(57)【要約】クロマトグラフ相の合成、送達又は沈積又は局在化、特にクロマトグラフ分離又は固相抽出のための方法は、超臨界二酸化炭素のような超臨界流体を用いて、化学部分を支持体に導入する過程からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフ相の合成、送達又は沈積又は局在化のため、特にクロマトグラフ分離又は固相抽出のための方法であって、超臨界流体を用いて化学部分を支持体に導入する過程からなる方法。
【請求項２】
前記支持体が多孔性固体金属酸化物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔性固体金属酸化物がナノポーラス、メソポーラス、マイクロポーラス又はマクロポーラスである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体が、粒子（多孔性及び非多孔性）、ゾル−ゲル、モノリス、エーロゲル、キセロゲル、膜、繊維、又は、キャピラリ若しくはナノシェル若しくはナノチューブ若しくはマイクロ／ナノチャネル若しくは微小成形されたオンチップカラムのような表面の形態をなす請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記金属酸化物が、シリカ、アルミナ、チタニア、又はアミノプロリルシリカ若しくは水素化ケイ素のような官能性金属酸化物のいずれか１つ又は複数から選択される請求項２乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記化学部分の反応形態が前記超臨界流体によって前記支持体に送達される請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記化学部分が支持体相上に沈積される請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記化学部分が前記超臨界流体に可溶性を有する請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記化学部分が、アルコキシ誘導体、ハロゲン化誘導体又はヒドロシランのような反応性有機シランである請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記化学部分が、ジメチルメトキシオクタデシルシラン又はトリクロロ−オクチルシランのいずれか１つ又は複数から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学部分が、水素化シリカによるヒドロシリル化の処理のために、ｎ−オクタデシルトリエトキシシラン、ｎ−オクタデシルジメチル−モノメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−過フルオロオクチルトリエトキシシラン、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルクロロシラン、又はアルケン誘導体及びアルキン誘導体のような試薬のいずれか１つ又は複数から選択される請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記化学部分がオクタデシルジメチルクロロシラン又はオクタデシルジメチルメトキシシランである請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記化学部分の前記支持体への結合又は沈積によって、炭化水素クロマトグラフ相、フッ化炭化水素クロマトグラフ相、過フルオロクロマトグラフ相、逆相クロマトグラフ相、順相クロマトグラフ相、イオン交換クロマトグラフ相、アフィニティクロマトグラフ相、キラルクロマトグラフ相、キレート相、（カリックスアレーン相のような）マクロサイクリック相又は水素化ケイ素相が得られる請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記炭化水素相がＣ8又はＣ18相である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記超臨界流体が超臨界二酸化炭素である請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記反応が３１．３℃から６００℃までの温度で行われる請求項１乃至１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記反応が４０℃から８０℃までの温度で行われる請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応が７２９５ｋＰａ（１０５８ｐｓｉ）から２０６８５０ｋＰａ（３００００ｐｓｉ）の圧力で行われる請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記反応が８２７４ｋＰａ（１２００ｐｓｉ）から５５１６０ｋＰａ（８０００ｐｓｉ）の圧力で行われる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応が最大１００時間までの時間で行われる請求項１乃至１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記反応が約３時間で行われる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
超臨界流体を用いた乾燥過程を含む請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
キレート剤を含む請求項１乃至２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記キレート剤が金属イオン封鎖剤である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キレート剤がフッ化又は非フッ化ヒドロキサム酸である請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記金属イオン封鎖剤が過フルオロオクチルヒドロキサム酸（ＰＦＯＨＡ）又はＮ−メチルヘプタフルオロブチリック・ヒドロキサム酸（ＭＨＦＰＨＡ）である請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロマトグラフ相を合成するための方法であって、
反応容器に支持体及び化学部分を加える過程と、
前記反応容器に反応媒質を送達する過程と、
前記反応容器の温度を７２９５ｋＰａ（１０５８ｐｓｉ）から２０６８５０ｋＰａ（３００００ｐｓｉ）の圧力で３１．２℃から６００℃の温度に上昇させて超臨界流体を形成する過程と、
前記反応容器の内容物を約３時間撹拌する過程と、
前記クロマトグラフ相を回収する過程とからなる方法。
【請求項２８】
前処理、処理中又は後処理でキレート剤を用いて前記クロマトグラフ相を修飾する過程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記反応が単一のチャンバ内で行われる請求項１乃至２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
クロマトグラフ相の合成のための方法であって、超臨界溶媒及びキレート剤の存在下で化学部分を支持体に導入する過程からなる方法。
【請求項３１】
前記キレート剤が、フッ化又は非フッ化ヒドロキサム酸のような金属イオン封鎖剤である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記金属イオン封鎖剤が過フルオロオクチルヒドロキサム酸（ＰＦＯＨＡ）又はＮ−メチルヘプタフルオロブチリック・ヒドロキサム酸（ＭＨＦＰＨＡ）である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
本願明細書に実質的に記載される方法。
【請求項３４】
請求項１乃至３３のいずれかに記載の方法により調整されるクロマトグラフ相。
【請求項３５】
請求項１乃至３３のいずれかに記載の方法により調整される、クロマトグラフ又は固相抽出のための結合シリカ相。
【請求項３６】
Ｓｉ−ＯＭｅ表面種を有するクロマトグラフ固定相。
【請求項３７】
その表面にキレート剤を有するクロマトグラフ固定相。
【請求項３８】
請求項３４又は３５に記載の固定相を有するクロマトグラフカラム。
【請求項３９】
結合シリカ相のようなクロマトグラフ相の調整における超臨界流体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフ相、特にクロマトグラフ固定相を合成するための方法、及びその製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日知られたクロマトグラフ固定相の大部分は２つの異なった部分、支持体及び配位子を有する。使用される支持体には、シリカ（１−３）、アルミナ（４）、ポリスチレン−ジビニルベンゼン（ＰＳ−ＢＶＢ）（５）及び多孔性黒鉛状炭素（ＰＧＣ）（６）が含まれる。これらの中で、シリカは、それを修飾することが比較的容易にできるために、最も広く使用されている（７）。広範囲の配位子が、これら支持体上に首尾よく固定されている。それらには、Ｃ８及びＣ１８鎖長が最も一般的である直鎖炭化水素（８）から、シクロデキストリン（９−１２）、カリックスアレーン（１３−１５）及び抗生物質（１６）のような複雑な大環状高分子までの範囲が含まれる。これらの相を合成する通常の方法は、配位子の反応形態を支持体に導入し、それにより共有結合を形成して安定構造を確実にすることである。配位子は、シリカ表面に結合される化学部分を意味するものと考えられる。
【０００３】
アルコキシシラン及びクロロシランのシリカとの反応はよく知られている（１７−１９）。これらの過程は詳しく研究されており、クロマトグラフ固定相の製造の大部分を説明している（７）。ある合成方法は、有機シランのガス流を高温（＞３００℃）でシリカの上に通過させる過程を有する（２０）。塩素原子又はアルコキシ基（Ｘ）が金属酸化物上の表面水酸基と反応し、Ｓｉ（ｓ）が表面シリコン原子を表す次の式に従って、表面から延長する有機基を残している。
【０００４】
【化１】
2006522328.tif 000002
【０００５】
代わりに、不揮発性有機シランを用いた場合には、１００℃以下で非水溶液内で金属酸化物を反応させることができる（２１）。有機シランは微量の水（シリカ上又は溶液内に存在）と反応して有機シラノールを形成し、これが次に、一例としてクロロ−有機シランを用いて、次の式に従って表面シラノール基と反応する（２２）。
【０００６】
【化２】
2006522328.tif 000003
【０００７】
近年では、水素化ケイ素が、シラン化（silanisation）／ヒドロシリル化（hydrosilation）プロトコロル（２３、２４）によるクロマトグラフ固定相の調整において中間物として大きな注目を集めている。水素物の高ローディングをもって再生可能な面を形成する方法論が開発されている（２５）。ここで、これらは、アルケン（２６）、アルキン（２７）、又はカルボニル（２８）での誘導体化により更に官能性をもたせることができる。
【０００８】
鏡像異性体の分離のために、様々なキラルセレクタが支持体に結合されている。例えば、キニーネは頻繁にキラル分離剤として（２９、３０）、及びクロマトグラフィではキラルセレクタ（２９）又は添加剤（３０）として使用されている。最近では、キニーネセレクタを含むキラルイオン交換カラムが、Ｎ−誘導体化アミノ酸、アミノスルホン酸及びアミノホスホン酸のような酸性キラル化合物の分離のためにＰｒｏｎｔｏＳＩＬ  Ｃｈｉｒａｌ  ＡＸ  ＱＮ−１として市販されている（２９）。これらの相は、極めて一般的に遊離基イニシエータとしてＡＩＢＮを用いて３−メルカプトプロピル修飾シリカのペンダントビニル基へのミハエル添加により有機溶媒内で形成される。
【０００９】
３−メルカプトプロピルシリカは容易に調製される官能性シリカ面として広く使用されており、それには注目のセレクタを都合よく繋ぐことができる。この方法は、幾人かの研究者により、特にリンドナー（Ｌｉｎｄｎｅｒ）及び共同研究者により使用されている。（３１−４４）。
【００１０】
シリカを主成分とする相は、残留表面シラノールが検体と相互作用するという問題がある。これは特に塩基性化合物に有利である（４６）。この問題を解消するために、配位子を結合させた後に相をエンドキャップする（４７）。これは、トリメチルクロロシラン、またはヘキサメチルジシリザン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌｉｚａｎｅ）のようなシリル化剤を用いてこれらの表面シラノールと反応させ、それにより検体への好ましくない親和力を抑制するシリル化過程である。
【００１１】
Ｙａｒｉｔａ他は、超臨界ＣＯ２を反応媒体として用いて、従来の方法で調製したオクタデカシリカ（ＯＤＳ）クロマトグラフ固定相をエンドキャップした（４８）。
【００１２】
いずれもＸｅｒｏｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる米国特許第５７２５９８７号及び米国特許第５７１４２９９号明細書は、写真複写産業用のトナー添加剤を調製するための方法を記載している。超臨界及び液体二酸化炭素が、官能性シラン及びシリカの反応のための代替媒体として使用されている（４９−５１）。
【００１３】
Ｓｈｉｎ他は、超臨界ＣＯ２を用いて、市販のゼオライトをメルカプトプロピルシランで修飾している（５２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
液体クロマトグラフィは、最も広く使用されている化学分析のための技術であり、その市場は毎年６％の割合で成長し続けている。クロマトグラフ相を合成するために使用されている最近の技術は複雑で時間を消費する。
【００１５】
そこで、固相抽出のような、改善された高効率の調製用クロマトグラフ相及び試料調製相が必要である。また、一度のランで多数の溶質を識別しかつ分析する、より効率的かつより高純度の不活性固定相が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、クロマトグラフ相の合成、送達又は沈積のため、特にクロマトグラフ分離又は固相抽出のための方法であって、超臨界流体を用いて化学部分を支持体に導入する過程からなる方法が提供される。
【００１７】
好ましくは、前記支持体が多孔性固体金属酸化物である。より好ましくは、前記多孔性固体金属酸化物がナノポーラス、メソポーラス、マイクロポーラス又はマクロポーラスである。
【００１８】
本発明の或る実施例では、前記支持体が、粒子、ゾル・ゲル、モノリシ、エーロゲル、キセロゲル、膜、繊維、又はキャピラリ、マイクロ／ナノ−チャネル若しくは微小成形されたオンチップカラムのような表面の形態をなす。
【００１９】
本発明の或る実施例では、前記支持体が非多孔性粒子、中空シェル、ナノシェル又はナノチューブの形態をなす。
【００２０】
好ましくは、前記金属酸化物が、シリカ、アルミナ、チタニア、又はアミノプロリルシリカ若しくは水素化ケイ素のような官能性金属酸化物のいずれか１つ又は複数から選択される。
【００２１】
本発明の或る実施例では、前記化学部分の反応形態が前記超臨界流体によって前記支持体に送達される。
【００２２】
前記化学部分は、支持体相上に沈積させることができる。
【００２３】
本発明の或る実施例では、前記化学部分が超臨界流体に可溶性を有する。
【００２４】
好ましくは、前記化学部分が、アルコキシ誘導体、ハロゲン化誘導体又はヒドロシランのような反応性有機シランである。
【００２５】
より好ましくは、前記化学部分が、ジメチルメトキシオクタデシルシラン又はトリクロロ−オクチルシランのいずれか１つ又は複数から選択される。
【００２６】
前記化学部分は、水素化シリカによるヒドロシリル化の処理のために、ｎ−オクタデシルトリエトキシシラン、若しくはｎ−オクタデシルジメチル−モノメトキシシラン、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−過フルオロオクチルトリエトキシシラン、ヘキサメチルジシラザン、若しくはトリメチルクロロシラン、又はアルケン誘導体及びアルキン誘導体のような試薬のいずれか１つ又は複数から選択することができる。
【００２７】
好ましくは、前記化学部分がオクタデシルジメチルクロロシラン又はオクタデシルジメチルメトキシシランである。
【００２８】
本発明の或る実施例では、前記化学部分の前記支持体への結合又は沈積によって、炭化水素クロマトグラフ相、フッ化炭化水素クロマトグラフ相、過フルオロクロマトグラフ相、逆相クロマトグラフ相、順相クロマトグラフ相、イオン交換クロマトグラフ相、アフィニティクロマトグラフ相、キラルクロマトグラフ相、キレート相、（カリックスアレーン相のような）マクロサイクリック相又は水素化ケイ素相が得られる。
【００２９】
本発明の別の実施例では、前記炭化水素相がＣ8又はＣ18相である。
【００３０】
本発明の好ましい実施例では、前記超臨界流体が超臨界二酸化炭素である。
【００３１】
最も好ましくは、前記反応が３１．２℃から６００℃までの温度で行われる。
【００３２】
前記反応は４０℃から８０℃までの温度で行うことができる。
【００３３】
本発明の或る実施例では、前記反応が７２９５ｋＰａ（１０５８ｐｓｉ（７２．９気圧））から２０６８５０ｋＰａ（３００００ｐｓｉ（２０４０．８気圧））までの気圧で、好ましくは８２７４ｋＰａ（１２００ｐｓｉ）から５５１６０ｋＰａ（８０００ｐｓｉ）の圧力で行われる。
【００３４】
好ましくは、前記反応は最大１００時間、最も好ましくは約３時間の時間に亘って行われる。
【００３５】
本発明の或る実施例では、前記方法はキレート剤を有する。好ましくは、前記キレート剤は金属イオン封鎖剤であり、かつフッ化又は非フッ化ヒドロキサム酸から選択される。
【００３６】
前記金属イオン封鎖剤は、過フルオロオクチルヒドロキサム酸（ＰＦＯＨＡ）又はＮ−メチルヘプタフルオロブチリック・ヒドロキサム酸（ＭＨＦＰＨＡ）とすることができる。
【００３７】
また、本発明によれば、クロマトグラフ相を合成するための方法であって、
反応容器に支持体及び化学部分を加える過程と、
前記反応容器にＣＯ２  のような反応媒質を送達する過程と、
前記反応容器の温度を６８９５ｋＰａ（１０００ｐｓｉ）から２０６８５０ｋＰａ（３００００ｐｓｉ）の圧力で３０℃から６００℃の温度に上昇させて超臨界流体を形成する過程と、
前記反応容器の内容物を約３時間撹拌する過程と、
前記クロマトグラフ相を回収する過程とからなる方法が提供される。
【００３８】
本発明の或る実施例では、前処理、処理中又は後処理でキレート剤を用いて前記クロマトグラフ相を修飾する過程を含む。
【００３９】
本発明の別の実施例では、前記反応が単一のチャンバ内で行われる。
【００４０】
本発明の別の実施例では、前記チャンバ内で超臨界流体でシリカを乾燥させる過程を有する。
【００４１】
本発明によれば、クロマトグラフ相の合成のための方法であって、超臨界溶媒及びキレート剤の存在下で化学部分を支持体に導入する過程からなる方法が提供される。好ましくは、前記キレート剤が、フッ化又は非フッ化ヒドロキサム酸のような金属イオン封鎖剤である。最も好ましくは、前記金属イオン封鎖剤が過フルオロオクチルヒドロキサム酸（ＰＦＯＨＡ）又はＮ−メチルヘプタフルオロブチリック・ヒドロキサム酸（ＭＨＦＰＨＡ）である。
【００４２】
また、本発明によれば、本発明の方法により調整したクロマトグラフ相が提供される。
【００４３】
さらに本発明によれば、本発明の方法により調整した、クロマトグラフ相又は固相抽出のための結合シリカ相が提供される。
【００４４】
別の側面では、本発明により、Ｓｉ−ＯＭｅ表面種を有する固定相が提供される。
【００４５】
別の側面では、本発明により、その表面にキレート剤を有するクロマトグラフ固定相が提供される。
【００４６】
また、本発明は、結合シリカ相のようなクロマトグラフ相の調整における超臨界流体の使用を説明している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、添付図面をも参照しつつ、単なる実施例として記載される以下の説明からより明確に理解することができる。
【００４８】
本発明によれば、超臨界流体、特に超臨界二酸化炭素（ｓｃ−ＣＯ２）において高効率でクロマトグラフ固定相を合成する方法が提供される。本願発明者らは、クロマトグラフ相特に結合したシリカ相の形成において、ｓｃ−ＣＯ２が実行可能で非常に望ましい媒質であることを見出した。
【００４９】
用語「超臨界」は、本願明細書全体において、流動性媒質がその臨界温度より高い温度及びその臨界圧より高い圧力にあることを意味すると理解される。
【００５０】
二酸化炭素の比較的低い臨界温度及び圧力、その広い利用可能性、低コスト、低い毒性及び反応性、並びに不燃性が、二酸化炭素をえり抜きの物質としている。しかしながら、超臨界流体として多くの物質を用いることができ、（水、メタノール、プロパノール、ヘキサノール、アセトニトリル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯを含む有機溶媒のような）修飾剤を有する超臨界二酸化炭素、（ヘキサン、ペンタン、ブタンのような）炭化水素、ハロアルカン（フルオロホルム及び１３４ａ−フレオンのような環境にやさしい、優れた溶剤）、及び不活性ガス（キセノン、ヘリウム、アルゴン）が含まれる。
【００５１】
６０％を超える逆相分離は、直鎖Ｃ８及びＣ１８炭化水素特にＣ１８炭化水素の配位子からなるクロマトグラフ相で実行されることが評価されている（８）。経済的にかつ効率的に製造され得る効率的なクロマトグラフ相には大きな市場がある。
【００５２】
フッ化配位子は、超臨界流体に可溶であることが知られており、フッ化鎖が可溶化を容易にしている。しかしながら、本発明では、非フッ化相が同様に超臨界ＣＯ２を用いて容易に調整し得ることがわかった。
【００５３】
反応媒質としての超臨界ＣＯ２の使用が、クロマトグラフ相の調製において従来使用されている溶媒に対して大きな利点を有する。
【００５４】
クロマトグラフ固定相の合成において従来使用されているトルエン及びジクロロメタンのような有機溶媒と比較して、より安全かつより環境に優しい溶媒である。さらに、毒性を有する有機溶媒の排気の問題がない。ＣＯ２は、再使用のために単に排気することができる。
【００５５】
また、反応動力学の向上が反応時間をより速くしている。この超臨界方法に要する時間は、従来の溶媒又は方法を用いるより長い処理時間と比較して、約３時間である。これは経済的に非常に望ましいことである。
【００５６】
クロマトグラフ相の合成に於ける表面シラノール基の反応性有機シランとの反応は、残留シラノール基が最終物質のクロマトグラフ効率を制限するという点で、制限過程である。超臨界ＣＯ２のような超臨界流体に於ける拡散性の向上及びより速い反応速度によって、反応部位へのアクセスをより大きくすることができ、その結果、超臨界ＣＯ２調製結合相シリカでより高いカバレッジ及び効率の改善が得られる。
【００５７】
更に、本発明の超臨界ＣＯ２方法は、シリカを乾燥させ、それを配位子と反応させかつ相をエンドキャップし、必要な場合には、錯化によりシリカ表面からの金属を除去し又は補捉し、全部を一つのチャンバ内で行う。本発明の超臨界結合シリカ相は、エンドキャップしない相でさえ、非常に高いカラム効率を示す。
【００５８】
合成の後、前記クロマトグラフ相は、複雑なろ過過程を全く受ける必要がなく、カラム充填又は表面修飾の場合のように、超臨界流体を用いて前記相を支持体に送達することを含めて、反応のすぐ後に容易に取り扱うことができる。
【００５９】
また、本発明は、キレート剤を用いて表面金属をキレート形成することにより、結合シリカを更に処理するための方法が提供される。金属、特に鉄及びアルミニウムは、シリカ結合相のクロマトグラフ性能に対して有害であることが知られている。これらは、２つの異なる意味で逆効果を生じさせる。第１に、前記金属は検体がキレートすることができる部位を提供し、それにより混合した保持モードを生じさせる。第２に、金属原子が近接する水酸基をより酸性にし、それにより、アミンのような塩基性化合物との好ましくない相互作用を増加させる。これら金属の除去または表面錯化を可能にする超臨界ＣＯ２  への金属イオン封鎖剤の添加によって、製造されたクロマトグラフ相の、疎水性のような特性及び品質を改善することができる。前記反応剤は、処理前、処理中又は処理後に用いることができる。使用される金属イオン封鎖剤の例は、過フルオロ−オクトヒドロキサム酸（ＰＦＯＨＡ）又はＮ−メチルヘプタフルオロブタン・ヒドロキサム酸（ＭＨＦＢＨＡ）である。
【００６０】
超臨界流体の溶媒和力、温度圧力及び時間のパラメータを変化させることにより、化学的に結合されたシリカの製造において、各化学過程について最適化することができる。
【００６１】
超臨界Ｃ２を用いる前記方法は、マイクロＬＣ、ＣＥＣキャピラリ若しくはチャネル、またはオンチップ分離機器において固定相の調製及び局在化のために配位子の送達、沈積又は反応に使用することができる。また、これは、粒子（マイクロポーラス、メソポーラス、及びナノポーラス、非多孔性、薄膜、ビーズ）、ナノシェル及びナノチューブの機能付与に加えて、モノリシッククロマトグラフ相、ゾル・ゲル、エーロゲル、キセロゲル、膜、繊維又は表面の流動体合成において用いることができる。
【００６２】
また、本発明のクロマトグラフ相は、ベッド、膜又は表面薄膜フォーマットにおける固相抽出のような試料の前処理のために用いることができる。
【００６３】
本発明は、以下の実施例からより明確に理解することができる。
【００６４】
結合相のクロマトグラフ特徴付け
クロマトグラフ手段によりクロマトグラフ相を試験することは有利である。クロマトグラフ実験室で未だ利用可能でない設備や専門的技術を必要としない。このような試験によって、選択された検体を設定された条件下で溶離する際に相の相対的強さ及び弱さを評価する手段が提供される。
【００６５】
１９９１年、エンゲルハート他は、今日最も広く利用されているクロマトグラフ試験の一つを公式化した（５３）。一連の溶離を通じて、彼は、その試験に於けるカラムの性能によってカラムを「優良」「不良」と区別することが可能であることを見出した。この試験は、カラムの特性を素早く評価しかつその強さ及び弱さを判定することができるという点において、明確に実用的な価値を有する。
【００６６】
この試験は、他の多くの試験と同様に、２つの異なる部分、疎水性を評価すること、及びシラノール活量を評価することを有する。シラノール活量試験は、７つの試験プローブ、即ちアニリン、フェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（ＤＭＡ）、トルエン、及びパラ−、オルト−並びにメタ−トルイジンを用いる。移動相の条件は、ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（５５：４５、ｖ／ｖ）である。前記試験は、アニリンをフェノールの前に溶離すべきであると定めている。その論法は、塩基性アニリンが表面シラノール基との好ましくない相互作用をより受けやすいと考えられることである。これをフェノールより前に溶離する場合には、構造的には非常に類似するが、シラノール相互作用の傾向がないので、その場合にはシラノール活量の効果が最小である。また、これと同じ論法により、ＤＭＡをトルエンより前に溶離すべきであることが指示されている。更に、残留シラノールとの相互作用に対応して、これらの溶離について観測される全てのピークテイリングは好ましくない。アニリン及びフェノールに関するピーク非対称化の割合は、１．３より小さくすべきである。異性化トルイジンはその疎水性ではなく、そのｐＫａ  値においてのみ異なる。従って、非常に小さいシラノール活量を示す相は、これらの異性体を分離することができないはずである。
【００６７】
本発明において合成される相は、試験プローブを含めて、固相ＮＭＲ分光学により特徴付けられ、かつ様々な溶質を用いてクロマトグラフにより評価した。また、実用的な薬剤の用途を説明した。
【００６８】
実施例１−超臨界フッ化Ｃ８シリカ相の調製
反応は、サファイア窓付き外部ステンレス鋼反応セル（１６×２ｃｍ  ｉ．ｄ．）を有するＩＳＣＯモデル２６０Ｄ注射器ポンプを用いて実行した。２．２１ｇの酸洗したシリカ（３μｍハイパーシル）を、０．３５９ｍｌの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−過フルオロオクチル−トリエトキシシランと共に加え、マグネチックスターラバーで撹拌した。前記セルに１５ｍｌのＣＯ２  を充填し、温度を６０℃に上げ、かつ圧力を４５５８５ｋＰａ（４５０気圧）に上げた。スターラプレートのスイッチを入れ、超臨界ＣＯ２  におけるシリカの撹拌を確実にし、反応を３時間に亘って進行させた。前記セルの窓を介して、中身がマグネチックスターラにより撹拌されるのを目で見ることができる。次に、前記系を冷却しかつ減圧し、修飾シリカを回収しかつ分析した。
【００６９】
元素分析の結果は、％Ｃ＝５．５４、％Ｈ＝０．７８であった。また、１３Ｃ及び２９Ｓｉ  ＣＰ／ＭＡＳ固体ＮＭＲ分析を実行した。
【００７０】
実施例２−超臨界Ｃ１８シリカ相の調製
また、同じ装置を用いてＣ１８相を合成した。２．２４ｇの前処理したシリカ（３μｍ  ハイパーシル）を、０．３８７ｇのｎ−オクタデシル−トリエトキシシランと共に加えた。
【００７１】
これにより、重量で２５％炭素の理論的ローディングが得られる。前記セルに１５ｍｌのＣＯ２を充填し、温度を６０℃に上げかつ圧力を４５５８５ｋｐａ（４５０気圧）に上げた。スターラプレートのスイッチを入れ、超臨界ＣＯ２及びシリカの撹拌を確実にした。これは、サファイア窓を通じて明確に見ることができる。この反応を３時間に亘って進行させた。次に、前記系を冷却しかつ減圧し、修飾されたシリカを回収しかつ分析した。
【００７２】
元素分析の結果は、％Ｃ＝２０．５８％、％Ｈ＝１．４４であった。また、１３Ｃ及び２９Ｓｉ  ＣＰ／ＭＡＳ固体ＮＭＲ分析を行った。
【００７３】
実施例３−超臨界エンドキャップした超臨界Ｃ１８シリカ相の調製
実施例２で概述した方法を用いて、Ｃ１８相を調製した。反応が完了した後、約１．０ｍｌのヘキサメチルジシラザンを加えた。更に、前記反応を４５５８５ｋＰａ（４５０気圧）に加圧し、６０℃の温度で更に３時間に亘って撹拌した。次に、前記系を冷却しかつ減圧し、修飾したシリカを回収した。
【００７４】
実施例４−水素化ケイ素相、ジメトキシ水素化シリカの調製
【００７５】
【化３】
2006522328.tif 000004
【００７６】
シリカゲル（５．１０ｇ）を７０℃で１２時間にわたって乾燥させ、かつ次に超臨界流体反応セル内に配置した。ジメチルメトキシシラン（３．９ｍｌ、ｃａ．２５ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を６５０ｒｐｍで４１３７０ｋＰａ（６０００ｐｓｉ）のＣＯ２雰囲気下で７０℃で６．５時間撹拌した。撹拌を２０分間停止し、前記系を動的に５０：５０メタノール，希塩酸（ａｑ）に２０分間抽出し、かつ最後に１５分に亘って減圧した。水素化ケイ素４．２８ｇが白い粉として取り出され、微量分析による分析の結果、Ｃ１．８２、Ｈ  ０．７２％ｗ／ｗであり、Ｎは検出されなかった（これは、０．７６ｍｍｏｌ水素物／ｇ  ＳｉＯ２のローディングと一致している）。ＮＭＲ  １３Ｃ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲは、５０．０及び−２．１ｐｐｍで共鳴信号を示し、２９Ｓｉ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲは−１．２、−６．１、−１６．２、ｃａ．−９１（肩）、−１０１．０及び−１０９．６ｐｐｍで共鳴信号を示した。赤外線ＤＲＩＦＴスペクトルは、３６５９、３３２７（ブロード、ＯＨ  ｓｔｒｅｔｃｈ）２９６８（ＣＨ２  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２９１０（ＣＨ２  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２３３８（大気中ＣＯ２）、２１４５（Ｓｉ−Ｈ）ｃｍ−１の吸光度を示した。
【００７７】
ＩＲスペクトルは、特徴的なシランＳｉ−Ｈ  ｓｔｒｅｔｃｈ  ｃａ２１４５ｃｍ−１の存在を明確に説明している。２９Ｓｉ  ＮＭＲ分析は、０と−２０ｐｐｍとの間のスペクトルの領域に特徴的な共鳴を示しており、特に−１．２ｐｐｍにおける強い吸光度は、表面修飾により形成される水素化シリカンに対応している。
【００７８】
実施例５−キラルシリカ結合相の調製
超臨界ＣＯ２を用いた３−メルカプトプロピルシリカゲルの調製
シリカゲル（３．４８９ｇ  ３μ  Ｅｘｓｉｌ、ｅｘ  Ａｌｌｔｅｃｈ）を６０ｍｌの超臨界流体反応セル内に入れた。３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（６．２ｍｌ、１．７８ｖｏｌ、３２．８ｍｍｏｌ）及びピリジン（６．２ｍｌ、１．７８ｖｏｌ）を加えた。懸濁液を７００ｒｐｍでＣＯ２雰囲気下で７０℃／３４４７５ｋＰａ（５０００ｐｓｉ）において８．５時間撹拌した。撹拌を３０分間停止し、前記系を動的に２Ｎ  ＨＣｌ（強いピリジン臭）に１５分間抽出し、かつ最後に３０分間減圧した。シリカ製品をＥｔＯＡｃ（ｃａ．２００ｍｌ）に懸濁し、ろ過し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍｌ）、ヘキサン（２×２０ｍｌ）で洗浄し、かつ７０℃で３時間以上に亘って一定重量に乾燥させた。回収された質量は白い粉体で３．３９６ｇ（９７．３％ｗ／ｗ）であった。微量分析の結果、Ｃ３．０６、Ｈ０．７４、Ｓ１．７３％ｗ／ｗであり、Ｎは検出されなかった。ＤＲＩＦＴスペクトルでは、３６４７、３５１７、３４４５、３２９５、３１７３、２９３８（ＣＨ２  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２８５２（ＣＨ２  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２５７９（Ｓ−Ｈ  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２３３８（大気中ＣＯ２）、１８６８、１６６２ｃｍ−１で吸光度を示した。１３Ｃ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲは、１０．８、２７．０、２２．９及び４８．８ｐｐｍで共鳴信号を示した。２９Ｓｉ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲは、−４８．３、−５７．１、−６６．７、−９１．８、−１００．９及び−１０９．８ｐｐｍで共鳴信号を示した。
【００７９】
キニーネ誘導固定相の調製
３−メルカブトプロピルシリカゲル（０．８６８ｇ、ｃａ．０．６５ｍｍｏｌ  チオール／ｇ  シリカ、ｅｓｔ．２．０３ｍｍｏｌチオール）を空気中で７０℃で２時間乾燥させ、かつ更に超臨界流体反応セル内で７０℃／３４４７５ｋＰａ（５０００ｐｓｉ）のＣＯ２において２５分間乾燥させた。ＡＩＢＮ（０．１０８ｇ、０．６６ｍｍｏｌ、０．３ｅｑ）及びｔ−ブチルカルバモイルキニーネ（０．８６８ｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．０１ｅｑ）を加え、かつ混合物を６５０ｒｐｍでＣＯ２雰囲気下で７０℃／３１７１７−４１３７０ｋＰａ（４６００−６０００ｐｓｉ）で４１時間撹拌した。撹拌を停止しかつ中身を２０分間沈殿させ、前記系を動的にｃａ．２−５ｍｌ／分でＭｅＯＨ溶液内に４０分間抽出した。撹拌を２０分間繰り返し、次に停止して、中身を２０分間沈殿させた。前記系を動的にｃａ．２−５ｍｌ／分でＭｅＯＨ溶液内に４０分間抽出し、かつ最後に１５分間減圧して、ベージュ色粉体として３．１２９ｇの製品を得た。試料（ｃａ２．９００ｇ）をＣＨＣｌ３（ｃａ．１０ｍｌ）において一晩細かく砕いた。濁った懸濁液をろ過し、かつベッドを新鮮なクロロフォルム（１×１０ｍｌ、１×５ｍｌ）で洗浄した。前記ベッドを更にポンプ上で１時間乾燥させかつ空気中で７０℃の温度で１時間乾燥させて、オフホワイト色の粉体２．６４５ｇを得た。
【００８０】
微量分析の結果、Ｃ１１．０７、Ｈ１．５４、Ｓ０．８４、Ｎ１．０８％ｗ／ｗであった。これは、入力した３−メルカプトプロピルシリカから７．８２％ｗ／ｗ炭素、０．６３％ｗ／ｗ水素及び１．０８％ｗ／ｗ窒素の増加を示している。
【００８１】
ＤＲＩＦＴスペクトル分析の結果、３６６０（アミドＮ−Ｈ  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２９３２（Ｃ−Ｈ  ｓｔｒｅｔｃｈ）、２３３９（大気中ＣＯ２）、１８６３、１７２４（Ｃ＝Ｏ  ｓｔｒｅｔｃｈ）、１５１０、１４５５、１０７６、８１１ｃｍ−１の吸光度を示した。
【００８２】
超臨界フッ化Ｃ８シリカ相−２９Ｓｉ固体ＮＭＲ
図１は、２９Ｓｉ固体ＮＭＲスペクトルを示しており、結合相化学種（Ｔ１からＴ３）及び非誘導体化シラノール基（Ｑ３及びＱ４）に共鳴が割り当てられている。
【００８３】
超臨界フッ化Ｃ８シリカ相−１３Ｃ固体ＮＭＲ
フッ化炭素（Ｃ３〜Ｃ８）は強い共鳴を示さない。２つの水素含有炭素に割り当てられた２つの異なる信号が図２に示され、表面結合が確認されている。
【００８４】
超臨界Ｃ１８シリカ相の２９ＳＩ固体ＮＭＲ
超臨界Ｃ１８シリカ相の固体２９ＳｉＮＭＲスペクトルが図３に示されている。−１１０及び−１１１ｐｐｍにおける２つの大きなピークが、非誘導体化シリカに対応している。ここにおいても、同様に、３つの共鳴（Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）が表面結合種及び良好な結合状態の存在を確認している。
【００８５】
超臨界Ｃ１８シリカ相の１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ固体ＮＭＲ
３２．８１ｐｐｍの大きな共鳴ピークが、結合炭化水素鎖における炭素原子の大部分に対応している（図４）。予想された共鳴が左側に示され、実験的に測定された値と良好に一致している。
【００８６】
カラム充填
超臨界フッ化Ｃ８相をシャンドン社製カラムパッカー（Ｓｈａｎｄｏｎ、英国）で４１３７０ｋＰａ（６０００ｐｓｉ）で充填した。イソプロピルアルコール（ＨＰＬＣグレード、メルク社、ダルムシュタット）を充填用溶媒として用い、かつ５０：５０メタノール／水をコンディショニング溶媒として用いた。クロマトグラフィカラムは全てステンレス鋼で作られ、長さ１５０ｍｍ及び内径４．６ｍｍの寸法を有し、ジョーンズ・クロマトグラフィ社（グラモーガン、ＵＫ）から入手した。超臨界Ｃ１８シリカ相を、商業的な相の基準（より高い圧力を含む）まで充填した。
【００８７】
クロマトグラフィによる評価
超臨界フッ化Ｃ８シリカ相
フッ化Ｃ８相を、ベンズアミド、ベンゾフェノン及びデフェニルを含む逆相テストミックス溶液を溶離することにより評価し、かつ５０：５０アセトニトリル／水移動相を用いて溶離した。テストミックス分離の結果を表１に示す。
【００８８】
【表１】
2006522328.tif 000005
【００８９】
超臨界調製Ｃ１８相
フッ化有機シランを、超臨界ＣＯ２に非常に溶けやすいと考えられることから、最初に配位子として選択した。更に、シリカ及び非フッ化有機シランを超臨界ＣＯ２中で用いる反応により、シリカ結合相を得た。
【００９０】
例えば、ｎ−オクタデシルトリエトキシシランは、上述したように超臨界流体条件下で酸洗したシリカと反応させ、かつステンレス鋼カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．）内に充填した。図５は、このエンドキャップしていない超臨界Ｃ１８カラムでのテストミックス溶離のクロマトグラムを示している。
【００９１】
表２は、エンドキャップしていない超臨界Ｃ１８カラムでのテストミックス溶離の計算（効率（Ｎ）及びピーク非対称要素）を表している。
【００９２】
【表２】
2006522328.tif 000006
【００９３】
プレート番号（Ｎ）及び非対称要素は、前記相がエンドキャップされていないことを考えると、驚くほど高い。実際、この相は、この長さのカラム及び０．９から１．２の範囲内の非対称要素について１００，０００を超えるプレート番号を期待する商業的な製造者が設定した基準に合格している。
【００９４】
オクタデシルジメチルトリクロロシラン及びオクタデシルジメチルメトキシシランを含む他の例を首尾良く３μシリカ上に固定化し、かつ得られた相について、充填したとき、上述したと同じ条件下でフルオレンに対して１０５，７８１及び１００，９９１のプレート番号を与えた。別の超臨界Ｃ１８シリカ相を調製し、かつ超臨界ＣＯ２内でヘキサメチルジシラザンを用いてエンドキャップした。このカラムはエンゲルハート試験を受けたとき、Ｎ、Ｎ−ＤＭＡをトルエンより前に溶離した。また、トルイジンの異性体が単一のピークとして溶離され、シラノール活量が低いことを示した（図６及び図７）。
【００９５】
また、超臨界エンドキャップ超臨界Ｃ１８カラム上で薬剤の用途を試験した。前記カラムは、図８及び図９に示すように、４つのβ遮断薬及び鎮痛薬の混合物を首尾良く分解することができた。
【００９６】
エンドキャップしていない超臨界流体生成のキラル固定相
ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル化キニーネをキラルテンプレート（１００ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．、３μｍ粒子）として用いる、エンドキャップしていない超臨界流体生成のキラル固定相でＮ−３，５−ジニトロベンゾイルフェニルグリシンのラセミ混合物のキラル分離を行った（図１２）。
【００９７】
本発明の方法により製造されるクロマトグラフ相は、次のような多くの重要かつ独特な特徴を有する。
【００９８】
・超臨界二酸化炭素における溶質の拡散性の向上によるより高い固定相のローディングであり、有機溶媒に吸蔵された一定のシラノールに接触可能となる。例えば、水素化ケイ素相の調製において、反応時間の延長によりローディングが増加することになり、例えば、超臨界流体条件下での２２時間により、２４時間以上での還流トルエンにおいて達成されるＳｉＯ２１ｇ当たり０．６４ｍｍｏｌの水素物と比較して、０．９６ｍｍｏｌ／ｇのローディングが得られた。
【００９９】
・また、乾燥剤として超臨界流体を使用し、水を除去してより均質の表面結合相を形成することによる利益がある。
【０１００】
・超臨界流体での反応は、有機溶媒の場合と異なる追加の化学結合種、即ち表面結合種を形成することができる。例えば、選択した相の１３Ｃ  ＮＭＲ分析は、アルコキシシランと一致する共鳴を示しており、表面シラノールとの置換反応よりもむしろＳｉ−ＯＭｅ表面種が得られる。
【０１０１】
・表面金属の錯体を作る過程でのキレート剤の使用により、相をその表面金属含有量において又は現場での錯化によるこの金属含有量の不活化により特性が異なるものにしている。後者の場合、キレート剤が表面に存在し、クロマトグラフィに対して金属錯化と疎水性側鎖を与えることとの２つの役割を果たすことになる。この場合、前記相は色が白ではなく、オフホワイト又はクリーム色であることが認められる。
【０１０２】
本発明は、上述した実施例に限定されるものでなく、その構成及び詳細においてさまざまに変化させることができる。
【０１０３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】超臨界フッ化Ｃ８相の２９Ｓｉ固体ＮＭＲを示している。前記相のグラフが上部に記載され、公知のシリコン共鳴が側部に記載されている。
【図２】超臨界フッ化Ｃ８相の１３Ｃ固体ＮＭＲを示している。
【図３】超臨界Ｃ１８相の２９Ｓｉ固体ＮＭＲを示している。前記相のグラフが上部に示され、公知のシリコン共鳴が側部に示されている。
【図４】超臨界Ｃ１８相の１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ固体ＮＭＲスペクトルを示している。公知の炭素共鳴が、実験スペクトル及び共鳴を右側にして、左手側に示されている。
【図５】エンドキャップしていない超臨界Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ、３ｍ粒子）でのテストミックス溶離を示すクロマトグラムである。使用した移動相は、１．００ｍｌ／分の流量で送給した５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。１ｍ当たり１４１０００理論段のカラム効率は、前記相がエンドキャップされていないとすると、驚くべきものである。
【図６】超臨界エンドキャップ超臨界Ｃ１８相でのＮ，Ｎ−ＤＭＡ及びトルエンの溶離を示すクロマトグラムである。溶離の状態は、エンゲルハート試験に従って、シラノール活量の低下を示している。
【図７】超臨界エンドキャップ超臨界Ｃ１８相でのパラ、メタ及びオルトトルイジンの溶離を示すクロマトグラムである。前記３つの化合物の共溶出は、エンゲルハート試験に従って、シラノール活量の低下を示している。
【図８】超臨界エンドキャップ超臨界Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ、３ｍ粒子）での４つのβ遮断薬の溶離を示すクロマトグラムである。使用した移動相は、１．００ｍｌ／分の流量でｐＨ４のＭｅＯＨ／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液であり、プロテレノール、ｔｒ＝１．１９２ｍｉｎ．、プロネタロール、ｔｒ＝５．７０６ｍｉｎ．、ラベタロール、ｔｒ＝８．０７０ｍｉｎ．、プロプラノロール、ｔｒ＝１１．９６８ｍｉｎ．であった。
【図９】超臨界エンドキャップ超臨界Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ、３ｍ  粒子）での４つの鎮痛薬の混合物の急速溶離を示すクロマトグラムである。使用した移動相は２．００ｍｌ／分の流量のＡｃＮ／ＫＨ２ＰＯ４（２５：７５、ｖ／ｖ）であり、ケトプロフェン、ｔｒ＝０．９４４ｍｉｎ．、ナプロキセン、ｔｒ＝１．１１１ｍｉｎ．、１．６２６ｔｒ＝１．６２６ｍｉｎ．、イブプロフェン＝２．５６８ｍｉｎ．であった。
【図１０】水素化ケイ素の２９Ｓｉ  ＮＭＲを示している。
【図１１】３−メカプトプロピルシリカの２９Ｓｉ  ＮＭＲを示している。
【図１２】ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル化キニーネをキラルテンプレート（１００ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．、３μｍ  粒子）として使用する、エンドキャップしていない超臨界流体生成のキラル固定相でのＮ−３，５−ジニトロベンゾイル−フェニルグリシンのラセミ混合物の溶離を示すクロマトグラムである。使用した移動相は、酢酸を用いて６．０のｐＨａ に調整したメタノール−０．０５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｖ／ｖ）であった。流量は環境温度で０．１５ｍｌ／分であり、２５４ｎｍのＵＶ波長を選択した。注入量は１０μｍであった。試料はメタノール中に溶解した。
【図１】
2006522328.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2006522328.tif 000018
【国際調査報告】
2006522328.tif 000019
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