(57)【要約】  支持体と、その上に配置された、生物学的プローブを担持する微小球の層とを含んでなるマイクロアレイであって、前記微小球が、該微小球を同定するために発色させて用いることができる潜在的カラーを有する少なくとも１種の物質を含むマイクロアレイ。該マイクロアレイを使用して生物学的分析物を同定する方法をも開示する。
2006528773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、その上に配置された
生物学的プローブを担持する微小球の層と
を含むマイクロアレイであって、前記微小球が、該微小球を同定するために発色させて用いることができる潜在的カラーを有する少なくとも一種の物質を含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
該マイクロアレイが該支持体上にランダムな分布又は秩序ある分布で配置されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
該潜在的な着色剤が現像されて光学シグナチャーとなることができることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
該光学シグナチャーが蛍光、吸収、又は化学発光であることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
該潜在的な着色剤が化学的又は物理的な手段によって光学シグナチャーに現像されることができることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
該化学的手段は、縮合反応、酸−塩基反応、酸化還元反応、引き抜き反応、付加反応、脱離反応、協調反応、連鎖伝播反応、錯形成反応、分子結合反応、転位反応、又は上記の二つ以上の組み合わせ、であることを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
該物理的手段は、光開始プロセス、熱開始プロセス、電離放射線開始プロセス、電子線開始プロセス、電気開始プロセス、圧力開始プロセス、磁気開始プロセス、超音波開始プロセス、又は上記の二つ以上の組み合わせ、であることを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
該光学シグナチャーを用いて標的分析物を同定できることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
該潜在的カラーを有する物質が、ロイコ色素、ロイコ色素の前駆物質、写真カプラー、金属錯形成リガンド、フォトクロミック色素、又はサーモクロミック色素であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
該生物プローブが生物活性であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１１】
該生物活性プローブが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、又は小さな合成分子、を含むことを特徴とする請求項１０に記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
該微小球が化学的又は物理的相互作用によって二次元支持体に固定されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
該微小球がゲル化プロセスによって二次元支持体に固定されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
該微小球が1乃至50μmという平均直径を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
該微小球が5乃至20μmという平均直径を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１６】
該支持体上の微小球の濃度が1 cm2あたり100乃至百万個であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１７】
該支持体上の微小球の濃度が1 cm2あたり10,000乃至100,000個であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１８】
生物分析物を同定する方法であって：
潜在着色剤と生物プローブを含む微小球のアレイを用意するステップ；
前記微小球と前記生物分析物との間で接触させるステップ、該分析物は光学的放出タグで標識されている；
該生物分析物とプローブの間で相互作用させるステップ；
該アレイを洗浄して結合していない分析物を除去するステップ；
光学的放出タグからの信号を記録するステップ、プローブと分析物の結合から生ずる前記信号を画像Aとして記録する；
微小球内の潜在着色剤化合物を、検出できる光学シグナチャーに現像するステップ；
該光学シグナチャーを画像Bとして記録するステップ；及び
画像AとBを比較して該生物的ターゲットを同定し濃度を決定するステップ；
を含む方法。
【請求項１９】
生物分析物を同定する方法であって：
潜在着色剤を含み生物プローブを表面に担持する微小球を用意するステップ；
前記微小球と前記生物分析物との間で接触させるステップ、該分析物は光学放出タグで標識されている；
該生物プローブと該分析物の間で相互作用させるステップ；
微小球を洗浄して結合していない分析物を除去するステップ；
前記微小球を支持体の二次元表面に固定してマイクロアレイを形成するステップ；
プローブと分析物の相互作用から生ずる該光学放出タグからの信号を測定し、その信号を画像Aとして記録するステップ；
該微小球の潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーに現像して、そのシグナチャーを画像Bとして記録するステップ；及び
画像AとBを比較して分析物を同定しその濃度を決定するステップ；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物的マイクロアレイ・テクノロジー一般に関する。詳しくは、本発明は基板に固定された微小球のアレイに関し、微小球の表面をテスト・サンプルに含まれる分析物に曝露する方法に関する。微小球は潜在的な着色剤を含み、色がスイッチオンされるとそれによって微小球が同定される。微小球はまた、表面にキャプチャー物質（プローブとも呼ばれる）を担持する。
【背景技術】
【０００２】
現在のテクノロジーはマイクロアレイを製造するのにいろいろなアプローチを用いている。例えば、米国特許第5,143,854, 5,412,087, 及び5,489,678号は、フォトリソグラフィー工程を用いてペプチド及びDNAマイクロアレイを作る方法を開示している。これらの特許は、ペプチド及びDNAマイクロアレイを作るために、感光性の保護基を使用して、フォトリソグラフィーによって1 cm x 1 cmチップ上の定められたスポットの保護を順次解除し、その後全表面に活性化されたアミノ酸又はDNA塩基を流すというやり方を教示している。このプロセスを繰り返すことによって、アレイの異なるスポットに何千という異なるペプチド又はオリゴヌクレオチド配列を有するペプチド又はDNAマイクロアレイを構築することができる。この方法は高価である。別の人たちは（例えば、米国特許第6,079,283, 6,083,762, 及び6,094,966号）インクジェット方法を用いて空間的にアドレスできるアレイを作成しているが、この方法も、スポット・サイズが40乃至100μmと比較的大きいのに加えて、製造コストが高くなる。
【０００３】
空間的にアドレスできる方法への別のアプローチとして、蛍光色素を組み込んだポリマー微小球を用いて生物的マルチプレックス・アレイを製造するという考え方がある。米国特許第5,981,180号は、カラー・コードを有する微小球をフローサイトメトリーと併せて用いてマルチプレックス生物学分析を行う方法を開示している。表面にDNA又はモノクローナル抗体プローブが接合された微小球が、いろいろな異なる比の二つの蛍光色素で内部的に染色された。何百という“分光的にアドレスされた”微小球を生物的サンプルと反応させ、単一微小球をフローサイトメトリー・セルに通してサンプル情報を解読することによって“液体アレイ”が分析された。米国特許第6,023,540号は、遠位端に予めエッチングされたマイクロウエルを有する光ファイバー束を用いて色素を組み込んだ微小球を構成する方法を開示している。分光的にアドレスされた各微小球の表面にユニークな生物活性物質が付着され、異なる生物活性プローブを担持する何千という微小球が全体として、光ファイバー束の予めエッチングされたマイクロウエルに“微小球アレイ” を形成する。最近は、光学的にコードされた微小球という新しいアプローチが、微小球に組み込まれた異なるサイズの硫化亜鉛キャップ（capped）のセレン化カドミウム・ナノ結晶を用いて実行された（Nature Biotech. 19, 631-635, (2001)）。これらのナノ結晶が有する狭い帯域幅を考えると、このアプローチは微小球における分光的なバーコード能力を著しく拡大する。
【０００４】
“分光的にアドレスできる微小球”アプローチが旧式の“空間的にアドレスできる” アプローチに比べてマイクロアレイの作成において簡単さの点で利点があるとしても、生物的マイクロアレイの製造をもっと難しくない、金のかからないものにしたいというニーズが依然としてこの分野に存在していた。
【０００５】
USSN 09/942,241は、以前に開示されたものに比べて、支持体を変える必要がなく、それでも微小球が基板に固定されるためにそれほどコストが高くなく容易に調製できるマイクロアレイを開示している。USSN 09/942,241は、ゲル化剤又はゲル化剤の前駆物質を含む液体中に分散された微小球を含む組成物でコートされたマイクロアレイを提供し、微小球は基板上にランダムな位置に固定される。基板は、微小球と物理的又は化学的に相互作用するように設計されたレセプターを含まない。その発明は、ユニークなコーティング組成物及びテクノロジーを用いて基板上にマイクロアレイを作成するものであり、この分野で開示されていたように、基板を予めエッチングしてマイクロウエルを作ること、又は何らかの仕方で予め場所をマークすることは必要ない。
【０００６】
USSN 09/942,241は、いろいろなコーティング方法を教示し、ゼラチン中に微小球を分散させた液体コーティング組成物によって支持体をコートする機械コーティングを例示している。コーティングの直後、支持体をコーティング機の冷却硬化チャンバを通過させてゼラチンを急速にゲル化させ、微小球を固定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
その発明は、当時存在していたテクノロジーに比べて製造面で大きな利点があったが、それでもやはりいくつか問題がある。微小球に基づくマイクロアレイを作成する現在のやり方の多くと同様に、これも個々の微小球を微小球に取り込まれた着色剤からのユニークに同定される光学信号によるカラー・バーコーディングを用いており、色の強度と色合いは微小球の表面に共有結合で付着されたユニークな生物学的プローブと結びついている。しかし、このアプローチには二つの問題がある：すなわち、（１）着色剤自身が蛍光を放出し、それが生物的相互作用から生ずる蛍光信号と干渉する；（２）バーコード色素の吸着波長が生物的相互作用から生ずる蛍光放出と相補的である場合、蛍光信号強度が著しく低下する。問題１は、微小球のカラー・バーコーディング多様性を厳しく制約し、問題２はダイナミック・レンジとマイクロアレイ・システムの検出限界を劇的に低下させる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
支持体と、その上に配置された
生物学的プローブを担持する微小球の層とを含んでなるマイクロアレイであって
前記微小球が、該微小球を同定するために発色させて利用できる潜色を有する少なくとも一種の物質を含むものからなる微小球系マイクロアレイシステムを開示することによって、上述の問題を解決する。
【０００９】
本発明は、また、そのようなマイクロアレイを利用する方法であって、
潜在着色剤と生物プローブを含む微小球のアレイを設けるステップ；
前記微小球と、光学的放出タグでラベルされた前記生物的分析物とを接触させるステップ；
生物的分析物とプローブの間で相互作用させるステップ；
アレイを洗浄して結合していない分析物を除去するステップ；
プローブと分析物の結合から生ずる信号である光学的放出タグからの信号を記録し、前記信号を画像Aとして記録するステップ；
微小球の潜在化合物を検出可能な光学シグナチャーとして発色させるステップ；
この光学シグナチャーを画像Bとして記録するステップ；
画像AとBを比較して生物的ターゲットを同定し濃度を決定するステップ；
を含む方法を開示する。
【００１０】
別の方法は、次のステップ、すなわち：
潜在着色剤を含み、表面に生物プローブを担持する微小球を設けるステップ；
微小球と、光学的放出タグでラベルされた分析物とを接触させるステップ；
生物的プローブと分析物の間で相互作用させるステップ；
微小球を洗浄して結合していない分析物を除去するステップ；
支持体の二次元表面に微小球を固定してマイクロアレイを形成するステップ；
プローブと分析物の相互作用から発生される信号である光学的放出タグからの信号を測定し、この信号を画像Aとして記録するステップ；
微小球の中の潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーに発色させ、このシグナチャーを画像Bとして記録するステップ；
画像AとBを比較して分析物を同定し濃度を決定するステップ；
を開示している。
【発明の効果】
【００１１】
本発明はいくつかの利点を有するが、そのすべてが一つの実施形態には組み込まれない。ある利点としては、本発明の微小球は“分光的にアドレスされる微小球”に関連したある特定の問題、すなわち、微小球で普通用いられる着色化合物が多くの場合蛍光性であり、マイクロアレイについて蛍光測定を行うときに過剰な“バックグラウンド・ノイズ”を生ずるという問題、を解決できる。この問題は、化学反応、物理的トリガー、又は何らかの環境的刺激によって着色状態に“スイッチ”されるまでは無色で比較的放出が低い潜在着色剤を使用することで解決できる。別の利点として、潜在着色剤の使用によって微小球の“分光的バーコーディング”能力は著しく拡大され、それにより多様な微小球を多数生成することが可能になる。したがって、単一のアレイで、より多くのターゲット分析物を一回の実験で測定することができる。本発明の別の利点として、無色コーディングによって微小球からのバックグラウンド蛍光が検出できないほどになり、したがって、検出限界が驚くほど改善される。そのようなものとして、本発明によって調製されるマイクロアレイはまた、ターゲット分析物の測定で広いダイナミック・レンジを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、支持体上の“ビーズ”とも呼ばれる微小球に基づくマイクロアレイを開示する。マイクロアレイの各微小球は、はっきりとした光学シグナチャーを有し、それによってその微小球を異なる光学シグナチャーを有する他の微小球から区別できる−すなわち、シグナチャーはユニークである。そのようなものとして、本発明は、微小球の層が二次元平面にランダム又は秩序あるパタンで固定された支持体から成るマイクロアレイを提供する。
【００１３】
本明細書で用いる場合、“マイクロアレイ”又は“アレイ”という用語は、支持体上に二次元平面にランダムに又は秩序よく分布された複数の微小球を意味する。微小球には、一種以上の化合物が取り込まれ、その化合物は潜在着色剤であって、化学的又は物理的な手段によって色を発現させることができる。微小球の表面は生物活性プローブを付着させることができ、通常付着されている。本明細書で用いる場合、生物活性プローブとは、ある種の生物的ターゲットと特異的に相互作用することができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、及び小さな合成分子などを含むが、それだけに限定されない。好ましい生物活性プローブは核酸及び蛋白質である。マイクロアレイは、普通、一つよりも多くの着色剤タイプと一つよりも多くのタイプの生物活性プローブを有する微小球を含む。アレイのサイズや形は組成と意図する用途によって異なる。さらに、アレイはいろいろな型式の複数のサブアレイを含むことがある。
【００１４】
本発明では、支持体上の微小球の分布又はパタンは、秩序あるものであっても、全くランダムであってもよい。微小球は、支持体の表面上の二次元平面に固定される。可能な支持体としては、ガラス、金属、ポリマー、及び半導体、などがあるが、それだけに限定されない。支持体は透明であっても不透明であってもよい。場合によっては、支持体は多孔質の膜、例えばニトロセルロース及びポリビニリデン・ジフルオリドであってもよい。微小球は、支持体と微小球の間の物理的又は化学的な相互作用によって支持体の表面に固定される。堅牢さと再現性を高めるために、ある種の化学的な機能物質によって修飾された表面に、すなわち、表面を化学的に処理又は修飾して微小球が付着できるようにして、微小球を固定する方が望ましい。当業者には理解されるように、表面を修飾して、物理的な力、例えば静電的、磁気的な力、圧縮力、接着力を付与してそのように修飾された表面に微小球が付着できるようにしてもよい。一般に、支持体表面は平面であるが、規則的又は不規則な三次元構造を有する修飾された表面であってもよく、例えば、マイクロウエル、又は空洞、を用いて微小球をウエルに埋め込むことによって表面に微小球を固定することもできる。微小球は、また、微小球が二次元アレイで並ぶことができるような、局限されたスペース、例えばチューブ、チャンバ、などを通って流れるようにして二次元平面に固定することもできる。
【００１５】
ある好ましい実施形態では、微小球は“ゾル−ゲル”転移プロセスを含むコーティング方法によって表面に固定される。本明細書で用いる場合、“ゾル−ゲル転移”又は“ゲル化”とは、粒子の液体溶液又は懸濁液が定常状態での流動を示さない三次元ネットワークを形成するプロセスを意味する。これは、多官能性モノマーの存在下での重合によるポリマーにおいて、反応性の側鎖を有する溶解したポリマーの共有結合による架橋によって、及び溶液中のポリマーの間の、例えば水素結合、による二次的な結合によって起こりうる。ゼラチンなどのポリマーは、後者のタイプの熱的なゲル化を示す。ゲル化又は硬化のプロセスは粘度の不連続な上昇によって特徴づけられる。（P. I. Rose, “The Theory of the Photographic Process,” 4th Edition, T. H. James ed. p. 51-67、を見よ）。
【００１６】
本明細書で用いる場合、“ゲル化剤”という用語は、上述のようなゲル化を生ずることができる物質を意味する。例としては、熱的なゲル化を起こすゼラチン、水溶性セルロース・エーテル、又はポリ（イソプロピルアクリルアミド）などの物質、又はホウ酸化合物により化学的に架橋されるポリ（ビニルアルコール）などの物質、がある。その他のゲル化剤としては、紫外線などの放射によって架橋するポリマーガアル。ゲル化剤の例としては、アカシア、アルギニン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、セトステアリル・アルコール、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、ゼラチン、グアールガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシプロピル・メチルセルロース、ケイ酸マグネシウム・アルミニウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリビニル・アルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレン・グリコール、アルギン酸ナトリウム、グリコール・デンプン・ナトリウム、スターチ、トラガカント及びキサンタム・ガム、などがある。（ゲル化剤についてのさらに詳しい議論は、添付の参照文献、Secundum Artem, Vol. 4, No. 5, Lloyd V. Allen, を見よ）。好ましいゲル化剤はアルカリ処理ゼラチンである。
【００１７】
コーティング方法は、Edward Cohen and Edgar B. Gutoff, “Modern Coating and Drying Technology”, (Interfacial Engineering Series; vol. 1), Chapter 1, (1992), VCH Publishers Inc/. New York, NY,に広く記述されている。単一層形態の場合、コーティング方法は、ディップ・コーティング、ロッド・コーティング、ナイフ・コーティング、ブレード・コーティング、エアーナイフ・コーティング、グラビア・コーティング、フォワード及びリバース・ロール・コーティング、及びスロット及び押出コーティングなどがある。
【００１８】
乾燥方法もいろいろあり、場合によっては驚くほど結果が異なる。例えば、液体ゼラチン／微小球組成を冷却硬化によって急速に乾燥すると、ゼラチンが微小球の隆起した表面から流動してしまう前にゲル化が起こり、ゼラチンの層が形成されて微小球の表面とそこに付着される物質との直接の接触がブロックされる。液体組成物を周囲温度でゆっくりと乾燥させた場合、ゼラチンが微小球の表面から流れ去り、実質的にゼラチンがない微小球が残される。“実質的にゼラチンがない”とは、微小球の表面がそれに付着するプローブ又は物質と相互作用するのに十分なほどゼラチンが無いということを意味する。
【００１９】
微小球又はビーズは、ポリマー、ガラス、又はセラミック、などから成るが、それだけに限定されない。好ましくは、微小球はポリマー材料から作られる。ポリマー微小球を作成するために適当な方法は、”Emulsion Polymerization” by I. Piirma, Academic Press, New York (1982)に記載されているような乳化重合、又はT. H. Whitesides and D. S. Ross in J. Colloid Interface Science, vol. 169, p.48-59, (1985)、に記載されているような限定凝集によるものである。粒子又は微小球を作るために用いられる特定のポリマーは、水不混和性の着色できる人工ポリマーである。好ましいポリマーは、水不混和性アモルファスポリマーである。用いることができるポリマータイプの例としては、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）又はポリ（ブチルアクリレート）などがある。スチレンとブチルアクリレートの共重合体などのコポリマーも使用できる。ポリスチレンポリマーは好適に用いられる。
【００２０】
形成された微小球には、以後の処理で溶解されない有機又は無機の不溶性潜在着色剤が取り込まれる。適当な化合物は油溶性のものであって良い。化合物は、微小球に取り込まれたときに非蛍光性であることが好ましい。調製の容易さという点では、微小球又は実質的に曲線的な形の粒子が好ましいが、他の形、例えば回転楕円体又は立方体、の粒子も用いることができる。
【００２１】
微小球は、平均直径が1乃至50μmの範囲にあることが望ましく、さらに好ましくはが3乃至30μmの範囲、最も好ましくはが5乃至20μmの範囲、にある。コーティングにおける微小球の濃度は、好ましくは1 cm2あたり100乃至100万個の範囲にあり、さらに好ましくは1 cm2あたり1000乃至200,000個の範囲、最も好ましくは1 cm2あたり10,000乃至100,000個の範囲にある。
【００２２】
微小球の表面には生物活性プローブが付着する。本明細書で用いられる場合、生物活性プローブとは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、及び小さな合成分子であってある生物ターゲットと特異的な相互作用できるもの、などであるが、それだけに限定されない。
【００２３】
核酸は、遺伝情報を担うポリヌクレオチド分子である。核酸には基本的に二種類あり、それはデオキシリボ核酸（DNA）とシリボ核酸（RNA）である。DNA分子は４種のヌクレオチド塩基、A、T、G、及びC、から成り、それらが共有結合によって線状に結合している。RNA分子は４種の塩基、A、U、G、及びC、から成り、それらが共有結合によって線状に結合している。４種の塩基間の相互作用は、水素結合で媒介されるAとT（U）、及びGとC、という“Watson-Crick”塩基対規則に従う。完全な“Watson-Crick”塩基対を有する二本の一本鎖DNA分子がマッチするとき、それらは相補的なストランドと呼ばれる。二つの相補的なストランドの間の相互作用はハイブリダイゼーションと呼ばれる。このようなものとして、一本鎖DNA又はRNAは、その相補的なストランドと相互作用する生物活性プローブとして用いることができる。場合によっては、相補的なストランドは一つ以上のミスマッチを含むことがある。
【００２４】
本発明において利用できるよく用いられる核酸生物活性プローブとしては、DNA及びDNA断片、RNA及びRNA断片、合成オリゴヌクレオチド、及びペプチド核酸、などがあるが、それだけに限定されない。本発明の別の実施形態では、核酸生物活性プローブは、特定のDNA配列を認識できる何らかの蛋白質骨格又は合成分子部分（moiety）である。核酸生物活性プローブは、末端で一つ以上の化学官能基を含むように修飾し、それを用いて別の分子又は表面に付着するようにできる。よく用いられる末端の修飾としては、アミノ、チオール、カルボキシル、ビオチン、及びジゴキシゲニン、などがあるが、それだけに限定されない。
【００２５】
蛋白質分子は20のアミノ酸から成り、それらが共有結合で線状に結合している。蛋白質によっては、リン酸化及びグリコシル化などの翻訳後のプロセスによっていくつかのアミノ酸の場所でさらに修飾されることがある。蛋白質分子は生物活性プローブとして使用することができる。蛋白質生物活性プローブは、高い親和度と高い特異性で蛋白質と相互作用できる。普通、蛋白質生物活性プローブと標的蛋白質の間の親和度結合定数は106 M-1よりも大きいことが望ましい。蛋白質マイクロアレイで蛋白質生物活性プローブとして用いることができる分子の部類はいくつかある。
【００２６】
抗体は、高い親和度と特異性で標的と結合できる天然に生ずる蛋白質分子の部類である。抗体の性質とそれを用いる手順は、“Using Antibodies: A Laboratory Manual”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, by Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor, NY 1999)、に見られる。
【００２７】
抗原も、抗体が検出しようと意図する標的である場合に蛋白質生物活性プローブとして使用できる。全蛋白質／酵素などの蛋白質骨格又はそれらの断片も蛋白質生物活性プローブとして用いることができる。例としては、ホスファターゼ、キナーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、ヒドロリアーゼ、サイトカイン、ケモカイン、又は合成ペプチド、がある。核酸リガンドは、ある種の標的に対する結合親和度と特異性をもつようにin vitroで選択され濃縮した後に蛋白質生物活性プローブとして使用できる。このような選択プロセスの原理は、Science, Vol. 249, 505-510, 1990,及びNature, Vol. 346, 818-822,に見ることができる。米国特許第5,110,833号は、抗体の結合親和度と特異性を模倣できる合成分子の別の部類を開示しており、これはいわゆるMolecular Imprinting Polymer (MIP)によって容易に調製できる。このテクノロジーの概説はChem. Rev. Vol. 100, 2495-2504, 2000にある。
【００２８】
化学的に官能化された微小球の表面への核酸生物活性プローブと蛋白質生物活性プローブの付着は、この分野で公開されている手順に従って行うことができる（Bangs Laboratories, Inc., Technote #205）。微小球の表面でよく用いられる化学的官能基としては、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド、アミド、クロロメチル、エポキシ、アルデヒド、等があるが、それだけに限定されない。
【００２９】
ある好ましい実施形態では、一つの微小球は一つのタイプの生物活性プローブとしか結びつけられない。また、最初に生物活性プローブを合成して、次に共有結合で微小球に付着させることが好ましい。しかし、当業者には理解されるように、生物活性プローブは微小球上でin situで（その場で）合成することもできる。どちらかの手段によって、いろいろな長さのリンカーを用いて生物活性プローブを微小球に結びつけて、生物活性プローブと標的分子との最適な相互作用のためにフレキシビリティーを付与することができる。
【００３０】
本発明によれば、微小球はさらに一つ以上の潜在着色剤を光学シグナチャーとして含む。本明細書で用いる場合、“潜在着色剤”という用語は、化学的又は物理的手段によって変調させることができる吸着及び放出特性を有する分子を意味する。潜在着色剤は無色で蛍光を出さないことが好ましい。ある好ましい実施形態では、光学シグナチャーは一つの潜在着色剤又は二つ以上の潜在着色剤の混合を用いて発生される。本明細書で用いる場合、“光学シグナチャー”という用語は、光学的方法で検出及び／又は測定できる吸着又は放出信号を意味する。そのような信号としては、吸着、蛍光、及び化学発光などがあるが、それだけに限定されない。
【００３１】
本発明によれば、微小球はさらに、一つ以上の潜在着色剤を光学シグナチャーとして微小球の中に含む。本明細書で用いる場合、“潜在着色剤”という用語は、化学的又は物理的手段によって変調させることができる吸着及び放出特性を有する分子を意味する。潜在着色剤は無色で蛍光を出さないことが好ましい。ある好ましい実施形態では、光学シグナチャーは一つの潜在着色剤又は二つ以上の潜在着色剤の混合を用いて発生される。本明細書で用いる場合、“光学シグナチャー”という用語は、光学的方法で検出及び／又は測定できる吸着又は放出信号を意味する。そのような信号としては、吸着、蛍光、及び化学発光などがあるが、それだけに限定されない。単一潜在着色剤の濃度又は（二つ以上の潜在着色剤を用いる場合は）潜在着色剤の比を変えてユニークな光学シグナチャーでコードされた微小球のライブラリーを生成することができる。ライブラリーの各微小球は微小球に付着されたユニークな生物活性プローブと結びつけられる。例えば、シグナチャーが単一の潜在着色剤から得られる場合、微小球に取り込まれた潜在着色剤の量が微小球の表面にある特定タイプの生物活性プローブを有する微小球のユニークなサブセットを表す。二つ以上の潜在着色剤から得られるシグナチャーの場合、化合物の比、例えば二つの潜在着色剤の1:2という比、又は三つの潜在着色剤の1:2:1という比、などが微小球の表面にある特定タイプの生物活性プローブを有する微小球のユニークなサブセットを表す。潜在着色剤は有機、無機、及びポリマーであってよい。潜在着色剤は共有結合又は非共有結合によって、微小球の表面で又は微小球の内側に取り込まれて微小球と結びつけられる。ある好ましい実施形態では、潜在着色剤は装填（loading）プロセスによって微小球の内側に取り込まれる。別の好ましい実施形態では、着色化合物は微小球の合成プロセスの間に微小球に取り込まれる。
【００３２】
ある微小球における着色化合物の量又は比を決定するためには、着色化合物を検出可能な光学信号に変換しなければならない。一般に、変換は化学的手段又は物理的手段によって行われる。潜在着色剤を測定できる光学シグナチャーに変える化学的手段としては、縮合反応、酸−塩基反応、酸化還元反応、引き抜き反応、付加反応、脱離反応、連鎖伝播反応、錯形成反応、分子結合反応、転位（rearrangement）反応、又は上記の二つ以上の組み合わせ、などがあるが、それだけに限定されない。潜在着色剤を測定できる光学シグナチャーに変換する物理的手段は、電磁放射又は粒子放射の作用によって、例えば、光開始プロセス、熱開始プロセス、Ｘ線開始プロセス、電子線開始プロセス、電気開始プロセス、圧力開始プロセス、磁気開始プロセス、及び上記の二つ以上の組み合わせ、によって実現できる。好ましい物理的方法としては、光開始プロセス、熱開始プロセス、電離放射線開始プロセス、電子線開始プロセス、電気開始プロセス、圧力開始プロセス、磁気開始プロセス、超音波開始プロセス、及び上記の二つ以上の組み合わせ、がある。当業者には理解されるように、化学的手段を物理的手段と組み合わせることもできる。一般に、微小球に取り込まれた潜在着色剤は、化学的手段を用いる場合、現像液を用いて測定できる光学シグナチャーにスイッチできる。本明細書で用いる場合、“現像液”という用語は、潜在着色剤が取り込まれた微小球と接触させると潜在着色剤を測定できる光学シグナチャーにスイッチできる水溶液又は有機溶液を意味する。
【００３３】
ある好ましい実施形態では、pHの変化を化学的手段として用いて、潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーにスイッチすることができる。例えば、米国特許Nos. 5,053,309に記載されているように、下に示されているような構造のロイコ染料前駆物質を微小球に潜在着色剤として取り込み、これらのロイコ染料前駆物質を取り込んだ微小球が、酸性現像液と接触すると測定できる光学シグナチャーに変換できる。本明細書で用いる場合、すべての化学構造で示されるR、R1、R2、R3、R4、及びR5は、必ずしもそれだけに限定されないが、以下のものから成る一般的置換基である：すなわち、単結合、水素原子、炭素原子、酸素原子、イオウ原子、カルボニル基（-CO-）、カルボン酸エステル基（-CO-O-）、スルホニル基（-SO2-）、スルホンアミド基（-SO2-NY-）、エチレンオキシ基、ポリエチレンオキシ基、又はアミノ基（-NXY）、ここで、置換基X、Y、及びZは、各独立に、水素原子。又は1-10炭素原子のアルキル基である；及び1-10炭素原子の線状又は枝分かれした、飽和又は不飽和アルキル基（メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、t-ブチル、ヘキシル、デシル。ベンジル、メトキシメチル、ヒドロキシエチル、イソブチル、及びn-ブチル、など）；6-14炭素原子の置換された又は置換されないアリール基（フェニル、ナフチル、アントリル、トリル、キシリル、3-メトキシフェニル、4-クロロフェニル、4-カルボメトキシフェニル、及び4-シアノフェニル、など）；及び5-14炭素原子の置換された又は置換されないシクロアルキル基（シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロオクチル、など）；置換された又は置換されない、飽和又は不飽和複素環式基（ピリジル、プリミジル、モルフォリノ、及びフラニル、など）；シアノ基。
【００３４】
シアン・ロイコ色素前駆物質
【化１】
2006528773.tif 000003
【００３５】
イエロー・ロイコ色素前駆物質
【化２】
2006528773.tif 000004
【００３６】
別の好ましい実施形態では、酸化還元反応を化学的手段として用いて潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーに変換できる。例えば、下に示されているような構造の写真カプラーを微小球に潜在着色剤として取り込むことができる。Friedrich, L. E. and Kapecki, J. A. によってHandbook of Imaging Materials, 2nd Ed. edited by Diamond and Weiss, Marcel Dekker, Inc., New York (2001)のChapter 2 に記載されているように、これらのカプラーはキノンジイミン又はキノンジイミン誘導体との酸化還元カプリングによって、シアン、マゼンタ、及びイエロー色を測定可能な光学シグナチャーとして生ずることができる。好ましい酸化還元カプリング剤は、N,N-ジエチルp-フェニレンジアミン硫酸塩（KODAKカラー現像剤CD-2）、4-アミノ-3-メチル-N-(2-メタン・スルフォンアミドエチル)アニリン・スルフェート、4-(N-エチル-N-β-ヒドロキシエチルアミノ)-2-メチル・アニリン・スルフェート（KODAKカラー現像剤CD-4）、p-ヒドロキシエチルエチルアミノアニリン・スルフェート、4-(N-エチル-N-2-メタンスルフォニルアミノエチル)-2-メチルフェニレンジアミン・セスキスルフェート（KODAKカラー現像剤CD-3）、4-(N-エチル-N-2-メタンスルフォニルアミノエチル)-2-メチルフェニレンジアミン・セスキスルフェート、など、当業者には直ちに明らかであるその他のもの、であるが、それだけに限定されない。シアン、マゼンタ、及びイエロー・カプラーと反応していろいろな色の色素を生ずることができる別の部類の有用な酸化還元カプリング剤はジアゾニウム塩である。これらのカプリング反応は、“The Theory of the Photographic Process”, 4th Edition, T. H. James ed. のChapters 11 and 12に記載されている。
【００３７】
【化３】
2006528773.tif 000005
イエロー・カプラー
【００３８】
【化４】
2006528773.tif 000006
マゼンタ・カプラー
【００３９】
【化５】
2006528773.tif 000007
シアン・カプラー
【００４０】
【化６】
2006528773.tif 000008
シアン・カプラー
別の好ましい実施形態では、錯形成反応を化学的手段として用いて、潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーにスイッチすることができる。例えば、米国特許第4,555,478, 4,568,633, 及び4,701,420号に記載されているように、
【００４１】
【化７】
2006528773.tif 000009
【００４２】
の構造の鉄リガンド錯体を形成していろいろな色を生成することができる。そのようなものとして、これらのリガンドを微小球に潜在着色剤として取り込むと、鉄イオンを含む現像液と接触させたときに、はっきりした色が測定できる光学シグナチャーとして生ずる。そのようなリガンドの例として次のような構造があげられるが、それだけに限定されない：
【００４３】
【化８】
2006528773.tif 000010
【００４４】
別の好ましい実施形態では、光開始プロセスを物理的手段として用いて、潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーにスイッチすることができる。必ずしもそれだけに限定されないが、いくつかの例として、米国特許第3,394,391, 3,394,392, 3,394,395, 3,410,687, 3,413,121号に記載されており、Wainer, E. in SPSE Symposium No. III, Unconventional Photographic Systems, Washington D. C. (1971), pp39-41に概説されているようなフォトラジカル開始色素形成、及びJacobson, R. E. in Photopolymerization and Photoimaging Science and Technology, Allen, N. S. edited, Elsevier Applied Science, London (1989)及びIchimura, K. in Photochromism, Durr and Bouas-Laurent edited, Elsevier, Amsterdam (1990)に概説されているような光開始フォトクロミック色素形成、があげられる。測定できる光学シグナチャーとしての識別できる色形成を生ずる反応スキームを下に示す。当業者には理解されるように、これらの化合物は潜在着色剤として微小球に容易に取り込むことができ、光開始によって測定できる光学シグナチャーに変換される。
【００４５】
これと同じ日に出願されて共通に所有されるDocket No. 85507は、フォトクロミック色素の利用を開示し特許を請求している。その開示は全体が本明細書に組み込まれる。
【００４６】
スキーム１．フォトラジカル開始色素
【化９】
2006528773.tif 000011
【００４７】
スキーム２．フォトクロミック色素
【化１０】
2006528773.tif 000012
【化１１】
2006528773.tif 000013
【００４８】
スキーム３．フォトクロミック色素
【化１２】
2006528773.tif 000014
【００４９】
別の好ましい実施形態では、Day, J. H. in Chem. Rev. 63, 65 (1963), 68, 649 (1968)により、Mustafa, A. in Chem. Rev. 43, 509 (1948),により、 及びBergman, E. et al., in J. Am. Chem. Soc. 81, 5605 (1959)により記載されたような熱開始プロセスを物理的手段として用いて、潜在着色剤を検出可能な光学シグナチャーにスイッチすることができる。熱開始によって測定できる光学シグナチャーとしての色の生成を生ずるいくつかの例として、それだけに限定されないが、スキーム４に示されている化合物がある。当業者には理解されるように、これらの化合物は潜在着色剤として微小球に容易に取り込むことができ、熱開始によって測定できる光学シグナチャーに変換される。
【００５０】
スキーム４：熱開始性質を有する化合物
【化１３】
2006528773.tif 000015
【００５１】
当業者には理解されるように、上で開示された潜在着色剤を用いて色を形成するいろいろなプロセスを、個別に又は組み合わせて利用してカラー・コードされた微小球のライブラリーを生成することができる。
【００５２】
いったん潜在着色剤が微小球に取り込まれると、各タイプの微小球は、いつでも潜在着色剤を物理的又は化学的手段によって測定できる光学シグナチャーにスイッチすることによって識別できる。各タイプの微小球は、その表面に上述したような“生物活性プローブ” を付着させることができる。したがって、ユニークな組成の潜在着色剤を有する各微小球を特定の生物活性プローブに対応させることができる。これらの微小球を等量で混合し、混合された微小球を二次元表面に上述したような単層又は多重層形態で固定することによってマイクロアレイを製造することができる。
【００５３】
本発明はさらに、このようなマイクロアレイを利用するプロセスを開示している。典型的なマイクロアレイ分析プロセスでは、分析物の混合を含む生物サンプル溶液が“放出タグ”で一様に標識される。ここで、“分析物”又は“分析物分子”とは、その存在、量、及び／又は同一性を決定しようとする分子、普通はポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリサッカライド、などの巨大分子である。よく用いられる放出タグとしては、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、酵素、酵素基体、その他の分光的に検出可能な標識、などがあげられるが、それだけに限定されない。あるいはまた、他の分子と結合したときに蛍光、化学発光、又は分光的に検出できる信号を放出できる分子も放出タグとして用いることができる。
【００５４】
放出タグが選択された後、核酸を標識する方法は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, by Sambrook and Russel, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001); Bio/Technology, 6: 816-821 (1988) by Kambara, H. et al., 及びNuc. Acid Res. 13:2399-2412 (1985) by Smith, L. et al., に記載されている。ポリペプチドを標識する方法は、Sequencing of Protein and Peptides, by Allen, G. Elsevier, New York (1989) 及びChemistry of Amino Acids, by Greenstein and Winitz, Wiley and Sons, New York (1961)に記載されている。そして、ポリサッカライドを標識する方法は、Carbohydrate Analysis; A practical Approach, by Chaplins and Kennedy, IRL Press, Oxford (1986)に記載されている。生物サンプル中の標的分析物を放出タグで標識した後、それを微小球ベースのマイクロアレイに適用することができる。
【００５５】
従来の微小球ベースのマイクロアレイでは、“カラー・アドレス可能”なポリマー微小球を最初に測定し、続いて標識された分析物と微小球の表面の生物プローブとの相互作用から生ずる放出タグの信号が測定される。本発明では、標識された分析物と微小球の表面の生物プローブとの相互作用から生ずる放出タグの信号が最初に測定され、続いて微小球に取り込まれた潜在着色剤を物理的又は化学的手段デスイッチして検出できる光学信号に変える。本発明のプロセスを図１に概略図で示す。
【００５６】
図１Aでは、微小球を含むマイクロアレイが作成される。マイクロアレイは、マイクロアレイ支持体１を含み、その上に潜在着色剤を取り込んだ微小球２が固定される。生物プローブ３が微小球の表面に付着される。
【００５７】
図１Bでは、放出タグ標識された分析物４がマイクロアレイに塗布される。このステップでは、マイクロアレイと分析物を含むサンプルとの良好な物理的接触が必要になる；そのような接触は、サンプル溶液の層をマイクロアレイの上に置くか、又はマイクロアレイをサンプル溶液に浸すことによって可能である。結合しない分析物（例えば、プローブと特異的に相補的でない分析物）は、このステップでマイクロアレイを緩衝溶液で何回も洗浄することによって除去される。分析物と微小球２の表面のプローブとの相互作用から生ずる放出タグ４の信号が撮像システムによって測定される。記録された画像はIMAGE1と名付けられてコンピューターに格納される。
【００５８】
図１Cでは、微小球２の内部の潜在着色剤が化学的又は物理的手段によって色にスイッチされる。明視野照明条件を用いて着色した微小球の画像を取り込み、マイクロアレイに固定された微小球の光学シグナチャー／バーコード情報を取得する；この画像はIMAGE2と名付けられてコンピューターに格納される。
【００５９】
最後に、画像処理アルゴリズムによってIMAGE1とIMAGE2の両方を分析し解読し、IMAGE1とIMAGE2を比較することによって未知の分析物を同定し定量化する。
【００６０】
本発明を利用する別のプロセスは、上述のプロセスを少し変更する。ある好ましい実施形態では、各微小球がユニークな生物活性プローブをもつ微小球のライブラリーを含む懸濁液を放出タグで標識された標的分析物と相互作用させた。結合していない分析物は、遠心分離で微小球を沈下させ濾過した後に上澄みを捨てることで除去される。微小球と放出タグで標識された分析物の相互作用が完了したら、得られた微小球をサポートの二次元表面に固定する。この時点で次のように別のプロセスが上述のように続く。分析物と微小球の表面上のプローブとの相互作用から生ずる放出タグ４の信号が撮像システムによって測定される。記録された画像はIMAGE1と名付けられてコンピューターに格納される。
【００６１】
図１Cでは、微小球２の内部の潜在着色剤が化学的又は物理的手段によって色にスイッチされる。明視野照明条件を用いて着色した微小球の画像を取り込み、マイクロアレイに固定された微小球の光学シグナチャー／バーコード情報を取得する；この画像はIMAGE2と名付けられてコンピューターに格納される。
【００６２】
最後に、画像処理アルゴリズムによってIMAGE1とIMAGE2の両方を分析し解読し、IMAGE1とIMAGE2を比較することによって未知の分析物を同定し定量化する。放出タグの信号も微小球からの光学信号も、光学システムによる画像拡大の後に荷電結合デバイスによって測定し分析できる。このような撮像システムの必要条件及び仕様は米国特許出願第10/036,828号に詳しく記載されている。
【実施例】
【００６３】
本発明は以下の具体的な実施例を参照することによってさらに良く理解される。
実施例１
本実施例は、写真カプラーを潜在着色剤としてポリスチレン微小球内に装填する二つの方法を説明する。
【００６４】
装填方法１：典型的な調製として、微小球サンプルが単一カプラーを用いて、又は固定した比の二つ以上のカプラー、及び異なる比のカプラー、カプラー溶媒、及び補助カプラー溶媒、を用いて調製された。シアン・カプラーCYAN1は、次のように超音波処理方法を用いて装填された：0.08 gのCYAN1が0.8 gのシクロヘキサノンと0.08 gのトリクレゾール・フォスフェートに攪拌しながら溶解された。次にこの油相が0.48 gのFAC-0064（界面活性剤）と6.52 gの水の水性相に室温で攪拌しながら加えられた。サンプルは1分間超音波処理されて乳白色の分散を生じ、その後攪拌された。等価な量、8.0 g、の4% 10μm・ポリスチレン微小球が超音波処理されたサンプルに加えられた。混合した後、サンプルは透析濾過バッグに注がれ、6時間洗浄された。透析濾過の後、カプラーが装填された微小球はその後の使用ができる状態になる。
【００６５】
装填方法２：典型的な調製として、微小球サンプルが単一カプラーを用いて、又は固定した比の二つ以上のカプラー、及び異なる比のカプラー、カプラー溶媒、及び補助カプラー溶媒、を用いて調製された。マジェンタ・カプラーMAG1とイエロー・カプラーYEL1がこの方法を用いて次のように装填された：1.0 gのMAG1が10 gのシクロヘキサノンと1.0 gのトリクレゾール・フォスフェート溶媒に攪拌しながら溶解された。カプラーが溶解された後、この油相が6.0 gのFAC-0064と81.5 gの水性相にプレミキサーを用いて加えられた。生じた乳白色の分散を7000 psiでミクロフルイダイザーに一回通した。各4グラムのミクロフルイダイズド・サンプルと4%の10μm・ポリスチレン微小球を混合市、透析濾過バッグで6時間洗浄した。透析濾過の後、カプラーが装填された微小球はその後の使用ができる状態になる。
【００６６】
【化１４】
2006528773.tif 000016
【００６７】
３つのカラー・カプラーと三者の混合物はすべて上述の方法を用いてポリスチレン微小球に装填できる。
実施例２
これらの例は、写真カプラーを潜在着色剤として微小球に現場重合プロセスを用いて装填する方法を示す。
【００６８】
【化１５】
2006528773.tif 000017
【００６９】
【化１６】
2006528773.tif 000018
【００７０】
【表１】
2006528773.tif 000019
【００７１】
【表２】
2006528773.tif 000020
【００７２】
表２．モノマーに結合したカプラーを含むビーズの調製に用いられた試薬と特性データ。
【００７３】
それぞれシアン、マゼンタ、及びイエロー・カプラー（カプラー１−３）を含むビーズ１−３がすべて、表２にリストされている量の試薬を用いて同じ手順によって合成された。窒素入口、攪拌機、及び還流凝縮器を備えた500 ml 3口丸底フラスコ内でポリアクリル酸（3.75 g, MW=450K）が67.5 mlの無水エタノールに溶解された。125 mlのメチル・セルソルブが加えられ、得られた溶液は65℃の恒温水槽に入れられ、窒素によって10分間バブル脱気された。モノマー−カプラーは別々に残ったエタノール（20 ml）と36.6 mlのスチレンの溶液にゆっくり加熱しながら溶解された。モノマー溶液が室温に戻った後、0.38 gのAIBNが加えられ、溶液を完全に溶解するまで攪拌し、同じように窒素によって10分間バブル脱気された。モノマー／イニシエーター溶液は全部一度にフラスコに加えられた。15分以内に反応物はわずかに乳白色に変わった。反応物は65℃で2時間次いで75℃で一晩（ほぼ16時間）250 RPMで攪拌された。生成されたビーズは遠心分離とそれに続く上澄みのデカンテーションとメタノールへの再分散で精製された。これは3-4界繰り返され最後の再分散ステップでは水が用いられた。ビーズは水中の5-20% w/w分散物として貯蔵された。
実施例３
本実施例は、カプラーが取り込まれた微小球の表面への予め合成された一本鎖オリゴヌクレオチド・プローブの付着を例示する。
【００７４】
100マイクロリットルのカプラーが取り込まれた微小球（4% w/v）が酢酸緩衝液（0.01 M, pH 5.0）で三回洗浄され、100マイクロリットルの20 mM 2-(4-ジメチルカルボモイル-ピリジノ)-エタン-1-スルフォネートと10パーセントのポリエチレンイミンと組み合わせられた。混合物は室温で１時間攪拌され、ホウ酸ナトリウム緩衝液（0.05M, pH 8.3）で三回洗浄された。ビーズはホウ酸ナトリウム緩衝液中に再分散された。
【００７５】
5-アミノ-C6修飾されたオリゴヌクレオチドDNAプローブが100マイクロリットルのホウ酸緩衝液に最終濃度40 nmolに溶解され、20 マイクロリットルのアセトニトリル中の塩化シアヌルがこのDNAプローブ溶液に加えられ、ホウ酸緩衝液を用いて全体積が250マイクロリットルになるようにされた。溶液は室温で1時間攪拌され、次に室温で3時間、１リットルのホウ酸緩衝液で透析された。
【００７６】
100マイクロリットルの透析されたDNA溶液が200マイクロリットルのビーズ懸濁液と混合された。混合物は室温で1時間攪拌され、リン酸ナトリウム緩衝液（0.01 M, pH 7.0）で3回洗浄された。
実施例４
本実施例は、カプラーが取り込まれた微小球の表面への抗体生物活性プローブの付着を例示する。
【００７７】
100マイクロリットルのカプラーが取り込まれた微小球（4% w/v）が酢酸ナトリウム緩衝液（0.01 M, pH 5.0）で３回洗浄され、1ミリリットルの50 mM 2-(4-ジメチルカルボモイル-ピリジノ)-エタン-1-スルフォネートと組み合わせられた。1 mgのヤギ抗マウスIgGが、1ミリリットルの酢酸ナトリウム緩衝液（0.01 M, pH 5.0）と共に微小球に加えられた。混合物は室温で1時間攪拌され、0.01 Mリン酸緩衝食塩水pH 7.0で３回洗浄された。この抗体修飾された微小球はその後の使用が可能な状態になっている。
実施例５
本実施例は、ガラス支持体上のゼラチンでコートされた微小球に対する標的核酸配列のハイブリダイゼーションと検出を例示する。
【００７８】
実施例３で示されたような微小球の表面に付着されたDNAプローブに対して相補的な配列を有する5’-Cy3標識を有するオリゴヌクレオチドDNAが、0.9 M NaCl, 0.06 M NaH2PO4, 0.006 M EDTA, 及び0.1% SDSを含むハイブリダイゼーション溶液、pH 7.6、（6XSSPE-SDS）に、最終濃度1 Mに溶解された。まず、顕微鏡スライドグラスがスライドグラスの表面に50マイクロリットルの2.5%ゼラチン溶液を広げることによってゼラチンの層でコートされた。ゼラチンの後、実施例３のように調製された0.5%のビス（ビニルスルホニル）メタンを含む1%の微小球懸濁液がゼラチンを予めコートされたスライドグラスに塗布され、放置乾燥され、微小球をスライドグラスの二次元表面に固定させた。ビーズでコートされたスライドグラスはハイブリダイゼーション溶液中で室温からスタートして1時間ハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションの後、スライドは0.5XSSPE-SDSで15分間３回洗浄された。
【００７９】
ハイブリダイゼーションが完了したスライドは、Olympus BH-2蛍光顕微鏡（Diagnostic Instruments, Inc. SPOTカメラ、CCD分解能1315x1033画素）で撮像され、微小球の表面でのDNAハイブリダイゼーションから生ずる蛍光信号が検出された。
実施例６
本実施例は、ガラス支持体上のゼラチン・コーティングされた微小球に対する蛋白質標的分子の検出を例示する。
【００８０】
Cy3又はCy5で標識されたマウスIgG 0.001 mg/mLが、0.05 Mリン酸緩衝液中に調製され、実施例４で記述されたような1%ヤギ抗マウズ修飾された微小球の懸濁液と組み合わせられ、全体積が1ミリリットルになるようにした。混合物は室温でゆっくりと攪拌しながら1時間インキュベートされた。インキュベーションの後、ビーズをスピンダウンさせ、リン酸緩衝液pH 7.0 0.1% Tween 20で３回洗浄した。顕微鏡スライドグラスが、スライドグラスの表面に50マイクロリットルの2.5%ゼラチン溶液を広げることによってゼラチンの層でコートされた。ゼラチンの後、0.5%のビス（ビニルスルホニル）メタンを含む1%の微小球懸濁液がゼラチンを予めコートされたスライドグラスに塗布され、放置乾燥され、微小球をスライドグラスの二次元表面に固定させた。
【００８１】
乾燥後、スライドグラスは、Olympus BH-2蛍光顕微鏡（Diagnostic Instruments, Inc. SPOTカメラ、CCD分解能1315x1033画素）で撮像され、微小球の表面での蛋白質相互作用から生ずる蛍光信号が検出された。
実施例７
本実施例は、ゼラチン・コーティングされたガラス支持体上でのカプラーを取り込んだ微小球の色の現像を例示する。
【００８２】
各サンプル現像のために、1 mLの微小球をpH 10.10, 0.1 M炭酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄し、次に微小球は純炭酸塩緩衝液又は小さなパーセンテージのベンジル・アルコール（3.5%）を含む炭酸塩緩衝液に0.6 mLまで再懸濁された。次に、脱気された水に3.5 g/Lのパラフェニレンジアミンを含む0.2 mLの現像液が加えられ、続いて0.2 mLの水中20 g/LのK2S2O8の酸化剤溶液が加えられた。微小球混合物を室温で30分間攪拌しながら反応させた。次に微小球溶液は15分間スピンダウンされ、水で２回洗浄された。
【００８３】
まず、顕微鏡スライドグラスが、スライドグラスの表面に50マイクロリットルの2.5%ゼラチン溶液を広げることによってゼラチンの層でコートされた。ゼラチンの後、0.5%のビス（ビニルスルホニル）メタンを含む1%の微小球懸濁液がゼラチンを予めコートされたスライドグラスに塗布され、放置乾燥され、微小球をスライドグラスの二次元表面に固定させた。
【００８４】
乾燥後、スライドグラスは、Olympus BH-2蛍光顕微鏡（Diagnostic Instruments, Inc. SPOTカメラ、CCD分解能1315x1033画素）で撮像され、微小球の内側におけるカプラーの現像によって生ずるカラー信号が検出された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】潜在着色剤が取り込まれた微小球２が固定されるマイクロアレイ支持体１を示す概略図である。各微小球の表面に生物プローブ３が付着される。
【図１Ｂ】潜在着色剤が取り込まれた微小球２を含むマイクロアレイを示す概略図である。いくつかの微小球２は放出タグで標識された分析物４が表面２に結合している。
【図１Ｃ】各微小球２の内側の潜在着色剤が、物理的又は化学的手段によって検出できる光学シグナチャーにスイッチされたマイクロアレイを示す概略図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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