(57)【要約】本発明は細胞内単一ドメイン免疫グロブリンに関し、また細胞内環境で標的に結合する免疫グロブリン単一ドメインの能力を測定する方法であって、ａ）第１の分子および第２の分子を提供するステップであって、前記第１の分子および前記第２の分子の安定した相互作用がシグナルの生成を導くステップと；ｂ）前記第１の分子に結合する細胞内単一免疫グロブリンドメインを提供するステップであって、前記単一免疫グロブリンドメインが相補的な免疫グロブリンドメインから遊離しているステップと；ｃ）前記第２の分子に結合する細胞内標的を提供するステップであって、前記免疫グロブリンドメインと前記標的との結合が、前記第１の分子および前記第２の分子の安定した相互作用を導き、前記シグナルを生成するステップと；ｄ）前記シグナルをモニターすることによって、前記免疫グロブリンドメインと前記標的との間の細胞内相互作用を評価するステップとを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン単一ドメインが細胞内環境で標的に結合する能力を測定する方法であって、
ａ）第１の分子および第２の分子を提供するステップであって、前記第１の分子と前記第２の分子との安定した相互作用がシグナルの生成を導くステップと、
ｂ）前記第１の分子に結合する細胞内単一免疫グロブリンドメインを提供するステップであって、前記単一免疫グロブリンドメインが相補的な免疫グロブリンドメインから遊離しているステップと、
ｃ）前記第２の分子に結合する細胞内標的を提供するステップであって、前記免疫グロブリンドメインと前記標的との結合が、前記第１の分子と前記第２の分子との安定した相互作用を導き、前記シグナルを生成するステップと、
ｄ）前記シグナルをモニターすることによって、前記免疫グロブリンドメインと前記標的との間の細胞内相互作用を評価するするステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の分子および／または前記第２の分子がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の分子と前記第２の分子とが結合して、活性レポーター分子を形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性レポーター分子が転写因子、酵素、および生物発光性分子からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性レポーター分子が酵素であり、前記方法が前記酵素の基質存在下で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の分子および前記第２の分子が前記活性レポーター分子のドメインである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の分子がＶＰ１６の活性化ドメインであり、前記第２の分子がＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記シグナルが、光学特性の変化およびレポーター遺伝子の活性化からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナルが細胞の選別を可能にするものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン単一ドメインが抗体単一ドメインである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体単一ドメインがＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫グロブリンをコードする核酸を細胞内で発現することによって、前記免疫グロブリン単一ドメインを提供する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンをコードする核酸が、免疫グロブリンをコードする核酸のライブラリーから得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ライブラリーが、１レパートリーの免疫グロブリンをコードするライブラリーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ライブラリーが、抗原に曝露された生物から単離された核酸から構築されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ｅ）シグナルを生じる免疫グロブリン単一ドメインを単離するステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ｆ）選択された免疫グロブリン単一ドメインを機能的細胞内アッセイに供するステップ、
をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン単一ドメインおよび前記標的の一方または両方が、前記第１の分子または第２の分子と共に核酸構築物の形態で提供され、前記核酸構築物が転写されることで、前記第１の分子または前記第２の分子と共に前記免疫グロブリンおよび／または前記標的が産生される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法における使用に適した免疫グロブリン単一ドメインを調製する方法であって、
（ａ）選択系で１レパートリーの免疫グロブリンドメイン遺伝子を発現して、所望の標的に特異的な免疫グロブリンドメインをコードする遺伝子を単離するステップと、
（ｂ）前記免疫グロブリンドメインおよび第１の分子を含む融合ポリペプチドを生成するために、単離された遺伝子を、前記第１の分子をコードする核酸と作動可能に結合させるステップであって、ここで前記第１の分子は第２の分子との安定した相互作用によりシグナルを生成するものである、ステップと、
を含む方法。
【請求項２０】
第１の分子と作動可能に結合した免疫グロブリン単一ドメインのライブラリーであって、前記第１の分子と第２の分子との安定した相互作用がシグナルの生成を導くライブラリー。
【請求項２１】
前記第１の分子および／または前記第２の分子がポリペプチドである、請求項２０に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記第１の分子と前記第２の分子とが結合して活性レポーター分子を形成する、請求項２０または２１に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記活性レポーター分子が転写因子、酵素、および生物発光性分子からなる群から選択される、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記活性レポーター分子が酵素であり、方法が前記酵素の基質存在下で行われる、請求項２３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
前記第１の分子および前記第２の分子が活性レポーター分子のドメインである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２６】
前記第１の分子がＶＰ１６の活性化ドメインであり、前記第２の分子がＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリン単一ドメインが抗体単一ドメインである、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２８】
前記抗体単一ドメインがＶＨドメインである、請求項２７に記載のライブラリー。
【請求項２９】
細胞内環境で標的に結合する細胞内単一ドメイン免疫グロブリンを調製する方法であって、
ａ）第１の分子および第２の分子を提供するステップであって、前記第１の分子と前記第２の分子との安定した相互作用がシグナルの生成を導くステップと、
ｂ）前記第１の分子に結合する細胞内免疫グロブリンを提供するステップと、
ｃ）前記第２の分子に結合する細胞内標的を提供するステップであって、前記免疫グロブリンと前記標的との結合が、前記第１の分子と前記第２の分子との安定した相互作用を導き、前記シグナルを生成するステップと、
ｄ）前記シグナルをモニターすることによって、前記免疫グロブリンと前記標的との間の細胞内相互作用を評価するするステップと、
ｅ）前記標的と相互作用する１つまたは複数の免疫グロブリンを選択して、それから１つまたは複数の単一ドメイン免疫グロブリンを単離するステップと、
を含む方法。
【請求項３０】
単一ドメイン免疫グロブリンのフレームワーク領域を突然変異させて、細胞内結合および／または安定性を促進させるステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞内単一ドメイン免疫グロブリン。
【請求項３２】
細胞内単一ドメイン抗体である、請求項３１に記載の細胞内単一ドメイン免疫グロブリン。
【請求項３３】
ドメイン内ジスルフィド結合を欠失している、請求項３２に記載の細胞内単一ドメイン抗体。
【請求項３４】
前記免疫グロブリン単一ドメインが細胞内ＶＨコンセンサス配列に適合したＶＨドメインである、請求項１〜１９および３０のいずれか１項に記載の方法、あるいは請求項２０〜２８のいずれか１項に記載のライブラリー、あるいは請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の免疫グロブリン。
【請求項３５】
前記ＶＨドメインが、図５ａに示され、かつ配列番号３として表されたコンセンサス配列と少なくとも８５％の相同性を示す、請求項３４に記載の発明。
【請求項３６】
前記免疫グロブリン単一ドメインが細胞内ＶＬコンセンサス配列に適合したＶＬドメインである、請求項１〜１９および３０のいずれか１項に記載の方法、あるいは請求項２０〜２８のいずれか１項に記載のライブラリー、あるいは請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の免疫グロブリン。
【請求項３７】
前記ＶＬドメインが、図５ａに示され、かつ配列番号４として表されたコンセンサス配列と少なくとも８５％の相同性を示す、請求項３６に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内単一ドメイン抗体、細胞内単一ドメイン抗体ライブラリー、ならびにそのような抗体および抗体ライブラリーを作製して、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内抗体またはイントラボディー(ｉｎｔｒａｂｏｄｙ)は、高等生物の細胞内で抗原認識機能を有することが実証されている（Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＢｉｏｃｃａ，Ｓ．（１９９７年）、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、Ｌａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇに総説）。この相互作用は、細胞性タンパク質の機能に影響を及ぼすことができ、細胞質、核、または分泌経路において、それらの機能を阻害することに成功している。この有効性は、植物バイオテクノロジーにおけるウイルス耐性で実証され（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．ら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３６６巻、４６９〜４７２ページ）、さらに、ＨＩＶウイルスタンパク質に結合する細胞内抗体の適用（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５年）、ＥＭＢＯ  Ｊ、第１４巻、１５４２〜５１ページ；Ｄｕａｎ，Ｌ．およびＰｏｍｅｒａｎｔｚ，Ｒ．Ｊ．（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２２巻、５４３３〜８ページ；Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９５年）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、第１巻、第６６７〜７３ページ；Ｌｅｖｙ−Ｍｉｎｔｚ，Ｐ．ら（１９９６年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７０巻、８８２１〜８８３２ページ）、および癌遺伝子産物に結合する細胞内抗体の適用（Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．、Ｐｉｅｒａｎｄｒｅｉ−Ａｍａｌｄｉ，Ｐ．、およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．（１９９３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、第１９７巻、、４２２〜７ページ；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．、Ｐｉｅｒａｎｄｒｅｉ−Ａｍａｌｄｉ，Ｐ．，Ｃａｍｐｉｏｎｉ，Ｎ．、およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．（１９９４年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ  Ｙ）、第１２巻、３９６〜９ページ；Ｃｏｃｈｅｔ，Ｏ．ら（１９９８年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第５８巻、１１７０〜６ページ）がいくつか報告されている。後者は、腫瘍細胞において染色体転座の後に癌遺伝子の強制的な発現が起こることが多いので、重要な領域である（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３７２巻、１４３〜１４９ページ）。これらのタンパク質は、したがって、細胞内抗体による結合によって不活性化できるかもしれない重要な細胞内治療標的である（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．（１９９８年）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ、第３３８巻、１９２〜１９４ページ）。最後に、全ゲノムシーケンシングにおける国際的な活動によって、それについて何も知られていないタンパク質をコードする無数の潜在的遺伝子配列が生み出されるだろう。
【０００３】
機能ゲノミクスはこれら大量のタンパク質の機能を確かめるアプローチであるが、細胞内抗体の使用は、タンパク質機能をノックアウトするのに細胞内で直接抗体を結合させるという、概念的に単純なアプローチとして、この活動における重要なツールとなることが約束されている。
【０００４】
本発明者らは、細胞内環境において安定であり、正しくフォールディングされ、かつ、その環境内でそれらのリガンドに対する選択的結合に関して機能的である免疫グロブリンの選択を行う技法を最近記載した。これは、国際特許出願第ＷＯ００／５４０５７号に記載されている。このアプローチでは、抗体−抗原相互作用法は、ベイト（ｂａｉｔ）として、ＤＮＡ結合ドメインに連結された抗原を用い、プレイ（ｐｒｅｙ）として、転写活性化ドメインに連結されたｓｃＦｖを用いる。これら２つの特異的相互作用によって、選択可能なレポーター遺伝子の転写活性化が促進される。最初に行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合ステップでは、１レパートリーの免疫グロブリン分子に対する抗原の結合がアッセイされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで、それらのリガンドに結合すると判明した免疫グロブリンは、次に、細胞内環境、通常は細胞質環境で、選択された抗原に結合する能力についてアッセイされる。
【０００５】
本発明者らは、同時係属の国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３５１２号において、コンセンサス構造に基づき、任意選択で、第ＷＯ００／５４０５７号記載の細胞内捕捉技法を用いて、細胞内免疫グロブリンを生成する方法を記載する。
【０００６】
抗体の抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ；これはＶκまたはＶλのいずれかでありうる）の２つの別々の領域を含む。抗原結合部位そのものは、ＶＨドメインから３本（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）、そして、ＶＬドメインから３本（Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３）の６本のポリペプチドループによって形成される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＶ遺伝子の多様な一次レパートリー（ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）は、遺伝子セグメントの組合せによる再編成（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）によって生成される。ＶＨ遺伝子は、ＶＨ、Ｄ、およびＪＨの３個の遺伝子セグメントの組み換えによって生成される。ヒトには、ハプロタイプに応じて、およそ５１個の機能的なＶＨセグメント（ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、第１６巻、２３７ページ）と、２５個の機能的なＤセグメント（Ｃｏｒｂｅｔｔら（１９９７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２６８巻、６９ページ）と、６個の機能的なＪＨセグメント（Ｒａｖｅｔｃｈら（１９８１年）、Ｃｅｌｌ、第２７巻、５８３ページ）とがある。ＶＨセグメントは、ＶＨドメインにおける第１および第２抗原結合ループ（Ｈ１およびＨ２）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、ＶＨドメインの第３の抗原結合ループ（Ｈ３）は、ＶＨ、Ｄ、およびＪＨセグメントが組み合わされて形成される。ＶＬ遺伝子は、ＶＬおよびＪＬの２つの遺伝子セグメントのみの組み換えによって生成される。ヒトには、ハプロタイプに応じて、およそ４０個の機能的なＶＨセグメント（ＳｃｈａｂｌｅおよびＺａｃｈａｕ（１９９３年）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、第３７４巻、１００１ページ）と、３１個の機能的なＶＬセグメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２６４巻、２２０ページ；Ｋａｗａｓａｋｉら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、第７巻、２５０ページ）と、５個の機能的なＪκセグメント（Ｈｉｅｔｅｒら（１９８２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５７巻、１５１６ページ）と、４個の機能的なＪλセグメント（ＶａｓｉｃｅｋおよびＬｅｄｅｒ（１９９０年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、第１７２巻、６０９ページ）とがある。ＶＬセグメントは、ＶＬドメインにおける第１および第２抗原結合ループ（Ｌ１およびＬ２）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、ＶＬドメインの第３の抗原結合ループ（Ｌ３）は、ＶＬおよびＪＬセグメントが組み合わされて形成される。この一次レパートリーから選択された抗体は、ほとんどすべての抗原に少なくとも中程度の親和性で結合するのに十分な多様性を有すると考えられている。高親和性抗体は、再編成された遺伝子の「親和性成熟」によって生成されるが、親和性成熟では、点突然変異が生成され、結合の改善に基づいて、免疫系によって選択される。
【０００７】
抗体の構造および配列の分析によって、６本の抗原結合ループのうちの５本（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は、限られた数の主鎖コンフォメーション、すなわち正準構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有することが示された（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、９０１ページ；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３４２巻、８７７ページ）。主鎖コンフォメーションは、（ｉ）抗原結合ループの長さと、（ｉｉ）抗原結合ループおよび抗体フレームワーク中のある特定の主要位置における特定の残基または残基タイプとによって決定される。ループ長および主要残基の分析によって、ヒト抗体配列の大部分によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の主鎖コンフォメーションが予測できるようになった（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９９２年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２２７巻、７９９ページ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第１４巻、４６２８ページ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２６４巻、２２０ページ）。Ｈ３領域は、配列、長さ、および構造（Ｄセグメントを用いることによって）においてはるかに多様であるが、またループ長が短いことにより、長さ、ならびにループおよび抗体フレームワーク中の主要位置における特定の残基または残基タイプに応じて、限られた数の主鎖コンフォメーションを形成する（Ｍａｒｔｉｎら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２６３巻、８００ページ；Ｓｈｉｒａｉら（１９９６年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３９９巻、１ページ）。
【０００８】
単鎖可変フラグメントは、ｓｃＦｖとしても知られ、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）可変ドメイン、ならびに柔軟なリンカーペプチドで構成される単一ペプチド鎖を形成するが、この単鎖可変フラグメントがＩＣＡｂに最適な形態であると考えられている。これは、遊離型のＨ鎖およびＬ鎖の正常な結合が細胞において小胞体中で起こり、細胞質では起こらないだろうからである。それに対して、ＳｃＦｖは単一ポリペプチドであり、ＶＨおよびＶＬが内在的な親和性で結合し、鎖間ジスルフィド結合を必要としない。実際、本発明者らが以前に記載した技法（国際公開第ＷＯ００／５４０５７号を参照）に従って選択を行った際、このフォーマットがｉｎ  ｖｉｖｏで標的タンパク質に対して有効であることが実証された。しかし、ｓｃＦｖの不溶性、不安定性、および不正確なタンパク質フォールディングのため、還元性の環境では、比較的わずかなｓｃＦｖしかＩＣＡｂとして有効に機能しない。上に記載したアプローチは、この限界を克服するものであり、ｓｃＦｖの内在的ｉｎ  ｖｉｖｏフォールディングと、生物学的機能とに基づいた直接的スクリーニング（細胞内抗体捕獲、ＩＡＣ、国際公開第ＷＯ００／５４０５７号）は、多様なセットの抗原を認識するＩＣＡｂｓを選択できることが実証された。さらに、ＩＡＣ技法は、細胞機能において特に有利な免疫グロブリンＶ領域残基の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を定義するのに有用である（第ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３５１２号）。
【０００９】
ｓｃＦｖをＩＣＡｂの供給源として用いることの限界の１つは、重鎖および軽鎖の組合せ効果（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）であり、それによって、抗原特異的なＩＣＡｂの一次スクリーニングに、多様性が必要となることである。通常のスクリーニングプロトコールでは、少数（およそ１０〜５０）のＩＣＡｂの単離を促進するのに、１０９を越えた多様性のファージ抗体ライブラリーが必要である。さらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの結合は弱く、ｓｃＦｖの解離型が、結合型と比較して、優性となりうる。解離したｓｃＦｖは、細胞内におけるタンパク質分解および凝集の標的となる。ＶＨ−ＶＬヘテロ二量体の別の形態には、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）があるが、ジスルフィド結合は細胞内で維持されないので、これはＩＣＡｂのオプションにならない。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来の使用のために、抗体フラグメントの大きさを、さらに縮小しようとする努力がいくつかなされている。免疫グロブリンに基づいた認識ユニットのうち、これまでに使用されている最小のものは、単一可変ドメインである（Ｗａｒｄら；Ｗｉｎｔｅｒ  ＩＩ  ＲＥＦ）。これらのいわゆるドメイン抗体（Ｄａｂ）は、細菌で発現され、機能的なＶＨドメインは、免疫処置したマウスから作製されたライブラリーから単離される。
【００１１】
最近、ラクダおよび近縁種で発見された、軽鎖を含まないいくつかの天然のＶＨフラグメントおよび重鎖抗体は、有効な結合活性および特異性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで有することが実証された（ＲＥＦに総説）。さらに、単一ドメインライブラリーは、ヒトＶＨドメインＲＥＦまたはマウスＶＨドメインＲＥＦのＣＤＲ３領域をランダム化することによって構築されたが、これらは、特に、フレームワークが細胞内での使用に適していないかもしれないので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適用に限定されているものである。
【発明の開示】
【００１２】
本明細書において、本発明者らは、ｓｃＦｖのＩＡＣから得られたコンセンサスＶＨフレームワークに基づいた細胞内ＶＨドメイン抗体（ＩＤａｂ）が、哺乳類細胞中の抗原に対して、極めて効果的であることを示す。実際上の重要な部分は、高親和性の抗原特異的抗体の、酵母における直接選択を可能にするのに十分な多様性を有するＩＤａｂライブラリー（コンセンサス足場フレームワークに基づいてランダム化されたＣＤＲを用いた）の作製にある。これらのライブラリーは、異なった抗原、すなわち、癌遺伝子ＲＡＳおよびｃＡＭＰ／カルシウム依存性転写因子ＡＴＦ−２を用いてＩＤａｂを単離するのに適用され、成功を収めている。抗ＲＡＳ  ＩＤａｂは、突然変異体ＲＡＳで誘発されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換を阻害できる。
【００１３】
すなわち、本発明に従って、免疫グロブリン単一ドメインが細胞内環境で標的に結合する能力を測定する方法であって、
ａ）第１の分子と第２の分子との安定した相互作用がシグナルの生成を導く上記第１の分子および上記第２の分子を提供するステップと、
ｂ）上記第１の分子に結合する細胞内免疫グロブリン単一ドメインを提供するステップと、
ｃ）上記第２の分子に結合する細胞内標的を提供するステップであって、上記免疫グロブリンと上記標的との結合が、上記第１の分子と上記第２の分子との安定した相互作用を導き、上記シグナルを生成するステップと、
ｄ）上記シグナルをモニターすることによって、上記免疫グロブリン単一ドメインと上記標的との間の細胞内相互作用を評価するするステップと、
を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明の方法の基礎となるものは、免疫グロブリン単一ドメインが細胞内環境で標的と結合することによって、第１の分子と、第２の分子との安定した相互作用がもたらされる際に、シグナルが生成することである。したがって、第１の分子および第２の分子は、相互作用することによってシグナルを生成できる、シグナル生成物質の２つの部分である。「安定した相互作用」とは、第１の分子と、第２の分子との間の相互作用を介してシグナルの生成を可能にする相互作用である。必要とされる安定性の程度は、シグナルを生成するのに必要であるそのような相互作用の程度に依存するだろう。例えば、シグナルが、転写因子の再構成、および転写誘導などの生物学的事象である場合、このような安定性は、比較的高いものである必要があろう。しかし、このシグナルがＦＲＥＴ相互作用などのシグナルである場合、このような安定性は、比較的低いものを必要とするのみである。本明細書において、「シグナル」は、いかなる検出可能な事象も指す。これには、例えばＦＲＥＴシグナルまたはルシフェラーゼ遺伝子の誘導など、発光もしくは蛍光シグナル、または、照射の発生もしくは吸収の強度もしくは周波数のモジュレーションを含む他のシグナルも含まれうる。以下に、これらおよび他のシグナルについてさらに記載する。
【００１５】
免疫グロブリン単一ドメインは、有用な単一ドメイン抗体である。本発明による抗体は、本明細書において、細胞内ドメイン抗体、すなわちＩＤＡｂを指し、好ましくは１つのＶＨドメインまたはＶＬドメインを含み、その構造が抗原の細胞内結合に適しており、特異性と、正しくフォールディングされた構造とを、細胞内環境でｉｎ  ｖｉｖｏで維持できるものである。
【００１６】
ｓｃＦｖと比較して、単一ドメイン抗体フラグメントが細胞内での使用に有利である点としては、単に大きさがより小さいことだけではなく、安定性がより高いこともある。さらに、単一ドメインのサイズがより小さいこと、そしてＶＨ−ＶＬ相互作用を考慮に入れる必要がないことは、スクリーニングの全体的な複雑さがｓｃＦｖより低いことを意味する。
【００１７】
「細胞内」とは、細胞の内部を意味し、本発明は、細胞内で選択的に標的に結合する免疫グロブリン単一ドメインの選択を対象とする。この細胞は、いかなる原核または真核の細胞でもよく、細菌細胞、酵母細胞、および高等真核生物細胞からなる群から選択されることが好ましい。最も好ましいのは、酵母細胞および哺乳類細胞である。通常、本発明のアッセイは、細胞の細胞質または核で実行され、免疫グロブリンが細胞質中または核質中で効果的にフォールディングして標的に結合する能力を測定する。したがって、本明細書において使用する「細胞内」免疫グロブリンおよび標的は、細胞内、好ましくは細胞質に存在するか、またはそこで機能できる免疫グロブリンおよび標的である。ゴルジまたはＥＲに分泌された抗体は、本明細書で定義する細胞内抗体ではない。
【００１８】
別の実施形態では、本発明の方法は、細胞内環境に類似した、またはこれを模擬した条件下で行ってもよい。したがって、「細胞内」は、細胞の内部ではなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境を指すこともある。例えば、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムおよび／または翻訳システムで行ってもよく、これらは、市販されているものでも、または天然のシステムに由来するものでもよい。この環境は、実際の細胞内条件で標的に選択的に結合できる免疫グロブリンの忠実な選択が可能となるように、細胞質中に存在する還元状態を再現するように調整されていることが好ましい。
【００１９】
本発明の方法は、免疫グロブリン単一ドメインの機能アッセイをさらに含むと有利である。したがって、この方法は、細胞内環境でシグナルを生成する免疫グロブリンを選択して、それらの免疫グロブリンを細胞内機能アッセイに供するステップをさらに含むことが好ましい。例えば、このアッセイが、突然変異体Ｒａｓ癌遺伝子の遺伝子産物など、腫瘍形成に関連した標的に結合する免疫グロブリンの選択を意図する場合、形質転換細胞の産生におけるいかなるモジュレーション活性を測定するためにでも、細胞形質転換アッセイで免疫グロブリンが試験されうる。
【００２０】
第１の分子および第２の分子は、シグナルを生成するという要件を満たす分子ならいかなる分子でもよい。それらは、必ずしもポリペプチドでなければならないわけではない。例えばそれらは、蛍光色素か、または照射を発生または吸収できる他の化学基であってもよい。しかし、好ましい態様では、本発明の第１の分子および第２の分子はポリペプチドである。
【００２１】
本発明によるポリペプチドは、結合することによってそれ自体でシグナルを生成できる活性レポーター分子を形成する。したがって、これらのポリペプチドは、そのようなレポーター分子のドメインであることが好ましい。
【００２２】
例えば、このポリペプチドは、ＧＦＰなどの蛍光ポリペプチドのドメインであってもよく、または、活性であるときにはレポーター遺伝子からの転写をアップレギュレートする転写因子のドメインでもよい。このレポーター遺伝子は、それ自体がＧＦＰ、または、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、検出可能なエンドポイントを有する酵素反応を触媒できる酵素、または必要な栄養素の提供などによって細胞増殖を調節できる分子など、他の検出可能な分子をコードするものでもよい。
【００２３】
本発明による免疫グロブリンと標的との結合は、第１の分子と、第２の分子との間の安定した連結を提供し、この連結によって、これらの分子の安定した相互作用をもたらす。「安定した相互作用」は、第１の分子および第２の分子が、使用するために選択されたシグナル伝達法に応じた検出可能な結果をもたらすために、機能的協同作用を行うのを可能にする相互作用と定義してもよい。第１の分子と、第２の分子との間の安定した相互作用は、免疫グロブリンと標的との結合を介してこれらの分子が集合させられない限り起こらないものが有利である。
【００２４】
「免疫グロブリン」および「標的」という用語は、以下でさらに定義するように、それらが当技術分野で与えられている通常の意味で用いられる。「免疫グロブリン」という用語は、特に標的に結合できるいかなる部分をも指し、特に、Ｔ細胞受容体および抗体を含めた免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを指す。「免疫グロブリン」には、標的分子に結合できる天然免疫グロブリンのいかなるフラグメント、例えばＦｖおよびｓｃＦｖなどの抗体フラグメントも含まれる。「標的」という用語には、抗原が含まれ、この抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または、他の免疫グロブリンの標的でありうる。
【００２５】
免疫グロブリンは抗体であることが好ましく、また、標的は抗原であることが好ましい。「抗体」単一ドメインは、単一ＶＨドメインまたは単一ＶＬドメインである。「抗体」単一ドメインは、単一ＶＨドメインであることが好ましい。
【００２６】
当技術分野で公知なように、単一ドメイン抗体は、ＶＨ−ＶＬインターフェースとして特定の残基を突然変異させて、ＶＨ（またはＶＬ）ドメインの「粘着性」を減少させ、それによって非特異的結合の傾向を低下させることによって、「ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ）」ものでもよい。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第２５９巻、９５７〜９６９ページを参照のこと。本発明者らは、細胞内単一ドメイン抗体を「ラクダ化する」ことによって、その抗体の細胞内で結合する能力が低減または除去されるということを決定している。したがって、本発明による免疫グロブリンは、ラクダ化されていないものが有利である。
【００２７】
好ましい実施形態では、免疫グロブリン単一ドメインおよび標的は、細胞内アッセイが行われる細胞の中で核酸を発現することによって提供される。シグナルを生成する分子を含めた免疫グロブリンおよび標的の構築物は、核酸から転写され、そして／または、翻訳され、例えば細胞質に局在化され、そこで細胞内アッセイが行われうる。他の有利な実施形態では、細胞内免疫グロブリンを、核に（例えば核局在化シグナルとの融合によって）、またはＥＲ保持シグナルを用いてＥＲに、または他の位置になど、いかなる所望の亜細胞コンパートメントに局在化してもよい。
【００２８】
免疫グロブリンをコードする核酸は、多数のそのような分子をコードするライブラリーから得てもよい。例えば、免疫グロブリン分子のファージディスプレイライブラリーが公知であり、この方法で用いてもよい。このライブラリーは、１レパートリーの免疫グロブリンドメインをコードするものが有利である。１「レパートリー」とは、結合特異性の多様性を提供するために、１個または複数個のテンプレート分子を核酸レベルで、ランダム、セミランダム、または部位特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）に変異させることによって生成される１セットの分子を指す。レパートリーを生み出す方法は、当技術分野で詳細に特徴付けされている。
【００２９】
さらに、ライブラリーは、標的、例えば抗原に曝露された生物から単離された核酸から構築してもよい。抗原への曝露によって、通常、それぞれが抗原に結合できるが、エピトープ特異性または他の特徴において他とは異なりうる免疫グロブリンのポリクローナル集団の産生が引き起こされるだろう。生物から免疫グロブリン遺伝子をクローニングすることによって、細胞内環境での使用に適した免疫グロブリンを単離するために、本発明の方法を用いて、免疫グロブリンのポリクローナル集団の選択を行ってもよい。
【００３０】
本発明による方法は、上述した方法で生成されたシグナルに基づいて、細胞内結合活性を示すことが可能な免疫グロブリンドメイン、および／またはそのような免疫グロブリンをコードする核酸の単離を可能にするものである。したがって、本発明の方法で使用される免疫グロブリンドメインおよび標的の一方または両方を、第１の分子または第２の分子と共に、転写されて上記免疫グロブリンドメインおよび／または標的を上記第１の分子または第２の分子と共に生成する核酸構築物の形態で提供する。核酸構築物は、本発明の方法が実行される細胞内で、免疫グロブリンドメインをコードする核酸の発現を指令できる発現ベクターであってもよい。
【００３１】
本発明は、細胞内で標的に結合する免疫グロブリンドメイン、および／または、それらをコードする核酸の単離を可能にするものである。本発明の方法でスクリーニングされる免疫グロブリンドメインは、標的特異性に関して事前に選択されたものが有利である。したがって、本発明は、本発明による手法における使用に適した免疫グロブリン単一ドメインを調製する方法であって、
ａ）選択系で１レパートリーの免疫グロブリン単一ドメイン遺伝子を発現して、所望の標的に特異的な免疫グロブリンドメインをコードする遺伝子を単離するステップと、
ｂ）上記免疫グロブリンドメインおよび第１の分子を含む融合ポリペプチドを生成するために、単離された遺伝子を、上記第１の分子をコードする核酸と作動可能に結合させるステップであって、ここで第１の分子は、第２の分子との安定した相互作用によりシグナルを生成するものである、ステップと、
を含む方法を提供する。
【００３２】
上記で使用した「作動可能に結合させる」とは、免疫グロブリンドメインと、シグナルを生成する分子とを含む融合タンパク質が生成されるように、コード配列を融合または並置させることを指す。通常、標的に対する選択を行うことによって、標的特異性を共有する抗体の、さらに小さなレパートリーが生じるであろう。そのような免疫グロブリンをコードする転写ユニットは、シグナル生成分子に融合されており、細胞内で機能できる免疫グロブリンドメインを選択するために、本発明によるアッセイで用いられる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、各単一ドメインが上述のレポーターシステムの第１の分子に作動可能に結合した免疫グロブリン単一ドメインのライブラリーを提供する。このライブラリーは、抗体単一ドメインのライブラリーであることが好ましく、この抗体単一ドメインはＶＨドメインであると有利である。
【００３４】
本発明者らは、さらに、マルチドメイン細胞内抗体から得られた単一ドメインが、細胞内単一ドメイン免疫グロブリンとして、極めて効率的に機能するという結果を得た。したがって、本発明は、細胞内環境で標的に結合する細胞内単一ドメイン免疫グロブリンを調製する方法であって、
ａ）第１の分子と第２の分子との安定した相互作用がシグナルの生成を導く上記第１の分子および上記第２の分子を提供するステップと、
ｂ）上記第１の分子に結合する細胞内免疫グロブリンを提供するステップと、
ｃ）上記第２の分子に結合する細胞内標的を提供するステップであって、上記免疫グロブリンと上記標的との結合が、上記第１の分子と上記第２の分子との安定した相互作用を導き、上記シグナルを生成するステップと、
ｄ）上記シグナルをモニターすることによって、上記免疫グロブリンと上記標的との間の細胞内相互作用を評価するするステップと、
ｅ）上記標的と相互作用する１つまたは複数の免疫グロブリンを選択して、それから１つまたは複数の単一ドメイン免疫グロブリンを単離するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３５】
本方法が、単一ドメイン免疫グロブリンのフレームワーク領域を突然変異させて、細胞内結合および／または安定性を促進させるステップをさらに含むと有利である。
【００３６】
別の態様では、細胞内単一ドメイン免疫グロブリンを提供する。細胞内単一ドメイン免疫グロブリンは、単一ドメイン抗体またはＶＨドメインであることが好ましい。
【００３７】
細胞内環境で機能する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメイン中に一般的に存在するドメイン内ジスルフィド結合を必要としないことを本明細書に示した。したがって、この細胞内単一ドメインは、ドメイン内ジスルフィド結合を含まないものが有利である。
【００３８】
本発明の単一ドメイン抗体は、第ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３５１２号記載の細胞内ＶＨコンセンサスまたはＶＬコンセンサスに一致したものが有利である。
【００３９】
このコンセンサスは、図５ａに記載され、かつ配列番号３または配列番号４として表されたコンセンサス配列のうちに少なくとも１つによって記載されたものが有利である。本発明で使用される「コンセンサス」は、図５ａ、および配列番号３または配列番号４に示されたコンセンサスと少なくとも８５％同一であるもの、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるものが有利である。同一性の計算では、ＣＤＲ３のアミノ酸残基が考慮から除かれていることが好ましい。
【００４０】
本発明は、上述した通りの単一ドメイン抗体のライブラリーであって、細胞内コンセンサスに一致したＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体を含むライブラリーをさらに提供する。
【００４１】
本発明による細胞内単一ドメイン免疫グロブリンは、細胞内治療応用に有用である。したがって、本発明は、細胞における生物学的機能をモジュレーションする方法であって、記載した細胞内単一ドメイン免疫グロブリンの有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。さらに、本発明は、細胞の生物学的機能をモジュレーションする組成物の製造における、本発明による細胞内単一ドメインの使用を提供する。
【００４２】
この生物学的機能は、ポリペプチドまたは核酸レベルでの遺伝子発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを含めた、所望のいかなる機能であってもよい。例えば、単一ドメイン細胞内免疫グロブリンは、特異的に癌遺伝子産物を標的にして、ポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルで、それらの発現をダウンレギュレートしうる。例えば、この癌遺伝子は、活性化ｐ２１  Ｒａｓ癌遺伝子でもよい。本発明による単一ドメイン免疫グロブリンは、Ｒａｓ癌遺伝子による発癌性形質転換を防止することが示されている。
【００４３】
図面の詳細な説明
図１．哺乳類細胞におけるＲＡＳタンパク質と、抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖイントラボディーおよび単一ドメイン誘導体との相互作用
ＣＯＳ７細胞を、ＧＡＬ４−ＤＢＤベイトプラスミドｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ（黒塗りボックス）またはｐＭ１−β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）（灰色ボックス）と共に、ＶＰ１６活性化ドメインに融合したｓｃＦｖまたは単一ドメイン誘導体を合成する様々なｐＥＦ−ＶＰ１６発現クローンで一時的に同時トランスフェクトした。さらに、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧ５−Ｌｕｃ、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部対照プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶを同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性はトランスフェクションの４８時間後に測定した。右手のパネルに、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性（トランスフェクション効率の内部対照として用いた）に対して正規化された、ホタルルシフェラーゼシグナルの活性を示す。中央パネルは、抗ＶＰ１６（１４−５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）モノクローナル抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体とを用いて検出された、ｓｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質の発現後における、ＣＯＳ７細胞抽出物のウェスタンブロットを示す。左手パネルは、様々な抗体フラグメントを発現させるのに使用した構築物を示す。
【００４４】
図２．合成単一ドメインライブラリーを用いた細胞内抗体捕獲
Ａ．２つのｐＶＰ１６＊−Ｄａｂライブラリー１の多様性は、Ｉ２１Ｒ３３由来ライブラリー１で２ｘ１０６であり、コンセンサスライブラリー１が１．４ｘ１０６であった（すなわち、合計の多様性３．４ｘ１０６）。最初のライブラリー１プールは、方法に記載されるようにＣＤＲ１で多様化した。ライブラリー２のそれぞれの多様性は、Ｉ２１Ｒ３３由来ライブラリーが３．０４ｘ１０７であり、コンセンサス由来ライブラリーが２．２１５ｘ１０７であった（すなわち、合計の多様性５．２５ｘ１０７）。１２個のクローンを、各ライブラリーから無作為に選択し、ＣＤＲのインサートと正しい挿入確認するために配列決定した。酵母Ｌ４０でスクリーニングされた初期のクローンの初期スクリーニングの結果と、ヒスチジン欠失プレート上で、３種のベイト（ＲＡＳ、ｐ５３、およびＡＴＦ−２）共に増殖しているコロニーの数とを示す。β−ｇａｌ活性化を引き起こす対応する割合を右のカラムに示す。
【００４５】
Ｂ．３種のベイトで得られた選択された細胞内Ｄａｂの派生するタンパク質配列のアライメント。ヌクレオチド配列を得て、派生するタンパク質翻訳（一文字コードで示す）をアライメントさせた。相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔら２６、およびＩＭＧＴ２７によって定義された通り）を左のパネルに示す（ＣＤＲ２のＮ末端における１１残基のみを示す）。
【００４６】
右のパネルは、Ｄａｂの抗原特異性を確かめるために、異なったベイトを用いて、酵母においてＩＤａｂの抗原抗体相互作用を再試験した結果を示す。ＨＩＳカラムは、ヒスチジン非依存性増殖アッセイを示し、β−ｇａｌカラムは、β−ガラクトシダーゼフィルターアッセイを示す。
【００４７】
クローン１〜９、２１〜３０はライブラリー１（正準なコンセンサスまたはＩ２１Ｒフレームワークのいずれか）に由来した。
【００４８】
クローン１１〜１９、１０１〜１１０は、ライブラリー２（正準なコンセンサスまたはＩ２１Ｒフレームワークのいずれか）に由来した。
【００４９】
ＣＯＮ ＝ コンセンサスフレームワーク配列４のＶＨドメインで構成されている。
【００５０】
Ｉ２１Ｒ＋ 抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３フレームワーク９のＶＨドメイン。
【００５１】
図３．哺乳類細胞における単一ドメインイントラボディーと抗原との相互作用
哺乳類ツーハイブリッド抗体抗原相互作用アッセイを３つの独立した方法で行った。
【００５２】
Ａ−Ｃ．ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＣＯＳ７を、ｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６ベクターと、ベイトｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ（黒塗りボックス）、ｐＭ１−ＡＴＦ−２（白抜きボックス）、ｐＭ１−ｐ５３ｗｔ（斜線ボックス）、またはｐＭ１−ＬｅｘＡ（灰色ボックス）とで、ｐＧ５−ｌｕｃおよびｐＲＬ−ＣＭＶと共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼレベルは、図１の記載の通りに測定した。各ヒストグラムは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性（トランスフェクション効率の内部対照として用いた）に対して正規化されたホタルルシフェラーゼシグナルの活性を表す。（Ａ）ＲＡＳ抗原によるＩＡＣスクリーニングから単離されたＲＡＳ選択ＩＤａｂサブグループ。右上ヒストグラムは、左ヒストグラム（フルスケールで最大１．４）の低い範囲（フルスケールで最大１５ｘ１０−３までの比活性）に焦点がある。（Ｂ）ＡＴＦ−２選択ＩＤａｂ。（Ｃ）ｐ５３選択ＩＤａｂ。
【００５３】
Ｄ．ＣＤ４発現のＦＡＣＳ分析
Ｇａｌ４上流活性化配列（ＵＡＳ）部位１４を介して調節されているＣＤ４レポーター遺伝子を有するＣＨＯ−ＣＤ４細胞を、様々なｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６ベクターと共に、ｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２ＶまたはｐＭ１−ｌａｃＺで同時トランスフェクトした。細胞表面ＣＤ４発現の誘導は、抗ヒトＣＤ４抗体およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇを用いて、トランスフェクションの４８時間後にアッセイした。示したＣＤ４＋細胞のパーセンテージは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定した。
【００５４】
Ｅ．ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析
ＧＡＬ４  ＵＡＳ１７を介して調節されているＧＦＰレポーター遺伝子を有するＣＨＯ−ＧＦＰ細胞系を、様々なｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−ＩＤａｂ−ｓｃＦｖベクターと共に、ｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２ＶまたはｐＭ１−ｌａｃＺで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞質ＧＦＰ発現を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定した。
【００５５】
図４．ＲＡＳに媒介されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の発癌性形質転換に対する抗ＲＡＳ単一ドメインイントラボディーによる阻害
突然変異体ＨＲＡＳＧ１２Ｖ  ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）に、そして、抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖまたはＩＤａｂを、原形質膜ターゲティングシグナルをｓｃＦｖまたはＩＤａｂのＣ末端に、また、ＦＬＡＧタグをＮ末端９に有するｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂベクターにサブクローニングした。１００ｎｇのｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ、および２μｇのｐＥＦ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖまたはｐＥＦ−Ｍｅｍｂ−ＩＤａｂを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、継代の少ないＮＩＨ３Ｔ３細胞クローンＤ４に同時トランスフェクトした。２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移した。集密に達した後に、細胞を、５％ドナーウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で１４日間保持した。プレートをクリスタルバイオレットで染色して、形質転換細胞の増殖巣を定量した。
【００５６】
Ａ．増殖プレートの代表的写真。左上パネルの空ベクターは、ＲＡＳを含まないｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）と、ｓｃＦＶまたはＩＤａｂを含まないｐＥＦ−ＶＰ１６ベクターとによる同時トランスフェクションを示す（陰性対照）；増殖巣の形成は観測されなかった。他のプレートは、ＨＲＡＳＧ１２Ｖと、示されたｓｃＦｖまたはＩＤａｂとによるトランスフェクションからのものであった。
【００５７】
Ｂ．ヒストグラムにおける形質転換巣の相対的パーセンテージは、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２ＶおよびｐＥＦ−ＶＰ１６空ベクターによって誘導された増殖巣形成を１００として、これに対して正規化した増殖巣の数として決定された。示された結果は、各トランスフェクションが二重で行われた１つの実験を表すものである（２回の追加実験は同様の結果を示す）。
【００５８】
図５．細胞内ｓｃＦｖの派生タンパク質配列のアライメント
ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を取得し、派生したタンパク質翻訳（一文字コードで示す）をアライメントさせた。相補性決定領域（ＣＤＲ）には陰影をつける。配列番号１〜４０におけるフレームワーク残基は下線で示したものである。特定の位置のコンセンサス配列は、出現頻度が最も高い残基に関して計算したが、その位置に５回を越えて現れた残基のみが考慮に入れられた。
【００５９】
Ａ．抗ＢＣＲ（Ｂ３〜Ｂ８９と命名された）および抗ＡＢＬ（Ａ５〜Ａ３２と命名された）からのＶＨおよびＶＬ配列。抗ＢＣＲ  ＩＣＡｂおよび抗ＡＢＬ  ＩＣＡｂを合わせたコンセンサス（Ｃｏｎ）を、カバットデータベースからのＶＨ３とＶＫＩに関するサブグループコンセンサスとの比較において示す。
【００６０】
−  細胞内抗体結合性ＶＨまたはＶＬコンセンサス（それぞれ配列番号３および配列番号４）との配列同一性を表す。
【００６１】
．  アライメントを最適化するために導入されたギャップを表す。
【００６２】
Ｂ．選択されなかったファージディスプレイライブラリーから無作為に取得したｓｃＦｖの配列比較。無作為に単離されたｓｃＦｖ（ｒｃＨおよびｒｃＬ）から得られたコンセンサスを示す。
【００６３】
−  アライメントを最適化するために導入されたギャップを表す。
【００６４】
Ｘは、コンセンサスを割り当てることができなかった位置を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
定義
本発明による単一ドメイン免疫グロブリンは、標的に結合できるいかなる単一ドメイン部分も指す。詳細には、単一ドメイン免疫グロブリンには、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーに由来する単一ドメインが含まれるが、免疫グロブリンスーパーファミリーは、抗体分子の特徴である免疫グロブリンフォールドを含むポリペプチドのファミリーであり、抗体分子は、２つのβシートと、通常は、保存されたジスルフィド結合とを含有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系における広範な役割（例えば、抗体、Ｔ細胞受容体分子、および同様のもの）、細胞接着における関与（例えば、ＩＣＡＭ分子）、および細胞内シグナル伝達（例えば、ＰＤＧＦ受容体などの受容体分子）を含めた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞性および非細胞性の相互作用の様々な側面に関与している。本発明は、標的分子に結合できる全免疫グロブリンスーパーファミリー分子に由来する単一ドメイン分子に適用可能である。本発明は、好ましくは、抗体単一ドメイン、特に重鎖可変（ＶＨ）ドメインに関する。単一ドメイン免疫グロブリンは、相補的ドメインから遊離しており、すなわち、自然の状態で、または他の方法で、この単一ドメインと結合して、標的に対する単一の複合結合部位を形成しうる他の結合ドメインと結合していない。詳細には、本発明の単一ドメインでは、ＶＨドメインに相補的なＶＬドメインが存在していない。しかし、抗体定常領域ドメインなどの他のドメインは、存在する必要はないが、存在していてもよい。
【００６６】
ドメインは、当技術分野における通常の意味で用いられる。したがって、ドメイン（通常、ポリペプチドドメインまたはタンパク質ドメイン）は、独立した三次構造と、独立した機能的属性を有する。ドメインは、集合してマルチドメインタンパク質を形成しうる。
【００６７】
本明細書において、抗体とは、選択された標的に結合でき、かつＦｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体を含めた改変抗体、そして、ファージ提示または代替技法を用いて産生され、人工的に選択された抗体を含めた完全抗体または抗体フラグメントを指す。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭを含めた、天然に存在するいかなる抗体タイプのものでも、または、そのいずれかに基づいたものでもよい。ＶＨドメインなどの単一ドメインは、そのような抗体のいかなるものに由来するものでも良い。
【００６８】
分子は、無機分子、有機分子、またはこれら２つの組合せを含めたいかなる化学構造でもありうる。通常、分子は、ポリペプチドまたは核酸であろう。ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の鎖であり、天然もしくは合成アミノ酸、またはこれら２つの組合せを含みうる。
【００６９】
活性レポーター分子は、直接的に、または化学的もしくは生物学的経路を介してシグナルを生成できる分子である。例えば、活性レポーター分子は、相互作用するとＦＲＥＴを介してシグナルを生成する１対の蛍光色素；相互作用すると活性型の転写因子を形成する、転写因子の２個のドメイン；または、相互作用すると検出可能な酵素活性を再構成する、酵素のドメインであってもよい。
【００７０】
重鎖可変ドメインは、免疫グロブリン分子重鎖における、その分子の抗原結合部位の一部を形成する部分を指す。ＶＨという略語が使用されている。構造類似性に基づいて、いくつかのサブタイプが定義されており、例えば、カバットデータベースに記載されているものが挙げられる。
【００７１】
軽鎖可変ドメインは、免疫グロブリン分子軽鎖における、その分子の抗原結合部位の一部を形成する部分を指す。ＶＬという略語が使用されている。構造類似性に基づいて、いくつかのサブタイプが定義されており、例えば、カバットデータベースに記載されているものが挙げられる。
【００７２】
免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域は、免疫グロブリンフォールドの存在を特徴とする、特別の３次元コンフォメーションを有する。可変ドメインに存在する特定のアミノ酸残基が、この特徴的な免疫グロブリンドメインのコア構造を維持する役割を果たしている。これらの残基は、フレームワーク残基として知られており、高度に保存される傾向を示す。フレームワークは抗体のＣＤＲを支持する。
【００７３】
免疫グロブリン分子における重鎖および軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（相補性決定領域）は、フレームワーク領域残基ではなく、可変領域における超可変ループ内に含有されるアミノ酸残基のことをいう。これらの超可変ループは、リガンドとの免疫グロブリンの相互作用に直接関与する。これらのループ内にある残基は、フレームワーク領域に比べて、保存の程度が低い傾向にある。
【００７４】
細胞内とは細胞の内部を意味し、本発明は、細胞の内部で選択的にリガンド／標的に結合する免疫グロブリンを対象とする。この細胞は、いかなる原核または真核の細胞でもよく、細菌細胞、酵母細胞、および高等真核生物細胞からなる群から選択されることが好ましい。最も好ましいのは、酵母細胞および哺乳類細胞である。したがって本明細書において、「細胞内」の免疫グロブリンおよび標的またはリガンドは、細胞の内部に存在する免疫グロブリンおよび標的／リガンドである。さらに、「細胞内」という用語は、細胞内環境に類似しているか、またはこれを模擬する環境も指す。したがって、「細胞内」は、細胞の内部ではなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境を指すこともある。例えば、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムおよび／または翻訳システムで行ってもよく、これらは、市販されているものでも、または天然のシステムに由来するものでもよい。
【００７５】
本発明の文脈において、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のコンセンサス配列は、細胞内環境で選択的にリガンドに結合できる免疫グロブリン分子に由来するＶＨ鎖およびＶＬ鎖のコンセンサス配列を指す。細胞内で結合できる免疫グロブリンの配列を比較した際に、いずれの位置でも、所与の一箇所において最も共通する残基が、その位置のコンセンサス残基として選択される。コンセンサス配列は、細胞内で結合する全免疫グロブリンの各位置における残基を順次比較して、その後データを照合することによって作製される。
【００７６】
本発明の文脈において、特異的な（抗体）結合とは、抗体とリガンドとの相互作用が選択的であること、すなわち、多数の分子が抗体に提示された場合、提示された分子のうち、１個または数個のみに、この抗体が結合するであろうことを意味する。抗体−リガンド相互作用は、高親和性であることが有利であろう。免疫グロブリンとリガンドとの相互作用は、水素結合形成およびファンデルワールス力などの非共有結合相互作用によって媒介されるだろう。
【００７７】
本発明の文脈において、１レパートリーとは、結合特異性の多様性を提供するために、１個または複数個のテンプレート分子を核酸レベルで、ランダム、セミランダム、または部位特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）に変異させることによって生成された１セットの分子を指す。この場合、テンプレート分子は、本明細書に記載される１つまたは複数のＶＨドメイン配列および／またはＶＬドメイン配列である。レパートリーを生み出す方法は、当技術分野で詳細に特徴付けされている。
【００７８】
ａ）単一ドメイン免疫グロブリン
単一ドメイン免疫グロブリン分子は、通常、他のドメイン、特に他の標的結合ドメインから分離した免疫グロブリンの単一標的結合ドメインである。例えば、単一ドメイン免疫グロブリンは、当技術分野においてＤａｂとして公知である単一ドメイン抗体でもよい。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からなる。
【００７９】
本発明による単一ドメイン免疫グロブリンは、特に診断上および治療上の適用が示される。したがってそれらは、毒素または標識などのエフェクタータンパク質を含む改変抗体でもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体分布のイメージングを可能にする標識が特に好ましい。そのような標識は、放射性標識、または、金属粒子などの放射線不透性標識であってもよい。金属粒子は、患者の体内においても容易に視覚化できる。さらに、そのような標識は、患者から除去された組織試料で視覚化可能な蛍光標識または他の標識でもよい。エフェクターグループは、本発明の方法による抗体の選択の前に添加しても、または後で添加してもよい。
【００８０】
単一ドメインがそれから由来しうる抗体それ自体は、動物血清から得ても良く、また、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合には、細胞培養中に産生してもよい。細菌培養、または好ましくは哺乳類細胞培養において抗体を生成するために、確立した操作手順に従って、組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。選択される細胞培養系は、抗体産物を分泌するものが好ましい。
【００８１】
ハイブリドーマ細胞または哺乳類宿主細胞の増殖は、適当な培地を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。適当な培地は、常用的な標準培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地であり、任意選択で、例えばウシ胎児血清などの哺乳動物血清、または微量元素および成長を維持するサプリメント、例えば、正常マウス腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージなどのフィーダー細胞、２‐アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸、または同様のものが添加される。宿主細胞の増殖は、宿主細胞が細菌細胞または酵母細胞である場合も同様に、当技術分野で公知の適当な培地、例えば、細菌用には、ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ｘＹＴ、またはＭ９最少培地、そして、酵母用には、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、または完全最小ドロップアウト培地（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて実行される。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、スケールアップして、所望の抗体を大量に提供することを可能にする。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養の技法は、当技術分野で公知であり、これらには例えば、エアリフト培養器（ａｉｒｌｉｆｔ  ｒｅａｃｔｏｒ）中、もしくは定常撹拌培養器中での均質懸濁培養、または、例えば、中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上、またはセラミックカートリッジ上での固定もしくは捕捉（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）細胞培養が含まれる。
【００８３】
所望の抗体は、哺乳類細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることによっても、大量に取得できる。このような目的で、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こすために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、組織適合性の哺乳動物に注入する。任意選択で、注射前に、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱油を用いて動物に初回抗原刺激を与える。１〜３週間後に、それらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾細胞と、適当な骨髄腫細胞の融合で得られたハイブリドーマ細胞、またはハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来の、所望の抗体を産生する形質転換細胞を、任意選択でプリスタンによる前処置を行ったＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入して、１〜２週間後に、動物から腹水を採取する。
【００８４】
上記の技法、および他の技法は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページ；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（１９８８年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒで論じられており、これらを参照により本明細書に組み込む。組換え抗体分子を調製する技法は、上記の参考文献と、例えば、欧州特許第０６２３６７９号、欧州特許第０３６８６８４号、および欧州特許第０４３６５９７号とに記載されており、これらを参照により本明細書に組み込む。
【００８５】
細胞培養上清は、所望の抗体について、所望の標的を発現する細胞を、免疫ブロッティングによって、例えばサンドウィッチアッセイ、またはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイなどの酵素免疫測定法によって免疫蛍光染色することによって、選択的にスクリーニングする。
【００８６】
抗体を単離するには、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性物質に対する透析、選択性の膜を通した濾過などによって濃縮してもよい。必要もしくは望ましい場合には、抗体を常用的なクロマトグラフィー手法で、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、および／または（免疫）親和性クロマトグラフィー、例えば、標的分子もしくはプロテインＡによる親和性クロマトグラフィーによって精製する。
【００８７】
以上の操作手順で産生された抗体は、標準的な操作手順に従って、細胞から核酸を単離することによってクローニングしてもよい。抗体の可変ドメイン核酸を単離して、ＶＨまたはＶＬドメインなどの単一ドメイン抗体を構築するのに使用すると有用であろう。
【００８８】
したがって、本発明は、抗体重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え型核酸を利用することが好ましい。定義上、そのような核酸には、コーディング一本鎖核酸、上記コーディング核酸およびそれに相補的な核酸からなる二本鎖核酸、またはこれら相補的な（一本鎖）核酸それ自体が含まれる。
【００８９】
さらに、抗体重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然に存在する重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、またはその突然変異体をコードする正統的な配列を有する、酵素的または化学的に合成された核酸でありうる。正統的配列の突然変異体は、１つまたは複数のアミノ酸が欠失されているか、あるいは１つまたは複数のアミノ酸で置換されている、上述の抗体重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。上記改変は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外であることが好ましい。そのような突然変異体核酸は、１つまたは複数のヌクレオチドが、同一のアミノ酸をコードする新規コドンを有する他のヌクレオチドで置換されているサイレント突然変異体であることも意図されている。そのような突然変異体配列は縮重配列でもある。縮重配列は、遺伝コードの意味内における縮重であり、縮重配列中では、制限のない数のヌクレオチドが、元々コードされていたアミノ酸配列を変化させることなく、他のヌクレオチドで置換される。そのような縮重配列は、それらが異なった制限部位を有することによって、かつ／または、特定の宿主、特に酵母、細菌、または哺乳類細胞にとって好ましい特定のコドンの頻度が異なることによって、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの最適の発現を得るのに有用であることがある。
【００９０】
突然変異体という用語には、当技術分野で公知の方法による、ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発で得られたＤＮＡ突然変異体が含まれることが意図されている。
【００９１】
組換えＤＮＡ技法は、本発明の抗体を改善するのに用いてもよい。したがって、診断上または治療上の適用におけるそれらの免疫原性を低下させるために、キメラ抗体を構築してもよい。さらに、免疫原性は、ＣＤＲ移植によって［ヨーロッパ特許出願第０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）に総説］、そして、任意選択でフレームワークの改変によって［国際特許出願第ＷＯ９０／０７８６１号（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）に総説］、抗体をヒト化することで、最小化してもよい。
【００９２】
したがって、本発明は、ヒト定常ドメインγ、例えば、γ１、γ２、γ３、γ４、好ましくはγ１またはγ４に融合した抗体重鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸も利用する。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合した抗体軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡにも関する。
【００９３】
本発明は、ＣＤＲ移植抗体を利用することがより好ましく、ＣＤＲ移植抗体は、ＣＤＲ移植された、単独の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインであることが好ましい。
【００９４】
さらに、抗体遺伝子の突然変異誘発を行って、抗体の人工的なレパートリーを生成することによって、抗体を産生してもよい。この技法は、以下でさらに論じる抗体ライブラリーの調製を可能にするものである。また、抗体ライブラリーは市販されているものを利用可能である。したがって、本発明は、単一ドメイン免疫グロブリンの人工的レパートリー、好ましくは人工的ＶＨレパートリーを利用すると有利である。
【００９５】
単一ドメイン免疫グロブリンは、いかなる適切な技法によって調製してもよい。単一ドメイン抗体の調製に関しては、Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻、５４４〜５４６ページ、および欧州特許出願第０３６８６８４号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に詳細に記載されている。
【００９６】
ｂ）標的
標的は、本発明の方法によって選択された細胞内の単一ドメイン免疫グロブリンを用いることが意図されている使用に応じて選択される。したがって、ポリペプチド、亜細胞構造、または細胞内病原体などの特定された細胞成分に結合できる免疫グロブリンを選択することが望ましい場合には、上記成分またはそれに由来するエピトープの全体を標的として用いてもよい。
【００９７】
潜在的標的には、ポリペプチド、特に新生ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチド前駆体が含まれるが、これらは細胞内に存在する。標的は、点突然変異、欠失、および染色体転座を含めた遺伝子突然変異を介して生成されたポリペプチドなどの突然変異体ポリペプチドであると有利である。そのようなポリペプチドは腫瘍形成に関与していることが多い。例としては、スプライシングされたＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子によって生成された遺伝子産物と、Ｒａｓ癌遺伝子の点突然変異体によって生成された遺伝子産物とが含まれる。本発明は、さらに、全突然変異癌遺伝子産物、全染色体転座癌遺伝子産物（特に融合タンパク質）、疾患中に発現される異常タンパク質、および、感染の結果として発現されるウイルス特異的または細菌特異的タンパク質に適用可能である。
【００９８】
あるいは、標的はＲＮＡ分子でもよく、例えば、前駆体ＲＮＡ、または遺伝子突然変異もしくは他の方法で生成された突然変異体ＲＮＡ種でもよい。
【００９９】
標的は、例えば、以下に記載されるように、細胞内に挿入されてもよく、または細胞に内在するものでもよい。標的が内在性である場合には、シグナルの生成は、細胞内での標的に対するシグナル伝達分子の結合、または、シグナル生成物質の半分として機能できる標的自体に依存する。
【０１００】
ｃ）ライブラリーおよび選択系
本発明での使用に供する免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工的レパートリーを含むライブラリーから単離してもよい。任意選択で、所望の標的に対するスクリーニングによって、免疫グロブリンをあらかじめ選択して、実質上すべてが意図された標的に特異的である免疫グロブリンを用いて本発明の方法が行われるようにしてもよい。
【０１０１】
本発明と組み合わせて、いかなるライブラリー選択システムを用いてもよい。大規模のライブラリーから、所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは、当技術分野で公知であり、典型的な例としてはファージ提示技法がある。そのようなシステムでは、繊維状バクテリオファージの表面に様々なペプチド配列が提示されるが（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、３８６ページ）、標的抗原に結合する特異的な抗体フラグメントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および増幅を行うために、抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに、そのようなシステムが有用であることが実証されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム間隙へ指令するリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結され、その結果、得られた抗体フラグメントは、通常、バクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合体として、バクテリオファージの表面に提示される。別法では、λファージキャプシド（ファージボディー（ｐｈａｇｅｂｏｄｙ））の外部に抗体フラグメントを提示する。ファージをベースにした提示システムの利点は、それらが生物学的システムであるため、選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを、単純に細菌細胞中で増殖させることによって、選択されたライブラリーメンバーを増幅できる点にある。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクターに含有されているため、配列決定、発現、および後続する遺伝操作が比較的簡単である。
【０１０２】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリー、およびλファージ発現ライブラリーを構築する方法は、当技術分野で周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３４８巻、５５２ページ；Ｋａｎｇら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻、４３６３ページ；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、６２４ページ；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３０巻、１０８３２ページ；Ｂｕｒｔｏｎら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻、１０１３４ページ；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１９巻、４１３３ページ；Ｃｈａｎｇら（１９９１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、３６１０ページ；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら（１９９１年）、Ｇｅｎｅ、第１０４巻、１４７ページ；Ｍａｒｋｓら（１９９１年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２２２巻、５８１ページ；Ｂａｒｂａｓら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８９巻、４４５７ページ；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２２巻、８６７ページ；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６７巻、１６００７ページ；Ｌｅｒｎｅｒら（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５８巻、１３１３ページ、これらを参照により本明細書に組み込む）。
【０１０３】
ｓｃＦｖファージライブラリーの使用は、特に有利なアプローチの１つである（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、５８７９〜５８８３ページ；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻、１０６６〜１０７０ページ；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、同上；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、６２４ページ；Ｍａｒｋｓら（１９９１年）、同上；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら（１９９２年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１０巻、８０ページ；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６７巻）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されたｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記載されている。ファージ提示アプローチの精密化も公知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９６／０６２１３号および第ＷＯ９２／０１０４７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）ならびに第ＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）に記載されており、これらを参照により本明細書に組み込む。ｓｃＦｖライブラリーの選択に適した方法を、本発明における使用に供する単一ドメイン（ＤＡｂ）の前選択に適用してもよい。
【０１０４】
代替的なライブラリー選択技法には、バクテリオファージラムダ発現系が含まれるが、これはバクテリオファージプラークとして、または、溶原菌コロニーとして、直接スクリーニングしてもよく、両方とも以前の記載（Ｈｕｓｅら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５ページ；ＣａｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻；Ｍｕｌｌｉｎａｘら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻、８０９５ページ；Ｐｅｒｓｓｏｎら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻、２４３２ページ）に従って行うことができ、本発明で有用である。そのような発現系は、１０６までの異なったメンバーを有するライブラリーのスクリーニングには使用できるが、より多数（１０６を越えたメンバー）のスクリーニングには実際には適さない。他のスクリーニングシステムは、例えば、ライブラリーメンバーの直接的化学合成に依存する。初期における一方法は、国際公開第ＷＯ８４／０３５６４号に記載されるように、１セットのピンまたはロッド上でペプチド合成を行うものを含む。ビーズ上でのペプチド合成を含む同様の方法では、各ビーズを個別のライブラリーメンバーとするペプチドライブラリーを形成するが、これは米国特許第４，６３１，２１１号に記載されており、関連した方法が国際公開第ＷＯ９２／０００９１号に記載されている。ビーズベースの方法ではかなりの改善がなされており、それは、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を促進するためのオリゴヌクレオチドなど、各ビーズに特有の識別子タグを付けることを含む。これらの改善されたビーズベースの方法は、国際公開第ＷＯ９３／０６１２１号に記載されている。
【０１０５】
別の化学合成法は、異なった各ライブラリーメンバー（例えば、特有のペプチド配列）が、事前に定められたアレイ中の個別の位置に配置されるような方法で、表面に、ペプチド（またはペプチドミメティック）のアレイを合成することを含む。各ライブラリーメンバーのアイデンティティーは、アレイ中の空間的位置によって決定される。あらかじめ決められた分子（例えば受容体）と、反応性ライブラリーメンバーとの間の結合相互作用が起きたアレイの位置を決定し、それによって、空間位置に基づき反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号；国際公開第ＷＯ９０／１５０７０号、および第ＷＯ９２／１００９２号；Ｆｏｄｏｒら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻、７６７ページ；ＤｏｗｅｒおよびＦｏｄｏｒ（１９９１年）、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第２６巻、２７１ページに記載されている。
【０１０６】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを生成する他のシステムには、ライブラリーメンバーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を行うための無細胞酵素機構を使用するものが含まれる。一方法では、標的リガンドに対する選択と、ＰＣＲ増幅とを交互のラウンドで行って、ＲＮＡ分子を選択する（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、５０５ページ；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３４６巻、８１８ページ）。あらかじめ決められたヒト転写因子に結合するＤＮＡ塩基配列を同定するのに、同様の技法を用いてもよい（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ（１９９０年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第１８巻、３２０３ページ；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５７巻、６３５ページ；国際公開第ＷＯ９２／０５２５８号および第ＷＯ９２／１４８４３号）。大規模のライブラリーを生成する方法として、同様の方法で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を用いてポリペプチドを合成することができる。これらの方法は、通常、安定化したポリゾーム複合体を含み、国際公開第ＷＯ８８／０８４５３号、第ＷＯ９０／０５７８５号、第ＷＯ９０／０７００３号、第ＷＯ９１／０２０７６号、第ＷＯ９１／０５０５８号、および第ＷＯ９２／０２５３６号に、さらに詳細に記載されている。国際公開第ＷＯ９５／２２６２５号、および第ＷＯ９５／１１９２２号（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されているものなど、ファージベースではない別の提示システムでは、選択用のポリペプチドをポリゾームを用いて提示する。これらの文献、および以上の全文献も参照により本明細書に組み込む。
【０１０７】
ファージまたは他のクローニングされたライブラリーの使用に代わる代替手段では、選択された標的で免疫処置された動物の脾臓から得た核酸、好ましくはＲＮＡを使用する。このようにして得られたＲＮＡは、天然の免疫グロブリンライブラリーを表すものである。Ｖ領域のｍＲＮＡを単離することによって、ＶＨまたはＶＬなどの単一ドメイン抗体フラグメントを、本発明に従って細胞内で発現することが可能となる。
【０１０８】
簡潔には、免疫処置された動物の脾臓からＲＮＡを単離し、ＰＣＲプライマーを用いて、ＶＨ  ｃＤＮＡおよびＶＬ  ｃＤＮＡを選択的にＲＮＡプールから増幅する。ＰＣＲプライマー配列は、公表されているＶＨ配列およびＶＬ配列に基づくもので、キットとして市販されているものも使用できる。
【０１０９】
ｄ）細胞への免疫グロブリンおよび標的の送達
本発明は、本質的には細胞内で、または細胞内環境、好ましくは細胞質環境を模擬した条件で行われる、細胞内抗体のアッセイを提供する。さらに、本発明による免疫グロブリンは、細胞の細胞質内または核内で有用である。したがって、本発明は、細胞の内部に、免疫グロブリンおよび／または標的をコードする核酸構築物を送達する方法、およびポリペプチドを送達する方法を提供する。
【０１１０】
細胞内環境に免疫グロブリンおよび標的分子を導入するために、免疫グロブリンおよび／またはそれらの標的をコードする核酸で、細胞をトランスフェクトすると有利である。
【０１１１】
免疫グロブリンおよび／または標的をコードする核酸は、発現のためにベクターに組み込むことができる。本明細書において、ベクター（またはプラスミド）とは、異種性ＤＮＡを発現させるために、それを細胞内に導入するのに使用される個別のエレメントを指す。そのような媒体の選択および使用は、十分に当業者の技術の範囲内にある。多数のベクターが利用可能であり、適切なベクターの選択は、意図されたベクターの使用、ベクターに挿入する核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される宿主細胞によるだろう。各ベクターは、その機能と、それと適合性のある宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。ベクター成分には、通常、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列、およびシグナル配列のうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
さらに、本発明による免疫グロブリンおよび／または標的をコードする核酸は、一般的な操作と、核酸の増幅とを行う目的で、クローニングベクターに組み込んでもよい。
【０１１３】
通常、発現ベクターおよびクローニングベクターは、両方とも、ベクターが、１つまたは複数の選択された宿主細胞内で、複製するのを可能にする核酸配列を含有する。クローニングベクター中では、この配列は、通常、ベクターが宿主染色体ＤＮＡから独立して複製するのを可能にするものであり、これには複製開始点または自己複製配列が含まれる。様々な細菌、酵母、およびウイルスにおける、そのような配列は周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、２ｍプラスミドオリジンは酵母に適しており、そして、様々なウイルスオリジン（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。通常、複製開始点成分は、哺乳類発現ベクターでは、これらをＣＯＳ細胞など、高レベルＤＮＡ複製が可能な哺乳類細胞で用いない限り必要とされない。
【０１１４】
ほとんどの発現ベクターは、シャトルベクターであり、すなわち、それらのベクターは、少なくとも１クラスの生物で複製が可能であるが、発現を行うために、別の１クラスの生物にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターは大腸菌にクローニングされ、その後、宿主細胞の染色体から独立した複製を行えないにしても、この同じベクターが酵母または哺乳類細胞内にトランスフェクトされる。ＤＮＡは、宿主ゲノム中に挿入されることによっても複製されうる。しかし、ゲノムＤＮＡの回収は、核酸を切り出すのに制限酵素消化が必要であるので、外在的に複製するベクターの回収より複雑である。ＤＮＡは、ＰＣＲで増幅して、いかなる複製成分もないまま宿主細胞内に直接トランスフェクトすることができる。
【０１１５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有すると有利となる場合がある。この遺伝子は、形質転換された宿主細胞の選択培地における生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、培地中で生き残らないであろう。典型的な選択遺伝子は、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンなどの抗生物質および他の毒素に対する耐性を与えるタンパク質、栄養要求性における欠乏を補足するタンパク質、または、複合培地からは利用できない重要な栄養を提供するタンパク質をコードする。酵母に適した選択遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子の表現型発現によって、形質転換体の選択を促進するいかなるマーカー遺伝子も使用できる。酵母に適したマーカーには、例えば、抗生物質であるＧ４１８、ハイグロマイシン、またはブレオマイシンに対する耐性を与えるもの、あるいは栄養要求性の酵母突然変異体に原栄養性を与えるもの、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、またはＨＩＳ３遺伝子がある。
【０１１６】
ベクターの複製は大腸菌で行うのが便利なので、大腸菌遺伝子マーカーと、大腸菌複製開始点とを含むものが有利である。これらは、大腸菌複製開始点と、アンピシリンなどの抗生物質に対する耐性を与える大腸菌遺伝子マーカーとの両方を含有するｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(著作権)ベクター、または例えばｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９などのｐＵＣプラスミドなどの大腸菌プラスミドから得ることができる。
【０１１７】
哺乳類細胞に適した選択マーカーは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８もしくはハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子など、望ましい核酸を発現する細胞の同定を可能にするものである。哺乳類細胞形質転換体は、マーカーを摂取して、かつ発現している形質転換体のみが、特有に適応して生存するような選択圧の下に置かれる。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合には、形質転換体を、圧力が徐々に増強され、それによって、選択遺伝子と、連結した核酸との両方の増幅（染色体挿入部位での）が導かれるような条件下で培養することによって、選択圧を加えることができる。増幅は、増殖に極めて重要なタンパク質を産生するために必要性がより高い遺伝子が、所望のタンパク質をコードしうる密接に関連した遺伝子と共に、組換え体細胞の染色体内で、タンデムに反復される過程である。したがって、所望のタンパク質の増量された合成は、通常、増幅されたＤＮＡから生じる。
【０１１８】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、望ましい核酸と作動可能に連結したプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは、誘導可能なものである場合も、または構成的なものである場合もある。プロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを切り出し、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって、核酸に作動可能に連結される。天然のプロモーター配列、および多数の異種プロモーターは、両方とも、免疫グロブリンまたは標的分子をコードする核酸の増幅および／または発現を指令するのに使用してもよい。「作動可能に連結する」という用語は、記載される成分が、意図された方法で機能するのを可能にするような関係で並置されていることを指す。コード配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合した条件下で実現されるように連結されている。
【０１１９】
原核細胞宿主での使用に適したプロモーターには、例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムおよびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。それらのヌクレオチド配列は公表されており、したがって、当業者ならば、必要とされるいかなる制限部位もリンカーまたはアダプターを用いて提供して、それらを所望の核酸と作動可能に連結させることができる。細菌システムでの使用に供するプロモーターは、通常、核酸に作動可能に連結したシャイン−ダルガノ配列も含有するであろう。
【０１２０】
好ましい発現ベクターは、ｐｈａｇｅｘまたはＴ７など、細菌で機能できるバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広範囲に使用されている発現系の１つでは、融合タンパク質をコードする核酸を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってベクターから転写することができる（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１８５巻、６０〜８９ページ、１９９０年）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株は、ｐＥＴベクターと共に使用されるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが宿主細菌のλ溶原菌ＤＥ３から生成され、その発現がＩＰＴＧ誘導性のｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの制御下にある。このシステムは、多くのタンパク質を過剰産生するのに利用され、成功を収めている。別法として、市販されているＣＥ６ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）などのｉｎｔファージで感染させることによって、ポリメラーゼ遺伝子をλファージ上に導入してもよい。他のベクターには、ＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＬ）などのλＰＬプロモーターを含有するベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳＥ）などのｔｒｃプロモーターを含有するベクター、または、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）もしくはＰＭＡＬ（ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）などのｔａｃプロモーターを含有するベクターが含まれる。
【０１２１】
酵母宿主での使用に適したプロモーター配列は、調節されるものでも、構成的なものでもよく、発現の高い酵母遺伝子、特にサッカロミセス・セレビシアエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)遺伝子に由来するものが好ましい。したがって、ＴＲＰ１遺伝子プロモーター、ＡＤＨＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子プロモーター、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子プロモーター、ａ因子もしくはα因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーター、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼまたはグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターなど、解糖系酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター、サッカロミセス・セレビシアエ(Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)ＧＡＬ４遺伝子、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｎｍｔ１遺伝子、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子に由来するプロモーターを用いることができる。さらに、ある酵母遺伝子の上流域活性化配列（ＵＡＳ）と、別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含んだ下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳと、酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含んだ下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することもできる。適当な構成的ＰＨＯ５プロモーターには、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３に開始して、ヌクレオチド−９に終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーターエレメントなどの上流調節エレメント（ＵＡＳ）欠失した、短縮型酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。
【０１２２】
哺乳類宿主でのベクターからの遺伝子転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムに由来するプロモーター、アクチンプロモータなどの異種哺乳類プロモーター、または、例えばリボソームタンパク質プロモーターなどの極めて強力なプロモーターに由来するプロモーター、そして、通常は、免疫グロブリン配列に結合しているプロモーターに由来するプロモーターで制御してもよい。
【０１２３】
高等真核生物による核酸の転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって、増強されうる。エンハンサーは、配向性および位置から比較的独立している。多数のエンハンサー配列が、哺乳類遺伝子（例えば、エラスターゼおよびグロビン）で公知である。しかし、通常は、真核生物細胞ウイルスに由来するエンハンサーが利用されるであろう。その例には、複製開始点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）にあるＳＶ４０エンハンサーと、ＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、所望の核酸の５’側の位置または３’側の位置にベクター中にスプライシングして良いが、プロモーターより５’側に位置する部位が好ましい。
【０１２４】
真核細胞発現ベクターは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むと有利であることがある。ＬＣＲは、宿主細胞染色質に挿入された導入遺伝子の、挿入部位に依存しない高レベル発現を指令できるものであり、染色体へのベクターの挿入が起こり、持続的にトランスフェクトされた真核細胞系の背景で、遺伝子が発現される場合に、特に重要である。
【０１２５】
真核細胞発現ベクターは、転写の終結、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有するだろう。そのような配列は、通常、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡにおける５’非翻訳領域および３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、免疫グロブリンまたは標的をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１２６】
本発明の実施に特に有用なのは、哺乳類細胞における核酸の一時的発現を提供する発現ベクターである。一時的発現は、通常、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積して、次に、所望の遺伝子産物を高レベルで合成するように宿主細胞内で効率的に複製できる発現ベクターの使用を含む。
【０１２７】
本発明によるベクターの構築は、従来のライゲーション技法を用いてもよい。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、所望の形態に切断、調整、および再連結されて、必要なプラスミドを生成する。望ましい場合には、構築されたプラスミドが正しい配列を有することを確認する分析を、公知の方法で行う。発現ベクターを構築する適当な方法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物を調製する適当な方法、宿主細胞にＤＮＡを導入する適当な方法、遺伝子産物の発現および機能を評価する分析を行う適当な方法は当業者に公知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、例えば、本明細書に提供した配列に基づいたものでありうる適切に標識されたプローブを用いた、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、試料中で直接測定してもよい。当業者ならば、望ましい場合には、これらの方法がどのように改変されうるか、容易に想定するであろう。
【０１２８】
免疫グロブリンおよび／または標的は、マイクロインジェクション法、または、細胞膜と融合できるリポソームなどのベシクルを用いた送達で直接、細胞に導入してもよい。ウイルス性融合誘導ペプチドは、細胞の膜融合および細胞質への送達を促進するのに用いると有利である。
【０１２９】
免疫グロブリンは、転移活性を有するタンパク質に由来するドメインまたは配列に融合または結合させることが好ましい。好ましい転移ドメインおよび配列には、ＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン蛋白質、ＴＬＭペプチド、抗ＤＮＡ抗体ペプチド技法、および単純ヘルペス−１ウイルスＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列が含まれる。このようにして、免疫グロブリンは、細胞近傍に導入した際、細胞またはその核に侵入することができる。
【０１３０】
外因的に添加されたＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）は、原形質膜を通って転移し、核に到達して、ウイルスゲノムのトランス活性化を行うことができる。転移活性は、ＨＩＶ  ＴＡＴのアミノ酸３７〜７２（Ｆａｗｅｌｌら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９１巻、６６４〜６６８ページ）、３７〜６２（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１９４巻、８７６〜８８４ページ）、および４９〜５８（塩基性配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）に同定されている。Ｖｉｖｅｓら（１９９７年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７２巻、１６０１０〜７ページは、アミノ酸４８〜６０（ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ）からなる配列を同定し、この配列が細胞性遺伝子の転移、核局在化、およびトランス活性化に重要であると考えられる。β−ガラクトシダーゼと、ＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質形質導入ドメインとからなる融合タンパク質を腹腔内注射したところ、生物学的活性な融合タンパク質がマウスの全組織に送達される結果となる（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８５巻、１５６９〜７２ページ）。
【０１３１】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質の第３ヘリックスも、同様の特性を有することが示されている（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、Ａ．、１９９９年、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、第８８６巻、１７２〜９ページに総説）。Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａにおいて転移を引き起こすドメインは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫという配列を有する、塩基性アミノ酸に富んだ、長さ１６アミノ酸のペプチドに局在する（Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９４年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２６９巻、１０４４４〜５０ページ）。このペプチドは、培養細胞の細胞質および核に生物学的に活性な物質を指向させるのに使用された（Ｔｈｅｏｄｏｒｅら、１９９５年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１５巻、７１５８〜７１６７ページ）。Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン第３ヘリックスの細胞内在化は、受容体には依存していないと考えられ、転移過程には膜リン脂質との直接的な相互作用が関与すると提案されている（Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９６年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７１巻、１８１８８〜９３ページ）。
【０１３２】
単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２テグメントタンパク質は、細胞間輸送を行うことができ、それによって、細胞の亜集団で発現されたＶＰ２２タンパク質は、集団内の他の細胞にも蔓延する（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、１９９７年、Ｃｅｌｌ、第８８巻、２２３〜３３ページ）。ＧＦＰ（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、１９９９年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、第６巻、１４９〜５１ページ）、チミジンキナーゼタンパク質（Ｄｉｌｂｅｒら、１９９９年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、第６巻、１２〜２１ページ）、またはｐ５３（Ｐｈｅｌａｎら、１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１６巻、４４０〜３ページ）とＶＰ２２とからなる融合タンパク質が、この様にして細胞に向けてターゲッティングされた。
【０１３３】
ＴＬＭペプチドは、ＨＢＶのプレＳ２ポリペプチドに由来する。Ｏｅｓｓ  Ｓ、Ｈｉｌｄｔ  Ｅ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０００年５月７日、第７巻、７５０〜８頁を参照のこと。抗ＤＮＡ抗体ペプチド技法は、Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  Ａｖｒａｍｅａｓら（１９９８年５月）、ＰＮＡＳ、第９５巻、５６０１〜５６０６ページ；Ｔｈｅｒｅｓｅ  Ｔｅｒｎｙｎｃｋら（１９９８年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、第１１巻、５１１〜５２１ページ；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９年）、第１０（１）巻、８７〜９３ページに記載されている。
【０１３４】
核膜および／または原形質膜を通した転移が可能なタンパク質由来の特定のドメインまたは配列は、突然変異誘発または欠失研究によっても同定されうる。別法として、候補配列を有する合成または発現されたペプチドをレポーターに連結させ、転移アッセイを行ってもよい。例えば、合成ペプチドにフルオレセインを結合させ、Ｖｉｖｅｓら（１９９７年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７２巻、１６０１０〜７ページに記載された方法によって、蛍光顕微鏡検査法で転移をモニターしてもよい。別法として、緑色蛍光タンパク質をレポーターとして用いてもよい（Ｐｈｅｌａｎら、１９９８年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１６巻、４４０〜３ページ）。
【０１３５】
上記のドメインもしくは配列、または転移活性を有すると同定されたドメインもしくは配列のいかなるものも、免疫グロブリンを細胞の細胞質中または核内に指向させるのに使用されうる。ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）としても知られる、上記のＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチドが好ましく、またＨＩＶ  Ｔａｔも好ましい。転移ペプチドは、本発明による単一ドメイン免疫グロブリンのＮ末端またはＣ末端に融合させてもよいが、Ｎ末端融合体が好ましい。
【０１３６】
ｅ）シグナルの生成
本発明の方法では、免疫グロブリンが標的に結合することによって、集合させられた２つの分子の相互作用によってシグナルが生成されることが有利である。したがって、生成されるシグナルは、本発明の方法で使用される分子の性質によるであろう。
【０１３７】
第１の実施形態では、シグナル生成分子が蛍光色素でもよい。特には、エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する蛍光分子が好ましい。
【０１３８】
ＦＲＥＴは、周波数の異なる蛍光を発する２つの蛍光標識が、相互に、１個の標識からもう一方の標識までエネルギーの移動が可能となるのに十分近接している場合に検出可能である。ＦＲＥＴは広く当技術分野で公知である（総説として、例えば、Ｍａｔｙｕｓ、１９９２年、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ：  Ｂｉｏｌ．、第１２巻、３２３〜３３７ページを参照されたい。この文献を参照により本明細書に組み込む）、ＦＲＥＴは、エネルギーが励起したドナー分子からアクセプター分子に移動する非放射性の過程であり、この移動の効率は、以下に記載されるように、ドナー分子とアクセプター分子との間の距離に依存している。このエネルギー移動の割合は、ドナーとアクセプターとの間の距離の６乗に逆比例するので、エネルギー移動効率は、距離の変化に極めて敏感である。エネルギー移動は、距離が１〜１０ｎｍの範囲において、検出可能な効率で起こると言われているが、これは、ドナーとアクセプターと良好な対では、通常４〜６ｎｍである。
【０１３９】
非放射性エネルギー移動は、蛍光色素の生物物理特性に基づいている。これらの原理は、他で総説されている（Ｌａｋｏｗｉｃｚ、１９８３年、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＪｏｖｉｎおよびＪｏｖｉｎ、１９８９年、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ、Ｅ．ＫｏｈｅｎおよびＪ．Ｇ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；これら両方を参照により本明細書に組み込む）。簡潔には、蛍光色素は、特有の波長で光エネルギーを吸収する。この波長は、励起波長としても知られている。蛍光色素によって吸収されたエネルギーは、この後、様々な経路で放出されるが、その１つが光子の照射であり、これによって蛍光が生じる。照射された光の波長は、発光波長として知られており、特定の蛍光色素に固有の特性である。非放射性エネルギー移動は、それによって、実際に光子を放出せずにある１つの蛍光色素の励起状態におけるエネルギーが第２の蛍光色素に移動する量子力学的過程である。そのエネルギーは、その後、第２の蛍光色素の発光波長で放出されうる。第１の蛍光色素は、通常、ドナー（Ｄ）と呼ばれ、励起状態のエネルギーは、アクセプター（Ａ）と呼ばれる第２の蛍光色素より高くなっている。この過程の重要な特徴は、アクセプターの励起スペクトルと、ドナーの発光スペクトルがオーバーラップすること、およびドナーとアクセプターとが十分に近接していることである。非放射性エネルギー移動が、効果的である距離は、ドナーの蛍光量子効率、アクセプターの消衰係数、それらのそれぞれのスペクトルのオーバーラップの程度、媒体の屈折率、および２個の蛍光色素の遷移モーメントの相対的配向を含めた多くの因子に依存する。蛍光色素の間の非放射性エネルギー移動を可能にするためには、もう一方の蛍光色素の励起波長とオーバーラップする最適の発光域を有することに加えて、ＤおよびＡの間の距離も十分に短くなくてはならない。
【０１４０】
ＦＲＥＴアッセイでは、これらの分子のうち一方（アクセプター分子）の励起スペクトルが励起した蛍光分子（ドナー分子）の発光スペクトルとオーバーラップするように、蛍光分子が選択される。ドナー分子は、ドナーの励起スペクトルの範囲にある適度の強度の光で励起される。ドナーは、その後、吸収したエネルギーの一部を蛍光として放出し、アクセプター蛍光分子へのＦＲＥＴによって、エネルギーの一部を消散する。ドナーが生成する蛍光エネルギーは、アクセプター蛍光分子によって消光される。ＦＲＥＴは、ドナーからの蛍光シグナル強度の減少、励起状態の寿命短縮、および、アクセプターの特性である、より長い波長（より低エネルギー）での蛍光の再発光としても現れうる。ドナーおよびアクセプター分子が空間的に分離した場合には、ＦＲＥＴは、減少するか、または消滅する。
【０１４１】
適当な蛍光色素は当技術分野で公知であり、これらには、化学蛍光色素と、ＧＦＰ、および、異なった波長または強度で蛍光を発するその突然変異体などの蛍光ポリペプチドとが含まれる（国際公開第ＷＯ９７／２８２６１号を参照）。化学蛍光色素は、その合成中にそれに対する結合部位を免疫グロブリンまたは標的分子に組み込むことによって、免疫グロブリンまたは標的分子に結合させてもよい。
【０１４２】
しかし、蛍光色素は蛍光タンパク質が好ましく、蛍光タンパク質はＧＦＰまたはその突然変異体が有利である。ＧＦＰおよびその突然変異体は、当技術分野で周知の方法に従って、免疫グロブリンまたは標的分子と共に、それらとの融合タンパク質として発現することによって合成してもよい。例えば、所望のＧＦＰと、免疫グロブリンまたは標的とのインフレーム融合として転写ユニットを構築し、従来のＰＣＲクローニング技法およびライゲーション技法を用いて上述の通りベクターに挿入してもよい。
【０１４３】
第２の実施形態では、免疫グロブリンおよび標的ポリペプチドは、生物学的シグナルを引き起こす分子と結合される。好ましいのは、ポリペプチド分子であり、相互作用して転写因子を形成するか、または、細胞内で遺伝子発現をモジュレーションする別の調節分子を形成するものが有利である。
【０１４４】
転写因子分子の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、２４５〜２４６ページなどの文献に記載されている。好ましい実施形態では、免疫グロブリン分子は、ＨＳＶ１  ＶＰ１６分子の活性化ドメインとの融合タンパク質として発現される。この転写因子ドメインは、ＤＮＡ結合活性を介してそれが結合するプロモーターからの遺伝子転写をアップレギュレートすることができる。後者は、大腸菌ＬｅｘＡポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって提供され、標的ポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。また、Ｇａｌ４  ＤＢＤなどの他のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を用いてもよく、様々な転写因子に由来する他の転写活性化ドメインを用いてもよい。ＬｅｘＡ、Ｇａｌ４、およびＶＰ１６の組合せは一般的に用いられている。ツーハイブリッドアッセイシステムの操作に関しては、次の文献に詳細に記載されている。Ｇｏｌｅｍｉｓ，Ｅ．Ａ．およびＳｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，Ｉ、Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年（以前はＭａｎｉａｔｉｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍａｎｕａｌ）。総説およびプロトコールの両方を含めて、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｐ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ、Ｉ．、Ｇ．Ｔｏｂｙ、Ｒ．Ｌ．Ｆｉｎｌｅｙ、およびＥ．Ａ．Ｇｏｌｅｍｉｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ。「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍ．Ｓｔａｒｋｅｙ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆａｓｈｅｎａ、Ｓ．Ｊ．、Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ、Ｉ．、およびＧｏｌｅｍｉｓ、Ｅ．Ａ．ＬｅｘＡ  ｂａｓｅｄ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ。「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｍ．Ｓｉｍｏｎ、Ｓ．Ｅｍｒ、Ｊ．Ｔｈｏｒｎｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ、Ｉ．、Ｍｉｔｉｎａ、Ｏ．、Ｃｈｅｒｎｏｆｆ、Ｊ．、およびＥ．Ａ．Ｇｏｌｅｍ、Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｄｕａｌ  ｂａｉｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅｓ。「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｒａｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ」、Ｃ．Ｊ．Ｄｅｒ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ。
【０１４５】
生物学的シグナルは、検出可能な遺伝子産物の発現誘導など、いかなる検出可能なシグナルでもよい。検出可能な遺伝子産物の例には、ルシフェラーゼおよびＧＦＰなどの生物発光性ポリペプチド、β−ガラクトシダーゼおよびＣＡＴなど、特異的なアッセイで検出可能なポリペプチド、および、ＨＩＳ３などの代謝に必要な酵素、または、Ｇ４１８などの抗生物質抵抗性遺伝子など、宿主細胞の増殖特性をモジュレーションするポリペプチドが含まれる。本発明の好ましい態様では、シグナルは細胞表面で検出可能である。例えば、シグナルは発光または蛍光のシグナルであってもよく、これらは、細胞外から検出可能であり、ＦＡＣＳまたは他の光学選別技法による細胞選別を可能にする。別法として、シグナルは、それ自体、例えば蛍光基で標識されるか、または標識抗体を用いて検出可能となりうるＣＤ分子、例えばＣＤ４またはＣＤ８などの細胞表面マーカーの発現を含んでもよい。
【０１４６】
この実施形態では、本発明は、所望の抗原に結合する抗体を単離するためにあらかじめファージ提示を適用することなく、ファージライブラリーなどの抗体ライブラリー全体のスクリーニングを可能にする。ＦＡＣＳなどの光学的選別を用いることによって、全ライブラリーのパニングを行って、細胞内で機能することができ、所望の標的に結合する抗体を選択することが可能となる。
【０１４７】
したがって、要約すると、本発明は、単一ドメイン実体が細胞内環境で標的に結合する能力を測定する方法であって、第１の分子および第２の分子の安定した相互作用がシグナルの生成を導く上記第１の分子および上記第２の分子を提供するステップと；上記第１の分子に結合する実体を提供するステップと；上記第２の分子に結合する標的を提供するステップであって、上記実体および上記標的の結合が、上記第１の分子および上記第２の分子の安定した相互作用を導き、上記シグナルを生成するステップと；上記シグナルをモニターすることによって、上記実体と上記標的との間の細胞内相互作用を評価するするステップとを含む方法に関する。好ましい実施形態では、この実体は単一ドメイン免疫グロブリン、好ましくは単一ドメイン抗体であり、かつ、この標的は抗原である。
【０１４８】
本発明を、例示のみを目的として、以下の実施例においてさらに記載する。
【実施例】
【０１４９】
迅速に単離でき、機能を妨害する試薬は、ヒトゲノムプロジェクトなどのゲノムプロジェクトにおける機能ゲノミクス部門の主要な構成要素である６。イントラボディーも、また、疾患における細胞内標的に対する魅力的な試薬であり、ｓｃＦｖの有効性がもつ限界を克服するために様々なアプローチが考案されている４，５，７，８。細胞内抗体捕獲（ＩＡＣ）技法は、免疫グロブリンＶ領域残基の足場を定義するのに有用であったが、これは特に、細胞機能において有利である４，９。ｓｃＦｖイントラボディーを使用する上での数的限界は、重鎖および軽鎖の組合せ効果であり、それによって、抗原特異的なイントラボディーの一次スクリーニングに、多様性が必要となることである。今までに確定しているものの中で最も小さい免疫グロブリンベースの認識ユニットは、単一可変ドメインであり１０、これは、スクリーニングの全体的な複雑さがｓｃＦｖより低くなるだろうという潜在的利点を有する１１，１２。本発明者らは、以前の研究で９、抗ＨＲＡＳ  ｓｃＦｖイントラボディーをＩＡＣ４，５によって単離したが、今回は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける個々のドメイン（すなわち、ＶＨまたはＶＬドメイン）の抗原に対する結合を試験した。抗体フラグメントは、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に連結されたＲＡＳ、またはＶＰ１６転写活性化ドメイン（ＡＤ）に連結されたイントラボディーフラグメントをコードするベクターと共に最小量のルシフェラーゼレポータークローンでＣＯＳ７細胞をトランスフェクトすることを含むルシフェラーゼレポーターアッセイ９で試験した。抗体発現性クローンを図１に図示する。イントラボディーの発現レベルを比較したところ、各ケースで同様のレベルのタンパク質が生成されたことを示した。イントラボディー−ＶＰ１６融合タンパク質をＤＢＤ−抗原と結合させた後にルシフェラーゼ活性化のレベルを比較した（図１）。重要なことに、最良のルシフェラーゼ活性化は、抗ＲＡＳ  ＶＨ単一ドメインフォーマットで実現された。例えば、抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ３３９由来のＶＨセグメント（図１、３３ＶＨ）は、親のｓｃＦｖクローン（図１、３３）よりも約５倍強くレポーター活性を刺激する。抗ＲＡＳ  ＶＬ単一ドメインは、全く活性化しなかった（３３ＶＬ）。さらに、システインコドン（ドメイン内ジスルフィド結合に関与）の突然変異は、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能に実質的な影響を与えなかった（クローンＩ２１Ｒ３３ＶＨ−Ｃ２２ＳおよびＩ２１Ｒ３３ＶＨ−Ｃ９２Ｓ）。したがって、抗原に対する抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ３３の結合は、ＶＨドメインのみを介して起こりうるものであり、今度はこのことによって、単一ドメインがイントラボディー機能のメディエーターかもしれないと示唆される。
【０１５０】
これらのデータは、抗原特異的なＩＤａｂの直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ単離を行うのに十分多様なイントラボディーライブラリーを作製するのに、以前に記載した最適のイントラボディーコンセンサスフレームワーク４，９に結合した単一ドメインイントラボディーフォーマット（ＩＤａｂ）を使用できるかもしれないことを示唆した。本発明者らは、酵母抗原抗体相互作用アッセイ４，５におけるｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング用に、そのようなライブラリーを作製した。Ｄａｂ−ＶＰ１６融合タンパク質をコードするように、様々なＶＨドメインを酵母ベクターにクローニングすることによって、２組のプールされたライブラリーを作製した（図２Ａ）。それらの一般的な有用性を確かめるために、それぞれのＤａｂライブラリーを、３種の異なった抗原、ＲＡＳ、ｐ５３、およびＡＴＦ−２（転写調節因子ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーのメンバー）でスクリーニングした。ＨＩＳ３遺伝子およびｌａｃＺレポーター遺伝子を有する酵母細胞を、ＬｅｘＡ  ＤＢＤに融合した抗原を発現する抗原ベイトクローンでトランスフェクトし、ＩＤａｂライブラリーでトランスフェクトした。各抗原によって、１００個を越えるＩＤａｂクローンが単離された（ただし、Ｄａｂライブラリー１では、ｐ５３ベイトで１６個のクローンしか得られなかった）（図２Ａ）。それぞれの抗原で発色が最も急速であった１０個のクローンをその後の研究用に選択した。同じ抗原で、選択されたクローンの中に、いくつかの同一のＩＤａｂが見つかった（例えば、抗ｐ５３クローン＃１０２、＃１０３、および＃１０９）。さらに、すべてのクローンについて調査したところ、クローン＃１、＃１４（ＲＡＳ選択より）、ならびに＃１０５および＃１０７（ｐ５３選択より）は、同一の配列を有しており、これらのクローンがＬｅｘＡ  ＤＢＤに結合したことを示唆した。これは、各ＩＤａｂクローンをそれぞれのベイトで再アッセイして、それぞれの抗原に対する特異性を測定することによって評価した（図２Ｂ）。
【０１５１】
ＩＤａｂの有効性は、哺乳類細胞で３つの転写トランス活性化アッセイを用いて試験した（図３）。ＩＤａｂは、ＣＯＳ７ルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した９。ＶＰ１６ＡＤに融合したＩＤａｂを発現するために、それぞれを哺乳類発現ベクター、ｐＥＦ−ＶＰ１６１３にクローニングした。ｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６構築物と、特異的なベイトまたはＧａｌ４ＤＢＤ−ＬｅｘＡ融合体を含むベイトのどちらかとで、ＣＯＳ７細胞を同時トランスフェクトした（図３Ａ）。一部のクローン、例えば抗ＲＡＳクローン＃６および＃１０は、レポーター活性に強い刺激を与えたが（図３Ａ、左上手パネル）、例えば抗ＲＡＳクローン＃３（右上手パネル）、または抗ＡＴＦ２クローン＃２７および＃２９（図３Ｂ）など、中程度の刺激しか与えなかったものもあった。興味深いことに、抗ＲＡＳクローン＃３は、他の抗ＲＡＳ  ＩＤａｂに比べて長いＣＤＲ３を有する（図２Ｂ）が、ルシフェラーゼ活性化は、ＨＲＡＳを介して示すのみで、Ｋ−ＲＡＳおよびＮ−ＲＡＳとでは示さない。その一方、抗ＲＡＳ  Ｄａｂクローン＃６、＃７、＃９、＃１０、＃１２、＃１３、＃１７、および＃１８は、３つの形態のＲＡＳに結合することができた（データは示されていない）。逆に、クローン＃１、＃２、＃４、＃１１、＃１４、＃１６、および＃１９は、ＬｅｘＡ抗原に対して有意にレポーター活性の増大を示した。
【０１５２】
抗ＲＡＳ  ＩＤａｂｓは、染色体ＣＤ４１４または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター（それぞれ、図３ＤおよびＥ）を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）で試験した。関係のない抗β−ｇａｌ  ｓｃＦｖＲ４１５を、ＲＡＳベイトと共にＣＨＯ−ＣＤ４で同時発現させたときには、レポーター活性化が観測されなかったが、ｓｃＦｖＲ４と、ｌａｃＺレポーターとを同時トランスフェクトしたときには、約１８％の細胞がＣＤ４発現を示した（図３Ｄ）。活性化はＲＡＳベイトでのみ観測されたので、抗ＲＡＳ  ＩＤａｂ３３（抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ３３９から改変されたオリジナルのＩＤａｂ）ＩＤａｂ＃６または＃１０（ＩＤａｂライブラリーに由来）をベイトと共に同時発現させた場合、ベイト特異性が逆転した（図３Ｄ）。ＧＦＰタンパク質の生成が抗原特異的な方法で起こるＣＨＯ−ＧＦＰ系を用いた際にも類似のデータが得られた（図３Ｅ）。これらの結果は、酵母Ｄａｂライブラリースクリーニング法を用いて、哺乳類細胞内での結合を促進するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏ特性が十分に良いＩＤａｂｓを選択できることを示す。
【０１５３】
選択された４個の抗ＲＡＳクローン＃３、＃１０、＃１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親和性を、バイオセンサを用いて、オリジナルのＤａｂ３３と比較した。ｓｃＦｖ３３のＫｄは、９．９７±８．８２ｎＭ（表１）であったが、これは本発明者らの以前の研究９と一致するものである。突然変異したｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ（抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ３３のフレームワークがＩ２１「コンセンサス」ＶＨに突然変異しているが、Ｉ２１  ＶＬ配列を保持している）は、ｓｃＦｖ３３の親和性（Ｋｄ  １８．１９±１．８５ｎＭ）を維持しており、ＶＨ抗原相互作用が最高に重要であることと一致している。ｓｃＦｖ３３のＶＨでＤａｂを作製したときには、親和性の低減が観測され、オリジナルのｓｃＦｖ３３よりほぼ１桁弱い親和性を示した（表１；Ｋｄ  ９０．１３±９．７０ｎＭ）。これは、ＶＨは単独で特異性を維持するが、ｓｃＦＶのＶＬドメインは抗原の認識に補助的な役割を果たすことを示唆する。抗ＲＡＳ  Ｄａｂクローン＃３、＃１０、および＃１２のＫｄは、それぞれ１８２．９８±７．１９ｎＭ、１２１．４５±４６．６ｎＭ、２６．６５±２．９０ｎＭであった。したがって、Ｄａｂ３３も含めて、抗ＲＡＳ  Ｄａｂでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの親和性（これは「実際」の抗体抗原相互作用を示す）と、ｉｎ  ｖｉｖｏの活性（これには、ｉｎ  ｖｉｖｏ溶解性、安定性、発現レベルを含めたいくつかの因子が関与する総合的な抗体抗原相互作用を示す）との間には相関関係がない。
【０１５４】
イントラボディーの主目的は、細胞内でタンパク質の機能を妨害することである。発癌性ＲＡＳの機能は、腫瘍における構成的なシグナル伝達を介して媒介されるが、これは突然変異体ＲＡＳ（ＨＲＡＳＧ１２Ｖ）をＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入することによって模擬でき、この結果、集密な細胞培養における接触阻害および増殖巣形成の減失がもたらされる。形質転換に対するＩＤａｂの影響は、イントラボディーの存在下または非存在下で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＨＲＡＳＧ１２Ｖでトランスフェクトすることによって評価した（図４）。ＨＲＡＳＧ１２Ｖをコードする発現クローンを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトしたときには、形質転換クローンが検出された（図４Ａ）が、ベクターだけがトランスフェクトされたときには、細胞はそれらの接触阻害を保持した。突然変異体ＲＡＳの形質転換能は、ｓｃＦｖＩ２１と共に同時トランスフェクトしても、影響を受けなかった（ｓｃＦｖは、哺乳類アッセイでいかなる検出可能なＲａｓ結合も示さない９）（図４ＡおよびＢ）。逆に、ＨＲＡＳＧ１２Ｖを抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、ｓｃＦｖが抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ３３のＶＨと、Ｉ２１のＶＬとを含む９）と共に同時発現したときには、形質転換の消失が起こり、ＨＲＡＳＧ１２Ｖのみと比較して、増殖巣が若干約２０％しかなかった（図４Ｂ）。２個の抗ＲＡＳ  ＩＤａｂをこのアッセイで試験した。哺乳類レポーターアッセイにおけるこれらの刺激を考慮して、Ｄａｂ＃６および＃１０を選択した（図３）。これらのＩＤａｂｓは、抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖと同様に挙動し、形質転換指数に阻害作用を示した。抗ＲＡＳ  Ｄａｂ＃６および＃１０は、発癌性ＨＲＡＳＧ１２Ｖの形質転換活性を陽性対照（図４Ｂ）の約１０％にまで低下させ、ＩＤａｂ選択法によって、タンパク質機能を妨害するのに十分良いｉｎ  ｖｉｖｏ特性を有する試薬を生成できることを示した。
【０１５５】
イントラボディーをｉｎ  ｖｉｖｏで用いる目的は、抗原結合性を通して生物学的応答を引き出すことであり、これには機能的ゲノム研究および治療における応用の可能性がある。これらの目的を達するには、そのようなイントラボディーフラグメントを同定する強力、迅速、かつ簡便な操作法が必要である。多様性のあるイントラボディーライブラリーをｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有するものを直接単離する本発明者らの発現戦略９は、細胞内試薬としては、ｓｃＦｖより、単一ドメイン（この場合、ＶＨ単独、ただしＶＬも同様の特性を有し得る）の方が、抗原特異的な分子セットを生成するのに効果的でありうることを示す。単一ドメインイントラボディーは、現在のところ、細胞内治療適用の可能性を有する、最も小さい抗体ベースの認識ユニットである。ＩＡＣ技術４，５，９を単一ドメインライブラリーに適用することには、ファージ抗体ライブラリーをスクリーニングするステップを回避するという即時的な利点がある。本発明者らの細胞内コンセンサスＶＨフレームワーク配列４，９は、保存されたドメイン内ジスルフィド結合を伴わず９に、発現、溶解性、機能性など、細胞内で機能するための理想的な特性を示すので、特異的細胞内ライブラリーを多様化するのに適したフレームワークとして、これらの配列を使用することは、ＩＤａｂライブラリーの有効性を増強する特徴を追加するものである。最後のキーポイントとして、ＩＤａｂライブラリーの直接的スクリーニングでは、抗原ベイトをｉｎ  ｖｉｖｏで生成するのにＤＮＡ配列のみが必要であるため、イントラボディーを同定するのに抗原精製を行う必要がないことが挙げられる。これは、ゲノム配列から新規のオープンリーディングフレームが生み出され、機能に関するデータが求められている機能ゲノミクスでの適用においてとりわけて利点がある。したがって、ＩＤａｂは、新規の治療法および機能ゲノミクス研究における主要なツールとして機能する有力な候補である。
【０１５６】
方法
プラスミド
すでに記載したプラスミドは、ｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ、ｐＭ１−ＬａｃＺ、ｐＥＦ−ＶＰ１６−ｓｃＦｖ３３（抗ＲＡＳ）、ｐＥＦ−ＶＰ１６−ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３（抗ＲＡＳ）９、ｐＥＦ−ＶＰ１６−ｓｃＦｖＲ４（抗ｌａｃＺ）ｐＧ５−Ｌｕｃ４、ｐＢＴＭ−ＡＴＦ−２１６、およびｐＧ５ＧＦＰ−ｈｙｇ（ＣＨＯ−ＧＦＰ用）１７である。ｐＲＬ−ＣＭＶは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｔｄ．から入手した。
【０１５７】
哺乳類発現クローンｐＥＦ−３３ＶＨ−ＶＰ１６、ｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ−ＶＰ１６、ｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＣ２２Ｓ−ＶＰ１６、またはｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＣ２２Ｓ−ＶＰ１６をクローニングするために、それぞれのＶＨドメインフラグメントを、ＰＣＲによって親のｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６からオリゴヌクレオチド、ＥＦＦＰ  ５’−ＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣ−３’およびＮｏｔＶＨＪＲ１’  ５’−ＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ−３’を用いて増幅して、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩクローニング部位を導入し、さらにｐＥＦ−ＶＰ１６１３のＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。哺乳類発現クローンｐＥＦ−３３ＶＬ−ＶＰ１６、ｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＬ−ＶＰ１６をクローニングするために、それぞれのＶＬドメインフラグメントを、ＰＣＲによって親のｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６から、ＶＬＦ１  ５’−ＡＴＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ−３’およびＶＰ１６２Ｒ、５’−ＣＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＡ−３’を用いて増幅して、ＮｃｏＩクローニング部位を導入し、さらにインフレームでｐＥＦ−ＶＰ１６のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。ｐＢＴＭ−ｐ５３ｗｔおよびｐＭ１−ｐ５３ｗｔは、ｐＧＢＴ９−ｐ５３ｗｔ１８からのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＴＭ１１６１９またはｐＭ１ベクター２０にサブクローニングすることによって生成した。ｐＥＦ−Ｄａｂ−ＶＰ１６は、単離されたｐＶＰ１６＊−Ｄａｂ（下記参照）のそれぞれのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＥＦ−ＶＰ１６にクローニングすることによって作製した。ベイトｐＭ１−ＡＴＦ−２は、ｐＢＴＭ−ＡＴＦ−２１６からのＳｍａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭ１ベクター２０にサブクローニングすることによって作製した。ｐＭ１−ＬｅｘＡ  ＤＢＤクローンは、ｐＢＴＭ１１６ベクターからＢＬＥＸＡＦ２、５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧ−３’、およびＢＡＭＬＥＸＡＲ  ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣ−３’を用いてＬｅｘＡフラグメントをＰＣＲで増幅して、さらに、ｐＭ１ベクターのＢａｍＨＩ部位にインフレームでクローニングすることによって作製した。
【０１５８】
ペリプラズム発現用には、ｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−Ｄａｂ−ＶＰ１６のそれぞれのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＨＥＮ２ファージミドにクローニングすることによって、ｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖまたはＤａｂベクターを作製した（マップは、ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋを参照）。ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖは、ｐＥＸＴ−ＨＲＡＳからのＨＲＡＳＧ１２Ｖ突然変異体ｃＤＮＡのコード配列をｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）ベクター２１にクローニングすることによって作製した。
【０１５９】
ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−Ｄａｂクローンは、ｐＥＦ−Ｄａｂ−ＶＰ１６のＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂベクター９にクローニングすることによって作製した。上記構築物すべてをシーケンシングによって確認した。
【０１６０】
Ｄａｂ酵母ライブラリーの構築
酵母ｐＶＰ１６＊Ｄａｂライブラリーの構築は、他に詳述されている通りに実行した１３。この操作法は、ｓｃＦｖ６２５（正準イントラボディーＶＨコンセンサスフレームワーク４と、抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖ３３のＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３とを含む）またはｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３（抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３由来のコンセンサスフレームワークを含む）９のＶＨセグメントＣＤＲ２および３をランダム化するフットプリント突然変異誘発を含む。これらのテンプレートは、ｐＶＰ１６＊ベクターにサブクローニングした２２，２３。ライブラリーの多様化を実現するために、２対のオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲで、２つのＶＨドメインを、別々に増幅した。
【０１６１】
テンプレートｓｃＦｖ６２５（コンセンサスＶＨ）については、ＥＦＦＰ２およびｃｏｎＣＤＲ２Ｒ、ならびにｃｏｎＣＤＲ２ＦおよびｒｄｍＣＤＲ３Ｒ、
テンプレートｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３（Ｉ２１  ＶＨ）については、ＥＦＦＰ２および３３ＣＤＲ２Ｒ、ならびに３３ＣＤＲ２ＦおよびｒｄｍＣＤＲ３Ｒ。
【０１６２】
プライマー配列：
テンプレートｓｃＦｖ６２５
ＥＦＦＰ２：５’−ＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧ−３’、これはｐＥＦ−ＶＰ１６のＥＦ−１αプロモーター領域でアニールする。  
ｃｏｎＣＤＲ２Ｒ：５’−ＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＧＴＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＣＴＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣ−３’
ｃｏｎＣＤＲ２Ｆ：５’−ＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧ−３’、これはプライマーｃｏｎＣＤＲ２Ｒの一部とハイブリダイズする。  
ｒｄｍＣＤＲ３Ｒ：５’−ＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡ（ＭＮＮＭＮＮ）ｎＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧ−３’（ＣＤＲ３に可変長を与えるために、また、ＣＤＲ３をランダム化するために、ｎは１から６まで変動させた)。
【０１６３】
テンプレートｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３
ＥＦＦＰ２：５’−ＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧ−３’
３３ＣＤＲ２Ｒ：５’−ＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＣＴＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣ−３’
３３ＣＤＲ２Ｆ：５’−ＡＴＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧ−３’
ｒｄｍＣＤＲ３Ｒ：５’−ＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡ（ＭＮＮＭＮＮ）ｎＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧ−３’
【０１６４】
増幅産物をアガロースゲルで分離、精製し、第２のＰＣＲ増幅を、ＥＦＦＰ２およびＪＨ５Ｒ（５’−ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣ−３’）を用いて行った。このＰＣＲでは、２つのフラグメントを組み合わせて、増幅させた。最終ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲは、ＥＦＦＰおよびＮｏｔＶＨＪＲ１（ＮｏｔＩ制限部位を組み込む）を用いて行った。最終ＰＣＲ産物を、ＳｆｉＩおよびＮｏｔ１Ｉで消化し、酵母ｐＶＰ１６＊ベクターに連結させ、２つのｐＶＰ１６＊−Ｄａｂライブラリー１を作製した。連結させたＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエレクトロポレーションで導入した。Ｉ２１Ｒ３３由来ライブラリー１の多様性は２ｘ１０６であり、コンセンサスライブラリー１は１．４ｘ１０６であった（すなわち、合計の多様性３．４Ｘ１０６）。
【０１６５】
第１のＤａｂライブラリーそれぞれからのＣＤＲ１を、同様のフットプリント突然変異誘発ストラテジー１３でランダム化することによって、Ｄａｂライブラリー２を構築した。それぞれのＤａｂライブラリー１のＶＨドメインを、２対のオリゴヌクレオチド、ｓＦｖＶＰ１６ＦおよびｒｄｍＣＤＲ１Ｒ、ならびにＣＤＲ１ＦおよびＶＰ１６２Ｒを用いて、別々にＰＣＲで増幅した。
【０１６６】
ｓＦｖＶＰ１６Ｆ：５’−ＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧ−３’、これはｐＶＰ１６＊のＡＤＨ１プロモーター領域とハイブリダイズする。  
ｒｄｍＣＤＲ１Ｒ：５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＭＮＮＣＡＴＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧ−３’、これはＣＤＲ１内の４つのアミノ酸残基をランダム化する。  
ＣＤＲ１Ｆ：５’−ＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧ−３’、これはｒｄｍＣＤＲ１Ｒの一部とハイブリダイズする。  
ＶＰ１６２Ｒ：これはｐＶＰ１６＊のＶＰ１６アクチベータードメインとハイブリダイズする。
【０１６７】
２つのＰＣＲフラグメントを組み合わせ、ｓＦｖＶＰ１６ＦおよびＶＰ１６２Ｒを用いて増幅し、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化して、酵母ｐＶＰ１６＊ベクターに連結した。ライブラリー２のそれぞれの多様性は、Ｉ２１Ｒ３３由来ライブラリーが３．０４ｘ１０７、そしてコンセンサス由来ライブラリーが２．２１５ｘ１０７であった（すなわち、合計の多様性  ５．２５ｘ１０７）。
【０１６８】
１２クローンを、各ライブラリーから無作為に選択して、インサートとＣＤＲの正しい挿入を確かめるため配列決定した。
【０１６９】
Ｄａｂライブラリーの細胞内抗体捕獲（ＩＡＣ）スクリーニング
合成Ｄａｂライブラリーのスクリーニングは、記載４，９の通り、イントラボディー捕捉（ＩＡＣ）技術のプロトコールに従って行ったが、ファージパニングのステップは除外した（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ内のリンクも参照）。５００μｇのｐＢＴＭ１１６−抗原、および１ｍｇのプールされたｐＶＰ１６＊−Ｄａｂライブラリー１、またはプールされたｐＶＰ１６＊−Ｄａｂライブラリー２をサッカロミセス・セレビシアエＬ４０に同時トランスフェクトした。陽性クローンを、栄養要求性マーカー、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、およびＨｉｓを用いて選択した。陽性コロニーを、Ｈｉｓのプロトトロピで選択し、フィルターアッセイでβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性によって確認した。選択された個々のクローンにおいて、関係のあるベイトベクターと関係のないベイトベクターとを用いて、Ｈｉｓ非依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化を再試験することによって偽陽性クローンを排除した。β−ｇａｌフィルターアッセイで青色の発色が最も早かった１０個の二重陽性クローンの配列決定を行った。
【０１７０】
哺乳類ルシフェラーゼレポーターアッセイ
この操作法は以前に詳細に記載されている４，９。簡潔には、ｓｃＦｖまたはＤａｂをｐＥＦ−ＶＰ１６発現ベクターにクローニングし、抗原をｐＭ１ベクター２０にクローニングした。８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従って、ＣＯＳ７細胞を５００ｎｇのｐＧ５−Ｌｕｃ、５０ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、５００ｎｇのｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−Ｄａｂ−ＶＰ１６、および５００ｎｇのｐＭ１−抗原ベイトで一過的に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、洗浄し、溶解させ、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルミノメータでアッセイした。トランスフェクション効率は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性で正規化した。データは、それぞれ二重で行われた２つの実験を表す。ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはＤａｂ−ＶＰ１６融合タンパク質の発現を確認するために、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その後、一次抗体として抗ＶＰ１６（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４−５）モノクローナル抗体、二次抗体としてのＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡＰＢ））を用いてウェスタンブロットを行った。このブロットは、ＥＣＬ検出キット（ＡＰＢ）で可視化された。
【０１７１】
ＣＤ４およびＧＦＰレポーターＣＨＯ細胞における哺乳類ツーハイブリッドアッセイ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含む最小必須培地α（α−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。ＣＨＯ−ＣＤ４系１４を用いたＦＡＣＳ分析は、以前の記載２４の通りに行った。ＣＨＯ−ＧＦＰ系を確立するために、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）を用いてｐＧ５ＧＦＰ−Ｈｙｇベクター１７をＣＨＯ親系にトランスフェクトし、細胞を７日間、０．３ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン含有のα−ＭＥＭ中で選択し、ＣＨＯ−ＧＦＰの安定クローン３９ａを以降のアッセイ用に選択した。ＦＡＣＳアッセイには、３ｘ１０５のＣＨＯ−ＣＤ４またはＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を、トランスフェクションの１日前に６ウェルプレートに接種し、０．５μｇのｐＭ１−抗原と、１μｇのｐＥＦ−ＶＰ１６−ｓｃＦｖまたはＤａｂをこれらの細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、洗浄、分離して、ＰＢＳ中に再懸濁した。ＣＨＯ−ＣＤ４アッセイでは、抗ヒトＣＤ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と、第２層としてＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とを用いて、細胞表面ＣＤ４発現の誘導を検出した。ＣＨＯ−ＣＤ４またはＣＨＯ−ＧＦＰ細胞の相対的な蛍光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定し、データはＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアで分析した。
【０１７２】
Ｄａｂフラグメントの精製および親和性測定
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ用には、Ｄａｂは、以前の記載９の通り、細菌性ペリプラズムから発現させた。ペリプラズム発現と、Ｈｉｓタグおよびｍｙｃタグとのために、Ｄａｂフラグメントを、ｐｅｌＢリーダー配列を含有するｐＨＥＮ２ベクターにクローニングした。１リットルの培地中で、４時間、３０℃で、Ｄａｂを発現させた。細胞を収集し、１０ｍｌの冷ＴＥＳ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ、およびスクロース）で抽出を行った。透析の後、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いてＤａｂフラグメントを精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器（ＹＭ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮し、アリコートを−７０℃で保存した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、製造業者の指示に従って、タンパク質濃度を測定した。ｓｃＦｖおよびＤａｂの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００測定器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）で、以前の記載９の通り表面プラズモン共鳴法を用いて測定した。動力学速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）は、製造業者によって供給されたソフトウェアを用いて評価した。Ｋｄ値は、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ速度定数から計算した（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。すべての測定を二重で行った。
【０１７３】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞における形質転換アッセイ
継代の少ないＮＩＨ３Ｔ３細胞クローンＤ４（Ｄｒ  Ｃ．Ｍａｒｓｈａｌｌからの寛大なギフト）をトランスフェクションの前日に６ウェルプレートに１ウェルあたり２ｘ１０５細胞で接種した。トランスフェクションのために、２μｇのｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖまたはｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−Ｄａｂベクター、１００ｎｇのｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖベクターと、１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）とを用いた。トランスフェクションの２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移した。集密に達した後に、それらを、５％ドナーウシ血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中に２週間保持した。接触阻害の減失による増殖巣形成を、クリスタルバイオレットでプレートを染色して計数した。
【表１】
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【０１７４】
細菌でタンパク質を発現させたが、精製されたＤａｂタンパク質の最終収量はかなり低かった（１リットル培養あたり最大０．５ｍｇ）。これはおそらく、疎水性ＶＬインタフェースが露出しているため、高濃度ではＤａｂの「粘性」が高く、凝集するためである２５。バイオセンサ測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて行った。表に会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）、ならびにＢＩＡ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．１ソフトウェアで計算された平衡解離定数（Ｋｄ）の値をまとめる。Ｄａｂ濃度が高いときには、Ｄａｂと抗原との非特異的な相互作用がわずかに検出された。
【０１７５】
参考文献
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【０１７６】
上記明細書で参照されたすべての刊行物を参照により本明細書に組み込む。記載された方法および本発明のシステムの様々な改変および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されたが、請求されている本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実行するために記載された態様の様々な改変は、分子生物学または関連分野の当業者には明らかなものであり、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、哺乳類細胞におけるＲＡＳタンパク質と、抗ＲＡＳ  ｓｃＦｖイントラボディーおよび単一ドメイン誘導体との相互作用を示す。
【図２】図２は、合成単一ドメインライブラリーを用いた細胞内抗体捕獲を示す。
【図３−１】図３−１及び図３−２は、哺乳類細胞における単一ドメインイントラボディーと抗原との相互作用を示す。
【図３−２】図３−１及び図３−２は、哺乳類細胞における単一ドメインイントラボディーと抗原との相互作用を示す。
【図４】図４は、ＲＡＳに媒介されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の発癌性形質転換に対する抗ＲＡＳ単一ドメインイントラボディーによる阻害を示す。
【図５Ａ−１】図５Ａ−１及び図５Ａ−２は、細胞内ｓｃＦｖの派生タンパク質配列のアライメントであって、抗ＢＣＲ（Ｂ３〜Ｂ８９と命名された）および抗ＡＢＬ（Ａ５〜Ａ３２と命名された）からのＶＨおよびＶＬ配列を示す。
【図５Ａ−２】図５Ａ−１及び図５Ａ−２は、細胞内ｓｃＦｖの派生タンパク質配列のアライメントであって、抗ＢＣＲ（Ｂ３〜Ｂ８９と命名された）および抗ＡＢＬ（Ａ５〜Ａ３２と命名された）からのＶＨおよびＶＬ配列を示す。
【図５Ｂ−１】図５Ｂ−１及び図５Ｂ−２は、細胞内ｓｃＦｖの派生タンパク質配列のアライメントであって、選択されなかったファージディスプレイライブラリーから無作為に取得したｓｃＦｖの配列比較を示す。
【図５Ｂ−２】図５Ｂ−１及び図５Ｂ−２は、細胞内ｓｃＦｖの派生タンパク質配列のアライメントであって、選択されなかったファージディスプレイライブラリーから無作為に取得したｓｃＦｖの配列比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【国際調査報告】
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