(57)【要約】ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ及び／又はエレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)質量分析法などによる更なる分析の前の、試料の脱塩及び濃縮のための試料調製用デバイス及び方法。本発明の具体例によるデバイスは、好ましくは複数の吸着性粒子ｅを含む三次元構造を含み、該粒子は、固相抽出を実施できるデバイスを形成するように多孔性ポリマーマトリクス中に加える。このデバイスは、ポリマー及び適宜粒子を含むキャスト用溶液をハウジング内に導入し、続いて、該デバイスを冷却液に溶媒交換及び沈殿を与えて該ハウジング内に複合体構造を形成するのに十分な時間にわたって曝露することにより製造される。本発明は又、本発明のデバイスを利用する試料調製方法にも向けられている。
2006508340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハウジング内に構造を形成する方法であって、該方法は、下記：
少なくとも第一及び第二の開口を有する該ハウジングを用意し、該第一の開口は、該第二の開口から離れており；
該ハウジング内に予め決めた量の、膜形成ポリマーを含むキャスト用溶液を分配し；
該キャスト用溶液を、該ポリマーが不溶性である冷却液に、該冷却液が該ポリマーを該ハウジング内で沈殿させるために該開口の各々に入るように、曝す
ことを含み、該沈殿したポリマーが、約１０未満の縦横比を有する当該方法。
【請求項２】
前記の多孔性ポリマー中に複数の吸着性粒子を与えることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の冷却液が、前記の開口の各々に等圧的に入る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の冷却液が、アルコールと水を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の冷却液が、気体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記のハウジングが、マルチウェルプレートのウェルの排水口である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ハウジング及び該ハウジング内に位置された複合体構造を含む試料調製用デバイスであって、該複合体構造が、１０ｐｓｉで該複合体構造を通る空気流が５１リットル／分／ｃｍ2未満であるような密度を有する当該試料調製用デバイス。
【請求項８】
前記の複合体構造を通る空気流が、１０ｐｓｉで約２３リットル／分／ｃｍ2である、請求項７に記載の試料調製用デバイス。
【請求項９】
前記のハウジングが、マルチウェルプレートのウェルの排水口である、請求項７に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１０】
前記のハウジングが、前記の複合体構造を支持する少なくとも一つの支持エレメントを含む、請求項７に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１１】
試料を予め決めた時間にわたって三次元構造を多数回通過させた後に該試料が予め決めた程度まで精製されるように溶質を捕捉するための、多孔性ポリマーマトリクス中に捕捉された複数の吸着性粒子を含み且つ約１０より小さい縦横比を有する三次元構造を含む型の試料調製用デバイスにおける、改良であって、下記を含む当該改良：
該デバイス中に該三次元構造を、駆動力を加えた際に、該試料が、該試料を一回だけ該構造を予め決めた時間にわたって通過させた後に、少なくとも該予め決めた程度まで精製されるように、十分な密度を有するように形成する。
【請求項１２】
前記のデバイスが、複数の開口を含み、各開口が、開いた上端と開いた底部を有し、前記の三次元構造が、該開口の各々において形成される、請求項１１に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１３】
前記の開口の各々が、多数の孔よりなる、請求項１２に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１４】
開いた上端が、開いた底部より一層大きい、請求項１２に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１５】
前記の開口が、前記の構造を支持するための少なくとも一つの支持エレメントを含む、請求項１１に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１６】
前記の駆動力が、真空である、請求項１１に記載の試料調製用デバイス。
【請求項１７】
溶質夾雑物を含む生物学的試料を、該試料を、予め決めた時間にわたって多数回、多孔性ポリマーマトリクス中に捕捉された複数の吸着性粒子を含み且つ約１０より小さい縦横比を有する三次元構造を通過させて該膜構造中に該溶質夾雑物を捕捉することによって、予め決めた程度まで精製する型の方法における改良であって、下記を含む当該改良：
多孔性ポリマーマトリクス中に捕捉された複数の吸着性粒子を含み且つ約１０より小さい縦横比を有し且つ、該試料を、予め決めた時間にわたって該構造を一回だけ通過させることにより、予め決めた程度まで精製するのに十分な密度を有する三次元構造を用意する。
【請求項１８】
前記のハウジングが、ピペットチップである、請求項７に記載の試料調製用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多くの分析手順が、生化学分野で開発されてきており、該分野では、有効に分析することのできる比較的純粋なペプチド試料を得るために、低分子量のイオン又は溶質をペプチド溶液から濃縮して分離することが求められる。多くの他の分析手順(ペプチドだけでなく、一般の巨大分子種をも含む)も又、開発されてきており、それらにおいては、一般に、生化学／医化学においては、塩、洗剤及び他の夾雑物を全く含まない比較的純粋な分析物に対する一般的要求があるので、液体試料中の巨大分子成分を濃縮し及び／又は「脱塩」することが必要である。汚染物質の存在は、それらがしばしば化学的又は物理的分析を邪魔する点において有害でありうる。同様の状況が、環境分野及び古典的化学分析において存在する。
【０００２】
限外濾過装置が、一般に、生体分子及び天然物の「精製」及び／又は試料調製のために利用される。かかるプロセスが成功するためには、関心ある分子を保持し、しかも不純物を通過させる膜を選ばなければならない。このシナリオは、約１０，０００より大きい分子量の分析物には比較的真っ直ぐであるが、約５０００より小さい分子量の物質については問題が増大する。この理由は、分子量５０００の分析物を保持するのに必要な膜の多孔性が、水透過性(流量)が乏しくなり且つプロセス時間が長すぎるようになるほどに低いという事実のためである。例えば、３０，０００以上の分子量を有する分析物に適した膜を利用する装置について、典型的な遠心分離の「回転時間」は、約１時間であるが、約１０００の分子量の分析物については、適当な膜を利用して６時間もの多くの時間が必要とされうる。その上、かかる長期間にわたって高いｇ力にさらすことは、しばしば、装置の故障を生じる。
【０００３】
真空を駆動力として利用する試料の処理は、遠心分離を超える利点を与える。マルチウェル形式の遠心分離による溶出容積の収集は、可能であるが、各ウェル内の容積が、マルチウェルプレートの遠心機への移動中及び特に遠心分離中の急速な蒸発のために変化しうるので、困難である。その上、毎回、タンパク質試料を例えばピペットから収集用プレートへ移動させ又は再懸濁させる際に、これらの装置の界面へ、接着のために試料が失われる。その上、遠心分離は又、プレートを手作業で遠心機から出し入れしなければならないので、容易に自動化することができない。
【０００４】
現在、当分野で一般的なタンパク質試料の量は、０．０１〜１０マイクログラムの範囲か又はそれより少ない。かかる低い搭載量では、効率的な試料の取扱いが、損失を回避するために非常に重要である。試料の調製のための限外濾過に基づく慣用の方法及び装置は、かかる少容積の試料の「微少分離」の取扱いには、実際的でない。しかしながら、この規模での吸着技術の応用は、微少容積試料調製物への高度に有効なアプローチを提供することができよう。
【０００５】
クロマトグラフィー媒質を含む試料調製用装置の慣用の製造方法の一つは、先ず、例えば、前もって切ってある、多孔性プラスチックフリットから得られた多孔性プラグ、又はガラス繊維若しくはセルロースシートをウェル又はピペットのチップに挿入し、その後、自由粒子及び第二の多孔性プラグを加える。これらのプラグは、これらの粒子を、ピペットチップ又はウェル中で適切な位置に維持するのに役立つ。しかしながら、これらのプラグは又、過剰の液体をも捕捉し、それにより、デッドスペース又はボリュームが創出される(即ち、媒質又はポリマーによって占められていない空間であり、これは、乏しい試料回収率、試料のキャリーオーバーなどによる汚染などへと導きうる)。これらのフリットは又、増大された表面積をも与え、これは、結合損失を増大させるであろう。これらのフリットは又、必要とされる溶出容積をも増大させ、それにより、溶離試料の濃度を低下させる。この手順は、極度に少量の液体の送達用デバイス例えばピペットチップを用いて利用することは、プラグ又は粒子を積載して、前述の極度に少量の試料の積載に使用すべき１ミリグラム以下の吸着剤を含む微少吸着用デバイスを獲得する実際的方法がないのでできない。
【０００６】
或は、微少試料調製用デバイスを、媒質をキャピラリーピペットの穴に積載することによって生成することができる。しかしながら、かかるデバイスを通る流れは、典型的には、遅く且つ変化しやすい。
【０００７】
その上、質量吸着の見地から、吸着パウダーが最高の容量を与えても、それらは、ミリグラムの量で扱うのは困難であり又は実際には不可能である。ポリマーベースの吸着膜シートは、比較的扱いが容易であるが、このアプローチでさえ、極度に小さい規模では困難を有する。その上、膜の結合容量は、比較的低い下部構造表面積の結果、乏しい。現在の研究の流れは、ますます多数の一層小さい試料を自動化操作装置又はロボット工学を利用して分析することである。個々の試料の量は、ナノモルレベルからアトモルレベルである。結果として、器械類は、一層鋭敏になりつつあり、試料操作形態を小型化し、高密度化し、使い捨てにすることに対する要求が存在する。
【０００８】
分析(ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析などによるもの)前の試料調製は、しばしば、試料(例えば、ペプチド)の脱塩及び１〜２マイクロリットルの容積への濃縮を含む。これらの容積が、早晩、ナノリットルの容積まで減少することはありそうなことである。多数の試料の同時の調製及び分析は、しばしば、望ましい。マルチウェルプレートが、同時アッセイのために開発されている(典型的には、プレート当たり９６、３８４又は１５３６の反応容器又はウェルよりなる)。
【０００９】
ある種の試料調製用デバイス例えばMillipore社から市販されているＺｉｐＴｉｐ(登録商標)デバイスは、ＭＡＬＤＩ分析前の試料調製のための優れたツールである。それらは、単一の試料処理装置であり、試料をＭＡＬＤＩターゲット上に手作業で又は自動化装置によってスポットするために利用することができる。一層詳細には、米国特許第６，０４８，４５７号及び６，２００，４７４号(これらの開示を、参考として本明細書中に援用する)は、ハウジングオリフィスにおける粒子積載ポリマーシステムの相変換により形成される試料調製のためのキャストメンブレン構造の形成を教示している。このポリマーは、ハウジングの部分(可溶性ポリマー／粒子ラッカーを含む)を沈殿液(典型的には水)に浸漬させたときに沈殿する。この挿入は、ラッカーを横切る僅かな液体の圧力を造り、それで、ポリマーが沈殿に際して開いたスポンジ様構造を造る際に水が浸入する。しかしながら、この構造におけるポリマーと水の界面には、半透膜フィルムがあって、流れに対する高い抵抗を生じる。このバリヤーが侵食され又は切り離されたならば、その結果生成した構造は、高度に透過性である。その結果生成したデバイスは、一般的な１０マイクロリットルの手動式ピペット(例えば、Gilson社製、ピペットマン)により生じる低差圧下で流れを与えるのに適している。しかしながら、マクロ孔質構造は、溶質の捕捉において、一層効率が低い。それ故、しばしば、試料容積を、膜構造を、多数回、通過させなければならない。
【００１０】
一層高密度な構造を有し、一回の通過で溶質を捕捉しなければならない真空プレートなどの形式に一層良好に適合した膜構造を含む試料調製用デバイス及び方法を提供することは、望ましいであろう。
【００１１】
高スループットの試料調製用デバイスの製造方法及びそのようにして製造したデバイスを提供することも又、望ましいであろう。
【００１２】
それ故、試料溶液から分子を濃縮し、精製し且つ／又は脱塩することのできる試料調製用デバイスを提供することは、本発明の目的である。
【００１３】
少量の試料溶液から分子及び溶離液を濃縮し、精製し且つ／又は脱塩することのできる試料調製用デバイスを提供することは、本発明の他の目的である。
【００１４】
様々な外形の、試料溶液から分子を濃縮し、精製し且つ／又は脱塩することのできる試料調製用デバイスを提供することは、本発明の他の目的である。
【００１５】
単純で製造が安価な試料調製用デバイスを提供することは、本発明の尚更なる目的である。
【００１６】
ハウジングの流し口とリザーバの両方が狭い外形を有する場合に、ハウジング流し口に直接膜構造を形成する方法を提供することは、本発明の尚更なる目的である。
【００１７】
キャストされたハウジング又はその部分の形状をとり且つそのハウジング中に化学的粘着により多孔性プラグの利用なしで保持されうる高密度の膜を提供することは、本発明の更なる目的である。
【００１８】
マルチウェルデバイスであって、ウェルのアレイ内の様々なアレイが、同じ又は異なる化学物質を有する高密度の複合膜を含む当該デバイスを提供することは、本発明の尚更なる目的である。
【００１９】
吸着性粒子を内部に含有して有するか又は有しない高密度の膜を有する単一又はマルチウェルデバイスであって、該膜が、それがキャストされたハウジング又はその部分の形状をとり且つそのハウジング中に多孔性プラグの利用なしで保持されうる当該デバイスを提供することは、本発明の尚更なる目的である。
【００２０】
発明の概要
従来技術の問題は、単一ウェル又はマルチウェルの試料調製用デバイス、試料をＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析による更なる分析の前に脱塩して濃縮する方法、及び該デバイスを形成する方法を提供する本発明によって克服された。例えば、本発明の一つの具体例によるデバイスは、複数のウェルを含み、各ウェルは、それぞれの三次元膜構造を含む出口又は排水口と流体連絡しており、該三次元膜構造は、好ましくは、固相抽出を実施できるデバイスを形成するように該出口内に固定された多孔性ポリマーマトリクス中に捕捉された複数の吸着性粒子を含む。本発明は又、試料調製用デバイスを形成する方法、及び本発明のデバイスを利用する試料調製方法にも向けられている。
【００２１】
その方法の面において、本発明は、吸着性若しくは反応性媒質として有用な緻密な複合物(充填)及び／若しくは非充填構造を現場でキャストする方法又はサイズベースの分離方法を包含する。一具体例において、これらの構造は、モノリシックであり及び／又は連続的である。この発明は、様々な特定のハウジングサイズ及び構成に適用可能であり、媒質を様々な容積及び外形のハウジング内に付着させる手段を提供する。この発明は、相当な量(沈殿した構造の表面積の増加と比例して)の媒質を、三次元ポリマー構造を保持したまま、ポリマー中に含ませることができる。他の具体例においては、非充填構造(自己保持及び／又は自己支持であってよい)を、現場で、適当なハウジング内にキャストして、サイズベースの分離に利用することができ、そのキャスト構造は、半透性バリヤーとして又は吸着用に作用する。本発明は又、これらの構造並びにこれらの構造を含むハウジングをも包含する。
【００２２】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の冷却液に部分的に浸漬されているマルチウェルプレートの透視図である。
図２は、細部描写Ａに拡大して示した複合体構造を有するマルチウェルデバイスの単一ウェルの透視図である。
図３は、本発明のデバイスを通る流れを慣用のデバイスと比較するグラフである。
図４Ａは、従来技術により形成された１５マイクロメートルの名目直径を有する粒子を有する複合体構造の断面のＳＥＭである。
図４Ｂは、本発明により形成された１５マイクロメートルの名目直径を有する粒子を有する複合体構造の断面のＳＥＭである。
図５Ａは、本発明のデバイスを通る単一通過にかけた試料のスペクトルである。
図５Ｂは、従来技術のデバイスを通る単一通過にかけた試料のスペクトルである。
図６は、複合体構造を含む多数の開口を有するウェルの流し口の断面図である。
【００２３】
発明の詳細な説明
用語「膜」は、ここで用いる場合、所望の適用に適した多孔度を有する透過性及び半透性の三次元構造(粒子を含むもの又は含まないもの)を包含する。用語「複合体構造」は、ここで用いる場合、充填膜を包含する。
【００２４】
本発明の試料調製用デバイスは、ポリマー及び適宜粒子を含むキャスティング用溶液又はラッカーを、適当なハウジング(マルチウェルデバイスの少なくとも一つのウェルなど)に導入し、その後、そのハウジングを冷却液に、該膜構造を該ハウジング内に形成するための溶媒交換と固形物の沈殿に十分な時間曝露することにより製造する。この冷却液は、流体であり、好ましくは液体である。かかる好適構造の一つは、多孔性ポリマーマトリクス中にトラップされた複数の吸着性粒子を含み且つ、約２０未満の、一層好ましくは約１０未満の、好ましくは約５未満の、特には、約１未満の縦横比(平均直径対平均厚み)を有する三次元構造である。
【００２５】
今から、図１及び２を見ていくが、本発明のデバイスを形成するための好適な方法は、マルチウェルプレート１０について説明してあるが、当業者は、ハウジングの型及び構成が、それに限られないことを認めるであろう。この具体例において、このデバイスは、複数の、それぞれ、三次元膜構造を含む出口又は排水口１５との流体連絡を有する各ウェル１２を含み、該三次元構造は、固相抽出を実施できるデバイスを形成するように、好ましくは、多孔性ポリマーマトリクス中にトラップされた複数の吸着性粒子を含む。好ましくは、膜構造３０を、排水口１５の遠位末端に位置させ、該構造は、約３００ナノリットルの容積を有する。この排水口は、好ましくは、この膜構造が比較的小さく従って一層少ない溶出容積を要するように、小さい内径(例えば、約０．５ミリメートル)を有する。構造３０が排水口１５の底部開口末端と境界線を共有する好適具体例においては、試料の希釈は、デッドスペースの減少又は不在のために最少化される。当業者は、流し口又は排水口の外形を適当に構成して、上に膜層を有する少なくとも一つの充填流し口を有するデバイスを含む様々な試料調製用デバイスをデザインすることができることを認めるであろう。
【００２６】
ポリマーラッカー(粒子を含むもの又は含まないもの)を各ウェル１２に導入(好ましくは、正確な、予め決めた量で)した後に、プレート１０を、適当な冷却液２０に曝す。この冷却液は、気体(例えば、水蒸気)又は液体であってよく、後者の場合には、適当な容器２１に含まれる。良好な溶媒交換を促進するために、液体冷却液とラッカーの間に空気をトラップしないように注意することは重要である。好ましくは、このプレート１０は、冷却が各ウェルの上端と底部(例えば、排水口)の両方から同時に且つ等圧的に開始する(即ち、冷却は、構造の外側から中心に向かう)ように曝す(液体冷却の場合、液面下に沈める)。これは、プレート１０を垂直に又は実質的に垂直に、図１に示した冷却液に浸漬することによって達成することができるが、当業者は、本願発明が垂直の浸漬に限られないことを認めるであろう。冷却液浸入を駆動する差圧がないので、溶媒交換は、拡散により制御される。このプロセスは、一層遅く且つ、片側冷却(例えば、ハウジング内の単一開口による冷却)により形成されるものより一層高密度の複合体構造を形成する。半透膜は又、流れの制限として作用する構造の何れの側にも形成される。このプレート１０は、好ましくは、冷却液２０中で、ポリマーが固化するのを確実にするのに十分な時間にわたって液面下に沈めたままにする。特定の冷却時間は、部分的に、構造の大きさに依存し、当業者は、容易に決定することができる。
【００２７】
形成された複合体構造の高さ及び直径は、特に制限されず、部分的に、ハウジングの外形に依存する。典型的なウェル内に、こうして形成された、典型的な複合体構造の高さは、約１．０〜１．５ｍｍ(直径約０．５ｍｍ)に及びうる。複合体構造の高さが約４〜８ｍｍの、一層深いウェル(直径２．５ｍｍ)も又、適当である。
【００２８】
当業者は、形成された膜構造を含むハウジングの構成は、二次元的、実質的に二次元的、円筒形、円錐形、又はこの膜構造を含むことができて、冷却液とキャスティング用溶液との間の形成中の十分な溶媒交換を可能にすることのできる他の任意の外形であってよいことを認めよう。このハウジングの構成は、冷却が２つより多くの側から起こりうるようなものであってよい。好ましくは、この構成は、冷却が一様に起きるように対称的である。これらの内部流し口の外形は、正方形、長方形、円形、卵形、又は更なる膜支持エレメントを含む他の形状であってよい。図６には、出口、排水口又は流し口１５へと導くウェル１２が示されている。流し口１５内のキャストは、三次元複合体構造３０であり、これは、好ましくは、流し口１５の内部外形を満たして、形においてそれと一致する。流し口１５内には、少なくとも一つの支持エレメント１００２が示されており、これは、この複合体構造に付着(特に、化学的付着)のための更なる表面を提供し、それにより、沈降工程中の複合体構造の収縮による付着の失敗の可能性を低減させる。２つの支持エレメント１００２が示されているが、当業者は、一層少ない又は一層多い支持エレメントを利用することができることを認めるであろう。加えて、これらの支持エレメント１００２の形状及び大きさは、特に制限されないが、適当な形状及び大きさは、形成された膜の機能を邪魔しないように選択すべきである。多数の支持エレメントを用いる場合は、各々は、他のものと同じ大きさ及び形状を有する必要はない。好ましくは、これらの支持エレメント１００２は、示したように、排水口１５の底から伸びる垂直カラムである。この具体例における複合体構造３０の上部１０００は、構造エレメント１００２を覆っており、それにより大きい面領域を有するデバイスを形成することが示されている。大きい面領域を支持するために、小さいチャンネル１００１が、複合体構造で満たされている。この具体例のこのデバイスが、これらのチャンネルの一層低い部分１００１が満たされ、それにより、一連の一層小さい満たされた開口を含むデバイス流し口を形成するように満たされうるということは、理解される。
【００２９】
適当なハウジング材料は、特に、制限されず、プラスチック(例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン)、硝子、セラミック及びステンレス鋼が含まれる。ポリオレフィン(特に、ポリプロピレン)は、ポリスルホン(特に、Amocoから入手可能なＵＤＥＬ Ｐ３５００及びＰ１７００ポリスルホン、又はDow Chemicalから入手可能なDow STYRON)を含む複合体構造を現場でキャストするときに、その複合体構造により生み出される化学的付着の故に、好適なハウジング材料である。
【００３０】
適当な冷却液には、水、アルコール、水とアルコールの混合物、水と非溶剤の混合物、空気、及び加湿された空気が含まれる。
【００３１】
個々の膜構造をキャストするためのシステムは、幾つかの要素を必要とする。第一のものは、好ましくは小さいオリフィス(流し口)のアレイを含むポリプロピレンよりなるハウジングである。かかるハウジングの例は、直径０．０１８”の９６の流し口を９ミリメートル間隔で有する Millipore社より市販されているMultiscreen (登録商標) Plateの下部排水口である。第二の要素は、関心ある媒質を含む膜ラッカーである。Ｃ１８シリカ媒質を含む典型的なラッカーは、１０ｇのポリスチレンポリマー(Dow STYRON 685D)及び６５ｇのＮ−メチル−２−ピロリドンよりなる。これらの要素を、ローラーミルで、溶液が均質になるまで混合する。その後、この混合物に、２５ｇのＣ１８−２００−１５球状シリカ(Millipore)を加えて、この溶液を再び均質になるまで混合する。
【００３２】
予め決めた量のラッカーをアレイに正確に分配することは手作業でも実施することができるが、Ｘ−Ｙ−Ｚロボット装置例えば DCl-Astra-Meridian Dispenser (マサチューセッツ、Franklin)を利用するのがずっと便利である。これは、小さいゲージの針を加圧リザーバに付着させて有するＸ−Ｙ−Ｚガントリー型ロボットである。これらの針の位置は、マイクロプロセッサー制御される。キャスティング工程は、このハウジングをこの装置のデッキに堅く固定して、ラッカーをレザーバに添加することにより開始される。次いで、これらの針の空気を追い出し、マイクロプロセッサーは、該針を各オリフィス内に約１秒間位置させて、約０．５ナノリットルのラッカーを分配するプログラムを開始する。好ましくは、この装置全体を、時期尚早のラッカーの沈殿を防止するために、除湿した室内に置くべきである。一度すべてのオリフィスが満たされたならば、このプレートを、この装置から取り出して、冷却液の２０％ｖ／ｖイソプロパノール中に垂直に、全ラッカー充填オリフィスが覆われる深さまで挿入する。このプレートを、穏やかに、振盪させて、トラップされた如何なる空気泡をも放出させ、室温に２分間置く。この期間後に、それを取り出して、ＤＩＷ浴に室温で１時間にわたって再浸漬する。次いで、このハウジングを取り出して、オーブン中で一晩６０℃で乾燥させる。
【００３３】
上述の膜構造の形成工程は、単一側面からの冷却により生成される構造よりも一層緻密な(単位容積当たり一層多くの結合部位)膜構造を生成する。加えて、アルコール／水システムを利用する２側面冷却は、単一側面冷却では必要とされる冷却末端を切ることを必要とせずに、真空下で容易に流れる構造を生じる。増大した密度の利点は、試料捕捉が、単一側面からの冷却及び切断方法により生成された開口構造と比較して、単位容積当たり一層多くの結合部位が利用可能であるので、ずっと効率的であることである。構造間の区別は、一層短い滞留時間及び希釈溶質濃度によって最も表明されている。即ち、所定の滞留時間について、一層緻密な構造は、効率的に、一層多くの希釈試料を捕捉し、それは、その後、質量スペクトル分析又は他の手段による一層低レベルの検出になる。
【００３４】
図３は、本発明に従って多側面冷却により形成されたマルチウェル複合膜アレイと、単一側面冷却と切断方法を利用する従来技術により生成されたピペットとの間の空気流の比較を示している。本発明の一層緻密な、一層透過性の小さい構造は、空気流データにより容易に同定される。５０００回を超える試験からの空気流の範囲は、１００ｃｃ／分未満であった(断面積用に調整するときには、１００ｃｃ／分は、５１リットル／分／ｃｍ２に等しい)が、一般には、約５〜７５ｃｃ／分(１０ｐｓｉで)であり、平均で、約４５ｃｃ／分であった。対照的に、単一側面冷却と切断は、１００ｃｃ／分より大きい(１０ｐｓｉで)空気流を生じ、平均で、約２３０ｃｃ／分であった(両構造の膜直径は、約０．５ミリメートルである)。本発明の一層密な構造は、一層高密度の吸着性粒子及び生成した一層長い滞留時間の故に、単一側面冷却と切断による構造より遥かにゆっくりながれるが、溶質捕獲は、一層効率的であり且つ単一通過にて生じうる。これは、この構造が、１回の通過のみが可能な真空により駆動されるデバイス(１２７ｍｍＨｇ(５インチＨｇ)が、適当であることが見出されている)において有効であることを可能にする。対照的に、従来技術の比較的「開いた」構造は、比較的低い流れ抵抗を有し、それ故、吸着性粒子の密度も一層低い。結果として、溶質の吸着は、一層非効率的であり、多くの場合に、この試料は、効率的な吸着のためには、この構造を多数回通過しなければならない。これは、手動式ピペッターを用いて容易に達成される。
【００３５】
この密度の差異は、図４Ａ及び４Ｂを参照して理解することができる。図４Ａは、単一側面の冷却及び切断により形成された複合体構造のＳＥＭであり、図４Ｂは、両側面冷却により形成された複合体構造のＳＥＭである。図４Ｂは、図４Ａよりも遥かに密な構造を示している。
【００３６】
この発明は、マルチウェルプレートを利用する具体例に関して議論してきたが、同発明は、ピペットチップなどの単一ウェルデバイスにおいて形成することができる。本発明による構造は、ラッカーをピペットチップにキャストすることにより得ることができ、従来技術が教示するように、流体をチップの底にだけ吸い込むことにより該構造を沈殿させるよりもむしろ、チップを浴中に挿入し、それで、流体は、該チップの両端に入って、本発明の構造を沈殿させる。
【実施例】
【００３７】
実施例
５０ｆモルの大腸菌β−ガラクトシダーゼ(Ｂ−ｇａｌ)トリプシン処理したペプチドを含む１００μｌの試料を、１２７ｍｍＨｇ(５インチＨｇ)の真空を利用する単一通過にて、本発明の密な複合体Ｃ１８膜(二側面冷却により形成したもの)上に積載した。結合したペプチドを、１００μｌの０．１％(ｖ／ｖ)トリフルオロ酢酸で、再び真空を利用して洗う。次いで、これらのペプチドを、１．５μｌの５０％アセトニトリル(１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸を含むＤＩＷ中)にて溶出させた。この溶離液を、次いで、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ標的上にスポットして、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ Ａｕｔｏ Ｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより分析した。１０種類のペプチドが、図５Ａに示したように、データベース検索によって、陽性に同定された。
【００３８】
５０ｆモルの大腸菌β−ガラクトシダーゼ(Ｂ−ｇａｌ)トリプシン処理ペプチドを含む１００μｌの試料を、慣用の多孔性複合体Ｃ１８メンブレン(単一側面冷却及び切断法により形成)上に、Gilson P200 ピペットマンを用いる単一通過にて積載した。これらの結合したペプチドを、１００μｌの０．１％(ｖ／ｖ)トリフルオロ酢酸で、再びピペットマンを用いて洗浄した。これらのペプチドを、次いで、１．５μｌの５０％アセトニトリル(１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸を含むＤＩＷ中)を用いて溶出させた。この溶離液を、次いで、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ標的上にスポットして、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ Ａｕｔｏ Ｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより分析した。図５Ｂに示したように、データベース検索によっては、ペプチドは陽性に同定されなかった。
【００３９】
明らかに、単一通過の、真空に駆動される、自動化しやすい適用に関して、二側面形成(非切断)法により創生された構造は、優れたマススペクトルを生じた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の冷却液に部分的に浸漬されているマルチウェルプレートの透視図である。
【図２】細部描写Ａに拡大して示した複合体構造を有するマルチウェルデバイスの単一ウェルの透視図である。
【図３】本発明のデバイスを通る流れを慣用のデバイスと比較するグラフである。
【図４Ａ】従来技術により形成された１５マイクロメートルの名目直径を有する粒子を有する複合体構造の断面のＳＥＭである。
【図４Ｂ】本発明により形成された１５マイクロメートルの名目直径を有する粒子を有する複合体構造の断面のＳＥＭである。
【図５Ａ】本発明のデバイスを通る単一通過にかけた試料のスペクトルである。
【図５Ｂ】従来技術のデバイスを通る単一通過にかけた試料のスペクトルである。
【図６】複合体構造を含む多数の開口を有するウェルの流し口の断面図である。
【符号の説明】
【００４１】
１０：マルチウェルプレート
１２：ウェル
１５：排水口
２０：冷却液
２１：容器
３０：構造
１０００：上部
１００１：小さいチャンネル
１００２：支持エレメント
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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