(57)【要約】本発明は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に結合可能な免疫因子（抗体）、このような抗体を発現する細胞株ならびに、このような抗体を用いて、ｐＤＣ含有組織から形質細胞様樹状細胞を同定、および精製するためのプロセスを提供する。最終的には、本発明は、ｐＤＣ含有サンプルからｐＤＣを同定するための方法を提供し、この方法は、前記サンプルを１２０Ｇ８抗体と接触させて、抗体／ｐＤＣ複合体を形成する工程、およびｐＤＣを同定するために、前記抗体／ｐＤＣ複合体の存在を検出する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合化合物であって、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９５７のもとで寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有する、結合化合物。
【請求項２】
前記結合化合物が、抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項３】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９５７のもとで寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体であって、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９５７のもとで寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項５】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９５７に寄託された、前記ハイブリドーマ細胞株。
【請求項６】
形質細胞様樹状細胞を、該形質細胞様樹状細胞を含むサンプルから精製するための方法であって、該方法は、該サンプルを、請求項１に記載の結合化合物と接触させる工程と、次いで、該結合化合物に結合している該形質細胞様樹状細胞を回収する工程とを包含する、方法。
【請求項７】
前記形質細胞様樹状細胞を、該形質細胞様樹状細胞を含むサンプルから同定するための方法であって、プロセスは、該サンプルを、請求項１に記載の結合化合物と接触させ、抗体／形質細胞様樹状細胞複合体を形成する工程；および該複合体の存在を検出する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に結合可能な免疫因子（抗体）、このような抗体を発現する細胞株ならびに、このような抗体を用いて、ｐＤＣ含有組織から形質細胞様樹状細胞を同定、および精製するためのプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、Ｔ細胞依存性免疫応答を惹起する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）。ヒトにおいて、樹状細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）は、ＤＣサブセットであり、それらのＩｇ分泌形質細胞との超微細構造の類似（Ｇｒｏｕａｒｄｅｔら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１）、それら固有の表面表現型（ＣＤ４＋ＩＬ−３Ｒ＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）（Ｇｒｏｕａｒｄら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１；Ｆａｃｃｈｅｔｔｉら，１９９９，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３５（１）：８８−９；Ｒｅｓら，１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４（８）：２６４７−５７）、およびウイルス刺激または特定のＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に応答して高いレベルのＩＦＮαを産生するそれら能力（Ｓｉｅｇａｌら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４２１）：１８３５−７；Ｋａｄｏｗａｋｉら，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６（４）：２２９１−５）によって特徴付けられ、ウイルス接触に続いて、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞のインビトロでの強力なプライミング、およびＴｈ−１分極を誘導する（Ｃｅｌｌａら，２０００，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １（４）：３０５−１０；Ｋａｄｏｗａｋｉら，２０００，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２（２）：２１９−２６）。ｐＤＣは、Ｔ細胞およびＢ細胞に共通する前駆体に由来すると考えられている（Ｇｒｏｕａｒｄら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６：１１０１−１１１１；Ｒｅｓら，１９９９．Ｂｌｏｏｄ  ９４，８：２６４７−５７；Ｒｅｓら，１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４（８）：２６４７−５７；Ｂｒｕｎｏら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：８７５−８８４；Ｂｅｎｄｒｉｓｓ−Ｖｅｒｍａｒｅら，２００１，ＪＣＩ  １０７：８３５；Ｓｐｉｔｓら，２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１２）：１７７５−８４）。
【０００３】
マウスにおいて、ｐＤＣは、最近、いくつかのグループによってＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０ｈｉＧｒ１ｌｏｗ細胞として同定され、ウイルス刺激に応答して、Ｉ型ＩＦＮを産生することが可能であり、形質細胞様形態を示す（Ｎａｋａｎｏら，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９４（８）：１１７１−８；Ｐａｔｕｒｅｌら，２００１，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（１２）：１１４４−１１５０；Ｂｊｏｒｃｋ，２００１，Ｂｌｏｏｄ  ９８（１３）：３５２０−６）。マウスｐＤＣはまた、ＦＬＴ３Ｌの存在下における骨髄細胞の樹状細胞への分化によって、インビトロで数多く得られ得る。
【０００４】
それらの形態、それらのＩＮＦα産生およびそれらの推定の起源に加えて、ｐＤＣはまた、それらの弱い食作用活性（Ｇｒｏｕａｒｄら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６：１１０１−１１１１）、それらの弱いＩＬ−１２産生能力（Ｒｉｓｓｏａｎら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３−１１８６）、およびそれらの活性化を誘導するシグナル（Ｋａｄｏｗａｋｉら，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６（４）：２２９１−５）において、骨髄性ＤＣと異なる。活性型ｐＤＣの補充は、ナイーブＴ細胞の活性化を通じて免疫を惹起するはずであるが、一方で未成熟ＤＣまたは不活化されたＤＣは、おそらく調節性Ｔ細胞の誘導を通じて、免疫寛容を誘導することが報告されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３９４；Ｂｅｌｌら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１１，Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら，２００１，ＪＥＭ  １９３：Ｆ５；Ｊｏｎｕｌｅｉｔら，２０００，ＪＥＭ  １６２：１２１３）。さらに、ｐＤＣは、ＩＬ−１０分泌Ｔ細胞（Ｒｉｓｓｏａｎら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３；Ｌｉｕら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：５８５）およびＣＤ８調節性Ｔ細胞（Ｇｉｌｌｉｅｔら，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９５（６）：６９５−７０４）を誘導することが示されている。ヒトの天然の（ｎａｔｕｒａｌ）ＩＦＮ産生細胞（ＨｕＩＰＣ）はまた、ウイルス感染細胞を殺傷するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化において、不可欠な役割を果たすことが示されている（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６４（１）：１８０−９５）。さらに、ｐＤＣは、最近、自己免疫疾患（特に、エリテマトーデス）と関連づけられている（Ｆａｒｋａｓら，２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９（１）２３７−４３）。
【０００５】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α、βまたはω）は、ウイルス感染または微生物感染に対する宿主の抵抗の主役である（Ｐｆｅｆｆｅｒら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８（１２）：２４８９−９９；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６９（８）：４７９２−６）。ウイルス感染におけるｐＤＣの重要な役割は、最近、インビボでの、ＭＣＭＶ感染モデルおよびＶＳＶ感染モデルで実証されている（Ｄａｌｏｄら，２００２，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９５（４）：５１７−２８；Ｂａｒｃｈｅｔら，２００２，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９５（４）：５０７−１６）。実際、マウスｐＤＣの非存在下において、ＩＦＮαのレベルは、ＭＣＭＶ感染マウス中で、劇的に減少する。その研究において、ｐＤＣを枯渇させるために用いる抗Ｇｒ１処理はまた、好中球に加えて、おそらくマクロファージの比率と活性型Ｔ細胞の比率とを枯渇させ得た。しかし、これらの細胞すべてがインビトロでＩＦＮ−αを産生するわけではなく、そしてＴリンパ球またはＢリンパ球は、インビボでのＩＮＦ−α産生に必要とされないので、これらのデータは、ＭＩＰＣが、ＭＣＭＶ感染に応答してインビボでＩ型ＩＦＮを産生することが可能な唯一の細胞であること、またはこれらのＩ型ＩＦＮの早期の産生は、他の細胞型からのＩＦＮ産生のカスケードを惹起するために必要であることのどちらかを実証した（Ｄａｌｏｄら，２００２，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９５（４）：５１７−２８頁）。
【０００６】
ヒトにおいて、休止ｐＤＣは、ＢＤＣＡ−２およびＢＤＣＡ−４を特異的に発現することが示されている（Ｄｚｉｏｎｅｋら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１１）：６０３７−４６）。マウスにおいて、そのような特異的マーカーは、現在までに同定されていない。モニタリングのための、マウスｐＤＣに特異的な新規のマーカーを同定し、ｐＤＣを特徴付け、そしてｐＤＣを単離すること、およびインビボの動物モデルにおいてそれらの機能を研究することもまた大きな利益がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、２００３年１月２７日にＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９５７のもとで寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体の結合特性を有する結合化合物を提供することによって、前述の必要性を満たす。好ましい実施形態において、この結合組成物は、抗体または抗体フラグメントである。最も好ましくは、このモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４９５７のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体１２０Ｇ８である。
【０００８】
登録番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９５７を有するハイブリドーマ細胞株もまた、提供される。
【０００９】
本発明はさらに、ｐＤＣ含有サンプルからｐＤＣを精製するための方法を提供し、この方法は、前記サンプルを１２０Ｇ８抗体と接触させる工程、次いで前記抗体に結合したｐＤＣを回収する工程を包含する。
【００１０】
最終的には、本発明は、ｐＤＣ含有サンプルからｐＤＣを同定するための方法を提供し、この方法は、前記サンプルを１２０Ｇ８抗体と接触させて、抗体／ｐＤＣ複合体を形成する工程、およびｐＤＣを同定するために、前記抗体／ｐＤＣ複合体の存在を検出する工程を包含する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、部分的に、マウスにおいて特異的にｐＤＣを認識する抗体の発見に基づく。
【００１２】
ＤＣによる抗原の提示の際のＴ細胞応答の性質は、含まれるＤＣの小集団および提示されるＤＣの成熟のステージに依存する（Ｓｔｅｉｎｍａｎら，２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１（３）：４１１−６）。機能的柔軟性にもかかわらず、ＭＤＣおよびｐＤＣは、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答へのＴ細胞応答の型を分極することが可能であり、それはそれぞれ、ＩＬ−１２を分泌する能力またはその能力を有さないことを通じて行われる（Ｒｉｓｓｏａｎら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３−１１８６）。２つのＤＣサブタイプもまた、獲得免疫応答と先天免疫応答との間の異なった連結を作り出し、ＭＤＣのＢ細胞の活性化（Ｄｕｂｏｉｓら，１９９９，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：２２４−２３０）およびＮＫ細胞の活性化（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５（３）：Ｆ９−１４）の両方と、ウイルスに対する応答における、ｐＤＣの多くの量の天然ＩＦＮの産生（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｊ．，２００１，Ｃｅｌｌ  １０６（３）：２５９−６２）とを伴う。例えば、マウスにおいて休止ｐＤＣと活性型ｐＤＣの両方を認識することが可能な特異的マーカーが欠如していることを考えると、発明者らは、マウスｐＤＣに対するｍＡｂを作製した。
【００１３】
この抗体は、１２０Ｇ８と表され、ハイブリドーマ細胞株によって産生される。このハイブリドーマ細胞株は、２００３年１月２７日にＢｕｄａｐｅｓｔ  ＴｒｅａｔｙのもとにＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９５７として寄託された。１２０Ｇ８  ｍＡｂは、全細胞からｐＤＣを選択的に単離するために用いられ得る。この抗体は、エキソビボの全細胞またはインビトロの骨髄由来ＤＣのいずれかに由来するｐＤＣを染色する。この抗体はまた、マウスにおいて異なる器官起源のｐＤＣ起源だけでなく、異なるマウス系統起源のｐＤＣ起源も認識する。この抗体は、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）研究、組織切片上の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色または免疫組織蛍光（ＩＨＦ）染色において用いられ得る。１２０Ｇ８  ｍＡｂは、休止ｐＤＣと活性型ｐＤＣとの両方を認識するので、インビトロおよびインビボで、活性化に対するｐＤＣ応答を研究することは、最も有用である。最終的には、インビボでの１２０Ｇ８  ｍＡｂ注射は、表現型的かつ機能的に両方で決定されたように、マウスのｐＤＣを枯渇させる。
【００１４】
用語「結合化合物」は、本明細書で用いられるとき、抗体およびｐＤＣに特異的に結合するそれらの機能フラグメントを含み、それらは、本明細書で記載される１２０Ｇ８  ｍＡｂと同じか、または類似するエピトープ特異性を有する。１２０Ｇ８  ｍＡｂと同じか、または類似するエピトープ特異性を有する結合化合物は、ｐＤＣへの結合について１２０Ｇ８  ｍＡｂと競合する、それらの能力によって同定され得る。
【実施例】
【００１５】
本発明は、以下の非限定な実施例を通じて説明され得、以下の材料および方法を参照することによって、より容易に理解され得る。
【００１６】
（マウス、培養培地および抗体）
特異的病原体のないＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、１２９  ＳｖＰａｓ、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ、ＣＢＡ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、ＤＢＡ／２Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃ−ヌード雌性マウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。すべてのマウス実験を、施設の動物委員会によって承認されたプロトコルに従って、ＥＥＣ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９ならびに施設の動物管理使用（ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ）ガイドラインに従って実施した。
【００１７】
初代細胞を、完全なＲＰＭＩ１６４０培地：１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、８０μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０μＭ  β２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ，Ｕ．Ｋ．）中、５％ＣＯ２中で３７℃において増殖させた。ハイブリドーマの高密度の上清を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｔａｌｌｉｎを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において生成した。特定されない限り、１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清（ＨＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。すべての抗体は、特に記されない限り、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。
【００１８】
（組織調製および細胞枯渇）
マウスを、ＣＯ２吸入によって屠殺した。単離した細胞を、手順の全体を通してＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ：５％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＣＳおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。血球を、屠殺後すぐの心臓穿刺により、過剰なＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中に回収した。脾臓、胸腺、リンパ節（膝窩または末梢（プールした鼡径部、腋窩および膝窩））、パイエル板を、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中に押し出し、２５Ｇ針を通した。赤血球を、ＮＨ４Ｃｌ溶液（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）中で、５分間溶解した。骨髄細胞を、冷たいＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡを用いて骨から流し出した。
【００１９】
Ｔ細胞枯渇およびＢ細胞枯渇について、細胞を、抗ＣＤ３分子複合体（１７Ａ２）の混合物と一緒に、３０分間４℃においてインキュベートし、抗ＣＤ８β（５３−５．８）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）または抗赤血球（ＴＥＲ１１９）を、代わりに用いた。細胞とヤギ抗ウサギＩｇＧコートＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）とを、１５分間４℃における持続的な攪拌のもとで混合した。ビーズおよび付着細胞を、Ｄｙｎａｌ  ｍａｇｎｅｔを用いて除いた。
【００２０】
ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＣＤ１１ｃ＋のＭｉｃｒｏｂｅａｄｓおよびＭｉｎｉＭａｃｓ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたポジティブ選択によって精製し、この精製は、全脾臓細胞、全骨髄細胞またはＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ８β、ＴＥＲ１１９枯渇細胞のいずれかから開始した。
【００２１】
ＦＬＴ３ＬにおけるインビトロでのＤＣ由来（ＢＭ−ＤＣ）骨髄について、２４ウェルプレート中に１０６細胞／ｍｌにおいてプレートした単離した骨髄細胞を、９日間、２５ｎｇ／ｍｌの組み換えマウスＦＬＴ３Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）を補充した完全なＲＰＭＩ１６４０倍地においてインキュベートした。培地は、２〜３日ごとに新しくした。
【００２２】
（マウス形質細胞様ＤＣを用いたラットの免疫）
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマウス脾臓細胞を、抗ＣＤ３分子複合体（１７Ａ２）、抗ＣＤ８β（５３−５．８）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＣＤ５（５３−７．３）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、および抗赤血球（ＴＥＲ１１９）を含むラットｍＡｂの混合物と共に３０分間４℃においてインキュベートし、次いで、抗体でコートした細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄを用いて除いた。枯渇細胞を、ラット抗Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（ＲＢ６−８Ｃ５）−フィコエリトリン（ＰＥ）、ハムスター抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３）−ビオチン、およびフルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）標識されたハムスター抗ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）のカクテル、ラット抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＣＤ５（５３−７．３）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、および抗全（ｐａｎ）ＮＫ細胞（ＤＸ５）を用い、３０分間４℃において染色した。次いで、細胞を、ストレプトアビジン−Ｐｅ−Ｃｙ５（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて染色し、ＣＤ１１ｃ＋Ｇｒ１＋ＣＤ３ε−ＣＤ１９−ＣＤ５−ＣＤ１１ｂ−ＤＸ５−細胞（ｐＤＣ）として、ＦＡＣＳｔａｒ  ｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いてソートした。ソートした細胞を、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ，Ｕ．Ｋ．）中で３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、注射時まで−２０℃において凍結した。
【００２３】
１匹のＬＯＵ雌性ラット（Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ）（４週齢）を、ソートしたｐＤＣで免疫した。そのプロトコルは、以下の通りであった：
０日目：完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）中１０６細胞の腹腔内注射（ｉｐ）
１４日目：不完全なＦｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）中１０６細胞のｉｐ注射
２１日目：ＰＢＳ中１０６細胞のｉｐ注射
３５日目：ＰＢＳ中２．１０６細胞の静脈内（ｉｖ）注射
３８日目：ラットを屠殺し、脾臓を回収した。
脾臓細胞を、ポリエチレングリコール−１０００（Ｓｉｇｍａ）を用いて、マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２Ｏと融合させた。ハイブッリド細胞を、９６ウェルプレートにプレートし、１０％ＨＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ、１％培養培地添加物（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｄｄｉｔｉｖｅ）（ＣＲＴＳ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、１０−５Ｍ  アザセリン（Ｓｉｇｍａ）および５×１０−５Ｍ  ヒポキサンチンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２を与えた。上清を、エキソビボでの単離脾臓細胞、骨髄および脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞との反応性について、スクリーニングした。選択したハイブリドーマを、限界希釈によりクローン化した。
【００２４】
ｍＡｂ  １２０Ｇ８を、無血清の高密度上清から、Ｈｉｌｏａｄ  Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上での陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、標準的手順を用いてＡｌｅｘａ４８８およびビオチンと結合させた。Ｂａｌｂ／ｃ−ヌードマウス（Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ）において、腹水を生成した。Ｉｇアイソタイプを、ラットＩｇサブタイピング（ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＥＬＩＳＡにより決定した。
【００２５】
（ＦＡＣＳ分析）
すべてのＦＡＣＳ分析について、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中で維持された細胞を、第一に、抗ＣＤ１６／３２未標識のラットＡｂと共に１５分間インキュベートし、Ｆｃレセプターのブロッキングを確実にし、次いで、指示されたＡｂと共に３０分間４℃において染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて分析した。ネガティブコントロールを、ラットＩｇまたはハムスターＩｇと適合したアイソタイプで実行した。ＰｅｒＣｐＣｙ５．５染色を用いない場合、自己蛍光（ａｕｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）細胞を、ＦＬ３チャネルを用いてゲートアウト（ｇａｔｅ  ｏｕｔ）した。
【００２６】
１２０Ｇ８＋細胞の表面表現型について、単離した細胞を、Ａｌｅｘａ−４８８標識した１２０Ｇ８、ＰＥ標識した抗体（抗ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＤＸ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ１，ＲＢ６−８Ｃ５）、ＣＤ１１ｂ、Ｉ−Ａｄ、Ｈ２−Ｋｄ）およびＡＰＣ標識したハムスター抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３）を用いて染色した。ＦＬＴ３Ｌ中の培養物の指示された日におけるＢＭ−ＤＣの染色のために、１２０Ｇ８  Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ、抗ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣｐＣｙ５．５および抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−ＡＰＣを用いて、細胞を染色した。異なる器官における１２０Ｇ８＋細胞および１２０Ｇ８−ＣＤ１１ｃ＋細胞の表面表現型について、１２０Ｇ８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−ＰＥ、抗Ｌｙ６Ｃ−ビオチンおよび抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣを用いて、単離した細胞を染色した。ビオチン標識した抗Ｌｙ６Ｃを、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて曝露した。
【００２７】
マウス器官におけるＤＣサブセット細胞頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の分析について、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中で維持した脾臓細胞を、ラット１２０Ｇ８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＤ１９と抗ＣＤ３ε−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５との両方、抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣならびに抗ＣＤ８α−ＰＥまたは抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥを用いて染色した。ＣＤ１９＋細胞／ＣＤ３ε＋細胞を、分析のためにＦＬ３チャネルを用いてゲートアウトした。結果を、全脾臓細胞中の指示された細胞サブセットの頻度として示す。
【００２８】
（細胞活性化およびサイトカイン産生）
細胞活性化について、指示された細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０倍地中（ソートしていない細胞について１０６細胞／ｍｌ、およびソートした細胞について０．５×１０６細胞／ｍｌ）で、指示された刺激の非存在下または存在下において、培養した。ホルムアルデヒドで不活化したヒトインフルエンザウイルス（ＮＫ／ＴＭ／１３８／００株（Ｎ．Ｋｕｅｈｎ，Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｖａｌ  ｄｅ  Ｒｅｕｉｌ，Ｆｒａｎｃｅにより、親切に提供された））を培養物に加え、１ｍｌあたり１００血球凝集素単位（ＨＡＵ）の最終濃度とした。特に特定されない限り、ホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ（ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＧＧＣ  Ｇ）（配列番号１）を、ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、１０μｇ／ｍｌの最終濃度において用いた。組み換えマウスＩＦＮ−α（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、指示された最終濃度において用いた。組み換えマウスＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ）を、２ｎｇ／ｍｌの最終濃度において用いた。
【００２９】
１２０Ｇ８＋細胞によるサイトカイン産生について、脾臓細胞を、３０分間４℃において、抗ＣＤ３分子複合体、抗ＣＤ８β、抗ＣＤ１９および抗赤血球（ＴＥＲ１１９）を含むｍＡｂの混合物と共にインキュベートし、次いで抗体でコートした細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄを用いて除いた。枯渇細胞を、ラット１２０Ｇ８−Ａｌｅｘａ４８８、ハムスター抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３）−フィコエリトリン（ＰＥ）を用いて、３０分間４℃において染色した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ  ｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてソートし、洗浄し、指示された刺激薬と共に２０〜２４時間、９６ウェル培養プレート中にプレートした。上清を２０〜２４時間において回収し、特異的ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２（ｐ４０またはｐ７０）（それぞれ、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪおよびＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）についてアッセイするまで−２０℃に保管した。
【００３０】
細胞活性化後の１２０Ｇ８発現について、単離した細胞を、指示された刺激薬と共に２０〜２４時間インキュベートした。次いで、刺激した細胞を、ＣＤ１１ｃ＋活性型細胞について、１２０Ｇ８−Ａｌｅｘａ４８８、抗ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣｐＣｙ５．５および抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−ＰＥ、または全脾臓細胞について、１２０Ｇ８−Ａｌｅｘａ４８８およびＰＥに結合した指示されたｍＡｂを用いて染色した。後者の実験のために、指示された細胞を、ＦＬ２チャネルを用いてゲートイン（ｇａｔｅ  ｉｎ）した。
【００３１】
（組織切片上の１２０Ｇ８の免疫染色）
脾臓を、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ）中に包埋し、液体窒素中に急凍結（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）し、そしてさらなる分析まで−８０℃において保管した。厚さ８μｍの凍結切片を、８０％アセトン（Ｓｉｇｍａ）中で−２０℃において２０分間固定し、室温において乾燥させ、染色するまで凍結保管した。切片を、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で再水和した。アビジン／ビオチンおよびペルオキシダーゼの組織含有量を、それぞれ特異的キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および０．３％のＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）を用いて中和した。切片を、２％正常マウス血清（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いてブロッキングし、室温において染色を実施した。種々のマウス組織におけるインサイチュの１２０Ｇ８＋細胞の分布のために、切片を、標識されていない１２０Ｇ８  Ａｂで６０分間、ビオチンに結合するヤギ抗ラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で６０分間、ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）に結合した余分なアビジン（Ｓｉｇｍａ）で３０分間、連続的に染色し、ペルオキシダーゼ基質（ＡＥＣ，Ｓｉｇｍａ）を用いて曝露した。ヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、対比染色を行った。免疫組織蛍光分析のために、切片を、未標識の１２０Ｇ８  Ａｂで６０分間、Ａｌｅｘａ４８８に結合したヤギ抗ラット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で６０分間、２％ラット血清、ビオチンおよびストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合した指示されたＡｂで、連続的に染色した。
【００３２】
（インビボでの処理）
ＣｐＧ処理について、マウス１匹につき、３０μｌの陽イオン性リポソーム調製（ＤＯＴＡＰ，Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、麻酔したマウスの後方の眼窩静脈への注射の前に、ポリスチレンチューブ中で１０分間、１７０μｌ  ＰＢＳ中５μｇのＣｐＧ  ＯＤＮと混合した。ＣｐＧ注射の６時間後、脾臓を回収し、免疫染色のために調製した。
【００３３】
インビボでの１２０Ｇ８＋細胞の枯渇について、最適な量の１２０Ｇ８腹水をマウスにｉ．ｐ．注射した。ｐＤＣ枯渇のＦＡＣＳ分析のために、１２０Ｇ８注射の２４時間後に脾臓を単離し、抗Ｌｙ６Ｃ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−ＰＥ、抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣおよび抗ＣＤ１９−ＰｅｒＣｐＣｙ５．５または抗ＣＤ３ε−ＰｅｒＣｐＣｙ５．５を用いて染色した。ＣｐＧ処理後のインビボでのサイトカイン産生に対する、１２０Ｇ８＋細胞の寄与を評価する実験のために、マウスに、１日目およびＣｐＧ処理の時点において、１２０Ｇ８腹水をｉ．ｐ．注射した。ＣｐＧ注射の６時間後に、屠殺後すぐの心臓穿刺によって、血液を回収した。３０分間３７℃における凝集および遠心分離によって、血清を全血から調製し、サイトカイン含有量についてアッセイされるまで、血清を凍結した。脾臓細胞を単離し、フローサイトメトリーによって枯渇の効率を評価した。
【００３４】
（実施例１）
（マウスｐＤＣに対して反応性のモノクローナル抗体１２０Ｇ８の選択）
２４００のハイブリドーマからの上清を、総マウス脾臓細胞の調製物の５％未満の細胞を用いて、反応性についてスクリーニングし、さらに、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＴＥＲ１１９＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞を枯渇した脾臓に対する反応性についてスクリーニングした。融合から生じた２５プレートのうちの５つの９６ウェルプレートを、−８０℃において１０％ＤＭＳＯを補充したＨＳ中で凍結した。これら５プレートのうち２つは、凍結せず、上に記載された通りの完全ＤＭＥＭ  Ｆ１２で培養し、そして上清を、総脾臓細胞上（５％未満）のＦＡＣＳ染色によって、二度目のスクリーニングをした。選択された上清を、骨髄と脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞との両方に対する反応性についてアッセイした。１つのハイブリドーマ（１２０Ｇ８と名付けた）からの上清は、骨髄ＣＤ１１ｃ＋細胞（６０〜７０％）の主要なサブセットと、脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞の微量なＣＤ１１クロー（ｃｌｏｗ）サブセット（１０〜２０％）とのみ反応することが、見出された。このハイブリドーマを、限界希釈によってクローン化した。この結果得られたクローンを、一度、親株と類似した反応性について選択し、さらに限界希釈によってクローニングした。そしてマウスＣＤ１１ｃ＋細胞に関する最も高い反応性、すなわちＡｂを産生する最も高い能力について、選択した（クローン６）。
【００３５】
この抗体を、腹水中の親クローンと高密度上清中のクローン６との両方から、作製した。ＭＡｂ  １２０Ｇ８は、ＥＬＩＳＡによって決定する場合、ＩｇＧ１／κアイソタイプであると見出した。脾臓における１２０Ｇ８細胞は、特に当該のものと思われるＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋Ｇｒ１＋細胞（以前はマウスｐＤＣとして定義された）であるようだが、さらなる研究のためにｍＡｂ  １２０Ｇ８を選択した。
【００３６】
（実施例２）
（１２０Ｇ８  ｍＡｂは、マウスＩＦＮ−α産生細胞［ｐＤＣ］と高度に反応性である）
１２０Ｇ８  ｍＡｂの反応性を、無刺激の脾臓細胞に関してさらに試験した。この試験は、Ａｌｅｘａ  ４８８および系統特異的マーカーに結合した１２０Ｇ８を用いる二重の免疫蛍光研究を使用した。１２０Ｇ８  Ａｂは、前方の散乱および側面の散乱において均質な、小さなサブセットの新しく単離された脾臓細胞を染色した。このサブセットは、ＴＥＲ１１９（赤血球系統マーカー）、ＣＤ１９（Ｂ細胞系統マーカー）、ＣＤ３ε（Ｔ細胞系統マーカー）およびＤＸ５（Ｎｋ細胞系統マーカー）を発現していなかった。すべての１２０Ｇ８＋細胞はまた、ＣＤ１１ｃｌｏｗであり、このＡｂが脾臓ＤＣのサブセットを染色したことを確認した。これらの結果は、少なくとも３つの実験の代表値である。
【００３７】
次に、１２０Ｇ８  ｍＡｂのＩＦＮ−α産生細胞（ＩＰＣ）を特異的に認識する能力を、インビトロで試験した。ＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞は、インビトロにおいてのインフルエンザウイルスに応答して多くの量のＩＦＮαを産生する唯一の細胞であることが、すでに実証されている（Ｐａｔｕｒｅｌら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１）。ＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８＋およびＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８−細胞を、フローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ８β＋ＴＥＲ１１９＋細胞を枯渇した脾臓細胞から精製した。この２つのサブセットを、上記のように、インビトロで不活化インフルエンザウイルスまたはＣｐＧによって刺激した。実験を３回実施し、同様の結果を得た。培地のみでインキュベートされた、両方のソートした集団に由来するＩＦＮ−α産生およびＩＬ−１２ｐ４０産生は、ＥＬＩＳＡ検出レベルを下回った。ＣＤ１１ｃ＋細胞の１２０Ｇ８＋サブセットのみが、インフルエンザウイルス刺激とＣｐＧ刺激との両方の後に、ＩＦＮ−αを産生した。インフルエンザウイルスとＣｐＧとの両方に対する応答における、１２０Ｇ８−ソート細胞によるＩＦＮ−α産生は、非常に低いか、または、検出レベルを下回った。１２０Ｇ８＋細胞はまた両方の刺激に対する反応において、ＩＬ−１２ｐ４０を産生することが可能であったが、ＣｐＧ刺激については、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＤＣを含むサブセットである１２０Ｇ８−細胞よりも低いレベルであった。このことは、ＣＤ８α＋ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＤＣが、種々の刺激に応答して、多くの量のＩＬ−１２を産生することが可能であることを示す前のデータと一致している。
【００３８】
（実施例３）
（１２０Ｇ８＋ＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞の表面表現型）
マウスｐＤＣは、脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋Ｇｒ１＋Ｂ２２０＋細胞（Ｐａｔｕｒｅｌ，２００１，Ｎａｇａｎｏ，２００１，Ｂｊｏｒｃｋ，２００１）およびインビトロで骨髄細胞から誘導したＤＣにおけるＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ−細胞であることが、以前に記載されている。１２０Ｇ８−ＣＤ１１ｃ＋ＤＣと比較して、１２０Ｇ８＋細胞の表面表現型を研究するために、エキソビボで単離したＣＤ１１ｃ＋およびＦＬＴ３Ｌ中でインビトロで誘導したＤＣを、１２０Ｇ８、ＣＤ１１ｃおよびＰＥに結合するいくつかのＡｂを用いて染色した。エキソビボで単離した脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞を分析する場合、１２０Ｇ８＋細胞は、Ｂ２２０ｈｉｇｈ、Ｇｒ１ｌｏｗ、Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ８αｎｅｇ／ｌｏｗ、ＩＡｄ  ｌｏｗおよびＨ−２Ｋｄ＋であり、他方では、ＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８−細胞は、Ｂ２２０ｎｅｇ／ｌｏｗ、Ｇｒ１−、Ｌｙ６Ｃｎｅｇ／ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋／−、ＣＤ８αｎｅｇ／ｈｉ、ＩＡｄ  ｌｏｗ／ｈｉｇｈおよびＨ−２Ｋｄ＋であった。１２０８Ｇ８の表現型は、以前に記載されたマウスｐＤＣの表面表現型と適合する。さらに、１２０Ｇ８はまた、以前に同定されたＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋マウスｐＤＣであって、インビトロでＦＬＴ３Ｌ中で刺激した骨髄細胞培養物（ＢＭ−ＤＣ）において誘導したｐＤＣを染色した。ＢＭ−ＤＣを分析する場合、１２０Ｇ８＋細胞は、Ｂ２２０ｈｉｇｈ、Ｇｒ１ｎｅｇ／ｌｏｗ、Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｂ−であり、他方では、１２０Ｇ８−細胞は、Ｂ２２０ｎｅｇ／ｌｏｗ、Ｇｒ１−、Ｌｙ６Ｃｎｅｇ、ＣＤ１１ｂ＋であった。
【００３９】
従って、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、マウス脾臓ｐＤＣとインビトロで誘導したｐＤＣとの両方を染色する。
【００４０】
（実施例４）
（１２０Ｇ８は、マウスｐＤＣ分化の早期のマーカーである）
ＢＭ−ＤＣ（ＦＬＴ３Ｌ）上の１２０Ｇ８  ｍＡｂ染色を、６日目から１０日目の間のインビトロでのｐＤＣ分化について研究した。細胞を、１２０Ｇ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＢ２２０を用いて染色した。１２０Ｇ８  ｍＡｂは、６日目から１０日目のＣＤ１１ｃ−細胞を染色しなかった。しかし、すべての１２０Ｇ８＋細胞は、早くも培養の６日後に、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ−Ｂ２２０＋細胞であった。Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８−のサブセットをまた検出し得、これはＣＤ１１ｂ＋であって、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性ＤＣに由来する可能性が最も高かった。６日目（７０％）から８日目（９０％）に、ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージが増加したし、そして１０日目までは一定なままであったが、ＣＤ１１ｃ＋細胞のうちの１２０Ｇ８＋細胞のパーセンテージは、６日目（２３％）から８日目（３８％）までゆっくりと増加し、そして、その後急速に減少した（１０日目における４％）。これらの結果は、１２０Ｇ８  ｍＡｂが、インビトロでの分化の間のマウスｐＤＣの早期のマーカーであることを実証する。
【００４１】
（実施例５）
（種々のリンパ系器官における１２０Ｇ８＋細胞の表面表現型）
１２０Ｇ８  ｍＡｂの染色を、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓、骨髄、血液、胸腺、末梢リンパ節および腸間膜リンパ節において研究した。単離した細胞を、１２０Ｇ８  Ａｂ、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０  Ａｂ、抗Ｌｙ６Ｃ  Ａｂおよび抗ＣＤ１１ｃ  Ａｂを用いた四重の表面染色において分析した。ＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８＋細胞およびＣＤｌｌｃ＋１２０Ｇ８−細胞におけるＬｙ６Ｃ発現およびＢ２２０発現を、研究した。試験したすべての器官および血液において、ＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８＋は、すべてＢ２２０ｈｉｇｈＬｙ６Ｃｈｉｇｈであった。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋１２０Ｇ８−は、Ｂ２２０ｈｉｇｈＬｙ６Ｃｈｉｇｈではなかった。このことは、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、それらがどの組織から単離したかにもかかわらず、マウスｐＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０ｈｉｇｈＬｙ６Ｃｈｉｇｈ）細胞を認識し得ることを実証する。
【００４２】
（実施例６）
（異なるマウス系統における１２０Ｇ８＋細胞の頻度）
１２０Ｇ８  ｍＡｂの異なるマウス系統に由来するｐＤＣと反応する能力を、さらに研究した。１２０Ｇ８  ｍＡｂは、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス、１２９  ＳｖＰａｓマウス、Ｃ５７ＢＩ／６Ｊマウス、ＣＢＡ／Ｊマウス、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスおよびＤＢＡ／２Ｊマウスから単離された脾臓ｐＤＣと反応した。これら６種の異なるマウス系統に由来する総脾臓細胞のうちの１２０Ｇ８＋ＤＣサブセットの頻度を、さらに研究した。同じ週齢のマウスから脾臓細胞を単離し（マウス系統につき、３匹のマウスで、実験は２回行った）、１２０Ｇ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９およびＣＤ３εを用いて染色した。分析のために、ＣＤ１９／ＣＤ３ε＋細胞を、ゲートアウトした。総脾臓細胞のうちのｐＤＣ頻度の分析は、どのマウス系統が企図されているかに依存して異なることを示した。例えば、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスは、最も低い脾臓ｐＤＣ頻度（総脾臓細胞の０．６％  ＋／−０．０６）を示し、１２９Ｓｖマウスは、最も高い頻度（総脾臓細胞の１．９４％  ＋／−０．３７）を示した。
【００４３】
（実施例７）
（組織切片上の１２０Ｇ８の免疫組織化学染色）
１２０Ｇ８＋細胞のインサイチュでの分布を、胸腺、脾臓、パイエル板、末梢リンパ節、腸間膜リンパ節の免疫組織化学によって試験した。すべてのこれらの器官において、１２０Ｇ８＋の個々の細胞を、検出し得た。いくつかの器官（例えば、胸腺）において、内皮細胞上のいくらかの低い染色を、検出し得た。腸絨毛上のいくらかの低い染色もまた、検出した。
【００４４】
（実施例８）
（１２０Ｇ８は、インビトロでの活性化の後にマウスｐＤＣ上に維持される）
ＢＤＣＡ２、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ４は、ヒトにおいてｐＤＣを検出するために一般的に用いられる、３つのマーカーである。しかし、活性型ヒトｐＤＣは、インビトロで、非常に急速にこれらのマーカーをダウンレギュレートすることが公知である。従って、活性型ｐＤＣをインサイチュで検出することは、現在まで非常に困難であった。マウスにおいてｐＤＣ（休止または活性型）は、一般に抗ＣＤ１１ｃおよび抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０を用いた二重染色によって検出されるが、この組み合わせは、他の細胞（例えば、Ｂ細胞）を染色する。休止ｐＤＣおよび活性型ｐＤＣに対する１２０Ｇ８染色を評価するために、ＭＡＣＳ精製した１２９Ｓｖマウス由来のＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞を、インビトロで２０時間、不活化インフルエンザウイルスおよびＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８（ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ）（配列番号２）と一緒にか、またはそれらなしでインキュベートした。１２０Ｇ８  ｍＡｂ染色の平均蛍光強度は、試験したすべての条件において小さなＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ−サブセット（ｐＤＣ）に対して、一定なままであった。いくらかのＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０ｈｉｇｈ１２０Ｇ８−を、インフルエンザウイルス刺激およびＣｐＧ刺激の後に検出したが、これらの細胞はまた、ＣＤ１１ｂを発現した。このことは、いくらかの骨髄性ＤＣは、Ｂ２２０をアップレギュレートし得るが、１２０Ｇ８をアップレギュレートし得ないことを示唆し、さらに、ｐＤＣに対する１２０Ｇ８染色の特異性を確認した。
【００４５】
１２０Ｇ８  ｍＡｂはまた、インビボで活性型ｐＤＣを染色し得ることをさらに確認するため、方法において記載したとおりにＣｐＧを用いて、１２９Ｓｖマウスを処理した。ＣｐＧ注射の６時間後に、脾臓細胞を単離し、ＤＣ上に発現する活性マーカーを、ＤＣサブセットに対して研究した。１２０Ｇ８＋細胞は、インビボでのＣｐＧでの刺激の後に、アップレギュレートされたＤＣ活性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８６）であり、そしてより低い程度でＣＤ８αならびにＭＨＣクラスＩＩ分子であった。これらの細胞は、コントロールマウスおよびＣｐＧ処理マウスにおいて同じレベルのＣＤ１１ｃ（ｌｏｗ）およびＣＤ１１ｂ（ネガティブ）を示し、そしてｐＤＣにおける１２０Ｇ８染色の平均蛍光強度は、一定のままであった。従って、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、インビトロとインビボとの両方において、休止ｐＤＣおよび活性型ｐＤＣを認識する。
【００４６】
（実施例９）
（正常マウスおよびＣｐＧ活性化マウス由来の脾臓における１２０Ｇ８＋細胞の局在）
いくつかの研究は、ヒトｐＤＣがＴ細胞帯（ｚｏｎｅ）に局在することを示しているが、ＨＳＶ感染に応答してＩＦＮαを産生する細胞は、マウスにおいては脾臓辺縁帯に位置している（Ｅｌｏｒａｎｔａ，Ａｌｍ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９）。実施例７において提示されるように、免疫組織化学染色研究は、正常マウスにおける脾臓ｐＤＣが、Ｔ細胞帯に位置したことを示唆した。１２０Ｇ８  ｍＡｂは、インサイチュで休止ｐＤＣと活性型ｐＤＣとの両方を染色する唯一のツールと思われるので、本発明者らは、脾臓におけるマウスｐＤＣ局在を追跡するために、１２９Ｓｖマウスを、方法において記載のとおりＣｐＧで処理した。この研究を、免疫蛍光によってインサイチュ分析において実行した。これには、ＣｐＧ処理の６時間後の、緑色蛍光（Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素）中の１２０Ｇ８＋細胞、および赤色蛍光（抗ＣＤ３ε  ｍＡｂ、抗ＣＤ１９  ｍＡｂ、抗ＣＤ１１ｃ  ｍＡｂ（Ｎ４１８クローン）および抗ＣＤ１１ｂ  ｍＡｂと一緒の、Ａｌｅｘａ５９４蛍光色素）中のＴ、Ｂ、ＤＣまたはマクロファージの、脾臓中での共染色を用いた。１２０Ｇ８＋細胞は、ｐＤＣによるＣＤ１１ｃの低い発現のために、本発明者らの実験条件において、ＣＤ１１ｃによって染色され得なかったことは注意すべきことである。従って、インサイチュでのＣＤ１１ｃ染色によって、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈのみを検出した。１２０Ｇ８を用いたＣＤ１９、ＣＤ３またはＣＤ１１ｂの共染色について、連続切片を分析した。安静時の動物において、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、Ｔ細胞帯（ＣＤ３ε染色）と辺縁帯（ＣＤ１１ｂ染色）との両方に由来する細胞を染色した。１２０Ｇ８＋細胞は、Ｂ細胞帯（ＣＤ１９染色）には見出され得なかった。ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ細胞（ＣＤ１１ｃ染色）を、赤脾髄とＴ細胞帯との間のブリッジング（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）チャネルにおいて検出したが、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ細胞は、ｐＤＣと同様の分布のパターンは示さなかった。
【００４７】
ＣｐＧ活性化した脾臓において、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、辺縁帯由来の細胞を染色する。Ｂ細胞帯またはＴ細胞帯において、１２０Ｇ８＋細胞は、全く検出されないか、もしくはほとんど検出され得なかった。対照的に、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ細胞の大量流入を、Ｔ細胞帯において検出し得た。
【００４８】
従って、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、活性化に応答するｐＤＣの移動を直接的にインサイチュで追跡するために、使用し得る。
【００４９】
（実施例１０）
（インビボでの１２０Ｇ８細胞の枯渇は、ＩＦＮ−α産生を抑止する）
以前の研究において、ウイルス感染におけるｐＤＣの役割は、これらの細胞を抗Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ１）処理を用いて枯渇することによって、実証されている。ｐＤＣおよび好中球に加え、この処理はまた、おそらくマクロファージの比率と活性型Ｔ細胞の比率とを枯渇させる。従って、特異的にｐＤＣを枯渇させるための１２０Ｇ８の使用は、インビボ研究のために非常に有用であり得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１２０Ｇ８  ｍＡｂをｉ．ｐ．注射するか、または注射せず、２４時間後に、脾臓細胞におけるＬｙ６Ｃ＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋頻度ならびに、ＣＤ１９またはＣＤ３ε混入細胞のレベルのＦＡＣＳ分析のために、１２０Ｇ８未処理マウスおよび１２０Ｇ８処理マウス（１群につき３匹）の両方において脾臓細胞を単離した。１２０Ｇ８  Ａｂを用いたインビボの処理は、脾臓Ｌｙ６Ｃ＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度を減少させた。さらに、残りのＬｙ６Ｃ＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋細胞は、すべてｐＤＣというわけではなかった。それは、それらが、ＣＤ３εを発現し（４２％）、そしてより低い程度でＣＤ１９を発現した（１８％）からである。
【００５０】
ＩＦＮα産生に対する１２０Ｇ８枯渇の効果を評価するために、セリック（ｓｅｒｉｃ）ＩＦＮαおよびＩＬ１２産生を、１２９Ｓｖマウス（１群につき３匹）におけるＣｐＧ処理の６時間後にアッセイした。それらのマウスは、予め１２０Ｇ８＋細胞を枯渇していたか、または枯渇していなかった。コントロールのマウス血清（ＤＯＴＡＰ単独）は、両方のサイトカインについてネガティブであった。１２０Ｇ８処理は、ＣｐＧ処理（正常マウスについて、１３３００ｐｇ／ｍｌ＋／−１５００、１２０Ｇ８処理マウスについて、１５０ｐｇ／ｍｌ未満）によって誘導されるＩＦＮα産生を、完全に消滅させた一方、ｐ４０とｐ７０との両方でＩＬ１２産生の小規模な阻害をもたらす（ＩＬ−１２ｐ７０：正常マウスについて、１２４０ｐｇ／ｍｌ＋／−５４０、１２０Ｇ８処理マウスについて、３００ｐｇ／ｍｌ＋／−７４；ＩＬ−１２ｐ４０：正常マウスについて、５８０６ｐｇ／ｍｌ＋／−１１３５、１２０Ｇ８処理マウスについて、４２５０ｐｇ／ｍｌ＋／−１１７０）。従って、１２０Ｇ８  ｍＡｂは、インビボでマウスからＩＦＮα産生細胞を枯渇させるために、使用し得る。
【００５１】
（実施例１１）
（ＩＦＮαの存在下で、Ｂ細胞において、１２０Ｇ８発現は、アップレギュレートされる）
１２０Ｇ８  ｍＡｂは、正常マウスから単離された全休止細胞のなかで、ｐＤＣのみを染色する。本発明者らは、いくらかの他の細胞もまた、サイトカイン活性化の後に、１２０Ｇ８によって染色され得るかどうかを調査した。Ｂａｌｂ／ｃマウスから脾臓細胞を単離し、２４時間、サイトカインの存在下においてインキュベートした。次いで、これらの細胞に対して、１２０Ｇ８と抗ＣＤ１９  ｍＡｂ、ＣＤ４  ｍＡｂ、ＣＤ８β  ｍＡｂまたはＣＤ１１ｃ  ｍＡｂとを用いた二重染色を分析した。自己蛍光細胞を、ＦＬ３チャネルを用いてゲートアウトした。このことは、１２０Ｇ８  ｍＡｂによって認識される抗原は、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αに応答してＢ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上でアップレギュレートされたが、Ｔ  ＣＤ４＋ＤＣまたはＴ  ＣＤ８＋ＤＣ上ではアップレギュレートされなかったことを示した。このアップレギュレーションは、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２またはＴＮＦαに対する応答においては観察されなかった。しかし、Ｂ細胞上の１２０Ｇ８染色の平均蛍光強度は、依然として、ｐＤＣよりも少なくとも１ログ低いままであった。
【００５２】
当業者に明らかであるように、本発明の多くの改変およびバリエーションは、その精神および範囲から逸脱することなく成され得る。本明細書に記載される特定の実施形態は、一例として提供され、本発明は、添付された特許請求の範囲の項目（このような特許請求の範囲が権利を与えられるものに対する等価物のすべての範囲を伴う）によってのみ限定される。
【配列表】
2006517963.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月15日(2005.8.15)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006517963000001.app
【国際調査報告】
2006517963.tif 000003
2006517963.tif 000004