(57)【要約】シクロオキシゲナーゼ−２酵素を阻害するｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅについて述べている。とりわけ、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ由来の化合物はｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの好ましい供給源であり、一方それらは他の植物の供給源由来であることもある。このＣＯＸ−２阻害はＣＯＸ−１に対しては起こらず選択的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを供与してＣＯＸ−２阻害を生じさせることを含む、ＣＯＸ−１酵素に比べＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する方法。
【請求項２】
前記ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅがＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物材料中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ中に存在する、単離、精製されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ又はその混合物の有効量を供与して、ＣＯＸ−２酵素阻害を生じさせることを含む、ＣＯＸ−１酵素に比べＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する方法。
【請求項４】
前記阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う、請求項１、２又は３のいずれか１つの方法。
【請求項５】
前記阻害を哺乳動物のｉｎ  ｖｉｖｏで行う、請求項１、２又は３のいずれか１つの方法。
【請求項６】
前記化合物が、ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド；２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ；４，１６−ジヒドロキシ−５β，６β−ｅｐｏｘｙｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；４−（１−ヒドロキシ−２，２−ジメチルシクロ−プロパノン）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ；２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ；ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ；ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅ  ＩＸ；ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；ｗｉｔｈａｎｏｓｉｄｅ  ＩＶ，ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１、２又は３のいずれか１つの方法。
【請求項７】
（ａ）天然に存在する量より多いｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ又はその混合物と；（ｂ）薬学的に許容できる基剤とを含み、ＣＯＸ−１酵素に比べＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する、組成物。
【請求項８】
（ａ）Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａに存在する単離、精製されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ又はその混合物と；（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含み、選択的にＣＯＸ１酵素に比べＣＯＸ２酵素を選択的に阻害する、組成物。
【請求項９】
前記化合物が、ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド；２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｇｌｙｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ；４，１６−ジヒドロキシ−５β，６β−ｅｐｏｘｙｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；４−（１−ヒドロキシ−２，２−ジメチルシクロ−プロパノン）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ；２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ；ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ；ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅ  ＩＸ；ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａおよびｗｉｔｈａｎｏｓｉｄｅ  ＩＶから成る群から選択される、請求項７または８の組成物。
【請求項１０】
単離、精製された以下の構造式の化合物：
2006508963.tif 000014
［式中、ＲはＧｌｃ−（１→６）−Ｇｌｃ−（１→４）−Ｇｌｃ（式中Ｇｌｃはグルコースである）であり、Ｒ’はＨである］。
【請求項１１】
以下の化学構造式の単離、精製された化合物：
2006508963.tif 000015
［式中、ＲはＧｌｃであり、Ｒ’はＧｌｃである（式中Ｇｌｃはグルコースである）］。
【請求項１２】
以下の化学構造式の単離、精製された化合物：
2006508963.tif 000016
［式中、Ｒ＝Ｏであり、Ｒ’＝Ｈであり、Ｒ’’＝ＨでありＲ’’’＝Ｇｌｃである（式中Ｇｌｃはグルコースである）］。
【請求項１３】
以下の化学構造式の単離され精製された化合物：
2006508963.tif 000017
［式中、Ｒ＝−ＯＨであり、Ｒ’＝Ｇｌｃであり、Ｒ’’＝ＯＨでありＲ’’’＝Ｈである］。
【請求項１４】
以下の化学構造式の単離され精製された化合物：
2006508963.tif 000018
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤としてのｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの使用に関する。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅはＣＯＸ−１に対しては、ほとんど作用しない。
【背景技術】
【０００２】
ナス科のＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ（Ｌ）Ｄｕｎａｌは、インドの乾燥帯全域に分布する直立性の常緑の低木である。Ａｓｗａｇａｎｄｈａとして知られるＷ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａは、Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ医薬に用いられるものとしてよく知られている。Ａｓｗａｇａｎｄｈａの根の抽出物は、アデノパシー、関節炎、喘息、高血圧、炎症、およびリウマチに対する公衆医薬品として報告された（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｊｏｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，５３１（１９８９））。Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉はまた、腫瘍、炎症、結膜炎および結核を含む数種の疾患の治療に使用された（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｊｏｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ  ５３１（１９８９））。現在、米国においてこの植物の粉末状の根あるいは根の抽出物が栄養補助食品として用いられている。
【０００３】
Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ由来の報告のあった主な化学成分は、ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅと呼ばれる。これらの化合物はＣ−２２およびＣ−２６が酸化されδ−ラクトンを形成したエルゴステロール骨格をもつ構造的に異なるステロイド系化合物である；（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４））。Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの根と葉の化学的研究では、種々のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの単離がなされ、それらの特徴が示された。（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９，１４９９−１５０７（２００１））。この植物の果実は小さなオレンジベリーであり、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸を含有すると報告されている（Ｓｔｏｌｌｅｒ  Ｅ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｌｏｙｄｉａ，３７，３０９−３１２（１９７４）；Ｍｏｎｉｋａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．６，４４２−４４４（１９９４）；ａｎｄ  Ｍｏｎｉｋａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｓｃｉ．Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．５，８１−８３（１９９３））。しかしながら、葉と果実は生物学的活性について十分検討されているとはいえない。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅはそれらの構造的骨格によって分類され（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４））、その構造的な変動が広範囲の一連の薬理活性を示す原因である。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、抗炎症作用、抗腫瘍活性、細胞毒性、免疫調節活性について、及びＣＣｌ４誘発性肝毒性に対する保護について検討されてきた（Ｒａｙ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６３，１−１０６（１９９４）；ａｎｄ  Ａｎｊａｎｅｙｕｌｕ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐａｒｔ  Ｆ）；Ｅｄ．Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ，Ｖｏｌ．２０，  １３５−２６１（１９９８））。それらは癌の化学的予防のメカニズムの１つであると考えられている、動物モデルにおけるフェーズＩＩ酵素を誘発することも報告された。（Ｍｉｓｉｃｏ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６５，６７７−６８０（２００２）；ａｎｄ  Ｓｕ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５８，３４５３−３４６６（２００２））。
【０００４】
シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）酵素は、細胞内に存在する脂質であるアラキドン酸のプロスタグランジンへの変換をもたらす。プロスタグランジンは次には体内で炎症性反応を引き起こす。ＣＯＸ−１酵素が阻害されると、多くのヒトで潰瘍が形成されることがあり、それ故、化合物によるＣＯＸ−２酵素の選択的阻害作用は、一般薬品として店頭販売されている非選択的非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）に対し重大な利点を有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：１４５−１８２（２０００））。ＣＯＸ−２酵素の過剰な発現は炎症を起こした細胞のみに観察されるわけではなく様々な種類の腫瘍細胞にも観察されるということに注目することが重要である（Ｐａｔｔｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１８０：１３−２１（２００２）；Ｏｈｎｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ９１：１８７６−１８８１（２００１）；ａｎｄ  Ｋｈｕｄｅｒ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４：１１８８−１１９２（２００１））。従って、ＣＯＸ−１に対する活性をほとんどあるいは全くもたないＣＯＸ−２阻害剤は、癌の化学的予防にとって大きな利益をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがっては、本発明の目的は、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する組成物および方法を提供することである。特に本発明の目的は、ＣＯＸ−１を阻害しない方法および組成物を提供することである。これらの目的および他の目的は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって徐々に明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＣＯＸ−２阻害が起こるように、有効量のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを供与することを含む、ＣＯＸ−１酵素に比べＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する方法に関連する。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅはＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物材料中に存在するものが好ましい。特に本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ中に存在する、単離、精製されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ又はその混合物の有効量を供与して、ＣＯＸ−２酵素阻害を生じさせることを含む、ＣＯＸ−１酵素に比べＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する方法に関連する。阻害はｉｎ  ｖｉｔｒｏでもできるが、哺乳動物のｉｎ  ｖｉｖｏで行うことが好ましい。
【０００７】
この方法は好ましくは、ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド；２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ；４，１６−ジヒドロオキシ−５β，６β−ｅｐｏｘｙｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；４−（１−ヒドロキシ−２，２−ジメチルシクロ−プロパノン）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ；２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ；ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ；ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅ  ＩＸ；ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ；ｗｉｔｈａｎｏｓｉｄｅ  ＩＶ，ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａおよびそれらの混合物から成る群から選択される化合物を用いる。
【０００８】
さらに、本発明は、
天然に存在する量より多いｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ又はその混合物と、
薬学的に許容できる担体とを含み、
ＣＯＸ−１酵素に比べＣＯＸ−２酵素を選択的に阻害する、組成物に関連する。
【０００９】
好ましくはこの組成物は、
Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａに存在する単離、精製されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ又はその混合物と、
薬学的に許容できる担体とを含み、
ＣＯＸ１酵素と比べＣＯＸ２酵素を選択的に阻害するものである。
この組成物の化合物は既に挙げたとおりである。
【００１０】
本発明はまた、化学構造式：
2006508963.tif 000002
［式中、ＲはＧｌｃ−（１→６）−Ｇｌｃ−（１→４）−Ｇｌｃ（式中Ｇｌｃはグルコースである）であり、Ｒ’はＨである］
の単離、精製された化合物に関する。
【００１１】
本発明はまた、化学構造式：
2006508963.tif 000003
［式中、ＲはＧｌｃであり、Ｒ’はＧｌｃである（式中Ｇｌｃはグルコースである）］
単離、精製された化合物に関する。
【００１２】
本発明はまた、化学構造式：
2006508963.tif 000004
［式中、Ｒ＝Ｏであり、Ｒ’＝Ｈであり、Ｒ’’＝Ｈであり、Ｒ’’’＝Ｇｌｃである（式中Ｇｌｃはグルコースである）］
の単離、精製された化合物に関する。
【００１３】
本発明はまた、化学構造式：
2006508963.tif 000005
［式中、Ｒ＝−ＯＨであり、Ｒ’＝Ｇｌｃであり、Ｒ’’＝−ＯＨであり、Ｒ’’’＝Ｈである］
の単離、精製された化合物に関する。
【００１４】
最後に、本発明は、化学構造式：
2006508963.tif 000006
の精製された化合物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉の抽出物が優れた選択的ＣＯＸ−２阻害活性をもつことが見出された。Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉の抽出物由来の種々の新規ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅおよび多くの既知ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの単離および特徴を開示する。葉から単離されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅのシクロオキシゲナーゼ酵素に対する阻害作用および抗酸化作用も開示する。
【００１６】
４つの新規ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅグリコシドおよび１つのｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ（本明細書中ではすべて「ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ」と呼ぶ）をＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉から単離した。新規化合物の構造は、１Ｄ−、２Ｄ−ＮＭＲおよびＭＳ（質量分析）スペクトルデータに基づいて、ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１）、２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル  ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（２）、２７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（３）、４、１６−ジヒドロキシ−５β、６β−エポキシｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（４）、および４−（１−ヒドロキシ−２、２−ジメチルシクロ−プロパノン）−２，３−ジヒドロｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（５）と解明された。さらに７つのすでに知られている、ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅｓ  ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（６）、２，３−ジヒドロｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（７）、ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（８）、２３，２４−ジヒドロｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（９）、ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅ  ＩＸ（１０）、ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１１）、およびｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  ＩＶ（１２）が単離された。これらのｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅをアッセイして、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）酵素並びに脂質過酸化を阻害する能力を測定した。試験を実施したｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、化合物９を除いて、１００μｇ／ｍｌで９％から４０％の範囲の選択的ＣＯＸ−２酵素阻害を示した。化合物４、１０および１１はまた、それぞれ脂質過酸化を４０、４４、および５５％阻害した。
【００１７】
（実施例１から１２）
購入したＷ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉の抽出物は、ミシガン州立大学のＢｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの温室で育てられたＷ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａから採取した新鮮な葉のメタノール抽出物である。抽出物は分取ＴＬＣおよびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製し純粋なｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  １−１２を得た。
【００１８】
化合物１は無定形（ａｍｏｒ  ｐｈａｎｓ）の粉末として分離され、ｍ／ｚ  ９４５．４６８２（計算値９４５．４６９５）における［Ｍ＋Ｈ］＋イオンによって示されたように、分子式はＨＲＦＡＢＭＳによってＣ４６Ｈ７３Ｏ２０と決定された。化合物１は、ＩＲスペクトルでそれぞれ−ＯＨおよびα，β−不飽和ラクトン部分に対応する３４０６と１６９８ｃｍ−１に吸収帯を示した。ＨＭＱＣスペクトルにおいて、δ４．２２、４．２０および４．１５における３つのアノマー陽子の二重線が、それぞれδ１０３．０、１０３．９および１０４．８で３つのアノマーの炭素に相関し、化合物１がトリグリコシド基を含有していることを示唆した。グリコシドシグナルとは別に、化合物１は２８個の炭素に対してシグナルを示した。８０．１ｐｐｍ、３２．８ｐｐｍ、１６０．４ｐｐｍ、１２３．６ｐｐｍおよび１６８．６ｐｐｍにおけるシグナルは、分子内の６員環α，β−不飽和δ−ラクトン部分に割り当てられ、δ１３９．０および１２５．５におけるオレフィンの炭素はＣ−５とＣ−６に割り当てられた。化合物１のＤＥＰＴスペクトルは、δ７４．９、７３．６、８０．１で３つのメチン炭素およびδ５７．６でメチレン炭素の存在を示し、Ｃ−１、Ｃ−３、Ｃ−２２およびＣ−２７は酸素が付加された炭素であることを示していた。
【００１９】
１Ｈ  ＮＭＲにおいてδ０．６０、０．９０と１．９０における一重線および０．９２ｐｐｍにおける二重線はそれぞれＣ−１８、１９、２８と２１に割り当てられた。δ５．５０におけるオレフィンのプロトンは、ＨＭＱＣにおいて１２５．５ｐｐｍの炭素と相関を示したため、Ｃ−６に置いた。化合物１における糖単位のＣ−６’およびＣ−４”は、それぞれ７０および７７．８ｐｐｍで現れた。これらの炭素は、結合していないグルコースでは、通常それぞれ約６２ｐｐｍと７１ｐｐｍで現れる。アグリコンのＣ−３に対してグルコース単位の１つが付着していることを、δ４．２２のＨ−１’と７３．６ｐｐｍのＣ−３との間で観察されたＨＭＢＣ相関（図２Ａ）によって確認した。化合物１においてグルコース結合に対して有意な他のＨＭＢＣ相関は、それぞれδ４．２０のＨ−１”からδ７０．０のＣ−６’およびδ４．１５のＨ−１”から７７．８ｐｐｍのＣ−４”であった。化合物１の酸加水分解によってＤ−グルコースおよびアグリコンのみが得られた。アグリコンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのデータはｓｏｍｉｎｏｎｅの発表されたスペクトルデータに全く一致した（Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ；Ｊａｍａｌ，Ｓ．Ａ．，；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，Ｍ．Ｉ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ  ３４：６８９−６９８（１９９２））。また化合物１の１３Ｃ  ＮＭＲのデータを我々の研究室においてｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（化合物１１）の加水分解生成物として得られたｓｏｍｉｎｏｎｅと比較した。その結果、化合物１におけるグルコース結合を［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（→４）β−Ｄ−グルコピラノシド］と確定した。ＦＡＢＭＳにおいて化合物１に対してｍ／ｚ（質量／電荷数）７８３、６２１および４５９で得られた質量スペクトルフラグメントでは、３つのグルコース単位が連続して失われたことが示され、それらが化合物１の提案した構造がさらにｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシドであることを裏付けた。
【００２０】
無定形の粉末として単離し、３４０７、１６９６ｃｍ−１で吸収帯を示した化合物２のＩＲ（赤外吸収）スペクトルは、ヒドロキシルおよびα，β−不飽和δ−ラクトンカルボニルによるものであった。化合物２の質量スペクトルでは、ｍ／ｚ  ７８３．４１６８（計算値７８３．４１８８）において［Ｍ＋Ｈ］＋イオンが示され、Ｃ４０Ｈ６３Ｏ１５の分子式と一致した。それぞれδ０．７６、１．０１、および２．１１で一重線として現われた１Ｈ  ＮＭＲシグナルは、化合物２の３つのメチル基に割り当てられた。それはまたδ１．２２で１つのメチルの二重線、δ４．６０と４．４６の、個々に１つのプロトンに対して統合される、二重線としてのＣ−２７メチレンのプロトン、δ４．５０と３．８３の２つのオキシメチンの多重線およびδ５．４９のオレフィンのプロトンを示した。化合物２の１３Ｃ  ＮＭＲは、δ１６８．６のα，β−不飽和δ−ラクトンカルボニルと、δ７４．９及び７３．６の２つの酸素付加されたメチンと、δ１３９．１及び１２５．４のオレフィンの炭素に対するシグナルを示した。化合物２のＮＭＲスペクトルは化合物１のＮＭＲスペクトルと類似し、主な相違は、それぞれδ４．２０及び１０４．８のアノマー性プロトンおよび炭素のシグナルの欠如が示すように、糖の１つの欠如によるものであった。化合物２の酸加水分解によってＤ−グルコースおよびｓｏｍｉｎｏｎｅが得られ（Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ  ３４：６８９−６９８（１９９２））、これはそのＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を化合物１の加水分解物と比較することによって確認した。化合物２によって化合物１より１６２ａｍｕ（原子質量単位）小さいｍ／ｚ  ７８３で分子のイオンが得られ、そのほぼ確実な構造はｓｉｍｏｎｅｎｅ  ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることが示唆された。化合物２におけるグルコース単位の１つは、δ３．８３のＨ−３とδ１０２．７のＣ−１’の間に観察されたＨＭＢＣ相関（図２Ｂ）に基づいてＣ−３に存在するとした。化合物２における第二のグルコース単位は、δ６３．５のこの炭素がδ５７．６の化合物１における同様の炭素の化学シフトと比較して５．９ｐｐｍダウンフィールドへシフトしたことから、Ｃ−２７に割り当てられた。化合物２における結合はさらにδ６３．５のＣ−２７とδ４．３１のＨ−１’’との間に観察されたＨＭＢＣスペクトル相関（図２Ｂ）によって裏付けられた。Ｃ−３およびＣ−２７におけるショ糖単位の配置は、化合物２におけるＡ環とラクトン環の炭素の１３Ｃ  ＮＭＲのデータをｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１１）およびｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅ  ＩＸ（１０）のデータと比較することによってさらに確認した。その結果、化合物２の構造は２７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄであるという結論に達した。
【００２１】
無定形の粉末として得られた化合物３のＨＲＦＡＢＭＳ（高解像高速電子衝撃質量スペクトル）は、ｍ／ｚ  ６７３．３２００（計算値６７３．３２２４）で［Ｍ＋Ｎａ］＋のピークを示し、Ｃ３４Ｈ５０Ｏ１２の分子式に一致した。化合物３のＩＲスペクトルは、それぞれ３４２５、１７００、１６５２ｃｍ−１における吸収帯が示すように、分子内のヒドロキシル、α，β−不飽和δ−ラクトンおよび６員環のケトンの存在を示した。化合物３の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、δ３．６６、３．３３及び４．４４で３つの酸素を付加したメチンのプロトン、δ０．６７、０．９８、１．１８及び２．１で４つのメチル、δ４．５９及び４．４５でオキシメチレンのプロトン、に対するシグナルを示した。それはまたδ４．３１でアノマーのプロトンに対する二重線と３．１５ｐｐｍで幅の広い一重線とを示し、それぞれＨＭＱＣ（インバース異種核）における、δ１０２．７でのアノマーの炭素とδ５６．６でのエポキシドの炭素に相関した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルでは、δ２１０．２でケト基のカルボニルの炭素、δ６３．８及び５６．６でエポキシド部分、δ７８．９、２９．６、１５９．１、１２２．５及び１６７．４で６員環α，β−不飽和ラクトン部分、によるシグナルを示した。スペクトルデータにより化合物３はｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（８）に密接に関連していることが示唆された。
【００２２】
スペクトルを用いた試験で立証されたように、化合物３の加水分解によってｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（８）およびＤ−グルコースが得られた。このことにより、化合物３はｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることが示された。ＨＭＢＣスペクトル（図２Ｃ）の解析により、δ６１．６のこの炭素が４．３１ｐｐｍのアノマー性プロトンに相関し、グルコース部分はＣ−２７に付着していることが示唆された。グルコース単位のうちの１つのＣ−２７に対する結合はまた、そのａｇｌｙｃｏｎｅ  ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（９）に比較して、Ｃ−２７のダウンフィールドへ５．３ｐｐｍシフトし、δ５７．１に現われたことによって裏付けられた。スペクトルによる証明により、化合物３の構造は２７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｖｉｓｃｏｓａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（３）であることが立証された。
【００２３】
化合物４は化合物１２との分離できない混合物として得られ、その比は約２：１であった。ＨＲＦＡＢＭＳは、ｍ／ｚ  ６６９．３４５６（計算値６６９．３４８６）で［Ｍ＋Ｈ］＋イオンを示し、分子式Ｃ３４Ｈ５３Ｏ１３に一致した。分子イオンから１６２ａｍｕ失うことによって生じたｍ／ｚ  ５０７における塩基のピークにより、化合物４はモノグリコシドを含むということが示された。化合物４に対する１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲの指定は、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣスペクトル試験から得られた証拠を裏付け、疑義なく決められた。
【００２４】
糖の炭素とは別に、１３Ｃ  ＮＭＲおよびＤＥＰＴスペクトルは、δ１１．９、１３．６、１５．０及び２０．０で４つのメチル基、δ１６８．５でα，β−不飽和δ−ラクトンカルボニル、δ７９．０、７５．６、７３．６及び５９．４で酸素を付加したメチン、に対するシグナルを示した。ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（ｍ／ｚ  ６２１）のものより４８ａｍｕ高いｍ／ｚ  ６６９の分子イオンは、化合物４が構造中に３つの追加の酸素作用性（ｏｘｙｇｅｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を含むことを示した。このような酸素作用性の１つは、それぞれその１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルにおいてδ６５．５と５９．４で共鳴し、Ｃ−５およびＣ−６のエポキシドとして割り当てられた。第二および第三の酸素作用性は、ヒドロキシル基と決定され、ＨＭＢＣ試験によって確認されたようにＣ−４とＣ−１６に置かれた（図２Ｄ）。化合物４の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータをｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄと比較することによって、糖部分がグルコースであり、それが分子のＣ−３に結合していることが示された。Ｃ−３に対するグルコース単位の結合は、δ７３．６のＣ−３とδ４．３８のＨ−１’の間に観察されたＨＭＢＣ相関（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）（図２Ｄ）によっても立証された。その結果、化合物４の構造は４，１７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５β，６β−ｅｐｏｘｙｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄと確認された。
【００２５】
無定形の粉末として単離された化合物５のＩＲスペクトルは、それぞれ３４３４ｃｍ−１と１７０４ｃｍ−１で−ＯＨおよびδ−ラクトンカルボニル基に対する吸収帯を示した。ＨＲＦＡＢＭＳによりｍ／ｚ  ５５５．３３３５で［Ｍ＋Ｈ］＋イオンが得られ、Ｃ３３Ｈ４７Ｏ７（計算値５５５．３３２３）と分析された。化合物５の１３Ｃ  ＮＭＲおよびＤＥＰＴスペクトルでは、６つのメチル、９つのメチレン、９つのメチンおよび９つの四級炭素の存在が立証された。化合物５の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはδ０．６９、０．９８、１．１８及び２．０７で４つのメチル基に対するシグナルを示した。δ４．３５および４．２８における２つの二重線は、Ｃ−２７のメチレンの２つのプロトンに割り当てられた。さらに、δ３．１９で現われたプロトンシグナルはＨ−４に割り当てられた。化合物５の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、化合物５がδ２１０．１、５２．１、７２．８及び２５．０で追加の炭素シグナルをもつことを除いてｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（７）のスペクトルに類似していた。化合物５における一致するプロトンシグナルはδ１．３５（６Ｈ、ｓ）および３．７０（１Ｈ、ｓ）で認められた。これらの他の炭素シグナルは、化合物５の２，２−ジメチルシクロプロパノン部分と起因し、これはＭＳおよびＤＥＰＴスペクトルデータの両方によって裏付けられた。ＨＭＢＣスペクトルの解析によって化合物５の２，２−ジメチルシクロプロパノン部分がｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（７）におけるＣ−４ヒドロキシルを介して結合していることが明らかになった（図２Ｅ）。そのＦＡＢＭＳにおけるｍ／ｚ  ４７２［Ｍ＋Ｈ−Ｃ５Ｈ７Ｏ］＋および４７１［Ｍ＋Ｈ−Ｃ５Ｈ８Ｏ］＋におけるフラグメントによっても化合物５に対する提案された構造が裏付けられた。
【００２６】
葉から単離されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを、プロスタグランジンエンドペルオキシダーゼ合成酵素のアイソザイム−１（ＣＯＸ−１）およびＰＧＨＳ−２（ＣＯＸ−２）を用いて、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素阻害作用について評価した。アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、セレブレックス、およびＢｅｘｔｒａを正の対照として用い、それらはそれぞれ６１、５３、７９、２３及び２５％のＣＯＸ−１阻害作用並びに７、５９、９５、９８及び９９％のＣＯＸ−２阻害作用を示した（図３Ａ）。ＶｉｏｘｘはＣＯＸ−２酵素を８０％まで阻害し、ＣＯＸ−１酵素阻害作用は認めなかった。新規ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ化合物１から５を、５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌで試験し、葉から単離した他のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅすべてを１００μｇ／ｍｌの濃度で試験した。化合物６、７、８、１０、１１及び１２によって、１００μｇ／ｍｌで、それぞれ３９、２７、３５、１３、１４及び２３％のＣＯＸ−２酵素阻害作用が認められた（図３Ｂ）。化合物１から５に対してＣＯＸ−２の用量依存性阻害作用（図３）が観察され、その活性は試験が行なわれた濃度でｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ間でかなり変動した。化合物１から５が示したＣＯＸ−２阻害作用は、５０μｇ／ｍｌで、それぞれ１５、９、７、５及び１５％であった（図４）。試験されたｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、５００μｇ／ｍｌの濃度でさえも、ＣＯＸ−１酵素を阻害しなかったことに注目することが重要である。しかし、ＣＯＸ−２検定においてその濃度を１００から２５０μｇ／ｍｌまで上昇させた際、その活性はすべての化合物で同じ値のままであった。高濃度でＣＯＸ−２活性の増大が認められないのは、おそらく検定条件下でのこれらのｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの溶解度によるものである。化合物８及び６に比較して、化合物３及び１０のＣＯＸ−２活性が低いのは、化合物３及び１０のＣ−２７におけるグリコシル化によるものと思われる。Ｃ−２３とＣ−２４の間に二重結合のない化合物９はＣＯＸ−１活性もＣＯＸ−２活性も示さなかった。このことから、α，β−不飽和δ−ラクトン部分の二重結合はＣＯＸ−２阻害作用にとって非常に重要であることが示された。
【００２７】
モデル系における脂質過酸化を阻害するｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの能力は、それらが抗酸化剤として作用することができるかどうか確認するために用いられた。このアッセイは大きな単一膜小胞を用いて実施し、Ｆｅ２＋を加えることによって過酸化を開始した。化合物４、７、１０、および１１を除いて、試験を行なった他のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは脂質過酸化を阻害しなかった（図５）。モノグリコシド４、７、１０、および１１は、我々のアッセイ系でそれぞれ４０、５、４４および５５％脂質過酸化を阻害した。
【００２８】
ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅのＣＯＸ−２酵素阻害作用に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果により、炎症の治療のための大衆薬としてのＷ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉調製物の使用について一定の科学的裏づけが得られた（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｊｏｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ；Ｅｄ．，；Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，ｐ．５３１（１９８９））。本発明はこのグループの化合物に対するＣＯＸ−２酵素阻害作用についての最初の報告を提示するものである。ＣＯＸ−２酵素の過剰発現が腫瘍細胞において観察されるので、選択的ＣＯＸ−２阻害剤は腫瘍の進行を妨げることができるであろう。証拠の不確かな報告により、ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅが抗癌作用を示すということが指摘されている（Ｔｈａｋｕｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｊｏｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ；Ｅｄ．；Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ｌｕｃｋｎｏｗ，Ｉｎｄｉａ，ｐ．５３１（１９８９））。それ故、これらの化合物は癌の化学的予防に対する治療法の開発のための鋳型として有用と思われる。Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの根と葉の両方に類似のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅが含有されているので、Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの根の粉末あるいは葉の抽出物を栄養補助食品として摂取することによって、ＣＯＸ−２酵素を抑制する濃度で、炎症性疼痛が軽減され、癌形成の危険性が低下し、腫瘍の進行を抑えることができる。
【００２９】
実験手順
概括的手順
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは５００ＭＨｚ  ＶＲＸスペクトロメーターで記録された。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは１２５ＭＨｚで得られた。化学シフトはＣＤＣｌ３あるいはＣＤ３ＯＤのいずれかで記録された。ＨＭＢＣはＪ＝８．０Ｈｚに対して最適化した。ＭＰＬＣのために用いられたシリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０であった（３５−７０μｍ粒子サイズ）。ＨＲＦＡＢ（高速電子衝撃）およびＦＡＢ質量スペクトルは、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅで作動させた、ＪＥＯＬ  ＨＸ−１１０二重収束型質量スペクトロメーターを用いて得られた。分取ＨＰＬＣは、流速３ｍｌ／分でｔａｎｄｅｍ  Ｃ１８カラム（ＪＡＩＧＥＬ，１０μｍ，２０×２５０ｍｍ）を用いて、リサイクル分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−２０）で実施した。用いたすべての有機溶媒および標準物質はＡＣＳ（アメリカ化学会）試薬グレードであった。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの収率は葉の乾燥重量パーセントで表される。
【００３０】
植物原料
抽出物（Ｈ−３４１）は、ＰｈｙｔｏＭｙｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、グリーンビル、ノースカロライナ州から購入し、以下のように調製した：日陰で乾燥してすりつぶしたＷ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａの葉をジクロロメタンとメタノール（１：１、ｖ／ｖ）の混合物、メタノールおよび水を用いて連続的に抽出し、３つの分画を得た。その後すべての分画をプールし、減圧下で濾過し乾燥した。得られた抽出物は使用時まで−２０℃で保存した。
【００３１】
ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの単離
ＰｈｙｔｏＭｙｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した混合した未加工の抽出物（４ｇ）をｎ−ヘキサン（５００ｍＬ）を加えて攪拌し、濾過した。ヘキサン不溶部分（３．２ｇ）は傾斜条件下でＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）を用いたＭＰＬＣ上でクロマトグラフィーにかけた。収集された分画はＩ（６００ｍｇ  ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ，９：１）、ＩＩ（５００ｍｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ，８．２），ＩＩＩ（１．２ｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ，７：３），およびＩＶ（２００ｍｇ，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ，１：１）であった。へキサン−ＥｔＯＡｃ（１：１，ｖ／ｖ）を用いて分画ＩのＭＰＬＣを繰り返し、純粋な化合物６（１２０ｍｇ，０．０７８％）、化合物７（５０ｍｇ，０．０３２％）および分画１（４．０ｍｇ）を得た。この分画１をさらにＰＴＬＣ（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ，６：４，ｖ／ｖ）を用いて精製し、純粋な化合物９（２．１ｍｇ，０．００１４％）を得た。ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（１：１，ｖ／ｖ）を用いた分取ＨＰＬＣによって分画ＩＩの精製を行い、１９．５分で化合物１０（２０ｍｇ，０．０１３％）、２４．２−２８．１分で分画２（５０ｍｇ）を得た。さらに分画２をＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（４：６，ｖ／ｖ）を用いたＨＰＬＣで精製を行い、３２．９６分で化合物１１（４０ｍｇ，０．０２６％）を得た。同様に、分取ＨＰＬＣ（ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ，６：４，ｖ／ｖ）を用いて分画ＩＩＩを精製し、１１２分で純粋な化合物１２（１５ｍｇ，０．００９７％）、２０−４５分で分画３（９５０ｍｇ）および１４０−１６０分で分画４（１６ｍｇ）を得た。分画３はさらにＨＰＬＣ（ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ，６：４，ｖ／ｖ）によって精製し、それぞれ６６．８分と７８．６分で化合物８（２００ｍｇ，０．１３％）と化合物５（１０ｍｇ，０．００６５％）および１３２分の時点で７００ｍｇのショ糖が得られた。分画４はＨＰＬＣ（ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ，７：３，ｖ／ｖ）で分離し、８１分に化合物２（１２ｍｇ，０．００７８％）を得た。分画ＩＶはＨＰＬＣ（ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ，７：３）によって精製し、２０−３０分に分画５（１３ｍｇ）および３０．１−６６分に分画６（３０ｍｇ）を収集した。分画６はＨＰＬＣ（ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ，７：３，ｖ／ｖ）によって精製し、５７．９分に化合物３（８．５ｍｇ，０．００５５％）を得た。分画５はさらにＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６：４，ｖ／ｖ）を用いたＨＰＬＣによって精製し、５９．３分の時点で純粋な化合物１（１０．５ｍｇ，０．００６８％）および９６．４分に化合物４と１２の混合物を得た（５．０ｍｇ，０．００３２％）。
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ａデータは２５℃、１２５ＭＨｚで、ＣＤ３ＯＤにおいて記録した。
ＭｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙはＤＥＰＴ実験によって測定し、ＨＭＱＣスペクトルの解析によって確認した。
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【００３２】
酸加水分解
化合物１から５のそれぞれ１ｍｇおよび化合物１１（５ｍｇ）を、別々に６％ＨＣｌに溶解し、３時間還流下で加熱した。この溶液は１Ｎ  ＮａＯＨで中和し、ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を濃縮し、スペクトル試験によってアグリコンの特徴付けを行った。水溶液を濃縮し糖について分析した。水性部分にはＤ−グルコースのみが存在することが確認された。
【００３３】
化合物６から１２
化合物６から１２の構造は、詳細な１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル試験によって、ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（化合物６）（Ａｎｊａｎｅｙｕｌｕ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｃｔ．Ｂ．３６：１６１−１６５（１９９７））；２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（７）（Ａｎｊａｎｅｙｕｌｕ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｃｔ．Ｂ．３６：１６１−１６５（１９９７））；ｖｉｓｃａｌａｃｔｏｎｅ  Ｂ（８）（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ  １５：３１７−３２０（１９８１））；２３，２４−ｄｉｈｙｄｒｏｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（９）（Ｋｉｒｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２６：２２０９−２２１９（１９７０））；ｓｉｔｏｉｎｄｏｓｉｄｅ  ＩＸ（１０）（Ｇｈｏｓａｌ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４：１２−１３（１９８８））；ｐｈｙｓａｇｕｌｉｎ  Ｄ（１１）（Ｓｈｉｎｇｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０：２０８８−２０９１（１９９２））；およびｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  ＩＶ（１２）（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：１４９９−１５０７およびその中に引用された参考文献（２００１））として導き出された。これらの化合物のスペクトルデータは、個々の公表されているスペクトルデータと一致した。
【００３４】
ＣＤ分析
化合物１から５についてのＣＤスペクトルは、以下の条件下でＭｅＯＨ（メタノール）中でＪＡＳＣＯ、ｍｏｄｅｌ  Ｊ−７１０、ＣＤ−ＯＲＤスペクトロメータで記録した：スキャンモード（波長）、吸収帯幅（０．５ｎｍ）、感度（５０ｍ  ｄｅｇ）、応答（１秒）、波長領域（２００−４００ｎｍ）、段階的分解能ｓｔｅｐ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（１ｎｍ）、スキャンスピード（１００ｎｍ  ｍｉｎ−１）、および積算回数（１）。化合物１から５について観察されたＣＤの最大値もしくは最小値（Δε）は以下の通りであった：化合物１（ｃ  ０．００１，ＭｅＯＨ）Δε＋７３．７（２５７）；化合物２（ｃ  ０．０００５，ＭｅＯＨ）Δε＋１５．４（２６２．５）；化合物３（ｃ  ０．００１，ＭｅＯＨ）Δε＋４．７（２６１）；化合物４（ｃ  ０．０００５，ＭｅＯＨ）Δε＋６１．６（２６０）および化合物５（ｃ  ０．００１，ＭｅＯＨ）Δε＋９．８（２６０）。
【００３５】
（実施例１３）
シクロオキシゲナーゼ酵素阻害検定法
ＣＯＸ−１酵素を雄ヒツジの精嚢から調製し、ＣＯＸ−２酵素をヒトＰＧＨＳ−２酵素を用いてクローン化した昆虫の細胞から単離した。試験化合物のＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対する阻害作用を、生物学的酸素モニター（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇ，オハイオ州）に取り付けた酸素電極（Ｉｎｓｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ペンシルベニア州）を用いて、３７℃でＯ２取り込みの初速度をモニタリングすることによって測定した。Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７、１０−１５μｌ）で酵素を希釈し（１：１）、ＤＭＳＯに溶解した試験化合物（１００μｇ／ｍｌ、１０μｌ）を、３ｍｌの０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７、１ｍｍｏｌフェノールおよび８５μｇのヘモグロビンから成るアッセイ用混合物に加えた。混合物を２から３分間インキュベートし、アラキドン酸（１０μｌの１．６４μＭ溶液）を加えて反応を開始した。瞬間的な阻害をＱｕｉｃｋ  Ｌｏｇ  Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよびコントロールコンピューターソフトウェア（Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  Ｔｒｅｅ  Ｉｎｃ．，サニーベール、カリフォルニア州，ＵＳＡ）を用いて測定した。正の対照であるアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンは、それぞれ１８０、２．１及び２．５μｇ／ｍｌで試験しセレブレックス，Ｖｉｏｘｘ及びＢｅｘｔｒａは１．６７μｇ／ｍｌで試験を行なった。ＤＭＳＯを溶媒対照として用いた（Ｗａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６２：２９４−２９６（１９９９））。結果を図３Ａおよび３Ｂに示した。図４はｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  １から５を用いた結果を示している。
【００３６】
（実施例１４）
抗酸化剤活性
大きな単一膜小胞（リポソーム懸濁液）を公表されている手順（Ｒａｍｓｅｗａｋ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：３０３−３０８（２０００））に従って調製した。最終的な検定量は２ｍｌで、これは１００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ  ＴＲＩＳ）、２００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１．６４ｍｌのＮ２分散水、２０μｌの試験検体若しくはＤＭＳＯおよび２０μｌのリポソーム懸濁液から成る。過酸化は２０μｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．５ｍＭ）の添加によって開始した。蛍光をＴｕｒｎｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４５０  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて０、１、３分に、そして３分毎に、２１分まで監視した。相対的蛍光強度の経時的な低下は、過酸化の速度を示した。阻害の割合はＤＭＳＯ対照に対して算出した。すべての化合物は１００μｇ／ｍｌで試験を行ない、正の対照ＢＨＡ，ＢＨＴおよびＴＢＨＱは１０μＭで試験を実施した。結果は図５に示す。
【００３７】
医薬用組成物
医薬用組成物においては、ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは１ｍｌ又は１ｇあたり１から１，０００μｇの用量で阻害作用を示す。好ましい態様においては、患者治療用の１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを薬学的に許容できる担体中に含め、その阻害用量を患者に投与する。このようにして、ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、慣習的な混和、顆粒化、コーティング、懸濁化、カプセル化など当業者によく知られた方法で製剤上用いる担体物質と共に経口若しくは直腸投与用の慣習的な製剤に加工される。従って、経口投与用ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ製剤は、１つ以上のアントラキノンを固体の製剤用担体と組み合わせ；任意に得られた混合物を顆粒化し；所望の場合および／又は任意に適切な補助薬を加えた後、混合物または粒状体を錠剤又は糖衣錠のコアの形態に加工することによって得ることができる。
【００３８】
固体製剤用に適した製剤用担体は、とりわけ、糖（例えば、乳糖、サッカロース、マンニトール又はソルビトール）、セルロース製剤および／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム）などの賦形剤；例えば、とうもろこし、小麦、コメ若しくはバレイショデンプンを使用するデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／又はポリビニルピロリドン、部分的に遊離官能基をもつポリアクリル酸塩又はポリメタクリル酸塩のエステルのような結合剤；並びに／或いは、必要であれば、前記のデンプン、カルボキシメチルデンプン、架橋を形成したポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩といった発泡剤である。補助薬は、主に流動調節剤および潤滑剤（例えばケイ酸、タルク、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウムなどのその塩）である。糖衣錠のコアは、任意に胃液に抵抗性のある、適切なコーティングをして提供される。その形態ではとりわけ、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、および／または二酸化チタンを含む濃縮ショ糖溶液、水性溶媒中のラッカー溶液、或いは胃液に対して抵抗性のあるコーティングを作成するためには、フタル酸エステル又はトリアセチンのような適当な軟化剤を含む、若しくは含まない、部分的に遊離官能基をもつポリアクリル酸エステル若しくはポリメタクリル酸エステルの溶液、又はフタル酸アセチルセルロース若しくはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースのような適当なセルロース製剤のエステル溶液が用いられる。染料又は色素を、例えば有効成分の様々な投与量の確認又はマーキングのために錠剤、又は糖衣錠のコーティング剤に加えてもよい。
【００３９】
経口的に投与することができる１つ以上のアントラキノンを含むｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ製剤は、更にゼラチンから製造される固いまたは柔らかい密閉カプセルだけでなく、固いゼラチンカプセルを含み、必要であれば、グリセリン又はソルビトールのような軟化剤を含む。固いゼラチンカプセルは、例えばとうもろこしデンプン、任意に顆粒化した小麦デンプンのような充填剤、結合剤又はタルク、ステアリン酸マグネシウム若しくはコロイド状ケイ酸のような潤滑剤および任意に安定化剤と混和して、粒状体の形態の１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを含むことができる。密閉カプセル内において、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、粉末又は粒状体の剤形である；あるいは好ましくは適当な溶媒中で懸濁液の形態で存在し、その形態では懸濁液を安定化させるために、例えばモノステアリン酸グリセリンを加えることができる。
【００４０】
経口投与される他のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ製剤は、例えば、通常の方法で調製した水性懸濁液であり、懸濁液中に１回投与量として十分な濃度の１つ以上のアントラキノンを含む。水性懸濁液は、せいぜい少量の安定剤および／又は香料、例えば、サッカリンナトリウムのような甘味料、あるいはシロップとして一定量の糖および／又はソルビトール又は類似物質を含む。また例えば合剤用の濃縮液又は濃縮懸濁液も適用可能である。このような濃縮液は１回投与量単位で包装することもできる。
【００４１】
直腸投与用に適したｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ製剤は、例えば、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅと坐薬基剤との混合物から成る坐剤である。このような物質としては、特に、天然若しくは合成のトリグリセライド混合物が挙げられる。また、基剤中の１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの懸濁物から成る直腸用ゼラチンカプセルが適当である。適した基剤は、例えば、より高い飽和度の又は、とりわけ中程度の飽和度の脂肪酸の液体トリグリセライドである。
【００４２】
さらに特に重要なものは、デンプン、特にとうもろこしデンプン又は小麦デンプン、また例えばじゃがいもデンプン又は米デンプンとの混合物中に、細かくすりつぶした、好ましくは粒子サイズの中央値が５μｍ以下の１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを含む製剤である。それらは好ましくはプロペラのような鋭い刃の攪拌装置を備えた、例えば３分から１０分のミキシング時間の、さらに成分が大量である場合には必要に応じて冷却装置を備えた高速ミキサー内で短時間のミキシングによって製造する。このミキシング工程において、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの粒子は、連続的に一部の粒子が小さくなってデンプン粒子の上に均一に堆積する。前記の混合物は、慣習的な、例えば前記の補助薬を用いて、固体の用量単位の剤形に、即ち、錠剤あるいは糖衣錠に圧縮し、又はカプセル内に充填し加工することができる。しかし、それらは直接投与することができ、あるいは例えば、約５倍から２０倍量の水を用いた水性懸濁液の調製のための濃縮液として、補助薬、例えば製剤学的に許容できる湿潤剤および分配剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンと高級脂肪酸またはラウリル硫酸ナトリウムとのエステル）および／又は芳香剤を加えた後投与することもできる。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ／デンプン混合物を界面活性剤あるいは他の補助薬と組み合わせる代わりに、これらの物質を懸濁液を調製するために用いられる水に加えてもよい。１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ／デンプン混合物および任意に補助薬から成る懸濁液を製造するための濃縮液は、１回投与量毎に包装し、必要に応じて気密容器でまた防湿して包装することができる。
【００４３】
さらに、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、患者の腹腔内、鼻腔内、皮下、又は静脈内に投与することができる。一般的に、腹腔内、鼻腔内、皮下、又は静脈内投与用には、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを、植物油または他の類似したオイル、合成脂肪酸グリセライド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールのような水性若しくは非水性の溶媒中で溶解し、懸濁化し、又は乳化して；必要に応じて、溶解化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および防腐剤のような慣習的な添加物を加えて供給される。好ましくは、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅは、温血動物またはヒトにおける腹腔内、皮下、又は静脈内投与のために許容できる組成物として供給される。例えば、このような組成物は、１つ以上のアントラキノンに対する担体として、リン酸塩緩衝液のような生理学的に許容できる溶液を含むことができる。好ましくは、この溶液は生理学的ｐＨを示す。特別な態様では、本製剤は静脈内投与によって腫瘍へ潅流液を送っている患者に直接注射する。
【００４４】
本発明による製剤は、その濃度は、温血動物又はヒトへの投与に適した濃度の１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを含み、投与方法によって約０．３％から９５％の間、好ましくは約２．５％から９０％である。懸濁液の場合、濃度は通常３０％以下で、好ましくは約２．５％である；また逆に言えば１つ以上のアントラキノンを含む錠剤、糖衣錠およびカプセルの場合、１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの必要な投与量を確実に容易に投与するために、濃度は好ましくは約０．３％以上である。１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅを含む製剤を用いた患者の治療は、好ましくは実際にＣＯＸ−２を阻害するのに時間的に十分である１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの投与量の１回以上の投与によって行なわれる。必要に応じて投与量は１日１回あるいは数時間の間隔で投与される様々な部分投与量に分けて投与することもできる。特別な症例では、本製剤は放射線照射あるいは化学療法のような１つ以上の他の治療法と併用してあるいはその後投与することもある。１つ以上のｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅの投与量は、治療する患者（温血動物もしくはヒト）、治療する患者の全身状態、および治療する疾患の種類の両方によって決まる。
【００４５】
前記の詳細な説明は単に本発明の実例となるものであり、本発明は以下の補遺の請求項によってのみ限定されることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１から１Ｄはｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  １から１２の構造を示す化学構造式である。
【図２Ａ−Ｅ】図２Ａから２Ｅは化合物１，２，３，４および５の一部に観察される一部の有意なＨＭＢＣ（インバース異種核）（→）相関を示す化学構造式である。
【図３Ａ】図３Ａは市販用非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）によるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素の阻害作用を示すグラフである。アスピリン、イブプロフェンおよびナプロキセンはそれぞれ１８０、２．１および２．５μｇ／ｍｌで試験を行った。セレブレックス、ＶｉｏｘｘおよびＢｅｘｔｒａはそれぞれ１．６７μｇ／ｍｌで検定した。ＤＭＳＯ溶媒対照はＣＯＸ酵素を阻害しなかった。データは平均±１標準偏差（ｎ＝２）として表わしている。
【図３Ｂ】図３Ｂは１００μｇ／ｍｌのｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  １−１２のＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害作用を示すグラフである。ＤＭＳＯ溶媒対照はＣＯＸ酵素を阻害しなかった。垂直の棒は個々のデータポイント（ｎ＝２）の標準偏差を表している。ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  １−１２は５００μｇ／ｍｌの濃度においてもＣＯＸ−１酵素を阻害しなかった。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは５０、１００および２５０μｇ／ｍｌの化合物１−５によるＣＯＸ−２酵素の用量依存性阻害を示すグラフである。垂直の棒は個々のデータポイントの標準偏差（ｎ＝２）を表している。
【図５】図５は１００ｐｐｍの化合物４、７、１０及び１１と、１０ｐｐｍの濃度における合成抗酸化物ＢＨＡ、ＢＨＴ及びＴＢＨＱによる２０分における脂質過酸化の阻害を示すグラフである。溶媒対照として用いられるＤＭＳＯは活性を示さなかった。同様にｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  １−３、５、６、８、９および１２は１００ｐｐｍの濃度で活性を示さなかった。データは平均±１標準偏差として表わしている（ｎ＝２）。
【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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