(57)【要約】本発明は、心臓疾患における鉄分分布障害の処置のためのエリスロポエチンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓疾患における鉄分分布障害の処置用薬剤の製造におけるエリスロポエチンタンパク質の使用。
【請求項２】
心臓疾患が心不全である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
エリスロポエチンタンパク質がヒトエリスロポエチンである、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
エリスロポエチンタンパク質が、エポエチン・アルファまたはエポエチン・ベータである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
エリスロポエチンタンパク質が、内因性遺伝子活性化によって発現される、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
エリスロポエチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
エリスロポエチンタンパク質が、１〜６個の糖鎖形成部位の付加により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を有する、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
エリスロポエチンタンパク質が、ダルベポエチン・アルファである、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
請求項３から８のいずれか１項において画定されたエリスロポエチンタンパク質が、ポリエチレングリコール化される、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
エリスロポエチンタンパク質がコンジュゲートであり、前記コンジュゲートが、少なくとも１つの遊離アミノ基と、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させる原因となるインビボ生物学的活性とを有するエリスロポエチンタンパク質であって、ヒトエリスロポエチンおよび、１〜６個の糖鎖形成部位の付加により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列または少なくとも１個の糖鎖形成部位の再配列を有するそれらの類似体から成る群から選ばれるエリスロポエチンタンパク質を含み、前記エリスロポエチンタンパク質が、ｎ個の式−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲのポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成し、Ｒは、低級アルキルであり、ｘは、２または３であり、ｍは、約４５０〜約９００であり、ｎは、１〜３であり、かつｎとｍは、前記エリスロポエチンタンパク質を引いた前記コンジュゲートの分子量が、２０キロダルトン〜１００キロダルトンである様に選ばれる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
ｘが２であり、ｍが６５０〜７５０であり、ｎが１でありかつＲがメチルである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
エリスロポエチンタンパク質がコンジュゲートであり、前記コンジュゲートが、少なくとも１つの遊離アミノ基と、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させる原因となるインビボ生物学的活性とを有するエリスロポエチンタンパク質であって、ヒトエリスロポエチンタンパク質および、１〜６個の糖鎖形成部位の付加により修飾されたヒトエリスロポエチンの一次構造を有するそれらの類似体から成る群から選ばれるエリスロポエチンタンパク質を含み、前記エリスロポエチンタンパク質が、１〜３個の低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各ポリ（エチレングリコール）基は、式−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｓ−Ｙ−のリンカーを介して前記エリスロポエチンタンパク質に共有結合し、前記リンカーのＣ（Ｏ）は前記アミノ基の１つとアミド結合を形成し、Ｘは、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−であり、ｋは、１〜１０であり、Ｙは、
【化１】
2006512326.tif 000020
であり、各ポリ（エチレングリコール）部分の平均分子量は、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり、かつ前記コンジュゲートの分子量は、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
式：
【化２】
2006512326.tif 000021
（式中、ｎは、１〜３の整数であり、ｍは、４５０〜９００の整数であり、Ｒは、低級アルキルであり、Ｘは、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−であり、ｋは、１〜１０であり、Ｐは、Ｘとのアミド結合を形成するｎ個のアミノ基を持たないエリスロポエチンタンパク質の残基である）のエリスロポエチンコンジュゲートを伴う、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
有効量のエリスロポエチンタンパク質の投与を含む、心臓疾患における鉄分分布障害の処置方法。
【請求項１５】
エリスロポエチンタンパク質の有効量を含むことを特徴とする、心臓疾患における鉄分分布障害を処置するための薬剤。
【請求項１６】
下記において画定された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチンの新しい使用に関し、特に、心臓疾患における鉄分分布障害の処置に関する。
【０００２】
鉄分の新陳代謝が正常ではない様々な疾患が知られている。貧血においては、身体における鉄分の全体的な欠乏により十分な血液が形成できない。鉄分に関するその他の代謝状態は、身体における鉄分の全体の濃度が正常よりも高い血色素症であり、様々な状態、例えば組織の破壊の原因となる。
【０００３】
鉄分分布障害は、身体における鉄分の全体の濃度が正常であるので上述の貧血および血色素症とは異なる。一方、鉄分は、様々な組織に蓄積され、これらの組織の損傷更には破壊の原因になり得る。一方、血液の形成において正常な量で存在する鉄分の使用は健康を損ない、貧血に相当する副次的効果を引き起すこととなる。
【０００４】
現在まで、心臓疾患に罹っている患者が、鉄分分布障害による影響を受ける高い可能性を有することは知られていない。鉄分分布障害は、鉄分の状態の診断で通常使用される様々なパラメーターにより診断できる。フェリチンおよび可溶性トランスフェリンレセプターの測定に基づいて、心臓疾患に罹っている患者における全体の鉄分濃度が正常かどうかを判断することが可能である。その場合、網状赤血球におけるヘモグロビンの低濃度は、鉄分分布障害の指標である。その他の指標は、心臓疾患に罹っていてかつ正常な全体の鉄分濃度を示す患者におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の連続的に／長期に上昇した濃度である。鉄分分布障害の診断方法は、Ｐ．Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ｍ．Ｖｏｌｋｍａｎｎ，  Ｊ．Ｌｏｔｚ，  Ａ．Ｂａｌｄａｕｆ，  Ｒ．Ｒｏｅｄｄｉｇｅｒ，  ｐｏｓｔｅｒ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ＡＡＣＣ／ＣＳＣＣ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｊｕｌｙ  ２９−Ａｕｇｕｓｔ  ２，  ２００１，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  Ｉｌｉｎｏｉｓによって記載されている。
【０００５】
今日まで、鉄分分布における障害に罹っている心臓疾患患者のための処置は未だ提案されていない。
【０００６】
したがって、本発明の背景をなす問題は、上述の欠点を最小化または抑制するために心臓疾患における鉄分分布障害の処置を提供することである。驚くべきことに、エリスロポエチンは、心臓疾患における鉄分分布障害について有益な効果を有することが分かった。したがって、この問題は、本発明により、心臓疾患における鉄分分布障害の処置における使用のためのエリスロポエチンを提供することによって解決される。
【０００７】
別段の表示がない限り、以下の定義は、ここで本発明を記述するために使用される様々な用語の意味および範囲を例示し且つ定義するために設けられる。
【０００８】
ここで使用される「低級アルキル」と言う用語は、１〜６個の炭素原子を有する線状または分岐アルキル基を意味する。低級アルキル基の例としては、メチル、エチルおよびイソプロピル、好ましくはメチルが挙げられる。
【０００９】
ここで使用される「低級アルコキシ」と言う用語は、基Ｒ′−Ｏ−（ここで、Ｒ′は、上述の低級アルキルである）を意味する。
【００１０】
「心臓疾患における鉄分分布障害」と言う用語は、心臓疾患に罹っている患者において起こる鉄分分布の障害を意味する。鉄分分布障害は、例えば、上述の様に特徴付けることができる。特に、鉄分分布障害は、次のパラメーターによって特徴付けられる：ｌｏｇ（フェリチンの濃度［μg／Ｌ］）で除された可溶性トランスフェリンレセプターの濃度［mg／Ｌ］が３．５よりも小さくかつ同時にＣ反応性タンパク質の濃度が５mg／Ｌより上である。
【００１１】
「エリスロポエチン」または「エリスロポエチンタンパク質」と言う用語は、骨髄細胞が網状赤血球と赤血球の産生を増加させる原因となるインビボ生物学的活性を持つタンパク質であって、以下に定義されるヒトエリスロポエチンおよび類似体から成る群から選ばれるタンパク質を意味する。
【００１２】
「ポリエチレングリコール化エリスロポエチン（Ｐｅｇ−ＥＰＯ又はＰＥＧ−ＥＰＯ）」と言う用語は、以下に定義される様な、１〜３個のポリエチレン誘導体と共有結合したエリスロポエチンタンパク質を意味する。
【００１３】
更に詳細には、本発明は、心臓疾患における鉄分分布障害の処置用薬剤の製造におけるエリスロポエチンの使用に関する。心臓疾患の例は、例えば、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、心不全、鬱血性心不全および／または心不全である。好ましい実施態様では、本発明は、心臓疾患が心不全である場合の上述の様な使用に関する。
【００１４】
本発明は、薬理学的に活性な成分としてエリスロポエチンを含む医薬組成物の調製にとって特に有用である。「エリスロポエチン」または「エリスロポエチンタンパク質」または「ＥＰＯ」と言う用語は、次のとおりのものである：特に、この用語は、糖タンパク質、例えば、ヒトエリスロポエチン、例えば、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）または（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）において示されるアミノ酸配列またはそれらに実質的に相同のアミノ酸配列を有し、その生物学的性質が、骨髄における赤血球の産生の刺激および関係した赤血球の前駆体の分割および分化の刺激に関わるヒトエリスロポエチンを意味する。ここで使用される様に、これらの用語は、意図的に、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、または突然変異によって偶然に修飾された様なタンパク質を含む。これらの用語は、また、糖鎖形成のための１〜６個の付加部位を有する類似体、糖タンパク質のカルボキシ末端において少なくとも１つの付加アミノ酸を有する類似体であって、付加アミノ酸が少なくとも１つの糖鎖形成部位を含む類似体、および糖鎖形成のための少なくとも１つの部位の再配列を含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。これらの用語は、天然のおよび組み替え的に生成されたヒトエリスロポエチンの両方を含む。本発明の好ましい実施態様においては、エリスロポエチンタンパク質はヒトエリスロポエチンである。
【００１５】
以下に詳細に示される様に、ＥＰＯの調製と精製は当該技術分野において良く知られている。エリスロポエチンとは、天然のまたは組み替えタンパク質、好ましくは、組織、タンパク質合成、天然または組み替え細胞での細胞培養の様な通常の資源から得られるヒトの、例えば、エポエチン・アルファまたはエポエチン・ベータを意味する。エリスロポエチンの活性を有する全てのタンパク質、例えば、突然変異タンパク質または別に修飾されたタンパク質が包含される。本発明の好ましい実施態様においては、エリスロポエチンタンパク質はエポエチン・アルファまたはエポエチン・ベータである。組み換えＥＰＯは、組み換えＤＮＡ方法または内因性遺伝子活性化によって、ＣＨＯ−、ＢＨＫ−またはＨｅＬａ細胞株での発現を介して調製されても良い。内因性遺伝子活性化を含むタンパク質の発現は、当該技術分野においては良く知られており、例えば、米国特許  Ｎｏｓ．  ５，７３３，７６１、５，６４１，６７０および５，７３３，７４６、並びに国際特許公開  Ｎｏｓ．  ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９４／１２６５０、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０６６６７およびＷＯ９１／０９９５５に記載されており、そのそれぞれの内容は、参考のために本明細書に組み込まれる。エリスロポエチンタンパク質が内因性遺伝子活性化によって発現される、上で定義された様な使用が好ましい。
【００１６】
エルスロポエチン糖タンパク質生成物の調製のために好ましいＥＰＯ種は、ヒトＥＰＯ種である。更に好ましくは、このＥＰＯ種は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されるアミノ酸配列を有するヒトＥＰＯであり、更に好ましくは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である。本発明の好ましい実施態様は、したがって、エリスロポエチンタンパク質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、上述の様な使用に関する。
【００１７】
更に、エリスロポエチンは、糖鎖形成のための１〜６個の付加部位を有する糖タンパク質類似体であっても良い。したがって、本発明は、また、エリスロポエチンタンパク質が、１〜６個の糖鎖形成部位の付加によって修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を有する、前述の様な使用に関する。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質の糖鎖形成は、ポリペプチドバックボーンに沿って特定の位置で起こり、タンパク質の安定性、分泌、亜細胞の局在性および生物学的活性の様なタンパク質の物性に大きな影響を及ぼす。糖鎖形成には、通常２つのタイプが存在する。Ｏ−結合オリゴ糖は、セリンまたはトレオニン残基に結合され、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラギン残基に結合される。Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方について見出されているオリゴ糖の１つのタイプは、９個以上の炭素原子を含むアミノ糖のファミリーであるＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）である。シアル酸は、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方において末端残基であり、それは負電荷を運ぶので、糖タンパク質に酸性を与える。１６５個のアミノ酸を有するヒトエリスロポエチンは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を含む３つのＮ−結合およびＯ−結合オリゴ糖鎖を含む。Ｎ−結合糖鎖形成は、２４、３８および８３の位置に配置されたアスパラギン残基において起こり、Ｏ−結合糖鎖形成は、１２６の位置に配置されたセリン残基において起こる。オリゴ糖鎖は、末端シアル酸残基で修飾される。糖鎖形成されたエリスロポエチンからの全てのシアル酸残基の酵素除去は、エリスロポエチンのシアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）が、肝結合タンパク質によって、その結合および順次クリアランスを妨げるのでインビボ活性の喪失をもたらすが、インビトロ活性の喪失をもたらすものではない。
【００１８】
「エリスロポエチン」と言う用語は、シアル酸結合のための部位の数の増加をもたらすヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列において１つまたは複数の変更を伴うヒトエリスロポエチンの類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、糖鎖形成のために利用できる部位を増加または変更させるアミノ酸残基の付加、削除または置換を有する部位特異的突然変異誘発によって生み出されても良い。ヒトエリスロポエチンにおいて見出されるものよりも大きいシアル酸水準を有する糖タンパク質類似体は、生物学的活性にとって必要とされる二次または三次構造を混乱させない糖鎖形成部位を付加することによって生成される。本発明の糖タンパク質は、また、Ｎ−結合またはＯ−結合部位の極近傍における１つ以上のアミノ酸の置換を通常含む、糖鎖形成部位における炭水化物結合の水準を増加させた類似体を含む。本発明の糖タンパク質は、また、エリスロポエチンのカルボキシ末端から伸びて、少なくとも１つの付加炭水化物部位を用意する１つ以上のアミノ酸を有する類似体を含む。本発明の組成物のエリスロポエチンタンパク質は、また、糖鎖形成のための少なくとも１つの部位の再配列を含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。糖鎖形成部位のその様な再配列は、ヒトエリスロポエチンにおける１つ以上の糖鎖形成部位の削除および１つ以上の非自然的に生じる糖鎖形成部位の付加を含む。エリスロポエチンにおける炭水化物鎖の数の増加、したがって、エリスロポエチン分子当りのシアル酸の数の増加は、増加された溶解性、タンパク質分解に対する大きな抵抗性、低減された免疫原性、増加された血清半減期および増加された生物学的活性の様な都合のよい性質を与えるかも知れない。付加糖鎖形成部位を伴うエリスロポエチン類似体は、欧州特許出願６４０６１９（Ｅｌｌｉｏｔ、１９９５年３月１日公開）において更に詳細に記載されている。
【００１９】
好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は、以下のものから選ばれる修飾によって修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を含むエリスロポエチンであってこれらに限定されないエリスロポエチンの様な糖鎖形成のための少なくとも１つの付加部位を含むアミノ酸配列を伴うエリスロポエチンタンパク質を含む：
【００２０】
【表１】
2006512326.tif 000002
【００２１】
アミノ酸配列の修飾のためにここで使用される表記は、上付け数字で示される、相当する未修飾タンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  のｈＥＰＯ）の位置が、それぞれの上付け数字の直前に置かれているアミノ酸に変換されることを意味する。
【００２２】
エリスロポエチンは、また、付加アミノ酸が少なくとも１つの糖鎖形成部位を含む、糖タンパク質のカルボキシ末端において少なくとも１つの付加アミノ酸を有する類似体であっても良い。付加アミノ酸は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端から誘導されるペプチドフラグメントを含んでも良い。好ましくは、糖タンパク質は、（ａ）カルボキシ末端から伸びるアミノ酸配列、Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  ＩＩｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎを有するヒトエリスロポエチン、（ｂ）Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯを更に含む（ａ）の類似体、および（ｃ）Ａｓｎ３０  Ｔｈｒ３２  Ｖａｌ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯを更に含む（ａ）の類似体から成る群から選ばれる類似体である。
【００２３】
エリスロポエチンタンパク質は、また、糖鎖形成のための少なくとも１つの部位の再配列を含むアミノ酸配列を有する類似体であっても良い。再配列は、ヒトエリスロポエチンにおけるＮ−結合炭水化物部位の任意の削除およびヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列の位置８８におけるＮ−結合炭水化物部位の付加を含んでも良い。好ましくは、糖タンパク質は、Ｇｌｎ２４  Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯ；Ｇｌｎ３８  Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯおよびＧｌｎ８３  Ｓｅｒ８７  Ａｓｎ８８  Ｔｈｒ９０  ＥＰＯから成る群から選ばれる類似体である。更なる類似体は、ダルベポエチン・アルファである。上述の使用において好ましいエリスロポエチンタンパク質は、ダルベポエチン・アルファである。
【００２４】
更に詳細には、本発明の医薬組成物のエリスロポエチンタンパク質は、また、それらのポリエチレングリコール化誘導体を含んでも良い。エリスロポエチンのポリエチレングリコール化誘導体およびそれらの調製は当該技術分野において知られており、例えば、ＷＯ０１／０２０１７、ＥＰ−Ａ−１０６４９５１、ＥＰ−Ａ−５３９，１６７、ＥＰ−Ａ−６０５，９６３、ＷＯ９３／２５２１２、ＷＯ９４／２００６９、ＷＯ９５／１１９２４、米国特許  Ｎｏ．５，５６、ＥＰ−Ａ−５８４，８７６、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９７／０４７９６、ＵＳ  Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３５９，０３０および５，６８１，８１１、米国特許  Ｎｏ．４，１７９，３３７、日本国特許、ＷＯ９８／３２４６６、米国特許  Ｎｏ．５，３２４，６５０において記載されている。好ましくは、上述の使用において、エリスロポエチンタンパク質はポリエチレングリコール化される。ポリエチレングリコール化エリスロポエチン種の好ましい実施態様は、以下に述べられる様な誘導体に関わるものである。
【００２５】
したがって、本発明は、また、エリスロポエチンタンパク質がコンジュゲート（conjugate）であって、前記コンジュゲートが、少なくとも１つの遊離のアミノ基と、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させる原因となるインビボ生物学的活性とを有するエリスロポエチンタンパク質であって、ヒトエリスロポエチンおよび、１〜６個の糖鎖形成部位の付加によって修飾されたヒトエリスロポエチンの配列または少なくとも１個の糖鎖形成部位の再配列を有するそれらの類似体から成る群から選ばれる上述のエリスロポエチンタンパク質を含み、前記エリスロポエチンが、式−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲであって、各ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（即ち、カルボニル）が前記アミノ基の１つとアミド結合を形成するｎ個のポリ（エチレングリコール）基に共有結合している（ここで、Ｒは、低級アルキルであり、ｘは、２または３であり、ｍは約４５０〜約９００であり、ｎは、１〜３でありかつｎとｍは、前記エリスロポエチンタンパク質を引いた前記コンジュゲートの分子量が２０キロダルトン〜１００キロダルトンである様に選ばれる）、上述の使用に関する。本発明は、更に、ｎが１であるコンジュゲートの割合が、組成物の全コンジュゲートの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、更に好ましくは９６％である、ここに記載されたコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
更に詳細には、上記コンジュゲートは、式（Ｉ）
Ｐ−［ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ］ｎ    （Ｉ）
（式中、Ｐは、ここに記載されている様なエリスロポエチンタンパク質（即ち、式Ｉにおいて示されるカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基を持たない）であって、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させる原因となるインビボ生物学的活性を有し、Ｒは、低級アルキルであり、ｘは２または３であり、ｍは、約４５０〜約９００であり、ｎは、１〜３でありかつｎとｍは、前記エリスロポエチン糖タンパク質を引いた前記コンジュゲートの分子量が２０キロダルトン〜１００キロダルトンである様に選ばれる）によって表示されても良い。本発明によれば、Ｒは、任意の低級アルキルである。Ｒがメチルであるコンジュゲートが好ましい。
【００２７】
記号「ｍ」は、ポリ（エチレンオキシド）基におけるエチレンオキシド残基（ＯＣＨ２ＣＨ２）の数を表す。エチレンオキシドの単一のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）サブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。したがって、（ＥＰＯの分子量を除いた）コンジュゲートの分子量は、「ｍ」の数に依存する。本発明のコンジュゲートにおいて、「ｍ」は、約４５０〜約９００（約２０kDa〜約４０kDaの分子量に相当する）であり、好ましくは約６５０〜約７５０（約３０kDaの分子量に相当する）である。ｍの数は、得られる本発明のコンジュゲートが、未修飾ＥＰＯに比べ得る生理学的活性（その活性が、同じかそれ以上を表しても良い）または未修飾ＥＰＯの相当する活性の画分を有する様に選択される。「約」のある数の分子量は、それが、通常の分析方法により決定されたその数の妥当な範囲内にあることを意味する。「ｍ」の数は、エリスロポエチン糖タンパク質に共有結合される各ポリ（エチレングリコール）基の分子量が約２０kDa〜約４０kDa、好ましくは約３０kDaである様に選択される。
【００２８】
本発明のコンジュゲートにおいては、「ｎ」の数は、アミド結合を介してエリスロポエチンタンパク質の遊離アミノ基（リジンアミノ酸のε−アミノ基および／またはアミノ末端アミノ基を含む）に共有結合したポリ（エチレングリコール）基の数である。本発明のコンジュゲートは、ＥＰＯの分子当り１、２または３個のＰＥＧ基を有しても良い。「ｎ」は、１〜３の範囲の整数であり、好ましくは、「ｎ」は、１または２であり、更に好ましくは「ｎ」は１である。上述のコンジュゲートの好ましいコンジュゲートは、ｘが２で、ｍが６５０〜７５０で、ｎが１でかつＲがメチルである化合物を含む。
式（Ｉ）の化合物は、公知の重合性物質：
【００２９】
【化３】
2006512326.tif 000003
【００３０】
（式中、Ｒおよびｍは、上述のとおりである）から調製することができる。即ち、式（ＩＩ）の化合物をエリスロポエチン糖タンパク質と縮合させることによって調製することができる。ｘが３である式（ＩＩ）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）のα−低級アルコキシ酪酸スクシニミジルエステルである（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ）。ｘが２である式（ＩＩ）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）のα−低級アルコキシプロピオン酸スクシニミジルエステルである（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）。活性化エステルとアミンを反応させてアミドを形成させる任意の通常の方法が利用できる。上述の反応において、例として挙げられたスクシニミジルエステルは、アミド形成を引き起す離脱基である。タンパク質を伴うコンジュゲートを製造するための、式（ＩＩ）の化合物の様なスクシニミジルエステルの使用は、米国特許  Ｎｏ．５，６７２，６６２（１９９７年９月３０日発行）（Ｈａｒｒｉｓ等）において記載されている。
【００３１】
ヒトＥＰＯは、９個の遊離アミノ基、即ち、アミノ末端アミノ基＋８個のリジン残基のε−アミノ基を含む。ポリエチレングリコール化試薬が式ＩＩのＳＢＡ化合物と組合された時に、ｐＨ７．５で、タンパク質：ＰＥＧ比が１：３で、かつ２０〜２５℃の反応温度で、モノ−、ジ−および痕跡量のトリ−ポリエチレングリコール化された種が製造されたことが分かった。ポリエチレングリコール化試薬が式ＩＩのＳＰＡ化合物であった時は、タンパク質：ＰＥＧ比が１：２以外は同じ条件で、主にモノ−ポリエチレングリコール化された種が生成される。ポリエチレングリコール化ＥＰＯは、混合物としてまたはカチオン交換クロマトグラフィーで分離された別々のポリエチレングリコール化された種として投与することができる。操作することによって、反応条件（例えば、試薬の比、ｐＨ、温度、タンパク質濃度、反応時間等）、別々のポリエチレングリコール化された種の相対量を変えることができる。
【００３２】
本発明の更に好ましい実施態様は、エリスロポエチンタンパク質がコンジュゲートであり、前記コンジュゲートが、少なくとも１つの遊離アミノ基と、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させる原因となるインビボ生物学的活性とを有するエリスロポエチンタンパク質であって、ヒトエリスロポエチンタンパク質および、１〜６個の糖鎖形成部位の付加によって修飾されたヒトエリスロポエチンタンパク質の一次構造を有するそれらの類似体から成る群から選ばれる、上で定義された様なエリスロポエチンタンパク質を含み、前記エリスロポエチンタンパク質が、１〜３個の低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、各ポリ（エチレングリコール）基は、式−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｓ−Ｙ−のリンカーを介してエリスロポエチンタンパク質に共有結合し、リンカーのＣ（Ｏ）は前記アミノ基の１つとアミド結合を形成し、Ｘは、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−であり、ｋは、１から１０であり、Ｙは、
【００３３】
【化４】
2006512326.tif 000004
【００３４】
であり、各ポリ（エチレングリコール）部分の平均分子量は、約２０キロダルトン〜約４０キロダルトンであり、かつコンジュゲートの分子量は、約５１キロダルトン〜約１７５キロダルトンである、上記で定義された様な使用に関する。
【００３５】
このエリスロポエチン種は、また、式（ＩＩＩ）
Ｐ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｙ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ］ｎ    （ＩＩＩ）
（式中、Ｒは、任意の低級アルキルである）で表されても良い。好ましい低級アルキルはメチルである。Ｘは、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−であっても良い（ここで、ｋは、１から１０である）。好ましくは、ｋは、１〜約４、更に好ましくは、ｋは１または２である。最も好ましくは、Ｘは−（ＣＨ２）である。
【００３６】
式１において、Ｙは、
【００３７】
【化５】
2006512326.tif 000005
【００３８】
、好ましくは、
【００３９】
【化６】
2006512326.tif 000006
【００４０】
、更に好ましくは、
【００４１】
【化７】
2006512326.tif 000007
【００４２】
である。
【００４３】
式（ＩＩＩ）において、ｍの数は、得られる式（ＩＩＩ）のコンジュゲートが、未修飾ＥＰＯに比べ得る生理学的活性（その活性が、同じかそれ以上を表しても良い）または未修飾ＥＰＯの相当する活性の画分を有する様に選択される。ｍは、ＰＥＧ単位におけるエチレンオキシド残基の数を表す。−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−の単一のＰＥＧサブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。したがって、（ＥＰＯの分子量を除いた）コンジュゲートの分子量は、ｍの数に依存する。「約」のある数の分子量は、それが、通常の分析方法により決定されたその数の妥当な範囲内にあることを意味する。ｍは、約４５０〜約９００（２０〜４０kDaの分子量に相当する）の範囲の整数であり、好ましくは、ｍは、約５５０〜約８００（約２４〜３５kDa）、最も好ましくは、ｍは、約６５０〜約７００（約２９〜約３１kDa）である。
【００４４】
式（ＩＩＩ）において、ｎの数は、アミド結合を介してＰＥＧ単位に共有結合したエリスロポエチンタンパク質におけるリジンアミノ酸のε−アミノ基の数である。本発明のコンジュゲートは、ＥＰＯの分子当り、１、２または３個のＰＥＧ単位を有しても良い。ｎは、１〜３の範囲の整数であり、好ましくは、ｎは１または２であり、更に好ましくは、ｎは１である。
【００４５】
式（ＩＩＩ）の好ましいエリスロポエチンタンパク質は、式：
【００４６】
【化８】
2006512326.tif 000008
【００４７】
で表される。
【００４８】
本発明の最も好ましい実施態様においては、エリスロポエチンコンジュゲートは、式：
【００４９】
【化９】
2006512326.tif 000009
【００５０】
（ここで、上記複数の式において、ｎは、１〜３の整数であり、ｍは、４５０〜９００の整数であり、Ｒは、低級アルキルであり、Ｘは、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−であり、Ｐは、Ｘとアミド結合を形成するアミノ基を持たないエリスロポエチンタンパク質の残基である）によって表される。
【００５１】
その他の好ましいエリスロポエチン糖タンパク質生成物は式：
【００５２】
【化１０】
2006512326.tif 000010
【００５３】
によって表される。
【００５４】
更に好ましいエリスロポエチン糖タンパク質生成物は、式：
【００５５】
【化１１】
2006512326.tif 000011
【００５６】
によって表される。
【００５７】
これらのエリスロポエチンタンパク質は、
（ａ）式Ｐ−［ＮＨ２］ｎで表されるエリスロポエチンタンパク質のリジンアミノ酸のε−アミノ基と、式Ｚ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑで表される二官能性試薬とを共有的に反応させて、式：
Ｐ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑ］ｎ
（式中、Ｐは、アミド結合を形成するアミノ基が少ないエリスロポエチンタンパク質であり、ｎは１〜３の整数であり、Ｚは、反応性基、例えば、カルボン酸−ＮＨＳエステルであり、Ｘは、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−（ここで、ｋは、１〜約１０である）であり、Ｑは、アルカノイル、例えばアセチルの様な保護基である）によって表されるアミド結合を持つ中間体を形成することによって、
（ｂ）工程（ａ）のアミド結合を持つ中間体を、式Ｗ−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｍ−ＯＲによって表される活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と共有的に反応させて、式：
【００５８】
【化１２】
2006512326.tif 000012
【００５９】
（式中、Ｗは、Ｙのスルフヒドリル反応形態であり、ｍは、約４５０〜約９００の範囲の整数であり、Ｒは低級アルキルであり、Ｙは上で定義されたとおりのものである）によって表されるエリスロポエチン糖タンパク質生成物を形成することによって、
調製されても良い。
【００６０】
この実施態様において、二官能性試薬は、好ましくは、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネートまたはＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートであり、Ｚは、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミドであり、活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体Ｗ−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｍ−ＯＲは、好ましくは、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンおよびメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドから成る群から選ばれる。
【００６１】
更に詳細には、式（ＩＩＩ）のエリスロポエチンタンパク質は、チオール基をＥＰＯに共有的に結合させ（「活性化」）、得られる活性化ＥＰＯをポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体とカップリングさせることによって調製されても良い。本発明によるポリエチレングリコール化ＥＰＯの調製のための第一工程は、ＥＰＯのＮＨ２−基を介してチオール基を共有結合させることを含む。ＥＰＯのこの活性化は、保護されたチオール基と付加反応性基、例えば、活性エステル、（例えば、スクシニミジルエステル）、無水物、スルホン酸エステル、カルボン酸およびスルホン酸のハロゲン化物をそれぞれに有する二官能性試薬と共に行われる。チオール基は、当該技術分野において知られている基、例えば、アセチル基によって保護される。これらの二官能性試薬は、アミド結合を形成することによって、リジンアミノ酸のξ−アミノ基と反応することができる。この反応の第一工程は以下に示される：
【００６２】
【化１３】
2006512326.tif 000013
【００６３】
（ここで、ＥＰＯ、ｎおよびＸは、上で定義されたとおりであり、Ｚは、当該技術分野において知られた反応性基、例えば、式
【００６４】
【化１４】
2006512326.tif 000014
【００６５】
のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）置換基である）。
【００６６】
好ましい実施態様においては、ε−アミノリジン基の活性化は、スクシニミジル部分を有する二官能性試薬との反応によって行われる。二官能性試薬は、別々のスペーサー種、例えば、−（ＣＨ２）ｋ−または−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−の部分（ここで、ｋは、１〜約１０、好ましくは、１〜約４、更に好ましくは１または２、最も好ましくは１である）を有しても良い。これらの試薬の例は、上で定義されたとおりのｋを持つＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）およびＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）である。
【００６７】
【化１５】
2006512326.tif 000015
【００６８】
アセチルチオアルキル−カルボン酸−ＮＨＳ−エステル、例えば
【００６９】
【化１６】
2006512326.tif 000016
【００７０】
２−（アセチルチオ）−（エトキシ）ｋ−酢酸−ＮＨＳ−エステル
【００７１】
二官能性試薬の調製は、当該技術分野において知られている。２−（アセチルチオ）−（エトキシ）ｋ−酢酸−ＮＨＳ−エステルの前駆体は、ＤＥ−３９２４７０５において記載されており、一方、アセチルチオ化合物の誘導体化は、Ｍａｒｃｈ，  Ｊ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  １９７７，  ３７５−３７６により記載されている。ＳＡＴＡは、市販されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ，  ＵＳＡ  ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）。
【００７２】
ＥＰＯ分子に付加されるチオール基の数は、反応パラメーター、即ち、タンパク質（ＥＰＯ）濃度およびタンパク質／二官能性試薬比を調整することによって選択できる。好ましくは、ＥＰＯは、ＥＰＯ分子当り１〜５個のチオール基、更に好ましくは、ＥＰＯ分子当り１．５〜３個のチオール基を共有的に結合することによって活性化される。これらの範囲は、ＥＰＯタンパク質集団全体のチオール基の統計学的分布を意味にする。
【００７３】
反応は、例えば、水性緩衝溶液、ｐＨ６．５〜８．０において、例えば、１０mMリン酸カリウム、５０mMＮａＣｌ、ｐＨ７．３において行われる。二官能性試薬は、ＤＭＳＯにおいて添加されても良い。反応の完結後、好ましくは３０分後に、反応はリジンの添加によって停止される。過剰の二官能性試薬は、当該技術分野において知られている方法、例えば、透析またはカラム濾過によって分離されても良い。ＥＰＯに付加されたチオール基の平均の数は、例えば、Ｇｒａｓｅｔｔｉ，  Ｄ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｊ．Ｆ．  ｉｎ  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１９，  ４１−４９（１９６７）において記載されている光度測定法により決めることができる。
【００７４】
上記の反応は、続いて、活性化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体の共有的カップリングによって行われる。適当なＰＥＧ誘導体は、約２０〜約４０kDa、更に好ましくは約２４〜約３５kDa、最も好ましくは約３０kDaの平均分子量を持つ活性化ＰＥＧ分子である。
【００７５】
活性化ＰＥＧ分子は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｍｏｒｐｕｒｇｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．（１９９６）７，  ｐａｇｅ  ３６３  ｆｆ  ｆｏｒ  ＰＥＧ−ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅにおいて記載されている。直鎖および分岐鎖ＰＥＧ種は、式１の化合物の調製にとって適当なものである。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧおよびメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである：
【００７６】
【化１７】
2006512326.tif 000017
【００７７】
これらのヨード−活性化物質の使用は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．Ｔ．  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）ｐ．１４７−１４８に記載されている。
【００７８】
最も好ましくは、ＰＥＧ種は、（低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミド）、例えば、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＭＷ  ３００００；  Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．）を使用してマレイミドで活性化される。低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドの構造は次のとおりであり：
【００７９】
【化１８】
2006512326.tif 000018
【００８０】
（式中、Ｒおよびｍは、上で定義されたとおりである）、好ましくは、
【００８１】
【化１９】
2006512326.tif 000019
【００８２】
である。
【００８３】
低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドとのカップリング反応は、水性緩衝溶液において、例えば、１０mMリン酸カリウム、５０mMＮａＣｌ、２mMＥＤＴＡ、ｐＨ６．２において、チオール保護基のインシトゥ（in situ）での開裂後に生じる。保護基の開裂は、例えば、ＤＭＳＯ中で、２５℃で、ｐＨ６．２で、約９０分間、ヒドロキシアミンで行われても良い。ＰＥＧ修飾のための活性化ＥＰＯ／低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比は、約１：３〜約１：６、好ましくは、１：４であるべきである。反応は、システインの添加および残留チオール基（−ＳＨ）とＮ−メチルマレイミドまたはジスルフィド結合を形成することのできるその他の適当な化合物との反応とによって停止されても良い。任意の残留活性チオール基と、Ｎ−メチルマレイミドの様な保護基またはその他の適当な保護基との反応のゆえに、本発明のコンジュゲートにおけるＥＰＯ糖タンパク質は、その様な保護基を含んでも良い。一般的に、ここに記載された方法は、ＰＥＧ−マレイミドにコンジュゲーションされなかった糖タンパク質上の活性化チオール基の数に依存して、異なる数の保護基で保護される異なる数のチオールを有する分子の混合物を生成する。
【００８４】
Ｎ−メチルマレイミドは、ポリエチレングリコール化タンパク質上の残留チオール基をブロックするために使用される時は、同じタイプの共有結合を形成するのに対して、ジスルフィド化合物は、ブロック剤のジスルフィド架橋カップリングのために分子間スルフィド／ジスルフィド交換反応を導く。このタイプのブロック反応にとって好ましいブロック剤は、酸化されたグルタチオン（ＧＳＳＧ）、システインおよびシスタミンである。システインでは更なる正味の電荷はポリエチレングリコール化タンパク質中に導入されないのに対して、ブロック剤ＧＳＳＧまたはシスタミンの使用は、更なる負または正電荷をもたらす。
【００８５】
モノ−、ジ−およびトリ−ポリエチレングリコール化ＥＰＯ種の分離を含む、式（ＩＩＩ）の化合物の更なる精製は、当該技術分野において知られている方法、例えば、カラムクロマトグラフィーによって行われても良い。
【００８６】
ポリエチレングリコール化エリスロポエチンは、好ましくは、少なくとも９０％のモノ−ＰＥＧコンジュゲートを含む。通常、エリスロポエチン糖タンパク質のモノ−ＰＥＧコンジュゲートは、それらがジ−ＰＥＧコンジュゲートよりも高い活性を有する傾向があるので望ましい。モノ−ＰＥＧコンジュゲートの割合およびモノ−とジ−ＰＥＧ種の比は、組成物において、モノ−ＰＥＧの割合を減少させる溶出ピーク近辺の広い画分またはモノ−ＰＥＧの割合を増加させる狭い画分をプールすることによって調節することができる。約９０％のモノ−ＰＥＧコンジュゲートは、収率と活性との良好な調和である。時には、例えば、コンジュゲートの少なくとも９２％または少なくとも９６％がモノ−ＰＥＧ種（ｎ＝１）である組成物が望まれるかも知れない。本発明の実施態様において、ｎが１であるコンジュゲートの割合は、９０％〜９６％である。
【００８７】
ポリエチレングリコール化エリスロポエチンを含む医薬組成物は当該技術分野において知られており、例えば、国際特許出願ＷＯ０１／８７３２９に記載されている。組成物は、上で定義された様に、１ml当り１０〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質を含んでも良い。好ましくは、組成物は、１ml当り１０〜１０００μg、例えば、１０、５０、１００、４００、８００または２５００μgを含む。更に、組成物は、１ml当り１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１０〜２００mmol／l硫酸塩、１０〜５０mmol／lリン酸塩、ｐＨ６．０〜６．５を含んでも良い。この組成物は、また、２０mMまでのメチオニン、１〜５％のポリオール（w/v）、０．１％までのプルロニック  Ｆ６８（w/v）および場合によっては、１mMまでのＣａＣｌ２を含んでも良い。この組成物の一例は、１ml当り１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、４０mmol／l硫酸塩、１０mmol／lリン酸塩、３％マンニトール（w/v）、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）、ｐＨ６．２を含む。或いはまた、組成物は、１ml当り１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１０〜１００mmol／lＮａＣｌ、１０〜５０mmol／lリン酸塩、ｐＨ６．０〜７．０、場合によっては１〜５％（w/v）のポリオールを含んでも良い。更に、この組成物は、２０mMまでのメチオニン、０．１％までのプルロニック  Ｆ６８（w/v）および場合によっては、７．５μmol／lＣａＣｌ２を含んでも良い。
【００８８】
特に、この組成物は、１ml当り１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１００mmol／lＮａＣｌ、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）、および１０mmol／lリン酸塩、ｐＨ７．０を含んでも良い。
【００８９】
本発明は、また、１ml当り１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１０〜５０mmol／lアルギニン、ｐＨ６〜ｐＨ６．５、１０〜１００mmol／l硫酸ナトリムを含む上記組成物に関する。更に、この組成物は、２０mMまでのメチオニン、０．１％までのプルロニック  Ｆ６８（w/v）、場合によっては１mmol／lＣａＣｌ２および場合によっては１〜５％のポリオール（w/v）を含んでも良い。特に、この組成物は、１ml当り１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、４０mmol／lアルギニン、ｐＨ６．２、３０mmol／l硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）および場合によっては、１mmol／lＣａＣｌ２を含んでも良い。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様は、１０〜１００００μg／mlのエリスロポエチン、好ましくは２５〜２５００μg／mlのエリスロポエチン、および
ａ）１０mMリン酸ナトリウム／カリウム、１００mMＮａＣｌ、ｐＨ７．０、または、
ｂ）１０mMリン酸ナトリウム、１２０mM硫酸ナトリウム、ｐＨ６．２、または、
ｃ）１０mMリン酸ナトリウム、４０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、ｐＨ６．２、または、
ｄ）１０mMリン酸ナトリウム、４０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）、ｐＨ６．２、または、
ｅ）４０mMアルギニン、３０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、ｐＨ６．２、または、
ｆ）４０mMアルギニン、３０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）、ｐＨ６．２、
を含む組成物に関する。
【００９１】
最も好ましい実施態様においては、組成物は、５０、１００、４００、８００または２５００μg／mlの量のエリスロポエチンタンパク質を含む。最も好ましい組成物は、１０mMリン酸ナトリウム、４０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）、ｐＨ６．２、または、４０mMアルギニン、３０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w/v）、１０mMメチオニン、０．０１％プルロニック  Ｆ６８（w/v）、ｐＨ６．２を含む。その様な組成物の更なる詳細は、ＷＯ０１／８７３２９で知ることができる。
【００９２】
本発明は、また、上で定義された様なエリスロポエチンタンパク質の有効量の投与を含む、心臓疾患における鉄分分布障害を処置するための方法に関する。更に、本発明は、エリスロポエチンタンパク質の有効量を含むことを特徴とする、心臓疾患における鉄分分布障害を処置するための薬剤に関する。心臓疾患の例は、例えば、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、心不全、鬱血性心不全および／または心不全である。上述の方法および薬剤についての記述においては、心不全が、心臓疾患の好ましい形態である。上述の方法および薬剤の好ましい方法および薬剤は、エリスロポエチンタンパク質が上で定義された様なものである。
【００９３】
心臓疾患における鉄分分布障害の処置においては、ＥＰＯは、例えば、１週間に２度、１５０U／kg体重の投与量で投与することができる。投与量は、個々の患者の要求によって変えることができ、また、例えば、１００〜２００U／kgの範囲であることもできる。使用されるＥＰＯ誘導体の半減期によって、投与量は、例えば、１週間に１回または３回の間で投与することができる。個々の患者の要求によって、医師は、また、異なる投与量を選択しても良い。
【００９４】
本発明のＥＰＯまたはＥＰＯコンジュゲートの特定の活性は、当該技術分野において知られている様々な評価法によって決めることができる。本発明の精製されたＥＰＯタンパク質の生物学的活性は、人間の患者に対して注射によるＥＰＯタンパク質の投与が、注射されていない、又は対照の被験者集団に比べて、網状赤血球および赤血球の産生を増加する骨髄細胞をもたらす様なものである。本発明により得られかつ精製されたＥＰＯタンパク質の生物学的活性、またはその断片は、Ａｎｎａｂｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｕｌｌ．  Ｗｌｄ．  Ｈｌｔｈ．  Ｏｒｇ．（１９７２）４７：９９−１２２およびＰｈａｒｍ．  Ｅｕｒｏｐａ  Ｓｐｅｃ．  Ｉｓｓｕｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＢＲＰ  Ｂｉｏ  １９９７（２）による方法で試験できる。ＥＰＯタンパク質の活性を決定するためのその他の生物学的評価法、即ち、正赤血球マウス評価法（normocythaemic mouse assay）は、文献（例えば、Ｐｈａｒｍ．  Ｅｕｒｏｐａ  Ｓｐｅｃ．  Ｉｓｓｕｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＢＲＰ  Ｂｉｏ  １９９７（２）およびＰｈ．  Ｅｕｒ．  ＢＲＰ．のエリスロポエチンの研究論文）に記載されている。
【００９５】
本発明は、ここに記述された本発明の例示であって限定をするものではない以下の実施例の参照によって一層良く理解されるであろう。
【実施例】
【００９６】
心臓疾患を持つ中年男性が、Ｐ．Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ｍ．Ｖｏｌｋｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｌｏｔｚ，  Ａ．  Ｂａｌｄａｕｆ，  Ｒ．Ｒｏｅｄｄｉｇｅｒ，  ｐｏｓｔｅｒ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ＡＡＣＣ／ＣＳＣＣ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｊｕｌｙ  ２９−Ａｕｇｕｓｔ  ２，２００１，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓに記載されているとおりに、以下のパラメーター−ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、フェリチンおよび可溶性トランスフェリンレセプターの決定により、鉄分分布障害に対して心臓カテーテル後に検査された。その結果は、鉄分分布障害を示した。患者を、１５０U／kgレコルモン（Ｒｅｃｏｒｍｏｎ）（登録商標）（市販のエリスロポエチンタンパク質）で、週に２回、最大１２週間、皮下的に処置した。その後、上述のパラメーターの決定は、鉄分欠乏障害の改善を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ヒトＥＰＯ（１６５アミノ酸）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の一次構造を示す図である。
【図２】ヒトＥＰＯ（１６６アミノ酸）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の一次構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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