(57)【要約】本発明は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３のアポトーシス活性を阻害するポリペプチドまたはその部分に関し、上記ポリペプチドの活性を妨害する作用物質を同定するスクリーニング方法を含む。
2006517787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする単離核酸分子、またはそれらの配列変異体であって、前記ポリペプチドは、図１ａまたは図１ｂに表されるポリペプチド配列の断片であって、該断片は、
ｉ）図１ａまたは図１ｂに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、
ｉｉ）図１ａまたは図１ｂに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片であって、前記配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されたポリペプチド断片、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）に定義されるようなポリペプチドであって、図１ａまたは図１ｂに表されるポリペプチドの生物活性を実質的に保持するポリペプチド
からなる群から選択される核酸分子。
【請求項２】
前記分子は、図１ａに表される配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなる断片をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記分子は、ヒトから単離される、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記分子は、図１ｂに表される配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなる断片をコードする、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記分子は、線虫から単離される、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記分子は、ポリペプチド、またはそれらの配列変異体をコードし、前記ポリペプチドは、図２に表されるアミノ酸配列により表されるポリペプチドの活性を阻害する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子はｃＤＮＡである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子はゲノムＤＮＡである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド断片またはそれらの配列変異体。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
前記ベクターは発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１１または１２に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞。
【請求項１４】
医薬品として使用するための請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１５】
医薬品として使用するための請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
希釈剤、キャリアまたは賦形剤をさらに含む、請求項１４または１５に記載の核酸またはポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドのｐ５３への結合を阻害する作用物質の同定のためのスクリーニング方法における請求項１０に記載のポリペプチドまたはそれらの断片の使用。
【請求項１９】
ポリペプチドまたはそれらの断片のｐ５３への結合を阻害する作用物質を同定するスクリーニング方法であって、
ｉ）
ｃ）本発明によるポリペプチド、および
ｄ）（ａ）におけるポリペプチドに関する結合部位（複数可）からなるｐ５３ポリペプチドまたはそれらの断片
を含む調製物を形成すること、
ｉｉ）試験されるべき少なくとも１つの作用物質を供給すること、
ｉｉｉ）（ａ）におけるポリペプチドの（ｂ）におけるポリペプチドへの結合に関して前記作用物質の活性を決定することと
を含む方法。
【請求項２０】
前記作用物質はポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドはペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、抗体またはそれらの結合部分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記断片はＦａｂ断片である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｂ断片、ならびにＣＤＲ３領域からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体はヒト化されている、請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体はキメラ抗体である、請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
線虫から単離される単離核酸分子であって、図１ｂにより表されるような核酸配列をハイブリダイズし、ｐ５３の阻害剤をコードする核酸分子。
【請求項２９】
前記分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である、請求項２８または２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
図２ｂに表されるようなアミノ酸を含む単離ポリペプチドまたは変異ポリペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾され、かつｐ５３の阻害剤である単離ポリペプチドまたは変異ポリペプチド。
【請求項３２】
有効量の請求項１０に記載のポリペプチドを投与することを含む動物の治療方法であって、前記有効量は、ｐ５３のアポトーシス活性を誘発する方法。
【請求項３３】
有効量の請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸分子、あるいは請求項１１または１２に記載のベクターを投与することを含む動物の治療方法であって、前記有効量は、ｐ５３のアポトーシス活性を誘発する方法。
【請求項３４】
前記治療は、癌治療である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドの長さは、少なくとも６アミノ酸残基である、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドの長さは、少なくとも７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１６アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１８アミノ酸残基、１９アミノ酸残基または２０アミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドの長さは、少なくとも２０アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、９０アミノ酸残基または１００アミノ酸残基である、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３９】
ＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項３５に記載のペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドは、複数のアルギニン残基をさらに含む、請求項３５ないし３９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４１】
前記複数のアルギニン残基は、少なくとも２アルギニン残基長、３アルギニン残基長、４アルギニン残基長、５アルギニン残基長、６アルギニン残基長、７アルギニン残基長、８アルギニン残基長、９アルギニン残基長または１０アルギニン残基長である、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
医薬品として使用するためのＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるペプチド。
【請求項４３】
ＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４４】
前記組成物は、キャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
請求項３５ないし４２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの抗癌剤を含む医薬組成物。
【請求項４６】
前記抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、エトポシド、コルヒシン、メシル酸デフェロキサミン、およびカンプトテシンからなる群から選択される、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記抗癌剤はシスプラチンである、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記抗癌剤はドキソルビシンである、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
請求項３５ないし４２のいずれか１項に記載のペプチドおよび抗体またはその結合部分を含む複合体。
【請求項５０】
前記抗体またはその結合部分は、細胞特異的抗体である、請求項４９に記載の複合体。
【請求項５１】
前記抗体は、癌細胞特異的抗体である、請求項４９または５０に記載の複合体。
【請求項５２】
動物、好ましくはヒトの治療方法であって、前記動物は、有効量の請求項３５ないし４１のいずれか１項に記載のペプチドを投与することを含むアポトーシスの誘発から利益を得る方法。
【請求項５３】
動物、好ましくはヒトの治療方法であって、前記動物は、有効量の請求項４３ないし４８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４９ないし５１のいずれか１項に記載の複合体を投与することを含むアポトーシスの誘発から利益を得る方法。
【請求項５４】
前記治療は、癌治療である、請求項５２または５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３のアポトーシス活性を阻害するポリペプチドまたはその部分、上記ポリペプチドの活性を妨害する作用物質を同定するスクリーニング方法、および上記活性を有する作用物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、多細胞生物が細胞数および分化を調節するプロセスである。このプロセスは、アポトーシス活性を誘発するか、または防止する因子により調節される。アポトーシスの誘発因子としては、Ｂｃｌ−２ファミリーの成員（member)、カスパーゼファミリーの成員ならびにそれらの関連因子Ａｐａｆ−１およびＦａｄｄが挙げられる。カスパーゼは、タンパク質分解性切断後に活性化されるようになるプロ酵素として合成される。次に、活性カスパーゼは、アポトーシスに関連した多くの形態学的および生化学的変化を誘発する。ミトコンドリアは、チトクロームｃ、ＡＩＦおよびＤｉａｂｌｏのようなアポトーシス促進（pro-apoptotic）因子の放出により活性化プロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。ミトコンドリアからの放出は、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質により制御される（例えば、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ１は放出を阻害し、ＢａｘおよびＢａｋは放出を誘発する）。
【０００３】
国際公開９９／５３０５１号パンフレットは、アポトーシス促進活性を有するサイトカイン依存性タンパク質ｐ２１を開示する。ｐ２１は、骨髄系／赤血球系細胞においてサイトカイン依存性様式で発現される。これらの細胞は、成長に関してＩＬ−３に依存性であり、ＩＬ−３の非存在下では、ｐ２１の翻訳が誘発され、その結果アポトーシスおよび細胞死をもたらす。ｐ２１は、外側のミトコンドリア膜へ移行して、アポトーシス促進活性を誘発する細胞質タンパク質である。
【０００４】
腫瘍抑制タンパク質もまた、アポトーシス促進活性を有する。
【０００５】
腫瘍抑制遺伝子は、細胞成長または分裂を阻害するように機能するタンパク質をコードし、したがって正常細胞の増殖、成長および分化の維持に関して重要である。腫瘍抑制遺伝子における突然変異は、異常な細胞周期の進行をもたらし、それにより例えばＤＮＡが損傷を受けた場合に細胞周期を停止させる正常細胞周期チェックポイントが無視され、損傷を受けた細胞は制御不能に分裂する。腫瘍抑制遺伝子の産物は、細胞の全部分（例えば、細胞表面、細胞質、核）で機能して、損傷を受けた細胞が細胞周期（すなわち、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍおよび細胞質分裂）を通過するのを防止する。
【０００６】
最も熱烈な研究の対象であった腫瘍抑制遺伝子はｐ５３であることはほぼ間違いない。ｐ５３は、転写因子として機能するタンパク質をコードし、細胞分裂周期の重要な調節因子である。ｐ５３は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原へ親和性をもって結合することが示されたタンパク質として１９７８年に発見された。ｐ５３遺伝子は、分子量５３ｋＤａを有する３９３アミノ酸ポリペプチドをコードする。ｐ５３の転写活性により調節される遺伝子は、それらの５’領域にｐ５３認識配列を含有する。これらの遺伝子は、ｐ５３の細胞レベルが例えばＤＮＡ損傷に起因して上昇すると活性化される。ｐ５３に応答する遺伝子の例としては、ｍｄｍ２、ＢａｘおよびＰＩＧ−３が挙げられる。ＢａｘおよびＰＩＧ−３は、ｐ５３の最も重要な機能の１つであるアポトーシスの誘発に関与する。
【０００７】
本発明者の同時係属中出願国際公開０２／１２３２５号パンフレットでは、本発明者等は、ｐ５３の特異的活性化因子としてＡＳＰＰと称されるタンパク質ファミリーについて開示しており、野生型ｐ５３がヒト乳癌のような腫瘍において容認されるメカニズムを明らかにした。本発明者等はまた、ｉＡＳＰＰと称されるＡＳＰＰファミリーの成員の阻害剤について開示している。ｉＡＳＰＰは発癌遺伝子であり、ＡＳＰＰファミリーの最も保存される成員である。ｉＡＳＰＰは、Ｃ．エレガンス(C. elegans)において見出される唯一のＡＳＰＰ様タンパク質である。ヒトｉＡＳＰＰと同様に、Ｃ．エレガンス相同体は、ｐ５３の重要な阻害剤として機能する。これらの見解により、ＡＳＰＰファミリーの成員によるｐ５３機能の調節は、門（phyla）にわたって進化的に保存されていることが示される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ｃ．エレガンスｉＡＳＰＰは、ヒト細胞において実施されるアッセイすべてにおいてヒトｉＡＳＰＰと置き換えることが可能である。さらに、相互置換研究により、Ｃ．エレガンスｐ５３のアポトーシス機能は、ヒトＡＳＰＰおよびｉＡＳＰＰそれぞれにより、増強または阻害されることが明らかとなっている。本発明者等はさらに、ＲＮＡｉを使用して、ｉＡＳＰＰが、Ｃ．エレガンスにおけるｐ５３媒介性アポトーシスの重要な阻害剤であることを実証している。これらの観察すべてにより、ＡＳＰＰファミリー成員によるｐ５３の調節が進化的に保存されることが示される。ｐ５３活性の制御は、発達および腫瘍形成において極めて重要な役割を果たす。したがって、ｉＡＳＰＰの発癌遺伝子機能の阻害は、腫瘍発現性野生型ｐ５３を処理するための重要な新たな戦略を提供することができる。Ｃ．エレガンスとヒトｉＡＳＰＰとの間の配列比較により、線虫とヒト配列との間の保存ドメインが明らかとなり、これがタンパク質間の機能的保存の説明となる可能性が高い。
【０００９】
本発明の態様によれば、ポリペプチドをコードする単離核酸分子、またはそれらの配列変異体であって、上記ポリペプチドは、図１ａまたは図１ｂに表されるポリペプチド配列の断片であって、該断片は、以下の：
ｉ）図１ａまたは図１ｂに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、
ｉｉ）図１ａまたは図１ｂに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片であって、上記配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されたポリペプチド断片、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）に定義されるようなポリペプチドであって、図１ａまたは図１ｂに表されるポリペプチドの生物活性を実質的に保持するポリペプチド
からなる群から選択される核酸分子が提供される。
【００１０】
本発明の好適な実施形態において、上記核酸分子は、図１ａに表される配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基から構成されるポリペプチド断片をコードする。好ましくは、上記核酸分子はヒトから単離される。
【００１１】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、上記核酸分子は、図１ｂに表される配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基から構成されるポリペプチド断片をコードする。好ましくは、上記核酸分子は線虫から単離される。好ましくは、上記線虫はカエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である。
【００１２】
本発明の好適な実施形態において、上記核酸分子は、ポリペプチド、またはそれらの配列変異体をコードし、上記ポリペプチドは、図１ａおよび１ｂに表されるアミノ酸配列により表されるポリペプチドの活性を阻害する。
【００１３】
本発明の好適な実施形態において、上記核酸分子はｃＤＮＡである。
【００１４】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、上記核酸分子はゲノムＤＮＡである。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子によりコードされるポリペプチド断片またはそれらの配列変異体が提供される。
【００１６】
配列変異体である断片は、完全長ポリペプチドの生物活性を保持し得るか、あるいはｐ５３における結合部位に関して競合することによりアンタゴニスト活性を有することが明らかである。概して、ｐ５３への結合に関する本発明のよるポリペプチドの特異性は、結合平衡定数により示される。ｐ５３を選択的に結合することが可能であるポリペプチドは、好ましくは少なくとも約１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、最も好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１の結合平衡定数を有する。
【００１７】
配列変異体、すなわち断片ポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、任意の組合せで存在し得る１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失、切断によりアミノ酸配列が異なり得る。好ましい変異体としては、保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドから変化した変異体である。かかる置換は、所定のアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸で置換する置換である。アミノ酸の以下の非限定的なリストは、保存的置き換え（類似体）とみなされる：ａ）アラニン、セリンおよびトレオニン、ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸、ｃ）アスパラギンおよびグルタミン、ｄ）アルギニンおよびリシン、ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００１８】
本発明による機能的に等価なポリペプチドは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基で置換された変異体、あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含んだ変異体である。保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中であるものを別のものに置き換えること、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの中での置き換えである。
【００１９】
さらに、本発明は、本明細書中に開示するポリペプチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド配列、またはそれらの断片および機能的に等価なポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に例示するアミノ酸配列と少なくとも８５％同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％同一性、より一層好ましくは少なくとも９７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２０】
上述のように、本発明はまた、ある特定の実施形態では、本明細書中に開示するポリペプチドから誘導される「優性ネガティブな（dominant negative)」ポリペプチドもまた提供する。優性ネガティブなポリペプチドは、タンパク質の不活性変異体であり、細胞機構と相互作用することにより、細胞機構とのその相互作用から活性タンパク質を押しのけるか、あるいは活性タンパク質と競合し、それにより活性タンパク質の影響を低減させる。例えば、リガンドに結合するが、リガンドの結合に応答してシグナルを伝達しない優性ネガティブ受容体は、リガンドの発現の生物学的影響を低減することができる。同様に、標的タンパク質と正常に相互作用するが、標的タンパク質をリン酸化しない優性ネガティブな触媒的に不活性なキナーゼは、細胞シグナルに応答した標的タンパク質のリン酸化を低減させることができる。同様に、遺伝子の制御領域において別の転写因子またはプロモーター部位に結合するが、遺伝子転写を増加させない優性ネガティブな転写因子は、転写を増加させることなく、プロモーター結合部位を占有することにより正常な転写因子の影響を低減させることができる。
【００２１】
細胞における優性ネガティブなポリペプチドの発現の最終的な結果は、活性タンパク質の機能の低減である。当業者は、１つまたはそれ以上の優性ネガティブな変異ポリペプチドを創出するための標準的な突然変異誘発技法を使用して、タンパク質の優性ネガティブな変異体に関する潜在力を評価することができる。例えば、ｉＡＳＰＰポリペプチドの本明細書中に含まれる教示の場合、当業者は、部位特異的突然変異誘発、スキャニング突然変異誘発、部分的遺伝子欠失または切断等によりｉＡＳＰＰポリペプチドの配列を改変させることができる。例えば、米国特許第５，５８０，７２３号明細書およびSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。次に、当業者は、選択した活性（例えば、ｐ５３結合、アポトーシスの調節）の減少に関しておよび／またはかかる活性の保持に関して、突然変異誘発したポリペプチドの集団を試験することができる。タンパク質の優性ネガティブな変異体を創出および試験する他の類似の方法は、当業者に明らかであろう。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸を含むベクターが提供される。
【００２３】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記ベクターは、遺伝子発現に関して従来に適応された発現ベクターである。
【００２４】
通常上記適応としては（例示であり、限定の目的ではない）、細胞／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給が挙げられる。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的であり、誘導的または構成的であり得る。
【００２５】
プロモーターは当該技術分野で認識されている用語であるが、明瞭性の目的で、単なる例示であり、限定の目的ではなく提供される以下の特徴を包含する。エンハンサー要素は、遺伝子の転写開始部位に対して５’に頻繁に見出されるシス作用性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列に対して３’に見出すことができるか、またはさらにはイントロン配列に位置させることができ、したがって位置非依存性である）。エンハンサーは、エンハンサーが連結される遺伝子の転写の割合を高めるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー要素に特異的に結合することが知られているトランス作用性転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性（Eukaryotic Transcripition Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diegoを参照)は、多数の環境的合図に応答性であり、環境的合図としては（例示であり、限定の目的ではない）、中間代謝産物（例えば、グルコース、脂質）、環境的エフェクター（例えば、光、熱）が挙げられる。
【００２６】
プロモーター要素としてはまた、いわゆるＴＡＴＡボックス、および転写開始の部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列が挙げられる。これらの配列はまた、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易とするように機能するポリペプチドを結合する。
【００２７】
適応としてはまた、選択マーカーおよび自己複製配列の提供が挙げられ、選択マーカーおよび自己複製配列はともに、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおいて上記ベクターの維持を容易にする。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと称される。エピソームベクターは、これらの分子が巨大なＤＮＡ断片（３０〜５０ｋｂ  ＤＮＡ）を組み込むことができることから望ましい。このタイプのエピソームベクターは、国際公開９８／０７８７６号パンフレットに記載されている。
【００２８】
ベクターにコードされた遺伝子の発現を容易にする適応としては、転写終結／ポリアデニル化配列の提供が挙げられる。これにはまた、ビシストロンまたはマルチシストロン発現カセットに配列されるベクターにコードされた遺伝子の発現を最大限とするように機能する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供を包含する。
【００２９】
発現制御配列にはまた、いわゆる遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）が包含される。これらは、マウスにおけるトランスジェニック構築物としてアッセイされる場合に、連結された遺伝子に位置非依存性コピー数依存性の発現を付与する調節要素である。ＬＣＲには、隣接へテロクロマチンのサイレンシング効果から導入遺伝子を隔離する調節要素が包含される(Grosveld et al., Cell (1987), 51: 975-985)。
【００３０】
これらの適応は当該技術分野で既知である。一般的に発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技法に関して非常に大量の公開文献が存在する。Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NYおよびそれら中の参照文献、Marston, F (1987) DNA Clonig Techniques: A Practical approach Vol III IRL Press, Oxford UK、DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子またはベクターで形質転換あるいはトランスフェクトされた細胞が提供される。
【００３２】
好ましくは、上記宿主細胞は、真核生物細胞、例えばバキュロウイルス発現系を用いたハスモンヨウ(Spodoptera frugiperda)種由来の細胞のような昆虫細胞である。この発現系は、ポリペプチドの翻訳後修飾が必要とされる場合に好適である。宿主細胞および細胞系は、原核生物（例えば、大腸菌）または真核生物（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）であり得る。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類等のような哺乳類細胞が特に有用である。これらは幅広い多様な組織型であり得、一次細胞および細胞系が挙げられる。具体例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、線維芽細胞、骨髄幹細胞および胚幹細胞が挙げられる。発現ベクター類は、関連配列、すなわち上述の核酸がプロモーターに操作可能に連結されることを要する。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、医薬品として使用するための本発明によるポリペプチドが提供される。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、医薬品として使用するための本発明による核酸が提供される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、上記医薬品は、希釈剤、キャリアまたは賦形剤をさらに含む。
【００３６】
投与される場合、本発明の治療用組成物は、医薬上許容可能な調製物において投与される。かかる調節物は、医薬上許容可能な塩の濃縮物、緩衝剤、防腐剤、適合可能なキャリア、補足的免疫増強剤（例えば、アジュバントおよびサイトカイン）、および任意の他の治療剤（例えば、化学療法剤）を日常的に含有し得る。
【００３７】
本発明の治療薬は、注射を含む任意の従来の経路により、あるいは時間をかけた少しずつの注入により投与することができる。投与は、例えば経口、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下または経皮であり得る。抗体が治療用に投与される場合、好ましい投与経路は、肺エーロゾルによるものである。抗体を含有するエーロゾル送達系を調製する技法は、当該技術分野で既知である。概して、かかる系は、パラトープ結合容量のような抗体の生物学的特性を有意に減じない成分を利用すべきである（例えば、Sciarra  and Cutie, 「Aerosols」, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp 1694-1712（参照して本明細書の一部とする）を参照）。当業者は、過度の実験に頼らずに抗体エーロゾルを生産するための各種パラメータおよび条件を容易に決定することができる。本発明のアンチセンス調製物を使用する場合、ゆっくりとした静脈内投与が好ましい。
【００３８】
本発明の組成物は、有効な量で投与される。「有効な量」は、単独で、あるいはさらなる用量とともに、所望の応答をもたらす組成物の量である。癌のような特定の疾患を治療する場合では、所望の応答は、疾患の進行を阻害することである。これには、一時的に疾患の進行を単に遅らせることが包含され得るが、より好ましくは、永続的に疾患の進行を停止させることを包含する。これは、日常的な方法によりモニタリングすることができるか、あるいは本明細書中で論じる本発明の診断方法に従ってモニタリングすることができる。
【００３９】
かかる量は、当然のことながら治療される特定の状態、状態の重篤性、年齢、健康状態、大きさおよび体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の持続期間、同時に行われる療法の性質（もしある場合）、投与の特定経路、ならびに医療従事者の知識および専門的技術内の同様の因子に依存する。これらの因子は、当業者に既知であり、単に日常的に過ぎない実験で対処することができる。個々の成分またはそれらの組合せの最大用量、すなわち適切な医療的判断に従って最高の安全な用量を使用することが一般的に好ましい。しかしながら、患者は、医療的理由、心理学的理由のために、あるいは事実上任意の他の理由のために、より低い用量または耐用用量を要求してもよいことは当業者に理解されよう。
【００４０】
上述の方法で使用される医薬組成物は、好ましくは滅菌してあり、患者への投与に適切な重さまたは容量のユニットで望ましい応答を生じるのに有効な量の優性ネガティブなｉＡＳＰＰまたは優性ネガティブなｉＡＳＰＰをコードする核酸を含有する。応答は、例えば本明細書中に記載するようなレポーター系により優性ネガティブなｉＡＳＰＰ−１組成物により阻害されるシグナル伝達を決定することにより、遺伝子発現のような下流の影響を測定することにより、あるいは腫瘍の後退、疾患症状の減少、アポトーシスの調節等のようなｉＡＳＰＰ組成物の生理学的影響を測定することにより、測定することができる。
【００４１】
被験体に投与される優性ネガティブなｉＡＳＰＰポリペプチドまたは核酸の用量は、種々のパラメータに従って、特に使用される投与様式および被験体の状態に従って選択することができる。他の因子としては、所望の治療期間が挙げられる。被験体における応答が、適用した初期の用量で不十分である場合には、より高用量（または異なるより局在化された送達経路による効果的により高い用量）を、患者の耐用性が許す程度にまで使用してもよい。
【００４２】
概して、優性ネガティブなｉＡＳＰＰの用量は、当該技術分野における任意の標準的な手順に従って、１ｎｇ〜約５００ｍｇ、および１０ｎｇ〜１００ｍｇの用量で配合および投与される。優性ネガティブなｉＡＳＰＰをコードする核酸が使用される場合、一般に１ｎｇ〜０．１ｍｇの用量が標準的な手順に従って配合および投与される。ｉＡＳＰＰ組成物の投与に関する他のプロトコルは、当業者に既知であり、そこでは用量、注射スケジュール、注射の部位、投与様式（例えば、腫瘍内）等が上述と変化している。例えば試験の目的または獣医学的療法の目的で、ヒト以外の哺乳類へのｉＡＳＰＰ組成物の投与は、上述と実質的に同条件下で実施される。本明細書中で使用する場合、被験体は、哺乳類、好ましくはヒトであり、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類を包含する。
【００４３】
投与する場合、本発明の医薬調製物は、医薬上許容可能な量で、かつ医薬上許容可能な組成で適用される。「医薬上許容可能な」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨害しない無毒性物質を意味する。かかる調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性キャリアおよび任意の他の治療薬を日常的に含有する。薬に使用される場合、塩は医薬上許容可能であるべきであるが、医薬上許容可能でない塩を便宜上使用して、それらの医薬上許容可能な塩を調製してもよく、本発明の範囲から排除されない。かかる薬理学的および医薬上許容可能塩としては、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、医薬上許容可能な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩）として調製することができる。
【００４４】
ｉＡＳＰＰ組成物は、所望であれば、医薬上許容可能なキャリアと組み合わせてもよい。本明細書中で使用する場合「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、１つまたはそれ以上の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤あるいは被包性物質（これらは、ヒトへ投与するのに適している）を意味する。「キャリア」という用語は、有機または無機成分（天然または合成）を示し、それらと活性成分を組み合わせて、適用を容易にする。医薬組成物の成分はまた、本発明の分子と、互いに所望の医薬有効性を実質的に減じる相互作用が存在しないような様式で混合することが可能である。
【００４５】
医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸を含む適切な緩衝剤を含有してもよい。
【００４６】
医薬組成物はまた、塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールのような適切な防腐剤を任意に含有してもよい。
【００４７】
薬学的組成物は、単位投薬形態で便宜上提示されてもよく、医薬の技術分野で既知の方法のいずれかにより調製され得る。方法はすべて、活性剤を、１つまたはそれ以上のアクセサリー成分を構成するキャリアと会合させる工程を含む。概して、組成物は、活性化合物を、液体キャリア、微細固体キャリア、またはその両方と均質にかつ緊密に会合させた後、必要であれば生成物を成形することにより調製される。
【００４８】
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジのような別個のユニットとして提示されてもよく、それぞれが既定量の活性化合物を含有する。他の組成物としては、水性液体中または非水性液体中の懸濁液（例えば、シロップ、エリキシルまたはエマルジョン）が挙げられる。
【００４９】
非経口投与に適した組成物は、ｉＡＳＰＰポリペプチドまたは核酸の滅菌水性または非水性調製物を利便性よく含み、これは好ましくは、レシピエントの血液と等張性である。この調製物は、適切な分散剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用いて、既知の方法に従って配合され得る。滅菌注射可能調製物はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液あるいは懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）であり得る。使用され得る許容可能な媒質および溶媒としては、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または沈殿防止媒質として従来通りに使用される。この目的では、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油が使用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射可能物質の調製物で使用され得る。経口、皮下、静脈内、筋内等の投与に適したキャリア配合は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【００５１】
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物を包含する。本明細書中で使用する場合、「トランスジェニック非ヒト動物」には、生殖系細胞および／または体細胞に組み込まれた１つまたはそれ以上の外因性核酸分子を有する非ヒト動物が含まれる。したがって、トランスジェニック動物としては、相同組換えによるホモ接合性またはヘテロ接合性遺伝子崩壊を有する「ノックアウト」動物、エピソームまたは染色体に組み込まれた発現ベクター等を有する動物等が挙げられる。ノックアウト動物は、当該技術分野で既知であるように、胚幹細胞を用いた相同組換えにより調製することができる。組換えは、ｃｒｅ／ｌｏｘ系または当業者に既知の他のリコンビナーゼ系により容易とすることができる。ある特定の実施形態では、リコンビナーゼ系自体は、条件付きで、例えばある特定の組織または細胞型で、ある特定の胚または胚後期発達段階で、発現を増加または減少させる化合物の添加により誘発的にといったように発現させる。概して、かかる系で使用する条件発現ベクターは、所望の遺伝子発現パターン（例えば、時間的または空間的）を付与する各種プロモーターを使用する。条件プロモーターはまた、ｉＡＳＰＰファミリー核酸分子に操作可能に連結して、調節様式または条件様式でこれらの核酸分子の発現を増加させることができる。ｉＡＳＰＰ活性または発現のトランス作用性ネガティブ調節因子もまた、上述の条件プロモーターに操作可能に連結させることができる。かかるトランス作用性調節因子としては、アンチセンス核酸分子、優性ネガティブな分子をコードする核酸分子、ｉＡＳＰＰ核酸に特異的なリボザイム分子等が挙げられる。トランスジェニック非ヒト動物は、ｉＡＳＰＰ発現の増加または減少を特徴とする条件に関して、診断薬または治療薬の生化学的あるいは生理学的影響を試験することに関する実験で有用である。他の用途は当業者に明らかであろう。
【００５２】
本発明のさらなる態様によれば、ｐ５３への上記ポリペプチドの結合を阻害する作用物質の同定のためのスクリーニング方法におけるポリペプチドまたはそれらの断片の使用が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる態様によれば、ポリペプチドまたはそれらの断片のｐ５３への結合を阻害する作用物質を同定するスクリーニング方法であって、
ｉ）
ａ）本発明によるポリペプチド、および
ｂ）（ａ）におけるポリペプチドに関する結合部位（複数可）からなるｐ５３ポリペプチドまたはそれらの断片
を含む調製物を形成すること、
ｉｉ）試験されるべき少なくとも１つの作用物質を供給すること、
ｉｉｉ）（ａ）におけるポリペプチドの（ｂ）におけるポリペプチドへの結合に関して作用物質の活性を決定することと
を含む方法が提供される。
【００５４】
本発明の好適な方法において、上記作用物質はポリペプチドであり、好ましくはペプチドである。
【００５５】
本発明の好適な方法において、上記ペプチドはＧＰＥＥＴＤ、ＤＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５６】
本発明の好適な方法において、上記ペプチドの長さは、少なくとも６アミノ酸残基である。好ましくは、上記ペプチドの長さは、少なくとも７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１６アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１８アミノ酸残基、１９アミノ酸残基または２０アミノ酸残基からなる群から選択される。代替的に、上記ペプチドの長さは、少なくとも２０アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、９０アミノ酸残基または１００アミノ酸残基である。
【００５７】
本発明のさらなる好適な方法において、上記ペプチドは、ＧＰＥＥＴＤ、ＤＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなるアミノ酸配列を含む。
【００５８】
ペプチド作用物質のアミノ酸配列に対する修飾が、その標的配列に関してペプチドの結合および／または安定性を高めることができることは、当業者に明らかであろう。さらに、ペプチドの修飾はまた、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増加させ得て、それによりｉＡＳＰＰのｐ５３結合を阻害するのに必要な有効な量のペプチドを減少させる。このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る望ましくない副作用を好適に減少させる。修飾としては（例示であり、限定の目的ではない）、アセチル化およびアミド化が挙げられる。あるいは、または好ましくは、上記修飾は、組換えまたは合成形態のペプチドの産生における修飾アミノ酸の使用を包含する。修飾アミノ酸としては（例示であり、限定の目的ではない）、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ６−アセチルリシン、Ｎ６−メチルリシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリシン、シクロヘキシルアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが挙げられることは、当業者に明らかであろう。他の修飾としては、ハロ（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシもしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される１個、２個または３個の置換基で任意に置換されたＣ２、Ｃ３あるいはＣ４アルキルＲ基を有するアミノ酸が挙げられる。
【００５９】
ｐ５３結合活性を保持するペプチドを環化により修飾することができることも、当業者に明らかであろう。環化は当該技術分野で既知である（Scott et al Chem Biol (2001), 8:801-815、Gellerman et al J. Peptide Res (2001), 57:277-291、Dutta et al J. Peptide Res (2000), 8:398-412、Ngoka and Gross J Amer Soc Mass Spec (1999), 10:360-363を参照）。
【００６０】
本発明のさらに好ましい方法では、上記アンタゴニストは、抗体または抗体結合部分である。好ましくは、上記抗体は、モノクローナル抗体またはそれらの結合部分である。
【００６１】
免疫グロブリンとしても知られる抗体は、通常外来分子（抗原）に対する特異性を有するタンパク質分子である。免疫グロブリン（Ｉｇ）は、一方の対が軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κまたはλ）であり、一方の対が重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δおよびε）である２つ対のポリペプチド鎖から構成される構造的に関連したタンパク質のクラスであり、４つの鎖はすべて、ジスルフィド結合でともに連結されている。Ｈ鎖およびＬ鎖はともに、抗原の結合に寄与し、かつあるＩｇ分子から別のＩｇ分子へ高度に可変性である領域を有する。さらに、Ｈ鎖およびＬ鎖は、非可変性または定常である領域を含有する。
【００６２】
Ｌ鎖は２つのドメインから構成される。カルボキシ末端ドメインは、所定のタイプのＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と称される。アミノ末端ドメインは、Ｌ鎖間で変化し、抗体の結合部位に寄与する。その可変性のために、「可変」（Ｖ）領域と称される。
【００６３】
Ｉｇ分子のＨ鎖は、幾つかのクラス、すなわちα、μ、σ、αおよびγ（これらは、その幾つかのサブクラスが存在する）である。２つの同一Ｈ鎖およびＬ鎖の１つまたはそれ以上のユニットから構成される構築されたＩｇ分子は、それが保有するＨ鎖からその名前を由来とする。したがって、５つのＩｇアイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ（Ｈ鎖の「定常」領域における差異に基づいて４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を有する）が存在する。抗体構造およびそれらの様々な機能に関するさらなる詳細は、Using Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Pressに見出すことができる。
【００６４】
本発明の好適な実施形態において、上記断片はＦａｂ断片である。
【００６５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記抗体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片、ならびにＣＤＲ３領域を含む抗体からなる群から選択される。
【００６６】
好ましくは、上記断片は、単鎖抗体可変領域（ｓｃＦＶ’ｓ）またはドメイン抗体である。ハイブリドーマが特異的なモノクローナル抗体に関して存在する場合、ＲＴ  ＰＣＲにより上記ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡからｓｃＦＶ’ｓを単離することは、十分に当業者の知見の範囲内である。あるいは、ファージディスプレイスクリーニングは、ｓｃＦＶ’ｓを発現するクローンを同定することを請け負うことができる。ドメイン抗体は、抗体の最小結合部分（およそ１３ｋＤａ）である。この技術の例は、米国特許６，２４８，５１６号明細書、米国特許６，２９１，１５８号明細書、米国特許６，１２７，１９７号明細書、およびＥＰ０３６８６８４号明細書（これらはすべて、それらの全体が参照により援用される）に開示されている。
【００６７】
修飾抗体または変異抗体と参照（reference)抗体は、１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失、切断（これらは任意の組合せで存在し得る）によりアミノ酸配列が異なり得る。好ましい変異体としては、保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドから変化しているものである。かかる置換は、所定のアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することである。アミノ酸の以下の非限定的リストは、保存的置き換え（類似）とみなされる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン、ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸、ｃ）アスパラギンおよびグルタミン、ｄ）アルギニンおよびリシン、ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。増強された生物活性を示す変異体が最も好ましい。
【００６８】
好ましくは、上記抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００６９】
キメラ抗体は、ヒト抗体の不変または定常領域とともに抗体の可変領域を含有する組換え方法により産生される。
【００７０】
ヒト化抗体は、ヒト抗体の定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域由来のフレームワーク領域の両方と抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を組み合わせる組換え方法により産生される。
【００７１】
キメラ抗体は、マウスまたはラット抗体のＶ領域すべてがヒト抗体Ｃ領域と組み合わせられた組換え抗体である。ヒト化抗体は、げっ歯類抗体Ｖ領域由来の相補性決定領域をヒト抗体Ｖ領域由来のフレームワーク領域と融合させた組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体由来のＣ領域もまた使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｖ領域の変動の大部分が制限されている抗体の重鎖および軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域である。これらの領域は、抗体分子の表面にあるループを形成する。これらのループは、抗体と抗原との間の結合表面を提供する。
【００７２】
非ヒト動物由来の抗体は、外来抗体に対する免疫応答および循環からのその除去を誘起する。組換えハイブリッド抗体内のげっ歯類（すなわち、外来）抗体の量が減じられている一方で、ヒト抗体領域が免疫応答を誘起しないため、キメラ抗体およびヒト化抗体はともに、ヒト被験体に注射されると減じられた抗原性を有する。このことが、より弱い免疫応答および抗体のクリアランスの減少をもたらす。これは、ヒト疾患の治療において治療用抗体を使用する場合に明らかに望ましい。ヒト化抗体は、より少ない「外来」抗体領域を有するように設計され、したがってキメラ抗体よりも免疫原性が低いと考えられる。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、線虫から単離される単離核酸分子であって、図１ｂにより表されるような核酸配列をハイブリダイズする核酸分子が提供される。
【００７４】
本発明の好適な実施形態において、上記核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。好ましくは、上記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である。
【００７５】
本発明のさらなる態様によれば、図１ｂに表されるようなアミノ酸を含む単離ポリペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されるポリペプチドが提供される。
【００７６】
本発明のさらなる態様によれば、有効量のポリペプチドあるいは核酸、あるいは本発明のベクターを投与することを含む動物の治療方法であって、上記有効量は、ｐ５３のアポトーシス活性を誘発する方法が提供される。
【００７７】
本発明の好適な方法において、上記治療は癌治療である。
【００７８】
本発明の一態様によれば、ＧＰＥＥＴＤ、ＤＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。
【００７９】
本発明の好適な実施形態において、上記ペプチドの長さは、少なくとも６アミノ酸残基である。好ましくは、上記ペプチドの長さは、少なくとも７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１６アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１８アミノ酸残基、１９アミノ酸残基または２０アミノ酸残基からなる群から選択される。代替的に、上記ペプチドの長さは、少なくとも２０アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、９０アミノ酸残基または１００アミノ酸残基である。
【００８０】
本発明のさらなる好適な実施形態において、上記ペプチドは、ＧＰＥＥＴＤ、ＤＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの抗癌剤を含む医薬組成物が提供される。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態では、上記抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、エトポシド、コルヒシン、メシル酸デフェロキサミン、およびカンプトテシンからなる群から選択される。
【００８３】
本発明のさらにより好ましい態様によれば、本発明によるペプチドおよび少なくとも１つの抗体またはそれらの活性結合部分を含む複合体が提供される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、上記抗体または断片は、細胞特異的抗体である。好ましくは、上記細胞は癌細胞である。
【００８５】
本発明によるペプチドおよび細胞、好ましくは癌細胞を特異的に結合する抗体の複合体は、上記ペプチドの細胞へのターゲッティングを可能にする。通常、複合体は、内部移行され、細胞内にペプチドを放出して、ペプチドをその標的に送達する。抗体およびペプチドの複合体を形成する手段は当該技術分野で既知であり、例えば、二官能性架橋剤（これらは、ヘテロ二官能性であってもホモ二官能性であってもよい）の使用を包含する。架橋剤は還元性であり、それにより上記ペプチド（複数可）の放出を容易にする。癌特異的細胞マーカーは当該技術分野で既知である。例えば、腫瘍拒絶抗原前駆体。これらとしては（例示であり、限定の目的ではない）、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＤＡＧＥファミリーの腫瘍拒絶抗原が挙げられる。Schulz et al Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88, pp991-993（参照して本明細書の一部とする）を参照されたい。
【００８６】
本発明の態様によれば、有効な量の本発明によるペプチドを投与することを含む、動物、好ましくはヒトの治療方法が提供され、ここでは上記動物は、アポトーシスの誘発から利益を得る。
【００８７】
本発明のさらなる態様によれば、有効な量の本発明による組成物を投与することを含む、動物、好ましくはヒトの治療方法が提供され、ここでは上記動物は、アポトーシスの誘発から利益を得る。
【００８８】
本発明の好適な方法において、上記治療は癌治療である。
【００８９】
ここで、本発明の実施形態を、単なる例示として以下の図面を参照して記載する。
【００９０】
材料および方法
細胞培養、抗体およびプラスミド
Ｓａｏｓ−２、ＭＣＦ−７およびＵ２ＯＳ細胞を、１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭ  グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で成長させた。抗ｐ５３抗体ＤＯ−１およびＤＯ−１３はモノクローナル抗体であるのに対して、ＣＭ−１は、ｐ５３に特異的なウサギポリクローナル抗体である。Ｖ５および９Ｅ１０エピトープは、それぞれマウスモノクローナル抗体Ｖ５および９Ｅ１０により認識される。マウスモノクローナルＰＣ−１０は、ＰＣＮＡタンパク質に特異的である。ＣＤ２０Ｌｅｕは、細胞表面マーカーＣＤ２０(Becton Dickinson)に特異的なＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体である。ＡＳＰＰ１およびＡＳＰＰ２に対するマウスおよびウサギ抗体はこれまでに記載されていた１。ｉＡＳＰＰ（ペプチドＲＬＱＰＡＬＰＰＥＡＱＳＶＰＥＬＥＥ）に対するマウスおよびウサギ抗体は、Harlow and Lane１３により記載されているように産生した。この研究で使用する発現プラスミドはすべて、ＣＭＶ極初期プロモーターにより駆動される。ＡＳＰＰ１、ｉＡＳＰＰおよびＣｅ−ｉＡＳＰＰは、Ｖ５エピトープで標識する一方で、Ｃｅ−ｐ５３は、９Ｅ１０エピトープで標識する。
【００９１】
ＤＮＡトランスフェクション
トランスフェクションミックスは、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２で沈殿させた１×ＨＢＳ緩衝液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１２ｍＭ  グルコース、３９ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．９〜７．３に調整）中の所定のＤＮＡを含んでいた。トランスフェクションミックスを細胞に滴下して、ＤＭＥＭを用いて６時間後に洗い流した。洗浄の１６〜２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイおよびウェスタンブロット用にはレポーター溶解緩衝液(Promega)中に、あるいはウエスタンまたは免疫沈降手順用にはＮＰ４０溶解緩衝液中に細胞を溶解させた。
【００９２】
トランス活性化アッセイ
転写アッセイ用に、５×１０５個のＳａｏｓ−２細胞を、６ｃｍ皿中でトランスフェクションの２４時間前に平板培養した。プラスミドＤＮＡの様々な組合せを、以下の量を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションアッセイはすべて、レポータープラスミド１μｇを含有する。野生型ヒトｐ５３  ５０ｎｇ、Ｃ．エレガンスｐ５３を発現するプラスミド１００ｎｇ、ＡＳＰＰ２  ４μｇまたはＡＳＰＰ１  ８μｇ、ヒトｉＡＳＰＰ  ５μｇまたはＣｅ−ｉＡＳＰＰ  ７．５μｇを示されるように使用した。トランスフェクション後、洗浄の１６〜２４時間後に細胞をレポーター溶解緩衝液(Promega, WI, USA)中に溶解させて、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega, WI, USA)を用いてアッセイした。特定のレポーターの活性倍数を、ベクター単独の活性を超えるトランスフェクトしたプラスミドの活性により決定した。ＡＳＰＰによるｐ５３トランス活性化活性の増加倍数は、各アッセイで使用したプロモーターに関してｐ５３単独の活性で除算したＡＳＰＰと組み合わせた活性ｐ５３により得られた。
【００９３】
細胞形質転換アッセイ
Biowhittakerから入手したラット胚線維芽細胞（ＲＥＦ）を、９０ｍｍ皿中で５０％集密にまでＤＭＥＭ中で成長させた。次に、これまでに記載されているように１４、細胞を形質転換した。簡潔に述べると、ＥＪ  ｒａｓ  ６．６  ２μｇ、ｐＣＥ（Ｅ１Ａ）  ２μｇ、ｐＣＢ６−１６Ｅ  ５μｇ、野生型ヒトｐ５３  ５μｇ、ヒトもしくはＣ．エレガンスｉＡＳＰＰ  １μｇまたは５μｇを示されるようにＲＥＦＳにトランスフェクトした。細胞すべてを、同量のｎｅｏ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。次に、トランスフェクトした細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択し、形質学的に形質転換されたコロニーを、トランスフェクションの３〜４週後にスコア付けした。
【００９４】
フローサイトメトリー
ＦＡＣＳ分析用に、１０６個のＳａｏｓ−２細胞を、１０ｃｍ皿中でトランスフェクションの２４〜４８時間前に平板培養した。次に、細胞をＣＤ２０を発現するプラスミド  ２μｇでトランスフェクトした。ＣＤ２０発現は、トランスフェクションマーカーとして使用した。トランスフェクションは、示されるように、ヒトｐ５３  １μｇまたはＣｅ−ｐ５３  ４μｇ、ＡＳＰＰ１およびＡＳＰＰ２  １０μｇ、Ｂａｘ  ２μｇ、アンチセンスｉＡＳＰＰ  １５μｇ、ヒトｉＡＳＰＰ  ７．５μｇ〜１０μｇまたはＣｅ−ｉＡＳＰＰプラスミド  ７．５μｇから構成されていた。トランスフェクションの３６時間後、接着細胞および浮遊細胞をともに、４ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳを使用して収集し、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ２０抗体ＣＤ２０Ｌｅｕで染色した。各実験に関して、細胞の一皿を、ＣＤ２０なしで対照ベクターのみでトランスフェクトした。その後、これらの細胞は、ＣＤ２０プラスミドとともに同時トランスフェクトした場合と同条件下にて抗体ＣＤ２０Ｌｅｕで染色し、ネガティブ対照として使用した。ＣＤ２０プラスミドの発現を欠如した細胞を使用して、ＣＤ２０ポジティブ（したがって、トランスフェクトした）細胞のゲーティング（gating)を可能にするように基線を設定した。抗体ＣＤ２０Ｌｅｕで染色した後、細胞を固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した。ＣＤ２０を発現する細胞すべてのＤＮＡ含有量を、記載されているように１５フローサイトメーター(Becton Dickson)を用いて分析した。
【００９５】
タンパク質生化学
ウェスタンブロッティング用に、単層で成長させた細胞を、１×ＰＢＳで洗浄して、ＮＰ４０溶解緩衝液（１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））またはルシフェラーゼレポーター溶解緩衝液のいずれかに溶解させた。細胞抽出物のタンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄタンパク質タンパク質アッセイ系(BioRad)を用いて標準曲線に対して決定した。抽出物１５〜１００μｇを５×試料緩衝液と混合して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。ゲルをＰｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜上へ湿潤転写して、得られたブロットを１×ＰＢＳ中の１０％再構成粉乳中でブロックした。続いて、ブロットを、組織培養培地中であるいは未希釈ハイブリドーマ上清として調製した一次抗体とともにインキュベートして、適切な二次ＨＲＰ結合抗体(Dako)とともにインキュベートした。各段階間で、ブロットを、ＴＢＳＴ（１０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）の繰り返し交換により洗浄した。ブロットを、ＥＣＬ基質溶液(Amersham Life Science)の使用に続いて、ハイパーフィルムに感光させた。
【００９６】
免疫沈降用に、細胞をＮＰ４０溶解緩衝液中に氷上で３０分間溶解させ、プロテインＧビーズにより４℃で１時間予め清浄化した。タンパク質濃度を決定して、抽出物１０００μｇを、プロテインＧビーズに予め結合させた抗体とともに４℃にて４時間インキュベートした。ビーズをＮＰ４０溶解緩衝液で二度、およびＮＥＴ緩衝液（５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で二度洗浄した。ＩＰビーズを５×試料緩衝液と混合して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上へ載せた。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫沈降
ＡＳＰＰファミリーの成員およびｐ５３をｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳させて、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ連結転写／翻訳系(Promega)を用いて３５Ｓ−メチオニンで標識した。図１Ｅに示した実験に関して、ｉＡＳＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳した溶解産物１５μｌ、３０μｌおよび４５μｌを、ｐ５３およびＡＳＰＰ２に加えて添加した。ウサギ抗ｐ５３抗体ＣＭ１を用いて、非標識ｐ５３の存在を検出した。
【００９８】
図６Ａに関して、ヒトｉＡＳＰＰ溶解産物（非標識）５〜１０μｌを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳したＣｅ−ｐ５３を含有する溶解産物１５μｌとともにインキュベートした。タンパク質の混合物を、３０℃で１時間同時翻訳させた。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２００μｌをタンパク質の混合物に添加して、回転輪上で４℃でさらに１時間インキュベートした。プロテインＧアガロースビーズ上に固定化した抗Ｖ５抗体を結合反応に添加して、回転輪上で４℃で１６時間インキュべートした。次に、ビーズをＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質を、ＳＤＳゲル試料緩衝液中で放出させて、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。Ｃｅ−ｐ５３は、オートラジオグラフィで検出し、ヒトｉＡＳＰＰは、ウェスタンブロット後の抗Ｖ５抗体により検出した。残りの図に関しては、タンパク質を３５Ｓ−メチオニンで標識し、示した抗体を用いた上述のように免疫沈降させた。結果は、オートラジオグラフィを用いて可視化させた。
【００９９】
３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインによる細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ標識
トランスフェクトしたプラスミド（図１Ａおよび図２Ｃに示されるように）の非存在下または存在下でのＵ２０Ｓ細胞をＰＢＳで洗浄し、続いてメチオニンおよびシステインをともに欠如したＤＭＥＭ中で２５０μｃｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンおよび２５０μｃｉの３５−システインとともに３７℃で２時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄した後、収集した。図２Ｃに関して、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインで２時間ｉｎ  ｖｉｖｏ標識した。ＣＤ２０を発現する細胞（トランスフェクトした細胞）をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ２０抗体で染色した。次に、ビオチン結合抗ＦＩＴＣ抗体を細胞ペレットに添加して、インキュベーション後に、細胞をストレプトアビジン結合磁性ビーズと混合して、ＣＤ２０発現細胞を単離した。続いて、細胞をＮＰ４０溶解緩衝液を用いて溶解し、マウス抗ｉＡＳＰＰ抗体によりタンパク質を免疫沈降させた。免疫沈降物をＮＥＴ緩衝液で洗浄して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分離した。
【０１００】
細胞固定
細胞の単層を３０ｍｍ皿で成長させて、１×ＰＢＳで洗浄させた。細胞を４％パラホルムアルデヒド１ｍｌで１５分間固定させた後、１×ＰＢＳで洗浄した。１×ＰＢＳ中の０．２％トリトン−Ｘ１００  １ｍｌを使用して、細胞を２分間透過処理して、これを１×ＰＢＳの３回洗浄により洗い流した。一次抗体を適切な濃度にて組織培養培地中で調製し、皿に３時間添加した。皿を１×ＰＢＳで洗浄し、抗ウサギＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）または抗マウスＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）のいずれかの二次抗体を製造業者が推奨した希釈(Sigma, UK)にて組織培養培地中で調製し、皿に１時間添加した。細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄して、風乾させた。Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ遮蔽剤(Citifluor, UK)を細胞の表面に１滴として適用し、最上部上にカバースリップを配置させた。カバースリップの最上部上に浸漬油１滴により、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を用いて免疫複合体を可視化させた。抗体９Ｅ１０およびＶ５を用いて、それぞれエピトープ標識Ｃｅ−ｐ５３（９Ｅ１０）、ヒトｉＡＳＰＰ（Ｖ５）およびＣｅ−ｉＡＳＰＰ（Ｖ５）の発現を検出した。ヒトｐ５３は、ＤＯ．１抗体により検出した。
【０１０１】
Ｃｅ−ｐ５３およびＣｅ−ｉＡＳＰＰ  ｃＤＮＡのクローニング
Ｃｅ−ａｐｅ−１（ｉＡＳＰＰ）およびＣｅ−ｃｅｐ−１（ｐ５３）の完全コード領域を保有するｃＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａアクセスキットを用いてＲＴ−ＰＣＲにより生成し、ベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングし、配列決定した。次に、Ｃ．エレガンスｐ５３およびｉＡＳＰＰを、それぞれ９Ｅ１０およびＶ５のエピトープとフレームで哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３にサブクローニングした。完全長Ｃｅ−ａｐｅ−１は、ＳＬ１にトランススプライシングされていると予測される(Y. Kohara、未公開）。
【０１０２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および細胞死アッセイ
ＲＮＡｉは、確立された手順(Fire et al., 1998、Timmons and Fire, 1998)を用いて摂食またはマイクロインジェクションにより実施した。ＲＮＡｉによるＣｅ−ｉＡＳＰＰおよびＣｅ−ｐ５３活性を排除するために、まずＮ２動物をＣｅ−ｉＡＳＰＰ  ＲＮＡｉ摂食（feeding）にさらした。続いて、２０Ｆ１動物を摂食プレートから取り出して、Ｃｅ−ｐ５３  ｄｓＲＮＡを注射し、別個のＣｅ−ｉＡＳＰＰ  ｄｓＲＮＡ摂食プレートに戻した。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰを摂食させた動物（Ｃｅ−ｐ５３  ｄｓＲＮＡの＋／−注射）のＦ２子孫をＳＹＴＯ１２で染色して、アポトーシス死を記載されているように１２にスコア付けした。したがって、動物はすべてＣｅ−ｉＡＳＳＰ摂食ＲＮＡｉにさらしているため、２つの群で検出されるアポトーシス細胞死の平均数におけるいずれの差異も、Ｃｅ−ｐ５３  ｄｓＲＮＡ注射に起因する可能性が高い。
【実施例】
【０１０３】
ｉＡＳＰＰは、ＡＳＰＰファミリーの最も保存的な成員である
配列分析により、Ｃ．エレガンスｐ５３遺伝子であるｃｅｐ−１は、ｐ５３ファミリーの遠い成員であるが、ＡＳＰＰに重要な残基およびＤＮＡ結合活性は保存されているようであることが示されている３、４。したがって、本発明者等は、ＡＳＰＰ相同体に関するＣ．エレガンスゲノムを研究し、Ｆ４６Ｆ３．４が、ＡＳＰＰファミリーの３つすべての成員に対して有意な配列相同性を有するタンパク質をコードする唯一のＣ．エレガンス遺伝子であることを見出した。Ｆ４６Ｆ３．４に相当する遺伝子は、ａｐｅ−１（ＲＮＡｉ）により産生される突然変異体表現型に基づいてａｐｅ−１（アポトーシスエンハンサーのため）と呼ばれている（以下参照）。しかしながら、タンパク質産物は、以後Ｃｅ−ｉＡＳＰＰと称する。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰは、７６９個のアミノ酸から構成され、配列比較により、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰのＣ末端が他のＡＳＰＰ成員と最も保存された領域であることが明らかである（図７）。ＡＳＰＰ２のＣ末端はｐ５３と相互作用することがこれまでに示された。さらに、この相互作用に関与する１つだけ除いたすべて（７つのうち６つ）の残基が、ｉＡＳＰＰおよびＣｅ−ｉＡＳＰＰの両方で保存されている。総合すると、これらの結果により、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰはヒトおよびＣ．エレガンスｐ５３の両方と相互作用する可能性があることが示唆された。このことを、共免疫沈降によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。図８Ｂに示されるように、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰは、ヒトおよびＣｅ−ｐ５３の両方と相互作用する。Ｃｅ−ｐ５３とＣｅ−ｉＡＳＰＰとの間の相互作用は、相互免疫沈降によりさらに確認した（図８Ｂ、右側のパネル）。
【０１０４】
Ｃｅ−ｉＡＳＰＰは、他のＡＳＰＰファミリーの成員に見出される特徴的なアンキリン反復およびＳＨ３ドメインを含有し、ヒト細胞の細胞質および核中で発現される（図８Ｃ）。ヒトｉＡＳＰＰの発現は、主に核であるが、細胞質染色もまた検出可能である。ヒトおよびＣ．エレガンスｐ５３はともに、トランスフェクトしたヒト細胞の核で主として発現される（図８Ｃ）。ＡＳＰＰおよびｉＡＳＰＰは、それぞれｐ５３のアポトーシス機能を正および負に調節することができるため、本発明者等は、ｐ５３の活性に対するＣｅ−ｉＡＳＰＰの影響を試験した。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰを哺乳類細胞中でヒトｐ５３と同時発現させると、それは、おそらく内因性ＡＳＰＰ機能を阻害することによりｐ５３のトランス活性化およびアポトーシス機能のわずかな減少をもたらした。しかしながら、ＡＳＰＰ１またはＡＳＰＰ２の存在下では、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの同時発現は、ＡＳＰＰ１またはＡＳＰＰ２が、ヒトｉＡＳＰＰと同程度にまでｐ５３のトランス活性化およびアポトーシス機能を刺激するのを防止した（図８Ｄ）。さらに、ヒトおよびＣ．エレガンスｉＡＳＰＰの、アポトーシスを阻害する能力は、それらがともに同条件下でＢａｘ誘発アポトーシスを阻害しなかったため、ｐ−５３依存性である（図８Ｅ）。ｉＡＳＰＰの、ｐ５３の活性を阻害する能力は、ｐ５３の発現の減少に起因しない（図８Ｆ）。ヒトｉＡＳＰＰと同様に、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰもまた発癌活性を有する。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの発現は、ｒａｓおよびＥ１Ａのトランスフォーミング活性を高めた。さらに、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの発現は、野生型ヒトｐ５３のサプレッサー機能を阻害した（図８Ｇ）。これらの結果により、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰは、ヒトＡＳＰＰのオルソログよりもヒトｉＡＳＰＰのオルソログである可能性が高いことが実証される。また、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの、ｐ５３を阻害する能力は、ＡＳＰＰファミリーのタンパク質によるｐ５３アポトーシス機能の調節が進化的に保存されることを示唆する。
【０１０５】
ＡＳＰＰファミリーのタンパク質によりｐ５３の調節は進化的に保存される
ヒトｐ５３とＣ．エレガンスｐ５３との間の限定された配列類似性のために、Ｃｅ−ｐ５３が哺乳類細胞中でアポトーシスを誘発することができるかどうかは明らかではないが、ＡＳＰＰと接触するＣｅ−ｐ５３残基のほとんどが保存されている。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰが、ヒトｉＡＳＰＰと類似した様式でヒトｐ５３の活性を阻害する場合、これは、ＡＳＰＰファミリーによるｐ５３の調節が進化的に保存されていることを論じる。このことはさらに、Ｃｅ−ｐ５３の活性が、ＡＳＰＰファミリーのタンパク質により調節の影響を受けやすいことを示唆する。これらの問題に対処するために、Ｃｅ−ｐ５３を、同時免疫沈降によりヒトＡＳＰＰファミリーの成員とｉｎ  ｖｉｔｒｏで相互作用するその能力に関して試験した。図６Ａに示されるように、Ｃｅ−ｐ５３は、ＡＳＰＰ２およびｉＡＳＰＰと相互作用する。Ｃｅ−ｐ５３の発現は、ヒトｐ５３に類似した効率で、ヒト細胞においてアポトーシスを誘発した。意外にも、ヒトＡＳＰＰ、特にヒトＡＳＰＰ２の発現は、Ｃｅ−ｐ５３の、アポトーシスを誘発する能力を、ヒトｐ５３に類似した程度にまで有意に高め、ヒトｉＡＳＰＰの発現はまた、Ｃｅ−ｐ５３のアポトーシス機能を阻害した（図６Ｂ）。さらに、ヒトおよびＣ．エレガンスｉＡＳＰＰはともに、同程度にまでＣｅ−ｐ５３誘発アポトーシスを阻害した（図６Ｃ）。Ｃｅ−ｐ５３の、ｐ５３標的遺伝子プロモーター（例えば、Ｂａｘ−ｌｕｃ）をトランス活性化する能力もまた試験して、ヒトｐ５３の能力よりもかなり低いことが見出された。興味深いことに、ＡＳＰＰ２とＣｅ−ｐ５３の同時発現は、Ｃｅ−ｐ５３のトランス活性化の機能のわずかではあるが検出可能な増加をもたらし、ヒトＡＳＰＰファミリーが、ヒトｐ５３と類似した様式でＣｅ−ｐ５３を調節することができることを示した（図６Ｄ）。ＡＳＰＰ２によるＣｅ−ｐ５３のトランス活性化機能のわずかな増加は、ｍｄｍ２プロモーター上では観察されない。これらの結果すべてが、ヒトｐ５３とＣ．エレガンスｐ５３との間で保存された残基は、ｐ５３のアポトーシス機能にとっておよびＡＳＰＰファミリーにより調節されるべきｐ５３にとって極めて重要かつ十分であることを示唆する。
【０１０６】
ｉＡＳＰＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐ５３の進化的に保存された阻害剤である
ヒトｐ５３と同様に、Ｃ．エレガンスｐ５３の最も重要な機能の１つは、ＤＮＡ損傷に応答して生殖細胞においてアポトーシスを誘発するその能力である３、４。ヒトまたはＣ．エレガンスｉＡＳＰＰの同時発現が哺乳類細胞系においてｐ５３のアポトーシス機能を阻害することができるということを踏まえて、本発明者等は、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの発現が、アポトーシスによる死からＣ．エレガンス生殖細胞を同様に保護し得ると仮定した。この問題は、ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）５を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで対処した。内因性Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの欠乏により、アポトーシスを受けた生殖細胞数が増加し、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの正常機能が、アポトーシスを阻害することを示した（図９Ａ、レーン１および５、６）。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの欠乏により引き起こされる生殖細胞アポトーシスの増大は、ＲＮＡｉがＣ．エレガンスＣＥＤ−３カスパーゼを欠如している突然変異体において実施された場合に、検出されず、コアのアポトーシス機構がこのプロセスに関与していることを示した（図９Ａ、レーン３および４）６。本発明者等はまた、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの主要な役割がＣｅ−ｐ５３のアポトーシス促進活性を阻害することであり、アポトーシス促進活性は通常遺伝毒性ストレスに応答して刺激される３、４という仮定に関するさらなる支持を得た。まず、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰの欠乏後にアポトーシスを受けたＣ．エレガンス生殖細胞数の増加が、ＲＮＡｉにより、Ｃｅ−ｐ５３を同時に欠乏させることにより廃止されることを見出した（図９Ａ、レーン５、６および８を比較せよ）。さらに、ＲＮＡｉによるＣｅ−ｉＡＳＰＰとＣｅ−ｐ５３の両方の欠乏により、アポトーシスは完全に排除されなかったが、代わりにアポトーシスを受けた生殖細胞数が野生型生理学的レベルにまで回復した。第二に、野生型の虫（worms）を１００Ｇｙ  ＩＲに暴露させた後に検出されるアポトーシス生殖細胞死数の増加が、１００Ｇｙ  ＩＲへの暴露の存在または非存在下でＲＮＡｉによるＣｅ−ｉＡＳＳＰの欠乏後に観察されるよりも上回らなかった（図９Ａ、レーン２および７）。これらの結果は、ｉＡＳＰＰがＣ．エレガンスにおいてｐ５３機能の重要な阻害剤であることを明らかに実証するが、本発明者等は、遺伝的ノックアウトにより、Ｃｅ−ｉＡＳＰＰがさらなる活性を有することが明らかとなり得るという可能性を排除することができない。ＡＳＰＰファミリーによるｐ５３の調節は高度に保存されるため、ｉＡＳＰＰはまた、ヒトを含む他の生物においてｐ５３の重要な阻害剤である可能性が高い。
【０１０７】
ここで、本発明者等は、ｉＡＳＰＰが、これまでのところで同定されたｐ５３の最も系統学的に保存された阻害剤であり、またＡＳＰＰファミリーの最も進化的に保存された成員であることを示す。意外にも、ＡＳＰＰファミリーの成員の、ｐ５３のアポトーシス機能を調節する能力は、Ｃ．エレガンスとヒトとの間で保存されている。このことは、ｐ５３のアポトーシス機能が、細胞周期停止を誘発するその能力よりも保存されている可能性が高いことを論じており、これは、Ｃ．エレガンスおよびショウジョウバエｐ５３の両方の異所性発現がアポトーシスを誘発するが、細胞周期停止を誘発しないことを示す最近の観察３、４、７、８と一致する。Ｃ．エレガンスでは、ｐ５３媒介性アポトーシスが、生殖細胞のフィデリティを維持する際に重要な役割を示すようであり、これがＤＮＡ損傷を被る可能性がある３、４。興味深いことに、ｐ５３の最も重要な腫瘍サプレッサー機能もまた、アポトーシスを誘発するその能力と関連している。したがって、ＡＳＰＰファミリーの成員であるｐ５３の進化的に保存された調節因子は、腫瘍形成において重大な役割を果たすはずである。
【０１０８】
腫瘍性タンパク質ｉＡＳＰＰ
ｉＡＳＰＰは、完全長ＡＳＰＰよりもＮ末端切断ＡＳＰＰ２突然変異体５３ＢＰ２とより高い配列類似性を共有する。ｉＡＳＰＰの発現は、ｐ５３のアポトーシス機能を阻害した。５３ＢＰ２と同様に、ｐ５３のアポトーシス機能に対するｉＡＳＰＰの最も顕著な影響は、ＡＳＰＰの競合物質として作用するその能力により媒介される。しかしながら、Ｃ．エレガンスでは、ｉＡＳＰＰは、ヒトＡＳＰＰファミリーに対して相同性を有する唯一の遺伝子である。したがって、ｉＡＳＰＰは、Ｃ．エレガンスにおいてｐ５３のアポトーシス機能を直接阻害する。同様のメカニズムはまた哺乳類細胞においても適用され得る。これと一致して、ｉＡＳＰＰアンチセンスＲＮＡは、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ７細胞においてアポトーシス細胞の３〜５倍増加を誘発した。この後者のモデルでは、ＡＳＰＰは、ｉＡＳＰＰがｐ５３に課した負の影響を取り除くことによりｐ５３のアポトーシス機能を刺激することができる。ｉＡＳＰＰアンチセンスＲＮＡがシスプラチン処理したＵ２ＯＳおよびＭＣＦ７細胞においてアポトーシスの有意な増加をもたらすことができないことは、シスプラチンが、ＡＳＰＰの活性を増加させることによりｐ５３のアポトーシス機能を刺激するという事実に起因し得る。このことは続いて、ＡＳＰＰアンチセンスＲＮＡの発現が、シスプラチンにより誘発されるアポトーシスに対する顕著な阻害効果を生み出したことの理由を説明し得る。また、この条件下で、ｉＡＳＰＰの抗アポトーシス機能は最も顕著である。したがって、ｐ５３のアポトーシス機能は、ｉＡＳＰＰにより負に調節され、ＡＳＰＰにより正に調節される。これらの２つの対抗するシグナル間の競合が、ｐ５３のアポトーシス状態、最終的には細胞運命を決定することができる。ｉＡＳＰＰがＡＳＰＰの優性ネガティブな調節因子またはｐ５３の直接的な阻害剤として作用するかどうかに関わらず、ｐ５３の結合に関するｉＡＳＰＰとＡＳＰＰとの間の競合は、ｐ５３のアポトーシス機能に重要である。このモデルと一致して、ＡＳＰＰ２と複合体形成したｐ５３の割合の変化がＤＮＡ損傷に応答して見られた。ｉＡＳＰＰおよびＡＳＰＰと複合体形成したｐ５３の割合は、死または生存を誘発するシグナルにより調節される可能性が高い。
【０１０９】
ｐ５３の阻害剤であるｉＡＳＰＰは、ヒトパピローマウイルスおよびアデノウイルスのｒａｓ＋Ｅ７またはＥ１Ａのような発癌遺伝子のトランスフォーミング活性を高めるが、ｒａｓ＋突然変異体ｐ５３を高めない。これは、Ｅ７およびＥ１Ａがｐ５３依存性アポトーシスを誘発することが知られている９ため特に興味深い。Ｅ７およびＥ１ＡはＲｂの腫瘍サプレッサー機能を結合し、それを不活性化することができるのに対し、それらの発癌性機能は、ｐ５３依存性アポトーシスを活性化するそれらの能力に起因して大いに減少される。Ｅ７およびＥ１Ａにより誘発されるアポトーシスを阻害することができるタンパク質は、Ｅ７およびＥ１Ａの発癌性機能を高める。したがって、優性ネガティブなｐ５３突然変異体と同様に、ｉＡＳＰＰは、ｐ５３のアポトーシス機能を阻害することによりＥ７およびＥ１Ａの発癌性機能を刺激することが可能であった。ｉＡＳＰＰが、本明細書に記載する実験条件下でＲＥＦを形質転換させるのにｒａｓと同時に作動させる際に突然変異体ｐ５３、ｐ５３Ｈ１７５またはｐ５３Ｌ１７３ほど活性でなかったことに注目することは重要である。理由の一部としては、アッセイにおいて、ｉＡＳＰＰの発現レベルが低いことに起因するものであった（データは示していない）。しかしながら、ｉＡＳＰＰおよび突然変異体ｐ５３のトランスフォーミング活性における差異はまた、突然変異体ｐ５３の他の既知の活性により引きこされる可能性があり、これは、ｐ５３の単純な優性ネガティブな阻害剤として作用するその能力と無関係である。それにもかかわらず、ＵＶおよびシスプラチンの細胞障害性効果に対して細胞耐性を付与する能力により、ｉＡＳＰＰの過剰発現が野生型ｐ５３を発現するヒト腫瘍において選択されることが示唆された。これと一致して、ｉＡＳＰＰ発現は、野生型ｐ５３を発現するヒト乳癌において増加される。高レベルのｉＡＳＰＰを発現する腫瘍の大部分（８つのうち７つ）はまた、野生型ｐ５３および正常レベルのＡＳＰＰを発現し、ｉＡＳＰＰがｉｎ  ｖｉｖｏでＡＳＰＰの阻害剤であることを示す。本発明者等のこれまでの研究により、ＡＳＰＰ１およびＡＳＰＰ２の発現レベルが、野生型ｐ５３を発現するヒト乳癌の６０％においてダウンレギュレートされることが示された。総合すると、ＡＳＰＰファミリーの成員の異常発現は、検査したヒト乳癌のほぼ８０％を示す。ＡＳＰＰファミリーの成員は、異なる染色体上に位置される３つの異なる遺伝子によりコードされる（データは示していない）。本発明者等は、ＡＳＰＰのダウンレギュレーションを示すヒト乳癌の頻度が、ｉＡＳＰＰの発現増加を示すものよりもかなり高い理由を理解していない。しかしながら、ＡＳＰＰファミリーの成員の発現パターンは、種々のタイプのヒト腫瘍において変化することが可能である。改変したＡＳＰＰ発現を伴う腫瘍の割合もまた、様々な腫瘍タイプで異なる。それにもかかわらず、ｉＡＳＰＰの発癌性機能を阻害することにより、野生型ｐ５３を発現する腫瘍を治療するための重要な新規戦略を提供することができる。
【０１１０】
ＡＳＰＰファミリーによるｐ５３の進化的に保存された調節
配列比較により、ヒトとＣ．エレガンスのｉＡＳＰＰアミノ酸配列との間に３８％の同一性が存在し、アンキリン反復およびＳＨ３ドメイン内では相同性は７８％程度と高い（ヒトｉＡＳＰＰの残基１５４〜２２７およびＣｅ−ｉＡＳＰＰの残基５５７〜６３０で、５５／７４残基が類似している）ことが明らかである。ｐ５３と接触しているｉＡＳＰＰ残基のほとんどが保存されている。ヒトとＣ．エレガンスのｉＡＳＰＰとの間の構造的保存は、ヒト細胞においてｐ５３機能を調節するそれらの能力により反映される。ヒトｉＡＳＰＰと同様に、Ｃ．エレガンスｉＡＳＰＰは、細胞系においてヒトｐ５３と相互作用して、ヒトｐ５３のトランス活性化およびアポトーシス機能を阻害する。ＡＳＰＰ／ｐ５３調節の保存は、ヒト細胞におけるＣ．エレガンスｐ５３の研究においてさらに実証される。ヒトとＣ．エレガンスのｐ５３との間の配列相同性が非常に限定されている（タンパク質レベルで１３．７％同一性）ということに注目することは興味深く、かつ重要なことである。２つの種間のｐ５３相同性の最高レベルは、非常に限定された領域でおよそ５０％である（残基９／１８残基が類似している）。しかしながら、結晶構造から同定された１０ＡＳＰＰ２接触残基のほとんどが、ヒトとＣ．エレガンスのｐ５３との間で保存される（８残基のうち５残基が保存されている）。Ｃ．エレガンスｐ５３の、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＡＳＰＰファミリーの成員と相互作用する能力は、これらの保存残基の重要性を強調する。意外にも、Ｃ．エレガンスｐ５３は、ヒト細胞において非常に効率よくアポトーシスを誘発する。ヒトｐ５３に類似して、Ｃ．エレガンスｐ５３のアポトーシス機能は、ヒトＡＳＰＰおよびｉＡＳＰＰによりそれぞれ正および負に調節される。これらの結果により、ｐ５３のアポトーシス機能が、ヒトとＣ．エレガンスのｐ５３との間で限定された配列相同性にも関わらず保存されることが初めて実証される。ヒトとＣ．エレガンスのｐ５３との間で保存される数個の重要な残基は、ＡＳＰＰファミリーの成員がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でｐ５３のアポトーシス機能を調節するのに十分である。
【０１１１】
Ｃ．エレガンスｐ５３は、ヒトｐ５３と比較して、ＢａｘおよびＰＩＧ３のようなヒトｐ５３標的遺伝子をトランス活性化するわずかな能力を示した（データは示していない）。Ｂａｘが多くの場合にアポトーシス中のｐ５３標的遺伝子であるとしても、ｐ５３誘発性アポトーシスに必要とされる唯一の標的遺伝子ではない。ｐ５３は、２０個を超えるアポトーシス促進性遺伝子をトランス活性化することが知られており、これらのアポトーシス促進性遺伝子のいずれも、ｐ５３誘発性アポトーシスにおいて必須であることが今のところ証明されていない。ヒトゲノムには４０００個を超える推定上のｐ５３標的遺伝子が存在し、それらの多くがアポトーシス促進性遺伝子である１１。Ｃｅ−ｐ５３が、ヒトｐ５３と同程度効率よくこれらの他のヒトｐ５３標的遺伝子のいくつかをトランス活性化し得ることが可能である。不運にも、本発明者等が試験したものはいずれも、今のところこのカテゴリーに属さない。Ｃｅ−ｐ５３によるヒト細胞におけるヒトＢａｘ−ｌｕｃレポーターのトランス活性化はあまり強力ではないが、ＡＳＰＰの同時発現が、Ｂａｘのプロモーター上のＣｅ−ｐ５３のみのトランス活性化機能を刺激したが、ｍｄｍ２上のＣｅ−ｐ５３のトランス活性化機能を刺激しなかったことに注目することは重要である。ＡＳＰＰ作用のこのパターンは、ヒトｐ５３に見られるのと類似している。あるいは、Ｃｅ−ｐ５３は、その転写活性に無関係にアポトーシスを誘発し得る。ヒトｐ５３は、転写依存性経路および転写非依存性経路の両方を通じてアポトーシスを誘発することが知られている１２。Ｃｅ−ｐ５３がヒト細胞においてどのようにアポトーシスを誘発するかにかかわらず、ヒトＡＳＰＰファミリーのタンパク質が類似した様式でＣｅ−ｐ５３およびヒトｐ５３の両方のアポトーシス機能を調節するということが最も顕著かつ重要な事実である。Ｃｅ−ｉＡＳＰＰもまた、ヒト細胞で実施されるアッセイすべてにおいて、ヒトｉＡＳＰＰと完全に置き換えることが可能である。これらの結果は、ＡＳＰＰファミリーによるｐ５３機能の調節が虫からヒトへ保存されることを強く論じている。ｐ５３とＡＳＰＰファミリーとの間の関連は、ＡＳＰＰファミリーによるｐ５３の調節が、癌療法のための新規戦略を開発する際に今度のターゲットとすべきであることを示唆する。野生型ｐ５３を発現する腫瘍は、ＡＳＰＰの活性を増強し、ｉＡＳＰＰの活性を取り除くことにより治療に感作され得る。
【０１１２】
化学療法薬は、ＡＳＰＰファミリーのタンパク質機能を改質させるようである
ヒト腫瘍の５０％が野生型ｐ５３を維持するため、癌を治療するためのアプローチの１つは、腫瘍細胞においてｐ５３を再活性化して、アポトーシスを誘発することであり得る。実際に、化学療法剤および放射線療法剤は、ＤＮＡ損傷を発生し、それが腫瘍細胞において機能性ｐ５３を活性化することができる。しかしながら、これらの薬物により影響を受ける経路は様々であり、腫瘍細胞は、生存を可能にするための防御的戦略を展開することができる。すでに記載されているように、ＡＳＰＰ１およびＡＳＰＰ２は、アポトーシス促進性遺伝子のプロモーター上でｐ５３のＤＮＡ結合およびトランス活性化機能を刺激することによりｐ５３のアポトーシス機能を特異的に高める(Samuels-Lev et al., 2001)のに対して、ｉＡＳＰＰは、ｐ５３の非常の保存された阻害剤である(Bergamaschi et al., 2003)。総合すると、このことは、ＡＳＰＰファミリーのタンパク質の機能は、化学療法剤により影響される可能性があり、次いでそれは、続くｐ５３アポトーシス応答を変化させ、したがって癌治療において使用される薬剤の有効性で役割を果たす。
【０１１３】
具体的に、化学療法薬が、ＡＳＰＰの活性を調整することによりＤＮＡ損傷を受けた細胞系においてより効果的となり得るという仮定を調査するために実験を行った。
【０１１４】
化学療法剤を用いて、細胞系において誘発されたアポトーシスがｐ５３発現レベルと直接相関するかどうかを調査した。Ｕ−２ＯＳおよびＭＣＦ７細胞を、Ｐｉｇ３プロモーター（Ｐｉｇ３−ｌｕｃ  １７量体）でトランスフェクトし、様々な化学療法薬（ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド、コルヒシン、メシル酸デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ダウノルビシン、カンプトテシンおよび５’フルオロウラシル）で処理した。
【０１１５】
ルシフェラーゼレベルを２４時間後にアッセイした（図１３）。結果により、ルシフェラーゼにより測定されるような薬物誘発性アポトーシスは、ｐ５３タンパク質レベルで直接相関しなかった（例えば、ドキソルビシン応答とシスプラチン応答を比較せよ）ことが示され、ｐ５３だけでは、アポトーシス促進性遺伝子の活性化を担わないことを示す。ＡＳＰＰタンパク質は、様々な化学療法薬に直接応答して、Ｐｉｇ３活性化とｐ５３タンパク質発現レベルとの間に観察される相違を与えることが可能である。
【０１１６】
ＡＳＰＰが当該プロセスにおいて役割を果たすかどうかを試験するために、短干渉ＲＮＡ（ｓｉ−ＲＮＡ）(Elbashir et al., 2001)およびアンチセンスＲＮＡを用いて、ＡＳＰＰ遺伝子発現をノックダウンした。ｓｉ−ＲＮＡを生成するための配列を、ｐＳｕｐｅｒプラスミドにクローニングした(Brummelkamp et al., 2002)。アポトーシス促進性遺伝子の応答は使用した薬物に応じて異なっていたため、ドキソルビシンおよびシスプラチンの両方をＵ−２ＯＳ細胞で試験した。Ｐｉｇ３−ルシフェラーゼは、アンチセンスまたはｓｉ−ｉＡＳＰＰのいずれかと一緒にトランスフェクトした（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。結果により、アンチセンスＡＳＰＰ１またはアンチセンスＡＳＰＰ２はともに、ドキソルビシンによるＰｉｇ３−ルシフェラーゼの誘発を減少する（図１４Ａ）が、ｉＡＳＰＰに関するアンチセンスまたはｓｉ−ＲＮＡは減少を引き起こさなかったことが示される。ｐ５３に関するｓｉ−ＲＮＡは、ドキソルビシン応答を防止した（図１４Ａ）。対比して、アンチセンスＡＳＰＰ１またはアンチセンスＡＳＰＰ２は、Ｐｉｇ３プロモーターのシスプラチン誘発に対してわずかに影響したが、ｉＡＳＰＰに関するｓｉ−ＲＮＡは、有意な増加を引き起こした。また、ｐ５３に関するｓｉＲＮＡはシスプラチン応答を防止した。
【０１１７】
これらのデータは、内因性ｐ５３活性がＵ−２ＯＳ細胞においてＡＳＰＰ１およびＡＳＰＰ２と共同してドキソルビシンにより誘発されたが、シスプラチンに応答して内因性ｐ５３活性はｉＡＳＰＰにより抑制されたことを示すと解釈することができる。これらの異なる影響は、ＡＳＰＰまたはｉＡＳＰＰ活性に対する薬物の調整の影響に起因し得る。
【０１１８】
ｉＡＳＰＰ／ｐ５３結合の崩壊は、アポトーシスを高めることができ、また癌療法で潜在的に使用され得る
合成分子とのｐ５３／ｉＡＳＰＰ相互作用を阻害することにより、ｐ５３陽性のストレスをかけた細胞においてｐ５３媒介性アポトーシスを導くことができる。
【０１１９】
ｐ５３はｉＡＳＰＰのＣ末端部分に結合することが知られており、特異的接触アミノ酸を図１０に示す。ｉＡＳＰＰ／ｐ５３結合を阻害し、かつアポトーシス促進性遺伝子に対する影響を試験するために、特定のｉＡＳＰＰ配列を含有する３つの異なるペプチドを設計した（図１０）。３つのペプチドは、Ｔａｔ配列およびＦＩＴＣに連結された。
【０１２０】
最初に、ペプチドを、ｐ５３を活性化するためのＵＶ照射を用いて、Ｂａｘプロモーターのｐ５３トランス活性化に対するそれらの影響を試験した（図１１）。Ｂａｘプロモーターのルシフェラーゼ活性は、対照ペプチドによりほんのわずか影響を受け、対照ペプチドは、ｉＡＳＰＰとｐ５３の相互作用に影響を及ぼすはずはない。しかしながら、ペプチド３、ペプチド６またはペプチド７の添加が、５０μＭペプチドを使用して、レポーター活性の約２倍増加を引き起こした。ペプチドによっては、１００μＭであまり活性でないものもあった。
【０１２１】
Ｐｉｇ３−ルシフェラーゼレポーターを用いた研究を続けた。Ｐｉｇ３遺伝子は、Ｂａｘと異なる様式でｐ５３によりトランス活性化される。Ｂａｘは従来の転写ドメインによりトランス活性化される(El-Deiry et al., 1992)(Bourdon et al., 1997)のに対して、ｐ５３は、反復配列（ＴＧＹＣＣ）ｎ（ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ）によりＰｉｇ３プロモーターに結合する(Polyak et al., 1997)。反復数は、母集団内で多様である(Contente et al., 2002)。１０回または１７回の反復を含有する２つのレポーターは、それらの間で応答して差異が存在する場合に使用された。考慮すべき他の変数は、時間およびペプチド濃度、ならびにｐ５３およびｉＡＳＰＰが主として核タンパク質であるため細胞中でのペプチドの位置である。
【０１２２】
第二世代のペプチドをこの実験用に使用した。これは、標識を除いてこれまでのペプチドと一致している。これらのペプチドを、９つのアルギニン残基で標識し、９つのアルギニン残基は、ペプチドに細胞へのより良好な浸透を与えると考えられる(Lindsay, 2002)。この場合では、ＡＳＰＰ２配列からのペプチド７が包含され（図１０を参照）、種々の対照ペプチド（Ｙａｐ）を使用した。細胞をシスプラチンで処理して、ペプチドを２つの異なる濃度（２５μＭおよび５０μＭ）で１２時間適用し、結果を図１５に示す。結果において幾らか変動性が見られるにもかかわらず、Ｐ３−ｉＡＳＰＰまたはＰ７−ｉＡＳＰＰペプチドは、対照Ｙａｐペプチドおよびシスプラチン処理で見られる応答を上回ってレポーター活性において実質的な増加を示し、化学療法中に誘発されるアポトーシスを、ｉＡＳＰＰペプチド阻害剤の使用により高めることができることを示唆した。
【０１２３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１ａ】ヒトｉＡＳＰＰの核酸配列である。
【図１ｂ】Ｃ．エレガンスのｉＡＳＰＰの核酸配列である。
【図２ａ】ヒトｉＡＳＰＰのアミノ酸配列である。
【図２ｂ】Ｃ．エレガンスのｉＡＳＰＰのアミノ酸配列である。
【図３ａ】ＦＩＴＣ標識ペプチド（３ａ）ＤＧＰＥＥＴＤおよび（３ｂ）ＴＴＬＳＤＧは細胞を浸透することができることを示す。
【図３ｂ】ＦＩＴＣ標識ペプチド（３ａ）ＤＧＰＥＥＴＤおよび（３ｂ）ＴＴＬＳＤＧは細胞を浸透することができることを示す。
【図４】様々なペプチド、特にＤＧＰＥＥＴＤとのインキュベーション後のｐ５３によるＢａｘプロモーターの刺激を示す。
【図５】ペプチドＤＧＰＥＥＴＤの存在下でのＤＮＡのＵＶ損傷後のヒト腫瘍細胞系Ｕ２ＳＯにおけるｐ５３トランス活性化の刺激を示す。
【図６】Ｃ．エレガンスｉＡＳＰＰとｐ５３の相互作用を示す様々な実験を示す。
【図７】Ｃ．エレガンスｉＡＳＰＰとヒトｉＡＳＰＰとの間の相同性比較を示す。
【図８】Ｃ．エレガンスｉＡＳＰＰとｐ５３の相互作用を示すさらなる実験を示す。
【図９】Ｃ．エレガンスｉＡＳＰＰ発現に対するＲＮＡｉの影響を示す。
【図１０】ｉＡＳＰＰ中のｐ５３接触部位を示す。
【図１１】Ｂａｘ−Ｌｕｃレポーターのトランス活性化レベルに対するペプチドの影響。細胞をＢａｘレポーター遺伝子でトランスフェクトし、ＵＶ（２０Ｊ／ｍ２）に暴露させた。ペプチドを、示したような２つの異なる濃度で培地中に２４時間添加した。
【図１２】１２時間のＰｉｇ３レポーター活性に対するペプチドの影響を示す。トランス活性化させた細胞を、２つの濃度でＡｒｇ標識ペプチドを含有する培地を用いて成長させた。左の棒グラフは、２５μＭの濃度でのトランス活性化活性を表し、第２の棒グラフは、５０μＭの濃度を用いた場合である。ｐ９の代わりに、ここではＹａｐペプチを対照ペプチドとして使用する。対照を除いて、細胞をシスプラチン（３μｇ／ｍｌ）で処理した。
【図１３】ｐ５３誘発アポトーシスに対する様々な化学療法薬の影響を示す。
【図１４】図１４ａは、抗癌剤ドキソルビシンの活性と組み合わせた、ＡＳＰＰ１、ＡＳＰＰ２もしくはｉＡＳＰＰのアンチセンスまたはｓｉ−ＲＮＡの影響を示す。１４ｂは、抗癌剤シスプラチンの活性と組み合わせた、ＡＳＰＰ１、ＡＳＰＰ２もしくはｉＡＳＰＰのアンチセンスまたはｓｉ−ＲＮＡの影響を示す。
【図１５】ＡＳＰＰ１、ＡＳＰＰ２およびｉＡＳＰＰに対する、シスプラチンと組み合わせた阻害性ペプチドの活性を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006517787.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月24日(2004.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする単離核酸分子、またはそれらの配列変異体であって、前記ポリペプチドは、図２ａまたは図２ｂに表されるポリペプチド配列の断片であって、該断片は、
ｉ）図２ａまたは図２ｂに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、または
ｉｉ）図２ａまたは図２ｂに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片であって、前記配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾され、前記ポリペプチドはｐ５３のアポトーシス活性を阻害することを特徴とするポリペプチド断片、
から選択される核酸分子。
【請求項２】
前記分子は、図２ａに表される配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基からなる断片をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記分子は、ヒトから単離される、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記分子は、図２ｂに表される配列のおよそ残基１２８〜２２４由来のアミノ酸残基から構成される断片をコードする、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記分子は、線虫から単離される、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子はｃＤＮＡである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子はゲノムＤＮＡである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド断片またはそれらの配列変異体。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
前記ベクターは発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１０または１１に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞。
【請求項１３】
医薬品として使用するための請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
医薬品として使用するための請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
希釈剤、キャリアまたは賦形剤をさらに含む、請求項１３または１４に記載の核酸またはポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドのｐ５３への結合を阻害する作用物質の同定のためのスクリーニング方法における請求項９に記載のポリペプチドまたはそれらの断片の使用。
【請求項１８】
ポリペプチドまたはそれらの断片のｐ５３への結合を阻害する作用物質を同定するスクリーニング方法であって、
ｉ）
ａ）請求項９記載のポリペプチド、および
ｂ）（ａ）におけるポリペプチドに関する結合部位（複数可）からなるｐ５３ポリペプチドまたはそれらの断片
を含む調製物を形成すること、
ｉｉ）試験されるべき少なくとも１つの作用物質を供給すること、
ｉｉｉ）（ａ）におけるポリペプチドの（ｂ）におけるポリペプチドへの結合に関して前記作用物質の活性を決定することと
を含む方法。
【請求項１９】
前記作用物質はポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドはペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、抗体またはそれらの結合部分である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体はモノクロナール抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記断片はＦａｂ断片である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｂ断片、ならびにＣＤＲ３領域からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体はヒト化されている、請求項２２ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体はキメラ抗体である、請求項２２ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
線虫から単離される単離核酸分子であって、図２ｂにより表されるような核酸配列をハイブリダイズし、ｐ５３の阻害剤をコードしｐ５３のアポトーシス活性を阻害する核酸分子。
【請求項２８】
前記分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
前記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である、請求項２７または２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
図２ｂに表されるようなアミノ酸を含む単離ポリペプチドまたは変異ポリペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾され、かつｐ５３の阻害剤である単離ポリペプチドまたは変異ポリペプチド。
【請求項３１】
有効量の請求項９に記載のポリペプチドを投与することを含む動物の治療方法であって、前記有効量は、ｐ５３のアポトーシス活性を誘発する方法。
【請求項３２】
有効量の請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸分子、あるいは請求項１０または１１に記載のベクターを投与することを含む動物の治療方法であって、前記有効量は、ｐ５３のアポトーシス活性を誘発する方法。
【請求項３３】
前記治療は、癌治療である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドの長さは、少なくとも６アミノ酸残基である、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドの長さは、少なくとも７アミノ酸残基、８アミノ酸残基、９アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１６アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１８アミノ酸残基、１９アミノ酸残基または２０アミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドの長さは、少なくとも２０アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、９０アミノ酸残基または１００アミノ酸残基である、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３８】
ＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドは、複数のアルギニン残基をさらに含む、請求項３４ないし３８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４０】
前記複数のアルギニン残基は、少なくとも２アルギニン残基長、３アルギニン残基長、４アルギニン残基長、５アルギニン残基長、６アルギニン残基長、７アルギニン残基長、８アルギニン残基長、９アルギニン残基長または１０アルギニン残基長である、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４１】
医薬品として使用するためのＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるペプチド。
【請求項４２】
ＤＧＰＥＥＴＤ、ＧＰＥＥＴＤ、ＴＴＬＳＤＧ、ＡＥＦＧＤＥ、またはＰＲＮＹＦＧからなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４３】
前記組成物は、キャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項３４ないし４０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの抗癌剤を含む医薬組成物。
【請求項４５】
前記抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、エトポシド、コルヒシン、メシル酸デフェロキサミン、およびカンプトテシンからなる群から選択される、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記抗癌剤はシスプラチンである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記抗癌剤はドキソルビシンである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
請求項３４ないし４０のいずれか１項に記載のペプチドおよび抗体またはその結合部分を含む複合体。
【請求項４９】
前記抗体またはその結合部分は、細胞特異的抗体である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５０】
前記抗体は、癌細胞特異的抗体である、請求項４８または４９に記載の複合体。
【請求項５１】
動物、好ましくはヒトの治療方法であって、前記動物は、有効量の請求項３４ないし４０のいずれか１項に記載のペプチドを投与することを含むアポトーシスの誘発から利益を得る方法。
【請求項５２】
動物、好ましくはヒトの治療方法であって、前記動物は、有効量の請求項４２ないし４７のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４８ないし５０のいずれか１項に記載の複合体を投与することを含むアポトーシスの誘発から利益を得る方法。
【請求項５３】
前記治療は、癌治療である、請求項５１または５２に記載の方法。
【国際調査報告】
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2006517787.tif 000023
2006517787.tif 000024
2006517787.tif 000025