(57)【要約】本発明は、生物によって産生される化合物の収量を高めるための方法に関する。より詳細には、本発明は、内因性糖（その植物で通常産生されるもの）の外来性糖（同じ発達段階にある植物では通常産生されないもの）への変換を触媒する糖代謝酵素を産生させることによって、植物組織の、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または甘味度を高めるための、または内因性炭水化物の含量を高めるための方法に関する。本発明はまた、外来性糖を生成する糖代謝酵素を産生し、結果的により多くの発酵性総炭水化物含量をもたらす植物および植物部分、ならびにそれらに由来する発酵性炭水化物およびその他の産物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照植物の対応するシンク組織と比較して、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量もしくは甘味度（sweetness）が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているシンク組織を有する植物を作製する方法であって、転写制御エレメントと機能的に結合している、植物の内因性糖の外来性糖（alien sugar）への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む複数のトランスジェニック植物から、そのシンク組織の総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物の含量が対照植物に対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で、糖代謝酵素を産生するトランスジェニック植物を選択する段階を含む方法。
【請求項２】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項3記載の方法。
【請求項５】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項3記載の方法。
【請求項６】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項1および3〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していて、かつ炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
外来性糖が、内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
糖代謝酵素が植物細胞において、その酵素をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
酵素をコードするポリヌクレオチドが構成的に発現される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
酵素をコードするポリヌクレオチドが選択的に発現される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
酵素をコードするポリヌクレオチドが植物のシンク組織において選択的に発現される、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
シンク組織が根、塊茎、茎、桿、果実または種子より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
植物がスクロースまたは他の糖を貯蔵産物として蓄積することが可能である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
植物が草木、野菜、穀類、マメ科植物および果実より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
植物がサトウキビ、サトウダイコン、サトウモロコシ、スイートコーン、エンドウ、ブドウ、トマトまたはバナナより選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
内因性糖および外来性糖が単糖類、オリゴ糖類および糖誘導体より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
糖誘導体が糖アルコール、糖酸、アミノ糖、デオキシ糖、メチル糖、糖リン酸およびUDP糖より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
内因性糖がスクロースであり、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
糖代謝酵素がスクロースイソメラーゼである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
糖代謝酵素がイソマルツロースシンターゼである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
糖代謝酵素がUQ68Jである、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
可溶性炭水化物がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
対照植物細胞と比較して、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているトランスジェニック植物シンク細胞であって、植物細胞の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントをそのヌクレオーム中に含んでおり、その総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または内因性炭水化物の含量が対照植物細胞のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が産生される、トランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項２７】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項26記載のトランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項２８】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項26または請求項27記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２９】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項28記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３０】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項28記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３１】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項28〜30のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３２】
糖代謝酵素が内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項26および28〜31のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３３】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項32記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３４】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項33記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３５】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項26〜24のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３６】
植物細胞が植物の茎細胞である、請求項26〜35のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３７】
植物がサトウキビである、請求項36記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３８】
可溶性炭水化物が単糖より選択される、請求項26記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３９】
単糖がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項38記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４０】
対照植物の対応するシンク組織と比較して、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量もしくは甘味度が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているシンク組織を有するトランスジェニック植物であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、ポリヌクレオチドが植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合していて、かつそのシンク組織の総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量もしくは甘味度、または内因性炭水化物の含量が対照植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が産生される、トランスジェニック植物。
【請求項４１】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項40記載のトランスジェニック植物。
【請求項４２】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項40または請求項41記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項42記載のトランスジェニック植物。
【請求項４４】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項42記載のトランスジェニック植物。
【請求項４５】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項42〜44のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項４６】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項40および42〜45のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項46記載のトランスジェニック植物。
【請求項４８】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項47記載のトランスジェニック植物。
【請求項４９】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項40〜48のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項５０】
植物細胞が植物の茎細胞である、請求項40〜49のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項５１】
植物がサトウキビである、請求項50記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
可溶性炭水化物が単糖より選択される、請求項40記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
単糖がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項52記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
対照植物シンク組織と比較して、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量もしくは甘味度が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているトランスジェニック植物シンク組織であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、ポリヌクレオチドが少なくとも一部の植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合していて、かつその総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物の含量が対照植物のシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が植物のソース組織、および/またはシンク組織で産生される、トランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５５】
シンク組織が果実、種子、茎、桿、塊茎および根より選択される、請求項54記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５６】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項54記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５７】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項54〜56のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５８】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項57記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５９】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項57記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６０】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項57〜59のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６１】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項54、55および57〜60のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６２】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項61記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６３】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項62記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６４】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項54〜63のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６５】
植物細胞が植物の茎細胞である、請求項54〜65のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６６】
植物がサトウキビである、請求項65記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６７】
可溶性炭水化物が単糖より選択される、請求項54記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６８】
単糖がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項67記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６９】
可溶性炭水化物を生産する工程であって、請求項40〜53のいずれか一項記載の植物、または請求項54〜68のいずれか一項記載のシンク組織から可溶性炭水化物を採取する段階を含む工程。
【請求項７０】
可溶性炭水化物が、スクロース、グルコースおよびフルクトースを含む単糖より選択される、請求項69記載の工程。
【請求項７１】
発酵による産物を生産する工程であって、発酵のための基質であり請求項69に従って生産される炭水化物を発酵させる段階を含む工程。
【請求項７２】
それによって生産される発酵産物が、エタノール、メタノール、1,3-プロパンジオール、酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、ソルビトール、リジン、ポリヒドロキシアルカノエート、二酸化炭素、産業用酵素またはこれらのいずれかを含むポリマーより選択される少なくとも1つの物質である、請求項71記載の工程。
【請求項７３】
外来性糖を含むトランスジェニック植物シンク細胞であって、トランスジェニック植物が、植物細胞の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントをそのヌクレオーム中に含み、糖代謝酵素が、植物細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含み、その結果、内因性植物炭水化物の相応するほどの減少を伴わずに外来性糖の蓄積がもたらされる、トランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項７４】
細胞内区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項73記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項７５】
外来性糖を含むシンク組織を有するトランスジェニック植物であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードする、植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合したポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、糖代謝酵素が、植物の細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含み、その結果、内因性植物炭水化物の相応するほどの減少を伴わずに外来性糖の蓄積がもたらされる、トランスジェニック植物。
【請求項７６】
細胞内区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項75記載のトランスジェニック植物。
【請求項７７】
サトウキビ・シンク組織の可溶性炭水化物含量を高めるための方法であって、サトウキビの細胞において、スクロースの、同じ発達段階にあるサトウキビでは通常産生されない外来性糖への変換を触媒するスクロースイソメラーゼ酵素を産生させる段階を含み、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択されるような方法。
【請求項７８】
スクロースイソメラーゼ酵素が、スクロースの外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
スクロースイソメラーゼ酵素が、糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項77または請求項78記載の方法。
【請求項８０】
スクロースイソメラーゼ酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
スクロースイソメラーゼ酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項79記載の方法。
【請求項８２】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項79〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
スクロースイソメラーゼ酵素が植物細胞において、スクロースの外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項77および79〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
スクロースイソメラーゼ酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項77〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
対照サトウキビ・シンク細胞と比較して可溶性炭水化物含量が増しているトランスジェニックサトウキビ・シンク細胞であって、スクロースの、スクロースイソメラーゼを産生しない対照サトウキビ細胞によって同じ条件下では産生されない外来性糖への変換を触媒するスクロースイソメラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントをそのヌクレオーム中に含んでおり、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択される、トランスジェニックサトウキビ・シンク細胞。
【請求項８８】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項87記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項８９】
スクロースイソメラーゼ酵素が、植物糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項87または請求項88記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９０】
スクロースイソメラーゼ酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項89記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９１】
スクロースイソメラーゼ酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項89記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９２】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項89〜91のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９３】
スクロースイソメラーゼ酵素がスクロースの外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生され、細胞分裂および／または伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する、請求項87および89〜92のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９４】
スクロースイソメラーゼ酵素がスクロースの外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生され、細胞分裂および／または伸長が起こっている、請求項87および89〜92のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９５】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項87〜94のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。。
【請求項９６】
桿細胞である、請求項87〜95のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９７】
柔組織細胞である、請求項96記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９８】
対照サトウキビの対応するシンク組織と比較して可溶性炭水化物含量が増しているシンク組織を有するトランスジェニックサトウキビであって、スクロースの、その酵素を産生しない対照サトウキビの対応する細胞によっては内因性に産生されない外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択され、ポリヌクレオチドが植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合している、トランスジェニックサトウキビ。
【請求項９９】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項98記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１００】
スクロースイソメラーゼ酵素が、植物糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項98または請求項99記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０１】
スクロースイソメラーゼ酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項100記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０２】
スクロースイソメラーゼ酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項100記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０３】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項100〜102のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０４】
スクロースイソメラーゼ酵素が、スクロースの外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項98および100〜103のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０５】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項104記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０６】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、スクロースの外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項104記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０７】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積する、請求項98〜106のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０８】
シンク組織が桿組織である、請求項98〜107の一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０９】
SEQ ID NO：10に示された配列に対して、もしくはその生物活性部分に対して、またはSEQ ID NO：10に示された配列と少なくとも約93、94、95、96、97、98、99％の配列同一性を示すこれらの変種に対して、一致するか相補的であるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項１１０】
SEQ ID NO：10に示された配列に対して、またはSEQ ID NO：10に示された配列に対して少なくとも約93％の配列同一性を示すその変種に対して、一致するか相補的であるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項１１１】
SEQ ID NO：20を含まず、しかもSEQ ID NO：10に示された配列と少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項１１２】
請求項109〜111のいずれか一項記載のDNA分子が、転写させようとする外来性または内因性核酸配列と機能的に結合したものを含む、キメラDNA構築物。
【請求項１１３】
形質転換植物細胞を作製するための方法であって、形質転換植物細胞を得るために、再生可能な植物細胞に請求項112記載のキメラDNA構築物を導入する段階、および形質転換植物細胞を同定または選択する段階を含む方法。
【請求項１１４】
形質転換植物細胞から安定な遺伝子形質転換体を選択するための方法であって、形質転換植物細胞を得るために、再生可能な植物細胞に請求項112記載のキメラDNA構築物を導入する段階、および形質転換植物細胞から形質転換植物系統を同定または選択する段階を含む方法。
【請求項１１５】
分化したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、再生可能な形質転換細胞を得るために、請求項112記載のキメラDNA構築物を再生可能な植物細胞に導入する段階、形質転換細胞の集団を同定または選択する段階、およびその集団から分化したトランスジェニック植物を再生させる段階を含む方法。
【請求項１１６】
請求項112記載のキメラDNA構築物を含む植物細胞。
【請求項１１７】
請求項112記載のキメラDNA構築物を含む細胞を含む、分化した植物体。
【請求項１１８】
所望の代謝産物のより高収量での生産のための方法であって、生物体によって通常感知される内因性基質化合物の、生物体内部で同等な様式では認知されない産物化合物への変換を触媒し、その結果、代謝フローを変化させる効果を及ぼし、所望の内因性化合物のより高収量での蓄積をもたらす酵素をコードする導入ポリヌクレオチドの生物体内部での発現を含む方法。
【請求項１１９】
産物化合物が生物体によって代謝されない、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
産物化合物が、生物体によって通常は感知されない、基質化合物の異性体である、請求項118または請求項119記載の方法。
【請求項１２１】
導入遺伝子産物が、代謝活性のあるサイトゾル区画、および代謝産物貯蔵区画の間に分布している、請求項118〜120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
代謝産物貯蔵区画が液胞、または液胞および細胞外間隙より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
変換活性が生物体の貯蔵組織に選択的に付与され、貯蔵組織の形成の前駆体として活発な生長および伸長が起こっている組織には付与されない、請求項118〜122のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
所望の代謝産物が内因性基質化合物を含む、請求項118〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
イソマルツロースを生産するための方法であって、貯蔵備蓄物としてスクロースを通常蓄積する植物体において、スクロース貯蔵区画に選択的にスクロースイソメラーゼ活性を付与するように任意に改変されたスクロースイソメラーゼUQ68Jをコードする導入ポリヌクレオチドを発現させる段階を含む方法。
【請求項１２６】
植物がサトウキビ、モロコシまたはサトウダイコンより選択される、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
スクロース貯蔵区画がスクロース貯蔵液胞、または液胞および細胞外間隙より選択される、請求項125記載の方法。
【請求項１２８】
ポリヌクレオチドの発現が、植物の桿を含む、成熟スクロース貯蔵組織において選好的に起こる、請求項125記載の方法。
【請求項１２９】
イソマルツロースを植物から採取する段階をさらに含む、請求項125〜128のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、生物によって産生される化合物の収量を高めるための方法に関する。より詳細には、本発明は、内因性糖（その植物で通常産生されるもの）の外来性糖（同じ発達段階にある植物では通常産生されないもの）への変換を触媒する糖代謝酵素を産生させることによって、植物組織の、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または甘味度を高めるための、または内因性炭水化物の含量を高めるための方法に関する。本発明はまた、外来性糖を生成する糖代謝酵素を産生し、結果的により多くの発酵性総炭水化物含量をもたらす植物および植物部分、ならびにそれらに由来する発酵性炭水化物およびその他の産物にも関する。
【０００２】
本明細書で言及した刊行物の文献学的な詳細は、明細書の最後にまとめている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
植物は、産業的バイオトランスフォーメーションのための再生可能なバイオエネルギー、生体材料および供給原料の主な供給源である。植物における所望の糖の収量および濃度は、下流部門での産業プロセスの技術的および経済的な実現可能性に関する主要な決定要因である。しかし、糖の生合成のための植物の代謝ネットワークにはかなりの緩衝性および冗長性があり、そのため、糖の代謝における重要な遺伝子の改変は一般に、採取しうる糖の収量には有用な変化が起こらないという結果をもたらす（Moore, 1995；Nguyen-Quoc and Foyer, 2001；Fernie et al., 2002）。例えば、Botha et al. (2001)は、スクロース分解における重要な酵素（酸転化酵素）の活性が70％低下しても、トランスジェニックサトウキビにおけるスクロースの収量および純度の有意な変化は起こらないことを示している。
【０００４】
スクロースイソメラーゼは、種々の微生物を含む生物体によって産生される酵素であり、二糖類スクロースをイソマルツロース（パラチノース）またはトレハルロースなどの異性体に変換する能力を備えている。スクロースイソメラーゼは、二糖類反応産物、反応産物におけるグルコースおよびフルクトースなどの単糖類の割合、酵素の速度論的特性、至適反応条件、ならびに至適条件からの差異に対する酵素の感受性を含め、特性の点で多様である（Veronese and Perlot, 1999）。
【０００５】
スクロースは、植物内部でのソース（光合成）組織とシンク（発育および貯蔵）組織との間の炭素フラックスにおける主要な中間産物であり、サトウキビおよびサトウダイコンといったある種の植物における主な貯蔵産物である。いくつかの報告により、植物に導入されたスクロースイソメラーゼ遺伝子の発現がスクロースのイソマルツロースなどの異性体への変換を引き起こすことが示されており、この変換が異性体の産業的生産にとって有益である可能性が予想されている。重点は、所望の産業製品としての（Birch and Wu, 2002；Bornke et al., 2002b）、または派生的な産業原料へのインプランタ（in planta）変換のための前駆物質としての（Kunz et al., 2002）、スクロースの異性体への高度または完全な変換に向けられてきた。
【０００６】
また、必須な炭素およびエネルギーの備蓄が利用不能な形態に変換されることにより、変換が植物細胞にとって致死的である可能性も想定されており、これには人工的な雄性不稔などを目的とする細胞除去の用途がある（Bornke and Sonnewald, 2001）。実際、いくつかの研究により、スクロースイソメラーゼ導入遺伝子の発現が植物の発育および収量にとって有害であり、重大な発育異常、デンプン含量の減少および可溶性炭水化物含量の減少を引き起こすことが示されている（Bornke et al., 2002a, b）。
【０００７】
タバコでは、スクロースイソメラーゼ遺伝子を、スクロースイソメラーゼ酵素を細胞外（アポプラスト）間隙に向かわせるためのジャガイモプロテイナーゼインヒビターIIシグナルペプチドと融合させたものの、CaMV35Sプロモーターからの構成性発現により、植物の発育に対して重大かつ有害な影響がみられた。低レベルのイソマルツロース（0.3〜0.6mM m-2葉組織）が検出され、これは葉デンプンにおける正常炭水化物レベルの約20％〜44％と同等であり、またはこのソース組織における正常な低い一過性スクロースレベルの10〜45倍であった。シンク組織における貯蔵炭水化物に対する影響は報告されていない。葉およびその他の器官の発育は高度に障害され、植物体は再生することができなかった（Bornke et al., 2002a）。
【０００８】
ジャガイモでは、塊茎特異的パタチンB33プロモーター由来の同じくアポプラズムを標的とするスクロースイソメラーゼの発現により、生長および発育に明らかな有害作用がみられない植物体が得られている。この場合もイソマルツロース収量は低く（10-15mol g-1塊茎組織生重量、これは塊茎デンプンにおける正常な貯蔵炭水化物レベルの約4％〜5％に相当する）、このデンプン貯蔵性シンク組織における通常のスクロースレベルよりも幾分下回った。さらに、スクロース、ヘキソースおよびデンプンの含量の随伴性減少のために、改変された系統では総可溶性炭水化物（デンプンを除く）および総発酵性炭水化物（デンプンを含む）の収量も減少した（Bornke et al., 2002b）。
【０００９】
これらの問題を克服するために、本発明者らは、（i）スクロースイソメラーゼ酵素、特にUQ68Jなどの高効率スクロースイソメラーゼ；（ii）貯蔵炭水化物としてスクロースを蓄積するサトウキビなどの植物種の利用；および（iii）導入したスクロースイソメラーゼのスクロース貯蔵区画（例えば、サトウキビの場合には成熟桿の内部のスクロース貯蔵性柔組織の大きな液胞）へのターゲティング、を組み合わせることに基づく新規アプローチを考案した。イソマルツロースは植物中で代謝されないため、本発明者らは、それはスクロースとは異なり、貯蔵効率および採取しうる収量を低下させる可能性のある成熟貯蔵組織での分解および合成という「無益回路」の対象にならないという仮説を立てた。このため、本発明者らのアプローチは、従来のアプローチで報告されているこれらの収量の減少とは異なり、改変植物における可溶性炭水化物および発酵性炭水化物の収量の増加を実現する目的でデザインされた。この仮説に一致して、サトウキビにおいて、成熟した茎柔組織におけるスクロース貯蔵液胞を標的とするスクロースイソメラーゼ（例えば、高効率スクロースイソメラーゼUQ68J）を発現させることにより、汁中で500mMを上回るイソマルツロース濃度が得られた。これは非改変サトウキビで得られる総貯蔵炭水化物含量を上回る上に、それに相応した内因性糖の含量の減少を伴わずに達成されうることから、改変系統における総可溶性糖含量の大きな増加をもたらす。
【００１０】
植物はスクロースに対して高度に適応したセンサーおよび輸送体を有するが、一般に、これらのスクロースセンサーおよび輸送体はイソマルツロースなどの異性体に対して同じように応答することはできないと考えられている（Loreti et al., 2000；Sinha et al., 2002）。スクロースとは全く対照的に、植物はイソマルツロースなどのいくつかの異性体を炭素およびエネルギーの源として代謝することはできない（Sinha et al., 2002）。しかしながら、これらの異性体は、植物において細胞の遺伝子発現パターンの変化を誘発し、スクロース代謝またはシグナル伝達カスケードに関与するある種の酵素の活性を変化させることができる（Fernie et al., 2001；Sinha et al., 2002）。
【００１１】
ジャガイモ塊茎の組織切片に対するイソマルツロースの外因性供給によって他の外因的に供給される糖の代謝が変化したことから、Fernie et al. (2001)は、ジャガイモ塊茎に対してイソマルツロースを供給することはデンプン合成を増加させる新たな手法であると示唆している。しかし、ジャガイモ塊茎などの植物器官に対するイソマルツロースのような物質の外因性供給は産業的用途には現実的でない可能性が高く、デンプン収量を高めるためにこのアプローチが検証または適用された報告もない。Bornke et al.(2002b)による検討では、アポプラスト性スクロースイソメラーゼ遺伝子を塊茎特異的プロモーターから発現するトランスジェニックジャガイモ植物体は、塊茎中での通常のスクロース含量に近いレベルでイソマルツロースを蓄積したが、デンプンおよび総可溶性糖の収量に関しては減少を示した。
【００１２】
植物がスクロースとイソマルツロースなどの類縁化合物とを識別感知する能力に関する考察に基づき、本発明者らは、導入したスクロースイソメラーゼの適切な発現により、植物における内因性糖の収量の増加を実現するためのもう一つのアプローチを考案した。これは、以前に開発された戦略の意図（イソマルツロースまたはイソマルツロースの誘導体の採取のために植物を作製すること）および成果（内因性炭水化物の収量が減少した植物）とは異なる。植物代謝に対して働くシグナル伝達および制御機構は十分には解明されていないため、本発明者らは、所望の産業的成果（内因性炭水化物の収量が増加した植物）が得られる条件の範囲を決定するためにかなりの実験を行った。この点に関して、サイトゾル区画を対象として、または複数の区画に配分されてスクロースイソメラーゼを低レベルで発現するように操作されたサトウキビ系統で、汁中に700〜900mMスクロース当量の範囲の総可溶性糖含量を実現しうることが判明した。これは非改変サトウキビから通常得られる総貯蔵炭水化物含量の約2倍であり、採取される糖組成の変化をほとんど伴わずに実現しうる。本アプローチは、例示的に用いているスクロースイソメラーゼ遺伝子、イソマルツロース変換産物またはサトウキビ植物体のいずれにも限定されない。これはより広範囲に、生物体によって通常感知される内因性基質化合物の、生物体内部で同等な様式では認知されない産物化合物への部分的変換を引き起こして、その結果、代謝フローを変化させる効果を及ぼし、所望の内因性化合物のより高収量での蓄積をもたらす導入遺伝子の生物体の内部での発現を含む。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、一部には、内因性糖の、同じ発達段階にある植物では通常産生されない糖への部分的変換をもたらす植物内部での遺伝子の適切な発現パターンが、その植物におけるソース-シンクシグナル伝達を変化させ、総可溶性炭水化物の含量の増加を招くという発見を根拠に置いている。この発見を、植物シンク組織の総炭水化物含量または甘味度を改変するための方法へ、そのシンク組織の総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または甘味度が非改変植物のシンク組織を上回る遺伝子改変植物へ、およびこのような遺伝子改変植物に由来する産物へと実行に移した。
【００１４】
したがって、本発明の1つの面においては、植物のシンク組織の総可溶性炭水化物含量または甘味度を改変するための方法が提供される。これらの方法は一般に、植物の細胞において、植物の内因性糖の、同じ発達段階にある植物では通常産生されない外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素を産生させる段階であって、糖代謝酵素が、シンク組織の総炭水化物含量または甘味度がその酵素を産生しない植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生される段階を含む。いくつかの態様において、糖代謝酵素は、その酵素をコードするポリヌクレオチドの発現によって植物細胞で産生される。これらの態様において、植物は、その酵素をコードするポリヌクレオチドが転写制御エレメントと機能的に結合したものをそのヌクレオーム中に含む複数のトランスジェニック植物より選択されるトランスジェニック植物である。トランスジェニック植物は、それが糖代謝酵素を、選択されたトランスジェニック植物のシンク組織の総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または甘味度が対照植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生することに基づいて選択される。ポリヌクレオチドはその植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合していることが好適である。いくつかの態様において、その酵素をコードするポリヌクレオチドは構成性に発現され、転写制御エレメントはそれゆえに構成性プロモーターである。また別の態様において、その酵素をコードするポリヌクレオチドは選択的に発現され、これには時期的な協調、組織特異的発現および細胞内局在が含まれる。これらの後者の態様において、転写制御エレメントは、組織特異的プロモーター、発生的な調節を受けるプロモーターまたは誘導性プロモーターより選択される。
【００１５】
いくつかの態様において、シンク組織の総炭水化物含量または甘味度は、糖代謝酵素を植物細胞において、内因性糖の外来性糖への部分的変換、一般的には約20％未満、しかし典型的には約15％未満、より一般的には約10％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生させることによって高められる。この部分的変換は、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長（cell expansion）が起こっている組織の内部で起こることが好適である。これらの態様において、糖代謝酵素は植物細胞のサイトゾル中で活性を有することが好適であり、またはその活性がサイトゾルならびに糖の貯蔵および／または輸送に関与する細胞内区画との両者に分布してもよい。これらの態様において、外来性糖は内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積することが好適である。
【００１６】
また別の態様において、シンク組織の総炭水化物含量または甘味度は、糖貯蔵のために用いられる植物細胞の細胞内区画に向けて糖代謝酵素のターゲティングを行うことによって高められる。これらの態様において、糖代謝酵素は、内因性糖の外来性糖への実質的な変換、一般に少なくとも約20％、しかし典型的には少なくとも約40％、より一般的には少なくとも約60％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で細胞内区画に存在することが好適である。この実質的な変換は、細胞分裂および細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こることが好適である。この実質的な変換は、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部では起こらないことが望ましい。細胞内区画は、糖を貯蔵する区画、典型的には液胞、または液胞およびアポプラスト間隙であることが好適である。これらの態様において、外来性糖は内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積することが好適である。
【００１７】
典型的には、炭素シンクとして機能する植物細胞には、光合成を行わない組織または器官および貯蔵性の組織または器官における細胞（例えば根、塊茎、桿、果実または種子など）、ならびに葉などのソース器官の非光合成細胞が含まれる。したがって、植物は典型的には、そのシンク組織が、糖含量によって左右される経済的価値を有する植物である。このような植物には、商業的な意義のある野菜および果実を生み出す種、ならびにスクロースおよびその他の糖の抽出のために収穫される種（サトウキビおよびサトウダイコンを含む）が含まれる。
【００１８】
内因性糖および外来性糖は、単糖類、オリゴ糖類、ならびに糖アルコール、糖酸、アミノ糖およびその他の変種（デオキシ糖、メチル糖など）を含む糖誘導体より選択される。1つの態様において、内因性糖はスクロースであり、外来性糖はイソマルツロースおよびトレハルロースより選択される。この態様において、糖代謝酵素は典型的にはスクロースイソメラーゼである。
【００１９】
1つの関連した面において、本発明は、内因性炭水化物の含量が対照植物の対応するシンク組織と比較して増しているシンク組織を有する植物を作製する方法を提供する。これらの方法は一般に、所望の内因性炭水化物含量を有するトランスジェニック植物を、転写制御エレメントと機能的に結合している、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む複数のトランスジェニック植物より選択する段階を含む。トランスジェニック植物は、それが糖代謝酵素を、そのトランスジェニック植物のシンク組織の内因性炭水化物の含量が対照植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生することに基づいて選択される。
【００２０】
もう1つの面において、本発明は、本明細書に定義するような対照植物細胞と比較して、総炭水化物含量が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているトランスジェニック植物細胞を提供する。本トランスジェニック植物細胞のヌクレオームは、糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントを含む。この糖代謝酵素は植物細胞の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する。糖代謝酵素は、トランスジェニック植物細胞の総炭水化物含量または内因性炭水化物の含量が対照植物細胞のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生されることが有利である。
【００２１】
さらにもう1つの面において、本発明は、本明細書に定義する対照植物の対応するシンク組織と比較して、総炭水化物含量もしくは甘味度が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているシンク組織を有するトランスジェニック植物を提供する。本トランスジェニック植物は、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含む。発現のために、このポリヌクレオチドは、植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合している。1つの態様において、糖代謝酵素は、トランスジェニック植物のシンク組織の総炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物の含量が対照植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生される。
【００２２】
さらにもう1つの面において、本発明は、本明細書に定義する対照植物と比較して総炭水化物含量もしくは甘味度が増している、または内因性炭水化物の含量が増しているトランスジェニック植物シンク組織を提供する。本トランスジェニック植物シンク組織は、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含む。発現のために、このポリヌクレオチドは少なくとも一部の植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合している。1つの態様において、糖代謝酵素は、植物のソースおよび／またはシンク組織において、トランスジェニック性シンク組織の総炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物の含量が対照植物シンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生される。シンク組織は、果実、種子、桿、塊茎および根より選択されることが好適である。
【００２３】
本発明のさらにもう1つの面は、植物体または以上に広範に記載したシンク組織から採取される総炭水化物または内因性炭水化物を提供する。1つの態様において、炭水化物は、スクロース、グルコースおよびフルクトースを含む単糖より選択される。
【００２４】
本発明のさらにもう1つの面においては、発酵による産物を生産する工程であって、発酵のための基質であって植物体または以上に広範に記載したシンク組織から採取される炭水化物を発酵させる段階を一般に含む工程が提供される。この工程によって生産される発酵産物は、エタノール、酢酸、乳酸、二酸化炭素、または植物体もしくは以上に広範に記載したシンク組織から採取される炭水化物を含む基質に対する発酵によって生じる他の産物のうち1つまたは複数を含むことが好適である。
【００２５】
もう1つの面において、本発明は、植物において、同じ発達段階にある植物では内因性糖として内因性に産生されない外来性糖を産生させるための方法を提供する。これらの方法は一般に、植物の細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画に対して、内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素を送達することを含む。いくつかの態様において、細胞内区画は液胞またはアポプラスト間隙より選択される。糖代謝酵素は、総糖含量の実質的な増加（これは一般に、対応する非改変植物の内因性糖含量を少なくとも約10％、しかし好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約100％上回る）を引き起こすレベルまたは機能的活性で、細胞内区画に対して送達されることが有利である。外来性糖は、内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積することが好適である。
【００２６】
さらにもう1つの面において、本発明は、本明細書に定義する外来性糖を含むトランスジェニック植物細胞を提供する。本トランスジェニック植物細胞のヌクレオームは、植物細胞の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントを含む。この糖代謝酵素は植物細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画に対して酵素を向かわせるターゲティングシグナルを含む。
【００２７】
さらにもう1つの面において、本発明は、本明細書に定義する外来性糖を含むシンク組織を有するトランスジェニック植物を提供する。本トランスジェニック植物は、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードし、しかも植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合したポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞であって、糖代謝酵素が植物の細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画に対して酵素を向かわせるターゲティングシグナルを含むような細胞を含む。
【００２８】
さらにもう1つの面において、本発明は、本明細書に定義する外来性糖を含むトランスジェニック植物シンク組織を提供する。本トランスジェニック植物シンク組織は、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードし、しかも少なくとも一部の植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合したポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含み、糖代謝酵素はシンク組織の細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画に対して酵素を向かわせるターゲティングシグナルを含む。シンク組織は、果実、種子、桿、塊茎および根より選択されることが好適である。
【００２９】
生物体の内部での、生物体によって通常感知される基質内因性化合物の、生物体内部で同等な様式では認知されない産物化合物への部分的変換を引き起こす導入遺伝子の発現が、代謝フローを変化させ、所望の内因性化合物のより高収量での蓄積をもたらしうることが示されたことは極めて新規かつ予想外のことであり、これには詳細な例として本明細書に提示したスクロースイソメラーゼ遺伝子、イソマルツロース変換産物、炭水化物内因性化合物またはサトウキビ植物体の範囲を上回る産業上の有用性がある。したがって、本発明は、生物体によって通常感知される基質内因性化合物の、生物体内部で同等な様式では認知されない産物化合物への部分的変換を引き起こして、その結果、代謝フローを変化させる効果を及ぼし、所望の内因性化合物のより高収量での蓄積をもたらす導入遺伝子の生物体内部での発現を広範囲に含む。
【００３０】
本発明者らはまた、植物（例えば、単子葉植物、特にサトウキビなどのイネ科の単子葉植物）における茎特異的な遺伝子発現を導きうる、その配列がSEQ ID NO：10に示されている新規プロモーターも発見した。本プロモーターは過去に検討されたプロモーターを用いては得られない有用な発現パターンを付与し、それは配列がSEQ ID NO：20に示されている領域が存在しないことを含め、いくつかのエレメント中のプロモーターとは構造的に異なる。したがって、本発明はもう1つの面において、SEQ ID NO：10に示された配列に対して、もしくはその生物活性部分に対して、またはSEQ ID NO：10に示された配列と少なくとも約93、94、95、96、97、98、99％の配列同一性を示すこれらの変種に対して、一致するか相補的であるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子を提供する。この変種はSEQ ID NO：20を含まず、しかもSEQ ID NO：10に示された配列と少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが望ましい。
【００３１】
通常、本発明のプロモーターは、関心対象の植物においてコード配列を発現させるためのキメラ構築物を作製する目的でコード配列と融合される。続いて構築物を、選択した任意の方法により、宿主植物細胞または植物体または植物体の部分に導入することができる。したがって、本発明のもう1つの面は、以上に広範に記載したDNAが、転写させようとする外来性または内因性核酸配列と機能的に結合したものを含むキメラDNA構築物を提供する。いくつかの態様において、キメラDNA構築物はさらに、植物細胞において、転写を終結させる、および／または転写されたRNA配列の3'末端へのポリアデニル化ヌクレオチド配列の付加を引き起こす働きをする外来性または内因性DNA配列と機能的に結合した3'非翻訳配列を含む。
【００３２】
外来性または内因性DNA配列は、それが導入されている、または導入される予定である植物細胞に対して外来性または内因性である。いくつかの態様において、外来性または内因性DNA配列は、構造タンパク質もしくは調節タンパク質をコードし、または代替的には、対応する標的遺伝子の発現を調節しうる転写物をコードする。いくつかの態様において、転写物はアンチセンスRNAまたはリボザイム、または対応する標的遺伝子の発現のダウンレギュレーションを目的とするその他の転写領域を含む。例えば、その他の転写領域には、対応する標的遺伝子のセンス抑制（共抑制）を目的とするセンス転写物が含まれうる。
【００３３】
さらにもう1つの態様において、本発明は、形質転換植物細胞を作製するための方法であって、形質転換植物細胞を得るために、再生可能な植物細胞に以上に広範に記載したキメラDNA構築物を導入する段階、および形質転換植物細胞を同定または選択する段階を含む方法を想定している。関連した1つの面において、本発明は、以上に広範に記載したキメラDNA構築物を含む形質転換植物細胞を提供する。
【００３４】
さらにもう1つの面において、本発明は、形質転換植物細胞から安定な遺伝子形質転換体を選択するための方法であって、形質転換植物細胞を得るために、以上に広範に記載したキメラDNA構築物を再生可能な植物細胞に導入する段階、および形質転換植物細胞から形質転換植物系統を同定または選択する段階を含む方法を提供する。再生可能な細胞は、再生可能な双子葉植物細胞であってもよいが、通常は再生可能なイネ科の単子葉植物の細胞などの単子葉植物細胞である。いくつかの態様において、形質転換細胞におけるキメラDNA構築物の発現は、表現型上の特徴を形質転換細胞に付与する。
【００３５】
さらにもう1つの面において、本発明は、分化したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、再生可能な形質転換細胞を得るために、以上に広範に記載したキメラDNA構築物を再生可能な植物細胞に導入する段階、形質転換細胞の集団を同定または選択する段階、およびその集団から分化したトランスジェニック植物を再生させる段階を含む。いくつかの態様において、キメラDNA構築物の発現は、分化したトランスジェニック植物を対応する非トランスジェニック植物に対して識別可能にする。関連した1つの面において、本発明は、以上に広範に記載したキメラDNA構築物を含む植物細胞を含む、分化したトランスジェニック植物を提供する。キメラDNA構築物は分化したトランスジェニック植物の完全な周期を経てその子孫へと継代されるため、それは子孫植物によっても発現される。したがって、本発明はまた、分化したトランスジェニック植物から派生する、種子、その他の植物部分、組織および子孫植物も提供する。
(表Ａ)配列の簡単な説明
2006525797.tif 000002
【００３６】
発明の詳細な説明
1. 定義
他に定義する場合を除き、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価なあらゆる方法および材料を本発明の実施または試験に用いうるが、好ましい方法および材料を記載している。本発明の目的において、以下の用語は以下のように定義される。
【００３７】
冠詞の「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本明細書において、前記冠詞の1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）の文法上の目的語を指すために用いられる。例えば、「1つの要素（an element）」は1つの要素または複数の要素のことを意味する。
【００３８】
「約（about）」という用語は、本明細書において、基準となる数量、レベル、値、寸法、長さ、位置、サイズまたは量に対して、最大で30％、好ましくは最大で20％、より好ましくは最大で10％異なる数量、レベル、値、寸法、長さ、位置、サイズまたは量を指して用いられる。
【００３９】
「外来性（alien）」という用語は、本明細書において、改変植物において産生され、同じ発達段階にある対応する非改変植物では通常産生されない物質のことを指して用いられる。
【００４０】
「生物活性部分」という用語は、プロモーター配列に対して適用される場合、参照プロモーター配列の活性の少なくとも約0.1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30％を有する部分のことを指す。また、「生物活性部分」という用語が、RNA転写を開始させる、または特定の遺伝子と融合されて植物細胞に導入された場合に指定DNA配列のそのような部分の非存在下で可能であるよりも高いレベルでの遺伝子の発現を引き起こす、指定DNA配列の部分のことを指すことも理解されると考えられる。本発明の範囲に含まれるものには、少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、400、500、600、700、800ヌクレオチド長、さらには900ヌクレオチド長の生物活性部分がある。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「シス作用性配列」「シス作用性エレメント」または「シス調節領域」または「調節領域」または類似の用語は、発現可能な遺伝子配列に対して適切に配置された場合に、その遺伝子配列の発現を少なくとも部分的には調節しうる、任意のヌクレオチド配列を意味すると解釈されるべきである。当業者は、シス調節領域が、遺伝子配列の発現および／または細胞種特異性および／または発生的特異性のレベルを、転写レベルまたは転写後レベルで、活性化する、サイレンス化する、増強する、抑制する、または他の様式で変化させることが可能なことを認識していると考えられる。本発明のある種の態様において、シス作用性配列は、発現可能な遺伝子配列の発現を増強または誘発する活性化配列である。
【００４２】
本明細書の全体を通じて、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」という用語は、明記した工程もしくは要素、または工程もしくは要素の群が含まれることを意味するが、任意の他の工程もしくは要素、または工程もしくは要素の群を除外することを意味してはないことが理解されるであろう。
【００４３】
「に対応する（corresponds to）」または「に対応する（corresponding to）」とは、（a）参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に対して実質的に同一もしくは相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または（b）ペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのことを意味する。この語句は参照ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に対して実質的に同一なアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドも、その範囲内に含む。
【００４４】
「内因性」という用語は、本明細書において、検討中の植物と同じ発達段階にある非改変植物で通常産生される物質のことを指して用いられる。
【００４５】
「外来ポリヌクレオチド」または「外因性ポリヌクレオチド」または「異種ポリヌクレオチド」などの用語は、実験的操作によって植物のゲノム中に導入される任意の核酸（例えば遺伝子配列）のことを指し、これには、その植物に認められる遺伝子配列が、その導入遺伝子が天然に存在する遺伝子に対する何らかの改変（例えば、点変異、選択マーカー遺伝子の存在、loxP部位の存在など）を含む限りにおいて含まれうる。
【００４６】
「遺伝子」という用語は、本明細書において、細胞のゲノムの任意およびすべての離散的なコード領域、ならびに随伴する非コード領域および調節領域を指して用いられる。遺伝子はまた、特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、ならびに発現の調節に関与する隣接性の5'および3'非コード性ヌクレオチド配列も意味するものとする。この点に関して、遺伝子がさらに、所定の遺伝子に天然に随伴するプロモーター、エンハンサー、終止および／もしくはポリアデニル化シグナルなどの制御シグナル、または異種制御シグナルを含んでもよい。DNA配列はcDNAまたはゲノムDNAまたはそれらの断片でもよい。遺伝子を、染色体外での維持のため、または宿主内への組込みのために、適切なベクター中に導入してもよい。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載している。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。この参考文献には水性下および非水性下での方法が記載されており、そのいずれを用いることもできる。本明細書で言及する具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：1）低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中にて約45℃、その後に0.2×SSC、0.1％ SDS中、少なくとも50℃で2回洗浄（低ストリンジェンシー条件では洗浄温度を55℃まで高めることができる）；2）中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、6×SSC中にて約45℃、その後に0.2×SSC、0.1％ SDS中、60℃で1回または複数回の洗浄；3）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、6×SSC中にて約45℃、その後に0.2×SSC、0.1％ SDS中、65℃で1回または複数回の洗浄；および4）超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、0.5Mリン酸ナトリウム、7％ SDS中にて65℃、その後に0,2×SSC、1％ SDS中、65℃で1回または複数回の洗浄。
【００４８】
「イントロン」は、一次転写RNAからスプライシングによって概ね除去され、成熟mRNA分子には存在しない、DNAまたはRNAの領域である。
【００４９】
本明細書における「免疫相互作用性の（immuno-interactive）」という言及は、分子間の任意の相互作用、反応または他の形態での結び付き、特に分子の一方が免疫系の構成要素であるかそれを模倣している場合のそれに対する言及を含む。
【００５０】
「単離された」とは、その天然状態において通常付随する構成要素を実質的または本質的に含まない物質のことを意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、天然で生じる状態においてそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常その断片に隣接する配列から切り離されたDNA断片のことを指す。
【００５１】
「マーカー遺伝子」とは、そのマーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を付与し、それによってこのマーカーを有さない細胞からこのような形質転換細胞を識別することを可能にする遺伝子のことを意味する。選択用マーカー遺伝子は、選択用因子（例えば、除草剤、抗生物質、照射、加熱、または非形質転換細胞を損傷させるその他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」しうる特性を付与する。スクリーニング用マーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち「スクリーニング」によって同定しうる特性（例えば、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または非形質転換細胞に存在しない他の酵素活性）を付与する。
【００５２】
「ヌクレオーム」とは、核酸を構成する全体のことを意味し、これにはゲノム、染色体外核酸分子、ならびに、mRNA、ヘテロ核RNA（hnRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、細胞質低分子RNA（scRNA）、リボソームRNA（rRNA）、翻訳制御RNA（tcRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、eRNA、メッセンジャーRNA干渉性相補RNA（micRNA）または干渉性RNA（iRNA）、クロロプラスト・プラスチドRNA（cpRNA）およびミトコンドリアRNA（mtRNA）などのすべてのRNA分子が含まれる。
【００５３】
「機能的に結合している（operably linked）」または「機能的に結合している（operably connected）」などは、ポリヌクレオチドエレメントが機能的な関係を伴って結び付いていることを指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的関係を伴って配置されている場合に「機能的に結合している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列と機能的に結合している。機能的に結合しているとは、結合される核酸配列が典型的には連続していることを意味し、2つのタンパク質コード領域が結合される必要がある場合には、連続していてしかもリーディングフレーム中にあることを意味する。コード配列は、RNAポリメラーゼが2つのコード配列を単一のmRNAとして転写し、それが続いて両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドへと翻訳されると考えられる場合には、もう一方のコード配列と「機能的に結合している」。コード配列は、発現される配列が最終的にプロセシングされて所望のタンパク質を生じる限り、必ずしも互いに連続していなくともよい。プロモーターを転写可能なポリヌクレオチドと「機能的に結合させる」とは、転写可能なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは他の転写物）を、そのポリヌクレオチドの転写（任意にはその翻訳も）を制御するプロモーターの調節制御下に置くことを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築においては、プロモーターまたはその変種を、転写可能なポリヌクレオチドの転写開始部位からある程度の距離をおいて配置することが一般に好ましく、この距離はその天然環境、すなわちそのプライマーの由来元である遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ等しい。当技術分野で公知であるように、この距離のある程度の変動には機能喪失を伴わない順応性がある。同様に、調節配列エレメント（例えば、オペレーター、エンハンサーなど）の、その制御下に置こうとする転写可能なポリヌクレオチドに対する好ましい配置も、その天然環境、すなわちその由来元である遺伝子における、そのエレメントの配置によって規定される。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「植物」および「分化した植物」とは、分化した植物細胞種、組織および／または器官系を含む、全植物体または植物部分のことを指す。苗木および種子も前記の用語の意味の範囲に含まれる。本発明に含まれる植物は、形質転換法の対象となりうる任意の植物であり、これには被子植物、裸子植物、単子葉植物、および双子葉植物が含まれる。
【００５５】
本明細書で用いる「植物細胞」という用語は、植物に由来するプロトプラストまたは他の細胞、配偶子を生じる細胞、および全植物体へと再生する細胞のことを指す。植物細胞には、植物体の内部の細胞のほか、プロトプラストまたは他の培養下の細胞が含まれる。
【００５６】
「植物組織」とは、根、苗条、果実、塊茎、花粉、種子、腫瘍組織（クラウンゴールなど）ならびに培養下にある植物細胞の種々の形態での集合体（胚およびカルスなど）に由来する、分化組織および未分化組織のことを意味する。
【００５７】
「ポリヌクレオチド変種」および「変種」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または本明細書に以下に定義するストリンジェント条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドのことを指す。これらの用語には、少なくとも1つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも含まれる。したがって、「ポリヌクレオチド変種」および「変種」には、1つまたは複数のヌクレオチドが異なるヌクレオチドによって付加、欠失または置換されたポリヌクレオチドが含まれる。この点に関して、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含むある種の改変を加えて、改変されたポリヌクレオチドに参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持させうることは、当技術分野で十分に理解されている。したがって、これらの用語には、RNA転写を開始させる、または特定の遺伝子と融合されて植物細胞に導入された場合、そのようなポリヌクレオチドの非存在下で可能であるレベルより、高いレベルでの遺伝子の発現を引き起こす、ポリヌクレオチドが含まれる。また、「ポリヌクレオチド変種」および「変種」という用語には、天然に存在する対立遺伝子変種も含まれる。
【００５８】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書で用いる場合、mRNA、RNA、cRNA、cDNAまたはDNAのことを指す。この用語は典型的には、長さが30ヌクレオチドを上回るオリゴヌクレオチドのことを指す。
【００５９】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体、ならびにその変種および合成類似体を指すために本明細書において互換的に用いられる。したがって、これらの用語は、天然に存在するアミノ酸重合体だけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体といった、天然に存在しない合成アミノ酸であるようなアミノ酸重合体にも適用される。
【００６０】
「プロモーター」は、本明細書においてその最も広範な意味で用いられ、これには、mRNAコード領域の一般に上流（5'）にあって、転写の開始およびレベルを制御する、DNAの領域が含まれる。本明細書における「プロモーター」に対する言及は、その最も広範な文脈において解釈されるべきであり、これには、TATAボックスおよびCCAATボックス配列を含む、古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列のほか、発生的および／もしくは環境的な刺激に応じて、または組織特異的もしくは細胞種特異的な様式で遺伝子発現を変化させるそのほかの調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）が含まれる。プロモーターは通常（しかし必然的にではない）、それが発現を調節する対象となる構造遺伝子の上流または5'側に位置する。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは通常、遺伝子の転写開始部位の2kb以内に位置する。本発明によるプロモーターは、細胞における発現をさらに増強するため、および／またはそれと機能的に結合した構造遺伝子の発現の時期もしくは誘導性を変化させるために、開始部位のさらに遠位に位置する、ほかの特異的な調節エレメントをさらに含んでもよい。
【００６１】
「構成性プロモーター」とは、植物の多くのまたはすべての組織において、機能的に結合した転写可能な配列の発現を指令するプロモーターのことを指す。
【００６２】
「シンク組織特異的プロモーター」とは、機能的に結合した転写可能な配列の、植物のシンク組織（例えば、果実組織、根組織、塊茎組織、種子組織、桿組織またはシンク葉組織）における発現を、ソース組織（例えば、葉）を含む植物の他の組織における発現と比較して選好的に指令するプロモーターのことを意味する。
【００６３】
本明細書で用いる「組換えポリヌクレオチド」という用語は、核酸の操作によりインビトロで、自然下では通常認められない形態として形成されたポリヌクレオチドのことを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形で存在しうる。一般に、このような発現ベクターは、ヌクレオチド配列と機能的に結合した転写調節性および翻訳調節性の核酸を含む。
【００６４】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を用いて、すなわち組換えポリヌクレオチドの発現によって作製されたポリペプチドのことを意味する。
【００６５】
植物材料に関連して本明細書で用いられる「再生」という用語は、植物細胞、植物細胞の群、植物の部分（種子を含む）、または植物片（例えば、プロトプラスト、カルスもしくは組織部分から）から、分化した全植物体を生長させることを意味する。
【００６６】
本明細書で用いる「レポーター分子」とは、その化学性性質により、抗原結合分子およびその標的抗原を含む複合体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子のことを意味する。「レポーター分子」という用語は、ラテックスビーズ上での赤血球細胞などといった、細胞凝集または凝集阻害を用いることにも適用される。
【００６７】
本明細書で用いる「選択的発現」とは、果実、塊茎、根または種子を非制限的に含む、植物の特定の器官にほぼ限定された発現のことを指す。この用語はまた、ある器官の特定の発達段階での、例えば桿における早期もしくは後期胚形成または異なる成熟段階での発現；またはある種の環境条件または処理によって誘導される発現のことも指しうる。このため、選択的発現は、植物が曝される大部分またはすべての条件下での植物の多くまたはすべての組織における発現のことを指す、構成性発現とは対照的である。選択的発現はまた、遺伝子発現産物の、特定の植物組織、器官または発達段階への区画化ももたらしうる。サイトゾル、液胞またはアポプラズム間隙などの特定の細胞内位置への区画化は、必要な細胞区画への輸送のために適したシグナルを遺伝子産物の構造に含めることにより、または半自律的オルガネラ（プラスチドおよびミトコンドリア）の場合には、適切な調節配列を備えた導入遺伝子をオルガネラゲノムに直接導入することにより、実現することができる。
【００６８】
2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を記載するために用いられる用語には、「参照配列」、「比較域（comparison window）」、「配列同一性」、「配列一致度（percentage of配列同一性）」および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、その長さが少なくとも12モノマー単位、往々にして15から18までのモノマー単位、しばしば少なくとも25モノマー単位である、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基である。2つのポリヌクレオチドはそれぞれ（1）2つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、および（2）2つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含みうるため、2つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は通常、「比較域」にわたって2つのポリヌクレオチドの配列を比較し、局所領域の配列類似性を同定し比較することによって行われる。「比較域」とは、2つの配列の最適アライメントを行った後に、配列が連続する位置の同数の参照配列と比較される、少なくとも50個の連続する位置、通常は約50〜約100、より一般的には約100〜約150の概念上のセグメントのことを指す。比較域は2つの配列の最適アライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約20％未満の付加または欠失（すなわちギャップ）を含みうる。比較域のアラインメントのための配列の最適アライメントは、アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison，WI, USAにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）のコンピュータ上での実行により、または目視検査および種々の方法のうち選択した任意のものにより生成される最良のアライメント（すなわち、比較域にわたって最大の相同度がもたらされるもの）によって行いうる。例えば、Altschul et al., 1997、Nucl. Acids Res. 25：3389により開示されているような、BLASTファミリーのプログラムにも言及してよいであろう。配列解析に関する詳細な考察は、Ausubel et al.,「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, 第15章、19.3項に記載されている。
【００６９】
「配列同一性」および「同一性」という用語は、本明細書において、比較域にわたって配列がヌクレオチド単位またはアミノ酸単位で同一である程度を指して互換的に用いられる。このため、「配列一致度」は、最適アライメントが行われた2つの配列を比較域にわたって比較し、同一な核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）または同一なアミノ酸残基（例えば、例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、比較域のサイズ）で除算し、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。本発明の目的において、「配列同一性」が、DNASISコンピュータプログラム（バージョン2.5、ウインドウズ用；Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco，California, USAより入手可能）を、ソフトウエアに添付のリファレンスマニュアルに用いられている標準的なデフォールトを用いることによって算出される「一致率」を意味することは理解されるであろう。
【００７０】
本明細書で用いる「シンク細胞」および「シンク組織」は、収穫の時点で、正味の流入により二酸化炭素以外の形態で細胞内に入った有機炭素を含む、細胞、組織または器官のことを指す。植物において、シンク組織には、すべての非光合成組織のほか、他の光合成細胞によって固定された、または二酸化炭素の直接固定以外の手段による他の様式で周囲の媒質もしくは環境から得られた有機炭素の正味の流入を伴う光合成組織が含まれる。
【００７１】
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション中の、温度およびイオン強度の条件、ならびにある種の有機溶媒の存在または非存在のことを指す。ストリンジェンシーが高いほど、固定化されたヌクレオチド配列と標識ポリヌクレオチド配列との相補性の程度が高くなると考えられる。
【００７２】
「ストリンジェント条件」は、相補的塩基を高い頻度で有するヌクレオチド配列のみがハイブリダイズすると考えられる温度およびイオンの条件のことを指す。要求されるストリンジェンシーはヌクレオチド配列依存的であり、ハイブリダイゼーション中に存在する種々の構成要素にも依存する。一般に、ストリンジェント条件は、定められたイオン強度およびpHでの特定の配列の融解点（Tm）よりも約10〜20℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50％が相補的プローブとハイブリダイズする温度（定められたイオン強度およびpHでの）である。
【００７３】
「糖」、「糖誘導体」という用語は、本明細書においてその最も広範な意味に用いられ、これには以下のものが含まれる：実験式（CH２O）n（式中、n＝3またはそれより幾分大きい数字）を有する化合物を含む単糖類（アルドースおよびケトース）；これにはテトロース（例えば、エリトロース、トレオース、エリトルロース）、ペントース（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、リキスロース、リブロース、キシルロース）、ヘキソース（例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）およびより長い分子、例えばセドヘプツロまたはマンノヘプツロースが含まれる；複数の単糖類単位がグリコシド結合によって互いに結合したオリゴ糖類；これには二糖類（例えば、マルトース、ラクトース、ゲンチビオース、メリビオース、トレハロース、ソホロース、プリモベロース（primoverose）、ルチノース、スクロース、イソマルツロース、トレハルロース、ツラノース、マルツロース、ロイクロース）およびより長いオリゴ糖類、例えばラフィノース、メレジトース、ベミシオース（bemisiose）またはスタキオース；糖アルコール（例えば、エリスリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール）；糖酸（例えば、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸）；アミノ糖（例えば、グルコサミン、ガラクトサミン）；ならびにその他の変種、例えばデオキシ糖、メチル糖、糖リン酸およびUDP糖（これらのいくつかは植物代謝経路の作用によって上記の糖または他の糖誘導体へと変換される場合がある）。
【００７４】
「形質転換」という用語は、外来核酸または内因性核酸の導入による、例えば細菌または植物などの生物体の遺伝子型の改変のことを意味する。「形質転換体」とは、そのようにして改変された生物体のことを意味する。
【００７５】
本明細書で用いる場合、「トランスジェニック」という用語は、導入された外来性または外因性の遺伝子または配列の、ランダムもしくは位置指定的な組込み、または複製可能な非組込み形態での安定的な維持により、内因性ゲノムに対する追加または改変が行われた、遺伝的に改変された植物のことを指す。「導入遺伝子」とは、植物に導入される遺伝子または配列のことを意味する。
【００７６】
「ベクター」とは、その内部に核酸配列を挿入またはクローニングしうる、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは植物ウイルスに由来する核酸分子、好ましくはDNA分子のことを意味する。ベクターは、1つまたは複数の一意的な制限部位を含むことが好ましく、標的の細胞もしくは組織もしくは始原細胞もしくはその組織を含む、規定された宿主細胞において自律複製しうる、またはクローニングされた配列が複製可能なように規定された宿主のゲノムに組み込まれうる。すなわち、本ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製から独立している、例えば、直鎖状または閉環状プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体などのベクターであってもよい。ベクターは自己複製を確実にするためのあらゆる手段を含みうる。または、ベクターは、細胞内に導入された場合に、受容細胞のゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体とともに複製されるものであってもよい。ベクター系は、単独のベクターもしくはプラスミド、宿主細胞のゲノム内に導入しようとする全DNAを全体として含む2つもしくはそれ以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンのいずれから構成されてもよい。ベクターの選択は通常、ベクターとそのベクターを導入しようとする細胞との適合性に依存する。ベクターはまた、適切な形質転換体の選別のために用いうる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーも含みうる。このような耐性遺伝子の例は当業者に周知である。
【００７７】
2. 植物組織の総炭水化物含量または甘味度を改変する方法
本発明は、一部には、植物（例えば、サトウキビ）における、細胞のスクロースの一定割合のイソマルツロース（植物において通常は産生されない外来性糖）への変換をもたらすスクロースイソメラーゼなどの外因性または外来性の糖代謝酵素の発現が、植物のスクロース貯蔵組織において実質的により高い総炭水化物濃度をもたらしうるという発見を根拠に置いている。いかなる特定の理論および作用様式にも拘束されるつもりはないが、植物によって通常感知される糖の、同等な様式では認知されない新規な糖への変換を伴う、代謝の特定的な改変は、代謝を変化させ、炭水化物のより高濃度での蓄積をもたらすと考えられている。本発明者らは、細胞レベルでのこのような特定的な改変はソース-シンクの関係を全植物体レベルで変化させ、ソース組織における合成、ソース組織とシンク組織との間の輸送、およびシンク組織の内部での代謝回転または貯蔵に対する影響の組み合わせにより、シンク組織における炭水化物の蓄積を増加させると考えている。
【００７８】
したがって、本発明は、植物のシンク組織の総炭水化物含量または甘味度を改変するための新規な方法を提供する。本方法は一般に、植物において、植物の内因性糖の、同じ発達段階にある植物では通常産生されない外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素を産生させる段階を含む。糖代謝酵素は、シンク組織の炭水化物含量または甘味度がその酵素を産生しない対照植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生されることが有利である。いくつかの態様において、糖代謝酵素は、その酵素をコードするポリヌクレオチドの発現によって植物細胞で産生される。これらの態様において、植物は、その酵素をコードするポリヌクレオチドが転写制御エレメントと機能的に結合したものをそのヌクレオーム中に含む複数のトランスジェニック植物より選択されるトランスジェニック植物である。トランスジェニック植物は、それが糖代謝酵素を、選択されたトランスジェニック植物のシンク組織の総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または甘味度が対照植物の対応するシンク組織のものと比較して増すようなレベルまたは機能的活性で産生することに基づいて選択される。
【００７９】
いくつかの態様において、シンク組織の総炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物含量は、植物の細胞において、糖代謝酵素を内因性糖の外来性糖への部分的変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生させることによって高められる。これらの態様において、糖代謝酵素は、植物細胞のサイトゾル中で活性を有することが好適であり、またはその活性がサイトゾルならびに糖の貯蔵および／または輸送に関与する細胞内区画の両者に分布してもよい。これらの態様において、典型的には、これらの態様において、内因性糖の外来性糖への約30％未満、20％未満または15％未満、好適には約10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満または1％未満の変換により、シンク組織の可溶性炭水化物含量または甘味度の増加が達成される。これらの態様において、外来性糖は、内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積することが好ましい。
【００８０】
また別の態様において、シンク組織の総炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物含量は、植物細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画（例えば、液胞またはアポプラスト間隙）に向けて糖代謝酵素のターゲティングを行うことによって高められる。これらの態様において、糖代謝酵素は、内因性糖の外来性糖への実質的な変換、一般に少なくとも約20％、25％または30％、しかし典型的には少なくとも約40％、45％、50％または55％、より一般的には少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％または90％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で、細胞内区画に存在することが好適である。この実質的な変換は、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部では起こらないことが望ましい。細胞内区画は、これらの態様において、外来性糖は内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴わずに蓄積することが好適である。
【００８１】
このように、シンク組織の総炭水化物含量もしくは甘味度または内因性炭水化物含量の改変は、内因性糖の外来性糖への変換のレベルを調節することによって達成される。この変換は、例えば、糖代謝酵素をコードする配列の発現を指令する構成性プロモーターを用いて、植物全体の組織中で実現させることもできる。または、組織特異的プロモーターまたは発生的な調節を受けるプロモーターを用いて、それをソース組織、輸送組織またはシンク組織において実現させることもできる。
【００８２】
いくつかの態様において、内因性糖の外来性糖への変換のレベルは、糖代謝酵素をコードする配列の発現レベルを上昇または低下させることによって調節される。例えば、これは、コード配列から発現される転写物のレベルを制御しうる、種々の強度のプロモーターまたは誘導性プロモーターを用いて達成することができる。または、酵素をコードする配列の発現レベルを、コード配列およびそれと機能的に結合した、その細胞において機能性である転写制御エレメントを含む構築物の細胞当たりのコピー数を変化させることによって調節することもできる。または、複数の形質転換体を選択し、導入遺伝子の組込み部位の近傍にある内因性配列の影響に起因する、好都合なレベルおよび／または特異性で導入遺伝子発現がみられるものに関してスクリーニングすることもできる。導入遺伝子発現の好都合なレベルおよびパターンとは、収穫しようとする組織の可溶性炭水化物含量または甘味度の実質的な増加をもたらすものである。これは、収穫しようとする発達段階に近い形質転換体の簡単な検査により、例えば実施例9における方法を用いて、検出することができる。ある種の態様において、コード配列の発現レベルは、基準となる発現レベルよりも、それが少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％もしくは90％、またはさらには少なくとも約100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％もしくは1000％高いように、または少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％もしくは99％、またはさらには少なくとも約99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％または99.999％低いように選択される。
【００８３】
もう1つの態様においては、糖代謝酵素をコードするmRNAのプロセシングまたは安定性に影響を及ぼす、転写される遺伝子の内部の配列（シスRNA配列）を用いることにより、または別個に転写される配列（トランスRNA配列）を用いることにより、コード配列の発現レベルを転写後に調節することが可能である。例えば、シスRNA配列が、翻訳されないリーダー部の二次構造を変化させてもよく、または翻訳速度を制御するためにアウトオブフレーム（out-of frame）開始コドンもしくは最適ではない開始コドン環境もしくは稀なコドン使用を含んでもよい；またはそれらが、RNAプロセシングの誤りもしくはmRNA安定性の低下をもたらす、イントロンのスプライス部位とある程度の類似性のある配列もしくはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。トランスRNA配列の例には、発現を妨害または阻害する共発現性アンチセンス分子またはリボザイムが含まれる。または、RNAiを媒介し、それによって酵素コード配列の発現を調節するために、例えばTuschl et al. 米国特許出願第20020086356号に記載されたような、対応する特異的mRNAの切断を導く約21〜約23ヌクレオチドのRNA分子を利用することもできる。
【００８４】
もう1つの態様において、内因性糖の外来性糖への変換のレベルは、機能的活性の異なる糖代謝酵素を用いることによって調節される。これは糖変換が行われる細胞区画における酵素の比活性または安定性の違いに起因してもよい。ある種の態様において、内因性糖の外来性糖への変換のために用いられる糖代謝酵素の活性は、基準となる酵素のものよりも、少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％もしくは90％、またはさらには少なくとも約100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％もしくは1000％高い、または少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％もしくは99％、またはさらには少なくとも約99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％もしくは99.999％低い。活性の異なる糖代謝酵素は天然に存在してもよく、合成的または組換え手段によって、例えば、基準となる酵素または親酵素の触媒部位または他の任意の部位（例えば、基質結合部位、補助因子結合部位）の改変によって入手することもできる。典型的には改変は、例えば、当技術分野で公知である、合理的なまたは確立された変異誘発またはコンビナトリアルケミストリーの方法を用いた、親酵素の配列における少なくとも1つのアミノ酸の置換、付加または除去によって行われる。糖代謝酵素の変種は保存的アミノ酸置換を含みうる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたもののことである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において明確にされている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、親酵素におけるアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置換されることが好適である。または、もう1つの態様において、変異を、飽和変異誘発法などによって、基準となる酵素をコードするポリペプチドの全長にわたってまたは一部に導入し、その結果生じた変異体を、親酵素とは異なる活性を有する変異体を同定するために酵素活性に関してスクリーニングすることもできる。関心対象の酵素を、例えば、これらの条件下での安定性および比活性に関する補足的な試験として、糖変換を行わせようとする植物細胞区画に類似した条件でのアッセイの前および／または最中での粗性または精製性の酵素調製物のインキュベーションによる変更を加えた、実施例2における方法を用いて、相対的活性に関して試験することもできる。
【００８５】
また別の態様において、内因性糖の外来性糖への変換のレベルおよび位置は、異なる機能的細胞内区画を対象とする糖代謝酵素を用いることによって改変される。説明的な例として、活性は、主要な代謝区画としてサイトゾルを対象とする。これは、他の細胞区画への輸送のためのシグナル配列を有しない型の酵素のサイトゾル内部での合成をもたらす核内遺伝子の発現によって実現することができる。また別の説明的な例として、酵素の配列内部にサイトゾルから所望の細胞区画への酵素の輸送のためのシグナルを含めることにより、活性は液胞などの貯蔵区画、または細胞外（アポプラスト）間隙などの貯蔵性かつ輸送性の区画に向けられる。ある種のシグナル配列は、酵素活性を2つまたはそれ以上の細胞区画に分布させることが可能である（Small et al., 1998）。例えば、実施例4に記載したNTPPシグナル（SEQ ID NO：7）は、タンパク質をサトウキビ液胞に効率的に導き、一方、実施例5に記載したCTPPシグナル（SEQ ID NO：8＋SEQ ID NO：9）は、サトウキビにおいてタンパク質をサイトゾルおよび分泌経路（液胞、内膜系およびアポプラズムを含む）に分布させることが可能である（Gnanasambandam and Birch 2004）。
【００８６】
その他の要因が、利用可能な基質（すなわち、内因性糖）の量を含む、シンク組織の可溶性炭水化物含量または甘味度の改変に影響を及ぼすこともある。糖代謝酵素が利用可能な基質の量は、改変（同一種の内部での変異体を含む）の対象となる植物種、発現が起こる組織の種類、発現の細胞内位置、および個々の植物の発達段階に依存する可能性がある。また、導入されたタンパク質の安定性は基質の量にも依存する可能性がある。しかし、このようなイベントにおいて必要と考えられるあらゆる最適化を、上記のものを含むルーチン的な方法を用いて得ることは可能であると考えられる。
【００８７】
異なる植物によって産生される内因性糖は異なる可能性があり、このため、一つの植物の内因性糖は別のものにとっては外来性糖である可能性がある。したがって、どの糖が選択した植物によって内因性に産生されるかを決定し、それにより、どの糖がその植物にとって外来性であるか、および植物において外来性糖を産生させるために有用と考えられる糖代謝酵素の種類を推定することが必須である。植物によって内因性に産生される糖の種類は、当業者に周知の方法を用いて決定することができる。これらの方法には、電気泳動法またはクロマトグラフィー法（ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ガス液体クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを含む）による糖または糖誘導体の分離が含まれる。分離された成分は一般に、実体が判明している標準物質の分離プロフィールとの比較によって、または質量分析法および核磁気共鳴法などの分析法によって同定される。例えば、実施例9、Robinson 1980, 「高等植物の有機成分（Organic Constituents of Higher Plants）」、Cordus Press， North Amherst, USA；Adams et al. 1999, Anal. Biochem. 266: 77-84；Veronese and Perlot 1999, Enz. Microbial Tech. 24: 263-269；Hendrix and Salvucci 2001、J. Insect Physiol. 47: 423-432；Thompson et al. 2001, Carbohydrate Res. 331: 149-161；およびそれらに引用された参考文献を参照されたい。
【００８８】
植物によって産生される内因性糖を知ることにより、内因性糖の1つまたは複数を外来性糖または糖誘導体に変換する適切な糖代謝酵素を推定することが可能となる。例えば、糖代謝酵素は、酸化反応、還元反応、脱水素反応、水素添加反応、異性化、アセチル化、カルボキシル化、グルクロン酸抱合、グリシン抱合、メチル化（O-、N-またはS-結合型）、リン酸化および硫酸抱合を非制限的に含む抱合反応、および加水分解反応より選択される反応を触媒しうる。所望の変換を触媒する可能性のある酵素の例には、イソメラーゼ、エピメラーゼ、ムターゼ、キナーゼ、アルドラーゼ、トランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、ホスファターゼ、シンターゼ、カルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼおよびヒドロラーゼが含まれる。
【００８９】
内因性糖および外来性糖は、単糖類、オリゴ糖類、糖アルコール、糖酸、アミノ糖およびその他の変種（デオキシ糖、メチル糖など）より選択されることが好適である。単糖類の例には、式（CH2O）n（式中、n＝3またはそれ以上、しかし10未満であることが好適である）を有する化合物が含まれる；これにはテトロース（例えば、エリトロース、トレオース、エリトルロース）、ペントース（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、リキスロース、リブロース、キシルロース）、ヘキソース（例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）およびさらに長い分子、例えばセドヘプツロまたはマンノヘプツロースを含む化合物が含まれる。複数の単糖類単位がグリコシド結合によって互いに結合したオリゴ糖類は、二糖類（例えば、マルトース、ラクトース、ゲンチビオース、メリビオース、トレハロース、ソホロース、プリモベロース（primoverose）、ルチノース、スクロース、イソマルツロース、トレハルロース、ツラノース、マルツロース、ロイクロース）およびさらに長いオリゴ糖類、例えばラフィノース、メレジトース、ベミシオース（bemisiose）またはスタキオースより選択されうる。糖アルコールの例には、エリスリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトールが含まれる。糖酸の非制限的な例には、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸が含まれる。アミノ糖の非制限的な例には、グルコサミン、ガラクトサミンが含まれる。内因性糖または外来性糖を、デオキシ糖およびメチル糖などの他の変種から選択してもよく、これらのいくつかは植物代謝経路の作用によって上記の糖または他の糖誘導体へと変換されうる。ある種の態様において、外来性糖は内因性糖の異性体である。この態様の一例において、内因性糖はスクロースであり、糖代謝酵素は、スクロースを異性化によりイソマルツロースおよびトレハルロースより選択される外来性糖へと変換するスクロースイソメラーゼである。
【００９０】
本発明によれば、植物における糖代謝酵素による内因性糖の外来性糖への部分的変換は、その酵素を産生しない対照植物の対応する組織のものと比較して、植物または植物の収穫部分の総炭水化物含量または甘味度を高める。炭水化物の例には、グルコース、フルクトースおよびスクロースなどの単糖、ならびにある種の可溶性ポリマーおよびその他の可溶性細胞成分が非制限的に含まれる。1つの態様において、本方法は、対照植物細胞において測定されるものと比較して、シンク組織の単位重量当たりの可溶性炭水化物の比の増大として、可溶性炭水化物としての炭素が増加しているシンク組織を生じさせる。炭水化物は当業者に公知の標準的なプロトコールを用いてアッセイすることができる。
【００９１】
3. 生物体における所望の代謝産物の含量を高める方法
植物における炭水化物の含量を高めるための、本明細書に詳述する原理および方法を、真菌におけるトレハロースおよび動物におけるグリコーゲンなどのように異なる貯蔵性炭水化物が大多数を占める他の生物体における炭水化物の含量を高めるために適用することもできる。また、これらの原理および方法を、生物体における、脂質、アミノ酸およびペプチドといった他のクラスの所望の代謝産物、または二次代謝産物の含量を高めるために適用することもできる。当業者は、例えば植物における炭水化物の増加を目的とする本明細書に詳細に開示した方法の変法により、生物体における他のクラスの所望の代謝産物の増加を実現しうることを認識していると考えられる。したがって、本発明は、生物体において通常感知される基質内因性化合物の、その生物体の内部で同等な様式では認知されない産物化合物への部分的変換を引き起こして、その結果、代謝フローを変化させる効果を及ぼし、所望の内因性化合物のより高収量での蓄積をもたらす導入遺伝子の生物体の内部での発現を広範に含む。
【００９２】
4. 核酸構築物
ある種の態様において、糖代謝酵素は、植物細胞における、その酵素をコードする外来性または外因性ポリヌクレオチドの発現によって産生される。一般に、外来性または外因性ポリヌクレオチドは核酸構築物中で転写制御エレメントと機能的に結合している。転写制御エレメントはプロモーターおよび任意にはシス作用性配列（それぞれ植物細胞において機能性であるもの）を含むことが好適である。構築物は3'非翻訳配列およびマーカー遺伝子の一方または両方を含むことが有利である。
【００９３】
4.1 転写制御エレメント
本発明によって想定しているプロモーター配列は、その領域が宿主植物中で機能性である場合、形質転換しようとする宿主植物にとって本来のものであってもよく、または別の源に由来するものでもよい。他の源としては、アグロバクテリウムT-DNA遺伝子、例えばノパリン、オクタピン、マンノピンまたは他のオピン（opine）の生合成のためのプロモーター；植物由来のプロモーター、例えばユビキチンプロモーター；組織特異的プロモーター（例えば、Conkling et al.,に対する米国特許第5,459,252号；Advanced Technologiesに対するWO 91/13992号を参照）；ウイルス（宿主特異的ウイルスを含む））由来のプロモーター、または部分的もしくは全体的に合成されたプロモーターが含まれる。単子葉植物および双子葉植物において機能性である多数のプロモーターが当分野で周知である（例えば、Greve, 1983, J. Mol. Appl. Genet. 1: 499-511；Salomon et al., 1984, EMBO, J. 3: 141-146；Garfinkel et al., 1983, Cell 27: 143-153；Barker et al., 1983, Plant Mol. Biol. 2: 235-350）；これには植物（トウモロコシubi-1遺伝子由来のUbiプロモーターなど、Christensen and Quail, 1996）（例えば、米国特許第4,962,028号を参照）およびウイルス（カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、CaMV 35Sなど）から単離される種々のプロモーターが含まれる。
【００９４】
プロモーター配列は転写を調節するシス作用性配列を含むことができ、この調節は例えば、化学的または物理的な抑制または誘導（例えば、代謝産物、光または他の物理化学的因子に基づく調節；例えば、線虫類応答プロモーターを開示しているWO 93/06710号を参照） または細胞分化に基づく調節（植物の葉、根、種子などと関連するものなど；例えば、根特異的プロモーターを開示している米国特許第5,459,252号を参照）を含む。したがって、このプロモーター領域またはこのような領域の調節部分は、そのように調節される適切な遺伝子から得られる。例えば、1,5-リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子は光誘導性であり、これを転写開始のために用いてもよい。ストレス、温度、創傷、病原体などの影響によって誘導される他の遺伝子も知られている。
【００９５】
用いうるその他のシス作用性配列には、転写および／または翻訳エンハンサーも含まれる。これらのエンハンサー領域は当業者に周知であり、ATG開始コドンや隣接配列を含むことができる。この開始コドンは、全配列の翻訳が確実に行われるように、外来性または内因性のポリヌクレオチド配列に関するコード配列のリーディングフレームとインフレーズでなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成のいずれでもよい種々の源のものでありうる。翻訳開始領域は転写開始領域の供給源から与えられてもよく、または外来性もしくは内因性のDNA配列から与えられてもよい。この配列は転写を行わせるために選択されたプロモーターの供給源に由来することができ、mRNAの翻訳が増大するように特異的に改変することができる。
【００９６】
転写エンハンサーの例には、CaMV 35Sプロモーター、および例えばLast et al.（米国特許第5,290,924号、これは本明細書に参照として組み入れられる）により記載されたオクトピンシンターゼ遺伝子からのエレメントが非制限的に含まれる。ocsエレメントなどのエンハンサーエレメント、特にこのエレメントの多数コピーの使用は、植物形質転換の状況に適用された場合、隣接プロモーターからの転写のレベルを高めるように作用すると考えられる。または、タバコモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子由来のオメガ配列（Gallie et al., 1987）を、本発明のポリヌクレオチドから転写されるmRNAの翻訳を促進させるために用いてもよい。
【００９７】
いくつかの態様において、転写制御エレメントは構成性プロモーターである。構成性遺伝子発現を得るのに有用なことが知られている配列には、例えばノパリンシンターゼ（Nos）、マンノピンシンターゼ（Mas）またはオクトピンシンターゼ（Ocs）などのアグロバクテリウム遺伝子に付随する調節領域のほか、ウイルス遺伝子の発現をコードする領域、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sおよびl9S領域などがある。構成性という用語は、本明細書で用いる場合、遺伝子がすべての細胞種で同じレベルで発現されることを必ずしも示すのではなく、存在量のある程度の違いは往々にしてみられるものの、遺伝子が広範囲の細胞種にわたって発現されることを示す。
【００９８】
また別の態様において、転写制御エレメントは組織特異的プロモーターである。例えば、さまざまな理由で糖代謝酵素の発現を得ようとする場合には、これらの酵素の発現を、炭素シンクとして機能する植物細胞に限定しようとすることが考えられる。この目的に向けて、根、塊茎、種子または果実といった特定の種類の組織における選好的な発現をもたらす有用な転写開始領域を同定することが可能である。これらの配列を、例えばディファレンシャルスクリーニング法を用いてcDNAライブラリーから同定することもでき、または文献で知られている配列から導き出すこともできる。
【００９９】
多くの組織特異的プロモーター領域が知られており、これには例えば、葉組織において選好的に発現されるRubisco小サブユニットプロモーター、ジャガイモ塊茎において選好的に発現されるパタチンプロモーターなどがある。特定の組織中または特定の成長条件下での転写を選好的にもたらす他の転写開始領域には、ナピン、種子または葉ACP、ゼインなどが含まれる。果実特異的プロモーターも公知であり、このようなプロモーターの一つに、Deikman et al.（1988、EMBO J. 2: 3315-3320）およびDella Penna et al.（1989、Plant Cell 1: 53-63）によって記載されたE8プロモーターがある。この型の1つの態様において、E8（果実特異的プロモーター）-スクロースイソメラーゼ構築物はスクロースイソメラーゼを果実特異的な様式で発現すると考えられ、果実中で産生されるスクロースのレベルを上昇させる可能性がある。または、スクロース貯蔵組織（サトウキビの成熟茎およびサトウダイコンの塊茎）においてコード配列を選択的に発現するプロモーターを用いることもできる。例えば、サトウキビの成熟茎に対して特異的なプロモーターは、本明細書のセクション6、および国際公報WO 01／18211号に記載されている。
【０１００】
または、プロモーターは、酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を植物の適切な発達段階で行わせる誘導性プロモーターである。この後者の態様において、転写制御エレメントは、発現の時期を制御するための発生的に調節されるプロモーターであることが好適である。糖代謝酵素の発現の時期は、植物の発育中に起こる糖濃度の変化を考慮に入れることが有利である。組織の内部での糖の重要性も時間とともに変わる可能性があり、この点に関して、シンク組織は発達過程でスクロース濃度の変化を来す場合がある。例えば、スウィートメロンなどのある種の果実におけるスクロース濃度は果実の成熟に伴って変化する。発達初期にはヘキソース糖が蓄積し、その後、後期にはスクロースが高レベルとなる（Schaffer et al., 1987, Phytochemistry 26: 1883-1887）。発達中のトウモロコシ内乳では、スクロース濃度が受粉8〜12日後に上昇し、その後は低下して受粉28日後には10分の1未満となる（Tsai et al., 1970, Plant Phys. 46: 299-306）。さらに、ダイズ種子におけるスクロース濃度は発達過程で有意に変化し、開花53日後にはラフィノース糖含量が劇的に増加する（Amuti, 1977, Phytochemistry 16: 529-532）。エンドウ種子では、スクロース含量が発達の継続に伴って劇的に減少する（Holl and Vose, Can. 1980, .J. Plant Sci. 60: 1109-1114）。これらの例は、変動性のあるスクロース貯蔵を利用するような時期に合わせた酵素遺伝子の特異的発現を目的とするプロモーター選択が望ましいことを例示している。
【０１０１】
4.2 3'非翻訳領域
本発明の核酸構築物は3'非翻訳配列を含みうる。3'非翻訳配列とは、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現を生じさせうる任意の他の調節シグナルを含むDNAセグメントを含む遺伝子の部分のことを指す。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸トラクトの付加を行うことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは一般に、標準形態である5'AATAAA-3'に対する相同性の存在によって認知されているが、変化は稀ではない。
【０１０２】
3'非翻訳調節DNA配列は一般に約50〜1000ヌクレオチド塩基対を含み、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセスまたは遺伝子発現を生じさせうる任意の他の調節シグナルに加えて、植物の転写および翻訳の終結配列を含みうる。適した3'非翻訳配列の例には、アグロバクテリウム-ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（nos）遺伝子由来のポリアデニル化シグナル（Bevan et al., 1983, Nucl. Acid Res., 11: 369）およびアグロバクテリウム-ツメファシエンスのオクトパインシンターゼ遺伝子由来のT7転写物のターミネーターを含む3'転写非翻訳領域である。または、適した3'非翻訳配列は、ジャガイモもしくはトマト由来のプロテアーゼインヒビターIもしくはII遺伝子、ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子の3'末端、および、リブロース-1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ssRUBISCO） 遺伝子のpea E9小サブユニットなどの植物遺伝子に由来するものであるが、当業者に知られた他の3'エレメントを用いることもできる。または、3'非翻訳調節配列を、例えば、An（1987, Methods in Enzymology, 153: 292）（これは参照として本明細書に組み入れられる）によって記載されたようにデノボで入手することもできる。
【０１０３】
4.3 任意的な配列
転写開始部位とコード配列の開始部との間に導入されるDNA配列、すなわち非翻訳リーダー配列は遺伝子発現に影響を及ぼしうるため、特定のリーダー配列を用いることも可能である。適したリーダー配列には、外来性もしくは内因性のDNA配列の最適な発現を導くように選択された配列を含むものが含まれる。例えば、このようなリーダー配列は、例えば、Joshi（1987, Nucl. Acid Res., 15: 6643）によって記載されたような、mRNAの安定性を増加または維持するとともに翻訳の不適切な開始を防止させうる好ましいコンセンサス配列を含む。しかし、他のリーダー配列、例えば、RTBVのリーダー配列は、mRNAの安定性を低下させ、および／またはmRNAの翻訳を低下させることが予想される高度の二次構造を有する。このため、（i）高度の二次構造を有しない、（ii）mRNA安定性を阻害しないおよび／もしくは翻訳を低下させない高度の二次構造を有する、または（iii）植物で高度に発現される遺伝子に由来する、リーダー配列が最も好ましいと考えられる。
【０１０４】
例えば、Vasil et al.（1989, Plant Physiol., 91: 5175）によって記載されたスクロースシンターゼのイントロン、例えば、Callis et al.（1987, Genes Develop., II）によって記載されたAdhイントロンI、例えば、Gallie et al.（1989, The Plant Cell, 1: 301）によって記載されたTMVオメガエレメントなどの調節エレメントを、必要に応じて含めることもできる。本発明の実施に有用なその他のこのような調節エレメントも当業者に公知である。
【０１０５】
さらに、外来性もしくは内因性ポリヌクレオチドによってコードされる酵素を、植物細胞内部の細胞内区画または細胞外環境に対して向かわせるために、ターゲティング配列を用いることもできる。例えば、移行ぺプチド配列またはシグナルぺプチド配列をコードする核酸配列を、本発明の選択した酵素をコードする配列と機能的に結合させ、それにより、翻訳された場合にこの移行ペプチドまたはシグナルぺプチドがこのタンパク質を細胞内または細胞外の特定の目的地へと輸送し、その後に任意に翻訳後に除去されるようにすることができる。移行ペプチドまたはシグナルぺプチドは、細胞内膜、例えば、小胞体、液胞、小胞、色素体、ミトコンドリアおよび原形質膜などの膜を通るタンパク質の輸送を促進することにより作用する。例えば、ターゲティング配列は所望のタンパク質を、サイトゾルへではなく、液胞または色素体（例えば、葉緑体）などの特定のオルガネラに向かわせることができる。このように、本発明の核酸構築物は、プロモーター領域と外来性または外因性ポリヌクレオチドの間に機能的に結合した、色素体移行ぺプチドをコードする核酸をさらに含みうる。例えば、Heijne et al.（1989, Eur. J. Biochem., 180: 535）およびKeegstra et al.（1989, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40: 471）を参照されたい。
【０１０６】
いくつかの態様において、シンク組織細胞に貯蔵されたスクロース（すなわち、内因性糖）は、細菌スクロースイソメラーゼ遺伝子をシンク組織特異的プロモーターおよびサイトゾル局在調節配列とともに導入することにより、イソマルツロースおよび／またはトレハルロース（すなわち、外来性糖）へと変換される。これらの態様において、本発明者らはスクロースイソメラーゼ遺伝子の発現のためにサイトゾルを選択したが、これはそれが中間代謝の多くの要素および多くの代謝産物フローにかかわる重要な細胞区画であるためである。また別の態様において、本発明者らは液胞をスクロースイソメラーゼ活性の部位として選択したが、これはそれがサトウキビなどの植物における糖の主要な貯蔵区画であるためである。さらにまた別の態様において、本発明者らは、糖の蓄積全体に対して最適な効果を得るためにスクロースイソメラーゼ活性を複数の区画に分布させることを選択した。また別の態様においては、酵素遺伝子産物の発現を、関心対象の代謝経路にとって適切な、液胞、リソソーム、ペルオキシソーム、プラスチド、ミトコンドリア、小胞体、核などの他の細胞区画、または細胞外間隙に対して向けさせることが適切であると考えられる。
【０１０７】
本発明の核酸構築物は、プラスミドなどのベクター中に導入することができる。プラスミドベクターは、原核または真核細胞における発現カセットの選択、増幅および形質転換を容易にする補足的な核酸配列を含み、これには例えば、pUC誘導ベクター、pSK誘導ベクター、pGEM誘導ベクター、pSP誘導ベクター、またはpBS誘導ベクターが含まれる。補足的な核酸配列には、ベクターの自律複製性を与える複製起点、好ましくは抗生物質耐性もしくは除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸構築物中にコードされる核酸または遺伝子を挿入するための複数の部位を与える一意的なマルチクローニング部位、ならびに原核および真核（特に植物）細胞の形質転換を増大させる配列を含む。
【０１０８】
ベクターは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定な組込みを可能とする要素、または細胞のゲノムとは独立した細胞内でのベクターの自律複製を可能とする要素を含むことが好ましい。ベクターは宿主細胞に導入された場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれうる。組込みに関して、ベクターは、相同組換えによりゲノム中にベクターを安定に組み込むために内部に存在する外来性もしくは内因性のポリヌクレオチド配列、またはそのベクターの任意の他のエレメントに依拠してもよい。または、ベクターが、宿主細胞のゲノム中に相同組換えによる組込みを導くための補足的な核酸配列を含んでもよい。この補足的な核酸配列は、宿主細胞のゲノム中の染色体の正確な位置にベクターを組み込むことを可能とする。正確な位置での組込みが起こる蓋然性を高めるために、組み込まれる要素は、相同組換えの確率が高くなるように対応する標的配列と高度に相同的な十分な数の核酸、例えば、100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、最も好ましくは800〜1,500塩基対の核酸を含むことが好ましい。組み込まれる要素は宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であってよい。さらに、組み込まれる要素はコード性核酸配列でも非コード性核酸配列でもよい。
【０１０９】
クローニングおよびサブクローニングのために、ベクターが、細菌細胞などの宿主細胞中でのベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでもよい。細菌の複製起点の例には、大腸菌における複製を可能とするプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、およびpACYC184の複製起点、ならびにバチルス中での複製を可能とするpUB110、pE194, pTA1060およびpAMβ1の複製起点がある。この複製起点はバチルス細胞中でのその機能に温度感受性を付与する変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich,1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1433）。
【０１１０】
4.4 マーカー遺伝子
形質転換体の同定を容易にするために、核酸構築物は、外来性または外因性のポリヌクレオチド配列として、またはそれに加えて、選択用またはスクリーニング用のマーカー遺伝子を含むことが望ましい。マーカーの実際の選択は、それが選択された植物細胞との組み合わせで機能的（すなわち、選択的）である限り、決定的に重要ではない。マーカー遺伝子と関心対象の外来性または外因性のポリヌクレオチド配列とが連結される必要はない。これは、例えば米国特許第4,399,216号に記載されているように、連結されていない遺伝子の同時形質転換は植物の形質転換においても効率的なプロセスであるためである。
【０１１１】
選択用またはスクリーニング用のマーカー遺伝子という用語には、形質転換された細胞を同定または選択する手段としてその分泌を検出しうる「分泌性マーカー」をコードする遺伝子が含まれる。その例には、抗体との相互作用によって同定しうる分泌性抗原、またはその触媒活性によって検出しうる分泌性酵素をコードするマーカーが含まれる。分泌性タンパク質には、細胞壁に挿入または捕捉されるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコPR-Sの発現ユニットに認められるもののようなリーダー配列を含むタンパク質）、例えばELISAによって検出可能な低分子量の拡散性タンパク質、および細胞外溶液中で検出可能な低分子量の活性酵素（例えば、α-アミラーゼ、β-ラクタマーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）が非制限的に含まれる。
【０１１２】
4.4.1 選択用マーカー
細菌の選択用マーカーの例には、枯草菌もしくはバシラス-リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のdal遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが含まれる。植物の形質転換体を選択するための選択用マーカーの例には、ハイグロマイシンB耐性をコードするhyg遺伝子；例えばPotrykus et al.（1985, Mol. Gen. Genet. 199：183）により記載されたような、カナマイシン、パロモマイシン、G418などに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子；例えばEP-A 256 223号に記載されたような、グルタチオン由来の除草剤に対する耐性を付与するラット肝臓由来のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子；例えばWO87／05327号に記載されたような、ホスフィノトリシンなどのグルタミンシンテターゼ阻害剤に対する耐性を過剰発現時に付与するグルタミンシンテターゼ遺伝子；例えばEP-A 275 957号に記載されたような、選択薬剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するストレプトミセスビリドクロモゲネス由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子；例えばHinchee et al.（1988, Biotech., 6: 915）により記載されたような、N-ホスホノメチルグリシンに対する耐性を付与する5-エノールシキミ酸-3-リン酸シンターゼ（EPSPS）をコードする遺伝子；例えばWO91／02071号に記載されたような、ビアラホス（bialaphos）に対する耐性を付与するbar遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を付与するクレブシエラ-オザエナ（Klebsiella ozaenae）由来のbxnなどのニトリラーゼ遺伝子（Stalker et al.,1988, Science, 242: 419）；メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子（Thillet et al.,1988, J. Biol. Chem., 263: 12500）；イミダゾリノン、スルホニル尿素または他のALS阻害化学物質（EP-A-154 204）に対する耐性を付与する変異型アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ALS）；5-メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異型アントラニル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤に対する耐性を付与するダラポン（dalapon）デハロゲナーゼ遺伝子が非制限的に含まれる。
【０１１３】
4.4.2 スクリーニング用マーカー
好ましいスクリーニング用マーカーには、種々の発色性基質が知られているβ-グルクロニダーゼ（GUS）酵素をコードするuidA遺伝子；発色性基質が知られている酵素をコードするβガラクトシダーゼ遺伝子；カルシウム感受性生物発光検出に用いうるエクオリン遺伝子（Prasher et al.,1985, Biochem. Biophys. Res. Comm., 126: 1259）；緑色蛍光タンパク質遺伝子（Niedz et al., 1995, Plant Cell Reports, 14: 403）；生物発光検出を可能とするルシフェラーゼ（luc）遺伝子（Ow et al.,1986, Science 234：856）；種々の発色性基質（例えば、PADAC、発色性セファロスポリン）が知られている酵素をコードするβ-ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3737）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色） の生産を調節する生成物をコードするR-遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al.,1988,「染色体の構造および機能（Chromosome Structure and Function）」、pp. 263-282）；α-アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al.,1990, Biotech., 8: 241）；チロシンをドーパおよびドーパキノンに酸化し、それらの縮合によって容易に検出可能なメラニン化合物を形成させる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol., 129: 2703）；または発色性のカテコールを変換しうるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子（Zukowsky et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1101）が非制限的に含まれる。
【０１１４】
5. 植物細胞へのキメラ構築物の導入
核酸分子を植物宿主細胞に導入するためには、さまざまな方法を利用することができる。当業者に周知の植物形質転換法は数多くあり、新たな技法も続々と知られつつある。形質転換法の具体的な選択は、特定の植物種が形質転換される効率、ならびに選択した具体的な方法に関する本発明の実施者の経験および好みによって決定されると考えられる。植物細胞に核酸構築物を導入するための形質転換系の具体的な選択は、それが許容しうるレベルの核酸移入を実現する限り、本発明にとって本質的なものとも本発明の制約ともならないことは当業者には明らかと考えられる。植物改良のために形質転換系を実地に行う場合の手引きは、Birch（1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 48: 297-326）によって示されている。
【０１１５】
原理的には、形質転換の対象となりうる双子葉植物および単子葉植物はいずれも、本発明による核酸構築物をレシピエント細胞に導入して、本発明によるポリヌクレオチドを保持および発現する新たな植物体を成長させることにより改変しうる。
【０１１６】
タバコ、ジャガイモおよびアルファルファなどの双子葉（幅広葉の）植物への外来性または外因性ポリヌクレオチドの導入およびそれらにおける発現は、アグロバクテリウム-ツメファシエンスの腫瘍誘導性（Ti）プラスミドのT-DNAを用いて行いうることが示されている（例えば、Umbeck, 米国特許第5,004,863号、および国際出願PCT／US93／02480号を参照）。本発明の構築物は、Tiプラスミドを含むA.ツメファシエンスを用いて植物細胞中に導入しうる。形質転換媒体としてA.ツメファシエンス培養物を用いる場合には、形質転換組織の正常かつ発癌性のない分化が可能なように、アグロバクテリウムの非発癌性株をベクター担体として用いるのが最も有利である。このアグロバクテリウムは二重のTiプラスミド系を保持することが好ましい。このような二重の系は、（1）植物に移入DNA（T-DNA）を導入するために不可欠なビルレンス領域を有する第1のTiプラスミド、および（2）キメラ性プラスミドを含む。このキメラ性プラスミドは、移入しようとする核酸に隣接する野性型TiプラスミドのT-DNA領域の少なくとも1つの境界領域を含む。二重のTiプラスミド系は、例えばDe Framond（1983, Biotechnology, 1: 262）およびHoekema et al.（1983, Nature 303: 179）によって記載されているように、植物細胞の形質転換に有効であることが示されている。このような二重系は、アグロバクテリウムでのTiプラスミド中への組込みを必要としないため、特に好ましい。
【０１１７】
アグロバクテリウムの使用を伴う方法には、（a）アグロバクテリウムと、培養され単離されたプロトプラストとの共培養、（b）アグロバクテリウムによる植物の細胞もしくは組織の形質転換、または（c）アグロバクテリウムによる種子、頂部もしくは分裂組織の形質転換が非制限的に含まれる。
【０１１８】
単子葉植物であるイネおよびトウモロコシが、アグロバクテリウムによる形質転換を同様に受けうることが示された。しかし、カラスムギ、モロコシ、キビおよびライムギを含む、多数の他の重要な単子葉植物はアグロバクテリウムを介した形質転換を用いる形質転換に成功していない。しかし、Tiプラスミドは今後、これらの他の単子葉植物のためのベクターとして作用するように操作される可能性がある。さらに、モデル系としてTiプラスミドを用いることで、これらの植物のための形質転換ベクターを人為的に構築することが可能となる可能性もある。また、Tiプラスミドを、微量注入法などの人為的方法により、または単子葉植物のプロトプラストとT-領域を含む細菌のスフェロプラストとの融合（これらは続いて植物の核DNA中に組み込まれうる）により、単子葉植物にも導入することも可能である可能性がある。
【０１１９】
さらに、遺伝子移入を、Bechtold et al.（1993, C.R. Acad. Sci. Paris, 316: 1194）によって記載されたように、アグロバクテリウムによるインサイチュー形質転換によって実現することもできる。この方法はアグロバクテリウム細胞の懸濁液の陰圧下浸透（vacuum infiltration）に基づいている。
【０１２０】
または、キメラ構築物を、アグロバクテリウムの根誘導性（Ri）プラスミドをベクターとして用いて導入することもできる。
【０１２１】
カリフラウワーモザイクウイルス（CaMV）も、植物細胞に外因性核酸を導入するためのベクターとして用いうる（米国特許第4,407,956号）。CaMVのDNAゲノムは親の細菌プラスミド内に挿入され、細菌内で増殖しうる組換えDNA分子を生ずる。クローニングの後に、組換えプラスミドを再びクローニングし、所望の核酸配列を導入することによりさらに改変することができる。続いて、この組換えプラスミドの改変されたウイルス部分を親の細菌プラスミドから切り出して、植物細胞または植物への接種のために用いる。
【０１２２】
核酸構築物を、例えばFromm et al.（1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 5824）およびShimamoto et al.（1989, Nature 338: 274-276）により記載されているように、電気穿孔法によって植物細胞に導入することもできる。この手法では、植物のプロトプラストを、関連する核酸配列を含むベクターまたは核酸の存在下で電気穿孔により導入する。高い電場強度の電気衝撃は膜を可逆的に透過化し、核酸の導入を可能にする。電気穿孔された植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂して植物カルスを形成する。
【０１２３】
核酸構築物を植物細胞内に導入するもう1つの方法は、例えばKlein et al.（1987, Nature 327: 70）に記載されたように、導入しようとする核酸を小さなビーズもしくは粒子の媒体の内部またはその表面のいずれかに含む、小さな粒子による高速射入である（微粒子銃法またはマイクロプロジェクタイル法としても知られる）。通常必要なのは新たな核酸配列の単回の導入のみであるが、この方法は特に複数の導入も得られる。
【０１２４】
または、核酸構築物を、機械的または化学的手段を用いて植物細胞と接触させることにより、その植物細胞に導入することもできる。例えば、ミクロピペットを用いることにより、核酸を微量注入によって直接、植物細胞に機械的に移入することができる。または、植物細胞によって取り込まれる遺伝物質との沈降複合体を形成するポリエチレングリコールを用いることにより、核酸を細胞内に移入することもできる。
【０１２５】
単子葉植物の形質転換に関しては、種々の方法が現在知られている。現時点での、単子葉植物の形質転換のための好ましい方法は、外植片または細胞懸濁液のミクロプロジェクタイル射入、直接的なDNA取り込み、または、例えばShimamoto et al.（1989, 前記）によって記載されたような電気穿孔法である。ミクロプロジェクタイル射入によってトウモロコシ懸濁培養物の胚形成性細胞にストレプトミセス-ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のbar遺伝子を導入することにより、トランスジェニックトウモロコシ植物が得られている（Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2: 603-618）。コムギやオオムギなどの他の単子葉植物のアリューロンプロトプラストへの遺伝物質の導入も報告されている（Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13: 21-30）。胚形成性懸濁培養物を樹立することを目的として、齢数を経た密な塊状の胚形成性カルス組織のみを選択することにより、胚形成性懸濁培養物からコムギ植物体が再生している（Vasil, 1990, Bio／Technol. 8: 429-434）。これらの穀類のための形質転換系との組み合わせにより、本発明を単子葉植物に適用することが可能となる。これらの方法を、双子葉植物の形質転換および再生に適用することも可能と思われる。例えば、Bower et al.（1996, Molecular Breeding 2: 239-249）によって記載されたように、トランスジェニック・サトウキビ植物体が胚形成性カルスから再生している。
【０１２６】
または、例えば、アグロバクテリウムをコーティングした微粒子を用いる射入法（EP-A-486234号）または創傷を誘導するためのミクロプロジェクタイル射入の後のアグロバクテリウムとの共培養（EP-A-486233）といった種々の方法の組み合わせを、形質転換プロセスの効率を高めるために用いることもできる。
【０１２７】
本発明に関して好ましい植物は、例えば食物、飼料、発酵または産業用供給原料などの用途のために用いられる、可溶性炭水化物を含む、有用な物質を産生するという理由で栽培または収穫される種である。このような種の例には、糖産生農作物（sugar crop）、例えばサトウキビ、サトウダイコン、サトウモロコシおよびチコリなど；果実、例えばブドウ、柑橘類、ナシ状果、核果および堅果など；葉、茎、根、塊茎、果実、鞘または種子を目的として収穫される野菜；ならびに牧草が含まれる。
【０１２８】
6. 本発明のプロモーター配列
本発明はまた、植物における、特に単子葉植物、より詳細にはイネ科の単子葉植物における、キメラ遺伝子または異種遺伝子の茎特異的発現のためのプロモーター配列であって、SEQ ID NO：10に示された配列を含むプロモーター配列も提供する。このプロモーター配列を本明細書ではP67Bプロモーターとも称する。本発明はまた、SEQ ID NO：10の生物活性部分ならびにそのポリヌクレオチド配列変種も想定している。当業者は、プロモーター配列の生物活性部分または断片を特定の遺伝子と融合させて植物細胞に導入すると、このような断片の非存在下で可能なよりも高いレベルで遺伝子の発現を引き起こすことを理解しているであろう。1つまたは複数の生物活性部分を本発明によるプロモーターに含めることができ、例えば、1つまたは複数のモチーフを「最小」プロモーターと結合させることができる。このようなモチーフは、プロモーターに対して、単子葉植物、特にイネ科の単子葉植物（その説明的な例にはサトウキビ、イネ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシなどが含まれる）の茎における成績向上のための適合性といったP67Bプロモーター機能を付与しうる。
【０１２９】
プロモーターの活性は、当技術分野で周知の方法によって決定しうる。例えば、プロモーター活性のレベルは、プロモーターから転写によって生じたmRNAの量の評価により、またはプロモーターから転写によって生じたmRNAの翻訳によって生じたタンパク質産物の量の評価により、定量可能である。発現系に存在する特定のmRNAの量は、例えば、そのmRNAとハイブリダイズ可能であって、しかも標識されているか、またはPCRなどの特異的増幅反応に用いうる、特異的オリゴヌクレオチドを用いて決定しうる。レポーター遺伝子の使用は、タンパク質産生を参照することにより、プロモーター活性の決定を容易にする。プロモーター活性を評価するための非制限的な例は、Medberry et al.（1992, Plant Cell 4: 185；1993, The Plant J. 3: 619）、Sambrook et al.（1989, 前記）およびMcPherson et al.（米国特許第5,164,316号）に開示されている。
【０１３０】
本発明はまた、本発明の基準プロモーターに対して実質的に相補的であるプロモーター変種も想定している。一般に、これらのプロモーター変種は、同一サイズの参照ポリヌクレオチド配列（「比較域」）にわたり、またはアラインメントが当技術分野で知られたコンピュータ相同性プログラムにより実施されるようにアラインメントが行われた配列と比較した場合に、適切には少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％の配列同一性を示す領域を含むと考えられる。どれが適した変種を構成するかは、従来の技法によって決定しうる。例えば、SEQ ID NO：10によるポリヌクレオチドを、本発明による単離された天然プロモーターの事前に調製した変種または非変種に対する、当業者に公知の標準的なプロトコールに従ったランダム変異誘発法（例えば、トランスポゾン変異誘発法）、オリゴヌクレオチドを介した（または部位特異的）変異誘発法、PCR変異誘発法およびカセット変異誘発法を用いて、変異させることができる。または、プロモーター配列変種を以下の手順に従って調製することもできる：
（a）適した生物体（これは単子葉植物が好適であり、好ましくはサトウキビなどのイネ科の単子葉植物である）から核酸抽出物を入手する段階；
（b）本発明の基準プライマー配列の少なくとも一部分と隣接するプライマーを設計する段階；および
（c）核酸増幅法により、プライマーを用いて、少なくとも1つの増幅産物を核酸抽出物から増幅する段階、この際、増幅産物は本発明のプロモーター変種に対応する。
【０１３１】
適した核酸増幅法は当業者に周知であり、これには、例えばAusubel et al.（前記）に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；例えば米国特許第5,422,252号に記載されている鎖置換増幅法（SDA）；例えばLiu et al.（1996, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594および国際出願WO92／01813号）およびLizardi et al.（国際出願WO97／19193号）に記載されているローリングサークル複製法（RCR）；例えばSooknanan et al.（1994, Biotechniques 17: 1077-1080）に記載されている核酸配列に基づく増幅法（NASBA）；ならびに例えばTyagi et al.（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395-5400）により記載されているQ-βレプリカーゼ増幅法が含まれる。
【０１３２】
7. 本発明のプロモーターの用法
本発明の単離されたプロモーター配列は、例えば、外来性または内因性DNA配列の発現を行わせるために用いることができる。外来性または内因性DNA配列は、対応する標的遺伝子の発現を調節するRNA分子として転写される領域を含みうる。このような発現の調節は、例えば、当技術分野で公知であるような、アンチセンス技術、リボザイム技術および共抑制または相同性依存的遺伝子サイレンシングによって行うことができる。このため、この転写物は、対応する標的遺伝子の発現のダウンレギュレーションを目的とする、アンチセンスRNA分子またはリボザイムまたは他の転写物（例えば、以下に述べるような逆方向反復配列およびdsRNA）を含みうる。
【０１３３】
したがって、いくつかの態様において、転写物は、標的遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を、mRNAと結合してタンパク質翻訳を妨げることによって直接阻止するアンチセンスRNA分子である。用いる場合、アンチセンスRNAは少なくとも約10〜20ヌクレオチド長またはそれ以上の長さであるべきであり、標的とされた相同配列の発現が起こらないように、その標的遺伝子または遺伝子転写物に対して少なくとも約75％の相補性を有するべきである。
【０１３４】
また別の態様において、転写物は、標的遺伝子mRNAの翻訳を阻害するように働くリボザイムである。リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒しうる酵素性RNA分子である。リボザイムの作用の機序には、リボザイム分子と標的RNAとの配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くヌクレオチド鎖切断が含まれる。本発明の範囲に含まれるものには、標的遺伝子のRNA配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する、人工的に操作されたハンマーヘッドモチーフ型リボザイム分子がある。任意のRNA標的候補の内部の特異的リボザイム切断部位は、以下の配列、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位に関して標的分子をスキャニングすることによってまず同定される。ひとたび同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にする可能性のある、二次構造などの予想される構造的特徴に関して評価することができる。用いる場合、リボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイム、アックスヘッド型リボザイム、ニュートサテライト型（newt satellite）リボザイム、テトラヒメナリボザイムおよびRNアーゼPからなる群より選択され、これらは標的遺伝子の配列に基づいて当技術分野で公知の方法に従って設計可能である（例えば、米国特許第5,741,679号を参照）。候補標的の適合性を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの到達可能性を調べることによって評価することもできる。
【０１３５】
また別の態様において、転写物は、標的遺伝子または遺伝子転写物のRNA干渉（RNAi）を媒介するRNA分子である。RNAiとは、標的遺伝子の転写物に対して相同な一本鎖、典型的には二本鎖のRNA（dsRNA）の導入による、標的遺伝子の産物との干渉またはその破壊のことを指す。したがって、いくつかの態様においては、標的遺伝子の少なくとも一部分に対応するdsRNAそれ自体、および特にdsRNAを生成する構築物を用いて、そのレベルおよび／または機能的活性を低下させることができる。RNAiを介した遺伝子発現の阻害は、当技術分野で報告されている技法の任意のものを用いて、例えば、ステムループ型またはヘアピン型のRNA構造をコードする核酸構築物を標的細胞のゲノム中にトランスフェクトすることにより、または、収束性プロモーター間から、または単一のプロモーターの後方からの頭-頭重複もしくは尾-尾重複として、標的遺伝子に対する相同性を有するトランスフェクトされた核酸構築物を発現させることにより、実現可能である。任意の類似した構築物を、それが自らに対する折り畳みを起こしてdsRNAを形成する能力を有する単一RNAを生じる限り、またはそれが2つの別々のRNA転写物を生じ、続いてそれらがアニーリングして標的遺伝子に対する相同性を有するdsRNAを形成する限り、用いることができる。
【０１３６】
RNAiのためには絶対的な相同性は必要ではなく、それよりも低い閾値である約85％の相同性が、約200塩基対のdsRNAに関して記載されている（Plasterk and Ketting, 2000、Current Opinion in Genetics and Dev. 10: 562-67）。したがって、dsRNAの長さに応じて、RNAiをコードする核酸は、標的遺伝子転写物に対する相同性のレベルの点でさまざまであり、すなわち、100〜200塩基対のdsRNAでは少なくとも約85％の相同性を標的遺伝子に対して有し、それよりも長いdsRNA、すなわち300〜100塩基対では標的遺伝子に対して少なくとも約75％の相同性を有する。別々に発現されたRNAとアニーリングするように設計された単一のRNA転写物を発現するRNAコード性構築物、または収束性プロモーターからの別々の転写物を発現する単一の構築物は、少なくとも約100ヌクレオチド長であることが好ましい。内部フォールディングによってdsRNAを形成するように設計された単一のRNAを発現するRNAコード性構築物は、少なくとも約200ヌクレオチド長であることが好ましい。
【０１３７】
dsRNA形成性構築物を発現させるために用いられるプロモーターは、結果として生じるdsRNAが、破壊の標的となる細胞系譜における遺伝子産物に対して特異的である限り、任意のタイプのプロモーターであってよい。または、特定の発生系譜の細胞のみにおいて発現されるという点で、プロモーターが系譜特異的であってもよい。これは、標的でない細胞系譜で発現される遺伝子との間にある程度の相同性の重複が認められる場合に有益な可能性がある。また、プロモーターが外部制御因子または細胞内環境因子によって誘導されてもよい。
【０１３８】
もう1つの態様において、例えばTuschl et al. 米国特許出願第20020086356号に記載されたような、対応する特異的mRNAの切断を導く約21〜約23ヌクレオチドのRNA分子を、RNAiを媒介させるために利用することもできる。このような21〜23ntのRNA分子は3'ヒドロキシル基を含むことができ、一本鎖でも二本鎖でもよく（2つの21〜23nt RNAとして）、この際、dsRNA分子は平滑末端性でもよく、または突出末端を含むこともできる（例えば、5'、3'）。
【０１３９】
また別の態様において、外来性または内因性DNA配列は以下のものをコードする：検出または測定が可能な産物、例えば、β-グルクロニダーゼまたはルシフェラーゼ；選択可能な産物、例えば、ジェネティシン（登録商標）およびパロモマイシンなどのアミノ配糖体抗生物質に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（nptII）；除草剤耐性、例えば、グリホサート耐性またはグルホシネート耐性を付与する産物；デンプンの生合成または改変に影響を及ぼす産物、例えば、デンプン分枝酵素、デンプンシンターゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ；脂肪酸生合成に関与する産物、例えば、デサチュラーゼまたはヒドロキシラーゼ；昆虫耐性を付与する産物、例えば、バチルス-チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の結晶性毒素タンパク質；ウイルス耐性を付与する産物、例えば、ウイルスコートタンパク質；真菌耐性を付与する産物、例えば、キチナーゼ、β-1,3-グルカナーゼまたはフィトアレキシン；スクロース代謝を変化させる産物、例えば、インベルターゼまたはスクロースシンターゼ；有用な医薬品、例えば、抗生物質、二次代謝産物、医薬品用ペプチドまたはワクチンをコードする遺伝子。
【０１４０】
外来性または内因性のDNA配列には、植物遺伝子から、ならびに細菌、酵母、動物またはウイルスなどの非植物性遺伝子からのDNAが非制限的に含まれる。さらに、外来性または内因性DNA配列を所定の植物遺伝子型から単離し、例えば、所定の遺伝子産物の産生を増強するために、引き続いてその配列の多数のコピーを同じ遺伝子型に対して導入することも、本発明の範囲に含まれる。導入されるDNAには、改変された遺伝子、遺伝子の部分、または同じもしくは異なる植物遺伝子型からの遺伝子を含むキメラ遺伝子が含まれうる。
【０１４１】
外来性または内因性DNA配列によってコードされる農業的特徴には以下のものが非制限的に含まれる：栽培者にとって有益な特性、例えば、水不足に対する抵抗性、害虫抵抗性もしくは耐性、除草剤抵抗性もしくは耐性、疾患抵抗性もしくは耐性（例えば、ウイルスまたは真菌性病原体に対する耐性）、ストレス耐性（塩耐性の増大）および食物含量の改良もしくは収量の増加；植物から採取される園芸製品の消費者にとって有益な特性、例えばヒト食品もしくは動物飼料における栄養分含量の改良；または、食品加工業者にとって有益な特性、例えば加工特性の改良。このような用途において、本発明のプロモーターを含むトランスジェニック植物は、一般に、動物用の貯蔵牧草の一部として、または装飾目的での使用を含め、ヒトまたは動物の食物においてその穀物、果実およびその他の植物部分（茎、外殻、野菜部分など）を使用する目的で栽培される。往々にして、穀類の化学成分が食品または産業的用途のために抽出されており、このような成分のレベルが増大または改良されたトランスジェニック植物が作出される可能性もある。
【０１４２】
本発明の単離されたプロモーター配列は、関心対象の化合物が植物部分、種子などから抽出または精製されるような、タンパク質または他の化合物の商業的製造にも有用な可能性がある。このようなタンパク質または化合物には、ワクチンに用いるための免疫原性分子、サイトカインおよびホルモンが非制限的に含まれる。植物からの細胞または組織を培養し、インビトロで生長させること、または発酵させてこのような分子を製造することもできる。
【０１４３】
本発明の単離されたプロモーター配列を含むトランスジェニック植物を、商業的な育種プログラムに用いること、または近縁の穀類種との交雑もしくは交配を行うこともできる。外来性または内因性DNA配列によりコードされている改良点を、例えばプロトプラスト融合により、例えば、1つの植物種の細胞から別の植物種の細胞へと移行させることもできる。
【０１４４】
本発明の単離されたプロモーター配列を含むトランスジェニック植物には研究または育種において多くの用途があり、これには、従来の変異誘発法および選別によって後に作出することが可能であるような有益な変異体を同定することを目的とする、挿入変異誘発法による新たな変異植物の作出が含まれる。その一例は、遺伝的変異を作製するために用いうる転移性エレメントをコードする組換えDNA配列の導入、または所有権下にある系統もしくは品種を同定するために用いうる一意的な「標示配列」もしくは他のマーカー配列の導入であると考えられる。
【０１４５】
8. 分化したトランスジェニック植物の作製および特性決定
8.1 再生
形質転換細胞を分化した植物へと再生させるために用いられる方法は、本発明にとって決定的に重要ではなく、標的植物に適した任意の方法を用いることができる。通常、植物細胞を形質転換プロセスの後に再生させることによって全植物体が得られる。
【０１４６】
プロトプラストからの再生には植物種によって違いがあるが、一般にはプロトプラストの懸濁液をまず作成する。種によっては、続いてこのプロトプラスト懸濁液から胚形成を誘導し、天然の胚として熟成および発芽の段階まで到達させることができる。培地は一般に、成長および再生に必要な種々のアミノ酸およびホルモンを含む。用いられるホルモンの例には、オーキシンおよびサイトカイニンが含まれる。時には培地にグルタミン酸およびプロリンを添加することがしばしば有益であり、これは特にトウモロコシおよびアルファルファなどの種でそうである。効率的な再生は、培地、遺伝子型およびその培養の履歴に依存する。これらの変数を制御すれば、再生は再現可能である。再生は、植物のカルス、外植片、器官または部分からも起こる。形質転換を、例えば、Methods in Enzymology、Vol. 118およびKlee et al.（1987, Annual Review of Plant Physiology, 38: 467）（これは参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたように、器官または植物部分の再生の状況下で行うこともできる。Horsch et al.（1985, Science, 227: 1229、これは参照として本明細書に組み入れられる）の葉ディスク形質転換再生法を用いて、ディスクを選択培地上で培養し、その後約2〜4週間で苗条を形成させる。発育した苗条をカルスから切り出し、適した根誘導性選択培地に移植する。根の形成した苗木を、根が現れた後できるだけ早く土壌に移植する。この苗木を成熟するまで必要に応じて別の大きな鉢に植え替える。
【０１４７】
栄養成長性に増殖する作物の場合には、成熟したトランスジェニック植物を伐採物の採取により、または組織培養法により増殖させて多数の同一な植物を作製する。所望のトランスジェニック体を選択し、新たな品種を入手し、商業的用途のために栄養成長性に増殖させる。
【０１４８】
種子で増殖する作物の場合には、成熟したトランスジェニック植物を自己交配させてホモ接合性の同系植物を作製する。この同系植物は新たに導入された外来遺伝子を含む種子を生じる。これらの種子を成長させて、選択された表現型、例えば早期開花を示すと考えられる植物を得ることができる。
【０１４９】
花、種子、葉、枝、果実などの再生された植物から得られた部分は、これらの部分が、記載された通りに形質転換された細胞を含むならば、本発明に含まれる。再生された植物の子孫および変種および変異体も、これらの部分が導入された核酸配列を含むならば、本発明の範囲内に含まれる。
【０１５０】
文献には具体的な植物種を再生させるための手法が数多く記載されており、その数がますます増加しつつあることは理解されているであろう。当業者は詳細について文献を参照し、不要な実験を行うことなく適切な手法を選択することができる。
【０１５１】
特性決定
再生過程にある植物の内部に外来性または外因性のポリヌクレオチドが存在することを確かめるために、種々のアッセイを行うことができる。このようなアッセイには、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法ならびにPCRなど；糖代謝酵素の活性を決定するアッセイ；ならびに酵素の発現を検出または定量化するイムノアッセイが含まれる。所望の酵素の発現が植物で示された後に、植物を栽培する。対象のなる表現型上の特徴が安定して維持および遺伝されることを確かめるために二世代またはそれ以上の世代にわたって栽培してもよい。
【０１５２】
所望の表現型上の特徴を同定するためには、所定の糖代謝酵素導入遺伝子を含有および発現するトランスジェニック植物を対照植物と比較する。トランスジェニック植物を、選択したシンク組織、例えば、塊茎、果実および／または根における酵素活性の測定によって選択することが好適である。糖代謝酵素活性を成長期から老化期に至るさまざまな段階で定期的に測定し、対照植物のものと比較する。対照として比較して、1つまたは複数の時期に酵素活性が上昇または低下している植物または植物部分を選択する。活性を、酵素の種類、転写制御エレメントの種類、翻訳開始の種類、終止領域の種類、導入遺伝子のコピー数、導入遺伝子の挿入および配置を含む、1つまたは複数の他の特性と比較することができる。
【０１５３】
酵素活性と関連性のある表現型上の特徴を評価する場合には、トランスジェニック植物および対照植物を、グロースチャンバー、温室、オープントップチャンバーおよび／または野外条件で栽培することが好ましい。特定の表現型特性の同定および対照との比較は、ルーチン的な統計分析およびスコア化に基づく。植物系統間の統計学的な差異は、糖代謝酵素活性を、その酵素を発現する各組織種における植物系統間で比較することによって評価しうる。発現および活性を成長、発達および収量のパラメーターと比較するが、これには、植物部分の形態、色調、数、サイズ、寸法、乾燥および湿重量、熟成、地上-地下バイオマス比、ならびに成長期から老化期に至る種々の段階の時期、速度および期間（栄養成長、果実形成、開花を含む）、ならびにスクロース、グルコース、フルクトースおよびデンプンレベルならびに他の内因性糖レベルおよび外来性糖レベルを含む可溶性炭水化物含量が含まれる。他の特性を有するトランスジェニック植物を同定するために、植物を光合成活性および代謝活性、ならびに最終産物合成に関して試験することができる。例えば、トランスジェニック植物細胞および植物部分（塊茎、果実および根など）から単離された材料を、デンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、糖アルコールならびに他の内因性糖および外来性糖に関して、標準的なプロトコールに従って測定する。糖含量、特にフルクトースおよびスクロースに基づく甘味度も同様に試験することができる。植物によっては、表現型への影響を観察するために栽培条件を変更することが必要な場合もある。一例として、酸素、二酸化炭素および光の制御および測定を開放ガスチャンバー系で行い、二酸化炭素または他の代謝基質のC14標識によって炭素分配を測定することができる。炭素分配を、果実、葉および／または根からの抽出物において、クロマトグラフィー法により、または糖屈折計を用いるブリックス法によって評価することもできる。これらの特性を、それぞれの種類の栽培条件における系統間でガス交換パラメーター、光の量および質、温度、基質および含水率を変化させた栽培条件に対して比較すること、またはそれによって誘導することもできる。
【０１５４】
9. 発酵産物の生産
本発明のトランスジェニック植物によって産生される可溶性炭水化物は、エタノール、エタノール含有飲料、ならびに食品、機能性食品、酵素および産業用材料など他の発酵産物のための発酵供給原料として後に用いることができる発酵性炭水化物を含むと考えられる。植物由来の炭水化物供給原料を用いる発酵のための方法は当業者に周知であり、さまざまな発酵産物に対する工程が確立されている（例えば、Vogel et al. 1996,「発酵および生化学工学ハンドブック：原理、工程設計および装置（Fermentation and Biochemical Engineering Handbook：Principles、Process Design and Equipment）」、Noyes Publications, Park Ridge， N.J., USAおよびそれに引用された参考文献）。1つの態様において、可溶性炭水化物は植物を破砕することによって、または植物組織から水もしくは別の適した溶媒中への拡散によって抽出しうる。可溶性炭水化物を含むその結果得られた汁または抽出物は、バッチ工程、連続工程または固定化細胞工程における発酵または生物的変換のための基質としてそのまま用いることができる。または、スクロースの大半を結晶化によって回収した後に残る糖蜜の場合のように、可溶性炭水化物の一部を他の用途のために回収し、回収されなかった成分を発酵供給原料として用いることもできる。
【０１５５】
本発明が容易に理解され、実行に移されるように、以下の非制限的な実施例により、特に好ましい態様をここに述べる。
【０１５６】
実施例
実施例1
大腸菌における3種のスクロースイソメラーゼ遺伝子の発現
スクロースイソメラーゼ遺伝子、UQErw（エルウィニア-ラポンティシ（Erwinia rhapontici））、UQ14SおよびUQ68Jの配列は、Birch and Wu (2002)によって記載されている。この3種のスクロースイソメラーゼ（SI）遺伝子の発現ベクターpET 24b（Novagen）中へのサブクローニングのために3対のプライマーを設計した。PCRによって非コード領域およびリーダー配列を検出し、人工的な開始コドンを組み入れた。
【０１５７】
各々の順方向プライマーは：1）開始コドンを1つ含み、2）翻訳開始に関して植物性の状況を作り出し、3）遺伝子のオープンリーディングフレームの容易なクローニングおよびマッチングのためのBamHI制限部位を1つ組み入れる。各々の逆方向プライマーは、KpnI制限部位を1つ組み入れ、開始コドンを1つ含む。
【０１５８】
プライマー配列は以下の表1に提示されている。
【０１５９】
【表１】
2006525797.tif 000003
【０１６０】
高忠実度DNAポリメラーゼpfu（Stratagene）をPCRのために用いた。PCR産物を、TOPO（商標）TA Cloning（登録商標）Kit（Invitrogen）を用いて、ベクターpCR（登録商標）2.1中に直接クローニングした。pCR（登録商標）2.1ベクター中にある3種のスクロースイソメラーゼ遺伝子を切り出し、pGEM（登録商標）-3Zf(+)中にクローニングし、続いて大腸菌BL21（DE3）株における発現のためにpET24b（Novagen）中にクローニングした。
【０１６１】
実施例2
大腸菌において発現されたスクロースイソメラーゼによるスクロースからイソマルツロースへの変換効率
BL21（DE3）中にあるSI構築物（実施例1による）のそれぞれに対して15個の培養物を、50μg／mLカナマイシンを加えた5mLのLB培地中に用意した。細胞を225rpmで振盪しながら37℃で増殖させた。構築物のそれぞれに対して、0D600が1.000±0.005に達した6〜10個の培養物をその後の誘導のために選択した。0.5mLを各培養物から試料として採取した後に、IPTGを最終濃度1.0mMとなるように培養物に添加した。培養物のインキュベーションをさらに3時間継続した。0D600が1.750±0.005の範囲にある誘導培養物のみを、スクロースからイソマルツロースへの変換効率の定量のためにさらに選択したところ、構築物1種につき3個の培養物の分析を反復的に行うことが可能であった。
【０１６２】
各培養物の1.0mLのアリコートを遠心処理し、続いてペレットを、35.8mMクエン酸Naおよび128.4mMリン酸で緩衝化した50％スクロース溶液（pH 6.0）0.4mL中に再懸濁させた。この懸濁液を、225rpmで振盪しながら37℃で48時間インキュベートした。以下に記載したように（実施例12および13）、CE分析により、イソマルツロース変換に関して反応をアッセイした。イソマルツロース／（イソマルツロース＋スクロース）×100として表される変換効率を、既知の濃度の標準物質に対して標準化したスクロースのピーク面積およびイソマルツロースのピーク面積から、Beckman P／ACE 5000シリーズCEシステムのソフトウエアを用いて算出した。
【０１６３】
実施例3
プロモーターUbiによって作動する、サイトゾルを標的とするSI遺伝子の発現のための構築物DNA（pU3ZErw、pU3Z14SまたはpU3Z68J）
トウモロコシubi-1遺伝子由来のUbiプロモーター（Christensen and Quail, 1996, Transgen. Res. 5、213-218）を用いた。サトウキビ細胞における細胞質性の遺伝子発現のために、pET 24bベクターからの種々のSI遺伝子のインサート（実施例1）をさらに、プラスミドベクターpU3Z中のUbiプロモーターとアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域との間にクローニングし（Bevan et al., 1983, Nature 304, 184-187）、pU3ZErw、pU3Z14SまたはpU3Z68Jプラスミドを構築した。
【０１６４】
実施例4
プロモーターUbiによって作動する、ERリーダーペプチド、N末端プロペプチド（NTPP）液胞ターゲティングシグナルおよびUQ68J SIを有し、6×Hisタグを有するまたは有しない構築物DNA（pU3ZERsN68JまたはpU3ZERsN68J-His）
【０１６５】
ベクターの調製
Ubiプロモーター、21アミノ酸のスポラミンERリーダーペプチド、16アミノ酸のスポラミンNTPP液胞ターゲティングシグナルペプチド、MGUSレポーター遺伝子およびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域（Gnanasambandam & Birch, 2004）を含むベクターを、制限酵素NcoIおよびSacIによって部分的に消化し、Ubiプロモーター、ERリーダーペプチドおよびNTPPを有するベクター骨格を含む、その結果得られた断片をゲル電気泳動によって精製した。
【０１６６】
PCRによるインサートの調製
5'BglII制限部位を有する順方向プライマー
2006525797.tif 000004
、5'SacI制限部位を有する逆方向プライマー
2006525797.tif 000005
、および5'SacI制限部位を有するHis標識された逆方向プライマー
2006525797.tif 000006
を、ペリプラスムリーダー配列を含まないUQ68J SI遺伝子の増幅のために設計した。pET24bベクター中のUQ68J SI遺伝子をDNAテンプレートとして用いた。高忠実度Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を、この順方向プライマーおよび逆方向プライマーの一方を用いるPCR反応に用いた。PCR産物を、TOPO（商標）TA Cloning（登録商標）Kit（Invitrogen）を用いてベクターpCR（登録商標）2.1中に直接クローニングした。BglII部位およびSacI部位でpCR（登録商標）2.1ベクターからインサートを切り出し、ゲル電気泳動によって精製した。
【０１６７】
リンカーの調製
順方向一本鎖オリゴ体
2006525797.tif 000007
および逆方向一本鎖オリゴ体
2006525797.tif 000008
を、NcoIおよびBglII突出末端を有するリンカーを形成させるために設計した。500μMの各オリゴ体5μLを95℃に5分加熱し、続いて室温へと3時間かけて冷却した。
【０１６８】
連結および形質転換
ベクター、インサートおよびリンカーを連結し、大腸菌Top 10コンピテント細胞（Invitrogen）に導入した。
【０１６９】
実施例5
プロモーターUbiによって作動する、ERリーダーペプチド、UQ68J SIおよびC末端プロペプチド（CTPP）シグナルを有し、6×Hisタグを有するまたは有しない構築物DNA（pU3ZERc68JCまたはpU3ZERc68JC-His）
CTPP尾部を有するUQ68J SI遺伝子のインサートの調製
BglII制限部位を有する順方向プライマー
2006525797.tif 000009
、7アミノ酸（GLLVDTM）の液胞ターゲティングシグナルをコードする21bpをSacI制限部位とともに有する逆方向プライマー
2006525797.tif 000010
および、His標識GLLVDTMをSacI制限部位とともにコードする逆方向プライマー
2006525797.tif 000011
を、ペリプラスムリーダー配列を含まないUQ68J SI遺伝子の増幅のために設計した。pET24bベクター中にあるUQ68J SI遺伝子をDNAテンプレートとして用いた。高忠実度Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を、この順方向プライマーおよび逆方向プライマーの一方を用いるPCR反応に用いた。PCR産物を、TOPO（商標）TA Cloning（登録商標）Kit（Invitrogen）を用いてベクターpCR（登録商標）2.1中に直接クローニングした。BglII部位およびSacI部位でpCR（登録商標）2.1ベクターからインサートを切り出し、ゲル電気泳動によって精製した。
【０１７０】
中間ベクターを作製するために、PCRによって調製してpSE420に挿入したERリーダー配列
タバコキチナーゼのERリーダーペプチドのDNA配列に基づき、BamHI部位を有する順方向プライマー
2006525797.tif 000012
およびBglII制限部位を有する逆方向プライマー
2006525797.tif 000013
を設計した。高忠実度Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）およびテンプレートとしてのpER-RGUS-CTPP（Gnanasambandam & Birch, 2004）を用いて、23アミノ酸のERリーダーエレメントをコードするDNAを増幅した。PCR産物を精製し、エタノール沈降によって精製し、BamHIおよびBglIIで消化処理した上で、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、1.5％アガロースゲル電気泳動によって精製した。この産物をベクターpSE420（Invitrogen）のBamHIおよびBglII部位にクローニングし、インサートが所望の向きにあることをDNAシークエンシングによって確かめた。その結果得られたプラスミドをさらにBglIIおよびSacIで消化処理し、最も大きな断片をUQ68J SI遺伝子の挿入のための中間体として回収した。
【０１７１】
UQ68J SIおよびCTPPのpSE420-ER中間ベクターとしての連結および形質転換
CTPP尾部を有する68J SIを、中間ベクター中の、ERリーダーペプチドの下流に連結した。この連結産物をTop 10（Invitrogen）コンピテント細胞に導入した。その結果得られたプラスミドを制限酵素BamHIおよびSacIで消化し、インサートを連結のために回収した。
【０１７２】
プロモーターUbiおよびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域を有するpU3Zベクターの調製
ベクターpU3Z68J（実施例3）を制限酵素BamHIおよびSacIで消化した。プロモーターUbiおよびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域を有するベクター骨格断片を、連結のために回収した。
【０１７３】
ERリーダーUQ68J SIおよびCTPPをコードする断片を含むインサートのpU3Zベクター中への連結および形質転換
中間ベクターからのER-68J-CTPP断片を、pU3Zベクター中のBamHI部位とSacI部位との間に連結した。この連結産物をTop 10コンピテント細胞に導入した。
【０１７４】
実施例6
プロモーターUbiによって作動する、ERリーダーペプチド、NTPP液胞ターゲティングシグナル、UQ68J SIおよびCTPPシグナルを有する構築物DNA（pU3ZERsN68JC）
ベクターの調製
実施例4で調製したプラスミド構築物pU3ZERsN68JをBglIIおよびSacIで消化した。ベクター骨格、ERリーダー、NTPPおよびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域を含む断片を連結のために回収した。
【０１７５】
インサートの調製
実施例5で調製したプラスミド構築物pU3ZERc68JCをBglIIおよびSacIで消化した。CTPP尾部を有するUQ68J SI遺伝子断片を連結のために回収した。
【０１７６】
連結および形質転換
上記のベクターおよびインサート断片を連結して、Top 10コンピテント細胞に導入した。
【０１７７】
実施例7
サトウキビ茎特異的プロモーター67Bのクローニング
サトウキビ茎特異的プロモーターP67（Birch & Potier, 2000）のDNA配列に基づき、SacI制限部位を有する順方向プライマー
2006525797.tif 000014
およびBamHI制限部位を有する逆方向プライマー
2006525797.tif 000015
を、プロモーター相同体の候補を増幅するために、サトウキビ栽培品種Q117のゲノムDNAをテンプレートとして用いて設計した。Wu et al.（2000, Plant Journal, 22: 495-502）に若干の変更を加えた上で、Q117幼葉から全ゲノムDNAを単離した。手短に述べると、葉2gを液体窒素中で粉砕した。凍結粉末を抽出バッファー14mL（1.4M NaCl、20mM EDTA、0.1M Tris-HC1、pH 8.0、3％ CTABおよび1％ 2-メルカプトエタノール）中に65℃で30分間懸濁させた。等容積のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）を添加し、混合した上で10,000×g、4℃で10分間遠心した。水層を等容積のイソプロパノールと混合した上で、15,000×g、4℃で15分間遠心してDNAをペレット化した。ペレットを70％エタノールで洗浄し、残留エタノールを除去するために短時間乾燥させて、TEバッファー中に溶解させた。高忠実度DNAポリメラーゼPfu（Strategene）を用いた3回の独立した増幅による産物を、TOPO（商標）TA Cloning（登録商標）Kit（Invitrogen）を用いてベクターpCR（登録商標）2.1中に直接クローニングした。プラスミドDNAを単離し、15個の形質転換細菌コロニーよりシークエンシングを行った。シークエンシングの結果、15コロニーのうち5つは、Birch & Potier (2000)により単離されたP67配列とは異なる同一な配列を有することが示された。このため、Birch & Potier (2000)により単離された配列はプロモーター67Aと命名されている。今回新たに示された配列はプロモーター67Bと命名されている。
【０１７８】
実施例8
プロモーター67Bによって作動する、GUSレポーター遺伝子を有する構築物DNA（p67BGUS）
インサートを有するプラスミドpCR（登録商標）2.1（実施例7で調製）をBamHIおよびSacIで消化してプロモーター67Bを遊離させ、これを用いて、プラスミドp67AGUS（Birch & Potier, 2000）中のプロモーター67Aを置き換えた。
【０１７９】
実施例9
プロモーター67Bによって作動する、UQ68J SI遺伝子を有する構築物DNA（p67B68J）
インサートの調製
実施例1に記載したpCR（登録商標）2.1中間体から、UQ68J SI遺伝子をBamHI部位およびKpnI部位で切り出し、連結のために回収した。
【０１８０】
プロモーター67B、マルチクローニング部位およびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域を有するベクター
（i）実施例7によるプロモーター67BをベクターpSE420（Invitrogen）中のBamHI部位およびSacI部位に挿入し、続いて連結のためにBamHI部位とHindIII部位との間で切り出した。（ii）アグロバクテリウムnosポリアデニル化領域をベクターpBI101（Clontech）のSacI部位およびEcoRI部位から遊離させ、ベクターpGEM（登録商標）3Zf(+)中の同じ部位に挿入した。（iii）（i）によるP67B配列を（ii）による中間ベクター中のBamHI部位およびHindIII部位に挿入した。pGEM（登録商標）3Zf(+)骨格、プロモーター67B、マルチクローニング部位およびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域を有するその結果得られたベクターをBamHIおよびKpnIで消化して、連結のために回収した。
【０１８１】
連結および形質転換
UQ68J SI遺伝子を中間ベクター中のプロモーター67Bとポリアデニル化領域との間に連結してp67B68Jを完成させ、これをTop 10コンピテント細胞に導入した。
【０１８２】
実施例10
プロモーター67Aによって作動する、UQ68J SI遺伝子を有する構築物DNA（p67A68J）
PCRによるプロモーター67Aの調製
順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、実施例7におけるプロモーター67Bのクローニング用のものと同じとした。p67AGUS（Birch & Potier, 2000）中の67AプロモーターをDNAテンプレートとして用いた。高忠実度Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）をPCR反応に用いた。PCR産物を、TOPO（商標）TA Cloning(登録商標） Kit（Invitrogen）を用いてベクターpCR（登録商標）2.1中に直接クローニングした。プロモーター67AをpCR（登録商標）2.1ベクターのBamHI部位およびSacI部位で切り出し、連結のために回収した。
【０１８３】
ベクター骨格を有するSI遺伝子の消化による調製
実施例9で調製したプラスミドp67B68JをBamHIおよびSacIによって部分的に消化した。UQ68J SI遺伝子およびアグロバクテリウムnosポリアデニル化領域を有するベクター骨格を含む断片を連結のために回収した。
【０１８４】
連結および形質転換
プロモーター67Aをベクター中のUQ68J SI遺伝子の上流に連結した。連結産物をTop 10コンピテント細胞に形質転換導入した。
【０１８５】
実施例11
微粒子射入
SI遺伝子を有するプラスミド（pU3ZErw、pU3Z14S、pU3Z68J、pUERsN68J、pUERsN68J-His、pUERc68JC、pUERc68JC-His、pUERsN68JC、p67A68Jまたはp67B68J）およびaphA構築物pEmuKN（選択マーカーとして）をアルカリ抽出によって単離し、TEバッファー中に溶解させた。プラスミドの完全性およびゲノムDNAまたはRNAの欠如をゲル電気泳動によって確かめ、濃度を分光法によって測定した。
【０１８６】
本質的には以前に記載された通りに（Bower et al., 1996；Birch, 2000）、Ubi-スクロースイソメラーゼ（UbiSI）遺伝子構築物および選択マーカー構築物をタングステン製マイクロプロジェクタイル表面に共沈させてサトウキビカルスに導入し、その後に形質転換したカルス選択およびトランスジェニック植物の再生を行った。
【０１８７】
沈降反応は4℃で以下のものを1.5mL微量遠心管に順次添加することによって行った：5μL pEmuKNプラスミドDNA（1mg／mL）、5μL UbiSIプラスミドDNA（1μg／μL）、50μLタングステン（Bio-Rad M10、100μg／μL）、50μL CaCl2（2.5M）、20μLスペルミジン（100mM遊離塩基）。この調製物を、CaCl2とスペルミジンの添加の間の遅延時間を最小限にしながら、各試薬の添加後に直ちに混合した。続いて、タングステンを氷上に5分間置いて沈降させ、その後に上清100μLを除去し、管の基部を試験管立てに対して横切るように動かすことによってタングステンを再懸濁させた。懸濁液は、各アリコートを採取する直前に微粒子の再懸濁を行いながら、1回の射入当たり4μLの負荷量を15分以内に用いた。全DNAが反応過程で沈降したと仮定すると、これは1回の射入につき、667μgのタングステン上にある1.3μgのDNAに相当する。
【０１８８】
サトウキビ栽培品種Q117由来の胚形成性カルスを射入のために用いた。微粒子は、減圧チャンバーにおける標的カルス内へのシリンジフィルターホルダーの圧迫により、ヘリウムガスパルス中での直接同期によって加速させた。射入の前後4時間は組織を浸透圧に関して馴化させた。抗生物質を含まない固形培地上で48時間回復させた後に、射入を行ったカルスを、選択、カルス発生および植物再生のために45mg／Lジェネティシン（登録商標）を含む培地に移した。
【０１８９】
実施例12
サトウキビの成長条件および成長速度測定
サトウキビ栽培品種Q117、およびSI遺伝子を発現するそのトランスジェニック系統を、UC園芸用培養土B（1m-1の砂、0.5m−１の泥炭および12.45kgの肥料混合物（これは「血液・骨（blood and bone）」12に対して：硝酸カリウムを2：硫酸カリウムを1：過リン酸石灰を12：ドロマイトを20：水和石灰を12：石膏を6：「ミクロワックス（micromax）」を2.4の重量比で含む）を含む直径20cmの鉢に入れ、自然光度下での28℃の封じ込め温室内で、1日2回給水しながら栽培した。カルスから再生させた植物体（第一栄養生長世代）またはその後の茎の挿し木による植物体（第二および第三栄養生長世代）に関しては鉢1つについて1本の茎のみを成長させた。刈り株苗（ratoon）植物体に関しては、それまでに成長した茎を鉢の表面から切断した後に、鉢の植え替えを行わずに表面下の芽から2本の茎を成長させた（第二および第三栄養生長世代も得られる）。それぞれの鉢に肥料としてOsmocote（登録商標）を1カ月目および2カ月目には5g与え、その後は1カ月当たり10gを与えた。高さ（鉢の表面から視認しうる一番上のデュロップ（dewlap）まで）、茎の直径（地上の第1節間）、節の数（視認しうる一番上のデュロップを有する葉を抱いている節を番号1として算定）および生重量を、最初の3カ月は毎月記録し、以後は2週間毎に記録した。
【０１９０】
実施例13
キャピラリー電気泳動のための試料調製
イオン性物質を除去するために、培養上清および植物組織抽出物は強力な陽イオンおよび陰イオン交換カラム（Varian Bond Elut-SCXおよびSAX）に通した。試料およびすすぎ洗い液はシリンジを利用して圧をかけてカラムに通した。
【０１９１】
カラムには、1倍容積のメタノール、続いて1倍容積の水ですすぎ洗いすることによってプレコンディショニングを行った。細菌培養上清（実施例2による）を、滅菌Milli-Q（SMQ）水を用いて150倍に希釈し、続いて1mLの希釈上清をSAXおよびSCXカラムに通し、吸着されなかった溶出液を1.5mL管に収集した。
【０１９２】
実施例14
キャピラリー電気泳動
高速キャピラリー電気泳動（HPCE）による分離を、Beckman P／ACE 5000シリーズCEシステムにて、試料検出用に254nmでの吸光度を用いて行った。キャピラリーは裸の溶融シリカ、内径50μm、外径363μm（Supelco Cat.# 70550-U）とした。キャピラリー全長は77cmであり、流入口から検出器までのウィンドウ長は69cmであった。キャピラリー検出用ウィンドウは、キャピラリーのコーティングをマッチで焼灼除去してメタノールで拭き取ることによって作成した。
【０１９３】
アルカリ性硫酸銅電解質緩衝液（EB、6mM硫酸銅（II）および500mMアンモニア、pH 11.6から構成される）をスクロースおよびイソマルツロースの分離、さらには細胞抽出物中に存在すると予想されるグルコースおよびフルクトースを含む他の糖との分離のために用いた。中性糖の分離および直接UV検出は、アルカリ条件下での糖と銅（II）とのキレート化反応によって容易になる。EBは各々の日の開始時点で新鮮な状態にし、使用15分前に減圧下で脱気した。
【０１９４】
移動時間の再現性を最大限に高めるために、以下のすすぎ洗い手順により、キャピラリーを毎日の使用前に馴化した：水で2分間、0.1M HClで10分間、水で2分間、0.1M NaOHで10分間、水で2分間、0.5Mアンモニアで15分間および水で2分間。溶液はすべてSMQ水で溶解／希釈し、0.45μmのMicroporeフィルターで濾過した。続いて、キャピラリーを最初の試料の前にEBで15分間すすぎ洗いし、試料間には10分間すすぎ洗いした。泳動は25KVで30分間行った。各バッチにおける最初の試料の前および最後の試料の後に標準物質（スクロースおよびイソマルツロース＋実験に適した他の糖からなる）を泳動し、EBの枯渇またはキャピラリー加熱などの要因に起因する移動時間の差の計測および補正を行えるようにした。試料中の各々の糖濃度は、既知のモル濃度の標準物質に対するピーク面積の比較によって算出した。
【０１９５】
実施例15
HPLC-EDのための、サトウキビ茎組織における3つの半径方向帯域の細胞内空間および細胞外間隙からの試料の調製
1.5cm長の切片を節間の中央部から切り出し、試料を3つの半径方向帯域（中心、中間および外側）から収集した。中心帯域は直径6mmの円筒形であり、鋭利なコルクボーラーを用いて採取した。中間帯域はその周囲の4mm幅のバンドとし、直径10mmのコルクボーラーを用いて採取した。外側帯域は外皮の直下の4mm厚を切り取ることによって収集した。切除した帯域を、液体の遠心分離収集のための膜を用いずに、GelSpin（商標）フィルター（Mo Bio Laboratories）中に別々に配置した。切断表面の細胞からの液体を除去するために、試料を150×g、4℃で10分間遠心して、濾液を廃棄した。600×g、4℃でさらに4分間遠心した後に、濾液を細胞外間隙からの液体として収集した。細胞内液の混入を避けるために、試料を1,500×g、4℃で5分間遠心し、濾液を廃棄した。続いて試料を液体窒素中で凍結させて室温まで加熱することによって細胞膜を破壊し、10,000×g、4℃で10分間遠心した。この濾液を細胞内液として収集した。細胞内液および細胞外液の両方を収集後に100℃で5分間加熱し、不溶性材料を除去するために15,000×gで10分間遠心した。上清を滅菌Milli-Q水を用いて1,000倍に希釈し、HPLC-Eにより分析した。
【０１９６】
実施例16
HPLC-EDによる糖濃度の測定
スクロース、イソマルツロース、トレハルロース、グルコースおよびフルクトースの分離および定量は、PA20分析用陰イオン交換カラムおよび四波形（quad waveform）パルス電気化学検出を用いるDionex BioLCシステムを用いて、高pH（100mmol l-1 KOH）でのイソクラティックHPLCにより、すべての試料バッチに関して糖標準物質の希釈系列に対する較正を行った上で実施した（Wu & Birch, 2004）。この方法は、NTPPおよび／またはCTPPシグナルを結合させたSI遺伝子を用いるすべての実験、ならびにP67プロモーターによって作動するSI遺伝子を用いるすべての実験に用い、糖濃度は汁中の濃度に相当する結果が得られるように手順における希釈度に対して補正した。
【０１９７】
実施例17
キャピラリー電気泳動によるサトウキビ組織中の糖濃度の測定
サトウキビ組織試料を収集して秤量し、液体窒素で急速凍結した後に、FW 1mg当たり3μLのSMQ水を添加し、管を20分間煮沸した（蓋が「ポンと抜ける」のを防ぐために微量遠心管の最上部には小さな孔を開けた）。すべての液体を管の基部に集めるためにごく短時間の遠心処理を行った後に、溶液を新たな管に移して、変性タンパク質を除去するために16,000×g、4℃で10分間遠心した。上清をBondElut（商標）SCXおよびSAXに通過させ、CE分析を実施例14に記載した通りに行った。この方法をUbiプロモーター／サイトゾルSI形質転換体を用いた実験に用い、糖濃度を、汁中の濃度に相当する結果が得られるように手順における希釈度に対して補正した。
【０１９８】
実施例18
葉クロロフィル、生重量、乾燥重量および含水量の測定
サトウキビ葉およびそれに付属する節に対して、視認しうる一番上のデュロップの葉に番号1を割り当てる形で、上から下に向かって番号を付した。測定は各系統当たり少なくとも3つずつの植物体に対して行った。クロロフィルまたは重量の各回の測定では、直径5mmの孔開け器を用いて、デュロップから葉長1／10の箇所にある葉身から4枚ずつのディスクを採取した。この4枚のディスクをあらかじめ秤量した1.5mL微量遠心管に入れ、直ちに秤量した上で液体窒素中に入れた。
【０１９９】
乾燥重量および含水量の測定に関しては、葉ディスクを70℃で一定の乾燥重量になるまでオーブン乾燥させた。含水量は以下の通りに算出した：
（生重量−乾燥重量）／生重量 * 100
【０２００】
クロロフィルの推算に関しては、凍結した葉ディスクを粉砕して粉末とし、暗所で80％アセトンにより抽出した後に、12,000×g、4℃で10分間遠心した。吸光度を664nmおよび647nmで測定した。クロロフィルa、クロロフィルbおよび総クロロフィル濃度（Graan and Ort, 1984）は以下の通りに算出した：
クロロフィルa（mM）＝13.19 A664−2.57 A647
クロロフィルb（mM）＝22.10 A647−5.26 A664
総クロロフィル（mM）＝7.93 A664＋19.53 A647
【０２０１】
実施例19
サトウキビ葉における光化学系IIの電子伝達速度
光合成電子伝達速度を、デュロップから葉長1／10の箇所に配置した光ファイバーMINI-PAM／F（Heinz Walz GmbH, Germany）および葉クリップホルダー2030-Bを用いて作成した蛍光曲線より推算した。MINI-PAMの光強度、飽和パルス強度、飽和パルス幅、葉吸光計数および照射時間に関するパラメーターはそれぞれ8、8、0.8、0.84および10秒間に設定した。測定中のMINI-PAMの内部温度は25〜30℃の間に制御した。蛍光は各系統当たり少なくとも3つずつの植物体からの同等な葉に対して測定した。
【０２０２】
実施例20
サトウキビ葉のCO2固定速度
250cm3の葉チャンバーを有するLI-6200携帯型光合成システム（LI-COR, USA）を、蛍光測定に用いたものと同じ葉におけるCO2固定速度の測定に用いた。
【０２０３】
実施例21
サトウキビ組織からの全RNA抽出およびRNAゲルブロット分析
6カ月齢サトウキビ植物体の番号1〜2の葉または番号3〜4の茎から、Bugos et al.(1995)の方法を用いて全RNAを単離した。手短に述べると、10gの凍結組織を液体窒素下で粉砕して微粉末とした。抽出バッファー（100mM Tris-HCl pH 9.0、200mM NaCl、15mM EDTA、0.5％サルコシル、100mM 2-メルカプトエタノールを20ml）を添加し、続いてホモジナイズ処理を5分間行った。バッファーで平衡化したフェノール（20ml）および4mlのクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）を添加し、続いてホモジナイズ処理を2分間行った。酢酸ナトリウム（3M、pH 5.2を1.4ml）を添加してホモジナイズ処理を30秒間行った。抽出物を氷上で15分間冷却し、10,000×g、4℃で10分間遠心した。水性部分を新たな管に移し、等容積のイソプロパノールを添加した。10,000×g、4℃での10分間の遠心処理の後に、ペレットを70％エタノールで洗浄し、真空乾燥させた。
【０２０４】
ペレットを水中に溶解させ、8M LiClを最終濃度2Mとなるように添加した。氷上で3時間インキュベートした後に、14,000×g、4℃での10分間の遠心処理によってRNAを沈降させた。このRNAペレットを70％エタノールで洗浄して真空乾燥させ、水中に溶解させて濃度を分光光度計によって測定した。
【０２０５】
各レーン当たり30μgの全RNAを、2.2Mホルムアルデヒドおよび1.0％アガロースゲル中での電気泳動によって分画し、Hybond N+ナイロン膜（Amersham Pharmacia BioTech）へのブロッティングを行った。このブロットに、ChurchおよびGilbertの変法によるハイブリダイゼーション溶液（7％SDS、10mM EDTAおよび0.5Mリン酸緩衝液、pH7.2）による2時間のプレハイブリダイゼーションを行い、続いて完全長UQ68J SI cDNAからのランダムプライミング法による32P標識プローブと65℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に、膜を2×SSC、0.1％SDS、23℃ですすぎ洗いし、65℃での洗浄を、2×SSC、0.1％SDSにより15分間、1×SSC、0.1％SDSにより15分間および0.1×SSC、0.1％SDSにより15分間行い、合成樹脂フィルムで覆った上で、潜像蓄積のためにphosphorimagerプレート（Molecular Dynamics）に一晩露光させた。
【０２０６】
実施例22
本発明の実施のために有用な可能性のあるスクロースイソメラーゼ以外の遺伝子
種々の遺伝子を導入することにより、生物体によって通常感知される基質化合物の、その生物体の内部で同等な様式では認知されない産物化合物への部分的変換を実現し、その結果、代謝フローを変化させる効果を及ぼし、所望の化合物のより高収量での蓄積がもたらされる可能性がある。
【０２０７】
所望の化合物が炭水化物である場合、有用な遺伝子には、炭水化物に対する活性のある酵素（http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html）、例えばイソメラーゼ（EC 5.4）またはトランスグリコシダーゼ（EC 3.2）、またはアミロスクラーゼ（EC 2.4.1.4）、デキストランスクラーゼ（EC 2.4.1.5）、レバンスクラーゼ（EC 2.4.1.10）もしくはシクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19）などのグルコシルトランスフェラーゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4）、ならびに改変された生物体にとって異質であるオリゴ糖を選好的に合成するこれらの酵素の変種が含まれうる（Demuth et al. 2002；Martin et al. 2004；Park et al. 2003；Plou et al. 2002；van der Veen et al. 2004）。
【０２０８】
または、糖または内因性糖誘導体の、糖アルコールなどの外来性糖誘導体への部分的変換をもたらす酵素をコードする遺伝子（Saha 2004；Zhifang and Loescher 2003）も有用な可能性がある。遺伝子の選択には、標的生物における対応する基質および補助因子の利用可能性および代謝上の役割、ならびにその生物が産物を感知および代謝する能力に関する考慮が情報として備わるべきである。本発明を生理的機能が大きく異なる生物を用いて実施することも可能であり、当業者には、種々の種において本発明の効果を実現するために導入される代替的な遺伝子の最適な発現パターンをルーチン的な実験によって決定しうることは認識されると考えられる。
【０２０９】
実施例23
本発明の実施のために有用な可能性のあるサトウキビ以外の植物
本発明を、可溶性糖の収穫のために栽培される他の植物、例えばサトウモロコシもしくはサトウダイコン、または可溶性糖によって付与される甘さが重要な特性である植物、例えば穀類（スイートコーンなど）、マメ科植物（エンドウなど）および果実（ブドウ、トマトおよびバナナなど）において実施することもできる。これらの植物における発現を目的とする遺伝子の導入のための工程は、公知物に十分に記載されており、例えば（Cortina 2004；Ganapathi et al. 2001；Grant et al. 2003；Hermann et al. 2001；Jeoung et al. 2002；Joersbo et al. 2000；Polowick et al. 2002；Tadesse et al. 2003；Vidal et al. 2003；Zhang et al. 2001；Zhang et al. 2002）の方法があり、当業者には周知である。
【０２１０】
サトウモロコシは、サトウキビをモデル植物種として用いて提示した実施例における、本明細書に記載の発現構築物を用いて形質転換することができる。他の種においては、構築物を適切なプロモーターおよびシグナル配列の置換によって調節するとよい。例えば、CaMV 35Sプロモーターを双子葉植物種における構成性発現のために用いることができる。プロモーターは所望のシンク組織で選好的に発現されるものを用いることが好適である；これには例えば、サトウダイコンの貯蔵根における発現のためのパタチンB33プロモーター、または他の種に対する果実特異的もしくは熟成関連プロモーターがある（Lessard et al. 2002）。その他のシグナル配列を、遺伝子産物を細胞内のスクロース貯蔵区画および代謝区画にさまざまな程度で配分するために用いることもでき、これには例えば、パタチンB33遺伝子由来のNTPPまたは他の既知の液胞シグナルがある（Vitale and Raikhel 1999）。
【０２１１】
実施例に関する結果および考察
プロモーターUbiによって作動する、サイトゾルを標的とするSI発現
イソマルツロースは、遺伝子UQ14SおよびUQ68Jを発現するUbi-SIトランスジェニックサトウキビ系統ではすべての組織から検出されたが、UQErwを発現するトランスジェニック系統では茎組織のみから検出された
Ubiプロモーターの下流に導入されたSI遺伝子UQErw（11系統）、UQ14S（11系統）またはUQ68J（9系統）を発現した、サトウキビ栽培品種Q117のトランスジェニック系統を選別した。このプロモーターは、ほとんどのサトウキビ組織で持続的な「構成性」発現を引き起こし、熱ショックおよび他のある種の環境ストレスによってより高度の発現レベルが誘導されることが知られている（Hansom et al., 1999）。温室で栽培した12〜15個の節を有する6カ月齢植物において、pUbi14SおよびpUbi68J系統では葉、根および茎組織からイソマルツロースが検出されたが、pUbiErw系統では茎組織のみから検出された（図1）。これらの結果は、導入されたSI遺伝子がサトウキビにおいて機能しうることを裏づけるとともに、大腸菌およびトランスジェニックサトウキビのカルスで以前に示されているように（Birch and Wu, 2002）、UQ68Jが成熟サトウキビ植物体においてスクロースからイソマルツロースへの最も効率的な変換効率を付与することを示している（図2）。
【０２１２】
サイトゾルを標的とするUQ68J SIの構成性過剰発現は、トランスジェニックサトウキビの成長を遅らせ、形態を変化させ、スクロース蓄積を阻害した
pUbiErwおよびpUbi14Sトランスジェニックサトウキビ系統はいずれも、同じ条件下で栽培した対照Q117植物と表現型上は識別不能であった（表2）。9つのpUbi68Jトランスジェニックサトウキビ系統を以下のように分類することができた（図3）：
1）「正常」。5つの系統（pUbi68J2.36など）は、対照Q117と表現型上は識別不能であった。
2）「中肋が弱い型（Weak Midrib）」。1つの系統（pUbi68J1.2）は成長およびサイズの点ではQ117と同様であったが、十分に広がった葉において中肋に折り目を生じた。
3）「矮小型（Stunted）」。3つの系統は成長遅延を示し、節間部が短くて細く、葉も小さかった。これらのうち、生存可能であったのは系統pUbi68J2.22のみであった。
【０２１３】
（表２）温室条件下で6カ月間栽培したQ117対照および代表的なトランスジェニックサトウキビ系統の表現型上の特徴
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【０２１４】
代表的な系統であるpUbi68J2.36（正常型）、pUbi68J1.2（弱い中肋型）およびpUbi68J2.22（矮小型）のノーザン分析からは、矮小型植物におけるUQ68J転写物のレベルが最も高く、他の2つのカテゴリーのSI遺伝子発現レベルはより低いことが示された（図4）。UQ68J転写物のレベルの高さはスクロースのイソマルツロースへの変換効率の高さと一致し（葉、根および茎において96％、90％および69％、図5）、茎におけるスクロース濃度を著しく枯渇させた（表3）。
【０２１５】
（表３）温室条件下で6カ月間栽培したQ117対照およびトランスジェニック植物における内因性スクロースのイソマルツロースへの変換効率および糖濃度1
2006525797.tif 000017
1 糖は、イオン交換フィルター（SCXおよびSAX）を通過させた後にCE分析によって定量した上で、汁中の濃度に相当する結果を提示するために、手順における既知の希釈度および糖の損失の違いに関して補正した。変換効率はイソマルツロース／（スクロース＋イソマルツロース）と定義される。
【０２１６】
スクロース蓄積パターンは、サイトゾルを標的とするSI遺伝子の低発現を伴うトランスジェニック系統におけるイソマルツロース産生によって有害な影響を受けない
UQ68J転写物が低レベルであるトランスジェニック系統の発達段階に沿った糖プロフィールにより、Q117対照と類似したスクロース蓄積パターンが示された（図6）。イソマルツロース濃度も茎の成熟に伴って上昇した（図7）。これらの結果は、ある一定の閾値下でのスクロースのイソマルツロースへの変換は、たとえ細胞質内であっても、スクロースの輸送および蓄積の妨げとならないことを示している。さらに、イソマルツロースは安定でサトウキビに蓄積されうることが判明した。
【０２１７】
これらの結果は以下のことを示している：
（i）UQ68J遺伝子は、スクロースのイソマルツロースへの効率的な変換を目的とする植物における発現に関して、検討した他のSI遺伝子を上回る利点を有する。このことは植物をイソマルツロースの製造のための生物工場として用いるといった産業的用途にとって非常に望ましい。
【０２１８】
（ii）イソマルツロースは植物によって代謝されないため、これは、スクロースの分解および合成の「無益回路」（これは貯蔵糖として植物における最終的な糖収量を制限する可能性がある）から、および貯蔵されたスクロースの特定の環境条件下での再動員（これは収穫しうる糖収量を減らす可能性がある）から切り離された貯蔵糖でありうる。このため、適切なSI活性パターンは、糖プールの一部を非代謝性シンクに転用させることにより、植物における全体的な糖収量を高めることができる。これは、糖の蓄積に対して、後に収穫されるイソマルツロースプールへの「一方向弁」を効率的に加える。さらに、イソマルツロースプールの蓄積を、可溶性糖の残りのプールの相応した枯渇を伴わずに実現することも可能である。これらの互いにつながりのある潜在的可能性を実地に実現することは、貯蔵される可溶性糖の考えられる最大限の収量での蓄積を目的とする生物工場として植物を用いるといった産業的用途にとって非常に望ましい。
【０２１９】
（iii）効率的なサイトゾル標的指向性SIの遺伝子の高レベルでの構成性発現は、成長のために必要なスクロースを植物代謝に利用されないイソマルツロースへと隔離することにより、植物成長を著しく抑制する。所望の産物：すなわちイソマルツロースおよびその他の可溶性糖を大量に貯蔵するための貯蔵体を得るためには植物の成長が必要であるため、これは極めて望ましくない。以下に、本発明者らは、イソマルツロースの最適な産業的生産のためには、導入されたSI遺伝子の発現を、成熟サトウキビ茎におけるサトウキビ貯蔵柔組織細胞の液胞区画といった糖貯蔵のために用いられる細胞内区画の内部にSI活性が実質的に限局されるように調節することが有利であることを示すことにより、この重大な限界に対する解決策を提供する。
【０２２０】
サイトゾル標的指向性SI遺伝子の低発現を伴ういくつかのトランスジェニック系統の茎では総可溶性糖含量が増加した
トランスジェニック系統pUbi68J2.36では、Q117対照と比較して、6カ月齢植物の成熟茎（節間部#12〜13）における総可溶性糖濃度（グルコース当量として表記）が1.9倍に高まり、葉におけるそれは2.4〜3.0倍に高まった（図8）。もう1つのトランスジェニック系統pUbi68J2.28における総グルコース当量糖濃度は、Q117対照と比較して、9カ月齢植物の成熟茎（節間部#18）では1.6倍に高まった。9カ月齢の系統pUbi14S2.27、pUbiErw2.1およびpUbiErW3.7の単一茎分析において、節間部#20におけるグルコース当量糖濃度はQ117対照よりも1.5〜1.6倍の高さであった。形態上は、これらの系統はいずれもQ117対照サトウキビ植物体との差を示さなかった。これらの系統におけるイソマルツロース濃度は一般にスクロース濃度よりも低く、成熟茎にイソマルツロースとして存在したのは糖全体の1％〜5％の範囲であった。
【０２２１】
この総可溶性糖含量の増加は、イソマルツロースの増加ではなく、主としてスクロース、グルコースおよびフルクトースの増加に起因した。例えば、トランスジェニック系統pUbi68J2.36では、成熟茎におけるグルコース当量に対する寄与率は、スクロース（80％）、イソマルツロース（3％）、フルクトース（6％）およびグルコース（11％）であった。これに対して、Q117対照における寄与率はスクロース（98％）、フルクトース（1％）およびグルコース（1％）であった。スクロースの寄与率はQ117における98％に対して系統pUbi68J2.36では80％に過ぎないとはいえ、トランスジェニック系統におけるスクロース絶対濃度はQ117対照の1.3倍であったことに注意すべきである（表2）。これらの系統による商業的可能性、特にエタノール生産などのための発酵供給原料としての産業的利用に対するそれは極めて大きい。
【０２２２】
サイトゾル標的指向性SI遺伝子の低発現を伴うトランスジェニック系統における発酵性糖濃度の上昇に並行して改良された、光合成に関する特性
SIの低発現を伴うトランスジェニック系統における総糖濃度の改善の機序についてさらに解明するために、光合成速度および関連指標を測定した。Q117対照と比較して、pUbi68J2.36のほとんどの葉はCO2固定速度が高く、特に古い葉でそうであった（図9）。
【０２２３】
クロロフィル含量および電子伝達速度もトランスジェニック系統の方が高く、この場合も差異は古い葉の方が大きかった（図10）。Q117対照葉におけるクロロフィルa／b比は、ほとんどの葉においてトランスジェニック系統の方が高いか同程度であった（図11）。クロロフィル蛍光によって測定した光化学系IIの電子伝達速度は、トランスジェニック植物と対照植物との間の光合成効率の違いを部分的に反映し、系統pUbi68J2.36のほとんどの葉ではQ117対照に比して高度の光応答を示す曲線が得られた（図12）。
【０２２４】
これらの結果は以下のことを示している：
i）植物におけるスクロースプールの一部を、関係する植物制御機構によってスクロースと同等には認知されない異性体へと変換させる、植物におけるスクロースイソメラーゼ遺伝子の発現は、植物組織におけるより高い総糖レベルの蓄積をもたらしうる；
【０２２５】
（ii）生物体によって通常感知される内因性糖の、同等な様式では認知されない新規な糖への変換を伴う、代謝に対する特定的な改変は、ソース組織における合成、ソース組織とシンク組織との間の輸送、およびシンク組織の内部での代謝回転または貯蔵に対する影響の組み合わせにより、可溶性炭水化物がより高濃度で蓄積するように代謝を変化させることができる。
【０２２６】
プロモーターUbiから発現される、液胞を標的とするSI
SI遺伝子産物の液胞へのターゲティングにより、イソマルツロース収量が高い健常植物が作製された
サツマイモスポラミン由来のNTPP（22系統はNTPPのみを有する；9系統はNTPPおよびHisタグを有する）と、タバコキチナーゼ由来のCTPP（7系統はCTPPのみを有する；11系統はCTPPおよびHisタグを有する）との融合、またはHisタグを含めないNTPPおよびCTPPシグナルペプチド（9系統）との融合により、サトウキビ栽培品種Q117の液胞にUQ68J SI遺伝子産物をターゲティングさせたトランスジェニックサトウキビ系統を選別した。温室で栽培した、約20個の節（植物は一条植えから成長させた）ないし30個の節（刈り株苗の植物体からのもの）を有する8カ月齢植物において、試験したpU3ZERsN68J、pU3ZERc68JC、pU3ZERsN68J-His、pU3ZERc68JC-HisおよびpU3ZERsN68JC系統（以下のセクションに詳述されている）の約80％の茎組織でイソマルツロースを検出することができた。
【０２２７】
最も高いイソマルツロース濃度は、系統pU3ZRsN68JHis3.2の成熟茎組織における756mMであった。独立した導入遺伝子挿入イベントにおける既知の変動性に一致するように（Matzke & Matzke, 1998；P各 & Velten, 1991）、イソマルツロース蓄積レベルはトランスジェニック系統によって異なり、これにはおそらく誘導性Ubiプロモーターに対する微小環境の影響を受けていると考えられる（Hansom et al., 1999）。イソマルツロース濃度は茎の成熟に伴って上昇し（これはサトウキビによる自然な糖蓄積増加パターンと一致する）、イソマルツロースと他の糖との比はトランスジェニック系統によって異なった（図15）。
【０２２８】
試験した20種のトランスジェニック系統のうち13種（65％）は、根においてイソマルツロース陽性であったが、系統pU3ZERsN68J1.4およびpU3ZERsN68JHis1.3を除いてイソマルツロース濃度は1mM未満であった（図13）。葉組織でイソマルツロースが検出可能であったのは、成熟茎組織中にイソマルツロースが高レベルで蓄積したトランスジェニック系統のみであった。これらの系統において、イソマルツロースは葉齢に伴って徐々に蓄積し、番号8の葉までは1mM未満のままであった（図14）。試験した他の系統（例えば、下記のスクロース含量の高い系統など）は葉組織においてイソマルツロース陰性であった。
【０２２９】
作製したトランスジェニック系統はすべて外見上は健常であり、Q117対照との外見上の形態的な差異はみられなかった（表4）。
【０２３０】
（表４）温室条件下で8カ月栽培した、Q117対照および液胞標的指向性SIを有する代表的なトランスジェニックサトウキビ系統の表現型
2006525797.tif 000018
a 苗を一条植えから作製
b 刈り株苗
【０２３１】
これらの結果は以下のことを示している：
（i）プロモーターUbiからの「構成性」発現を行わせた場合でも、SI導入遺伝子産物の液胞へのターゲティングにより、植物の成長および発達に対する明らかな有害な影響を伴わずにサトウキビ茎貯蔵組織中に高度のイソマルツロース蓄積を得ることができる。
【０２３２】
（ii）サトウキビ液胞はほとんどの導入タンパク質を容易には受け入れないことが知られているため（Gnanasambandam & Birch, 2004）、SIがこの区画に蓄積する可能性は低い。しかし、UQ68Jなどの高効率SIをスクロース貯蔵性液胞に連続供給することにより、発達に伴って最終的に高収量でのイソマルツロースの蓄積を得ることができる。
【０２３３】
（iii）液胞経路への効率的なターゲティングにより、活発に成長している組織の細胞において多くを占める代謝活性のあるサイトゾル区画でのSI活性が回避され、それによって成長に対する有害な影響が避けられる。このことは、スクロースの、植物によって効率的には代謝されない化合物への変換を伴う産業的用途にとって非常に望ましい。
【０２３４】
液胞ターゲティングを行ったトランスジェニック系統における細胞内空間および細胞外間隙の両方でイソマルツロースが検出された
イソマルツロースは細胞外液画分および細胞内液画分の両方で検出可能であり、濃度もほぼ等しかった。この現象は、NTPP、CTPPまたはその両方のすべての液胞ターゲティング構築物に共通してみられた（図16）。スクロース濃度もこれらの画分とも同程度であったが、ほとんどの糖は細胞内（液胞）区画に存在した（この区画の容積がはるかに大きいため）。液胞を標的とするタンパク質のわずかな割合は、分泌経路を介して、液胞内よりも安定性が高い可能性のある細胞外間隙に存続することが知られている（Gnanasambandam & Birch, 2004）。植物は区画間でのイソマルツロース輸送を行えないと考えられており、このため、観察された細胞外イソマルツロースの蓄積は分泌されたSIに起因する可能性が高い。
【０２３５】
本検討で観察した系統におけるように、植物に対する有害な影響がないとすれば、この効果は、変換産物の収量を最大にするためにスクロースの総変換量が最大であることが求められる産業的用途にとっては有益である。
【０２３６】
総糖含量は種々の様式で増加した
構築物ならびにサトウキビ茎に蓄積したイソマルツロースおよびスクロースのプロフィールの違いに基づき、総糖濃度が対照Q117よりも高いトランスジェニックサトウキビ系統を4つの群に分類することができる：
【０２３７】
1. イソマルツロース濃度が高く（＞70mM）、総糖含量に対するイソマルツロースの寄与が対照Q117のものよりもかなり大きい系統における、NTPP-SIを有するもの。
【０２３８】
2. イソマルツロース濃度が中程度であり（20〜70mM）、総糖含量の多さが主としてスクロース濃度が対照Q117のものよりも高いことによる系統における、NTPP-SIを有するもの。
【０２３９】
3. イソマルツロースが検出閾値未満であり、成熟茎におけるスクロース濃度が対照Q117のものよりも高いレベルに上昇した系統における、NTPP-SIを有するもの。
【０２４０】
4. イソマルツロース濃度が低く（＜10mM）、総糖含量の多さが主としてスクロース濃度が対照Q117のものよりも高いことによる系統における、SI-CTPP＋6×Hisを有するもの。
【０２４１】
NTPP-SIを有するいくつかののトランスジェニック系統の成熟茎において高いイソマルツロース濃度は総可溶性糖含量の増加に大きく寄与した
トランスジェニック系統pU3ZERsN68J3.2（以下のセクションではN3.2と略記）において、一条植えによって成長した8カ月齢植物体では、第26節間部における帯域2の細胞内空間に108mMのイソマルツロースが蓄積し、これは総糖含量の14％に相当した。刈り株苗の茎では第22節間部に286mMのイソマルツロースが蓄積し、これは総糖含量の47％に相当した。35個の節を有する系統pU3ZERsN68J3.2His（N3.2Hisと略記）刈り株苗の茎では756mMのイソマルツロースが蓄積し、これは第33節間部における総糖含量の67％に相当した。
【０２４２】
Q117対照における総糖濃度は、別々の茎の第20節間部において369mM〜490mM（スクロース当量）の範囲であった。Q117対照で観察された最も高い総糖含量（490mM）と比較して、第20節間部における総糖濃度はN3.2では29％高く、N3.2刈り株苗では24％高く、N3.2His刈り株苗では20％高かった。第33節間部に至ると、N3.2His刈り株苗における総糖濃度はQ1l7対照におけるレベルの2.7倍であった（図17）。
【０２４３】
CTPPシグナル、またはNTPP＋CTPP二重ターゲティングシグナルを有するトランスジェニック系統では、高いイソマルツロース濃度は観察されなかった。NTPPシグナルの方が、活性SI遺伝子産物のサトウキビスクロース貯蔵区画へのターゲティングをより高い効率で導く可能性がある。
【０２４４】
イソマルツロース濃度が中程度であるNTPP-SIを有するトランスジェニック系統の成熟茎において高いスクロース濃度は総可溶性糖含量の増加に大きく寄与した
pU3ZERsN68J1.17（N1.17と略記）およびpU3ZERsN68J1.2（N1.2と略記）などのトランスジェニック系統で蓄積したスクロース含量はQ117対照の1.1〜1.6倍であった。N1.17の第20節間部におけるスクロース濃度は、条植え苗サトウキビではQ117対照よりも28％高く、刈り株苗サトウキビでは56％高かった。N1.2刈り株苗サトウキビにおけるスクロース含量はQ117対照よりも20％高かった。以上の3種のトランスジェニック茎の成熟節間部における総糖濃度に占めるスクロースの割合はそれぞれ95％、90％および91％であった。これらの系統におけるイソマルツロース濃度は25、8および48mMであり、総可溶性糖の5％、1％および9％を占めるに過ぎなかった（図18）。
【０２４５】
NTPP-SIを有するトランスジェニック系統の成熟茎ではスクロース濃度が高く、イソマルツロースは検出されなかった
pU3ZERsN68J1.10（N1.10と略記）などのトランスジェニック系統は、糖プロフィールに関して別のパターンを有していた。SI遺伝子はPCRによって検出されたものの、茎、葉および根組織のいずれからもHPLC-EDによってイソマルツロースは検出されなかった。N1.10の成熟茎におけるスクロースの蓄積はQ117対照におけるレベルの1.5倍であった（表5）。
【０２４６】
（表５）トランスジェニック系統N1.10およびQ117対照の刈り株苗サトウキビの第20節間部における糖プロフィールの比較
2006525797.tif 000019
1 この表および以後の表では、糖はHPAE-PAD分析によって定量した上で、汁中の濃度に相当する結果を提示するために、手順における既知の希釈度および糖の損失の違いに関して補正した。
【０２４７】
SI-CTPPHisを有するトランスジェニック系統の成熟茎ではスクロース濃度が高く、イソマルツロース濃度は低い
SI-CTPPHisを有する11種の被験トランスジェニック系統のうち3種では、成熟茎中に2mM未満のイソマルツロースしか産生されず、Q117対照よりも総可溶性糖は多く蓄積した。トランスジェニック系統pU3ZERc68JC1.3His（C1.3Hisと略記）、pU3ZERc68JC3.7His（C3.7Hisと略記）およびpU3ZERc68JC3.8His（C3.8Hisと略記）ではスクロースがQ117対照におけるレベルよりも1.8、1.9および1.6倍蓄積し、グルコースおよびフルクトースの含量も高かった（表6）。トランスジェニック系統C3.7Hisに関しては、イソマルツロースが検出不能であった。これらの系統では、成熟茎にQ117対照よりも多くの総可溶性糖が蓄積したことに加えて、糖蓄積の発達プロフィールも変化しており、幼若な伸展中の節間部における糖濃度が非常に高く、成熟節間部で観察された高い濃度に近かった（図19）。
【０２４８】
これに対して、SI-CTPPを有し6×Hisタグを有さない7種の被験系統ではスクロース蓄積の増加は認められなかった。
【０２４９】
（表６）SI-CTPP＋6×Hisを有する刈り株苗系統の第20節間部における高い糖含量
2006525797.tif 000020
【０２５０】
総糖含量の多い表現型に向けてのSI構築物およびトランスジェニック系統の設計および選別
レポーター構築物を用いた検討に基づくと、CTPPはサトウキビ細胞における液胞ターゲティングの目的にはNTPPよりも効率的でないように思われ、サイトゾル活性が依然としてかなり検出される（Gnanasambandam & Birch, 2004）。NTPPを用いた場合でも、特定の発達上または生理的な条件下では、結合タンパク質の一定割合はサイトゾル中に残存するか、または他の細胞区画を誤って標的とする可能性がある（Gnanasambandam & Birch, 2004）。これらの影響は、周囲配列の違い、および異なる形質転換イベントにおける挿入配列の配置の違いのために、一部の形質転換体で他のものよりも顕著となる可能性がある。6×Hisタグは種々の区画におけるSIタンパク質の輸送、安定性および／または活性に影響を及ぼす可能性が高いが、このような影響の詳細はタンパク質レベルではまだ解明されていない。
【０２５１】
このような影響の組み合わせを通じて、種々のSI発現構築物から、総糖含量の高い表現型を付与するSI活性のパターンを有する形質転換体を一定割合で得ることができる。本発明者らは、SI構築物の設計および選別を通じて、高糖含量表現型の内部での、種々の所望の糖組成を有する形質転換体の割合を高めることが可能であることを示した。例えば、NTPP-SI構築物はイソマルツロース含量が高い系統を選別する目的に好ましく、SI-CTPPHis構築物は茎発達プロフィールの全体を通じてスクロース含量の高い系統を選別する目的に有望である。
【０２５２】
高糖含量表現型の所望のカテゴリーにおける個体に関して形質転換体をスクリーニングすることはルーチン的である。本明細書に示した結果は、トランスジェニックサトウキビ系統のカルスから苗条までの再生後の早期栄養生長世代における封じ込め温室条件下における条植え苗サトウキビおよび刈り株苗サトウキビからのものである。同様のスクリーニングは多様な植物種に対して可能であり、一般的には初期選別の後に、封じ込め温室および／または承認下の野外試験において栽培された植物体の試験が繰り返し行われると考えられる。
【０２５３】
本発明者らは、形質転換体における所望の高糖含量表現型の頻度および程度を高めることを目的とするSI構築物の他の変形物も想定している。特に、本発明者らは、シンク組織などの特定の組織および／または貯蔵柔組織などの特定の細胞種におけるSI遺伝子の選好的発現を、イソマルツロース高収量を目的とする貯蔵区画またはスクロース高収量を目的とする代謝区画などの特定の細胞区画へのSIタンパク質のターゲティングと組み合わせることを想定している。最適なSI活性レベルは、高糖含量表現型の所望のカテゴリーに応じて異なると考えられる。例えば、成熟茎液胞における比較的高い活性は、イソマルツロース収量を高めるような、SIの対応する発現強度およびプロテアーゼ耐性を付与する改変によって実現しうる。または、サイトゾルにおける低活性は、弱いプロモーターならびに／またはmRNAおよび／もしくはタンパク質の安定性を低下させる遺伝子配列の改変によって実現しうる。以下に一例として、茎成熟に伴って調節される比較的弱い発現を目的として設計した構築物を提示する。
【０２５４】
茎特異的プロモーターP67Bのクローニングおよび特性決定
サトウキビ成熟茎特異的遺伝子67の第2のプロモーター相同体によって作動する、サトウキビにおける配列およびGUSレポーター活性
以前に記載されている遺伝子67（Birch & Potier, 2000）は、ノーザン分析で示されているように成熟サトウキビ茎で特異的に発現されるが、サトウキビゲノムから単離された対応するプロモーター配列は主として未成熟茎においてGUSレポーター遺伝子の発現を引き起こした。既知のプロモーターから設計したプライマー（P67Aと命名）を用いる高忠実度PCRのためのテンプレートとしてゲノムDNAを用いたところ、987bpであってP67Aよりも60bp短い、P67Bと命名した異なるプロモーター候補が得られた。この2つの型のアラインメントでは92.98％の同一性が示され、P67BにはP67Aと比較して4つの欠失（49bp＋4bp＋1bp＋1bp）、2つの挿入（1bp＋1bp）および18個の点変異があった。
【０２５５】
P67B-GUSレポーター構築物を有する11種のトランスジェニックサトウキビ系統では、葉および根組織のいずれにおいてもGUS組織化学アッセイおよび蛍光分析アッセイによって活性は観察されなかった。GUS活性は組織化学アッセイによって茎組織で辛うじて検出され、このことから低レベル発現が示された。感度を高めるためにインキュベーションを延長した蛍光分析アッセイにより、少なくとも1つのP67B-GUS系統では茎成熟に伴う活性の上昇が示されたが、これはP67A-GUS系統では比較的幼若な節間部の発現の方が高度であったことと対照的であった（図20）。これらの系統における対照的なパターンは、試験した二つの栄養生長世代を通じて保たれた。
【０２５６】
プロモーター67Aまたは67Bによって作動するUQ68J SI遺伝子の細胞質発現
プロモーター67Bによって作動する組換えUQ68J SI遺伝子を有するいくつかのトランスジェニック系統では高いスクロース濃度が検出された
P67AまたはP67Bによって作動する導入SI遺伝子に関してPCR検査で陽性であったトランスジェニック系統の葉および根のいずれにおいてもイソマルツロースは検出されなかった。これは、試験したP67A-SI系統の9種中3種およびP67BSI系統の18種中8種の成熟茎組織で低濃度（＜3mM）で検出され、これらはすべて正常な成長および発達を示した。
【０２５７】
イソマルツロース陰性系統のすべておよび11種のイソマルツロース陽性系統は、Q117対照との比較で成熟節間部における総糖含量が同程度であった。67Bプロモーターによって作動するSIを有する3種の系統（P67B68J1.5、P67B68J2.5およびP67B68J2.6）で蓄積した糖レベルはQ117対照におけるレベルの約1.8倍であった。この増加は主としてスクロース含量によるものであり、グルコースおよびフルクトースの増加の寄与の程度はさまざまであった（表7）。
【０２５８】
（表７）プロモーター67Aまたは67Bによって作動するSIを有するイソマルツロース陽性トランスジェニック系統およびQ117対照における第20節間部での糖含量
2006525797.tif 000021
【０２５９】
本明細書中に引用したすべての特許、特許出願および刊行物の開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０２６０】
本明細書における参考文献の引用はいずれも、このような参考文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることを認めたものとみなされるべきではない。
【０２６１】
本明細書を通じて、その目的は、本発明をいかなる態様または特定の特徴の集合物にも限定することなく、本発明の好ましい実施態様を記述することであった。したがって、当業者は、本開示に鑑みて、種々の改変および変更を、本発明の範囲を逸脱することなく、例示された特定の実施態様に対して加えうることを理解すると考えられる。このような改変および変更はすべて、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
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【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１】Q117対照植物、またはトランスジェニック系統pUbi68J1.2、pUbi14S2.36およびpUbiErw2.1由来の植物からの、葉（#3）、茎（節間部#12）および若い根組織の可溶性糖に関するキャピラリー電気泳動を図示したものである。試料とした植物は6カ月齢で12〜13個の節を有した。トランスジェニック系統は、カルスからの第一栄養生長世代であった。ピークは以下の通りである：1 スクロース、2 イソマルツロース、3 フルクトースおよび4 グルコース。
【図２】大腸菌（A）およびトランスジェニックサトウキビ（B）の茎における種々のスクロースイソメラーゼ遺伝子の変換効率を図示したものである。変換効率は、イソマルツロース／（スクロース＋イソマルツロース）*100と定義される。Aにおける結果は、3回の反復による培養物からの平均および標準誤差である。Bにおける結果は、pUbiErw 11系統、pUbi14S 11系統およびpUbi68J 9系統による、茎での最大変換効率である。試料としたサトウキビは6カ月齢で12〜15個の節を有し、カルスからの第一栄養生長世代であった。
【図３】pUbi68Jを用いたサトウキビ系統形質転換における3種の表現型クラスの6カ月齢での代表的な植物を写真で示したものである。左：正常型（Normal）（pUbi68J2.36）。中央：中肋が弱い型（Weak Midrib）（pUbi68J1.2）。右：矮小型（Stunted）（pUbi68J2.22）。植物はカルスからの第一栄養生長世代であった。
【図４】サトウキビの葉および茎からの全RNAに関するノーザンブロット分析を写真で示したものである。試料とした植物は6カ月齢で12〜15個の節を有し、カルスからの第一栄養生長世代であった。上列は、UQ68JスクロースイソメラーゼcDNAを用いてプロービングしたハイブリダイズ性バンドを示しており、分子サイズは約1700bpである。下列は、rRNAの大サブユニットおよび小サブユニットの臭化エチジウム染色による全RNAローディングを示している。レーン1. pUbi68J2.22節間部3-4。レーン2. pUbi68J2.22葉番号1-2。レーン3. pUbi68J2.36節間部3-4。レーン4. pUbi68J2.36葉番号1-2。レーン5. pUbi68J1.2節間部3-4。レーン6. pUbi68J1.2葉番号1-2。レーン7. Q117対照節間部3-4。レーン8. Q117対照葉番号1-2。
【図５】トランスジェニック系統pUbi68J2.22の茎、葉および根におけるスクロースからイソマルツロースへの変換効率の高さを図示したものである。試料とした植物は6カ月齢で12個の節を有し、カルスからの第一栄養生長世代であった。
【図６】トランスジェニックpUbi68J2.36およびQ117対照サトウキビ植物体におけるスクロース蓄積を図示したものである。試料とした植物は6カ月齢で15個の節を有し、カルスからの第一栄養生長世代であった。
【図７】トランスジェニック系統pUbi68J2.36の茎および葉組織におけるイソマルツロース蓄積を図示したものである。試料とした植物は6カ月齢で15個の節を有し、カルスからの第一栄養生長世代であった。
【図８】トランスジェニックpUbi68J2.36およびQ117対照サトウキビ植物体における総可溶性糖濃度（グルコース当量）を図示したものである。試料とした植物は6カ月齢で15個の節を有し、カルスからの第一栄養生長世代であった。
【図９】トランスジェニック系統pUbi68J2.36およびQ117対照サトウキビ植物体の葉における光合成CO2固定速度を図示したものである。植物は4カ月齢であり、形態学的には識別不能であった。トランスジェニックpUbi68J2.136系統の植物は、再生後の第三栄養生長世代（茎の挿し木による）であった。結果は3回の反復による植物からの平均および標準誤差である。
【図１０】トランスジェニック系統pUbi68J2.36およびQ117対照サトウキビ植物体の葉におけるクロロフィル濃度を図示したものである。植物は4カ月齢であり、形態学的には識別不能であった。トランスジェニックpUbi68J2136系統の植物は、再生後の第三栄養生長世代（茎の挿し木による）であった。結果は3回の反復による植物からの平均および標準誤差である。
【図１１】トランスジェニック系統pUbi68J2.36およびQ117対照サトウキビ植物体の葉におけるクロロフィルa／b比を図示したものである。植物は4カ月齢であり、形態学的には識別不能であった。トランスジェニックpUbi68J2.136系統の植物は、再生後の第三栄養生長世代（茎の挿し木による）であった。結果は3回の反復による植物からの平均および標準誤差である。
【図１２】トランスジェニック系統pUbi68J2.36およびQ117対照サトウキビ植物体の葉における種々の光強度でのクロロフィル蛍光から計測した光合成電子伝達速度を図示したものである。植物は4カ月齢であり、形態学的には識別不能であった。トランスジェニックpUbi68J2.l36系統の植物は、再生後の第三栄養生長世代（茎の挿し木による）であった。結果は3回の反復による植物からの平均および標準誤差である。
【図１３】液胞を標的とするスクロースイソメラーゼを有する種々のトランスジェニック系統、およびQ117対照の根におけるイソマルツロース濃度を図示したものである。根は、湿らせたティッシュで覆って28℃に7日間おいた二条植え（two-eye set）のサトウキビから採取した。
【図１４】トランスジェニック系統pU3ZERsN68J3.2（液胞を標的とするスクロースイソメラーゼを有する）の葉におけるイソマルツロース濃度を図示したものである。植物は8カ月齢で21個の節間部を有し、Q117対照とは形態学的に識別不能であった。このトランスジェニック植物は再生後の第二栄養生長世代（茎の挿し木による）であった。
【図１５】トランスジェニック系統pU3ZERsN68J3.2His（液胞を標的とするスクロースイソメラーゼを有する）の茎組織におけるイソマルツロース濃度を図示したものである。植物は8カ月齢で35個の節間部を有し、Q117対照とは形態学的に識別不能であった。このトランスジェニック植物は、カルス再生後の第二栄養生長世代（最初の鉢における刈り株苗）であった。
【図１６】トランスジェニック系統pU3ZERsN68J3.2His（a）、pU3ZERsN68J1.17（b）、pU3ZERc68JC3.1His（c）およびpU3ZERsN68JC3.7His（d）の茎組織からの「細胞外」および「細胞内」液画分におけるイソマルツロース濃度を図示したものである。a、b、dの植物は8カ月齢であり、cは12カ月齢であった。植物a、b、cおよびdに関する節間部の数はそれぞれ35、20、43および30であった。トランスジェニック植物bは茎の挿し木による第二栄養生長世代であった；トランスジェニック植物a、cおよびdは、最初の鉢における刈り株苗としての第二栄養生長世代であった。これらの系統はいずれも、Q117対照とは形態学的に識別不能であった。
【図１７】Q117対照（a）ならびにトランスジェニック系統pU3ZERsN68J3.2 #1（b）、pU3ZERsN68J3.2 #2（c）およびpU3ZERsN68J3.2His（d）の茎組織における、イソマルツロース、他の糖（グルコース、フルクトースおよびスクロースの合計、スクロース当量として、すなわちG/2＋F/2＋S）および総糖（スクロース当量）の濃度を図示したものである。植物はいずれも8カ月齢であり、それぞれ21、27、22および35個の節間部を有した。Q117対照は茎の挿し木によって作製した。トランスジェニック植物bおよびcは、茎の挿し木による第二栄養生長世代であった。トランスジェニック植物dは、最初の鉢における刈り株苗としての第二栄養生長世代であった。トランスジェニック系統はいずれも、Q117対照とは形態学的に識別不能であった。
【図１８】Q117対照（a）ならびにトランスジェニック系統pU3ZERsN68J1.17 #1（b）、pU3ZERsN68J1.17 #2（c）およびpU3ZERsN68J1.2（d）の茎組織における、スクロース、他の糖（グルコース、フルクトースおよびイソマルツロースの合計、スクロース当量として）および総糖（スクロース当量）濃度を図示したものである。植物はいずれも8カ月齢であり、それぞれ21、20、30および31個の節間部を有した。Q117対照は茎の挿し木により作製した。トランスジェニック植物bは茎の挿し木による第二栄養生長世代であった。トランスジェニック植物cおよびdは、最初の鉢における刈り株苗としての第二栄養生長世代であった。トランスジェニック系統はいずれも、Q117対照とは形態学的に識別不能であった。
【図１９】Q117対照（a）ならびにトランスジェニック系統pU3ZERc68JC1.3His（b）、pU3ZERc68JC3.7His（c）およびpU3ZERc68JC3.8His（d）の茎組織におけるスクロース、他の糖（グルコース、フルクトースおよびイソマルツロースの合計、スクロース当量として）および総糖（スクロース当量）濃度を図示したものである。植物はいずれも8カ月齢であり、それぞれ28、32、38および30個の節間部を有した。Q117対照ならびにトランスジェニック植物b、cおよびdは、最初の鉢における刈り株苗からの第二栄養生長世代であった。トランスジェニック系統はいずれも、Q117対照とは形態学的に識別不能であった。
【図２０】プロモーター67Aを有するトランスジェニック系統（p67A-GUS6.7）およびプロモーター67Bを有するトランスジェニック系統（p67B-GUS3.1）の茎組織におけるGUS活性レベルを図示したものである。どちらの系統も6カ月齢で14個の節間部を有し、茎の挿し木によって作製された。
【図２１】サトウキビで総糖含量の多い表現型を作り出すために用いた例示的な「直接遺伝子導入ベクター」の構造を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2006525797.tif 000042
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月7日(2006.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照植物の対応するシンク組織と比較して、総炭水化物含量が増しているか、または総貯蔵炭水化物含量もしくは非構造炭水化物含量が増している、または可溶性炭水化物含量もしくは甘味度（sweetness）が内因性炭水化物含量の増加に伴って増しているシンク組織を有する植物を作製する方法であって、転写制御エレメントと機能的に結合している、植物の内因性糖の外来性糖（alien sugar）への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む複数のトランスジェニック植物から、対照植物に対応するシンク組織と比較して、トランスジェニック植物のシンク組織の総炭水化物含量、または総貯蔵炭水化物含量もしくは非構造炭水化物含量が増しているか、またはトランスジェニック植物のシンク組織の可溶性炭水化物含量もしくは甘味度が内因性炭水化物含量の増加に伴って増しているようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素を産生するトランスジェニック植物を選択する段階を含む方法。
【請求項２】
対照植物の対応するシンク組織と比較して、スクロース含量が増しているか、または総炭水化物含量を減少させることなく内因性炭水化物含量が増しているか、または内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに外来性糖が蓄積しているシンク組織を有する植物を作製する方法であって、転写制御エレメントと機能的に結合している、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む複数のトランスジェニック植物から、対照植物の対応するシンク組織と比較して、トランスジェニック植物のシンク組織のスクロース含量が増しているか、またはトランスジェニック植物のシンク組織の内因性炭水化物含量が総炭水化物含量を減少させることなく増しているか、またはトランスジェニック植物のシンク組織の外来性糖が内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに蓄積するようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素を産生するトランスジェニック植物を選択する段階を含む方法。
【請求項３】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項4記載の方法。
【請求項６】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項4記載の方法。
【請求項７】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項1、2および4〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していて、かつ炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
糖代謝酵素が植物細胞において、その酵素をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項１２】
酵素をコードするポリヌクレオチドが構成的に発現される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
酵素をコードするポリヌクレオチドが選択的に発現される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
酵素をコードするポリヌクレオチドが植物のシンク組織において選択的に発現される、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
シンク組織が根、塊茎、茎、桿、果実または種子より選択される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項１６】
植物がスクロースまたは他の糖を貯蔵産物として蓄積することが可能である、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項１７】
植物が草木、野菜、穀類、マメ科植物および果実より選択される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項１８】
植物がサトウキビ、サトウダイコン、サトウモロコシ、スイートコーン、エンドウ、ブドウ、トマトまたはバナナより選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
内因性糖および外来性糖が単糖類、オリゴ糖類および糖誘導体より選択される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項２０】
糖誘導体が糖アルコール、糖酸、アミノ糖、デオキシ糖、メチル糖、糖リン酸およびUDP糖より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
内因性糖がスクロースであり、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項２２】
糖代謝酵素がスクロースイソメラーゼである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
糖代謝酵素がイソマルツロースシンターゼである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
糖代謝酵素がUQ68Jである、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
可溶性炭水化物がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項２６】
対照植物細胞と比較して、総炭水化物含量が増しているか、または総貯蔵炭水化物含量もしくは非構造炭水化物含量が増しているか、または可溶性炭水化物含量が内因性炭水化物含量の増加に伴って増しているトランスジェニック植物シンク細胞であって、植物細胞の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントをそのヌクレオーム中に含んでおり、ここで、対照植物細胞と比較して、総炭水化物含量、または総貯蔵炭水化物含量もしくは非構造炭水化物含量が増しているか、または内因性炭水化物含量の増加に伴ってトランスジェニック植物のシンク細胞の可溶性炭水化物含量が増しているようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が産生される、トランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項２７】
対照植物細胞と比較して、スクロース含量が増しているか、または総炭水化物含量を減少させることなく内因性炭水化物含量が増しているか、または内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに外来性糖が蓄積しているトランスジェニック植物シンク細胞であって、転写制御エレメントと機能的に結合している、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含んでおり、ここで対照植物のシンク細胞と比較して、トランスジェニック植物シンク細胞のスクロース含量が増しているか、またはトランスジェニック植物シンク細胞の内因性炭水化物含量が総炭水化物含量を減少させることなく増しているか、またはトランスジェニック植物シンク細胞の外来性糖が内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに蓄積するようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が産生されるトランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項２８】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項26または請求項27記載のトランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項２９】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項26〜28のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３０】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項29記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３１】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項29記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３２】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項29〜31のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３３】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項26、27および29〜32のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３４】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項33記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３５】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項34記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３６】
植物細胞が植物の茎細胞である、請求項26〜35のいずれか一項記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３７】
植物がサトウキビである、請求項36記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３８】
可溶性炭水化物が単糖より選択される、請求項26または請求項27記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３９】
単糖がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項38記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４０】
対照植物の対応するシンク組織と比較して、総炭水化物含量が増しているか、または総貯蔵炭水化物含量もしくは非構造炭水化物含量が増しているか、または内因性炭水化物含量の増加に伴って可溶性炭水化物含量もしくは甘味度が増している、シンク組織を有するトランスジェニック植物であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、ポリヌクレオチドが植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合していて、かつここで対照植物の対応するシンク組織と比較して、トランスジェニック植物のシンク組織の総炭水化物含量もしくは総貯蔵炭水化物含量もしくは非構造炭水化物含量が増しているか、またはトランスジェニック植物のシンク組織の可溶性炭水化物含量もしくは甘味度が内因性炭水化物含量の増加に伴って増しているようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が産生される、トランスジェニック植物。
【請求項４１】
対照植物の対応するシンク組織と比較して、スクロース含量が増しているか、または総炭水化物含量を減少させることなく内因性炭水化物含量が増しているか、または内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに外来性糖が蓄積しているシンク組織を有するトランスジェニック植物であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、ポリヌクレオチドが植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合していて、かつここで対照植物の対応するシンク組織と比較して、トランスジェニック植物のシンク組織のスクロース含量が増しているか、またはトランスジェニック植物のシンク組織の内因性炭水化物含量が総炭水化物含量を減少させることなく増しているか、またはトランスジェニック植物のシンク組織の外来性糖が内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに蓄積するようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が産生される、トランスジェニック植物。
【請求項４２】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項40または請求項41記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項40〜42のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項４４】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項43記載のトランスジェニック植物。
【請求項４５】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項43記載のトランスジェニック植物。
【請求項４６】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項43〜45のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項40、41および43〜46のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項４８】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項47記載のトランスジェニック植物。
【請求項４９】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項48記載のトランスジェニック植物。
【請求項５０】
植物細胞が植物の茎細胞である、請求項40〜49のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項５１】
植物がサトウキビである、請求項50記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
可溶性炭水化物が単糖より選択される、請求項40または請求項41記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
単糖がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項52記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
なし
【請求項５５】
対照植物シンク組織と比較して、スクロース含量が増している、または総炭水化物含量を減少させずに内因性炭水化物含量が増しているか、または外来性糖が内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに蓄積するトランスジェニック植物シンク組織であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、ポリヌクレオチドが少なくとも一部の植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合していて、かつここで対照植物のシンク組織と比較して、トランスジェニックシンク組織のスクロース含量が増しているか、またはトランスジェニックシンク組織の内因性炭水化物含量が総炭水化物含量を減少させることなく増しているか、またはトランスジェニックシンク組織の外来性糖が内因性炭水化物含量の相応した減少を伴わずに蓄積するようなレベルまたは機能的活性で糖代謝酵素が植物のソース組織、および/またはシンク組織で産生される、トランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５６】
シンク組織が果実、種子、茎、桿、塊茎および根より選択される、請求項54または請求項55記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５７】
糖代謝酵素が植物細胞において、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項54〜59のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５８】
糖代謝酵素が、糖貯蔵のために用いられる植物細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項54〜57のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項５９】
糖代謝酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項58記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６０】
糖代謝酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項58記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６１】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項58〜60のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６２】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項54、55および57〜61のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６３】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項62記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６４】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項63記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６５】
植物細胞が植物の茎細胞である、請求項54〜64のいずれか一項記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６６】
植物がサトウキビである、請求項65記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６７】
可溶性炭水化物が単糖より選択される、請求項54または55記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６８】
単糖がスクロース、グルコースおよびフルクトースより選択される、請求項67記載のトランスジェニック植物シンク組織。
【請求項６９】
可溶性炭水化物を生産する工程であって、請求項40〜53のいずれか一項記載の植物、または請求項54〜68のいずれか一項記載のシンク組織から可溶性炭水化物を採取する段階を含む工程。
【請求項７０】
可溶性炭水化物が、スクロース、グルコースおよびフルクトースを含む単糖より選択される、請求項69記載の工程。
【請求項７１】
発酵による産物を生産する工程であって、発酵のための基質であり請求項69に従って生産される炭水化物を発酵させる段階を含む工程。
【請求項７２】
それによって生産される発酵産物が、エタノール、メタノール、1,3-プロパンジオール、酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、ソルビトール、リジン、ポリヒドロキシアルカノエート、二酸化炭素、産業用酵素またはこれらのいずれかを含むポリマーより選択される少なくとも1つの物質である、請求項71記載の工程。
【請求項７３】
外来性糖を含むトランスジェニック植物シンク細胞であって、トランスジェニック植物が、植物細胞の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントをそのヌクレオーム中に含み、糖代謝酵素が、植物細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含み、その結果、内因性植物炭水化物の相応するほどの減少を伴わずに外来性糖の蓄積がもたらされる、トランスジェニック植物シンク細胞。
【請求項７４】
細胞内区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項73記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項７５】
外来性糖を含むシンク組織を有するトランスジェニック植物であって、植物の内因性糖の外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードする、植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合したポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、糖代謝酵素が、植物の細胞における糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含み、その結果、内因性植物炭水化物の相応するほどの減少を伴わずに外来性糖の蓄積がもたらされる、トランスジェニック植物。
【請求項７６】
細胞内区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項75記載のトランスジェニック植物。
【請求項７７】
サトウキビシンク組織の総可溶性炭水化物含量を高めるための方法であって、サトウキビの細胞において、スクロースの、同じ発達段階にあるサトウキビでは通常産生されない外来性糖への変換を触媒するスクロースイソメラーゼ酵素を産生させる段階を含み、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択され、ここで、対照サトウキビの対応するシンク組織と比較して、スクロースイソメラーゼ酵素がサトウキビシンク組織で総炭水化物含量が増しているようなレベルまたは機能的活性で産生される方法。
【請求項７８】
スクロースイソメラーゼ酵素が、スクロースの外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
スクロースイソメラーゼ酵素が、糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項77または請求項78記載の方法。
【請求項８０】
スクロースイソメラーゼ酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
スクロースイソメラーゼ酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項79記載の方法。
【請求項８２】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項79〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
スクロースイソメラーゼ酵素が植物細胞において、スクロースの外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項77および79〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
スクロースイソメラーゼ酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴うことなく蓄積する、請求項77〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
対照サトウキビ・シンク細胞と比較して可溶性炭水化物含量が増しているトランスジェニックサトウキビ・シンク細胞であって、スクロースの、スクロースイソメラーゼを産生しない対照サトウキビ細胞によって同じ条件下では産生されない外来性糖への変換を触媒するスクロースイソメラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドと機能的に結合した転写制御エレメントをそのヌクレオーム中に含んでおり、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択され、ここで、対照サトウキビの対応するシンク組織細胞と比較して、スクロースイソメラーゼ酵素がサトウキビシンク組織細胞で総炭水化物含量が増しているようなレベルまたは機能的活性で産生されるトランスジェニックサトウキビ・シンク細胞。
【請求項８８】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項87記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項８９】
スクロースイソメラーゼ酵素が、植物糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項87または請求項88記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９０】
スクロースイソメラーゼ酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項89記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９１】
スクロースイソメラーゼ酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項89記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９２】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項89〜91のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９３】
スクロースイソメラーゼ酵素がスクロースの外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生され、細胞分裂および／または伸長が終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する、請求項87および89〜92のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９４】
スクロースイソメラーゼ酵素がスクロースの外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生され、細胞分裂および／または伸長が起こっている、請求項87および89〜92のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９５】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴うことなく蓄積する、請求項87〜94のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。。
【請求項９６】
桿細胞である、請求項91〜95のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９７】
柔組織細胞である、請求項96記載のトランスジェニックサトウキビ細胞。
【請求項９８】
対照サトウキビの対応するシンク組織と比較して総可溶性炭水化物含量が増しているシンク組織を有するトランスジェニックサトウキビであって、スクロースの、その酵素を産生しない対照サトウキビの対応する細胞によっては内因性に産生されない外来性糖への変換を触媒する糖代謝酵素をコードするポリヌクレオチドをそのヌクレオーム中に含む細胞を含んでおり、外来性糖がイソマルツロースおよびトレハルロースより選択され、ポリヌクレオチドが植物細胞において機能性である転写制御エレメントと機能的に結合しており、かつここで、対照サトウキビの対応するシンク組織と比較して、スクロースイソメラーゼ酵素がサトウキビシンク組織で総炭水化物含量が増しているようなレベルまたは機能的活性で産生されるトランスジェニックサトウキビ。
【請求項９９】
糖代謝酵素が、内因性糖の外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項98記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１００】
スクロースイソメラーゼ酵素が、植物糖貯蔵のために用いられる細胞内区画を酵素の標的とするターゲティングシグナルを含む、請求項98または請求項99記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０１】
スクロースイソメラーゼ酵素がサイトゾルおよび貯蔵区画の間に分布している、請求項100記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０２】
スクロースイソメラーゼ酵素が貯蔵区画に実質的に限局している、請求項100記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０３】
貯蔵区画が液胞、または液胞およびアポプラスト間隙より選択される、請求項100〜102のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０４】
スクロースイソメラーゼ酵素が、スクロースの外来性糖への少なくとも約20％の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項98および100〜103のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０５】
変換が、細胞分裂および／または細胞伸長が実質的に終了していてしかも炭水化物貯蔵の機能を有する組織の内部で起こる、請求項104記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０６】
糖代謝酵素が、植物生長に寄与する細胞分裂および／または細胞伸長が起こっている組織の内部での、スクロースの外来性糖への約20％未満の変換をもたらすレベルまたは機能的活性で産生される、請求項104記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０７】
外来性糖が内因性糖または炭水化物の含量の相応した減少を伴うことなく蓄積する、請求項98〜106のいずれか一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０８】
シンク組織が桿組織である、請求項98〜107の一項記載のトランスジェニックサトウキビ。
【請求項１０９】
SEQ ID NO：10に示された配列に対して、もしくはその生物活性部分に対して、またはSEQ ID NO：10に示された配列と少なくとも約93、94、95、96、97、98、99％の配列同一性を示すこれらの変種に対して、一致するか相補的であるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項１１０】
SEQ ID NO：10に示された配列に対して、またはSEQ ID NO：10に示された配列に対して少なくとも約93％の配列同一性を示すその変種に対して、一致するか相補的であるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項１１１】
SEQ ID NO：20を含まず、しかもSEQ ID NO：10に示された配列と少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
【請求項１１２】
請求項109〜111のいずれか一項記載のDNA分子が、転写させようとする外来性または内因性核酸配列と機能的に結合したものを含む、キメラDNA構築物。
【請求項１１３】
形質転換植物細胞を作製するための方法であって、形質転換植物細胞を得るために、再生可能な植物細胞に請求項112記載のキメラDNA構築物を導入する段階、および形質転換植物細胞を同定または選択する段階を含む方法。
【請求項１１４】
形質転換植物細胞から安定な遺伝子形質転換体を選択するための方法であって、形質転換植物細胞を得るために、再生可能な植物細胞に請求項112記載のキメラDNA構築物を導入する段階、および形質転換植物細胞から形質転換植物系統を同定または選択する段階を含む方法。
【請求項１１５】
分化したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、再生可能な形質転換細胞を得るために、請求項112記載のキメラDNA構築物を再生可能な植物細胞に導入する段階、形質転換細胞の集団を同定または選択する段階、およびその集団から分化したトランスジェニック植物を再生させる段階を含む方法。
【請求項１１６】
請求項112記載のキメラDNA構築物を含む植物細胞。
【請求項１１７】
請求項112記載のキメラDNA構築物を含む細胞を含む、分化した植物体。
【請求項１１８】
所望の代謝産物のより高収量での生産のための方法であって、生物体によって通常感知される内因性基質化合物の、生物体内部で同等な様式では認知されない産物化合物への変換を触媒し、その結果、代謝フローを変化させる効果を及ぼし、所望の内因性化合物のより高収量での蓄積をもたらす酵素をコードする導入ポリヌクレオチドの生物体内部での発現を含む方法。
【請求項１１９】
産物化合物が生物体によって代謝されない、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
産物化合物が、生物体によって通常は感知されない、基質化合物の異性体である、請求項118または請求項119記載の方法。
【請求項１２１】
導入遺伝子産物が、代謝活性のあるサイトゾル区画、および代謝産物貯蔵区画の間に分布している、請求項118〜120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
代謝産物貯蔵区画が液胞、または液胞および細胞外間隙より選択される、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
変換活性が生物体の貯蔵組織に選択的に付与され、貯蔵組織の形成の前駆体として活発な生長および伸長が起こっている組織には付与されない、請求項118〜122のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
所望の代謝産物が内因性基質化合物を含む、請求項118〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
イソマルツロースを生産するための方法であって、貯蔵備蓄物としてスクロースを通常蓄積する植物体において、スクロース貯蔵区画に選択的にスクロースイソメラーゼ活性を付与するように任意に改変されたスクロースイソメラーゼUQ68Jをコードする導入ポリヌクレオチドを発現させる段階を含む方法。
【請求項１２６】
植物がサトウキビ、モロコシまたはサトウダイコンより選択される、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
スクロース貯蔵区画がスクロース貯蔵液胞、または液胞および細胞外間隙より選択される、請求項125記載の方法。
【請求項１２８】
ポリヌクレオチドの発現が、植物の桿を含む、成熟スクロース貯蔵組織において選好的に起こる、請求項125記載の方法。
【請求項１２９】
イソマルツロースを植物から採取する段階をさらに含む、請求項125〜128のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
2006525797.tif 000048
2006525797.tif 000049
2006525797.tif 000050