ（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）である。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例にはBLASTパッケージ（Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410）及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートがあるがそれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方がオフライン及びオンライン検索のために入手できる（Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60）。しかし、一部の応用にはＧＣＧ  Bestfitプログラムの使用が好ましい。ＢＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールもタンパク質及びヌクレオチド配列を比較するために利用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50、FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【０１２２】
最終的な相同率（％）を同一性により測定できるが、アライメントの方法自体は全か無かの対比較に概して基づかない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいてそれぞれの対比較にスコアを割り振る、尺度づけされた類似度スコア行列が総じて使用される。通常使用されるそのような行列の例は、プログラムのＢＬＡＳＴスイートのためのデフォルト行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列である。ＧＣＧ  Wisconsinプログラムは公開のデフォルト値、又は供された場合はカスタムのシンボル比較表を総じて使用する（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照のこと）。一部の応用については、ＧＣＧパッケージには公開のデフォルト値を、他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルト行列を使用することが好ましい。
【０１２３】
代わりに、相同率をＣＬＵＳＴＡＬに似たアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（日立ソフトウェア）での多アライメント性を用いて計算できる（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1),237-244）。
【０１２４】
いったん、ソフトウェアが最適のアライメントを作り出すと、相同率（％）、好ましくは配列同一性（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは配列比較の一環として概してこれを行い、数値結果を生成する。
【０１２５】
配列はアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有する場合があり、それらはサイレント変化を生じ機能的に等価の物質を生じる。物質の二次結合活性が保たれる限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて計画的なアミノ酸置換を作り出すことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に荷電したアミノ酸にはリシン及びアルギニンがあり、類似した親水性値を有する荷電していない極性ヘッドの基をもつアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンがある。
【０１２６】
例えば下の表に従って保存的置換を作り出すことができる。第２列の同ブロックにあり、かつ好ましくは第３列の同行にあるアミノ酸を互いに置換できる。
【０１２７】
［表］
2006512088.tif 000002
【０１２８】
本発明は、起こり得る相同置換（置換及び交換は共に本明細書において現存するアミノ酸残基と代替残基との相互交換を意味する）、すなわち塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性などの似たもの同士の置換も包含する。非相同置換、すなわちあるクラスの残基から別のクラスへ、又は代替的にオルニチン（以後Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと呼ぶ）、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴う置換も起こり得る。
【０１２９】
置換は非天然アミノ酸によっても生じ得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーの他にメチル、エチル又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る適当なスペーサー基を含み得る。ペプトイド形態の１つ又は複数のアミノ酸残基の存在を伴う変異体のさらなる形態は、当業者に十分理解されるであろう。疑いを避けるために、「ペプトイド形態」はα炭素置換基がα炭素よりもむしろ残基の窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製法は当技術分野、例えばSimon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134に公知である。
【０１３０】
好ましくは、突然変異がコード領域に存在するならば、その配列はアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有する場合があり、これにより低下した活性を有するか、又は活性を有さないか、又は非改変物質とは異なる活性を有する物質が産生する。その物質の活性が変化する限りその残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて計画的なアミノ酸置換を作り出すことができる。
【０１３１】
本発明は、本発明の核酸配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列の一方とハイブリダイズできる配列も包含する。
【０１３２】
本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語には、「塩基対形成により核酸鎖を相補鎖と結び付ける方法」及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法において実施される増幅法を含める。
【０１３３】
本発明は、本明細書において提示された配列と相補的な配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列、又はその任意の誘導体、断片若しくは誘導体の使用も包含する。
【０１３４】
「変異体」という用語は、本明細書において提示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列に相補的な配列も包含する。
【０１３５】
好ましくは、「変異体」という用語は本明細書において提示されたヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）でハイブリダイズできる配列と相補的な配列を包含する。
【０１３６】
さらに好ましくは、「変異体」という用語は本明細書において提示されたヌクレオチド配列と高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）でハイブリダイズできる配列と相補的な配列を包含する。
【０１３７】
本発明は、（本明細書において提示されたヌクレオチド配列の相補配列を含めた）本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列にも関する。
【０１３８】
本発明は、（本明細書において提示されたヌクレオチド配列の相補配列を含めた）本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列に相補的なヌクレオチド配列にも関する。
【０１３９】
中間から最高のストリンジェンシーの条件下で本明細書において提示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０１４０】
好ましい態様において、本発明は本発明のヌクレオチド配列、又はその相補物とストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列にわたる。
【０１４１】
より好ましい態様において、本発明は本発明のヌクレオチド配列、又はその相補物と高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列にわたる。
【０１４２】
本発明のヌクレオチド配列はベクターに存在し得る。
【０１４３】
本発明に使用するためのベクターを形質転換して適当な宿主細胞に入れることができる。
【０１４４】
本発明は、本発明の配列を有する発現ベクターも包含する。
【０１４５】
「発現ベクター」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現が可能な構築体を意味する。
【０１４６】
好ましくは、発現ベクターは適当な宿主生物のゲノムに組み込まれる。「組み込まれる」という用語は、ゲノムへの安定組み込みに好ましくはわたる。 
【０１４７】
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択はそれを導入する宿主細胞に依存することが多い。
【０１４８】
本発明に使用するためのベクターは１つ又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。
【０１４９】
ベクターを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＲＮＡの産生のために、又は宿主細胞のトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染に使用できる。
【０１５０】
このように、さらなる実施形態において、本発明は複製可能なベクターに本発明のヌクレオチド配列を導入すること、適合する宿主細胞にそのベクターを導入すること、及びベクターの複製を生じる条件下で宿主細胞を増殖させることによって本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０１５１】
ベクターは、問題の宿主細胞中でそのベクターを複製可能にするヌクレオチド配列をさらに有し得る。
【０１５２】
異種調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダー及びターミネーター領域の選択によっても本発明のヌクレオチド配列の発現増加を達成できる。
【０１５３】
本発明は、本発明の配列を有する構築体も包含する。構築体は遺伝子構築体の選択を可能にするマーカーを含むか、又は発現さえし得る。
【０１５４】
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、上記のヌクレオチド配列又は発現ベクターの一方を有する任意の細胞を含む。
【０１５５】
このように、本発明のさらなる実施形態は、本発明のヌクレオチドで形質転換されたか、又はそれをトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は前記ベクターと適合性するように選択され、例えば原核細胞（例えば細菌）、菌類細胞、酵母細胞又は植物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞ではない。
【０１５６】
適当な細菌宿主生物の例は、グラム陽性又はグラム陰性細菌種である。
【０１５７】
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明に従うヌクレオチド配列及び／又はそれから得られた産物を有し得る任意の生物を含む。
【０１５８】
適当な生物には、原核生物、菌類、酵母又は植物があり得る。好ましい生物は植物である。
【０１５９】
本発明に関係する「トランスジェニック生物」という用語は、本発明に従うヌクレオチド配列及び／又はそれから得られた産物を有する任意の生物を含む。好ましくはヌクレオチド配列は生物のゲノムに組み込まれる。
【０１６０】
本発明のトランスジェニック生物には、本発明に従うヌクレオチド配列、本発明に従う構築体、本発明に従うベクター、本発明に従うプラスミド、本発明に従う細胞、本発明に従う組織、若しくはその産物のいずれか１つ又はその組み合わせを有する生物がある。
【０１６１】
例えばトランスジェニック生物は、本発明に従う突然変異プロモーターの制御下で異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有し得る。
【０１６２】
前に示したように、宿主性物は原核又は真核生物であり得る。
【０１６３】
原核宿主の形質転換についての教示は、当技術分野に十分に記録されている。例えばSambrook et al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照のこと。原核宿主が使用されるならば、ヌクレオチド配列を形質転換前にイントロンの除去によるなどして適当に改変する必要があり得る。
【０１６４】
別の宿主性物は植物であり得る。植物を形質転換するために使用される一般法の総説をPotrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による論文に見出すことができる。植物形質転換についてのさらなる教示をＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出すことができる。
【０１６５】
本発明のプロモーターを異種タンパク質の発現に使用できる。異種タンパク質は融合タンパク質であり得る。
【０１６６】
目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする配列又は目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）などの１つ又は複数の追加の配列と共に、本発明に従う使用のための配列を使用することもできる。
【０１６７】
本発明は、別に指摘しない限り化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の通常の方法を採用し、これは当業者の能力の範囲内である。そのような方法は文献に解説されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press；及びD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照のこと。これらの本文全般の各々は参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１６８】
以下非制限実施例を参照して本発明をこれからさらに詳細に記載する。実施例は添付の図を参照する。
【０１６９】
花の器官脱離が遅延した突然変異体のスクリーニングにあたって、転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）ベクターｐＭＨＡ２で形質転換したアラビドプシス系のコレクションから器官脱離が欠損した突然変異花序ｉｄａを検出した（１０）。ｅｔｒ１及びｅｉｎ２と対照的に、ｉｄａ突然変異体はエチレンに感受性である（図１）。エチレン合成、認識及び反応が変化した突然変異体を同定するために「三重反応」アッセイを使用した（１１）。エチレンの天然前駆体である１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）に反応して発芽した（示さず）か、又は１０ｐｐｍのエチレンに曝露された（図１Ａ）ｉｄａ突然変異体の実生は、ｗｔ実生に特徴的な同一の強烈な形態変化、すなわち根及び胚軸の伸長、胚軸及び根の横方向の膨潤、並びに頂端部フックの屈曲の強調を示した。このように、ｅｔｒ１−１の実生と対照的にｉｄａの実生は完全にエチレンを認識しエチレンに反応することができると考えられる。エチレン１０ｐｐｍを有するチャンバーで植物を栽培すると野生型及びｉｄａ植物においてロゼット及び茎性葉のしおれが生じ、ｅｔｒ１−１植物のみがこの処理に影響を受けない（示さず）。ｗｔ植物においてこのレベルのエチレンは開花直後に花器官の老化及び脱離も生じる。ｉｄａ植物において花器官は老化するが脱離しない（図１Ｂ）。
【０１７０】
ｗｔのアラビドプシス花において、膨れた花弁、がく片及び雄ずいの脱落が開花直後に続いて起こる（図２）（１）。対照的に、突然変異ｉｄａはこれらの花の部分を確定できない期間だけ保有する（位置３０よりも後）（図２Ａ）。（花序の頂部に眼に見える白い花弁を有する第１花から数えて）位置２、４及び６にｗｔ、ｅｔｒ１−１及びｉｄａの器官が膨れ、発育中の長角果に付着している（図２Ｂ）。位置８で花被及び雄ずいはｗｔ花から脱離する。ｉｄａ突然変異体の花器官は位置１６でも保たれ、その位置でｅｔｒ１−１突然変異体から花が脱落した（図２Ｂ）。成熟種子の脱落後も、突然変異ｉｄａの今や完全に乾燥した無色で透明な花部分はまだ付着している（図２Ｃ）。葯片の開放及び裂開並びにｉｄａの偽隔壁からの種子の放出は、花の器官脱離の制御に特異的な経路に突然変異が関与していることを強く示している。
【０１７１】
突然変異体ｅｔｒ１（７、１２）及びｅｉｎ１（８、１３）はｉｄａ突然変異体といくらか類似性を示す。しかし、上記の花の器官脱離の異常なパターン以外に、これらの突然変異体は野生型植物と比較した場合に葉の老化の遅れ、大きなロゼット、抽だい及び開花の遅れ、並びに非常に低い種子発芽率を示す（７、８、１４）。ｉｄａ突然変異体において、花の器官脱離以外の発育過程が影響を受けることは観察されなかった。
【０１７２】
アラビドプシスにおいて、花のＡＺは花床と花器官の間の結合部で、小さい細胞質が密な細胞のバンドとして発生する。花弁の強制的な除去又は自然な器官脱離のどちらかの後で、走査電子顕微鏡を使用してｗｔとｉｄａの花弁ＡＺの形態を比較した（図３Ａ及びＢ）。花弁を除去するとｋｗｔ及びｉｄａ突然変異体において開花直後に平らな裂断面が観察される。この段階で壊れた細胞が明らかになる（図３Ａ、ｉ及び３Ｂｉ）。平らな裂断面が位置８で観察され（図３Ａ、ｉｉ及び３Ｂii）、これはｗｔにおいて花器官が脱離した時間に対応する。位置１０ではｗｔの裂断面の細胞の外見が丸くなり始め（図３Ａ、iii）、一方ｉｄａの裂断面は平らな腔のように見える（図２Ｂ、ii及びiii）。位置１２以降では、保護性痕層が形成されるためｗｔ植物は完全に丸い細胞を示す（図２Ａ、iv及びｖ）。突然変異体において花弁を強制的に除去すると、不均一に丸まったＡＺ細胞（図２Ｂ、iv）及びその後に前の位置にみられたものと大きく類似した破壊された細胞数の増加（図２Ｂ、ｖ）を示す。これは一次細胞壁の破壊を示す。
【０１７３】
ｗｔ及びｉｄａの違いの量的な評価を得るために、植物から花弁を除くのに必要な力を応力トランスデューサを用いて測定した（５）。図３Ｃに示すようにｗｔ花弁の破壊強さは位置ゼロから急激に減少する。位置８で破壊強さはゼロまで低下する。ｉｄａ突然変異体は初めは類似しているが遅れた破壊強さプロフィルを示し、位置１０でゼロに近づく。しかし、位置１２で破壊強さは再び増加し、花序にある最も古い花（位置３２）は最も若い花と類似した破壊強さを有する。ＳＥＭのデータに追加して、このことは器官脱離プロセスにおける最初のステップはｉｄａ突然変異体では遅れているだけであるが、突然変異の主な作用は主な植物体から花器官の分離が通常起こるであろう段階でみられることを示している。
【０１７４】
植物体から花器官を分離するためには、共有の細胞壁又は中葉を溶解しなければならない。多数の細胞壁分解酵素、最も注目すべきは大きな遺伝子ファミリーを代表するポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）及びβ−１，４−エンド−グリカナーゼ（ＥＧ）がこのプロセスに重要である（１５）が、器官脱離に特異的であると報告された遺伝子はほとんどない。トマトでは、ＭＡＤＳボックス転写因子をコードするＪＯＩＮＴＬＥＳＳ遺伝子が小花柄の形成を制御している（１６）。ＪＯＩＮＴＬＥＳＳ及びＡＧＬ１５は器官脱離プロセスに重要であるとしてＭＡＤＳドメインタンパク質を指定する。しかし、ｉｄａ突然変異体の独特な表現型はまだキャラクタリゼーションされていない遺伝子の関与を示唆した。
【０１７５】
ｉｄａ表現型の遺伝子基盤を同定するために、突然変異体をｗｔアラビドプシスと交雑した。交雑から得たＦ１植物はその表現型を示さなかった。Ｆ２代において野生型植物及びｉｄａ植物の数は３：１の比に一致し（ｗｔ３７：ｉｄａ１１、χ２＝０．１３、Ｐ＞０．７）、これはｉｄａの表現型が同型接合、劣性、一遺伝子的突然変異の発現であるならば予想されることである。ｉｄａ表現型を示す全ての後代植物はｉｄａ突然変異系に存在する単一のＴ−ＤＮＡについて同型接合であった（１７）。Ｔ−ＤＮＡ及びｉｄａ表現型の同型接合性の共分離はＴ−ＤＮＡの挿入が突然変異表現型を引き起こしていることを示唆した。
【０１７６】
Ｔ−ＤＮＡに隣接する植物ＤＮＡのクローニング（１８）は、Ｔ−ＤＮＡが第１染色体中の１０個のＬＲＲを有する推定タンパク質をコードする注釈付きの遺伝子（Ａｔ１ｇ６８７８０）と、イントロンを有さない小さな遺伝子（Ａｔ１ｇ６８７６５）の間に挿入されたことを示した（図４Ａ）。これらに遺伝子のどれかがＴ−ＤＮＡの挿入により影響を受けたかどうかを検討するために、我々は一方がＬＲＲ遺伝子にわたり、他方が上流及び下流の配列を有する小さなオープンリーティングフレームにわたる２つのゲノム断片でｉｄａ突然変異体を形質転換した（１９）（図４Ａ）。各構築体についてそれぞれ５９及び５８個の別々の形質転換体が発生した。ＬＲＲ遺伝子を保有する全ての形質転換体は突然変異ｉｄａ表現型を示した（図４Ｂ）が、他の構築体で形質転換した５４個の植物は全て野生型の器官脱離パターンを示した（図４Ｃ）。上流及び下流の配列を有する小さなオープンリーティングフレームが突然変異体の表現型を相補できることから、我々はＩＤＡ遺伝子を同定したと結論した（２０）。これは相補に使用したＤＮ断片が機能的ＩＤＡプロモーターを含んでいることも意味する。
【０１７７】
ｗｔ  ＩＤＡ遺伝子の発現パターンを検討するために、プライマー５’ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＣＡＴ３’及び５’ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ３’（配列番号１参照）を用いて１４１９ｂｐのプロモーター断片をＰＣＲで増幅させ、ｐＰＺＰ２１１ＧベクターのＳｍａ  Ｉ部位に挿入し、構築体ｐＰＺＰ  ＩＤＡ：：ＧＵＳを発生させた。ｐＰＺＰ２１１ＧベクターはｐＰＺＰベクターであり（Hajdukiewicz et al., Plant Mol.Biol. 989-994, 1994）、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界の間に植物選択マーカーとしてｎｐｔII遺伝子、及びポリリンカーのＳｍａ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉ部位の間にｎｏｓターミネーターが挿入された、プロモーターを有さないＧＵＳ遺伝子を保有する。形質転換されたアラビドプシス植物についてマーカー遺伝子の発現を検討した。位置５から８までの植物体側の離層帯及び位置５から器官脱離するまでの位置の花弁の基部に発現を観察した（図７）。
【０１７８】
図７はＩＤＡプロモーターにより指令された離層帯特異的発現を表す。植物体側及び脱離する器官の両方の離層帯に対してマーカー遺伝子（β−グルコロニダーゼをコードするｇｕｓ）の発現をＩＤＡプロモーターが指令する。マーカー遺伝子の発現は花の位置５（Ｖ）から８（VIII）で明らかである。野生型の花では花器官は位置８で脱離した。花をＸ−ｇｌｕｃ溶液（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００に溶かした１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇｌｕｃＡ）に浸すことによってＧＵＳ活性のための染色を行った。試料を３７℃で一晩温置した。無水ＥｔＯＨ：酢酸（１：１）で３０分間、３回洗浄することで葉緑体を除いた。ライカＷＩＬＤ  ＭＺ８双眼顕微鏡からニコンＣＯＯＬＰＩＸ９９５デジタルカメラを使って染色後の組織を撮影した。
【０１７９】
９８ｂｐの５’ＵＴＲ及び２０５ｂｐの３’ＵＴＲを有する、この遺伝子に対応するｃＤＮＡが最近クローニングされた（アクセッション番号ＡＹ０８７８８３）。したがって、ｉｄａ突然変異体におけるＴ−ＤＮＡはＩＤＡ遺伝子のプロモーターに位置すると考えられる。花（位置１から８）のｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲにより、予想されるＰＣＲ断片が野生型組織から増幅したが、突然変異組織からは増幅しなかった（図３Ｄ）（２１）。本実験は、Ｔ−ＤＮＡの挿入が正常な遺伝子発現を妨害したことを示唆している。
【０１８０】
ＩＤＡ遺伝子の発現レベルの操作が器官脱離に影響することをさらに確認するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用に設計した構築体でアラビドプシス植物を形質転換した（２２）。ＩＤＡ遺伝子のオープンリーティングフレームを包含するＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡベクターに入れてＧＵＳレポーター遺伝子断片の隣に逆方向にクローニングした（図５Ａ）。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の発現を駆動し、正常なＩＤＡの発現を妨害できる。選択された形質転換体を破壊強さの測定にかけた。器官脱離の遅れを有する２つの形質転換体を図５Ｂに示す。その両方は位置１０まではｉｄａ突然変異体と同じ破壊強さプロフィルを有し、ｗｔ植物よりも有意に長い時間だけ花器官を保持する。しかし、位置１０から植物が成熟するまでの破壊強さの増加はＲＮＡｉ植物ではみられなかった。逆方向の遺伝子断片の間の詰め込み（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片としてイントロンを含みｄｓＲＮＡの形成を促進するｐＫＡＮＮＩＢＡＬ及びｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥのようなベクターを用いてＩＤＡ発現をさらに効果的な妨害を達成できると我々は推定する（２３）。別の可能性はｄｓＲＮＡ発現の駆動にＩＤＡ自体のプロモーターを使用することである。
【０１８１】
ＩＤＡ遺伝子は、シグナルペプチドとして働くとＳｉｇｎａｌＰを伴うと予想されるＮ末端疎水性領域を有するアミノ酸（ａａ）77個の低分子量タンパク質をコードする。ＩＤＡタンパク質が運び出されるかどうかを検討するために、ＩＤＡ  ｃＤＮＡ又は推定シグナルペプチドを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合して発現させる構築体をタマネギ細胞に対して発射した（２５）。ＩＤＡ−ＧＦＰ(図６Ａ、ｉ）及びシグナルペプチド−ＧＦＰ融合タンパク質（図６Ａ、ii）の両方が細胞外に局在する。対照的にＧＦＰ単独は細胞質に発現し（図６Ａ、iii）、一方ドロソフィラ（Drosophila）異質染色質タンパク質１（ＨＰ１）は核にＧＦＰを導く（図６Ａ、iv）。
【０１８２】
細胞外空間にＩＤＡタンパク質が局在すると考えられること、その小さなサイズ及び高いｐＩ（１１．８７）はリガンドＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３）（２６）に類似した特徴であり、花及び花器官の過剰産生の妨害に必要である。大きなファミリーのＣＬＶ３様（ＣＬＥ）遺伝子がアラビドプシスデータベースにおける反復ＢＬＡＳＴ検索により最近同定された（２７）。同様に、アブラナ属（ブラジカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））における非適合性に関与するＳ遺伝子座のシステインリッチ（ＳＣＲ）遺伝子がコードするタンパク質に類似した推定リガンドのファミリー（２８）が最近発見された。ＣＬＥタンパク質及びＳＣＲ様（ＳＣＲＬ）タンパク質はＲＬＫに対するリガンドを表すことが示唆されている。アラビドプシスゲノムには、細胞外ドメインに基づいて２１クラスを超えて分割できる４００個を超えるＲＬＫがある（２９）。
【０１８３】
理論に縛られることを欲することなしに、本発明者らはＩＤＡタンパク質が植物における新しいクラスのリガンドを表していると考える。ＢＬＡＳＴＰ検索は、アラビドプシス（１２．２４）、ハス（１１．１３）、トマト（１１．０２）、ダイズ（１１．７４）、ニセアカシア（１１．４２）、トウモロコシ（１２．６２）、ポプラ（１２．５３）、及びコムギ（１１．３７）を含めた他の植物種から、さらなるＩＤＡ様（ＩＤＬ）ｃＤＮＡを同定した。それらのｃＤＮＡは、疎水性Ｎ末端、ＩＤＡタンパク質に近い等電点、及び保存されたＣ末端モチーフ（ｖ／ｉＰＰＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮ）（図６Ｂ）を有する類似した短いタンパク質をコードしている可能性があり、そのＣ末端モチーフはＳＣＲＬのＣＬＥモチーフ及びシステインリッチパターンとは異なる。翻訳されたアラビドプシスゲノムに対するＢＬＡＳＴＰ検索及びＲＴ−ＰＣＲ分析は１００ａａ未満のタンパク質をコードする４つの追加のＩＤＬ遺伝子の存在を示している（図６Ｃ、Ｄ、及び表１参照）。そのような小さなサイズの遺伝子は自動注釈プログラムから見逃されることが多い。植物における異なる細胞分離プロセスに共通の特徴があるとすると（１５）、ＩＤＬタンパク質が、種子及び果実の裂開又は葉の脱離のような他の器官脱離プロセスに機能を果たしていると目下のところ考えられる。
【０１８４】
【表１】
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【０１８５】
ｉｄａ突然変異体の表現型及びＩＤＡタンパク質の性状は、器官脱離プロセスの実用モデルを洗練することを可能にする（４）。まず、小さく密な細胞を有するＡＺが脱落する器官の基部に形成する。明らかに、トマトにおけるｊｏｉｎｔｌｅｓｓ変異体のようにＡＺの形成が欠損している突然変異体は器官脱離を経ることができない（１６）。しかし、ｉｄａ突然変異体はＡＺの発生では器官脱離が起こるために不十分であることを実証している。器官脱離の第二段階で、ＡＺは器官脱離シグナルに反応する反応能を獲得すると推定される。反応性のＡＺにおいて、エチレンは器官脱離プロセスの活性化を加速できる。しかし、エチレン感受性ｉｄａ突然変異体は、エチレン自体では器官脱離が起こるために不十分であることを示す。器官脱離プロセスは、細胞の伸展性及び伸長に変化を伴う成熟段階並びに植物の本体及び脱落する器官の細胞の間の中葉の現実の溶解を必要とする。花弁の破壊強さの初期の減少及びｉｄａ突然変異体のＡＺ（位置１２）における細胞の丸まり傾向は、ＡＺ成熟のこれらの面は器官脱離が起こるためには不十分であることを示している。純粋な分離ステップは独立した制御下にある。
【０１８６】
発明者らはＩＤＡタンパク質が受容体のリガンドであり、ＩＤＡ遺伝子の作用はＡＺの成熟が絶頂に達することにより誘発されると考える。機能的ＩＤＡ遺伝子の非存在下では器官脱離プロセスの最終分離段階である細胞壁の分解が起こらない。
【０１８７】
コード領域（配列番号１、２及び１２参照）における突然変異の例として、ＳＡＬＫコレクション（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｄｎａｅｘｐｒｅｓｓ）からのＴ−ＤＮＡ挿入系（番号ＳＡＬＫ＿１３３２０９）を参照できる。これはＩＤＡ遺伝子のコード配列にＴ−ＤＮＡが挿入されている。この挿入について同型接合の植物はｉｄａ突然変異体の表現型を示す。このＴ−ＤＮＡ挿入の位置を配列番号１１に表す。
【０１８８】
概略の項
本発明のいくつかの態様を番号を付した項によりこれから記載する。
１．配列番号１に示すヌクレオチド配列又はその変異体、ホモログ、断片若しくは誘導体を有する改変された植物であって、その植物が器官脱離の減少を示すように前記配列又はその発現が改変された植物。
２．ヌクレオチド配列がＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号  ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）から選択される、１項に定義される植物。
３．ヌクレオチド配列がＣ末端モチーフＰｐＳａ／ｇＰＳｋ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列を含む、１又は２項に定義される植物。
４．ヌクレオチド配列がＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む、１、２又は３項に定義される植物。
５．ヌクレオチド配列がＣ末端モチーフｖ／ｉＰｐＳａ／ｇＰＳＫ／ｒｋ／ｒＨＮに対するコード配列及びＮ末端疎水性シグナルペプチドに対するコード配列を含む、１又は２項に定義される植物。
６．配列が配列番号２［ＡＹ０８７８８３］である、１から５項のいずれかに定義される植物。
７．減少した器官脱離がその花若しくは部分であるか、又はそれに関係する、前項のいずれかに定義される植物。
８．顕花植物又は高木である、前項のいずれかに定義される植物。
９．アラビドプシス タリアナである、前項のいずれかに定義される植物。
１０．クロッカス、チューリップ、シクラメン、ポインセチア、ハス若しくはバラである８項に定義される顕花植物、又はポプラ若しくはクリスマスツリーである高木。
１１．前項のいずれかに定義される植物からの他の繁殖材料の種子。
１２．１から１０項のいずれかに従う植物からの花。
１３．１から６項のいずれかに定義される配列又は配列の発現を改変することを含む、植物における器官喪失を防止する方法。
１４．ヌクレオチド配列の改変が突然変異又は欠失による、１３項に定義される方法。
１５．改変がプロモーター又は他の調節配列の改変である、１３項に定義される方法。
１６．改変がアンチセンス構築体又はＲＮＡ干渉構築体の使用により達成される、１３項に従う方法。
１７．配列番号１に示す配列、又はその変異体、ホモログ、断片若しくは誘導体を有する単離されたヌクレオチド配列。
１８．（ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５）、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０）、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）である、１７項に定義される配列。
１９．配列番号２［ＡＹ０８７８８３］である、１７又は１８項に定義される配列。
２０．１７から１９項のいずれか一項に定義されるヌクレオチド配列に対するアンチセンスであるヌクレオチド配列。
２１．プロモーター又は他の調節配列である、１７項に従う配列。
２２．配列番号３に示す配列若しくはそれと実質的に相同の配列、又はその断片を有する単離されたアミノ酸配列。
２３．１７から２１項のいずれか一項に定義されるヌクレオチド配列を有するベクター。
２４．１７から２１項のいずれか一項に定義されるヌクレオチド配列をトランスフェクトされたか、又はそれで形質転換された宿主細胞。
２５．植物器官脱離の制御への、１７から２１項のいずれか一項に定義される単離されたヌクレオチド配列の使用。
【０１８９】
本明細書に挙げた全ての刊行物は参照により組み込まれている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の改変及び変型は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施形態と関連して本発明を記載したが、請求された発明はそのような特定の実施形態に不等に制限されてはならない。実際、当業者に明白な、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、添付の請求項の範囲内に入ることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】エチレンに対するｉｄａ突然変異体の反応を示す図である。（Ａ）実生を１０ｐｐｍエチレンに曝露することにより「トリプル反応」アッセイを行った。ｉｄａはｗｔ実生と同様に反応するが、ｅｔｒ１−１はエチレン非感受性で、空気にさらされた対照実生のように挙動することに注意。（Ｂ）空気又は１０ｐｐｍのエチレンに曝露された位置０から３の花の比較。ｗｔの花ではエチレンの曝露は位置１の花ですでに老化及び花器官脱離を引き起こす。対照的にｉｄａの花は老化するが器官脱離しない。
【図２】ｗｔ及びｅｔｒ１−１と比べたｉｄａ突然変異体の表現型を示す図である。（Ａ）ｗｔアラビドプシス植物及びｉｄａ突然変異体の花序。矢印は花器官が脱離した最初のｗｔ花の位置を示す。この位置の長角果は完全には成長していないことに注意。ｉｄａの花は花序全体に沿って付着していることに注意。（Ｂ）花序に沿った２つ毎の位置の花を示す。位置１６以降のｉｄａの花が老化を表し、突然変異体がエチレンに感受性でることを示していることに注意。エチレン非感受性ｅｔｒ１−１突然変異体では器官脱離前の全ての位置で新鮮で膨れて生き生きとした花器官であることに注意。（Ｃ）ｗｔと比べてｉｄａ突然変異体では、種子の裂開後に乾燥した花器官が依然として付着している、乾燥した植物の隔壁。
【図３】離層帯の形態及び花弁の破壊強さを示す図である。強制除去又は自然の器官脱離後の位置４（i）、位置８（ii）、位置１０（iii）、位置１２（iv）及び位置２２（iv）での（Ａ）ｗｔ及び（Ｂ）ｉｄａの花における花弁のＡＺの走査電子顕微鏡像。ｗｔ花弁は位置８で自然に器官脱離する。（Ｃ）花序に付いた２つ毎の花の位置で測定した花弁の破壊強さ、すなわち花から花弁を取り除くのに必要な力。１５個のｗｔ植物及びｉｄａ植物について破壊強さを測定し、各位置で最低２０回測定を行った。縦棒線の上の細い線で標準偏差を示す。
【図４】ＩＤＡ遺伝子の同定を示す図である。（Ａ）ｉｄａ系の１番染色体の遺伝子Ａｔ１ｇ６８７８０及びＡｔ１ｇ６８７６５の間にベクターバックボーンの１２３９ｂｐを有する単一Ｔ−ＤＮＡを挿入した。Ｔ−ＤＮＡの挿入により７４ｂｐの標的部位欠失（Δ）を生じた。これらの２つの遺伝子のそれぞれ終止コドン及び開始コドンからＴ−ＤＮＡ挿入点までのｂｐで表した距離、並びにこれら２つの遺伝子における開始コドンから終止コドンまでのｂｐ数を示す。Ａｔ１ｇ６８７８０における単一イントロンを濃い色で示す。転写方向を矢印で示す。相補実験に使用した２つのゲノム断片の伸展をゲノム領域の下に示す。図中の全ての要素の縮尺は正しくない。（Ｂ）（９５９ｂｐの上流配列及び１５４ｂｐの下流配列を有する）Ａｔ１ｇ６８７８０遺伝子を包含する２６３３ｂｐの断片で形質転換したｉｄａ植物の表現型はｉｄａ突然変異体の表現型と同一である。完全に成長した長角果に付着した花に注意。（Ｃ）（Ａｔ１ｇ６８７８０遺伝子の終止コドンの８ｂｐ下流から始まりＡｔ１ｇ６８７６５のオープンリーディングフレームの３０３ｂｐ下流に終わる）２０１９ｂｐの断片で形質転換したｉｄａ植物の表現型はｗｔ表現型と同一であった。花器官は花序の上側の位置にのみみられることに注意。（Ｄ）位置１〜８の花からのｍＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲは、ｉｄａ植物からではなく、ｗｔ植物からＩＤＡプライマーを有する予想された４２１ｂｐ断片を増幅したが、ｗｔ及びｉｄａテンプレートの両方から２９４ｂｐのＡＣＴＩＮ２−７断片を増幅した。Ｍ−ΦＸ１７４をＨａｅ  IIIで分解した。
【図５】ＲＮＡ干渉を示す図である。（Ａ）ＧＵＳ詰め込み断片の隣に逆方向にクローニングされた２１９ｂｐのＩＤＡオープンリーディングフレームでｗｔアラビドプシス植物を形質転換するために使用した構築体。３５Ｓプロモーターからの転写はループとしてＧＵＳ部分を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成できるｍＲＮＡを発生する。ｄｓＲＮＡは低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解し、正常なＩＤＡ  ｍＲＮＡの分解を仲介する。ｔｅｒはターミネーター。（Ｂ）花序に沿った２つ毎の位置でｗｔ及びｉｄａ突然変異体と比べた２つのＲＮＡｉ植物の花弁の破壊強さ。ＲＮＡｉ植物は位置１０まではｉｄａと同じプロフィルを有し、ｗｔと比べて器官脱離の遅れを示す。
【図６】ＩＤＡタンパク質の特徴を示す図である。Ａ．タマネギ表皮一過性発現アッセイにおけるタンパク質の細胞内局在。（i）ＩＤＡ−ＧＦＰ融合タンパク質及び（ii）ＩＤＡ−シグナルペプチド−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞外局在。（iii）ＧＦＰ単独の細胞質局在。（iv）同アッセイにおけるＨＰ１−ＧＦＰ融合タンパク質の核局在。ＧＦＰ蛍光は蛍光及びＮｏｒｍａｒｓｋｉ光学系を備える顕微鏡を利用したボンバードメントの２時間後に現れた。Ｂ．ＩＤＡタンパク質、並びにアラビドプシス（ＡｔＩＤＬ１、遺伝子Ａｔ３ｇ２５６５５、トマト（ＬｅＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＩ７７９５７０、ハス（ＬｊＩＤＬ１、アクセッション番号ＡＷ７１９４８６）、ダイズ（ＧｍＩＤＬ１、アクセッション番号Ｂｑ６３０６４６）、ニセアカシア（ＲｐＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ６４２５３８）、トウモロコシ（ＺｍＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＩ４３０５７２）、ポプラ（ＰｔＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＵ８８９７５６）、及びコムギ（ＴａＩＤＬ１、アクセッション番号ＢＭ１３５４５９）によりコードされるＩＤＡ様（ＩＤＬ）タンパク質のアライメント。ＺｍＩＤＬ１の初めの２０ａａは示していない。推定疎水性シグナルペプチド、及び推定切断部位の位置を示す矢印に注意。Ｃ．アラビドプシスＩＤＬタンパク質のアライメント。推定疎水性シグナルペプチドに注意。矢印は全てのタンパク質でアラニン残基後の推定切断部位を表す。アラビドプシスゲノムに対するｔＢＬＡＳＴｎ検索においてＩＤＡタンパク質のＣ末端２０ａａを使用することにより遺伝子ＡｔＩＤＬ２−５を同定した。（ＳｉｇｎａｌＰを使って）推定シグナルペプチドを有するタンパク質をコードする短いオープンリーディングフレーム及びＣ末端におけるＩＤＡとの類似性について発見したヒットを精査した。アミノ酸を性質に応じて、黄色：疎水性残基、灰色：塩基性残基、緑：短い残基、青：極性非脂肪族残基に色分けする。Ｄ．上の枠に示した４６５ｂｐ（ＡｔＩＤＬ１）、２８０ｂｐ（ＡｔＩＤＬ２）、２５６ｂｐ（ＡｔＩＤＬ３）、２６１ｂｐ（ＡｔＩＤＬ４）及び２５９ｂｐ（ＡｔＩＤＬ５）の断片を増幅するプライマーを用いた（下の枠に）表示した種々の組織からのｍＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲ。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、マーカー系（Ｍ）を示す。陽性対照ＡＣＴＣＩＮ２−７は全ての組織で類似のレベルで増幅したことに注意。ＤＡＧは発芽後日数。
【図７】ＩＤＡプロモーターにより指令される離層帯特異的発現を示す図である。植物体側及び脱離する器官の両方の離層帯に対してＩＤＡプロモーターにより指令されるマーカー遺伝子（β−グルコロニダーゼをコードするｇｕｓ）の発現。マーカー遺伝子の発現は花の位置５（Ｖ）から８（VIII）で顕著である。花器官は野生型の花の位置８で器官脱離した。花をＸ−ｇｌｕｃ溶液（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００に溶かした１ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇｌｕｃＡ）に浸すことによってＧＵＳ活性用の染色を行った。試料を３７℃で一晩温置した。無水ＥｔＯＨ：酢酸（１：１）で３０分間、３回洗浄することで葉緑体を除いた。ライカＷＩＬＤ  ＭＺ８双眼顕微鏡からニコンＣＯＯＬＰＩＸ９９５デジタルカメラを使って染色後の組織を撮影した。アラビドプシスの花の切片にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使って、プロモーター−レポーター遺伝子構築体を用いて確認結果、すなわち離層帯にＩＤＡ遺伝子が発現するということを得る。
【０１９１】
[参考文献及び注記]
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17. The T-DNA of pMHA2 carries a marker gene(nptl) conferring Kanamycin (Km) resistance. The progeny of ida plants was always 100% Km resistant. 
18. Genomic DNA flanking the Right border of the T-DNA was cloned using inverse
PCR ( (30), 1st primer set gus78 5'-CAC GGG TTG GGG TTT CT-3'and gus 330 5'-TGC
GGT CAC TCA TTA CGG-3', 2nd primer set gus 64L 5'-TTT CTA CAG GAC GGA CCA T-3'and gus 3425'-. TTA CGG CAA AGT GTG GGT C-3'), while the other side was cloned by PCR with a T-DNA specific primer (5074+5'-ATT TGT CGT TTT ATC AAA ATG TAC-3') and a genomic primer (ida49 5'GGT GTT TCT ACT ATG CGT GTG 3'). 
19. The fragments were inserted in the Xbal site of the t h e Ti vectorpGSC1704 (kindly provided by the Laboratory of Genetics, Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, Gent, Belgium) which has a Hygromycin resistant gene within the T- DNA. Ida plants were transformanted by the Agrobacteriumtumefaciens-mediated floral dip method (31), andtransformants were selected by germinating seeds on plates containing 10 mg/mlHygromycin. 
20. Agrobacterium insert T-DNA at random positions in the plant genome. The expression level of a gene residing in T-DNAs will vary between independent transformants, due to position effects and/or integration of multi-copy or rearranged T-DNAs. We therefore assume that in the four transformants displaying the mutant ida phenotype although carrying the second construct, the expression level from the IDA gene was not sufficient to achieve complementation. 
21. MARNA was isolated using Genoprep MARNA beads (Genovision, Norway) and treated with 1 U DNaseI (Invitrogen Cat. No 18068-015) per mg MARNA for 15 min. at room temperature, prior to first strand cDNA synthesis with AMV-Reverse Transcriptase (Promega). The IDA cDNA fragment of 421 bp was amplified by PCR using the primers pipp2U (5'GAAGAAAAAAAACATTGACTCCA-3') and pippl62 (5'-TGGCCGTAATGACCTTAAAC-3'). The ACTIN2-7 fragment of 294 bp was amplified using the primers 5'-GCTGGTTTTGCTGGTGATGATG-3'and 5'- TAGAACTGGGTGCTCCTCAGGG-3'. 
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25. The coding region and the region encoding the first 24 aa encompassing the putative signal peptide, both with 96 bp 5'UTR, were amplified with primers (idaGFPA 5'-TTATTCATTTCATTCATAAGACCCTTC-3'plus idaGFPD5'- ATGAGGAAGAGAGTTAACAAAAGAG-3'and idaGFPA plus idaGFPE (5'- ACAAGAACTACTCGCCGC-3', respectively) with additional Gateway att-sequences in the 5'end and recombined into the vector pKEx4tr-smGFP (32) converted to a Gateway vector by the Gateway Vector Conversion System(Invitrogen), so that the IDA coding region or signal peptide would be expressed as fusion proteins with the Green Fluorescence protein (GFP) in the C-terminal end. 
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【０１９２】
[配列表]
（配列番号１）
2006512088.tif 000004
【０１９３】
（配列番号２）
2006512088.tif 000005
【０１９４】
（配列番号３）
2006512088.tif 000006
【０１９５】
（配列番号４）
2006512088.tif 000007
【０１９６】
（配列番号５）
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【０１９７】
（配列番号６）
2006512088.tif 000009
【０１９８】
（配列番号７）
2006512088.tif 000010
【０１９９】
（配列番号８）
2006512088.tif 000011
【０２００】
（配列番号９）
2006512088.tif 000012
【０２０１】
（配列番号１０）
2006512088.tif 000013
【０２０２】
（配列番号１１）
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【０２０３】
（配列番号１２）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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