(57)【要約】本発明は、免疫グロブリンの植物産生であって、免疫グロブリンに結合されたグリカンの少なくとも一部分がフコースを欠く植物産生を提供する。本発明は、このような免疫グロブリンを産生するために用いられる構築物、プラスミド、ベクター、形質転換植物細胞、形質転換植物カルス、形質転換植物組織（例えば葉、種子、塊茎等）および形質転換全植物体、免疫グロブリンの産生方法、開示された方法により産生される免疫グロブリン、ならびにこのような免疫グロブリンの使用も提供する。
2006517392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコースを欠く少なくとも1つの糖ペプチドを含む糖ペプチドプロフィールを有する、植物産生性免疫グロブリン。
【請求項２】
少なくとも1つの糖ペプチドがアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含む、請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項３】
免疫グロブリンの植物産生性重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）であって、フコースを欠く少なくとも1つの糖ペプチドを含む糖ペプチドプロフィールを有する前記ＨＣまたはＬＣ。
【請求項４】
少なくとも1つの糖ペプチドがＣＨ２領域にアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含む、請求項３記載のＨＣ。
【請求項５】
フコースを欠く少なくとも1つのグリカンを含む遊離グリカンプロフィールを有する植物産生性免疫グロブリン。
【請求項６】
アスパラギン（Ａｓｎ）残基を含む、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項７】
グリカンプロフィールが図１２に提示されたものと同一であるかまたは実質的に同一である、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項８】
グリカンが、３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ；２Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ；３Ｍａｎ、３ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ；３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ；３Ｍａｎ、３ＧｌｃＮＡｃ；４Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ；５Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ；および６Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）からなる群から選択される、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項９】
グリカンが、３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌまたは２Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）である、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項１０】
グリカンプロフィールが図１６に提示されたグリカンプロフィールのうちの1つと同一であるかまたは実質的に同一である、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項１１】
グリカンが、Ｈ２Ｎ２Ｘ；Ｈ３Ｎ２；およびＨ３Ｎ２Ｘ（ここで、Ｈ＝ヘキソース、Ｎ＝ＨｅｘＮＡｃ＝Ｎ−アセチルヘキソースおよびＸ＝キシロース）からなる群から選択される、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項１２】
グリカンが、Ｎ２Ｈ８；Ｎ２Ｈ３Ｘ；Ｎ２Ｈ３Ｘ；Ｎ２Ｈ４Ｘ；Ｎ２Ｈ５；Ｎ２Ｈ６；Ｎ２Ｈ７；Ｎ２Ｈ８；Ｎ３Ｈ３Ｘ；Ｎ２Ｈ４；およびＮ２Ｈ５（ここで、Ｈ＝ヘキソース、Ｎ＝ＨｅｘＮＡｃ＝Ｎ−アセチルヘキソースおよびＸ＝キシロース）からなる群から選択される、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項１３】
ヘキソースがマンノースであり、Ｎ−アセチルヘキソースがＮ−アセチルグルコサミンである、請求項１１または請求項１２記載の免疫グロブリン。
【請求項１４】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群から選択される、請求項１または請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項１５】
ＩｇＡまたはＩｇＧである、請求項１４記載の免疫グロブリン。
【請求項１６】
重鎖および軽鎖を有するＩｇＡ抗体である、請求項１４記載の免疫グロブリン。
【請求項１７】
抗単純ヘルペスウイルス抗体である、請求項１６記載の免疫グロブリン。
【請求項１８】
重鎖および軽鎖を有するＩｇＧ抗体である、請求項１４記載の免疫グロブリン。
【請求項１９】
抗二重インテグリン抗体である、請求項１８記載の免疫グロブリン。
【請求項２０】
抗αＶβ３、αＶβ５二重インテグリン抗体である、請求項１９記載の免疫グロブリン。
【請求項２１】
グリカンプロフィールが図１９に提示されたグリカンプロフィールと同一であるかまたは実質的に同一である、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項２２】
グリカンプロフィールが図２１に提示されたグリカンプロフィールと同一であるかまたは実質的に同一である、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項２３】
グリカンプロフィールが図２３に提示されたグリカンプロフィールと同一であるかまたは実質的に同一である、請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項２４】
末端フコースを伴わない少なくとも1つの結合グリカンを含む植物産生性免疫グロブリン。
【請求項２５】
ＣＨ２領域にアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含む、請求項２４記載の免疫グロブリン。
【請求項２６】
フコースを欠く少なくとも1つのグリカンを含むグリカンプロフィールを有する植物産生性免疫グロブリンであって、当該グリカンプロフィールが、当該免疫グロブリンから酵素的に放出される遊離Ｎ結合グリカンのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分光（ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ）分析を用いて確定される前記免疫グロブリン。
【請求項２７】
ＩｇＡである、請求項２６記載の免疫グロブリン。
【請求項２８】
抗単純ヘルペスウイルス抗体である、請求項２７記載の免疫グロブリン。
【請求項２９】
ＩｇＧである、請求項２６記載の免疫グロブリン。
【請求項３０】
抗二重インテグリン抗体である、請求項２９記載の免疫グロブリン。
【請求項３１】
抗αＶβ３、αＶβ５二重インテグリン抗体である、請求項３０記載の免疫グロブリン。
【請求項３２】
請求項１または請求項５の免疫グロブリンを含む植物細胞、植物組織、植物カルス、苗、全植物体または種子。
【請求項３３】
単子葉植物のものである、請求項３２記載の植物細胞、植物組織、植物カルスまたは種子。
【請求項３４】
単子葉植物がトウモロコシである、請求項３３記載の植物細胞、植物組織、植物カルスまたは種子。
【請求項３５】
単子葉類である、請求項３２記載の苗または全植物体。
【請求項３６】
単子葉植物がトウモロコシである、請求項３５記載の植物細胞、植物組織、植物カルスまたは種子。
【請求項３７】
免疫グロブリンが種子の内胚乳に位置する、請求項３２記載の種子。
【請求項３８】
ヒト免疫グロブリンである、請求項１または請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項３９】
尾片を欠く重鎖を含む、請求項１または請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項４０】
ＩｇＡ抗体である、請求項３９記載の免疫グロブリン。
【請求項４１】
抗単純ヘルペスウイルス抗体である、請求項３９記載の免疫グロブリン。
【請求項４２】
免疫グロブリンの重鎖が尾片を欠く、請求項３記載の免疫グロブリン。
【請求項４３】
ＩｇＡ抗体である、請求項４２記載の免疫グロブリン。
【請求項４４】
抗単純ヘルペスウイルス抗体である、請求項４３記載の免疫グロブリン。
【請求項４５】
免疫グロブリンを産生するために用いられる植物から単離される、請求項１または請求項５記載の免疫グロブリン。
【請求項４６】
図１２に提示される構造番号１（３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ）（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物。
【請求項４７】
図１２に提示される構造番号２（２Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ）（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物。
【請求項４８】
フコースを有する結合グリカンを欠くアミノ酸断片を含む植物産生性免疫グロブリンであって、当該免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、同一アミノ酸断片上にまたは実質的同一アミノ酸断片上にフコースを有する結合グリカンを有する前記免疫グロブリン。
【請求項４９】
特定アミノ酸断片に関するグリカンプロフィールを含む植物産生性免疫グロブリンであって、当該免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、同一アミノ酸配列に関するまたは実質的同一アミノ酸配列に関する同一または実質的同一グリカンプロフィールを有する前記免疫グロブリン。
【請求項５０】
フコースを欠く結合グリカンを有するアミノ酸断片を含む植物産生性免疫グロブリンであって、当該免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、同一アミノ酸断片上にまたは実質的同一アミノ酸断片上にフコースを有する結合グリカンも欠く前記免疫グロブリン。
【請求項５１】
フコースを欠く結合グリカンを含む遊離グリカンプロフィールを有する植物産生性免疫グロブリンであって、当該免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、さらにまたフコースを欠く同一グリカンを含む遊離グリカンプロフィールを有する前記免疫グロブリン。
【請求項５２】
哺乳類産生性免疫グロブリンがＣＨＯ細胞中で産生される、請求項４８、請求項４９、請求項５０または請求項５１記載の免疫グロブリン。
【請求項５３】
植物産生性免疫グロブリンがトウモロコシ細胞中で産生され、そして哺乳類産生性免疫グロブリンがＣＨＯ細胞中で産生される、請求項４８、請求項４９、請求項５０または請求項５１記載の免疫グロブリン。
【請求項５４】
フコースを伴わない少なくとも１つの結合グリカンを有する免疫グロブリンを発現する形質転換植物細胞の産生方法であって、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を含み、各核酸がプロモーターと操作可能的に連結される単一ベクターを植物細胞中に導入することにより、植物細胞を形質転換し、そして形質転換植物細胞を培養して、フコースを伴わない少なくとも１つの結合グリカンを有する免疫グロブリンを発現する植物細胞を産生することを包含する前記方法。
【請求項５５】
形質転換植物細胞から免疫グロブリンを単離することをさらに包含する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
形質転換植物細胞から形質転換植物体カルスまたは形質転換全植物体を再生することをさらに包含する、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
形質転換植物体カルスまたは形質転換全植物体から免疫グロブリンを単離することをさらに包含する、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
重鎖および軽鎖に関する配列が同一プロモーターと操作可能的に連結される、請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
重鎖および軽鎖に関する配列が異なるプロモーターと操作可能的に連結される、請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
プロモーターが構成性プロモーターである、請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
構成性プロモーターが３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターまたはトウモロコシユビキチン−１プロモーターである、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
プロモーターが内胚乳特異的プロモーターである、請求項５４記載の方法。
【請求項６４】
ベクターが、ｐＤＡＢ８５０５；ｐＤＡＢ１４７２；ｐＤＡＢ１４７３；ｐＤＡＢ１４７４；およびｐＤＡＢ１４７５からなる群から選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項６５】
ｐＤＡＢ８５０５；ｐＤＡＢ１４７２；ｐＤＡＢ１４７３；ｐＤＡＢ１４７４；およびｐＤＡＢ１４７５からなる群から選択されるベクター。
【請求項６６】
植物細胞が、アグロバクテリウム媒介性形質転換法またはWHISKERSTM形質転換法を用いて形質転換される、請求項５４記載の方法。
【請求項６７】
単離単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体の産生方法であって、（ｉ）各々がプロモーターに操作可能的に連結される配列番号１または配列番号５および配列番号９または配列番号１３を有する核酸を植物細胞中に導入して、形質転換植物細胞を産生し；（ｉｉ）形質転換植物細胞を培養して導入核酸を発現し；そして（ｉｉｉ）植物細胞により産生される単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体を単離することを包含する前記方法。
【請求項６８】
形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することをさらに包含する、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
配列番号１５（ｐＤＡＢ６３５）；配列番号１６（ｐＤＡＢ１６）；配列番号１７（ｐＤＡＢ６３７）；配列番号８４（ｐＤＡＢ３０１４）；および配列番号８５（ｐＤＡＢ８５０５）からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子。
【請求項７０】
配列番号１０または配列番号１４によりコードされるアミノ酸をコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項７１】
配列番号１または配列番号５を含む単離核酸分子。
【請求項７２】
配列番号９または配列番号１３を含む単離核酸分子。
【請求項７３】
配列番号１または配列番号５を含む単離ベクターまたはプラスミド。
【請求項７４】
配列番号２または配列番号６によりコードされるアミノ酸をコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項７５】
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項７６】
配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項７７】
配列番号９または配列番号１３を含む単離ベクターまたはプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、米国特許仮出願第60/429,385号（2002年11月27日提出）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
産業上の利用分野
本発明は一般に、植物における免疫グロブリン組成物の産生であって、植物産生免疫グロブリンに結合されたグリカンの少なくとも一部がフコースを欠く産生に関する。本発明は、一般に、植物における単量体抗体組成物の産生であって、植物産生性単量体抗体に結合されたグリカンの少なくとも一部分がフコースを欠く産生にも関する。本発明の方法により産生される免疫グロブリンは、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等）またはイソタイプのものであり得る。さらに本発明は、植物における単量体免疫グロブリンＡ（単量体ＩｇＡ）抗体組成物の産生であって、典型的にはフコシル化されたグリコシル化部位のみを有する抗体尾片を有さないという理由で、単量体ＩｇＡ抗体がフコースを欠く産生にも関する。本発明は、植物における抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）単量体免疫グロブリンＡ（抗ＨＳＶ単量体ＩｇＡ）抗体組成物の産生であって、典型的にはフコシル化されたグリコシル化部位のみを有する抗体尾片を有さないという理由で、ＨＳＶ単量体ＩｇＡ抗体に結合されたグリカンの少なくとも一部分がフコースを欠く産生にも関する。さらに本発明は、植物における単量体免疫グロブリンＧ（単量体ＩｇＧ）抗体組成物の産生にも関する。本発明は、植物における−アルファ−ｖ−ベータ３、アルファ−ｖ−ベータ５（即ちαＶβ３およびαＶβ５）二重インテグリンＩｇＧ抗体組成物の産生であって、植物産生抗体組成物に結合されたグリカンの少なくとも一部分がフコースを欠く産生にも関する。本発明は、このような免疫グロブリンおよび抗体の全てを産生するために用いられる構築物、プラスミド、ベクター、形質転換化植物細胞、植物カルス、植物組織、苗、種子および全植物体；このような免疫グロブリンおよび抗体の産生方法；開示された方法により産生される免疫グロブリンおよび抗体；ならびにこのような免疫グロブリンおよび抗体の使用も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
参照出版物および特許出願は全て、各々の個々の出版物または特許出願が特定的におよび独立して参照により援用されることを示されたのと同程度に、参照により本明細書中で援用される。
【０００４】
以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書中で提供された情報のいずれかは、従来技術であるか、または本発明に関連しているということ、あるいは特定的にまたは無条件に参照される任意の出版物は従来技術であるということは、認められた事実ではない。
【０００５】
ますます、治療薬としてのより大型のそしてより複雑なタンパク質分子の産生および使用により大きな注意が集中されている。このような治療用タンパク質の例としては、免疫応答および抗体を誘導するためにワクチン接種に用いられる抗原が挙げられる。
【０００６】
植物は、哺乳類治療用タンパク質、例えば多量体タンパク質、例えば抗体の産生のための宿主として、大きな可能性を有する（例えばHiatt, A. et al., Nature 342 (6245): 76-78 (1989); Hein et al., Biotechnol. Prog. 7(5): 455-461 (1991); Hiatt, A., and Ma, J.K., FEBS Lett 307(1): 71-5 (1992); Ma et al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138 (1994); Ma et al., TIBTECH 13: 522-527 (1995); Zeitlin et al., Nature Biotechnology 16(1361-1364 (1998); Ma, H.K.-C et al. Nature Medicine 4(5): 601-606 (1998); Miele, L., Trends Biotechnol. 15: 45-50 (1997); Khoudi et al., Biotechnology and Bioengineering 64(2): 135-143 (1999); and Hood, E.E. & Jilka, J.M., Curr. Opin. Biotechnol. 10: 382-386 (1999)参照）。抗体産生のために植物を用いることの利点としては、大規模生産、生産、保持および送達のためのコスト削減、ならびにおそらくは有害な夾雑物、例えばヒトおよびその他の哺乳類に対して病原性であるウイルスまたはプリオンを含有する結果的に生じる製品の危険の排除が挙げられる。植物は、他の異種発現系、例えば哺乳類細胞、細菌、酵母および昆虫と同様、グリコシル化における差を示す（例えばMa et al., Science 268: 716-719 (1995); Jenkins et al., Nat. Biotechnol. 14: 975-981 (1996);およびLerouge et al., Plant Mol. Biol. 38: 31-48 (1998)参照）。
【０００７】
植物では、他の真核生物と同様に、小胞体（ＥＲ）と会合されるポリリボソーム上で合成される可溶性および膜結合タンパク質のほとんどが、糖タンパク質、例えば後にゴルジ装置、リソソーム、形質膜または細胞外マトリックスに輸出されるタンパク質である。糖タンパク質に結合されたグリカンは、多数の異なる立体配座を呈し得る線状または分枝構造で連結される種々の糖残基を含有する。これらのグリカンは、正確なタンパク質フォールディングおよびアセンブリーを促すに際して基本的役割を演じ、その結果、タンパク質安定性を増強する。それらはターゲッティング情報も含有し得るし、あるいはタンパク質認識に直接関与し得る（Maia et al., Genetics and Molecular Biology 24: 231-234 (2001)）。炭水化物を包含するタンパク質の3つの主な翻訳後修飾は、Ｎ−およびＯ−結合グリコシル化ならびにグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの挿入である。
【０００８】
哺乳類および植物系におけるＮ−結合グリコシル化メカニズムは、臣下の間保存されてきた。しかしながらゴルジ装置におけるオリゴ糖トリミングおよびグリカン修飾の最終段階で、差が観察される。Ｎ−結合グリカンを有さない細菌、およびポリマンノースグリカンを有する酵母と対比して、植物は2つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基により置換されるコアを有する複雑なＮ−結合グリカンを伴う糖タンパク質多量体を産生する。これらの糖タンパク質多量体は、哺乳類でも観察される（例えばKornfeld and Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631 (1985)参照）。植物および動物糖ポリペプチド多量体は、存在するオリゴ糖の外側枝に直接連結される異なる末端炭水化物を含有する。動物糖ポリペプチド多量体、例えば哺乳類糖ポリペプチド多量体は、末端炭水化物残基として存在するシアル酸を有するが、一方、植物糖ポリペプチド多量体は有さない。末端コアは、哺乳類に生じる場合、α１，６−結合コアフコースの代わりに、β１，２−結合キシロース（Ｘｙｌ）およびα１，３−結合コアフコース（Ｆｕｃ）により置換される。さらに植物糖タンパク質多量体は、哺乳類において見出される特徴的ガラクトース（Ｇａｌ）−およびシアル酸−含有複合Ｎ−グリカン（Ｎ−アセチルノイラミン酸−α２−６／３Ｇａｌβ１−４）を欠く（例えばSturm et al., J. Biol. Chem: 262: 13392 (1987)参照）。植物特異的グリカンを有するトランスジェニック植物において産生されるネズミモノクローナル抗体は、マウスにおいて免疫原性でないことが判明した（Chargelegue et al., Transgenic Research 9: 187-194 (2000)）。
【０００９】
抗体は、2つの重鎖の各々のＦｃ領域のＮ−結合グリコシル化を保存している。ヒトＩｇＡ抗体は、それらのヒンジ部分におけるＯ−結合オリゴ糖および2つのＮ−結合炭水化物鎖（1つは重鎖のＣＨ２領域中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基上に生じ、他方は尾片領域中のＡｓｎ残基上である）を有する（例えばBaenzinger, J. and Kornfield, S.J., Biol. Chem. 249: 7260-7269 (1974)；およびTorano et al., PNAS 74: 2301-2305 (1997)参照）。ヒト血清から単離されたＩｇＡのフコシル化は、尾片領域におけるＡｓｎ上でのみ起こる（Tanaka et al., Glycoconj. J. 10: 995-1000 (1998)）。
【００１０】
Hiatt等は、個別のまたは集合化免疫グロブリン重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物を産生した。各免疫グロブリン産物は、内分泌経路にタンパク質を向けて、抗体分子の正確なアセンブリーおよびグリコシル化を可能にする配列を形成するリーダー配列を含有するプロタンパク質として発現された。リーダー配列は、成熟タンパク質から切断される（例えば米国特許第5,202,422号；第5,639,947号および第6,417,429号参照）。機能性抗体に集合される重鎖、軽鎖、Ｊ鎖および分泌構成成分ポリペプチドを含有する分泌性免疫グロブリンの協調発現のための方法が開示されている（例えば米国特許第5,959,177号；第4,046,037号および第6,303,341号参照）。本明細書中に引用された米国特許の各々は、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。ネズミ免疫グロブリン膜貫通配列は、植物における組換え免疫グロブリン鎖の形質膜ターゲッティングのために用いられた（Vine et al., Plant Molecular Biology 45: 159-167 (2001)）。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明の重要性は、植物における免疫グロブリン組成物の製造のために免疫グロブリンプロフィールを簡明にすることを中心とする。一態様では、本発明は、植物において免疫グロブリンを産生するための材料および方法であって、免疫グロブリンに結合されたグリカンのうちの少なくともいくつかがフコシル化されない（即ちグリカンのうちの少なくとも1つがフコースを欠くか、および／または免疫グロブリンが少なくとも一部非フコシル化される）材料および方法を提供する。別の態様では、本発明は、植物における単量体免疫グロブリンを産生するための材料および方法であって、免疫グロブリンのうちの少なくともいくつかが非フコシル化されるグリカンを含む材料および方法を提供する。したがって一態様において、本発明は、植物におけるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ組成物を産生するための材料および方法であって、組成物がフコースを欠く少なくとも１つのグリカン構造を含む材料および方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、植物における免疫グロブリンを産生するための材料および方法であって、免疫グロブリンの重鎖が尾片を欠く材料および方法を提供する。
【００１２】
一態様では、本発明の材料および方法により産生される免疫グロブリンの混合物は、少し（pauci-）フコシル化されると、または非最小フコシル化されると言われ、これは、そのように産生される免疫グロブリンのうちのいくつか、ほとんどまたは全てがフコシル化を欠く、ということを示す。別の態様では、本発明の材料および方法により産生される免疫グロブリンの混合物はこのようなものとして用いられ得るし、あるいは非フコシル化免疫グロブリンは免疫グロブリンの混合物から分離され、別個に用いられ得る。
【００１３】
別の態様では、本発明は、植物により産生された免疫グロブリンの投与により単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）または腫瘍新脈管形成を治療するための材料および方法であって、免疫グロブリンのグリカン構造のうちの少なくとも1つがフコースを欠く材料および方法も生じる。
【００１４】
本発明の別の態様では、免疫グロブリンの発現は、軽鎖および重鎖の両方をコードする核酸を含む単一ベクターを用いて成し遂げられる。
【００１５】
一態様では、本発明は、植物産生性免疫グロブリンであって、フコースを欠く少なくとも1つの糖ペプチドを含む糖ペプチドプロフィールを有する免疫グロブリンを提供する。別の態様では、本発明は、少なくとも1つの糖ペプチドがアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含むこのような免疫グロブリンを提供する。
【００１６】
一態様では、本発明は、免疫グロブリンの植物産生性重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）であって、フコースを欠く少なくとも1つの糖ペプチドを含む糖ペプチドプロフィールを有するＨＣまたはＬＣを提供する。さらに別の態様では、ＨＣは、ＣＨ２領域にアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含む少なくとも1つの糖ペプチドを有する。
【００１７】
一態様では、本発明は、フコースを欠く少なくとも1つのグリカンを含む遊離グリカンプロフィールを有する植物産生性免疫グロブリンを提供する。別の態様では、本発明は、アスパラギン（Ａｓｎ）残基を含むような免疫グロブリンを提供する。
【００１８】
さらに別の態様では、グリカンプロフィールは、図１２に提示されたものと同一であるかまたは実質的に同一である。一態様では、グリカンは、３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ；２Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ；３Ｍａｎ、３ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ；３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ；３Ｍａｎ、３ＧｌｃＮＡｃ；４Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ；５Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ；および６Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）からなる群から選択される。さらに別の態様では、選択されるグリカンは、３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌまたは２Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）である。
【００１９】
さらに別の態様では、グリカンプロフィールは、図１６に提示されたグリカンプロフィールのうちの1つと同一であるかまたは実質的に同一である。さらに別の態様では、グリカンは、Ｈ２Ｎ２Ｘ；Ｈ３Ｎ２；およびＨ３Ｎ２Ｘ（ここで、Ｈ＝ヘキソース、Ｎ＝ＨｅｘＮＡｃ＝Ｎ−アセチルヘキソースおよびＸ＝キシロース）からなる群から選択される。さらに別の態様では、グリカンは、Ｎ２Ｈ８；Ｎ２Ｈ３Ｘ；Ｎ２Ｈ３Ｘ；Ｎ２Ｈ４Ｘ；Ｎ２Ｈ５；Ｎ２Ｈ６；Ｎ２Ｈ７；Ｎ２Ｈ８；Ｎ３Ｈ３Ｘ；Ｎ２Ｈ４；およびＮ２Ｈ５（ここで、Ｈ＝ヘキソース、Ｎ＝ＨｅｘＮＡｃ＝Ｎ−アセチルヘキソースおよびＸ＝キシロース）からなる群から選択される。本発明の一態様では、これらの免疫グロブリンの各々に関して、ヘキソースはマンノースであり、そしてＮ−アセチルヘキソースはＮ−アセチルグルコサミンである。
【００２０】
本発明の一態様では、本明細書中に詳述された免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群から選択される任意の免疫グロブリンであり得る。一態様では、当該免疫グロブリンは、ＩｇＡまたはＩｇＧである。例えば本発明の一態様では、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有するＩｇＡ抗体である。このようなＩｇＡの特定の例は、抗単純ヘルペスウイルス抗体である。別の例では、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有するＩｇＧ抗体である。このようなＩｇＧの特定の例は、抗二重インテグリン抗体、例えば抗αＶβ３、αＶβ５二重インテグリン抗体である。
【００２１】
一態様では、本発明の免疫グロブリンのグリカンプロフィールは、図１９または図２１または図２３に提示されたグリカンプロフィールと同一であるかまたは実質的に同一である。
【００２２】
一態様では、本発明は、末端フコースを伴わない少なくとも1つの結合グリカンを含む植物産生性免疫グロブリンを提供する。さらに別の態様では、このような免疫グロブリンは、ＣＨ２領域にアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含む。
【００２３】
一態様では、本発明は、フコースを欠く少なくとも1つのグリカンを含むグリカンプロフィールを有する植物産生性免疫グロブリンであって、グリカンプロフィールが、免疫グロブリンから酵素的に放出される遊離Ｎ結合グリカンのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分光（ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ）分析を用いて確定される免疫グロブリンを提供する。このような免疫グロブリンの例は、ＩｇＡ、例えば抗単純ヘルペスウイルス抗体である。別の態様では、このような免疫グロブリンの例は、ＩｇＧ、例えば抗二重インテグリン抗体である。このような抗二重インテグリン抗体の例は、抗αＶβ３、αＶβ５二重インテグリン抗体である。
【００２４】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載され、そして開示された免疫グロブリンを含む植物細胞、植物組織、植物カルス、苗、全植物体または種子を提供する。一態様では、植物細胞、植物組織、植物カルスまたは種子は単子葉植物のものである。別の態様では、本発明は、単子葉植物がトウモロコシである植物細胞、植物組織、植物カルスまたは種子を提供する。さらに別の態様では、本発明は、単子葉類である苗または全植物体を提供する。例えば本発明の植物細胞、植物組織、植物カルスまたは種子は、トウモロコシ植物のものであり得る。
【００２５】
一態様では、本発明の免疫グロブリンは、種子の内胚乳中に存在し得る。
一態様では、本発明の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンであり得る。
一態様では、本発明の免疫グロブリンは、尾片を欠く重鎖を有する。一態様では、このような免疫グロブリンは、ＩｇＡ抗体、例えば抗単純ヘルペスウイルス抗体である。
一態様では、本発明により提供される免疫グロブリンは、免疫グロブリンを産生するために用いられる植物から単離される。
【００２６】
一態様では、本発明は、図１２に提示されるような構造番号１（３Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ）（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、図１２に提示されるような構造番号２（２Ｍａｎ、２ＧｌｃＮＡｃ、１Ｘｙｌ）（ここで、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＸｙｌ＝キシロース）を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物を提供する。
【００２８】
一態様では、本発明は、フコースを有する結合グリカンを欠くアミノ酸断片を含む植物産生性免疫グロブリンであって、免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、同一アミノ酸断片上にまたは実質的同一アミノ酸断片上にフコースを有する結合グリカンを有する免疫グロブリンを提供する。
【００２９】
一態様では、本発明は、特定アミノ酸断片に関するグリカンプロフィールを含む植物産生性免疫グロブリンであって、免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、同一アミノ酸配列に関するまたは実質的同一アミノ酸配列に関する同一または実質的同一グリカンプロフィールを有する免疫グロブリンを提供する。
【００３０】
一態様では、本発明は、フコースを欠く結合グリカンを有するアミノ酸断片を含む植物産生性免疫グロブリンであって、免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、同一アミノ酸断片上にまたは実質的同一アミノ酸断片上にフコースを有する結合グリカンも欠く免疫グロブリンを提供する。
【００３１】
一態様では、本発明は、フコースを欠く結合グリカンを含む遊離グリカンプロフィールを有する植物産生性免疫グロブリンであって、免疫グロブリンが哺乳類産生性である場合、さらにまたフコースを欠く同一グリカンを含む遊離グリカンプロフィールを有する免疫グロブリンを提供する。
【００３２】
一態様では、本発明は、哺乳類産生性免疫グロブリンがＣＨＯ細胞中で産生されるこのような免疫グロブリンを提供する。
一態様では、本発明は、植物産生性免疫グロブリンがトウモロコシ細胞中で産生され、そして哺乳類産生性免疫グロブリンがＣＨＯ細胞中で産生されるような免疫グロブリンを提供する。
【００３３】
一態様では、本発明は、フコースを伴わない少なくとも１つの結合グリカンを有する免疫グロブリンを発現する形質転換植物細胞の産生方法であって、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を含み、各核酸がプロモーターと操作可能的に連結される単一ベクターを植物細胞中に導入することにより、植物細胞を形質転換し、そして形質転換植物細胞を培養して、フコースを伴わない少なくとも１つの結合グリカンを有する免疫グロブリンを発現する植物細胞を産生することを包含する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、形質転換植物細胞から免疫グロブリンを単離する方法をさらに提供する。別の態様では、本発明は、形質転換植物細胞から形質転換植物体カルスまたは形質転換全植物体を再生する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、形質転換植物体カルスまたは形質転換全植物体から免疫グロブリンを単離する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖に関する配列が同一プロモーターと操作可能的に連結されるような方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖に関する配列が異なるプロモーターと操作可能的に連結されるような方法を提供する。一態様では、本発明は、プロモーターが構成性プロモーターであるような方法を提供する。例えば３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターまたはトウモロコシユビキチン−１プロモーターが、本発明の方法に用いられ得る。さらに別の態様では、本発明の方法は、種子特異的プロモーターを利用する。さらに別の態様では、本発明は、内胚乳特異的プロモーターを利用する。
【００３４】
一態様では、本発明は、ベクターが、ｐＤＡＢ８５０５；ｐＤＡＢ１４７２；ｐＤＡＢ１４７３；ｐＤＡＢ１４７４；およびｐＤＡＢ１４７５からなる群から選択されるような方法を提供する。
【００３５】
一態様では、本発明は、ベクターｐＤＡＢ８５０５；ｐＤＡＢ１４７２；ｐＤＡＢ１４７３；ｐＤＡＢ１４７４；およびｐＤＡＢ１４７５を提供する。
【００３６】
一態様では、本発明は、植物細胞が、アグロバクテリウム媒介性形質転換法またはWHISKERSTM形質転換法を用いて形質転換されるような方法を提供する。
【００３７】
一態様では、本発明は、単離単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体の産生方法であって、（ｉ）各々がプロモーターに操作可能的に連結される配列番号１または配列番号５および配列番号９または配列番号１３を有する核酸を植物細胞中に導入して、形質転換植物細胞を産生し；（ｉｉ）形質転換植物細胞を培養して導入核酸を発現し；そして（ｉｉｉ）植物細胞により産生される単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体を単離することを包含する方法を提供する。一態様では、本発明はさらに、形質転換植物細胞から形質転換植物を再生することを包含するこのような方法を提供する。
【００３８】
一態様では、本発明は、配列番号１５（ｐＤＡＢ６３５）；配列番号１６（ｐＤＡＢ１６）；配列番号１７（ｐＤＡＢ６３７）；配列番号８４（ｐＤＡＢ３０１４）；および配列番号８５（ｐＤＡＢ８５０５）からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号１０または配列番号１４によりコードされるアミノ酸をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。
【００３９】
一態様では、本発明は、配列番号１または配列番号５を含む単離核酸分子を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号９または配列番号１３を含む単離核酸分子を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号１または配列番号５を含む単離ベクターまたはプラスミドを提供する。
【００４０】
一態様では、本発明は、配列番号２または配列番号６によりコードされるアミノ酸をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。
別の態様では、本発明の免疫グロブリンは、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖を有する。さらに別の態様では、本発明の免疫グロブリンは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
【００４１】
一態様では、本発明は、配列番号９または配列番号１３を含む単離ベクターまたはプラスミドを提供する。
本発明のツールおよび方法は、配偶子を産生する全ての植物に対する用途を有する、ということが上記から理解される。このような植物としては、双子葉類、単子葉類、例えば薬草、飼い葉、イネ科植物、芝、飼料用マメ科植物（例えばアルファルファ）、野菜、栽培作物植物（例えばトウモロコシおよびダイズ）、樹木および観賞用花が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のその他の対象、利点および特徴は、明細書および本明細書中に呈示された図面を再検討すれば、当業者に明らかになる。
【００４３】
上記の要約、ならびに本発明の下記の詳細な説明は、添付の図面とともに読めば、より良好に理解される。本発明を説明するために、目下好ましい実施形態（単数または複数）を図面で示す。しかしながら本発明は、示された精確な配置および手段に限定されない、と理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
詳細な説明
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術的および科学的用語は全て、本発明が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと類似のまたは等価の任意の方法および材料が本発明の実施または試験に用いられ得るが、好ましい方法および材料を記載する。
【００４５】
Ｉ．定義
本明細書中で用いる場合、「非フコシル化された」および「非フコシル化」という用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリンの一部、抗体または抗体の一部に結合される特定のグリカン、グリカン分画、糖ペプチドまたは糖ペプチドにフコースが存在しない情況を指す。「非フコシル化された」および「非フコシル化」という用語は、本明細書注では、フコースが結合しないようにされるか、または結合後に除去される、分子的なまたは他の、任意の特定のメカニズムを含むことを意味しない。したがって本明細書中での本用語の使用は、フコースが以下のメカニズム：転写的、翻訳的または翻訳後的に：のうちの特定の1つにより排除されたということを含むことを意味しない。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「栽培作物植物」という用語は、生産規模で、最も典型的には種子、貯蔵牧草または干草の収穫のために栽培される任意の作物植物を指す。例としては、トウモロコシ、ダイズ、ライムギ、コムギ、オートムギ、オオムギ、レンズマメ、乾燥エンドウ、セイヨウアブラナ、モロコシ、アルファルファ、トリチカレ、クローバ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書中で用いる場合、「対立遺伝子」という用語は、いくつかの代替形態の遺伝子のいずれかを指す。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、「アミノ酸」という用語は、タンパク質およびペプチドの構成成分であるアミノカルボン酸を指す。表６および７ならびに本明細書中の他の箇所に用いたアミノ酸略号を以下に示す：
Ａ（Ａｌａ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｓｏ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）。
【００４９】
本明細書中で用いる場合、「抗−アルファ−ｖ−ベータ３、アルファ−ｖ−ベータ５二重インテグリン抗体」、「抗二重インテグリン抗体」、「抗二重インテグリン抗体部分」、「抗−αＶβ３、抗αＶβ５」、「抗αｖβ3、抗αｖβ5」または「抗二重インテグリン抗体断片」および／または「抗二重インテグリン抗体変異体」等としては、本発明の後退中に組入れられ得る免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子、例えば重鎖または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）あるいはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変部、重鎖または軽鎖定常部、フレームワーク領域、またはそれらの任意の部分、あるいは二重インテグリン受容体または結合タンパク質の少なくとも一部分（これらに限定されない）を含有する任意のタンパク質またはペプチドが挙げられる。
【００５０】
本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、病原体、あるいは「自己」と認識されない他の部分との接触に応答して身体（ヒトまたは動物）中で普通に産生されるタンパク質を指す。抗体（例えばＩｇＧおよびｓＩｇＡ）および抗体断片（例えばＦａｂおよびＳｃＦｖ）は、病原体を中和し、それゆえ病原体に対する免疫を作るという特異的能力を有する。抗体分子は、4つのポリペプチド鎖：2つの同一重鎖（ＨＣ）および2つの同一軽鎖（ＬＣ）からなる。Ｙ抗体立体配置の各「腕」は、1つの軽鎖と、1つの重鎖の一部を含む。ヒンジ領域は、腕を動くようにさせ、そして「幹」は2つの重鎖の残り部分により形成される（図１３参照）。Ｙの各腕領域は抗原結合部位として役立ち、結合部位はポリペプチドの可変部と会合される。ＨＣおよびＬＣは、ジスルフィド架橋により一緒に保持される。分泌抗体も、連結鎖（ＪＣ）および分泌構成成分（ＳＣ）からなる。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、「抗原」という用語は、特異的免疫応答を誘導し得る、そしてその応答により産生される結果的に生じる抗体と反応し得る任意の物質を指す。
本明細書中で用いる場合、「抗ウイルス性」という用語は、ウイルスの複製を妨げる物質を指す。
【００５２】
本明細書中で用いる場合、「主鎖プラスミド」または「主鎖ベクター」という用語は、当該遺伝子（単数または複数）の発現に必要な素子の全てを含有するプラスミドを指し、例としては、ＭＡＲ配列、プロモーター、３’ＵＴＲ、選択可能マーカー遺伝子カセット、ならびに抗体コード領域の一段階付加のための独特の制限部位が挙げられる。主鎖ベクターの別の特質は、抗生物質耐性遺伝子の効率的除去のための独特の制限部位の存在である。
【００５３】
本明細書中で用いる場合、「ベータ−グルクロニダーゼ」または「ＧＵＳ」という用語は、大腸菌から得られる植物形質転換試験にルーチンに用いられるスクリーン可能マーカー遺伝子を指す（例えばJefferson, R., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 8447-8451 (1986); Jefferson, R., et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987); Jefferson, R., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405 (1987); およびJefferson, R., Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405(1988)参照）。
【００５４】
本明細書中で用いる場合、「作物植物」という用語は、任意の商業的目的のために栽培される任意の植物を指し、例としては以下の目的：種子生産、干草生産、観賞用、果実生産、漿果生産、野菜生産、油製造、タンパク質製造、飼い葉生産、動物放牧、ゴルフコース、芝生、花卉生産、景観用、腐蝕制御、緑肥、土壌耕作／健康の改良、製剤製品／薬の製造、食品添加物製造、喫煙製品、製紙および製材が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、「他家受粉」または「交雑」という用語は、植物に言及するのに用いる場合、ある植物上のある花の花粉が別の植物上のある花の胚珠（柱頭）に（人工的にまたは天然に）適用される過程を意味する。
【００５６】
本明細書中で用いる場合、「栽培品種」という用語は、植物に言及する場合、園芸的または作物栽培的技術により生産された、そして野生集団中には普通は見出されない植物の変種、系統または品種を意味する。
【００５７】
本明細書中で用いる場合、「双子葉類」および「単子葉類」という用語は、2つの種子半分体または子葉を含有する胚を有する顕花植物を指す。例としては、タバコ；トマト；マメ科植物、例えばエンドウ、アルファルファ、クローバおよびダイズ；オーク；カエデ；バラ；ハッカ；カボチャ；デージー；クルミ；サボテン；スミレおよびキンポウゲが挙げられる。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、「二量体抗体」または「ｄＩｇＡ」という用語は、Ｊ鎖により連結される2つの単量体抗体を含む抗体を指す。したがって「二量体ＩｇＡ」または「ｄＩｇＡ」は、Ｊ鎖により連結される2つの単量体ＩｇＡ抗体を含み（図１３Ｂ参照）、そして「二量体抗ＨＳＶ  ＩｇＡ」または「抗ＨＳＶ  ｄＩｇＡ」は、Ｊ鎖により連結される単純ヘルペスウイルスに対する2つの単量体ＩｇＡ抗体を含む。
【００５９】
本明細書中で用いる場合、「内胚乳」という用語は、胚嚢の2つの極核および多数の植物種子に見出される花粉からの雄核のうちの1つとの間の融合の発生に起因する三倍体構造を指す。内胚乳はしばしば、栄養物を貯蔵し、これが発芽中に分解される。
【００６０】
本明細書中で用いる場合、「雑種世代」という用語は、特定の親世代後の植物細胞、組織または器官の世代のいずれかを指す。親植物の交配に起因する世代は、雑種第一世代（「Ｆ１」または「Ｆ1」と呼ばれる）であり、一方、Ｆ１植物の交雑に起因するものは、雑種第二世代（「Ｆ２」または「Ｆ2」と呼ばれる）である。
【００６１】
「配偶子」という用語は、その核（そしてしばしば細胞質）が、同一起源であるがしかし反対の性の別の配偶子の核と融合して、新規の個々の植物に発生する能力を有する接合体を形成する生殖細胞を指す。配偶子は、典型的には一倍体であり、雄および雌に区別される。
【００６２】
「遺伝子」という用語は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって遺伝子としては、それらの発現に必要とされるコード配列および／または調節配列が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子は、例えば他のタンパク質に関する認識配列を構成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は種々の供給源から得られ、たとえば当該供給源からクローニングされ、あるいは既知のまたは予測された配列情報から合成され得るし、そして所望のパラメーターを有するよう意図された配列を含み得る。
【００６３】
本明細書中で用いる場合、「遺伝子型」という用語は、細胞、細胞培養、組織、全生物体（例えば全植物体または動物体）または全生物体の群（例えば植物または動物の群）の遺伝子的構造組成を指す。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「グリカン」（「多糖」と同義語）という用語は、グリコシド結合により互いに連結される単糖（即ちグルコース）からなる任意の線状または分枝鎖ポリマーを指す。グリカンの例としては、グリコーゲン、デンプン、ヒアルロン酸およびセルロースが挙げられる。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「グリコシド」という用語は、炭水化物分子（糖）を含有する任意の化合物、特に加水分解的切断により、糖および非糖化合物に転換可能な、植物における任意のこのような天然産物を指す。
【００６６】
本明細書中で用いる場合、「糖ペプチド」という用語は、その中で炭水化物がペプチドまたはオリゴペプチドと共有的に結合される化合物または組成物を指す。
本明細書中で用いる場合、「糖タンパク質」という用語は、その中で炭水化物がタンパク質と共有的に結合される化合物または組成物を指す。
【００６７】
本明細書中で用いる場合、「グリコシル化」という用語は、タンパク質上の特定残基へのオリゴ糖の付加を指す。この修飾は、同時翻訳的および翻訳後的で、小胞体およびゴルジ対中で起こり得る。3つの異なる形態のグリコシル化が識別され得る：Ｎ−結合オリゴ糖、Ｏ−結合オリゴ糖およびグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー。
【００６８】
本明細書中で用いる場合、「半接合的」という用語は、一倍体細胞または生物体中の遺伝子、ヘテロ配偶子を持つ性における伴性遺伝子、あるいは二倍体細胞または生物体における染色体のセグメント中の遺伝子（この場合、その相手セグメントは欠失されている）として、遺伝子が遺伝子型中に1回のみ存在する細胞、組織または生物体を指す。
本明細書中で用いる場合、「ヘルペス」という用語は、単純ヘルペスウイルスまたは水痘ウイルスにより引き起こされる炎症性皮膚疾患を意味する。
【００６９】
本明細書中で用いる場合、「単純ヘルペス」という用語は、「単純ヘルペスウイルス１」（「ＨＳＶ１」および「１型単純ヘルペスウイルス」とも呼ばれる）および「単純ヘルペスウイルス２」（「ＨＳＶ２」および「２型単純ヘルペスウイルス」とも呼ばれる）により引き起こされる種々の感染症を指す（全ていくつかの急性炎症性ウイルス疾患のいずれかを指す）。当該疾患は、通常は口、口唇、顔面および生殖器上の小水疱の発疹により特性化される。ＨＳＶ１およびＨＳＶ２により引き起こされる水疱の位置は、位置特定的でない。
【００７０】
本明細書中で用いる場合、「ヘルペスウイルス」とは、ヘルペスウイルス科に属する任意のウイルスを指す。
本明細書中で用いる場合、「ヘテログリカン」または「ヘテロ多糖」という用語は、2つまたはそれ以上の異なる種類の単糖残基から成るグリカンを指す。
【００７１】
「非相同ポリヌクレオチド」または「非相同核酸」あるいは「外因性ＤＮＡセグメント」とは、特定の宿主細胞に対して異物である供給源から生じるか、あるいは同一供給源からである場合には、その元の形態から修飾されるポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを指す。したがって宿主細胞中の非相同遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、しかし修飾された遺伝子を含む。したがって本用語は、（ｉ）細胞に対して異物であるかまたは非相同である、あるいは（ｉｉ）細胞に対して相同性であるが、しかし宿主細胞内のある位置では、その素子は普通は見出されない核酸であるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを産生するよう発現され得る。
【００７２】
「非相同形質」とは、外因性ＤＮＡセグメント、非相同性ポリヌクレオチドまたは非相同性核酸により、形質転換宿主細胞またはトランスジェニック生物に付与される表現型を指す。
【００７３】
本明細書中で用いる場合、「ヘテロ接合体」という用語は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態）を有する二倍体または多倍数体の個々の植物細胞または植物を指す。
本明細書中で用いる場合、「ヘテロ接合性」という用語は、特定遺伝子座での異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態）の存在を指す。
【００７４】
本明細書中で用いる場合、「ＨＰＬＣ」という用語は、高速液体クロマトグラフィーを指す。
本明細書中で用いる場合、「ホモ接合体」という用語は、１つまたは複数の遺伝子座に同一対立遺伝子を有する個々の植物細胞または植物を指す。
【００７５】
本明細書中で用いる場合、「ホモ接合性」という用語は、相同染色体セグメント中の１つまたは複数の遺伝子座での同一対立遺伝子の存在を指す。
本明細書中で用いる場合、「ハイブリッド」という用語は、１つまたは複数の遺伝子が異なる親間の交配に起因する任意の細胞、組織または全生物体（例えば全植物体または動物体）を指す。
【００７６】
本明細書中で用いる場合、「ＨＸ８」または「ＨＸ−８」という用語は、ＩｇＡ抗体に関する同定略号（ここで、Ｈ＝ヘルペス、Ｘ＝単純および８＝試料番号）を指す。ＨＸ８は、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の両方を中和し、糖タンパク質Ｄ上に存在するエピトープと結合し、ATCC 69522により産生されるＦａｂ断片の結合特異性を有し、そして配列番号１のＣＤＲ３を伴う重鎖を有するヒトモノクローナル抗体（試料番号８）である（米国特許第6,156,313号に記載）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。ＨＸ８抗体の重鎖および軽鎖に関する全ヌクレオチドは、それぞれ配列番号１および配列番号９として示される。
【００７７】
本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、免疫学的に活性であり、抗原と特異的に結合し得る血漿およびその他の体液中に見出される一クラスの構造的に関連したタンパク質産物またはタンパク質の一部を指す。各Ｉｇは、免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）（κ、λ）および免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）（γ、α、μ、δおよびε）の2対の免疫学的活性部分からなる（図１３Ａ参照）。それらの構造および生物学的活性に基づいて分類される5つの主なクラスの抗体タンパク質または免疫グロブリンが存在する：ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ。ほとんどの抗体クラスが単一分子として分泌されるが、しかしＩｇＡおよびＩｇＭ抗体は、他のタンパク質鎖により一部安定化される大型ポリマーとの会合を形成する。
【００７８】
本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン産物」または「Ｉｇ産物」という用語は、抗原と特異的に結合し得るポリペプチド、タンパク質または多量体タンパク質を指す。免疫グロブリン産物の例は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的無傷免疫グロブリン分子、抗原結合部位を含有する免疫グロブリンの任意の部分、例えばＦａｂ断片として当該技術分野で既知の部分である。
【００７９】
本明細書中で用いる場合、「純系」または「近交系」という用語は、相対的純粋育種系統を指す。
本明細書中で用いる場合、「インテグリン」または「複数のインテグリン」という用語は、細胞接着分子のための受容体として作用する膜貫通タンパク質の大ファミリーの任意の成員を指す。インテグリンは、αおよびβサブユニットが非共有結合されるヘテロ二量体分子である。
【００８０】
本明細書中で用いる場合、「連結鎖」、「Ｊ鎖」または「ＪＣ」という用語は、免疫グロブリンの重合および上皮細胞による重合化免疫グロブリンの運搬に関与するポリペプチドを指す（例えばThe Immunoglobulin Helper: The J Chain in Immunoglobulin Genes, at pg. 345, Academic Press (1989)参照）。ＪＣは、五量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＡに見出され（図１３Ｂ参照）、典型的にはジスルフィド結合を介して結合される。
【００８１】
本明細書中で用いる場合、「locus遺伝子座」（複数：「loci遺伝子座」）という用語は、遺伝子的に限定された任意の部位を指す。遺伝子座は、なんらかの調節的役割を有し、そして異なる配列により占められ得る遺伝子または遺伝子の一部あるいはＤＮＡ配列であり得る。
【００８２】
本明細書中で用いる場合、「ＭＡＬＤＩ」という用語は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化を指す。
【００８３】
本明細書中で用いる場合、「質量スペクトルのＭＡＬＤＩ−Ｔ」または「ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ」という用語は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分光分析を指す。質量スペクトルのＭＡＬＤＩ−Ｔを確定するために用いられる設備の例は、Applied Biosystems Voyager ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−Ｔ）質量分光分析計である。
本明細書中で用いる場合、「マトリックス付着領域」または「ＭＡＲ」（「足場付着領域」または「ＳＡＲ」とも呼ばれる）という用語は、核足場網状構造への付着が起こる特定ＤＮＡ配列を指す。本発明に用いられるＭＡＲ配列に関する情報は、米国特許第5,773,689号および第6,239,328号（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）において入手可能である。
【００８４】
本明細書中で用いる場合、「集団選択」という用語は、植物繁殖方法を記載するために用いられる場合、個々の植物が選択され、次の世代がそれらの種子の集合体から繁殖される選択の形態を指す。
本明細書中で用いる場合、「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」という用語は、特定の抗原を認識する単一抗体産生細胞に由来する抗体を指す。ＭＡｂは、抗体を産生する細胞と多発性骨髄腫細胞の融合物であるハイブリドーマ細胞により産生される。骨髄腫細胞は、抗体を継続的に産生し得る。
【００８５】
本明細書中で用いる場合、「単子葉類monocotyledon」または「単子葉類monocot」という用語は、子葉を1枚だけ含有し、そして通常は平行葉脈葉および3の倍数の花部分を有し、茎および根の二次成長を示さない顕花植物の亜綱（単子葉亜綱）のいずれかを指す。例としては、ユリ；ラン；イネ；トウモロコシ、牧草、例えばオニウシノケグサ、goat grassおよびケンタッキーブルーグラス；穀類、例えばコムギ、オートムギおよびオオムギ；アヤメ類；タマネギおよびヤシが挙げられる。
【００８６】
本明細書中で用いる場合、「単量体抗体」という用語は、ジスルフィド架橋により互いに連結される2つの軽鎖および2つの重鎖を含む抗体を指す（図１３Ａ参照）。したがって「単量体ＩｇＡ」または「ｍＩｇＡ」は、ＩｇＡ抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖を含み；そして「単量体ＨＳＶ  ＩｇＡ」または「ＨＳＶ  ｍＩｇＡ」は、単純ヘルペスウイルスに対するＩｇＡ抗体の2つの軽鎖および2つの重鎖を含む。
【００８７】
本明細書中で用いる場合、「多量体タンパク質」という用語は、単一球状タンパク質を形成するために互いに会合された1つより多い別個のポリペプチドまたはタンパク質鎖を含有する球状タンパク質を指す。ヘテロ二量体およびホモ二量体タンパク質はともに、多量体タンパク質である。
【００８８】
本明細書中で用いる場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を油脂、そして天然ヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に縮重コドン置換は、１つまたは複数の選定（または全ての）コドンの三番目の位置が混合−塩基および／またはでオキシイノシン残基で置換される配列を生成することにより達成され得る（例えばBatzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)参照）。核酸という用語は、遺伝子、遺伝子によりコードされるｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと互換的に用いられる。
【００８９】
本明細書中で用いる場合、「オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合により連結された少数（2〜約20）の単糖残基を含有する任意の分子を指す。
本明細書中で用いる場合、ＤＮＡセグメントは、それが別のＤＮＡセグメントと機能的関係にある場合、「操作可能的に連結される」として言及される。例えばシグナル配列をコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡと操作可能的に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写を刺激する場合、コード配列と操作可能的に連結される。一般に、操作可能的に連結されるＤＮＡ配列は連続的であり、シグナル配列の場合、連続的で且つ読取相である。しかしながらプロモーターおよびエンハンサーは、その転写をそれらが制御するコード配列と連続的である必要はない。連結は、便利な制限部位での、あるいはその代わりに挿入されるアダプターまたはリンカーでの結繋により成し遂げられる。
【００９０】
本明細書中で用いる場合、「放任受粉」という用語は、植物に言及するのに用いられる場合、遺伝子流動に対する有効なバリヤーが存在する閉鎖型のものとは対照的に、何らかの遺伝子流動に自由に曝露される植物集団を意味する。
【００９１】
本明細書中で用いる場合、「放任受粉集団」または「放任受粉品種」という用語は、植物に言及するのに用いられる場合、変異を示すがしかし手段または品種が他のものと区別され得る１つまたは複数の遺伝子型または表現型特質も有する標準に対して選択される少なくともなんらかの交差受精を普通に可能にする植物を指す。他家受粉に対するバリヤーを有さないハイブリッドは、放任受粉集団または放任受粉品種である。
本明細書中で用いる場合、「胚珠」という用語は、雌性配偶体を指すが、一方、「花粉」という用語は、雄性配偶体を意味する。
本明細書中で用いる場合、「胚珠特異的プロモーター」という用語は、広範に、胚珠形成および／または機能に不可欠な植物の細胞または組織において選択的に核酸配列の発現を調節し、および／または植物における胚珠形成の期間に核酸配列の発現を限定する核酸配列を指す。
【００９２】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド」という用語は、加水分解時に2またはそれ以上のアミノ酸を産生し、タンパク質の構成成分部分を形成する低分子量の化合物の一クラスを指す。本明細書中で用いる場合、「オリゴペプチド」とは、ペプチド結合により連結される少数（2〜約20）のアミノ酸残基を含有する任意の分子を指す。
本明細書中で用いる場合、「ペプチド結合」という用語は、それらのＣＯＯＨおよびＮＨ２期間でアミノ酸を連結するアミド結合を指す；これは本質的には、いくつかの二重結合特質を有する平面結合であり、したがって自由回転はできない。
【００９３】
本明細書中で用いる場合、「表現型」という用語は、細胞、細胞培養、組織または生物体および環境の遺伝子構成（即ち遺伝子型）間の相互作用に起因する細胞、細胞培養、組織、全生物体（例えば全植物体または動物体）、あるいは全生物体の群（例えば全植物体または動物体の群）の観察可能な特質を指す。
本明細書中で用いる場合、「植物」という用語は、全植物体および全植物体の子孫、植物細胞、植物組織、植物カルス、種子および花粉を指す。本発明の方法に用いられ得る植物のクラスは一般に、形質転換技術に応じ易いより高等な植物のクラス、例えば単子葉類および双子葉類植物の両方と同じくらい広範である。
【００９４】
本明細書中で用いる場合、「植物系統」という用語は、組織培養技法により単一親植物から無性的に繁殖された植物の群、あるいは共通の親（単数または複数）からの系統のため、遺伝的に非常によく似ている近交系植物の群を含むよう用いられるが、これらに限定されない。植物は、それが（ａ）その系統の材料から再生される一次形質転換体（Ｔ０）植物であり；（ｂ）その系統のＴ０植物から構成される家系を有し；または（ｃ）共通の先祖のため遺伝的に非常に類似している（例えば同系交配または自家受粉）である場合、特定の系統に「属する」といわれる。この情況では、「家系」という用語は、例えば遺伝子または遺伝子の組合せが、ヘテロ接合性（半接合性）またはホモ接合性条件で、植物に所望の形質を付与するよう、実行される雄性交配の点から見た植物の家系を意味する。
【００９５】
本明細書中で用いる場合、「植物器官」という用語は、植物の任意の部分を指す。植物器官の例としては、葉、茎、根、塊茎、種子、枝、軟毛、根瘤、葉腋、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花弁、花柄、葉柄、柱頭、花柱、苞葉、果実、幹、心皮、萼片、葯、胚珠、小花梗、針葉、球果、根茎、匍匐枝、新芽、果皮、内胚乳、胎座、漿果、雄蕊および葉鞘が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いる場合、「プランティボディplantibodyTM」とは、植物、植物器官または植物細胞により産生される抗体、例えば個々の抗体鎖、単量体、二量体または分泌抗体あるいは抗体断片を指す。
【００９６】
本明細書中で用いる場合、「植物転写ユニット」または「ＰＴＵ」という用語は、プロモーター配列をコードする核酸配列、コード配列および３’終結配列を指す。
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結されるアミノ酸の線状ポリマーを指す。ポリペプチドは、事実上任意の長さに対して2アミノ酸ほど短いことがある。
本明細書中で用いる場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子に発現制御素子を提供し、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列の群の上野認識部位を指す。
【００９７】
本明細書中で用いる場合、「組換え体」という用語は、組換えＤＮＡによる形質転換を受ける細胞、細胞培養、組織または生物体を指す。最初の組換え体は、「Ｒ０」または「Ｒ0」と呼ばれる。Ｒ0の自家受粉は、「Ｒ１」または「Ｒ1」と呼ばれる第一形質転換世代を生じる。
本明細書中で用いる場合、「分泌構成成分」または「ＳＣ」という用語は、宿主の外側への鎖の分泌を助成するのに有用なキメラ免疫グロブリン鎖のＮ末端に存在するポリペプチドを指す。
【００９８】
本明細書中で用いる場合、「分泌ＩｇＡ抗体」および（「ｓＩｇ」）という用語は、4つの遺伝子によりコードされる10のタンパク質鎖：単量体ＩｇＡ（「ｍＩｇＡ」）を形成するために結合する重鎖（「ＨＣ」）および軽鎖（「ＬＣ」）（図１３Ａ参照）；２つの単量体ＩｇＡ単量体を二量体ＩｇＡ（「ｄＩｇＡ」）に連結する連結鎖（「ＪＣ」）（図１３Ｂ参照）；ならびにｄＩｇＡ分子周囲を包む分泌構成成分（「ＳＣ」）（図１３Ｃ参照）からなる抗体を指す。
【００９９】
本明細書中で用いる場合、「自家受粉される」または「自家受粉」という用語は、植物に言及するのに用いられる場合、ある植物上のある花の花粉が同一植物上の同一のまたは異なる花の胚珠（柱頭）に（人工的にまたは天然に）適用されることを意味する。
本明細書中で用いる場合、的に伝染される感染」または「ＳＴＩ」という用語は、ＳＴＤまたは性的伝染性疾患としても既知である、性的交わりまたは接触によりあるヒトから次のヒトに受け渡されるあるクラスの疾患および感染を指す。
本明細書中で用いる場合、「シグナル配列」という用語は、ポリペプチドを小胞体に結合し、タンパク質分泌に不可欠であるポリペプチドに結合されるアミノ酸配列（シグナルペプチド）を指す。
【０１００】
本明細書中で用いる場合、「合成品種」という用語は、植物に言及する場合、特定組のクローンまたは種子繁殖性系列を交わらせることにより得られる一組の子孫を意味する。合成物は、他家受精、自家受精および同胞受精に起因する種子の混合物を含有する。
【０１０１】
本明細書中で用いる場合、「尾片」という用語は、普通はフコシル化されるＡｓｎ残基を含む重鎖の一部を指す。例えばＩｇＡ  ＨＸ８抗体では、尾片は、配列番号１のアミノ酸残基476〜497を含む。Ａｓｎ残基は、ＨＸ８抗体中の位置４８４に存在する。
本明細書中で用いる場合、「転写体」という用語は、転写過程の産物を指す。
本明細書中で用いる場合、「形質転換」という用語は、細胞中への核酸（即ちヌクレオチドポリマー）の移入を指す。本明細書中で用いる場合、「遺伝子形質転換」という用語は、細胞中へのＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移入および組入れを指す。
【０１０２】
本明細書中で用いる場合、「形質転換体」という用語は、形質転換を受けた細胞、組織または生物体を指す。最初の形質転換体は、「Ｔ０」または「Ｔ0」と呼ばれる。Ｔ０の自家受粉は、「Ｔ１」または「Ｔ1」と呼ばれる第一形質転換世代を生じる。
本明細書中で用いる場合、「導入遺伝子」という用語は、その機能を保証する方法で、生物体、宿主細胞またはベクター中に挿入される核酸を指す。
本明細書中で用いる場合、「導入遺伝子」という用語は、形質転換の種々の方法のうちの1つにより異物または修飾遺伝子を受理した細胞、細胞培養、組織、生物体（例えば植物または動物）およびそれらの子孫を指し、この場合、異物または修飾遺伝子は、異物または修飾遺伝子を受理する細胞、細胞培養、組織または生物体の種と同一のまたはそれと異なる種からである。
【０１０３】
本明細書中で用いる場合、「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、タンパク質をコードしないｍＲＮＡ分子の任意の部分（例えば真核生物では、ポリ（Ａ）尾）を指す。
本明細書中で用いる場合、「ベクター」という用語は、外因性核酸をコードする任意のプラスミドまたはウイルスを広範に指す。本用語はまた、ビリオンまたは細胞中への核酸の移入を促す非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリシン化合物等を含むよう意図されるべきである。ベクターは、細胞への核酸またはその変異体の送達のための送達ビヒクルとして適しているウイルスベクターであり得るし、あるいはベクターは、同一目的に適している非ウイルスベクターであり得る。細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当該技術分野で周知であり、例えばMa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746 (1997)に記載されている。ウイルスベクターの例としては、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換え鶏痘ウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない（例えばCranage et al., EMBO J. 5: 3057-3063 (1986)；国際特許出願WO94/17810（1994年8月18日公開）；および国際特許出願WO94/23744（1994年10月27日公開）参照）。非ウイルスベクターの例としては、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「ウイルス」という用語は、動物における種々の疾患、例えば麻疹、流行性耳下腺炎等、あるいは植物における種々の疾患、例えばモザイク病を引き起こす超顕微鏡的または極微小感染性作因の一群のいずれかを指す；ウイルスは、生体細胞との関係においてのみ倍加することができ、生きている生物体と、ならびに時としては複合タンパク質、酵素等を含む核酸のパッケージとみなされる。
【０１０５】
本発明は、フコシル化単量体抗体を含む植物細胞、植物カルス、苗、全植物体または種子を包含する。一実施形態では、植物はトウモロコシ植物である。別の実施形態では、抗体は、種子の内胚乳中に位置する。異なる実施形態では、抗体はヒト抗体である。好ましい実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。非常に好ましい実施形態では、重鎖は尾片を欠く。別の好ましい実施形態では、抗体はＩｇＡ抗体である。非常に好ましい実施形態では、抗体は抗単純ヘルペスウイルス抗体である。
【０１０６】
本発明の別の態様は、配列番号２または配列番号６によりコード去れるアミノ酸をコードする核酸を含む単離核酸分子も包含する。単離核酸分子は、配列番号１０または配列番号１４によりコードされるアミノ酸をコードする核酸を含む。単離核酸は、配列番号１または配列番号５を含む。そして単離核酸は、配列番号９または配列番号１３を含む。
本発明の別の態様は、配列番号１または配列番号５を含む単離ベクターまたはプラスミドを包含する。そして単離ベクターまたはプラスミドは、配列番号９または配列番号１３を含む。
【０１０７】
本発明は、図１２における構造からなる群から選択される2つまたはそれ以上の異なるグリカン構造を含む抗体組成物であって、図１２からの選定グリカン構造のうちの少なくとも1つが非フコシル化される抗体組成物も包含する。
図１２における構造からなる群から選択される2つまたはそれ以上の異なるグリカン構造を含む抗体組成物であって、図１２からの選定グリカン構造のうちの少なくとも1つが非フコシル化される抗体組成物を含む植物材料も、本発明に包含される。一実施形態では、組成物は植物材料から単離される。別の実施形態では、植物材料はトウモロコシからである。
【０１０８】
本発明は、図１２に列挙されたような構造１のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物も含む。単量体抗体組成物は、図１２に列挙されたような構造２のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを含む。そして単量体抗体組成物は、図１６に列挙されたような構造１のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカン、ならびに図１６に列挙されたような構造２のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを含む。
【０１０９】
図１２に列挙されたような構造１のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物；図１２に列挙されたような構造２のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物；そして図１６に列挙されたような構造１のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを、ならびに図１６に列挙されたような構造２のうちの構造を有する少なくとも１つのグリカンを含む単量体抗体組成物である単量体抗体組成物を含む植物カルス、苗、全植物体または種子が、さらに本発明に包含される。
【０１１０】
本発明は、以下の：（ｉ）各々がプロモーターに操作可能的に連結される配列番号１または配列番号５および配列番号９または配列番号１３を有する核酸を植物細胞中に導入し；（ｉｉ）植物細胞を培養して導入核酸を発現し；そして（ｉｉｉ）植物細胞により産生される非フコシル化単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体を単離することを包含する方法により産生される単離非フコシル化単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体も包含する。（ｉ）各々がプロモーターに操作可能的に連結される配列番号１または配列番号５および配列番号９または配列番号１３を有する核酸を植物細胞中に導入し；（ｉｉ）植物細胞を培養して導入核酸を発現し；そして（ｉｉｉ）植物細胞により産生される非フコシル化単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体を単離することを包含する単離非フコシル化単量体抗単純ヘルペスウイルス抗体の産生方法も本発明に包含される。
【０１１１】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号１５（ｐＤＡＢ６３５）；配列番号１６（ｐＤＡＢ１６）；配列番号１７（ｐＤＡＢ６３７）；配列番号８４（ｐＤＡＢ３０１４）；および配列番号８５（ｐＤＡＢ８５０５）からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子を包含する。
【０１１２】
本発明は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列を含む単一ベクターを植物細胞中に導入し、そして形質転換植物細胞を培養して、非フコシル化抗体を発現する植物を産生することを包含する非フコシル化抗体を発現する形質転換植物細胞の産生方法にも向けられる。一実施形態では、形質転換植物は、形質転換植物細胞から再生される。好ましい実施形態では、ベクターはｐＤＡＢ８５０５である。
【０１１３】
ＩＩ．植物におけるＩｇＡの産生のための背景
Ａ．利用するのに適したＩｇＡの例
任意のＩｇＡ抗体が、本発明の方法に用いられ得る。ＩｇＡは、ヒト血漿中に見出される免疫グロブリンである。それは漿粘液性分泌の主要免疫グロブリンであり、微生物の攻撃に対する身体外表面の防御に関与する。
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）タンパク質は周知であり、それらの核酸およびアミノ酸配列を含めて、特性化されている。本発明の組成物および方法に用いられ得るＩｇＡ免疫グロブリンの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヒト分泌性ＩｇＡ抗体により認識される赤痢アメーバEntamoeba histolytica抗原（Carrero et al., Parasitol Res. 86 (4): 330-4 (2000)）；固形器官移植片レシピエントにおけるヒトサイトメガロウイルスに対する免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）およびＩｇＭ抗体（Eing et al., Clin Diagn Lab Immunol. 6(4): 621-3 (1999)）；虚血後腎臓における分泌ＩｇＡの排出（Rice et al., Am J Physiol. 276 (5 Pt 2): F666-73 (1999)）；Ｃａｌｕ−３気道上皮細胞による分泌免疫グロブリンＡ放出（Loman et al., Immunology. 96(4): 537-43 (1999)）；ＨＢｓＡｇ慢性保因者の血清中の特異的ＩｇＡ（Elsana et al., J Hum Virol. 1(1): 52-7 (1997)）；抗トキソプラズマ原虫ＩｇＡ抗体（Ronday et al., Am J Ophthalmol. 127(3): 294-300 (1999)）；ヒト乳汁からの分泌免疫グロブリンＡ（Kit et al., Biochemistry (Mosc). 64(1): 40-6 (1999)）；活性結核の診断における抗Ｋｐ９０ＩｇＡ抗体（Arikan et al., Chest. 114(5): 1253-7 (1998)）；有袋目ハイイロジネズミオポッサムMonodelphis domesticaからのＩｇＡのクローニング（Aveskogh et al., Eur J Immunol. 28(9): 2738-50 (1998)）；腹膜Ｂ−１細胞中の生殖系列および全長ＩｇＡ  ＲＮＡ転写体（deWaard et al., Dev Immunol. 6(1-2): 81-7 (1998)）；および有袋目：フクロギツネTrichosurus vulpecula（一般的フクロギツネ）からの免疫グロブリンＡ重鎖（Ｃアルファ）の定常部（Belov et al., Immunol Lett. 60(2-3): 165-70 (1998). Erratum in: Immunol Lett 63(3): 175-6 (1998)）。
【０１１４】
Ｂ．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
単純ヘルペスは、１型（ＨＳＶ  １）および２型（ＨＳＶ  ２）ヘルペスウイルスにより引き起こされる種々の感染症を指す。サブタイプ１および２単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）は、ヒトが出くわす最も一般的な感染性作因の1つであるヘルペスウイルスである。１型感染は、生殖器上に生じる病変を伴う、口唇の唇紅縁上のまたは外鼻孔での１つまたは複数の群の小胞の皮疹により、最も一般的に特徴づけられる。２型は、口唇の唇紅縁上にまたは外鼻孔でしばしば起こる病変を伴う生殖器上のこのような病変により特徴づけられる。ウイルスは高頻度で潜伏性になり、数年間発現され得ない。
【０１１５】
これらのウイルスは、相対的に無意味な且つ迷惑な感染、例えば再発性単純ヘルペス口唇炎から、重症および致命的疾患、例えば年長小児および成人の単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）、または新生児の播種性感染までの範囲である広範囲の疾患を引き起こす。ヘルペス感染の臨床的結果は、早期診断および抗ウイルス療法の即時開始によっている。しかしながら何らかの上首尾の療法にもかかわらず、真皮および上皮病変は再発し、そして新生児のＨＳＶ感染および脳の感染は、高い罹患率および死亡率を伴う。治療改善が、切に必要とされる。
【０１１６】
単純ヘルペスウイルス−１の系統の例としては、ＨＳＶ−１７１６、ＨＳＶ−３４１０、ＨＳＶ−３６１６、ＨＳＶ−Ｒ３６１６、ＨＳＶ−Ｒ４７、ＨＳＶ−Ｇ２０７、ＨＳＶ−７０２０、ＨＳＶ−ＮＶＲ１０、ＨＳＶ−Ｇ９２Ａ、ＨＳＶ−３６１６−ＩＬ−４およびＨＳＶ−ｈｒＲ３が挙げられるが、これらに限定されない。単純ヘルペスウイルス−２の系統の例としては、系統２７０１、系統２６１６および系統２７０４が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第6,156,313号は、１型および２型単純ヘルペスウイルスを標的にし、中和する抗体に関する重鎖可変部配列のアミノ酸残基配列（特許’３１３の配列番号２）、ならびに重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸配列（特許’３１３の配列番号１）を提供する。
【０１１７】
Ｃ．抗ＨＳＶ抗体に関する処方物
本発明の抗ＨＳＶ抗体は、植物中で産生され、少なくとも部分的に精製され、そして次に、局所的用途に処方され得る。本発明の抗ＨＳＶ抗体は、陸上哺乳類、例えばヒト、飼育ペット、ならびに家畜類およびその他の農場動物の皮膚の治療に用いられ得る。本発明の抗ＨＳＶ抗体の好ましい使用は、ＨＳＶの伝染を防止することである。
【０１１８】
このような療法に関して、本発明の化合物は、種々の負荷の投与、例えば全身および局所または限局投与のために処方され得る。技法および処方物は一般に、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に見出され得る。全身投与のためには、注射、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下注射が好ましい。注射用に、本発明の化合物が液体溶液中に、好ましくは生理学的に適合性緩衝液、例えばハンクス溶液中に処方され得る（ハンクス溶液：リン酸カリウム0.44 mM、塩化カリウム5.37 mM、リン酸ナトリウム、二塩基性0.34 mM、塩化ナトリウム136.89 mM、Ｄ−グルコース5.55 mM）。試薬は直ぐに使用できる。希釈ハンクス塩溶液のｐＨは、6.7±0.2である。重炭酸ナトリウムが溶液に付加され得る（0.35 g/L）。溶液のｐＨは、1 NＨＣｌまたは1 NＮａＯＨで調整され得る）。さらに化合物は固体形態で処方され、そして使用直前に再溶解されるかまたは懸濁され得る。凍結乾燥形態も含まれる。
【０１１９】
本発明の好ましい実施において、本発明の抗ＨＳＶ抗体は、局所投与のための製薬上許容可能である処方物中の活性成分として投与され得る。局所処方物、例えば経皮薬剤放出のために有用であるものは、当業者に周知であり、皮膚への適用のために本発明の情況に適している。局所的または鼻腔内適用に適した処方物としては、活性成分ならびに種々の支持剤およびビヒクルを含有する軟膏、滴薬、クリーム、溶液、チンキ剤、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エーロゾルおよび油が挙げられる。これらの処方物は、ビヒクルまたは担体を含有することもしないこともあるが、しかしビヒクルまたは担体の使用が好ましい。このような処方物のための適切な担体としては、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコールおよびそれらの組合せが挙げられる。好ましいビヒクルは、非脂質ビヒクル、特に水混和性液体または液体の混合物である。例は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびブチレングリコール、ならびに2つまたはそれ以上のこれらの化合物の混合物である。活性成分は、典型的には0.1〜15％w/wの濃度でこのような処方物中に存在する。
【０１２０】
このように本明細書中で考察された処方物は、任意の適切な方法により、典型的には活性化合物を液体または微粉砕固体担体またはその両方と、必要な割合で、均質におよび緊密に混合し、次に、必要な場合には、その結果生じた混合物を所望の形状に造形することにより調製され得る。
【０１２１】
例えば錠剤は、活性成分および１つまたは複数の任意の成分、例えば結合剤、滑剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤の粉末または顆粒を含むよく混じった混合物を圧縮することにより、あるいは粉末化活性成分および不活性液体希釈剤のよく混じった混合物を成型することにより、調製され得る。
【０１２２】
局所半固体軟膏処方物は、典型的には、担体、例えば製剤クリーム基剤中に約1〜20％、例えば5〜10％の濃度の活性成分を含有するが、しかし濃度はこの範囲外で変化し得る。任意の所定の場合の最適量は、当業者に容易に明らかになるか、またはルーチン実験により確定し得る。
【０１２３】
本発明の抗ＨＳＶ抗体を含有する局所処方物は、ローション、溶液、ゲル、クリーム、エモリエントクリーム、膏薬、スプレーまたは局所適用を可能にする任意のその他の形態として処方され得る。処方物は、影響を及ぼされる領域全体に処方物を広げるのを促すが、そうでない場合は生物学的に不活性である１つまたは複数の作用物質も含有し得る。これらの作用物質の例は、界面活性剤、保湿剤、湿潤剤、乳化剤または噴射剤である。
【０１２４】
本発明の活性ＨＳＶ抗体はまた、取込み、分布および／または吸収を助けるために、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の処方物として、他の分子、分子構造物または化合物の混合物と混合され、封入され、接合されるかまたはそうでなければ会合され得る。このような取込み、分布および／または吸収支援処方物の調製を教示する代表的米国特許としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第5,108,921号；第5,354,844号；第5,416,016号；第5,459,127号；第5,521,291号；第5,543,158号；第5,547,932号；第5,583,020号；第5,591,721号；第4,426,330号；第4,534,899号；第5,013,556号；第5,108,921号；第5,213,804号；第5,227,170号；第5,264,221号；第5,356,633号；第5,395,619号；第5,416,016号；第5,417,978号；第5,462,854号；第5,469,854号；第5,512,295号；第5,527,528号；第5,534,259号；第5,543,152号；第5,556,948号；第5,580,575号；および第5,595,756号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【０１２５】
投与の最適な方法および頻度は、当業者には容易に明らかになり、ルーチン実験により確定され得る。ほとんどの場合の有効な結果は、罹患領域全体に、あるいは所望の効果を達成しようと試みる領域に薄層を局所適用することにより達成され得る。取り扱われる条件によって、その段階または程度、ならびに適用が治療のために実行されるかまたは予防のために実行されるかによって、2または3日ごとに1回適用から、毎日4回またはそれ以上適用までの適用率で、有効な結果が達成される。
【０１２６】
組成物は、所望により、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサー装置中に提示され得る。パックは、例えば金属またはプラスチック箔、例えばブリスター包装を含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書を添付される。
【０１２７】
Ｄ．抗ＨＳＶ抗体に関する配列番号の要約一覧
【０１２８】
【表１】
2006517392.tif 000003
【０１２９】
Ｅ．植物から単離される抗ＨＳＶ重鎖、軽鎖および単量体ＩｇＡ抗体のアミノ酸配列
本発明は、抗ＨＳＶ抗体に関する重鎖、軽鎖および単量体ＩｇＡのためのポリペプチドを提供するが、この場合、このようなポリペプチドは植物から単離される。
【０１３０】
本明細書中で用いる場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、一部は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４で示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸を指す。本用語は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４で特定的に提示されたものとわずかに異なるアミノ酸配列を有する天然対立遺伝子変異体およびタンパク質も指す。対立遺伝子変異体は、本明細書中で列挙されたものとわずかに異なるアミノ酸配列を保有するが、しかし依然としてこれらのタンパク質に関連した同一のまたは類似の生物学的機能を有する。
【０１３１】
本明細書中で用いる場合、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４を有するアミノ酸配列に関連したタンパク質のファミリーは、ヒトを加えて、生物体から単離されたタンパク質を指す。
【０１３２】
本発明の抗ＨＳＶ抗体ポリペプチドは、好ましくは単離形態である。本明細書中で用いる場合、ポリペプチドは、物理的、機械的または化学的方法が用いられて、タンパク質と普通に会合される細胞構成成分からタンパク質を除去する場合、単離されるといわれる。当業者は、単離タンパク質を得るために標準精製方法を容易に用い得る。
【０１３３】
本発明のタンパク質はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４の挿入、欠失または保存的アミノ酸置換変異体をさらに包含する。本明細書中で用いる場合、保存的変異体は、タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更配列がタンパク質と関連した生物学的機能を妨げるかまたは破損する場合、タンパク質に悪影響を及ぼすといわれる。例えばタンパク質の全体的電荷、構造または疎水性／親水性特性は、ある場合には、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変更され得る．したがってアミノ酸配列は、タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、変更され、例えばペプチドをより疎水性または親水性にさせ得る。
【０１３４】
普通は、対立遺伝子変異体、保存的置換変異体およびタンパク質ファミリーの成員は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４で記述される配列と少なくとも約50％、60％、70％または75％の、さらに好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90〜95％、最も好ましくは約99％または99.5％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。このような配列に関する同一性または相同性は、配列を一列に並べ、必要な場合にはギャップを導入して、最大パーセント相同性を達成した後、そして配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして、本明細書中で限定される。融合タンパク質、あるいはＮ末端、Ｃ末端または内部延長、欠失またはペプチド配列への挿入は、相同性に影響を及ぼすと解釈されない。
【０１３５】
したがって本発明のタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４で開示されるアミノ酸配列；これらのタンパク質の少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基の連続配列を有するそれらの断片；１つまたは複数のアミノ酸残基が、開示コード配列に対してＮ−またはＣ末端にあるいは配列内に挿入されたアミノ酸配列変異体；ならびに少なくとも１つの残基により置換された開示配列または上記のようなそれらの断片のアミノ酸配列変異体を有する分子を包含する。ペプチドまたはポリペプチドとしても言及されるこのような断片は、抗原領域、既知のタンパク質ドメインに対応するアミノ酸配列の領域として同定されるタンパク質の機能性領域、ならびに顕著な親水性を有する領域を含有し得る。領域は全て、市販のタンパク質配列分析ソフトウエア、例えばMac Vector（Oxford Molecular）を用いることにより、容易に同定可能である。本発明の実施に有用なその他のタンパク質分析ソフトウエアが、当該技術分野で既知である。
【０１３６】
意図された変異体はさらに、例えば相同組換え、部位特異的またはＰＣＲ突然変異誘発による予定突然変異、他の動物種、例えばウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよび非ヒト霊長類の対応するタンパク質、そしてＨＳＶ関連タンパク質のファミリーの対立遺伝子またはその他の天然変異体；そして天然アミノ酸以外の部分（例えば検出可能部分、例えば酵素または放射性同位元素）を用いた置換、キメラ、酵素的またはその他の適切な手段により、タンパク質が共有的に修飾された誘導体を含有するものを包含する。
【０１３７】
本発明はさらに、本発明のタンパク質またはポリペプチド、ならびに希釈剤を含む組成物を提供する。適切な希釈剤は、水性または非水性溶媒あるいはそれらの組合せであり、そしてタンパク質またはポリペプチドの安定性、溶解性、活性および／または貯蔵に寄与する付加的構成成分、例えば水溶性塩またはグリセロールを含み得る。
【０１３８】
Ｆ．抗ＨＳＶ重鎖、軽鎖および単量体ＩｇＡ抗体の核酸配列
本発明は、抗ＨＳＶ抗体の重鎖（配列番号１および５）および軽鎖（配列番号９および１３）、ならびに本明細書中に記載された関連ポリペプチドをコードする核酸分子を、好ましくは単離形態で、利用する。
【０１３９】
本明細書中で用いる場合、「核酸」とは、本明細書中で定義されたようなタンパク質またはペプチドをコードする、このようなペプチドをコードする核酸配列と相補的であり、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の核酸とハイブリダイズし、そして適切な緊縮条件下でそれを依然として安定的にハイブリダイズしたままであり、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のペプチド配列と少なくとも約50％、60％、70％または75％の、好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約85％、最も好ましくは少なくとも約90％、95％、98％、99％、99.5％またはそれ以上の同一性を共有するポリペプチドをコードし、あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のオープンリーディングフレーム全体に亘って、少なくとも約50％、60％、70％または75％の、好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約85％、さらに好ましくは少なくとも約90％、95％、98％、99％、99.5％またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を示すＲＮＡ又はＤＮＡと定義される。
【０１４０】
本発明はさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３相補体と特異的にハイブリダイズする単離核酸分子、特にオープンリーディングフレーム全体に亘って特異的にハイブリダイズする分子を包含する。配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の相補体と特異的にハイブリダイズするこのような分子は、典型的には緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、そうするが、このような条件は、以下に記載される。
特に意図されるのは、天然供給源に由来するか、または合成されるかにかかわらず、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、ならびに代替的主鎖を基礎にした、あるいは代替的塩基を含む核酸である。
【０１４１】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより用いられるアルゴリズムを用いて、ＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）分析により確定される（例えばAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)参照）（ともにこれらの記載内容は、参照により本明細書中で援用され、配列類似性検索のために適合される）。ＢＬＡＳＴプログラムにより用いられるアプローチは、先ずギャップを用いておよび用いずに、query配列およびデータベース配列間の類似セグメントを考慮し、次に同定される全てのマッチの統計学的有意性を評価し、そして最後に有意性の予備選定閾値を満たすマッチのみを要約することである。配列データベースの類似性検索における基本的問題点の考察に関しては、例えばAltschul et al., Nat. Genet. 6: 119-129 (1994)（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。ヒストグラム、解説、アラインメント、期待（即ちデータベース配列に対するマッチを報告するための統計学的有意性閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルター（低複雑性）に関する検索パラメーターは、デフォルト設定である。blastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより用いられるデフォルトスコアリングマトリックスは、85ヌクレオチドに亘るまたはアミノ酸長のquery配列に関して推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（例えばHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992)参照）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）である。
【０１４２】
Blastnに関しては、スコアリングマトリックスは、Ｍ（即ち一対のマッチ残基に関する報酬スコア）対Ｎ（即ち一対のミスマッチ残基に関するペナルティースコア）の比により設定され、この場合、ＭおよびＮに関するデフォルト値はそれぞれ5および-4である。4つのblastnパラメーターは、以下のように調整された：Ｑ＝10（gap作製ペナルティー）；Ｒ＝10（gap拡張ペナルティー）；wink＝1（queryに沿った全てのwinkth位置でワードヒットを生成する）；およびgapw＝16（ギャップ化アラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）。等価Blastpパラメーター設定は、Ｑ＝9；Ｒ＝2；wink＝1；およびgapw＝32であった。ＧＣＧパッケージバージョン10.0に利用可能な配列間のBestfit比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝50（gap作製ペナルティー）およびＬＥＮ＝3（gap拡張ペナルティー）を用い、タンパク質比較における等価設定はＧＡＰ＝8およびＬＥＮ＝2である。
【０１４３】
「ストリンジェント（緊縮）条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温を、多と0.015 MＮａＣｌ／0.0015 Mクエン酸ナトリウム／0.1％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を50℃で用いるか、あるいは（２）ハイブリダイゼーション中に、変性剤、例えばホルムアミドを、例えば50％（vol/vol）ホルムアミドを、0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％ポリビニルピロリドン／50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.5（750 mMＮａＣｌ、75 mMクエン酸ナトリウムを含有）とともに42℃で用いる、というものである。別の例は、50％ホルムアミド、5×ＳＳＣ溶液（0.75 MＮａＣｌ、0.075 Mクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（ｐＨ6.8）、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液（50Xデンハート試薬：1％（w/v）フィコール４００、1％（w/V）ポリビニルピロリドン、1％（w/v）ウシ血清アルブミン（Sigma、分画Ｖ））、音波処理サケ精子ＤＮＡ（50μg/ml）、0.1％ＳＤＳおよび10％硫酸デキストラン中での42℃でのハイブリダイゼーションと、0.2×ＳＳＣ溶液お呼び0.1％ＳＤＳ中で42℃での洗浄である。当業者は容易に確定し、適切に緊縮条件を変更して、明確且つ検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得ることができる。好ましい分子は、上記の条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の相補体とハイブリダイズし、機能性または全長タンパク質をコードするものである。さらに好ましいハイブリダイゼーション分子は、上記の条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のオープンリーディングフレームの相補鎖とハイブリダイズするものである。
【０１４４】
本明細書中で用いる場合、核酸分子は、核酸分子が他のポリペプチドをコードする夾雑核酸分子から実質的に分離される場合、「単離される」といわれる。
【０１４５】
本発明はさらに、開示核酸分子の断片を利用する。本明細書中で用いる場合、核酸分子の断片は、コードまたは非コード配列の小部分を指す。断片のサイズは、意図された用途により確定される。断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられるべきものである場合には、断片長は、プロービング／プライミング中に相対的に少数の擬陽性を得るよう、選択される。断片が、タンパク質の活性部分をコードするよう選択される場合、断片は、タンパク質の機能性領域（単数または複数）をコードするのに十分大きいことが必要である。例えば予測抗原領域に対応するペプチドをコードする断片が調製され得る。例えば本発明は、米国特許第6,156,313号の配列番号１（本明細書中では配列番号１８として記述される）により提供されるようなクローンＦａｂＨＳＶ８の重鎖のＣＤＲ３領域に関するアミノ酸配列をコードする断片を利用する。さらに本発明は、１型および２型ＨＳＶの両方を中和し、糖タンパク質Ｄ上に存在するエピトープと結合し、ＡＴＣＣ69522により産生されるＦａｂ断片の結合特異性を有し、そして米国特許第6,156,313号により提供されるような配列番号２（本明細書中では配列番号１９として記述される）のＣＤＲ３を有する重鎖を有するヒトモノクローナル抗体を利用する。
【０１４６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプローブまたは特異的プライマーとして、あるいは本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために用いられる本発明の核酸分子の断片（即ち合成オリゴヌクレオチド）は、化学的技法により、例えばMatteucci等（J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191 (1981)）のホスホルアミダイト法により、あるいは自動合成方法を用いて、容易に合成され得る。さらに、大型ＤＮＡセグメントは、周知の方法により、例えば遺伝子の種々のモジュラーセグメントを限定し、その後オリゴヌクレオチドを結繋して、完全修飾遺伝子を構築するオリゴヌクレオチドの一群の合成により、容易に調製され得る。
【０１４７】
本発明の核酸分子はさらに、診断およびプローブ目的のための検出可能な標識を含有するよう修飾され得る。種々のこのような標識は当該技術分野で既知であり、本明細書中に記載されたコード分子とともに容易に用いられ得る。適切な標識としては、ビオチン、放射能標識または蛍光標識ヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は任意のこのような標識を容易に用いて、本発明の核酸分子の標識化変異体を生成し得る。
【０１４８】
ＩＩ．植物におけるＩｇＧの産生のための背景
Ａ．利用するのに適したＩｇＧの例
任意のＩｇＧ抗体が、本発明の方法に用いられ得る。ＩｇＧは、ヒト血漿およびその他の内部体液の主要免疫グロブリンである。それは最も一般的に観察される骨髄腫タンパク質でもある。ヒトタンパク質からのＥｕと呼ばれる骨髄腫タンパク質は、完全にシーケンシングされた最初の免疫グロブリンである（Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 78 (1969)）。
【０１４９】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）タンパク質は周知であり、それらの核酸およびアミノ酸配列を含めて、特性化されている。本発明の組成物および方法に用いられ得るＩｇＧ免疫グロブリンの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：血小板および内皮細胞のインテグリンβ３上の異なるエピトープと反応するヒト抗体（Jallu et al., Eur J Biochem. 222(3): 743-51 (1994)）；高親和性組換えヒトＩｇＧ１抗ＲｈＤ抗体（Miescher et al., Br J Haematol. 111(1): 157-66 (2000)）；結核菌M. ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＥＦ−Ｔｕに対する滑液ＩｇＧ（Adachi et al., J Dent Res. 79(10): 1752-7 (2000)）；ＨＩＶ−１感染ヒトにおける内因性レトロウイルス抗原との結合（Lawoko et al., J Med Virol. 62(4): 435-44 (2000)）；１型ヒト免疫不全ウイルスに対する免疫グロブリンＧ抗体（Hashinaka et al., Clin Diagn Lab Immunol. (6): 967-76 (2000)）；組換えヒトＣＣＲ５−特異的抗体（Steinberger et al.,m J Biol Chem. 275(46): 36073-8 (2000)）；南極硬骨魚ショウワギスTrematomus bernacchiiの免疫グロブリン重鎖をコードするｃＤＮＡ配列（Coscia et al., Fish Shellfish Immunol. 10(4): 343-57 (2000)）；リンパ球中にトランスフェクトされた免疫グロブリン重鎖遺伝子の発現および調節（Neuberger, EMBO J. 2(8): 1373-8 (1983)）；イエローファットテールAndroctonus australisヘクトルサソリ毒の中和に関与するネズミモノクローナルＩｇＧ（Devaux et al., Eur J Biochem. 268(3): 694-702 (2001)）；切頭形態のヒト化Ｌ２４３ＩｇＧ１（Lund et al., Eur J Biochem. 267(24): 7246-57 (2000)）；ピキア酵母Pichia pastorisにおける一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ融合（Powers et al., J Immunol Methods. 1; 251(1-2): 123-35 (2001)）；ＣＲＭＰ−５に特異的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）自己抗体（Yu et al., Ann Neurol. 49(2): 146-54 (2001)）；マレー糸状虫Brugia malayiに感染したアカゲザルにおけるウォルバキア表面タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体（Punkosdy et al., J Infect Dis. 184(3): 385-9. Epub 2001 Jul 03 (2001)）；ヒトＩｇＧモノクローナル抗α（ＩＩｂ）β（３）結合断片（Jacobin et al., J. Immunol. 168(4), 2035-2045 (2002)）；全身性硬化症免疫グロブリンＧ自己抗体（Lunardi et al., Nat Med. 6(10): 1183-6 (2000)）；ロイシン−３３に特異的なヒトモノクローナル抗体（Ｐ１Ａ１、ＨＰＡ−１ａ）（Griffin et al., Blood. 15: 86(12): 4430-6 (1995)）；ヒト化抗ＣＤ１８ネズミ免疫グロブリンＧ（Ipp et al., Arch Biochem Biophys. 308(2): 387-99 (1994)）；およびＧＰＩＩｂα（300-312）に対する抗体（Taylor et al., Proc Soc Exp Biol Med. 205(1): 35-43 (1994)）。
【０１５０】
Ｂ．インテグリン
インテグリン受容体（インテグリンとも呼ばれる）は、生理学的状況における広範な一続きの細胞外マトリックスとの細胞接着、ならびに細胞認識および膜貫通応答を媒介する分子の一クラスである（Clark et al., Science 285: 1028-1032 (1995)）。インテグリンαＶβ３およびαＶβ５は、新規の血管増殖に強く関与することが示されている。これらのインテグリンの各々は、細胞外マトリックス中の特定の分子と結合する：αＶβ３は、ビトロネクチン＋その他の細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブリノーゲンを結合し；αＶβ５はビトロネクチン受容体である。抗インテグリンαＶβ３／αＶβ５抗体の主な医学的標的は、腫瘍による血管動員（「腫瘍新脈管形成」）である。新脈管形成中、血管内皮細胞は先在血管をそのまま残して、新規の細管を形成し、これは毛管に発達する。この過程が正常に進行している場合、血管内皮細胞中で発現されるαＶβ５に結合するビトロネクチンはαＶβ３の発現を誘導し、シグナルおよび相互作用のカスケードにより新脈管形成を促す。内皮αＶβ３に結合するビトロネクチンはまた、プロテインキナーゼＡを抑制する。抗αＶβ３抗体がビトロネクチンとのその結合を遮断する場合、血管発達、腫瘍細胞移動および転移が抑制されるよう、プロテインキナーゼＡは細胞を撹乱する。細胞死は、血管形成系のこのような抗体遮断細胞において起こる。
【０１５１】
αＶβ３遮断塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対して生成される抗体は新脈管形成を誘導し、一方、αＶβ５に特異的な抗体は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導性新脈管形成を抑制した（Eliceiri, et al., J. Clin. Invest. 103: 1227-1230 (1999); Friedlander et al., Science 270: 1500-1502 (1995)）。上記のもののほかに、本発明の組成物および方法に用いられ得るインテグリン関連免疫グロブリンの他の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：インテグリンアルファＩＩｂベータ３（糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ）のリガンド占有コンフォーマーに対するモノクローナル抗体（Frelinger et al., J Biol Chem. 266(26): 17106-11 (1991)）；血小板インテグリンＩＩｂ重鎖に特異的なヒト自己抗体２Ｅ７（Kunicki et al., J Autoimmun. (3): 433-46 (1991)）；白血球インテグリンのＣＤ１８構成成分に対して向けられるネズミモノクローナル抗体（Daugherty et al., Nucleic Acids Res. 19(9): 2471-6 (1991)）；抗インテグリン（アルファ５ベータ１）抗体（Fogerty et al., J Cell Biol. 111(2): 699-708 (1990)）；血小板ＧＰＩＩｂに対するモノクローナル抗体（Golino et al., J Biol Chem. 265(16): 9575-81 (1990)）；ヒト血小板糖タンパク質ＩＩｂ（インテグリンアルファＩＩｂ）重鎖に特異的なヒトモノクローナル自己抗体（Kunicki et al., Hum Antibodies Hybridomas 1(2): 83-95 (1990)）；血小板インテグリンｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的なヒト化抗体（Co et al., J Immunol. 15: 152(6): 2968-76 (1994)）；抗インテグリンＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体における生体活性Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ立体配座（Prammer et al., Receptor. 4(2): 93-108 (1994)）；ヒト化抗ベータ１インテグリン鎖ｍＡｂ（Poul et al., Mol Immunol. 32(2): 101-16 (1995)）；白血球インテグリンリンパ球機能関連抗原１（Holness et al., J Biol Chem. 270(2): 877-84 (1995)）；インテグリンのための接着リガンドとしての合成抗体（Smith et al., J Biol Chem. 269(52): 32788-95 (1994)）；血小板インテグリンアルファＩＩｂベータ３に対するモノクローナル抗体（Yano et al., J Biochem (Tokyo). 116(4): 778-86 (1994)）；インテグリンアルファＩＩｂベータ３に特異的な組換えネズミＦａｂ断片（Kunicki et al., J Biol Chem. 270(28): 16660-5 (1995)）；血小板糖タンパク質ＩＩＩａを伴うＩｇＧ抗リン脂質抗体（Tokita et al., Thromb Haemost. 75(1): 168-74 (1996)）；および糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ上の血小板ＨＰＡ−１ａアロ抗原と特異的に結合するヒトモノクローナルＦａｂ断片（Proulx et al., Vox Sang. 72(1): 52-60 (1997)）。
【０１５２】
本発明の組成物および方法に用いられ得る抗二重インテグリン抗体の例としては、米国特許出願第2003/0040044号および国際公告特許出願WO02/12501に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＴＣＣ寄託番号AX472604、AX472605、AX472606、AX472607、AX472608およびAX47209も参照されたい。
【０１５３】
ＩＩＩ．植物におけるＩｇＡおよびＩｇＧの産生に関する一般的背景
Ａ．核酸分子を含む組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子
本発明はさらに、コード配列を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書中で用いる場合、ｒＤＮＡ分子は、分子操作を受けたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡの製造方法は当該技術分野で、例えばSambrook et al., Molecular Cloning-A laboratory Manual,Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 2001において周知である。好ましいｒＤＮＡ分子では、コードＤＮＡ配列は発現制御配列および／またはベクター配列と操作可能的に連結される。
【０１５４】
本発明のタンパク質ファミリーコード配列のうちの1つが操作可能的に連結されるベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当該技術分野で周知のように、所望される帰納的特性、例えばタンパク質発現、および形質転換されるべき宿主細胞に直接よっている。本発明により意図されるベクターは、少なくともｒＤＮＡ分子中に含まれる構造遺伝子の複製または宿主染色体中への挿入を、好ましくは発現も指図し得る。
操作可能的に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現制御素子は当該技術分野で既知であり、例としては誘導プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナルおよびその他の調節素子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは誘導プロモーターは、容易に制御され、例えば宿主細胞の培地中の栄養素に応答性である。
【０１５５】
Ｂ．ｒＤＮＡ分子を用いた組換えタンパク質の製造
本発明はさらに、本明細書中に記載された核酸分子を用いた本発明のタンパク質の製造方法を提供する。一般的に、組換え形態のタンパク質の製造は、典型的には以下の工程を包含する：
【０１５６】
先ず、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、例えば配列番号１または配列番号９を含み、本質的にそれらからなり、またそれらからなる核酸が生成される。
コード配列が、これらのオープンリーディングフレームであるので、イントロンにより中断されない場合、それはまさに任意の宿主細胞中での発現に適している。
核酸は次に、好ましくは上記のように適切な制御配列との操作可能連結で配置されて、タンパク質オープンリーディングフレームを含有する発現ユニットを形成する。発現ユニットを用いて適切な宿主を形質転換し、形質転換宿主は組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。任意に組換えタンパク質は、培地から、または細胞から単離される；タンパク質の回収および精製は、いくつかの不純物が耐容され得るいくつかの場合には必要でない。
【０１５７】
上記の工程の各々は、種々の方法で実行され得る。例えば所望のコード配列は、ゲノム断片から生成され、適切な宿主中に直接用いられ得る。種々の宿主中で操作可能である発現ベクターの構築は、適切なレプリコンおよび上記のような制御配列を用いて成し遂げられる。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞の型によっており、以前詳細に考察された。適切な制限部位は、普通は利用可能でない場合、これらのベクターを挿入するために切断可能遺伝子を提供するよう、コード配列の末端に付加される。当業者は、本発明の核酸分子とともに用いて組換えタンパク質を製造するために、任意の宿主／発現系を容易に適合し得る。
【０１５８】
Ｃ．プロモーター
誘導プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度が外部刺激により変調されるプロモーターである。このような刺激としては、光、熱、嫌気性応力、栄養条件の変化、代謝産物の存在または非存在、リガンドの存在、微生物攻撃、創傷等が挙げられる。
【０１５９】
ウイルスプロモーターは、ウイルス遺伝子の５’末端に見出されるプロモーターと実質的に同様のＤＮＡ配列を有するプロモーターである。例えば典型的ウイルスプロモーターは、Huang et al., Cell 27: 245 (1981)により記載されたＭＭＴＶのｐ２Ｉタンパク質をコードする遺伝子の５’末端に見出される。
合成プロモーターは、生物的に得られるというよりむしろ、化学的に合成されたプロモーターである。通常、合成プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ開始の効率を最適化する配列変化を組入れる。
【０１６０】
構成プロモーターは、生物、例えば植物全体の遺伝子産物の発現を促すプロモーターである。構成プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（例えばPoszkowski et al., EMBO J. 3: 2719 (1989); Odell et al., Nature 313: 810 (1985)）；ならびにトウモロコシユビキチン−１プロモーター（例えば米国特許第5,510,474号；第5,614,399号；第6,020,190号および第6,054,574号）が挙げられる。
【０１６１】
時間的調節プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度が発生中の特定の時間に変調されるプロモーターである。時間的調節プロモーターの例は、例えばChua et al., Science, 244: 174-181 (1989)に示されている。
空間的調節プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度が、生物の特定の構造、例えば葉、茎、種子または根において変調されるプロモーターである。空間的調節プロモーターの例は、Chua et al., Science, 244: 174-181 (1989)に示されている。このような組織特異的または器官特異的プロモーターは当該技術分野で周知であり、例としては、種子特異的プロモーター、器官原基特異的プロモーター、茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、葉肉特異的プロモーター（例えば光誘導性Rubiscoプロモーター）、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、維管束特異的プロモーター、雄蕊特異的プロモーター、裂開特異的プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いるための最も好ましいプロモーターは、種子、果実および塊茎中で最も活性である。
【０１６２】
空間時間的調節プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度が発生中の特定の時間に生物体の特定の構造中で変調されるプロモーターである。典型的空間時間的調節プロモーターの一例は、Chua et al., Science, 244: 174-181 (1989)により記載されたＥＰＳＰシンターゼ−３５Ｓプロモーターである。
【０１６３】
本発明に関しては、トウモロコシ内胚乳は遺伝子発現のための標的組織であると確定されたが、しかし本発明は、全植物体全体の、あるいは植物の任意の特定組織（単数または複数）における選定ｓＩｇＡの発現に適用可能である。トウモロコシ内胚乳における遺伝子発現は高レベルの標的タンパク質の蓄積を保証し、そしてタンパク質貯蔵、輸送、抽出および精製を簡単にする。本発明の一実施形態では、内胚乳特異的プロモーターを用いて、工ＨＳＶ抗体のＨＣおよびＬＣの発現を駆動する。
【０１６４】
種子特異的遺伝子の発現は、非常に詳細に研究されている（例えばGoldberg et al., Cell 56: 149-160 (1989)およびHiggins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191-221 (1984)による再検討を参照）。種子特異的遺伝子のプロモーター分析は、Goldberg et al., Cell 56: 149-160 (1989)およびThomas, Plant Cell 5: 1401-1410 (1993)において再検討されている。研究は、種子貯蔵タンパク質をコードするものよりしっかりと空間的発現に関して調節される植物遺伝子はない、ということを示す。
【０１６５】
多数の種子貯蔵タンパク質遺伝子が種々の植物種からクローン化されており、それらのプロモーターが詳細に分析されている（Thomas, Plant Cell 5: 1401-1410 (1993)）。トランスジェニック植物における種子貯蔵タンパク質遺伝子の種子特異的発現の多数の例が一般的に存在する。例えばｂ−ファセオリン（Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320-3324 (1985); Hoffman et al., Plant Mol. Biol. 11, 717-729 (1988)）；インゲンマメレクチン（Voelker et al., EMBO J. 6: 3571-3577 (1987)）；ダイズレクチン（Okamuro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8240-8244 (1986)）；ダイズKunitzトリプシン阻害剤（Perez-Grau et al., Plant Cell 1: 095-1109 (1989)）；ダイズｂ−コングリシニン（Beachy et al., EMBO J. 4: 3047-3053 (1985)）；エンドウビシリン（Higgins et al., Plant Mol. Biol. 11: 683-695 (1988)）；エンドウコンビシリン（Newbigin et al., Planta 180: 461-470 (1990)）；エンドウレグミン（Shirsat et al., Mol. Gen. Genetics 215: 326-331 (1989)）；ナタネナピン（Radke et al., Theor. Appl. Genet. 75: 685-694 (1988)）；トウモロコシ18 kDオレオシン（Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 888: 6181-6185 (1991)）；オオムギｂ−ホルデイン（Marris et al., Plant Mol. Biol. 10: 359-366 (1988)）；コムギグルテニン（Colot et al., EMBO J. 6: 3559-3564 (1987)）参照。種子特異的プロモーターの付加的供給源に関しては、例えば米国特許第5,623,067号；第6,100,450号；第6,177,613号；第6,225,529号；第6,342,657号および第6,403,371号；Knutzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624 (1992)；Bustos et al., EMBO J. 10: 1469 (1991)；Lam and Chua, Science 248: 471 (1991)；Stayton et al., Aus. J. Plant. Physio. 18: 507 (1991)（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。さらに、キメラ遺伝子構築物中の非相同コード配列に操作可能的に連結された種子特異的プロモーター遺伝子も、トランスジェニック植物中でそれらの時間的および空間的発現パターンを保持する。このような例としては、シロイヌナズナおよびセイヨウアブラナ種子においてエンケファリンペプチドを発現するためのシロイヌナズナ２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーター（例えばVandekerckhove et al., Bio/Technology 7: 929-932 (1989)参照）；ルシフェラーゼを発現するためのインゲンマメレクチンおよびインゲンマメｂ−ファセオリンプロモーター（例えばRiggs et al., Plant Sci. 63: 47-57 (1989)参照）、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するためのコムギグルテニンプロモーター（例えばColot et al., EMBO J. 6: 3559-3564 (1987)参照）の使用が挙げられる。
【０１６６】
Ｄ．ベクター
本明細書中の他の箇所に提示したように、本発明のいくつかの実施形態は、植物において外因的に供給される核酸配列を発現するための発現ユニット（あるいは発現ベクターまたは系）を用いる。植物において用いるための発現ユニット／系／ベクターの生成方法は当該技術分野で周知であり、本発明において用いるために容易に適合され得る。本明細書中に提示した大要を読めば、本発明の方法における任意の適切な植物／ベクター／発現系を、当業者は容易に用い得る。
【０１６７】
配偶子特異的プロモーター、構成プロモーター（例えばＣａＭＶまたはＮｏｓプロモーター）、器官特異的プロモーター（例えばトマトからのＥ８プロモーター）または誘導プロモーターは、典型的には、当該技術分野で既知の標準技法を用いて、タンパク質またはアンチセンスコード領域に結繋される。発現ユニットは、補足素子、例えば転写ターミネーターおよび／またはエンハンサー素子を用いることにより、さらに最適化され得る。
タンパク質の発現を調節するために用いられる発現制御素子は、コード配列と会合されて普通に見出される発現制御素子（相同発現素子）であるか、あるいは非騒動発現制御素子であり得る。種々の相同および非相同発現制御素子が当該技術分野で既知であり、本発明に用いるための発現ユニットを作製するために容易に用いられ得る。
【０１６８】
例えば転写開始領域は、種々のオピン開始領域、例えばアグロバクテリウム属のアグロバクテリウム・ツメファシアンスのＴｉプラスミド中に見いだされるオクトピン、マンノピン、ノパリン等の開始領域のいずれかを含み得る。
【０１６９】
植物における遺伝子発現を制御するために、植物ウイルスプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターも用いられ得る。
植物プロモーター、例えばプロリフェラプロモーター、果実特異的プロモーター、Ａｐ３プロモーター、熱ショックプロモーター、種子特異的プロモーター等も用いられ得る。本発明に用いるための最も好ましいプロモーターは、種子、果実および塊茎中で最も活性である。
【０１７０】
したがって例えば植物においては、発現ユニットは典型的には、タンパク質配列のほかに、植物プロモーター領域、転写開始部位および転写終結配列を含有する。発現ユニットの５’および３’末端の独特の制限酵素部位は、典型的には先在ベクター中への容易な挿入を可能にするために含まれる。
非相同プロモーター／構造遺伝子またはアンチセンス組合せの構築において、プロモーターは好ましくは、その天然設定における転写開始部位からとほぼ同じ非相同転写開始部位からの距離に配置される。しかしながら当該技術分野で既知であるように、この距離の多少の変動は、プロモーター機能の損失を伴わずに受け入れられ得る。
【０１７１】
プロモーター配列のほかに、発現カセットは、効率的終結を提供するために構造遺伝子の下流の転写集結領域も含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同一遺伝子から得られるし、あるいは異なる遺伝子から得られる。構造遺伝子によりコードされるｍＲＮＡが効率的にプロセシングされるべきである場合、ＲＮＡのポリアデニル化を指図するＤＮＡ配列も一般的にベクター構築物に付加される。ポリアデニル化配列としては、アグロバクテリウムオクトピンシンターゼシグナル（Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846 (1984)）またはノパリンシンターゼシグナル（Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1: 561-573 (1982)）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
その結果生じる発現ユニットは、高等植物形質転換に適しているベクターに結繋されるか、あるいはそうでなければ、それに含まれるよう構築される。ベクターは典型的には、形質転換植物細胞がそれにより培養中で同定され得る選択可能マーカーも含有する。抗生物質耐性マーカーが用いられ得る。これらのマーカーとしては、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性が挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましくは、除草剤耐性マーカーが利用される。例えばホスフィノトリシル−アラニル−アラニン（ＰＴＴ）に対するホスフィノトリシン（ＰＴＣ）耐性に関しては、米国特許第5,879,903号；第5,637,489号および第5,276,268号を参照されたい。さらにまた、例えばイミダゾリノン除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）に関しては、米国特許第5,767,361号；第5,9,28,937号および第6,444,875号を参照されたい。植物細胞を形質転換後、ベクターを有する細胞は、特定の抗生物質を含有する培地上で増殖するそれらの能力により同定される。細菌またはウイルス起源の複製配列は一般に、ベクターを細菌またはファージ宿主中でクローン化させるために含まれ（これに限定されない）、好ましくは複製の広範な宿主範囲原核生物起点が含まれる。細菌に関する選択可能マーカーは、所望の構築物を保有する細菌細胞の選択を可能にするために含まれるべきである。適切な原核生物選択可能マーカーとしては、抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
付加的機能をコードするその他のＤＮＡ配列も、当該技術分野で既知であるように、ベクター注に存在し得る。例えばアグロバクテリウム形質転換の場合、Ｔ−ＤＮＡ配列も植物染色体へのその後の移入のために含まれる。
本発明の配列はまた、種々のその他の核酸分子、例えば発現配列タグ（ＥＳＴ）、エピトープまたは蛍光タンパク質マーカーに融合され得る。
【０１７４】
ＥＳＴは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの３’または５’末端からシーケンシングされた、典型的には300〜400ヌクレオチド長の、遺伝子断片である。フランスおよび米国合弁企業により、ほぼ30,000のシロイヌナズナＥＳＴが産生されている（Delseny et al., FIBS Lett. 405(2): 129-132 (1997)；シロイヌナズナデータベース、http://genome.www.stanford.edu/Arabidopsis）。大型ＥＳＴデータベース由来の遺伝子発現パターンの分析の考察に関しては、例えばM.R. Fannon, TIBTECH 14: 294-298 (1996)を参照されたい。
【０１７５】
生物学的適合性蛍光タンパク質プローブ、特にクラゲAequorea victoriaからの自己アッセンブリンググリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、それらが生きている細胞中での生化学的事象の可視化を可能にするため、細胞、分子および発生生物学における研究を改革した（例えばMurphy et al., Curr. Biol. 7(11): 870-876 (1997); Grebenok et al., Plent J. 11(3): 573-586 (1997);Chiu et al., Curr. Biol. 6(3): 325-330 (1996);およびPlautz et al., Gene 173(1): 83-87 (1996);およびSheen et al., Plant J. 8(5): 777-784 (1995)参照）。
【０１７６】
部位特異的突然変異誘発は、可溶性修飾ＧＦＰ（ｓｍＧＦＰ）と呼ばれるコドン修飾ＧＦＰのより可溶性バージョンを開発するために用いられてきた。シロイヌナズナ中に導入する場合、コドン修飾ＧＦＰと比較して、より大きな蛍光が観察されたが、このことは、そのより多くが可溶性および機能性形態で存在するため、ｓｍＧＦＰが「より明るい」ことを意味する（Davis et al., Plant Mol. Biol. 36(4): 521-528 (1998)）。ＧＦＰおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子を融合することにより、植物、例えばシロイヌナズナにおける一過性の且つ安定な発現系に用いるために最適化される一組の二機能性受容体構築物を、研究者は作製し得た（例えばQuaedvlieg et al., Plant Mol. Biol. 37(4): 715-727 (1998)参照）。
【０１７７】
Berger等（Dev. Biol. 194(2): 226-234 (1998)）は、シロイヌナズナ胚軸表皮細胞に関するＧＦＰマーカー系統の単離を報告している。ＧＦＰ融合タンパク質は、ゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）を含めた多数のシロイヌナズナ遺伝子を限局し、特性化するために用いられてきた（Zhu et al., Plant Mol. Biol. 35(3): 331-341 (1997)）。
【０１７８】
Ｅ．遺伝子無能力化
導入遺伝子の発現を得るために、および／または導入遺伝子の発現の結果として産生される所望のタンパク質を生成するために、ある種の植物遺伝子を無能力にするのが望ましい。例えば本発明においては、トランスジェニック植物に固有であるある種の酵素、例えば１つまたは複数の特定の植物トランスフェラーゼを無能力化するのが望ましい。遺伝子を無能力化する方法は、当業者に周知である。
【０１７９】
例えば有効な無能力化修飾は、翻訳リーディングフレームシフトを生じる遺伝子の開始時に起こる単一ヌクレオチド欠失の導入である。このようなフレームシフトは遺伝子を無能力化し、非発現可能遺伝子産物を生じて、それによりその遺伝子による機能性タンパク質産生を破損する。例えば非修飾遺伝子がプロテアーゼをコードする場合、遺伝子によるプロテアーゼ産生は、プロテアーゼ遺伝子の調節領域またはコード領域が破損された場合、破損され得る。
【０１８０】
ヌクレオチドを欠失することにより遺伝子を無能力化して、移行性リーディングフレームシフトを引き起こすほかに、無能力化修飾は、当業者に周知の他の技法、例えばＤＮＡによりコードされるタンパク質の生成を有効に防止する遺伝子のＤＮＡ内のヌクレオチドの挿入、置換、百位または転換によっても可能である。
低特異的方法の使用により遺伝子を無能力化することも、当業者の能力の範囲内である。低特異的方法の例は、遺伝子を無作為に突然変異化するための、化学的突然変異原、例えばヒドロキシルアミンまたはニトロソグアニジンの使用、あるいは放射線突然変異原、例えばγ放射線または紫外線の使用である。遺伝子が任意の１つまたは複数のドメインに関して機能性タンパク質をもはや産生し得ないよう、このような突然変異化系統は、偶然、無能力化遺伝子を含有し得た。所望の無能力化遺伝子の存在は、ルーチンのスクリーニング技法により検出され得る。さらなる手引きのためには、例えば米国特許第5,759,538号を参照されたい。
【０１８１】
Ｆ．ベクターをコードするアンチセンス
上記のように、導入遺伝子の発現を得るためには、および／または導入遺伝子によりコードされる所望のタンパク質を生成するためには、ある種のネイティブ植物遺伝子の発現を抑制するのが望ましい。アンチセンス構築物を用いて植物における発現を抑制するための方法、例えばｉｎ  ｓｉｔｕでのアンチセンスの生成は当業者に周知であり、例えば米国特許第5,107,065号；第5,254,800号；第5,356,799号；第5,728,926号および第6,184,439号に記載されている。
【０１８２】
植物における内因性遺伝子の発現を抑制するために用いられ得るその他の方法も、本発明において用いられ得る。例えば二重鎖遺伝子の必須領域での三重らせんの形成は、この目的に役立つ。適正一本鎖関与体の設計を可能にする三つ組暗号も、当該技術分野で既知である（例えばH.E. Moser et al., Science 238: 645-650 (1987)およびM. Cooney et al., Science 241: 456-459 (1988)参照）。プリン塩基の一続きを含有する制御配列中の領域は、特に魅力的な標的である。光架橋に伴う三重らせん形成は、例えばD. Praseuth et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 1349-1353 (1988)に記載されている。
【０１８３】
Ｇ．形質転換
慣用的方法により所望の遺伝子または遺伝子組を導入するためには、所望の特質を有する植物が得られるまで、2つの系統間の性的交配を、次にハイブリッド子孫と親の一方との間の反復戻し交配を要する。しかしながらこの方法は、性的にハイブリダイズし得る植物に制限され、遺伝子が、所望の遺伝子のほかに、移入される。
組換えＤＮＡ技法は、植物遺伝学者に、望ましい形質、例えば害虫に対する耐性に関して特定の遺伝子を同定させ、クローン化させて、これらの遺伝子を植物のすでに有用な品種に導入させることにより、これらの制限を植物学者に回避させる。一旦外来遺伝子が植物に導入されると、その植物は次に慣用的植物育種計画（例えば系統育種、単一種子系統育種計画、相互循環選択）に用いて、これもまた当該遺伝子を含有する子孫を産生し得る。
【０１８４】
遺伝子は、相同組換えを用いて、部位特異的方式で導入され得る。相同組換えは、内因性遺伝子における部位特異的修飾を可能にし、したがって遺伝または獲得突然変異が起こり得るし、および／または新規の変更がゲノム中に工学処理され得る。植物における相同組換えおよび部位特異的組込みは、例えば米国特許第5,451,513号；第5,501,967号および第5,527,695号で考察される。
【０１８５】
トランスジェニック植物の産生方法は、当業者に周知である。トランスジェニック植物は、ここで、種々の異なる形質転換方法により産生され、例としては電気穿孔；マイクロインジェクション；粒子加速またはbiolistic bombardmentとしても既知の微粒子銃；ウイルス媒介性形質転換；ならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換が挙げられるが、これらに限定されない（例えば米国特許第5,405,765号；第5,472,869号；第5,538,877号；第5,538,880号；第5,550,318号；第5,641,664号；第5,736,369号および第5,736,369号；Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books (1992); Hinchee et al., Bio/Tech. 6: 915-922 (1988); McCabe et al., Bio/Tech. 6: 923-926 (1988); Toriyama et al., Bio/Tech. 6: 1072-1074 (1988); Fromm et al., Bio/Tech. 8: 833-839; Mullins et al., Bio/Tech. 8: 833-839 (1990); Hiei et al., Plant Molecular Biology 35: 205-218 (1997); Ishida et al., Nature Biotechnology 14: 745-750 (1996); Zhang et al., Molecular Biotechnology 8: 223-231 (1997); Ku et al., Nature Biotechnology 17: 76-80 (1999);およびRaineri et al., Bio/Tech. 8: 33-38 (1990)参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。
【０１８６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、そのＤＮＡ（遺伝情報）を植物中に挿入して、根頭癌腫病として既知の植物に対する損傷の一型を生じる天然細菌である。植物のほとんどの種、例えばアルファルファは、目下、この方法を用いて形質転換され得る（例えばWang et al., Australian Journal of Plant Physiology 23(3): 265-270 (1996); Hoffman et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 10(3): 307-315 (1997);およびTrieu et al., Plant Cell Reports 16: 6-11 (1996)参照）。
【０１８７】
微粒子銃は、粒子加速、biolistic bombardmentおよび遺伝子銃（Biolistic（商標）Gene Gun）としても既知である。遺伝子銃は、その後新規の遺伝子を発現するための植物細胞を得るために、（例えば所望の形質に関する）遺伝子で被覆されるペレットを、植物種子または植物組織中に撃つために用いられる。遺伝子銃は、物質を推進させるために実際の爆薬（.22 口径空包）を用いる。圧縮空気または蒸気も、推進剤として用いられ得る。Biolistic（商標）Gene Gunは、John Sanford, Edward WolfおよびNelson Allenによりコーネル大学で1983〜1984年に発明された。それおよびその登録商標は、目下、E.I. du Pont de Nemours and Companyにより所有されている。植物のほとんどの種は、この方法を用いて形質転換されてきたが、その例を以下に示す：アルファルファ（米国特許第5,324,646号）およびクローバー（Voisey et al., Biocontrol Science and Technology 4(4): 475-481 (1994); Quesbenberry et al., Crop Science 36(4): 1045-1048 (1996); Khan et al., Plant Physiology 105(1): 81-88 (1994);およびVoisey et al., Plant Cell Reports 13(6): 309-314 (1994)）。
【０１８８】
1993年にICI Seeds Inc.（Garst Seed Company）により開発されたWHISKERSTMは、植物細胞中にＤＮＡを挿入する他の方法（例えばBiolistic（商標）Gene Gun、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、「ショットガン」法等）の代替物である；そしてそれは炭化ケイ素の針様結晶（「ひげ」）からなる。繊維は、植物細胞とともに容器中に入れられて、次に拘束で混合され、これが結晶に植物細胞壁を貫通させて、顕微鏡的「穴」（入口）を生じる。次に新規のＤＮＡ（遺伝子）が付加され、これがＤＮＡを植物細胞中に流入させる。植物細胞は次に、新規の遺伝子（単数または複数）を組入れる。このようにしてそれらは遺伝子工学処理された。
【０１８９】
WHISKERSTM技術の本質は、小針様炭化ケイ素「ひげ」（直径0.6ミクロン、長さ5〜80ミクロン）であり、超えは以下の方法で用いられる。ＤＮＡからなる「形質転換カクテル」（例えば農業遺伝子＋選択可能マーカー遺伝子）、胚形成トウモロコシ組織および炭化ケイ素「ひげ」を保持する容器は、歯科用アマルガム混合機または塗料振盪器上で激しく混合されるかまたは、振盪される。胚形成トウモロコシ細胞と鋭い炭化水素「ひげ」との間のその後の衝突は、植物細胞壁に小穴を開けて、それによりＤＮＡ（農業遺伝子）が細胞中に進入すると考えられる。新規の遺伝子を受け取り、組入れる細胞は次に、増殖し、最終的には稔性トランスジェニック植物に発生するよう誘導される。
【０１９０】
炭化ケイ素「ひげ」形質転換は、目下、種々の植物種、例えばトウモロコシにおいて安定形質転換化細胞および／または植物を産生している（例えば米国特許第5,302,523号および第5,464,765号（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）；Frame et al., The Plant Journal 6: 941-948 (1994); Kaeppler et al., Plant Cell Reports 9: 415-418 (1990); Kaeppler et al., Theoretical and Applied Genetics 84: 560-566 (1992); Petolino et al., Plant Cell Reports 19(8): 781-786 (2000); Thompson et al., Euphytica 85: 75-80 (1995); Wang et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology 31: 101-104 (1995); Song et al., Plant Cell Reporter 20: 948-954 (2002); Petolino et al., Molecular Methods of Plant Analysis, In Genetic Transformation of Plants, Vol. 23, pp. 147-158, Springer-Verlag, Berlin (2003)）。その他の例としては、ネズミムギLolium multiflorum、ホソムギLolium perenne、オニウシノケグサFestuca arundinacea、ハイコヌカグサAgrostis stolonifera（Dalton et al., Plant Science 132: 31-43 (1997)）、イネOryza sativa（Nagatani et al., Biotechnology Techniques 11: 471-473 (1997)）、ならびにパンコムギTriticum aestivumおよびタバコNicotiana tabacum（Kaeppler et al., Theoretical and Applied Genetics 84: 560-566 (1992)）が挙げられる。クラミドモナスでさえ（例えばDunahay, T.G., Biotechniques 15: 452-460 (1993)参照）、「ひげ」アプローチを用いて形質転換され得る。それは一般的に高等植物に関して実行されるので、「ひげ」系はいくつかの植物細胞を形質転換するための少なくとも複雑な方法の1つである。
【０１９１】
組換えＤＮＡ法を用いて植物中に首尾よく導入される遺伝子としては、以下の形質をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない：種子貯蔵タンパク質、例えば修飾７Ｓマメ科植物種子貯蔵タンパク質（例えば米国特許第5,508,468号、第5,559,223号および第5,576,203号参照）；除草剤耐容性または耐性（例えばDe Greef etal., Bio/Technology 7: 61 (1989)；米国特許第4,940,835号；米国特許第4,769,061号；米国特許第4,975,374号；Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83, 435；米国特許第5,489,520号；米国特許第5,498,544号；米国特許第5,554,798号；Powell et al., Science 232: 738-743 (1986); Kaniewski et al., Bio/Tech. 8: 750-754 (1990); Day et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6721-6725 (1991)参照）；フィターゼ（例えば米国特許第5,593,963号参照）；細菌、真菌、線虫および害虫に対する耐性、例えばＢｔ遺伝子により付与される鱗翅類昆虫に対する耐性（例えば米国特許第5,597,945号および第5,597,946号；Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9871-9875 (1989)；Perlak et al., Bio/Tech. 8: 939-943 (1990)参照）；レクチン（例えば米国特許第5,276,269号参照）；花色（Meyer et al., Nature 330: 677-678 (1987); Napoli et al., Plant Cell 2: 279-289 (1990); van der Krol et al., Plant Cell 2:291-299 (1990)）；Ｂｔ遺伝子（Voisey et al.、上記）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Quesbenberry et al.、上記）；エンドウレクチン遺伝子（Diaz et al., Plant Physiology 109(4): 1167-1177 (1995); Eijsden et al., Plant Molecular Biology 29(3):431-439 (1995)）；オーキシン応答性プロモーターＧＨ３（Larkin et al., Transgenic Research 5(5): 325-335 (1996)）；ヒマワリからの種子アルブミン遺伝子（Khan et al., Transgenic Research 5(3): 179-185 (1996)）；ならびに酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、除草剤Basta（商標）に対する耐性をコードするβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびα−アミラーゼ阻害剤（Khan et al.、上記）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【０１９２】
ある種の目的のために、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが選択され得る。形質転換にルーチンに用いられる選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（例えばMessing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)参照）、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（White et al., Nucl Acids Res 18: 1062 (1990); Spencer et al., Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990)）、ならびにメトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)）が挙げられる。
【０１９３】
トランスジェニックアルファルファ植物は、アルファルファおよび非アルファルファ種から単離された多数の異なる遺伝子を用いて産生されたが、その例としては以下のものが挙げられる：レポーター遺伝子ｇｕｓＡと融合された初期ノデュリン遺伝子のプロモーター（Bauer et al., The Plant Journal 10(1): 91-105 (1996)）；初期ノデュリン遺伝子（Charo et al., Proc. Natl. Acad. Of Sci. USA 94(16): 8901-8906 (1997); Bauer et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 10(1): 39-49 (1997)）；ＮＡＤＨ−依存性グルタメートシンターゼ（Gantt, The Plant Journal 8(3): 345-358 (1995)）；3つのレクチン遺伝子の各々に関するプロモーター−ｇｕｓＡ融合物（Bauchrowitz et al., The Plant Journal 9(1): 31-43 (1996)）；ＣａＭＶプロモーターと融合された海洋性軟質サンゴ・ウミシイタケRenilla reniformsのルシフェラーゼ酵素（Mayerhofer et al., The Plant Journal 7(6): 1031-1038 (1995)）；Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼｃＤＮＡ（McKersie et al., Plant Physiology 111(4): 1177-1181 (1996)）；バシラス・ツリンギエンシスδ−内毒素をコードする合成ｃｒｙＩＣ遺伝子（Strizhov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(26): 15012-15017 (1996)）；グルカナーゼ（Dixon et al., Gene 179(1): 61-71 (1996)）；ならびに葉老化遺伝子（米国特許第5,689,042号）。
【０１９４】
遺伝子形質転換は、多数の飼い葉および芝種でも報告されている（Conger B.V., Genetic Transformation of Forage Grasses in Molecular and Cellular Technologies for Forage Improvement, CSSA Special Publication No. 26, Crop Science Society of America, Inc. E.C. Brummer et al. Eds. 1998, pages 49-58）。これらの例としては、カモガヤ（Dactylis glomerata L.）、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea Schreb.）、オオウシノケグサ（Festuca rubra L.）、ヒロハノウシノケグサ（Festuca pratensis Huds.）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、クリーピングベントグラス（Agrostis palustris Huds.）、およびレッドトップ（Agrostis alba L.）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
トランスジェニック植物は、工業用タンパク質の分子農業（「ファーミングpharming」）のために利用されてきた。例えば組換え卵白色アビジンおよびトランスジェニックトウモロコシからの細菌Ｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は商業的に生産されており、トウモロコシからのユビキチンプロモーターを用いることにより、種子において高レベルの発現が得られている（Hood et al., Adv Exp Med Biol 464: 127-147 (1999)）。
【０１９６】
Ｈ．半接合
アグロバクテリウム形質転換法を用いて生成されるトランスジェニック植物は典型的には1つの染色体上の単一遺伝子を含有するが、しかし多コピーも可能である。このようなトランスジェニック植物は、付加遺伝子に関して半接合性であると言及され得る。各形質転換化植物が独自のＴ−ＤＮＡ組込み事象を表すため、このような植物に関するさらに正確な名称は、独立分離個体である（例えば米国特許第6,156,953号参照）。導入遺伝子座は一般に、導入遺伝子の存在および／または非存在により特性化される。一対立遺伝子が導入遺伝子の非存在に対応するヘテロ接合性遺伝子型も、半接合性と呼ばれる（例えば米国特許第6,008,437号参照）。
【０１９７】
正常半接合性を想定すると、自家交配は、Ｒ１またはＲ1世代としても既知である第一自家交配組換え世代において最大の遺伝子型分離を生じる。Ｒ1世代は、Ｒ０またはＲ0としても既知である元の組換え系統を自家交配することにより産生される。各挿入物が優性対立遺伝子として作用するため、連鎖の不存在下では、そして1つの半接合性挿入物のみが耐容性発現に必要とされると仮定すると、1つの挿入物は3:1に分離し、2つの挿入物は15:1に、3つの挿入物は63:1にといった具合に分離する。したがって少なくとも1つの耐性表現型を見出すよう成長させるためには相対的に少数のＲ1植物が必要である（例えば米国特許第5,436,175号および第5,776,760号参照）。
【０１９８】
上記のように、半接合性トランスジェニック再生植物の自家受粉は、約25％がホモ接合性トランスジェニック植物であるべきＦ2と等価の子孫を産生するはずである。非形質転換対照植物に対するＦ2子孫の自家受粉および試験交配を用いて、ホモ接合性トランスジェニック植物を同定し、系統を保持し得る。再生植物に関して最初に得られた子孫が他家受粉からであった場合には、ホモ接合性トランスジェニック植物の同定は、自家受粉のさらなる世代を要する（例えば米国特許第5,545,545号参照）。
【０１９９】
Ｉ．品種改良方法
放任受粉集団.  ライムギ、多数のトウモロコシおよびサトウダイコン、牧草、マメ類、例えばアルファルファおよびクローバ、ならびに熱帯樹作物、例えばカカオ、ココナツ、パーム油ヤシおよびいくつかのゴムのような作物の放任受粉集団の改良は、本質的に、高い（がしかし最大からは遠い）程度のヘテロ接合性を保持しながら、好ましい対立遺伝子の固定に向けての遺伝子頻度の変更によっている。このような集団における均一性は不可能であり、放任受粉品種における純粋種対類型は、個々の植物の特質ではなく、全体としての集団の統計学的特徴である。したがって放任受粉集団の不均一性は、近交系、クローンおよびハイブリッドの均質性（または事実上そうである）と対照する。
【０２００】
集団改良方法は、天然には、2つの群：即ち普通は集団選択と呼ばれる、純粋に表現型選択に基づいたものと、子孫試験を用いた選択に基づくものとに分かれる。集団間改良は、放任品種改良集団の概念を利用し、遺伝子をある集団から別の集団に流動させる。一集団（栽培変種植物、系統、生態型または任意の生殖質源）中の植物は、天然に（例えば風により）、あるいは手により、またはハチ（一般にミツバチApis mellifera L.またはアルファルファハキリバチMegachile rotundata F.）により、他の集団からの植物と交配される。両供給源からの所望の形質を有する植物を単離することにより、一方の（または時としては両方の）集団（単数または複数）を改良するために、選択が適用される。
【０２０１】
放任受粉集団改良については基本的に2つの主な方法がある。第一に、集団が選定選択手法により一まとめに変更される情況がある。結果は、単離においてそれ自体の中で無作為交配により不確定的に繁殖可能な改良型集団である。第二に、合成品種が、集団改良と同一最終結果を得るが、しかしそれ自体はそのようなものとして繁殖可能でない。それは、親系統またはクローンから再構築されねばならない。放任受粉集団を改良するためのこれらの植物品種改良手法は当業者に周知であり、他家受粉植物を改良するためにルーチンに用いられる品種改良手法の包括的再検討が、多数のテキストおよび論文に、例えばAllard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, Inc. (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited (1979); Hallauer and Miranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press (1981);およびJensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988)に提示されているが、これらに限定されない。
【０２０２】
集団選択.  集団選択では、望ましい個々の植物が選択され、収穫され、そして子孫試験なしで種子が合成されて、次世代を産生する。選択は母系親のみに基づいており、そして受粉を支配する制御はないため、集団選択は、選択を伴う無作為交配の形態に相当する。上記のように、集団選択の目的は、集団中の優れた遺伝子型の割合を増大することである。
【０２０３】
合成物．  合成品種は、全ての考え得るハイブリッド組合せにおける能力を、放任受粉による品種のその後の保持と良好に組合せるために選択された多数の遺伝子型を同一育種間で交配することにより産生される。親が、いくつかのミツバチおよびマメ類（ソラマメ）の場合のような（多少近交系の）種子繁殖系統、あるいは、牧草、クローバおよびアルファルファの場合のようなクローンであるか否かは、原則として差を生じない。親は、一般的組合せ能力に関して、時としては試験交配または品種系統間交雑により、さらに一般的には多交雑により選択される。親種子系統は、熟慮して同系交配される（例えば自家交配または同胞交配により）。しかしながら親が慎重に同系交配されない場合でも、系統保持中の系統内での選択は、何らかの同系交配が起こることを保証する。クローン親は、もちろん、変化しないままであり、高ヘテロ接合性である。
【０２０４】
合成物が親種子生産プロットから農業経営者に直接届くか、あるいは先ず、種子生産および種子に対する需要量の規模によって、1または2回の繁殖を受けなければならない。実際、草およびクローバは一般に、1または2回繁殖され、したがって元の合成物からかなり除去される。
【０２０５】
集団選択は時として用いられるが、しかしそれらの操作の簡易性および目的との明白な関連性、即ち合成物における一般的組合せ能力の利用のため、子孫試験は一般に、多交配に関して選択される。
【０２０６】
合成物に入る親系統またはクローンの数は、広範に変化する。実際、親系統の数は、10〜数百の範囲であり、平均は100〜200である。100またはそれ以上のクローンから生成される広い支持基盤を有する合成物は、種子繁殖中、狭い支持基盤の合成物より安定であると予測される。
【０２０７】
ハイブリッド．  ハイブリッドは、異なるｉｄｅｎｎｓｉ型の親間の交配に起因する個々の植物である。商業的ハイブリッドは、目下、多数の作物、例えばトウモロコシcorn（maize）、モロコシ、サトウダイコン、ヒマワリおよびブロッコリーにおいて広範に用いられている。ハイブリッドは、多数の異なる方法で、例えば2つの親間の交配により直接的に（単一交配ハイブリッド）、単一交配ハイブリッドと別の親との交配により（三系または三重交配ハイブリッド）、あるいは2つの異なるハイブリッドを交配することにより（四系または二重交配ハイブリッド）、生成され得る。
【０２０８】
厳密に言えば、異系交配（即ち放任受粉）集団中のほとんどの個々の植物はハイブリッドであるが、しかし本用語は通常は、親が個々のそのゲノムがそれらが異なる種または亜種として認識されるのに十分に異なっている個体である場合に関しては、意味が変わる。
【０２０９】
ハイブリッドは2つの親のゲノムにおける定性的および／または定量的差によって、稔性であるかまたは不稔性であり得る。雑種強勢またはハイブリッド強勢は、通常は、ハイブリッドを生成するために用いられた親系統と比較して、ハイブリッドの成長、生存および稔性の強勢増大を生じるヘテロ接合性増大に関連づけられる。最大雑種強勢は通常は、2つの遺伝的に異なる高度近交系を交配することにより達成される。
【０２１０】
ハイブリッドの産生は、それらの系統の交配に起因する親系統およびハイブリッドの両方の単離産生を包含する良好に開発された産業である。ハイブリッド産生方法の詳細な考察に関しては、例えばWright, H., Commercial Hybrid Seed Production, volume 8, pages 161-176, In Hybridization of Crop Plants（上記）を参照されたい。
【実施例】
【０２１１】
実施例
Ｉ．植物におけるＩｇＡの産生に関する実施例
2つの基本戦略を用いて、トウモロコシにおける抗ＨＳＶ単量体ＩｇＡを産生した：
ＩｇＡの構成的発現；および
ＩｇＡの内胚乳特異的発現。
【０２１２】
実験は、単一プラスミドにおける重鎖（「ＨＣ」）および軽鎖（「ＬＣ」）対2つの別個のプラスミドにおけるＨＣおよびＬＣの発現の効力も比較した。
【０２１３】
実施例１．ユビキチン／ＨＣ、ＬＣプラスミドの構築
カルス組織におけるタンパク質産生の迅速分析を可能にするために、抗ＨＳＶ抗体遺伝子の構成的発現を選択した。特にトウモロコシユビキチン−１プロモーター駆動性ＨＳＶ重鎖ＨＣおよびＬＣプラスミド構築およびトランスジェニック事象を作って、ある種のプラスミド立体配置からの重鎖および軽鎖遺伝子の正確なアセンブリーおよび蓄積を実証した。
【０２１４】
トウモロコシユビキチン−１（「ｕｂｉ」）は、例えば米国特許第5,510,474号；第5,614,399号；第6,020,190号および第6,054,574号に記載されている（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。ＭＡＲ（マトリックス関連領域）は、米国特許第5,773,689号および第6,239,328号に記載されている（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。トウモロコシｐｅｒ５ＵＴＲは、米国特許第6,384,207号に記載されている（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。この実験に用いられる遺伝子は、植物コドンバイアスに関して再構築されなかった。そしてそれらは、小胞体に対してタンパク質をターゲッティングするための大麦アルファ−アミラーゼリーダー配列を含有する。
以下のベクターを組み立てた：
ｐＤＡＢ６３５（ＭＡＲ：：ｕｂｉ／ＨＣ／ｐｅｒ５：：ＭＡＲ）（図１；配列番号１５）；
ｐＤＡＢ６３６（ＭＡＲ：：ｕｂｉ／ＬＣ／ｐｅｒ５：：ＭＡＲ）（図２；配列番号１６）；
ｐＤＡＢ６３７（ＭＡＲ：：ｕｂｉ／ＨＣ／ｐｅｒ５：：ｕｂｉ／ＬＣ／ｐｅｒ５：：ＭＡＲ）（図３；配列番号１７）；
【０２１５】
抗体遺伝子をＮｃｏＩ−ＨｐａＩ断片上の供給源ベクターから遊離させて、トウモロコシユビキチンプロモーターとトウモロコシｐｅｒ５  ３’ＵＴＲとの間で、ベクターｐＤＡＢ４００５のＮｃｏＩ−ＰｍｅＩ部位にクローン化して、ＧＵＳコード領域を置き換えた。次に完全ｕｂｉプロモーター／抗体遺伝子／ｐｅｒ５カセットをＮｏｔＩ断片上に遊離させて、逆ＭＡＲベクター２５２−４のＮｏｔＩ部位に挿入した。中間ベクターからＮｏｔＩ断片上にｕｂｉ／ＨＣ／ｐｅｒ５カセットを遊離させ、そしてｐＤＡＢ６３６注の独特のＳｒｆＩ部位への挿入のためにＴ４ポリメラーゼで断片を平滑末端化することにより、プラスミドｐＤＡＢ６３７を構築した。選択可能マーカーカセットコメアクチン／ｐａｔ／リパーゼを含有するｐＤＡＢ３０１４を用いたトウモロコシ形質転換のための調製に際して、3つのプラスミドを全て、一緒にした。
【０２１６】
実施例２．多プラスミドを送達するための代替方法
ＰＡＴプラスミド（ｐＤＡＢ３０１４）と抗体プラスミドとの間のサイズの極端な差のため、同時形質転換のための等質量のＤＮＡが、トウモロコシ細胞中へのプラスミドの各々の非効率的送達を生じる、という懸念があった。トウモロコシ細胞中への多プラスミドの送達に関するある種のパラメーターを評価しようとして、ＤＮＡのモル等価量の使用を、ＤＮＡの質量等価量使用と比較して、細胞が必要なプラスミドの全てを受理する効率に及ぼす任意の作用が存在するか否かを確定した。
【０２１７】
総計106事象がＰＣＲに利用可能であり、陽性であると分析された10事象を再生した。
ユビキチン／ＨＣ、ＬＣプラスミドで形質転換したトランスジェニック事象の分析を、2段階で実施した：１）当該無傷遺伝子を含有する事象のＰＣＲ同定；ならびに２）タンパク質発現およびＩｇＡアセンブリーに関するＰＣＲ陽性事象のウエスタンおよびＥＬＩＳＡ分析。図４は、トランスジェニックトウモロコシカルスにより産生されたユビキチンＨＳＶ−ＩｇＡ（ＨＣ／ＬＣ）単量体抗体からのタンパク質発現を検出するための検出抗体としてＩｇＡκ鎖を用いたネイティブウエスタンブロットを示す。
【０２１８】
3つのプラスミド内に含入される反復調節素子、ならびにその結果生じる、所望のＰＴＵを特異的に且つ正確に増幅するプライマーを設計することの難しさのため、無傷ＰＴＵ（植物転写ユニット：プロモーター／コード領域／３’ＵＴＲ）のＰＣＲ同定は特に骨の折れる仕事であった。いくつかの増幅戦略、ＰＣＲ系および増幅条件を、8つの異なるプライマー組を含めて、試験した。ＨＣ  ＰＴＵ（ｕｂｉ／ＨＣ／ｐｅｒ５）およびＬＣ  ＰＴＵ（ｕｂｉ／ＬＣ／ｐｅｒ５）はともに、単一ＰＣＲ反応において単一組のプライマーで増幅され得る、ということが確定された。ＨＣおよびＬＣと側面を接する領域において異なる数個の塩基対を利用することにより、第二および第三組のプライマーも、ＨＣまたはＬＣ  ＰＴＵを別個に認識し、特定的に増幅し得るということが判明した。
【０２１９】
二系形質転換（ｐＤＡＢ６３７（配列番号１７）およびｐＤＡＢ３０１４（配列番号８４））に由来する総計53のトランスジェニックカルス、ならびに三系形質転換（ｐＤＡＢ６３５（配列番号１５）およびｐＤＡＢ３０１４（配列番号８４））に由来する23のトランスジェニックカルスをＰＣＲ分析して、導入遺伝子に関するＰＴＵの存在を検出した。単一ＰＣＲ反応においてＨＣおよびＬＣの両方を増幅するための戦略を用いた。二系由来のカルス系統の間では、79％がＰＣＲ陽性であったが、一方、三系由来のカルス系統の78％がＰＣＲ陽性であった。第一増幅戦略からの結果を立証するために、ＨＣおよびＬＣのＰＴＵを別個に増幅し得る代替的戦略を用いて、16試料のサブセットを分析した。結果は、ＨＣおよびＬＣ  ＰＴＵを同一ＰＣＲ反応で検出した第一ＰＣＲ分析と一致した。これら16サブセット試料をさらに、ＨＣおよびＬＣのコード領域のみを増幅するプライマーを用いて、分析した。増幅はうまくいったが、しかし結果はＰＴＵ分析と正確にマッチしなかった。この差は、コード領域特異的プライマーにより検出されるが、しかしＰＴＵ特異的プライマーによっては検出されない断片化ＰＴＵの結果であり得る。尾ＰＴＵ陽性および陰性の両方であったカルス事象に、ウエスタンおよびＥＬＩＳＡ分析を施した。
【０２２０】
上記したユビキチン／ＨＣ、ＬＣ形質転換からの事象を用いて、タンパク質分析データを生成した。実験の目標は、単一プラスミド上のＨＣおよびＬＣ対2つの別個のプラスミド上のＨＣおよびＬＣの発現の効力を比較することであった。カルス材料を収集し、−70℃で凍結した後、タンパク質分析のために発送した。ＩｇＡ重鎖捕獲抗体およびＩｇＡκ鎖検出抗体を用いて、捕獲ＥＬＩＳＡ検定により、事象の初期スクリーニングを実施した。ＥＬＩＳＡ陽性試料のみを、ネイティブウエスタンブロットで、そしてＩｇＡκ鎖も検出抗体として用いて、評価した。
【０２２１】
ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした54の事象のうち、26が陽性であった（表１）。これら26の陽性試料の全てが、約160,000 kdのモル重量を有する集合ＩｇＡ単量体を生じた。18の事象は、いくらかの非集合化ＩｇＡも含む。形質転換法、2−プラスミドおよび3−プラスミドの両方が集合化ＩｇＡを生成し、三系戦略は陽性60％を、二系戦略は陽性38％を生じた。発現系統の頻度の差は、プラスミド立体配置の一関数であるとは考えられないが、しかしむしろ分析のために提示された小データ組の結果であると考えられる。
【０２２２】
【表２】
2006517392.tif 000004
【０２２３】
【表３】
2006517392.tif 000005
【０２２４】
これらの実験は、単一プラスミド上または2つの別個のプラスミド上にＨＣおよびＬＣが存在する場合、タンパク質発現およびアセンブリーにおける有意差は認められない、ということを実証する。質量等価量またはモル等価量でのＤＮＡの付加に関わらず、平均して、同数の事象が各戦略に関して生成された。さらに両ＤＮＡ送達戦略は、当該遺伝子全てを含有する同数の事象を生じた。これらの結果に基づいて、ＤＮＡをその後の作業のために質量等価量で付加した。
【０２２５】
実施例３．植物における内胚乳特異的抗ＨＳＶ抗体発現のためのベクター構築
以下の実施例は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の制御のための単量体ＩｇＡ抗体を包含する。ＨＳＶに対する機能性を有する単量体抗体の種子特異的発現のための一ベクター中で、ＨＣおよびＬＣをコードする2つの遺伝子を植物中に導入した。
【０２２６】
米国特許第5,380,831号（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に教示されたものと類似の方法を用いて植物における最適発現のために、2つの抗体遺伝子（ＨＣおよびＬＣ）を再設計した。したがって2つのヒトＨＳＶ抗体遺伝子ＨＣ（配列番号１）およびＬＣ（配列番号９）、ならびにヌクレオチド配列、配列番号３、５、７、９、１１および１３は、トウモロコシにおける遺伝子発現増強のためにヒトコドンより植物コドンに最も近似するコドンバイアスを有する。
【０２２７】
抗ＨＳＶプロジェクトのためのプラスミド構築は、各々が2つの交代植物転写単位（ＰＴＵ）と側面を接するＭＡＲ配列を含有する4つの複合プラスミドのアセンブリーを要する。抗体遺伝子は、内胚乳特異的発現のためのトウモロコシガンマ−ゼイン（「ｇｚ」または「γ−ゼイン」）プロモーターの制御下にあり（Ueda, T. et al., Mol. Cell. Biol. 14(7): 4350-9 (1994)）、トウモロコシペルオキシダーゼ３’ＵＴＲ（ｐｅｒ５）で終結する。
【０２２８】
主鎖ベクター構築．  プラスミド構築の第一期は、主鎖ベクターの調製を包含した。主鎖プラスミドは、当該遺伝子（単数または複数）の発現のために必要な全ての素子、例えばＭＡＲ配列、プロモーター、３’ＵＴＲ、選択可能マーカー遺伝子カセット、ならびに抗体コード領域の単一段階付加のための独特の制限部位を含有する。主鎖ベクターの別の特質は、抗生物質耐性遺伝子の効率的除去のための独特の制限部位の存在である。抗体特異的主鎖ベクターの別の特質は、将来的生成物概念ベクターのための抗体遺伝子セグメントのクローニングを妨げ得る部位の不存在である。
【０２２９】
抗体ベクター構築を、2段階で実施した：過程１＝γ−ゼインプロモーターとｐｅｒ５  ３’ＵＴＲとの間の抗体遺伝子の挿入；ならびに過程２＝逆ＭＡＲベクター中へのγ−ゼイン：抗体遺伝子：ｐｅｒ５カセットの挿入。2つの主鎖ベクターに対していくつかの修飾を作製して、可変部モチーフのサブクローニングを促して、無アンピシリン断片精製を可能にし、そしてサザン分析およびＰＴＵ同定を支持した。Ｔ４ポリメラーゼによるヌクレオチド除去により、「過程１」ベクターからＡｖｒＩＩ部位を除去した。さらにＰｍｅＩ部位を取り除いた同様の断片で現存するｐｅｒ５断片を置換することにより、「過程１」ベクターからＰｍｅＩ部位を除去した。独特のＳａｐＩ部位への合成アダプターの付加により、「過程２」ＭＡＲベクターにＦｓｐＩ部位を付加した。そして最後に、ｐＤＡＢ４００５からユビキチンプロモーターを除去し、それを、Ｗ２２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅されたγ−ゼインプロモーターで置き換えることにより、「過程１」ベクター中にγ−ゼインプロモーターを挿入した。修飾主鎖プロモーターをシーケンシングして、変化を立証した。さらに、γ−ゼインプロモーターの徹底的シーケンシングを完了して、ＰＣＲ誘導性誤りが認められないことを保証した。
【０２３０】
表２は、構築された主鎖ベクターを、ならびに抗体遺伝子を受け入れるために実施された修飾を列挙する。
【０２３１】
【表４】
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【０２３２】
主鎖ベクターのさらに詳細な説明、ならびにそれを構築するために用いられる戦略を以下に示す。
【０２３３】
ｐＤＡＢ８５０６は、標準試験ベクターであるよう意図された修飾ｐＤＡＢ４００５ベクターである。それは、トウモロコシｕｂｉ／ＧＵＳ／ｐｅｒ５カセットを含有し、そしてその後の主鎖ベクターに関する基礎であった。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ｐＤＡＢ４００５からＡｖｒＩＩ部位を除去した。
【０２３４】
ｐＤＡＢ６３４は、トウモロコシガンマ・ゼイン−プロモーター／ＧＵＳ／ｐｅｒ５（「ｇｚ／ＧＵＳ／ｐｅｒ５」）カセットを含有する。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片上のガンマゼインプロモーターでＤＡＢ８５０６のユビキチンプロモーターを置き換えることにより、このプラスミドを作製した。GenBank寄託番号＃MZEZEIN27に基づいて設計されたプライマーを用いて、ガンマゼインプロモーターをＷ２２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０２３５】
ｐＤＡＢ１４１６は、ＳａｃＩ−ＦｓｅＩ断片から現存するｐｅｒ５  ３’ＵＴＲを除去することによりＰｍｅＩ部位を欠失させたｐＤＡＢ６３４の修飾物である。その部位を直すよう設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅により、ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲからＰｍｅＩ部位を除去した。ＰｍｅＩはｐｅｒ５機能性配列の外側にあり、したがってこの部位の除去は素子の機能性を妨害しない。
【０２３６】
ｐＤＡＢ８５０４は、互いに対して逆配向で、そしてイネアクチン／ＰＡＴ／リパーゼ３’ＵＴＲカセットに側面を接するＲｂ７  ＭＡＲ、ならびに当該遺伝子の挿入のための多クローニング領域を含有するＭＡＲベクターｐ２５４−３の修飾物である。プラスミドｐＤＡＢ８５０４は、プラスミド主鎖におけるＦｓｐＩ部位の付加に関して以外は、本質的にｐ２５４−３である。ＦｓｐＩ部位を含有する９−ｂｐアダプターをＭＡＲベクター中のＳａｐＩ部位に挿入して、ＭＡＲベクターの主鎖領域中の3つのＦｓｐＩ部位の付加を生じた。これらのＦｓｐＩ部位を用いて、形質転換前に一塊にしたプラスミド調製物からアンピシリン耐性遺伝子を除去する。
【０２３７】
ｐＤＡＢ１４１４は、ＰｍｅＩで修飾してＰＴＵを欠失することによりイネアクチン／ＰＡＴ／リパーゼカセットが除去されたｐＤＡＢ８５０４の修飾バージョンである。
【０２３８】
抗体ベクター構築．  最終抗体プラスミドのアセンブリーを完成するためには、三クローニング過程、ならびに2つの中間ベクターの調製を必要とした。三クローニング過程を以下に示す：
１．ガンマゼインプロモーターとｐｅｒ５  ３’ＵＴＲとの間に抗体遺伝子をサブクローニングして、「ガンマゼイン／抗体カセット」を作成する（過程１ベクター）。
２．ＭＡＲ配列を含有するベクター中に抗体遺伝子＃１を含有する「ガンマゼイン／抗体カセット」をサブクローニングする（過程２ベクター）。
３．過程＃２で作製されたＭＡＲベクター中に抗体遺伝子＃２を含有する「ガンマゼインカセット」をサブクローニングする（過程３ベクター＝最終ベクター）。
【０２３９】
ベクターアセンブリーは、前記のように、ＨＣおよびＬＣに関するコドン最適化遺伝子を産生することで開始した。全てのベクターを一塊にして、主鎖プラスミドｐＤＡＢ１４１６中に独立してクローン化した。これらの中間ベクターの各々に、新規のプラスミド数を割り当てた（表３）。
【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
プラスミドｐＤＡＢ８５０５（図１５）は、逆配向ＭＡＲ配列（Ｒｂ７）と側面を接するｇｚ／ＨＣ／ｐｅｒ５：：ｇｚ／ＬＣ／ｐｅｒ５発現カセットを含有し、そしてプラスミドｐＤＡＢ２１０１は、ＭＡＲ：：ｇｚ／ＬＣ／ｐｅｒ５：：ｇｚ／ＨＣ／ｐｅｒ５：：ＭＡＲを含有する。プラスミドｐＤＡＢ８５０５を、同時形質転換と交雑戦略の両方で用いた。ベクター構築の詳細を、以下に記載する：
【０２４２】
ｐＤＡＢ１４１５は、ｇｚ／ＬＣ／ｐｅｒ５を含有するカセットを有する。この構築物を作り上げるために、ｐＤＡＢ１４１６中のＧＵＳ遺伝子をＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切り取って、これもＮｃｏＩおよびＳａｃＩでそのドナーベクターから切り取られたＬＣ遺伝子で置き換えた。
【０２４３】
ｐＤＡＢ１４１７は、ｇｚ／ＬＣ／ｎｏｓＡを含有するカセットを有する。この構築物を作り上げるために、ｐＤＡＢ１４１６中のＧＵＳ遺伝子をＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切り取って、これもＮｃｏＩおよびＳａｃＩでそのドナーベクターから切り取られたＬＣ遺伝子で置き換えた。
【０２４４】
ｐＤＡＢ８５０１は、ｇｚ／ＨＣ／ｐｅｒ５を含有するカセットを有する。この構築物を作り上げるために、ｐＤＡＢ１４１６中のＧＵＳ遺伝子をＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切り取って、これもＮｃｏＩおよびＳａｃＩでそのドナーベクターから切り取られたＨＣ遺伝子で置き換えた。
【０２４５】
ｐＤＡＢ８５０２は、ｇｚ／ＨＣ／ｎｏｓＡを含有するカセットを有する。この構築物を作り上げるために、ｐＤＡＢ１４１７中のＬＣ遺伝子をＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切り取って、これもＮｃｏＩおよびＳａｃＩでそのドナーベクターから切り取られたＨＣ遺伝子で置き換えた。
【０２４６】
ｐＤＡＢ８５０３は、ＭＡＲ／ｇｚ／ＬＣ／ｐｅｒ５：：イネアクチン／ＰＡＴ／リパーゼ：：ＭＡＲを含有するカセットを有する。この構築物を作り上げるために、ｐＤＡＢ１４１５からのｇｚ／ＬＣ／ｐｅｒ５カセットをＮｏｔＩで切り取って、ｐＤＡＢ８５０４のＮｏｔＩ部位に挿入した。
【０２４７】
ｐＤＡＢ８５０５（図５）は、2つの最終ベクターのうちの1つである。それは、ＭＡＲ：：ｇｚ／ＨＣ／ｐｅｒ５：：ｇｚ／ＬＣ／ｐｅｒ５：：イネアクチン／ＰＡＴ／リパーゼ：：ＭＡＲを含有するカセットを有する。この構築物を作り上げるために、ｇｚ／ＨＣ／ｐｅｒ５カセットをＮｏｔＩを用いてｐＤＡＢ８５０１から切り取って、その後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して、平滑末端を作製し、最終的にｐＤＡＢ８５０３のＳｒｆＩ部位に結繋した。
【０２４８】
最終プラスミドを大規模ＤＮＡ精製および断片精製に付して、アンピシリン遺伝子を除去した。約15 mgの各最終プラスミド（ａｍｐ断片を伴わない）が、形質転換に利用可能であった。
尾に関するコード配列を含まないベクターを作製することにより、無尾重鎖抗体も生成され得た。
【０２４９】
実施例４．アンピシリン耐性遺伝子の除去のための植物形質転換ベクターの大規模ＤＮＡ断片精製
上記のように、植物形質転換ベクターからのプラスミド主鎖配列の除去は、形質転換化植物材料がいかなる夾雑抗生物質耐性遺伝子も含有しないことを保証するために必要である。ＤＮＡ断片の大規模除去のためのゲルベースの戦略は、形質転換品質断片を産生するために有効な方法であったが、しかしながらその方法は労働集約的で、時間を要するものである。
【０２５０】
分離の第一過程は、ベクターから遺伝子構築物断片を切り取り、望ましくないＤＮＡ断片を考え得る最少単位まで下げるために制限酵素を用いることである。Ｆｓｐを用いて、Ａｍｐ断片を除去した。この戦略を用いて、アンピシリン耐性遺伝子含有領域を、それぞれ1023および1236 bpのサイズを有する2つの断片に分けた。
【０２５１】
総計で、34.8 mgを超えるａｍｐ無含有ｐＤＡＢ８５０５を産生した。産生されたＤＮＡ断片の各バッチに関する制限消化を用いて品質制御を実施して、調製物中に残存する親プラスミドまたは部分消化断片が存在しないことを保証した。ＰＣＲ増幅を用いて、送達前に、プロセッシングされたＤＮＡ断片の純度を確定した。全体的純度は、約98％〜約99.5％の範囲であった。ほとんどの場合、約99％またはそれ以上の純度を達成した。ＦＰＬＣベースの技法は、ゲル精製プロトコールよりコスト効率が高い。
【０２５２】
ＦＰＬＣ包装セファクリルＳ−1000カラムを用いた大規模ＤＮＡ断片分離方法．  一定速度でＦＰＬＣ系を用いて、セファクリルＳ−1000で2.6/100 cmカラムを包装した。150 mMＮａＣｌを補足したＴＥ緩衝液を濾過媒質予備洗浄およびカラム包装、ならびにＤＮＡ溶離のために用いた。2 mg（1 mg/mL）のＦｓｐＩ消化ｐＤＡＢ３０１６ＤＮＡをカラムに投入した。総計500 mLの溶離液を8 ｍ／収集管で収集した。
【０２５３】
溶離工程を、260、280および320 nmでモニタリングした。分離の結果を検査するために、各収集からの20 μLのアリコートをアガロースゲル上に載せた後、電気泳動処理した。
100 bp〜12 kbの範囲のサイズを有するＤＮＡ断片を含有する1 kb＋ＤＮＡはしごを試験した。結果は、7 kbまたはそれ以上のサイズを有するＤＮＡ断片が一般的手法で1.0および1.2 kbアンピシリン耐性断片から分離され得る、ということを示唆した。
【０２５４】
再現可能性を改良し、さらに分離効率を増強するために、いくつかの因子、例えばＤＮＡ予熱温度および持続時間、1回投入当たりのＤＮＡ量、ならびに継続使用後のカラム性能の安定性を試験した。55℃で15〜20分間の前処理は、最良の解決のために最も望ましい（即ち最良の分離効率）、ということを見出した。さらに、カラムは、3〜4回連続使用後に再状態調節すべきである、ということを確定した。25 ml（25 mg）という高量をカラムに投入し得るが、しかし断片回収効率はＤＮＡ投入増大に伴って低減した。約95％より多いＤＮＡ断片が、2 mgＤＮＡ投入で回収され得た。しかしながらこの回収率は、投入されたＤＮＡの量が5 mgに増大すると、約70％に低下した（表４）。3 mg投入レベルが、用いられる典型的規模であり、これは第1回のカラム精製において約85％の平均回収率を示す。結果は、ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーが、トウモロコシ形質転換前にプラスミドからアンピシリン遺伝子断片を回収するための有効な技法である、ということを示す。
【０２５５】
【表６】
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【０２５６】
実施例５．定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による導入遺伝子コピーの概算
直接ＤＮＡ送達法により生成される大多数のトランスジェニック事象が、複雑な挿入パターンを示す。これらの多コピー挿入は、品種改良を漸増的に困難にし、そしてサイレント事象の頻度増大ももたらす。したがって、形質転換過程の早期段階でこれらを排除すべきである。導入遺伝子挿入／多難は通常は、サザンブロット分析により確定される。しかしながらこの方法は、高処理量分析法に適合するためには、むしろ労働集約的で、時間が掛かり、実行可能でない。これらの問題を回避するために、コピー数の迅速な概算を提供する技法を用いて、事象を弁別し、工程の早期に廃棄した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が開発され、そしてＨＳＶ構築物に関する導入遺伝子コピー数を予測するために履行されてきた。
【０２５７】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）．  定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、トランスジェニックトウモロコシカルスの導入遺伝子コピー数を概算するための効率的方法であることが立証された。
ＡＯおよびＩＭＴ遺伝子を用いたこの技法の妥当性は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより概算されたコピー数およびサザンブロット分析により確定された挿入帯域が非常に密接に且つ高度に相関する、ということを示した。
【０２５８】
ｐＤＡＢ８５０５（ＨＣ＋ＬＣ＋ＰＡＴ）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲ分析の妥当性を実行した。2つの遺伝子、即ちＨＣおよびＬＣの各々の2対のプライマーを設計し、レギュラーＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲの両方を用いて試験した。ＨＳＶトランスジェニックトウモロコシカルスにおける導入遺伝子コピー数を概算するために、ＬＣのみをｐＤＡＢ８５０５事象に関して分析した。
【０２５９】
ｑＲｔ−ＰＣＲの再現可能性も試験した。この方法は、高度に再現可能であることが判明した。異なる研究者によりまたは単一研究者により数回得られた概算コピー数は、非常に密接に且つ高度に相関した。したがって、異常データが観察されない限り、分析の再現は必要でないことが判明した。さらに低コピー数および高コピー数を用いた事象の不均一分布が観察された。これは、事象のクローンが多単離物として存在し得る、ということを示唆する。
【０２６０】
実施例６．トウモロコシ種子における単量体ＩｇＡ産生のための形質転換
WHISKERSTM形質転換法を用いたｐＤＡＢ８５０５による直接ＤＮＡ送達により、トウモロコシ近交系「Ｈｉｌｌ」の植物細胞を処理した（Song et al., Plant Cell Reporter 20: 948-954 (2002)）。利用した「小規模」WHISKERSTM法は、一度に約2 mlのパックした植物細胞を処理し得た。分析した541カルス事象のうち、約67％（360/541）が5コピーより多い転写物を有し；約5％（29/541）が5コピーを有し；約5％（27/541）が4コピーを有し；約6％（33/541）が3コピーを有し；約8％（45/541）が2コピーを有し；約7％（36/541）が1コピーを有し；そして約2％（11/541）が0コピーを有した。126事象を示す総計871の植物を再生し、温室に移して、成熟するまで生育させた。
【０２６１】
種子産生．  抗ＨＳＶ形質転換化植物を5ガロン鉢に植えて、近交系とうもろこし「ＯＱ４１４」で受粉させて、子孫種子を産生し、これを、抗体産生に関して分析した。
除草剤耐性ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択可能マーカーであることは、フィールド試験ならびにin plantaでの形質移入交雑活性における重要なツールである。除草剤耐容性に関する葉ペイント試験を、それらが5ガロン鉢中で確立された後、陽性対照（４ＸＨ７５３）および陰性対照（ＨｉＩＩＦ１）とともに、全ての植物に関して実施する。プロトコールは、10 μLの2.0％Finale（商標）溶液（1インチ平方）／植物を葉の先端から20 cm上に適用することを包含する。結果は、４ＸＨ７５３植物が明らかに感受性であるということ、そしてＨｉＩＩＦ１植物が除草剤に対する耐容を生じた、ということを実証した。1つを除いて抗ＨＳＶ形質転換化植物は全て、耐性であった。
【０２６２】
要するに、形質転換されたと思われる植物に、2％Finale（商標）をペイントし、除草剤に対して耐性の植物を、さらなる再現および特性化のために選択した。全ての抗ＨＳＶ植物の葉試料も、サザン分析に用いるために収集した。
【０２６３】
実施例７．トウモロコシ内胚乳におけるタンパク質分析
ＨＣ／ＬＣ形質転換体．  ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ非還元ウエスタンブロットにより、γ−ゼイン／ＨＣ／ＬＣ構築物（ｐＤＡＢ８５０５）に関して、Ｔ1種子を分析した。この方法も、試料重量および抽出物中の総抽出可能タンパク質を確定することを要した。事象用に少なくとも25個の種子を産生する場合、分析のために事象を選択した−10〜20粒を、それぞれ低および高種子数事象に関して試験した。検査のために1または2穂ファミリーから、粒を選択した。穂ファミリーは、単一受粉穂の子孫である。
【０２６４】
非破壊的に種子から試料を削り取って、発芽陽性種子のオプションを保存した。ＩｇＡ単量体の重鎖を捕獲し、軽鎖を検出するよう、ＥＬＩＳＡを意図した。これらの事象の全てに関して用いた標準は、ｓＩｇＡ抗体（U.S. BiologicalからのＩ１８９０−１０）であった。
【０２６５】
ウエスタン分析は、発現事象の全てが非集合化または分解重鎖および軽鎖とともに集合化ＩｇＡ単量体を産生する、ということを示した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析の両方が陽性結果を生じた場合、種子は陽性であると考えられた。試験した粒内で観察されたタンパク質発現および分離比に基づいた方面に進行するよう、事象を推奨した。
【０２６６】
総計930の個々の種子を、ｐＤＡＢ８５０５構築物に関して分析し、試験するために十分に高い種子数を有する66事象を示した。要するに、33事象（50％）が好ましい発現および分離データに基づいて進められた。発現は、問題、例えば分離不良データを有した別の8事象（12％）に関して見出され、25事象（38％）はＩｇＡを発現しないことが見出された。
【０２６７】
実施例８．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるトウモロコシ中で発現された単量体ＩｇＡ−ＨＸ８のＡｓｎ−２６９（アルファ重鎖のＣＨ２領域）のオリゴ糖プロフィール
単量体ＩｇＡ−ＨＸ８のグリカン分析に用いた典型的手法を以下に記載する。
還元／アルキル化ＩｇＡ−ＨＸ８のトリプシン消化物．  100 μgのアフィニティー精製ＩｇＡ−ＨＸ８を、顕微遠心管中の遠心蒸発器中で乾燥した（0.6 mL、低タンパク質結合）。6 M塩酸グアニジンおよび0.4 M重炭酸アンモニウムを含有する100 μLのタンパク質溶解緩衝液中にペレットを再懸濁した。10 μLの0.1 MＤＴＴの付加により試料を還元し、65℃で1時間インキュベートした。還元後、0.2 Mヨードアセトアミド20 μLの付加によりタンパク質試料をアルキル化し、暗所で室温で2時間インキュベートした。0.1 MＤＴＴ40 μLの付加によりアルキル化反応を停止させて、室温で30分間インキュベートした。次にメーカーの手法に従って、逆相カートリッジ（Protein Macro Trap, Michrom Bioresources）を用いてタンパク質を脱塩し、150μL の80％アセトニトリル／0.2％ＴＦＡで、次に100％アセトニトリル／0.2％ＴＦＡで溶離して、溶離タンパク質を遠心蒸発器中で乾燥した。脱塩還元／アルキル化タンパク質を消化緩衝液（100 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.5）50 μL中に再懸濁して、トリプシン（シーケンシング等級、Roche）の溶液を、1:100のトリプシン：タンパク質比で付加した。試料を37℃で16時間インキュベートした。次にトリプシン消化物を−20℃で貯蔵した後、さらなる過程を実施した。
【０２６８】
（代替的）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離されたＩｇＡ−ＨＸ８重鎖のゲル中トリプシン消化物．  70〜100 μgのＩｇＡ−ＨＸ８を遠心蒸発器中で乾燥し、1:19 v/vμ−メルカプトエタノールを含有する120 μLのLaemmli試料緩衝液（Bio-Rad）中にペレットを再懸濁し、その結果生じたよう液を95℃で10分間加熱した。その結果生じた還元および変性ＩｇＡ−ＨＸ８試料を4〜20％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-Rad）（6レーン、20 μL／レーン）に載せて、ゲルを60 mA一定電流で約1時間走行させた。ゲルを、クーマシーブルー染色で染色した。〜50 kDaでのＩｇＡ−ＨＸ８重鎖に対応する帯域をゲルから切り出して、脱染緩衝液（50％アセトニトリル、50％重炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ8.5）で脱染した。脱染ゲル片を遠心蒸発器中で乾燥し、トリプシンの溶液（25 mM重炭酸アンモニウム、ｐＨ8.5中に31.25 μg/mL）で再水和した。試料を37℃で16時間インキュベートした。400 μLの50％アセトニトリル／1％ＴＦＡ、次に400 μLの70％アセトニトリル／25％の25 mM重炭酸アンモニウム緩衝液／5％蟻酸を用いて、トリプシンペプチドをゲルから抽出した。抽出物を併合し、濾過して、遠心蒸発器で乾燥した。その結果生じた単離トリプシンペプチドをＣ１８カートリッジ（Peptide Macro Trap, Michrom Bioresources）で脱塩し、遠心蒸発器で乾燥した後、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼＡ（ＰＮＧアーゼＡ）で消化した。
【０２６９】
（代替的）ペプシンによるＩｇＡ−ＨＸ８の消化．  25 μgのアフィニティー精製ＩｇＡ−ＨＸ８を、200 μLの20 mM酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ3.5中に再懸濁した。10 μLのペプシン（Roche）溶液（10 mMＨＣｌ中2 mg/mL）をタンパク質試料に付加し、試料を37℃で16時間インキュベートした。1 MＮａＯＨ5 μLの付加により反応を停止させて、95℃で30分間加熱して、ペプシンを完全に不活性化した。試料を遠心蒸発器で乾燥して、50 μLの20 mM酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ5.0中に再懸濁した後、ＰＮＧアーゼＡを付加した。
【０２７０】
Ｎ−結合オリゴ糖の酵素的放出．  タンパク質分解性ペプチド（トリプシンまたはペプシンによる消化後の全消化物、またはＲＰ−ＨＰＬＣにより単離されたトリプシン糖ペプチド）を5〜50 μLの20 mM酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ5.0中に溶解し、5〜10 μLのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＡ溶液（ＰＮＧアーゼＡ、Roche）を付加した。試料を37℃で16時間インキュベートした。
【０２７１】
タンパク質分解性ペプチドからの放出オリゴ糖の単離．  タンパク質分解性／ＰＮＧアーゼ−Ａ消化物をＣ１８カートリッジ（Peptide Macro Trap, Michrom Bioresources；メーカーの手法に従って予備状態調節）に通して、フロースルー分画を収集した。カートリッジを0.5 mLの0.1％水性ＴＦＡで洗浄し、洗浄液を一次フロースルー分画と併合した。放出オリゴ糖を含有するこれらの分画を、メーカーの手法に従って多孔性グラファイト炭素カートリッジ（ＰＧＣ）（GlycoClean-H, Glyko）を用いてさらに精製した。50％アセトニトリル／0.1％ＴＦＡを用いて、ＰＧＣカートリッジからオリゴ糖を溶離し、遠心蒸発器中で乾燥を完了した。グリカン試料を2.5 μLの高純水中に再溶解し、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（Millipore）に通した。メーカーの手法に従って、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓを予備状態調節した。次に精製グリカン試料を、ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔによる分析のために用意した。
【０２７２】
トリプシンペプチドの液体クロマトグラフィー分離．  約100 μgのアフィニティー精製ＩｇＡ−ＨＸ８に起因するトリプシンペプチドを、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーにより分離した。MagicＣ１８（内径2 mm×長さ150 mm）（Michrom Bioresources）およびPerkin Elmer２００ＬＣ系を分離のために用いた。分離のために0.5 mL／分の一定流速を用いた。100〜120 μLのトリプシン消化物混合物を注入した。以下の勾配を用いて、ペプチドの分離を成し遂げた：100％溶媒Ａ（3％アセトニトリル／0.06％ＴＦＡ）イソクラティック、10分、0〜50％溶媒Ｂ（80％アセトニトリル／0.05％ＴＦＡ）165分、50〜100％溶媒Ｂ、10分。次にカラムを100％溶媒Ｂで2分間洗浄し、次に100％溶媒Ａ中に再平衡させて、100％溶媒Ａで5分間洗浄した。室温で分離を実施した。205 nmでのＵＶ吸光度により、ペプチドの溶離をモニタリングした。2 mL分画をシリコン処理顕微遠心管中に収集し、分離後に遠心蒸発器中で乾燥した。ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔによる分析前に、最初の4つの分画を、メーカーの手法に従ってＣ１８  ＺｉｐＴｉｐ（Millipore）を用いて脱塩した。分画の残りを2 μLの50％アセトニトリル／0.1％ＴＦＡ中に再溶解し、各分画中の材料1 μLをＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔにより検査した。
【０２７３】
放出Ｎ−結合オリゴ糖のＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ．  Reflectronモードで操作される質量分光計のVoyager ＤＥ−ＳＴＲ（Applied BioSystems）ＭＡＬＤＩ−Ｔを用いた。加速電圧を20 kVに設定した。格子電圧を、加速電圧の69％に設定した。遅延時間を215 nsecに設定した。レーザー設定は約3000であった。各スペクトルでの平均獲得物を500とした。以下の標準オリゴ糖で、質量スケールを較正した：（ＧｌｃＮＡｃ）2（Ｍａｎ）5、m/z（ＭＮａ+）＝1257.46；（ＧｌｃＮＡｃ）4（Ｍａｎ）3（Ｆｕｃ）、m/z（ＭＮａ+）＝1485.56；（Ｇａｌ）（ＧｌｃＮＡｃ）4（Ｍａｎ）3（Ｆｕｃ）、m/z（ＭＮａ+）＝1647.62；（Ｇａｌ）2（ＧｌｃＮＡｃ）4（Ｍａｎ）3（Ｆｕｃ）、m/z（ＭＮａ+）＝1809.68。精製グリカンの試料1 μLをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させ、1 μLのｓＤＨＢマトリックス（66％アセトニトリル中の18 mg/mLの２，５−ジヒドロキシ安息香酸と66％アセトニトリル中の15 mg/mLの２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸の9:1 v/v混合物）で被覆し、風乾した。
【０２７４】
ペプチドのＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ．  Reflectronモードで操作される質量分光計のVoyager ＤＥ−ＳＴＲ（Applied BioSystems）ＭＡＬＤＩ−Ｔを用いた。加速電圧を20 kVに設定した。格子電圧を、加速電圧の66％に設定した。遅延時間を215および350 nsecに設定した。レーザー設定は2000〜2500の間で変化した。各スペクトルでの平均獲得物を500とした。以下の標準ペプチド（Applied BioSystems）で、質量スケールを較正した：des−ＡｒｇI−ブラジキニン、m/z  904.4；アンギオテンシンＩ、m/z  1,296.6；ＧｌｕI−フィブリノペプチドＢ、m/z  1570.6；ニューロテンシン、m/z  1672.9；ＡＣＴＨ（クリップ１〜１７）、m/z  2093.0；ＡＣＴＨ（クリップ１８〜３９）、m/z  2465.1；ＡＣＴＨ（クリップ７〜３８）、m/z  5730.6；。精製ペプチドの試料1 μLをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させ、1 μLのＣＨＣＡマトリックス（α−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸）で被覆し、風乾した。
【０２７５】
ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔデータの分析．  データ・エクスプローラｖ4.0ソフトウエア（Applied BioSystems）を用いて、ＭＳデータを分析した。ペプチドおよび糖ペプチド：MassLynx  ｖ3.4ソフトウエア（Micromass）を用いて、分子量およびアミノ酸配列をＩｇＡ−ＨＸ８の配列に帰属させた。オリゴ糖：home-writtenソフトウエア（The Dow Chemical Company）を用いて、オリゴ糖の質量スペクトルを解明した。
【０２７６】
実施例９．ＥＳＩ−ＭＳによるＮ２６９（ＩｇＡアルファ重鎖のＣＨ２領域）トウモロコシＨＸ８事象８１（自己）のグリカンプロフィール
トウモロコシＨＸ８の精製
工程１．      トウモロコシ内胚乳の粉末を生成
生成物１．    トウモロコシ内胚乳の粉末
工程２．      1×ＰＢＳ、室温で1時間撹拌
生成物２．    抽出スラリー
工程３．      5000×gで15分間遠心分離
生成物３．    粗製トウモロコシ抽出物
工程４．      0.22 μmＣＡ微量濾過
生成物４．    濾過トウモロコシ抽出物
工程５．      アフィニティー精製（オーバーフローを検査；ない場合には、廃棄する）
生成物５．    精製ＨＸ８−ＩｇＡ抗体。
【０２７７】
アフィニティーカラム調製物−ＰＯＲＯＳマトリックス上での抗体固定
カラムを調製して、ＰＯＲＯＳ20樹脂（Applied BioSystems）2 mlを15 ml円錐管中で混合する。樹脂を緩衝液（10 mMリン酸塩、0.15 MＮａＣｌ、ｐＨ7.2）ですすぎ、8 mgの各ポリクローナルＩｇＧヤギ抗ヒトＩｇＡおよびポリクローナルＩｇＧヤギ抗ヒトκ（ともにSouthern Biotechから）を付加し、室温で30分間反応させる。次にＡｂ−樹脂混合物を15 mlの1×ＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水：137 mMＮａＣｌ；2.7 mMＫＣｌ；10 mMＮａ2ＨＰＯ4；2 mMＫＨ2ＰＯ4；ｐＨ7.4）ですすいだ。次に15 mlの架橋溶液（10 mlの100 mMトリエタノールアミン、ｐＨ8.5および117 mgのジメチルピメルイミデート）の付加により抗ＩｇＡ抗体を樹脂と架橋し、静かに振盪しながら1時間インキュベートした。遠心分離により、架橋溶液を除去した。5 mlのモノエタノールアミン（100 mM、ｐＨ9.0）の付加により反応を停止させて、静かに振盪しながら、室温で30分間インキュベートした。次に、15 mlの1×ＰＢＳでスラリーを反復洗浄した。次にアフィニティー樹脂をカラム（2.1×75 mM）中に重力装填した。
【０２７８】
トランスジェニックトウモロコシの抽出．  5 gのトウモロコシ粒の胚芽を除去し、平均粒子サイズ150 μmに粉砕して、50 mlの1×ＰＢＳに付加した。抽出スラリーを室温で1時間、静かに撹拌した。次にスラリーを遠心分離（5000×gで15分間）して、上清を回収した。上清を濾過（0.22 μm）した後、アフィニティー精製した。
【０２７９】
アフィニティーカラム精製条件．  ＵＶ280 nmでモニタリンした場合に安定ベースラインが観察されるまで、1×ＰＢＳ（ｐＨ7.4）を用いて1 ml/分で、抗−α／抗−βアフィニティーカラムを予備平衡させた。抗体を含有する上清（45 ml）を、0.5 ml／分の流量でカラムに適用した。次にカラムを10カラム容積の1×ＰＢＳで洗浄したが、この場合、安定ベースラインが再び観察された。5 ml分画を収集しながら、12カラム容積のグリシン（100 mM、ｐＨ2.5）を用いて、カラムからＩｇＡを溶離した。溶離過程前に、各分画管は、500 μlの中和緩衝液（1 Mトリス−ＨＣｌ、ｐＨ9.0）を含入した。次にカラムを10カラム容積の1×ＰＢＳで再平衡させた。280 nmでのＵＶ吸光度により、ＩｇＡ含有分画を定量した。
【０２８０】
ＨＸ８の逐次トリプシンおよびアスパラギン酸−Ｎ消化物．  250 μlのアフィニティー精製ＩｇＡ中の50 μgを微量遠心管（1.7 ml低タンパク質結合緩衝液）中で遠心真空乾燥した。ペレットを35 μlのタンパク質溶解緩衝液（7.5 mlの8 M塩酸グアニジン、316 mgの重炭酸アンモニウム、ｐＨ7.8、水で最終容積10 mlに希釈）中に再懸濁した。1.75 μlのＤＴＴ（1 M）の付加により再懸濁試料を還元し、75℃で40分間インキュベートした。還元後、管を室温に冷却させた。4.2 μlのヨードアセトアミド（1 M、1 NＮａＯＨ中に調製）の付加により試料をアルキル化した。暗所で室温で40分間、アルキル化反応を実施した。1 μlのＤＴＴ（1 M）の付加によりアルキル化反応を停止させた。Ｃ１８カートリッジ（Michrome Protein Macro Trap, Michrom Bioresources, Inc.）上で試料を脱塩し、250μl の溶離緩衝液（アセトニトリル、0.1％ＴＦＡ）で溶離した。溶離還元−アルキル化試料を遠心真空乾燥した。その結果生じたペレットを、20 μlトリプシン消化緩衝液（100 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.1、10 mMＣａＣｌ2）中に再懸濁した。トリプシン（シーケンシング等級、Promega）を、1:100（トリプシン：試料）で付加し、37℃で16時間インキュベートした。混合物を95℃で3分間加熱して、反応を停止させた。アスパラギン酸−Ｎプロテアーゼ（1:100比の酵素：基質、Roche）による逐次消化のために、10 μlのトリプシン消化物を除去した。Ａｓｐ−Ｎ反応混合物を、30℃で20時間インキュベートした。
【０２８１】
トリプシンおよびトリプシン＋Ａｓｐ−Ｎペプチドの脂質クロマトグラフィーおよびナノエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分光分析．  逆相Ｃ１８クロマトグラフィー（MagicＣ１８（内径2 mm×長さ150 mm、Michrom Bioresources））により、約16 pmol（1 μl）のトリプシンまたはトリプシン＋Ａｓｐ−Ｎペプチド断片を分離した。毛管ＨＰＬＣ（Agilent）を内径50 μmの管を通して垂直になるよう調整し、分離のために0.3 ml／分の流速を用いた。0％溶媒Ａ（0.05％ＴＦＡ）イソクラティック、10分、その後、40％溶媒Ｂ（アセトニトリル+0.04％ＴＦＡ）165分の勾配を用いて、ペプチドの分離を成し遂げた。次に勾配を50％溶媒Ｂ、15分に増大し、カラムクリーニングのために50％で20分間保持した。カラム温度を35℃に保持して、215 nmでのＵＶ吸光度により、そしてエレクトロスプレーイオン化質量分光計により、ペプチドをモニタリングした。
【０２８２】
ナノスプレーイオン源（New Objective, Inc., Woburn, MA）を装備したFinniganＬＣＯTMＤｅｃａイオントラップ質量分光計（San Jose, CA）で、ナノ−エレクトロスプレーイオン化質量分光分析（ＮＥＳＩ）を実施した。    3 μl／分の流量に関して1.3〜1.8 kVの電位差で、エレクトロスプレーイオン源を操作した。毛管電圧42ボルトおよび管レンズオフセット10ボルトで、135℃の温度でＮＳＩ源を操作した。全ＭＳ標的8×107、Ｍｓｎ標的6×107、およびズーム標的3×107で、自動利得制御を設定した。シグナル閾値をモニタリングする自動ＬＣ／ＭＳ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳモードで、ＬＣ  ＮＥＳＩ−ＭＳおよびＬＣ  ＮＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを作動させて、閾値判定基準を超えた場合には、基本ピークでＭＳ／ＭＳを実施した。イオントラップパラメーターを以下のように用いた。全実験に関して自動利得制御を用いて、トラップを作動させた。このモードでは、系はトラッピングパラメーターを自動的に選択して、トラップ中に存在するイオンを一定存在値に保持する。収集された「マイクロスキャン」の数は、全ＭＳおよびＭＳ／ＭＳに関してはそれぞれ3および2であった。ＭＳ／ＭＳシグナルに関しては、標準化衝突エネルギーは35％に設定し、活性化Ｑは0.250であった。
【０２８３】
ペプチドおよび糖ペプチド割り当て．  ＧＰＭＡＷ（Lighe House Data, Version 5.01）およびBioWorkソフトウエア（ＬＣＱ  Ｄｅｃａを用いて供給）を用いて、分子量およびアミノ酸配列をＨＸ８ＩｇＡに帰属させた。
Ｎ２６９のトリプシン＋Ａｓｐ−Ｎペプチドの配列（モノイソトピック）
ＭＨ＋            1948.01
Ｍ２Ｈ＋           974.51
Ｍ３Ｈ＋           650.01
配列      DLLLGSEANLTCTLTGLR（配列番号２０）
【０２８４】
【表７】
2006517392.tif 000009
【０２８５】
実施例１０．植物において産生されるＩｇＡ抗ＨＳＶ抗体のグリカン構造
図６は、還元およびアルキル化ＩｇＡ−ＨＸ８のトリプシン消化物の代表的Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラムを提示する。図７は、還元およびアルキル化ＩｇＡ−ＨＸ８のトリプシン消化により生成されたＩｇＡ−ＨＸ８  ＨＣの糖形態のＨＣ−Ｔ１３ペプチドの代表的質量スペクトルのＭＡＬＤＩ−Ｔを提示する。ＩｇＡ−ＨＸ８の糖形態のＨＣ−Ｔ１３ペプチドの不均質性は、グリカンの酵素的放出（ＰＮＧアーゼ−Ａ）により除去される（図８）。図９に示したように、トウモロコシ発現ＩｇＡ−ＨＸ８  ＨＣの2つの付加的糖形態のＨＣ−Ｔ１３が観察される。図１０は、ＩｇＡ−ＨＸ８から酵素的に放出された遊離Ｎ−結合グリカンの代表的ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔプロフィールを提示する。
【０２８６】
表６は、ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔによる、トウモロコシ（事象193自己）中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８の軽鎖に関して観察されたペプチドトリプシン断片を提示する。総ペプチド質量適用範囲は100％である。「Ｌ」＝ＬＣ。
【０２８７】
【表８】
2006517392.tif 000010
【０２８８】
表７は、質量スペクトルのＭＡＬＤＩ−Ｔによる、トウモロコシ（事象193自己）中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８の重鎖に関して観察されたペプチドトリプシン断片を提示する。総ペプチド質量適用範囲は93.8％である。「ＮＤ」＝検出されず、ならびに「Ｈ」＝ＨＣ。
【０２８９】
【表９】
2006517392.tif 000011
【０２９０】
【表１０】
2006517392.tif 000012
【０２９１】
【表１１】
2006517392.tif 000013
【０２９２】
図１２は、質量スペクトルのＭＡＬＤＩ−Ｔの結果に基づいてトランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８に関して同定された示唆された推定グリカン構造を提示する。ＩｇＡ−ＨＸ８から酵素的に還元された遊離グリカンの質量スペクトルのＭＡＬＤＩ−Ｔにおける対応するイオンの強度を用いて、グリカン種の存在度を概算した。図１６は、トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）を提示する。
【０２９３】
実施例１１．内胚乳由来ＨＸ８によるＨＳＶ−２の中和
トランスジェニックトウモロコシ種子を粉砕して、内胚乳を単離した。内胚乳を微粉末に粉砕して、抗体を0.15 MＰＢＳ中に溶解した。内胚乳抽出物を含有する粗製ＨＸ８を低速遠心分離により清澄化し、ヤギ抗ヒトＩｇＡアフィニティーカラムを用いてアフィニティー精製した。内胚乳抽出物を、ＨＳＶ−２を中和するそれらの能力に関して試験した。
【０２９４】
ＨＳＶ−２ウイルスストックの190プラーク形成単位／ウエルを、内胚乳由来ヒトモノクローナル抗体ＨＸ８の連続希釈液とともに、96ウエルフォーマットで37℃、5％ＣＯ2で1時間、インキュベートした。Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, Ohioから市販されているＥＬＶＩＳ  ＨＳＶ細胞を用いて、プレ−ＣＰＥ検定を用いて、ＨＸ８抗体の中和活性を測定した。Ｇ４１８抗生物質耐性マーカーを含有するプラスミド、ならびにＨＳＶリボヌクレオチドレダクターゼの大型サブユニットであるＩＣＰ６をコードするＨＳＶ−１ＵＬ３９遺伝子からの誘導ＨＳＶプロモーターの後に配置された大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドで同時トランスフェクトされたハムスター乳仔腎細胞（ＢＨＫ）から、この細胞系統を得た（E.C. Stabell and P.D. Olivo, “Isolation of a Cell Line for Rapid and Sensitive Histochemical Assay for the Detection of Herpes Simplex Virus,” J. Virological Methods 38: 195-204 (1992)）。ＥＬＶＩＳ  ＨＳＶ細胞単一層を96ウエルフォーマット中に入れて、37℃、5％ＣＯ2で24時間、抗体−ウイルス接種物に感染させた。上清を除去し、細胞を、Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, Ohioから購入したＥＬＶＩＲＡ溶解緩衝液で溶解させた。Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, Ohioから購入したＥＬＶＩＲＡ検出緩衝液を付加することにより、β−ガラクトシダーゼ活性を検出した。ＨＳＶ感染のレベルに対応するspectrophometerＯＤ５７０により、β−ガラクトシダーゼの濃度を検出した。ＨＸ８により中和されたウイルスのパーセントを、抗体−陰性対照のパーセンテージとして算定した。この検定を用いて得られた結果（図１１にも含まれている）は、所定のウイルス濃度で、抗体がウイルスを1 μg/mlで完全に中和することを示す。
【０２９５】
ＩＩ．抗二重インテグリン抗体の植物産生に関する例
本明細書中に記載した場合を除いて、上に詳述した基本実験プロトコール、例えばプラスミド構築に関連するもの（実施例１および２）、ベクター構築（実施例３および４）ならびに形質転換および再生（実施例６）の全てを用いて、植物細胞、植物カルスおよび全植物体において、ＩｇＧの抗体を産生した。このような方法を用いて産生されたＩｇＧ抗体の分子および生化学的分析を、実施例５および７〜１１に提示した基本プロトコールに従って確定した。
【０２９６】
実施例１２．ＩｇＧを産生するために利用されるプラスミドおよびベクター
これらの実験に利用される特定のＩｇＧは、抗αＶβ３、αＶβ５二重インテグリン抗体としても既知でアルインテグリン受容体αＶβ３およびαＶβ５に対して向けられるものである。
以下のプラスミドを利用した（「ＨＣ」＝重鎖；「ＬＣ」＝軽鎖）：
【０２９７】
【表１２】
2006517392.tif 000014
【０２９８】
実施例１３．ＩｇＧの植物細胞形質転換および再生
WHISKERSTM形質転換法を用いたｐＤＡＢ１４７２、ｐＤＡＢ１４７３、ｐＤＡＢ１４７４またはｐＤＡＢ１４７５による直接ＤＮＡ送達により、トウモロコシ近交系「Ｈｉｌｌ」の植物細胞を処理した。これらのプラスミドは、どの素子組合せが抗体の最高発現レベルおよび蓄積を生じるかを見るための「試験」として、抗体をコードする遺伝子の発現を作動するために用いられた調節素子において異なった。
【０２９９】
利用した「大規模」WHISKERSTM法は、一度に約18 mlのパックした植物細胞を処理する（Petolino et al., Molecular Methods of Plant Analysis, In Genetic Transformation of Plants, Vol. 23, pp. 147-158, Springer-Verlag, Berlin (2003)）。抗二重インテグリン形質転換化植物を植えて、抗体産生に関して分析される子孫種子を産生するよう、近交系「５ＸＨ７５１」により受粉させた。
【０３００】
実施例１４．ＩｇＧの導入遺伝子コピー数の概算
Third Wave Molecular DiagnosticsからのInvader（商標）検定プラットフォームを用いて、抗二重インテグリン構築物に関する導入遺伝子コピー数を予測した。この方法は、上記のＩＧＡプロトコールに用いたものと違って、ポリメラーゼというよりむしろ、ハイブリダイゼーション検定を基礎にしている。転写体の1〜2コピーを有する植物細胞を、さらなる試験のために再生した。
【０３０１】
実施例１５．精製ＩｇＧの還元およびカルボキシメチル化、ならびにその後のタンパク質分解
ＭＡＬＤＩ  ＭＳによる「無傷」タンパク質の質量の測定のために、25 μLの試料をアリコート化した。遠心蒸発器を用いて、残りのタンパク質溶液をシリコン処理微量遠心管中で完全に乾燥させた。180 μLのタンパク質溶解緩衝液（6 M塩酸グアニジン／0.4 M重炭酸アンモニウム、ｐＨ7.8）を乾燥タンパク質に付加し、試料をピペットでかき混ぜて混合して、完全溶解を達成した。20 μLの100 mMＤＴＴ（還元試薬）を試験管に付加した。
【０３０２】
試験管を密封し、渦巻き撹拌して、65℃で1時間インキュベートした。次にそれを室温に冷却し、30秒間遠心分離して、40 μLの200 mMＩＡＡ（アルキル化試薬）溶液を試験管に付加した。試験管を暗所で室温で1時間インキュベートした。ＤＴＴ60 μLを付加して、非反応ＩＡＡを消費させて、試験管を室温で30分間放置した。
【０３０３】
還元／アルキル化タンパク質試料の脱塩を、以下のように実施した。タンパク質トラップカートリッジ（Michrom Bioresources、カタログ番号004-25108-53）を2×500 μLの100％アセトニトリル（「ＡＣＮ」）／0.1％ＴＦＡで洗浄し、500 μLの2％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡで平衡させた。4 μLのＡＣＮおよび0.25 μLのＴＦＡを、還元／アルキル化タンパク質溶液に付加し（最終濃度を2％ＡＣＮおよび0.2％ＴＦＡとする）、溶液をタンパク質トラップカートリッジに投入した。還元／アルキル化タンパク質を含入する試験管を100 μLの2％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡですすぎ、すすぎ液をカートリッジに投入した。結合タンパク質を含有するタンパク質トラップカートリッジを500 μLの2％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡで洗浄した。脱塩タンパク質を、シリコン処理微量遠心管中で、400 μLの80％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡで溶離した。
【０３０４】
脱塩タンパク質試料を、以下のようにトリプシンで消化した。試料を遠心蒸発器中で完全に乾燥させて、100 μLの100 mMトリス緩衝液、ｐＨ8〜8.5中に再溶解した。50 μLのトリプシン溶液（Roche、カタログ番号1-418-025；消化手法の直前に、25 mMの重炭酸アンモニウムかんしょうえき0.5 mL中に25 μgを溶解した）を試験管に付加し、試料を37℃で16時間インキュベートした。消化後、試料を−20℃で貯蔵した後、ＨＰＬＣ分離および／またはＭＡＬＤＩ  ＭＳ分析に付した。
【０３０５】
実施例１６．ＩｇＧトリプシン消化物のＨＰＬＣ分別
系設定
ＨＰＬＣ系：日立ＬＣ（Ｌ−7100ポンプ、Ｌ−7200自動試料採取機、Ｌ−7420ＵＶ／Ｖｉｓ検出器）。
カラム：MagicＣ１８、内径2.0 mm×150 mm（Michrom Bioresources、カタログ番号901-61221-00）。
ＵＶ検出：205 nmで
自動注入器：200 μL試料ループ；注入容積100 Lを使用。
流量：0.5 mL／分、一定。
背圧：読取値は約2050〜2100 psi（100％Ａで）。
【０３０６】
移動相
Ａ：3％ＡＣＮ、97％Milli-Q水、0.006％ＴＦＡ。
Ｂ：80％ＡＣＮ、20％Milli-Q水、0.05％ＴＦＡ。
【０３０７】
【表１３】
2006517392.tif 000015
【０３０８】
1-MlＢ分画をシリコン処理微量遠心管中に収集し、分離後に遠心蒸発器中で分画を乾燥した。Gilson ＦＣ−203分画収集器を用いて、分画を収集した。
【０３０９】
実施例１７．酵素的脱グリコシル化（ＰＮＧアーゼＡ手法）
分離トリプシン消化物において、糖ペプチドを含有する分画をＭＡＬＤ  ＭＳにより同定した。これらの分画中の残りの材料（〜50％）を併合し、遠心蒸発器で乾燥して、10 μLの20 mM酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ5.0中に再溶解した。10 μLのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＡ（ＰＮＧアーゼＡ）溶液（Roche、カタログ番号1-642-995）を付加し、試験管を37℃で16時間インキュベートした。
【０３１０】
実施例１８．放出Ｎ−グリカンの精製
タンパク質分解性／ＰＮＧアーゼ−Ａ消化物をＣ１８カートリッジ（Peptide Macro Trap, Michrom Bioresources（カタログ番号004-25108-52）；メーカーの手法に従って予備状態調節）に通して、フロースルー分画を収集した。カートリッジを0.5 mLの0.1％水性ＴＦＡで洗浄し、洗浄液を一次フロースルー分画と併合した。放出オリゴ糖を含有するこれらの分画を、メーカーの手法に従ってＥ−カートリッジ（QA-Bio, カタログ番号Ｃ−Ｅ001、ロット番号Ａ２ＡＡ−01）を用いてさらに精製した。50％アセトニトリル／0.1％ＴＦＡを用いて、ＰＥ−カートリッジからオリゴ糖を溶離し、遠心蒸発器中で乾燥を完了した。グリカン試料を、メーカーの手法に従って、2.5 μLの高純度Milli-Q水中に再溶解し、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（Millipore）に通した。精製グリカン試料を、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによる分析のために用意した。
Ｃ１８カートリッジ上に捕獲された脱グリコシル化ペプチドを、100％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡで溶離し、遠心蒸発器で濃縮して、ＭＡＬＤ  ＭＳにより検査した。
【０３１１】
実施例１９．ＭＡＬＤ  ＭＳおよびＰＳＤ
陽性reflectronモードで操作される質量分光計のVoyager ＤＥ−ＳＴＲ（Applied BioSystems、シリアル番号4260）ＭＡＬＤＩ−Ｔを用いて、ペプチドおよびオリゴ糖（グリカン）に関するデータを得た。陽性線状モードで計器を操作して、無傷タンパク質に関するデータを得た。
【０３１２】
分離トリプシン消化物の最初の4つのＨＰＬＣ分画（）を、10 μLの0.1％ＴＦＡ中に溶解し、併合した；標準プロトコールに従って、Ｃ１８zip tipを用いて、ペプチドを脱塩した。残留ＨＰＬＣ分画を3 μLの50％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡ中に溶解し、いくつかの分画を併合した。各分画の50％（併合後）をＭＡＬＤＩプレート（1.5 μL中）上に沈着させて、1 μLのＣＨＣＡマトリックス溶液で被覆し、風乾した。糖ペプチドを含有することが判明した残りの50％の分画を、上記のようにＰＮＧアーゼＡでさらに処理した。
【０３１３】
ペプチドのＭＡＬＤＩスペクトルを得るために用いられる設定．  加速電圧を20 kVに設定した。格子電圧を、加速電圧の66％に設定した。遅延時間を215 および350 nsecに設定した。レーザー設定は2200〜3000で変化した。各スペクトルでの平均獲得物を500とした。以下の標準ペプチド（Applied BioSystems）で、質量スケールを較正した：des−ＡｒｇI−ブラジキニン、m/z  904.4；アンギオテンシンＩ、m/z  1,296.6；ＧｌｕI−フィブリノペプチドＢ、m/z  1570.6；ニューロテンシン、m/z  1672.9；ＡＣＴＨ（クリップ１〜１７）、m/z  2093.0；ＡＣＴＨ（クリップ１８〜３９）、m/z  2465.1；ＡＣＴＨ（クリップ７〜３８）、m/z  5730.6；。
mirror電圧比1.12を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤスペクトルを記録した；以下のmirror比を用いた：1、0.85、0.75、0.65、0.55、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05。
【０３１４】
オリゴ糖（グリカン）のＭＡＬＤＩスペクトルを得るために用いられる設定．  加速電圧を20 kVに設定した。格子電圧を、加速電圧の69％に設定した。遅延時間を215 nsecに設定した。レーザー設定は約3000であった。各スペクトルでの平均獲得物を500とした。
以下の標準オリゴ糖で、質量スケールを較正した：（ＧｌｃＮＡｃ）2（Ｍａｎ）5、m/z（ＭＮａ+）＝1257.46；（ＧｌｃＮＡｃ）4（Ｍａｎ）3（Ｆｕｃ）、m/z（ＭＮａ+）＝1485.56；（Ｇａｌ）（ＧｌｃＮＡｃ）4（Ｍａｎ）3（Ｆｕｃ）、m/z（ＭＮａ+）＝1647.62；（Ｇａｌ）2（ＧｌｃＮＡｃ）4（Ｍａｎ）3（Ｆｕｃ）、m/z（ＭＮａ+）＝1809.68。精製グリカンの試料1 μLをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させ、1 μLのｓＤＨＢマトリックス（66％アセトニトリル中の18 mg/mLの２，５−ジヒドロキシ安息香酸と66％アセトニトリル中の15 mg/mLの２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸の9:1 v/v混合物）で被覆し、風乾した。
【０３１５】
無傷タンパク質のＭＡＬＤＩスペクトルを得るために用いられる条件．  計器を陽性線状モードで操作した。加速電圧を25 kVに設定した。格子電圧を、加速電圧の89％に設定した。抽出遅延時間は750〜1500 nsecで変化した。レーザー設定は約3300であった。低質量ゲートを5000 Daに設定した。各スペクトルでの平均獲得物を500を2組とした。
以下の標準（Sequazyme ＩｇＧ１、Applied BioSystems、カタログ番号GEN602151）で質量スケールを較正した：二重荷電Sequazyme ＩｇＧ１単量体、m/z 74249；単一荷電Sequazyme ＩｇＧ１単量体、m/z 148500。
【０３１６】
以下の手法を用いて、質量分光分析前に、タンパク質試料を脱塩した。Ｃ４zip-tip（Millipore）を50％ＡＣＮでプライムし、次に0.1％ＴＦＡで平衡させた。タンパク質試料のアリコートをzip-tipに10回通して、次に、消費溶液を元のバイアルに戻した。zip-tipを結合タンパク質とともに0.1％ＴＦＡで洗浄し、ＭＡＬＤＩプレート上で直接（滴下）、3 μLの80％ＡＣＮ／0.1％ＴＦＡでタンパク質を溶離した。脱塩タンパク質試料を1 μLのマトリックス（シナピン酸（Sequazymeキットから）、Applied BioSystems、カタログ番号P2-3143-00）で覆い、風乾した。
【０３１７】
ＭＡＬＤ  ＭＳデータの分析．  データ・エクスプローラｖ4.0ソフトウエア（Applied BioSystems）を用いて、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＰＳＤデータを分析した。MassLynx  ｖ3.4ソフトウエア（Micromass）を用いて、ペプチドおよび糖ペプチドの分子量およびアミノ酸配列をＩｇＡ−ＨＸ８の配列に帰属させた。
【０３１８】
実施例２０．無傷ＩｇＧのＭＡＬＤＩ  ＭＳ
3つの別個の形質転換事象（即ち事象660、661および663）に関するトウモロコシ発現ＩｇＧからの、ならびにＣＨＯ発現ＩｇＧに関する「無傷」アフィニティー精製ＩｇＧタンパク質の試料を用いて、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ実験を実行した（データは示されていない）。
抗体軽鎖（ＬＣ）に関する測定質量は、理論的平均質量（Ｍ＝23486 Da）の〜1.0％内であった。無傷集合抗体に関する測定質量は、予測理論的平均質量（非グリコシル化タンパク質に関してＭ＝145612 Da）より1.7〜2.0％高かった。この不一致は、おそらくは重鎖のグリコシル化により説明される。
【０３１９】
全体的に、「無傷」抗体の4つの試料（3つのトウモロコシ発現およびＣＨＯ発現）の全てに関するＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、集合ＩｇＧの典型であった。
【０３２０】
実施例２１．ペプチドマッピング結果
3つのトウモロコシ発現ＩｇＧ試料およびＣＨＯ発現ＩｇＧ試料の全てに関して、ペプチドマッピング結果を得た（データは示されていない）。配列質量適用範囲（併合トリプシンおよびＡｓｐ−Ｎペプチドマップ）およびトリプシンペプチドマップも、全ての試料に関して得た（データは示されていない）。要するに、全体的配列質量適用範囲は、全ての抗体試料中の重鎖および軽鎖に関して約90％〜約100％であった。Ｎ末端断片を、全ての重鎖および軽鎖で検出した。全試料において、重鎖のＮ末端は、ピロ−ＧｌｕをＮ末端残基として含有したが、これは抗体における典型的翻訳後修飾である。微量含量の非プロセシング化Ｎ末端重鎖断片（ＧｌｎをＮ末端残基として含有）と一致する弱いシグナルも検出した。軽鎖のＣ末端断片を、全試料で検出した。事象660および663に関するトウモロコシ発現抗体試料では、重鎖のＣ末端断片は、全サイズＣ末端断片（Ｌｙｓ449をＣ末端残基として有する）および検出されたＬｙｓ449を有するＣ末端断片（「無Ｋ」）の混合物により代表された。Ｃ１−661試料では、切頭化（「無Ｋ」、即ちＬｙｓ449を含有せず）バージョンのＣ末端重鎖のみが検出された。ＣＨＯ−発現抗体では、切頭化（「無Ｋ」、即ちＬｙｓ449を含有せず）バージョンのＣ末端重鎖のみが検出された。ＭＡＬＤＩ  ＰＳＤ実験により、全てのＮ末端トリプシン断片および重鎖Ｃ末端断片の配列を確証した。
【０３２１】
実施例２２．グリコシル化プロファイリング
3つのトウモロコシ発現および1つのＣＨＯ発現ＩｇＧ抗体の一次構造およびグリコシル化を検査し、互いに比較した。抗体試料で観察された（糖ペプチドとして）Ｎ−結合グリカンの全プロフィールを、図１９（事象660）、図２１（事象661）、図２３（事象663）および図２５（ＣＨＯ−発現）に提示する。上記のように、フコシル化は、哺乳類賛成糖タンパク質に関してはα１，６、ならびに植物産生糖タンパク質に関してはα１，３である。
【０３２２】
代表的ＭＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプロフィールを、事象660に関して図２０Ａ−Ｂに；事象661に関して図２２Ａ−Ｃに；事象663に関して図２４Ａ−Ｂに；そしてＣＨＯ発現に関して図２６Ａ−Ｂに提示する。図２２Ｄは、Ｈ−Ｔ２７糖ペプチドから放出されたＮ−グリカンの質量スペクトル結果を提示する。このＭＡＬＤＩ質量スペクトルの強度は、中性Ｎ−グリカンの存在度にほぼ比例する。無傷抗体の全試料に関するＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、集合ＩｇＧの典型である。
【０３２３】
トウモロコシ発現重鎖試料のＡｓｎ２９９に観察された2つの最も豊富なグリカンは、組成ＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ2−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ２ＸＦ）およびＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ3−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ３ＸＦ）を有し、一方、ＣＨＯ発現における最も豊富なグリカンは、組成ＨｅｘＮＡｃ4−Ｈｅｘ3−Ｆｕｃ（またはＮ４Ｈ３Ｆ）およびＨｅｘＮＡｃ4−Ｈｅｘ4−Ｆｕｃ（またはＮ４Ｈ４Ｆ）を有する。単一ＨｅｘＮＡｃ単糖で修飾される重鎖のレベルは、ＣＨＯ発現抗体試料におけるよりもトウモロコシ発現抗体試料の方が高いと思われる。ＣＨＯ−発現試料におけるＮ−グリコシル化は、トウモロコシ発現抗体試料の場合よりヘテロ接合性（多様性）であると思われる。
【０３２４】
この研究で検査した全ての抗体試料に関して、ＭＡＬＤＩ  ＰＳＤ実験により、Ｈ−Ｔ２７重鎖トリプシン断片（即ち、Ａｓｎ２９９グリコシル化部位を含有する断片）および単一ＨｅｘＮＡｃ単糖で修飾されるその変異体の配列を確証した。しかしながら遊離Ｎ−グリカンとして観察された糖形態のシグナル強度は、糖ペプチドとして観察されたものとは多少異なった。Ｈ−Ｔ２７ペプチド糖形態のＭＡＬＤＩ質量スペクトルでは、グリカンＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ2−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ２ＸＦ）およびＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ3−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ３ＸＦ）を有する糖ペプチドは、最も強いシグナルを生成した。これに反して、酵素的放出遊離オリゴ糖のＭＡＬＤＩ質量スペクトルでは、グリカンＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ3−Ｘｙｌ（またはＮ２Ｈ３Ｘ）およびＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ3−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ３ＸＦ）およびＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ2−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ２ＸＦ）およびＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ5（またはＮ２Ｈ５）は、大きな種と考えられた。文献報告（D. Harvey, Mass Spectrometry Reviews 18: 349-451 (1999)）ならびにわれわれの知見によれば、遊離グリカンのＭＡＬＤＩ  ＭＳは、Ｎ−グリカンの相対量の一般的により正確な概算を示すはずである。任意の場合、両アプローチ（即ち糖ペプチドおよび遊離グリカン）により、Ｎ−グリカンＨｅｘＮＡｃ2−Ｈｅｘ3−Ｘｙｌ−Ｆｕｃ（またはＮ２Ｈ３ＸＦ）が最も豊富な種として観察された。
この研究で検査した抗体試料では、Ｏ−結合グリコシル化の証拠は見出されなかった。
【０３２５】
明快に理解するために上記で詳細に説明してきたが、これらは本発明を限定するものではなく、修正がなされ得ることは当業者には明らかである。
【０３２６】
本発明を、その特定の実施形態と結びつけて説明してきたが、本発明はさらなる修正が可能であると理解されるべきであり、本出願は、概して本発明の原理に従って、そして本発明が関する当該技術分野内で既知のまたは慣例の実施になる場合、本明細書中に上記した、そして添付の特許請求の範囲に従う本質的特徴に当てはまり得る場合、本発明の任意の変更、使用または適当を網羅するよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
【図１】図１．  pDAB635（ubiH）（配列番号１５）に関するプラスミドＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:424-1589トウモロコシユビキチンプロモーター/イントロン           ヌクレオチド:1717-3730抗ＨＳＶ重鎖（w/オオムギαアミラゼリーダー）            ヌクレオチド:3732-5240トウモロコシper5３’ＵＴＲ                              ヌクレオチド:5248-5612ＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:5720-6885
【図２】図２．  pDAB636（ubiL）（配列番号１６）に関するプラスミドＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:424-1589トウモロコシユビキチンプロモーター/イントロン           ヌクレオチド:1717-3730抗ＨＳＶ軽鎖（w/オオムギαアミラゼリーダー）            ヌクレオチド:3732-4448トウモロコシper5３’ＵＴＲ                              ヌクレオチド:4456-4820ＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:4928-6093
【図３】図３．  pDAB637（ubiH+L）（配列番号１７）に関するプラスミドＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:424-1589トウモロコシユビキチンプロモーター/イントロン           ヌクレオチド:1709-3722抗ＨＳＶ重鎖（w/オオムギαアミラゼリーダー）            ヌクレオチド:724-5232トウモロコシper5３’ＵＴＲ                              ヌクレオチド:5240-5604トウモロコシユビキチンプロモーター/イントロン           ヌクレオチド:5745-7758抗ＨＳＶ軽鎖（w/オオムギαアミラゼリーダー）            ヌクレオチド:7760-8476トウモロコシper5３’ＵＴＲ                              ヌクレオチド:8484-8848ＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:8956-10121
【図４】図４．  トランスジェニックトウモロコシカルスにより産生されるユビキチンＨＳＶ−ＩｇＡ（ＨＣ／ＬＣ）抗体からのタンパク質発現を検出するための検出抗体としてＩｇＡκ鎖を用いるネイティブウエスタンブロット。二系形質転換（ｐＤＡＢ６３７（配列番号１７）およびｐＤＡＢ３０１４（配列番号８４））由来の53個のトランスジェニックカルス、および三系形質転換（ｐＤＡＢ６３５（配列番号１５）およびｐＤＡＢ３０１４（配列番号８４））由来の23個のトランスジェニックカルスを全て、ＰＣＲにより分析して、導入遺伝子に関するＰＴＵの存在を検出した。ＰＴＵ陽性および陰性の両方であるカルス事象に、ウエスタンおよびＥＬＩＳＡ分析を施した。上記したユビキチン／ＨＣ、ＬＣ形質転換からの事象を用いて、タンパク質分析データを生成した。実験の目的は、単一プラスミドに及ぼすＨＣおよびＬＣ対2つの別個のプラスミドに及ぼすＨＣおよびＬＣの発現の効力を比較することであった。カルス材料を収集し、−70℃で凍結した後、タンパク質分析のために発送した。ＩｇＡ重鎖捕獲抗体およびＩｇＡκ鎖検出抗体を用いて、捕獲ＥＬＩＳＡ検定により、事象の初期スクリーニングを実施した。ＥＬＩＳＡ陽性試料のみを、ネイティブウエスタンブロットで、そしてＩｇＡκ鎖も検出抗体として用いて、評価した。ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした54の事象のうち、26が陽性であった（表１）。レーン１：分子量標準；レーン２：重鎖ＩｇＡ；レーン３：トランスジェニック植物からのカルス材料；レーン４：試料３−００６から検出されたＩｇＡ（表１）；レーン５：試料４−００８から検出されたＩｇＡ（表１）；レーン６〜１０：それぞれ試料２１、２４、２５、２８および２９から検出されたＩｇＡ（表１）。ウエスタンブロット条件：4〜12％ゲル非還元試料緩衝液62 ng総タンパク質／ウエル；1:5000ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ、室温で1時間；ならびに曝露時間5分。
【図５】図５．  ｐＤＡＢ８５０５断片（11398 bp）（配列番号８５）に関する線状プラスミド。
【図６】図６．  還元およびアルキル化ＩｇＡ−ＨＸ８（事象193自己）のトリプシン消化物の代表的Ｃ１８−ＨＰＬＣクロマトグラム。ピーク割り当ては、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分光分析（「ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ」）によるＨＰＬＣ分画の分析に基づいた。「Ｌ」で標識されたピークは、ＩｇＡ−ＨＸ８の軽鎖に起因するペプチドに対応する。「Ｈ」で標識されたピークは、ＩｇＡ−ＨＸ８の重鎖に起因するペプチドに対応する。詳細に関しては、表１および２ならびに添付の文を参照されたい。糖ペプチドを含有する分画をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ−Ａ（ＰＮＧアーゼ−Ａ）で処理し、その結果生じた脱グリコシル化ペプチドおよび放出されたグリカンを、ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔにより別個に分析した。ＨＰＬＣ：Magic C18、2×150 mm。オフラインＭＡＬＤＩ  ＭＳを収集分画で実施した。
【図７】図７．  還元およびアルキル化ＩｇＡ−ＨＸ８（事象193自己）のトリプシン消化により生成されたＩｇＡ−ＨＸ８重鎖の糖形態のＨ−Ｔ１３ペプチドの代表的ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔ。糖ペプチドのモノアイソトピック質量を示す。ピークより上の大きい数は、表８に要約したグリカン種に対応する。単糖単位に関する短い略号を以下に示す：Ｈ、ヘキソース；Ｎ、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧlｃＮＡｃ）；Ｘ、ペントース（キシロース）。
【図８】図８．  ＩｇＡ−ＨＸ８重鎖の糖形態のＨ−Ｔ１３ペプチドの不均質性は、グリカンの酵素的放出（ＰＮＧアーゼ−Ａ）により除去される。ＰＮＧアーゼＡで処理後、糖形態のＨ−Ｔ１３ペプチドに対応するシグナルは消失し、脱グリコシル化ペプチドＨ−Ｔ１３に対応する強いシグナルが質量スペクトルに出現する。脱グリコシル化反応中、ＰＮＧアーゼ−ＡはＡｓｎ（Ｎ）をＡｓｐ（Ｄ）に転換する、ということに留意されたい。したがって、脱グリコシル化Ｈ−Ｔ１３ペプチドが〜＋1 Ｄａの質量シフトで出現する。糖ペプチドの質量スペクトルにおけるピークより上の大きい数（ＰＮＧアーゼ−Ａ処理前）は、表８に列挙したグリカン種に対応する。
【図９】図９．  トウモロコシ発現ＩｇＡ−ＨＸ８重鎖の2つの付加的糖形態のＨ−Ｔ１３が観察される：Ｎ２６９に結合された単一および二重ＧｌｃＮＡｃ残基。糖ペプチドの質量スペクトルにおけるピークより上の大きい数（ＰＮＧアーゼ−Ａ処理前）は、表８に列挙したグリカン種に対応する。ＰＮＧアーゼ−Ａによる処理は、（ＧｌｃＮＡｃ）２の除去および単一ＧｌｃＮＡｃ残基の部分除去を生じる。脱グリコシル化ペプチドＨ−Ｔ１３に対応するピークが、ＰＮＧアーゼ−Ａによる試料の処理後に、質量スペクトルに出現する（示されていない）。
【０３２８】
【図１０】図１０．  単量体ＩｇＡ−ＨＸ８（事象193自己）から酵素的に放出された遊離Ｎ−結合グリカンの代表的ＭＳのＭＡＬＤＩ−Ｔプロフィール。ピークより上の大きい数は、表８に要約したグリカン種に対応する。単糖単位に関する短い略号を以下に示す：Ｈ、ヘキソース；Ｎ、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧlｃＮＡｃ）；Ｘ、ペントース（キシロース）。500ダルトン（Da）より低い分子量領域に対するＭＡＬＤＩ  ＭＳの非到達性のため、単一および二重ＧｌｃＮＡｃ種（表８の構造１１および１２）は、遊離グリカンとして検出されなかった。グリカン種は、ナトリウム化イオンとして観察される。
【図１１】図１１．  内胚乳由来ＨＸ８を用いたＨＳＶ−２の中和
【図１２】図１２．  植物から単離されたＩｇＡグリカンの構造。500ダルトン（Da）より低い分子量領域に対するＭＡＬＤＩ  ＭＳの非到達性のため、単一および二重ＧｌｃＮＡｃ種（構造１１および１２）は、遊離グリカンとして検出されなかった。
【図１３】図１３．  単量体、二量体および分泌抗体の絵による表示。
【図１４】図１４．  pDAB3014（配列番号８４）に関するプラスミドコメアクチンプロモーター                                ヌクレオチド:1172-1724PAT（ホスフィノトリシンアシルトランスフェラーゼ遺伝子） ヌクレオチド:1727-2281トウモロコシリパーゼ３’ＵＴＲ                          ヌクレオチド:2296-6652
【図１５】図１５．  pDAB8505（配列番号８５）に関する環状プラスミドＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:424-1589トウモロコシγゼインプロモーター                        ヌクレオチド:1709-3722抗ＨＳＶ重鎖遺伝子                                      ヌクレオチド:3178-4668トウモロコシper5３’ＵＴＲ                              ヌクレオチド:4678-5045トウモロコシγゼインプロモーター                        ヌクレオチド:5157-6659抗ＨＳＶ軽鎖                                            ヌクレオチド:6662-7360トウモロコシper5３’ＵＴＲ                              ヌクレオチド:7370-7737コメアクチンプロモーター／イントロン                    ヌクレオチド:7889-9258PATコード領域                                           ヌクレオチド:9260-9820トウモロコシリパーゼ３’ＵＴＲ                          ヌクレオチド:9831-10162ＳＡＲ                                                  ヌクレオチド:10229-11394注：抗ＨＳＶ重鎖遺伝子および抗ＨＳＶ軽鎖はともに、マウスリーダー配列を含む。
【図１６Ａ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１６Ｂ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１６Ｃ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１６Ｄ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１６Ｅ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１６Ｆ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１６Ｇ】トランスジェニックトウモロコシ中で発現されたＩｇＡ−ＨＸ８のグリカンプロファイリングの要約（異なる事象）。示唆されたグリカン構造の絵による表示も含まれるが、ここで「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；「Ｆ」または三角形＝フコース；および「Ｐ」＝ホスフェート（ＰＯ３）。注：ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク高に基づいたグリカンのパーセンテージ（％）は参照のためにのみ提示され、正確な定量のために用いられ得ない。
【図１７】図１７Ａ．  プラスミドｐＤＡＢ１４７２（図１７Ａ）およびプラスミドｐＤＡＢ１４７３（図１７Ｂ）
【図１８】図１８Ａ．  プラスミドｐＤＡＢ１４７４（図１８Ａ）およびプラスミドｐＤＡＢ１４７５（図１８Ｂ）
【図１９】図１９．  ＩｇＧに関する事象６６０に関して観察された糖形態。グリカンは全て、ＰＮＧアーゼ−Ａ処理により糖ペプチドから除去した。単一Ｎに関しては、除去は不完全である。略号：「Ｈ」＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」＝キシロース；および「Ｆ」＝フコース。    信号強度：      *＝Ｓ／Ｎ＞3〜5、しかし＜10；      **＝Ｓ／Ｎ＞10；      ***＝強いシグナル、しかし「小」未満；ならびに      「有意のシグナル」＝「小」と「大」の間の強度。
【図２０Ａ】図２０Ａ．  事象６６０に関する糖形態のＨ−Ｔ２７ペプチド（重鎖のＮ２９９部位）のＭＳプロフィールの代表的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。
【図２０Ｂ】図２０Ｂ．  事象６６０に関するm/z 2360.06（大きい糖形態、Ｎ２Ｈ３ＸＦ）における画像拡大。
【図２１】図２１．  ＩｇＧに関する事象６６１に関して観察された糖形態。グリカンは全て、ＰＮＧアーゼ−Ａ処理により糖ペプチドから除去した。単一Ｎに関しては、除去は不完全である。略号：「Ｈ」または円形＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」または長方形＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」または十字形＝キシロース；および「Ｆ」または三角形＝フコース。    信号強度：      *＝Ｓ／Ｎ＞3〜5、しかし＜10；      **＝Ｓ／Ｎ＞10；      ***＝強いシグナル、しかし「小」未満；ならびに      「有意のシグナル」＝「小」と「大」の間の強度。
【０３２９】
【図２２Ａ】図２２Ａ．  事象６６１に関する糖形態のＨ−Ｔ２７ペプチド（重鎖のＮ２９９部位）のＭＳプロフィールの代表的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。
【図２２Ｂ】図２２Ｂ．  事象６６１に関するm/z 2360.06（大きい糖形態、Ｎ２Ｈ３ＸＦ）における画像拡大。
【図２２Ｃ】図２２Ｃ．  事象６６１に関する糖形態のＨ−Ｔ２７ペプチド（m/z 1189.65での非グリコシル化、そしてm/z 1392.76での単一ＨｅｘＮＡｃ＋より高いm/ｚでのＨ−Ｔ２６−２７におけるいくつかのＮ−糖形態を伴う）のＭＳプロフィールの代表的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。ＨＰＬＣ分画１７。
【図２２Ｄ】図２２Ｄ．  Ｈ−Ｔ２７糖ペプチドから放出されるＮ−グリカン。遊離グリカンのＭＡＬＤＩ  ＭＳ。このＭＡＬＤＩ質量スペクトルにおける強度は、多量の中性Ｎ−グリカンにほぼ比例する。注：単一および二重ＧｌｃＮＡｃは説明されない。
【図２３】図２３．  ＩｇＧに関する事象６６３に関して観察された糖形態。グリカンは全て、ＰＮＧアーゼ−Ａ処理により糖ペプチドから除去した。単一Ｎに関しては、除去は不完全である。略号：「Ｈ」＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」＝キシロース；および「Ｆ」＝フコース。    信号強度：      *＝Ｓ／Ｎ＞3〜5、しかし＜10；      **＝Ｓ／Ｎ＞10；      ***＝強いシグナル、しかし「小」未満；ならびに      「有意のシグナル」＝「小」と「大」の間の強度。
【図２４Ａ】図２４Ａ．  事象６６３に関する糖形態のＨ−Ｔ２７ペプチド（重鎖のＮ２９９部位）のＭＳプロフィールの代表的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。
【図２４Ｂ】図２４Ｂ．  事象６６３に関するm/z 2360.07（大きい糖形態、Ｎ２Ｈ３ＸＦ）における画像拡大。
【図２５】図２５．  ＣＨＯ発現ＩｇＧに関して観察された糖形態。グリカンは全て、ＰＮＧアーゼ−Ａ処理により糖ペプチドから除去した。単一Ｎに関しては、除去は不完全である。略号：「Ｈ」＝ヘキソース（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）；「Ｎ」＝ＨｅｘＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；「Ｘ」＝キシロース；および「Ｆ」＝フコース。    信号強度：      *＝Ｓ／Ｎ＞3〜5、しかし＜10；      **＝Ｓ／Ｎ＞10；      ***＝強いシグナル、しかし「小」未満；ならびに      「有意のシグナル」＝「小」と「大」の間の強度。
【図２６Ａ】図２６Ａ．  ＣＨＯ発現ＩｇＧに関する糖形態のＨ−Ｔ２７ペプチド（重鎖のＮ２９９部位）のＭＳプロフィールの代表的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。
【図２６Ｂ】図２６Ｂ．  ＣＨＯ発現ＩｇＧに関するm/z 2633.61（大きい糖形態、Ｎ４Ｈ３Ｆ）における画像拡大。
【図１】
2006517392.tif 000016
【図２】
2006517392.tif 000017
【図３】
2006517392.tif 000018
【図４】
2006517392.tif 000019
【図５】
2006517392.tif 000020
【図６】
2006517392.tif 000021
【図７】
2006517392.tif 000022
【図８】
2006517392.tif 000023
【図９】
2006517392.tif 000024
【図１０】
2006517392.tif 000025
【図１１】
2006517392.tif 000026
【図１２】
2006517392.tif 000027
【図１３】
2006517392.tif 000028
【図１４】
2006517392.tif 000029
【図１５】
2006517392.tif 000030
【図１６Ａ】
2006517392.tif 000031
【図１６Ｂ】
2006517392.tif 000032
【図１６Ｃ】
2006517392.tif 000033
【図１６Ｄ】
2006517392.tif 000034
【図１６Ｅ】
2006517392.tif 000035
【図１６Ｆ】
2006517392.tif 000036
【図１６Ｇ】
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【図１７】
2006517392.tif 000038
【図１８】
2006517392.tif 000039
【図１９】
2006517392.tif 000040
【図２０Ａ】
2006517392.tif 000041
【図２０Ｂ】
2006517392.tif 000042
【図２１】
2006517392.tif 000043
【図２２Ａ】
2006517392.tif 000044
【図２２Ｂ】
2006517392.tif 000045
【図２２Ｃ】
2006517392.tif 000046
【図２２Ｄ】
2006517392.tif 000047
【図２３】
2006517392.tif 000048
【図２４Ａ】
2006517392.tif 000049
【図２４Ｂ】
2006517392.tif 000050
【図２５】
2006517392.tif 000051
【図２６Ａ】
2006517392.tif 000052
【図２６Ｂ】
2006517392.tif 000053
【配列表】
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