(57)【要約】本発明は、GABAA レセプターに結合する式 Iの化合物を提供する。その式において、可変部分は本明細書で定義したとおりである。その化合物は、インビボまたはインビトロでGABAA レセプターに結合するリガンドを調節するのに使用され得、ヒト、飼いならしたコンパニオン・アニマル、および家畜動物における種々の中枢神経系(CNS)疾患の治療に特に有用である。本明細書で提供した化合物は、単独でまたは１以上の他のCNS薬と組み合わせて投与され、別のCNS薬の効果を増強し得る。そのような疾患を治療するための医薬組成物と方法、およびGABAA レセプターを検出するためのリガンドを用いるための方法(例えば、レセプター局在研究)を提供する。2006517958.tif 000093
2006517958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物:
【化１】
2006517958.tif 000082
またはその医薬的に許容される形態、
式中、
Arは、フェニル、ナフチルまたは5-から10-員環のヘテロアリール基を示す、その各々が、R8から独立して選択される0から4の基で置換されている、
X、YおよびZは、
(i)独立して窒素またはCR1であり、但し、Xが窒素ならばYはCR1である; または
(ii)Yは、XまたはZと一体となって、R1から独立して選択された0から2の置換基で置換される縮合した5-員の複素環を形成する; および他方のXおよびZは、窒素であるかCR1である;
R1は、現れるたびに以下から独立して選択される:
(a)水素、ハロゲン、ニトロおよびシアノ; および
(b)以下の式の基:
【化２】
2006517958.tif 000083
式中、
Gは、結合、C1-C4アルキル、-N(RB)-、-O-、-C(=O)-、-C(=O)N(RB)-、-N(RB)C(=O)-、-S(O)m-、-CH2C(=O)-、-S(O)mN(RB)-または-N(RB)S(O)m-である; ここで、mは0、1または 2である; および
RAおよび各々のRBは、独立して以下から選択される:
(i)水素; および
(ii)C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C3-C8炭素環)C0-C4アルキルおよび(3-から8-員の複素環)C0-C4アルキル、その各々は、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、C1-C4アルカノイル、モノ-およびジ(C1-C4アルキル)アミノ、C1-C4ハロアルキルおよびC1-C4ハロアルコキシから独立して選択される0から4の置換基で置換される;
R4は、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、C3-C7シクロアルキル、C1-C8ハロアルキル、C1-C8アルコキシ、C1-C8ハロアルコキシ、C2-C8アルキルエーテル、C2-C8ハロアルキルエーテル、またはモノ-またはジ-(C1-C8アルキル)アミノ(C0-C4アルキル)である;
R5およびR6は、独立して水素、メチルまたはエチルである;
R7は、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、シアノおよびヒドロキシから独立して選択された0から3の置換基で置換されているC1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C4アルキル、またはベンジルを示す; および
R8は、現れるたびに以下から独立して選択される、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、C1-C8アルキル、C1-C8アルケニル、C1-C8アルキニル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C8アルキル、C1-C8ハロアルキル、C1-C8アルコキシ、(C3-C7シクロアルキル)C1-C8アルコキシ、C1-C8ハロアルコキシ、C1-C8アルキルエーテル、C1-C8アルカノン、C1-C8アルカノイル、(3-から7-員のヘテロシクロアルキル)C0-C8アルキル、C1-C8ヒドロキシアルキル、C1-C8アミノアルキル、およびモノ-およびジ-(C1-C8アルキル)アミノC0-C8アルキル。
【請求項２】
Arが、フェニルまたはピリジルであり、その各々が、R8から独立して選択される0から4の置換基で置換される請求項1の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項３】
各々のR8が、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、モノ-およびジ-C1-C4アルキルアミノ、C2-C4アルカノイル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C2アルキル、C1-C2ハロアルキルおよびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される、請求項1または請求項2の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項４】
Arが、フェニルまたは2-ピリジルであり、その各々が、クロロ、フルオロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、C1-C2アルキルアミノ、C1-C2ハロアルキルおよびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される0から3の置換基で置換されている、請求項2の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項５】
Arが、フェニルまたは2-ピリジルであり、その各々が、フルオロおよびクロロから独立して選択される1、2または3の置換基で置換されている、請求項4の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項６】
Arが、2,6-ジフルオロフェニルまたは6-フルオロ-ピリド-2-イルである、請求項4の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項７】
R4が、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、C1-C8アルコキシ、C2-C8アルキルエーテル、またはモノ-またはジ-(C1-C8アルキル)アミノ(C0-C4アルキル)である、請求項1-6のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項８】
R4が、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニルまたはC1-C6アルコキシである、請求項7の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項９】
各々のR1が、以下から独立して選択される、請求項1-8のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態:
(a)水素およびハロゲン; および
(b)以下の式の基:
【化３】
2006517958.tif 000084
式中、
Gは、結合、-NH-、-N(RB)-、-O-または-C(=O)-である; および
RAおよびRBは、独立して以下から選択される:
(i) 水素; および
(ii) C1-C6アルキル、C2-C6アルケニルおよび(C3-C7シクロアルキル)C0-C2アルキル、その各々は、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、C1-C2アルキルおよびC1-C2アルコキシから独立して選択される0から4の置換基で置換される。
【請求項１０】
各々のR1が、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C4アルカノイル、C1-C2ハロアルキル、C1-C2ハロアルコキシ、およびモノ-およびジ-(C1-C4アルキル)アミノから独立して選択される請求項9の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１１】
X、YおよびZは、独立して窒素またはCR1である、請求項1-10のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１２】
示した基:
【化４】
2006517958.tif 000085
が、
【化５】
2006517958.tif 000086
[式中、R1aおよびR1bは、独立して水素、ハロゲン、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C1-C6アルカノイルまたはC1-C6アルコキシである]
である、請求項11の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１３】
R1aは、ハロゲン、C1-C4アルキル、C1-C4アルカノイルまたはC1-C4アルコキシであり、
R1bは、水素、メチルまたはメトキシであり、そして
R4は、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである、
請求項12の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１４】
示した基:
【化６】
2006517958.tif 000087
が、
【化７】
2006517958.tif 000088
[式中、R1aおよびR1bは、独立して水素、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである]
である、請求項11の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１５】
R1aが水素であり、R1bが水素、C1-C4アルキルおよびC1-C4アルコキシであり、そしてR4はC1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである、請求項14の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１６】
X、YおよびZは、独立してCR1であり、ここで、各々のR1は、水素、ハロゲン、C1-C6アルキルおよびC1-C6アルコキシから独立して選択され、そして
R4は、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである、
請求項11の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１７】
示した基:
【化８】
2006517958.tif 000089
が、
【化９】
2006517958.tif 000090
である、請求項1-10のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１８】
各々のR1が、独立して、水素、ハロゲン、C1-C6アルキルおよびC1-C6アルコキシから選択され、そして
R4が、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである、
請求項17の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項１９】
示した基:
【化１０】
2006517958.tif 000091
が、
【化１１】
2006517958.tif 000092
[式中、WはNまたはCR1である]
である、請求項1-10のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項２０】
各々のR1が、独立して水素、ハロゲン、C1-C6アルキルおよびC1-C6アルコキシから選択され、そして
R4が、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである、
請求項19の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項２１】
R5およびR6は、両方とも水素である、請求項1-20のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項２２】
R7がC3-C6アルキルである、請求項1-21のうちの何れかの化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項２３】
R7が、3-メチル-ブチル、イソブチルまたはn-ブチルである、請求項22の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項２４】
化合物が、
N-(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-(3-メチル-ブチル)-ベンズアミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミド;
N-(6-クロロ-4-プロピル-ピリミジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (6-クロロ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミド;
2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(7-プロピル-[1,2,4] トリアゾロ[4,3-b]ピリダジン-6-イルメチル)-ベンズアミド;
2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(3-メチル-7-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-b]ピリダジン-6-イルメチル)-ベンズアミド;
N-(6-アセチル-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド;
2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(5-メチル-3-プロピル-イミダゾ[1,5-b]ピリダジン-2-イルメチル)-ベンズアミド;
2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(5-メチル-3-プロピル-イミダゾ[1,5-b]ピリダジン-2-イルメチル)-ベンズアミド;
N-(6-クロロ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-N-エチル-2,5-ジフルオロ-ベンズアミド;
2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン-7-イルメチル)-ベンズアミド;
2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン-7-イルメチル)-ベンズアミド;
N-(3,5-ジエトキシ-ピリジン-2-イルメチル)-N-(3-メチル-ブチル)-2,5-ジフルオロ-ベンズアミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 ブチル-(3,5-ジエトキシ-ピリジン-2-イルメチル)-アミド;
N-ブチル-2,5-ジフルオロ-N-(5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)ベンズアミド;
N-イソアミル-2,5-ジフルオロ-N-(5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)ベンズアミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 ブチル-(5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-アミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 イソアミル-(5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-アミド;
N-イソアミル-2,5-ジフルオロ-N-(6-メトキシ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)ベンズアミド;
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 イソアミル-(6-メトキシ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-アミド;または
6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 イソアミル-(6-メチル-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-アミド
である、請求項1の化合物またはその医薬的に許容される形態。
【請求項２５】
GABAA レセプター結合のアッセイにおいて、1マイクロモル以下のKiを示す、請求項1の化合物またはその形態。
【請求項２６】
GABAA レセプター結合のアッセイにおいて、100ナノモル以下のKiを示す、請求項1の化合物またはその形態。
【請求項２７】
GABAA レセプター結合のアッセイにおいて、10ナノモル以下のKiを示す、請求項1の化合物またはその形態。
【請求項２８】
生理学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた請求項1の化合物またはその形態を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
医薬組成物が、注射可能な液体、エアロゾル、クリーム、ゲル、丸薬、カプセル、シロップまたは経皮パッチとして製剤される、請求項28の医薬組成物。
【請求項３０】
不安、抑欝、睡眠障害、注意力欠如障害、またはアルツハイマー性痴呆の治療方法であって、その治療を必要とする患者にGABAA レセプター活性を調節する量の請求項1の化合物またはその形態を投与することが含まれる、該治療方法。
【請求項３１】
CNS薬の治療効果を増強する方法であって、患者にCNS薬および請求項1の化合物またはその形態を投与することが含まれる、該方法。
【請求項３２】
患者の短期記憶を改善する方法であって、GABAA レセプター活性を調節する量の請求項1の化合物またはその形態を患者に投与することが含まれる、該方法。
【請求項３３】
サンプルにおけるGABAAレセプターの存在または不在を判定する方法であって、
(a) 請求項1の化合物またはその形態がGABAAレセプターに結合できる条件下で該化合物とサンプルとを接触させる工程;
(b) GABAAレセプターに結合していない化合物またはその形態を取り除く工程;および
(c) GABAAレセプターに結合した化合物またはその形態のレベルを検出する工程
を含み、それにより、サンプル中のGABAA レセプターの存在または不在を判定する、該方法。
【請求項３４】
結合化合物の存在または不在を、オートラジオグラフィーを用いて検出する、請求項33の方法。
【請求項３５】
GABAA レセプターのシグナル伝達活性を変化させる方法であって、
GABAA レセプターを発現する細胞と、該細胞の電気生理を検出可能な程度に変化させるのに十分な量の請求項1の化合物またはその形態とを接触させること
を含み、それにより、GABAA レセプターのシグナル伝達活性を変化させる、該方法。
【請求項３６】
細胞が、組み換え的に異種GABAA レセプターを発現し、該細胞の電気生理の変化が、細胞内記録またはパッチクランプ記録により検出される、請求項35の方法。
【請求項３７】
コンテナー中に請求項28の医薬組成物が含まれ、および不安、抑欝、睡眠障害、注意力欠如障害、アルツハイマー性痴呆、または短期記憶喪失を患う患者を治療するべく該組成物を用いるための説明書が含まれる、パッケージされた医薬製剤。
【請求項３８】
不安、抑欝、睡眠障害、注意力欠如障害、アルツハイマー性痴呆、または短期記憶喪失の治療用の医薬の製造のための請求項1の化合物またはその形態の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、高い選択性および／または高い親和性でGABAA レセプターに結合するアリール酸ピリミジニルメチルアミド、ピリダジニルメチルアミドおよび関連化合物に関係する。本発明は、更に、その化合物を含む医薬組成物、および中枢神経系(CNS)の疾患の治療におけるその化合物の使用にも関係する。
【０００２】
発明の背景
GABAAレセプタースーパーファミリーは主要な阻害性神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸、即ちGABAがそれを介して作用する１つのクラスのレセプターを表す。哺乳類の脳において均一ではないが広く分布しているGABAはGABAAレセプターと称されるタンパク質複合体を介してその作用の多くを媒介し、クロライドコンダクタンスおよび膜分極における変化をもたらす。多数の薬剤、例えば抗不安および鎮静性のベンゾジアゼピンもこのレセプターに結合する。GABAAレセプターはGABAに応答して一定ではないが一般に開くクロライドチャンネルを含み、塩素イオンの細胞内への流入を可能にする。これは細胞膜電位の過分極を介して神経細胞活性を遅延させる効果を有する。
【０００３】
GABAAレセプターは５つのタンパク質サブユニットから構成される。これらGABAAレセプターサブユニットの多数のcDNAがクローニングされており、その一次構造が決定されている。これらサブユニットは４つの膜貫通ヘリックスの基本モチーフを保有するがこれらをいくつかの群に分類するのに十分な配列多様性がある。今日まで、少なくとも6つのα、3つのβ、3つのγ、1つのε、1つのδおよび2つのρサブユニットが同定されている。ネイティブなGABAAレセプターは典型的には2つのαサブユニット、2つのβサブユニットおよび1つのγサブユニットから構成される。様々な証拠(例えば転写産物分布、ゲノム局在および生化学的研究結果)が、天然のレセプター組み合わせは主にα1β2γ2、α2β3γ2、α3β3γ2およびα5β3γ2であることを示唆している。
【０００４】
GABAについてのGABAAレセプター結合部位(レセプター複合体当たり２つ)はαおよびβサブユニットからのアミノ酸によって形成される。αおよびγサブユニットからのアミノ酸はレセプター当たり１つのベンゾジアゼピン部位を形成し、ここでベンゾジアゼピンがその薬理活性を発揮する。さらに、GABAAレセプターはいくつかのその他のクラスの薬剤との相互作用部位を含む。これらには、ステロイド結合部位、ピクロトキシン部位、およびバルビツール酸部位が含まれる。GABAAレセプターのベンゾジアゼピン部位はその他のクラスの薬剤またはGABAとの相互作用部位とオーバーラップすることのないレセプター複合体における特徴的な部位である。
【０００５】
古典的なアロステリック機構において、ベンゾジアゼピン部位への薬剤の結合はGABAのためのGABA レセプターのアフィニティーを変化させる。ベンゾジアゼピンおよびGABAAレセプターチャンネルを開くGABAの能力を増強する関連薬剤は、GABA増強のレベルに応じてアゴニストまたは部分的アゴニストとして知られている。同じ部位に結合してGABAの作用を負に調節する別のクラスの薬剤、例えばβ-カルボリン誘導体はインバースアゴニストと称される。同じ部位に結合するがGABAの活性に影響をほとんどまたは全く与えない化合物はアゴニストまたはインバースアゴニストの作用をブロックすることが出来、したがってGABAAレセプターアンタゴニストと称される。
【０００６】
ベンゾジアゼピン部位において作用する薬剤の重要なアロステリック調節効果は早くから認識されており、異なるレセプターサブタイプにおける活性の分布が薬理学の発明の重要な領域であった。ベンゾジアゼピン部位において作用するアゴニストは抗不安、鎮静、抗痙攣および催眠効果を示すことが知られているが、この部位にてインバースアゴニストとして作用する化合物は、不安促進（anxiogenic）、認知促進、および痙攣促進（proconvulsat)効果を引き起こす。
【０００７】
ベンゾジアゼピン類は抗不安薬として長期にわたって医薬として使用されてきたが、これら化合物は多数の望ましくない副作用を示す可能性がある。かかる副作用としては、認知障害、鎮静、失調症、エタノールの効果の増強、および耐性および薬物依存の傾向が挙げられる。したがって、当該技術分野においてGABAAレセプター活性化および/または活性を調節するさらなる治療薬が求められている。本発明はこの要求を満たし、さらなる関連する利点を提供するものである。
【０００８】
発明の概要
本発明はGABAAレセプター活性化および/またはGABAAレセプター-媒介シグナル伝達を調節する化合物を提供する。かかるGABAAレセプター活性調節因子は好ましくは高アフィニティーおよび/または高選択性GABAAレセプターリガンドであり、GABAAレセプター、例えばヒトGABAAレセプターのアゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。したがって、それらは様々なCNS障害の治療に有用である。
【０００９】
特定の態様において、本発明によって提供されるGABAA レセプター活性調節因子は、式 Iのアリール酸ピリミジニルメチルアミド、ピリダジニルメチルアミドおよび関連化合物:
【化１】
2006517958.tif 000003
式 I
またはその医薬的に許容される形態である
[式中、
Arは、フェニル、ナフチルまたは5-から10-員環のヘテロアリール基を示す、その各々が、R8から独立して選択される0から4の基で置換されている;
X、YおよびZは、
(i)独立して窒素またはCR1であり、但し、Xが窒素ならば、YはCR1である; または
(ii)Yは、XまたはZと一体となって、縮合した5-員の複素環を形成し、それは、R1から独立して選択された0から2の置換基で置換されている; および他方のXおよびZは、窒素またはCR1である;
R1は、現れるたびに独立して以下から選択される:
(a)水素、ハロゲン、ニトロおよびシアノ; および
(b)以下の式の基:
【化２】
2006517958.tif 000004
式中、
Gは、結合、C1-C4アルキル、-N(RB)-、-O-、-C(=O)-、-C(=O)N(RB)-、-N(RB)C(=O)-、-S(O)m-、-CH2C(=O)-、-S(O)mN(RB)-または-N(RB)S(O)m-である; ここで、mは0、1または 2である; および
RAおよび各々のRBは、独立して以下から選択される:
(i) 水素; および
(ii) C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C3-C8炭素環)C0-C4アルキルおよび(3-から8-員の複素環)C0-C4アルキル、その各々が、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、C1-C4アルカノイル、モノ-およびジ(C1-C4アルキル)アミノ、C1-C4ハロアルキルおよびC1-C4ハロアルコキシから独立して選択される0から4の置換基で置換されている;
R4は、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、C3-C7シクロアルキル、C1-C8ハロアルキル、C1-C8アルコキシ、C1-C8ハロアルコキシ、C2-C8アルキルエーテル、C2-C8ハロアルキルエーテル、またはモノ-またはジ-(C1-C8アルキル)アミノ(C0-C4アルキル)である;
R5およびR6は、独立して、水素、メチルまたはエチルである; 
R7は、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、シアノおよびヒドロキシから独立して選択される0から3の置換基で置換されているC1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C4アルキル、またはベンジルを示す; および
R8は、現れるたびに、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、C1-C8アルキル、C1-C8アルケニル、C1-C8アルキニル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C8アルキル、C1-C8ハロアルキル、C1-C8アルコキシ、(C3-C7シクロアルキル)C1-C8アルコキシ、C1-C8ハロアルコキシ、C1-C8アルキルエーテル、C1-C8アルカノン、C1-C8アルカノイル、(3-から7-員のヘテロシクロアルキル)C0-C8アルキル、C1-C8ヒドロキシアルキル、C1-C8アミノアルキル、およびモノ-およびジ-(C1-C8アルキル)アミノC0-C8アルキルから独立して選択される]。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、上記の１以上の化合物またはその形態を医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。パッケージされた医薬製剤がまた提供され、それには、コンテナー中に医薬組成物、および該組成物を用い不安、抑欝、睡眠障害、注意力欠如障害またはアルツハイマー性痴呆などの中枢神経系疾患を患う患者を治療するための説明書が含まれる。
【００１１】
本発明は、更に、他の態様において、不安、抑欝、睡眠障害、注意力欠如障害、統合失調症またはアルツハイマー性痴呆のような、特定のCNS疾患を患う患者を治療するための方法を提供し、その方法には、GABAA レセプター活性を調節する量の上記の化合物またはその形態で治療する必要のある患者に投与する工程が含まれる。患者の短期記憶を改善するための方法をも提供し、その方法には、GABAA レセプター活性を調節する量の上記の化合物またはその形態で治療する必要のある患者に投与する工程が含まれる。有効量の本発明の化合物による、特定のCNS疾患を患うヒト、飼いならしたコンパニオン・アニマル(ペット)または家畜の治療が本発明に含まれる。
【００１２】
別の態様において、本発明はその他のCNS作用化合物の作用を増強する方法を提供する。これらの方法はGABAAレセプター活性を調節する量の式Iの化合物または塩をその他のCNS作用化合物の投与と組み合わせて投与する工程を含む。
【００１３】
本発明はサンプル(例えば、組織切片)におけるGABAAレセプターの局在のためのプローブとしての式Iの化合物の使用に関する。ある態様において、GABAAレセプターはオートラジオグラフィーを用いて検出される。さらに、本発明は以下の工程を含む、サンプルにおけるGABAAレセプターの存在または不在を判定する方法を提供する：
(a) 化合物がGABAAレセプターに結合できる条件下で上記化合物とサンプルとを接触させる工程;
(b) GABAAレセプターに結合していない化合物を取り除く工程;および
(c) GABAAレセプターに結合した化合物のレベルを検出する工程。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、中間体を含む本明細書に開示した化合物の調製方法を提供する。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の態様は以下の詳細な説明から明らかであろう。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、式Iの化合物を提供する。特定の好ましい化合物は好ましくは高選択性にてGABAAレセプターに結合する; より好ましいそのような化合物は脳機能の有益な調節を更に提供する。いかなる原理にも拘束される意図ではないが、かかる化合物とGABAAレセプターのベンゾジアゼピン部位との相互作用の結果、かかる化合物の薬理効果が生じると考えられる。かかる化合物はGABAAレセプターの位置の決定のため、あるいは様々な状況でのGABAAレセプター活性の調節のためにインビトロまたはインビボで利用できる。
【００１７】
化学的記載および用語
本発明によって提供される化合物は一般に標準的命名法を用いて記載される。不斉中心を有する化合物については、(特に断りのない限り)そのすべての光学異性体および混合物が含まれることを理解されたい。ある構造のすべてのキラル(エナンチオマーおよびジオステレオマー)、およびラセミ形態ならびにすべての幾何異性体形態が、特定の立体化学または異性体形態を意図する場合でない限り、含まれる。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合などの多くの幾何異性体がまた本明細書に記載する化合物において存在し得、すべてのかかる安定な異性体が本発明に含まれる。本発明の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、異性体混合物としてあるいは別々の異性体形態として単離され得る。言及される化合物はさらに１または複数の原子が同位体(即ち、原子番号は同じであるが質量数が異なる原子)で置換された化合物も含む。限定的ではなく一般例として、水素の同位体にはトリチウムおよび重水素が含まれ、炭素の同位体には１１Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃが含まれる。
【００１８】
特定の化合物は可変部を含む一般式を用いて本明細書に記載される。特に断りのない限り、かかる式中の各可変部はその他の可変部と独立して定義され、式中に２回以上現れるあらゆる可変部は、現れるたびに独立に定義される。したがって、例えば、基が０−２のＲ＊で置換されていると記載されている場合、該基は非置換でもよいし、２までのＲ＊基によって置換されていてもよく、各Ｒ＊はＲ＊の定義から独立に選択される。さらに、置換基および/または可変部の組み合わせはかかる組み合わせにより安定な化合物が生じる場合にのみ許容されることは明らかである。
【００１９】
本明細書において用いる「アリール酸ピリミジニルメチルアミド、ピリダジニルメチルアミドおよび関連化合物」の語は、式Iの化合物、およびその医薬上許容される形態を指す。
【００２０】
本明細書において言及する化合物の「医薬上許容される形態」は、かかる化合物の医薬上許容される塩、水和物、溶媒和物、結晶形態、同質異像、キレート、非共有結合的複合体、エステル、包接化合物およびプロドラッグである。本明細書において用いる、医薬上許容される塩は、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー性応答またはその他の問題や合併症を起こすことなく、ヒトまたは動物の組織と接触させて使用するのに好適であると当該技術分野において一般に考えられている酸または塩基塩である。かかる塩には、塩基性部分（例えば、アミンおよびアルカリ）の鉱酸および有機酸塩または酸性部分（例えば、カルボン酸）の有機塩が挙げられる。特定の医薬上の塩としてはこれらに限定されないが以下のような酸の塩が挙げられる：例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、アルカン酸、例えば、酢酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ここでｎは０−４）など。同様に、医薬上許容されるカチオンにはこれらに限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウムおよびアンモニウムが含まれる。当業者であれば本発明によって提供される化合物のさらなる医薬上許容される塩を認識するであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、17th ed.、Mack Publishing Company、Easton、PA、p. 1418 (1985)に例示されている。一般に、医薬上許容される酸または塩基の塩は塩基性または酸性部分を含む親化合物からあらゆる常套の化学方法をもちいて合成できる。簡単に説明すると、塩は、それらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水、有機溶媒、またはそれら２つの混合物中の化学量論的量の適当な塩基または酸と反応させることにより調製し得る;一般に、非水性媒体、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどが好ましい。
【００２１】
「プロドラッグ」とは、式Iの構造的要求を完全には満たさなくてもよいが、患者への投与後にインビボで修飾されて式Iの化合物を生じる化合物のことをいう。例えば、プロドラッグは本発明によって提供される化合物のアシル化誘導体であってよい。プロドラッグには、いずれかの基にヒドロキシ、アミンまたはスルフヒドリル基が結合している化合物であって、哺乳類対象に投与された場合に切断されて遊離のヒドロキシル、アミノ、またはスルフヒドリル基をそれぞれ生じるような化合物も含まれる。プロドラッグの例としてはこれらに限定されないが本発明によって提供される化合物のアルコールおよびアミン官能基の酢酸エステル（塩）、ギ酸エステル（塩）および安息香酸エステル（塩）誘導体が挙げられる。式Iの化合物のプロドラッグは、例えば、化合物に存在する官能基をその修飾がインビボで切断されて式Iの化合物が生じるように修飾することによって調製できる。
【００２２】
本明細書において用いる「置換基」とは、目的の分子内の原子に共有結合している分子部分のことをいう。例えば、「環置換基」は環のメンバーである原子(好ましくは、炭素または窒素原子)に共有結合している部分、例えば、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基またはその他の本明細書において議論される置換基であってよい。本明細書において用いる、「置換」の語は、目的の原子上の１または複数の水素が、示された置換基から選択されたものによって置換されていることをいい、ただし、目的の原子の通常の原子価を超えることはなく、置換の結果、安定な化合物(即ち、単離、特性解析および生理活性について試験できる化合物)が生じる場合をいう。置換基がオキソ(即ち、＝Ｏ)である場合、原子上の２つの水素が置換されたことになる。芳香族部分がオキソ基によって置換された場合、芳香族環は、対応する部分的に不飽和の環によって置換される。例えばオキソによって置換されたピリジル基はピリドンである。
【００２３】
「置換されていてもよい」の語は、基が非置換でもよいし、１または複数のいずれかの可能な位置、典型的には1、2、3、4、または5の位置にて、例えば本明細書に記載する１または複数の好適な置換基によって置換されていてもよいことを指す。置換されていてもよい、ということは「0〜Xの置換基によって置換された」という表現によっても表され、ここでXは置換基の最大数である。
【００２４】
２つの文字または記号の間ではないダッシュ(「-」)は、置換基の結合部位を示すのに用いられる。例えば、−ＣＯＮＨ２は炭素原子を介して結合している。
【００２５】
本明細書において用いる、「アルキル」は、分枝および直鎖状飽和脂肪族炭化水素基を含み、特記する場合、明示した数の炭素原子を有するものとする。したがって、本明細書において用いるＣ１−Ｃ６アルキルの語は、炭素原子数1-6のアルキル基をいう。「Ｃ０−Ｃ４アルキル」は結合またはＣ１−Ｃ４アルキル基を指す。アルキル基には、炭素原子数1-8(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、炭素原子数1-6(Ｃ１−Ｃ６アルキル)および炭素原子数1-4(Ｃ１−Ｃ４アルキル)の基が含まれ、、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、2-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、2-ヘキシル、3-ヘキシルおよび3-メチルペンチルが挙げられる。ある態様において、好ましいアルキル基はメチル、エチル、プロピル、ブチル、および3-ペンチルである。「アミノアルキル」は１または複数の−ＮＨ２置換基で置換された上記のアルキル基である。「ヒドロキシアルキル」は１または複数の−ＯＨ置換基で置換された上記のアルキル基である。
【００２６】
「アルケニル」は１または複数の炭素-炭素二重結合を含む直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、例えば、エテニルおよびプロペニルが挙げられる。アルケニル基には、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルケニルおよびＣ２−Ｃ４アルケニル基(それぞれ、2〜8、2〜6または2〜4の炭素原子数)、例えば、エテニル、アリルまたはイソプロペニルが含まれる。
【００２７】
「アルキニル」は１または複数の炭素-炭素三重結合を含む直鎖状または分枝状炭化水素鎖をいう。アルキニル基にはＣ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニルおよびＣ２−Ｃ４アルキニル基が含まれ、それぞれ2〜8、2〜6または2〜4の炭素原子数である。アルキニル基としては、例えば、エチニルおよびプロピニルのような基が挙げられる。
【００２８】
本明細書において用いる「アルコキシ」とは、酸素架橋を介して結合した上記のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を意味する。アルコキシ基にはＣ１−Ｃ６アルコキシおよびＣ１−Ｃ４アルコキシ基が含まれ、それぞれ1〜6または1〜4の炭素原子を含む。メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペントキシ、2-ペントキシ、3-ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、ヘキソキシ、2-ヘキソキシ、3-ヘキソキシおよび3-メチルペントキシが特定のアルコキシ基である。同様に「アルキルチオ」は硫黄架橋を介して結合した上記のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基をいう。
【００２９】
「シクロアルキル」は、飽和または部分的飽和環状基であって、そのすべての環メンバーが炭素であるものをいい、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ノルボルニル、アダマンチル、デカヒドロ-ナフタレニル(naphthalenyl)、オクタヒドロ-インデニル(indenyl)、および前記の何れかの部分的に飽和した変形、例えば、シクロヘキセニルが挙げられる。かかる基は典型的には、3〜約10の環炭素原子を含む;ある態様において、かかる基は3〜7の環炭素原子を有する(すなわち、C3-C7シクロアルキル)。置換されている場合、いずれかの環炭素原子が、示されたいずれかの置換基に結合していてもよい。
【００３０】
「(シクロアルキル)アルキル」の語において、「シクロアルキル」および「アルキル」は上記の通りであり、結合点はアルキル基上である。特定のこの基は、シクロアルキル基が直接結合またはC1-C8アルキルを介して連結する、(C3-C7シクロアルキル)C0-C8アルキルである。この用語は、例えば、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルメチルおよびシクロヘキシルエチルを含む。同様に、「(C3-C7シクロアルキル)C1-C8アルコキシ」とは、C1-C8アルコキシを介して連結するC3-C7シクロアルキル基をいう。
【００３１】
「アルカノイル」の語は、カルボニル架橋を介して結合した上記のアルキル基をいう。アルカノイル基にはＣ２−Ｃ８アルカノイル、Ｃ２−Ｃ６アルカノイルおよびＣ２−Ｃ４アルカノイル基が含まれ、それぞれ2〜8、2〜6または2〜4の炭素原子を含む。「Ｃ１アルカノイル」は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｈをいい、それは(Ｃ２−Ｃ８アルカノイルとともに)「Ｃ１−Ｃ８アルカノイル」の語に含まれる。エタノイルはＣ２アルカノイルである。
【００３２】
「アルカノン」は上記のアルキル基であって、少なくとも１つの位置でオキソ基に置換された示された数の炭素原子を含む。「Ｃ３−Ｃ８アルカノン」、「Ｃ３−Ｃ６アルカノン」および「Ｃ３−Ｃ４アルカノン」はそれぞれ3〜8、6または4の炭素原子を含むアルカノンをいう。例えば、Ｃ３アルカノン基は−ＣＨ２-（Ｃ＝Ｏ)−ＣＨ３の構造を有する。
【００３３】
同様に、「アルキルエーテル」は炭素-炭素結合を介して結合した直鎖状または分枝状エーテル置換基をいう。アルキルエーテル基にはＣ２−Ｃ８アルキルエーテル、Ｃ２−Ｃ６アルキルエーテルおよびＣ２−Ｃ４アルキルエーテル基が含まれ、それぞれ2〜8、6または4の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２アルキルエーテル基は、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３の構造を有する。
【００３４】
「アルキルアミノ」は、一般構造−ＮＨ−アルキルまたは−Ｎ(アルキル)(アルキル)の二級または三級アミン置換基であり、ここで各アルキルは同じであっても異なっていてもよい。かかる基には、例えば、モノ−およびジ-(Ｃ１−Ｃ６アルキル)アミノ基が含まれ、ここで各アルキルは同じであっても異なっていてもよく、1〜6の炭素原子、およびモノ−およびジ-(Ｃ１−Ｃ４アルキル)アミノ基を含んでいてもよい。アルキルアミノアルキルはアルキル基を介して結合したアルキルアミノ基（即ち一般構造-アルキル−ＮＨ−アルキルまたは−アルキル−Ｎ（アルキル)(アルキル)の基）をいう。かかる基としては、例えば、モノ−およびジ-(Ｃ１−Ｃ８アルキル)アミノＣ１−Ｃ８アルキルが含まれ、ここで各アルキルは同じであっても異なっていてもよい。「モノ-またはジ-(C1-C8アルキル)アミノC0-C4アルキル」とは、直接結合またはC1-C4アルキル基を介して連結するモノ-またはジ-(C1-C8アルキル)アミノ基をいう。以下のものは、代表的なアルキルアミノアルキル基である:
【化３】
2006517958.tif 000005
【化４】
2006517958.tif 000006
【化５】
2006517958.tif 000007
【００３５】
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。「ハロアルキル」は１または複数のハロゲン原子で置換された分枝状または直鎖状アルキル基である(例えば、「C1-C8ハロアルキル」基は、1から8の炭素原子を有する; 「C1-C2ハロアルキル」基は、1から2の炭素原子を有する)。ハロアルキル基の例としては、これらに限定されないが、モノ−、ジ−またはトリ−フルオロメチル; モノ−、ジ−またはトリ−クロロメチル; モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−フルオロエチル;およびモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−クロロエチルが挙げられる。典型的なハロアルキル基はトリフルオロメチルおよびジフルオロメチルである。「ハロアルコキシ」の語は、酸素架橋を介して結合した上記のハロアルキル基をいう。「Ｃ１−Ｃ８ハロアルコキシ」基は1〜8の炭素原子を有する。
【００３６】
本明細書において用いる、「アリール」の語は芳香族環において炭素のみを含む芳香族基をいう。かかる芳香族環は炭素または非-炭素原子または基によってさらに置換されていてもよい。典型的なアリール基は1〜3の別々の、縮合した、スピロまたはペンダント環および6〜約18の環原子を含み、環のメンバーとしてヘテロ原子を含まない。代表的なアリール基には、フェニル、ナフチル(1-ナフチルおよび2-ナフチルを含む)およびビフェニルが含まれ、特定の実施態様で好ましいのはフェニルである。二環式アリール基は、芳香族環(例えば、テトラヒドロナフチル基)に加えてシクロアルキル環を含み得る(かならずしも必要ではないが)。
【００３７】
本明細書に用いる「炭素環」または「炭素環基」の語は、飽和、部分的に不飽和または芳香族基であって1つの環または2つの縮合、ペンダントまたはスピロ環を有し、各環において3〜8原子を含むものをいい、この場合、すべての環原子が炭素である。炭素環基は安定な構造となる限りいずれの炭素原子を介して結合していてもよく、生ずる化合物が安定となるならばいずれの炭素原子上で置換されていてもよい。炭素環基には、シクロアルキルおよびアリール基が含まれる。本明細書において言及する特定の炭素環は、(C3-C8炭素環)C0-C4アルキル基である(すなわち、3-から8-員の炭素環基が直接結合またはC1-C4アルキル基を介して連結する基)。
【００３８】
「複素環」または「複素環基」の語は、1または2の環を有する飽和、部分的に不飽和または芳香族基であって、各環に3〜8原子あり、そして少なくとも1つの環において独立に選択される1〜4のヘテロ原子(すなわち、酸素、硫黄または窒素)がある該基を示すのに用いている。複素環は安定な構造となるいずれかの環ヘテロ原子または炭素原子を介して結合していてもよく、化合物が安定となるならば、炭素および/または窒素原子上で置換されていてもよい。いずれかの窒素および/または硫黄ヘテロ原子も酸化されてもよく、いずれかの窒素も四級となってもよい。本明細書において言及する特定の複素環は、(3-から8-員の複素環)C0-C4アルキル基である(すなわち、3-から8-員の複素環基が直接結合またはC1-C4アルキル基を介して連結する基)。
【００３９】
特定の複素環は「ヘテロアリール」(すなわち、1〜4のヘテロ原子を有し、他の環原子が炭素である少なくとも１つの芳香族環を含む)であり、例えば、5〜7-員環単環式基および7〜10員環二環式基である。ヘテロアリール基中のＳおよびＯ原子の総数が１を上回る場合、これらヘテロ原子は互いに隣接していない；好ましくはヘテロアリール基中のＳおよびＯ原子の総数は1、2または3以下、より好ましくは1または2以下、好ましくは1以下である。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、インドリル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、および5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリンが挙げられる。二環式ヘテロアリール基は、芳香族環(例えば、テトラヒドロキノリニルまたはテトラヒドロイソキノリニル基)に加えて飽和環を含み得る(かならずしも必要ではないが)。「5または6員環ヘテロアリール」は5または6の環メンバーを有する単環式ヘテロアリールである。かかる5-または6-員のヘテロアリール基が、特定の実施態様において好ましい。
【００４０】
別の複素環は本明細書において「ヘテロシクロアルキル」(すなわち、飽和または部分的飽和複素環)と称される。ヘテロシクロアルキル基は3〜約8の環原子、より典型的には3〜7または5〜7の環原子を含む。ヘテロシクロアルキル基の例としては、モルホリニル、ピペラジニルおよびピロリジニルが含まれる。(3-から7-員のヘテロシクロアルキル)C0-C8アルキル基は、直接結合またはC1-C8アルキル基を介して連結する3〜7の環メンバーを有するヘテロシクロアルキルである。ヘテロシクロアルキル基の例としては、モルホリニル、ピペラジニルおよびピロリジニル基が含まれる。
【００４１】
「GABAAレセプター」および「ベンゾジアゼピンレセプター」の語は、GABAに検出可能に結合し、クロライドコンダクタンスおよび膜分極の用量依存的変化を媒介するタンパク質複合体をいう。天然の哺乳類(特にヒトまたはラット)GABAAレセプターサブユニットを含むレセプターが一般に好ましいが、サブユニットは、いかなる修飾も実質的にレセプターのGABAへの結合能力を阻害しない限り修飾されてもよい(すなわち、GABAについてのレセプターの結合アフィニティーの少なくとも50%が維持される)。GABAについての候補GABAAレセプターの結合アフィニティーは本発明によって提供される標準的リガンド結合アッセイを用いて評価することが出来る。様々なGABAAレセプターサブタイプが「GABAAレセプター」の語の範囲内に含まれるのが明らかである。これらサブタイプとしては、これらに限定されないが、α2β3γ2、α3β3γ2、α5β3γ2、およびα1β2γ2レセプターサブタイプが挙げられる。GABAAレセプターは様々な起源から得られ、例えば、ラット皮質からの調製物またはクローニングされたヒトGABAAレセプターを発現する細胞から得られる。特定のサブタイプは標準的技術を用いて容易に調製できる(例えば、所望のサブユニットをコードするmRNAを本明細書に記載するように宿主細胞に導入する)。
【００４２】
GABAAレセプターの「アゴニスト」とは、GABAAレセプターにおけるGABAの活性を増強する化合物である。アゴニストは必ずしもそうである必要はないが、GABAのGABAAレセプターに対する結合も増強する。GABAAアゴニストとして作用する化合物の能力は、電気生理学的アッセイ、例えば、実施例4に記載のアッセイを用いて測定することが出来る。
【００４３】
GABAAレセプターの「インバースアゴニスト」とは、GABAAレセプターにおけるGABAの活性を減少させる化合物である。インバースアゴニストは必ずしもそうである必要はないが、GABAのGABAAレセプターに対する結合も阻害し得る。GABA-誘導性GABAAレセプター活性の減少は電気生理学的アッセイ、例えば、実施例4に記載のアッセイを用いて測定することが出来る。
【００４４】
本明細書において用いるGABAAレセプターの「アンタゴニスト」はGABAAレセプターのベンゾジアゼピン部位を占有する化合物であって、GABAAレセプターにおけるGABA活性には検出可能な効果を有さないものである。かかる化合物はアゴニストまたはインバースアゴニストの作用を阻害することが出来る。GABAAレセプターアンタゴニスト活性は、好適なGABAAレセプター結合アッセイ、例えば、実施例3に記載のアッセイと好適な機能アッセイ、例えば、実施例4に記載の電気生理学的アッセイの組み合わせを用いて測定することが出来る。
【００４５】
「GABAAレセプター活性調節因子」はGABAAレセプターアゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するいずれかの化合物である。ある態様において、かかる活性調節因子は、標準的GABAAレセプター放射性リガンド結合アッセイにおいて1マイクロモル未満のアフィニティー定数(Ki)を示すか、実施例4の電気生理学的アッセイにおいて1マイクロモル未満のEC50を示し得る。別の態様において、GABAAレセプター活性調節因子は、アフィニティー定数またはEC50、500 nM、200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、10 nM または5 nM未満を示し得る。
【００４６】
「GABAAレセプター活性を調節する量」とは、投与において、標的GABAAレセプターに活性調節因子の有効濃度をもたらすGABAAレセプター活性調節因子の量である。有効濃度は、実施例3に記載のアッセイにおいて3H-フルマゼニルの総特異的結合の統計的に有意な阻害をもたらすのに十分な濃度である(すなわち、常套のパラメトリック統計分析方法 、例えば、スチューデントT検定を用いて測定して、pは0.05以下)。
【００４７】
GABAAレセプター活性調節因子は、GABAAレセプターにおけるKiが1マイクロモル未満、好ましくは 100 ナノモル未満または10 ナノモル未満の場合「高アフィニティー」を有するといわれる。GABAAレセプターにおけるKi測定の代表的アッセイを実施例3に示す。Kiはアッセイに用いたレセプターサブタイプに依存し得ることが明らかである。言い換えると、高アフィニティー化合物は「サブタイプ-特異的」(すなわち、Kiが１つのサブタイプについて別のサブタイプと比べて少なくとも10-倍大きい)である。かかる化合物は、少なくとも１つのGABAAレセプターサブタイプについてのKiが上記基準値を満たすとGABAAレセプターについて高アフィニティーであるといわれる。
【００４８】
GABAAレセプター活性調節因子は、それがGABAAレセプターに、他の膜-結合型レセプターの結合についてのKiと比較して少なくとも10分の１小さい、好ましくは少なくとも 100分の１小さいKiにて結合する場合「高選択性」を有するといわれる。特に、化合物はGABAAレセプターにおけるよりも以下のレセプターにおいて少なくとも10-倍大きいKiを有するべきである:セロトニン、ドーパミン、ガラニン、VR1、C5a、MCH、NPY、CRF、ブラジキニンおよびタキキニン。その他のレセプターにおけるKiを測定するためのアッセイは標準的結合アッセイプロトコールを用いて行うことが出来、例えば、市販の膜レセプター結合アッセイ(例えば、MDS PHARMA SERVICES、Toronto、CanadaおよびCEREP、Redmond、WAから市販されている結合アッセイ)を用いるとよい。
【００４９】
「CNS障害」は、患者におけるGABAAレセプターの調節に応答する中枢神経系の疾患または症状である。かかる障害には、不安障害(例えば、パニック障害、強迫性障害、広場恐怖、対人恐怖、特定の恐怖症、情緒異常、適応障害、分離不安、気分循環症、および全般的不安障害)、ストレス障害(例えば、外傷後ストレス障害、予測的不安急性ストレス障害および急性ストレス障害)、抑鬱性障害(例えば、抑欝、非定型抑欝、双極性障害および双極性障害の抑欝相)、睡眠障害(例えば、一次性不眠、概日リズム睡眠障害、睡眠異常症NOS、睡眠時異常行動、例えば、悪夢障害、睡眠恐怖障害、抑欝に二次的な睡眠障害、不安および/またはその他の精神的障害および物質誘導性睡眠障害)、認知障害(例えば、認知機能障害、穏やかな認知障害(MCI)、加齢に関連する認知低下(ARCD)、統合失調症、外傷性脳損傷、ダウン症、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病および脳卒中)、AIDS-関連痴呆、抑欝関連痴呆、不安または精神病、注意欠陥障害(例えば、注意欠陥障害および注意欠陥および多動性障害)、痙攣性障害(例えば、てんかん)、ベンゾジアゼピン過量および薬物およびアルコール中毒が含まれる。
【００５０】
「CNS薬」は、CNS障害の治療または予防に用いられるあらゆる薬物をいう。CNS薬としては、例えば:セロトニンレセプター(例えば、5-HT1A)アゴニストおよびアンタゴニストおよび選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI);ニューロキニンレセプターアンタゴニスト; コルチコトロピン放出因子レセプター(CRF1)アンタゴニスト; メラトニンレセプターアゴニスト; ニコチン性アゴニスト; ムスカリン性薬; アセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびドーパミンレセプターアゴニストが挙げられる。
【００５１】
「患者」は本発明によって提供される化合物によって処置されるあらゆる個体をいう。患者にはヒトおよびその他の動物、例えば、コンパニオン・アニマルおよび家畜が含まれる。患者はCNS障害を患っているものでもよいし、かかる症状を有さないものでもよい(すなわち処置は予防的でもよい)。
【００５２】
アリール酸ピリミジニルメチルアミド、ピリダジニルメチルアミドおよび関連化合物
上記のように、本発明は、上記のような、式 Iの化合物であるGABAA レセプター活性調節因子、およびかかる化合物の医薬上許容される形態を提供する。式 Iの特定の化合物では、Arは、フェニルまたはピリジルであり、その各々が、R8から独立して選択される0から4の置換基で置換されている。特定の実施態様において、各々のR8は、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、モノ-およびジ-C1-C4アルキルアミノ、C2-C4アルカノイル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C2アルキル、C1-C2ハロアルキルおよびC1-C2ハロアルコキシから選択される。典型的なAr部分としては、例えば、フェニルおよび2-ピリジルが挙げられ、その各々は、クロロ、フルオロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、C1-C2アルキルアミノ、C1-C2ハロアルキルおよびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される0から3の置換基で置換されている。特定のかかる化合物において、Arは、フェニルまたは2-ピリジルであり、その各々は、フルオロおよびクロロから独立して選択される1、2または3の置換基で置換されている。かかる基として、例えば、2,6-ジフルオロフェニルおよび6-フルオロ-ピリド-2-イルが挙げられる。
【００５３】
式 Iの特定の化合物において、R4は、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、C1-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、C1-C8アルコキシ、C2-C8アルキルエーテル、またはモノ-またはジ-(C1-C8アルキル)アミノC0-C4アルキルである。典型的なR4基としては、例えば、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニルおよびC1-C6アルコキシが挙げられる。
【００５４】
本明細書で提供する特定の化合物において、各々のR1は以下から独立して選択される:
(a)水素およびハロゲン; および
(b)以下の式の基:
【化６】
2006517958.tif 000008
式中、
Gは、結合、-NH-、-N(RB)-、-O-または-C(=O)-である; および
RAおよびRBは独立して以下から選択される:
(i)水素; および
(ii)C1-C6アルキル、C2-C6アルケニルおよび(C3-C7シクロアルキル)C0-C2アルキル、それらは各々、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、C1-C2アルキルおよびC1-C2アルコキシから独立して選択される0から4の置換基で置換される。
【００５５】
典型的なR1基として、例えば、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C4アルカノイル、C1-C2ハロアルキル、C1-C2ハロアルコキシ、およびモノ-およびジ-(C1-C4アルキル)アミノが挙げられる。
【００５６】
本明細書で提供する特定の化合物において、R5およびR6は、両方とも水素である。
【００５７】
本明細書で提供する特定の化合物において、R7は、C3-C6アルキル、例えば、3-メチル-ブチル、イソブチルまたはn-ブチルである。
【００５８】
式 Iの特定の化合物において、可変部分(variables)X、YおよびZは、独立して窒素またはCR1である。かかる化合物において、示した基:
【化７】
2006517958.tif 000009
は、例えば、
【化８】
2006517958.tif 000010
、
【化９】
2006517958.tif 000011
または
【化１０】
2006517958.tif 000012
であり得、それらは、式II、IIIおよびIVの化合物を各々生じ、この場合、可変部分は上記の定義の通りである。
【化１１】
2006517958.tif 000013
【化１２】
2006517958.tif 000014
【化１３】
2006517958.tif 000015
【００５９】
式 IIの化合物において、X、YおよびZは、独立してCR1であり、ここで、各々のR1は、水素、ハロゲン、C1-C6アルキルおよびC1-C6アルコキシから独立して選択される; およびR4は、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである。
【００６０】
式 IIIの特定の化合物において、示した基:
【化１４】
2006517958.tif 000016
は、
【化１５】
2006517958.tif 000017
であり、ここで、R1aおよびR1bは、独立して水素、ハロゲン、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、C1-C6アルカノイルまたはC1-C6アルコキシである。例えば、かかる化合物としては、R1aがハロゲン、C1-C4アルキル、C1-C4アルカノイルまたはC1-C4アルコキシであり、R1bが水素、メチルまたはメトキシであり、そしてR4がC1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシであるものが挙げられる。
【００６１】
式 IVの特定の化合物において、示した基:
【化１６】
2006517958.tif 000018
は、
【化１７】
2006517958.tif 000019
であり、ここで、R1aおよびR1bは、独立して水素、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである。例えば、かかる化合物として、R1aが水素であり、R1bが水素、C1-C4アルキルおよびC1-C4アルコキシであり、そしてR4がC1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシであるものが挙げられる。
【００６２】
式 Iの他の化合物において、Yは、XまたはZと一体となって、縮合した複素環を形成する。かかる化合物において、示した基:
【化１８】
2006517958.tif 000020
は、例えば、
【化１９】
2006517958.tif 000021
、
【化２０】
2006517958.tif 000022
、
【化２１】
2006517958.tif 000023
、
【化２２】
2006517958.tif 000024
、
【化２３】
2006517958.tif 000025
、または
【化２４】
2006517958.tif 000026
であり得る。特定のかかる化合物において、R1は、独立して水素、ハロゲン、C1-C6アルキルおよびC1-C6アルコキシから選択される; および特定のかかる化合物において、R4は、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシである。
【００６３】
本発明によって提供される化合物は、標準的インビトロレセプター結合アッセイを用いて測定して、検出可能にGABAAレセプターに対するリガンド結合を変化させる(調節する）。本明細書において「GABAAレセプターリガンド結合アッセイ」とは実施例3に提供される標準的インビトロレセプター結合アッセイを意味する。簡単に説明すると、GABAAレセプター調製物が標識化(例えば、3H)リガンド、例えば、フルマゼニルおよび非標識被験化合物とともにインキュベートされる競合アッセイを行えばよい。GABAAレセプターに対するリガンド結合を検出可能に調節する化合物とのインキュベーションの結果、GABAAレセプター調製物へ結合した標識の量が、化合物の非存在下で結合した標識の量と比較して増減する。好ましくは、かかる化合物はGABAAレセプターにおけるKiが1マイクロモル未満、より好ましくは500 nM未満、100 nM未満、20 nM未満または10 nM未満である。インビトロ結合の判定に用いるGABAAレセプターは様々な起源から得られ、例えばラット皮質調製物から、またはクローニングされたヒトGABAAレセプターを発現する細胞から得られる。
【００６４】
ある態様において、好ましい化合物は有利な薬理特性を有し、例えば、経口バイオアベイラビリティー(したがって、致死量以下または好ましくは医薬上許容される経口用量、好ましくは2グラム未満、より好ましくは1g以下または200 mgによって、検出可能なインビボ効果が得られる)、低毒性(好ましい化合物は、GABAAレセプター活性を調節する量を対象に投与した場合、非毒性である)、最小の副作用(好ましい化合物はGABAAレセプター活性を調節する量の化合物を対象に投与した場合、プラセボど同様の副作用しか示さない)、低血清タンパク質結合、および好適なインビトロおよびインビボ半減期(好ましい化合物はインビボ半減期と同じインビトロ半減期を示し、１日４回投与、好ましくは１日３回投与、より好ましくは１日２回投与、もっとも好ましくは１日１回投与が可能である)が挙げられる。体内における補体活性部位への分布も望ましい(例えば、CNS障害の治療に用いる化合物は、好ましくは血液脳関門を透化するが、末梢障害の治療に使用する化合物の脳レベルは低いのが、典型的には好ましい)。
【００６５】
当該技術分野において周知のルーチンアッセイを用いてこれらの特性を評価し、特定の用途に好適な化合物を同定すればよい。例えば、バイオアベイラビリティーの予測に使用されるアッセイには、ヒト腸細胞単層、例えば、Caco-2細胞単層を横切る輸送が挙げられる。ヒトにおける化合物の血液脳関門の透化は化合物を(例えば、静脈内に)投与された実験動物における化合物の脳レベルから予測できる。血清タンパク質結合は例えば、 Oravcova、et al. (1996) Journal of Chromatography B 677:1-27に記載のアルブミン結合アッセイから予測できる。化合物の半減期は有効量を達成するのに必要な化合物の用量の頻度に逆比例する。化合物のインビトロ半減期はKuhnz and Gieschen (1998) Drug Metabolism and Disposition 26:1120-27に記載のミクロソーム半減期アッセイから予測できる。
【００６６】
上記のように、本発明によって提供される好ましい化合物は非毒性である。一般に、本明細書において用いる「非毒性」の語は、相対的な意味で解釈され、United States Food and Drug Administration (「FDA」)によって哺乳類(好ましくはヒト)への投与が認可されたあらゆる物質または、確立した基準をふまえて、哺乳類(好ましくはヒト)への投与がFDAによって認可されそうなあらゆる物質をいう。さらに、非常に好ましい非毒性の化合物は一般に以下の基準の１または複数を満たす: (1)細胞のATP産生を実質的に阻害しない; (2)心臓のQT間隔を実質的に長くしない; (3)実質的に肝腫大を引き起こさない、そして(4)肝臓の酵素の実質的な放出を引き起こさない。
【００６７】
本明細書において用いる、「細胞のATP産生を実質的に阻害しない」化合物は、本明細書の実施例5に示す基準を満たす化合物である。換言すると、実施例5に記載のように100μMのかかる化合物で処置した細胞は、非処置細胞において検出されるATPレベルの少なくとも50%のATPレベルを示す。さらに好ましい態様において、かかる細胞は非処置細胞において検出されるATPレベルの少なくとも80%のATPレベルを示す。
【００６８】
「心臓のQT間隔を実質的に長くしない」化合物は治療的なインビボ有効濃度をもたらす最小用量の２倍投与した際に、モルモット、ミニブタまたはイヌにおける心臓のQT間隔 (心電図記録法によって測定して)の統計的に有意な延長を導かない化合物である。特定の好ましい態様において、非経口または経口投与した用量、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、40 または50 mg/kg は統計的に有意な心臓のQT間隔の延長を導かない。「統計的に有意な」とは、統計的有意性の標準的パラメトリックアッセイ、例えば、スチューデントT検定を用いて測定して、p<0.1レベルまたはより好ましくはp<0.05 レベルの有意性においてコントロールと異なる結果を意味する。
【００６９】
「実質的に肝腫大を引き起こさない」化合物は、実験用げっ歯類(例えば、マウスまたはラット）を5-10日間毎日治療的インビボ有効濃度をもたらす最小用量の２倍で治療した場合に、対応対照を超えて100%を超える体重に対する肝臓の比の上昇をもたらさないことをいう。さらに好ましい態様においてかかる用量は対応対照の75% または50%を超えて肝腫大を引き起こさない。非げっ歯類哺乳類(例えばイヌ)を用いる場合、かかる用量は非処置対応対照より50%以下、好ましくは25%以下、より好ましくは10%以下の体重に対する肝臓の比の上昇をももたらすべきでない。かかるアッセイにおける好ましい用量は、例えば、0.01、0.05. 0.1、0.5、1、5、10、40 または50 mg/kgの非経口または経口投与である。
【００７０】
同様に、「肝臓の酵素の実質的な放出を引き起こさない」化合物は、治療的に有効なインビボ濃度をもたらす最小用量の２倍を投与した場合に、実験用げっ歯類において、対応偽処置対照を超えてさらにその100%を超えるALT、LDHまたはASTの血清レベルにまで上昇させないものである。より好ましい態様において、かかる用量はそのような血清レベルを対応対照を超えてさらにその75%または50%を超えて上昇させない。あるいは、「肝臓の酵素の実質的な放出を引き起こさない」化合物は、化合物のインビボ最小治療的濃度の２倍に匹敵する濃度でのインビトロ肝細胞アッセイにおいて(インビトロで肝細胞と接触されるとともにインキュベートされる培地またはその他の溶液中)、対応偽処置対照細胞からの培地にみられるベースラインレベルを超えて培地中へかかる肝臓の酵素を検出可能に放出しないものである。さらに好ましい態様において、化合物の最小インビボ治療濃度の５倍、好ましくは１０倍の濃度の化合物を用いた場合にもベースラインレベルを超える培地へのかかる肝臓の酵素の検出可能な放出を導かない。
【００７１】
別の態様において、特定の好ましい化合物は治療的に有効なインビボ最小濃度に匹敵する濃度にてミクロソームチトクロームP450酵素活性、例えば、CYP1A2活性、CYP2A6活性、CYP2C9活性、CYP2C19活性、CYP2D6活性、CYP2E1活性またはCYP3A4活性を増減させない。
【００７２】
特定の好ましい化合物は治療的に有効なインビボ最小濃度に匹敵する濃度においては染色体異常誘発性でも突然変異原性でもない（例えば、標準的アッセイ 、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞ビトロ微小核アッセイ、マウスリンパ腫アッセイ、ヒトリンパ球染色体異常アッセイ、げっ歯類骨髄微小核アッセイ、エイムス試験などを用いて判定して)。別の態様において、特定の好ましい化合物はかかる濃度において、娘染色分体交換(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞において)を誘導しない。
【００７３】
検出の目的で、以下に詳細に説明するように、本発明によって提供される化合物は同位体標識または放射標識してもよい。かかる化合物は上記のものと以下の点を除いては同一である：１または複数の原子が通常天然にみられる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子によって置換されている。本発明によって提供される化合物に導入可能な同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素 および塩素の同位体、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌが挙げられる。さらに、重い同位体、例えば、重水素(すなわち、２Ｈ)による置換により、代謝安定性が大きいことによるいくらかの治療上の利点が得られる。例えば、インビボ半減期の上昇または要求用量の減少が得られ、したがってある状況では好ましい。
【００７４】
上記のように、異なる立体異性体形態、例えば、ラセミ体および光学活性な形態が本発明に含まれる。ある態様において、単一のエナンチオマー(すなわち、光学的に活性な形態)を得るのが望ましいであろう。単一のエナンチオマーを調製する標準的方法には、不斉合成およびラセミ体の分割が含まれる。ラセミ体の分割は常套方法、例えば、分割剤の存在下での結晶化、または例えばキラルHPLCカラムを用いるクロマトグラフィーによって達成され得る。
【００７５】
医薬組成物
本発明はまた、少なくとも１つの生理的に許容される担体または賦形剤とともに少なくとも１つの本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子を含む医薬組成物も提供する。かかる化合物はGABAAレセプター調節が望ましい患者(例えば、健忘症の導入によって利益を受ける痛い手順を経ている患者、不安、抑欝、睡眠障害または認知障害の患者)の治療に利用できる。医薬組成物は、例えば以下を含んでいてもよい：水、緩衝液(例えば、中性緩衝液食塩水またはリン酸衝液食塩水）、エタノール、鉱油、植物油、ジメチルスルホキシド、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、アジュバント、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、抗酸化剤、キレート化剤、例えば、EDTAまたはグルタチオンおよび/または保存料。好ましい医薬組成物はヒトまたはその他の動物(例えば、ペット、例えば、イヌまたはネコ)への経口送達用に製剤される。所望の場合、その他の活性成分、例えば、さらなるCNS-作用薬を含めてもよい。
【００７６】
医薬組成物はいかなる投与様式のために製剤してもよく、投与様式としては、例えば、局所、経口、経鼻、直腸または非経口投与が挙げられる。本明細書において用いる非経口の語には、皮下、皮内、血管内(例えば、静脈内)、筋肉内、脊髄、頭蓋内、くも膜下腔内および腹腔内注射、および類似の注射または注入技術が含まれる。ある態様において、経口使用に適した形態の組成物が好ましい。かかる形態としては、例えば、錠剤、トローチ剤、薬用キャンデー、水性または油性懸濁液、分散可能な散剤または顆粒剤、乳濁液、硬または軟カプセルまたはシロップまたはエリキシル剤が挙げられる。さらに別の態様において、本発明の組成物は凍結乾燥物として製剤してもよい。
【００７７】
経口使用のための組成物はさらに１または複数の成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、例えば、魅力的でおいしい製剤を提供するための甘味料、香味剤、着色料および保存料が挙げられる。錠剤は、錠剤の製造に好適な生理的に許容される賦形剤と混合して活性成分を含む。かかる賦形剤としては、例えば、不活性希釈剤(例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム)、顆粒化剤および崩壊剤(例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）、結合剤(例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア)および滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）が挙げられる。錠剤はコーティングしていなくてもよいし公知技術によってコーティングして、消化管における崩壊および吸収を遅らせ、長期にわたる徐放作用を提供してもよい。例えば、徐放性材料、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを用いればよい。
【００７８】
経口使用のための製剤は、硬ゼラチンカプセルとして提供してもよく（ここで、活性成分は不活性固体希釈剤(例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン)と混合される）、または軟ゼラチンカプセルとして提供してもよい（ここで活性成分は水または油性媒体(例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油)と混合される）。
【００７９】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した１または複数の賦形剤と混合して活性物質を含む。かかる賦形剤としては、懸濁剤(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴム);および分散剤または湿潤剤(例えば、天然のリン脂質、例えば、レシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアラート、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、エチレンオキシドと脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、またはエチレンオキシドと脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアート)が挙げられる。水性懸濁液は１または複数の保存料、例えばエチル、またはn-プロピルp-ヒドロキシ安息香酸、１または複数の着色剤、１または複数の香味剤、および１または複数の甘味料、例えば、スクロースまたはサッカリンを含んでいてもよい。
【００８０】
油性懸濁液は活性成分を植物油(例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油)または鉱油、例えば、流動パラフィン中に懸濁させることによって製剤することが出来る。油性懸濁液は増粘剤 、例えば、蜜蝋、硬パラフィンまたはセチルアルコールを含んでいてもよい。甘味料、例えば、上記のもの、および/または香味料を添加しておいしい経口調製物を提供してもよい。かかる懸濁液は、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸の添加によって保存することが出来る。
【００８１】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散可能な散剤および顆粒剤は分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１または複数の保存料と組み合わせて活性成分を提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は既に述べたとおりである。さらなる賦形剤、例えば、甘味料、香味料および着色料も含めてもよい。
【００８２】
医薬組成物は水中油型乳剤の形態であってもよい。油性相は、植物油(例えば、オリーブ油またはラッカセイ油)または鉱油(例えば、流動パラフィン)またはそれらの混合物とすればよい。好適な乳化剤は天然ゴム(例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴム)、天然リン脂質(例えば、ダイズ、レシチン、および脂肪酸とヘキシトール由来のエステルまたは部分エステル)、無水物(例えば、ソルビタンモノオレアート)および脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)である。乳濁液は甘味料および/または香味料を含んでいてもよい。
【００８３】
シロップおよびエリキシル剤は甘味料、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースとともに製剤すればよい。かかる製剤は１または複数の保護剤、保存料、香味料および/または着色料を含んでいてもよい。
【００８４】
医薬組成物は無菌注射可能水性または油性懸濁液として調製してもよい。化合物は、使用する媒体および濃度に応じて、媒体中に懸濁しても溶解してもよい。かかる組成物は好適な分散剤、湿潤剤および/または懸濁剤、例えば、上記のものを用いて公知方法により製剤すればよい。使用できる許容される媒体および溶媒は、水、1,3-ブタンジオール、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の、不揮発性油も溶媒または懸濁媒体として用いることが出来る。この目的のためにあらゆる無菌不揮発性油を用いてもよく、例えば、合成モノ−またはジグリセリドが挙げられる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸は注射可能組成物の調製に有用であり、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、保存料および/または緩衝剤を媒体に溶解させてもよい。
【００８５】
医薬組成物は坐薬形態に調製してもよい(例えば、直腸投与用)。かかる組成物は薬剤を常温では固体であるが直腸温度では液体となる好適な非刺激賦形剤と混合することにより調製することが出来、それゆえ直腸で融解して薬剤が放出される。好適な賦形剤としては、例えば、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８６】
非ヒト動物への投与のために、組成物は動物飼料または飲料水に添加してもよい。動物飼料および飲料水組成物を製剤して、動物が適当な量の組成物を食事と共に摂取するのが便宜である。飼料または飲料水への添加用のプレミックスとして組成物を提供するのもまた便宜である。
【００８７】
医薬組成物は徐放性製剤(すなわち、例えば投与後に化合物のゆっくりした放出を可能にするカプセルなどの製剤)として製剤してもよい。かかる製剤は周知技術により一般に調製でき、例えば、経口、直腸または皮下埋め込み、または所望の標的部位への埋め込みにて投与できる。かかる製剤に用いる担体は生体適合性であり、生分解性のものがよい。好ましくは製剤は比較的一定なレベルの活性化合物の放出を提供する。徐放性製剤に含まれる化合物の量は、埋め込み部位、放出速度および予想放出時間ならびに治療または予防される症状の性質に依存する。
【００８８】
本発明によって提供される化合物は一般的に治療上有効量において医薬組成物中に存在する。治療上有効量は、識別可能に患者に利益、例えば、CNS障害の症状の減少をもたらす量である。好ましい濃度は、GABAAレセプターリガンドのGABAAレセプターに対する結合をインビトロで阻害するのに十分な濃度である。用量レベル範囲、約0.1 mg〜約 140 mg／体重kg／日をもたらす組成物が好ましい(約 0.5 mg〜約 7 g／ヒト患者／日)。単一用量形態をもたらす担体物質と組み合わされ得る活性成分の量は治療対象および特定の投与態様に応じて異なる。用量単位形態は一般的に活性成分を約 1 mg 〜 約 500 mg含む。しかし、特定の患者にとっての最適用量は様々な因子に依存することが理解されるであろう。かかる因子としては、使用する特定の化合物の活性; 患者の年齢、体重、全般的健康、性別および食事;投与時期と経路;排出速度;同時治療、例えば、併用薬剤;および治療を受ける特定の疾患のタイプおよび重症度が挙げられる。最適用量は、ルーチン試験および当該技術分野において周知の手順を用いて決定できる。
【００８９】
医薬組成物はCNS障害、例えば、不安、抑欝、睡眠障害、注意欠陥障害またはアルツハイマー痴呆の治療用にパッケージ化してもよい。パッケージ化医薬調製物は、本明細書に記載する治療上有効量の少なくとも１つの化合物を含む容器と、含まれる組成物がCNS障害の治療用であることを示す指示書(例えばラベル)を含む。
【００９０】
使用方法
特定の態様において、本発明はCNS障害の進行の阻害方法を提供する。換言すると、本発明によって提供される治療方法は既存の障害の治療、あるいはCNS障害が検出されない患者におけるかかる障害の予防、重症度の軽減または発症の遅延に用いられる。CNS障害は以下に詳細に説明するが、当該技術分野において確立された基準を用いて診断およびモニターすることが出来る。あるいは、またはさらに、本発明によって提供される化合物は短期記憶の向上のための患者に投与してもよい。患者には、ヒト、飼いならしたコンパニオン・アニマル(ペット、例えば、イヌ)および家畜が含まれ、用量および用法は上記の通りである。
【００９１】
投与頻度は使用する化合物および治療または予防すべき特定の疾患に依存する。一般に、ほとんどの障害の治療において、用法・用量は１日4回またはそれ未満が好ましい。睡眠障害の治療には、迅速に有効濃度に達する一回用量が望ましい。患者は一般的に当業者に周知の治療または予防すべき症状に好適なアッセイを用いて治療有効性がモニターされる。
【００９２】
好ましい態様において、本発明によって提供される化合物はかかる治療を必要とする患者の治療に用いられる。一般に、かかる患者はGABAAレセプター活性を調節する量の式Iの化合物(またはその医薬上許容される形態)で、好ましくはCNS障害の１または複数の症状を変化させるのに十分な量で治療される。α2β3γ2およびα3β3γ2 レセプターサブタイプにおいてアゴニストとして作用する化合物は特に不安障害、ストレス障害の治療に有用である。不安障害としては、例えば、パニック障害、強迫性障害および全般的不安障害が挙げられ; ストレス障害としては、外傷後ストレス、および急性ストレス障害が挙げられる。α2β3γ2およびα3β3γ2レセプターサブタイプにおいてアゴニストとして作用する化合物は抑鬱性または双極性障害、統合失調症および睡眠障害の治療に有用であり、加齢に関連する認知低下およびアルツハイマー病の治療にも有用であり得る。α5β3γ2レセプターサブタイプまたはα1β2γ2およびα5β3γ2 レセプターサブタイプにおいてインバースアゴニストとして作用する化合物は認知障害の治療に特に有用であり、例えば以下に起因する認知障害が挙げられる：ダウン症、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病、および脳卒中関連痴呆。α5β3γ2レセプターサブタイプにおいてインバースアゴニストとして作用する化合物は特に記憶障害患者において記憶増強、特に短期記憶の増強を介する認知障害の治療に有用である; α5β3γ2レセプターサブタイプにおいてアゴニストとして作用する化合物は特に健忘症の誘導に有用である。α1β2γ2レセプターサブタイプにおいてアゴニストとして作用する化合物は、痙攣性障害、例えば、てんかんの治療に有用である。ベンゾジアゼピン部位においてアンタゴニストとして作用する化合物はベンゾジアゼピン過量の効果に対抗することおよび薬物およびアルコール中毒の治療に有用である。
【００９３】
本発明によって提供される化合物および組成物を用いて治療され得るCNS障害には以下が含まれる:
抑欝、例えば、抑欝、非定型抑欝、双極性障害、双極性障害の抑欝相。
不安、例えば、一般的不安障害(GAD)、広場恐怖、パニック障害+/-広場恐怖、対人恐怖、特定の恐怖症、外傷後ストレス障害、強迫性障害(OCD)、情緒異常、気分障害および不安を伴う適応障害、分離不安障害、予測的不安急性ストレス障害、適応障害、気分循環症。
睡眠障害、例えば、睡眠障害、例えば、一次性不眠、概日リズム睡眠障害、睡眠異常症NOS、睡眠時異常行動、例えば、悪夢障害、睡眠恐怖障害、抑欝および/または不安またはその他の精神障害に伴う睡眠障害、薬物誘導性睡眠障害。
認知機能障害、例えば、認知機能障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、穏やかな認知障害(MCI)、加齢に関連する認知低下(ARCD)、脳卒中、外傷性脳損傷、AIDS関連痴呆および抑欝、不安および精神病(例えば、統合失調症および幻覚障害) 関連痴呆。
注意欠陥障害、例えば、注意欠陥障害(ADD)、および注意欠陥および多動性障害(ADHD)。
言語障害、例えば、運動チック、間代性どもり、流ちょう性不全、話詰まり、構語障害、トゥレット症候群および表語障害（logospasm）。
【００９４】
本発明によって提供される化合物および組成物は患者における短期記憶(作業記憶)の向上にも利用できる。短期記憶障害を改善する治療上有効量の化合物は短期記憶機能のいずれかの標準的試験における統計的に有意な向上をもたらすのに十分な量である。例えば前方数字スパンおよび連続経路学習などの試験が挙げられる。例えば、かかる試験は患者が言葉や文字を反復できる能力を評価するように設計してもよいし、あるいは、より完全な神経生理学的評価を用いて短期記憶機能を評価してもよい。短期記憶を向上するために治療される患者は、記憶機能障害と診断されたものやかかる機能障害が進行しやすいと考えられているものであってもよいし、そうでなくてもよい。
【００９５】
別の態様において、本発明は別のCNS薬の効果(または治療効果)を増強する方法も提供する。かかる方法は本発明によって提供されるGABAAレセプター活性を調節する量の化合物を別のCNS薬と組み合わせて投与することを含む。かかるCNS薬としては、これらに限定されないが以下が含まれる:不安については、セロトニンレセプター (例えば、5-HT1A)アゴニストおよびアンタゴニスト;不安と抑欝については、ニューロキニンレセプターアンタゴニストまたはコルチコトロピン放出因子レセプター (CRF1)アンタゴニスト;睡眠障害については、メラトニンレセプターアゴニスト;そして神経変性障害、例えば、アルツハイマー痴呆については、ニコチン性アゴニスト、ムスカリン性薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびドーパミンレセプターアゴニスト。ある態様において、本発明は、本発明によって提供される有効量のGABAアゴニスト化合物をSSRIと組み合わせて投与することによる、選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)の抗うつ活性の増強方法も提供する。化合物の有効量は、その他のCNS薬のみによって治療した患者と比較して患者の症状に検出可能な変化が起こるのに十分な量である。併合投与は周知技術を用いて行うことが出来る。(例えば以下に記載： Da-Rocha、et al. (1997) J. Psychopharmacology 11(3):211-218; Smith、et al. (1998) Am. J. Psychiatry 155(10):1339-45;および Le、et al. (1996) Alcohol and Alcoholism 31(suppl.):127-132、PCT国際公開WO 99/47142; WO 99/47171; WO 99/47131 および WO 99/37303）。
【００９６】
本発明はまた、ベンゾジアゼピン化合物(すなわち、ベンゾジアゼピン環構造を含む化合物）、例えば、RO15-1788またはGABA、のGABAAレセプターへの結合の阻害方法も含む。かかる方法は、GABAAレセプター活性を調節する量の本発明によって提供される化合物とGABAAレセプターを発現する細胞を接触させることを含む。この方法にはこれに限定されないが、ベンゾジアゼピン化合物のGABAAレセプターへの結合のインビボでの阻害も含まれる(例えば、ベンゾジアゼピン化合物またはGABAの、GABAAレセプターへの結合をインビトロで阻害するのに十分な量の本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子を与えられた患者において)。一つの態様において、かかる方法はベンゾジアゼピン薬物過量の治療に有用である。ベンゾジアゼピン化合物の、GABAAレセプターへの結合を阻害するのに十分な量のGABAAレセプター活性調節因子は、実施例3に記載のGABAAレセプター結合アッセイを介して容易に判定できる。
【００９７】
別の態様において、本発明は本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子についての様々なインビトロ使用を提供する。例えば、かかる化合物はサンプル、例えば、組織切片におけるGABAAレセプターの検出および局在化用のプローブとして利用できる。また、レセプター活性についてのアッセイにおける陽性対照として、GABAAレセプターに結合する候補薬の結合能力を判定するための標準および試薬として、またはポジトロン放出断層撮影(PET)のためのあるいは単一光子放出CTスキャン(SPECT)のための放射性トレーサーとして利用できる。かかるアッセイを用いて生体におけるGABAAレセプターを特徴づけることが出来る。かかる化合物はGABAAレセプターに対する候補薬の結合能力の判定における標準および試薬としても有用である。
【００９８】
サンプルにおけるGABAAレセプターの存在または不在を判定する方法において、サンプルは、GABAAレセプター活性調節因子の、GABAAレセプターへの結合を可能とする条件下で本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子とともにインキュベートされ得る。サンプルにおけるGABAAレセプターに結合したGABAAレセプター活性調節因子の量が検出される。例えば、GABAAレセプター活性調節因子は様々な周知技術によって標識でき(例えば、放射性核種、例えば本明細書に記載するように、トリチウムによる放射性標識)、サンプル(例えば、培養細胞調製物、組織調製物またはその画分)とインキュベートされる。好適なインキュベーション時間は一般的にある期間にわたっておこる結合レベルをアッセイすることによって判定し得る。インキュベーションの後、結合しなかった化合物を除き、結合した化合物を用いた標識に好適な方法を用いて検出する(例えば、放射標識化合物についてはオートラジオグラフィーまたはシンチレーションカウンター;分光法も発光基および蛍光基の検出に用いることが出来る)。コントロールとして、同じサンプルを同時に、放射標識化合物およびより多量の非標識化合物と接触させるとよい。非結合標識化化合物および非標識化合物を同様にして除き、結合標識を検出する。コントロールと比較して被験サンプルにおける検出可能な標識の量が多ければサンプルにおけるGABAAレセプターの存在が示される。検出アッセイ、例えば、培養細胞または組織サンプルにおけるGABAAレセプターのレセプターオートラジオグラフィー(レセプターマッピング)を Kuhar、Current Protocols in Pharmacology (1998) John Wiley & Sons、New York の8.1.1 〜 8.1.9 に記載のように行ってもよい。
【００９９】
例えば、本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子を用いて細胞または組織サンプルにおけるGABAAレセプターを検出してもよい。これは複数の同一の細胞または組織サンプルを調製することによって行い、少なくともその１つは実験サンプルとして、少なくともその１つはコントロールサンプルとして調製する。実験サンプルは少なくとも１つの同一の細胞または組織サンプル（これは以前に本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子と接触されたことがない）と実験溶液（これは検出可能に標識した選択したGABAAレセプター活性調節因子調製物を最初に測定したモル濃度にて含む）を（RO15-1788の細胞および組織サンプル中のGABAAレセプターへの結合を可能とする条件下で）接触させることによって調製する。コントロールサンプルは実験サンプルど同様に調製し、同一の化合物のより高モル濃度の非標識調製物を含む。
【０１００】
実験およびコントロールサンプルを次いで洗浄して未結合の検出可能に標識した化合物を除去する。結合したままの検出可能に標識した化合物の量を測定し、実験およびコントロールサンプルにおける検出可能に標識した化合物の量を比較する。コントロールサンプルよりも洗浄した実験サンプルにおける検出可能な標識の検出量が多ければ、実験サンプルにおけるGABAAレセプターの存在が示される。
【０１０１】
この方法に用いられる検出可能に標識したGABAAレセプター活性調節因子は放射性標識によって標識してもよいし直接または間接に発光標識してもよい。組織切片をこの方法に用い、標識が放射性標識である場合、結合した標識化合物をオートラジオグラフィーで検出することが出来る。
【０１０２】
本発明によって提供される化合物は、様々な周知の細胞培養および細胞分離方法において用いることも出来る。例えば、化合物を組織培養プレートまたはその他の細胞培養支持体の内面に結合させて、GABAAレセプター-発現細胞をスクリーニング、アッセイおよび培養のために固定化してもよい。かかる結合は好適な技術、例えば、上記方法およびその他の標準的技術によって行うことが出来る。化合物をインビトロでの細胞同定およびソーティングのために用いてもよく、GABAAレセプター発現細胞の選抜が可能となる。好ましくは、かかる方法に用いる化合物は本明細書に記載するように標識する。１つの好ましい態様において、蛍光マーカー、例えば、フルオレセインと結合させた化合物を細胞と接触させ、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によって分析する。
【０１０３】
その他の態様において、リガンドの、GABAAレセプターへの結合をインビトロまたはインビボで調節する方法が提供され、これは、GABAAレセプターを十分な量の本発明によって提供されるGABAAレセプター活性調節因子と、レセプターに対するリガンドの結合に好適な条件下で接触させることを含む。GABAAレセプターは溶液、培養または単離細胞調製物または患者中に存在するものであってよい。好ましくは、GABAAレセプターは哺乳類の脳に存在する。一般に、レセプターと接触させる化合物の量は、例えば、実施例3に記載の結合アッセイにおいてGABAAレセプターに対するリガンド結合をインビトロで調節するのに十分な量とすべきである。
【０１０４】
本発明によって、細胞GABAAレセプターのシグナル伝達活性(特に、クロライドイオンコンダクタンス)を変化させる方法も提供され、これはGABAAレセプターをインビトロまたはインビボで、十分な量の上記化合物と、レセプターに対するフルマゼニルの結合に好適な条件下で接触させることによる。GABAAレセプターは、溶液、培養または単離細胞または細胞膜調製物または患者におけるものであってよく、化合物の量はGABAAレセプターのシグナル伝達活性をインビトロで変化させるのに十分な量とすればよい。ある態様において、レセプターと接触させる化合物の量は、例えば、実施例3に記載の結合アッセイにおいてGABAAレセプターに対するフルマゼニル結合をインビトロで調節するのに十分な量とすべきである。シグナル伝達活性に対する効果は標準的技術を用いて細胞の電気生理における変化として測定すればよい。GABAAレセプターのシグナル伝達活性を変化させるのに十分な化合物の量は、例えば、実施例4に記載のアッセイなどのGABAAレセプターシグナル伝達アッセイを用いて決定すればよい。インビボでGABAレセプターを発現する細胞としては、これらに限定されないが、神経細胞または脳細胞が挙げられる。かかる細胞を化合物を含む体液、例えば脳脊髄液との接触を介して本発明の化合物と接触させるとよい。細胞におけるインビトロのGABAAレセプターのシグナル伝達活性の変化は、細胞をGABAの存在下で本発明の化合物と接触させた場合のGABAAレセプター発現細胞の電気生理の検出可能な変化から測定することが出来る。
【０１０５】
細胞内記録またはパッチクランプ記録を用いて細胞における電気生理の変化を定量することが出来る。本発明の化合物を与えた動物の挙動における再現性のある変化もまたGABAAレセプターを発現する動物細胞の電気生理における変化が起こったことを示すと考えられ得る。
【０１０６】
化合物の調製
本発明によって提供される化合物は一般的に標準的合成方法を用いて調製できる。出発物質は一般的に市販源、例えば、Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis、MO)から容易に入手でき、本明細書に記載するように調製することも出来る。本明細書で提供する化合物の調製に好適な代表的手順を以下のスキーム1-8に概説する。これは本発明の範囲または精神の限定として、特定の試薬およびその条件を構成するものではない。当業者であれば、試薬および条件は改変でき、さらなる工程を用いて本発明の化合物を作ることが出来ることを認識するであろう。ある場合には、反応性官能基の保護が所望の変換の達成に必要であり得る。一般に、かかる保護基の必要性、およびかかる基を結合および除去するのに必要な条件は、有機合成の当業者に明らかであろう。以下のスキームにおいて特に断りのない限り、可変部は式Iに定義したとおりである。
【０１０７】
スキーム1-6および実施例に用いる略語は以下の通り:
BF3-Et2O  トリフルオロボランエーテル化合物
Bu  ブチル
CDCl3  重水素化クロロホルム
δ  化学シフト
DCM  ジクロロメタン
DMAP  N,N-ジメチルアミノピリジン
DME  エチレングリコールジメチルエーテル
DMF  N,N-ジメチルホルムアミド
EDCI  1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド ハイドロクロライド
Et3N  トリエチルアミン
EtOAc  酢酸エチル
ETOH  エタノール
HOAc  酢酸
HPLC  高速液体クロマトグラフィー
H1 NMR  プロトン核磁気共鳴
LiAlH4  水素化アルミニウムリチウム
LC-MS  液体クロマトグラフィー／質量分析
M-CPBA  m-クロロペルオキシ安息香酸
MS  質量分析
(M+1)  質量+1
NaOEt  ナトリウムエトキシド
Pd/C  パラジウム炭素触媒
Pd(PPh3)4  テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム (0)
Pd2(dba)3  トリス(ジベンジリジンアセトン)ジパラジウム (0)
PrI  プロピルヨウ素
R.T.  室温
SOCl2  塩化チオニル
(t-Bu)3P  トリ-t-ブチルリン酸塩
THF  テトラヒドロフラン
TLC  薄層クロマトグラフィー
【０１０８】
【化２５】
2006517958.tif 000027
スキーム 1は、選択した式9の化合物までの経路を示す。2.5 当量のナトリウムアルコキシドとジクロロピリダジンエステル 1との反応は、ジアルコキシ化合物 2(工程 1)を生ずる。1 当量ナトリウムアルコキシドとジクロロピリダジンエステル 1との反応は、モノアルコキシド 3 (工程 2)を生ずる。SuzukiまたはStilleカップリング条件での、適当な ボロン酸またはスズ試薬によるモノアルコキシド 3の処理は、式 4の化合物を生ずる(工程 3)。ボロン酸またはスズ試薬中のR2基は、アルキル、アルケニル、アリール、および複素環基を含む種々の基から選択され得る。化合物 4中のエステル基は、適当な還元剤で還元され、アルコール 5(工程 4)を生ずる。4の特定の性質により、より強いまたはより弱い還元剤が選択され、工程 4の反応を促進し得る。塩化チオニルは、アルコール 5を塩化物6(工程 5)に変換し、それが、CH3CN中のアミンと反応し、化合物 7(工程 6)を生ずる。適当な塩化アシルまたは酸による7のアシル化は、化合物 9(工程 8)を生ずる。その他に、式 9の化合物は、SuzukiまたはStilleカップリングおよびアシル化を介して式 8の化合物から調製され得る(工程 7 および 8)。
【０１０９】
【化２６】
2006517958.tif 000028
スキーム 2は、式 14の化合物を調製するための方法を示す。1と適当なボロン酸またはスズ試薬とのSuzukiまたはStilleカップリングは、工程 1において中間体 10を生ずる。式 10の化合物は、ボロン酸またはスズ試薬による二番目のSuzukiまたはStilleカップリングを介し式 11に変換される(工程 2)。望ましいR4基が、工程 2のカップリング反応により直接導入され得ない場合においては、更なる官能基変換が、工程 2のカップリング反応後に用いられる。一般的に、かかる変換は、有機合成の当業者にとっては明かである。11の還元、その後の塩化チオニル処理は、式 12の化合物を生ずる。式 12の化合物は、アミンと反応し、その後、アシル化(工程 4および5)し、14を生ずる。
【０１１０】
【化２７】
2006517958.tif 000029
スキーム 3は、式 24および25の化合物を調製するためのその他の方法を示す。ピリダジン前駆体ケトン酸 17は、アルキル化および脱炭酸反応(工程 1および2)を介し15から調製される。17は、ヒドラジンと反応し(工程 3)、その後、酢酸中の臭素で芳香族化(工程 4)し、ヒドロキシピリダジン 19を生ずる。19は、POCl3と反応し、クロロピリダジン 20 を生ずる(工程 5)。mCPBAによる20のN-酸化は、21を生じ(工程 6)、それは、POCl3による処理においてクロロメチルピリダジン22に変換される(工程 7)。アミン置換、その後のアシル化 (工程 8および9)は、式 24の化合物を生ずる。化合物 25は、クロロピリダジン 24の還元から調製される(工程 10)。
【０１１１】
【化２８】
2006517958.tif 000030
スキーム 4は、式 28、27および30の化合物を調製するための方法を示す。ヒドラジンによるクロロピリダジン 24の処理、その後の、カルボン酸によるトリアゾール形成は、[1,2,4]トリアゾロ[4,3-b]ピリダジン 27を生ずる(工程 1および2)。化合物 28は、ビニルスズ試薬によるパラジウムカップリング処理、その後の加水分解を介し24から調製される(工程 3)。ホルムアミドおよびギ酸によるアセチルピリダジン 28の処理、その後の、POCl3による処理における環化は、イミダゾ[1,5-b]ピリダジン 30を生ずる(工程 4および5)。
【０１１２】
【化２９】
2006517958.tif 000031
【化３０】
2006517958.tif 000032
スキーム 5、6および7は、式 43の化合物の合成を示す。適当なヨウ化アルキルによるアセト酢酸メチル 31のアルキル化は、32を生じ(工程 1)、それは、ナトリウムエトキシドの存在下、チオ尿素と反応し、33を生ずる(工程 2)。34への33の変換は、クロロ酢酸と共に33を還流することによって達成される(工程 3)。ピリミジン-2,4-ジオン 34は、POCl3で処理され、2,4-ジクロロピリミジン 35を生じ(工程 4)、それは、Pd/Cの存在下、酢酸エチル中で水素化され、36、37および38の分離可能な混合物を生ずる(工程 5)。37および38の塩素原子は、アルコキシド/アミンによるSuzuki/Stille カップリング条件または求核性置換条件の何れかの下、求核試薬(nucleuphile)により置換され得る(スキーム 6)。36、39および40中のメチル基は、選択的に臭素化され、41を生じ(工程 1、スキーム 7)、それは、アミンと反応し(工程 2、スキーム 7)、その後、アシル化し、化合物 43を生ずる(工程 3、スキーム 7)。
【０１１３】
【化３１】
2006517958.tif 000033
スキーム 8は、式 49および54の化合物を調製するための方法を示す。アミジンとケトンエステル 44との縮合は、メタノール中の過剰のナトリウムメトキシドによる処理により達成される(工程 1)。POCl3による45の処理は、クロロ-ピリミジン 46を生ずる(工程 2)。中間体 46は、85℃におけるHOAc中のBr2での臭素化によりブロモメチルピリミジン 47に変換され得る(工程 3)。アミンによる47のアルキル化(工程 4)、その後のアシル化 (工程 5)は、式 49の化合物を生ずる。ヒドラジンによるクロロピリミジン 46の処理(工程 6)、その後のカルボン酸による反応は、トリアゾール 51を生ずる(工程 7)。酸性酸(acidic acid)中の臭素による臭素化が、選択的に、メチル基において起き、ブロモメチル中間体 52を生じ(工程 8)、それは、式 54の化合物に変換される(工程 9および10)。
【実施例】
【０１１４】
実施例
以下の実施例に記載する出発物質および様々な中間体は、市販源から得ることが出来、市販の有機化合物から調製することが出来、あるいは周知の合成方法を用いて調製できる。本発明の中間体の調製に好適な方法の代表例も以下に記載する。
【０１１５】
以下の実施例において、化合物の特性解析のためのLC-MS条件は以下の通り:
1.分析的HPLC/MS装置:分析は、Waters 600シリーズポンプ(Waters Corporation、Milford、MA)、Waters 996 Diode Array DetectorおよびGilson 215 自動サンプラー(Gilson Inc、Middleton、WI)、Micromass（登録商標） LCT 飛行時間型エレクトロスプレーイオン化質量分析機を用いて行う。データはOpenLynx Global Server、OpenLynx、およびAutoLynx プロセシングを備えたMassLynx 4.0ソフトウェアを用いて得る。
2.分析的HPLC条件:  4.6x50mm、Chromolith SpeedROD RP-18e カラム(Merck KGaA、Darmstadt、Germany); UV 10 スペクトル/秒、220-340nm の和; 流速 6.0 mL/分; 注入容量 1μl; 
グラジエント条件- 移動相Aは、95% 水5% メタノール、0.05% TFA含有; 移動相Bは、95% メタノール、5% 水、0.025% TFA含有。グラジエントは0-0.5分10-100% B、100%Bで1.2 分保持、1.21分に10 %Bに戻る。注入間サイクル時間は2.15分。
3.分析的 MS条件:キャピラリー電圧3.5kV;コーン電圧30V; 分割およびソース温度はそれぞれ350℃および120℃;質量範囲181-750、スキャン時間0.22秒およびスキャン間遅延0.05 分。
【０１１６】
実施例 1
典型的なアリール酸ピリダジニルメチルアミドおよび関連化合物の合成
A. N-(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-(3-メチル-ブチル)-ベンズアミド
【化３２】
2006517958.tif 000034
工程 1. 4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-カルボン酸エチルエステルの調製
【化３３】
2006517958.tif 000035
ナトリウムエトキシド (1.71 g, 25 mmol)を、0℃に冷却したTHF (35 mL)中の4,6-ジクロロ-ピリダジン-3-カルボン酸エチルエステル (2.20 g, 10 mmol)の撹拌溶液に添加する。反応混合物を室温にて一夜撹拌し、次いで、1N HCl (25 mL)に注いだ。次いで、得られた溶液を、飽和NaHCO3により中和する。EtOAc (20 mL)を添加し、その層を分離する。その水層を、EtOAc (20 mL)で２回抽出し、合わせた抽出物を、塩水 (25 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。その残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(2:1 ヘキサン、EtOAcで溶出した)で精製し、明黄色のワックスとして標題生成物を得る。
H1 NMR δ (CDCl3) 6.32 (s, 1H), 4.57 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.41 (q, 4H, J = 7.2 Hz), 4.09 (q, 4H, J= 7.2 Hz), 1.34-1.44 (m, 9H).  LC-MS (M+1) 241.1 
【０１１７】
工程 2. (4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イル)-メタノールの調製
【化３４】
2006517958.tif 000036
LiAlH4 (THF中の1N 溶液、1 mL)を、0℃に冷却したTHF (8 mL) 中の4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-カルボン酸 エチル エステル (213 mg, 0.8 mmol)の撹拌溶液に添加する。その溶液を、0℃で3 時間撹拌する。次いで、過剰のNa2SO410H2Oを添加し、該混合物を、室温にて45 分間撹拌する。固体を濾取し、EtOAcで洗浄する。真空で濾液を蒸発すると、明黄色のオイルを生ずる。このアルコールを次の工程で更に精製することなく使用した。LC-MS (M+1) 199.2.
【０１１８】
工程 3. 3-クロロメチル-4,6-ジエトキシ-ピリダジンの調製
【化３５】
2006517958.tif 000037
過剰のSOCl2を、CH2Cl2 (4 mL)中の(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イル)-メタノール (174 mg, 0.88 mmol) の撹拌溶液に添加する。その反応混合物を、室温にて4 時間撹拌する。次いで、その溶媒を真空で除去し、トルエン (4 mL)を添加し、乾燥するまで蒸発させる。残渣のフラッシュカラムクロマトグラフィーの精製(3:1 ヘキサン、EtOAcで溶出した)が、透明なオイルとして標題生成物を生ずる。H1 NMR δ (CDCl3)  6.28(s, 1H), 4.78 (s, 2H), 4.54 (q, 2H, J= 7.2 Hz), 4.11 (q, 2H, J= 7.2 Hz), 1.48 (t, 3H, J=7.2 Hz), 1,41 (t, 3H, J= 7.2 Hz,) LC-MS (M+1) 217.1. 
【０１１９】
工程 4. (4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミンの調製
【化３６】
2006517958.tif 000038
過剰のK2CO3を、アセトニトリル (5 mL)中の3-クロロメチル-4,6-ジエトキシ-ピリダジン (220 mg, 1.02 mmol)およびイソアミルアミン (440 mg, 5.10 mmol)の撹拌溶液に添加する。その混合物を室温にて一夜撹拌する。その溶媒を真空で除去し、水 (10 mL)およびDCM (15 mL)を添加する。層を分離し、水層をDCM (15 mL)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (10 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させ、オイルとして標題化合物を生ずる。H1 NMR δ (CDCl3)  6.22 (s, 2H), 4.56 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.12 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 3.97 (s, 2H), 2.64 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.40-1.51 (m,9H), 0.88 (d, 6H, J = 7.2 Hz).  
【０１２０】
工程 5. N-(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-(3-メチル-ブチル)-ベンズアミドの調製
【化３７】
2006517958.tif 000039
ジフルオロ安息香酸塩化物 (0.11g)を、DCM (5ml)中の(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-3-メチル-ブチル)-アミン (0.16 g)およびトリエチルアミン (0.11g) の撹拌溶液に滴下する。その混合物を１時間室温にて撹拌する。DCM (10 ml)を添加し、その混合物を希釈する。その混合物を水 (5 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。残渣の分取TLC精製(ヘキサン: 酢酸エチル 2:1)が、標題生成物(化合物 1)を生ずる。H1 NMR δ (CDCl3)  7.01-7.20 (m,3H), 6.22 (s, 2H), 4.98 (s, 2H), 4.56 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.12 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 3.20 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.35-1.55 (m,9H), 0.88 (d, 6H, J = 7.2 Hz). LC-MS (M+1) 408.3. 
【０１２１】
B.  6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミド
【化３８】
2006517958.tif 000040
EDCI (80 mg)およびDMAP (20 mg)を、DCM (10ml)中の(4,6-ジエトキシ-ピリダジン-3-イルメチル)-3-メチル-ブチル)-アミン (93.5 mg)およびフルオロピリジニル酸(fluoropyridinyl acid)(59 mg)の撹拌溶液に添加する。その混合物を室温にて一夜撹拌する。DCM (10 ml)を添加し、該混合物を希釈する。その混合物を水 (5 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。残渣の分取TLC精製(ヘキサン: 酢酸エチル 2:1)が、標題生成物 (化合物 2)を生ずる。H1 NMR δ (CDCl3) 7.80-7.92 (m, 1H), 7.60-7.68 (m, 1H), 6.95-7.02 (m, 1H), 6.22 (s, 2H), 4.98 (s, 2H), 4.56 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.12.
【０１２２】
C. N-(6-クロロ-4-プロピル-ピリミジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド
【化３９】
2006517958.tif 000041
工程 1. 2-アセチル-2-プロピル-コハク酸ジエチルエステルの調製
【化４０】
2006517958.tif 000042
DMSO (250 ml)中の2-アセチル-コハク酸ジエチルエステル (30 g, 139 mmol)の溶液に、1 時間に渡り10回に分けてNaH (5.8 g, ミネラルオイル中60%, 145 mmol)を添加する。得られた溶液を、更に1.5 時間室温にて撹拌する。PrI (17.1 ml, 174 mmol)を、45 分に渡りゆっくりと添加し、得られた溶液を、室温にて一夜撹拌する。水(500 ml)を添加し、溶液をNaClで飽和し、EtOAc (3 x 250 ml)で抽出する。合わせた抽出物を、塩水 (400 ml)で洗浄、Na2SO4で乾燥させ、真空で蒸発させる。得られた黄色のオイルを、更なる精製することなく次の工程に用いる。
【０１２３】
工程 2. 3-アセチル-ヘキサン酸の調製
【化４１】
2006517958.tif 000043
2-アセチル-2-プロピル-コハク酸ジエチルエステル35 gに、濃HCl (200 ml)を加える。混合物を一夜還流(油浴 105 ℃)し、それに、塩水(100 ml)を加える。その混合物をEtOAc (4 x 150 ml)で抽出し、合わせた抽出物を2N 水性 NaOH 溶液 (4 x 100 ml)で抽出する。次いで、NaOH 溶液を0 ℃に冷却し、濃HClで酸性化する。その混合物をEtOAc (4 x 200 ml)で抽出し、合わせた抽出物を塩水 (200 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、真空で蒸発させ、それにより、黄色のオイルとして標題生成物を生ずる。
【０１２４】
工程 3. 6-メチル-5-プロピル-4,5-ジヒドロピリダジン-3-オンの調製
【化４２】
2006517958.tif 000044
EtOH (150 ml)中の3-アセチル-ヘキサン酸 (18.8 g, 119 mmol)の溶液にNH2NH2-H2O (6.94 ml, 143 mmol)を加え、その混合物を4 時間還流(油浴 85 ℃)する。その溶媒を真空で除き、その残渣に水 (100 ml)およびEtOAc (100 ml)を加える。層を分離し、水層をEtOAc (3 x 100ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水(150 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、蒸発させる。得られた明黄色のオイルを更なる精製をすることなく次の工程に用いる。
【０１２５】
工程 4. 6-メチル-5-プロピル-ピリダジン-3-オンの調製
【化４３】
2006517958.tif 000045
85 ℃に加熱した、HOAc (200 ml) 中の6-メチル-5-プロピル-4,5-ジヒドロピリダジン-3-オン (16.7 g, 108 mmol)の溶液に、Br2 (5.5 ml, 108 mmol)を滴下する。添加後、その混合物を85 ℃で1 時間撹拌する。その溶媒を真空で除き、その残渣をEtOAc (250 ml)に溶解し、NaHCO3 (200 ml)で洗浄し、その後、Na2S2O3飽和溶液(50 ml)および塩水(200 ml)で洗浄する。その有機相を乾燥させ(Na2SO4)、蒸発させる。得られた黄色の固体を次の工程に更なる精製をすることなく用いる。
【０１２６】
工程 5. 6-クロロ-3-メチル-4-プロピル-ピリダジンの調製
【化４４】
2006517958.tif 000046
6-メチル-5-プロピル-4,5-ジピリダジン-3-オン (15.3 g, 100 mmol)およびPOCl3 (125 ml)の混合物を85 ℃で4 時間加熱する。その溶媒を除き、その残渣をEtOAc (200 ml)に溶解する。その溶液を、氷浴により冷却し、それに、水層が塩基性となるまで、NaHCO3の飽和水溶液を注意深く加える。層を分離し、水層をEtOAc (150 ml)で抽出する。合わせた有機性抽出物を塩水 (150 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。4:1 ヘキサン、EtOAcによる残渣のフラッシュカラム分離が、明黄色のオイルとして標題生成物を生ずる。
【０１２７】
工程 6. 6-クロロ-3-メチル-4-プロピル-ピリダジン2-オキシドの調製
【化４５】
2006517958.tif 000047
CH2Cl2 (200 ml)中の6-クロロ-3-メチル-4-プロピル-ピリダジン (8.03 g, 47.06 mmol)の溶液に、mCPBA(11.6 g, 77%, 51.77 mmol)を加える。その混合物を室温にて一夜撹拌する。飽和K2CO3 水溶液(50 ml)を添加し、その層を分離する。次いで、その有機層を、塩水 (100 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、蒸発させ、それにより、明黄色のオイルとして標題生成物を生ずる。
【０１２８】
工程 7. 6-クロロ-3-クロロエチル-4-プロピル-ピリダジンの調製
【化４６】
2006517958.tif 000048
6-クロロ-3-メチル-4-プロピル-ピリダジン 2-オキシド (9.3 g, 50 mmol)およびPOCl3 (80 ml)の混合物を85 ℃で4 時間加熱する。溶媒を除き、残渣をEtOAc (200 ml)に溶解する。その溶液を氷浴により冷却し、それに、水層が塩基性となるまで、NaHCO3の飽和水溶液を注意深く加える。層を分離し、水層をEtOAc (150 ml)で抽出する。合わせた有機性抽出物を塩水 (200 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。5:1 ヘキサン、EtOAcによる残渣のフラッシュカラム分離が、明黄色のオイルとして標題生成物を生ずる。
【０１２９】
工程 8. (6-クロロ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミンの調製
【化４７】
2006517958.tif 000049
CH3CN (30 ml)中の6-クロロ-3-クロロエチル-4-プロピル-ピリダジン (3.4 g, 16.58 mmol) の溶液に、K2CO3 (9.15 g, 66.3 mmol)、イソブチルアミン (6.6 ml, 66.3 mmol)を加え、その混合物を室温にて一夜撹拌する。溶媒を真空で除き、残渣に水(60 ml)およびEtOAc (60 ml)を加える。層を分離し、有機層を塩水 (20 ml)で洗浄し、乾燥させる(Na2SO4)。溶媒の蒸発が、明黄色のオイルを生じ、更なる精製をすることなく次の工程にそれをを用いる。
【０１３０】
工程 9. N-(6-クロロ-4-プロピル-ピリミジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミドの調製
【化４８】
2006517958.tif 000050
0℃に冷却したCH2Cl2 (30 ml)中の(6-クロロ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミン (1.47 g, 6.1 mmol)およびEt3N (1.28 ml, 9.2 mmol)の溶液に、2,5-ジフルオロ-ベンゾイルクロライド (1.14 ml, 9.2 mmol)を加える。その混合物を室温にて一夜撹拌する。水 (10 ml)を添加し、層を分離する。有機層を塩水 (10 ml)で洗浄し、次いで、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。その残渣をフラッシュカラム(シリカゲル、1:1 ヘキサン、EtOAc)で精製し、それにより、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。 1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 7.34 (s, 0.8H), 7.24 (s, 0.2H), 7.04-7.11 (m, 3H), 5.05 (s, 1.6H), 4.72 (s, 0.4H), 3.08 (d, 2H), 2.74 (t, 1.6H), 2.35 (t, 0.4H), 2.09-2.17 (m, 1H), 1.67-1.76 (m, 1.6H0, 1.47-1.51 (m, 0.4H), 1.04 (t, 2.4H), 0.97 (d, 1.2H), 0.93 (t, 0.6H), 0.79 (d, 4.8H). 
【０１３１】
D. 6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (6-クロロ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミド
【化４９】
2006517958.tif 000051
CH2Cl2 (10ml)中の(6-クロロ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミン (940 mg, 3.89 mmol)および6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (663 mg, 4.7 mmol) の撹拌溶液に、EDCI (783 mg, 4.7 mmol)およびDMAP (244 mg, 2 mmol)を加える。その混合物を室温にて一夜撹拌する。水(10 ml)を添加し、層を分離する。有機層を塩水 (10 ml)で洗浄し、次いで、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。残渣のフラッシュカラム精製(ヘキサン: 酢酸エチル 2:1)が、標題生成物を生ずる。1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 7.89 (q, 0.7H), 7.81 (q, 0.3H), 7.69 (dd, 0.3H), 7.53 (dd, 0.7H), 7.34 (s, 0.7H), 7.20 (s, 0.3H), 6.99 (dd, 0.7H), 6.91 (dd, 0.3H), 5.19 (s, 0.6H), 5.07 (s, 1.4H), 3.41 (d, 0.6H), 3.31 (d, 1.4H), 2.75 (t, 1.4H), 2.48 (t, 0.6H), 2.08-2.17 (m, 1H), 1.69-1.75 (m, 1.4H), 1.54-1.60 (m, 0.6H), 1.02 (t, 2.1H), 0.99 (d, 1.8 H), 0.97 (t, 0.9H), 0.80 (d, 4.2H).
【０１３２】
E. 6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミド
【化５０】
2006517958.tif 000052
EtOH (5 ml)中の6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸(6-クロロ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-イソブチル-アミド(110 mg, 0.30 mmol)の溶液に10 % Pd/Cを加え、その混合物を30 psiで一夜、水素化する。触媒を濾取し、濾液を真空で蒸発させる。CH2Cl2中の5 % MeOHによる残渣の分取TLC分離が、無色のオイルとして標題生成物を生ずる。1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 9.02 (d, 0.7H), 8.94 (d, 0.3H), 7.88 (q, 0.7H), 7.79 (q, 0.3H), 7.64 (dd, 0.3H), 7.54 (dd, 0.7H), 7.30 (d, 0.7H), 7.15 (d, 0.3H), 6.98 (dd, 0.7H), 6.89 (dd, 0.3H), 5.18 (s, 0.6H), 5.14 (s, 1.4H), 3.41 (d, 0.6H), 3.29 (d, 1.4H), 2.74 (t, 1.4H), 2.47 (t, 0.6H), 2.08-2.18 (m, 1H), 1.66-1.77 (m, 1.4H), 1.51-1.57 (m, 0.6H), 1.00 (t, 2.1H), 0.99 (d, 1.8H), 0.94 (t, 0.9H), 0.79 (d, 4.2H).
【０１３３】
F. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(7-プロピル-[1,2,4] トリアゾロ [4,3-B] ピリダジン-6-イルメチル)-ベンズアミド
【化５１】
2006517958.tif 000053
工程 1. 2,5-ジフルオロ-N-(6-ヒドラジノ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-N-イソブチル-ベンズアミドの調製
【化５２】
2006517958.tif 000054
EtOH (5 ml)中のN-(6-クロロ-4-プロピル-ピリミジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド (188 mg, 0.52 mmol)の溶液に、ヒドラジンモノ水和物 (91 mg, 1.82 mmol)を加え、その混合物を85 ℃で一夜加熱する。溶媒を真空で除き、残渣にEtOAc (10 ml)および水 (10 ml)を加える。層を分離し、水層をEtOAc (2 × 10 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (10 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして真空で蒸発させ、それにより、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。
【０１３４】
工程 2. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(7-プロピル-[1,2,4] トリアゾロ [4,3-b] ピリダジン-6-イルメチル)-ベンズアミドの調製
【化５３】
2006517958.tif 000055
HCOOH (3 ml)中の2,5-ジフルオロ-N-(6-ヒドラジノ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-N-イソブチル-ベンズアミド (78 mg, 0.21 mmol)の溶液を、110 ℃で一夜加熱する。溶媒を真空で除き、その残渣にEtOAc (10 ml)および飽和NaHCO3 水溶液 (10 ml)を加える。層を分離し、水層をEtOAc (10 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (10 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして真空で蒸発させる。CH2Cl2中の5% MeOHによる残渣の分取TLC分離が、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 9.07 (s, 0.2H), 9.00 (s, 0.8H), 7.87 (s, 0.8H), 7.78 (s, 0.2H), 6.96-7.13 (m, 3H), 4.91 (s, 1.6H), 4.62 (s, 0.4H), 3.13 (d, 2H), 2.71 (t, 1.6H), 2.40 (t, 0.4H), 2.09-2.13 (m, 0.2H), 1.92-2.00 (m, 0.8H), 1.74-1.83 (m, 1.6H), 1.48-1.55 (m, 0.4H), 1.09 (t, 2.4H), 1.00 (d, 1.2 H), 0.96 (t, 0.6H), 0.81 (d, 4.8H).
【０１３５】
G. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(3-メチル-7-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-B] ピリダジン-6-イルメチル)-ベンズアミド
【化５４】
2006517958.tif 000056
HOAc (3 ml)中の2,5-ジフルオロ-N-(6-ヒドラジノ-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-N-イソブチル-ベンズアミド (63 mg, 0.17 mmol)の溶液を、110 ℃で一夜加熱する。溶媒を真空で除き、その残渣にEtOAc(10 ml)および飽和NaHCO3 水溶液(10 ml)を加える。層を分離し、水層をEtOAc (10 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (10 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして真空で蒸発させる。CH2Cl2中の5% MeOHによる残渣の分取TLC分離が、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 7.79 (s, 0.75H), 7.71 (s, 0.25H), 6.95-7.12 (m, 3H), 4.91 (s, 1.5H), 4.62 (s, 0.5H), 3.17 (d, 2H), 2.81 (s, 0.75H), 2.79 (s, 2.25H), 2.69 (t, 1.5H),  2.39 (t, 0.5H), 2.06-2.17 (m, 0.25H), 1.91-2.01 (m, 0.75H), 1.72-1.82 (m, 1.5H), 1.45-1.55 (m, 0.5H), 1.08 (t, 2.25H), 1.00 (d, 4.5H), 0.93 (t, 0.75H), 0.82 (d, 1.5H).
【０１３６】
H. N-(6-アセチル-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド
【化５５】
2006517958.tif 000057
トルエン (8 ml)中のN-(6-クロロ-4-プロピル-ピリミジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド (270 mg, 0.71 mmol)、トリブチル(1-エチルオキシビニル)スズ (386 mg, 1.07 mmol)およびPd(PPh3)2Cl2 (49 mg, 0.07 mmol)の溶液を10 分間Arにより脱気し、次いで、一夜、焼いた試験管(seared tube)中で、110 ℃で加熱する。溶媒を真空で蒸発させ、その残渣にTHF (3 ml)および3N HCl (3 ml)を加え、その混合物をR.T.で2 時間撹拌する。飽和NaHCO3水溶液を添加し、その反応混合物を中和する。EtOAc (10 ml)を添加し、層を分離する。水層をEtOAc (10 ml)で抽出し、合わせた抽出物を塩水 (10 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。2:1 EtOAc、ヘキサンによる残渣のフラッシュカラム分離が、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 7.95 (s, 0.8 H), 7.84 (s, 0.2H), 7.01-7.13 (m, 3H), 5.11 (s, 1.6H), 4.80 (s, 0.4H), 3.17 (d, 2H), 2.89 (s, 3H), 2.81 (t, 2.4H), 2.39 (t, 0.6H), 2.07-2.18 (m, 1H), 1.70-1.79 (m, 1.6H), 1.48-1.53 (m, 0.4H), 1.04 (t, 2.4H), 0.99 (d, 1.2H), 0.90 (t, 0.6H), 0.81 (d, 4.8H).
【０１３７】
I. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(5-メチル-3-プロピル-イミダゾ[1,5-B]ピリダジン-2-イルメチル)-ベンズアミド
【化５６】
2006517958.tif 000058
工程 1. 2,5-ジフルオロ-N-[6-(1-ホルミルアミノ-エチル)-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル]-N-イソブチル-ベンズアミドの調製
【化５７】
2006517958.tif 000059
160 ℃に加熱したHCONH2 (0.5 ml)に、HCONH2 (0.5 ml)中のN-(6-アセチル-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル)-2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-ベンズアミド (103 mg, 0.26 mmol)およびHCOOH (0.2 ml)の溶液を加える。その混合物を160 ℃で30 分間加熱する。更に、HCOOH0.2 mlを20 分毎に3回加え、その時のLC-MS 分析では出発物質は見られない。その混合物をR.T.に冷却し、飽和NaHCO3水溶液を添加し、その反応混合物を中和する。EtOAc (10 ml)を添加し、層を分離する。水層をEtOAc (10 ml)で抽出し、合わせた抽出物を塩水 (10 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。3:1 EtOAc、ヘキサンによる残渣のフラッシュカラム分離が、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。
【０１３８】
工程 2. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(5-メチル-3-プロピル-イミダゾ [1,5-b] ピリダジン-2-イルメチル)-ベンズアミドの調製
【化５８】
2006517958.tif 000060
2,5-ジフルオロ-N-[6-(1-ホルミルアミノ-エチル)-4-プロピル-ピリダジン-3-イルメチル]-N-イソブチル-ベンズアミド (89 mg)およびPOCl3 (3 ml) の混合物を100 ℃で3 時間加熱する。溶媒を真空で除き、その残渣に飽和NaHCO3水溶液を加え、その反応混合物を中和する。EtOAc (10 ml)を添加し、層を分離する。水層をEtOAc (10 ml)で抽出し、合わせた抽出物を塩水 (10 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。CH2Cl2中の5 % MeOHによる残渣のフラッシュカラム分離が、明黄色のオイルとして標題化合物を生ずる。1H NMR (CDCl3) (回転異性体の混合物) 8.30 (s, 0.4H), 8.25 (s, 0.6H), 7.45 (s, 0.6H), 7.35 (s, 0.4H), 7.00-7.13 (m, 3H), 4.83 (s, 1.2H), 4.48 (s, 0.8H), 3.08 (d, 2H), 2.48 (s, 1.8H), 2.46 (s, 1.2H), 2.56 (t, 1.2H), 2.08-2.17 (m, 0.4H), 1.95-2.05 (m, 0.6H), 2.26 (t, 0.8H), 1.66-1.75 (m, 1.2H), 1.38-1.47 (m, 0.8H), 1.05 (t, 1.8H), 0.99 (d, 2.4H), 0.91 (t, 1.2H), 0.79 (d, 3.6H).
【０１３９】
実施例 2
更なる典型的なアリール酸ピリミジニルメチルアミドの合成
A. 6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (6-クロロ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミド
【化５９】
2006517958.tif 000061
工程 1. 2-アセチル-ペンタン酸メチルエステルの調製
【化６０】
2006517958.tif 000062
DME (50 ml)中のアセト酢酸メチル(10.8 ml, 100 mmol)の溶液を、0 ℃に冷却したDME (250 ml)中のNaH (95% 乾燥, 2.44 g, 100 mmol)の懸濁液に滴下する。得られた溶液を室温にて1 時間撹拌する。Bu4NI (3.7 g, 10 mmol)を加え、その後、PrIを加える。次いで、その混合物を還流で6 時間撹拌する。溶媒を真空で除き、水 (200 ml)およびEtOAc (200 ml)を加える。層を分離し、水層をEtOAc (200 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (200 ml)で洗浄し、そして乾燥させる(Na2SO4)。溶媒の蒸発が、明黄色のオイルを生ずる。7:1 ヘキサン、EtOAcで溶出する、シリカゲルによる残渣のフラッシュカラムクロマトグラフィーが、無色のオイルとして標題生成物を生ずる。LC-MS, M+1 159.2
【０１４０】
工程 2. 6-メチル-5-プロピル-2-チオ-2,3-ジヒドロピリミジン-4-オンの調製
【化６１】
2006517958.tif 000063
EtOH (50 ml)中の2-アセチル-ペンタン酸メチルエステル (3.0 g, 19 mmol)、チオ尿素 (7.23 g, 95 mmol)、およびNaOEt (7.76 g, 114 mmol)の混合物を還流で4 時間撹拌する。溶媒を真空で除き、その残渣を水 (40 ml)に溶解する。その溶液を濃HClによりpH 4に注意深く酸性化し、0 ℃で45 分間撹拌する。形成する固体を濾取し、水で洗浄し、乾燥させ、明黄色の固体として標題化合物を生ずる。LC-MS, M+1 185.1
【０１４１】
工程 3. 6-メチル-5-プロピル-ピリミジン-2,4-ジオンの調製
【化６２】
2006517958.tif 000064
クロロ酢酸 (40 ml)の10% 水溶液を6-メチル-5-プロピル-2-チオ-2,3-ジヒドロピリミジン-4-オン (1.74 g, 9.4 mmol)に添加する。その混合物を還流で4 時間加熱し、次いで、氷浴中で冷却する。形成する固体を濾過により回収し、水で洗浄し、そして乾燥させ、白色の固体を生ずる。LC-MS, M+1 169.2
【０１４２】
工程 4. 2,4-ジクロロ-6-メチル-5-プロピル-ピリミジンの調製
【化６３】
2006517958.tif 000065
6-メチル-5-プロピル-ピリミジン-2,4-ジオン (1.68 g, 10 mmol)、POCl3 (10 ml)、およびDMF (3滴) の混合物を85 ℃で4 時間撹拌する。溶媒を真空で除き、EtOAc (20 ml)および水 (20 ml)をその残渣に添加する。層を分離し、水層をEtOAc (20 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (20 ml)で洗浄し、乾燥させる(Na2SO4)。溶媒の蒸発が、明黄色のオイルを生じ、それを、次の工程に更なる精製をすることなく用いる。LC-MS, M+1 206.2
【０１４３】
工程 5. 2,4-ジクロロ-6-メチル-5-プロピル-ピリミジンの水素化
【化６４】
2006517958.tif 000066
5 % Pd/C (25 mg)およびCH3COONa (820 mg, 10 mmol)を、EtOAc (25 ml)中の2,4-ジクロロ-6-メチル-5-プロピル-ピリミジン (1.02 g, 5 mmol)の溶液に添加する。次いで、混合物を50 psiで一夜水素化する。触媒を濾過し、溶媒を真空で除く。4:1 ヘキサン、EtOAcによるシリカゲルにおける残渣のフラッシュカラムクロマトグラフィーが、1:1:1.5の混合物として2-クロロ-6-メチル-5-プロピル-ピリミジン (LC-MS, M+1 171.7)、4-クロロ-6-メチル-5-プロピル-ピリミジン (LC-MS, M+1 171.7)および6-メチル-5-プロピル-ピリミジン (LC-MS, M+1 157.7)を生じ、それをHPLCで分離する。
【０１４４】
工程 6. 4-ブロモメチル-6-クロロ-5-プロピル-ピリミジンの調製
【化６５】
2006517958.tif 000067
Br2 (0.153 ml, 3 mmol)を、HOAc (10 ml)中、85 ℃に加熱した4-クロロ-6-メチル-5-プロピル-ピリミジン (3 mmol)の溶液に滴下する。添加後、その混合物を85 ℃で1 時間撹拌する。溶媒を真空で除き、残渣をEtOAc (15 ml)に溶解し、Na2S2O3 溶液 (sat. 5 ml)で洗浄し、その後、NaHCO3 (10 ml)、および塩水 (10 ml)で洗浄する。有機相を乾燥させ(Na2SO4)、蒸発させる。得られた黄色のオイルをフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、それにより、標題化合物を生ずる。
【０１４５】
工程 7. (6-クロロ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミンの調製
【化６６】
2006517958.tif 000068
アセトニトリル (30 mL)中の4-ブロモメチル-5-プロピル-6-クロロ-ピリミジン (10 mmol)およびイソアミルアミン (4.35g, 50 mmol)の撹拌溶液に、過剰のK2CO3 (6.9g)を加える。その混合物を室温にて一夜撹拌する。溶媒を真空で除き、水 (10 mL)およびDCM (15 mL)を加える。層を分離し、水層をDCM (2x15 mL)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (10 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を蒸発させ、オイルとして標題生成物を生ずる。
【０１４６】
工程 8. 6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (6-クロロ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミドの調製
【化６７】
2006517958.tif 000069
DCM (10ml)中の(6-クロロ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-(3-メチル-ブチル)-アミン (0.715 g, 2.8 mmol)および6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (0.47g, 3.34 mmol)の撹拌溶液に、EDCI (0.61 g)およびDMAP (0.153 g)を加える。その混合物を室温にて一夜撹拌する。DCM (10 ml)を添加し、その混合物を希釈する。その混合物を水 (5 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして溶媒を蒸発させる。残渣の分取TLC精製(ヘキサン: 酢酸エチル 2:1)が、標題生成物を生ずる。H1 NMR δ (CDCl3) 8.69 and 8.75 (s, 1H), 7.71-7.97 (m,1H), 7.58-60 (m, 1H), 4.79 and 5.07 (s, 2H), 3.50-3.64 (m, 2H), 2.59-2.87 (m, 2H), 1.45-1.72 (m,5H), 0.92-1.09 (m, 4H), 0.81 (d, 6H).
【０１４７】
B. N-(6-クロロ-5-プロピル-ピリミジン-4-イルメチル)-N-エチル-2,5-ジフルオロ-ベンズアミド
【化６８】
2006517958.tif 000070
この化合物は、実質的に上記のように調製する。LCMS: M+1 354.04.
【０１４８】
C. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-C]ピリミジン-7-イルメチル)-ベンズアミド
【化６９】
2006517958.tif 000071
工程 1. 5-プロピル-6-メチル-ピリミジン-4-オンの調製
【化７０】
2006517958.tif 000072
NaOMe (1.30 g, 24 mmol)を、室温にてMeOH (75 ml)中のホルムアミジン (12 mmol)の撹拌溶液に添加する。その混合物を15 分間撹拌する。2-アセチル-ペンタン酸メチルエステル (10 mmol)を添加し、その混合物を室温にて一夜撹拌する。酢酸 (0.72 g, 12 mmol)を添加し、溶媒を真空で除く。水 (30 ml)を残渣に添加し、それを、2-ブタノン (3 x 30 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水 (40 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させ、黄色の固体を生じ、それを、次の工程に更なる精製をすることなく用いる。
【０１４９】
工程 2. 5-プロピル-4-クロロ-6-メチル-ピリミジンの調製
【化７１】
2006517958.tif 000073
5-プロピル-6-メチル-ピリミジン-4-オン (10 mmol)およびPOCl3 (25 ml)の混合物を85 ℃で4 時間加熱する。溶媒を真空で除き、EtOAc (30 ml)および水 (30 ml)を残渣に添加する。水層のpHが7を超えるまで、NaHCO3を注意深く加える。層を分離し、水層をEtOAc (2 x 30 ml)で抽出する。合わせた抽出物を塩水(50 ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして蒸発させる。6:1 EtOAc:ヘキサンによる残渣のフラッシュカラム精製が、明黄色のオイルとして標題生成物を生ずる。
【０１５０】
工程 3. (6-メチル-5-プロピル-ピリミジン-4-イル)-ヒドラジンの調製
【化７２】
2006517958.tif 000074
エタノール (20 mL)中の5-プロピル-4-クロロ-6-メチル-ピリミジン (10 mmol)およびヒドラジンモノ水和物 (30 mmol)の混合物を80℃で一夜加熱する。溶媒を真空で除き、残渣固体を次の工程に更なる精製をすることなく用いる。
【０１５１】
工程 4. 7-メチル-8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジンの調製
【化７３】
2006517958.tif 000075
ギ酸 (3 mL)中の(6-メチル-5-プロピル-ピリミジン-4-イル)-ヒドラジン (10 mmol)の溶液を110℃で一夜加熱する。過剰量のギ酸を真空で除く。残渣に、EtOAc (15 mL)を加え、混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄する。層を分離し、水層をEtOAc (2 x 15 mL)で抽出し、乾燥させ、溶媒を除去する。PTLC分離 (塩化メチレン中、5% メタノール)が、標題化合物を生ずる。
【０１５２】
工程 5. 7-ブロモメチル-8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジンの調製
【化７４】
2006517958.tif 000076
Br2 (0.153 ml, 3 mmol)を、HOAc (10 ml)中、100 ℃に加熱した7-メチル-8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン (3 mmol)の溶液に滴下する。添加後、その混合物を100 ℃で一夜撹拌する。溶媒を真空で除き、残渣をEtOAc (15 ml)に溶解し、Na2S2O3溶液(sat. 5 ml)で洗浄し、その後、NaHCO3 (10 ml)、および塩水 (10 ml)で洗浄する。有機相を乾燥させ(Na2SO4)、蒸発させる。得られた黄色のオイルをPTLCで精製し、それにより、標題化合物を生ずる。
【０１５３】
工程 6. イソブチル-(8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン-7-イルメチル)-アミンの調製
【化７５】
2006517958.tif 000077
CH3CN (30 ml)中の7-ブロモメチル-8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン (16.58 mmol)の溶液に、K2CO3 (9.15 g, 66.3 mmol)、イソブチルアミン (6.6 ml, 66.3 mmol)を加え、その混合物を室温にて一夜撹拌する。溶媒を真空で除き、残渣に水 (60 ml)およびEtOAc (60 ml)を加える。層を分離し、有機層を塩水 (20 ml)で洗浄し、乾燥させる(Na2SO4)。溶媒の蒸発が、明黄色のオイルを生じ、それを、次の工程に更なる精製をすることなく用いる。
【０１５４】
工程 7. 6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 イソブチル-(8-プロピル[1,2,4]トリアゾロ-[1,5-c]ピリミジン-7-イルメチル)-アミドの調製
【化７６】
2006517958.tif 000078
DCM (10ml)中のイソブチル-(8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン-7-イルメチル)-アミン (2.8 mmol)および6-フルオロ-ピリジン-2-カルボン酸 (0.47g, 3.34 mmol)の撹拌溶液に、EDCI (0.61 g)およびDMAP (0.153 g)を加える。その混合物を室温にて一夜撹拌する。DCM (10 ml)を添加し、その混合物を希釈する。その混合物を水 (5 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして溶媒を蒸発させる。残渣の分取TLC精製(ヘキサン:酢酸エチル 2:1)が、標題生成物を生ずる。H1 NMR δ (CDCl3) (回転異性体の混合物) 9.25 (s, 0.5H), 9.18 (s, 0.5H), 8.39 (s, 0.5H), 8.36 (s, 0.5H), 7.78-7.93 (m, 1H), 7.68 (d, 0.5H), 7.57 (d, 0.5H), 6.99 (d, 0.5H), 6.92 (d, 0.5H), 5.03 (s, 1H), 4.89 (s, 1H), 3.52 (d, 1H), 3.35 (d, 1H), 3.12 (t, 1H), 2.83 (t, 1H), 1.95-2.20 (m, 1H), 1.59-1.85 (m, 2H), 0.88-1.10 (m, 6H), 0.82 (t, 3H).
【０１５５】
D. 2,5-ジフルオロ-N-イソブチル-N-(8-プロピル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-C]ピリミジン-7-イルメチル)-ベンズアミド
【化７７】
2006517958.tif 000079
この化合物は、実質的に上記のように調製する。 H1 NMR δ (CDCl3) (回転異性体の混合物) 9.24 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 7.00-7.25 (m, 3H), 4.88 (s, 1H), 4.59 (s, 1H), 3.22 (d, 2H), 3.15 (t, 1H), 2.81 (t, 1H), 1.98-2.18 (m, 1H), 1.73-2.18 (m, 1H), 1.53-1.66 (m, 1H), 0.80-1.12 (m, 9H).
【０１５６】
E. 更なる典型的なアリール酸ピリミジニルメチルアミド、ピリダジニルメチルアミドおよび関連化合物
以下の化合物は、上記開示の方法を介し調製する。
【表１】
2006517958.tif 000080
【表２】
2006517958.tif 000081
【０１５７】
実施例 3
リガンド結合アッセイ
GABAA レセプターのベンゾジアゼピン部位に対する本発明の化合物の高い親和性は、Thomas and Tallman (1981) J. Bio. Chem. 156:9838-9842、および(1983) J. Neurosci. 3:433-440に実質的に記載されている結合アッセイを用い確認する。
【０１５８】
ラット皮質組織を切開し、25 体積 (w/v)の緩衝液 A (0.05 M トリスHCl緩衝液、pH 7.4、4℃)中にホモジナイズする。組織ホモジネートを、冷却して(4℃)20,000 x gで20 分間、遠心分離する。上清をデカントし、ペレットを同体積の緩衝液に再度ホモジナイズし、20,000 x gで再度遠心分離する。この遠心分離工程の上清をデカントし、ペレットを-20℃で一夜保存する。次いで、ペレットを融解し、25 体積の緩衝液 A (もとは wt/vol)に再懸濁し、20,000 x gで遠心分離し、そして上清をデカントする。この洗浄工程をもう一度繰り返す。ペレットを最終的に50 体積の緩衝液 Aに再懸濁する。
【０１５９】
インキュベーションは、100 μlの組織ホモジネート、100 μlの放射性リガンド(0.5 nM 3H-RO15-1788 [3H-フルマゼニル]、比活性度 80 Ci/mmol)、および試験化合物またはコントロールを含み(以下、参照)、全体積は緩衝液 Aで500 μlとする。インキュベーションは4℃で30 分間行い、次いで、素早くWhatman GFBフィルターで濾過し、遊離および結合リガンドを分離する。フィルターを新しい緩衝液 Aで２回洗浄し、液体シンチレーションカウンターでカウントする。非特異的結合(コントロール)を、3H RO15-1788を10 μM ジアゼパム (Research Biochemicals International, Natick, MA)と置換することにより測定する。データは３回収集し、平均し、そして全特異的結合(全特異的結合 = 全体  非特異的)の阻害％を各々の化合物で算出する。
【０１６０】
競争結合曲線は、阻害％を測定するための上記の方法により、曲線あたり得られる10-12Mから10-5Mの化合物濃度範囲で分布する11点までを用い、得る。Ki 値は、Cheng-Prussof等式により算出する。上記に開示の各々の化合物は、この方法で試験し、各々、Ki < 1μMであることが判った。本発明の好ましい化合物は、Ki 値が100 nM未満であり、本発明のより好ましい化合物は、Ki 値が10 nM未満である。
【０１６１】
実施例 4
電気生理学
以下のアッセイは、本発明の化合物が、GABAA レセプターのベンゾジアゼピン部位においてアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストとして作用するかどうかの決定に用いる。
【０１６２】
アッセイは、実質的にWhite and Gurley (NeuroReport 6:1313-1316, 1995)およびWhite, Gurley, Hartnett, Stirling, and Gregory (Receptors and Channels 3:1-5, 1995)(修飾した)の記載を比較して行う。電気生理学的記録は、膜において電位を-70 mVに保持したtwo electrode voltage-clamp法を用い行う。アフリカツメガエル卵母細胞を酵素的に単離し、α、βおよびγサブユニットを各々4:1:4の割合で混合した非ポリアデニル化cRNAを注入する。Whiteらの刊行物に記載の９つのα、βおよびγサブユニットの組合せのうち、好ましい組合せは、α1β2γ2、α2β3γ2、α3β3γ2、およびα5β3γ2である。好ましくは、各々の組合せにおけるすべてのサブユニットcRNAが、ヒトクローンであるか、すべてがラットクローンである。これらのクローン化サブユニットの各々の配列はGENBANKで入手可能であり、例えば、ヒトα1、GENBANK受け入れ番号X14766、ヒトα2、GENBANK受け入れ番号A28100; ヒトα3、GENBANK受け入れ番号A28102; ヒトα5、GENBANK受け入れ番号A28104; ヒトβ2、GENBANK受け入れ番号M82919; ヒトβ3、GENBANK受け入れ番号Z20136; ヒトγ2、GENBANK受け入れ番号X15376; ラットα1、GENBANK受け入れ番号L08490、ラットα2、GENBANK受け入れ番号L08491; ラットα3、GENBANK受け入れ番号L08492; ラットα5、GENBANK受け入れ番号L08494; ラットβ2、GENBANK受け入れ番号X15467; ラットβ3、GENBANK受け入れ番号X15468; およびラットγ2、GENBANK受け入れ番号L08497である。各々のサブユニットの組合せでは、各々の構成要素サブユニットとして十分なメッセージが組み入れられ(inject)、1 μM GABAを適用するとき、電流振幅>10 nAとなるようにした。
【０１６３】
化合物を最大誘導可能GABA電流の<10% (例えば、1μM−9μM)を誘導するGABA 濃度について評価した。各卵母細胞は様々な濃度の試験すべき化合物(被験化合物)に曝し、濃度/効果相関関係を評価した。被験化合物の効力は電流振幅におけるパーセント変化として計算した:100*((Ic/I)-1)、ここでIcは被験化合物の存在下で観察されたGABA誘導性電流振幅、Iは被験化合物の非存在下で観察されたGABA誘導性電流振幅である。
【０１６４】
被験化合物のベンゾジアゼピン部位についての特異性は以下のように濃度/効果曲線を完成させることによって測定した。先に適用した被験化合物を完全に除去するために卵母細胞を洗浄した後、卵母細胞をGABA + 1μM RO15-1788に曝し、次いでGABA + 1μM RO15-1788 + 被験化合物に曝した。化合物の添加によるパーセント変化を上記のように計算した。RO15-1788の存在下で観察されたパーセント変化を1μMのRO15-1788の非存在下で観察された電流振幅におけるパーセント変化から差し引いた。かかる正味の値を用いて標準的方法により平均効果およびEC50値を計算した。平均効果およびEC50値を評価するために、濃度/効果データを細胞について平均し、ロジスティック式に適合させた。
【０１６５】
実施例 5
MDCK毒性アッセイ
本実施例はMadin Darby イヌ腎臓(MDCK)細胞毒性アッセイを用いた化合物毒性の評価を示す。
【０１６６】
1μLの被験化合物を透明底 96-ウェルプレート (PACKARD、Meriden、CT)の各ウェルに添加し、アッセイにおける化合物の終濃度を10 マイクロモル、100 マイクロモルまたは200マイクロモルとした。被験化合物を含まない溶媒をコントロールウェルに添加した。
【０１６７】
MDCK細胞、ATCC番号CCL-34 (American Type Culture Collection、Manassas、VA)をATCC製品情報シートの指示に従って、無菌条件で維持した。集密したMDCK細胞をトリプシン処理し、収集し、温かい(37℃)培地(VITACELL Minimum Essential Medium Eagle、ATCC カタログ番号30-2003)で希釈して濃度を0.1 x 106細胞/mlとした。100μLの希釈した細胞を各ウェルに添加したが、ただし、100μLの細胞を含まない温かい培地を含む５つの標準曲線コントロールには添加しなかった。プレートを次いで37℃、95% O2、5% CO2下で2時間常に振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、50μLの哺乳類細胞溶解溶液(PACKARD (Meriden, CT)のATP-LITE-M Luminescent ATP detection kit)を各ウェルに添加し、ウェルをPACKARD TOPSEALスティッカーで被覆し、プレートをおよそ700 rpmで好適なシェーカーで2分間振盪した。
【０１６８】
毒性をもたらす化合物は非処理細胞と比較してATP生産を減少させる。一般的に、ATP-LITE-M Luminescent ATP detection kitを製造業者の指示に従って用いて処理および非処理MDCK細胞のATP生産を測定した。PACKARD ATP LITE-M試薬を室温で平衡化した。平衡化した後、凍結乾燥した基質溶液を5.5mLの基質緩衝溶液（キットに含まれている)で再構成した。凍結乾燥したATP標準溶液を脱イオン水中で再構成して 10 mMのストックを作成した。５つのコントロールウェルについて、10μLの段階希釈したPACKARD標準を各標準曲線コントロールウェルに添加し、各ウェルの終濃度を200 nM、100 nM、50 nM、25 nMおよび12.5 nMとした。PACKARD基質溶液(50μL)をすべてのウェルに添加し、次いで、ウェルを被覆し、プレートをおよそ700 rpmで好適なシェーカーで2分間振盪した。白色PACKARDスティッカーを各プレートの底につけ、サンプルをプレートをホイルでつつみ、10分間暗所に置くことによって暗条件にした。発光を22℃で発光カウンター(例えば、PACKARD TOPCOUNT マイクロプレートシンチレーション・発光カウンターまたはTECAN SPECTRAFLUOR PLUS)を用いて測定し、標準曲線からATPレベルを計算した。被験化合物で処理された細胞におけるATPレベルを非処理細胞において測定されたレベルと比較した。10μMの好ましい被験化合物で処理した細胞は、非処理細胞の少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%のATPレベルを示した。100μM濃度の被験化合物を用いた場合、好ましい被験化合物で処理された細胞は非処理細胞で検出されたATPレベルの少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%のATPレベルを示した。
【国際調査報告】
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