(57)【要約】【課題】感染性炎症を治療するための薬剤を提供する。【解決手段】人間を含む哺乳動物の感染性炎症を治療するための薬剤の製造のためのグルココルチコイドと組合せた、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用であって、前記組合せが感染性炎症の治療を達成するために治療的に効果的な量で使用されるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人間を含む哺乳動物の感染性炎症を治療するための薬剤の製造のためのグルココルチコイドと組合せた、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用であって、前記組合せが前記炎症の治療を達成するために治療的に効果的な量で使用されることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記感染性炎症が微生物、蠕虫または昆虫に起因することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記微生物が細菌、真菌、ウイルス、マイコプラスマまたは原虫類であることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記感染性炎症が細菌に起因することを特徴とする請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
前記感染性炎症が感染性副鼻腔炎、呼吸器感染、上気道感染、感染性気管支拡張、感染性気管支炎及び感染性慢性気管支炎、細菌性またはウイルス性のような微生物性肺炎、性尿器路感染症、尿路感染症、感染性髄膜炎、感染性急性呼吸困難症候群、感染性心筋炎、感染性心膜炎、感染性心内膜炎、リウマチ熱、敗血症、肺血性関節炎、消化管感染、ウイスル肝炎、ＨＩＶ感染、血管内感染及び外科感染から選ばれることを特徴とする請求項１から４のいずれか一つに記載の使用。
【請求項６】
前記感染性炎症が敗血症であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記感染性炎症が細菌性またはウイルス性のような微生物性肺炎であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記感染性炎症が感染性急性呼吸困難症候群であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が全身的効果を持つことを特徴とする請求項１から８のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が前記一酸化窒素と前記グルココルチコイドをそれらの同時投与のために含む組成物の形であることを特徴とする請求項１から９のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１１】
前記製造が前記一酸化窒素と前記グルココルチコイドのいずれかの順序での継続的投与のための薬剤に関することを特徴とする請求項１から９のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１２】
前記製造が前記一酸化窒素と前記グルココルチコイドの前記の順序での継続的投与のための薬剤に関することを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記製造がグルココルチコイド治療下の哺乳動物への一酸化窒素の投与のための薬剤に関することを特徴とする請求項１０から１２のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１４】
前記製造が一酸化窒素治療下の哺乳動物へのグルココルチコイドの投与のための薬剤に関することを特徴とする請求項１０から１２のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１５】
前記ガス状一酸化窒素が吸入可能な一酸化窒素として投与されることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１６】
前記グルココルチコイドが静脈内に投与されることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤が吸入可能な薬剤であることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
吸入されるガス状一酸化窒素の濃度が０．１−１８０ｐｐｍ、好ましくは１−８０ｐｐｍ、より好ましくは１−４０ｐｐｍの範囲内にあり、前記ガス状一酸化窒素がキャリアガスまたはガス混合物内に存在していることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
グルココルチコイドの投薬量が０．１から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にあることを特徴とする請求項１から１８のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２０】
前記一酸化窒素供与体がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−システイン、ニトロソグアニジン、ニトロプルシド、ＮＯ−フェレドキシン、ＮＯ−ヘム錯体、アルギニン、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリチル、亜硝酸イソアミル、無機亜硝酸塩、アジド及びヒドロキシルアミンから選ばれることを特徴とする請求項１から１９のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２１】
前記グルココルチコイドがヒドロコルチゾン、コルチゾン、コルチコステロン、プレドニソロン、プレドニソン、メチルプレドニソロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、ブッデソナイド、デオキシコルトン、フルオシノイド、クロベタゾン及びコルチコトロフィンから選ばれることを特徴とする請求項１から２０のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２２】
人間を含む哺乳動物の感染性炎症を治療する方法であって、それがかかる治療を必要とする哺乳動物に、グルココルチコイドと組合せた、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素を投与することを含み、前記組合せが前記炎症の治療を達成するために治療的に効果的な量で使用されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２から２１のいずれか一つに規定されていることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
人間を含む哺乳動物の感染性炎症を治療する方法であって、それがａ）前記哺乳動物の細胞上のグルココルチコイド受容体の発現を一酸化窒素の投与を通して増加する段階、及びｂ）グルココルチコイドを投与する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２から２１のいずれか一つに規定されていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
人間を含む哺乳動物の感染性炎症の治療のための医薬組成物であって、それがグルココルチコイドと組合せた、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素を含み、前記一酸化窒素及び前記グルココルチコイドが前記炎症の治療を達成するために治療的に効果的な量で存在していることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２から２１のいずれか一つに規定されている使用のための請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
人間を含む哺乳動物の細胞内のグルココルチコイド受容体の発現を増加するための薬剤の製造のための、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用。
【請求項２９】
前記ガス状一酸化窒素が吸入可能な一酸化窒素として投与されることを特徴とする請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記薬剤が吸入可能な薬剤であることを特徴とする請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
吸入されるガス状一酸化窒素の濃度が０．１−１８０ｐｐｍ、好ましくは１−８０ｐｐｍ、より好ましくは１−４０ｐｐｍの範囲内にあり、前記ガス状一酸化窒素がキャリアガスまたはガス混合物内に存在していることを特徴とする請求項２８から３０のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３２】
前記一酸化窒素供与体がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−システイン、ニトロソグアニジン、ニトロプルシド、ＮＯ−フェレドキシン、ＮＯ−ヘム錯体、アルギニン、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリチル、亜硝酸イソアミル、無機亜硝酸塩、アジド及びヒドロキシルアミンから選ばれることを特徴とする請求項２８から３０のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３３】
人間を含む哺乳動物の細胞内のグルココルチコイド受容体の発現を増加する方法であって、その方法がガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素を前記発現の増加を達成するのに十分な量で前記哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２９から３２のいずれか一つに規定されていることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人間を含む哺乳動物における感染性炎症を治療するための薬剤の製造のためのグルココルチコイドと組合せた、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用、かかる炎症を治療する方法、及びかかる炎症の治療のための医薬組成物に関する。更に、本発明は人間を含む哺乳動物の細胞内のグルココルチコイド受容体の発現を増加するための薬剤の製造のためのガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用、及びかかる増加のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の実験及び臨床研究が急性肺傷害の治療における吸入された一酸化窒素（吸入されたＮＯ，ＩＮＯ）による血液の改善された酸素付加及び肺高血圧症の軽減または弱化を立証している。これらの効果は換気された肺実質における肺血管の選択的拡張により引き起こされる。ＩＮＯはまた、抗炎症効果を持ち、炎症性疾患に含まれると考えられる多くの遺伝子の発現を抑制する。これらはケモカイン、癒着分子、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン、核因子カッパーＢ（ＮＦ−ｋＢ）、及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）を含む。しかし、ＮＯと炎症マーカ間の相互作用の理解は全く完璧ではない。増大する知識は炎症を抑制する新たなルートを開くかもしれない。ＩＮＯは肺外効果、例えば凝固防止、改善された尿排出を示すかもしれないが、全身的な抗炎症効果の実際の証拠は全く示されていない（Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）９２（２），７９５−８０１；Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．（１９９７）４１（４），４５７−４６３；Ｔｒｏｎｃｙ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ａｎａｅｓｔｈ．（１９９７）７９（５），６３１−６４０；Ｂａｌｌｅｖｒｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｎａｔｅ．（１９９６）６９（６），３８９−３９８；Ｗｒａｉｇｈｔ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ（２００１）８６（２），２６７−２６９．）。
【０００３】
吸入されたＮＯの主要な治療作用は肺血管拡張である。二つの概念がこの適用を重要とした：第一は、ＮＯの作用は肺循環に限定されることである。第二は、ＮＯは吸い込まれた空気で投与されるので、それは換気された肺胞上で優先的に作用する（Ｒａｎｇ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ．）。従って、ＮＯの従来の治療的使用は局部的な肺の効果に関連していた。
【０００４】
グルココルチコイド（ＧＣ）は視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸の刺激により副腎により生成されるステロイドホルホンである。それらの有効な抗炎症及び免疫調節作用はプロ炎症遺伝子のモデュレーション内に包含されている活性化蛋白質−１（ＡＰ−１）及びＮＦ−ｋＢのような転写因子の活性の抑制のためであることが一般的に受け入れられている。ＧＣの効果はグルココルチコイド受容体（ＧＲ）、核受容体上科に属するリガンド誘導転写因子を通して発揮される。ＧＲは転写を二つの主要な作用モードにより制御する。一つはＧＲホモ二量体のＧＲ標的遺伝子の調節配列内のグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）への結合を含む。別の作用モードはＧＲがＡＰ−１、ＮＦ−ｋＢ及びＳｔａｔ５のような他の転写因子の活性を、クロストークとして示したプロセスである直接ＤＮＡ接触とは無関係に、調節することである。ＧＲ自身はこの第二作用モードのためにＤＮＡに結合する必要がない（Ａｄｃｏｃｋ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）７９（４），３７６−３８４；Ｄｅ  Ｂｏｓｓｃｈｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１０９（１），１６−２２；Ｒｅｆｏｊｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）７９（４），３８５−３９４；Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）２０（２４），７１６８−７１７３．）。
【０００５】
グルココルチコイドの臨床的使用は副腎不全を持つ患者に対する代償療法、抗炎症／免疫抑制療法、及び腫瘍性疾患における使用を含む。一般的に、グルココルチコイドは抗炎症及び免疫抑制活性を持つと考えられていた。それらは炎症の初期及び末期発現の両者を抑制する。従って、グルココルチコイドはぜん息の、皮膚、目、耳または鼻の炎症状態（例えば湿疹、アレルギー性結膜炎または鼻炎）の、過敏状態の自己免疫及び炎症成分を持つ種々の疾患の抗炎症／免疫抑制療法のために、かつ移植片対宿主疾患を予防するために使用される（Ｒａｎｇ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ．）。
【０００６】
しかし、グルココルチコイドの上述の使用は全て非感染性の炎症に関する。伝統的に、抗生物質療法は感染性疾患に対して好ましかった。
【０００７】
細菌性肺炎は肺の病原感染により起こる。感染病原因子の例は肺炎球菌病原因子；インフルエンザ菌；クレブシエラ属、ブドウ球菌属、及びレジオネラ属の種；グラム陰性微生物；及び吸入された物質である。上気道からの細菌、またはより一般的ではないが、血液により広げられた細菌は肺実質へのそれらの道筋を見出す。そこに至ると、因子の組合せ（感染微生物の毒性、局所的防御の状態、及び患者の全体的健康状態）が細菌性肺炎に導くかもしれない（Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｊ．（２００３），Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｅｍｅｒｇ／ｔｏｐｉｃ４６５．ｈｔｍ＞）。
【０００８】
細菌性肺炎に対する医薬療法の頼みの綱は抗生物質治療である。急性細菌性肺炎におけるグルココルチコイドの役目はまだ明らかでない。古典的教示は感染におけるグルココルチコイドの使用が免疫応答を損うかもしれないことを警告する。しかし、最近の知見は局所的肺炎症が全身的グルココルチコイドにより減少させられるかもしれないことを示す（Ｔｏｓｈｉｎｏｂｕ  Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００２）８（３），２４７−２５１；Ｌｅｆｅｒｉｎｇ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９５）２３，１２９４−１３０３．）。
【０００９】
敗血症または敗血症ショックは微生物感染に対する二次的全身炎症応答である。臨床業務における抗生物質の導入以前は、グラム陽性菌が敗血症を起こす主要な微生物であった。より最近は、グラム陰性菌が深刻な敗血症及び敗血症ショックを起こすキー病原体となった。
【００１０】
敗血症ショックを持つ患者の治療は次の三つの主要目標からなる：（１）低酸素、低血圧、及び損われた組織酸素付加を矯生する支援方策を用いて患者を敗血症ショックから蘇生させる。（２）感染源を識別し、抗菌療法、手術、またはそれら両方により治療する。（３）心臓血管監視により誘導される適正な器官システム機能を維持して多器官システム機能不全の病原を中断する。
【００１１】
理論的及び実験的動物証拠が深刻な敗血症及び敗血症ショックを持つ動物におけるコルチコステロイドの大量投与の使用に対して存在するが、全ての無作為人間研究（１９７６からの１件を除き）はコルチコステロイドがショックの進展を防がなかったこと、ショック状態を逆転しなかったこと、または１４日死亡率を改善しなかったことを見出した。従って、敗血症または敗血症ショックを持つ患者におけるコルチコステロイドの高投与の日常的使用に対する支持は医学文献中に存在しない（更に以下参照）（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，Ｍｉｎｋ，Ｓ．（２００３），Ｓｅｐｔｉｃ  Ｓｈｏｃｋ，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｍｅｄ／ｔｏｐｉｃ２１０１．ｈｔｍ＞）。
【００１２】
しかし、最近の試験は深刻で難治性のショックを持つ患者におけるコルチコステロイドの強制投与の肯定的な結果を証明した（Ｂｒｉｅｇｅｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９９）２７，７２３−７３２）。
【００１３】
急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）は心原性肺水腫の形跡のない両側肺浸潤と重症低酸素血により特徴付けられる急性状態として定義される。ＡＲＤＳは肺胞及び肺毛細管内皮への拡散損傷と関連付けられる。ＡＲＤＳに対する危険因子は直接肺損傷、全身的病気、及び損傷を含む。ＡＲＤＳに対する最も一般的な危険因子は敗血症である。ＡＲＤＳ発現に対する危険に寄与する他の非胸部状態は大量輸血を伴うまたは伴わない外傷、急性膵炎、薬剤過量及び長骨骨折を含む。ＡＲＤＳと関連する最も一般的な直接肺損傷は胃内容物の誤嚥である。他の危険因子は種々のウイルス性及び細菌性肺炎、近溺死、及び毒吸入を含む（Ｈａｒｄｍａｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｗａｌｉａ，Ｒ．（２００３），Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｔｒｅｓｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｏｍ／ｍｅｄ／ｔｏｐｉｃ７０．ｈｔｍ＞）。
【００１４】
ＡＲＤＳの予防または管理に有益な薬剤は立証されていない。敗血症患者におけるコルチコステロイドの早期投与はＡＲＤＳの発現を防がない。吸入された一酸化窒素（ＮＯ）は早期試験では有望である効能ある肺血管拡張薬であると思われたが、大規模の管理された試験ではＡＲＤＳを持つ成人の死亡率を変えなかった。コルチコステロイドに対する可能性のある役目は後期ＡＲＤＳ（線維増殖期）を持つ患者に存在するかもしれない。なぜなら、それらは多核白血球の移行を抑制し、かつ増大した毛細管透過性を逆転することにより炎症を縮小するからである。これは選択された患者の救助療法と考えられることができるが、今実行中のＡＲＤＳネットワーク試験の結果が出るまで広範囲にわたる使用は推奨されない（Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）９２（２），７９５−８０１；Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）２０（２４），７１６８−７１７３．）。
【００１５】
幾つかの感染状態の先の観察から理解されるように、敗血症及び敗血症ショックのような感染性炎症を持つ患者におけるグルココルチコイド療法の使用は議論の余地があり、かつかなり討論されている。大規模な無作為研究及びメタ分析は死亡率の利益を示すことに失敗し、ステロイド療法が有害であるかもしれないことを示した（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９５）２３，１４３０−１４３９；Ｌｅｆｅｒｉｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９５）２３，１２９４−１３０３）。抗生物質の使用のような、病気の細菌性の原因に向けた療法は一般的に好ましい。更に、敗血症患者に対してグルココルチコイド療法が示唆されたとき、それは副腎機能異常を持つ患者を目的としている（Ａｎｎａｎｅ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ（２００２）２８８，８６２−８７１）。従って、グルココルチコイド療法は敗血症または敗血症ショックを患っている患者に対面する医師のための明白かつ一般的な選択ではない。
【００１６】
要約すれば、細菌性肺炎、敗血症ショック及びＡＲＤＳは上で検討したように、感染性炎症の例である。かかる炎症の療法は伝統的に根底にある感染に焦点を合わせていた、すなわち種々の種類の抗生物質が使用されていた。ある場合には主として特定の付加条件と関連して、グルココルチコイド療法が示唆された。しかし、種々の理由のため細菌性肺炎、敗血症ショック及びＡＲＤＳにおけるグルココルチコイド療法に対して、例えば治療効果が得られなかったことまたは副作用が発生したことが助言された。
【００１７】
ＷＯ  ９９／２０２５１（Ｚａｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．）は非肺虚血再灌流障害及び非肺炎症を縮小しまたは予防する方法を開示する。非肺炎症の例は関節炎、心筋炎、脳炎、移植組織拒絶、全身性エリマト−デス、痛風、皮膚炎、炎症性腸疾患、肝炎、及び甲状腺炎である。この方法は哺乳動物にガス状一酸化窒素を吸入させることを含む。ＮＯガスは循環する白血球または血小板の活性化される能力及び非肺組織の虚血再灌流または炎症の部位での炎症プロセスへの寄与能力を縮小する。吸入されるＮＯガスと組合せて、ガス状ＮＯの治療効果を増強する第二化合物が投与されることができる。第二化合物は特にホスホジエステラーゼ阻害剤であることができるが、例えばグルココルチコイドであることもできる。しかし、ＷＯ  ９９／２０２５１で引用された幾つかの特定の炎症が感染により引き起こされるかもしれないことは医学分野ではそれ自体既知であるけれども、この文献は非感染性炎症のみの治療に関することは明らかである。
【００１８】
米国５４８５８２７（Ｚａｐｏｌ及びＦｒｏｓｔｅｌｌ）は急性呼吸不全のまたは可逆肺血管収縮の喘息発作または他の形の気管支収縮の予防のための方法を開示し、そこでは冒された哺乳動物はガス状一酸化窒素または一酸化窒素放出化合物を吸入させられる。更に、喘息の吸入治療で有用な薬学的活性剤としてグルココルチコイドが示唆されている。しかし、炎症であるけれども、喘息は感染状態ではない。
【００１９】
米国５８３７６９８及び米国５９８５８６２（Ｔｊｏｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）はステロイド亜硝酸／硝酸エステル誘導体に関し、かつ炎症疾患を治療するためのそれらの使用に関する。この誘導体は単一分子中にグルココルチコイドと一酸化窒素供与体の組合された生物学的特性を持つと言われている。前記使用は二つの周知の効果、すなわちグルココルチコイドによる抗炎症及び免疫調節活性及び放出された一酸化窒素による気管支弛緩に基づいており、それらの両者は非感染疾患の治療のためには既知であるが、それらのどれも感染性疾患の治療に関係しない。従って、ＷＯ  ９９／２０２５１の場合のように、引用された二つの米国特許は非感染性炎症のみの治療を開示することは明らかである。
【００２０】
ＷＯ  ９８／５２５８０（Ｇａｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）は喘息を持つ患者を治療する方法に関し、それは前記患者にＳ−ニトロソチオール破壊阻害剤またはＮＯ供与体を投与することを含む。追加的に、全身性コルチコステロイドが投与されることができる。しかし、喘息は感染性炎症ではなく、その治療は感染性状態に適用可能ではない。
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明は感染性炎症過程におけるグルココルチコイドと一酸化窒素の間に複合相互作用があることを見出したことに基づく。これらの相互作用から、強力な相乗効果が得られることが明らかとなった。一酸化窒素がグルココルチコイド受容体の発現をアップレギュレートし、グルココルチコイドの投与と組合せて炎症応答を鈍らせるようである。
【００２２】
本発明の目的は感染性炎症を治療するための薬剤を提供することである。より詳細には、前記薬剤の目的は上述の相乗効果による利益を得ることである。
【００２３】
本発明の別の目的は哺乳類の細胞における薬剤の効果がグルココルチコイド受容体上に作用する薬剤による療法に対しより受容し易い細胞をもたらす薬剤を提供することである。
【００２４】
以下の説明を研究した後に当業者に明らかとなるべき本発明の上述の目的並びに他の目的は、人間を含む哺乳動物の感染性炎症を治療するための薬剤の製造のためのグルココルチコイドと組合せた、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用によって達成され、前記組合せは前記炎症の治療を達成するために治療的に効果的な量で使用される。これらの目的はまた、感染症炎症を治療する方法及び感染性炎症の治療のための医薬組成物により達成される。
【００２５】
更に、本発明は人間を含む哺乳動物の感染性炎症を治療する方法を提供し、それはａ）前記哺乳動物の細胞内のグルココルチコイド受容体の発現を一酸化窒素の投与を通して増加する段階、及びｂ）グルココルチコイドを投与する段階を含む。
【００２６】
グルココルチコイドと組合せた一酸化窒素の使用は上述の相乗効果を利用する。その効果は一酸化窒素またはグルココルチコイドのみの効果と比べると著しい。組合せた薬剤の効果は更に以下の実施例中に示される。
【００２７】
非感染性炎症におけるグルココルチコイドの一つの効果は免疫応答を抑制することである。しかし、感染性状態を治療するとき活性免疫系が一般的に必要である。従って、グルココルチコイド受容体をアップレギュレートする一酸化窒素のグルココルチコイドとの組合せ使用は感染性炎症を治療するために効果的であることが見出された。
【００２８】
感染性炎症は微生物、蠕虫または昆虫により起こされるかもしれない。微生物は例えば細菌、真菌、ウイルス、マイコプラスマまたは原虫類であるかもしれない。細菌性感染症は例えばバクテロイデス、コリネバクテリウム、エンテロバクター、腸球菌、大腸菌、ブドウ球菌及びストレプトコッカス属または種の細菌により起こされるかもしれない。
【００２９】
本発明による一酸化窒素とグルココルチコイドの使用による治療のために適した感染性炎症の例は感染性副鼻腔炎、呼吸器感染、上気道感染、感染性気管支拡張、感染性気管支炎及び感染性慢性気管支炎、細菌性またはウイルス性のような微生物性肺炎、性尿器路感染症、尿路感染症、感染性髄膜炎、感染性急性呼吸困難症候群、感染性心筋炎、感染性心膜炎、感染性心内膜炎、リウマチ熱、敗血症、肺血性関節炎、消化管感染、ウイスル肝炎、ＨＩＶ感染、血管内感染、及びやけど及び術後感染のような外科感染である。
【００３０】
本発明による治療のために好適な炎症は敗血症、細菌性またはウイルス性のような微生物性肺炎及び感染性急性呼吸困難症候群である。
【００３１】
更に、薬剤の全身的効果は肺、腎及び肝に良い効果を持つと思われる。他の全身的組織における効果がそれ故、期待される。
【００３２】
一酸化窒素とグルココルチコイドは同時に投与されることができる。
【００３３】
しかし、より好ましくは一酸化窒素はグルココルチコイドとは別個に投与される。別個投与は一酸化窒素とグルココルチコイドのそれぞれの投与量の独立制御を可能とする。二つの成分の最適投与量比は患者の年齢、性、状態等及び病気の深刻さに応じて変えることができる。
【００３４】
最も好ましくは、一酸化窒素はグルココルチコイドの前に投与される。一酸化窒素の早期投与はグルココルチコイドの投与に先んじてのグルココルチコイド受容体の始動、すなわちアップレギュレーションを可能とする。一酸化窒素とグルココルチコイドのかかる継続的投与は本発明の相乗効果に対し優れた根拠を提供する。一酸化窒素の投与とグルココルチコイドの投与の間の時間間隔は例えば肺における炎症のための約１分から肝または腎のようなより遠い組織における炎症のための約３０分までであることができる。
【００３５】
本発明の目的はまた、グルココルチコイド治療下の哺乳動物への一酸化窒素の投与により、または一酸化窒素治療下の哺乳動物へのグルココルチコイドの投与により達成されることができる。
【００３６】
一酸化窒素はガス状一酸化窒素としてまたは一酸化窒素供与体として投与されることができる。吸入可能な一酸化窒素としてのガス状一酸化窒素の好適な投与はその効果の速い発現と停止を提供する。それはまた、機械的換気を必要とする患者への投与の便利なルートを示す。一酸化窒素供与体は例えば吸入により、ネブライゼーションにより、血管内にまたは経口的に投与されることができる。
【００３７】
グルココルチコイドは経口的に、吸入により、筋肉内または皮下注射により、静脈注入または注射により、または皮内または関節内注射によるような、ステロイドのための投与のいずれかの既知のルートにより投与されることができる。しかし、投与の好適なルートは静脈内である。なぜなら敗血症を持つ患者のような深刻な病気の患者における微小循環は不十分であり、従って薬剤の吸収を制限するかもしれないからである。
【００３８】
更に、本発明による薬剤は吸入可能な薬剤であることができる。
【００３９】
吸入可能な一酸化窒素は例えば一酸化窒素を酸化から保護するために窒素と混合された、キャリアガスまたはガス混合物中に存在する。かかるキャリアガスまたはガス混合物中の一酸化窒素の濃度は通常０．１−１８０ｐｐｍ、好ましくは１−８０ｐｐｍ、より好ましくは１−４０ｐｐｍの範囲内である。
【００４０】
本発明の薬剤中のグルココルチコイドの投薬量は通常０．１から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にある。
【００４１】
ガス状一酸化窒素の吸入の代替物として、一酸化窒素は一酸化窒素供与体、すなわち一酸化窒素を放出することにより作用する化合物、の形で投与されることができる。本発明の実施で有用な既知の一酸化窒素放出化合物は生理学的条件下で化合物から自発的に放出されるまたはそうでなければ移動される−ＮＯ部分により特徴付けられるＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−システイン及びニトロソグアニジンのようなニトロソまたはニトロシル化合物である。他の化合物はＮＯが遷移金属錯体上の配位子であり、それ自体が生理学的条件下で化合物から容易に放出されまたは移動される化合物、例えばニトロプルシド、ＮＯ−フェレドキシン、またはＮＯ−ヘム錯体である。更なる好適な窒素含有化合物は呼吸及び／または血管系に対して内因性の酵素により新陳代謝されＮＯラジカルを生成する化合物、例えばアルギニン、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリチル、亜硝酸イソアミル、無機亜硝酸塩、アジド及びヒドロキシルアミンである。かかる形式の一酸化窒素放出化合物及びそれらの合成方法は従来技術で周知である。
【００４２】
いずれのグルココルチコイド、すなわちグルココルチコイド受容体を誘発するいずれのステロイドホルモンも本発明による使用のために適している。好適なグルココルチコイドの例はヒドロコルチゾン、コルチゾン、コルチコステロン、プレドニソロン、プレドニソン、メチルプレドニソロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔａｓｏｎｅ）、ベクロメタゾン、ブッデソナイド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、デオキシコルトン（ｄｅｏｘｙｃｏｒｔｏｎｅ）、フルオシノイド（ｆｌｕｏｃｉｎｏｉｄｅ）、クロベタゾン及びコルチコトロフィン（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈｉｎ）である。
【００４３】
第二態様において、本発明は人間を含む哺乳動物の細胞内のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）の発現を増加するための薬剤の製造のための、ガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素の使用を提供する。人間を含む哺乳動物の細胞内のグルココルチコイド受容体の発現を増加する方法であって、前記哺乳動物に前記発現増加を達成するのに十分な量でガス状一酸化窒素または一酸化窒素供与体の形の一酸化窒素を投与することを含む方法も提供される。
【００４４】
上述したように、ＧＲの発現における一酸化窒素の驚くべき効果は重要な発見であり、それは細胞がＧＲ発現の増加にさらされていない状態に比べると、ＧＲ上に作用する薬剤、例えばグルココルチコイドのより高い治療効能を達成することを可能とする。炎症性感染とＧＲ発現のダウンレギュレーションの間の関係のため、かかる知見は特にかかる疾患において重要である。
【００４５】
グルココルチコイド受容体の発現を“増加する”または発現の“増加”に言及されるとき、これは所定の瞬間での問題の細胞の細胞質内に存在する受容体の量が本発明により処理されていない細胞の細胞質内のその量より大きいことを意味すると解釈される。本発明において、受容体のかかる発現の“増加”は一般用語の受容体の“アップレギュレーション（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）”と相互に置き換え可能に使用される。
【００４６】
感染性炎症は微生物、蠕虫または昆虫により起こされうる。微生物は例えば細菌、真菌、ウイルス、マイコプラスマまたは原虫類でありうる。細菌感染は例えばバクテロイデス、コリネバクテリウム、エンテロバクター、腸球菌、大腸菌、ブドウ球菌及びストレプトコッカス属または種の細菌により恐らく起こされうる。
【００４７】
本発明による一酸化窒素の使用によりＧＲの発現を増加することが重要である感染性炎症の例は、感染性副鼻腔炎、呼吸器感染、上気道感染、感染性気管支拡張、感染性気管支炎及び感染性慢性気管支炎、細菌性またはウイルス性のような微生物性肺炎、性尿器路感染症、尿路感染症、感染性髄膜炎、感染性急性呼吸困難症候群、感染性心筋炎、感染性心膜炎、感染性心内膜炎、リウマチ熱、敗血症、肺血性関節炎、消化管感染、ウイスル肝炎、ＨＩＶ感染、血管内感染及びやけど及び術後感染のような外科感染である。本発明による治療のために好適な炎症は敗血症、細菌性肺炎及び急性呼吸困難症候群である。
【００４８】
本発明のこの態様においても、一酸化窒素はガス状一酸化窒素としてまたは一酸化窒素供与体として投与されることができる。吸入可能な一酸化窒素としてのガス状一酸化窒素の好適な投与はＧＲ発現のその効果の早い発現と停止を提供する。それはまた、機械的換気を必要とする患者への投与の便利なルートを示す。
【００４９】
本発明のこの態様の目的のために、吸入可能な一酸化窒素は例えば一酸化窒素を酸化から保護するために窒素と混合された、キャリアガスまたはガス混合物中に存在する。かかるキャリアガスまたはガス混合物中の一酸化窒素の濃度は通常０．１−１８０ｐｐｍ、好ましくは１−８０ｐｐｍ、より好ましくは１−４０ｐｐｍの範囲内である。
【００５０】
ガス状一酸化窒素の吸入の代替物として、一酸化窒素はＧＲ発現の希望の増加を達成するために、一酸化窒素供与体の形で投与されることができる。好適な一酸化窒素供与体の例はＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−システイン、ニトロソグアニジン、ニトロプルシド、ＮＯ−フェレドキシン、ＮＯ−ヘム錯体、アルギニン、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリチル、亜硝酸イソアミル、無機亜硝酸塩、アジド及びヒドロキシルアミンである。
【００５１】
図面の簡略説明
図１は実施例で使用された種々のプロトコールを示す。
【００５２】
図２Ａ及び２Ｂは実施例からの平均肺動脈圧（ＭＰＡＰ）結果及び動脈酸素付加（ＰａＯ２）結果をそれぞれ示す。データは健康な動物（星）から、及びエンドトキシンのみ（三角）に、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（丸）に、エンドトキシン＋ステロイド（菱形）に、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素及びステロイド（プラス）にさらされた動物からのものである。
【００５３】
図３は健康な子豚（健康）からの肺と比べた、エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）による、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）による、エンドトキシン＋ステロイド（ＬＰＳ＋ステロイド）による、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素及びステロイド（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド）による肺組織の組織学的変化を示す。エンドトキシンは肺胞隔壁内の及び気管支壁周りの急性炎症細胞浸潤、上皮及び内皮細胞の膨張、及び肺水腫及び肺出血を誘発した。
【００５４】
図４は健康な子豚（健康）からの肝と比べた、エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）による、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）による、エンドトキシン＋ステロイド（ＬＰＳ＋ステロイド）による、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素及びステロイド（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド）による肝組織の組織学的変化を示す。エンドトキシンは小葉の周辺の結合組織の急性炎症細胞湿潤、大量肝細胞うっ血及び壊死、クッパー細胞反応性過形成、及び出血を誘発した。
【００５５】
図５は健康な子豚（健康）からの腎と比べた、エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）による、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）による、エンドトキシン＋ステロイド（ＬＰＳ＋ステロイド）による、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素及びステロイド（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド）による腎組織の組織学的変化を示す。エンドトキシンは急性炎症細胞湿潤、水腫、及び糸球体構造の破壊、及び糸球体の細胞の壊死を誘発した。
【００５６】
図６はエンドトキシンのみ（ＬＰＳ）にまたはエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）にさらされた子豚の肺組織内のグルココルチコイド受容体の発現を示す。
【００５７】
図７はエンドトキシンのみ（ＬＰＳ）にまたはエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）にさらされた子豚の肺組織内のＮＦ−ｋＢの発現を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
実施例
材料及び方法
動物準備
本研究はＵｐｐｓａｌａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。スウェーデン国で飼育された、２２−２８ｋｇの体重の３８頭の子豚が使用された。麻酔が筋肉にアストロピン、０．０４ｍｇ／ｋｇ、チレタミン／ゾラゼパム（Ｚｏｌｅｔｉｄ，Ｖｉｒｂａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、６ｍｇ／ｋｇ、及び塩化キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，Ｂａｙｅｒ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２．２ｍｇ／ｋｇにより誘導され、催眠性のクロメチアゾニル（Ｈｅｍｉｎｅｖｒｉｎ，Ａｓｔｒａ，Ｓｏｅｄｅｒｔａｅｌｊｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、４００ｍｇ／ｈ、パンクロニウム、２ｍｇ／ｈ、及びフェンタニル、１２０ｍｇ／ｈの連続注入により維持された。予め暖められた（３８℃）等浸透圧食塩水５００ｍｌ／ｈが脱水を防ぐために静脈内に与えられた。動物は研究の残りの間仰臥位置に置かれた。
【００５９】
麻酔の誘導後に気管開口術が実施され、カフ付き気管チューブが挿入された。機械的換気が１分当たり２２±２呼吸（平均±ＳＤ）の呼吸回数で、１：２の吸・呼気比で、かつ呼吸周期の５％の吸入終期休止で、容積制御されたモードで（Ｓｅｒｖｏ  ９００Ｃ，Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）提供された。初期制御状況で３３−４５ｍｍＨｇ（４．４−６．０ｋＰａ）の呼吸終期ＣＯ２分圧（ＰｅｔＣＯ２）を得るように微小な換気が調整され、次いで実験を通して一定に保たれた。平均１回換気量は１０±１．４ｍｌ／ｋｇであった。５ｃｍＨ２Ｏの正の呼吸終期圧（ＰＥＥＰ）が適用された。酸素の吸入フラクション（ＦＩＯ２）は０．５であった。三重管腔バルーン先端を持つカテーテル（Ｓｗａｎ  Ｇａｎｚ  ｎｏ.７Ｆ）が血液試料採取と圧力記録のために肺動脈に導入された。圧力記録、血液試料採取及び注入のために対側頸静脈及び右頸動脈もまた、カテーテル挿入された。平均動脈圧（ＭＡＰ）、平均肺動脈圧（ＭＰＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、中心静脈圧（ＣＶＰ）、肺毛細ウェッジ圧（ＰＣＷＰ）及び心拍出量（Ｑｔ）が記録された。ダグラス及び膀胱カテーテルが尿流動と腹水流体の測定のために挿入された。
【００６０】
混合された静脈及び動脈血液試料が血液ガス分析（ＡＢＬ  ５００，Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のため及び酸素飽和度及びヘモグロビン濃度（ＯＳＭ  ３，Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の決定のために集められた。血液酸素計データは豚血液に対し修正された。
【００６１】
プロトコール
豚は５群に分割された：
１.正常対照群
２.エンドトキシン（リポ多糖類、ＬＰＳ）群
３.ＬＰＳ＋ＩＮＯ群
４.ＬＰＳ＋ステロイド群
５.ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド群
異なるプロトコールが図１に概略的に示されており、以下に説明される。
【００６２】
１.健康対照群（ｎ＝８）
麻酔、手術準備及びカテーテル挿入が３０分の休止により続けられた。次いでベースライン測定がなされた。豚は別の６時間の間、全研究期間にわたる対照データの確立が続けられた。豚は最後の測定後にＫＣｌの静脈内注射により殺され、形態学的及び生化学的研究のために組織試料が肺、肝及び腎から取られた。
【００６３】
２.ＬＰＳ群（ｎ＝８）
麻酔、手術及びカテーテル挿入は対照と同様であった。ベースライン測定後、急性肺損傷及び敗血症ショックが２．５時間の間、食塩水中ＬＰＳ２５μｇ／ｋｇ／ｈの静脈内注入により誘発され、研究の残りの間、１０μｇ／ｋｇ／ｈの注入が続けられた。豚は血行力学及び血液ガス測定が続けられ、実験の終わりに殺され、上述のように組織試料が取られた。
【００６４】
３.ＬＰＳ＋ＩＮＯ群（ｎ＝８）
ＬＰＬ注入がベースライン測定後に開始され、６時間の間続けられた。エンドトキシン注入の開始後２時間半で、ＮＯ３０ｐｐｍの吸入が開始され、３．５時間の間維持された。肺及び肺外器官へのＩＮＯ治療の保護効果をチェックするために１時間毎に測定がなされた。
【００６５】
４.ＬＰＳ＋ステロイド（Ｓ）群（ｎ＝７）
プロトコールは上記と同じであったが、豚はエンドトキシン注入の開始後ＩＮＯ２．５時間の代わりに、ステロイド、ヒドロコルチゾン（Ｓｏｌｕｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の３．５ｍｇ／ｋｇを静脈内に受けた。
【００６６】
５.ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋Ｓ群（ｎ＝７）
この群は上述のように６時間にわたってエンドトキシンを受け、エンドトキシン投与の開始後２．５時間にステロイドが静脈内に与えられ、ＩＮＯ３０ｐｐｍが開始され、残りの３．５時間の研究期間の間続けられた。
【００６７】
ＮＯ投与
Ｎ２中１０００ｐｐｍのＮＯがＯ２／Ｎ２の混合物に添加され、換気装置の低流入口を通して投与された。吹き込まれたガスはＮＯ２を吸収するためにソーダ石灰を含むキャニスターを通過させられた。吸入されたＮＯは３０ｐｐｍに設定され、吹き込まれたＮＯ２の濃度は常に０．２ｐｐｍ未満であった。吹き込まれたＮＯとＮＯ２の濃度は換気装置の配管の吹き込み突出部内の化学発光（９８４１  ＮＯｘ，Ｌｅａｒ  Ｓｉｅｇｌｅｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ，ＵＳＡ）により連続的に測定された。ＦＩＯ２はＮＯ添加後にチェックされ、前のＩＮＯ水準に安定的に保たれた。
【００６８】
免疫組織化学
ＧＲ及びＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的検出は標準的なストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ検出技術（ＧＲ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ.ｓｃ−１００４  ＵＳＡ，Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｄｉｌｕｔｉｏｎ  １：２００；ＮＦ−ｋＢ：ＳＩＧＭＡ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｎ５８２３  Ｇｅｒｍａｎｙ，ｄｉｌｕｔｉｏｎ  １：１００）により達成された。パイロット実験はオートクレーブまたはマイクロウエーブ抗原回復及び原発性抗体の一晩のインキュベーションが最良の感度を生じたことを示した。抗体は色原体として３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（ＡＥＣ，ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．Ａ−６９２６  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるペルオキシダーゼ−アンチ−ペルオキシダーゼ法により検出された。全てのスライドは０．１％保証ヘマトキシリン（ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．ＭＨＳ−１６  Ｇｅｒｍａｎｙ）により対比染色された。
【００６９】
免疫組織化学の画像解析
全自動Ｌｅｉｃａ（Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ＤＭ  ＲＸＡ顕微鏡に取り付けられた１２−ビット冷却電荷結合素子カメラ（Ｓｅｎｓｙｓ  ＫＡＦ  １４００，Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）からなる画像解析システムがグレイスケール画像をデュアル−Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）２００ＭＨｚホストコンピュータにデジタル化するために使用された。顕微鏡設定は全測定を通して一定に保たれた（×４０対物レンズ、Ｌｅｉｃａ  ＰＬ  Ｆｌｕｏｔａｒ  ４０×／０．７５）。安定化された１２Ｖタングステン−ハロゲンランプ（１００Ｗ）が照明のために使用された。微小濃度測定がベクター赤色基体の吸光度測定（中心波長５２５ｎｍ、ハーフバンド幅１０±２ｎｍ）のためにＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）により製造された注文設計されたフィルターにより実施された。最適中心波長はＬｅｉｃａ  ＭＰＶ  ＳＰ顕微鏡光度計システム（Ｌｅｉｃａの好意による）での基体の測定により決定された。
【００７０】
統計的分析
値は平均±ＳＤとして表される。有意差はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験に続く変動の２ウェイ分析により評価された。統計的有意差はｐ＜０．０５と仮定された。
【００７１】
結果
血行力学及び動脈酸素付加
５研究群の中でベースライン血行力学及び動脈酸素付加に有意差はなかった。エンドトキシン群において、ＬＰＳ注入はベースライン水準の２または３倍に上昇したままである肺動脈圧の増加を起こした（図２）。ＰａＯ２はＬＰＳ注入の開始後半時間で有意に減少し、それは数時間の間減少を続け、次いでベースラインの水準の半分より小さくなった（図２）。ＩＮＯはＭＰＡＰの増加を弱めたが、それは健康な対照（ｐ＜０．０１）より７５−８０％有意に高かった（図２）。ＩＮＯはＰａＯ２の降下の一部を防いだ。エンドトキシン注入時にステロイドのみを受けた豚はエンドトキシンのみを受けた豚と同じ高さのＭＰＡＰを持っていた。従って、ステロイドは明白な効果を示さなかった。また、ＰａＯ２はステロイド処理により改善しなかったが、エンドトキシン群と同じ低さのままであった。
【００７２】
最後に、ＩＮＯとステロイドの両者を受けた豚はエンドトキシン注入の６時間後の実験の終わりに健康な対照ともはや有意に異ならないＭＰＡＰの連続降下を示した（図２）。更に、ＰａＯ２は治療中に改善し、実験の終わりに健康な対照ともはや有意に異ならなかった。
【００７３】
組織学的変化
表１と図３，４及び５を参照。
図３は肺組織の組織学的変化を示す。エンドトキシンは肺胞隔壁内の及び気管支壁周りの急性炎症性細胞浸潤、上皮及び内皮細胞の膨張、及び肺水腫及び出血を誘発した。ステロイド処理（ＬＰＳ＋ステロイド）は損傷の幾らかを修復しまたは防いだ。ＬＰＳ＋ＩＮＯ群の肺はずっと少ないこれらの変化を持ち、ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイドにさらされた肺はほんの小さな変化を持ち、従って、正常に近い組織を持っていた。しかし、幾つかの炎症性細胞浸潤及びより厚い肺胞隔壁及び幾らかの水腫がなお見られた。矢印は上述のような変化を示す。
【００７４】
図４は肝組織の組織変化を示す。エンドトキシンは小葉の周辺の結合組織の急性炎症性細胞浸潤、大きな肝細胞うっ血及び壊死、クッパー細胞反応性過形成、及び出血を誘発した。エンドトキシンに加えてステロイド（ＬＰＳ＋ステロイド）にさらされた豚においては、肝退化はＬＰＳ群におけるそれより少し少なかった。エンドトキシンに加えて吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）にさらされた肝においては、これらの変化はＬＰＳ群におけるよりかなり少なかった。エンドトキシンに加えて吸入された一酸化窒素とステロイドの両者（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド群）にさらされた群においては、肝組織の構造は健康な対照からの肝に近かった。従って、クッパー細胞の増加した数及び幾らかの炎症性細胞浸潤が見られたが、壊死は殆どなかった。矢印は上述の変化を示す。
【００７５】
図５は腎組織の組織変化を示す。エンドトキシンは急性炎症性細胞浸潤、水腫、及び糸球体構造の破壊及び糸球体の細胞の壊死を誘発した。エンドトキシンに加えてステロイド（ＬＰＳ＋ステロイド)にさらされた腎においては、これらの変化はＬＰＳ群におけるよりほんのわずかだけ目立たなかった。従って、糸球体内により多くの細胞があった（より少ない退化を示す）。エンドトキシンに加えて吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）にさらされた豚においては、それらの変化はＬＰＳ＋ステロイド群におけるよりなお目立たなかった。エンドトキシンに加えて吸入された一酸化窒素及びステロイドの両者（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド）にさらされた群においては、糸球体構造は維持された。しかし、炎症性細胞浸潤、糸球体の膨張及びボーマン嚢間隔の減少がなお見られた。矢印は上述の変化を示す。
【００７６】
表１は健康な豚（健康）と比べた、エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）、エンドトキシン＋ステロイド（ＬＰＳ＋Ｓ）、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素とステロイド（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋Ｓ）による肺（上パネル）、肝（中パネル）及び腎（下パネル）の組織学的変化を示す。＋は５階級尺度による（−、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋）変化のきびしさを示す。＊はＬＰＳに対するｐ＜０．０５を意味する。肺水腫または出血を示さないかまたは少ししか示さず、肝における小葉構造の破壊または壊死を示さず、かつ腎における壊死を示さないＬＰＳ＋ＩＮＯ＋Ｓ豚を除き全ての形式の変化はまた健康な対照から顕著に異なっていた。
【００７７】
【表１】
2006522116.tif 000002
【００７８】
免疫組織化学
グルココルチコイド受容体、ＧＲ
図６参照。
図６は肺組織におけるグルココルチコイド受容体の発現を示す。ＬＰＳ群において、正常組織（ここには示されていない）におけるより少ない数個の細胞にＧＲの弱い発現が観察された。ＧＲの発現は染色（黒ずんだ色、ＧＲ発現を示す）の増大した強度を持つ多数の細胞により、ＬＰＳ＋ＩＮＯ群で顕著に上昇させられた。染色は炎症細胞及び気道及び肺胞の上皮細胞に見られた。矢印は明確に染色された細胞を示す。
【００７９】
ＮＦ−ｋＢ
図７参照。
図７は肺組織におけるＮＦ−ｋＢの発現を示す。強いＮＦ−ｋＢ発現（黒ずんだ色）は炎症細胞、特にマクロファージに、並びに気管支壁の幾つかの上皮細胞に見られた。ＮＦ−ｋＢ発現は細胞の核内に位置しており、ＮＦ−ｋＢポジティブ細胞は凝集する傾向を持っていた。ＬＰＳ＋ＩＮＯ群において、ＮＦ−ｋＢ発現は低水準にあり、殆ど細胞質内に位置しており、ポジティブ細胞はまばらで散在していた。矢印は明確に染色された細胞を示す。
【００８０】
ＧＲ及びＮＦ−ｋＢに対する染色の定量測定
表２は健康な子豚（対照）からの組織と比べた、エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）、エンドトキシン＋ステロイド（ＬＰＳ＋Ｓ）、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素とステロイド（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋Ｓ）にさらされた子豚の肺、肝及び腎組織におけるグルココルチコイド受容体及びＮＦ−ｋＢの発現を示す。与えられた量は吸光度単位である。表において、有意に異なる関係が示された。
【００８１】
【表２】
2006522116.tif 000003
【００８２】
検討
この研究は豚モデルにおけるエンドトキシン注入が肺循環（肺）及び全身的循環（肝及び腎）の両者で深刻な炎症性応答を起こすことを示した。更に、エンドトキシン注入は肺組織及び肝（腎はＧＲに関しては今まで研究されなかった）におけるグルココルチコイド受容体発現の殆ど完全な排除と炎症性マーカーＮＦ−ｋＢのアップレギュレーションを起こした。炎症性応答は水腫、血栓の形成、例えば腎の糸球体のような微細構造の出血及び破裂及び肝の小葉の退化からなっていた。吸入されたＮＯ治療（ＩＮＯ）の開始は炎症性応答を弱めたが、ほんの限定された程度であった。別の治療技術の静脈内ステロイド投与は研究期間中の炎症性応答には殆ど効果がなかった。最後に、ＩＮＯとステロイドの組合せは炎症性応答を弱めるのに驚くべき効果を持っていた。幾らの形態学的異常がなお見られたが、肺、腎及び肝からの組織は正常な対照組織に比較的似ていた（図３−５）。
【００８３】
別の観察は生理学的変量、すなわち平均肺動脈圧及び動脈酸素付加が両者とも組合せたＩＮＯとステロイド療法により殆ど正常化されたことであった。エンドトキシンモデルにおけるＩＮＯのみは酸素付加を改善し、ＭＰＡＰを下げたが、正常に戻らず、ステロイド療法は殆ど効果を持たなかった。
【００８４】
我々が得たむしろ著しい結果は次の方法で説明されることができるようである。エンドトキシン敗血症モデルはグルココルチコイド受容体のほぼ完全なダウンレギュレーションを持つ炎症性応答を起こす。この受容体の活性化は炎症性カスケード応答を防ぎ、このカスケードの早期段階はＮＦ−ｋＢ及び他の炎症性マーカーの放出である。ＧＲのダウンレギュレーションにより、炎症性マーカーの生成及び放出が増強され、敗血症プロセスを促進する（Ｍｏｌｉｊｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．（１９９５）８０（６），１７９９−１８０３）。
【００８５】
ＩＮＯはある抗炎症効果並びに誘発可能なＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）の活性化を介しての内因的に生成されたＮＯを持つ。我々が最初に示すＩＮＯの最も重要な効果はこの敗血症状態のＧＲ発現のアップレギュレーションである。我々はこれが炎症プロセスの調節のための重要な役目を持つと考える。我々はまた、ＧＲの増加した利用可能性が共働ステロイド療法のより効率的な効果を可能とするであろうと考える。より多くのグルココルチコイド受容体を利用可能とすることにより、外因性ステロイド投与はより多くの受容体を結合させることができ、これらの手段により炎症プロセスをより効率的にブロックする。我々の知見はこの仮定を支持する（Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）９２（２），７９５−８０１；Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．（１９９７）４１（４），４５７−４６３；Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００１）９８（１２），６８６５−７０；Ａｌｍａｗｉ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００２）２８（２），６９−７８；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）２８３（３），Ｌ６３６−Ｌ６４７）。
【００８６】
結論
エンドトキシン豚モデルにおいてＩＮＯと静脈内ステロイドの組合せた投与は肺及び全身的器官（肝と腎）の両者の組織学的外観を著しく改善し、水腫形成、血栓形成及び構造的損傷を防いだ。この有益な効果はＩＮＯによるグルココルチコイド受容体のアップレギュレーションを徹底させ、ステロイド療法をより効率的にすると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】実施例で使用された種々のプロトコールを示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは実施例からの平均肺動脈圧（ＭＰＡＰ）結果及び動脈酸素付加（ＰａＯ２）結果をそれぞれ示す。
【図３】健康な子豚（健康）からの肺と比べた、エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）による、エンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）による、エンドトキシン＋ステロイド（ＬＰＳ＋ステロイド）による、及びエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素及びステロイド（ＬＰＳ＋ＩＮＯ＋ステロイド）による肺組織の組織学的変化を示す。
【図４】図３と同様に処理された、肝組織の組織学的変化を示す。
【図５】図３と同様に処理された、腎組織の組織学的変化を示す。
【図６】エンドトキシンのみ（ＬＰＳ）にまたはエンドトキシン＋吸入された一酸化窒素（ＬＰＳ＋ＩＮＯ）にさらされた子豚の肺組織内のグルココルチコイド受容体の発現を示す。
【図７】図６と同様に処理された子豚の肺組織内のＮＦ＋ｋＢの発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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