(57)【要約】本発明は、個々の成分がＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸である新規ペプチドに関する。該ペプチドは、フリーラジカルの増加した発生が病態生理学的役割を演じる疾病を処置するため、あるいは身体の臓器系、特に中枢神経系における急性の低酸素症または虚血を伴う疾病を処置するため、あるいは鉄貯蔵疾患、例えばＨａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ症候群を処置するため、あるいは神経変性疾患、特にアルツハイマー病、アルツハイマー病のＬｅｗｙ  ｂｏｄｙ変異形、パーキンソン病、多系統萎縮、Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ痴呆またはハンチントン舞踏病、および該神経変性疾患に類似するすべての症候群を処置するための薬物における有効成分として使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＳＭＡＫＥＧＶ
ＭＡＫＥＧＶ
ＡＫＥＧＶ
ＫＥＧＶ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳ
ＭＤＶＦＭＫＧＬ
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ＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧ
ＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥ
ＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫ
ＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡ
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ＤＶＦ
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ＧＬＳ
ＧＬ
ＬＳＭＡＫＥＧ
ＬＳＭＡＫＥ
ＬＳＭＡＫ
ＬＳＭＡ
ＬＳＭ
ＬＳ
からなる群から選ばれる新規ペプチド。
【請求項２】
個々の成分がＬ−アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
個々の成分がＤ−アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸プロリンがＮ−末端位において置換されている、請求項１もしくは２に記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸プロリンがＣ−末端位において置換されている、請求項１もしくは２に記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸プロリンがＮ−末端位およびＣ−末端位において置換されている、請求項１もしくは２に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｎ−末端位においてアセチル化されている、請求項１〜６の１つに記載のペプチド。
【請求項８】
Ｃ−末端位においてアミド化されている、請求項１〜７の１つに記載のペプチド。
【請求項９】
Ｎ−末端位においてアセチル化され、そしてＣ−末端位においてアミド化されている、請求項７もしくは８に記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸バリン（Ｖ）がアミノ酸プロリン（Ｐ）によって置換されている、請求項１〜９の１つに記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０の１つに記載の少なくとも１種のペプチドを特徴とする、フリーラジカルの増加した発生が病態生理学的役割を演じる疾病の治療における使用のための製薬学的薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜１０の１つに記載の少なくとも１種のペプチドを特徴とする、身体の器官系、特に中枢神経系における急性の低酸素症または虚血を伴う疾病の治療における使用のための製薬学的薬剤。
【請求項１３】
請求項１〜１０の１つに記載の少なくとも１種のペプチドを特徴とする、Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ−Ａｐｐｅｌｂａｕｍ病、例えばＨａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ病の治療における使用のための製薬学的薬剤。
【請求項１４】
有効成分として請求項１〜１０の１つに記載の少なくとも１種のペプチドを特徴とする、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、アルツハイマー病のＬｅｗｙ  ｂｏｄｙ変異形、パーキンソン病、多系統萎縮、Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ痴呆またはハンチントン舞踏病、およびこれらの神経変性疾患に類似するすべての状態の治療における使用のための製薬学的薬剤。
【請求項１５】
経口投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項１６】
直腸投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項１７】
吸入による投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項１８】
経皮投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項１９】
経粘膜投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項２０】
有効成分含有の移植物（ｉｍｐｌａｎｔｓ）による投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項２１】
脳室内投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項２２】
注射による投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項２３】
経鼻投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項２４】
注入による投与のために調製される、請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤。
【請求項２５】
請求項１１〜１４の１つに記載の製薬学的薬剤の製造のための、請求項１〜９に記載の少なくとも１種のペプチドの使用。
【請求項２６】
請求項１１〜２４に記載の製薬学的薬剤の製造のための請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は長さ４〜１４個のアミノ酸であるペプチドに関する。本発明によるペプチドは中枢神経系の変性疾患、例えばアルツハイマー病、Ｌｅｗｙ  Ｂｏｄｙ痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病（舞踏病）、多系統萎縮および他の類似する疾病を処置するための製薬学的薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）における有効成分として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患では、一般に脳におけるタンパク質の凝集体が共通の特徴として生じる。アルツハイマー病の場合には、いわゆる老人斑は、第一かつ真っ先に、アミロイドβペプチドと、いわゆる神経原線維のもつれ、過度にリン酸化したτタンパク質由来の細胞内タンパク質糸球とからなる細胞外アルブミン沈着である。パーキンソン病に関しては、凝集したα−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）からなる細胞内封入体が見い出された。ごく最近の科学的知見によれば、家族性および散発性アルツハイマー病を罹患している患者の７０％以上においてそのような封入体、すなわちＬｅｗｙ  Ｂｏｄｙを検出することができた；それらはまたダウン症候群に罹っている患者でも見いだされる。グリア細胞におけるα−シヌクレインの凝集体は多系統萎縮において起きる。これと同様に、プリオンタンパク質の凝集がクロイツフェルト・ヤコブ病および関連疾患、そして最後にハンチントン萎縮におけるハンチントン沈着において見いだされる。
【０００３】
多くの患者で、特に顕著な凝集挙動を有する変異したタンパク質が存在する。しかしながら、患者の大多数では、凝集体は正常な野生型タンパク質からなる。タンパク質の溶解性挙動を突然に変える種々の因子が推定され、これには例えば、老化プロセス中に増加した酸化ストレスが必須の役割を演じるであろう。障害によって不適当に改変されたアルブミンが生じることがあり、次いでこれが沈着され、そしてもはや種々の処理酵素によってさらなる処理ができないので、種々のタンパク質分解酵素の能力における変化さえもまた因子として適当である。
【０００４】
その他の引き金になる病態生理学的メカニズムは、凝集性と抗凝集性タンパク質間の破壊された平衡にある。シナプスタンパク質α−シヌクレインがいわゆるＬｅｗｙ  Ｂｏｄｙの主成分を表し、そしてこのタンパク質の突然変異が家族性パーキンソン病を誘導するという発見は、このアルブミンをして科学的研究の焦点にさせた。α−シヌクレインに加えて、γ−シヌクレインおよびβ−シヌクレインならびに近年発見されたシノレチン（ｓｙｎｏｒｅｔｉｎ）はこのタンパク質ファミリーのさらなる代表として存在する（非特許文献１）。
【０００５】
種々の神経変性疾患の場合、個々のシヌクレイン間の量的割合の変化が、α−シヌクレインの相対的割合が増大される程度に起きる。β−シヌクレイン、α−シヌクレインの非常に密接な近縁物が用量依存様式でα−シヌクレインの凝集を抑制できることはイン・ビトロで検出することが可能である（非特許文献２）。正常な細胞増殖と分化の崩壊がα−シヌクレインの過剰発現によって誘発された細胞培養物における試験は、これらの培養物において軸索の接着、生存および成長をさらに正常化するβ−シヌクレインの、治療的意味における有利な作用をまた示した。α−シヌクレインについてトランスジェニックであるマウスは、このアルブミンの高い生産を示し、したがってα−とβ−シヌクレイン間の壊れた量的割合を表した。老化の過程にわたって、それらは、Ｌｅｗｙ  Ｂｏｄｙに類似するニューロン内の封入体を形成し、そしてパーキンソン病における機能の崩壊に匹敵する進行性の運動破壊をまた示す。β−シヌクレインを有するこれらの動物がこのアルブミンの高い発現を示すトランスジェニック動物と交雑される場合、シヌクレイン全体の発現における有意に高いレベルがホメオスタシスを回復することができる。結果として、封入体数が非常に有意に減少され、そして特徴的なニューロン機能の損失が完全に防がれる。
【０００６】
しかしながら、またα−シヌクレインはアルツハイマー病の病態において特に重要な役割を演じている。このことはまた、このタンパク質の一部分、ＮＡＣＰ（非アミロイド成分タンパク質（Ｎｏｎ−Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））ドメインが老人斑の部分として例証できる（非特許文献３および特許文献１）という事実、その上、先に述べたように、アルツハイマー病を罹患している患者の約７０％が脳の種々の領域においてＬｅｗｙ  Ｂｏｄｙを呈示し、ここに、α−シヌクレインがまた見いだされる（非特許文献４）という事実によって示される。トランスジェニックマウスモデルにおいて、β−アミロイドはα−シヌクレインの蓄積と神経毒性を増加する（非特許文献５）。それに加えて、α−シヌクレインについては、シナプスタンパク質として初期のシナプス変性において重要な役割を演じ、その結果、病原論において鍵となる役割を占めることが可能である。
【０００７】
現時点では、アルツハイマー病、Ｌｅｗｙ  Ｂｏｄｙ痴呆、パーキンソン病または他の神経変性疾患の因果関係に関連する何らの有効な治療法も得られていない。かくして、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｉｃ）因子による異常なタンパク質凝集の予防はこの方向における第１段階を表すであろう。さらにα−シヌクレインおよびβ−シヌクレインが種々の内因性シグナル伝達カスケード、例えばプロテインキナーゼＣもしくはホスホリパーゼＤ２および種々の転写因子と相互作用するので、神経保護効果をもつことができるであろう他のポジティブ効果がこれらの作用機構とともに考えられた。
【０００８】
β−シヌクレインおよび特にα−シヌクレインに関連してそれから誘導されるペプチドの使用が知られている（例えば、特許文献２によるオクタペプチドおよび特許文献３における３種のさらなるペプチドを参照のこと）。特許文献４および特許文献５は、α−シヌクレインが関与する神経学的疾患の治療のために、分子全体としてのβ−シヌクレインの使用、またはイン・ビボでその発現を増強する方法を記述している。特にまた特許文献５は、α−シヌクレインおよびβ−アミロイドの結合を防ぐために、β−シヌクレインのＮ−末端アミノ酸１〜１５に対応するアミノ酸配列ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶをもつペプチドの使用を教示している。しかしながら、特許文献５は、生存ニューロン細胞におけるこのペプチドの実際の保護作用の証拠を何も得ておらず、そしてこの配列範囲における他の活性なペプチドに対する何の引用も含んでいない。しかしながら、一般に鎖長を減少させることにより、化学的および生物学的安定性ならびに生物学的利用能の問題点が大きく低下されるので、より短いペプチドは製薬学的薬剤として使用するために非常に有利であった。
【特許文献１】ＷＯ−９５０６４０７
【特許文献２】ＷＯ−Ａ−０２／０４４８２
【特許文献３】ＷＯ−Ａ−０２／０４６２５
【特許文献４】ＷＯ−Ａ−００２／００２０
【特許文献５】ＷＯ−Ａ−０１／６０７９４
【非特許文献１】Ｓｕｒｇｕｒｃｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３（２）：９５−１０３［１９９９］
【非特許文献２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３２（２）：２１３−２３［２００１］
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２，９１４１−５［１９９５］
【非特許文献４】Ｅｉｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２９０（１），４１−４［２０００］
【非特許文献５】Ｍａｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（２１）：１２２４５−５０［２００１］
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は先行技術より知られる欠点を避けることにある。本発明によれば、
ＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＫＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＧＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＬＳＭＡＫＥＧＶ
ＳＭＡＫＥＧＶ
ＭＡＫＥＧＶ
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ＫＥＧＶ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥＧ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫＥ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡＫ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭＡ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＭ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳ
ＭＤＶＦＭＫＧＬ
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ＤＶＦＭＫＧＬ
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ＤＶＦＭＫ
ＤＶＦＭ
ＤＶＦ
ＧＬＳＭＡＫＥＧ
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ＧＬＳＭＡ
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ＧＬＳ
ＧＬ
ＬＳＭＡＫＥＧ
ＬＳＭＡＫＥ
ＬＳＭＡＫ
ＬＳＭＡ
ＬＳＭ
ＬＳ
の群から選ばれるペプチドが提供される。
【００１０】
本発明によるこれらのペプチドは、β−シヌクレインのＮ−末端配列から誘導され、そしてそれらが神経変性疾患において存在しているように、有毒なまたは活力（ｖｉｔａｌｉｔｙ）を損ねる病毒の影響を中和する。
【００１１】
驚くべきことに、先行技術からは得られなかったように、ＷＯ−０１６０７９４に記述されている１５個のアミノ酸の配列の半分のみまたはわずか３分の１のみを含有する個々のペプチドでさえもが、病理学的過程のモデルにおいて、それらが神経変性疾患において存在しているか予期されているかのごとく、優れた作用を発揮することが十分に判明した（例えば、ヘプタペプチドＳＭＡＫＥＧＶおよびペンタペプチドＬＳＭＡＫ）。
【００１２】
個々の成分がＬ−アミノ酸であるペプチドのみならず、個々の成分がＤ−アミノ酸であるペプチドもまた本発明の範囲内にある。
【００１３】
また本発明の範囲内には、Ｎ−またはＣ−末端の変化したペプチドも考慮されている。
【００１４】
本発明によるペプチドの他の有利な実施態様は従属クレイム（ｓｕｂｃｌａｉｍ）において開示されている。
【００１５】
さらに、本発明は製薬学的有効成分として本発明によるペプチドを含有する製薬学的薬剤に関する。
【００１６】
本発明のペプチドは種々の方法において合成的に製造することができる。
【００１７】
ペプチドの化学合成は慣用の方法を意味し、そして例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって達成できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４［１９６３］；ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２９ｆｆ  ｅｄｓ．Ａｌｉｔａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９８５；Ｈａｕｇ，Ｊ．Ｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，５（１）：４０−４７［１９８７］）。また化学的ペプチド合成方法は、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ（Ｍｏｄｅｌｓ  ９５００および９６００）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｄｅｌ  ４３０）；Ｍｉｌｉｇｅｎ（Ｍｏｄｅｌ  ９０５０）などのような市販されている保護したアミノ酸の使用による自動ペプチドシンセサイザーの使用を伴う。化学的方法に加えて、これらのペプチドは細菌類、真菌類もしくは哺乳類の細胞において組み換え技術の手段によって製造し、そして慣用の方法によって精製することができる。
【００１８】
本発明によるペプチドの合成が化学合成かまたは組み換え技術かいずれによって実施されるかによらず、処置される生物体中への導入後に安定性を特に増大するようにペプチドを改変することが望ましい。この目的のために、例えば次の方法が使用できる：
本発明を実行する有利な方法
１）共有的改変、ここでは、ペプチドの予め決定したアミノ酸基が選択した側鎖または末端基において有機誘導体化物質と反応できる。例えば、システイニル基はα−ハロアセテートおよび対応するアミン、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、そしてこの場合にはカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル基はまたブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチル−ホスフェート、Ｎ−アルキルマレミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、安息酸ｐ−クロロ水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールもしくはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応することによって誘導体化できる。アミノ酸ヒスチジンはまたｐＨ５．５〜７においてジエチルプロカルボネート（ｐｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）との反応によって、この物質がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるので容易に誘導体化できる。臭化パラブロモフェナジルもまた可能性があり、それによる反応は、好ましくはｐＨ６．０において０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施される。
【００１９】
２）リジンおよびアミノ末端基もまたコハク酸塩または他の無水カルボン酸により誘導体化することができる。これらの薬剤との反応はリジニル基の電荷を逆転させるという効果を有する。α−アミノを含有する基の誘導体化のための他の適当な試薬は、イミド−エステル、例えばメチルビコリンイミデート、ピリドキサール−リン酸、ピリドキサール、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオン、およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。アルギニル基は１種以上の慣用試薬、例えばフェニルグリオキサル、２，３ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって改変できる。アルギニル基の誘導体化は、グアニジン基の高いｐＫ値のために反応がアルカリ条件下で実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬はまた、リジンの基、ならびにアルギニン−ε−アミノ基と反応することができる。
【００２０】
３）チロシン基は、芳香族ジアゾニウム物質またはテトラニトロメタンとの反応によるスペクトル標識の導入のための既知標的である。Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンはＯ−アセチルチロシルおよび３−ニトロ誘導体を製造するためにもっともしばしば使用される。
【００２１】
４）カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル（４−エチル））カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジエチルペンチル）−カルボジイミドとの反応によって選択的に改変される。アスパルチルおよびグルタミル基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル基に転化される。グルタミニルおよびアスパラギニル基はしばしば対応するグルタミルおよびアスパルチル基に脱アミドされる。
【００２２】
５）他の改変はプロリンおよびリジンのヒドロキル化、セリルおよびスレオニル基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、ならびにＮ−末端アミノ基のアセチル化およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００２３】
そのような誘導体化は溶解度、吸収、生物学的半減期などを改良するために使用できる。あるいはまた、誘導体化はタンパク質の若干の望ましくない副作用を最小化するためにもまた使用できる。
【００２４】
生物学的活性の決定
本発明により提供されるペプチドによる治療の標的は種々の神経変性疾患であるので、神経変性疾患の場合において本発明によるペプチドの生物学的活性を検出するために種々のモデル系が使用された。以下、個々に使用したモデル系およびそれにより達成された結果が記述される。
【００２５】
ニワトリの胚から得られる皮質性ニューロンが８日間培養プレートにおいて培養され、次いで特異的な病毒に曝露されることは、これらの生物学的試験系に共通している（Ｐｅｔｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１（５７３０）：３７８−８０［１９７９］）。
【００２６】
この目的のために、１日齢の受精したニワトリの卵が＋１２＋／−０．１℃で８０＋／−５％雰囲気湿度において８日間インキュベートされる。胚発生０日目に、卵がインキュベーター中に移され、３８＋／−０．５℃で５５＋／−５％において胚発生８日目までインキュベートされる。脳が除去された後、皮質が分離され、ホモジナイズされ、そしてニューロンが一次培養中に採取される（培養条件：Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地、２０％ｖ／ｖ胎児ウシ血清、０．０１％ゲンタマイシン、グルコース１ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン２ｍｍｏｌ、＋３７℃、５％ＣＯ２および９５％雰囲気湿度）。培養８日後、試験されるペプチドが添加（最終濃度１．５６〜２００μｍ）され、そして特定の病毒が除去される。各試験において、結果は損傷した対照および媒質対照である。特定のストレス期間の終了後、なお生存しているニューロンの割合が代謝比色アッセイ（青色ホルマザン生成物への黄色発色団ＭＴＴの反応が生存細胞によってのみ実施される）により決定される。
【００２７】
引用したペプチドのアミノ酸配列に関して表１参照。
【実施例１】
【００２８】
血清離脱アッセイ
成長因子の離脱（胎児ウシ血清の混合の２％ｖ／ｖまでの減少）によって、アポトーシスと神経変性による徐々に進行する細胞死が起こされる。これは、神経変性疾患の可能性のある病因の１つであると推定される神経成長因子によるニューロンの刺激における崩壊をシミュレートしている。細胞死の防御における新規ペプチドの有効性が測定された。
【００２９】
総括すれば、この試験では４５種の試験したペプチドフラグメントの３１種が神経保護性、抗アポトーシス機能を有した。この場合、効果が対照の効果（＝１００％）を越える１５０％であった物質ＢＨ＃１６およびＢＨ＃３７が特に有効であった。オクタペプチドＢＨ＃７（ＬＳＭＡＫＥＧＶ配列）の場合、効果は約４５０％であった。
【実施例２】
【００３０】
イオノマイシンによるカルシウム代謝の慢性的崩壊
種々の神経変性疾患の場合には、代謝機能不全のために慢性のカルシウム過負荷が起き、最終的に種々の酵素系の活性化を経て細胞死を生じることが予測される。このモデルでは、この損傷がメタノール溶液中イオノマイシンの添加（最終濃度：１０μｍ）によって２４時間にわたり誘導される。培地中に希釈されるメタノールは媒質対照として使用される。
【００３１】
この虚血損傷モデルにおいて、６物質が神経保護活性を有した。主として３物質が有利である。ＢＨ＃８、ＢＨ＃１３およびＢＨ＃３４は約１５０％まで細胞生存能力の増加をもたらした。
【実施例３】
【００３２】
塩化鉄による酸化ストレス
塩化鉄による長期の処置は神経細胞のみならず他の細胞を壊死に至らしめる慢性的酸化ストレスを表す。鉄バランスの崩壊は両アルツハイマー病およびパーキンソン病に関して、特にＲｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ−Ａｐｐｅｌｂａｕｍ病、例えばＨａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ病の場合に記述されているので、このモデルは適切な試験系を表す。培養８日目に、神経細胞がＦｅＣｌ２溶液の１０μｌの添加（最終濃度：１ｍｍｏｌ）によって損傷される。損傷は２４時間実施される。
【００３３】
このアッセイでは、２３種のペプチドフラグメントが一定の神経保護作用を示し、そして１５０％以上の活力の増加が物質の２分の１以上に存在した。いかなる他の損傷アッセイにおけるよりも多数の物質が２００％以上（ＢＨ＃８、ＢＨ＃１０、ＢＨ＃１１、ＢＨ＃１３）または２５０％（ＢＨ＃１５、ＢＨ＃６、ＢＨ＃２７、ＢＨ＃２８）の細胞活力の増加をもたらした。
【実施例４】
【００３４】
過酸化水素による酸化ストレス
培養基への過酸化水素の添加によって、神経細胞培養物において大量の細胞死をもたらすフリーラジカルが生成される。これは細胞損傷の遍在的なメカニズムを表しているので、このモデルは急性および慢性の両神経変性について適当である。培養８日目に、神経細胞培養物にＨ２Ｏ２が１００μｍの最終濃度まで添加される。
【００３５】
ここでは、３０ペプチドの全部が神経保護能を示した。損傷対照（＝１００％）に比較して２００％以上の効果を有する、物質ＢＨ＃５、ＢＨ＃８、ＢＨ＃９およびＢＨ＃２９が特に有意であった。ペプチドＢＨ＃１３、ＢＨ＃２９、ＢＨ＃３７、ＢＨ＃３８およびＢＨ＃４６がまた１４５％以上のニューロンの活力増加を示した。
【実施例５】
【００３６】
アミロイドβ凝集アッセイ
β−アミロイドペプチドは、凝集形態において強力な神経毒性を表し、神経細胞培養物へのこれの添加は急速かつ進行性の細胞死をもたらす。β−アミロイドペプチドはアルツハイマー病の発病において必須の役割を構成するので、このモデルは特に適切であると考えられる。
【００３７】
この生物学的試験はこのプロジェクトのために特別に開発された抗凝集性物質能を試験する方法である。新規に合成したペプチドが神経毒性のある凝集体の形成を防ぐためにアミロイドβペプチドの新鮮溶液に直接添加される。続いて発生する凝集体が神経細胞培養物の増殖および生存に及ぼす効果が測定パラメーターである。
【００３８】
試験した４５ペプチドフラグメントのうち６種がβ−アミロイド２５−３５の神経毒性作用を部分的に補償することができた。ニューロンの活力の増大を４４または７４％もたらすペプチドＢＨ＃２４およびＢＨ＃２６が有意である。しかしながら、合成が困難であったか、またはごく少い材料しか得られなかったので１回のみであった他のペプチドを試験することは可能であった。したがって、１種または他のペプチドもまた有効であり得ることは除外できない。
【実施例６】
【００３９】
予め凝集したβ−アミロイドペプチドの細胞毒性作用
前記試験に対して、後者は予め形成した神経毒性アミロイド凝集体を用いて操作する。後者を生成するために、アミノ酸２５〜３５からなるβ−アミロイドペプチド（Ｂ−Ａ（２５−３５））がリン酸緩衝化した通常の塩溶液（１ｍｍｏｌ）中に溶解され、そして室温で複合体化のために少なくとも７２時間保存される。培養８日目に、この溶液が２０μｍの最終濃度において培養物中にピペット注入され、曝露２４時間後に、通常のように生存細胞の割合が決定される。
【００４０】
試験した４５ペプチド中２１種が神経保護能を示した。効果は無損傷の媒質対照に対して１２０〜１５０％であっが。それによる部分効果は非常に低用量において既に検出できる。
【００４１】
１回のみの試験が実施された凝集アッセイ（実施例５）を除いて、少なくとも２つの独立した実験（ｎ＞６）の平均値（ＭＷ）および標準偏差（Ｓｔａｂｗ）が全ての数字（ｆｉｇｕｒｅ）において示される。すなわち、試験の実施は異なる細胞調製物により、かつ異なる個人によって異なる日に実施された。若干のペプチドでは、２つのナンバーが与えられた（＃１＝＃２３または＃６＝＃３５または＃７＝＃４３）が、これらのペプチドによる結果は１回のみ示した。ペプチドが溶液にすることができない（＃４９）ので、そのペプチドを試験することは不可能であった。若干の他の物質では、製造に問題があって、少量しか得られず、全てのアッセイにおいてその物質を試験することはできなかった（＃１２，１４，１７，３５および＃４８）。一般に、数種のペプチドのみがいずれのアッセイにも有効ではなかった（，１８，，３２，，４１，）。ナンバー＃１２，２０，３０，３３，３９および４５をもつペプチドは１つのスクリーニングアッセイのみで有効であった。数字から見られるように、標準偏差、すなわち独立した実験間の変動はある程度かなり大きい。これらの変動は安定性の問題に帰せられるかもしれない。
【００４２】
【表１】
2006508022.tif 000002
【００４３】
下記表２はこのスクリーニングからの最重要物質の特徴を総括する。これらのペプチドは本発明の範囲内で好適であるペプチドである。
【００４４】
【表２】
2006508022.tif 000003
【００４５】
説明、請求項において、および表１と２において：
Ａ      Ｄ−もしくはＬ−アラニンを表す
Ｄ      Ｄ−もしくはＬ−アスパラギン酸を表す
Ｅ      Ｄ−もしくはＬ−グルタミン酸を表す
Ｆ      Ｄ−もしくはＬ−フェニルアラニンを表す
Ｇ      Ｄ−もしくはＬ−グリシンを表す
Ｋ      Ｄ−もしくはＬ−リジンを表す
Ｌ      Ｄ−もしくはＬ−ロイシンを表す
Ｍ      Ｄ−もしくはＬ−メチオニンを表す
Ｓ      Ｄ−もしくはＬ−セリンを表す、および
Ｖ      Ｄ−もしくはＬ−バリンを表す。
【００４６】
投与量および投与形態
一般に、本発明による化合物は、製薬学的に許容しうる担体または溶媒中治療的に有効な量において投与される。そのような担体は、限定されるものではないが、生理学的な通常の塩溶液、緩衝化した通常の塩溶液、デキストローズ、水、グリセロール、エタノールおよびそれらから作成された組み合わせ物を含む。それぞれの形態は投与の形式に合致されねばならない。
【００４７】
必要ならば、組成物はまた種々の量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化物質を含有することができる。製薬学的組成物は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）製剤または散剤であってもよい。調製物はまた慣用の結合剤および担体、例えばトリグリセリドを含有する坐剤としても製造できる。経口製剤は、製薬学的純度における標準の担体、例えばマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有できる。種々の投与システムは既知であり、そして本発明による物質の治療的使用を確実にするために使用できる、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への被包化。
【００４８】
投与形態は、ヒトまたは他の哺乳類における静脈内投与に適合された製薬学的投与形態として常法にしたがって調製される。典型的には、静脈内投与のための組成物は無菌の等張バッファー水溶液における液剤である。必要ならば、調製物はまた注射部位における痛みを緩和するために可溶化剤および局所的作用の麻酔剤を含有してもよい。
【００４９】
一般に、成分は、用量単位においていずれか別々にまたは混合されて、例えば、活性製薬学的薬剤の量が指示されているアンプルのような密封容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として利用可能にされる。
【００５０】
調剤形態が浸剤として投与される必要がある場合、それは製薬学的純度における無菌水または塩溶液を含有する注入フラスコ中に溶解される。調製物が常に注射によって投与される場合は、個々の成分が投与前に用法にしたがって混合されるように、注射目的のための無菌水または通常の塩溶液を含有するアンプルが利用可能にされる。
【００５１】
本発明において述べられる治療物質は、両中性形態および塩として製剤化することができる。製薬学的に許容しうる塩は、遊離アミノ基と形成される塩、例えば塩酸またはシュウ酸から生成する塩、および遊離カルボキシル基と形成される塩、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−（エチルアミノ）エタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される塩を含む。
【００５２】
本発明において述べられる治療薬剤の量は、特定の疾病または症状の処置のために有効であらねばならず、疾病または症状の性質に依存し、そして標準化した臨床経過によって決定される。本発明において使用する必要がある正確な用量は、また、投与形式ならびに疾患または障害の重篤度に依存し、そしてこの量は、担当医のアセスメントに基づく患者の特定の環境を考慮して適用されるべきである。静脈内投与のための適当な用量範囲は、一般に、体重１ｋｇ当たり有効成分２０〜４，０００μｇである。鼻内適用のための適当な用量は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり１ｍｇまでの範囲内にある。経口適用のための有効用量は体重１ｋｇ当たり、および１日当たり１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲内である。有効用量は、イン・ビトロのモデルまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定される。
【国際調査報告】
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