(57)【要約】ラムノスス乳酸桿菌から単離された新規なポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーと、ポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトと、前記ポリヌクレオチドを取り込んでいる、植物、微生物および多細胞生物を含む生体材料と、前記ポリヌクレオチドで発現されるポリペプチドと、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの利用方法とが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８４−１２１からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号８４−１２１の相補体と、
（ｂ）配列番号８４−１２１の逆相補体と、
（ｃ）配列番号８４−１２１の逆配列とからなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号８４−１２１の配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、
（ｂ）配列番号８４−１２１の配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、
（ｃ）配列番号８４−１２１の配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号８４−１２１に列挙される配列の１００量体であるヌクレオチド配列と、
配列番号８４−１２１に列挙される配列の４０量体であるヌクレオチド配列と、
配列番号８４−１２１に列挙される配列の２０量体であるヌクレオチド配列とからなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１−３のいずれかに列挙されたヌクレオチド配列の１０個の連続する残基に対して相補的な少なくとも１０個の連続する残基を含む、単離オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマー。
【請求項６】
請求項５に記載の複数のオリゴヌクレオチドのプローブを含むキット。
【請求項７】
請求項１−３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子コンストラクトを含む、トランスジェニック宿主細胞。
【請求項９】
合計が全配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果、配列番号８４−１２１に列挙されたヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド 。
【請求項１０】
合計が全配列長の１５％未満の置換、挿入、および／または欠失の結果として、配列番号８４−１２１に列挙されたヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド 。
【請求項１１】
５’から３’の方向に、
（ａ）遺伝子プロモーター 配列と、
（ｂ）（１）配列番号１２２−２５３のポリペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするポリヌクレオチドと、（２）請求項１−３のいずれか１つのポリヌクレオチドのノンコーディング領域を含むポリヌクレオチドとのうち少なくともいずれかを含むポリヌクレオチド配列とを含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドはセンス方向に配向される、請求項１１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドはアンチセンス方向に配向される、請求項１１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１４】
前記遺伝子プロモーター 配列は原核生物または真核生物で機能する、請求項１１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１５】
請求項１１に記載のコンストラクトを含む、トランスジェニック宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載のトランスジェニック宿主細胞またはその子孫を含む、トランスジェニック生物。
【請求項１７】
前記生物体は乳酸桿菌種からなる群から選択される、請求項１６に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１８】
請求項１−３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを生物のゲノムに安定的に取り込むことを含む、前記生物におけるポリペプチド活性をモジュレーションする方法。
【請求項１９】
前記生物は微生物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１２２−２５３に列挙される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項２１】
（ａ）配列番号１２２−２５３の配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、
（ｂ）配列番号１２２−２５３の配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、
（ｃ）配列番号１２２−２５の配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２０または請求項２１に記載のポリペプチドをエンコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２０または請求項２１に記載のポリペプチドを少なくとも１つ含む、融合蛋白。
【請求項２４】
請求項１−３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドにエンコードされた、単離ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２０または２１に記載のポリペプチドと、生理学的に許容される担体および免疫促進剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分とを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項１−３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドと、生理学的に許容される担体および免疫促進剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分とを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の組成物を投与することを含む、哺乳類の疾患を治療する方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の組成物を投与することを含む、哺乳類の疾患を治療する方法。
【請求項２９】
生物、あるいは、それに由来する生殖材料または抽出物を特定の起源に由来するものとして同定する方法であって、前記生物、材料または抽出物の遺伝子相補体の中に前記起源を表すポリヌクレオチド同定子の有無を検出することを含み、前記ポリヌクレオチド同定子は配列番号８４−１２１に列挙された配列を含む、生物、あるいは、それに由来する生殖材料または抽出物を特定の起源に由来するものとして同定する方法。
【請求項３０】
乳製品、食品、食品添加物、栄養サプリメント、生理活性物質またはプロバイオティックなサプリメントの製造に用いられる微生物の性質を改良する方法であって、請求項１−３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを用いて前記微生物の形質転換を行うことにより、前記微生物のポリヌクレオチド含量または組成をモジュレーションすることを含む、微生物の性質を改良する方法。
【請求項３１】
風味、香り、食感および／または栄養と、免疫系のモジュレーションと、乳製品、食品、食品添加物、栄養サプリメント、生理活性またはプロバイオティックな サプリメント製品の健康上の有益性を改変する方法であって、請求項２０に記載のポリペプチドの１つまたは２つ以上を、乳か、前記製品の他の材料かに添加することを含む、製品の健康上の有益性を改変する方法。
【請求項３２】
哺乳類生物に対して非病原性の、１つまたは２つ以上の種のプロバイオティックな微生物か、その抽出物かを含む組成物であって、前記微生物は請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項３３】
前記微生物は、桿菌属、乳酸桿菌属、スポロラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の種からなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３４】
チーズの熟成、風味の発現および生理活性ペプチドの産生に用いられるトランスジェニックな微生物集団であって、配列番号８４−９２、９５、９７、１００、１０１、１０５、１１４、１１７、１１９または１２０のポリヌクレオチドを含む、トランスジェニックな微生物群集。
【請求項３５】
製造工程における生存率か、製品状態または腸管内または他の環境における保存性かが改変されたトランスジェニックな微生物集団であって、配列番号８４−９２、９５、９７、１００、１０１、１０５、１１４、１１７、１１９および１２０からなる群から選択されるポリペプチドを含む、トランスジェニックな微生物群集。
【請求項３６】
配列番号８４−１２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドの挿入型突然変異および／または破壊につながる遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニックなラムノスス乳酸桿菌ＨＮ００１株であって、風味、香り、食感、栄養、免疫系のモジュレーション、生理活性物質の産生、プロバイオティックまたは健康上の有益性、接着、あるいは、工業プロセス中、保存中または環境中における生存率をの改変された特性を有する、トランスジェニックなラムノスス乳酸桿菌ＨＮ００１株。
【請求項３７】
配列番号８４−１２１のポリヌクレオチドに関連する形質を有する微生物を同定する方法であって、前記微生物の遺伝子相補体中における配列番号１−８４のポリヌクレオチドの有無を検出することを含む、微生物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌から単離されたポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに特異的なプローブおよびプライマーと、前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトと、前記ポリヌクレオチドを取り込んでいる、植物、微生物および多細胞生物を含む生体材料と、前記ポリヌクレオチドによって発現されるポリペプチドと、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを利用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、特定の乳酸菌株、特にラムノスス乳酸桿菌ＨＮ００１（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＨＮ００１）から単離されたポリヌクレオチドに関する。乳酸菌とその酵素は、チーズおよびヨーグルトのような発酵乳製品の風味、および発酵特性の主要な決定要素である。風味は、細菌およびその酵素が、蛋白質、糖質および脂質に作用することにより生じる。
【０００３】
ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株は、最適成長温度が３７±１°Ｃで、至適ｐＨが６．０−６．５で、グラム陽性、非運動性、非胞子形成、カタラーゼ陰性および条件的嫌気性の、桿状ヘテロ発酵細菌である。ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株を食品に添加すると、自然免疫および獲得免疫の両方の複数の局面で持続的な増強が誘導されることが実験的研究により証明されている（特許文献１参照）。さらに、ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株およびある種の他のグラム陽性菌は、ヒトおよび動物の健康を特異的かつ直接的にモジュレーションすることができる（例えば、非特許文献１−２０を参照。
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／１０４７６号公報
【非特許文献１】Ｔａｎｎｏｃｋら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６巻：２５７８−２５８８頁、２０００年
【非特許文献２】Ｇｉｌｌら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、８３巻、１６７−１７６頁
【非特許文献３】Ｑｕａｎ  Ｓｈｕら、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３８巻、１５３−１６１頁、２０００年
【非特許文献４】Ｑｕａｎ  Ｓｈｕら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６巻、８７−９６頁、２０００年
【非特許文献５】Ｑｕａｎ  Ｓｈｕら、Ｉｎｔｌ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．、９巻、８３１−８３６頁、１９９９年
【非特許文献６】Ｐｒａｓａｄら、Ｉｎｔｌ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．、８巻、９９３−１００２頁、１９９８年
【非特許文献７】ＳａｎｄｅｒｓおよびＨｕｉｓ  ｉｎ’ｔ  Ｖｅｌｄ、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、２９３−３１５頁、１９９９年
【非特許文献８】Ｓａｌｍｉｎｅｎら、１９９８年、“Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”、Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓおよびｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ共編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、２１１−２５３頁
【非特許文献９】Ｄｅｌｃｏｕｒら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、１５９−１８４頁、１９９９年
【非特許文献１０】Ｂｌｕｍら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、１９９−２０５頁、１９９９年
【非特許文献１１】Ｙａｓｕｉら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、３８３−３８９頁、１９９９年
【非特許文献１２】ＨｉｒａｙａｍａおよびＲａｆｔｅｒ、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、３９１−３９４頁、１９９９年
【非特許文献１３】Ｏｕｗｅｈａｎｄ、１９９８年、“Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”、Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓおよびｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ共編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、１３９−１５９頁
【非特許文献１４】Ｉｓｏｌａｕｒｉ  Ｓら、１９９８年、“Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”、Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓおよびｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ共編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、２５５−２６８頁
【非特許文献１５】ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＧｏｌｄｉｎ、１９９８年、“Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”、Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓおよびｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ共編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、２６９−２７７頁
【非特許文献１６】Ｅｌ−ＮｅｚａｍｉおよびＡｈｏｋａｓ、１９９８年、“Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”、Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓおよびｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ共編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、３５９−３６７頁
【非特許文献１７】Ｎｏｕｓｉａｎｅｎら、１９９８年、“Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”、Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓおよびｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ共編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、４３７−４７３頁
【非特許文献１８】ＭｅｉｓｅｌおよびＢｏｃｋｅｌｍａｎｎ、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、２０７−２１５頁、１９９９年
【非特許文献１９】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、２１７−２４６頁、１９９９年
【非特許文献２０】Ｄｕｎｎｅら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、２７９−２９２頁、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの菌に由来する健康上の効果には、以下が含まれる。
【０００５】
ロタウイルス感染および乳児下痢の治療を含む、腸内病原体に対する抵抗力の向上および抗感染活性―アジュバント効果による抗体産生の増加と、病原体の転移増殖に対する抵抗力の増大と、ｐＨのような小腸内条件の変化と、バクテリオシンおよび有機酸のような特異的抗菌物質の存在とが原因である。
【０００６】
乳糖消化の補助―小腸において作用する細菌の乳糖分解酵素（β−ガラクトシダーゼ等）による乳糖の分解による。
【０００７】
抗癌活性（特に、抗大腸癌活性）および抗突然変異活性―抗突然変異活性と、大腸微生物の癌誘発性（ｐｒｏｃａｎｃｅｒｏｕｓ）酵素活性の変化と、消化管および／または糞便におけるアゾレダクターゼ、β−グルクロニダーゼおよびニトロレダクターゼという発癌性酵素の減少と、免疫機能の刺激と、胆汁塩濃度への陽性の影響と、抗酸化効果とによる。
【０００８】
肝癌の低減―アフラトキシンの無毒化およびカビの成長阻害による。
【０００９】
小腸細菌の過剰成長の低減―抗菌活性と、過剰成長した細菌叢からの有毒な代謝中間体の産生の減少とによる。
【００１０】
免疫系のモジュレーションと、自己免疫疾患およびアレルギーの治療―感染および腫瘍に対する非特異的および抗原特異的な防御の増強と、増強された粘膜免疫と、抗原特異的免疫応答におけるアジュバント効果と、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞およびサイトカイン産生の調節とによる。
【００１１】
食品に対するアレルギー反応の治療―抗原の血流への移行の阻止と、食品中のアレルギー因子のモジュレーションとによる。
【００１２】
血中脂質の減少および心臓病の予防―細菌によるコレステロールの同化と、胆汁塩の加水分解と、抗酸化効果とによる。
【００１３】
抗高血圧効果―乳ペプチドに対する細菌のプロテアーゼまたはペプチダーゼの作用により、抗高血圧ペプチドが生成される。細胞壁成分はＡＣＥ阻害剤として作用する。
【００１４】
泌尿生殖器感染の予防および治療―競合的な排除につながる尿路および膣の細胞への接着と、抗菌物質（酸、過酸化水素および生体界面活性剤）の産生とによる。
【００１５】
炎症性腸疾患および過敏性腸症候群の治療―免疫モジュレーションと、病原体の転移増殖に対する抵抗力の増大と、ｐＨのような小腸内条件の変化と、バクテリオシン、有機酸、過酸化水素および生物界面活性物質のような特異的抗菌物質の産生と、競合的排除とによる。
【００１６】
感染性心内膜炎のモジュレーション―乳酸桿菌敗血症に伴うフィブロネクチンレセプターを介在する血小板の凝集による。
【００１７】
ヘリコバクター・ピロリ菌感染の予防および治療―競合的な転移増殖と、抗菌効果とによる。
【００１８】
肝性脳症の予防および治療―ウレアーゼを産生する消化管細菌叢の阻害および／または排除による。
【００１９】
蛋白質および糖質の利用および変換の改善―蛋白質および糖質に対する細菌の作用による有用生成物の生成による。
【００２０】
ラムノスス乳酸に関連する健康上有益なその他の効果には、栄養の改善と、大腸細胞の増殖および分化の調節と、リグナンおよびイソフラボン代謝の改善と、粘膜の透過性の低減と、発癌物質その他の有害化合物の無毒化と、便秘および下痢の軽減と、ビタミン、特に葉酸の合成とが含まれる。
【００２１】
ペプチダーゼは、ペプチド鎖の中の１つのアミノ酸のアミノ基と隣接するアミノ酸のカルボキシル基（酸性基）とを連結するペプチド結合を切断する酵素である。前記結合は加水分解反応により切断される。切断する特定のペプチド結合に対する特異性によって定義されるペプチダーゼ酵素の大きなファミリーがある（非特許文献２１）。２つの主要なファミリーは、エキソペプチダーゼとエンドペプチダーゼである。
【非特許文献２１】Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．およびＷｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．編、１９９８年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ
【００２２】
エキソペプチダーゼは、ペプチド鎖のＮ−末端またはＣ−末端からアミノ酸を切断し、遊離アミノ酸または短いペプチド（ジペプチドおよびトリペプチド）を放出する。エキソペプチダーゼには、下記の種類がある。
・アミノペプチダーゼ―ペプチド鎖のＮ−末端から遊離アミノ酸を放出する。
・ジペプチジル・ペプチダーゼ（別名、ジペプチジル・アミノペプチダーゼ）―ペプチド鎖のＮ−末端からジペプチドを放出する。
・トリペプチジル・ペプチダーゼ（別名、トリペプチジル・アミノペプチダーゼ）―ペプチド鎖のＮ−末端からトリペプチドを放出する。
・カルボキシペプチダーゼ―ペプチド鎖のＣ−末端から遊離アミノ酸を放出する。
・ペプチジル・ジペプチダーゼ―ペプチド酸のＣ−末端からジペプチドを放出する。
・ジペプチダーゼ―単一のジペプチドから２個の遊離アミノ酸を放出する
・トリペプチダーゼ―単一のトリペプチドから３個の遊離アミノ酸を放出する
【００２３】
ペプチダーゼは、チーズの熟成の過程およびチーズの風味の発現において重要な酵素である。チーズ中の乳カゼインの加水分解により、食感の変化やチーズの風味の発現がもたらされる。この加水分解の原因となるたくさんの蛋白質分解酵素が、チーズに付着している乳酸菌、すなわち、チーズ製造の際に成長するスターター培養か、チーズの熟成とともにチーズの中で成長する、スターターではない偶発的で付属的な乳酸菌かのいずれかに由来する（非特許文献２２）。
【非特許文献２２】ＬａｗおよびＨａａｎｄｒｉｋｍａｎ、Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．、７巻、１−１１頁、１９９７年
【００２４】
他にも多くの酵素が、成長速度、酸産生および生存率のような前記細菌の発酵特性に影響を与えるとともに、乳製品の風味と、機能および食感についての特性に影響を与える場合がある（非特許文献２２−３０）。特定の特性および／または機能に影響を与える酵素には、以下が含まれる。
【非特許文献２３】Ｕｒｂａｃｈ、Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．５巻、８７７−８９０頁、１９９５年
【非特許文献２４】ＪｏｈｎｓｏｎおよびＳｏｍｋｕｔｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３巻、１９６−２０４頁、１９９１年
【非特許文献２５】Ｅｌ  ＳｏｄａおよびＰａｎｄｉａｎ、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７４巻、２３１７−２３３５頁、１９９１年
【非特許文献２６】Ｆｏｘら、“Ｃｈｅｅｓｅ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”、１巻、総論、第２版、Ｐ．Ｆｏｘ編、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献２７】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、７６巻、２１７−２４６頁、１９９９年
【非特許文献２８】Ｓｔｉｎｇｌｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２０巻、６３５４−６３６０頁、１９９９年
【非特許文献２９】Ｓｔｉｎｇｌｅら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３２巻、１２８７−１２９５頁、１９９９年
【非特許文献３０】Ｌｅｍｏｉｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３巻、１５１２−３５１８頁、１９９７年
【００２５】
・細胞の溶解―これらの酵素の大部分は細胞壁加水分解酵素であり、アミダーゼと、ムラミダーゼと、Ｎ−アセチルムラミダーゼ等のリゾチーム類と、ムラミダーゼと、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン・アミダーゼとを含む。ＤＥＡＤボックスヘリカーゼ蛋白も自己消化に影響を与える。
【００２６】
糖質の利用―乳糖、クエン酸およびジアセチルの代謝と、アルコール代謝とが特に重要である。関与する酵素は、β−ガラクトシダーゼ、乳酸脱水素酵素、クエン酸リアーゼ、クエン酸パーミアーゼ、２，３−ブタンジオール・脱水素酵素（アセトイン・レダクターゼ）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ジアセチルリダクターゼ、アルコールデカルボキシラーゼ、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素およびアルデヒド脱水素酵素を含む。
【００２７】
脂質の分解、修飾および合成―関与する酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、セリンヒドロラーゼ、デサチュラーゼおよびリノール酸イソメラーゼを含む。
【００２８】
多糖類合成―多糖類は、免疫増強および接着活性の可能性のために重要なだけでなく、発酵乳製品の食感の観点からも重要である。関与する酵素は、β−（１−３）グルコシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、ホスホガラクトシルトランスフェラーゼ、α−グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンＣ４エピメラーゼおよびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを含む、一連の糖転移酵素である。
【００２９】
アミノ酸分解―酵素としては、グルタミン酸脱水素酵素、アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、およびシストチオンβ−リアーゼ等の含硫アミノ酸分解に関与する酵素を含む。
【００３０】
これまでにヒト、動物、微生物およびさまざまな植物種を含む多数の生物のゲノム、あるいはゲノムの部分の配列決定が大規模に行われてきており、現在も進行中である。配列決定技術を駆使して同定されたポリヌクレオチドは、遺伝子の一部である場合もあれば、完全長の遺伝子である場合もあり、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームを含む場合もあれば、オープン・リーディング・フレームの一部を含む場合もある。推定ポリペプチドは、ポリヌクレオチド配列にもとづいて同定され、さらに特徴付けされる場合もある。したがって、ポリヌクレオチドに関する配列決定データは、貴重かつ有用な情報を表す。
【００３１】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、同定された配列をＥＭＢＬ等の各種公共ドメイン・データベースに公表された配列と比較することにより、さまざまな程度の新規性について解析される。既知のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対する相同性を確認するために、新たに同定されたポリヌクレオチドと、対応するポリペプチドとが、パブリックドメインの情報に含まれるポリヌクレオチドおよびポリペプチドと比較される場合がある。このようにして、未知の機能を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの類似性、同一性または相同性が、既知の機能を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの関係において決定される場合がある。
【００３２】
単離ポリヌクレオチドの配列に関する情報は、さまざまな方法で利用される場合がある。特定の配列を有する特定のポリヌクレオチドが、プローブまたはプライマーとして生体内または試験管内の実験用に単離され、あるいは、合成される場合がある。代替的には、単離ポリヌクレオチドの配列のコレクションが、磁気的または光学的な記憶媒体を用いて保存され、コンピュータハードウェアおよびソフトウェア、あるいはその他のタイプのツールも利用して解析または操作される場合がある。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
発明の概要
本発明は、（ａ）添付された配列表において配列番号１−１２１と同定された配列と、（ｂ）これらの配列の変異体と、（ｃ）配列番号１−１２１に記載された配列とその変異体とを含む拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）配列と、（ｄ）配列番号１−１２１の配列の少なくとも特定数の連続する残基を含む配列（ｘ量体）とからなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。また、配列番号１−１２１に記載された配列に対応するオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマー、およびこれらの変異体も提供する。本発明では、これらポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーを、「本発明のポリヌクレオチド」と総称することにする。
【００３４】
配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチド配列は、微生物材料、特に、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／１０４７６号公報に記載のラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株の断片化されたゲノムＤＮＡに由来した。ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株は、グラム陽性で、非遊走性で、胞子非形成型で、カタラーゼ陰性で、条件的嫌気性で、桿状のヘテロ発酵細菌で、最適成長温度が３７±１°Ｃで、至適ｐＨが６．０−６．５である。ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株を食品に添加すると、自然免疫および獲得免疫の両方の複数の局面で持続的な増強が誘導されることが実験的研究により証明されている。ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株の生物学的に純粋な培養物は、豪州政府分析研究所（ＡＧＡＬ）、ニュー・サウス・ウェールズ地域研究所、１  Ｓｕａｋｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｙｍｂｌｅ、ＮＳＷ  ２０７３、Ａｕｓｔｒａｌｉａに、寄託番号ＮＭ９７／０９５１４として、１９９７年８月１８日付けで寄託された。
【００３５】
ここに開示するポリヌクレオチド配列のある物は、完全長ポリペプチドをエンコードする完全長遺伝子を表さない、という点で「部分」配列である。かかる部分配列は、プライマーおよび／またはプローブ、並びに公知のハイブリダイゼーション法および／またはＰＣＲ法を用いて種々のＤＮＡライブラリを解析、配列決定することにより拡張される場合がある。ここに開示される部分配列は、ポリペプチド、ポリペプチドを表現可能な完全長ポリヌクレオチドおよび／または遺伝子、または前記ゲノムの別の有用な部分をエンコードするオープン・リーディング・フレームが同定されるまで、このようにして拡張される場合がある。完全長ポリヌクレオチドおよび遺伝子も含めたかかる拡張配列は、該拡張ポリヌクレオチドが配列番号１−１２１の配列の１つまたはその変異体の同定された配列またはその変異体、あるいは同定された連続部位（ｘ量体）である場合に、配列番号１−１２１の配列またはその変異体、または配列番号１−１２１の配列のいずれかの一部またはその変異体の１つとして同定される配列に「対応する」ものとして記載される。
【００３６】
配列番号１−１２１として同定された前記ポリヌクレオチドは、ラムノスス乳酸桿菌ゲノムＤＮＡクローンから単離され、前記ＤＮＡが調製された細胞内に存在する配列を表す。前記配列情報は、プロモーター、ＤＮＡ結合要素、オープン・リーディング・フレームまたは完全長遺伝子等、トランスジェニック生物個体内で発現可能な、さもなくば機能可能なＤＮＡとして用いられるＤＮＡ分子の同定、単離または合成に用いられる場合がある。同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列、アンチセンス配列等も、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドを用いてルーチンに確認し、得られる場合がある。
【００３７】
本発明はさらに、ここに開示されたポリヌクレオチドにエンコードされた、または部分的にエンコードされた単離ポリペプチドを提供する。ある特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１２２−２５３として同定された配列と、それらの変異体と、からなるグループから選択される配列を含む。本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドは、それらの生物学的な活性を決定するために、発現され、さまざまなアッセイに使用される。かかるポリペプチドは、抗体の作製、対応する相互作用蛋白その他の化合物の単離、相互作用蛋白その他の化合物の濃度の定量に用いられる場合がある。
【００３８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトとともに、かかる遺伝子コンストラクトをトランスジェニックな宿主細胞、およびかかる細胞を含む微生物のようなトランスジェニック生物も提供する。
【００３９】
本発明は、生物のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの量と組成とをモジュレーションするための方法をも意図しているが、かかる方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトを前記生物のゲノムの中に安定的に取り込むことに関する。１つの実施態様では、標的生物は微生物であり、発酵に使用される微生物が好ましく、乳酸桿菌属の微生物であることがより好ましく、ラムノスス乳酸菌その他の酪農業において用いられる微生物学的に近い関係にある種が最も好ましい。関連する局面では、改変された遺伝子型および／または表現型を有する微生物を作出するための方法が提供されるが、かかる方法は、本発明の遺伝子コンストラクトを用いて微生物細胞を形質転換することによりトランスジェニック細胞を得、該トランスジェニック細胞をその成長および複製を助ける条件下で培養することを含む。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの濃度または含量をモジュレーションした結果として遺伝子型または表現型野が野生型生物と比較して改変された生物、並びにかかる生物の構成部分および子孫も、本発明の意図するところであり、かつ、本発明に含まれる。
【００４０】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、以下に詳述するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＤＮＡハイブリダイゼーション法等、当業者に周知の技術を用いたサンプル材料中の乳酸菌、好ましくはラムノスス乳酸菌の検出のために有用な場合がある。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、より有効なプロバイオチックな細菌を選別・生産する方法に、免疫機能増強に役立つ「生物活性を有する」（健康を促進する）食材および健康サプリメントとして、コレステロール等の血中脂肪の低減に、遺伝子改変細菌に由来する生物活性材料の生産に、アジュバントとして、創傷治癒に、ワクチン、特に粘膜ワクチンの開発に、動物の健康および生産性の改善に役立つ動物プロバイオティックスとして、動物の栄養および生産性の改善に、風味の改善、乳組成の改善に役立つ遺伝子改変された反芻胃内微生物の選別および生産に、改良された風味と、より迅速な風味の発生と、より良い発酵特性と、ビタミン合成と、改良された食感の特性とを目指したより良い自然食品細菌の選別および生産方法に、遺伝子改変を通じた改良食品細菌の生産に、そして、例えば、風味または香り濃縮物の生産に役立つ新規な酵素の同定に、用いられる場合がある。
【００４２】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、ゲノム地図作製と、物理地図作製と、多少とも関連する微生物の遺伝子の位置クローニングとにおいて有用性がある。さらに、配列番号１−１２１として同定された前記ポリヌクレオチド配列、およびこれらの変異体は、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーを設計するために使用される場合がある。かかるオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、該ポリヌクレオチドのある一定の部分にわたり、注目するポリヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列を有する。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、スロットブロットＤＮＡハイブリダイゼーション法等、当業者に周知の技術を用いて、十分に類似性があるＤＮＡおよびＲＮＡ配列を細胞内に有するあらゆる生物の遺伝子の存在の検出、およびその表現型の検討に用いられる場合がある。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ増幅に用いられる場合もある。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、アフィメトリクス社（カリフォルニア州サンタクララ）のマイクロアレイ技術を含む、さまざまなマイクロアレイ技術と関連して使用される場合がある。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドはまた、生物またはこれに由来する材料またはそれから得られる生産物のタグ付けまたは同定に用いられる場合がある。かかるタグ付けは、例えば、非破壊的で非機能的な異種ポリヌクレオチド同定子を安定的に生物個体に取り込む方法により行われる場合があり、このときの前記ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部分を含む。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、（発現ベクターまたはインテグレーションベクターのような）遺伝学的なツールのための、プロモーターと、遺伝子調節因子と、ＤＮＡ複製開始点と、分泌シグナルと、細胞壁または膜のアンカーとのような調節エレメントを取り込む場合がある。
【００４５】
ここに言及された特許文献および非特許文献を含む全ての参照文献は、引用によりここに取り込まれる。
【００４６】
発明の詳細な説明
ここに開示されたポリヌクレオチドは、実施例１に説明するとおり、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ由来のＤＮＡライブラリの高速（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）配列決定により単離された。乳酸菌の細胞壁、細胞表面および分泌成分は、免疫モジュレーション、細胞接着および抗細菌活性を介在することが知られており、以下の事項を含む多くの有益な効果をもたらす。腸内病原体に対する抵抗性、大腸癌を含む癌のモジュレーション、抗突然変異効果、小腸細菌の過剰増殖の低減、自己免疫疾患のモジュレーション、アレルギー疾患の低減、尿生殖器感染、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、ピロリ菌感染および肝性脳症のモジュレーション、病原体感染の低減、腸細胞の増殖および分化の調節、粘膜透過性の低減、および便秘および下痢の軽減。これらの細胞の成分は、ペプチドグリカン、テイコ酸、リポテイコ酸、多糖類、接着蛋白、分泌蛋白、表面層あるいはＳ層蛋白、コラーゲン結合蛋白その他の細胞表面蛋白、およびバクテリオシン、およびこれらに細菌類によって産生される有機酸等の抗菌物質を含むが、これらに限定はされない。これらの蛋白の合成と、これらの蛋白の前駆体分子の合成、修飾、調節、輸送、合成および／または蓄積とに関与するポリヌクレオチドは、前記細菌またはこれらの細菌により産生される成分の免疫的効果、抗菌性、細胞接着、および競合的排除の効果のモジュレーションに用いることができる。
【００４７】
プロバイオティックな細菌として有効に機能するためには、ラムノスス乳酸菌ＨＮ００１株は,胃腸管と、商業および工業的な処理工程とにおける環境ストレス条件に生き残らなければならない。特定のポリヌクレオチドまたは調節処理の改変は、酸化ストレス、ｐＨ、浸透圧ストレス、脱水、炭素飢餓、リン飢餓、窒素飢餓、アミノ酸飢餓、高温または低温ショックおよび突然変異ストレス等の多くのストレスに対して効果的であることが示されている。ストレス抵抗性に関与するポリヌクレオチドは、マルチストレス抵抗性、すなわち、あるひとつのストレスに曝されるときには、生き残った細胞が複数の無関係なストレスにも抵抗性を示す場合がしばしばある。マルチストレス抵抗性への関与が知られている細菌の遺伝子および／または処理には、以下のものがある。
【００４８】
細胞内リン貯蔵―無機リンの飢餓は、ｐｈｏレギュロン遺伝子の誘導につながり、細菌の緊縮応答に関連する。リン酸受容体遺伝子に関連する遺伝子ノックアウトは、マルチストレス応答につながるようである。
【００４９】
細胞内グアノシン貯蔵―プリン生合成およびスカベンジャー経路は、前記細菌の緊縮応答においてシグナル分子として作用するリン酸グアノシン化合物の産生に関与する。プリンスカベンジャー経路遺伝子に関連する遺伝子ノックアウトは、マルチストレス抵抗性を付与するようである。
【００５０】
浸透圧調節分子―グリシン−ベタイン等のコリン系低分子と、トレハロース等のような糖とは、浸透圧ショックに対する保護効果を有し、浸透圧の増大に応答して迅速に細胞内に取り込まれ、および／または合成される。
【００５１】
酸に対する抵抗性―乳酸菌は、主にクエン酸の取り込みおよび利用を担うｃｉｔオペロン遺伝子による乳酸の分泌を通じて、その生育環境を自然のままで酸性に変化させる。
【００５２】
ストレス応答遺伝子―多数の遺伝子が、特異的なプロモーターの作用を通して、高温ショック、低温ショックおよび塩濃度の増大によって誘導され、あるいは抑制されると考えられる。
【００５３】
本発明の単離ポリヌクレオチドと、かかるポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトとは、ストレス抵抗性の向上および発酵特性の改善を含む所望の表現型を有する細菌を作出するために用いられる場合がある。
【００５４】
多くの酵素が、乳製品の風味、機能および食感特性と、成長速度、酸生成および生存率のような一般的な発酵特性とに影響を与えることが知られている。これらの酵素には、脂質、多糖類、アミノ酸および糖質の代謝に関与するものと、細菌細胞の溶解に関与するものとがある。
【００５５】
本発明の単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、既知の機能を有するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドとの類似性が実証されている。かかる類似性にもとづく本発明のポリヌクレオチドの同定番号および機能は、以下の表１に示される。
【００５６】
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【００５７】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、本明細書で配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドと、配列番号１−１２１からなるグループから選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドと、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドのいずれかの少なくとも特定された数の連続した残基（ｘ量体）を含む単離ポリヌクレオチドと、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対して相補的なポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドと、上記ポリヌクレオチドのいずれかの逆配列か逆相補体かであるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドと、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応するアンチセンス配列と、上記のポリヌクレオチドのいずれかの変異体とを含む。
【００５８】
ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基の１本鎖または２本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ分子と、これに対応するｍＲＮＡ分子を含めたＲＮＡ分子、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、および全合成または部分合成されたポリヌクレオチドとともに、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組み換えＤＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子全体でもよく、あるいはそのいかなる部分であってもよい。遺伝子とは、機能的な蛋白質またはＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列をいう。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドの断片を含み、それゆえに「ポリヌクレオチド」の定義には全てのかかる操作可能なアンチセンス断片が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドに関する技術は当業者に周知であり、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（アンチセンス技術）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２５４巻、２３号、３６３−３７５頁、１９９５年およびＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ、２０巻、８号、８３６−８４８頁、１９９６年に記載される。
【００５９】
ここで使用する「相補体」、「逆相補体」、および「逆配列」という用語の定義は、以下の例で極めて巧く説明される。５'ＡＧＧＡＣＣ３'という配列に対して、相補体、逆相補体および逆配列は以下のとおりである。
相補体                ３'ＴＣＣＴＧＧ５'
逆相補体              ３'ＧＧＴＣＣＴ５'
逆配列                ５'ＣＣＡＧＧＡ３'
【００６０】
具体的に列挙されたポリヌクレオチド配列の相補体である配列は、前記具体的に列挙されたポリヌクレオチド配列の全長に亘って相補的であることが好ましい。
【００６１】
ゲノムＤＮＡおよび異種ＤＮＡの同定は、標準的なＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション技術により、適度にストリンジェントな条件下で、あるＤＮＡ配列の全体または一部をプローブとして用いて適当なライブラリをスクリーニングすることによって達成できる。あるいは、既知のＤＮＡおよび蛋白質の配列にもとづいて設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ技術を用いて、他の同一または類似のＤＮＡの配列を増幅し同定することもできる。同定された配列またはこれらの変異体に対応する合成ＤＮＡは、通常の合成方法で製造してもよい。ここで説明されるポリヌクレオチドは全て、本発明の技術分野で慣用される字義どうりに単離され精製される。
【００６２】
配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドをエンコードする、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）または部分オープン・リーディング・フレームを含む。さらに、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドは、制御エレメントとして有用なプロモーターおよびターミネータのようなノンコーディング配列を含む場合がある。ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは、配列番号１−１２１として記載された配列に対応する拡張配列または完全長配列中で同定される場合がある。オープン・リーディング・フレームは、当業者に周知の手法により同定される場合がある。これらの手法は、例えば、既知の開始コドンおよび停止コドンの位置解析、コドン配列にもとづく最も可能性の高いリーディング・フレームの同定、既知の最近の発現遺伝子との類似性を含む。ＯＲＦ解析に適したツールおよびソフトウェアは、ＧｅｎｅＷｉｓｅ（Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＭＨＧ  Ｂｏｘ  ４３  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ  ５５４５５）、およびＧＲＡＩＬ（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ、ＴＮ）を含む。オープン・リーディング・フレームおよびオープン・リーディング・フレームの部分は、本発明のポリヌクレオチド中で同定される場合がある。部分的なオープン・リーディング・フレームが一旦同定されれば、そのポリヌクレオチドは、完全オープン・リーディング・フレームに相当するポリヌクレオチドが同定されるまで当業者に周知の手法を用いて拡張される場合がある。このようにして、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは、本発明のポリヌクレオチドを用いて同定される場合がある。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチド中でオープン・リーディング・フレームが一旦同定されたら、そのオープン・リーディング・フレームは単離および／または合成される場合がある。オープン・リーディング・フレームと、適当なプロモータ、イニシエータ、ターミネータ等とを含む当業者に周知の発現可能な遺伝子コンストラクトが、こうして構築される場合がある。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン・リーディング・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現する宿主細胞に導入される場合がある。適切な宿主細胞には、さまざまな原核細胞および真核細胞が含まれる。試験管内でポリペプチドを発現させることも、当業者に周知のごとく可能である。
【００６４】
ここで使用する「オリゴヌクレオチド」という語は、一般に６ないし６０個のヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド配列の比較的短いセグメントを指し、ハイブリダイゼーションアッセイ法に使用するプローブと、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅に使用するプライマーとの両方を含む。
【００６５】
ここで使用する、「ｘ」というある特定の値を持つ「ｘ量体」という語は、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドのいずれかの、少なくともある特定の数「ｘ」の連続する残基を含むポリヌクレオチドを指す。ｘの数値は、具体的配列に応じ、約２０から約６００までであってよい。
【００６６】
別の局面では本発明は、上記のポリヌクレオチドによってエンコードされ、あるいは部分的にエンコードされる単離ポリペプチドを提供する。具体的な実施形態においては、かかるポリペプチド配列番号１２２−２５３からなるグループから選択される配列、またはその変異体を含む。ここで使用する「ポリペプチド」という語は、アミノ酸残基がペプチド共有結合で連結される、完全長蛋白を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。また、ここで使用する「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という語は、ここで提供される単離ポリヌクレオチド配列または変異体を含むポリヌクレオチドによりエンコードされるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、天然物の精製品であってもよく、あるいは、組換え技術を部分的または全面的に用いて作製したものであってもよい。かかるポリペプチドは、細菌、真菌類、哺乳類その他の真核生物の糖質で糖鎖修飾される場合もあるが、糖鎖修飾されない場合もある。
【００６７】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、前記ポリペプチドを適当な宿主内で発現させる組換え法で産生することができる。当業者に知られたさまざまな発現ベクターのいずれを用いてもよい。発現は、組換えポリペプチドをエンコードするポリペプチドを含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされたあらゆる適当な宿主細胞において達成される場合がある。適当な宿主細胞には、原核生物、酵母および高等真核細胞が含まれる。用いる宿主細胞は、大腸菌、乳酸球菌、乳酸桿菌属、昆虫、酵母、ＣＯＳまたはＣＨＯのような哺乳類細胞株であることが好ましい。このようにして発現されるポリヌクレオチドは、天然ポリペプチドか、天然ポリペプチドの一部分か、これらの他の変異体かをエンコードする場合がある。
【００６８】
関連する局面では、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも機能性のある部分を含むポリペプチドが提供される。ここで用いられるポリペプチドの「機能性のある部分」とは、前記ポリペプチドの機能に影響を与えるために必須の活性部位を含む部分、例えば、１または２以上の反応物と結合することが可能な分子の部分をいう。活性部位は、１または２以上のポリペプチド鎖に存在する分離した部分からなる場合もあり、一般的には高い結合親和性を示す。
【００６９】
ポリペプチドの機能的な部分は、先ず該ポリペプチドの化学的消化または酵素的消化のいずれかにより前記ポリペプチドの断片を調製するか、あるいは前記ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの変異解析を行い、得られた変異ポリペプチドを発現させることにより、同定することができる。次に、例えば、以下に提供する代表的なアッセイ法を用いて前記ポリペプチド断片または変異ポリペプチドをテストし、どの部分が生物活性を保持するかを決定する。
【００７０】
本発明のポリペプチドの部分その他の変異体は、人工合成法または組み換え法により生成される。アミノ酸の数が約１００個未満、一般には約５０個未満の合成ポリペプチドは、本発明の技術分野の当業者に周知の技術を用いて生成できる。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が次々に伸長中のアミノ酸鎖に付加されていくＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法のような、商業的に利用可能な固相技術のいずれかを用いて合成することが可能である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５巻、２１４９−２１４６頁、１９６３年を参照）。ポリペプチド自動合成装置は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）等の供給元から市販品を入手可能であり、製造者の指示に従って操作することができる。天然ポリペプチドの変異体は、オリゴヌクレオチド指定位置特異的変異導入法のような標準的な突然変異導入法を用いて調製される（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、４８８−４９２頁、１９８５年）。ＤＮＡ配列のセクションは、トランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ポリペプチドを調製する標準的な技術を用いて除去される場合がある。
【００７１】
一般に、ここに開示されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離され実質的に純粋な形で調製される。このポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも純度約８０％であることが好ましく、少なくとも純度約９０％であることがより好ましく、少なくとも純度約９９％であることが最も好ましい。
【００７２】
ここで使用する「変異体」という語は、具体的に同定された配列と異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を含むものであって、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたものをいう。変異体は、天然に存在する対立遺伝子の変異体でも、天然に存在しない変異体でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体配列は、本発明の配列に対し、少なくとも６０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を示すものをいう。ポリペプチドの変異体配列は、本発明の配列に対し、少なくとも５０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を示すものをいう。同一性の百分率とは、以下に説明するとおり、比較すべき２つの配列のアライメントをとり、アライメントがとれた部分の同一残基数を決定し、該同一残基数を本発明の（クエリーの）配列中の全残基数で除算し、その結果を１００倍した値をいう。
【００７３】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、アライメントをとることができ、特定の領域のヌクレオチドの同一性の百分率を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して決定することができる。ポリヌクレオチド配列のアライメントおよび類似性同定のための２つの代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリヌクレオチドは、（両方の鎖の）ヌクレオチドのクエリー配列の６つの読み枠の概念的な翻訳産物を蛋白配列データベースに対して比較するＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いても解析できる。ポリペプチド配列の同一性の百分率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。前記ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＰプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の匿名ＦＴＰサーバーと、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ、Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４  ＵＳＡ）とから入手することができる。本発明による変異体の決定には、後述のようにパラメータが設定されたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．４（１９９８年２月２４日）、バージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）およびバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を用いることが好ましい。後述のようにパラメータを設定したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、本発明のポリペプチド変異体の決定に好ましく用いられる。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムについては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年に記載されている。
【００７４】
コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡは、インターネット上、およびバージニア大学副学長（ｖｉｃｅ  ｐｒｏｖｏｓｔ）のＤａｖｉｄ  Ｈｕｄｓｏｎ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＰＯ  Ｂｏｘ  ９０２５、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ  ２２９０６−９０２５）から入手可能である。添付の説明書に記載される如くにデフォルト・パラメータが設定されたＦＡＳＴＡアルゴリズムのバージョン２．０ｕ４（１９９６年２月）は、本発明の変異体の決定に好適に用いられる場合がある。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４−２４４８頁、１９８８年と、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３−９８頁、１９９０年とに記載されている。
【００７５】
ＢＬＡＳＴＮを用いるアライメントおよび類似性の決定においては、ポリヌクレオチド配列のＥ値および同一性の百分率に寄与する以下のランニングパラメーターを用いることが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）ランニングコマンド：「ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｄ  ｅｍｂｌｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ０  −Ｅ０  −ｒ  １  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ  −ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下のとおりである。
−ｐ  プログラムの名称  ［文字列］；−ｄ  データベース［文字列］；−ｅ  期待値（Ｅ）［実数］；−Ｇ  ギャップを空けるためのコスト（ゼロでデフォルト挙動となる）［整数］；−Ｅ  ギャップを拡張するためのコスト  （ゼロでデフォルト挙動となる）［整数］；−ｒ  ヌクレオチドのマッチの報酬  （ｂｌａｓｔｎのみ）［整数］；−ｖ  １行説明の数（Ｖ）［整数］；−ｂ  表示するアライメントの数  （Ｂ）［整数］；−ｉ  クェリーファイル［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；−ｏ  ＢＬＡＳＴレポート出力ファイル［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］任意。
【００７６】
以下のランニングパラメーターを、ポリペプチド配列のＥ値および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＰを使うアライメントおよび類似性の決定に用いるのが好ましい。「ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｄ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ  ０−Ｅ  ０  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ  −ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下のとおりである。
−ｐ  プログラムの名称［文字列］；−ｄ  データベース［文字列］；−ｅ  期待値（Ｅ）［実数］；−Ｇ  ギャップを空けるためのコスト（ゼロでデフォルト挙動となる）［整数］；−Ｅ  ギャップを拡張するためのコスト（ゼロでデフォルト挙動となる）［整数］；−ｖ  １行説明の数（Ｖ）［整数］；−ｂ  表示するアライメントの数（Ｂ）［整数］；−ｉ  クェリーファイル［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；−ｏ  ＢＬＡＳＴレポート出力ファイル［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］任意。
【００７７】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰまたは同様のアルゴリズムにより作成された、クエリー配列による１または２以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列の類似部分のアライメントをとって同定する。前記ヒットは、類似性の程度および配列重複の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは一般に、前記クエリー配列の配列長の一部のみとの重複を表す。
【００７８】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、アライメントの「期待」値をも算出する。この期待値（Ｅ）は、ある規模のデータベースを検索する際に、ある数の隣接する配列にわたってたまたま「期待」できそうなヒットの数を表す。Ｅ値は、好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、あるポリヌクレオチドのヒットにＥ値０．１が割り当てられた場合、ＥＭＢＬデータベース規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分にわたってマッチングがたまたま期待できるのは０．１回である、と解釈される。この判定基準により、前記ポリヌクレオチド配列のアライメントおよびマッチングがとれた部分は、同一性の確率が９０％であることになる。アライメントおよびマッチングがとれた部分にわたってＥ値が０．０１未満である配列については、アルゴリズムＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡを用いてＥＭＢＬデータベース内にたまたまマッチングが見出せる確率は１％未満である。
【００７９】
１つの実施態様によれば、各々本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して「変異した」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較した場合に、Ｅ値が０．０１以下となるような配列を含むことが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、パラメータを上述のように設定したＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下と測定され、少なくとも９９％の確率で本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと一致するような、いかなる配列であってよい。好ましい１つの実施態様によれば、変異体ポリヌクレオチドとは、パラメータを上述のように設定したＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下と測定され、少なくとも９９％の確率で本発明のポリヌクレオチドと一致するようなポリヌクレオチドと比べ、同じまたはより少ない数の核酸を有する配列である。同様に、好ましい１つの実施態様によれば、変異体ポリペプチドとは、パラメータを上述のように設定したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下と測定され、少なくとも９９％の確率で本発明のポリペプチドと一致するようなポリペプチドと比べ、同じまたはより少ない数のアミノ酸を有する配列である。
【００８０】
上記のとおり、同一性の百分率は、上記のとおりにランニングパラメーターを設定したＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのうちの１つを用いて配列のアライメントをとり、アライメントがとれた部分の同一の核酸またはアミノ酸の数を同定し、この同一の核酸またはアミノ酸の数を本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの中の核酸またはアミノ酸の総数で除算し、その結果を１００倍した値をいう。例えば、上記のとおりのパラメーターを用いてＢＬＡＳＴＮアルゴリズムによって作出されたアライメントにおいて、２２０個の核酸を有する本発明のポリヌクレオチドには、ＥＭＢＬデータベース中の５２０個の核酸を有するポリヌクレオチド配列に対する２３個のヌクレオチドにわたるヒットがある。この２３個のヌクレオチドのヒットには、２１個の同一ヌクレオチドと、１つのギャップと、１個の相違するヌクレオチドとが含まれる。本発明のポリヌクレオチドのＥＭＢＬライブラリ中の前記ヒットに対する類似性の百分率は、２２０分の２１の１００倍、すなわち９．５％である。よって、ＥＭＢＬデータベース中の前記ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの変異体ではないことになる。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して特定の同一性の百分率を有することに加え、変異体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共通する更なる構造上および／または機能上の特徴を有することが好ましい。本発明のポリペプチドに対して特定の程度の同一性を有するポリペプチドは、その１次構造の類似性の程度の高さが共通し、実質的に類似の機能上の特性を有する。本発明のポリヌクレオチドに対する１次構造の類似性の程度の高さに加えて、本発明のポリヌクレオチドに対する同一性が特定の程度であるか、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドは、以下の特徴のうち少なくとも１つを有することが好ましい。（ｉ）本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドと実質的に同一の機能上の特性を有するポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームの全体またはその一部を含むこと。あるいは、（ii）同定可能なドメインを共通に含むこと。
【００８２】
代替的には、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列番号１−１２１に列挙されたポリヌクレオチド配列か、これらの配列の相補体、逆配列または逆相補体かと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。ここで使用する「ストリンジェントな条件」とは、０．２％ＳＤＳの６Ｘ  ＳＳＣ溶液で前洗浄し、０．２％ＳＤＳの６Ｘ  ＳＳＣ中で６５°Ｃ、終夜ハイブリダイゼーションさせ、その後６５°Ｃ、０．１％ＳＤＳの１Ｘ  ＳＳＣ中で各３０分間ずつ２回洗浄し、更に６５°Ｃ、０．１％ＳＤＳの０．２Ｘ  ＳＳＣ中で各３０分間ずつ２回洗浄することを指す。
【００８３】
本発明はまた、開示された配列とは相違するが、その遺伝暗号の不一致の結果として、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドと類似の酵素活性を有するポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドも含む。したがって、保存的置換の結果、配列番号１−１２１に列挙されたポリヌクレオチド配列またはこれらの配列の相補体、逆配列または逆相補体と相違する配列を含むポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果として、本発明のポリヌクレオチド配列、またはこれらの配列の相補体、逆相補体または逆配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドも、本発明により意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換、挿入および／または欠失の結果として本発明のポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、前記変異体ポリペプチドが本発明のポリペプチドと類似の活性を有する限りにおいて、本発明により意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、さまざまなライブラリから単離してもよく、あるいは当業者に周知の技術を用いて合成してもよい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、５０個まで、あるいはそれ以上の数の核酸からなるポリヌクレオチドセグメントが得られる自動オリゴヌクレオチド合成機（例としてベックマン社オリゴ１０００Ｍ  ＤＮＡシンセサイザー）を用いて合成してもよい。複数のかかるポリヌクレオチドセグメントは、分子生物学の分野で周知の標準的なＤＮＡ操作技術を用いて連結することができる。１つの従来の代表的なポリヌクレオチド合成技術は、例えば、８０個の核酸を有する１本鎖ポリヌクレオチドセグメントを合成すること、該セグメントを相補的な８５個の核酸セグメントと雑種形成して５ヌクレオチドのオーバーハングを作り出すことに関する。次のセグメントも同様の手法で反対側の鎖に５ヌクレオチドのオーバーハングを持つように合成される。この「粘着」末端が、前記の２つの部分が雑種形成したときに適切に連結することを保証する。このようにして、本発明の完全なポリヌクレオチドは、試験管内で全合成することができる。
【００８５】
配列番号１−１２１として同定されるポリヌクレオチドの一部は、天然ポリペプチドをエンコードする遺伝子の完全なコーディング部分を表していない場合があることから、一般に「部分」配列と呼ばれる。ここで開示する部分ポリヌクレオチド配列は、例えば、本発明のポリヌクレオチドにもとづきハイブリダイゼーションプローブを用いてＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることにより、あるいは本発明のポリヌクレオチドにもとづきプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、さまざまな種および生物の対応する完全長遺伝子を得る目的で用いられる場合がある。このようにして当業者に周知の方法を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを対応するＤＮＡの上流方向および下流方向に拡張させるとともに、完全遺伝子の対応するｍＲＮＡと、プロモータ、エンハンサ領域等を含むゲノムＤＮＡとを同定することが可能である。したがって本発明は、完全長遺伝子を含め、機能ポリペプチドをエンコードする、配列番号１−１２１中で同定される配列か、または特定の前記配列の１つの変異体を含む単離ポリヌクレオチドかを含む。かかる拡張ポリヌクレオチドは、約５０〜約４，０００個の核酸または塩基対、好ましくは約４，０００個未満の核酸または塩基対、より好ましくは約３，０００個未満の核酸または塩基対、更に好ましくは約２，０００個未満の核酸または塩基対分の長さを有する場合がある。場合によっては、本発明の拡張ポリヌクレオチド約１，８００個未満の核酸または塩基対、好ましくは約１，６００個未満の核酸または塩基対、更に好ましくは約１，４００個未満の核酸または塩基対、更に好ましくは約１，２００個未満の核酸または塩基対、最も好ましくは約１，０００個未満の核酸または塩基対分の長さを有することもある。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドまたはそれらの変異体のいずれかの、少なくとも特定の数の連続した残基を含むポリペプチド（ｘ量体）を含むポリヌクレオチドを含む。好ましい実施態様によると、ｘの値は少なくとも２０が好ましく、少なくとも４０がより好ましく、少なくとも６０がさらに好ましく、少なくとも８０が最も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドか、あるいは配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドの１つの変異体かの、２０量体、４０量体、６０量体、８０量体、１００量体、１２０量体、１５０量体、１８０量体、２２０量体、２５０量体、３００量体、４００量体、５００量体または６００量体を含むポリヌクレオチドを含む。
【００８７】
配列番号１−１２１とこれらの配列の変異体とに相補的および／または対応するオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーも、本発明に含まれる。かかるオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、注目するポリヌクレオチド対して実質的に相補的である。あるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが、配列番号１−１２１として提示された配列の１つを含む本発明のポリヌクレオチドまたは変異体に「対応する」と記載されるのは、前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、あるいはその相補体が、配列番号１−１２１として提示された１の配列か、または上記のように特定された配列の１の変異体かに含まれるときである。
【００８８】
２つの１本鎖配列に実質的な相補性があると言えるのは、最適なアライメントをとって比較すると、適当なヌクレオチド挿入および／または欠失を有する一方の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％ないし９５％、そしてより好ましくは少なくとも９８％ないし１００％対合するときである。あるいは、実質的な相補性は、第１のＤＮＡ鎖が、第２のＤＮＡ鎖と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイゼーションする場合に存在する。相補性を決定するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、塩濃度が約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満である。ハイブリダイゼーションの温度は、５°Ｃまで低くすることもできるが、一般的には約２２°Ｃよりも高く、より好ましくは約３０°Ｃよりも高く、最も好まくは約３７°Ｃよりも高い。長いＤＮＡ断片ほど、特異的なハイブリダイゼーションには高いハイブリダイゼーション温度が必要である。ハイブリダイゼーションのストリンジェントさは、プローブ組成、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチングの度合い等、他の要因の影響を受けるため、パラメーターの組み合わせは、いずれかの単独パラメータの絶対値よりも重要である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの研究は、ゲノムＤＮＡか、あるいは、被検サンプル中に存在するＲＮＡからｃＤＮＡを調製することにより得られたＤＮＡかのいずれかを用いて行うことができる。
【００８９】
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションに加えて、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ法も可能である。前者では、発現遺伝子由来のｍＲＮＡが、ゲノムＤＮＡまたはサンプルのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの代わりに検出される。後者では、ＲＮＡプローブを用いることができる。さらに、標的配列に対して特異的にハイブリダイゼーションするＤＮＡの人工類似体を用いることもできる。
【００９０】
特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも約６個の連続した残基を含み、より好ましくは少なくとも約１０個の連続した残基を含み、最も好ましくは少なくとも約２０個の連続した残基を含む。本発明のプローブおよびプライマーは約８個ないし１００個の塩基対分の長さであってもよいが、約１０個ないし５０個の塩基対分の長さが好ましく、約１５個ないし４０個分の塩基対分の長さがより好ましい。前記プライマーおよびプローブは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのストリンジェントさと、熱処理温度および融点と、ループ形成の可能性と、当業者に周知のその他の要因とを考慮して、当業者に周知の手順を用いて容易に選択できる。プローブの設計に適し、特に、ＰＣＲプライマーの設計に適するツールおよびソフトウェアは、インターネット上、例えば、プレミア・バイオソフト・インターナショナル、パロアルト、カリフォルニア州（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、３７８６  Ｃｏｒｉｎａ  Ｗａｙ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ  ９４３０３−４５０４）から入手可能である。ＰＣＲプライマーの設計のための好ましい技術は、ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）およびディクスラー（Ｄｙｋｓｌｅｒ）、「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー、１９９５年にも開示されている。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーは、キットの形で提供される場合がある。かかるキットは、一般的には、複数のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブを含み、それぞれのプローブはある１つのポリヌクレオチド配列に特異的である。本発明のキットは、本発明のポリヌクレオチドに対応し、配列番号１−１２１に同定されたポリヌクレオチド配列を含む、１または２以上のプローブまたはプライマーを含む。
【００９２】
高速アッセイ法に有用な１つの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、固体の表面で所定の番地により空間的にアドレス可能な場所に各プローブが固定化された、アレイ状のフォーマットにしたがった複数のプローブを含む。本発明で有効に用いられるアレイ状フォーマットは、例えば、米国特許第５、４１２、０８７号明細書、第５、５４５、５３１号明細書および国際公開第ＷＯ９５／００５３０号公報に開示されており、その開示内容は引用よりここに取り込まれる。
【００９３】
本発明で使用するオリゴヌクレオチドのプローブは、当業者に周知の技術を用いて、アレイ上に固定化するに先立ち、人工合成により構築される場合がある（Ｇａｉｔ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８４年を参照）。オリゴヌクレオチドの自動合成装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）等の供給元から市販品を入手可能であり、製造者の指示に従って運転できる。代替策として、プローブは、例えばＰＣＴ国際公開第ＷＯ９５／００５３０号公報に教示された技術を用いて前記アレイの表面に直接構築される場合もある。
【００９４】
固体基板およびその表面は、剛直な支持体を形成し、一般的に同一の素材で形成されることが好ましい。前記固体基板を構成する素材の例は、ポリマー、プラスチック、樹脂、膜、多糖類、シリカまたはシリカ系材料、炭素、金属および無機ガラスを含む。人工合成で調製されたプローブは、米国特許第５，４１２，０８７号明細書に開示された技術のような、当業者に周知の技術を用いて、前記固体基板の表面に固定化される場合がある。
【００９５】
かかる技術の１つでは、光化学的に除去可能な保護基で保護されたチオール基のような保護された官能基を有する化合物が前記基板の表面に付着させられる。続いて、前記表面の選択された領域を光源、好ましくはレーザで照射し、反応性チオール基とする。この照射のステップは、所定の位置に開口を有するマスクを使って半導体の分野の当業者に周知であるフォトリソグラフィー技術を用いて実行されることが一般的である。次に、前記反応性チオール基を、固定化したいオリゴヌクレオチドプローブとともにインキュベートする。温度、時間およびｐＨ等の正確なインキュベーション条件は、個々のプローブごとに異なり、当業者によって容易に決定され得る。前記基板表面を未結合のプローブが残らないように洗浄し、開口パターンの異なる第２のマスクを使って上記の照射ステップを繰り返す。その後、前記表面を第２の異なるプローブとともにインキュベートする。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、約１ｍｍ２未満の離間した領域に固定化されるのが典型的である。それぞれの離間した領域は約１０，０００ｍｍ２未満であることが好ましく、約１００ｍｍ２未満であることがより好ましい。このようにして、多数のオリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の所定の位置に固定化される。
【００９６】
得られたアレイは、生物または遺伝物質を含むサンプルまたは製品の違いをスクリーニングする上で、下記のように用いられる場合がある。まず、ゲノムＤＮＡライブラリまたはｃＤＮＡライブラリを、当業者に周知の技術を用いて調製する。そして、得られた標的ＤＮＡを、当業者に周知の手順により放射能標識、発色団、蛍光発色団または化学ルミネッセンス試薬等の適当なマーカーで標識する。前記標識をされた標的ＤＮＡの溶液を前記アレイの表面と接触させ、適当な時間インキュベートする。
【００９７】
前記アレイの表面を未結合の標的ＤＮＡが残らないように洗浄し、標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブを、前記マーカーが付着した前記アレイの領域を同定することにより決定する。前記マーカーが３２Ｐのような放射能標識である場合、オートラジオグラフィーが検出方法として用いられる。１つの実施態様では、前記マーカーは、フルオレセインのような蛍光発色団であり、結合した標的ＤＮＡの位置は蛍光分光法により決定される。オリゴヌクレオチドプローブアレイの蛍光スキャンに使用する自動装置は、アフィメトリクス社（カリフォルニア州、サンタクララ）から入手可能であり、製造者の指示書にしたがって操作すればよい。かかる装置は、前記アレイのそれぞれの所定の位置での蛍光強度を決定するために用いられ、これによって各場所における標的ＤＮＡの量の測定値が得られる場合がある。かかるアッセイは、標的におけるマーカープローブの有無だけでなく、定量的な値も示すことができる。
【００９８】
かかるハイスループットスクリーニングシステムの意義は、微生物の選択と、多数のサンプルまたは製品について望ましくない材料を同定すること、微生物か、検疫の目的等のために微生物材料を含むサンプルまたは製品かを同定すること、あるいは、微生物を含むサンプルまたは製品の本当の起源を確認することの必要性がある品質管理作業とのような用途については自明である。微生物および微生物産物をタグ付けするための同定子として使用された本発明のポリヌクレオチドの有無をスクリーニングすることは、後で食品、発酵および工業に利用される微生物か、プロバイオティック食品（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）摂取後のヒトまたは動物の消化器系の微生物かの遺伝的組成を検出するうえで貴重である。
【００９９】
このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドのプローブキットは、異なる材料を含む異なるサンプルまたは製品におけるポリヌクレオチドの有無（混合物の場合は相対的な量）を迅速、かつ低コストに調べるために用いられる場合がある。本発明を用いて調べられる微生物種の例は、ラムノスス乳酸菌のような乳酸菌その他の微生物種を含む。
【０１００】
本発明の別の局面は、本発明の複数のポリヌクレオチドのコレクションに関する。本発明の複数のポリヌクレオチド、特に、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドのコレクションは、記録媒体に記録および／または保存され、その後、解析、比較等の目的でアクセスされる場合がある。好適な記録媒体としては、磁気ディスケットのような磁気媒体、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ記録媒体、光記録媒体等がある。好適な媒体と、情報を記録および保存するとともにかかる媒体に記録されたポリヌクレオチド配列のような情報にアクセスするための方法とは、当業者に周知である。前記記録媒体に保存されたポリヌクレオチド情報は、コンピュータで読出し可能であることが好ましく、前記ポリヌクレオチド情報の解析および比較に用いられる場合がある。
【０１０１】
したがって本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドのコレクション、特に配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドのコレクションに関する。１つの実施態様によると、前記記録媒体は、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも１００個、そして最も好ましくは少なくとも２００個の本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドと、これらのポリヌクレオチドの変異体とのコレクションを含む。
【０１０２】
本発明の別の局面は、ポリヌクレオチドの組合せであって、配列番号１−１２１から選択されたポリヌクレオチドと、これらのポリヌクレオチドの変異体とを含む、少なくとも５個の、好ましくは少なくとも１０個の、より好ましくは少なくとも２０個の、そして最も好ましくは少なくとも５０個の本発明の異なるポリヌクレオチドを含む組合せに関する。
【０１０３】
他の局面では、本発明は、５'から３'の方向に、遺伝子プロモーター配列と、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするオープン・リーディング・フレームとを含む遺伝子コンストラクトを提供する。ある種の実施態様では、本発明の遺伝子コンストラクトは遺伝子ターミネーション配列を含む。前記オープン・リーディング・フレームは、センスまたはアンチセンスのいずれの方向に配向されていてもかまわない。また、上記のポリヌクレオチドによってエンコードされるポリペプチドをコードする遺伝子のノンコーディング領域か、ノンコーディング領域に対して相補的なヌクレオチド配列を、遺伝子プロモーター配列とともに含む遺伝子コンストラクトも提供される。ターミネーター配列は、このコンストラクトの一部を構成する場合がある。前記遺伝子プロモーターおよびターミネーション配列は宿主生物で機能することが好ましい。前記遺伝子プロモーターおよびターミネーション配列が、導入されるポリヌクレオチドのそれらと共通であることが更に好ましい。前記遺伝子コンストラクトは更に、形質転換細胞の同定のためのマーカーを含むこともある。
【０１０４】
本発明の遺伝子コンストラクトの構成要素を操作可能に連結するための技術は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）に記載された、１または２以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーの利用を含む。本発明の遺伝子コンストラクトは、例えば大腸菌のような、少なくとも１つの複製システムを有するベクターと連結されてもよい。この場合、各操作の後に、得られたコンストラクトをクローン化し、配列決定を行って、操作の正確さを決定することができる。
【０１０５】
本発明の遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニック微生物細胞も、かかるトランスジェニック細胞を含む微生物と、かかる微生物の産生物および子孫と、かかる微生物を含む材料とともに本発明によって提供される。乳酸桿菌属の種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓまたは大腸菌のような標的微生物のゲノムに遺伝子コンストラクトを安定的に取り込むための技術は、微生物の形質転換の分野の当業者に周知であり、実施例１で述べるシーケンシングのための大腸菌の形質転換で例示される。
【０１０６】
本発明の遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニックな非微生物細胞も、かかるトランスジェニック細胞を含む生物と、かかる生物の産物および子孫とともに提供される。本発明の遺伝子コンストラクトは、菌類のような非微生物性の標的生物のゲノムに当業者に周知の技術を用いて安定的に取り込まれる場合がある。
【０１０７】
好ましい実施態様では、本発明の遺伝子コンストラクトは、食料品、食品成分、加工補助材、添加物またはサプリメントの生産と、医薬用、特に、免疫系の機能および免疫効果をモジュレートするための微生物産物の生産と、有益な効果を提供する化学保護材、プロバイオティック食品および健康サプリメントの提供とのために使用される微生物を形質転換するために用いられる。本発明の遺伝子コンストラクトは、酵素、または多糖類、風味化合物、生物活性物質等の物質を産生する目的と、乾燥等の工業的工程およびヒトの消化器系内での有害刺激に対する耐性を増強する目的とに使用される細菌の形質転換に用いられることがある。ラムノスス乳酸菌における抗生物質の産生、ファージ取込みおよび耐性に関与する遺伝子は特に有用と考えられる。本発明の１または２以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子コンストラクトによる形質転換に用いられる標的微生物は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、乳酸桿菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓその他のさまざまな発酵産業で潜在的な有用性がある属の細菌からなるグループから選択されることが好ましく、以下のリストの乳酸桿菌属の種からなるグループから選択されることが最も好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｉｚｏｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｖｉａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｖａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｊｕｇｕｒｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｌｔａｒｏｍｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｃｉｎｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈａｒｐｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｅおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ。
【０１０８】
別の局面では、本発明は、本発明の遺伝子コンストラクトで微生物のような宿主生物を形質転換することにより、前記宿主生物のゲノムに前記遺伝子コンストラクトを安定的に取り込むことを含む、前記宿主生物におけるポリペプチドの濃度、組成および／または活性を改変するための方法を提供する。本発明の遺伝子コンストラクトは、さまざまな生物を形質転換するために使用することができる。本発明のコンストラクトで形質転換できる生物は、単子葉類被子植物（例、牧草、トウモロコシ、カラスムギ、コムギおよびオオムギ）と、双子葉類被子植物（例、シロイヌナズナ、タバコ、野菜、アルファルファ、樫、ユーカリ、カエデ）と、裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ｓｃｏｔ  ｐｉｎｅ）（Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．Ｐａｐｅｒｓ、５９５巻、１９９６年）、ホワイトスプルース（Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１巻、８４−８９頁、１９９３年）およびカラマツ（ｌａｒｃｈ）（Ｈｕａｎｇら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ、２７巻、２０１−２０７頁、１９９１年）のような植物、その他遺伝子工学の対象となり得るあらゆる種類の植物とを含む。
【０１０９】
したがって、別の局面では、本発明の遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニック植物細胞が、かかるトランスジェニック細胞を含む植物と、かかる植物の果実、種子、産物および子孫とともに提供される。遺伝子コンストラクトを植物のような標的生物のゲノムに安定的に取り込むための技術は、当業者に周知で、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介する導入法、エレクトロポレー高速発射体導入法（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）等を含む。技術の選択は形質転換される植物に応じて異なる。例えば、双子葉類植物と、ある種の単子葉類および裸子植物とは、例えばＢｅｖａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２巻、８７１１−８７２１頁、１９８４年）に記載のアグロバクテリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換することができる。前記遺伝子コンストラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、解離された細胞、プロトプラスト、種子、胚、分裂組織領域、子葉、胚軸等が含まれる。
【０１１０】
一旦前記細胞が形質転換されると、前記遺伝子コンストラクトをゲノムに取り込んだ細胞が選択される。つぎにトランスジェニック細胞は、当業者に周知の技術を用いて、適当な培地中で培養される。プロトプラストの場合には、細胞壁は適当な浸透圧条件下で再形成させられる。種子または胚の場合には、適当な発芽またはカルス誘導培地が用いられる。外植体については、適当な再生培地が用いられる。植物の再生は多くの種について十分に確立されている。林木の再生の総説としては、Ｄｕｎｓｔａｎら、「Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔｓ（木本植物における体細胞的胚発生）」、Ｔｈｏｒｐｅ  ＴＡ編、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ（植物の試験管内胚発生）、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｌａｎｔ  ＳｃｉｅｎｃｅおよびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、２０巻（１２号）、４７１−５４０頁、１９９５年）を参照されたい。スプルースの再生についての具体的なプロトコールは、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｐｒｕｃｅ（スプルースの体細胞的胚発生）、Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ  Ｋ編、Ｓｙｎｓｅｅｄ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｅｅｄ  ｔｏ  ｃｒｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ（シンシード：人工的な種子の作物改良への応用）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２３章、４２７−４４９頁、１９９３年に説明されている。得られた形質転換植物は、当業者に周知の技術を用いて、次世代以降のトランスジェニック植物および実用的に無限量のタグ付き植物由来の産物を得るために、有性的または無性的な生殖で増殖させられる場合がある。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドはさらに、生物、特に微生物をマーキングするための非破壊タグとして用いられる場合がある。しかし、商業価値のある植物、動物、魚、真菌、酵母等、他の生物も、本発明のポリヌクレオチドでタグ付けできる場合がある。本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトは、異種、非機能的、非破壊的タグとして安定に導入できる場合がある。したがって、材料サンプル中のタグの有無を後日調べることによって、その生物の起源または原料を同定することができる。タグの検出は、従来のさまざまな手法により行われる場合があり、一般的には核酸プローブを利用する。Ｈｏｒｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻（２３号）、４８４２４８４９頁、１９９７年）が述べている分枝オリゴヌクレオチドを用いれば、プローブを検出するためのアッセイの感度を首尾良く向上させることができ、サンプル中のＤＮＡわずか５０分子を検出することができる。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、標的遺伝子による生産物の合成を転写後にブロックするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のような方法、およびクエーリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）によって、遺伝子発現を特異的に抑制する目的にも用いられる場合がある。簡単に云えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを用いる従来の遺伝子抑制法は、目的の遺伝子の逆配列に結合が生ずることによって、その後の細胞の諸過程が干渉を受け、その結果、対応する蛋白の合成がブロックされるものである。ＲＮＡｉは転写後レベルでも働き、配列特異的であるが、遙かに効果的に遺伝子発現を抑制する。ＲＮＡｉを用いた遺伝子発現の調節または改変法の例が、国際公開第ＷＯ９９／４９０２９号公報および国際公開第ＷＯ９９／５３０５０号公報に記載されている。これらの方法では、配列関連遺伝子の翻訳が急速に損なわれる配列特異的ＲＮＡ分解処理によって、転写後サイレンシングが惹き起こされる。種々の研究から、２本鎖ＲＮＡが配列特異的遺伝子サイレンシングの仲介因子の役割を果たしている可能性があることがわかっている（例えばＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙおよびＦｉｒｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４巻、２５５−２５８頁、１９９８年を参照）。自己相補的な領域を用いた転写体を産生する遺伝子コストラクトは、遺伝子サイレンシングに特に有効である。この転写後遺伝子サイレンシングのユニークな特徴は、サイレンシングが、それが開始される細胞に限定されないことである。遺伝子サイレンシングの効果は生物個体の他の部分にも波及し、生殖系列を通じて数世代にもわたり継承される場合すらある。
【０１１３】
本発明のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって微生物細胞等の細胞に到達させることが可能な、遺伝子をサイレンシングするコンストラクトおよび／または遺伝子特異的で自己相補的なＲＮＡ配列を生成させる目的で用いられる場合がある。遺伝子コンストラクト中、センス配列およびアンチセンス配列は、イントロン配列は転写産物のプロセッシングのときに除去され、センスおよびアンチセンス配列、並びにスプライスジャンクション配列が結合して２本鎖ＲＮＡを形成するように、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を有する適切なスプライシング配向でイントロン配列を挟む領域に配置される場合がある。代替的には、さまざまな長さのスペーサ配列が、前記コンストラクト中の配列の自己相補的領域を分離するのに用いられる場合がある。遺伝子コンストラクト転写産物のプロセッシングの際、イントロン配列が切り出されて、センス配列およびアンチセンス配列、並びにスプライス接合配列が結合して２本鎖ＲＮＡが形成される。続いて、選択されたリボヌクレアーゼが結合して前記２本鎖ＲＮＡを切断すると、一連の連鎖的事象が開始され、特定のｍＲＮＡ遺伝子配列が破壊され、特定の遺伝子がサイレンシングされる。代替的には、自己相補的なＲＮＡ配列の発現に遺伝子コンストラクトを用いる代わりに、細胞質遺伝子特異的な２本鎖ＲＮＡのセグメントを１つまたはそれ以上の初期化すべき標的領域の細胞の細胞質に送達させ、遺伝子サイレンシング効果を発揮させる。ＲＮＡｉを仲介するには、２本鎖ＲＮＡが標的遺伝子に対して十分な相同性を持つ必要があり、それは少なくとも２５ヌクレオチド分の長さであることが好ましい。前記２本鎖ＲＮＡは、本発明のポリヌクレオチドに特異的に対応することが好ましい。本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング用ＲＮＡ配列は、所望の表現型を有する遺伝子改変生物の作出、並びに遺伝子の特徴付け（ハイスループット配列スクリーニング等）、および無傷の生物個体におけるそれらの機能を研究するのに有用である。
【０１１４】
別の局面において本発明は、ヒト等の哺乳類の疾患を治療するために本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを１種類または２種類以上用いる方法を提供する。
【０１１５】
この局面において前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、一般に、医薬品または免疫原性組成物等の組成物中に存在する。医薬品組成物は１種類または２種類以上のポリペプチドを含む場合があり、その各々は上述の配列（またはその変異体）の１種類または２種類以上と、生理学的に受容可能な担体とを含む場合がある。免疫原性組成物は、上記ポリペプチドの１種類または２種類以上と、前記ポリペプチドが取り込まれるアジュバントまたはリポソームのような免疫賦活剤とを含む場合がある。
【０１１６】
代替的には、本発明の組成物は、ここで述べたポリペプチドが局所的に（ｉｎ  ｓｉｔｕ）生成されるよう、該ポリペプチドの１種類または２種類以上をエンコードするＤＮＡを含む場合がある。かかる組成物では、ＤＮＡは、核酸発現システムと、細菌およびウイルス発現システムとを含む、当業者に知られたさまざまな送達システムのいずれかの中に存在してもよい。適当な核酸発現システムは、患者体内での発現に必要なＤＮＡ配列（適当なプロモーターおよびターミネーターシグナル等）が含む。細菌の送達システムは、ポリペプチドの免疫原性部位をその細胞表面に発現させる細菌（ＢＣＧ等）の投与を含む。好ましい１つの実施態様においては、ウイルス発現システム（例えば、ワクシニアその他のポックスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス）を用いて前記ＤＮＡが導入される場合があり、これには非病原性、または複製能を持つ欠損ウイルスが用いられる場合がある。かかる発現システムにＤＮＡを取り込む技術は、当業者に周知である。また、たとえばＵｌｍｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、１７４５−１７４９頁、１９９３年）、およびＣｏｈｅｎによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、１６９１−１６９２頁、１９９３年）に述べられているように、前記ＤＮＡは「裸」であってもよい。裸のＤＮＡの取込みは、生分解性ビーズの表面にＤＮＡをコーティングすることで増進できる場合があり、効率的に細胞内に輸送される。
【０１１７】
本発明の医薬品組成物には当業者に知られたいかなる担体が用いられていても良いが、担体の種類は投与の形態により異なる。皮下注射のような非経口投与を行う場合は、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ロウまたは緩衝液を含むことが好ましい。経口投与の場合は、上記の担体か、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖および炭酸マグネシウムのような固体担体かのいずれかが用いられる場合がある。本発明の医薬品組成物用の担体として、生分解性ミクロスフィア（例えばポリ乳酸ガラクチド）が用いられる場合もある。好適な生分解性ミクロスフィアには、例えば米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。
【０１１８】
さまざまなアジュバンドのいずれかが、免疫応答を非特異的に増強するために本発明の免疫原性組成物に用いられる場合がある。アジュバンドの多くは、水酸化アルミニウムまたは鉱物油のように抗原を速やかな異化から保護するための物質と、脂質Ａ、百日咳菌または結核菌のような免疫応答の非特異的刺激因子とを含む。適切なアジュバンドは、例えばフロイントの不完全アジュバンドおよびフロイントの完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州、デトロイト）と、およびＭｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州、Ｒａｈｗａｙ）とのように商業的に入手可能である。他の適当なアジュバンドは、ミョウバン、生分解性ミクロスフィア、モノホスホリル脂質ＡおよびＱｕｉｌ  Ａを含む。
【０１１９】
投与の経路および頻度、並びに投与量は個人ごとに異なる。本発明の組成物は通常、注射（例えば皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば吸入）、あるいは経口投与される。１回投与分に含まれる（または１回投与分のＤＮＡによって局所的に産生される）ポリペプチド量は、通常、投与対象の体重１ｋｇ当たり約１ｐｇないし約１００ｍｇであり、典型的には投与対象の体重１ｋｇ当たり約１０ｐｇないし約１ｍｇであり、好ましくは投与対象の体重１ｋｇ当たり約１００ｐｇないし約１μｇである。投与の適切量は患者の体格によっても異なるが、典型的には約０．１ｍｌないし約２ｍｌの範囲である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２０】
以下の実施例は例示のために提供されるものであり、限定のためではない。
【実施例１】
【０１２１】
ラムノスス乳酸桿菌株ＨＮ００１由来のＤＮＡ配列の単離と特徴付け
ラムノスス乳酸桿菌株ＨＮ００１株ＤＮＡライブラリは以下のとおり構築され、スクリーニングされた。
【０１２２】
ＤＮＡは、１００ｍｌ  ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州、デトロイト）入りの１００ｍｌ培地２本を使用し、乳酸桿菌グリセロール保存液１ｍｌを接種材料とし、５００ｍｌ培養フラスコに入れて、３７°Ｃで約１６時間振とう（２２０ｒｐｍ）しながら菌体を培養することにより、大量調製された。
【０１２３】
前記培養物は、３５００ｒｐｍにて１０分間遠心され、菌体をペレット化された。上清は除去され、菌体ペレットは４０ｍｌの新鮮なＭＲＳブロスに再懸濁し、清浄な５００ｍｌ培養フラスコに移された。新鮮なＭＲＳブロス（６０ｍｌ）を添加して全量を１００ｍｌとし、フラスコをさらに２時間、３７°Ｃで振とう（２２０ｒｐｍ）しながらインキュベートした。菌体は、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）によりペレット化し、上清が除去された。菌体ペレットは２０ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄された。
【０１２４】
菌体は２．５ｍｌの緩衝液Ｂ（２５％  ショ糖（ｗ／ｖ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、２０μｇ／ｍｌ  ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ））に再懸濁され、３７°Ｃで４５分間インキュベートされた。各試験管に等容のＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）が添加され、室温で５分間インキュベートされた。２０％ＳＤＳ溶液（１ｍｌ）が添加、混合され、６５°Ｃで９０分間インキュベートされた。２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）ストック溶液から５０μｌが添加され、試験管を６５°Ｃで１５分間インキュベートされた。
【０１２５】
ＤＮＡは、等容のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出された。試験管が３５００ｒｐｍで４０分間遠心された。水相が清浄な滅菌オークリッジ遠心管（３０ｍｌ）に分取された。粗ＤＮＡが等容の冷却イソプロパノールで沈殿され、−２０°Ｃで終夜インキュベートされた。
【０１２６】
５００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁後、ＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅが最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加され、３７°Ｃで３０分間インキュベートされた。２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫのストック溶液から１００μｌを添加した後、さらにインキュベーションを３０分間行った。ＤＮＡは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）およびクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した後、エタノールで沈殿させ、２５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【０１２７】
ＤＮＡは、ＤＮＡ９９６μｌ、１０ｘＲＥＡＣＴ４緩衝液１３８．７５μｌ、水２５２．７５μｌからなる全体積１４８０μｌ中で、濃度０．００４Ｕ／μｇのＳａｕ３Ａ  Ｉを用いて消化された。３７°Ｃ、１時間のインキュベーションを行った後、ＤＮＡは２本の試験管に分注された。３１μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加して消化を停止させ、アガロースゲル分析用に１７μｌのサンプルが採取された。サンプルは１５ｍｌ容のファルコンチューブに入れられ、ショ糖濃度勾配遠心管への重層用に３ｍｌに希釈された。
【０１２８】
ショ糖濃度勾配サイズ分画は、以下のようにして行われた。ＴＥＮ緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて１００ｍｌの５０％ショ糖（ｗ／ｖ）溶液を調製し、滅菌濾過した。５、１０、１５、２０、２５、３０、３５および４０％の各ショ糖希釈液を調製し、ベックマン・ポリアロマー遠心管に注意深く重層し、４°Ｃで終夜保存した。ＴＥＮ緩衝液（４ｍｌ）をこの濃度勾配上に重層し、その上に３ｍｌのＤＮＡ溶液を重層した。ＫｏｎｔｒｏｎＴＳＴ２８−３８ロータを備えたＣｅｎｔｒｉｃｏｎＴ−２０６０遠心機で、前記濃度勾配を２６Ｋ、１８時間、４°Ｃで遠心した。ブレーキを掛けずに減速（約１時間）させた後、前記濃度勾配を取り出し、自動式のＤｅｎｓｉ−Ｆｌｏｗ（Ｈａａｋｅ−Ｂｕｃｈｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して各画分が回収された。各画分の分析にはアガロースゲルが用いられた。最良の画分２組がプールされ、ショ糖含量が１０％未満となるように希釈された。ＴＥＮ緩衝液（４ｍｌ）が添加され、ＤＮＡが２倍容の１００％氷冷エタノールで沈殿され、−２０°Ｃで終夜インキュベートされた。
【０１２９】
ＤＮＡペレットは３００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁され、１／１０容の３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．２と２倍容のエタノールとが添加された後、約６時間、−２０°Ｃで再沈殿された。ＤＮＡは微量遠心機の最高速度で１５分間遠心してペレット化され、７０％エタノールで洗浄され、再度ペレット化され、乾燥され、１０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁された。
【０１３０】
ＤＮＡは、ＢａｍＨＩで消化され、脱リン酸化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ＋と、ＢａｍＨＩで消化され、脱リン酸化されたラムダＺＡＰエキスプレスとに標準的な手順を用いて連結された。ＤＮＡのパッケージングは、製造元のプロトコールに従ってギガパックＩＩＩゴールド・パッケージングエキストラクト（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）を使用して行われた。パッケージ化ライブラリは４°Ｃで保存された。
【０１３１】
前記プライマリーパッケージ化ファージライブラリからの大量切り出しは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'細胞およびＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（ストラタジーン）を用いて行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹブロス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で希釈され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）およびイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上で培養された。インキュベーション後、配列決定用に最適ライブラリが選択される前に、ＰＣＲサイズ決定用に単独コロニーが採取された。
【０１３２】
ＤＮＡミニプレップおよびそれに続く配列決定用に採取したコロニーの大多数は、配列決定に適したインサートを含んでいた。使用するベクターに応じてカナマイシンまたはアンピシリンを添加したＬＢブロス中で陽性のコロニーが培養され、ＤＮＡは高速アルカリ溶菌ミニプレップ法（溶液はキアゲン、Ｖｅｎｌｏ、オランダ、クリアリングプレートはミリポア、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）により精製された。染色体の混入と濃度とについて、配列決定用の鋳型をスクリーニングするために１％のアガロースゲルが用いられた。ダイターミネータ配列決定反応は、Ｂｉｏｍｅｋ２０００ロボット（ベックマン・コールター、カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）および液体取扱用のＨｙｄｒａ９６（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州、Ｓｕｎｎｙｖａｌ）を用いて行われた。ＤＮＡ増幅は、９７００ＰＣＲマシン（パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を用いて、製造元のプロトコールに従って行われた。
【０１３３】
ゲノムＤＮＡ断片の配列は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ部門  プリズム３７７シーケンサーを用いて決定された。ＤＮＡクローンは５'および／または３'末端から配列決定され、配列番号１−１２１として同定された。
【０１３４】
本実施例は、配列が如何に得られたかを示すのみならず、安定的な遺伝のための永久マーキングを目的として、細菌（大腸菌）が本発明のいかなる所望のＤＮＡ断片によっても安定に形質転換され得ることをも示している。
【０１３５】
決定されたＤＮＡ配列を公開データベースの既知配列と比較し、アライメントを行った。具体的には、配列番号１−１２１として同定されたポリヌクレオチドを、以下のランニングパラメータに設定したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を利用し、２００２年８月１２日時点のＥＭＢＬデータベース収載のポリヌクレオチドと比較した。Ｕｎｉｘ（登録商標）ランニングコマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｄ  ｅｍｂｌｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ  ０  −Ｅ  ０  −ｒ  １  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ  −ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ。信頼性の高いコンセンサス配列を構築するため、重複配列の多重アライメントを用いた。また、配列番号１２２−２５３として同定されたポリペプチドを、以下のランニングパラメータに設定したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を利用し、２００２年８月１２日時点のＳｗｉｓｓＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載のポリペプチドと比較した。Ｕｎｉｘ（登録商標）ランニングコマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｄ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｔｒｅｍｂｌｅｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ  ０  −Ｅ  ０  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ  −ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ。
【０１３６】
ＢＬＡＳＴＮポリヌクレオチド解析
上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用い、配列番号１−１８、２０−５０、５２−６２、６４−６９、７１−８３、８５−９３および９５−１２２のポリヌクレオチド配列を上述のように決定したところ、ＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は５０％未満であった。配列番号９４の配列は、上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて上述のように決定したところ、ＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は７５％未満であった。最後に配列番号１９のポリヌクレオチド配列、は上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用い、上述のように決定したところ、ＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は９８％未満であった。
【０１３７】
ＢＬＡＳＴＰアミノ酸解析
上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰを用い、配列番号１２４、１３３、１３４、１３７−１３９、１４１、１４８、１５０−１５６、１５９、１６２、１６４−１６８、１７０−１７２、１７４、１７５、１７８、１８４、１８７、１８８、１９０、１９４、１９５、１９８−２００、２０２、２０３、２０５−２０８、２１２−２１４、２１６、２２１−２２４、２２７、２２９、２３４、２３５、２３７、２４０、２４２−２４５、２４９および２５２のアミノ酸配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は５０％未満であった。上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰを用い、配列番号１２３、１２５−１２９、１３１、１４４、１４９、１５８、１６０、１６１、１６３、１６９、１７３、１７６、１７９−１８１、１８３、１８５、１８６、１９１−１９３、１９７、２０１、２０９、２１１、２１５、２１７、２１８、２２５、２２６、２２８、２３０−２３３、２３８、２３９、２４７、２４８、２５０、２５１、２５３、２５４および２５６のアミノ酸配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は７５％未満であった。上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰを用い、配列番号１３２、１３５、１４２、１４５−１４７、１５７、１８２、２０４、２１９、２４１、２４６および２５５のアミノ酸配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は９０％未満であった。さらに、上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰを用い、配列番号１４０および２３６のアミノ酸配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は９８％未満であった。
【０１３８】
ＢＬＡＳＴＸポリヌクレオチド解析
上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを用い、配列番号１−１０、１２−１８、２０−３０、３２−４２、４４−５０、５２、５３、５５、５８、５９、６１、６２、６４、６６−６９、７１−７７、７９−８３、８５−８８、９０、９２、９５−１０５、１０７−１０９、１１１−１１４、１１６−１１９、１２１および１２２のｃＤＮＡ配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は５０％未満であった。上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを用い、配列番号１１、１９、４３、５４、５７、６０、６５、７０、７８、８９、９１、９３、１０６、１１０、１１５および１２０のｃＤＮＡ配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は７５％未満であった。上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを用い、配列番号３１、５１、５６および６３のｃＤＮＡ配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は９０％未満であった。さらに、上述のようにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを用い、配列番号９４のｃＤＮＡ配列を上述のように決定したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＴｒＥＭＢＬデータベース収載の配列に対する同一性は９８％未満であった。
【０１３９】
既知の配列との類似性に基づき、配列番号１−１２１として同定された本発明の単離ポリヌクレオチドは、前掲の表１に示すポリペプチドに類似性を有するポリペプチドをエンコードするものと推定される。配列番号１−１２１のＤＮＡ配列にエンコードされるアミノ酸は、各々配列番号１２２−２５３に掲載されている。
【０１４０】
配列番号１−１２１に現れた配列のいくつかは、「完全長」でオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦｓ）を含むことがわかった。これらの完全長配列と、これらの配列内に含まれるＯＲＦｓの位置（ヌクレオチド位置による）と、対応するアミノ酸配列とを、下記の表２に示す。
【０１４１】
2006500951.tif 000099
2006500951.tif 000100
2006500951.tif 000101
【０１４２】
配列番号１０６、１０７、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８および１１９は、各々配列番号５、１２、１６、４４、６５、７１、７２、７８、７９、８１、８３、１０３および２１の完全長配列であり、配列番号１０８は配列番号１５および４２の完全長配列である。配列番号２５３は、配列番号９９の完全長配列である。
【０１４３】
配列番号１−２５３を添付の配列リストに示す。添付の配列リストで用いられる、記号「ｎ」を含むヌクレオチド配列のコードは、ＷＩＰＯ規格ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１に準拠する。
【０１４４】
ここに言及した全ての参考文献は、特許文献と非特許文献とを含めて、引用によりそれらの全体が包含されるものとする。
【０１４５】
以上の明細書において、本発明は好ましい実施態様との関連において説明され、例示の目的で詳細の多くが提示されてきたが、本発明には更なる実施態様の余地があり、ここに説明した詳細の一部が本発明の趣旨から逸脱しない範囲で大幅に変更される場合があることは、当業者にとって自明である。
【配列表】
2006500951000001.app
【国際調査報告】
2006500951.tif 000102
2006500951.tif 000103
2006500951.tif 000104
2006500951.tif 000105
2006500951.tif 000106