(57)【要約】本発明は、生体の臓器または組織の損傷などの処置において、自己化するような組織片を提供することに関する。従来は細胞を含ませることが必要であると考えられていた移植のための組織片の代わりに、生体分子と支持体とを含む生体適合性組織片を用いると、上述のような自己化する性質を具備することを予想外に発見したことにより上記課題を解決した。したがって、本発明は、生体適合性組織片であって、Ａ）生体分子；およびＢ）支持体、を含む、生体適合性組織片を提供する。本発明はまた、Ａ）粗面を有する第一層；およびＢ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を提供する。
2006508773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性組織片であって、
Ａ）生体分子；および
Ｂ）支持体、
を含む、生体適合性組織片。
【請求項２】
前記生体分子は、タンパク質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３】
前記生体分子は、細胞生理活性物質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項４】
前記生体分子は、細胞接着分子を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項５】
前記生体分子は、細胞外マトリクスを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項６】
前記生体分子は、細胞接着性タンパク質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項７】
前記生体分子は、インテグリンを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項８】
前記生体分子は、コラーゲンおよびラミニンからなる群より選択される、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項９】
前記生体分子は、繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１０】
前記生体分子は、繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１１】
前記生体分子は、コラーゲンＩ型またはＩＶ型を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１２】
前記生体分子は、コラーゲンおよびサイトカインを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１３】
前記支持体は、膜状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１４】
前記支持体は、管状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１５】
前記支持体は、弁状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１６】
前記支持体は、生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１７】
前記支持体は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１８】
前記支持体は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１９】
前記支持体は、細胞接着分子を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２０】
前記支持体は、タンパク質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２１】
前記支持体は、メッシュ状およびスポンジ状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２２】
前記支持体は、少なくとも約０．２ｍｍ〜約１．０ｍｍ厚である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２３】
前記支持体は、少なくとも約２０Ｎ以上の強度を有する、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２４】
前記支持体は、少なくとも約５０Ｎ以上の強度を有する、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２５】
前記支持体は、前記生体分子でコーティングされている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２６】
前記支持体は、隙間を有し、該隙間が前記生体分子で埋められている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２７】
前記生体分子および前記支持体は、架橋可能な分子を含み、該架橋可能な分子は、該支持体と該生体分子との間で架橋処理されている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２８】
前記支持体は、前記生体分子と同じ物質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２９】
さらに、細胞が付着した、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３０】
体内への移植用である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３１】
前記体内における移植されるべき部位は、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管からなる群より選択される、請求項３０に記載の生体適合性組織片。
【請求項３２】
滅菌されている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３３】
免疫抑制剤をさらに含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３４】
さらなる医薬成分をさらに含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３５】
前記生体適合性組織片は、前記移植を目的とする生体に由来する、請求項３０に記載の生体適合性組織片。
【請求項３６】
請求項１に記載の生体適合性組織片を含む、医薬。
【請求項３７】
請求項１に記載の生体適合性組織片および該組織片の使用法を示した指示書を含む、医薬キットであって、該指示書には、所定の部位に該組織片を投与することが記載される、医薬キット。
【請求項３８】
前記所定の部位は、血管内皮、血管平滑筋、弾性線維、骨格筋、心筋、骨芽細胞、神経細胞および膠原線維からなる群より選択される、請求項３７に記載の医薬キット。
【請求項３９】
前記指示書には、前記生体適合性組織片を、移植を目的とする臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植することが記載される、請求項３７に記載の医薬キット。
【請求項４０】
体内における損傷部位を処置する方法であって、
Ａ）該損傷部位の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含む、生体適合性組織片を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記移植工程において、前記生体適合性組織片は、前記損傷部位が属する臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞生理活性物質を投与する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞生理活性物質は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、免疫グロブリンファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、シンデカン、アグリカン、インテグリンファミリーのメンバー、インテグリンα鎖、インテグリンβ鎖、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、セレクチン、カドヘリン、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ならびにそれらに関連するポリペプチドおよびペプチドからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
免疫反応を抑制する処置を行う工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
体内における臓器または組織を強化する方法であって、
Ａ）該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含む、生体適合性組織片を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
臓器または組織を生産または再生する方法であって、
Ａ）目的とする臓器または組織を含む生体において、該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含む、生体適合性組織片を移植する工程；ならびに
Ｂ）該臓器または組織を該生体内で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における損傷部位を処置するための使用。
【請求項４８】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における臓器または組織を強化するための使用。
【請求項４９】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用。
【請求項５０】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用。
【請求項５１】
生体適合性組織支持体であって、
Ａ）粗面を有する第一層；および
Ｂ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、支持体。
【請求項５２】
前記第一層は、編物である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５３】
前記第二層は、織物である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５４】
前記粗面は、細胞が入り込むに充分なスペースを有する、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５５】
前記封着は、生体吸収性高分子を融着することにより達成される、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５６】
前記第二層は、通気性が実質的に遮断される、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５７】
前記支持体の強度は、少なくとも１００Ｎである、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５８】
前記支持体の通気性は、１０ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５９】
前記第一層は、生体分解性材料を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６０】
前記第一層は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６１】
前記第一層は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６２】
前記第一層は、ポリグリコール酸を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６３】
前記第二層は、生体分解性材料を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６４】
前記第二層は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６５】
前記第二層は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６６】
前記第二層は、ポリＬ乳酸を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６７】
前記第二層は、織物であり、前記第一層は編物である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６８】
前記第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、前記第一層は、ポリグリコール酸の編物である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６９】
前記接着は、Ｃ）前記第一層と前記第二層とを封着する中間層による、支持体。
【請求項７０】
前記中間層は、合成生体吸収性ポリマーである、請求項６９に記載の支持体。
【請求項７１】
前記中間層は、乳酸（ラクチド）、グリコリドおよびε−カプロラクタムからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーのホモポリマーまたはそれらの２つ以上を含むコポリマーを含む、請求項６９に記載の支持体。
【請求項７２】
前記中間層を構成する材料は、前記第二層および前記第一層の両方の融点よりも低い融点を有する、請求項６９に記載の支持体。
【請求項７３】
前記第一層は、複数の編物層を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項７４】
前記第二層は、複数の織物層を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項７５】
前記第一層に、生体分子が配置される、請求項５１に記載の支持体。
【請求項７６】
前記生体分子は、細胞外マトリクスである、請求項７５に記載の支持体。
【請求項７７】
前記生体分子は、コラーゲンおよびラミニンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、請求項７５に記載の支持体。
【請求項７８】
前記生体分子は、マイクロスポンジに含ませて第一層に配置される、請求項７５に記載の支持体。
【請求項７９】
前記生体分子は、前記支持体と架橋処理されている、請求項７５に記載の支持体。
【請求項８０】
請求項５１に記載の支持体を含む、医薬。
【請求項８１】
細胞をさらに含む、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８２】
体内への移植用途に使用される、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８３】
前記体内における移植されるべき部位は、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管からなる群より選択される、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８４】
前記生体分子は、前記移植を目的とする生体に由来する、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８５】
Ａ）粗面を有する第一層；および
Ｂ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を製造する方法であって、
該第一層と該第二層とを接着する工程、
を包含する、方法。
【請求項８６】
前記接着は、Ｃ）該第一層と該第二層とを封着する中間層により達成され、前記接着は、
ａ）該第一層と該第二層との間に該中間層を提供する工程；
ｂ）該第一層と該第二層とが融解せず、該中間層が融解する条件に該第一層、該第二層および該中間層を配置する工程；および
ｃ）該第一層、該第二層および該中間層を所望の形状に保持しながら該中間層が固化する条件に配置する工程、
を包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記融解する条件は、温度による違いを利用し、前記第一層および前記第二層の両方の融点より前記中間層の融点が低い、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、前記第一層は、ポリグリコール酸の編物であり、前記中間層は、乳酸（ラクチド）、グリコリドおよびε−カプロラクタムからなる群より選択される少なくとも１つのホモモノマーのポリマーまたはそれらの２つ以上を含むコポリマーを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記温度は、前記中間層の融点よりも高く、前記第一層および前記第二層のそれぞれの融点よりも低い、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記支持体は、さらに生体分子を含み、前記生体分子を前記第一層に付着させる工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記付着は、架橋処理を包含する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記生体分子はコラーゲンであり、前記付着は、コラーゲン架橋処理を包含する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記中間層は、ガラス上にキャストした後風乾してフィルムを作成することによって製造される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記ｂ）工程は、少なくとも約０．１ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることを包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｂ）工程は、少なくとも約０．５ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることを包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
体内における損傷部位を処置する方法であって、
Ａ）該損傷部位の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項９７】
体内における臓器または組織を強化する方法であって、
Ａ）該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
臓器または組織を生産または再生する方法であって、
Ａ）目的とする臓器または組織を含む生体において、該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程；ならびに
Ｂ）該臓器または組織を該生体内で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項９９】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための使用。
【請求項１００】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための使用。
【請求項１０１】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用。
【請求項１０２】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性組織片、そのような組織片の製造および利用のための方法、ならびに関連する医薬および治療方法に関する。以下に発明の詳細な説明を記載する。
【背景技術】
【０００２】
臓器（例えば、心臓、血管など）の移植に外来性組織を使用する際の主な障害は免疫拒絶反応である。同種異系移植片（または同種移植片、ａｌｌｏｇｒａｆｔ）および異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）で起こる変化が最初に記述されたのは９０年以上前のことである（Ｃａｒｒｅｌ  Ａ．，１９０７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ９：２２６−８；Ｃａｒｒｅｌ  Ａ．，１９１２．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ９：３８９−９２；Ｃａｌｎｅ  Ｒ．Ｙ．，１９７０，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ２：５５０；およびＡｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ  １９８８，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４６：１）。動脈移植片の拒絶反応は、病理学的には移植片の拡張（破裂に至る）または閉塞のいずれかを招く。前者の場合、細胞外マトリクスの分解により生じ、他方で、後者は血管内細胞の増殖により起こるといわれている（Ｕｒｅｔｓｋｙ  ＢＦ，Ｍｕｌａｒｉ  Ｓ，Ｒｅｄｄｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７６：８２７−３４）。
【０００３】
従来、これらの物質の拒絶反応の軽減を目指して２つの戦略が採用されてきた。ひとつは、宿主の免疫反応を低下させた（Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｒｉｘｅｎ  Ｔ，Ｍｅｇｅｒｍａｎ  Ｊ，Ｃｏｌｖｉｎ  ＲＢ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＭ，Ａｂｂｏｔ  Ｗ．，１９８８，Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ７：８２−９２；およびＰｌｉｓｓｏｎｎｉｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｔｈｒｏｍｂ  １３：１１２−９）。もうひとつは主に架橋結合により同種移植片または異種移植片の抗原性の低下を図った（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９５６，Ｓｕｒｇ  Ｆｏｒｕｍ  ６：２４２−６；およびＤｕｍｏｎｔ  Ｃ，Ｐｉｓｓｏｎｎｉｅｒ  Ｄ，Ｍｉｃｈｅｌ  ＪＢ．，１９９３，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ５４：６１−６９）。細胞外マトリクスの架橋結合は移植片の抗原性を低下させるが、生体工学的機能（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ＤＭ，Ｌｙｔｌｅ  ＢＷ，Ｇｏｌｄｉｎｇ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ６４：１７２−１７６；およびＢｒｏｏｍ  Ｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ＧＷ．，１９８２，Ｉｎ：Ｃｏｈｎ  ＬＨ，Ｇａｌｌｕｃｃｉ  Ｖ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ  Ｐａｇｅｓ  ４７６−４９１）が変化し、無機質化に感受性を示すようになる（Ｓｃｈｏｅｎ  ＦＪ，Ｌｅｖｙ  ＲＪ，Ｐｉｅｈｌｅｒ  ＨＲ．，１９９２，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９９２；１：２９−５２）。
【０００４】
心血管修復用パッチとしては従来からグルタールアルデヒド処理した異種心膜や自己心膜を用いているが、石灰化・血栓形成・易感染性・耐久性等解決されなければならない問題がある．これらの問題を解決するために組織工学を応用して，より生体適合性の高い心血管修復用人工パッチ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｐａｔｃｈ）が開発されつつある。
【０００５】
移植片に細胞をコーティングしたものを移植する試みも行われている（新岡俊治、今井康晴、瀬尾和宏ほか；テッシュエンジニアリングによる心血管材料の開発、応用。日心臓血管外会誌２０００；２９：３８およびＪ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １９９８；１１５；５３６−４６）。しかし、細胞がうまくコーティングされないという問題、細胞を使うことによる免疫学的な問題などがあることから、作製および取扱いが容易で、免疫学的な問題のない支持体（例えば、人工パッチ）の開発が急がれている。細胞がうまくコーティングされないという問題、細胞を使うことによる細胞の採取方法、細胞の採取部位の問題、免疫学的な問題、生体外で培養するため感染症の問題、施設環境の問題などがあることから、作製および取扱いが容易で免疫学的な問題のない支持体の形状（例えば、人工パッチ）の開発が急がれている。
【０００６】
また、臓器または組織の損傷を処置する場合、移植により修復された組織または臓器が自己化（移植後に成長する性質など、本来の組織または臓器のように振舞うこと）が望ましいとされているが、そのような自己化を実現するような技術はいまだ実現されていない。
【０００７】
他方で、生体適合性材料の形状として、編物の形状および織物の形状が知られている。編物は、人工組織として生体適合性でないものでは首尾よく使用されるものが報告されているが、生体適合性を用いた場合は、強度などの点で不十分なものが多く、しかも、編物の形状から液体が漏れる構造となりやすく、生体内において支持体（例えば、パッチ状のもの）として首尾よく使用されているものはまだない。
【０００８】
また、生体適合性の形状として、織物の形状も頻繁に使用される。織物の形状は、強度の点で優れているが、織物につきものの欠点である解れが生じることから、生体内での使用に必ずしも適しているとはいえない。
【０００９】
このように、生体適合性のパッチなどとして使用可能な組織片または支持体は、現在のところ利用可能なものはまだない。
【００１０】
また、特開２００２−５４３９５０号は、粒子状の強化媒体を含む生体高分子材料を開示するが、生体内への移植は意図していない。この材料は、アルブミンをアルデヒドで架橋することにより接着を行う生体用接着剤であり、これに補強剤を挟み込んでいる。しかし、組織の再生を意図していない。また、残存するアルデヒドによって傷害性があるなどの障害がある。
【００１１】
特開２００１−７８７５０号は、発泡体と補強材とからなる細胞の足場を開示するが、生体内への移植は意図していない。特に、この構成では、材料により物性が特定されてしまうという欠点を有する。また、この文献では、細胞を播種してから移植することを目的としているので、インビトロでの培養足場としての利用が考えられており、再生のための支持体としては考えられていない。
【００１２】
ＷＯ８９／０５３７１号は、細胞の足場を開示するが、生体内への移植により臓器を補強、再生することは記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明は、生体の臓器または組織の損傷などの処置において、自己化するような組織片およびそれに使用することができる支持体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、従来は細胞を含ませることが必要であると考えられていた移植のための組織片の代わりに、生体分子と支持体とを含む生体適合性組織片を用いると、上述のような自己化する性質を具備することを予想外に発見したことにより上記課題を解決した。本発明はさらに、Ａ）粗面を有する第一層；およびＢ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される支持体が、予想外に組織再生に使用でき、耐久性も高く、生体親和度が高いこと、強度が充分であることを見出したことによって上記課題を解決した。
【００１５】
本発明はまた、生体適合性であり得る編物と織物との組織片層を重ね合わせ、中間層により接着する構造を提供することによって、編物において見られた漏れの問題と、織物において見られた解れの問題を、予想外に両方とも解決した。このように編物と織物とを複合したことによって、さらに、細胞が入り込むスペースを有しつつ、漏れを防ぎ、解れが防止されている材料を予想外に提供することができた。さらに、このような支持体に生体分子（コラーゲン、サイトカイン、ケモカインなど）を提供することによって、生体内に提供した場合に初期には細胞を呼び込み、その後その支持体自体は生体により分解され、消失し、実質的に跡形も残らない移植片を提供することができる。また、この複合支持体は、編物と織物との作製において任意の方法を選択することによって、強度を保ち、一定の厚みを有することができる。さらに、編みと織りに用いる糸に任意の材料を用いることによって、それぞれの吸収速度を制御することができ、さらには、組織の再生速度と支持体に必要な強度とに適合した支持体を作成することができるというように、種々の応用が考えられる。また、本発明では、１つの実施形態において、織物を使用することから、従来の支持体において欠点とされていた材料による物性の特定がなく、織り方によって物性を調節することができる一方で、強度を一定以上にすることができる。また、織物を使用する場合は、より簡単に、分解速度を調節する材料をより容易に選択し、自在に種々の支持体を作製することができることから、本発明は、従来よりも多様な支持体を提供することができる。
【００１６】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１７】
（１）  生体適合性組織片であって、
Ａ）生体分子；および
Ｂ）支持体、
を含む、生体適合性組織片（ｉｍｐｌａｎｔ）。
【００１８】
（２）  上記生体分子は、タンパク質を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００１９】
（３）  上記生体分子は、細胞生理活性物質を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２０】
（４）  上記生体分子は、細胞接着分子を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２１】
（５）  上記生体分子は、細胞外マトリクスを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２２】
（６）  上記生体分子は、細胞接着性タンパク質を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２３】
（７）  上記生体分子は、インテグリンを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２４】
（８）  上記生体分子は、コラーゲンおよびラミニンからなる群より選択される、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２５】
（９）  上記生体分子は、繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２６】
（１０）  上記生体分子は、繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２７】
（１１）  上記生体分子は、コラーゲンＩ型またはＩＶ型を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２８】
（１２）  上記生体分子は、コラーゲンおよびサイトカインを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００２９】
（１３）  上記支持体は、膜状である、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３０】
（１４）  上記支持体は、管状である、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３１】
（１５）  上記支持体は、弁状である、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３２】
（１６）  上記支持体は、生分解性ポリマーを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３３】
（１７）  上記支持体は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３４】
（１８）  上記支持体は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＧＬＡを含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３５】
（１９）  上記支持体は、細胞接着分子を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３６】
（２０）  上記支持体は、タンパク質を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３７】
（２１）  上記支持体は、メッシュ状およびスポンジ状である、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３８】
（２２）  上記支持体は、少なくとも約０．２ｍｍ〜約１．０ｍｍ厚である、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００３９】
（２３）  上記支持体は、少なくとも約２０Ｎ以上の強度を有する、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４０】
（２４）  上記支持体は、少なくとも約５０Ｎ以上の強度を有する、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４１】
（２５）  上記支持体は、上記生体分子でコーティングされている、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４２】
（２６）  上記支持体は、隙間が上記生体分子で埋められている、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４３】
（２７）  上記生体分子および上記支持体は、架橋可能な分子を含み、上記架橋可能な分子は、上記支持体と上記生体分子との間で架橋処理されている、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４４】
（２８）  上記支持体は、上記生体分子と同じ物質を含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４５】
（２９）  さらに、細胞が付着した、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４６】
（３０）  体内への移植用である、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４７】
（３１）  上記体内における移植されるべき部位は、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管からなる群より選択される、項目２６に記載の生体適合性組織片。
【００４８】
（３２）  滅菌されている、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００４９】
（３３）  免疫抑制剤をさらに含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００５０】
（３４）  さらなる医薬成分をさらに含む、項目１に記載の生体適合性組織片。
【００５１】
（３５）  上記生体分子は、上記移植を目的とする生体に由来する、項目３０に記載の生体適合性組織片。
【００５２】
（３６）  項目１に記載の生体適合性組織片を含む、医薬。
【００５３】
（３７）  項目１に記載の生体適合性組織片および上記組織片の使用法を示した指示書を含む、医薬キットであって、上記指示書には、所定の部位に上記組織片を投与することが記載される、医薬キット。
【００５４】
（３８）  上記所定の部位は、血管内皮、血管平滑筋、弾性線維、骨格筋、心筋、骨芽細胞、神経細胞および膠原線維からなる群より選択される、項目３７に記載の医薬キット。
【００５５】
（３９）  上記指示書には、上記生体適合性組織片を、移植を目的とする臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植することが記載される、項目３７に記載の医薬キット。
【００５６】
（４０）  体内における損傷部位を処置する方法であって、
Ａ）上記損傷部位の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含む、生体適合性組織片を移植する工程、
を包含する、方法。
【００５７】
（４１）  上記移植工程において、上記生体適合性組織片は、上記損傷部位が属する臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植される、項目４０に記載の方法。
【００５８】
（４２）  細胞生理活性物質を投与する工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
【００５９】
（４３）  上記細胞生理活性物質は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、免疫グロブリンファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、シンデカン、アグリカン、インテグリンファミリーのメンバー、インテグリンα鎖、インテグリンβ鎖、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、セレクチン、カドヘリン、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ならびにそれらに関連するポリペプチドおよびペプチドからなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
【００６０】
（４４）  免疫反応を抑制する処置を行う工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
【００６１】
（４５）  体内における臓器または組織を強化する方法であって、
Ａ）上記臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含む、生体適合性組織片を移植する工程、
を包含する、方法。
【００６２】
（４６）  臓器または組織を生産または再生する方法であって、
Ａ）目的とする臓器または組織の少なくとも一部を含む生体において、上記臓器または組織に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含む、生体適合性組織片を移植する工程；ならびに
Ｂ）上記臓器または組織を上記生体内で培養する工程、
を包含する、方法。
【００６３】
（４７）  項目１に記載の生体適合性組織片の、体内における損傷部位を処置するための使用。
【００６４】
（４８）  項目１に記載の生体適合性組織片の、体内における臓器または組織を強化するための使用。
【００６５】
（４９）  項目１に記載の生体適合性組織片の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用。
【００６６】
（５０）  項目１に記載の生体適合性組織片の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用。
【００６７】
（５１）  生体適合性組織支持体であって、
Ａ）粗面を有する第一層；および
Ｂ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、支持体。
【００６８】
（５２）  上記第一層は、編物（ｋｎｉｔ）である、項目５１に記載の支持体。
【００６９】
（５３）  上記第二層は、織物（ｗｏｖｅｎ）である、項目５１に記載の支持体。
【００７０】
（５４）  上記粗面は、細胞が入り込むに充分なスペースを有する、項目５１に記載の支持体。
【００７１】
（５５）  上記封着は、生体吸収性高分子を溶着することにより達成される、項目５１に記載の支持体。
【００７２】
（５６）  上記第二層は、通気性が実質的に遮断される、項目５１に記載の支持体。
【００７３】
（５７）  上記支持体の強度は、少なくとも１００Ｎである、項目５１に記載の支持体。
【００７４】
（５８）  上記支持体の通気性は、１０ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である、項目５１に記載の支持体。
【００７５】
（５９）  上記第一層は、生体分解性材料を含む、項目５１に記載の支持体。
【００７６】
（６０）  上記第一層は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、項目５１に記載の支持体。
【００７７】
（６１）  上記第一層は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、項目５１に記載の支持体。
【００７８】
（６２）  上記第一層は、ポリグリコール酸を含む、項目５１に記載の支持体。
【００７９】
（６３）  上記第二層は、生体分解性材料を含む、項目５１に記載の支持体。
【００８０】
（６４）  上記第二層は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、項目５１に記載の支持体。
【００８１】
（６５）  上記第二層は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、項目５１に記載の支持体。
【００８２】
（６６）  上記第二層は、ポリＬ乳酸を含む、項目５１に記載の支持体。
【００８３】
（６７）  上記第二層は、織物であり、上記第一層は編物である、項目５１に記載の支持体。
【００８４】
（６８）  上記第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、上記第一層は、ポリグリコール酸の編物である、項目５１に記載の支持体。
【００８５】
（６９）  上記接着は、Ｃ）上記第一層と上記第二層とを接着する中間層による、項目５１に記載の支持体。
【００８６】
（７０）  上記中間層は、合成生体吸収性ポリマーである、項目６９に記載の支持体。
【００８７】
（７１）  上記中間層は、乳酸（ラクチド）、グリコリドおよびε−カプロラクタムからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーのホモポリマーまたはそれらの２つ以上を含むコポリマーを含む、項目６９に記載の支持体。
【００８８】
（７２）  上記中間層を構成する材料は、上記第二層および上記第一層の両方の融点よりも低い融点を有する、項目６９に記載の支持体。
【００８９】
（７３）  上記第一層は、複数の編物層を含む、項目５１に記載の支持体。
【００９０】
（７４）  上記第二層は、複数の織物層を含む、項目５１に記載の支持体。
【００９１】
（７５）  上記第一層に、生体分子が配置される、項目５１に記載の支持体。
【００９２】
（７６）  上記生体分子は、細胞外マトリクスである、項目７５に記載の支持体。
【００９３】
（７７）  上記生体分子は、コラーゲンおよびラミニンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目７５に記載の支持体。
【００９４】
（７８）  上記生体分子は、マイクロスポンジに含ませて配置される、項目７５に記載の支持体。
【００９５】
（７９）  上記生体分子は、上記支持体と架橋処理されている、項目７５に記載の支持体。
【００９６】
（８０）  項目５１に記載の支持体を含む、医薬。
【００９７】
（８１）  細胞をさらに含む、項目８０に記載の医薬。
【００９８】
（８２）  体内への移植用途に使用される、項目８０に記載の医薬。
【００９９】
（８３）  上記体内における移植されるべき部位は、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管からなる群より選択される、項目８０に記載の医薬。
【０１００】
（８４）  上記生体分子は、上記移植を目的とする生体に由来する、項目８０に記載の医薬。
【０１０１】
（８５）    Ａ）粗面を有する第一層；および
Ｂ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、項目第一層と項目第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を製造する方法であって、
項目第一層と項目第二層とを接着する工程、
を包含する、方法。
【０１０２】
（８６）    上記接着は、Ｃ）項目第一層と項目第二層とを接着する中間層により達成され、上記接着は、
ａ）項目第一層と項目第二層との間に項目中間層を提供する工程；
ｂ）項目第一層と項目第二層とが融解せず、項目中間層が融解する条件に項目第一層、項目第二層および項目中間層を配置する工程；および
ｃ）項目第一層、項目第二層および項目中間層を所望の形状に保持しながら項目中間層が固化する条件に配置する工程、
を包含する、項目８５に記載の方法。
【０１０３】
（８７）  上記融解する条件は、温度による違いを利用し、上記第一層および上記第二層の両方の融点より上記中間層の融点が低い、項目８６に記載の方法。
【０１０４】
（８８）  上記第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、上記第一層は、ポリグリコール酸の編物であり、上記中間層は、乳酸（ラクチド）、グリコリドおよびε−カプロラクタムからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーのホモポリマーまたはそれらの２つ以上を含むコポリマーを含む、項目８６に記載の方法。
【０１０５】
（８９）  上記温度は、上記中間層の融点よりも高く、上記第一層および上記第二層のそれぞれの融点よりも低い、項目８８に記載の方法。
【０１０６】
（９０）  上記支持体は、さらに生体分子を含み、上記生体分子を上記第一層に付着させる工程をさらに包含する、項目８６に記載の方法。
【０１０７】
（９１）  上記付着は、架橋処理を包含する、項目９０に記載の方法。
【０１０８】
（９２）  上記生体分子はコラーゲンであり、上記付着は、コラーゲン架橋処理を包含する、項目９０に記載の方法。
【０１０９】
（９３）  上記中間層は、ガラス上にキャストした後風乾してフィルムを作成することによって製造される、項目８６に記載の方法。
【０１１０】
（９４）  上記ｂ）工程は、少なくとも約０．１ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることを包含する、項目８６に記載の方法。
【０１１１】
（９５）  上記ｂ）工程は、少なくとも約０．５ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることを包含する、項目８６に記載の方法。
【０１１２】
（９６）  体内における損傷部位を処置する方法であって、
Ａ）上記損傷部位の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程、
を包含する、方法。
【０１１３】
（９７）  体内における臓器または組織を強化する方法であって、
Ａ）上記臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程、
を包含する、方法。
【０１１４】
（９８）  臓器または組織を生産または再生する方法であって、
Ａ）目的とする臓器または組織を含む生体において、上記臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程；ならびに
Ｂ）上記臓器または組織を上記生体内で培養する工程、
を包含する、方法。
【０１１５】
（９９）        Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための使用。
【０１１６】
（１００）        Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための使用。
【０１１７】
（１０１）        Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用。
【０１１８】
（１０２）        Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用。
【発明の効果】
【０１１９】
本発明により、細胞など生体に由来する自己増殖性のものを用いることなく、自己化する組織片が提供された。そのような組織片を移植することで、臓器または組織の再生がみられたことはかつてなく、予想外の効果が達成された。また、従来の編物、織物において見出された欠点が克服された生体適合性支持体が提供された。
【０１２０】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２１】
以下、本発明を発明の実施の形態とともに説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【０１２２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【０１２３】
本明細書において使用される「再生」（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）とは，個体の組織の一部が失われたあるいは先天的に欠損している際に残った組織が自発的にまたは他からの助けを借りて増殖して復元される現象をいう。本明細書では、再生は、例えば、損傷した組織または臓器に生体内の細胞などが集合しその細胞などが増殖もしくは増幅することによっても生じ得る現象も指す。従って、再生という概念は、広く、動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し、不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には，生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し，さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療がある。神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてきた。近年、これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞（体性幹細胞）の存在が報告され、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はすべての組織に分化する能力をもった細胞であり、それを用いた腎臓、肝臓などの複雑な臓器の再生が試みられているが、これは実現されていない。このように、幹細胞自体を注入した組織などの再生方法は魅力的な方法である。従って、本発明の組織片には、このような幹細胞が含まれていてもよい。
【０１２４】
本明細書において「自己化」とは、移植において用いられる場合、移植された組織片が、宿主の臓器または組織の一部として機能するようになることをいう。従って、自己化とは、例えば、ある組織片が自己増殖する能力を獲得すること、材料やデバイスをつくり上げる際に、人が手を加えなくても、材料やデバイスの構成要素が自ら集まってある構造をとったり、エネルギーや物質が拡散していく動的過程の中で構成要素が自ら進んであるパターンを形成したりすること（周囲組織との生体適合性を有すること、異物反応を最小限に抑える（炎症反応、内膜増殖、硬化、石灰化）こと、および成長の可能性を有すること）などという現象を含むがそれに限定されない。本明細書において移植片または組織片が自己化したかどうかは、例えば、フォンビルブランド因子、α−ＳＭＡ、弾性組織についてのエラスチカ・ファン・ギーソンなどのように、自己細胞の増殖を確認するマーカーを用いて判定することができる。
【０１２５】
具体的には、移植片が自己化したかどうかを判定する方法としては、例えば、細胞のパターン形成および自己配置の状況として組織学的検索、免疫反応の有無、細胞の集合体の精密合成として電気的結合性の測定、超音波検査による機能測定、ヒドロプロリンアッセイ、エラスチンアッセイ、ＤＮＡアッセイ、細胞数定量化、タンパク質定量化、グリコサミノグリンカンアッセイ、ミオシン重鎖アッセイという方法を用いることができるが、それらに限定されない。例えば、血管の場合、血管新生が起こっているかどうかで自己化したかどうかを判定することができる。そのような血管新生は、例えば、第ＶＩＩＩ因子関連抗原等で免疫組織化学染色した後に血管数を計数することによって判定される。この計数方法では、検体を１０％の緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、各々の検体から数個の連続切片を調製し、凍結する。次いで、凍結切片をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液で５分間、室温にて固定し、３％過酸化水素を含むメタノール中に１５分間浸漬し、次いでＰＢＳで洗浄する。このサンプルをウシ血清アルブミン溶液で約１０分間覆って、非特異的反応をブロックする。検体を、ＨＲＰと結合する、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対するＥＰＯＳ結合体化抗体と共に一晩インキュベートする。サンプルをＰＢＳで洗浄した後、これらを、ジアミノベンジジン溶液（例えば、ＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン）中に浸漬して、陽性染色を得る。染色された血管内皮細胞を、例えば、１００倍の倍率の光学顕微鏡下で計数し、例えば、計数結果を、１平方ミリメートルあたりの血管の数としてあらわす。特定のサイトカインおよび増殖因子の処置後、血管数が統計学的に有意に増加しているか否かを判定することにより、血管新生活性を判定することができる。望ましくは、パッチクランプ法などによる細胞の集合体の精密合成として電位の測定、電気密度解析のような電気生理的な測定により宿主細胞と同じ電気生理的活性を有することによって、組織片が自己化しているかどうかを確認する。そのような電気的結合性を有している場合、本明細書において、そのような状態を「電気的自己化」ともいう。
【０１２６】
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子およびその集合体をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子およびその集合体を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子およびその集合体であれば生体分子の定義に入る。したがって、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子、およびその集合体（例えば、細胞外マトリクス、線維など）などが包含されるがそれらに限定されない。本発明では、生体分子は、移植を目的とする宿主に適合性があるか、または適合するように処置され得ることが好ましい。ある生体分子が宿主に適合性または適合するように処置され得るかあるかどうかは、その生体分子をその宿主に移植して、必要に応じて免疫拒絶反応などの副反応を抑制することによりその宿主に定着するかどうかを観察することによって、判定することができる。本発明において使用される好ましい生体分子としては、例えば、細胞外マトリクスのような細胞との親和性を有するものが挙げられる。別の好ましい実施形態では、本発明では、生体分子として、細胞を誘引する機能を有するものが挙げられる。
【０１２７】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーおよびその改変体をいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得るものを包含する。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の組織片において使用される場合は、「タンパク質」は、その組織片が使用されるべき宿主において適合性のあるタンパク質であることが好ましいが、その宿主において適合するように処置され得る限り、どのようなタンパク質を用いてもよい。あるタンパク質が宿主に適合性があるかどうか、または宿主において適合するように処置され得るかどうかは、そのタンパク質をその宿主に移植して、必要に応じて免疫拒絶反応などの副反応を抑制することによりその宿主に定着するかどうかを観察することによって、判定することができる。代表的には、上述の適合性があるようなタンパク質としては、その宿主に由来するタンパク質を挙げることができるがそれに限定されない。
【０１２８】
本明細書において「細胞生理活性物質」または「生理活性物質」（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞または組織に作用する物質をいう。そのような作用としては、例えば、その細胞または組織の制御、変化などが挙げられるがそれに限定されない。生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものであるが改変された作用を持つものであってもよい。本明細書では、生理活性物質はタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。
【０１２９】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。
【０１３０】
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、「成長因子」または「発育因子」ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。
【０１３１】
サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、カルディオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【０１３２】
サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能（例えば、細胞接着活性または細胞−基質間の接着活性など）で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性（例えば、宿主の細胞を呼び寄せる活性）を有してさえいれば、本発明の組織片または医薬の好ましい実施形態において使用することができる。
【０１３３】
本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ；細胞外基質）とは、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。本発明において用いられる細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、弾性繊維、膠原繊維などが挙げられるがそれに限定されない。本発明において用いられる場合、細胞外マトリクスは、好ましくは、宿主の自己細胞を呼び寄せる活性を持っていることが有利である。
【０１３４】
本明細書において「細胞接着分子」（Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または「接着分子」とは、互換可能に使用され、２つ以上の細胞の互いの接近（細胞接着）または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、細胞と細胞の接着（細胞間接着）に関する分子（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と，細胞と細胞外マトリックスとの接着（細胞−基質接着）に関与する分子（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に分けられる。本発明の組織片では、いずれの分子も有用であり、有効に使用することができる。従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）も包含され、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における細胞接着分子または細胞接着分子の概念に入る。
【０１３５】
細胞間接着に関しては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの分子（ＮＣＡＭ、Ｌ１、ＩＣＡＭ、ファシクリンＩＩ、ＩＩＩなど）、セレクチンなどが知られており、それぞれ独特な分子反応により細胞膜を結合させることも知られている。
【０１３６】
他方、細胞−基質接着のために働く主要な細胞接着分子はインテグリンで，細胞外マトリックスに含まれる種々のタンパク質を認識し結合する。これらの細胞接着分子はすべて細胞膜表面にあり，一種のレセプター（細胞接着受容体）とみなすこともできる。従って、細胞膜にあるこのようなレセプターもまた本発明の組織片において使用することができる。そのようなレセプターとしては、例えば、αインテグリン、βインテグリン、ＣＤ４４，シンデカンおよびアグリカンなどが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３７】
なお、本明細書では、インテグリンなどの結合の相手となる細胞外マトリックス分子（フィブロネクチン，ラミニンなどの細胞接着性タンパク質）も細胞接着分子の範疇に入る。それぞれの接着受容体の，細胞間接着，細胞−基質接着における機能分担は厳密なものではなく，相手となる分子（リガンド）の分布によって変動する。例えば、インテグリンのあるものは血球間の接着など細胞間接着にも関与する。また、増殖因子、サイトカインなどが細胞膜タンパク質として存在する場合、他の細胞に分布するそれらのレセプターとの反応が、結果として細胞を接着させることが知られていることから、そのような増殖因子、サイトカインもまた、本発明の組織片に含まれる生体分子として使用することができる。
【０１３８】
このように多種多様な分子が細胞接着に関与しており、それぞれの機能は異なっていることから、当業者は、目的に応じて、適宜本発明の組織片に含まれるべき分子を選択することができる。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周知であり、例えば、細胞外マトリックス  −臨床への応用―  メディカルレビュー社に記載されている。
【０１３９】
ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）ＰＤＲ法、ハイブリダイゼイション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１）、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれに限定されない。このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。従って、本発明の組織片において用いられる接着因子としては、そのような細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達するものが好ましい。細胞活性化により、組織片としてある組織または臓器における損傷部位に適用された後に、そこに集合した細胞および／または組織もしくは臓器にある細胞の増殖を促すことができるからである。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）ＰＤＲ法、ハイブリダイゼイション法というアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。
【０１４０】
細胞接着分子としては、例えば、組織固着性の細胞系に広く知られる細胞接着分子としてカドヘリンがあり、カドヘリンは、本発明の好ましい実施形態において使用することができる。一方，非固着性の血液・免疫系の細胞では，細胞接着分子としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（ＣＤ  ２、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１など）；インテグリンファミリー分子（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ１、ＶＬＡ２、ＶＬＡ３、ＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＶＬＡ６など）；セレクチンファミリー分子（Ｌ−セレクチン，Ｅ−セレクチン，Ｐ−セレクチンなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、そのような分子は、血液・免疫系の組織または臓器を処置するための特に有用であり得る。
【０１４１】
細胞接着分子は、非固着性の細胞が特定の組織で働くためにはその組織への接着が必要となる。その場合，恒常的に発現するセレクチン分子などによる一次接着、それに続いて活性化されるインテグリン分子などの二次接着によって細胞間の接着は段階的に強くなると考えられている。従って、本発明において用いられる細胞接着分子としては、そのような一次接着を媒介する因子、二次接着を媒介する因子、またはその両方が一緒に使用され得る。
【０１４２】
本明細書において「細胞接着性タンパク質」とは、上述のような細胞接着を媒介する機能を有するタンパク質をいう。従って、本明細書において「細胞接着性タンパク質」は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）をも包含する。例えば、基質側のタンパク質を吸着した基質（ガラスやプラスチック）の上に無血清条件下で培養細胞を播種すると，レセプターであるインテグリンが細胞接着性タンパク質を認識し、細胞はその基質に接着する。細胞接着性タンパク質の活性部位はアミノ酸レベルで解明されており、ＲＧＤ，ＹＩＧＳＲなどが知られている（これらを、総称して「ＲＧＤ配列」とも呼ぶ）。従って、１つの好ましい実施形態において、本発明の組織片に含まれるタンパク質は、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲなどのＲＧＤ配列を含むことが有利であり得る。通常、細胞接着性タンパク質は、細胞外マトリックス、培養細胞表面、血漿・血清・各種体液に存在する。その生体内での機能としては，細胞の細胞外マトリックスへの接着だけでなく，細胞の移動・増殖・形態調節・組織構築などが知られている。細胞作用とは別に，血液凝固・補体作用の調節機能を示すタンパク質もあり、本発明では、そのような機能を有するタンパク質もまた有用であり得る。そのような細胞接着性タンパク質としては、例えば、フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチン，ラミニンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４３】
本明細書において「ＲＧＤ分子」とは、アミノ酸配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）またはその機能的に同一な配列を含むタンパク質分子をいう。ＲＧＤ分子は、細胞接着性タンパク質の細胞接着活性部位のアミノ酸配列として有用なアミノ酸配列であるＲＧＤまたは機能的に等価な別のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。ＲＧＤ配列は、フィブロネクチンの細胞接着部位として発見され、その後，Ｉ型コラーゲン、ラミニン，ビトロネクチン，フィブリノゲン，フォンヴィルブランド因子，エンタクチンなど多くの細胞接着性の活性を示す分子に見出された。化学合成したＲＧＤペプチドを固相化すると細胞接着活性を示すことから、本発明における生体分子は、化学合成したＲＧＤ分子であってもよい。そのようなＲＧＤ分子としては、上述の天然に存在する分子のほかに、例えば、ＧＲＧＤＳＰペプチドが挙げられるがそれに限定されない。ＲＧＤ配列は細胞接着分子（かつ、レセプターでもある）であるインテグリン（例えば、フィブロネクチンのレセプター）によって認識されることから、ＲＧＤの機能的に等価な分子は、そのようなインテグリンを用いて相互作用を調べることによって同定することができる。
【０１４４】
本明細書において、「インテグリン」とは、細胞接着に関与するレセプターである膜貫通糖タンパク質をいう。インテグリンは、細胞表面に存在し、細胞が細胞外マトリックスに接着するときに機能する。血球系などでは細胞どうしの接着にも関与することが知られている。そのようなインテグリンとしては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンなどのレセプター、血小板のＩＩｂ／ＩＩＩａ，マクロファージのＭａｃ−１，リンパ球のＬＦＡ−１，ＶＬＡ−１〜６，ショウジョウバエのＰＳＡなどが挙げられるがそれに限定されない。通常、インテグリンは，分子量１３０ｋＤａ〜２１０ｋＤａのα鎖と分子量９５ｋＤａ〜１３０ｋＤａのβ鎖とが，非共有結合で１対１に会合したヘテロ二量体の構造をとる。α鎖としては、例えば、α１、α２、α３、α４、α５、α６、αＬ、αＭ、αＸ、αＩＩｂ、αＶ、αＥなどがあるがそれに限定されない。β鎖としては、例えばβ１、β２、β３、β４、β５、β６、β７などがあるがそれに限定されない。
【０１４５】
このようなヘテロ二量体としては、例えば、ＧｐＩＩｂＩＩＩａのほかに、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６、ＣＤ５１／ＣＤ２９、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０，９０、ビトロネクチンレセプター、β４サブファミリー、β５サブファミリー、β６サブファミリー、ＬＰＡＭ−１、ＨＭＬ−１などがあるがそれに限定されない。通常、α鎖の細胞外ドメインに二価カチオン結合部位があり、β鎖の細胞外ドメインにシステインリッチ領域があり、β鎖の細胞内ドメインにチロシンリン酸化部位があることが多い。結合リガンド中の認識部位はＲＧＤ配列であることが多い。従って、インテグリンは、ＲＧＤ分子であり得る。
【０１４６】
本明細書において「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、線維形成コラーゲンであり３本のポリペプチド鎖が３重螺旋を巻いた領域の総称であり、細胞生着、増殖の足場であり、組織骨格を形成するものをいう。コラーゲンは、動物の細胞外マトリクスの主成分である。コラーゲンもまた、ＲＧＤ配列をもち、細胞接着活性を示すことが知られている。コラーゲンは、動物の全タンパク質中の約２０〜３０％も含まれ、皮膚、腱、軟骨などに多量に含まれることが知られている。コラーゲン分子としては、Ｉ型〜ＸＩＩＩ型が知られている。通常、分子１つが３本のポリペプチド鎖からなる三重らせん構造を採り、各鎖はα鎖と呼ばれることが多い。コラーゲン分子では、１分子は１種類のα鎖からなっていてもよく、別々の遺伝子にコードされた複数種のα鎖からなっていてもよい。α鎖は、通常、α１，α２，α３のようにαの後に数字をつけてよび，さらにコラーゲンの型をつけて，α１（Ｉ）などと称する。従って、本発明では、例えば、［α１（Ｉ）２α２（Ｉ）］（Ｉ型コラーゲン）のような天然に存在するコラーゲン分子のほか、天然に存在しないような組み合わせの三量体もまた使用され得る。コラーゲンの一次構造の大部分は、［Ｇｌｙ−Ｘ−Ｐｒｏ（またはヒドロキシプロリル）］ｎ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列からなる特徴をもつ。この構造は、３残基周期の左巻きらせん構造をとる。コラーゲンは通常、特殊なアミノ酸としてヒドロキシリジンを含む。コラーゲンは、糖タンパク質であるが、糖はヒドロキシリジンの水酸基に結合している。
【０１４７】
コラーゲンには、線維状で存在し集まって膠原線維をなす線維形成コラーゲンまたは間質型コラーゲンという種類がある。そのような線維形成コラーゲンには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型コラーゲンがあり、本発明の好ましい実施形態において使用される。コラーゲンとしては、このほかに、短鎖コラーゲン（ＶＩＩＩ型、Ｘ型など）、基底膜コラーゲン（ＩＶ型など）、ＦＡＣＩＴコラーゲン（ＩＸ型、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型、ＸＶＩ型、ＸＩＸ型など）、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｓコラーゲン（ＸＶ型、ＸＶＩＩＩ型など）、ミクロフィブリルコラーゲン（ＶＩ型など）、長鎖コラーゲン（ＶＩＩ型など）、膜結合型コラーゲン（ＸＩＩＩ型，ＸＶＩＩ型など）などが挙げられ、これらはすべて本発明において使用され得る。本明細書において「基底膜コラーゲン」とは、基底膜を構成する主要なコラーゲンをいう。
【０１４８】
本明細書において「Ｉ型コラーゲン」とは、［α１（Ｉ）２α２（Ｉ）］という構造を有するコラーゲンであり、α１（Ｉ）鎖２本およびα２（Ｉ）鎖のポリペプチド鎖のヘテロ３本鎖からなり、生体内のあらゆる組織に存在する組織骨格およびその機能的に等価な分子をいい、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列としては、代表的には、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号では、ｐ０２４５４、ｐ０２４６４が挙げられるがそれに限定されない。本明細書において、Ｉ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
【０１４９】
本明細書において「ＩＶ型コラーゲン」とは、基底膜コラーゲンであり、その分子は、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインからなっており、Ｎ末端の７Ｓで４分子が重合し、Ｃ末端のＮＣ１で２分子が重合することにより、網目状のネットワークを形成しているコラーゲンまたはその機能的に等価な分子をいい、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列としては、代表的には、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ｐ０２４６２、ｐ０８５７２、Ｕ０２５２０、Ｄ１７３９１、Ｐ２９４００、Ｕ０４８４５が挙げられるがそれに限定されない。本明細書において、ＩＶ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
【０１５０】
本明細書において「フィブロネクチン」は、当該分野において使用される意味と同じ意味で用いられ、従来接着因子の一つとして分類されるタンパク質である。
【０１５１】
本明細書において「ラミニン」とは、当該分野において使用される意味と同じ意味で用いられ、従来接着因子の一つとして分類されるタンパク質であり、細胞接着機能に注目されて研究が進められている分子である。ラミニンは基底膜を構成する高分子糖タンパク質で、その生理活性は細胞接着、伸展、細胞間信号伝達、正常細胞および癌細胞の増殖、細胞分化誘導、癌細胞転移など、多くの細胞機能に関与している。ラミニンは、Engelbreth-Holm-Swarm マウス腫瘍などから精製することができる。ラミニンを合成する場合は、α鎖、β鎖およびγ鎖からなり、種々の組み合わせにより２０種類以上の組み合わせが知られている。本明細書では、どのラミニンであっても、支持体に結合する生体分子として使用することができる。どのラミニンであっても細胞接着に関与することが知られているからである。
【０１５２】
ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどは、ＢＤ（Becton and Dickinson and Company）から入手することができる。
【０１５３】
本明細書において「架橋可能な分子」とは、生体適合性材料と生体分子との間、タンパク質とタンパク質との間、タンパク質と核酸との間、またはＤＮＡの二本鎖の間などで共有結合が起ることが可能な分子をいう。そのような架橋の形態としては、例えば、未熟架橋（シッフ塩基型架橋）、成熟架橋（ピリジノリン）、老化架橋（ヒスチジノアラニン）などが挙げられるがそれに限定されない。このような架橋は、歯などの強固な構造が望ましいときに好ましくあり得る。
【０１５４】
本明細書において「支持体」とは、本発明の組織片または生体適合性組織片が構築される材料（好ましくは固体）をいう。支持体としては、例えば、パッチ、弁状、管状、膜状などの形態があり得る。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。従って、そのような支持体の材料としては、例えば、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、生分解性ポリマー（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬＡ）、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）、タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料から形成されていてもよい。そのような材料は、本発明の組織片において用いられる場合、生体適合性であることが好ましい。生体適合性であるかどうかは、例えば、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）等の拒絶反応をみることにより確認することができる。より好ましくは、本発明において使用される支持体は、生分解性であることが有利であり得る。本発明の組織片は、一定期間後はその中の成分が不要となることから、その一定期間後に分解して消えることが望ましいことがあるからである。そのような生分解性の材料としては、例えば、生分解性ポリマー（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＣＬＡなど）が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、本発明において使用される支持体は、生体の一部となることができる成分であってもよい。そのような成分としては、例えば、シリコーン、セラミック、タンパク質、脂質、核酸、糖（炭水化物）およびそれらの複合体が挙げられるがそれに限定されない。
【０１５５】
本明細書において「第一層」は、本発明の支持体において使用されるときは粗面を有することから、通常、移植片として使用されるときに内腔側に向けられるように用いられることが企図される。
【０１５６】
本明細書において「第二層」は、本発明の支持体において使用されるときは強度を生体内の衝撃に対して耐え得ることから、通常、移植片として使用されるときに、内腔側の反対側として使用されることが企図される。
【０１５７】
本明細書において「中間層」とは、支持体中の第二層と第一層との間の層として使用されることが企図される層をいう。中間層は、必ずしも第二層または第一層と密着する必要はないが、少なくとも１点において、第一層および第二層と接着されていることが通常必要である。封着が目的とされる場合は、第二層および第一層のいずれかの層と密着されることが好ましく、より好ましくは両方の層と密着されることが有利である。
【０１５８】
本明細書において、本発明の支持体は、第一層、第二層を含み、この両層は少なくとも１点において接着され、好ましくは、中間層を含み、この中間層によってその接着が達成され、必要に応じて、更なる層（第三層、第四層など）を含み得ることが理解される。
【０１５９】
本明細書において「粗面」とは、表面上に孔を有することをいい、好ましくは、細胞を収容するに充分なスペースを有する孔が配置される面をいう。このような孔は、細胞を収容することができることが望ましいことから、通常、少なくとも１μｍ程度の直径を有し、好ましくは少なくとも１０μｍ程度の直径を有することが好ましい。より好ましくは、粗面に存在する孔は、少なくとも５０μｍの直径、さらに好ましくは少なくとも１００μｍの直径を有することが有利である。このような粗面を有することによって、本発明の支持体の第一層は、細胞の足場として機能することになる。粗面を有する層としては、例えば、編物があるがそれに限定されない。
【０１６０】
本明細書において「生体内衝撃に耐え得る強度」とは、移植された後に移植された場所での通常の生体内の衝撃に耐え得ることをいい、移植部位によって変動するが、当業者はその移植部位が決定されると、この強度を即座に理解することができ、決定することができる。そのような強度は、引っ張り強度（代表的単位はＮ（力）、ＭＰａ（応力））、弾性率（ヤング率；代表的単位はＮ（力）、ＭＰａ（応力））、伸び（代表的単位は％）などの尺度によって表現することができる。このような強度を有する層としては、例えば、織物があるがそれに限定されない。
【０１６１】
本明細書において引っ張り強度、弾性率、伸びなどは、引張り試験によって確認することができる。本明細書において使用される例示的な引張り試験は、以下のとおりである。
【０１６２】
本明細書において組織片の引っ張り強度は、引張試験機（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）で強度測定することができる。具体的には、幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷および弾性率を測定することができる。代表的には、移植可能な組織片は、その強度が少なくとも約１０Ｎ以上であり得、通常約２５Ｎ以上であり得、好ましくは約５０Ｎ以上であり、より好ましくは約７５Ｎ以上であり得る。通常の臓器移植に使用する場合には、約５０Ｎ以上であることが好ましい。破壊されないからである。上述のプロトコルにおいて、伸びの測定は、引張り刺激の前後での各方向の長さを測定し、引張り後の長さを引張り前の長さで割り１００をかけることによって得ることができる。応力で表示する場合、本発明の支持体は、通常、少なくとも１ＭＰａの引張り強度を有し、好ましくは少なくとも５ＭＰａの引張り強度を有し、より好ましくは少なくとも１０ＭＰａの引張り強度を有する。弾性率でみると、本発明の支持体は、通常１ＭＰａの弾性率を有し、好ましくは少なくとも１０ＭＰａの弾性率を有し、より好ましくは少なくとも２０ＭＰａの弾性率を有する。伸びに関しては、本発明の支持体は、通常少なくとも１０５％、好ましくは１１０％の伸びを有する。伸びは、縦方向と横方向とを両方測定する。この両方の伸びにばらつきがないほうが好ましいがそれに限定されない。強度、弾性率などは、Ｎ（力）で表示してもよく、ＭＰａ（応力）で表示してもよい。そのような場合、1N/測定mm2=1MPaという公式によって換算することができる。
【０１６３】
本明細書において「封着」とは、本発明の支持体において表面と裏面との間の生体分子の行き来が実質的に不可能になる程度に接着されていることをいう。このような封着の度合いは、水漏れ率によって表現することができる。封着することができる層としては、例えば、合成生体分解性ポリマーが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６４】
本明細書において水漏れ率は、対象となる支持体を水平に置き、その上に１０ｍｌの水を垂らし、６０秒間でどのくらい水が漏れるかを測定し、漏れた量自体、または漏れた量を１０ｍｌで割ることによって得られた値を水漏れ率として表示する。
【０１６５】
本明細書においてある層と別の層との間の接着強度は、引張り試験によって測定することができる。具体的には、上述の試験において、以下のようにすることによって測定することができる。
【０１６６】
引っ張り試験において、接着強度を測るには、具体的には、２０ｍｍ長さの第一層と２０ｍｍ長さの第二層とを１０ｍｍ分好ましくは接着層（中間層）を設けて接着し、長さ３０ｍｍの短冊状支持体を製作し、長手軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点における負荷を接着強度をして採用した。その測定の模式図は図２８に示す。接着強度の測定については、Ｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７（１９９６）１３８７−１３９１を参照のこと。
【０１６７】
本明細書において「編物」（ｋｎｉｔ）とは、材料（通常糸状のものが使用される）を、針またはワイヤーなどの手段を用いて材料のループを組み合わせる（順次つなげていく）ことによって作製された生地をいう。編物は、生地中にスペースがあることが望ましい場合に用いられる。編物は、このように輪をつなげていくことから、隙間が開き、細胞を収容するに十分なスペースを作製することができる。しかし、編物だけでは、隙間が多く液体（例えば、血液のような体液）が漏れてしまうという欠点がある。
【０１６８】
本明細書において「織物」（ｗｏｖｅｎ）とは、材料（通常糸状のものが使用される）を、代表的には縦部分（縦糸；径部分、径糸ともいう）と横部分（横糸；緯糸ともいう）とを組み合わせることによって作製された生地をいう。織物は、隙間がほとんどないことから、液体（例えば、血液）の漏れを防止することが望ましい場合に用いられる。しかし、織物だけでは縫合したときに端が解れるという問題点がある。
【０１６９】
本明細書において「細胞が入り込むに充分なスペース」とは、支持体または層について言及されるとき、細胞がその支持体または層に少なくとも付着することができ、好ましくは細胞が収容されるに充分なスペースをいう。そのようなスペースは、例えば、少なくとも１０μｍ、好ましくは少なくとも５０μｍ、さらに好ましくは少なくとも１００μｍの直径であらわすことができる。細胞が入り込むに充分なスペースは、細胞が支持体または層に付着することができる限り、上記下限の数値よりも小さな直径のスペースであってもよい。好ましくは、このようなスペースは、液体が漏れにくい程度の大きさであることが好ましい。したがって、例えば、上限として直径２００μｍなどがあげられるがそれらに限定されない。
【０１７０】
本明細書において「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。本発明において「生体適合性」とは、ある物質について用いられる場合、その物質が、そのまま使用される場合に生体適合性を有する場合を当然に含むが、上述のような毒性、免疫反応または損傷を必要に応じて防御する手段（例えば、免疫抑制剤の投与など）を講じることができる（すなわち、その物質自体を使用する場合には毒性、免疫反応または損傷を生じるとしても、防御手段とともに用いる場合にそのような毒性、免疫反応、損傷などが顕著に減少または実質的に消失する）限り、そのような物質もまた、生体適合性であるといえる。単独で用いる場合に生体適合性とはいえない場合は、上述の防御手段を本発明の組織片に含むことが好ましい。本発明において使用され得る生体適合性材料としては、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬＡ、ＰＬＧＡ、ポリＬ乳酸、ポリブチレート、シリコーン、生分解性リン酸カルシウム、多孔質４フッ化エチレン樹脂、ポリプロピレン、アミロース、セルロース、合成ＤＮＡ，ポリエステル類等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１７１】
本明細書において、「生分解性材料」とは、天然に分解するかまたは生体内での代謝もしくは微生物によって分解される任意の材料をいう。通常生分解性材料としては、生分解性ポリマーが使用される。
【０１７２】
本明細書において「生分解性ポリマー」または「生分解性高分子」とは、互換可能に使用され、天然に分解するか、または生体内での代謝もしくは微生物の作用により分解される高分子をいう。このような生分解性ポリマーは、通常、加水分解により，水，二酸化炭素，メタンなどに分解される。このような生分解性ポリマーには、天然および合成高分子がある。天然高分子の例としては、例えば、コラーゲンなどのタンパク質、例えば、デンプンなどの多糖類が挙げられ、合成高分子の例としては、ポリグリコール酸，ポリＬ乳酸，ポリエチレンスクシナートなどの脂肪族ポリエステルが挙げられるがそれらに限定されない。このような生分解性ポリマーは、外科手術用の吸収性縫合糸，徐放性薬剤の基材，骨接合用材料として用いられており、そのような用途で使用されるようなものであれば、どのようなポリマーであっても本発明において使用することができる。生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリペプチド、ポリサッカリド、核酸、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリＬ乳酸、ポリブチレート、マレイン酸共重合体、ラクチド−カプロラクトン共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシカルボン酸、ポリジオキサノーン、ポリ−１，４−ジオキセパン−７−オン、グリコリド−トリメチレンカーボネート共重合体、ポリセバシン酸無水物、ポリ−ω−（カルボキシフェノキシ）アルキルカルボン酸無水物、ポリ−１，３−ジオキサン−２−オン、ポリデプシペプチド、ポリ−α−シアノアクリル酸エチル、ポリホスファゼン、ヒドロキシアパタイトが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生分解性ポリマーとしては、好ましくは、生体内で一定時間は定着し、その後分解または吸収される性質をもつことが有利であり得る。そのような分解は、代謝に用いられる酵素系の作用により進行する特異的分解機構によるものと、酵素などがなくても体液との接触により自然分解する非特異的分解機構とがあるが、本発明においては、いずれかまたは両方の機構により分解されるものであっても使用することができる。好ましくは、そのような生分解性ポリマーは、それ自体が無毒および／または免疫原性がないことに加えて、その分解（代謝）中間産物、分解（代謝）産物などもまた、無毒および／または免疫原性がないことが好ましい。
【０１７３】
本明細書において「ＰＧＡ」とは、ポリグリコール酸の略称であり、グリコール酸の重合体である。グリコール酸は、ＣＨ２（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される。ＰＧＡはポリグリコリドとも呼ばれ得る。ポリグリコール酸は、編物を作製するのに適していることから、本発明では、代表的には、粗面を有する第一層のために使用され得るがそれに限定されない。
【０１７４】
本明細書において「ＰＬＡ」とは、ポリＬ乳酸の略称であり、Ｌ乳酸の重合体である。グリコール酸は、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される。ＰＬＡはポリラクチドとも呼ばれ得る。ポリＬ乳酸は、織物を作製するのに適していることから、本発明では、生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層のために使用され得るがそれに限定されない。
【０１７５】
ＰＧＡおよびＰＬＡは、当該分野において周知の方法により合成することができる。そのような方法としては、例えば、グリコール酸または乳酸の加熱脱水重合、α−ハロ酢酸、α−ハロプロピオン酸の脱ハロゲン化水素などの縮重合などにより合成することができる。好ましくは、重合度を上昇させるために、得られたオリゴマーを、いったん減圧下に加熱分解して環状二量体であるグリコリドまたはラクチドを得、これらを開環重合することにより目的の重合度の高分子を合成することができる（例えば、Ｈ．Ｒ．Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１２，２５（１９８５）を参照のこと）。この場合、重合後に残る触媒が生体毒とならないことが好ましい。そのような触媒としては、例えば、オクチル酸スズなどが挙げられるがそれに限定されず、当該分野において用いられる生体毒を生じないか低生体毒性であるものであれば、どのようなものでも用いることができる。
【０１７６】
本明細書において「ＰＬＧＡ」とは、ポリＬ乳酸ポリグリコール酸共重合体の略称であり、グリコール酸と乳酸との共重合体である。乳酸は、ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨで表される。ＰＬＧＡは、ポリグラクチン（ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ）と呼ばれ得る（例えば、グリコリド／ラクチド＝９／１）。
【０１７７】
そのようなＰＬＧＡは、当該分野において周知の手法により合成することができる。ＰＬＧＡは、含まれるグリコール酸および乳酸の割合によって、その性質を劇的に変動させることができる。例えば、生体内の吸収半減期は、Ｒ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．１１，７１９（１９７７）において記載されるような関係式を利用して、数日〜数ヶ月の範囲内で変動させることができる。２〜３週間以内の生体内半減期が望ましい場合は、通常、ＰＬＡとＰＧＡとの割合を２０：８０〜８０：２０に採ることが好ましい。これに対し、１ヶ月以上の生体内半減期が望ましい場合は、通常、ＰＬＡとＰＧＡとの割合を２０：８０〜０：１００とするか、あるいは８０：２０〜１００：０とすることが好ましい。従って、長い吸収半減期（例えば、数ヶ月）が望ましい場合は、ＰＬＡまたはＰＧＡを使用することが好ましい。ＰＬＧＡは、ＰＬＡとＰＧＡとの割合を変化させることにより繊維強度の半減期も変動させることができる。繊維強度の半減期は、通常、ＰＧＡおよびＰＬＡで２〜３週間であり、ＰＬＡで３〜６ヶ月であることから、繊維強度の半減期が長いものが望ましい場合は、ＰＬＧＡにおいてＰＬＡの割合を増加させるか、あるいはＰＬＡ自体を使用することが好ましい。
【０１７８】
ＰＬＧＡの合成は、当該分野において周知であり、上述のＰＬＡおよびＰＧＡの合成において生成されるグリコリドおよびラクチドを混合物として用いて、開環共重合させることによって達成される。このようにして得られたＰＬＧＡは、通常グリコリド：ラクチドの割合が２５：７５〜７５：２０までではガラス状の高分子であるが、グリコリド：ラクチドの割合が２５：７５〜０：１００では、ポリＬ乳酸に類似する結晶性の高分子となり、グリコリド：ラクチドが７５：２５〜１００：０では、ポリグリコール酸に類似する結晶性高分子となる。従って、当業者は、これらの組成を変動させることによって、加水分解性、材料強度を変動させることができる。
【０１７９】
本明細書において「メッシュ状」とは、組織片などの形状についていう場合、網目状のものをいう。メッシュ状の組織片は、当該分野において周知の方法により生産することができる。そのようなメッシュ状の組織片のメッシュの細かい形状もまた、当該分野において周知の方法を用いて調製することができる。そのようなメッシュ状組織片としては、例えば、市販のもの（ＶＩＣＲＹＬ  ＫＮＩＴＴＥＤ  ＭＥＳＨ（ＥＴＨＩＣＯＮ製））を使用することができる。
【０１８０】
本明細書において「スポンジ状」とは、組織片などの形状についていう場合、多孔質のものをいう。そのようなスポンジ状の組織片は、当該分野において周知の方法を用いて調製することができる。そのようなスポンジ状組織片としては、例えば、市販のもの（ＶＩＣＲＹＬ  ＷＯＶＥＮ  ＭＥＳＨ（ＥＴＨＩＣＯＮ製））を使用することができる。
【０１８１】
本明細書において「コーティング」とは、支持体などにおいて使用される場合、その支持体がある別の物質によって覆われる状態をいう。従って、コーティングは、コーティングがされる支持体と相互作用をすることができる物質を用いて行うことができる。コーティングによって、支持体は、その支持体自体の物質が外界（例えば、空気）と触れなくなるように処理されていてもよいが、支持体とコーティング物質とがある程度相互作用する状態を保持するのであれば、外界と触れなくなるほどにコーティングされていなくてもよい。そのようなコーティングの程度は、任意であり、当業者は、当該分野において周知の技法を用いて調整することができる。そのようなコーティング技術は、例えば、高分子機能材料シリーズ医療機能材料  共立出版株式会社に記載されている。
【０１８２】
本明細書において「ポリサッカリド」、「多糖」、「オリゴサッカリド」、「糖」および「炭水化物」は、本明細書において互換可能に使用され、単糖がグリコシド結合によって脱水縮合した高分子化合物をいう。「単糖」または「モノサッカリド」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表されるものをいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。このようなポリサッカリドは、単独でまたは複合体もしくは混合物として本発明において支持体として使用され得る。
【０１８３】
本明細書において「脂質」とは、生体を構成する物質のうち水に溶けにくく，有機溶媒に溶けやすい物質群をいう。脂質には、多種類の有機化合物が含まれる。通常、脂質には、長鎖脂肪酸とその誘導体または類似体が含まれるが、本明細書においては、ステロイド，カロテノイド，テルペノイド，イソプレノイド，脂溶性ビタミンなどの生体内にある水不溶で有機溶媒に易溶の有機化合物群もまた包含される。脂質としては、例えば、１）単純脂質（脂肪酸と各種アルコールとのエステルで中性脂質ともいう。例えば、油脂（トリアシルグリセロール），蝋（ワックス，高級アルコールの脂肪酸エステル），ステロールエステル，ビタミンの脂肪酸エステルなど）；２）複合脂質（脂肪酸とアルコールのほかにリン酸，糖，硫酸，アミンなど極性基をもつ化合物で，グリセロリン脂質，スフィンゴリン脂質，グリセロ糖脂質，スフィンゴ糖脂質，Ｃ−Ｐ結合をもつ脂質，硫脂質などが含まれる）；３）誘導脂質（単純脂質および複合脂質の加水分解によって生成する化合物のうち脂溶性のものをさし，脂肪酸，高級アルコール，脂溶性ビタミン，ステロイド，炭化水素などが含まれる）が挙げられるがそれに限定されない。本発明においては、細胞を集合させる機能を阻害しない限り、どのような脂質でも支持体として用いることができる。
【０１８４】
本明細書において「複合体」とは、物質について使用されるとき、複数の種類の物質を含む（好ましくはそれら複数の成分が相互作用している）分子をいう。そのような複合体としては、例えば、糖タンパク質、糖脂質などが挙げられるがそれに限定されない。
【０１８５】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【０１８６】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【０１８７】
本発明において使用される生体分子は、生体から採取され得るほか、当業者に公知の方法によっ化学的に合成され得る。例えば、タンパク質であれば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、以下により記載される：Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（１９９２）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９９３）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１  ９９４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ。その他の分子もまた、当該分野において周知の技術を用いて合成することができる。
【０１８８】
本明細書において生体分子（例えば、コラーゲン、ラミニンなどをコードする核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、比較可能な配列を有する場合、２以上の配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの配列の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの配列を直接比較する場合、その配列間で配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、生体分子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。本発明では、このように同一性が高いものまたは類似性が高いものもまた、有用であり得る。
【０１８９】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。または、ＦＡＳＴＡ（デフォルトパラメータを用いる）が、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの代わりに用いられ得る。
【０１９０】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【０１９１】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【０１９２】
用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【０１９３】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【０１９４】
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
【０１９５】
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。例えば、マウスコラーゲンに対応する遺伝子は、ヒトコラーゲンである。
【０１９６】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本発明では、生体分子としてポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどが使用される場合、所望の目的（例えば、細胞誘引効果など）が達成される限り、このようなフラグメントもまた、全長のものと同様に使用され得ることが理解される。
【０１９７】
本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【０１９８】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【０１９９】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０２００】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて生物学的な有用性の明らかな消失なしに行われ得る。
【０２０１】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０２０２】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０２０３】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。このような改変体もまた、所望の目的を達成することができる限り、本発明の生体分子として使用することができる。
【０２０４】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。このような改変体もまた、所望の目的を達成することができる限り、本発明の生体分子として使用することができる。「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体」または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０２０５】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。
【０２０６】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０２０７】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本明細書において細胞数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクスおよび細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。
【０２０８】
細胞は、石灰化および免疫反応惹起の原因となる。従って、組織または臓器への移植のためには、自己由来以外の細胞はできるだけ除去されるべきであり、本発明においては、含まないことが好ましくあり得る。本発明の組織片において細胞を含む場合は、自己由来の細胞のような免疫拒絶の問題が通常生じないと考えられる細胞を用いることが好ましい。
【０２０９】
本発明で細胞が用いられる場合、そのような細胞はどの生物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）由来の細胞でもよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細胞が用いられる。ヒトへの移植に用いられる場合、最も好ましくはヒト（特に、自己または遺伝子系の類似もしくは同一である個体）由来の細胞が用いられる。
【０２１０】
本明細書において「細胞の置換」とは、組織内で、もとあった細胞または何もなかった場所に代わり、別の細胞が侵入し置き換わることをいい、「細胞の浸潤」ともいう。本発明の組織片を用いると、細胞の置換は、移植の宿主内の細胞によって行われる。本発明の組織片を用いると、自己由来の細胞などは全くないにもかかわらず、移植後に宿主由来の細胞が浸潤し置換することが認められた。このような事象はこれまで開発された移植片では決して起こらなかったことであり、このこと自体、本発明の予想外の極めて優れた効果を示すものといえる。細胞の置換は、当該分野において公知の手法を用いて確認することができ、例えば、フォンビルブランド因子、α−ＳＭＡ、弾性組織についてのファン・ギーソンなどのように、自己細胞の増殖を確認するマーカーを用いて判定することができる。そのような細胞の置換を確認する手法は、例えば、病理組織染色ハンドブック  医学書院に記載されている。
【０２１１】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、生物において、同一の機能・形態をもつ細胞集団をいう。多細胞生物では、通常それを構成する細胞が分化し、機能が専能化し、分業化がおこる。従って細胞の単なる集合体であり得ず，ある機能と構造を備えた有機的細胞集団，社会的細胞集団としての組織が構成されることになる。組織としては、外皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明が対象とする組織は、生物のどの臓器または器官由来の組織でもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明の組織片が移植される対象組織としては、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、心臓、心臓内皮、皮膚、骨、軟部組織、気管などの組織が挙げられるがそれらに限定されない。本発明で用いられる支持体に使用される分子は、好ましくは生体適合性であることから、原理的にはどの器官由来の組織でも本発明の移植対象とすることができる。従って、本発明が対象とする組織は、生物のどの臓器または器官由来でもよく、また、本発明が対象とする組織は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
【０２１２】
本明細書において「組織片」（ｉｍｐｌａｎｔまたはｅｘｐｌａｎｔ）とは、組織または臓器の一部（もしくは全部）または組織または臓器の一部（もしくは全部）となり得る物質をいう。組織片は、人工的に合成することもでき、または天然に存在する材料を使用してもよく、あるいは、両者を使用してもよい。組織片は、通常、その形状を維持するための支持体を含む。本明細書において、本発明の支持体は、それ自体のみで、または生体分子と組み合わせて組織片として使用することができる。好ましくは、本発明では、組織片として人工の材料が使用される。
【０２１３】
本明細書において「組織片」は、「移植片」、「グラフト」および「組織グラフト」と交換可能に用いられ得る。組織片は、通常、身体の特定部位に挿入されるべき同種または異種の組織または細胞群あるいは人工合成物であって、身体への挿入後その一部となる。従来の移植片としては、例えば、臓器または臓器の一部、血管、血管様組織、皮片、心臓弁、心膜、硬膜、角膜、骨片、歯などが使用されてきた。従って、移植片には、ある部分の欠損部に差し込んで欠損を補うために用いられるものすべてが包含される。移植片としては、そのドナー（ｄｏｎｏｒ）の種類によって、自己（自家）移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（同種異系移植片）（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、異種移植片が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１４】
本明細書において「膜状組織」とは、「平面状組織」ともいい、膜状の組織をいう。膜状組織には、心膜、硬膜、角膜などの器官の組織が挙げられる。
【０２１５】
本明細書において「管状組織」とは、管状の組織をいう。管状組織には、血管などの器官の組織が挙げられる。
【０２１６】
本明細書において「臓器」または「器官」（ｏｒｇａｎ）とは、互換的に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする器官は、虚血性の器官（心筋梗塞を起こした心臓、虚血を起こした骨格筋など）が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、本発明が対象とする臓器は、心臓、肝臓、腎臓、胃、腸、脳、骨、気管、皮膚、血管、軟部組織である。より好ましい実施形態では、本発明が対象とする臓器は、心臓（心臓弁）、骨、皮膚、血管などである。
【０２１７】
本明細書において「免疫反応」とは、移植片と宿主との間の免疫寛容の失調による反応をいい、例えば、超急性拒絶反応（移植後数分以内）（β−Ｇａｌなどの抗体による免疫反応）、急性拒絶反応（移植後約７〜２１日の細胞性免疫による反応）、慢性拒絶反応（３カ月以降の細胞性免疫による拒絶反応）などが挙げられる。
【０２１８】
本明細書において免疫反応を惹起するかどうかは、ＨＥ染色または免疫染色により染色された組織切片の検鏡によって、移植組織中への細胞（免疫系）浸潤について、その種、数などの病理組織学的検討を行うことにより判定することができる。
【０２１９】
本明細書において「石灰化」とは、生物体で石灰質が沈着することをいう。生体内の組織または臓器が石灰化すると、通常その組織または臓器の正常な機能が損なわれることから、石灰化は起こらないほうが好ましい。従って、移植治療では、石灰化を回避する処置をとることが従来より望まれていた。本発明の組織片を用いると、石灰化の問題は回避される。
【０２２０】
本明細書において生体内で「石灰化する」かどうかは、カルシウム濃度を測定することによって判定することができ、移植組織を取り出し、酸処理などにより組織切片を溶解させ、その溶液を原子吸光度などの微量元素定量装置により測定し、定量することができる。
【０２２１】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
【０２２２】
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０２２３】
本明細書において「エキソビボ」（ｅｘ  ｖｉｖｏ）とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。
【０２２４】
本明細書において「自己移植片」または「自家移植片」とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する移植片をいう。本明細書において「自己移植片」というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片をも含み得る。
【０２２５】
本明細書において「同種移植片（同種異系移植片）」とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される移植片をいう。遺伝的に異なることから、同種異系移植片は、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような移植片の例としては、親由来の移植片などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２６】
本明細書において異種移植片とは、異種個体から移植される移植片をいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植片は異種移植片という。
【０２２７】
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植片または移植体を受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植片または移植体を提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。
【０２２８】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０２２９】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、農学的もしくは薬学的アジュバントなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３０】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０２３１】
（生体分子付着組織片）
１つの局面において、本発明は、生体適合性組織片を提供する。この生体適合性組織片は、Ａ）生体分子；およびＢ）支持体を含む。この生体適合性組織片は、生体分子と支持体との構成のみで実際に移植治療に使用され得るだけでなく、移植後に、自己化を起こすことが予想外に発見された。従来は、移植片としては、生体由来の自己増殖性を有するもの（例えば、組織の一部、臓器そのもの）を利用するか、あるいは人工物を使用した場合であっても、その人工物に生体由来の自己増殖性を有するもの（例えば、細胞）を付着させる必要があると考えられていた。
【０２３２】
本発明では、実施例などでも示すように、自己増殖性を有するもの（例えば、細胞）を全く含まない組織片を用いて移植処置をしても、その処置の部位において自己化（すなわち、自己またはそれと等価な細胞が集合し、増殖すること）が起こることが明らかになった。従って、本発明の組織片は、従来不可能とされていた組織または臓器を治療するのにも使用することができる。なぜなら、本発明の組織片に含まれる支持体は、どのような形状にも変更することができるからである。
【０２３３】
理論に束縛されないが、本発明の組織片が宿主内の臓器または組織の一部（代表的には損傷部位あるいは強化が望まれる部位）に移植されると、組織片に含まれる生体分子（例えば、コラーゲンなど）の働きにより、宿主内の細胞（特に、その臓器または組織の一部となる（例えば、増殖または分化）ことができるもの）がその組織片の周辺に集合し、場合によって増殖することにより、その臓器または組織の損傷部位または強化部位が修復または強化される。
【０２３４】
従って、そのような生体分子としては、宿主内の細胞を直接または間接的に集合させる（例えば、接着あるいは、接着を媒介する分子の誘導など）ことができる分子であれば、どのような生体分子であっても使用することができる。従って、このような生体分子は、生体に由来するものであってもよいが、上述の機能を有する限り、合成により生産することもでき、天然に存在するものであっても天然に存在しないものであってもよい。好ましくは、天然に存在するものであって、その宿主に害を与えないことが判明している物質（例えば、厚生労働省から医薬品の成分として使用することが認められている物質、例えば、日本薬局方収載品など）を用いることが有利であり得る。あるいは、そのような生体分子は、その宿主に害を与えないことが別途確認されたものであってもよい。代表的には、そのような生体分子は、タンパク質を含む。
【０２３５】
１つの実施形態において、本発明において使用される生体分子は、細胞生理活性物質を含み得る。そのような細胞生理活性物質としては、例えば、ＨＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）などが挙げられるがそれに限定されない。
【０２３６】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる生体分子は、細胞接着分子を含み得る。細胞接着分子は、細胞と細胞または基質との接着を媒介することから、移植されたときに、その場所に宿主内の細胞を呼び寄せる機能を有すると考えられることから、好ましい実施形態と考えられる。しかし、従来は、このような細胞接着分子が直接そのような移植片として使用されるかどうかは不明であり、むしろ、細胞などの自己増殖性のものを含ませることが必須と考えられていた（Ｒａｆ  Ｓｏｄｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｔｈｒｏｒａｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２０００；７０；１４０−４４；Ｓｏｄｉａｎ  Ｒ，Ｌｅｍｋｅ  Ｔ，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  Ｃ，Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ  ＳＰ，Ｆｕ  Ｐ，Ｐｏｔａｐｏｖ  ＥＶ，Ｈａｕｓｍａｎｎ  Ｈ，Ｈｅｔｚｅｒ  Ｒ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ２００２  Ｏｃｔ；８（５）：８６３−７０；Ｋａｄｎｅｒ  Ａ，Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐ  ＳＰ，Ｚｕｎｄ  Ｇ，Ｅｉｄ  Ｋ，Ｍａｕｒｕｓ  Ｃ，Ｍｅｌｎｉｔｃｈｏｕｋ  Ｓ，Ｇｒｕｎｅｎｆｅｌｄｅｒ  Ｊ，Ｔｕｒｉｎａ  ＭＩ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２００２  Ｊｕｎ；２１（６）：１０５５−６０などを参照）ことから、本発明の移植片がもたらした効果は予想外といえる。
【０２３７】
そのような細胞接着分子としては、例えば、コラーゲン、ＩＣＡＭ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチン，ラミニン、インテグリン、ビトロネクチン，フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーなどが挙げられるがそれに限定されない。
【０２３８】
別の好ましい実施形態において、本発明において用いられる生体分子は、細胞外マトリクスを含む。そのような細胞外マトリクスもまた、細胞を集合させる活性を有することが知られることから、本発明における好ましい実施形態と考えられる。しかし、従来は、このような細胞外マトリクスが直接そのような移植片として使用されるかどうかは不明であり、むしろ、細胞などの自己増殖性のものを含ませることが必須と考えられていたことに鑑みると、このような細胞外マトリクスを直接移植片の主要成分として用いることができるという知見は、予想外の効果といえる。
【０２３９】
そのような細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニンなどが挙げられるがそれに限定されない。
【０２４０】
別の好ましい実施形態において、本発明において用いられる生体分子は、細胞接着性タンパク質を含む。そのような細胞接着性タンパク質もまた、細胞を集合させる活性を有することが知られることから、本発明における好ましい実施形態と考えられる。しかし、従来は、このような細胞接着性タンパク質が直接そのような移植片として使用されるかどうかは不明であり、むしろ、細胞などの自己増殖性のものを含ませることが必須と考えられていたことに鑑みると、このような細胞接着性タンパク質を直接移植片の主要成分として用いることができるという知見は、予想外の効果といえる。
【０２４１】
そのような細胞接着性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ＩＣＡＭ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチン，ラミニン、インテグリン、ビトロネクチン，フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーなどが挙げられるがそれに限定されない。
【０２４２】
１つの好ましい実施形態において、本発明において用いられる生体分子は、ＲＧＤ分子を含む。そのようなＲＧＤ分子もまた、細胞を接着させる活性を有することが知られることから、本発明における好ましい実施形態と考えられる。しかし、従来は、このようなＲＧＤ分子が直接そのような移植片の主要成分として使用されるかどうかは不明であり、むしろ、細胞などの自己増殖性のものを含ませることが必須と考えられていたことに鑑みると、このようなＲＧＤ分子を直接移植片の主要成分として用いることができるという知見は、予想外の効果といえる。
【０２４３】
そのようなＲＧＤ分子としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型など）、ラミニン、フィブロネクチン、ＩＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ビトロネクチン、フォンヴィルブランド因子、エンタクチンなどが挙げられるがそれに限定されない。
【０２４４】
より好ましい実施形態では、本発明において用いられる生体分子は、コラーゲンまたはラミニンを含む。コラーゲンおよびラミニンもまた、細胞を接着させる活性を有することが知られることから、本発明における好ましい実施形態と考えられる。しかし、従来は、このようなコラーゲンおよびラミニンは、補助成分として使用されており、直接そのような移植片の主要成分として使用されるかどうかは不明であり、むしろ、細胞などの自己増殖性のものを含ませることが必須と考えられていたことに鑑みると、このようなコラーゲンおよびラミニンを直接移植片の主要成分として用いることができるという知見は、予想外の効果といえる。
【０２４５】
より好ましくは、このコラーゲンは、線維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンであり得る。さらに好ましくは、本発明において用いられる生体分子は、この線維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを含む。線維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンの両方を含むことにより、組織片の移植後の自己化が最もよく促進された。これは、理論に束縛されないが、細胞の集合および接着活性がこの組み合わせにより最も最適化されるからであると考えられる。
【０２４６】
さらに好ましくは、このコラーゲンは、Ｉ型またはＩＶ型のコラーゲンであることが有利であり得る。Ｉ型およびＩＶ型が有利であるのは、血管内皮、平滑筋細胞、心筋細胞、それらの前駆細胞（幹細胞）が生着、増殖の足場としてより有効であるという原因が挙げられるがそれに限定されない。
【０２４７】
もっとも好ましい実施形態において、本発明の生体分子は、コラーゲンＩ型およびＩＶ型の両方を含む。コラーゲンＩ型およびコラーゲンＩＶ型の両方を一緒に含むことにより、組織片の移植後の自己化が最もよく促進された。これは、理論に束縛されないが、細胞の集合および接着活性がこの組み合わせにより最も最適化されるからであると考えられる。
【０２４８】
別の実施形態において、本発明に用いられる支持体は、膜状であり得る。膜状の支持体を用いた組織片は、膜状の組織または臓器への移植に適切であり得る。そのような膜状の組織または臓器としては、例えば、皮膚、角膜、硬膜、大型の臓器（例えば、肝臓、心臓など）の一部などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４９】
別の実施形態において、本発明に用いられる支持体は、管状であり得る。管状の支持体を用いた組織片は、管状の組織または臓器への移植に適切であり得る。そのような管状の組織または臓器としては、例えば、血管、リンパ管などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５０】
別の実施形態において、本発明に用いられる支持体は、弁状であり得る。弁状の支持体を用いた組織片は、弁状の組織または臓器への移植に適切であり得る。そのような弁状の組織または臓器としては、例えば、心臓弁などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２５１】
好ましい実施形態において、本発明の支持体は、生分解性ポリマーを含むことが有利であり得る。より好ましくは、本発明の支持体は、生分解性ポリマーから構成されることがより有利であり得る。支持体が生分解性ポリマーを含むかまたは生分解性ポリマーから構成されることにより、一定期間の後には、本発明の組織片は自己の細胞のみから構成されるようになり、移植の対象となった臓器または組織が自己のものと区別がほとんどできなくなるからである。本発明において使用されることが好ましい生分解性ポリマーとしては、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）などが挙げられるがそれに限定されない。
【０２５２】
好ましい実施形態では、本発明において使用される支持体は、ＰＧＡおよびＰＬＧＡからなる群より選択される少なくとも１成分を含む。より好ましくは、本発明において使用される支持体は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む。このような比率のＰＬＧＡを用いることによって、適度な強度および半減期（およそ１ヶ月〜数ヶ月）という性質を達成することができるからである。強度としては、例えば、少なくとも約１０Ｎ以上であり得、通常約２５Ｎ以上であり得、好ましくは約５０Ｎ以上であり得る。より好ましくは約７５Ｎ以上であり得る。
【０２５３】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明において使用される支持体にも細胞接着分子を用いることができる。そのような細胞接着分子は、上述したものであり得るが、好ましくは、支持体としての強度を有するものが有利であり得る。そのような強度としては、例えば、約１０Ｎ以上の強度、約２０Ｎ以上の強度、約２５Ｎ以上の強度であり得、好ましくは約５０Ｎ以上の強度、より好ましくは約７５Ｎ以上の強度であり得る。応力で表示した場合には、例えば、約１０ＭＰａ以上の強度、約２０ＭＰａ以上の強度、約２５ＭＰａ以上の強度であり得、好ましくは約５０ＭＰａ以上の強度、より好ましくは約７５ＭＰａ以上の強度であり得る。そのような支持体としての強度を保持する細胞接着分子としては、例えば、フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチン，ラミニン、インテグリン、ビトロネクチン，フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーなどが挙げられるがそれに限定されない。通常の細胞接着分子の一部を改変（例えば、置換基の追加）することによって強度を上げることができる。そのような物質の強度に関する改変は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、そのような方法は、例えば、高分子機能材料シリーズ医療機能材料  共立出版株式会社、Ｇｕｏｐｉｎｇ  Ｃｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ，５１，２７３−２７９，２０００に記載されている。
【０２５４】
本発明のある実施形態において、本発明において使用される支持体は、それ自体がタンパク質を含んでいてもよい。そのようなタンパク質は、上述したもの（例えば、細胞接着性タンパク質など）であり得るが、好ましくは、支持体としての強度を有するものが有利であり得る。そのような支持体としての強度を保持するタンパク質としては、例えば、フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチン，ラミニン、インテグリン、ビトロネクチン，フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーなどが挙げられるがそれに限定されない。通常のタンパク質の一部を改変（例えば、（糖または脂質などとの）複合体化、置換基の追加）することによって強度を上げることができる。そのような物質の強度に関する改変は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、そのような方法は、例えば、高分子機能材料シリーズ医療機能材料  共立出版株式会社、Ｇｕｏｐｉｎｇ  Ｃｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ，５１，２７３−２７９，２０００に記載されている。
【０２５５】
支持体において上述のタンパク質または細胞接着分子の改変体を用いる場合は、そのような改変体は、生体適合性であることが好ましい。
【０２５６】
好ましい実施形態において、本発明において使用される支持体は、メッシュ状であり得る。別の実施形態において、そのような支持体は、例えば、膜状、織物様、管状、スポンジ状、ファイバー状のような形状をとっていてもよい。ある実施形態では、メッシュ状が好ましい。メッシュ状であると、生体分子が容易にコーティングされ得るからである。しかし、当業者は、目的によって、そのような形状は適宜選択することができ、当業者は選択した形状を当該分野における周知技術に基づき容易に作製することができる。
【０２５７】
本発明の支持体は、目的に応じてその厚みを変動することが必要であり得る。そのような支持体は、通常、約０．２ｍｍ〜約１．０ｍｍ厚であることが好ましい。血管などで用いる場合は、そのような支持体は、少なくとも約０．６ｍｍ厚であることが好ましくあり得る。
【０２５８】
好ましくは、本発明の組織片において、支持体は、生体分子でコーティングされていることが有利であり得る。コーティングによって、ほぼ均等に生体分子がその組織片において分布させることができるからである。コーティングの方法は、当該分野において公知であり、例えば、再生医学と生命科学  共立出版；Ｇｕｏｐｉｎｇ  Ｃｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ，５１，２７３−２７９，２０００に記載される手法が考えられるがそれに限定されない。
【０２５９】
好ましい実施形態では、本発明の組織片において、支持体に隙間がある場合（例えば、メッシュ状の場合）、その隙間は生体分子がふさいでいることが有利であり得る。隙間が「ふさがれている」または「埋められている」との用語は、その隙間を所望でない流体（例えば、液体または気体）が通り抜けられない状態を意味する。隙間がふさがれていることにより、その組織片から液体または気体がもれ出ることを防止することができるからである。従って、そのような隙間がふさがれている形態は、例えば、血管、心臓など血液に関する臓器の破損の修復などにおいて有用であり得る。
【０２６０】
好ましくは、本発明において使用される生体分子は、架橋可能な分子を含む。この架橋可能な分子は、支持体との間で架橋処理されている。本発明において使用され得る架橋可能な分子には、例えば、未熟架橋（シッフ塩基型架橋）、成熟架橋（ピリジノリン）、老化架橋（ヒスチジノアラニン）コラーゲンなどが挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、架橋可能な分子は成熟架橋（ピリジノリン）コラーゲンである。
【０２６１】
ある実施形態において、本発明で使用される支持体は、本発明に含まれる生体分子と同じ物質を含んでいてもよい。そのような場合、本発明の組織片は、その生体分子のみで形成されることがあり得る。したがって、例えば、本発明の組織片は、ＨＧＦのみで形成されていてもよく、コラーゲンのみで形成されていてもよい。ただし、そのような場合、ある程度の強度を保持する必要があり得る。そのような強度を獲得するために、上記生体分子は、改変され得る。そのような改変は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が適宜行うことができる。
【０２６２】
別の実施形態において、本発明の組織片は、さらに細胞が付着したものであってもよい。本発明は、細胞なしでも自己化を達成することができることにひとつの特徴があるが、細胞がある場合でも、同様な効果（自己化、修復など）を達成することが本明細書において示されていることから、そのように細胞を含む形態も本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。なぜなら、細胞ありの場合でも、１ヶ月程度で細胞が消去し、自己由来の細胞が生着するからである。
【０２６３】
１つの実施形態において、本発明の移植片は、体内への移植用のものであり得る。移植用に用いられる場合、その標的となる部位は、例えば、心臓弁、血管、血管様組織、心臓弁、心臓、心膜、硬膜、皮膚、骨、軟部組織、気管などがあるがそれに限定されない。好ましくは、標的となる部位は、血管様組織、心臓弁、心臓、心膜、硬膜、皮膚、骨、軟部組織、気管などであり得る。
【０２６４】
ある実施形態において、本発明の組織片は、ある臓器または組織の損傷を修復するために用いられ得る。修復を標的とする臓器または組織もまた、上述に記載のものから選択され得る。好ましくは、標的となる損傷部位は、心臓、肝臓、腎臓、胃、腸、脳、骨、気管、皮膚、血管、軟部組織などであり得る。修復を目的とする場合、本発明の組織片は、その損傷部位と同じまたはそれより大きな面積、好ましくはすべてを覆う程度の広さを有することが好ましいが、それより小さな面積であっても所期の目的は達成可能である。そのように損傷部位を覆う程度の広さを有することによって、損傷により有害な影響を伴う事象（例えば、流血など）を抑えることができ、有利な治療効果を達成することができる。
【０２６５】
別の実施形態において、本発明の組織片は、臓器または組織の強化のために使用され得る。強化を目的とする場合、本発明の組織片は、その強化を目的とする部位と同じまたはそれより大きな面積、好ましくはすべてを覆う程度の広さを有することが好ましいが、それより小さな面積であっても所期の目的は達成可能である。そのように損傷部位を覆う程度の広さを有することによって、損傷により有害な影響を伴う事象（例えば、流血など）を抑えることができ、有利な治療効果を達成することができる。
【０２６６】
別の実施形態において、本発明の組織片は、滅菌されていることが好ましい。そのような滅菌をする方法としては例えば、オートクレーブ、乾熱滅菌、薬剤滅菌（例えば、アルコール消毒、ホルマリンガス、オゾンガスなどによる滅菌）、放射線滅菌（γ線照射など）などが挙げられ、そのような滅菌は、例えば、アルコール消毒、γ線照射、エチレンオキサイドガス滅菌などで行うことができる。従って、本明細書においてある材料、支持体などが「滅菌可能」とは、少なくとも１つの滅菌方法に対して耐性である性質をいう。滅菌されることにより、感染などの二次的な有害事象を防ぐことができる。
【０２６７】
別の好ましい実施形態において、本発明の組織片は、その中にかまたはそれに伴って、免疫抑制剤をさらに含んでいてもよい。そのような免疫抑制剤は、当該分野において公知である。免疫抑制の目的では、免疫抑制剤のほか、免疫抑制を達成する別の方法を用いてもよい。上述のような拒絶反応を起こさないようにする免疫抑制法として、免疫抑制剤によるもの、外科的手術、放射線照射等が挙げられる。まず、免疫抑制剤として主なものとして副腎皮質ステロイド薬、シクロスポリン、ＦＫ５０６等がある。副腎皮質ステロイド薬は循環性Ｔ細胞の数を減少させ、リンパ球の核酸代謝、サイトカイン産生を阻害してその機能を抑え、マクロファージの遊走および代謝を抑制して免疫反応を抑える。一方、シクロスポリンおよびＦＫ５０６の作用は類似しており、ヘルパーＴ細胞の表面にある受容体と結合して細胞内に入り込み、ＤＮＡに直接働いてインターロイキン２の生成を阻害する。最終的には、キラーＴ細胞が機能できなくなり免疫抑制作用が起こる。これらの免疫抑制剤の使用においては副作用が問題となる。ステロイドは特に副作用が多く、また、シクロスポリンは肝臓・腎臓に対する毒性がある。また、ＦＫ５０６は腎臓に対する毒性を有する。次に外科的手術としては、例えば、リンパ節摘出、脾臓摘出、胸腺摘除が挙げられるが、これらについてはその効果が十分に証明されてはいない。外科的手術の中でも胸菅ろうとは、循環しているリンパ球を体外に導くものであり効果も確認されているが、大量の血清タンパク質および脂肪の流出を引き起こし、栄養障害が起こりやすくなるという欠点がある。放射線照射には全身照射と移植片照射があるが、効果が不確実な面もあり、レシピエントに対する負担が大きいので、前述の免疫抑制剤との併用により利用されている。上述のいずれの方法も拒絶反応の防止にはあまり好ましくない。
【０２６８】
本発明の組織片は、さらなる医薬成分を含んでいてもよい。そのような医薬成分は、好ましくは、細胞の集合および結合を妨害しないようなものが有利であり得る。あるいは、そのような医薬成分は、処置を目的とする損傷部位などの改善に有利な作用を有するものが選択され得る。そのような医薬成分としては、例えば、ヘパリン、抗生剤、血管拡張剤、降圧剤（ＡＣＥ阻害剤，ＡＲＢ（＝ＡＣＥレセプターブロッカー））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２６９】
好ましい実施形態において、本発明の組織片において用いられる生体分子は、移植を目的とする生体自体に由来することが有利であり得る。ここで、「その生体に由来する」とは、その生体から単離したもののほか、その単離体に基づいて合成または複製などをしたものを包含する。このようなものを「自己由来」ともいう。自己由来の生体分子を用いることによって、免疫拒絶をより効率的に防止することができる。
【０２７０】
別の実施形態において、本発明は、本発明の生体適合性組織片を含む医薬に関する。そのような医薬は、好ましくは、日本における薬事法などに基づく基準を満たしたものである。したがって、そのような場合、生体適合性組織片に含まれる成分は、そのような基準を満たしたものであり得る。そのような基準を満たしたものの例としては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンがあるがそれに限定されない。当然、申請すれば基準を満たす状態にあるものは種々存在する。したがって、ここに挙げたものは、現時点ですでに基準を満たすことが当局によって認められているということのみを示し、本発明を限定的に解釈する根拠として用いるべきではないことに留意するべきである。
【０２７１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の生体適合性組織片およびその組織片の使用法を示した指示書を含む医薬キットまたはシステムに関する。この指示書には、所定の部位に本発明の組織片を移植する方法が記載される。そのような移植は、当該分野において周知の方法によって行うことができ、例えば、そのような方法は、新外科学体系、心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて（改訂第３版）、標準外科学第９版医学書院、心臓の外科  新外科学大系，１９Ａ，１９Ｂ，１９Ｃ，（中山書店）に記載されている。本発明の組織片の移植に際しては、上述の一般的な方法において、過大な圧がかからないということに留意することが好ましくあり得る。
【０２７２】
本発明の組織片が移植される部位としては、例えば、血管内皮、血管平滑筋、弾性線維、心臓、肝臓、腎臓、胃、腸、脳、骨、気管、皮膚、血管および軟部組織からなる群より選択される部位があるがそれに限定されない。好ましくは、血管内皮、血管平滑筋  弾性線維、膠原線維などが挙げられる。
【０２７３】
好ましい実施形態において、本発明において添付される指示書には、本発明の生体適合性組織片を、移植を目的とする臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植することが記載され得る。
【０２７４】
本発明において添付される指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる「添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）」であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるウェブサイト、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０２７５】
本発明の組織片およびキットは、ヒトにおいて用いる場合、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
【０２７６】
別の実施形態において、本発明は、体内における損傷部位を処置する方法を提供する。このような方法は、Ａ）損傷部位の一部または全部に、Ａ−１）生体分子；およびＡ−２）支持体、を含む、生体適合性組織片を移植する工程、を包含する。ここで、組織片は、損傷部位に直接接触されてもよく、間接的に接触されるような処置を行ってもよい。好ましくは、本発明の方法における移植工程において、本発明の生体適合性組織片は、損傷部位が属する臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植されることが有利であり得る。一部が残存することにより、残存する組織内に存在する細胞が生体分子によって活性化され得、その結果、自己化が促進され得るからである。
【０２７７】
好ましい実施形態において、本発明の処置方法では、細胞生理活性物質を投与する工程をさらに包含してもよい。そのような細胞生理活性物質としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、免疫グロブリンファミリー（ＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ８）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択され得るがそれらに限定されない。
【０２７８】
好ましい実施形態において、本発明の方法では、免疫反応を抑制する処置を行う工程をさらに包含し得る。そのような免疫反応を抑制する処置は前述したとおりである。そのような場合、好ましくは、免疫抑制剤を用いることが有利であり得る。
【０２７９】
別の実施形態において、本発明は、体内における臓器または組織を強化する方法を提供する。このような方法は、Ａ）該臓器または組織の一部または全部に、Ａ−１）生体分子；およびＡ−２）支持体、を含む、生体適合性組織片を移植する工程、を包含する。そのような移植の方法は当該分野において周知であり、新外科学体系、心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて（改訂第３版）などに記載の方法をそのまま用いるか適宜改良して使用することができる。
【０２８０】
別の実施形態において、本発明は、臓器または組織を生産または再生する方法を提供する。この方法は、Ａ）目的とする臓器または組織の少なくとも一部を含む生体において、該臓器または組織に、Ａ−１）生体分子；およびＡ−２）支持体、を含む、生体適合性組織片を移植する工程；ならびにＢ）該臓器または組織を該生体内で培養する工程、を包含する。
【０２８１】
このように臓器または組織を再生または生産する方法においても、移植工程は上述のものと同じように行うことができる。培養工程は、生体を通常の条件下で飼育することによって行うことができる。そのような飼育条件は、当該分野において周知であり、当業者であれば、動物の種、サイズなどに鑑みて適宜行うことができる。
【０２８２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の生体適合性移植片の、体内における損傷部位を処置するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性移植片として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０２８３】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の生体適合性移植片の、体内における臓器または組織を強化するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性移植片として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０２８４】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の生体適合性移植片の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性移植片として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０２８５】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の生体適合性移植片の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性移植片として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０２８６】
医薬を製造する方法は、当該分野において周知であり、本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する細胞組成物とを混合することによって、凍結乾燥された状態で調製され保存されるが、適切な保存液中に保存されることが好ましい。
【０２８７】
本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。本発明において使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、農学的または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、支持体および生体分子を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、移植のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０２８８】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０２８９】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、αとこフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０２９０】
（複合支持体）
別の局面において、本発明は、新規構造を有する生体適合性組織支持体を提供する。この支持体は、Ａ）粗面を有する第一層；およびＢ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を提供する。この支持体は、生体内に移植され、臓器補填の足場として使用される。ここで、粗面を有する第一層は、通常生体において適用されるとき内側層として使用される。
【０２９１】
本発明の１つの実施形態において、通常、この粗面を有する第一層として、編物が使用される。編物として使用される材料は、編むことができ、生体適合性である限りどのような材料を使用してもよい。編物は、当該分野において公知の任意の製造方法を用いて製造することができる。編物は、材料を糸状にし、その糸で輪を作り、その輪を順々につなげていくことによって作製することができる。編物は、このように輪をつなげていくことから、隙間がひらき、細胞を収容するに十分なスペースを作製することができる。この場合、同じように織物とする場合よりも厚みが大きな層が提供される。
【０２９２】
本発明の１つの実施形態において、本発明の支持体の第二層としては、織物が使用される。織物として使用される材料は、織ることができ、生体適合性である限りどのような材料を使用してもよい。織物の製造方法としては、当該分野において公知の任意の方法を用いることができ、織物は、例えば、縦部分（縦糸ともいう）と横部分（横糸ともいう）とを交互に織り込んでいくことによって製造することができる。織物は、隙間がほとんどないことから、液体（例えば、血液のような体液）がもれにくくなる。
【０２９３】
本発明はまた、生体適合性であり得る編物と織物との組織片層を重ね合わせ、中間層により接着する構造を提供することによって、編物において見られた漏れの問題と、織物において見られた解れの問題を、予想外に両方とも解決した。このように編物と織物とを複合したことによって、さらに、細胞が入り込むスペースを有しつつ、漏れを防ぎ、解れが防止されている材料を予想外に提供することができた。さらに、このような支持体に生体分子（コラーゲンなど）を提供することによって、生体内に提供した場合に初期には細胞を呼び込み、その後その支持体自体は生体により分解され、消失し、実質的に跡形も残らない移植片を提供することができる。したがって、好ましくは、内側層として使用される第一層の方が、第二層よりも生分解性が早い方が有利であるが、それに限定されない。また、この複合支持体は、編物と織物との作製において任意の方法を選択することによって、強度を保ち、一定の厚みを有することができる。さらに、編みと織りに用いる糸に任意の材料を用いることによって、それぞれの吸収速度を制御することができ、さらには、組織の再生速度と支持体に必要な強度とに適合した支持体を作成することができるというように、種々の応用が考えられる。
【０２９４】
１つの実施形態において、本発明の第一層における粗面は、細胞が入り込むに充分なスペースを有する。細胞が入り込むに充分なスペースを有することによって、組織片として移植された後に、細胞が生着することが容易になるという効果が奏される。あるいは、このようなスペースは、細胞を予め本発明の支持体に付与する場合にも、細胞の担持に利用することができる。
【０２９５】
１つの好ましい実施形態では、本発明の支持体は、中間層を有する。中間層を有することによって、第一層と第二層とを効率よく密着または封着させることができるからである。
【０２９６】
１つの実施形態において、中間層による封着は、生体吸収性高分子を融着することにより達成される。このような封着は任意の手段を用いて実行することができる。封着としては、例えば、融点の違いを利用して、封着が企図される層よりも融点が低い材料を中間層として使用し、その中間層材料の融点より高く、他の層の材料の融点よりも低い温度に加熱することによって達成することができる。あるいは、フィブリンのような生体物質をのりとして使用することも可能である。中間層は、フィルムのような形態をとることが好ましいがそれに限定されない。
【０２９７】
好ましい実施形態において、本発明の第二層は、通気性が実質的に遮断されることが好ましい。通気性が実質的に遮断されているかどうかは、水漏れ試験を行なうことによって確認することができる。
【０２９８】
本発明の支持体が有する強度は、通常、少なくとも約１０Ｎ以上、より好ましくは、約２０Ｎ以上、さらに好ましくは約５０Ｎ以上、なおさらに好ましくは、引張り試験において、力で表示する場合、少なくとも１００Ｎであり得る。応力で表示した場合には、例えば、約１０ＭＰａ以上の強度、約２０ＭＰａ以上の強度、約２５ＭＰａ以上の強度であり得、好ましくは約５０ＭＰａ以上の強度、より好ましくは約７５ＭＰａ以上の強度であり得る。
【０２９９】
本発明の支持体は、弾性率でみると、本発明の支持体は、通常多くとも１００ＭＰａの弾性率を有し、好ましくは多くとも約８０ＭＰａの弾性率を有するが、本発明の支持体は、使用に耐え得る限り、天然物よりも劣る弾性率を有していてもよい。伸びに関しては、本発明の支持体は、通常少なくとも１０５％、好ましくは１１０％の伸びを有する。伸びは、縦方向と横方向とを両方測定する。この両方の伸びにばらつきがないほうが好ましいがそれに限定されない。用途に応じて、伸びに関する特性は、例えば、少なくとも１２０％、好ましくは１５０％であることが好ましいが、それに限定されない。伸びに関する特性についても、本発明の支持体は、使用に耐え得る限り、天然物よりも劣る伸びを有していてもよい。
【０３００】
１つの実施形態において、本発明の支持体の通気性は、通常、２５ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下であり、より通常には、１５ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下であり、好ましくは１０ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下であり、より好ましくは、約５ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下であり、さらに好ましくは約４ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下であり、もっとも好ましくは、約３ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である。ここで、従来の編物および織物のみでは、せいぜい約５ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ程度までしか達成できていなかったが、本発明の支持体では、予想外にそれよりも優れた通気性を有する支持体を提供することができたという効果を達成する。本明細書において、支持体の通気性は、ＪＩＳ−Ｌ−１０９６Ａに準じて測定することができる。このような測定方法では、フラジール型試験機に試験片を取り付けた後、加圧抵抗器によって傾斜形気圧計が１２５Ｐａの圧力を示すように調節し、通過する空気量（ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ）を測定することによって通気性を決定する。通気性はまた、水漏れ率に関連する数値をとることから、水漏れ率によって、通気性を表現してもよい。このような場合、好ましい水漏れ率としては、例えば、６０秒、１０ｍｌのうち、５ｍｌ以下、好ましくは３ｍｌ以下、より好ましくは２ｍｌ以下、さらに好ましくは１ｍｌ以下であることが有利である。
【０３０１】
１つの実施形態において、本発明の支持体の第一層および／または第二層は、独立して選択される生体分解性材料を含む。好ましくは、第一層および第二層の両方が生体分解性材料を有していることが好ましい。生体分解性材料の分解速度は、細胞が生着するに充分な期間（例えば、数ヶ月）をとることが好ましい。
【０３０２】
このような生体分解性材料としては、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分またはそれらの混合物であり得る。あるいは、このような生体分解性ポリマーは、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含んでいてもよい。
【０３０３】
好ましい実施形態において、本発明の支持体の第一層は、ポリグリコール酸を含む。編物として製造することが容易であるからである。また、細胞の生着も良好であるからである。
【０３０４】
別の好ましい実施形態において、本発明の支持体の第二層は、ポリＬ乳酸を含む。織物として製造することが容易であるからである。また、細胞の生着も良好であるからである。
【０３０５】
好ましい実施形態において、本発明の第二層は、織物であり、第一層は編物である。このような構造をとることによって、細胞との生着性を高め、かつ、強度を保持する支持体を提供することができる。このような構造を有する支持体はこれまでに存在しておらず、従来の支持体では達成できなかった効果を提供する。このような組み合わせの支持体はまた、コラーゲン、ラミニンなどの生体分子との組み合わせによって、さらに細胞の生着を高め、再生修復のための機能を高めることができる。
【０３０６】
好ましい実施形態において、本発明の支持体では、第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、第一層は、ポリグリコール酸の編物であることが有利である。このような構造を有することによって、強度を保ち、漏れを防ぎ、生体分子（例えば、コラーゲン）のスペースを収容し得、支持体に一定の厚みを付与し、解れを防止し、強度および厚みをコントロールすることができるという従来の支持体では、到底達成し得なかった効果を達成する。例えば、従来の織構造を有する支持体では、強度を保つことはできたが、細胞との生着性が担保できなった。
【０３０７】
１つの実施形態において、中間層は、合成生体吸収性ポリマーを含む。ここで、このポリマーは、ポリ乳酸系フィルムまたはカプロラクタムフィルムであることが好ましい。このようなフィルムは、融点が低く、接着が容易であるので、製造が容易であるからである。従って、好ましい実施形態では、中間層を構成する材料は、第一層および第二層の少なくとも一方、好ましくはその両方の融点よりも低い融点を有する。
【０３０８】
第一層および第二層は、一層のみから構成されていてもよいが、複数の層から構成されていてもよい。好ましい実施形態では、第一層は、複数の編物層を含む。別の好ましい実施形態では、第二層は、複数の織物層を含む。第一層は、編物に加えて別の層（例えば、編物）を含んでいてもよい。
【０３０９】
他の好ましい実施形態では、第一層に、生体分子が配置されていてもよい。この実施形態では、上述の生体分子付着組織片に関して記載される任意の実施形態を使用してもよい。ここで好ましくは、生体分子は、細胞外マトリクスである。特に好ましい生体分子は、コラーゲンおよびラミニンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む。
【０３１０】
生体分子は、好ましくは、生体分子は、マイクロスポンジに含ませて配置される。このようなマイクロスポンジは、細胞の足場として適切な形態であることから、望ましい形態である。
【０３１１】
好ましくは、生体分子は、支持体と架橋処理されていることが有利である。コラーゲンが使用される場合、この架橋は、コラーゲン架橋処理によって実施される。
【０３１２】
別の局面において、本発明は、本発明の支持体を含む医薬を提供する。この医薬において使用される支持体は、上述の任意の支持体の形態をとりえる。本発明の支持体は、細胞を含まなくても支持体として使用することができることが特徴であるが、別の実施形態において、本発明の医薬は、細胞をさらに含んでいてもよい。
【０３１３】
１つの実施形態において、本発明の医薬は、体内への移植用途に使用される。移植された後、細胞がこの支持体に生着するという効果が見出されている。このような効果は、従来の支持体では考えられなかった効果であり、数週間から数ヶ月すると、細胞が組織化して、移植された部分を修復することができる。好ましい実施形態では、生体分解性の材料が使用されることから、移植部分の修復がなされると前後して材料自体は消失することになる。このように、本発明の支持体は、完全に天然と同じ状態に修復することができるという格別の効果を達成する。このような効果は、従来の支持体、パッチなどでは達成できなかったものである。
【０３１４】
特定の実施形態において、本発明の支持体が体内において移植されるべき部位は、心臓、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、液体（例えば、血液）が流れる部分での適用が好ましい。そのような部分としては、消化管、血管、心臓、心臓弁などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３１５】
好ましい実施形態において、本発明の医薬において用いられる生体分子は、移植を目的とする生体に由来することが有利であるが、それに限定されない。このような宿主と同じ起源の生体分子は、免疫反応等がほとんどないと考えられることから、有利であると考えられる。ただし、生体分子は、精製されたものであれば、免疫反応は通常起きないと考えられることから、特に起源を限定する必要はない。
【０３１６】
（支持体製造法）
別の局面において、本発明は、Ａ）粗面を有する第一層；およびＢ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体、を含む、生体適合性組織支持体を製造する方法を提供する。この方法は、上記第一層と上記第二層とを接着する工程を包含する。接着する工程としては、例えば、超音波ミシン、ＵＶ光などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３１７】
超音波ミシンは当上記分野において公知の手法を用いることができる。そのような手法としては、例えば、市販の超音波シーラー（例えば、アームタイプ（例えば、ブラザーＵＳ−１１５０）、ＣＮＣタイプ（ＵＳ−７０１０）、ユニットタイプ（ＵＳ−２１５０）（ブラザー社、愛知、日本）から入手可能）を用いる手法が挙げられる。
【０３１８】
1つの実施形態では、この製造法は、ａ）上記第一層と上記第二層との間に上記中間層を提供する工程；ｂ）上記第一層と上記第二層とが融解せず、上記中間層が融解する条件に上記第一層、上記第二層および上記中間層を配置する工程；およびｃ）上記第一層、上記第二層および上記中間層を所望の形状に保持しながら上記中間層が固化する条件に配置する工程、を包含する。
【０３１９】
ここで、好ましい実施形態では、融解する条件は、温度による違いを利用し、上記第一層および上記第二層のいずれか一方の融点より、好ましくは両方の融点より上記中間層の融点が低い。
【０３２０】
好ましい実施形態において、本発明の支持体の第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、第一層は、ポリグリコール酸の編物であり、上記中間層は、ポリ乳酸系フィルムまたはカプロラクタムフィルムであって、ここで、上記融解する条件の温度は、８０℃より高く〜１４０℃以下であり、好ましくは１００℃〜１４０℃であることが有利である。
【０３２１】
別の好ましい実施形態において、中間層としてカプロラクタムが使用される場合、融解させる温度は、約８０℃〜約１４０℃であることが有利である。このような温度で接着させると、接着強度が他の温度に比して格段に（２倍以上）向上した。したがって、好ましい温度としては、中間層として使用される材料の融点より高く、第一層および第二層として使用されるそれぞれの材料の融点よりも低い温度が使用される。
【０３２２】
他の実施形態において、本発明の支持体の製造法において、本発明の支持体は、さらに生体分子を含む。この場合、本発明の方法は、生体分子を前記第一層に付着させる工程をさらに包含する。このような付着工程は、どのような技術を用いても実施することができるが、好ましくは、架橋処理を包含する。
【０３２３】
１つの実施形態において、本発明の支持体において使用される生体分子はコラーゲンであり、この場合付着は、コラーゲン架橋処理を包含する。
【０３２４】
１つの実施形態において、本発明の支持体の中間層は、ガラス上にキャストした後風乾してフィルムを作成することによって製造される。このようなフィルムは、封着に適していることから、本発明の支持体を製造するために好ましく使用され得る。
【０３２５】
１つの実施形態において、本発明の付着工程では、少なくとも約０．１ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることが好ましい。このような重りは、より好ましくは、少なくとも約０．５ｇ／ｃｍ２の重りであり、さらに好ましくは０，７５ｇ／ｃｍ２であり得る。
【０３２６】
（治療法）
別の局面において、本発明は、体内における損傷部位を処置する方法を提供する。このような方法は、Ａ）上記損傷部位の一部または全部に、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程、を包含する。ここで、組織片は、損傷部位に直接接触されてもよく、間接的に接触されるような処置を行ってもよい。好ましくは、本発明の方法における移植工程において、本発明の生体適合性組織片は、損傷部位が属する臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植されることが有利であり得る。一部が残存することにより、残存する組織内に存在する細胞が生体分子によって活性化され得、その結果、自己化が促進され得るからである。本発明の損傷部位の処置方法において使用される生体適合性組織支持体としては、本明細書において記載される任意の支持体が使用され得る。
【０３２７】
好ましい実施形態において、本発明の処置方法では、細胞生理活性物質を投与する工程をさらに包含してもよい。そのような細胞生理活性物質としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、免疫グロブリンファミリー（ＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ８）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択され得るがそれらに限定されない。
【０３２８】
好ましい実施形態において、本発明の方法では、免疫反応を抑制する処置を行う工程をさらに包含し得る。そのような免疫反応を抑制する処置は前述したとおりである。そのような場合、好ましくは、免疫抑制剤を用いることが有利であり得る。
【０３２９】
別の局面において、本発明は、体内における臓器または組織を強化する方法を提供する。このような方法は、Ａ）該臓器または組織の一部または全部に、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程、を包含する。そのような移植の方法は当該分野において周知であり、新外科学体系、心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて（改訂第３版）などに記載の方法をそのまま用いるか適宜改良して使用することができる。本発明の強化方法において使用される生体適合性組織支持体としては、本明細書において記載される任意の支持体が使用され得る。
【０３３０】
別の局面において、本発明は、臓器または組織を生産または再生する方法を提供する。この方法は、Ａ）目的とする臓器または組織の少なくとも一部を含む生体において、該臓器または組織に、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体を移植する工程；ならびにＢ）該臓器または組織を該生体内で培養する工程、を包含する。本発明の再生方法において使用される生体適合性組織支持体としては、本明細書において記載される任意の支持体が使用され得る。
【０３３１】
このように臓器または組織を再生または生産する方法においても、移植工程は上述のものと同じように行うことができる。培養工程は、生体を通常の条件下で飼育することによって行うことができる。そのような飼育条件は、当該分野において周知であり、当業者であれば、動物の種、サイズなどに鑑みて適宜行うことができる。
【０３３２】
別の局面において、本発明は、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性組織支持体として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０３３３】
さらに別の局面において、本発明は、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性組織支持体として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０３３４】
さらに別の局面において、本発明は、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性組織支持体として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０３３５】
さらに別の局面において、本発明は、Ａ−１）粗面を有する第一層；およびＡ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、を含み、上記第一層と上記第二層とが少なくとも１点で接着される、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用に関する。この使用において、使用される生体適合性組織支持体として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。
【０３３６】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０３３７】
以下の実施例で用いた試薬、材料は、特に言及しない限り、和光純薬、Ｓｉｇｍａ、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＰｅｐｔｏＴｅｃｈから入手した。
【０３３８】
（実施例１：ＰＬＧＡを用いた実験）
本実施例では、ＰＬＧＡを支持体として用い、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を生体分子として用いて組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３３９】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＶｙｃｒｙｌのポリラクチン９１０メッシュ（グリコール酸と乳酸の比率が９０：１０の共重合体，ＰＬＧＡ）を内腔側にニットメッシュ（ｋｎｉｔｔｅｄ  ｍｅｓｈ）１枚、外側にウーブンメッシュ（ｗｏｖｅｎ  ｍｅｓｈ）２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにコラーゲンを架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜を足場とした。コラーゲンを架橋剤としてはコラーゲンＩ型のみを架橋処理した群、コラーゲンＩ型にさらにコラーゲンＩＶ型を架橋した群を作製した（図１）。架橋方法は、以下のとおりである。図２には、左第５肋間開胸した際の様子を示す。肺動脈主幹部に径２０ｍｍのパッチを縫着した。
【０３４０】
＜架橋方法＞
細胞外マトリクス（例えば、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニンなど）の溶液に対して、必要に応じて終濃度１／１０量のＩＶ型コラーゲンまたはラミニンを加える。この溶液に上記支持体を含浸させる。次に、凍結乾燥、３７℃グルタルアルデヒド飽和蒸気により４時間程度架橋処理する。最後に、０．１Ｍグリシン水溶液中で１５分間３回振盪させ、蒸留水で３回洗浄し、凍結乾燥を行った。これにより、種々の細胞外マトリクス含有支持体を作製した。
【０３４１】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した。（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）。コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。引っ張り強度はＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜が７５±５Ｎ、グルタールアルデヒド処理ウマ心膜が３４±１１Ｎであり、ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜のほうが引っ張り強度が高かった（図３）。
【０３４２】
＜細胞接着の効率＞
ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ））で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をコラーゲンＩ型のみを架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜とコラーゲンＩ型にさらにＩＶ型架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもコラーゲンＩ型、ＩＶ型架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた（図４）。
【０３４３】
以上の結果よりコラーゲンＩ型およびＩＶ型で架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜が強度も従来のグルタールアルデヒド処理ウマ心膜と同等以上であり、細胞性生着性も高いことから、このＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜を使用し、事前の細胞播種の効果をインビボにおける検討を行った。
【０３４４】
＜第ＶＩＩＩ因子染色＞
血管数の計数は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原等で免疫組織化学染色した後に計数することによって判定することができる。この計数方法では、検体を１０％の緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、各々の検体から数個の連続切片を調製し、凍結する。次いで、凍結切片をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液で５分間、室温にて固定し、３％過酸化水素を含むメタノール中に１５分間浸漬し、次いでＰＢＳで洗浄する。このサンプルをウシ血清アルブミン溶液で約１０分間覆って、非特異的反応をブロックする。検体を、ＨＲＰと結合する、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対するＥＰＯＳ結合体化抗体と共に一晩インキュベートする。サンプルをＰＢＳで洗浄した後、これらを、ジアミノベンジジン溶液（例えば、ＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン）中に浸漬して、陽性染色を得る。染色された血管内皮細胞を、例えば、２００倍の倍率の光学顕微鏡下で計数し、例えば、計数結果を、１平方ミリメートルあたりの血管の数としてあらわす。特定の処置後、血管数が統計学的に有意に増加しているか否かを判定することにより、第ＶＩＩＩ因子の存在を確認し、これにより例えば、血管内皮細胞の確認および血管新生活性を判定することができる。
【０３４５】
＜エラスチカ・ファン・ギーソン染色＞
弾性線維を染色するために、エラスチカ・ファン・ギーソン染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗を行い、武藤化学などから入手可能なレゾルシンフクシン液に４０〜６０分間サンプルを浸す。その後70% アルコールでサンプルを洗浄し、オムニのヘマトキシリンに１５分間浸す。その後、流水水洗を５分行い、ファン（ワン）・ギーソン液に２分浸す。水洗しすばやく脱水し、透徹し、封入する。
【０３４６】
＜ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色＞
細胞における支持体の定着・消長を観察するために、ＨＥ染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを１０分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを３０秒間行った。その後、流水水洗を５分行い、塩酸エオジン１０倍希釈液で２分間染色し、脱水し、透徹し、封入する。
【０３４７】
＜フォン・コッサ（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色＞
細胞における石灰化を観察するために、フォン・コッサ法によって染色した。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン（例えば、純エタノールにて）、水洗（蒸留水）を行い、２５％硝酸銀液（間接光下）に２時間浸す。その後、蒸留水水洗し、４２％チオ硫酸ナトリウム（ハイポ）に５分浸す。その後、流水水洗を５分行い、次いでケルンエヒテロートに５分浸す。その後、流水水洗を５分行い、脱水し、透徹し、封入する。
【０３４８】
＜移植＞
コラーゲンＩ型およびＩＶ型架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜（１５ｘ１０ｍｍ）と、この複合膜に自己の血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）を播種した膜を作製し、ビーグル成犬（８〜１０ｋｇ）の肺動脈主幹部に部分遮断（ｐａｒｔｉａｌ  ｃｌａｍｐ）下に移植した。
【０３４９】
細胞は同種のビーグル成犬の下肢表在静脈を摘出し、血管内皮細胞（ＶＥＣ）、および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）を単離培養した。ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜に血管内皮細胞、平滑筋細胞をそれぞれ１．３×１０６ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種した。移植後、２週、２ヵ月、６ヶ月後に摘出し組織学的に検討を行った。  
【０３５０】
（インビボ：移植２週後）
ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜および自己細胞を播種したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜の両群とも肉眼的に明らかな血栓形成は認めなかった。ＨＥ染色ではＰＬＧＡの残存を認め、その間は結合組織が介在していた。自己の血管内皮細胞および平滑筋細胞を播種したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜では蛍光抗体標識した播種した血管内皮細胞は内腔側に散在しているのみであり、多くの細胞はＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜より脱落していることが示唆された（図５）。
【０３５１】
（インビボ：移植２ヶ月後）
ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜および自己細胞を播種したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜の両群とも肉眼的に内腔側表面は平滑で、ＨＥ染色でＰＬＧＡは完全に吸収されており正常の血管と比較しても遜色のない組織構造であった（図６）。
【０３５２】
血管内皮細胞を第ＶＩＩＩ因子染色にて、平滑筋細胞α−ＳＭＡ免疫染色にて検討した。両群とも第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞を認め（図７）、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有した平滑筋細胞を認めた（図８）。
【０３５３】
さらにエラスチカ・ファン・ギーソン（ｅｌａｓｔｉｃａ−ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ）染色にて血管の弾性繊維を検討した。両群とも血管内層に弾性繊維の発現が認められた（図９）。
【０３５４】
（インビボ：移植６ヶ月後）
両群とも移植後２ヶ月目に見られたのと同様に第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞を認めた（図１０）。平滑筋細胞は移植後２ヶ月目に見られたよりもさらにその形態を明らかにし、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有し、正常血管とほぼ同等であった。エラスチカ・ファン・ギーソン染色にておける血管弾性繊維も移植後２ヶ月目に見られたよりも血管内層に弾性繊維の発現が認められた（図１１）。
【０３５５】
さらに、血管の石灰化の有無はフォンコッサ（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色において移植した複合膜および周辺血管に陽性反応を認めず、石灰沈着は認められなかった（図１２）。
【０３５６】
（考察）
現在開発中世界で開発中の組織工学を応用下した人工パッチ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｐａｔｃｈ）の問題点としてより自己組織に近い細胞外環境を構築した構造物となりうるかとの課題がある。通常、血管修復用人工パッチは小児の心臓血管外科領域にて用いられ自己化（成長の可能性）が重要な要素である。このため、自己の細胞を生体内吸収性の高い素材に培養して再生血管を作製することが考えられるが、自己の細胞を事前に採取する必要性があり、さらに、その細胞を単離分離、培養する技術と装置、構造物への播種しの方法等多くの問題がある。
【０３５７】
一方最近、インサイチュで前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の発現が報告されている。浅原らは成体の血管形成が血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれる組織既存の血管からの血管造成だという概念を覆し、成体にも、胎児発生に見られるような、血管幹細胞・前駆細胞から新たな血管を創り出すメカニズムである血管発生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）が存在することが明らかにした。（Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，４５１−４５７  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，４３４−４３８；Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ  （１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，３９６４−３９７２；Ｉｓｎｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３，１２３１−１２３６；Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，９６４−９６７）。
【０３５８】
また、骨髄間質細胞には間葉系組織（血管、筋肉、脂肪、骨、軟骨など）に分化する間葉系幹細胞が含まれることが古くから知られており（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，７１−７４，１９９７）この間葉系幹細胞は幹細胞としての性質である自己複製能と多分化能を備えている。Ｏｒｌｉｃらはこの骨髄由来の幹細胞を取り出し利用することにより心筋梗塞などにより損傷した心筋や血管網を再生し，心臓の機能を改善することが試みている。（Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，７０１−７０５，２００１；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１０３４４−１０３４９，２００１；Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３８，２２１−２２９，２００１）。
【０３５９】
一方、コラーゲンは、動物界に最も広く存在するタンパク質で、動物の体の全タンパク質の１／３以上を占め、動物の皮膚・腱・骨などの結合組織を構成している。動物の体は多数の細胞から構成されているが、コラーゲンは、これらの細胞と細胞との間のマトリクスとして、重要な役割を果たしている。コラーゲンの生体における役割は、動物の体の構造を支えることだけと考えられていた。しかし、最近になってコラーゲンは、細胞の発生、分化、形態形成等において、細胞間マトリックスとして、細胞に生物学的な影響を及ぼしていることが明らかになり（永井裕、藤本大三郎編、コラーゲン代謝と疾患．講談社（１９８２）、Ｊ．Ｙａｎｇ  ＆  Ｓ．Ｎａｎｄｉ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，８１，２４９−２８６（１９８３））、コラーゲンを細胞培養に利用することは、有益であろうと考えられる。コラーゲン基質の利用は、ガラス、プラスチック基質よりも細胞の接着、増殖、分化などを促進するという実験が数多く報告されている（Ｊ．Ｙａｎｇ  ＆  Ｓ．Ｎａｎｄｉ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，８１，２４９−２８６（１９８３））。コラーゲン上とガラス上での各種細胞の成長を比較したのは、ＥｈｒｍａｎｎおよびＧｅｙが最初である（Ｒ．Ｌ．Ｅｈｒｍａｎｎ  ＆  Ｇ．Ｏ．Ｇｅｙ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，１６（６），１３７５−１４００（１９５６））。１９５３年Ｇｒｏｂｓｔｅｉｎは、コラーゲン基質が細胞増殖と形態形成に関して重要な役割を果たしていると報告した（Ｃ．Ｇｒｏｂｓｔｅｉｎ，Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，１２４，３８３−３８８  （１９５３））。また、角膜内皮細胞（Ｄ．Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｇ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＆  Ｃ．Ｒ．Ｂｉｒｄｗｅｌｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３８，４１５５（１９７８））、乳腺上皮細胞（Ｍ．Ｗｉｃｈａ，Ｌ．Ａ．Ｌｉｏｔｔａ，Ｓ．Ｇａｒｂｉｓａ  ＆  Ｗ．Ｒ．Ｋｉｄｗｅｌｌ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１２４，１８１（１９７９））、表皮細胞（Ｊ．Ｃ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｇ．Ｓｔｉｎｇｌｅ，Ｈ．Ｋ．Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ  ＆  Ｓ．Ｉ．Ｋａｔｚ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８０，１９７  （１９７８）、肝実質細胞（Ｃ．Ａ．Ｓｏｔｔｌｅｒ，＆  Ｇ．Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３８，１５３９  （１９７８））、線維芽細胞（Ｇ．Ｏ．Ｇｅｙ，Ｍ．Ｓｕｏｔｅｌｉｓ，Ｍ．Ｆｏａｒｄ  ＆  Ｆ．Ｂ．Ｂａｎｇ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，８４，６３  （１９７４））は、プラスチック、または、ガラス製培養皿上よりも、コラーゲン基質上で長期間生存することも報告されている。したがって、本発明では、コラーゲンは、上述の臓器または組織を対象にした移植に有用であることは理解され得る。
【０３６０】
今回行った検討では、コラーゲンＩ型およびＩＶ型架橋処理した場合、細胞播種した細胞は生着率が改善した。これはコラーゲンＩ型およびＩＶ型が、細胞の発生、分化、形態形成等において、細胞間マトリックスとして、特に有用な役割を果たすことが示されるものである。
【０３６１】
今回行った検討では、コラーゲンＩ型およびＩＶ型架橋処理した場合、細胞播種に関わらず自己組織化が認められた。この構造物内に生着した細胞は自己の細胞に他ならず、生体内を浮遊する幹細胞が生着し、コラーゲンＩ型およびＩＶ型架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜を足場とし、同部位で分化、増殖したのではないかと推察される。
【０３６２】
（まとめ）
生体分解性高分子を足場としたＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜は，エキソビボでの細胞播種なしでも移植後２ヶ月で血管壁構造の再構築が見られ，６ヵ月後も石灰化を認めず、自己化をめざした心血管修復用人工パッチとして右心系での有用性が期待できた。したがって、このような組織片は、従来の技術では達成することができなかった格別の効果を示す。
【０３６３】
（実施例２：ＰＧＡを用いた実験）
本実施例では、ＰＧＡを支持体として用い、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を生体分子として用いて組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３６４】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＰＧＡのメッシュを内腔側にニットメッシュ１枚、外側にウーブンメッシュ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにコラーゲンを架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜を足場とした。コラーゲンを架橋剤としてはコラーゲンＩ型のみを架橋処理した群、コラーゲンＩ型にさらにコラーゲンＩＶ型を架橋した群を作製した。架橋処理は実施例１に記載のように行った。
【０３６５】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した。（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。
【０３６６】
＜細胞接着の効率＞
ＰＧＡ−コラーゲン複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ）  で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をコラーゲンＩ型のみを架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜とコラーゲンＩ型にさらにＩＶ型架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもコラーゲンＩ型、ＩＶ型架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０３６７】
以上の結果よりコラーゲンＩ型およびＩＶ型で架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜が強度も従来のグルタールアルデヒド処理ウマ心膜と同等以上であり、細胞性生着性も高いことから、このＰＧＡ−コラーゲン複合膜を使用し、事前の細胞播種の効果をインビボにおける検討を行った。
【０３６８】
＜移植＞
コラーゲンＩ型およびＩＶ型架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜（１５ｘ１０ｍｍ）と、この複合膜に自己の血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）を播種した膜を作製し、ビーグル成犬（８〜１０ｋｇ）の肺動脈主幹部に部分遮断下に移植した。
【０３６９】
細胞は同種のビーグル成犬の下肢表在静脈を摘出し、血管内皮細胞、および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）を単離培養．ＰＧＡ−コラーゲン複合膜に血管内皮細胞、平滑筋細胞をそれぞれ１．３×１０６ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種した。移植後、２週、２ヵ月、６ヶ月後に摘出し組織学的に検討を行った。  
【０３７０】
（インビボ：移植２週後）
ＰＧＡ−コラーゲン複合膜および自己細胞を播種したＰＧＡ−コラーゲン複合膜の両群とも肉眼的に明らかな血栓形成は認めなかった。ＨＥ染色ではＰＧＡの残存を認め、その間は結合織が介在していた。自己の血管内皮細胞および平滑筋細胞を播種したＰＧＡ−コラーゲン複合膜では蛍光抗体標識した播種した血管内皮細胞は内腔側に散在しているのみであり、多くの細胞はＰＧＡ−コラーゲン複合膜より脱落していることが示唆された。
【０３７１】
（インビボ：移植２ヶ月後）
ＰＧＡ−コラーゲン複合膜および自己細胞を播種したＰＧＡ−コラーゲン複合膜の両群とも肉眼的に内腔側表面は平滑で、ＨＥ染色でＰＧＡは完全に吸収されており正常の血管と比較しても遜色のない組織構造であった。
【０３７２】
血管内皮細胞を第ＶＩＩＩ因子染色にて、平滑筋細胞α−ＳＭＡ免疫染色にて検討した。両群とも第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞を認め、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有した平滑筋細胞を認めた。
さらにエラスチカ・ファン・ギーソン染色にて血管の弾性繊維を検討した。両群とも血管内層に弾性繊維の発現が認められた。
【０３７３】
（インビボ：移植６ヶ月後）
両群とも移植後２ヶ月目に見られたのと同様に第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞を認めた。平滑筋細胞は移植後２ヶ月目に見られたよりもさらにその形態を明らかにし、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有し、正常血管とほぼ同等であった。エラスチカ・ファン・ギーソン染色にておける血管弾性繊維も移植後２ヶ月目に見られたよりも血管内層に弾性繊維の発現が認められた。
【０３７４】
さらに、血管の石灰化の有無はフォンコッサ染色において移植した複合膜および周辺血管に陽性反応を認めず、石灰沈着は認められなかった。
【０３７５】
（実施例３：スポンジ状ＰＧＡを用いた実験）
本実施例では、スポンジ状ＰＧＡを支持体として用い、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を生体分子として用いて組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３７６】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＰＧＡのスポンジを内腔側にニットメッシュ１枚、外側にウーブンメッシュ  ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにコラーゲンを架橋処理したスポンジ状ＰＧＡ−コラーゲン複合膜を足場とした。コラーゲンを架橋剤としてはコラーゲンＩ型のみを架橋処理した群、コラーゲンＩ型にさらにコラーゲンＩＶ型を架橋した群を作製した。架橋処理は、実施例１に記載されるように行った。
【０３７７】
＜機械強度＞
スポンジ状ＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した。（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。
【０３７８】
＜細胞接着の効率＞
スポンジ状ＰＧＡ−コラーゲン複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ））で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をコラーゲンＩ型のみを架橋処理したスポンジ状ＰＧＡ−コラーゲン複合膜とコラーゲンＩ型にさらにＩＶ型架橋処理したスポンジ状ＰＧＡ−コラーゲン複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもコラーゲンＩ型、ＩＶ型架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０３７９】
（実施例４：フィブロネクチンを用いた実験）
本実施例では、ＰＬＧＡを支持体として用い、フィブロネクチンを生体分子として用いて組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３８０】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＶｙｃｒｙｌのポリラクチン９１０メッシュ（グリコール酸と乳酸の比率が９０：１０の共重合体，ＰＬＧＡ）を内腔側にニットメッシュ  １枚、外側にウーブンメッシュ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにフィブロネクチンを架橋処理しさらにコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）にＨＧＦ融合タンパク質を付け処理したＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜を足場とした。肺動脈主幹部に径２０ｍｍのパッチを縫着した。
【０３８１】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−フィブロネクチン複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した。（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。
【０３８２】
＜細胞接着の効率＞
ＰＬＧＡ−フィブロネクチン複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ）で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をフィブロネクチン架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもフィブロネクチン架橋処理したＰＬＧＡ−フィブロネクチン複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０３８３】
（実施例５：フィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）とのＨＧＦ融合タンパク質を用いた実験）
本実施例では、ＰＬＧＡを支持体として用い、フィブロネクチンを生体分子として用いてさらにコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）にＨＧＦ融合タンパク質を付けその組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３８４】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＶｙｃｒｙｌのポリラクチン９１０メッシュ（グリコール酸と乳酸の比率が９０：１０の共重合体，ＰＬＧＡ）を内腔側にニットメッシュ  １枚、外側にウーブンメッシュ  ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにフィブロネクチンを架橋しさらにコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）にＨＧＦ融合タンパク質を付け処理したＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜を足場とした。肺動脈主幹部に径２０ｍｍのパッチを縫着した。
【０３８５】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）。コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。  
＜細胞接着の効率＞
ＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ））で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をフィブロネクチン−ＨＧＦ架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン−ＨＧＦ複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもフィブロネクチン架橋処理したＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０３８６】
（実施例６：ＰＧＡで血管形状にして用いた実験）
本実施例では、ＰＧＡを支持体として用い、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を生体分子として用いて血管を作製し、本発明の効果を実証した。
【０３８７】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＰＧＡのメッシュを内腔側にニットメッシュ  １枚、外側にウーブンメッシュ  ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにコラーゲンを架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜を足場とし、人工血管を作製した。コラーゲンを架橋剤としてはコラーゲンＩ型のみを架橋処理した群、コラーゲンＩ型にさらにコラーゲンＩＶ型を架橋した群を作製した。架橋処理は、実施例１に記載されるプロトコールに従った。
【０３８８】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−コラーゲン複合人工血管を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した。（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）コントロールとしてウーブンダクロンの人工血管を用いて比較検討した。
【０３８９】
＜細胞接着の効率＞
ＰＧＡ−コラーゲン複合人工血管における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ））で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をコラーゲンＩ型のみを架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合人工血管とコラーゲンＩ型にさらにＩＶ型架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合人工血管で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもコラーゲンＩ型、ＩＶ型架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０３９０】
以上の結果よりコラーゲンＩ型およびＩＶ型で架橋処理したＰＧＡ−コラーゲン複合人工血管が強度も従来の人工血管と同等以上であり、細胞性生着性も高いことから、このＰＧＡ−コラーゲン複合人工血管を使用し、事前の細胞播種の効果をインビボにおける検討を行った。
【０３９１】
（実施例７：フィブロネクチンのコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）とのＨＧＦ融合タンパク質を心臓に用いた実験）
本実施例では、ＰＬＧＡを支持体として用い、フィブロネクチンを生体分子として用いてさらにコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）にＨＧＦ融合タンパク質を付けその組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３９２】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＶｙｃｒｙｌのポリラクチン９１０メッシュ（グリコール酸と乳酸の比率が９０：１０の共重合体，ＰＬＧＡ）を内腔側にニットメッシュ１枚、外側にウーブンメッシュ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにフィブロネクチンを架橋しさらにコラーゲン結合性ドメイン（ＦＮＣＢＤ）にＨＧＦ融合タンパク質を付け処理したＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜を足場とした。ビーグル成犬（８〜１０ｋｇ）に心筋梗塞を作成し、心筋梗塞部に径２０ｍｍのパッチを縫着した。
【０３９３】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）。コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。
【０３９４】
＜細胞接着の効率＞
ＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ））で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および心筋細胞をフィブロネクチン−ＨＧＦ架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン−ＨＧＦ複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および心筋細胞のいずれの細胞においてもフィブロネクチン架橋処理したＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０３９５】
さらに心筋梗塞巣にＰＬＧＡ−フィブロネクチン−ＨＧＦ複合膜を移植したところ心筋梗塞巣を再生した心筋が占め、さらに新たな血管が形成されていることが確認できた。これらの心筋細胞はＬｉｎ−、ｃ−ｋｉｔ＋の骨髄間葉系細胞と同様の表現型を有し、自己組織内での臓器再生、組織化が認められた。
【０３９６】
（実施例８：ラミニンを用いた実験）
本実施例では、ＰＬＧＡを支持体として用い、ラミニンを生体分子として用いて組織片を調製し、本発明の効果を実証した。
【０３９７】
（方法・結果）
エキソビボでの実験
＜足場設計＞
生体分解性合成高分子であるＶｙｃｒｙｌのポリラクチン９１０メッシュ（グリコール酸と乳酸の比率が９０：１０の共重合体，ＰＬＧＡ）を内腔側にニットメッシュ１枚、外側にウーブンメッシュ２枚の計３枚重ね（各０．２ｍｍ，計０．６ｍｍ厚）とし、それにラミニンを架橋処理したＰＬＧＡ−ラミニン複合膜を足場とした。肺動脈主幹部に径２０ｍｍのパッチを縫着した。                                                      
【０３９８】
＜機械強度＞
ＰＬＧＡ−ラミニン複合膜を引張試験機で強度測定した。幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷及び弾性率を測定した。（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）コントロールとしてグルタールアルデヒド処理ウマ心膜を用いて比較検討した。
【０３９９】
＜細胞接着の効率＞
ＰＬＧＡ−ラミニン複合膜における細胞生着性の確認のため、インビトロにおいて蛍光抗体（ＰＫＨ−２６（ＳＩＧＭＡ）で標識した血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）をラミニン架橋処理したＰＬＧＡ−コラーゲン複合膜で細胞接着効率の比較検討をおこなった。蛍光顕微鏡にて一視野あたりの蛍光色素の発色領域（％）を比較すると血管内皮細胞（ＶＥＣｓ）および平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）のいずれの細胞においてもラミニン架橋処理したＰＬＧＡ−ラミニン複合膜が有意に蛍光色素の発色領域が多く、細胞生着が認められた。
【０４００】
（実施例９：支持体の作製：編物および織物の生産）
まず、織物として、ポリグリコール酸およびポリＬ乳酸のメッシュを当該分野において公知の手法を応用して、作製した。その手順は以下のとおりである。糸として２４０ｄ（デニール）の６４ｆ（フィラメント）のマルチフィラメントを用いた。織り方は、平織りを採用し、径約６４本／吋、緯４０〜４７．５本／吋で織った。
【０４０１】
完成したポリグリコール酸メッシュおよびポリＬ乳酸メッシュをそれぞれ図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。
【０４０２】
次に、編物として、ポリグリコール酸を材料として編物を作製した。この編物もまた、公知の手法を応用して、作製した。以下にその手順を示す。糸として約６８ｄの３０ｆマルチフィラメントを用いた。編み方としては、以下の編み方を採用した。
【０４０３】
組み合わせ
Ｎｏ．１：ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３
Ｎｏ．２：ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３（Ｎｏ．１よりＬ２の送りが多い）
Ｎｏ．３：ＢＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３（細胞接着実験に用いた）
Ｎｏ．４：ＢＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３（Ｎｏ．３よりＬ３のふり幅を多くした）
Ｎｏ．５：ＢＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３（Ｎｏ．４よりＬ２の送りが多い）
Ｎｏ．６：ＢＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３（Ｎｏ．３よりＬ２のふり幅を多くした）
Ｎｏ．７：ＢＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３（Ｎｏ．６よりＬ２の送りが多い）
Ｎｏ．８：ＢＬ１、ＢＬ２、ＡＬ３
【０４０４】
【表１】
2006508773.tif 000003
完成したポリグリコール酸編物を図１４および１５に示す。図１６Ａおよび図１６Ｂには、それぞれポリグリコール酸編物とポリグリコール酸織物との複合体、ならびにポリグリコール酸編物とポリＬ乳酸織物との複合体の断面図を示す。
【０４０５】
次に、編物と織物とを中間層としてフィルムを用いて接着させた。その模式的方法を図１７および１８（詳細図）に示す。
【０４０６】
フィルムは、ガラス上に材料（ポリ乳酸系フィルム）またはカプロラクタム系の材料をキャストした後に風乾して作製した。
【０４０７】
次に、織物を下に敷き、その上にこのポリ乳酸系フィルムを敷き、その上に、ポリグリコール酸の編物を置いた。この後、熱処理（８０℃〜１４０℃の間）を行い、各々の層を接着させた。
【０４０８】
この支持体は、移植片として使用することができる。
【０４０９】
（実施例１０：生体分子の付与）
生体分子として、コラーゲン（Ｉ型およＩＶ型）およびラミニンを用いて、実施例９において作製した支持体に生体分子を付与した。その模式図は図１８および図１９に示される。
【０４１０】
その後、コラーゲンおよびラミニンを架橋した。架橋方法は実施例１に記載されるとおりである。
【０４１１】
コラーゲン架橋を行なった後の支持体は図２０Ａおよび図２０Ｂ（それぞれポリグリコール酸織物およびポリＬ乳酸織物）に示されるようにコラーゲンが付着されていた。織物と編物とでコラーゲン架橋がどのように異なるかも試みた。その概要は、図２１に示す。
【０４１２】
このようにして、種々の生体分子支持体を作製した。以下に作製した支持体を示す。
１．ＰＧＡ  ｋｎｉｔ  Ｎｏ．３−ＰＬＡ  ｗｏｖｅｎ横
２．ＰＧＡ  ｋｎｉｔ  Ｎｏ．３−ＰＬＡ  ｗｏｖｅｎ縦
３．ＰＬＡ  ｗｏｖｅｎ  ４７．５横（比較例）
４．ＰＬＡ  ｗｏｖｅｎ  ４７．５縦（比較例）
５．ＰＧＡ  ｋｎｉｔ  Ｎｏ．３  横
６．ＰＧＡ  ｋｎｉｔ  Ｎｏ．３  縦
以下の実験では、コントロールとして、ヘマシールド人工血管（Ｈａｍｓｈｉｌｅｄ  ＰｌａｔｉｎｕｍＴＭ  Ｗｏｖｅｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＭＡ、ＵＳＡ）およびバスクテック人工血管（ＧｅｌｓｅａｌＴＭ、テルモ、日本）を使用した。
【０４１３】
（実施例１１：生体分子支持体の機能）
次に、実施例１０で作製したコラーゲン支持体について、引張り強度、弾性率および伸びを、引張り試験により観察した。その概要を以下に示す。
【０４１４】
本実施例では、引張試験機（ＴＥＮＳＩＬＬＯＮ  ＯＲＩＥＮＴＥＣ）で強度測定した。具体的には、幅５ｍｍ長さ３０ｍｍの短冊状素材を短軸方向に１０ｍｍ／分の速度で荷重負荷し、破断点負荷および弾性率を測定した。
【０４１５】
その結果を図２２〜２４に示す。これらの図は、それぞれ、引張り強度、弾性率および伸びを示す。図２２Ａには、ポリグリコール酸編物とポリグリコール酸織物の組み合わせの結果を示し、図２２Ｂには、ポリグリコール酸編物とポリＬ乳酸織物との組み合わせの結果を示す。
【０４１６】
その結果、本発明の支持体は、コントロールとして用いた大動脈血管壁および市販の人工血管と同程度またはそれ以上の強度および弾性率を有することが明らかになった。伸びについても、許容範囲であることがわかった。
【０４１７】
次に、水漏れ率および通気性を調べた。以下にそのプロトコルを記載する。
【０４１８】
水漏れ率は、支持体を水平にし、その上に水１０ｍｌを垂らし、６０秒間でどれだけの量がもれるのかを測定することによって決定した。その結果を図２５に示す。本発明の支持体を用いても、血液などの漏れはないであろうことが明らかになった。
【０４１９】
次に本発明の支持体および他の支持体の通気性を確認した。本実施例では、ＪＩＳ−Ｈ−１０９６Ａ法を利用した。ここでは、フラジール型試験機に試験片を取り付けた後、加圧抵抗器によって傾斜形気圧計が１２５Ｐａの圧力を示すように調節し、通過する空気量（ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ）を測定することによって通気性を決定した。その結果を図２６に示す。これまでの実験からイヌに移植したときに血液が漏れないことがわかっているビクリルｗｏｖｅｎの２枚重ねをコントロールとして用いた。今回作製した２枚重ねのメッシュは、このコントロールとほぼ同様の通気性を有しており、２．０ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下に抑えられていることがわかる。従って、本発明の支持体は、血液を漏らさないことが通気性試験でも確認された。
【０４２０】
（実施例１２：生体分子支持体の細胞接着性）
次に、本発明の生体分子支持体の細胞接着性を確認した。実施例１０で作製したものを使用してこの試験を行なった。まず各支持体（１×１ｃｍ２）に血管内皮細胞１×１０５細胞を播種した。１５時間培養後、ＭＴＴアッセイを行い、５９５ｎｍの吸光度を測定した。ＭＴＴアッセイの手順は、以下のとおりである。支持体を培養液で洗浄後、ＭＴＴ溶液を１／１０容量加えた培地を用いて、１時間３７℃で培養した。この培養後、支持体をＰＢＳで洗浄し、酸性イソプロパノールに加え、１０分間振盪させた。その溶液を、マイクロプレートリーダーにより５９５ｎｍの吸光度を測定することによって、ＭＴＴの指標を決定した。
【０４２１】
ＭＴＴは、細胞内のミトコンドリアの脱水素酵素によりテトラゾリウム塩がホルマザンに還元されることに由来する細胞活性の評価法である。ホルマザンについては、生成量と細胞数がよく対応し、また特定波長の吸光特性示すため、試料の吸光度を測定するだけで、容易に生存細胞数の計測が行うことができる。また、細胞内ミトコンドリアの代謝活性を測定するために比較的初期の細胞死を検出することができる。
【０４２２】
その結果を、１５時間の時点での状態として図２７に示す。図２７Ａには、ポリグリコール酸編物とポリグリコール酸編物との組み合わせを示し、図２７Ｂにはポリグリコール酸編物とポリＬ乳酸織物との組み合わせを示す。その結果、コラーゲンで架橋をした方が、細胞の接着性が向上していることがわかった。この向上は、他の細胞外マトリクス（例えば、ラミニン、フィブロネクチンなど）でも見出された。また、織物よりも編物のほうがコラーゲン架橋後の細胞の接着性が高くなることが判明した。
【０４２３】
また、本発明の支持体に対する細胞の接着性に問題がないことがわかった。
【０４２４】
（実施例１３：接着条件検討）
次に、本発明の支持体の接着の際の条件検討を行なった。
【０４２５】
ポリＬ乳酸織物と、ポリグリコール酸織物との間にカプロラクタムフィルムを中間層として用いて、種々の接着条件を検討した。カプロラクタムフィルムは、５％カプロラクタム／ジオキサン溶液を３００μｍの厚さでガラス上にキャストし、その後風乾して作製した。作製方法を、図２８に示す。
【０４２６】
次に、接着強度を実施例１１に示されるのと本質的に同様に行なった。その結果を図２９Ａに示す。その結果、約８０℃〜１４０℃、すなわち中間層の融点より高く第一層および第二層の融点よりも低い温度において、強度で顕著な向上が見られた。従って、本発明の支持体を製造するためには、この温度前後を採用することが好ましい。この場合、最低でも１０分間の処理をすることが望ましいことが明らかになった。
【０４２７】
さらに、接着条件の種々のパラメータを検討した。
【０４２８】
接着条件としては接着に用いるカプロラクトンの量・接着時に上からかける圧力・接着温度・時間の4つをふり、上記実施例と同様の方法で接着強度を測定した。  
【０４２９】
ＰＣＬの濃度依存性に関する結果を以下の表および図２９Ｂに示す。
【０４３０】
【表２】
2006508773.tif 000004
圧力依存性に関する結果を以下の表および図２９Ｃに示す。
【０４３１】
【表３】
2006508773.tif 000005
次に、接着に用いるカプロラクトンの量に関して、量に依存して接着強度が高くなることが確認された。次に上からかける圧力についても今回調べた範囲では圧力に依存して接着強度が高くなった。
【０４３２】
（温度条件）
次に、次に接着温度と時間とに関して調べた。本実施例では、ＰＧＡとＰＬＧＡとをカプロラクトンを用いて接着する場合の条件を検討した。
【０４３３】
本実施例において調べた範囲では接着温度は高く、接着時間も長くなるほど接着強度が高くなった。
【０４３４】
その結果を以下の表および図２９Ｄに示す。
【０４３５】
【表４】
2006508773.tif 000006
他の条件( 硬さ・部材の厚さ)についても検討の必要がある可能性があるが、接着強度だけを見ると本実施例において調べた範囲ではよりカプロラクトンの量を多くし、接着時に上から強く押さえつけ、接着温度を高くし、接着時間を長くした方が強く接着できることが分かる。
【０４３６】
（実施例１４：強度劣化試験）
次に、インビトロでの強度劣化試験を行なった。
【０４３７】
生体内での移植期間に対するＰＧＡ系の強度劣化を予測するために、分解試験を行なった。方法としては、本発明の支持体とＤｅｘｏｎメッシュ（コントロール）とをＰＢＳ中３７℃で放置し、１、３および６週間後に外見、重さおよび引張り強度を観察した。その変化の様子を図３０に示す。各々の数値をグラフ化したものを図３１に示す。
【０４３８】
図３１からも明らかなように、３週間たつとほとんど強度がなくなっていた。生体内でもこのアッセイとほぼ同じ分解がする無とされており、移植後３週間で強度がなくなるようである。
【０４３９】
（実施例１５：他の細胞外マトリクス）
次に、コラーゲンに加えて、他の細胞外マトリクスでも同様の支持体が作製されるかどうかを確認した。
【０４４０】
細胞外マトリクスとしては、コラーゲンＩ型、ＩＶ型およびラミニンを用いた。細胞としては、血管内皮細胞および平滑筋細胞を用いた。アッセイとしては、上記ＭＴＴアッセイを用いた。
【０４４１】
今回作製した支持体は、充分な強度を有していた（本発明の支持体：１０１．４Ｎ、成体イヌ大動脈壁：５．４Ｎ、従来の人工血管（ヘマシールドおよびＧｅｌｓｅａｌ）：１０１．４Ｎ）。
【０４４２】
通気性試験を上記同様に行なったところ、本発明の支持体：２．１、織物：５．１、編物：１４２．３（単位はｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ）であった。
【０４４３】
細胞接着性試験もまた上記実施例と同様に行なった。ところ、織物：０．１１６±０．００５、編物（コラーゲンスポンジあり）：０．３９８±０．００８、および本発明の支持体:０．４０２±０．０３５であった。従って、コラーゲンスポンジを導入することによって、有意に細胞生着性が改善した。
【０４４４】
細胞接着性は、Ｉ型コラーゲンのとき、内皮細胞：０．１４５±０．０５３／平滑筋細胞：０．２８６±０．０３２；ＩＶ型コラーゲンのとき、内皮細胞：０．１５９±０．０５６／平滑筋細胞：０．２５２±０．０１６；ラミニンのとき、内皮細胞：０．１４６±０．０１７／平滑筋細胞：０．２５１±０．０１４と、ほとんどの細胞外マトリクスで、同様に有効であることが明らかになった。
【０４４５】
従って、このように本発明の支持体は、自己組織再生による心血管および他の組織修復パッチとして充分な強度を有し、血液漏出も少なく、細胞生着性の高い、心血管および他の組織修復支持体として、臨床応用を行うことができる。
【０４４６】
（実施例１６：インビボ試験）
実施例１０で作製された本発明の支持体（コラーゲンなしおよびコラーゲン付与；１５ｍｍ×１０ｍｍ）を、ビーグル成犬（８−１２ｋｇ）の肺動脈主幹部に部分遮断下に移植した。移植後、２週、２ヶ月、６ヵ月後に摘出し、組織学的に検討した。
【０４４７】
＜インビボ：移植２週間後＞
移植した支持体には肉眼的に明らかな血栓形成は認められなかった。ＨＥ染色では、支持体の残存が認められ、その間には結合織が介在していた。
【０４４８】
＜インビボ：移植２ヶ月後＞
移植した支持体の内腔側表面は肉眼的に平滑であり、ＨＥ染色によって、ＰＧＡおよびＰＬＡは完全に吸収されており、正常の血管として遜色のない組織構造であることが明らかになった。
【０４４９】
血管内被細胞を第ＶＩＩＩ因子染色により、平滑筋細胞をα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）免疫染色にて検討した。α−ＳＭＡ免疫染色は、α−ＳＭＡに対する抗体を用いて染色を行った。第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞が認められ、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有する平滑筋細胞が認められた。
【０４５０】
さらに、エラスチカ・ファン・ギーソン染色にて、血管の弾性線維を検討した。血管内層に弾性線維の発現が認められた。
【０４５１】
＜インビボ：移植後６ヵ月後＞
移植後２ヶ月目に見られたのと同様に、第VIII因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞が認められた。平滑筋細胞は、移植後２ヶ月目に見られたよりもさらにその形態を明らかにし、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔に配向性を有し、正常血管とほぼ同様であった。エラスチカ・ファン・ギーソン染色において血管弾性線維も移植後に見られたよりも血管内層に弾性線維の発現がより多く認められた。さらに、血管の石灰化の有無は、フォンコッサ染色により、移植した支持体および周辺血管には陽性反応が認められなかったことから、石灰沈着は認められなかった。
【０４５２】
（実施例１７：心臓への移植）
次に、実施例１０で作製された支持体（コラーゲンなしおよびコラーゲン付与）をラット梗塞心に移植した。
【０４５３】
＜心筋梗塞ラットモデル＞
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットモデルを本実施例において用いた。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。
【０４５４】
急性心筋梗塞を、Ｗｅｉｓｍａｎ  ＨＦ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １９８８；７８：１８６−２０１）に記載されるように誘導した。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔し、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き、左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮した。
【０４５５】
＜支持体の移植＞
心筋梗塞ラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って２群に分けた：Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）と、Ｓ群（支持体移植群、ｎ＝５）。支持体は、左前下降枝結紮２週間後に梗塞部位に直接移植した。
【０４５６】
＜ラット心臓の心機能の測定＞
梗塞モデル作製２週間後、移植後４週間後、同８週間後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて心機能を測定した（図３２参照）。１２ＭＨｚのトランス（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を用いて、左側方より左室が最大径を示す位置にて短軸像を描出した。Ｂモード（Ｂ−ｍｏｄｅ）にて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍモード（Ｍ−ｍｏｄｅ）にて左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、および左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）および左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）を算出した。
【０４５７】
＜組織学的分析＞
本発明の支持体の移植後、４週間後、８週間後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液に浸し、パラフィン固定を行った。切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色、マッソントリクローム染色を行った。マッソントリクローム染色は以下のように行った。また、同時期の凍結切片を作製し、第VIII因子免疫染色を行った（図３２参照）。
【０４５８】
＜マッソントリクローム染色＞
マッソントリクローム染色法は以下のとおりである：マッソントリクローム染色では、鉄ヘマトキシリンで核が染められ、その後に拡散速度の大きい小色素分子（酸フクシン、ポンソーキシリジン）が細胞の細網孔へ浸透し、次いで拡散速度の小さい大色素分子（アニリン青）が膠原線維の粗構造に入り込み青色に染め出す。
【０４５９】
マッソントリクローム染色で使用される試薬
Ａ）媒染剤
10%トリクロル酢酸水溶液          1容
10%重クロム酸カリウム水溶液      1容
Ｂ）ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液（使用時に1液と2液を等量混合）
１液
ヘマトキシリン         1ｇ
100%エタノール      100ml
２液  
塩化第二鉄          2.0ｇ
塩酸（25％）        1ml
蒸留水              95ml
Ｃ）1%塩酸70%アルコール
Ｄ）I 液
1%ビーブリッヒスカーレット    90ml
1%酸性フクシン                10ml
酢酸                            1ml
Ｅ）II液
リンモリブデン酸          5ｇ
リンタングステン酸        5ｇ
蒸留水                   200ml
Ｆ）III液
アニリン青      2.5ｇ
酢酸              2ml
蒸留水          100ml
Ｇ）1%酢酸水
マッソントリクローム染色法の手順
1.脱パラ、水洗、蒸留水
2.媒染（10〜15分）
3.水洗（5分）
4.ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液（5分）
5.軽く水洗
6.1%塩酸70%アルコールで分別
7.色出し、水洗（10分）
8.蒸留水
9.I 液（2〜5分）
10.軽く水洗
11.II液（30分以上）
12.軽く水洗
13.III液（5分）
14.軽く水洗
15.1%酢酸水（5分）
16.水洗（すばやく）
17.脱水、透徹、封入。
【０４６０】
マッソントリクローム染色法では、膠原線維、細網線維、糸球体基底膜は、鮮やかな青に染まり、核は黒紫色に染まり、細胞質は淡赤色に染まり、赤血球は橙黄色〜深紅色に染まり、粘液は青色に染まり、細胞分泌顆粒は好塩基性が青に好酸性が赤に染まり、線維素は赤に染まる。従って、青く染まった面積を線維化した部位として算出することができる。本明細書において、特定のサイトカインおよび増殖因子の処置後、線維症化した面積が統計学的に有意に減少しているか否かを判定することにより、抗線維化作用を判定することができる。
【０４６１】
＜結果＞
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ群における駆出率および左室短縮率は、Ｃ群に比較して有意な改善を示した。これらの機能改善は、移植後少なくとも８週間までは維持されていた。
【０４６２】
＜組織学的評価＞
Ｓ群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。具体的な図を、図３３〜３５に示す。図３３は、コントロール（移植なし）の図３４および３５と同じ時期での様子を示し、図３４は、本発明の支持体（生体分子付与なし）の移植後１ヶ月の様子を示し、図３５は、本発明の支持体（コラーゲンＩＶ型およびＩ型付与）の移植後１ヶ月の様子を示す。示されるように、本発明の支持体では、血管の新生および支持体（パッチ）の消長が見られた。この傾向は、図３５に示されるように、コラーゲンＩＶ型およびＩ型付与支持体においてより顕著であった。
【０４６３】
従って、本発明の支持体は、細胞など生体に由来する自己増殖性のものを用いることなく、自己化する組織片を提供することを実証した。また、支持体単独でもそのような効果が見出されたことから、従来の編物、織物において見出された欠点が克服された生体適合性支持体が提供されることが実証された。
【０４６４】
（実施例１８：心血管修復素材の心筋梗塞ラットモデルでの実証）
本実施例では、本発明の支持体が管状でも作用することを確認することを実証した。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物，ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに，Ｉ型コラーゲンと他の細胞外マトリックスであるＩＶ型コラーゲン、ラミニンを導入した心血管修復素材を作製した。
【０４６５】
（心筋梗塞ラットモデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いた。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。急性心筋梗塞をＷｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，  Ｂｕｓｈ  ＤＥ，  Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８８；７８：１８６−２０１に記載されるように誘導した。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮した。
【０４６６】
（移植）
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に移植した物質に従って３群に分けた。Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材のみ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＩＶ型コラーゲン＋ラミニン導入移植群、ｎ＝５）。心血管修復素材は左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に直接移植した。
【０４６７】
移植の様子を図３６に示す。
【０４６８】
（ラット心臓の心機能の測定）
梗塞モデル作製２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定した。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出した。
【０４６９】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行った。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン（ＨＥ）染色、マッソン−トリクローム染色を行った。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行った。
【０４７０】
摘出後の写真、ＨＥ染色、Ｄｅｓｍｉｎ染色の様子を図３７（心血管修復素材移植群）に、および摘出後の写真、ＨＥ染色、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴ染色、Ｄｅｓｍｉｎ染色の様子を図３８（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＩＶ型コラーゲン＋ラミニン導入移植群）に示す。
【０４７１】
（結果）
以下の結果において示される写真は、ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせであるが、同様の効果がポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも見られた。ポリＬ乳酸の方が、分解しにくいので好ましい場合もあるようであるが、それに限定されず、むしろ、両者とも本発明の目的を達成するのに十分であったことに留意すべきである。
【０４７２】
（心機能評価）
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ２群における駆出率は６０％とＣ群の４０％、Ｓ１群４２％に比較して有意な改善を示した。これらの機能改善は、移植後８週間まで維持された。結果を図３９にまとめて示す。
【０４７３】
（組織学的評価）
図３７および図３８からも明らかなように、Ｓ２群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。さらにＳ２群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められた。
【０４７４】
（実施例１９：短ペプチドを用いた場合の例）
本実施例では、本発明の支持体に短ペプチドを塗布した場合でも作用することを確認することを実証する。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物、ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに、短ペプチドＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）を導入した心血管修復素材を作製する。短ペプチドＳＶＶＹＧＬＲは、例えば、ＷＯ０３／０３０９２５に記載されるように血管新生作用があるとして知られているペプチドである。
【０４７５】
心筋梗塞ラットモデル
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。急性心筋梗塞をＷｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，  Ｂｕｓｈ  ＤＥ，  Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８８；７８：１８６−２０１に記載されるように誘導する。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮する。
【０４７６】
（移植）
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に移植した物質に従って３群に分ける。Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材のみ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋短ペプチド導入移植群、ｎ＝５）。心血管修復素材は左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に直接移植する。
【０４７７】
（ラット心臓の心機能の測定）
梗塞モデル作製２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定する。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出する。
【０４７８】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行う。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行う。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行う。
【０４７９】
（結果）
（心機能評価）
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ２群における駆出率はＣ群およびＳ１群に比較して有意な改善を示す。これらの機能改善は、少なくとも移植後８週間まで維持される。
【０４８０】
（組織学的評価）
Ｓ２群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。さらにＳ２群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められる。
【０４８１】
ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせでも、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも同様の効果が見られる。
【０４８２】
（実施例２０：サイトカインを用いた場合の例）
本実施例では、本発明の支持体にサイトカインを塗布した場合でも作用することを確認することを実証する。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物、ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに、サイトカインとしてＨＧＦ（東洋紡より入手可能）を導入した心血管修復素材を作製する。ＨＧＦは、肝細胞増殖因子として同定されたが、心臓、血管などの再生にも寄与する因子として知られている。
【０４８３】
（心筋梗塞ラットモデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。急性心筋梗塞をＷｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，Ｂｕｓｈ  ＤＥ，Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８８；７８：１８６−２０１に記載されるように誘導する。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮する。
【０４８４】
（移植）
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に移植した物質に従って３群に分ける。Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材のみ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋ＨＧＦ導入移植群、ｎ＝５）。心血管修復素材は左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に直接移植する。
【０４８５】
（ラット心臓の心機能の測定）
梗塞モデル作製２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定する。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出する。
【０４８６】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行う。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行う。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行う。
【０４８７】
（結果）
（心機能評価）
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ２群における駆出率はＣ群およびＳ１群に比較して有意な改善を示すことが観察される。
【０４８８】
（組織学的評価）
Ｓ２群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。さらにＳ２群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められる。
【０４８９】
ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせでも、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも同様の効果が見られる。
【０４９０】
（実施例２１：別のサイトカインを用いた場合の例）
本実施例では、本発明の支持体に別のサイトカインを塗布した場合でも作用することを確認することを実証する。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物、ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに、サイトカインとしてＶＥＧＦ（バイオソースより入手可能）を導入した心血管修復素材を作製する。ＶＥＧＦは、心臓、血管などの再生にも寄与する因子として知られている。
【０４９１】
（心筋梗塞ラットモデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。急性心筋梗塞をＷｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，Ｂｕｓｈ  ＤＥ，  Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８８；７８：１８６−２０１に記載されるように誘導する。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮する。
【０４９２】
（移植）
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に移植した物質に従って３群に分ける。Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材のみ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋ＶＥＧＦ導入移植群、ｎ＝５）。心血管修復素材は左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に直接移植する。
【０４９３】
（ラット心臓の心機能の測定）
梗塞モデル作製２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定する。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出する。
【０４９４】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行う。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行う。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行う。
【０４９５】
（結果）
心機能評価
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ２群における駆出率はＣ群およびＳ１群に比較して有意な改善を示すことが観察される。
【０４９６】
（組織学的評価）
Ｓ２群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。さらにＳ２群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められる。
【０４９７】
ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせでも、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも同様の効果が見られる。
【０４９８】
（実施例２２：サイトカインと細胞外マトリクスとの組み合わせを用いた場合の例）
本実施例では、本発明の支持体にサイトカインと細胞外マトリクスとを組み合わせて塗布した場合でも作用することを確認することを実証する。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸のｋｎｉｔ，ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに、サイトカインとしてＨＧＦ（東洋紡より入手可能）、および細胞外マトリクスとしてコラーゲンＩを導入した心血管修復素材を作製する。コラーゲンは、上述の実施例において使用されるように用いる。
【０４９９】
（心筋梗塞ラットモデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。急性心筋梗塞をＷｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，  Ｂｕｓｈ  ＤＥ，  Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９８８；７８：１８６−２０１に記載されるように誘導する。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮する。
【０５００】
（移植）
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に移植した物質に従って３群に分ける。Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材のみ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋ＨＧＦおよびコラーゲンＩ導入移植群、ｎ＝５）。心血管修復素材は左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に直接移植する。
【０５０１】
（ラット心臓の心機能の測定）
梗塞モデル作製２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定する。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出する。
【０５０２】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行う。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行う。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行う。
【０５０３】
（結果）
（心機能評価）
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ２群における駆出率はＣ群およびＳ１群に比較して有意な改善を示すことが観察される。
【０５０４】
（組織学的評価）
Ｓ２群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。さらにＳ２群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められる。
【０５０５】
一般に、細胞外マトリクスとサイトカインとの組み合わせは、単独の生体分子（細胞外マトリクス単独、またはサイトカイン単独）よりも高い効果が見られる。
【０５０６】
ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせでも、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも同様の効果が見られる。
【０５０７】
（実施例２３：別の生体分子を用いた場合の例）
本実施例では、本発明の支持体に別の生体分子を塗布した場合でも作用することを確認することを実証する。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物，ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに、生体分子として、ラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．）；アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＨＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）商品名フィブラストスプレー（科研製薬）；Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）商品名グラン（麒麟麦酒）；ＳＤＦ−１（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．）；ＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；およびＩＬ１−β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）を単独で導入した心血管修復素材をそれぞれ作製する。これらは、心筋などの再生にも寄与する因子として知られている。
【０５０８】
（心筋梗塞ラットモデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。急性心筋梗塞をＷｅｉｓｍａｎ  ＨＦ，  Ｂｕｓｈ  ＤＥ，  Ｍａｎｎｉｓｉ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９８８；７８：１８６−２０１に記載されるように誘導する。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮する。
【０５０９】
（移植）
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に移植した物質に従って３群に分ける。Ｃ群（無治療群、ｎ＝５）；Ｓ１群（修復素材のみ移植群、ｎ＝５）；Ｓ２群（修復素材＋ＳＤＦ−１；ＴＮＦ−α；またはＩＬ１−β導入移植群、それぞれｎ＝５）およびＳ２群（修復素材＋コラーゲンおよびＳＤＦ−１；ＴＮＦ−α；またはＩＬ１−β導入移植群、それぞれｎ＝５）。心血管修復素材は左前下降枝結紮２週後に梗塞部位に直接移植する。
【０５１０】
（ラット心臓の心機能の測定）
梗塞モデル作製２週後、移植後４週、８週後に、心臓超音波（ＳＯＮＯＳ  ５５００，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて心機能を測定する。１２−ＭＨｚのｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。Ｂ−ｍｏｄｅにて、左室収縮末期面積（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ａｒｅａ）、Ｍ−ｍｏｄｅにて、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）、左室前壁厚（ＬＶＡＷＴｈ）を測定し、ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳを算出する。
【０５１１】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行う。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行う。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行う。
【０５１２】
（結果）
（心機能評価）
移植の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｓ２群およびＳ３群における駆出率はＣ群およびＳ１群に比較して有意な改善を示すことが観察される。
【０５１３】
（組織学的評価）
Ｓ１〜Ｓ３群は、それぞれ、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。さらにＳ１〜Ｓ３群では、それぞれ再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められる。さらに、コラーゲンと他のサイトカインとの組み合わせでは、単独の場合よりも再生の効果が増進していることが確認される。さらに、コラーゲンと他のサイトカインとの組み合わせでは、単独の場合よりも再生の効果が増進していることが確認される。
【０５１４】
ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせでも、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも同様の効果が見られる。
【０５１５】
（実施例２４：修復素材のラット背部移植モデルでの実証）
本実施例では、本発明の管状の支持体が背部でも作用することを確認することを実証した。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物，ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作成した。また、編物−織物複合支持体にコラーゲンマイクロスポンジを架橋処理し、さらに、Ｉ型コラーゲンと他の細胞外マトリックスであるＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ＨＧＦを導入した心血管修復素材を作成した。
【０５１６】
（ラット背部移植モデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いた。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの背部に移植した物質に従って３群に分けた。Ｃ群（修復素材のみ移植群群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＨＧＦ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＩＶ型コラーゲン＋ラミニン導入移植群、ｎ＝５）。
【０５１７】
実験は、Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ，Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，Ａｋｕｔｓｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００２  Ｆｅｂ  ２２；９０（３）：ｅ４０．に基づいて行った。
【０５１８】
実際に行った実験の手順を図４０にまとめて示す。図４１に、ラット背部移植（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＨＧＦ移植群）の様子を示す。図４４には、ラット背部移植（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＩＶ型コラーゲン移植群）の様子を示す。
【０５１９】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行った。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン−トリクローム染色を行った。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行った。
【０５２０】
（定量ＰＣＲ）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、ｃａｒｄｉａｃ  ａｃｔｉｎ、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣの定量ＰＣＲを施行した。定量ＰＣＲは、プライマーおよび定量のためのプローブとして以下を使用した：
CardiacActin
5'プライマー  ACCCTG GAA TTG CTG ATC GTA TG（配列番号２）
3'プライマー  TGT CGT CCT GAG TGT AAG GTA GCC（配列番号３）
プローブ      AAA TTA CCG CAC TGG CTC CCA GCA（配列番号４）
αMHC
5'プライマー  TAG AAT AGC CTC AGA GGC CCA G（配列番号５）
3'プライマー  GCT TCC GAG ACC GCT CTG TC（配列番号６）
プローブ      CAG TCC GTG CCA ATG ACG ACC TGA A（配列番号７）
βMHC
5'プライマー  TGC TGA AGG ACA CTC AAA TCC A（配列番号８）
3'プライマー  GTT GAT GAG GCT GGT GTT CTG G（配列番号９）
プローブ      ACG CAG TCC GTG CCA ATG ACG ACC（配列番号１０）
定量ＰＣＲは、以下のように行った。
１．摘出したサンプルは、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）で保存した。
２．ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ）でＲＮＡを抽出した。
３．ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡを処理した。
４．Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で処理したＤＮＡから逆転写反応を行った。
５．ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）でＰＣＲした。
【０５２１】
（結果）
以下の結果において示される写真は、ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせであるが、同様の効果がポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも見られた。ポリＬ乳酸の方が、分解しにくいので好ましい場合もあるようであるが、それに限定されず、むしろ、両者とも本発明の目的を達成するのに十分であったことに留意すべきである。
【０５２２】
（組織学的評価）
図４２（ラット背部移植（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＨＧＦ移植群））、および図４５（ラット背部移植（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＩＶ型コラーゲン移植群））には、それぞれ移植後４週の凍結切片のＤｅｓｍｉｎ，Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色の写真を示す。
【０５２３】
Ｓ２群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。さらにＳ２群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められた。
【０５２４】
（定量ＰＣＲ）
図４３に、ラット背部移植（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＨＧＦ移植群）の種々のＰＣＲの結果を示す。定量ＰＣＲではＳ１群とＳ２群はＣ群では認められなかったｃａｒｄｉａｃ  ａｃｔｉｎ、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣの発現が認められた。
【０５２５】
図４６には、ラット背部移植（心血管修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＩＶ型コラーゲン＋ＨＧＦ移植群）の種々のＰＣＲの結果を示す。定量ＰＣＲではＳ１群とＳ２群はＣ群では認められなかったｃａｒｄｉａｃ  ａｃｔｉｎ、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣの発現が認められた。
【０５２６】
発現の傾向は、導入する生体分子の種類が増えるほど増加した。
【０５２７】
（実施例２５：他の分子での修復素材のラット背部移植モデルでの実証）
本実施例では、本発明の生体分子としてＶＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＨＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）商品名フィブラストスプレー（科研製薬）；Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）商品名グラン（麒麟麦酒）；ラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．  ）；ＳＤＦ−１（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．）；ＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；およびＩＬ１−β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いても背部で作用することを確認することを実証する。生体吸収性高分子であるポリグリコール酸の編物，ポリグリコール酸またはポリＬ乳酸の織物による編物−織物複合支持体を作製する。この支持体に上記３種類の分子をそれぞれ導入した心血管修復素材をそれぞれ作製する。
【０５２８】
（ラット背部移植モデル）
雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成しＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，１９８５改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行う。ラットの背部に移植した物質に従って３群に分ける。Ｃ群（修復素材のみ移植群群、ｎ＝５）とＳ１群（修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＨＧＦ移植群、ｎ＝５）Ｓ２群（修復素材＋ＶＥＧＦ；アンギオポイエチン；ＨＧＦ；ＦＧＦ；Ｇ−ＣＳＦ；またはラミニン導入移植群、それぞれ、ｎ＝５）とＳ３群（修復素材＋Ｉ型コラーゲン＋ＶＥＧＦ；アンギオポイエチン；ＨＧＦ；ＦＧＦ；Ｇ−ＣＳＦ；またはラミニン導入移植群、それぞれ、ｎ＝５）。
【０５２９】
Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ，  Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，  Ａｋｕｔｓｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｆｅｂ  ２２；９０（３）：ｅ４０．に基づいて行った。
【０５３０】
（組織学的分析）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、１０％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行う。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン（ＨＥ）染色、マッソン−トリクローム染色を行う。また同時期の凍結切片を作成し、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色を行う。
【０５３１】
（定量ＰＣＲ）
移植後４週、８週後に心臓を摘出し、ｃａｒｄｉａｃ  ａｃｔｉｎ、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣの定量ＰＣＲを施行する。実験は実施例２４に準じる。
【０５３２】
（結果）
（組織学的評価）
Ｓ１〜Ｓ３群は、Ｃ群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、修復素材にはない細胞の存在が認められ、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。さらにＳ１〜Ｓ３群では再生された部位の免疫組織染色でＤｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴの免疫染色にて陽性細胞が認められる。さらに、コラーゲンと他のサイトカインとの組み合わせでは、単独の場合よりも再生の効果が増進していることが確認される。
【０５３３】
（定量ＰＣＲ）
定量ＰＣＲではＳ１群〜Ｓ３群はＣ群では認められなかったｃａｒｄｉａｃ  ａｃｔｉｎ、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣの発現が認められる。
【０５３４】
ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせでも、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも同様の効果が見られる。
【０５３５】
（実施例２６：本発明の二層構造（編物および織物）の支持体のさらなる解析：細胞増殖支持性の確認）
次に、本発明の二層構造の支持体のさらなる解析として細胞増殖活性を有するかどうかを調べた。
【０５３６】
（細胞増殖実験）
ＰＬＡまたはＰＧＡ  編物とＰＬＧＡとをカプロラクトンで接着させた部材を用い、Ｉ型コラーゲンスポンジ架橋処理の細胞増殖に対する効果を見た。さらにＩＶ型コラーゲン、ラミニンの効果もあわせて見た。
【０５３７】
実験方法は、ＰＬＡまたはＰＧＡ  編物とＰＬＧＡとをカプロラクトンで接着させた部材を用い未処理の物・Ｉ型コラーゲンスポンジ架橋処理・Ｉ型＋ＩＶ型コラーゲンスポンジ架橋処理・Ｉ型コラーゲン＋ラミニンスポンジ架橋処理を行った物を作成した。ラット血管内皮細胞、平滑筋細胞をＤＭＥＭ＋２０％  ＦＣＳ培地で１×１０５細胞／ｍｌに調整した細胞縣濁液４０ｍｌを１００ｍｌ三角フラスコに入れ、そこへ１×１ｃｍに切った部材をまとめて入れた（１日につきｎ＝５）。Ｄｙｎａｍｉｃ培養下（６０ｒｐｍ）で培養し１、３、７日目に部材に生着している細胞量をＭＴＴアッセイにより評価した。
【０５３８】
その結果を以下の表に示す。さらに細胞増殖試験をまとめた図を図４７（血管内皮細胞）および図４８（血管平滑筋細胞）に示す。
【０５３９】
【表５】
2006508773.tif 000007
今回の実験条件では細胞の接着自体にはＩ型コラーゲン架橋処理の効果はそれほど顕著ではなかったが、細胞の増殖に対しては血管内皮細胞、平滑筋細胞どちらにおいてもＩ型コラーゲン架橋処理されている方が細胞の増殖は高かった。また、今回の実験ではＩ型コラーゲン架橋処理した物に対しＩＶ型コラーゲン、ラミニンを加えても効果はわずかである。
【０５４０】
なお、上記結果において示される結果は、ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせであるが、同様の効果がポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせでも見られた。ポリＬ乳酸の方が、分解しにくいので好ましい場合もあるようであるが、それに限定されず、むしろ、両者とも本発明の目的を達成するのに十分であったことに留意すべきである。
【０５４１】
（実施例２７：他の動物での他のサイトカインの効果）
本実施例では、本発明の生体分子としてアンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＨＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）商品名フィブラストスプレー（科研製薬）；Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）商品名グラン（麒麟麦酒）；ラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．  ）；ＳＤＦ−１（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．）；ＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）；およびＩＬ１−β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，  Ｉｎｃ．）を用いてもイヌの肺動脈および心筋梗塞部においても作用することを確認することを実証する。
【０５４２】
イヌの肺動脈または心筋梗塞部位の実験は、実施例１６または実施例１７に示されるようなビーグル犬を用いて、種々のサイトカインの本発明の支持体に対する効果を実証する。
【０５４３】
肺動脈に移植した支持体の内腔側表面は肉眼的に平滑であり、ＨＥ染色によって、ＰＧＡおよびＰＬＡは完全に吸収されており、正常の血管として遜色のない組織構造であることが明らかになる。
【０５４４】
血管内被細胞を第ＶＩＩＩ因子染色により、平滑筋細胞をα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）免疫染色にて検討することができる。α−ＳＭＡ免疫染色は、α−ＳＭＡに対する抗体を用いて染色を行う。第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞が認められ、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有する平滑筋細胞が認められる。
【０５４５】
さらに、エラスチカ・ファン・ギーソン染色にて、血管の弾性線維を検討した。血管内層に弾性線維の発現が認められる。
【０５４６】
心筋梗塞部位については、移植の４週間後、心エコー検査を行って判定することができる。いずれのサイトカインでの処置群における駆出率および左室短縮率は、コントロール群に比較して有意な改善を示す。これらの機能改善は、移植後少なくとも８週間維持される。
【０５４７】
サイトカイン処置群は、コントロール群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補う。本発明の支持体では、血管の新生および支持体（パッチ）の消長が見られる。
【０５４８】
上記実験では、ポリグリコール酸の編物−ポリＬ乳酸の織物の組み合わせと、ポリグリコール酸の編物−ポリグリコール酸の織物の組み合わせとはほぼ同様の効果が見られる。ポリＬ乳酸の方が、分解しにくいので好ましい場合もあるようであるが、それに限定されず、むしろ、両者とも本発明の目的を達成するのに十分であったことに留意すべきである。
【０５４９】
（実施例２８：本発明の二層構造（編物および織物）の支持体の解れ試験）
本実施例では、図４９に示すような解れ試験を用いて、本発明の二層構造の支持体が解れ耐性を増しているかどうかを調べた。
【０５５０】
解れ試験の概要は以下のとおりである。本発明の支持体を１ｃｍ×２ｃｍ大にし、上から２ｍｍのところに手術用縫合糸を縫いつけ、上下に引っ張り耐えられる荷重の重さで解れ耐性を表現した。その結果をモノフィラメントとの比較で、3方向の解れ耐性を図４９に示す。示されるように、横方向に対する解れ耐性が2倍以上に顕著に増進していた。
【０５５１】
（実施例２９：本発明の二層構造（編物および織物）の支持体の移植実験）
本発明の二層構造の支持体が実際に生体内で長期にわたり生着していることを実証する実験を本実施例において行った。
【０５５２】
本発明の支持体（ポリグリコール酸（編物）およびポリＬ乳酸（織物）；１５ｍｍ×１０ｍｍ）を、ビーグル成犬（８−１２ｋｇ）の肺動脈および大動脈に部分遮断下に移植した。移植後、２週、２ヶ月、６ヵ月後に摘出し、組織学的に検討した。検討は、上記実施例に記載されるように、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、第ＶＩＩＩ因子によって行った。
【０５５３】
＜インビボ：移植２週間後＞
移植した支持体には肉眼的に明らかな血栓形成は認められなかった。ＨＥ染色では、支持体の残存が認められ、その間には結合織が介在していた。
【０５５４】
＜インビボ：移植２ヶ月後＞
移植した支持体の内腔側表面は肉眼的に平滑であり、ＨＥ染色によって、ＰＬＧＡは完全に吸収されており、正常の血管として遜色のない組織構造であることが明らかになった。
【０５５５】
血管内被細胞を第ＶＩＩＩ因子染色により、平滑筋細胞をα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）  免疫染色にて検討した。α−ＳＭＡ免疫染色は、α−ＳＭＡに対する抗体を用いて染色を行った。第ＶＩＩＩ因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞が認められ、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔側に配向性を有する平滑筋細胞が認められた。
【０５５６】
さらに、エラスチカ・ファン・ギーソン染色にて、血管の弾性線維を検討した。血管内層に弾性線維の発現が認められた。
【０５５７】
ＳＭＡなどの染色によって、本発明の織物×編物の組み合わせの支持体によって、より内部まで再細胞化が浸透していることが明らかになった（図５０）。
【０５５８】
これを、同様の処置を行ったＰＬＧＡコポリマーの支持体（図５１）に比べると、上記組み合わせの方が再細胞化の進捗度が進んでいることがわかった。
【０５５９】
＜インビボ：移植後６ヵ月後＞
移植後２ヶ月目に見られたのと同様に、第VIII因子免疫染色で単層の連続する血管内皮細胞が認められる。平滑筋細胞は、移植後２ヶ月目に見られたよりもさらにその形態を明らかにし、α−ＳＭＡ免疫染色で内腔に配向性を有し、正常血管とほぼ同様である。エラスチカ・ファン・ギーソン染色において血管弾性線維も移植後に見られたよりも血管内層に弾性線維の発現がより多く認められる。さらに、血管の石灰化の有無は、フォンコッサ染色により、移植した支持体および周辺血管には陽性反応が認められなかったことから、石灰沈着は認められない。
【０５６０】
（実施例３０：一弁付パッチ）
次に、本発明の支持体を弁つきの形状で作製した（図５２および図５３）。弁つき形状の作製方法は以下のとおりである：
（方法）
Ｉ型コラーゲンおよびポリＬ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）生体分解性ポリマーをパッチを作製するために調製した。生体分解性の足場を、コラーゲンマイクロスポンジで架橋処理されたポリＬ乳酸織物メッシュで強化し、一弁つき環状パッチを形成した。この環状パッチを、イヌの右心室動脈に前細胞化無しで移植した（ｎ＝３）。
【０５６１】
材料と方法の詳細は以下のとおりである。
【０５６２】
（詳細な材料と方法）
（足場設計）
生体分解性足場を、コラーゲンマイクロスポンジで架橋処理されたポリＬ乳酸（ＰＬＡ）織物メッシュで外側を強化し、一弁つき環状パッチを形成した。この弁はまた、ＰＬＡ織物からなる（図５５参照）。これらのポリマー足場は、Ｓｅｎｋｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍｆｇ．Ｃｏ．Ｌｔｄ（大阪、日本）から提供された。
【０５６３】
（インビボ研究）
環状パッチ（５０×３０ｍｍ）を、雑種犬（体重２０ｋｇ）の右心室動脈に移植した（ｎ＝３）。大腿動脈および右心房静脈カニューレ挿入によって、正常体温心肺バイパスが実施した。心臓の拍動に伴い、肺動脈幹から右心室動脈に対する血流は長期的に増加し、腹側の本来のリーフレットは取り除かれた。前細胞化無しの環状パッチを、５〜０のモノフィラメント縫糸を使用して移植した。リーフレット機能および肺の逆流について、経食道心臓エコー（ＴＥＥ）および血管造影を移植の２ヶ月後に検査した。
【０５６４】
前述のとおり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表したＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。
【０５６５】
（結果）
環状パッチモデルにおいて、移植２ヶ月後の心臓エコーおよび血管造影検査は、良好なリーフレット機能および肺の逆流が無いことを示した。
【０５６６】
（インビボ研究）
図５２は、本発明の一弁つきパッチを実際に生体内に移植した様子を示す。
【０５６７】
心臓エコー検査を、本発明の一弁つきパッチが実際に弁として機能するかどうかを決定するために実施した。結果を図５６に示す。環状パッチは、移植後２ヶ月のＴＥＥおよび血管造影検査で血栓形成および右心室動脈管狭窄は認められ無かった。合成リーフレットは良好に機能し、肺の逆流は認められ無かった（図５６）。
【０５６８】
図５６に示されるように、本発明の一弁つき支持体が各図の中央部において実際に弁として機能しているのは明らかであった。
【０５６９】
環状パッチの本例において、移植２ヶ月後の心臓エコーおよび血管造影検査は、良好なリーフレット機能および肺の逆流が無いことを示した。
【０５７０】
臨床的な応用のために、コラーゲンマイクロスポンジの作製手順を簡便にＩ型コラーゲンのみを使用するよう改良した。
【０５７１】
結論として、生体分解性ポリマーおよび生物学的活性物質因子からなる、生体工学移植片（好ましくはマイクロスポンジ型）は、組織学的な発見であり、前細胞化無しでも耐久性を示した。この生体工学移植片は、将来有望なインサイチュ細胞化のための外科用の材料であり、心血管手術において自家組織の再生を導く。
【０５７２】
図５５には、本発明の一弁つきパッチを実際に移植した様子を示す。本発明の一弁つきパッチは、実際の弁として機能しているかどうかを、心臓エコーをとって確認した。その結果を図５６に示す。図５６に示すように、中央に示す弁状の形状を示す本発明の支持体が実際に弁として機能していることが明らかになった。
【０５７３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０５７４】
本発明により、細胞など生体に由来する自己増殖性のものを用いることなく、自己化する組織片が提供された。そのような組織片を移植することで、臓器または組織の再生がみられたことはかつてなく、そのような再生医療産業において本発明は特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０５７５】
【図１】図１は、本発明の生体適合性組織片の一例である。
【図２】図２は、移植の様子を示す写真である。
【図３】図３は、機械的強度を示すグラフである。
【図４】図４は、インビトロでの細胞接着効率を示す図である。
【図５】図５は、インビボでの移植２週間後の様子を示す図である。
【図６】図６は、インビボでの移植２ヶ月後の様子を示す図である。
【図７】図７は、移植２ヶ月後の血管内皮細胞の様子を示す図である。
【図８】図８は、移植２ヶ月後の血管平滑筋細胞の様子を示す図である。
【図９】図９は、移植２ヶ月後の弾性線維細胞の様子を示す図である。
【図１０】図１０は、インビボでの移植６ヶ月後の様子を示す図である。
【図１１】図１１は、インビボでの移植６ヶ月後の様子を示す別の図である。
【図１２】図１２は、移植６ヶ月後の石灰化の様子を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ポリグリコール酸のメッシュの上面からの撮影写真である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ポリＬ乳酸のメッシュの上面からの撮影写真である。
【図１４】図１４は、ポリグリコール酸編物の様子を示す下面からの撮影写真である。
【図１５】図１５は、ポリグリコール酸編物を上から取った写真である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ポリグリコール酸編物を示す断面図であり、この断面図からその環が連続的に接合されていることが観察される。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ポリグリコール酸編物およびポリＬ乳酸織物を示す断面図である。
【図１７】図１７は、ポリグリコール酸編物と、ポリＬ乳酸織物とを接着させる方法の模式図である。
【図１８】図１８は、本発明の支持体の作製法を示す。
【図１９】図１９は、コラーゲン架橋の概略図である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、コラーゲン架橋された支持体例（ポリグリコール酸織物）を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、コラーゲン架橋された支持体例（ポリＬ乳酸織物）を示す。
【図２１】図２１は、コラーゲン架橋を種々の支持体に施した例を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、各種支持体（ポリグリコール酸）の引張り強度を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、各種支持体（ポリＬ乳酸）の引張り強度を示す。
【図２３】図２３は、各種支持体の弾性率を示す。
【図２４】図２４は、各種支持体の伸びを示す。
【図２５】図２５は、各種支持体の水漏れ率を示す。
【図２６】図２６は、各種支持体の通気性を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、インビトロでの細胞接着性（ポリグリコール酸）を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、インビトロでの細胞接着性（ポリＬ乳酸）を示す。
【図２８】図２８は、接着条件検討試験での試験プロトコール例を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、接着条件試験の結果を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、本発明の複合支持体の接着条件（ポリカプロラクタム濃度）試験の結果を示す。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、本発明の複合支持体の接着条件（圧力）試験の結果を示す。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、本発明の複合支持体の接着条件（温度および時間）試験の結果を示す。
【図３０】図３０は、強度劣化試験の結果（０、１、３および６週間後）を表面形状で示す。
【図３１】図３１は、強度劣化試験に関し、重量変化（Ａ）、最大点荷重の変化（Ｂ）、および最大点荷重変化の割合（Ｃ）の結果を示す。
【図３２】図３２は、ラット心臓への本発明の支持体の移植の手順の模式図を示す。
【図３３】図３３は、ラット心臓の支持体移植なしの場合の梗塞後１ヶ月の様子を示す。
【図３４】図３４は、本発明の支持体（生体分子付与なし）の移植後１ヶ月の様子を示す。
【図３５】図３５は、本発明の支持体（コラーゲンIV型およびI型付与）の移植後１ヶ月の様子を示す。
【図３６】図３６は、ラット心筋梗塞部位への移植例を示す。
【図３７】図３７は、ラット心筋梗塞部位への移植例（複合素材のみ）を示す。
【図３８】図３８は、ラット心筋梗塞部位への移植例（複合素材にI型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびラミニンコーティングしたもの）を示す。
【図３９】図３９は、ラット心筋梗塞部位への移植の際の心機能評価を示す。
【図４０】図４０は、ラット背部への移植例を示す。
【図４１】図４１は、ラット背部への移植例（PLGA素材にI型コラーゲンおよびHGFをコーティングしたもの）を示す。
【図４２】図４２は、ラット背部への移植例（複合素材にI型コラーゲンおよびHGFをコーティングしたもの）を示す。
【図４３】図４３は、ラット背部への移植例（複合素材にI型コラーゲンおよびHGFをコーティングしたもの）のリアルタイムＰＣＲ結果を示す。
【図４４】図４４は、ラット背部への移植例（PLGA素材にI型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびラミニンをコーティングしたもの）を示す。
【図４５】図４５は、ラット背部への移植例（複合素材にI型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびラミニンをコーティングしたもの）を示す。
【図４６】図４６は、ラット背部への移植例（複合素材にI型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびラミニンをコーティングしたもの）の各種細胞マーカーの発現強度を示す。
【図４７】図４７は、本発明の複合支持体の細胞増殖試験(血管内皮細胞）の結果を示す。
【図４８】図４８は、本発明の複合支持体の細胞増殖試験(血管平滑筋細胞）の結果を示す。
【図４９】図４９は、本発明の複合支持体の接着条件（ポリカプロラクタム濃度）試験の結果を示す。
【図５０】図５０は、本発明の複合支持体の移植結果（２ヶ月）を示す。左上は、ポリグリコール酸（編物）＋ポリＬ乳酸（織物）で、対象は大動脈であり、移植後２ヶ月の平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色結果（倍率×１００）を示す。右上は、ポリグリコール酸（編物）＋ポリＬ乳酸（織物）で、対象は大動脈であり、移植後２ヶ月の第ＶＩＩＩ因子染色結果（倍率×１００）を示す。左下は、ポリグリコール酸（編物）＋ポリＬ乳酸（織物）で、対象は肺動脈であり、移植後２ヶ月の平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色結果（倍率×１００）を示す。右下は、ポリグリコール酸（編物）＋ポリＬ乳酸（織物）で、対象は肺動脈であり、移植後２ヶ月の第ＶＩＩＩ因子染色結果（倍率×１００）を示す。
【図５１】図５１は、ＰＬＧＡ支持体の移植結果（２ヶ月）を示す。左下は、ＰＬＧＡコポリマー（多孔体）を用い移植対象は、肺動脈であり、移植後２ヶ月の第ＶＩＩＩ因子染色結果（倍率×１００）を示す。右下は、ＰＬＧＡコポリマー（多孔体）を用い移植対象は、肺動脈であり、移植後２ヶ月の平滑筋アクチン（ＳＭＡ）染色結果（倍率×１００）を示す。
【図５２】図５２は、本発明の一弁付支持体例を示す（一弁付支持体）。
【図５３】図５３は、本発明の別の一弁付支持体例を示す（一弁付支持体）。コラーゲンマイクロスポンジで架橋処理されたポリＬ乳酸織物メッシュで強化された生体分解性の足場は、環状一弁付パッチへと形成された。
【図５４】図５４は、ＰＬＧＡコラーゲンマイクロスポンジ上で培養した播種細胞の生着および増殖が、単にコラーゲンでコートされたＰＬＧＡおよびＰＬＧＡのみに比べて有意に高いことを示す（＊：ｐ＜０．０５対ＰＬＧＡのみ、＊＊：ｐ＜０．０５対コラーゲンコートされたＰＬＧＡおよびＰＬＧＡのみ）。
【図５５】図５５は、本発明の一弁つき支持体が移植された様子を示す。
【図５６】図５６は、本発明が環状パッチモデルにおいて実際に作用していることを示す。環状パッチモデルにおいて、移植２ヶ月後の経食道心臓エコー（ＴＥＥ）および血管造影検査は、良好なリーフレット機能および肺の逆流が無いことを示した。矢印は人工のリーフレットを示す。ＬＡ：左心房、ＲＶ：右心室、ＰＡ：肺動脈、ＲＶＧ（Ｌ）：ＲＶグラフの側面からの図、ＰＡＧ（Ｌ）：ＰＡグラフの側面からの図。図５６は、本発明の一弁つき支持体が実際の弁として機能することを実証する、心臓エコーによる連続写真である。これらの図から示されるように、写真中央部に示される弁は、開閉している。
【配列表フリーテキスト】
【０５７６】
（配列表の説明）
配列番号１は、実施例１９で用いた短ペプチドアミノ酸配列を示す。
【０５７７】
配列番号２は、CardiacActinの同定のための５’プライマー核酸配列を示す。
【０５７８】
配列番号３は、CardiacActinの同定のための３’プライマー核酸配列を示す。
【０５７９】
配列番号４は、CardiacActinの同定のためのプローブ核酸配列を示す。
【０５８０】
配列番号５は、αMHCの同定のための５’プライマー核酸配列を示す。
【０５８１】
配列番号６は、αMHCの同定のための３’プライマー核酸配列を示す。
【０５８２】
配列番号７は、αMHCの同定のためのプローブ核酸配列を示す。
【０５８３】
配列番号８は、βMHCの同定のための５’プライマー核酸配列を示す。
【０５８４】
配列番号９は、βMHCの同定のための３’プライマー核酸配列を示す。
【０５８５】
配列番号１０は、βMHCの同定のためのプローブ核酸配列を示す。
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【図１４】
2006508773.tif 000010
【図１５】
2006508773.tif 000011
【図１７】
2006508773.tif 000012
【図１８】
2006508773.tif 000013
【図１９】
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【図２８】
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【図２９Ｂ】
2006508773.tif 000017
【図２９Ｃ】
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【図３９】
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【図５２】
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【図５３】
2006508773.tif 000021
【図５５】
2006508773.tif 000022
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2006508773.tif 000033
【図１２】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
2006508773.tif 000042
【図２５】
2006508773.tif 000043
【図２６】
2006508773.tif 000044
【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2006508773.tif 000053
【図３５】
2006508773.tif 000054
【図３６】
2006508773.tif 000055
【図３７】
2006508773.tif 000056
【図３８】
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【図４０】
2006508773.tif 000058
【図４１】
2006508773.tif 000059
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
2006508773.tif 000062
【図４５】
2006508773.tif 000063
【図４６】
2006508773.tif 000064
【図４７】
2006508773.tif 000065
【図４８】
2006508773.tif 000066
【図４９】
2006508773.tif 000067
【図５０】
2006508773.tif 000068
【図５１】
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【図５４】
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【図５６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月11日(2003.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性組織片であって、
Ａ）生体分子；および
Ｂ）支持体、
を含み、該生体分子がコラーゲンＩ型である、生体適合性組織片。
【請求項１１】
前記生体分子は、さらにコラーゲンＩＶ型を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１２】
前記生体分子は、さらにサイトカインを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１３】
前記支持体は、膜状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１４】
前記支持体は、管状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１５】
前記支持体は、弁状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１６】
前記支持体は、生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１７】
前記支持体は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１８】
前記支持体は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項１９】
前記支持体は、細胞接着分子を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２０】
前記支持体は、タンパク質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２１】
前記支持体は、メッシュ状およびスポンジ状である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２２】
前記支持体は、少なくとも約０．２ｍｍ〜約１．０ｍｍ厚である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２３】
前記支持体は、少なくとも約２０Ｎ以上の強度を有する、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２４】
前記支持体は、少なくとも約５０Ｎ以上の強度を有する、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２５】
前記支持体は、前記生体分子でコーティングされている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２６】
前記支持体は、隙間を有し、該隙間が前記生体分子で埋められている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２７】
前記生体分子および前記支持体は、架橋可能な分子を含み、該架橋可能な分子は、該支持体と該生体分子との間で架橋処理されている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２８】
前記支持体は、前記生体分子と同じ物質を含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項２９】
さらに、細胞が付着した、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３０】
体内への移植用である、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３１】
前記体内における移植されるべき部位は、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管からなる群より選択される、請求項３０に記載の生体適合性組織片。
【請求項３２】
滅菌されている、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３３】
免疫抑制剤をさらに含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３４】
さらなる医薬成分をさらに含む、請求項１に記載の生体適合性組織片。
【請求項３５】
前記生体適合性組織片は、前記移植を目的とする生体に由来する、請求項３０に記載の生体適合性組織片。
【請求項３６】
請求項１に記載の生体適合性組織片を含む、医薬。
【請求項３７】
請求項１に記載の生体適合性組織片および該組織片の使用法を示した指示書を含む、医薬キットであって、該指示書には、所定の部位に該組織片を投与することが記載される、医薬キット。
【請求項３８】
前記所定の部位は、血管内皮、血管平滑筋、弾性線維、骨格筋、心筋、骨芽細胞、神経細胞および膠原線維からなる群より選択される、請求項３７に記載の医薬キット。
【請求項３９】
前記指示書には、前記生体適合性組織片を、移植を目的とする臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植することが記載される、請求項３７に記載の医薬キット。
【請求項４０】
体内における損傷部位を処置する方法であって、
Ａ）該損傷部位の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含み、該生体分子がコラーゲンＩ型である、生体適合性組織片を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記移植工程において、前記生体適合性組織片は、前記損傷部位が属する臓器または組織の少なくとも一部が残存するように移植される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞生理活性物質を投与する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞生理活性物質は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、免疫グロブリンファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、シンデカン、アグリカン、インテグリンファミリーのメンバー、インテグリンα鎖、インテグリンβ鎖、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、セレクチン、カドヘリン、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ならびにそれらに関連するポリペプチドおよびペプチドからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
免疫反応を抑制する処置を行う工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
体内における臓器または組織を強化する方法であって、
Ａ）該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含み、該生体分子がコラーゲンＩ型である、生体適合性組織片を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
臓器または組織を生産または再生する方法であって、
Ａ）目的とする臓器または組織を含む生体において、該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）生体分子；および
Ａ−２）支持体、
を含み、該生体分子がコラーゲンＩ型である、生体適合性組織片を移植する工程；ならびに
Ｂ）該臓器または組織を該生体内で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における損傷部位を処置するための使用。
【請求項４８】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における臓器または組織を強化するための使用。
【請求項４９】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用。
【請求項５０】
請求項１に記載の生体適合性組織片の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用。
【請求項５１】
生体適合性組織支持体であって、
Ａ）粗面を有する第一層；および
Ｂ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体。
【請求項５４】
前記粗面は、細胞が入り込むに充分なスペースを有する、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５５】
前記封着は、生体吸収性高分子を融着することにより達成される、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５６】
前記第二層は、通気性が実質的に遮断される、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５７】
前記支持体の強度は、少なくとも１００Ｎである、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５８】
前記支持体の通気性は、１０ｍｌ／ｃｍ２／ｓｅｃ以下である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項５９】
前記第一層は、生体分解性材料を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６０】
前記第一層は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６１】
前記第一層は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６２】
前記第一層は、ポリグリコール酸を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６３】
前記第二層は、生体分解性材料を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６４】
前記第二層は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）およびポリカプロラクタム（ＰＣＬＡ）ならびにそれらの共重合体からなる群より選択される少なくとも１成分を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６５】
前記第二層は、グリコール酸と乳酸との比率が約９０：約１０〜約８０：約２０であるＰＬＧＡを含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６６】
前記第二層は、ポリＬ乳酸を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６８】
前記第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、前記第一層は、ポリグリコール酸の編物である、請求項５１に記載の支持体。
【請求項６９】
前記接着は、Ｃ）前記第一層と前記第二層とを封着する中間層による、支持体。
【請求項７０】
前記中間層は、合成生体吸収性ポリマーである、請求項６９に記載の支持体。
【請求項７１】
前記中間層は、乳酸（ラクチド）、グリコリドおよびε−カプロラクタムからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーのホモポリマーまたはそれらの２つ以上を含むコポリマーを含む、請求項６９に記載の支持体。
【請求項７２】
前記中間層を構成する材料は、前記第二層および前記第一層の両方の融点よりも低い融点を有する、請求項６９に記載の支持体。
【請求項７３】
前記第一層は、複数の編物層を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項７４】
前記第二層は、複数の織物層を含む、請求項５１に記載の支持体。
【請求項７５】
前記第一層に、生体分子が配置される、請求項５１に記載の支持体。
【請求項７６】
前記生体分子は、細胞外マトリクスである、請求項７５に記載の支持体。
【請求項７７】
前記生体分子は、コラーゲンおよびラミニンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、請求項７５に記載の支持体。
【請求項７８】
前記生体分子は、マイクロスポンジに含ませて第一層に配置される、請求項７５に記載の支持体。
【請求項７９】
前記生体分子は、前記支持体と架橋処理されている、請求項７５に記載の支持体。
【請求項８０】
請求項５１に記載の支持体を含む、医薬。
【請求項８１】
細胞をさらに含む、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８２】
体内への移植用途に使用される、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８３】
前記体内における移植されるべき部位は、心臓弁、血管、心膜、心臓隔壁、心内導管、心外導管、硬膜、皮膚、骨、軟部組織および気管からなる群より選択される、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８４】
前記生体分子は、前記移植を目的とする生体に由来する、請求項８０に記載の医薬。
【請求項８５】
Ａ）粗面を有する第一層；および
Ｂ）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体を製造する方法であって、
該第一層と該第二層とを接着する工程、
を包含する、方法。
【請求項８６】
前記接着は、Ｃ）該第一層と該第二層とを封着する中間層により達成され、前記接着は、
ａ）該第一層と該第二層との間に該中間層を提供する工程；
ｂ）該第一層と該第二層とが融解せず、該中間層が融解する条件に該第一層、該第二層および該中間層を配置する工程；および
ｃ）該第一層、該第二層および該中間層を所望の形状に保持しながら該中間層が固化する条件に配置する工程、
を包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記融解する条件は、温度による違いを利用し、前記第一層および前記第二層の両方の融点より前記中間層の融点が低い、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記第二層は、ポリＬ乳酸の織物であり、前記第一層は、ポリグリコール酸の編物であり、前記中間層は、乳酸（ラクチド）、グリコリドおよびε−カプロラクタムからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーのホモポリマーまたはそれらの２つ以上を含むコポリマーを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記温度は、前記中間層の融点よりも高く、前記第一層および前記第二層のそれぞれの融点よりも低い、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記支持体は、さらに生体分子を含み、前記生体分子を前記第一層に付着させる工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記付着は、架橋処理を包含する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記生体分子はコラーゲンであり、前記付着は、コラーゲン架橋処理を包含する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記中間層は、ガラス上にキャストした後風乾してフィルムを作成することによって製造される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記ｂ）工程は、少なくとも約０．１ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることを包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｂ）工程は、少なくとも約０．５ｇ／ｃｍ２の重りで上から圧力をかけることを包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
体内における損傷部位を処置する方法であって、
Ａ）該損傷部位の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項９７】
体内における臓器または組織を強化する方法であって、
Ａ）該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
臓器または組織を生産または再生する方法であって、
Ａ）目的とする臓器または組織を含む生体において、該臓器または組織の一部または全部に、
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体を移植する工程；ならびに
Ｂ）該臓器または組織を該生体内で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項９９】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための使用。
【請求項１００】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための使用。
【請求項１０１】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体の、体内における損傷部位を処置するための医薬を製造するための使用。
【請求項１０２】
Ａ−１）粗面を有する第一層；および
Ａ−２）生体内衝撃に耐え得る強度を有する第二層、
を含み、該第一層と該第二層とが少なくとも１点で接着され、該第一層が編物であり、該第二層が織物である、生体適合性組織支持体の、体内における臓器または組織を強化するための医薬を製造するための使用。
【国際調査報告】
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