(57)【要約】本発明は、望ましい形質を有する突然変異体の個体の同定法を伴う２つの人工的な突然変異誘発サイクルによって遺伝的に変更されたヒマワリ種子に関する。該ヒマワリ種子は、トコフェロールの２６％〜８０％をδ−トコフェロールの形態で含有することによって特徴づけられる。高濃度のδ−トコフェロールの産生は、このような効果をもたらすように変更された種子の遺伝子型によって決定されるために、栽培条件に左右されずに遺伝的な形質として常に得られる。従来は、δ−トコフェロールを高濃度で生産するヒマワリ種子は存在しなかった。δ−トコフェロールを高濃度で含有する種子を自家受精で生産する遺伝的に変更されたヒマワリ及び該ヒマワリの種子から抽出される天然のδ−トコフェロールを高濃度で含有する油も本発明の対象である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
δ−トコフェロールの含有量の高いヒマワリ種子であって、δ−トコフェロールを全トコフェロールに対して２６％〜８０％の割合で含有する該ヒマワリ種子。
【請求項２】
全トコフェロールに対してα−トコフェロールを０．５％〜４５％、β−トコフェロールを０％〜６０％、及びγ−トコフェロールを０％〜７０％含有する請求項１記載のヒマワリ種子。
【請求項３】
δ−トコフェロールの含有量が、ヒマワリ種子中の全トコフェロールに対して常に５０％よりも高い請求項１又は２記載のヒマワリ種子。
【請求項４】
δ−トコフェロールの含有量が、ヒマワリ種子中の全トコフェロールに対して常に６５％よりも高い請求項３記載のヒマワリ種子。
【請求項５】
δ−トコフェロールの含有量が、ヒマワリ種子中の全トコフェロールに対して常に７５％よりも高い請求項４記載のヒマワリ種子。
【請求項６】
油抽出処理に付したときに、δ−トコフェロールを２６〜８０％含有する油を生成する請求項１から５いずれかに記載のヒマワリ種子。
【請求項７】
自家受精したときに、δ−トコフェロールの含有量が高いという形質を、環境条件に依存することなく、安定して発現する請求項１から６いずれかに記載のヒマワリ種子。
【請求項８】
δ−トコフェロールの含有量が高い請求項１から７いずれかに記載のヒマワリ種子を油抽出処理に付して得られるヒマワリ種子油であって、外部添加成分の不存在下において、全トコフェロールに対して２６％〜８０％のδ−トコフェロールを本来的に含有する該ヒマワリ種子油。
【請求項９】
自家受精したときに、δ−トコフェロールの含有量の高い請求項１から７いずれかに記載の種子を実らせるヒマワリ（ヒーリアンサス・アンヌス  Ｌ．）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、δ−トコフェロールの含有量の高い種子に関連する農業の分野に属する。このような種子から抽出される油は高い酸化安定性を有するので、食品や工業的な用途（生物燃料及び潤滑剤）に対して最適である。該油とその副産物は、食品工業、化粧品工業及び薬品工業において多数の用途を有するδ−トコフェロールの抽出に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
トコフェロール類は、種子油中に存在する抗酸化特性を有する主要な天然成分である。このようなトコフェロール類は油溶性であるために、抽出処理中において油中へ溶解し、瓶詰め油中及び植物油含有食品中において重要な抗酸化活性を発揮する［Ｆ．Ｂ．パドレイら、１９９４年；「油脂の存在と特性」、脂質ハンドブック、Ｆ．Ｄ．グンストン、Ｊ．Ｌ．ハーウード及びＦ．Ｂ．パドレイ編、チャップマン＆ホール社（ロンドン）、第４７頁〜第２２３頁］。
【０００３】
存在する４種のトコフェロール（α−、β−、γ−及びδ−トコフェロール）の内で、インビトロ（即ち、人体外）における最大の抗酸化活性はβ−トコフェロール、γ−トコフェロール及びδ−トコフェロールに対応し、α−トコフェロールは、インビトロでは、他の３種のトコフェロールに比べて著しく低い活性を示す［Ｇ．ポングラスら、「天然の抗酸化剤であるトコフェロール」、ファット・サイエンス・アンド・テクノロジー、第９７巻、第９０頁〜第１０４頁、１９９５年］。
【０００４】
標準的なヒマワリ種子は、α−トコフェロールを主成分（全トコフェロールの約９５％）とするトコフェロールを含有し、残りの成分はβ−トコフェロールとγ−トコフェロールから成り、これらの含有量は、全トコフェロールの５％未満である［Ｆ．Ｂ．パドレイら、１９９４年、前記文献］。
【０００５】
ヒマワリ種子中にはα−トコフェロールが圧倒的に多く含まれているために、該種子から得られる油は、他の植物油（即ち、インビトロにおいて高い抗酸化活性を示すβ−トコフェロール、γ−トコフェロール及び／又はδ−トコフェロールをより高い濃度で含有する種子から抽出される他の植物油）に比べて、酸化に対してより低い保護能を示す。主要な種子油に含まれるトコフェロール類の組成を以下の表１に示す。
【０００６】
【表１】
2006524498.tif 000002
【０００７】
ヒマワリ種子中にはα−トコフェロールが圧倒的に多く含まれているということは、実際的見地からは一般的なことであり、又、トコフェロール類の組成比の異なる４種のヒマワリの系統（line）が報告されており、これらの系統は次の２群に類別することができる。
【０００８】
（ａ）γ−トコフェロールの含有量が高い系統：
これには、８５％よりも多くがγ−トコフェロールの形態であって、残りがα−トコフェロールの形態であるトコフェロール類を含有する２種の系統が含まれる。これらの内の一方はロシアにおいて開発され、「ＬＧ−１７」として知られており［Ｙ．デムリン、「ヒマワリ種子におけるトコフェロール組成の遺伝的可変性」、ヘリア、第１６巻、第５９頁〜第６２頁、１９９３年］、又、他方はスペインにおいて開発され、「Ｔ２１００」として知られている［Ｌ．ベラスコら、「改変されたトコフェロール組成を有するＴ５８９とＴ２１００ヒマワリの生殖細胞質の登録」、クロップ・サイエンス、印刷中］。
【０００９】
（ｂ）β−トコフェロールの含有量が平均的な系統：
この群には、種子中のトコフェロールの３０〜５０％がβ−トコフェロールの形態であって、残りがα−トコフェロールの形態である２つの系統が含まれる。これらの内の一方はロシアにおいて開発され、「ＬＧ−１５」として知られており（Ｙ．デムリン、前記の文献）、他方はスペインにおいて開発され、「Ｔ５８９」として知られている（Ｌ．ベラスコら、前記の文献、印刷中）。
【００１０】
ロシアとユーゴスラビアの研究者によって、系統ＬＧ−１５及びＬＧ−１７の交配により、δ−トコフェロールの濃度が幾分増加した組換え体（recombinant）が得られているが、得られたδ−トコフェロールの最大濃度は、種子中に存在する全トコフェロールに対して２５％である［Ｙ．デムリンら、「油質改良のための品種改良の基礎としてのヒマワリ種子中のトコフェロール組成の遺伝的可変性」、植物の品種改良、第１１５巻、第３３頁〜第３６頁、１９９６年］。
【００１１】
要約すると、現在のところ、ヒマワリ種子中に存在する個々のトコフェロールの最大濃度は次の通りである：
α−トコフェロール９５％（天然組成）
β−トコフェロール５０％
γ−トコフェロール９５％
δ−トコフェロール２５％
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、δ−トコフェロールの含有量の高いヒマワリ種子を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一つの対象は、δ−トコフェロールの含有量の高いヒマワリ種子であって、全トコフェロールに対してδ−トコフェロールを２６％〜８０％含有し、その他のトコフェロールとして、α−トコフェロール、β−トコフェロール及びγ−トコフェロールを全トコフェロールに対してそれぞれ０．５％〜４５％、０％〜６０％及び０％〜７０％含有する該種子である。
【００１４】
これらの種子の一部のものは、種子中の全トコフェロールに対して、常に５０％、６５％又は７５％よりも高い濃度のδ−トコフェロールを含有する。ヒマワリ種子のδ−トコフェロールの含有量が高いという形質は自家受精によって遺伝され、該形質は、環境条件に左右されることなく安定して発現される。
【００１５】
本発明の別の対象は、いずれかの適当な方法によってこれらの種子から抽出されるヒマワリ種子油であって、該ヒマワリ種子油は、外部からの成分添加がなくても、高いδ−トコフェロール含有量を示す（全トコフェロールに対して２６％〜８０％のδ−トコフェロールを含有する）。
【００１６】
本発明のさらに別の対象は、ヒマワリ［ヒーリアンサス・アンヌス（Helianthus annus）Ｌ．］であって、自家受精したときに、高いδ−トコフェロール含有量（全トコフェロールの２６％〜８０％）を示す種子を実らせる該ヒマワリである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、種子中にδ−トコフェロールを高濃度で含有することによって特徴づけられるヒマワリ（ヒーリアンサス・アンヌス  Ｌ．）の生殖細胞質（germplasm）に関する。該トコフェロールの含有量は、種子中の全トコフェロールに対して２６％〜８０％である。
【００１８】
このような高濃度のδ−トコフェロールは、天然のヒマワリによっては生産されず、突然変異（mutation）の２つの人工的な誘発サイクル（induction cycle）から成る複合法及びその後の突然変異体植物の同定（identification）と突然変異された形質の固定によって得られる。本発明の対象であるδ−トコフェロールを高濃度で含有するという形質は遺伝されるので、高濃度のδ−トコフェロールは栽培条件に左右されずに常に生産される。
【００１９】
δ−トコフェロールを高濃度で含有する種子をもたらす遺伝的に変更された植物を得るために、トコフェロール類の生合成経路を遺伝的に改変する目的で、時間のかかる遺伝的改良法を実施した。この方法は次の４段階から成る。
【００２０】
（１）ヒマワリの標準的変種の種子中における人工的突然変異の誘発、
（２）誘発された突然変異と突然変異された形質の固定の結果としてのトコフェロール類の生合成経路の改変（alteration）による個体の同定、
（３）既にトコフェロール類の生合成経路における第一改変レベルを示した個体についての人工的突然変異のための新たな誘発処理、及び
（４）出発個体によって示される改変とは異なるトコフェロール類の生合成経路における変更による個体の同定とその後の新たな突然変異体形質の固定。
【００２１】
突然変異誘発又は人工的な突然変異誘発の第一プロセスは、ヒマワリの標準的な変種の種子を、突然変異誘発性特性を有する化合物、即ち、植物のＤＮＡにおける突然変異を誘発し得る化合物を用いて処理することから成る。突然変異発現性処理を付随させるトコフェロール類の生合成経路のための原因となる遺伝子において期待される突然変異の頻度が低いために、このプロセスの後には、数千個の個々の種子においてトコフェロール組成の非破壊的分析（non-destructive analysis）をおこなう。
【００２２】
検出される突然変異体が商業的な観点から有用である場合には、このような突然変異体は遺伝させ、当該植物を栽培する環境条件に左右されることなく発現させるべきである。このような理由から、突然変異体の形質を固定すると共に異なる環境条件下における該形質の安定性を実証するために、選別操作を実施する。
【００２３】
このプロセスの後、最初に検出された突然変異体のいくつかは除外し、一方、γ−トコフェロールの含有量の高い１つの突然変異体（種子中に存在する全トコフェロールの９５％がγ−トコフェロールである場合）を固定した。「ＩＡＳＴ−１」として知られているこの突然変異体が、γ−トコフェロールの含有量の高い別の系統の遺伝塩基とは異なる遺伝塩基に対応することが実証された。
【００２４】
系統ＬＧ−１７及びＴ２１００を標準的なトコフェロール組成を有する系統と交配させることによって、中間的な濃度のγ−トコフェロールを分離させないＦ２子孫がもたらされるが［Ｙ．デムリンら、前記の文献；Ｌ．ベラスコ及びＪ．Ｍ．フェルナンデス−マルチネス、「ヒマワリの生殖細胞質における新たなβ−及びγ−トコフェロール源の同定と遺伝的特徴付け」、ヘリア（Helia）、印刷中］、突然変異体ＩＡＳＴ−１と標準的なトコフェロール類の組成を示す系統との間の交配から得られるＦ２子孫は、中間的な濃度のγ−トコフェロールを広範囲に分離した。
【００２５】
ＩＡＳＴ−１突然変異体の遺伝的単離の後、高濃度の他のトコフェロール類に対する付加的な変異（variation）を発生させるために、該突然変異体の種子について、突然変異誘発性の第２の操作を実施した。突然変異誘発のためのこの第２サイクルの場合にも、その後において、突然変異体を同定するための分析プロセスを大規模に実施すると共に、突然変異体の固定及び栽培条件に左右されることのない該突然変異体の発現の確認のための操作を実施した。
【００２６】
突然変異誘発のためのこの第２サイクルにおいては、本発明の対象となる突然変異体を同定して固定した。該突然変異体は、その種子が高濃度のδ−トコフェロール（該種子中の全トコフェロールに対して２６％〜８０％）を含有することによって特徴づけられる。該種子中にδ−トコフェロールを高濃度で含有することは遺伝性の形質であって、該形質は当該植物の栽培条件に左右されることなく安定して発現される。
【００２７】
［発明の実施の態様］
第１の突然変異誘発サイクル
個体群変種「ペレドヴィク（Peredovik）」のヒマワリ種子（該種子中のトコフェロール組成：α−トコフェロール９６％、β−トコフェロール３％及びγ−トコフェロール１％）を、２０℃の蒸留水中に４時間にわたって浸漬した。次いで、該種子を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ：７．０）を溶剤とする７０ｍＭのエチルメチルスルフォネート（ＥＭＳ）［突然変異誘発剤］溶液中へ移して、一定の攪拌条件下（６０ｒｐｍ）で処理した。この突然変異誘発処理を行った後、該種子（Ｍ１世代）を、流水で１６時間にわたって洗浄してから畑にまいた。
【００２８】
上記のＭ１植物を別々に収穫し、これらの種子（Ｍ２世代）のトコフェロール組成を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって別々に分析し、次いで、Ｆ．ゴフマンらによって開発されたプロトコルに従った［Ｆ．ゴフマンら、「セイヨウアブラナ（ブラッシカ・ナプス  Ｌ．）の種子の単一種におけるトコフェロール類の定量的測定」、フェスト／リピド、第１０１巻、第１４２頁〜第１４５頁、１９９９年］。分析処理に付したＭ１植物（全部で１０８０個の検体）のうちで、１個は、高レベルのγ−トコフェロールに対する分離（segregation）を示した（γ−トコフェロールの最大含有量は、全トコフェロールの９５％であった）。
【００２９】
このような高濃度のγ−トコフェロールを含有する種子は、このような形質を一様に発現する植物を生産した。γ−トコフェロールを９５％含有する種子に由来する植物を、ヒマワリの標準的な変種植物と交配させることによって、Ｆ２種子（該種子は、γ−トコフェロールの含有量に関して両親の場合の中間の値を示した）におけるγ−トコフェロールの含有量に関して広範囲の分離が観察された。
【００３０】
従来開発された類似濃度のγ−トコフェロールを含む原料が、ヒマワリの標準的な変種と交配させた後であっても、中間濃度のγ−トコフェロールに関して分離をもとらさなかったことを考慮するならば（Ｙ．デムリンら、前記文献；Ｊ．Ｍ．フェルナンデス−マルチネス、前記文献）、この非常に広範囲の分離は全く予想外のことであった。このようにして得られた突然変異体は「ＩＡＳＴ−１」と命名された。
【００３１】
第２の突然変異誘発サイクル
突然変異体ＩＡＳＴ−１のヒマワリ種子（該種子中のトコフェロール組成：α−トコフェロール５％、γ−トコフェロール９５％）を、２０℃の蒸留水中に４時間にわたって浸漬した。次いで、該種子を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：３．０）を溶剤とする４ｍＭのアジドナトリウム［突然変異誘発剤］溶液中へ移して、一定の攪拌条件下（６０ｒｐｍ）で処理した。この突然変異誘発処理を行った後、該種子（Ｍ１世代）を、流水で１６時間にわたって洗浄してから畑にまいた。
【００３２】
上記のＭ１植物を別々に収穫し、これらの種子（Ｍ２世代）のトコフェロール組成を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって別々に分析し、次いで、Ｆ．ゴフマンらによって開発されたプロトコルに従った（Ｆ．ゴフマンら、前記文献）。分析処理に付したＭ１植物（全部で１２４０個の検体）のうちで、１個は、高レベルのδ−トコフェロールに対する分離を示した（δ−トコフェロールの最大含有量は、全トコフェロールの５５％であった）。
【００３３】
このような高濃度のδ−トコフェロールを含有する種子は、このような形質を一様に発現する植物を生産した（δ−トコフェロールの濃度：該種子中に存在する全トコフェロールに対して２６％〜８０％）。δ−トコフェロールのこのような含有量は、継続的な世代において維持された。全トコフェロールに対して２６％〜８０％の濃度でδ−トコフェロールを生産する種子をもたらすこの新規なヒマワリの突然変異体系統は「ＩＡＳＴ−３」と命名された。
【国際調査報告】
2006524498.tif 000003
2006524498.tif 000004
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2006524498.tif 000006