(57)【要約】カスパーゼ３活性の計画的な操作により、治療目的のために幹細胞の運命を方向付ける方法を提供する。幹細胞の分化を誘導するのに使用することができるカスパーゼ３活性化剤及び／またはエフェクター、及び幹細胞の分化を抑制しそれによって幹細胞の増殖を促進あるいは維持することができるカスパーゼ３抑制剤も含めて、幹細胞の分化を調節するためのカスパーゼ３活性調節剤の使用を開示する。カスパーゼ３調節剤のスクリーニング方法及びこのような化合物を幹細胞の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ  ｖｉｖｏで調節するために使用することも、該化合物の治療的適用として提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを備えることを特徴とする幹細胞分化調節化合物のスクリーニング方法：
（ａ）カスパーゼ３タンパクあるいはカスパーゼ３タンパクを発現する細胞を候補化合物と接触させた後、カスパーゼ３タンパク活性を測定し、その測定した活性を候補化合物に接触させなかった場合のカスパーゼ３タンパク活性と比較し、活性の差異があった場合の候補化合物をカスパーゼ３活性調節剤とすることにより、カスパーゼ３活性調節剤を同定する；
（ｂ）幹細胞群を前記カスパーゼ３活性調節剤と接触させて、処理幹細胞群を得る；
（ｃ）前記幹細胞群において少なくとも一つの分化マーカーのレベルを測定する；及び
（ｄ）処理幹細胞群における前記マーカーレベルを調節剤と接触させなかったコントロール幹細胞群と比較して、マーカーレベルの差異があった場合の調節剤を幹細胞分化調節能を有する化合物であるとする。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、ステップ（Ｃ）の前に、さらに前記処理幹細胞群を分化培地中で培養することを特徴とする、幹細胞分化調節化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
幹細胞分化調節化合物のスクリーニングのための、カスパーゼ３タンパクあるはカスパーゼ３タンパクをエンコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項４】
幹細胞分化調節のための、カスパーゼ３シグナル伝達経路の１つ以上の構成要素を抑制または活性化することによりカスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項５】
請求項４記載の使用において、前記１つ以上の構成要素が、プロカスパーゼ３、活性型カスパーゼ３、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＳＴ１）、ＭＥＫＫ１、ＡＳＫ１、ＳＬＫ、ＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ｐ３８α、ｐ３８γ、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ２、ｃ−ＩＡＰ１、スルビビン、カスパーゼ１、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、グランザイムＢ、Ｉ−ＦＬＩＣＥ、及びＣｒｍＡからなる群から選ばれることを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項６】
請求項４又は５記載の使用において、前記１つ以上の化合物がカスパーゼ３活性を増強し、幹細胞分化を誘導することを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項７】
請求項４又は５記載の使用において、前記１つ以上の化合物がカスパーゼ３活性を低減し、幹細胞分化を抑制することを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項８】
請求項４、５、６又は７の何れかに記載の使用において、前記幹細胞が、筋幹細胞、心臓幹細胞、神経幹細胞、外皮幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項９】
請求項４、５、６、７又は８の何れかに記載の使用において、前記幹細胞がｉｎ  ｖｉｖｏであることを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項１０】
請求項４、５、６、７又は８の何れかに記載の使用において、前記幹細胞がｅｘ  ｖｉｖｏであることを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項１１】
請求項４、５、６、７又は８の何れかに記載の使用において、前記幹細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏであることを特徴とする、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用。
【請求項１２】
幹細胞あるいは幹細胞群を１つ以上のカスパーゼ３活性調節剤に接触させることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記１つ以上のカスパーゼ３活性調節剤が、カスパーゼ３シグナル伝達経路の１つ以上の構成要素を活性化または抑制することを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１４】
請求項１３又は１４記載の方法において、前記１つ以上の構成要素が、プロカスパーゼ３、活性型カスパーゼ３、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＳＴ１）、ＭＥＫＫ１、ＡＳＫ１、ＳＬＫ、ＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ｐ３８α、ｐ３８γ、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ２、ｃ−ＩＡＰ１、スルビビン、カスパーゼ１、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、グランザイムＢ、Ｉ−ＦＬＩＣＥ、及びＣｒｍＡからなる群から選ばれることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１５】
請求項１２、１３又は１４の何れかに記載の方法において、前記１つ以上の調節剤がカスパーゼ３活性を増強し、幹細胞分化を誘導することを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１６】
請求項１２、１３又は１４の何れかに記載の方法において、前記１つ以上の調節剤がカスパーゼ３活性を低減し、幹細胞分化を抑制することを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１７】
請求項１２、１３、１４、１５又は１６の何れかに記載の方法において、前記幹細胞あるいは幹細胞群が筋幹細胞、心臓幹細胞、神経幹細胞、外皮幹細胞及び骨髄幹細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１８】
請求項１２、１３、１４、１５，１６又は１７の何れかに記載の方法において、前記幹細胞あるいは幹細胞群がｉｎ  ｖｉｖｏであることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項１９】
請求項１２、１３、１４、１５，１６又は１７の何れかに記載の方法において、前記幹細胞あるいは幹細胞群がｅｘ  ｖｉｖｏであることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項２０】
請求項１２、１３、１４、１５，１６又は１７の何れかに記載の方法において、前記幹細胞あるいは幹細胞群がｉｎ  ｖｉｔｒｏであることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項２１】
請求項１２、１３又は１４の何れかに記載の方法において、前記幹細胞あるいは幹細胞群を、カスパーゼ３活性を低減し幹細胞分化を抑制する調節剤、及びカスパーゼ３活性を増強し幹細胞分化を誘導する調節剤に順次接触させることを特徴とする、幹細胞分化調節方法。
【請求項２２】
請求項１記載のスクリーニング方法によって化合物を同定し、該化合物を薬学的に許容可能な剤型に製剤化することを特徴とする、幹細胞分化調節用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞治療分野、特に、カスパーゼ３タンパクの活性化または抑制によって幹細胞の分化を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、様々な特定のタイプの細胞を作り出し、究極的には最終的な分化細胞を作り出す能力を持つ未分化の、あるいは未成熟の細胞である。幹細胞は、他の細胞と異なり、基本的に必要な時に成熟細胞を無限に供給するように自己更新することができる。この自己更新能があることにより、幹細胞は組織の再生及び修復において治療的に有用である。
【０００３】
脊椎動物において、組織系や器官系の発達には、前もって決められた幹細胞の系統の拡張、次いで最終的な分化が介在している。幹細胞の治療的有用性（すなわち、障害を受けたあるいは欠陥のある組織の再生能）は、目標とする細胞を十分な数だけ得ること、そして、分化した成熟組織の特定細胞への移行が操作可能であることにかかっている。そのため、最近の研究では、これら細胞数を増やすためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞を培養する方法の探索が中心となっている。ここ数年で、幹細胞の分化の理解、サイトカインの発見、細胞のサブタイプの分離及び同定、ならびに様々なバイオリアクターコンセプトの発達（例えば、ｔｈｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｙ  Ｎｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４：１１１−２８参照）において進歩があり、また組換えの成長因子や細胞選択技術が利用できるようになったことにより、幹細胞あるいは前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏやｅｘ  ｖｉｖｏで拡張させようと試みる研究が可能になってきている。しかしながら、幹細胞の拡張及び分化を制御するには、細胞培養において最も挑戦的な分野の一つが残っている。
【０００４】
幹細胞の増殖を刺激する方法は知られているが、これらの方法は、主として特定のタイプの幹細胞、例えば、造血幹細胞（米国特許第５，９８１，７０８号及び第５，７２８，５８１号参照）や、神経幹細胞（米国特許第５，７５０，３７６号参照）に限定されている。さらに、分化への移行についてはよくわかっていないが、成長促進遺伝子産生物の抑制及び組織特異的な転写因子の上方調節を伴う協調反応に依存することが知られている。
【０００５】
骨格筋形成は、細胞分化を統制する制御調節の基礎的な指令を探索する理想的なモデル系として役立ってきた。最近では、選択ばれた情報伝達経路が筋肉分化の開始に刺激を与え、プロマイトジェン的役割はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路にあるとする証拠が示されてきている。例えば、ｐ３８αはＭＡＰＫｓのｐ３８サブファミリーの一員であるが、その活性化は分化の誘発と同時に起こり、ｐ３８αの薬理的抑制剤を使用するとこのプロセスを効果的にブロックできる（Ｃｕｅｎｄａ，  Ａ．，  ＆  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．，  （１９９９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ４３４１−４３４６；  Ｗｕ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０，  ３９５１−３９６４；  Ｚｅｔｓｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ５１９３−５２００；  Ｏｒｎａｔｓｋｙ，  Ｏ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７，  ２６４６−２６５４）。また、ｐ３８γが筋形成を促進する機構は未だ解明されていないが、プロマイトジェン的効果はこのキナーゼにもある（Ｇｒａｖｅｓ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １７，  ２２２４−２２３４）。
【０００６】
ｐ３８ＭＡＰＫファミリーはアポトーシスの開始及び進行にも関与している（Ｊｕｏ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７，  ２４−３５；  Ｈａｌｌ，  Ａ．，  ＆  Ｎｏｂｅｓ，  Ｃ．  Ｄ．  （２０００）  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３５５，  ９６５−９７０）。アポトーシスと分化が同じシグナルカスケードを利用して筋肉細胞におけるＭＡＰＫ活性を保証しているこという数多くの結果が示されている。例えば、アクチン線維の分解／再構成は、アポトーシス（Ｓａｂｏｕｒｉｎ，  Ｌ．  Ａ．，  ＆  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，  Ｍ．  Ａ．  （２０００）  Ｃｌｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．    ５７，  １６−２５；  Ｇａｌｌｏ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １０，  ３１３７−３１５０）と分化筋芽細胞（Ｑｕ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７，  ５１４−５２７；  Ｍｉｌｌｓ，  Ｊ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４０，  ６２７−６３６）の両方の特徴を保持したものである。そして、保存筋肉収縮性タンパクであるミオシン軽鎖キナーゼが、アポトーシスの特徴である膜ブレビングのために必要とされる（Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｗ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ９，  １４４１−１４４７）。さらに、マトリックスメタロプロテアーゼ活性の増加が、筋芽細胞の分化とアポトーシスとの両方における膜融合を調整するために不可欠な要件のようである（Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，  ６５２−６５６；  Ｕｔｚ，  Ｐ．  Ｊ．，  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ７，  ５８９−６０２）。
【０００７】
アポトーシスのプログラムが成功して完了するかどうかは、カスパーゼと呼ばれるユニークなクラスのタンパク分解酵素の活性に依存している（Ｕｔｚ，  Ｐ．  Ｊ．，  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．    ７，  ５８９−６０２）。カスパーゼタンパクは主としてタンパクをターゲットとし、セリンを切断することによりタンパクを不活性化するが、様々なカスパーゼタンパクがＭＥＫＫ１（Ｃａｒｄｏｎｅ，  Ｍ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  ９０，  ３１５−３２３）及びＳＬＫ（Ｈａｌｌ，  Ａ．，  ＆  Ｎｏｂｅｓ，  Ｃ．  Ｄ．  （２０００）  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３５５，  ９６５−９７０）を含むシグナル伝達分子の切断活性化によりアポトーシスも保証する。さらに、カスパーゼ３活性は、介在するキナーゼの活性化であるにもかかわらずＭＡＰＫｓＪＮＫ及びｐ３８の活性化にも関連している（Ｕｔｚ，  Ｐ．  Ｊ．，  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．    ７，  ５８９−６０２；  Ｃａｒｄｏｎｅ，  Ｍ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  ９０，  ３１５−３２３；  Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，  Ｐ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  １９２１１−１９２１９）。
最近の報告では、骨格筋形成プログラムの早期開始が、重要なアポトーシス性セリンプロテアーゼであるカスパーゼ３の活性に依存することも示唆された（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＰＮＡＳ  ９９：１１０２５−３０）。この報告は、組換えの活性型カスパーゼ３をトランスフェクトした一次筋芽細胞が分化を受けること、そして、カスパーゼ３で活性化されるキナーゼであるＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＭＳＴ１）がカスパーゼ３−／−筋芽細胞における筋形成を助けることができるということを示唆した。
【０００８】
幹細胞の増殖を刺激する方法は知られており、また、幹細胞の分化誘導の理解も進歩してきてはいるが、これらは特定の、通常予め決められたタイプの幹細胞に限定される。従って、より広く適用できる幹細胞分化調節方法が依然として求められている。
【発明の要約】
【０００９】
本発明の目的は、カスパーゼ３活性調節剤を用いて幹細胞の分化を調節する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の一つの態様に従って、次のステップを含む幹細胞分化調節化合物のスクリーニング方法が提供される：
（ａ）カスパーゼ３タンパクを候補化合物と接触させた後、カスパーゼ３タンパク活性を測定し、その測定した活性を候補化合物なしの場合のカスパーゼ３タンパク活性と比較し、活性の差異があった場合の候補化合物をカスパーゼ３活性調節剤とすることにより、カスパーゼ３活性調節化合物を同定する；
（ｂ）幹細胞群を前記カスパーゼ３活性調節剤と接触させて、処理幹細胞群を得る；
（ｃ）前記幹細胞群において少なくとも一つの分化マーカーのレベルを測定する；及び
（ｄ）処理幹細胞群における前記マーカーレベルを調節剤と接触させなかったコントロール幹細胞群と比較して、マーカーレベルの差異があった場合の調節剤を幹細胞分化調節能を有する化合物であるとする。
【００１１】
本発明の別の態様に従って、幹細胞分化調節化合物のスクリーニングのための、カスパーゼ３タンパクあるいはカスパーゼ３タンパクをエンコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様に従って、幹細胞分化調節のために、カスパーゼ３活性を調節する１つ以上の化合物の使用が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様に従って、幹細胞あるいは幹細胞群を１つ以上のカスパーゼ３活性調節剤に接触させることを含む幹細胞分化調節方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様に従って、前記方法において、幹細胞あるいは幹細胞群を、カスパーゼ３活性を低減し幹細胞の分化を抑制する調節剤、及びカスパーゼ３活性を増強し幹細胞の分化を誘導する調節剤に順次接触させる方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様に従って、本発明のスクリーニング方法により化合物を同定し、該化合物を薬学的に許容可能な剤型に製剤化することを含む、幹細胞の分化調節用医薬組成物の製造方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明は、幹細胞の分化の調節におけるカスパーゼ３介在シグナルカスケードの予期せぬ役割の解明に基づく。よって、本発明はカスパーゼ３活性の意図的な操作により、治療目的のために幹細胞の運命を管理する手段を提供する。
【００１７】
従って、本発明は、幹細胞の分化を調節するために、カスパーゼ３活性調節剤を使用することを提供するものであり、前記調節剤は、カスパーゼ３シグナル伝達経路の１つ以上の構成要素を抑制あるいは活性化することによりその効果を発揮する。本発明の調節剤はカスパーゼ３活性化剤及び／またはエフェクターであることができ、これは幹細胞の分化を誘導するのに用いることができる。あるいは、本発明の調節剤はカスパーゼ３抑制剤であることができ、これは幹細胞の分化を抑制し、それによって幹細胞の増殖を促進または維持するのに用いることができる。
【００１８】
このように、本発明の一つの実施形態において、カスパーゼ３のシグナル伝達経路の誘導により、幹細胞の分化を誘導する方法、ならびに幹細胞の分化を誘導において使用するためのカスパーゼ３活性化剤及びエフェクターを提供する。
【００１９】
本発明の別の実施形態においては、幹細胞の分化を抑制する方法、ならびにこれによって増殖を促進する方法、そして、幹細胞の増殖促進に用いるためのカスパーゼ３タンパク抑制剤を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、幹細胞の運命の段階的な操作、例えば、幹細胞の増殖を促進するために幹細胞群を最初に一つ以上のカスパーゼ３抑制剤に接触させ、次いで増殖した幹細胞群の分化を誘導するために一つ以上のカスパーゼ３活性化剤／エフェクターに連続的に連続的に接触させることにより段階的に操作することも意図している。
【００２１】
ここで記載された方法ならびにカスパーゼ３調節剤（活性化剤、エフェクター及び抑制剤）は、例えば、代替組織の提供を目的としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞の分化を刺激するために、あるいは損傷を受けた組織の置換又は修復を目的としてｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞の分化を刺激するために、あるいは損傷を受けた組織の置換又は修復を患者のそれが本来あった場所で助けることを目的としてｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞の増殖を促進するために、あるいはｅｘ  ｖｉｖｏでの幹細胞の増殖を促進し、これにより移植に適した細胞群を提供するために、使用することができる。本発明の治療への適用は、幹細胞の分化の促進及び／または損傷を受けたもしくは欠陥のある組織を置換する必要がある疾病や疾患、例えば筋ジストロフィー、心血管疾患、卒中、心不全、心筋梗塞、神経変性疾患などに関係し、また、損傷を受けたあるいは機能不全の組織を置換する必要がある疾病や疾患、例えば肝硬変や肝炎を含む変性肝疾患、糖尿病、パーキンソン病やアルツハイマー病のような神経変性疾患、ならびに変性または虚血性心疾患にも関係する。
【００２２】
定義
特記しない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関係する分野の当業者が通常理解しているのとと同じ意味である。
本発明の開示を通じて用いているように、以下の用語は、特に指示のない限り、次のような意味を有するものと理解されるべきである。
【００２３】
「カスパーゼ３」という用語は、ここで用いられているように、哺乳動物のカスパーゼ３タンパク及びその生物学的に活性なフラグメントを指す。カスパーゼ３は、他のポリペプチド及び／またはタンパクを切断することができるセリンプロテアーゼであり、ＣＰＰ３２、Ｙａｍａ、ならびにアポペイン（ａｐｏｐａｉｎ）としても知られている。カスパーゼ３はＤＥＶＤモチーフの切断に最も効果的に作用するが、効果は低いものの他の部位（ＤＸＸＤモチーフを有するものを含む）も切断することができる。
当該分野において知られているように、カスパーゼ３はＮ末端ペプチド（ＰＲＯ−ドメイン）と二つのサブユニットを含む酵素前駆体として合成される（Ｃｏｈｅｎ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  （１９９７）  ３２６：１−１６参照）。ＰＲＯ−ドメインは酵素前駆体から切断され、活性型カスパーゼ３を生じる。従って、そのタンパクの前駆体及び種々の活性体の両方が「カスパーゼ３」との用語に包含される。
ヒトの酵素においては、ＰＲＯ−ドメインに要求される切断部位はＡｓｐ−９またはＡｓｐ−２８またはこれらの両方のいずれかである。活性化カスパーゼ３の二つのサブユニットの形成は、アミノ酸残基Ａｓｐ−１７５における追加的切断によって起こるように要求される。サブユニットの１つまたは両方においてさらに進行することがある。このように、カスパーゼ３の活性型は、一つのポリペプチド、または２つもしくはそれ以上のサブユニットポリペプチド、またはこれらの混合物を含んでよい。例えば、多くのカスパーゼは各サブユニットを二つずつ含むヘテロ四量体として活性である。
【００２４】
「カスパーゼシグナル伝達経路」との用語は、ここで用いられているように、カスパーゼ３タンパクによって介在され、最終的に細胞分化に影響を及ぼす細胞シグナル伝達経路を指す。
【００２５】
「幹細胞」という用語は、ここで使用されているように、幹細胞、予め定められた幹細胞、及び前駆細胞を包含する。従って、本用語は全能性、多能性、及び単能性の細胞に適用する。全能性幹細胞は、一般に、分化及び増殖によって完全に分化した機能的な後代系列を生み出す能力を有する。全能性幹細胞は、ある成人の組織から分離されたものもあるが、一般には起源は胚である。
単能性及び多能性細胞は、一般に、１つまたは数個の異なる最終の分化した細胞のタイプに分化する能力を有する幹細胞系における細胞である。単能性及び多能性幹細胞は、これらに限定されるものではないが、血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺などを含む様々な組織系や臓器系を起源とすることができる。本発明において、「幹細胞」という用語は、最も分化したあるいは完全に成熟した細胞以前の、分化系列及び増殖系列におけるすべての細胞を包含する。例えば、成熟した個体における皮膚前駆細胞は、ただ一つのタイプの細胞に分化することができるが、それ自体は完全に成熟や分化はしていない細胞であり、これも幹細胞の定義に含まれる。
【００２６】
「分化」という用語は、本発明で用いているように、特定機能の個別細胞になる発達プロセスを指す。例えば、このプロセスでは、細胞が最初の細胞のタイプとは異なる１つ以上の形態的特徴及び／または機能を獲得する。分化は、例えば、当業者に知られている免疫組織化学的手法やその他の手法を用いて、系列マーカーがあるか否かをモニターすることによって判定される。本発明の方法によって幹細胞から誘導された分化済みの後代細胞は、その幹細胞の源である組織と同じ胚葉や組織に必ずしも関連しているわけではない。例えば、神経前駆細胞及び筋前駆細胞は造血細胞系列へ分化することが可能である。
【００２７】
「増殖」及び「拡張」という用語は、ここでは細胞に関して互換性を持って用いられ、分裂によって同じタイプの細胞の数が増加することを意味する。本発明において、ある化合物が、その化合物で処理されていない幹細胞と比較して幹細胞群の増殖速度を増大するならば、その化合物は「増殖を促進する」とみなされる。また、その化合物、その化合物で処理されていない幹細胞と比較して幹細胞群の増殖速度を維持している場合には、分化を受ける。
【００２８】
ここで用いているように、カスパーゼ３の「活性化剤」とは、カスパーゼ３が活性となるように作用するか、あるいはカスパーゼ３活性を向上することにより、カスパーゼ３活性を促進する化合物または分子であり、これには、カスパーゼ３タンパクそのもの（前駆体、活性化体の両方）も、その生物学的活性フラグメントも含まれる。
本発明で用いているように、カスパーゼ３の「エフェクター」とは、その経路においてカスパーゼ３の下流で働いてカスパーゼ３活性の効果を増強する化合物又は分子を指す。すなわち、それはカスパーゼ３活性化により生じる分子的及び細胞的事象のカスケードの一部であるか、あるいはこのようなカスケードの一部を活性化するものである。このように、「活性化剤」及び「エフェクター」という用語は、カスパーゼ３シグナル伝達経路がもともと活性になっていない細胞内で該経路を刺激する能力を有する化合物及び分子にも、「エンハンサー」として働いて該経路の元々の活性を向上する化合物及び分子にも及ぶ。
【００２９】
カスパーゼ３の「抑制剤」という用語は、ここで用いているように、カスパーゼ３の活性を直接的あるいは間接的に弱める化合物または分子を指す。よって、この用語は、カスパーゼ３そのものに働く化合物／分子も、シグナル伝達経路においてカスパーゼ３の上流で働いてカスパーゼ３が活性化することを妨げる化合物／分子も含む。このように、「抑制剤」という用語は、カスパーゼ３シグナル伝達経路がもともと活性化している細胞内で該経路を抑制することができる化合物及び分子にも、該経路の活性化を妨げる化合物又は分子にも及ぶ。
【００３０】
ここで用いているように、「他の細胞」または「二次細胞」または「エデュケーター細胞」という用語は互換性があり、使用中の幹細胞と非同一の細胞を指す。通常、他の細胞は、幹細胞とは別のタイプ、あるいは一部もしくは全体が分化した非幹細胞であり、使用中の幹細胞と同じ胚葉あるいは異なる胚葉を起源としてよい。通常、他の細胞は目標とする分化した幹細胞に発達上関連し、使用中の幹細胞の発達経路に影響（エデュケート）する。そのような他の細胞として、例えば筋芽細胞、肝細胞、膵島細胞、セルトリ細胞などがあり、また、例えば一次細胞株あるいは樹立細胞株などであってもよい。当業者は、共培養に幹細胞を暴露するなどの当該分野において既知の方法を用いて、本発明の方法のエデュケーター細胞として働くよう、様々な組織源からの細胞及び様々な分化段階の細胞の適正を評価することができる（例えば、Ｓｅａｌｅ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｃｅｌｌ．  １０２，  ７７７−７８６；  Ｍｉｎａｓｉ，  Ｍ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  １２９，  ２７７３−２７８３；  Ｈｉｅｒｌｉｈｙ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５３０，  ２３９−２４３）。他の細胞への幹細胞の暴露は、直接的暴露でもよく、例えば、幹細胞と他の細胞との接触によることができる。あるいは間接的暴露でもよく、例えば、調整培地、溶解物、または他の細胞由来の溶解物因子によることができる。
【００３１】
核酸配列に関連してここで用いられる「相当する」という用語は、参照ポリヌクレオチドの配列の全部あるいは一部が同一であるポリヌクレオチド配列を意味する。一方、「相補的」という用語は、ここにおいてはポリヌクレオチドの配列が参照ポリヌクレオチド配列の相補体の全部または一部と同一であることを意味する。具体例を挙げると、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００３２】
以下に挙げる用語は、ここにおいては２種以上のポリヌクレオチド間の配列関係、あるいは２種以上のポリペプチド間の配列関係を示すために使用される：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、及び「実質的同一性」。
「参照配列」は、配列比較のための基準として用いた確定した配列である；参照配列は、例えば全長のｃＤＮＡ、遺伝子、あるいはタンパク配列のセグメントのようにより大きな配列のサブセットであってよく、また、完全なｃＤＮＡ、遺伝子、あるいはタンパク配列を含んでもよい。一般に、参照ポリヌクレオチド配列は少なくとも２０ヌクレオチド長さであり、少なくとも５０ヌクレオチド長さであることが多い。参照ポリペプチド配列は、一般には少なくとも７アミノ酸長さであり、少なくとも１７アミノ酸長さであることが多い。
【００３３】
「比較ウィンドウ」とは、ここで用いられいるように、少なくとも１５個の隣接ヌクレオチド配置あるいは少なくとも５個の隣接アミノ酸配置から成る参照配列の概念的セグメントを指し、これらによって候補配列が参照配列と比較される。この２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（これは追加あるいは削除を含まない）に比べて、比較ウィンドウ中の候補配列の部分が２０％以下の追加もしくは削除（すなわちギャップ）を含んでもよい。
本発明は、参照配列あるいは候補配列のいずれかの全長以下の比較ウィンドウの様々な長さを想定している。比較ウィンドウを並べるための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同アルゴリズム（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  （１９８１）    ２：４８２）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同アラインメントアルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９７０）  ４８：４４３）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎらの類似法調査（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  （１９８８）  ８５：２４４４）を用いて行ってよい。また、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）や、ＡＬＩＧＮあるいはＭａｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のような市販コンピュターソフトウエアの使用により、あるいは視察により、行ってもよい。最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウで同一性パーセンテージが最も高い結果を示したもの）が選択される。
【００３４】
「配列同一性」という用語は、比較ウィンドウにより、２つのポリヌクレオチド配列あるいはポリペプチド配列が同一（すなわち、ヌクレオチド−ヌクレオチドあるいはアミノ酸−アミノ酸基準で）であることを意味する。
「配列同一性パーセント（％）」という用語は、ここでは参照配列に関して用いられ、候補配列中のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、それは、配列及び導入したギャップの最適アラインメント後の比較ウィンドウで参照ポリペプチド配列中の残基と同一であり、必要に応じて、何れの保守的置換も配列同一性部分と見なさずに、最大の配列同一性パーセントを達成する。
【００３５】
「実質的同一性」という用語は、ここで用いているように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の特徴を示し、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、比較ウィンドウで参照配列と比較したときに、少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。比較ウィンドウで参照配列と比較したときに、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、及び少なくとも９０％の配列同一性であるポリヌクレオチド及びポリペプチドも参照配列と実質的同一性を有するとみなす。
【００３６】
ここで用いる「自然発生」とは、ある物に対して適用され、物が自然界において見出すことができるという事実を指す。例えば、自然発生ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、生物（ウィルスを含む）中に存在するものであり、生物から分離することができ、実験室において人間により意図的に修飾されたことがないものである。
【００３７】
ここにおいて、「約」という用語は、公称値の＋／−１０％の変動を指す。特に言及があるないにかかわらず、このような変動は本発明で提供される何れの値にも常に含まれることが理解されるべきである。
【００３８】
ここで用いる「対象」または「患者」という用語は、本発明において用いるように、治療が必要とされる動物を指す。
【００３９】
「動物」という用語は、ここで用いているように、ヒト及びヒトではない動物の両方を指し、哺乳類、鳥、魚を含むがこれらに限定されるものではない。
【００４０】
ここで本発明で用いた他の化学的用語は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  （ｅｄ．  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．，  １９８５），  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏに例示されるような、当該分野での通常の使用に従って用いられている。
【００４１】
幹細胞の分化調節
本発明は、分化を調節することによって、幹細胞の運命を方向付ける方法を提供する。これは、カスパーゼ３活性を調節する化合物を用いて、カスパーゼ３シグナル伝達経路内でカスパーゼ３活性を計画的に操作することにより達成される。従って、本発明に係る方法は、幹細胞または幹細胞群を一つ以上のカスパーゼ３活性調節剤と接触させることを含む。本発明中、「調節剤」は活性化剤、エフェクターあるいは抑制剤であることができる。
【００４２】
従って、本発明の一つの実施形態のように、カスパーゼ３活性の誘導あるいは増強により幹細胞の分化を誘導するための、カスパーゼ３活性化剤及びエフェクターの使用が提供される。また、本発明の別の実施形態のように、カスパーゼ３活性を弱めることにより幹細胞の分化を抑制するための、カスパーゼ３抑制剤の使用が提供される。
【００４３】
本発明中、カスパーゼ３調節剤は、カスパーゼ３タンパクそのもの（あるいはカスパーゼ３の前駆体）に作用する直接的なカスパーゼ３活性調節剤でも、シグナル伝達経路中カスパーゼ３の上流もしくは下流で作用する１つ以上のタンパクの活性を調節する間接的なカスパーゼ３活性調節剤であってもよい。
【００４４】
１．カスパーゼ３活性化剤及びエフェクター
本発明中、活性化剤とは、カスパーゼ３が活性になるようにするか、またはカスパーゼ３活性を向上させるかの何れかにより、カスパーゼ３活性を促進する化合物である。エフェクターとは、カスパーゼ３シグナル伝達経路においてカスパーゼ３の下流に作用してカスパーゼ３活性の効果を高める化合物である。すなわち、エフェクターは、カスパーゼ３の活性化により生じる分子的事象及び細胞的事象のカスケードの一部であるか、あるいはこのカスケードの一部を活性化するものであり、幹細胞の分化に影響を与えるものである。
このような活性化剤及びエフェクターの例としては、カスパーゼ３タンパク（前駆体及び活性体の両方を含む）、カスパーゼ３タンパクの生物学的に活性なラグメント、シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって活性化されるタンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメント、シグナル伝達経路においてカスパーゼ３を活性化するタンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメント、前記タンパクやフラグメントをエンコードしているポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びカスパーゼ３を活性化するか、あるいはカスパーゼ３活性を向上させるか、あるいはカスパーゼ３の発現を促進する他の化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
１．１  タンパク及びポリペプチド
本発明の活性化剤及びエフェクターとして用いられるタンパク及びポリペプチドには、カスパーゼ３タンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメント、シグナル伝達経路においてカスパーゼ３により活性化されるタンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメント、及びシグナル伝達経路においてカスパーゼ３を活性化するタンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメントが含まれる。シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって活性化されるタンパクには、ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｔｗｅｎｔｙ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＳＴ１）、ＭＥＫＫ１、ＡＳＫ１、ＳＬＫのようなカスパーゼ３のタンパク分解活性により直接活性化されるタンパク、及びＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ｐ３８α、ｐ３８γのようにカスパーゼ３によって直接活性化されたタンパクのキナーゼ活性の結果として間接的に活性化されるタンパクが挙げられる。
【００４６】
当該分野において知られているように、タンパクのカスパーゼ活性化は、通常切断ステップを含み、その結果そのタンパクの活性体となる。例えば、ＭＳＴ１のカスパーゼ３活性化は、アミノ酸残基３２３−３２７間にあるモチーフでの切断により起こることが要求される（Ｊｕｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９７）  １７：２４−３５参照）。従って、本発明は、アミノ酸１−３２７を含むＭＳＴ１の活性体のような、前記タンパクの活性体を用いることも想定している。
【００４７】
生物学的に活性なフラグメントとは、野性型タンパクと実質的に同じ活性を有する自然発生の（あるいは野生型の）タンパクのフラグメントであり、前記タンパクの活性化体も、実質的に同じ活性を有するより小さなあるいはより大きなフラグメントも含む。タンパクの活性フラグメントの例として、アミノ酸１−３３０を含むＭＳＴ１のフラグメントが挙げられる（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９９）  ９：１２０３−１２０６、及び本発明の実施例１参照）。
【００４８】
候補フラグメントは、野性型タンパクから生じたランダムフラグメントから選択することができ、あるいは、特別にデザインすることもできる。フラグメントの活性を野性型タンパクの活性と比較試験し、野性型タンパクと実質的に同じ活性を有するフラグメントを選択する。ポリペプチドフラグメントを生成する方法は当該分野においてよく知られており、野性型タンパクあるいはその組換え体の酵素的、化学的、または機械的切断、このようなフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドの発現などの方法がある。
【００４９】
本発明に従って、タンパクやポリペプチドはその本来有する活性を保持するような方法で調製される。アミノ酸残基を除去あるいは追加してもよいことや、あるいは野性型タンパクのアミノ酸配列において野性型タンパクと実質的に同じ生物学的活性を有する変異タンパクまたはフラグメントを生成するようなアミノ酸残基に置換してもよいことは、当業者に理解されている。このような変異タンパクやフラグメントは、本発明の範囲内であると考えられる。
【００５０】
本発明中、変異タンパクまたはタンパクフラグメントは、それらが野性型タンパクの５０％の活性を示すとき、野性型タンパクと実質的に同等の活性を有するとみなす。ある実施例では、変異タンパクまたはフラグメントは野性型タンパクの６０％の活性を示す。別の実施例では、変異タンパクまたはフラグメントは、野生型タンパクの７５％の活性を示す。また別の実施例では、変異タンパクまたはフラグメントが野性型タンパクの９０％の活性を示す。
【００５１】
本発明のタンパク及びポリペプチドは、細胞抽出物からの精製、あるいは組換え技術の使用（Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４  ＆  ｕｐｄａｔｅｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）など、当該分野で公知の方法により調製することができる。
カスパーゼ３シグナル伝達経路に関わる多くのタンパクのアミノ酸系列は、当該分野において知られている。例えば、
カスパーゼ３  ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜８５７５６９，  ＮＰ＿０３３９４０  （ｍｏｕｓｅ）及びＡＡＡ７４９２９  （ｈｕｍａｎ）］（図７も参照）、
ＭＳＴ１［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１１１７７９１］（図９も参照）、
ＭＥＫＫ１［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜２８１５８８８］、
ＡＳＫ１［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１８０５５００］、
ＳＬＫ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＡＡＤ２８７１７  （ｍｏｕｓｅ）及びｇｉ｜７６６１９９４  （ｈｕｍａｎ，  ｐｕｔａｔｉｖｅ）、
ＭＫＫ６［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＰ＿０３６０７３  （ｍｏｕｓｅ）、ＮＰ＿１１４３６５及びＮＰ＿００２７４９  （ｈｕｍａｎ）］、
ＭＫＫ３［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＰ＿０３２９５４  （ｍｏｕｓｅ）及びＮＰ＿６５９７３２  （ｈｕｍａｎ）］、
ｐ３８α［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＰ＿０３６０８１  （ｍｏｕｓｅ）及びＮＰ＿００１３０６  （ｈｕｍａｎ）］、
ｐ３８γ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ＮＰ＿００２９６０  （ｈｕｍａｎ）及びＮＰ＿０３８８９９  （ｍｏｕｓｅ）］等が挙げられる。
【００５２】
これら配列の一つに由来するポリペプチド、またはそのフラグメントは、当該分野の既知の方法により化学合成することもできる。例えば、排他的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、あるいは古典的な溶液合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，８５：２１４９；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明のタンパク及びポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、サイジングカラムクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィーなど）、遠心分離、溶解度差のような標準的な手法を用いて、あるいは、当業者によく知られているその他の手法により、精製することができる。
【００５３】
１．２ポリヌクレオチド
本発明の一つの実施形態において、タンパク及びポリペプチドは組換え技術によって作られる。このような技術は当該分野においてよく知られており（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４  ＆  ｕｐｄａｔｅｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）、通常タンパクやポリペプチドをエンコードするＤＮＡの全部あるいは一部含む発現ベクターを用いた適当な宿主細胞のトランスフォーメーション（トランスフェクション、トランスダクション、インフェクションなども含む）を含む。
ヒト及びマウスから分離されたカスパーゼ３遺伝子のヌクレオチド配列は、当該分野において知られており（Ｔｅｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃｅｌｌ  ８１：８０１−８０９；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜８５７５６８及びＵ２６９４３  （ｈｕｍａｎ）及びＮＭ＿００９８１０  （ｍｏｕｓｅ）；図６も参照）、ＭＳＴ１のヌクレオチド配列も同様である（Ｃｒｅａｓｅｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｎｏｆｆ  （１９９５）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６０：２１６９５−  ２１７００；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１１１７７９０；図８参照）。
カスパーゼ３シグナル伝達経路に関連する他の多くのタンパクの遺伝子配列が知られており、例えば、
ＭＥＫＫ１［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜２８１５８８７，  ＮＭ＿０１１９４３  （ｍｏｕｓｅ），  ＮＭ＿０３１９８８及びＮＭ＿００２７５８  （ｈｕｍａｎ）］、
ＡＳＫ１［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１８０５４９９］、
ＳＬＫ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜４７４１８２２及びＡＦ１１２８５５  （ｍｏｕｓｅ）及びｇｉ｜７６６１９９４  （ｈｕｍａｎ，  ｐｕｔａｔｉｖｅ）］、
ＭＫＫ６［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１２０９６７０］、
ＭＫＫ３［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜６８５１７３，  ＮＭ＿００８９２８  （ｍｏｕｓｅ）及びＮＭ＿１４５１１０  （ｈｕｍａｎ）］、
ｐ３８α［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜５２９０３９，  ＮＭ＿０１１９５１  （ｍｏｕｓｅ）及びＮＭ＿００１３１５  （ｈｕｍａｎ）］、及び
ｐ３８γ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  ｇｉ｜１７７２６４５，  ＮＭ＿００２９６９  （ｈｕｍａｎ）及びＮＭ＿０１３８７１  （ｍｏｕｓｅ）］が挙げられる。なお、上記Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏは、単に代表的な例として挙げたものであり、何れもこれに限定することを意図するものではない。当業者により容易に認識されるように、前記に挙げた多くの遺伝子の転写変異体が生まれ、当該分野において知られている。例えば、ＭＭＫ６、ＭＫＫ３、ｐ３８α、ｐ３８γなどは全て転写変異体を持つことが知られている。これらの転写変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
本発明にかかるタンパクまたはポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、標準的な手法により適当な起源から容易に精製することができる。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡやゲノムＲＮＡであることができ、あるいは標準的な手法により分離されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡであることができる。ポリヌクレオチドを得るための適当な起源は、カスパーゼ３シグナル伝達カスケードにおいてカスパーゼ３及び他のタンパクを発現することが知られている細胞であり、例えば筋細胞、肝細胞、胸線細胞、心筋細胞、神経細胞などの細胞である。
さらに、カスパーゼ３及びＭＳＴ−１を含むカスパーゼ３シグナル伝達カスケード中のタンパクをエンコードするポリヌクレオチドは、市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）から入手可能なクローンバンククレクションより）。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドと用いるのに適当な発現ベクターとして、プラスミド、ファージミド、ウィルス粒子及びベクター、ファージなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。昆虫細胞の場合、バキュロウィルス発現ベクターが適している。発現ベクター全体もしくはその一部を宿主細胞ゲノムに統合することができる。ある条件下では、例えばｔｈｅ  ＬＡＣＳＷＩＴＣＨＴＭ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  ＬａＪｏｌｌａ，  ＣＡ）などのように、誘導可能な発現ベクターを採用することが好ましい。本発明の一つの実施形態においては、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１  Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いている。
【００５６】
分子生物学分野における技術者は、広汎で多様な発現系が組換えタンパクまたはポリペプチドを得るために用いることができるということを理解するであろう。使用される精密な宿主細胞は、本発明には重要ではない。タンパクやポリペプチドは原核性宿主中（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉあるいはＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）または真核性宿主中（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ；ＣＯＳ，  ＮＩＨ  ３Ｔ３，  ＣＨＯ，  ＢＨＫ，  ２９３，あるいはヘラ細胞のような哺乳動物細胞；または昆虫細胞など）で作ることができる。
さらにタンパク及びポリペプチドは、植物細胞を使用して作ることもできる。植物細胞として、ウィスル発現ベクター（カリフラワーモザイクウィルスやタバコモザイクウィルスなど）及びプラスミド発現ベクター（Ｔｉプラスミドなど）が適している。
トランスフォーメーションあるいはトランスフェクションの方法、及び発現ベクターの選択は、選択された宿主系に依存し、当業者により容易に決定することができる。トランスフォーメーション及びトランスフェクションの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  に記載されており、様々な発現ベクターを、例えばＣｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｕｐｐ．  １９８７）などにより提供されるものの中から選択すればよい。。
【００５７】
発現ビヒクルを取り込んだ宿主細胞は、選択された遺伝子の活性化や抑制、トランスフォーメーションの選択、あるいは選択された遺伝子の増幅に必要なように、適当な従来の栄養培地中で培養することができる。
【００５８】
野性型タンパクをエンコードするポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発のような標準的手法により変化させることができ、その結果、核酸がコード配列から削除されたり、及び／又はコード配列に追加されたり、及び／又はその中で置換され、しかも活性タンパクまたはポリペプチドが依然として発現されるということは、当業者に明らかである。野性型タンパクと実質的に同等の活性を有するタンパクまたはポリペプチドをエンコードする核酸変異体は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００５９】
さらに、本発明のタンパク及びポリペプチドは、融合タンパクとして作ることができる。このような融合タンパクの一つの使用としては、タンパクまたはポリペプチドの精製あるいは検出の改善のためである。例えば、タンパクまたはポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合し、得られた融合タンパクは、プロテインＡカラムを使用して容易に精製することができる。融合タンパクの他の例としては、ヒスジチンタグに融合したタンパク又はポリペプチド（Ｎｉ２＋レジンカラムで精製可能）、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼに融合したタンパク又はポリペプチド（グルタチオンカラムで精製可能）、あるいはビオチンに融合したタンパク又はポリペプチド（ストレプトアジビンラベル化磁気ビーズで精製可能）などが挙げられる。
【００６０】
特定の開始シグナルが、クローン化されたポリヌクレオチドの効率的翻訳に要求されるかもしれない。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンや隣接配列などが挙げられる。それ自身の開始コドン及び隣接配列を含む完全な野性型遺伝子またはｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入する場合、追加的な翻訳調節シグナルは必要でないかもしれない。他のケースにおいては、おそらくＡＴＧ開始コドンなどの外因性翻訳調節シグナルを与える必要がある。さらに、開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のフレームの読み取りと同調していなければならない。
これらの外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の様々な起源のものであることができる。発現効率は、適当な転写促進要素、転写終止因子を含むことによって促進されてよい（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３，  ５１６）。
【００６１】
さらに、当業者により容易に認識されるように、宿主細胞として、挿入された配列の発現を調節するもの、あるいは特定の所望の種類に遺伝子産物を修飾及び処理するものを選択してもよい。タンパク産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化など）及び処理（例えば、切断など）は、タンパクの活性に重要であるかもしれない。別の宿主細胞は、タンパク及び遺伝子産物を翻訳後処理及び修飾するのに、特徴的で特異的なメカニズムを有する。適当な細胞系列または宿主系は、発現される異質タンパクの正しい修飾及び処理を確実にするように、当業者が選択することができる。
【００６２】
本発明の一つの実施形態において、タンパク／ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、幹細胞に直接導入する。当業者は、この特別な適用のために、発現ベクターの選択がより重要であるということを認識するであろう。本目的に適したベクターは当該分野において知られており、通常はウィルスベースのベクターである。代表的な例はここに記載されている（遺伝子治療の欄及び実施例を参照）。
【００６３】
１．３その他の化合物
カスパーゼ３の活性化剤またはエフェクターとして作用する能力が隠されているかもしれない候補化合物は、任意にあるいは合理的に選択することができ、また、デザインすることもできる。
ここで用いているように、幹細胞の分子成分、あるいは共培養を用いた場合には他の細胞の分子成分との潜在的関連に伴う特異的相互作用を考慮せずに化合物を任意に選択した場合は、その候補化合物は任意に選択されたと言う。候補化合物の任意の抽出の例は、ケミカルライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリーまたは生物の成長ブロスの使用である。
ここで用いているように、標的部位の配列及び／又はコンフォメーションやその化合物の作用に関連したプロセスを考慮した非任意基準により化合物を選択する場合、その候補化合物は合理的に選択された、あるいはデザインされたと言う。候補化合物は、例えば、標的部位を作り上げるヌクレオチド又はペプチド配列を用いて、合理的に選択あるいは合理的にデザインすることができる。例えば、合理的に選択されたペプチドは、そのアミノ酸配列が機能的に共通な部位と同一であるか、あるいはその誘導体であるようなペプチドであることができる。
【００６４】
本発明に係る候補化合物は、例えば、ポリヌクレオチド、小さな分子（ポリペプチドを含む）、抗体（及び／またはそのフラグメント）、合成有機分子、自然発生の有機分子、ビタミン誘導体、炭水化物、及びそれらの成分あるいは誘導体などであることができる。
【００６５】
前記候補化合物は、分離されたもの、分離されていないもの、純粋なもの、部分的に精製されたもの、あるいは粗混合物の状態でもよい。例えば、細胞、細胞由来の溶解物又は抽出物、あるいは細胞由来の分子の形であってもよい。候補化合物が一つ以上の分子を含む組成物中にある場合、その組成物をそのまま及び／又は適当な方法により任意に分割したサンプルについて、本発明記載の方法または別の方法を用いて試験し、カスパーゼ３活性化剤あるいはエフェクターとして作用する組成物の特定の機能あるいは成分を同定してもよいと考えられる。さらに、試験組成物のサブ画分を再分割し、カスパーゼ３活性化剤あるいはエフェクターとして同定されたサブコンビネーションから不活性成分を除くことを最終的な目的として、本発明の方法を用いて繰り返し分析してもよい。化合物の分離及び／又は精製及び／又は同定の中間的ステップは、本発明の方法の使用前及び／又は使用中及び／又は使用後に必要とされ、あるいは適当に含まれてもよい。
【００６６】
候補化合物は、合成化合物あるいは天然化合物の膨大なライブラリーの形で得ることができる。現在多数の手法が糖類、ペプチド及び核酸をベースとする化合物の任意及び方向的な合成に用いられ、それらは当該分野において公知である。合成化合物ライブラリーは多くの会社から市販され、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，  Ｃｏｒｎｗａｌｌ，  ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ  （Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，  Ｎ．Ｈ．）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  Ｃｏｎｎ．）などが挙げられる。希少な化学ライブラリーは、Ａｌｄｌｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手できる。コンビナトリアルライブラリーも入手可能であり、また標準的な手法により調製することができる。
また、バクテリア、菌類、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物ライブラリーも例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｂｏｔｈｅｌｌ，  Ｗａｓｈ．）、ＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ  （Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）などから入手可能であり、また容易に作り出すこともできる。さらに、天然及び合成的に作られたライブラリー及び化合物は、通常用いられる化学的、物理的、及び生化学的手段によって容易に修飾される。
【００６７】
２．  カスパーゼ３抑制剤
本発明中、抑制剤とは、カスパーゼ３タンパクまたは遺伝子に作用して直接カスパーゼ３活性を減少させる化合物、あるいはカスパーゼ３シグナル伝達経路中、カスパーゼ３の上流または下流に作用して間接的にカスパーゼ３の活性あるいは効果を減少させる化合物である。すなわち、抑制剤は、カスパーゼ３活性化に導く、あるいはカスパーゼ３活性化の結果として生じる分子的及び細胞的事象のカスケードの一部を弱めるまたは不活性化する。
【００６８】
本発明に係る抑制剤の例として、カスパーゼ３タンパクのオリゴヌクレオチド抑制剤（例えば、アンチセンス分子など）、抗体、生物学的に不活性なフラグメントまたは変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって活性化されるタンパクの生物学的に不活性なフラグメントまたは変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって不活性化されるタンパクまたはその生物学的に活性なフラグメントや変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３を活性化するタンパクの生物学的に不活性なフラグメントまたは変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３を抑制するタンパクまたはその生物学的に活性なフラグメントや変異体；これらのタンパク、フラグメントまたは変異体をエンコードする核酸配列、及びカスパーゼ３の活性を低下させるあるいはカスパーゼ３の発現を減少させる他の化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって活性化されるタンパクとしては、前記記載のものが挙げられる。カスパーゼ３活性を抑制するタンパクとしては、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ２、ｃ−ＩＡＰ１、スルビビンなど直接的にカスパーゼ３を抑制するものが挙げられる。また、カスパーゼ３活性化タンパク（カスパーゼ１、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、グランザイムＢなど）の抑制によって間接的にカスパーゼ３活性を制限するタンパクも挙げられ、Ｉ−ＦＲＩＣＥ、ＣｒｍＡ、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ２、ｃ−ＩＡＰ１、スルビビンなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
２．１  オリゴヌクレオチド抑制剤
本発明にかかるオリゴヌクレオチド抑制剤は、哺乳類のカスパーゼ３遺伝子またはＭＳＴ１のようなカスパーゼ３によって活性化されるタンパクをエンコードする他の遺伝子、またはカスパーゼ３を活性化するタンパクをエンコードする遺伝子を標的とする。シグナル伝達経路の下流または上流で作用するタンパクをエンコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、当該分野において知られており、番号は前記の通りである（１．２欄）。他の公知の配列としては、
ｐ３８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１７７２６４５）、
ｐ３８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜５２９０３９）、
ＸＩＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜８９２３７９４）、
ｃ−ＩＡＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜３９７８２４３）、
ｃ−ＩＡＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１４７７０１８６）、
スルビビン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜４５０２１４４）、
カスパーゼ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜５３７２９１）、
カスパーゼ８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜２４２９１６１）、
カスパーゼ９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜３０５６７２６）、
カスパーゼ１０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜３３８６５２２）、
グランザイムＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜１２４７４５０）、
Ｉ−ＦＬＩＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜２８２７２８９）、
ＣｒｍＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ｇｉ｜３２３４０１）
などが挙げられる。
【００７１】
本発明の一つの実施形態において、オリゴヌクレオチド抑制剤は哺乳類のカスパーゼ３遺伝子を標的とする。別の実施形態においては、ヒトのカスパーゼ３遺伝子を標的とする。また別の実施形態においては、哺乳動物のＭＳＴ１遺伝子を標的とし、また別の実施形態においては、ヒトのＭＳＴ１遺伝子を標的とする。
【００７２】
本発明中、「オリゴヌクレオチド抑制剤」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ショートインターフェリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、リボザイム及び三重螺旋形成オリゴヌクレオチドを包含する。
【００７３】
ここで用いているように「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、又はそれらの修飾された変異体のオリゴマーやポリマー、あるいはＲＮＡやＤＮＡのミメティクを指す。従って、この用語は、自然発生の核酸塩基、糖、及び共有結合性ヌクレオシド間（バックボーン）結合から構成されるオリゴヌクレオチドも、その機能は同等であるが非自然発生部分を持つオリゴヌクレオチドも含む。このような修飾あるいは置換オリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば、増強された細胞内への取り込み、核酸ターゲットとの増強された親和性、ヌクレアーゼの存在下での向上した安定性などの特性のため、天然型よりも好ましいことが多い。
また、この用語は、キメラのオリゴヌクレオチドも含む。キメラオリゴヌクレオチドはとは、２つ以上の化学的に別個の領域を含み、各領域は少なくとも一つのモノマーユニットを含むオリゴヌクレオチドである。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、一本鎖または２本鎖であることができる。
【００７４】
当該分野において知られているように、ヌクレオシドとは塩基−糖の結合体であり、ヌクレオチドとは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに有するヌクレオシドである。オリゴヌクレオチドの形成においては、リン酸基が隣接したヌクレオシドをもう一つのヌクレオチドと共有結合して、３’から５’のリン酸ジエステル結合であるＲＮＡやＤＮＡの通常の鎖あるいは骨格を有する鎖状ポリマー化合物を形成する。
本発明において有用なオリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾骨格もしくは非天然ヌクレオシド間結合を有するものが挙げられる。本明細書で定義しているように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドとは、骨格中にリン原子を有するもの及びリン原子を持たないものの両方を含む。本発明の目的において、当該分野において時々言及されるように、リン原子をヌクレオシド間骨格中に持たない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオチドと見なすことができる。
【００７５】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドに包含することができる修飾オリゴヌクレオチド骨格として、例えば、ホスホロチオエート型、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、３’−アルキレンホスホネートやキラルホスホネートを含むメチルホスホネートあるいは他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミドやアミノアルキルホスホラミドを含むホスホラミド、チオノホスホラミド、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに、通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、及びヌクレオシドユニットの隣接ペアが３’−５’から５’−３’、あるいは２’−５’から５’−２’と逆の極性であるアナログなどが挙げられる。また、様々な塩、混合塩、遊離酸型も含まれる。
【００７６】
リン酸原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格の例としては、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子とアルキルまたはシクロアルキル結合ヌクレオシド間結合、あるいは１つ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合により形成されるものなどが挙げられる。このような骨格として、モルフォリノ結合(ヌクレオシドの糖部から部分的に形成される)；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混在したＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２の構成部分を有する他の骨格などが挙げられる。
【００７７】
ここで用いられる「アルキル」という用語は、１〜２０の炭素原子を有する一価のアルキル基を指す。本発明の一つの実施形態において、アルキル基は１〜６の間の炭素原子を有する。適当なアルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
「シクロアルキル」とは、３〜２０の炭素原子の、一つの環あるいは複数の縮合した環を有する環状アルキル基を指す。適当なシクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどの単環構造、またはアダマンタニルなどの多環構造が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
また、本発明は、ヌクレオチドユニットの糖とヌクレオシド間結合との両方が新しい基で置き換えられたオリゴヌクレオチドミメティクも考慮している。塩基ユニットは、適当な核酸ターゲットとのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴヌクレオチドミメティクの例で、優れたハイブリダイゼーション特性を示すものとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）がある［Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７−１５００（１９９１）］。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持されて骨格のアミド部位のアザ−窒素原子に直接的にまたは間接的に結合する。
【００８０】
また、本発明に係る修飾オリゴヌクレオチドは、一つ以上の置換された糖部分を含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、次の置換基の一つを有する糖を２’位に含んでいてもよい：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。前記のアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換の、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、Ｃ２〜Ｃ１０のアルケニル及びアルキニルであってよい。これらの基の例は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］］２であり、ｎ及びｍは１〜約１０である。
あるいは、オリゴヌクレオチドは、次の置換基の一つを２’位に含んでいてもよい：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換の低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、及び類似の特性を有する他の置換基。具体例としては、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）［Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  ７８：４８６−５０４（１９９５）］、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。
【００８１】
また、オリゴヌクレオチドの別の部位、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位に同様の修飾がされていてもよい。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖ミメティクを含んでいてもよい。
【００８２】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、核酸塩基に対する修飾または置換も含んでよい。ここで用いられているように、「非修飾」あるいは「天然の」核酸塩基とは、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。
修飾核酸塩基としては、次のような他の合成及び天然の核酸塩基が挙げられる：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；イノシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体；アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体；２−チオウラシル，２−チオチミン及び２−チオシトシン；５−ハロウラシル及びシトシン；５−プロピニルウラシル及びシトシン；６−アゾウラシル、シトシン及びチミン；５−ウラシル（偽ウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ，８−アミノ，８−チオール，８−チオアルキル，８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン；５−ハロ、特に５−ブロモ，５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン；７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン；８−アザグアニン及び８−アザアデニン；７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン；３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなど。さらに、核酸塩基としては、次のものに記載されているものも含まれる：米国特許第３，６８７，８０８号；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  （１９９０）  ｐｐ  ８５８−８５９，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．，  ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ３０：６１３  （１９９１）；Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  （１９９３）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ  ２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ。
これら核酸塩基のうちのあるものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増すのに特に有用である。このようなものとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンなどのＮ−２及びＮ−６及びＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸の二本鎖の安定性を高めることが示されている［Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  （１９９３）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ  ２７６−２７８，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ］。
【００８３】
本発明における別のオリゴヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布あるいは細胞への取り込みを高める一つ以上の部分や接合体のオリゴヌクレオチドへの化学的結合である。
このような部分として、コレステロール部のような脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：６５５３−６５５６  （１９８９））、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  ４：１０５３−１０６０  （１９９４））、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６６０：３０６−３０９  （１９９２）；  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  ３：２７６５−２７７０  （１９９３））、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：５３３−５３８  （１９９２））、ドデカンジオール残基やウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：１１１１−１１１８  （１９９１）；  Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２５９：３２７−３３０  （１９９０）；  Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ７５：４９−５４  （１９９３））、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールやトリエチルアンモニウム  １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒｅｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６：３６５１−３６５４  （１９９５）；  Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：３７７７−３７８３  （１９９０））、ポリアミン鎖やポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １４：９６９−９７３  （１９９５））、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６：３６５１−３６５４  （１９９５））、パルミチル部（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２６４：２２９−２３７  （１９９５））、オクダデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２７７：９２３−９３７  （１９９６））などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
当業者には、与えられたオリゴヌクレオチドの全ての位置が、均一に修飾されていることが必ずしも必要でないことがわかるであろう。従って、本発明は、前記修飾の一つ以上を一つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内にある一つのオリゴヌクレオシドに取り入れることを考慮している。
【００８５】
前記のように、キメラ化合物であるオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内に含まれる。キメラオリゴヌクレオチドは、通常少なくとも１つの領域を含み、この領域では、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の向上及び／又は細胞内への取り込みの増進及び／又は標的とする核酸との結合親和性の向上が付与されるようにオリゴヌクレオチドが修飾される。オリゴヌクレオチドの付加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断する能力を有する酵素の基質として働いてもよい。
【００８６】
本発明中、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレアーゼ及びＲＮＡヌクレアーゼによる分解の影響を受けにくいような修飾がされた場合、あるいはＤＮＡヌクレアーゼやＲＮＡヌクレアーゼからオリゴヌクレオチドを保護するようなデリバリービヒクル中にある場合には、「ヌクレアーゼ抵抗性」である。
ヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドとして、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、及びモルホリノオリゴマーなどが挙げられる。ヌクレアーゼ抵抗性を与えるのに適したデリバリービヒクルとしては、例えばリポソームである。
【００８７】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を改善する基、または薬力学的特性を改善する基を含むオリゴオリゴヌクレオチドも考慮している。
【００８８】
２．１．１  アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明において用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、関心のある遺伝子（すなわち、カスパーゼ３シグナル伝達経路中のタンパクなど関心のあるタンパクをエンコードする遺伝子）から転写されるｍＲＮＡの部分に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００８９】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、関心のある遺伝子を標的とする。本発明中、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の核酸に対する「ターゲティング」は、通常、その機能が調節される核酸配列の同定から始まる多段階のプロセスである。本発明中、標的は、カスパーゼ３シグナル伝達経路中のタンパクをエンコードする遺伝子またはそれから転写されるｍＲＮＡである。
また、このターゲティングプロセスは、アンチセンス相互作用を生じた結果、遺伝子によりエンコードされたタンパクの発現の調節が起こるような核酸配列内の一つあるいは複数の部位を同定することを含む。標的となる部位が同定されると、所望の結果を与えるのに前記ターゲットと十分に相補的な（すなわち、十分な強さと特異性を持ってハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。
【００９０】
一般に、遺伝子またはそれから転写されるｍＲＮＡには５つの領域があり、これらの領域はアンチセンス調節のターゲットとしてもよい：５’未翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、翻訳開始（またはスタート）コドン領域、自由読み取りフレーム（ＯＲＦ）、翻訳終止（またはストップ）コドン領域、及び３’未翻訳領域（３’−ＵＴＲ）。
【００９１】
「翻訳開始コドン」及び「スタートコドン」との用語は、たとえ各々の場合において開始アミノ酸が通常（真核生物において）メチオニンであっても、多くのコドン配列を包含し得る。また、当該分野においては、真核生物の遺伝子は２つ以上の代替スタートコドンを有し、これらの何れか１つが、特定のタイプの細胞や組織中、または特定の条件下で翻訳開始のために優先的に利用され得ることも知られている。本発明中、「スタートコドン」及び「翻訳開始コドン」は、コドンの配列に関わらず、関心をもっているタンパクをエンコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するために、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる一つ又は複数のコドンを指す。
【００９２】
当該分野において知られているように、いくつかの真核生物の転写産物は直接翻訳されるが、大抵の哺乳動物の遺伝子、あるいは自由読み取りフレーム（ＯＲＦｓ）は、翻訳される前に転写産物から切り取られる一つ以上の配列を含み、これは「イントロン」として知られている。ＯＲＦの発現部分（切り取られない部分）は「エクソン」と呼ばれ、これらがつなぎ合わせられてｍＲＮＡ転写産物を形成する（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ４１１−４１５）。
本発明中、イントロン及びエクソンは両方とも、アンチセンスのための標的となってよい。ある場合には、ＯＲＦも、ｉｎ  ｖｉｖｏでのいくつかの機能的重要性によりアンチセンスの標的とすることができる部位を１つ以上含んでいてもよい。後者のタイプの部位の例としては、遺伝子内のステム・ループ構造（例えば、米国特許第５，５１２，４３８号参照）や、非処理ｍＲＮＡ分子（一次転写産物）においてはイントロン／エクソンの結合部位が挙げられる。
また、当該分野において知られているように、一次ＲＮＡ転写産物は、エクソンのスプライシングによってｉｎ  ｖｉｖｏで処理されてもよく、よって、これは同じ遺伝子に相当するが構造は異なるスプライシングされたｍＲＮＡ分子を作り出すことができる。さらに、ｍＲＮＡ分子は、アンチセンスのターゲットとしてもよい５’キャップ領域を有する。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、ｍＲＮＡの５’最残基（５’−ｍｏｓｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）に５’−５’トリフォスフェート結合を介して結合しているＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体も、キャップに隣接した最初の５０のヌクレオチドも含むと考えられる。
【００９３】
このように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、イントロンを含む完全な遺伝子の領域、遺伝子の一次ｍＲＮＡ転写産物、あるいは関心のある遺伝子から転写されたｍＲＮＡの１つ以上の最終的なスプライシングされたものに相補的であることができる。
【００９４】
本発明に用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、関心のある遺伝子と相補的であり、二本鎖、ヘアピン構造を形成するあるいはホモオリゴマー／配列リピートを含む可能性を少なくとも示す配列から選ばれる。さらに、オリゴヌクレオチドはＧＣクランプを有することができる。当業者は、これらの特性を、様々なコンピューターモデリングプログラム、例えば、ｐｒｏｇｒａｍ  ＯＬＩＧＯ（Ｒ）  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０  （ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，  ＭＮ）などを利用して定性的に決定可能であるということを認識している。
【００９５】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ以上のスピーシーズの遺伝子の間で高度に保存される標的遺伝子の領域を構成する核酸配列に相補的であるものを選択することができる。これらの特性は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）  ｄａｔａｂａｓｅｓとＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：３８７−３９５）のＢＬＡＳＴＮ  ｐｒｏｇｒａｍ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−１０）を利用して決定することができる。
【００９６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、有効であるために、その標的配列の相補体と１００％の同一性を有する必要はないということは、当該分野において理解されている。従って、本発明にかかるアンチセンスオリゴオリゴヌクレオチドは、標的配列の相補体と少なくとも約７０％同一の配列を有する。本発明の一つの実施形態においては、アンチセンスオリゴオリゴヌクレオチドは、標的配列の相補体と少なくとも約８０％同一の配列を有する。また別の実施形態においては、標的配列の相補体と少なくとも約９０％同一、あるいは少なくとも９５％同一であり、いくつかの塩基のギャップやミスマッチは許容される。同一性は、例えば、前記Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）  ｓｏｆｔｗａｒｅのＢＬＡＳＴＮ  ｐｒｏｇｒａｍを用いて決定することができる。
【００９７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが関心のある遺伝子の発現抑制において機能するために、それらが標的配列に十分な特異性を示し、細胞中の他の核酸配列に結合しないことが必要である。従って、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列の相補体と適当なレベルの配列同一性を有すると同時に、他の既知の配列とは密接に類似しているべきではない。
従って、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、何れの他の哺乳動物の核酸配列とも同一性が５０％未満であるべきである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の配列に対する同一性は、例えば前記ＢＬＡＳＴＮ  ｐｒｏｇｒａｍ及びＮＣＢＩ  ｄａｔａｂａｓｅｓの使用などにより決定することができる。
【００９８】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常７〜１００ヌクレオチド長さである。一つの実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約７〜５０ヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログを含む。関連する実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約７〜３５ヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドアナログ、及び約１５〜２５ヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドアナログを含む。
【００９９】
本発明の別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１つ以上のホスホロチオエート骨格結合を含む。関連の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全骨格結合は、ホスホロチオエート結合である。
【０１００】
本発明のもう一つの実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートと２’−Ｏ−メチルの混在する骨格を持つキメラ分子である。関連した実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらにＴＣＣＣモチーフを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチド中のこのようなモチーフの存在は、ｍＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖がＲｎａｓｅ  Ｈが介在する分解を受ける可能性を高めることが示されている。Ｒｎａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、アンチセンス治療において、Ｒｎａｓｅ  Ｈの活性化は、ｍＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド抑制効率が著しく高まる。
【０１０１】
２．１．２  ショートインターフェリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子
ショートインターフェリング二本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）が介在するＲＮＡ干渉は、当該分野において、転写後遺伝子サイレンシングにおいて重要な役割を果たすことが知られている（Ｚａｍｏｒｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：７４６−７５０  （２００１））。本質的に、ｓｉＲＮＡは通常２１〜２２塩基対長さで、長い二本鎖ＲＮＡ分子が内因性リボヌクレアーゼの作用により切断された時に生じる。最近では、標的遺伝子と同一の配列をもつ合成ｓｉＲＮＡ分子での哺乳動物細胞のトランスフェクションが、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを低下させることが示されている［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４−４９８  （２００１）］。
【０１０２】
本発明に係るオリゴヌクレオチド抑制剤は、関心のある遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子であることができ、その結果、ｓｉＲＮＡの配列は前記遺伝子の一部に相当する。当該分野において知られているように、有効なｓｉＲＮＡ分子は通常３０塩基対長さより小さく、それがインターフェロン応答を介して細胞内の非特異的ＲＮＡ干渉経路の引き金となるのを妨げるのを助ける。従って、本発明の一つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子は約１５〜２５塩基対長さである。関連する実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は約１９〜２２の塩基対長さである。
【０１０３】
二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、さらに、Ｒｎａｓｅが介在する分子の分解を最小限に抑えるために、３’末端及び５’末端にｐｏｌｙ−Ｔまたはｐｏｌｙ−Ｕの突出部を含むことができる。従って、本発明の別の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子は、３’末端及び５’末端に２個のチミジン残基または２個のウリジン残基を有する突出部を含む。ｓｉＲＮＡ分子のデザイン及び構築については、当該分野において知られている［例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４−４９８  （２００１）；  Ｂｉｔｋｏ  ａｎｄ  Ｂａｒｉｋ，  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １：３４  （２００１）参照］。
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるｓｉＲＮＡ分子の構築のための迅速かつ効率的手段を提供するキットも市販されており（Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ；  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）、本発明に係るｓｉＲＮＡ分子の構築に用いてもよい。
【０１０４】
２．１．３  リボザイム
本発明に係るオリゴヌクレオチド抑制剤は、関心のあるタンパクをエンコードするｍＲＮＡを特異的に標的とするリボザイムであることができる。当該分野において知られているように、リボザイムとは、別の分割されたＲＮＡ分子をヌクレオチド配列特有の方法で連続的に切断することが可能な酵素活性を有するＲＮＡ分子である。このうな酵素活性を有するＲＮＡ分子は、実質的にどんなｍＲＮＡ転写産物も標的とすることができ、効率的な切断をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる［Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：８７８８，  （１９８７）；  Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５，  （１９８８）；  Ｃｅｃｈ，  ＪＡＭＡ，  ２６０：３０３０，  （１９８８）；  Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７：１３７１，  （１９８９）］。
【０１０５】
通常、リボザイムは非常に近接した２つの部位を含む：それは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を持つｍＲＮＡ結合部位と、標的ｍＲＮＡを切断するように作用する触媒部位である。リボザイムはまず、リボザイムの標的ｍＲＮＡ結合部位による相補的な塩基対形成によって標的ｍＲＮＡを認識し結合することにより作用する。標的に特異的に結合すると、リボザイムはこの標的ｍＲＮＡの切断を触媒する。このような戦略的切断により、エンコードされたタンパクの合成を指示する標的ｍＲＮＡの能力が破壊される。リボザイムがｍＲＮＡ標的に結合しこれを切断すると、リボザイムは放れ、新しい標的ｍＲＮＡ分子と結合し、切断を繰り返すことができる。
【０１０６】
最も特徴的なリボザイム分子の一つは、「ハンマーヘッドリボザイム」である。ハンマーヘッドリボザイムは、ヌクレオチド配列において、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるハイブリダイジング領域、及び標的ｍＲＮＡに結合して切断する触媒領域を含む。一般に、ハイブダイジング領域は少なくとも９ヌクレオチドを含む。従って、本発明は、オリゴヌクレオチド抑制剤をハンマーヘッドリボザイムのハイブリダイジング領域の一部として利用することも考慮している。このときのハイブリダイジング領域は、関心のあるタンパクをエンコードする遺伝子に相補的な少なくとも９個のヌクレオチドを含み、適当な触媒ドメインに結合している。このようなリボザイムの構築及び作製は、当該分野においてよく知られている［例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５−５９１  （１９８８）参照］。
【０１０７】
また、本発明に係るリボザイムには、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）に自然に発生するもののようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「Ｃｅｃｈタイプリボザイム」という）も含まれ、これは、文献に広く記載されている［Ｚａｕｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４：５７４−５７８  （１９８４）；  Ｚａｕｇ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３１：４７０−４７５  （１９８６）；  Ｚａｕｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４：４２９−４３３  （１９８６）；  米国特許第４，９８７，０７１号；  Ｂｅｅｎ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，  Ｃｅｌｌ，  ４７：２０７−２１６  （１９８６）参照］。Ｃｅｃｈタイプリボザイムは、８ヌクレオチドの活性部位を有し、これが標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズし、次いでリボザイムにより標的ｍＲＮＡを切断する。
【０１０８】
当業者は、リボザイムと、最大のリボザイム活性を産み出す基質との間の結合自由エネルギーの範囲が狭いことを理解している。このような結合エネルギーは、ｍＲＮＡ結合部位においてＧがＩ（イノシン）に、ＵがＢｒＵ（ブロモウラシル）に置換したリボザイムとするのに利用することができる。このような置換は、標的認識配列や、ｍＲＮＡ結合部位の長さ、あるいはリボザイムの酵素部位を変えることなく、結合自由エネルギーを操作することを可能にする。
自由エネルギー対リボザイム活性曲線の形は、リボザイム／基質相互作用の規模を変更する複雑さなしに、各塩基（あるいは幾つかの塩基）が修飾あるいは非修飾の当該分野で既知の標準的実験データを用いて容易に決定することができる。
【０１０９】
必要であれば、このような実験を用いて活性が最大であるリボザイムの構造を示すことが可能である。従って、修飾塩基の使用は、結合自由エネルギーの「微調整」が最大リボザイム活性を確かなものとすることを可能にすし、これは、本発明の範囲内であると考えられる。さらに、非標的ＲＮＡの切断が問題となる場合には、前記のような塩基の置換、例えば、ＧをＩとするような置換により、基質特異性のレベルをより高めてもよい。
【０１１０】
２．１．４  三重螺旋形成オリゴヌクレオチド
本発明の別の実施形態において、抑制剤は、標的遺伝子の５’末端にハイブリダイズし三重螺旋構造を形成するオリゴヌクレオチドであり、よって、これは転写をブロックするために用いることができる。三重螺旋形成オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと関連して前記記載のように調製することができる。
【０１１１】
２．１．５  オリゴヌクレオチド抑制剤の有効性
関心のある遺伝子の発現抑制における本発明に係るオリゴヌクレオチド抑制剤の有効性は、当該分野において知られている多くの異なる方法を用いて決定することができる。本発明のオリゴオリゴヌクレオチドの有効性決定に使用可能な方法の例を以下に挙げる。
【０１１２】
本発明のオリゴヌクレオチド有効性の最初の決定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術を用いて行うことができる。例えば、オリゴヌクレオチドを、標的遺伝子が正常にあるいは過剰に発現する細胞系に導入し、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット分析法や定量的ＲＴ−ＰＣＲ法などの標準的技術により測定することができる。あるいは、その細胞で生成された標的タンパクの量を、例えばウェスタンブロット分析法などにより測定することができる。その後、オリゴヌクレオチドで処理した細胞中で生成されるｍＲＮＡまたはタンパクの量を、コントロールの細胞、すなわち未処理の細胞またはコントロールのオリゴヌクレオチドで処理された細胞で生成された量と比較し、どれだけオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を抑制できたかという結果が得られる。
ｍＲＮＡ標的に対するオリゴヌクレオチドの特異性は、適当なコントロール実験を並行して行うことにより決定することができる。適当なコントロールは、調べるオリゴヌクレオチド抑制剤のタイプに依存し、当業者により容易に選択可能である。適当なコントロールの例としては、未処理の細胞や、任意あるいは「無作為」のオリゴヌクレオチドで処理した細胞、確定した数のミスマッチを含むオリゴオリゴヌクレオチドで処理した細胞、長鎖非特異的二本鎖ＲＮＡ分子で処理した細胞、あるいは任意のオリゴオリゴヌクレオチドをそのｍＲＮＡ結合ドメインに組み入れたリボザイムで処理した細胞などが挙げられる。これらを行うための方法は、当業者によく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０１１３】
また、本発明のオリゴヌクレオチド抑制剤が標的タンパクの発現を抑制する能力は、オリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下でのタンパクの総合的な細胞活性を分析することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することができる。そのタンパクが酵素である場合、タンパクレベルは、そのタンパクに関連する酵素活性レベルを測定することにより決定され、例えば、その酵素によって触媒される反応の基質あるいは生産物の細胞レベルにおいて、抑制剤により誘発される変化を測定することにより決定することができる。当業者は、このようなタイプの分析において、当該分野において知られている様々な細胞系、レポーター遺伝子、及び決定法を用いることができるということを認識している。
【０１１４】
また、オリゴヌクレオチド抑制剤が標的タンパクの発現や活性を抑える能力、あるいは逆に幹細胞の増殖を促進するまたは分化を抑える能力は、移植片培養もしくは適当な動物モデルで決定することもできる。例えば、適当な濃度のオリゴヌクレオチド抑制剤をニューロスフェア培養物（Ｈｉｔｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６，  ８４６−８５８参照）または完全な骨格筋線維培養物（Ａｓａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ  １５９，  １２３−１３４）とインキュベートし、これら移植片からの幹細胞の成長を抑制する能力を試験することができる。同様に、オリゴヌクレオチド抑制剤を、エデュケーター細胞として一次心筋細胞を用いた心臓幹細胞共培養物とインキュベートし、その増殖抑制能を評価することできる。
【０１１５】
また、オリゴヌクレオチド抑制剤の毒性は、まず標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価することもできる。例えば、ヒト一次繊維芽細胞を、リポフェクタミンなどの市販の脂質担体の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでオリゴヌクレオチドと処理することができる。その後、細胞をトリパンブルー排除試験のような標準的生存率測定法を用いて、その生存率を処理後の異なる時点で試験する。また、細胞を、例えばチミジン取り込み法を用いてそのＤＮＡ合成能も測定し、また、例えばフルオロサイトメーター細胞分類機（ＦＡＣＳ）を組み合わせた標準的な細胞分類法を用いて細胞サイクル動態の変化も測定する。
【０１１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるオリゴヌクレオチドの毒性効果は、当該分野において知られている方法、例えば、処理中の動物の体重に対する効果の測定や、その動物を死亡させた後の血液学的プロファイル及び肝酵素分析などにより評価することができる。
【０１１７】
２．１．６  オリゴヌクレオチド抑制剤の調製
本発明のオリゴヌクレオチド抑制剤は、当業者によく知られた通常の方法によって調製することができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．  （Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｃａｎａｄａ）から入手可能な装置のような、市販の装置を用いた固相合成により調製することができる。当該分野においてよく知られているように、ホスホロチオエートやアルキル化誘導体などの修飾オリゴヌクレオチドも、同様の方法により容易に調製可能である。
【０１１８】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド抑制剤は、当該分野において知られている標準的技術を用いて、自然発生の標的遺伝子またはｍＲＮＡ、あるいはｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの酵素的消化及び／又は増幅により、調製することができる。オリゴヌクレオチド抑制剤がＲＮＡを含む場合、当該分野においても知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法により調製できる。前記のように、ｓｉＲＮＡ分子も市販のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットを利用して簡便に調製できる。
【０１１９】
また、オリゴヌクレオチドも遺伝子組み換えＤＮＡ技術を利用して調製することが可能である。従って、本発明には、オリゴヌクレオチド抑制剤をエンコードする核酸配列を含む発現ベクターや、適当な宿主細胞中でのエンコードされたオリゴヌクレオチドの発現も含まれる。このような発現ベクターは、前記（１．２欄参照）のような当該分野において知られている手順を用いて容易に構築できる［Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ，  ＮＹ．  （１９８９  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅｓ）］。
【０１２０】
本発明に係るリボザイム抑制剤は、当該分野において知られている技術によって容易に構築することができる。これらの分子において、オリゴヌクレオチド配列は、リボザイムのハイブリダイジング部位またはｍＲＮＡ結合部位に含まれ、適当な触媒作用部位に結合される。適当な触媒部位の選択は、構築すべきリボザイムのタイプに依存し、当業者が容易に決定できる［例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５−５９１  （１９８８）；  米国特許第４，９８７，０７１号参照］。
【０１２１】
２．２  タンパク及びポリペプチド抑制剤
本発明のタンパク及びポリペプチド抑制剤としては、カスパーゼ３タンパクの生物学的に不活性なフラグメントまたは変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって活性化されるタンパクの生物学的に不活性なフラグメントや変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって不活性化されるタンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体；シグナル伝達経路においてカスパーゼ３を活性化するタンパクの生物学的に不活性なフラグメントまたは変異体；及びシグナル伝達経路においてカスパーゼ３を抑制するタンパクあるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
生物学的に活性なフラグメントとは、野性型タンパクと実質的に同等の活性を有する野性型タンパクのフラグメントである。このようなフラグメントを得る方法の例は、前記のとおりである（1.１欄参照）。前記のとおり、変異タンパクまたはタンパクフラグメントが野性型タンパクの約５０％の活性を示すとき、それは野生型タンパクと実質的に同等の活性を有すると認められる。
【０１２３】
また、本発明は、野性型タンパクの作用を妨害する、すなわちタンパク活性抑制剤として作用する、生物学的に不活性なタンパクあるいはそのフラグメントの使用も考慮している。本発明で考慮している生物学的に不活性なタンパクまたはフラグメントは、野性型タンパクよりも実質的に低い活性を有するものである。
【０１２４】
候補抑制フラグメントは、標準的方法を用いて野性型タンパクから得ることができる。本発明中、生物学的に不活性なタンパク、フラグメント、または変異体は、その活性が野性型タンパクの７５％以下である場合に、実質的に野生型タンパクよりも低い活性を持つと見なす。別の実施形態においては、変異タンパクまたはフラグメントは、野性型タンパクの６０％以下の活性を示す。また別の実施形態においては、生物学的に不活性な変異タンパクやフラグメントは、野性型タンパクの約５０％以下の活性を示し、例えば、野生型タンパクの約１〜４０％の間である。
【０１２５】
また、本発明は、カスパーゼ３、またはカスパーゼ３シグナル伝達経路中の他のタンパクに結合しその活性を抑制するペプチドも提供する。このようなペプチドを同定する方法の一例として、ファージディスプレイ法が挙げられる。任意の短鎖ペプチドのファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．から入手可能であり、「パニング」として知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法により利用される。最もシンプルな場合においては、パンニングは、まず最初に標的分子でコーティングされたプレートまたはビーズとファージディスプレイドペプチドのライブラリーをインキュベートし、その後結合しなかったファージ粒子を洗い流し、最後に特異的に結合したファージを抽出することを含む。標的分子の例としては、カスパーゼ３タンパクやそのフラグメントが挙げられる。
【０１２６】
その後、特異的結合ファージによってディスプレーされたペプチドは分離され、当業者に公知の標準的技術により配列決定される。いくつかの場合には、その後、分離されたペプチドの結合強度が標準的技術により試験される。
【０１２７】
ペプチドが同定されれば、様々なペプチドアナログ、ペプチド誘導体、及び同等の活性をシェアするペプチドミメティク化合物の調製に用いてもよい。このような化合物は、当該分野においてよく知られており、自然発生のペプチドに勝る利点、例えば、より高い化学的安定性、向上したタンパク分解抵抗性、増強した薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、有効性、効能など）、変更された特殊性（例えば、広範囲の生物学的活性など）、及び／又は低減した抗原性などを有するかもしれない。
【０１２８】
本発明のタンパクまたはポリペプチド抑制剤は、前記のように当該分野において知られている方法によって調製することができる。例えば、細胞抽出物からの精製や遺伝子組換え技術の使用、あるいは化学合成などの方法が挙げられる。
【０１２９】
２．３  タンパク及びポリペプチド抑制剤をエンコードするポリヌクレオチド
本発明の一つの実施形態において、タンパク及びポリペプチド抑制剤は遺伝子組換え技術によって得られる。このような技術は当該分野においてよく知られており（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４  ＆  ｕｐｄａｔｅｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）、大体は前記の通りである（１．２欄参照）。
【０１３０】
２．４  抗体
本発明は、カスパーゼ３シグナル伝達経路における標的タンパクに対して作られ、該タンパクと結合しこれを抑制する抗体及び抗体のフラグメントの使用も考慮している。本発明中、標的タンパクは、カスパーゼ３タンパクや、カスパーゼ３を活性化するタンパク、あるいはシグナル伝達経路においてカスパーゼ３によって活性されるタンパクである。
【０１３１】
抗体の産生に関し、様々な宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを、標的タンパク、または免疫原性を有するそれらのフラグメントあるいはペプチドで免疫することができる。宿主種に応じて、様々な補助剤を免疫応答を増強するために使用してもよい。このような補助剤として、例えば、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモリシン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられる補助剤の例としては、例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどが挙げられる。
【０１３２】
抗体を誘導するために用いられるペプチドまたはタンパクフラグメントは、約５個のアミノ酸程しかない少ないアミノ酸配列を有することができる。本発明の一つの実施形態において、少なくとも約１０個のアミノ酸であるアミノ酸配列が使用される。これらのペプチドまたはタンパクフラグメントは、野性型タンパクのアミノ酸配列の一部と同一であるか、自然発生の低分子のアミノ酸配列全体を含むことができる。必要であれば、標的タンパクのアミノ酸の短いストレッチを、ＫＬＨのような別のタンパクのそれと融合し、キメラ分子に対する抗体を作ることができる。
【０１３３】
標的タンパクに対するモノクローナル抗体は、連続する培養細胞系により抗体分子を産生するのための技術を用いて調製することができる。このような技術としては、ハイブリドーマ法やヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、ＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；  Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２；  Ｃｏｔｅ，  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：２０２６−２０３０；  ａｎｄ  Ｃｏｌｅ，  Ｓ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６２：１０９−１２０参照）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例えば、本発明に係るモノクローナル抗体は、マウスやラットのような動物を精製されたタンパクで免疫することにより得ることができる。その後、免疫された動物から分離された脾細胞を、標準的技術を用いて不死化する。
【０１３４】
免疫動物から取り出された脾細胞の不死化は、例えば、Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈ．  ３９：２８５−３０８（１９８０）の記載の方法に従って、これらの細胞をＰ３Ｘ６３−Ａｇ  ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）のような骨髄腫細胞系と融合することにより行うことができる。また、当業者に知られている別の方法も脾細胞の不死化に使用することができる。標的タンパクに対する所望の抗体を産生する不死化脾細胞を検出するために、培養液の上澄みサンプルの反応性を、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いて検査する。標的タンパクの活性を抑制するこれらの抗体を得るために、、タンパクと結合する抗体を産生するクローンの培養液の上澄みを、さらに適当な分析法を用いてタンパク活性抑制を調べる。
その後、その培養液の上澄みに、標的タンパクの活性を抑制し、かつＩＣ５０が１００ｎｇ／ｍｌ未満である抗体を含むような分離不死化細胞を選択し、当業者に知られている技術を用いてクローン化する。そして、これらのクローンによって作り出されたモノクローナル抗体を、標準的なプロトコルに従い分離する。
【０１３５】
さらに、適当な抗原特異性及び生物学的活性を持つ分子を得るために、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子へスプライシングするような、「キメラ抗体」産生技術を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：６８５１−６８５５；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；  ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５）。また、一本鎖抗体の産生技術も、当該分野において知られている方法を用いて、標的タンパクに特異的な一本鎖抗体を得るのに用いることができる。関連する特異性を有するが別個のイディオタイプ組成の抗体は、任意のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからの鎖混合により得ることができる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ．  Ｒ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：１０１３４−１０１３７参照）。
【０１３６】
また、抗体は、リンパ細胞群のｉｎ  ｖｉｖｏ産生誘導により、あるいは免疫グロブリンライブラリー又は文献記載の高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより得ることもできる（Ｏｒｌａｎｄｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８６：  ３８３３−３８３７；  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）。
【０１３７】
標的タンパクに特異的に結合する部位を含む抗体フラグメントも得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２は抗体分子のペプシン消化によって産生でき、また、次いでＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによりＦａｂフラグメントを生じることができる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを速やかにかつ簡便に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することもできる（例えば、Ｈｕｓｅ，  Ｗ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１参照）。
【０１３８】
様々な免疫学的検定法が、所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングに利用可能である。競争的結合のための多くのプロトコル、または、確立された特異性を持つポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いる免疫放射定量測定法は、当該分野においてよく知られている。このような免疫学的検定法は、通常標的タンパクとその特異的抗体との複合体の形成を測定することを含む。このような技術の例としては、ＥＬＩＳＡｓやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。あるいは、二つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用したツーサイトモノクローナルベース免疫学的検定法や、競争的結合検定を用いることもできる（Ｍａｄｄｏｘ，  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １５８：１２１１−１２１６参照）。これら及びその他の分析法は当該分野においてよく知られている（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｔ  Ｐａｕｌ，  Ｍｉｎｎ．，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ；  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７，  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｍａｄｄｏｘ，  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １５８：１２１１−１２１６参照）。
【０１３９】
２．５  その他の化合物
また、本発明は、カスパーゼ３シグナル伝達経路の低分子抑制剤も提供する。例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、合成有機分子、自然発生有機分子、ビタミン誘導体、炭水化物、及びそれらの成分や誘導体などが挙げられる。低分子化合物は、経路中のタンパクに結合し、カスパーゼ３シグナルカスケードの正常な活性を妨害してよく、または野性型カスパーゼ３をエンコードする核酸あるいはシグナル伝達経路中の別のタンパクをエンコードする核酸に結合して、タンパクの発現を妨害してもよい。
カスパーゼ３の低分子抑制剤の例としては、ＤＥＶＤ．ｆｍｋ（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ３２６０８−３２７５５）が挙げられる。その他の有効なカスパーゼ３低分子抑制剤として、Ｃｈｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４５，  ５００５−５０２２に記載の化合物３、４、４７ｃ、５９、６２ｂ、６４ｂ、６６ａ、６６ｂ、６９ｂの非ペプチド性ファーマコフォアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４０】
カスパーゼ３シグナル伝達経路の抑制剤として作用する活性についてスクリーニングされた候補低分子は、当該分野において知られている標準的な方法ならびに前記に概説した方法（１．３欄参照）を用いて、任意にあるいは合理的に選択、あるいはデザインすることができる。
【０１４１】
カスパーゼ３活性調節剤の選択
本発明は、カスパーゼ３調節剤として作用し、幹細胞の細胞の運命に影響を及ぼす化合物を同定する方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、当該分野において知られている様々な技術を用いて、候補化合物がカスパーゼ３調節剤として作用する能力を決定することができる。例えば、候補化合物について、前記した代表的な方法（２．１．５欄参照）を用い、カスパーゼ３シグナル伝達経路中の特定タンパクの発現への影響を試験してよい。また、候補化合物について、カスパーゼ３シグナル伝達経路におけるカスパーゼ３あるいは他のタンパクのタンパク活性を促進もしくは抑制する能力を試験してもよい。あるいは、もしくは追加的に、カスパーゼ３シグナル伝達経路における効果は、幹細胞分化へ影響を及ぼす能力を決定することにより間接的に試験することもできる。
【０１４２】
プロテアーゼ及びキナーゼの活性を測定する方法は当該分野においてよく知られており、カスパーゼ３、ＭＳＴ１、その他のカスパーゼ３シグナル伝達経路中のキナーゼを活性化もしくは抑制する候補化合物の能力を決定するために使用するのに適している（Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，  Ｉ．，  ＆  Ｆｕｊｉｓａｗａ，  Ｈ．  （１９８９）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    １８３，  １３９−１４３；  Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ，  Ｊ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４，  １１３５−１１４０；  Ｙａｏｉｔａ，  Ｙ．，  ＆  Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｋ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．    ２７２，  ５１２２−５１２７；  Ｆｅｒｎａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９９，  １１０２５−１１０３０）。
例えば、活性は、タンパクの分離、イムノブロット分析、免疫細胞化学、免疫共沈法、キナーゼ分析を用いて測定してもよい。さらに、シグナル伝達経路のカスパーゼ３及び他のタンパクの活性を測定するキット、例えば、カスパーゼ３蛍光分析キット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）などが市販されており、これをカスパーゼ３活性調節候補化合物の能力を決定するのに使用することもできる。
【０１４３】
幹細胞の分化に影響する候補化合物の能力は、候補化合物の存在下もしくは非存在下で幹細胞を培養し、細胞における分化及び／または増殖の一つ以上の指標をモニターすることにより決定することができる。様々な組織に由来する幹細胞または前駆細胞を、候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。例えば、胚、心臓、筋肉、膵臓、神経、肝臓などの組織由来の幹細胞、骨髄、造血細胞、筋芽細胞、肝細胞、胸線細胞、心臓細胞由来の幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
幹細胞を培養で維持する方法は、当該分野において知られている（例えば、Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ，  Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．    Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．    １０，  ４８１−４９２；  Ｈｉｅｒｌｉｈｙ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５３０，  ２３９−２４３；  Ａｓａｋｕｒａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５９，  １２３−１３４）。幹細胞はそれ単独で培養することができ（単培養）、あるいは他の（エデュケーター）細胞と一緒に共培養することもできる。例えば、共培養としては、筋肉由来幹細胞（または他の幹細胞）と筋芽細胞（エデュケーター細胞）を、別々の培養系での維持期あり、あるいはなしで分離した後、混合した細胞群が可能であった。あるいは、この二つの細胞群を起源である組織から分離することなく外植片（例えば、マウスの後肢筋外植片）として共培養することができた。もし、幹細胞群及び／またはエデュケーター細胞群が完全には純粋でなければ、１種以上（単培養）あるいは２種以上（共培養）の細胞群が最初に存在し、その後幹細胞群が分化することがあることが理解及び予測される。
【０１４５】
培養期間の前、間、あるいは後に、細胞群を同定あるいは単離するステップや、本方法の成功に寄与する別のステップなど追加のステップが、本スクリーニング法に含まれてよい。例えば、成長因子または他の化合物を幹細胞群の分離及び拡張のために用いてよい。Ｇｒｉｔｔｉら（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  （１９９９）  １９：３２８７−３２９７）に記載されているように、ＥＧＦ及びＦＧＦは上記目的のために神経幹細胞と共に用いられており、Ｂｃｌ−２は「筋幹細胞」群の分離に利用されている（米国特許第６，３３７，１８４号参照）。
【０１４６】
スクリーニング法で用いられる幹細胞は、正常哺乳動物から分離あるいは取り出された一次細胞または培養幹細胞系であることができる。あるいは、カスパーゼ３シグナル伝達経路中のタンパクをエンコードする１つ以上の遺伝子に突然変異を保因する哺乳動物から分離または取り出された幹細胞であることができ、例えば、ヌル変異（カスパーゼ３-/-）などのように、カスパーゼ３活性の減少という結果をもたらすカスパーゼ３突然変異哺乳動物からの幹細胞が挙げられる。
【０１４７】
一般に、培養物に添加される候補化合物は、通常１０００倍濃度範囲にわたって試験され、適当な暴露プロトコルが当業者により容易に確立される。共培養系を用いる場合、候補化合物への幹細胞の暴露は、エデュケーター細胞に対する最初の幹細胞の暴露の前及び／又は間及び／又は後に行うことができる。あるいは、候補調節剤がポリヌクレオチド、またはタンパクやポリペプチドのようなポリヌクレオチドによってエンコードされた化合物である場合、ここであるいはその他の箇所で記載された標準的方法を用いて、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む発現ベクターで幹細胞をトランスフェクトすることができ、候補調節剤を内因的に産生することができる。さらに、候補活性化剤や候補エフェクターを安定に発現する細胞系をスクリーニング法に用いて、多様な増殖刺激からの保護における活性化剤／エフェクターの有効性を決定することができる。
【０１４８】
幹細胞における分化及び／または増殖の指標は、定性的あるいは定量的にモニターすることができ、例えば、全体的形態変化、総細胞数変化、組織学的変化、組織化学的変化あるいは免疫組織化学的変化、または特定の細胞マーカーレベルの有無または相関などが挙げられる。これらの指標は、細胞全体または標準的技術により調製される細胞溶解液において評価することができ、サイズ分画のような分析を容易にする別の手法をまず行った細胞や溶解液で、あるいはそうでない細胞や溶解液でモニターすることができる。
【０１４９】
様々な細胞マーカーレベルの有無または相関は、多くの標準的な技術を用いて分析できる。例えば、組織化学的技術、免疫学的技術、電気泳動法、ウェスタンブロット法、ＦＡＣＳ法、フローサイトメトリーなどが挙げられる。あるいは、細胞マーカータンパクをエンコードする遺伝子から発現したｍＲＮＡの存在を、例えば、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、適当なオリゴヌクレオチドプローブの使用などにより検出することができる。
【０１５０】
分化の指標として評価することができる細胞マーカーは、通常、系列に特異的なタンパクである。例を挙げれば、心筋幹細胞の分化を評価するためにモニターされる細胞マーカーとして、例えばコネキシン−４３、ＭＥＦ２Ｃ及び／またはミオシン重鎖などが挙げられる。筋肉由来幹細胞については、ミオシン重鎖、次亜リン酸化ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５及び／又はトロポニンＴなどの１つ以上の筋細胞マーカータンパクの発現を測定することができ、ニューロスフェアやＳＰ細胞などのような神経幹細胞については、ＧＦＡＰ、ＭＡＰ２及び／またはβ−ＩＩＩチューブリンのようなマーカーを測定することができる（例えば、Ｈｉｔｏｓｈｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６，  ８４６−８５８参照）。
増殖の指標として評価される細胞マーカーの例としては、例えば、サイクリンＤ１、ホスホ−ヒストンＨ１及びＨ３、Ｅ２Ｆ、及びＰＣＮＡなどが挙げられる。
【０１５１】
本発明の一つの実施形態において、スクリーニング法に用いられる幹細胞は筋芽細胞である。筋芽細胞における分化誘導は、例えば、筋芽細胞の融合または筋管の形成を測定することにより、あるいはミオシン重鎖、次亜リン酸化ＭｙｏＤ、ミオゲニン、トロポニンＴなどのマーカータンパクの発現について細胞を試験することにより測定ことができる。これらマーカーの１つ以上の欠如あるいはダウンレギュレーションは、細胞が分化できなかったことを示唆する。増殖におけるどのような増加も、総細胞数を測定し、これを候補化合物で処理しなかったコントロールと比較することにより評価することができる。
【０１５２】
本発明の別の実施形態においては、スクリーニング法で用いられる幹細胞は心臓のサイドポピュレーション（ＳＰ）細胞である。心臓ＳＰ細胞は幹細胞様活性を有し、その常在群は実験的に操作可能で、成人の心臓に存在することが示されている［Ｈｉｅｒｌｉｈｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５３０，  ２３９−２４３］。心臓ＳＰ細胞は、心筋細胞とともに共培養することができ、心臓ＳＰ細胞中のコネキシン−４３、ＭＥＦ２Ｃ及びミオシン重鎖のような心筋細胞特有のマーカーの出現をモニターすることにより分化誘導を測定することができる。これらマーカーの１つ以上の欠如あるいはダウンレギュレーションは、細胞が分化できなかったことを示唆する。
【０１５３】
本発明の別の実施形態においては、スクリーニング法に用いられる幹細胞は神経幹細胞である。神経幹細胞は、ニューロスフェアやサイドポピュレーション（ＳＰ）細胞画分として得られるが、神経皮質前駆細胞とともに共培養すると、それらが本来持っている成熟ニューロンへの分化能力を調べることができる。分化誘導は、例えば、ＧＦＡＰ、ＭＡＰ２、β−ＩＩＩチューブリン［例えば、Ｈｉｔｏｓｈｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６，  ８４６−８５８参照］、ミエリン塩基性タンパク、グリア繊維酸性タンパクなどの発現をモニターすることによって測定することができる。これらマーカーの１つ以上の欠如あるいはダウンレギュレーション、またはマーカーであるネスチンの存在は、細胞が分化できなかったことを示唆する。
【０１５４】
医薬組成物
本発明は、カスパーゼ３タンパク調節剤及び薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本医薬品組成物は、さらに、１つ以上の治療用化合物、例えば、抗生物質、抗炎症剤、抗うつ剤などを含んでいてもよい。
【０１５５】
本発明に係る医薬組成物は、通常の無毒性の薬学的に許容される担体、補助剤、及びビヒクルを含む用量単位の処方において、経口的、局所的、非経口的、吸入あるいはスプレー、あるいは直腸によりに投与してよい。ここで使用する非経口的との用語は、皮下注射、または静脈内、筋肉内、子宮内への注射あるいは注入技術などを含む。
【０１５６】
経口用製剤とする場合、医薬組成物剤の剤型として、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散可能な粉末剤あるいは顆粒剤、エマルジョンのハードあるいはソフトカプセル、シロップ剤、エリキシル剤などとすることができる。
【０１５７】
経口用組成物は、当該分野において知られている医薬組成物製造方法に従って調製してよく、このような医薬品組成物は、製剤的に優れた服用しやすい製品とするために、一つ以上の添加剤、例えば、甘味料、香料、着色剤、保存剤などを含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適当な無毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含む。これら賦形剤としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなどの不活性な希釈剤；コーンスターチ、アルギン酸などの顆粒化剤及び崩壊剤；スターチ、ゼラチン、アカシアなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの滑沢剤などが挙げられる。錠剤はコーティングされていなくてもよく、あるいは、消化管における崩壊及び吸収を遅らせて長時間にわたり作用を維持するための公知技術によりコーティングされていてもよい。例えば、グリセリルモノステアレートやグリセリルジステアアレートのような遅延材料を用いてよい。
【０１５８】
また、経口用医薬組成物は、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなどの不活性な固体希釈剤と活性成分とを混合したハードゼラチンカプセルとしてもよく、あるいは、水や、ピーナッツ油、液状パラフィン、オリーブ油などの油性媒体と活性成分とを混合したソフトゼラチンカプセルとしてもよい。
【０１５９】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適当な賦形剤との混合物中に活性成分を含む。このような賦形剤は、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガムなどの懸濁剤である。分散剤あるいは湿潤剤は、レシチンなどの天然発生のホスファチド、ポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキシド−脂肪酸縮合物、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシド−長鎖脂肪族アルコール縮合物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレートなどのエチレンオキシド−脂肪酸及びヘキシトール部分エステル縮合物、またはポリエチレンソルビタンモノオレートなどのエチレンオキシド−脂肪酸及びヘキシトール無水物部分エステル縮合物等であってよい。
また、水性懸濁液は、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つ以上の保存剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香料、あるいはスクロースやサッカリンなどの１つ以上の甘味料を含んでもよい。
【０１６０】
油性懸濁液は、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、ココナッツ油などの植物油中、あるいは液状パラフィンなどの鉱物油中に活性成分を懸濁することにより製剤化してよい。油性懸濁液は、密ロウ、硬化パラフィン、セチルアルコールのような増粘剤を含んでもよい。前記のような甘味料及び香料も服用しやすい経口剤とするために添加してよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加して保存してもよい。
【０１６１】
水を加えることにより水性懸濁液を調製するのに適当な分散可能な粉末剤及び顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の保存剤との混合物中に活性成分を有する。適当な分散剤または湿潤剤、及び懸濁剤の例として、前記記載のものが挙げられる。追加の賦形剤として、例えば、甘味料、香料、着色剤なども含んでよい。
【０１６２】
本発明に係る医薬組成物は、水中油型乳化物であってもよい。油相は、オリーブ油、落花生油などの植物油、または液状パラフィンなどの鉱物油、またはこれらの混合物などであってよい。適当な乳化剤として、アカシアガム、トラガカントガムなどの自然発生のガム、大豆レチシンなどの自然発生のホスファチド、脂肪酸とヘキシトールとに由来するエステル又は部分エステルあるいはソルビタンモノオレートなどの脂肪酸と無水物とに由来するエステル又は部分エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートなどの前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物などが挙げられる。また、乳化物は甘味料や香料を含んでもよい。
【０１６３】
シロップ剤及びエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロースなどの甘味料とともに製剤化してよい。このような製剤は、粘滑剤、保存剤、香料、着色剤を含んでいてもよい。本医薬組成物は、無菌で注射可能な水性あるいは油性懸濁液であってもよい。本懸濁液は前記のような適当な分散剤または湿潤剤、及び懸濁剤を用いて公知技術に従い製剤化してよい。また、無菌で注射可能な製剤は、例えば１，３―ブタンジオールなどの無毒性の非経口に投与可能な希釈剤あるいは溶剤中、無菌の注射可能な溶液あるいは懸濁液であってよい。許容されるビヒクル及び溶剤のうち用いてよいものとしては、水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、及び生理食塩水がある。さらに、無菌の不揮発性油も通常溶媒または懸濁媒体として利用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む何れの不揮発性油分も用いてよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤における使用がみられる。
【０１６４】
投与
本発明の調節剤及びそれを含む医薬組成物は、局所的治療か全身的治療かによって、あるいは治療すべき範囲によって、様々な方法で投与することができる。投与は、局所的投与（眼、及び膣や直腸などの粘膜デリバリーを含む）、ネブライザーによるものを含む粉末剤やエアゾールの吸入あるいは通気等による肺的投与、気管内的投与、鼻腔的投与、表皮的投与、経皮的投与、経口投与、あるいは非経口投与などが挙げられる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、あるいは筋肉内への注射または注入；あるいはクモ膜下や心室内などの頭蓋内への投与を含む。
【０１６５】
本発明の調節剤は、薬学的に許容可能なビヒクルと組み合わせて投与してよい。このようなビヒクルは、調節剤の安定性及び／またはデリバリー特性を高めることが理想的である。本発明は、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどの適当なビヒクル用いた調節剤またはその医薬組成物の投与も提供する。本発明の多様な実施形態において、このようなビヒクルの使用は、活性成分の放出持続において利点を有してよい。
【０１６６】
非経口注射剤とする場合、調節剤またはその医薬組成物は他の溶質を含む無菌溶液の形態で使用され、溶質としては、例えば、溶液を等張とするのに十分な生理食塩水あるいはグルコースなどが挙げられる。
【０１６７】
吸入または通気による投与のために、調節剤またはその医薬組成物は、水性のあるいは部分的に水性の溶液に製剤化することができ、これはその後エアゾールの形態で利用することができる。また、本発明は、調節剤またはその医薬組成物の局所使用も考慮している。この目的のために、薬学的に許容可能なビヒクル中の粉剤、クリーム、ローションなどとして製剤化することができ、これは、皮膚の作用させる部分に適用される。
【０１６８】
本発明の調節剤の投与量は、用いる個々の化合物または組成物、投与経路、症状の程度、治療する個々の患者により変化する。投与量は、当業者に知られている標準的な臨床技術により決定することができる。一般に、治療はその化合物の最適量よりも少ない用量で始める。その後、用量を最適な効果に達するまで増やす。一般に、調節剤は、どのような有害あるいは有毒な副作用も起こさずに有効な結果を与える濃度で投与する。投与は１日に１回とすることができ、あるいは、必要に応じて、用量を使いやすく分けて一日の適当な時間に服用することができる。
【０１６９】
１．  遺伝子治療
また、本発明は、オリゴヌクレオチド、タンパク、ポリペプチド及びペプチド調節剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏで分子合成されるようにデザインされた遺伝子ベクター構築物の形態で投与することも提供する。適当なベクターとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バクロウイルス、ヘルペスウィルスなどのウイルスベクターが挙げられる。ベクター構築物内で、抑制剤をエンコードするポリヌクレオチド配列は、適当なプロモーターのコントロール下にある。ここで記載されているように、ベクター構築物はさらに、調節剤をエンコードするポリヌクレオチドの効率的な転写及び／または翻訳が行われるように、他の調節コントロール要素を含んでよい。このような投与方法は、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
【０１７０】
オリゴヌクレオチド、タンパク、ポリペプチド、あるいはペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏ合成するためのこのような遺伝子ベクター構成物を構築、投与する方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ  （ｅｄｓ．），  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  （２０００）  Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．参照）。
【０１７１】
従って、例えば、患者の細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて１つ以上の調節剤（オリゴヌクレオチド、タンパク、ポリペプチド、又はペプチド）をエンコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作し、その後操作された細胞を治療すべき被験者に提供する。同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのポリペプチドの発現のために、調節剤をエンコードするポリヌクレオチドを被験者に投与することにより、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで操作してもよい。このような方法は、当該分野においてよく知られている。細胞をポリヌクレオチド単独と操作することができ、あるいは発現ベクターの形態で操作することもできる。このような使用に適当な代表的発現ベクターとして、例えば、ウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルスが挙げられる（例えば、Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ  （ｅｄｓ．），  Ｉｂｉｄ．参照）。また、プラスミドも利用可能であり、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）のｐＶＡＸ１プラスミドが挙げられる。
【０１７２】
当該分野において知られているように、本発明の調節剤をエンコードするＲＮＡを含むウイルス粒子を生産する生産細胞を、細胞を操作して調節剤をｉｎ  ｖｉｖｏで発現することを目的として、被験者に投与するのに用いてもよい。さらに、ポリヌクレオチドのみを、さらに賦形剤、担体、あるいはデリバリー分子を用いて、あるいは用いないで投与できることも考慮している。「裸の」ＤＮＡを注射することは、当該分野において知られている。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，５８０，５８９号参照。
【０１７３】
また、本発明は、カスパーゼ３シグナル伝達経路のタンパクをエンコードする内因性遺伝子の発現増加のために、組換えＤＮＡ構築物を使用することも考慮している。このような構築物及び標的遺伝子の発現増加のためにこれを使用することは、米国特許第5,641,670号に記載されている。一般に、このような構築物は、調節配列、エクソン部位、スプライスドナー部位を含み、より典型的にはターゲティング配列、調節配列、エクソン部位、非対スプライスドナー部位を含む。本構築物は、予め選択された部位で宿主細胞のゲノムへホモログ遺伝子組み換えにより導入され、その結果標的遺伝子の発現が増加する。本構成物は、そのＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エクソン部位、及びスプライスドナー部位が適切に内因性遺伝子に結合して遺伝子発現が変化する新しい転写ユニットができるような方法で、ゲノムに導入される。
【０１７４】
２．  移植
また、本発明は、幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで操作し、移植処置により患者に再び導入することも考慮している。このような移植は、当該分野において知られている。
使用
【０１７５】
本発明により提供される調節剤及び幹細胞の分化の操作方法は、多くの治療に適用される。調節剤はｉｎ  ｖｉｖｏで内因性幹細胞の最終形態を操作するのに使用することができ、あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、移植のための拡張したあるいは分化した幹細胞群を得るために用いることができる。調節剤は、幹細胞群が所望の最終結果となるように選択することができる。従って、例えば、もし分化した幹細胞群が必要であれば、カスパーゼ３を活性化する調節剤を選択し、幹細胞へ適用することができる。一方、拡張した幹細胞群が必要であれば、カスパーゼ３を抑制する調節剤を選択することができる。
また、本発明は、調節剤を組み合わせて使用することも考慮している。例えば、１つ以上のカスパーゼ３抑制剤を使用して、まず幹細胞群を拡張し、次いで所望の細胞数に達したら、一つ以上の活性化剤を使用して分化を刺激する。
【０１７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用として、例えば、常在性幹細胞を増殖及び／または分化するように刺激して損傷を受けたもしくは欠陥のある組織を置換または修復するために、調節剤を被験者に投与することができる。従って、本発明の調節剤及び方法は、損傷を受けた組織を置換するのに有用であり、例えば、化学療法や放射線治療の後や、組織の変質や損傷をもたらす疾病や疾患、例えば筋ジストロフィー、心臓血管疾患、脳卒中、心不全、心筋梗塞、パーキンソン病やアルツハイマー病のような神経変性疾患などの治療中あるいは管理中、あるいは欠損または損傷または機能不全の組織の置換が必要な疾病や疾患、例えばガン（白血病を含む）や、肝硬変、肝炎などの変性肝疾患、糖尿病、変性または虚血性心疾患などの治療中または管理中において有用である。
【０１７７】
また、本調節剤及び方法は、移植のための代替組織を得るために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞または前駆細胞の増殖及び／または分化を刺激するのに使用することもできる。幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡張は、多くの症状の治療に対して明らかな治療上の適用を有する。例えば、骨髄移植は白血病などの血液感染性ガンの治療において十分に立証された治療法であり、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）やへそ臍帯血（ＣＢ）細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡張は、従来の血液治療の延長として認められている（Ｄｏｕａｙ  （２００１）  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １０，  ３４１−３４６）。
【０１７８】
また、本発明は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖及び／または分化を促進し、その幹細胞群をさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するために、例えば調査目的で使用するために本発明の調節剤及び方法を用いることも考慮している。また、本調節剤及び方法は、薬物試験のための新しいｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの開発など、組織工学の分野における適用の可能性も有している。
【０１７９】
キット
さらに、本発明は、幹細胞の分化を調節するカスパーゼ３調節剤の１つ以上を含む治療用キットも提供する。本調節剤は１つ以上の医薬組成物の形態で提供されてよい。キットの内容物は、凍結乾燥することができ、さらにキットには凍結乾燥したものを再構成するための適当な溶剤を含むことができる。キットの個々の構成品は、別々の容器に包装することができ、このような容器に関しては、医薬品または微生物製品の製造、使用及び売買を統制する政府機関により規定された方式の、動物投与のための製造、使用及び売買が認可されている旨が表示された注意書きを有することができる。本キットは、本発明の調節剤と合わせて、使用可能な他の治療用化合物をさらに含むことができる。
【０１８０】
ここに記載した本発明のより深い理解のために、以下の実施例を示す。これら実施例は、代表的な目的だけのためのものであることが理解されるべきである。従って、いずれにしてもこれらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１８１】
実施例１：筋幹細胞（筋芽細胞）の分化調節
一般：材料及び方法
＜筋芽細胞培養＞
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウスの骨格筋筋芽細胞）培養物は、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で成長させ、維持した。分化は、低血清濃度（２％ウマ血清）しか含まないＤＭＥＭ中で培養物をインキュベートすることにより誘導した。カスパーゼ活性は、カスパーゼ３及びカスパーゼ８蛍光分析キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した。カスパーゼ活性が変動した細胞を、カスパーゼ３（ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ）またはカスパーゼ８（ｚ−ＬＥＴＤ．ｆｍｋ）（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の何れかに特異的な抑制剤２０μＭで処理した（０〜１００μＭの濃度曲線試験に基づいた）。コントロール細胞は、等量のビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した。一次筋芽細胞は、記載されているように（Ｃｒｅｇａｎ，  Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ．  １９，  ７８６０−７８６９）、１−２日齢のＣ５７ＢＬ／６野性型のカスパーゼ３異種接合マウス及びカスパーゼ３ヌルマウスの後肢及び前肢の骨格筋から取り出した（Ｆｒａｓｃｈ，  Ｓ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ８３８９−８３９７；  Ｋｕｉｄａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，  ３６８−３７２）（各ゲノタイプに対してｎ＝５）。分化を誘導するため、一次筋芽細胞培養物は、５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。
【０１８２】
＜トランスフェクションアッセイ＞
クローンバンクコレクション（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手したヒトＭＳＴ１の完全な自由読み取りフレーム（ＯＲＦ）を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１  Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。構成的に活性なＭＳＴ１（ＭＳＴ１−ａｃｔ）は、既知の方法により調製した（Ｍｅｇｅｎｅｙ，  Ｌ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０，  １１７３−１１８３）。ＭＳＴ１及びＭＳＴ１−ａｃｔの両方が完全であることをシ配列決定により確認した。これらタンパクのキナーゼ活性を、ＣＯＳ１細胞への一時的トランスフェクションにより確認し、次いで免疫沈降法及びＨｉｓｔｏｎｅ−Ｈ１を標的基質として用いたキナーゼ分析を行った（下記参照）。ＭＳＴ１及びＭＳＴ１−ａｃｔのＣＯＳ１及び一次筋芽細胞へのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて使用説明書の指示通りに行った。
【０１８３】
＜タンパクの分離、イムノブロット分析及び免疫細胞化学＞
Ｃ２Ｃ１２及び一次筋芽細胞株からの細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、２０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭＮａ３ＶＯ４、各々１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン及びＰＭＳＦを含む修飾ＲＩＰＡ緩衝液中、４５分間氷上で溶解した。総タンパクはＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。イムノブロット分析は、ＭＳＴ１、ＭＫＫ６、ｐ３８γ、ｐ３８α（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ｐ３８、ＭＥＦ２Ｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ミオゲニンＦ５Ｄ、ミオシン重鎖ＭＦ２０  ｍＡｂ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、及び活性カスパーゼ３  （Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）の抗体を用いて、既知の方法に従い行った（Ｃｒｅａｓｙ，  Ｃ．Ｌ．，  ＆  Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，  Ｊ．（１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  ２１６９５−２１７００）。
【０１８４】
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を既知の方法により固定し、抗ＭＦ２０で染色した（Ｃｒｅｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ．    １９，  ７８６０−７８６９）。一次筋芽細胞株は４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄し、前記のように染色した。Ｃ２Ｃ１２及び一次筋芽細胞培養物の両方に対し、細胞をＰＢＳによって１：１００００倍希釈した４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで１０分間インキュベートすることにより、核を検出した。
【０１８５】
＜免疫共沈法及びキナーゼ分析＞
免疫沈降法は、１５０〜２００μｇの総タンパクを用いて行い、それぞれの抗体を含む修飾ＲＩＰＡ緩衝液中４℃で１６時間インキュベートした。サンプルは５０％プロテインＧ（Pharimacia）２５μｌと１時間混合した。免疫共沈法のために、免疫沈降物を修飾ＲＩＰＡ緩衝液で洗浄し、１Ｘ  Ｌａｍｅｌｌｉ緩衝液中で煮沸し、イムノブッロト分析のためＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより分離した。キナーゼ分析に用いる免疫沈降物は、修飾ＲＩＰＡ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ  ７．２）、２５ｍＭ  β−グリセロホスフェート、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、及び１ｍＭ  ＤＴＴを含み、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び標的基質として組換え型ＭＢＰか組換え型Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１（Ｕｐｓｔａｔｅ）の何れかを添加したキナーゼ緩衝液中でインキュベートした。サンプルは３７℃で３０分間インキュベートし、その後１Ｘ  Ｌａｍｅｌｌｉ緩衝液中で煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルを乾燥し、リンの取り込みをオートラジオグラフィーによって分析した。
【０１８６】
サンプルは、ＭＢＰまたはＨｉｓｔｏｎｅＨ１を標的基質として用い、既知の方法（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９，  １２０３−１２０６）によりインゲルキナーゼ分析に供した。二次元インゲルキナーゼ分析については、サンプルをｐＨ４．０−７．０  ＩＰＧストリップ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて一次元で等電点電気泳動を行った。二次元分析は、インゲル基質としてＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１を含む１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。追加のインゲルキナーゼ分析を前記のとおりに行った。
【０１８７】
＜ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳及びＭＳＴ１タンパク分解＞
ＭＳＴ１−ｐｃＤＮＡ３．１  Ｍｙｃ／Ｈｉｓは、ＴｎＴ  Ｔ７  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写、翻訳した。ラベリング効率を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色及びオートラジオグラフィーにより確認した。［３５Ｓ］−メチオニンでラベルしたＭＳＴ１タンパクを、ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ（カスパーゼ３抑制剤）及び低血清培地で処理した後のＣ２Ｃ１２細胞サンプルと３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＳＴ１のタンパク分解的切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで評価した。
【０１８８】
１．１  カスパーゼ３-/-筋芽細胞は分化欠損を示す
カスパーゼ３に標的ヌル突然変異を有するマウスを飼育した。既に報告されているとおり、周産期初期のマウスは、野性型及び異型接合型の腹子に比べて著しく小さかった（Ｆｒａｓｃｈ，  Ｓ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ８３８９−８３９７；  Ｋｕｉｄａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，  ３６８−３７２）。さらに、骨格筋総質量の顕著な減少が認められ、これはこれらの動物において筋形成が損なわれたことを示す。
筋形成におけるカスパーゼ３除去の影響を調べるために、一次筋芽細胞培養物を、カスパーゼ３ヌル突然変異（カスパーゼ３-/-）の１−２日齢マウスから得た。細胞株の目視観察では、野性型、カスパーゼ３+/-、及びカスパーゼ３-/-の筋芽細胞の増殖は同様であった。０日に分化を誘導した後、誘導後４日目までに、野性型細胞に比べてカスパーゼ３-/-の筋管形成の重度欠損が明らかとなった（図１Ａ；それぞれ野生型に対して１０％ｖｓ８０％、ヌルの融合インデックスを比較）。また、次亜リン酸化ＭｙｏＤ、ミオゲニン及びトロポニン  Ｔ（各々、図１のＤ，Ｅ及びＨ）など多くの分化特異的タンパクの発現が、野性型筋芽細胞に比べてカスパーゼ３-/-筋芽細胞中で実質的に減少した。さらに、カスパーゼ-/-筋芽細胞中において、細胞増殖マーカーであるサイクリンＤ１の残存レベルが、野性型筋芽細胞に比べて高くなった（図１Ｆ）。これらの観察結果は、カスパーゼ３活性の上昇が、骨格筋形成の初期段階中における効果的な分化に必要であることを示唆するものである。
【０１８９】
あるいは、カスパーゼ３活性は、通常分化プロセスを抑制する筋芽細胞群の（アポトーシスによる）除去に、すなわち、非細胞的自律性効果に必要なのかもしれない。または、カスパーゼ３活性の上昇が細胞内変化をもたらし、分化プログラムを活性化する、すなわち細胞性自律的効果をもたらすのかもしれない。従って、カスパーゼヌル型筋芽細胞及び野性型筋芽細胞におけるアポトーシスの程度を、低血清分化誘導中において比較した。
驚くべきことに、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  及びヨウ化プロピジウム染色及びポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断の分析を用いたフローサイトメトリーにより示されるように（図１Ｂ，Ｃ：１１８ｋＤａ  ＰＡＲＰタンパク及び８５ｋＤａの切断フラグメントの両方が検出された）、アポトーシスの初期あるいは後期のマーカーにおいて測定可能な差異は全く認められなかった。さらに、カスパーゼ３異型接合型マウス由来の筋細胞は、野性型のコントロールに比べ筋形成レベルの低下を示したが、それにもかかわらず分化した（図１Ａ）。これらの結果は、通常分化と関連付けられるカスパーゼ３活性上昇は、全くアポトーシス的なものではないことを示唆するものである。
【０１９０】
より詳細には、図１は次のことを示す：
（Ａ）  ２日間または４日間低血清培地中でインキュベート後、固定し、ミオシン重鎖を染色した野性型及びカスパーゼ３-/-マウス（各ゲノタイプに対しｎ＝５）由来の一次筋芽細胞株。細胞は核マーカーのヘマトキシリン（暗染色パターン）で対比染色した。筋形成の重度欠損がカスパーゼ３-/-細胞で示されている。
（Ｂ）  表示された期間低血清培地中でインキュベート後の、野性型筋芽細胞及びカスパーゼ３-/-筋芽細胞のフローサイトメトリー分析。細胞は、染色されずにいるか（左下枠）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣによって染色されているか（右下枠）、ヨウ化プロピジウムで染色されているか（左上枠）、あるいは両染料で染色されているか（右上枠）のいずれかであった。２日間の低血清処理後、野性型及びカスパーゼヌル型筋芽細胞の両方において、同等数のアポトーシス細胞が観察された。
（Ｃ）  ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は野性型及びカスパーゼ３ヌル型の筋芽細胞の両方において同等である。低血清（分化）培地中でインキュベートされた野性型及びカスパーゼ３ヌル型の筋芽細胞において、抗ＰＡＲＰ抗体を用いたＰＡＲＰウェスタンブロット分析。１１８ｋＤａＰＡＲＰタンパク、及び８５ｋＤａ切断フラグメントの両方が検出された。
（Ｄ），（Ｅ），（Ｈ）  カスパーゼ３ヌル型筋芽細胞における筋分化特異的タンパクの減少が、（Ｄ）次亜リン酸化ＭｙｏＤ（各パネルにおける上及び下の矢印は、リン酸化及び次亜リン酸化ＭｙｏＤをそれぞれ示す）、（Ｅ）ミオゲニン、及び（Ｈ）トロポニンＴ、のウエスタンブロット分析を用いて観察された。
（Ｆ）  カスパーゼ３ヌル型筋芽細胞は、低血清（分化）培地の存在下、サイクリンＤ１の蓄積延長を示した。
（Ｇ）  抗チューブリン抗体を用いてウェスタンブロット分析と同等のローディングが観察された。
【０１９１】
１．２  カスパーゼ３活性が骨格筋分化中において積極的な役割を果たす
カスパーゼ３ヌル型動物由来の筋芽細胞で見られる現象を、確立された筋芽細胞群においてさらに試験した。既に骨格筋のカスパーゼ３及びカスパーゼ８の活性変化が研究報告されているので（Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，  Ｉ．，  ＆  Ｆｕｊｉｓａｗａ，  Ｈ．  （１９８９）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．    １８３，  １３９−１４３；  Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ，  Ｊ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４，  １１３５−１１４０；  Ｙａｏｉｔａ，  Ｙ．，  ＆  Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｋ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ５１２２−５１２７）、Ｃ２Ｃ１２骨格筋細胞系のカスパーゼ３及びカスパーゼ８の活性を、分化の開始期及び進行中において測定した。増殖中のＣ２Ｃ１２細胞を低血清培地中に置き、５日間分化させた。５日間の様々な時点で、細胞のサブセットを広範囲にわたり洗浄し、溶解液に非付着性アポトーシス細胞がないことを保証した。蛍光分析により、２４時間以内にカスパーゼ３活性がシャープに９倍増加し、その後、分化が進行するにつれて下降することが明らかとなった（図２Ａ）。興味深いことに、カスパーゼ８の活性においても同様の傾向が見られたが、正常値と比べた活性の増加はカスパーゼ３で観察されたほど大きくなかった（平均±標準誤差、ｎ＝５）。活性型カスパーゼ３の免疫組織化学的検出により、測定されたカスパーゼ３活性の増加は分化中の筋芽細胞の特徴であり、アポトーシスを受けている細胞の結果ではないことが確認された。
【０１９２】
カスパーゼ３ヌル型モデルの分析結果を補うものとして、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるカスパーゼ活性を、カスパーゼ３に特異的な薬理学的抑制剤（ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ）及びカスパーゼ８に特異的な薬理学的抑制剤（ｚ−ＬＥＴＤ．ｆｍｋ）を用い直接的に標的とした。細胞を分化開始０、２及び４日間後に固定し、ミオシン重鎖抗体ＭＦ２０で染色した。筋管形成の僅かな減衰が、カスパーゼ８抑制で観察された。カスパーゼ３が抑制された筋芽細胞では、筋管形成が損なわれた（図２Ｂ中央パネル、Ｃ）。特に、これらの細胞は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞に比べ、低血清状態に４日間置いた後も単核で非融合の状態を維持していた。
【０１９３】
タンパク処理細胞及びコントロール細胞の溶解液をカスパーゼ３特異的抗体でウェスタン分析したところ、ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ処理がカスパーゼ３活性抑制に有効であることが確認された（図２Ｄ−矢印は、カスパーゼ３活性化を示す２１ｋＤａカスパーゼ３フラグメントを示し、コントロール細胞では高レベルであり、カスパーゼ３が抑制されたサンプルでは非常に低レベルである）。
注目すべきは、ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ処理したＣ２Ｃ１２細胞の筋芽細胞の分化欠損が、カスパーゼ３-/-筋芽細胞と著しく似ていたことである。一方、カスパーゼ８抑制剤であるｚ−ＬＴＥＤ．ｆｍｋとインキュベートした細胞においては、分化はより顕著であった（図２Ｂ下段パネル、Ｃ）。しかしながら、分化の程度はビヒクル処理した細胞で観察されるよりも低いままであった。カスパーゼ３が抑制された細胞の部分は、筋肉転写因子ミオゲニンを発現することができたが（図２Ｆ）、コントロールの筋芽細胞と比較すると、蓄積の遅延及び減少は明らかであった。さらに顕著には、後筋原性マーカーＭＥＦ２Ｃの発現が、カスパーゼ３活性を抑制した細胞中において、実質的に観察されなかった（図２Ｇ）。明らかに、筋形成の欠損がおおよそカスパーゼ３抑制によって引き起こされることは、カスパーゼ３が筋原性プロテアーゼの前駆体であることを示唆しており、また、その効果はカスパーゼ８により介在される効果よりも大きいということを示唆している。さらに、ＰＡＲＰ切断物が、ｚ−ＤＥＶＤで処理された筋芽細胞及び処理されていない筋芽細胞において同程度に蓄積され（図２Ｅ）、これは、カスパーゼ３活性が、分化中の筋芽細胞群のアポトーシス周辺速度の原因ではないことを示唆している。
【０１９４】
より詳細には、図２は次のことを示す：
（Ａ）  蛍光分析：カスパーゼ３活性（四角）のシャープな増加が、低血清処理１日後のＣ２Ｃ１２筋芽細胞において認められた。同様の傾向がカスパーゼ８（円）の活性化においても認められたが、カスパーゼ８活性においてはより小さな増加であった（平均±標準偏差、ｎ＝５）。
（Ｂ）  カスパーゼ３またはカスパーゼ８の活性を抑制した後のＣ２Ｃ１２細胞の細胞形態。Ｃ２Ｃ１２細胞は、カスパーゼ３特異的抑制剤（ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ）、カスパーゼ８特異性抑制剤（ｚ−ＬＥＴＤ．ｆｍｋ）、あるいはコントロール（ＤＭＳＯ）のいずれかの存在下、低血清培地中でインキュベートした。細胞を分化開始０、２及び４日後に固定し、ミオシン重鎖抗体ＭＦ２０で染色した。筋管形成は、分化４日後のカスパーゼ３抑制細胞において、劇的に減少する。カスパーゼ８抑制では筋管形成の僅かな減少が観察される。
（Ｃ）  カスパーゼ３抑制細胞は、融合能力を欠く。筋芽細胞融合率は、分化した筋管内に２つ以上の核を有する細胞（ＭＦ２０  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）のパーセンテージとして計算。値は、３〜４の独立した由来の初代培養物から平均±標準誤差として決定した。
（Ｄ）  コントロール細胞及びカスパーゼ３抑制細胞からの活性型カスパーゼ３のウェスタンブロット分析。矢印は２１ｋＤａのカスパーゼ３フラグメントを示し、コントロール細胞においてはカスパーゼ３活性化が高く、カスパーゼ３抑制サンプルにおいては非常に低レベルであることを示している。
（Ｅ）  コントロール細胞及びカスパーゼ３抑制細胞におけるＰＡＲＰ切断の同等なレベル。コントロール細胞及びカスパーゼ３抑制細胞におけるＰＡＲＰ切断はウェスタンブロットにより評価した。１１８ｋＤａ  ＰＡＲＰ種が示されている。
（Ｆ）  カスパーゼ３抑制Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞及びコントロール細胞において、ミオゲニンの蓄積は遅れ、より低量である。抗ｐ３８αを用いたウェスタンブロットにより同等のローディングが認められた。
（Ｇ）  カスパーゼ３抑制Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、コントロール細胞に比べＭＥＦ２Ｃの発現レベルが低い。カスパーゼ３抑制細胞及びコントロール細胞におけるＭＥＦ２Ｃの発現。同等のローディングが図（Ｆ）と同様に認められた。
【０１９５】
筋芽細胞の分化誘導におけるカスパーゼ３の細胞性自律的役割をさらに調べるため、活性型カスパーゼ３タンパクを、成長培地中で維持したサブコンフルエントのＣ２Ｃ１２筋芽細胞群にトランスフェクトした。サブコンフルエントなＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、２０ｐｇの組み換え活性型カスパーゼ３でトランスフェクトし、１２時間後に、ＦＩＴＣ結合二次抗体を用いて検出されるミオシン重鎖（抗ＭＦ２０）の存在を調べた。コンフルエントな細胞群を、低血清培地（分化培地）中でインキュベートして、筋芽細胞の分化を誘導し、１２時間後に試験した。試験した全ての細胞において、核をＤＡＰＩ染色で局在化した。結果を図３に示すが、これは７回の試験のうちの代表的なものである。
【０１９６】
ミオシン重鎖及び形態的再構成の免疫的検出により測定されたように、トランスフェクトされた筋芽細胞は分化プログラムを開始した（図３；トランスフェクション効率〜１０％；分化を受けたトランスフェクト細胞＞９５％、ｎ＝４  独立したトランスフェクション）。ミオシン重鎖を発現する筋芽細胞もトランスフェクトされた活性カスパーゼ３タンパク（非表示）に対してポジティブで、通常アポトーシスに起因する形態的な特徴を全く示さなかった。さらに、活性型カスパーゼ３のトランスフェクションは、成長刺激性条件、すなわち高血清条件にかかわらず、筋芽細胞の分化を誘導した（図３）。合わせて考えると、これらの結果は、内因性カスパーゼ３活性が筋芽細胞の分化に必要であるということを示すものである。
【０１９７】
１．３  カスパーゼ３は分化中にMST1キナーゼを活性化する
カスパーゼ３を活性型にする場合、通常その調節C末端ドメインを切断及び除去することにより、それらが活性となる幾つかのプロテインキナーゼを標的とすることができる（Ｕｔｚ，  Ｐ．  Ｊ．，  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ７，  ５８９−６０２；  Ｍｕｋａｓａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６０，  １３９−１４２）。従って、カスパーゼ３活性化は、筋原性シグナルカスケードの一部であるキナーゼを刺激するの必要なのかもしれない。実際、様々なＭＡＰＫファミリー由来の筋形成キナーゼ前駆体（Ｃｈｅｎｇ，  Ｔ．Ｃ．，  ａｔ  ｅｌ．，  （１９９３）    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，  ２１５−２１８；  Ｃｕｅｎｄａ，  Ａ．，  ＆  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．，  （１９９９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４，    ４３４１−４３４６；  Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．    １９，  ４０２８−４０３８）が、カスパーゼ３によって切断―活性化され、もしくはカスパーゼの指示よる切断により刺激された上流のキナーゼエフェクター自体に関連することが示されている（Ｕｔｚ，  Ｐ．  Ｊ．，  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ７，  ５８９−６０２；  Ｍｕｋａｓａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６０，  １３９−１４２）。
【０１９８】
二次元インゲルキナーゼ分析は、標的基質としてミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）を用い、カスパーゼ３活性により標的とされるプロテインキナーゼを同定した。Ｃ２Ｃ１２細胞をカスパーゼ３抑制剤で処理し、全タンパク溶解液を１次元で等電点電気泳動し、その後、交差基質としてＭＢＰを用いて２次元に分離した。Ｃ２Ｃ１２細胞をｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋと１２時間低血清処理した後、多くの内因性キナーゼの活性レベルが、未処理の筋芽細胞と比べて低下した（図４）。同様の結果が、ヒストンＨ１をインゲル基質として用いたときにも観察された。
【０１９９】
活性が変化したあるキナーゼは、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＳＴ１）と一致した予想されたｐＩ（５．２）及び分子量（３６ｋＤａ）で移動した。ＭＳＴ１は、セリン／スレオニン  Ｓｔｅ２０キナーゼの酵母ファミリーと相同であるカスパーゼ３活性化キナーゼとして知られている（Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，  ４３５５−４３５９；  Ｍｅｇｅｎｅｙ，  Ｌ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０，  １１７３−１１８３）。興味深いことに、ＭＳＴ１は、ＭＭＫ６及びｐ３８ＭＡＰＫファミリーのメンバーを標的とする上流キナーゼエフェクターとして作用するとされている（Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．    Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，  ４３５５−４３５９Ｓｕｎ，  Ｓ．，  ＆  Ｒａｖｉｄ，  Ｋ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７６，  ４４−６０）。ウェスタンブロットによる分析から、低血清処理開始から２４時間の間、完全長ＭＳＴ１のレベルがｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ処理培養物と比較して低いことが明らかとなった（図４Ｂ）。一方、ＭＳＴ１タンパクはｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ処理培養物とあまり変らないままであった。この相違は、２次元イムノブロット分析を用いてさらに示された（図４Ｃ）。
ＭＳＴ１の蓄積における相違が、カスパーゼ３介在性の切断によるものであることを確認するために、３５Ｓ−メチオニンでラベル化したＭＳＴ１を、コントロール及びｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋで処理されたＣ２Ｃ１２培養物の両方から分離したタンパク溶解液と共にインキュベートした。完全長ＭＳＴ１は１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５８ｋＤａへ移動した。正常に分化中のＣ２Ｃ１２細胞由来の溶解液とインキュベートした場合、約３６ｋＤａのより低いバンドが現れ、これは切断されたＭＳＴ１フラグメントを示す（図４Ｄ）。これらサンプルでは、約４５ｋＤａの別のバンドも存在した。
最近の報告では、ＭＳＴ１アミノ酸配列内にカスパーゼ切断に感受性の強い２つの部位が同定された（Ｓｕｎ，  Ｓ．，  ＆  Ｒａｖｉｄ，  Ｋ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７６，  ４４−６０）。これら部位の一つはアミノ酸３２３−３２７の間にあり、これは保存カスパーゼ３切断モチーフＤＥＶＤであった。この部位における切断により、３６ｋＤａの触媒活性フラグメントが生じる（Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，  ４３５５−４３５９）。アミノ酸３４６−３４９の間にある２番目の部位（ＴＭＴＤ）における切断により、４１ｋＤａフラグメントが生じ、これは機能的カスパーゼ８切断ドメインを表すかもしれない。Ｃ２Ｃ１２細胞において、カスパーゼ３活性が抑制されたサンプルでは、より低い３６ｋＤａのＭＳＴ１フラグメントは現れず、これはＭＳＴ１が筋形成の初期段階中においてカスパーゼ３によって正常に切断されることを示唆する。
標的となるＭＳＴ１の切断がその活性化と密接に結びつくことが明らかになったので、分化の初期段階中におけるＭＳＴ１活性を測定した。ＭＳＴ１はコントロール及びｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋで処理された溶解液から免疫沈降し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ分析においてＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１とインキュベートした。低血清培地中で１２時間処理した後のコントロール溶解液中で、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１が強くリン酸化された（４倍以上の増加）のに対し、ｚ−ＤＥＶＤ．ｆｍｋ処理細胞からは、基底レベル以上のリン酸化は検出されなかった（図４Ｄ）。総合的に考えれば、以上の結果は、カスパーゼ３がＭＳＴ１の活性化に介在しているというメカニズムを支持するものである。
【０２００】
さらに詳細には、図４は次のことを示す：
（Ａ）  ２次元ゲル内キナーゼ分析。Ｃ２Ｃ１２細胞をカスパーゼ３抑制剤で処理し、全タンパク溶解液を１次元等電点電気泳動した後、交差基質としてＭＢＰを用いて２次元に分離した。カスパーゼ３抑制の結果、ＭＢＰ指示性の細胞キナーゼ活性は著しく減少する。活性型ＭＳＴ１キナーゼの推定位置を、予測ｐＩ（５．２）及び分子量（３６ｋＤａ）に基づき、白矢印で示す。
（Ｂ）    抗ＭＳＴ１抗体を用いたＣ２Ｃ１２細胞のウェスタンブロット分析。コントロール処理細胞では、分化開始０日及び１日の間においてＭＳＴ１量が変化し、タンパク分解に関連した現象を示す。ＭＳＴ１は、カスパーゼ３が抑制された筋芽細胞中に低血清培地の添加しても変化しない。下に示すのは、ｐ３８αを用いたローディングコントロールである。
（Ｃ）  １２時間低血清培地中においた後のコントロール及びカスパーゼ３で処理した細胞の２Ｄ  ＩＥＦ／ウェスタンブロット。引き続きイムノブロット分析を抗ＭＳＴ１抗体を用いて行った。示されているのは、コントロール及びカスパーゼ３抑制サンプルの両方の１分暴露の結果である。カスパーゼ３サンプルの２０秒暴露が、シグナル強度の比較として含まれている。
（Ｄ）  ＭＳＴ１は分化中の筋芽細胞において切断される。［３５Ｓ］−メチオニンでラベルしたＭＳＴ１をコントロールあるいはカスパーゼ３が抑制されたＣ２Ｃ１２細胞の何れかからの溶解液と、分化条件下でインキュベートした。矢印は、約３６ｋＤａと４５ｋＤａのＭＳＴ１切断物を示し、これらは、コントロールサンプルでは見られたが、カスパーゼ３抑制サンプルでは見られなかった。
（Ｅ）  筋芽細胞の分化中において、ＭＳＴ１キナーゼ活性が増加する。分化条件下でＣ２Ｃ１２筋芽細胞から得たＭＳＴ１を免疫沈降したあとのg−３２Ｐ−［ＡＴＰ］ラベル化Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１。分化１２時間後のコントロールサンプルにおけるＭＳＴ１の実質的な活性化は、（Ａ）及び（Ｃ）で示されたようにＭＳＴ１の切断と合致する。サンプルのローディングは、乾燥及びオートラジオグラフィーに先立ってクーマシーブルーでゲルを染色して指標とした（Ｄの下パネル）。矢印はＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１の位置を示す。
【０２０１】
ＭＳＴ１の基質として、ｐ３８αＭＡＰＫ経路の関連があるメンバーが既に報告されている（Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，  ４３５５−４３５９；  Ｓｕｎ，  Ｓ．，  ＆  Ｒａｖｉｄ，  Ｋ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７６，  ４４−６０）。これらのキナーゼは、リン酸化及び骨格筋転写因子の内因性活性を増加することによって、筋形成の促進することが示されている。
よって、カスパーゼ３／ＭＳＴ１シグナルルートにおける下流基質として、これらのキナーゼの能力を調べた。興味深いことに、カスパーゼ３の抑制により、ＭＫＫ６及びｐ３８αの両方の活性化が遮断される。総合的に考えれば、これらデータは、ＭＳＴ１が骨格筋の分化を効果的に促進するＭＡＰＫカスケードの下流メンバーを増強するように作用することを示すものである。
【０２０２】
１．４  活性型ＭＳＴ１はカスパーゼ３-/-筋芽細胞中の筋形成を救済する
筋形成におけるＭＳＴ１の効果を示すために、野性型ＭＳＴ１、活性化ＭＳＴ１（ａａ  １−３３０、ＭＳＴ１−ａｃｔ）、またはプラスミド単独を、カスパーゼ３-/-マウス由来の一次筋芽細胞中へ一時的にトランスフェクトした。これらの構築物の活性は、一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞からのＭＳＴ１のＨｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１標的キナーゼ分析によって確認した（図５Ａ）。
ＭＳＴ１−ａｃｔをトランスフェクトした細胞は、高レベルのキナーゼ活性を示した。プラスミド単独または野性型ＭＳＴ１の何れかをトランスフェクトしたカスパーゼ３−／−筋芽細胞は、一核筋芽細胞のままであった（図５Ｂ，Ｄ）。一方、ＭＳＴ１−ａｃｔをトランスフェクトしたカスパーゼ３-/-筋芽細胞は、伸張し、近接する細胞と融合して多核性の筋管を形成した（図５Ｃ，Ｅ）。これは、カスパーゼ３-/-筋芽細胞中の活性化MST1の発現が、異常な筋原性フェノタイプを救済することを示すものである。
さらに、活性化ＭＳＴ１の前筋原的役割を明らかにするために、ＭＳＴ１−ａｃｔを野性型一次筋芽細胞にトランスフェクトした。分化培地に２日間おかれたトランスフェクト野性型培養物は、分化４〜５日後の野性型培養物と比較してフェノタイプ的特徴を示した（図５Ｆ，Ｇ）。さらに、分化タイムコースを延長（４日間以上）したＭＳＴ１−ａｃｔトランスフェクト細胞は、アポトーシスの増加を示すことが観察された。これらの結果は、ＭＳＴ１の内因性の活性化パターンが骨格筋細胞の分化を加速し、活性化期間が延長すると該キナーゼにより強力なアポトーシス現象がもたらされることを示す。
【０２０３】
さらに詳細には、図５は次のことを示す：
（Ａ）  ＭＳＴ１タンパク構築物物のキナーゼ活性。完全長ＭＳＴ１または切断されたＭＳＴ１（ａａ  １−３３０，  ＭＳＴ１−ａｃｔ）をＣＯＳ１細胞へトランスフェクション（ｎ＝４）。トランスフェクション後、ＭＳＴ１を免疫沈降し、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１標的キナーゼ分析に用いた。サンプルのローディングの精度は、クーマシー染色により示される。
(B)  ベクター単独をトランスフェクトしたカスパーゼ３ノックアウト筋芽細胞は、分化しなかった。
（Ｃ）  ＭＳＴ１−ａｃｔを含むカスパーゼ３ノックアウト筋芽細胞は、分化して融合した多核性の筋管を形成した。ＭＳＴ１−ａｃｔ筋芽細胞中での分化率は８５％以上であった。
全部の核をＤＡＰＩ染色を用いて目視化した（Ｄ及びＥ）。核は、ベクター単独を含む筋芽細胞（パネルＤ）よりも、ＭＳＴ１−ａｃｔを含む筋芽細胞（パネルＥ）の方がより多く、より密接である。
ＭＳＴ１−ａｃｔをトランスフェクトした野性型筋芽細胞（Ｆ）は、非トランスフェクト野性型筋芽細胞と比較して２日後の筋形成を加速し、４日間分化させた非トランスフェクト野生型筋芽細胞と同程度であった（Ｇ）。
【０２０４】
前記実施例は、カスパーゼ３の生物学的封鎖及び化学的封鎖の両方が筋形成において重大な欠損を招き、またＳｔｅ２０−ｌｉｋｅキナーゼＭＳＴ１が、筋肉分化のカスパーゼ３誘導の介在において重要なパイプ役を果たすことを示す。従来の報告は、カスパーゼ３があるタイプの細胞において非アポトーシス的機能、すなわち、分化中のレンズ上皮及びケラチノサイトにおける核排出（Ｇｒａｖｅｓ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  １４９０９−１４９１５；  Ｉｓｈｉｚａｋｉ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．    １４０，  １５３−１５８）、及びＴ−細胞の活性化（Ｗｅｉｌ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ９，  ３６１−３６４））を調節できることを示唆している。それでも、本観察は、フェノタイプのように死を招くことのない細胞形態の重大な変化にカスパーゼ３活性を直接結びつける初めてのものである。また、同様のシグナル伝達要素（ＭＳＴ１、ＭＫＫ６、ｐ３８）が、肝細胞、胸線細胞及びニューロンを含む多くの分化した細胞においても見られること（Ａｌａｍ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９０，  １８７９−１８９０；  Ｚｈｅｎｇ，  Ｔ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  ９５，  １３６１８−１３６２３；  Ｋｏ，  Ｈ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７４，  ２４５５−２４６１）、よって、カスパーゼ３／ＭＳＴ１シグナル伝達が、一般に細胞分化の開始に欠くことのできない構成要素であるということに注目することが重要である。
【０２０５】
実施例２：種々の幹細胞群におけるカスパーゼ３及びプロカスパーゼ３の局在
プロカスパーゼ３（すなわち、その切断されていない不活性型）が骨格タンパクとして作用する可能性を探るため、プロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の局在化試験を実施した。「骨格タンパク」という用語は、プロカスパーゼ３が、幹細胞における分化効果（またはアポトーシス効果）を誘導するのに必要な他のシグナル伝達タンパクと分子複合体を形成することを指す。骨格タンパクとして作用する利点は、正確な刺激、すなわち、細胞死の誘導よりは分化を引き起こすための刺激が与えるのに、プロカスパーゼ３型が急速に活性化でき、前分化効果を促進する鍵となるシグナル伝達経路に存在することができることである。大抵のシグナルトランスダクションカスケードのように、カスパーゼ３の応答は用量及び時間依存性である。このように骨格タンパクとして作用することにより、カスパーゼ３は、細胞内環境が要求する正確な効果（すなわち、増殖または分化）をもたらす、より良い機会を有する。
【０２０６】
図１０は、増殖中及び分化中の筋芽細胞中のプロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の局在を示す。
（Ａ）は、骨格筋芽細胞の成長（分化）中において、プロカスパーゼ３を（Ｃｙ３）赤で染色したもの、及び切断型の活性型カスパーゼ３をＦＩＴＣで染色（緑色）したものを示す。プロカスパーゼ３は細胞の全範囲に分布する。活性型カスパーゼ３も核（ＤＡＰＩ染色の青で示される）周辺に点在した蓄積状態で細胞の全範囲に分布する。プロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の両者の併合は、両タンパクの共局在を示す。
（Ｂ）  プロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の再分布は、骨格筋芽細胞の分化中観察される。ＦＩＴＣ（緑）により示される活性型カスパーゼ３は細胞の全範囲に局在するが、蓄積がより点在した状態で核（ＤＡＰＩ染色の青で示される）周辺に認められる。プロカスパーゼ３は、（成長細胞との比較して）核周辺にはほとんど蓄積の点在はなく、細胞の全範囲でより分散されたパターンを示す。
（Ｃ）及び（Ｄ）  活性型カスパーゼ３は、筋芽細胞分化の後期中において消失し、一方、プロカスパーゼ３は細胞の全範囲に分布したままである。
【０２０７】
図１１は、増殖中及び分化中の一次線条体幹細胞における、プロカスパーゼ３（Ａ）及び活性型カスパーゼ３（Ｂ）の局在を示す。この図は、細胞の主要部分から切り離された細胞（ニューロスフェア）では、活性型カスパーゼ３が明確に染色されているのに対し、切り離されていない細胞（すなわち、ほとんど分化していない細胞）においてはプロカスパーゼ３が明確に染色されていることを示す。
筋芽細胞及び線条体幹細胞におけるカスパーゼ３及びプロカスパーゼ３の局在確認及び視覚化に関する方法論については実施例３を参照（下記）。
【０２０８】
実施例３：一次線条体幹細胞におけるカスパーゼ３の抑制
原料及び方法：
＜線条体幹細胞の産生と取り扱い＞
妊娠Ｅ１３日目（Ｅ０はプラグが確認された日）に、妊娠雌マウスをその胚を傷つけないように（すなわち、脊髄脱臼）死亡させた。その後、腹部に７０％エタノールを噴霧した。腹部に対して垂直に２ｃｍ開腹した。ホーンを滅菌ピンセットで取り出し、ＰＢＳ中に入れた。ホーンを切り開いて一つの胚を一度に露出させ、各胚を２ｍｌのＰＢＳを入れた別々の３５ｍｍの組織培養皿に入れた。各々の胚は皿にピンで固定し、外皮を一枚一枚はがして線条体を露出させ、取り外した。線条体組織を、氷冷下、冷Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＢＳ）を入れた５０ｍＬのファルコンチューブに入れ、組織がチューブの底に沈むようにした。ＨＢＳＳを２ｍｌの完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地で置換し、組織をそのフラグメントがほとんど残らなくなるまで、注意深く粉砕した。上澄みを集め、組織のフラグメントを１ｍｌの培地中で粉砕した。上澄みをさらに取って、集めておいた最初の上澄みと一緒に保存した。
【０２０９】
この時点で、細胞数をトリパンブルー（１／５希釈）のアリコートを用いてカウントすることができる。細胞は完全増殖培地２５ｍｌ当たり１００万個の細胞密度とし、完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地中で４日間成長させ、４日目にプレートがコンフルエントになりすぎているようであれば、拡張した。拡張の必要がない場合は、細胞を集菌する前にさらに数日間成長させた。一次培養物を拡張するため、細胞懸濁液の半分を新しい皿に入れ、１２．５ｍｌの完全増殖培地を最初のプレートと拡張プレートのそれぞれに添加した。数日後、スフェアのほとんどがプレートから持ち上がり、スフェア懸濁液はコンフルエントであった。この時点で、細胞を成長培地に移すか、凍結するか、分化プレートに植えつけるかの何れかとした。
【０２１０】
＜線条体幹細胞の解凍＞
凍結細胞を入れたバイアルを、３７℃のインキュベーター内で、ほとんど解凍されるまで温め、その後１ｍｌの完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地を各バイアルに滴下した。スフェア懸濁液を８ｍｌの完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地が入った新しいチューブに移し、チューブを４℃で５分間、５００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液の半分をアスピレーションにより取り出し、スフェアペレットを５ｍｌピペットを用いて５回注意深く再懸濁した。次いで、スフェア懸濁液を１０ｃｍの皿に入った２５ｍｌの完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地に入れ、３７℃でインキュベートした。毎日、スフェアの生育性と拡張性を観察した。培養物はスフェアのほとんどがプレートから離れるまで成長させた（５〜１０日間）。
【０２１１】
＜線条体幹細胞のプレーテュング及び分化＞
ニューロスフェアの分化のため、ニューロスフェアをラミニン及びポリ−Ｄ−リジンでコーティングした表面上に塗布しなければならない。スフェア懸濁液を１０ｃｍの皿から集め、５０ｍｌチューブに入れて４℃で５分間、５００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を吸い出して除去し、２ｍｌの完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地を添加し、スフェアペレットをスフェアが再懸濁するまで注意深く粉砕した。その後、スフェア懸濁液を完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ増殖培地で所望の濃度に希釈した（ニューロスフェアの１０ｃｍ皿一つは、約４のコーティングされたチャンバースライドに適当である）。１チャンバー当たりスフェア懸濁液２ｍｌを塗布し、３７℃で数時間後、培地を完全Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ分化培地に変えた。
【０２１２】
＜細胞のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定＞
新しく調製した４％ＰＦＡを用いた。培地をウェルから吸引除去し、各ウェルを２ｍｌのＰＢＳで３分間洗浄した。ウェルからＰＢＳを吸引除去後、１．５ｍｌの４％ＰＦＡを各ウェルに添加し、室温にて１０分間（Ｃ２Ｃ１２）、あるいは３０分間（ニューロスフェア）、インキュベートした。その後ＰＦＡをウェルから吸引除去し、各ウェルを２ｍｌのＰＢＳで３分間洗浄した。ウェルからＰＢＳを吸引除去した後、各ウェルに２ｍｌのＰＢＳを添加し、染色に必要とされるまでプレートを４℃で保存した。
【０２１３】
＜免疫細胞化学＞
４％ＰＦＡ固定で固定され、ＰＢＳで洗浄された細胞を、室温で１０分間、１ｍｌの０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｉｎ  ＰＢＳ）中でインキュベートし、その後、２ｍｌのＰＢＳで３回室温で４分間洗浄した。ＰＢＳを吸引除去した後、細胞を室温１時間、５％ウマ血清（ｉｎ  ＰＢＳ）でブロックした。ブロック溶液を吸引除去後、細胞を１ウェル当たり１ｍｌの一次抗体（Ｃ２Ｃ１２細胞用はｉｎ  ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ、ニューロスフェア用はｉｎ  ＰＢＳ＋１０％ＨＳ）で終夜４℃でインキュベートした。（用いた一次抗体の希釈度：活性カスパーゼ３（Ｒｂ  Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）  １：５０、プロカスパーゼ３（Ｍｓ  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）  １：５００、Ｍｆ２０（Ｍｓ）  １：５０。）その後、各ウェルを２ｍｌのＰＢＳで３回室温にて５分間洗浄し、細胞を室温で１時間、１ウェル当たり１ｍｌのニ次抗体（Ｃ２Ｃ１２細胞用はｉｎ  ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ、ニューロスフェア用はｉｎ  ＰＢＳ＋１０％ＨＳ）とインキュベートした（この時点から細胞を遮光した）。（用いたニ次抗体の希釈度：ＦＩＴＣ（Ｒｂ  Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）  １：１５０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（Ｍｓ  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）  １：１５０。）各ウェルは２ｍｌのＰＢＳで３回室温で５分間洗浄し、細胞を室温で１０分間、１ｍｌのＤＡＰＩ（１：１０００希釈、ｉｎ  ＰＢＳ）とインキュベートした。各ウェルを２ｍｌのＰＢＳで５分間室温にて再洗浄し（ウェル壁面に沿わせてＰＢＳを添加）、細胞を封入用のｄｄＨ２Ｏ２ｍＬ中に懸濁した。
【０２１４】
結果
Ｅ１４胎児マウス由来の一次線条体ニューロスフェアは、培地中で増殖し続けることが可能であり、あるいは、別の神経細胞系列へと分化を誘導することができる。分化した神経組織は、ニューロンあるいはグリア（乏突起神経膠細胞及び星状細胞も、他の系列も含む）を形成することができる。
【０２１５】
ニューロスフェアをＥ１４マウスから培養し、１μＭのカスパーゼ３抑制剤ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（+/-カスパーゼ３抑制剤）の存在下あるいは非存在下でインキュベートした。インキュベート後、ニューロスフェアの増殖能力及び／または分化能力を調べた。細胞は固定し、神経系列のマーカーを免疫染色した。
【０２１６】
増殖中の線条体幹細胞を抗ネスチン抗体で染色し（初期神経細胞のマーカー）、Ｃｙ３蛍光色素で対比染色することにより視覚化した。細胞は核が見えるようにＤＡＰＩで共染色した。通常、初期の神経前駆体は、ニューロスフェア成長中に存在する。この実験結果は、図１２（Ａ）に示すように、この特定の抑制剤を用いたカスパーゼ３の抑制が細胞サイクルに影響を与えないことを示す。
【０２１７】
図１２（Ｂ）は、抗ミエリン塩基性タンパク抗体（乏突起神経膠細胞系統のマーカー）で染色し、ＦＩＴＣ蛍光色素で対比染色することにより視覚化した増殖中の細胞を示している。細胞は核が見えるようにＤＡＰＩで共染色した。予想どおり、分化した乏突起神経膠細胞はニューロスフェア成長中には存在しない。
【０２１８】
図１２（Ｃ）は、抗グリア繊維性酸性タンパク抗体（星状細胞系統のマーカー）で染し、ＦＩＴＣ蛍光色素で対比染色することにより視覚化した増殖中の細胞を示している。細胞は核が見えるようにＤＡＰＩで共染色した。予想どおり、分化した星状細胞はニューロスフェア成長中には存在しない。
【０２１９】
分化中の線条体幹細胞（４８時間）も抗ネスチン抗体で染色し、Ｃｙ３蛍光色素で対比染色することにより視覚化した。細胞は核が見えるようにＤＡＰＩで共染色した。初期の神経前駆体は細胞分化中には存在せずに細胞成長中に存在するべきである。
図１３（Ａ）は、初期の神経前駆体がカスパーゼ３抑制剤で処理されていない細胞中には存在しないことを示す。しかしながら、カスパーゼ３抑制剤の存在下では、ネスチンの存在によって示されるように、細胞は未分化の系列を維持する。従って、カスパーゼ３の抑制は神経細胞の分化を抑制する。
【０２２０】
図１３（Ｂ）は、抗ミエリン塩基性タンパク抗体（乏突起神経膠細胞のマーカー）で染色し、ＦＩＴＣ蛍光色素で対比染色することにより視覚化した分化中の細胞を示す。細胞は核が見えるようにＤＡＰＩで共染色した。分化したニューロスフェアは乏突起神経膠細胞の存在を示すべきである。カスパーゼ３抑制剤の非存在下でインキュベートした細胞は、乏突起神経膠細胞の明確な染色からわかるように、適切に分化した。カスパーゼ３抑制剤の存在下でインキュベートした細胞は、乏突起神経膠細胞の明確な染色が認められず、これは、これらの細胞の分化が遅延あるいは停止されたことを示すものである。従って、カスパーゼ３の抑制は、乏突起神経膠細胞の形成を抑制し、よって神経細胞の分化を抑制する。
【０２２１】
図１３（Ｃ）は、グリア繊維性酸性タンパク抗体（星状細胞のマーカー）で染色し、ＦＩＴＣ蛍光色素で対比染色することにより視覚化した分化中の細胞を示している。細胞は核が見えるようにＤＡＰＩで共染色した。星状細胞は、分化した神経細胞系列の一部分である。カスパーゼ３抑制剤非存在下でインキュベートした細胞では、星状細胞マーカーが明確に染色され、一方、カスパーゼ３抑制剤非存在下で分化した細胞は星状細胞が染色されなかった。これは、カスパーゼ３抑制が星状細胞の形成も遅延あるいは停止させることを示すものである。従って、カスパーゼ３活性の非存在下では、神経細胞の分化が抑制される。
【０２２２】
実施例４：ヒトプロカスパーゼ３のクローニング
細胞中のプロカスパーゼ３と他のタンパクとの間の一時的なタンパク−タンパク相互作用の調査を容易するために、プロカスパーゼ３遺伝子をＰＣＲ増幅してクローニングに供した。具体的には、ＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩの挿入のために、プロカスパーゼ３の５’末端と３’末端の各々に制限部位を提供するプライマーを用いて、ＨｅＬａ細胞ＲＮＡの逆転写ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡプールからヒトのプロカスパーゼ３遺伝子（Ｕ２６９４３）を、ＰＣＲ増幅した：
５’Ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
３’Ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＣＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＰＣＲプロトコルは次の通り：９５℃２分、（９９℃１分、５５℃１分、７２℃１分）の３０回繰り返し、７２℃１０分。
【０２２３】
ＰＣＲフラグメントは、その後ＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩで消化され、対応するＥｃｏＲＩ及びＰａｃＩ部位を有する適当なベクターに連結することができる。組換え型ベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａｌｐｈａ細胞へトランスフォーメーションし、組換え型ベクターを含む単一の細菌コロニーを選択した後、プラスミドＤＮＡの大スケールでの調製を行うことができる。次いでプラスミドＤＮＡを精製し、プロカスパーゼ３の挿入の確認のために配列決定することができる。
【０２２４】
実施例５：種々幹細胞の初期の分化におけるカスパーゼ３の役割の決定方法
多様な組織起源を利用した従来の研究は、ヘキスト染料で染色された細胞懸濁液がヘキスト流出サブ細胞群（サイド細胞群あるいはＳＰ細胞）を明らかにすることを示している。これらの細胞は幹細胞様活性を有し、また多剤抵抗性タンパクの抑制剤であるベラパミルの存在に敏感であるという特徴も有する（Ｇｏｏｄｅｌｌ，  Ｍ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８３，  １７９７−１８０６ ；  Ｇｕｓｓｏｎｉ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，  ３９０−３９４ ；  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｋ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０７，  １３９５−１４０２）。実験的に操作可能である成人心臓の常在性心臓幹細胞群が最近報告されている（Ｈｉｅｒｌｉｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５３０，  ２３９−２４３）。
【０２２５】
心臓幹細胞の初期分化過程におけるカスパーゼ３の役割は、心臓ＳＰ細胞を用いて直接分析することができる。共培養試験は、カスパーゼ３抑制剤及びカスパーゼ８抑制剤の存在下で、Ｚ／ＡＰ由来心臓ＳＰ細胞及び非標識心筋細胞を用いて行うことができる。免疫組織化学的分析を行い、１つ以上のカスパーゼ３調節剤で処理した後、β−グルコシダーゼ活性、及びコネキシン−４３、ＭＥＦ２Ｃ、ミオシン重鎖のような心筋細胞特異的マーカーの発現を共染色して同定することができる（ＦＩＴＣ接合抗体を用いる）。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方における心筋細胞の分化に関与するカスパーゼ３ヌル型心臓ＳＰ細胞の能力を分析することができる。活性化ＭＳＴ−１  （Ａｄ−ＡｃｔＭＳＴ−１）や、キナーゼ失活ＭＳＴ−１（Ａｄ−ｋｄＭＳＴ−１）、野性型ＭＳＴ−１（Ａｄ−ｗｔＭＳＴ−１）を含む一連のＥ１削除アデノウィルスベクターが開発され、これらは心臓SP細胞に感染させ、共培養誘導分化に対する応答を試験するのに用いることができる。この際、カスパーゼ３ヌル型マウスは機能的な心筋を発達させることに注目することが重要である。フェノタイプのこのようなはっきりとした欠損は、ＭＳＴ−１を活性化する能力があることが示されたカスパーゼ８の補償活性から生じるのかもしれず（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９，  １１０２５−１１０３０参照）、このことは、カスパーゼ３またはカスパーゼ８のいずれかが心臓系列における分化プロセスを保証するかもしれないということを示唆するものである。カスパーゼ３ヌル型心臓ＳＰ細胞及び一次心筋細胞を用いた共培養試験を、カスパーゼ８抑制剤の共存下及び非共存下で行い、各々のプロテアーゼの役割を同定する手助けとすることができる。
【０２２６】
さらに、野性型及びカスパーゼ３ヌル型由来心臓ＳＰ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの心筋細胞再構成能力を評価することができる。この試験を実施するために、カスパーゼヌル型マウスが、損傷のある心筋に注射された場合にこれらの細胞の位置と運命を追跡できるようＺ／ＡＰマーカー染色して飼育されている。また、これら分析は、神経由来ＳＰ細胞及び胎齢１４日由来皮質前駆細胞を用いて行ってもよい。共培養試験はＺ／ＡＰマーカー染色及び適当な神経マーカーを利用する。
【０２２７】
同様に、脳や骨髄由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養ＳＰ細胞群において、カスパーゼ３調節剤の効果を評価することができる。細胞の数、成長曲線、ＤＮＡ複製マーカー、及びウェスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ法による分化に特異的な遺伝子産物の資料も含めて分化の表示を行うことができる。これらの試験の後、適当な系列特異的共培養試験を行って、カスパーゼ３調節が細胞の可塑性／生育性を変化させないことを確かめることができる。
【０２２８】
また、前記試験を補足するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験も行うことができる。調節剤濃度を変えてマウスを処理するのに用い（尾静脈注射）、続いて回収した単一細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析を行うことができる。本方法では、種々の組織起源（骨格筋、心臓、脳、及び骨髄）からのＳＰ群を測定し、プロカスパーゼ３調節とポストカスパーゼ３調節とを比較する。Ｃ５７ＢＬ／６野性型マウス、カスパーゼ３異型接合型マウス、及びカスパーゼ３ヌル型マウスにおけるこれらの同じ組織起源からのＳＰフラクション（Ｆｒａｓｃｈ，  Ｓ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ８３８９−８３９７；  Ｋｕｉｄａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，  ３６８−３７２）（通常各ゲノタイプに対しｎ＝５）は、記載されているように（Ｃｒｅｇａｎ，  Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ．  １９，  ７８６０−７８６９）、比較することができる。
【０２２９】
さらに、各標的組織においてそれぞれ障害を誘導するｉｎ  ｖｉｖｏ試験（例えば、心筋梗塞を誘導する冠状動脈結結紮、急性虚血性脳疾患を誘導する頚動脈閉塞、及び再生応答反応を誘導する骨格筋への直接的カルジオトキシン注射など）を行うことができる。所望の幹細胞群をｉｎ  ｖｉｖｏ拡張及び／または分化するために、カスパーゼ３調節剤の濃度を変えて投与し、修復プロセスの促進に影響を与えることができる。
【０２３０】
以上の発明は、明瞭性及び理解を目的としていくらか詳しく記載してきたが、本発明及び添付の請求項の真の範囲を逸脱しないで形式及び詳細において多様な変更が可能であるということは、本発明の開示から当業者が認識できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】図１は、カスパーゼ３ヌル型筋芽細胞における不完全な筋管形成を示している。
【図２】図２は、カスパーゼ３活性が骨格筋分化に必要であることを示している。
【図３】図３は、活性化されたカスパーゼ３による成長中の筋芽細胞の分化誘導を示している。
【図４】図４は、骨格筋の分化中、カスパーゼ３によりＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ（ＭＳＴ１）が活性化することを示している。
【図５】図５は、活性化されたＭＳＴ１によりカスパーゼ３-/-筋芽細胞フェノタイプが救済されることを示している。
【図６】図６は、ヒトカスパーゼ３遺伝子のヌクレオチド配列を示している［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ｜８５７５６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１］。
【図７】図７は、（Ａ）ヒトカスパーゼ３タンパクのアミノ酸配列［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ｜８５７５６９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］、（Ｂ）活性型カスパーゼ３タンパクの一つの型のアミノ酸配列（アミノ酸９と１０の間で切断）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］、（Ｃ）活性型カスパーゼ３タンパクの別の型のアミノ酸配列（アミノ酸２８と２９の間で切断）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］、（Ｄ）及び（Ｅ）活性型カスパーゼ３タンパクの２つの可能なサブユニットのアミノ酸配列（アミノ酸１７５及び１７６の間でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の切断）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（Ｄ）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（Ｅ）］、を示している。
【図８】図８は、ヒトＭＳＴ１遺伝子のヌクレオチド配列を示している［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ｜１１１７７９０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３］。
【図９】図９は、ヒトＭＳＴ１タンパクのアミノ酸配列を示している［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｇｉ｜１１１７７９１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４］。
【図１０Ａ】図１０Ａは、成長条件下の筋芽細胞中におけるプロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の分布を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、分化条件下１２時間後の筋芽細胞中におけるプロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の分布を示している。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、分化条件下２４時間後の筋芽細胞中におけるプロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の分布を示している。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、分化条件下４８時間後の筋芽細胞中におけるプロカスパーゼ３及び活性型カスパーゼ３の分布を示している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、成長条件下及び分化条件下（１２時間、２４時間、４８時間）で培養した、一次線条体幹細胞中におけるプロカスパーゼ３の分布を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、成長条件下及び分化条件下（１２時間、２４時間、４８時間）で培養した、一次線条体幹細胞中における活性型カスパーゼ３の分布を示している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、カスパーゼ３抑制剤の存在下あるいは非存在下で増殖中の線条体幹細胞の、ネスチン染色を示している。
【図１２Ｂ】図１２Ａは、カスパーゼ３抑制剤の存在下あるいは非存在下で増殖中の線条体幹細胞のミエリン塩基性タンパク染色を示している。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、カスパーゼ３抑制剤の存在下あるいは非存在下で増殖中の線条体幹細胞のグリア線維性酸性タンパク染色を示している。
【図１３Ａ】図１３Ａは、カスパーゼ３抑制剤の存在下あるいは非存在下において４８時間分化後の線条体幹細胞のネスチン染色を示している。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、カスパーゼ３抑制剤の存在下あるいは非存在下において４８時間分化後の線条体幹細胞のミエリン塩基性タンパク染色を示している。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、カスパーゼ３抑制剤の存在下あるいは非存在下において４８時間分化後の線条体幹細胞のグリア線維性酸性タンパク染色を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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