(57)【要約】本発明は、表１Ｂに示した配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの機能を変調する薬剤を同定する方法であって、（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドを含有する試料と、候補薬剤とを用意して、候補薬剤が上記ポリペプチドに結合することが可能になる条件下でインキュベートするステップ；（ｂ）その試料における、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの候補薬剤への結合を測定するステップ；ならびに（ｃ）その試料における、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの上記候補薬剤への結合を、表１Ｂに記載するその配列を有するポリペプチドの、表１Ｂに示したその配列を有するポリペプチドに結合しないことが公知の対照物質への結合と比較するステップ、を含み、ここで、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドによる対照物質への結合と比較した、試料における表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの候補薬剤への結合の増大により、上記候補薬剤が表１Ｂに記載のその配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの機能を変調することが示される、上記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの機能を変調する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドを含有する試料と、候補薬剤とを用意し、前記候補薬剤が前記ポリペプチドに結合するのを可能にする条件下でインキュベートするステップ、
（ｂ）表１Ｂに記載の配列を有する前記アポトーシス関連ポリペプチドの、試料中での前記候補薬剤への結合を測定するステップ、および
（ｃ）表１Ｂに記載の配列を有する前記アポトーシス関連ポリペプチドの試料中での前記候補薬剤への結合を、表１Ｂに記載の配列を有する前記ポリペプチドの、表１Ｂに記載の配列を有する前記ポリペプチドに結合しないことが既知である対照物質への結合と比較するステップ、
を含み、表１Ｂに記載の配列を有する前記アポトーシス関連ポリペプチドによる前記対照物質への結合と比べて、表１Ｂに記載の配列を有する前記アポトーシス関連ポリペプチドによる試料中の前記候補薬剤への結合が増大していることによって、前記候補薬剤が表１Ｂに記載の配列を有する前記アポトーシス関連ポリペプチドの機能を変調することが示される、方法。
【請求項２】
表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤を同定する方法であって、前記コードされているタンパク質を含有する調製物を用意するステップ；スクリーニングする被験薬剤が前記タンパク質に結合するのを可能にする条件下で、前記調製物を前記被験薬剤とともにインキュベートするステップ；および、前記薬剤の前記タンパク質との相互作用から生成されるシグナルの存在または不在を検出することによって、前記被験薬剤が前記タンパク質と相互作用するかどうか判定するステップ、および、それによって、前記被験薬剤が前記アポトーシス関連タンパク質を阻害するかどうか判定するステップ、を含む方法。
【請求項３】
前記タンパク質を含有する前記調製物が、前記タンパク質を発現する細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
表１Ｂから選択されるプロテインキナーゼ遺伝子によってコードされているアポトーシス関連プロテインキナーゼの阻害剤を同定する方法であって、前記コードされているプロテインキナーゼを含有する調製物を用意するステップ；スクリーニングする被験薬剤が前記プロテインキナーゼに結合するのを可能にする条件下で、前記調製物を前記被験薬剤とともにインキュベートするステップ；前記プロテインキナーゼのホスホトランスフェラーゼ活性の変化を検出することによって、前記被験薬剤が前記プロテインキナーゼと相互作用するかどうか判定するステップ、および、それによって、前記被験薬剤が前記アポトーシス関連プロテインキナーゼを阻害するかどうか判定するステップ、を含む方法。
【請求項５】
表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされているアポトーシス関連細胞表面受容体タンパク質の阻害剤を同定する方法であって、表１Ｂから選択される細胞表面受容体遺伝子によってコードされているタンパク質への薬剤の結合に反応して検出可能なシグナルを提供できる第２の構成要素と連結したそのタンパク質を表面上に発現している細胞を提供するステップ；前記タンパク質に結合するのを可能にする条件下で、被験薬剤と接触させるステップ；および、前記薬剤が前記タンパク質に結合しそれを阻害するかどうかを、その化合物による前記タンパク質との相互作用から生成されるシグナルの存在または不在を検出することによって判定するステップ、および、それによって、前記表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされているアポトーシス関連細胞表面受容体タンパク質の活性を、前記被験薬剤が阻害するかどうか判定するステップ、を含む方法。
【請求項６】
前記検出可能なシグナルを提供できる第２の構成要素がＧタンパク質であり、かつＧｉ、Ｇｏ、Ｇｓ、Ｇ１６、Ｇ１５、Ｇｑ、またはＧ１２−１３のＧタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学化合物が、表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に特異的に結合し、かつこれを阻害するかどうか判定する方法であって、セカンドメッセンジャー反応を生成し、かつ表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質を発現する細胞を、タンパク質阻害に適した条件下で、前記化学化合物と接触させるステップ、および前記化学化合物の存在下および不在下で前記セカンドメッセンジャー反応を測定するステップを含み、そのような細胞は、通常は前記タンパク質を発現しないものであり、前記化学化合物の存在下における前記セカンドメッセンジャー反応の変化は、前記化合物が、表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされるアポトーシス関連タンパク質を阻害することを示すものである、方法。
【請求項８】
前記セカンドメッセンジャー反応が、塩素イオンチャンネルの活性化、細胞内カルシウムイオンレベルの変化、イノシトールリン酸の遊離、アラキドン酸の遊離、ＧＴＰγＳ結合、ＭＡＰキナーゼの活性化、ｃＡＭＰの蓄積、細胞内カリウムイオンレベルの変化、または、細胞内ナトリウムイオンレベルの変化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記セカンドメッセンジャー反応が、分泌型アルカリ性ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびβガラクトシダーゼから好ましくは選択されるレポーター遺伝子活性の変化によって測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験薬剤が低分子量有機分子、抗体または抗体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子抑制性ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試料中の、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在を検出する方法であって、
（ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、表１Ｂに記載の配列を有する核酸の、少なくとも１５ヌクレオチドの断片を含むプローブと接触させるステップ；および
（ｂ）前記プローブと、前記試料中の核酸との間で形成された二本鎖分子を検出するステップ、
を含み、二本鎖分子が検出されることによって、試料中の、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在が示される、方法。
【請求項１２】
試料中の、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在を検出する方法であって、
（ａ）表１Ｂに記載の配列を有する前記アポトーシス関連ポリペプチドに結合できる抗体を用意するステップ；
（ｂ）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、生物試料を前記抗体とともにインキュベートするステップ；および
（ｃ）前記抗体を含む抗体抗原複合体を検出するステップ、
を含み、抗体抗原複合体が検出されることによって、前記試料中の、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在が示される、方法。
【請求項１３】
細胞におけるアポトーシスを変調する方法であって、
（ａ）表１Ｂに記載の配列、またはその相補配列を有する二本鎖核酸を前記細胞内に導入し形質転換させるステップであって、その核酸配列が調節配列に作用可能に連結している、ステップ；および
（ｂ）前記核酸配列が発現される条件下で、前記細胞を培養するステップ、
を含み、それによって、前記細胞におけるアポトーシスを変調する、方法。
【請求項１４】
細胞におけるアポトーシスを変調する方法であって：
（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドをコードする二本鎖核酸配列を前記細胞内に導入し形質転換させるステップであって、その核酸配列が調節配列に作用可能に連結している、ステップ；および
（ｂ）前記核酸配列が発現される条件下で、前記細胞を培養するステップ、
を含み、それによって、前記細胞におけるアポトーシスを変調する方法。
【請求項１５】
細胞におけるアポトーシスを変調する方法であって、
（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする二本鎖核酸配列を、前記細胞内に導入し形質転換させるステップであって、前記核酸配列が調節配列に作用可能に連結している、ステップ；および
（ｂ）前記核酸配列が発現される条件下で、前記細胞を培養するステップ、
を含み、それによって、前記細胞におけるアポトーシスを変調する方法。
【請求項１６】
細胞におけるアポトーシスを変調する方法であって、
（ａ）リボ核酸（ＲＮＡ）前駆体をコードする核酸配列に作用可能に連結した調節配列を含む単離された核酸分子を、前記細胞内に導入し形質転換させるステップであって、ここで前記前駆体が、
（ｉ）表１Ｂに記載の配列上の連続した１５〜４０ヌクレオチドに同一である１５〜４０ヌクレオチド長の配列を含む第１のステム部分と、
（ｉｉ）表１Ｂに記載の配列上の連続した１５から４０ヌクレオチドに相補的である１５〜４０ヌクレオチド長の配列を含む第２のステム部分と、
（ｉｉｉ）その２つのステム部分を結合するループ部分と、
を含み、かつ、前記第１のステム部分および前記第２のステム部分は互いにハイブリダイズして、二本鎖ステムを形成することができる、ステップ；および
（ｂ）前記核酸配列が発現される条件下で、前記細胞を培養するステップ、
を含み、それによって前記細胞におけるアポトーシスを変調する、方法。
【請求項１７】
前記核酸配列が、表１Ｂに記載の配列またはその相補配列を有する核酸である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸配列が、表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドに対して８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
アポトーシスが低減される、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アポトーシスが増強される、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
表１Ｂに記載の配列を有する核酸配列によってコードされているＲＮＡ前駆体。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＲＮＡ前駆体を、生物活性成分として含む組成物。
【請求項２４】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法で形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
抗アポトーシスタンパク質を哺乳動物に与える方法であって、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法で形質転換された哺乳類細胞を、前記哺乳動物に導入することを含む方法。
【請求項２６】
哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療する方法であって、前記組織を、請求項２２に記載のＲＮＡ前駆体と接触させることを含む方法。
【請求項２７】
前記疾患が癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
活性成分としての表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連核酸および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
活性成分としての表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
活性成分としての表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連核酸に対する抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
活性成分としての表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドに対する抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を診断する方法であって、前記組織を、請求項３０または３１に記載の抗体と接触させるステップ、および、抗体／抗原複合体を検出するステップを含み、それが検出されることによって前記疾患または病的状態であることが示される、方法。
【請求項３３】
哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療する方法であって、前記組織を、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドのアンタゴニストと接触させるステップを含む、方法。
【請求項３４】
哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療する方法であって、前記組織を、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドのアゴニストと接触させるステップを含む、方法。
【請求項３５】
哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療するためのキットであって、
（ａ）表１Ｂに記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチド；
（ｂ）表１Ｂに記載のヌクレオチド配列を有する核酸；または
（ｃ）（ａ）に記載のポリペプチドのエピトープを認識する抗体
を含むキット。
【請求項３６】
表１Ｂに記載の配列を有する核酸配列をそれぞれ有する少なくとも２つのアポトーシス遺伝子を含むアレイ。
【請求項３７】
前記核酸配列がＤＮＡ配列である、請求項３６に記載のアレイ。
【請求項３８】
前記核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項３６に記載のアレイ。
【請求項３９】
表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチド配列をそれぞれ有する少なくとも２つのアポトーシスタンパク質を含むアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、アポトーシスの過程で機能を有する多数のヒト遺伝子、およびそれらがコードするタンパク質の同定に関する。本発明は、細胞中でのアポトーシスの変調におけるこれらの「アポトーシス関連」遺伝子およびタンパク質の使用、ならびに、これらの遺伝子またはタンパク質の変調因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、したがって、アポトーシスの変調因子を、同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プログラム細胞死すなわちアポトーシスは、生理条件下および様々な疾病条件下の両方において細胞を死に至らしめる、遺伝学的にプログラムされたプロセスである（Ｋｅｒｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第２６巻、２３９〜２５７頁、１９７２年）。それは成体期には、有糸核分裂に対する反対平衡力として機能し、多くの発生過程では、生理的構造を彫り出すのに貢献する主要寄与因子である（Ｗｙｌｌｉｅら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ、第６８巻、２５１〜３０５頁、１９８０年）。アポトーシスは、多くの明確な生化学的特徴によって特徴付けられており、これらには、内在性エンドヌクレアーゼ酵素の活性化によって引き起こされるＤＮＡ断片化が含まれる（Ｗｙｌｌｉｅ、Ｎａｔｕｒｅ、第２８４巻、５５５〜５５６頁、１９８０年；Ｅｎａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、４３〜５０頁、１９９８年）。その結果は、アガロースゲル中で、ＤＮＡラダーパターンとして容易に可視化することができる。ＤＮＡ断片化と共に、細胞縮小が起こり（Ｗｅｓｓｅｌｂｏｒｙら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１４８巻、２３４〜４１頁、１９９３年）、その際、水が積極的に細胞から押出される。アポトーシス細胞は、その後、アポトーシス小体に断片化され、これらは、隣接した細胞、または細網内皮系の細胞に飲み込まれる。
【０００３】
第２の明確な特徴は、細胞がアポトーシスを行う際に、リン脂質ホスファチジルセリンが、細胞原形質膜の外側表面に曝露されることである（Ｆａｄｏｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１４８巻、２２０７〜１６頁、１９９２年）。通常、この脂質は、膜脂質二重層の内側に局在する。このような脂質の反転の原因としてなる機構に関しては、現在のところ、ほとんど判っていないが、その出現は、アポトーシス細胞の認識および食作用のシグナルとして役立っている（Ｆａｄｏｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１４８巻、２２０７〜１６頁、１９９２年）。
【０００４】
アポトーシスは、正常な生理条件下では厳密に調節されている。しかし、いくつかの疾患において、この過程の調節が緩み、特定の病態が導かれる。アポトーシスが遅延または阻害されている状態の例には、腫瘍の発生、ならびに、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の関連状態など、多くの炎症状態が含まれる（Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、第５６巻、１９６９〜７７頁、１９９７年）。不適当または過度のアポトーシスは、虚血状態下（卒中、心筋梗塞など）（Ｌｉｎｎｉｋら、Ｂｌｏｏｄ、第８０巻、１７５０〜７頁、１９９２年；Ｇｏｒｍａｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ、第１３９巻、４５〜５２頁、１９９６年）、一連の神経変性状態下、骨髄抑圧下（Ｍｏｒｉら、Ｂｌｏｏｄ、第９２巻、１０１〜７頁、１９９８年）、化学療法または放射線照射の後（Ｌｏｔｅｍら、Ｂｌｏｏｄ、第８０巻、１７５０〜７頁、１９９２年）、および、細胞死が病態の重要な特色をなす他の多くの疾患で起こる。
【０００５】
好中球、炎症、およびホスファチジルイノシトールシグナル伝達
好中球は、炎症における主要な細胞性メディエーターとして認識されている。これらは、宿主を保護する不可欠な役割を果たしており、それによって、微生物の侵入に対して動員される防御反応の第一線となっている。好中球は、急性炎症反応における細胞フェーズで優勢な細胞型である（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓ、「Biochemistry and Physiology of the Neutrophil」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年）。宿主の保護における好中球の重要性は、重度の好中球減少症を有し、その結果、再発性の細菌感染を患う患者に認めることができる（Ｂｏｘｅｒ  ＬおよびＤａｌｅ  ＤＣ、「Neutropenia: causes and consequences」、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２００２年、第３９（２）巻、７５〜８１頁）。
【０００６】
病原体の侵入に対して宿主を保護するために、好中球は、様々な活性酸素および活性窒素分子種を含む、殺菌兵器の大きな蓄えを有し、それらは、侵入した細菌の食作用に続いて、プロテアーゼおよびエラスターゼと共に、その顆粒からファゴリソソームに放出される。しかし、これら傷害性物質の一部は、必然的に周囲の環境に漏出し、そこで、炎症部位に組織損傷を引き起こすことがある。さらに好中球は、インターロイキン−１α、インターロイキン１β、インターロイキン６、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＩＬ１受容体アンタゴニストα、ならびに、ケモカインであるインターロイキン８、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、および増殖関連遺伝子産物α（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ−α）を含めた、多数の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方を合成する能力があるため、他の免疫細胞を動員するシグナルを発信することができる（Ｃａｓｓａｔｅｌｌ  ＭＡ、「Cytokines Produced by Polymorphonuclear Neutrophils: Molecular and Biological Aspects」、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｘ、ＲＧ  Ｌａｎｄｅｓ社、１９９６年）。
【０００７】
これらの細胞の不適切な活性化、ならびにプロテアーゼおよびエラスターゼの放出は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含めた多くの疾患に寄与すると認識されている（Ｎｏｇｕｅｒａａら、Ｔｈｏｒａｘ、２００１年、第５６巻、４３２〜４３７頁；Ｌａｍｂら、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１９９９年９月、第２７（９）巻、１７３８〜４４頁）。
【０００８】
有害な活性化の程度を制限するために存在する制御調節機構の１つがプライミングである。プライミングの作用を介して、細胞の活性化レベル、および後続の反応を、活性化状態の連続が実現できるように調節することができる。炎症部位においてその時点で見られるそのようなプライミング因子の１つが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、これは、単球およびＴ細胞を含めたいくつかの活性化された細胞型で放出される２２ｋＤａの炎症誘発性サイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦとともに好中球のプレインキュベーションを行うと、走化性因子および食作用因子を含めた多くの刺激に応答（プライミング）するそれらの能力が促進され、それによって炎症過程が増強される（Ｌｏｐｅｚら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９８６年、第７８（５）巻、１２２０〜８頁）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、スーパーオキシド産生増強（Ｗｅｉｓｂａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年３月２８日〜４月３日、第３１４（６００９）巻、３６１〜３頁）、カルシウム動員（Ｎａｃｃａｃｈｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８８年５月１５日、第１４０（１０）巻、３５４１〜６頁）、ならびにアラキドン酸遊離およびロイコトリエンＢ４の合成（ＤｉＰｅｒｓｉｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８８年６月１５日、第１４０（１２）巻、４３１５〜２２頁）などの好中球の生物活性を増強することが知られている。
【０００９】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子活性化および好中球のプライミングは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼの刺激と同時に起こることが以前に示されている（ａｌ−Ｓｈａｍｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年２月１日、第８９（３）巻、１０３５〜４４頁）。さらに最近の研究によって、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ活性の調節が、ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸からホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸への変換の促進、およびスーパーオキシドアニオン反応の増大と正の相関を有することが示された（Ｃａｄｗａｌｌａｄｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００２年９月１５日、第１６９（６）巻、３３３６〜４４頁）。
【００１０】
さらに、ＰＩ３Ｋ−ｐ８５αの調節サブユニットを欠失しているマウスから得られた好中球は、野生型マウスと同様、プライミングされていない好中球に匹敵するレベルのスーパーオキシドアニオンを産生したが、それらによる産生は、プライミング後の野生型より有意に低く、これは改めて、スーパーオキシド産生を導くプライミング現象でのＰＩ３Ｋの役割を確認するものである（Ｙａｓｕｉら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ、２００２年１１月、第７２（５）巻、１０２０〜６頁）。別のノックアウト研究では、今度はＰＩ３Ｋ−ｐ１１０触媒サブユニットがターゲティングされ、様々な走化性物質への好中球の移動効率が低下すること、そして、ノックアウトマウスは好中球酸化バーストの低減を示し、その結果、細菌が腹腔内で持続的に生存するようになることが研究者によって見いだされた（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年２月１１日、第２８７（５４５５）巻、１０４９〜５３頁）。
【００１１】
活性化状態を制限するため、好中球は、プライミングされていない状態、プライミングされた状態、脱プライミング状態、そして、再びプライミングされた状態の間を循環できることが知られている。この現象は、ホスホイノシチド、特にホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸の産生および分解のレベルの制御によるものと考えられている。事実、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を加水分解する酵素であるＳＨＩＰ（ＳＨ２−イノシトール−５−ホスファターゼ）を欠失したマウスから得られた好中球は、ＧＭ−ＣＳＦなどのプライミング因子に対して反応性が亢進していることが判った。これらの動物では、マクロファージおよび好中球の両方が肺に致命的にまで浸潤するため、死亡率が高く（Ｈｅｌｇａｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９８年６月１日、第１２（１１）巻、１６１０〜２０頁）、これは、ホスホイノシチドレベルの調節ができないと、過度の炎症を起こすかもしれないことを示すものである。
【００１２】
好中球、ホスファチジルイノシトールシグナリング、および生存
好中球プライミングの他に、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３産生の別の結果として、レトロウイルス性発癌遺伝子ｖ−ＡＫＴの細胞性ホモログであるＡＫＴのリン酸化および活性化がある。好中球における、ＡＫＴ活性化の生物学的結果はアポトーシスの阻害であり、そして、その結果による生存の長期化であるが、これらは、そうでなければ短命の好中球の数に大きな影響を与える現象である。
【００１３】
ＧＭ−ＣＳＦ処理の後に起こる、好中球アポトーシスの阻害が、ＰＩ３ＫおよびＡＫＴによって媒介されることが研究によって示されたが、これは、そのいずれのキナーゼの化学抑制剤によっても生存が抑止されるからである（Ｋｌｅｉｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００年、第１６４（８）巻、４２８６〜９１頁）。同様に、遺伝的ノックアウトマウスにおいて、ＰＩ３Ｋを活性化できないと、ＧＭ−ＣＳＦによるＡＫＴの活性化が行われない結果となり、さらに、その後で好中球のアポトーシスを遅延できなくなることが他の研究者によって示された（Ｙａｓｕｉら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ、２００２年１１月、第７２（５）巻、１０２０〜６頁）。
【００１４】
好中球におけるＡＫＴ活性化の直接的な抗アポトーシス機構は、現在のところ不明であるが、ＡＫＴの活性化に媒介された生存が、カスパーゼ９、Ｂａｄ、およびＦｏｒｋｈｅａｄ転写因子を含めた多数のアポトーシス促進タンパク質をリン酸化し、不活性化するＡＫＴの能力によるらしいことが知られている。さらに、ＮＦκＢは、アポトーシス性のいくつかの刺激に反応して生存を促進する転写因子であるが、ＡＫＴは、ＮＦκＢ抑制物質ＩκＢの分解を誘導するキナーゼであるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）をリン酸化して活性化することによって、ＮＦκＢに正の影響を与えることもできる。
【００１５】
ホスファチジルイノシトールシグナリングおよび癌
ホスファチジルイノシトールは、ＰＩ３Ｋ活性が、ＳＲＣチロシンキナーゼおよびポリオーマウイルス中型Ｔ抗原（ｍｉｄｄｌｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）などのウイルス性癌遺伝子の形質転換活性に物理的かつ機能的に関連することが明らかになって以来、約２０年間にわたって癌研究の主要な焦点となっている。同じ時期に、それまで存在することが知られていなかった脂質であるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３が、活性化された好中球で検出された（Ｔｒａｙｎｏｒ−Ｋａｐｌａｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、３５３〜３５６頁）。それ以来、ＰＩ３Ｋの役割、ホスファチジルイノシトール、および癌に関する文献が対数関数的に増大している（総説として、Ｖｉｖａｎｃｏ  ＩおよびＳａｗｙｅｒｓ  ＣＬ（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、第２巻、４８９〜５０１頁を参照）。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に発癌性の潜在力があるということは、それが厳密な制御の下に保たれており、そのため、ＰＩ３ＫおよびＰＩＰ３ホスファターゼ（ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２）の調節によって、無刺激の増殖においては、ほとんど検出できないレベルになっていることを意味する。腫瘍形成への関与が最も明確なＰＩＰ３ホスファターゼはＰＴＥＮであり、これは、ＰＩＰ３を、元のＰＩＰ２に変換する３位の脂質ホスファターゼである。このホスファターゼの変異は、元々、乳癌およびグリア芽腫で同定されたが、現在では、癌に関連して変異する最も一般的なタンパク質の１つであると認識されている。ＰＴＥＮと同様、ホスファチジルイノシトールに関連していて、かつ癌にも関連している変異には、ＰＩ３キナーゼの構成的な活性と、ＡＫＴ活性の上昇とが含まれる。
【００１６】
アポトーシスおよび治療標的探索のための好中球モデル
国際公開ＷＯ０２／０４６５７は、アポトーシスの好中球モデルを記載する。ＧＭ−ＣＳＦは、シグナル伝達カスケードを介して作用するシグナルを提供し、細胞の遺伝子発現における著しい変化、または変化のパターンと関連している。したがって、アポトーシスを介した好中球細胞死の阻害は、アポトーシスの過程を制御する「エフェクター遺伝子」の調節によって行われる。しかしこれまで、そのような「エフェクター遺伝子」の正体、および、細胞死の生化学的イベントを導くシグナル伝達経路におけるそれらの役割は、不完全にしか決定されていない。これまでのところ、発見された遺伝子の多くは、なんらかの根本的な不都合を有するものであった。例えば、それらは細胞が死プログラムに確実に進んだ後のアポトーシス後期に作用するものであったり、または偏在的、すなわち、特定の細胞型に限定されないものであったりした。アポトーシスを制御するための理想的な標的は、この過程の初期に作用するものであって、かつ特定の細胞型に限定されているものである。
【００１７】
アポトーシスの制御は、多くの疾患がこの過程における欠損によるものであるため、重要な治療標的となっている。したがって、この過程を調節する遺伝子の同定が、緊急に必要である。換言すれば、アポトーシスを阻止する遺伝子が同定されれば、この遺伝子／遺伝子産物、またはその機能を薬物で遮断して、アポトーシスを生じさせることができる。同様に、過度のアポトーシスが起こる場合には、この過程の遮断が重要な治療目標となる。
【００１８】
以上のことから、細胞をプライミングして細胞活性を促進させることに関しても、また、アポトーシス過程を遅延させて細胞の生存を延長させることに関しても、その両方について、ホスファチジルイノシトールシグナリングが、ＧＭ−ＣＳＦで刺激された好中球の生物学における根本的な部分であるのが明らかである。同様に、ホスファチジルイノシトールシグナリングと腫瘍生存との関連も明らかにされている。活性化された好中球においてホスファチジルイノシトールのシグナリングに関連して調節される標的の同定は、明らかに、癌治療の有効な標的であろう。したがって、ＧＭ−ＣＳＦで刺激された好中球は、炎症および癌における標的を含めた新規の治療標的を同定する研究を行うのに優れたモデルであると結論づけられる。
【発明の開示】
【００１９】
発明の要旨
本発明は、その発現がアポトーシスの調節における初期段階と関連する多数の遺伝子、すなわち「アポトーシス関連」遺伝子を同定する。これらの遺伝子の同定およびアポトーシスにおける役割の検証は、本明細書に記載するように、国際公開ＷＯ０２／０４６５７に記載のモデルアッセイを用いることによって、また、ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現をノックダウンし、その結果生ずるアポトーシスの進行が変化した表現型を評価することによって、行った。したがって、これらの遺伝子は治療薬剤の新規の標的となるものである。
【００２０】
本発明は、表１に記載したすなわち同定された配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの機能を変調する薬剤を同定する方法であって、（ａ）表１に記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドを含有する試料と、候補薬剤とを用意して、候補薬剤（または被験薬剤）が上記ポリペプチドに結合するのが可能になる条件下でインキュベートするステップ；（ｂ）上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの、試料中での候補薬剤への結合を測定するステップ；ならびに、（ｃ）上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの、試料中での上記候補薬剤への結合を、上記表１Ｂに記載する配列を有するポリペプチドの、表１に記載の配列を有するポリペプチドに結合しないことが既知である対照物質への結合と比較するステップ、を含み、ここで、上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの上記対照物質への結合に比べて、上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの上記試料中での候補薬剤への結合が増大していることによって、上記候補薬剤が、上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの機能を変調することが示される、方法に関する。
【００２１】
本発明は、試料中における、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、表１Ｂに記載の配列を有する核酸の少なくとも１５ヌクレオチドの断片を含むプローブと接触させるステップ；および（ｂ）上記プローブと、上記試料中の核酸との間で形成された二本鎖分子を検出するステップを含み、二本鎖分子を検出することによって、上記試料中における、上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在が示される方法も提供する。
【００２２】
遺伝子発現のレベルは、他のいかなる適切な方法で測定してもよい。遺伝子発現の減少は、処理されていない細胞に対して、処理された細胞におけるアポトーシス関連遺伝子の発現を測定することによって検出されうる。遺伝子発現は、アポトーシス関連ｍＲＮＡ転写物またはその断片などのアポトーシス関連ポリペプチドをコードする核酸を検出することによって測定することが好ましい場合がある。一実施形態では、ｍＲＮＡ転写物を測定する方法として、本明細書に記載する増幅技法が使用されうる。別の実施形態では、アポトーシス関連遺伝子の発現は、アポトーシス関連ポリペプチド遺伝子産物またはその断片を、例えばアポトーシス関連ポリペプチドに結合する薬剤を用いて検出することによって測定されうる。適当な薬剤としては抗体が挙げられる。
【００２３】
したがって別の態様では、本発明は、試料中における、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在を検出する方法であって、（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドに結合できる抗体を提供するステップ；（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、生物試料を上記抗体とインキュベートするステップ；および（ｃ）上記抗体を含む抗体−抗原複合体を検出するステップを含み、抗体−抗原複合体を検出することによって、上記試料中の、上記表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドの存在が示される方法に関する。
【００２４】
別の態様では、細胞のアポトーシスを変調（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する方法であって、アポトーシス関連ポリペプチドまたはそれをコードする核酸の機能的活性を増大させるか、低下させるか、または他の様式で変化させるステップを含む方法を提供する。一実施形態では、上記アポトーシスの変調は阻害である。別の実施形態では、上記アポトーシスの変調によって、細胞の生存がもたらされる。
【００２５】
好適には、アポトーシス関連ポリペプチドは、表１Ｂに特定する配列を有するものである。
【００２６】
本発明の内容においては、「アポトーシス関連ポリペプチドまたはそれをコードする核酸の機能的活性の変化」という用語の範囲に、正常な環境下、すなわち、天然条件下における単一細胞内で、天然タンパク質の機能と比較した際の、アポトーシス関連ポリペプチドの活性の増大、低下、または他の様態での変化が含まれる。さらにこれには、アポトーシス関連ポリペプチドをコードする核酸の発現レベルの増大もしくは低下、および／または細胞内分布の変化、および／またはアポトーシス関連ポリペプチドの細胞内分布の変化が含まれる。
【００２７】
一実施形態では、上記方法は、アポトーシス関連遺伝子の発現を低減させることを含む。好ましい態様では、アポトーシス関連遺伝子の発現が、処理されていない細胞における正常レベルの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、２００％超、５００％超、またはそれ以上低減される。
【００２８】
アポトーシス関連遺伝子発現の低減は、アンチセンス発現により行うのが好ましいこともある。アポトーシス関連遺伝子の発現を低減する他の方法も、当業者ならば認識しているであろう。これには、ドミナントネガティブのペプチド、または、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現の低下を引き起こすｓｉＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子を含めた小分子を導入することが含まれる。適当なｓｉＲＮＡ分子に関しては、本明細書における実施例の項に記載する。
【００２９】
別の実施形態では、上記方法は、アポトーシス関連遺伝子発現を増大させることを含む。好ましい態様では、アポトーシス関連遺伝子の発現が、処理されていない細胞における正常レベルの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、２００％超、５００％超、またはこれより大きく増大される。
【００３０】
好ましくは、上記方法は、アポトーシス関連ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用意するステップ、細胞に発現ベクターを導入するステップ、および、細胞内のコードされているポリペプチドの発現を可能にする条件下に細胞を維持するステップを含む。本明細書に定義するように、アポトーシス関連ポリペプチドまたはアポトーシス関連ポリペプチドをコードする核酸は、それらの断片も包含する。
【００３１】
したがって、本発明は、細胞においてアポトーシスを変調する方法であって、（ａ）表１Ｂに記載の配列、またはその相補配列を有する二本鎖核酸配列を細胞内に導入し形質転換させるステップであって、その核酸配列が調節配列に作用可能に連結している、ステップ；および（ｂ）上記核酸配列が発現される条件下で、上記細胞を培養するステップを含み、それによって、上記細胞においてアポトーシスを変調する方法に関する。
【００３２】
本発明は、細胞においてアポトーシスを変調する方法であって、（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドをコードする二本鎖核酸配列を細胞内に導入し形質転換させるステップであって、上記核酸配列が調節配列に作用可能に連結している、ステップ；および、（ｂ）上記核酸配列がそれによって発現される条件下で、上記細胞を培養するステップを含み、それによって、上記細胞のアポトーシスを変調する方法にも関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、細胞におけるアポトーシスを変調する方法であって、（ａ）表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする二本鎖核酸配列を、上記細胞内に導入し形質転換させるステップであって、上記核酸配列が調節配列に作用可能に連結している、ステップ；および、（ｂ）上記核酸配列が発現される条件下で、上記細胞を培養するステップを含み、それによって、上記細胞においてアポトーシスを変調する方法に関する。
【００３４】
本発明の別の態様は、細胞におけるアポトーシスを変調する方法であって、（ａ）リボ核酸（ＲＮＡ）前駆体をコードする核酸配列に作用可能に連結した調節配列を含む単離された核酸分子を、上記細胞内に導入し形質転換させるステップであってここで上記前駆体が、（ｉ）表１Ｂに記載の配列にある連続した１５〜４０ヌクレオチドに同一な、１５〜４０ヌクレオチド長の配列を含む第１のステム部分と、（ｉｉ）表１Ｂに記載の配列にある連続した１５〜４０ヌクレオチドに相補的な、１５〜４０ヌクレオチド長の配列を含む第２のステム部分と、（ｉｉｉ）２つのステム部分を接続するループ部分と、を含み、かつ、上記第１のステム部分および上記第２のステム部分は相互にハイブリダイズして、２本鎖ステムを形成することができる、ステップ；および、（ｂ）上記核酸配列が発現される条件下で、上記細胞を培養するステップ、を含み、それによって、上記細胞のアポトーシスを変調する、上記方法に関する。
【００３５】
細胞は、疾患の治療のための治療標的が適切でありうる。例えば、そのような細胞は、癌細胞、炎症性疾患に関与する細胞、自己免疫疾患または神経変性障害に関与する細胞でありうる。
【００３６】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、核酸配列は、表１Ｂに記載の核酸配列、またはその相補配列である。核酸配列は、表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドをコードすることができる。核酸配列は、表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドに対して８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしうる。
【００３７】
本明細書に記載の方法は、アポトーシスを増加させるのにも、減少させるのにも用いることができる。
【００３８】
本発明の別の特徴は、表１Ｂに記載または特定する核酸配列によってコードされるＲＮＡ前駆体である。そのようなＲＮＡ前駆体は、生物活性成分として組成物に含めることができる。そのようなＲＮＡ前駆体または組成物は、哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または状態を治療するために、その組織をＲＮＡ前駆体または組成物と接触させることによって、用いることができる。この疾患は、癌または炎症性疾患であることが適切でありうる。
【００３９】
本発明の別の特徴は、本明細書に記載する方法で形質転換された宿主細胞である。そのような宿主細胞は、表１Ｂに記載の核酸配列のすべてまたは一部を含有しうる。そのような宿主細胞は、表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドのすべてまたは一部を発現することができる。
【００４０】
本発明の別の態様では、表１Ｂに特定されるアポトーシス関連遺伝子は、下流標的を同定するのに使用されうる。例えば、アポトーシス関連遺伝子と相互作用するか、または、それによって発現が制御されるタンパク質が同定されうる。
【００４１】
本明細書に記載の方法は、哺乳動物に抗アポトーシスタンパク質を提供するのに使用でき、この場合、この方法は、本明細書に記載の方法によって形質転換された哺乳類細胞を、哺乳動物に導入することを含む。
【００４２】
アポトーシスの変調は、治療目的で行うことができる。したがって、本発明は、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連核酸配列を活性成分として含み、さらに、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関する。
【００４３】
本発明は、さらに、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドを活性成分として含み、さらに、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関する。
【００４４】
したがって、本発明の別の態様では、異常なアポトーシスを特徴とする疾患の治療方法であって、アポトーシス関連遺伝子発現または機能的活性の変調因子を個体に投与することを含む方法を提供する。
【００４５】
そこで、一実施形態では、本発明はさらに、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連核酸に対する抗体を活性成分として含み、さらに、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。そのような抗体は、哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を診断する方法であって、上記組織を上記抗体と接触させること、および抗体／抗原複合体を検出することを含み、上記検出によって、上記疾患または状態の存在が示される方法において使用することができる。
【００４６】
別の態様では、本発明は、表１Ｂに示した配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドに対する抗体を活性成分として含み、さらに、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。そのような抗体は、哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を診断する方法であって、上記組織を上記抗体と接触させること、および抗体／抗原複合体を検出することを含み、上記検出によって、上記疾患または状態の存在が示される方法で使用することができる。
【００４７】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療する方法であって、上記組織を、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドのアンタゴニストと接触させることを含む方法に関する。
【００４８】
本発明の別の態様は、哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療する方法であって、上記組織を、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連ポリペプチドのアゴニストと接触させることを含む方法に関する。
【００４９】
本発明は、哺乳類組織における異常なアポトーシスを特徴とする疾患または病的状態を治療するためのキットであって、（ａ）表１Ｂに記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチド；（ｂ）表１Ｂに記載のヌクレオチド配列を有する核酸；または、（ｃ）（ａ）に記載のポリペプチドのエピトープを認識する抗体、を含むキットにも関する。
【００５０】
本発明の方法において有用な細胞は、いかなる供給源から得たものでもよく、例えば、初代培養もしくは樹立細胞系から得たもの、または器官培養もしくはｉｎ  ｖｉｖｏから得たものでもよい。本発明において有用な細胞系には、造血系由来の細胞および細胞系が含まれる。好適な細胞には、ＨｅＬａ、Ｕ９３７（単球）、ＴＦ１、ＨＥＫ２９３（Ｔ）、好中球または好中球の特徴を有する細胞の初代培養、例えば、ＨＬ６０細胞、マウスＦＤＣＰ−１、ＦＤＣＰｍｉｘ、３Ｔ３、初代またはヒト幹細胞が含まれる。他の適当な細胞には、Ｕ２５１、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＭＣＦ７ＰＣ３、ＨＣＴ１５、７８６−０、ＨＴ２９、Ｍ−１４、Ｍｏｌｔ４、ＣＥＭ、Ｋ５６２、ダウディ、ＤＵ１４５、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＬｎＣａｐなどの癌細胞系が含まれる。
【００５１】
治療のための方法の場合には、細胞は、癌、炎症、自己免疫、または神経変性関連細胞などの疾患関連細胞でありうる。
【００５２】
別の態様では、疾患の治療において使用するための医薬の製造における、アポトーシス関連遺伝子の発現または活性に対する変調因子の使用を提供する。
【００５３】
上記変調因子は、好適には、アンチセンス分子、またはＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡ分子であって、したがって、アポトーシス関連遺伝子の発現を低減するものである。
【００５４】
適当な疾患には、癌、炎症、自己免疫疾患、および神経変性障害が含まれる。
【００５５】
喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性繊維症（ＣＦ）、リウマチ関節炎（ＲＡ）、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの多数の炎症性疾患は、ａ）サイトカイン、および主として骨髄細胞に作用する増殖因子のレベルおよび発現の増大、ｂ）骨髄細胞の生存の延長、およびｃ）骨髄細胞の長期活性化を特徴とする。
【００５６】
したがって、活性化された、好中球などの骨髄細胞の数の増加は、これら多数の慢性および急性炎症性疾患の病理に随伴し、それとの関連性が強く示唆されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＴＪおよびＪｏｓｅ  ＰＪ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ、２００１年、第２３４巻、１３６〜４１頁；考察１４１〜８頁；Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ、Ｃｈｅｓｔ、２０００年２月、第１１７（２補）巻、１０Ｓ〜４Ｓ頁；Ｎａｄｅｌ  ＪＡ、Ｃｈｅｓｔ、２０００年２月、第１１７（２補）巻、１０Ｓ〜４Ｓ頁；Ｗａｒｄ  Ｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ、１９９９年１２月、第２０（１２）巻、５０３〜９頁；Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ＪおよびＬａｋａｔｏｓ  Ｌ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、２００１年５月１日、第６（９）巻、４４１〜４４２頁）。
【００５７】
したがって、一実施形態では、骨髄細胞アポトーシスの変調を介した炎症性疾患治療における、アポトーシス関連遺伝子の使用、または、細胞のアポトーシス関連遺伝子発現を変化させる薬剤の使用を提供する。
【００５８】
本発明の内容において、「骨髄細胞」という用語は、最終的に分化した、骨髄細胞系列の非分裂細胞を指す。これらの細胞には、好中球、好酸球、および単球／マクロファージが含まれる。本発明の態様の一実施形態では、骨髄細胞は、好中球、好酸球、または単球／マクロファージである。
【００５９】
炎症性疾患には、敗血症、急性呼吸窮迫症候群、子癇前症、心筋虚血、再潅流損傷、乾せん、喘息、ＣＯＰＤ、細気管支炎、嚢胞性繊維症、リウマチ関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、および潰瘍性大腸炎などの疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の別の態様では、表１Ｂに記載の配列を有するアポトーシス関連遺伝子の発現に干渉することができるＲＮＡ分子を提供する。上記ＲＮＡｉ分子は、本明細書における実施例の項に記載の配列を有するものが好適である。
【００６１】
本発明の別の態様は、表１Ｂに記載の核酸配列を有する少なくとも２つのアポトーシス関連遺伝子を含むアレイである。この核酸配列は、ＤＮＡ配列でありうる。この核酸配列は、ＲＮＡ配列でもありうる。
【００６２】
本発明の別の態様は、表１Ｂに記載の配列を有するポリペプチドを有する少なくとも２つのアポトーシス関連タンパク質を含むアレイである。
【００６３】
本明細書の表１Ｂに特定するアポトーシス関連遺伝子には、１）アポトーシスの抑止を目的とする細胞防御機構に関与する「エフェクター」遺伝子（抗アポトーシス遺伝子）であって、そのため治療標的に相当する遺伝子と、２）アポトーシスおよび／またはＧＭ−ＣＳＦシグナルカスケードの諸様相を構成し、そのため治療標的に相当する遺伝子と、３）アポトーシス過程を開始させる遺伝子（アポトーシス促進性遺伝子）であって、そのため治療標的に相当する遺伝子と、４）アポトーシスおよび防御の過程に関連する遺伝子であって、主要な経路、過程、および機構を理解する上で助けになり、ひいては治療標的の同定に繋がるであろう遺伝子と、が含まれる。
【００６４】
具体的には、本発明で同定された遺伝子は、プロテインキナーゼおよびＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。
【００６５】
プロテインキナーゼ
キナーゼは、リン酸基をタンパク質に付加することによって、多数の異なった細胞増殖、分化、およびシグナル伝達の過程を調節する。制御されないシグナル伝達は、炎症、癌、動脈硬化、および乾せんを含めた様々な疾患状態に関連づけられている。タンパク質の可逆的リン酸化は、真核生物細胞の活性を制御するための主要なストラテジーである。典型的な哺乳類細胞で活性を有する１万のタンパク質のうち、１０００を超えるタンパク質がリン酸化されると推定されている。リン酸化は、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長因子、および分化因子など）、細胞周期チェックポイント、および環境もしくは栄養ストレスに反応して起こるものであり、これは大雑把に言って分子スイッチをＯＮにするのに似ている。スイッチがＯＮになると、適当なプロテインキナーゼが代謝酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャネル、ポンプ、または転写因子を活性化する。
【００６６】
キナーゼは、既知のタンパク質グループのうちで最大のものであり、広範な機能および特異性を有する酵素のスーパーファミリーを構成する（例えば、Ｈａｒｄｉｅ，Ｇ．およびＨａｎｋｓ，Ｓ．（１９９５年）、The Protein Kinase Facts Books、Ｖｏｌ  Ｉ：７−２０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．を参照）。
【００６７】
Ｇタンパク質共役型受容体
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内でシグナル伝達を行うタンパク質の主要なクラスを構成する。ＧＰＣＲは、３つの構造ドメインを有する。すなわち、アミノ末端の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびカルボキシ末端の細胞内ドメインであり、膜貫通ドメインは７つの膜貫通セグメント、３つの細胞外ループ、および３つの細胞内ループを含有する。ＧＰＣＲの細胞外部分にリガンドが結合することによって、細胞内にシグナルが伝達され、その結果、細胞の生物学的または生理的性質に変化がもたらされる。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって変調される細胞内酵素およびチャネル）と共に、細胞内におけるセカンドメッセンジャーの状態を細胞外の入力に接続するモジュラーシグナリングシステムの構成要素である。
【００６８】
ＧＰＣＲ遺伝子および遺伝子産物は、疾患の潜在的原因物質である（Ｓｐｉｅｇｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、第９２巻、１１１９〜１１２５頁（１９９３年）；ＭｃＫｕｓｉｃｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ、第３０巻、１〜２６頁（１９９３年））。ロドプシン遺伝子中、およびＶ２バソプレッシン受容体遺伝子中の特定の欠損によって、様々な形態の網膜色素変性症（Ｎａｔｈａｎｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ、第２６巻、４０３〜４２４頁（１９９２年））、および腎性尿崩症（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、第２巻、１２０１〜１２０４頁（１９９３年））が引き起こされることが示されている。これらの受容体は、中枢神経系と、末梢の生理学的過程との両方にとって極めて重要なものである。進化的分析は、これらのタンパク質の祖先が、元来、複雑なボディプランおよび神経系と協調して発生したことを示唆する。
【００６９】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、５つのファミリーに分けられる。すなわち、ファミリーＩ、ロドプシンおよびβ２アドレナリン受容体を典型とする、現在２００を超える固有のメンバーによって代表される受容体（Ｄｏｈｌｍａｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、第６０巻、６５３〜６８８頁（１９９１年））；ファミリーＩＩ、副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー（Ｊｕｐｐｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５４巻、１０２４〜１０２６頁（１９９１年）；Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５４巻、１０２２〜１０２４頁（１９９１年）；ファミリーＩＩＩ、代謝調節型グルタミン酸受容体ファミリー（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５８巻、５９７〜６０３頁（１９９２年））；ファミリーＩＶ、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性および発生に重要なｃＡＭＰ受容体ファミリー（Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４１巻、１４６７〜１４７２頁（１９８８年））；および、ファミリーＶ、ＳＴＥ２などの真菌接合フェロモン受容体（Ｋｕｒｊａｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、第６１巻、１０９７〜１１２９頁、１９９２年）である。
【００７０】
また、７つの推定疎水性セグメントがあるが、ＧＰＣＲとの関連が見られない他のタンパク質も少数存在し、それらではＧタンパク質との会合が示されていない。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は、光受容体特異的タンパク質であるｂｒｉｄｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ｂｏｓｓ）という７回膜貫通セグメントタンパク質を発現するが、これは詳細に研究されているが、なおＧＰＣＲであるという証拠が示されていない（Ｈａｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、５０４７〜５０５１頁（１９９３年））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の遺伝子ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ｆｚ）も、７つの膜貫通セグメントを有するタンパク質であると考えられている。ｂｏｓｓと同様に、ｆｚでも、Ｇタンパク質との会合が示されていない（Ｖｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３８巻、２６３〜２６４頁（１９８９年））。
【００７１】
Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合するα、β、およびγサブユニットで構成されるヘテロ三量体タンパク質ファミリーである。通常、これらのタンパク質は細胞表面受容体、例えば、７つの膜貫通セグメントを含有する受容体に連結する。リガンドがＧＰＣＲに結合した後、立体配座変化がＧタンパク質に伝達され、それによって、αサブユニットによる結合型ＧＤＰ分子からＧＴＰ分子への交換、およびβγサブユニットからの分離が引き起こされる。ＧＴＰ結合型のαサブユニットは、通常、エフェクター変調部分として機能し、ｃＡＭＰ（例えば、アデニルシクラーゼの活性化によって）、ジアシルグリセロール、またはイノシトールリン酸などのセカンドメッセンジャーの産生を導く。２０を超える異なったタイプのαサブユニットがヒトで知られている。これらのサブユニットが結合するβおよびγサブユニットのプールは、これより小さいものである。哺乳類Ｇタンパク質の例には、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ、およびＧｔが含まれる。Ｇタンパク質に関しては、Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９５年）に詳細に記載されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、ならびにＧタンパク質連結型エフェクターおよびセカンドメッセンジャーシステムに関しては、Ｔｈｅ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔ  Ｂｏｏｋ、Ｗａｔｓｏｎら編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）に総説されている。
【００７２】
したがって、キナーゼおよびＧＰＣＲは、薬物作用および薬物開発の主要な対象である。それゆえ、以前には未知であったキナーゼやＧＰＣＲを同定して、特徴付けることは、医薬開発の分野にとって価値のあることである。本発明は、役割が以前に同定されていない特定のキナーゼおよびＧＰＣＲの、アポトーシスにおける役割を同定することによって、技術水準を前進させるものである。
【００７３】
したがって、本明細書でアポトーシス関連遺伝子として同定されるＧＰＣＲおよびキナーゼポリペプチドの変調因子は、ＧＰＣＲ活性およびキナーゼ活性の標準的なアッセイを用いて同定できる。適当なアッセイは、当業者には周知である。
【００７４】
本発明の態様の好ましい実施形態では、アポトーシス関連遺伝子もしくはタンパク質、または、その配列が表１Ｂに特定される遺伝子もしくはタンパク質は、ＭＡＫ、ＧＰＲ８６、ＰＣＴＡＩＲＥプロテインキナーゼ３、ＢＡＩ２、ｐｐ１２５、ＳＴＫ６、ＵＬＫ１、セリン／トレオニンキナーゼ１６、リボゾームＳ６プロテインキナーゼ、ＴＬＫ２、エタノールアミンキナーゼ、ＭＮＫ１（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）、ＦＬＪ２０５５９、ＦＬＪ１３３５１、ＮＴＫＬ、ＣＤＣ４２結合タンパク質キナーゼβ（ＤＭＰＫ様）、ＲＢＳＫリボキナーゼ、ＥＤＧ６、ＤＡＧＫ、Ｇタンパク質共役型受容体１２、ＰＲＫ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ５、ホスファチジルイノシトール４キナーゼ触媒βポリペプチド、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４、ＰＳＫＨ１プロテインセリンキナーゼＨ１、およびイノシトール１，４，５−三リン酸３キナーゼＣから選択される。
【００７５】
本発明は、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤を同定する方法であって、上記コードされているタンパク質を含有する調製物を用意すること；スクリーニングされる被験薬剤が上記タンパク質に結合するのを可能にする状態下で、上記調製物を上記被験薬剤とインキュベートすること；および、上記薬剤による上記タンパク質との相互作用から生成されるシグナルの存在または不在を検出することによって、上記被験薬剤が上記タンパク質と相互作用するかどうか判定して、それによって、上記被験薬剤がアポトーシス関連タンパク質を阻害するかどうか判定することを含む方法を提供する。
【００７６】
本発明の内容では、上記コードされているタンパク質を含有する調製物は、そのタンパク質を発現する細胞、組換え産生されたタンパク質を始めとする精製タンパク質、または、そのタンパク質を含有する膜画分を含みうる。さらに、阻害剤化合物を同定するために本発明の方法を使用する際には、そのタンパク質は、本明細書に記載のヒトタンパク質を含むことが好ましいが、別の実施形態では、他の哺乳類ホモログ（例えば、イヌ、ブタ、ラット、マウス）を含めた、この構造の機能的変異型、融合タンパク質（例えば、精製の補助用に付加される配列、例えば、ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列を備えたタンパク質）、そのタンパク質の機能ドメインまたは断片（例えば、プロテインキナーゼの活性触媒ドメイン）を使用することもできる。
【００７７】
本発明は、表１Ｂから選択されたプロテインキナーゼ遺伝子によってコードされているアポトーシス関連プロテインキナーゼの阻害剤を同定する方法であって、上記コードされているプロテインキナーゼを含有する試料を用意するステップ；スクリーニングされる被験薬剤が上記プロテインキナーゼに結合するのを可能にする条件下で、上記試料を上記被験薬剤とインキュベートするステップ；プロテインキナーゼのホスホトランスフェラーゼ活性における変化を検出することによって、上記被験薬剤が上記プロテインキナーゼと相互作用するかどうか判定して、それによって、上記被験薬剤が上記アポトーシス関連プロテインキナーゼを阻害するかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００７８】
本発明は、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連細胞表面受容体タンパク質の阻害剤を同定する方法であって、表１Ｂから選択される細胞表面受容体遺伝子によってコードされているタンパク質への薬剤の結合に反応して検出可能なシグナルを提供できる第２の構成要素と連結したそのタンパク質を表面に発現している細胞を提供するステップ；上記タンパク質に結合するのを可能にする条件下で、スクリーニングすべき被験薬剤と接触させるステップ；および、上記薬剤がタンパク質に結合しそれを阻害するかどうかを、その化合物による上記タンパク質との相互作用から生成されるシグナルの存在または不在を検出することによって判定するステップ、および、それによって、上記表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされているアポトーシス関連細胞表面受容体タンパク質の活性を、上記被験薬剤が阻害するかどうか判定するステップ、を含む方法をさらに提供する。この方法の内容において、検出可能なシグナルを提供できる第２の構成要素は、Ｇタンパク質、例えば、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｓ、Ｇ１６、Ｇ１５、ＧｑまたはＧ１２−１３のＧタンパク質でありうる。別の一実施形態では、第２の構成要素がβアレスチンでありうる。
【００７９】
本発明は、化学化合物が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に特異的に結合し、かつこれを阻害するかどうか判定する方法であって、セカンドメッセンジャー反応を生成し、かつ上記表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質を発現する細胞を、タンパク質阻害に適した条件下で、上記化学化合物と接触させるステップ、および上記化学化合物の存在下、および不在下でセカンドメッセンジャー反応を測定するステップを含み、そのような細胞は、通常、上記タンパク質を発現しないものであり、上記化学化合物の存在下におけるセカンドメッセンジャー反応の変化によって、上記化合物が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるアポトーシス関連タンパク質を阻害することが示される方法をさらに提供する。
【００８０】
本発明の内容において、セカンドメッセンジャー反応は、塩素イオンチャンネルの活性化、細胞内カルシウムイオンレベルの変化、イノシトールリン酸の遊離、アラキドン酸の遊離、ＧＴＰγＳ結合、ＭＡＰキナーゼの活性化、ｃＡＭＰの蓄積、細胞内カリウムイオンレベルの変化、または細胞内ナトリウムイオンレベルの変化から選択されるが、これらに限定されるものではない。セカンドメッセンジャー反応は、当技術分野で周知の様々な方法で、またはレポーター遺伝子活性の変化によって測定できる。そのようなレポーター遺伝子には、分泌されるアルカリ性ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびβガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
本発明は、アポトーシスの活性化物質を同定する方法であって、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質を含有する調製物を用意するステップ；スクリーニングされる被験薬剤が上記タンパク質に結合するのを可能にする条件下で、上記調製物を上記被験薬剤とインキュベートするステップ；上記被験薬剤が上記タンパク質に結合しそれを阻害するかどうかを、上記薬剤による上記タンパク質との相互作用から生成されるシグナルの存在または不在を検出することによって判定するステップ、および、上記タンパク質を阻害する任意の被験薬剤がアポトーシスの活性物質であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００８２】
本発明は、アポトーシス促進活性を有する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質と、そのコードされているタンパク質を含む調製物中で相互作用するかどうか判定するステップ、および、上記コードされているタンパク質と相互作用する任意の薬剤がアポトーシスの活性物質であるかどうかを判定するステップ、を含む方法をさらに提供する。
【００８３】
本発明は、腫瘍細胞の増殖に対する阻害剤を同定する方法であって、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質を含有する調製物を用意するステップ；スクリーニングされる被験薬剤が上記タンパク質に結合するのを可能にする条件下で、上記調製物を上記被験薬剤とインキュベートするステップ；上記薬剤による上記タンパク質との相互作用から生成されるシグナルの存在または不在を検出することによって、上記被験薬剤が上記タンパク質に結合しそれを阻害するかどうか判定するステップ、および、上記タンパク質を阻害する任意の被験薬剤が腫瘍細胞の増殖の阻害剤であるかどうかを判定するステップ、を含む方法をさらに提供する。
【００８４】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する薬剤の同定方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質と、上記コードされているタンパク質を含む調製物中で相互作用するかどうか判定するステップ、および上記コードされているタンパク質と相互作用する任意の薬剤が腫瘍細胞の増殖の阻害剤であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００８５】
本発明の方法において、薬剤が腫瘍細胞の増殖を阻害するかどうかの判定は、当業者に公知のいかなる方法で行ってもよく、例えば、ＢｒｄＵ、または放射性同位元素標識されたチミジンで、ＤＮＡ合成可能な細胞を標識することによって行ってもよい。
【００８６】
本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされているタンパク質と、上記コードされているタンパク質を含む調製物中で相互作用するかどうか判定するステップ、および、コードされているタンパク質と相互作用する任意の薬剤が腫瘍細胞の成長に対する阻害剤であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００８７】
本発明は、腫瘍の成長を阻害する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質と、上記コードされているタンパク質を含む試料中で相互作用するかどうか判定するステップ、および、コードされているタンパク質と相互作用する任意の薬剤が腫瘍の成長に対する阻害剤であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００８８】
本発明は、アポトーシス促進活性を有する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現を変調するかどうか判定するステップ、および、上記活性または発現を変調する任意の薬剤がアポトーシスの活性物質であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００８９】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現を変調するかどうか判定するステップ、および、上記活性または発現を変調する任意の薬剤が腫瘍細胞の増殖に対する阻害剤であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００９０】
本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現を変調するかどうか判定するステップ、および、上記活性または発現を変調する任意の薬剤が腫瘍細胞の成長に対する阻害剤であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００９１】
本発明は、腫瘍の成長を阻害する薬剤を同定する方法であって、被験薬剤が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現を変調するかどうか判定するステップ、および、上記活性または発現を変調する任意の薬剤が腫瘍の成長に対する阻害剤であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００９２】
上記の方法において、被験薬剤は、低分子量（５０００ダルトン未満）有機分子、抗体、抗体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子抑制ｄｓＲＮＡ、またはリボザイムから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
本発明は、上記の方法によって同定された、腫瘍細胞増殖または腫瘍成長の阻害剤も提供する。腫瘍細胞増殖または腫瘍成長のそのような阻害剤は、低分子量有機分子（約５０００ダルトン未満）、抗体、抗体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子抑制ｄｓＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ干渉に使用されるような）、またはリボザイムでありうるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
本発明は、そのような治療の必要性が認められる哺乳動物における腫瘍の成長を阻害する方法であって、上記そのような治療の必要性が認められる哺乳動物に、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の活性または発現に対する阻害剤を投与するステップを含み、上記投与が、上記哺乳動物における腫瘍の成長を低減させるのに有効な量で行われる方法をさらに提供する。この方法の内容において、阻害剤は、低分子量（５０００ダルトン未満）有機分子、抗体、抗体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子抑制ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムから選択されうるが、これらに限定されるものではない。表１Ｂから選択された遺伝子でコードされているタンパク質の発現レベルを減少させるＲＮＡ干渉実験の実施に関する、本明細書の方法の項で記載する小分子抑制ｄｓＲＮＡは、この方法を実施するのに使用できる阻害剤の特定の例である。
【００９５】
本発明は、そのような治療の必要性が認められる哺乳動物における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、上記そのような治療の必要性が認められる哺乳動物に、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現に対する阻害剤を投与することを含み、上記投与が、上記哺乳動物における腫瘍細胞の増殖を減弱させるのに有効な量で行われる方法をさらに提供する。この方法の内容において、阻害剤は、低分子量（５０００ダルトン未満）有機分子、抗体、抗体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子抑制ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムから選択されうるが、これらに限定されるものではない。表１Ｂから選択された遺伝子でコードされているタンパク質の発現レベルを減少させるＲＮＡ干渉実験の実施に関する、本明細書の方法の項で記載する小分子抑制ｄｓＲＮＡは、この方法を実施するのに使用できる阻害剤の特定の例である。
【００９６】
本発明は、そのような治療の必要性が認められる哺乳動物における腫瘍細胞のアポトーシスを刺激する方法であって、上記そのような治療の必要性が認められる哺乳動物に、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現に対する阻害剤を投与することを含み、上記投与が、上記哺乳動物における腫瘍細胞のアポトーシスを刺激するのに有効な量で行われる方法をさらに提供する。この方法の内容において、阻害剤は、低分子量有機分子、抗体、抗体フラグメント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子抑制ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムから選択されうるが、これらに限定されるものではない。表１Ｂから選択された遺伝子でコードされているタンパク質の発現レベルを減少させるＲＮＡ干渉実験の実施に関する、本明細書の方法の項で記載する小分子抑制ｄｓＲＮＡは、この方法を実施するのに使用できる阻害剤の特定の例である。
【００９７】
本発明は、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に特異的に結合し、かつこれを阻害する化学化合物を含む組成物を調製する方法であって、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるアポトーシス関連タンパク質を、そのような化合物が上記タンパク質に結合するのに適した条件下で、試験化学化合物と接触させるステップ、上記試験化学化合物による、上記コードされているタンパク質に対する特異的結合および阻害を検出するステップ、および、そのようにして同定された試験化学物質、または上記試験化学物質の機能的アナログもしくはホモログを、担体と混合して、それによって、上記組成物を調製するステップを含み、そのような細胞が、通常、上記コードされているタンパク質を発現しない、上記方法をさらに提供する。
【００９８】
本発明は、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質を特異的に阻害する化学化合物を含む組成物を調製する方法であって、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質を、そのような化合物が上記タンパク質に結合するのに適した条件下で、試験化学化合物と接触させるステップ、上記試験化学化合物による、上記タンパク質に対する特異的阻害を検出するステップ、および、そのようにして同定された試験化学物質、または上記試験化学物質の機能的アナログもしくはホモログを、担体と混合して、それによって、上記組成物を調製するステップを含む方法をさらに提供する。
【００９９】
本発明は、新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）を選択的に阻害する化合物による治療に対して応答性の新生物を同定する方法であって、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に対する阻害活性を有する化合物に、新生物の試料を曝露するステップ、および上記化合物が上記新生物を阻害するかどうか判定するステップを含む方法を提供する。
【０１００】
本発明は、新生物を選択的に阻害する化合物による治療に対して応答性の新生物を同定する方法であって、（ａ）患者から新生物組織試料を取り出すステップ、（ｂ）上記試料から得られた細胞を外植体としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させるステップ、（ｃ）表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に対する阻害活性を有する化合物に、上記細胞の試料を接触させるステップ、（ｄ）上記化合物の存在下における細胞の成長を、上記化合物の不在下における細胞の成長と比較するステップ、および、（ｅ）新生物の成長が、上記化合物による阻害に対して応答性であるかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１０１】
本発明は、新生物を選択的に阻害する化合物による治療に対して応答性の新生物を同定する方法であって、（ａ）患者から新生物組織試料を取り出すステップ、（ｂ）上記試料から得られた細胞を外植体としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させるステップ、（ｃ）表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に対する阻害活性を有する化合物に、上記細胞の試料を接触させるステップ、（ｄ）上記化合物の存在下におけるアポトーシス細胞の数を、上記化合物の不在下におけるアポトーシス細胞の数と比較するステップ、および、（ｅ）上記化合物が、上記腫瘍におけるアポトーシスの増大を促進するかどうか判定するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１０２】
本発明は、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤による治療に対して応答性の新生物を同定する方法であって、新生物組織試料中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定するステップを含み、上記新生物組織中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質のレベルが、正常組織と比較して上昇していることによって、上記新生物には、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に対する阻害剤によって治療される可能性があることが示される方法をさらに提供する。
【０１０３】
この方法の一実施形態では、新生物組織中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているタンパク質のレベルの測定は、上記新生物組織試料中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質のタンパク量を測定することを含む。
【０１０４】
この方法の別の実施形態では、新生物組織試料中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの測定は、上記新生物組織試料中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定することを含む。
【０１０５】
この方法のさらに別の実施形態では、新生物組織試料中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの測定は、上記新生物組織試料中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるタンパク質の生化学活性を測定することを含む。例えば、アポトーシス関連タンパク質がプロテインキナーゼである場合には、タンパク質基質またはペプチド基質の自己リン酸化またはリン酸化を測定することができる。アポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質の場合には、下流のシグナル伝達経路コンポーネントの活性化レベルの測定結果を評価することができる。
【０１０６】
本発明は、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤による治療に応答性の、患者の新生物を同定する方法であって、（ａ）新生物の疑いがある組織試料を患者から取得するステップと、（ｂ）免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、試料を、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に対する免疫反応性を有する抗体と接触させるステップと、（ｃ）そのようにして形成された複合体を検出するステップとを含み、上記新生物組織中における、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の量が、正常組織と比較して上昇していることによって、上記新生物には、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質に対する阻害剤によって治療される可能性があることが示される方法をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
本発明は、アポトーシスに関与するヒト遺伝子を記載するものである。そのような遺伝子は、候補物質がアポトーシスの阻害剤であるかどうか判定するための本明細書に記載のアッセイで使用することができる。その物質がアポトーシスの促進物質であるかどうかを判定するのにも、これらの同じアッセイを使用することができる。
【０１０８】
そのようなアッセイには結合アッセイが含まれるが、この場合、本明細書に記載のポリペプチドに対するその物質の結合の程度が測定される。そのようなアッセイには、その物質が、本明細書に記載のポリペプチドと、このポリペプチドに結合することが知られている別の物質との間の結合を阻止するかどうかの測定も含まれる。
【０１０９】
これらのアッセイには、試料中における、本明細書に記載のポリペプチドの存在または不在を、このポリペプチドに結合することが知られている物質を試料に添加し、結合が起こるかどうか測定することによって判定するアッセイも含まれる。別法として、このポリペプチドをコードする核酸にその配列が基づいている核酸プローブを使用して、このポリペプチドをコードする核酸が試料中に存在しているか、または存在していないかを判定することもできる。プローブを試料に添加し、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、その核酸が試料中に存在する場合、これに対する結合を引き起こすことができる。そのようなプローブは、結合が起こったかどうかをより容易に判定できるように標識することができる。別法として、核酸プローブの代わりに、これらの核酸またはポリペプチドに特異的な抗体を使用することもできる。
【０１１０】
本明細書に記載のポリペプチドをコードしている核酸で突然変異が起こっているかどうかを知ることが望ましい状況では、この核酸を含有する試料を取得して、突然変異が起こっていると考えられる領域に特異的な核酸プローブを使用することができる。突然変異を含まない同等な核酸を含有する試料と比較して、結合が欠如している場合、それは、その核酸がその位置に突然変異を含有することを示す。その核酸のどこで突然変異が起こっているか判らない場合には、その核酸の全長をカバーする逐次シリーズのプローブを使用することができる。
【０１１１】
これらのアッセイは、ある組織、例えば腫瘍、または過剰増殖している細胞を含んでいる疑いがある組織で、本明細書に記載のポリペプチドが過剰発現されているかどうか判定するのに使用することができる。その組織から得た試料に、既知のリガンドを一定量添加することができ、それによって、このリガンドが上記ポリペプチドに結合する。試料中の結合リガンド−ポリペプチド複合体の量が、通常の量より多い場合には、このポリペプチドが過剰発現されている。「通常」とは、同じ生物から得た別の組織、もしくは別の生物から得た同等の組織の試料で検出されるポリペプチドの量、または事前に測定した、発現のベースラインレベルを意味しうる。
【０１１２】
上述したアッセイのいずれも、本明細書に記載の核酸もしくはポリペプチドの存在／不在、または本明細書に記載のポリペプチドの発現のレベルを測定するキットに組み込むことができる。
【０１１３】
別段の定義がない限り、本明細書におけるすべての技術用語および科学用語は、当該分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法、および生化学）の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。分子生物学的、遺伝学的、および生化学的手法の標準的な技法が用いられる。全般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、および、Ａｕｓｕｂｅｌら、Short Protocols in Molecular Biology（１９９９年）、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと；また、Ｇｕｔｈｒｉｅら、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology、第１９４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９１年）、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Ｉｎｎｉｓら、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、PCR、第１巻、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７年、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、および、Gene Transfer and Expression Protocols、１０９〜１２８頁（Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編集、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）も参照されたい。これらの文献を参照により本明細書に組み込む。
定義
「アポトーシス」、またはプログラム細胞死は、細胞核の凝縮と、それに続く断片化とが、その間、原形質膜が元の状態で残ったままで行われることを特徴とする、制御された細胞内プロセスである。アポトーシスは、細胞縮小と、細胞内容物のアポトーシス小体へのパッケージングとによって識別される、活発で、かつ厳密に調節された過程である。アポトーシス小体は、後にマクロファージに飲み込まれ、それによって、炎症反応の活性化が回避される（総説には、Ｗｙｌｌｉｅ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．、第５３巻、４５１〜４６５頁、１９９７年を参照のこと）。アポトーシス死は、壊死性細胞死および複製性老化を含めた他の細胞プロセスとは異なる。
【０１１４】
本明細書において、「核酸」という用語は、自然界に存在する天然の核酸、および／または、当技術分野で公知の、修飾骨格または塩基を有する人工の修飾核酸を含めた、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。本発明の「核酸」は、上述したアポトーシス関連遺伝子またはタンパク質をコードする核酸である。この用語には、さらに、上記に特定した天然存在の核酸またはその相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドが含まれる。
【０１１５】
本明細書において、「単離された」ポリペプチドまたは核酸とは、元の環境（例えば、その物質が天然に存在する自然環境）から取り出された物質を指し、したがって、そのような物質は、すでに人の手によってその自然な状態から改変されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部であるかもしれず、または細胞内に含有されているかもしれないが、そのベクター、組成物、または特定の細胞は、そのポリヌクレオチドの元の環境ではないので、このポリヌクレオチドは、それでも、「単離された」状態でありうる。「単離された」という用語は、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、全細胞全ｍＲＮＡ試料もしくはｍＲＮＡ試料、ゲノムＤＮＡ試料（電気泳働で分離され、ブロット上に転写されたものも含める）、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ試料、または、本発明の核酸の明確な特徴が当該技術によって実証されていない他の組成物を指さないことが好ましい。
【０１１６】
「ベクター」は、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製配列、ファージ、直鎖状一本鎖、環状一本鎖、直鎖状二本鎖、または環状二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列など、宿主細胞または宿主生物に導入される外因性ＤＮＡを保持するいかなる物質も意味する。組換えベクターは、いかなる供給源から得られたものでもよく、ゲノムへの組み込み、または自律複製が可能なものである。
【０１１７】
本発明のアポトーシス関連ポリペプチドに「特異的に結合する」か、またはこれを「特異的に認識する」リガンドは、そのようなポリペプチドに、他の関係のないポリペプチドに結合するよりも高い親和性で結合するリガンドである。
【０１１８】
「アポトーシスを変調する」とは、所与の細胞に関して、その細胞がアポトーシスを生じる通常の傾向を、ある特定の環境条件下で、処理されていない細胞と比較して、少なくとも１０％変化させることを意味する。例えば、血中好中球は、アポトーシスをある一定の傾向で生じる。すなわち、最初の２４時間以内に、細胞集団のうち、８０％を超える細胞がアポトーシスを生じることになる。血中好中球のアポトーシスを変調するということは、この正常なアポトーシス性の傾向を変化させることを意味し、それによって、正常速度に比べて、アポトーシスが増強または低減される。同様に、ＧＭ−ＣＳＦの存在下にある血中好中球は、アポトーシスを生じる傾向が低減している。したがって、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で血中好中球のアポトーシスを変調するということは、低下しているそれらの正常な傾向に比べて、その条件下でアポトーシスを増強または低減させることを意味する。アポトーシスを生じる傾向の低減は、細胞生存の測定可能な増大でもよく、また、アポトーシス経路の１つまたは複数の構成要素を阻害することによるアポトーシス阻害の結果であってもよい。
【０１１９】
「発現」という用語は、遺伝子のＤＮＡテンプレートを転写して、対応するｍＲＮＡの生成を行うこと、および、このｍＲＮＡを翻訳して、対応する遺伝子産物（すなわち、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）を生成することを意味する。「遺伝子発現を活性化する」という用語は、ある処理に対する反応によって、遺伝子の転写を誘導または増強することを意味し、そのような誘導または増強は、上記処理の不在下における遺伝子発現の量との比較によるものである。同様に、「遺伝子発現を低下させる」、または「遺伝子発現をダウンレギュレートする」という用語は、ある処理に対する反応によって、遺伝子の転写を抑制または阻止することを意味し、そのような抑制または阻止は、上記処理の不在下における遺伝子発現の量との比較によるものである。
【０１２０】
本発明の内容において、タンパク質の「機能的活性」とは、このタンパク質にとって自然な環境で、このタンパク質が行う機能について記述するものである。タンパク質の機能的活性を変化させることには、そのタンパク質自体の元々の活性を増強すること、低減させること、または別の方法で変化させることが包含される。さらにそれには、発現レベルを増強または低減させること、および／またはそのタンパク質をコードする核酸の細胞内分布を変化させること、および／またはそのタンパク質自体の細胞内分布を変化させることが包含される。
【０１２１】
「レポーター遺伝子」は、発現ベクターに組み込まれ、目的の遺伝子と同じ制御下に置かれて、容易に測定可能な表現型を発現する遺伝子である。
【０１２２】
「骨髄細胞」という用語は、骨髄細胞系に由来する、最終分化した非分裂性（すなわち、非増殖性）細胞を包含し、これには、好中球または多形核好中球（ＰＭＮ）、好酸球、および単核食細胞が含まれる。後者の細胞は、血中にあるときには単核細胞として知られ、組織中に移動した際には、マクロファージとして知られる。最終分化は細胞分化の正常な終点であり、通常は非可逆的である。
【０１２３】
「炎症性障害」または「炎症性疾患」は、慢性または急性の炎症を特徴とする障害である。そして、これは、サイトカインおよび／または骨髄細胞生存因子のレベルの上昇を特徴とする。これらの障害は、好中球、好酸球、および単核細胞／マクロファージを含めた骨髄細胞の生存が延長されることを特徴とし、骨髄細胞は、これらの細胞型の１種または複数の混合集団として存在しうる。したがって、炎症性障害または疾患の治療に関して言及した場合、それは、個々の細胞型に対する処理、または異なった細胞型の混合集団に対する処理が含まれる。その結果として、これらの炎症細胞の数が増大した場合、それはこの疾患の病理に関連している。慢性炎では、持続的な炎症反応によって、組織損傷などの有害な効果が引き起こされる。慢性炎症性疾患には、嚢胞性繊維症、成人型呼吸窮促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、およびリウマチ関節炎が含まれる。他の炎症性疾患は当業者に公知であり、これには、敗血症、子癇前症、心筋虚血、再潅流損傷、乾癬、喘息、細気管支炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎が含まれる。
【０１２４】
「ポリヌクレオチド」または「ポリペプチド」は、本明細書に開示するＤＮＡ配列およびタンパク質配列を意味する。これらの用語には、それらの配列に近似した変異型も含まれ、その場合、これらの変異型は、参照配列と同じ生物活性を有する。そのような変異型配列には、「アレル」（同一種または近縁種の同一遺伝子座に見られる変異型配列）、および「ホモログ」（共通の先祖ＤＮＡ配列を有する近縁関係によって、第２の遺伝子との関係を有する遺伝子であって、種分化（「オーソログ」）または遺伝子重複（「パラログ」によって分けられる遺伝子）も、そのような変異型が本明細書に開示する参照配列と同じ生物活性を保有する限りにおいて含まれる。
【０１２５】
本発明は、本明細書に開示するポリヌクレオチドおよびポリペプチドのサイレント多型および保存的置換も、そのような変異型が本明細書に開示する参照配列と同じ生物活性を保有する限り、含むものとする。
【０１２６】
ポリペプチド
本明細書に特定するポリペプチドは、表１Ｂに特定するポリペプチド、または表１Ｂに特定する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその断片に限定されものではなく、任意の供給源から得られた相同配列、例えば、近縁性を有するウイルス／細菌タンパク質、細胞性ホモログ、および合成ペプチド、そして、変異型またはその誘導体も含まれることを理解されたい。
【０１２７】
したがって、本明細書で「ポリペプチド」に関して言及した場合、それには哺乳動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）、特に霊長類などの動物を含めた、他の生物種のホモログをコードしている配列も含まれる。特に好ましいポリペプチドには、相同性を有するヒト配列が含まれる。
【０１２８】
この用語には、表１Ｂに特定する核酸にコードされているアミノ酸配列の変異型、ホモログ、または誘導体、そして同様に、このアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異型、ホモログまたは誘導体も包含される。
【０１２９】
本発明の内容において、相同配列は、少なくとも５０または１００アミノ酸、好ましくは２００、３００、４００または５００アミノ酸にわたって、本明細書に開示するポリペプチド配列のいずれか１つに、アミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列を含むものとする。詳細には、相同性は、通常、タンパク質機能に必須であることが知られている配列の領域に関して考慮されるべきであり、それに隣接した必須でない配列に関してではない。このことは、近縁性が疎遠な生物の相同配列を考慮するときに特に重要である。
【０１３０】
相同性は、機能的類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考慮することもできるが、本発明の内容では、相同性を配列同一性に関して計算するのが好ましい。
【０１３１】
相同性比較は、目視によって、また、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。公的にも、商業的にも利用可能なこれらのコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間におけるホモロジーパーセントを計算することができる。
【０１３２】
ホモロジーパーセントは、連続した配列に関して、すなわち、ある配列をもう一方の配列と整列させ、ある配列の各アミノ酸をもう一方の配列の対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ直接比較して計算してもよい。これを「ギャップなし」アライメントという。通常、そのようなギャップなしアライメントは、比較的少ない数の残基（例えば、連続した５０個未満のアミノ酸）においてのみ行われる。
【０１３３】
この方法は極めて単純で、一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一な配列対に挿入または欠失が１回起こると、それ以降のアミノ酸残基がアライメントからはずれてしまい、それによって、全体的なアライメントを行った際に、パーセント相同性の大幅な低下が引き起こされる可能性があることを考慮に入れていない。その結果、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアに過度の減点を加えないで挿入および欠失の可能性を考慮した最適アライメントを生成するように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して、局所的相同性の最大化を試みることによって実現される。
【０１３４】
しかし、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一アミノ酸に対して、可能な限り少ない数のギャップを有する配列アラインメント−比較した２つの配列間の近縁性がより高いことを反映する−が、多数のギャップを有するものより高いスコアとなるように、アライメントに生じた各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。「アフィンギャップコスト」を用いると、通常、ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ内で後に続く各残基に、より小さいペナルティを課す。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティを高くすれば、当然、より少ない数のギャップを有する最適化アライメントが生成されるであろう。ほとんどのアライメントプログラムで、ギャップペナルティの変更が可能である。しかし、配列比較にそのようなソフトウェアを用いる際には、デフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を用いる際には、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップ１つあたり−１２、各伸長あたり−４である。
【０１３５】
したがって、最大ホモロジーパーセントの計算には、まず、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アライメント作成が必要である。そのようなアライメントを実施するのに適したコンピュータプログラムの１つがＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（米国ウィスコンシン大学；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻、３８７頁）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年、同書−第１８章を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ、第２１５巻、４０３〜４１０頁）、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは、両方ともオフライン探索およびオンライン探索に用いることができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年、同書、７〜５８から７〜６０頁）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いるのが好ましい。
【０１３６】
最終のホモロジーパーセントは同一性に関して計算されるが、アライメントの過程自体は、通常、全か無かの対比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール調整された類似性スコアマトリクスが、通常使用される。通常使用されるそのようなマトリクスの例には、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリクスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスがある。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、公開されているデフォルト値か、または、供給されている場合には、カスタムシンボル比較表のどちらかを用いる（より詳細には、ユーザマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージには、公開されているデフォルト値を用い、他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリクスを用いることが好ましい。
【０１３７】
ソフトウェアによって最適アライメントが生成されれば、ホモロジーパーセント、好ましくは配列同一性パーセントを計算することが可能である。ソフトウェアは、通常、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を与える。
【０１３８】
アミノ酸配列に関して、「変異型」または「誘導体」という用語は、その配列から、またはその配列への、１個（または複数個）のアミノ酸のいかなる置換、変異、改変、交換、欠失、または付加も含み、その結果提供されるアミノ酸配列は、改変されていない配列と実質上同一の活性を保有し、好ましくは表１Ｂに特定するポリペプチド、または表１Ｂに特定する核酸配列によってコードされているポリペプチドと同一の活性を有する。
【０１３９】
本明細書において、「実質上同一の活性」という句は、本明細書に記載の配列を有する既知ポリペプチドと比べて、ある変異型ポリペプチドが、同一の反応を触媒すること；同一の反応を阻害すること；上記既知ポリペプチドが特異的に結合する少なくとも１個の分子に、特異的に結合するか、またはその分子がこの変異型ポリペプチドに結合すること；および、同一酵素の基質またはコファクタとして機能することのうち少なくとも１つを示すことを意味する。
【０１４０】
表１Ｂに特定する核酸配列によってコードされているアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片もしくはホモログは、本発明で使用するために改変することができる。通常、導入される改変は、この配列の生物活性を維持するものである。アミノ酸置換は、改変された配列が改変されていない配列の生物活性を保有するならば、例えば、１、２、または３から１０、２０、または３０個の置換を導入することができる。別法として、改変は、本発明のポリペプチドにある１つまたは複数の機能ドメインを不活性化するために導入してもよい。アミノ酸置換には、例えば、治療で投与されるポリペプチドの血漿内半減期を延長するために、天然には存在しないアナログを使用することも含まれうる。
【０１４１】
保存的置換は、例えば、下記の表に従って導入することができる。第２列の同一プロック、そして、好ましくは第３列の同一行に示すアミノ酸が相互に置換されうる。
【０１４２】
2006518590.tif 000002
【０１４３】
上述の通り、本発明での使用に供するポリペプチドには、完全長配列の断片が含まれる。上記断片は、少なくとも１つのエピトープを含むものが好ましい。エピトープを同定する方法は当技術分野で周知である。断片は、通常、少なくとも６つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０、２０、３０、５０、または１００個のアミノ酸を含むであろう。
【０１４４】
タンパク質は、例えば以下に記載するように、組換えによる方法で生成する。しかし、タンパク質は、固相合成法など、当業者に周知の技法を用いた合成手法によって生成してもよい。タンパク質は、例えば、抽出および精製を補助するために、融合タンパク質として生成してもよい。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）、およびβガラクトシダーゼが含まれる。また、融合タンパク質パートナーと、目的のタンパク質配列との間に、タンパク分解性切断部位を含めて、融合タンパク質配列の切除を可能にすると好都合な場合がある。融合タンパク質は、目的のタンパク質配列の機能を妨げないであろうものが好ましい。タンパク質は、動物細胞の細胞抽出物の精製によって取得してもよい。
【０１４５】
アポトーシスタンパク質を含む多量体タンパク質も、本発明に包含されるものとする。「多量体」とは、あるサブユニットタンパク質を２コピー以上含むタンパク質を意味する。このサブユニットタンパク質は、本発明のタンパク質の１つでもよく、例えば、２回以上反復した、本明細書に記載のアポトーシスタンパク質でもよい。そのような多量体は、融合タンパク質またはキメラタンパク質でもよく、例えば、反復したアポトーシスタンパク質を、ポリリンカー配列および／または１つもしくは複数のアポトーシスペプチドに結合してもよい。そして、このアポトーシスペプチドは、単一コピーで存在しても、直列に反復していてもよく、例えば、タンパク質は、その全タンパク質中に２つ以上の多量体を含みうる。
【０１４６】
タンパク質は、実質上単離された形態にあるものでもよい。このタンパク質は、そのタンパク質の本来の目的を妨げないであろう担体または希釈剤と混合されていてもよく、そして、それでも、実質上単離されているものとみなされることを理解されたい。本発明での使用に供するタンパク質は、実質上精製された形態にあってもよく、その場合、それは通常、そのタンパク質を試料中に含み、その試料中のタンパク質の９０％超、例えば、９５％、９８％、または９９％が、本明細書に特定するタンパク質である。
【０１４７】
ポリペプチドは、顕在性標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）で標識してもよい。顕在性標識は、そのポリペプチドの検出を可能にするいかなる適当な標識であってもよい。適当な標識には、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、およびビオチンなどのリンカーが含まれる。本発明の標識ポリペプチドは、試料中における本発明のポリペプチドの量を測定するのに、イムノアッセイなどの診断法で使用できる。本発明のポリペプチドまたは標識ポリペプチドは、標準プロトコールを用いて、動物およびヒトにおける上記ポリペプチドに対する免疫応答性を検出するための血清学的アッセイまたは細胞介在免疫アッセイでも使用できる。
【０１４８】
ポリペプチドもしくは標識ポリペプチド、またはその断片は、固相、例えば、マイクロアレイ、イムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定してもよい。そのような標識および／または固定されたポリペプチドは、適当な試薬、対照、説明書などと共に、適当な容器に入ったキットに包装してもよい。そのようなポリペプチドおよびキットは、ポリペプチド、またはそれらのアレル変異型もしくは種変異型に対する抗体を、イムノアッセイで検出する方法に用いることができる。
【０１４９】
イムノアッセイ法は、当技術分野で周知であり、通常、（ａ）上記タンパク質に対する抗体が結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供すること、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で生物試料を上記ポリペプチドとインキュベートすること、および、（ｃ）上記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されているかどうか判定することを含む。
【０１５０】
イムノアッセイは、ポリペプチドを検出するのに、例えば、タンパク質の発現または機能の変調を検出するのに用いることができる。
【０１５１】
本明細書に特定するポリペプチドは、それらの対応遺伝子およびそのホモログの、疾患におけるそれらの機能を含めた細胞機能における役割を研究するのに、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはＩｎ  ｖｉｖｏの細胞培養系で用いることができる。例えば、細胞で行われる正常機能を破壊するために、切断型または改変ポリペプチドをその細胞に導入することができる。本発明のポリペプチドは、組換え発現ベクターからのポリペプチドを、ｉｎ  ｓｉｔｕ発現させることによって細胞内に導入してもよい（下記参照）。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するための誘導プロモーターを任意選択で保持する。
【０１５２】
昆虫細胞または哺乳類細胞などの適当な宿主細胞を使用することによって、最適生物活性を本発明の組換え発現産物に与えるのに必要でありうる翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質付加、およびチロシン、セリン、またはトレオニンリン酸化）の提供が予測される。本発明のポリペプチドの発現が行われるそのような細胞培養系は、細胞における、本発明のポリペプチドの機能を妨害または促進する候補物質を同定するためのアッセイシステムで用いることができる。
【０１５３】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドまたは核酸には、表１Ｂに特定するポリヌクレオチド、または、表１Ｂに特定する核酸によってコードされているポリペプチドをコードする核酸のいずれか１つまたは複数、およびその断片が含まれる。通常、断片は、完全長ポリヌクレオチドにおける少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、より好ましくは、完全長ポリヌクレオチドにおける少なくとも２０、３０、５０、または１００個の連続したヌクレオチドを含むであろう。そのようなポリペプチドをコードする核酸配列は、遺伝コードを参照することによって、容易に特定できる。さらに、核酸配列からポリペプチド配列への翻訳、および／またはその逆を行うコンピュータプログラムが利用可能である。一核酸、およびそれに対応するポリペプチド配列の開示には、そのポリペプチド配列をコードするすべての核酸（および、それらの配列）の開示が含まれる。
【０１５４】
当業者ならば、遺伝コード縮重の結果として、同一のポリペプチドを、多数の異なったポリヌクレオチドでコードできることを理解するであろう。さらに、当業者ならば、本発明のポリペプチドの発現が行われるいかなる特定の宿主生物でも、そのコドン使用頻度を考慮することによって、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド配列に影響を与えずに、日常的技法を用いてヌクレオチド置換を導入できることを理解されたい。
【０１５５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびゲノムＤＮＡなどの、それらのポリヌクレオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは、通常、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびゲノムＤＮＡなどである。実施例では、これらの核酸配列のアクセッション番号を提供し、それらがコードするポリペプチドは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースを含めたヒト配列データベースなどの関連データベースでそのようなアクセッション番号を使用することによって取得できる。アクセッション番号は、そのようなヒトポリヌクレオチド配列、またはポリペプチド配列を特定するのに使用できる。関連した配列は、ポリペプチド配列を用いて、ＢＬＡＳＴなどの配列データベースを探索することによっても取得できる。詳細には、ＴＢＬＡＳＴＮを用いた探索が利用できる。
【０１５６】
本発明での使用に供する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。それらは、一本鎖でも、二本鎖でもよい。それらは、合成ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なったタイプの修飾が当技術分野で知られている。これらには、メチルホスホン酸エステル骨格、ホスホロチオネート骨格、ならびに分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。本発明では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、当技術分野で利用可能ないかなる方法で修飾してもよいことを理解されたい。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を促進するために行ってもよい。
【０１５７】
本発明での使用に供するヌクレオチド配列に関して、「変異型」、「ホモログ」、または「誘導体」という用語には、その配列からの、あるいはその配列への、１つ（または複数）の核酸のいかなる置換、変異、改変、交換、欠失、または付加も含まれる。上記の変異型、ホモログ、または誘導体は、生物活性を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。
【０１５８】
上述のように、配列相同性に関しては、本明細書の配列リストに示す配列に対して、少なくとも５０％または７５％の相同性を有することが好ましく、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する。ヌクレオチドの相同性比較は上述の通りに行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、上述したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリクスは、各同一ヌクレオチドにつき１０、各ミスマッチにつき−９のマッチ値を有する。デフォルトギャップ生成ペナルティは−５０であり、各ヌクレオチドあたりのデフォルトギャップ伸長ペナルティは−３である。
【０１５９】
本発明は、本明細書に提示する配列、またはそのいかなる変異型、断片、もしくは誘導体、または上記のいずれかに対する相補鎖に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用も包含する。ヌクレオチド配列は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドあるものが好ましく、より好ましくは長さが少なくとも２０、３０、４０、または５０ヌクレオチドである。
【０１６０】
「ハイブリダイズ」という用語には、「核酸の鎖が、塩基対合を介して相補鎖と連結する過程」、および、ポリメラーゼ連鎖反応技法で実行される増幅過程が含まれるものとする。
【０１６１】
本明細書に提示するヌクレオチド配列、またはその相補配列に選択的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドは、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５または３０個、例えば、少なくとも４０、６０、もしくは１００個、またはそれより多くの連続したヌクレオチドの領域にわたって、本明細書に提示する対応ヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、そして、より好ましくは少なくとも９５％または９８％相同である。
【０１６２】
「選択的にハイブリダイズ可能」という用語は、ある核酸が、表１Ｂに特定する配列を有する核酸に、バックグランドを有意に超えたレベルでハイブリダイズすると判っていることを意味する。バックグランドとは、試験核酸と、試料中の非特異的ＤＮＡメンバーとの相互作用によって生成されるシグナルのレベルを意味し、このシグナルは、強度が標的ＤＮＡとの特異的相互作用で観測されるものの１０分の１未満、好ましくは１００分の１未満である。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐで放射標識することによって測定できる。
【０１６３】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７年、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、以下に説明するように特定の「ストリンジェンシー」を与える。ストリンジェンシーの条件は、米国特許第５，９７６，８３８号に記載されており、この教示を参照により全体として本明細書に組み込む。詳細には、高ストリンジェント、ストリンジェント、低減した最小限にストリンジェントな条件の例が、米国特許第５，９７６，８３８号の１５頁の表に提供されている。ハイブリダイゼーション中、およびハイブリダイゼーション後の溶液のストリンジェンシー条件の例が示されており、高ストリンジェントな条件は、最低限、例えばその表の条件Ａ〜Ｆと同程度にストリンジェントな条件であり；ストリンジェントな条件は、最低限、例えばその表の条件Ｇ〜Ｌと同程度にストリンジェントな条件であり；そして、低減ストリンジェンシー条件は、最低限、例えばその表の条件Ｍ〜Ｒと同程度にストリンジェントな条件である。
【０１６４】
最大ストリンジェンシーは、通常、ほぼＴｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で；高ストリンジェンシーは、Ｔｍの５℃から１０℃下；中間ストリンジェンシーは、Ｔｍの１０℃から２０℃下；そして、低ストリンジェンシーは、Ｔｍの２０℃から２５℃下で起こる。当業者ならば理解するであろうが、最大ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一ポリヌクレオチド配列を同定または検出するのに用いることができ、一方、中間（低）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、類似したポリヌクレオチド配列、または近縁のポリヌクレオチド配列を同定または検出するのに用いることができる。
【０１６５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件とは、第１の核酸配列が、第２の核酸配列にハイブリダイズするのを可能にする、温度および緩衝液組成の条件を指し、それらの条件は、相互にハイブリダイズするそれらの配列間の同一性の程度を決定するものである。したがって、「高ストリンジェンシー条件」とは、相互の類似性が非常に高い核酸配列のみがハイブリダイズするであろう条件である。複数の配列が中度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合では、それらの配列相互の類似性は、それほど高くなくてもよい。そして、２つの配列が低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするのに必要な類似性は、それよりもさらに低いものである。ハイブリダイゼーション条件を、ハイブリダイゼーションがまったく起こらないストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観測されるレベルにまで変化させることによって、所与の配列がそれに最も類似した配列にハイブリダイズするであろう条件を決定することができる。特定のハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを決定する正確な条件には、イオン強度、温度、およびホルムアミドなどの不安定化剤の濃度だけが含まれるのではなく、核酸配列の長さ、それらの塩基組成、２つの配列間でミスマッチしている塩基対のパーセント、そして、同一でない他の配列中にある配列サブセット（例えば、反復配列の短い領域）の出現頻度などの因子も含まれる。洗浄は、相互にハイブリダイズする配列間にある類似性の最低レベルを決定するために、条件の設定が行われるステップである。通常、任意の選択されたＳＳＣ濃度において、２つの配列間でミスマッチが１％あるごとに、融解温度（Ｔｍ）が、相同的なハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から１℃低下する。通常、ＳＳＣの濃度を倍にするごとに、Ｔｍが約１７℃上昇する。これらのガイドラインを用いて、所望のミスマッチレベルに応じて、洗浄温度を経験的に決定することができる。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、Current Protocols in Molecular Biology（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年、および補足的アップデート）２．１０．１から２．１０．１６頁、および６．３．１から６．３．６頁に説明されている。
【０１６６】
高ストリンジェンシー条件は、（１）１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ３−クエン酸・２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、６５℃、（２）１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１リットルあたり１３４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ  ８５％  Ｈ３ＰＯ４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに調整）、１０％デキストラン硫酸、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、６５℃、または、（６）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ、サケ精子変性ＤＮＡ、４２℃のいずれかの条件でのハイブリダイゼーションを用いることができ、（１）０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、または、（２）１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃のいずれかの条件での高ストリンジェンシー洗浄を伴う。上記の条件は、５０塩基対またはさらに長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いることが意図されている。ハイブリットの長さが、１８塩基対未満であると考えられる場合には、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度を、計算されたハイブリットのＴｍより、５〜１０℃低くするべきである。この場合、Ｔｍ＝（２×塩基ＡおよびＴの数）＋（４×塩基ＧおよびＣの数）℃と計算される。長さが約１８から約４９塩基対であると考えられるハイブリットは、Ｔｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）℃と計算され、式中、「Ｍ」は一価陽イオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度、「Ｌ」はハイブリットの長さを塩基対で表したものである。
【０１６７】
中度ストリンジェンシー条件は、（１）４×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ３−クエン酸・２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、６５℃、（２）４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１リットルあたり１３４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ３ＰＯ４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに調整）、１０％デキストラン硫酸、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ、サケ精子変性ＤＮＡ、４２℃のいずれかの条件でのハイブリダイゼーションを用いることができ、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での中度ストリンジェンシー洗浄を伴う。上記の条件は、５０塩基対またはさらに長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いることが意図されている。ハイブリットの長さが、１８塩基対未満であると考えられる場合には、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度を、計算されたハイブリットのＴｍより、５〜１０℃低くするべきである。この場合、Ｔｍ＝（２×塩基ＡおよびＴの数）＋（４×塩基ＧおよびＣの数）℃と計算される。長さが約１８から約４９塩基対であると考えられるハイブリットは、Ｔｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）℃と計算され、式中、「Ｍ」は一価陽イオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度、「Ｌ」はハイブリットの長さを塩基対で表したものである。
【０１６８】
低ストリンジェンシー条件は、（１）４×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ３−クエン酸・２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、５０℃、（２）６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、４０℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１リットルあたり１３４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ３ＰＯ４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、５０℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００×＝１０ｇフィコール４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに調整）、１０％デキストラン硫酸、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、４０℃、（５）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌサケ精子変性ＤＮＡ、５０℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ、サケ精子変性ＤＮＡ、４０℃のいずれかの条件でのハイブリダイゼーションを用いることができ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、または、（２）０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳのいずれかの条件での低ストリンジェンシー洗浄を伴う。上記の条件は、５０塩基対またはさらに長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに用いることが意図されている。ハイブリットの長さが、１８塩基対未満であると考えられる場合には、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度を、計算されたハイブリットのＴｍより、５〜１０℃低くするべきである、この場合、Ｔｍ＝（２×塩基ＡおよびＴの数）＋（４×塩基ＧおよびＣの数）℃と計算される。長さが約１８から約４９塩基対であると考えられるハイブリットは、Ｔｍ＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）℃と計算され、式中、「Ｍ」は一価陽イオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度、「Ｌ」はハイブリットの長さを塩基対で表したものである。
【０１６９】
好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３−クエン酸、ｐＨ７．０））下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用を包含する。
【０１７０】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、本発明は、この二本鎖分子の両鎖、およびそれらの個別または組合せでの使用を包含する。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、本発明は、このポリヌクレオチドの相補配列の使用も包含することを理解されたい。
【０１７１】
表１Ｂの配列に対して１００％の相同性をもたないが、その使用が本発明に包含されるポリヌクレオチドを、多くの方法で得ることができる。本明細書に記載の配列の他の変異型は、例えば、様々な個体、例えば異なった集団の個体から作製したＤＮＡライブラリーのプロービングを行うことによって取得されうる。加えて、他のウイルス／細菌ホモログ、または細胞性ホモログ、特に哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、および霊長類細胞）で発見された細胞性ホモログが取得されうる。そして、そのようなホモログおよびその断片は、通常、表１Ｂに特定する配列に選択的にハイブリダイズできるであろう。そのような配列は、表１Ｂのいずれの一配列でも、その配列の全体または一部を含むプローブを用いて、他の動物種から作製したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーのこのようなライブラリーを、中度から、高ストリンジェンシーな条件下でプロービングすることによって取得されうる。他の霊長類／哺乳類ホモログまたはアレル変異型を同定するには、表１Ｂのヌクレオチド配列、または表１Ｂ第３列に特定するヒトタンパク質をコードするヌクレオチド配列が好ましくは使用されうる。
【０１７２】
変異型および細胞株／種ホモログも、縮重ＰＣＲを用いて取得されうる。そのような縮重ＰＣＲでは、表１Ｂの配列の変異型およびホモログの中にある配列を標的とするように設計されたプライマーが用いられるであろう。例えば、いくつかの変異型／ホモログのアミノ酸配列を整列させることによって、保存配列を予測することができる。当技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いることによって、配列アラインメントを行うことができる。例えばＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広範囲に用いられている。
【０１７３】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１箇所または複数の縮重位置を含有し、既知の配列に対して単一配列のプライマーを用いて配列をクローニングする際に用いられるものより低いストリンジェンシー条件で使用されるであろう。当業者ならば理解するであろうが、近縁性が疎遠な生物の配列間にある全体的ヌクレオチド相同性は、非常に低い傾向があり、したがって、そのような状況では、標識された断片でライブラリーをスクリーニングするよりも、縮重ＰＣＲを行うことが選択すべき方法となりうる。
【０１７４】
加えて、相同配列は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートなどの探索アルゴリズムを用いて、ヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを探索することによっても同定されうる。
【０１７５】
別法として、そのようなポリヌクレオチドは、特徴付けされている配列の部位特異的突然変異によっても取得されうる。これは例えば、コドン使用頻度を、そのポリヌクレオチド配列の発現が行われる特定の宿主細胞に最適化するために、サイレントなコドン変更がその配列に必要である場合に有用でありうる。制限酵素認識部位を導入するために、または、そのポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの性質または機能を変化させるために、他の配列改変が望まれる場合もある。例えば、調節機能を失った変異遺伝子を生成する核酸配列にある特定のコーディング変化を実現するために、さらに別の改変が望まれる場合もある。そのような改変に基づくプローブは、そのような変異体を検出するための診断用プローブとして用いることができる。
【０１７６】
ポリヌクレオチドは、プライマー、例えばＰＣＲプライマーや他の増幅反応用のプライマー、プローブ、例えば放射性または非放射性の標識を用いた従来の方法によって顕在性標識で標識されたプローブを生成するのに用いてもよく、また、ポリヌクレオチドはベクターにクローニングしてもよい。そのようなプライマー、プローブ、および他の断片は、長さが少なくとも８、９、１０、または１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５、３０、または４０ヌクレオチドであり、本明細書では、これらも、ポリヌクレオチドという用語に包含される。
【０１７７】
本発明での使用に供するＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換え、合成、または当業者に利用可能ないかなる方法によって生成してもよい。それらは、標準的な技法によってもクローニングされうる。本発明は、アポトーシスタンパク質をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物、例えば、アポトーシスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、およびそのようなベクターを含有する宿主細胞も包含する。「宿主細胞」とは、ベクターによって導入される核酸の受容細胞として使用されている、あるいは使用できる細胞を意味する。宿主細胞は、原核でも、真核でも、哺乳類でも、植物でも、昆虫でもよく、また、単一細胞として、または、収集物として、例えば、培養として、組織培養中に、組織または生物中に存在することができる。宿主細胞は、多細胞生物、例えば哺乳動物の正常または疾患組織から得ることもできる。本明細書では、宿主細胞は、核酸によって形質転換された元々の細胞だけではなく、その核酸を依然として含有している、そのような細胞の子孫も含まれるものとする。外因性ポリヌクレオチドは、非挿入型（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ベクター、例えば、プラスミドとして維持されてもよく、あるいは、宿主ゲノムに挿入されてもよい。ベクターは、調節配列、例えばそのポリヌクレオチドの発現を可能にする配列を含有することもできる。
【０１７８】
通常、プライマーは、所望の核酸配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階的に生成する合成手法で生成されるであろう。自動化法を用いてこれを実行する技法は、当技術分野で容易に利用可能である。
【０１７９】
より長いポリヌクレオチドは、通常、組換えによる方法を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて生成されるであろう。これは、クローニングが望まれている脂質ターゲッティング配列の領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５から３０ヌクレオチド）を生成すること、このプライマーを、動物またはヒト細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅された断片を単離すること（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することによって）、および、増幅されたＤＮＡを回収することを含むものである。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローニングができるように、適当な制限酵素認識部位を含有するように設計してもよい。
【０１８０】
本発明での使用に供するポリヌクレオチドまたはプライマーは、顕在性標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）を保持しうる。適当な標識には、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位元素、酵素標識、またはビオチンなどの他のタンパク質標識が含まれる。そのような標識は、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーに付加してもよく、そして、当業者に周知の技法を用いることによって検出してもよい。
【０１８１】
本発明での使用に供するポリヌクレオチドもしくはプライマー、またはその断片は、標識されて、または無標識で、ヒトまたは動物の体内にある本発明のポリヌクレオチドを検出または配列決定する、核酸ベースの試験で当業者により使用することができる。
【０１８２】
通常、そのような検出試験は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生物試料を、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させること、および、プローブと試料中の核酸との間で形成されたいかなる二本鎖分子も検出することを含む。そのような検出は、ＰＣＲなどの技法を用いることによって、または、プローブを固形担体に固定し、プローブとハイブリダイズしなかった核酸を試料から除去し、その後、プローブにハイブリダイズした核酸を検出することによって実現できる。別法として、試料核酸を固形担体に固定してもよく、そのようなサポートに結合したプローブの量を検出することもできる。このフォーマット、または他のフォーマットによる適当なアッセイ方法は、例えば、国際公開ＷＯ８９／０３８９１、およびＷＯ９０／１３６６７に見ることができる。
【０１８３】
本発明での使用に供するヌクレオチドを配列決定するための試験は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含む生物試料を、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させること、および、例えばサンガージデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）で配列を決定することを含む。
【０１８４】
通常、そのような方法は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な鎖を合成することによって、適当な試薬の存在下でプライマーを伸長させ、伸長反応を、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕ残基のうち１つまたは複数で選択的に終結させること；鎖伸長反応、および停止反応を行わせること；伸長産物をサイズによって分離して、選択的終結が起こったヌクレオチドの配列を決定することを含む。適当な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、緩衝液、ならびにＡＴＰが含まれる。ジデオキシヌクレオチドは選択的な終結に用いられる。
【０１８５】
生物試料中にある表１Ｂに特定するヌクレオチドを検出または配列決定するための試験は、改変された遺伝子配列を有するか、または有している疑いがある個体の細胞内、例えば、白血病細胞、ならびに、乳腺、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、脳、筋、および骨の腫瘍などの固形腫瘍を含めた癌細胞内における特定の配列の存在を判定するのに使用できる。炎症性疾患を患う患者から得た細胞も、同様に検査できる。
【０１８６】
加えて、実施例に記載する遺伝子の同定によって、遺伝病におけるこれらの遺伝子の役割が調べられるようになるであろう。一般的には、これは、例えば新生物を有する動物またはヒトから得られた細胞における、これらの遺伝子の状態を確立する（例えば、ＰＣＲ配列分析を用いて）ことを含むであろう。
【０１８７】
本発明での使用に供するプローブは、試験キットの形態で適当な容器に包装するのが好都合でありうる。そのようなキットにおいて、そのキットがそのために設計されているアッセイフォーマットで、プローブが固形担体に結合している必要がある場合には、プローブを固形担体に結合させてもよい。キットは、プロービングされる試料を処理するため、そして、試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせるための適当な試薬、対照試薬、および説明書なども含有しうる。
【０１８８】
相同性探索
配列相同性（または同一性）は、例えばデフォルトパラメータを用いて、いかなる適当な相同性アルゴリズムも用いて決定してもよい。
【０１８９】
デフォルト値に設定されたパラメータを用い、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用するのが有利である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、米国政府（「．ｇｏｖ」）、国立衛生研究所（「ｎｉｈ」）、全米バイオテクノロジー情報センター（「．ｎｃｂｉ」）のワールドワイドウェブサイト（「ｗｗｗ」）、「／Ｂｌａｓｔ／」ディレクトリ、「ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ」ファイル中に詳細に記載されている。以下の通り定義される検索パラメータは、特定のデフォルトパラメータに設定すると有利である。
【０１９０】
ＢＬＡＳＴによって評価を行う場合、「実質上の相同性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは１０以上のＥＸＰＥＣＴ値でマッチする配列に相当する。ＢＬＡＳＴ探索におけるＥＸＰＥＣＴのデフォルト閾値は、通常、１０である。
【０１９１】
ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムによって用いられる発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７（６）巻、２２６４〜８頁の統計的手法にいくつかの改良を加えたものを用いて（上述のように、「ｂｌａｓｔ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ」を参照）、それらの探索結果の有意性を計算する。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性探索用に、例えばクエリー配列のホモログを同定するのに合わせて作られている。モチーフスタイルの探索には、このプログラムは、必ずしも有用ではない。配列データベースの類似性探索における基本的問題の考察に関しては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４年）を参照されたい。
【０１９２】
配列比較は、上述したＮＣＢＩワールドワイドウェブサイト、「／ＢＬＡＳＴ」ディレクトリに提供されている単純なＢＬＡＳＴ探索アルゴリズムを用いて行うのが最も好ましい。
【０１９３】
アポトーシス関連ポリペプチドの調製
本発明によるアポトーシス関連ポリペプチドは、化学合成、生物試料からの単離、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸の発現を含めたいかなる望ましい技法でも生成することができる。そして、核酸は、合成するか、またはアポトーシス関連タンパク質の生物性の供給源から単離することができる。
【０１９４】
したがって、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードするベクター、またはその断片に関する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、または、レトロウイルスベクターでありうる。
【０１９５】
本発明による核酸は、宿主内で増殖するための選択的マーカーを含有するベクターの一部でありうる。通常、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿などの沈殿中で、または荷電脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、適当なパッケージング細胞系を用いて、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングし、その後宿主細胞内に導入することができる。
【０１９６】
核酸インサートは、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲプロモーターなどの適当なプロモーターに作用可能に連結される。他の適当なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物は、転写開始部位および終止部位、ならびに、転写された領域に、翻訳用リボソーム結合部位をさらに含有する。構築物によって発現された転写産物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを、終結部に適切に配置された終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含むことが好ましい。
【０１９７】
指摘したように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択的マーカーを含むことが好ましい。そのようなマーカーには、真核細胞培養用には、ジヒドロ葉酸リダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性が、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）および他の細菌培養用には、テトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。適切な宿主の代表例には、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ボウメラノーマ細胞などの動物細胞；および植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１９８】
適当な培地および上述した宿主細胞用の条件は、当技術分野で公知であり、また、市販されている。
【０１９９】
細菌で使用するのに好ましいベクターには、ＱＩＡＧＥＮ社販売のｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社販売のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社販売のｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社販売のｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ、およびｐＳＧ；ならびに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社販売のｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬである。酵母システムで使用するのに好ましい発現ベクターには、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤｌ、ｐＴＥＦｌ／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓｌ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９ＫおよびＰＡ０８１５（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから購入可能）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２００】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、および他の方法で行うことができる。このような方法は、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらなど、多くの標準的実験マニュアルに記載されている。
【０２０１】
本発明によるポリペプチドは、組換え細胞培養から、硫安もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法によって、回収および精製することができる。精製には、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を用いるのが最も好ましい。
【０２０２】
本発明によるポリペプチドは、体液、組織、および細胞、特に対象の腫瘍組織または腫瘍の疑いがある組織に由来する細胞を含めた生物性の供給源からも回収できる。
【０２０３】
さらに、本発明によるポリペプチドは、当技術分野で公知の技法を用いて化学合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、および、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第３１０巻、１０５〜１１１頁（１９８４年）を参照）。例えば、アポトーシス関連タンパク質の断片に対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。
【０２０４】
抗体
本発明は、表１Ｂに特定する核酸によってコードされたポリペプチド、またはその断片に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を提供する。抗体産生の方法は当業者に周知である。ポリクローナル抗体が望ましい場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、あるポリペプチドのエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫処理する。免疫処理された動物から得た血清を、公知の方法に従って収集し、処理する。当技術分野で公知の様々なアジュバントを用いて抗体産生を促進させることができる（さらに詳細には、例えば、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．編集、１９９９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（例えば、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）を参照のこと）。あるポリペプチドのエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する抗体も含有する場合、免疫アフィニティークロマトグラフィーでポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生し、処理する技法は当技術分野で公知である。より大きな免疫原性反応を生成するためには、ポリペプチドまたはその断片を、動物またはヒトで免疫原として使用される別のポリペプチドにハプテン結合させる（ｈａｐｔｅｎｉｓｅ）ことができる。
【０２０５】
抗体を単離するには、例えば、硫安による沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性物質に対する透析、選択性膜を通した濾過、または同様の方法によって、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンを濃縮することができる。必要および／または希望に応じて、通例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、および／または（イムノ）アフィニティークロマトグラフィー、例えば、標的抗原またはプロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製する。
【０２０６】
本発明の実施に有用な抗体は、ポリクローナルであってもよいが、好ましい抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、培養の連続細胞系で抗体分子の産生を提供するいかなる技法を用いても調製および単離することができる。産生および単離の技法には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、第２５６巻、４９５〜４９７頁）によって最初に記載されたハイブリドーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、第４巻、７２頁；Ｃｏｔｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８０巻、２０２６〜２０３０頁）；および、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０７】
別法として、一本鎖抗体産生用に記載された技法（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、目的のアポトーシス関連タンパク質に対する一本鎖抗体を産生するために適合させることができる。本発明を実施するのに有用な抗体ベースの薬剤には、限定されるものではないが、完全な抗体分子のペプシン消化によって生成できるＦ（ａｂ’）２、および、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって生成できるＦａｂフラグメントを含めた抗体フラグメントも含まれる。別法として、目的のアポトーシス関連タンパク質に対して望ましい特異性を有するフラグメントの迅速な同定を可能にするために、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築することもできる（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５〜１２８１頁参照）。
【０２０８】
モノクローナル抗体および抗体フラグメントを産生および単離する技法は、当技術分野で周知であり、加えて、他の文献、中でもＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Antibodies: A Laboratory Manual、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、およびＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。ヒト化抗体および抗体フラグメントも、Ｖａｕｇｈｎ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、第１６巻、５３５〜５３９頁、およびその中の引用文献に記載のものなど、公知の技法に従って調製することができ、そのような抗体またはそのフラグメントも、本発明を実施するのに有用である。
【０２０９】
代替技法の１つは、ファージディスプレーライブラリーのスクリーニングを行うものであり、この場合例えば、ファージは、それらのコート表面に、大きな多様性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）をもつｓｃＦｖフラグメントを発現する。この技法は当技術分野で周知である。
【０２１０】
表１Ｂに特定する核酸でコードされているポリペプチドのエピトープに対して産生された抗体は、モノクローナルのものも、ポリクローナルのものも両方、診断において特に有用であり、中和抗体は受動免疫治療に有用である。詳細には、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を産生させるのに用いてもよい。抗イディオタイプ抗体は、防御が望まれている薬剤の抗原の「内部イメージ」を保持する免疫グロブリンである。
【０２１１】
抗イディオタイプ抗体を産生する技法は、当技術分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体も治療において有用でありうる。
【０２１２】
本発明では、「抗体」という用語は、逆のことが指定されない限り、標的抗原に対する結合活性を保有する、抗体全体のフラグメントも含む。そのようなフラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えば、欧州特許出願公開第２３９４００号に記載されるように、ヒト化抗体であってもよい。
【０２１３】
抗体は、（ａ）本発明の抗体を提供すること；（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、生物試料を上記抗体とインキュベートすること；および、（ｃ）上記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されているかどうか判定することを含む方法によって、生物試料中における、本明細書に特定するアポトーシス関連ポリペプチドを検出するのに使用できる。
【０２１４】
適当な試料には、脳、乳腺、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋、および骨組織などの組織、または、そのような組織に由来する新生組織成長からの抽出物が含まれる。
【０２１５】
アポトーシスタンパク質に特異的に結合する抗体は、体液または組織中のアポトーシスタンパク質を検出または定量するための当業者に周知の診断方法および診断用キットで用いることができる。これらの試験からの結果は、癌および他のアポトーシス媒介性疾患の発症または再発を診断または予測するのに用いることができる。
【０２１６】
本発明は、アポトーシスタンパク質、これらのタンパク質に対する抗体、ならびにこれらのタンパク質および／またはこれらの抗体を含む組成物の、増殖性活性を特徴とする疾患の診断または予後診断における使用を含む。本明細書において、「予後診断の方法」という用語は、疾患、特にアポトーシス依存的な疾患を診断されたヒトまたは動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。本明細書において、「診断方法」という用語は、ヒトまたは動物の中または表面におけるアポトーシス依存的な疾患の存在またはタイプの判定を可能にする方法を意味する。
【０２１７】
アポトーシスタンパク質は、これらのタンパク質に結合できる抗体を検出し、定量化する診断方法および診断キットで用いることができる。これらのキットは、アポトーシスタンパク質に対する循環抗体の検出を可能にするであろう。これは、例えば、疾患細胞のアポトーシスが促進されていることを示すものである。
【０２１８】
本発明における使用に供する抗体は、固形担体に結合させてもよく、かつ／または、適当な試薬、コントロール、および説明書などと共に適当な容器に入ったキットに包装してもよい。
【０２１９】
診断用組成物に使用する場合、抗体は、抗体を検出する手段を併せて提供することが好ましく、そのような手段は、酵素によるもの、蛍光によるもの、放射性同位元素によるもの、または他の手段でありうる。抗体およびその検出手段は、診断用に意図された診断キットで、同時使用、別々に行う同時使用、または、逐次使用するように提供することができる。
【０２２０】
本発明の抗体の免疫特異性結合は、当技術分野で公知のいかなる方法でも、アッセイすることができる。使用できるイムノアッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫検定法、免疫沈降反応アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫法、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いた競合的アッセイシステムおよび非競争的なアッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイは、当技術分野で日常的に行われるものである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照、この文献をその全体において参照により本明細書に組み込む）。以下に、例示的なイムノアッセイを簡潔に記載する。
【０２２１】
通常、免疫沈降反応プロトコールは、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）が補足されているＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム、１％トラジロール）などの溶解緩衝液で細胞集団を溶解すること、目的の抗体を細胞溶解液に添加すること、４℃で一定時間（例えば、１〜４時間）インキュベートすること、タンパク質Ａおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解液に添加すること、４℃で約１時間以上インキュベートすること、溶解緩衝液でビーズを洗浄すること、およびＳＤＳ／試料緩衝液でビーズを再懸濁することを含む。目的の抗体が、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価できる。
【０２２２】
通常、ウェスタンブロット分析は、タンパク質試料を調製すること、ポリアクリルアミドゲル中でのタンパク質試料の電気泳働（抗原の分子量に応じて、例えば８％から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行うこと、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロンなどの膜に転写すること、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは無脂乳を含有するＰＢＳ）で膜のブロッキングを行うこと、洗浄用緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈された一次抗体（目的の抗体）で膜のブロッキングを行うこと、洗浄用緩衝液で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合された二次抗体（一次抗体を認識する抗体、例えば、抗ヒト抗体）で膜のブロッキングを行うこと、洗浄緩衝液で膜を洗浄すること、および抗原の存在を検出することを含む。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製すること、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングすること、酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合された目的の抗体をウェルに添加して、しばらくインキュベートすること、および、抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、目的の抗体を検出可能な化合物に結合する必要はなく、代わりに、検出可能な化合物に結合された二次抗体（目的の抗体を認識する抗体）をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、ウェルを抗体でコーティングすることもできる。この場合、目的の抗原をコーティングされたウェルに添加した後に、検出可能な化合物に結合された二次抗体を添加することができる。
【０２２４】
抗原に対する抗体の結合親和性と、抗体−抗原相互作用の解離速度は、競合結合アッセイで測定することができる。競合結合アッセイの一例が、量がしだいに増加される無標識抗原の存在下で、目的の抗体と標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）とのインキュベーションを行うこと、および標識抗原に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する、目的の抗体の親和性および結合解離速度は、スキャッチャードプロット分析によって、データから決定できる。二次抗体との競合に関しても、ラジオイムノアッセイを用いて測定できる。この場合、しだいに量が増加される無標識の二次抗体の存在下で、抗原を、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合された、目的の抗体とインキュベートする。
【０２２５】
アポトーシス関連タンパク質と相互作用するタンパク質を検出する方法
相互作用するタンパク質を同定するのに有用な技法の１つは、上述の通り免疫沈降反応である。
【０２２６】
相互作用するタンパク質を同定するのに有用な、別の技法には、例えば、Ｂａｒｔｅｌら（編集）、Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）（ＩＳＢＮ：０１９５１０９３８４）に記載の酵母２ハイブリッドシステムがある。この開示を参照により本明細書に組み込む。
【０２２７】
タンパク質相互作用は、タンパク質アレイを用いても分析できる。タンパク質アレイは、様々な異なった技法で作製できるが、それらの技法によって、タンパク質を異なった密度で平らな平面に沈着させることができる。ＤＮＡアレイ（下記参照）に関して記載されたものと同様の自動化法を用いて、高密度のタンパク質アレイは生成することができる。アポトーシス関連タンパク質と相互作用するタンパク質は、例えば、発現アレイのプロービングにアポトーシス関連タンパク質を用いることによって同定されうる。陽性の相互作用は、その後、例えば、標識抗体の存在によって、または、アポトーシス関連タンパク質に配置されたタグによって検出されるかもしれない。相互作用するタンパク質の正体は、質量分析などの技法で判定することができる。
【０２２８】
遺伝子発現の測定
遺伝子発現のレベルは、多くの異なった技法を用いて測定されうる。
【０２２９】
ａ）ＲＮＡレベルでの測定
遺伝子発現は、ＲＮＡレベルで検出することができる。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、またはＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）の使用を含めたＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出できる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いた典型的なアッセイフォーマットには、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＲＮアーゼプロテクションアッセイが含まれる（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１２巻、７０３５頁）。利用できる検出方法には、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、および他の適当な標識が含まれる。
【０２３０】
通常、ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ標的を増幅するのに用いられる。この過程では、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、次に、それを増幅して、検出を容易することができる。
【０２３１】
多数のＤＮＡ増幅法が公知であるが、その大部分は、酵素連鎖反応に依存するもの（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または自己持続型配列複製など）か、または、そのＤＮＡがクローニングされているベクター全体またはその一部の複製によるものである。
【０２３２】
多数の標的増幅法およびシグナル増幅法が文献に記載されており、例えば、これらの方法の全般的総説には、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、２２９〜２３７頁（１９８８年）、およびＬｅｗｉｓ，Ｒ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、第１０（１）巻、５４〜５５頁（１９９０年）がある。
【０２３３】
ＰＣＲは、中でも、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲは、診断上の内容におけるいかなる既知の核酸を増幅するのにも使用できる（Ｍｏｋら、（１９９４年）、Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第５２巻、２４７〜２５２頁）。自己持続型配列複製（３ＳＲ）は、ＴＡＳの変形形態であり、酵素カクテルおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される、逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ、およびヌクレアーゼ活性の逐次ラウンドを介して核酸テンプレートの等温増幅を行うものである（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、１８７４頁）。ライゲーション増幅反応またはライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼと、標的鎖あたり２本の４本のオリゴヌクレオチドを用いる。この技法は、ＷｕとＤ．Ｙ．およびＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．、（１９８９年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４巻、５６０頁に記載されている。Ｑβレプリカーゼ技法は、Ｌｉｚａｒｄｉら（１９８８年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、１１９７頁に記載されているように、一本鎖ＲＮＡを複製する、バクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを用いて標的ＤＮＡを増幅する。
【０２３４】
本発明では、別の増幅技術も利用することができる。例えば、ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら（１９９８年）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、第１９巻、２２５頁）は、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動される市販の増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））であるが、等温条件下において、線形または幾何級数的速度式で環状のオリゴヌクレオチドプローブを複製することができる。さらに別の技法である鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒら（１９９２年）、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、第８０巻、３９２頁）は、特定の標的に特有な特別に特定した配列で開始する。
【０２３５】
様々な増幅技法での使用に適したプライマーは、当技術分野で公知の方法に従って調製できる。
【０２３６】
ひとたび核酸が増幅されれば、多くの技法がＤＮＡの定量に、したがって、存在するＲＮＡ転写物の定量に利用可能である。利用可能な検出方法には、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、および他の適当な標識が含まれる。
【０２３７】
本発明の内容では、アポトーシス関連タンパク質をコードする核酸の検出は、細胞の初期アポトーシスを特定するのに使用できる。
【０２３８】
ｂ）ポリペプチドレベルでの測定
遺伝子発現は、アポトーシス関連ポリペプチドを測定することによって検出してもよい。これは、アポトーシス関連ポリペプチドに結合する分子を用いることによって実現されうる。アポトーシス関連タンパク質の存在を検出するために、このタンパク質に直接的または間接的に結合する適当な分子／薬剤には、ペプチドおよびタンパク質、例えば抗体など、天然に存在する分子が含まれ、あるいは、それらは合成分子であってもよい。
【０２３９】
上述した免疫ブロッティングなどの標準的な実験室技法を用いて、同じ細胞集団における処理されていない細胞と比較することによって、アポトーシス関連タンパク質のレベルが変化しているかどうか検出することができる。
【０２４０】
遺伝子発現は、ポリペプチドの翻訳後過程か、または核酸の転写後修飾の変化を検出することによっても測定されうる。例えば、ポリペプチドの示差的リン酸化、ポリペプチドの切断、またはＲＮＡの選択的スプライシング、および同様のものが測定されうる。ポリペプチドなどの遺伝子産物の発現のレベルは、それらの翻訳後修飾と同様、専用のタンパク質アッセイか、または２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの技法を用いて検出されうる。
【０２４１】
アポトーシス発生のモニタリング
アポトーシスの発生をモニターするための多数の方法が、当技術分野で知られている。これらには、形態分析、ＤＮＡラダー形成、細胞周期分析、膜リン脂質ホスファチジルセリンの外在化、およびカスパーゼ放射化分析が含まれる。細胞生存は、細胞周期分析、および細胞生存度測定を含めた、多くの技法でモニターできる。細胞増殖の測定は、プラークアッセイを含めた多くの技法を用いて行える。プラークアッセイでは、付着細胞を組織培養プレートにプレーティングし、増殖させた後、固定して染色する。形成されたコロニーの数が、細胞増殖の量を反映する。
【０２４２】
アポトーシスタンパク質の機能的活性の改変
アポトーシスタンパク質の機能的活性は、アポトーシスタンパク質、または、それをコードする核酸に直接的または間接的に結合する適当な分子／薬剤によって改変されうる。薬剤は、ペプチドおよびタンパク質、例えば抗体などの天然に存在する分子でもよく、また、それらは合成分子でもよい。アポトーシスタンパク質の発現レベルを変調する方法には、例えば、アンチセンス技法の使用が含まれる。
【０２４３】
したがって、本発明での使用に供する被験薬剤または候補薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づいたものでありうる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内で、目的のアポトーシス関連タンパク質のｍＲＮＡの翻訳を、それに結合することによって直接阻止し、それによって、タンパク質翻訳を阻止するか、またはｍＲＮＡの分解を増強し、それによって、目的のアポトーシス関連タンパク質のレベルを低下させ、それによって、その活性も低下させる効果があると考えられる。例えば、目的のアポトーシス関連タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物配列の特有の領域に相補的で、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のリン酸ジエステル法によって合成することができる。配列が既知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に抑制するアンチセンス技法の使用方法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号、および第５，９８１，７３２号を参照）。
【０２４４】
適当なアンチセンス分子は、これらの分子に基づいて、化学的に修飾された変異型でありうる。例えば、アンチセンス核酸は、修飾され、しばしばヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチド間結合を含むものが有用となりうる。Ｈａｒｔｍａｎｎら（編集）、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ｌａｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９年）（ＩＳＢＮ：０７９２３８５３９Ｘ）；Ｓｔｅｉｎら（編集）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｌｉｓｓ（１９９８年）（ＩＳＢＮ：０４７１１７２７９０）；Ｃｈａｄｗｉｃｋら（編集）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｎｏ．  ２０９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ  Ｌｔｄ（１９９７年）（ＩＳＢＮ：０４７１９７２７９７）を参照のこと。
【０２４５】
他の修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’連結を有するボラノリン酸、２’−５’連結されたこれらのアナログ、および極性を逆にしたものであり、ここで、隣接した対のヌクレオシドユニットは、３’−５’から５’−３’へ、２’−５’から５’−２’に連結されている。
【０２４６】
アンチセンス使用に供する、他のリン原子を含有しない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間連結、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルの混合ヌクレオチド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオチド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、モルフィリノの連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミンおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルファンアミド骨格；アミド骨格；ならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の混合構成部分を有する他の骨格を有するものが含まれる。
【０２４７】
遺伝子発現を変調する他の方法は、当業者に公知であり、ドミナントネガティブアプローチと、遺伝子発現または機能的活性を抑制するペプチドまたは小分子の導入とが含まれる。
【０２４８】
小分子抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明での使用に供する被験薬剤として機能しうる。目的のアポトーシス関連タンパク質の遺伝子発現は、腫瘍、対象、または細胞を、小さい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小さい二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターまたは構築物と接触させ、それによって、目的のアポトーシス関連タンパク質の発現を特異的に抑制すること（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）によって低減できる。配列が既知である遺伝子に適したｄｓＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｉ，Ｔ．ら（１９９９年）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、第１３（２４）巻、３１９１〜３１９７頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４９４〜４９８頁；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ、第４１８巻、２４４〜２５１頁；ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３巻、７３７〜７４頁；Ｂｒｅｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら（２００２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９６巻、５５０〜５５３頁；米国特許第６，５７３，０９９号；国際公開ＷＯ０１／３６６４６；ＷＯ９９／３２６１９；米国特許第６，５０６，５５９号；国際公開ＷＯ０１／６８８３６を参照）。
【０２４９】
リボザイムも、本発明での使用に供する被験薬剤として機能しうる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイズと、それに続くヌクレオチド鎖切断とが関与するものである。目的のアポトーシス関連タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する、構築されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、それにより、本発明の範囲において有用である。いかなる潜在的ＲＮＡ標的でも、その中にある特定のリボザイム切断部位は、まず、標的分子にリボザイム切断部位があるかどうかスキャンすることによって同定する。リボザイム切断部位は、通常、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含む。ひとたび同定されれば、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する約１５から２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、２次構造など、そのオリゴヌクレオチド配列を不適当なものにしうる予測される構造特性に関して評価することができる。標的候補の適性は、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズに関するそれらのアクセシビリティを、例えば、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイで試験することによっても評価できる。
【０２５０】
被験薬剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、両方とも、公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホラマダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）化学合成による化学合成法が含まれる。別法として、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写で生成することもできる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターに組み入れることができる。細胞内での安定性および半減期を増大させる方法として、本発明のオリゴヌクレオチドに様々な改変を導入することができる。可能な改変には、分子の５’および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を付加すること、または、ホスホロチオエートもしくはオリゴヌクレオチド骨格中のホスホジエステラーゼ連結の代わりに２’−Ｏ−メチルを使用することが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２５１】
さらに、アポトーシス関連タンパク質の発現によってその転写が調節される遺伝子の発現など、アポトーシス関連タンパク質のすぐ下流で起こるイベントの変化は、問題の分子がそのようなタンパク質の機能的活性に影響を与えることの指標として用いることができる。
【０２５２】
細胞内でのアポトーシス関連タンパク質の発現
アポトーシス関連タンパク質は、アポトーシス関連ポリペプチドをコードするベクターを導入することによって、細胞内で発現されうる。
【０２５３】
本発明では、挿入された異種核酸からポリペプチドの発現を引き起こすベクター（「発現ベクター」）が特に有用である。これらはしばしば、タンパク質をコードする異種核酸インサートに作用可能に連結した他の様々な遺伝エレメント、典型的には、プロモーターおよびエンハンサーエレメントなど、転写を引き起こす遺伝エレメント、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルなど、ＲＮＡプロセシングを促進するエレメント、および、リボソームコンセンサス配列など、翻訳を促進するエレメントを含むであろう。当業者によって認識されるように、これらのベクターからのポリペプチドの発現を可能にする条件は、ベクターのタイプと、選択された細胞発現系とに依存するであろう。
【０２５４】
タンパク質を発現するためのベクターとしては、原核細胞、酵母細胞、通常、S. cerevisiae、および哺乳類細胞で発現を行うものが知られており、それぞれ、特定の細胞型で発現を行うための特定の遺伝エレメントを含有する。
【０２５５】
ベクターによって行われるタンパク質発現は、構成的なものでも、誘導性のものでもよい。誘導性ベクターには、ｌａｃオペロンによって調節されるｔｒｃプロモーター、トリプトファンによって調節されるｐＬプロモーター、およびデキサメサゾンによって誘導されるＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターなど、天然に誘導性のプロモーターが含まれ、また、これらは合成プロモーターおよび／または隣接するプロモーターに誘導性を付与する追加エレメントを含有することもできる。
【０２５６】
ベクターおよび核酸を宿主細胞内に導入する方法は、当技術分野で周知のものであり、技法の選択は、主として導入される特定のベクターと、選択された宿主細胞とによるであろう。プラスミドベクターは、通常、細菌の化学的コンピテント細胞、またはエレクトロコンピテント細菌細胞に導入されるであろう。酵母細胞へのベクターの導入は、リチウム塩によるスフェロプラスト処理、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合法で行うことができる。哺乳類細胞および昆虫細胞は、パッケージングされたウイルスベクターを直接感染させるか、あるいは脂質による方法、化学的方法、または電気的方法でトランスフェクションすることができる。
【０２５７】
発現ベクターは、精製および／または可視化を容易にする小タンパク質タグに、発現されたポリペプチドが融合されるように設計することができる。
【０２５８】
例えば、タンパク質は、融合タンパク質の精製を容易にするタグを付けて発現させることができる。適当なタグおよびそれらの精製方法は公知であり、これには、ポリ−Ｈｉｓ／固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／グルタチオン親和性樹脂、Ｘｐｒｅｓｓエピトープ／抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体で検出可能（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ｍｙｃタグ／抗ｍｙｃタグ抗体、Ｖ５エピトープ／抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ／抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が含まれる。
【０２５９】
発現されたタンパク質が分泌されるように、リーダーペプチドなどの分泌シグナルをコードする適当な配列をベクターに含ませることができる。異種核酸インサートによってコードされているタンパク質が、精製および／または識別タグより大きなポリペプチドに融合されるように発現ベクターを設計することもできる。有用なタンパク質融合体には、コードされているタンパク質をファージまたは細胞の表面にデイスプレイできるようにするもの、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）様の発色団を有するものなど、内因的に蛍光を発するタンパク質への融合、ＩｇＧ  Ｆｃ領域への融合、および２ハイブリッドシステムで使用するための融合が含まれる。
【０２６０】
アポトーシス関連タンパク質は、アポトーシス関連タンパク質と相互作用する分子を検出する方法で使用するためのシステムなど、システムから発現および精製することができる。
【０２６１】
標的タンパク質の阻害剤を同定するための上記方法または過程で使用する生化学分析ツールおよび方法論は当技術分野で周知である。例えば、ＧＰＣＲ受容体タンパク質の場合、本発明のヒトアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質などの標的タンパク質の遺伝子がひとたびクローニングされれば、それを受容細胞内に導入し、その後、その表面に標的タンパク質を発現させる。この細胞は標的ヒト受容体サブタイプの単一集合を発現するが、この細胞を増殖させて、細胞系を確立する。この細胞系は薬物発見システムを構成し、２種の異なったタイプのアッセイ、すなわち結合アッセイおよび機能アッセイで用いられる。結合アッセイでは、特定の薬物発見プログラムの標的である受容体サブタイプと、副作用に関連するかもしれない他の受容体サブタイプとに対する化合物の親和性を測定する。これらの測定は、化合物の効力と、他の受容体サブタイプをよりわけて、化合物が標的受容体サブタイプに対して有する選択性の度合いとを予測できるようにする。結合アッセイから得られたデータは、化学者が、最適の治療効率が得られるように、化合物を必要に応じて、１つまたは複数の関連したサブタイプに似せて、または相違させて設計するのを可能にするものでもある。機能アッセイでは、化合物に対する受容体サブタイプの反応特性が測定される。機能アッセイから得られたデータは、化合物の作用が、受容体サブタイプの活性を阻害するのか、あるいは促進するのかを示し、それによって、薬理学者が、彼らの最終的なヒト受容体サブタイプ標的に関して、化合物を迅速に評価できるようにして、化学者が、より効果的で、既存の薬物より重度の副作用が少ないか、実質上少ないであろう薬物を合理的に設計できるようにする。
【０２６２】
受容体サブタイプ選択的な化合物を設計および合成するアプローチは周知であり、これには、伝統的な医薬品化学と、より新しいコンビナトリアル化学の技術とが含まれるが、これらは両方とも、コンピュータを利用した分子モデリングを補助とする。そのようなアプローチによって、化学者および薬理学者は、標的受容体サブタイプと、この受容体サブタイプに結合すること、および／またはその活性化を活性化または阻害することが判明した化合物との構造に関する知見を用いて、これらの受容体サブタイプに対する活性を有するであろう構造を設計および合成する。
【０２６３】
コンビナトリアル化学は、様々な新規化合物を、化学的構成要素の異なった組合せを用いて組み立てることによって自動合成するものである。コンビナトリアル化学の使用によって、化合物を生成する過程が大きく加速された。この結果得られる化合物のアレイをライブラリーと呼び、目的の受容体に対して十分な活性レベルを示す化合物（「リード化合物」）を得るためのスクリーニングをするのに用いられる。コンビナトリアル化学を用いて、目的の受容体標的に大きく偏向していることが予期される化合物の「集中的な」ライブラリーが合成可能である。
【０２６４】
コンビナトリアル化学もしくは伝統的医薬品化学を用いて、または他の方法によって、ひとたびリード化合物が同定されたならば、様々なホモログやアナログを調製して、化学構造と、生物学的または機能的活性との関係の理解を促進させる。このような研究は、構造活性相関を明らかにし、これはその後、効力、選択性、薬物動態特性が改善された薬物を設計するのに用いられる。コンビナトリアル化学は、リード化合物の最適化（ｌｅａｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）のための様々な構造を生成するのにも用いられる。伝統的医薬品化学は一度に一化合物の合成を行うものであるが、これも、また、一層のリファインメントをはかるために、そして、自動化法では生成できない化合物を生成するために用いられる。ひとたび、そのような薬物が規定されれば、製薬工業および化学工業のいたるところで利用されている標準的な化学製造法を用いて生産を拡大する。
【０２６５】
したがって、本発明の一態様では、Ｇタンパク質結合のリードアウト（ｒｅａｄｏｕｔ）を測定することによって、本発明のアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質の活性をモニターすることができる。例えば、そのようなリードアウトは、電気生理学的な方法を用いてＧタンパク質によって調節されるＣａ２＋またはＫ＋チャネルの活性を測定することによって、または、蛍光色素を用いて細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによってモニターすることができる。受容体活性をモニターするのに通常使用できる他の方法には、ＧＴＰγＳまたはｃＡＭＰのレベルまたは活性を測定するものがある。
【０２６６】
アポトーシス関連タンパク質と相互作用する分子の検出
アポトーシス関連タンパク質と直接相互作用する分子を検出するには、分析用遠心、クロマトグラフィーまたは電気泳働を用いた親和性結合分析などの技法を用いることができる。このリストが到底、網羅的でないことは、当業者には理解されよう。より詳細には、アポトーシス関連タンパク質は、検出可能な標識でこれを標識し、それを、電気泳働ゲルでアポトーシス産物を検出するプローブとして用いることによって；アポトーシス関連タンパク質標的を標識し、それを、遺伝子および／またはｃＤＮＡのライブラリーをプロービングするのに用いることによって；アポトーシス関連タンパク質標的を標識し、それを、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをプロービングするのに用いて、標的に結合できるタンパク質を合成するクローンを見つけることによって；ＵＶ架橋実験を行って、標的に結合できる薬剤を同定することによって；アポトーシス関連タンパク質をゲルリターデイションアッセイで用いて、それが、同定した薬剤をコードする核酸に結合する能力を検出することによって；フットプリント分析を行って、核酸の中で、標的が結合する領域を同定することによって、これに結合する薬剤を同定するためのアフィニティーリガンドとして用いることができる。当業者ならば他の適当な技法も認識し、このリストは、網羅的であることが意図されていないと理解するであろう。
【０２６７】
タンパク質間相互作用の同定を可能にする他の技法には、上述の通り、酵母２ハイブリット法、および免疫沈降反応が含まれる。
【０２６８】
酵母アッセイは、本発明のアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質または変異型ポリペプチドの活性を変調する薬剤を得るためのスクリーニングに使用されうる。典型的な酵母アッセイでは、本発明のアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質または変異型ポリペプチドを、複数のレポーター遺伝子を含有する改変された酵母株で、異種的に（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）発現する。この複数のレポーター遺伝子は、典型的にはＦＵＳ１ｐ−ＨＩＳ−３およびＦＵＳ１ｐ−ｌａｃＺであり、それぞれ内在性ＭＡＰＫカスケードベースのシグナル伝達経路に連結されている。この経路は、通常フェロモン受容体に連結されているが、酵母Ｇタンパク質を酵母／哺乳類Ｇタンパク質キメラで置換することによって、外来受容体と連結されうる。酵母株は、アッセイを強化するために、ＳＳＴ２欠失およびＦＡＲ１欠失など、さらに別の遺伝子欠損を含有してもよい。異種受容体のリガンド活性化は、例えば、ヒスチジン不在下での細胞増殖として、またはβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の適当な基質を用いてモニターできる。そのような技術は当技術分野で周知である。例えば、国際公開ＷＯ９９／１４３４４、ＷＯ００／１２７０４、または米国特許第６，１００，０４２号を参照されたい。
【０２６９】
別法として、メラニン細胞アッセイを、本発明のアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質の変調因子を得るためのスクリーニングに用いてもよい。アポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質を、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）メラニン細胞で異種的に発現することができ、それらの活性化または抑制は、メラノソームの分散または凝集によって測定することができる。基本的に、メラノソーム分散は、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化、すなわち、それぞれ、Ｇｓ媒介性およびＧｑ媒介性のシグナル伝達で促進され、一方、凝集は、アデニル酸シクラーゼの阻害を引き起こすＧｉタンパク質活性化の結果として起こるものである。したがって、異種受容体のリガンド活性化は、単純に、細胞を通過した光透過率の変化を測定することによって、または細胞応答を映像化することによって測定できる。
【０２７０】
観測された反応が、アポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質の変調による結果であるかどうか確証するために、本発明のアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質を発現しない細胞を用いて、対照実験を行うのが好ましい。
【０２７１】
タンパク質相互作用は、タンパク質アレイを用いて分析することもできる。タンパク質アレイは、様々な異なった技法で作製できるが、それらの技法によって、タンパク質を異なった密度で平らな平面に沈着させることができる。ＤＮＡアレイ（下記参照）に関して記載されたのと同様の自動化法を用いて、高密度のタンパク質アレイは生成することができる。アポトーシス関連タンパク質と相互作用するタンパク質は、例えば、発現アレイのプロービングにこれらのタンパク質を用いることによって同定されうる。陽性の相互作用は、その後、例えば、標識抗体の存在によって、または、アポトーシス関連タンパク質に配置されたタグによって検出されるかもしれない。相互作用するタンパク質のアイデンティティは、質量分析などの技法で判定することができる。
【０２７２】
細胞
本発明の方法で有用な細胞は、いかなる供給源、例えば、初代培養、樹立細胞系、器官培養、またはｉｎ  ｖｉｖｏに由来するものでもよい。本発明で有用な細胞系には、造血系由来の細胞および細胞系が含まれる。適当な細胞には、ＨｅＬａ、Ｕ９３７（単核細胞）、ＴＦ１、ＨＥＫ２９３（Ｔ）、好中球または好中球の特性を有する細胞の初代培養、例えば、ＨＬ６０細胞、マウスＦＤＣＰ−１、ＦＤＣＰｍｉｘ、３Ｔ３、初代またはヒト幹細胞が含まれる。
【０２７３】
全体的遺伝子発現の測定
細胞における組換えアポトーシス関連タンパク質の発現は、本明細書に記載のいかなるものを含めた発現系を用いても誘導できる。
【０２７４】
アポトーシス関連タンパク質に関連した遺伝子の発現レベルを測定することによって、アポトーシスにおける役割を演じている他の既知遺伝子または新規遺伝子の同定が可能となるであろう。
【０２７５】
遺伝子活性の調節は、多くのレベルで行われうる。最も一般的には、転写レベルで調節が行われる。特定の転写因子によって、標的遺伝子のサブセットの発現が変調される。転写後調節（翻訳調節）は、細胞内のＲＮＡプロセシングの速度および機構、すなわち、蓄積、翻訳、および分解によって決定されている。それに続く、タンパク質レベルでの遺伝子活性の調節は、翻訳後修飾を介して行われる。
【０２７６】
本発明では、その発現または機能がアポトーシス関連タンパク質遺伝子発現に関連する多数の個別の遺伝子産物タイプに関して、スクリーニングが行われうる。これらの産物には、ポリペプチドおよび核酸が含まれる。評価される発現レベルは、特定のポリペプチドまたは核酸の生成に関する絶対レベルでも、または、任意のポリペプチドまたは核酸の派生物の生成レベルでもよい。例えば、本発明は、特定のｍＲＮＡスプライス変異型の発現レベル、または、特定のポリペプチドのリン酸化誘導体の存在する量を測定するように構成してもよい。
【０２７７】
既知遺伝子産物の発現レベルをモニターするのが望ましい場合には、核酸ハイブリダイゼーション分析、および活性ベースのタンパク質アッセイを含めた従来のアッセイ技法を用いてもよい。核酸およびポリペプチドを定量するためのキットは市販されている。
【０２７８】
しかし、モニターされる遺伝子産物が未知である場合には、その発現が測定されている遺伝子産物の同定を促進する方法が用いられる。例えば、遺伝子産物が核酸である場合、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて、細胞から得られたｍＲＮＡ集団をスクリーニングする基礎とすることができる。
【０２７９】
ａ）アレイ
ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースに記録された遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドの遺伝子アレイが、多数の供給業者（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＵＳＡなど）から市販されている。そのような市販アレイの例として、膜フィルタ（ニトロセルロースなど）または固形担体（ガラスなど）のいずれかの表面にヌクレオチドをスポッティングした形態のものがある。好中球および他の細胞型のアポトーシス過程に関連した遺伝子の発現パターンプロフィールを得るのに、市販の遺伝子アレイが用いられる。
【０２８０】
遺伝子アレイを、新規のライブラリーから生成されたｃＤＮＡクローン、または購入したｃＤＮＡクローンから得られたヌクレオチド配列をスポッティングすることによって追加構築することもできる。そのようなアレイは、専売（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）および／または新規のヌクレオチド配列の発現プロフィールの取得を可能にする。
【０２８１】
遺伝子アレイは、商業的供給源（例えば、Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）によっても、新規のライブラリーから生成されたｃＤＮＡクローン、または購入したｃＤＮＡクローンから得られたヌクレオチド配列をスポッティングすることによって追加構築される。そのようなアレイは、専売（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）および／または新規のヌクレオチド配列の発現プロフィールの取得を可能にする。
【０２８２】
公共ドメインデータベースに記録されたｃＤＮＡ配列またはＥＳＴ（発現遺伝子配列断片）配列の多くは、肝臓、脳、および胎児組織など、限定されたセットの組織タイプに由来するものである。ＲＯＳ媒介性アポトーシスなどの特定の細胞イベントに焦点を合わせた自家製ｃＤＮＡライブラリーのクローニングは、この過程に関連した新規の遺伝子類を同定、クローニング、特徴付けする可能性を提供する。同様に、好中球などの特定の組織タイプに焦点を合わせた自家製ｃＤＮＡライブラリーのクローニングは、その発現がこの細胞型に限定されている新規の遺伝子を同定、クローニング、特徴付けする可能性を提供する。ＣｌｏｎＴｅｃｈ社の「Ｓｅｌｅｃｔ」ＳＳＨ（抑制ハイブリダイゼーション）法、およびその新規な変形形態など、物理的サブトラクションを用いて構築されたライブラリー（ｃＤＮＡ）は、記載の通り、研究される過程または細胞型でその発現が示差的に調節されている遺伝子の選択的クローニングを可能にする。遺伝子アレイ技術は、擬陽性のものを同定するためにＳＳＨ  ｃＤＮＡライブラリーと併用され、真に示差的に発現された遺伝子にさらに焦点を合わせる。構築されたＳＳＨライブラリーのそれぞれから得たクローンは、採取し、培養して、グリセロールストックとして保存する。個々のプラスミドクローン中に含有されるｃＤＮＡインサートは、ＰＣＲ増幅して、自家製アレイにスポッティングする。示差的発現は、各相互サブトラクションに用いたｍＲＮＡから生成された放射線標識プローブとのハイブリダイゼーションを用いて確認する。
【０２８３】
核酸のアレイは、核酸分子の直接的化学合成によって調製してもよい。化学合成では、識別可能な核酸（例えば、特有の核酸配列）のそれぞれが、アレイにおける別個の所定位置に配置されるような方法で表面に核酸アレイを合成する。各核酸のアイデンティティは、アレイの空間位置によって判定される。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号；国際公開ＷＯ９０／１５０７０、およびＷＯ９２／１００９２；Ｆｏｄｏｒら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻、７６７ページ；ＤｏｗｅｒおよびＦｏｄｏｒ（１９９１年）、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第２６巻、２７１ページに記載されているものから適合させてもよい。
【０２８４】
本発明の好ましい態様では、核酸アレイが核酸分子のグリッディング（ｇｒｉｄｄｉｎｇ）によって調製されうる。ロボット技術は、核酸分子の最も正確で濃縮されたグリッディングを可能にするため、ロボットによるピッキングによってオリゴヌクレオチドを整列させるのが有利であろう。しかし、手動の技法も含めた、担体上の別個の位置にある分子の場所を見つけるのに適したいかなる技法も、利用されうる。
【０２８５】
グリッディングは、各コロニーが次のコロニーから、所与の距離にあるように規則的でもよく、またはランダムでもよい。分子間の距離がランダムに決められる場合、それらの分子の密度は、選択された支持体上で重なりあう確率が、統計的に、減少または消失するように調整することができる。
【０２８６】
核酸マイクロアレイを作製する装置は市販されており、例えばＧｅｎｅｔｉｘ社およびＧｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入できる。さらに、あらかじめ調製された核酸分子アレイが市販されており、例えばＩｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社（Ｈｕｍａｎ  ＬｉｆｅＧｒｉｄ（商標））から購入できる。そのようなアレイは、通常、ある細胞または生物で発現した遺伝子の大部分またはすべてを代表するＥＳＴ（発現遺伝子配列断片）を含むであろう。したがって、それによって、複数のＲＯＳ処理された細胞から得られるｍＲＮＡ集合をスクリーニングするプラットフォームが提供される。
【０２８７】
ｍＲＮＡ集団解析用の試料は、いかなる適当なｍＲＮＡ生成方法で単離し、精製してもよい。例えば、ＲＮＡ単離キットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入できる。
【０２８８】
さらに、遺伝子産物がポリペプチドである場合には、細胞から得られたポリペプチド集合をスクリーニングする基礎として、抗体アレイを用いてもよい。タンパク質アレイおよび抗体アレイの例は、参照により本明細書に組み込まれている、Proteomics: A Trends Guide、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、２０００年７月に示されている。
【０２８９】
本発明の内容では、アレイ技術は、例えば、本明細書に特定するアポトーシスタンパク質のうち、１つまたは複数の発現を分析する際に用いることもできる。一実施形態では、本明細書に特定されている多数のアポトーシスタンパク質に対する候補化合物の効果を同時にアッセイするのに、アレイ技術が用いられることがある。したがって、本発明の別の態様は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくともいくつかの、表１に特定する核酸、もしくはその断片を含むマイクロアレイ、またはタンパク質アレイもしくは抗体アレイを提供する。
【０２９０】
ｂ）２Ｄ  ＰＡＧＥ
未知のポリペプチド遺伝子産物をモニターするには、２次元ゲル電気泳働などの分離技法が用いられる。通常、２Ｄ  ＰＡＧＥでは、試料の調製、固定化ｐＨ勾配における第１次元の電気泳働、第２次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳働、および、試料の検出が行われる。２Ｄ  ＰＡＧＥのプロトコールは当技術分野で広範に、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｈ２ｄ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／で利用可能であり、２００１年１１月３０日現在におけるその内容を参照により本明細書に組み込む。
【０２９１】
２Ｄ  ＰＡＧＥ用の試料は、従来の技法で調製してもよい。本発明の場合には、アポトーシス関連タンパク質でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ  １６４０などの適当な培地で成長させる。懸濁液をチューブに移し、細胞を１０００ｇで５分間遠心する。上清を廃棄し、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０で細胞を洗浄する。遠心して、ＲＰＭＩ  １６４０を除去した後、０．８×１０６の細胞を、尿素（８Ｍ）、ＣＨＡＰＳ（４％  ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｓ（４０ｍＭ）、ＤＴＥ（６５ｍＭ）、およびごく少量のブロムフェノールブルーを含有する溶液６０μｌと混合し、溶解させる。最終希釈されたＨｅＬａ試料全体を１次元目の分離に添加する。
【０２９２】
本発明の方法では、調査される遺伝子産物の参照発現レベルを確定するステップを用いるのが有利である。これは、トランスフェクションされていないＨｅＬａ細胞を用いて、後続する１つまたは複数のアッセイの標準物質として利用することによって実行でき、あるいは、これをすべてのアッセイに一体化されている部分としてもよい。例えば、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞と、トランスフェクションされていないＨｅＬａ細胞とから得たｍＲＮＡまたはポリペプチド集合を、同時に核酸アレイまたは２Ｄ  ＰＡＧＥによって評価し、発現パターンの変化を直接的な比較で同定してもよい。
【０２９３】
２Ｄ  ＰＡＧＥ結果の分析は、必要に応じて適切なソフトウェアを用いて行われ、目的のポリペプチドの存在を明らかにする。これらのポリペプチドは、単離、配列決定され、さらに、それらをコードする遺伝子を同定するために使用されうる。
【０２９４】
アッセイ
本発明は、本発明のポリペプチドに結合し、かつ、例えば、カスパーゼの活性化、ＤＮＡ断片化、細胞の収縮および断片化、原形質膜でのリン脂質の曝露などを特徴とするアポトーシスの進行に影響を与える物質を同定するのに適したアッセイを提供する。加えて、ＧＰＣＲ、および、ＰＩ３キナーゼを含めたプロテインキナーゼの変調因子を同定するのに適したアッセイも組み込まれている。
【０２９５】
通常、これらのアポトーシスの特徴のうち１つまたは複数を阻害する物質は、５００ｍＭ以下の濃度で、そのタンパク質活性を完全に阻害するか、または、対照と比較して有意（すなわち、５０％超）な低下を導くものである。この阻害は、対照と比較して７５％の阻害であることが好ましく、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％または１００％の阻害である。これらのアポトーシスの特徴のうち１つまたは複数を促進または増大させる物質は、５００ｍＭ以下の濃度で、対照と比較して、タンパク質活性の有意（すなわち、５０％超）な増大を導くものである。この増大は、対照と比較して７５％の増大であることが好ましく、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％または１００％の増大である。
【０２９６】
さらに、アッセイは、本発明のポリペプチドの結合を阻止する物質を同定するのにも使用できる。この結合は、適切な場合には、アポトーシス機構の構成成分に対する結合である。通常、そのようなアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。予備的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで同定された候補物質が、全細胞アッセイにおける無傷細胞に与える効果を試験するアッセイも提供する。以下に記載するアッセイ、または当技術分野で公知のいかなる適当なアッセイも、これらの物質を同定するのに用いることができる。
【０２９７】
したがって、以下に詳細に記載するように、本発明の一態様によって、発明者らは、以下に記載するアッセイ、すなわち、アポトーシスアッセイ、キナーゼアッセイ、キナーゼ阻害剤アッセイ、ＧＰＣＲアッセイ、および全細胞アッセイのうち任意のものよって同定された１つまたは複数の物質を提供する。
【０２９８】
変調因子スクリーニングアッセイ
アポトーシスを誘導する方法は、当技術分野で周知であり、これには、限定をもうけずに、化学療法薬または放射線療法薬への曝露と、適切な場合には、絶対生存因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＮＧＦ）の排除とが含まれる。処理された細胞と、処理されていない細胞との相違が試験化合物に起因する効果を示す。
【０２９９】
骨髄細胞は培養中、自発的に死亡するが、そのタイムコースには、細胞型に応じた相違がある。培養中の好中球は、２４時間以内にアポトーシスを行うが、これは生存因子の存在下では、４８時間超にまで遅延されうる。好酸球アポトーシスは、４８時間超に観測され、生存因子の存在下では、数日にまで遅延される。マクロファージは、通常はるかに長い間生存する。したがって、骨髄細胞アポトーシスを変調する化合物の効力は、試験化合物の存在下または不在下で、そして適切な場合には、絶対生存因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−５、Ｇ−ＣＳＦ、またはＢＡＬ）の排除を行った後に、アポトーシスの速度をモニターすることによって評価することができる。処理された細胞と、処理されていない細胞との相違が試験化合物に起因する効果を示す。
【０３００】
阻害活性、活性化活性、または変調活性を有する化合物、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそれらのホモログおよびミメティックは、アポトーシスタンパク質活性および／または発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、同定することができる。変調因子スクリーニングは、推定上の変調因子試験化合物を組織または細胞試料に添加し、アポトーシスタンパク質の機能および／または発現に対する試験化合物の効果をモニターすることによって行うことができる。試験化合物が添加されない平行試料も対照としてモニターされる。処理された細胞および処理されていない細胞は、その後、限定されるものではないが、顕微鏡分析、生存度試験、複製能力、組織学的検査、特定のＲＮＡまたは細胞に関連したポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解液で発現された酵素活性レベル、および、他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力を含めた、任意の適当な表現型判定基準によって比較される。
【０３０１】
本発明のポリペプチドとの相互作用の結果としてアポトーシスを阻害する物質は、いくつかの方法によってそれを行いうる。例えば、その物質が、ＰＩ３ＫまたはＧＰＣＲシグナル伝達経路を阻害する場合、それは、例えば、このポリペプチドに結合して、他の構成要素との相互作用の部位を遮蔽または改変することによって、シグナル伝達経路の構成要素に対する本発明のポリペプチドの結合を直接的に破壊しているかもしれない。ＰＩ３ＫまたはＧＰＣＲシグナル伝達経路を阻害する物質は、リン酸化を阻害することによって、それを行うかもしれないし、またはタンパク質の脱リン酸化が関与しているかもしれない。このタイプの候補物質は、例えば、以下に記載するようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって予備的にスクリーニングし、その後、例えば、以下に記載するような全細胞アッセイで試験するのが好都合な場合がある。候補物質の例には、本発明のポリペプチドを認識する抗体が含まれる。
【０３０２】
本発明のポリペプチドに直接結合できる物質は、このポリペプチドの細胞内局在性を変化させ、それによって、それが正常な基質と相互作用する能力を変化させることによって、このポリペプチドのアポトーシスにおける機能も阻害しうる。そのような物質は、このポリペプチドに直接結合することによって、または、別の構成要素と、このポリペプチドとの相互作用を間接的に破壊することによって、その細胞内局在性を変化させうる。
【０３０３】
これらの物質は、例えば以下に記載する全細胞アッセイを用いて試験されうる。本発明のポリペプチドの非機能的ホモログは、このタンパク質の正常な機能を行使することが不能であるが、アポトーシス機構の構成要素に対する結合において、野生型タンパク質と競合するか、または、アポトーシス機構に結合したタンパク質の機能を妨害する可能性があるため、このようなホモログも、アポトーシスの阻害に関して試験されうる。そのような非機能的ホモログには、天然に存在する変異体、および改変された配列またはその断片が含まれうる。
【０３０４】
別の可能性として、この物質は、構成要素の会合を直接的に阻止するのではなく、本発明のポリペプチドの生物学的に利用可能な量を抑制するのかもしれない。これは、構成要素の発現を、例えば、転写、転写産物の安定性、翻訳、または翻訳後の安定性のレベルで抑制することによってなされうる。そのような物質の例としては、アンチセンスＲＮＡまたは二本鎖干渉ＲＮＡ配列が挙げられるであろう。これらは、ｍＲＮＡ生合成の量を抑制するものである。
【０３０５】
適当な候補物質にはペプチド、特に、実施例に記載するポリペプチド配列に基づいた、大きさが約５から３０アミノ酸または約１０から２５アミノ酸のペプチド、または１つまたは複数の残基が置換されている、そのようなペプチドの変異型が含まれる。ランダム配列、すなわち、最大限に多様化されたペプチドパネルを提供するためにむらなく変化させられた配列を含むペプチドパネルからのペプチドも使用されうる。
【０３０６】
適当な候補物質には、本発明のポリペプチドに特異的な抗体産物（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ならびにＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））も含まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチドおよびペプチドミメティック、特定の化学的実体、オリゴヌクレオチド、ならびに天然物ライブラリーも、アポトーシス機構に対する本発明のポリペプチドの結合の阻害剤としての活性に関してスクリーニングされうる。候補物質は、初期スクリーニングでは、例えば一反応あたり１０物質のバッチで使用し、阻害を示すバッチの物質を個別に試験してもよい。以下に記載するものなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングで活性を示す候補物質は、次に、哺乳類細胞などの全細胞システムで試験できる。この場合、哺乳類細胞は阻害剤に曝露され、アポトーシスのいずれの段階でも、阻害があるかどうか試験されるであろう。
【０３０７】
上記アッセイでテストすることができる他の適当な被験物質または候補物質には、コンビナトリアルライブラリー、特定の化学的実体、ペプチドおよびペプチドミメティック、オリゴヌクレオチド、天然物ライブラリー、デイスプレイ（例えば、ファージディスプレーライブラリー）、および抗体産物が含まれる。アッセイは、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンドまたは活性物質の存在下で行ってもよい。被験物質は、初期スクリーニングでは、例えば一反応あたり１０物質のバッチで使用し、阻害または活性化を示すこれらのバッチの物質を個別に試験してもよい。被験物質は、濃度１ｎＭから１０００μＭ、好ましくは１μＭから１００μＭ、より好ましくは１μＭから１０μＭで使用されうる。
【０３０８】
本発明のアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質を発現する細胞は、機能アッセイを用いた、リガンドを得るためのスクリーニングに使用できる。同じアッセイは、リガンドの存在下または不在下で、様々な治療目的に利用されうるアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに使用できる。ＧＰＣＲの過剰発現によって、細胞内シグナル伝達経路の構成的活性化が起こりうることは、当業者によく知られている。同様にして、上述したいずれの細胞系でアポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質を過剰発現させても、以下に記載する機能的反応の活性化をもたらすことができ、本明細書に記載するいずれのアッセイも、アポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質のアゴニストリガンドおよびアンタゴニストリガンドの両方を得るためのスクリーニングに使用できる。
【０３０９】
アポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質の変調因子を得るためのスクリーニングには、広範な機能アッセイを利用することができる。これらのアッセイは、例えば、総イノシトールリン酸蓄積、ｃＡＭＰ濃度、細胞内カルシウム動員、およびカリウムもしくはナトリウム電流の伝統的な測定から、例えば；これらの同じセカンドメッセンジャーを測定するが、より高いスループットがあって、より汎用であって、より応答性であるように改変または適合されているシステムにまで；そして、受容体活性化から生じる、代謝変動、分化、細胞分裂、または増殖などのより一般的な細胞イベントを報告する細胞ベースのアッセイにまで及ぶ。
【０３１０】
アポトーシス関連タンパク質の阻害剤を同定するための本発明の前述の方法または過程において、これらのタンパク質またはそれらが細胞で変調する生化学経路に作用する検出可能な化合物のタイプには、アンタゴニスト、逆アゴニスト、部分逆アゴニスト、アロステリックまたはアロトピック（ａｌｌｏｔｏｐｉｃ）アンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニスト、およびアロステリックまたはアロトピック（ａｌｌｏｔｏｐｉｃ）アゴニストが含まれる。そのような化合物を検出するためのアッセイは、活性化リガンドまたは他の活性化機構、例えば、活性化タンパク質もしくは因子の結合、または、リン酸化もしくは別の可逆的共有結合修飾機構による改変の存在下または不在下で行うことができる。
【０３１１】
本発明の実施において、本発明のプロテインキナーゼと被験薬剤との相互作用を検出するために、免疫沈降反応、免疫ブロッティング（ウェスタンブロット法）、およびＥＬＩＳＡアッセイを含めた、一般的に使用されるいずれのイムノアッセイ技法を、本発明のプロテインキナーゼアポトーシス関連タンパク質のホスホトランスフェラーゼ活性を定量するのに用いてもよい。一実施形態では、抗キナーゼ抗体を用いて、キナーゼタンパク質を、例えば免疫沈降反応によって単離し、タンパク質の自己リン酸化を評価するために、タンパク質活性の変化を、標識されたアンチホスホアミノ酸抗体を用いることによって、または、ペプチドまたはタンパク質基質に対するタンパク質のホスホトランスフェラーゼ活性によって定量する。別の実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイを用い、最初に、抗キナーゼ抗体を用いてキナーゼを捕捉し、次に第２ステップで、標識されたアンチホスホアミノ酸抗体を用いて自己リン酸化を評価する。
【０３１２】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、特異的結合対は、免疫タイプでも、非免疫タイプでもよい。免疫性特異的結合対は、抗原抗体システムまたは抗ハプテン／ハプテンシステムによって例示される。そのようなものの例には、フルオレセイン／抗フルオレセイン、抗ジニトロフェニル／ジニトロフェニル、ビオチン／抗ビオチン、抗ペプチド／ペプチド、および同様のものが含まれる。特異的結合対の抗体メンバーは、当業者が熟知している通例の方法で生成できる（例えば、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．編集、１９９９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（例えば、ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４４−７）を参照）。そのような方法では、特異的結合対の抗原メンバーを用いた、動物の免疫処理が行われる。特異的結合対の抗原メンバーが、免疫原性でない場合（例えば、ハプテン）、それに免疫原性を付与するため、それを担体タンパク質に共有結合で結合することができる。
【０３１３】
さらに、本発明のアポトーシス関連プロテインキナーゼに関して、そのようなキナーゼにおける活性変化を検出する方法は、特に、精製されたタンパク質、または膜画分中のタンパク質のアッセイが企図されている場合、タンパク質またはペプチドホスホトランスフェラーゼ活性のアッセイであり、このアッセイでは、活性がＰ３２リン酸による自己リン酸化を介してタンパク質中に取り込まれる放射性リンによって、あるいは代替基質タンパク質またはペプチド中に取り込まれる放射性リンによってモニターされる。別法として、多くの非放射性のアッセイフォーマット、例えば、ＥＬＩＳＡ、シンチレーション近接、電気泳動、ビーズベース免疫沈降反応、およびウェスタンブロットが、精製された酵素試料中のキナーゼ活性の評価に利用できる。検出方法には、放射性トレーサ、比色分析基質、または化学発光基質の使用、時間分解蛍光、共鳴伝達（ＦＲＥＴ）、および蛍光偏光が含まれる。これらのアッセイフォーマットの多くは、市販キットとして容易に利用できる。
【０３１４】
ある物質がアポトーシス活性を、阻害、低減、増強、促進、または活性化することが判明している場合、その物質はアポトーシス活性の変調因子として同定される。通常、これらのアポトーシスの特徴のうち１つまたは複数を阻害する物質は、５００ｍＭ以下の濃度で、そのタンパク質活性を完全に阻害するか、または、対照（すなわち、アポトーシスの特徴のうち１つまたは複数を変調しないことが既知の物質）と比較して有意（すなわち、５０％超）な低下を導くものである。この阻害は、対照と比較して７５％の阻害であることが好ましく、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％または１００％の阻害である。この阻害は、アポトーシスを阻止するものでもよく、あるいは、アポトーシスを単純に遅延させるか、または延長するものでもよい。これらのアポトーシスの特徴のうち１つまたは複数を促進または増大させる物質は、５００ｍＭ以下の濃度で、対照と比較して、タンパク質活性の有意（すなわち、５０％超）な増大を導くものである。この増大は、対照と比較して７５％の増大であることが好ましく、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％または１００％の増大である。
【０３１５】
ポリペプチド結合アッセイ
本発明のポリペプチドに結合する物質を同定するアッセイの１タイプは、固形担体上に固定された本発明のポリペプチドを、固定されていない候補物質と接触させること、ならびに、本発明のポリペプチドおよび候補物質が相互に結合するかどうか判定すること、および／または、それがいかなる程度であるか判定すること含む。別法として、候補物質が固定され、本発明のポリペプチドが無固定でもよい。
【０３１６】
アポトーシス関連ポリペプチドに対する物質の結合は、一過性、可逆的、または恒久的でありうる。この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、アポトーシス関連ポリペプチドではないことが既知のポリペプチド）に結合する際のＫｄ値より低いＫｄ値でポリペプチドに結合することが好ましい。この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドに結合する際のＫｄ値より２倍小さいことが好ましく、より好ましくは、Ｋｄ値が対照ポリペプチドに結合する際のＫｄ値より１００倍小さく、最も好ましくは、Ｋｄ値が１０００倍小さい。
【０３１７】
好ましいアッセイ法では、本発明のポリペプチドはアガロースビーズなどのビーズに固定される。通常、これは、構成要素をＧＳＴ融合タンパク質として細菌、酵母、または高等真核細胞系で発現し、グルタチオンアガロースビーズを用いて、粗細胞抽出物からＧＳＴ融合タンパク質を精製することによって実現される（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８年、Ｇｅｎｅ、第６７（１０）巻、３１〜４０頁）。対照として、固定された本発明のポリペプチドに対する、ＧＳＴ融合タンパク質ではない候補物質の結合を、本発明のポリペプチドの不在下で測定する。次に、固定された本発明のポリペプチドに対する候補物質の結合を測定する。このタイプのアッセイは、当技術分野でＧＳＴプルダウンアッセイとして知られている。ここでも、候補物質が固定され、本発明のポリペプチドが無固定でもよい。
【０３１８】
このタイプのアッセイは、構成要素の１つを固定するのに異なった親和性精製システム、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびヒスチジンタグ付きの構成要素を用い実施することもできる。
【０３１９】
候補物質に対する本発明のポリペプチドの結合は、当技術分野で周知の様々な方法で測定されうる。例えば、固定されていない構成要素を標識してもよい（例えば、放射性標識、エピトープ標識、または酵素抗体複合体で）。別法として、免疫学的検出方法で、結合を測定してもよい。例えば、反応混合物のウェスタンブロットを行い、このブロットを、固定されていない構成要素を検出する抗体を用いてプロービングすることができる。ＥＬＩＳＡ法も使用されうる。
【０３２０】
候補物質は、通常、最終濃度１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌまで添加する。抗体の場合、使用される最終濃度は、通常、１００〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０３２１】
他のＩｎ  Ｖｉｔｒｏアッセイ
目的のポリペプチドに結合する物質を同定する他のアッセイも提供する。アポトーシス関連ポリペプチドに対する物質の結合は、一過性、可逆的、または恒久的でありうる。この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、アポトーシス関連ポリペプチドではないことが既知のポリペプチド）に結合する際のＫｄ値より低いＫｄ値でポリペプチドに結合することが好ましい。この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドに結合する際のＫｄ値より２倍小さいことが好ましく、より好ましくは、Ｋｄ値が対照ポリペプチドに結合する際のＫｄ値より１００倍小さく、最も好ましくは、Ｋｄ値が１０００倍小さい。
【０３２２】
キナーゼ活性に影響を与える物質は目的の物質である。
【０３２３】
キナーゼ活性を阻害するか、またはこれに影響を与える物質は、当技術分野で公知のキナーゼアッセイによって、例えば、候補物質の存在下で、適当なペプチドまたは他の基質の中に取り込まれる３２Ｐを測定することによって同定されうる。同様に、タンパク質分解活性を阻害するか、またはこれに影響を与える物質は、適当なポリペプチド基質の切断の増加または減少を検出することによってアッセイされうる。
【０３２４】
これら、および他のタンパク質またはポリペプチド活性のアッセイは当業者に公知であり、目的のポリペプチドに結合し、活性に影響を与える物質の同定に使用するのに適している。
【０３２５】
全細胞アッセイ
アポトーシスに対する候補物質の効果は、全細胞でも試験されうる。候補物質は、上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって同定されたものが好ましい。別法では、予備的スクリーニングとして、アポトーシスを阻害または促進できる物質を得るための迅速なスループットスクリーニングを用い、その後、上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでそれを用いて、その効果が、目的の特定のポリペプチドに対するものであること確認する。
【０３２６】
候補物質、すなわち、試験化合物は、いくつかの方法で細胞に投与されうる。例えば、それは、細胞培地に直接添加してもよく、また、細胞に注入してもよい。別法として、ポリペプチド候補物質の場合、細胞内でポリペプチドの発現を指示する核酸構築物で、細胞にトランスフェクションしてもよい。ポリペプチドの発現は、調節可能なプロモーターの制御下にあることが好ましい。
【０３２７】
通常、本発明の方法で同定された候補物質のアポトーシスに対する効果を測定するアッセイは、候補物質を細胞に投与すること、およびその物質がアポトーシスを阻害するかどうか測定することを含む。細胞集団のアポトーシスを測定する技法は当技術分野で周知である。処理を受けた細胞のアポトーシスの程度は、未処理の対照細胞集団のアポトーシスの程度と比較して、阻害がある場合には、阻害の程度を判定する。例えば、アポトーシスの阻害剤は、ｓｕｂ−Ｇ１集団にある細胞の割合を測定し、これを未処理の集団における細胞の割合と比較することによってアッセイされうる。
【０３２８】
使用される候補物質の濃度は、通常、細胞内での最終濃度がＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに関して上述した濃度と同様となるようなものであろう。
【０３２９】
候補物質は、アポトーシスを生じている細胞の割合が、未処理の対照細胞集団で見られる割合の５０％未満、好ましくは、４０、３０、２０、または１０％未満まで低下した場合、通常、アポトーシスの阻害剤であるとみなされる。
【０３３０】
上記アッセイの内容では、目的のポリペプチドは、表１Ｂに特定する核酸配列の任意のものによってコードされているポリペプチドである。
【０３３１】
アポトーシス関連タンパク質と相互作用する化合物が、腫瘍成長、腫瘍細胞成長、または腫瘍細胞増殖の阻害剤、あるいは腫瘍細胞アポトーシスの活性物質であるかどうか判定する方法は、当技術分野で周知である。
【０３３２】
腫瘍成長に対する化合物の効果は、当業者にとって公知の多くの方法、またはその変法のいずれでもモニターすることができる。例えば、動物モデルで化合物の有効性を試験することができる。その化合物単独、または細胞毒／抗腫瘍薬、および抗血管新生剤などの従来の抗腫瘍薬との併用における有効性は、従来の薬剤単独のものと比較できる。通常、所与の大きさの腫瘍がラットまたはマウスに存在する。マウスを薬剤で処理し、腫瘍の大きさを経時的に測定する。動物の平均生存期間も測定できる。使用されるアポトーシス関連タンパク質の活性を変調する化合物は、試験される動物の受容体に活性に結合しなければならない。異種移植片をそれらの動物体内に移植して、化合物の種特異的阻害能を試験することができる。適当な試験動物には、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４系およびＬｅｗｉｓラットなどの近交系ラット、および無胸腺ＮＣＲ−ＮＵマウスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３３３】
腫瘍細胞成長または腫瘍細胞増殖に対する化合物の効果は、当業者に公知の多数の方法、またはその変法のいずれでもモニターすることができる（例えば、本明細書における方法の項を参照）。
【０３３４】
アポトーシスに対する化合物の効果は、当業者に公知の多数の方法、またはその変法のいずれでもモニターすることができる（例えば、本明細書における方法の項を参照）。アポトーシスアッセイの特定の例は、以下の参考文献にも例示されている。リンパ球アポトーシスのアッセイは以下によって開示される。Ｌｉら（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６８巻、４２９〜４３１頁；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉら（１９９５年）、Ｂｒ  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、第８９巻、２４〜３３頁；Ｍａｒｔｉｎら（１９９４年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５２巻、３３０〜４２頁；Ｔｅｒａｉら（１９９１年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、第８７巻、１７１０〜５頁；Ｄｈｅｉｎら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３７３巻、４３８〜４４１頁；Ｋａｔｓｉｋｉｓら（１９９５年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１８１５巻、２０２９〜２０３６頁；Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｐら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３７５巻、４９７頁；および、ＤｅＲｏｓｓｉら（１９９４年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１９８巻、２３４〜４４頁。繊維芽細胞アポトーシスのアッセイは以下によって開示される。Ｖｏｓｓｂｅｃｋら（１９９５年）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第６１巻、９２〜９７頁；Ｇｏｒｕｐｐｉら（１９９４年）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、１５３７〜４４頁；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（１９９４年）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２００９〜１７頁；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（１９９４年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第１３巻、３２８６〜３２９５頁；および、Ｉｔｏｈら、（１９９３年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、１０９３２〜７頁。神経細胞アポトーシスのアッセイは以下によって開示される。Ｍｅｌｉｎｏら（１９９４年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第１４巻、６５８４〜６５９６頁；Ｒｏｓｅｎｂｌａｕｍら（１９９４年）、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、第３６巻、８６４〜８７０頁；Ｓａｔｏら（１９９４年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、第２５巻、１２２７〜１２３４頁；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９５年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１５１６巻、２８５７〜２８６６頁；Ｔａｌｌｅｙら（１９９５年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第１５８５巻、２３５９〜２３６６頁；Ｔａｌｌｅｙら（１９９５年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、第１５巻、２３５９〜２３６６頁；および、Ｗａｉｋｉｎｓｈａｗら（１９９５年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第９５巻、２４５８〜２４６４頁。昆虫細胞アポトーシスのアッセイは以下によって開示される。Ｃｌｅｍら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５４巻、１３８８〜９０頁；Ｃｒｏｏｋら（１９９３年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、第６７巻、２１６８〜７４頁；Ｒａｂｉｚａｄｅｈら（１９９３年）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、第６１巻、２３１８〜２１頁；Ｂｉｒｎｂａｕｍら（１９９４年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、第６８巻、２５２１〜８、１９９４頁；および、Ｃｌｅｍら（１９９４年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、第１４巻、５２１２〜５２２２頁。
【０３３５】
治療適用
多くの疾患状態が、異常なアポトーシスにおける欠損に関連している。そのような状態には、癌、炎症、自己免疫疾患、および神経変性障害が含まれる。したがって、アポトーシスを変調することは、そのような疾患を治療するための治療アプローチの１つでありうる。そのようなアプローチは、全般的に、いかなる増殖性疾患の治療にも使用されうる。したがって、本発明のポリペプチドは、正常なアポトーシスに必要であると判明したため、特に腫瘍細胞および炎症細胞を含めた疾患細胞において、その機能を変調するべき標的となっている。
【０３３６】
癌または増殖性疾患／障害には、悪性腫瘍、および前新生物障害が含まれる。本発明は、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、および乳癌などの腺癌の治療または診断に関して特に有用である。例えば、本発明によって治療されうる悪性腫瘍には、急性および慢性の白血病、リンパ腫、骨髄腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑液膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫などの肉腫、結腸癌腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、絨毛膜癌、腎細胞腫、肝細胞癌、輸胆管癌腫セミノーマ、胎児性癌、子宮頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、ぼうこう癌、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および膜胚種細胞腫が含まれる。
【０３３７】
可能なアプローチの１つは、本発明のポリヌクレオチドに対して向けられたアンチセンス構築物を、好ましくは疾患細胞で選択的に発現させて、遺伝子機能を阻害するか、または他の方法で変調し、アポトーシスを誘導または阻害することである。別のアプローチは、アポトーシス機構の細胞構成要素に関して、内在性遺伝子産物と競合を行い、機能阻害をもたらす本発明のポリペプチドの非機能的変異型を用いることである。別法として、上述したアッセイによって、本発明のポリペプチドに結合するものとして同定された化合物は、疾患細胞がこのポリペプチドの機能を阻止または促進する補助となりうる。これは、例えば、遺伝子療法によって、または化合物の直接投与によって行われうる。本発明の適当な抗体は、治療薬剤としても使用されうる。
【０３３８】
別法として、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは様々な生物で遺伝子発現を妨害する強力な方法であり、最近になって、哺乳類でも成功することが示されている（ＷｉａｎｎｙおよびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、２０００年、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０００年、第２巻、７０〜７５頁）。本発明によるポリヌクレオチドの配列に対応する二本鎖ＲＮＡを、正常なアポトーシスを妨害するために、個体の疾患細胞に導入して、そこで発現させることができる。
【０３３９】
通常、疾患または状態に関連した異常なアポトーシスが、対照と比較して、有意に（すなわち、５０％以上）阻害されている場合、疾患が「治療」されていると定義される。この阻害は、対照と比較して７５％の阻害であることが好ましく、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％または１００％の阻害である。この阻害は、アポトーシスを単純に阻止するものでもよく、あるいは遅延または延長するものでもよい。
【０３４０】
投薬
本発明のアッセイ法によって同定された物質、または同定可能な物質は、様々な構成要素と合成して、本発明の組成物を生成するのが好ましい。この組成物を、薬学的に許容される担体または希釈剤と合成して、医薬組成物（ヒトまたは動物で使用するためのものでありうる）を生成するのが好ましい。適当な担体および希釈剤には、等張食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水が含まれる。本発明の組成物は、直接的な注射によって投与してもよい。組成物は、非経口投与用、筋肉内投与用、静脈内投与用、皮下投与用、眼内投与用、または経皮投与用に製剤されうる。通常、各タンパク質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されうる。
【０３４１】
アポトーシスの阻害で使用するためのポリペプチド成分（または、アンチセンス構築物）をコードするポリヌクレオチド／ベクターは、裸の核酸構築物として、直接投与してもよい。それらは、宿主細胞ゲノムに対して相同性がある隣接配列を含みうる。ポリヌクレオチド／ベクターを裸の核酸として投与する場合、投与される核酸の量は、通常、１μｇから１０ｍｇまで、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇの範囲にあるであろう。例えば、適当な調節構築物によって、または指向性（ｔａｒｇｅｔｅｄ）ウイルスベクターの使用によって、腫瘍または増殖性細胞を特異的に標的とするポリヌクレオチド／ベクターを用いることが特に好ましい。
【０３４２】
哺乳類細胞による裸の核酸構築物の摂取は、例えば、トランスフェクション薬の使用を含めた、いくつかの公知のトランスフェクション技法によって促進される。これらの薬剤の例には、陽イオン性薬剤（例えば、リン酸カルシウム、およびＤＥＡＥ−デキストラン）、およびリポフェクタント（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔ）（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ（商標）およびｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標））が含まれる。通常は、核酸構築物を、トランスフェクション薬剤と混合して組成物を生成する。
【０３４３】
本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、またはベクターは、膜転移配列に結合、連合、連結、融合、または別の方法で関連づけされていることが好ましい。
【０３４４】
本明細書に記載のポリヌクレオチドやポリペプチドや化合物やベクターなどは、原形質膜および／または核膜を通過できるタンパク質（すなわち、膜転移配列）と結合、連合、連結、融合、または別の方法で関連づけされることによって、細胞内に送達するのが好ましい。目的の物質は、転移活性を担うタンパク質に由来するドメインまたは配列に融合または結合することが好ましい。転移ドメインおよび配列には、例えば、ＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ（Drosophila）Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質、および単純ヘルペス−１ウイルスＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列が含まれる。非常に好ましい実施形態では、目的の物質は、ペネトラチンタンパク質またはこの断片に結合されている。ペネトラチンは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫという配列を含み、Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、第２６９巻、１０４４４〜５０頁に記載されており；細胞内送達用のペネトラチン−薬物複合体の使用は、国際公開ＷＯ００／０１４１７に記載されている。国際公開ＷＯ００／２９２７に記載されるように、切断型または改変型のペネトラチンも使用されうる。
【０３４５】
本発明の内容では、組成物を調製する際に使用される担体は、薬学的に許容される担体であることが好ましい。治療適用用には、この組成物は、薬学的に許容される担体と、非毒性治療有効量の、アポトーシス関連タンパク質（または、そのような化合物の薬学的に許容される塩）を阻害する化合物とを含む。
【０３４６】
さらに、この好ましい実施形態の中に、本発明は、それを使用することによって、腫瘍細胞、良性もしくは悪性腫瘍の成長、または転移の阻害がもたらされる疾患治療用医薬組成物であって、薬学的に許容される担体と、非毒性治療有効量の、アポトーシス関連タンパク質を阻害する化合物とを含む医薬組成物を包含する。アポトーシス関連タンパク質を阻害する化合物を治療応用するための医薬組成物を調製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１８版（１９９０年）に記載されている。
【０３４７】
本発明の医薬組成物は、活性成分である阻害剤化合物、薬学的に許容される担体、および任意選択で他の薬効成分またはアジュバントを含みうる。他の治療薬剤には、細胞毒、化学療法剤、抗癌剤、またはそのような薬剤の効果を促進する薬剤が含まれうる。この組成物は、経口投与、直腸投与、局所投与、および非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、および静脈内投与を含む）に適した組成物が含まれるが、任意の症例で最も適切な経路は、特定の宿主、ならびに活性成分がそのために投与される状態の性質および重度によるであろう。医薬組成物は、単位剤形で提供するのが好都合であり、薬学分野で周知の方法のいずれで調製されてもよい。
【０３４８】
実際には、本発明の阻害剤化合物は、活性成分として、従来の製薬調剤技法に従って、薬学的担体と完全な混合物に合成されうる。担体は、投与、例えば、経口投与または非経口投与（静脈内投与を含む）に望しい製剤形態に応じて、様々な形態を取りうる。したがって、本発明の医薬組成物は、それぞれが予定された量の活性成分を含有する、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤などの経口投与に適した個別ユニットとして提供されうる。さらに、組成物は、粉末薬、果粒、溶液、水性液体の懸濁液、非水性液体、水中油エマルジョン、または油中水エマルジョンとして提供されうる。上述した一般的な剤形に加えて、阻害剤化合物組成物は、調節放出手段および／または送達装置によっても投与されうる。この組成物は、薬学的方法のいずれでも調製されうる。通常、そのような方法は、活性成分を、１つまたは複数の必要な成分を構成する担体と連合させるステップを含む。通常、組成物は、活性成分を、液体担体、微粉化された固形担体、またはその両方と一様かつ完全に混合することによって調製される。その後、製品を、所望のプレゼンテーションに形成することができるのが好都合である。
【０３４９】
利用される薬学的担体は、例えば、固形、液体、または気体でありうる。固形担体の例には、ラクトース、石膏、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が含まれる。液体担体の例は、糖シロップ、落花生油、オリーブ油、および水である。気体担体の例には、二酸化炭素および窒素が含まれる。
【０３５０】
経口投与薬用に組成物を調製する際には、いかなる好都合な薬学的媒体も利用されうる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、風味料、保存剤、着色剤、および同様のものは、懸濁液、エリキシール、溶液などの経口液体製剤を形成するのに使用されうる；一方、デンプン、糖、微晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤などの担体は、粉末薬、カプセル、および錠剤などの経口固形製剤を形成するのに使用されうる。錠剤およびカプセルは、投与が容易であるため、好ましい経口投薬単位であり、それには、固形薬学的担体が利用される。任意選択で、錠剤は、標準的な水性技法または非水性技法によってコーティングされうる。
【０３５１】
本発明の組成物を含有する錠剤は、圧縮または成形によって、任意選択で１つまたは複数のアクセサリー成分または補助剤と共に調製されうる。圧縮錠剤は、粉末薬または果粒などの自由流動形態の活性成分を、任意選択で、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適当な機械で圧縮することによって調製されうる。すりこみ錠剤は、不活性液体希釈剤で潤された粉末化合物の混合物を、適当な機械の中で成形することによって作製されうる。各錠剤は、約０．０５ｍｇ〜約５ｇの活性成分を含有することが好ましく、各カシェ剤またはカプセル剤は、約０．０５ｍｇ〜約５ｇの活性成分を含有することが好ましい。
【０３５２】
例えば、ヒトへの経口投与用に意図されている製剤は、総組成物の約５から約９５パーセントまで変動しうる適当かつ好都合な量の担体物質と合成されている約０．５ｍｇから約５ｇの活性薬を含有しうる。単位剤形は、通常、約１ｍｇから約２ｇの間、典型的には、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇの活性成分を含有しているであろう。
【０３５３】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、活性化合物の水溶液、または水性懸濁液として調製されうる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの適当な界面活性剤を含むこともできる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその油中混合物でも調製されうる。さらに、微生物の有害な成長を防止するために、保存剤を含めることもできる。
【０３５４】
注射可能な使用に適した本発明の医薬組成物は、無菌水溶液または分散液を含む。さらに、組成物は、そのような無菌注射剤溶液または分散液を即座に調製するための無菌粉末薬の形態もとりうる。すべての場合において、最終注入可能形態は、無菌でなければならず、また、注射器操作が容易となるように実効的に流動的でなければならない。医薬組成物は、製造条件および保存条件下で安定でなければならない。したがって、細菌および菌類などの微生物による汚染作用に対して保全されているべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油、およびその適当な混合物を含有する溶剤または分散媒でありうる。
【０３５５】
本発明の医薬組成物は、例えば、エアゾール、クリーム、軟膏剤、ローション、丸衣など、局所投与に適した形態をとりうる。さらに、組成物は、経皮装置内での使用に適した形態もとりうる。これらの製剤は、本発明の阻害剤化合物を用いて、従来の処理方法によって調製されうる。一例として、クリームまたは軟膏剤は、親水性物質および水を、約５ｗｔ％から約１０ｗｔ％の化合物と混合して、望ましい硬度を有するクリームまたは軟膏剤を生成することによって調製される。
【０３５６】
本発明の医薬組成物は、担体が固形である、直腸投与に適した形態をとりうる。混合物は単位量坐剤を形成していることが望ましい。適当な担体には、ココアバター、および当技術分野で一般的に使用される他の物質が含まれる。坐剤は、最初に組成物を、軟化または融解した担体と混合し、その後、型の中で冷却および成形することによって、形成させると好都合である。
【０３５７】
前述の担体成分に加えて、上述した製剤は、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、風味料、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、および保存剤（抗酸化剤を含む）などの１つまたは複数の追加担体成分を含みうる。さらに、製剤を、意図された受容者の血液と等張にするために、他の補助剤を含めることもできる。阻害剤化合物を含有する組成物は、粉末薬または濃縮液形態でも調製されうる。
【０３５８】
本発明の組合せにある化合物の投薬レベルは、ほぼ、本明細書に記載されている通りであろう。しかし、いかなる特定の患者用の特定の投薬レベルも、年齢、体重、全般的健常状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、排出速度、複合薬、および治療を行う特定の疾患の重度を含めた様々な因子に依存するであろうことは理解されている。
【０３５９】
表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされるアポトーシス関連タンパク質の阻害剤による治療に反応する可能性が高いタイプの新生物を、患者が有するかどうか判定するためには、患者から得られた新生物組織試料を、そのような阻害剤（例えば、本発明のスクリーニング法で同定された化合物；小分子抑制ｄｓＲＮＡ、例えば、方法の項に記載するもの）に曝露し、試験して、新生物組織試料が阻害剤による処理に対して応答性を示すかどうか判定する。
【０３６０】
例えば、固形腫瘍を有する患者では、適当な組織培養液および条件で、疑いのある腫瘍組織試料を取得し、処理し、阻害剤の存在下および不在下で培養して、腫瘍組織試料が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質のそのような阻害剤による処理に対して応答性であるかどうか判定する。阻害剤に対する応答性は、成長阻害または、処理されていない組織試料と比較した、阻害剤で処理された腫瘍細胞のアポトーシスの増大によって特徴付けることができる。
【０３６１】
一実施形態では、本発明の診断方法は、新生物組織試料が、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤による処理に対して反応性であるかどうかの判定を、新生物組織試料をそのような阻害剤に曝露し、そのような処理が腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長を低減するかどうか判定することによって行う。簡潔には、疑いのある新生物組織試料を、患者から取り出し、外植体としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させる。この組織試料を、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤の存在下および不在下で成長させる。培養で成長させた後、冷却した三塩化酢酸を添加することによって、細胞を固定することができ、タンパク質レベルは、Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．ら、New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screening、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、第８２巻、１１０７〜１１１２頁、１９９０年によって、以前に記載されている通り、スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）比色分析タンパク質染色アッセイを用いて測定する。別法として、他の多くの方法が、成長阻害を測定するのに利用可能であり、ＳＲＢアッセイの代わりに利用できる。これらの方法には、トリパンブル染色後に生存細胞を計数すること、ＤＮＡ合成可能な細胞をＢｒｄＵ、もしくは放射性同位元素標識されたチミジンで標識すること、生存細胞のニュートラルレッド染色、または、ＭＴＴもしくはＷＳＴ−１細胞生存度アッセイが含まれる。細胞成長阻害は、問題の腫瘍が表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤に応答性であることを示す。細胞成長阻害は、患者がそのような阻害剤による治療の適切な候補であろうことを示す。
【０３６２】
本発明の診断方法の別の態様では、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤による処理に対する新生物組織の応答性を、アポトーシスアッセイで試験する。例えば、疑いのある新生物組織試料を処理し、そのような阻害剤に曝露する。阻害剤に対する応答性は、処理されていない組織試料と比較した、阻害剤で処理された新生物組織試料のアポトーシスの増大によって特徴付けられる。アポトーシスの不適切な調節は、癌、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病などを含めた多数の病理学的状態で重要な役割を果たしていると考えられている。表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤による処理の後で、アポトーシスを介した細胞死の増大を示す新生物を有する患者は、そのような阻害剤による治療の候補である。
【０３６３】
アポトーシスアッセイの１タイプでは、疑いのある新生物細胞を患者から取り出す。その後、この細胞を、表１Ｂから選択された遺伝子によってコードされているアポトーシス関連タンパク質の阻害剤の存在下または不在下で、培養する。培養の付着コンパートメントと、「浮遊」コンパートメントとを併せることによって、アポトーシス細胞を測定する。アポトーシス促進化合物で処理された腫瘍細胞培養においてアポトーシスを評価するための適当かつ詳細なプロトコールは文献に記載されている（例えば、Ｐｉａｚｚａ，Ｇ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５５巻、３１１０〜１６頁、１９９５年）。別法として、本明細書、または本明細書に引用した参考文献に記載されている他のアポトーシスアッセイ、例えば、形態学的アッセイまたはＤＮＡ断片化アッセイが使用されうる。
【０３６４】
本発明の上記方法における、阻害剤化合物への曝露に反応した細胞増殖阻害またはアポトーシス増大の測定に代わる方法として、アポトーシスを促進するか、または細胞増殖を阻害し、それによって、腫瘍成長を阻害する化合物の効力を示すであろう様々な代用マーカーを評価することができる。例えば、アポトーシス関連タンパク質がプロテインキナーゼである場合、自己リン酸化、または細胞基質タンパク質のリン酸化の阻害を測定することができ、これは、アポトーシスまたは細胞増殖に対する効果を予測するものであろう。アポトーシス関連ＧＰＣＲタンパク質に関しては、下流シグナル伝達経路の阻害の測定が、アポトーシスまたは細胞増殖に対する効果を予測するものであろう。
【０３６５】
例示のみを目的として、本発明を以下の実施例でさらに説明する。
【実施例】
【０３６６】
実施例１：  アポトーシスの好中球モデル
ヒト一次好中球のアポトーシスにおける初期制御遺伝子を同定するためのモデル系は、国際公開ＷＯ ０２／０４６５７に記載されている。国際公開ＷＯ ０２／０４６５７は、ヒト一次好中球の単離、好中球生存に対するＧＭ−ＣＳＦの用量応答性作用、およびＧＭ−ＣＳＦに対する真菌代謝産物であるグリオトキシンの効果を記載する。したがって、このモデルから、好中球アポトーシスのパラメータが確立され、これによりアポトーシス関連遺伝子の同定が可能となっている。
【０３６７】
さらに、好中球アポトーシスは、以下の通りにして、ＤＮＡ断片化によって測定できる。
【０３６８】
国際公開ＷＯ０２／０４６５７の記載に従って、好中球を血液から単離し、濃度２×１０６／ｍｌにて再懸濁する。５００ｍｌを２４ウェルプレートのウェルの中にピペットで移し、生存因子の存在下または不在下でインキュベートする。
【０３６９】
このインキュベーションの後、好中球を穏やかに撹拌することにより注意深く再懸濁し、ウェルの全内容をエッペンドルフチューブに入れ、ミニフュージ中で２８００ｒｐｍ、室温で２分間遠心する。細胞ペレットを３００μｌの氷冷低張蛍光色素溶液（５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．１％クエン酸ナトリウム、および０．１％トリトンＸ−１００）に注意深く再懸濁し、４℃の冷蔵庫に２４時間置く。
【０３７０】
調製された試料は、ＦａｃｓＣａｌｉｂｒｅフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で、確実に単一細胞懸濁液とするために、Ｌｏｇ  ＦｏｒｗａｒｄおよびＳｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒパラメータ取得による二重識別を用いて分析する。
【０３７１】
図１に示すように、正常細胞（ＧＭ−ＣＳＦの存在下で一晩培養した好中球）は、単一のＧ１期ピークを生じ（好中球は細胞周期が停止しているので）、わずかな細胞だけがＳｕｂ−Ｇ１期ピークに存在する。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦの不在下で培養した好中球は、アポトーシスが増強されており、それは、Ｇ１期ピークの細胞数が減少し、Ｓｕｂ−Ｇ１期ピークの数が増強されている（ＤＮＡ断片化を示唆する）ことによって検出される。
【０３７２】
さらに、本発明者らは、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路が、ＧＭ−ＣＳＦ媒介性生存シグナルにおいて役割を担うことを、以下の通りにして確認した。
【０３７３】
好中球を、２４ウェルプレート内の完全培地（１ｍｌ／ウェル）に２×１０６／ｍｌで播種る。ＰＩ３Ｋ阻害剤（Ｌｙ２９４００２）を好中球に最終濃度２０μＭで添加し、その後、ＧＭ−ＣＳＦ（５０単位／ｍｌ）を添加する。対照ウェルでは、阻害剤の不在下で、ＧＭ−ＣＳＦが添加されないか、またはＦ  ＧＭ−ＣＳＦ（５０単位／ｍｌ）の添加が行われる。好中球を３７℃で１８時間培養し、その後回収して、以前の記載の通り、Ｓｕｂ−Ｇ１期分析用に調製する。
【０３７４】
Ｌｙ２９４００２によるＰＩ３キナーゼの阻害を図２に示す。図から明らかなように、好中球をＧＭ−ＣＳＦの不在下で１８時間培養すると、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養したものと比べて、Ｓｕｂ−Ｇ１期分析で測定されるアポトーシスを生じている細胞の数が増大する。対照的に、好中球をＧＭ−ＣＳＦおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の両方の存在下で培養した場合、生存が無効化されることから、ＧＭ−ＣＳＦがＰＩ３Ｋ経路を介して生存を媒介していることを示唆する。
【０３７５】
発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦによって媒介される生存におけるＡＫＴの役割も、以下の通りにして実証する。
【０３７６】
好中球を、２４ウェルプレート内の完全培地（１ｍｌ／ウェル）に２×１０６／ｍｌで播種る。ＡＫＴ阻害剤（［１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−カイロ−イノシトール２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカルボネート］（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社））を、好中球に最終濃度２０μＭで添加し、２時間インキュベートし、その後、ＧＭ−ＣＳＦ（５０単位／ｍｌ）を添加する。対照ウェルでは、阻害剤の不在下で、ＧＭ−ＣＳＦを添加しないか、またはＧＭ−ＣＳＦ（５０単位／ｍｌ）の添加が行われる。好中球を、以前の記載の通り、３７℃で１８時間培養した後、回収し、Ｓｕｂ−Ｇ１期分析用に調製する。
【０３７７】
［１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−カイロ−イノシトール２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカルボネート］（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）によるＡＫＴの阻害を、図３に示す。図から明らかなように、好中球をＧＭ−ＣＳＦの不在下で１８時間培養すると、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養したものと比べて、Ｓｕｂ−Ｇ１期分析で測定されたアポトーシスを生じている細胞の数が増大する。対照的に、好中球をＧＭ−ＣＳＦおよびＡＫＴ阻害剤の両方の存在下で培養した場合、生存が無効化されることから、ＧＭ−ＣＳＦがＰＩ３Ｋ経路を介して生存を媒介していることが示唆される。
【０３７８】
実施例２：  アポトーシスの好中球モデルにおける遺伝子発現解析は、アポトーシスの調節因子を同定する
市販のマイクロアレイを、好中球アポトーシスに関連した全体的遺伝子発現、好中球アポトーシスのＧＭ−ＣＳＦ阻害、および、真菌代謝産物グリオトキシンの使用によるこの効果の阻害を測定するのに用いる。対照実験には、グリオトキシンの非活性アナログであるメチルグリオトキシンを使用する。そのようなマイクロアレイ結果の分析により、測定可能なアポトーシス表現型と関連してその発現パターンが変化（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する遺伝子が同定される。
【０３７９】
このモデル探索アッセイは、アポトーシスにおいて、そして、特に、ＧＭ−ＣＳＦによるアポトーシスの阻害において起こる「初期」の調節イベントを標的とするように構成されている。ＧＭ−ＣＳＦによるアポトーシスが、それ自体、グリオトキシンなどの薬物で阻害される場合、共通しており処理に応じて増大および／または減少の両方を生じる変化をクラスター化することにより、それらの変化または変化のパターンを標的とすることができる。例えば、アポトーシス誘導後に「減少」する変化は候補標的遺伝子であるが、これに加えてＧＭ−ＣＳＦによるアポトーシス阻害の後に「増大」する変化は、標的遺伝子である可能性がさらに高い、というのも、この遺伝子の調節は、そのプロセスと高い相関を示すからである。同様に、ＧＭ−ＣＳＦによる阻害作用に対する阻害の後にさらに「減少する」変化は、遺伝子の調節がそのプロセスと高い相関を示すため、標的遺伝子である可能性がなお一層高い。
【０３８０】
この実施例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（米国）から入手したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｕ９５マイクロアレイチップセットの使用を記載する。このチップセットは、約５０，０００のヒトｍＲＮＡに相当するオリゴヌクレオチドプローブを含有している。
【０３８１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現プロファイリングのための好中球ＲＮＡの単離と精製
一次ヒト好中球を、１５人の正常な健常個体の末梢血から標準的な技法を用いて単離、精製した。各試料を以下の処理グループに分割した。 
１）Ｔ０未処理の対照
２）自発的アポトーシスＴ４（血清中、３７℃で、４時間インキュベートする）
３）ＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ）およびグリオトキシン（１０μＭ）で処理（３７℃で、４時間インキュベートする）
４）ＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ）およびメチルグリオトキシン（１０μＭ）で処理（３７℃で、４時間インキュベートする）。
【０３８２】
その後、トータルＲＮＡをメーカーの説明書（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）に従って、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出を２回逐次的に用いて調製し、続いて、メーカーの説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。試料は処理に応じてプールした。
【０３８３】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロファイリングのための好中球ＲＮＡの逆転写と第２鎖合成
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅシステム（Ｇｉｂｃｏ社）を用い、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ａａｒｈｕｓ）によって提供されているＴ７−（ｄＴ）オリゴマーを使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現マニュアルのプロトコールに従い、好中球ＲＮＡ試料に対する逆転写反応と第２鎖合成反応とを行った。
【０３８４】
ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの５’末端、中央、および３’末端を標的とするよう設計したプライマーを用いたＰＣＲを行って、第２鎖ｃＤＮＡの質を確認した。これは、産物相対量の比較を可能にして、完全長ｃＤＮＡの割合について指標を与えるものである。その後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕ９５Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥのチップに対するプロフィールを得るために、ｃＤＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄｅｐｔ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａａｒｈｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｓｋｅｊｂｙ  Ｓｙｇｅｈｕｓ、ＤＫ  ８２００  Ａａｒｈｕｓ  Ｎ  Ｄｅｎｍａｒｋに送った。
【０３８５】
処理グループ全体に関する示差的遺伝子発現のバイオインフォマティクス分析はアポトーシスの調節因子を同定する
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐソフトウェア解析によって様々な測定結果が提供される。これらは、示差的遺伝子発現の有意性を計算するのに用いる。以下のパラメータが決定される。
【０３８６】
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ：陽性と判定されたプローブ対の数。以下の２つの規準が満たされるとき、プローブ対はＰｏｓｉｔｉｖｅであるとみなされる。
【０３８７】
１）完全一致強度（ＰＭ）  マイナス  ミスマッチ強度（ＭＭ）＞  統計的弁別閾（ＳＤＴ、弁別閾とも呼ばれる）＊
ＰＭ−ＭＭ＞ＳＤＴ
２）バックグランド減算後、ＰＭ／ＭＭ＞統計比率閾値（ＳＲＴ、比率閾値と呼ばれる）＊
ＰＭ／ＭＭ＞ＳＲＴ
＊ＳＤＴおよびＳＲＴはユーザによって設定される。
【０３８８】
Ｎｅｇａｔｉｖｅ：陰性と判定されたプローブ対の数。以下の２つの規準が満たされるとき、プローブ対はＮｅｇａｔｉｖｅであるとみなされる。
【０３８９】
１）ＭＭ  マイナス  ＰＭ  ＞  統計弁別閾
ＭＭ−ＰＭ＞ＳＤＴ
２）バックグランド減算後、ＭＭ／ＰＭ＞統計比率閾値
ＭＭ／ＰＭ＞ＳＲＴ
これは、ＰＭとＭＭの相違がわずかであるプローブ対を分析から除去する。一部のプローブ対は、どちらのセットの要件も満たさないかもしれず、従ってその場合、ＰｏｓｉｔｉｖｅともＮｅｇａｔｉｖｅとも判定されないであろう。
【０３９０】
Ｐａｉｒｓ：プローブアレイ上にあるこの遺伝子に対するプローブ対の総数。
【０３９１】
Ｐａｉｒｓ  Ｕｓｅｄ：これは分析で用いられる遺伝子あたりのプローブ対の数である。これは、１遺伝子あたり、もしくはこのチップあたりのプローブ総数か、または、プローブマスクファイルで指定できる、あらかじめ選択されたサブセットのプローブ対数である場合がある。
【０３９２】
Ｐａｉｒｓ  ｉｎ  ａｖｅｒａｇｅ：これはＬｏｇ  ＡｖｇおよびＡｖｇ  Ｄｉｆｆの計算に用いられたプローブ対の数である。Ｐａｉｒｓ  ｉｎ  ａｖｅｒａｇｅを測定するモードは３つある。
【０３９３】
Ａｌｌ−ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ：一遺伝子に対するプローブ対すべてが計算に用いられる。その遺伝子に対するプローブ対の数が８未満である場合には、これがデフォルトとなる。
【０３９４】
Ｏｌｙｍｐｉｃ  ｓｃｏｒｉｎｇ：Ｏｌｙｍｐｉｃ  ｓｃｏｒｉｎｇは強度差（ＰＭ−ＭＭ）が最大値および最小値であったプローブ対を除外する。この方法は、プローブ対の数が、９からプローブ閾値数（＃）（ＮＰＴ＊、デフォルト＝１５）までの範囲にある場合に、使用される。
【０３９５】
Ｓｕｐｅｒ  Ｏｌｙｍｐｉｃ  ｓｃｏｒｉｎｇ：最大値および最小値の両方を除外して計算される平均強度差の標準偏差（ＳＴＰ＊）が３以内のデータのみ、使用される。最大値および最小値の除外は強制的に行われる。すなわち、それらが指定された範囲内に入っていても、それらは除外される。この方法は、その遺伝子に対するプローブ対の数がプローブ閾値数（＃）より大きい場合に使用される。
【０３９６】
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：これは、Ｐｏｓｉｔｉｖｅと判定されたプローブ対の数を、使用されたプローブ対の数で割った比率である。Ｐｏｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎは、転写産物が存在しているか否かの良い指標である。プローブ対の大部分が陽性であるならば、プローブ利用が良好であり、おそらく転写産物が存在している。
【０３９７】
Ｌｏｇ  Ａｖｇ（Ｌｏｇ  Ａｖｅｒａｇｅ  Ｒａｔｉｏ）：用いられた各プローブ対の強度比（ＰＭ／ＭＭ）が、完全一致の強度をミスマッチの強度で割ることで計算される。各遺伝子についてＰａｉｒｓ  ｉｎ  Ａｖｇから強度比の平均を計算し、これに１０を掛ける。
【０３９８】
Ｌｏｇ  Ａｖｇ＝１０×［Ｓ ｌｏｇ（ＰＭ／ＭＭ）］／（＃プローブＰａｉｒｓ  Ｉｎ  Ａｖｇ）
注：Ｌｏｇ  Ａｖｇ＝０は、ランダムなクロスハイブリダイゼーションを示す。Ｌｏｇ  Ａｖｇが高いほど、その遺伝子転写物の存在に確信がもてる。
【０３９９】
ＰＭ  Ｅｘｃｅｓｓ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ  ｅｘｃｅｓｓ）：強度比が所与の値（比率限界値）を超えるプローブ対の数。
【０４００】
ＭＭ  Ｅｘｃｅｓｓ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｘｃｅｓｓ）：強度比の逆数が所与の値（比率限界値）を超えるプローブ対の数。
【０４０１】
ＰＭ  ｅｘｃｅｓｓおよびＭＭ  ｅｘｃｅｓｓに示される数は、ＰＭ／ＭＭ比またはＭＭ／ＰＭ比のうちのどれだけが特定の値を超えたかを示す。例えば、５である場合、全ＰＭ／ＭＭまたはＭＭ／ＰＭ（比率）のうち５つが、１０（デフォルト値）を上回ったことを意味する。
【０４０２】
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ）：これは、Ｐｏｓｉｔｉｖｅと判定されたプローブ対と、Ｎｅｇａｔｉｖｅと判定されたプローブ対との比率である。
【０４０３】
Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）：用いられた各プローブ対の強度差（ＰＭ／ＭＭ）を、完全一致の強度からミスマッチに対する強度を差し引いて計算する。プローブＰａｉｒｓ  ｉｎ  Ａｖｇから各遺伝子について強度差の平均を計算する。
【０４０４】
Ｓ（ＰＭ−ＭＭ）／（＃プローブＰａｉｒｓ  Ｉｎ  Ａｖｇ）
Ａｂｓ  Ｃａｌｌ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃａｌｌ）：Ａｂｓ  Ｃａｌｌでは次の３通りの結果がありうる：「Ｐ」（存在）、「Ａ」（不在）、および「Ｍ」（境界）。この判定は、Ｐｏｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ、Ｌｏｇ  Ａｖｇ、およびＰｏｓ／Ｎｅｇの値に基づいている。
【０４０５】
Ｉｎｃ（Ｉｎｃｒｅａｓｅ）：各遺伝子に関して、実験データにおけるＰＭマイナスＭＭが、ベースラインデータにおける値より有意に大きいものとなるプローブ対の数。有意であるとみなされるには、次の２つの条件を満たさなければならない。
【０４０６】
１）（ＰＭ−ＭＭ）実験値  −（ＰＭ−ＭＭ）ベースライン＞変化閾値（ＣＴ）＊
２）［（ＰＭ−ＭＭ）実験値  −（ＰＭ−ＭＭ）ベースライン］／（ＰＭ−ＭＭ）ベースライン＞パーセント変化閾値（ＰＣＴ）＊／１００
Ｄｅｃ（Ｄｅｃｒｅａｓｅ）：各遺伝子に関して、ベースラインデータにおけるＰＭマイナスＭＭが、実験データにおける値より有意に大きいものとなるプローブ対の数。有意であるとみなされるには、次の２つの条件を満たさなければならない。
【０４０７】
１）（ＰＭ−ＭＭ）ベースライン  −（ＰＭ−ＭＭ）実験値＞ＣＴ
２）［（ＰＭ−ＭＭ）ベースライン  −（ＰＭ−ＭＭ）実験値］／（ＰＭ−ＭＭ）ベースライン＞ＰＣＴ／１００
Ｐｏｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）：これは、用いたプローブ対の数で、Ｐｏｓｉｔｉｖｅと判定されたプローブ対数を割った比率である。Ｐｏｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎは、転写産物が存在しているか否かの良い指標である。プローブ対の大部分が陽性であるならば、プローブ利用が良好であり、おそらく転写産物が存在している。
【０４０８】
Ｌｏｇ  Ａｖｇ（Ｌｏｇ  Ａｖｅｒａｇｅ  Ｒａｔｉｏ）：用いられた各プローブ対についての強度比（ＰＭ／ＭＭ）を、完全一致の強度をミスマッチの強度で割って計算する。Ｐａｉｒｓ  ｉｎ  Ａｖｇから各遺伝子について強度比の平均を計算し、これに１０を掛ける。 
Ｌｏｇ  Ａｖｇ＝１０×［Ｓ ｌｏｇ（ＰＭ／ＭＭ）］／（＃プローブＰａｉｒｓ  Ｉｎ  Ａｖｇ）
注：Ｌｏｇ  Ａｖｇ＝０はランダムなクロスハイブリダイゼーションを示す。Ｌｏｇ  Ａｖｇが高いほど、遺伝子転写物が存在することに確信がもてる。
【０４０９】
Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）：用いられた各プローブ対についての強度差（ＰＭ／ＭＭ）を、完全一致の強度からミスマッチに対する強度を差し引いて計算する。プローブＰａｉｒｓ  ｉｎ  Ａｖｇから各遺伝子についての強度差の平均を計算する。 
Ｓ（ＰＭ−ＭＭ）／（＃プローブＰａｉｒｓ  Ｉｎ  Ａｖｇ）。
【０４１０】
Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ  Ｃｈａｎｇｅ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｈａｎｇｅ）：実験値平均差とベースライン平均差（Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ）との間の差異。 
Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ（実験値）−Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ（ベースライン）
Ｉｎｃ  Ｒａｔｉｏ（Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｒａｔｉｏ）：各遺伝子に関して、分析で用いたプローブ対の数に対する、増大した（Ｉｎｃ）として同定されたプローブ対の数の比率。
【０４１１】
Ｄｅｃ  Ｒａｔｉｏ（Ｄｅｃｒｅａｓｅ  Ｒａｔｉｏ）：各遺伝子に関して、分析で用いたプローブ対の数に対する、減少した（Ｄｅｃ）として同定されたプローブ対の数の比率。
【０４１２】
Ｍａｘ  Ｉｎｃ  ＆  Ｄｅｃ  Ｒａｔｉｏ（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｒａｔｉｏ  ａｎｄ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ  Ｒａｔｉｏ）：Ｉｎｃ  ＲａｔｉｏまたはＤｅｃ  Ｒａｔｉｏの大きい方。
【０４１３】
Ｐｏｓ  Ｃｈａｎｇｅ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｈａｎｇｅ）：各遺伝子について実験ファイルおよびベースラインファイルのそれぞれにおいて陽性と判定されたプローブ対の数の間の差異。
【０４１４】
Ｎｅｇ  Ｃｈａｎｇｅ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｈａｎｇｅ）：各遺伝子について実験ファイルおよびベースラインファイルのそれぞれにおいて陰性と判定されたプローブ対の数の間の差異。
【０４１５】
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ（Ｉｎｃｒｅａｓｅ／Ｄｅｃｒｅａｓｅ）：減少したプローブ対の数に対する、増大したプローブ対の数の比率、ＩｎｃおよびＤｅｃを参照。
【０４１６】
Ｄｉｆｆ  Ｃａｌｌ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃａｌｌ）：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃａｌｌについては、５通りの結果がありうる。ＲＮＡの発現レベルは、増大（Ｉ）、減少（Ｄ）、わずかに増大（ＭＩ）、わずかに減少（ＭＤ）、または発現レベルに検出可能な変化なし（ＮＣ）である。すべての判定の間の差異は、Ｉｎｃ／Ｄｅｃ、Ｉｎｃ  Ｒａｔｉｏ（またはＤｅｃ  Ｒａｔｉｏ）、Ｄｐｏｓ−Ｄｎｅｇ  ＲａｔｉｏおよびＬｏｇ  Ａｖｇ  Ｒａｔｉｏ  Ｃｈａｎｇｅの値に基づいている。
【０４１７】
Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ：Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅは、実験ファイルとベースラインファイルの間での平均差（Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ）の比率である。この数は変化の方向性（Ｄｉｆｆ  Ｃａｌｌを参照）ではなく、変化の規模を反映する。例えば、Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ実験値が３０００であり、Ａｖｇ  Ｄｉｆｆベースライン値が３００である場合、Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅは１０である。Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ実験値が３００であり、Ａｖｇ  Ｄｉｆｆベースライン値が３０００である場合も、Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅは１０である。Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ実験値またはＡｖｇ  Ｄｉｆｆベースライン値のどちらかが＜２０である場合には、計算の都合上、この値は２０に設定される。
【０４１８】
Ｓｏｒｔ  Ｓｃｏｒｅ：Ｓｏｒｔ  Ｓｃｏｒｅは、Ｆｏｌｄ  ＣｈａｎｇｅおよびＡｖｇ  Ｄｉｆｆ  Ｃｈａｎｇｅの両方に基づいている。このスコアは、実験ファイルと、ベースラインファイルとの間の遺伝子発現の差異を評価するのに用いることができる。Ｓｏｒｔ  Ｓｃｏｒｅの数値が大きいほど、実験ファイルとベースラインファイルとの間の遺伝子発現の測定差異がより「有意」であり、すなわち信頼性が高い。例えば、Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅが５である場合、Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ  Ｃｈａｎｇｅ値が２００から１０００に変化する際の有意性値は、Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ  Ｃｈａｎｇｅ値が２０から１００に変化する際の有意性値よりも大きい。
【０４１９】
本発明者らは、本明細書および国際公開ＷＯ０２／０４６５７にすでに概説されているモデルスクリーニング法の原則に従って、処理群を横断した以下の示差的遺伝子発現パターンを使用し、アポトーシスの調節因子の同定を行った。 
１．未処理群（Ｔ＝０時間）と比較した、未処理群（Ｔ＝４時間）におけるダウンレギュレーション（Ｔ４：Ｔ０）、および
２．未処理群（Ｔ＝０時間）と比較した、ＧＭ−ＣＳＦ＋グリオトキシン群（Ｔ＝４時間）におけるダウンレギュレーション（Ｇ：Ｔ０）、および
３．未処理群（Ｔ＝４時間）と比較した、ＧＭ−ＣＳＦ＋メチルグリオトキシン群（Ｔ＝４時間）におけるアップレギュレーションまたは無変動（Ｍ：Ｔ４）、および
４．ＧＭ−ＣＳＦ＋グリオトキシン群（Ｔ＝４時間）と比較した、ＧＭ−ＣＳＦ＋メチルグリオトキシン群（Ｔ＝４時間）におけるアップレギュレーションまたは無変動（Ｍ：Ｇ）
あるいは
１．未処理群（Ｔ＝０時間）と比較した、未処理群（Ｔ＝４時間）におけるアップレギュレーション（Ｔ４：Ｔ０）、および
２．未処理群（Ｔ＝０時間）と比較した、ＧＭ−ＣＳＦ＋グリオトキシン群（Ｔ＝４時間）におけるアップレギュレーション（Ｇ：Ｔ０）、および、
３．未処理群（Ｔ＝４時間）と比較した、ＧＭ−ＣＳＦ＋メチルグリオトキシン群（Ｔ＝４時間）におけるダウンレギュレーションまたは無変動（Ｍ：Ｔ４）、および、
４．ＧＭ−ＣＳＦ＋グリオトキシン群（Ｔ＝４時間）と比較した、ＧＭ−ＣＳＦ＋メチルグリオトキシン群（Ｔ＝４時間）におけるダウンレギュレーションまたは無変動（Ｍ：Ｇ）。
【０４２０】
本発明者らは、これらのパラメータを用いて、表１Ａおよび表１Ｂに示すものを含めた多数の示差的に調節される遺伝子を同定した。
【０４２１】
表２は、上記に列挙した処理パターンに従う未処理好中球と比較した、処理群全体の遺伝子発現の変化倍率（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を示す。
【０４２２】
Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベース（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）を用いるバイオインフォマティクス遺伝子機能分析を利用して、示差的に調節される特定遺伝子を、さらに特徴付ける。表１Ａおよび表１Ｂにおいて特定したそのような遺伝子は、キナーゼおよびＧタンパク質共役型受容体と相同性を有することが判明している。
【０４２３】
ＱＰＣＲを用いたアレイデータの確認
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）は、遺伝子発現プロファイリング技法の中でも高精度な検出を提供する。さらに、リアルタイム分析は、高感度性および正確な定量性を提供することにより、マイクロアレイ分析を補完することができる。加えて、ＱＰＣＲは遺伝子特異的プライマーを必要とするので、標的遺伝子の特異性が高められる。この実施例では、アポトーシスにおいて調節されるものとしてマイクロアレイ分析により同定された多数の遺伝子について、様々な処理群に関してＱＰＣＲを用いたプロファイリングをさらに行い、そして未処理の好中球と比較する。
【０４２４】
上記に列挙した様々な処理から、好中球ＲＮＡを単離し、精製した。同様に、逆転写および第２鎖合成を、上述の通りに行った。定量的ＰＣＲは、実施例３に詳細に記載する条件下で行った。
【０４２５】
多数の標的遺伝子に関するＱＰＣＲ分析の結果を図４に示す。比較がなされた７つの遺伝子に関しては、様々な処理グループにわたって、マイクロアレイ分析の結果とＱＰＣＲの結果の間に良好な相関関係が認められた。
【０４２６】
したがって、この結果は、マイクロアレイによる測定により標的遺伝子の上記調節を確認するものである。
【０４２７】
いくつかのアポトーシス変調因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）に関する記述
表１Ａは、アポトーシス調節因子の詳細に特徴付けされている例としてのキナーゼおよびＧＰＣＲをコードする、示差的に調節された遺伝子を示す。これらは、癌および炎症性疾患の治療標的となっている。これらには、以下のような、その機能がすでに記載されている既知の遺伝子が含まれる。
【０４２８】
１）プロテインキナーゼＣゼータ（ＰＫＣζ）
プロテインキナーゼＣは、細胞調節、癌、およびアポトーシスに関与するシグナル伝達経路で中心的役割を果たすセリントレオニンキナーゼである。同定されている１１種のイソ型は、構造的に関連しているが、異なった補助因子要求性を示す。それらは次の３つのファミリーを構成する：（ｉ）古典的アイソフォーム（ｃＰＫＣ−α、βＩ、βＩＩ、およびγ）は、ＤＡＧによって活性化され、Ｃａ２＋依存性である；（ｉｉ）新規のアイソフォーム（ｎ  ＰＫＣ−δ、ε、η、θ、およびμ）は、ＤＡＧによって活性化されるが、Ｃａ２＋非依存性である；（ｉｉｉ）非定型的アイソフォーム（ＰＫＣ−ζおよびι／λ）は、ＤＡＧ非応答性であり、かつＣａ２＋非依存性である。これらアイソフォームは、活性化に際して、細胞質ゾルおよび膜分画から移行する。
【０４２９】
プロテインキナーゼζは、哺乳類細胞の分化、悪性形質転換、およびアポトーシスを調節するいくつかのシグナル伝達経路に関係している。ＰＫＣζが直接的に関係する主たる経路のうちの２つが、スフィンゴミエリナーゼ／セラミド経路と、ＰＩ３／ＡＫＴ経路であるが、これらのうちのどちらかを介したシグナル伝達は相互に排他的ではない（Ｃａｌｃｅｒｒａｄａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２００２  １３、５１４（２〜３）、３６１〜５頁）。
【０４３０】
ＰＫＣζが、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸によって活性化されうるという事実（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９３年、第２６８（１）巻、１３〜６頁）は、それがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ生存経路で機能することを示唆する。ＡＫＴ酵素の完全活性化には、トレオニンおよびセリンアミノ酸のリン酸化が必要である。トレオニンのリン酸化はＰＤＫ１によるものであるが、ＰＤＫ２によるセリンリン酸化を導く機構はほとんど判っていない。最近の証拠から、ＰＤＫζがＰＤＫ２およびＡＫＴに結合し、それによってアダプターとして機能することにより、ＡＫＴのセリンリン酸化を促進し、その完全活性化を導くことが示唆されている（Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ  ＣＰら、２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４１２（３２）巻、１０３５１〜９頁）。
【０４３１】
加えて、マウス赤白血病細胞（フレンド）は、高用量電離放射線に反応して、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）ｐ８５αサブユニットの活性化および核転座を引き起こし、その結果、ＰＫＣζの下流活性化および核転座をもたらす。ＰＩ−３−キナーゼの比較的特異的な阻害剤であるウォルトマニンで処理すると、それに続いて、アポトーシス細胞数の増加と、プロテインキナーゼＣゼータの転座阻害とが、両方検出される。この結果は、ＰＩ−３−キナーゼ／ＰＫＣゼータ経路が、フレンド細胞を電離放射線誘発性アポトーシスから保護する上で潜在的役割を果たすことを示唆しており、そのことから、ＰＫＣゼータは、薬物治療の可能性のある標的としての検討対象として提供される（Ｃａｔａｌｄｉら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ、２００３年１月、第２２（１）巻、１２９〜３５頁）。
【０４３２】
ｐａｒ−４遺伝子の産物は、その発現がアポトーシスと相関しており、ＰＫＣζの調節ドメインと特異的に相互作用して、その活性を阻害する。ｐａｒ−４の過剰発現はＮＩＨ−３Ｔ３細胞のアポトーシスを誘発するが、このアポトーシスは、ＰＫＣζ（ただし、キナーゼ不活性変異体ではない）が過剰発現されれば抑止されうることから、これは、ＰＫＣζが生存を制御できることを示唆する（Ｄｄｉａｚ−Ｍｅｃｏら、Ｃｅｌｌ、１９９６年、第８６（５）巻、７７７〜８６頁）。ＰＫＣζが細胞を保護することの別の例が、ｄｅ  Ｔｈｏｎｅｌら（Ｂｌｏｏｄ、２００１年、第９８（１３）巻、３７７０〜７頁）によって明らかにされ、彼らは、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）におけるＦａｓ耐性の機構が、ＰＫＣζ発現によるものであることを示した。ｐａｒ−４の化学的阻害または過剰発現によって、Ｆａｓ誘発性アポトーシスが回復した。
【０４３３】
同様に、Ｕ９３７ヒト白血病細胞系で、キナーゼ活性のないドミナントネガティブＰＫＣζを過剰発現させることによって、ＰＫＣζを阻害したところ、同時に、Ｂａｘ発現の増大を伴う、ＢＣＬ２発現の低下がもたらされた。さらに、ＰＫＣζの阻害は、エトポシドおよびＴＮＦαに曝露された白血病細胞のアポトーシスの発生を加速し、この阻害が、これらの試薬に対する細胞の感受性を増大させたことを示唆した。ＰＫＣζの阻害は、ヌードマウス体内で増殖した腫瘍細胞の、エトポシドに対する感受性も増強した。その結果、筆者らは、ＰＫＣζの阻害が、腫瘍細胞の化学増感のための魅力的な標的であると結論している（Ｆｉｌｏｍｅｎｋｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６２（６）巻、１８１５〜２１頁）。
【０４３４】
ＰＫＣζの活性化の１つの結果が、ＩκＫのリン酸化を間接的に誘導することによるＮＦκＢの活性化であり、それによって、ＮＦκＢが核に移行して、抗アポトーシス遺伝子を転写することが可能となる（Ｄｉａｚ−Ｍｅｃｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９４年、第１３（１２）巻、２８４２〜８頁）。相同組換えによって、ＰＫＣζが特異的に不活性化されているマウスは、外観上正常に見えるが、それらの２次リンパ器官に形質変化を有することが判明した。さらに、このマウスには、ＮＦκＢ経路の活性化に欠陥があり、特に肺では、ＩκＫの活性化が阻害された（Ｌｅｉｔｇｅｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００１年１０月、第８（４）巻、７７１〜８０頁）。
【０４３５】
また、プロテインキナーゼＣζは、ＴＮＦαで刺激された内皮細胞における反応性オキシダントの生成にも関係づけられている。ＴＮＦαによる内皮細胞の処理は、オキシダント産生のために必要なイベントである、ｐ４７およびｇｐ９１（ＮＡＤＰＨオキシダーゼサブユニット）のリン酸化をもたらした。ＰＫＣζの阻害は、ｐ４７（ｐｈｏｘ）のＴＮＦα誘導性のリン酸化と膜への移行とを阻止し、続いてオキシダント産生を阻害した（Ｆｒｅｙら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、２００２年５月１７日、第９０（９）巻、１０１２〜９頁）。
【０４３６】
上述の抗アポトーシス性の例とは逆に、ＰＫＣζは、ＴＮＦαで処理された好中球ではアポトーシス促進性であることも示唆されている。ＴＮＦαへの曝露によって、ＰＫＣζの発現が用量依存的に増強されたが、これは死亡と相関していた（Ｄａｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９９年、第１９７（１〜２）巻、９７〜１０８頁）。
【０４３７】
２）３’ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）
ＰＤＫ１は、ＡＧＣプロテインキナーゼであるＡｋｔ、Ｓ６Ｋ、ＲＳＫ、ＭＳＫ、およびＳＧＫの活性化において中心的役割を果たす。詳細には、ＰＤＫ１は、Ａｋｔをリン酸化し、活性化する能力によって、細胞生存の調節において重要な役割を果たす。完全活性化には、Ａｋｔは、トレオニン−３０８およびセリン−４７３残基のリン酸化を必要とするが、部分的活性化には、トレオニンのリン酸化のみでも十分である。活性化に続いて、Ａｋｔ生存は、Ｂａｄ、Ｃａｓｐａｓｅ９、およびＦｏｒｋｈｅａｄ転写因子のリン酸化および阻害を含めた多くのイベントによって媒介される。
【０４３８】
過剰発現研究は、ＰＤＫ１が、乳腺腫瘍形成において役割を担うことを実証した。レトロウイルスを用いてＰＤＫ１を形質導入したＣＯＭＭＡ−１Ｄマウス乳腺上皮細胞は、ＡｋｔおよびプロテインキナーゼＣの活性化を伴った、高度な形質転換（軟寒天中での足場非依存性増殖によって測定した）を示した。筆者らは、ＰＤＫ１の活性化が乳腺腫瘍形成を導きうると結論し、ＰＤＫ１の発現がヒト乳癌における重要な標的でありうることを示唆している（Ｚｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００２年、第６２（１２）巻、３５３８〜４３頁）。
【０４３９】
この仮説と一致して、Ａｒｉｃｏら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００２年、第２７７（３１）巻、２７６１３〜２１頁）は、ＣＯＸ−２特異的阻害剤であるセレコキシブの抗腫瘍効果がＰＤＫ１の阻害によって媒介されうることを実証した。セレコキシブは、腺腫様結腸直腸ポリープの数を減少させることが以前に示されている。セレコキシブは、ＰＤＫ−１を阻害することによって、大腸癌細胞系ＨＴ−２９のアポトーシスを誘導し、それによってＡｋｔのリン酸化の阻害をもたらした。構成的に活性な形態にあるＡｋｔの発現は、セレコキシブ誘発性の細胞死に対して低い防御効果を有したが、ＰＤＫ１の構成的に活性な変異体の発現は強力にアポトーシスを阻害した。これは、セレコキシブの抗腫瘍活性がＰＤＫ−１阻害によるものであることを確認するものである。
【０４４０】
同様に、ＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）は、現在臨床試験中の薬物であり、特有のフィンガープリントパターンを有するが、これはＡｋｔの脱リン酸化および不活性化を誘導し、それにより生存シグナルの消失と、アポトーシスの誘導とをもたらす。更なる分析によって、ＵＣＮ０１媒介性のＡｋｔ不活性化は、Ａｋｔそれ自体、またはホスファチジルイノシチド３−ＯＨキナーゼの抑制によってではなく、上流のＡｋｔキナーゼとして機能するＰＤＫ１を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、そして、細胞から、阻害することによって（ＩＣ５０＝３３ｎＭ）引き起こされることが明らかになった。ＵＣＮ−０１誘発性のＰＤＫ１阻害も、ｉｎ  ｖｉｖｏで、マウスおよびヒト腫瘍異種移植体で観測された。活性型Ａｋｔの過剰発現によってＵＣＮ−０１の細胞傷害効果が減弱されたが、これは、ＵＣＮ−０１が、部分的には、ＰＤＫ１−Ａｋｔ生存経路を阻害することによってその細胞傷害性を発揮することを示唆している。ＵＣＮ−０１はｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を有することがすでに証明されているので、ＰＤＫ１−Ａｋｔ生存経路は、癌化学療法の新規かつ魅力的な標的である（Ｓａｔｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００２年３月７日、第２１（１１）巻、１７２７〜３８頁）。
【０４４１】
癌においてＰＤＫ１が演じている極めて重要な役割を実証するさらに別の例では、Ｂａｌｌｉｆら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、第２７６（１５）巻、１２４６６〜７５頁）が、抗腫瘍形成性および抗増殖性の薬剤であるｎ−α−トシル−ｌ−フェニルアラニル−ｌ−クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）が、Ｓ６Ｋ１およびＡｋｔのＰＤＫ１調節部位のリン酸化を阻止することを実証した。次に、これによって、アポトーシス促進タンパク質であるＢＡＤのリン酸化状態の低減がもたらされ、その結果、ＩＬ３依存性３２Ｄ細胞の細胞死が引き起こされた。
【０４４２】
ノックアウト研究では、Ｌａｗｌｏｒら（ＥＭＢＯ  Ｊ、２００２年、第２１（１４）巻、３７２８〜３８頁）が、ＰＤＫ１の正常レベルの１０％しか発現しない、ＰＤＫ１の低次形態対立遺伝子を有するマウス、ＰＤＫ１を欠失しているマウスを産生した。ＰＤＫ１（−／−）胚は、多発奇形を示し、胚齢９．５日で死亡する。対照的に、低次形態ＰＤＫ１マウスは、対照動物より４０〜５０％小さいが、生存可能である。同様に、臓器および細胞体積も、これに比例して減少している。筆者は、ＰＤＫ１はマウスの胚発生に必須であり、細胞の大きさを調節すると結論している。
【０４４３】
３）Ｊａｋ３
ＳＴＡＴは、チロシンリン酸化によって活性化されるまで細胞質に局在しているＤＮＡ結合タンパク質ファミリーを構成する。ＳＴＡＴのリン酸化は、ＪＡＫ３を含めたチロシンキナーゼのＪａｎｕｓファミリーのメンバーによって触媒される。しかし、Ｊａｋファミリーには、ＳＴＡＴファミリーを介した遺伝子転写の活性化だけではなく、より一般的な役割もあることが判明している。少なくとも細胞活性化の一例において、Ｊａｋ３は、ＰＩ３Ｋの調節サブユニットと会合し、ｐ８５サブユニットのチロシンリン酸化を媒介することによってＩＬ−７誘発性のＰ１３キナーゼ活性化を調節することが示されている。ＩＬ−７誘発性Ｊａｋキナーゼ活性の特異的阻害は、ｐ８５チロシンリン酸化、それに続くＰＩ３キナーゼの活性化、そして最終的には増殖を、排除する（Ｓｈａｒｆｅら、Ｂｌｏｏｄ、１９９５年、第８６（６）巻、２０７７〜８５頁）。
【０４４４】
アポトーシスおよび生存におけるＪａｋ３の重要性が阻害剤研究で認められる。Ｊａｋ３の特異的阻害剤であるＷＨＩ−Ｐ１３１は、濃度依存的様式で、ＪＡＫ３陽性白血病細胞系ＤＡＵＤＩ、ＲＡＭＯＳ、ＬＣ１；１９、ＮＡＬＭ−６、ＭＯＬＴ−３、およびＨＬ−６０のクローン原性増殖を阻害する（ただし、ＪＡＫ３陰性ＢＴ−２０乳癌、Ｍ２４−ＭＥＴメラノーマ、またはＳＱ２０Ｂ扁平上皮癌細胞系を阻害しない）。これらの知見に基づき、筆者らは、ＷＨＩ−Ｐ１３１など、ＪＡＫ３の強力かつ特異的な阻害剤は、小児癌の最も一般的な形態である急性リンパ芽球性白血病に対する新規治療戦略の設計の基礎を提供しうると結論している（Ｓｕｄｂｅｃｋら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９年、第５（６）巻、１５６９〜８２０頁）。さらに、Ｊａｋ３の阻害剤である、ＷＨＩ−Ｐ１３１およびＷＨＩ−ｐ１５９は、グリア芽腫細胞の接着および移動の強力な阻害剤である（Ｎａｒｌａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４（１０）２４６３〜７１頁）。
【０４４５】
Ｊａｋ３欠失マウスは、リンパ系細胞数の大幅な低減を示した。Ｊａｋ３欠失マウスから得た胸腺細胞および末梢Ｔ細胞は、高いアポトーシス指数を有し、これは、Ｊａｋ３が生存シグナルをもたらすことを示唆する。Ｗｅｎら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００１年、第２１（２）巻、６７８〜８９頁）は、Ｊａｋ３によるＴリンパ球新生の調節は、少なくともその一部が、ＢａｘおよびＢＣＬ２の選択的調節を介したものであると報告している。Ｊａｋ３欠失胸腺細胞は、野生型同腹仔の同細胞に比べて、Ｂａｘの発現レベルが上昇しており、また、ＢＣＬ２の発現レベルが低下している。彼らは、Ｊａｋ３が、アポトーシス促進性および抗アポトーシス性のＢＣＬ２ファミリータンパク質の選択的かつ細胞内容依存的調節によって細胞生存を調節すること、ならびに、ＢａｘおよびＢＣＬ２がＴ細胞の発生において別個の役割を演じていることを示唆し、結論付けた。
【０４４６】
４）ホスホフルクトキナーゼ、肝臓（ＰＦＫＬ）
ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ；ＡＴＰ：Ｄ−フルクトース−６−リン酸−１−ホスホトランスフェラーゼ）は、２カ所の別個の遺伝子座の産物のランダムな会合によって形成される四量体であり、それによって５種類の可能な四量体が形成される。筋肉および肝臓のＰＦＫは、それぞれ、ＭおよびＬサブユニットのホモ四量体である。赤血球は、５つのアイソザイム：Ｍ４、Ｍ３Ｌ、Ｍ２Ｌ２、ＭＬ３、およびＬ４をすべて有する。肝ホスホフルクトキナーゼは、解糖において機能し、フルクトース−６−リン酸をフルクトース１，６−二リン酸へとリン酸化する。
【０４４７】
６−ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）は、正常細胞および腫瘍細胞の両方で解糖の調節における中心的役割を果たす。ＰＦＫは、パスツール効果も媒介するので、ほとんどの細胞システムでエネルギー生産の２つの方法、すなわち解糖および呼吸を協調させる。癌細胞におけるエネルギー生産は、好気的解糖（ワールブルク効果）の優勢と、パスツール効果の低下または欠如を特徴とする。
【０４４８】
Ｓｔａａｌら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９８７年、第４７（１９）巻、５０４７〜５１頁）は、神経膠腫組織のＰＦＫＬレベルが、正常脳組織に比べて増大していること、および、これが、正常なＰＦＫのレベルの低下に対応していることを実証した。他の研究者は、正常甲状腺組織内のホスホフルクトキナーゼと比べて、癌腫内のＰＦＫ活性が有意に増大していることを報告した。小胞状腺腫の比活性は、かなり不均一である。これらの腫瘍を、組織病理学的基準によって判断して、増殖活性の増大に応じた３つのグループに分割した場合、ホスホフルクトキナーゼの最も高い比活性は、増殖活性が最も高いグループに見いだされた。後者のグループの酵素活性は、癌腫内で見られたものに類似している。ＰＦＫの３つのアイソザイムＭ（筋肉）タイプ、Ｌ（肝臓）タイプ、およびＰ（血小板）タイプがすべて存在していた（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎら、Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ、１９８６年、第７（１）巻、７〜９頁）。
【０４４９】
ヒト白血病、リンパ腫、ウイルス形質転換細胞系、ならびにリンパ系、骨髄、赤血球系、および線維芽細胞由来の樹立された悪性細胞系からの悪性細胞、およびそれらの正常対応物に由来する、ＰＦＫのアイソザイムプロフィールのさらなる研究から、すべての悪性組織においてＰＦＫＬレベルの増大が認められることが明らかになった（Ｖｏｒａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９８５年、第４５（７）巻、２９９３〜３０００１頁）。
【０４５０】
このように、本明細書に記載のスクリーニングアプローチを用いて同定された遺伝子の中には、癌および炎症性疾患の治療標的として認められており詳細に特徴付けされているアポトーシス調節因子がかなり多数ある。このことから、本発明で初めてアポトーシス調節因子として同定された遺伝子も、治療標的候補である。
【０４５１】
実施例３：正常組織試料と形質転換組織試料とを対比した、同定された遺伝子標的の示差的発現、および癌細胞系でのそれらの発現
この実施例は、標的遺伝子の発現レベルについての正常組織および形質転換組織のスクリーニングを記述する。加えて、様々な組織から単離された広範な癌細胞系にわたって、これらの遺伝子の発現を調べた。発現は、リアルタイムＱＰＣＲを用いて測定した。
【０４５２】
Ａ）正常組織および形質転換組織、ならびに癌細胞系における、示差的発現
正常組織ＲＮＡおよび腫瘍組織ＲＮＡの供給源
以下に示す組織に関して、一群の腫瘍および対応する隣接正常組織（ＮＡＴ）のＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ社から入手した。各試料は、プールされていない個々のヒト腫瘍および隣接正常組織より得た。腫瘍の分類は以下の通りである。
【０４５３】
2006518590.tif 000003
【０４５４】
癌細胞系
表３に示す癌細胞系を、国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手して、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩで維持した。細胞は、５％ＣＯ２含有の加湿雰囲気中、３７℃で培養し、この後にＱＰＣＲ用の全細胞ＲＮＡを単離するために、集密になった時点でトリプシン処理によって回収する。
【０４５５】
全細胞ＲＮＡの単離
下記細胞系を、対数増殖で増殖させる。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてメーカーの説明書に従って調製する。各細胞系につき、５×１０６の細胞を採取し、その細胞ペレットをβ−メルカプトエタノールを含有する６００μｌのＲＬＴ緩衝液中で溶解させる。試料をＲＮｅａｓｙカラムに添加する前に、溶解物をＫＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）に通すことによって、ＤＮＡを剪断する。ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅを用いてカラム上消化することによりＤＮＡを除去し、続いて緩衝液で洗浄し、ＲＮａｓｅフリーのＨ２Ｏ中に溶出した。
【０４５６】
ＱＰＣＲ分析用のｃＤＮＡ調製
オリゴ（ｄＴ）プライマーでプライミングしたＲＮＡ（１〜２μｇ）を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＲＴ緩衝液、およびｄＮＴＰｓを含有する反応液中で、メーカーの説明書に従い、第１鎖ｃＤＮＡへと逆転写する。反応液を４２℃で２時間インキュベートし、使用するまで−２０℃で保存する。
【０４５７】
定量的ＲＴ  ＰＣＲの実施
Ｑｉａｇｅｎ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキットは、ホットスタートＴａｑポリメラーゼと、最適化濃度のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎとを含有するマスターミックスを、専用緩衝液と共に提供する。その緩衝液は、各ＰＣＲサイクルのアニーリングステップにおける非特異的プライマー結合に対する特異的結合の比率が高くなるようにＫＣｌおよび（ＮＨ４）２ＳＯ４をバランスよく組み合わせて含有している。これによって、ＭｇＣｌ２濃度を最適化する必要がなくなっている。メーカーの説明書に従って、このキットを用いた。
【０４５８】
・ＯｐｔｉｃｏｎリアルタイムＰＣＲ機器（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｃｈ社）および設定
実験パラメータは、各操作についてマスターファイルを作成することによって定める。マスターファイルには、以下の３構成要素がある。 
１  プレートファイル
２  プロトコールファイル
３  オプションファイル。
【０４５９】
プレートファイル：ウェルを試料、標準、ブランク（テンプレートを含まない対照）、または空のウェルとして割り振るプレートのレイアウトを設定する。
【０４６０】
プロトコールファイル：ＰＣＲパラメータおよびプレートリードステップを設定し、融解曲線プロフィールの組み込みを可能にする。
【０４６１】
オプションファイル：データ処理および定量化のオプションを設定する。これには、以下を含む。
【０４６２】
１．標準およびゼロを適用：各ウェルからのデータに対する正規化定数の適用による、ウェル間のシグナル変動の正規化。
【０４６３】
２．ブランクの減算：ブランクとして指定されたウェルからのデータを、試料データから差し引くことができる。
【０４６４】
３．ベースラインシグナルの減算。
【０４６５】
４．閾値：定量化で使用するＣ（Ｔ）サイクル閾値ラインを設定する。それは、手作業でまたは自動的に、規定サイクル範囲に対する平均値を超えた多様な標準偏差に設定されうる。
【０４６６】
オプション設定は、操作後のデータ解析中に調整できる。
【０４６７】
・定量化
開始コピー数と検出前のサイクル数との関係性を、試料中のテンプレートの初期量を計算するのに用いることができる。最初に、閾値またはＣ（Ｔ）ラインの位置を、蛍光 対 サイクル数のグラフ上に定義しなければならない。通常、これは、試料がバックグラウンドノイズを超え、増加し始めるポイントに設定される。次に、個々の試料に関する閾値サイクルを、蛍光トレースとＣ（Ｔ）ラインとが交差するサイクルとして定義する。定量化標準物質を含めることによって、対数量 対 Ｃ（Ｔ）サイクルの標準曲線のグラフをプロットすることができる。そして、試料の閾値サイクルをその標準曲線に適用することによって、未知試料中の初期テンプレート量を計算できる。
【０４６８】
ＲＴ反応の効率の相違を補正するために、参照ハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨまたはＲＰＳ１３）に対するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行い、その結果を標的 対 参照遺伝子テンプレート量の比率として示す。
【０４６９】
・標準物質
ＲＮＡ標準物質およびＤＮＡ標準物質は、両方とも定量的ＰＣＲで一般的に用いられている。これらの実験には、ｐＭＳＣＶベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）中にクローニングしたＰＣＲ産物からなるＤＮＡ標準物質を用いた。この方法では、大量の参照物質を生成することができ、それは分光光度法で定量化できる。プラスミドは線状化するが、それはそのような形態の方がｃＤＮＡの増幅効率をより近似的にシミュレートするからである。１００ｐｇ／ｍｌ〜１ｆｇ／ｍｌまでの標準物質の１０倍希釈物を含めて、試験ｃＤＮＡの結果の範囲を包含する範囲を決定する。
【０４７０】
ＱＰＣＲの手順を以下のように要約する：ｃＤＮＡテンプレートを、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ２０４１４３）を用い、標的特異的なＱＰＣＲプライマーで増幅する。増幅条件は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの初期活性化のための１５分間にわたる９５℃のステップ、それに続いて３５サイクルの（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）を含む。５２１ｎｍでの試料の蛍光を、そのプロトコールのアニーリングステップと伸長ステップとの間で測定する。融解曲線を、３５サイクルの終わりに計算して、生成物の均質性を確認する。
【０４７１】
標準曲線は、ＲＰＳ１３対照テンプレート希釈液（上記の通り）の対数［テンプレート量］を用いて、そのウェルで測定された蛍光強度がサイクル閾値パラメータ（Ｃ（Ｔ）値）で指定されたレベルを超える時点のサイクル数に対して、プロットする。処理試料の初期テンプレート量の推定値をこのプロットから決定し、そして、各試料中に存在する標的ｍＲＮＡの量を、各試料についてＲＰＳ１３に対する標的の比率を計算することによって、試料間で正規化する。
【０４７２】
・ＰＣＲプライマー
標的遺伝子に対するプライマーは、Ｇｅｎｅｔｏｏｌソフトウェア（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）を用いて設計し、表４に配列を示す。
【０４７３】
正常組織と癌組織との間での標的の示差的発現
ＱＰＣＲによって測定されるように、ある範囲の対応正常組織および癌組織全体にわたって、標的遺伝子の示差的発現が認められる。表５は、対応ペア間での相違倍率を表す。提示する結果は、同定した遺伝子（例えば、ＧＰＲ８６、ＧＲＡＦ、ＥＫＩ、ＮＴＫＬ、ＣＤＣ４２、ＲＢＳＫ、ＥＤＧ６、ＰＲＫ／ＣＮＫ、ＦＬＴ４、およびＰＳＫＨ１）が、隣接した正常組織と比較して、示差的に発現されており、かつ／または癌と相関していることを実証する。これは、これらの遺伝子の脱調節した発現と、癌表現型の発現との間の相関を示す。
【０４７４】
これらの例は、同定されたアポトーシス関連遺伝子が、癌表現型と正の相関を有することを実証する。
【０４７５】
遺伝子標的は一連の癌細胞系で発現される
表６は、様々な癌タイプから得られた広範囲な癌細胞系にわたる候補遺伝子の示差的発現を示す。絶対レベルをＱＰＣＲを用いて測定し、ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＳ１３）に対して正規化した。
【０４７６】
標的遺伝子の発現は、身体の様々な部位から単離された広範な癌細胞系の一部またはすべてにおいて検出される。発現レベルは、癌細胞型に応じてかなり相違している。
【０４７７】
Ｂ）さらなる発現プロフィール
発現プロファイリングを、表７に特定するさらなる範囲の癌細胞系について別のＱＰＣＲ法を用いて拡張した。
【０４７８】
細胞系からの全細胞ＲＮＡの精製
表７に示す細胞系を対数増殖で増殖させる。ＲＮＡは、おおよそ上述の通りに、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて調製する。試料をＲＮｅａｓｙカラムに添加する前に、ローターステーターホモジナイザーを用いたホモジナイゼーションによって、ＤＮＡを剪断する。ＲＮＡは、合計４００μｌのＲＮａｓｅフリーのＨ２Ｏ中に溶出する。ＤＮＡフリーのＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、メーカーの説明書に従い、１５分間処理することによって混入ゲノムＤＮＡを除去し、さらにＤＮａｓｅ活性を樹脂ベースの不活性化によって除去する。ＲＮＡをエタノール沈殿させ、７０％エタノール中で洗浄し、その後、ＲＮＡ保存緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ社）に懸濁した。
【０４７９】
ＱＰＣＲ分析用のｃＤＮＡ調製
ランダムヘキサヌクレオチドプライマーでプライミングしたＲＮＡ（１０μｇ）を、ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（ＡＢＩ）を用いて、逆転写酵素、ＲＴ緩衝液、およびｄＮＴＰｓを含有する反応液中で、第１鎖ｃＤＮＡに逆転写する。反応液を２５℃で１０分間、３７℃で２時間インキュベートし、その後、使用するまで−７０℃で保存する。
【０４８０】
定量的ＰＣＲ
遺伝子発現の定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）プロファイリングを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ２×マスターミックスキット（Ａｂｇｅｎｅ社）を用いて、メーカーの説明書に従って行う。ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡＢＩ）またはウェブベースのＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のいずれかを用いて設計する。すべてのプライマーを、アニーリング温度６０℃で、９０ｂｐ〜１２０ｂｐのアンプリコンを生成するように設計し、さらに、標的配列の増幅が最適かつ特異的になる濃度を特定するため、標準的なＱＰＣＲ反応においてそれらを５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭでテストする。プライマー配列と、決定された最適濃度とを表８に示す。
【０４８１】
増幅は、ＡＢＩ７０００配列検出システムを用いて、メーカーの説明書に従って行う。各ＰＣＲは、５０ｎｇのＲＮＡから得られたｃＤＮＡとともに、適切なプライマーおよび１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックスを全量２５μｌとして含めた。遺伝子発現レベルは、標準的方法に従い、比較Ｃｔ（サイクル閾値）法を用いて、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と比較して表す。簡潔には、各細胞系試料について、標的遺伝子のＣｔから、ＧＡＰＤＨのＱＰＣＲから得られたＣｔ値を差し引き、ΔＣｔと呼ばれる値を求める。各プレート中の内部対照は、各ΔＣｔを正規化してＱＰＣＲ実験間の変動を排除できるようにし、それによりΔΔＣｔと呼ばれる値が算出される。ＧＡＰＤＨと比較した、各試料中における標的遺伝子の発現は、相対発現＝２−ΔΔＣｔの方程式を用いることで計算される。
【０４８２】
癌細胞系における標的遺伝子の発現を示す代表的データ
発現プロファイリングデータを、図５に「ヒートマップ」として示す。ヒートマップでは、各標的遺伝子の発現レベルが、異なった影で表される。各遺伝子の発現を、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現と比較して記述する。
【０４８３】
データの概要
この発現プロファイリングデータは、１２個の同定された標的遺伝子が、ヒト腫瘍の様々なタイプを代表するある範囲の細胞系全体で発現されていることを示す。ＢＡＩ２は、試験したすべての細胞系で、ＧＡＰＤＨと比較して対数３の値域で発現され、特定の癌タイプで顕著な出現率を示さない。これは、ＤＡＧＫ−θおよびＥＫＩの発現についてもあてはまる。ＧＰＲ１２  ｍＲＮＡの発現は、細胞系パネルの２／３で検出可能であり、発現レベルは、対数５という高い値域を示す。ＧＰＲ１２発現が、主として、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、および前立腺癌を代表する細胞系に存在することは、注目に値する。これは、ＧＰＲ１２の発現が低レベルまたは検出不可能なレベルであるメラノーマおよび卵巣細胞系とは大きく異なっている。ＧＰＲ１２を発現する細胞系のうち、３株の乳腺細胞系、１株の肺細胞系、および２株の膵臓細胞系が、ＧＰＲ１２  ｍＲＮＡを平均レベルよりも高発現しており、つまりこの遺伝子を過剰発現していると考えられる。ＧＰＲ８６遺伝子は、その一連の癌細胞系全体にわたりＧＡＰＤＨと比較して対数５の値域を有する広範囲の発現を示し、いかなる癌細胞タイプでも特に優勢を示さない。ＧＲＡＦ遺伝子は、試験した細胞系すべてで発現され、対数３の値域内の、狭い分布の発現を示す。ＧＲＡＦは、一連の細胞系全体にわたり、比較的高いレベルで発現されるが、ＧＲＡＦ発現が、結腸直腸細胞系および膵臓細胞系を代表する細胞系で特に優勢であることは注目に値する。ＩＴＰＫＣの発現は、試験した細胞系すべてで検出可能であるが、発現レベルは対数４の値域に分布する。ＩＴＰＫＣ発現は、乳癌および前立腺癌から得られた細胞系で特に高い。ＮＴＫＬ発現のプロファイリングは、この遺伝子がこの一連の癌細胞系全部にわたって比較的高いレベルで発現され、たった対数２の値域に及ぶ特に狭い分布を示すことを実証する。ＲＢＳＫは、この一連の細胞系全体で、対数４の値域で発現される。乳腺細胞系、結腸直腸細胞系、および前立腺細胞系の大部分が、この細胞系群全体の発現平均と比較して、相対的に高いレベルのＲＢＳＫを発現することは注目に値する。ＲＯＣＫ１およびＵＬＫ１遺伝子は、一連の細胞系全体で発現され、いかなる特定の癌タイプでも顕著な優勢を示さない。ＵＫＨは、一連の癌細胞系全体で、対数３の値域にわたって、比較的高いレベルで発現される。とりわけ、ＵＫＨは、乳癌、肺癌、および卵巣癌を代表する多くの細胞系で非常に高いレベルで発現される。
【０４８４】
実施例４：同定された遺伝子の過剰発現はアポトーシスを機能的に変調（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する
赤白血病ＴＦ１細胞系は、成長因子依存性であり、培養中、生存にＧＭ−ＣＳＦを必要とする。ＧＭ−ＣＳＦを排除することで、ＴＦ１細胞は自然発生的にアポトーシスを生じる。ＥＤＧ６およびＴＬＫ２などの、アポトーシス過程の候補調節因子の効果は、これらの細胞に候補遺伝子を導入し、それに続いて、アポトーシスの程度を測定することによって、これらの細胞で判定することができる
光散乱分析によるＴＦ１アポトーシスの分析
光散乱分析は、フローサイトメータのレーザビームを用いることによって、細胞のサイズ（前方散乱）と粒度（側方散乱）とを測定できることを利用する。サイズの減少（縮小）および粒度の低下などの、アポトーシスに伴う形態変化は、これらのパラメータに影響を与える。結果として、アポトーシスを起こしている細胞は、健常集団のパラメータから、左側に、そして、わずかに下側に移動するであろう。
【０４８５】
ＴＦ１細胞を、２４ウェルプレート（２×１０５／ｍｌ）にプレーティングし、ＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で４８時間培養する。その後、遠心（１０００ｒｐｍ、１０分間）によって、細胞を回収し、それをＰＢＳで洗浄する。そのペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し（２×１０５細胞／ｍｌ）、ＦａｃｓＣａｌｉｂｒｅによって取得する。前方および側方散乱パラメータは、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて評価する。
【０４８６】
Ｓｕｂ−Ｇ１期分析によるＴＦ１アポトーシスの分析
ＴＦ１細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で４８時間培養する。その後、遠心（１０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄する。そのペレットをＰＢＳに再懸濁し（２×１０５細胞／ｍｌ）、その後、１ｍｌを、氷冷７０％ＥｔｏＨに、継続的にボルテックスしながら、滴下により加える。その後、細胞を、−２０℃で２４時間インキュベートすることによって、透過化処理する。ＤＮＡを染色するため、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄する。細胞を、５００μｌのヨウ化プロピジウム緩衝液（ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）；ＲＮａｓｅ  Ａ（５０μｇ／ｍｌ））に再懸濁し、暗黒下に１５分間置いた後、ＦａｃｓＣａｌｉｂｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いたフローサイトメトリー解析を行う。分析は、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて行う。
【０４８７】
ＧＭ−ＣＳＦ排除は生存ゲート（ｌｉｖｅ  ｇａｔｅ）内の細胞の割合を減少させる
ＧＭ−ＣＳＦの不在下でＴＦ１細胞を培養すると、細胞死が誘導される。この死は、前方および側方散乱パラメータに見られる形態変化を引き起こし、これらは、ＦａｃｓＣａｌｉｂｒｅ分析によって検出できる。その結果、生存ゲート（これは、ＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で増殖させたＴＦ１細胞の健常集団について事前に設定した任意の領域である）内の細胞の割合を観測することによって、サイトカインが排除されたときに、これらの光散乱パラメータを有する細胞の割合の低下が観測される。
【０４８８】
図６は、４８時間の因子排除によって、生存ゲート内の細胞の割合が７７％から３５％まで低下していることを示すが、これは、この期間全体で約５０％の低下を表す。
【０４８９】
図７は、ＧＭ−ＣＳＦの不在下で４８時間増殖させたＴＦ１細胞では、アポトーシスを起こしている細胞を示すｓｕｂ−Ｇ１プロフィールを有する細胞が５％から約５５％まで増加していることを示す。
【０４９０】
対照アポトーシス調節因子ＢＣＬ２の発現はＴＦ１細胞のアポトーシスを阻害する
これまでに、多数の遺伝子産物について、細胞へのアポトーシス刺激の効力を調節することが示されている。これの典型的例がＢＣＬ２タンパク質発現であり、この遺伝子の過剰発現によってアポトーシスが阻害されることが多くの細胞性システムですでに示されてきている（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙ  Ｄ、Ｎｕｎｅｚ  Ｇ、Ｍｉｌｌｉｍａｎ  Ｃ、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＲＤ、Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  ＳＪ、Ｎａｔｕｒｅ、第３４８（６２９９）巻、３３４〜６頁、１９９０年）。本発明者らは、ヒトＢＣＬ２遺伝子をＴＦ１細胞に形質導入して、ＧＭ−ＣＳＦ排除後の生存に対する影響を試験した。
【０４９１】
ＴＦ１細胞におけるＢＣＬ２過剰発現の抗アポトーシス効果を評価するために、完全長ＢＣＬ２コード配列を発現するレトロウイルス、またはＢＣＬ２を欠失している対照ベクターを用いて、細胞に形質導入する。その後、４８時間にわたりＧＭ−ＣＳＦを排除することによって、アポトーシスを引き起こすように細胞を誘導する。生存ゲート（ＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で増殖させたＴＦ１細胞の健常集団について事前に設定した任意の領域）に残留している形質導入細胞の割合を記録する。抗アポトーシス活性の指数は、試料＋／−ＧＭＣＳＦにおける差異をコンピュータ処理することによって計算する。
【０４９２】
図８から判るように、培養培地からＧＭ−ＣＳＦを除去すると、生存ゲート（ゲートで示す）から外へ移動する細胞の数によって測定される通り、対照細胞のアポトーシスが誘導される。対照的に、ＢＣＬ２を発現させると、生存ゲートから移動する細胞の数が減少する。ＧＭ−ＣＳＦの排除によって誘発されるアポトーシスを阻止するＢＣＬ２の能力は、以前に報告されている（Ｉｔｏ、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＣＬ２  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＴＦ１、Ｒｉｎｓｈｏ  Ｂｙｏｒｉ、１９９７年、第４５（７）巻、６２８〜３７頁）。
【０４９３】
これらのデータは、アポトーシス活性または生存活性を測定するためのこのアッセイの妥当な性質を示すものである。
【０４９４】
同定されたＧＰＣＲ  ＥＤＧ６の過剰発現はＧＭ−ＣＳＦの排除で誘発されるＴＦ１細胞のアポトーシスを減少させる
ＥＤＧ６のアポトーシス活性を評価するために、ＥＤＧ６コード配列を発現するレトロウイルス、またはＥＤＧ６を欠失した対照ベクターを用いて、ＴＦ１細胞に形質導入する。表１Ｂに記載のアミノ酸配列をコードするＥＤＧ６コード配列を、レトロウイルス発現ベクターｐＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）中にクローニングする。プラスミドは、ＣａｌＰｈｏｓ哺乳類トランスフェクションキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いて、レトロウイルスパッケージング細胞系Ｐｈｏｅｎｉｘ  ２９３（Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ）に、メーカーの説明書に従って、トランスフェクションする。レトロウイルスは７２時間後に回収する。レトロウイルスをＴＦ１細胞に、１８時間インキュベートすることによって形質導入する。培地を交換し、さらに４８時間細胞をインキュベートする。
【０４９５】
形質導入した細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）の不在下または存在下でさらに４８時間培養し、その後、前方散乱／側方散乱パラメータを用いて、生存度を調べる。図９は、対照ＴＦ１細胞におけるＧＭ−ＣＳＦの排除によって、生存度が６５％まで低下するが、一方、ＥＤＧ６を過剰発現する細胞は７９％を超える生存度を有したことを示し、これは、ＥＤＧ６発現が、ＴＦ１細胞において生存をもたらすことを示すものである。
【０４９６】
同定されたキナーゼＴＬＫ２の過剰発現はＴＦ１細胞でアポトーシスを誘導する
ＴＬＫ２のアポトーシス活性を評価するために、ＴＬＫ２コード配列を発現するレトロウイルス、またはＴＬＫ２を欠失した対照ベクターを用いて、ＴＦ１細胞に形質導入する。表１Ｂに記載のアミノ酸配列をコードするＴＬＫ２コード配列を、レトロウイルス発現ベクターｐＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）中にクローニングする。プラスミドは、ＣａｌＰｈｏｓ哺乳類トランスフェクションキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いて、レトロウイルスパッケージング細胞系Ｐｈｏｅｎｉｘ  ２９３（Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ）に、メーカーの説明書に従って、トランスフェクションする。レトロウイルスは７２時間後に回収する。レトロウイルスをＴＦ１細胞に、１８時間インキュベートすることによって形質導入する。培地を交換し、さらに９６時間細胞をインキュベートする。
【０４９７】
９６時間後に、前方散乱／側方散乱パラメータを用いて、細胞の生存度を試験する。図１０は、対照細胞集団がまだ生存能力を有している（４６．３３％）のに対して、ＴＬＫ２トランスフェクション細胞集団がほとんどすべて死亡している（生存細胞は０．４８％）ことを示す。これらのデータは、ＴＬＫ２が、ＴＦ１細胞において、強力なアポトーシス促進作用を媒介することを実証する。
【０４９８】
実施例５：癌細胞系における、同定された遺伝子のノックダウン
これらの遺伝子のサイレンシングによる機能的影響を、低分子干渉ＲＮＡオリゴマーを用いて調べる。このサイレンシングの効果は、実施例６〜８に記載するような生存度アッセイおよびアポトーシスアッセイを用いて測定する。
【０４９９】
各ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが意図する標的をノックダウンする能力を評価するために、その標的を発現することが既知の細胞系で各ｓｉＲＮＡを評価した。ノックダウンの効力は、２つの別々の実験、Ａ）およびＢ）でＱＰＣＲを用いて測定した。
【０５００】
Ａ）
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計
同定された新規の遺伝子であるキナーゼ／ＧＰＣＲＳのコード配列を、ＧＣ含量４０〜５５％のＡＡＮ１９ＴＴ  ｓｉＲＮＡ標的配列についてスクリーニングする（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）。候補オリゴヌクレオチドをＧｅｎｂａｎｋデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索に供して、選択された配列が、他のいかなるヒト遺伝子とも有意な相同性を共有しないことを確実にする。さらに、サブセットの遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、Ａｍｂｉｏｎ社によって、それらの専売設計アルゴリズムを用いて設計された。選択されたオリゴヌクレオチドを表９に示す。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、Ｎ１９（ＲＮＡ）＋ＴＴ（ＤＮＡ）として、Ｑｉａｇｅｎ社によって化学的に合成され、Ｑｉａｇｅｎ  ＨＰＰ標準にまで精製される。これらのオリゴはアニールされた状態で供給される。そのオリゴを、ｓｉＲＮＡ緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中に、２０  Ｍの濃度で再懸濁し、９０℃で１分間、その後、３７℃で１時間インキュベートする。Ａｍｂｉｏｎ社によって設計されたｓｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ社によって化学的に合成されて、ＨＰＬＣによって精製される。これらのｓｉＲＮＡ二本鎖は、Ｈ２Ｏ中に２０μＭにて再懸濁する。二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要になるまで−２０℃で保存する。
【０５０１】
遺伝子発現のサイレンシングにおけるｓｉＲＮＡの有効性の検証
各ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドがその意図した標的をノックダウンする能力について評価するために、その標的を発現することが既知の細胞系で各ｓｉＲＮＡを評価した。この例では、遺伝子をＰＣ３細胞で試験した。ＰＣ３細胞については、発現プロファイリングによって、すべての標的遺伝子を発現することが示された。ノックダウンの有効性は、ＱＰＣＲを用いて測定した。細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに、細胞密度２×１０４でプレーティングし、３７℃で、一晩インキュベートする。ＲＮＡｉＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）と濃度５０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて、メーカーの説明書に従い、ｓｉＲＮＡを細胞内にトランスフェクションする。別のウェル中の細胞は、５０ｎＭの非サイレンシング対照（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションする。後者の試料は、ＲＮＡｉの陰性対照として機能し、また、ｓｉＲＮＡによるノックダウンの特異性を証明する。トランスフェクションした細胞は、トランスフェクションの２４時間後に回収し、カラム上でのＤＮａｓｅ消化ステップを用いたＲＮｅａｓｙミニプレップカラムを用いて、ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーのＨ２Ｏ  ３０μｌ中に溶出する。ｃＤＮＡは、このＲＮＡ  １２μｌから、アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓｉｇｍａ社）と、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、メーカーの説明書に従って、全量２０μｌにて５５℃で、合成する。この結果得られたｃＤＮＡを、Ｈ２Ｏで合計２００μｌに希釈し、１０μｌをそれぞれのＱＰＣＲ反応で用いる。転写産物のレベルは、非サイレンシング対照と比較して、ＱＰＣＲによって比較する。ＱＰＣＲは、発現プロファイリングに用いたものと同一のプライマー、条件、および手法を用いて行う。表８を参照のこと。すべての反応を２重の実験にて行い、平均Ｃｔ値を計算した。各試料について、各標的遺伝子のＣｔ値をＧＡＰＤＨに対して正規化した。ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化された、標的でトランスフェクションした細胞と非サイレンシングｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞との間の相対発現を、比較Ｃｔ法で決定する。表１０は、ＰＣ３細胞においてノックダウンされた標的遺伝子の割合を、対照細胞（この場合非サイレンシングｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞）と比較して示す。
【０５０２】
Ｂ）
第２バッチのｓｉＲＮＡは、大体上述の通りに生成され、Ｎ１９（ＲＮＡ）＋ＴＴ（ＤＮＡ）としてＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）によって化学的に合成された。ｓｉＲＮＡオリゴの純度は、０．２μｍｏｌの合成スケール（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｃａｌｅ）によって記載されており、ＰＡＧＥで精製されている。このオリゴは、濃度２０μＭで、アニーリング緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中、９０℃で１分間にわたり、それに続いて３７℃で１時間にわたり、アニーリングさせる。二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要になるまで−２０℃で保存する。表１１は、選択されたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【０５０３】
遺伝子発現のサイレンシングにおける、ｓｉＲＮＡの有効性の検証
これらのｓｉＲＮＡオリゴについて、まず、その遺伝子が発現される細胞系、例えばＨｅｌａ、Ｕ２５１、ＴＦ１、またはＤＵ１４５細胞系で、有効性を試験する。細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに密度７．５〜１０×１０４でプレーティングし、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地（１×ダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社Ｄ２５５４）、０．００４％葉酸、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．３７％重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭピルビン酸ナトリウム）中、３７℃で、一晩インキュベートする。２μｇの二本鎖ｓｉＲＮＡを、米国特許出願第６０／４９８，４８８号に記載の方法に従って、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社１０４５９−０１４）を用いて、細胞内にトランスフェクションする。簡潔には、トランスフェクション溶液１ｍｌを調製するために、２μｇのｓｉＲＮＡ二本鎖を、１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ社）に添加し、これに、８μｌのＤＭＲＩＥ  Ｃ試薬を添加する。トランスフェクション混合物を、細胞に直接添加し、３７℃で４時間インキュベートする。この４時間のインキュベーションの後、トランスフェクション溶液を除去し、細胞に新しい培地を与え、さらに２４時間インキュベートする。トランスフェクション操作の毒性を最小限にするために、この時点でさらに培地の交換が必要である。トランスフェクションの２４時間後または４８時間後に、ｍＲＮＡ発現の分析用に細胞を回収する。追加ウェルの細胞は、上述の通り、２μｇのミスセンス対照物でトランスフェクションする。
【０５０４】
ＴＦ１細胞の場合、２４ウェルプレートの各ウェル中、２×１０５細胞／ウェルを、２μｇのｓｉＲＮＡにより、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ社）１ｍｌあたり８μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションする。細胞は、対照ミスセンスｓｉＲＮＡを並行して用いて、同時にトランスフェクションする。トランスフェクションの際、２ｎｇ／ｍｌの組換えＧＭ−ＣＳＦをＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に添加する。トランスフェクション培地は、４時間後に、２μｇ／ｍｌ  ＧＭＳＣＦおよび１０％  ＦＣＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ  １６４０に置換し、３７℃でインキュベートする。トランスフェクションの２４時間後に、培地を次のように交換する：２μｇ／ｍｌ  ＧＭＳＣＦを含有するＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳを、３つのウェルに添加し、ＧＭＳＣＦを含まないＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳを他の３つのウェルに添加する。これらの細胞は、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後にＱＰＣＲアッセイおよび表現型アッセイ用に回収する。トランスフェクションされない対照ＴＦ１細胞も、同様に処理する。試料は、トランスフェクション後の回収した時間、および培地中のＧＭ−ＣＳＦの存在（＋Ｇ）または不在（−Ｇ）に応じて、Ｔ４８＋Ｇ、Ｔ４８−Ｇと名付ける。上述の通り、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＱＰＣＲを行う。用いた短期間（トランスフェクションの７２時間後）細胞生存度アッセイ／アポトーシスアッセイについては、以下に論じる。
【０５０５】
ミスセンス対照物は、ＲＮＡｉ機構の活性化それ自体がその細胞にとって毒性ではないことを実証する陰性対照として機能する。ミスセンス対照物は、ｓｉＲＮＡオリゴマーによって誘発されるノックダウンの特異性も示す。使用されたミスセンス対照ｓｉＲＮＡオリゴの配列は以下の通りである：
ＭＳ
センス：ＵＧＡＧＡＡＵＧＵＧＡＵＧＣＧＣＧＵＣＴＴ
アンチセンス：ＧＡＣＧＣＧＣＡＵＣＡＣＡＵＵＣＵＣＡＴＴ。
【０５０６】
上記に概説したミスセンス対照物は、ＥＬＡＶ−１（アクセッション番号ＸＭ ００８９４７；ｇｉ１４７５９４１）用のｓｉＲＮＡオリゴ配列中に４塩基対のミスマッチ置換を導入するように、設計されている。そのｓｉＲＮＡオリゴは、これらの置換によって、ＥＬＡＶ−１の発現を低減することができなくなることが確認されたことから、したがってその置換によってＭＳ  ｓｉＲＮＡは真の陰性対照となる。
【０５０７】
これまでに、文献中でアポトーシスに関連すると記載されているさらなる遺伝子を、ＲＮＡｉアッセイにおける対照遺伝子として選択した。例えば、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（サービビン）は、その発現が癌で脱調節される既知の主要アポトーシス変調因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であり、癌発生における既知の薬物標的である。その発現（生存および癌の表現型を維持している）を、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的なｓｉＲＮＡオリゴによって減少させると、癌細胞は死滅する（以下に論じる細胞生存度アッセイによって説明する）。したがって、Ｓｕｒｖｉｖｉｎのノックダウンは、細胞傷害性の誘導に関する陽性対照を提供し、また、ノックダウンの際に標的遺伝子も癌細胞で細胞傷害応答を誘導する場合には、本明細書に特定された標的遺伝子のうち任意のものについての癌表現型を増強する上での機能および潜在的役割が、Ｓｕｒｖｉｖｉｎのノックダウンから類推により判断できるようになる。これらの対照と、それらに対して用いられたｓｉＲＮＡオリゴマーの配列を以下に示す。
【０５０８】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  Ｂ、ＳｕｒＢ、ＳＵＲＢ、ＳＵＲ）
センス：ＧＡＡＣＵＧＧＣＣＣＵＵＣＵＵＧＧＡＧｔｔ
アンチセンス：ＣＵＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＵＵＣｔｔ
ＰＩ３ＫＲ１
センス：ＡＵＧＡＵＣＧＡＵＧＵＧＣＡＣＧＵＵＵｔｔ
アンチセンス：ＡＡＡＣＧＵＧＣＡＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵｔｔ
ＢＣＬ２
センス：ＧＵＡＣＡＵＣＣＡＵＵＡＵＡＡＧＣＵＧｔｔ
アンチセンス：ＣＡＧＣＵＵＡＵＡＡＵＧＧＡＵＧＵＡＣｔｔ
ｃ−Ｒａｆ（ＣＲＡＦ）
センス：ＵＡＧＵＵＣＡＧＣＡＧＵＵＵＧＧＣＵＡｔｔ
アンチセンス：ＵＡＧＣＣＡＡＡＣＵＧＣＵＧＡＡＣＵＡｔｔ
本明細書に特定するアポトーシス関連遺伝子または対照に対するｓｉＲＮＡオリゴを用いて、ＤＭＲＩＥトランスフェクションを行った後、トランスフェクションの２４時間後または４８時間後に、上述の通りに、細胞を回収する。その後、ＫＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ社  ７９６５４）上での細胞溶解の後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ社７４１０４）を用いて、ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡを、分光学的分析で定量化し、１μｇを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮＡｓｅＨ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社１８０６４−０１４）を用いてｃＤＮＡに逆転写する。転写産物のレベルを、実施例３で詳細に記載した通りに、ミスセンス対照に対し、ＱＰＣＲによって比較する。ＱＰＣＲプライマーは、Ｑｉａｇｅｎ社発行のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲハンドブックに概説されたガイドラインに従って、長さが約１００〜３００ヌクレオチドのＰＣＲ産物をＣＤＳから増幅するように設計する。
【０５０９】
選択されたＱＰＣＲプライマーは、上述のように、その概要が表４に示されているものである。
【０５１０】
２種類のテンプレート標準物質を、ｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲ評価に用いる。
【０５１１】
１．対照ＲＰＳ１３、すなわち、それぞれ［１０００、１００、１０、１、および０．１ｆｇ］に希釈された、リボソームタンパク質サブユニット１３（ＮＭ ００１０１７）増幅ＰＣＲ産物を、転写産物のレベルを定量するのに使用する。  
２．正規化を目的として別々のＰＣＲ反応で、試料テンプレートからＲＰＳ１３を増幅する。
【０５１２】
遺伝子特異的な陽性対照、例えばＳｕｒｖｉｖｉｎ、またはミスセンス対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた適当な細胞系から得たｃＤＮＡテンプレートを、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎシステム（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）において、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社  ２０４１４３）を用いて、遺伝子特異的ＱＰＣＲプライマーで増幅する（実施例３で詳細に記載した通り）。増幅条件は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの初期活性化のための９５℃で１５分間のステップ、それに続く（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）の３５サイクルを含む。試料の５２１ｎｍでの蛍光を、プロトコールのアニーリングステップと伸長ステップとの間で測定する。融解曲線を、３５サイクルの終わりに計算して、産物の均質性を確認する。
【０５１３】
標準曲線は、ＲＰＳ１３対照テンプレート希釈液（上記の通り）の対数［テンプレート量］を用いて、そのウェルで測定された蛍光強度がサイクル閾値パラメータ（Ｃ（Ｔ）値）で指定されたレベルを超えた時点のサイクル数に対して、プロットする。処理試料中の初期テンプレート量の推定値はこのプロットから決定し、各試料中に存在する標的ｍＲＮＡの量は、各試料についてＲＰＳ１３に対する標的の比率を計算することによって、試料間で正規化する。
【０５１４】
正規化された発現値は、トランスフェクションされた対照細胞（この場合ミスセンスｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞）と比較して、標的のノックダウンの割合を算出するのに用いる。
【０５１５】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは標的遺伝子発現を低減するのに有効である
特定の遺伝子をｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでターゲッティングすることにより、その標的とした遺伝子のｍＲＮＡの発現が効率良く低減する。これは、それぞれのｓｉＲＮＡオリゴによる処理の前および後の細胞中に存在する特定のｍＲＮＡの相対的レベルを比較することによって、そして、ミスセンス対照オリゴでトランスフェクションされた細胞中の特定のｍＲＮＡのレベルを比較することによって測定される。実現されたノックダウンのレベルは、調べた細胞系の範囲で、各オリゴについて様々である。
【０５１６】
表１２は、４種の異なった細胞型をｓｉＲＮＡで処理した後の標的遺伝子の減少の割合を示す。
【０５１７】
ｓｉＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない
ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子発現の阻害は、標的細胞からのインターフェロンの非特異的な誘導と関連付けられてきた（Ｓｌｅｄｚ  ＣＡら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００３年９月、第５（９）巻、８３４〜９頁）。インターフェロンの誘導は、生物学的アッセイに影響を与える可能性があるため、本発明者らは、インターフェロンの誘導に対する本発明のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの効果を制御する。これは、２つのインターフェロン応答遺伝子、すなわちＯＡＳ１およびＧＢＰ１のｍＲＮＡレベルを、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの前と後の両方について定量することにより、調べる。
【０５１８】
ＱＰＣＲプライマーは、前述のように、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社によって設計されたものであるが、これは以下の通りである。  
2006518590.tif 000004
【０５１９】
図１１は、ＭＳまたはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを用いてｓｉＲＮＡトランスフェクションした後の７つの細胞系（ＨＣＴ１５、Ａ５４９、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、ＰＣ３、Ａ４９８、およびＵ２５１）における、２つのインターフェロン応答遺伝子、ＯＡＳ１（ＮＭ ００２５３４）およびＧＢＰ１（ＮＭ ００２５０３）のｍＲＮＡレベルの測定（前述のようにＱＰＣＲ定量による）を示す。これは、ＨＣＴ１５、Ａ５４９、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、およびＵ２５１細胞において、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、非トランスフェクション細胞と比較して、インターフェロン応答遺伝子のｍＲＮＡレベルを増強させないことを実証する。ＰＣ３およびＡ４９８細胞については、インターフェロン応答遺伝子のｍＲＮＡにいくらかの増大が認められたが、これは、特にミスセンス対照物（ＭＳ）を用いた結果から考えると、生物学的アッセイにおいて十分な影響を有する規模とは考えられない。
【０５２０】
ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞中のＯＡＳ１およびＧＢＰ１の発現レベルは、トランスフェクションされていない対照細胞中での発現レベルに対するパーセンテージで表す。
【０５２１】
実施例６：細胞における、同定された遺伝子のノックダウンは、短期間アッセイによって測定されるアポトーシスを機能的に変調する
この実施例は、同定された「新規」の遺伝子が、様々な細胞型でアポトーシス経路における基本的な役割を担っていることを実証する。本発明者らは、これらの遺伝子の機能的発現の破壊によって、広範な癌細胞系で、７２時間にわたってアポトーシスおよび細胞生存度が変調されることを実証する。
【０５２２】
ｓｉＲＮＡ活性の確認に続き、癌細胞系にｓｉＲＮＡ二本鎖を導入して、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現をノックダウンした際にアポトーシス／細胞生存度、および癌の表現型に関連した他の特徴（実施例７および８で論じる）が変調されるかどうか試験する。試験細胞系としてはＨｅｌａ、ＴＦ１、Ｕ２５１、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＨＣＴ１５、７８６−０、ＨＴ２９、Ｍ−１４、Ｈ４６０、ＬｎＣａｐ、ＤＵ１４５、Ａ５４９、Ａ４９８、ＨＣＴ１１６、ＰａｎＣ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８が挙げられる。
【０５２３】
特に示されている場合を除いて、トランスフェクションとそれに続くＱＰＣＲまたは細胞生存度／アポトーシスアッセイによる分析に用いられる方法は、用いる実験規模と、使用する細胞系とに応じて変動するのみである。簡潔には、試験細胞系を、トランスフェクションの２４時間前に、細胞系と必要な実験規模とに応じて異なるがトランスフェクションの際にそれらが４０〜７０％コンフルエントとなるような密度で、播種する。細胞は、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ社）１ｍｌあたり２μｇのｓｉＲＮＡ＋８μｌのＤＭＲＩＥ  Ｃ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションする。細胞は、対照ミスセンスｓｉＲＮＡを並行して用いて、それと同時にトランスフェクションする。トランスフェクション培地は、４時間後に、１０％ＦＣＳを含有する新鮮な培地に交換して、３７℃で２４時間インキュベートする。この２４時間のインキュベーションの後、トランスフェクション操作に関連した毒性を最小限にするために、さらなる培地交換が必要である。これらの細胞を、トランスフェクションの２４時間後または４８時間後にＱＰＣＲ分析用に回収する。前述の通り、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＱＰＣＲを行う。本発明者らの短期細胞生存度／アポトーシスおよび表現型アッセイ用には、トランスフェクションの４８時間後または７２時間後に細胞を回収し、本発明者らの長期生存度アッセイ（実施例７および８で論じる）用には、トランスフェクションの１０〜１４日後に、細胞を回収する。
【０５２４】
ＴＦ１細胞は、上述の通りに培養する。利用する細胞生存度／アポトーシスアッセイは、以下に論じる。
【０５２５】
特定の遺伝子のＲＮＡｉノックダウンによるアポトーシス誘導／細胞生存度の低下を検出するための生存試験の感受性は、上記に詳細に論じたように、各実験で、Ｓｕｒｖｉｖｉｎおよび／またはＢＣＬ２（アポトーシス／生存度対照）に対するｓｉＲＮＡオリゴ、およびミスセンス陰性対照オリゴを含めることによって評価する。
【０５２６】
７２時間にわたる、標的ノックダウンの細胞生存に対する影響の測定、すなわち、短期細胞生存度アッセイ
ＲＮＡｉによって標的遺伝子の発現をノックダウンした影響を測定するために、標的ｍＲＮＡが減少した細胞の生存度を、以下に記載する様々なアッセイを用いて調べる。さらに、生存度の低下が、アポトーシスによって生じたことを実証するために、多数のアポトーシスアッセイを行う。
【０５２７】
利用する細胞生存度アッセイおよびアポトーシスアッセイは以下の通り：
１．ＭＴＴハイスループットスクリーニング（ＭＴＴ  ＨＴＳ）
ＭＴＴアッセイは、細胞が、可溶性のＭＴＴ塩を不溶性の青いホルマザン結晶に変換する能力を測定する。この変換には、生存細胞のミトコンドリアコハク酸脱水素酵素の活性を必要とする。したがって、死んでいる細胞はＭＴＴを変換することができない。この結果、色変化の量は細胞集団の生存度のレベルに正比例する。
【０５２８】
本発明者らの標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴを用いたトランスフェクションの７２時間後に生存している細胞の数を、ミスセンスｓｉＲＮＡオリゴを用いてトランスフェクションした後に引き続き生存している細胞の数と比較し、本発明者らの標的遺伝子のそれぞれについて、調べた細胞系における細胞傷害性％を確認する。
【０５２９】
細胞を９６ウェルプレートに播種し、大気中５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃に一晩置いて細胞を付着させる。ウェルには、細胞系に応じた適切な数の細胞を播種する。次いで、目的の遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴマーを濃度２μｇにて用いて、細胞をトランスフェクションする。トランスフェクション混合物は、詳細に上述したように、８μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬を含有するＯｐｔｉｍｅｍ  １ｍｌ中、２μｇのｓｉＲＮＡ二本鎖からなる。トランスフェクションを４時間継続し、その後、トランスフェクション溶液を除去し、細胞に新鮮な培地を供給し、一晩インキュベートする。トランスフェクションの２４時間後に行うさらなる培地交換は、トランスフェクション試薬の毒性を最小限にする上で必須である。その後、上述の通り、トランスフェクション後さらに４８時間の間、３７℃のインキュベーションで細胞をインキュベートし、続いて、細胞数のＭＴＴ定量を行う。
【０５３０】
細胞生存度は、ＭＴＴアッセイを用いて決定する。簡潔には、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）中５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液１０μｌを、細胞の１００μｌアリコートに添加し、十分に混合し、３７℃で２．５〜４時間インキュベートする。生存細胞のミトコンドリアコハク酸脱水素酵素によって、可溶性のＭＴＴ塩が不溶性の青いホルマザン結晶に変換される。次に、培地を吸引によってウェルから除去し、１００μｌのＤＭＳＯを添加することによってホルマザン結晶を可溶化する。細胞生存度は、ＤＭＳＯによる可溶化の際に濃い紫色の溶液を生成するホルマザン結晶へのＭＴＴの変換と相関している。プレートは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｅｍａｘ精密マイクロプレートリーダーによって５７０ｎｍで読み取る。
【０５３１】
２．前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）分析
この実施例で使用するＦＳＣ／ＳＳＣ分析は、アポトーシスまたは壊死を起こしている細胞を、生存細胞から正確に識別できるアポトーシスアッセイである。これは、生存細胞、アポトーシス細胞、および壊死細胞の形態学と関連した細胞のサイズおよび粒度における特徴的な変化に基づいている。細胞集団の特徴的な細胞サイズおよび粒度を確認するために、ミスセンス対照でトランスフェクションされた細胞を、フローサイトメータを用いて分析する。ＦＳＣおよびＳＳＣスケールにおけるこの細胞集団の位置は、ゲートでこの集団を単離することによって認識する。本発明者らの標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴトランスフェクションの、細胞生存度への影響は、事前に記録された生存細胞ゲートからの細胞集団の移動を観測することによって確認する。壊死性の細胞は、崩壊する前にサイズが大きくなり、したがって、初期には、生存細胞集団の上方および右側への移行が認められ、次に、崩壊すると、ＦＳＣ／ＳＳＣプロットの細胞片箇所（下部左側）に完全に移行する。しかし、アポトーシス細胞は、徐々に細胞サイズを減少させながら生存細胞集団の左側へ単純に移行し、その後、アポトーシス後期には、細胞の粒度が増大するのに伴って徐々にＳＳＣスケールをシフトダウンする。
【０５３２】
したがって、アポトーシスに関連した細胞サイズおよび粒度の変化によって、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータにおける変化を、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後にアポトーシスを起こしている細胞を同定するのに用いることができる。ミスセンスｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いたモデル細胞のトランスフェクションの２４〜７２時間後に、上述の通り、生存細胞の前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）プロフィールを有する細胞の割合を決定する。トランスフェクションの手順は、上記の記載に従って正確に行った。細胞を、これらの時点で回収し、遠心分離し（１０００ｒｐｍ、１０分間）、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）で洗浄する。ペレットをＰＢＳまたは培地に再懸濁し、直後に、ＦａｃｓＣａｌｉｂｒｅ（ＨＰ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって細胞を取得する。前方および側方散乱パラメータは、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて評価する。本発明者らの標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴを用いてトランスフェクションされた細胞集団の、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータによって決定される位置を、前述のミスセンス対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞の位置と比較する。標的ｓｉＲＮＡオリゴによるトランスフェクション後に生存細胞ゲート内に残留している細胞のパーセンテージ（％）を、各遺伝子標的について、調べた細胞系全体にわたって確かめる。
【０５３３】
３．アポトーシスのＳｕｂ  Ｇ１分析
細胞周期の各期にある細胞のパーセンテージ（％）の定量は、細胞懸濁液を透過化処理し、各細胞の核内ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで染色することによって実現される。これは蛍光染色であり、したがって、フローサイトメータによって検出される蛍光の強度は、その細胞中のＤＮＡ量と相関する。本発明者らのミスセンスｓｉＲＮＡオリゴを用いてトランスフェクションされた細胞を分析することによって、生存細胞集団における、細胞周期の各期に予測される細胞集団に対する％が明らかとなる。Ｇ１期の細胞は、二倍体量のＤＮＡ、すなわち「２ｎ」を有し、ＤＮＡ量＞２ｎである細胞は、細胞周期の合成期すなわち「Ｓ」期にある。「４ｎ」である細胞は、細胞周期のＧ２Ｍ期にあり、まさに分裂して２細胞になろうとしているところである。しかし、アポトーシスを起こしている細胞は、ＤＮＡが断片化されて細胞の核から外へ漏れ出てしまっているため、＜２ｎ、すなわちＳｕｂ−Ｇ１量（Ｇ１未満量）のＤＮＡを有する。したがって、Ｓｕｂ−Ｇ１量のＤＮＡを有する細胞の割合（％）を定量化することによって、集団内のアポトーシス細胞の％を定量できる。この集団の定量化は、トランスフェクションの２４〜７２時間後に行われる。そのため、細胞周期のＳｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合は、ミスセンス対照物を用いてトランスフェクションされた細胞と比較した、新規に同定された遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴマーによるトランスフェクション後の細胞集団におけるアポトーシスの尺度を示す。細胞周期分析／ＳｕｂＧ１パラメータは、緩衝液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム２００μｌ、ＰＢＳで全量を２０ｍｌにする）に、細胞を再懸濁し、暗黒下の４℃で７〜２４時間にわたり細胞を染色することによって、取得する。その後、ＰＩ染色された細胞を、フローサイトメータによって獲得する。ＦＬ２蛍光の分析をＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアで行い、細胞のＳｕｂ−Ｇ１期の定量をする。
【０５３４】
図１２〜３１は、ＲＮＡｉによる標的遺伝子のノックダウンが、ＭＴＴ  ＨＴＳ、ＦＳＣ／ＳＳＣ、およびＳｕｂ−Ｇ１分析によって検出されるようにアポトーシスを変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）ことを実証するものである。これらの図は、それらアポトーシスアッセイを用いて各遺伝子に関して調べた細胞系の範囲全体において、ミスセンス（ＭＳ）、ＢＣＬ２、および／またはＳｕｒｖｉｖｉｎ対照と比較した、標的遺伝子によるアポトーシスの示差的誘導を明らかにする。
【０５３５】
４．ミトコンドリア膜の脱分極のＪＣ−１分析
細胞集団のミトコンドリア膜電位の分析によって、集団内のアポトーシス細胞、および生存細胞のパーセンテージ（％）が測定される。ミトコンドリア膜電位は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から入手したＪＣ−１色素をメーカーの説明書に従って用いることで定量化される。標的特異的ｓｉＲＮＡオリゴマー、本発明者らの陽性対照すなわちＳｕｒｖｉｖｉｎ、陰性対照すなわちミスセンス（ＭＳと呼ばれる）を用いて、前述の通りに、細胞をトランスフェクションする。簡潔には、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの４８〜７２時間後に、細胞を回収し、ＪＣ１色素とともにインキュベートする。この色素を生存細胞とともにインキュベートした場合、この色素は、アルゴンレーザを用いて活性化すると赤い蛍光を発する凝集形態のままである。しかし、アポトーシスが起こっている場合には、ＪＣ−１色素は、活性化の際に緑色の蛍光を発する単量体優勢形態へと移行する。したがって、赤色蛍光集団から、赤／緑または緑色蛍光集団への移行が、アポトーシス集団を示す。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアで蛍光の分析を行うことにより、調べた細胞の集団で起こっているアポトーシスの定量を行う。標的特異的ｓｉＲＮＡオリゴを用いたトランスフェクション後にアポトーシスを起こしている細胞のパーセンテージ（％）を、ｓｉＲＮＡミスセンスオリゴによって誘導されたアポトーシスと直接比較する。
【０５３６】
図２５は、ＲＮＡｉによる標的遺伝子のノックダウンが、ＪＣ−１分析で検出されるようにアポトーシスを変調することを実証している。これは、ミスセンス（ＭＳ）、ＢＣＬ２、および／またはＳｕｒｖｉｖｉｎ対照と比較した、Ｕ２５１細胞系における標的遺伝子によるアポトーシスの示差的誘導を実証するものである。
【０５３７】
５．カスパーゼ活性化の役割、およびカスパーゼ阻害剤ｚ−ｖａｄ  ｆｍｋを用いたアポトーシスの分析
新規に同定された遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴマーによるトランスフェクションによって誘導され、Ｓｕｂ−Ｇ１集団の分析によって検出されるアポトーシスが、カスパーゼ依存性であるかどうか判断するために、トランスフェクション実験と、それに続く７２時間のインキュベーションを、＋／−  ｚ−ｖａｄ  ｆｍｋで行う。一般的なカスパーゼ阻害剤がアポトーシスを低減するのは、アポトーシスがカスパーゼ依存性経路で誘導されている場合のみである。
【０５３８】
図２５は、ＲＮＡｉによる標的遺伝子のノックダウンが、Ｓｕｂ−Ｇ１分析で検出される通りアポトーシスを誘導し、さらに、遺伝子および細胞系に特異的な様式でカスパーゼ活性化に依存しうることを示す。この例は、ミスセンス（ＭＳ）、ＢＣＬ２、および／またはＳｕｒｖｉｖｉｎ対照と比較した、Ｕ２５１細胞系における、カスパーゼ依存性または非依存性経路におけるアポトーシスの標的遺伝子による示差的誘導を、実証するものである。
【０５３９】
６．ＷＳＴ−１生存度スクリーニング
Ｗｓｔ１アッセイは、ｗｓｔ１塩を可溶性の青色のホルマザンに変換する細胞の能力を測定する。この変換は生存細胞のミトコンドリアコハク酸脱水素酵素の活性を必要とする。したがって、死んでいる細胞はｗｓｔ−１を変換することができない。その結果、色変化の量は、細胞集団の生存度のレベルに正比例する。
【０５４０】
細胞（Ｐａｎｃ１、ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＴ１１６）を、９６ウェルプレート中の１００μｌの培地に３０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で、一晩、インキュベートする。その後、付着細胞を、ＲＮＡｉＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、メーカーの説明書に従い、濃度２５ｎＭまたは５０ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションする。簡潔には、１μｇのｓｉＲＮＡを全容量１００μｌのＥＣ−Ｒ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）に添加し、細胞系に応じた適当な容量のＲＮＡｉＦｅｃｔを細胞に添加する。室温で１５分間のインキュベーションの後に、ｓｉＲＮＡ−ＲＮＡｉＦｅｃｔ複合体をＥＣ−Ｒ緩衝液で２７５ｎＭまたは５５０ｎＭに希釈する。その後、希釈されたｓｉＲＮＡ複合体を、最終濃度が２５ｎＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）または５０ｎＭ（Ｐａｎｃ１、ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＨＣＴ１１６）となるように細胞に添加する。４時間後に、トランスフェクション溶液を倒置によって細胞から除去し、新鮮な増殖培地を添加する。すべてのトランスフェクションを三重のウェルで行い、これは、模擬トランスフェクション（トランスフェクション試薬のみ）、陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ非サイレンシングｓｉＲＮＡ）および、ＢＣＬ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、およびＣ−Ｒａｆをターゲッティングする陽性対照を含む。
【０５４１】
Ｗｓｔ１細胞生存度アッセイは、トランスフェクションの７２時間後に行う。トランスフェクションされた細胞の各ウェルに、Ｗｓｔ１試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を１１倍希釈となるように添加し（１００μｌの細胞増殖培地に１０μｌのＷｓｔ１）、９６ウェルプレート中を十分に混和させ、細胞系に応じた一定時間、３７℃でインキュベートする。このインキュベーション中、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（４−［−３（４−ヨードフェニル）−２（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート）は、生存細胞のミトコンドリア活性によってホルマザンに変換される。遊離したホルマザン色素は、生存細胞数に比例しており、走査型マルチウェル分光光度計を用いて、４５０ｎＭで測定する。各トランスフェクション細胞集団における生存細胞の相対数は、模擬トランスフェクション細胞に由来する吸光度の低減率として表す。
【０５４２】
図３２から明らかなように、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウンは、Ｗｓｔ−１変換で検出される細胞死を変調する。この例は、ミスセンスおよび陰性対照と比較した、本発明者らの標的遺伝子をノックダウンすることによる、細胞死の示差的誘導を実証するものである。詳細に特徴付けされている他のアポトーシス遺伝子（ＢＣＬ２、ｃ−Ｒａｆ、およびＳｕｒｖｉｖｉｎ）のターゲッティングを行った結果も示す。
【０５４３】
図３２は、標的遺伝子のサイレンシングを行うｓｉＲＮＡでトランスフェクションした癌細胞系の細胞生存度の低下を示す。各グラフは、上述の通り、ｎ＝３またはｎ＝４の独立した実験から得られた、模擬トランスフェクション細胞と比較したＷＳＴ−１吸光度の平均低下を示す。エラーバーは標準誤差を示す。有意性検定は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１で各遺伝子を陰性対照と比較するスチューデントのｔ検定を用いて行った。すべての試料に関して統計的分析を行う。しかし、サンプルサイズが限定されていること、そして、標準誤差を増大させる試料異常値が含まれることから、すべての遺伝子が有意な効果を引き起こすものとして記録されたわけではなかった。しかし、これらの遺伝子も、サンプルサイズが増加すれば、有意な生物学的効果を引き起こしうる。
【０５４４】
７．細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）
増殖中の細胞は、ＤＮＡ合成時にブロモデオキシウリジンをそのＤＮＡに組み入れることができる。ＢｒｄＵアッセイは、ＤＮＡ合成を行っている細胞のＤＮＡへのブロモデオキシウリジンの取込みを測定することができ、したがって、細胞集団においてＳ期にある生存細胞の相対数を定量することができる。
【０５４５】
細胞のトランスフェクションは、ＷＳＴ−１アッセイに関する上記と同様に行うが、白壁で底が透明の９６ウェルプレートを用いる。ＢｒｄＵアッセイは、ＢｒｄＵ化学発光増殖アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、メーカーの説明書に従って、トランスフェクションの７２時間後に行う。簡潔には、ＢｒｄＵ標識溶液をトランスフェクションした細胞の各ウェルに添加し、細胞系に応じた２〜４時間の期間、細胞をインキュベートする。培地を倒置によって細胞から除去し、細胞を３０分間ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液で固定した後、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液を添加して、さらに６０分間置く。抗体溶液を倒置によって除去し、ウェルを、洗浄緩衝液で３回リンスする。洗浄の後に、基質溶液を各ウェルに添加し、３分間のインキュベーションに続いて、マイクロプレートルミノメータで相対光ユニットを測定する。各トランスフェクション細胞集団における増殖中の細胞の相対数は、模擬トランスフェクション細胞に由来する相対光ユニットにおける低減率として表す。
【０５４６】
図３３は、ｓｉＲＮＡによる本発明者らの標的遺伝子のノックダウンにより、ブロモデオキシウリジン取り込みによって検出される細胞増殖が変調されることを実証するものである。ＢｒｄＵアッセイは、規定の２時間の期間内にＤＮＡ合成を行っている、組織培養表面に付着した生存細胞の数を測定する。この例は、ミスセンスおよび陰性対照と比較した、本発明者らの標的遺伝子をノックダウンすることによる、細胞死の示差的減少を実証するものである。詳細に特徴付けされている他のアポトーシス遺伝子（ＢＣＬ２、ｃ−Ｒａｆ、およびＳｕｒｖｉｖｉｎ）のターゲッティングを行った結果も示す。
【０５４７】
図３３は、標的遺伝子のサイレンシングを行うｓｉＲＮＡでトランスフェクションした癌細胞系の細胞増殖の低下を示す。各グラフは、上述の通り、ｎ＝３またはｎ＝４の独立した実験から得られた、模擬トランスフェクション細胞と比較した、ＢｒｄＵの取込みに由来する相対光ユニットの平均低下を示す。エラーバーは標準誤差を示す。有意性検定は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１で各遺伝子を陰性対照と比較するスチューデントのｔ検定を用いて行った。すべての試料に関して統計的解析を行う。しかし、サンプルサイズが限定されていること、そして、標準誤差を増大させる試料異常値が含まれることから、すべての遺伝子が有意な効果を引き起こすものと記録されたわけではなかった。しかし、これらの遺伝子も、サンプルサイズが増加すれば、有意な生物学的効果を引き起こしうる。
【０５４８】
８．アネキシンＶアポトーシスアッセイ
細胞生存度の低下がアポトーシスの誘導によるものであることを実証するために、標的がサイレンシングされている細胞のアポトーシス状態を、細胞表面のアポトーシスマーカーに対するアネキシンＶの結合を測定するアッセイを用いて調べる。アポトーシスあるいはプログラム細胞死は、細胞成長および増殖の重要かつ有効な調節経路である。細胞は、特徴的な生理学的変化をもたらす細胞内過程を開始することによって、特定の誘発シグナルに応答する。これらには、細胞表面へのホスファチジルセリン（ＰＳ）の外在化、特定の細胞性タンパク質の切断および分解、核クロマチンの圧縮（Ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）および断片化、ならびに、膜完全性の喪失（後期ステージ）がある。アネキシンＶは、細胞膜の内側面に通常、局在する膜成分であるホスファチジルセリン（ＰＳ）に対し高親和性のカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。ＰＳ分子は、アポトーシス経路の初期に、細胞膜の外部表面に移行するが、そこでは、アネキシンＶがそれらに容易に結合できる。
【０５４９】
アネキシンＶアッセイは、アポトーシス細胞の膜外側にあるＰＳを検出するのに、アネキシンＶ−ＰＥを利用するグアバネキシンアッセイを用いて行われる。細胞非透過性色素７−ＡＡＤは、生存細胞や初期アポトーシス細胞からは排除されるが、後期アポトーシス細胞および死細胞には浸透するので、膜構造完全性の指標として、このアッセイに含められる。アッセイは、Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製パーソナルサイトメータおよびグアバネキシンキット（カタログＮｏ．４５００−００１０、Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、２４ウェルプレート内で細胞をｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションし、トランスフェクションの２４、４８、および７２時間後にアッセイを行うように、メーカーのプロトコールを改変して、行った。
【０５５０】
細胞（ＤＵ１４５、ＰＣ３、およびＨＣＴ１１６）を、２４ウェルプレート中の５００μｌの培地に２００００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で、一晩、インキュベートする。その後、ＲＮＡｉＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、メーカーの説明書に従って、濃度５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ＥＫＩ、ＲＯＣＫ１、ＮＴＫＬ、およびＲＢＳＫ）を用いて、付着細胞をトランスフェクションする。簡潔には、１μｇのｓｉＲＮＡを全容量１００μｌのＥＣ−Ｒ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）に添加し、細胞系に応じた適当な容量のＲＮＡｉＦｅｃｔを細胞に添加する。室温での１５分間のインキュベーションの後に、ｓｉＲＮＡ−ＲＮＡｉＦｅｃｔ複合体をＥＣ−Ｒ緩衝液で５５０ｎＭに希釈する。その後、希釈されたｓｉＲＮＡ複合体を、最終濃度が５０ｎＭになるように細胞に添加する。４時間後に、トランスフェクション溶液を細胞から除去し、５００μｌの新鮮な増殖培地を添加する。すべてのトランスフェクションが、模擬トランスフェクション（トランスフェクション試薬のみ）と、陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ非サイレンシングｓｉＲＮＡ）を含んでいた。
【０５５１】
５００μｌの培地をデカントで細胞から除去し、細胞を洗浄するのに使用した１５０μｌのＰＢＳと合わせる。１００μｌのトリプシンを用いて、付着した細胞を剥がし、これを中和して、細胞を、５００μｌの培地／ＰＢＳ混合液中に再懸濁する。細胞を遠心し、５００μｌの１×ネキシン緩衝液で洗浄し、濃度２〜１０×１０５細胞／ｍｌで緩衝液に再懸濁する。４０μｌの細胞懸濁液に２．５μｌのアネキシンＶ−ＰＥ、および２．５μｌの７−ＡＡＤを添加し、その細胞を氷上で、２０分間、光を遮蔽しながらインキュベートする。その後、４５０μｌの１×ネキシン緩衝液を細胞に添加し、Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製パーソナルサイトメータを使用して、メーカーの説明書に従って細胞集団を分析する。したがって、このアッセイを用いて、以下３つの細胞集団：（ｉ）非アポトーシス細胞（アネキシンＶ（−）かつ７−ＡＡＤ（−））、（ｉｉ）初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ（＋）かつ７−ＡＡＤ（−））、（ｉｉｉ）後期アポトーシス細胞、および死細胞（アネキシンＶ（＋）かつ７−ＡＡＤ（＋））を識別することができる。初期および後期アポトーシス細胞の総数を測定し、アポトーシス細胞の相対数を計算する。
【０５５２】
図３４は、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウンが、ホスファチジルセリン陽性細胞の増大で測定されるアポトーシスを、様々な細胞系で誘導することを実証するものである。この例は、ミスセンスおよび模擬対照（トランスフェクション試薬のみ）と比較した、本発明者らの標的遺伝子をノックダウンすることによるアポトーシス誘導を実証するものである。
【０５５３】
図３４は、ＥＫＩ、ＲＯＣＫ１、ＮＴＫＬ、およびＲＢＳＫ遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞がアポトーシスを起こすことを示す。各グラフは、アポトーシス特異的マーカーであるアネキシンＶで染色された、トランスフェクションされたＤＵ１４５、ＨＣＴ１１６、またはＰＣ３細胞の、模擬トランスフェクションされた（トランスフェクション試薬のみ）細胞集団に対するパーセンテージを示す。２つの独立した実験から得られた結果を示す。
【０５５４】
実施例７：細胞における同定された遺伝子のノックダウンは、長期生存度アッセイによって測定されるアポトーシスを機能的に変調する
この例では、ｓｉＲＮＡオリゴマー、および各ｓｉＲＮＡオリゴマーについて行われたｓｉＲＮＡ有効性試験は、実施例５に記載したものである。
【０５５５】
ｓｉＲＮＡによる癌細胞系での標的遺伝子発現の阻害は、クローン原性アッセイによって測定される長期癌細胞生存度を変調する
クローン原性アッセイ（Ｃｌｏｎａｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）は、長期の対数増殖についての癌細胞系の様々な播種密度での細胞傷害性損傷の評価を可能にする細胞生存度スクリーニングであり、それにより被験物質の最終的な効果を正確に定量化することができる。この場合、試験される「細胞傷害性損傷」は、上記に概説したように、新規の標的キナーゼおよびＧＰＣＲの発現をノックダウンするｓｉＲＮＡオリゴマーのトランスフェクションを伴うものである。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの１０〜１４日後に、実施例６に詳細に記載した通りにして、ＭＴＴ変換によって細胞数の定量を行う。
【０５５６】
クローン原性アッセイ
この例では、様々な癌細胞に対する標的遺伝子発現のノックダウンの影響を１４日間にわたり測定する。モデル細胞系としては、Ｈｅｌａ、ＤＵ１４５、ＴＦ１、Ｕ２５１、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＨＣＴ１５、７８６−０、ＨＴ２９、Ｍ−１４、Ｈ４６０、ＬｎＣａｐ、ＰＣ３、Ａ４９８、およびＡ５４９が含まれる。
【０５５７】
クローン原性アッセイにおける播種数を、調べる各細胞系について最適化する。播種数は各細胞系で異なり、問題にしている各細胞系の細胞サイズ、増殖速度、および、トランスフェクションで誘導される毒性に対する感受性、における差異を説明するものである。この例のモデルとなっている細胞系には、ＨＣＴ１５、ＭＣＦ７、Ａ５４９、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、Ｕ２５１、ＰＣ３、Ａ４９８、およびＨｅＬａが含まれる。実施例５および６で詳細に記述したように、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに対するｓｉＲＮＡオリゴは、このアッセイにおいて毒性に関する陽性対照として機能し、ミスセンス対照オリゴマーは陰性対照として機能する。前述のように、ｃ−Ｒａｆ、ＢＣＬ２、およびＰＩ３Ｋ  ｓｉＲＮＡオリゴマーは、上述の通り、追加的な対照として機能する。クローン原性アッセイは、以下に概説するようにして実施する。
【０５５８】
１０〜１４日のクローン原性アッセイ／長期細胞傷害性スクリーニングの方法
下記に記述するように、細胞を９６ウェルプレートに播種し、大気中５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃に一晩置いて細胞を付着させる。播種は、９６ウェルプレートのカラム１のウェルに適切な細胞数（細胞系による）で行い、この細胞懸濁液を、９６ウェルプレート全体で、カラム１から６まで（結果ではｘ軸上に表す）、１／２に希釈する。次に、目的の遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴマーを濃度２μｇ／ｍｌで用いて細胞をトランスフェクションする。トランスフェクションを４時間継続し、その後、トランスフェクション溶液を除去し、細胞に新鮮な培地を与え、一晩、インキュベートする。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクション試薬の毒性を最小限にするために、さらなる培地交換を行う。続いて細胞を、上述の通り、トランスフェクション後１０〜１４日の期間、３７℃でインキュベートする。培地は、週に１回交換する。続いて、ＭＴＴの定量を、実施例５に記載した通りに行う。
【０５５９】
癌細胞系における標的遺伝子発現のｓｉＲＮＡによる阻害は、足場非依存性／軟寒天アッセイにおいて増殖によって測定されるように、長期癌細胞生存度を変調する
足場非依存性／軟寒天アッセイにより、クローン腫瘍様体形成に対する遺伝子発現の変調の影響を、腫瘍様体形態学および長期対数増殖でのコロニー数を観測し定量し、それによって、なんらかの細胞死が誘導されているかどうか確かめることによって、評価できる。
【０５６０】
半固形寒天中で腫瘍様体を形成する癌細胞の能力は攻撃的腫瘍細胞の表現型に特有のものである。この例では、標的遺伝子をノックダウンすることの機能上の結果を、この足場非依存性細胞アッセイで調べる。
【０５６１】
ｓｉＲＮＡ実験を開始する前に、各癌細胞系が軟寒天中で足場非依存性腫瘍様体形成を行う能力を評価する。６日間のインキュベーション期間の後に形成された腫瘍の目視観測によって、ＰＣ３、Ｕ２５１、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ７、ＨＣＴ１５、およびＡ５４９細胞系が、このアッセイで明確な腫瘍を形成でき、この癌表現型分析の適当なモデルとして機能することが示された。しかし、上記に概略が示されたすべての癌細胞系は、それらがＲＮＡｉにおいて高い適合性を示すため、この癌細胞特性のモデルとして機能しうる。
【０５６２】
ＲＮＡｉにより遺伝子発現をノックダウンした際に細胞傷害性を成功裏に同定できるようなこのアッセイの能力は、被験細胞系における細胞傷害薬としてのＳｕｒｖｉｖｉｎに対するｓｉＲＮＡの特定により、検証される。したがって、足場非依存性／軟寒天アッセイを用いて、目的の本発明者らのキナーゼ／ＧＰＣＲＳの発現を、特異的ｓｉＲＮＡオリゴマーを用いて低下させることの、腫瘍様体形成に対する効果を評価し、その結果をＳｕｒｖｉｖｉｎによって誘導された細胞傷害性と比較する。軟寒天アッセイは、以下にその概略を示す通りに実施する。
【０５６３】
軟寒天アッセイの方法
細胞を６ウェルプレートに播種、大気中５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で、一晩置いて細胞を付着させる。その後、目的の遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴマーを濃度２μｇで用いて細胞をトランスフェクションする。トランスフェクションを４時間継続し、その後、トランスフェクション溶液を除去し、細胞に新鮮な培地を与え、一晩、インキュベートする。軟寒天アッセイにおいて以下のように播種するために、トランスフェクション細胞を回収する。細胞を、６ウェルプレートにウェルあたり５×１０４細胞で播種し、１２／１４日間にわたりインキュベートし、その間、大気中５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気にて３７℃で、０．０５％寒天／培地細胞懸濁液中で増殖させる。続いて、形成されたコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、それらの形態学を評価し、形成されたコロニーを、４倍の倍率で計数する。
【０５６４】
各遺伝子の細胞傷害効果は、本発明者らのＭＳ対照と比較して、コロニー数の減少によって判定されるが、コロニー形態に対するいかなる影響も記録される。
【０５６５】
ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現低下は１０／１４日のクローン原性アッセイにおいて癌細胞の生存度を減少させる−パートＩ
この例は、アポトーシス／生存度対照である、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＢＣＬ２、ｃ−Ｒａｆ、ＰＩ３Ｋ、およびミスセンス（ＭＳ）対照と比較して、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現の低下が、１０／１４日のクローン原性アッセイで、ＭＴＴ分析で測定される細胞死を誘導できることを実証するものである。対照遺伝子Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、ＭＳ対照と比較して、これらの細胞系において、このアッセイで試験する細胞系の生存度／クローン原性の大幅な低減を誘導する。
【０５６６】
ノックダウンの際に細胞傷害効果を有する遺伝子（ＳＴＫ６）、およびノックダウンの際に細胞傷害性を誘導しない別の遺伝子（ＦＬＪ１３３５１）のクローン原性アッセイから得られた結果／クローン原性プロフィールの例を、Ｕ２５１細胞系について、後述図３５に示す。
【０５６７】
多くの遺伝子のターゲッティングにより、用いた一連の細胞系全体で毒性の誘導が見られたが、一方、他の遺伝子では、細胞型特異的様式で細胞傷害性の誘導が見られた。各遺伝子のノックダウンで誘導された最大の細胞傷害性を、３回の独立した実験すべてで、クローン原性プロフィールから以下に記述する通りに測定し、各細胞系について表１３（ａ〜ｇ）にまとめた。
【０５６８】
図３５は以下を示す：（ａ）ＳＴＫ６に対するｓｉＲＮＡオリゴによるトランスフェクションが、クローン原性アッセイによって測定されるように、Ｕ２５１細胞系での生存度を低下させることを示す。播種密度がｘ軸上で３．５×１０３から０．１×１０３細胞に低下し、ｙ軸は、トランスフェクションの１０〜１４日後、ＭＴＴ変換で定量される細胞数を表すことに留意されたい。この低下は、アポトーシス遺伝子であるＳｕｒｖｉｖｉｎより、実質上大きなものである；（ｂ）ＦＬＪ１３３５１に対するｓｉＲＮＡオリゴによるトランスフェクションが、クローン原性アッセイによって測定されるように、Ｕ２５１細胞系での細胞傷害性を誘導しない。播種密度がｘ軸上で３．５から０．１×１０３細胞まで低下し、ｙ軸は、トランスフェクション後１０〜１４日目における、ＭＴＴ変換で定量される細胞数を表すことに留意されたい。
【０５６９】
注意：
細胞傷害性であるとみなすためには、遺伝子標的に対するｓｉＲＮＡオリゴが、ある細胞系において、標的遺伝子とＭＳとの間で有意差が観測されるように、すなわち、標準誤差バーの重なりが検出されないように、クローン原性アッセイにおいて少なくとも２つの播種密度で生存度の低下を誘導しなければならない。最大毒性が誘導された希釈率について、ミスセンスと比較して記録された生存度の平均パーセンテージを、表１３に示した。
【０５７０】
表１３  クローン原性アッセイ−この表は、クローン原性アッセイにおける、指示された細胞系の平均生存率を、３回の独立した実験について、ミスセンスと比較して示す。内部標準として、既知の生存遺伝子である「Ｓｕｒｖｉｖｉｎ」、ＢＣＬ２、ｃ−Ｒａｆ、およびＰＩ３ＫＲ１に対しても、ｓｉＲＮＡによるターゲッティングを行った。細胞傷害応答が検出されなかった場合には、「−」と記録されている。
【０５７１】
これらの例は、標的遺伝子ｍＲＮＡのノックダウンが、特定の癌細胞ではアポトーシスおよび細胞死の機能的変調をもたらし、別の腫瘍型から得られた細胞ではアポトーシスを誘導しないことを実証するものである。遺伝子発現のダウンレギュレーションによって影響を受ける癌細胞型は、「新規」に同定された各アポトーシス調節因子によって異なる。したがって、これらの同じ同定された遺伝子の阻害は、特定の癌細胞型の細胞傷害をもたらすことから、この例は、特定の癌の治療的処置へのそれらの遺伝子の阻害の直接的治療適用を証明するものである。
【０５７２】
ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現低下は１４日間のクローン原性アッセイにおいて癌細胞の生存度を低下させる−パートＩＩ
標的遺伝子のサイレンシングによる効果を、クローン原性アッセイを用いて１４日間にわたり測定する。このクローン原性アッセイでは、コロニーを計数することによってクローン原性を測定する。
【０５７３】
細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｐａｎｃ１、Ａ５４９、およびＨＣＴ１１６）を、２４ウェルプレート中の５００μｌの培地に２００００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で、一晩、インキュベートする。その後、付着細胞を、ＲＮＡｉＦｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、メーカーの説明書に従い、濃度５０ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションする。簡潔には、１μｇのｓｉＲＮＡを全容量１００μｌのＥＣ−Ｒ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）に添加し、細胞系に応じた適当な容量のＲＮＡｉＦｅｃｔを細胞に添加する。室温で１５分間インキュベートした後に、ｓｉＲＮＡ−ＲＮＡｉＦｅｃｔ複合体をＥＣ−Ｒ緩衝液で５５０ｎＭに希釈する。その後、希釈されたｓｉＲＮＡ複合体を、最終濃度が５０ｎＭになるように細胞に添加する。４時間後に、トランスフェクション溶液を細胞から除去し、５００μｌの新鮮な増殖培地を添加する。すべてのトランスフェクションは、模擬トランスフェクション（トランスフェクション試薬のみ）、陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ非サイレンシングｓｉＲＮＡ）、および、陽性対照ｓｉＲＮＡ（ＢＣＬ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、およびＣ−Ｒａｆに対してターゲッティングする）を含んでいた。
【０５７４】
トランスフェクションの２４時間後に、細胞増殖培養液中でのトリプシン処理および中和処理によって、組織培養プレートからトランスフェクション細胞を取り出す。生存細胞の密度は、Ｇｕａｖａ社製パーソナルサイトメータと組み合わせて用いるＶｉａＣｏｕｎｔアッセイを用いて、メーカーの説明書に従い、測定した。細胞を２５００細胞／ｍｌの密度に希釈し、この細胞懸濁液の５０μｌアリコートを、２．５ｍｌの細胞増殖培地を含有する６ウェルプレートの三重ウェルに、ウェルあたり１２５細胞を播種するよう添加する。細胞を、１４日間インキュベートする。細胞の固定および染色は、培地を除去し、そして０．５％（ｗ／ｖ）メチレンブルーを含有する５０：５０のエタノール：水を細胞が浸漬するように添加することによって行う。細胞を３０分間インキュベートし、そしてプレートを水中に浸漬することによって染色液を除去する。コロニーの計数を行う。
【０５７５】
図３６は、標的遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞において、１４日間のクローン原性アッセイでの生存度が低下することを示す。各グラフは、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞に由来するコロニーの平均数を示す。データは、１回の実験に由来する三重ウェルのものである。エラーバーは標準誤差を示す。
【０５７６】
軟寒天アッセイ
軟寒天アッセイは、腫瘍様体を形成する癌細胞の能力の低下によって測定される通り、ＲＮＡｉによる標的遺伝子の発現低下が癌細胞系のアポトーシス／細胞死を誘導することを実証する。
【０５７７】
軟寒天アッセイによって検出された、ノックダウンの際に細胞傷害効果をもつ遺伝子の例の概略を表１４に示す。表１４は、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴマーを用いたトランスフェクション後の所与の細胞系について、足場非依存性アッセイにおけるミスセンスの生存と比較した生存パーセンテージを示す。内部標準として、既知の生存遺伝子であるＳｕｒｖｉｖｉｎに対しても、ｓｉＲＮＡによるターゲッティングを行った。この表は、各標的遺伝子のノックダウンによって誘発される細胞傷害のＭＳ対照と比較した規模、すなわち、すでに論じたような、形成され、クリスタルバイオレットで染色され、目視によって計数されたコロニーの数を、示すものである。
【０５７８】
ＰＳＫＨ１およびＴＬＫ２遺伝子に関する軟寒天の結果の例も、図３７および図３８に個別に示す。表１４に記載する細胞傷害応答率は、これら図３７および図３８に示されているグラフから決定した。併せて、これらの結果は、ある範囲の癌細胞型においては標的遺伝子発現をノックダウンした後に生存度が低下することを実証するものである。
【０５７９】
図３７は、ＲＮＡｉによるＰＳＫＨ１遺伝子のノックダウンが、足場非依存性軟寒天アッセイによって測定されるように、癌細胞系のアポトーシスを変調することを示す。図３８は、ＲＮＡｉによるＴＬＫ２遺伝子のノックダウンが、足場非依存性軟寒天アッセイによって測定されるように、癌細胞系のアポトーシスを変調しないことを示す。細胞傷害性は、ＰＳＫＨ１  ｓｉＲＮＡオリゴによるトランスフェクション後の癌細胞系が１４日間にわたる対数増殖において形成した腫瘍様体／コロニー数の減少として定量化する。内部標準として、既知の生存遺伝子であるＳｕｒｖｉｖｉｎに対しても、ｓｉＲＮＡによるターゲッティングを行った。
【０５８０】
示されている標的のうち、軟寒天アッセイによって測定された細胞傷害性が最も高い被験キナーゼは、ＭＰＳＫ１およびＰＳＫＨ１であり、これらは、すべての細胞系で、有意な細胞死を誘導する。ＭＫＮＫは、被験細胞系のうち２株で一貫して、さらに、１回の実験のみだがＨＣＴ１５細胞系でも、細胞死を誘導した。ＰＲＫ／ＣＮＫは、ＨＣＴ１５細胞系で一貫して、さらに、これも１回の実験のみだがＡ５４９細胞系でも、毒性を誘導した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、すべての細胞系で細胞死を誘導し、この実験における再現性の高い対照として機能したが、ｃ−Ｒａｆは、Ａ５４９およびＨＣＴ１５細胞系でのみ細胞死を誘導した。
【０５８１】
この例は、多数の標的遺伝子が、１４日間にわたる足場非依存性アッセイで、示した細胞系において死を誘導することができることを実証する。これらの例は、「新規」に同定された「アポトーシス調節因子」のｍＲＮＡのノックダウンが、特定の癌細胞では、アポトーシスの機能的な変調をもたらし、一方、別の腫瘍型から得られた細胞では、アポトーシスを誘導しないことを実証する。遺伝子発現のダウンレギュレーションによって影響を受ける癌細胞型は、「新規」に同定された各アポトーシス調節因子によって異なる。したがって、これらの同じ同定された遺伝子の阻害は特定の癌細胞型の細胞傷害をもたらすので、この例は、特定の癌の治療的処置へのそれら遺伝子の阻害の直接的治療適用を証明するものである。
【０５８２】
コロニー形態に関する注：
この例で示した細胞系は、軟寒天アッセイで、様々な大きさおよび形状の腫瘍様体（tumouroid）を形成する。しかし、特定の遺伝子のノックダウンが細胞生存度に影響を与える場合に、すべての細胞系、とりわけＡ５４９およびＨＣＴ１５によって形成された腫瘍様体の形態が変化することに留意されたい。ＭＳでトランスフェクションされた腫瘍様体は、分散／散在形態を示し、これらの試料中にある腫瘍様体の大部分が分散形態であるが、毒性遺伝子がトランスフェクションされた場合（例えば、Ａ５４９中にＭＫＮＫおよびＭＰＳＫＩ）には、しばしば、形態が、分散形態から、概してサイズがより小さく丸い固形腫瘍に、極めて劇的に変化した。ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションで細胞傷害性が誘導された場合には、これらの丸い固形腫瘍が優勢である。
【０５８３】
標的遺伝子発現のＲＮＡｉノックダウンは癌細胞の長期生存度を低下させる
軟寒天アッセイおよびクローン原性アッセイを組み合わせて用いた癌細胞の長期生存度の評価は、特定の遺伝子が候補薬物標的として有効でありうることを実証する（「要旨」の項を参照）。これらの例は、「新規」に同定された「アポトーシス調節因子」のｍＲＮＡのノックダウンが、細胞クローン化および足場非依存性増殖によるストレスの付加と共に、何代もの細胞世代にわたって細胞におけるアポトーシスの機能的変調をもたらすことを実証する。さらに、これらの同じ同定された遺伝子の阻害は、特定の癌細胞の細胞傷害をもたらすので、この例は、癌の治療的処置へのそれら遺伝子の阻害の直接的治療適用を証明するものである。
【０５８４】
実施例８：同定された遺伝子の細胞におけるノックダウンは癌細胞の移動を機能的に変調する
癌細胞の移動は、腫瘍における最も悪性の特性の１つである。以下の実施例で、本発明者らは、示された標的遺伝子の発現を抑制することによって、移動を阻止できることを実証する。この実施例では、本発明者らは市販の細胞移動アッセイを用いる。
【０５８５】
細胞移動アッセイ
細胞を６ウェルプレートに播種し、大気中５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で一晩置いて細胞を付着させる。次に、細胞を、実施例５で詳細に記載した通りに、目的の遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを濃度２μｇ／ｍｌで用いてトランスフェクションする。トランスフェクションを４時間継続し、その後、トランスフェクション溶液を除去し、細胞に新鮮培地を与え、一晩、インキュベートする。トランスフェクション細胞を、以下の記載の通り移動アッセイにおいて播種するため、回収する。
【０５８６】
Ｃｈｅｍｉｃｏｎ細胞移動アッセイ（ＥＣＭ５５０）を用いて、２４時間のインキュベーション時間の間に、走化性物質に向かってボイデンチャンバーを横切って成功裏に移動するＰＣ３細胞の数を定量する。ＰＣ３細胞の移動の評価は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に慣用手法で行う。目的の遺伝子の発現を低下させる効果は、ミスセンス対照オリゴマーによるもの、およびＵＰＡノックダウンの影響と比較する。なおＵＰＡノックダウンは、文献において、ＰＣ３細胞移動を減少させることが報告されている。移動アッセイはメーカーの説明書に従って行う。結果を、図３９から４１に図示する。
【０５８７】
図３９は、ＰＣ３細胞におけるｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウンが、それらの移動能力を低下させることを示す。
【０５８８】
図４０は、ＰＣ３細胞におけるｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウンが、それらの移動能力を増大させることを示す。
【０５８９】
図４１は、ＰＣ３細胞におけるｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウンが、それらの移動能力を変調しないことを示す。
【０５９０】
細胞をプレーティングし、上述の通り、所与のｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。ＰＣ３細胞の移動は、蛍光色素を用いて追跡した。結果的に、蛍光単位の増加は、移動の増大と正の相関を有する。特定の遺伝子をターゲッティングする効果については、ミスセンス対照またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）のいずれかに対するターゲッティングと比較した。ＵＰＡは、ＰＣ３細胞の移動を変調する遺伝子であることが、以前に実証されている。
【０５９１】
標的遺伝子の標的化ノックダウンはＰＣ３前立腺癌細胞系における移動を変調する
この例では、前立腺細胞系ＰＣ３を用いて、ｓｉＲＮＡによる様々なキナーゼおよびＧＰＣＲのターゲッティングの効果を測定する。ＰＣ３細胞系は、そのような走化性アッセイに伝統的に用いられている。
【０５９２】
ＰＣＴＡＩＲＥ、ＭＰＳＫ１、ＲＳ６ＰＫ、ＴＬＫ２、ＭＫＮＫ、ＣＤＣ４２、ＥＤＧ６、およびＦＬＴ４の発現を低下させることにより、ボイデンチャンバーの８μｍ多孔性フィルタを横切った前立腺癌細胞による移動の阻害が、ミスセンス対照およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）対照遺伝子の両方と比較して、様々な程度でもたらされる。
【０５９３】
対照的に、ＲＮＡｉによるＰＣ３細胞系において、ｓｉＲＮＡによってＭＡＫ、ＰＲＫ／ＣＮＫ、およびＰＳＫＨ１の発現を低下させると、癌細胞の移動能力が増大する。
【０５９４】
ＭＡＰＫＫ５およびＰ１４ＫＢの発現をＲＮＡｉによって変化させても、この細胞系の移動に対する影響はなかった。したがって、これらの遺伝子は、これら前立腺癌細胞の移動運動／走化性においては役割を果たさないにちがいない。
【０５９５】
これらの例は、「新規」に同定されたアポトーシス調節因子のｍＲＮＡのノックダウンが、前立腺癌細胞の癌表現型に機能的な変調をもたらすことを実証する。これらの遺伝子の発現を低下させることによって、本発明者らは、これらの攻撃的細胞が走化性を示す能力に影響を及ぼし、それによって、癌の転移能力に影響を与える。癌の転移能力は、癌の再発、治療に対する抵抗性、および死亡率に大きく寄与する特性である。したがって、これらの同じ同定された遺伝子の阻害は癌細胞の転移を低減させうることから、この例は、癌の治療的処置へのそれら遺伝子の阻害の直接的治療適用を証明するものである。
【０５９６】
以上本明細書で参照されたすべての刊行物、および上記刊行物に引用された参考文献を、参照により本明細書に組み込むものとする。本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、本発明の記載の方法およびシステムの様々な変更形態および変形形態が、当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態との関連において本発明を記載したが、特許請求の範囲に示した本発明は、そのような特定な実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されたい。事実、分子生物学分野または関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するために記載した方法の様々な変更形態も、添付した特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０５９７】
【図１】ｓｕｂ−Ｇ１プロフィールを有する細胞の比率分析の前に、ＧＭ−ＣＳＦの存在下または不在下で一晩培養した好中球のｓｕｂ−Ｇ１分析を示す図である。このプロフィールから、ＧＭ−ＣＳＦを加えて培養した場合に、加えずに培養した場合より有意に少ない好中球がアポトーシスを起こしていることが明らかである。それは、ｓｕｂ−Ｇ１プロフィールを有する細胞の比率（存在下９．７％  対  不在下６５％）によって判定した。
【図２】ＧＭ−ＣＳＦの不在、またはＬｙ２０４００２存在下のＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦのみで培養された好中球と比較して、アポトーシスの量を増大させることを示す図である。
【図３】ＧＭ−ＣＳＦの不在、またはＡＫＴ阻害剤（１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−カイローイノシトール２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカルボネート）存在下のＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦのみで培養された好中球と比較して、アポトーシスの量を増大させることを示す図である。
【図４】マイクロアレイ分析およびＱＰＣＲを用いた発現データの比較分析を示す図である。網掛け棒グラフ（暗色）はＱＰＣＲ、斜線棒グラフ（明色）はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘである。
【図５】６１細胞系の群全体についての１２標的遺伝子の相対発現を表す「ヒートマップ」を示す図である。発現は、ＧＡＰＤＨに対する相対値である。
【図６】フローサイトメトリーによるＴＦ１集団の前方散乱および側方散乱分析を示す図である。ＴＦ１細胞は、ＦａｃｓＣａｌｉｂｒｅフローサイトメータを用いた獲得および分析の前に、ＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で４８時間培養する。ゲートで囲まれた領域は生存ゲート領域を表す。この図から、その因子が枯渇している細胞では、健常細胞の側方散乱パラメータを示す細胞の数が約５０％減少することが観測される。
【図７】フローサイトメトリーによる細胞周期分析を示す図である。アポトーシス細胞は、分解されたＤＮＡを有し、その結果、蛍光ヒストグラムでｓｕｂ−Ｇ１ピークとして測定される低強度染色が増大している。
【図８】様々な条件下で処理されたＴＦ１細胞の典型的な結果を示すドットプロットの合成画像である。細胞は、完全長ＢＣＬ２コード配列を含有するレトロウイルスベクター（Ｃ）、またはＢＣＬ２を含まない対照ベクター（ＡおよびＢ）で形質導入され、示された条件下に置かれる。ＴＦ１細胞におけるＢＣＬ２の存在は、生存ゲート（囲まれている領域）内の細胞の割合によって判定すると、ＧＭ−ＣＳＦの排除下でより多くの細胞が生存するのを可能にする。
【図９】実施例の説明で記載したように、完全長ＥＤＧ６コード配列を含有するレトロウイルスベクター、またはＥＤＧ６を含まない対照ベクターで形質導入され、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータを用いた生存度分析の前の４８時間にわたりＧＭ−ＣＳＦの存在下または不在下で培養されたＴＦ１細胞を示す図である。ＧＭ−ＣＳＦ排除の後、ＥＤＧ６を発現する生存細胞は、対照ベクターのみで形質導入されたものより有意に多かったが、これは、ＥＤＧ６がＴＦ１細胞をアポトーシスから保護することを示すものである。
【図１０】実施例の説明に記載したように、完全長ＴＬＫ２コード配列を含有するレトロウイルスベクター、またはＴＬＫ２を含まない対照ベクターで形質導入され、そして、形質導入後でＦＳＣ／ＳＳＣパラメータを用いた生存度分析の前の９６時間にわたって培養されたＴＦ１細胞を示す図である。ＴＬＫ２で形質導入された集団では、生存し続けることができた細胞が１％未満であったが、これとは対照的に、対照ベクターのみで形質導入された集団では、生存細胞がかなり多く、これは、ＴＬＫ２によって、ＴＦ１細胞中でアポトーシスが誘導されることを示す。
【図１１】７つの細胞系（ＨＣＴ１５、Ａ５４９、ＳＫＯＶ３、ＤＵ１４５、ＰＣ３、Ａ４９８、およびＵ２５１）における、ＭＳまたはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡでｓｉＲＮＡトランスフェクションした後の、２つのインターフェロン応答遺伝子、ＯＡＳ１（ＮＭ ００２５３４）、およびＧＢＰ１（ＮＭ ００２５０３）のｍＲＮＡレベル（記載したＱＰＣＲ定量による）の測定を示す。
【図１２】図１２は、ＭＡＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。なお、図１２〜３１は、ＭＴＴ、ＦＳＣ／ＳＳＣ、およびＳｕｂ−Ｇ１分析で検出されるアポトーシスを示す図である。ＭＴＴアッセイは、７２時間目に行った。光学密度／吸光度は、細胞生存度と正の相関を有する。ＦＳＣ／ＳＳＣ分析は、細胞の前方散乱パラメータと側方散乱パラメータによって決定される細胞形態の変化をモニターすることによってアポトーシスを検出する。生存度％は、遺伝子特異的なｓｉＲＮＡオリゴによるトランスフェクション後に生存細胞ゲート内に残留している集団の、ミスセンス対照と比較した％との、正の相関を有する。ｓｕｂ−Ｇ１分析は、ＤＮＡの断片化を測定する。ＤＮＡの断片化は、アポトーシスを起こしている細胞の特徴の１つである。ｓｕｂ−Ｇ１の割合（％）は、アポトーシスを起こしている細胞数と正の相関を有する。図２５は、本明細書に記載のＪＣ−１アッセイおよびカスパーゼアッセイの結果をさらに示す。ｓｉＲＮＡオリゴによって誘導されたアポトーシスの変調を、対照ＭＳ、ＢＣＬ２、および／またはＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｓｉＲＮＡオリゴを用いて得られたものと比較する。
【図１３】図１３は、ＧＲＰ８６のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図１４】図１４は、ＰＣＴＡＩＲＥのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図１５】図１５は、ＧＲＡＦのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図１６】図１６は、ＭＰＳＫ１のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図１７】図１７は、ＲＳ６ＰＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図１８】図１６は、ＴＬＫ２のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図１９】図１９は、ＥＫ１のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２０】図２０は、ＭＫＮＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２１−１】図２１は、ＮＴＫＬのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２１−２】図２１は、ＮＴＫＬのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２２】図２２は、ＣＤＣ４２のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２３】図２３は、ＲＢＳＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２４】図２４は、ＥＤＧ６のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２５】図２５は、ＰＲＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。図２５は、本明細書に記載のＪＣ−１アッセイおよびカスパーゼアッセイの結果をさらに示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２６】図２６は、ＭＡＰＫＫ５のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２７−１】図２７は、Ｐ１４ＫＢのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２７−２】図２７は、Ｐ１４ＫＢのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２８】図２８は、ＦＬＴ４のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図２９】図２９は、ＰＳＫＨ１のｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図３０】図３０は、ＩＴＰＫＣのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図３１−１】図３１は、ＲＯＣＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図３１−２】図３１は、ＲＯＣＫのｓｉＲＮＡノックダウンによるアポトーシスの変調を示す。他は図１２の欄に記載した通りである。
【図３２−１】Ｗｓｔ１生存度アッセイの結果を示す図である。
【図３２−２】Ｗｓｔ１生存度アッセイの結果を示す図である。
【図３２−３】Ｗｓｔ１生存度アッセイの結果を示す図である。
【図３３−１】ＢｒｄＵ増殖アッセイの結果を示す図である。
【図３３−２】ＢｒｄＵ増殖アッセイの結果を示す図である。
【図３３−３】ＢｒｄＵ増殖アッセイの結果を示す図である。
【図３４】アネキシンＶによって測定されたトランスフェクション細胞のアポトーシスを示す図である。
【図３５】クローン原性アッセイのサンプル結果を示す図である。
【図３６−１】１４日間のクローン原性アッセイの結果を示す図である。
【図３６−２】１４日間のクローン原性アッセイの結果を示す図である。
【図３７】足場非依存性軟寒天アッセイにおける、ＰＳＫＨ１のノックダウンを示す図である。
【図３８】足場非依存性軟寒天アッセイにおける、ＴＬＫ２のノックダウンを示す図である。
【図３９−１】ｓｉＲＮＡで処理したＰＣ３細胞の移動を示す図である。
【図３９−２】ｓｉＲＮＡで処理したＰＣ３細胞の移動を示す図である。
【図４０】ｓｉＲＮＡで処理したＰＣ３細胞の移動を示す図である。
【図４１】ｓｉＲＮＡで処理したＰＣ３細胞の移動を示す図である。
【図４２−１】特定の遺伝子と、それらの各アクセッション番号のリストを示す、表１Ａおよび１Ｂ。
【図４２−２】特定の遺伝子と、それらの各アクセッション番号のリストを示す、表１Ａおよび１Ｂ。
【図４２−３】特定の遺伝子と、それらの各アクセッション番号のリストを示す、表１Ａおよび１Ｂ。
【図４３】未処理の好中球と比較した、処理群全体の、表１に特定した遺伝子の発現の変化倍率を示す表２。
【図４４】第１の範囲の癌細胞系を列挙する表３。
【図４５】第１セットの標的遺伝子のためのＱＰＣＲプライマーを記載する表４。
【図４６】正常組織／癌組織における、ＱＰＣＲの結果を示す表５。癌組織中の発現を、同じ組織からの正常細胞と比較して表す。
【図４７】癌細胞におけるＱＰＣＲの結果を示す表６。
【図４８−１】第２の範囲の癌細胞系を列挙する表７。
【図４８−２】第２の範囲の癌細胞系を列挙する表７。
【図４９】第２セットの標的遺伝子のためのＱＰＣＲプライマーを記載する表８。
【図５０】第１バッチのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す表９。
【図５１】ＰＣ３前立腺癌細胞系における、ｓｉＲＮＡの有効性を実証する表１０。
【図５２】第２バッチのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す表１１。１−  図中に示したように、第２の代替ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが実施例７で用いられる。２−  示されている通り、ＴＬＫ２に用いられた代替ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【図５３】いくつかの細胞系における第２バッチのためのｓｉＲＮＡの有効性を実証する表１２。
【図５４−１】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(a) Ｕ２５１。
【図５４−２】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(b) ＰＣ３。
【図５４−３】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(c) Ａ５４９。
【図５４−４】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(d) ＤＵ１４５。
【図５４−５】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(e) ＳＫＯＶ３。
【図５４−６】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(f) Ａ４９８。
【図５４−７】ｓｉＲＮＡを用いた場合の示した細胞系の生存度を、３回の独立した実験を行い、クローン原性アッセイにおけるミスセンスと比較して示す、表１３。表(g) ＨＣＴ１５。
【図５５】示した細胞系が、ｓｉＲＮＡオリゴマーでトランスフェクションした後の、足場非依存性軟寒天アッセイにおける生存度を示す表１４。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５４−３】
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【図５４−４】
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【図５４−５】
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【図５４−６】
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【図５４−７】
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【図５５】
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【国際調査報告】
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2006518590.tif 000081
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