(57)【要約】【課題】基質ペプチド（ＳＰ）がリンカータンパク質（Ｌ）を介して基板（Ｓ）に固定されていることを特徴とするＳ−Ｌ−ＳＰ型のタンパク質チップと、前記タンパク質チップを用いた反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法とを提供する。【解決手段】タンパク質チップを用いた反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応分析法は、タンパク質チップに固定された基質ペプチドに特異的に反応する反応タンパク質を前記タンパク質チップに加え、それらの間の反応を検出する段階を含む。
2006512581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質ペプチド（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＳＰ）がリンカータンパク質（ｌｉｎｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｌ）を介して基板（Ｓ）に固定されていることを特徴とするＳ−Ｌ−ＳＰ型のタンパク質チップ。
【請求項２】
リンカータンパク質はレプチンまたはリンゴ酸酵素（ｍａｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質チップ。
【請求項３】
基質ペプチドはペプチド単量体、単量体−プロリン−単量体の二量体またはプロリンにより連結された多量体の形でリンカータンパク質と融合されていることを特徴とする請求項１記載のタンパク質チップ。
【請求項４】
ペプチド単量体はケムプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ；配列番号１）またはＡｂ１（配列番号８）であることを特徴とする請求項３記載のタンパク質チップ。
【請求項５】
基板はアルデヒドが露出されているスライドであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質チップ。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質チップに固定された基質ペプチドに特異的に反応する反応タンパク質を前記タンパク質チップに加え、基質ペプチドと反応タンパク質の間の反応を検出する段階を含む、反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法。
【請求項７】
反応タンパク質は酵素または抗体であることを特徴とする請求項６記載の反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法。
【請求項８】
酵素はプロテインキナーゼＡまたはＡｂ１キナーゼであることを特徴とする請求項７記載の反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法。
【請求項９】
基質ペプチドと反応タンパク質間の反応の検出は蛍光体によりラベルされた抗体を用いて行うことを特徴とする請求項６記載の反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法。
【請求項１０】
キナーゼによる基質ペプチドのリン酸化反応の検出は、Ｃｙ３によりラベルされた抗リン酸化セリン抗体またはＣｙ５によりラベルされた抗リン酸化チロシン抗体を用いて行うことを特徴とする請求項８記載の反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析するためのタンパク質チップに関する。より詳しく言うと、基質ペプチド（ＳＰ）がリンカータンパク質（Ｌ）を介して基板（Ｓ）に固定されていることを特徴とするＳ−Ｌ−ＳＰ型のタンパク質チップ及び前記タンパク質チップを用いた反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質チップは、特定のタンパク質に特異的に相互作用する生体分子の機能を明らかにし、タンパク質の機能分析及びネットワーク分析を通じて得られたデータに基づいた古典的な方法では不可能であった疾病に対する治療及び予防法を開発・研究する上で核心となる技術である。
【０００３】
今まで開発されてきたタンパク質チップに関する最新技術は、下記の４種類に分類できる。（１）ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いてＤＮＡとタンパク質との間の相互作用をチップで分析する技術である。この技術は、チップ上において単一筋のオリゴヌクレオチドを二重筋のオリゴヌクレオチドに切り換えた後、さらに特定のＤＮＡ配列に特異的である制限酵素を反応させて切断の有無によりＤＮＡ−タンパク質の相互作用を検査することにより、新たなＤＮＡ結合タンパク質を見出し、その特性を究明することに有用である(例えば、下記の非特許文献１参照)。
【０００４】
（２）制限酵素、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、プロテインキナーゼなどの各種の酵素及び抗原−抗体反応をチップ上において分析する技術である(例えば、下記の特許文献１及び２、並びに下記の非特許文献２〜４参照)。特に、この技術は、タンパク質−タンパク質間の相互作用、キナーゼ−ペプチド間の基質反応、タンパク質−リガンド間の結合反応を通じて大量検索、生化学的な分析、新薬候補物質の分析、疾病診断などに応用することができる。しかしながら、キナーゼに特異的な基質であるペプチド、または分子量が少ないタンパク質を固定する場合、非特異的な固定を防ぐ目的で使われる遮断物質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により固定さるべき物質が埋められてしまうという制限がある。さらに、チップ上に相異なる種類の抗体を固定した後、蛍光体がラベルされた抗原混合物と反応させたとき、抗体の６０％だけが定量的な結果を示し、僅か２３％だけが定性的な結果を示すということが報告されている(例えば、下記の非特許文献５及び６参照)。
【０００５】
（３）ｃＤＮＡライブラリから大量のタンパク質をチップ上において発現させて分析する技術である（例えば、下記の特許文献３及び４参照）。この技術は、タンパク質の生化学的な活性についての大量検索に役立つものである（例えば、下記の非特許文献７参照）。
【０００６】
（４）親和性タグ（ｔａｇ）を用いて生体分子の配向性(ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ)を分子レベルで調節しながら、均一でかつ安定した生体分子の単一層をチップの表面に形成する技術を用いて試料を分析する技術である(例えば、下記の特許文献５及び６、並びに下記の非特許文献８〜１０参照)。例えば、タンパク質をＨｉｓタグが融合された形で発現させた後、Ｎｉ−ＮＴＡ機能基が固定されたチップに反応させて固定することにより、生体分子の活性を保持するか、あるいは、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）が融合された形で発現させて精製し易くするだけではなく、特定の部位をビオチン化させてアビジン処理されたチップ上において一定の方向に固定して、より一層安定的で且つ活性状態を保持するこ
とができる（例えば、下記の非特許文献１１及び１２参照)。さらに、支持体に特異的に結合するタンパク質（カルモジュリンなど）及びタグ（ポリシステイン、ライシン、ヒスチジンなど）を用いて融合形で発現させた後に固定し、タンパク質間の相互作用を用いてタンパク質の精製、ＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）及びＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）に活用している（例えば、下記の特許文献７及び非特許文献１３〜１５参照）。
【０００７】
しかしながら、上述したような各種のタンパク質チップ技術が開発されているにも関わらず、現在の分子量が少ない、通常、５０個未満のアミノ酸よりなる、ペプチドを用いたタンパク質チップ技術は、ペプチドと相互作用する巨大分子（酵素及び抗体）に対する空間的で且つ構造的な問題があるために固定されたペプチドと反応物質との間の相互作用が困難であり、蛍光体がラベルされた抗体を用いて反応の有無を検出するには制限が多いために実用化が困難であるほか、ペプチドをチップの上に固定するためには高濃度であることが求められるために経済的でないという不具合がある。
【０００８】
これらの理由から、タンパク質チップ上で、分子量が少ない基質ペプチドと分子量が多い反応タンパク質間の相互作用を効率よく分析できる方法の開発に対する必要性が絶えず望まれている。
【０００９】
そこで、本発明者らは、反応タンパク質とその基質ペプチド間の相互作用を効果的に分析できる方法を開発するために鋭意研究を重ねてきた結果、分子量が少ない基質ペプチドをリンカータンパク質を介して基板に固定し、反応タンパク質を処理した後、これらの相互反応を抗体を用いて検出することにより、基質ペプチドと反応タンパク質間の特異的な相互作用を容易で且つ効率よく分析できるということを知見し、本発明を完成することに至った。
【特許文献１】ＵＳ  ２００２／００５５１８６Ａ１
【特許文献２】ＷＯ  ０１／８３８２７Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ０１／８３８２７
【特許文献４】ＷＯ  ０２／５０２６０
【特許文献５】ＵＳ  ２００２／００５５１２５Ａ１
【特許文献６】ＵＳ  ６，４０６，９２１
【特許文献７】ＵＳ  ６，１１７，９７６
【非特許文献１】Ｂｕｌｙｋ，  Ｍ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．, １７：５７３−７, １９９９
【非特許文献２】Ｂｒａｕｎｗａｌｄｅｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．， Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２３４：２３−６，１９９６
【非特許文献３】Ｈｏｕｓｅｍａｎ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．, ２０：２７０−４，  ２００２
【非特許文献４】Ｒｕｕｄ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １８：９８９−９４，２０００
【非特許文献５】ＭａｃＢｅａｔｈ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９：１７６０−３，  ２０００
【非特許文献６】Ｈａａｂ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ２：ｒｅｓｅａｒｃｈ  ０００４，  ２００１
【非特許文献７】Ｈｅｎｇ  Ｚｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２６：２８３−９，  ２０００
【非特許文献８】Ｐａｕｌ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＣＳ，  １２２：７８４９−５０，  ２０００
【非特許文献９】ＲａＶｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ７３：４７１−８０，  ２００１
【非特許文献１０】Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｂｔｅｃｈ．， ２０：２７９−８１，  ２００２
【非特許文献１１】Ｚｈｕ ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３：２１０１−５，  ２００１
【非特許文献１２】Ｍａｒｉｅ−Ｌａｕｒｅ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＣＳ １２４：８７６８−９，  ２００２
【非特許文献１３】Ｈｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．, ６８：３９３９−４４，  １９９６
【非特許文献１４】Ｈｏｄｎｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ， ９９：５０４８−５２，  ２００２
【非特許文献１５】Ｋｕｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３０６：５０−４，  ２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の主たる目的は、基質ペプチド（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＳＰ）がリンカータンパク質（ｌｉｎｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｌ）を介して基板（Ｓ）に固定されていることを特徴とするＳ−Ｌ−ＳＰ型のタンパク質チップを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記タンパク質チップを用いた反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応を分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明に係るタンパク質チップは、基質ペプチドをリンカータンパク質と融合させ、前記リンカータンパク質を介して基板に固定することにより得られる。このとき、基質ペプチドは、ペプチド単量体、単量体−プロリン−単量体の二量体またはプロリンにより連結された多量体の形でリンカータンパク質と融合されていることを特徴とする。
【００１３】
基質ペプチドとリンカータンパク質の融合物は、前記融合された形の基質−リンカータンパク質を暗号化するＤＮＡを含む組換えベクターに形質転換された微生物を培養してこれより分離・精製することにより得てもよく、あるいは、基質ペプチドとリンカータンパク質の実験室的な条件のもとで化学的な結合を通じて得ても良いが、経済的な側面と生産の容易性という側面からみたとき、微生物の発現システムを用いて得ることが好ましい。
【００１４】
ここで、基質ペプチドは、分析しようとする反応タンパク質と特異的に反応可能な基質であって、反応タンパク質の種類に応じて選択可能である。また、リンカータンパク質は特に制限はないが、レプチン、リンゴ酸酵素（ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）など微生物における発現と精製が容易に行われるタンパク質を用いることが好ましい。さらに、基板も特に制限はないが、チップとして汎用されているアルデヒドが露出されているスライドであることが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明に係るタンパク質チップを用いた反応タンパク質とその基質ペプチド間の反応分析法は、前記タンパク質チップに固定された基質ペプチドに特異的に反応する反応タンパク質を前記タンパク質チップに加え、これらの間の反応を検出する段階を含む。このとき、反応タンパク質は、分析の目的に応じて酵素、抗体などとして使い分けられ、且つ、基質ペプチドの選択にも相互依存的に決定される。例えば、反応タンパク質としてプロテインキナーゼＡを、その基質ペプチドとしてケムプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ；配列
番号１）を用いることもでき、反応タンパク質としてＡｂ１キナーゼを、基質ペプチドとしてＡｂ１（配列番号８）を用いることもできる。
【００１６】
配列番号１：Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
配列番号８：Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ
【００１７】
基質ペプチドと反応タンパク質間の反応検出法は反応タンパク質の特性によるが、蛍光体によりラベルされた抗体を用いて行うことが好ましい。例えば、反応タンパク質としてプロテインキナーゼＡまたはＡｂ１キナーゼを用いた場合、これらキナーゼによる基質ペプチドのリン酸化反応の検出は、Ｃｙ３によりラベルされた抗リン酸化セリン抗体またはＣｙ５によりラベルされた抗リン酸化チロシン抗体を用いて行うことが好ましい。
【００１８】
以下、本発明を具体的に詳述する。
【００１９】
キナーゼなどの酵素と反応するペプチド基質をチップに固定し、抗体を用いて基質と酵素との間の反応を検出する場合には、抗体と抗体基質との間で起こる反応において空間的及び構造的な制限が存在し、しかも分子量が小さいため、ペプチド基質の安定性も劣るという制限がある。
【００２０】
このような問題点を解決するために、本発明者らは、遺伝子組換え技術を用い、ペプチド基質を大腸菌で不溶性の凝集体の形、あるいはＮ末端部位に６個のヒスチジン残基が結合された水溶性の形で過剰発現するリンカータンパク質に融合された形で発現させた後、前記融合タンパク質を基板に固定してタンパク質チップを製作した。人間由来のレプチン及びＮ末端部位に６個のヒスチジン残基が結合されたリンゴ酸酵素の終止コドンは除去されている。その後、融合しようとするペプチド基質のアミノ酸配列に終止コドンを連結して単量体の形で発現させるか、あるいは、両ペプチド基質をプロリンにより連結して二量体の形で発現させることにより、抗体による検出が一層効率的でかつ容易に行われるようにした。
【００２１】
図１は、本発明に従い得られたレプチン−ケムプチド、リンゴ酸酵素−ケムプチド及びレプチン−Ａｂ１タンパク質を示す模式図であって、基質ペプチドとなるケムプチド及びＡｂ１が単量体の形及びプロリンにより連結された二量体の形でリンカータンパク質となるレプチン及びリンゴ酸酵素に融合された状態を示している。
【００２２】
具体的には、本発明者らは、図１に示すようにタンパク質が発現可能な組換えプラスミドでそれぞれ大腸菌を形質転換させた後、これを培養してレプチン−ケムプチド、リンゴ酸酵素−ケムプチド及びレプチン−Ａｂ１の３種類のタンパク質を不溶性凝集体または水溶性の形で得た。次いで、その結果物を精製し、アルデヒドスライドに固定してタンパク質チップを製造した後、蛍光体がラベルされた抗体との相互反応を分析した。その結果、タンパク質チップ上に分子量が少ないケムプチドなどの基質ペプチドだけを固定した場合には抗体反応が現れなかったが、レプチン、リンゴ酸酵素などのリンカータンパク質と結合されたペプチドを固定した場合には抗体反応が特異的に現れた。特に、単量体の形よりは二量体の形で一層高い反応性が得られるということが確認できた。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るＳ−Ｌ−ＳＰ型のタンパク質チップを用いる場合、タンパク質チップ上における低分子量のペプチドと高分子量の酵素タンパク質間及びペプチドと反応抗体間の反応性を高めることができ、ペプチドとタンパク質間の反応を迅速でかつ効率よく分析する
ことができる。これにより、本発明に係るタンパク質チップは、ペプチド−タンパク質反応に基づく効率的でかつ経済的な大量検索、生化学的な分析、新薬候補物質の分析及び疾病診断などの研究と応用に役立つものであると見られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳述するが、これらの実施例は単に本発明を一層具体的に説明するためのものであって、当業界における通常の知識を有する者であれば、本発明の範囲がこれらの実施例により全く制限されないということは明らかであろう。
【実施例１】
【００２５】
組換えプラスミドの作製
【００２６】
（１）組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤの作製
プロテインキナーゼＡに特異的なレプチン−ケムプチドタンパク質（図１）を発現する組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤを作製した。プロテインキナーゼＡに特異的なペプチド基質であるケムプチド（配列番号１）を人間由来のレプチンに単量体の形で融合させるために、人間由来の４１４ｂｐサイズのレプチン遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥＤＯｂ５（Ｊｅｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６５（７）：３０２７−３２，  １９９９）を鋳型ＤＮＡとして、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩの切断位置を含む下記のプライマー１及びケムプチド遺伝子の配列を含むプライマー２を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００２７】
プライマー１（配列番号２）：
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＴＣＣＡ−３’
プライマー２（配列番号３）：
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＣＧＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧ−３’
【００２８】
さらに、二量体の形で融合させるために、上記と同じ鋳型ＤＮＡと前記プライマー１及び下記のプライマー３を用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩの切断位置と終止コドンが除去された鋳型ＤＮＡを得た。
【００２９】
プライマー３（配列番号４）：
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＣＧＡＣＧ−３’
【００３０】
次いで、制限酵素ＢａｍＨＩの切断位置と終止コドンが含まれたケムプチドがＣ−末端に二量体の形で融合されたものを暗号化する遺伝子を含むＤＮＡを得るために、下記のプライマー４を用いてＰＣＲを行った。
【００３１】
プライマー４（配列番号５）：
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＣＧＡＣＧ−３’
【００３２】
ＰＣＲは下記のような条件のもとで行われた：最初の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｉｏｎ）を９４℃において５分間１回行い；２回目の変性を９４℃において１分間、アニール（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を５６℃において５０秒間、延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を７２℃において９０秒間行う過程を３０回繰り返し行い；最後の延長を７２℃において５分間１回行った。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法を用いて約４３５及び４５９ｂｐサイズのＤＮＡを分離し、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩに切断してＤＮＡ断片を得た。
【００３３】
次いで、Ｔ７プロモータを含むプラスミドｐＥＴ−３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩに切断し、前記ＤＮＡ断片と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）により連結して組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤを作製した（図２）。図２は、組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤを示す模式図であって、前記組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤは人間由来のレプチンを暗号化するｃＤＮＡ、プロテインキナーゼＡに特異的なケムプチドを暗号化するオリゴヌクレオチド及びカナマイシン抵抗遺伝子を含み、それぞれレプチン−単量体ケムプチドまたはレプチン−二量体ケムプチドの形のタンパク質を発現させることができる。
【００３４】
前記組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤを熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）法を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ(ｒＢ− ｍＢ−) ｇａｌ ｄｃｍ （ＤＥ３） ａ ｐｒｏｐｈａｇｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ］（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）に導入した後、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板培地で培養して形質転換された大腸菌を選別した。前記大腸菌から組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤを分離し、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩに切断して約４３５及び４５９ｂｐサイズのＤＮＡ断片を得た。前記ＤＮＡ断片は、人間由来のレプチンにペプチド基質であるケムプチドが融合されたタンパク質を暗号化する遺伝子である。
【００３５】
（２）組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３の作製
プロテインキナーゼＡに特異的なリンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質（図１）を発現する組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３を作製した。大腸菌Ｋ−１２から得られた大腸菌Ｗ３１１０（λ−，Ｆ−，原栄養菌（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ))の染色体ＤＮＡを鋳型として、制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩの切断位置を含む下記のプライマー５（Ｎ−末端に６個のヒスチジン残基を暗号化する配列が含まれるように工夫されている）及びプライマー６（Ｃ−末端にケムプチド遺伝子の配列が含まれるように工夫されている）を用い、Ｎ末端に６個のヒスチジン残基が連結されたリンゴ酸酵素を得るために、前記実施例１．（１）と同じ条件のもとでＰＣＲを行った（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ． ２０，  ７４（２）：８９−９５，  ２００１）．
【００３６】
プライマー５（配列番号６）：
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧ−３’
プライマー６（配列番号７）：
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＧＧＣＧＧＴＡ−３’
【００３７】
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法を用いて約１７８２ｂｐサイズのＤＮＡを分離して制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩに切断した後、同じ制限酵素に切断したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｗｅｄｅｎ）に挿入して組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３を作製した（図３）。図３は、組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３を示す模式図であって、前記ｐＴＬＭＫ３は大腸菌由来のリンゴ酸酵素を暗号化するｃＤＮＡ、ケムプチドを暗号化するオリゴペプチド及びアンピシリン抵抗遺伝子を含み、Ｎ末端に６個のヒスチジン残基が連結されたリンゴ酸酵素−単量体ケムプチドタンパク質を発現させることができる。
【００３８】
前記組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３に大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＵＳＡ)を形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含む
ＬＢ平板培地において培養して形質転換された大腸菌を選別した後、これより組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３を分離した。
【００３９】
（３）組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤの作製
Ａｂ１キナーゼに特異的なレプチン−Ａｂ１タンパク質（図１）を発現する組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤを作製した。Ａｂ１（配列番号８）を暗号化するＤＮＡ配列を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩに切断して約４７７ｂｐ及び５１６ｂｐサイズのＤＮＡ断片を得る一方、Ｔ７プロモータを含むプラスミドｐＥＴ−３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を同制限酵素となるＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩに切断した。
【００４０】
リンカータンパク質として選定された人間由来の４３８ｂｐサイズのレプチン遺伝子を得るために、組換えプラスミドｐＥＤＯｂ５（Ｊｅｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６５：３０２７−３２，  １９９９）を鋳型として、制限酵素であるＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩの切断位置を含む下記のプライマー７及び８を用いてＰＣＲを行った。
【００４１】
プライマー７（配列番号９）：
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＴＣＣＡ−３’
プライマー８（配列番号１０）：
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＣＧＣＴＴＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴ−３’
【００４２】
さらに、二量体の形で融合させるために、前記と同じ鋳型ＤＮＡと前記プライマー１及び下記のプライマー９を用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩの切断位置と終止コドンが除去された鋳型ＤＮＡを得た。
【００４３】
プライマー９（配列番号１１）：
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＣＧＣＴＴＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴ−３
【００４４】
得られたプライマー７及び９を用いてＰＣＲにより増幅した後、二量体ＰＣＲ産物を得るために、ＢａｍＨＩの切断位置を含むプライマー１０を製作した。
【００４５】
プライマー１０（配列番号１２）：
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＣＧＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣ−３’
【００４６】
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法を用いて約４７７ｂｐ及び５１６ｂｐサイズのＤＮＡを分離し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩに切断した後、同制限酵素で切断されたプラスミドｐＥＴ−３０ａに挿入して組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤを作製した（図４）。図４は、組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤを示す模式図であって、ｐＬＡＭ及びｐＬＡＤは人間由来のレプチンを暗号化するｃＤＮＡ、Ａｂ１を暗号化するオリゴヌクレオチド及びカナマイシン抵抗遺伝子を含み、それぞれレプチン−単量体Ａｂ１及びレプチン−二量体Ａｂ１の形のタンパク質を発現させることができる。
【００４７】
前記組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板培地において培養して形質転換された大腸菌を選別した後、これより組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤを分離した。
【実施例２】
【００４８】
レプチン−ケムプチドタンパク質が固定されているタンパク質チップを用いたレプチン−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応分析
【００４９】
（１）レプチン−ケムプチドタンパク質が固定されているタンパク質チップの製作
レプチン−ケムプチドタンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤに形質転換された前記実施例１．（１）の組換え大腸菌を２００ｍＬのＬＢ培地に接種して３７℃において培養し、６００ｎｍの波長で測定した光学密度（ＯＤ）が０．７となった時点で１ｍＭのＩＰＴＧを加え、レプチン−ケムプチドタンパク質の発現を誘導した。４時間後、培養液を４℃及び６，０００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離して得た沈殿物を１００ｍＬのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０ｍＭ；ＥＤＴＡ １ｍＭ，ｐＨ８．０）により洗浄し、さらに４℃及び６，０００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離した後、１００ｍＬのＴＥ緩衝液に懸濁して４℃において超音波粉砕器（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて細胞を破砕した。
【００５０】
破砕された溶液を４℃及び６，０００ｒｐｍの条件下で３０分間遠心分離して得た沈殿物を１０ｍＬの変性溶液（８Ｍ Ｕｒｅａ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０）に懸濁し、室温において４時間攪拌して溶解させた後、さらに４℃及び６，０００ｒｐｍの条件下で３０分間遠心分離し、上澄み液を回収して０．２μｍのろ過器によりろ過した。ろ過された溶液に含まれているタンパク質をブラッドフォードタンパク定量法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２；２４８−５４，  １９７６）により定量し、固定液（４０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。
【００５１】
前記希釈液をマイクロアレイ（Ｙｏｏｎ，  Ｓ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １０：２１−６，  ２０００）を用いてアルデヒドスライドの上に３００〜５００μｍの間隔にて（５００個／１ｃｍ２）に滴下し、３０℃のヒュミッドチャンバ（ｈｕｍｉｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）において１時間固定した後、室温において１時間封止液（１％ＢＳＡ，ＰＢＳ，ｐＨ７．４）と反応させてタンパク質チップを製作した。対照群としては、ケムプチド１ｍｇ／ｍＬ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍＬ、レプチン１ｍｇ／ｍＬ及びリン酸塩緩衝液を同じ固定液により希釈して用いた。
【００５２】
（２）レプチン−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応分析
前記実施例２．（１）に従い得られたタンパク質チップを洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，ｐＨ７．５）により５分間３回洗浄し、キナーゼ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．５）により１回洗浄した後、１００μＭのＡＴＰが加えられた２００μＬのキナーゼ溶液をチップ上に分注し、カバーウェルにより覆って１時間反応させた。
【００５３】
前記反応が終わった後、キナーゼ溶液により十分に洗浄し、２００μＬのキナーゼ反応液（１００μＭ ＡＴＰ及び１０ｕｎｉｔｓのｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼを含むキナーゼ溶液）を分注した後、カバーウェルにより覆って１時間反応させた。反応が終わると、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）により十分に洗浄し、Ｃｙ３によりラベルされた抗リン酸化セリン抗体と反応させた後にさらに十分に洗浄し、２００ｇで１分間遠心分離することにより余分の溶液を完全に除去した後、スキャンアレイ５０００（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，  Ｆｏｒｓｔｅｒ，  ＵＳＡ）レーザスキャナを用いて反応を分析した（図５）。
【００５４】
図５は、タンパク質チップ上におけるレプチン−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応を示す蛍光分析写真であって、１はレプチン−二量体ケムプチド（１ｍ＾−ｇ／ｍＬ）、２は１０倍に希釈された前記二量体、３はレプチン−単量体ケムプチド（１ｍｇ／ｍＬ）、４は１０倍に希釈された前記単量体、ＰはＰＢＳ、そしてＫはケムプチド（１ｍｇ／ｍＬ）を示す。
【００５５】
図５から明らかなように、プロテインキナーゼＡはレプチンと結合された形のケムプチドとは特異的に反応したが、単独型ケムプチドとは全く反応しなかった。さらに、２及び４の希釈状態では、単量体よりは二量体の方の反応性が一層高かった。このため、予想の通り、タンパク質チップ上においてサイズが小さなペプチドは酵素タンパク質との反応性に劣っているが、レプチンなどのリンカータンパク質と結合された形のペプチドは反応性に優れ、且つ、単量体の形よりは二量体の形でリンカータンパク質と結合されたものの反応性が一層高いということが確認できた。
【実施例３】
【００５６】
リンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質が固定されているタンパク質チップを用いたリンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応分析
【００５７】
（１）リンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質が固定されているタンパク質チップの製作
リンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３で形質転換された前記実施例１．（２）の組換え大腸菌を前記実施例２．（１）における方法ど同様にして培養し、超音波粉砕器を用いて細胞を破砕した。破砕された溶液を４℃及び６，０００ｒｐｍの条件下で３０分間遠心分離して上澄み液を回収し、平衡溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に透析した後、ニッケル−キレート樹脂（Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて精製し、さらにＰＢＳで透析し、０．２μｍのろ過器によりろ過した。ろ過された溶液に含まれているタンパク質を前記実施例２．（１）における方法と同様にして定量して希釈した後、アルデヒドスライドに滴下してタンパク質チップを製作した。
【００５８】
（２）リンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応分析
前記実施例２．（２）における方法と同様にして、前記実施例３．（１）に従い得られたタンパク質チップを用いてリンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応を分析した（図６）。図６は、タンパク質チップ上におけるリンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応を示す蛍光分析写真であって、１は陽性対照群（Ｃｙ３によりラベルされた抗リン酸化セリン抗体）、２−１はレプチン−単量体ケムプチド、２−２はレプチン−二量体ケムプチド、３はケムプチド、４はＰＢＳ、そして５はリンゴ酸酵素−単量体ケムプチドを示す。
【００５９】
図６に示すように、プロテインキナーゼＡはレプチン又はリンゴ酸酵素と結合された形のケムプチドとは特異的に反応したが、単独型ケムプチドとはほとんど反応しなかった。このため、図５に示すように、タンパク質チップ上においてサイズの小さなペプチドは酵素タンパク質との反応性に劣っているが、レプチンまたはリンゴ酸酵素などのリンカータンパク質と結合された形のペプチドは反応性に優れているということが改めて確認できた。
【実施例４】
【００６０】
レプチン−Ａｂ１タンパク質が固定されているタンパク質チップを用いたレプチン−Ａｂ１タンパク質とＡｂ１キナーゼ間の反応分析
【００６１】
（１）レプチン−Ａｂ１タンパク質が固定されているタンパク質チップの製作
レプチン−Ａｂ１タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤでそれぞれ形質転換された大腸菌を前記実施例２．（１）における方法と同様にして培養し、これよりレプチン−Ａｂ１タンパク質を得た後、アルデヒドスライドに滴下してタンパク質チップを製作した。
【００６２】
（２）レプチン−Ａｂ１タンパク質とＡｂ１キナーゼ間の反応分析
前記実施例４．（１）に従い得られたタンパク質チップを洗浄液（ＰＢＳ，ｐＨ７．５）により５分間３回洗浄し、キナーゼ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０．０１％ Ｂｒｉｊ ３６，ｐＨ７．５）により１回洗浄した後、１００μＭのＡＴＰが加えられた２００μＬのキナーゼ溶液をチップ上に分注し、カバーウェルにより覆って１時間反応させた。前記反応が終わった後、キナーゼ溶液により十分に洗浄し、２００μＬのキナーゼ反応液（１００μＭ ＡＴＰ及び１００ｕｎｉｔｓのＡｂ１キナーゼ）を分注した後、カバーウェルにより覆って１時間反応させた。
【００６３】
反応が終わった後、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）により十分に洗浄し、Ｃｙ５によりラベルされた抗リン酸化チロシン抗体と反応させた後にさらに十分に洗浄し、２００ｇで１分間遠心分離して余分の溶液を完全に除去した後、反応結果を分析した（図７）。
【００６４】
図７は、タンパク質チップ上におけるレプチン−Ａｂ１タンパク質とＡｂ１キナーゼ間の反応を示す蛍光分析写真であって、１はレプチン−二量体Ａｂ１を示し、２はレプチン−単量体Ａｂ１を示し、そしてＰはＰＢＳを示す。図７から明らかなように、Ａｂ１キナーゼはレプチンと結合されたＡｂ１単量体及び二量体と特異的に反応している。
【００６５】
以上、本発明の内容の特定の部分について詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な記述は単なる好適な実施の態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されないという点は自明であろう。よって、本発明の実質的な権利範囲は請求の範囲とその等価物によって定義さるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明に係るＳ−Ｌ−ＳＰ型のタンパク質チップを用いる場合、タンパク質チップ上における低分子量のペプチドと高分子量の酵素タンパク質間及びペプチドと反応抗体間の反応性を高めることができ、ペプチドとタンパク質間の反応を迅速でかつ効率よく分析することができる。これにより、本発明に係るタンパク質チップは、ペプチド−タンパク質反応に基づく効率的でかつ経済的な大量検索、生化学的な分析、新薬候補物質の分析及び疾病診断などの研究と応用に役立つものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】レプチン−ケムプチド、リンゴ酸酵素−ケムプチド及びレプチン−Ａｂ１タンパク質を示す模式図である。
【図２】組換えプラスミドｐＬＫＭ及びｐＬＫＤを示す模式図である。
【図３】組換えプラスミドｐＴＬＭＫ３を示す模式図である。
【図４】組換えプラスミドｐＬＡＭ及びｐＬＡＤを示す模式図である。
【図５】タンパク質チップ上におけるレプチン−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応を示す蛍光分析写真である。
【図６】タンパク質チップ上におけるリンゴ酸酵素−ケムプチドタンパク質とプロテインキナーゼＡ間の反応を示す蛍光分析写真である。
【図７】タンパク質チップ上におけるレプチン−Ａｂ１タンパク質とＡｂ１キナーゼ間の反応を示す蛍光分析写真である。
【配列表】
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2006512581.tif 000004
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2006512581.tif 000006
2006512581.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006512581.tif 000012
【図６】
2006512581.tif 000013
【図７】
2006512581.tif 000014
【国際調査報告】
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