(57)【要約】本発明は、インフルエンザウイルスの感染により起こる疾患に対するワクチン及びワクチン接種方法を提供する。本ワクチンは、キャリアタンパク質と連結させた、インフルエンザウイルスのＭ２及び／又はＨＡタンパク質由来のペプチドを含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質の細胞外ドメイン由来のアミノ酸配列を有するペプチドを複数含有し、前記複数のペプチドがキャリアタンパク質の表面に共有結合されており、前記結合の各々が、ペプチドの一方の末端と前記タンパク質の表面にある反応部位との間にあり、前記キャリアタンパク質が、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体、破傷風トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニン、ロタウイルスキャプシドタンパク質及びウシ又はヒトパピローマウイルス  ＶＬＰのＬ１タンパク質からなる群から選択される、Ｍ２ペプチド−タンパク質連結物又は医薬適合性のその塩。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号１、２、１０及び３９からなる群から選択される、請求項１に記載の連結物。
【請求項３】
前記ペプチドが配列番号３９の配列を有する、請求項２に記載の連結物。
【請求項４】
前記キャリアタンパク質が、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項１に記載の連結物。
【請求項５】
前記ペプチドが配列番号３９のアミノ酸配列を有し、前記免疫原性タンパク質がナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項４に記載の連結物。
【請求項６】
前記ペプチドがチオエーテルリンカーを介して前記タンパク質に共有結合されている、請求項１に記載の連結物。
【請求項７】
少なくとも１つの、請求項１に記載のペプチド−タンパク質連結物と、アジュバントと、生理学的に許容可能な担体とを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスによる哺乳類の感染を予防又は改善するためのワクチン。
【請求項８】
前記アジュバントがアルミニウム含有アジュバントを含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記アジュバントがアルミニウム及びＱＳ２１を含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ペプチド−タンパク質連結物が配列番号３９のアミノ酸配列を有する複数のペプチドを含有し、前記タンパク質がナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載の連結物の有効量を患者に接種する段階を含む、患者において免疫反応を誘導する方法。
【請求項１２】
前記患者がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質由来のアミノ酸配列を有するペプチドを複数含有し、前記複数のペプチドがキャリアタンパク質の表面に共有結合されており、前記結合の各々が、ペプチドの一方の末端と前記タンパク質表面にある反応部位との間にある、ＨＡ０ペプチド−タンパク質連結物又は医薬適合性のその塩。
【請求項１４】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５９、６０、６１及び６２からなる群から選択される、請求項１３に記載の連結物。
【請求項１５】
前記ペプチドが配列番号６２の配列を有する、請求項１４に記載の連結物。
【請求項１６】
前記キャリアタンパク質が、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体、破傷風トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、キーホールリンペットヘモシアニン、ロタウイルスキャプシドタンパク質及びウシ又はヒトパピローマウイルス  ＶＬＰのＬ１タンパク質からなる群から選択される、請求項１３に記載の連結物。
【請求項１７】
前記ペプチドが配列番号６２のアミノ酸配列を有し、前記免疫原性タンパク質がナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項１６に記載の連結物。
【請求項１８】
前記ペプチドがチオエーテルリンカーを介して前記タンパク質に共有結合されている、請求項１３に記載の連結物。
【請求項１９】
少なくとも１つの、請求項１３に記載のペプチド−タンパク質連結物と、アジュバントと、生理学的に許容可能な担体とを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスによる対象者の感染を予防又は改善するためのワクチン。
【請求項２０】
前記アジュバントがアルミニウム含有アジュバントを含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記アジュバントがアルミニウム及びＱＳ２１を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ペプチド−タンパク質連結物が、配列番号６２のアミノ酸配列を有する複数のペプチドを含有し、前記タンパク質が、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２３】
請求項１３に記載の連結物の有効量を患者に接種する段階を含む、患者において免疫反応を誘導する方法。
【請求項２４】
前記患者がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質由来のアミノ酸配列を有するペプチドを複数含有し、前記複数のペプチドがキャリアタンパク質の表面に共有結合されており、前記結合の各々がペプチドの一方の末端と前記タンパク質表面にある反応部位との間にある、ＨＡ０ペプチド−タンパク質連結物又は医薬適合性のその塩。
【請求項２６】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６０、１２６ないし１６８からなる群から選択される、請求項２５に記載の連結物。
【請求項２７】
前記ペプチドが配列番号６０の配列を有する、請求項２６に記載の連結物。
【請求項２８】
前記キャリアタンパク質が、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体、破傷風トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、キーホールリンペットヘモシアニン、ロタウイルスキャプシドタンパク質及びウシ又はヒトパピローマウイルス  ＶＬＰのＬ１タンパク質からなる群から選択される、請求項２５に記載の連結物。
【請求項２９】
前記ペプチドが配列番号６０のアミノ酸配列を有し、前記免疫原性タンパク質がナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項２８に記載の連結物。
【請求項３０】
前記ペプチドがチオエーテルリンカーを介して前記タンパク質に共有結合されている、請求項２５に記載の連結物。
【請求項３１】
少なくとも一つの請求項２５に記載のペプチド−タンパク質連結物と、アジュバントと、生理学的に許容可能な担体とを含有する、Ｂ型インフルエンザウイルスによる対象者の感染を予防又は改善するためのワクチン。
【請求項３２】
前記アジュバントがアルミニウム含有アジュバントを含む、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
前記アジュバントがアルミニウム及びＱＳ２１を含む、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３４】
前記ペプチド−タンパク質連結物が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するペプチドを複数含有し、前記タンパク質が、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体である、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３５】
請求項２５に記載の連結物の有効量を患者に接種する段階を含む、患者において免疫反応を誘導する方法。
【請求項３６】
前記患者がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの請求項１に記載のペプチド−タンパク質連結物と、少なくとも１つの請求項１３に記載のペプチド−タンパク質連結物と、アジュバントと、生理学的に許容可能な担体とを含有する、インフルエンザウイルスによる患者の感染を予防又は改善するためのワクチン。
【請求項３８】
少なくとも１つの請求項１に記載のペプチド−タンパク質連結物と、少なくとも１つの請求項２５に記載のペプチド−タンパク質連結物と、アジュバントと、生理学的に許容可能な担体とを含有する、インフルエンザウイルスによる患者の感染を予防又は改善するためのワクチン。
【請求項３９】
少なくとも１つの請求項１に記載のペプチド−タンパク質連結物と、少なくとも１つの請求項１３に記載のペプチド−タンパク質連結物と、少なくとも１つの請求項２５に記載のペプチド−タンパク質連結物と、アジュバントと、生理学的に許容可能な担体とを含有する、インフルエンザウイルスによる患者の感染を予防又は改善するためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスが関与する疾患の予防及び処置のためのワクチン、ワクチン接種及び治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
外被のある分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルスには、２種類の主要なタイプ、Ａ型インフルエンザとＢ型インフルエンザがある。このウイルスは、ヒトにおけるインフルエンザを引き起こす原因となる感染物質である。Ａ型インフルエンザウイルスは、２つのウイルス性膜貫通タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原の相違に基づき、さらにサブタイプに分けられる。現在まで、ヒトにおいてＡ型インフルエンザの３種類のサブタイプ、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２が同定されている（Ｈｉｌｌｅｍａｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，３０６８−３０８７，２００２）。ほぼヒトでのみ広がっているＢ型インフルエンザウイルスの特徴は、抗原変化の割合がより低いことである。最近単離されたＢ型インフルエンザウイルスは、インフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７サブクラスとインフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８サブクラスの２種類の主要な系統に分類される。これら２つの系列は、抗原的及び遺伝学的に異なり、フェレットにおいて、感染後の交差中和抗体反応がほとんど見られない（Ｒｏｔａら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（Ｐｔ  １０），２７３７−４２（１９９２））。
【０００３】
インフルエンザウイルスゲノムは分節型であるため、超感染性細胞においてウイルスが複製する間に分節の再集合が起こる。遺伝子の突然変異及び遺伝的浮動と組み合わさって、分節の再集合により、やがて各血清型群の中でインフルエンザの無数の分岐種が生じる。新種では、そのヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼタンパク質において抗原変化が起こっている。
【０００４】
現在の主なインフルエンザ予防法は、ワクチン接種を毎年行うことである。通常、ウイルス全体に対するワクチンが使用される。このワクチンには、Ａ型インフルエンザ  Ｈ１Ｎ１株、Ａ型インフルエンザ  Ｈ３Ｎ２株及びＢ型インフルエンザ株が含有されなければならない。しかし、インフルエンザ膜貫通タンパク質が常に抗原性を変化させるため、これらのタンパク質に対する単一のワクチンを毎年使用することは適切ではない。従って、インフルエンザウイルスの全体的集団の無数の株の特徴を調べ、追跡し、予想する。ある年のウイルスの個々の株の流行及び予想に基づいて、有力かつ予想されるウイルス株に対する防御的免疫反応を刺激するようにワクチンが設計される。
【０００５】
単回のワクチン接種で何年にもわたる、又は一生の防御効果を付与するワクチンを使用することに比べ、毎年ワクチン接種を行うことは患者及び医師にとって不便であり、患者間で一貫性がなく、ある血清型群の中の他のインフルエンザウイルス株に対する交差防御が得られず、その結果、生物はインフルエンザに感染してしまうこととなる。従って、単回接種で行うことができるインフルエンザに対するワクチンにより、変化の大きなウイルス集団における新株に対する交差防御が可能となり、ワクチン接種を受けた人に何年にもわたり、又は生涯を通して、そのような防御効果を付与できる可能性があるが、これは非常に有用と考えられる。
【０００６】
あるインフルエンザ型の全株に共通する安定したインフルエンザ抗原を基にしたワクチンにより、そのような利益が得られる可能性がある。最近、Ａ型インフルエンザのＭ２タンパク質が、そのようなワクチンの基盤を形成し得る抗原タンパク質として研究されている（Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎら、１９９５，Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１３９９−１４０２）。Ｍ２タンパク質は、構造的に保存されたウイルス表面タンパク質である。Ｍ２は、インフルエンザビリオンの中で比較的少ない成分である（Ｚｅｂｅｄｅｅ及びＬａｍｂ，１９８８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２７６２−２７７２）が、ウイルス感染中に感染細胞において多量に発現される（Ｌａｍｂら、１９８５  Ｃｅｌｌ  ４０：６２７−６３３）。感染細胞において、Ｍ２は細胞膜に現れ、ウイルス複製のためのプロトンフラックスを作る（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，１９９２  Ｃｅｌｌ  ６９：５７７−５７８）。
【０００７】
Ａ型インフルエンザの複製は、感染のインビボ及びインビトロモデルの両方でＭ２に対する抗体により阻害されると述べられている（Ｚｅｂｅｄｅｅ及びＬａｍｂ，１９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２７６２−２７７２；Ｈｕｇｈｅｙら、１９９５  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１２：４１１−４２１）。Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎら（１９９５  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１３９９−１４０２）は、全長Ｍ２をワクチン接種したマウスにおいて、異種のＡ型インフルエンザによる致死性の感染が防御され、感染した肺組織からのウイルス除去が促進されたことを示す実験について述べている。
【０００８】
最近、疎水性膜貫通ドメインが除去された改変型Ｍ２タンパク質がワクチン調製に有用であることが報告された（米国特許第６，１６９，１７５号）。別の方向から、Ｎｅｉｒｙｎｃｋら（１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７−１１６３）が、Ｍ２の細胞外ドメインをＢ型肝炎コア抗原のＮ末端に融合させたものを用いることについて述べている。肝炎コア抗原をウイルス様粒子に組み込んだ場合、Ｍ２エピトープは、Ｂ型肝炎コア抗原の露出されたＮ末端の一部として存在すると考えられた。この著者らは、これらの系において、ウイルス粒子及び感染細胞でのＭ２タンパク質の野生型の構造を模倣する形で、Ｂ型肝炎コア抗原に対するＮ末端融合物がＭ２エピトープを提示することについて述べている。
【０００９】
しかし、このアプローチは、Ｍ２に相当するワクチン標的が欠けているのでＢ型ウイルスまで拡大することができない。Ｂ型インフルエンザウイルスにおけるＭ２に相当する機能を有するものとして最も有望な候補タンパク質、ＢＭ２は、５アミノ酸から７アミノ酸のみという非常に短い細胞外ドメインを有する（Ｍｏｕｌｄら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ５，１７５−１８４，２００３）。他の候補タンパク質、ＮＢは、最近、インビトロにおいてウイルス複製に不要ではないことが示された（Ｈａｔｔａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，６０５０−６０５４，２００３）。
【００１０】
普遍的なＢ型インフルエンザワクチンを開発するための別のアプローチは、ＨＡ０と呼ばれるＨＡ前駆体の成熟のための切断部位を利用するものである。ＨＡの保存的エピトープ及び特にＨＡ０の保存的エピトープを標的とするワクチンは、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザの両方に適応可能であると考えられる。
【００１１】
外被糖タンパク質ＨＡは、ウイルスの初期接着及びそれに続く内在化の両方を仲介する（Ｓｋｅｈｅｌら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９，５３１−６９，２０００）。ＨＡは、２つのサブユニット、ＨＡ１及びＨＡ２から構成されるが、これらはその前駆体ＨＡ０から切り出されたものである（Ｓｋｅｈｅｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７２，９３−７  １９７５；Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  ９５，４０９−１７，１９９８）。ＨＡ０の成熟は、細胞内プロセスであり、ウイルスが複製している細胞により分泌されるプロテアーゼが介在する（Ｚｈｉｒｎｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６８，１０２０−６（２００３））。プラスミン、カリクレイン、ウロキナーゼ、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ、アクロシン、トリプターゼ  クララ、トリプターゼＴＣ３０、ミニプラスミン、ヒト呼吸器洗浄液由来のプロテアーゼ及びスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、黄色ブドウ球菌）及びシュードモナスエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  緑膿菌）由来の細菌性プロテアーゼを含む、多くの分泌酵素がＨＡ０切断に関与している。ＨＡ０がＨＡ１−ＨＡ２となるように切断されることより、ウイルス感染が活性化されるが（Ｋｌｅｎｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８，４２６−３９，１９７５；Ｌａｚａｒｏｗｉｚ＆Ｃｈｏｐｐｉｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８，４４０−５４（１０７５））、これはヒト及び鳥類ホストにおける病原性に極めて重要である（Ｋｌｅｎｋ  ＆  Ｇａｒｔｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，３９−４３  １９９４；Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５８，１−２０，１９９９）。
【００１２】
ホストプロテアーゼに対する感受性を決定するＨＡの主な特徴は、ＨＡ０前駆体のタンパク質分解部位の構成であるが、Ｘ線結晶解析により、Ａ型インフルエンザに対するその構造が最近解明された（Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  ９５，４０９−１７，１９９８）。ＨＡ０は、プロセシングを受けた成熟ＨＡ１−ＨＡ２タンパク質とほぼ同じであり、主として切断部位周辺の１８残基が異なっている。前駆体において、これらの残基は、広がった非切断ループとして折りたたまれている。サブユニット間の切断部位のアミノ酸配列は、各インフルエンザサブタイプ内、およびＢ型インフルエンザの２つの株内で非常によく保存されている。融合ペプチドに対応するＨＡ２側も、Ａ型インフルエンザサブユニットにおいてよく保存されており、Ｈ３及びＨ１、ならびにＢ型インフルエンザについてもほぼ同じである。
【００１３】
本願を通して、ＨＡ０ペプチドという用語は、ＨＡ０の一次配列由来のあらゆるペプチドを表すために使用される。これにはＨＡ０に特有の切断部位配列が含まれるが、それだけでなく、ＨＡ０前駆体及び成熟ＨＡが共有するいかなる配列も含まれる。同様に、成熟ＨＡは、２つの共有結合サブユニット、ＨＡ１及びＨＡ２から構成される。このような理由から、切断部位配列と異なるＨＡ０ペプチドは、あるいは、ＨＡペプチド又はＨＡ２ペプチドを意味する。これらの用語はそれぞれ、本明細書中でＨＡ０ペプチドを意味するクラス内のペプチドのタイプを意味する。
【００１４】
このアプローチの実現可能性は、まず、Ｎａｇｙら（ＨＡ０（サブタイプＨ１）の配列３１７−３４１に相当する合成ペプチドを用いてワクチン接種したマウスにおいて、致死性のウイルス感染がある程度防御された（Ｎａｇｙら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０，２８１−９１，１９９４）ことを示した。）により調べられた。ウイルス複製におけるプロテアーゼ阻害剤の効果から、ＨＡ０のＨＡ１−ＨＡ２への転換がワクチン標的として有効であることがさらに確認された。単一タイプの切断部位を有するインフルエンザウイルスにおいて、セリンプロテアーゼ阻害剤は、ＨＡ０切断を抑え、培養細胞、ヒト気道上皮及び感染マウスの肺におけるウイルス活性化を低下させることができる（Ｚｈｉｒｎｏｖら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６３，４６９−７４，１９８２；Ｚｈｉｒｎｏｖら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６５，１９１−６，１９８４；Ｚｈｉｒｎｏｖら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，８６８２−９，２００２）。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の要約
本発明のある局面は、複数のペプチドが、それぞれＡ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質の細胞外エピトープを含有し、キャリアタンパク質の表面に連結している（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、タンパク質−ペプチド連結物又は医薬適合性のその塩である。
【００１６】
本発明の別の局面は、複数のペプチドが、それぞれＡ型インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質のエピトープを含有し、キャリアタンパク質の表面に連結している、タンパク質−ペプチド連結物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又は医薬適合性のその塩である。
【００１７】
本発明の別の局面は、複数のペプチドが、それぞれＢ型インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質のエピトープを含有し、キャリアタンパク質の表面に連結している、タンパク質−ペプチド連結物又は医薬適合性のその塩である。
【００１８】
特定の実施形態において、前記ペプチドは、前記タンパク質表面の反応部位に対する共有結合ペプチドにより前記タンパク質に連結する。得られる構造は連結物である。前記タンパク質表面における反応部位は、化学的に活性があるか、又は活性化され得、ペプチドとの共有結合のために立体的に見て利用できる部位である。好ましい反応部位は、アミノ酸リジンのイプシロン窒素である。共有結合されるとは、生理的条件下での加水分解に対して安定である共有結合の存在を意味する。好ましくは、共有結合は、付加体形成、酸化及び還元を含む、生理的条件下で起こり得る他の反応に対して安定である。ペプチドのタンパク質への共有結合は、「結合生成手段」により遂行される。そのような方法は、本明細書中に記載されている対応する構造、物質又は作用及びそれらの同等物の範囲にわたる。
【００１９】
本発明のこの局面の特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、ワクチン接種の分野で有用な抗原性タンパク質である。本発明のある特定の実施形態において、本抗原性タンパク質は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、髄膜炎菌）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）である。他の実施形態において、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、キーホールリンペットヘモシアニン、ロタウイルスキャプシドタンパク又はウシもしくはヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えば、タイプ６、１１又は１６の  ＨＰＶのＶＬＰ、のＬ１タンパク質、である。
【００２０】
本発明のこの局面のさらなる実施形態において、本ペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端を介してキャリアタンパク質に連結する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本ペプチドは、リンカー部分を介してキャリアタンパク質に連結する。特定の実施形態において、このリンカーは、モノジェネリック（Ｍｏｎｏｇｅｎｅｒｉｃ）又はバイジェネリックスペーサー（ｂｉｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）である。
【００２２】
さらなる実施形態において、本キャリアタンパク質は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、髄膜炎菌）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）であり、その連結物は、各ＯＭＰＣの表面に連結した約１００ペプチドから約６０００ペプチドを有する。
【００２３】
さらなる実施形態において、本ペプチドの配列における天然に生じるアミノ酸を、他のアミノ酸で置換する。ある特定の実施形態において、システイン残基をセリン残基で置換する。
【００２４】
さらなる実施形態において、本ペプチドの配列を改変して、本ペプチドの等電点を変更する。
【００２５】
本発明の別の局面は、連結物、アジュバント及び生理学的に許容可能な担体を有するワクチンである。特定の実施形態において、前記アジュバントは、アルミニウムを基にしたアジュバントである。特定の実施形態において、本ワクチンにはさらに、陽イオン性アジュバント、例えばＱＳ２１アジュバントが含まれる。
【００２６】
本発明の別の局面は、Ｍ２連結物及びＢ型インフルエンザ由来のＨＡ０ペプチド連結物、アジュバント及び生理学的に許容可能な担体を有するワクチンである。
【００２７】
本発明の別の局面は、Ｍ２連結物及びＡ型インフルエンザ由来のＨＡ０ペプチド連結物、Ｂ型インフルエンザ由来のＨＡ０ペプチド連結物、アジュバント及び生理学的に許容可能な担体を有するワクチンである。
【００２８】
本発明の別の局面は、多数のペプチドそれぞれが、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質の細胞外エピトープを含有し、キャリアタンパク質の表面に連結する、ペプチド−タンパク質連結物又は医薬適合性のその塩を含有するワクチンを用いた、Ａ型インフルエンザウイルス感染により起こる疾患に対する、患者のワクチン接種方法である。好ましい実施形態において、本発明のワクチンを有効量患者に投与する。
【００２９】
本発明の別の局面は、多数のペプチドそれぞれがＡ型インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質のエピトープを含有し、キャリアタンパク質の表面に連結する、タンパク質−ペプチド連結物又は医薬適合性のそれらの塩を含有するワクチンを用いた、Ａ型インフルエンザウイルス感染により起こる疾患に対する、患者へのワクチン接種方法である。好ましい実施形態において、本発明のワクチンを有効量患者に投与する。
【００３０】
本発明の別の局面は、多数のペプチドそれぞれが、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質のエピトープを含有し、キャリアタンパク質の表面に連結する、タンパク質−ペプチド連結物又は医薬適合性のその塩を含有するワクチンを用いた、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルス感染により起こる疾患に対する、患者へのワクチン接種方法である。好ましい実施形態において、本発明のワクチンを有効量患者に投与する。
【００３１】
本発明の別の局面は、インフルエンザのＭ２タンパク質の細胞外エピトープの配列を有するペプチドをタンパク質表面の反応部位に共有結合させることにより、ペプチド−タンパク質連結物を作成する方法である。
【００３２】
本発明の別の局面は、本発明の連結物を補い、補助された本連結物を医薬適合性の担体を用いて処方することによりワクチンを作成する方法である。
【００３３】
本発明の別の局面は、抗原性成分の１つが、キャリアタンパク質表面のアミノ酸に連結するＡ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質の細胞外エピトープを有するペプチドを含有する、併用ワクチンである。特定の実施形態において、この併用ワクチンは、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、Ａ、Ｂ又はＣ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、ロタウイルス、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、肺炎球菌）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、黄色ブドウ球菌）から選択される抗原性成分を含有する。さらに、本発明ワクチンを、特に、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ由来のエピトープを含む、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスの他の抗原性成分と組み合わせることができる。
【００３４】
本発明の詳細な説明
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質の細胞外エピトープを含有する複数のペプチドがキャリアタンパク質表面のアミノ酸に連結している、インフルエンザワクチンを提供する。連結物の調製及びワクチンの処方方法を本明細書中で提供する。本発明はまた、疾患に対する長期間にわたる防御効果を患者に対して付与し、Ａ型インフルエンザウイルスの感染により起こった症状を軽減する、患者へのワクチン接種方法も提供する。
【００３５】
ペプチド
Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質細胞外部分は通常、そのタンパク質の２４個のＮ末端アミノ酸として認識される。ワクチンにおいて用いるペプチドは、この２４アミノ酸配列中から選択されるアミノ酸配列を有する。そのペプチドの特定の配列は、その２４個全てのアミノ酸配列又は少なくとも７アミノ酸を有し、抗原エピトープを含むその一部であり得る。
【００３６】
注目すべきは、インフルエンザＭ２タンパク質の最初のアミノ酸がメチオニンであるという点である。本発明のあらゆる実施形態において、終末メチオニンの存在は任意である。
【００３７】
２４個のＮ末端アミノ酸の有効なサブ配列は、例えば、次の過程を介して決定し得る。最初に、産生される抗体が前記２４個のアミノ酸配列に対して結合するかどうかを決めるために、サブ配列を有するペプチドを調べる。次に、そのペプチドをキャリアタンパク質に連結させ、得られた連結物を使用して、マウス、フェレット又はサル等の動物にワクチン接種する。動物から採取した血清にそのペプチドに対する抗体があるかどうかを調べる。最後に、その動物に対してインフルエンザウイルス感染処理を行う。感染の経過及びその結果起こった疾患の重症度を評価する。この過程は、多数の動物で行うことが望ましく、全ての動物にわたり結果を評価する。この連結物によるワクチン接種により感染レベルが低下したか、又はこの結果起こる疾患の重症度が低下した場合は、そのペプチドをワクチン調製において有用であるとみなす。
【００３８】
好ましい実施形態において、本ペプチドのアミノ酸配列には、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４個等のＭ２タンパク質Ｎ末端アミノ酸が含まれる。最小サイズは、患者の免疫系に提示したいエピトープの大きさによってのみ限定される。ある好ましいアミノ酸配列は、配列番号１、１０及び３９である。
【００３９】
【表１】
2006519775.tif 000002
2006519775.tif 000003
【００４０】
本ペプチドのアミノ酸配列に、Ｍ２タンパク質の位置１７又は位置１９のシステインが含まれる実施形態において、好ましくは、このシステインをセリンに置換し得る。使用する連結技術に依存して、システインの反応性により、このペプチドの付加末端システインではなく、内部のシステインにおいて、このペプチドの多量体形成、ペプチドとペプチドとの連結又はキャリアタンパク質へのペプチドの連結が起こる可能性があるため、システインをセリンに置換することは有用である。これらの副反応の結果、この連結物に対するペプチド負荷率が低くなる。しかし、注目すべきことは、このペプチドの内部システインにおけるキャリアタンパク質へのこのペプチドの連結により、効果のないワクチンが生じないであろうという点であり、これは本発明の範囲内である。
【００４１】
ＨＡ０の一定のセグメント、特に、サブユニット間切断部位領域及びＨＡ２サブユニットにあるセグメントは非常によく保存されている。インビボの免疫原性及び広範囲に及ぶ一連の重複ＨＡ０ペプチドを用いた防御に関する研究に基づいて、防御的エピトープを含有するいくつかのＨＡ０領域を同定した。ある領域はＨＡ０の切断部位を包含し、他のものはＨＡ２サブユニットに位置する（下表参照）。
【００４２】
さらに、ＨＡペプチドを用いて調製した連結物及びＭ２ペプチドを用いて調製した連結物の併用により、それぞれの連結物を単独で投与した場合と比較して、Ａ型インフルエンザにより起こる疾患に対して、より優れた防御効果が得られる。従って、本発明のある好ましい実施形態は、他の保存的で防御効果のあるインフルエンザウイルスペプチドから構成される連結物と組み合わせた、Ｍ２ペプチド連結物を含有するワクチンである。本発明の方法の好ましい実施形態は、患者にそのようなワクチンを投与し、その患者が、Ｍ２ペプチド連結物のみを含有するワクチンの投与において見られる免疫反応よりも優れたＡ型インフルエンザに対する免疫反応を得ることである。
【００４３】
ＨＡペプチドを以下から選択することができる。
【００４４】
【表２】
2006519775.tif 000004
2006519775.tif 000005
2006519775.tif 000006
2006519775.tif 000007
ＢｒＡｃ＝ブロモアセチル
Ａｃ＝アセチル
Ｍａｌ＝マレイミジル
Ｓｕｃ＝スクシニル
Ａｈｘ＝６−アミノへキサン酸
ｂ＝βアラニン
Ａｂｕ＝２−アミノ酪酸
【００４５】
さらに、Ｂ型インフルエンザＨＡ０切断部位ペプチドを用いて調製した連結物とＡ型インフルエンザＭ２ペプチドを用いて調製した連結物との併用により、Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ両方により起こる疾患に対する防御能を付与することができた。従って、本発明のある好ましい実施形態は、他の保存的で防御効果のあるＢ型インフルエンザ由来のペプチドから構成される連結物と組み合わせた、Ｍ２ペプチド連結物を含有するワクチンである。本発明のさらに好ましい実施形態は、他の保存的で防御効果のあるＡ型インフルエンザ由来ペプチドから構成される連結物及び他の保存的で防御効果のあるＢ型インフルエンザ由来ペプチドから構成される連結物と組み合わせた、Ｍ２ペプチド連結物を含有するワクチンである。本発明の方法の好ましい実施形態は、患者にそのようなワクチンを投与して、その患者が、Ｍ２ペプチド連結物のみを含有するワクチンの投与において見られる免疫反応よりも優れた、Ａ型インフルエンザに対する免疫反応を得ることである。
【００４６】
Ｍ２又はＨＡ０ペプチド抗原もまた、リジン又は他の適切な骨格における、多抗原ペプチド（ＭＡＰｓ）により提示することができる。本発明の連結ワクチンにおいて、そのような方法で並べられたペプチドを使用することができる。その例を図１５から１８及び２０から２１に示す。本発明の連結ワクチンにおける、ペプチドの別の代替的提示方法は、二量体のＭ２又はＨＡ０ペプチドである。この方式において、結合、好ましくは共有結合を介して、２つのペプチドを架橋し、二量体を形成させる。Ｍ２ペプチドに対する例は、図１９で見ることができる。この方式で本ペプチドが並んでいる連結ワクチンは、対応する単量体ペプチド連結物を用いて調製したワクチンよりも抗原性が強いであろう。
【００４７】
本分野において公知の技術を用いてペプチドを生産し得る。そのような技術には、化学的及び生化学的合成が含まれる。ペプチドの化学合成に対する技術の例は、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０に記載されている。細胞への核酸導入及び核酸発現を用いた生化学的合成技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００４８】
キャリアタンパク質
本明細書中で使用する場合、キャリアタンパク質は、本ペプチドが連結する免疫原性タンパク質を意味する。本分野で様々なキャリアタンパク質が知られており、多糖類−タンパク質連結ワクチンにおいて使用されている。本発明のワクチンにおいて、これら及び他の免疫原性タンパク質も使用することができる。好ましいキャリアタンパク質は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、髄膜炎菌）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）及びコア抗原タンパク質（ＨＢ  Ｃｏｒｅ）を含むＢ型肝炎ウイルスタンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロタウイルスキャプシドタンパク質及びウシ又はヒトパピローマウイルス  ＶＬＰ、例えばタイプ６、１１又は１６等のＨＰＶのＶＬＰ、のＬ１タンパク質である。
【００４９】
製造を容易にするため、連結物の製造に１種類のキャリアタンパク質を使用し得る。しかし、それぞれにおいて、様々なキャリアタンパク質を用いて、複数の連結物を調製することもできる。次に、ワクチンを処方する際、連結物を混合することができる。この方式において、インフルエンザに対する免疫反応を生じさせることに加えて、この連結物において使用する様々なキャリアタンパク質に対する免疫反応も生じさせるワクチンを提供することができる。必要に応じて、様々なペプチド及びキャリアタンパク質を組み合わせた連結物のさらなる置換も可能である。
【００５０】
好ましいキャリアタンパク質はＯＭＰＣである。ＯＭＰＣには、連結に利用できる多数の反応部位が含まれる。連結に対する反応部位の利用可能性は、ＯＭＰＣにおいて存在する原子の配置及びその基の位置により決定される。連結に利用できる求核性官能基は、本分野で公知の技術を用いて決定され得る。（Ｅｍｉｎｉら、米国特許第５，６０６，０３０号を参照。）。連結のための反応部位として使用できる基のうちあるタイプは、リジンのイプシロンアミノ基及びタンパク質のＮ末端アミノ酸のアルファアミノ基等の、アミノ酸に存在する一級アミノ基である。さらに、ＯＭＰＣのチオール化型を得るためのこれらのアミノ基の変換により、チオール反応性ペプチドに対して連結に使用し得る反応性のある官能基が得られる。チオール反応性ペプチドの例は、図１３で説明するような、ブロモアセチル化又はマレイミド誘導体化ペプチドである。Ｆｕ，米国特許第５，４９４，８０８号により記載されているような本分野で公知の技術を用いて、ＯＭＰＣを得ることができる。
【００５１】
キャリアタンパク質の別の好ましいカテゴリーは、ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）へと自己集合することができるウイルスキャプシドタンパク質に代表される。ペプチドキャリアとして使用されるＶＬＰｓの例は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びコア抗原（ＨＢｃＡｇ）（Ｐｕｍｐｅｎｓら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＢｓ，ＨＢｃ，ａｎｄ  ｆｒＣＰ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６  Ｅ７  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ（ヒトパピローマウイルス１６Ｅ７癌タンパク質エピトープ発現のためのＨＢｓ、ＨＢｃ及びｆｒＣＰウイルス様粒子の評価）」，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．２４−３２，２００２）、Ｅ型肝炎ウイルス粒子（Ｎｉｉｋｕｒａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ（外来エピトープを提示する、経口ワクチンビヒクルとしてのキメラ組み換えＥ型肝炎ウイルス様粒子）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９３，ｐｐ．２７３−２８０，２００２）、ポリオーマウイルス（Ｇｅｄｖｉｌａｉｔｅら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎｔｏ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ハムスターポリオーマウイルス主要キャプシドタンパク質の表面露出領域へのエピトープの挿入による免疫原性ウイルス様粒子の形成）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ．２１−３５，２０００）、及びウシパピローマウイルス（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（パピローマウイルス様粒子への自己抗原の連結により、防御性のある自己抗体が効果的に誘導される。）」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１０８（３），ｐｐ．４１５−４２３，２００１）である。最近、本物のウイルス粒子の分子量及びサイズを模倣するような、抗原提示人工ＶＬＰｓが構築された（Ｋａｒｐｅｎｋｏら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｘｐｏｓｉｎｇ  ＨＩＶ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（ＨＩＶエピトープを露出する人工ウイルス様粒子の構築及びその免疫原性特性の研究）」、Ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｐ．３８６−３９２，２００３）。
【００５２】
ペプチド抗原キャリアとしてパピローマウイルスＶＬＰｓを使用することにより、免疫系から最適の反応を確実に得られると考えられる規則正しい配列で抗原性配列を提示できるようになるという利益が得られ得る。ある報告において、２０面体のビリオンを模倣したマトリックスにおいて抗原性配列を露出したところ、自己と外来物とを区別するという液性免疫系の能力がなくなるということが分かった（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ＣＣＲ５  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（組み換えパピローマウイルス粒子によるマウスＣＣＲ５に対する自己抗体の誘導）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２３７３−２３７８，１９９９）。マウス自己ペプチドＴＮＦ−αをパピローマウイルス  ＶＬＰｓと連結させることにより、タイターの高い、長期間持続する自己抗体がマウスにおいて誘導される。最小抗原キャリアとしてＶＬＰｓを用いる場合、ＶＬＰキャリアへ前もって曝露することで誘導される抗キャリア抗体の存在によって起こる発現した連結ワクチンへの免疫原性低下をいかに回避するか、ということが課題の１つとして挙げられる。
【００５３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＶＬＰｓは、サイズが約６０ｎｍの典型的な２０面体の格子構造を持ち、それぞれが、７２個の  Ｌ１タンパク質５量体（カプソマーと呼ばれる。）のアセンブリーにより形成される（Ｃｈｅｎら、２０００；Ｍｏｄｉｓら、「Ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ（パピローマウイルスキャプシドの原子モデル）」，ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．２１，ｐｐ．４７５４−４７６２，２００２）。ウシパピローマウイルス  ＶＬＰｓは、Ｌ１タンパク質（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら、１９９９）又はＶＬＰｓのＬ２（Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｌｉｃｉｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｅ７  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｎ  ＨＰＶ  １６  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ（キメラパピローマウイルス  ウイルス様粒子が、ＨＰＶ  １６  腫瘍モデルにおいて、Ｅ７癌タンパク質に対する抗腫瘍免疫を誘導する。）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９５，ｐｐ．１８００−１８０５，１９９８）タンパク質への遺伝子融合により挿入されているか、又は後にビオチン化ＶＬＰｓに結合させるストレプトアビジンと融合されている（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら、２００１）かいずれかの抗原配列を運ぶためにうまく使用されている。
【００５４】
上記で引用した参考文献及び次の代表的な特許及び特許明細書、米国特許第６，１５９，７２９号、第５，８４０，３０６号、第５，８２０，８７０号及び国際特許ＷＯ第０１／１４４１６号により示されるように、本分野において、ヒト及びウシパピローマウイルスＶＬＰｓの調製は公知である。
【００５５】
下記の実施例において、インフルエンザのペプチド断片をヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に化学的に連結させることにより得られる代表的な連結ワクチンの調製及び免疫原性を説明する。その結果として生じる連結分子は、ＶＬＰ１個あたり抗原ペプチド  約８００コピーから４，０００コピーを含有し、そのペプチドのＣ末端システイン残基及びマレイミド活性化ＨＰＶ  ＶＬＰｓを反応させることにより得られる。これらの連結物の平均粒子サイズは、ＶＬＰキャリア単独の場合よりもわずかに大きく、化学的及び温度誘発性の変性に対して概して安定性が優れている。Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物は、ある抗ＨＰＶ立体配置抗体に対する結合親和性を失っていたが、抗Ｍ２抗体により完全に認識された。インフルエンザＭ２ペプチド−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結ワクチンを、アルミニウムアジュバントとともに処方した。３０ｎｇペプチドを２回投与すると、非常に高い免疫原性を示し、マウスにおける致死性のインフルエンザウイルス感染処理に対する優れた防御効果が付与された。これらの結果から、連結ワクチンにおけるインフルエンザペプチド用のキャリアとして、ＨＰＶ  ＶＬＰを使用し得ることが示される。
【００５６】
化学的カップリングインフルエンザペプチド連結ワクチンを開発するために抗原キャリアとしてヒトパピローマウイルス  ＶＬＰ系を使用することにより、一定の利益が得られる。化学的カップリングにより、ＶＬＰｓの正しいアセンブリーを妨害する可能性のあるＬ１配列へのペプチド挿入において起こり得る問題が避けられ、また、化学的カップリングはビオチン化及び結合法よりもかなり容易である。さらに、この結果から、以前に報告された方法と比較して、化学的カップリングにより、ＶＬＰあたりのペプチド負荷が非常に高くなることが分かる。さらに、以下の実施例において、ペプチド連結プロセスにより、ＨＰＶ  ＶＬＰｓの形態における顕著な変化が誘導されなかった。従って、本発明の範囲内でワクチンを構築するために、ＨＰＶ  ＶＬＰｓ及び類似のウシパピローマウイルスＶＬＰｓを含むＶＬＰｓを使用することができる。
【００５７】
連結
本分野のあらゆる連結方法を用いて、本発明のペプチド及びキャリアを連結させ得る。例えば、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイロキシ］スルホスクシニミドエステル（ｓＥＭＣＳ）、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）、グルタールアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）、ビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＢ）又はＮ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ）を用いて連結を遂行し得る。
【００５８】
キャリアマレイミド活性化法において、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）又はＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）を用いて連結を遂行し得る。ｓＳＭＣＣを用いた方法は広く用いられ、特異性が高い（例えば、Ｍｅｙｅｒら、２００２、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．７６，２１５０−２１５８を参照のこと。）。ｓＳＭＣＣは、システイン残基のＳＨ基をキャリアタンパク質のリジン残基のアミノ基に架橋する。
【００５９】
ｓＳＭＣＣを用いた連結反応において、キャリアは、ｓＳＭＣＣ試薬をキャリアのアミン（例えばリジン）残基に結合させることにより、まず活性化される。活性化キャリアを過剰な試薬及び副産物から分離した後、システイン含有ペプチドを付加し、活性化キャリアのマレイミド官能基にＳＨ基を付加することにより結合を生じさせる。ＭＢＳを用いた方法により、同様の機構を介してペプチドとキャリアとを連結させる。
【００６０】
ｓＳＭＣＣを用いた連結は、ＳＨ基に対して高い特異性があり得る。従って、本ペプチド中のシステイン残基は、連結を容易に行うために必須である。ペプチドにシステイン残基がない場合、そのペプチドの好ましくはＮ末端又はＣ末端にシステイン残基を付加すべきである。そのペプチド中の望ましいエピトープにシステインが含まれる場合、ｓＳＭＣＣ活性化キャリアを使用しない方法で連結を遂行すべきである。そのペプチドが複数のシステイン残基を含有する場合、過剰なシステイン残基を置換又は修飾することが可能でない限り、ペプチドをｓＳＭＣＣを用いてキャリアと連結させるべきではない。
【００６１】
結合は、そのペプチド中の望ましいエピトープを妨害するようなものであるべきではない。そのシステインは、好ましくは、望ましいエピトープ配列と、スペーサーとして少なくとも１アミノ酸は離れている。
【００６２】
本発明において有用な他の連結は、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ）を用いて行う。例えば、マレイミド化又はブロモアセチル化ペプチドと連結させるために、ＯＭＰＣにチオール官能基を導入するためにチオラクトンを使用し得る（Ｔｏｌｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１，１９９３，４５５−４６６；Ｃｏｎｌｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４，１２，４４５−４５１）。
【００６３】
本発明の特定の実施形態において、本ペプチドをキャリアタンパク質にカップリングさせるための連結反応には、ある反応物質における本質的な求核基の導入及び／又は使用、及びもう一方の反応物質における本質的な求電子基の導入及び／又は使用が含まれる。好ましい活性化スキーム（Ｉ）（図１）は、求核チオール基をキャリアタンパク質（好ましくはＯＭＰＣ）に導入し、本ペプチドに求電子基（好ましくは、ハロゲン化アルキル又はマレイミド）を付加することと言えよう。得られる連結物は、本ペプチド及びキャリアに連結するチオールエーテル結合を持つことになる。本ペプチド求電子基（マレイミド又はハロゲン化アルキル）と、キャリアタンパク質の本質的な求核基（好ましくは、一級アミンまたはチオール）との直接反応により、二級アミン結合（スキーム（ＩＩ）図２）又はチオールエーテル結合が導かれる。しかし、同じ反応条件下においてアミンに対するチオール求核試薬の反応性がより高いことが予想されるので、スキームＩが好ましいであろう。代替スキームには、本キャリアへのマレイミド基の付加（ＩＩＩ）図３又はハロゲン化アルキルの付加（ＩＶ）図４、本ペプチドへの末端システインの導入及び／又は本質的なペプチドチオールの使用が含まれるが、これもチオールエーテル結合を生じる。
【００６４】
結合
イオウ含有アミノ酸は反応性のあるイオウ族を含有する。イオウ含有アミノ酸の例には、システイン及び非タンパク質アミノ酸（ホモシステイン等）が含まれる。さらに、反応性のあるイオウは、活性化及びキャリアとの反応前のジスルフィド型に存在し得る。マレイミド又はハロゲン化アルキル（スキームＩＩＩ（図３）及びＩＶ（図４））等の求電子基により活性化されたキャリアへのカップリング反応において、Ｍ２配列に存在するシステイン１７及び１９を使用し得る。反応性マレイミド及び活性化エステルを含有するヘテロ２官能価の架橋剤を用いたマレイミド基の導入がよく用いられる。多量体タンパク質に対する高レベルのマレイミド活性化を試みることにより、アミン基が架橋剤の両官能基と反応し得る架橋反応が起こり得る。その結果、利用可能なマレイミド基のレベルは低くなり、従って、ペプチド負荷が低くなる。多量体キャリアのサブユニットの架橋は、連結物の免疫原性及び／又は安定性にも影響を与え得る。複数のシステインを有するペプチドの場合、キャリアマレイミド又はハロゲン化アルキル基との複数の結合が１個のペプチドで起こり得る。これにより、ペプチドの負荷レベルがおそらく減少すると考えられる。この複数の結合が異なるキャリアタンパク質のマレイミドを介して生じる場合、そのペプチドを介するキャリアタンパク質サブユニットの架橋ができる可能性が生じ得る。Ｎ−アセチルシステインラクトンによるＯＭＰＣ一級アミンのチオレーション反応により、チオール基が高レベルになり、その結果、適切な緩衝液反応条件下においてキャリアサブユニット架橋（ジスルフィド結合形成を介して）が最小限になる（Ｍａｒｂｕｒｇら、１９８６  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：５２８２−５２８７）。１つの末端求電子基（マレイミド又はハロゲン化アルキル）によるペプチドの活性化により、キャリア連結への高い方向性を持ったペプチドによる、高レベルのペプチド負荷が起こり得る。
【００６５】
リンカー
ペプチドをキャリアに結合させる共有リンカーは生理的条件下で安定である。このようなリンカーの例は、非特異的架橋剤、モノジェネリックスペーサー（ｍｏｎｏｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）及びバイジェネリックスペーサー（ｂｉｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｐａｃｅｒ）である。非特異的架橋剤及びその使用は本分野で公知である。このような試薬及びそれらの使用の例には、グルタールアルデヒドとの反応；スクシニル化キャリアの混合を伴う、又は伴わない、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの反応；グリコシル化置換基の過ヨウ素酸塩酸化（その後、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でタンパク質キャリアの遊離アミノ基へのカップリングが行われる。）；非アシル化末端セリン及びスレオニン残基の過ヨウ素酸塩酸化により、末端アルデヒドが生じ得、次にそのアルデヒドをアミン又はヒドラジドと反応させて、シアノ水素化ホウ素で２級アミンに還元することができるシッフ塩基又はヒドラゾンを生じさせる反応；芳香族アミノ基のジアゾ化を行い、その後そのタンパク質のチロシン側鎖残基でカップリングを行う反応；イソシアネートとの反応；又は混合無水物の反応が含まれる。全般的には、Ｂｒｉａｎｄら、１９８５  Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．７８：５９を参照のこと。
【００６６】
モノジェネリックスペーサー及びそれらの使用は、本分野で公知である。モノジェネリックスペーサーは２官能性であり、連結を行う前に反応ペアの一方のみの官能基化が必要である。モノジェネリックスペーサー及びその使用の例には、カルボジイミド存在下における、２官能性分子アジピン酸ジヒドラジドの片方の末端への免疫原性ＨＣＶペプチドのカップリングが含まれる。おそらく、ジアシル化ヒドラジンは、キャリアのペンダントグルタミン酸カルボキシ基又はアスパラギン酸カルボキシ基とともに形を成す。次に、カルボジイミド存在下で、キャリアタンパク質との第二のカップリング反応により連結が行われる。
【００６７】
バイジェネリックスペーサー及びそれらの使用は、本分野で公知である。反応ペアの各パートナーが官能基化された後、バイジェネリックペーサーが形成される。官能基化された各パートナーがその対立するパートナーと反応して安定した共有結合（１個又は複数）を形成する際に連結が起こる（例えば、Ｍａｒｂｕｒｇら、１９８６  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：５２８２−５２８７；及びＭａｒｂｕｒｇら、米国特許第４，６９５，６２４号参照。）。
【００６８】
ペプチドカップリングの負荷
本発明の利点は、様々なモル比でペプチドをキャリアタンパク質に連結させることができるということである。望ましい特性を有する連結を得るために、トライアンドエラー方式で連結方法の局面を変化させることにより、キャリアタンパク質における、この「ペプチドカップリング負荷」を変化させることができる。例えば、キャリアタンパク質の全ての反応部位をペプチドと連結させるような、高いカップリング負荷が望ましい場合、キャリアタンパク質の反応部位を評価し、カップリング反応に対して過剰なモル数のペプチドを用いることができる。低密度でカップリングさせることが望ましい場合、キャリアタンパク質の反応部位１モルあたりの反応に加えるペプチドが１モル未満になるようなモル比にすることができる。
【００６９】
選択する特定の条件は、最終的には、達成する回収率、連結物の生理学的特徴、得られる連結物の有効性、患者集団及び投与したい望ましい用量に基づく。ワクチンのタンパク質総量が重要な検討事項ではない場合、同じ有効用量を送達するために、様々なカップリング負荷及び様々な免疫原性の連結物の用量を処方することができる。しかし、タンパク質総量又は体積が重要である場合、例えば、連結物が、併用ワクチンにおいて使用することを意図するものである場合、最終併用ワクチンに対して連結物からもたらされるタンパク質の総体積に留意し得る。次に、様々なカップリング負荷を有するいくつかの連結物の免疫原性を評価し、その後、適切な免疫原性及びタンパク質の総量又は併用ワクチンに添加できる体積で連結物を使用するよう選択し得る。
【００７０】
一般に、ペプチド負荷量を高くする際、障壁となるものが主に２つある。（ｉ）得られる連結物の溶解度及び（ｉｉ）ペプチドの溶解度である。これらの特性は、独立したものではなく、後者を向上させる操作は、前者に対して不利益であり得る。従って、ペプチド負荷を高くすることは困難であることが多い。
【００７１】
従って、米国特許出願第６０／５３０，８６７号（２００３年１２月１８日出願）に記載されているように、ペプチドの配列を改変するのが望ましいと思われる。この出願には、ペプチドの免疫原性を向上させる方法が記載されている。その方法は、ペプチドを改変することによりペプチドの等電点（ｐＩ）を調整すること及びペプチドをキャリアに連結させることを含む。本明細書中で使用する場合、「ペプチドのｐＩを調整する」ということは、ペプチド負荷及び連結物の溶解度の両方が向上するような範囲に、ペプチドのｐＩを変化させることを意味する。ペプチドのｐＩは、上記範囲に低くされることが多い。
【００７２】
等電点電気泳動法（ＩＥＦ）等の実験又は適切なソフトウェアを用いた計算のいずれかにより、ペプチドのｐＩを決定し得る。米国特許出願第６０／５３０，８６７号に記載されているように、ペプチドのｐＩを、そのペプチド全体の電荷を変更する様々な方法で変更することができる。この改変は、結果としてそのペプチドの電荷が変化するような、ペプチドに対するいかなる変更でもあり得る。このような改変には、ペプチドにおけるアミノ酸残基の置換、付加又は欠失が含まれる。その改変には、ペプチドの残基又はＮ末端アミノ基もしくはＣ末端カルボキシル基の側鎖の改変も含まれ得る。そのような改変の方法は当業者の知識の範囲内である。
【００７３】
免疫原性の点で活性のある配列、すなわち望ましいエピトープの外側でそのペプチドを改変すべきである。つまり、免疫原性特性を維持しなければならないということである。改変にペプチドの望ましいエピトープが含まれたり、そのエピトープが妨害されることがないようにすべきである。改変によりペプチド連結物の免疫原性特性に影響を与えてはならないので、ペプチドのＮ及び／又はＣ末端で改変を導入することが好ましい。
【００７４】
カップリング負荷が最大であれば常に最大の免疫原性を有する連結物が得られる訳ではないことにも留意すべきである。いかなるキャリアタンパク質においても、ペプチドの長さ及びカップリング負荷により、連結物の全体的な免疫原性に影響が及ぼされ得る。従って、あらゆるキャリアタンパク質のあらゆる特定のペプチドの一連のカップリング負荷の免疫原性を評価すべきである。そのような情報から、患者において許容可能な免疫原性反応を刺激するために、適切な用量の連結物を付与するようにワクチンを製造及び処方することができる。
【００７５】
処方
本分野で公知であり使用されている方法に従い、本発明ワクチンを処方することができる。例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｒｓｔａｋ，Ｐｌｅｎｕｍ編  Ｍｅｄ．Ｃｏ．１９９４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０；及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  第２版、Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０において、一般的な医薬投与のガイドラインが示されている。
【００７６】
本発明の連結物を酸性塩又は塩基性塩として調製することができる。医薬適合性の塩（水溶性もしくは油溶性、又は分散製品）には、例えば、無機もしくは有機酸又は塩基から形成される、従来の非毒性塩又は四級アンモニウム塩が含まれる。そのような塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩等の酸付加塩；及びアンモニウム塩、ナトリウム及びカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等の有機塩基を有する塩及びアルギニン及びリジン等のアミノ酸を有する塩等の塩基性塩が含まれる。
【００７７】
連結に使用する特定のキャリアタンパク質との使用ならびに最終処方物のイオン構成に適切であるようにアジュバントを選択するのが好ましい。ワクチンに連結物のみを処方するのか、又は併用ワクチンに連結物を処方するのかということも考慮すべきであろう。後者の例において、最終併用ワクチンに含有されるであろう緩衝液、アジュバント及び他の処方成分を考慮すべきである。
【００７８】
本分野において、アルミニウムを用いたアジュバントが一般に使用され、それには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、水酸化リン酸アルミニウム及び水酸化硫酸リン酸アルミニウムが含まれる。一般に使用されるアジュバントの商品名には、ＡＤＪＵＰＨＯＳ、ＭＥＲＣＫ  ＡＬＵＭ及びＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬが含まれる。連結物を使用する特定のアジュバントに必要かつ適切なように、そのアジュバントと結合又は共沈殿させ得る。
【００７９】
非アルミニウムアジュバントも使用可能である。非アルミニウムアジュバントには、ＱＳ２１、リピッド−Ａ及びそれらの誘導体又は変異体、フロイド完全もしくは不完全アジュバント、中性リポソーム、ワクチン及びサイトカインもしくはケモカイン含有リポソームが含まれる。
【００８０】
本ワクチンはアルミニウムアジュバントとともに処方されることが好ましい。他の好ましい実施形態において、アルミニウムアジュバント及びＱＳ２１の両方とともに本ワクチンを処方する。
【００８１】
ある実施形態において、本願に記載するように、Ｂ型インフルエンザ由来の免疫原とともに、及び／又は、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、Ａ、Ｂ又はＣ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、ロタウイルス、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、肺炎球菌）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、黄色ブドウ球菌）由来の免疫原とともに、Ｍ２ペプチド−タンパク質連結物を処方することが好ましい。さらに、本発明ワクチンを、特に、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ由来のエピトープを含むＡ型インフルエンザウイルスの他の抗原成分と組み合わせることができる。この方式において併用ワクチンを調製できる。併用ワクチンの利点は、患者にとって楽であり、必要な接種回数が少ないので投与コストを低く抑えられるという点である。
【００８２】
併用ワクチンを処方する際、他の免疫原とともに使用されている様々な緩衝液及びアジュバントに留意すべきである。ある緩衝液は、ある免疫原−アジュバントの組み合わせに適切であり得るが、他のものには適切ではない可能性がある。特に、最終処方物における適合性を確認するために、様々な免疫原−アジュバントの組み合わせにおけるリン酸レベルの効果を評価すべきである。
【００８３】
ワクチン接種
患者に対して、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内等の様々な経路により、本発明のワクチンを投与することができる。好ましい経路は、筋肉内である。対象者の年齢、体重、性別及び健康状態；投与経路；望ましい効果；及び用いる特定の連結物（例えば、ペプチド、キャリアに対するペプチド負荷等）を含む本分野で公知の要因を考慮して、適切な投薬計画を好ましく決定する。複数回投与ワクチン接種方式で本ワクチンを使用することができる。１回分は、１μｇから１．０ｍｇ総タンパク質の範囲で構成されると予想される。本発明のある実施形態において、その範囲は、０．１ｍｇから１．０ｍｇである。しかし、送達するペプチド量に基づいて用量を調整するのが好ましいと思われる。いずれにせよ、これらの範囲はガイドラインである。免疫学的に有効な量を送達するよう、生成連結物の免疫原性を評価することにより、さらに正確な用量を決定すべきである。免疫学的有効量とは、インフルエンザウイルス感染により起こる疾患に対して免疫記憶が長期防御を与えるのに十分なレベルを確立できるように、患者の免疫系を刺激するものである。連結物は、アジュバントとともに処方することが好ましい。
【００８４】
投与タイミングは、本分野で公知の因子に依存する。初回投与後、抗体タイターを維持するために、１回又は複数回の免疫促進投与をその後に行い得る。投与計画の例は、第１日の投与、１ヶ月又は２ヶ月の時点での第二の投与、４、６又は１２ヶ月のいずれかにおける第三の投与及び必要に応じて時間間隔をおいた、さらなる免疫促進投与である。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、患者又は対象は、動物である。ワクチン接種に対して、哺乳類及び鳥類、特に家禽が適切な対象である。好ましくは、前記患者はヒトである。患者は、その患者が免疫反応を生じさせることにより本ワクチンの接種に反応することができるあらゆる年齢であり得る。そのように生じた免疫反応により、インフルエンザウイルス感染により起こった疾患及び消耗性症候群が完全に防御され得るか、又はその症状が緩和され得る。
【００８６】
Ｍ２ペプチドのみを有する本発明のワクチンは、患者の細胞の感染を防御しないであろうことに着目されたい。これは、ウイルスが患者の体内に侵入し、感染を開始した際に、インフルエンザウイルスに存在する本ワクチンのペプチドのＭ２エピトープのコピー数が非常に少ないからである。これらのＭ２エピトープは、典型的には、ウイルスが感染した細胞表面でのみ見られる。つまり、このＭ２ペプチド−タンパク質連結物を基にしたワクチンによるワクチン接種により生じた免疫反応は、感染した細胞に対して向けられている。特定の効果理論に結びつける必要がない場合、患者の免疫反応によりウイルスのバーストサイズが減少し、全体的なウイルス感染を終結させ、それにより基本的に、最初に感染した細胞に感染が限定されると考えられている。
【００８７】
本発明ワクチンの利点は、インフルエンザウイルスの保存的エピトープに対して免疫反応が生じることである。従って、本ワクチンの投与により、インフルエンザ感染に対する患者の防御能を維持するためにワクチン接種を毎年行う必要性がなくなる。
【００８８】
上記のような併用ワクチンを得るために、本Ｍ２ペプチド−タンパク質連結ワクチンを、他のワクチンとともに処方し得る。次に、Ｍ２エピトープならびに併用ワクチン中の他の免疫原に対する免疫反応を生じさせるために、患者に本併用ワクチンを接種することができる。
【実施例１】
【００８９】
ペプチドの調製
本分野で一般的に実施されている固相化学合成法により、Ｍ２タンパク質配列部分を提示し、Ｃ末端又はＮ末端反応性ブロモアセチル又はマレイミド基を含有する合成ペプチドが生産された。
【００９０】
例えば、Ｃ末端ブロモアセチル化Ｍ２  １５ｍｅｒ、ＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５ｍｅｒ、Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｈａ−Ｌｙｓ（Ｎε−ＢｒＡｃ）−ＮＨ２−  ＴＦＡ塩（配列番号１３）を、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＩＴＹ  ＳＴＡＴＥ）で、保護レジン結合ペプチドとして合成した。０．５ｍｍｏｌのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジンを用いて開始し、４倍過剰量（２ｍｍｏｌ）の各Ｎα−Ｂｏｃ保護アミノ酸を使用するプロトコールを用いた。側鎖の保護は、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｔｒｐ（ホルミル）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）であった。メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中で、ＤＣＣ及びＨＯＢＴ活性化によりカップリングを遂行した。Ｎ末端アセチル基を導入するために、酢酸をカップリングさせた。１：１の塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）中ＴＦＡを用いて、Ｂｏｃ基の除去を行い、そのＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中性化した。
【００９１】
保護ペプチドレジンの会合に続いて、ＮＭＰ中の２５％ピペリジンを用いて、１０分間、Ｔｒｐ残基のホルミル基及びＮε−Ｌｙｓ残基のＦｍｏｃ保護を手動処理で除去した。このレジンをＮＭＰ及びＭｅＣｌ２で洗浄した後、ＬｙｓのＮεアミノ基を、ブロモ酢酸無水物（１ｇ／２０ｍｌ、ＭｅＣｌ２）と１時間、又はニンヒドリン反応が陰性になるまで反応させた。ＭｅＣｌ２で洗浄した後、このレジンを恒量（２．７０ｇ）になるまで乾燥させた。
【００９２】
０℃にて１時間、捕捉剤としてＨＦ（３０ｍｌ）及びアニソール（３ｍｌ）を用いて、保護ペプチドレジン（２．７０ｇ）を処理した。ＨＦ及びアニソールを蒸発させた後、残渣をエーテルでよく洗浄し、濾過し、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ）中の２５％酢酸で抽出した。濾過物を凍結乾燥させて、未精製生成物１．５ｇを回収した。
【００９３】
分取ＨＰＬＣ、緩衝液Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮにより未精製生成物の精製を行った。未精製生成物（０．７５ｇ）を最小体積の２０％酢酸−Ｈ２Ｏ（約１００ｍｌ）に溶解し、９０％  Ａ−１０％  Ｂ緩衝液で平衡化したＣ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル加圧（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）カラム（ＷＡＴＥＲＳ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ，１５μｍ、１００Å、５ｘ３０ｃｍ）に汲み上げた。
【００９４】
ペプチドの添加後、９０％  Ａ−１０％  Ｂ  緩衝混合液１Ｌを添加した。濃度（５％）を連続的に増加させた移動相各１Ｌから、段階的勾配（１０％  Ｂから４０％  Ｂ）（増加量  １００ｍｌ）を作った。生成物を溶出するために使用した流速は、８０ｍｌ／分であった。２１４ｎｍのＵＶ吸収をモニタリングすることにより検出を行った。均一な生成物分画（分析的ＨＰＬＣによる純度は、＞９８％）を集め、凍結乾燥させ、ＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５ｍｅｒペプチド、２００ｍｇを得た。アミノ酸分析及びマススペクトル解析により同一性を確認した。
【００９５】
同様にして、他のＣ末端ブロモアセチル化ペプチドの合成を行うことができる。例えば、次のように、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＩＴＹ  ＳＴＡＴＥ）で、保護レジン結合ペプチドとしてＣ末端ブロモアセチル化Ｍ２  ２３ｍｅｒペプチド、ＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２−２３ｍｅｒ、Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｈａ−Ｌｙｓ（Ｎε−ＢｒＡｃ）−ＮＨ２  ＴＦＡ塩、（配列番号３９）を合成した。０．７５ｍｍｏｌのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジンを用いて開始し、過剰量（２ｍｍｏｌ）の各Ｎα−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いる、二重カップリングプロトコールを使用した。側鎖の保護は、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｔｒｐ（ホルミル）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）であった。メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中で、ＤＣＣ及びＨＯＢＴ活性化を用いてカップリングを遂行した。Ｎ末端アセチル基を導入するために、酢酸をカップリングさせた。１：１の塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）中ＴＦＡを用いて、Ｂｏｃ基の除去を行い、このＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中性化した。保護ペプチドレジンの会合に続いて、ＮＭＰ中の２５％ピペリジンを用いて、１０分間、Ｔｒｐのホルミル基及びＮε−ＬｙｓのＦｍｏｃ保護を手動処理で除去した。このレジンをＮＭＰ及びＭｅＣｌ２で洗浄した後、ＬｙｓのＮεアミノ基を、ブロモ酢酸無水物（１ｇ／２０ｍｌ、ＭｅＣｌ２）と１時間、又はニンヒドリン反応が陰性になるまで反応させた。ＭｅＣｌ２で洗浄した後、このレジンを恒量になるまで乾燥させた。
【００９６】
０℃にて１時間、捕捉剤としてＨＦ（２０ｍｌ）及びアニソール（２ｍｌ）を用いて、保護ペプチドレジンの半分（１．８３ｇ）を処理した。ＨＦ及びアニソールを蒸発させた後、残渣をエーテルでよく洗浄し、濾過し、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ）中の２５％酢酸で抽出した。濾過物を凍結乾燥させて、未精製生成物１．１ｇを回収した。
【００９７】
分取ＨＰＬＣ、緩衝液Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮにより未精製生成物の精製を行った。未精製生成物（１．１ｇ）を最小体積の２０％酢酸−Ｈ２Ｏ（約１００ｍｌ）に溶解し、９０％  Ａ−１０％  Ｂ緩衝液で平衡化したＣ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル加圧（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）カラム（ＷＡＴＥＲＳ，ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，１５μｍ、１００Å、５ｘ３０ｃｍ）に汲み上げた。ペプチドの添加後、９０％  Ａ−１０％  Ｂ  緩衝混合液１Ｌを添加した。濃度（５％）を連続的に増加させた移動相各１Ｌから、段階的勾配（１０％  Ｂから４０％  Ｂ）（増加量  １００ｍｌ）を作った。生成物を溶出するために使用した流速は８０ｍｌ／分であった。２１４ｎｍのＵＶ吸収をモニタリングすることにより検出を行った。均一な生成物分画（分析的ＨＰＬＣによる純度は、＞９８％）を集め、凍結乾燥させ、生成物、ＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−２３ｍｅｒペプチド、２２４ｍｇを得た。アミノ酸分析及びマススペクトル解析により同一性を確認した。
【００９８】
マレイミド化ペプチドの合成を以下に説明する。ペプチド、Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｈａ−Ｌｙｓ（Ｎε−４−マレイミドブチリル−ＮＨ２  ＴＦＡ塩（配列番号１４）を、０．７５ｍｍｏｌのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジンを用いて開始し、合成した。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＩＴＹ  ＳＴＡＴＥ）で、保護レジン結合ペプチドを合成した。４倍過剰量（２ｍｍｏｌ）の各Ｎα−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いるプロトコールを使用した。側鎖の保護は、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ），Ｔｒｐ（ホルミル）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）であった。メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中で、ＤＣＣ及びＨＯＢＴ活性化を用いてカップリングを遂行した。Ｎ末端アセチル基を導入するために、酢酸をカップリングさせた。１：１の塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）中ＴＦＡを用いて、Ｂｏｃ基の除去を行い、このＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中性化した。保護ペプチドレジンの会合に続いて、ＮＭＰ中の２５％ピペリジンを用いて、１０分間、Ｔｒｐのホルミル基及びＮε−ＬｙｓのＦｍｏｃ保護を手動処理で除去した。このレジンをＮＭＰ及びＭｅＣｌ２で洗浄した後、このレジンのうち２５％を除去し（０．１８８ｍｍｏｌ）、ＬｙｓのＮεアミノ基を、４−マレイミド酪酸（２ｍｍｏｌ）及びＮＭＰ中のＤＣＣ及びＨＯＢＴ  ２ｍｍｏｌと３時間、又はニンヒドリン反応が陰性になるまで反応させた。ＮＭＰ及びＭｅＣｌ２で洗浄した後、このレジンを恒量（０．７ｇ）まで乾燥させた。
【００９９】
０℃にて１時間、捕捉剤としてＨＦ（１５ｍｌ）及びアニソール（１．５ｍｌ）を用いて、保護ペプチドレジン（０．７ｇ）を処理した。ＨＦ及びアニソールを蒸発させた後、残渣をエーテルでよく洗浄し、濾過し、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ）中の２５％酢酸で抽出した。濾過物を凍結乾燥させて、未精製生成物０．４０ｇを回収した。
【０１００】
分取ＨＰＬＣ、緩衝液Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮにより未精製生成物の精製を行った。未精製生成物（０．４０ｇ）を最小体積の２０％酢酸−Ｈ２Ｏ（約１００ｍｌ）に溶解し、９０％  Ａ−１０％  Ｂ緩衝液で平衡化したＣ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル加圧（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）カラム（ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ、１５μｍ、１００Å、５ｘ３０ｃｍ，ＷＡＴＥＲＳ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に汲み上げた。ペプチドの添加後、９０％  Ａ−１０％  Ｂ  緩衝混合液１Ｌを添加した。濃度（５％）を連続的に増加させた移動相各１Ｌから、段階的勾配（１０％  Ｂから３５％  Ｂ）（増加量  １００ｍｌ）を作った。生成物を溶出するために使用した流速は８０ｍｌ／分であった。２１４ｎｍのＵＶ吸収をモニタリングすることにより検出を行った。均一な生成物分画（分析的ＨＰＬＣによる純度は、＞９８％）を集め、凍結乾燥させ、生成物  ９４ｍｇを得た。アミノ酸分析及びマススペクトル解析により同一性を確認した。
【０１０１】
分析的ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｖｙｄａｃ  １５ｃｍ  ＃２１８ＴＰ５４１５，Ｃ１８．
溶出：勾配  ９５：５（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）から、５：９５  （０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）、４５分間。
流速：１．５ｍｌ／分
波長：２１４ｎＭ、２５４ｎＭ
保持時間：１６．９分
分子式：Ｃ９９Ｈ１５５Ｎ２５Ｏ３１
分子量：２１９０．１３
【０１０２】
第二のマレイミド化ペプチド、Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｈａ−Ｌｙｓ（Ｎε−４−マレイミドブチリル−ＮＨ２  ＴＦＡ塩（配列番号２３）の合成を以下に説明する。０．５０ｍｍｏｌのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジンを用いて開始し、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＩＴＹ  ＳＴＡＴＥ）で、保護レジン結合ペプチドを合成した。過剰量（２ｍｍｏｌ）の各Ｎα−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いる二重カップリングプロトコールを使用した。側鎖の保護は、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｔｒｐ（ホルミル）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）であった。メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中で、ＤＣＣ及びＨＯＢＴ活性化を用いてカップリングを遂行した。Ｎ末端アセチル基を導入するために、酢酸をカップリングさせた。１：１の塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）中のＴＦＡを用いてＢｏｃ基の除去を行い、このＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中性化した。保護ペプチドレジンの会合に続いて、ＮＭＰ中の２５％ピペリジンを用いて、１０分間、Ｔｒｐのホルミル基及びＮε−ＬｙｓのＦｍｏｃ保護を手動処理で除去した。このレジンをＮＭＰ及びＭｅＣｌ２で洗浄した後、このレジンのうち５０％（０．２５ｍｍｏｌ）を、４−マレイミド酪酸（２ｍｍｏｌ）及び、ＤＣＣ及びＨＯＢＴ  ２ｍｍｏｌと３時間、又は、ニンヒドリン反応が陰性になるまで反応させた。ＮＭＰ及びＭｅＣｌ２で洗浄した後、このレジンを恒量（２．０ｇ）まで乾燥させた。
【０１０３】
０℃にて１．５時間、捕捉剤としてＨＦ（２０ｍｌ）及びアニソール（２ｍｌ）を用いて、保護ペプチドレジン（２．０ｇ）を処理した。ＨＦ及びアニソールを蒸発させた後、残渣をエーテルでよく洗浄し、濾過し、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ）中の５０％酢酸で抽出した。濾過物を凍結乾燥させて、未精製生成物１．０ｇを回収した。
【０１０４】
分取ＨＰＬＣ、緩衝液Ａ＝０．１％  ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％  ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮにより未精製生成物の精製を行った。未精製生成物（１．０ｇ）を最小体積の１０％酢酸−Ｈ２Ｏ（?１００ｍｌ）に溶解し、８５％  Ａ−１５％  Ｂ緩衝液で平衡化したＣ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル加圧（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）カラム（ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ，１５μｍ、１００Å、５ｘ３０ｃｍ，ＷＡＴＥＲＳ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に汲み上げた。ペプチドの添加後、１５％Ｂから４５％Ｂまでの勾配溶出を９０分間にわたり行った。生成物を溶出するために使用した流速は８０ｍｌ／分であった。２１４ｎｍのＵＶ吸収をモニタリングすることにより検出を行った。均一な生成物分画（分析的ＨＰＬＣによる純度は、＞９８％）を集め、凍結乾燥させ、生成物  ３２０ｍｇを得た。アミノ酸分析及びマススペクトル解析により同一性を確認した。
【０１０５】
分析的ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｖｙｄａｃ  １５ｃｍ  ＃２１８ＴＰ５４１５，Ｃ１８
溶出：勾配  ９５：５（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）から、５：９５  （０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）、４５分間
流速：１．５ｍｌ／分
波長：２１４ｎＭ、２５４ｎＭ
保持時間：１６．４分
分子式：Ｃ１２９Ｈ２０３Ｎ３７Ｏ４８
分子量：３０３８．４６
【０１０６】
本合成ペプチドのチオール相当物をアッセイした。例えば、ＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５（Ｎ末端  ブロモアセチル化Ｍ２  １５ｍｅｒ  配列番号１１）及びＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５（Ｃ末端  ブロモアセチル化Ｍ２  １５ｍｅｒ  配列番号１３）を、Ｎ２−注入した２５ｍＭ  ホウ酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５緩衝液に、最終濃度が７．５ｍｇペプチド粉末／ｍｌになるように溶解した。０．９７Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを８．５に調整した。この溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。次に示すようなチオール消費アッセイにより、Ｂｒアセチル相当物について、等量ずつ分注したものをアッセイした。Ｎ２−注入した２５ｍＭ  ホウ酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５緩衝液中に溶解したＮ−アセチル−システインを、適切なペプチドの希釈物（〜１５−３０μＭ、最終濃度）に添加し、同体積の緩衝液に添加し（５０μＭ  最終濃度）、室温にて３０分間インキュベーションを行った。インキュベーション後、５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］（ＤＴＮＢ；Ｅｌｌｍａｎ試薬）を添加した（最終濃度、５ｍＭ、Ｎ２  飽和０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７中の５０ｍＭ  ＤＴＮＢ保存液を使用）。室温にて１５分間インキュベーションを行った後、ε４１２ｎｍ、１ｃｍ＝１４．１５ｘ１０３Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、適切なＤＴＮＢブランクを差し引き、チオール濃度を測定した。本ペプチド存在及び非存在下での遊離チオールの相違から、チオール反応性相当物を推定した。
【０１０７】
同様にして、ＮＴ−ＭａｌＭ２−１５（Ｎ末端マレイミド化Ｍ２  １５ｍｅｒ  配列番号１２）及びＣＴ−ＭａｌＭ２−１５（Ｃ末端マレイミド化Ｍ２  １５ｍｅｒ  配列番号１４）を、Ｎ２注入した０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３緩衝液に、最終濃度が７．５ｍｇペプチド粉末／ｍｌになるように溶解した。０．９７Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを７．３に調整した。その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。次に示すようなチオール消費アッセイにより、マレイミド相当物について等量ずつ分注したものをアッセイした。Ｎ２注入した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３緩衝液中に溶解したＮ−アセチル−システイン（５０μＭ  最終濃度）を、適切なペプチドの希釈物（〜１５−３０μＭ、最終濃度）に添加し、同体積の緩衝液に添加し、室温にて３０分間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ＤＴＮＢを添加した（最終濃度、５ｍＭ、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７中の５０ｍＭ  ＤＴＮＢ保存液を使用）。室温にて１５分間インキュベーションを行った後、ε４１２ｎｍ、１ｃｍ＝１４．１５ｘ１０３Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、適切なＤＴＮＢブランクを差し引き、チオール濃度を決定した。本ペプチド存在下及び非存在下の遊離チオールの相違から、チオール反応性相当物を推定した。
【０１０８】
チオール含有ペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、１０等）に対して、氷冷Ｎ２−飽和０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３緩衝液にペプチドを溶解し（２．５ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ）、０．２ミクロンフィルターで濾過した。Ｎ２飽和０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７緩衝液で、本ペプチドを適切な体積になるように希釈することにより、チオール含量を測定した。０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７  緩衝液中の５０ｍＭ  ＤＴＮＢ保存液を使用して、最終濃度が５ｍＭになるようにＤＴＮＢを添加した。室温にて１５分間インキュベーションを行った後、ε４１２ｎｍ、１ｃｍ＝１４．１５ｘ１０３Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、適切なＤＴＮＢブランクを差し引き、チオール濃度を決定した。
【０１０９】
濾過したブロモアセチル又はマレイミド化ペプチドのチオール反応性相当物
【０１１０】
【表３】
2006519775.tif 000008
ａチオール消費アッセイにより測定
ｂａｓｐ、ｇｌｕ、ｇｌｙ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ及びａｒｇ値のＡＡＡ平均により決定。
ｃ注意：チオール消費アッセイにおけるブロモアセチル基の反応が遅いため、ＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５に対する［チオール反応性相当物］は、少なく見積もって、おそらく、〜３倍から５倍であろう。
【０１１１】
濾過したＭ２ペプチド含有システインのチオール含量
【０１１２】
【表４】
2006519775.tif 000009
2006519775.tif 000010
ａペプチド配列を基にしたもの
ｂ改変Ｅｌｌｍａｎアッセイに基づいたチオール含量。
【０１１３】
ペプチド濃度は、Ｍ２ペプチドの１個のトリプトファンに基づいて測定（ε２７８ｎｍ、１ｃｍ＝５，５５０Ｍ−１ｃｍ−１及びε２８８ｎｍ、１ｃｍ＝４，５５０Ｍ−１ｃｍ−１と仮定。用いた濃度は、これらの２波長において測定した値の平均である。）。
【実施例２】
【０１１４】
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、髄膜炎菌）のチオール化外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）の調製
本分野で公知の技術及びＦｕ，米国特許第５，４９４，８０８号で記載されている技術を用いてＯＭＰＣを得た。Ｎ−アセチルホモシステインラクトンを用いたＯＭＰＣのチオール化は、無菌法を用いている、Ｍａｒｂｕｒｇら、１９８６で述べられている一般的方法により行った。ＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５及びＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５に対してはＮ２飽和２５ｍＭ  ホウ酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５で、ＮＴ−ＭａｌＭ２−１５及びＣＴ−ＭａｌＭ２−１５を用いた反応に対しては、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３で、チオール化ＯＭＰＣを最終的に再懸濁した。ＯＭＰＣへのチオール化物をＮ２飽和０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７  緩衝液へと適切に希釈することにより、チオール含量を測定した。Ｎ２飽和０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７緩衝液中の５０ｍＭ  ＤＴＮＢ保存液を使用して、最終濃度が５ｍＭになるようにＤＴＮＢを添加した。室温にて１５分間インキュベーションを行った後、ε４１２ｎｍ、１ｃｍ＝１４．１５ｘ１０３Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、適切なＤＴＮＢブランク及びＯＭＰＣブランク（ＤＴＮＢなし）を差し引いた後、チオール濃度を決定した。
【０１１５】
チオール化ＯＭＰＣの特性
【０１１６】
【表５】
2006519775.tif 000011
2006519775.tif 000012
ａ改変Ｅｌｌｍａｎアッセイにより測定。
ｂ改変Ｌｏｗｒｙ法により測定。
【実施例３】
【０１１７】
マレイミド化又はハロゲン化アルキル活性化ＯＭＰＣの調製
全ての操作を無菌的に行った。適切な量の滅菌０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加して、Ｈ２Ｏ中の滅菌ＯＭＰＣ（５．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．５±０．１中で５０ｍＭにした。スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）又はスルホスクシニミジル４−（ヨードセチル）アミノベンゾエート（ｓＳＩＡＢ）（氷冷Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ  保存液；試薬は、ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．，ＲＯＣＫＦＯＲＤ．ＩＬより。）を、穏やかに混合しながら緩衝ＯＭＰＣに滴下添加し、最終濃度が２．５ｍＭ  ｓＳＩＡＢ又はｓＳＭＣＣ、及びＯＭＰＣ濃度が〜３．８ｍｇ／ｍｌになるようにした。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステルも使用することができる。この反応物を４℃にて、１時間、暗所で熟成させる。１時間後、滅菌した１Ｍ  リン酸ナトリウムで反応混合物のｐＨを７．３に調整し、３００Ｋ  分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（Ｒ）（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＲＡＮＣＯ  ＤＯＭＩＮＧＵＥＺ，ＣＡ）を用いて、滅菌した６．３ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．３、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに対して、４℃にて１２から２４時間にわたり徹底的に透析する。あるいは、ｐＨ調整を省いて、反応混合物を直接透析することができる。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３、他の適切な緩衝液又は水もこの透析に使用することができる。暗所でＳＩＡＢ透析を行った。Ｎ２−注入した透析緩衝液を添加することができる。
【０１１８】
ｓＳＩＡＢ活性化ＯＭＰＣ混合物に対する好ましい透析緩衝液は、ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．５±０．１中の５０ｍＭ液である。アッセイ緩衝液が０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７であり、Ｎ−アセチルシステインインキュベーション時間が１５分間であったことを除き、本ペプチドに対して上述したＮ−アセチル−システイン消費アッセイを用いて、チオール反応性相当物について、透析した活性化ＯＭＰＣをアッセイする。４１２ｎｍでのＯＭＰＣの影響を補正するために、ＯＭＰＣブランク（ＤＴＮＢなし）を測定する。Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質を測定する。ｐＨ８．５におけるマレイミド活性化に対して、０．０９μｍｏｌから０．１２μｍｏｌ  マレイミド相当物／ｍｇ（Ｌｏｗｒｙのタンパク質）が通常得られる。このレベルは、ｐＨ７．３で得られた値よりもおよそ２倍から３倍高い。滅菌した０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８保存液を用いて、活性化ＯＭＰＣを、２ｍＭ  ＥＤＴＡ最終濃度にする。
【実施例４】
【０１１９】
Ｍ２ペプチドのチオール化ＯＭＰＣへの連結
無菌法を用いて、次のようにチオール化ＯＭＰＣをＭ２ペプチド  ＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５（Ｎ末端ブロモアセチル化Ｍ２  １５ｍｅｒ、配列番号１１）、ＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５（Ｃ末端ブロモアセチル化Ｍ２  １５ｍｅｒ、配列番号１３）、ＮＴ−ＭａｌＭ２−１５（Ｎ末端マレイミド化Ｍ２  １５ｍｅｒ、配列番号１２）及びＣＴ−ＭａｌＭ２−１５（Ｃ末端マレイミド化Ｍ２  １５ｍｅｒ、配列番号１４）と連結させた。様々な量のペプチドにチオール化ＯＭＰＣを添加し、穏やかに混合した。その反応混合物を混合せずに４℃にて一晩、暗所にて熟成させた。
【０１２０】
次に、反応を停止させ、無菌状態で脱塩した。反応混合物をＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で５ｍＭにしてＯＭＰＣの過剰なチオールと反応させることにより、ＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５及びＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５／チオール化ＯＭＰＣ連結反応を停止させ、４℃にて、４時間、暗所で熟成させた。４℃にて、滅菌した０．１５Ｍ  ＮａＣｌに対して、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（Ｒ）を用いて透析することにより、反応停止させた反応混合物を脱塩した。反応混合物をヨードアセトアミドで５ｍＭにすることにより、ＮＴ−ＭａｌＭ２−１５／チオール化ＯＭＰＣ連結反応を停止させ、４℃にて一晩、暗所で熟成させた。４℃にて、滅菌した０．１５Ｍ  ＮａＣｌに対して、３００Ｋ  分子量ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（Ｒ）を用いて透析を行い、反応停止させた反応混合物を脱塩した。
【実施例５】
【０１２１】
マレイミド化又はヨードアセチル化ＯＭＰＣに対するＭ２ペプチドの連結
無菌法を用いて、マレイミド化ＯＭＰＣ又はヨードアセチル化ＯＭＰＣ（あるいは、ブロモアセチル化ＯＭＰＣ）のチオール含有Ｍ２ペプチド（配列番号１）との連結を次のようにして行った。穏やかに混合したマレイミド化又はヨードアセチル化ＯＭＰＣに、チオール／マレイミドのモル比が〜３になるようにして、Ｍ２ペプチドを滴下添加した。逆の添加法、例えば、ＯＭＰＣをペプチドに添加することも可能であり、好ましい。１２時間から２４時間、４℃にて暗所で混合せずに、反応混合物を熟成させる。０．２ミクロンのフィルターで濾過したβ−メルカプトエタノール（１５ｍＭ  最終濃度）を用いて、その試薬を暗所、４℃にて混合せずに３時間から４時間連結物と反応させることにより、ＯＭＰＣの過剰なチオール反応基を不活性化（反応停止）させた。４℃にて、滅菌した０．１５Ｍ  ＮａＣｌに対して、３００Ｋ  分子量ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（Ｒ）で透析を行い、反応停止させた反応混合物を徹底的に透析した。
【実施例６】
【０１２２】
連結物の分析
ＯＭＰＣタンパク質の測定又は連結物におけるタンパク質＋ペプチドの測定のために、改変Ｌｏｗｒｙ  アッセイを用いた。このアッセイにおいて、キャリアデオキシコールナトリウムの存在下で、トリクロロ酢酸を用いてタンパク質試料を沈殿させた（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎ及びＷｅｉｎｓｔｅｉｎ  １９７６  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：２４１−２５０）。ＳＤＳ含有Ｌｏｗｒｙ試薬Ａによりタンパク質ペレットを溶解させた。ＢＳＡ標準物質を同様に処理した。
【０１２３】
アミノ酸分析（ＡＡＡ）のために、試料に内部標準物質、ノルロイシンを添加し、６Ｎ  ＨＣｌ、０．２％フェノール（ｗ／ｖ）を用いて、１１０℃にて真空下で７０時間、加水分解した。予想されるアミノ酸加水分解産物に関しては、スキームＶ−ＶＩＩＩ、図５から８を参照のこと。加水分解後、試料を乾燥させ、試料緩衝液で再懸濁し、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ポストカラムのニンヒドリン検出を行い、分析した（ＢＥＣＫＭＡＮ  Ｍｏｄｅｌ  ６３００，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。感受性及び／又は解像度で優れていると思われる、ＡＣＣＵＴＡＧＴＭ（ＷＡＴＥＲＳ  ＣＯＲＰ．，ＭＩＬＦＯＲＤ，ＭＡ）又はＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＤＩＲＥＣＴＴＭ（ＤＩＯＮＥＸ  ＣＯＲＰ．，ＳＵＮＮＹＶＡＬＥ，ＣＡ）を含む他の系を用いて、アミノ酸分析を行うこともできる。
【０１２４】
少なくとも２種類の方法によるアミノ酸データから、連結物のペプチド負荷を調べることができる。そのペプチド中のユニークなアミノ酸（例えば、６−アミノへキサン酸、ＡＨＡ）から、ペプチド量を推定することができる。ＯＭＰＣに存在するが、そのペプチドにはないアミノ量から、ＯＭＰＣタンパク質の量を推定することができる。Ｌｏｗｒｙ  タンパク質数には、そのペプチドからのタンパク質も含まれ、ペプチド負荷が高い場合、得られた値に対して占める割合は重要なものである。代替法には、スプレッドシート方式におけるＡＡＡデータの重回帰、最小２乗解析の使用が含まれる（Ｓｈｕｌｅｒら、１９９２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５６：１３７−１４９）。一般に、２種類の方法により得られた値の差は、互いに２０％以内である。
【０１２５】
還元した連結試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／染色分析により、ペプチド連結物の質を明らかにすることができる。マレイミド又はヨードアセチル活性化ＯＭＰＣ／チオール含有Ｍ２ペプチド連結物に対して、不活性／活性化ＯＭＰＣの分析により、３量体として存在するＯＭＰＣの主要なクラス２タンパク質の架橋を引き起こす、ＳＭＣＣ又はＳＩＡＢの副反応の証拠が得られる。
【実施例７】
【０１２６】
チオール化ＯＭＰＣ／マレイミド化又はブロモアセチルＭ２連結物の特性
透析したＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５／チオール化ＯＭＰＣ連結物の特性
【０１２７】
【表６】
2006519775.tif 000013
ａ改変Ｌｏｗｒｙ法
ｂ０．４２μｍｏｌリジン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質及び０．６３μｍｏｌアラニン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質と仮定するＡＡＡデータから計算した値の平均に基づく。
ｃＳ−カルボキシメチルシステイン分析は、定性分析的であった。
ｄＡＡＡ、推定ＯＭＰＣ  ＭＷ＝４０ｘ１０６及びペプチドのモルを算出するためのＡＡＡタンパク質／６−アミノへキサン酸（Ａｈａ）値により決定したタンパク質値に基づく。
【０１２８】
透析したＮＴ−ＭａｌＭ２−１５／チオール化ＯＭＰＣ連結物の特性
【０１２９】
【表７】
2006519775.tif 000014
2006519775.tif 000015
ａ改変Ｌｏｗｒｙ法
ｂ０．４２μｍｏｌリジン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質及び０．６３μｍｏｌアラニン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質と仮定するＡＡＡデータから計算した値の平均に基づく。
ｃＳ−ジカルボキシエチルホモシステイン分析は、定性分析的であった。
ｄＡＡＡ、推定ＯＭＰＣ  ＭＷ＝４０ｘ１０６及びペプチドのモルを算出するためのＡＡＡタンパク質／６−アミノへキサン酸（Ａｈａ）値により決定したタンパク質値に基づく。
【０１３０】
透析したＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５／チオール化ＯＭＰＣ連結物の特性
【０１３１】
【表８】
2006519775.tif 000016
2006519775.tif 000017
ａ改変Ｌｏｗｒｙ法
ｂ０．６３μｍｏｌアラニン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質と仮定するＡＡＡデータから計算した値の平均に基づく。
ｃＳ−カルボキシメチルシステイン分析は、定性分析的であった。
ｄＡＡＡ、推定ＯＭＰＣ  ＭＷ＝４０ｘ１０６及びペプチドのモルを算出するためのＡＡＡタンパク質／６−アミノへキサン酸（Ａｈａ）値により決定したタンパク質値に基づく。
【０１３２】
透析したＣＴ−ＭａｌＭ２−１５／チオール化ＯＭＰＣ連結物の特性
【０１３３】
【表９】
2006519775.tif 000018
ａ改変Ｌｏｗｒｙ法
ｂ０．６３μｍｏｌアラニン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質と仮定するＡＡＡデータから計算した値に基づく。
ｃＳ−ジカルボキシエチルホモシステイン分析は、定性分析的であった。
ｄＡＡＡ、推定ＯＭＰＣ  ＭＷ＝４０ｘ１０６及びペプチドのモルを算出するためのＡＡＡタンパク質／６−アミノへキサン酸（Ａｈａ）値により決定したタンパク質値に基づく。
【０１３４】
一般に、電荷が等しい（ｍｏｌ）ペプチドにおいて、マレイミド化ペプチドは、ブロモアセチル化ペプチドよりも、連結物におけるペプチド負荷が高かった。マレイミド基と比較してブロモアセチル基のチオールの速度論的な反応性が低いことがおそらくその差の原因と思われる。
【実施例８】
【０１３５】
マレイミド化ＯＭＰＣ及び選択システイン含有ペプチド連結物の特性
透析したシステイン含有ペプチド／マレイミド化ＯＭＰＣ連結物の特性
【０１３６】
【表１０】
2006519775.tif 000019
ａ改変Ｌｏｗｒｙ法
ｂＳ−ジカルボキシエチルシステイン（ＤＣＥＣ）及び６−アミノへキサン（ＡＨＡ）定量はＡＡＡによる。ＤＣＥＣ反応因子／ＡＳＰ反応因子＝１．２８５。
ｃ０．６３μｍｏｌ  アラニン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質と仮定してするＡＡＡ、推定ＯＭＰＣ  ＭＷ＝４０ｘ１０６及びペプチドのモル数を計算するための６−アミノへキサン酸（ＡＨＡ）値により決定したタンパク質値に基づく。
【０１３７】
システインを１個有するペプチド（例えば配列番号２）と対比して、複数のシステイン残基を含有するＭ２ペプチド（例えば、配列番号１）のＤＣＥＣ／ＡＨＡレベルが高いことから、１個のＭ２ペプチドに対して複数のマレイミド／システイン結合があることが示唆される。この結果、連結物におけるペプチド負荷がより少なくなり、おそらく連結物の免疫原性に影響を与えることがあると考えられる。より小さいペプチド（配列番号１０）では、１個のシステインを含有するＭ２ペプチド連結物に対する反応に際してのペプチド負荷量が同等の場合、ペプチド負荷がより高くなると思われる。この影響は、ＯＭＰＣのマレイミド部位における立体構造上の制限及び／又は、ペプチドの反応性システイン近くの電荷の相違によるものであり得る。不活性／マレイミド活性化ＯＭＰＣに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、活性化及び脱塩段階の際に架橋を生じるＯＭＰＣ中の本質的な求核試薬とのマレイミドの反応（Ｂｒｅｗｅｒ及びＲｉｅｈｍ  １９６７  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：２４８−２５５参照）が示唆された。より低いｐＨの場合、活性化物との架橋はあまり明確ではなかった。ＳＩＡＢ活性化ＯＭＰＣの場合、架橋が最小限となることが分かった。マレイミド基には、イミドの開環反応により、マレアミド酸に変換され得るものもある。マレアミド酸は、チオール反応性が不十分である。一般に、１個のシステインを含有するペプチド及びマレイミド活性化ＯＭＰＣを用いた同様のペプチド反応と対比して、マレイミド化ペプチド及びチオール化ＯＭＰＣを用いて調製された連結物のペプチド負荷数が多いことが観察された。マレイミド化（０．０９μｍｏｌ  マレイミド／ｍｇタンパク質から０．１２μｍｏｌ  マレイミド／ｍｇタンパク質）と対比して、チオール化（〜０．２６μｍｏｌ  チオール／ｍｇタンパク質）によるＯＭＰＣ活性化レベルが高いことは、この観察から説明できる。
【実施例９】
【０１３８】
動物実験用の連結物
動物実験のために、ＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５の場合にペプチド／ＯＭＰＣチオール使用分量比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が〜２であったことを除き、ペプチド／ＯＭＰＣチオール使用分量比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が〜１になるようにして連結物を調製した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中の無菌調製連結物を、アルミニウムアジュバント（ＭＥＲＣＫ  ａｌｕｍ）を用いて処方した。
【０１３９】
動物実験で用いた連結物の特性
【０１４０】
【表１１】
2006519775.tif 000020
ａ０．６３μｍｏｌアラニン／ｍｇ  Ｌｏｗｒｙタンパク質と仮定するＡＡＡデータから計算した値に基づく。
ｂＡＡＡ、推定ＯＭＰＣ  ＭＷ＝４０ｘ１０６及びペプチドのモル数を計算するための６−アミノへキサン酸（ＡＨＡ）値により決定したタンパク質値に基づく。
【実施例１０】
【０１４１】
ワクチンの処方
実施例１１で次の連結物を使用した。「群」の番号は、ワクチン接種した動物の群を意味する。処方で使用した連結物は、群１から３で使用するＣＴ−Ｍ２−１５ｍｅｒ−ｍａ−ＯＭＰＣ（また、連結物「Ａ」と呼ぶ。）、群４から６で使用するＣＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣ（また、連結物「Ｂ」と呼ぶ。）、群７から９で使用するＮＴ−ＢｒＡｃＭ２−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣ（また、連結物「Ｃ」と呼ぶ。）、群１０から１２で使用するＣＴ−ＢｒＡｃＭ２（ＳＲＳ）−２３−ｍｅｒ−ＯＭＰＣ（また、連結物「Ｄ」と呼ぶ。）、群１３で使用する活性化／不活性ＯＭＰＣ（また、化合物「Ｅ」と呼ぶ。）である。Ｌｏｗｒｙ法による保存液のタンパク質濃度測定及びアミノ酸分析によるペプチド負荷測定に基づき、希釈を行う。
【０１４２】
段階１  連結物ＡからＤを１ｘ生理食塩水で希釈する。化合物Ｅを０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈する。
【０１４３】
段階２  １ｘａｌｕｍ中、最終濃度５０ｍｃｇ／ｍｌ  ペプチドになるように（化合物Ｅに対して、最終タンパク質濃度は、１ｘａｌｕｍ中、０．２５ｍｇ／ｍｌになるように）、段階１からの各溶液を、予め撹拌した１：１の比の２ｘａｌｕｍ（ＭＥＲＣＫ  ＡＬＵＭ．製品番号＃３９９４３、ＭＥＲＣＫ＆ＣＯ，Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）に添加する。
【０１４４】
段階３．室温にて２時間、回転ホイールで混合する。
【０１４５】
段階４．その連結物を１ｘａｌｕｍで希釈し、各目標ペプチド濃度にする。
【０１４６】
４．１  段階３からの溶液を、１ｘａｌｕｍで次のように希釈する：溶液１に対して１ｘａｌｕｍを４（ｖ／ｖ）の割合で混合する。
【０１４７】
４．２  室温にて回転ホイールで１時間混合する。
【０１４８】
４．３  段階４．２の溶液を、群３、６、９、１２（１ｍｃｇ  ペプチドを受容）及び群１３（５ｍｃｇ  活性化／不活性ＯＭＰＣを受容）に対して必要な体積ずつ分配する。
【０１４９】
４．４  ４．２の溶液の残りを、１ｘａｌｕｍと次のように混合する：溶液１に対して１ｘａｌｕｍを９（ｖ／ｖ）の割合で混合する。
【０１５０】
４．５  室温にて回転ホイールで１時間混合する。
【０１５１】
４．６  群２、５、８、１１（０．１ｍｃｇ  ペプチドを受容。）に対して、段階４．５の溶液を必要な体積ずつ分配する。
【０１５２】
４．７  ４．５の溶液の残りを１ｘａｌｕｍと次のように混合する：溶液１に対して１ｘａｌｕｍを９（ｖ／ｖ）の割合で混合する。
【０１５３】
４．８  室温にて回転ホイールで１時間混合する。
【０１５４】
４．９  段階４．８の溶液は、群１、４、７、１０（０．０１ｍｃｇのペプチドを受容）に対する処方に相当する。
【０１５５】
段階５  バイアルに分注する。
【０１５６】
試料の操作は全て、滅菌状態で行った。
【実施例１１】
【０１５７】
哺乳類に対するワクチンの投与
マウス感染モデルにおける、Ｍ２ペプチド連結ワクチンの免疫原性及び防御
Ｍ２ペプチド特異的抗体反応の誘導能及びマウスにおける致死性インフルエンザウイルス感染処理に対する防御力付与能について、４種類の様々なＭ２ペプチド連結物を評価した。試験連結物を次の表に示す。
【０１５８】
【表１２】
2006519775.tif 000021
【０１５９】
実施例１０で述べたように、全てＭＥＲＣＫ  ＡＬＵＭを用いて全ての連結物を処方した。筋肉内注射により、１群あたり１０匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスからなる各動物群に連結物を１００μｌ免疫接種し、３週間後に同じ連結物で一度免疫促進を行った。３種類の様々な投与量、すなわち０．０１μｇ、０．１μｇ及び１μｇ（ペプチド含量に基づく）で、動物において各連結物を試験した。例えば、処方した実施例１０の連結物Ａを、群１に対して０．０１μｇ、群２に対して０．１μｇ、群３に対して１μｇを投与し、一方、処方連結物Ｂを、群４に対して０．０１μｇ、群５に対して０．１μｇ、群６に対して１μｇというように投与した。
【０１６０】
同じスケジュールにより、ＭＥＲＣＫ  ＡＬＵＭ中に処方した非連結ＯＭＰＣで対照動物を免疫した。第２週（投与１の後）及び第６週（投与２の後）に、血液試料を回収した。免疫促進から４週間後に、ＬＤ９０（９０％が致死となる投与量）のマウス馴化Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／６８  リアソータント（Ａ／ＨＫ／６８由来のＨＡ遺伝子及びＡ／ＰＲ／８／３４由来のＭ２遺伝子）（Ｈ２Ｎ２）（本明細書中で、「Ａ／ＨＫ／６８リアソータント」と呼ぶ。）を用いて、動物の鼻腔内に感染処理を行った。感染処理後、全部で２０日間、マウスの体重減少及び死亡状況を毎日モニタリングした。
【０１６１】
検出抗原として非改変２３アミノ酸  Ｍ２ペプチドを用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）により、Ｍ２特異的抗体タイターを調べた。非投薬群及びＯＭＰＣ群の両対照群では、抗Ｍ２抗体タイターは全く検出されなかった。連結物ワクチン接種群の結果を図９に示した。ＰＤ１及びＰＤ２の両試料において、全ワクチン群で明らかな用量効果が観察されたことから、本ワクチンが適切な用量範囲で試験されていることが示された。全連結物が顕著なＭ２特異的抗体反応を誘発し得た。投与量が１μｇの場合、免疫促進投与後、本連結物全てが５０万以上の特異的抗体タイターを誘発した。様々なワクチンの中で、ＣＴ  ＮＢｒＡｃ２３ｍｅｒ（ＳＲＳ）−ＯＭＰＣが最も高いタイターを誘導し、一方、ＣＴ１５ｍｅｒ−ｍａ−ＯＭＰＣのタイターが最低であった。ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣとＮＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣとの間にははっきりとした差は見られず、このことから、Ｎ末端を介して連結させたペプチドとＣ末端を介して連結させたペプチドとは同程度の免疫原性を有することが示される。
【０１６２】
致死性のウイルス感染処理後、対照群は、予想通り９０％から１００％の死亡率が示された。一方、投与量が１μｇのワクチン群では、全ての群で、８０％から１００％の生存率が示された。これにより、試験したワクチンが死亡を防ぐ効果を与え得ることが確証された。図１０は、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣとＣＴ  １５−ｍａ−ＯＭＰＣとの間の比較を示す。この２種類の連結物の間の最も顕著な違いは、投与量が０．０１μｇの場合に、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣを投与されたマウスでは生存率が８０％であったが、ＣＴ  １５−ｍａ−ＯＭＰＣを投与されたマウスでは、本質的に対照群と同程度の死亡率であったことである。この結果から、致死性の感染処理に対する防御という点で、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣがＣＴ  １５−ｍａ−ＯＭＰＣよりも有効であることが示される。この主張は実際、これら２群により示された相対的Ｍ２抗体タイターと合致する。図１１は、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣとＣＴ  Ｂｒ−Ａｃ−２３ｍｅｒ（ＳＲＳ）−ＯＭＰＣとの比較を示す。この場合、死亡率に関して、この２種類の連結物間で明確な差はない。しかし、ＣＴ  ＢｒＡｃ−２３ｍｅｒ（ＳＲＳ）−ＯＭＰＣを投与された群では、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣを投与された群よりも体重減少が全般的に少なく、この結果から、前者の防御力がより強い可能性が考えられ得る。図１２は、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣとＮＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ−ＯＭＰＣとの比較を示す。全般的に、ＣＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ連結物を投与された群の生存率は、ＮＴ  ＢｒＡｃ−１５ｍｅｒ連結物を投与された群よりも高い。この実験において、全てのＭ２ペプチド連結物は、致死性のウイルス感染処理に対して防御力があり、チオール化ＯＭＰＣに対してＣ末端を介して連結しているＭ２  ２３ｍｅｒ（ＳＲＳ）が最も効果的なワクチンであると思われる。
【実施例１２】
【０１６３】
ペプチドＡ／Ｈ３／ＨＡ０−２
【０１６４】
【表１３】
2006519775.tif 000022
【０１６５】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２のペプチド配列は、Ａ型インフルエンザ配列、Ｈ３サブタイプ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ａ／６８のヘマグルチニンタンパク質前駆体、ＨＡ０の切断部位に広がるサブユニット間領域に相当する。太字の部分のように、Ｎ末端にグリシン及びシステイン等の残基がある。これらは、スペーサーとして、及び、チオエーテル結合を介してペプチド−ＯＭＰＣ連結物を生成させるために、マレイミド活性化ＯＭＰＣキャリアと反応するためのシステインリガンドとして必要である。
【０１６６】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２のペプチド合成
Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を用いて、固相により本ペプチドを合成した。使用したレジンは、Ｆｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ  ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ，１％  架橋（ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で、修飾Ｒｉｎｋ  リンカー  ｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋ，Ｈ．（１９８７）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８，３７８７−３７８９；Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｓ．Ｂ．及びＫｏｓｔｅｒ，Ｈ．（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３０，４６４５−４６６７）で誘導体化された、ＰＥＧ−ＰＳを基にしたレジンであった。
【０１６７】
アシル化反応は全て、レジンフリーのアミノ基で、活性化アミノ酸  ４倍過剰量を用いて６０分間行った。等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）及び２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）で、アミノ酸を活性化した。側鎖保護基は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ，Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒに対してｔｅｒｔ−ブチル、；Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ及びＧｌｎに対してトリチル；Ｌｙｓ、Ｔｒｐに対してｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルであった。会合の最後に、乾燥ペプチドレジンを、８８％  ＴＦＡ、５％  フェノール、２％  トリイソプロピルシラン及び５％  水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．，及びＢａｒａｎｙ，Ｇ．（１９９２）  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７，５３９９−５４０３）で、室温にて１．５時間処理した。
【０１６８】
このレジンを濾過し、本ペプチドを沈殿させるために、冷メチル−ｔ−ブチルエーテルにその溶液を添加した。遠心後、有機捕捉剤を除去するために、新鮮な冷メチル−ｔ−ブチルエーテルで本ペプチドペレットを洗浄した。このプロセスを２回繰り返した。最終ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％アセトニトリル中で再懸濁し、凍結乾燥させた。
【０１６９】
セミ分取  ＷＡＴＥＲＳ（ＭＩＬＦＯＲＤ，ＭＡ）ＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫＴＭ  Ｃ−１８カートリッジ（４０ｘ１００ｍｍ、１５μｍ）を用いて、溶出液として（Ａ）水中の０．１％  トリフルオロ酢酸及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  トリフルオロ酢酸を使用して、逆相ＨＰＬＣにより未精製ペプチドを精製した。２０分間にわたるＢ：２５％−４０％という勾配、流速  ８０ｍｌ／分という条件で、生成物に相当するピークを保持時間（ｔＲ）１６’で溶出した。ＵＬＴＲＡＳＨＰＥＲＥ、Ｃ１８カラム、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍを用いて、２０分間にわたるＢ：２０％−５０％Ｂの勾配、流速１ｍｌ／分という条件で分析的ＨＰＬＣを行った。ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＷＥＬＬＳＬＥＹ，ＭＡ）ＡＰＩ−１００でエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより、精製ペプチドの特徴を調べた。理論的平均ｍｗが２１６３．４８Ｄａのところ、測定値は、２１６３．６Ｄａであった。
【０１７０】
ペプチドＡ／Ｈ３／ＨＡ０−２の、ＯＭＰＣへの連結
グラム陰性細菌由来のＯＭＰＣを精製する様々な方法が考案されている（Ｆｒａｓｃｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０，８７（１９７４）；Ｆｒａｓｃｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７，６２９（１９７８）；Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら、米国特許第４，７０７，５４３号（１９８７）；Ｈｅｌｔｉｎｇら、Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｃ．８９，６９（１９８１）；Ｈｅｌｔｉｎｇら、米国特許第４，２７１，１４７号）。Ｆｕによる米国特許第５，４９４，８０８号に記載されているような、本分野で公知の技術を用いて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）Ｂの改良外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）を得ることができる。
【０１７１】
ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、髄膜炎菌）の改良外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）溶液（６．８４ｍｇ／ｍｌ）、２．９ｍｌに対して、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（０．３２２ｍｌ）を、最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ８．５になるように添加した。これに、ヘテロ２官能価の架橋剤スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ，ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）の２０μＭ溶液  ０．８３ｍｌを、２倍過剰量として（ＯＭＰＣのリジン残基について、０．４２μｍｏｌ  リジン／ｍｇ  ＯＭＰＣタンパク質）、滴下添加した。４℃にて、暗所で１時間その溶液を熟成させた後、１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４溶液（４６μｌ）を添加して、ｐＨを中性まで低下させた。過剰量の試薬を除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ＣＡ）を用いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３  （４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）２Ｌで６回（２時間ごと）緩衝液交換を行い、この溶液を透析した。透析後に、総量８．０８ｍｌの活性化ＯＭＰＣ（ａＯＭＰＣ）を回収した。
【０１７２】
Ｃｙｓ−含有ペプチドリガンド、Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２の０．７ｍｇ／ｍｌ保存溶液を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．３の脱気溶液中で調製した。このペプチド溶液のチオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．（１９５９）、Ａｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８２，７０）により測定したところ、２３０μＭのＳＨ−タイターを示した。
【０１７３】
沈殿を生じさせずにａＯＭＰＣに安全に取り込むことができるペプチドリガンドの最大量を定義するために、連結反応を最初に小規模で行い、ペプチドリガンド量を増量させながらａＯＭＰＣをインキュベーションした。ＯＭＰＣに組み込むことができるマレイミド基の最大数は、ＯＭＰＣの総リジン残基により制限される。すなわち、０．４２μｍｏｌ  リジン／ｍｇ  ＯＭＰＣである。ＯＭＰＣに対する平均ＭＷが４０ｘ１０６Ｄａであるとするならば、これは、１６，０００リジンモル数／ＯＭＰＣ  ｍｏｌに相当する。これらのうち一部のみが、最高で３５％、実際にｓＳＭＣＣにより活性化され得るが、これは、約５０００ｍｏｌに到達可能な最大ペプチド負荷に相当する。従って、次の、ＯＭＰＣ  １ｍｏｌあたりのモル過剰量のペプチドリガンド、すなわち、５００、１０００、２０００、３０００と、ａＯＭＰＣをインキュベーションした。１時間後、何らかの沈殿の有無又は濁度の上昇について調べるために、この試料をａＯＭＰＣ試料と比較した。
【０１７４】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２の場合、最大２０００（ｍｏｌ  Ｃｙｓ−ペプチド／ＯＭＰＣ  ｍｏｌ）のモル濃度過剰量を使用して１時間のインキュベーション反応を行った場合、連結反応により可溶性生成物のみが得られた。この比を超えると、ＯＭＰＣ溶液は完全に沈殿した。
【０１７５】
これらの観察を基に、大規模な反応を行った：ａＯＭＰＣ４ｍｌ  （９．８ｍｌ）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３  ２．０８ｍｌで希釈した。穏やかにボルテックスにかけながら、ペプチド保存溶液  ２．０８ｍｌをこの希釈液に滴下添加したが、これは、２０００モル濃度過剰量のペプチドモル／ＯＭＰＣ  ｍｏｌに相当する。マレイミド−活性化ＯＭＰＣ溶液の試料を、最終連結物のペプチド負荷測定用ブランクとして用いた。４℃にて１７時間、暗所で連結反応混合物を熟成させた。４℃にて暗所で１時間、最終濃度が１５ｍＭになるようにβ−メルカプトエタノールを添加して（総量８．６μＬを添加）、あらゆるＯＭＰＣの残留マレイミド基を不活性化させた。非連結ペプチド及びβ−メルカプトエタノールを除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲを用いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３  １Ｌで４時間ごとに４回緩衝液交換を行い、この溶液を透析した。
【０１７６】
Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．，Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．及びＲａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．（１９５１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５）により濃度を測定した結果、ＯＭＰＣ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２の濃度は、１．０ｍｇ／ｍｌであることが分かった。真空排気された密封ガラス試験管中で、共沸性のＨＣｌを用いて、１１０℃にて７０時間、この連結物及びａＯＭＰＣ試料を加水分解した。アミノ酸分析によりアミノ酸組成を調べた。この連結物アミノ酸組成を、ＯＭＰＣキャリア及びペプチドリガンド両方のアミノ酸組成と比較すること及びそのデータの重回帰、最小二乗解析により（Ｓｈｕｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５６，（１９９２）１３７−１４９）、ＯＭＰＣタンパク質へのペプチドの連結負荷を調べた。連結ＯＭＰＣ及びＡ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して、得られたペプチド対ＯＭＰＣモルのモル比は、１１６０であった。
【実施例１３】
【０１７７】
ペプチドＡ／Ｈ３／ＨＡ０−１８
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２のペプチド配列のｐＩは、ＰｒｏＭａＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）ソフトウェア  ｖ．１．５．３で計算すると、８．４である。そのペプチドのｐＩ値が４．１に下がるようにこの配列を処理し、その結果、ペプチドＨＡ０−１８を得たが、これは、Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２と、インフルエンザＨＡ０前駆体由来の同じ配列を有する。太字は、連結、スペーシング及びｐＩ処理に必要な残基である。
【０１７８】
【表１４】
2006519775.tif 000023
【０１７９】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１８のペプチド合成
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして、上記ペプチドを合成した。ペプチドＣ末端の酸を生成させるために、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで、活性剤としてＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔを用いて既に誘導体化されたＣｈａｍｐｉｏｎ  ＰＥＧ−ＰＳレジン（ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で、上記ペプチドを合成した。ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）で、最初のアミノ酸、グルタミン酸を対称無水物として活性化し、触媒量のＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）の存在下でそのレジンとエステル結合させた。上記ペプチド会合の最後に、１０倍過剰量のＤＭＦ中無水酢酸との反応により、アセチル化反応を行った。
【０１８０】
セミ分取（ＷＡＴＥＲＳ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫＴＭ  Ｃ１８カートリッジ（４０ｘ１００ｍｍ、１５μｍ）を用いて、溶出液として（Ａ）水中の０．１％  トリフルオロ酢酸及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  トリフルオロ酢酸を使用して、逆相ＨＰＬＣにより未精製ＨＡ０−１８を精製した。２０分間にわたるＢ：３０％−４５％の勾配、流速  ８０ｍｌ／分の条件を使用した。ＵＬＴＲＡＳＨＰＥＲＥ、Ｃ１８カラム（ＢＥＣＫＭＡＮ、ＦＵＬＬＥＲＴＯＮ、ＣＡ）、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍで、Ｂ：３０％−４５％Ｂを２０分間、８０％を３分間の勾配、流速１ｍｌ／分で分析的ＨＰＬＣを行った。ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）ＡＰＩ−１００でのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより精製ペプチドの特徴を調べた。理論的平均ＭＷが２３３６．８３Ｄａのところ、測定値は、２３３６Ｄａであった。
【０１８１】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１８の、ＯＭＰＣへの連結
実施例１２でＡ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして、ｉＯＭＰＣを活性化した。Ｃｙｓ−含有ペプチドリガンド、Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１８の保存溶液を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．３の脱気溶液で調製した。このペプチド溶液のチオール含量をＥｌｌｍａｎアッセイにより測定したところ、２００μＭのＳＨ−タイターを示した。沈殿を生じさせずにａＯＭＰＣに安全に取り込むことができるペプチドリガンドの最大量を定義するために、再び、連結反応を最初に小規模で行い、ペプチドリガンド量を増量させながらａＯＭＰＣをインキュベーションした。すなわち、ＯＭＰＣ  １ｍｏｌあたり、次のモル過剰量のペプチドリガンド、１０００、２０００、３０００と、ａＯＭＰＣをインキュベーションした。１時間後、何らかの沈殿の有無又は濁度の上昇について調べるために、対照ａＯＭＰＣ試料とその試料を比較した。ｐＩ値を低下させた処理済配列の場合、最大モル濃度過剰量のリガンド、３０００モル／ＯＭＰＣ  ｍｏｌを使用しても沈殿は見られず、濁度は上昇しなかった。
【０１８２】
これらの観察から、ａＯＭＰＣ溶液  ２ｍｌ（４．６ｍｇ）に、ペプチド保存溶液（Ｅｌｌｍａｎアッセイにより２００μＭ、３０００モル濃度過剰量に相当）１．６８ｍｌを添加した。この連結反応混合物を、４℃にて１７時間、暗所で熟成させた。次に、４℃にて暗所で１時間、最終濃度が１５ｍＭになるようにβ−メルカプトエタノールを添加して、あらゆるＯＭＰＣの残留マレイミド基を不活性化させた。非連結ペプチド及びβ−メルカプトエタノールを除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲを用いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３に対して、十分にその溶液を透析した。Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして、Ｌｏｗｒｙ法及びアミノ酸分析により最終連結物を分析した。連結ＯＭＰＣ及びＡ／Ｈ３／ＨＡ０−１８に対して、得られたペプチド対ＯＭＰＣモル比は、２５４２であった。
【実施例１４】
【０１８３】
ペプチド  Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１７
【０１８４】
【表１５】
2006519775.tif 000024
【０１８５】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１７のペプチド配列は、Ａ型インフルエンザ配列、ＨＫ  Ａ／６８、Ｈ３サブタイプのヘマグルチニンタンパク質前駆体、ＨＡ０の切断部位に相当する。この配列は、実施例１のペプチドＡ／Ｈ３／ＨＡ０−２の配列と同様であるが、この場合は、マレイミド活性化キャリアとの連結に必要とされるシステイン残基がＣ末端にある。このペプチドのｐＩを４に調整するために、この配列をさらに改変した。この改変は、アミドの代わりのＣｙｓ末端カルボキシレート、Ｎ末端のグルタミン酸及びスクシニル付加を含む。
【０１８６】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１７のペプチド合成
ペプチドＣ末端の酸を生成させるために、活性剤としてＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔを用いて４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで既に誘導体化されたＣｈａｍｐｉｏｎ  ＰＥＧ−ＰＳレジン（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で合成を行った。ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）で、最初のアミノ酸、グルタミン酸を対称無水物として活性化し、触媒量のＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）の存在下でそのレジンとエステル結合させた。Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして会合を行った。ペプチド会合の最後に、１０倍過剰量のＤＭＦ中無水コハク酸との反応によりスクシニル化反応を行った。
【０１８７】
セミ分取  ＷＡＴＥＲＳ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−ＰａｋＴＭ  Ｃ−１８カートリッジ（４０ｘ１００ｍｍ、１５μｍ）を用いて、溶出液として（Ａ）水中の０．１％  トリフルオロ酢酸及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  トリフルオロ酢酸を使用して、逆相ＨＰＬＣにより未精製ペプチド、Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１７を精製した。２０分間にわたるＢ：３０％−４５％の勾配、流速  ８０ｍｌ／分の条件を用いた。ＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ、Ｃ１８カラム（ＢＥＣＫＭＡＮ、ＦＵＬＬＥＲＴＯＮ、ＣＡ）、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍで、Ｂ：３０％−４５％Ｂを２０分間、−８０％を３分間の勾配を用いて、流速１ｍｌ／分で分析的ＨＰＬＣを行った。ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＷＥＬＥＳＬＬＥＹ，ＭＡ）ＡＰＩ−１００でのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより精製ペプチドの特徴を調べた。理論的平均ＭＷが２３３７．６２Ｄａのところ、測定値は、２３３６，８Ｄａであった。
【０１８８】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１７の、ＯＭＰＣへの連結
実施例１２で述べたようにして、ｉＯＭＰＣを活性化した。ＨＡ０−１７の保存溶液を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．３の脱気溶液で調製した。このペプチド溶液のチオール含量をＥｌｌｍａｎアッセイにより測定したところ、２００μＭのＳＨ−タイターを示した。沈殿を生じさせずにａＯＭＰＣに安全に取り込むことができるペプチドリガンドの最大量を定義するために、再び連結反応を最初に小規模で行い、Ａ／Ｈ３／ＨＡ０  １７の量を増量させながらａＯＭＰＣをインキュベーションした。すなわち、ＯＭＰＣ  １ｍｏｌあたり、次のモル過剰量のペプチドリガンド、１０００、２０００、３５００と、ａＯＭＰＣをインキュベーションした。１時間後、何らかの沈殿の有無又は濁度の上昇について調べるために、ａＯＭＰＣ試料とその試料を比較した。ｐＩ値を低下させるよう処理した配列の場合、最大モル濃度過剰量のリガンド、３５００モル／ＯＭＰＣｍｏｌを使用しても、沈殿は見られず、濁度は上がらなかった。
【０１８９】
これらの観察に基づき、ａＯＭＰＣ  ３ｍｇ（０．９４ｍｌ）で大規模反応を行った。穏やかにボルテックスを行いながら、ペプチド保存溶液  １．３３４ｍｌをこの溶液に滴下添加したが、これは、ペプチドモル／ＯＭＰＣモルの３５００モル濃度過剰量に相当する。その連結反応混合物を、４℃にて１７時間、暗所で熟成させた。４℃にて暗所で１時間、最終濃度が１５ｍＭになるようにβ−メルカプトエタノールを添加して、あらゆるＯＭＰＣの残留マレイミド基を不活性化させた。非連結ペプチド及びβ−メルカプトエタノールを除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＲＡＮＣＨＯ  ＤＯＭＩＮＧＵＥＺ，ＣＡ）を用いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３に対して、十分にその溶液を透析した。Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして、Ｌｏｗｒｙ法及びアミノ酸分析により最終連結物を分析した。分析により、組み込みレベルとして、１８６０モル（Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−１７ペプチド／ｍｏｌ  ＯＭＰＣ）の値が得られた。
【実施例１５】
【０１９０】
ペプチド  Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５
【０１９１】
【表１６】
2006519775.tif 000025
【０１９２】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５のペプチド配列は、Ａ型インフルエンザ配列、Ｈ３サブタイプ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ａ／６８のヘマグルチニンタンパク質、ＨＡ２の融合ペプチド領域に相当する。この配列には、マレイミド活性化ＯＭＰＣと連結するためのシステイン、スペーサーとしてのグリシン残基及びｐＩを３．４の値に調整するためのＣ末端残基としてのグルタミン酸（太字）の取り込みが含まれる。
【０１９３】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５のペプチド合成
ペプチドＣ末端の酸を生成させるために、活性剤としてＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔを用いて４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで既に誘導体化したＣｈａｍｐｉｏｎ  ＰＥＧ−ＰＳレジン（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で、本ペプチドを合成した。ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）で、最初のアミノ酸、グルタミン酸を対称無水物として活性化し、触媒量のＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）の存在下でそのレジンとエステル結合させた。Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして会合を行った。
【０１９４】
セミ分取  ＷＡＴＥＲＳ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−ＰａｋＴＭ  Ｃ−４カートリッジ（４０ｘ１００ｍｍ、１５μｍ）を用いて、溶出液として（Ａ）水中の０．１％  トリフルオロ酢酸及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  トリフルオロ酢酸を使用して、逆相ＨＰＬＣにより未精製ペプチド、Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５を精製した。Ｂ：４０％−４０％（５分）−６０％（２０分）の勾配、流速は８０ｍｌ／分の条件を用いた。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム、１５ｘ４．６ｍｍ、５μｍにおいて、Ｂ：３５％−５５％（２０分）−８０％（３分）の勾配で、流速  １ｍｌ／分で分析的ＨＰＬＣを行った。ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）ＡＰＩ−１００でのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより、精製ペプチドの特徴を調べた。理論的平均ＭＷが２２７１，５５Ｄａのところ、測定値は、２２７１，２Ｄａであった。
Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５の、ＯＭＰＣへの連結
実施例１２で述べたようにして、ｉＯＭＰＣを活性化した。
【０１９５】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５の溶液を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．３の脱気溶液で調製した。このペプチド溶液のチオール含量をＥｌｌｍａｎアッセイにより測定したところ、２５０μＭのＳＨ−タイターを示した。
【０１９６】
沈殿を生じさせずにａＯＭＰＣに安全に取り込むことができるペプチドリガンドの最大量を定義するために、連結反応を最初に小規模で行い、Ａ／Ｈ３／ＨＡ２  ２５の量を増量させながらａＯＭＰＣをインキュベーションした。すなわち、ＯＭＰＣ  １ｍｏｌあたり、次のモル過剰量のペプチドリガンド、５００、１０００、２０００、４０００、６０００と、ａＯＭＰＣをインキュベーションした。１時間後、何らかの沈殿の有無又は濁度の上昇について調べるために、ａＯＭＰＣ試料とその試料を比較した。ｐＩ値を低下させるよう処理した配列の場合、最大モル濃度過剰量のリガンド、６０００モル／ＯＭＰＣｍｏｌを使用しても沈殿は見られず、濁度は上昇しなかった。
【０１９７】
これらの観察により、ａＯＭＰＣ  ６．３ｍｇ（２．５７ｍｌ）で大規模反応を行った。穏やかにボルテックスを行いながら、この溶液に、ペプチド保存溶液  ３．８５ｍｌを滴下添加したが、これは、ペプチドモル／ＯＭＰＣモルの６０００モル濃度過剰量に相当する。その連結反応混合物を、４℃にて１７時間、暗所で熟成させた。次に、４℃にて暗所で１時間、最終濃度が１５ｍＭになるように添加したβ−メルカプトエタノールと反応させて、あらゆるＯＭＰＣの未反応マレイミド基を不活性化した。非連結ペプチド及びβ−メルカプトエタノールを除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲを用いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３に対して十分にその溶液を透析した。Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして、Ｌｏｗｒｙ法及びアミノ酸分析により最終連結物を分析した。分析により、Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−２５の取り込みレベルとして、２４３６モルペプチド／ｍｏｌ  ＯＭＰＣの値が得られた。
【実施例１６】
【０１９８】
ペプチドＢ／ＨＡ０−２２
Ｂ／ＨＡ０−２２のペプチド配列は、Ｂ型インフルエンザ配列（Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａ株、例えば、Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／５４、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３３０／２００１及びＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／１９９８等のＢ型インフルエンザウイルスにおけるものと一致する。）のヘマグルチニンタンパク質前駆体、ＨＡ０の切断部位に相当する。
【０１９９】
【表１７】
2006519775.tif 000026
【０２００】
この配列は、Ｎ末端へのブロモアセチル基の導入（それによりチオール化ＯＭＰＣへの連結が可能となる（Ｔｏｌｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１，１９９３，４５５−４６６；Ｃｏｎｌｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４，１２，４４５−４５１））、グリシンスペーサー導入及びこのペプチドのｐＩ値を調整するための修飾により改変されている。この改変は、カルボキサミドのＣ末端カルボキシレートへの置換、及びＮ及びＣ末端におけるグルタミン酸の付加を含む。
【０２０１】
Ｂ／ＨＡ０−２２のペプチド合成
Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を用いて、固相により上記ペプチドを合成した。ペプチドＣ末端の酸を生成させるために、活性剤としてＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔを用いて４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーにより既に誘導体化したＣｈａｍｐｉｏｎ  ＰＥＧ−ＰＳレジン（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で、上記ペプチドを合成した。ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）で最初のアミノ酸、グルタミン酸を対称無水物として活性化し、触媒量のＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）の存在下でそのレジンとエステル結合させた。ペプチド会合の最後に、活性剤としてＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔを用いて、３倍過剰量のブロモ酢酸との反応によりブロモアセチル化反応を行った。
【０２０２】
アシル化反応は全て、レジンフリーのアミノ基において、活性化アミノ酸  ４倍過剰量を用いて６０分間行った。等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）及び２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）で、アミノ酸を活性化した。側鎖保護基は、Ｇｌｕに対してｔｅｒｔ−ブチル、；Ｌｙｓに対してｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；Ａｒｇに対して２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであった。会合の最後に、乾燥ペプチドレジンを、８８％  ＴＦＡ、５％フェノール、２％トリイソプロピルシラン及び５％  水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．，及びＢａｒａｎｙ，Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７，５３９９−５４０３）で、室温にて１．５時間処理した。このレジンを濾過し、ペプチドを沈殿させるために、冷メチル−ｔ−ブチルエーテルにその溶液を添加した。遠心後、有機捕捉剤を除去するために、新鮮な冷メチル−ｔ−ブチルエーテルでこのペプチドペレットを洗浄した。このプロセスを２回繰り返した。この最終ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％アセトニトリルで再懸濁し、凍結乾燥させた。
【０２０３】
セミ分取  ＷＡＴＥＲＳ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−ＰａｋＴＭ  Ｃ−１８カートリッジ（４０ｘ２００ｍｍ、１５μｍ）を用いて、溶出液として（Ａ）水中の０．１％  トリフルオロ酢酸及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  トリフルオロ酢酸を使用して、逆相ＨＰＬＣにより未精製ペプチドを精製した。２０分間にわたるＢ：３０％−４５％の勾配、流速  ８０ｍｌ／分という条件を用いた。ＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ（ＢＥＣＫＭＡＮ，ＦＵＬＬＥＲＴＯＮ，ＣＡ）、Ｃ１８カラム、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍで、Ｂ：３０％−５０％Ｂ（２０分）、−８０％（３分）の勾配を用いて、流速１ｍｌ／分で分析的ＨＰＬＣを行った。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＡＰＩ−１００でのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより、精製ペプチドの特徴を調べた。理論的平均ＭＷが２５００．７Ｄａのところ、測定値は、２５００．４Ｄａであった。
【０２０４】
Ｂ／ＨＡ０−２２の、ＯＭＰＣへの連結
超遠心（Ｔｉ−７０ローター、５０，０００ＲＰＭ、４５分間、４℃）及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度でダウンス型ホモジェナイザーによりホモジェナイズ／再懸濁を行うことにより、窒素注入した濾過滅菌済みＣＭ７６１（０．１１Ｍ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ１１．３）にｉＯＭＰＣ出発物質（１５０ｍｇ）を最初に移した。次に、ＥＤＴＡ−ＤＴＴ溶液（ＣＭ７６１中、０．５７ｇ  ＥＤＴＡ／ｇ  ＯＭＰＣ、０．１１ｇ  ＤＴＴ／ｇ  ＯＭＰＣ）と併せてＮ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ）（窒素注入水中、０．８９ｇ  ＮＡＨＴ／ｇ  ＯＭＰＣ）の溶液を用いてそのタンパク質をチオール化した。チオール化反応を室温（〜２０℃）にて４時間進行させた。次に、２回の超遠心（５０，０００ＲＰＭ、４５分間、４℃）及びダウンス型ホモジェナイザーによるホモジェナイズ／再懸濁ステップを行うことにより、チオール化ｉＯＭＰＣを、２５ｍＭ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０緩衝液に移した。チオール化終了時に、次の段階に進む前に、Ｌｏｗｒｙ法及びＥｌｌｍａｎアッセイを行った。チオール化ＯＭＰＣのチオール含量は、０．２５μｍｏｌ  チオール／ｍｇであった。
【０２０５】
最初に２５ｍＭ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０緩衝液に、濃度が５ｍｇ／ｍｌになるようにＢ／ＨＡ０−２２  ６５ｍｇを溶解した。１Ｎ  ＮａＯＨによりペプチド溶液のｐＨをｐＨ８．０に戻るように再調整し、次に０．２２ミクロン滅菌フィルターで濾過した。チオール化ＯＭＰＣ  ５３ｍｇ（質量による負荷量比  １．２ｇペプチド／ｇ  ＯＭＰＣ）を、軽く撹拌しながらペプチド保存溶液に滴下添加した。全く撹拌せずに、連結反応を１５．５時間、室温にて進行させた。
【０２０６】
連結反応終了時に、６個の３００ｋＤ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲに、使用体積が各５ｍｌになるように連結溶液を移した。３個のＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲを、濾過滅菌した水がそれぞれ３．５Ｌから４Ｌ入った４Ｌのビーカーに入れた。３インチのマグネチックスターラーバー及び速度調節可能な撹拌プレートを用いて、連結物と３．５Ｌから４Ｌの濾過滅菌水両方が入った各４Ｌ  ガラスビーカーを穏やかに撹拌した。反応副産物及び過剰な遊離ペプチドを除去するために、少なくとも６時間ごとに、濾過滅菌水を用いて、全部で５回の透析液交換を行った。
【０２０７】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２に対して述べたようにして、Ｌｏｗｒｙ法及びアミノ酸分析により最終連結物を分析した。これらの分析により、Ｂ／ＨＡ０−２２に対する取り込みレベルとして、６５００モル  ペプチド／ｍｏｌ  ＯＭＰＣの値が得られた。
【実施例１７】
【０２０８】
ＨＡ０ペプチド−ＯＭＰＣ連結物をワクチン接種したマウスにおける、Ａ型インフルエンザウイルスによるマウス感染処理実験
ＯＭＰＣに連結させたＨＡペプチドの連結物を用いて、筋肉内投与によりメスＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。ＨＡ０−２１（Ｈ１）及びＨＡ０−２２（Ｈ３）を用いた実験において、連結に用いた化学物質は、チオール化ＯＭＰＣ及びブロモアセチル化ペプチドであった。ＨＡ０−２５（Ｈ３Ｌ）及びＨＡ０−２５（Ｈ１）を用いた実験において、用いた化学物質はマレイミジル−ＯＭＰＣ及びシステイニルペプチドであった。連結物を精製し、標準的方法を用いて処方用に調製した。
【０２０９】
ワクチンは全て、Ｍｅｒｃｋ  Ａｌｕｍ又はＱＳ２１アジュバント  ２０μｇを用いて処方し、１回の注射につき、マウス１匹あたり１００μｌの体積で投与した。第０、２及び４週に、マウスに対してワクチン接種を行った。第７週に、このマウスに対して、鼻腔内に致死用量のインフルエンザウイルス  ＰＲ８又はＨＫを用いて感染処理を行った。データを以下に示す。
【０２１０】
ＨＡペプチド／ＯＭＰＣ連結ワクチンを用いた、マウス感染処理実験
【０２１１】
【表１８】
2006519775.tif 000027
ａペプチド−ＯＭＰＣ連結物の各処方中のペプチド量
【０２１２】
血清試料を回収し、標準的ＥＬＩＳＡ方式で上記のようにアッセイした。
ＥＬＩＳＡ  タイター
【０２１３】
【表１９】
2006519775.tif 000028
2006519775.tif 000029
【実施例１８】
【０２１４】
ＯＭＰＣに連結させたＢ型インフルエンザウイルス由来のＨＡ０ペプチドをワクチン接種したマウスにおける、Ｂ型インフルエンザウイルスによるマウス感染処理実験
上述のように、Ｂ型インフルエンザＨＡ０連結物を調製した（上記の実施例参照）。Ｂ型／ＨＡ０−２２  ＥＧＰＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＥ（配列番号６０）ペプチド−ＯＭＰＣ連結物について使用した連結は、チオール化ＯＭＰＣに連結させたブロモアセチルペプチドであった。
【０２１５】
Ｍｅｒｃｋ  Ａｌｕｍ中に処方したＢ／ＨＡ０−２２  １、１０、１００又は１０００ｎｇ（本処方中の連結物のペプチド含量を基にしたｎｇ）を用いて、第０週及び第２８週に、筋肉内投与によりメスＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。第２週及び第４週に血清試料を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＡ０−特異的抗体を測定した。
【０２１６】
２回目の免疫から３週間後、マウス適合Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／５４を、ＬＤ９０の量（９０％のマウスが死亡する量）、鼻腔を介してマウスへの感染処理を行った。その後２０日間、マウスの生存及び体重変化を観察した。
【０２１７】
Ｂ／ＨＡ０−ＯＭＰＣ連結ワクチンは、強力なＨＡ０−特異的な抗体反応を誘導した（図２２Ａ）。この抗体反応は用量依存的であった。本ワクチン１ｎｇからかなりのＨＡ０−特異的抗体タイターが誘導され得、本ワクチン  １０００ｎｇから、約１００万のタイターが誘導された。
【０２１８】
Ｂ／ＨＡ０−ＯＭＰＣ連結ワクチンは、致死性のウイルス感染処理に対しても高い効果を示した。生存曲線（図２２Ｂ）で示すように、Ｂ／ＨＡ０−ＯＭＰＣワクチン  １０ｎｇ、１００ｎｇ又は１０００ｎｇを投与されたマウスでは生存率が１００％であり、ワクチン  １ｎｇを投与されたマウスでは生存率が７０％であった。予想通り、非処置の対照では死亡率が９０％であった。Ｂ／ＨＡ０−ＯＭＰＣワクチンは、体重減少を防ぐ点でも大きな効果があった。例えば、対照マウスにおいて３０％の体重減少があった一方で、本ワクチン  １００ｎｇ又は１０００ｎｇを投与したマウスの場合、最大体重減少はわずか１０％であった。
【０２１９】
亜致死性の感染処理モデルにおいて、インビボウイルス複製におけるＢ型インフルエンザワクチンの効果を調べた。４週間に２回の割合でマウスを免疫し、亜致死性量のＢ／Ａｎｎ  Ａｒｈｏｒ／５４を用いて感染させた。第１、３、５及び７日に、鼻腔及び肺洗浄液を回収した。ワクチン接種マウス及び対照マウスは、鼻腔のウイルス排出の点では明らかな差が見られなかった。しかし、対照と比較して、免疫されたマウスにおいて、肺のウイルス排出が著しく減少した。（図２３）
【実施例１９】
【０２２０】
Ａ／Ｈ３／ＨＡ２ペプチド−ＫＬＨ連結物をワクチン接種したマウスにおける、Ａ型インフルエンザウイルスによるマウス感染実験
マレイミド活性化ＫＬＨとの反応のためのチオール基を与えるために本ペプチドのＮ末端にシステイン残基を付加することにより、Ａ／Ｈ３／ＨＡ２−６−ＫＬＨ連結物（ＫＩＤＬＷＳＹＮＡＥＬＬＶＡＬＥＮＱＨＴ（配列番号５９）を調製した。
【０２２１】
第０、３及び５週に、各群１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対して、２０ＱＳ２１中のＡ／Ｈ３／ＨＡ２−６−ＫＬＨ連結物  ２０μｇを皮下投与して免疫した。最後の免疫から２週間後に、ＬＤ９０量のインフルエンザＨＫ  リアソータントを用いて、鼻腔を介してマウスへの感染処理を行った。ＨＡ６−ＫＬＨは、致死性感染処理に対してある程度の防御効果を示した。例えば、感染処理後、対照の死亡率が９０％であったのに対して、ワクチン群の死亡率は６０％であった。さらに、本ワクチンを投与したマウスにおいて、全般的に対照よりも体重減少が軽度であった（図２４）。
【実施例２０】
【０２２２】
ＨＰＶ  ＶＬＰｓへのＭ２ペプチドの連結
（Ｔｏｂｅｒｙら、２００３）に記載されているようにして、ＨＰＶタイプ１６ＶＬＰｓを発現させ、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、出芽酵母）から精製した。この実験で使用した抗原は、標準的なｔ−Ｂｏｃ固相合成により調製した合成２５−残基Ｍ２−ペプチドである。このペプチドの配列は、インフルエンザウイルス株、Ａ／Ａｉｃｈｉ／４７０／６８（Ｈ３Ｎ１）のＭ２タンパク質の細胞外セグメント、Ａｃ−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＳＲＳＮＤＳＳＤ−Ａｈａ−Ｃ−ＮＨ２（配列番号２であり、非天然アミノ酸、６−アミノへキサン酸（Ａｈａ）を含有する。）と類似している。
【０２２３】
抗原キャリア連結物
Ｌ１タンパク質濃度が１４μＭである、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．４中のＨＰＶ  ＶＬＰｓを、市販のヘテロ２官能価架橋剤、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）（ＰＩＥＲＣＥ  ＥＮＤＯＧＥＮ，ＲＯＣＫＦＯＲＴ，ＩＬ）と混合して、最終ｓＳＭＣＣ／Ｌ１タンパク質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比を〜１００とした。その反応を、２℃から８℃にて１時間進行させ、次に、１０ｍＭ  ヒスチジン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５％ポリソルべート８０を含有するｐＨ６．２  緩衝液に対して透析により脱塩し、ｓＳＭＣＣ活性化ＨＰＶ  ＶＬＰｓを生成させた。実施例１に記載されているようなＤＴＮＢアッセイにより、マレイミド相当物を調べた。Ｎ２注入緩衝液中に溶解させたＭ２−ペプチドを、ｓＳＭＣＣ活性化ＨＰＶ  ＶＬＰｓと混合し、チオール／マレイミド（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比が〜３になるようにした。あるいは、ｓＳＭＣＣ活性化ＨＰＶ  ＶＬＰｓをＮ−アセチルシステインと、チオール／マレイミド（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比が〜１０になるように混合することにより、活性化／不活性ＨＰＶ  ＶＬＰ（Ａ／Ｑ  ＨＰＶ  ＶＬＰ）を調製した。２℃から８℃にて、この反応を〜１５時間進行させた。次に、両試料をβ−メルカプトエタノールで処理し、過剰なマレイミドを全て不活性化した。最後に、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０１５％  ポリソルベート８０に対して、本試料を透析（ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＳＥＲ  ＭＷＣＯ  ３００，０００  ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＲＡＮＣＨＯ  ＤＯＭＩＮＧＵＥＺ、ＣＡ）した。連結前にＨＰＶ  ＶＬＰｓ中の遊離チオールをヨードアセトアミドにより不活性化した場合、同様の結果が得られた。
【０２２４】
タンパク質濃度及びＶＬＰ１個あたりのペプチド負荷の測定
比色ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより溶液中のタンパク質濃度を測定した。アミノ酸分析によりＶＬＰ１個あたりのペプチド負荷を調べた。１１０℃にて、６Ｎ  ＨＣｌ中で７０時間、試料を加水分解し、次に陽イオン交換クロマトグラフィー処理後に定量した（ＡＡＡ  ＳＥＲＶＩＣＥＳ  ＩＮＣ．，ＢＯＲＩＮＧ，ＯＲ）。Ａｈａ含量を参照するか、又はＳｈｕｌｅｒら、１９９２により記載された手段に基づいた分析を行うかのいずれかにより、ペプチド量を測定した。両方法から同様の結果が得られた。
【０２２５】
ウイルス様粒子における抗原性ペプチド負荷
そのペプチドにおける非天然アミノ酸（Ａｈａ、６−アミノへキサン酸）の定量又はデータの重回帰最小２乗解析（Ｓｈｕｌｅｒら、「Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ（アミノ酸分析を用いた、ペプチド−タンパク質モル比の測定に対する簡便法）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，Ｖｏｌ．１５６  ｐｐ．１３７−１４９，１９９２）のいずれかにより、アミノ酸分析を用いて、ＨＰＶ  ＶＬＰにおけるペプチド負荷を調べた。両方法により、Ｌ１タンパク質１分子あたり約１１のペプチド負荷が示された。１個のＨＰＶ  ＶＬＰ中には３６０コピーのＬ１タンパク質があり（１個のＶＬＰは、７２個のＬ１タンパク質５量体又はカプソマーを含有する。）、従って、ＶＬＰ１個あたり、全部で約４，０００ペプチドコピーが負荷されているということになる。この数は、以前報告された、ウシパピローマウイルス粒子において負荷された全ペプチド数（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら、２００１）よりも著しく多い。ウシパピローマウイルスの場合、抗原ペプチドは、ストレプトアビジン（ＳＡ）に融合しており、その融合構築物がビオチニル化ＶＬＰｓと相互作用した。ＶＬＰｓのＬ１タンパク質は、〜１．５ＳＡ  ４量体を収容しており、その結果、Ｌ１単量体１個あたり〜６ペプチドの比になることが分かった。この負荷数は、本発明者らの、ＨＰＶ  ＶＬＰに対するＭ２ペプチドの連結物の場合の約半分である。ＳＡ  ４量体は容積が大きいため、報告されたこのケースにおいては、抗原が多数負荷することができない可能性がある。
【０２２６】
ｓＳＭＣＣにより活性化された最初の部位のうちいくつがペプチドカップリングを生じさせたかを調べることで、連結効率を調べることができる。アミノ酸分析により、加水分解プロセスにおけるｓＳＭＣＣ架橋剤の産物であるＴＸＡ（トラネキサム酸）の量的推計を行うことができる。ＴＸＡの平均測定値から、Ｌ１タンパク質１分子あたりの活性化部位が〜１９個であることが示されたが、このことから、活性化部位のうち５８％（又は１１／１９）のみがペプチドカップリングに関与することが示唆された。活性化部位の中にはＣｙｓ、Ｌｙｓ又はＨｉｓの近接した側鎖と相互作用することができるものがあり、その結果、そのタンパク質の架橋が起こるという可能性がある。Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ及び活性化／不活性（Ａ／Ｑ）ＨＰＶ  ＶＬＰｓの両方が、還元条件下で、７０℃にて１０分間、変性溶液処理を行っても、１０％ＳＤＳ−Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに浸透し得ないことが観察された。非活性化ＨＰＶ  ＶＬＰｓの場合は、ゲル添加前に同条件で処理した後、予想された移動度のタンパク質バンドが得られる。従って、マレイミド活性化後に、顕著な内部−ＶＬＰ架橋が起こっていると思われる。以下に示すように、ＶＬＰサイズ測定から、ＶＬＰｓの粒子サイズ分布に対するＶＬＰ間架橋の影響は無視してよいと思われる。
【０２２７】
ＨＰＶ  ＶＬＰｓ表面における抗原性ペプチドの空間的分布を考慮した場合、Ｌｙｓ側鎖の一級アミンは、ｓＳＭＣＣ活性化が最も起こりやすい部位である。ＨＰＶタイプ１６のＬ１タンパク質に３４個のＬｙｓがあり、これらのリジンのうち９個がＣ末端に位置する。図２５に示す分子の図から、ＨＰＶタイプ１６ＶＬＰｓにおける推定活性化部位は、ＶＬＰ表面に均一に広がっていることが分かる。図２５で示されるＬｙｓ残基のＮＺ原子は、ＶＬＰの外側に配向している。Ｌｙｓ２３０を除き、Ｌｙｓ残基は全て、表面の２５％超が溶媒に曝露されている。Ｃ末端領域は非常に柔軟であり、プロテアーゼに接近しやすく、従って、この領域に位置するＬｙｓの側鎖が活性化に利用され得ることは十分に考えられ得ることである。残念ながら、このＣ末端領域は、Ｘ線構造において明らかとならなかった（Ｃｈｅｎら、２０００）。
【実施例２１】
【０２２８】
Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物の医薬的特性
ＥＬＥＣＴＲＯＮ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＢＩＯＳＥＲＶＩＣＥＳ（ＭＯＮＲＯＶＩＡ，ＭＤ）により、ＪＥＯＬ  １２００  ＥＸ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（透過型電子顕微鏡）を用いて、高倍率で電子顕微鏡測定が行われた。２％  リンタングステン酸を用いて、風乾試料を染色した。Ｍａｌｖｅｒｎ  ４７００装置において、９０°の角度での検出で、室温にて動的光散乱測定を行った。出力は０．２５Ｗ、絞り（開口）は１００、総タンパク質濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであった。報告されたサイズは、同じ試料における５回の連続的測定から得られたデータの単一モード解析による結果である、Ｚ−平均流体力学的直径を表す。ＨＰＶ  ＶＬＰ又はＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物溶液濁度の熱誘導性の上昇を、温度調節装置  タイプ８９０９０Ａ付きの分光光度計  ＨＰ  ８４５３でモニタリングした。２４℃から７４℃へと、〜１．５℃／分の割合で温度を上げながら、３５０ｎｍの光学密度の変化を記録した。分析的超遠心機  Ｂｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−１により、Ａｎ６Ｔｉローター及びダブルセクターセルを用いて沈降速度実験を行った。ローター速度は、１０，０００ｒｐｍであり、２８０ｎｍの吸収により境界運動を観察した。プログラムＤＣＤＴ＋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｐｈｉｌｏ．ｍａｉｌｗａｙ．ｃｏｍ）を用いてデータを解析した。Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０５カラム及び２５ｍＭ  リン酸、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含有する溶出緩衝液を備えたＨＰ  １１００システムにおいて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを行った。
【０２２９】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定から、Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物の平均粒子サイズは、非処理ＨＰＶ  ＶＬＰキャリアの場合は〜６０ｎｍであるが、この連結物（Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ）の場合は〜８０ｎｍというように、わずかに大きくなることが示された。Ａ／Ｑ  ＨＰＶ  ＶＬＰｓの平均流体力学サイズは６５ｎｍであることが明らかになったが、この値は非処理キャリアのサイズと非常に近い。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果（図２６Ａ）において、Ａ／Ｑ又は非処理ＨＰＶ  ＶＬＰｓと比較して、短い保持時間でＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物の主要なピークが溶出されることが示されているが、これは、Ａ／Ｑ又は非処理ＨＰＶ  ＶＬＰｓの粒子サイズよりも本連結物の粒子サイズが大きいことに対応するものである。クロマトグラムにおける小さな肩部分から、この連結物の前後に凝集物質の小さな断片が存在することが分かる。最終的に、沈降速度データ（図２６Ｂ）から、Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰの場合の沈降係数分布において、非処理又はＡ／Ｑ  ＨＰＶ  ＶＬＰｓの沈降係数よりも大きいｓ＊値に中心があることが示される。キャリアのみの沈降係数と比較して、連結物の沈降係数がわずかに上昇しているのは、ＤＬＳ及びクロマトグラフィー測定により明らかになったように、この連結物に対するサイズがわずかに大きくなっていることと一致する。全体の結果から、連結プロセスの間に、著しいＶＬＰ間架橋（及び、間接的な凝集）が起こっていないことも示唆される。
【０２３０】
ＥＭによるＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物の観察（図２７）により、サイズ分布が４０ｎｍから９５ｎｍであり、平均が約６５ｎｍであることが示される。この値は、非処理ＨＰＶ  ＶＬＰｓの値と非常に近い。しかし、非連結キャリアと比較して、この連結物がＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰにおいて「不鮮明な様相」を持つことが分かったが、これは連結したペプチドによるものであり得る。ＥＭ像で示される複数のＶＬＰ凝集体が、同様にＨＰＶ  ＶＬＰに対して観察される。従って、これらは、ＥＭ測定のための試料操作の結果であり得、溶液中での試料の典型的な様子ではない。結論として、ＥＭの結果により、ＨＰＶ  ＶＬＰｓの形態が保存され、化学連結プロセスの間にＨＰＶ  ＶＬＰの骨格の大きな破壊が起こらなかったということが支持される。
【０２３１】
処理及び非処理ＨＰＶ  ＶＬＰｓ又はこの連結物に対する溶液濁度アッセイで調べた熱誘導凝集の特徴を図２８に示す。非処理ＨＰＶ  ＶＬＰｓに対して、熱誘導性凝集（光散乱による光学密度の増加により明らかになったように）は６０℃で検出可能となり、温度をさらに上げた場合、突然上昇する。Ａ／Ｑ  ＶＬＰｓ又はＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物の場合、溶液の濁度から７０℃以下では検出可能な凝集が示されない。熱誘導性凝集に対する安定性が強まったのは、ｓＳＭＣＣ処理により誘導されたＶＬＰ内架橋によるものと考えられる。ｓＳＭＣＣを介して形成されるさらなるＶＬＰ内結合により、Ｌ１タンパク質が部分的に折り畳まれなくなること及び疎水性表面に対する連続的な曝露を防ぎ得る。連結又はｓＳＭＣＣ処理により、ＨＰＶ  ＶＬＰｓの表面特性が変化し、それがある部分、キャリアの安定性の強化に寄与し得るということは注目するに値する。
【実施例２２】
【０２３２】
Ｍ２−ＨＶＰ連結物のインビトロ抗原性の分析
抗ＨＰＶ及び抗Ｍ２抗体との連結相互作用の検出
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００において表面プラスモン共鳴技術を用いて、ＨＰＶタイプ１６ＶＬＰｓ及びＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物の、Ｍ２又はＨＰＶタイプ１６特異的抗体に対する結合を調べた。抗ＨＰＶ抗体（配座抗体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）  Ｈ１６．Ｖ５、Ｈ１６．Ｅ７０及び抗体Ｈ１６．Ｊ４に結合する直線状エピトープ）及び抗Ｍ２抗体を、センサーチップ  タイプＣＭ５の表面に化学的に固定化したラット抗マウスＦｃγ抗体に結合させた。
【０２３３】
Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物及びＡ／Ｑ  ＨＰＶ  ＶＬＰの、直線状及び立体配座抗ＨＰＶマウス抗体（ｍＡＢ）への結合を調べることにより、抗原の空間分布をさらに調べた。配座又は中和抗体Ｈ１６．Ｖ５及びＨ１６．Ｅ７０に対する結合親和性が劇的に低下することが分かったが、一方、直線状抗体Ｈ１６．Ｊ４への結合の場合は、連結への影響はごくわずかであった。配座抗体Ｈ１６．Ｖ５及びＨ１６．Ｅ７０の結合に関与するエピトープは、Ｐｈｅ５０を含有する（Ｗｈｉｔｅら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｌ１（ヒトパピローマウイルスタイプ１６  Ｌ１における主要な中性化エピトープの特徴）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７３（６），ｐｐ。４８８２−４８８９，１９９９）。図２５に示すように、６個のリジン残基があるが、これは、Ｐｈｅ５０に隣接している。Ｐｈｅ５０周辺のいかなるＬｙｓ残基に対するペプチドの連結も、抗体結合を混乱させると思われる。Ｈ１６．Ｊ４は、ＶＬＰにおけるＬ１タンパク質の上のループと結合する。このループには、Ｌｙｓが１個しかなく、そのＨ１６．Ｊ４への結合がＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰにおいて変化しないので、ペプチドとは連結しないと思われる。
【０２３４】
１つの懸念事項は、このキャリアの表面で、ペプチドが正しい３−Ｄ立体配置を取るかどうかということである。Ｍ２タンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスの内在性膜タンパク質であり、選択した抗原配列は、Ｍ２の細胞外部分を表す。Ｍ２タンパク質は、２個のジスルフィド結合二量体により形成されたホモ四量体であり（Ｔｉａｎら、「Ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ（脂質二重膜におけるＭ２タンパク質膜貫通及び両親媒性ヘリックスの一次構造及び動的特徴）」、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．２５９７−２６０５、２００３）、我々の知る限り、Ｍ２の細胞外部分に関する文献において、詳しい３Ｄ−構造は報告されていなかった。ＣＤ及び蛍光測定から、溶液中の非連結ペプチドが、大部分、ランダムな構造的配置にあることが示唆される。これらの知見は、ＶＬＰの表面の確定的な構造的配置におけるペプチド提示を支持するものではないが、表面プラスモン共鳴により得られた予備的な結果から、Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物が抗Ｍ２抗体  Ｌ１８．Ｈ１２及びＰ６．Ｃ８に結合することが示される。同条件下で、ＨＰＶ  ＶＬＰｓ又は（Ａ／Ｑ）  ＨＰＶ  ＶＬＰを用いた場合、抗Ｍ２抗体に対する結合は全く検出されなかった。
【実施例２３】
【０２３５】
インビボ免疫評価
４週齢から１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを、ＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より入手した。Ｍｅｒｃｋ  Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＡＡ）に様々なペプチド用量で吸着させたＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰを、４週間の間隔をあけて２回の注射で、０．１ｍｌ  Ｉ．Ｍ．  投与した。第２回目の注射から３週間後、マウスに対して感染処理を行った。３、３０及び３００ｎｇのペプチド用量は、ＨＰＶ  ＶＬＰ  約５、５０及び５００ｎｇに相当する。各注射で投与したＭＡＡ用量は、４５ｍｃｇであった。各注射から２週間後に、抗Ｍ２幾何平均タイターを調べた。Ｍ２抗体ＥＬＩＳＡに対して、５０ｍＭ  重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中の４μｇ／ｍｌの濃度のＭ２ペプチド、１ウェルあたり各５０μｌで、９６ウェルプレートを４℃にて一晩被覆した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でプレートを洗浄し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の３％スキムミルク（ミルク−ＰＢＳＴ）でブロッキングした。４倍ずつＰＢＳＴで試験試料を連続希釈した。希釈試料  １００μｌを各ウェルに添加し、そのプレートを２４℃にて２時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。所定の希釈率のミルク−ＰＢＳＴ中のＨＲＰ連結二次抗体  ５０μｌを各ウェルに添加し、そのプレートを２４℃にて１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の１ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド  １００μｌを各ウェルに添加した。２４℃にて３０分間インキュベーションした後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を１ウェルあたり１００μｌ添加して反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４９０ｎｍでそのプレートの読み取りを行った。連結対照ウェルの平均プラス標準偏差２つ分を超えるＯＤ４９０ｎｍ値を与える最大希釈の逆数として、抗体タイターを定義した。ウイルス感染に対して、マウス馴化ウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８；Ｈ１Ｎ１）及びＸ−３１（Ｈ３Ｎ２）、ＰＲ８とＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）との間のリアソータントを、１０日齢の発育鶏卵の尿膜腔液で増殖させた。マウスをケタミン／キシラジンで麻酔した。１  ＬＤ９０のウイルス２０μｌを鼻腔に植え付けた。感染処理後、マウス生存率を毎日記録した。（ある特定の日のマウス数／０日のマウス数）ｘ１００％として、死亡率を計算した。
【０２３６】
各免疫から２週間後に採取した血液試料に対するＥＬＩＳＡ測定の結果から、この連結物により、高い抗Ｍ２抗体反応が誘導されたことが示される（図２９Ａ）。Ｍ２ペプチド用量が３ｎｇから３００ｎｇまで増えるに従い、タイターが体系的に向上するにもかかわらず、最低用量と最高用量との間のタイターの差は１対数単位内である。これらの結果から、適切なキャリアにおいて提示された場合、ナノグラム用量の抗原性ペプチドが顕著な免疫反応を誘導し得ることが示される。Ｍ２ペプチドをより大きなキャリア、上記のようなナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）に連結させた場合、マウスにおいて同様のタイターが観察されることは注目に値する。
【０２３７】
致死性の感染処理に対するマウスの生存率を図２９Ｂに示す。最低ペプチド用量（３ｎｇ）を投与した群の生存率はわずか６０％であったが、一方で、３０又は３００ｎｇペプチドといった最高用量を投与した群での防御効果は１００％であった。対照群では、感染処理後に生存していたマウスはいなかったことから、ウイルス感染処理及びワクチン防御両方が有効であったことが確認できる。上記でＭ２−ＯＭＰＣ連結ワクチンで見られるように、感染処理後に１００％生存した群においてでさえも、ある程度の体重減少が観察された。結論として、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対する、Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結ワクチンを用いたワクチン接種により、生ウイルス感染処理から動物を効果的に守ることができる。
【０２３８】
キャリア誘導エピトープ特異的抑制が文献（Ｒａｕｌｙら、１９９９）に記載されている。従って、さらなる実験においては、インビボにおいて抗キャリア抗体の存在により、本連結物の免疫原性がどのように影響を受けるかを調べることになろう。Ｍ２−ＯＭＰＣ連結ワクチンを用いた、実施例２６で示す実験から、キャリアへ予め曝露することにより、インフルエンザペプチド連結ワクチンに対する反応はなくならないが、わずかに低下することが示される。しかし、連続的な免疫促進により、本キャリアに対する既に存在する抗体のあらゆる有害な影響を切り抜け得ることが示唆された。
【０２３９】
キャリアによるプレ免疫が抗体反応を弱めることが示されたケースは多数あるが、抗キャリア抗体が存在すると連結ワクチンの免疫原性に対して悪影響が及ぼされるということを推測的にただ提案することはできない。キャリアに対する事前に存在する免疫性（破傷風トキソイド）が、抗ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｓｈａｈら、「Ｐｒｉｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈＣＧ  ｉｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ｈＣＧ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ（ｈＣＧ−キャリア連結ワクチンのレシピエントにおいて、既に存在するキャリアに対する免疫性により、ｈＣＧに対する抗体反応が促進される。）」、Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．３１１６−３１２３，１９９９）又はマラリアペプチド（Ｌｉｓｅら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｙ  ｐｒｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒ（破傷風毒素キャリアを用いたプレ免疫による、合成ヒトマラリアペプチドに対するエピトープ性反応の促進）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．５５，ｐｐ．２６５８−２６６１，１９８７）反応のいずれかに対する有用性が報告された。インフルエンザペプチドエピトープのキャリアとしての組み換え鞭毛について述べている様々なケースにおいて、キャリアに予め曝露しても効果がないことが分かった（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ及びＡｒｎｏｎ，「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ（合成インフルエンザワクチンの効力における、既に存在する免疫の効果）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．６４，ｐｐ．９−１５，１９９８）。ＨＰＶ  ＶＬＰｓの場合、非処理型（抗ＨＰＶワクチンとして）又は処理型（様々な抗原を提示するキャリアとして）のキャリアに予め曝露した動物モデルにおいて何らかの差があるかどうかについてはまだ分かっていない。反応性ヒト血清の７５％超がＨ１６．Ｖ５抗体により完全にブロックされることが分かった（Ｗａｎｇら、「Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔａｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｃａｐｓｉｄｓ  ｂｌｏｃｋｓ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒａ（インタクトなヒトパピローマウイルス  タイプ１６キャプシドに対するモノクローナル抗体は、ほとんどのヒト血清の血清反応性をブロックする。）」、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７８，ｐｐ．２２０９−２２１５，１９９７）。Ｈ１６．Ｖ５抗体が結合する立体配座エピトープを連結Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰが提示するということから、ＨＰＶに対して予め曝露された対象者に対して、抗原とキャリアとしてのＨＰＶ  ＶＬＰｓとの間における化学連結により調製したワクチンに対するキャリア抑制をそれ程懸念する必要なないであろうことが示唆される。
【０２４０】
本明細書中で示すＭ２−ＯＭＰＣを用いた実験において、インフルエンザウイルスの致死性感染処理に対する防御効果を、免疫した動物血清を投与することにより受動的に移すことができることが示されているが、このことから、中和抗体が防御力を与えるのに十分であったことが示される。同じ抗原をＨＰＶ  キャリアに連結させたので、Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ連結物を用いた免疫により、同様の液性反応が引き起こされることが予想される。細胞性免疫に関しては、以前の実験により、ＩＬ−４のＣＤ４＋Ｔ細胞産生により測定したところ、ＨＰＶタイプ１６ＶＬＰｓが強いＴｈ２反応を誘導することが示された（Ｔｏｂｅｒｙら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ１６  Ｌ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ（免疫したｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ（アカゲザル）における、ＨＰＶ１６−Ｌ１特異的液性及び細胞性免疫反応の誘導におけるワクチン送達システムの効果）」、Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２１，ｐｐ．１５３９−１５４７、２００３）。ＨＰＶ  ＣＬＰｓにより提示される非立体配座抗原性配列が、細胞性免疫反応を促進し得ることも提案された（Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅら、１９９８）。
【実施例２４】
【０２４１】
ＶＬＰへのヘマグルチニン由来ペプチドの連結
ペプチド、Ｃｙｓ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２２を、ＨＰＶ  ＶＬＰに連結させた。
【０２４２】
【表２０】
2006519775.tif 000030
【０２４３】
Ｃｙｓ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２２のペプチド配列は、Ａ型インフルエンザコンセンサス配列、Ｈ３サブタイプのヘマグルチニンタンパク質前駆体、ＨＡ０の切断部位に広がる領域に相当する。太字で示すものは様々な機能を果たすために必要な残基であり、それぞれＮ末端において、グリシンはスペーサーとして、グルタミン酸はｐＩ調整基として（本明細書で述べるように）、及びシステインはリガンドとして、マレイミド活性化ＨＰＶ  ＶＬＰキャリアと反応してチオエーテル結合を介したペプチド−ＶＬＰ連結物を生成させるために必要な残基であり、Ｃ末端において、グルタミン酸はｐＩ調整基として必要な残基である。
【０２４４】
Ｃｙｓ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２２のペプチド合成
ＰＩＯＮＥＥＲ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＦＯＳＴＥＲ  ＣＩＴＹ，ＣＡ）において、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ  化学を用いて、固相により本ペプチドを合成した。ペプチドＣ末端の酸を生成させるために、活性剤としてＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔを用いて４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで既に誘導体化したＣＨＡＭＰＩＯＮ  ＰＥＧ−ＰＳレジン（ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＮＯＶＡＴＯ，ＣＡ）で、本ペプチドを合成した。。ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）で、最初のアミノ酸、グルタミン酸を対称無水物として活性化し、触媒量のＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）の存在下でそのレジンとエステル結合させた。本ペプチド会合の最後に、ＤＭＦ中の１０倍過剰量の無水酢酸との反応によりアセチル化反応を行った。
【０２４５】
アシル化反応は全て、レジンフリーのアミノ基において、活性化アミノ酸  ４倍過剰量を用いて６０分間行った。等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）及び２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）でアミノ酸を活性化した。一般的な側鎖保護基スキームは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒに対してｔｅｒｔ−ブチル、；Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ及びＧｌｎに対してトリチル；Ａｒｇに対して２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；Ｌｙｓ、Ｔｒｐに対してｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルであった。会合の最後に、８８％  ＴＦＡ、５％フェノール、２％トリイソプロピルシラン及び５％  水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．，及びＢａｒａｎｙ，Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｚ．，５７，５３９９−５４０３）で、乾燥ペプチドレジンを室温にて１．５時間処理した。
【０２４６】
そのレジンを濾過し、本ペプチドを沈殿させるために、冷メチル−ｔ−ブチルエーテルにその溶液を添加した。遠心後、有機捕捉剤を除去するために、新鮮な冷メチル−ｔ−ブチルエーテルでこのペプチドペレットを洗浄した。このプロセスを２回繰り返した。最終ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％アセトニトリルで再懸濁し、凍結乾燥させた。
【０２４７】
セミ分取ＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫＴＭ（ＷＡＴＥＲＳ，ＭＩＬＦＯＲＤ，ＭＡ）  Ｃ−１８カートリッジ（４０ｘ２００ｍｍ、１５μｍ）を用いて、溶出液として（Ａ）水中の０．１％  トリフルオロ酢酸及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  トリフルオロ酢酸を使用して、逆相ＨＰＬＣにより未精製ペプチドを精製した。２０分間にわたるＢ：３０％−４５％の勾配、流速  ８０ｍｌ／分の条件を使用した。ＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ（ＢＥＣＫＭＡＮ、ＦＵＬＬＥＲＴＯＮ，ＣＡ）、Ｃ１８カラム、２５ｘ４．６ｍｍ、５μｍで、Ｂ：３０％−４５％Ｂ（２０分）の勾配を用いて、流速１ｍｌ／分で分析的ＨＰＬＣを行った。ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＷＥＬＥＳＬＬＥＹ，ＭＡ）ＡＰＩ−１００でのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより、精製ペプチドの特徴を調べた。理論的平均ｍｗが２２９３．４Ｄａのところ、測定値は、２２９３．８Ｄａであった。
【０２４８】
ＨＰＶ  ＶＬＰに対する、ペプチド  Ｃｙｓ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２２の連結
０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｉｓ緩衝液、０．０２６％  ＰＳ８０、ｐＨ６．２中で０．８６９ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＨＰＶ  ＶＬＰ１６滅菌保存溶液を調製した。活性化反応を妨害する可能性のあるＨｉｓ緩衝液を除去するために、ＨＰＶ  ＶＬＰ１６保存溶液を２．５ｍｌずつ分注したものを、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＲＡＮＣＨＯ  ＤＯＭＩＮＧＵＥＺ，ＣＡ）を用いて、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２６  ＰＳ８０  ２Ｌの緩衝液を６回交換（２時間ごと）しながら、透析を行った。ＨＰＶ  ＶＬＰ溶液（０．４７４ｍｇ／ｍｌ、４．５８ｍｌ）に対して、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（０．５０６ｍｌ）を、最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ８．２になるように添加した。これに、ヘテロ二官能価架橋剤、スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ，ＲＯＣＫＦＯＲＤ，ＩＬ）の２０μＭ  溶液  ０．１５６ｍｌを滴下添加したが、この量は、利用可能なリジン残基を超える４倍過剰量に相当する。４℃にて、暗所で２時間その溶液を熟成させた後、過剰量の試薬を除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ＣＡ）を用いて、１０ｍＭ  Ｈｉｓ緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５％  ＰＳ８０、ｐＨ６．２  ２Ｌの緩衝液を６回交換（少なくとも２時間ごと）しながら、活性化ＨＰＶ  ＶＬＰを透析した。透析後に、全部で６．１ｍｌの活性化ＨＰＶ  ＶＬＰ（ａＶＬＰ）、０．３５６ｍｇ／ｍｌを回収した。
【０２４９】
Ｃｙｓ含有ペプチドリガンド、Ｃｙｓ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２２の０．５ｍｇ／ｍｌ保存溶液を、０．１Ｍ  Ｈｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５％  ＰＳ８０  ｐＨ７．２の脱気溶液で調製し、０．２μで濾過した。そのペプチド溶液のチオール含量をＥｌｌｍａｎアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．（１９５９），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８２，７０）により測定したところ、２１８μＭのＳＨ−タイターを示した。
【０２５０】
沈殿を生じさせずにＶＬＰに安全に取り込むことができるペプチドリガンドの最大量を定義するために、連結反応を最初に小規模で行い、ペプチドリガンドの量を増量させながらＶＬＰをインキュベーションした。ＶＬＰに導入できるマレイミド基の最大数は、その外面に示される、つまり、化学的修飾に利用可能なリジン残基の数により制限される。Ｌ１タンパク質のＸ線構造を基すると、連結に利用可能なＶＬＰは、０．３６μｍｏｌリジン／ｍｇ  （連結に利用可能なＶＬＰ）である。ＶＬＰの平均ＭＷ、２０ｘ１０６Ｄａを考慮する場合、これは、７，２００リジンモル／ＶＬＰモルに相当する。従って
、次のＶＬＰ１モルあたりのモル濃度過剰量のペプチドリガンド：１０００、２０００、４０００、６０００と、ａＶＬＰをインキュベーションした。１時間後、何らかの沈殿の有無又は濁度の上昇について調べるために、ａＶＬＰ試料とその試料を比較した。連結反応により、最大１０００まで（ｍｏｌ  Ｃｙｓ−ペプチド／ＶＬＰ  ｍｏｌ）のモル濃度過剰量を使用して１時間インキュベーション反応を行った場合、可溶性生成物のみが得られた。その比を超えると、ＯＭＰＣ溶液の完全な沈殿が起こった。
【０２５１】
これらの観察を基に大規模な反応を行った：ｐＨを７．２に上げるために、１０ｍＭ  Ｈｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中の３．５ｍｌ（１．２５ｍｇ）に、ＮａＯＨ  ０．２５Ｍ  ５６μｌを添加した。穏やかにボルテックスしながら、これに、ペプチド保存溶液  ０．２８ｍｌを滴下添加したが、これは、１０００モル濃度過剰量のペプチドモル／ＶＬＰｍｏｌに相当する。マレイミド−活性化ＶＬＰ溶液の試料を、最終連結物のペプチド負荷測定用ブランクとして用いた。連結反応混合物を、４℃にて１７時間、暗所で熟成させた。４℃にて、暗所で１時間、最終濃度が１５ｍＭ（総量４μＬを添加した。）になるように、β−メルカプトエタノールを添加して、あらゆるＶＬＰの残留マレイミド基を不活性化させた。非連結ペプチド及びβ−メルカプトエタノールを除去するために、４℃にて、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＲＡＮＣＨＯ  ＤＯＭＩＮＧＵＥＺ，ＣＡ）を用いて、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５％  ＰＳ８０  １Ｌで、５時間ごとに４回液交換を行い、その溶液を透析した。ＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．，ＲＯＣＫＦＯＲＤ，ＩＬ）により濃度を測定したところ、ＶＬＰ−Ａ／Ｈ３／ＨＡ０−２２の濃度は、０．１３１ｍｇ／ｍｌ（４．５ｍｌ）であることが分かった。
【０２５２】
真空排気された密封ガラス試験管中で、共沸性のＨＣｌを用いて、１１０℃にて７０時間、本連結物及びａＯＭＰＣ試料を加水分解した。アミノ酸分析により、アミノ酸組成を調べた。連結物アミノ酸組成を、ＶＬＰキャリア及びペプチドリガンドの両アミノ酸組成と比較すること、及び、そのデータの重回帰、最小二乗解析により（Ｓｈｕｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１５６，（１９９２）１３７−１４９）、ＯＭＰＣタンパク質へのペプチドの連結負荷を調べた。ＶＬＰとＡ／Ｈ３／ＨＡ０−２２との間の連結物に対して、モル比は７７０であった（ペプチド／ＶＬＰ  ｍｏｌ／ｍｏｌ）。
【実施例２５】
【０２５３】
Ｍ２連結ワクチンによるウイルス排出の抑制
実施例５で述べたようにＭ２ペプチド配列番号１を用いて調製したＭ２−ＫＬＨ連結ワクチンの、マウスの気道におけるウイルス複製に対する効果を評価した（図３０）。各群のＢａｌｂ／ｃマウスに対して、第０、１４及び２８日に、連結ワクチン、Ｍ２−ＫＬＨ  ２０μｇとＱＳ２１（Ｍ２−ＫＬＨ／ＱＳ２１）  ２０μｇ、又はＱＳ２１のみ  ２０μｇ（ＱＳ２１）を用いて、筋肉内注射により免疫した。３回目の免疫から３週間後に、Ａ／ＨＫ／６８  リアソータントの７５  ＴＣＩＤ５０を用いてマウスの鼻腔内に対して感染処理を行った。感染処理後、第１、３、５、７又は９日に、各群から８匹のマウスを屠殺し、鼻腔洗浄液及び肺洗浄液を回収した。それぞれの時間点のウイルスタイターを調べた。免疫したマウスは、対照マウスよりも全般的に鼻腔試料及び肺試料の両方においてウイルスタイターが低かった。ウイルス排出の低下は、肺においてより顕著であった。対照とワクチン接種群との間の肺における排出の差は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【実施例２６】
【０２５４】
アカゲザルにおけるＭ２連結ワクチンの免疫原性
非免疫及びＯＭＰＣ−免疫アカゲザルの両方において、Ｍ２ペプチド配列番号２を用いて、実施例５のように調製したＭ２−ＯＭＰＣ連結物を試験した（図３１）。認可済みのヘモフィルスインフルエンザワクチン（ＰＥＤＶＡＸＨＩＢ、ＭＥＲＣＫ＆ＣＯ．，ＩＮＣ．，ＷＥＳＴ  ＰＯＩＮＴ，ＰＡ）を含むいくつかの細菌性多糖類連結ワクチンに対するキャリアとして、ＯＭＰＣが使用されている。従って、この実験では、ＯＭＰＣに対する既存の免疫が本インフルエンザワクチンの効力に明らかに影響を及ぼすか否かを調べた。
【０２５５】
３０匹のサルを各１５匹ずつ２群に分けた。抗ＯＭＰＣ抗体反応を誘導するために、一方の群に、２種類のヒト用量のＰＥＤＶＡＸＨＩＢを用いてプレ免疫を行った。ＰＥＤＶＡＸＨＩＢ免疫を受けたサルでは、Ｍ２−ＯＭＰＣ免疫の６週間前に、ＯＭＰＣ  ＧＭＴｓが１４，７０３であった。
【０２５６】
次に、ＯＭＰＣ免疫されたサル及び免疫を受けなかったサルを、各３匹ずつそれぞれ５群に分け、筋肉内投与により、Ａｌｕｍ中に処方したＭ２−ＯＭＰＣ連結ワクチンを１０μｇ、３０μｇ、１００μｇ及び３００μｇ（総連結タンパク質に基づいた用量）又はＡｌｕｍプラスＱＳ２１中に処方した本ワクチン  １００μｇを用いて免疫した。０−、８−及び２５週のスケジュールを用いて免疫を行った。３３週間にわたり、４週間から５週間隔で血液試料を回収した。
【０２５７】
１回の免疫後、Ｍ２−ＯＭＰＣワクチンは、顕著なＭ２−特異的タイターを誘導した。２回目及び３回目の免疫後、これらの反応がさらに促進された。ＯＭＰＣ免疫したサル及びＯＭＰＣを免疫しなかったサルの両方で、明らかな用量効果はなく、最低用量である１０μｇにおいて、最高用量である３００μｇで誘導されたＭ２特異的タイターと同程度のＭ２特異的タイターが誘導された。ＡｌｕｍプラスＱＳ２１中に処方されたワクチンは、Ａｌｕｍのみの中に処方された同用量の連結物よりも、５倍から１０倍高い抗体タイターを示した。さらに、ＡｌｕｍプラスＱＳ２１中のワクチンを投与されたサルにおける抗体タイターは、Ａｌｕｍのみの中のワクチンを投与されたサルにおいて観察されるよりも、低下速度が遅かった。
【０２５８】
ＯＭＰＣ免疫したサルとＯＭＰＣを免疫しなかったサルとを比較すると、初回注射後、ＯＭＰＣを免疫しなかったサルよりも前者は、タイターがおよそ１０倍低かった。このことから、キャリアに対する既存の抗体が、Ｍ２−ＯＭＰＣ連結ワクチンの免疫原性に対して悪影響を及ぼすことが示された。しかし、キャリアに対する既存の免疫による有害な影響は、その後の免疫促進により解消される。２回目及び３回目の免疫後、本実験の２種類の治療群における群で、同程度の抗Ｍ２タイターを得た。従って、この結果から、キャリアに対する既存の抗体の有無にかかわらず、Ｍ２−ＯＭＰＣワクチンが非ヒト霊長類において免疫原性があることが示された。サルを用いた別の実験においてＰＥＤＶＡＸＨＩＢ及びＭ２−ＯＭＰＣ連結ワクチンの共投与を含む投薬計画についても試験し、Ｍ２ペプチドに対する全般的な抗体反応に対して悪影響が全くないことが分かった。従って、以前に他のＯＭＰＣを利用した連結ワクチンに曝露されている集団にもこのワクチンを使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】チオール化したキャリア（１）とブロモアセチル化した（２）又はマレイミド化した（３）ペプチドとの反応及びその結果得られるチオールエーテル結合（スキームＩ）。
【図２】キャリアの本来の一級アミン（１）とブロモアセチル化した（２）又はマレイミド化した（３）ペプチドとの反応及びその結果得られる二級アミン結合（スキームＩＩ）。
【図３】マレイミド化したキャリア（１）とチオール含有ペプチド（２）との反応及びチオールエーテル結合の生成（スキームＩＩＩ）。複数のチオールを含有するペプチドの場合、キャリアマレイミド基との複数の結合が１つのペプチドにより生じ得る。これにより、そのキャリアに負荷するペプチド総数が減少し得る。個々のタンパク質のマレイミドにおいて複数の結合が生じる場合、そのペプチドを介してキャリアサブユニットの架橋結合が生じ得る。
【図４】ハロゲン化アルキルキャリア（１）と、チオール含有ペプチド（２）との反応及びチオールエーテル結合の生成（スキームＩＶ）。複数のチオールを含有するペプチドの場合、キャリアハロゲン化アルキル（示されているヨードアセチル又はブロモアセチル）基との複数の結合が、１つのペプチドにより生じ得る。これにより、そのキャリアに負荷されるペプチド総数が減少し得る。個々のタンパク質のヨードアセチル基において複数の結合が生じる場合、そのペプチドを介してキャリアサブユニットの架橋結合が生じ得る。
【図５】架橋結合したマレイミド化インフルエンザペプチド及びチオール化ＯＭＰＣの加水分解。共有結合があることを証明するために、非タンパク質アミノ酸  Ｓ−（１，２−ジカルボキシエチル）−ホモシステインを定量することができる。存在する総ペプチドを推定するために、４−アミノ酪酸及び６−アミノヘキサン酸を定量することができる（スキームＶ）。
【図６】カップリングしたブロモアセチル化インフルエンザペプチド及びチオール化ＯＭＰＣの加水分解。共有結合があることを証明するために、非タンパク質アミノ酸  Ｓ−（カルボキシメチル）−ホモシステインを定量することができる。存在する総ペプチドを推定するために、６−アミノへキサン酸を定量することができる（スキームＶＩ）。
【図７】インフルエンザペプチドを含有するカップリングさせたシステイン及びヨードアセチル化ＯＭＰＣの加水分解。共有結合があることを証明するために、非タンパク質アミノ酸  Ｓ−（カルボキシメチル）−システインを定量することができる。存在する総ペプチドを推定するために、６−アミノへキサン酸を定量することができる。ＯＭＰＣと会合する架橋剤の総量を推定するために、４−アミノ安息香酸を定量することができる（スキームＶＩＩ）。
【図８】Ｆｌｕ  Ｍ２ペプチドを含有するカップリングさせたシステイン及びマレイミド化ＯＭＰＣの加水分解。共有結合があることを証明するために、非タンパク質アミノ酸  Ｓ−（１，２−ジカルボキシエチル）−システインを定量することができる。存在する総ペプチドを推定するために、６−アミノへキサン酸を定量することができる。ＯＭＰＣと会合する架橋剤の総量を推定するために、トラネキサム酸を定量することができる（スキームＶＩＩＩ）。
【図９】マウスにおける、Ｍ２ペプチド連結ワクチンによるＭ２特異的抗体反応の誘導。メスＢａｌｂ／ｃマウス、各群１０匹を、筋肉内注射により、指定された連結物、０．０１μｇ、０．１μｇ又は１μｇ（ペプチド重量を基に投薬）を用いて免疫し、３週間後に１度、同用量で免疫促進した。初回免疫（ＰＤ１）から２週間後及び免疫促進（ＰＤ２）から３週間後に血液試料を回収した。酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）によりＭ２−特異的抗体のタイターを調べた。データは、群の幾何平均±標準誤差（ＧＭＴ±ＳＥ）で表す。ＣＴ  Ｍ２  １５ｍｅｒ  ｍａ  −ＯＭＰＣ、Ｍ２−１５−ｍｅｒ（配列番号１０）をマレイミド活性化ＯＭＰＣに対してＣ末端システインを介して連結させた；ＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２  １５ｍｅｒ  ＯＭＰＣ、Ｃ末端ブロモアセチル化Ｍ２  １５ｍｅｒ（配列番号１３）をチオール化ＯＭＰＣに連結させた；ＮＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２  １５ｍｅｒ  ＯＭＰＣ、Ｎ末端ブロモアセチル化  １５ｍｅｒ  Ｍ２ペプチド（配列番号１１）をチオール化ＯＭＰＣに連結させた；ＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２（ＳＲＳ）ＯＭＰＣ、Ｃ末端ブロモアセチル化  Ｍ２  ２３−ｍｅｒ（ＳＲＳ）（配列番号３９）をチオール化ＯＭＰＣに連結させた。ＧＭＴ＝幾何平均タイターである。
【図１０】致死性のインフルエンザ感染処理に対する、ＣＴ  Ｍ２  １５ｍｅｒ  ｍａ−ＯＭＰＣ及びＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２  １５ｍｅｒ  ＯＭＰＣによる防御。動物免疫プロトコールに対する凡例は図９のとおりである。免疫促進から４週間後に、ｆｌｕ  Ａ／ＨＫ／６８再集合物のＬＤ９０量を動物に対して鼻腔内投与した。試験日の群平均体重／インフルエンザ投与後０日の群平均体重ｘ１００％として、体重変化の割合を計算した。試験日の動物数／インフルエンザ投与後０日の動物数ｘ１００％として、生存率を計算した。
【図１１】致死性のインフルエンザ感染処理に対する、ＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２  １５ｍｅｒ  ＯＭＰＣ及びＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２（ＳＲＳ）ＯＭＰＣによる防御。凡例は図９、図１０のとおりである。
【図１２】致死性のインフルエンザ感染処理に対する、ＣＴ  ＢｒＡｃ−Ｍ２  １５ｍｅｒ  ＯＭＰＣ及びＮＴ  Ｍ２  １５ｍｅｒ  ｍａ−ＯＭＰＣによる防御。凡例は図９、図１０のとおりである。
【図１３Ａ】チオール化ＯＭＰＣに対する、マレイミド誘導体化インフルエンザペプチドの連結。
【図１３Ｂ】チオール化ＯＭＰＣに対する、ブロモアセチル化インフルエンザペプチドの連結。
【図１４】ペプチド、配列番号１２及び配列番号１４は、図１３ａで概略的に示すように、キャリアタンパク質と連結させることが可能なペプチドの例である。ペプチド、配列番号１１及び配列番号１３は、図１３ｂで概略的に示すように、キャリアタンパク質と連結させることが可能なペプチドの例である。ペプチド、配列番号３９は、ＯＭＰＣ又は他のキャリアタンパク質のチオール反応誘導体に連結し得るＣ末端システインを有するＳＲＳ  Ｍ２配列の短縮型である。配列番号２は、より長いＭ２の対応体を表す。
【図１５】リジン骨格における複数のＭ２ペプチドの略図。Ｒ＝配列番号８
【図１６】リジン骨格における複数のＭ２ペプチドの略図。Ｒ＝配列番号１
【図１７】リジン骨格における複数のＭ２ペプチドの略図。Ｒ＝配列番号２
【図１８】リジン骨格における複数のＭ２ペプチドの略図。Ｒ＝配列番号２
【図１９】二量体としてリジン骨格に一緒に結合する複数のＭ２ペプチドの略図。ＤＡＰ＝Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸。上の二量体には、配列番号５５及び５６が含まれる。下の二量体には、配列番号５７及び５８が含まれる。
【図２０】リジン骨格における複数のＭ２ペプチドの略図。Ｒ＝配列番号２。図１８で表される構造へのＣｙｓ残基の導入により、図１７及び２０で示されるような、遊離チオール官能基を持つＭＡＰが得られる。ブロモアセチル、マレイミド又は他のチオール反応基を含有するキャリアタンパク質へ連結させるために、このようなＭＡＰｓを使用し得る。
【図２１】複数のリジン骨格（その骨格が相互に結合している。）における複数のＭ２ペプチドの略図。Ｒ＝配列番号２。
【図２２Ａ】ＨＡ０特異的抗体は、Ｂ型インフルエンザペプチド連結ワクチンに対して反応する。
【図２２Ｂ】Ｂ型インフルエンザペプチド連結ワクチンを接種したマウスにおける、Ｂ型インフルエンザ感染処理後の生存曲線。
【図２３】亜致死性感染処理モデルにおいて、インビボのウイルス複製に対するＢ型インフルエンザワクチン成分の効果を調べた。
【図２４】Ａ型インフルエンザＨＡ２ペプチド連結ワクチンで免疫したマウスの生存曲線。
【図２５】Ｘ線により調べた、１２−カプソメアＶＬＰにおけるＬ１タンパク質のリボンダイヤグラム（Ｃｈｅｎら、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６（ヒトパピローマウイルス１６のＬ１タンパク質からアセンブルさせた小ウイルス様粒子の構造）”、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．５５７−５６７，２０００）。個々の灰色の丸は、ＶＬＰの外面にある１９Ｌｙｓ鎖のＮＺ原子を表す。濃い灰色の部分は、Ｈ１６．Ｖ５及びＨ１６．Ｅ７０抗体両方に対するエピトープ部分である、Ｐｈｅ５０を示す。薄い灰色の部分は、Ｈ１６．Ｊ４抗体に対する結合ループを表す。この図は、プログラム  ＭｏｌＭｏｌ（Ｋｏｒａｄｉ，Ｒ．，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｍ．及びＷｕｔｒｉｃｈ，Ｋ．１９９６．ＭＯＬＭＯＬ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（巨大分子構造の表示及び解析用プログラム）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ  １４，５１−５５）を用いて作成した。
【図２６Ａ】（２７Ａ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び（２７Ｂ）分析的超遠心により調べた、ＨＰＶ  ＶＬＰタイプ１６（実線）、活性化／不活性  ＨＰＶ−ＶＬＰ（破線）及び連結Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ（丸付きの実線）の粒子サイズ分布。
【図２６Ｂ】（２７Ａ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び（２７Ｂ）分析的超遠心により調べた、ＨＰＶ  ＶＬＰタイプ１６（実線）、活性化／不活性  ＨＰＶ−ＶＬＰ（破線）及び連結Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ（丸付きの実線）の粒子サイズ分布。
【図２７】Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰの電子顕微鏡像。
【図２８】ＨＰＶ  ＶＬＰタイプ１６（実線）、活性化／不活性ＨＰＶ−ＶＬＰ（破線）及び連結Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰ（丸付きの実線）に対する、ＯＤ３５０ｎｍで観察した温度誘発凝集。
【図２９Ａ】Ｔ＝０及びＴ＝４週間において様々なペプチド用量のＭ２  ＨＰＶ  ＶＬＰを含有するワクチンで免疫してから、Ｔ＝２及び６週間後のマウスにおける、Ｍ２−ＨＰＶ  ＶＬＰにより誘導された抗−Ｍ２抗体の幾何平均タイター（ＧＭＴ）。
【図２９Ｂ】様々なペプチド用量のＭ２−ＨＰＶ  ＶＬＰを含有するワクチンで免疫したマウスの致死性の感染処理に対する生存率
【図３０】マウスにおける鼻部及び肺のウイルス排出に対する、Ｍ２−ＫＬＨ連結ワクチンを用いた免疫による防御。マウスにおける亜致死性感染処理後の上気道及び下気道におけるウイルス排出の特徴。データは、各日付時点の８匹のマウスのＧＭＴ＋／−Ｓ．Ｅ．として表す。破線はアッセイ検出閾値である。ＧＭＴ＝幾何平均タイター。
【図３１】アカゲザルにおける、Ｍ２−ＯＭＰＣ連結ワクチンによる抗体反応の誘導。３０匹のアカゲザルを、各３匹ずつ１０群に分けた。各データポイントは、群ごと３匹の動物の平均ＧＭＴを表す。平均／Ａｌｕｍは、Ａｌｕｍ中で処方したＭ２−ＯＭＰＣを投与した、ＯＭＰＣ免疫又はＯＭＰＣ未免疫サルいずれかの全４群のＧＭＴを表す。ＧＭＴ＝幾何平均タイター。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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