(57)【要約】本発明は、生物学的活性を保ったまま、免疫グロブリン半抗体を免疫グロブリンの完全な抗体から確実かつ制御可能に分離する方法、ならびに精製された免疫グロブリン半抗体調製物および精製された免疫グロブリンの完全な抗体の調製物に関する。解離された半抗体は、クロマトグラフィーによって完全な抗体から分離できる。ＩｇＧ分子には４つの既知のサブクラス：ＩｇＧ１；ＩｇＧ２；ＩｇＧ３；およびＩｇＧ４が存在する。ＩｇＧ４分子は、２つの重鎖サブユニットを結合させるジスルフィド結合が必ずしも形成されない点で他のＩｇＧアイソタイプと異なる。重鎖サブユニットをまとまらせる非共有相互作用が原因で、ＩｇＧ４分子の不均一性は、精製されたＩｇＧ４タンパク質のゲル濾過後に明らかでない。しかし、精製されたＩｇＧ４タンパク質を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって非還元条件下で分離する場合、２つの異なるタンパク質種−完全な抗体および「半抗体」を同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ半抗体を、該ＩｇＧ半抗体と同一のアイソタイプの完全なＩｇＧ抗体から分離する方法であって：
ＩｇＧ半抗体および該ＩｇＧ半抗体と同一のアイソタイプの完全なＩｇＧ抗体の混合物を含む試料を得る；
前記半抗体が互いに解離するように前記試料のｐＨを低下させて、溶液を形成する；および
前記溶液を、前記ＩｇＧ半抗体と前記完全なＩｇＧ抗体の移動度を差別化して遅らせるカラムに装填する；工程を含む方法。
【請求項２】
前記カラムが、前記溶液中に存在するＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体の両方を保持することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記カラムがイオン交換カラムであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記イオン交換カラムが陽イオン交換カラムであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記カラムを、該カラムに保持されたＩｇＧ半抗体を選択的に溶出する条件にさらす工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記カラムに保持されたＩｇＧ半抗体を選択的に溶出する条件が、カラム内に存在する緩衝液のｐＨがＩｇＧ半抗体を選択的に溶出させるのに十分なレベルまで上昇するように緩衝液をカラムに加えることを含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約７．０以上に上昇させることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記カラムを、該カラムに保持された完全なＩｇＧ抗体を溶出する条件にさらす工程をさらに含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記完全なＩｇＧ抗体を溶出する条件が、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が完全なＩｇＧ抗体を溶出させるのに十分なレベルまで上昇するように緩衝液をカラムに加えることを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体がＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３アイソタイプであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体が、哺乳類ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体が、ヒトＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体が、キメラＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体が、Ｆ（ａｂ）２半抗体およびＦ（ａｂ）２の完全な抗体であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、乳から得られることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記乳が、哺乳類に由来することを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記乳が、有蹄類、ブタ、ウサギ、またはマウスに由来することを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、卵から得られることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、血清から得られることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が、細胞培地から得られることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
請求項１記載の方法によって得られた精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項２３】
抗体がＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする請求項２２の精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項２４】
半抗体が調製物中の抗体総量の少なくとも９０％を占めることを特徴とする請求項２２の精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項２５】
半抗体が調製物中の抗体の総量の少なくとも９５％を占めることを特徴とする請求項２４の精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項２６】
半抗体が調製物中の抗体の総量の少なくとも９９％を占めることを特徴とする請求項２５の精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項２７】
請求項１記載の方法によって処理される前の試料と比較して、完全な抗体が調製物中の総抗体のより大きな部分を占めることを特徴とする、請求項１記載の方法によって得られた精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項２８】
抗体がＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする、請求項２７記載の精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項２９】
完全な抗体が調製物中の総抗体の少なくとも８０％を占めることを特徴とする、請求項２７記載の精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項３０】
完全な抗体が調製物中の総抗体の少なくとも９０％を占めることを特徴とする、請求項２９記載の精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項３１】
ＩｇＧ半抗体を、該ＩｇＧ半抗体と同一のアイソタイプの完全なＩｇＧ抗体から分離する方法であって：
ＩｇＧ半抗体および該ＩｇＧ半抗体と同一のアイソタイプの完全なＩｇＧ抗体の混合物を含む試料を得る；
前記半抗体が互いに解離するように前記試料のｐＨを低下させて、溶液を形成する； 
前記溶液を、ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体の両方がカラムに保持されるようにイオン交換カラムに装填する；
前記カラム内に存在する緩衝液のｐＨがＩｇＧ半抗体を選択的に溶出させるのに十分なレベルまで上昇するように緩衝液をカラムに加える；および
次に、完全なＩｇＧ抗体を溶出させるのに十分な量で、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が上昇するように緩衝液をカラムに加える；工程を含む方法。
【請求項３２】
前記試料が乳から得られることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記乳が哺乳類に由来することを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記乳が、有蹄類、ブタ、ウサギ、またはマウスに由来することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が卵から得られることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が血清から得られることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が細胞培地から得られることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
前記ＩｇＧ半抗体および完全なＩｇＧ抗体がＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
前記試料のｐＨをｐＨ４．０未満に低下させることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
前記試料のｐＨを約ｐＨ２．０ないし４．０に低下させることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記試料のｐＨを約ｐＨ３．５に低下させることを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記イオン交換カラムが陽イオン交換カラムであることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
前記カラム内に存在する緩衝液のｐＨを６．５以上に上昇させることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
前記カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約７．０に上昇させることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
請求項３１記載の方法によって得られた精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項４６】
抗体がＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする請求項４５記載の精製半抗体調製物。
【請求項４７】
半抗体が調製物中の抗体の総量の少なくとも９０％を占めることを特徴とする請求項４５記載の精製半抗体調製物。
【請求項４８】
半抗体が調製物中の抗体の総量の少なくとも９５％を占めることを特徴とする請求項４７記載の精製半抗体調製物。
【請求項４９】
半抗体が調製物中の抗体の総量の少なくとも９９％を占めることを特徴とする請求項４８記載の精製半抗体調製物。
【請求項５０】
請求項３１記載の方法によって処理される前の試料と比較して、完全な抗体が調製物中の総抗体のより大きな部分を占めることを特徴とする、請求項３１記載の方法によって得られた精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項５１】
抗体がＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする、請求項５０記載の精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項５２】
完全な抗体が調製物中の総抗体の少なくとも８０％を占めることを特徴とする、請求項５０記載の精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項５３】
完全な抗体が調製物中の総抗体の少なくとも９０％を占めることを特徴とする、請求項５２記載の精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項５４】
調製物中の総抗体の少なくとも９０％が半抗体であることを特徴とする精製ＩｇＧ半抗体調製物。
【請求項５５】
半抗体および完全な抗体を含み、かつ総抗体の少なくとも８０％が完全な抗体であることを特徴とする精製された完全なＩｇＧ抗体の調製物。
【請求項５６】
前記調製物がさらにカゼイン夾雑物を含むことを特徴とする請求項５５記載の調製物。
【請求項５７】
前記カラムがＨＩＣカラムであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５８】
前記カラムがＨＩＣカラムであることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項５９】
前記カラムがＨＩＣカラムであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６０】
前記カラムがＨＩＣカラムであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項６１】
前記カラムがＨＩＣカラムであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項６２】
前記カラムがＨＩＣカラムであることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン半抗体を、「免疫グロブリンの完全な抗体」から、生物学的活性を保ったまま、制御分離することを可能にする方法論を提供する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリン半抗体を免疫グロブリンの完全な抗体から分離する方法、ならびに精製免疫グロブリン半抗体調製物および精製された免疫グロブリンの完全な抗体の調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ分子といった免疫グロブリン分子は、脊椎動物の免疫反応に関与する多量体タンパク質である。免疫グロブリン分子の基本構造は四量体であり、２個の軽鎖サブユニットと２個の重鎖サブユニットから成る；重鎖サブユニットはクラスに特有であり、免疫グロブリン分子の別のクラスに独自の影響を与える。免疫グロブリン分子の四本鎖構造は、各重鎖サブユニットのアミノ末端側の半分と軽鎖サブユニットの間、および２個の重鎖サブユニットのカルボキシ末端側の半分の間の、強い非共有相互作用によってまとまっている。ジスルフィド結合は、重鎖および軽鎖サブユニット、および２個の重鎖サブユニットの、両方の間に結合を形成することによって、これらの相互作用をさらに強化する。本発明の目的のために、ＩｇＭは重鎖１０本と軽鎖１０本を有し、一方、ＩｇＡは主に、軽鎖と重鎖の両方の種類の４本を含む二量体であることに注意すべきである。
【０００３】
ＩｇＧ分子には４つの既知のサブクラス；ＩｇＧ１；ＩｇＧ２；ＩｇＧ３；ＩｇＧ４が存在する。ＩｇＧ４分子は、２個の重鎖サブユニットを連結させるジスルフィド結合が必ずしも形成されないという点で、他のＩｇＧアイソタイプと異なる。重鎖サブユニットをまとまらせる非共有相互作用が原因で、ＩｇＧ４分子の不均一性は精製ＩｇＧ４タンパク質のゲル濾過後に明らかではない。しかし、精製ＩｇＧ４タンパク質が変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって非還元条件下で分離される場合、２つの異なるタンパク質種を同定することができる。一方は四量体分子の大きさと合致する１５０ｋＤサイズ範囲に移動し、他方は重鎖サブユニット１個と軽鎖サブユニット１個を含む「半免疫グロブリン」の大きさと合致する約８０ｋＤサイズ範囲に移動する（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２），Ｂｉｏｃｈｅｉｎ Ｊ２８１； ３１７−２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、部分的には、いくつかの変性条件が「免疫グロブリン半抗体(immunoglobulin half antibodies)」の解離を誘発できるが、一方でそれらの条件の大部分は凝集および不可逆的変性を引き起こし、生物医薬のための８０ｋＤと１５０ｋＤ種の分離には容易に適用できないことの発見に基づく。条件の注意深い選択が解離を調節できる場合、酸性化によっても解離を達成することができる。本発明は、「免疫グロブリンの完全な抗体(immunoglobulin whole antibodies)」から、生物学的活性を保った状態で免疫グロブリン半抗体を制御分離することを可能にする方法論を提供する。
【０００５】
ＩｇＧ４抗体の産生の結果、完全な抗体と半抗体の混合物の形成が生じる。完全な抗体は、重鎖のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド結合を介して四量体を形成する。一方、半抗体は、これらの重鎖間ジスルフィド結合を欠く。半抗体は、重鎖間ジスルフィド結合の欠如にもかかわらず四量体を形成するように非共有相互作用することが見出されている。半抗体間のこの非共有相互作用のために、半抗体の物理的性質は完全な抗体のものと非常に類似しており、非変性条件下で半抗体を完全な抗体から分離するのを困難にしている。本発明はこの分離についての困難を克服する方法論を提供する。
【０００６】
本発明はまた、部分的に、クロマトグラフィーによって、解離した半抗体を完全な抗体から分離できることの発見に基づく。したがって、本発明は、免疫グロブリン半抗体を免疫グロブリンの完全な抗体から分離する方法、ならびに、精製免疫グロブリン半抗体調製物および精製された免疫グロブリンの完全な抗体の調製物に関する。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、半抗体と完全な抗体が同一のアイソタイプである場合に半抗体を完全な抗体から分離する方法を提供する。その方法は：
同一のアイソタイプの半抗体と完全な抗体の混合物を含む試料を得る；
半抗体が互いに解離するように試料のｐＨを低下させて溶液(resulting solution)を形成する；
溶液を、ＩｇＧ半抗体と完全なＩｇＧ抗体の移動度を差別化して遅らせるカラムに装填する；工程を含む。
【０００８】
好ましい実施形態では、抗体は免疫グロブリン分子、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子である。好ましくは、抗体はＩｇＧ４分子である。別の実施形態では、抗体はＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ分子である。
【０００９】
一部の実施形態では、抗体は天然に存在する抗体、たとえば、哺乳類において産生された抗体、たとえば、マウスモノクローナル抗体またはヒト抗体である。別の実施形態では、抗体は改変されている、たとえば、組み換え抗体、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体断片、たとえば、Ｆ（ａｂ）２断片である。さらに別の実施形態では、抗体はたとえば、特定のリガンドについての親和性および特異性に関して、たとえば、ファージディスプレイ法によって、改変されている。抗体は、たとえば、軽鎖または重鎖の定常領域または可変領域において改変されている。たとえば、抗体は、たとえば、欠失、挿入、または置換によって、抗体の可変領域の１個以上のＣＤＲおよび／または骨格部分内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、および／または、抗体の定常領域内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、改変されている。産生方法として、遺伝子導入哺乳類、特に有蹄類の乳または他の体液中への産生を含む。最も好ましくは、ヤギまたはウシでの産生が挙げられる。
【００１０】
本発明の他の特性および利点は下記の詳細な説明および請求項から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
用語の説明：
イオン交換クロマトグラフィー：
タンパク質は２０種類の共通なアミノ酸から構成される。これらのアミノ酸の一部は、正または負のどちらかに荷電している側基（「Ｒ」基）を持つ。正電荷または負電荷の全体数の比較は、タンパク質の性質についての手掛かりを与える。タンパク質が負電荷より多くの正電荷を持つ場合、塩基性タンパク質と呼ばれる。負電荷が正電荷より大きい場合、タンパク質は酸性である。タンパク質が優勢なイオン性電荷を含む場合、タンパク質は反対電荷を有する担体に結合されうる。塩基性タンパク質は、正に荷電しているが、負に荷電している担体に結合する。酸性タンパク質は、負に荷電しているが、陽性担体に結合する。イオン交換クロマトグラフィーの使用は、したがって、分子をその電荷に基づいて分離することを可能にする。分子の種類（酸性分子、塩基性分子、中性分子）をこの方法によって容易に分離することができる。これはおそらく、タンパク質精製のために最も高頻度に用いられるクロマトグラフィー法である。
【００１２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）：
ＨＩＣは、イオン交換クロマトグラフィーについて観察されるよりもはるかに大きい選択性を可能にする。これらの疎水性アミノ酸は、固定化された疎水性基を含む担体に結合することができる。これらのＨＩＣ担体は「クラスター化」作用によって働くことに注意する；これらの分子が会合する際に、共有結合またはイオン結合は形成も共有もされない。
【００１３】
ゲル濾過クロマトグラフィー：
この方法はタンパク質を大きさおよび形に基づいて分離する。ゲル濾過クロマトグラフィー用の担体は、任意の大きさの「ポア」と呼ばれる孔を含む。ポアに侵入することができないより大きな分子はビーズを迂回して、ビーズを隔てる空隙を、ポアに侵入しうるより小さな分子よりも速く移動する。
【００１４】
アフィニティクロマトグラフィー：
この方法は標的分子の１段階精製を可能にする。この方法は、特異的リガンドが入手可能であるならば、任意のタンパク質の精製に有用である。
【００１５】
本発明は完全な抗体と半抗体の分離を改良するための系に関する。ここで用いられる「Ｉｇ」または「抗体」の語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ分子といったまたはその任意のサブクラス、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４をいう。
【００１６】
ここで用いられる「完全なＩｇ(whole Ig)」または「完全な抗体(whole antibody)」の語は、２個の軽鎖免疫グロブリンサブユニットおよび２個の重鎖免疫グロブリンサブユニットから成り、２個の重鎖免疫グロブリンサブユニットが１個以上のジスルフィド結合によって互いに共有結合している、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ分子といった免疫グロブリン分子、またはその任意のサブクラスをいう。
【００１７】
ここで用いられる「半Ｉｇ(half Ig)」または「半抗体(half antibody)」の語は、１）１個の軽鎖免疫グロブリンサブユニットおよび１個の重鎖免疫グロブリンサブユニット；または２）重鎖サブユニットがジスルフィド結合によって互いに共有結合していない、２個の軽鎖免疫グロブリンサブユニットおよび２個の重鎖免疫グロブリンサブユニット：のどちらかから成る、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ分子といった免疫グロブリン分子、またはその任意のサブクラスをいう。
【００１８】
ここで用いられる「アイソタイプ」の語は、抗体を説明するのに用いられる場合、抗体の特定のクラスおよびサブクラス、たとえば、ＩｇＧ４アイソタイプをいう。
【００１９】
ここで用いられる「移動度を差別的に遅らせる」の語句は、タンパク質をカラムに装填し、一方のタンパク質がカラムに入って出るのに要する時間が、平均して、他方のタンパク質がカラムに入って出るのに要する時間とは異なる、少なくとも２種類のタンパク質を含む過程をいう。
【００２０】
ここで用いられる「〜と相互作用する」の語句は、タンパク質とカラムの相互作用を説明するのに用いられる場合、タンパク質の移動度がカラムによって変化させられる過程をいう。タンパク質の移動度における変化は；タンパク質とカラムの間の、たとえば、ファンデルワールス力および／または双極子−双極子相互作用が関係する、一過性分子相互作用；タンパク質とカラムの間の、たとえば、ファンデルワールス力または双極子−双極子相互作用が関係する、安定分子相互作用；またはカラムがカラム有効容積に対して有する、異なる大きさのタンパク質がカラムを通過する際に受ける作用、の結果として起こりうる。
【００２１】
ここで用いられる「一過性分子相互作用」の語句は、１秒未満の半減期で形成されおよび破壊されるかまたは可逆的である、分子結合相互作用をいう。本発明に関しては、物質をカラムから溶出することができるということに注意することもまた重要である。
【００２２】
ここで用いられる「安定分子相互作用」の語句は、１秒以上の半減期で形成されおよび破壊される、分子結合相互作用をいう。
【００２３】
ここで用いられる「〜に保持される」または「結合する」の語句は、タンパク質とカラムの間の相互作用を説明するのに用いられる場合、１０％を超えるタンパク質がカラムから洗浄緩衝液中に溶出することなく、カラム容量の数倍の適当な洗浄緩衝液をカラムに加える（すなわち、通過させる）ことができるような、十分な強さおよび持続時間の相互作用をいう。好ましくは、タンパク質がカラムに保持されるかまたはカラムと結合する場合、タンパク質の２５％、１０％、５％、２％、１％未満が、カラム容量の数倍の適当な洗浄緩衝液をカラムに加えた後にカラムから洗い出される。
【００２４】
ここで用いられる「純粋な」の語は、半抗体の精製調製物、たとえば、クロマトグラフィーによって精製された半抗体調製物に用いられる場合、総抗体濃度の約２５％以下だけが完全な抗体から成る半抗体調製物をいう。好ましくは、総抗体濃度の約１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満だけが完全な抗体から成る。
【００２５】
ここで用いられる「純粋な」の語は、完全な抗体の精製調製物、たとえば、クロマトグラフィーによって精製された完全な抗体の調製物に用いられる場合、総抗体濃度の約３０％以下だけが半抗体から成る半抗体調製物をいう。ここでも、製品に特異的であるが、３０は報告された最高値である。好ましくは、総抗体濃度の約３０％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ未満だけが半抗体から成る。
【００２６】
他の語は、たとえば、本発明の分野の当業者にとって定義されるような、通常の定義を有する。
【００２７】
発明の実施形態：抗体構造または特異性の変化
本発明によると、抗体構造の有用な改変を提供する多数の実施形態が存在する。これらの変化は、問題の抗体を製造するために用いられるＤＮＡの変化を反映する。
【００２８】
一部の実施形態では、抗体は重鎖ヒンジ領域の改変を含む。たとえば、ヒンジ領域またはその一部が、たとえば、欠失、挿入、またはたとえば、同一のクラスおよびサブクラスの天然に存在する抗体中に存在するヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部での置換によって、改変されている。
【００２９】
一部の実施形態では、試料は、哺乳類、たとえば、有蹄類（たとえば、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、ブタ、ウサギ、またはマウスから得られる。たとえば、試料は、乳、血液（たとえば、血清）、または組織ホモジネートから得ることができる。別の実施形態では、試料は、鳥類、たとえば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、キジ、またはダチョウから得られる。たとえば、試料は卵、血液（たとえば、血清）、または組織ホモジネートから得ることができる。さらに別の実施形態では、試料は、たとえば、哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、または昆虫細胞のような細胞を培養するのに用いられた培地である。好ましい実施形態では、試料を提供した哺乳類、鳥類、または細胞は、遺伝子導入哺乳類、鳥類、または細胞、たとえば、目的の抗体たとえば外来抗体を産生する遺伝子導入哺乳類、鳥類、または細胞である。好ましい実施形態では、試料は、哺乳類、たとえば、目的の抗体たとえば外来抗体を産生する遺伝子導入哺乳類から得られた乳である。
【００３０】
好ましい実施形態では、試料のｐＨを低下させる前に、試料は部分精製される。たとえば、試料を処理して非免疫グロブリンタンパク質、低分子、および脂質を除去することができる。そのような処理は、クロマトグラフィー段階、たとえば、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィー、沈澱段階、および遠心分離段階を含みうる。たとえば、乳を処理してカゼイン、細胞片および脂質を除去することができる；卵を処理してリゾチームを除去することができる；血液を処理して、たとえば、凝固を開始することによって、細胞および凝固因子を除去することができる；および、組織ホモジネートおよび細胞培地を処理して不溶性タンパク質および細胞片を除去することができる。一部の実施形態では、試料のｐＨを、酸、たとえば、酸性緩衝液、たとえば、グリシン−ＨＣｌ、クエン酸、酢酸、ギ酸緩衝液、または酸性溶液、たとえば、ＨＣｌまたはリン酸溶液を、試料に加えることによって低下させる。好ましい実施形態では、試料のｐＨを、グリシン−ＨＣｌ緩衝液を試料に加えることによって低下させる。
【００３１】
好ましい実施形態では、試料のｐＨを、解離が完全になるまで低下させる。一部の実施形態では、試料のｐＨを、約４．０、３．５、またはそれ未満になるまで低下させ、それによって、半抗体の大部分が互いに解離した、結果として生じる溶液を提供する。好ましい実施形態では、試料のｐＨを、約３．５になるまで低下させる。
【００３２】
一部の実施形態では、カラムは陽イオン交換カラムである。別の実施形態では、カラムはサイズ排除カラムである。さらに別の実施形態では、カラムは疎水性相互作用カラムである。
【００３３】
さらに別の実施形態では、カラムはアフィニティカラムである。好ましくは、カラムは陽イオン交換カラムである。Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＰＯＲＯＳ ＳＨおよび他の高選択性陽イオン交換体。
【００３４】
一部の実施形態では、カラムは得られた溶液中に存在する半抗体を保持する（すなわち、結合する）。別の実施形態では、カラムは得られた溶液中に存在する完全な抗体を保持する（すなわち、結合する）。さらに別の実施形態では、カラムは得られた溶液中に存在する半抗体または完全な抗体を保持しない（すなわち、結合しない）が、半抗体と完全な抗体がカラムを通って移動する速度が異なるように、半抗体、完全な抗体、または両方と相互作用する（たとえば、動きを遅らせる）。好ましい実施形態では、カラムは得られた溶液中に存在する半抗体および完全な抗体の両方を保持する（すなわち、結合する）。
【００３５】
一部の実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する抗体の大部分を保持する（すなわち、結合する）。一部の実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する抗体の約８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより多くを保持する。好ましい実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する半抗体の約８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより多くを保持する（すなわち、結合する）。好ましい実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在するＩｇの完全な抗体の約８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより多くを保持する（すなわち、結合する）。
【００３６】
好ましい実施形態では、カラムは、たとえば、約５．０、４．５、４．０、３．５、またはそれ未満のｐＨの、低ｐＨ条件下で半抗体と結合する。より好ましい実施形態では、カラムは低ｐＨ条件下で半抗体と結合するが、しかしたとえば、約６．５、７．０、７．５、またはより高いｐＨの、中性ないし高ｐＨの条件下では結合しない。
【００３７】
好ましい実施形態では、カラムは、たとえば、約５．０、４．５、４．０、３．５、またはそれ未満のｐＨの、低ｐＨ条件下で完全な抗体と結合する。より好ましい実施形態では、カラムは低ｐＨ条件、およびたとえば、約６．５、７．０、７．５、またはより高いｐＨの、中性ないし高ｐＨの条件下で、完全な抗体と結合する。
【００３８】
一部の実施形態では、本方法はさらに、カラムによって保持された半抗体を選択的に溶出する条件にカラムをさらす工程を含む。そのような条件は、たとえば、カラム内に存在する緩衝液のｐＨまたはイオン強度を変えることを含んでいてよい。好ましい実施形態では、カラムに結合した半抗体を選択的に溶出する条件は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを、半抗体を選択的に溶出させるのに十分なレベルまで上昇させるように、緩衝液をカラムに加えることを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを高めるためにカラムに加えられる緩衝液（すなわち、「高ｐＨ緩衝液」）は、約４．０ないし８．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、たとえば、ＭＥＳ（２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸）ＨＥＰＥＳ（Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'[４−ブタンスルホン酸）、酢酸緩衝液、またはその混合物を含む。一部の実施形態では、高ｐＨ緩衝液トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）。緩衝液のリストはまた、塩化ナトリウムを含むかまたは含まないリン酸緩衝液を含む。これらの緩衝液の一部は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０またはＣＨＡＰＳまたはコール酸のようなイオン性または非イオン性界面活性剤を含んでいてもまたは含まなくてもよい。好ましい実施形態では、高ｐＨ緩衝液は約４．０ないし８．０のｐＨを有し、ＨＥＰＥＳ−酢酸緩衝液を含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、半抗体は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、７．５、またはそれより高くまで上昇させることによってカラムから溶出される。好ましい実施形態では、半抗体の大部分、たとえば、半抗体の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれより多くが、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、７．５、またはそれより高く上昇させることによってカラムから溶出される。好ましい実施形態では、半抗体は、カラム内に存在する緩衝液の塩濃度を最大３００ｍＭまで高めることによってカラムから溶出される。
【００４１】
好ましい実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、またはそれより高く上昇させる場合、完全な抗体はカラムに結合したまま保たれる。好ましい実施形態では、完全な抗体の大部分、たとえば、完全な抗体の８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれより多くが、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、またはそれより高くまで上昇させた後にカラムに結合したまま保たれる。
【００４２】
一部の実施形態では、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが、１以上の段階から成る段階グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが直線グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨがまず段階グラジエントとして、たとえば、ｐＨ約４．０、４．５、または５．０へ、次いで、直線グラジエントとして、たとえば、約６．５、７．０、７．５、またはより高いｐＨに上昇するように加えられる。さらに別の実施形態では、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨがまず直線グラジエントとして、たとえば、ｐＨ約４．５、５．０、または５．５へ、次いで段階グラジエントとして、たとえば、約６．５、７．０、７．５、またはより高いｐＨへ上昇するように加えられる。好ましくは、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが段階グラジエントとしてｐＨ約４．５へ、次いで直線グラジエントとしてｐＨ約７．０に上昇するように加えられる。
【００４３】
一部の実施形態では、方法はさらに、カラムによって保持される完全な抗体を溶出させる条件にカラムをさらす工程を含む。そのような条件は、たとえば、カラム内に存在する緩衝液のｐＨまたはイオン強度を変化させることを含みうる。好ましい実施形態では、その条件は、完全な抗体を溶出させるのに十分な量で、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が上昇するようにカラムに緩衝液を加えることを含む。特に好ましい実施形態では、条件は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが上昇するようにカラムに緩衝液を加えること、および、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が上昇するようにカラムに緩衝液を加えること、その場合にｐＨとイオン強度の上昇の組み合わせが完全な抗体を溶出するために十分であることを含む。好ましい実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のｐＨとイオン強度を独立に上昇させる。別の実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のｐＨとイオン強度を同時に上昇させる。好ましい実施形態では、完全な抗体を溶出させる前に半抗体をカラムから溶出させ、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを上昇させた後にカラム内の緩衝液のイオン強度を上昇させる。
【００４４】
一部の実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を上昇させる、カラムに加えられた緩衝液（すなわち、「高イオン強度緩衝液」）は、高濃度を有する１種類以上の塩を含む。一部の実施形態では、高イオン強度緩衝液は、少なくとも１種類の塩、たとえば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、または、おそらく少なくとも５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、またはより高い濃度で存在する、上昇した緩衝液濃度を含む。好ましい実施形態では、高イオン強度緩衝液は、少なくとも約５０ｍＭのＮａＣｌ、またはより好ましくは約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、高イオン強度緩衝液はさらに、他のリン酸塩を含む。
【００４５】
好ましい実施形態では、完全な抗体は、１）カラム内に存在する緩衝液のｐＨを、たとえば、約５、７．０、またはより高くまで上昇させること、および２）カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を、たとえば、高イオン強度緩衝液のイオン強度まで上昇させること；によって、カラムから溶出される。特に好ましい実施形態では、完全な抗体は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約７．０に上昇させることおよびカラム内に存在する緩衝液のイオン強度を高イオン強度緩衝液のイオン強度まで上昇させることによって、カラムから溶出される。
【００４６】
好ましい実施形態では、完全な抗体の大部分、たとえば、完全な抗体の５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはより多くは、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約５．０ないし７．５、またはより高くまで上昇させること、および、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を高イオン強度緩衝液のイオン強度まで上昇させることによって、カラムから溶出される。好ましい実施形態では、溶出された完全な抗体の純度は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはより高い。
【００４７】
一部の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が、１個以上の段階を含む段階グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が直線グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度がまず段階グラジエントとして、次いで直線グラジエントとして上昇するように加えられる。さらに別の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度がまず直線グラジエントとして、次いで段階グラジエントとして上昇するように加えられる。好ましい実施形態では、カラムに加えられている高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が、５ｍＭ ＮａＣｌ溶液とほぼ等しいかまたはより高いイオン強度へ上昇するように加えられる。好ましい実施形態では、完全な抗体をカラムから溶出させる前に半抗体をカラムから溶出させ、それによって半抗体を完全な抗体から分離することを可能にする。特に好ましい実施形態では、完全な抗体をカラムから溶出させる前に、半抗体の大部分、たとえば、半抗体の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより多くを、カラムから溶出させ、それによって半抗体を完全な抗体から分離することを可能にする。
【００４８】
別の一態様では、本発明は、半抗体と完全な抗体が同一のアイソタイプである場合に、半抗体を完全な抗体から分離する方法に関する。その方法は：
同一のアイソタイプの半抗体と完全な抗体の混合物を含む試料を得る；
半抗体が互いに解離するように試料のｐＨを低下させて、溶液を形成する；
得られた溶液を、半抗体と完全な抗体の両方がカラムによって保持されるようにイオン交換カラムに装填する；
カラム内に存在する緩衝液のｐＨが半抗体を選択的に溶出させるのに十分なレベルまで上昇するように、緩衝液をカラムに加える；および
完全な抗体を溶出させるのに十分な量で、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を上昇させるように緩衝液をカラムに加える；工程を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、抗体は、免疫グロブリン分子、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子である。好ましくは、抗体はＩｇＧ４分子である。別の実施形態では、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、分子である。
【００５０】
一部の実施形態では、抗体は天然に存在する抗体、たとえば、哺乳類において産生された抗体、たとえば、マウスモノクローナル抗体またはヒト抗体である。別の実施形態では、抗体は改変されている、たとえば、組み換え抗体、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆｃ融合タンパク質または抗体断片、たとえば、Ｆ（ａｂ）２断片である。さらに別の実施形態では、抗体はたとえば、特定のリガンドについての親和性および特異性に関して、たとえば、ファージディスプレイ法によって、改変されている。抗体は、たとえば、軽鎖または重鎖の定常領域または可変領域において改変されている。たとえば、抗体は、たとえば、欠失、挿入、または置換によって、抗体の可変領域の１個以上のＣＤＲおよび／または骨格部分内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、および／または、抗体の定常領域内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、改変されている。
【００５１】
一部の実施形態では、抗体は重鎖ヒンジ領域の改変を含む。たとえば、ヒンジ領域またはその一部が、たとえば、欠失、挿入、またはたとえば、同一のクラスおよびサブクラスの天然に存在する抗体中に存在するヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部での置換によって、改変されている。たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３抗体が、ＩｇＧ４型ヒンジ領域を含みうる。
【００５２】
一部の実施形態では、試料は、哺乳類、たとえば、有蹄類（たとえば、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、ブタ、ウサギ、またはマウスから得られる。たとえば、試料は、乳、血液（たとえば、血清）、または組織 抽出物から得ることができる。別の実施形態では、試料は、鳥類、たとえば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、キジ、またはダチョウから得られる。たとえば、試料は卵、血液（たとえば、血清）、または組織ホモジネートから得ることができる。さらに別の実施形態では、試料は、たとえば、哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、または昆虫細胞のような細胞を培養するのに用いられた細胞培地である。好ましい実施形態では、試料を提供する哺乳類、鳥類、または細胞は、遺伝子導入哺乳類、鳥類、または細胞、たとえば、目的の抗体たとえば外来抗体を産生する遺伝子導入哺乳類、鳥類、または細胞である。好ましい実施形態では、試料は、哺乳類、たとえば、目的の抗体たとえば外来抗体を産生する遺伝子導入哺乳類から得られた乳である。
【００５３】
好ましい実施形態では、試料のｐＨを低下させる前に、試料は部分精製される。たとえば、試料を処理して非免疫グロブリンタンパク質、低分子、および脂質を除去することができる。そのような処理は、クロマトグラフィー段階、たとえば、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィー、沈澱段階、および遠心分離段階を含みうる。たとえば、乳を処理してカゼインおよび可溶性脂質および非外来免疫グロブリンであるタンパク質を除去することができる；卵を処理してリゾチームを除去することができる；血液を処理して、たとえば、凝固を開始することによって、細胞を除去することができる；および、組織抽出物および細胞培地を処理して不溶性タンパク質および細胞片を除去することができる。一部の実施形態では、試料のｐＨを、酸、たとえば、酸性緩衝液、たとえば、グリシン−ＨＣｌ、クエン酸、酢酸、ギ酸緩衝液、または酸性溶液、たとえば、ＨＣｌまたはリン酸溶液を、試料に加えることによって低下させる。好ましい実施形態では、試料のｐＨを、グリシン−ＨＣｌ緩衝液を試料に加えることによって低下させる。
【００５４】
好ましい実施形態では、試料のｐＨを、半抗体の大部分が互いに解離するまで低下させる。一部の実施形態では、試料のｐＨを、半抗体の約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはより多くが互いに解離するまで低下させる。一部の実施形態では、試料のｐＨを、約５．０、４．５、４．０、３．５、またはそれ未満になるまで低下させ、それによって、半抗体の大部分が互いに解離した、結果として生じる溶液を提供する。一部の実施形態では、試料のｐＨを、約２．０ないし４．０になるまで低下させる。好ましい実施形態では、試料のｐＨを、約３．５になるまで低下させる。
【００５５】
好ましい実施形態では、イオン交換カラムは陽イオン交換カラムである。
【００５６】
一部の実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する抗体の大部分を保持する（すなわち、結合する）。一部の実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する抗体の約５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはより多くを保持する（すなわち、結合する）。好ましい実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する半抗体の約５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはより多くを保持する（すなわち、結合する）。好ましい実施形態では、イオン交換カラムは試料中に存在する完全な抗体の約５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはより多くを保持する（すなわち、結合する）。
【００５７】
好ましい実施形態では、イオン交換カラムは、たとえば、約５．０、４．５、４．０、３．５、またはそれ未満のｐＨの、低ｐＨ条件下で半抗体と結合する。より好ましい実施形態では、イオン交換カラムは低ｐＨ条件下で半抗体と結合するが、しかしたとえば、約６．５、７．０、７．５、またはより高いｐＨの、中性ないし高ｐＨの条件下では結合しない。
【００５８】
好ましい実施形態では、イオン交換カラムは、たとえば、約５．０、４．５、４．０、３．５、またはそれ未満のｐＨの、低ｐＨ条件下で完全な抗体と結合する。より好ましい実施形態では、イオン交換カラムは低ｐＨ条件、およびたとえば、約６．５、７．０、７．５、またはより高いｐＨの、中性ないし高ｐＨの条件下で、完全な抗体と結合する。
【００５９】
一部の実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを高める、カラムに加えられた緩衝液（すなわち、「高ｐＨ緩衝液」）は、約４．０ないし８．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、たとえば、ＭＥＳ（２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'[４−ブタンスルホン酸）、酢酸緩衝液、またはその混合物を含む。一部の実施形態では、高ｐＨ緩衝液トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）。緩衝液のリストはまた、塩化ナトリウムを含むかまたは含まないリン酸緩衝液を含む。これらの緩衝液の一部は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０またはＣＨＡＰＳまたはコール酸のようなイオン性または非イオン性界面活性剤を含んでいてもまたは含まなくてもよい。
【００６０】
好ましい実施形態では、高ｐＨ緩衝液は約４．０ないし８．０のｐＨを有し、ＨＥＰＥＳ−ＭＥＳ−酢酸緩衝液を含む。
【００６１】
好ましい実施形態では、半抗体は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、７．５、またはより高く上昇させることによってカラムから溶出される。好ましい実施形態では、半抗体の大部分、たとえば、半抗体の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより多くは、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、７．５、またはより高く上昇させることによってカラムから溶出される。好ましい実施形態では、溶出された半抗体は約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより多い完全な抗体である。すなわち、半Ａｂを溶出する際、結果として生じる産物は完全な抗体と考えることができ、または特定の純度レベルを有する産物のレベルとして表すことができる。たとえば、本発明の目的のためには、Ａｂのうちどれだけが１５０ｋＤであるかを百分率の形で表す。
【００６２】
好ましい実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、７．５、またはそれより高くまで上昇させる場合、完全な抗体はカラムに結合したまま保たれる。好ましい実施形態では、完全な抗体の大部分、たとえば、完全な抗体の８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより多くが、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約６．５、７．０、７．５、またはそれより高く上昇までさせた後にカラムに結合したまま保たれる。
【００６３】
一部の実施形態では、カラムに加えられる高ｐＨ緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが、１個以上の段階から成る段階グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる高ｐＨ緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが直線グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる高ｐＨ緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨがまず段階グラジエントとして、たとえば、ｐＨ約４．０、４．５、または５．０まで、次いで、直線グラジエントとして、たとえば、約６．５、７．０、７．５、またはそれより高いｐＨまで、上昇するように加えられる。さらに別の実施形態では、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨがまず直線グラジエントとして、たとえば、ｐＨ約４．５、５．０、または５．５まで、次いで段階グラジエントとして、たとえば、約６．５、７．０、７．５、またはそれより高いｐＨまで上昇するように加えられる。好ましい実施形態では、カラムに加えられる緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨが段階グラジエントとしてｐＨ約４．５まで、次いで直線グラジエントとしてｐＨ約７．０まで上昇するように加えられる。直線グラジエント表記もまた使用できることにも注意すべきである。
【００６４】
一部の実施形態では、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を上昇させる、カラムに加えられた緩衝液（すなわち、「高イオン強度緩衝液」）は、高濃度を有する１種類以上の塩を含む。一部の実施形態では、高イオン強度緩衝液は、少なくとも１種類の塩、たとえば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、または、おそらく少なくとも５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、またはより高い濃度で存在する、上昇した緩衝液濃度を含む。好ましい実施形態では、高イオン強度緩衝液は、少なくとも約５ｍＭのＮａＣｌ、より好ましくは約１００ｍＭ、またはより高いＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、高イオン強度緩衝液はさらに、ＭＥＳ（２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'[４−ブタンスルホン酸）、酢酸緩衝液、またはその混合物を含む。一部の実施形態では、高ｐＨ緩衝液はトリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）でありうる。緩衝液のリストはまた、塩化ナトリウムを含むかまたは含まないリン酸緩衝液を含む。これらの緩衝液の一部は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０またはＣＨＡＰＳまたはコール酸のようなイオン性または非イオン性界面活性剤を含みうるかまたは含まないことができる。
【００６５】
一部の実施形態では、完全な抗体は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨおよびイオン強度の両方を上昇させることによってカラムから溶出される。好ましい実施形態では、完全な抗体は、１）カラム内に存在する緩衝液のｐＨを、たとえば、約６．５、７．０、７．５、またはそれより高く上昇させること、および２）カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を、たとえば、高イオン強度緩衝液のイオン強度まで上昇させること：によってカラムから溶出される。特に好ましい実施形態では、完全な抗体は、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを約７．０に上昇させることおよびカラム内に存在する緩衝液のイオン強度を高イオン強度緩衝液のイオン強度まで上昇させることによってカラムから溶出される。
【００６６】
好ましい実施形態では、完全な抗体の大部分、たとえば、完全な抗体の５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはより多くは、カラム内に存在する緩衝液のｐＨを、たとえば、ｐＨ約６．５、７．０、７．５、またはそれより高くまで上昇させること、および、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度を、たとえば、高イオン強度緩衝液の値まで上昇させることによって、カラムから溶出される。好ましい実施形態では、溶出された完全な抗体の純度は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれより高い。
【００６７】
一部の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が、１個以上の段階を含む段階グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が直線グラジエントとして上昇するように加えられる。別の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度がまず段階グラジエントとして、次いで直線グラジエントとして上昇するように加えられる。さらに別の実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度がまず直線グラジエントとして、次いで段階グラジエントとして上昇するように加えられる。好ましい実施形態では、カラムに加えられる高イオン強度緩衝液は、カラム内に存在する緩衝液のイオン強度が、５ｍＭ ＮａＣｌ溶液とほぼ等しいイオン強度まで上昇するように加えられる。
【００６８】
好ましい実施形態では、完全な抗体をカラムから溶出させる前に半抗体をカラムから溶出させ、それによって半抗体を完全な抗体から分離することを可能にする。特に好ましい実施形態では、完全な抗体をカラムから溶出させる前に、半抗体の大部分、たとえば、半抗体の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれより多くを、カラムから溶出させ、それによって半抗体を完全な抗体から分離することを可能にする。
【００６９】
別の一態様では、本発明は、ここに記載する方法によって得られた精製半抗体調製物に関する。
【００７０】
好ましい実施形態では、精製半抗体調製物は、ガンマ免疫グロブリンを含む分子、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４半抗体を含む。好ましくは、精製半抗体調製物はＩｇＧ４半抗体を含む。別の実施形態では、精製半抗体調製物は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、半抗体を含みうる。
【００７１】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物は、天然に存在する半抗体、たとえば、哺乳類において産生された半抗体、たとえば、マウスモノクローナル半抗体またはヒト半抗体を含む。別の実施形態では、精製半抗体調製物は、改変された半抗体、たとえば、組み換え半抗体、たとえば、可変領域が別のポリペプチドまたは半抗体断片で置換された、キメラ半抗体、ヒト化半抗体、Ｆｃ融合タンパク質、たとえば、Ｆ（ａｂ）２断片から得られた半抗体を含む。さらに別の実施形態では、精製半抗体調製物は、たとえば、特定のリガンドについての親和性および特異性に関して、たとえば、ファージディスプレイ法によって、改変されている半抗体を含む。半抗体は、たとえば、軽鎖または重鎖の定常領域または可変領域において改変されている。たとえば、半抗体は、たとえば、欠失、挿入、または置換によって、半抗体の可変領域の１個以上のＣＤＲおよび／または骨格部分内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、および／または、半抗体の定常領域内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、改変されている。
【００７２】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物は、重鎖ヒンジ領域の改変を含む半抗体を含む。たとえば、ヒンジ領域またはその一部が、たとえば、欠失、挿入、またはたとえば、同一のクラスおよびサブクラスの天然に存在する抗体中に存在するヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部での置換によって、改変されている。たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３半抗体が、ＩｇＧ４型ヒンジ領域を含みうる。
【００７３】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物中に存在する半抗体は、その調製物中に存在する総抗体の８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより多くを構成する。好ましい実施形態では、精製半抗体調製物中に存在する半抗体は、その調製物中に存在する総抗体の少なくとも８０％を構成する。
【００７４】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物は、夾雑物、たとえば、タンパク質、低分子、核酸および／または脂質夾雑物を含む。そのような夾雑物は、たとえば、精製半抗体調製物が得られた試料および／または調製物を得るのに用いられた処理の反映でありうる。たとえば、精製半抗体調製物が乳の試料から得られた場合、調製物は、典型的には乳で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、カゼイン、ラクトース、リン酸カルシウム、カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、および／または内因性免疫グロブリンのような痕跡量の血清タンパク質内因性免疫グロブリンを含みうる。卵から得られた場合、調製物は、典型的には卵で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、リゾチーム、卵白アルブミンを含みうる。動物血清から得られた場合、調製物は、典型的には血液で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、グルコース、コレステロール、ヘモグロビン、アルブミン、内因性抗体を含みうる。本発明の方法によって精製されうる最終起源または供給液では、調製物が細胞培地から得られた場合、調製物は、典型的には細胞培地で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、細胞外マトリクスタンパク質、ペニシリン、グルコースおよび細胞培地起源の他の成分を含みうる。
【００７５】
別の一態様では、本発明は、ここに記載される方法によって得られた精製された完全な抗体の調製物に関する。
【００７６】
好ましい実施形態では、精製された完全な抗体の調製物は、ガンマ免疫グロブリンを含む分子、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４完全な抗体を含む。好ましくは、精製完全な抗体の調製物はＩｇＧ４完全な抗体を含む。別の実施形態では、精製完全な抗体の調製物は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、完全な抗体を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、精製された完全な抗体の調製物は、天然に存在する完全な抗体、たとえば、哺乳類において産生された完全な抗体、たとえば、マウスまたはラットモノクローナル完全な抗体またはヒト完全な抗体を含む。別の実施形態では、精製された完全な抗体の調製物は、改変された完全な抗体、たとえば、組み換え完全な抗体、たとえば、キメラ完全な抗体、ヒト化完全な抗体、Ｆｃ融合タンパク質またはその断片または完全な抗体断片、たとえば、Ｆ（ａｂ）２断片を含む。さらに別の実施形態では、精製された完全な抗体の調製物は、たとえば、特定のリガンドについての親和性および特異性に関して、たとえば、ファージディスプレイ法によって、改変されている完全な抗体を含む。完全な抗体は、たとえば、軽鎖または重鎖の定常領域または可変領域において改変されている。たとえば、完全な抗体は、たとえば、欠失、挿入、または置換によって、完全な抗体の可変領域の１個以上のＣＤＲおよび／または骨格部分内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、および／または、完全な抗体の定常領域内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、改変されている。
【００７８】
一部の実施形態では、精製された完全な抗体の調製物は、重鎖ヒンジ領域の改変を含む完全な抗体を含む。たとえば、ヒンジ領域またはその一部が、たとえば、欠失、挿入、またはたとえば、同一のクラスおよびサブクラスの天然に存在する抗体中に存在するヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部での置換によって、改変されている。たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３完全な抗体が、ＩｇＧ４型ヒンジ領域を含みうる。
【００７９】
一部の実施形態では、精製された完全な抗体の調製物中に存在する完全な抗体は、その調製物中に存在する総抗体の６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、またはより多くを構成する。好ましい実施形態では、精製された完全な抗体の調製物中に存在する完全な抗体は、その調製物中に存在する総抗体の少なくとも９０％を構成する。
【００８０】
一部の実施形態では、完全な抗体の調製物は、完全な抗体および半抗体の両方を含む。好ましい実施形態では、完全な抗体は、そのような調製物中に存在する抗体の総量の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより多くを構成する。特に好ましい実施形態では、完全な抗体は、そのような調製物中に存在する抗体の総量の少なくとも９０％以上を構成する。
【００８１】
別の一態様では、本発明は精製半抗体調製物に関する。好ましい実施形態では、精製半抗体調製物は、ガンマ免疫グロブリンを含む分子、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４半抗体を含む。特に好ましい実施形態では、精製半抗体調製物はＩｇＧ４半抗体を含む。別の実施形態では、精製半抗体調製物は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、半抗体を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物は、天然に存在する半抗体、たとえば、哺乳類において産生された半抗体、たとえば、マウスモノクローナル半抗体またはヒト半抗体を含む。別の実施形態では、精製半抗体調製物は、改変された半抗体、たとえば、組み換え半抗体、たとえば、キメラ半抗体、ヒト化半抗体、または半抗体断片、たとえば、Ｆ（ａｂ）２断片から得られた半抗体を含む。さらに別の実施形態では、精製半抗体調製物は、たとえば、特定のリガンドについての親和性および特異性に関して、たとえば、ファージディスプレイ法によって、改変されている半抗体を含む。半抗体は、たとえば、軽鎖または重鎖の定常領域または可変領域において改変されている。たとえば、半抗体は、たとえば、欠失、挿入、または置換によって、半抗体の可変領域の１個以上のＣＤＲおよび／または骨格部分内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、および／または、半抗体の定常領域内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、改変されている。
【００８３】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物は、重鎖ヒンジ領域の改変を含む半抗体を含む。たとえば、ヒンジ領域またはその一部が、たとえば、欠失、挿入、またはたとえば、同一のクラスおよびサブクラスの天然に存在する抗体中に存在するヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部での置換によって、改変されている。たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３半抗体が、ＩｇＧ４型ヒンジ領域を含みうる。
【００８４】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物中に存在する半抗体は、その調製物中に存在する総抗体の８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより多くを構成する。好ましい実施形態では、精製半抗体調製物中に存在する半抗体は、その調製物中に存在する総抗体の少なくとも９９％を構成する。
【００８５】
一部の実施形態では、精製半抗体調製物は、夾雑物、たとえば、タンパク質、低分子、および／または脂質夾雑物を含む。そのような夾雑物は、たとえば、精製半抗体調製物が得られた試料および／または調製物を得るのに用いられた処理の反映でありうる。たとえば、精製半抗体調製物が乳の試料から得られた場合、調製物は、典型的には乳で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、カゼイン、ラクトース、リン酸カルシウム、カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、および／または内因性免疫グロブリンのような痕跡量の血清タンパク質内因性免疫グロブリン、などを含む可能性があり、調製物が卵から得られた場合、調製物は、典型的には卵で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、リゾチーム、などを含む可能性があり、調製物血清から得られた場合、調製物は、典型的には血液で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、グルコース、コレステロール、ヘモグロビン、アルブミン、内因性抗体、などを含む可能性があり、または調製物が細胞培地から得られた場合、典型的には細胞培地で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、細胞外マトリクスタンパク質、ペニシリン、グルコースおよび細胞培地起源の他の成分を含む可能性がある。
【００８６】
別の一態様では、本発明は、半抗体と完全な抗体の分離を含む、精製抗体の調製に関する。
【００８７】
好ましい実施形態では、精製抗体調製物は、ガンマ免疫グロブリンを含む分子、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４完全な抗体および半抗体を含む。特に好ましい実施形態では、精製抗体調製物はＩｇＧ４完全な抗体および半抗体を含む。別の実施形態では、精製抗体調製物は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、完全な抗体および半抗体を含む。これらの抗体は任意の哺乳類の抗体であることができるが、好ましくは完全なヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００８８】
一部の実施形態では、精製抗体調製物は、天然に存在する抗体、たとえば、哺乳類において産生された抗体、たとえば、マウスまたはラットモノクローナル抗体またはヒト抗体を含む。別の実施形態では、精製抗体調製物は、改変された抗体、たとえば、組み換え抗体、たとえば、キメラ抗体、遺伝子導入抗体、ヒト化抗体、または抗体断片、たとえば、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）２断片を含む。さらに別の実施形態では、精製抗体調製物は、たとえば、特定のリガンドについての親和性および特異性に関して、たとえば、ファージディスプレイ法によって、改変されている抗体を含む。抗体は、たとえば、軽鎖または重鎖の定常領域または可変領域において改変されている。たとえば、抗体は、たとえば、欠失、挿入、または置換によって、抗体の可変領域の１個以上のＣＤＲおよび／または骨格部分内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、および／または、抗体の定常領域内に存在する１個以上のアミノ酸残基で、改変されている。
【００８９】
一部の実施形態では、精製抗体調製物は重鎖ヒンジ領域の改変を含む抗体を含む。たとえば、ヒンジ領域またはその一部が、たとえば、欠失、挿入、またはたとえば、同一のクラスおよびサブクラスの天然に存在する抗体中に存在するヒンジ領域とは異なるヒンジ領域またはその一部での置換によって、改変されている。たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３抗体が、ＩｇＧ４型ヒンジ領域を含みうる。
【００９０】
一部の実施形態では、精製抗体調製物中に存在する完全な抗体は、その調製物中に存在する総抗体の６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、またはより多くを構成する。好ましい実施形態では、精製抗体調製物中に存在する完全な抗体は、その調製物中に存在する総抗体の少なくとも７０％を構成する。
【００９１】
一部の実施形態では、精製抗体調製物は、夾雑物、たとえば、タンパク質、核酸、低分子、および／または脂質夾雑物を含む。そのような夾雑物は、精製抗体調製物が得られた試料および／または調製物を得るのに用いられた処理の反映でありうる。たとえば、精製抗体調製物が乳の試料から得られた場合、調製物は、典型的には乳で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、カゼイン、ラクトース、リン酸カルシウム、カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、および／または内因性免疫グロブリンのような痕跡量の血清タンパク質内因性免疫グロブリン、などを含みうる。調製物が卵から得られた場合、調製物は、典型的には卵で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、リゾチーム、卵白アルブミンを含みうる。調製物が血清から得られた場合、調製物は、典型的には血液で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、グルコース、コレステロール、ヘモグロビン、アルブミン、内因性抗体を含みうる。最後に、調製物が細胞培地から得られた場合、調製物は、典型的には細胞培地で見出される夾雑タンパク質または低分子、たとえば、細胞外マトリクスタンパク質、ペニシリン、グルコース、および細胞培地またはバイオリアクター容器起源の他の成分を含みうる。
【実施例】
【００９２】
実施例１
ｈＩｇＧ４の２種類の型の最適化された分離
１．ヤギ乳からのｒｈＩｇＧ４の単離
２．８０ｋＤ種と１５０ｋＤ種の分離
３．調製(formulation)
【００９３】
１．ヤギ乳からのｒｈＩｇＧ４の単離
ヤギ乳は二層十字流濾過によって清澄化し、清澄化された乳をＰＯＲＯＳプロテインＡ５０カラムに負荷容量１０ｍｇ／ｍＬにて加えた。線速度１２０ｃｍ／ｈｒ
溶出は０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ３．５を用いて実施した。溶出されたタンパク質のｐＨを３．６に調整した
抗体を室温にて１時間インキュベートした。
【００９４】
２．８０ｋＤ種と１５０ｋＤ種の分離（半ＩｇＧ４と完全なＩｇＧ４）
ｐＨを４．５に調整し、材料をＳｏｕｒｃｅ Ｓカラムに負荷した
負荷容量９ｍｇ／ｍＬ
線速度１２０ｃｍ／ｈｒ
８０ｋＤ種（半抗体）の溶出は、ｐＨ４．５ないしｐＨ７．３のｐＨグラジエントを用いることによって実施した
１５０ｋＤ種（完全な抗体）の溶出は、ＮａＣｌ濃度の小さい増加（０〜１０ｍＭ）を用いることによって実施した。
【００９５】
３．調製（formulation）
完全な抗体の画分および半抗体画分を集め、濃縮し、緩衝液をＴｗｅｅｎ８０添加ＰＢＳ ｐＨ６．０に交換した。
【表１】
2006508062.tif 000002
【表２】
2006508062.tif 000003
【００９６】
遺伝子導入動物における抗体産生
免疫グロブリンは、通常は循環Ｂリンパ球から合成、修飾、組立、および分泌されるヘテロ多量体タンパク質である。組み換えＤＮＡ技術を用いて、Ｂリンパ球以外の細胞を、免疫グロブリン遺伝子を発現するようにプログラムすることが可能である。この試みが直面する問題はいくつかの因子に由来する；１）免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の両方が適当なレベルで同時発現されなければならない；２）未完成の免疫グロブリンポリペプチドは、異種細胞では十分な信頼性または効率で起こらない可能性があるさまざまな翻訳同時修飾および翻訳後修飾を受ける；３）免疫グロブリンは組立のために補助的なシャペロンタンパク質を必要とする；４）細胞の合成および分泌能力が多量の異種タンパク質を分泌するのに不適当である可能性がある；および５）分泌された免疫グロブリンが異種細胞の細胞外環境において不安定である可能性がある。
【００９７】
免疫グロブリンは多数の治療用途、診断用途および工業用途を有するため、これらのタンパク質を再現可能に高レベルで、機能する立体構造で、および容易に採集および精製が可能な形で、製造できる発現系が本分野で必要とされている。遺伝子導入動物技術の発達は、遺伝子にプログラムされたタンパク質工場として大型動物を用いることの可能性を高めている。国際公開第９０／０４０３６号パンフレット（１９９０年４月１９日公開）は、免疫グロブリン発現のための遺伝子導入技術の使用を開示する。国際公開第９２／０３９１８号パンフレット（１９９２年３月１９日）、および国際公開第９３／１２２２７号パンフレット（１９９３年６月２４日）は、遺伝子導入動物の生殖細胞系列への、再構成されていない免疫グロブリン遺伝子の導入を教示する。完全な免疫グロブリン遺伝子（それぞれのプロモーター領域を含む）の使用は、リンパ球におけるそれらの発現および宿主動物の血流中への分泌を結果として生じる；これは、宿主の内因性免疫グロブリンの発現を抑制するための戦略を必要とさせ、および、タンパク質分解酵素を含む多数の他のタンパク質を含む血清から、免疫グロブリンを精製する問題を引き起こす。さらに、遺伝子導入手法を選択する場合、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方を、同時発現を可能にする方法で宿主ゲノムに組み込まなければならない。
【００９８】
本発明は、遺伝子導入動物の乳中に分泌されるモノクローナル抗体の産生のための方法、およびそのような動物の作製のための方法に関する。これは、乳腺上皮細胞で優先的に発現されるプロモーター配列の下流に、特定の対の免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ部分がクローニングされたＤＮＡ構造を作製することによって達成される。プロモーターと結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含む組み換えＤＮＡを次いで移植前胚へ同時注入する。両方の導入遺伝子の存在について子孫をスクリーニングする。これらの系統に由来する代表的な雌を次いで搾乳し、乳をモノクローナル抗体の存在について分析する。抗体が存在するためには、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方が同一細胞で同時に発現されなければならない。抗体を乳から精製することができ、または免疫グロブリンを含む乳自体を用いてレシピエントへ抗体を送達することができる。
【００９９】
本発明において有用な免疫グロブリン遺伝子は、たとえば個々のＢ細胞クローンまたはそれに由来するハイブリドーマのような、天然起源から得ることができる。または、それらは軽鎖および重鎖可変領域が単一ポリペプチドの一部として発現される合成一本鎖抗体を含みうる。さらに、アミノ酸配列を変化させるかまたは変化させないヌクレオチド置換によって、配列の付加または欠失によって、またはポリペプチドの異なる領域が異なる起源に由来するハイブリッド遺伝子の作製によって、予測的に改変されている組み換え抗体遺伝子を用いることができる。抗体遺伝子は元来、極めて多様であり、したがって相当な変化を必然的に許容する。本発明の方法によって抗体を産生するための唯一の制限は、抗体は機能する立体構造へ組み立てられて安定型で乳中へ分泌されなければならないということであると当業者には理解される。
【０１００】
本発明の実施において有用な転写プロモーターは、乳腺上皮細胞で優先的に活性化されるプロモーターであり、カゼイン、ベータラクトグロブリン(Clark et al.,(1989) Bio/Technology 7; 487-492)、乳清酸性タンパク質（Gordon et al., (1987)Bio/ Technology 5; 1183-1187)、およびラクトアルブミン(Soulier et al., (1992) FEBS Letts. 297; 13)といった乳タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターを含む。カゼインプロモーターは、任意の哺乳類種のアルファ、ベータ、またはカッパカゼイン遺伝子に由来しうる；好ましいプロモーターはヤギベータ−カゼイン遺伝子に由来する(DiTullio, (1992) Bio/ Technology 10; 74-77)。
【０１０１】
本発明における使用のためには、下記の方法論を用いることができる；独自のＸｈｏＩ制限部位をプロモーター配列の３'末端に導入し、免疫グロブリンコード配列のルーチン挿入を可能にする。好ましくは、挿入された免疫グロブリン遺伝子は、乳腺特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列が３'側に隣接し、ポリアデニル化部位および転写物安定化配列を提供する。その構造のｉｎ ｖｉｖｏ転写は、結果として、カゼイン由来５'非翻訳配列を免疫グロブリン遺伝子の翻訳開始コドンの上流に、および３'非翻訳配列を免疫グロブリン遺伝子の翻訳終止コドンの下流に含む、安定なｍＲＮＡの産生を生じる。最終的に、カセット全体（すなわちプロモーター−免疫グロブリン−３'領域）に、プロモーター−ｃＤＮＡカセットが容易に単一断片として切り出されることを可能にする制限部位が隣接する。これは、受精卵への注入前に、不要な原核ベクター由来ＤＮＡ配列の除去を促進する。
【０１０２】
プロモーターと結合した免疫グロブリン重鎖および軽鎖ＤＮＡは次いで、哺乳類、たとえば雌牛、ヒツジ、ヤギ、マウス、雄牛、ラクダ、またはブタの生殖細胞系列へ導入される。哺乳類はここでは、乳腺を持ち乳を産生する、ヒトを除くすべての動物と定義される。乳を大量に長期にわたって産生する哺乳類種が好ましい。典型的には、ＤＮＡを受精卵の前核へ注入し、受精卵を次いでレシピエント雌の子宮内へ移植し、妊娠させる。出生後、遺伝子導入と推定される動物を、導入されたＤＮＡの存在について試験する。これは、血液細胞または他の利用可能な組織から抽出されたＤＮＡの、レシピエント種のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを示さない注入遺伝子の一部をプローブとして用いるサザンブロットハイブリダイゼーションによって容易に達成される。重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の両方の少なくとも１コピーの証拠を示す子孫を、以降の分析のために選択する。
【０１０３】
遺伝子導入雌を、乳中への免疫グロブリン分泌について、本分野で標準的である免疫学的方法のうち任意のものを用いて試験することができる（たとえばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ）。この分析に用いられる抗免疫グロブリン抗体は、単離された重鎖または軽鎖を検出するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、または完全に組み立てられた（Ｈ２Ｌ２）免疫グロブリンとだけ反応する他の抗体であることができる。
【０１０４】
組み換え免疫グロブリンはまた、その機能性、すなわち特定の抗原に対する特異性および親和性によって特徴づけられる。これは、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、固定化抗原への結合、などといった本分野で標準的である免疫学的方法を用いて達成される。任意の種の乳中の免疫グロブリンの安定性特性もまた、動物からの回収後に、漸増する時間インキュベートした乳に上記の検出法を適用することによって測定される。
【０１０５】
本発明の方法によって産生された免疫グロブリンを、固定化プロテインＧへの吸着、カラムクロマトグラフィー、および抗体精製分野において当業者に既知である他の方法を用いて、乳から精製することができる。
【０１０６】
個々の遺伝子導入哺乳類における組み換え免疫グロブリンの産生のレベルは、受精卵への注入後の、導入遺伝子の組み込みの部位および方法によって主に決定される。したがって、注入された別々の卵に由来する別々の遺伝子導入子孫は、このパラメータに関して異なりうる。乳中の組み換え免疫グロブリンの量はしたがって代表的な子孫において監視され、産生が最高である雌が好ましい。
【０１０７】
当業者は、本発明の方法を用いて天然および合成免疫グロブリンの産生を最適化しうることを理解する。遺伝子導入動物の作製、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方の存在についての試験、雌の子孫の乳中への免疫グロブリンの分泌の測定、および、最後に、結果として生じる抗体の品質の評価の段階を、異なる用途のための好ましい構造を確立するために、必要以上の実験無しに連続的に反復することができる。
【０１０８】
本発明によると、組み換え免疫グロブリンの性質およびその特異的使用方法は変化しうる。一実施形態では、本発明は乳から採取および精製され、精製された形で使用される抗体の、高レベル発現を包含する。高レベル発現はここでは、タンパク質約１ｍｇ／ｍｌの産生と定義される。別の一実施形態では、望ましい抗体は、感染症に対してヒトに防御を提供するよう操作されている；治療投与はその時、乳を飲用することによって達成される。さらに別の一実施形態では、乳を分泌する動物が、その子孫に特異的に有益である抗体を産生するように操作され、子孫は哺乳を通じてその抗体を獲得する。さらに別の一実施形態では、動物は、乳を分泌する哺乳類自身を、乳房病原体、たとえば乳腺炎を生じる細菌から保護する抗体を産生する。
【０１０９】
本発明に従って産生された遺伝子導入抗体、組み換え抗体、またはキメラ抗体、（たとえば、半抗体および／または完全な抗体）は、患者への投与のための医薬組成物の調製物に、または疾患の診断に、といった幅広い治療手続に用途を見出す。たとえば、遺伝子導入によって産生された抗体は、本分野で既知である通り、抗関節炎薬または抗がん剤として有用でありうる。
【０１１０】
乳タンパク質特異的シグナルおよびプロモーター配列を用いる、遺伝子導入動物の乳中での組み換え抗体の商業的生産への遺伝子導入技術の応用は、抗体産生の従来の方法に対して顕著な利点を提供する。これらの利点は、必要な設備投資の総額の減少、製品開発ライフサイクルの初期における施設構築のためのキャピタル・コミットメントの必要性の消失、および抗体を産生するためのハードについての単位当たり直接生産コストがより低いことを含む。中心的に重要なのは、完全な抗体と、すべてのジスルフィド結合を完全な形では有しない抗体との分離を可能にする、本発明によって利用可能になった分離法である。実際、遺伝子導入産生は、商業生産の唯一の技術的におよび経済的に実現可能な方法を示しうる。
【０１１１】
本発明の方法は、通常は非分泌であるタンパク質、たとえば、遺伝子導入哺乳類の乳中の抗体または抗体断片の、効率的な分泌に繋がる戦略を示す。ヤギβ−カゼインシグナルペプチド、またはβ−カゼインシグナルペプチドおよびβ−カゼインのＮ末端部分を、抗体のＤＮＡ転写物のＮ末端部分へ加えることが、これらの通常は細胞質に存在するタンパク質を遺伝子導入マウスおよび他の遺伝子導入動物の乳中へ分泌させるのに十分であることがここで実証されている。このように、本発明の方法は、望ましい抗体またはその断片の、遺伝子導入動物の乳中への、信頼できる一貫した産生を促進する。
【０１１２】
乳特異的プロモーター
本発明の実施において有用な転写プロモーターは、乳腺上皮細胞で優先的に活性化されるプロモーターであり、カゼイン、ベータラクトグロブリン(Clark et al., (1989) Bio/Technology 7; 487-492)、乳清酸性タンパク質(Gordon et al., (1987) Bio/ Technology 5; 1183-1187)、およびラクトアルブミン(Soulier et al., (1992) FEBS Letts. 297; 13)といった乳タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターを含む。カゼインプロモーターは、任意の哺乳類種のアルファ、ベータ、ガンマ、またはカッパカゼイン遺伝子に由来しうる；好ましいプロモーターはヤギベータカゼイン遺伝子に由来する(DiTullio, (1992) Bio/ Technology 10; 74-77)。乳特異的タンパク質プロモーターまたは乳腺組織で特異的に活性化されるプロモーターは、ｃＤＮＡまたはゲノム配列のどちらかに由来しうる。好ましくは，それらはゲノム起源である。
【０１１３】
ＤＮＡ配列情報は、上に列挙した乳腺特異的遺伝子のすべてについて、少なくとも１種類、およびしばしば数種類の生物において入手可能である。たとえば、Richards et al., J. Biol. Chem. 256,526-532 (1981)（α−ラクトアルブミン、ラット）； Campbell et al.,Nucleic Acids Res. 12,8685-8697 (1984) （ラットＷＡＰ）； Jones et al., J. Biol. Chem. 260,7042-7050 (1985) （ラットβ−カゼイン） ； Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258,10794- 10804 (1983) （ラットγ−カゼイン） ； Hall, Biochem. J. 242,735-742 (1987) （α−ラクトアルブミン、ヒト）； Stewart, Nucleic Acids Res. 12,389 (1984) （ウシαｓ１およびκカゼインｃＤＮＡ）； Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988) (ウシβカセ゛イン); Alexander et al.,Eur. J. Biochem. 178,395-401 (1988)（ウシκカゼイン）； Brignon et al., FEBS Lett. 188,48-55 (1977) （ウシαＳ２カゼイン）； Jamieson et al., Gene 61,85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369,425-429 (1988), Alexander et al.,Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) （ウシβラクトグロブリン）； Vilotte et al., Biochimie 69,609-620 (1987) （ウシα−ラクトアルブミン）を参照。さまざまな乳タンパク質遺伝子の構造および機能は、Mercier & Vilotte,J. Dairy Sci. 76,3079-3098 (1993)によって総説される（その全体が参照により本開示に含まれる）。追加の配列データが必要でありうる程度まで、すでに得られた領域に隣接する配列は、その既存の配列をプローブとして用いることによって容易にクローニングすることができる。異なる生物に由来する乳腺特異的調節配列は、そのような生物に由来するライブラリを、既知の同族ヌクレオチド配列、または同族タンパク質に対する抗体を、プローブとして用いてスクリーニングすることによって同様に得られる。
【０１１４】
シグナル配列
本発明に従って有用であるシグナル配列の中に、乳特異的シグナル配列または、真核タンパク質または原核タンパク質の分泌を結果として生じる他のシグナル配列がある。好ましくは、シグナル配列は乳特異的シグナル配列から選択される、すなわち、乳中に分泌される産物をコードする遺伝子に由来する。非常に好ましくは、乳特異的シグナル配列は本発明の発現系に用いられる乳特異的プロモーターに関連する。シグナル配列の大きさは本発明に関しては重要でない。必要なのは、シグナル配列が、目的の組み換えタンパク質の分泌をたとえば乳腺組織において引き起こすために十分な大きさであるということだけである。たとえば、カゼイン、たとえば、アルファ、ベータ、ガンマまたはカッパカゼイン、ベータラクトグロブリン、乳清酸性タンパク質、およびラクトアルブミンをコードする遺伝子に由来するシグナル配列は本発明において有用である。好ましいシグナル配列はヤギβ−カゼインシグナル配列である。
【０１１５】
たとえば、肝細胞、腎細胞、または膵細胞によって分泌されるタンパク質といった、他の分泌タンパク質からのシグナル配列もまた用いることができる。
【０１１６】
結果として、完全な抗体からの半抗体の分離のための改良された方法をここに提供する。本発明の実施形態は、さまざまな開始材料について見出される際、単に本発明の原理の応用の一例に過ぎないことを理解すべきである。完全な抗体および半抗体の分離および精製使用のための改良された方法のための開示された方法の要素の形態、使用方法、および用途における変化は新規であり、および本発明の精神または付属の請求項の範囲を離れることなく改変および／または使用することができることは、前記の説明から明らかになる。
【参考文献】
【０１１７】
2006508062.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１はＩｇＧ４精製および１５０ｋＤ種の濃縮のフローチャートを示す。
【図２】図２は、さまざまな濃度のクエン酸（図２Ａ〜図２Ｃ）を用いたＩｇＧ４解離の動態試験を示す。
【図３】図３ＡはｐＨ３．０および１００ｍＭグリシンでのＩｇＧ４解離の動態試験、図３ＢはｐＨ３．０および２００ｍＭグリシンでのＩｇＧ４解離の動態試験、図３ＣはｐＨ３．５および１００ｍＭグリシンでのＩｇＧ４解離の動態試験、図３ＤはｐＨ３．５および２００ｍＭグリシンでのＩｇＧ４解離の動態試験。
【図４】図４は抗体解離の動態試験とその後のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図５】図５はＩｇＧ４ｒ−Ｍａｂ（組み換えモノクローナル抗体）の８０ｋＤ種と１５０ｋＤ種の分離。（精製物質の安定性を最大３ヶ月間試験した。凝集または分解は検出されなかった。）
【図６】図６は陽イオン交換クロマトグラフィー画分の等電点電気泳動分析。
【図７】図７はＩｇＧ４陽イオン交換２／５／０２画分のＮ−結合型オリゴ糖プロファイル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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