(57)【要約】  本発明は、ヒト細胞及びポリマー繊維の複合体を含む組成物、及び治療用途のためのそれらの使用方法に関する。かかる組成物の製造方法もまた提供する。本発明は、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー及び保存血小板を含む組成物、並びに創傷治癒の促進及び止血実現のためのそれらの使用を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板の豊富な血漿及び精製されたポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを含む組成物であって、前記血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られるものである、上記組成物。
【請求項２】
前記ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーがポリβ−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維スラリーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
血小板の豊富な血漿５０％及びポリβ−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維スラリー５０％である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリβ−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維スラリーが、蒸留水５ｍｌ当たり１ｍｇのポリβ−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
当量の血小板の豊富な血漿及びポリβ−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維スラリー、並びに少なくとも０．１２５％のＣａＣｌ２溶液である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣａＣｌ２溶液が１０％ＣａＣｌ２溶液である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも０．１２５％のマグネシウムをさらに含む、請求項３、４又は６に記載の組成物。
【請求項８】
血小板の豊富な血漿及び０．９％ＮａＣｌ  １．０ｍｌ当たり１ｍｇのポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む組成物であって、前記血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られるものである、上記組成物。
【請求項９】
血小板の豊富な血漿及び０．９％ＮａＣｌ  １．０ｍｌ当たり２ｍｇのポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む組成物であって、前記血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られるものである、上記組成物。
【請求項１０】
医薬組成物である、請求項２から６、８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
ゲルである、請求項２から６、８又は９に記載の組成物。
【請求項１２】
後で治療に使用するために、哺乳動物から単離された血小板を保存する方法であって、ゲルが形成されるように前記血小板をポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーと接触させるステップと、後で治療に使用するために前記ゲルを凍結するステップとを含む方法。
【請求項１３】
哺乳動物から単離された血小板を凝集させる方法であって、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを前記血小板と接触させて前記血小板を凝集させるステップを含む方法。
【請求項１４】
哺乳動物から単離された血小板を活性化する方法であって、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを前記血小板と接触させ、それによって前記血小板を活性化するステップを含む方法。
【請求項１５】
創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進する方法であって、前記患者において創傷治癒が促進されるように、血小板の豊富な血漿及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を含む組成物を創傷に投与するステップを含み、前記血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られるものである、上記方法。
【請求項１６】
止血を必要とする患者において止血時間を短縮する方法であって、前記患者において止血時間が短縮されるように、血小板の豊富な血漿及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を含む組成物を創傷に投与するステップを含み、前記血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られるものである、上記方法。
【請求項１７】
前記保存血小板が前記患者から得られる、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
血小板−ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維ゲルを製造する方法であって、等量のキトサン繊維と血小板を含む混合物よりも多数のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維と血小板が結合するように、単離された血小板の集団とポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維溶液とを１０％塩化カルシウム溶液の存在下で混合するステップを含む方法。
【請求項１９】
血小板−繊維ゲルを製造する方法であって、血小板が繊維に結合し、それによって血小板−繊維ゲルを形成するように、（ｉ）単離された血小板の集団と、（ｉｉ）キトサンに結合するよりも多数の血小板が結合する繊維とを混合するステップを含み、前記混合ステップが溶液中で実施される、上記方法。
【請求項２０】
前記混合ステップが１０％塩化カルシウム溶液の存在下で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記繊維とほぼ同じ表面積を有するキトサンよりも少なくとも２５％、５０％、１００％、２００％又は５００％多い血小板が前記繊維に結合する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．導入
本発明は、ヒト細胞とポリマー繊維の複合体を含む組成物に関する。本発明は、さらに、治療用途におけるかかる組成物の使用方法にも関する。本発明は、ヒト細胞とポリマーの複合体を含む組成物の製造方法にも関する。本発明は、さらに、α又はβコンホメーションのポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー（ｐＧｌｃＮＡｃ）及び保存血小板細胞を含む組成物にも関する。本発明は、本発明の組成物を用いた創傷治癒及び止血実現のための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００３年２月２４日に出願された米国仮出願第６０／４４９，４７８号、及び２００３年２月２５日に出願された米国仮出願第６０／４５０，１９５号の優先権を主張するものである。これらの特許の各々を参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００３】
２．背景
２．１  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー（ｐＧｌｃＮＡｃ）及び他の多糖
ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン多糖種は、一般に、その構成単糖が１→４コンホメーションで結合した高分子量ポリマーである。一部がｐＧｌｃＮＡｃからなる多糖の諸特性、活性及び使用については多数の文献がある。かかる材料種は総称して「キチン」と呼ばれ、脱アセチルキチン誘導体は「キトサン」と呼ばれる。１８２３年頃、これらの用語が最初に使用されたときに、キチンとキトサンは別個の明確で独特な不変の化学種として天然に常に存在し、キチンは完全にアセチル化された組成物であり、キトサンは完全に脱アセチル化された組成物であると考えられていた。しかし、ほぼ１世紀の後、「キチン」及び「キトサン」という用語は、実際には極めて曖昧であることが判明した。これらの用語は、明確な化合物を指すのではなく、実際には、物理的及び化学的諸特性が大きく異なる化合物群を指している。これらの相違は、生成物の分子量の違い、アセチル化度の違い、及び共有結合された種特異的タンパク質、単一アミノ酸、無機汚染物質などの汚染物質の有無に起因する。現在でも、「キチン」及び「キトサン」という用語は曖昧に使用されており、実際には、定義が不明瞭な多数の異なる化合物の混合物を指している。
【０００４】
例えば、甲殻類の外殻、真菌の菌蓋などの従来の供与源から単離された「キチン」の諸特性は、予測不可能なほど多様である。かかる多様性は、種の違いだけでなく、「キチン」産生種の生化学的特性の一部を決定する環境及び季節的効果の変動にも起因している。実際、原材料の予測不可能な多様性は、キチン産業の成長を遅らせる要因になっている。
【０００５】
完全にアセチル化されたｐＧｌｃＮＡｃ、又は有機若しくは無機不純物によって汚染されていないｐＧｌｃＮＡｃを製造することは困難である。ＭｃＬａｃｈｌａｎ等（McLachlan, A.G. et al., 1965, Can. J. Botany 43: 707-713）はキチンの単離について報告したが、得られた「純粋な」物質は、実際には、タンパク質及び他の汚染物質を含んでいることがその後の研究で判明した。
【０００６】
脱アセチル及び部分脱アセチルキチン調製物は、高反応性、高密度陽イオン電荷、強力な金属キレート能、タンパク質を共有結合させる能力、多数の水系溶媒への溶解性など潜在的に有益な化学的諸特性を示す。しかし、上述したように、これらの調製物の予測不可能な多様性のために、これらの不均一化合物の有用性は極めて限定されている。例えば、現在利用可能な「キチン」及び「キトサン」は、再現性のないデータやばらつきの大きな許容されない実験結果を生じている。また、利用可能な調製物は、十分に均質又は純粋なものではなく、その調製成分は、これらの調製物が様々な用途、特に医学用途における使用が許容されるには再現性が不十分である。
【０００７】
治療用途に有用な純粋で一定したポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン生成物の製造に成功した研究もある（Kulling et al., 1998, Endoscopy 30 (3): S41-2; Cole et al., 1997, Clin. Cancer Res. 3 (6): 867-73; Maitre et al., 1999, Clin. Cancer Res. 1999, 5 （5): 1173-82）。ポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体を止血剤又は創傷治癒剤として使用することは、特に有効であることが判明した（Cole et al., 1999, Surgery. 126 (3): 510-7; Chan et al., 2000, J. Trauma 48 (3): 454-7）。また、ポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン生成物の使用及び誘導体に関する特許がいくつかある。米国特許第５，６２２，８３４号は、タンパク質がなく、他の有機汚染物質が実質的になく、無機汚染物質が実質的にない約４，０００〜１５０，０００個のサブユニットからなるポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミンを単離する化学的及び機械的力による方法を記載している。米国特許第５，６２３，０６４号は、純度、アセチル化度及び分子量が異なるポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン及びその誘導体を記載している。米国特許第５，８４６，９５２号は、薬物／ポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン組成物を記載している。米国特許第５，６２４，６７９号は、ポリ−β−１−４→アセチルグルコサミン又はその誘導体を含む生分解性バリア形成材料を記載している。米国特許第５，８５８，３５０号は、ポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン又はその誘導体によって封じ込められた生体細胞を記載している。米国特許第５，６３５，４９３号は、ポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミンによって封じ込められた薬物を含めた抗腫瘍薬／ポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン、及びかかる薬物の抗腫瘍送達方法を記載している。米国特許第５，６８６，１１５号は、別の化合物に架橋されたポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体を含むハイブリッド組成物を記載している。米国特許第６，０６３，９１１号は、エンドセリン拮抗物
質及びポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン又はポリ−β−１−４→Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体を含む抗腫瘍組成物を記載している。米国特許第５，５１０，１０２号は、凝固剤として働き、組成物を創傷に接触させることによって創傷の凝固を促進するために使用することができる組成物を開示している。この組成物は、血小板の豊富な血漿と、アルギナートなどの止血剤である生体適合性ポリマーとを含む。
【０００８】
２．２  血小板相互作用
本発明の組成物は、血小板を長期間保存するために、様々な方法で使用することができる。これは、保存後に活性化することができる、又は依然として活性である血小板は、多数の有益な化合物及び相互作用を生じることができるからである。保存血小板の生存能力は、保存されていた自己由来の血小板を含む本発明の組成物を患者に投与する自家療法又は手順においても重要な意味を有する。
【０００９】
血小板の最初の発見以来続いている血小板と「異質」材料との相互作用の研究（Donne, 1842, Bizzozero et al., 1882a and 1882b）。既存の証拠によれば、血小板と異質材料との相互作用には２つのステップが含まれる。第一に、フィブリノーゲン（Mason et al., 1971, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 320: 123-128; Zucker and Vromen, 1969, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87: 758-762; Feuerstein and Sheppard, 1993, Biomaterials 14: 137-147）、フィブロネクチン（Lewandowska et al., 1992, J. Biomedical Materials Res. 26: 1343-1363）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）（Kuwahara et al., 1999, Blood 94: 1149-1155）などの接着性タンパク質を含めて、血清タンパク質（Silberberg, 1962, J. Physical Chem. 66: 1872-1883）は、表面に吸着するとコンホメーションが変化する。これらの相互作用は、本質的に「無作為」である異質材料に巨大分子が結合する複数の点を必要とするが、その結果、溶液相のタンパク質コンホメーションが変わる。第二に、吸収されたタンパク質のコンホメーション変化によって、血小板細胞表面タンパク質を「活性化する」構造ドメインが露出する。例えば、フィブリノーゲンは「フィブリン様」コンホメーションをとることができ、したがって、α２ｂβ３複合体を介して細胞内への（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ）シグナル伝達を惹起する。同様に、吸収されたｖＷＦは、「ずれた（ｓｈｅａｒｅｄ）」コンホメーションをとることができ、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体に結合することができる。かなり多くの証拠によって、α２ｂβ３（例えば、Rozenberg and Stormorken, 1967, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 19: 82-85; Coller et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 325-338; Ginsberg et al., 1983, J. Clin. Invest. 71: 619-624）及びＧＰＩｂ−ＩＸ（例えば、Mattson et al., 1984, 走査型Electron Microscopy 4: 1941-1950）が、血小板と吸収された血漿タンパク質との相互作用に重要であることが実際に示されている。α２ｂβ３、ＧＰＩｂ−ＩＸ及び他の表面タンパク質が、吸収されたリガンドによって活性化されるプロセスは、かなり漠然としているが、局所的レベルの高い吸収された血漿タンパク質が、血小板膜上で糖タンパク質細胞表面タンパク質のクラスターを形成し、細胞骨格のシグナル伝達機構をまとめて、細胞内へのシグナル伝達複合体を活性化している可能性が高い。
【００１０】
血漿タンパク質ＦＸＩＩ（ハーゲマン因子）は、凝固、繊維素溶解、カリクレイン−キニン及び補体の血漿防御システムと関連があることが判明した。ＦＸＩＩは、負に帯電した表面を含む複雑な現象によって活性化することができる。ＦＸＩＩは、多数の陰イオン性表面にも結合し、多数の陰イオン性表面との接触によってタンパク質分解により活性化し、血小板表面と表面的に会合して（Iatridis et al., 1953, Thromb. Et Diath. 11: 355-371）細胞の微小環境内の固有の凝固経路を活性化する。血小板表面で起こる一連のタンパク質分解ステップはあまり理解されていないが、心肺バイパス中の血小板に対するアプロチニンの保護作用は、細胞が体外循環（extracorpealizaton）装置において異質表面に接触したときの「カリクレイン様」タンパク質分解現象の阻止に一部起因していると仮定されている（Bradfield and Bode, 2002, Blood, in press）。
【００１１】
細胞内カルシウムシグナル伝達は、血小板活性化応答の調整において中心的役割を果たし、血小板がガラス（Ikeda et al., 1996, J. Cellular Biocem. 61: 292-3000; Hussain and Mahaut-Smith, 1999, J. Physiol. 524: 713-718）及びポリリジン（Ikeda et al., 1996, J. Cellular Biocem. 61: 292-3000）に接触したときに起こることが判明した。血小板が物質と相互作用する公知の機序は、依然として理解しにくい。
【００１２】
２．３  血液保存に伴う問題
国内と世界の両方の血液供給についての懸念が着実に増加している。既存の供給の健全性及び信頼性と、在庫を次第に増加させることができるかどうかとの両方が問題になっている。その理由の１つは、血液製剤の保存安定性が比較的短いことにある。現在、輸血用血液製剤の主流である濃縮ＲＢＣ（赤血球濃縮物又はＲＣＣ）などは、保存期間が４２日に限られている。その後は、ＡＴＰレベルがかなり低下し、ｐＨの大きな減少とともに、生存能力が欠如し、或いは、生存可能であったとしても注入後インビボでの循環寿命が極めて短いことがはっきりと示されている。全血は、長期間保存されない。血小板の場合には、現在の保存期間はさらに短く、標準で２２℃で５日である。一般に、血小板は、静かに連続撹拌しながら２０〜２４℃（ほぼ室温）で保存される。血小板は、一般に、最高５日間保存され、その後は廃棄されなければならない。赤血球は、一般に、４２日間保存される。血小板及び赤血球をより長期間保存することが当分野では求められている。例えば、America's Blood Supply in the Aftermath of September 11, 2001というタイトルの米国連邦議会報告書によれば、２００１年９月１１日のニューヨークにおけるテロ後、その時期では通常よりも約５０万ユニット多い血液が収集された（H. R. Comm. Energy and Commerce, America's Blood Supply in the Aftermath of September 11, 2001, 107th Cong., 107-137 (September 10, 2002)）。この報告書は、血液供給システムが血液を十分な速さで処理できず、又は血液を長期間保存できなかったので、この時期に収集された血液の大部分が処分されたことも示している。生存者が少なく緊急輸血の必要性が限られていることが明らかになると、献血者は自分たちの血液の行方を知って落胆し、血液供給団体の関係者も多量の血液を扱うことができないことに失望した。献血された血液の必要性、したがって、献血された血液の保存改善は、依然として重要である。米国内では３秒に１人の患者が血液を必要とするが、それでも血液はヒト組織であり製造することができないので、献血されなければならない。
【００１３】
血小板を含む本発明の組成物は、様々な治療用途に使用することができ、輸血を目的とした期間が過ぎた後に現在は処分されている保存血小板を利用することができる点で、現行用途よりも特に有利である。
【００１４】
本発明は、血小板と、創傷を治療し、止血を実現し、細胞を移植するのに有益な組成物を製造するために開発されたポリマー繊維との分子相互作用に関連する、本発明者らによって発見された新たな知識に基づいている。本願のセクション２又は他のすべてのセクションにおけるいかなる参考文献の引用又は特定も、かかる参考文献が従来技術として本発明に利用可能であることを認めるものと解釈すべきではない。
【発明の開示】
【００１５】
３．概要
本発明は、ヒト細胞とポリマー繊維の複合体を治療用途に使用するための組成物及び方法に関する。本発明は、細胞が、重合されたＮ−アセチルグルコサミンと組み合わせるとゲルを形成するという本発明者の発見に一部基づいている。また、本発明者らは、重合されたＮ−アセチルグルコサミンが、ヒト細胞上の細胞表面タンパク質に結合することによって複合体を形成することを発見した。特に、本発明者らは、予想外にも、血小板が、血小板とポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの複合体において活性化されることを明らかにした。
【００１６】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、該繊維が哺乳動物細胞上に存在する１個又は複数のタンパク質に結合することによって哺乳動物細胞と相互作用するものである、上記医薬組成物を提供する。１個又は複数の細胞表面タンパク質は、ＧＰＩＩＩａ、ＧＰＩｂ又はα２ｂβ３インテグリンとすることができる。
【００１８】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、該哺乳動物細胞集団が一次哺乳動物細胞集団である、医薬組成物も提供する。
【００１９】
本発明は、さらに、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、組成物が０℃以下で凍結され、又は２２℃以下で保存される、医薬組成物も提供する。
【００２０】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、相互作用の結果、細胞が活性化される、医薬組成物に関する。細胞の活性化は、細胞の形態学的変化として表され得る。細胞の形態学的変化は、足（ｐｏｄｉａ）の伸長を含むことができる。
【００２１】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、細胞集団が、リンパ球、顆粒球、好塩基球、好中球、リンパ性細胞、マクロファージ、内皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、間葉細胞、造血細胞、顆粒球、赤血球、好酸球、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）、肝細胞、骨髄細胞、幹細胞又は胎児細胞を含む、医薬組成物を提供する。細胞集団は、実質的に精製された集団とすることができる。細胞集団は、異なる組織又は体液に由来する細胞を含むこともできる。好ましい実施形態においては、細胞集団は血小板を含む。血小板は、実質的に精製されたものとすることもできる。他の好ましい実施形態においては、細胞集団は、赤血球を含むことができる。赤血球は、実質的に精製されたものとすることもできる。
【００２２】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、ポリマー繊維は走査型電子顕微鏡で測定して長さ約５μｍ〜１ｃｍである、医薬組成物を提供する。ポリマー繊維は、走査型電子顕微鏡で測定して長さ約５０μｍ〜７５０μｍとすることができる。ポリマー繊維は、走査型電子顕微鏡で測定して長さ約１００μｍ〜５００μｍとすることができる。ポリマー繊維は、走査型電子顕微鏡で測定して幅１０〜５００ｎｍとすることができる。ポリマー繊維は、走査型電子顕微鏡で測定して幅２５〜２５０ｎｍとすることができる。ポリマー繊維は、走査型電子顕微鏡で測定して幅５０〜１００ｎｍとすることができる。
【００２３】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、ポリマー繊維がポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンである、医薬組成物を提供する。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンは、微細藻類のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンとすることができる。微細藻類のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンは、微細藻類のコスキノディスクス（Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓ）属、キクロテラ（ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属又はタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属から得ることができる。微細藻類のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンは、微細藻類のタラシオシラ属から得ることができ、タラシオシラ種は、フルビアテリス（ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ）又はワイスフロッギー（ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）である。
【００２４】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、ポリマー繊維が、ゲル、固体、液体、スポンジ、発泡体、スプレー（ｓｐｒａｙ）、エマルジョン、懸濁液、又は溶液、マット、糸、ガーゼ、縫合糸、ビーズ、ミクロスフェア又はミクロフィブリルとして製剤化される、医薬組成物にも関する。
【００２５】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、組成物が、縫合糸として製剤化されたポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維及び血小板を含む、医薬組成物も提供する。
【００２６】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、単離細胞の体積とポリマー繊維懸濁液の体積の比が１：１である、医薬組成物も提供する。
【００２７】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、本発明が、さらに、二価の陽イオンも含む、医薬組成物も提供する。二価の陽イオンは、マグネシウムとすることができる。二価の陽イオンは、カルシウムとすることができる。カルシウムは、１０％ＣａＣｌ２溶液とすることができる。
【００２８】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、細胞集団が少なくとも１、２、３又は４日間単離された哺乳動物である、医薬組成物も提供する。
【００２９】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、組成物が、さらに、１種類又は複数の増殖因子又はサイトカインを含む、医薬組成物も提供する。増殖因子は、神経増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＮｏｔｃｈのＲＢＰＪκ結合ドメイン、レチノイン酸、肥満細胞増殖因子又はトロンボポイエチンとすることができる。増殖因子は、インターフェロン又は腫瘍壊死因子とすることができる。増殖因子は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６などのインターフェロンとすることができる。
【００３０】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、単離細胞が少なくとも５分間保存される、医薬組成物も提供する。
【００３１】
本発明は、単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物であって、ポリマー繊維がポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンである、医薬組成物も提供する。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維は、精製されたものとすることができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、アセチル化されていてもよい。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、脱アセチル化されていてもよい。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、タンパク質を含まず、他の有機汚染物質を実質的に含まず、無機汚染物質を実質的に含まないものとすることができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、半晶質とすることができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、生分解性及び生体適合性とすることができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、分子量約８００，０００ダルトン〜約３０，０００，０００ダルトンとすることができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンは、分子量約８００，０００ダルトン〜約３０，０００，０００ダルトンの半晶質を含むことができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、分子量約１０，０００ダルトン〜約８００，０００ダルトンとすることができる。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンは、分子量約１０，０００ダルトン〜約８００，０００ダルトンの半晶質を含むことができる。
【００３２】
本発明は、一次哺乳動物細胞の単離集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維とを、細胞と繊維が相互作用する条件下で混合することによって製造された組成物も提供する。
【００３３】
本発明は、ＧＰＩＩＩａ及びＧＰＩｂ表面タンパク質を発現する細胞と複合体を形成するポリマー繊維を特定する方法であって、標識されたＧＰＩＩＩａ及びＧＰＩｂ表面タンパク質と細胞を接触させるステップと、細胞からタンパク質を溶出するステップと、細胞に結合した繊維が特定されるように標識の強度又は有無を測定するステップとを含む方法も提供する。
【００３４】
本発明は、細胞と複合体を形成しているポリマーを特定する方法であって、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を標識するステップと、標識されたポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を試験ポリマー繊維と混合するステップと、この混合繊維試料及び純粋なポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン試料に細胞集団を添加するステップと、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンと細胞の結合が正常に起こる条件下にその混合物をおくステップと、その混合物を溶出させて非結合性細胞と繊維を除去するステップと、細胞へのポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの結合を競合的に阻害するポリマー繊維が特定されるように、標識されたポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの量を比較するステップとを含む方法も提供する。
【００３５】
本発明は、後で治療に使用するために、哺乳動物から単離された細胞集団を保存する方法であって、ゲルが形成されるように、前記細胞をポリマー繊維と接触させるステップと、そのゲルをその後使用するために凍結するステップとを含む方法も提供する。
【００３６】
本発明は、哺乳動物から単離された細胞集団を活性化する方法であって、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を細胞と接触させ、それによって細胞を活性化するステップを含む方法も提供する。
【００３７】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進する方法であって、前記患者において創傷治癒が促進されるように、哺乳動物から単離された細胞集団及びポリマー繊維を含む組成物を創傷に投与するステップを含み、前記細胞が、保存細胞から得られ、前記ポリマーに結合する方法も提供する。細胞は、患者から得ることができる。細胞とポリマー繊維は、組成物を患者に投与するステップの直前、又は組成物を患者に投与するステップと同時に混合することができる。
【００３８】
本発明は、止血を必要とする患者において止血時間を短縮する方法であって、患者において止血時間が短縮されるように、哺乳動物から単離された細胞集団と、細胞が相互作用するポリマー繊維とを含む組成物を創傷に投与するステップを含み、細胞が保存細胞から得られる方法も提供する。細胞は、患者から得ることができる。細胞とポリマー繊維は、組成物を患者に投与するステップの直前、又は組成物を患者に投与するステップと同時に混合することができる。
【００３９】
本発明は、血小板の豊富な血漿及び精製されたポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを含む組成物であって、血小板の豊富な血漿が、保存血小板から得られる組成物、を提供する。ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーは、ポリ−β−１−４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維スラリーを含むことができる。組成物は、血小板の豊富な血漿５０％及びポリ−β−１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維スラリー５０％とすることができる。ポリ−β−１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維スラリーは、蒸留水５ｍｌ当たり１ｍｇのポリ−β−１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む。
【００４０】
本発明は、血小板の豊富な血漿及び精製されたポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを含む組成物であって、組成物が、等量の、血小板の豊富な血漿及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維スラリー、並びに少なくとも０．１２５％のＣａＣｌ２溶液である、組成物を提供する。ＣａＣｌ２溶液は、好ましくは、約１０％ＣａＣｌ２溶液である。組成物は、さらに、少なくとも０．１２５％のマグネシウムを含むことができる。
【００４１】
本発明は、血小板の豊富な血漿及び０．９％ＮａＣｌ溶液約１．０ｍｌ当たり約１ｍｇのポリ−β−１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む組成物であって、血小板の豊富な血漿が、保存血小板から得られる組成物を提供する。血小板の豊富な血漿は、保存血小板から得ることができる。
【００４２】
本発明の実施形態においては、組成物は医薬組成物とすることができる。本発明の別の実施形態においては、組成物はゲルとすることができる。
【００４３】
本発明は、後で治療に使用するために、哺乳動物から単離された血小板を保存する方法であって、ゲルが形成されるように、血小板をポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーと接触させるステップと、そのゲルをその後使用するために凍結するステップとを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明は、哺乳動物から単離された血小板を凝集させる方法であって、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを細胞と接触させて、血小板を凝集させるステップを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明は、哺乳動物から単離された血小板を活性化する方法であって、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを細胞と接触させ、それによって血小板を活性化するステップを含む方法を提供する。
【００４６】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進する方法であって、患者において創傷治癒が促進されるように、血小板の豊富な血漿及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を含む組成物を創傷に投与するステップを含み、血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られる方法を提供する。保存血小板は、患者から得ることができる。
【００４７】
本発明は、止血を必要とする患者において止血時間を短縮する方法であって、前記患者において止血時間が短縮されるように、血小板の豊富な血漿及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を含む組成物を創傷に投与するステップを含み、前記血小板の豊富な血漿が保存血小板から得られる方法を提供する。保存血小板は、患者から得ることができる。
【００４８】
本発明は、血小板−ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維ゲルを製造する方法であって、等量のキトサン繊維と血小板を含む混合物よりも多数のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維と血小板が結合するように、単離された血小板の集団とポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維溶液とを１０％塩化カルシウム溶液の存在下で混合するステップを含む方法を提供する。
【００４９】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、ｐＧｌｃＮＡｃをバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップであって、細胞表面タンパク質が、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができる条件下で、細胞表面及び試験化合物上で発現され、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成されるステップと；ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップとを含む方法を提供する。かかる方法においては、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップは、ｐＧｌｃＮＡｃと細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含むことができる。かかる方法においては、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップは、試験化合物と細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含むことができる。この方法は、インビトロで実施することができる。この方法は、インビボで実施することができる。細胞表面は、血小板細胞表面とすることができる。細胞表面は、赤血球表面とすることができる。試験化合物は繊維とすることができる。繊維はポリマー繊維とすることができる。繊維はタンパク質繊維とすることができる。タンパク質はヒトタンパク質とすることができる。
【００５０】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、ｐＧｌｃＮＡｃをバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップであって、細胞表面タンパク質が、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができる条件下で、細胞表面及び試験化合物上で発現され、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成されるステップと；ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを決定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップとを含む方法を提供する。本方法は、さらに、止血を促進することができる試験化合物、又は創傷治癒を加速することができる試験化合物が治療薬候補となるように、試験化合物が止血を促進することができるかどうか、又は創傷治癒を加速することができるかどうかを判定するステップを含むことができる。別の実施形態においては、本方法は、さらに、ゲルを形成することができる試験化合物が細胞保存剤候補となるように、試験化合物が、血小板と、場合によっては、１０％塩化カルシウム溶液とも混合されたときにゲルを形成することができるかどうかを判定するステップを含むことができる。
【００５１】
別の実施形態においては、本方法は、さらに、ｐＧｌｃＮＡｃをバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップであって、試験化合物の非存在下の条件下で、細胞表面タンパク質が細胞表面及び試験化合物上で発現されるステップの前に、ある分子の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができる条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質及び前記分子と接触させ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成されるステップを含む方法によって適切な試験化合物を特定するステップと、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成が前記分子によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、前記分子によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、前記分子が適切な試験化合物として特定されるステップを含む。ｐＧｌｃＮＡｃは、ｐＧｌｃＮＡｃを分子と接触させるステップの前に、細胞表面タンパク質と接触させることができる。ｐＧｌｃＮＡｃは、ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させるステップの前に、分子と接触させることができる。細胞表面タンパク質は、ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質及び試験化合物と接触させるステップの前に、分子と接触させることができる。細胞表面タンパク質は、固体表面上に固定することができる。細胞表面タンパク質は、固体表面上に固定された細胞膜中に存在することができる。
【００５２】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物並びにバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップと、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップとを含む方法を提供する。ｐＧｌｃＮＡｃは、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物と接触させるステップの前に細胞表面タンパク質と接触させられる。ｐＧｌｃＮＡｃは、ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させるステップの前に試験化合物と接触させられる。細胞表面タンパク質は、ｐＧｌｃＮＡｃ及び試験化合物と接触させるステップの前に試験化合物と接触させられる。ｐＧｌｃＮＡｃはｐＧｌｃＮＡｃ繊維である。試験化合物は繊維である。繊維はポリマー繊維である。繊維はタンパク質繊維である。タンパク質はヒトタンパク質である。
【００５３】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物並びにバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップと、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップとを含み、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップが、ｐＧｌｃＮＡｃと細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含むことができる方法を提供する。
【００５４】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物並びにバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップと、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップとを含み、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップが、試験化合物と細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物並びにバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップと、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップを含み、止血を促進することができる試験化合物、又は創傷治癒を加速することができる試験化合物が治療薬候補となるように、試験化合物が止血を促進することができるかどうか、又は創傷治癒を加速することができるかどうかを判定するステップをさらに含む方法を提供する。
【００５６】
本発明は、治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物並びにバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップと、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップであって、試験化合物によるｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成の阻害によって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定されるステップを含み、ゲルを形成することができる試験化合物が細胞保存剤候補となるように、試験化合物が、血小板と、場合によっては、１０％塩化カルシウム溶液とも混合されたときに、ゲルを形成することができるかどうかを判定するステップをさらに含む方法を提供する。
【００５７】
本明細書において使用する「単離された細胞」、「単離された血小板」又は「単離された血小板」という用語は、その本来の環境から変更された若しくは取り出された、又はその両方の細胞若しくは血小板を意味する。哺乳動物の血小板に関しては、哺乳動物の体から取り出されたときに、細胞は単離されたことになる。これは、細胞が依然として混合細胞集団中にあってもあてはまる。
【００５８】
本明細書において使用する「マトリックス」という用語は、任意の固体又は半固体構造、例えばゲル構造を意味する。特に、「マトリックス」は、ポリマー繊維組成物及び細胞を指す。
【００５９】
４．図面の簡単な説明
図１は、ｐＧｌｃＮＡｃマトリックス１ｍｇ当たりの血小板数が、最初に混合されたｐＧｌｃＮＡｃ１ｍｇ当たりの血小板数に比例して増加することを示したグラフである。飽和点は認められなかった。観測された最大比は５ｘ１０８血小板／ｍｇ  ｐＧｌｃＮＡｃであったが、これは上限として確定されなかった。グラフ上で１及び２で示された比は、新しい血小板と脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃスポンジの反応のものである。グラフ上で３で示された比は、保存血小板と完全アセチルｐＧｌｃＮＡｃスラリーのものである。
【００６０】
図２Ａは、４種類のｐＧｌｃＮＡｃ製剤、すなわち、脱アセチルスポンジ、脱アセチル膜、アセチルスポンジ及びアセチル膜に対するｐＧｌｃＮＡｃ１ｍｇ当たりの血小板数を示すグラフである。脱アセチル製剤及びスポンジ製剤は、それぞれアセチル製剤及び膜製剤よりも多数の血小板を含んだ。図２Ｂは、会合した蛍光標識血小板を含む４種類の製剤の肉眼観察図であり、相対蛍光度を示している。
【００６１】
図３Ａは、伸びた仮足がｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維に接触している活性化血小板細胞の走査型顕微鏡写真である。図３Ｂは、標識されたｐＧｌｃＮＡｃ繊維と会合した血小板の蛍光顕微鏡写真、及びｐＧｌｃＮＡｃ繊維と会合した血小板の位相顕微鏡写真（ｐｈａｓｅ  ｍｉｒｃｒｏｇｒａｍ）である。
【００６２】
図４Ａは、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックス１ｍｇ当たりの吸収された血小板数が、α２ｂβ３の阻害剤、すなわち、エキスタチン及びロプロスト（ｌｌｏｐｒｏｓｔ）の存在下で対照（担体）よりも減少したことを示すグラフである。図４Ｂは、レーン１〜３が、コロイド状クーマシー染色（ＣＣＢ）で染色された総血小板タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動を示す写真である。レーン１は全血小板由来のタンパク質であり、レーン２はｐＧｌｃＮＡｃに吸収されたタンパク質及び血漿由来のタンパク質であり、レーン３はｐＧｌｃＮＡｃに吸収されたタンパク質単体由来の血漿から得られるタンパク質である。レーン４及び５は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ａｌｋ  ｐｈｏｓ）を用いた、血小板細胞表面タンパク質のより厳密性の高い変性及び染色のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動である。Ｐ−セレクチン、ＧＰＩＩＩａ、ＧＰＩｂ及びＧＰＩＩｂを含めて、いくつかの表面タンパク質が確認された。
【００６３】
図５は、ｐＧｌｃＮＡｃマトリックス上の凍結乾燥された血小板の走査型電子顕微鏡写真であり、細胞が活性化された形態をとっていることを示している。
【００６４】
図６は、レーン１〜３が全血小板由来の糖タンパク質ＩＩｂ、ＩＩａ及びＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動であり、レーン４〜６が、ｐＧｌｃＮＡｃに吸収されたタンパク質由来の糖タンパク質ＩＩｂ、ＩＩａ及びＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動である写真である。
【００６５】
図７は、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックスによって吸収された血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及びＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体の有無を確認するための抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及び抗ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ抗体を用いたウエスタンブロット分析のグラフである。
【００６６】
図８は、レーン１〜３がコロイド状クーマシー染色（ＣＣＢ）によって染色された赤血球由来の総タンパク質を示す写真である。レーン１は全赤血球由来のタンパク質であり、レーン２はｐＧｌｃＮＡｃによって吸収された試料由来の赤血球及び血漿であり、レーン３はｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維によって吸収された試料由来の血漿単体である。レーン４及び５は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ａｌｋ  ｐｈｏｓ）で染色された赤血球表面タンパク質である。レーン４は全赤血球由来の表面タンパク質であり、レーン５はｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維によって吸収された試料由来の表面タンパク質である。レーン６及び７は、ｐＧｌｃＮＡｃと会合した赤血球表面タンパク質の有無を確認するための抗グリコホリンＡ（レーン６）及び抗バンドＩＩＩ抗体（レーン７）を用いたウエスタンブロットである。
【００６７】
図９は、赤血球表面タンパク質がｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維によって吸収されたことを確認するための抗グリコホリンＡ及び抗バンドＩＩＩ抗体を用いたウエスタンブロット分析のグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ヒト細胞とポリマーの複合体を含む組成物の治療用途のための使用に関する。本発明は、細胞とポリマーの複合体を含む組成物の製造方法も包含する。本発明の組成物においては多数のタイプの細胞を使用することができる。同様に、本発明の組成物においては様々な繊維を使用することもできる。繊維候補をスクリーニングし、細胞と相互作用して本発明の複合体を形成する繊維を特定する方法を本明細書に記載する。本発明は、本発明の組成物を用いた創傷治癒及び止血実現のための方法にも関する。特に、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー（ｐＧｌｃＮＡｃ）及び保存血小板を含む組成物を本明細書に開示する。
【００６９】
本発明は、血小板がポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー（ｐＧｌｃＮＡｃ）繊維とどのように相互作用するかの基本的な機構の解釈についての本発明者らの判断に一部基づいている。本発明者らは、血小板とグルコサミンポリマーの相互作用を媒介する血小板表面上のタンパク質を明らかにした。本発明者らは、蛍光抗体プローブを用いた共焦点顕微鏡法、並びにｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維と直接接触（約２０オングストローム以内）する血小板上の脂質及びタンパク質を測定する化学架橋試験によって、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維と血小板の接触点に局在する血小板細胞表面タンパク質／接着分子複合体（例えば、α２ｂβ３−フィブリノーゲン）を明らかにした。
【００７０】
５．１  本発明の組成物及び方法において使用することができる細胞
本発明の方法及び組成物において使用することができる細胞としては、繊維芽細胞、平滑筋細胞、血小板、赤血球などが挙げられるが、これらだけに限定されない。単離することができ、本発明のポリマーと相互作用してゲルを形成することができるあらゆる細胞型を本発明の組成物及び方法に使用することができる。好ましい実施形態においては、使用される細胞は哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。しかし、細胞は他の生物から得ることもでき、単細胞生物とすることもできる。例えば、有益な単細胞微生物を使用して、かかる生物を必要とする患者に投与するための組成物を産生することができる。別の実施形態においては、細胞は、血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ、インスリン、ペプチド、ホルモンなどの、但し、これらだけに限定されない生物学的に有用な化合物であるポリペプチドをコードする遺伝子を生成又は過剰発現するように操作された組換え細胞である。かかる化合物のリストをセクション５．４．３に示す。
【００７１】
本発明の組成物は、細胞が実質的に生細胞である細胞集団を含む。しかし、さほど好ましくない実施形態においては、本発明の組成物及び方法の細胞の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、２０％、１０％又は５％が生細胞である。
【００７２】
本発明の組成物でできた各生成物において、ヒト細胞を利用するときには、細胞はすべて単一の個体に由来することが好ましい。かかる生成物は、自家療法用途に有利である。別の実施形態においては、本発明の組成物を生成するのに使用される細胞は、別個の起源、すなわち、同じ種の異なる個体（同種異系）又は異なる種（異種）のどちらかに由来する。非限定的な例は、異なるヒト個体から単離された血小板の組み合わせである。
【００７３】
細胞は、哺乳動物から新たに単離することができ、或いは単離し、約１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間  ７時間、１０時間、１５時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日又は１５日保存することができる。ある実施形態においては、単離細胞は、室温若しくは低温（例えば、それぞれ２２℃又は４℃）で保存することができ、かつ／又はセクション５．４．３に記載の保存及び他の目的のための添加剤を用いて保存することができる。
【００７４】
ある実施形態においては、本発明の組成物のポリマーに接触する細胞の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％が凝集する。別の実施形態においては、本発明の組成物のポリマーに接触する細胞の約５〜１５％、１０〜２０％、１５〜２５％、３０〜４０％、２５〜３５％、４０〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、７５〜８５％、８０〜９０％、８５〜９５％、９０〜１００％又は９５〜１００％が凝集する。
【００７５】
ある実施形態においては、本発明の組成物は、目的とする細胞型（例えば、血小板）に関して精製された細胞集団を含む。ある特定の実施形態においては、精製された細胞集団は、合計で４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％以下の、目的細胞型以外の型の細胞を含む。したがって、かかる実施形態においては、本発明の組成物の対象となる細胞型は、組成物中の全細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。
【００７６】
本発明の組成物においては、各細胞は、ポリマー繊維と１箇所又は数箇所の接触点を有することができる。ある実施形態においては、個々の細胞は、ポリマー繊維に封入されていない。本発明のポリマー繊維は、細胞の吸収を可能にし細胞とポリマー繊維のより開放的な相互作用を可能にするマトリックスを形成する。これは、細胞送達用にポリマー繊維に封入された細胞とは明らかに異なる。かかる例においては、ポリマー繊維は、細胞とポリマー繊維の相互作用、及び／又は繊維と相互作用している各細胞間、例えば、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーと会合した血小板（この血小板は相互作用し一緒に凝集する）の相互作用を可能にする開放的なマトリックスではなく、被膜として機能する。本発明の組成物においては、ポリマー繊維は、少なくとも１個の他のポリマー繊維及び／又は１個の細胞に接触している場合には凝集体と考えられ、細胞は、少なくとも１個のポリマー繊維及び／又は１個の他の細胞に接触している場合には凝集体と考えられる。凝集は、標準的な微視的技術によって容易に判定することができる。好ましい実施形態においては、複数の他のポリマー繊維及び／又は細胞が接触することによって、本発明の組成物中のポリマー繊維と細胞が凝集する。
【００７７】
本発明の組成物を製造する際には、免疫系の血小板及び細胞など、但し、これらだけに限定されない細胞集団又は細胞型の混合物をポリマーと混合することができる。かかる混合物においては、ポリマーと相互作用することができる１種類の細胞型のみが特定されればよい。かかる細胞型混合物は、天然に存在し得るものであり、血中の場合と同様に、タンパク質及び他の非細胞成分と混合することができ、又は細胞型を単離し精製し、次いで天然に存在してもしなくてもよい所望の比で細胞集団を混合することによって調製することができる。かかる混合物は、セクション５．４．３に記載の添加剤などの天然又は合成添加剤を含むこともできる。
【００７８】
本発明の組成物中の細胞数を調節することを望む理由は多数ある。例えば、ある実施形態においては、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックスを飽和させずに、ある数の血小板をｐＧｌｃＮＡｃ調合物と混合することができる。得られた組成物は後で使用するために凍結することができ、又はすぐに使用することができる。組成物を適用する直前に追加の細胞を添加することができる。別の実施形態においては、患者の体から得られた細胞又は体液が、血小板がまだ結合していないｐＧｌｃＮＡｃ繊維と相互作用し、又はポリマー繊維マトリックスによって吸収されるように、組成物を適用することができる。
【００７９】
細胞がポリマー繊維と相互作用して複合体を形成する限り、あらゆるタイプの細胞を本発明の組成物及び方法に使用することができる。一部の実施形態においては、ポリマー繊維と相互作用する細胞は、ある種の表面タンパク質を発現する。これらの非限定的ないくつかの例としては、赤血球など、但し、これらだけに限定されない細胞上に存在するバンドＩＩＩ及びグリコホリンＡ、並びに血小板など、但し、これらだけに限定されない細胞上に存在するＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３が挙げられる。
【００８０】
本組成物及び方法に使用される細胞は、（上述したように新しい又は保存された）一次細胞又は細胞系とすることができ、或いはヒト、動物、植物、哺乳動物、脊椎動物、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ又はウシを含めて、但し、これらだけに限定されないあらゆる種に由来することができる。
【００８１】
好ましい実施形態においては、本組成物及び方法に使用される細胞集団は、精製され、又は少なくとも高度に濃縮されている。しかし、本発明の方法及び組成物においては、純粋な集団である細胞を使用する必要は必ずしもない。
【００８２】
本発明に使用される細胞は、当業者に通常知られている多数の方法のいずれによってでも単離することができる。例えば、細胞を単離する一般的な方法の１つは、抗体結合の差を利用して患者から細胞集団を回収することである。１つ又は複数のある分化段階の細胞に分化抗原抗体が結合し、選択された分化抗原を発現する所望の細胞が、蛍光活性化細胞選別によって単離細胞集団から分離される。以下のセクションに、本発明の方法及び組成物に使用される様々なタイプの細胞を単離し培養する例示的な方法を示す。また、当分野で知られるあらゆる方法を使用することができる。
【００８３】
特定の実施形態においては、細胞は幹細胞である。
【００８４】
５．１．１  血小板
ある実施形態においては、本発明の組成物及び方法に血小板を使用することができる。血小板は、血中に存在する無色の細胞である。その粘着性のある細胞表面は、出血を止める血塊を形成する役割を果たす。傷から突然出血したときには、血小板が傷に集まり、血流を止めようとする。無機質のカルシウム、ビタミンＫ及びフィブリノーゲンは、血小板が血塊を形成するのを補助する。血小板は、フィブリノーゲンと反応してフィブリンを形成し始める。次いで、フィブリンは、血球をその中に捕捉するクモの巣状の網目を形成する。血塊の形成を補助するためには、カルシウム及びビタミンＫが血中に存在しなければならない。したがって、本発明の組成物に血小板を入れることによって、創傷部位に投与されるとすぐに機能し、創傷治癒プロセスを促進することができる血小板を含む生成物が得られる。
【００８５】
本発明の組成物及び方法に使用される血小板細胞は、セクション６に記載する手段などの当分野で既知の任意の手段によって単離することができる。好ましい実施形態においては、細胞は、血小板の豊富な血漿として単離される。
【００８６】
好ましい実施形態においては、血小板は保存され、又は輸血用としては期限の切れた保存血液から得られる。ほとんどの保存血小板、血小板と血漿、及び保存血液は、通常、２２℃で約３〜５日後に破壊される。したがって、本組成物及び方法は、通常では破壊される血小板をさらに保存し、使用する手段を提供する。米国特許第６，２２１，６６９号及び米国特許第６，４１３，７１３号に開示された技術などの血小板保存技術は、血小板の不活性化に基づいている。温度も、血小板が保存中に生物学的に活性化されるのを阻害する。低温（４又は２２℃）では活性化が阻害され、細胞形態が保持される。上述したように保持され、かつ／又は保存された細胞を本発明の方法及び組成物に使用することができる。
【００８７】
一実施形態においては、血小板はアフェレーシスによって採取される。アフェレーシスでは、血小板又は細胞は、ドナーから取り出され、血清の残りの部分（例えば、赤血球、白血球及び血漿）がドナーに戻される。
【００８８】
凍結細胞−ポリマー繊維組成物を含む本発明の組成物は、数日、数ヶ月又は数年貯蔵することができる。本組成物は、患者が本組成物を必要とするまで保存されることが好ましい。別の実施形態においては、例えば計画手術の前に、患者が血液又は細胞抽出から回復し、患者から取り出された血液又は細胞を自然に入れ替えることが可能になる期間、本組成物は保存される。
【００８９】
ある実施形態においては、本発明の組成物のポリマーに接触する血小板の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％が凝集する。
【００９０】
血小板は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）も産生する（Ross 1978, Cell 14: 203; Antoniades et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 2635）。ＰＤＧＦは、血小板に加えて、いくつかの細胞型によって産生されることが現在知られている。ＰＤＧＦは、間葉に由来するほぼすべての細胞、すなわち、血液、筋肉、骨／軟骨及び結合組織細胞に対する分裂促進因子であることが見出された（Raines, 1993, in Biology of Platelet-Derived Growth Factor, Westermark, B. and C. Sorg, eds., Basel, Karger, p. 74）。ＰＤＧＦは血小板によって産生され、創傷部位における血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）及び繊維芽細胞の増殖を担う。ある実施形態においては、ＰＤＧＦ、又は血小板によって産生される他の生物学的に活性な薬剤、例えば、ホルモン、ペプチド（セクション５．４．３参照）の影響を受ける他の細胞型を含む血小板−ポリマー繊維マトリックスを有することが有利である。かかる実施形態においては、第２のタイプの細胞は、ポリマー繊維と相互作用する必要は必ずしもない。本明細書に記載する発明は、ポリマー繊維と相互作用する少なくとも１種類の細胞型を提供する。非限定的な例は、繊維芽細胞を含むポリマー繊維−血小板マトリックスである。これは、膜として製剤され、創傷部位に局所的に又は創傷部位の内部に移植又は適用することができる。かかるマトリックス組成物は、血小板によるＰＤＧＦ産生の利点が得られ、ＰＤＧＦは血塊の形成中に繊維芽細胞に影響を及ぼす。かかる実施形態においては、繊維芽細胞は、本組成物を投与する直前に本組成物に添加することができる。組成物が単に血小板及びポリマー繊維しか含まない場合には、組成物の血小板は、投与後、組成物に接触する内因性の繊維芽細胞に対して同じ効果を有することができる。
【００９１】
別の実施形態においては、血小板−ポリマー繊維組成物は、血小板によって産生される生物学的に活性な薬剤の生成及び放出手段として、他の細胞型のインビトロ培養物に添加される。別の実施形態においては、かかるマトリックスは、薬剤をインビボで産生し放出するために移植することができる。別の実施形態においては、本発明の血小板−ポリマー繊維マトリックスは、治療用途用の生物学的に活性な薬剤を産生し、その後収集／精製するために、培養物中に維持することができる。さらに別の実施形態においては、貴重な生物学的に活性な化合物を産生する血小板、かかるβ細胞よりもはるかに稀な細胞型が、血小板及びポリマー繊維を含む本発明の組成物に入れられる。かかる実施形態においては、血小板は、この稀な細胞を維持するのに役立つＰＤＧＦなどの作用物質を産生し、この稀な細胞によって産生される化合物の産生を増大させ、この稀な細胞自体の増殖及び樹立も増大させる。当業者は、かかる組成物のインビボとインビトロの両方での適用を明確に予見することができる。好ましい実施形態においては、実施例セクション９に記載のように、血小板は活性化され、かつ／又は活性化形態を示す。
【００９２】
一実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物及び関係する方法は、血小板の豊富な血漿を含み、血小板の豊富な血漿は、自動血小板濃縮システムによって製造される。本発明の組成物及び方法の血小板の豊富な血漿を調製するのに使用が企図される自動血小板濃縮システムには、全血からの血小板平均回収率が約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％のものがある。かかる自動化システムは、従来の遠心分離技術よりも、血小板の活性化が約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％低いものもある。かかる自動化システムは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来血管新生因子（ＰＤＡＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、セロトニン、カテコールアミン、ＡＤＰ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＡＴＰ、第Ｖ因子、フォンウィルブランド因子８、トロンボキサンＡ２、カルシウム又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含めて、但し、これらだけに限定されない、本発明の組成物及び方法において使用される血小板によって産生される増殖因子及び他の化合物を生成するために使用することもできる。ある関連実施形態においては、自動血小板濃縮システムはＳｍａｒｔＰＲｅＰ（商標）又はＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）である。かかる自動化システムは、本発明の組成物及び方法と併せると特に有用である。本発明の組成物の血小板又は因子は、それらが投与される被験者自身に由来し、かつ／又は血小板は本発明の方法によって保存される。或いは、血小板は、ＨＬＡ（ヒトリンパ球抗原）タイプに基づいて患者に特異的に一致する家族又は団体のドナーから得ることができる。
【００９３】
５．１．２  赤血球（ＲＢＣ）
赤血球は、酸素及び二酸化炭素の運搬を担う。ＲＢＣは、最終分化細胞であり、さらに分化することはない。赤血球は、約１２０日間生存し、その後、肝臓及び脾臓において食細胞によって吸収される。赤血球のヘモグロビン中の鉄の大部分は、回収され再使用される。この分子のヘム部分の残りは、分解されて胆汁色素となり、肝臓によって排泄される。赤血球は、グリコホリンＡ及びバンドＩＩＩを含めて、多数の細胞表面タンパク質を発現する。グリコホリンＡに関しては、各ＲＢＣは、その原形質膜中に埋め込まれたこの分子のコピーをおよそ５００，０００個含む。したがって、赤血球がグリコホリンＡを介してｐＧｌｃＮａｃ繊維と相互作用するという本発明者の発見は、予想外であるだけでなく、細胞表面上のグリコホリンＡタンパク質の数のために、潜在的な相互作用強度に基づく多数の用途の基礎を提供するものである。
【００９４】
血塊形成中に、赤血球は、フィブリン網にからまった状態となり、したがって血塊形成及び止血に寄与する。したがって、本発明のポリマー繊維と複合化された赤血球は、創傷治癒及び止血を促進するために使用することができる。
【００９５】
好ましい実施形態においては、赤血球は、輸血用としては期限の切れた保存血液から得ることができる。保存血液中のほとんどの保存赤血球は、通常、２２℃で約３〜５日後に破壊される。したがって、本組成物及び方法は、通常では破壊される赤血球をさらに貯蔵し、使用する手段を提供する。赤血球及びポリマー繊維を含む本発明の組成物の別の用途としては、自家療法が挙げられる。創傷又は塗布対象、及び内部で使用される器具に、ポリマー繊維と相互作用する赤血球を含む本発明の組成物を適用することによって、患者の免疫系による拒絶の可能性が低下する。
【００９６】
５．１．３  間葉細胞
間葉細胞も使用することができる。間葉細胞は、一般に、多分化能細胞として認識されており、何回も分化して子孫細胞を産生することができる。子孫細胞は、軟骨、骨、腱、靭帯、骨髄間質及び結合組織を含めた骨格組織を最終的に生じることができる。
【００９７】
５．１．３．１  幹細胞
治療用途に関して前駆細胞の最も重要なタイプの１つは、間葉に由来する前駆細胞である。間葉前駆体は、極めて多数の異なる組織を生じる（Caplan, 1991, J. Orth. Res 641-650）。これまでのほとんどの研究は、軟骨細胞及び骨芽細胞に分化することができる細胞の単離及び培養を必要とする。関連する前駆細胞集団を単離するために開発された系は、最初にニワトリ胚において良い結果が得られた（Caplan, 1970, Exp. Cell. Res. 62: 341-355; Caplan, 1981, 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology, pp. 37-68; Caplan et al., 1980, Dilatation of the Uterine Cervix 79-98; DeLuca et al., 1977, J. Biol. Chem. 252: 6600-6608; Osdoby et al., 1979, Dev. Biol. 73: 84-102; Syftestad et al., 1985, Dev. Biol. 110: 275-283）。ニワトリ間葉細胞が軟骨細胞及び骨に分化する条件が明確にされた。軟骨及び骨に関しては、マウス又はヒト間葉の肢の諸特性は、同一ではないとしてもかなり類似していると考えられる（Caplan, 1991, J. Orth. Res. 641-650）。骨及び軟骨に分化することができる間葉細胞は、骨髄からも単離された（Caplan, 1991, J. Orth. Res. 641-650）。
【００９８】
Ｃａｐｌａｎ他、１９９３、米国特許５，２２６，９１４号及びＣａｐｌａｎ他、１９９６、米国特許５，４８６，３５９号は、間葉幹細胞を骨髄から単離する例示的な方法を記載している。
【００９９】
いくつかの骨髄単離プロトコルが報告されており、前駆細胞を得るために使用することができる。ラット骨髄から得られる単細胞懸濁液は、Goshima et al., 1991, Clin. Orth. and Rel. Res. 262: 298-311に従って調製することができる。骨髄由来のヒト幹細胞培養物は、以下のとおり、Bab et al., 1988, Bone Mineral 4: 373-386に記載されたように調製することができる。骨髄細胞全体は、５人の患者から得られる。骨髄試料は、腸骨稜又は大腿骨幹中部（ｍｉｄｓｈａｆｔ）のどちらかから分離される。体積３ｍｌの骨髄試料を、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び０．０５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン−硫酸塩を含む無血清最少必須培地（ＭＥＭ）６ｍｌに移す。主として単細胞からなる懸濁液を、既報（Bab et al., 1984, Calcif. Tissue Int. 36: 77-82; Ashton et al., 1984, Calcif. Tissue Int. 36: 83-86）のように、調製物をシリンジで吸引し、それを１９、２１、２３及び２５番ゲージ針を通して連続的に数回吐出させることによって調製する。固定体積の血球計を用いて細胞を計数し、濃度を１〜５ｘ１０８総骨髄細胞／ｍｌ懸濁液に調節する。既報（Shteyer et al., 1986, Calcif. Tissue Int. 39: 49-54）のように、ウサギの骨髄細胞及び脾臓細胞全体を用いて、正及び負の対照細胞懸濁液を設定することができる。
【０１００】
５．１．３．２  軟骨細胞
軟骨細胞は、正常成熟軟骨組織から得ることができる。例えば、１９８９年７月１１日に発行されたＧｒａｎｄｅの米国特許第４，８４６，８３５号、及び１９９１年８月２０日に発行されたＶａｃａｎｔｉ他の米国特許第５，０４１，１３８号は、関節軟骨をコラゲナーゼ溶液で消化し、続いてインビトロ培地における軟骨細胞の分裂増殖によって、移植前に軟骨細胞を得ることを開示している。
【０１０１】
５．１．４  結合組織
結合組織は、繊維芽細胞、軟骨、骨、脂肪及び平滑筋細胞を含む。繊維芽細胞は、結合組織細胞中で最も分化が少ない細胞であり、体全体の結合組織中に散在する。繊維芽細胞は、Ｉ型及び／又はＩＩＩ型コラーゲンの特徴的な分泌によって確認することができる。繊維芽細胞は、組織創傷に移動し、創傷を治癒及び分離するコラーゲン性マトリックスを分泌することができる。また、繊維芽細胞は、その局所的な合図（ｃｕｅ）に応じて、結合組織ファミリーの他のメンバーに分化することができる。したがって、繊維芽細胞は、ポリマーと潜在的に相互作用する細胞として、かつ／又はポリマーと相互作用する細胞に加えて、本発明の組成物と組み合わせることができる。繊維芽細胞は、当業者に公知の方法によって、骨髄間質を含めて、但し、これらだけに限定されない多種多様な組織から単離することができる。
【０１０２】
繊維芽細胞の有用性は、その可塑性、すなわち、多数の細胞型に分化する能力だけでなく、培養において繊維芽細胞を増殖させる容易さ、及びその迅速な分裂にある。したがって、繊維芽細胞は、当業者に周知の基本的組織培養技術、及び多数の容易に入手可能な出版物、例えば、Freshney, 1994, Culture of Animal Cells, third edition, Wiley-Liss Inc., New Yorkに記載された基本的組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０１０３】
５．１．５  内皮
内皮細胞も、本発明の組成物及び方法、特に心血管組織に関係する治療用途に使用することができる。内皮細胞は、補体による溶解及び活性化に抵抗するように改変され、参照により本明細書に援用する米国特許第６，１００，４４３号に記載されたものなどの非自己宿主に挿入されたときに異質細胞を除去するための宿主の免疫機構を回避するように改変された内皮細胞を含めて使用することができる。
【０１０４】
関連組織からの内皮膜の単離及び分離は、Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ他、米国特許第５，６１０，００８号に記載されている。また、内皮培養技術は、科学系出版物（例えば、Haudenschild et al., 1976, Exp. Cell Res. 98: 175-183; Folkman and Haudenschild, 1980, Nature 288: 551-556）に記載されている。ヒトにおいては、内皮細胞は、ヒトさい静脈（Jaffe et al., 1973）及びヒト脂肪（Kern et al., 1983, J. Clin. Invest. 71:1822-1829）及び皮膚（Davison et al., 1983, In Vitro 19: 937-945）毛細血管から単離が成功している。一般に、内皮細胞は、周囲の組織からコラゲナーゼ処理によって遊離し、増殖因子の存在下で適切な基質上で増殖する（Zetter, 1994, in Culture of Animal Cells, third edition, Wiley-Liss Inc., New York, p. 334参照）。
【０１０５】
５．１．６  神経外胚葉性細胞
５．１．６．１  神経幹細胞
一般に、中枢神経系における神経形成は、誕生前又は誕生直後に終わると考えられている。近年、いくつかの研究によって、少なくともある程度新しいニューロンが成体脊椎動物の脳に追加し続けられていることを示す証拠が提示された（Alvarez-Buylla and Lois, 1995, Stem Cells (Dayt) 13: 263-272）。この前駆体は、一般に、脳室壁にある。ニューロン前駆体は、この増殖性領域から、微小環境がその前駆体の分化を誘発する標的位置に向かって移動すると考えられている。Alvarez-Buylla and Lois, 1995, Stem Cells (Dayt) 13: 263-272に概説されているように、脳室下領域からの細胞がインビボとインビトロの両方でニューロンを生成できることがいくつかの研究で報告された。
【０１０６】
成体の脳のニューロン前駆体は、神経細胞移植用の細胞源として使用することができる（Alvarez-Buylla, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2074-2077）。神経堤細胞も、神経堤細胞が存在する微小環境から受け取る指示に従って移動し、異なる細胞神経細胞型に分化することができる多能性神経細胞であると長年認識されてきた（LeDouarin and Ziller, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5: 1036-1043）。
【０１０７】
成熟ニューロン及びグリアは、当業者に公知の方法によって単離することができる。
【０１０８】
５．１．６．２  内分泌細胞
血中のインスリン供給を増加させることによって治療効果を示すことができる膵臓β細胞などの特殊な細胞も、本方法及び組成物に使用することができる。膵島（ランゲルハンス島）、肝細胞又は他のタイプの腺細胞も使用することができる。
【０１０９】
甲状腺、副甲状腺及び膵臓の内分泌細胞は、Ｃｏｏｎ他、米国特許第５，８８８，８１６号及び同第５，６４６，０３５号に記載の方法によって単離し、培養することができる。
【０１１０】
５．１．７  胎児細胞
成体の傷害を受けた脳に胎児の脳組織を移植したときに明らかな行動上の効果を有することが判明したことによって、神経変性障害を改善するように設計された移植プロトコルにおける細胞源候補として、ヒト胎児の組織が注目された（Bjorklund, 1993, Nature 362: 414-415; McKay, 1991, Trends Neurosci. 14: 338-340）。それにもかかわらず、倫理的及び実用的な観点から、胎児組織は取り扱いが困難な細胞源となった。胎児でもそれ以外でもインビトロ培養で増殖される神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、本方法及び組成物に使用される所望の量の細胞を得る細胞源を提供する。胎児の細胞は、例えば、Sabate et al., 1995, Nature Gen. 9: 256-260によって開発されたプロトコルを用いて、一次培養に入れることができる。非限定的な例として、その手順は以下のとおりである。ヒト胎児の脳細胞の一次培養物は、妊娠５〜１２週後の合法中絶から得られたヒト胎児から単離することができる。娩出は、音波検査器の制御下でシリンジ駆動の静かな吸引によって実施することができる。無菌冬眠培地（ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）に回収した胎児を実体顕微鏡下、無菌フード中で解剖する。まず、ペニシリンＧ  ５００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及び抗真菌薬５μｇ／ｍｌを含む冬眠培地中に脳全体を取り出す。６〜８週齢の胎児の場合には、骨髄膜を慎重に除去した後、脳を前方（終脳胞及び間脳）、後方部分（中脳、脳橋及び小脳原基（ｅｎｌａｇｅ））及び後方全体に分離する。８週齢を超える胎児の場合には、増殖細胞を含むと予想される線条体  海馬、皮質及び小脳帯域が実体顕微鏡下で可視化され、別個に解剖される。細胞は、１５％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｅｒｏｍｅｄ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、又はグルコース、６ｇ／ｌ、グルタミン２ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、インスリン２５ｕｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）トランスフェリン１００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、亜セレン酸ナトリウム３０ｎＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、プロゲステロン２０ｎＭ（Ｓｉｇｍａ）、プトレシン６０ｎＭ（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリンＧ（５００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びファンギゾン５μｇ／ｍｌを含むＢｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ−Ｓａｔｏ培地３９をわずかに改変したヒト組換えｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む既知組成の無血清培地（ＤＳ−ＦＭ）のどちらかに移される。ゼラチン（０．２５％ｗｔ／ｖｏｌ）、続いてマトリゲル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ラミニンが豊富で微量の１／２０希釈増殖因子を含む基底膜抽出物）で被覆された組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ又はＮｕｎｃ）において１０％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で細胞約４０，０００／ｃｍ２を増殖させる。
【０１１１】
５．１．８  造血細胞
リンパ球、顆粒球、好塩基球、好中球、リンパ性細胞及びマクロファージを含めて、但し、これらだけに限定されない免疫系細胞も使用することができる。かかる免疫細胞を含む本発明の組成物及び方法は、刺激すること又は抑制すること、及び免疫応答又は創傷治癒プロセスを調整することに治療上使用することができる。肥満細胞は、ヒスタミン供給を増加させることによって効果を有することができ、本発明の組成物及び方法とともに使用して、創傷治癒、炎症又はアレルギー関連プロセスを調整することができる。かかる細胞は、当業者に公知の任意の方法によって得ることができる。
【０１１２】
成熟造血細胞に加えて、造血幹細胞も本方法及び組成物に使用することができる。
【０１１３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）をインビトロで単離し、増殖させ、維持するあらゆる技術を、本発明のこの実施形態においては使用することができる。これを実施することができる技術は、（ａ）将来の宿主、又はドナーから単離された骨髄細胞に由来するＨＳＣ培養物の単離及び樹立、或いは（ｂ）同種でも異種でも、先に樹立された長期ＨＳＣ培養物の使用を含む。特定の本発明の実施形態においては、ヒト骨髄細胞は、腸骨稜後方から針吸引によって得ることができる（例えば、Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73: 1377-1384参照）。本発明の好ましい実施形態においては、ＨＳＣは、高度に濃縮することができ、実質的に純粋な形にすることができる。この濃縮は、長期培養前、培養中又は培養後に実施することができ、当分野で公知の任意の技術によって実施することができる。骨髄細胞の長期培養物は、例えば、改変Ｄｅｘｔｅｒ細胞培養技術（Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91: 335）又はＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養技術（Witlock and Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3608-3612）を用いて樹立し、維持することができる。
【０１１４】
ＨＳＣを単離する別の技術は、Milner et al., 1994, Blood 83: 2057-2062に記載されている。骨髄試料は得られると、フィコール−ハイパック密度勾配遠心分離法によって分離され、洗浄され、二色間接免疫蛍光抗体結合によって染色され、次いで蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分離される。同時に、この細胞は、個々の系統に関連する抗原ＣＤ３４＋ｌｉｎ−が発現しない未成熟サブセットを含めて、ＣＤ３４＋造血幹細胞が、骨髄から採取された細胞から単離されるように、ＩｇＧ抗体で標識される。
【０１１５】
造血前駆細胞が所望の場合には、造血前駆細胞及び／又はその子孫の存在は、一般に知られているインビトロコロニー形成アッセイ（例えば、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅを検出するアッセイ）によって検出することができる。別の例として、造血幹細胞用のアッセイ（例えば、再培養（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）後の前駆体形成能力を検出するアッセイである脾臓フォーカス形成アッセイ）も当分野で知られている。
【０１１６】
５．１．９  上皮細胞
５．１．９．１  幹細胞及びケラチン生成細胞
上皮幹細胞（ＥＳＣ）及びケラチン生成細胞は、皮膚、腸内膜などの組織から公知手順によって得ることができる（Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229）。皮膚などの重層上皮組織においては、再生は、基底層に最も近い層である胚芽層内の前駆細胞の有糸分裂によって起こる。腸内膜内の前駆細胞は、この組織の再生速度を速める。患者又はドナーの皮膚又は腸内膜から得られるＥＳＣは、組織培養によって増殖させることができる（Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229; Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771）。
【０１１７】
５．１．９．２  唾液腺上皮細胞
非形質転換唾液腺上皮細胞の培養及び増殖条件は、Ｃｈｏｐｒａの米国特許第５，４６２，８７０号に記載されている。
【０１１８】
５．１．９．３  肝幹細胞
肝幹細胞は、１９９４年４月２８日の国際公開第９４／０８５９８号に記載されている方法によって単離することができる。
【０１１９】
５．１．９．４  成熟肝細胞
コラゲナーゼ−肝臓−かん流方法が、ラット（Seglen et al., 1976, in Methods in Cell Biology, D.M. Prescott, Ed., Vol. XIII, pp. 29-83, Academic Press, New York）とヒト（Butterworth et al., 1989, Cancer Res. 49:1075-84）の両方から得られる肝臓細胞（肝細胞）を単離するために記載されている。脂質結合グリコサミノグリカン基質の使用を含めて、適切な培養条件は、Ｙａｄａ他の米国特許第５，６２４，８３９号に教示されている。
【０１２０】
５．１．９．５  乳腺細胞（ｍａｍｍａｒｙ  ｃｅｌｌ）
特定の一実施形態においては、本方法及び組成物での使用が求められる上皮細胞集団は乳腺上皮細胞からなる。これらは、米国特許第４，４２３，１４５号の方法によって単離することができる。
【０１２１】
５．１．９．６  頚部細胞
頚部ケラチン生成細胞は、表皮ケラチン生成細胞を培養するために使用される方法の変法を用いた培養で増殖させることができる（Stanley and Parkinson, 1979, Int. J. Cancer 24: 407-414）。この方法は、２つのステップ、すなわち、一次培養と二次培養を含む。一次培養は、血清、増殖因子、及び照射された又はマイトマイシンＣを与えられたＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３繊維芽細胞の存在下で、解離した上皮を組織培養フラスコ又はプレートに播種するステップを含む。二次培養物は、繊維芽細胞支持細胞上で増殖される。
【０１２２】
５．１．９．７  腎臓幹細胞
哺乳動物の腎臓は、成熟尿収集システムを最終的に形成する一連の形態形成運動を子宮芽（ｕｔｅｒｉｃ  ｂｕｄ）に促す後腎間葉から出現する（Nigam and Brenner, 1992, Curr. Opin. Nephrol. Huper 1:187-191。ウォルフ管の上皮増殖物である子宮芽は、初期胚期における上皮多様性獲得の分化経路に沿って、収縮し、隣接する間葉の凝縮を引き起こす。このプロセスをインビトロで研究しようとする試みが報告されている。器官培養において、後腎は、胚性脊髄を誘発物質として用いて、尿細管を形成するように誘導することができる。子宮芽によってインビボで、又は脊髄によってインビトロで後腎間葉を誘導する特異的形質導入因子（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は知られていないが、細胞特異的マーカーによって、分化プログラムが前駆細胞中で誘発されることが示された（Karp et al., 1994, Dev. Biol. 91:5286-5290）。
【０１２３】
５．１．９．８  成熟腎細胞
成熟腎臓は様々な細胞型からなる。これらの細胞型のうち多数の単離又は分離が科学系出版物に記載されている（例えば、Taub et al., 1989, In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 770-775; Wilson et al., 1985, Am. J. Physiol. 248: F436-F443; Smith and Garcia-Perez et al. 1985., Am. J. Physiol. 248:F1-F7; Pizzonia et al. 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. 27A: 409-416）。また、成熟ヒト腎臓の一次培養物を培養する方法が記載されている（Detrisac et al., 1984, Kidney Int. 25: 383-390; States et al., 1984, Biochem. Med. Metab. Biol. 36: 151-161; McAteer et al., 1991, J. Tissue Cult. Methods 13: 143-148）。説明のための一例において、近位尿細管の諸特性を有する成体腎細胞を培養することの主な特徴は、以下のとおり、すなわち、外部皮層組織断片の酵素消化の進行；培養用単細胞の採取：血清の存在下でプラスチック支持細胞層上での細胞の高密度増殖である（Kempson et al., 1989, J. Lab. Clin. Med. 113:285-296）。
【０１２４】
５．１．９．９  肺の上皮細胞
均一な肺上皮細胞系は、米国特許第５，３６４，７８５号に記載の方法によって単離し、培養することができる。
【０１２５】
気管支及び気管細胞の培養が成功するかどうかの鍵は、無血清培地である。無血清培地は、末端分化を防止し、繊維芽細胞の増殖に対して選択性がある（LaVeck and Lechner, 1994, in Culture of Animal Cells, third edition, Wiley-Liss Inc., New York, p. 325）。
【０１２６】
５．１．１０  他の細胞型
本発明の組成物及び方法に使用することができる他の細胞型は多数ある。特に、創傷治癒に有用な化合物、すなわち、トロンビンなどの生物学的に有用な化合物を分泌する細胞、並びに組織成分又は細胞層が産生されるように、ポリマー繊維マトリックス上で増殖する、或いは増殖を誘発することができる細胞。細胞表面タンパク質ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ、ＧＰＩＩＩｂ（血小板上で発現される細胞など、但し、これらだけに限定されない）、Ｐ−セレクチン、グリコホリンＡ及び／又はバンドＩＩＩ（赤血球上で発現される細胞など、但し、これらだけに限定されない）を発現する細胞を、本発明の組成物及び方法に使用することができる。かかる表面タンパク質を発現する細胞が関与する疾患は、本発明の組成物及び方法によって治療することができる。
【０１２７】
上記細胞型に加えて、本発明の組成物及び方法は、造血性細胞、顆粒球、赤血球、好酸球、上皮細胞、肝細胞、骨芽前駆細胞（骨芽細胞を形成する幹細胞）、骨芽細胞及び／又は骨髄細胞を含むことができる。本発明の組成物及び方法は、幹細胞、胎児細胞など、但し、これらだけに限定されない、すべての細胞型の前駆細胞を含むこともできる。
【０１２８】
本明細書において開示される方法又は参照される方法に加えて、様々な起始組織及び体液を形成する細胞型の他の単離方法も当業者によく知られている。
【０１２９】
５．２  本発明の組成物及び方法に使用することができるポリマー
本発明の組成物は、セクション５．１に記載の細胞などの細胞、及びポリマー繊維を含む。かかるポリマー繊維は天然のものであっても又は合成のものでもよい。
【０１３０】
本発明の方法及び組成物の実施において、繊維を得ることができる適切なポリマーの例としては、セルロースポリマー、キサンタンガム、ポリアラミド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミド／イミド、ポリアミドヒドラジド、ポリヒドラジド、ポリイミダゾール、ポリベンゾキサゾール、ポリエステル／アミド、ポリエステル／イミド、ポリカーボネート／アミド、ポリカーボネート／イミド、ポリスルホン／アミド、ポリスルホンイミドなど、これらのコポリマー及びブレンドなどが挙げられる。繊維を製造することができる他の適切なクラスのポリマーとしては、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリルなどが挙げられる。ポリマーの例としては、米国特許第ＲＥ３０，３５１号；同第４，７０５，５４０号，同第４，７１７，３９３号；同第４，７１７，３９４号；同第４，９１２，１９７号；同第４，８３８，９００号；同第４，９３５，４９０号；同第４，８５１，５０５号；同第４，８８０，４４２号；同第４，８６３，４９６号；同第４，９６１，５３９号；及び欧州特許出願第０  ２１９  ８７８号が挙げられる。これらすべてを参照により本明細書に援用する。ポリマーは、セルロースポリマー、ポリアミド、ポリアラミド、ポリアミド／イミド又はポリイミドのいずれかの少なくとも１種類を含むことができる。ある実施形態においては、ポリマーとしては、ポリアラミド、ポリエステル、ウレタン、ポリテトラフルオロエチレンなどが挙げられる。本発明の好ましい実施形態においては、重合Ｎ−アセチルグルコサミン繊維又はその誘導体が使用される。最も好ましい実施形態においては、ポリマー繊維は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維又はその誘導体である。ある実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維はβ−１→４配置である。別の実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維はα−１→４配置である。
【０１３１】
好ましい実施形態においては、ポリマー繊維はタンパク質で構成される。かかるタンパク質繊維はヒトタンパク質繊維であることが好ましい。本発明の特定の実施形態においては、繊維としては、ｐＧｌｃＮＡｃと相互作用する受容体などの細胞表面タンパク質（例えば、ＧＰＩＩＩａ、ＧＰＩＩｂ、ＧＰＩｂ並びにバンドＩＩＩ、α２ｂβ３及びグリコホリンＡ）に結合する又はそれと相互作用するタンパク質繊維が挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる表面タンパク質に結合する繊維を特定する方法は、以下のセクション５．３にある。ある実施形態においては、本発明の組成物は、タンパク質繊維ではない繊維を含む。
【０１３２】
天然ポリマー繊維は、当業者に周知の手段によって抽出することができ、本発明の組成物及び方法が投与される患者に対して自己、同種又は異種とすることができる。
【０１３３】
好ましい実施形態においては、ポリマー繊維は生体適合性及び生分解性である。一実施形態においては、ポリマー繊維は生分解性であり、患者に投与又は移植後、およそ又は少なくとも１日、２日、５日、８日、１２日、１７日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日若しくは１００日以内に分解する。
【０１３４】
一実施形態においては、本発明の組成物は、純度がおよそ又は少なくとも１００％、９９．９％、９９．８％、９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％若しくは２０％とすることができる精製されたポリマー繊維を含む。好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用されるポリマー繊維は、９０〜１００％精製されている。
【０１３５】
好ましい実施形態においては、細胞と混合されて本発明の組成物を形成するポリマー繊維はスラリーとして製剤化される。一般に、蒸留水１ｍｌ当たり約０．５〜２０ｍｇの繊維を含むスラリーが使用される。好ましい実施形態においては、蒸留水１ｍｌ当たり１０ｍｇの繊維が使用される。さらに好ましい実施形態においては、蒸留水１ｍｌ当たり２〜５ｍｇの繊維が使用される。特定の実施形態においては、スラリーは、蒸留水１ｍｌ当たり約０．５ｍｇ，１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ又は９ｍｇの繊維を含む。本発明のある態様においては、繊維は、電子顕微鏡法で測定して長さ約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０又は１３０ミクロンとすることができる。本発明の関係するある態様においては、繊維は、電子顕微鏡法で測定して厚さ及び／又は直径約０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．５４、０．５０、０．５５、０．６０又は０．６５ミクロンとすることができる。好ましい実施形態においては、繊維は、電子顕微鏡法、特に、走査型電子顕微鏡法で測定して幅約０．５０ミクロンであり、長さ約２０〜１００ミクロンの範囲にある。別の好ましい実施形態においては、繊維は、電子顕微鏡法、特に、走査型電子顕微鏡法で測定して幅約０．５０ミクロンであり、長さ約５０〜１００ミクロンの範囲にある。さらに別の好ましい実施形態においては、繊維は、電子顕微鏡法、特に、走査型電子顕微鏡法で測定して幅約０．５０ミクロンであり、長さ約７５〜１００ミクロンの範囲にある。
【０１３６】
ある実施形態においては、本発明の組成物中の細胞と相互作用するポリマーは、限定されるものではないが、架橋ポリ（ＡＡｎ−アクリル酸）、ポリ（ＡＡｍ−メタクリル酸ジメチルアミノエチル）などのイオン性合成ヒドロゲルではない。ある実施形態においては、本発明の組成物中の細胞と相互作用するポリマーは、限定されるものではないが、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メトキシ−ＰＥＧメタクリレート）などの非イオン性合成ヒドロゲルではない。ある実施形態においては、ポリマーは、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ−グルタミン酸又はそれらの混合物などのポリ−Ｌ−アミノ酸ではない。ある実施形態においては、ポリマーは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ストロンチウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸マグネシウム又は他のあらゆるアルギン酸塩、それらの混合物などのアルギン酸塩ポリマーではない。ある実施形態においては、ポリマーは、貝、甲殻類、昆虫、真菌又は酵母に由来するものではない。ある実施形態においては、本発明の組成物はコラーゲン繊維を含まない。ある実施形態においては、本発明の組成物はエラスチン繊維を含まない。別の実施形態においては、これらの繊維が本発明の組成物中に含まれる。
【０１３７】
一実施形態においては、本発明の組成物は、２種類以上のポリマー繊維を含む。かかる実施形態においては、かかる繊維によって形成されるマトリックスは、１つの繊維タイプから別の繊維タイプにわたって濃度が徐々に変化することができる。一方の繊維が細胞と異なる相互作用強度を有する場合には、得られた組成物は、細胞との相互作用が段階的に変化する。その結果、マトリックスのある部分における細胞数が多いポリマー繊維マトリックスを得ることができる。これは、特に移植において、貴重な医学的用途を有することができる。繊維の段階的変化は、変化が異なる繊維を使用する場合にも有用になり得る。例えば、実施例８においては、脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃは、アセチルｐＧｌｃＮＡｃよりも多数の血小板に結合した。したがって、繊維の変化によって、細胞と繊維の相互作用に影響を及ぼすことができる。
【０１３８】
本発明の実施形態においては、ポリマー繊維は、セクション５．３に記載の方法によって特定される任意の繊維とすることができる。
【０１３９】
５．２．１  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン
セクション２．１では、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維の構造を詳細に記載した多数の米国特許文献を参照により組み入れた。そのいずれもが本発明の組成物及び方法に使用することができる。
【０１４０】
好ましい実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維は、ａ）細胞体及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む微細藻類を培養し、それによって微細藻類の細胞培養物を産生するステップと、ｂ）ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維が無傷の細胞体から放出されるよう十分な時間にわたり、細胞体を分裂させない濃度の、微細藻類の細胞壁を軟化させることができる化学物質を用いて、ステップ（ａ）の微細藻類の細胞培養物を処理するステップと、ｃ）ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を細胞体から分離し、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン種を単離し、精製するステップを含む方法から得られる。関係する実施形態においては、化学物質はフッ化水素酸である。
【０１４１】
本明細書において使用されるポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー誘導体としては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーの半晶質体；β−１→４コンホメーションで共有結合された約５０〜約１５０，０００個のＮ−アセチルグルコサミン単糖を含む分子量約１０，０００ダルトン〜約３０，０００，０００ダルトンのポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー；β−１→４コンホメーションで共有結合された約５０〜約５０，０００個のＮ−アセチルグルコサミン単糖を含む分子量約１０，０００ダルトン〜約１０，０００，０００ダルトンのポリ−β−１→４−アセチルグルコサミンポリマー；β−１→４コンホメーションで共有結合された約５０〜約１０，０００個のＮ−アセチルグルコサミン単糖を含む分子量約１０，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトンのポリ−β−１→４−アセチルグルコサミンポリマー；β−１→４コンホメーションで共有結合された約５０〜約４，０００個のＮ−アセチルグルコサミン単糖を含む分子量約１０，０００ダルトン〜約８００，０００ダルトンのポリ−β−１→４−アセチルグルコサミンポリマー；脱アセチル化された少なくとも１個のＮ−アセチルグルコサミン単糖を含み、前記Ｎ−アセチルグルコサミン単糖の少なくとも４０％がアセチル化された半晶質ポリ−β−１→４Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーなどが挙げられる。ポリ−β−１→４  Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー誘導体は、ポリ−β−１→４Ｎ−アセチルグルコサミンが１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である組成物も含む。
【０１４２】
好ましい実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む。ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維は、長さ約５００アセチルグルコサミン単糖単位以上で生成することができる。繊維のサイズは、２００２年２月１４日に２００２−００１９３６７として発行された米国特許出願第０９／７８１，１８２号に記載された方法などの方法によって短縮することができる。
【０１４３】
好ましい実施形態においては、細胞と混合されて本発明の組成物を形成するポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維はスラリーとして調製される。ある実施形態においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンスラリーは、蒸留水１ｍｌ当たり約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ又は５ｍｇのポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維を含む。本発明のある態様においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維は、長さ約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０又は１３０ミクロンである。関係する態様においては、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維は、厚さ及び／又は直径約０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．５４、０．５０、０．５５、０．６０又は０．６５ミクロンである。好ましい実施形態においては、繊維は幅約０．５０ミクロンであり、長さ約２０〜１００ミクロンの範囲にある。
【０１４４】
５．３  本発明の組成物及び方法に使用することができるポリマー及び細胞の特定
本発明の組成物及び方法に使用することができるポリマーをスクリーニングし、特定する方法は、血小板及び赤血球上の細胞表面タンパク質がポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維と相互作用するという本発明者らの発見に基づいている。本発明者らによって特定された表面タンパク質は、本発明の組成物及び方法に使用することができるポリマー繊維をスクリーニングする方法の基礎を成す。特に、ＧＰＩＩＩａ、ＧＰＩｂ及びバンドＩＩＩ、グリコホリンＡなどの細胞表面タンパク質と相互作用するポリマー繊維、並びに／又はこれらのタンパク質の細胞表面タンパク質と相互作用するポリマーは、本発明の組成物及び方法に使用することができるポリマーを特定するために使用することができる。ＧＰＩＩＩａ及びＧＰＩｂ並びにバンドＩＩＩ、α２ｂβ３及びグリコホリンＡなどの細胞表面タンパク質の作用物質又は拮抗物質である抗体は、本発明の組成物及び方法に使用することができるポリマー繊維を特定するために使用することができる。
【０１４５】
本発明の一実施形態においては、表面タンパク質、又は表面タンパク質を発現する細胞は、ポリマー繊維に結合できるかどうかで評価される。当業者に公知の結合アッセイを、本発明の組成物及び方法に潜在的に使用することができるポリマー繊維を特定するために使用することができる。かかる結合アッセイの例は、実施例セクション１０にある。別の実施形態においては、競合結合アッセイを、特定の細胞表面タンパク質、細胞表面タンパク質を発現する細胞、又は少なくともその一部が細胞表面タンパク質を発現する一般的な細胞カテゴリーと相互作用するポリマーを特定するために利用することができる。特定の実施形態においては、細胞はヒト細胞又は軟骨細胞である。好ましい実施形態においては、競合結合は、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維の存在下で表面タンパク質又は細胞の結合度を調べるステップを含む。
【０１４６】
本発明のアッセイは、まず小規模で（すなわち、試験管中で）最適化され、次いでハイスループットアッセイ用にスケールアップすることができる。本発明のスクリーニングアッセイは、タンパク質、単離細胞及び培養細胞について実施することができる。本発明によれば、表面タンパク質、又はインビトロで表面タンパク質を発現する細胞と相互作用することが判明した試験ポリマー繊維は、試験ポリマー繊維がインビボで同様の効果を有するかどうかを判定する動物モデル、並びに創傷治癒及び止血に対する試験ポリマー繊維−細胞複合体の効果を測定する動物モデルを含めて、さらにインビボで分析することができる。
【０１４７】
結合アッセイは、所望の表面タンパク質及び／又は細胞型に結合するポリマー繊維を特定するために使用することができる。結合アッセイは、直接結合アッセイ又は競合結合アッセイのどちらかで実施することができる。直接結合アッセイにおいては、試験ポリマー繊維は、所望の表面タンパク質又は細胞型に結合するかどうか試験される。一方、競合結合アッセイは、試験ポリマー繊維が、表面タンパク質又は表面タンパク質を発現する細胞との結合について、細胞と相互作用する既知のポリマー繊維と競合することができるかどうかを評価する。
【０１４８】
直接結合アッセイにおいては、表面タンパク質又は細胞は、試験ポリマー繊維の結合を可能にする条件下で試験ポリマー繊維と接触させる。結合は、溶液中でも固体表面でも起こり得る。試験ポリマー繊維、表面タンパク質又は細胞は、検出のためにあらかじめ標識されていることが好ましい。発光、蛍光若しくは放射性同位体、又はそれを含む基、又は酵素、色素などの非同位体標識など（但し、これらだけに限定されない）の任意の検出可能化合物を標識に使用することができる。結合が起こるのに十分なインキュベーション期間後に、過剰の若しくは非特異的に結合した標識試験ポリマー繊維、表面タンパク質又は細胞を除去する条件及び操作に反応物をかける。一般に、これには、適切な緩衝液による洗浄が含まれる。最後に、ポリマー繊維−細胞又はポリマー繊維−表面タンパク質複合体の存在が検出される。
【０１４９】
競合結合アッセイにおいては、ポリマー繊維候補は、血小板などの細胞又は細胞表面タンパク質と、前記細胞又は表面タンパク質と相互作用するｐＧｌｃＮＡｃなどの既知ポリマー繊維との結合を阻害又は促進する能力について評価される。標識ｐＧｌｃＮＡｃは、表面タンパク質又は細胞と混合され、それらの相互作用が通常起こる条件下に、繊維を添加して、また、添加せずに置かれる。表面タンパク質又は細胞に結合する標識ｐＧｌｃＮＡｃ量は、試験ポリマー繊維の存在下又は非存在下における結合量と比較することができる。
【０１５０】
特定の実施形態においては、血小板、血小板細胞表面タンパク質、及び／又は表面タンパク質若しくは細胞とポリマー繊維の相互作用に関与することが知られている血小板細胞表面タンパク質の断片との結合をｐＧｌｃＮＡｃと競合する天然ヒト繊維、例えば、コラーゲン、エラスチンを本発明のアッセイに使用することができる。
【０１５１】
原則的には、当業者に公知の多数の方法を、本発明のアッセイを設計するのに容易に適合させることができる。スクリーニング方法は当分野で周知である（例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する、１９９６年１０月３１日に発行された国際公開第９６／３４０９９号を参照されたい）。これらの方法によって、当業者は、本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なポリマー繊維候補を特定することができる。
【０１５２】
表面タンパク質又は表面タンパク質を発現する細胞と相互作用するポリマー繊維が特定された後に、そのポリマー繊維は、異なる比の細胞とポリマーを用いてゲルが形成されるかどうかを判定するためにさらに試験することができる。実施例セクション６の実験は、かかる方法の例である。
【０１５３】
表面タンパク質又は表面タンパク質を発現する細胞に結合するポリマー繊維が本明細書に記載する方法によって特定された後に、その繊維は、表面タンパク質を発現する細胞の活性化を引き起こすかどうかを判定するためにさらに試験することができる。細胞の形態学的変化を可視化する電子顕微鏡法を使用する、実施例セクション９に記載のアッセイなどのアッセイを使用することができる。例えば、血小板を用いて、仮足の形成、及び特定された繊維とのその相互作用を試験することができる。この追加の試験によって特定されたポリマー繊維は、本発明の保存及び治療の実施形態において特に有用なはずである。
【０１５４】
５．３．１  細胞表面タンパク質に対するポリマー繊維の結合を競合阻害する化合物のスクリーニング
本発明は、ポリマー繊維、例えば、ｐＧｌｃＮＡｃ繊維と、その結合相手、例えば、細胞表面受容体との結合を競合する新規試薬の特定を包含する。かかる試薬は、ポリマー繊維自体と類似の様式で利用することができる。例えば、ｐＧｌｃＮＡｃと血小板細胞表面タンパク質の相互作用を阻害する試薬は、止血又は創傷治癒を促進する治療薬候補である。以下は、かかる化合物を特定する例示的な方法である。
【０１５５】
細胞−ポリマー繊維阻害剤を特定するために使用されるアッセイ系の基本的原理は、目的とする細胞型のポリマー繊維結合部分、例えば、セクション５．１．３に記載の細胞表面タンパク質とポリマー繊維とを少なくとも含む反応混合物を、これら２つが相互作用し、結合し、複合体を形成することができる条件下及び十分な時間で調製することを含む。化合物が、表面タンパク質又は表面タンパク質を発現する細胞への結合を繊維と競合することができるかどうかを試験するために、試験化合物の存在下及び非存在下で反応混合物を調製する。試験化合物は、反応混合物に最初に入れることができ、或いはポリマー繊維に結合する細胞又は細胞成分の添加に続いて添加することができる。対照反応混合物は、試験化合物なしで、又はプラセボとともにインキュベートする。次いで、ポリマー繊維に結合する細胞又は細胞成分とポリマー繊維との複合体の形成が検出される。好ましい実施形態においては、細胞成分は、表面タンパク質又はその繊維結合部分である。試験化合物を含む反応混合物においてではなく、対照反応において細胞又は細胞成分と繊維との複合体が形成されることは、化合物が、表面タンパク質−又は細胞−ポリマー繊維相互作用を妨害していることを示している。
【０１５６】
細胞とポリマー繊維の相互作用を競合阻害する化合物のアッセイは、不均一又は均一な形式で実施することができる。不均一法は、ポリマー繊維に結合する細胞若しくは細胞成分（例えば、ポリマー繊維と相互作用する表面タンパク質）又はポリマー繊維のどちらかを固相上に固定するステップと、反応の最後に固相に固定された複合体を検出するステップとを含む。均一法においては、反応全体は液相中で実施される。どちらの手法においても、反応物の添加順序は、試験化合物について異なる情報を得るために変えることができる。例えば、表面タンパク質又は細胞とポリマー繊維との相互作用を、例えば、競合によって妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を実施することによって、すなわち、試験物質を細胞又は細胞成分及びポリマー繊維の前に又はそれらと同時に反応混合物に添加することによって特定することができる。或いは、あらかじめ形成された複合体を分離させる試験化合物、例えば、複合体の成分の１つを置換するより高い結合定数を有する化合物を、複合体が形成された後に反応混合物に試験化合物を添加することによって試験することができる。様々な形式を以下に手短に述べる。
【０１５７】
不均一法の系においては、細胞若しくは細胞成分（例えば、表面タンパク質）又はポリマー繊維のどちらかが固体表面に固定され、非固定種は直接的又は間接的に標識される。実際には、マイクロタイタープレートが好都合に利用される。固定種は、非共有結合又は共有結合によって固定することができる。非共有結合は、固体表面に細胞、表面タンパク質又はポリマー繊維溶液を塗布し、乾燥させることによって簡単に実施することができる。或いは、固定される種に特異的な固定化抗体を使用して、種を固体表面に固定することができる。表面は、あらかじめ調製し、保存することができる。
【０１５８】
アッセイを実施するために、固定種の相手は、試験化合物を含む被覆表面、又は含まない被覆表面に曝される。反応が完結した後に、未反応成分を（例えば、洗浄によって）除去すると、形成された複合体が固体表面上に固定されて残る。固体表面に固定された複合体は、いくつかの方法によって検出することができる。非固定種があらかじめ標識されている場合には、固定された標識が表面に検出されることによって、複合体が形成されたことがわかる。非固定種があらかじめ標識されていない場合には、間接的な標識を使用して、表面に固定された複合体を検出することができる。例えば、最初の非固定種に特異的な標識抗体を使用する（抗体は、標識抗Ｉｇ抗体で直接又は間接的に標識することができる）。反応成分の添加順序に応じて、複合体の形成を阻害する試験化合物、又は形成された複合体を解離させる試験化合物を検出することができる。
【０１５９】
或いは、反応は、試験化合物の存在下又は非存在下で、液相中で実施することができる。反応生成物が未反応成分から分離され、複合体が検出される。例えば、結合成分の一方に特異的な固定化抗体を使用して、溶液中で形成された複合体を固定し、固定された複合体をもう一方の相手に特異的な標識抗体を使用して検出する。また、反応物の液相への添加順序に応じて、複合体を阻害する試験化合物又は形成された複合体を解離させる試験化合物を特定することができる。
【０１６０】
本発明の別の実施形態においては、均一法を使用することができる。この手法においては、表面タンパク質又は細胞とポリマー繊維とであらかじめ形成された複合体が調製される。表面タンパク質又は表面タンパク質を発現する細胞のどちらかとポリマー繊維は標識されているが、標識によって生成されるシグナルは複合体形成によって消失する（例えば、免疫測定法にこの手法を利用したＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎの米国特許第４，１０９，４９６号を参照されたい）。形成された複合体由来の種の１つと競合し、それを置換する試験物質を添加すると、バックグラウンドを上回るシグナルが生成される。このようにして、表面タンパク質−又は細胞−ポリマー繊維相互作用を阻害する試験物質を特定することができる。
【０１６１】
特定の実施形態においては、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、表面タンパク質を固定用に調製することができる。例えば、表面タンパク質は、得られる融合タンパク質においてその結合活性が維持されるように、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１などの融合ベクターを用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させることができる。結合相手（すなわち、ポリマー繊維）は、当分野の上記常法を用いて精製することができ、それを使用してモノクローナル抗体を産生することができる。この抗体は、例えば、当分野の常法によって、放射性同位体１２５Ｉで標識することができる。不均一法においては、ＧＳＴ−表面タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズに固定することができる。次いで、試験化合物の存在下又は非存在下で相互作用及び結合が起こるようにそれぞれポリマー繊維を添加することができる。反応期間の最後に、非結合材料を洗浄除去することができ、標識されたモノクローナル抗体を系に添加し、複合成分に結合させることができる。表面タンパク質とポリマー繊維の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに依然として付随している放射能量を測定することによって検出することができる。試験化合物によって相互作用を阻害することに成功すると、測定される放射能が減少する。
【０１６２】
或いは、ＧＳＴ−表面タンパク質とその結合相手（すなわち、ポリマー繊維）を、液体中、固体グルタチオン−アガロースビーズの非存在下で混合することができる。試験化合物は、種が相互作用している間、又は相互作用した後に添加することができる。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加し、非結合材料を洗浄除去する。また、表面タンパク質−ポリマー繊維相互作用の阻害度は、標識抗体を添加し、ビーズに付随する放射能を測定することによって検出することができる。
【０１６３】
５．３．１．１  細胞系アッセイ
ポリマー繊維に結合する細胞表面タンパク質を内因的に又は組換えによって発現する細胞集団を利用して、細胞−ポリマー繊維阻害剤候補を特定し、又は確認することができる。
【０１６４】
ポリマー繊維に結合する細胞表面タンパク質を組換えによって発現させるために、表面タンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームを、目的とする細胞型において遺伝子発現をもたらすことができる制御配列に連結することができる。かかる調節領域は、当業者に周知であり、過度の実験をせずに利用することができる。細胞表面タンパク質発現構築体のトランスフェクションは、標準技術を利用して実施することができる。例えば、上記Ausubel, 1989を参照されたい。トランスフェクトされた細胞は、組換え標的遺伝子配列の有無、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現及び蓄積、並びに組換え標的遺伝子タンパク質産生の有無について評価すべきである。
【０１６５】
５．４  本発明の組成物
本発明の組成物は、様々な比の細胞とポリマー繊維、並びに保存剤又は生物学的に活性な薬剤として機能する他の薬剤を含むことができる。所望の比は、製剤及び組成物の使用に応じて変わり得る。本発明の組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の細胞を含むことができる。好ましい実施形態においては、本組成物は、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の細胞を含む。他の好ましい実施形態においては、本組成物は、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％以上の細胞を含む。他の好ましい実施形態においては、本組成物は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％以上の細胞を含む。好ましい実施形態においては、細胞量とポリマー量の比は１：１である。細胞量は、単離された細胞の量である。例えば、血小板の場合には、細胞量は、シトラート−ホスフェート−デキストロース溶液（ＣＤＰ）標準ポリ−ビニル血液保存バッグから処理された血小板の豊富な血漿の量など、利用可能な単離血小板の標準型とすることができる。他の実施形態においては、血小板は、血漿を含まないようにさらに精製することができる。別の実施形態においては、細胞量は、マイクロリットル、ミリリットル、リットルなど（但し、これらだけに限定されない）の既定体積中に含まれる所与の細胞型の最大量である。
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態においては、組成物はカルシウムを含む。カルシウムは、塩又は塩溶液の形で組成物に添加することができる。カルシウム溶液は、好ましくは、１〜３０％ＣａＣｌ２溶液である。特定の実施形態においては、カルシウム溶液は、５〜２５％、５〜２０％、５〜１５％、７．５〜２５％、７．５〜２０％、最も好ましくは、およそ７．５〜１５％ＣａＣｌ２溶液であり、最も好ましくは、およそ１０％ＣａＣｌ２溶液である。他のカルシウム塩（例えば、ＣａＳＯ４）を代用することができ、ＮａＣｌ２塩溶液も代用することができる。カルシウムは、好ましくは、１０％ＣａＣｌ２溶液の形である。特定の実施形態においては、ＣａＣｌ２溶液は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６又は３０パーセントＣａＣｌ２溶液である。別の実施形態においては、組成物は、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、スルホン酸カルシウム、炭酸カルシウム及びシュウ酸カルシウムからなる群から選択されるカルシウム塩を含む。
【０１６７】
本発明の好ましい実施形態においては、組成物は、カルシウムに加えて又はカルシウムの代わりにマグネシウムを含む。好ましい実施形態においては、組成物は、繊維１ｍｇ当たり少なくとも０．０２５Ｍのマグネシウム溶液（例えば、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４溶液）を含む。
【０１６８】
ある実施形態においては、本発明の組成物中の細胞数は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、７００、１，０００、５，０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００又は１００，０００細胞である。好ましい実施形態においては、細胞数は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００細胞である。他の好ましい実施形態においては、細胞数は、少なくとも３００、４００、５００、７００、１，０００細胞である。さらに他の好ましい実施形態においては、細胞数は、少なくとも７００、１，０００、５，０００、１０，０００細胞である。さらに他の好ましい実施形態においては、細胞数は、少なくとも５，０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００又は１００，０００細胞である。さらに他の好ましい実施形態においては、細胞数は、少なくとも５０，０００又は１００，０００細胞である。別の実施形態においては、細胞数は、ポリマー繊維１ｍｇ当たり少なくとも１ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７，５ｘ１０７、１ｘ１０８、５ｘ１０８細胞以上である。好ましい実施形態においては、細胞数は、ポリマー繊維１ｍｇ当たり少なくとも１ｘ１０６、５ｘ１０６又は１ｘ１０７細胞以上である。他の好ましい実施形態においては、細胞数は、ポリマー繊維１ｍｇ当たり少なくとも１ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８細胞以上である。他の好ましい実施形態においては、細胞数は、ポリマー繊維１ｍｇ当たり少なくとも５ｘ１０７、１ｘ１０８、５ｘ１０８細胞以上である。
【０１６９】
標準単位（４５０ｍｌ）の血液は、一般に、６３ｍｌ  ＣＰＤポリ塩化ビニルバッグを用いて収集される。ある実施形態においては、本発明の組成物において使用される血小板量は、ＣＰＤから単離することができる細胞又は血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）の量である。好ましい実施形態においては、組成物は、ＰＲＰ  ５ｍｌに対して塩化カルシウム０．１２５ｍｌ及びｐＧｌｃＮＡｃスラリー（１ｍｇ／ｍｌ蒸留Ｈ２Ｏ）５ｍｌを含む。別の好ましい実施形態においては、組成物は、５ｍｌアリコートのＰＲＰに対して塩化カルシウム０．１２５ｍｌ及びｐＧｌｃＮＡｃスラリー（１ｍｇ／ｍｌ蒸留Ｈ２Ｏ）５ｍｌを含む。
【０１７０】
細胞とポリマー繊維の相互作用は、電荷相互作用、結合（共有結合又は非共有結合）又は接着によることができる。好ましい実施形態においては、相互作用は、ポリマー繊維の成分への細胞表面タンパク質の結合である。相互作用は、化学的シグナル伝達（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）も含むことができる。例えば、血小板及びｐＧｌｃＮＡｃの場合には、血小板は仮足を伸ばしてｐＧｌｃＮＡｃ繊維に接触する（図３）。かかる相互作用は、細胞による化学的シグナル及び／又は電荷相互作用の検出の制御下にある可能性が高い。
【０１７１】
ある実施形態においては、本発明の組成物は、例えば、ヒト皮膚又は内臓表面と会合する点で接着性である。別の実施形態においては、組成物は接着性ではない。
【０１７２】
ある実施形態においては、本発明の組成物は、（例えば、約０℃〜−８０℃で、より好ましくは、約−１０℃〜−４０℃で凍結される。かかる凍結組成物は、後で使用するために保存することができる。別の実施形態においては、組成物は、約１〜２５℃で保存される。特定の実施形態においては、組成物は約４℃又は２２℃で保存される。
【０１７３】
本発明の組成物においては、各細胞は、ポリマー繊維と１箇所又は数箇所の接触点を有することができる。ある実施形態においては、個々の細胞は、ポリマー繊維に封入されていない。本発明のポリマー繊維は、細胞の吸収を可能にし細胞とポリマー繊維のより開放的な相互作用を可能にするマトリックスを形成する。これは、細胞送達用にポリマー繊維で封入された細胞とは明らかに異なる。かかる例においては、ポリマー繊維は、細胞とポリマー繊維の相互作用、及び／又は繊維と相互作用している各細胞間、例えば、ポリ−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーと会合した血小板（この血小板は相互作用し一緒に凝集する）の相互作用を可能にする開放的なマトリックスではなく、被膜として働く。
【０１７４】
本発明の組成物を製造する際には、免疫系の血小板及び細胞など（但し、これらだけに限定されない）の細胞集団又は細胞型の混合物をポリマーと混合することができる。かかる混合物においては、ポリマーと相互作用することができる１種類の細胞型のみが特定されればよい。かかる細胞型混合物は、天然に存在し得るものであり、血中の場合と同様に、タンパク質及び他の非細胞成分と混合することができ、又は細胞型を単離し精製し、次いで天然に存在してもしなくてもよい所望の比で細胞集団を混合することによって調製することができる。かかる混合物は、セクション５．４．３に記載の添加剤などの天然又は合成添加剤を含むこともできる。
【０１７５】
本発明の組成物中の細胞数を調節したい理由は多数ある。例えば、ある実施形態においては、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックスを飽和させずに、ある数の血小板をｐＧｌｃＮＡｃ製剤と混合することができる。得られた組成物は後で使用するために凍結することができ、又はすぐに使用することができる。組成物を適用する直前に追加の細胞を添加することができる。別の実施形態においては、患者の体から得られた細胞又は体液が、血小板がまだ結合していないｐＧｌｃＮＡｃ繊維と相互作用し、又はポリマー繊維マトリックスによって吸収されるように、組成物を適用することができる。
【０１７６】
５．４．１  本発明の組成物の製剤化
本発明の組成物のポリマーと会合細胞のマトリックスは、三次元とすることができ、ゲル、膜、織られた組織又は織物、織られていない組織又は不織布、スポンジ、ガイドチャネル（ｇｕｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）、ガーゼ、ミクロスフェア、顆粒剤の形とすることができ、或いは哺乳動物の天然部分の密度、多孔性又は形状を複製するように製剤化することができる。
【０１７７】
組成物は、ゲル、固体、液体、スポンジ、発泡体、スプレー、エマルジョン、懸濁液、溶液、糸、マイクロビーズ、ミクロスフェア又はミクロフィブリルとして製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、中性液体、中性ゲル又は中性固体を含むことができる。ある好ましい実施形態においては、組成物は、バリア、膜又はフィルムとして製剤され、裏材などのバリア、膜又はフィルムに添加されている。バリア、膜又はフィルムは、様々な標準サイズで供給することができ、治療面積にあわせてさらに切断及びサイズ合わせすることができる。バリア、膜又はフィルムは、従来の包帯又はガーゼとすることができ、患者に適用する前に、本発明の組成物がそれに添加され、又は塗布される。或いは、組成物は、糸、マイクロビーズ、ミクロスフェア又はミクロフィブリルでできたバリア、膜又はフィルムとして製剤することができ、或いはバリア形成マットとして製剤することができる。
【０１７８】
また、前記生分解性マトリックス中の各成分の比を変えることによって、細胞マトリックスの外科的な取扱い特性を、寸法が安定したマトリックスから、成型可能なパテ状の粘稠性  柔軟なゲル又はスラリー、粉体、又は注射液の範囲で調節することができる。
【０１７９】
５．４．１．１  ゲル
好ましい実施形態においては、本発明の組成物はゲルとして製剤化される。ゲルは、様々な粘度のものとすることができる。ゲルが包帯に塗布されて局所的創傷を治療する実施形態の場合には、低粘度が望ましい。注射用ゲルの場合、組成物がすぐに散逸するのではなく、体のある部分に残るようにしたいときには、より高粘度が望ましいことがある。粘度は、流体の流動抵抗を示す量であり、センチポアズ（ｃＰ）で測定される。粘度範囲は連続している。例えば、粘度の意味を限定するものではなく、参考として、約１〜４ｃＰの粘度が、一般に、流体組成物に典型的である。約５〜１４ｃＰの粘度は、一般に、ゲル状組成物に典型的であり、１５〜２０ｃＰの粘度は、プラスチックなどの比較的硬い組成物である。細胞質の粘度は約１１ｃＰである。粘度は、例えば、Ｓａｙｂｏｌｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂ．Ｖ．（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって測定することができる。当業者は、当分野で一般的な他の測定技術及び装置も使用することができる。
【０１８０】
５．４．１．２  スポンジ
他の好ましい実施形態においては、本発明の組成物はスポンジとして製剤化される。組成物がスポンジであるときには、所定量の細胞懸濁液をスポンジマトリックス上に移すことができ、吸収することができる。治療用ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板複合物は、一般に、細胞がマトリックス全体に会合したポリマー繊維マトリックスを含む。これによって、より多数の細胞が繊維と相互作用することができ、マトリックスは多数の細胞を吸収することができる。
【０１８１】
５．４．１．３  膜
本発明のある実施形態においては、本発明の組成物は膜として製剤化される。膜は、多孔質でも比較的連続していてもよい。好ましい実施形態においては、膜は、細胞と組み合わせて本発明の組成物を形成する織られたポリマー繊維でできている。かかる膜は、皮膚表面又は表面又は内臓若しくは体腔内膜の表面の創傷治療において特に有用である。
【０１８２】
５．４．１．４  縫合糸
本発明のある実施形態においては、細胞と相互作用することが知られているポリマー繊維から作製された縫合糸は、細胞と組み合わせて、縫合糸の生体適合性を向上させることができる。例えば、ｐＧｌｃＮＡｃ繊維でできた縫合糸は、血小板と接触して細胞の被膜を形成することができる。かかる縫合糸は、生分解性であり、創傷治癒を促進し、縫合糸単体よりも生体適合性が向上し、特に適用された細胞が自家由来であった場合には、免疫応答を低下させる。
【０１８３】
５．４．２  医薬組成物
本発明の医薬組成物は、組成物製剤及び目的用途に応じて広範に変わり得る。
【０１８４】
ある実施形態においては、本発明の組成物は、スポンジ又は別の三次元剤形として製剤化される。細胞、及び組成物の細胞によって産生される薬剤は、マトリックスを介して拡散する必要があり、製剤内部は、露出した外部ほど迅速に生分解されないので、これらの実施形態は、移植のための徐放療法の設計において、特定の薬学的用途を有する。
【０１８５】
組成物は、血液に対してバリアを形成するバリア形成材料として製剤化することができる。組成物は、血液に対してバリアを形成するバリア形成材料を被覆し、バリア形成材料に添加し、又はバリア形成材料と一体化させることができる。一実施形態においては、医薬組成物は、バリア形成材料でできたパッチを含む。一実施形態においては、医薬組成物は、本発明の組成物を塗布したガーゼを含む。ある実施形態においては、医薬組成物は、本発明の組成物で被覆されたバリア形成材料を含み、このバリア形成材料は、材料が患者の皮膚表面に付着することができるように接着剤を含む。或いは、組成物は、バリア形成材料を欠くことができる。
【０１８６】
本発明の医薬組成物は、裏材（backing）を含むことができる。例えば、組成物がパッチとして製剤化される場合には、裏材をパッチに付けることができる。裏材は任意の接着化合物で被覆することができ、又は任意の接着化合物を埋め込むことができ、皮膚に接触する裏材部分によって、裏材及び付着した本発明の組成物が患者の皮膚表面に接着する。使用される接着剤タイプは、医学的に許容される任意の接着剤タイプとすることができる。かかる裏材は、天然ポリマーでできていても合成材料でできていてもよい。裏材を作製することができる天然ポリマーとしては、セルロース、キシランなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。裏材を作製することができる合成材料としては、ポリウレタン、テフロン、ダクロン、ステンレススチールメッシュスクリーン、ポリエステル織物などが挙げられるが、これらだけに限定されない。裏材及び接着剤は、皮膚に接触する部分が多孔質であり、酸素が拡散できることが好ましい。裏材は、手で圧迫することができる表面としても役立ち得る。
【０１８７】
本発明の医薬組成物は、創傷治癒剤及び／又は鎮痛剤を含むこともできる。かかる薬剤としては、血管中の裂け目又は穴の部分に白血球が遊走するのを阻害する薬剤など（但し、これらだけに限定されない）のステロイドと非ステロイドの両方の抗炎症剤（すなわち、スルファジアジン銀  アセチルサリチル酸、インドメタシン及びナファザトロム）、抗ヒスタミン剤（すなわち、ピリラミン、クロルフェニラミン、テトラヒドロゾリン（ｔｅｔｒａｙｄｒｏｚｏｌｉｎｅ）、アンタゾリン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルオコルトロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、インドメタシン、及びスリンダク、その塩及びその対応するスルフィド）；フリーラジカル形成を阻害する薬剤（すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ｂ−カロテン、アスコルビン酸、トランスフェリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、フェリチン、セルロプラスミン、及びデスフェリオキサミン  α−トコフェノール（ｔｏｃｏｐｈｅｎｏｌ））；静菌剤又は殺菌剤（すなわち、セフォキシチン、ｎ−ホルムアミドイル（ｆｏｒｍａｍｉｄｏｙｌ）チエナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、グラミシジン、バシトラシン、スルホンアミド、ゲンタマイシン、カナマイシン、アミカシン、シソマイシン、トブラマイシン、ノルフロキシカン（ｎｏｒｆｌｏｘｉｃａｎ）、ニトロフラゾン、及びフロウロアラニン（ｆｌｏｕｒｏａｌａｎｉｎ）／ペンチジドン（ｐｅｎｔｉｚｉｄｏｎｅ）の組み合わせ）などが挙げられる。
【０１８８】
本発明の医薬組成物は、α−２−抗プラスミン、α−１−抗トリプシン、α−２−マクログロブリン、アミノヘキサン酸、アプロチニン、カルシウムイオン源、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム−ナトリウム、カゼインキナーゼＩＩ、キチン、キトサン、コラーゲン、シアノアクリレート、イプシロン−アミノカプロン酸、第ＸＩＩＩ因子、フィブリン、フィブリン糊、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、生きている血小板、メタクリラート、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、プラスミン活性化因子阻害剤、プラスミノゲン、血小板作用物質、硫酸プロタミン、プロトロンビン、ＲＧＤペプチド、スフィンゴシン、スフィンゴシン誘導体、トロンビン、トロンボプラスチン、トラネキサム酸など、但し、これらだけに限定されない１種類又は複数の凝固剤を含むこともできる。組成物は、所望であれば、放射線治療又は他の抗ウイルス性若しくは抗悪性腫瘍薬治療を含めて、他の活性薬剤と組み合わせることもできる。
【０１８９】
本発明の医薬組成物は、エンドセリン−１、エピネフリン、フェニレフリン、セロトニン、トロンボキサン、ノルエピネフリン、プロスタグランジン、メテルギン、オキシトシン、イソプレランド（ｉｓｏｐｒｅｌａｎｄ）Ｕ−４６６１９など、但し、これらだけに限定されない１種類又は複数の血管収縮薬を含むこともできる。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、セロトニン、カテコールアミン、第Ｖ因子、フォンウィルブランド因子８又はトロンボキサンＡ２を含むこともできる。
【０１９１】
本発明の医薬組成物は、従来の賦形剤、すなわち、本発明の組成物と有害な反応を起こさない、非経口、経腸（例えば、経口又は吸入）又は局所投与に適切な薬学的に許容される有機若しくは無機の担体物質など、但し、これらだけに限定されない薬学的に許容される担体も含むことができる。薬学的に許容される適切な担体としては、水、塩、糖液などが挙げられるが、これらだけに限定されない。薬剤は、滅菌することができ、必要に応じて、助剤と混合することができる。
【０１９２】
５．４．３  本発明の組成物において使用することができる添加剤
多数の薬剤を本発明の組成物に添加することができる。かかる薬剤は、保存剤、凍結防止剤、他の細胞に対して効果を及ぼす生物学的に活性な薬剤、及び／又は免疫応答をモジュレートする薬剤として機能することができる。
【０１９３】
赤血球を含む本発明の組成物及び方法の場合には、Ａｄｓｏｌ（商標）（ＡＳ−１）、Ｎｕｔｒｉｃｅｌ（商標）（ＡＳ−３）、Ｏｐｔｉｓｏｌ（商標）（ＡＳ−５）及びＥｒｙｔｈｒｏ−Ｓｏｌ（商標）を含む（但し、これらだけに限定されない）添加剤溶液を添加して、赤血球を含む本発明の組成物の保存を延長することができる。赤血球を含む本発明の組成物の保存を延長するために使用することができる他の添加剤としては、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、クエン酸−リン酸−デキストロース溶液（ＣＰＤ）、アデニンを含むＣＰＤ（ＣＰＤＡ−１）、米国特許第６，１５０，０８５号に記載のＥＡＳ−６１などが挙げられるが、これらだけに限定されない。一般に、赤血球の保存を延長する添加剤は、４℃又は２２℃で有効である。
【０１９４】
血小板を含む本発明の組成物及び方法の場合には、ジメチルスルホキシド（Valeri et al., 1974, Blood, Vol. 43, No.1）、血小板活性化阻害剤などのプロストグランジン（ｐｒｏｓｔｏｇｌａｎｄｉｎ）Ｅ及びテオフィリン（Vox Sang 1991, 60: 105-112）、及び全血にも使用することができる米国特許第６，４８２，５８５号に記載のＬ−カルニチンを含めて、但し、これらだけに限定されない添加剤溶液を使用することができる。
【０１９５】
増殖因子は、本発明の組成物に添加して、組成物の細胞が所望の化合物を産生するように、又は増殖し組織層を形成するように誘導することができる薬剤である。増殖因子は、組成物に添加して、組成物が投与された後に、細胞及び組織を取り囲む組成物の効果を増強することもできる。神経増殖因子（ＮＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ＮｏｔｃｈのＲＢＰＪκ結合ドメイン（ＲＡＭ）；レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）；ｃ−ｋｉｔリガンド又は肥満細胞増殖因子（ＳＣＦ）としても知られる幹細胞因子；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）トロンボポイエチン（Ｔｐｏ）。本発明の組成物及び方法に利用することができる増殖因子は、商業的に得ることができ、組換え発現によって産生することができ、又は化学的に合成することができる。例えば、ＡＴＲＡ、ＢＤＮＦ（ヒト）、ＣＮＴＦ（ヒト及びラット）、ＥＧＦ（ヒト）、ＦＧＦ−１（ヒト及びウシ）、ＦＧＦ−２（ヒト及びウシ）、ＦＧＦ−７（ヒト）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ヒト）、ＧＤＮＦ（ヒト及びラット）、ＨＧＦ（ヒト）、ＩＧＦ−１（ヒト）、ＩＬ−６（ヒト及びマウス），ＩＬ−１１（ヒト）、ＮＧＦ（ネズミ）、ＰＤＧＦ（ヒトＡＡ、ＡＢ及びＢＢアイソフォーム）、ＳＣＦ（ヒト），ＴＧＦ−β（ヒト）、Ｔｐｏ（ヒト及びネズミ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入することができる。ＥＧＦ（ヒト及びネズミ）、ＦＧＦ−１（ヒト）、ＦＧＦ−２（ヒト）、ＧＭ−ＣＳＦ（ヒト及びネズミ），ＩＧＦ−Ｉ（ヒト）、ＩＬ−６（ヒト及びネズミ）、ＩＬ−７（ヒト及びネズミ）、ＮＧＦ（ネズミ）、ＰＤＧＦ（ヒトＡＡ、ＡＢ及びＢＢアイソフォーム）、ＳＣＦ（ヒト）及びＴＧＦ−β（ヒト）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）から購入することができる。トランスフォーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）とは、多数の細胞型の成長及び分化を調節する関連二量体タンパク質の増殖ファミリーを指す（Barnard et al., 1990, Biochem. Biophys. Acta. 1032: 79-87; Massague, 1990, Annu. Rev. Cell. Biol. 6: 597-619; Roberts and Sporn, 1990, in: M. B. Sporn and A. B. Roberts (eds.), Peptide Growth Factors and Their Receptors I, Springer-Verlag, Berlin, pp. 419-472）。
【０１９６】
本発明の一部の実施形態においては、組成物はサイトカインを含む。サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦ∝、ＴＮＦβ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−βからなる群から選択することができる。ある実施形態においては、本発明の組成物は、１種類又は複数のサイトカインを含まない。
【０１９７】
５．５  本発明の組成物の製造方法
本発明の組成物は、細胞とポリマー繊維の懸濁液を混合し、この２成分を相互作用させてゲルを形成することによって主に製造される。ある実施形態においては、ゲルを形成させるにはカルシウムが必要である。約０．０２５％カルシウムを添加することが好ましい。別の実施形態においては、マグネシウムを添加してゲルを形成させる。
【０１９８】
ゲルとして製剤化される本発明の組成物は、その場で製造することができる。すなわち、患者に投与するときにシリンジ中で混合するか、適用直前に製造し、次いで、患者に適用するか、又は適用前に製造し、後で使用するために保存することができる。本発明の組成物がその場で製造される実施形態においては、患者に投与するときに、組成物の各成分をシリンジ中で混合して、本発明の組成物を形成させることができる。例えば、血小板、ｐＧｌｃＮＡｃスラリー及び塩化カルシウム溶液を混合することによって製造される組成物は、患者に投与するときに、区画が２つあるシリンジ中で製造することができる。血小板及びｐＧｌｃＮＡｃスラリーをシリンジの一方の区画に入れ、塩化カルシウム溶液をもう一方の区画に入れ、次いで投与前又は投与と同時に２つの区画の内容物を混合するなど、いくつかの異なる順列を使用することができる。或いは、血小板及び塩化カルシウム溶液をシリンジの一方の区画に入れ、ｐＧｌｃＮＡｃスラリーをもう一方の区画に入れ、次いで、投与前又は投与と同時に２つの区画の内容物を混合する。
【０１９９】
生成物を長期間、すなわち、約１、２、３、４、５、６、７、８又は９時間以上保存しようとする場合には、本発明の組成物を凍結及び解凍し、又は後で使用するために約４、１０、１５、２０若しくは２２℃で保存する。当業者は、この目的のために米国特許第６，５１９，９５４号及び同第６，３７２，４２３号に記載されたものなどの凍結保存技術を使用することができる。
【０２００】
５．６  本発明の組成物を使用した治療方法
本発明は、本発明の組成物を使用した治療方法を提供する。本発明の組成物は、生体適合性材料として使用することができ、場合によっては、生物学的に活性な材料、バリア材料、又は損傷若しくは傷害を受けた組織を補う移植片として使用することができる。したがって、所望の細胞を、スポンジ若しくはゲル、又は他の剤形として製剤化されたポリマー繊維マトリックスと、移植のために複合化することができる。
【０２０１】
例えば、インスリン産生β細胞を、ポリマー繊維−細胞マトリックスを用いて患者に移植することができる。β細胞自体はポリマー繊維と相互作用してもしなくてもよいが、マトリックスは、ポリマー繊維と相互作用する細胞を含む。細胞は、β細胞に加えて、血小板、又は移植されたβ細胞の樹立を促進する増殖因子若しくはホルモンを産生する他の細胞などの細胞とすることができる。軟骨細胞は、当業者が患者に移植を望む別の細胞例である。本発明の組成物は、軟骨細胞を含むポリマー繊維マトリックスを含むことができる。本発明の実施形態においては、軟骨細胞はポリマー繊維と相互作用する。かかる実施形態においては、他の細胞もマトリックス中に存在することができる。別の実施形態においては、軟骨細胞は、繊維と相互作用しない。かかる場合には、ポリマー繊維と相互作用する他の細胞が組成物中に存在する。軟骨細胞がマトリックス中で増殖するように誘導し、又は軟骨を産生するように誘導する増殖因子、ホルモンなどの物質を産生する細胞は、かかる実施形態において望ましい。
【０２０２】
本発明の一実施形態においては、本発明の組成物を使用して、再生及び修復プロセス中に組織を補充し、又は置換することができる。別の実施形態においては、本発明の組成物を使用して、内耳の感覚上皮の変性疾患又は外傷性障害を治療する。
【０２０３】
本発明のさらに別の実施形態においては、細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物を使用して、疾患によって損なわれた組織、例えば、肝臓組織、肺組織、膵臓組織、皮膚、軟骨、骨、造血細胞、腸、心臓、腎臓などに取って代わり（ｓｕｐｐｌａｎｔ）、又は置換する。肝臓細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物は、肝炎、硬変又は毒性の薬物療法などの疾患によって肝臓が損なわれた、又は破壊された患者に移植することができる。
【０２０４】
肺細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物を使用して、肺の腫瘍の除去後に患者自身の肺が十分な機能を果たすことができない患者の肺機能を補うことができる。同様に、腸細胞を含む本発明の組成物を使用して、癌手術後に除去された腸の部分を置換することができる。軟骨−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物は、子供における耳及び鼻の欠陥を修復するのに適している。真皮細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物は、火傷の患者に対して、例えば、人工皮膚として使用することができる。膵臓細胞−繊維マトリックスを含む本発明の組成物の移植は、膵臓除去後（例えば、癌手術後）、又は重度の糖尿病の治療に適切である。後者の状況においては、インスリンを発現するように遺伝子操作された膵臓細胞を含む組成物を使用することが好ましい。軟骨細胞又は他の骨組織を含む組成物は、失われた骨を置換又は補充するために接合又は移植することができる。骨移植は、体によって新しい骨組織の形成における足場として使用されることが多い。甲状腺細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物は、甲状腺の機能細胞が、例えば、橋本甲状腺炎によって破壊された患者に移植することができる。本発明の造血細胞又は免疫細胞含有マトリックスは、投与されたマトリックス中の細胞が必要な免疫又は造血機能を果たすように、例えば、後天性免疫不全症候群の結果、或いは癌の治療のための放射線療法又は化学療法に曝された結果、免疫無防備状態又は免疫抑制性である患者、或いは免疫不全患者に投与することができる。
【０２０５】
本発明の組成物が、組成物が投与され組成物が移植される患者に対して自家性でない細胞を含む場合には、組成物は、好ましくは、拒絶を抑制する方法と併せて使用される。ある実施形態においては、組成物は、患者に必要な化合物を産生及び分泌する細胞を含む。
【０２０６】
上記実施形態は、単に例示的なものであり、本発明の組成物は、細胞又は組織の補充を必要とするあらゆる疾患に適用できることを当業者は理解されたい。
【０２０７】
ある実施形態においては、移植される本発明のポリマー繊維−細胞マトリックス組成物は、感染症又は癌を治療するのに有効な化合物を産生する細胞を含む。別の実施形態においては、細胞は、かかる化合物を産生するように操作される。
【０２０８】
５．６．１  移植片被覆
細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物を使用して、移植片の生体適合性を改善するために、又は移植片に生物学的活性を付与するために、合成移植片若しくは補綴具を被覆することができる。補綴具は、外科用途、例えば、再建外科又は関節置換術に使用されることが多い。補綴移植片に最適な材料は、金属、通常はチタンであるが、他の材料、例えば、セラミックスを使用することもできる。補綴具は、合成セメントを用いて移植部位に固定されることが多い。近年、移植片は薄い多孔質材料で被覆され、周囲組織が、移植片を包む多孔質層中に成長できるようになっている。しかし、かかる補綴移植片が移植部位の細胞型で包囲されていることがより望ましい。これによって、固定及び一体化がよりうまくいく。したがって、本発明の一態様においては、細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物を使用して、ヒトへの移植用補綴具が被覆される。本組成物で被覆される補綴具としては、関節部分（例えば、膝、肩及び股関節部）、心臓弁置換、椎間板移植、小骨置換、骨（例えば、大腿骨、けい骨）再構築用の板／棒などが挙げられるが、これらだけに限定されない。好ましい実施形態においては、補綴移植片を被覆するのに使用される細胞−繊維ポリマーマトリックスは、個体に対して自家性である。
【０２０９】
５．６．２  移植方法
細胞−繊維ポリマーマトリックスを含む本発明の組成物は、疾患若しくは傷害の治療、又は遺伝子療法のために、マトリックス中の細胞型に適切な当分野で既知の任意の方法によって患者に移植することができる。造血細胞を含むマトリックスは、肝細胞が肝臓に位置することができるように、静脈内に移植することができる。神経細胞を含むマトリックスは、脳の傷害又は疾患部位に直接移植することができる。皮膚細胞を含むマトリックスは、火傷などを治療する移植用として使用することができる。間葉細胞を含むマトリックスは、（上述したように）移植前に補綴具を被覆するために使用することができる。
【０２１０】
導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外経路などが挙げられるが、これらだけに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚内膜（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、腸管粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与することができる。投与は全身投与とすることもできるが、好ましくは、局所投与である。また、本発明の組成物は、脳室内及び鞘内注射を含めて、任意の適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましいこともある。脳室内注射は、例えばオンマヤ槽などの槽に付けられた脳室内カテーテルによって容易になる。
【０２１１】
特定の実施形態においては、本発明の組成物を、治療が必要な部分に局所投与することが望ましいこともある。これは、例えば、手術中の局所注入、手術後の例えば創傷被覆材と併せた局所適用、注射、カテーテルによって、移植片として、又は移植片によって実施することができるが、これらは限定的なものではない。前記移植片は、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、繊維を含めて、多孔質、非多孔質又はゼラチン質の材料である。
【０２１２】
好ましい実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維マトリックス中の細胞は自家性である。別の実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維マトリックス中の細胞は非自家性である。
【０２１３】
移植される本発明の細胞−ポリマー繊維マトリックスの、特定の障害又は病気の治療に有効な量は、障害又は病気の性質によって決まるが、標準の臨床技術によって決定することができる。製剤において使用される正確な量は、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度（例えば、組織傷害の程度）によっても決まるが、開業医の判断及び各患者の状況によって決定すべきである。
【０２１４】
５．６．３  創傷治癒及び止血
本発明は、皮膚創傷又は内臓創傷の治療方法を提供する。かかる創傷は、一般に、血管を破壊する。本発明の一実施形態においては、創傷は、銃弾、ナイフ、外科用具などの物体によって引き起こされる。好ましい実施形態においては、創傷を引き起こす物体はカテーテルである。さらに別の好ましい実施形態においては、創傷は、心臓カテーテル操作によるものである。カテーテルによって裂け、又は穴があけられ、本方法及び組成物によって治療することができる動脈としては、大腿動脈、とう骨動脈、上腕動脈、えきか動脈などが挙げられるが、これらだけに限定されない。カテーテルによって裂け、又は穴があけられ、本方法及び組成物によって治療することができる静脈としては、大腿静脈、内頚静脈、鎖骨下静脈などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２１５】
一般に、カテーテル処置による創傷は、直径の小さいカテーテルによって引き起こされる。直径の小さいカテーテルの例としては、サイズ４Ｆ〜６Ｆ（Ｆ＝フレンチユニット（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｕｎｉｔ）、１Ｆは０．３３ｍｍである）のカテーテルが挙げられる。本発明の別の実施形態においては、創傷は、サイズ７Ｆ〜１１．５Ｆの直径の大きいカテーテルによっても引き起こされることがある（Sanborn et al., 1993, Journal of the American College of Cardiology. 22（5): 1273-1279）。動脈は、サイズ６Ｆ〜８Ｆのカテーテルよりも太いことが好ましい。創傷がカテーテル処置に起因するかかる実施形態においては、本発明の方法及び組成物を使用して、スワンガンツカテーテル、ソーンズカテーテル及びピッグテールカテーテルを含めて、但し、これらだけに限定されない様々なタイプのカテーテルによって引き起こされた創傷を治療することができる（Olade et al., 2002, Emedicine Journal, 3(3):1-13）。
【０２１６】
ある実施形態においては、カテーテルは、皮膚表面に垂直に挿入される。別の実施形態においては、カテーテルは、皮膚表面に２０°〜４０°の角度で挿入される。ある実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、歯周部の手術、顎顔面の手術、口部の手術、又は洞の移植など、但し、これだけに限定されない移植手術に使用して、創傷治癒若しくは止血を行うことができる。関係する実施形態においては、本発明の組成物をかかる手術に適用すると、軟部組織（結合組織及び歯肉組織）の成熟が促進される。他の関係する実施形態においては、本発明の組成物を適用すると、骨移植が向上する。
【０２１７】
本発明の一実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、骨移植を向上させるために使用される。かかる実施形態においては、本発明の組成物は、移植部位に適用することができる。
【０２１８】
関係する実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、血小板の豊富な血漿を含む。関係する実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、１種類又は複数の増殖因子を含む。
【０２１９】
本方法は、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ウシ、サル又はヒツジを含めて、但し、これらだけに限定されないあらゆる哺乳動物における静脈又は動脈の創傷を治療するのに使用することができる。患者はヒトであることが好ましい。
【０２２０】
５．６．３．１  創傷の局所治療用組成物及び方法
ある実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、組織創傷を治療するのに使用することができる。
【０２２１】
本発明の一態様によれば、患者における心臓のカテーテル操作に起因する静脈又は動脈の穴を治療する方法は、ａ）患者の皮膚のカテーテル出口部位に有効量の本発明の組成物を局所的に適用するステップであって、カテーテル出口部位が静脈又は動脈のカテーテル刺し傷に１〜１０ｃｍ隣接しているステップと、同時にｂ）穴のあいた静脈又は動脈を圧迫するステップであって、静脈又は動脈における裂け目又は穴からの血流の中断又は低下が、本発明の前記組成物なしで局所的バリア形成材料と共に圧迫するステップよりも３０％〜５０％短い時間で達成されるステップとを含む。
【０２２２】
本発明の別の態様によれば、患者における心臓のカテーテル操作に起因する大腿動脈の穴を治療する方法は、ａ）患者の皮膚のカテーテル出口部位に有効量の本発明の組成物を局所的に適用するステップであって、カテーテル出口部位が大腿動脈のカテーテル刺し傷に１〜１０ｃｍ隣接しているステップと、同時にｂ）穴のあいた静脈又は動脈を圧迫するステップであって、大腿動脈における裂け目又は穴からの血流の中断又は低下が、本発明の前記組成物なしで局所的バリア形成材料と共に圧迫するステップよりも３０％〜５０％短い時間で達成されるステップとを含む。
【０２２３】
本発明のさらに別の態様によれば、患者における心臓のカテーテル操作に起因する血腫の形成を阻止する方法は、ａ）静脈又は動脈のカテーテル刺し傷に１〜１０ｃｍ隣接した患者の皮膚のカテーテル出口部位に、有効量の本発明の組成物を局所的に適用するステップと、ｂ）穴のあいた静脈又は動脈を同時に圧迫するステップと、ｃ）形成された血腫の数を記録するステップであって、血腫の形成が、本発明の前記組成物なしで局所的バリア形成材料と共に圧迫するステップよりも阻止されるステップとを含む。
【０２２４】
ある実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、創傷部位に局所投与される。組成物は、さらに、１種類又は複数の血管収縮薬を含むことができる。本発明の方法において使用される血管収縮薬の場合には、治療に有効な量は、組織又は組織培養アッセイから最初に推定することができる。
【０２２５】
１つの標準組織アッセイは、ラットから切除された大動脈輪を用いて実施される。次いで、大動脈は、１１８  ＮａＣｌ、４．７５  ＫＣｌ、２．５４  ＣａＣＩ２・２Ｈ２Ｏ、１．１９  ＫＨ２ＰＯ４、１．１９  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２．５  ＮａＨＣＯ３及び１０．０グルコース（ｍｍｏｌ／１）からなる加温されたクレブス−ヘンゼライト（ＫＨ）緩衝液中に素早く浮遊させられる。単離された血管は、慎重に結合組織が取り除かれ、長さ２〜３ｍｍに切断することができる。次いで、これらのリングをステンレススチールのフックに取り付け、１０ｍｌ組織浴中に吊るし、ＦＴ−０３力変位変換器（ｆｏｒｃｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）（Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｑｕｉｎｃｙ、ＭＡ）に接続して、Ｇｒａｓｓモデル７オシログラフを用いて力の変化を記録する。組織浴をＫＨ緩衝液で満たし、３７℃で９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２で曝気する。０．５ｇの静止力をＳＭＡリングにかけ、次いで、リングを９０分間平衡にする。この間、組織浴中の緩衝液を１５〜２０分間ごとに交換し、０．５ｇの前負荷が維持されるまで血管リングの静止力を調節する。平衡９０〜１２０分後に、リングを１００ｎＭ  Ｕ−４６６１９（９，１１−ジデオキシ−９α−１１α−メタンエポキシ−プロスタグランジンＦ２α、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）、トロンボキサンＡ２擬態物に曝して、１．０ｇの発生力を生じさせる。安定な収縮が得られた後に、典型的な内皮依存性血管拡張薬であるアセチルコリンを０．１、１、１０及び１００ｎＭの累積濃度で組織浴に添加して内皮の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を評価する。累積的な応答が安定した後に、リングを洗浄し、再びベースラインと平衡にする。
【０２２６】
この手順とＵ−４６６１９以外の血管収縮薬を用いて、血管収縮維持における血管収縮薬の有効性を求めることができる。血管収縮薬の濃度を変えてこの手順を繰り返し、有効な投与量を求めることができる。
【０２２７】
ある実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物は、創傷部位に局所投与される。組成物は、さらに、１種類又は複数の凝固剤を含むことができる。凝固剤の機能と有効性は、標準アッセイによって試験することができる。かかるアッセイにおいては、抗凝血性のない正常なヒト血液を抜き取り、数本の試験管に入れる。本発明の組成物を含まない正常血液は、（通常１０分以内に）凝固する。他の正常血液試料を抜き取り、１ミリリットル一定量を、本発明の方法、組成物及びキットにおいて使用される、凝固剤特性を試験したい特定の凝固剤の漸減一定量とともに試験管に入れる。かかるアッセイにおいては、１０分の何ミリリットルの凝固剤が、凝固剤のない血液よりも高速で、又は短時間で血餅を生じるのに有効であるかを容易に求めることができる。患者が血液の抜き出し前に血流中に導入された抗凝血薬を有するこの標準アッセイの変法を実施することができる。この結果を使用して、本発明の方法、組成物及びキットに使用される凝固剤を特定することができる。
【０２２８】
細胞−ポリマー繊維組成物がある量の血管収縮薬及び／又は凝固剤を含む本発明のある実施形態においては、その量は、有効投与量の０．５倍、０．７５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、５０倍又は１００倍とすることができる。例えば、かかる組成物は、体重が例えば約５０、６０、７０、８０又は９０ｋｇの成体、及び例えばパッチの局所投与面積が約１〜２、２〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１５、１５〜２０、２０〜２５若しくは２５〜３０ｃｍ２、又は例えば液体若しくはゲルの局所投与体積が約０．２５〜０．５、０．５〜１、１〜１．２５、１．２５〜１．５、１．５〜１．７５、１．７５〜２、２〜２．５若しくは２．５〜３ｍｌに対して、一般用として製造することができる。例示的な濃度計算を以下に示す。
【０２２９】
本発明の細胞−ポリマー繊維組成物がパッチとして製剤化されるか、パッチに埋め込まれるか、又はパッチに塗布され、かつ組成物が血管収縮薬及び／又は凝固剤をさらに含む本発明の実施形態においては、パッチの創傷接触表面１ｃｍ２当たり１００ｍｇの血管収縮薬及び／又は凝固剤が存在することができる。別の実施形態においては、本発明の方法、組成物及びキットに使用される、パッチ１ｃｍ２当たりの血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量は、約０．０５ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５０ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ又は２０００ｍｇとすることができる。好ましい実施形態においては、パッチ１ｃｍ２当たりの本発明の血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量は、血管収縮薬及び／又は凝固剤０．０５ｍｇ〜３０ｍｇである。
【０２３０】
細胞−ポリマー繊維組成物が血管収縮薬及び／又は凝固剤を含み、組成物がパッチとして製剤化されるか、パッチに埋め込まれるか、又はパッチに塗布される別の実施形態においては、パッチの創傷接触表面１ｃｍ２当たり１００μｇの血管収縮薬及び／又は凝固剤が存在することができる。別の実施形態においては、パッチ１ｃｍ２当たりの本発明の血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量は、約１ｍＭ〜７０ｍＭで約５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１０５μｇ、１１０μｇ、１１５μｇ、１２０μｇ、１２５μｇ、１３０μｇ、１３５μｇ、１４０μｇ、１４５μｇ、１５０μｇ、１５５μｇ又は１６０μｇとすることができる。かかる量で有効となり得る凝固剤の例はトロンビンである。かかる量で有効となり得る血管収縮薬の例はエンドセリン−１である。
【０２３１】
本方法及び組成物の好ましい実施形態においては、例えばパッチ表面上の血管収縮薬及び／又は凝固剤の用量は、その分子量に関わらず約１ｍＭ〜約７０ｍＭである。ある例示的な実施形態においては、この用量は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約７０ｍＭである。
【０２３２】
さらに別の実施形態においては、本発明の血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量は約１〜１０００ＩＵ／ｃｍ２であり、血管収縮薬及び／又は凝固剤は、パッチとして製剤化されるか、パッチに埋め込まれるか、或いはパッチに塗布される。一実施形態においては、血管収縮薬及び／又は凝固剤は、静脈又は動脈における裂け目又は穴に対する適用部位から減少する濃度勾配を形成する。例えば、心臓のカテーテル処置の軌跡による創傷の場合には、血管収縮薬及び／又は凝固剤は、軌跡による創傷にわたって濃度勾配を形成することができ、軌跡全体にわたって血餅形成を促進し、止血するのに必要な時間が短縮される。
【０２３３】
ある実施形態においては、本発明の細胞−ポリマー繊維組成物に使用される血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量は、凝固剤又は抗凝血薬の存在下で止血を活性化する量である。
【０２３４】
ある実施形態においては、この有効量は、圧迫してもしなくても凝固し始めるのに必要な用量である。別の実施形態においては、この有効量は、圧迫してもしなくても残る安定した血餅を形成するのに必要な用量である。さらに別の実施形態においては、有効量は、血餅の強度、すなわち、圧迫してもしなくても血餅が保持される時間によって決定することができる。
【０２３５】
様々な濃度及び量の特定の血管収縮薬及び／又は凝固剤がインビトロでどのように作用するかが明らかになれば、有効な血管収縮薬及び／又は凝固剤を、それらが機能する距離についてさらに動物モデルで試験することができる。血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量は、血餅形成時間、並びに静脈又は動脈中の裂け目又は穴を塞ぐ血餅の強度を血栓弾性描写法により測定することによって求めることができる。一連の測定は、有効量を求める血管収縮薬及び／又は凝固剤の濃度又は量を変えて行うことができる。静脈又は動脈の裂け目又は穴の皮膚表面からの距離を変えて、最大又は最適有効距離を求めることもできる。かかる連続した測定は、特定の血管収縮薬及び／又は凝固剤が特定の距離でどのように機能するかを予測し、所望の距離に対する有効量を求めるために使用することができる。距離動物静脈又は動脈は皮膚表面の下にあり、超音波など、但し、これらだけに限定されない画像処理技術によって求めることができる。ある濃度又は量の血管収縮薬及び／又は凝固剤がインビボで有効な距離は、特定の患者に必要な所望の距離に対する有効量、或いは特定の血管収縮薬及び／又は凝固剤が有効である距離の限界を外挿するのに使用することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２３６】
動物モデルの結果を外挿してヒト被験者に対する有効量を決定することができる。１種類又は複数の動物モデルにおいて様々な濃度の血管収縮薬及び／又は凝固剤を比較することによって、用量反応曲線が作成される。この用量反応曲線を使用して、各被験者の特定の状況、すなわち、創傷距離、創傷サイズ、血流中の凝固剤又は抗凝血薬の有無を考慮すれば、ヒトにおける有効量を推定することができる。
【０２３７】
ヒト患者もまた、血管収縮薬及び／又は凝固剤が有効である距離を決定するために使用することができる。例えば、超音波を使用して、皮膚表面からの静脈又は動脈中の裂け目又は穴の距離を可視化し、裂け目又は穴からの血流が減少し、或いは無くなったかどうかを確認することができる。超音波プローブを使用して、裂け、又は穴のあいた静脈若しくは動脈の位置を突き止め、プローブを所望の静脈若しくは動脈の位置に合わせることによって具体的な領域を画像表示することができる。裂け目又は穴の部位の超音波画像診断は、ドップラー血流分析と組み合わせることができる。ドップラー血流分析によって、動脈又は静脈を通る血流の中断又は低下を測定することができる。静脈又は動脈を通る血流が阻止された場合には、障害を起こすことがある。したがって、ドップラー血流と超音波を組み合わせることによって、血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量の上限を決定することができる。例えば、凝固剤の効果が血管中に広がり、血管内での血小板の凝固及び血液の中断を起こす場合には、その効果は有害なものになる恐れがある。別の実施形態においては、血管収縮薬及び／又は凝固剤の有効量の上限は、本発明の方法、組成物及びキットに使用される血管収縮薬及び／又は凝固剤が心拍出量を増加させる量として測定することができる。
【０２３８】
ある実施形態においては、本発明の方法、組成物及びキットの細胞−ポリマー繊維組成物は、有効量の血管収縮薬を含むこともできる。使用される血管収縮薬の有効量は、すべて当業者が求めることができる、患者の年齢、状態及び性別、並びに被験者の病気の性質及び程度に応じて変わる。例えば、患者体重は、血管収縮薬の有効量を決定するために使用することができる。
【０２３９】
一実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約１１ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬アドレナリン（商標）を含む。成体の場合には、好ましいアドレナリン（商標）濃度範囲は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇである。関係する実施形態においては、アドレナリン（商標）の有効量は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ、０．００００５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ又は１１．０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、アドレナリン（商標）の有効量は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ〜７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ〜９．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０．０ｍｇ／ｋｇ〜１１．０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、アドレナリン（商標）の有効量は、約０．００００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ〜３．５ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ〜５．５ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ〜９．５ｍｇ／ｋｇ、又は１０．５ｍｇ／ｋｇ〜１１．５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４０】
別の実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約１５００ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬  酒石酸水素メタラミノールを含む。成体の場合には、好ましい酒石酸水素メタラミノール濃度範囲は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇである。関係する実施形態においては、酒石酸水素メタラミノールの有効量は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ又は１５００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、酒石酸水素メタラミノールの有効量は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ〜１３００ｍｇ／ｋｇ、又は１３００ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、酒石酸水素メタラミノールの有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ〜８００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ〜１２００ｍｇ／ｋｇ、又は１２００ｍｇ／ｋｇ〜１４００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４１】
一実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬ドーパミンＨＣｌを含む。成体の場合には、好ましいドーパミンＨＣｌ濃度範囲は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。関係する実施形態においては、ドーパミンＨＣｌの有効量は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、ドーパミンＨＣｌの有効量は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ〜１１０ｍｇ／ｋｇ、又は１３０ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、ドーパミンＨＣｌの有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は１２０ｍｇ／ｋｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４２】
一実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬イソプロテレノールＨＣｌを含む。成体の場合には、好ましいイソプロテレノールＨＣｌ濃度範囲は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。関係する実施形態においては、イソプロテレノールＨＣｌの有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、イソプロテレノールＨＣｌの有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は１２０ｍｇ／ｋｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、イソプロテレノールＨＣｌの有効量は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ〜１３０ｍｇ／ｋｇ、又は１３０ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４３】
一実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約２ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬ノルエピネフリンを含む。成体の場合には、好ましいノルエピネフリン濃度範囲は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０１ｍｇ／ｋｇである。関係する実施形態においては、ノルエピネフリンの有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、ノルエピネフリンの有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、又は１．０ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、ノルエピネフリンの有効量は、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、又は１．５ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４４】
一実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約７５０ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬セロトニン（商標）を含む。成体の場合には、好ましいセロトニン（商標）濃度範囲は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．６ｍｇ／ｋｇである。関係する実施形態においては、セロトニンの有効量（商標）は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２１０ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、セロトニン（商標）の有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜１２０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、２１０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、又は６００ｍｇ／ｋｇ〜７００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、セロトニン（商標）の有効量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ〜１３０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ〜１７０ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇ〜２１０ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ〜５５０ｍｇ／ｋｇ、又は６５０ｍｇ／ｋｇ〜７５０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４５】
一実施形態においては、本発明の方法において患者に局所投与される組成物は、約４．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ患者体重〜約５．０ｘｌ０−６ｍｇ／ｋｇ患者体重の濃度の有効量の血管収縮薬エンドセリンを含む。関係する実施形態においては、エンドセリンの有効量は、約４．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、５．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、６．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、７．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、８．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、９．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、１．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、２．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、３．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、４．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、５．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、６．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、８．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、１．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、２．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、３．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、４．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ又は５．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、エンドセリンの有効量は、約５．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜７．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜９．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、又は４．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ患者体重である。関係する実施形態においては、エンドセリンの有効量は、約４．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜５．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、６．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、８．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜９．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、１．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、３．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜４．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、５．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜６．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜８．５ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、１．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、又は３．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜４．５ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４６】
エンドセリン−１、エピネフリン、フェニレフリン、トロンボキサン、プロスタグランジン、メテルギン、オキシトシン、イソプレランドＵ−４６６１９、パパベリン、ヨヒンビン、ビスナジン、ケリン、ベベリン（ｂｅｂｅｌｌｉｎ）及びニコチナート誘導体を含めて、但し、これらだけに限定されない他の血管収縮薬の場合には、当業者は、適切な有効量を決定することができる。関係する実施形態においては、血管収縮薬の有効量は、約４．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、５．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、７．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、９．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２１０ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ又は１５００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４７】
ある実施形態においては、血管収縮薬の有効量は、約６．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ〜１２０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜２４０ｍｇ／ｋｇ、２８０ｍｇ／ｋｇ〜３２０ｍｇ／ｋｇ、３２０ｍｇ／ｋｇ〜３６０ｍｇ／ｋｇ、３６０ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ〜４４０ｍｇ／ｋｇ、４４０ｍｇ／ｋｇ〜４８０ｍｇ／ｋｇ、４８０ｍｇ／ｋｇ〜５２０ｍｇ／ｋｇ、５２０ｍｇ／ｋｇ〜５６０ｍｇ／ｋｇ、５６０ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ〜６４０ｍｇ／ｋｇ、６４０ｍｇ／ｋｇ〜６８０ｍｇ／ｋｇ、６８０ｍｇ／ｋｇ〜７２０ｍｇ／ｋｇ、７２０ｍｇ／ｋｇ〜７６０ｍｇ／ｋｇ、７６０ｍｇ／ｋｇ〜８００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ〜８４０ｍｇ／ｋｇ、８４０ｍｇ／ｋｇ〜８８０ｍｇ／ｋｇ、８８０ｍｇ／ｋｇ〜９２０ｍｇ／ｋｇ、９２０ｍｇ／ｋｇ〜９６０ｍｇ／ｋｇ、９６０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ〜１０４０ｍｇ／ｋｇ、１０４０ｍｇ／ｋｇ〜１０８０ｍｇ／ｋｇ、１０８０ｍｇ／ｋｇ〜１１２０ｍｇ／ｋｇ、１１２０ｍｇ／ｋｇ〜１１６０ｍｇ／ｋｇ、１１６０ｍｇ／ｋｇ〜１２００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ〜１２４０ｍｇ／ｋｇ、１２４０ｍｇ／ｋｇ〜１２８０ｍｇ／ｋｇ、１２８０ｍｇ／ｋｇ〜１３２０ｍｇ／ｋｇ、１３２０ｍｇ／ｋｇ〜１３６０ｍｇ／ｋｇ、１３６０ｍｇ／ｋｇ〜１４００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ〜１４４０ｍｇ／ｋｇ、１４４０ｍｇ／ｋｇ〜１４８０ｍｇ／ｋｇ、又は１４８０ｍｇ／ｋｇ〜１５２０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４８】
ある実施形態においては、血管収縮薬の有効量は、約４．５ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−８ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−７ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−６ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−４ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ〜６．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ、６．０ｘ１０−３ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、１．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｘ１０-２ｍｇ／ｋｇ、８．０ｘ１０−２ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜４．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ〜１６ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ〜１８０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ〜２２０ｍｇ／ｋｇ、２２０ｍｇ／ｋｇ〜２６０ｍｇ／ｋｇ、２６０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ〜３４０ｍｇ／ｋｇ、３４０ｍｇ／ｋｇ〜３８０ｍｇ／ｋｇ、３８０ｍｇ／ｋｇ〜４２０ｍｇ／ｋｇ、４２０ｍｇ／ｋｇ〜４６０ｍｇ／ｋｇ、４６０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ〜５４０ｍｇ／ｋｇ、５４０ｍｇ／ｋｇ〜５８０ｍｇ／ｋｇ、５８０ｍｇ／ｋｇ〜６２０ｍｇ／ｋｇ、６２０ｍｇ／ｋｇ〜６６０ｍｇ／ｋｇ、６６０ｍｇ／ｋｇ〜７００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ〜７４０ｍｇ／ｋｇ、７４０ｍｇ／ｋｇ〜７８０ｍｇ／ｋｇ、７８０ｍｇ／ｋｇ〜８２０ｍｇ／ｋｇ、８２０ｍｇ／ｋｇ〜８６０ｍｇ／ｋｇ、８６０ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ〜９４０ｍｇ／ｋｇ、９４０ｍｇ／ｋｇ〜９８０ｍｇ／ｋｇ、９８０ｍｇ／ｋｇ〜１０２０ｍｇ／ｋｇ、１０２０ｍｇ／ｋｇ〜１０６０ｍｇ／ｋｇ、１０６０ｍｇ／ｋｇ〜１１００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ〜１１４０ｍｇ／ｋｇ、１１４０ｍｇ／ｋｇ〜１１８０ｍｇ／ｋｇ、１１８０ｍｇ／ｋｇ〜１２２０ｍｇ／ｋｇ、１２２０ｍｇ／ｋｇ〜１２６０ｍｇ／ｋｇ、１２６０ｍｇ／ｋｇ〜１３００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ〜１３４０ｍｇ／ｋｇ、１３４０ｍｇ／ｋｇ〜１３８０ｍｇ／ｋｇ、１３８０ｍｇ／ｋｇ〜１４２０ｍｇ／ｋｇ、１４２０ｍｇ／ｋｇ〜１４６０ｍｇ／ｋｇ、又は１４６０ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２４９】
一般に、本発明の方法、組成物及びキットの細胞−ポリマー繊維組成物のある実施形態において使用される血管収縮薬の有効量は、静脈内投与されたときに全身的血管収縮を引き起こす量よりも少ない濃度である。
【０２５０】
血管収縮薬の有効量は、本発明の方法、組成物及びキットにおいて使用される組成物の特定の製剤においても記述することができる。例えば、組成物が、心臓のカテーテル処置後の投与用パッチとして製剤化される場合、又はパッチに適用される場合には、細胞−ポリマー繊維組成物は、血管収縮薬としてアドレナリンを含む。患者が約７０ｋｇの成体であるときには、パッチは、約０．０００７５ｍｇ／ｋｇ〜約３７．５ｍｇ／ｋｇの濃度範囲のアドレナリンを含むべきである。かかる手順において使用されるパッチは、一般に、使用されるカテーテルのＦサイズに応じて約４ｃｍ２〜２５ｃｍ２であるので、当業者は、パッチ１ｃｍ２当たりのアドレナリンのｍｇ単位での濃度を容易に決定することができ、例えば、約０．０００２０ｍｇ／ｃｍ２〜約１．５ｍｇ／ｃｍ２である。同様に、例えば、組成物が、心臓のカテーテル処置後の投与用ゲル又は液体として製剤化される場合には、アドレナリンが本組成物に使用される血管収縮薬である。患者が約７０ｋｇの成体であるときには、ゲルは、約０．０００７５ｍｇ／ｋｇ〜約３７．５ｍｇ／ｋｇの濃度範囲のアドレナリンを含むべきである。かかる手順において使用されるゲルは一般に約１〜２ｍｌであるので、当業者は、ゲル１ｍｌ当たりのアドレナリンのｍｇ単位での濃度を容易に決定することができ、例えば、約約０．０００７５ｍｇ／ｍｌ〜約１８．７５ｍｇ／ｍｌである。
【０２５１】
上記変換計算の例を実施して、上述した血管収縮薬及び／又は凝固剤のいずれに対しても、或いは本発明の方法、組成物及びキットに使用するのに適切なあらゆる血管収縮薬及び／又は凝固剤の投与量範囲のいずれに対しても局所的適用に適切な濃度範囲を外挿することができる。組成物がパッチ、ゲル又は液体として製剤化される好ましい実施形態においては、かかる組成物は、例えば体重が約５０、６０、７０、８０若しくは９０ｋｇの成体、及び約１〜２、２〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１５、１５〜２０、２０〜２５若しくは２５〜３０ｃｍ２の例えばパッチの局所投与面積、又は約０．２５〜０．５、０．５〜１、１〜１．２５、１．２５〜１．５、１．５〜１．７５、１．７５〜２、２〜２．５若しくは２．５〜３ｍｌの例えば液体若しくはゲルの局所投与体積に対して、一般用として製造することができる。
【０２５２】
５．６．４  疾患
本発明の方法及び組成物によって治療又は防止することができる疾患としては、感染症、自己免疫疾患、癌、増殖性障害などが挙げられるが、これらだけに限定されない。ある実施形態においては、患者は、特定の感染症を治療するのに有用であり、又は免疫応答を誘発する細胞を扱うのに有用であることが知られている薬剤を産生する細胞を含む組成物を移植される。或いは、患者は、皮膚感染症、及び／又は外傷若しくは手術の結果として曝される内臓表面の感染症に対して局所的な治療を受ける。ある実施形態においては、患者は、特定の感染症を治療するのに有用であり、又は免疫応答を誘発する細胞を扱うのに有用であることが知られている薬剤を産生する細胞を含む組成物を局所投与される。かかる実施形態においては、本発明の組成物は、病原体に対する障壁を築き、ある実施形態においては病原体が定着するのを防ぐ細胞又は薬剤を含むことができる点で、予防的とすることができる。別の実施形態においては、患者は、感染症、自己免疫疾患、癌、増殖性障害によって損なわれた組織、化学療法、他の治療又は外傷によって損なわれた細胞及び組織を交換するための、新しい組織の成長用細胞及び／又は細胞を含む組成物を移植され、適用される。
【０２５３】
５．６．４．１  感染症
本方法及び組成物は、感染体によって細胞又は組織に引き起こされる傷害の治療に使用することができる。本方法及び組成物を使用して、例えば、ウイルス、細菌、原生動物、細胞内寄生体などの細胞内病原体によって引き起こされる組織傷害を治療することができる。
【０２５４】
ある実施形態においては、本方法及び組成物は、Ｂ型肝炎ウイルスなどのウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルスなどのパルボウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、エプスタインバーウイルスなどのヘルペスウイルス、痘瘡（天然痘）ウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）及びヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）を含めて、但し、これらだけに限定されないＲＮＡウイルス；インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ポリオウイルスなどのピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、風疹ウイルス（三日ばしか）、セムリキ森林ウイルスなどのトガウイルス、アルボウイルス、及びＡ型肝炎ウイルスによって引き起こされる傷害の治療に使用することができる。
【０２５５】
別の実施形態においては、本方法及び組成物を使用して、ストレプトコッカス  ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス  ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ナイセリア  ゴノローエ（Neisseria gonorrhoea）、ナイセリア  メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、コリネバクテリウム  ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）、クロストリジウム  ボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム  テタニ（Clostridium tetani）、ヘモフィルス  インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、クレブシエラ  ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ  オザエネ（Klebsiella ozaenae）、クレブシエラ  リノスクレロモチス（Klebsiella rhinoscleromotis）、スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）、ビブリオ  コレラ（Vibrio cholerae）、エシェリキア  コリ（Escherichia coli）、シュードモナス  アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、カンピロバクター（Campylobacter）（ビブリオ）フィタス（fetus）、カンピロバクター  ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、アエロモナス  ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）、エドワードシエラ  タルダ（Edwardsiella tarda）、エルシニア  エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、エルシニア  ペスチス（Yersinia pestis）、エルシニア  シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）、シゲラ  ディセンテリエ（Shigella dysenteriae）、シゲラ  フレキシネル（Shigella flexneri）、シゲラ  ソンネ（Shigella sonnei）、サルモネラ  チフィムリウム（Salmonella typhiimurium）、サルモネラ  チフィ（Salmonella typhii）、トレポネーマ  パリダム（Treponema pallidum）、トレポネーマ  ペルテニュ（Treponema pertenue）、トレポネーマ  カラテネウム（Treponema carateneum）、ボレリア  ビンセンティ（Borrelia vincentii）、ボレリア  ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、レプトスピラ  イクテロヘモラギエ（Leptospira icterohemorrhagiae）、マイコバクテリウム  ツベルキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）、トキソプラズマ  ゴンジイ（Toxoplasma gondii）、ニューモシスチス  カリニ（Pneumocystis carinii）、フランシセラ  ツラレンシス（Francisella tularensis）、ブルセラ  アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ  スイス（Brucella suis）、ブルセラ  メリテンシス（Brucella melitensis）、マイコプラズマ・ｓｐｐ、リケッチア  プロワツェキイ（Rickettsia prowazeki）、リケッチア  ツツガムシ（Rickettsia tsutsugumushi）、クラミジア種・ｓｐｐ、及びヘリコバクター  ピロリ（Helicobacter pylori）を含めて、但し、これらだけに限定されない病原菌によって引き起こされる組織傷害を治療することができる。
【０２５６】
別の好ましい実施形態においては、本方法及び組成物を使用して、エントオメーバ  ヒストリティカ（Entomoeba histolytica）、トリコモナス  テナス（Trichomonas tenas）、トリコモナス  ホミニス（Trichomonas hominis）、トリコモナス  バギナリス（Trichomonas vaginalis）、トリパノソーマ  ガンビエンス（Trypanosoma gambiense）、トリパノソーマ  ロデシエンス（Trypanosoma rhodesiense）、トリパノソーマ  クルージ（Trypanosoma cruzi）、リーシュマニア  ドノヴァニ（Leishmania donovani）、リーシュマニア  トロピカ（Leishmania tropica）、リーシュマニア  ブラジリエンシス（Leishmania braziliensis）、ニューモシスチス・ニューモニア（Pneumocystis pneumonia）、プラスモディウム  ビバクス（Plasmodium vivax）、プラスモディウム  ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、プラスモディウム  マラリア（Plasmodium malaria）など、但し、これらだけに限定されない病原性原虫によって引き起こされる傷害を治療することができる。
【０２５７】
５．６．４．２  増殖性疾患及び発癌性疾患
増殖性疾患及び発癌性疾患によって引き起こされる具体的な傷害に関して、本発明の方法及び組成物を使用して、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、すい癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、へん平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、骨髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、ぼうこう癌、上皮癌、神経こう腫、星状細胞腫、骨髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）；及び真性赤血球増多症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びＨ鎖病によって引き起こされる傷害を治療することができる。
【０２５８】
細胞増殖不全が関与し、例えば、変性組織、病変組織、傷害組織などにおける創傷治癒を促進し、或いは再生を促進するために、ポリマー繊維−細胞組成物の移植によって新しい細胞集団が定着することによって治療又は予防することができる疾患及び障害としては、変性障害、発育不全、低増殖性障害（ｈｙｐｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、物理的外傷、病変、創傷などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２５９】
５．６．４．３  自己免疫疾患
本発明の方法及び組成物を使用して、患者自身（自己）組織に対する免疫応答を軽減又は消失させる細胞を含む組成物を移植することによって、或いは罹患した患者自身の細胞を置換する細胞を移植することによって、かかる自己免疫疾患を治療することができる。移植においては、細胞を含む本発明の組成物を使用して、患者自身の免疫系に対して局所的に保護する細胞を定着させ、それによって局所的に疾患を防止することもできる。本発明は、さらに、自己免疫疾患によって引き起こされる組織傷害を治療する、一般に本発明の繊維−細胞マトリックスの移植を含む方法及び組成物を提供する。
【０２６０】
かかる自己免疫疾患としては、インシュリン依存性糖尿病（すなわち、ＩＤＤＭ又は自己免疫性糖尿病）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合性結合組織病、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、リウマチ様関節炎、硬変、尋常性天ぽうそう、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー病、水ほう性類天ほうそう、円板状ループス、潰よう性大腸炎、デンスデポジット病などが挙げられるが、これらだけに限定されない。本明細書に記載の上記疾患としては、かかる疾患の動物モデル、例えば、ＩＤＤＭの非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス、多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスなどによって示される疾患が挙げられる。
【０２６１】
５．６．４．４  神経系障害及び傷害
補充又は置換が必要な細胞型を含む神経系障害又は傷害は、本発明の方法によって治療することができる。これらの神経系障害又は傷害としては、軸索の切断、ニューロンの減少若しくは変性、又は脱髄をもたらす神経系傷害及び疾患若しくは障害が挙げられるが、これらだけに限定されない。（ヒト及び非ヒト哺乳動物患者を含めた）患者において本発明によって治療することができる神経系病変としては、（脊髄、脳を含めた）中枢神経系又は末梢神経系のどちらかの以下の病変が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２６２】
（ｉ）物理的傷害によって引き起こされる病変、又は手術に伴う病変、例えば、神経系の一部を切断する病変又は圧迫傷害を含めた外傷性病変、
（ｉｉ）神経系の一部における酸素の欠乏によって、脳梗塞若しくは虚血、又は脊髄梗塞若しくは虚血を含めた、ニューロンの傷害若しくは死がもたらされる虚血性病変、
（ｉｉｉ）神経系に関連する悪性腫瘍又は非神経系組織に由来する悪性腫瘍のどちらかである悪性組織によって神経系の一部が破壊され、又は傷害を受ける悪性病変、
（ｉｖ）例えば、膿瘍による感染、或いはヒト免疫不全症ウイルス、帯状ほう疹若しくは単純ヘルペスウイルスによる感染に関連する感染、或いはライム病、結核、梅毒に付随する感染の結果、神経系の一部が破壊され、又は傷害を受ける感染性病変、
（ｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病又は筋萎縮性側索硬化症に関連する変性を含めて、但し、これらだけに限定されない変性プロセスの結果、神経系の一部が破壊され、又は傷害を受ける変性病変、
（ｖｉ）ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ病、タバコアルコール性弱視、マルキアファーヴァビニャミ病（脳梁の一次変性）及びアルコール依存性小脳変性を含めて、但し、これらだけに限定されない栄養病又は代謝障害によって神経系の一部が破壊され、或いは傷害を受ける栄養病又は障害に関連する病変、
（ｖｉｉ）糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌腫又はサルコイドーシスを含めて、但し、これらだけに限定されない全身性疾患に関連する神経病変、
（ｖｉｉｉ）アルコール、鉛又は特定の神経毒を含めた毒性物質によって引き起こされる病変、並びに
（ｉｘ）多発性硬化症、ヒト免疫不全症ウイルス関連骨髄障害、横断性脊髄症又は様々な病因、進行性多巣性白質脳症、及び橋中心髄鞘崩壊症を含めて、但し、これらだけに限定されない脱髄疾患によって神経系の一部が破壊され、又は傷害を受ける脱髄病変。
【０２６３】
特定の実施形態においては、本発明の組成物及び方法によって治療することができる運動ニューロン障害としては、梗塞などの障害、感染、毒素への暴露、外傷、手術による損傷、運動ニューロン及び神経系の他の要素に影響を及ぼし得る変性疾患又は悪性腫瘍、並びに筋萎縮性側索硬化症などのニューロンに選択的に影響を及ぼす障害、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児及び若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（ファチオロンデ症候群）、灰白髄炎及びポリオ後症候群、並びに遺伝性運動感覚神経障害（シャルコーマリートゥース病）を含めて、但し、これらだけに限定されない障害が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２６４】
５．６．４．５  美容用途
美容外科の多くの態様では、人体に異物を導入する必要がある。非限定的な一例においては、豊胸は、シリコーン又は食塩水を含む嚢の挿入を含む。これらの嚢は破裂又は漏洩して有害な副作用を起こす危険性があり、また、女性は乳児に授乳できなくなる。したがって、乳房組織に移植するために、形成外科患者から得られる細胞を本発明の組成物に入れることができる。一実施形態においては、この組成物が食塩水又はシリコーン嚢の代わりに移植される。別の実施形態においては、形成外科から得られる細胞を含む本発明の組成物の乳房組織移植片が乳房切除術後に使用される。
【０２６５】
５．７  本発明の方法を用いた血小板の活性化及び／又は凝集
保存期間後の血小板の活性を求めるために一般に使用される血小板活性試験がいくつかある。これらの試験は、血小板数の測定、低浸透圧応力応答（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、コラーゲンによって誘発される凝集、及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって誘発される凝集を含む。低浸透圧応力応答は、血小板が代謝能力を保持しているかどうかを判定するために用いられるアッセイである。このアッセイは、血小板が低張溶液の添加に打ち勝つ能力を光度測定するものである。この活性は、細胞機能（すなわち、機能膜水ポンプ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｗａｔｅｒ  ｐｕｍｐ））を反映し、保存後の血小板の回復を示している。低浸透圧応力応答は、開放創と接触させた後の血小板の生存能力、又は移植若しくは注射によって体に戻した後の血小板の生存能力の重要な指標であることが実証されている。その結果、低浸透圧応力応答は、保存後の血小板の生化学的特徴を評価する極めて重要なパラメータである。上記試験は、本発明のポリマー繊維と複合化された血小板に対して使用することができる。
【０２６６】
凝集可能性は、血小板が保存中にその機能的完全性を維持しているかどうかを示す別の特徴である。この可能性は、凝集を誘発するＡＤＰ及びコラーゲンを用いることによって測定される。作用物質は、受容体に結合し、ある応答を惹起する薬剤である。作用物質によって誘発される凝集においては、凝集又は凝集体が応答である。作用物質、ＡＤＰ及びコラーゲンは、凝集を引き起こして、血小板がその凝集能力を保持しているかどうかを判定するために使用される。また、凝集応答を実施するときには、自然凝集の存在、すなわち、作用物質を添加せずとも互いに付着する血小板を検出することができる。自然凝集の発生は、循環からの血小板の除去と相関がある。かかる作用物質を本発明の組成物に添加するときには、凝集度を記録することができる。これが経時的に繰り返し行われる場合には、血小板凝集の点での本発明の組成物の有効性をモニターすることができる。或いは、かかる試験によって、本発明の組成物を製造する前に保存血小板を評価することができる。
【０２６７】
また、実施例セクション９に記載の血小板活性化のアッセイは、顕微鏡法及び／又は凍結乾燥技術を用いて細胞を直接観察することによって血小板活性化を評価するのに利用することもできる。
【０２６８】
５．８  本発明の組成物及び方法の用量及び投与
一般に、本発明の組成物の治療有効量は、すべて当業者が求めることができる、患者の年齢、状態及び性別、並びに被験者の病気の性質及び程度に応じて変わる。例えば、乳児に必要な有効量（すなわち、量）は、高齢患者とは異なり得る。投与される生物学的材料又はその組成物の実際の量及び製剤は、創傷の重篤度、患者の状態、患者の年齢、患者が持っているあらゆる副次的な傷害又は医学的病気などの様々な要因によって決まる。
【０２６９】
本発明の組成物の毒性及び効力は、細胞培養又は実験動物において、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定する標準の医薬手順によって求めることができる。より大きな治療効果を示す組成物が好ましい。この場合、本発明の方法を実施するのに毒性副作用を示す組成物を使用することができる。組成物は患部組織部位に適用され、それによって副作用のリスクが減少するので、罹患していない細胞への潜在的な損傷は最小限に抑えられる。かかる組成物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含む濃度の範囲内にある。投与量は、組成物の剤形、すなわち、ゲル、発泡体、パッチなどに応じて、この範囲内で変わる。
【０２７０】
本発明の組成物がパッチとして製剤化され、又はパッチに適用される本発明の実施形態においては、パッチの創傷接触表面１ｃｍ２当たりの組成物を１００ｍｇとすることができる。別の実施形態においては、パッチ１ｃｍ２当たりの本発明の組成物の有効量は、組成物約０．０５ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５０ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ又は２０００ｍｇとすることができ、組成物の濃度は約１ｍＭ〜７０ｍＭである。好ましい実施形態においては、パッチ１ｃｍ２当たりの本発明の組成物の有効量は、組成物０．０５ｍｇ〜３０ｍｇであり、組成物の濃度は約１ｍＭ〜７０ｍＭである。
【０２７１】
本発明の組成物は、皮膚表面又は露出器官表面の創傷部位に局所投与することができ、移植することができ、或いは注射することができる。ある実施形態においては、本発明の組成物は、カテーテル軌跡中に投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、血管の裂け目又は穴を処理するために局所投与される。局所投与部位は、血管の裂け目又は穴に隣接する。注射の場合には、注射用に設計された本発明の組成物、例えばゲル又は溶液を皮内、皮下又は筋肉内注射によって投与することができる。
【０２７２】
５．９  キット
本発明に従って上記実施形態のいずれかを含むキットも提供される。キットは、組成物を汚染されずに容易に取り出すことができる、密封、防水、無菌パッケージ内に入れられた組成物を含むことができる。容器を構成することができる材料としては、滅菌が容易なアルミ箔、プラスチック、別の従来の材料などが挙げられる。キットは、単一組成物でも複数の組成物でも含むことができ、好ましくは、各組成物が別個の防水無菌パッケージで提供される。
【０２７３】
本発明のキットは、本発明の細胞−ポリマー繊維を含むことができ、ヒト又は動物に対する使用許可を示す規制上の表示を場合によっては含むことができる。
【０２７４】
或いは、本発明のキットは、本発明の組成物中に製剤化することができる１種類又は複数の成分を含むことができる。本発明の組成物を製造するための説明書、及び／又は製造後に組成物を患者に投与するための説明書をかかるキットに場合によっては添付してもよい。例えば、本発明のキットは、１個若しくは複数の区画中に、ポリマー繊維と、ポリマー繊維と相互作用する単離細胞、又はポリマー繊維に結合する単離細胞とを含むことができる。本発明の組成物を製造する追加の成分、例えば、二価の陽イオン溶液又は二価の陽イオン溶液を作製することができる塩を場合によっては含んでいてもよい。また、本発明の組成物を製造するのに使用することができる他の試薬、例えば、滅菌水又は細胞培地を使用することができる。キットは、本発明の組成物の成分を混合するための、かつ／又は組成物を患者に投与するための１個若しくは複数のシリンジ又は他の容器若しくは道具を場合によっては含んでいてもよい。本発明のある実施形態においては、特に自家療法を含む実施形態においては、本発明のキットは、細胞を含まないが、患者の細胞を用いて本発明の組成物を製造するための他の試薬を含む。
【０２７５】
キットは、移植用に設計された哺乳動物の体の一部を模倣するようになされたスポンジ又は三次元形状として製剤することができる組成物を含むことができる。かかるキットにおいては、本発明のポリマー繊維スポンジ又は他の構造部材を、送達用の別個の無菌区画に入れることができる。次いで、細胞、例えばスポンジが投与される患者の自家細胞を、医用の設定に加えることができる。
【０２７６】
これに加えて、又はこれとは別に、本発明のキットは、１つ若しくは複数の本発明の方法の実行について記載した説明書、或いは医薬品若しくは生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の表示を備えることができる。この表示は、ヒト投与に対する製造、使用又は販売が政府機関によって承認されたことを示すものである。したがって、キットは、ＦＤＡ承認に関する表示、及び／或いはある距離をおいて、かつ／又は圧迫と組み合わせて使用する指示書を備えることができる。
【０２７７】
また、緊急用又は軍用に設計されたキットは、はさみ、メス、鉗子、止血器、弾性又は非弾性包帯などあらかじめ殺菌された使い捨ての機器を含むことができる。好ましい実施形態においては、キットはガーゼを含む。
【０２７８】
本発明は、番号付けされた以下のパラグラフに列挙された以下の実施形態によって説明することができる。
【０２７９】
１．  単離された哺乳動物細胞集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維との複合体を含む医薬組成物
２．  繊維が、哺乳動物細胞上にある１個又は複数の細胞表面タンパク質に結合することによって哺乳動物細胞と相互作用する、パラグラフ１に記載の医薬組成物
３．  １個又は複数の細胞表面タンパク質がＧＰＩＩＩａ、ＧＰＩｂ又はα２ｂβ３インテグリンを含む、パラグラフ２に記載の医薬組成物
４．  哺乳動物細胞集団が一次哺乳動物細胞集団である、パラグラフ１に記載の医薬組成物
５．  組成物が０℃以下で凍結される、パラグラフ１に記載の医薬組成物
６．  組成物が２２℃以下で保存される、パラグラフ１に記載の医薬組成物
７．  相互作用によって細胞が活性化される、パラグラフ１に記載の医薬組成物
８．  細胞の活性化が細胞の形態学的変化として示される、パラグラフ７に記載の医薬組成物
９．  細胞の形態学的変化が足（podia）の伸長を含む、パラグラフ７に記載の医薬組成物
１０．  細胞集団が、リンパ球、顆粒球、好塩基球、好中球、リンパ性細胞、マクロファージ、内皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、間葉細胞、造血細胞、顆粒球、赤血球、好酸球、上皮、肝細胞、骨髄細胞、幹細胞又は胎児細胞を含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
１１．  細胞集団が実質的に精製された集団である、パラグラフ１に記載の医薬組成物
１２．  細胞集団が、異なる組織又は体液に由来する細胞を含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
１３．  細胞集団が血小板を含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
１４．  血小板が実質的に精製されている、パラグラフ１３に記載の医薬組成物
１５．  細胞集団が赤血球を含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
１６．  赤血球が実質的に精製されている、パラグラフ１５に記載の医薬組成物
１７．  繊維が走査型電子顕微鏡で測定して長さ約５μｍ〜１ｃｍである、パラグラフ１に記載の医薬組成物
１８．  繊維が走査型電子顕微鏡で測定して長さ約５０μｍ〜７５０μｍである、パラグラフ１７に記載の医薬組成物
１９．  繊維が走査型電子顕微鏡で測定して長さ約１００μｍ〜５００μｍである、パラグラフ１７に記載の医薬組成物
２０．  繊維が走査型電子顕微鏡で測定して幅１０〜５００ｎｍである、パラグラフ１７から１９のいずれかに記載の医薬組成物
２１．  繊維が走査型電子顕微鏡で測定して幅２５〜２５０ｎｍである、パラグラフ１７から１９のいずれかに記載の医薬組成物
２２．  繊維が走査型電子顕微鏡で測定して幅５０〜１００ｎｍである、パラグラフ１７から１９のいずれかに記載の医薬組成物
２３．  ポリマー繊維がポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンである、パラグラフ１に記載の医薬組成物
２４．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンが微細藻類のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンである、パラグラフ２３に記載の医薬組成物
２５．  微細藻類のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンが、微細藻類のコスキノディスクス属、キクロテラ属又はタラシオシラ属に由来する、パラグラフ２４に記載の医薬組成物
２６．  微細藻類のポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンが微細藻類のタラシオシラ属に由来し、タラシオシラの種がフルビアテリス又はワイスフロッギーである、パラグラフ２５に記載の医薬組成物
２７．  繊維が、ゲル、固体、液体、スポンジ、発泡体、スプレー、エマルジョン、懸濁液、又は溶液、マット、糸、ガーゼ、縫合糸、ビーズ、ミクロスフェア又はミクロフィブリルとして製剤化される、パラグラフ１に記載の医薬組成物
２８．  組成物が、縫合糸として製剤化されたポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン繊維及び血小板を含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
２９．  単離細胞の体積とポリマー繊維懸濁液の体積の比が１：１である、パラグラフ１に記載の医薬組成物
３０．  二価の陽イオンをさらに含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
３１．  二価の陽イオンがマグネシウムである、パラグラフ３０に記載の医薬組成物
３２．  二価の陽イオンがカルシウムである、パラグラフ３０に記載の医薬組成物
３３．  カルシウムが１０％ＣａＣｌ２溶液である、パラグラフ３２に記載の医薬組成物
３４．  細胞集団が少なくとも１、２、３又は４日間単離された哺乳動物である、パラグラフ１に記載の医薬組成物
３５．  １種類若しくは複数の増殖因子又はサイトカインをさらに含む、パラグラフ１に記載の医薬組成物
３６．  増殖因子が、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、ＮｏｔｃｈのＲＢＰＪκ結合ドメイン、レチノイン酸、肥満細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β又はトロンボポイエチンである、パラグラフ３５に記載の医薬組成物
３７．  増殖因子がインターフェロン又は腫瘍壊死因子である、パラグラフ３５に記載の医薬組成物
３８．  増殖因子がインターフェロンＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＩＬ−６である、パラグラフ３７に記載の医薬組成物。
【０２８０】
３９．  哺乳動物から単離された細胞集団及びポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーを含む組成物であって、単離細胞が少なくとも５分間保存される、組成物
４０．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維が精製されている、パラグラフ３９に記載の組成物
４１．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーがアセチル化されている、パラグラフ３９に記載の組成物
４２．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーが脱アセチル化されている、パラグラフ３９に記載の組成物
４３．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーが、タンパク質を含まず、他の有機汚染物質を実質的に含まず、無機汚染物質を実質的に含まない、パラグラフ３９に記載の組成物
４４．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーが半晶質である、パラグラフ３９に記載の組成物
４５．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーが生分解性及び生体適合性である、パラグラフ３９に記載の組成物
４６．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーの分子量が約８００，０００ダルトン〜約３０，０００，０００ダルトンである、パラグラフ３９に記載の組成物
４７．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーが、分子量約８００，０００ダルトン〜約３０，０００，０００ダルトンの半晶質を含む、パラグラフ３９に記載の組成物
４８．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーの分子量が約１０，０００ダルトン〜約８００，０００ダルトンである、パラグラフ３９に記載の組成物
４９．  ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーが、分子量約１０，０００ダルトン〜約８００，０００ダルトンの半晶質を含む、パラグラフ３９に記載の組成物
５０．  一次哺乳動物細胞の単離集団と、哺乳動物細胞と相互作用する実質的に精製されたポリマー繊維とを、細胞と繊維が相互作用する条件下で混合することによって製造された組成物。
【０２８１】
５１．  ＧＰＩＩＩａ及びＧＰＩｂ表面タンパク質を発現する細胞と複合体を形成するポリマー繊維を特定する方法であって、
ａ）標識されたＧＰＩＩＩａ及びＧＰＩｂ表面タンパク質と細胞を接触させるステップと、
ｂ）細胞からタンパク質を溶出するステップと、
ｃ）標識の強度又は存在を測定するステップと
を含み、その結果細胞に結合した繊維が特定される、上記方法
５２．  細胞と複合体を形成するポリマーを特定する方法であって、
ａ）ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維を標識するステップと、
ｂ）標識されたｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維を試験ポリマー繊維と混合するステップと、
ｃ）細胞集団を混合繊維試料及び純粋なｐＧｌｃＮＡｃ試料に添加するステップと、
ｄ）ｐＧｌｃＮＡｃと細胞の結合が通常起こる条件下に混合物を置くステップと、
ｅ）混合物を溶出して結合していない細胞及び繊維を除去するステップと、
ｆ）標識されたｐＧｌｃＮＡｃの量を比較するステップと
を含み、その結果細胞へのｐＧｌｃＮＡｃの結合を競合的に阻害するポリマー繊維が特定される、上記方法
５３．  後で治療に使用するために、哺乳動物から単離された細胞集団を保存する方法であって、ゲルが形成されるように、前記細胞をポリマー繊維と接触させるステップと、そのゲルをその後使用するために凍結するステップとを含む方法
５４．  哺乳動物から単離された細胞集団を活性化する方法であって、ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリマー繊維を細胞に接触させ、それによって細胞を活性化するステップを含む方法
５５．  創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進する方法であって、患者において創傷治癒が促進されるように、哺乳動物から単離された細胞集団及びポリマー繊維を含む組成物を創傷に投与するステップを含み、該細胞が保存細胞から得られ、ポリマーに結合するものである、上記方法
５６．  止血を必要とする患者において止血時間を短縮する方法であって、患者において止血時間が短縮されるように、哺乳動物から単離された細胞集団と、該細胞が相互作用するポリマー繊維とを含む組成物を創傷に投与するステップを含み、該細胞が保存細胞から得られるものである、上記方法
５７．  細胞が前記患者から得られるものである、パラグラフ５５又は５６に記載の方法
５８．  細胞とポリマー繊維が、組成物を患者に投与するステップの直前、或いは組成物を患者に投与するステップと同時に混合される、パラグラフ５６又は５６に記載の方法
５９．  治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、
（ａ）ｐＧｌｃＮＡｃを、バンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップであって、細胞表面タンパク質が、試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができる条件下で、細胞表面及び試験化合物上で発現され、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成されるステップと、
（ｂ）ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップとを含み、
ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されることによって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定される、上記方法
６０．  ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物と接触させる、パラグラフ５９に記載の方法
６１．  ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させる、パラグラフ５９に記載の方法
６２．  細胞表面タンパク質を試験化合物と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃと試験化合物を接触させる、パラグラフ５９に記載の方法
６３．  ｐＧｌｃＮＡｃがｐＧｌｃＮＡｃ繊維である、パラグラフ５９に記載の方法
６４．  試験化合物が繊維である、パラグラフ５９に記載の方法
６５．  繊維がポリマー繊維である、パラグラフ６４に記載の方法
６６．  繊維がタンパク質繊維である、パラグラフ６４に記載の方法
６７．  タンパク質がヒトタンパク質である、パラグラフ６６に記載の方法
６８．  ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップが、ｐＧｌｃＮＡｃと細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含む、パラグラフ５９に記載の方法
６９．  ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップが、試験化合物と細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含む、パラグラフ５９に記載の方法
７０．  前記方法をインビトロで実施する、パラグラフ５９に記載の方法
７１．  前記方法をインビボで実施する、パラグラフ５９に記載の方法
７２．  細胞表面が血小板表面である、パラグラフ５９に記載の方法
７３．  細胞表面が赤血球表面である、パラグラフ５９に記載の方法
７４．  止血を促進することができる試験化合物、又は創傷治癒を加速することができる試験化合物が治療薬候補となるように、試験化合物が止血を促進することができるかどうか、又は創傷治癒を加速することができるかどうかを判定するステップをさらに含む、パラグラフ５９に記載の方法
７５．  ゲルを形成することができる試験化合物が細胞保存剤候補となるるように、試験化合物が、血小板と、場合によっては、１０％塩化カルシウム溶液と混合されたときにゲルを形成することができるかどうかを判定するステップをさらに含む、パラグラフ５９に記載の方法
７６．  ステップ（ａ）の前に、
（ａ）分子の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合し、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質及び前記分子と接触させるステップと、
（ｂ）ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体形成が前記分子によって阻害されるかどうかを判定するステップと
を含む方法によって適切な試験化合物を特定するステップをさらに含み、
ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が前記分子によって阻害されることによって、前記分子が適切な試験化合物として特定される、パラグラフ５９に記載の方法
７７．  ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを前記分子と接触させる、パラグラフ７６に記載の方法
７８．  ｐＧｌｃＮＡｃを前記分子と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させる、パラグラフ７６に記載の方法
７９．  細胞表面タンパク質を前記分子と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質及び試験化合物と接触させる、パラグラフ７６に記載の方法
８０．  細胞表面タンパク質を固体表面に固定する、パラグラフ７６に記載の方法
８１．  細胞表面タンパク質が細胞膜中に存在し、細胞膜を固体表面上に固定する、パラグラフ８０に記載の方法。
【０２８２】
８２．  治療薬候補又は細胞保存剤候補を特定する方法であって、
（ａ）試験化合物の非存在下でｐＧｌｃＮＡｃが細胞表面タンパク質に結合することができ、それによってｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体が形成される条件下で、ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物並びにバンドＩＩＩ、グリコホリンＡ、ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ及びα２ｂβ３からなる群から選択される細胞表面タンパク質と接触させるステップと、
（ｂ）ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップとを含み、
ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されることによって、試験化合物が治療薬候補又は細胞保存剤候補として特定される方法
８３．  ｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物と接触させる、パラグラフ８２に記載の方法
８４．  ｐＧｌｃＮＡｃを試験化合物と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃを細胞表面タンパク質と接触させる、パラグラフ８２に記載の方法
８５．  細胞表面タンパク質を試験化合物と接触させた後にｐＧｌｃＮＡｃと試験化合物を接触させる、パラグラフ８２に記載の方法
８６．  ｐＧｌｃＮＡｃがｐＧｌｃＮＡｃ繊維である、パラグラフ８２に記載の方法
８７．  試験化合物が繊維である、パラグラフ８２に記載の方法
８８．  繊維がポリマー繊維である、パラグラフ８７に記載の方法
８９．  繊維がタンパク質繊維である、パラグラフ８７に記載の方法
９０．  タンパク質がヒトタンパク質である、パラグラフ８９に記載の方法
９１．  ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップが、ｐＧｌｃＮＡｃと細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含む、パラグラフ８２に記載の方法
９２．  ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体の形成が試験化合物によって阻害されるかどうかを判定するステップが、試験化合物と細胞表面タンパク質の結合量を測定するステップを含む、パラグラフ８２に記載の方法
９３．  止血を促進することができる試験化合物、又は創傷治癒を加速することができる試験化合物が治療薬候補となるように、試験化合物が止血を促進することができるかどうか、又は創傷治癒を加速することができるかどうかを判定するステップをさらに含む、パラグラフ８２に記載の方法
９４．  ゲルを形成することができる試験化合物が細胞保存剤候補となるように、試験化合物が、血小板と、場合によっては、１０％塩化カルシウム溶液と混合されたときにゲルを形成することができるかどうかを判定するステップをさらに含む、パラグラフ８２に記載の方法。
【実施例】
【０２８３】
６．実施例：血小板−ｐＧｌｃＮＡｃゲル
血小板−ｐＧｌｃＮＡｃゲルを、ｐＧｌｃＮＡｃ、血小板及びカルシウム塩溶液の様々な組み合わせによって製造した。本明細書に提示する結果は、本発明の組成物を支持するものである。
【０２８４】
材料及び方法
２つの手法を利用して、本発明の組成物及び方法に使用される血小板を調製した。１つの手法では、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔにあるアメリカ赤十字社から得られた高収率血小板を使用した。血小板は、Ｂａｘｔｅｒ  Ａｍｉｃｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ及びＣｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて実施された血小板フェレーシス処置によって得られた。もう１つの手法は、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて収集されたＣＰＤ全血から血小板が豊富な血漿を単離するものであった。両方の血小板処置では、白血球が低減された。別の手法は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  ＭａｇｅｌｌａｎＴＭＡｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒなどの血小板分離装置によって患者から血小板の豊富な血漿を得るものである。Ｍａｇｅｌｌａｎ分離装置は、密度差及び軽い遠心力を使用して、重要な増殖因子を含む、血小板が豊富な血漿を血液試料から分離し、これらの成分を個別の無菌シリンジに入れる自動化システムである。このシステムは、極めて少量の患者血液（３０〜６０ｃｃ）しか必要とせず、医師が望む安定した、血小板が豊富な血漿が得られる点で独特である。外科医は、患者の要望に応じて様々な用途及び臨床手順に対して、血小板が豊富な血漿と、ｐＧｌｃＮＡｃなどの活性化物質とを混合することができる。
【０２８５】
米国赤十字社から得られた高収率血小板を撹拌しながら２２℃で４〜１０日間保存した。血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）を血小板数測定のためにサンプリングし、次いで、いくつかの方法で処理して治療用薬剤を製造した。第１に、ゲルを製造せず、単に血小板の豊富な血漿を超遠心分離によって製造した。血液試料を１０ｍｌアリコートのＰＲＰで、２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞非含有血漿を得た。第２に、１０ｍｌアリコートのＰＲＰを１０回凍結・解凍して、凍結された対照を製造した。次いで、このアリコートの試料を２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞非含有血漿を得た。第３に、１０％塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０．２５ｍｌを１０ｍｌアリコートのＰＲＰに添加し、次いでこれを室温で３０分間インキュベートすることによって、カルシウム処理された組成物を製造した。３０分後、２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞非含有血漿を得た。第５に、ウシのトロンビン５０００単位を１０ｍｌアリコートのＰＲＰに添加し、次いでこの混合物を室温で３０分間インキュベートすることによって、トロンビン組成物を製造した。試料を２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞非含有血漿を得た。第６に、塩化カルシウム０．２５ｍｌ及びウシトロンビン５０００単位を１０ｍｌアリコートのＰＲＰに添加し、これを室温で３０分間インキュベートすることによって、ＣａＣｌ／トロンビン処理された組成物を製造した。次いで、混合物を２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞非含有血漿を得た。第７に、塩化カルシウム０．１２５ｍｌ及びｐＧｌｃＮＡｃスラリー５ｍｌ（１ｍｇ繊維／ｍｌ蒸留Ｈ２Ｏ）をＰＲＰ  ５ｍｌに添加することによって、ｐＧｌｃＮＡｃスラリーで処理された組成物を製造した。次いで、混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いで２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞非含有血漿を得た。第８に、塩化カルシウム０．１２５ｍｌ及びｐＧｌｃＮＡｃスラリー５ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｌアリコートのＰＲＰに添加することによって、ｐＧｌｃＮＡｃスラリー／ＣａＣｌで処理された組成物を製造した。混合物を室温で３０分間インキュベートし、２０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞非含有血漿を得た。
【０２８６】
結果
ＣａＣｌ２は、ＰＲＰをｐＧｌｃＮＡｃで処理したときに、血小板ゲルを生成するのに必要であった。血小板ゲルは、トロンビンとＣａＣｌ２によって生成されるゲルと類似した速度で、ｐＧｌｃＮＡｃとＣａＣｌ２によって生成された。次いで、ゲル形成を調べるために、血小板が豊富な血漿をペトリ皿上に置き、ｐＧｌｃＮＡｃ及びＣａＣｌ２で処理した。この混合物は、手で撹拌しながら３分以内に血小板ゲルを生成した。この研究で使用されるｐＧｌｃＮＡｃスラリーは、１ｍｇ／ｍｌ蒸留水であった。０．９％ＮａＣｌ  １．０ｍｌ当たり１ｍｇのｐＧｌｃＮＡｃ及び０．９％ＮａＣｌ  １．０ｍｌ当たり２ｍｇのｐＧｌｃＮＡｃを用いて類似の結果が得られた。
【０２８７】
結論
ｐＧｌｃＮＡｃ及び血小板を含むゲルを様々な方法によってうまく製造することができる。これらの結果に基づいて、最も有効な方法は、ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板ゲルの生成におけるカルシウム塩溶液の添加を含む。上記のとおり生成されたゲルは、様々な治療用途に使用することができ、輸血を目的とした期間が過ぎた後に現在は処分されている保存血小板を利用することができる点で、現行用途よりも特に有利である。
【０２８８】
７．実施例：血小板は、ｐＧｌｃＮＡｃポリマーに付着して、様々な血小板／ｐＧｌｃＮＡｃ比のポリマー−細胞大凝集体を形成する
本明細書に示す実施例は、血小板とｐＧｌｃＮＡｃの凝集相互作用の確認に成功したことを説明するものである。本明細書に示す実験は、本発明の組成物の製造に関係する本発明の方法の基礎を成す。特に、これらの結果は、様々な製剤の本発明の組成物における血小板とｐＧｌｃＮＡｃの比の基礎を成す。本発明は、本発明の組成物を製造する方法、及びかかる方法の効率にも関する。
【０２８９】
材料及び方法
新しい血小板と保存血小板の両方を、蛍光団ＣＭＦＤＡで標識した（Fischer et al., 2001, Art. Cell. Blood Subs. Imm. Biotech.近刊）。ｐＧｌｃＮＡｃ  １ｍｇ当たり約２ｘ１０６個の血小板及びｐＧｌｃＮＡｃ  １ｍｇ当たり７ｘ１０７個の血小板を含めて、新しい血小板とｐＧｌｃＮＡｃを異なる比で混合した。両方の場合において、ｐＧｌｃＮＡｃは脱アセチル化され、スポンジとして製剤化した。保存血小板とｐＧｌｃＮＡｃも、ｐＧｌｃＮＡｃ  １ｍｇ当たり約５．４ｘ１０８個の血小板の比で混合された。ここで、ｐＧｌｃＮＡｃは、完全にアセチル化されたスラリーであった。これらの混合物を室温でタイロード緩衝液中で二価の陽イオンと反応させた。得られた血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークをタイロード緩衝液で１５分間にわたり５回洗浄して付着していない血小板を除去し、次いで相対蛍光強度を比較することによって血小板含量を推定した。
【０２９０】
結果
図１のデータは、相互作用反応における血小板とｐＧｌｃＮＡｃの比を変えることによって、得られる血小板−ｐＧｌｃＮＡｃマトリックスの血小板含量が、広い範囲にわたって比例し得ることを示している。様々な比の蛍光標識された血小板と脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃを反応させ、次いで生理緩衝液によって徹底的に洗浄することによって結合していない細胞を除去した。多糖上に保持された血小板数を蛍光によって定量した。血小板とｐＧｌｃＮＡｃの最も高い比は、５．４ｘ１０８細胞／ｍｇ  ｐＧｌｃＮＡｃであった（総細胞内体積約５．４ｕｌ／ｍｇ  ｐＧｌｃＮＡｃに相当する）。しかし、この値が限界では決してない。
【０２９１】
結論
これらの結果によれば、少量のｐＧｌｃＮＡｃが大きい血小板−血小板凝集体に取り込まれた場合には、血小板含量に制限の無い血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークを形成することができる。血小板とｐＧｌｃＮＡｃの比は、添加された血小板の量、並びにｐＧｌｃＮＡｃの製剤及び血小板の古さによって調節することができる。これらの結果は、本発明の組成物中の血小板とｐＧｌｃＮＡｃの比に対する支持を提供することによって実証される。したがって、効果的に混合して組成物を形成することができるｐＧｌｃＮＡｃと血小板の量についての理解が得られた。
【０２９２】
８．実施例：血小板は、完全にアセチル化されたｐＧｌｃＮＡｃネットワークよりも脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃネットワークに容易に付着し、膜製剤よりもスポンジに容易に付着する
本明細書に示す実施例は、血小板と様々なｐＧｌｃＮＡｃ製剤及び改変製剤との良好な相互作用を説明するものである。本明細書に示す実験は、本発明の組成物の製造に関係する本発明の方法の基礎を成す。特に、この結果は、様々な製剤の組成物の製造に使用される比の基礎を成す。
【０２９３】
材料及び方法
新しい（ゲルろ過された）血小板を４種類の異なるｐＧｌｃＮＡｃポリマー製剤とともにインキュベートして、マトリックスの相対「負荷」効率を求めた。４種類の製剤は、脱アセチルスポンジ、脱アセチル膜、アセチルスポンジ及びアセチル膜であった。蛍光標識された血小板を生理緩衝液中でインキュベートし、徹底的に洗浄して過剰の細胞を除去した後に、相対蛍光を測定することによって結合した血小板を定量した。
【０２９４】
結果
蛍光分析によれば、血小板は、陽イオン性脱アセチルポリマーに最も容易に付着した。図２Ａのデータは、ｐＧｌｃＮＡｃ  １ｍｇ当たりの血小板数（ｘ１０７）を比較したものである。ｐＧｌｃＮＡｃの脱アセチル及びアセチルスポンジ製剤は、脱アセチル及びアセチル膜製剤よりも多数の血小板に結合した。脱アセチル膜は、アセチル膜よりも多数の血小板に結合した。脱アセチルスポンジは、アセチルスポンジの少なくとも２倍の血小板に結合した。図２Ｂは、４種類の製剤のｐＧｌｃＮＡｃにおいて観測された相対蛍光度である。
【０２９５】
結論
この結果は、多糖と細胞表面上の負に帯電したタンパク質及び脂質とのイオン性相互作用を示唆している。血小板が膜試料よりもスポンジにより付着し易いのは、繊維空隙率の物理的な差によるものの可能性がある。これらの結果は、分析された４種類の製剤のｐＧｌｃＮＡｃと効果的に混合することができる血小板数を与えることによって、細胞とｐＧｌｃＮＡｃ繊維の比を調節することができることを示している。
【０２９６】
９．実施例：血小板はｐＧｌｃＮＡｃポリマーに接触したときに活性化する
得ることができる高血小板/ｐＧｌｃＮＡｃ比は、細胞とポリマーの接触によって血小板が活性化される証拠である。本明細書に示す実験においては、血小板と多糖の接触によって細胞が活性化されることを確認するために、走査及び蛍光顕微鏡法を実施した。本発明の方法及び本発明の組成物の基礎のためのこれらの実験。特に、これらの実験は、細胞を活性化する方法、及び／又は凝集させる方法の基礎を成す。これによって、かかる活性化及び／又は凝集細胞が必要とされるある治療用途における利点を増大させることができる。
【０２９７】
材料及び方法
血小板は、実施例６において記載したように分画遠心分離及びゲルろ過によって新鮮血から単離された。次いで、血小板を、二価のイオンを含むタイロード緩衝液中で、完全アセチルｐＧｌｃＮＡｃスラリーと混合した。室温で５分間インキュベーションした後に、α顆粒タンパク質ｐ−セレクチンの表面暴露用にＭａｂ抗ｐ−セレクチン−ＰＥを添加して細胞を標識した。電子及び蛍光顕微鏡法のために氷冷２％パラホルムアルデヒドで試料をクエンチした。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して細胞の活性化状態を調べた。かかる顕微鏡法の例は、試料を金でスパッタコーティングし、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ＸＬ３０  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｇｕｎ走査型電子顕微鏡などの走査型電子顕微鏡を用いて３ｋＶで観察することである。しかし、当業者に公知のあらゆる技術を使用することができる。
【０２９８】
凍結乾燥されたｐＧｌｃＮＡｃ−血小板組成物上の血小板もＳＥＭによって調べた。
【０２９９】
結果
図３（パネルＡ）の走査型電子顕微鏡写真によれば、ｐＧｌｃＮＡｃ繊維に結合した血小板は、伸びた仮足を有する活性化された非円板状の形態を示していることが明らかである。また、血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ組成物とｐ−セレクチンに対するＰＥ−複合化モノクローナル抗体とをインキュベートすると（図３、パネルＢ）、ポリマーに接触した細胞が、（少なくとも）ｐ−セレクチンを含めたα顆粒の内容物が表面に露出する程度に活性化されたことが明らかになった。α２ｂβ３の活性化コンホメーションに対する蛍光抗体を用いても類似の結果が得られた（下記実施例１０参照）。
【０３００】
凍結乾燥されたｐＧｌｃＮＡｃ−血小板組成物上の血小板のＳＥＭの結果を図５に示す。凍結乾燥された血小板は、ｐＧｌｃＮＡｃ上でその活性化形態を保持した。
【０３０１】
結論
これらの結果によれば、ｐＧｌｃＮＡｃと血小板の相互作用によって、ガラス（例えば、Rozenberg and Stormorken, 1967, Scand. J. Clinic. Lab. Invest. 19: 82-85; Coller et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 325-338）、ポリリジン（例えば、Kinlough-Rathbone et al., 1977, Thromb. Haem. 37: 291-308; Ishihara et al., 1994, J. Biomedical Materials Res. 28: 1347-1355）、プラスチック（例えば、Goodman et al., 1993, J. Biomedical Materials Res. 27: 683-695）及び金属（De Scheerde et al., 1998, Seminars in Interventional Cardiology 3: 139-144）を含めて他の材料と血小板が相互作用するときに認められる形態と類似したように見える活性化細胞形態がもたらされる。これらの結果が、ｐＧｌｃＮＡｃによる血小板の活性化、及びｐＧｌｃＮＡｃとの相互作用による血小板の凝集を実証していることは議論の余地がなく、相互作用はポリマー繊維と細胞が相互作用するときに生じるという事実に基づいて、そのような組成物等を得る方法を支持するものである。
【０３０２】
１０．実施例：ｐＧｌｃＮＡｃポリマーへの血小板の付着は、α２Ｂβ３糖タンパク質ＩＩＢ−ＩＩＩＡ複合体に部分的に関与している
吸収された接着タンパク質及びその細胞表面タンパク質が、多糖による血小板の接触活性化に関与することができるかどうかを明らかにするために３通りの試験が実施された。第１に、脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃが血漿タンパク質を吸収した程度が調べられた。第２に、ＲＧＤ含有α２ｂβ３阻害剤エキスタチン及びインテグリリンが、脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃポリマーへの血小板の付着を阻害するかどうかが調べられた。第３に、脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃが、血小板とｐＧｌｃＮＡｃの相互作用に関与する可能性がある血小板表面タンパク質を吸収する「親和性」マトリックスとして使用された。
【０３０３】
材料及び方法
第２の試験では、脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃスポンジを過剰のヒト血漿（血漿１．０ｍｌ／脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃスポンジ１０．３ｍｇ）とともにインキュベートし、次いで徹底的に洗浄して結合していないタンパク質を除去した。マトリックスをＳＤＳ及びβ−ＭＥ中に入れ、煮沸し、電気泳動させた。
【０３０４】
第２の試験では、ゲルろ過された新しい（蛍光標識された）血小板を、エキスタチン、安定なプロスタサイクリンアナログであるイロプロスト（一般的な血小板阻害用の強力なｃＡＭＰシグナル活性化物質）、インテグリリン又は対照緩衝液で処理した。接触活性化第ＸＩＩａ因子（トウモロコシトリプシン阻害剤）及びトロンビン（ヘパリン）の阻害剤が、特異的相互作用機序を調べるために一部の試料に入れられた。次いで、細胞を脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃスポンジと二価の陽イオンの存在下で混合し、次いで徹底的に洗浄して結合していない血小板を除去した。次いで、得られた血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークの血小板含量を蛍光によって測定した。フィブリン−ゲル形成及び血餅収縮に対するｐＧｌｃＮＡｃの効果も記録された。
【０３０５】
第３の試験では、未変性及び変性界面活性剤抽出が実施された。ｐＧｌｃＮＡｃと会合したタンパク質をそのままの状態で単離するために、血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワーク（上記第２の試験から得られる「阻害剤を含まない」緩衝液対照試料）を、１％デオキシコレート及び１％ＴＸ−１００を含有する氷冷タイロード緩衝液で徹底的に洗浄した。この界面活性剤抽出は、ｐＧｌｃＮＡｃ−細胞表面タンパク質複合体をほぼそのままのコンホメーションで維持しながら、結合していない膜成分を可溶化し除去するように設計された。抽出された血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ複合体をＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動にかけてｐＧｌｃＮＡｃに結合した各タンパク質を分離させた。
【０３０６】
多糖の約２０オングストローム以内にある血小板表面タンパク質を直接特定するために、別の極めて厳密な変性タイプの抽出を実施した。血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークが得られた後に、ｐＧｌｃＮＡｃと近傍のタンパク質の相互作用が、ジスルフィド還元可能な架橋剤ＤＴＳＳＢ（ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオナート］）と混合物を反応させることによって共有結合的に固定された。次いで、架橋血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ凝集体と、４％ＳＤＳを含有するタイロード緩衝液を用いて１００℃で徹底して抽出した。これらは、共有結合性ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板タンパク質複合体のみを元のまま残すはずである強い変性条件である。次いで、各タンパク質を同定するために、（ｐＧｌｃＮＡｃに結合したタンパク質を遊離させるために）ＳＤＳで抽出された試料を還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動にかけた。
【０３０７】
結果
第１の試験では、結合した血漿タンパク質（レーン１、図４Ｂ）及び最初の血漿試料（レーン２、図４Ｂ）の、ＳＤＳ−ＰＡＧで測定された総タンパク染色の結果によれば、広範な血漿タンパク質が多糖に吸収された。総タンパク染色の密度に基づくと、血漿タンパク質約０．１ｍｇ／ｍｇ  ｐＧｌｃＮＡｃが結合した。
【０３０８】
第２の試験では、図４Ａの結果によれば、エキスタチンによるα２ｂβ３の機能の阻害によって、多糖への血小板の付着が対照緩衝液（担体）よりもかなり減少した。α２ｂβ３拮抗物質、トウモロコシトリプシン阻害剤及びヘパリンも、血小板とｐＧｌｃＮＡｃの相互作用をある程度阻害した。ｐＧｌｃＮＡｃ繊維は、フィブリンの重合を加速し、ｐＧｌｃＮＡｃ−フィブリン−血小板大凝集体の、血小板誘導型の血餅収縮に関与した。
【０３０９】
第３の試験の場合には、この分析の主な結果は、α２ｂ、β３、フィブリノーゲン鎖及びアクチンとともに移動するタンパク質がｐＧｌｃＮＡｃに吸収されたことである（図４Ｂのレーン３参照、ｐＧｌｃＮＡｃに結合したタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧによって確認された）。
【０３１０】
より厳密な変性とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動の結果を図４Ｂのレーン４及び５に示す。フォンウィルブランド因子（ｖＷｆ）  ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ、ＧＰＩＩＩａ及びフィブリノーゲンα２ｂβ３表面タンパク質がｐＧｌｃＮＡｃに結合した。未変性状態の親和性吸収の場合と同様に、α２ｂβ３、フィブリノーゲン鎖及びアクチンとともに移動するタンパク質がポリマーに架橋された。高分解能２Ｄ  ＩＥＦ−ＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動及びウエスタン分析によって、吸収されたタンパク質の同定が明確に確認された。
【０３１１】
結論
これらの結果は、ｐＧｌｃＮＡｃと血小板の相互作用が、フィブリノーゲン−α２ｂβ３複合体及びおそらくは他の細胞表面タンパク質との特異的相互作用によって部分的に媒介される予備的な証拠である。これらの知見は、本明細書に記載する血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ相互作用機序をより完全に解明する基礎となる。かかる相互作用は、ヒト細胞と相互作用する繊維、及びｐＧｌｃＮＡｃと相互作用する細胞の種類を特定する本発明の方法を支持するものである。フィブリン及び血餅収縮に関係するこれらの結果は、創傷を治癒し、止血を促進する本発明の方法の有効性を支持するものである。
【０３１２】
１１．実施例：血小板とｐＧｌｃＮＡｃの相互作用を媒介する血小板表面のタンパク質
血小板細胞表面タンパク質がｐＧｌｃＮＡｃと複合体を形成することができるかどうかを明らかにするために血小板細胞表面タンパク質を検討した。
【０３１３】
材料及び方法
多糖の約２０オングストローム以内にある血小板表面タンパク質を直接特定するために。血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークが得られた後に、ｐＧｌｃＮＡｃと近傍のタンパク質の相互作用が、ジスルフィド還元可能な架橋剤ＤＴＳＳＢ（ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオナート］）と混合物を反応させることによって共有結合で固定された。次いで、架橋された血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ凝集体が、４％ＳＤＳを含有するタイロード緩衝液を用いて１００℃で徹底して抽出された。これらは、共有結合性ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板タンパク質複合体のみを元のまま残すはずである強い変性条件である。次いで、各タンパク質を同定するために、（ｐＧｌｃＮＡｃに結合したタンパク質を遊離させるために）ＳＤＳで抽出された試料を還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動にかけた。
【０３１４】
次いで、抗ＧＰＩＩＩａ及び抗ＧＰＩ抗体を用いてウエスタンブロットを実施して細胞表面タンパク質の有無を確認した。
【０３１５】
結果
図６は、全血小板由来の糖タンパク質ＩＩｂ、ＩＩａ及びＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動である（レーン１〜３）。レーン４〜６は、ｐＧｌｃＮＡｃに吸収されたタンパク質由来の糖タンパク質ＩＩｂ、ＩＩａ及びＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動である。
【０３１６】
図７は、ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックスに吸収された血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及びＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体の有無を確認するための抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及び抗ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果である。
【０３１７】
結論
血小板表面タンパク質は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及びＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸを介してｐＧｌｃＮＡｃ繊維と相互作用する。このことは、本発明の方法、及びポリマー繊維と複合化して相互作用する血小板を含む本発明の組成物を支持するものである。
【０３１８】
１２．実施例：赤血球とｐＧｌｃＮＡｃの相互作用を媒介する赤血球表面のタンパク質
赤血球表面タンパク質がｐＧｌｃＮＡｃと複合体を形成することができるかどうかを明らかにするために赤血球表面タンパク質を検討した。
【０３１９】
材料及び方法
多糖の約２０オングストローム以内にある赤血球表面タンパク質を直接特定するために。赤血球−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークが得られた後に、ｐＧｌｃＮＡｃと近傍のタンパク質の相互作用が、ジスルフィド還元可能な架橋剤ＤＴＳＳＢ（ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオナート］）と混合物を反応させることによって共有結合的に固定された。次いで、架橋された赤血球−ｐＧｌｃＮＡｃ凝集体が、４％ＳＤＳを含有するタイロード緩衝液を用いて１００℃で徹底して抽出された。これらは、共有結合性ｐＧｌｃＮＡｃ−赤血球タンパク質複合体のみを元のまま残すはずである強い変性条件である。次いで、各タンパク質を同定するために、（ｐＧｌｃＮＡｃに結合したタンパク質を遊離させるために）ＳＤＳで抽出された試料を還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動にかけた。
【０３２０】
次いで、抗バンドＩＩＩ及び抗グリコホリンＡ抗体を用いてウエスタンブロットを実施して細胞表面タンパク質の有無を確認した。
【０３２１】
結果
図８のレーン１〜３は、コロイド状クーマシー染色（ＣＣＢ）によって染色された赤血球由来の総タンパク質である。レーン１は全赤血球由来のタンパク質であり、レーン２はｐＧｌｃＮＡｃに吸収された試料由来の赤血球及び血漿であり、レーン３はｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維に吸収された試料由来の血漿単体である。レーン４及び５は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ａｌｋ  ｐｈｏｓ）で染色された赤血球表面タンパク質である。レーン４は全赤血球由来の表面タンパク質であり、レーン５はｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維によって吸収された試料由来の表面タンパク質である。レーン６及び７は、ｐＧｌｃＮＡｃと会合した赤血球表面タンパク質の有無を確認するための抗グリコホリンＡ抗体（レーン６）及び抗バンドＩＩＩ抗体（レーン７）を用いたウエスタンブロットである。
【０３２２】
図９は、抗グリコホリンＡ及び抗バンドＩＩＩ抗体を用いたウエスタンブロット分析であり、赤血球表面タンパク質がｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維に吸収されたことが確認された。
【０３２３】
結論
赤血球表面タンパク質は、グリコホリンＡ  抗バンドＩＩＩを介してｐＧｌｃＮＡｃ繊維と相互作用する。このことは、本発明の方法、及びポリマー繊維と複合化して相互作用する赤血球を含む本発明の組成物を支持するものである。
【０３２４】
１３．実施例：相互作用ｐＧｌｃＮＡｃ及び血小板の検討
ｐＧｌｃＮＡｃによる血小板活性化における血漿タンパク質吸収/細胞表面タンパク質活性化プロセスの潜在的な重要性を検討するためにさらに試験を実施した。新しい血小板をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて、血漿タンパク質に結合していない細胞型を遊離させた。これによって、ポリマーへの「粘着性」血漿タンパク質の吸収を含まない直接の血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ相互作用を調べることが可能になる。しかし、休止血小板の表面は、かなりの量のフィブリノーゲン、ｖＷＦ及び他の接着タンパク質に結合する。予備的なデータによれば、これらの結合した接着タンパク質は、ｐＧｌｃＮＡｃ繊維との相互作用をある程度媒介することが示唆される。以下の実験は、血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ相互作用（但し、海洋ポリマー（ｍａｒｉｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）へのバルク血漿タンパク質の結合ではない）を具体的に分析するために設計されたが、全血における血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ相互作用を調べるために追加の試験を組むことができる。
【０３２５】
これらの試験の目的は、血小板とグルコサミンポリマーの相互作用を媒介する血小板表面のタンパク質を特定することである。特定の血小板膜複合体に対する蛍光抗体プローブを用いた共焦点顕微鏡法及び生化学的親和吸収法を使用する。これらの試験は、α２ｂβ３−フィブリノーゲン相互作用、ＧＰＩｂ／ＩＸ−ｖＷＦ相互作用及びｐ−セレクチン−ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド相互作用の特異的阻害剤の存在下並びに非存在下で実施される。
【０３２６】
第１の試験
材料及び方法
ゲルろ過された新しい血小板を（脱アセチル及び完全アセチル）ｐＧｌｃＮＡｃ繊維とともに１５分間インキュベートし、次いで（以下に示す）血小板分子用蛍光プローブを添加する。さらに１５分間インキュベーションした後に、試料を共焦点顕微鏡法用にクエンチする。共焦点分析は、多糖が細胞に接触する焦点面のイメージングを強調するものである。様々な表面タンパク質を特定するために使用されるプローブを表１に示す。
【表１】
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【０３２７】
結論
かかる実験によって、本明細書に示す予備的結果が確認され、α２ｂβ３、ＧＰ１ｂ、ｐ−セレクチン及び／又はホスファチジルセリンがｐＧｌｃＮＡｃと血小板の接触点に集中することが明確になる。
【０３２８】
第２の試験
どのタンパク質がｐＧｌｃＮＡｃポリマーに吸収された親和性であるかを決定するために、図４Ｂに示す実験を支持する「背景及び予備的データセクション」に詳述された未変性状態の界面活性剤による抽出手順を利用することができる。
【０３２９】
材料及び方法
血小板−ｐＧｌｃＮＡｃネットワークは、脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃと完全アセチルｐＧｌｃＮＡｃの両方を用いて形成され、次いで、デオキシコレート及びＴＸ−１００を用いて０℃で凝集体を抽出することによって、結合したタンパク質が得られる。次いで、結合タンパク質混合物を２Ｄ  ＩＥＧ、ＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動及びウエスタン分析にかけて個々のタンパク質を上記方法によって同定した。
【０３３０】
結論
この分析において特に興味深いのは、α２ｂβ３−フィブリノーゲン複合体を同時吸収するリンタンパク質及び細胞骨格成分を特定することである。この試験は、血小板と相互作用する繊維を特定する本発明の方法をさらに支持するものである。
【０３３１】
第３の試験
材料及び方法
どのタンパク質がｐＧｌｃＮＡｃポリマーに直接接触するかを求めるために、ヘテロ２官能性架橋剤を利用して、多糖の約２０オングストローム以内にあるタンパク質を調べた。ヘテロ２官能性架橋剤ＳＡＮＤ（スルホスクシンイミジル２−［ｍ−アジド−ｐ−ニトロベンズアミド−１２５Ｉ（ヨード）］−１，３’−ジチオプロピオナート）をこれらの試験に利用する。この化合物は還元することができ（したがって、架橋されたタンパク質−ｐＧｌｃＮＡｃ複合体を電気泳動のために分離することができる）、光活性化されるときに１２５Ｉ芳香族部分がタンパク質に移動する。ＳＡＮＤは、スクシンイミジル部分を介して（［ＳＡＮＤ］＜＜脱アセチル機能によって）脱アセチルｐＧｌｃＮＡｃに付着する。血小板ネットワークがＳＡＮＤ−ｐＧｌｃＮＡｃを用いて形成され、次いで、このネットワークは長波長ＵＶ照射に曝されて、放射性ヨウ素標識芳香族部分が、光活性化状態が減衰する前に架橋剤に接触する血小板タンパク質に移動する。試料は、４％ＳＤＳ溶液を用いて１００℃で抽出されて、ポリマーに架橋していないタンパク質が除去され、次いで、２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動及びオートラジオグラフィーが実施されて、１２５Ｉ成分に接触した血小板タンパク質が特定される。
【０３３２】
第４の試験
血小板−ｐＧｌｃＮＡｃ相互作用に対するα２ｂβ３、ＧＰＩｂ−ＩＸ、ｐ−セレクチン及び接触（アプロチニン感応性）プロテアーゼ活性化によって媒介される付着機序の相対寄与度を上記実験によって調べる。
【０３３３】
材料及び方法
試験は、表２に示す以下の阻害剤を用いて実施される。
【表２】
2006518764.tif 000003
【０３３４】
結論
この試験は、本発明の組成物及び方法が機能する機序を支持するものである。
【０３３５】
１４．実施例：ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板活性化プロセスの検討
これまでの実験によれば、血小板がｐＧｌｃＮＡｃとの相互作用の結果として活性化することは明らかである。発明者らは、ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板ゲルを形成するのにカルシウムが必要であることも見出した。細胞がｐＧｌｃＮＡｃポリマーに接触するときに惹起される血小板活性化応答の性質を明確にするために、いくつかの実験を実施することができる。異質材料に対する血小板応答の基本的性質を観察することに加えて、これらの実験は、止血及び創傷治癒の促進に使用することができる、ｐＧｌｃＮＡｃネットワークにおける血小板組成物をさらに支持するものである。時間順に起こる血小板活性化応答の４つの中心的態様、すなわち、膜電位放出、細胞内カルシウムシグナル発生、プロテインキナーゼシグナル活性化及び最後に顆粒内容物の分泌が検討される。
【０３３６】
１５．実施例：ｐＧｌｃＮＡｃ−血小板活性化プロセスの検討
材料及び方法
高収率血小板をＮｏｒｔｈｅａｓｔにある米国赤十字社から入手し、試験前に撹拌しながら２２℃で４〜１０日間保存した。血小板が豊富な血漿を、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて収集され、輸送され、試験前に２２℃で４８時間貯蔵（short）されたＣＰＤ全血から単離した。等体積のｐＧｌｃＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ）を含む血小板の乏しい血漿（ＰＰＰ）、血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）、並びにＰＲＰ＋ヘマトクリット値が２０Ｖ％、３５Ｖ％及び４５Ｖ％である赤血球、並びにｐＧｌｃＮＡｃを含まない血小板の乏しい血漿（ＰＰＰ）、血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）、並びにＰＲＰ＋ヘマトクリット値が２０Ｖ％、３５Ｖ％及び４５Ｖ％である赤血球を調製した。トロンボエラストグラムを０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を用いて描き、トロンボキサンＢ２、断片１．２、Ｄ−ダイマー及びフィブリノーゲンとともに測定した。血小板ｐ−セレクチン、ＧＦＩｂ、第Ｘ因子、血小板アネキシンＶ結合及び血小板微粒子、並びに赤血球アネキシンＶ結合を測定した。
【０３３７】
結果
トロンボエラストグラムにおいては、ｐＧｌｃＮＡｃは、ＲＢＣを補充したＰＰＰ、ＰＲＰ及びＰＲＰにおいてＲ時間を減少させた。ｐＧｌｃＮＡｃは、血小板に結合したアネキシンＶ及び第Ｘ因子を増加させ、血小板微粒子を増加させ、ＲＢＣアノキシンＶ結合を増加させた。ｐＧｌｃＮＡｃ単体、ＲＢＣ単体、及びｐＧｌｃＮＡｃとＲＢＣとの組み合わせは、カルシウムの存在下及び非存在下で血小板の豊富な血漿によるトロンボキサンＡ２産生を増加させた。
【０３３８】
１６．具体的な実施形態、参考文献の引用
本発明は、本明細書に記載する具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、上記説明及び添付の図から、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な改変形態が当業者には明らかなはずである。かかる改変形態は、添付した特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３３９】
特許出願、特許及び科学系出版物を含めて様々な参考文献が本明細書では引用される。各参考文献の開示を、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０３４０】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の出版物又は特許又は特許出願の各々が参照によりその全体を本明細書に援用されるように具体的かつ個々に示されたとおなじ程度に、参照により本明細書に援用される。
【０３４１】
当業者には明らかなように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の多数の改変形態及び変更形態を実施することができる。本明細書に記載する具体的実施形態は、例としてのみ提供されるものであって、本発明は、かかる特許請求の範囲の権利が与えられるあらゆる等価物とともに、添付した特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】ｐＧｌｃＮＡｃマトリックス１ｍｇ当たりの血小板数が、最初に混合されたｐＧｌｃＮＡｃ１ｍｇ当たりの血小板数に比例して増加することを示したグラフである。
【図２Ａ】４種類のｐＧｌｃＮＡｃ製剤、すなわち、脱アセチルスポンジ、脱アセチル膜、アセチルスポンジ及びアセチル膜に対するｐＧｌｃＮＡｃ１ｍｇ当たりの血小板数を示すグラフである。
【図２Ｂ】会合した蛍光標識血小板を含む４種類の製剤の肉眼観察図であり、相対蛍光度を示している。
【図３Ａ】伸びた仮足がｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維に接触している活性化血小板細胞の走査型顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】標識されたｐＧｌｃＮＡｃ繊維と会合した血小板の蛍光顕微鏡写真、及びｐＧｌｃＮＡｃ繊維と会合した血小板の位相顕微鏡写真（ｐｈａｓｅ  ｍｉｒｃｒｏｇｒａｍ）である。
【図４Ａ】ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックス１ｍｇ当たりの吸収された血小板数が、α２ｂβ３の阻害剤、すなわち、エキスタチン及びロプロスト（ｌｌｏｐｒｏｓｔ）の存在下で対照（担体）よりも減少したことを示すグラフである。
【図４Ｂ】レーン１〜３が、コロイド状クーマシー染色（ＣＣＢ）で染色された総血小板タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動を示す写真である。レーン４及び５は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ａｌｋ  ｐｈｏｓ）を用いた、血小板細胞表面タンパク質のより厳密性の高い変性及び染色のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動である。
【図５】ｐＧｌｃＮＡｃマトリックス上の凍結乾燥された血小板の走査型電子顕微鏡写真であり、細胞が活性化された形態をとっていることを示している。
【図６】レーン１〜３が全血小板由来の糖タンパク質ＩＩｂ、ＩＩａ及びＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動であり、レーン４〜６が、ｐＧｌｃＮＡｃに吸収されたタンパク質由来の糖タンパク質ＩＩｂ、ＩＩａ及びＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動である写真である。
【図７】ｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維マトリックスによって吸収された血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及びＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体の有無を確認するための抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩｂ及び抗ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ抗体を用いたウエスタンブロット分析のグラフである。
【図８】レーン１〜３がコロイド状クーマシー染色（ＣＣＢ）によって染色された赤血球由来の総タンパク質を示す写真である。レーン４及び５は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ａｌｋ  ｐｈｏｓ）で染色された赤血球表面タンパク質である。レーン６及び７は、ｐＧｌｃＮＡｃと会合した赤血球表面タンパク質の有無を確認するための抗グリコホリンＡ（レーン６）及び抗バンドＩＩＩ抗体（レーン７）を用いたウエスタンブロットである。
【図９】赤血球表面タンパク質がｐＧｌｃＮＡｃポリマー繊維によって吸収されたことを確認するための抗グリコホリンＡ及び抗バンドＩＩＩ抗体を用いたウエスタンブロット分析のグラフである。
【図１】
2006518764.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2006518764.tif 000017
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