(57)【要約】本発明において、乳酸菌は、Ｇタンパク質に依存しかつ転写後である機構で炎症応答を阻害する可溶性因子（ペプチド若しくはタンパク質のような）を産生して、細胞によるタンパク質の産生若しくは分泌を効果的に阻害する。
2006519014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌から分泌される、抗炎症活性を含んでなる化合物。
【請求項２】
前記乳酸菌が、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）がアシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ、イエンセン乳酸杆菌（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、デルブリュック乳酸杆菌（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、醗酵乳酸杆菌（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、乳酸短杆菌（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー乳酸杆菌（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．ケフィ（Ｌ．ｋｅｆｉ）、カセイ菌（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．コリニフォルミス（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）であり、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス  サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物がポリペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が受容体結合活性をさらに含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、サイトカイン発現調節活性、ケモカイン発現調節活性、若しくは双方をさらに含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含んでなるキット。
【請求項７】
請求項１を産生する最低１種の単離された細菌を含んでなるキット。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を産生する単離された細菌。
【請求項９】
前記細菌が、請求項１に記載の化合物を分泌することが可能であるとさらに定義される、請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
前記細菌が乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求項８に記載の細菌。
【請求項１１】
請求項８に記載の細菌を含んでなる培養物。
【請求項１２】
請求項８に記載の細菌を含んでなるキット。
【請求項１３】
乳酸菌から分泌された化合物を細胞に投与する段階を含んでなる、細胞中のサイトカイン発現の低下方法。
【請求項１４】
前記サイトカイン発現が転写後に低下される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記分泌された化合物のＧタンパク質受容体への結合をさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインがＴＮＦ−αである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が免疫細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫細胞がマクロファージである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療上有効な量の乳酸菌を個体に送達する段階を含んでなり、前記乳酸菌は接触非依存性の機構により前記炎症を阻害する、個体における炎症の阻害方法。
【請求項２０】
前記乳酸菌が、免疫細胞上の受容体に結合する可溶性化合物を産生するとさらに定義される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該方法が、前記細胞中でサイトカイン産生、サイトカイン分泌、ケモカイン産生若しくはそれらの組合せを少なくとも部分的に阻害するとさらに定義される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記阻害段階が、阻害性のヘテロ三量体のＧ（Ｇｉ）タンパク質活性による、前記サイトカイン産生、サイトカイン分泌、ケモカイン産生若しくはそれらの組合せを阻害することを含んでなるとさらに定義される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サイトカインがＴＮＦ−αである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ケモカインがＩＬ−８である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
乳酸菌が最低１種のさらなる治療薬とともに投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
最低１種の治療薬が、コルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記個体が、大腸炎、関節炎、滑膜炎、リウマチ性多発性筋痛、筋炎若しくは敗血症に悩まされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドでありかつ抗炎症活性を有する乳酸菌分泌物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦に支援された研究若しくは開発に関する声明
本発明はＮＩＨ助成金番号Ｋ０８−ＤＫ０２７０５からの資金で部分的に展開された。
関連出願への交差引用
本出願は２００３年１月３０日出願の米国仮出願第６０／４４３，６４４号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は免疫学、医学、細胞生物学および分子生物学の分野に向けられる。特定の一態様において、本発明は、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）および他の種を包含する乳酸菌から分泌される抗炎症性分子、ならびにそれに関する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロバイオティクスは単なる栄養を超えた正の健康上の利益をもつ片利共生微生物である（非特許文献１）。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の片利共生種は臨床研究で最も普遍的に使用される生菌を代表する。それらの遍在する存在および自生の（固有の）微生物叢のメンバーとしての役割（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）が腸管に有益な細菌としてのそれらの役割における興味を刺激した。カプセル内視鏡検査により、Ｒｅｕｔｅｒら（非特許文献４）は、健康な小児および成人の胃腸管中に存する固有の腸内細菌として複数の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の存在を記述している。１つの研究（非特許文献５）は、ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）が、健康なヒト個体の口腔および直腸粘膜で見出される３種の最も普遍的に見出される腸内乳酸杆菌の１種であったことを示した。マウスを包含する健康なげっ歯類もまた、乳酸杆菌により一般に胃および腸にコロニーを作られる（非特許文献６）。この種はヒトの口腔に棲息しそしてう食中に見出された（非特許文献７）。Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）は腸粘膜中でもまた見出されており（非特許文献８）、また、膣微生物叢の一部を含んでなる（非特許文献９）。
【０００４】
ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＬＧＧ）は、健康な個体の糞便からＳ．ＧｏｒｂａｃｈとＢ．Ｇｏｌｄｉｎにより１９８５年に単離され（非特許文献１０；特許文献１）、そしてその後の研究は大腸炎を伴う患者で有益な効果を示した（非特許文献１１）。この生物体は当初カセイ菌亜種ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）と分類されたが、しかし、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の分類法におけるその後の微細な区別がＬ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）としての再分類をもたらした（非特許文献１２；非特許文献１３）。ＬＧＧはげっ歯類（非特許文献１４）およびヒト（非特許文献１５）の腸管にコロニーを形成し、かつ、多様なグラム陰性およびグラム陽性細菌の増殖を阻害する（非特許文献１６）。この株は結腸粘膜に接着することがヒト個体で示されており（非特許文献１７）、また、結腸粘膜および糞便から成功裏に回収され得る。それは大部分の個体で１〜３日間、および被験体の３０％で７日まで生存する。それのコロニー形成能力に加え、ＬＧＧの存在は粘膜の免疫応答に影響を及ぼす。ＬＧＧは粘膜のＩｇＡ応答を刺激しかつパイエル板における抗原の取り込みを高める（非特許文献１８）。
【０００５】
潜在的な生菌剤として、複数の研究が腸管にコロニーを形成しかつ粘膜上皮および免疫応答を調節するＬＧＧの能力を示した。ＬＧＧは一関連（ｍｏｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）無菌ラットの腸細胞増殖および絨毛の大きさを増大させた（非特許文献１４）。ＬＧＧはまた、経口投与後にｅｘ  ｖｉｖｏでネズミリンパ球応答の拡散も調節し（非特許文献１９）、また、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）はＣＤ４＋  Ｔリンパ球の調節性サイトカインのプロファイルを変える（非特許文献２０）。適応免疫応答に加え、ＬＧＧは自然免疫応答に対する影響を有する。ＬＧＧは核因子κＢ（ＮＦκＢ）、ならびにヒトマクロファージのシグナル伝達物質および転写活性化因子（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路を活性化し（非特許文献２１）、また、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）はマクロファージによるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）産生を刺激する（非特許文献２２）。ＬＧＧはまた小児においてＩＬ−１０のような免疫調節性サイトカインの産生も刺激し（非特許文献２３）、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで炎症前応答を調節するかもしれない。マクロファージ、樹状細胞および好中球のような自然免疫のエフェクター細胞は免疫応答の大多数の一次駆動体である（非特許文献２４）。自然免疫が抗原に対する自然および適応双方の応答の経過を自己若しくは非自己として指図するという考えは、炎症の制御における自然免疫の役割を強調している。
【０００６】
特許文献２は製薬学的乳酸杆菌製剤、とりわけ特定の特性を有しかつある株であるものに関する方法に関し、該特性は、低栄養素を含んでなる培養物およびＮａ２Ｓ、ＮＨ３、低級脂肪酸若しくはそれらの混合物の群からの物質を含んでなる培養物中で増殖することを包含する。特定の態様において、本発明は胃炎および腸炎に向けられる。
【０００７】
特許文献１は、ＡＴＣＣ受託番号５３１０３を有する特定の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株およびそれに関する方法に向けられ、該株はラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧである。
【０００８】
特許文献３は、新生児の壊死性全腸炎の胃腸組織の傷害を予防するのに有用な特定のＬ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）およびＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株を記述している。
【０００９】
特許文献４は、サイトカインを産生するグラム陽性細菌若しくはサイトカインアンタゴニストを産生するグラム陽性細菌株を投与することにより炎症性腸疾患を治療することに関する。特定の態様において、ＩＬ−１０、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは別のＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１２アンタゴニスト、インターフェロン−γアンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニストおよび他者から選択されるサイトカイン若しくはサイトカインアンタゴニスト。特定の態様において、グラム陽性細菌がサイトカイン、サイトカインアンタゴニストなどを産生するよう遺伝子的に工作される。
【００１０】
Ｂｏｒｒｕｅｌら（非特許文献２５）は、数種の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の提供に際してのＴＮＦ−αのダウンレギュレーションを記述しているが、とは言え該効果はプロテアーゼ阻害剤により防止されなかった。
【００１１】
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に加え、例えば乳製品を醗酵させかつ腸感染症および下痢を治療するのに使用されるビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉｕｍ）、ならびに、食品工業でかつ下痢ならびに腸および膣感染症を治療しかつ微量養分を宿主に利用可能にすることにより食物の栄養価を向上させるために使用される連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えばストレプトコッカス  サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））のような他の乳酸菌が生菌として使用されている。
【００１２】
多くの異なる乳酸が、抗菌性、免疫調節性および／若しくは抗炎症性の効果を有する多様な因子を産生することが既知であるとは言え、これらの因子は一般に複雑かつ／若しくは高分子量の産物である（例えば特許文献５の２０ｋＤＡのタンパク質および「付加的因子（１種若しくは複数）」）。
【００１３】
本発明は、しかしながら、とりわけＴＮＦ−αおよびＧタンパク質の転写後阻害を含んでなる機構における抗炎症性の可溶性乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌剤の有効な接触非依存性の投与手段を提供するための当該技術分野における必要性を取り扱う。
【特許文献１】米国特許第４，８３９，２８１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３１４，９９５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１３２，７１０号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００２００１９０４３  Ａ１号明細書
【特許文献５】Ｐａｎｉｇｒａｈｉ、２００１年２月１５日公開の国際公開第ＷＯ  ０１／１０４４８号明細書
【非特許文献１】ＬｉｌｌｙとＳｔｉｌｌｗｅｌｌ  Ｒ．Ｈ．、１９６５
【非特許文献２】Ａｌｖａｒｅｚ−ＯｌｍｏｓとＯｂｅｒｈｅｌｍａｎ、２００１
【非特許文献３】Ｈｏｌｚａｐｆｅｌら、２００１
【非特許文献４】Ｒｅｕｔｅｒ、２００１
【非特許文献５】Ａｈｒｎｅら、１９９８ｂ
【非特許文献６】Ｔａｎｎｏｃｋ、１９９７
【非特許文献７】Ｍａｒｃｈａｎｔら、２００１
【非特許文献８】Ａｈｒｎｅら、１９９８ａ
【非特許文献９】Ｐａｖｌｏｖａら、２００２
【非特許文献１０】Ｇｏｒｂａｃｈ、２０００ａ
【非特許文献１１】Ｇｏｒｂａｃｈら、１９８７
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎら、２０００
【非特許文献１３】Ｍｏｒｉら、１９９７
【非特許文献１４】Ｂａｎａｓａｚら、２００２
【非特許文献１５】Ａｌａｎｄｅｒら、１９９７
【非特許文献１６】Ｄｏｎｇら、１９８７
【非特許文献１７】Ａｌａｎｄｅｒら、１９９９
【非特許文献１８】Ｇｏｒｂａｃｈ、２０００ｂ
【非特許文献１９】Ｋｉｒｊａｖａｉｎｅｎら、１９９９
【非特許文献２０】ｖｏｎ  ｄｅｒら、２００１
【非特許文献２１】Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎら、２０００
【非特許文献２２】Ｈｅｓｓｌｅら、１９９９
【非特許文献２３】Ｐｅｓｓｉら、２０００
【非特許文献２４】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．とＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２００２
【非特許文献２５】Ｂｏｒｒｕｅｌら（２００２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
［発明の要約］
本発明は、炎症の阻害に有用である系、方法および組成物に向けられる。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物において炎症を促進若しくは調節するタンパク質（サイトカイン）の産生を阻害する細菌からの新規抗炎症化合物の単離方法に関する。本発明の特定の態様において、発明者は、自然免疫系による炎症前サイトカイン産生を特異的に阻害するＬＧＧのような乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌の能力を特徴づける。ネズミのマクロファージモデルを用いて、本発明者はＬＧＧがアポトーシス若しくは細胞傷害性の効果に依存せずにＴＮＦ−α産生を特異的に阻害することを示す。ＬＧＧは、他のサイトカインに対する効果と独立にリポ多糖（ＬＰＳ）若しくはリポテイコ酸（ＬＴＡ）で活性化したマクロファージによるＴＮＦ−α産生を減少させるタンパク質を包含する可溶性因子を分泌する。さらに、ＬＧＧのＴＮＦ−α阻害効果は、ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）若しくはヘリコバクター  ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）馴化培地の刺激効果にもまた拮抗する。
【００１５】
全般として、本発明は乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）生物体（この属のいずれかの種）および他の乳酸菌、ならびにそれらが産生しかつそれらの環境中に分泌する可溶性因子に直接関する。これらの因子（これまでとりわけ同定されていない）は、Ｇタンパク質依存性の（Ｇタンパク質共役型受容体）機構によるｍＲＮＡ合成後の（転写後）サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）産生を阻害する。本発明のいくつかの態様は、Ｇタンパク質に依存しかつｍＲＮＡ合成後の段階に作用して細胞によるタンパク質の産生若しくは分泌を効果的に阻害する機構で炎症応答を阻害する可溶性因子（ペプチド、タンパク質など）を乳酸杆菌が産生しているという事実に関する治療薬（抗炎症作用）の応用を含んでなる。
【００１６】
従って、本発明者は、炎症前サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）および／若しくはケモカイン（例えばＩＬ−８）産生を減少させる乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）および他の乳酸菌株を同定した。好ましい態様における細菌由来の可溶性因子は炎症前サイトカインの発現を阻害しかつ免疫系に対する正味の抗炎症効果をもたらす。他の態様は細菌生物体およびこれらの生物体により産生される可溶性因子を包含する。
【００１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究は多様な刺激物質により活性化した培養マクロファージ（免疫細胞）および上皮細胞を利用した。本発明において、乳酸杆菌は、自然免疫系の細胞上の受容体に結合しかつサイトカイン発現および自然免疫と適応免疫の間の連関を調節する可溶性ペプチド因子の分泌により接触非依存性の様式で炎症前サイトカイン発現を阻害する。すなわち、サイトカインの産生が阻害され、そして特定の態様においてそれはＴ細胞（適応）応答を低下させる。本発明はまた、これらの可溶性因子が他の病原体の炎症前効果を阻害かつ／若しくは拮抗することも示す。
【００１８】
従って、本発明のさらなる特定の態様において、ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧは接触非依存性の機構によりリポ多糖で活性化したネズミのマクロファージにおけるＴＮＦ−α産生を低下させ、また、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧは初代腹膜（１２９  ＳｖＥｖの）および形質転換（ＲＡＷ  ２６４．７）マクロファージによるＬＰＳおよびＬＴＡ媒介性のＴＮＦ−α産生を特異的に阻害する。
【００１９】
いくつかの態様において、特定の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌種が他者より好ましく、そして、当業者は、本明細書に提供される教示から至適の若しくは好ましい種を決定する方法を知っている。いくつかの態様において、特定の免疫効果が種若しくは株特異的であるかもしれない。本発明の好ましい態様において、抗炎症性の分泌型乳酸菌化合物の効果は血清および／若しくは接触非依存性であり、至適の調節活性のために可溶性ＬＧＧイムノモジュリンの存在を必要とする。
【００２０】
特定の態様において、ＬＧＧはマクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害するために阻害性ヘテロ三量体Ｇ（Ｇｉ）タンパク質を利用する。当業者は、ＴＮＦ−α産生が減少する一方でＩＬ−１０が影響されないためにＬＧＧの正味の効果が本来免疫調節性であることを認識している。特定の態様において、腸内乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、アポトーシス前効果若しくは細胞壊死に依存せずにおそらく細胞表面受容体に結合しかつＴＮＦ−αの合成若しくは分泌を阻害する可溶性タンパク質因子を産生する。
【００２１】
本発明の特定の態様において、本発明の化合物は乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌培養物からの最低１種の可溶性の剤であり、ここで該剤は抗炎症活性、抗サイトカイン産生活性、Ｇタンパク質受容体結合活性若しくはそれらの組合せを含んでなる。特定の態様において、該化合物は、タンパク質若しくはペプチドのようなポリペプチド、または核酸分子若しくは小分子のような非ポリペプチドである。本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」は最低２アミノ酸の分子鎖であり、そして小型ペプチドを包含する。好ましい態様において、該化合物は本明細書で論考される実験で決定されるところの小型ペプチドである。
【００２２】
前述は、後に続く本発明の詳細な記述がより良好に理解されうるために本発明の特徴および技術的利点をむしろ広範に概説した。本発明の請求の範囲の主題を形成する本発明の付加的な特徴および利点を下述するであろう。開示される概念および特定の態様は、本発明の同一の目的を実施するために他の構造を改変若しくは設計するための基礎として容易に使用しうることが当業者により認識されるべきである。こうした同等の構築物が、付属として付けられる請求の範囲に示されるところの本発明の技術思想および範囲から離れないこともまた当業者により理解されるべきである。その構成および操作方法の双方に関して本発明の特徴であると考えられる新規特徴は、さらなる目的および利点と一緒に、付随する図とともに考慮される場合に以下の記述からより良好に理解されるであろう。しかしながら、図のそれぞれは具体的説明および記述のみの目的上提供されかつ本発明の制限の定義として意図されないことが明白に理解されるべきである。
［発明の詳細な記述］
定義
本明細書で明細中で使用されるところの「ａ」若しくは「ａｎ」（１つの）という用語は１個若しくはそれ以上を意味することがある。本明細書で請求項で使用されるところの、「含んでなる」という語とともに使用される場合の「ａ」若しくは「ａｎ」（１つの）という語は１個若しくは１個以上を意味することがある。本明細書で使用されるところの「別の」は少なくとも第二の若しくはそれ以上を意味することがある。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「大腸炎」という用語は、結腸、特定の態様においては大腸を内張する膜の急性若しくは慢性の炎症を指す。大腸炎の症状は、腹痛、下痢、直腸出血、疼痛性攣縮（テネスムス）、食欲の喪失、大腸潰瘍、発熱および／若しくは疲労感を包含しうる。本明細書で使用されるところの「接触非依存性」という用語は細胞と細胞の接触が必要とされない態様を指す。特定の一態様において、可溶性因子の利用が細胞と細胞の接触の要件を回避する。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「生菌」という用語は、腸管の健康および均衡に寄与する最低１種の生物体を指す。特定の態様において、それは、摂取される場合に健康な腸管の維持において補助しかつ疾病および／若しくは疾患との闘いにおいて補助する「友好的な」、「有益な」若しくは「善玉」細菌とも称される。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、いずれかのかつ全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含する。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体若しくは剤が本発明のベクター若しくは細胞と不適合性である場合を除き、治療的組成物でのその使用が企図される。補助的有効成分もまた該組成物に組込み得る。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」という用語は、疾患、障害、または該疾患若しくは状態の症状の改善若しくは治療をもたらす量を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「治療すること」および「処置」という用語は、被験体が該疾患の改善を有するように治療上有効な量の組成物を被験体に投与することを指す。改善は症状のいかなる改善若しくは治療であってもよい。改善は観察可能な若しくは測定可能な改善である。従って、当業者は、処置は疾患状態を改善するかもしれないがしかし疾患の完全な治癒でなくともよいことを理解している。
本発明
本発明は本明細書に抗炎症活性を含んでなる乳酸菌から分泌される化合物を含んでなる。該乳酸菌は、好ましくは、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）がアシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ、イエンセン乳酸杆菌（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、デルブリュック乳酸杆菌（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、醗酵乳酸杆菌（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、乳酸短杆菌（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー乳酸杆菌（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．ケフィ（Ｌ．ｋｅｆｉ）、カセイ菌（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．コリニフォルミス（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）であり、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス  サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびそれらの混合物よりなる群から選択される。該化合物は、好ましくは、受容体結合活性、ならびにサイトカイン発現調節活性、ケモカイン発現調節活性、若しくは双方を好ましくは含んでなるポリペプチドである。本発明はまた、上のような最低１種の単離された細菌を包含するキット；該化合物を産生しかつ該化合物を分泌することが可能であるかもしれない単離された細菌；および細胞中でのサイトカイン発現の低下方法（ここでサイトカインはＴＮＦ−αであってよく、細胞はマクロファージのような免疫細胞であってよい）も含んでなる。本発明は、本明細書に、治療上有効な量の乳酸菌（ここで該乳酸菌は接触非依存性の機構により炎症を阻害しうる）を個体に送達する段階を含んでなる、例えば大腸炎、関節炎、滑膜炎、リウマチ性多発性筋痛、筋炎若しくは敗血症のような状態で見出されるところの個体における炎症の阻害方法をさらに含んでなる。別の態様において、乳酸菌は免疫細胞上の受容体に結合する可溶性化合物を産生するとさらに定義される。本方法は細胞のサイトカイン産生、サイトカイン分泌、ケモカイン産生若しくはそれらの組合せを少なくとも部分的に阻害するとさらに定義しうる。別の態様における阻害段階は、阻害性のヘテロ三量体Ｇ（Ｇｉ）タンパク質活性によりサイトカイン産生、サイトカイン分泌、ケモカイン産生若しくはそれらの組合せを阻害することを含んでなるとさらに定義される。好ましくはサイトカインはＴＮＦ−αである。別の好ましい態様においてケモカインはＩＬ−８である。付加的な態様において、乳酸菌は、コルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリンおよびそれらの混合物のような最低１種の付加的な治療薬とともに投与される。
【００２８】
動物試験およびヒト臨床試験が、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が慢性大腸炎における炎症を予防若しくは回復し得ることを示した。しかしながらこの効果の分子機構は明快に解明されてはいない。本発明者は、乳酸杆菌および他の乳酸菌が腸内微生物叢により誘発される炎症前サイトカイン応答をダウンレギュレートすることが可能であることを決定した。本明細書に提供される実施例は、乳酸杆菌がｉｎ  ｖｉｔｒｏでネズミのマクロファージによる腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の産生を低下させかつＴＮＦ−α／インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の均衡を変えるかどうかを取り扱う。ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＬＧＧ）により馴化した培地をリポ多糖（ＬＰＳ）若しくはリポテイコ酸（ＬＴＡ）と共インキュベートする場合、ＴＮＦ−α産生は対照に比較して有意に阻害される一方、ＩＬ−１０合成は影響されない。興味深いことに、ＬＧＧ馴化培地は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）馴化培地で活性化した腹膜マクロファージのＴＮＦ−α産生もまた低下させる。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種および他の乳酸菌は、活性化したマクロファージでのＴＮＦ−α産生を阻害する可溶性分子を産生することが可能であるかもしれない。炎症前サイトカイン、とりわけＴＮＦ−αの過剰産生は慢性の腸の炎症の病因に関与しているため、炎症前サイトカイン産生の腸内乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）媒介性の阻害およびサイトカインプロファイルの変化は、胃腸管における片利共生細菌の重要な免疫調節性の役割を強調している。
【００２９】
本発明のいくつかの態様において、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）および他の乳酸菌種は胃腸の感染症および炎症性腸疾患の生菌戦略で使用されている。Ｇｉαサブタイプ２（Ｇαｉ２）欠損マウスは、ヒトにおける潰瘍性大腸炎の病理学的病変を模倣する大腸炎を発症する。本発明者は、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の特定の単離物が、生菌の作用の主機構として初代マクロファージおよび形質転換マクロファージ双方でリポ多糖（ＬＰＳ）誘発性のＴＮＦ−α産生を低下させることが可能であることを示す。さらに、いくつかの態様において、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌種はマクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害するために阻害性のヘテロ三量体Ｇ（Ｇｉ）タンパク質を利用する。固有の腹膜マクロファージをＧαｉ２欠損マウスおよび野性型１２９Ｓｖマウスから回収した。初代マクロファージは精製した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ単独で刺激したか、若しくは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種からの馴化培地と共培養した。ＲＡＷ  ２６４．７γ（ＮＯ−）マクロファージを、Ｇｉタンパク質依存性の応答を除去するためにＧｉタンパク質阻害剤、百日咳トキシン（ＰＴｘ）に曝露した。ＰＴｘ処理後にＲＡＷ  ２６４．７細胞をＬＰＳ単独で刺激したか、若しくは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地（ＣＭ）と共培養した。マクロファージ培養上清中のＴＮＦ−αレベルを定量的ＥＬＩＳＡにより測定した。モデル生物体としてのラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ−ＣＭは、ＬＰＳ単独に曝露した初代および形質転換マクロファージ（それぞれ１０００ｐｇ／ｍｌおよび１５００ｐｇ／ｍｌ）に比較して、野性型の１２９Ｓｖ由来の腹膜マクロファージ（１３５ｐｇ／ｍｌ）およびＲＡＷ  ２６４．７細胞（１５０ｐｇ／ｍｌ）でのＴＮＦ−α産生を阻害した。対照的に、Ｇαｉ２欠損マウスからの初代マクロファージは、ＬＰＳおよび乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣＭへの曝露後に高レベルのＴＮＦ−αを産生した。ホモ接合性Ｇαｉ２ノックアウトマウス由来の細胞中のＴＮＦ−α産生のレベルはヘテロ接合性の動物からの細胞のほぼ２倍多かった（１８００対９６０ｐｇ／ｍｌ）。ＴＮＦ阻害効果を発揮する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣＭの能力は、ＲＡＷ  ２６４．７細胞をＰＴｘで毒性化した（ｉｎｔｏｘｉｃａｔｅｄ）場合にもまた部分的に低下した（６５０ｐｇ／ｍｌ）。従って、ヒトから単離した乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）および他の乳酸菌種はＧｉタンパク質依存性の機構によりマクロファージのＴＮＦ−α産生を阻害する。
【００３０】
当業者はｉｎ  ｖｉｖｏモデルが本発明の態様で有用であることを認識している。例えば、特定の一態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用して抗炎症活性、抗ＴＮＦ−α活性、抗ケモカイン活性若しくはそれらの組合せを有すると疑われる乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から分泌されるような乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌からの化合物の安全性若しくは有効性を試験しうる。モデルのようなの一例は、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｂ２７の遺伝子の過剰発現が大腸炎、胃十二指腸炎、末梢関節炎および脊椎炎の発症に至るＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックラットである（Ｒａｔｈら、およびその中で引用される参考文献）。モデルの他の例は当該技術分野で公知である（Ａｒａｎｄａら、１９９７；Ｃｏｎｇら、１９９８；Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒら、１９９８；Ｄｉａｎｄａら、１９９７；Ｇａｒｃｉａ−Ｌａｆｕｅｎｔｅら；１９９７；Ｋｕｈｎら、１９９３；Ｏｎｄｅｒｄｏｎｄｏら、１９８１；Ｖｅｌｔｋａｍｐら、２００１；Ｙａｍａｄａら、１９９３）。さらなる特定の態様において、こうしたモデルから得られる免疫細胞は、サイトカインおよび／若しくはケモカイン産生の変化についてアッセイするためのように有用である。
【００３１】
本発明は、特定の態様において、アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ  ４７９６、Ｌ．アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ３５０４６、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ  ＡＴＣＣ  ５３１０３、イエンセン乳酸杆菌（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＡＴＣＣ  ３３２００、Ｌ．ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ  ３５０２０、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ  １４９１７、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ  ４９４４５、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５３６０８、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５５１４８、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ  １１４７１、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、デルブリュック乳酸杆菌（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．コリニフォルミス（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）を包含する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のいずれかの種、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス  サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、若しくはそれらの混合物を包含する乳酸菌のいずれかの種に関する。本発明のいくつかの態様において、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列がその発現レベルをモニターするためのように利用される。ＴＮＦ−α配列の一例は配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２１５２２）に含まれる。類似の態様において、ＴＮＦ−αタンパク質レベルを、配列番号２（ＣＡＡ０１５５８）の少なくとも一部分に対する抗体を使用することによるようにモニターする。当業者は、米国国立生命工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースを包含する公的に利用可能なデータベースからそれらを評価することによるような他の有用な配列を得る方法を認識している。
【００３２】
米国特許第４，８３９，２８１号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるところの特定の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌株の例示的単離方法は、当該技術分野で既知である。
【００３３】
本発明の特定の態様において、本発明の化合物は乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌からの最低１種の可溶性の剤であり、ここで該剤は抗炎症活性、抗サイトカイン産生活性、Ｇタンパク質受容体結合活性若しくはそれらの組合せを含んでなる。特定の態様において、該化合物はタンパク質若しくはペプチドのようなポリペプチド、または核酸分子若しくは小分子のような非ポリペプチドである。特定の一態様において、抗炎症性はＧタンパク質受容体リガンドである。当業者は、当該技術分野で標準的な方法により分泌された化合物を得かつ／若しくは単離する方法を認識している。例えば、化合物は多様な画分中の活性について試験すること、次いで付加的な分画および活性について試験することにより精製しうる。試験されるべき活性は、プロテアーゼ感受性、抗炎症活性、抗サイトカイン若しくはケモカイン発現活性、Ｇタンパク質受容体結合活性またはそれらの組合せを包含する。特定の態様においてはサイトカイン発現がモニターされ、その例はインターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０および／若しくはＴＧＦを包含する。
【００３４】
特定の態様において、２次元ゲルを化合物の同定で利用する。
乳酸杆菌
乳酸杆菌は通常杆状形であり、短い曲がった杆状体から長くかつ細い杆状体まで変動する。大部分の種はホモ型醗酵性であるが、とは言え数種はヘテロ型醗酵性である。ホモ型醗酵性種は主産物として乳酸を産生し、４５℃で増殖する数種は長い杆状体を含んでなりかつグリセロールテイコ酸を含んでなる（デルブリュック乳酸杆菌（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）およびアシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）のような）一方、他のホモ型醗酵性種は１５℃で増殖し、４５℃で変動性の増殖を有し、短い杆状体およびコリネ型であり、そしてリビトールおよびグリセロールテイコ酸を含んでなる（カセイ菌（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｍｔａｒｕｍ）およびＬ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）のような）。醗酵乳酸杆菌（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、乳酸短杆菌（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー乳酸杆菌（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）およびＬ．ケフィ（Ｌ．ｋｅｆｉ）のような）ヘテロ型醗酵性種はブドウ糖から約５０％の乳酸を産生しかつＣＯ２およびエタノールを産生する。
サイトカインおよびケモカイン
本発明の特定の一態様において、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に分泌される化合物の存在に際してサイトカインの産生が阻害される。サイトカインは本明細書で宿主防御および修復に関与する過程における細胞の複製、分化および／若しくは活性化を調節する細胞由来のホルモン様ポリペプチドと称される。
【００３５】
多数のサイトカインが当該技術分野で既知である。例を表１（ダルハウジー医科大学（Ｄａｌｈｏｕｓｉｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）のウェブサイトから再掲）に具体的に説明する。
表１：例示的サイトカイン
サイトカイン  主供給源      主な活性
ＩＬ−１      マクロファージＴ、Ｂ細胞活性化；発熱；炎症
ＩＬ−２      Ｔ細胞 Ｔ細胞増殖
ＩＬ−３      Ｔ細胞 多くの細胞型の増殖
ＩＬ−４      Ｔ細胞 Ｂ細胞の増殖および分化
ＩＬ−５      Ｔ細胞 Ｂ細胞、好酸球増殖
ＩＬ−６      マクロファージ、Ｔ細胞      Ｂ細胞刺激、炎症
ＩＬ−７      間質細胞      初期のＢおよびＴ細胞の分化
ＩＬ−８      マクロファージ好中球（ＰＭＮ）誘引
ＩＬ−９      Ｔ細胞 マイトジェン
ＩＬ−１０    Ｔ細胞 Ｔｈ１サイトカイン産生を阻害する
ＩＬ−１１    骨髄間質      造血
ＩＬ−１２    ＡＰＣ Ｔ、ＮＫ細胞を刺激する
ＩＬ−１３    Ｔ細胞 ＩＬ−４と同様
ＩＬ−１４    樹状細胞、Ｔ細胞     Ｂ細胞記憶
ＩＬ−１５    Ｔ細胞 ＩＬ−２に同一
ＩＬ−１６    −     −
ＩＦＮα      大部分の細胞  抗ウイルス
ＩＦＮβ      大部分の細胞  抗ウイルス
ＩＦＮγ      Ｔ、ＮＫ細胞  炎症、マクロファージを活性化する
ＴＧＦβ      マクロファージ、リンパ球    標的に依存
ＴＮＦα      マクロファージ炎症；腫瘍殺傷
ＴＮＦβ      Ｔ細胞 炎症；腫瘍殺傷；食作用を高める
全部のサイトカインは共通してある特性を有する。それらは全部低分子量のペプチド若しくは糖ペプチドである。多くはリンパ球、単球／マクロファージ、肥満細胞、好酸球、なお血管を内張する内皮細胞のような複数の細胞型により産生される。各個々のサイトカインはそれを産生する細胞およびそれが作用する標的細胞（１種若しくは複数）に依存して多くの機能を有し得る（多面発現性と呼ばれる）。また、数種の異なるサイトカインが同一の生物学的機能を有し得る（冗長性と呼ばれる）。サイトカインは、離れた標的細胞（内分泌性）、それらを産生する細胞に隣接する標的細胞（パラクリン）若しくは該サイトカインを産生する同一細胞（オートクリン）に対して、血流を通じてそれらの効果を発揮し得る。生理学的には、大部分のサイトカインはパラクリンおよび／若しくはオートクリンの様式でそれらの最も重要な効果を発揮するようである。それらの主機能は宿主防御若しくは血液要素の維持および修復を伴うようである（表１）。
【００３６】
当業者は、サイトカインがそれらの主要な特定の機能（１種若しくは複数）により分類され、そしてサイトカインの４種の主要な範疇、すなわちインターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子およびインターロイキンが存在することを認識している。インターフェロンはウイルス複製を妨害し、そしてインターフェロンの供給源に基づき３種の主要な型が存在する。インターフェロンα（ＩＦＮα）は白血球からのバフィーコート層により産生され、そして多様な悪性および免疫障害の処置で使用される。インターフェロンβ（ＩＦＮβ）は繊維芽細胞により産生され、そして現在、多発性硬化症の処置で評価されている。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は活性化Ｔ細胞により産生され、そしてとりわけアレルギー性疾患において重要な免疫調節分子である。
【００３７】
コロニー刺激因子は骨髄の多様な要素の増殖および分化を支援する。多くは顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなそれらが支援する特定の要素により命名される。他のＣＳＦは、多様な造血前駆細胞を刺激し得るインターロイキン（ＩＬ）−３；およびｃ−Ｋｉｔリガンド（幹細胞因子）を包含する。
【００３８】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は注入に際してそれらの腫瘍の出血性壊死を引き起こす。ＴＮＦαは活性化マクロファージにより産生され、また、ＴＮＦβは活性化Ｔ細胞（ＴＨおよびＣＴＬ双方）により産生される。ヒト腫瘍を臨床で治療するためのＴＮＦの使用に対する試みもまたなされているが、しかし、それらの極めて狭い治療窓（有効性対毒性）により、これを有用な独立した癌治療とみなす者はほとんどない。
【００３９】
最大の群はインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）であり、それらの基礎的な機能が白血球（ｌｅｕｃｏｃｕｔｅｓ−ｌｅｕｋｉｎ）の多様な集団間（ｉｎｔｅｒ−）の通信であるようであるためにそう命名された。インターロイキン（ＩＬ）は番号を与えられている。それらは単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびなお非白血球のような多様な細胞型により産生される。
【００４０】
ケモカインは効果的な白血球活性化および／化学走性活性を含んでなる構造的に関連した糖タンパク質の一族である。それらは長さ７０ないし９０アミノ酸かつ分子量がおよそ８ないし１０ｋＤａである。それらの大部分は、２個のアミノ末端システイン残基が直接隣接しているか１アミノ酸により分離されているかどうかに依存して、４個のシステイン残基を有する２個のサブファミリーに入る。ＣＸＣケモカインとしてもまた知られているαケモカインは、１番目および２番目のシステイン残基の間に単一アミノ酸を含んでなり；βすなわちＣＣケモカインは隣接したシステイン残基を有する。大部分のＣＸＣケモカインは好中球に対する化学誘引物質である一方、ＣＣケモカインは一般に単球、リンパ球、好塩基球および好酸球を誘引する。
【００４１】
ケモカインの２つの付加的な小さなサブグループが知られている。Ｃグループは１メンバー（リンフォタクチン）を有する。それは４システインモチーフ中のシステインの１個を欠くが、しかしそのカルボキシル末端でＣ−Ｃケモカインと相同性を共有する。Ｃケモカインはリンパ球特異的であると思われる。第四のサブグループはＣ−Ｘ３−Ｃサブグループである。Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン（フラクタルカイン／ニューロタクチン）は最初の２個のシステインの間に３アミノ酸残基を有する。それは長いムチン柄を介して細胞膜に直接結合されており、そして白血球の接着および遊走双方を誘導する。
Ｇタンパク質受容体
本発明の好ましい一態様において、分泌された乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）化合物は細胞中でＧタンパク質受容体に対する作用を間接的に若しくは直接引き起こす。当業者は、Ｇタンパク質は通常、不活性の静止状態で受容体の近くに存することを認識している。受容体がリガンド結合により活性化される場合に、それは迅速にＧタンパク質を誘導することができる。Ｇタンパク質はそれ自身のスイッチを活性状態に入れることにより応答する。活性状態に一旦なれば、Ｇタンパク質は細胞にさらにシグナルを送ることができ、１種のシグナルはサイトカインおよび／若しくはケモカイン発現の直接若しくは間接的いずれかの低下である（転写後にのような）。しかしながら、Ｇタンパク質は短期間のみ活性状態に留まることができ、その後それはそれ自身で遮断することができる。事実上、Ｇタンパク質は、一旦入れられればそれがそれ自身を遮断する前に制限された時間入れられたまま留まることができる二相スイッチのように作用する。
【００４２】
Ｇタンパク質の２種の状態（入若しくは切）は、それが結合するグアニンヌクレオチドにより決定される（これゆえにＧタンパク質という用語）。それが不活性である場合、それはＧＤＰを結合するが、しかしそれが活性である場合、それはＧＴＰを結合する。従って、休止状態の切の形態のＧタンパク質は結合したＧＤＰを含んでなる。リガンドで活性化した受容体がそれを誘導する場合、Ｇタンパク質はその結合したＧＤＰを放出しかつＧＴＰ分子を結合させ、そしてこのＧＴＰを結合した形態のＧタンパク質はＧタンパク質の活性の入のかたちを表す。活性化状態にある際に、Ｇタンパク質は下流のシグナルを達成する。短時間（数秒若しくはそれ未満）の後に、Ｇタンパク質はその後、それ自身のＧＴＰをＧＤＰに加水分解してそれによりそれ自身を遮断することができる。この加水分解は、Ｇタンパク質が短時間のみ活性のシグナルを発射する「入」様式にあることを確実にするネガティブフィードバック機構を表す。
【００４３】
免疫細胞中のＧタンパク質受容体の例は当該技術分野で公知であるが、しかし、特定の例は少なくともＣＣＲ１；ＣＣＲ４；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ２；ＣＸＣＲ４；ＨＭ６３；ＦＰＲ１；ＥＸ３３；マウスＦ４／８０、ヒトＥＧＦモジュール含有ムチン様ホルモン受容体（ＥＭＲ）１、ヒトＥＭＲ２、ならびにヒトおよびマウスＣＤ９７を含んでなるＥＧＦ−ＴＭ７グループを包含する。当業者は、Ｇタンパク質共役受容体データベース（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）のようなワールドワイドウエブ上で利用可能なデータベースを包含するＧタンパク質受容体を列挙する多様な供給源を知っている。
転写後修飾
本発明の一態様において、サイトカイン産生（発現ともまた称される）および／若しくはケモカイン産生は、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が産生する可溶性分子の提供に応答して変えられる。当業者は、この転写後修飾がサイトカイン産生を好ましく低下させてそれにより抗炎症効果を提供することを認識している。特定の態様において、１種以上のサイトカインおよび／若しくはケモカインの転写後修飾が起こる。
【００４４】
転写後修飾の特定の例は当該技術分野で公知である。例は、少なくとも：多重遺伝子転写単位の利用；代替プロモーターの利用；選択的スプライシング；選択的ポリアデニル化；転写後切断；二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘導されるような転写後スプライシング（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる）；ＣからＵへのＲＮＡ編集；リン酸化；二方向プロモーターからのアンチセンス転写；Ｌａタンパク質結合（Ｌａは３’エキソ核分解性（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）消化からＲＮＡを保護しかつまたそれらの核保持にも寄与する）；Ｑ／ＲのＲＮＡ編集；塩基の脱アミノ化ＲＮＡ編集；ＧからＡへの編集；ＣからＵへの編集；分解；若しくはそれらの組合せを包含する。
【００４５】
示されるとおり、ＲＮＡ編集は転写後修飾の一形態である。ＲＮＡ編集は、ゲノム内に存在する塩基に一致しないＲＮＡ転写物内のヌクレオチドの生成をもたらす。哺乳動物のＲＮＡ編集事象（通常はシチジンからウリジンおよびアデノシンからイノシンへの転化）は主として塩基の脱アミノ化により媒介される。
【００４６】
当業者は、リポ多糖により刺激される骨髄系細胞でのようなＴＮＦαの安定性を媒介する因子の例を知っている（Ｍａｈｔａｎｉら、２００１、およびその中で引用される参考文献）。具体的には、Ｍａｈｔａｎｉらは、トリステトラプロリンのリン酸化がｐ３８で調節されるキナーゼＭＡＰＫＡＰＫ２により媒介されて転写後レベルでＴＮＦα遺伝子発現を調節する機構への直接の関連を提供することを示している。
合理的な薬物設計
合理的な薬物設計の最終目標は、それらが相互作用する生物学的に活性のポリペプチド若しくは化合物の構造的アナログ（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、結合パートナーなど）を製造することである。こうしたアナログを創製することにより、天然分子より活性若しくは安定であるか、変更に対し異なる感受性を有するか、または多様な他の分子の機能に影響を与えうる薬物を作り上げることが可能である。一アプローチにおいて、とりわけ抗炎症活性を含んでなる乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌から分泌されるポリペプチド、またはそれらのフラグメントの三次元構造を生成することができる。これはｘ線結晶学、コンピュータモデル化若しくは双方のアプローチの組合せにより達成し得るであろう。代替の一アプローチ、「アラニンスキャン」は、分子全体の残基のアラニンでの無作為置換を必要とし、そして機能に対する生じる影響を決定する。
【００４７】
機能アッセイにより選択したとりわけ抗炎症活性を含んでなる乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌種から分泌されるポリペプチドに対する特異的抗体を単離すること、およびその後その結晶構造を解明することもまた可能である。原則として、このアプローチはその後の薬物設計が基づくことができるファルマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生じる。機能的な薬理学的に活性の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成することによりタンパク質結晶学を全く迂回することが可能である。一鏡像の一鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は元の抗原のアナログであると期待することができる。抗イディオタイプをその後、化学的に若しくは生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定かつ単離するのに使用し得る。選択されたペプチドがその後ファルマコアとしてはたらくとみられる。抗イディオタイプは、抗体を抗原として使用して本明細書に記述される抗体の製造方法を使用して生成しうる。
【００４８】
従って、改善された抗炎症活性を有するか、またはサイトカイン若しくはケモカインの刺激物質、阻害剤、アゴニスト若しくはアンタゴニストとして作用する薬物、またはサイトカイン若しくはケモカインの機能により影響される分子を設計しうる。結晶学的研究を実施するために十分な量の本発明の化合物を製造し得る。加えて、ポリペプチド配列の知識が構造と機能の関係のコンピュータを使用する予測を可能にする。
【００４９】
本発明は多様な動物モデルの使用もまた包含する。増大されたレベルのＴＮＦ−αを含んでなる変異体細胞株を開発若しくは単離することにより、いくつかの態様において、ヒトおよび他の哺乳動物中でそれを高度に予測することができる、マウスのようなげっ歯類の大腸炎モデルを生成し得る。野性型サイトカインおよび／若しくはケモカインを欠くトランスジェニック動物を、大腸炎の発症および処置のモデルとして使用しうる。
【００５０】
試験化合物での動物の処置は適切な形態の化合物の動物への投与を伴うことができる。投与は、限定されるものでないが経口、鼻、頬側、直腸、膣若しくは局所を挙げることができる臨床的若しくは非臨床的目的上利用し得るいかなる経路によることもできる。あるいは、投与は気管内点滴注入、気管支点滴注入、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内若しくは静脈内注入によることができる。全身静脈内注入、血液若しくはリンパ供給を介する局所投与および腸内注入がとりわけ企図されている。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の有効性の決定は多様な異なる基準を必要としうる。こうした基準は、限定されるものでないが、生存、大腸炎の症状（１種若しくは複数）の低下、大腸炎の阻害若しくは予防、増大された活性レベルおよび改善された結腸機能を挙げることができる。
製薬学的組成物および投与経路
本発明の組成物は、結腸疾患、関節疾患、若しくは全身性炎症状態のようないずれかの炎症状態に対する治療的投与のための、ならびにいくつかの態様においては抗大腸炎疾患剤および／若しくは抗炎症剤である有効量の化合物（第二の剤）と組合せの乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が分泌する抗炎症化合物の有効量を有しうる。こうした組成物は一般に製薬学的に許容できる担体若しくは水性媒体に溶解若しくは分散することができる。
【００５２】
「製薬学的若しくは薬理学的に許容できる」という句は、適切なように動物若しくはヒトに投与される場合に有害な、アレルギー性の若しくは他の不利な反応を生じさせない分子化合物および組成物を指す。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」は、いずれかのおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含する。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体若しくは剤が該有効成分と不適合性である場合を除き、治療的組成物中でのその使用が企図されている。他の抗癌剤のような補助的有効成分もまた該組成物に組込み得る。
【００５３】
静脈内若しくは筋肉内注入のような非経口投与のため処方された化合物に加え、他の製薬学的に許容できる形態は、例えば経口投与のための錠剤若しくは他の固形物；調時放出カプセル剤；およびクリーム剤、ローション剤、含漱剤、吸入剤などを包含する現在使用されているいかなる他の形態も包含する。
【００５４】
本発明の発現ベクターおよび送達ベヒクルは古典的製薬学的製剤を包含しうる。本発明のこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限りはいずれの普遍的経路も介することができる。これは経口、鼻、頬側、直腸、膣若しくは局所を包含する。あるいは、投与は同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内若しくは静脈内注入によってよい。こうした組成物は通常、上述された製薬学的に許容できる組成物として投与することができる。
【００５５】
本発明の送達ベヒクル、ベクターおよび／若しくは製薬学的組成物は、有利には、液体の溶液若しくは懸濁剤いずれかとして注入可能な組成物の形態で投与され；注入前に液体の溶液若しくは懸濁剤に適する固体の形態もまた製造しうる。これらの製剤はまた乳化してもよい。こうした目的上典型的な組成物は、リン酸緩衝生理的食塩水１ミリリットルあたり５０ｍｇ若しくは約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含んでなる。他の製薬学的に許容できる担体は、塩、保存剤、緩衝剤などを包含する水性溶液、非毒性の賦形剤を包含する。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油およびテイルオレエート（ｔｈｅｙｌｏｌｅａｔｅ）のような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、生理的食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンゲル液などのような非経口ベヒクルを包含する。静脈内ベヒクルは液体および栄養素補給剤を包含する。保存剤は抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスを包含する。薬品中の多様な成分のｐＨおよび正確な濃度は公知のパラメータに従って補正する。
【００５６】
製剤は経口投与に適する。経口製剤は、例えば製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような典型的な賦形剤を包含する。組成物は溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤若しくは散剤の形態をとる。経路が局所である場合、該形態はクリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）若しくはスプレー剤であってもよい。
【００５７】
治療薬の有効量は意図される目標に基づき決定する。「単位用量」という用語は被験体での使用に適する物理的に別個の単位を指し、各単位はその投与、すなわち適切な経路および処置レジメンとともに所望の応答を生じさせるよう計算された予め決められた量の治療的組成物を含有する。処置の回数および単位用量双方に従って投与されるべき量は、治療されるべき被験体、被験体の状態および所望の保護に依存する。治療的組成物の正確な量もまた実務者の判断に依存しかつ各個体に独特である。
【００５８】
大腸炎のような炎症性疾患の予防および／若しくは処置に必要とされる不可欠の物質および試薬の全部をキットに一緒に集めてよい。キットの成分を１種若しくはそれ以上の液体溶液で提供する場合、該液体溶液は好ましくは水性溶液であり、無菌水性溶液がとりわけ好ましい。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために、抗炎症性疾患剤および／若しくは抗大腸炎剤を単一の若しくは別個の製薬学的に許容できる注入可能な（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｌｅ）組成物に処方しうる。この場合、容器手段は、それ自身が製剤を肺のような感染した身体領域に適用しうるか、動物に注入しうるか、若しくはなおキットの他成分に適用しかつそれらと混合しうる吸入装置、シリンジ、ピペット、点眼容器、若しくは他のこうした類似の装置であってよい。
【００６０】
キットの成分は乾燥若しくは凍結乾燥した形態で提供してもまたよい。試薬若しくは成分が乾燥した形態として提供される場合、再構成は一般に適する溶媒の添加による。溶媒もまた別の容器手段中に提供してよいことが予見される。本発明のキットは遺伝子治療および／若しくは抗大腸炎疾患薬物の投与を定義する説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｈｅｅｔ）もまた包含してよい。
【００６１】
本発明のキットはまた、典型的には、例えば所望のバイアルを保持する射出成型若しくは吹込成形プラスチック容器のような商業的販売のため緊密な限局にバイアルを含有するための手段も包含することができる。容器の数若しくは型に関係なく、本発明のキットはまた、最終的な複雑な組成物の動物の身体内への注入／投与若しくは設置で補助するための機器を含んでもそれらとともに包装してもよい。こうした機器は吸入装置、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼容器、若しくはいずれかのこうした医学的に承認された送達媒体であってよい。
【００６２】
本発明の有効成分はしばしば非経口投与のため処方される、例えば静脈内、筋肉内、皮下若しくはなお腹腔内経路を介する注入のため処方されることができる。有効成分としての第二の剤（１種若しくは複数）を含有する水性組成物の製剤は本開示に照らして当業者に既知であろう。典型的には、こうした組成物は液体の溶液若しくは懸濁剤いずれかの注入可能物として製造し得；注入の前に液体の添加に際して溶液若しくは懸濁剤を調製するために使用するのに適する固体の形態もまた製造し得；そして、該製剤はまた乳化もし得る。
【００６３】
遊離塩基若しくは薬理学的に許容できる塩としての有効成分の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適して混合した水中で製造し得る。分散剤もまたグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中で製造し得る。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
【００６４】
注入可能な使用に適する製薬学的形態物は、無菌の水性溶液若しくは分散剤；ゴマ油、ラッカセイ油若しくは水性プロピレングリコールを包含する製剤；および無菌の注入可能な溶液若しくは分散剤の即時調製のための無菌粉末を包含する。全部の場合において、該形態物は無菌でなくてはならず、また、容易な注入可能性が存在する程度まで流動性でなくてはならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、かつ、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
【００６５】
有効成分は中性のすなわち塩の形態で組成物に処方しうる。製薬学的に許容できる塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を包含し、そしてそれらは例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは鉄のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基由来でもあり得る。
【００６６】
担体はまた、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適する混合物ならびに植物油を含有する溶媒若しくは分散媒でもあり得る。例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散系の場合には必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により適正な流動性を維持し得る。微生物の作用の予防は多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらし得る。多くの場合、等張剤、例えば糖若しくは塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注入可能な組成物の持続性吸収は、組成物中での吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらし得る。
【００６７】
無菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの多様な上に列挙された他の成分とともに適切な溶媒中に必要とされる量の有効成分を組込むこと、次いで濾過滅菌により製造する。一般に、分散系は、基礎的な分散媒および上で列挙されたものからの必要とされる他成分を含有する無菌ベヒクル中に多様な滅菌した有効成分を組込むことにより製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、それらの事前に滅菌濾過した溶液から有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００６８】
ある場合には、本発明の治療的製剤をクリーム剤およびローション剤でのような局所投与に適する形態でも製造し得る。
【００６９】
処方に際して、溶液は投薬製剤と適合性の様式でかつ治療上有効であるような量で投与することができる。製剤は、上述された注入可能な溶液の型のような多様な投薬形態物で容易に投与され、薬物放出カプセルなどさえ使用可能である。
【００７０】
例えば水性溶液中での非経口投与のために、溶液は必要な場合は適して緩衝されるべきであり、また、液体希釈剤を十分な生理的食塩水若しくはブドウ糖で最初に等張にすべきである。これらの特定の水性溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとりわけ適する。これに関して、使用し得る無菌の水性媒体が本開示に照らして当業者に既知であろう。例えば、一投薬量を１ｍＬの等張のＮａＣｌ溶液に溶解し得、そして１０００ｍＬの皮下注射液に添加し得るか若しくは提案される注入部位に注入し得るかのいずれかである（例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１５版、１０３５−１０３８および１５７０−１５８０ページを参照されたい）。治療されている被験体の状態に依存して投薬量の何らかの変動が必然的に起こるであろう。投与の責任をもつ人がいずれにしても個々の被験体の適切な用量を決定するであろう。
【００７１】
腸組織への標的設定は多様な方法のいずれか１つで達成してよい。プラスミドベクターおよびレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターならびに他のウイルスベクターは全部それにより腸組織を標的とする手段を提示する。発明者は、本発明のポリペプチド若しくはそれをコードする核酸の標的を細胞（例は免疫細胞を包含する）に定めるためのリポソームの使用について特定の成功を予期する。例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡを上述された様式でリポソームと複合体形成することができ、そしてこのＤＮＡ／リポソーム複合体を炎症性疾患を伴う患者に注入し、ここで静脈内注入を使用して該ＤＮＡをいかなる細胞にも向けることができる。疾患に罹った組織の近くにリポソーム複合体を直接注入することは、いくつかの形態の炎症性疾患との複合体のターゲッティングもまた提供する。もちろん、免疫細胞のような細胞の一集団により選択的に取り込まれるリポソームの可能性が存在し、そしてこうしたリポソームは遺伝子のターゲッティングにもまた有用であろう。
【００７２】
当業者は、腸組織を治療するために本発明の化合物を使用するための最良の処置レジメンを直接決定し得ることを認識するであろう。これは実験の問題でなく、しかしむしろ医学の技術分野で慣例に実施される至適化の問題である。一例示的態様において、ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究が、投薬量および送達レジメンを至適化するために開始すべき出発点を提供する。注入の頻度はいくつかのマウス研究でなされたとおり当初は週１回であることができる。しかしながら、この頻度は、初期の臨床試験から得られる結果および特定の一患者の必要性に依存して１日から２週間ごとないし毎月まで至適に調節してよい。ヒトの投薬量は当初、マウスで使用した化合物の量から外挿することにより決定し得る。ある態様において、投薬量が、約１ｍｇのポリペプチドをコードするＤＮＡ／ｋｇ体重から約５０００ｍｇのポリペプチドをコードするＤＮＡ／ｋｇ体重までの間；または約５ｍｇ／ｋｇ体重から約４０００ｍｇ／ｋｇ体重まで若しくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重から約３０００ｍｇ／ｋｇ体重まで；または約５０ｍｇ／ｋｇ体重から約２０００ｍｇ／ｋｇ体重まで；または約１００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで；または約１５０ｍｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重まで変動してよいことが予見される。他の態様において、この用量は約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。他の態様において、より高用量を使用してよいことが予見され、こうした用量は約５ｍｇのポリペプチドをコードするＤＮＡ／ｋｇ体重ないし約２０ｍｇのポリペプチドをコードするＤＮＡ／ｋｇ体重の範囲にあってよい。他の態様において、該用量は約８、１０、１２、１４、１６若しくは１８ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。もちろん、この投薬量は、初期の臨床試験の結果および特定の一患者の必要性に依存して、こうした処置プロトコルで慣例になされるとおり上方若しくは下方に調節してよい。
【００７３】
本発明の特定の一態様において、化合物は丸剤若しくはカプセル剤として口により、または代替の一態様においては直腸により投与する。直腸投与のためには内視鏡および／若しくは結腸鏡のような装置による補助が有用なことがある。
キット
本明細書に記述される組成物のいずれもキットに含んでよい。制限しない一例において、幹細胞、脂質および／若しくは付加的な剤をキットに含んでよい。キットは、従って、適する容器手段中に幹細胞および脂質、ならびに／若しくは本発明の付加的な剤を含むことができる。
【００７４】
該キットは、適して分注された幹細胞、脂質、および／若しくは検出アッセイのための標準曲線を作成するのに使用しうるところの標識されているにしろされていないにしろ本発明の付加的な剤の組成物を含んでよい。キットの成分は水性媒体中若しくは凍結乾燥された形態でのいずれで包装してもよい。キットの容器手段は、一般に、成分を入れかつ好ましくは適して分注しうる最低１個のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ若しくは他の容器手段を包含することができる。キット中に１種以上の成分が存在する場合、キットは一般に付加的な成分を個別に入れてよい第二、第三若しくは他の付加的な容器もまた含有することができる。しかしながら、成分の多様な組合せが１本のバイアル中に含まれてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、商業的販売のために、緊密な限局に幹細胞若しくは本発明の薬理学的組成物、脂質、付加的な剤を含有するための手段およびいかなる他の試薬容器も包含することができる。こうした容器は、所望のバイアルを保持する射出成型若しくは吹込成形プラスチック容器を包含してよい。
【００７５】
本発明の治療キットは幹細胞を含んでなるキットである。こうしたキットは一般に、適する容器手段中に幹細胞の製薬学的に許容できる製剤を含有することができる。該キットは単一の容器手段を有してよく、かつ／若しくはそれは各化合物について別個の容器手段を有してもよい。
【００７６】
キットの成分が１種かつ／若しくはそれ以上の液体溶液で提供される場合、該液体溶液は水性溶液であり、無菌の水性溶液がとりわけ好ましい。幹細胞組成物はまた注入可能な組成物に処方してもよい。その場合、該容器手段は、それ自身が、感染した身体部位に製剤を適用することができ、動物に注入することができ、かつ／またはキットの他成分になお適用かつ／若しくはそれらと混合してもよいシリンジ、ピペット、および／若しくは他のこうした類似の装置であってよい。
【００７７】
しかしながら、キットの成分は乾燥した粉末（１種若しくは複数）として提供してもよい。試薬および／若しくは成分が水分を含まない粉末として提供される場合、該粉末は適する溶媒の添加により再構成し得る。該溶媒を別の容器手段中で提供してもまたよいことが予見される。
【００７８】
該容器手段は、一般に、幹細胞が入れられている、好ましくは適して割り当てられている最低１個のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジおよび／若しくは他の容器手段を包含することができる。キットは、無菌の製薬学的に許容できる緩衝液および／若しくは他の希釈剤を含有するための第二の容器手段もまた含んでよい。
【００７９】
本発明のキットはまた、典型的には、例えば所望のバイアルを保持する射出成型および／若しくは吹込成形プラスチック容器のような商業的販売のための緊密な限局にバイアルを含有するための手段もまた包含することができる。
【００８０】
容器の数および／若しくは型に関係なく、本発明のキットはまた、動物の身体内への最終結果幹細胞組成物の注入／投与および／若しくは配置で補助するための機器も含んでよくかつ／若しくはそれとともに包装してもよい。こうした機器は、シリンジ、ピペット、鉗子および／若しくはいずれかのこうした医学的に承認された送達媒体でありうる。
【００８１】
実施例
以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために包含する。後に続く実施例に開示される技術は本発明の実務において十分に機能することが発明者により発見された技術を表し、そして従ってその実務の好ましい様式を構成すると考え得ることが当業者により認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を鑑み、開示されかつ本発明の技術思想および範囲から離れることなくほぼ等しい（ｌｉｋｅ）若しくは類似の（ｓｉｍｉｌａｒ）結果をなお得る特定の態様において多くの変更をなし得ることを認識するはずである。
【実施例１】
【００８２】
ＬＰＳ活性化マクロファージによるＴＮＦ−α産生のＬＧＧ媒介性の阻害
われわれは培養マクロファージにおける炎症応答をダウンレギュレートする乳酸菌種の能力を調べるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイを開発した（図１）。自然免疫系の細胞は、生殖細胞系にコードされるパターン認識受容体（ＰＲＲ）を利用して病原体若しくは片利共生関連の分子パターン（Ｐ／ＣＡＭＰ）を認識する。１つのこうしたＰ／ＣＡＭＰが細菌ＬＰＳであり、それはそれがＰＲＲに対する１リガンド、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）としてはたらく（Ｌｉｅｎら、２０００；Ｐｏｌｔｏｒａｋら、１９９８）。われわれはＢＡＬＢ／ｃマウスからの形質転換腹膜マクロファージ株、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージをレポーター細胞として使用した（Ｒａｓｃｈｋｅら、１９７８）。野性型ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージおよび自発的変異体ＲＡＷ  ２６４．７γＮＯ（−）双方を比較した。γＮＯ（−）細胞は一酸化窒素の産生および完全な活性化にＩＦＮ−γおよびＬＰＳの双方を必要とする自発的変異体である（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら、１９９３）。簡潔には、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを培養しかつＬＰＳに曝露させ、そしてマクロファージ培養上清を活性化後３０分、１、３、５、７、９、１２および２４時間に収集した。ＬＰＳ活性化後の最大ＴＮＦ−α分泌にはおよそ５時間で達し、定量的ＥＬＩＳＡにより測定されるところの活性化後２４時間と比較した場合に有意差はなかった。ＴＮＦ−α産生のレベルは、野性型マクロファージでγＮＯ（−）細胞に対しより高いことが示された（５０，０００細胞あたりのレベル：それぞれ＞２５００ｐｇ／ｍｌおよび２０００〜２５００ｐｇ／ｍｌ）。定量的ＥＬＩＳＡは、単量体および二量体を包含する全部の形態のＴＮＦ−αを検出するよう設計されているため、これらのレベルはＴＮＦ−αホモ三量体のレベルを高く見積もりすぎているかもしれないことに注意しなくてはならない。
【００８３】
生存可能な無傷の紫外光（ＵＶ）で殺傷した、および超音波処理した乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、共インキュベーション実験でマクロファージのＬＰＳ媒介性の活性化に対し異なる影響を有した。生存可能な若しくはＵＶで殺傷した細菌いずれへの細菌へのマクロファージの曝露もＴＮＦ−α分泌を誘導しなかった一方、細菌細胞の超音波処理物は高レベルのＴＮＦ−αを導き出した（データは示されない）。無傷の生存可能なおよびＵＶで殺傷したの双方のＬＧＧ細胞は、マクロファージをＬＰＳに共曝露した場合にＴＮＦ−α産生を阻害することに失敗した。
【００８４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅおよび多様な乳酸杆菌からの細菌細胞を含まない馴化培地を炎症前サイトカイン出力に対する影響について試験した（図２）。免疫調節効果がＬＧＧ由来の細胞を含まない馴化培地で観察され、可溶性の免疫応答調節分子すなわちイムノモジュリン（１種若しくは複数）の存在を示した。ＬＧＧ馴化培地（ＬＧＧ−ｃｍ）の存在下で、ＬＰＳで活性化したマクロファージは、ＬＰＳ単独に曝露したマクロファージに比較した場合にＴＮＦ−α分泌の有意の減少を有する（ｐ＜０．０２５）。マクロファージでのＬＰＳ誘発性のＴＮＦ−α産生を阻害するＬＧＧの能力はＬＰＳの相対濃度および推定の細菌のイムノモジュリンに依存する。ＬＰＳの濃度が増大される際に、ＴＮＦ−α応答を調節するＬＧＧ−ｃｍの能力が低下する（データは示されない）。逆に、ＬＰＳ濃度を２ｎｇ／ウェルに維持することおよびＬＧＧ−ｃｍの量を変動させることは類似の結果を生じた。
【００８５】
ＬＧＧ−ｃｍの調節活性は濃度依存性であると思われたため、われわれは、推定のイムノモジュリンによるＬＰＳ媒介性のＴＮＦ−α産生を阻害する能力（２ｎｇ  ＬＰＳ／ウェルを用いて）が細菌密度依存性であるかどうかを検査した。接種後４、８および２４時間に収集したＬＧＧ−ｃｍを比較した。これら３つの時間点は、吸光度分光測光法に基づき、ＬＧＧ増殖のそれぞれ対数期初期、対数中期および対数後期／プラトー初期を表す。免疫調節活性は２４時間で収集したＬＧＧ−ｃｍで最も強力であった一方、対数期の細菌の馴化培地は部分的な免疫調節活性のみを有した。再攻撃実験を実施してＴＮＦ−α阻害活性の寿命を決定した。マクロファージはＬＰＳを伴うＬＧＧ−ｃｍ若しくはＬＰＳ単独を使用して刺激した。活性化後の５時間の終了時に細胞培地を除去しかつ新鮮培地で置き換えた。２４時間後にＬＰＳを伴うＬＧＧ若しくはＬＰＳで処理した細胞の双方をＬＰＳ単独で再攻撃した。ＴＮＦ−αは双方の群で検出可能であり、推定のイムノモジュリンが可逆的様式でＴＮＦ−αを阻害することを示した（図３）。
【００８６】
ＰＲＲを介してＰ／ＣＡＭＰを認識するマクロファージおよび他の免疫細胞は、可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）およびＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）のような血清中の可溶性補助因子を必要とすると考えられる（ＭｕｔａとＴａｋｅｓｈｉｇｅ、２００１）。血清を含まない培地中でバイオアッセイを実施し、そしてＬＰＳに曝露した細胞でＴＮＦ−αを測定した。われわれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で、マクロファージによるＬＰＳ誘発性のＴＮＦ−α産生は血清に可溶性の補助因子に依存しなかったとは言え、血清を補充したマクロファージに比較して、血清を枯渇した細胞で、ＴＮＦ−αの産生のわずかなしかし重要でない差違が存在した。重要なことに、ＬＧＧの免疫調節活性は血清の非存在下で保持された（図４）。
【実施例２】
【００８７】
ＬＴＡで活性化したマクロファージによるＴＮＦ−α産生のＬＧＧ媒介性の阻害
他の病原体若しくはグラム陽性細菌のリポテイコ酸（ＬＴＡ）のような片利共生関連分子パターン（Ｐ／ＣＡＭＰ）生体分子はＰＲＲを介してマクロファージを活性化することが示されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９９）。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ２）媒介性の経路を探究するために、ＬＧＧ馴化培地をＬＴＡで活性化したマクロファージに添加した。事実、ＬＧＧ−ｃｍは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｅ．フェーカリス（Ｅ．ｇａｅｃａｌｉｓ）若しくは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＬＴＡにより誘導されるマクロファージによるＴＮＦ−α分泌を阻害した。本アッセイにおいて、ＬＴＡは、ＬＰＳのレベルに匹敵したＴＮＦ−αレベルを誘導することが可能であった。該バイオアッセイで使用したＬＴＡの濃度はＬＰＳの濃度の１０倍以上であった（それぞれ２５ｎｇ／５００００細胞および２ｎｇ／５００００細胞）一方で、同量のＬＧＧ−ｃｍがＬＴＡおよびＬＰＳで活性化したマクロファージ双方についてＴＮＦ−α分泌を阻害した（実験の手順を参照されたい）ことは言及に値する。しかしながら、マクロファージをＬＰＳおよびＬＴＡ双方に曝露した場合、ＬＧＧのＴＮＦ−α阻害活性は部分的に低下される（図５）。これらの結果は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４媒介性の経路の二重の刺激がＴＮＦ−α産生の阻害を部分的に克服することを示唆している。
【実施例３】
【００８８】
サイトカインプロファイルおよび細菌−細菌拮抗作用の評価
自然免疫応答のサイトカインネットワークに対するＬＧＧによるＴＮＦ−α阻害の意味をさらに理解するために、われわれは、ＬＧＧ−ｃｍの存在若しくは非存在下でのＬＰＳで刺激したマクロファージのサイトカインプロファイルを評価した。バイオアッセイを実施し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ  ＬａｂＭＡＰ  １００ＴＭ系によりサイトカインを定量した（Ｍａｒｔｉｎｓら、２００２）。インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αは、ＬＰＳで刺激したマクロファージの培養上清で検出されたが、しかし、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）はされなかった。ＬＧＧ処理したＬＰＳで刺激したマクロファージでのＩＬ−１βおよびＩＬ−１０のレベルは、ＬＰＳで刺激した細胞により産生される量に匹敵した。ＥＬＩＳＡデータと同様に、ＬＧＧ処理したＬＰＳで刺激した細胞ではＬＰＳ単独に比較してＴＮＦ−αレベルの７倍の低下が観察された。興味深いことに、ＩＬ−１０のレベルは、マクロファージをＬＰＳ単独に曝露しようとＬＧＧ−ｃｍと共インキュベートしようと影響されなかった。ＬＧＧ処理したマクロファージはＬＰＳ単独に比較して低下したＴＮＦ−α／ＩＬ−１０比を有し（図６）、正味の免疫調節効果を示した。グラム陰性細菌由来の産物はナイーブなマクロファージを刺激するため、われわれは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくは病原性ヘリコバクターにより誘導されるＴＮＦ−α産生をＬＧＧが予防し得るかどうかを確立したいと思った。われわれのアッセイにおいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）若しくはＨ．ヘパティクス（Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）のようなグラム陰性細菌の馴化培地はマクロファージによるＴＮＦ−α分泌を誘導することが可能である。しかしながら、馴化培地中に存在するＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）若しくはＨ．ヘパティクス（Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）由来のＰ／ＣＡＭＰのいずれも、マクロファージにおけるＴＮＦ−α分泌の刺激において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＰ／ＣＡＭＰほど強力でない。マクロファージ活性化の属間の比較は、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）馴化培地が約９００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを導き出す一方、Ｈ．ヘパティクス（Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に誘導されるレベルのおよそ半分を生じさせることを示している。ＬＧＧ−ｃｍの存在下でＴＮＦ−α誘導は有意に阻害され、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）由来の免疫調節因子に対するＬＧＧ由来のイムノモジュリンの拮抗作用を示している（ｐ＜０．０１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による誘導がＬＧＧ−ｃｍの添加により影響されないことを示すことは興味深い。ＬＧＧは、所定の性質若しくは特定の閾値濃度のＬＰＳ（若しくは免疫刺激性Ｐ／ＣＡＭＰ）が存在する場合にのみＴＮＦ−αを阻害するとみられる（図７）。
【００８９】
この推定のイムノモジュリンをさらに特徴づけるため、ＬＧＧからの馴化培地をＤＮアーゼＩ、プロテイナーゼＫ若しくはプロテアーゼＥで処理した。馴化培地のプロテアーゼ処理、次いでプロテアーゼの熱不活性化は、未改変のＬＧＧ−ｃｍに関して部分的なしかし有意の（ｐ＜０．０５）ＬＧＧ−ｃｍのＴＮＦ−α阻害性活性の喪失をもたらした（図８）。これは、該推定のイムノモジュリンが、マクロファージでのＴＮＦ−α産生を阻害するタンパク質若しくはペプチド成分を有することを意味している。
【実施例４】
【００９０】
本発明の意義
要約すれば、これらの結果は、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧがネズミのマクロファージモデルにおいてＴＮＦ−α産生を特異的に阻害しかつＴＮＦ−α／ＩＬ−１０比を低下させることを示す。正味の影響は本来免疫調節性である。他の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種はこうした調節性の効果を有さず、特定の免疫効果が種若しくは株特異的でありうることを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏでは細胞外ｐＨが免疫応答に影響しうると考えられている（Ｌａｒｄｎｅｒ、２００１）。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の培地（ＭＲＳ培地）はわずかに酸性（ｐＨ約６）であり、そして乳酸菌による培地中の炭水化物の利用がｐＨを約４までさらに減少させる。マクロファージ細胞培養物への乳酸杆菌馴化培地の添加（ＲＡＷアッセイ）はｐＨを酸性範囲に移動させ、そしてＴＮＦ−α産生に影響していたかもしれない。ＴＮＦ−α産生に対するｐＨの可能な影響を取り扱うため、ＭＲＳ培地を乳酸杆菌馴化培地に匹敵するｐＨ（およそｐＨ４）まで酸性化し、そして対照として使用した。酸性化したＭＲＳは、ＬＰＳ媒介性のＴＮＦ−α産生を阻害せず、そして、その酸性化したＭＲＳ単独ではナイーブなマクロファージでＴＮＦ−α産生を誘導し得なかった（データは示されない）。
【００９１】
加えて、乳酸がＴＮＦ−α産生に人工的に影響するはずであるとすれば、ＴＮＦ−α産生のＬ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ媒介性の減少というわれわれの観察結果はより広く受け入れられるとみられる（すなわち、より多くの単離物がこの効果を表すとみられる）。乳酸杆菌の大部分の種および単離物は、低下した酸素圧力下で培養される場合に多様な炭水化物を乳酸に醗酵する。われわれは試験した１００以上から１０未満の株でＴＮＦ−α阻害を見出したのみであったため、乳酸若しくは他の酸代謝物がＴＮＦ−α阻害を与えることは高度にありそうにないと思われる。われわれのデータは、乳酸アシドーシスがラット腹膜マクロファージでのＴＮＦ−α産生を増加させるという（Ｊｅｎｓｅｎら、１９９０）の知見によりさらに裏付けられる。
【００９２】
この効果は血清および接触非依存性であり、完全な調節活性のために可溶性ＬＧＧイムノモジュリンの存在を必要とする。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のような他のＮＦ−κＢ依存性サイトカインは阻害されず、そしてＩＬ−１０産生は影響されない。従って、この調節効果はＴＮＦ−αに特異的であるようであり、かつ、ＮＦ−κＢ非依存性でありうる。腸内乳酸杆菌は、おそらく細胞表面受容体に結合しかつアポトーシス前効果若しくは細胞壊死に依存せずにＴＮＦ−αの合成若しくは分泌をいくぶん阻害する可溶性タンパク質因子を産生する（その結果好ましくはこれらの化合物は毒性効果によりヒト細胞を殺さずかつ／若しくはそれらに損傷を与えない）。
【００９３】
ＴＮＦ−αはＴｈ１免疫応答を刺激する活性化したマクロファージにより産生される強力な炎症前サイトカインを代表する。ＬＰＳで活性化したマクロファージでのＴＮＦ−α産生はＮＦ−κＢの活性化に依存する。ＮＦ−κＢは宿主の自然免疫応答で重要な炎症前遺伝子の重要な転写調節因子であると考えられている。ＴＮＦ−α産生の阻害はＮＦ−κＢの活性化の妨害に二次的であるとみられ、ＴＮＦ−αの転写を阻害する。ＬＧＧおよびネズミのマクロファージに関して、ＩＬ−１２のような他のＮＦ−κＢに調節される遺伝子が減少されないため、この経路は影響されていると思われない。データは、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルがＬＰＳ若しくはＬＴＡで活性化したマクロファージで影響されないことを示している。代わりに、ＴＮＦ−α産生は、転写後機構により特異的に阻害されるようである。
【００９４】
片利共生細菌は、免疫応答を調節することにより宿主における感染を高めうる免疫調節因子を産生することが知られている（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。こうしたイムノモジュリンは腸の健康の維持および全身性の炎症応答の抑制において重要な役割を有するとみられる。ラクトバチルス  パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）は、高レベルの調節性サイトカインＩＬ−１０およびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を産生する調節性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団を誘導する（ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｉｄら、２００１）。乳酸杆菌は、種依存性の様式でサイトカインプロファイル全体を変えるという正味の影響を伴い、骨髄由来樹状細胞におけるサイトカイン産生を調節する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００２）。非毒性のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株は、ＮＦ−κＢの阻害性サブユニットＩκＢαのユビキチン化を予防することにより炎症前サイトカイン産生のＮＦ−κＢ依存性の誘導を調節する（Ｎｅｉｓｈら、２０００）。
【００９５】
原核生物は炎症前サイトカイン応答を阻害しかつ長期のコロニー形成および微生物：宿主の共存を助長するための機構を発展させてきた。乳酸杆菌はげっ歯類モデルにおいて粘膜および全身双方のサイトカインレベルに対し異なる影響を発揮し（Ｈａら、１９９９；Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら、１９９９）かつサイトカイン合成の量的な差異の検査の重要性を強調しているかもしれない。これらの表面上は異質の結果は、ライセートを用いた実験的研究を無傷の細胞若しくは馴化培地と区別することの重要性を強調する。加えて、いずれかの属の異なる種若しくは株は異なる生物学的影響を有するようである。病因および片利共生に重要な生物学的単位は最終的にクローンである。株の差異の裏付けとして、研究が、デルブリュック乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の免疫増強効果の株依存性を示している（Ｎａｇａｆｕｃｈｉら、１９９９）。
【００９６】
病原性細菌は、多様な機構により宿主免疫細胞でのＴＮＦ−α発現を減少させかつおそらく全身性の展開および増殖を助長するタンパク質を産生する。例えば、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）は、感染の間のヒトマクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害する主要外膜タンパク質Ｏｍｐ２５を産生する（Ｊｕｂｉｅｒ−Ｍａｕｒｉｎら、２００１）。炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）により産生される炭疽菌致死因子はマクロファージ中で２種のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）を切断して、リポ多糖に応答した一酸化窒素（ＮＯ）およびＴＮＦ−α若しくはＩＦＮ−γの産生の実質的低下を引き起こす（Ｐｅｌｌｉｚｚａｒｉら、１９９９）。腸の病原体エルジニア  エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）は、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ経路を妨害することによりネズミの単球−マクロファージ中でのＴＮＦ−α産生を妨害するタンパク質ＹｏｐＰを発現する（ＢｏｌａｎｄとＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９８）。
【００９７】
生菌の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ならびに他の生菌乳酸菌種は数種の動物モデルおよび臨床試験で有効であった。ＩＬ−１０欠損マウスへのＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の投与は、処理した動物での大腸炎の回復および腸内微生物叢の性質の見かけ上の移動をもたらした（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９；Ｍａｄｓｅｎら、２０００）。酢酸誘発性ラット大腸炎モデルで、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）およびＬ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧは有益な効果を生じかつ粘膜の炎症を低下させた（Ｈｏｌｍａら、２００１）。多様な種の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）が、ヒト患者の抗生物質関連性大腸炎、ウイルス性胃腸炎および炎症性腸疾患の処置のための現代の生菌処方に包含されている。ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧの経口摂取は抗生物質関連性大腸炎の再発のリスクを低下させた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９６）。ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）の投与は疾患の長さを短縮しかつロタウイルス性胃腸炎による症状を回復させた（Ｓｈｏｒｎｉｋｏｖａら、１９９７）。最後に、結腸直腸吻合術後の潰瘍性大腸炎患者における乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の混合物（ＶＳＬ＃３）の投与は、慢性回腸嚢炎の突発の再発を低下させた（Ｇｉｏｎｃｈｅｔｔｉら、２０００）。
【００９８】
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは当該技術分野で既知のところの他の乳酸菌種のメンバーを包含する生菌生物体は抗炎症生物治療剤として興味深い可能性を提供する。胃腸管の炎症および感染性疾患の処置のためのプロバイオティクスにおける増大する興味は、新たな治療レジメンに対する熱意を生成したが、しかしこれらの目的上至適の細菌株はさらなる検討を必要とする。免疫調節の分子機構のより完全な理解が、次世代のプロバイオティクスの発展を助長するであろうし、かつ、宿主と微生物の相互作用のわれわれの理解を高めるであろう。宿主および片利共生生物体の共進化が、われわれが前進する際の科学的疑問を組み立てるための価値ある情況としてはたらく。乳酸杆菌を包含する明らかに片利共生性の細菌は、宿主粘膜と単純な接着を超えて緊密に相互作用する。表面結合型および分泌型因子の産生は特定の真核生物シグナル伝達経路を誘発し、そして最終的には特定の宿主タンパク質の産生に影響を及ぼす。こうした分子相互作用は、粘膜の炎症および宿主免疫応答の調節への洞察を明らかにしかつ新たな機構を明らかにするであろう。
【実施例５】
【００９９】
例示的実験手順
以下の材料および方法は本発明に関し例示的であるとは言え、特定の一態様においてそれらは実施例１〜４に記述される実験に有用である。
細菌学的方法
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種（アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ  ４７９６、Ｌ．アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ３５０４６、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ  ＡＴＣＣ  ５３１０３、イエンセン乳酸杆菌（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＡＴＣＣ  ３３２００、Ｌ．ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ  ３５０２０、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ  １４９１７、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ  ４９４４５、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５３６０８、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５５１４８、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ  １１４７１）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ（Ｖ．Ｆｕｓｓｉｎｇ、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、デンマーク・コペンハーゲンから得られた）を、それぞれｄｅ  Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）およびＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ、メリーランド州スパークス）中で増殖させた。乳酸杆菌の一夜培養物を１．０のＯＤ６００（およそ１０９細胞／ｍｌに相当する）に希釈しかつさらに１０倍希釈し、そして追加の４、８および２４時間増殖させた。ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）Ｓｙｄｎｅｙおよびヘリコバクター  ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）３Ｂ１は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＢｒｕｃｅｌｌａ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で４８時間培養した。培養物を１０倍希釈しそして別の２４および４８時間増殖させた。細菌細胞を含まない馴化培地を８５００ｒｃｆで４℃で１０分間の遠心分離により収集した。馴化培地を細胞ペレットから分離し、そして０．２２μｍ孔のフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した。無傷のＵＶで殺傷した細菌は、ＰＢＳ中で乳酸杆菌を洗浄することおよび細胞を１のＯＤ６００まで再懸濁することにより調製した。細菌細胞をＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｒ）ＵＶ架橋装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）で２４００μジュールのＵＶ２５４ｎｍ光に曝露し、そして生存率を評価するためＭＲＳアガー上にプレーティングした。ＵＶで殺傷した細胞の無傷性をグラム染色形態学により評価した。
馴化培地の操作
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地を分解酵素および温度移動で処理して、これらの微生物によりおそらく分泌されている免疫調節性分子の性質を決定した。馴化培地を以下、すなわち、３周期の凍結および融解、９５℃での１５分加熱、Ｔｒｏｏｍでの１５分のＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）処理、またはプロテイナーゼＫ若しくはプロテアーゼＥ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）での３７℃での２０分消化、次いで９５℃での１０分の熱不活性化にかけた。ＭＲＳ培地を、乳酸杆菌馴化培地に匹敵するｐＨ（およそｐＨ４）まで塩酸で酸性化しかつ対照として使用した。
細胞培養物およびバイオアッセイ
マウス単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ  ２６４．７（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−７１）およびＲＡＷ  ２６４．７γＮＯ（−）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２７８）を、炎症応答経路を研究するためのレポーター細胞として使用した。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳおよび２％抗生物質（５０００単位／ｍｌのペニシリンおよび５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（野性型マクロファージのため）若しくはＲＰＭＩ培地１６４０（γＮＯ（−）細胞のため）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバード）のいずれか中、５％ＣＯ２  ３７℃で８０〜９０％コンフルエントまで増殖させた。およそ５×１０４細胞を９６ウェル細胞培養クラスターに接種し、そしてＬＰＳ活性化および馴化培地の添加前に２時間接着させた。ナイーブなＲＡＷ  ２６４．７細胞を、細胞を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ）馴化培地、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｂ８からの精製したリポ多糖（ＬＰＳ）、若しくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス  フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのリポテイコ酸（ＬＴＡ）（Ｓｉｇｍａ）に曝露した。活性化培地は、２ｎｇのＬＰＳ若しくは２５ｎｇのＬＴＡをウェルあたり２０μｌの馴化培地に添加することにより作成した。マクロファージは、無傷の細胞の実験でマクロファージあたり２０若しくは２００いずれかの乳酸杆菌細胞に曝露した。マクロファージは、細胞を含まない乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地と前インキュベート若しくは共インキュベートのいずれかをした。組換えｍＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を免疫調節研究の対照として使用した。細胞生存率はトリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）排除アッセイにより評価した。
サイトカイン測定
マクロファージ細胞培養上清中のＴＮＦ−αの産生はマウスＴＮＦ−α特異的サンドイッチエンザイムイムノアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州カマリロ）を用いて測定した。推定の免疫調節物質の存在下での活性化したマクロファージ培養物のサイトカイン環境を研究するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＬａｂＭＡＰ  １００ＴＭ系（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）のためのマウス特異的サイトカイン抗体ビーズキットを使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、テキサス州オースティン）で培養上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０およびｐ４０特異的）、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを検出かつ定量した。
統計学的解析
全部の実験は最低３回（各回三重で）実施し、そして独立サンプルＴ検定（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓａｍｐｌｅｓ  Ｔ−Ｔｅｓｔ）（ＳＰＳＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  バージョン１１．０．１、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）を使用してｐ＜０．０５という有意性レベルで解析した。図中の誤差の棒は標準偏差（ＳＤ）を表す。
【実施例６】
【０１００】
付加的な態様
ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＬＧＧ）のグラム染色を行い（１００倍）、ＬＰＳで活性化したＲＡＷ  ２６４．７マクロファージのヘマトキシリン−エオシン染色を行った（４０倍）。
【０１０１】
図９は、ＬＰＳで活性化したマクロファージに対する細菌馴化培地の影響を示す。マクロファージをＬＰＳおよび細菌馴化培地の混合物で活性化した。活性化５時間後に培地をＴＮＦ−αについて試験した。アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）４７９６はＭＲＳ＋ＬＰＳのみで活性化したマクロファージに比較してＴＮＦ−α産生を有意に増大させた（ｐ＜０．０１）一方、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５５１４８は影響を有しなかった。ＬＧＧはＴＮＦ−α産生を有意に減少させた（ｐ＜０．０１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌は培地単独に比較してＴＮＦ−α産生を有意に増大させた。
【０１０２】
図１０は免疫調節がｐＨの影響によらないことを示す。乳酸産生および低下されたｐＨの影響について制御するために、酸性化したＭＲＳ培地（ｐＨ４）を試験し、そしてＬＧＧ−ｃｍの存在を伴わずにＴＮＦ−αレベルに影響しなかった。他の乳酸菌由来の馴化培地はＴＮＦ−α分泌を阻害せず、そして乳酸産生による一般的なｐＨの影響と矛盾しなかった。
【０１０３】
図１１はＬＴＡで活性化したマクロファージに対するＬＧＧ馴化培地の影響を提供する。マクロファージを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＥ．フェーカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＬＴＡで活性化した。ＬＧＧ馴化培地は、ＭＲＳ培地単独に比較して、ＬＴＡで活性化したマクロファージでの炎症前サイトカイン発現を有意に低下させた（ｐ＜０．０１）。
【０１０４】
図１２は免疫調節効果が１０ｋＤＡの画分に保持されることを示す。サイズ排除フィルターを使用してＬＧＧ馴化培地を分画した。ＴＮＦ−α産生の阻害は＜１０ｋＤａの画分で観察された。対照的に＞１０ｋＤａの画分は免疫調節活性を喪失した。発明者からの以前のデータと一緒にすれば、これは、小型ペプチドが免疫調節の原因でありかつ血清を必要としないことを示す。
【０１０５】
図１３は免疫調節がヘテロ三量体のＧタンパク質を利用することを示す。ＰＴｘ処理後に、ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、ＬＰＳ単独で刺激したか、若しくは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地（ＣＭ）と共培養した。ＴＮＦ阻害効果を発揮する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地の能力は、ＲＡＷ  ２６４．７細胞をＰＴｘで毒性化した場合に部分的に低下した。
【０１０６】
図１４はＴＮＦ−α／ＩＬ−１０の比がＬＧＧの存在下で低下することを示す。ＬＰＳで活性化したマクロファージのサイトカインレベルを、マウス特異的多サイトカイン抗体ビーズサンドイッチイムノアッセイを使用してＬｕｍｉｎｅｘ  １００機器で測定した。ＬＧＧ−ｃｍ＋ＬＰＳで刺激したマクロファージのＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのレベルをＬＰＳ単独に曝露したマクロファージに関して比較した。ＬＧＧ（Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）馴化培地）およびＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２７：Ｂ８由来リポ多糖）。
【０１０７】
ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびストレプトコッカス  サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）で得られた類似の結果は、本明細書の図に示されない。
【実施例７】
【０１０８】
付加的な例示的手順
以下の材料および方法は本発明に関する例示であるとは言え、特定の態様において、それらは実施例６に記述される実験に有用である。
細菌培養物
Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｉｓｓｌｅをそれぞれＭＲＳ培地およびＬＢ培地中で増殖させた。一夜培養物を１０倍希釈し、そして別の４、８および２４時間増殖させた。ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）Ｓｙｄｎｅｙおよびヘリコバクター  ヘパティクス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）３Ｂ１は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＢｒｕｃｅｌｌａ培地中で４８時間培養した。培養物を１０倍希釈し、そして別の２４および４８時間増殖させた。細菌により馴化された培地を、培養物を遠心分離することにより収集した。
ＲＡＷバイオアッセイ
１２９  ＳｖＥｖマウスからの腹膜マクロファージおよび単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ  ２６４．７γＮＯ（−）を、炎症応答経路を研究するためのレポーター細胞として使用した。ナイーブなＲＡＷ  ２６４．７γＮＯ（−）細胞を、細胞を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ）馴化培地、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｂ８からの精製したリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）若しくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびエンテロコッカス  フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）からのグラム陽性リポテイコ酸（Ｓｉｇｍａ）に曝露した一方、初代マクロファージをＬＰＳ若しくはＬＴＡに曝露した。マクロファージは、細胞を含まない乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地と前インキュベート若しくは共インキュベートのいずれかをした。トキシンアッセイのため、ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージを、Ｇｉタンパク質依存性の応答を排除するためにＧｉタンパク質阻害剤、百日咳トキシン（ＰＴｘ）に曝露した。ＰＴｘ処理後にＲＡＷ  ２６４．７細胞をＬＰＳ単独で刺激したか、若しくは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地（ＣＭ）と共培養した。細胞培養上清中でのＴＮＦ−αの産生を、サンドイッチエンザイムイムノアッセイ、マウスＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州カマリロ）を用いて測定した。
サイトカイン測定
推定の免疫調節物質の存在下での活性化したマクロファージ培養物のサイトカイン環境を研究するために、マウス多重サイトカイン検出系（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）２（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、テキサス州オースティン）機器で培養上清中のＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを検出かつ定量することができる。
【実施例８】
【０１０９】
健康なおよびＩＬ−１０欠損マウスからの腸内乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）
乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種は胃腸感染症および炎症性腸疾患の処置のための生菌剤として使用されている。ネズミの胃腸管は、ヒトを包含する他の哺乳動物と同様に、腸の健康の維持に重要と考えられる十分な数の片利共生乳酸杆菌を含有する。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）欠損マウスは、重要な免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０）の非存在により、腸内細菌にコロニー形成される場合に大腸炎を発症する。
【０１１０】
健康なおよびＩＬ−１０欠損マウスからの乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物叢を比較するために、小腸の多様な領域および糞便から腸内乳酸杆菌を単離した。候補のネズミの腸内乳酸杆菌を選択培地上で培養し、そしてグラム染色形態学および選択された生化学的検査によりスクリーニングした。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）単離物を、詳細な生化学的研究、１６Ｓ  ｒＲＮＡシークェンシングおよびｒｅｐ−ＰＣＲに基づくＤＮＡフィンガープリント法により特徴付けした。
【０１１１】
腸内乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）単離物の詳細な生化学的および分子研究は、ＩＬ−１０欠損マウスに対する健康なマウスでの異なる乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）集団の存在を強調した。同一の動物から単離したおよび腸管の多様な領域から培養した腸内乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）単離物は、ＤＮＡフィンガープリント法により同一であった。健康な動物からの単離物は、生化学的分析およびＤＮＡシークェンシングによりラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）（若しくはＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）／醗酵乳酸杆菌（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）複合物）と同定された。対照的に、ＩＬ−１０欠損マウスからの単離物は、生化学的研究およびＤＮＡシークェンシングによりラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）若しくはアシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）と同定された。これらのデータに一致して、健康なおよび疾患に罹った動物からの単離物は、ｒｅｐ−ＰＣＲに基づくＤＮＡフィンガープリント法に基づくクラスター分析により明瞭に識別された（図１５および１６）。
【０１１２】
異なる腸内乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種が、健康な動物および大腸炎を伴うＩＬ−１０欠損マウスで優位を占める。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物叢の性質が腸の健康若しくは炎症に部分的に寄与するとみられ、また、生菌処置戦略に適切であるとみられる。
【実施例９】
【０１１３】
ＴＮＦ−αの阻害性（「イムノモジュリン」）活性はＧタンパク質Ｇｉα２の存在を必要とする
野性型およびヘテロ接合性ノックアウト動物からのマクロファージは、ＬＰＳ単独で刺激した場合に匹敵するレベルのＴＮＦ−αを分泌した。ヘテロ接合性Ｇｉα２＋／−マクロファージは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣＭの存在下で中間レベルのＴＮＦ−αを産生した（図１７）。ホモ接合性Ｇｉα２欠損マクロファージは、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のＣＭの存在にもかかわらず過剰量のＴＮＦ−αを産生した（図１７）。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のＣＭは、野性型マクロファージによるＬＰＳで刺激されたＴＮＦ−α分泌を阻害したが、しかし、この効果はＧｉα２欠損細胞中では阻害された（図１７）。これらの結果は、片利共生乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種によるマクロファージのサイトカイン応答の調節におけるＧタンパク質Ｇｉα２の重要性を示し、かつ、Ｇｉα２欠損マウスモデルの提案された研究を正当化する。
参考文献
本明細中で言及される全部の特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者の水準を暗示する。全部の特許および刊行物は、各個々の刊行物が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
特許および特許出願
米国特許第４，３１４，９９５号
米国特許第４，８３９，２８１号
米国特許第５，０３２，３９９号
米国特許第６，１３２，７１０号
米国特許出願第２００２００１９０４３  Ａ１号
【０１１５】
【表１】
2006519014.tif 000003
【０１１６】
【表２】
2006519014.tif 000004
【０１１７】
【表３】
2006519014.tif 000005
【０１１８】
【表４】
2006519014.tif 000006
【０１１９】
【表５】
2006519014.tif 000007
【０１２０】
【表６】
2006519014.tif 000008
【０１２１】
【表７】
2006519014.tif 000009
【０１２２】
【表８】
2006519014.tif 000010
【０１２３】
【表９】
2006519014.tif 000011
【０１２４】
【表１０】
2006519014.tif 000012
【０１２５】
本発明およびその利点を詳細に記述したとは言え、多様な変更、置換および変化を、付属として付けられる請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想および範囲から離れることなく本明細書で行い得ることが理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細に記述された方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）、機械、製造、組成物、手段、方法（ｍｅｔｈｏｄ）および段階の特定の態様に制限されることを意図していない。当業者が本発明の開示から容易に認識するであろうとおり、本明細書に記述される対応する態様と実質的に同一の機能を遂行する若しくは実質的に同一の結果を達成する、現在存在する若しくは後で開発されるべき方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）、機械、製造、組成物、手段、方法（ｍｅｔｈｏｄ）若しくは段階を、本発明により利用してよい。従って、付属として付けられる請求の範囲は、こうした方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）、機械、製造、組成物、手段、方法（ｍｅｔｈｏｄ）若しくは段階をそれらの範囲内に包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
本発明のより完全な理解のため、今や付随する図面とともに解釈される以下の記述に言及する。
【図１】ＬＧＧ−マクロファージバイオアッセイの図解を提供する。マクロファージを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの精製したＬＰＳで刺激する。活性化は細胞過程の空胞化および放出のような形態学的変化を特徴とする。加えて、活性化はＴＮＦ−αのような炎症前サイトカインの分泌もまたもたらす。乳酸杆菌により作成される推定のイムノモジュリンの存在はＴＮＦ−αのＬＰＳ媒介性の産生を阻害するとみられる。
【図２】図２Ａおよび２Ｂ  ＬＧＧ馴化培地がＬＰＳで活性化したマクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害することを示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と対照的に、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）若しくは他の乳酸菌種により馴化された培地は、定量的ＥＬＩＳＡにより測定されるところのＲＡＷ  ２６４．７マクロファージでのＴＮＦ−α産生を誘導しない（図１Ａ）。ＬＧＧからの馴化培地のみがマクロファージによるＬＰＳ媒介性のＴＮＦ−α産生を阻害した（Ｂ）。選択した細菌種の馴化培地が表される。すなわち、Ｌａｃｉｄ  ４７９６（アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ  ４７９６）、ＬＧＧ（Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ）、Ｌｒｅｕｔ  ５５１４８（Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５５１４８）、Ｅｃ  Ｎｉｓｓｌｅ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ）。培地対照：ＭＲＳ（ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ）およびＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）。
【図３】ＬＧＧによるＴＮＦ−α産生の阻害が可逆的であることを示す。ＲＡＷ  ２６４．７マクロファージをＬＧＧ−ｃｍ＋ＬＰＳ若しくはＬＰＳ単独で活性化した。活性化５時間後に、定量的ＥＬＩＳＡを使用して細胞培地をＴＮＦ−αについてアッセイした。消費された培地を除去しそして新鮮培地を補充した。マクロファージを一夜増殖させ、その後ＬＰＳ単独で再攻撃した。培地をＬＰＳ再攻撃５時間後にＴＮＦ−αについてアッセイした（ＰＬＳ再攻撃）。ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２７：Ｂ８由来リポ多糖）。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ  ＬＰＳによるマクロファージ活性化およびＬＧＧの免疫調節効果が血清非依存性であることを示す。ＦＢＳを含まない条件でＲＡＷ  ２６４．７マクロファージバイオアッセイを実施して、定量的ＥＬＩＳＡにより測定されるところのＴＮＦ−α産生に対する観察された効果に血清溶解性の補助因子が必要とされるかどうかを決定した。ＦＢＳ補充条件（図４Ａ）とＦＢＳを含まない条件（図４Ｂ）との間に有意差は示されなかった。ＭＲＳ（ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ培地）、ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２７：Ｂ８由来リポ多糖）。
【図５】図５Ａから５Ｂ  ＬＧＧ馴化培地がＬＴＡで活性化したマクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害することを示す。３種の異なるグラム陽性細菌からの精製したＬＴＡを、ＬＰＳを伴い若しくは伴わずにマクロファージを刺激するのに使用した（図５Ａ）。ＬＧＧ馴化培地の存在下で、定量的ＥＬＩＳＡにより測定されるとおりＴＮＦ−α産生が減少した（図５Ｂ）。培地のみ／ＭＲＳ（ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ培地）、Ｓａｕｒ（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））、Ｅｆａｅｃ（エンテロコッカス  フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｂｓｕｂ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ＬＴＡ（リポテイコ酸）、ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２７：Ｂ８由来リポ多糖）。
【図６】ＴＮＦ−α／ＩＬ−１０比がＬＧＧの存在下で減少されることを示す。ＬＰＳで活性化したマクロファージのサイトカインレベルを、マウス特異的多サイトカイン抗体ビーズサンドイッチイムノアッセイを使用してＬｕｍｉｎｅｘ  １００機器にて測定した。ＬＧＧ−ｃｍ＋ＬＰＳで刺激したマクロファージでのＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのレベルをＬＰＳ単独に曝露したマクロファージに関して比較した。ＬＧＧ（Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）馴化培地）およびＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２７：Ｂ８由来リポ多糖）。
【図７】ＬＧＧ由来因子がヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ）種によるマクロファージの活性化に拮抗するがしかし大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による活性化はしないことを示す。マクロファージを、ＬＰＳ補充したヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ）若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）馴化培地、またはグラム陰性馴化培地単独のいずれかで活性化した。ＬＧＧ馴化培地をヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ）若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）馴化培地に添加し（１：１の比）、ＬＧＧがヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ）で活性化したマクロファージでのＴＮＦ−α産生を低下させ得たかどうかを定量的ＥＬＩＳＡを使用して決定した。Ｈｐ（Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）馴化培地）、ＬＧＧ（Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）馴化培地）、Ｈｈ（Ｈ．ヘパティクス（Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）馴化培地）およびＥｃ  Ｎｉｓｓｌｅ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ馴化培地）。
【図８】ＬＧＧ由来タンパク質が免疫調節効果を与えることを示す。マクロファージをＬＰＳおよび改変ＬＧＧ馴化培地の混合物で活性化し、そしてＴＮＦ−α産生を定量的ＥＬＩＳＡにより測定した。馴化培地はＬＰＳと混合する前に多様な処理にかけた。すなわち、未処理対照（未改変）、凍結融解循環（Ｆ／Ｔ）、熱変性（熱）、ＤＮアーゼＩ処理（ＤＮａｓｅ）およびプロテイナーゼＫ消化次いでプロテイナーゼＫの熱不活性化（ＰＫ）。
【図９】ＬＰＳで活性化したマクロファージに対する細菌馴化培地の効果を示す。マクロファージはＬＰＳおよび細菌馴化培地の混合物で活性化した。活性化５時間後に培地をＴＮＦ−αについて試験した。アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）４７９６はＭＲＳ＋ＬＰＳのみで活性化したマクロファージに比較してＴＮＦ−α産生を有意に増大させた（ｐ＜０．０１）一方、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ５５１４８は効果を有しなかった。ＬＧＧはＴＮＦ−α産生を有意に低下させた（ｐ＜０．０１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌は培地単独に比較してＴＮＦ−α産生を有意に増大させた。
【図１０】免疫調節がｐＨの影響によらないことを示す。乳酸産生および低下されたｐＨの影響について制御するために、酸性化したＭＲＳ培地（ｐＨ４）を試験し、そしてＬＧＧ−ｃｍの存在を伴わずにＴＮＦ−αレベルに影響しなかった。他の乳酸菌由来の馴化培地はＴＮＦ−α分泌を阻害せず、そして乳酸産生による一般的なｐＨの影響と矛盾しなかった。
【図１１】ＬＴＡで活性化したマクロファージに対するＬＧＧ馴化培地の影響を提供する。マクロファージを黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＥ．フェーカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＬＴＡで活性化した。ＬＧＧ馴化培地は、ＭＲＳ培地単独に比較して、ＬＴＡで活性化したマクロファージにおける炎症前サイトカイン発現を有意に減少させた（ｐ＜０．０１）。
【図１２】免疫調節効果が１０ｋＤＡの画分に保持されることを示す。サイズ排除フィルターを使用してＬＧＧ馴化培地を分画した。培地対照を「ｍｏｃｋ」により示す。ＴＮＦ−α産生の阻害は＜１０ｋＤａの画分で観察された。対照的に＞１０ｋＤａの画分は免疫調節活性を喪失した。発明者からの以前のデータと一緒にすれば、これは、小型ペプチドが免疫調節の原因でありかつ血清を必要としないことを示す。
【図１３】免疫調節がヘテロ三量体のＧタンパク質を利用することを示す。ＰＴｘ処理後に、ＲＡＷ  ２６４．７細胞をＬＰＳ単独で刺激したか、若しくは乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地（ＣＭ）（特定の乳酸菌株（１種若しくは複数）の増殖により馴化した培地）と共培養した。ＴＮＦ阻害効果を発揮する乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）馴化培地の能力は、ＲＡＷ  ２６４．７細胞をＰＴｘで毒性化した場合に部分的に低下した。
【図１４】ＴＮＦ−α／ＩＬ−１０の比がＬＧＧの存在下で低下することを示す。ＬＰＳで活性化したマクロファージのサイトカインレベルを、マウス特異的多サイトカイン抗体ビーズサンドイッチイムノアッセイを使用してＬｕｍｉｎｅｘ  １００機器で測定した。ＬＧＧ−ｃｍ＋ＬＰＳで刺激したマクロファージのＩＬ−１０およびＴＮＦ−αのレベルをＬＰＳ単独に曝露したマクロファージに関して比較した。ＬＧＧ（Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）馴化培地）およびＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２７：Ｂ８由来リポ多糖）。
【図１５】乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株のクラスター図を具体的に説明する。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種は「Ｌ．ｓｐｐ」により示し；ラクトバチルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）は「Ｌ．ｒ．」により示し；イエンセン乳酸杆菌（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を「Ｌ．ｊ．」により示し、そして「野性型」を「Ｗ−ｔ」により示す。右側の欄で、「ｔ」はゲルＤＮＡプロファイル上のＤＮＡフラグメント位置に関して「上」を指しかつ「ｂ」は「下」を指す。
【図１６】乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株のクラスター図を具体的に説明する。略語は図１５でのとおりである。
【図１７】ＴＮＦ−α阻害（「イムノモジュリン」）活性がＧタンパク質Ｇｉ  α  ２の存在を必要とすることを示す。Ｇｉα２欠損マウス（１２９  Ｓｖバックグラウンド）からの固有の腹膜マクロファージをＬＰＳ単独（ＭＲＳ＋ＬＰＳ）若しくはＬＰＳおよび乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来ＣＭ（ＬＧＧ＋ＬＰＳ、ＭＭ７＋ＬＰＳ、ＣＦ４８＋ＬＰＳ）で刺激した。相対的ＴＮＦ−αレベルを定量的ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。ＭＲＳ、ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ培地；ＬＧＧ、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株ＧＧ；ＭＭ７、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＭＭ７；ＣＦ４８、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＣＦ４８。ＷＴ、野性型Ｇｉα２＋／＋マクロファージ；Ｈｅｔｚｙｇ、ヘテロ接合性ノックアウトＧｉα２＋／−マクロファージ；Ｈｏｍｚｙｇ、ホモ接合性ノックアウトＧｉα２−／−マクロファージ。
【配列表】
2006519014.tif 000013
2006519014.tif 000014
2006519014.tif 000015
2006519014.tif 000016
2006519014.tif 000017
2006519014.tif 000018
2006519014.tif 000019
2006519014.tif 000020
【図１】
2006519014.tif 000021
【図２Ａ】
2006519014.tif 000022
【図２Ｂ】
2006519014.tif 000023
【図３】
2006519014.tif 000024
【図４Ａ】
2006519014.tif 000025
【図４Ｂ】
2006519014.tif 000026
【図５Ａ】
2006519014.tif 000027
【図５Ｂ】
2006519014.tif 000028
【図６】
2006519014.tif 000029
【図７】
2006519014.tif 000030
【図８】
2006519014.tif 000031
【図９】
2006519014.tif 000032
【図１０】
2006519014.tif 000033
【図１１】
2006519014.tif 000034
【図１２】
2006519014.tif 000035
【図１３】
2006519014.tif 000036
【図１４】
2006519014.tif 000037
【図１５Ａ】
2006519014.tif 000038
【図１５Ｂ】
2006519014.tif 000039
【図１６Ａ】
2006519014.tif 000040
【図１６Ｂ】
2006519014.tif 000041
【図１７】
2006519014.tif 000042