(57)【要約】プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料、及び周囲の環境において影響力のある条件、例えば病原性微生物に対して水生動物の抵抗性を改良するための水生動物の水産養殖における該製品の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料。
【請求項２】
前記飼料が、それ自体知られている水生動物飼料成分を含む、請求項１に記載の水生動物飼料。
【請求項３】
前記水生動物飼料が、少なくとも１０６ＣＦＵ／ｇ飼料の濃度でプロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む、請求項１又は２に記載の水生動物飼料。
【請求項４】
前記飼料が、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌及びプロバイオティック・バチルス・サブチリス菌の混合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の水生動物飼料。
【請求項５】
ニジマスの水産養殖において飼育に使用する場合、該ニジマスを病原性エルシニア・ルッケリで誘発試験した際に、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料で飼育されたコントロール群に比較して、ニジマスの相対生存率の少なくとも２％の増加を提供できることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の水生動物飼料。
【請求項６】
水生動物が、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料と接触される、水生動物の水産養殖。
【請求項７】
前記水産養殖の水生動物が、該水産養殖の水生動物の全生物量の０.５％〜１０％に相当する量の水生動物飼料と接触される、請求項６に記載の水生動物の水産養殖。
【請求項８】
前記水生動物が、大西洋サケ(サルモ・サラル）及びニジマス(オンコルヒュンクス・ミキス)を含むサケ科などの魚類である、請求項６又は７の水生動物の水産養殖。
【請求項９】
水生動物を、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料で飼育することを含む、水産養殖における水生動物の飼育方法。
【請求項１０】
前記水生動物が、大西洋サケ(サルモ・サラル)及びニジマス(オンコルヒュンクス・ミキス)を含むサケ科などの魚類である、請求項９に記載の水生動物の飼育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)菌を含む水生動物飼料、及び周囲環境における影響力のある条件、例えば、病原性微生物に対する水性動物の抵抗性を改善するための、水生動物の水産養殖における当該飼料の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
水産養殖は、最も成長の早い食料生産部門の１つになってきており、そして水産養殖において、家畜養殖に知られている病害対策及び成長促進についての慣用方法を適用する可能性がかなり注目されてきた。しかしながら、すぐそばの周囲環境が、陸生動物に比べて水生動物の健康状態にずっと大きい影響を与える。周囲環境における有害な微生物の存在により引き起こされる病気の発生は、水産養殖生産に関する最も重大な制約の１つとして認識され、多くの国々における該食料生産部門の経済発達に影響を及ぼす。
【０００３】
ケージ内で飼育される水生動物は、周囲環境からの有害な影響に対して脆弱である。有害な病原性微生物は、保護された水産養殖環境中で増殖し、そして養殖動物に対して重大な問題を引き起こすこともある。そのもの自体病原体として特徴付けられていない微生物でさえも、大量に存在すると水産養殖生産の潜在的な問題を構成することもある。
【０００４】
陸生動物の養殖において使用される慣用方法を適用及び試験することにより、水産養殖環境において病原体の存在をコントロールすることに多大な注目がされてきた。当該方法は、抗菌剤化合物、例えば抗生物質を環境に添加することを含む。しかしながら、これらの慣用アプローチは、限られた成功しか収めなかった。さらに失敗したことに、抗菌剤の使用に関して、一般的な懸案事項及び成長についての懸案事項が存在し、そして抗生物質の使用について国際的な規制が存在する。
【０００５】
予想通りに、疾患コントロールの必要性は、慣用の方法とは異なる方法の開発によって満たされてきた。そうした方法のうちの１は、「プロバイオティクス」の使用であり、該プロバイオティクスは、例えば競争的排除を介して、潜在的な病原体数をコントロールするために使用される拮抗細菌種である。当該技術の例は、陸生動物の飼育において既に使用されており、ここで市販のプロバイオティックの製品は市販されてきた。これらの製品の経口投与は、腸内感染に対する抵抗性の増大を引き起こし、そして治療された動物の一般的免疫応答を高めた。
【０００６】
複数の細菌種が水生環境をコントロールするために試験されてきたということが、水産養殖における従来技術により明らかにされた。水産養殖において、選別された細菌種が淡水及び塩水水生動物の外部スライム層を含む水生環境においてコロニー形成することが文献から明らかになった。当該細菌コロニー形成の効果は、有害な微生物を排除し、そして他の天然の生物的過程により有機性廃棄物が二酸化炭素と水へと分解されることであった。プロバイオティクスの使用が、一の水生生物をある環境から別の環境へと移すことに伴う輸送ストレスなどの有害な効果の軽減することがさらに見つかったということに注意すべきである。輸送ストレスは、とりわけ、水生生物種のスライム層がその生来有する保護的マイクロフローラのかなりの部分を失うという事実により特徴付けられる。多量のプロバイオティック細菌へ晒されることにより、健常なマイクロフローラが回復するように思える。プロバイオティック細菌は、多くの病原菌、例えばアエロモナス及びビブリオ種と競合する。これらの細菌は水生環境に元々存在しており、そして競争的排除によって、これらの細菌病原体により引き起こされる疾患の頻度は、有意に低減する。
【０００７】
WO 02/00035は、水生動物における細菌性の病気をコントロールするための生物活性飼料複合体を記載する。該飼料複合体は、抗菌化学物質の産生について選ばれた少なくとも１のプロバイオティック細菌を含み、かつ少なくとも１の阻害性又は調節性化合物を含むエマルジョンとして記載される。当該少なくとも１の阻害性又は調節性化合物は、フラノンであり、該化合物は、一般的に微生物の表面コロニー化を阻害する化学物質の群を含む。プロバイオティック細菌として、一般的にバチルスが記載されている。特定の好ましいバチルスの種は言及されておらず、そして実施例は、そのようなものとしてプロバイオティック細菌を指す。
【０００８】
JP2000217567Aは、バチルス菌の高濃度胞子を得る方法を記載し、そしてそうしたバチルス胞子の魚の飼料への使用を特許請求する。当該説明に、「いずれのバチルス種を使用してもよく、そしてその例として、バチルス・パミルス(Bacillus pumils)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・ラテロスポルス(Bacillus laterosporus)、及びバチルス・アルベイ(Bacillus alvei)が挙げられる」と記載されている。全ての実施例は、記載された方法の改良された胞子形成を行った結果に関する。魚の飼料として使用する際の有効な効果に関して具体的なデーターは提供されていない。
【０００９】
JP2000103740Aは、魚類及び貝類の医薬であって、活性主成分としてバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)及びバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)の混合培養物により得られた代謝産物及び生成物、例えばペプチドを含む医薬を記載する。特定の実施例に基づいて、当該混合培養物が養殖魚の免疫活性及び感染予防を改善するということが結論付けられた。
【００１０】
EP287699B1(Calpis、日本)は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis）(C-3102)が魚に与えられると、体重増加及び飼料効率の改良の有効な効果を有するということを記載する。実施例５は、ニジマスについての体重増加効果を記載する。
【００１１】
JP62138148Aは、水生動物用の飼料添加物であって、有効成分としてバチルス・セレウス(Bacillus cereus)の細胞又はその胞子を含む添加物を記載する。漁場の汚染、抵抗性細菌などの問題を引き起こさずに魚の成長効果を促進し、そして細菌性疾患を予防すると言われている。
【００１２】
RU2186576は、プロバイオティック剤を含む治療用飼料を魚に給餌することを含む魚の病気の治療及び予防方法であって、胞子形態のバチルス・サブチリスＶＫＰＭ ｖ-４７５９が、５日間、飼料１トンあたりで使用されることを特徴とする方法を記載する。
【００１３】
Chr. Hansen A/S (デンマーク)は、バイオ・プラス(ＢｉｏＰｌｕｓ)(商標)２Ｂという商標名の製品を市販している。該製品は、バチルス・リケニホルミス及びバチルス・サブチリスの胞子の混合物を含む。種々の実験では、バイオプラス２Ｂを加えることの有効な効果は、子豚、ウシ、肥育豚、肥育鶏、肥育シチメンチョウ、及び子牛における日々の平均体重増加、飼料消費量、飼料効率、及び/又は死亡率に関して示されてきた。
【００１４】
魚に関して、バイオプラス２Ｂの効果は記載されていないし、又は示唆されてもいない。現在、上記恒温動物におけるバイオプラス２Ｂの作用機序は、あまり分かっておらず、そして魚が多くの点で上記恒温動物と異なるということは、当業者に周知である。
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約
本発明により解決される問題は、水生動物(例えば、魚)の飼料であって、関連する病原性微生物に対する水産養殖動物(例えば、魚)の抵抗性を有意に増加できる飼料の提供において見られる。
【００１６】
当該解決方法は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を多く含む飼料が、関連病原性微生物に対する水産養殖魚の抵抗性を有意に増大させることができるということを本発明者が同定したことに基づく。このことは、本明細書中の実施例においてビオプラス２Ｂ(バチルス・リケニホルミスの胞子を含む)を多く含む魚飼料について示された。このことは、養殖魚をエルシニア・ルッケリ(Yerinia ruckeri)で誘発試験した際に、そうしたバチルス・リケニホルミスを多く含む飼料により水産養殖魚の相対生存率を有意に増大されたことによって示された。エルシニア・ルッケリは、レッドマウス病(enteric redmouth disease)に対する原因細菌である病原性微生物である。
【００１７】
従って、本発明の第一態様は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料に関する。
【００１８】
上で記載したように、そうした飼料は、水生動物用の飼料としての使用にかなり適している。
【００１９】
従って、本発明の第二態様は、水生動物の養殖であって、ここで該水生動物が、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料と接触される水産養殖に関する。
【００２０】
本発明の第三態様は、水産養殖において水生動物を飼育する方法であって、該水生動物を、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含む水生動物飼料で飼育することを含む方法に関する。
【００２１】
理論に限定されることなく、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌は、エルシニア・ルッケリなどの病原性微生物に対する水生動物の抗体量を有意に増大できると信じられている。抗体増加は、水生動物を病原性微生物に対してより抵抗性にする。さらなる詳細について、本明細書中の実施例を参照のこと。プロバイオティック微生物がその有効な効果を競争的排除よりはむしろ免疫刺激を通して与えるということが実証されたことは、始めてであると信じられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
定義
本発明の詳細な実施態様について議論する前に、本発明の主要な態様に関連する特有の用語の定義が与えられる。
「水産養殖」という用語は、水生動物がケージなどの物理的に閉じられた領域で養殖される、水生動物を水で養殖することとして当該技術分野に理解されるべきである。
【００２３】
「プロバイオティック」という用語は、当該技術分野において明確な用語であり、そして水生動物と物理的に接触される(例えば、食べられる)と、該動物に健康上の利益を与える微生物に関する。
【００２４】
「バチルス・リケニホルミス」という用語は、当該バチルス菌種について周知かつ明確な用語である。更なる詳細については、例えば標準参考書である「Bergeys Manual Of Systematic Bacteriology」を参照のこと。当業者の一般的な知識に基づいて、当業者は、関心のある特定のバチルス菌がバチルス・リケニホルミス菌であるかどうかを完全に決定できる。
本発明の実施態様は、一例として以下に記載される。
【００２５】
発明の詳細な記載
水生動物飼料
水生動物飼料は、適切な水生動物飼料成分を含むべきである。当業者は、関心のある特定の水生動物に関して、適切な飼料を選別することを承知している。本明細書中で、そうした適切な水生動物飼料成分は、それ自体周知である水生動物飼料成分であってよい。
【００２６】
当該成分は、好ましくは、動物の飼料必要量に合わせるために調節された濃度であるべきであり、そして動物性タンパク質などの栄養成分を約０〜９５重量％で、植物性タンパク質を約０〜９５重量％；家禽の卵を約０〜２５重量％で含んでも良い。
【００２７】
さらに、水生動物飼料は、他の適切な成分、例えばエルゴサン(アルギンに基づく免疫調節剤)；サラフィン、ロメット、テラマイシンなどの抗生物質を、約０.０１〜５０重量％；シアノコバラミンを約４０〜６０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ−ビオチンを約５〜２０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ−パントテン酸を約２５０〜３５０ｍｇ/ｋｇ；葉酸を約１０ｍｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ；Ｌ−アスコルビル−２−ポリホスフェート(ＳＴＡＹ−Ｃ、ビタミンＣの安定型)を約１０００〜４０００ｍｇ／ｋｇ；ミオ−イノシトールを約３,０００〜４,０００ｍｇ／ｋｇ；ナイアシンを約６００〜８００ｍｇ／ｋｇ；ｐ−アミノ−安息香酸を約３５０〜４５０ｍｇ／ｋｇ；塩酸ピリドキシンを約４０〜６０ｍｇ／ｋｇ；リボフラビンを約１２５〜１７５ｍｇ／ｋｇ；塩酸チアミンを約５０〜８０ｍｇ／ｋｇ；塩化コリンを約６,５００〜７,５００ｍｇ／ｋｇで含んでも良い。
【００２８】
水生動物飼料は、いずれの適切な形態、例えば粉末又はペレット若しくは錠剤の形態であってもよい。
【００２９】
水生動物飼料は、例えば一方の組成物が適切な水生動物飼料成分を含み、そしてもう一方が本明細書中に記載されるプロバイオティック・バチルス菌を含む２の異なる組成物の形態であってもよい。そうした場合では、水生動物飼料は、そうした２個の組成物から構成され、そして適切な指示により、水生動物に併せて同時に又は連続して与えられる。言い換えると、水生動物は適切な水生動物飼料成分で飼育される一方、該水生動物はまた、本明細書中で記載されるプロバイオティック・バチルス菌で飼育されるべきである。
【００３０】
或いは、該水生動物飼料は、適切な水生動物飼料成分と本明細書中に記載されるプロバイオティック・バチルス菌を含む組成物形態であってもよい。当該飼料は、適切な粉末又はペレット若しくは錠剤の形態であってもよい。
【００３１】
プロバイオティック細菌の幾つかの安定性の態様を改良するために、水生動物飼料を、脂溶性の生物活性化合物を含んだ油中固体型の安定なエマルジョン、例えば連続層の脂質形態中に溶解された阻害性フラノースとして提供し、そして飼料成分及び関心のプロバイオティック細菌を乾燥し、安定乳濁液の分散層を形成することは、利点があるであろう。例えば、更なる詳細についてWO02/00035を参照のこと。
【００３２】
さらに水生動物飼料は、カプセル、例えばマイクロカプセル化製品の形態であってもよい。
【００３３】
プロバイオティック・バチルス菌
プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌は、いずれのプロバイオティック・バチルス・リケニホルミスであってもよい。本明細書中に開示された情報に基づいて、当業者は、関心の特定のバチルス・リケニホルミスを選択することが出来る。
【００３４】
バイオ・プラス(商標)２Ｂ(Chr. Hansen A/S, デンマーク)は、バチルス・リケニホルミス・ＤＳＭ５７４９株を含む。本明細書中の実施例に示されるように、当該バチルス・リケニホルミス・ＤＳＭ５７４９株は、本文脈では、特に適切であり、そしてそれゆえ好ましいバチルス・リケニホルミス株である。当該バチルス・リケニホルミスＤＳＭ５７４９株は、本明細書中でＣＨ２００と呼ばれる。
【００３５】
プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌のほかに、水生動物飼料は、他の関心の微生物の全てを含んでもよい。好ましくは、関心のプロバイオティック微生物である。好ましくは、プロバイオティック微生物は、グラム陰性菌又はより好ましくはグラム陽性菌である。好ましいグラム陽性菌は、ラクトコッカスｓｐｐ.(Lactococcus spp.)、ラクトバチルスｓｐｐ.(Lactobacillus spp.)、ロイコノストックｓｐｐ.(Leuconostoc spp.)オエノコッカスｓｐｐ.(Oenococcus spp.)、ストレプトコッカスｓｐｐ.(Streptococcus spp.)、及びより好ましいバチルスｓｐｐ.(Bacillus spp.)から選ばれる株である。
【００３６】
好ましい他のプロバイオティック・バチルス菌は、バチルスｓｐｐであり、非限定的に、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ラテロスポラス(Bacillus laterosporus),Ｂ.アゾトホルマンス(B. azotoformans)、Ｂ.サーキュランス(B. circulans)、Ｂ.プミルス(B. pumilus)、Ｂ.レンタス(B. lentus)、Ｂ.アルベイ(B. alvei)、Ｂ.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、Ｂ.セレウス(B. cereus)、及びＢ.フィルムス(B. firmus)を含む。
【００３７】
多くの好ましい他のプロバイオティック・バチルス種は、バチルス・サブチリスである。本明細書中の実施例に記載されるように、バチルス・リケニホルミスとバチルス・サブチリスの混合物は、本事情ではかなり適切である。これらの２種のバチルス種は、異なる潜在的な相乗効果を導く生物化学特性を有する。 
【００３８】
バイオプラス(商標)２Ｂ(Chr. Hansene A/S、デンマーク)は、バチルス・サブチリスＤＳＭ５７７０株を含む。本明細書中の実施例に示されるように、当該バチルス・サブチリスＤＳＭ５７５０株は、本事情ではかなり適切であり、そしてそれゆえ好ましいバチルス・サブチリス株である。当該バチルス・サブチリスＤＳＭ５７７０株は、本明細書中でＣＨ２０１と呼ばれる。
【００３９】
従って、好ましい実施態様では、水生動物飼料は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌とプロバイオティック・バチルス・サブチリス菌の混合物を含む。
【００４０】
好ましくは、水生動物飼料は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を少なくとも１０6ＣＦＵ/ｇ飼料、より好ましくは少なくとも１０7ＣＦＵ/ｇ飼料、さらに好ましくは少なくとも１０8ＣＦＵ/ｇ飼料の濃度で含む。一般的に水生動物飼料は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を１０14ＣＦＵ/ｇ飼料未満の濃度で含む。
【００４１】
水生動物飼料は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌と１以上のほかのプロバイオティック微生物(例えばバチルス・サブチリス)との混合物を含み、プロバイオティック微生物の総量に基づいて、５〜９５％のプロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌及び５〜９５％の他のプロバイオティック微生物が存在することが好ましい。当業者は、合計が１００％を超えないことは当業者は当然理解している。言い換えれば、８０％がバチルス・リケニホルミスであるならば、残りの微生物は２０％を超えることはない。
【００４２】
他のプロバイオティック微生物がバチルス・サブチリスである場合、プロバイオティック微生物の総量に基づいて、３５％〜６５％のプロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌が存在し、そして３５％〜６５％のバチルス・サブチリス菌が存在することが好ましい。
【００４３】
プロバイオティック・バチルス菌は、細菌胞子、増殖性細菌細胞、細菌細胞壁、又はそれらの組み合わせのいずれかの形態であってもよい。好ましくは、プロバイオティック・バチルスは、増殖性細菌細胞の形態であるか、又はより好ましくは細菌胞子の形態である。
【００４４】
好ましくは、プロバイオティック・バチルス菌を、水生動物飼料中に乾燥(好ましくは凍結乾燥)細菌として含む。しかしながら、該プロバイオティック・バチルス菌を、細菌の凍結培養物として含んでもよい。
【００４５】
水生動物
本明細書中に記載される水生動物飼料は、甲殻類、軟骨魚類、魚類(fin fish)、又は水生動物に有害な効果を発揮する微生物の生存率の低下を主に引き起こすことにより、漁業及び養殖業において特に有用であることが認められる。
【００４６】
甲殻類は、ろ過摂食性の二枚貝、例えば、ハマグリ、アサリ、牡蛎、ホタテ、及びイガイを含んでもよいし、そしてさらにロブスター、カニ、及びエビを含んでもよい。
【００４７】
魚類は、非限定的に、例えば大西洋サケ(サルモ・サラル(Salmo salar)）、ニジマス(オンコルヒュンクス・ミキス(Oncorhynchus mykiss)）を含むサケ科からなる群から選ばれてもよい。
【００４８】
さらに好ましい水生動物は、ガドュス・カラリアス(Gadus callarias)、降海マス(サルモ・トルッタ(Salmo trutta)）、及びスズキ(ディケントラルクス・ラブラクス(Dicentrarchus labrax)）、及びタラ、ウナギ、並びに淡水魚類、及びコイである。さらに水生動物は、イルカ又はクジラであってもよい。
【００４９】
好ましくは水生動物は、水産養殖される動物である。
水生動物は、初期発生段階、例えば幼生、及び幼若動物であってもよく、又は幼若期より後の発育段階であってもよい。
【００５０】
病原性微生物に対する抵抗性
上記されるように、本明細書中で記載される水生動物飼料は、関連病原体微生物に対する水産養殖動物の抵抗性を有意に増大することができる。本明細書中の実施例において、バイオプラス２B(バチルス・リケニホルミスの胞子を含む)を多く含む魚飼料について実証される。そうしたバチルス・リケニホルミスを多く含む魚飼料は、養殖魚をエルシニア・ルッケリで誘発試験した際に、養殖魚の相対生存度を有意に増大できるということが示された。エルシニア・ルッケリは、レッドマウス病の原因細菌である重要な病原体微生物である。
【００５１】
本明細書中の実施例において、水産養殖ニジマスについて、本明細書中に記載される水生動物飼料が、プロバイオティック・バチルス菌を含まない対応の動物飼料で飼育されたコントロール群と比較して、少なくとも２０％、エルシニア・ルッケリに対するニジマスの相対生存率を増大できることが示された。
【００５２】
この事情では、ニジマスは、代表的な水生動物であると信じられている。言い換えれば、エルシニア・ルッケリに対する肯定的な抵抗性効果がニジマスについて示された場合、当該効果は他の水生動物一般に適用できると信じられている。理論に限定されることなく、プロバイオティック微生物が、エルシニア・ルッケリなどの重要な病原体微生物に対する肯定的な効果を与えると示したことは、始めてであったと現在信じられている。
【００５３】
従って、好ましい実施態様は、本明細書中に記載される水生動物飼料であって、該製品がニジマスの水産養殖に与えるために使用された場合、ニジマスをエルシニア・ルッケリで誘発試験した際に、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料で飼育されたコントロール群と比較して、ニジマスの相対生存率を少なくとも２％増大することができるという点で特徴付けられる飼料に関する。
【００５４】
上記されるように、好ましい実施態様では、水生動物飼料は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌及びプロバイオティック・バチルス・サブチリス菌の両方を含む。なぜなら、これらの２種のバチルス種は、有効な相乗効果を導く異なる生化学特性を有するからである。この特別な実施態様に関する特別な状況では、対応の動物飼料コントロールは、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌及びプロバイオティック・バチルス・サブチリス菌の両方を伴うべきではない。
【００５５】
本明細書中の実施例において、エルシニア・ルッケリで誘発試験されたニジマスの抵抗性の増加を評価する適切な試験アッセイが提供される。この事情において、当該アッセイは好ましいアッセイである。実施例の関連情報に基づいて、当業者は、当業者の一般的知識に基づいて、ニジマスの相対生存率の増加を測定するために十分正確であり、通常の計測誤差の範囲である対応のアッセイを作るかもしれない。
【００５６】
つまり、本アッセイは、以下のステップ：
(i)  １００匹の４月齢のニジマスからなる水産養殖ニジマス集団を２つ作り、
(ii)  １ｍ×１ｍ×１ｍの水層内の１の集団を、本明細書中に記載される水生動物飼料で飼育し(２８日間、毎日生物体量の３％の投与量)、もう一方の集団を同様に、但しプロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料コントロールを使用して飼育し(コントロール群)、
(iii)  ２８日の飼育後、各群の魚１０匹を取り出し、そして新しい水層へと移し変え、
(iv)  ２日間順化した後に、１匹あたり約２．５×１０６ＣＦＵの量を腹腔内注射することにより、該魚をエルシニア・ルッケリで誘発試験し、
(ｖ)  該魚を、個別の水層(１２〜１３度)中で２８日間観測し、そして毎日死亡数と相対生存率を計測する
を含む。
【００５７】
好ましくは、本明細書中に記載される水生動物飼料が水産養殖のニジマスの飼育に使用される場合、該ニジマスをエルシニア・ルッケリで誘発試験する際に、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料で飼育したコントロール群と比較すると、本明細書中に記載される水生動物飼料はニジマスの相対生存率の少なくとも５％の増加(より好ましくは、少なくとも１０％、さらに好ましくは１５％)を提供することができる。
【００５８】
水生動物が本明細書中に記載される水生動物飼料と接触される、水生動物の水産養殖
好ましくは、これは産業に関わる水産養殖に関し、ここで水生動物は物理的に規定された少なくとも１ｍ×１ｍ×１ｍの空間、例えば少なくとも１ｍ×１ｍ×１ｍの水層内で養殖される。物理的に規定された水産養殖の空間は、例えば１０ｍ×１０ｍ×５ｍのようにかなり大きくてもよい。
【００５９】
「水生動物が水生動物飼料と接触する」という用語は、給餌の直後の典型的な状況であって、水生動物が水生動物飼料と接触する状況、例えば水生動物が飼料を食べている間のことを指す。
【００６０】
飼育は当該技術分野に従って行われ、そして当業者は水産養殖の水生動物を適切に飼育する方法を知っている。
【００６１】
好ましい実施態様において、水産養殖における水生動物は、水産養殖の水生動物の全生物量の０.５％〜２５％に相当する量の水生動物飼料と接触され、より好ましくは、水産養殖における水生動物は、水産養殖の水生動物の全生物量の１％〜１０％に相当する量の水生動物飼料と接触される。
【００６２】
水生動物を本明細書中に記載される水生動物飼料で飼育することを含む、水産養殖における水生動物の飼育方法。
上で記載されるように飼育は、当該技術分野に従って行われ、そして当業者は、水産養殖における水生動物を適切に飼育する方法を知っている。
【００６３】
好ましくは、水産養殖における水生動物は、水産養殖における水生動物の全生物量の０.５％〜２５％に相当する量の水生動物飼料で飼育され、より好まし水産養殖の水生動物の全生物量の１％〜１０％に相当する量の水生動物飼料で飼育される。
【００６４】
例えば、本実施例中に記載されるとき、本明細書中に記載される水生動物飼料はまた、体重増加及び/又は飼料効率を改善する。
【００６５】
従って、好ましい実施態様は、水産養殖における水生動物を本明細書中に記載される水生動物飼料で飼育することを含む、水産養殖における水生動物の飼育方法であって、体重増加が、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミスを含まない対応の動物飼料で飼育されたコントロール群と比較して、少なくとも２％、例えば少なくとも５％、７％、１０％、１５％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上である、飼育方法に関する。
【００６６】
さらに、好ましい実施態様は、水生動物を本明細書中に記載される水生動物飼料で飼育することを含む水産養殖における水生動物の飼育方法であって、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料で飼育したコントロール群と比較して、飼料効率が少なくとも２％、例えば、少なくとも４％、７％、１０％、１５％、２０％、３０％又はさらにそれ以上増加する、飼育方法に関する。
【００６７】
さらに、好ましい実施態様は、水生動物を本明細書中に記載される水生動物飼料で飼育することを含む水産養殖における水生動物の飼育方法であって、水生動物をエルシニア・ルッケリで誘発試験した際に、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料で飼育したコントロール群と比較して、少なくとも２％の相対生存率の増加が得られる、飼育方法に関する。
【００６８】
上で記載されるように、好ましい実施態様では、水生動物飼料は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌及びプロバイオティック・バチルス・サブチリス菌の両方を含む。なぜなら当該２種のバチルス種は、有効な相乗効果を導く異なる生化学特性を有するからである。この特異的実施態様に関する特別の状況において、対応する動物の給餌コントロール製品は、プロバイオティック・バチルス・リケニホルミス菌とプロバイオティック・バチルス・サブチリス菌の両方を含むべきではない。
【００６９】
上記「病原性微生物に対する抵抗性」の節で説明したように、本明細書中の実施例は、エルシニア・ルッケリでの誘発試験に対する抵抗性の増加を評価するために、適切な試験アッセイを提供する。前節において、ニジマスに注目した。しかしながら、本節及び本明細書中のさらなる情報に基づいて、当業者は、当業者の一般知識に基づいて、関心の水生動物のいずれかに対する対応のアッセイであって、関心の水生動物の相対生存率の増加を測定するために十分正確であり、そして通常の計測誤差の範囲内であるアッセイを作ってもよい。
【００７０】
好ましくは、本明細書中に記載される水生動物の飼育方法において、水生動物をエルシニア・ルッケリで誘発試験した際に、バチルス・リケニホルミス菌を含まない対応の動物飼料で飼育したコントロール群に比較して、水生動物の相対生存率の少なくとも５％(より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも１５％)の増加を得られた。
【００７１】
本発明の別の態様
上記される様に、プロバイオティック・微生物が、重要な病原性微生物、例えばエルシニア・ルッケリに対する本明細書中に記載された有効な効果を与えても良いと示されたことが始めてであると現在信じられている。
【００７２】
理論に限定されることなく、本明細書中に提供される情報に基づいて、当業者は、当業者の通常の一般的な知識に基づいて、当該有効な効果を与えることができる他のプロバイオティック微生物及びそれらの組み合わせを同定することができる。
【００７３】
従って、本発明の別の態様は、プロバイオティック微生物を含む水生動物飼料で水生動物を飼育することを含む水産養殖における水生動物を給餌する方法であって、水生動物をエルシニア・ルッケリで誘発試験した際に、プロバイオティック微生物を含まない対応の動物飼料で飼育したコントロール群と比較して水生動物の相関生存割合の少なくとも２％の増加が得られる方法に関する。
【００７４】
好ましくは、当該プロバイオティック微生物は、グラム陰性菌であるか、又はより好ましくはグラム陽性菌である。好ましいグラム陽性菌は、菌又はより好ましくはグラム陽性菌である。好ましいグラム陽性菌は、ラクトコッカスｓｐｐ.(Lactococcus spp.)、ラクトバチルスｓｐｐ.(Lactobacillus spp.)、ロイコノストックｓｐｐ.(Leuconostoc spp.)オエノコッカスｓｐｐ.(Oenococcus spp.)、ストレプトコッカスｓｐｐ.(Streptococcus spp.)、及びより好ましいバチルスｓｐｐ.(Bacillus spp.)からなる群から選ばれる種である。
全ての他の態様、実施態様、及び本明細書中のほかの情報はまた、本発明の別の態様に関し、本発明の別の態様に関して含まれる。
【実施例】
【００７５】
材料と方法
魚
使用されたニジマスは、Faarup Molle Dambrug,デンマークからBorhholms Laksekiaekkeri, デンマークに提供された卵を孵化させることにより得た。該卵を到着時に殺菌し、そして再循環淡水中で７℃にて孵化させた。
【００７６】
ニジマスの稚魚は、２００２年３月１日に孵化し、その後、特別なトレー中に１０℃の冷水中で飼育し、そしてその後１ｍ×１ｍ×１ｍの水槽中で飼育した。稚魚を実験で使用するまで、市販のニジマス飼料(Biomar, Denmark)で飼育した。
【００７７】
水産養殖地
水産養殖地は、デンマークのBorhholms Lakeseklaekkeriであった。この地の水は再循環した淡水であり、そして病原体がいない状態に連続して維持した。水を機械的及び生物学的にろ過し、そしてＵＶ処理することにより循環した。
【００７８】
実験設計
４月齢のニジマスを、各１００匹の６群に分けた。ニジマスを１０℃の再循環水で満たした１ｍ×１ｍ×１ｍの水槽中で養殖した。２つの群は、プロバイオティックを加えていないＢｉｏＭａｒニジマス飼料で飼育したコントロール群であった。
【００７９】
２つの群を、アルギンに基づく免疫調節製品・アクアバック・エルゴサン(Ａｑｕａｖａｃ Ｅｒｇｏｓａｎ)(Aquaculture Vaccines Ltd.)を多く含む同じ飼料で飼育した。アクアバック・エルゴサンは、製品説明書に従って、混合飼料中０.２％になるまで加えた。
【００８０】
２つの群を、プロバイオティック・バチルス菌を多く含む同じ飼料で飼育した。当該飼料は、バイオプラス２B(Chr. Hansen A／S)を多く含んだ。バイオプラス２Bの定量的組成は以下：
バチルス・リケニホルミスＣＨ２００胞子濃度      ０.５％
バチルス・サブチリスＣＨ２０１胞子濃度          ０.５％
ケイ酸アルミニウム・ナトリウム(Ｅ５５４)        １.０％
乳清透過液                                      ９８.０％
であった。バチルス濃度４×１０９ＣＦＵ／ｇ(飼料)の濃度で得るために、バイオプラス２Ｂを加えた。
【００８１】
全ての魚に、その全生物量の３％に相当する量の１日あたりの飼料を与えた。当該実験を２００２年７月２日に開始し、そして２００２年８月１３日に終えた。２００２年７月２日、２００２年７月１６日、２００２年７月３０日、そして２００２年、８月１３日にサンプルをとり、そして分析した。
【００８２】
サンプル分析
血液
各サンプル分析において、各群から１０匹の魚の血液サンプルを採取した。但し、実験未使用魚の初回サンプル採取を除く。ここで全体として２０匹から血液サンプルを得た。該血液サンプル試験を、ヘパリン処理されたヘマトクリットチューブ(１０又は２０μｌの体積)中で行った。ヘマトクリット分析を、１０００×ｇで５分間遠心後に行った。チューブを切った後に、体積を計算し、そして血漿サンプルを、更なる分析まで−２０℃で維持した。さらに、対物ガラス上に血液細胞を蒔いた。これを風乾し、そして無水エタノールで固定した。細胞をギムザ染色し、そして顕微鏡により１０００血球数あたりのリンパ球の数を計数した。血漿サンプルをタンパク質検出にも使用した。ここではＢＣＡ−Ｋｉｔ(Ｐｒｏｍｅｇａ)を使用した。
【００８３】
誘発試験
サンプルを回収した各日に、１０匹を各群から回収した。これらの魚を、他の水槽へ生きたまま移した。２日の順化期間の後、魚１匹あたり約２.５×１０６ＣＦＵの量を腹腔内注射することにより、エルシニア・ルッケリで誘発試験した。個別の水槽(１２℃〜１３℃)で、魚をその後２８日間連続して観測した。死亡数を毎日記録し、そして相対生存率を計算した。
【００８４】
抗体決定
ニジマスサンプルの異なる群におけるエルシニア・ルッケリに対する異なる抗体特性が存在したかを決定するために、血漿サンプルをＥＬＩＳＡ試験に使用した。マイクロタイター・プレート(９６ウェル免疫プレート)を、ホルマリンで殺菌したエルシニア・ルッケリ(１ウェルあたり２００マイクロタイター、１×１０5ｃｆｕ／ｍｌ)で標準条件にてコートした。ブロッキング及び洗浄の標準方法により、アッセイを行った。試験サンプル魚からの血漿(１：１００希釈)を、一次抗体として使用し、ニジマス抗体と反応するウサギ抗体を、二次抗体として使用し、そして三次抗体としてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体(Ｓｉｇｍａ)を使用した。発色基質は、ＯＰＤ(Ｓｉｇｍａ)であり、そして吸光度を４９２ｎｍで計測した。
【００８５】
飼料中及び魚の腸管内のバチルス胞子
４２日目において、魚の腸管内にバチルス・サブチリス及びバチルス・リケニホルミスが存在するかを分析するために、異なる試験群からサンプルを取った。さらに、使用されたＢｉｏＭａｒ飼料のサンプルを採取した。
【００８６】
全量及び重量増加
魚のサンプルをとった各日及び時間に、該魚の全長及び重量を計測した。
【００８７】
結果
全体
試験群のいずれにおいても、拒食症又は他の悪い状態は記録されなかった。ニジマスは、申し分のない様式で飼料を全て食べた。
誘発試験
エルシニア・ルッケリ誘発試験において、エルゴサン群は、１４日及び２８日後において、コントロールに対して改善された生存率を有さなかった。エルゴサンを多く含む飼料で４２日の飼育後、弱い限定された生存率の改善が見られた。バイオプラス２Ｂを多く含む飼料で飼育された魚は、全ての試験において、生存率の有意な改善を有した。相対生存率は、バイオプラス２Ｂを多く含む飼料で１４日、２８日、４２日飼育後に、それぞれ２０％、２０％、及び３５％であった。
【００８８】
血液パラメーター
血漿タンパク質、ヘマトクリット値、及びリンパ球細胞数について、個々の試験群間の計測できる有意な差を同定できなかった。
しかしながら、エルシニア・ルッケリに対する抗体特性について、エルゴサンを多く含む飼料群と比較して、バイオプラス２Ｂを多く含む飼料群において有意に高いエルシニア・ルッケリ抗体があったと明らかにされた。
【００８９】
飼料中及び魚の腸管中のバチルス胞子
分析により、バイオプラス２Ｂを多く含む飼料で飼育された魚の中において、及びバイオプラス２Ｂを多く含む飼料中にも、高濃度の２種のバチルス種が示された。
【００９０】
全長及び体重増加
全長及び体重増加の両方は、コントロール群とエルゴサン群の両方と比較して、バイオプラス２Ｂ群において有意に増大した。
【００９１】
考察
本調査により、水産養殖された魚をエルシニア・ルッケリに晒すことで誘発試験した際に、バイオプラス２Ｂを多く含む魚飼料は、水産養殖されたニジマスの生存率を有意に増大できるということが示された。
【００９２】
当該データーにより、エルゴサンを多く含む飼料群に比較して、バイオプラス２Ｂを多く含む飼料群において、有意に高いエルシニア・ルッケリ抗体タイターが存在したということが示された。この抗体の増加が、ニジマスを、病原性エルシニア・ルッケリに対しより抵抗性にしたと信じられている。さらに、コントロール群及びエルゴサン群と比べて、バイオプラス２Ｂ群において、全長及び重量はともに有意に増加した。
【００９３】
参考文献
ＷＯ  ０２／０００３５
ＪＰ  ２０００２１７５６７Ａ
ＪＰ  ２０００１０３７４０Ａ
ＥＰ  ２８７６９９Ｂ１  (Ｃａｌｐｉｓ,日本)
ＪＰ  ６２１３８１４８  Ａ
ＲＵ  ２１８６５７６
バイオプラス(商標)２Ｂ  (Ｃｈｒ.  Ｈａｎｓｅｎ  Ａ／Ｓ,デンマーク)
【国際調査報告】
2006524997.tif 000002
2006524997.tif 000003
2006524997.tif 000004
2006524997.tif 000005