(57)【要約】脂肪分解を誘発し、肥満、インスリン耐性、肝臓脂肪変性、高脂血漿及びII型糖尿病を処理するためへの甲状腺−刺激ホルモン（TSH）の使用が記載される。
2006519876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的有効量の甲状腺−刺激ホルモン（TSH）ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における脂肪分解の誘発方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の体重の臨床学的有意な低下をもたらす方法。
【請求項２】
前記哺乳類が肥満である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類が、25以上のボディ・マス指数を有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ボディ・マス指数が、26、26〜50又は50である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳類の体重の低下が、脂肪組織の脂肪分解刺激に起因する請求項１記載の方法。
【請求項６】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における減量の誘発方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の体重の臨床学的有意な低下をもたらす方法。
【請求項７】
前記哺乳類が肥満である請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類が、25以上のボディ・マス指数を有する請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記ボディ・マス指数が、26、26〜50又は50である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類におけるII型糖尿病の処理方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の糖尿病状態の改良性をもたらす方法。
【請求項１１】
前記哺乳類が肥満である請求項10記載の方法。
【請求項１２】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における高脂血症の処理方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の低められた高脂血症をもたらす方法。
【請求項１３】
前記哺乳類が肥満である請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類が、II型糖尿病である請求項12記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの投与が、低められた血清グルコース又はインスリンレベルをもたらす請求項12記載の方法。
【請求項１６】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における脂肪肝炎の処理方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類における改良された脂肪肝炎状態をもたらす方法。
【請求項１７】
前記哺乳類が肥満である請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類が、II型糖尿病である請求項16記載の方法。
【請求項１９】
血清コレステロール又は血清トリグリセリドレベルが低められる請求項16記載の方法。
【請求項２０】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、脂肪変性を有する哺乳類における脂肪肝炎を妨げるための方法であって、前記ポリペプチド投与が脂肪変性を維持するか又は低める方法。
【請求項２１】
前記哺乳類が肥満である請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳類が、II型糖尿病である請求項20記載の方法。
【請求項２３】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における高められた血漿コレステロールレベルを低めるための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類における血漿コレステロールレベルを低める方法。
【請求項２４】
前記哺乳類が、高コレステロール血症である請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類が、II型糖尿病である請求項23記載の方法。
【請求項２６】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における高められたトリグリセリドレベルを低めるための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類におけるトリグリセリドレベルを低める方法。
【請求項２７】
前記哺乳類が、II型糖尿病である請求項26記載の方法。
【請求項２８】
医薬有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、脂肪変性を有する哺乳類における肝臓の脂肪変性を処理するための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記脂肪変性を維持するか又は低める方法。
【請求項２９】
前記哺乳類が肥満である請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳類が、II型糖尿病である請求項28記載の方法。
【請求項３１】
医薬有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類におけるインスリン感受性を改良するための方法であって、前記ポリペプチドの投与がインスリンに対する高められた感受性をもたらす方法。
【請求項３２】
血清グルコースレベルが低められる請求項31記載の方法。
【請求項３３】
インスリンレベルが低められる請求項31記載の方法。
【請求項３４】
医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類におけるアテローム硬化症の処理方法であって、前記ポリペプチドの投与が改良されたアテローム硬化症状態をもたらす方法。
【請求項３５】
前記哺乳類が高脂血症である請求項34記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、肥満、肥満に関連する合併症、肝臓脂肪変性、インスリン耐性及び糖尿症の処理に関する。より特定には、本発明は、肥満、肥満に関連する合併症、肝臓脂肪変性、インスリン耐性及び糖尿症の処理のために脂肪分解を刺激するためへの甲状腺−刺激ホルモン（TSH又は甲状腺刺激ホルモン）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
肥満症は、重症で且つ広範囲に広まっている公衆の健康問題である。産業国の人口の1/3が、少なくとも20％の理想体重の超過を有する。この現象は、発展途上国、特に経済が近代化している地球の地域に広がっている。2000年現在、世界に推定される３億の肥満の人工が存在した。
【０００３】
肥満症は、進行性心血管疾患又は代謝疾患の危険性を相当に高める。30％以上の超過体重に関しては、冠状動脈疾患の発生率が年齢50歳下で２倍になる。他の疾患に関して行なわれた研究は、同様のことを表す。20％の超過体重に関しては、高血圧の危険性が２倍になる。30％の超過体重に関しては、進行性非インスリン依存性糖尿病の危険性が３倍になり、そして異常な脂肪血症の発生率が６倍に上昇した。肥満により促進される追加の疾病は多く；肝機能の異常、消化病理学、多くの癌及び生理学的疾病がそれらの中で顕著である。
【０００４】
肥満症についての処理は、カロリー摂取の制限、及び物理的運動を通しての高められたカロリー消費を包含する。しかしながら、節食による肥満症の処理は、短期間では効果的であるが、非常に高い割合の常習性を有する。運動による処理は、節食の不在下で適用される場合、比較的無効果であることが示されている。他の処理は、胃腸の手術、又は食事の脂質の吸収を制限する剤を包含する。それらの方策は、それらの使用の副作用のために、ほとんど不成功であった。
【０００５】
肥満に関連する合併症、例えばII糖尿病、高脂血症、及び脂肪肝炎についての現在の治療は、ほとんどの場合、それらの生命−脅威の病理学進行を止めるには不適切であった。
脂肪分解剤が、集中的に研究されており、そして肥満症、グルコース感受性及び異脂肪血症における著しい改良性を生成することが見出されている。それらの剤、すなわち交感神経系のアゴニスト（カテコールアミン）は、交換神経性神経支配に応答する他の組織を刺激しないで脂肪組織のみを標的化する特異的剤を創造できないために、好結果を生む治療剤であるとは証明されていない。
【０００６】
明かに、ヒトにおける体重の減量及び高められた肥満性に関連する有害な効果のために有用である新規処理の必要性が存在する。脂肪分解及び減量を促進するために投与され得る治療剤は、肥満の制御を助け、そしてそれにより、この状態に関連する多くの負の結果を軽減する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約：
１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量の甲状腺−刺激ホルモン（TSH）ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における脂肪分解の誘発方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の体重の臨床学的有意な低下をもたらす。１つの態様においては、前記哺乳類は肥満である。もう１つの態様においては、哺乳類は、25以上のボディ・マス指数を有する。さらなる態様においては、ボディ・マス指数は、26、26〜50又は50である。もう１つの態様においては、哺乳類の体重の低下は、脂肪組織の脂肪分解刺激に起因する。
【０００８】
１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における減量の誘発方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与は前記哺乳類の体重の臨床学的有意な低下をもたらす。１つの態様においては、前記哺乳類は肥満である。もう１つの態様においては、前記哺乳類は、25以上のボディ・マス指数を有する。さらなる態様においては、前記ボディ・マス指数は、26、26〜50又は50である。
【０００９】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類におけるインスリン感受性を改良するための方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与がインスリンに対する高められた感受性をもたらす。１つの態様においては、血清グルコースレベルは低められる。もう１つの態様においては、インスリンレベルが低められる。
【００１０】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類におけるII型糖尿病の処理方法又は予防方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の糖尿病状態の改良性をもたらす。１つの態様においては、前記哺乳類は肥満である。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドの投与が、低められた血清グルコース又はインスリンレベルをもたらす。
【００１１】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における高脂血症の処理方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の低められた高脂血症をもたらす。１つの態様においては、前記哺乳類が肥満である。もう１つの態様においては、前記哺乳類が、II型糖尿病である。もう１つの態様においては、前記哺乳類における血清コレステロール又は血清トリグリセリドレベルが低められる。
【００１２】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における脂肪肝炎の処理方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類における改良された脂肪肝炎状態をもたらす。１つの態様においては、前記哺乳類が肥満である。もう１つの態様においては、前記哺乳類が、II型糖尿病である。
【００１３】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、脂肪変性を有する哺乳類における脂肪肝炎を妨げるための方法を提供し、ここで前記ポリペプチド投与が脂肪変性を維持するか又は低める。１つの態様においては、前記哺乳類が肥満である。もう１つの態様においては、前記哺乳類が、II型糖尿病である。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における高められた血漿コレステロールレベルを低めるための方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類における血漿コレステロールレベルを低める。１つの態様においては、前記哺乳類が、II型糖尿病及び/又は肥満である。もう１つの態様においては、前記哺乳類が、高コレステロール血症である。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における高められたトリグリセリドレベルを低めるための方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類におけるトリグリセリドレベルを低める。１つの態様においては、前記哺乳類が、II型糖尿病である。もう１つの態様においては、前記哺乳類が、高トリグリセリド血症である。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、脂肪変性を有する哺乳類における肝臓の脂肪変性を処理するための方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が前記脂肪変性を維持するか又は低める。１つの態様においては、前記哺乳類が肥満である。もう１つの態様においては、前記哺乳類が、II型糖尿病である。
【００１７】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的有効量のTSHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類におけるアテローム硬化症の処理方法を提供し、ここで前記ポリペプチドの投与が改良されたアテローム硬化症状態をもたらす。１つの態様においては、前記哺乳類が高脂血症である。
本発明のそれらの及び他の観点は、本発明の次の詳細な記載により明らかに成るであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の特定の記載：
本発明は、減量を促進し、そして/又は肥満に時折関係する糖尿病を処理するために新規治療についての必要性を満たす。本発明は、脂肪分解を促進し、そしてそれにより、減量を促進し、肝臓脂肪変性を低め、そして/又はインスリン感受性を高めるために、個人に甲状腺刺激ホルモン（TSH）を投与することを含んで成る。本発明はさらに、TSHを個人に投与することを含んで成る、個人におけるII型糖尿病又は前−糖尿病状態を処理するための方法を包含する。
【００１９】
本発明はさらに、医薬的有効量のTSHを個人に投与することを含んで成る、個人におけるII型糖尿病又は前−糖尿病状態を処理するための方法を包含する。さらに、本発明は、甲状頚動脈を破壊しないで、個人にTSHを投与することを含んで成る、個人におけるインスリン感受性を改良するための方法を包含する。１つの観点においては、前記個人は、治療的効果量のTSHにより処理される。もう１つの観点に追いては、TSHは脂肪変性又は脂肪肝炎の逆転を促進するために使用される。本発明の観点においては、個人は哺乳類である。１つの態様においては、哺乳類はヒトである。
【００２０】
本明細書に引用されるすべての文献の教授は、引用により本明細書に組込まれる。
ここで、本発明者は、肥満症の処理のために有効である方法を開示する。下記のように、脂肪組織における脂肪分解を刺激する能力は、肥満症に関連する多くの病理学に介在する手段を提供する。特に、本発明者は、TSHが、インビトロ又はインビボで投与される場合、脂肪分解を刺激することを発見した。結果として、代謝速度が高められ、減量、高められたインスリン感受性、及び低められた高脂血清が導かれる。この代謝の上昇は、甲状頚動脈の活性化とは無関係である。さらに、本発明者は、甲状腺ホルモンレベルの慢性的上昇を伴わないで、脂肪分解を直接的に刺激するTSHの投与方法を開発した。
【００２１】
脂肪分解を促進するために使用される場合、TSHは減量を促進することができる。本発明の方法は、肥満、肥満又は異脂肪血症に関連するアテローム硬化症、糖尿病、肥満又は糖尿病に関連する高血圧、脂肪変性又は脂肪肝炎、又はより一般的には、肥満に関連する種々の病理学を包含する病状を処理するために有用である。
本発明のもう１つの観点においては、TSHは、減量を誘発する他の薬剤により処理された個人における減量の維持のために使用され得る。
【００２２】
本発明はまた、特に肥満に関連する非インスリン依存性糖尿病の処理のためにも有用である。１つの態様においては、非インスリン依存性糖尿病を処理するためへのTSHの使用は、非肥満個人においても構想される。
本発明はさらに、高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症を包含する異脂肪血症の処理のためにも有用である。
本発明のさらにもう１つの観点は、個人における休止代謝速度を早めるためへのTSHの使用に関する。この観点の１つの態様においては、遅い休止代謝速度を有する個人は、甲状腺機能正常状態を維持しながら、脂肪分解を促進し、そしてエネルギー使用を高めるためにTSHを投与される。
【００２３】
エネルギー消費は、エネルギー平衡等式の１つの観点を提供する。安定した体重を維持するためには、エネルギー消費は、エネルギー摂取と平衡して存在すべきである。相当の努力が、減量し、又は体重を維持する手段としてエネルギー摂取（すなわち、節食及び食欲）を操作することに払われて来たが、しかしながら、それらのアプローチに向けられた莫大な合計全額にもかかわらず、それらはほとんど未成功である。体重調節を管理し、そして肥満を処理する手段としてエネルギー消費を薬理学的に高める努力がまた存在した。上昇するエネルギー代謝は、それが正常レベルでの食物摂取の影響される個人による維持を可能にする可能性を有するので、魅力的な治療アプローチである。さらに、薬理学的手段によるエネルギー消費の上昇はエネルギー摂取及び食欲における対応する上昇により十分には中和されない観点を支持する証拠が存在する。Bray, G.A. (1991) Annu. Rev. Med. 42, 205-216を参照のこと。
【００２４】
エネルギー消費は、中枢神経系の操作により、交感神経系（SNS）の末梢遠心性神経の活性化により、又は甲状腺ホルモンレベルの上昇により薬理学的に刺激され得る。
甲状腺ホルモンは、身体のほとんどの細胞における炭水化物及び脂質代謝を刺激し、そしてタンパク質合成の速度を早める。TSHは、甲状腺ホルモン生合成及び分泌を刺激する。下垂体前葉体の向甲状腺細胞からのTSHの分泌は、循環性T4及びT3により阻害され、そして視床下部において生成される甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンにより刺激される。Utiger, in Endocrinology andMetabolisnl (Felig and Frohman, eds), pp. 261-347, McGraw-Hill, (2001)を参照のこと。
【００２５】
甲状腺ホルモンにより生成される異化の結果として、熱が放され、そしてエネルギー消費が高められる。甲状腺ホルモンレベルを高めることによる基本エネルギー消費を高める機会のために、肥満における甲状腺ホルモンレベルに強い興味がある。研究は、肥満及び正常体重の個人が類似する甲状腺ホルモンプロフィールを有することを示した。過剰の甲状腺ホルモンは、一般的に甲状腺中毒症と称する種々の障害を導く。この状態は、異常に高い代謝速度、高められた血圧、高い体温、熱不耐性、被刺激性、及び指の震えにより特徴づけられる。高められた及び激しい心拍傾向が特に、肥満状態における興味である。
【００２６】
高められた甲状腺ホルモンレベルの悪影響のために、肥満を処理するためへの甲状腺ホルモンの使用は、甲状腺機能不全により同定される少数の肥満患者において以外に、ほとんど好結果は見出されなかった。
【００２７】
毎日、消費されるエネルギーの多くは、休止代謝速度（RMR）に由来し、それは、毎日の合計エネルギー消費の50−80％を占める。再考に関しては、Astrup. A. (2000) Endocrine 13, 207-212を参照のこと。ノルアドレナリンターンオーバー研究は、身体サイズ及び組成により説明されないRMRにおける変動性のほとんどがSNS活性の差異に関連していること示し、このことは、SNS活性がRMRを調節することを示唆する。Snitker, S., など．（2001）Obes．Rev. 1, 5-15を参照のこと。食物摂取は、高められたSNS活性を付随し、そして研究は、食物に応答しての高められたSNS活性が食物誘発された熱発性の少なくとも一部を説明することを示した。
【００２８】
エネルギー使用の調節に関与するSNSの末梢標的物は、β−アドレナリン性受容体（β−AR）である。それらの受容体は、第二メッセンジャーサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）に結合される。cAMPレベルの上昇は、タンパク質キナーゼA（PKA）、多能タンパク質キナーゼ及び種々の細胞効果を誘発する転写因子の活性化を導く。Bourne, H.R., など. (1991) Nature349, 117-127を参照のこと。脂肪組織は、SNSにより非常に弱められ、そしてβ−アドレナリン性受容体の３種の既知サブタイプ、すなわちβ1、β2−及びβ3−ARを有する。
【００２９】
SNSの活性化は、それらの受容体の脂肪分解及び脂肪酸化へのカップリングを通してエネルギー消費を刺激する。脂肪組織により生成され、そして血流中に開放される高められた血清フリーの脂肪酸（FFA）が、エネルギー消費を刺激し、そして熱発生を高める。再考のためには、Astrup, A. (2000) Endocrine B, 207-212を参照のこと。さらに、高められたPKAレベルは、不用熱を生成する、ミトコンドリアにおける無益回路を創造するカップリングしていないタンパク質−１（UCP−１）をアップレギュレートすることにより、脂肪におけるエネルギー利用を高める。
【００３０】
過去20年間にわたって、肥満及び肥満に関する糖尿病の処理のためのSNS活性化の生理学的有益性の研究が、β3-ARの薬理学的活性化に集中されて来た。β3-ARの発現は、β1又はβ2イソフォームよりも狭い組織範囲に制限され、そして他のイソフォームに比較して、囓歯動物組織において高く発現される。β3−ARアゴニストにより処理された囓歯動物における実験研究は、脂肪分解及び脂肪酸化の刺激が高められたエネルギー消費、減量及び高められたインスリン感受性を生成することを示した。De souza, C.J. and Burkey, B.F. (2001) Curr. Pharm. Des. 7, 1433-1449を参照のこと。
【００３１】
しかしながら、それらの化合物の可能性ある有益性は、ヒトβ3−ARでの効能のそれらの欠失のために実現されていない。さらに、従って、囓歯動物脂肪組織におけるβ3−ARのレベルがヒト脂肪組織においてよりも高いことが現実化された。ヒト脂肪組織においては、β1及びβ2イソフォームが、優性アドレナリン性受容体イソフォームを表す。Arch, J.R. (2000) Eur. J. Pharmacol. 440, 99-104を参照のこと。従って、肥満の処理のための脂肪分解の刺激の生化学的前提条件は齧歯動物において明らかに示されているが、ヒトにおいてその対応する効果を治療激に生成するための機構は実現されていない。
【００３２】
脂肪分解を通して脂肪酸化を促進するための方策は、減量を促進しない用量で、及び体中に影響を及ぼさない時間にわたって、改良されたインスリン感受性を示した。インスリン感受性効果が抗−肥満効果よりも容易に検出できる。脂肪酸化の刺激は、インスリンシグナル化を調節する代謝物の細胞内濃度を急速に低めることができる。対照的に、抗−肥満効果は、脂肪の大きな貯蔵物が酸化されるにつれて、徐々に進行すべきである。
【００３３】
本発明は一般的に、脂肪組織における脂肪分解を刺激するために有用である方法に関する。当業者は、脂肪分解が、トリグリセリドの形で貯蔵される脂肪が脂肪細胞から、個々の遊離脂肪酸として循環中に開放される生化学工程であることを理解するであろう。脂肪分解の刺激は、ヒトにおける高められたエネルギー消費に明かに連結されており、そして脂肪分解を促進し、そして脂肪酸化を高めるためにいくつかの方策が、減量を促進し、そして肥満に関連する糖尿病状態を処理するために研究されて来た。それらの治療努力は、その末梢β−アドレナリン作用性受容体を通して交感神経系（SNS）を刺激する化合物の創造に主に集中する。脂肪組織におけるTSH−促進された脂肪分解の発見は、インビボ及びインビトロで、脂肪、及び肥満に関連するインスリン−耐性糖尿病状態の新規且つ特定の方法を提供する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語“褐色脂肪体”とは、高密度のミトコンドリアを含み、そしてその一次機能がミトコンドリアにおけるATP生成に脂肪酸化の非カップリングを通しての熱の生成である（“無益サイクル”）、脂肪組織貯蔵物を言及する。用語“白色脂肪”とは、優性形の脂肪組織を言及し、そしてトリグリセリドの形で脂肪酸のための主要貯蔵物として作用する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語“肥満症”及び“肥満−関連の”とは、個人の身長及び骨格に関する理想よりもある程度、大きい身体質量を有する個人を言及する。好ましくは、それらの用語は、25以上の、30に等しいか又はそれ以上の、35に等しいか又はそれ以上の、及び40以上のボディ・マス指数値を有する個人を言及する。
【００３６】
甲状腺−刺激ホルモン（TSH）は、２種の非共有結合されたペプチドサブユニット（α及びβサブユニット）から成る、約30kDaの糖タンパク質である。TSHのαサブユニットは、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン及び繊毛性性腺刺激ホルモンのそのサブユニットと同じであり、そして次のアミノ酸配列を有する：mdyyrkyaaiflvtlsvflhvlhsapdvqdcpectlqenpffsqpgapilqcmgccfsrayptplrskktmlvqknvtsestccvaksynrvtvmggfkvenhtachcstcyyhks（配列番号１）。配列番号１についてポリヌクレオチド配列は、配列番号２で示される。αサブユニットのアミノ酸25〜116は、成熟タンパク質（配列番号３）を含んで成る。
【００３７】
TSHのβサブユニットは、ユニークであり、そして次のアミノ配列を有し：mtalflmsmlfglacgqamsfcipteytmhierrecaycltintticagycmtrdingklflpkyalsqdvctyrdfiyrtveipgcplhvapyfsypvalsckcgkcntdysdciheaiktnyctkpqksylvgfsv（配列番号４）、そしてホルモンの生物学的特異性を決定する。配列番号４についてのポリヌクレオチド配列は、配列番号５で示される。βサブユニットのアミノ酸21〜132、は、成熟タンパク質（配列番号６）を包含する。TSHは、当業界において知られている技術を用いて生医薬方法により生成されるか、又は市販源、例えばGenzyme Coporation (Cambridge, MA)から入手され得る。
【００３８】
甲状腺は、２種のホルモン、すなわちサイモキシン（T4）及びトリヨードサイロニン（T3）を生成する。正常ヒト血清におけるT4：T3の比は、典型的には100：１である。正常ヒトにおける合計の甲状腺ホルモンレベルは、dl血清当たり５〜11μgの範囲であり；この範囲は、甲状腺機能正常状態として定義される。過剰レベルの甲状腺ホルモン（甲状腺中毒症）は、甲状腺機能亢進状態をもたらし；そして血清における低レベルの甲状腺ホルモンは、甲状腺機能低下状態として定義される。
【００３９】
脂肪変性は、肝臓における脂肪貯蔵体の蓄積である。いずれかの病因学の脂肪変性は、線維症、いわゆる脂肪肝炎、及び肝臓の硬変の進行に関連している。
【００４０】
TSHは脂肪組織におけるcAMPの上昇を促進する：
TSHは、チロトロピン−刺激ホルモン（TSH）受容体との相互作用を通してその効果を発揮する。Nakabayashi, K., など. (2002) J. Clin. Invest. 109, 1445-1452を参照のこと。TSH受容体（TSHR）は、G−タンパク質結合された、７種のトランスメンブラン受容体スーパーファミリーのメンバーである。TSH受容体の活性化は、下流の細胞効果を引き起こす、ヘテロトリマーGタンパク質とのカップリングを導く。TSH受容体は、サブタイプGs, Gq, G12及びGiのGタンパク質と相互作用することが示されている。特に、Gsとの相互作用は、アデニルシクラーゼの活性化及び高められたcAMPレベルを導く。 Laugwitz,  K.L., など. (1996) Proc, Natl. Acad. Sci. USA93, 116-120を参照のこと。
【００４１】
最近の報告は、ヒト及び囓歯動物の組織細胞におけるTSHRの存在を示している。 Bell, A., など. (2999) Am. J. Rhysial. Cell. Physiol. 279, (335-340, 及びEndo, T., など. (1995) J. Biol. Chem. 270, 10833-10837を参照のこと。
【００４２】
例１は、培養されたネズミ3T3−L1脂肪細胞及び一次ヒト脂肪細胞におけるTSHによる高められたcAMPの生成を示す。本発明者は、TSHがcAMP応答要素（CRE）エンハンサー配列の制御下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子構造体の活性化を生成することを発見した。典型的には、本発明者は、TSH処理に応答してのルシフェラーゼレポーター遺伝子の10−40倍の誘発を観察し、このことは、TSHRの活性化に続いて、脂肪細胞におけるcAMPの有意な生成を示す。それらのデータは、TSHが、細胞内cAMPレベルにより主に制御される、脂肪組織脂肪分解の重要な生理学的調節体であることを示す。再考に関しては、Astrup, A. (2000) Endocrine 13, 207-212を参照のこと。
【００４３】
TSHは脂肪細胞及び完全な動物における脂肪分解を促進する：
TSHを、例２に記載のように、培養された3T3−L1ネズミ脂肪細胞における脂肪分解を活性化するその能力について試験した。４時間の試験化合物による脂肪細胞の処理に続いて、脂肪分解を、脂肪細胞培養培地におけるグリセロール及び遊離脂肪酸（FFA）の蓄積により評価した。10nMのヒト組換えTSHによる脂肪細胞の処理は、有意に高められたレベルの細胞外グリセロール及びFFAを生成した。図１は、イソプロテレノール、すなわち非特異的β−アドレナリン性アゴニストに対するTSHの脂肪分解活性を比較する。TSHにより達成される最大の脂肪分解は、イソプロテレノールにより生成されるその脂肪分解の約50％である。脂肪分解は、1nMの濃度でTSHにより有意に刺激され、このことは、TSHが脂肪細胞における脂肪分解の有能な調節体であることを示す。
【００４４】
本発明の有意な観点は、インビボでの脂肪分解の刺激である。TSHの腹膜内（IP）注射は、完全な動物において血清グリセロール及びFFAの急性上昇を生成する。例３に記載されるように、マウスは、TSH（300μg/kg）、β3−ARアゴニストCL316,243（1mg/kg）又はビークル塩溶液のIP注射の前、一晩、絶食された。血清を、基線を確立するために注射の前、サンプリングし、次に注射の後、２及び４時間で、再びサンプリングした。ビークル対照は４時間で血清グリセロール及びFFAレベルの低下を示したが、TSHにより処理された動物は、両者において有意な上昇性を示し、このことは、TSHがインビボでの脂肪分解の有能な刺激体であることを示す。図２に示されるように、本発明はインビボで高められた血清FFAの有能な刺激体であり、このことは、４時間の時点でβ3−ARアゴニストよりも有意な上昇性を示す。本発明の１つの態様においては、TSHは血漿FFAにおける急性上昇をもたらすために使用され、従って、高められた基礎代謝速度を促進するために使用される。
【００４５】
TSHによるob/obマウスの慢性的処理は甲状腺ホルモンレベルにおける持続される上昇を伴わないで脂肪分解を生成する：
肥満ob/obマウスは時折、ヒト肥満及び糖尿病のモデルとして使用される。このモデルにおけるTSH−刺激された脂肪分解の効果を試験するために、TSH、β3−ARアゴニストCL316,243、サイロキシン又はビークル塩溶液を、例４に記載のようにして、IP注射により、４週間、毎日投与した。サイロキシングループは、TSHにより介在される脂肪細胞における脂肪分解の直接的な刺激とサイロイドホルモンの代謝効果とを区別するために包含された。
【００４６】
本発明の観点は、脂肪分解を刺激する用量でIP注射により末梢中に導入される場合、TSHが慢性甲状腺機能亢進状態の創造をもたらさない発見である。図３に示されるように、TSHの１ヶ月間の毎日の注射に続く甲状腺ホルモン（T4）の循環レベルは、ビークル対照において見出されるレベル以上に上昇しない。毎日注射されるTSHの量は、下垂体から１日に放出されることが予測されるTSHの量の100倍以上である。従って、本発明は、肥満及び糖尿病の処理のための治療効果を生成するために脂肪分解を刺激すると共に、著しい甲状腺機能亢進状態を生成するために、甲状頚動脈を変性しないでTSHを導入する方法を提供する。
【００４７】
４週間の処理の後、注射された動物を、血清グルコースレベル及びインスリン感受性に対するTSH処理の効果を評価するために、腹膜内グルコース耐性試験（IPGTT）にゆだねた。対象マウスは、基線グルコース及びインスリンレベルを得るために、血液サンプリングの前、４時間、断食され、次にグルコース攻撃に対するインスリン感受性の測定を可能にするためにグルコースを注射された。図４に示されるように、TSH−処理された動物における断食された血清グルコースレベルは、４週間の処理の後、ビークル対照又はサイロキシン−処理された動物においてよりも有意に低かった。TSHは、このモデルにおける高血糖を低めることにおいて対照β3−ARアゴニストと同じほど効果的であることが見出される。図４は、サイロキシンの投与による甲状腺ホルモンレベルの上昇がビークル対照グループに比較して、断食グルコースレベルを低めないので、TSHの末梢投与が甲状腺ホルモン活性を通して血清グルコースを低めるよう作用しない発見を示す。
【００４８】
本発明のさらなる観点は、図５に示されるように、グルコース攻撃に応答してのインスリン感受性及び低められた高血糖の改良である。グルコース耐性試験は、糖尿病及びインスリン感受性の典型的な診断測定である。Defronzo R. A. など. (1991) Diabetes Care 14,173-194を参照のこと。パネルAは、グルコース攻撃のクリアランスが、ビークル−又はサイロキシン−処理されたグループに比較して、TSH−処理されたグループにおいて有意に増強されることを示す。パネルBは、TSH−処理されたグループにおけるインスリン感受性が、ビークル−又はサイロキシン−処理された対照に比較して、有意に改良されることを示す。TSH及び対照β3−ARアゴニストグループは、ビークル又はサイロキシン処理グループに比較して、低いインスリンレベルによる増強されたグルコース処理を示す。
【００４９】
本発明のさらなる観点においては、TSHによる脂肪分解の刺激が低められた血清脂質レベルをもたらす。特に、TSHによるob/obマウスの慢性的処理は、血清コレステロース及びトリグリセリドレベルの有意な低下を導く。本発明は、典型的には、肥満及びII型糖尿病に関連する、高められた血漿コレステロール及びトリグリセリドレベルを低める方法を包含する。
【００５０】
TSH−刺激された脂肪分解が高脂血症の改良性を生成する発見は、β−ARアゴニストによる脂肪分解の共感刺激が血清コレステロールレベルの低下をもたらさず、そして典型的には、変更されていないか、又はわずかに高められた血清トリグリセリドレベルをもたらす観察に比較して、表す（例えば、例４における血清脂質分析）。さらに、血清トリグリセリド及びコレステロールレベルを低めることに対するTSHの効果は、甲状腺ホルモンの循環レベルの上昇によらない。例４に詳細されるように、甲状腺ホルモンによる慢性的処理は、高められた血漿トリグリセリドをもたらし、そして血清コレステロールレベルを低めなかった。
【００５１】
本発明はさらに、肥満の処理方法を提供する。脂肪分解の刺激は、動物及びヒトにおける減量及び脂肪マスの低下をもたらすことができる。β−ARアゴニストによるSNS刺激による脂肪における高められた脂肪分解は典型的には、齧歯動物における肩褐色脂肪マスにおける上昇、及び白色脂肪組織マスにおける低下をもたらす。高められた褐色脂肪マスは、褐色脂肪における熱の生成による脂肪の酸化により、より早い代謝速度をもたらす。TSHにより処理されたマウスは、ビークル対照よりも褐色脂肪マスを高めた（例４）。さらに、TSH−処理されたマウスは、メサンギウム腹部内白色脂肪のマスにおける有意な低下を有した。さらに、TSHグループにおける体重低下が、対照に比較して低められた（ｐ＝0.11）。TSH処理グループ（ｎ＝８）は、１ヶ月の処理後、開始体重からの低下を示した固体（ｎ＝３）のみを含んだ。上記のように、TSHによる処理の抗−肥満効果は、インスリン−刺激性効果よりもよりゆっくりと進行することが予測される。
【００５２】
本発明のさらなる態様においては、TSHは、脂肪変性及び脂肪肝炎の処理のために有用である。肝臓疾患は肥満の広く認識される合併症ではないが、疫学的証拠は、肥満が硬変の危険性を高めることを示唆する。例えば、検死シリーズにおいて、肥満は、硬変対象の12％において疾病についての唯一の危険性因子として同定された。Yang, S. Q. など. (1997) Proc Natl Acad Sci U5'A 94, 2557-2562を参照のこと。注目に値することには、硬変は、一般的集団における肥満個人において約6倍、有力である。USAにおいては、一般集団におけるオーバーウェイトの人々の高い割合は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）が最も共通する肝疾患である事実を一部、説明する。II型糖尿病はそれらの対象の33％で存在する。
【００５３】
肥満の程度は、脂肪肝（脂肪変性）の有病率及び重症度と明確に相互関係し、そしてこれは脂肪肝炎とも相互関係する。脂肪肝炎の病因の現在の説明は、“２−ヒット（two-hits）”仮説である。Day, C. P, and James,O.,Gastroeaaterology 114,842-845を参照のこと。最初の“ヒット”は、肝臓又は脂肪変性肝炎の脂肪分解を導く、肝細胞における脂肪の沈着である。この脂肪分解は、糖尿病、薬物代謝のための脂質過酸化、又は過剰アルコール摂取を包含する種々の障害の原因の１つであり得る第２の“ヒット”に対する器官の感受性を高める。
【００５４】
例４に詳細されるように、TSHによるob/obマウスの慢性的処理は、それらの対象における脂肪変性を有意に逆転する。従って、本発明は、脂肪肝炎及び硬変への進行のために必要とされると思われる第1の“ヒット”を逆転する方法を生成する。さらに、効果的な治療が現在、入手できない脂肪肝炎を有する対象の本発明による処理は、正常な（非脂肪変性）肝臓状態への逆転を誘発し、前−硬変性肝炎の硬変への進行を妨げる。
【００５５】
脂肪分解刺激剤としてのTSHの利点：
本発明は、脂肪分解を生成し、そして代謝速度を早める新規方法を提供する。これまで使用されて来た脂肪分解を治療的に誘発するための他の方策は、特異性、例えば一般的にβ-ARアゴニストに欠失、又は今日まで開発されて来たβ3-ARアゴニストの特異性に関しての効力の欠失を有する。ヒト使用のために研究された剤のほとんどは、満足のゆく選択性を示さず、そして結果として、脂肪細胞以外の組織における交感神経路の活性化のために、高められた血圧及び心拍をもたらした。Arch, J.R. (2002) Eur. J. Pharmacol. 440, 99-107を参照のこと。
【００５６】
β3-AR特異的アゴニストの開発の強調にもかかわらず、最近のヒト研究は、交感神経的に誘発された熱発生及びエネルギー消費の主要メディエーターとしてβ1−及びβ2−アドレナリン性受容体を包含して来た。さらに、ヒト肥満集団における研究は、それらの個人に観察される休止代謝速度の低下が脂肪組織におけるβ2−アドレナリン性受容体の損なわれた機能の結果であることを示す。Schiffelers, S.L., など. (2001) J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 2191-2199及びBloak，E. E., など. (1993) Am. J. Physiol. 264, E11-17を参照のこと。従って、交感神経性神経衰弱を伴なわないでの脂肪分解を高める新規機構は、肥満症の処理のためのユニーク機会を提供する。
【００５７】
ヒト細身及び肥満対象における他の研究は、血漿FFAレベルの上昇が脂質酸化及びエネルギー消費において類似する上昇を誘導することを見出した。それらの研究は、肥満対象における脂肪の蓄積が脂質利用の欠陥のためであるよりもむしろ脂肪組織細胞分解の欠陥のためであり得ることを結論づける。Schiffelers, S. L., など. (2001) Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 25, 33-38 を参照のこと。
【００５８】
高められた脂肪分解及び得られる脂肪細胞サイズの低下は、ヒト横断面研究において、インスリン耐性と相互関係しない。Weyer, C., など., (2000) Diabetologia 43, 1498-1506を参照のこと。従って、脂肪分解を刺激し、そして脂肪細胞サイズを低めるための方法は、肥満症に関連するインスリン−耐性糖尿病を低めることが予測される。脂肪組織における有意な数のTSH受容体の存在は、ヒト肥満集団における脂肪分解及びRMRを調節する新規方法を提供する。
【００５９】
II型糖尿病を処理するためへのTSHの使用：
TSHはまた、II型糖尿病（II型DM）を処理するためにも投与され得る。II型DMは通常、30歳以上の患者において診断される型の糖尿病であるが、しかしそれはまた、子供及び青年においても発生する。それは、高血糖及びインスリン耐性によって臨床学的に特徴づけられる。II型DMは通常、肥満症、特に身体の上部（内臓/腹部）の肥満に関連し、そしてしばしば、体重の増加の後に発生する。
【００６０】
II型DMは、高血糖が、グルコースに対する損なわれたインスリン分泌応答、及び骨格筋によるグルコース摂取の刺激及び肝グルコース生成（インスリン耐性）の抑制における低められたインスリン有効性の両者に起因する異種グループの障害である。その得られる高血糖症は、他の通常の状態、例えば肥満、高血圧、高脂血症及び冠状動脈疾患を導くことができる。
TSHは下記用量で個人に投与され得る。TSHはまた、インスリン及び他の糖尿病用薬剤、例えばトルブタミド、クロルプロパミド、等と共に投与され得る。
【００６１】
TSHの配合及び投与：
TSHは、肥満症及び糖尿病に関する疾病を処理するか又は改善するための治療的有効用量で、単独で、又はそれが適切なキャリヤー又は賦形剤と共に混合されている組成物により投与され得る。TSHの処理用量は、安全性及び効力を最適化するよう滴定されるべきである。投与方法は、静脈内、腹腔内、直腸、鼻腔内、皮下及び筋肉内投与を包含する。医薬滴に許容できるキャリヤーは、水、塩溶液及び緩衝液を包含するであろう。
【００６２】
投与量範囲は通常、0.1μg〜1mg/kg体重/日であることが予測される。初期において試みる有用な用量は25μg/kg/日である。しかしながら、その用量は、当業者により決定される場合、高くても又は低くても良い。薬剤配合及び投与量範囲の完全な議論については、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1990) 及びGoodman and Gilman’s: The Pharmaceutical Basis of therapeutics, 9th Ed. (Pergamon Press, 1996) を参照のこと。
【００６３】
医薬使用に関しては、本発明のタンパク質は、経口、直腸、非経口（特に、静脈内又は皮下）、槽内、膣内、局部（粉末、軟膏、点滴又は経皮用パッチとして）、頬内投与されるか、又は肺又は鼻腔内吸入剤として投与され得る。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間にわたってのボーラス注射又は注入によるであろう。一般的に、医薬製剤は、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース又は同様のものと組合してTSHタンパク質を含むであろう。
【００６４】
製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミン、等を含むことができる。TSHポリペプチドの用量は一般的に、毎日〜毎週のスケジュールに基づいて投与されるであろう。用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、数日〜数ヶ月又は数年にわたって、急性又は慢性処理のために投与され得る。一般的に、TSHの治療的有効量は、体重の臨床学的に有意に低下、肥満に関連する糖尿病状態の改良、肝臓脂肪変性の低下、及び/又はインスリン感受性の上昇をもたらすのに十分な量である。
【実施例】
【００６５】
本発明はさらに、次の非制限的例により例示される。
例１．3T3 L1脂肪細胞及びヒト脂肪細胞のTSH活性化がcAMP生成をもたらす：
要約：
分化されたネズミ3T3 L1脂肪細胞及び一次ヒト脂肪細胞を用いて、TSHのシグナルトランスダクションについて研究した。3T3 L1線維芽細胞を脂肪細胞に分化し、そして細胞を、レポーター構造体、すなわちcAMP応答要素（CRE）エンハンサー配列の制御下でのホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウィルスによりトランスダクションした。このアッセイシステムは、Gs−カップリングされたG−タンパク質カップリングされた受容体（GPCR）の活性化の下流にcAMP−介在の遺伝子誘発を検出する。イソプロテレノール、すなわちβ−アドレナリン性受容体アゴニストによる分化された3T3 L1細胞の処理は、cAMPレベルの上昇及びルシフェラーゼ発現の50倍の誘発をもたらした。
【００６６】
TSHによる分化された3T3 T1細胞の処理はまた、高められたcAMPレベル及びルシフェラーゼ発現の24倍の誘発をもたらした。別の実験においては、未分化の3T3 L1線維芽細胞を、組換えアデノウィルスによりトランスダクションした。TSHによる線維芽細胞の処理は、レポーター遺伝子誘発の上昇をもたらさなかった。もう１つの実験においては、ヒト一次脂肪細胞をまた、レポーター構造体を含む組換えアデノウィルスによりトランスダクションした。イソプロテレノールによるヒト脂肪細胞の処理は、ルシフェラーゼ発現の22倍の誘発を生成した。TSHによるヒト脂肪細胞の処理は、レポーター遺伝子の20倍の誘発をもたらした。それらの結果は、ネズミ脂肪細胞及びヒト脂肪細胞を通してのTSHシグナル化、及びβ−アドレナリン性受容体刺激を通して達成されるcAMPレベルに類似するcAMPレベルの生成を示す。
【００６７】
実験方法：
3T3 L1細胞を、ATCC（CL−173）から得、そして次の通りにして増殖培地において培養した：細胞を、10％ウシ胎児血清（JRH Biosciences, カタログ番号12133−73P）を含むDMEM高グルコース（Life Technologies, カタログ番号11965−092）において増殖した。細胞を、8％CO2の湿潤されたインキュベーターにおいて37℃で培養した。細胞を、コラーゲン被覆された96−ウェルプレート（Becton Dickinson, カタログ番号356407）に、ウェル当たり5,000の細胞の密度で接種した。２日後、分化用培地を次の通りに添加した：10％ウシ胎児血清（Hyclone, カタログ番号SH30071）、１μg/mlのインスリン、１μMのデオキサメタゾン及び0.5mMの３−イソブチル−メチルキサンチン（ICN、カタログ番号195262）を含むDMEM高グルコース。
【００６８】
細胞を、8％CO2において37℃で４日間インキュベートし、そして培地を、10％ウシ胎児血清及び１μg/mlのインスリンを含むDMEM高グルコースにより置換した。細胞を、8％CO2において、37℃で３日間インキュベートし、次に、培地を、10％ウシ胎児血清を含むDMEM高グルコースにより置換した。細胞を、8％CO2において37℃で３日間インキュベートし、そして培地を、10％ウシ胎児血清を含むDMEM低グルコース（Life Technologies, カタログ番号12387−015）により置換した。
【００６９】
アッセイの前日、細胞を、2mMのL−グルタミン（Life Technologies, カタログ番号25030−149）、0.5％ウシアルブミン画分V（Life Technologies, カタログ番号15260−037）、1mMのMEMピルビン酸ナトリウム（Life Technologies, カタログ番号11360−070）及び20mMのHEPESを含むF12 Ham (Life Technologies, カタログ番号12396−016)によりすすいだ。細胞をAV KZ55, すなわちKZ55、すなわちCRE−由来のルシフェラーゼレポーターカセットを含むアデノウィルスベクターにより、細胞当たり5,000の粒子でトランスダクションした。
【００７０】
一晩のインキュベーションに続いて、細胞を、アッセイ培地（0.5％ウシアルブミン画分V、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム及び20mMのHEPESを含むF12 HAM）により１度すすいだ。50μlのアッセイ培地を、個々のウェルに添加し、続いて50μlの２倍に濃縮された試験タンパク質を添加した。プレートを、５％CO2下で37℃で４時間インキュベートした。培地をプレートから除き、そして細胞を、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega, カタログ番号E4530）において供給される１×細胞培養物溶解試薬25μl（ウェル当たり）により溶解した。細胞を、室温で15分間インキュベートした。
【００７１】
ルシフェラーゼ活性を、個々のウェル中への40μlのルシフェラーゼアッセイ基質の自動化された注入に従って、マイクロプレートルシノメーター（RerkinElmer Life Sciences, Inc., モデルIB96V2R）上で測定した。変性を伴なっての上記の方法をまた使用し、96ウェルプレートに接種された、Stratageneから得られたヒト脂肪細胞（カタログ番号937236）に対するTSH及びイソプロテレノールを試験した。ヒト脂肪細胞を、0.5％ウシアルブミン画分Vを含む基本培地（Stratagene, カタログ番号220002）により1度すすぎ、次に、AV KZ22により5,000の粒子/細胞でトランスダクションした。一晩のインキュベーションに続いて、細胞を、0.5％ウシアルブミン画分Vを含む基本培地から成るアッセイ培地により１度すすぎ、そして上記のようにしてアッセイした。
【００７２】
例２．3T3 L1脂肪細胞におけるTSH−誘発された脂肪分解：
要約：
3T3 L1脂肪細胞を、TSH及び非特異的β−アドレナリン性受容体アゴニストイソプロテレノールにより４時間、処理した。脂肪分解を、ならし培地におけるグリセロール及びFFAの蓄積により評価した。図１は、グリセロール（上方パネル）及びFFA（下方パネル）についてのTSH及びイソプロテレノールの用量−応答曲線を示す。TSHは、図１に示されるように、たぶんネズミ脂肪細胞における脂肪分解を刺激した。
【００７３】
分化した3T3 L1細胞からのならし培地における遊離脂肪酸の測定：
遊離脂肪酸を、改良されたプロトコールによるエステル化されていない（又は遊離）脂肪酸の定量決定のためにWako NEFA Cキットを用いて測定した。イソプロテレノール（ICN）、すなわち脂肪分解−誘発の正の対照を、アッセイ培地（Life Technologies 低グルコースDMEM, 1mMのピルビン酸ナトリウム、2mMのL−グルタミン、20mMのHEPES、及び0.5％BSA）において、２μMの出発濃度に希釈した。イソプレテレノールをさらに、半対数連続希釈度で希釈した。TSHを、0.06nMに連続的に希釈した。培地を、96ウェルプレートにおける3T3 L1脂肪細胞から除去した。50μlのアッセイ培地を個々のウェルに添加し、続いて、50μlのTSH又はイソプロテレノールを個々のウェルに添加した。
【００７４】
プレートを、37℃で４時間インキュベートした。40μlのならし培地を、グリセロールアッセイ分析のために集め、そして40μlのならし培地を、遊離脂肪酸分析のために集めた。オレイン酸（Sigma）をメタノールに溶解し、ならし培地における遊離脂肪酸の量の決定のための対照として使用した。Wako試薬A及びBを、推薦される濃度の４倍に再構成した。ならし培地サンプルを、96ウェルプレートにおいてアッセイした。50μlのWako試薬Aを、5μlのオレイン酸標準＋40μlのアッセイ培地に添加した。
【００７５】
50μlのWako試薬Aを、分化した3T3 L1細胞からのならし培地40μl及びメタノール5μlに添加した。96ウェルプレートを37℃で10分間インキュベートした。100μlのWako試薬Bを個々のウェルに添加した。96ウェルプレートを、37℃で10分間インキュベートした。次に、96ウェルプレートを、室温で５分間、放置した。96ウェルプレートを、3250×gで５分間、Beckman Coulter Allegra 6R遠心分離機により遠心分離し、気泡を除去した。530nmでの吸光度を、Wallac Victor2 Multilabelカウンター上で測定した。
【００７６】
分化した3T3 L1細胞からのならし培地におけるグリセロールの測定：
グリセロールを、改良されたプロトコールで、Sigma Triglyceride (GPO-Trinder)キットを用いて、ならし培地において測定した。イソプロテレノールを、２μMの出発濃度に希釈した。イソプロテレノールをさらに、半対数連続希釈で希釈した。TSHを、アッセイ培地において300nMの出発濃度に希釈した。次に、TSHを、0.06nMに連続して希釈した。培地を、96ウェルプレートにおける3T3 L1脂肪細胞から除去した。50μlのアッセイ培地を個々のウェルに添加し、続いて、50μlのTSH又はイソプロテレノールを個々のウェルに添加した。プレートを、37℃で４時間インキュベートした。
【００７７】
40μlのならし培地を、グリセロールアッセイ分析のために集め、そして40μlのならし培地を、遊離脂肪酸分析のために集めた。グリセロール標準を、200nモル/10μl〜0.25nモル/10μlの範囲に水により希釈した。グリセロールを、ならし培地におけるグリセロールの量を決定するための対象として使用した。Sigma試薬Aを、推薦される濃度に再構成した。ならし培地サンプルを、96ウェルプレートにおいてアッセイした。150μlのSigma試薬Aを、10μlのグリセロール標準＋40μlのアッセイ培地に添加した。150μlのSigma試薬Aを、分化した3T3 L1細胞からのならし培地40μl＋水10μlに添加した。96ウェルプレートを、室温で15分間インキュベートした。96ウェルプレートを、3250×gで５分間、Beckman Coulter Allegra 6R遠心分離機により遠心分離し、気泡を除去した。530nmでの吸光度を、Wallac Victor2 Multilabelカウンター上で測定した。
【００７８】
例３．インビボでのTSHによる脂肪分解の刺激：
要約：
TSH、β3−アドレナリン性受容体アゴニストCL316,243（CL）、及び塩溶液ビークルを、一晩の断食に続いて、マウスにおける脂肪分解の刺激について試験した。マウス（ｎ＝7〜8/グループ）を、TSH（300μg/kg）、CL（1mg/kg）又はビークルのIP注射の直前に、放血し、そして、血液を、注射後、２及び４時間で、後眼窩採血によりサンプリングした。脂肪分解を、基線に比較して、血清グリセロール又はFFAにおける％変化率として評価した。
【００７９】
図２は、処理グループに関してのグリセロール（血清におけるμg/ml、上部パネル）及びFFA（血清におけるμg/ml、下記パネル）における変化を示す。TSH投与は、ビークル対照に比較して、２及び４時間で、高められたグリセロールレベルを誘発した（148＋/−23（P＝0.09）及び165＋/−15μg/ml（P＜0.001）対80＋/−29及び−62＋/−14）。TSHは、それぞれ、ビークル値−20＋/−77及び−460＋/−67に比較して、２及び４時間で、血清FFAを、1,447＋/−219（P＜0.001）及び1,506＋/−94（P＜0.001）高められた（すべての誤差は平均の標準誤差である）。対照β−ARアゴニストはまた、血清グリセロール及びFFAレベルを有意に高められた。
【００８０】
処理プロトコール：
生後10週目のC57BL/6雄マウスを、体重を標準化するためにグループ分けした（個々の処理あたりｎ＝7〜8；平均グループ重量＝37.8g±0.4g）。マウスを、処理の前、18時間それぞれ収容し、この時点で、食物は回収され、与えられる水へは自由に接近できた。およそ８a.m.で、対象は、ハロタンにより麻酔をかけられ、そして血液サンプルが眼窩後から採血された。血液を凝固せしめ、そして血清を、遠心分離により分離し、そして後での分析のために凍結した。試験物質を、0.1mlの体積でIP注射により投与し、そして動物を、水への自由な接近を伴なって、２時間、それらのかごにおいて置換した。２時間で、マウスを殺害し、そして血液を、心臓穿刺しにより放血した。
【００８１】
ネズミ血清におけるグリセロール及びFFAの測定：
血清における遊離脂肪酸の測定に関しては、ならし培地における遊離脂肪酸を測定するための前記方法に、次の変法を伴なって従って。Wako試薬A及びBを、２倍の推薦される濃度に再構成した。75μlのWako試薬Aを、５μlのオレイン酸標準＋５μlの水に添加した。75μlのWako試薬Aを、５μlの血清及び５μlのメタノールに添加した（オレイン酸標準条件を代表するために）。96ウェルプレートを、37℃で10分間インキュベートした。150μlのWako試薬Bを個々のウェルに添加した。96ウェルプレートを、37℃で10分間インキュベートした。96ウェルプレートを、室温で５分間、放置した。96ウェルプレートを、3250×gで５分間、Beckman Coulter Allegra 6R遠心分離機上で遠心分離し、気泡を除去した。530nmでの吸光度を、Wallac Victor2 Multilabelカウンター上で測定した。
【００８２】
血清中のグリセロールの測定に関しては、ならし培地におけるグリセロールを測定するための前記方法に、下記変性を伴なって従った。
Sigma試薬Aを、0.5倍の推薦される濃度に再構成した。200μlのSigma試薬Aを、10μlのグリセロール標準に添加した。200μlのSigma試薬Aを、５μlの血清＋５マイクロの水に添加した。96ウェルプレートを室温で15分間インキュベートした。96ウェルプレートを、3250×gで５分間、Beckman Counter Allegra6R遠心分離機により遠心分離し、気泡を除去した。530nmでの吸光度を、Wallac Victor2 Multilabelカウンター上で測定した。
【００８３】
例４．TSHによるob/obマウスの慢性的処理：
要約：
TSHを、肥満の雄ob/obマウスに28日間、毎日投与した。データは、体重、食物摂取、グルコース、インスリン、脂質及び甲状腺ホルモンについて得られた。動物グループのサブセットを、研究の最後でグルコース耐性試験にゆだねた。殺害で、動物を、脂肪貯蔵物重量の変化、肝臓病理学、全体的組織学について試験した。下記のように、TSH処理は、低められた残りのグルコース及びインスリンレベル、及びグルコース耐性試験における高められたインスリン感受性をもたらした。
【００８４】
血清トリグリセリド及びコレステロースレベルは、対照に比較して、有意に低められ、そして甲状腺ホルモンレベルはビークルグループ以上に高められた。脂肪組織の検死分析は、肩甲骨間褐色脂肪組織（IBAT）における実質的な及び有意な上昇、及び腹部内メセンギウム白色脂肪における有意な減少を示した。TSH処理グループは、対照及びサイロキシン−処理された動物に比較して、低められた体重増加への強い傾向を示した。肝臓組織切片の評価を行い、肝臓脂肪変性に対するTSH−介在性脂肪分解の効果を試験した。それらの研究に使用されるob/ob株に典型的には関連する著しい肝臓変性が、TSH処理により有意に示され、このことは、肝臓細胞における脂肪沈着の著しい低下を示す。甲状腺ホルモンは、脂肪変性の程度の変化を生成した。
【００８５】
処理プロトコール：
生後11週の雄のob/obマウスは、それぞれカゴに入れ、そして標準の実験用食物（４％脂肪）を与えられ、そして食物及び水には自由に接近できた。動物を、処理グループ（ｎ＝７〜８、平均体重54.3＋/−0.3g/グループ）に割り当て、12時間の暗サイクル（6PM〜6AM）に維持し、そしてそれぞれの日、７〜９AMで注射した。個々の動物により消費された食物を、週２度、計量した。すべての動物は、0.1mlの注射体積によるIP処理を受けた。TSHを267μg/kgで、及びβ3−ARアゴニストCLを0.75mg/kgで投与した。
【００８６】
甲状腺ホルモン（T4）を４日間、1.5μg/マウスで投与し、10日間、１μg/マウスに低め、そして次の14日間、1.5μg/マウスに戻した。ビークル対照は無菌の塩溶液を受けた。TSHは、Genzyme Pharmaceuticals, (Thyrogen（商標）, カタログ番号36778号; Genzyme  Corporation, Cambridge,  MA)から得られ、CL316,243はSigma  Biochemicalsから得られ、そしてT4はCalbiochem, Inc.から得られた。すべての血液採取は、イソフルラン麻酔下で後−眼窩の穿刺により行われた。
【００８７】
体重及び食物摂取：
食物摂取は、グループの間で有意には異ならなかった（ビークル5.9＋/−0.22、CL16,243 6.3＋/−0.11，TSH5.9＋/−0.36、及びサイロキシン6.1＋/−0.17g/日の食物）。体重変化を、研究の開始から体重の％上昇率として評価した。ビークルグループの体重は8.8＋/−0.6％上昇した。サイロキシングループは、ビークル対照に比較して、体重のわずかな上昇を有し（9.4＋/−0.5％）、そしてβ3−ARグループは体重のわずかな下降を有した（7.7＋/−0.41％）。TSH−処理されたグループは、対照グループよりも低い体重増加を示し（4.6＋/−2.4％、p＝0.11）、そしてそのグループの８メンバー中の３メンバーは、体重全体的な低下を示した（研究における動物のみ）。
【００８８】
血清サイロキシンレベルの測定：
上記のような25日間の処理の後、血液をすべての処理された動物からサンプリングし（ｎ−７〜８/グループ）、血清を分離し、そして市販のキット（Biocheck, Burlingame, CA）により全T4について分析した。図３は、個々のグループ＋/−標準誤差について決定されたサイロキシンのレベルを示す。25日間の処理の後、ビークルT4レベルは、5.14＋/−0.08μg/dlであった。TSH−処理されたグループは、5.31＋/−0.16のT4レベルを有し、β3−AR受容体グループは5.14＋/−0.19μg/dlを有し、そしてサイロキシン−処理されたグループは9.04＋/−0.47μg/dlを有した。β3−AR及びTSH−処理されたグループは、対照よりも有意に低いT4の循環レベルを有し（p＜0.02）、そしてサイロキシン処理グループは、ビークル対照よりも有意に高いレベルを有した（p＜0.001）。
【００８９】
脂肪組織分析：
個々のグループからの４匹の動物を、処理の４日後、脂肪組織貯蔵物マスの変化の評価について分析した。殺害の後、肩甲骨間褐色脂肪（IBAT）及び腹部内脂肪を切開し、そして組織を計量した。すべての３種の処理グループは、肩甲骨間褐色脂肪マスにおける有意な上昇を示した。サイロキシンは、ビークル対照（0.66＋/−0.07g）に対して最大の上昇性（1.26＋/−0.03g、p＜0.001）を示した。高められた甲状腺ホルモンレベルは、IBATを刺激するよう作用することが知られている。TSH及びCL316,243はまた、IBATマスを高めた（それぞれ、1.25＋/−0.13、p＜0.01及び0.87＋/−0.03、p＜0.05）。
【００９０】
IBATにおけるそれらの上昇は、上記のように早められた代謝速度に関連している。メセンギウム脂肪貯蔵物を切開し、そして重量測定のために結腸から除いた。メセンギュウム脂肪は白色脂肪であり、そして容易に可視化され、そして肥満マウスにおいて切開する。メセンギウム白色脂肪を、軟骨に結合される脂肪を注意して取り除くことにより除去し、そして層を支持する血管を結腸の長さから除去した。
【００９１】
ビークル対照から除去された脂肪及び軟骨の重量は、1.31＋/−0.04gであり、そして除去された材料は、除去されたマスにおける脂肪細胞からの外観において、ほとんど白色であった。CL316,243, TSH、及びT4処理グループから除去された貯蔵物の重量は、それぞれ1.53＋/−0.10g（p＝0.08）、1.11＋/−0.03g（p＜0.02）及び1.18＋/−0.11g（p＝0.32）であった。サイロキシン及び特にTSHから除去されたメセンギウム貯蔵物の外観は、貯蔵物における低められた脂肪のために、より低い白色度であり、そしてこのことは、貯蔵物内の脂肪細胞マスの相対的な損失が除去された構造体の重量の変化よりも大きかったことを示唆した。
【００９２】
肝臓脂肪変性：
貯蔵切片を、上記のすべての処理グループから切開し、そしてNBS−ホルマリンによる固定化に続いて、パラフィンに固定した。切片を固定し、そして貯蔵構造変化の可視化のために、ヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）により染色した。肝臓脂肪変性の程度を、０〜３の４−点尺度で評価し、ここで０：肝臓脂肪変性の徴候を示さず、そして４：明確な大きな小胞及び小さな小胞の脂肪変性を表す。グループ（ｎ＝４）の平均は、切片において眼に見える肝細胞構造体の脂質封入及び統合性のサイズにより判断されるような脂肪変性の程度の有意な差異を示した。グループに与えられた平均評価は、ビークル（４）、サイロキシン（３）、TSH（２）及びCL316,243（１）であった。
【００９３】
IPGTT：
上記のような４週間の毎日の処理に続いて、マウス（ｎ＝４/グループ）を、明サイクルの開始の直後、４時間、断食せしめ、そして血液サンプルを、グルコース溶液のIP注射（1.5g/kg体重）の前に得た。血液サンプルを、注射に続いて20、40及び120分で得、血液グルコース及びインスリンの変化を評価した。グルコース濃度を、Freestyle血液グルコースモニター（Therasense Corp.）により決定し、そしてインスリン濃度を、市販のELISA キット(Alpco Diagnostics, Windham NH)により決定した。図４に示されるように、基線血液グルコースレベルは、ビークル対照（218＋/−25mg/dl）においてよりも、CL−処理された動物（139＋/−９、p＜0.05）及びTSH−処理される動物（114＋/−７、ｐ＝0.02）において有意に低かった。サイロキシン−処理された動物は、ビークル対照（252＋/−34）とは有意に異ならなかった。
【００９４】
図５に示されるように、対照β3−ARアゴニスト及びTSH−処理されたグループは、ビークル対照に比較して、高められたインスリン感受性及び０時点で投与されるグルコース負荷物の高められたクリアランスを示した。特に、サイロキシン−処理されたグループは、ビークル−処理された対照に比較して、高められたグルコースクリアランスを示さなかった。但し、TSH−介在性効果は甲状頚動脈を通して介在されないが、しかし脂肪分離の刺激を通して介在される（グルコース注射後120分でのTSH−処理された及びサイロキシン−処理されたグループの血清グループは、それぞれ361＋/−37及び802＋/−69mg/dlの値を有した、p＜0.005）。
【００９５】
血清脂質分析：
IPGTTのために使用される研究組を、殺害の前、７日間処理した（５週間の合計処理時間）。対照動物を、明サイクルの開始で４時間、断食し、そして血清を、イソフルラン麻酔下で殺害で得た。トリグリセリド及び合計コレステロールレベルを、Cholestech  LDX っ血液分析機(Cholestech  Corporation, Hayward  CA)により決定した。ビークル対照及びβ3−ARアゴニストCL316,243についての血清トリグリセリドレベルはそれぞれ、164＋/−34及び191＋/−９mg/dlであった。TSH処理されたグループにおける血清トリグリセリドはビークル対照よりも低く（80＋/−10mg/dl、p＝0.05）、そしてサイロキシン処理されたグループにおけるトリグリセリドはビークル対照よりも高かった（297＋/−30mg/dl、p＝0.05）。
【００９６】
ビークル−処理された、β3−ARアゴニスト−処理された、及びサイロキシン−処理されたグループにおける合計のコレステロールレベルは、それぞれ220＋/−16、198＋/−７及び231＋/−11mg/dlであった。TSH処理されたグループにおける合計のコレステロールは、124＋/−16mg/dl（p＜0.01）で有意に低かった。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、3T3 L1脂肪細胞におけるTSH及びイソプロテレノール−誘発された脂肪分解の用量応答を示す。グリセロール（上方パネル）及び遊離脂肪酸（FFA；下方パネル）蓄積を、示される濃度でのTSH（黒くぬりつぶされた四角）又はイソプロテレノール（黒く塗りつぶされた三角）による４時間の処理に続いて決定した。
【図２】図２は、インビボでのTSHによる脂肪分解の刺激を示す。雄ob/obマウス（ｎ＝７〜８/グループ）を、ビークル塩溶液、TSH（300μg/kg）又はβ3−ARアゴニストCL316,234（1mg/kg）により注射した。注射後２及び４時間での血清グリセロール（上方パネル）及びFFA（下方パネル）における基線の変化を、例３に記載のようにして、個々のグループについて決定した。誤差棒は、測定の標準誤差である。
【図３】図３は、TSHにより処理の25日後の雄ob/obマウスにおける甲状腺ホルモンレベルを示す。マウス（ｎ＝７〜８/グループ）を、ビークル塩溶液、TSH（267μg/kg）、β3−ARアゴニストCL316,243（1mg/kg）又はサイロキシン（１〜1.5μg/マウス；例４を参照のこと）により毎日、注射した。血清における合計の循環T4のレベルを、ELISAにより決定した。
【図４】図４は、TSHにより処理の28日後、雄ob/obマウスにおける血清グルコースレベルを示す。動物は、暗サイクルの直後４時間、断食され、次に採血され、血清が分離され、そしてグルコースレベルが酵素方法により決定された。処理グループは、図３に記載される通りであり、そして個々のグループについての記号は、数値説明文に示される。
【図５】図５は、図４に記載される動物グループのグルコース攻撃を示す。基礎グルコース及びインスリンレベルを測定するために血清サンプリングに続けて、グルコース（1.5g/kg）を、０時点で注射し、そして注射に続いて20,40及び120分で再び血液をサンプリングした。パネルAは血液グルコースレベルを示し、そしてパネルBは血清インスリンレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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