(57)【要約】本発明は、核酸の抽出のために生物学的試料を前処理するための方法に関する。本発明は、以下の要素の１つまたは複数と、少なくとも１つのタンパク質変性剤の組合せを採用して、核酸の抽出のための反応混合物を形成する：（１）少なくとも１つの非プロトン性溶剤、（２）段階的加熱、および（３）試料希釈。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのタンパク質変性剤および少なくとも１つの非プロトン性溶媒で試料を処理することを含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理する方法。
【請求項２】
該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、塩基、タンパク質を変性させる塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該タンパク質変性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ＮＰ−４０、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート、およびポリエチレングリコールｔ−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される洗剤であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該タンパク質変性剤が界面活性剤であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該タンパク質変性剤が、フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコールからなる群から選択される溶剤であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
該タンパク質変性剤が、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−ブチルアセトアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選択されるアミドであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
該タンパク質変性剤が、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、およびジチオトレイトールからなる群から選択される還元剤であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
該タンパク質変性剤がＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、およびＣａ（ＯＨ）2からなる群から選択される塩基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
該タンパク質変性剤がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4、および過塩素酸塩からなる群から選択される、タンパク質を変性させる塩であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該方法が約４℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該方法が約２５℃から約９５℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該方法が約６５℃から約８５℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該方法が約５５℃から約８５℃の温度範囲で段階的に加熱することによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該プロテイナーゼＫの濃度が生物学的試料のミリリットルあたり約１から約１００単位であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
該生物学的試料が希釈または濃縮されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ホルムアミドの濃度が約１０体積％から約８０体積％であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
該核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
試薬はタンパク質変性剤および非プロトン性溶媒の両方であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該方法が、処理された試料を希釈剤で希釈することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該希釈剤が、水、水性緩衝液、および非プロトン性溶媒からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該方法が約４℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該方法が約２５℃から約９５℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該方法が固体担体の存在をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
該固体担体が、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マット、ガラス膜、ガラス類、ゼオライト、およびセラミックスからなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料を少なくとも１つのタンパク質変性剤と混合すること、および混合物を段階的に加熱することを含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理する方法。
【請求項３０】
該段階的加熱が約５５℃から約８５℃の温度範囲であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
試料を少なくとも１つのタンパク質変性剤で処理して反応混合物を形成すること、および該反応混合物を希釈剤で希釈することを含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理する方法。
【請求項３２】
該希釈剤が、水、水性緩衝液、および非プロトン性溶媒からなる群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該方法が約４℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
該方法が約２５℃から約９５℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのタンパク質変性剤および少なくとも１つの非プロトン性溶媒を含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理するための反応混合物。
【請求項３６】
該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、塩基、タンパク質を変性させる塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とすることを特徴とする請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項３７】
該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とすることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項３８】
該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫであることを特徴とすることを特徴とする請求項３７に記載の反応混合物。
【請求項３９】
該タンパク質変性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ＮＰ−４０、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート、およびポリエチレングリコールｔ−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される洗剤であることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４０】
該タンパク質変性剤が界面活性剤であることを特徴とすることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４１】
該タンパク質変性剤が、フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコールからなる群から選択される溶剤であることを特徴とすることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４２】
該タンパク質変性剤が、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−ブチルアセトアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドからなる群から選択されるアミドであることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４３】
該タンパク質変性剤が、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、およびジチオトレイトールからなる群から選択される還元剤であることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４４】
該タンパク質変性剤が、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、および（ＣａＯＨ）2からなる群から選択される塩基であることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４５】
該タンパク質変性剤が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4、および過塩素酸塩からなる群から選択される、タンパク質を変性させる塩であることを特徴とする請求項３６に記載の反応混合物。
【請求項４６】
該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサンおよびｎ−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項４７】
該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項４６に記載の反応混合物。
【請求項４８】
該処理が約４℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項４９】
該処理が約２５℃から約９５℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項４８に記載の反応混合物。
【請求項５０】
該処理が約７０℃から約８５℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項５１】
該処理が、約５５℃から約８５℃の温度範囲で段階的に加熱することによって行われることを特徴とする請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項５２】
該プロテイナーゼＫの濃度が、生物学的試料のミリリットルあたり約１から約１００単位であることを特徴とする請求項３８に記載の反応混合物。
【請求項５３】
該ホルムアミドの濃度が、約１０体積％から約８０体積％であることを特徴とする請求項４７に記載の反応混合物。
【請求項５４】
固体担体をさらに含むことを特徴とする、請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項５５】
該固体担体が、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マット、ガラス膜、ガラス類、ゼオライト、およびセラミックスからなる群から選択されることを特徴とする請求項５４に記載の反応混合物。
【請求項５６】
少なくとも１つのタンパク質変性剤および少なくとも１つの非プロトン性溶媒を含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理するためのキット。
【請求項５７】
該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、タンパク質を変性させる塩、塩基類、およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫであることを特徴とする請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサンおよびｎ−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項５６に記載のキット。
【請求項６１】
該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
固体担体をさらに含むことを特徴とする請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
該固体担体が、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マット、ガラス膜、ガラス類、ゼオライト、およびセラミックスからなる群から選択されることを特徴とする請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
少なくとも１つのタンパク質変性剤および少なくとも１つの非プロトン性溶媒で試料を処理することによって抽出されることを特徴とする、生物学的試料から抽出される核酸。
【請求項６５】
該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、塩基、タンパク質を変性させる塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項６４に記載の核酸。
【請求項６６】
該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項６５に記載の核酸。
【請求項６７】
該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫであることを特徴とする請求項６６に記載の核酸。
【請求項６８】
該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサンおよびｎ−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項６４に記載の核酸。
【請求項６９】
該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項６８に記載の核酸。
【請求項７０】
該核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項６４に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析のための、血漿および血液試料のような生物学的試料を処理する方法に関する。より具体的には、本発明は、ハイブリダイゼーション、増幅および検出のような、後続の核酸解析と適合する生物学的試料の処理加工方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の同定のための核酸に基づく遺伝学的な方法は、臨床診断に関与する時間および労力を大いに削減してきている。そのような方法は、例えば、核酸ハイブリダイゼーション（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｓ／マイクロアレイおよびスロット−ブロット）、ヌクレオチド配列決定、核酸クローニング技術、核酸の制限消化、および核酸増幅を含む。特に、核酸増幅は、特異的遺伝子または遺伝子断片の増幅および検出による微生物の迅速、高感度および特異的な同定のための手段を提供している。診断方法としての使用のためには、これらの核酸分析を血漿および全血試料のような生物学的試料に適用することが特に興味深い。微生物の検出および同定のための核酸に基づく方法の有用性に先立ち、血液培養することによって微生物の存在に関して血漿および血液試料を分析した。しかしながら、核酸分析のための臨床試料の処理加工は、培養のための試料処理加工とは異なる基準を要する。例えば、核酸は、分析のために適当な形態で微生物から放出されなければならず；核酸は、分析の生化学的反応のために好適な成分、イオン強度、およびｐＨを有する組成物中に存在しなければならず；および、ヌクレアーゼのような反応の阻害剤が臨床試料中に存在するか、あるいは試料処理加工の間に導入される場合には、該阻害剤を取り除くかまたは非阻害性にしなければならない。
【０００３】
１つの潜在的な生化学的検出方法は、核酸ハイブリダイゼーションの使用を含む。核酸中に具現化される配列特異性は、核酸ハイブリダイゼーションによって、事実上任意の２つの種を差別化することを可能にする。特定ヌクレオチド配列の検出のための標準的な技術は、一般的に、細胞タンパク質および他の細胞汚染物質から分離して精製された核酸を用いる。精製の最も一般的な方法は、細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で溶解すること、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）で消化すること、および、フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコールのような有機溶剤で抽出することによって残留するタンパク質および他の分子を取り除くことを含む。
【０００４】
細胞可溶化の間に放出される内因性のヌクレアーゼは、無傷の核酸、特にリボ核酸（ＲＮＡ）を回収するための努力を無効にする可能性がある。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）は、溶解溶液（lysis solution）に対するキレート剤の添加によって容易に不活性化される一方で、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）は、除去することがはるかに困難である。ＲＮアーゼは遍在し、人間の手の上に見つけられる油の中にさえ存在する。従って、ＲＮアーゼから保護することは、あらゆる標準的なＲＮＡ調製技術の一般的に広く認められた局面である。膵臓のＲＮアーゼ実験用ストックを調製するための標準的な手順は、酵素の溶液を１５分間煮沸することである。この処理の目的は、全ての痕跡量の汚染酵素の活性を破壊することである。なぜならば、他の酵素は煮沸すると生き残れないからである。
【０００５】
非特許文献１（一般的に模範とされる実験操作の概説）は、実験室におけるＲＮアーゼ汚染を避けるために、幅広い予防策を推奨する（非特許文献１参照）。そのような予防策は、ＲＮアーゼを含まないガラス製品、加圧滅菌された水、および、焼いたスパチュラで排他的に分配される、ＲＮＡを伴う作業用に確保された薬品を用いて、ＲＮＡと接触する全ての溶液を調製することを含む。実験用試薬からＲＮアーゼを除去することに加えて、典型的には、ＲＮアーゼ阻害剤を溶解溶液中に含ませる。これらは、一般的に細胞溶解の間に活性化される、内因性のＲＮアーゼを破壊することを意図する。また、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）処理された水にＲＮＡを可溶化することは、一般的な操作である。さらに、ＲＮＡ試料の取り扱いを改善するための試みにおいて、ＲＮＡの長期貯蔵のための可溶化剤として、ホルムアミドがテストされてきている（非特許文献２参照）。
【０００６】
ＲＮアーゼから保護することは、厄介でかつ費用がかかり、および典型的な抽出手順は、苛性溶剤の取り扱い、水浴へのアクセス、換気フード、および遠心分離機、および有害廃棄物の貯蔵および処分までもを必要とする。未分画（unfractionated）の可溶化された生物学的試料の直接分析は、これらの精製技術の費用および不都合を回避するであろう。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，９７３，１３８号明細書
【非特許文献１】Molecular Cloning、第３版(2001)、Sambrookら
【非特許文献２】Nucleic Acids Research 20、3791-3792 (1992)、P. Chomczynski
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述を考慮すると、血漿および血液のような生物学的試料を分析用核酸の抽出のために処理することができる、簡単かつ迅速な方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、血漿および血液のような生物学的試料を、核酸の抽出のために処理する簡単かつ迅速な方法の必要性に取り組む。１つの実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料を少なくとも１つのタンパク質変性剤と混合すること、および混合物を約５５℃から約８５℃までの温度範囲で段階的に加熱して反応混合物を形成することによって、核酸の抽出のための生物学的試料を前処理する。別の実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料を約５５℃から約８５℃までの温度範囲で少なくとも１つのタンパク質変性剤と混合して反応混合物を形成すること、および該反応混合物を水溶液または非プロトン性溶媒で希釈することによって、生物学的試料を前処理する。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、約４℃以上において、少なくとも１つのタンパク質変性剤および少なくとも１つの非プロトン性溶媒で試料を処理して核酸分析のための反応混合物を形成することによって、核酸の抽出のための生物学的試料を前処理する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、約２５℃以上において、少なくとも１つのタンパク質変性剤および少なくとも１つの非プロトン性溶媒で試料を処理することによって、生物学的試料を前処理する。本発明の例示的な実施形態では、タンパク質変性剤としてＰｒｏＫを使用し、非プロトン性溶媒としてホルムアミドを使用し、および約５５℃から約８５℃の範囲の温度で約３０分間にわたって処理を実施する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
また、本明細書中で使用される際に、用語「精製する」および「精製」は、抽出する／抽出および単離する／単離を含む。
【００１１】
本発明は、核酸の抽出のために生物学的試料（例えば、血漿および全血試料のようなもの、しかしそれらに限定されるものではない）を処理する組成物および方法である。本発明は、以下の要素のうち１つまたは複数と、少なくとも１つのタンパク質変性剤の組合せを採用して、核酸の抽出のための反応混合物を形成する：（１）少なくとも１つの非プロトン性溶媒、（２）段階的加熱、および（３）試料希釈。
【００１２】
本発明に従って使用される生物学的試料は、核酸を含有する任意の生物学的材料であってもよく、該材料は、例えば、臨床試料、法医学的試料、または環境試料のようなものであるが、それらに限定されるものではない。これらの試料は、原核細胞および真核細胞、ウィルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、および細胞小器官を含む任意のウィルス性材料または細胞性材料を含有してもよい。そのような生物学的材料は、哺乳類および非哺乳類の動物細胞、植物細胞、ラン藻を含む藻類、菌類、バクテリア、酵母菌および原生動物の全タイプを含んでもよい。代表的な例は、血液、ならびに全血、血漿および血清のような血液由来製剤；精液、尿、糞便、痰、組織、細胞培養物および細胞浮遊液、鼻咽頭の吸引物、および頸管内、膣、眼、咽喉および口腔の綿棒採集標本を含む綿棒採集標本のような臨床標本；および指爪、皮膚、毛および脳脊髄液または他の体液のような他の生物学的試料を含む。
【００１３】
少なくとも１つのタンパク質変性剤は、単独で、または他のタンパク質変性剤および／または非プロトン性溶媒と組み合わされた時に、タンパク質の膜または細胞の壁、ビリオン、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼを破壊し、タンパク質変性と有機体溶解とをもたらし、および生物学的試料の中の核酸を放出させる能力がある試薬である。タンパク質変性剤は、当技術分野においてよく知られており、および既知の業者から購入しても、あるいはよく知られた標準的な技術を用いて調製してもよい。本発明において有用であるタンパク質変性剤は、ＰｒｏＫ、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼおよびエラスターゼのようなタンパク質分解酵素；ＳＤＳ、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（すなわち、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート（すなわち、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ＮＰ−４０、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェニルエーテル（すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のようなＴｒｉｔｏｎ  Ｘの洗剤）のような、アニオン性、非イオン性、および両性の洗剤；サーファクチンのような界面活性剤；フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコールのような溶剤；Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−ブチルアセトアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドのようなアミド類；グルタチオン、β−メルカプトエタノール、およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤；ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4および過塩素酸塩のような、タンパク質を変性させる塩；およびＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨおよびＣａ（ＯＨ）2のようなｐＨの上昇をもたらす薬剤を含む。一般的に、タンパク質分解酵素はタンパク質変性剤として好ましく、およびＰｒｏＫはそのようなタンパク質分解酵素の好例である。本発明の方法における任意のタンパク質変性剤の有用性を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認するだろう。
【００１４】
本発明の方法において使用される場合、タンパク質変性剤の濃度は、他の薬剤および条件に依存して変動しうるが、しかし、他のタンパク質変性剤および／または非プロトン性溶媒の存在下で、タンパク質の膜または細胞の壁、ビリオン、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼを破壊して、タンパク質変性および有機体溶解をもたらし、および生物学的試料の中の核酸を放出するために十分である。タンパク質変性剤のこの濃度を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に決定することができる。タンパク質変性剤としてＰｒｏＫを少なくとも１つの非プロトン性溶媒とともに使用する場合、ＰｒｏＫの望ましい濃度は、生物学的試料のタンパク質含有量に依存する。たいていの生物学的試料に関して、それは、生物学的試料のミリリットルあたり約１から約１００単位の範囲である。しかしながら、いくつかの生物学的試料は、その最適濃度範囲、すなわち生物学的試料のミリリットルあたり約１から約１００単位でＰｒｏＫを使用するために、前処理の前に希釈または濃縮を必要とする可能性がある。タンパク質変性剤として塩基または塩を使用する場合、たいていの生物学的試料に関して、塩基または塩の濃度は、約１０から約４００ｍＭの範囲、より好ましくは約８０から約２２０ｍＭ、および最も好ましくは約１００ｍＭである。タンパク質変性剤として洗剤を使用する場合、たいていの生物学的試料に関して、洗剤の濃度は、約０．０５％から約８．０％の範囲、より好ましくは約０．０５％から約４％、および最も好ましくは約１％である。
【００１５】
本発明に従って、前処理のために２つ以上のタンパク質変性剤を利用することができる。同タイプまたは異なるタイプのタンパク質変性剤の組合せは、核酸の抽出のための生物学的試料の前処理にさらなる利点を提供する。当業者は、本発明の方法において混合されるタンパク質変性剤の濃度を、同様に、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認できる。
【００１６】
１つの実施形態では、タンパク質変性剤とともに、１つまたは複数の非プロトン性溶媒を利用する。使用される非プロトン性溶媒は、イオン−双極子力の形成を可能にする永久双極子または誘導双極子のために、イオン性物質を溶解することができる。非プロトン性溶媒は、アニオンと不安定な水素結合を形成するのに適当な水素原子を供与しない。荷電した求核試薬でのＳＮ２機構による求核置換は、多くの場合、非プロトン性溶媒中で、より速い。
【００１７】
双極性非プロトン性溶媒は、例えば約１５を超える比較的高い比誘電率（または誘電率）、および双極子モーメントを持つ溶剤である。しかしながら、より一般的な極性溶剤である水とは異なり、非プロトン性溶媒は、イオン化して水素イオンを形成することが無く、そのことが利点を与える。
【００１８】
本発明において有用な非プロトン性溶媒は、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン、二酸化硫黄、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、および、標的核酸を変性および可溶化するために使用することができる他の非水媒体を含む。ホルムアミドは、好ましい非プロトン性溶媒である。そのような非プロトン性溶媒は、当技術分野においてよく知られており、および既知の業者から購入してもよく、またはよく知られた標準的な技術を用いて合成してもよい。本発明の方法における任意の非プロトン性溶媒の有用性を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認するだろう。
【００１９】
本発明の方法において使用される場合、非プロトン性溶媒の濃度は、他の薬剤および条件に依存して変動しうるが、しかし、必要とされる温度および少なくとも１つのタンパク質変性剤の存在下で、核酸を溶液中に維持することによって核酸を保護するために十分である。当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して、この濃度を容易に決定することができる。ホルムアミドが本発明の方法において使用される非プロトン性溶媒である場合、たいていの生物学的試料に関して、ホルムアミドの濃度は、好ましくは反応混合物の約１０体積％から約８０体積％の範囲、より好ましくは約２０体積％から約４０体積％、および最も好ましくは、約３０体積％である。
【００２０】
本発明に従って、前処理のために２つ以上の非プロトン性溶媒を利用することができる。異なる非プロトン性溶媒の組合せは、核酸の抽出のための生物学的試料の前処理にさらなる利点を提供する。本発明の方法において混合される非プロトン性溶媒の濃度を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認できる。
【００２１】
本発明の方法を実施する温度は、一般的には約４℃以上、好ましくは約２５℃以上とされる。より好ましい範囲は、約５５℃から約９５℃である。さらにより好ましい温度の範囲は、約６５℃から約８５℃である。最も好ましい温度は、約７０℃である。本発明の方法において、高温はタンパク質の変性に寄与すると考えられる。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、生物学的試料からの核酸の抽出のために、単独の、または少なくとも１つの非プロトン性溶媒と組合せられる少なくとも１つのタンパク質変性剤とともに、段階的加熱を利用する。段階的加熱は、生物学的試料からの核酸の抽出のために、処理温度を２以上の段階によって体系的に増加または減少させる加熱手順である。例えば、タンパク質分解酵素ＰｒｏＫを用いるタンパク質変性および核酸抽出に関して、５５℃および８５℃の各々の処理温度における２０分間の処理を利用する。段階的加熱は、改善された核酸抽出の回収を示している。本発明の方法における加熱工程の温度範囲および継続時間を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認できる。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、単独の、または少なくとも１つの非プロトン性溶媒を伴う少なくとも１つのタンパク質変性剤とともに、水溶液または非プロトン性溶媒による試料希釈を利用する。水溶液は、水または約３．０から約１０．０の間のｐＨ値を持つ任意の緩衝液であることができる。試料希釈は改善された核酸抽出の回収を示している。希釈工程は、溶液中に核酸を維持すると同時に、さらなるタンパク質の変性および／または沈降を引き起こす。通常、希釈ファクター（反応混合物／希釈剤）は、試料、希釈剤、および処理条件に依存して、４：１と１：１０との間である。本発明の方法における使用のための希釈剤および希釈ファクターの選択を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に決定することができる。
【００２４】
本発明のさらに別の態様は、核酸の抽出のために生物学的試料を処理するためのキットを提供することであり、該キットは、本明細書に記載されるように、１つまたは複数の非プロトン性溶媒とともに、または伴わずに、少なくとも１つのタンパク質変性剤を含む。キットは、本明細書に記載されるような水および緩衝液に加えて、核酸精製のための酸化鉄または他の固体担体を含有してもよく、これらは他の場所に、より詳細に記載される。また、キットは、生物学的試料を処理加工および分析するために、以下の品目の１つまたは複数を含有してもよい：綿棒、管、およびピペットのような採集道具；対照標準；ｐＨ指示薬；および体温計。キットは、本発明に従って方法を実施するために適当な比率で混合される試薬の容器を含んでもよい。試薬容器は、好ましくは、対象の方法を実施するときに計量工程を不要にする単位量で試薬を含有する。
【００２５】
また、本発明は、反応混合物ばかりでなく、反応混合物から核酸を抽出する方法も含む。反応混合物は、１つまたは複数の非プロトン性溶媒とともに、または伴わずに、少なくとも１つのタンパク質変性剤を含む。反応混合物は、いくつかの実施形態において、核酸を精製および検出するために対象の反応混合物とともに使用される様々な試薬（緩衝液および核酸精製のための酸化鉄または他の固体担体のようなもの）を含んでもよい。
【００２６】
ここで、特定の実施例を介して、本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は、例示の目的で提供され、およびいかなる意味においても本発明を限定することを意図しない。これらの実施例において、参照によって本明細書中に組み込まれる特許文献１に開示されるように、本発明に従って無傷の核酸の抽出のための試料を処理することから生じる反応混合物からの核酸単離のために、酸性環境における常磁性粒子上の核酸分子の可逆的結合を使用する（特許文献１参照）。結合ｐＨは、好ましくは約１から約６．５、より好ましくは約１から約４、および最も好ましくは約２である。溶離ｐＨは、好ましくは約６．５から約１２、より好ましくは約７．５から約１１、および最も好ましくは約８である。常磁性酸化鉄テクノロジーは、非特異的、すなわち配列とは無関係に、核酸を捕捉する。特異的および非特異的捕捉の両方を代表する、現在市場に出回っているいくつかの他の自動化された核酸抽出テクノロジーがある。最も注目すべき非特異的捕捉システムは、Ｒｏｃｈｅ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣおよびＯｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓを含み、その両方が磁性シリカ粒子を利用する。Ｑｉａｇｅｎ  ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６０４は、シリカ膜を包含する。Ｒｏｃｈｅ  ＡｍｐｌｉＰｒｅｐは、ストレプトアビジンで被覆された磁性粒子およびビオチン化捕捉プローブで、標的を特異的に捕捉する。ＧｅｎＰｒｏｂｅ’ｓ  Ｔｉｇｒｉｓシステムは、オリゴヌクレオチドで被覆された磁性粒子を利用すると思われる。また、さらに、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マット、ガラス膜、および他のガラス類、ゼオライト、およびセラミックスのような材料を、核酸抽出のための固相結合表面として使用することができる。要約すれば、液体および固体の相分離を含む、当技術分野において知られている核酸単離および精製のための任意の慣用の有効な技術を、本発明の前処理プロセスに続いて核酸の単離および精製のために利用することができる。あるいはまた、当技術分野において知られている核酸単離および精製のための慣用の有効な技術の存在下または非存在下で前処理プロセスを実施してもよい。
【００２７】
また、これらの実施例において、標的核酸配列の増幅および検出のために、本発明の抽出プロセスおよび任意の好適な単離または精製工程に続いて、鎖置換増幅（ＳＤＡ）を利用する。ＳＤＡ法は、最初に、一本鎖標的配列を、核酸ポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、および標的断片の３’末端における領域に対して相補的である少なくとも１つのプライマー（各プライマーは５’末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列である配列を有する）と混合し、および、次いで、混合物を、反応生成物を生成するために十分な時間にわたって反応させることを含む。核酸がＲＮＡを含む場合、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに転換させることが好ましい。しかしながら、本発明はＳＤＡ検出に限定されず、および、検出のために、本発明の前処理プロセスに続いてハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような多くの慣用および有効な検出技術を使用してもよい。
【００２８】
以下の実施例は、核酸抽出のための全血および血漿試料を前処理するための本発明の前処理プロセスの有効性を説明する。全血および血漿は、その高度なタンパク質含有量のために、核酸抽出のための最も手腕を問われる試料のうちの一つである；従って、本発明の方法は、他の生物学的試料のためにも同様に有効であると予想される。代表的な例を、本明細書中に論じる。
【実施例１】
【００２９】
多様な温度における血漿前処理の評価
本発明のＰｒｏＫ血漿前処理方法の間の温度がＲＮＡの抽出に与える効果を評価するために、本実験を設計した。酸化鉄を用いて試料からＲＮＡを抽出した。
【００３０】
最初に、４０ｍｇの酸化鉄と１２００μｌの３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）とを、８本の２ｍｌポリプロピレン管の中へ分配した。６本の管にＥＤＴＡで抗凝固された血漿（６００μｌ）を加え、および残りの２本の管に６００μｌの３０ｍＭのＫＰＢを加えた。次いで、各管に３単位のＰｒｏＫを加え、および管を混合した。ＫＰＢを含有する２本の管および血漿を含有する管のうちの２本を、室温で２０分間にわたりインキュベートした。血漿を含有する２本の管を３７℃で２０分間にわたりインキュベートし、および血漿を含有する２本の管を５２℃で２０分間にわたりインキュベートした。インキュベーションに続いて、各管に、１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌ、１μｇのキャリアＲＮＡ、および５０００のＨＩＶ生体外転写物を加えた。次いで、管の反対側に配置された電磁石を交互に電源オンオフすることによって、１５分間にわたって管を混合した。これは、溶液の端から端まで前後に酸化鉄粒子を引き寄せることによって試料を混合した。次いで、電磁石を電源オンすることによって、酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定した。次いで、各管からの非結合試料を吸引によって除去した。次いで、２ｍｌの９０ｍＭのグリシン／ＨＣｌで粒子を２回洗浄した。次いで、上述のように、各管を混合し、粒子を側面に固定し、および流体を吸引によって除去した。各管において、４５ｍＭのＫＯＨ、９０ｍＭのビシンおよび２０ｍＭのＫＰＯ4から成る０．４ｍｌの溶離緩衝液を加え、および管を混合することによって、酸化鉄から試料を溶離した。溶離に続いて、酸化鉄粒子を側面に磁気的に固定し、および試料を新しい管の中へ吸引することによって、溶離剤を新しい管に移動させた。次に、各管に１μｇの酵母菌キャリアＲＮＡを加えた。次いで、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）−ＳＤＡ分析システムを用いるＳＤＡによって、溶離された試料を分析した。結果は以下のとおりであった：
【００３１】
【表１】
2006517298.tif 000002
【００３２】
様々な温度におけるシグナル応答は、５２℃もの温度においてＰｒｏＫで血漿を前処理したときのＲＮＡ標的の回収を示唆する。
【実施例２】
【００３３】
高いＰｒｏＫ濃度および温度における血漿前処理の評価
以下の実験は、多様なＰｒｏＫ濃度および高温の血漿前処理がＲＮＡの抽出に与える効果を試験した。酸化鉄を用いて試料を抽出した。
【００３４】
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）製のＰＰＴ（商標）管に採集されたＥＤＴＡで抗凝固された血漿（６００μｌ）を、４０〜４５ｍｇの酸化鉄を各々含有する新しい管に移動させた。移動に続いて、各々の管に２２０μｌの３０ｍＭのＫＰＢを加えた。次に、それらの管に３、６または９単位のＰｒｏＫを加え、および、次いで、５５℃、６５℃、または７５℃の水浴中で２０分間にわたり管をインキュベートした。インキュベーションに続いて、各管に１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、およびピペットで上下に吸引することによって管を混合した。各管に酵母菌キャリアＲＮＡ（濃度１０μｇ／ｍｌの１０μｌ）を加えた。次いで、６μｌの１０7コピー／ｍｌのＨＩＶ−ＲＮＡ生体外転写物で試料をスパイクした。１回につき８００μｌを吸引および分配し、２４回繰り返すことによって、試料を混合した。次いで、混合に続いて、実施例１に記載されるように、すなわち、酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を新しい管の中へ吸引することによって、試料を抽出した。１ｍｌの８６ｍＭのグリシン／ＨＣｌで、８００μｌを計１２回吸引および分配し、管の側面に酸化鉄粒子を固定し、および流体を管から吸引することによって、粒子を２回洗浄した。次いで、各管に、９０ｍＭのビシン、５０ｍＭのＫＯＨ、および２０ｍＭのＫＰＯ4から成る０．４ｍｌの溶離緩衝液を加え、３００μｌを１２回、吸引および分配することによって混合することにより、試料を酸化鉄から溶離した。溶離に続いて、各管に１０マイクロリットルの酵母菌キャリアＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。次いで、管を６０℃に加熱し、その間、管の反対側に配置された電磁石を交互にオンオフすることによって２０分間にわたって磁気的混合にさらした。これは、溶液の端から端まで前後に酸化鉄粒子を引き寄せることによって試料を混合した。実施例１に記載されるように、すなわち、酸化鉄粒子を側面に磁気的に固定し、および試料を新しい管の中へ吸引することによって試料を混合することにより、溶離された試料を新しい管に移動させ、およびＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）−ＳＤＡ分析システムを用いるＳＤＡによって分析した。結果は以下のとおりである：
【００３５】
【表２】
2006517298.tif 000003
【００３６】
結果は、テストした温度範囲（５５℃から７５℃）全体にわたって、６〜９単位のＰｒｏＫでの血漿の前処理が標的回収をもたらすことを実証する。さらに、温度とＰｒｏＫの量との間の相関は、テストしたＰｒｏＫの範囲（３〜９単位のＰｒｏＫ）全体にわたって、より高温で標的回収を達成できることを示す。
【実施例３】
【００３７】
ホルムアミドおよび多様な熱プロファイルによる血漿前処理の評価
以下の実験は、ＰｒｏＫおよびホルムアミドと血漿前処理の間の多様な熱プロファイルとがＲＮＡの抽出に与える効果を試験した。酸化鉄を用いて試料からＲＮＡを抽出した。
【００３８】
最初に、４０〜４５ｍｇの酸化鉄を各々含有する６４本の管に、ＥＤＴＡで抗凝固された血漿５００μｌを加えた。これらの管のうち８本を対照標準として取っておいた（すなわち、前処理しなかった）。管のうち８本にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（３００μｌ）を加えた。残りの４８本の管に３００μｌのホルムアミドを入れた。ＰＢＳまたはホルムアミドのいずれかを含有する４６本の管の各々に、２０単位のＰｒｏＫを加えた。以下の総括表中に明記される温度および時間において、管をインキュベートした。次いで、全ての管を、２，５００コピーのＨＩＶ生体外転写物でスパイクして、５，０００コピー／ｍｌのＨＩＶ  ＲＮＡを含有する血漿試料の模擬実験をした。次に、各管に１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、および８００μｌをピペットで上下に計２４回吸引することによって試料を混合した。次いで、酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および吸引によって非結合試料を除去した。１ｍｌの９０ｍＭのグリシン／ＨＣｌで、８００μｌを計１２回吸引および分配することによって、粒子を２回洗浄した。各洗浄後、粒子を管の側面に固定し、および吸引によって各管から流体を除去した。７５ｍＭのビシンおよび８５ｍＭのＫＯＨから成る１２０μｌの溶離緩衝液を添加して、１回につき１００μｌを計１５回、吸引および分配することによって混合することにより、粒子から試料を溶離した。次いで、各管に４００ｍＭのビシンから成る６０μｌの中和緩衝液を加え、および１回につき１００μｌを計１５回、吸引および分配して混合することによって、試料を中和した。実施例１に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。ＨＩＶ  ＲＴ-ＳＤＡ分析システムを用いるＳＤＡによって、溶離された試料を分析した。結果は以下のとおりである：
【００３９】
【表３】
2006517298.tif 000004
【００４０】
結果は、記載された時間および温度にわたってＰｒｏＫおよびホルムアミドで血漿を前処理することは、前処理しない場合、または７５℃で２０分間にわたってＰｒｏＫおよびＰＢＳで前処理する場合と比べて、かなり高い平均シグナルを与えることを明確に実証した。
【実施例４】
【００４１】
血漿前処理の間に存在する酸化鉄の有無による、血漿からのＤＮＡ抽出の評価
血漿前処理の間に酸化鉄が存在する場合に対する、前処理の後に酸化鉄を加える場合の、血漿からのＤＮＡ抽出効率を比較するために、以下の実験を実施した。
【００４２】
１２本の２ｍｌ管（６本は４０ｍｇの酸化鉄を含有し、および６本は空の管）の各々に、ヒト血漿（５００μｌ）を加えた。各管にＰｒｏＫ（５単位）を加え、および管を６５℃で２０分間にわたりインキュベートした。ホルムアミド（４００μｌ）を加え、および管を７０℃で１０分間にわたりインキュベートした。４０ｍｇの酸化鉄を含有する６本の新しい２ｍｌ管に、酸化鉄無しで前処理された試料を移動させた。次に、結核菌（ＴＢ）特定配列を含有するＫ１０  ＤＮＡプラスミド２，５００コピーを、存在する酸化鉄無しで前処理された６本の管のうち５本、および存在する酸化鉄有りで前処理された６本の管のうち５本にスパイクした。各管に１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、続いて上下に吸引することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を吸引した。５ｍＭのグリシン／ＨＣｌで管を２回洗浄し、各洗浄後は、粒子を管の側面に固定し、および流体を管から吸引した。１０５ｍＭのＫＯＨおよび１４％のＤＭＳＯから成る溶離緩衝液（１２０μｌ）を加えて、および上下にピペット移動させることによって混合した。次いで、実施例１に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。３５０ｍＭのビシンおよび３８．５％のグリセロールから成る中和緩衝液（６０μｌ）を加え、および上下にピペット移動させることにより混合した。直接ＴＢ  ＳＤＡ分析（ＤＴＢ）（Direct TB SDA assay）において、溶離された試料を増幅して、ＤＴＢ特異的応答および内部増幅制御（ＩＣ）応答を得た。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
ＴＢ増幅分析におけるシグナル改善によって示唆されるように、結果は、血漿前処理の前よりもむしろ後に血漿と酸化鉄とを結合させることが血漿からのＤＮＡ抽出効率を改善することを実証する。
【実施例５】
【００４５】
血漿前処理の間に存在する酸化鉄の有無、および混合の間に加えるＡＣ電界の有無による、血漿からのＤＮＡ抽出の評価
血漿前処理の間に酸化鉄が存在する場合対、前処理後に酸化鉄を加えた場合の、血漿からのＤＮＡ抽出効率を比較し、および混合の間の交流（ＡＣ）電界の有無の２つの条件を試験するために、以下の実験を実施した。
【００４６】
４０ｍｇの酸化鉄を含有する２４本の２ｍｌ管および２４本の空の２ｍｌ管の各々に、ヒト血漿（５００μｌ）を加えた。各管にＰｒｏＫ（５単位）および３００μｌのホルムアミドを加えた。全ての管を、６５℃で２０分間、および８５℃で１０分間にわたってインキュベートした。酸化鉄無しで前処理された試料を、４０ｍｇの酸化鉄を含有する新しい２ｍｌ管に移動させた。次に、存在する酸化鉄無しで前処理された２４本の管のうち２０本、および存在する酸化鉄有りで前処理された２４本の管のうち２０本の中へ、結核菌（ＴＢ）特定配列を含有するＫ１０  ＤＮＡプラスミド４，０００コピーをスパイクした。次いで、１５０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加えて、および上下に吸引することによって混合した。存在する酸化鉄有りで前処理された管のうち１２本、および存在する酸化鉄無しで前処理された管のうち１２本を、各混合工程においてＡＣ電界無しで混合した。存在する酸化鉄有りで前処理された残りの１２本の管を、存在する酸化鉄無しで前処理された残りの１２本の管と同様に、各混合工程において３０ｍＶのＡＣ電界下で混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を管から吸引した。５ｍＭのグリシン／ＨＣｌで管を２回洗浄し、各洗浄後は、粒子を管の側面に固定し、および流体を管から吸引した。次に、１０５ｍＭのＫＯＨおよび１４％のＤＭＳＯから成る１２０μｌの溶離緩衝液を加えて、および上下にピペット移動させることにより混合した。実施例１におけるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。３５０ｍＭのビシンおよび３８．５％のグリセロールから成る中和緩衝液（６０μｌ）を加えて、および上下にピペットで移すことにより混合した。直接ＴＢ  ＳＤＡ分析において、溶離された試料を増幅して、ＤＴＢ特異的応答およびＩＣ応答を得た。結果は以下のとおりである：
【００４７】
【表５】
2006517298.tif 000006
【００４８】
ＴＢ増幅分析におけるシグナル改善によって示唆されるように、結果は、血漿前処理の前よりもむしろ後に血漿と酸化鉄とを結合することが、血漿からのＤＮＡ抽出効率改善することを実証する。ＡＣ電界の存在下で混合することは、前処理の間に酸化鉄を含有しない試料に関するシグナルを改善した。
【実施例６】
【００４９】
酸化鉄での血漿からのＤＮＡ抽出に与える、ＰｒｏＫ消化前に対するＰｒｏＫ消化後の血漿試料の希釈の効果の評価
血漿をＰｒｏＫ消化前にリン酸カリウム緩衝液で希釈する場合に対する、ＰｒｏＫ消化後に水で希釈する場合の、酸化鉄での血漿からのＤＮＡ抽出効率を比較するために、以下の実験を実施した。
【００５０】
２４本の２ｍｌ管の各々に、ヒト血漿（５００μｌ）を加えた。血漿の管のうち８本に、ＰｒｏＫ（５単位）および４００μｌの３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液を加え、および６５℃で２０分間にわたってインキュベートし、続けて７０℃で１０分間にわたってインキュベートした。血漿の管のうち８本に、ＰｒｏＫ（９単位）および４００μｌの３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液を加え、および６５℃で２０分間にわたってインキュベートし、続けて７０℃で１０分間にわたってインキュベートした。血漿の管のうち８本に、ＰｒｏＫ（５単位）を加え、および６５℃で２０分間にわたってインキュベートした。６５℃のインキュベーションに続いて、これらの管を４００μｌの水で希釈し、および７０℃で１０分間にわたってインキュベートした。追加の８本の２ｍｌ管に、リン酸カリウム緩衝液（９００μｌ）を加えた。各溶液を、各々４０ｍｇの酸化鉄を含有する新しい２ｍｌ管に移動させた。次に、４つの条件の各々８本の管のうち６本の中へ、結核菌特定配列を含有するＫ１０  ＤＮＡプラスミド３，０００コピーをスパイクした。各条件の残りの２本の管を、陰性の対照標準として残した。次に、管の各々に１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、および上下に吸引することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を吸引した。５ｍＭのグリシン／ＨＣｌで管を２回洗浄し、各洗浄後、粒子を管の側面に固定し、および管から流体を吸引した。１０５ｍＭのＫＯＨおよび１４％のＤＭＳＯから成る溶離緩衝液（１２０μｌ）を加えて、および上下にピペット移動させることにより混合した。実施例１において記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。３５０ｍＭのビシンおよび３８．５％のグリセロールから成る中和緩衝液（６０μｌ）を加えて、および上下にピペット移動させることにより混合した。直接ＴＢ  ＳＤＡ分析において、溶離された試料を増幅して、ＤＴＢ特異的応答およびＩＣ応答を得た。結果は以下のとおりである：
【００５１】
【表６】
2006517298.tif 000007
【００５２】
ＴＢ増幅分析における増大されたシグナルによって示唆されるように、結果は、ＰｒｏＫ消化の後に血漿を希釈することが、血漿からのＤＮＡ抽出効率を改善することを実証する。ＰｒｏＫ後希釈条件の結果は、緩衝液試料の対照標準の結果にほぼ等しい。
【実施例７】
【００５３】
酸化鉄でのＤＮＡ抽出における血漿希釈剤としてのホルムアミドおよび水の評価
ＰｒｏＫ消化後にホルムアミドまたは水のいずれか一方で血漿を希釈する場合の、酸化鉄での血漿からのＤＮＡ抽出効率を比較するために、以下の実験を実施した。
【００５４】
１２本の２ｍｌ管の各々に、５００μｌのヒト血漿および５単位のＰｒｏＫを加えた。６５℃で２０分間にわたって管をインキュベートした。管のうち６本にホルムアミド（４００μｌ）を加え、および７０℃で１０分間にわたって管をインキュベートした。残りの６本の管に水（４００μｌ）を加え、および７０℃で１０分間にわたって管をインキュベートした。各溶液を、各々４０ｍｇの酸化鉄を含有する新しい２ｍｌ管に移動させた。次に、２つの条件の各々６本の管のうち５本の中へ、結核菌特定配列を含有するＫ１０  ＤＮＡプラスミド２,５００コピーをスパイクした。各条件の残りの管を、陰性の対照標準として残した。次に、管の各々に１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、および上下に吸引することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を管から吸引した。５ｍＭのグリシン／ＨＣｌで管を２回洗浄し、各洗浄後に、粒子を管の側面に固定し、および管から流体を吸引した。１０５ｍＭのＫＯＨおよび１４％のＤＭＳＯから成る溶離緩衝液（１２０μｌ）を加え、および上下にピペット移動させることによって混合した。実施例１に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。３５０ｍＭのビシンおよび３８．５％のグリセロールから成る中和緩衝液（６０μｌ）を加え、および上下にピペット移動させることにより混合した。直接ＴＢ  ＳＤＡ分析において、溶離された試料を増幅して、ＤＴＢ特異的応答およびＩＣ応答を得た。結果は以下のとおりである：
【００５５】
【表７】
2006517298.tif 000008
【００５６】
ＴＢ増幅分析における同等のシグナルによって示唆されるように、結果は、ＰｒｏＫ消化後に水またはホルムアミドのいずれで血漿を希釈することも、同等の血漿からのＤＮＡ抽出効率をもたらすことを実証する。
【実施例８】
【００５７】
酸化鉄での血漿からのＲＮＡの回収に関する多様なキャリアＲＮＡ濃度の評価
酸化鉄での血漿からのＲＮＡ抽出に与える、増大する酵母菌キャリアＲＮＡ濃度の効果を評価するために、以下の実験を実施した。
【００５８】
ｍｌあたり１０,０００個のＨＩＶ粒子でヒト血漿をスパイクし、およびＨＩＶでスパイクされた血漿５００μｌを、４０本の２ｍｌ管に加えた。各管に、ＰｒｏＫ（４０単位）を加えた。次に、０、２．５、５、１０、または２０μｇのキャリアＲＮＡを含有する３００μｌの３０ｍＭのＫＰを、管（キャリアＲＮＡのレベル毎に管８本）に加えた。０．５ｍｌの血漿試料を考えれば、これは、ｍｌ血漿あたり０、５、１０、２０、および４０μｇのキャリアＲＮＡ濃度となる。ＲＮＡ対照標準としての働きをさせるために、５００μｌのスパイクされていない血漿、４０単位のＰｒｏＫ、３００μｌのホルムアミドおよび１０,０００コピーのＨＩＶ生体外転写物を、８本の２ｍｌ管に加えた。全ての管を、７０℃の水浴中で３０分間にわたってインキュベートした。次に、１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、および８００μｌを２４回吸引および分配することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を吸引した。１ｍｌの６ｍＭのグリシン／ＨＣｌで、８００μｌを１５回吸引および分配することによって、管を２回洗浄した。粒子を管の側面に固定し、および管から流体を吸引した。各管に、７５ｍＭのビシン、８５ｍＭのＫＯＨ、および３０ｍＭのＫＰＯ4から成る溶離緩衝液（１２０μｌ）を加え、および１００μｌを１５回吸引および分配することによって混合した。実施例１に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。各管に、４００ｍＭのビシンから成る中和緩衝液（６０μｌ）を加え、および１００μｌを１５回吸引および分配することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定して、溶離された試料の除去を可能にした。ＨＩＶ  ＲＴ−ＳＤＡ分析において離された試料を増幅した。結果は以下のとおりである：
【００５９】
【表８】
2006517298.tif 000009
【００６０】
結果は、キャリアＲＮＡの存在が血漿からの特異的ＲＮＡ標的の回収を改善することを実証する。キャリアＲＮＡをあらかじめＨＩＶ増幅分析において２０μｇに至るまで滴定し、およびキャリアＲＮＡは増幅に与える効果を有さないことを示した。
【実施例９】
【００６１】
核酸抽出のための段階的加熱での血漿のＰｒｏＫ前処理
酸化鉄システム中でＲＮＡを結合させる前に、ＰｒｏＫを５５℃または６５℃で活性化させ、続いて７５℃で２０分間にわたるインキュベーションを行う効果を試験するために、以下の実験を実施した。
【００６２】
ＢＤ  ＰＰＴ（商標）管からの６００μｌの容積の血漿を、４０〜４５ｍｇの酸化鉄を含有する管に加え、そして次に、管の各々に２２０μｌの３０ｍＭのＫＰＯ4を加えた。また、各管にＰｒｏＫ（６単位）を加え、および管を５５℃水浴または６５℃の水浴のいずれかにおいて２０分間にわたってインキュベートすることによって、ＰｒｏＫを活性化した。管を７５℃の水浴に移動させ、および２０分間にわたってインキュベートした。試料を、室温で５分間にわたって冷却した。次に、各管に１８０μｌの６Ｍのグリシン／ＨＣｌを加え、および試料をピペット混合した。次に、１０μｌの酵母菌キャリアＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）を、続いて６μｌのＨＩＶストックＲＮＡ（１０7コピー／ｍｌ）を各管に加え、およびピペット混合した。酸化鉄粒子を管の側面に固定し、および無駄になる溶液を吸引することによって、管から非結合試料を除去した。１０００μｌの洗浄溶液（８６ｍＭのグリシン／ＨＣｌ）で、ピペット混合し、酸化鉄粒子を各管の側面に固定し、および非結合溶液を吸引することによって、粒子を３回洗浄した。次いで、各管に試料を４００μｌの溶離緩衝液（９０ｍＭのビシン、５０ｍＭのＫＯＨ、および２０ｍＭのＫＰＯ4）を加え、および、１２サイクルの吸引混合、続いて６０℃で２０分間の磁気的混合、続いて２回目の１２サイクルの吸引混合を実施することによって試料を溶離した。各管に酵母菌キャリアＲＮＡ（１０μｇ）を加えた。分析前にスパイクをされたコントロール試料に標的を加えた。実施例１に記載されるように、試料を新しい管に移動させ、およびＨＩＶ  ＲＴ−ＳＤＡ分析によって分析した。結果は以下のとおりである：
【００６３】
【表９】
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【００６４】
高められた温度（５５℃から６５℃の活性化温度に続いて７５℃のインキュベーション温度)でＰｒｏＫで血漿を前処理することは、陽性の分析シグナルによって示唆されるような抽出効率を実証する。
【実施例１０】
【００６５】
全血からのＲＮＡ抽出
本実験を実施して、全血からＲＮＡを抽出し、および溶離工程中への阻害性成分の繰越し汚染を減少させるための付加的な洗浄工程の使用を試験した。
【００６６】
全血試料（５００μｌ）を、６５℃で２０分間、および８５℃で１０分間にわたって、２０単位のＰｒｏＫおよび３００μｌのホルムアミドでそれぞれ前処理した。ひと組の試料を２回洗浄６サイクルの洗浄で、および他の組を３回洗浄９サイクルの洗浄で前処理した。試料を８５ｍＭのＫＯＨ／７５ｍＭのビシンで溶離し、４００ｍＭのビシンで中和し、およびＨＩＶgag遺伝子ＲＴ−ＳＤＡ増幅システムにおいて検出した。結果は以下のとおりである：
【００６７】
【表１０】
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【００６８】
結果は、洗浄の増加に伴う阻害物質の繰越し汚染の減少を示して、付加的な洗浄が分析シグナルを改善することを実証する。
【００６９】
本発明はなんらかの具体性とともに記載されているものの、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかな変形を施してもよい。本発明の様々な特徴は、特許請求の範囲に記載される。
【国際調査報告】
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