(57)【要約】本発明は、主要なエネルギー源としてＡＴＰを必要とする無細胞系における、生物高分子の生体外合成を増強するための方法及び組成を提供する。なお、前記無細胞系はＡＴＰ−スルフリラーゼで富化される。本発明は、また、生物高分子の生体外合成を増強するための、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系及び無細胞抽出物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要なエネルギー源としてＡＴＰを必要とする無細胞系における生物高分子の生体外合成を増強するための方法であって、前記無細胞系がＡＴＰ−スルフリラーゼで富化されている、方法。
【請求項２】
前記生物高分子が、核酸、タンパク質、それらの断片等の高分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無細胞系が、外来のＡＰＳからなる、請求項１あるいは２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体外合成が、また、ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写からなる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生体外合成が、バッチ反応として反応器内で、半連続的に、あるいは連続的に実行される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記無細胞系にＡＴＰ−スルフリラーゼを、前記生体外合成の開始時に、そして／あるいは前記生体外合成中に添加する、または前記生体外合成中に時折添加する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記無細胞系が、ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から準備した無細胞抽出物からなる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度が、実験条件と、合成すべき生物高分子とに応じて適合される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記無細胞系内に、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの初期濃度でＡＴＰ−スルフリラーゼが存在している、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系。
【請求項１１】
外来のＡＰＳからなる、請求項１０に記載の無細胞系。
【請求項１２】
ｍＲＮＡの翻訳、そしてＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写に必要なすべての物質からなる、請求項１０あるいは１１に記載の無細胞系。
【請求項１３】
余分なＡＴＰ−スルフリラーゼが、原核生物、真核生物、遺伝子導入ベクター、遺伝的に修正した細菌細胞、大腸菌抽出物から得られる、あるいは精製される、請求項１０から１２のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項１４】
ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物が準備される、請求項１０から１３のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項１５】
ＡＴＰ−スルフリラーゼが、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１０から１４のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項１６】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物。
【請求項１７】
外来のＡＰＳからなる、請求項１６に記載の無細胞抽出物。
【請求項１８】
ｍＲＮＡの翻訳、そしてＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写に必要なすべての物質からなる、請求項１６あるいは１７に記載の無細胞抽出物。
【請求項１９】
余分なＡＴＰ−スルフリラーゼが、原核生物、真核生物、遺伝子導入ベクター、遺伝的に修正した細菌細胞、大腸菌抽出物から得られる、あるいは精製される、請求項１６から１８のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項２０】
ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から準備した、請求項１６から１９のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項２１】
ＡＴＰ−スルフリラーゼが、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６から２０のいずれかに記載の無細胞抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞系における、核酸及びタンパク質等の生物高分子の生体外合成を強化する方法及び組成の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外合成は、細胞表出に関連する不利益がない、比較的高レベルの核酸及びタンパク質生産の理由から、従来の組換えＤＮＡ技術に対する代案であると考えられてきた。強力なツールである、生体内タンパク質表出には、深刻な限界がある。（１）生体内で生成したタンパク質は、細胞表出中に、グリコシル化、脱アミノあるいは酸化等の、崩壊あるいは翻訳後変異にさらされる。（２）細胞毒性あるいは不溶解性タンパク質が合成に影響を与え、細胞の新陳代謝プロセス及び生育力を抑制する可能性がある。これらの問題を克服するために、生体外タンパク質合成は、主に次のものに適用される。（１）有毒なタンパク質の表出、（２）新たに合成したタンパク質の放射性標識、そして異常なアミノ酸の組み込み、（３）薬剤、食物、環境産物、そして製品の経済的な素早いスクリーニング。
【０００３】
無細胞系におけるタンパク質及び他の生物高分子の合成は、細胞抽出物に基づいている。典型的な生体外無細胞系は、次のものからなる。（１）転写及び翻訳に必要な酵素及び要素を含む生細胞抽出物（Zubay G: In vitro synthesis of proteins in microbial system「微生物系における生体外タンパク質合成」, Annu Rev Genet 1973,7 : 267-287）、（２）ＮＴＰ、（３）アセチル燐酸（ＡｃＰｈ）及びアセテートキナーゼ、エノールピルビン酸二燐酸塩（ＰＥＰ）及びピルビン酸キナーゼ、あるいはクレアチン燐酸（ＣｒＰｈ）及びクレアチンキナーゼ等の、エネルギー再生系、そして（４）ＤＮＡ及びＲＮＡ。
【０００４】
しかしながら、無細胞の遺伝子表出系のいわゆるバッチ・モードは、タンパク質合成が短時間であるため、実用的な選択肢として、広く受け入れられてはいない。反応時間が５０時間に延長した、スピリン（Spirin）氏らによる連続流無細胞（ＣＦＣＦ）系の開発後（Science 242:
1162-1164,1988）、他の人たちによって、いくつかの改良がなされた（Kim DM, Choi CY:
A semicontinous prokaryotic coupled cell-free system using a dialysis membrane「透析膜を用いる、半連続原核結合無細胞系」, Biotechnol Prog 1996,12 : 645-649; Madin K. , Sawasaki T. , Ogasawara
T., Endo E: A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system
prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system
directed at ribosomes「コムギ胚芽から準備した高度に効率的な、そして強靭な無細胞のタンパク質合成系：植物は、明らかにリボソームに向けた自殺系を含む」, Proc Natl Acad Sci 2000, 97: 559-564）。
【０００５】
種々のアプリケーションの要約は、現在、バッチ・モード系（Kawarasaki Y, Nakano H, Yamane T, Anal Biochem 1995,226 : 320-324 ;
Nakano H, Tananka T, Kawarasaki Y, Yamane T, Biosci Biotechnol Biochem 1994,
58: 631-634 ; Kim DM, Kigawa T, Chen CY, Yokoyama S, Eur J Biochem 1996, 239:
881-886; Patnaik R, Swartz JR, BioTechniques 1998, 24: 862-868）、そして連続作用系（Tulin EE, Ken-Ichi T, Shin-Ichiro E, Biotechnol Bioeng 1995, 45:
511-516 ; Kim DM, Choi CY, Biotechnol Prog 1996, 12: 645-649; Madin K.,
Sawasaki T., Ogasawara T., Endo E, Proc Natl Acad Sci 2000, 97: 559-564）の、両タイプの生体外表出系が、集中的な研究の下で非常に速く発展していることを示している。
【０００６】
公表の、そして市販のバッチ生体外系は、０.５ｍｇ／ｍｌまでの合成が可能であり、連続反応器は、１ｍｌの反応に対して３から５ｍｇまでの、所望のタンパク質を生成することができる。コムギ麦芽無細胞連続表出系の場合、反応時間は、５日間まで延長された（Madin K., Sawasaki T., Ogasawara T. , Endo E, Proc Natl Acad Sci
2000, 97: 559-564）。これらの系では、抑制の副産物の連続的な除去、そして基質及びエネルギー源の連続的な供給によって、連続反応系による、長い反応時間に渡るタンパク質合成のサポートを可能にしている。
【０００７】
無細胞系の生化学エネルギーは、三リン酸の加水分解によって供給される。効率的な転写及び翻訳のためには、三リン酸濃度を、次のエネルギー再生系によって維持する。クレアチンホスホキナーゼとクレアチン燐酸、ピルビン酸キナーゼとエノールピルビン酸二燐酸塩、そして内生大腸菌アセテートキナーゼとアセチル燐酸（Ryabova LA, Vinokurov LM, Shekhovtsova EA, Alakhov YB, Spirin AS,
Anal Biochem 1995, 226: 184-186）。
【０００８】
種々の無細胞系における三リン酸レベルの研究から、主にタンパク質合成から独立した、それらの、無機燐酸塩及び二燐酸塩への加水分解の高い割合を検出した。これらは、タンパク質合成の突然の停止に関連する（Yao SL, Shen XC, Suzuki E, J Ferment Bioeng 1997, 84: 7-13 ; Kim RG,
Choi CY, J Biotechnol 2000, 84: 27-32）。また、蓄積する燐酸塩の抑制効果が、明らかに示された（Kim D-M, Swartz JR, Biotechnol Prog 2000, 16: 385-390）。
【０００９】
大腸菌生体外表出のためのＡＴＰ再生系に対する重要な変更が、スワルツ（Swartz）氏によってなされた（Kim D-M, Swartz JR,
Biotechnol and Bioengin 1999, 66: 180-188; Kim D-M et al, Biotechnol and
Bioengin 2001, 74, 309-316; US patent 6,168,931; US patent 6,337,191）。このケースでは、アセチル燐酸、エノールピルビン酸二燐酸塩（ＰＥＰ）及びピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）のような標準エネルギー源が、酵素ピルビン酸オキシダーゼとの組み合わせで、ピルビン酸塩によって置換され、アセチル燐酸を生成している。また、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ+ との組み合わせで解糖中間体あるいはグルコース・エネルギー源を使用するという提案があった。したがって、反応混合物内の正味遊離燐酸塩を増加させるＰＥＰのようなエネルギー源を省くことができた。しかし、解糖中間体、グルコースあるいはピルビン酸塩の使用は、一般的に、２時間までのタンパク質合成をサポートする。このことは、ＮＴＰの再生効率の減少、すなわち遊離燐酸塩の蓄積を示している。
【００１０】
上記のように、タンパク質の低生産量が、無細胞タンパク質合成の工業化に対する重大な欠点である。したがって、未だに、特定な生産率を増加させることによるタンパク質の全生産性、そして高価なエネルギー源を再生させることによる系作動時間に関して、再生エネルギー源を再利用する、そして強いタンパク質合成抑制剤である無機燐酸塩を費やすための改良が必要である。
【００１１】
生体外転写翻訳及び無細胞転写翻訳は、所望のタンパク質をコード化するＤＮＡからの所望タンパク質の無細胞合成のための方法に言及する。
【００１２】
生体外翻訳及び無細胞翻訳は、所望のタンパク質をコード化するリボ核酸（ＲＮＡ）からの所望タンパク質の無細胞合成のための方法に言及する。
【００１３】
無細胞タンパク質合成及び生体外タンパク質合成は、生体外転写翻訳及び生体外翻訳の両方に言及する。
【００１４】
本文で用いる無細胞抽出物は、細胞のタンパク質合成機構の成分からなる調剤を示す。このような成分は、所望のタンパク質をコード化する核酸を表出することができる。したがって、無細胞抽出物は、所望のタンパク質をコード化する伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）を翻訳することができる成分からなる。
【００１５】
生物高分子、生物材料及び生物重合分子は、核酸、タンパク質及びそれらの断片に言及する。
【００１６】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物、あるいは余分なＡＴＰ−スルフリラーゼを含む無細胞抽出物は、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度が通常のものを超えていることを意味する。増加させた、あるいは余分な量のＡＴＰ−スルフリラーゼは、無細胞抽出物へ外来のＡＴＰ−スルフリラーゼを外部から添加することによって、あるいは、ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで変質させた細胞から無細胞抽出物を準備することによって得た。
【００１７】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系は、系のＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度が通常のものを超えていることを意味する。それは、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物と、高分子合成に用いるすべての成分、あるいは標準無細胞抽出物と、余分なＡＴＰ−スルフリラーゼを添加した高分子合成に用いるすべての成分からなる。
【００１８】
ＮＴＰは、ヌクレオチド三燐酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰ）に言及する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、主要なエネルギー源としてＡＴＰを必要とする無細胞系における、生物高分子の生体外合成を増強するための方法を提供する。前記方法は、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系を用いる。本発明は、また、上記方法による生物高分子の生体外合成を増強するための、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系及び無細胞抽出物に関する。これらの生物高分子は、種々の（原核の、そして真核の）起源を持つ。
【００２０】
本発明が提供する増強生体外合成方法及び組成は、核酸、タンパク質、それらの断片等の、広範囲の生物高分子の生体外生成に役立つ。
【００２１】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、自然界で種々の役割を演ずる。菌類、イースト、ほとんどの従属栄養菌、藻、そして高等植物では、ＡＴＰ−スルフリラーゼは、硫酸塩の還元有機分子への同化作用において、第一細胞内反応を触媒する。無酸素性の硫酸塩還元バクテリアでは、ＡＴＰ−スルフリラーゼは、従属栄養菌新陳代謝の最終電子受容体としてのみ機能するＡＰＳ（アデノシン５’−ホスホ硫酸）を形成する。ある化学光石栄養細菌（chemo- and photolithotrophic bacteria）では、ＡＴＰ−スルフリラーゼは、還元無機硫黄化合物の硫酸塩への酸化における最終反応を触媒する。硫酸塩吸収生物では、ＡＴＰ−スルフリラーゼ（ＡＴＰ：スルフェート・アデニル・トランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．７．４）は、無機硫酸塩（ＳＯ２-４）の、アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）等の有機分子内への組み込みにおける第一細胞内反応を触媒する（Karamohamed S et al.: Production, purification, and luminometric
analysis of recombinant saccharomyces cerevisiae MET3 adenosine triphosphate
sulfurylase expressed in Escherichia coli, Protein expression and Purification 「大腸菌に表出する組換型酵母菌属セレビシエＭＥＴ３アデノシン三燐酸スルフリラーゼの生成、精製及び照度計分析、タンパク質表出及び精製」1999, 15: 381-388）。
【００２２】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、自然界に広く分布しており、下等及び高等微生物、植物、動物を含む多くのソースから精製されている。ＡＴＰ−スルフリラーゼ遺伝子は、原核生物、下等真核生物、植物、そして動物からも複製されている。
【００２３】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、ＤＮＡ配列決定に関する応用に用いられている（W09813523A1, Nyren et al. Anal. Biochem.,（1985）151,504-509）。この方法は、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）のリリースによる塩基結合の検出に基づいている。分析においては、生成したＰＰｉを、その後、ＡＴＰ−スルフリラーゼによってＡＴＰに変換し、ＡＴＰ生成をルシフェラーゼによってモニターする。しかし、分析では、ＡＴＰ生成は、ＤＮＡ合成に用いず、単に検出処理に用いる。
【００２４】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、下記のスキームに示すように、無機燐酸塩をＡＴＰの再生に利用する。これは、最も一般的に利用されるエネルギー源であるが、他の三つのＮＴＰも、タンパク質表出に用いられ、細胞抽出物内におけるそれらの再生に、ＡＴＰを用いることができる。
【００２５】
ＡＴＰ−スルフリラーゼ
ＰＰｉ＋ＡＰＳ＜−−−−−−−−−−−＞ＡＴＰ＋ＳＯ４２-
【課題を解決するための手段】
【００２６】
主要なエネルギー源としてＡＴＰを必要とする無細胞系における生物高分子の生体外合成を強化するための方法及び組成を提供する。この方法は、ＮＴＰを主要なエネルギー源として利用する反応において生物材料を合成することからなる。この場合、ＮＴＰは、エネルギー再生系を用いて再生する。
【００２７】
本発明による方法は、生物高分子の生体外合成が、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系で実行されることを特徴とする。
【００２８】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、タンパク質合成の抑制を引き起こす無機燐酸塩を取り除くＡＰＳ及び無機燐酸塩を利用することによって、ＡＴＰを再生することができる。ＡＴＰ−スルフリラーゼを、単独で、あるいは適当な濃度のＡＰＳと共に、転写翻訳無細胞系に添加したとき、タンパク質合成が促進され、有意な収量を得た。本発明の主題に限定せずに、無細胞系におけるＡＴＰ−スルフリラーゼの作用のために、次の少なくとも二つの機構を提案することができる。（１）ＡＴＰ再生、そして（２）無機燐酸塩の利用。
【００２９】
したがって、無細胞反応系は、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物を用いて再生されるエキストラＡＴＰからなる。
【００３０】
もう一つの実施例では、無細胞反応系は、外来のＡＰＳからなる。
【００３１】
本発明の方法による生体外合成は、特に、ＤＮＡテンプレートからｍＲＮＡを転写した後の、最終的にポリペプチドを生成するためのｍＲＮＡの翻訳に関する。したがって、本発明の方法は、さらに、結合転写翻訳生体外合成に関する。これらの実施例では、無細胞系は、ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写、そして前記ｍＲＮＡの翻訳に必要なすべての物質を含む。
【００３２】
本発明の方法による生体外合成は、バッチ反応として反応器内で実行することができる。
【００３３】
本発明の方法による生体外合成は、また、連続的に、あるいは半連続的に実行することができる。
【００３４】
本発明による、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系の余分なＡＴＰ−スルフリラーゼは、原核生物、真核生物、遺伝子導入ベクター、遺伝子的に修正した細菌細胞、大腸菌抽出物から得ることができる、あるいは精製することができる。この抽出物は、ＡＴＰ−スルフリラーゼを表出するベクターで形質転換した細胞から準備することができる。
【００３５】
本発明の第一の実施例では、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、ＡＴＰ−スルフリラーゼ（余分なＡＴＰ−スルフリラーゼ）で富化した無細胞系を得るために無細胞系に添加する。特に、余分なＡＴＰ−スルフリラーゼは、無細胞抽出物に添加する。
【００３６】
余分なＡＴＰ−スルフリラーゼは、生体外合成の初めに、そして／あるいは途中で、無細胞系に添加することができる。ＡＴＰ−スルフリラーゼは、合成中に、時折添加することができる。
【００３７】
余分なＡＴＰ−スルフリラーゼは、生体外合成反応を始める前に無細胞系内に存在してもよい。例えば、余分なＡＴＰ−スルフリラーゼは、無細胞抽出物内に存在してもよい。
【００３８】
本発明の第二の実施例では、無細胞系は、ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで変質させた細胞から準備した無細胞抽出物からなる。
【００３９】
実際、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度は、実験条件に応じて、特に表出すべきタンパク質へ適合される。
【００４０】
ＡＰＳの有無にかかわらず、例えば、０．１から１０Ｕ／ｍｌの範囲でＡＴＰ−スルフリラーゼの滴定を行うことによって、無細胞系で最適なタンパク質表出に必要なＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度の最適化を達成することができる。リニアモードにおいて最大量のタンパク質生産、そしてより長期に渡るタンパク質表出をサポートする濃度は、これらの実験条件に最適化していると考えることができる。
【００４１】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物内に、初期濃度で少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌ存在するのが有利である。約０．５Ｕ／ｍｌであればより有利である。
【００４２】
本発明は、また、上記方法によって生物高分子の生体外合成を促進する、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系に関する。
【００４３】
本発明によるＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系は、主要なエネルギー源としてＡＴＰを必要とする生物高分子の生体外合成のための無細胞反応混合物を形成する。それは、ノバゲンあるいはインヴィトロゲン等の市販の無細胞反応混合物、または標準の、あるいは前記無細胞反応混合物に余分なＡＴＰ−スルフリラーゼを添加して改質したＳ３０抽出物から準備することができる。したがって、本発明は、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物からなる無細胞系に向けられる。
【００４４】
無細胞系は、さらに、外来のＡＰＳからなってもよい。それは、また、ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写とｍＲＮＡの翻訳とに必要なすべての物質からなることができる。
【００４５】
先に述べたように、本発明のＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物に存在する余分なＡＴＰ−スルフリラーゼは、原核生物、真核生物、遺伝子導入ベクター、遺伝的に修正した細菌細胞、大腸菌抽出物から得ることができる、あるいは精製することができる。
【００４６】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物は、ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から準備することができる。
【００４７】
ＡＴＰ−スルフリラーゼは、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの濃度で存在することが有利である。少なくとも約０．５Ｕ／ｍｌであればより好ましい。
【００４８】
本発明によるＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞系を準備することが可能な、ベースとなる無細胞系の一例は、
＊転写及び翻訳に必要な酵素及び要因を含む無細胞抽出物、
＊合成すべき高分子のモノマー（例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど）、
＊アセチル燐酸（ＡｃＰｈ）とアセテートキナーゼ、エノールピルビン酸二燐酸塩（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ、あるいはクレアチン燐酸（ＣｒＰｈ）とクレアチンキナーゼ等のエネルギー再生系、そして
＊最後に、例えば、ＤＮＡそして／あるいはｍＲＮＡなどの高分子の生産のためのテンプレートからなる。
【００４９】
このような無細胞系は、本技術では既知である（例えば、１９９９年のキガワ氏らの文献を参照）。
【００５０】
本発明では、無細胞系は、ＡＴＰ−スルフリラーゼでさらに強化される。
【００５１】
本発明は、また、ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した上記無細胞系によるＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物に関する。
【００５２】
本発明によるＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物を準備することが可能な、ベースとなる無細胞抽出物の一例は、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などの、細胞のタンパク質合成機構の酵素、因子及び成分からなる。
【００５３】
このような無細胞抽出物は、本技術では既知であり、文献が出ている（Zubay G et al.（1973）In
vitro synthesis of proteins in microbial system「微生物系におけるタンパク質の生体外合成」, Annu Rev Genet, 7: 267287; Roberts BE et al.（1973）Efficient translation of tobacco mosaic
virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat
germ「市販コムギ麦芽からの無細胞系での、タバコ・モザイク・ウイルスＲＮＡ及びウサギ・グロビン９ＳＲＮＡの効率的な翻訳」, Proc Natl Acad Sci USA, 70: 2330-2334; Pelham HRB et al.（1976）An efficient mRNA- dependent
translation system from reticulocyte lysates「網状赤血球溶解産物からの、効率的なｍＲＮＡ依存翻訳系」, Eur J Biochem, 67: 247-256; Shimizu Y. et al（2001）Cell-free translation reconstituted
with purified components「精製成分で再構成した無細胞翻訳」, Biotech.
Nature, 19, 751-755）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
次の例は、本発明を説明するもので、限定するものではない。
【００５５】
例１：インヴィトロゲンからの無細胞転写翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度に対するβ−ラクタマーゼの合成
【００５６】
ＡＴＰ−スルフリラーゼに依存する無機燐酸塩の利用及びＡＴＰ再生を用いる無細胞転写翻訳系のための５０μｌの標準反応混合物は、５０μｌ内に次の成分を含む。２５μｌのＩＶＰＳ大腸菌抽出物（インヴィトロゲン所有の組成、エクスプレスウェイ生体外タンパク質合成系大腸菌、カタログ番号１２３３３．０１９）、２０μｌの２．５ｘＩＶＰＳ大腸菌反応緩衝液（インヴィトロゲン所有の組成）、１μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（インヴィトロゲン所有の組成）、そしてβ−ラクタマーゼにコード化する０．１ｍｇ／ｍｌのＰＣＲ生成物。この反応では、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、１．２及び２．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。製造業者の使用説明書（インヴィトロゲン）に従って、３７℃にセットした水槽で２ｈ反応させた。β−ラクタマーゼ作用の検出を、オカラハン氏らが説明するようにニトロセフィン試験によって行った（O'Callaghan C. H., Morris S. M., Kirby S. M., Shingler A. H,
Antimicrob. Agents Chemother 1972, 1: 283-288）。無細胞転写翻訳反応混合物からの５０μｌを、６００倍に希釈して、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。β−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマ（Sigma）からのものである。
【００５７】
外来ＡＴＰ−スルフリラーゼの使用は、無機燐酸塩濃度に特に敏感なタンパク質の表出に重要であるように思われる。β−ラクタマーゼの最終産出量は、外来ＡＴＰ−スルフリラーゼを添加しないで実験を行ったものよりも少なくとも３倍高かった。
【００５８】
例２：ノバゲンからの大腸菌無細胞転写翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度に対するβ−ラクタマーゼの合成
【００５９】
ＡＴＰ−スルフリラーゼに依存する無機燐酸塩の利用とＡＴＰ再生とを用いる無細胞転写翻訳系のための標準反応混合物の５０μｌは、５０μｌ内に次の成分を含む。３５μｌのエコプロ（EcoPro）反応混合物x（ノバゲン所有の組成、導入エコプロＴ７系、カタログ番号７０８８８−３）、２μｌの５ｍＭメチオニン、そして０．１ｍｇ／ｍｌのＰＣＲ生成物あるいは０．１ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ（両方ともβ−ラクタマーゼにコード化する）。
【００６０】
この市販の抽出物内に、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、０．６、１．２、２．５、そして３．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。製造使用説明書（ノバゲン）に従って、３７℃にセットした水槽内で１ｈ反応させた。β−ラクタマーゼ作用の検出を、ニトロセフィン試験によって行った（図１参照）。ＰＣＲあるいはＤＮＡテンプレートに対するβ−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。無細胞転写翻訳反応混合物からの５０μｌを、２５倍に希釈して、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマからのものである。
【００６１】
添加したＡＴＰ−スルフリラーゼの、β−ラクタマーゼ表出レベルに対する効果は、衝撃的で、ノバゲンからの大腸菌無細胞転写翻訳系内にＡＴＰ−スルフリラーゼがないものよりも、少なくとも６倍高いレベルに到達する。
【００６２】
例３：キガワ氏らに従って構築した無細胞転写翻訳系内における、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如あるいは存在でのβ−ラクタマーゼの合成
【００６３】
キガワ氏が説明するような無細胞転写翻訳系のための５０μｌの標準反応混合物（Kigawa T., Yabuki T., Yoshida Y., Tsutsui M., Ito Y. , Shibata T.,
Yokoyama S: Cell-free production and stable-isotope labeling of milligram
quantities of proteins「無細胞生産と、ミリグラム量のタンパク質の安定同位体標識」,
FEBS Lett. 1999, 442: 15-19）。これは、クレアチン燐酸とクレアチンホスホキナーゼが６０ｍＭのアセチル燐酸によって置換されたものである。β−ラクタマーゼにコード化する０．１ｍｇ／ｍｌのＰＣＲ生成物あるいは０．１ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡで、転写翻訳反応を実行した。Ｓ３０抽出物内に、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、０．６、１．２、２．５、そして３．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。３０℃にセットした水槽内で３ｈ反応させた。無細胞転写翻訳反応混合物からの５０μｌを、６００倍に希釈して、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。ＰＣＲあるいはＤＮＡテンプレートに対するβ−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。
【００６４】
ズベイ（Zubay）氏の説明のようにＳ３０大腸菌抽出物を準備した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ハイベイド（Hybaid）からのもので、Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマからのものであった。
【００６５】
キガワ氏ら（１９９９）が説明するように準備した大腸菌無細胞転写翻訳系内へのＡＴＰ−スルフリラーゼの添加は、β−ラクタマーゼ表出レベルを２．５倍まで増加させる。これは、インヴィトロゲン混合物での結果に類似している。
【００６６】
下記の表１は、ＰＣＲテンプレートでプログラムした種々の転写翻訳無細胞系内へのＡＴＰ−ＳＦの添加による、β−ラクタマーゼ表出の刺激作用を報告する。
【００６７】
【表１】
2006500924.tif 000002
【００６８】
例４：キガワ氏らに類似させて構築した無細胞翻訳系内における、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如あるいは存在によるβ−ラクタマーゼの合成
【００６９】
１２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２及び０．２ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡと共に、キガワ氏（１９９９）が説明するような無細胞翻訳系のための５０μｌの標準反応混合物を用いた。クレアチン燐酸とクレアチンホスホキナーゼを、６０ｍＭのアセチル燐酸で置換した。Ｓ３０抽出物内に、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、０．５、１．０、そして２．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。３０℃にセットした水槽内で３ｈ反応させた。無細胞転写翻訳反応混合物からの５０μｌを、６００倍に希釈して、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。β−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。
【００７０】
ズベイ氏が説明するようにＳ３０大腸菌抽出物を準備した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ハイベイドからのもので、Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマからのものであった。
【００７１】
キガワ氏ら（１９９９）が説明するように準備した大腸菌無細胞転写翻訳系内へのＡＴＰ−スルフリラーゼの添加は、β−ラクタマーゼ表出レベルを３倍まで増加させる。これは、大腸菌転写翻訳系での結果に類似している。
【００７２】
例５：大腸菌無細胞翻訳系内における、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如あるいは存在によるβ−ラクタマーゼ合成の速度
【００７３】
キガワ氏（１９９９）が説明したような無細胞翻訳系のための５０μｌの標準反応混合物は、５０μ内に次の成分を含む。６０ｍＭのヘペスｐＨ８．２、１０ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２
、８０ｍＭのＮＨ４（ＯＡｃ）、１．２ｍＭのＡＴＰ、０．８ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、０．６４ｍＭのｃＡＭＰ、２００ｍＭのグルタミン酸カリウム、６０ｍＭのアセチル燐酸、３４μｇ／μｌのフォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ、１Ｕ / μｌのＴ７ポリメラーゼ、そして０．３ボリュームのＳ３０を用いた。
【００７４】
ズベイ氏ら（１９７３）が説明するように準備したＳ３０抽出物内に、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、１．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。３０℃にセットした水槽内で反応させた。異なる時点で無細胞転写翻訳反応混合物から取り出した５０μｌを、６００倍に希釈して、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。β−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。
【００７５】
Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマからのものであった。
【００７６】
下記の表２は、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如及び存在における、反応時間に対するβ−ラクタマーゼ相対作用（％）を報告する。
【００７７】
【表２】
2006500924.tif 000003
【００７８】
β−ラクタマーゼ無細胞合成の速度は、翻訳系温置３０分後に、タンパク質生産が３倍に増加するのを観察することができることを示す。
【００７９】
例６：大腸菌無細胞転写翻訳系における、Ｓ．セレビシエからのＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如及び存在でのβ−ラクタマーゼの合成
【００８０】
ＡＴＰ−スルフリラーゼに依存する無機燐酸塩の利用と、クレアチン燐酸とクレアチンホスホキナーゼが６０ｍＭのアセチル燐酸によって置換されたＡＴＰ再生とを用いる、キガワ氏（１９９９）が説明するような無細胞翻訳系のための５０μｌの標準反応混合物。反応混合物内に、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、１．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。３０℃にセットした水槽内で３ｈ反応させた。無細胞転写翻訳反応混合物から、異なる時点で５０μｌを分取し、６００倍に希釈して、それから、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。β−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。
【００８１】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ハイベイドからのもので、Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマからのものであった。
【００８２】
下記の表３は、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如及び存在での、反応時間に対するβ−ラクタマーゼ相対作用（％）を報告する。
【００８３】
【表３】
2006500924.tif 000004
【００８４】
これらの実験は、ＡＴＰ−スルフリラーゼがβ−ラクタマーゼ合成に効果があることを示す。実に、反応１時間後のβ−ラクタマーゼ生産量は、ＡＴＰ−スルフリラーゼなしに得たものよりも、少なくとも２倍大きかった。
【００８５】
例７：枯草菌無細胞翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼがある場合とない場合のβ−ラクタマーゼの合成
【００８６】
チャンブリス（Chambliss）氏ら（１９８３）が説明するように準備した０．３ボリュームのＳ３０抽出物と共に、主にキガワ氏（１９９９）が説明するような、ＡＴＰ−スルフリラーゼに依存する無機燐酸塩の利用とＡＴＰ再生を用いる無細胞翻訳系のための５０μｌの標準反応混合物。修正無細胞翻訳系は、１０ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、５０ｍＭのアセチル燐酸、そして０．２ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡを含む。Ｓ３０抽出物内に、ＡＴＰ−スルフリラーゼを、１Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。３０℃にセットした水槽内で３ｈ反応させた。無細胞転写翻訳反応混合物から、異なる時点で５０μｌを分取し、５００倍に希釈して、マイクロ滴定プレートの溜め内で１５０μｌのニトロセフィン（１６μｇ／ｍｌ）と混合し、そして４８６ｎｍでＯＤを計測した。β−ラクタマーゼ表出の最高値を１００％に設定する。
【００８７】
Ｓ．セレビシエＡＴＰ−スルフリラーゼは、シグマからのものであった。
【００８８】
下記の表４は、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如及び存在での、枯草菌抽出物に基づく無細胞翻訳系におけるβ−ラクタマーゼ相対作用（％）を報告する。
【００８９】
【表４】
2006500924.tif 000005
【００９０】
ＡＴＰ−スルフリラーゼの存在で、枯草菌転写翻訳系におけるβ−ラクタマーゼの生産量は、ＡＴＰ−スルフリラーゼがない場合と比較して２．５倍までに増加した。この効果は、３０分温置後に観察した。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】インヴィトロゲン（Invitrogen）の大腸菌無細胞転写翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度に対するβ−ラクタマーゼの合成を示す。
【図２】ノバゲン（Novagen）の大腸菌無細胞転写翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度に対するβ−ラクタマーゼの合成を示す。
【図３】主にキガワ（Kigawa）氏ら（１９９９）に従って構築した大腸菌Ｓ３０抽出物に基づく無細胞転写翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度に対するβ−ラクタマーゼの合成を示す。
【図４】主にキガワ（Kigawa）氏ら（１９９９）に従って構築した大腸菌Ｓ３０抽出物に基づく無細胞翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度に対するβ−ラクタマーゼの合成を示す。
【図５】大腸菌Ｓ３０抽出物に基づく無細胞翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如あるいは存在に対するβ−ラクタマーゼの合成速度を示す。
【図６】大腸菌Ｓ３０抽出物に基づく無細胞転写翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如あるいは存在に対するβ−ラクタマーゼの合成速度を示す。
【図７】枯草菌無細胞翻訳系における、ＡＴＰ−スルフリラーゼの欠如あるいは存在に対するβ−ラクタマーゼの合成を示す。
【図１】
2006500924.tif 000006
【図２】
2006500924.tif 000007
【図３】
2006500924.tif 000008
【図４】
2006500924.tif 000009
【図５】
2006500924.tif 000010
【図６】
2006500924.tif 000011
【図７】
2006500924.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月4日(2004.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要なエネルギー源としてＡＴＰを必要とする、内生のアデノシン５’−ホスホ硫酸を含む無細胞系における、タンパク質の、そしてそれらの断片の生体外合成を増強するための方法であって、前記無細胞系がＡＴＰ−スルフリラーゼで強化されている、方法。
【請求項２】
前記無細胞系が、外来のアデノシン５’−ホスホ硫酸からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体外合成が、また、ＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写からなる、請求項１あるいは２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体外合成が、バッチ反応として反応器内で、半連続的に、あるいは連続的に実行される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記無細胞系へ、ＡＴＰ−スルフリラーゼが、前記生体外合成の始めに、そして／あるいは前記生体外合成中に添加される、あるいは前記生体外合成中に時折添加される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記無細胞系が、ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から準備した無細胞抽出物からなる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＡＴＰ−スルフリラーゼ濃度が、実験条件と、合成すべき生物高分子とに応じて適合される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記無細胞系内にＡＴＰ−スルフリラーゼが、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの初期濃度で存在する、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した所望のタンパク質をコード化する伝令リボ核酸の翻訳が可能な成分を含む無細胞系。
【請求項１０】
外来のアデノシン５’−ホスホ硫酸からなる、請求項９に記載の無細胞系。
【請求項１１】
ｍＲＮＡの翻訳、そしてＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写に必要なすべての物質からなる、請求項９あるいは１０に記載の無細胞系。
【請求項１２】
余分なＡＴＰ−スルフリラーゼが、原核生物、真核生物、遺伝子導入ベクター、遺伝的に修正した細菌細胞、大腸菌抽出物から得られる、あるいは精製される、請求項９から１１のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項１３】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した無細胞抽出物が、ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から準備される、請求項９から１２のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項１４】
ＡＴＰ−スルフリラーゼが、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する、請求項９から１３のいずれかに記載の無細胞系。
【請求項１５】
ＡＴＰ−スルフリラーゼで富化した所望のタンパク質をコード化する伝令リボ核酸の翻訳が可能な成分を含む無細胞抽出物。
【請求項１６】
外来のアデノシン５’−ホスホ硫酸からなる、請求項１５に記載の無細胞抽出物。
【請求項１７】
ｍＲＮＡの翻訳、そしてＤＮＡテンプレートからのｍＲＮＡの転写に必要なすべての物質からなる、請求項１５あるいは１６に記載の無細胞抽出物。
【請求項１８】
余分なＡＴＰ−スルフリラーゼが、原核生物、真核生物、遺伝子導入ベクター、遺伝的に修正した細菌細胞、大腸菌抽出物から得られる、あるいは精製される、請求項１５から１７のいずれかに記載の無細胞抽出物。
【請求項１９】
ＡＴＰ−スルフリラーゼを過度に表出するベクターで形質転換した細胞から準備した、請求項１５から１８のいずれかに記載の無細胞抽出物。
【請求項２０】
ＡＴＰ−スルフリラーゼが、少なくとも約０．１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１５から１９のいずれかに記載の無細胞抽出物。
【国際調査報告】
2006500924.tif 000013
2006500924.tif 000014