(57)【要約】本発明は、免疫調節ポリヌクレオチド及び当該免疫調節ポリヌクレオチドを用いた個体の免疫調節法を提供する。
2006512096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）０，１，２，３，４又は５塩基離れている少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドを含んで成るパリンドローム配列であって、少なくとも８塩基の長さであるパリンドローム配列；及び
ｂ）（ＴＣＧ）y（ここで、ｙは１又は２であり、（ＴＣＧ）yの５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０，１，２又は３塩基の位置にある）であって、前記パリンドローム配列の５’末端から０，１，又は２塩基離れている（ＴＣＧ）y、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記パリンドローム配列が前記（ＴＣＧ）y配列の全部又は一部を含む、請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項４】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）０，１，２，３，４又は５塩基離れている少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドを含んで成るパリンドローム配列であって、少なくとも８塩基の長さであるパリンドローム配列；及び
ｂ）（ＴＣＧ）y配列（ここで、ｙは１又は２であり、（ＴＣＧ）y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０，１，２又は３塩基の位置にある）、
を含んで成り；
（ａ）のパリンドローム配列が前記（ＴＣＧ）y配列の全部又は一部を含み；且つ
前記（ＴＣＧ）y配列のＣＧが（ａ）のパリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドのうちの１つであってもよい、免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記パリンドローム配列が前記（ＴＣＧ）y配列の全部又は一部を含む、請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項７】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５６）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基である）；及び
ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項７に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号２７、配列番号３９、配列番号５３、配列番号５５、配列番号１１３、配列番号１７５、及び配列番号１７２から成る群から選択される配列を含んで成る、請求項７に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５９）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ3及びＸ3’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基である）；及び
ｂ）少なくとも１０塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項１０に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６０）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ3及びＸ3’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ4及びＸ4’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ5及びＸ5’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基である）；及び
ｂ）少なくとも１２塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項１２に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号１６１）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び
ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z配列の最初の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項１４に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６２）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び
ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項１６に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６３）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び
ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項１８に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６４）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ3及びＸ3’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び
ｂ）少なくとも１０塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項２０に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
免疫調節ポリヌクレオチドであって：
ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号１６５）
（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び
ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z配列の最初の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ）を含んで成るパリンドローム配列、
を含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記パリンドローム配列が、１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する、請求項２２に記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを含んで成る免疫調節組成物。
【請求項２５】
個体の免疫反応を調節する方法であって、前記個体の免疫反応を調節するのに十分な量の請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを個体に投与することを含んで成る方法。
【請求項２６】
個体の免疫反応を調節する方法であって、前記個体の免疫反応を調節するのに十分な量の請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを個体に投与することを含んで成る方法。
【請求項２７】
個体のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を増大させる方法であって：
請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、前記個体に対し、前記個体のＩＦＮ−γを増大させるのに十分な量投与することを含んで成る方法。
【請求項２８】
個体のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を増大させる方法であって：
請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、前記個体に対し、前記個体のＩＦＮ−γを増大させるのに十分な量投与することを含んで成る方法。
【請求項２９】
個体のインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）を増大させる方法であって：
請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、前記個体に対し、前記個体のＩＦＮ−αを増大させるのに十分な量投与することを含んで成る方法。
【請求項３０】
個体のインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）を増大させる方法であって：
請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、前記個体に対し、前記個体のＩＦＮ−αを増大させるのに十分な量投与することを含んで成る方法。
【請求項３１】
個体のインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）を増大させる方法であって：
請求項７に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、前記個体に対し、前記個体のＩＦＮ−αを増大させるのに十分な量投与することを含んで成る方法。
【請求項３２】
個体の感染症の症候を回復させる方法であって：
有効量の請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを前記個体に投与することを含んで成り、ここで、有効量とは前記感染症の症候を回復させるのに十分な量である、方法。
【請求項３３】
個体の感染症の症候を回復させる方法であって：
有効量の請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを前記個体に投与することを含んで成り、ここで、有効量とは前記感染症の症候を回復させるのに十分な量である、方法。
【請求項３４】
個体のＩｇＥ関連障害の症候を回復させる方法であって：
有効量の請求項１に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、ＩｇＥ関連障害を有する個体に投与することを含んで成り、ここで、有効量とは前記ＩｇＥ関連障害の症候を回復させるのに十分な量である、方法。
【請求項３５】
個体のＩｇＥ関連障害の症候を回復させる方法であって：
有効量の請求項４に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを、ＩｇＥ関連障害を有する個体に投与することを含んで成り、ここで、有効量とは前記ＩｇＥ関連障害の症候を回復させるのに十分な量である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節ポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、免疫反応を調節するための当該ポリヌクレオチドの投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染又は他の抗原曝露に対して起こる免疫反応の型は、一般にこの反応に関連したヘルパーT(Th)細胞のサブセットにより特徴付けることができる。Th1サブセットは、遅発型過敏症及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化のような古典的細胞媒介型機能に寄与しているのに対し、Th2サブセットは、B細胞活性化のヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫反応の型は、一般に抗原に対して反応している細胞により産生されたサイトカインにより影響される。Th1及びTh2細胞により分泌されたサイトカインの差異は、これら2種のサブセットの異なる生物学的機能を反映していると考えられる。例えば、Romagnani、Ann. Allergy Asthma Immunol.、85:9-18 (2000)を参照のこと。
【０００３】
Th1サブセットは、CTLを活性化するIL-2及びIFN-？を分泌するので、これは、ウイルス感染症、細胞内病原、及び腫瘍細胞に対する反応に特に適していることがある。Th2サブセットは、IL-4及びIL-5が、各々IgE産生及び好酸球活性化を誘導することが知られているので、自由生活細菌及び寄生虫に対する反応により適していることがあり、かつアレルギー反応を媒介することがある。一般に、Th1及びTh2細胞は、個別のパターンでサイトカインを分泌し、かつそのようなひとつの反応型は、他の反応型の活性を調節しうる。Th1/Th2バランスの偏向はアレルギー反応を生じ、例えば、又は、その代わりとして、増大したCTL反応をもたらすことがある。
【０００４】
結核及びマラリアのような多くの感染症に関して、Th2-型反応は、感染に対してほとんど保護的価値がない。標的抗原に由来した小ペプチド及び感染の可能性のある完全なウイルス粒子を使用することを避けるためにその他の現在使用される抗原性物質を使用する提唱されたワクチンは、治療的効果を達成するのに必要な免疫反応を常に惹起するものではない。治療に有効なヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチンが存在しないことは、この欠点の不幸な例である。タンパク質-ベースのワクチンは、典型的にはTh2-型免疫反応を誘導し、これは、顕著な細胞-媒介型免疫は伴わないが高力価の中和抗体を特徴とする。
【０００５】
更に、一部の抗体反応の型は、ある種の適応症、最も顕著にはIgE抗体反応がアナフィラキシーショックを生じるようなアレルギー、において不適切である。一般にアレルギー反応は、Th2-型免疫反応にも関連している。アレルギー反応、例えばアレルギー性喘息は、アレルゲン曝露後数秒から数分以内に生じ、かつ細胞の脱顆粒により特徴付けられる早発反応、及び、アレルゲン曝露後4〜24時間で生じ、かつ好酸球のアレルゲン曝露部位への浸潤を特徴とする遅発反応を特徴としている。より詳細に述べると、アレルギー反応の早期に、アレルゲンは、好塩基球及び肥満細胞上のIgE抗体と交差連結し、これは次に脱顆粒の引き金を引き、かつ引き続き肥満細胞及び好塩基球からのヒスタミン及び他の炎症メディエーターの放出の引き金を引く。遅発反応期間、好酸球は、アレルゲン曝露部位に浸潤する(そこで組織損傷及び機能不全を生じる)。
【０００６】
アレルギー障害のための抗原免疫療法は、少量であるが、しかし漸増量の抗原の皮下注射を伴う。このような免疫感作処置は、IgE-媒介アナフィラキシーを誘導するリスクがあり、かつ遅発アレルギー反応のサイトカインが媒介した事象には効果的には対処しない。従ってこれまで、この方法はごく限られた成功をもたらしてきた。
【０００７】
一般に免疫刺激配列として知られているある種のDNA配列の投与は、Th1に関連したサイトカインの分泌により示されるようなTh1-型バイアスによる免疫反応を誘導する。免疫刺激ポリヌクレオチドと抗原との投与は、投与された抗原に対するTh1-型免疫反応を生じる。Romanら、Nature Med、3:849-854 (1997)。例えば、生理食塩水中又はアジュバントミョウバン中のエスケリッチャ・コリ(Escherichia. coli)β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)を皮内注射したマウスは、特異的IgG1及びIgE抗体、並びにIL-4及びIL-5は分泌するがIFN-γは分泌しないCD4+細胞の産生により反応し、これはこのT細胞はTh2サブセット支配的であることを示している。しかし、β-Galをコードしかつ免疫刺激配列を含むプラスミドDNA(生理食塩水中)を皮内注射した(又は、tyne皮膚擦過傷アプリケーターにより)マウスは、IgG2a抗体、並びにIFN-γは分泌するがIL-4及びIL-5は分泌しないCD4+細胞の産生により反応し、これはこのT細胞はTh1サブセット支配的であることを示している。更に、このプラスミドDNAを注射したマウスによる特異的IgE産生は、66〜75％低下した。Razら、Proc. Natl. Acad Sci. USA、93:5141-5145 (1996)。一般に、裸のDNA免疫感作に対する反応は、抗原-刺激したCD4+ T細胞によるIL-2、TNFα及びIFN-γの産生により特徴付けられ、これはTh1-型反応を示唆している。これは、IgE産生の低下により示されるように、アレルギー及び喘息の治療において特に重要である。免疫刺激ポリヌクレオチドのTh1-型免疫反応を刺激する能力は、細菌抗原、ウイルス抗原及びアレルゲンにより明らかにされている(例えば、WO98/55495参照のこと)。
【０００８】
ポリヌクレオチドの免疫刺激活性を説明する文献には：Krug et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 3026; Bauer et al. (2001) J. Immunol. 166: 5000; Klinman et al. (1999) Vaccine 17: 19; Jahn-Schmid et al. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 104: 1015; Tighe et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30: 1939; Shirota et al. (2000) J. Immunol. 164: 5575; Klinman et al. (1999) Infect. Immun. 67: 5658 ; Sur et al. (1999) J. Immunol. 162: 6284; Magone et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30: 1841; Kawarada et al. (2001) J. Immunol. 167: 5247; Kranzer et al. (2000) Immunology 99: 170; Krug et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 2154; Hartmann et al. (2000) J. Immunol. 164: 944; Bauer et al. (1999) Immunology 97: 699; Fujieda et al. (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162: 232; Krieg (2002) Annu. Rev. Immunol. 20: 709; Verthelyi et al. (2002) J. Immunol. 168: 1659; Hornung et al. (2002) J. Immunol. 168: 4531 ; Yamamoto et al. (2000) Springer Semin. Immunopathol. 22: 35 ; Lee et al. (2000) J. Immunol. 165: 3631 ; Gursel et al. (2002) J. Leukoc. Biol. 71: 813; Gursel et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32: 2617; Broide et al. (2001) J. Clin. Immunol. 21: 175; Zhu et al. (2001) Immunology 103: 226; Klinman et al. (2002) Microbes Infect. 4: 897; Hartmann et al. (2000) J. Immunol. 164: 1617; Krieg (1999) Biochim. Biophys. Acta 1489: 107; Dalpke et al. (2002) Immunology 106: 102; Yu et al. (2002) Biochem. Bioplzys. Res. Commun. 297: 83; Hafner et al. (2001) CancerRes. 61: 5523; Zwaveling et al. (2002) J. Immunol. 169: 350; Davis et al. (2000) Vaccine 18: 1920; Gierynska et al. (2002) J. Virol. 76: 6568; Lipford et al. (2000) J. Immunol. 165: 1228; Freidag et al. (2000) Infect. Immun. 68: 2948; Dieudonne et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107: S233が含まれる。
【０００９】
免疫刺激配列を説明する他の文献には、Krieg et al. (1989) J. Immunol. 143: 2448-2451 ; Tokunaga et al. (1992) Microbiol. Imnzunol. 36: 55-66; Kataoka et al. (1992) Jpn. J. CancerRes. 83 : 244-247; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076 ; Mojcik et al. (1993) Clin. Immuno. and Imnzunopathol. 67: 130-136; Branda et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043; Pisetsky et al. (1994) Life Sci. 54 (2): 101-107; Yamamoto et al. (1994a) Antisense Research and Development. 4: 119-122; Yamamoto et al. (1994b) Jpn. J. Cancer Res. 85: 775-779; Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519- 9523; Kimura et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo) 116: 991-994; Krieg et al. (1995) Nature 374 : 546-549; Pisetsky et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 772: 152-163; Pisetsky (1996a) J. Immunol. 156 : 421-423; Pisetsky (1996b) Immunity 5: 303-310 ; Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51: 173-182; Yi et al. (1996) J. Immunol. 156: 558-564; Ki-ieg (1996) Trends Microbiol. 4 (2): 73-76; Krieg et al. (1996) AntisenseNucleicAcid DrugDev. 6 : 133-139 ; Klinman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 2879-2883; Raz et al. (1996); Sato et al. (1996) Science 273: 352-354; Stacey et al. (1996) J. Immunol. 157: 2116-2122; Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157: 1840-1845; Branda et al. (1996) J. Lab. Clin. Med. 128: 329-338; Sonehara et al. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16: 799-803; Klilunan et al. (1997) J. Immunol. 158: 3635-3639; Sparwasser et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 1671-1679 ; Roman et al. (1997); Carson et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1621-1622; Chace et al. (1997) Clin. Immunol. and lininunopathol. 84: 185-193; Chu et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1623-1631 ; Lipford et al. (1997a) Eur. J. Immunol. 27: 2340-2344; Lipford et al. (1997b) Eur. J. Immunol. 27: 3420-3426; Weiner et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10833-10837; Macfarlane et al. (1997) Immunology 91: 586-593; Schwartz et al. (1997) J. Clin. Invest. 100: 68-73; Stein et al. (1997) Antisense Technology, Ch. 11 pp. 241-264, C. Lichtenstein and W. Nellen, Eds. , IRL Press; Wooldridge et al. (1997) Blood 89: 2994-2998; Leclerc et al. (1997) Cell. Immunol. 179: 97-106; Kline et al. (1997) J. Invest. Med. 45 (3): 282A; Yi et al. (1998a) J. Immunol. 160: 1240-1245; Yi et al. (1998b) J. Immunol. 160: 4755-4761; Yi et al. (1998c) J. Immunol. 160: 5898-5906; Yi et al. (1998d) J. Immunol. 161: 4493-4497; Krieg (1998) Applied Antisense Oligonucleotide Technology Ch. 24, pp. 431-448, C. A. Stein and A. M. Krieg, Eds. , Wiley- Liss, Inc.; Krieg et al. (1998a) Trends Microbiol. 6: 23-27; Krieg et al. (1998b) J. Immunol. 161: 2428-2434; Krieg et al. (1998c) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636; Spiegelberg et al. (1998) Allergy 53 (45S): 93-97; Horner et al. (1998) Cell Immunol. 190: 77-82; Jakob et al. (1998) J. Immunol. 161: 3042-3049; Redford et al. (1998) J. Immunol. 161: 3930-3935; Weeratna et al. (1998) Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8: 351-356; ＭＣCluskie et al. (1998) J. Immunol. 161 (9): 4463-4466; Gramzinski et al. (1998) Mol. Med. 4: 109-118; Liu et al. (1998) Blood 92: 3730-3736; Moldoveanu et al. (1998) Vaccine 16: 1216-1224; Brazolot Milan et al. (1998) Proe. Natl. Acad. Sci. USA 95: 15553-15558; Briode et al. (1998) J. Immunol. 161: 7054-7062; Briode et al. (1999) Int. Arch. Allergy ImmunoL 118: 453-456; Kovarik et al. (1999) J. Immunol. 162: 1611-1617; Spiegelberg et al. (1999) Pediatr. Pulmonol. Suppl. 18: 118-121; Martin-Orozco et al. (1999) Int. Immunol. 11: 1111-1118; EP 468, 520; WO 96/02555; WO 97/28259; WO 98/16247; WO 98/18810; WO 98/37919; WO 98/40100; WO 98/52581; WO 98/55495; WO 98/55609及びWO 99/11275が含まれる。更に、Elkins et al. (1999) J. Immunol. 162: 2291-2298, WO 98/52962, WO 99/33488, WO 99/33868, WO 99/51259及びWO 99/62923も参照のこと。また、Zimmermann et al. (1998) J. Immunol. 160: 3627-3630; Krieg (1999) Trends Microbiol. 7: 64-65及び米国特許第5,663,153号、第5,723,335号及び第5,849,719号も参照のこと。また、Liang et al. (1996) J. Clin. Invest. 98: 1119-1129; Bohle et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29: 2344-2353及びWO 99/56755も参照のこと。また、WO 99/61056; WO 00/06588; WO 00/16804; WO 00/21556; WO 00/54803; WO 00/61151 ; WO 00/67023; WO 00/67787並びに米国特許第6,090, 791号も参照のこと。また、Manzel et al. (1999) AntisenseNucl. Acid DrugDev. 9: 459-464; Verthelyi et al. (2001) J. Immunol. 166: 2372-2377; WO 01/15726 ; WO 01/12223; WO 01/22972 ; WO 01/22990 ; WO 01/35991 ; WO 01/51500 ; WO 01/54720; 米国特許第6,174, 872号、第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号も参照のこと。.また、WO 01/12804 ; WO 01/45750 ; WO 01/55341 ; WO 01/55370 ; WO 01/62207 ; WO 01/68077 ; WO 01/68078 ; WO 01/68103 ; WO 01/68116 ; WO 01/68117 ; WO 01/68143 ; WO 01/68144; WO 01/72123 ; WO 01/76642 ; WO 01/83503; WO 01/93902 ; WO 02/026757; WO 02/052002; WO 02/069369; WO 02/074922; 米国特許第6,339,068号、第6,406,705号、第6,426,334号、第6,426,336号、第6,429,199号、第6,476,000号も参照のこと。
【００１０】
免疫調節ポリヌクレオチドは通常ＣＧ配列を含む。ＩＭＰのＣＧに隣接しているヌクレオチドも前記ポリヌクレオチドの免疫調節活性において役割を果たしているようである。免疫調製ポリヌクレオチドの同定を継続する必要がある。
【００１１】
本願明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、引用によりそれらの全体が本願明細書に組み入れられる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、免疫調節ポリヌクレオチド（ＩＭＰ）及びこれらのポリヌクレオチドを用いて個体、特にヒトにおける免疫反応を調節する方法、に関する。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、免疫調節ポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に記載の免疫調節ポリヌクレオチドのいずれかを含んで成る組成物を含む。当該組成物はまた、例えば、医薬として許容される賦形剤又は多数の他の成分のいずれか、例えば抗原を含むことがある。
【００１４】
１つの側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドを含んで成るパリンドローム配列であって、当該ＣＧジヌクレオチドが０，１，２，３，４又は５塩基離れており、且つ当該パリンドローム配列が少なくとも８塩基の長さであるパリンドローム配列；及び（ｂ）（ＴＣＧ）y（ここで、ｙは１又は２であり、（ＴＣＧ）yの５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０，１，２又は３塩基の位置にあり、且つ（ＴＣＧ）yは前記パリンドローム配列の５’末端から０，１，又は２塩基離れている）を含んで成る。本段落又は本願のいずれかに記載されている本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの一部において、前記パリンドローム配列は、２／３未満がＧ及びＣという塩基組成を有する。幾つかの態様において、当該パリンドローム配列は１／３超がＡ及びＴという塩基組成を有する。
【００１５】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドを含んで成るパリンドローム配列であって、当該ＣＧジヌクレオチドが０，１，２，３，４又は５塩基離れており、且つ当該パリンドローム配列が少なくとも８塩基の長さであるパリンドローム配列；及び（ｂ）（ＴＣＧ）y（ここで、ｙは１又は２であり、（ＴＣＧ）y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチド５’末端から０，１，２又は３塩基の位置にあり、且つ（ＴＣＧ）y配列は前記パリンドローム配列の５’末端から０，１，又は２塩基離れている）を含んで成り、更にここで、（ａ）のパリンドローム配列は（ＴＣＧ）y配列の全部又は一部を含み、且つ（ＴＣＧ）y配列のＣＧは（ａ）のパリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドのうちの１つであってもよい。
【００１６】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５６）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。幾つかの態様において、Ｘ1及びＸ2はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。
【００１７】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５９）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ3及びＸ3’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも１０塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号２１７）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’）（配列番号２１６）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。幾つかの態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。幾つかの態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のうちの少なくとも２つはＡ又はＴのいずれかである。
【００１８】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６０）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ3及びＸ3’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ4及びＸ4’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ5及びＸ5’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも１２塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号２１９）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号２１８）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。幾つかの態様において、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、及びＸ5のうちの少なくとも３つはＡ又はＴのいずれかである。
【００１９】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号１６１）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z配列の最初の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。
【００２０】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６２）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’）配列を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。
【００２１】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６３）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号２２０）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。幾つかの態様において、Ｘ1及びＸ2はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。
【００２２】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６４）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ3及びＸ3’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも１０塩基の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号２２２）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号２２１）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。幾つかの態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はＡ又はＴのいずれかである。幾つかの態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のうちの少なくとも２つはＡ又はＴのいずれかである。
【００２３】
別の側面において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、（ａ）５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号１６５）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）；及び（ｂ）少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号２２３）配列の最初の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。幾つかの態様において、Ｘ1及びＸ2はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。
【００２４】
別の側面において、本発明は、個体の免疫反応を調節する方法であって、前記個体の免疫反応を調節するのに十分な量の本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを個体に投与することを含んで成る方法、を提供する。本発明の方法による免疫調節は、Th2-型免疫反応に関連した障害(例えば、アレルギー、アレルギー誘導型喘息又はアトピー性皮膚炎）に罹患した個体、治療的ワクチン(例えば、アレルギーエピトープ、マイコバクテリアエピトープ、又は腫瘍関連エピトープを含有するワクチン)もしくは予防的ワクチンのようなワクチンを受けている個体、ガンを有する個体及び感染症を有する個体を含む、個体で実施されうる。
【００２５】
更なる側面において、本発明は、個体のインターフェロン−ガンマ(IFN-γ)を増大させる方法であって、有効量の本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを前記個体に投与することを含んで成る方法、を提供する。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの投与は、個体におけるIFN-γを増大させる。
【００２６】
別の側面において、本発明は、個体のインターフェロン−アルファ(IFN-α)を増大させる方法であって、有効量の本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを前記個体に投与することを含んで成る方法、を提供する。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの投与は、個体におけるIFN-αを増大させる。
【００２７】
別の側面において、本発明は、感染症の１又は複数の症候を回復させる方法であって、有効量の本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを、感染症を有する個体に投与することを含んで成る方法、を提供する。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの投与は、感染症の１又は複数の症候を回復させる。
【００２８】
別の側面において、本発明は、ＩｇＥ関連障害の１又は複数の症候を回復させる方法であって、有効量の本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを、ＩｇＥ関連障害を有する個体に投与することを含んで成る方法、を提供する。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの投与は、ＩｇＥ関連障害の１又は複数の症候を回復させる。
【００２９】
本発明は更に、キット、好ましくは本発明の方法を実施するためのキットに関する。本発明のキットは通常、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド（通常適当な容器中）を含んで成り、そして、個体の免疫調節における免疫調節ポリヌクレオチドの使用についての説明書を更に含むことがある。
【００３０】
本発明の実施形態
本発明者らは、免疫調節ポリヌクレオチド、及び、個体、特にヒトの免疫反応を調節するための方法であって、これらの免疫調節ポリヌクレオチドを用いる方法、を発見した。本発明の組成物は、本明細書に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを含んで成る。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、ａ）少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列及びｂ）前記ポリヌクレオチドの５’末端又はその付近の少なくとも１つのＴＣＧトリヌクレオチド、を含む。
【００３１】
本発明者は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドが、免疫細胞、例えばヒト細胞を種々の方法で効率的に調節することを発見した。本発明者は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドがサイトカイン、例えばＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−α及びＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−γ、のヒト細胞からの産生を効果的に刺激することができる。本発明者はまた、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドがＢ細胞を効果的に刺激して増殖させうることを発見した。本発明者は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの幾つかが形質細胞様樹状細胞を活性化して成熟を受けさせることを観察した。本発明者はまた、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドのうちの幾つかの存在が培養液中の形質細胞様樹状細胞のアポトーシスの遅延をもたらしうることも観察した。
【００３２】
本発明はまた、個体の免疫反応を調節する方法であって、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを前記個体に投与することにより調節する方法も提供する。更に提供されるものとしては、本発明のＩＭＰを含んで成るキットがある。当該キットは、対象者の免疫調節のために本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを投与するための説明書及び免疫調節ポリヌクレオチドを更に含んで成ることがある。
【００３３】
一般的技術
本発明の実施は、特に言及しない限りは、当該技術分野の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の通常の技術を使用するであろう。このような技術は、文献において十分に説明されており、これは例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(Sambrookら、1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編集、1984)；Animal Cell Culture(R.I. Freshney編集、1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir及びC.C. Blackwell編集)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller及びM.P. Calos編集、1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編集、1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編集、1994)；Current Protocols in Immunology(J.E. Coliganら編集、1991)；The Immunoassay Handbook(D. Wild編集、Stockton Press NY、1994)；Bioconjugate Techniques(Gr例えば T. Hermanson編集、Academic Press社、1996)；及び、Methods of Immunological Analysis(R. Masseyeff、W.H. Albert、及びN.A. Staines編集、Weinheim:VCH Verlags gesellschaft社、1993)を含む。
【００３４】
定義
本願明細書において使用される単数形「ひとつの(a、an)」、及び「当該(the)」は、特に記さない限りは、複数の意味も含む。例えば、「ひとつの(an)」ＩＭＰは、１又は複数のＩＭＰを含む。
【００３５】
本願明細書において同義的に使用される用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は、1本鎖DNA(ssDNA)、2本鎖DNA(dsDNA)、1本鎖RNA(ssRNA)及び2本鎖RNA(dsRNA)、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド又はそれらの組合せを含む。当該オリゴヌクレオチドは、直鎖状又は環状の形状であってもよく、あるいは当該オリゴヌクレオチドは、直鎖状及び環状の両セグメントを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一般にホスホジエステル連結を介して結合されたヌクレオシドのポリマーであるが、代わりの連結、例えばホスホロチオエートエステルも、オリゴヌクレオチドにおいて使用することができる。ヌクレオシドは、糖に結合した、プリン(アデニン(A)又はグアニン(G)あるいはそれらの誘導体)又はピリミジン(チミン(T)、シトシン(C)又はウラシル(U)、あるいはそれらの誘導体)塩基から構成される。DNA中の4種のヌクレオシド単位(又は塩基)は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと称されている。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００３６】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド」又は「ＩＭＰ」は、本明細書で使用する場合、in vitro、in vivo及び／又はex vivoにおいて測定される際に、測定可能な免疫反応に作用する及び／又は寄与するポリヌクレオチドを意味する。測定可能な免疫反応の例は、限定しないが、抗原特異的抗体の産生、サイトカインの分泌、NK細胞、CD4+Tリンパ球、CD8+Tリンパ球、Bリンパ球などのようなリンパ球集団の活性化又は拡大などを含む。好ましくは、ＩＭＰ配列は、優先的にTh1-型反応を活性化する。
【００３７】
用語「免疫調節」又は「免疫反応を調節する」とは、本明細書で使用する場合、免疫刺激作用に加え免疫抑制作用を含む。免疫調節は、全般的免疫反応における主要な定性的変化であるが、定量的変化も免疫調節と一緒に生じることがある。本発明に従い免疫調節された免疫反応は、「Th2-型」免疫反応とは反対側、「Th1-型」免疫反応に偏向したものである。Th1-型反応は、典型的には細胞性免疫システム(例えば、細胞傷害性リンパ球)反応と見なされるのに対し、Th2-型反応は一般に「体液性」又は抗体-ベースである。Th1-型免疫反応は通常、抗原に対する「遅延-型過敏症」反応により特徴付けられ、かつIFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12、及びTNF-β、更にはIL-6のようなTh1-関連サイトカインの増大したレベルにより、生化学的レベルで検出することができるが、IL-6は、更にTh2-型反応にも関連づけることができる。Th1-型免疫反応は一般に、細胞傷害性リンパ球(CTL)の産生及び抗体の低レベル又は一過性の産生により関連づけられる。Th2-型免疫反応は一般に、IgE産生を含む、比較的高レベルの抗体産生、CTL産生の非存在又は最小化、更にはIL-4のようなTh2-関連サイトカインの発現に関連づけられる。従って本発明の免疫調節は、例えば、無処置と比較した場合の、本発明の方法で処置した個体における、IFN-γの増加及び／又はIgE産生の低下により認識することができる。
【００３８】
用語「３’」は一般に、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの別の領域又は位置から3'側(下流)のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの領域又は位置を意味する。用語「３’末端」は、ポリヌクレオチドの３’末を意味する。
【００３９】
用語「５’」は一般に、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの別の領域又は位置から5'側(上流)のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの領域又は位置を意味する。用語「５’末端」は、ポリヌクレオチドの３’末を意味する。
【００４０】
別の配列に「隣接している」領域、部分又は配列は、その領域、部分、又は配列に直接接触している。例えば、免疫調節ポリヌクレオチドの特定の部分に隣接している追加のポリヌクレオチド配列（例えば、ＴＣＧトリヌクレオチド）は、その領域に直接接している。
【００４１】
用語「パリンドローム配列」又は「パリンドローム」とは、逆方向反復の核酸配列を意味し、例えば、ＡＢＣＤＤ’Ｃ’Ｂ’Ａ’であり、ここで、塩基、例えばＡ、及びＡ’、Ｂ及びＢ’、Ｃ及びＣ’、Ｄ及びＤ’は、ワトソンクリックの塩基対を形成することができる。そのような配列は一本鎖であってもよく、あるいは二本鎖構造を形成してもよく、あるいは条件によってはヘアピンループ構造を形成してもよい。例えば、本明細書で使用する場合、「８塩基のパリンドローム」とは、パリンドローム配列が８塩基の長さ、例えばＡＢＣＤＤ’Ｃ’Ｂ’Ａ’である核酸配列を意味する。パリンドローム配列は、非パリンドローム配列も含むポリヌクレオチドの一部であってもよい。ポリヌクレオチドは、１又は複数のパリンドローム配列部分及び１又は複数の非パリンドローム配列部分を含んでもよい。あるいは、ポリヌクレオチド配列は全体的にパリンドロームであってもよい。１つ以上のパリンドローム配列部分を有するポリヌクレオチドにおいて、当該パリンドローム配列部分は互いに重複していてもよく、あるいは当該パリンドローム配列部分は互いに重複していなくてもよい。
【００４２】
用語「接合体(conjugate)」は、ＩＭＰと抗原が連結している複合体を意味する。このような接合体の連結は、共有結合的及び／又は非共有結合的連結を含む。
【００４３】
用語「抗原」は、抗体又はT細胞抗原受容体が特異的に認識し且つ結合する物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、複合糖質、糖質、ガングリオシド、脂質、及びリン脂質；それらの一部及びそれらの組合せを含む。これらの抗原は、天然で見られるものであるか、又は合成することができる。ＩＭＰと共に投与するのに適した抗原は、B細胞又はT細胞抗原特異的反応を誘起することが可能な分子を含む。抗原は、抗原に対し特異的な抗体反応を誘起することが好ましい。ハプテンは、「抗原」の範囲内に含まれる。ハプテンは、それ自身は免疫原性はないが、抗原決定基を含む免疫原性分子と複合した場合に免疫原性となるような、低分子量化合物である。小分子は、抗原性となるために、ハプテン化される必要があることがある。好ましくは本発明の抗原は、ペプチド、脂質(例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、ヘモフィルスインフルエンザワクチンにおいて使用されるもののような多糖類、ガングリオシド及び糖タンパク質を含む。
【００４４】
「アジュバント」は、抗原のような免疫原性物質に添加された場合に、この混合物に曝露した際にレシピエント宿主における当該物質に対する免疫反応を非特異的に増強又は強化する物質を意味する。
【００４５】
用語「ペプチド」は、そのペプチドがハプテンであるか否かに関わらず、例えば抗体産生又はサイトカイン活性のような、生物学的反応に作用する、十分な長さのポリペプチド及び組成物である。典型的にはペプチドは、少なくとも6個のアミノ酸残基の長さを含む。用語「ペプチド」は更に、修飾されたアミノ酸(天然又は非天然であるか否かに関わらず)を含み、このような修飾には、限定しないがリン酸化、グリコシル化、PEG化、脂質化及びメチル化が含まれる。
【００４６】
「抗原性ペプチド」は、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化した又は不活化したウイルス、細胞、微生物、又はこのようなペプチドの断片を含むことができる。従って「抗原性ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は、１又は複数の抗原性の特性を発揮するポリペプチドの全て又は一部を意味する。従って例えば、「Amb a 1 抗原性ポリペプチド」又は「Amb a 1ポリペプチド抗原」は、全配列、配列の一部、及び／又は配列の修飾のいずれかである、Amb a 1由来のアミノ酸配列であり、これは抗原性の特性(すなわち、抗体又はT細胞受容体へ特異的に結合する)を示す。
【００４７】
「送達分子」又は「送達担体」は、免疫調節ポリヌクレオチドの特定部位への及び／又は特定の時期に関する送達を促進、許容、及び／又は増強する化学的部分である。送達担体は、更に免疫反応を刺激してもしなくとも良い。
【００４８】
「抗原に対するアレルギー反応」は、一般に好酸球及び／又は抗原特異的IgEの生成並びにそれらの結果的作用を特徴とする免疫反応を意味する。当業界で周知なように、IgEは、肥満細胞及び好塩基球上のIgE受容体に結合する。その後のIgEにより認識された抗原への曝露時には、この抗原は、肥満細胞及び好塩基球上のIgEと交差反応し、これらの細胞の脱顆粒を生じ、これはヒスタミン放出を含むが、これらに限定されるものではない。用語「抗原に対するアレルギー反応」、「アレルギー」、及び「アレルギー状態」は、本発明の方法の一部の適用に関し同等に適切であると理解されかつ意図される。更に、本発明の方法は、アレルギー反応の予防に加え、予め存在するアレルギー状態の治療に関し同等に適切であるものを含むと理解されかつ意図される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「アレルゲン」は、対象曝露時にアレルギー反応を誘起する分子の抗原又は抗原性部分、通常はタンパク質を意味する。典型的には、対象者は、例えば膨疹及び発赤試験又は当該技術分野において公知の方法のいずれかにより示されるようなアレルゲンに対しアレルギー性である。例え対象者の小サブセットのみが分子への曝露時にアレルギー性(例えば、IgE)免疫反応を発したとしても、この分子は、アレルゲンと称される。多くの単離されたアレルゲンが当該技術分野において公知である。これらは本願明細書の表1において提示されたものを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
用語「脱感作」は、感受性を示す対象者へ、漸増量のアレルゲンを投与する過程を意味する。脱感作に使用されるアレルゲン投与量の例は、当該技術分野において公知であり、例えば、Fornadleyの論文(Otolaryngol. Clin. North Am.、31:111-127 (1998))を参照のこと。
【００５１】
「抗原特異的免疫療法」は、抗原に関連し、かつ免疫反応の抗原特異的調節を生じるような免疫療法を意味する。アレルギーの状況において、抗原特異的免疫療法は脱感作療法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
用語「マイクロキャリア」は、水に不溶性であり、かつ約150、120又は100μｍ未満、好ましくは約50〜60μｍ未満、好ましくは約10μｍ未満、好ましくは約5、2.5、2又は1.5μｍ未満のサイズを有するような粒子状組成物を意味する。マイクロキャリアは、約1μｍ未満、好ましくは約500nm未満のサイズを有するマイクロキャリアである「ナノキャリア」を含む。マイクロキャリアは、生体適合性の天然のポリマー、合成ポリマー又は合成コポリマーから形成された粒子のような、固相粒子を含むが、アガロース又は架橋したアガロースから形成されたマイクロキャリア、更にはその他の当該技術分野において公知の生体適合性材料は、本願明細書におけるマイクロキャリアの定義に含んでも、含まなくとも良い。本発明において使用するためのマイクロキャリアは、生分解性又は非生分解性である。非生分解性固相マイクロキャリアは、哺乳類の生理的条件下で非腐蝕性及び／又は非分解性のポリマー又は他の材料、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミックス、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ハイドロキシアパタイト、デキストラン並びに強磁性及び常磁性の材料から形成される。生分解性固相マイクロキャリアは、哺乳類の生理的条件下で、分解性ポリマー(例えば、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)及びそれらのコポリマー)又は腐蝕性ポリマー(例えば、3,9-ジエチリデン-2,4,8,10-テトラオキサスピロ[5.5]ウンデカン(DETOSU)のようなポリ(オルトエステル、又はセバシン酸ポリ(無水物)のようなポリ(無水物))から形成することができる。マイクロキャリアはまた、抗原を伴わない液相(例えば、油又は脂質ベース)、例えばリポソーム、ISCOM(免疫刺激複合体、これはコレステロール、リン脂質及びアジュバント-活性サポニンの安定した複合体である)、又は水中油型もしくは油中水型乳剤で認められた液滴もしくはミセルであることもできる。生分解性液相マイクロキャリアは、典型的には、スクアレン及び植物油を含む、その多くは当該技術分野において公知である生分解性油分を混入している。マイクロキャリアは、典型的には球形であるが、球形からはずれたマイクロキャリアも許容できる(例えば、楕円形、棒状など)。マイクロキャリアは、それらの不溶性の性質のために(水に関して)、水及び水-ベースの(水性)溶液から濾過可能である。
【００５３】
本願明細書において使用される用語「非生分解性」は、正常な哺乳類の生理的条件下で分解も腐蝕もされないマイクロキャリアにあてはまる。一般に、マイクロキャリアは、正常なヒト血清中において37℃で72時間インキュベーションした後にそれが分解されない場合(すなわち、その質量又は平均ポリマー長の5％未満が喪失される場合)は、非生分解性であるとみなされる。
【００５４】
マイクロキャリアは、正常な哺乳類の生理的条件下で分解性又は腐蝕性である場合は、「生分解性」であるとみなされる。一般に、マイクロキャリアは、正常なヒト血清中において37℃で72時間インキュベーションした後にそれが分解される場合(すなわち、その質量又は平均ポリマー長の少なくとも5％が喪失される場合)は、生分解性であるとみなされる。
【００５５】
マイクロキャリアの「サイズ」は、一般に「デザインサイズ」又は製造業者により提示された粒子の意図されたサイズである。サイズは、平均又は最大直径のような、直接測定した寸法であるか、又は濾過スクリーニングアッセイのような間接的アッセイにより決定することができる。マイクロキャリアサイズの直接測定は、典型的には、顕微鏡、一般には光学顕微鏡又は走査型電子顕微鏡(SEM)により実行され、公知のサイズ又はマイクロメーターで示された粒子と比較される。サイズの小さい変動は、製造工程時に生じるので、マイクロキャリアは、測定値が、そのマイクロキャリアが公称測定値±約5〜10％であることを示す場合に、公称サイズであると考えられる。同じくサイズ特性は、動的光散乱又はオブスキュレーション(obscuration)技術により決定することもできる。あるいはマイクロキャリアサイズは、濾過スクリーニングアッセイにより決定することができる。粒子の少なくとも97％が、公称サイズの「スクリーン型」フィルター(すなわち、フィルター内に粒子ロッジを保持する「深層フィルター」とは対照的に、ポリカーボネートフィルター又はポリスルホンフィルターのようなフィルターの表面上に粒子が保持されているフィルター)を通過した場合に、マイクロキャリアは公称サイズ未満である。マイクロキャリア粒子の少なくとも約97％が、公称サイズのスクリーン型フィルターにより保持された場合に、マイクロキャリアは公称サイズよりも大きい。従って、約10μｍ〜約10nmのマイクロキャリアの少なくとも約97％が、10μｍ孔のスクリーンフィルターを通過し、かつ10nmスクリーンフィルターに保持される。
【００５６】
先の考察が示唆するように、マイクロキャリアのサイズ又はサイズ範囲に関して、公称サイズ及び／又はサイズ範囲のおおよその変動及び概算を限外に含んでいる。これは、サイズ及び／又はサイズ範囲に言及する場合の用語「約」の使用により反映されており、「約」を言及しないサイズ又はサイズ範囲に関しては、そのサイズ及び／又はサイズ範囲が正確であることを意味するものではない。
【００５７】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体」又は「ＩＭＰ／ＭＣ複合体」は、ＩＭＰとマイクロキャリアの複合体を意味する。この複合体の構成要素は、共有結合的又は非共有結合的に連結され得る。非共有結合的連結は、疎水性相互作用、イオン(静電気力)結合、水素結合及び／又はファンデルワールス引力を含む非共有結合力のいずれかにより媒介され得る。疎水性連結の場合、この連結は、一般にＩＭＰへ共有結合的に連結された疎水性部分(例えば、コレステロール)を介している。
【００５８】
「個体」は、鳥類のような脊椎動物を含み、かつ好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は、ヒト、霊長類、家畜、狩猟用動物、齧歯類及びペットを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
物質の「有効量」又は「十分量」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果に作用するのに十分な量であり、かつ「有効量」は、それ自体が適用される状況に応じて決まる。同時投与された抗原に対する免疫反応を調節する組成物を投与する状況において、免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原の有効量は、抗原が単独投与された場合に得られた免疫反応と比較してこのような調節を達成するのに十分な量である。有効量は、単回又は反復投与で投与することができる。
【００６０】
本願明細書において使用される用語「同時投与」は、免疫反応を調節するために、十分に近い時間に、少なくとも2種の異なる物質を投与することを意味する。好ましくは、同時投与は、少なくとも2種の異なる物質の同時投与を意味する。
【００６１】
反応又はパラメーターの「刺激」は、その反応又はパラメーターを誘起及び／又は増強することを含む。例えば、Th1反応のような免疫反応の「刺激」は、反応の誘起及び／又は増強から生じ得るような反応の増大を意味する。同様に、サイトカイン又は細胞型(例えばCTL)の「刺激」は、サイトカイン又は細胞型の量又はレベルの増加を意味する。Ｂ細胞の「刺激」には、例えば、Ｂ細胞増殖の増強、Ｂ細胞活性化の誘導及び／又はサイトカイン、例えばＩＬ−６及び／又はＴＮＦ−αの、刺激されたＢ細胞からの産生の増大、が含まれる。
【００６２】
「IgE関連障害」は、一部、持続性であるか又は持続性でないことができる、上昇したIgEレベルを特徴とする生理的状態である。IgE関連障害は、アレルギー及びアレルギー反応、アレルギー関連障害(以下に説明する)、喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎、結膜炎、じんま疹、ショック、ハチ毒(Hymenoptera sting)アレルギー、及び薬物アレルギー、並びに寄生体感染症を含むが、これらに限定されるものではない。この用語は更に、これらの障害の症状発現に関連している。一般に、このような障害におけるIgEは抗原特異的である。
【００６３】
「アレルギー関連障害」は、抗原特異的IgE免疫反応の作用から生じた障害を意味する。このような作用は、低血圧及びショックを含むことができるが、これらに限定されるものではない。アナフィラキシーはアレルギー関連障害の例であり、その間に、循環血中に放出されたヒスタミンが、血管拡張に加え、毛細血管の透過性上昇を引き起し、結果的に循環血からの血漿の著しい喪失を生じる。アナフィラキシーは、関連作用を体全体で体験するように全身性に生じることができ、及び反応が特定の標的組織又は器官に限定されるように局所的に生じることがある。
【００６４】
本願明細書において使用される用語「ウイルス疾患」は、その病因物質としてウイルスを有する疾患にあてはまる。ウイルス疾患の例は、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(AIDS)、及び帯状疱疹を含む。
【００６５】
本願明細書において使用されかつ当該技術分野において良く理解された「処置」は、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果を得る方法である。本発明の目的のための有益な又は所望の臨床結果は、検出可能又は検出不可能のいずれかの、１又は複数の症候の軽減又は回復、疾患程度の消失、疾患の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、疾患拡大の予防、疾患進行の遅延又は緩徐化、病状の回復又は緩和、並びに寛解(部分的又は全体的のいずれか)を含むが、これらに限定されるものではない。「処置」は更に、処置を受けない場合に予想される生存に比べて延長された生存も意味する。
【００６６】
疾患又は障害の「緩和」は、疾患が治療されないことに比べ、疾患又は障害の状態の程度及び／又は望ましくない臨床症状発現が低減されるか、並びに／又は進行の時間経過が遅延又は延長されることを意味する。特にアレルギーの状況において、当業者には良く理解されるように、緩和は、アレルゲンに対する免疫反応の調節時に生じることがある。更に緩和は、単回投与量の投与により必ずしも生じず、一連の投与量の投与時に生じることが多い。従って反応又は障害を緩和するのに十分な量は、単回又は反復の投与量において投与することができる。
【００６７】
免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原により「誘起」されている「抗体力価」又は「抗体量」は、免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原の投与後所定の時点で測定された生じた抗体の量を意味する。
【００６８】
「Th1-関連抗体」は、その産生及び／又は増加がTh1免疫反応に関連している抗体である。例えばIgG2aは、マウスのTh1-関連抗体である。本発明の目的に関して、Th1-関連抗体の測定値は、１又は複数のこのような抗体の測定値であってもよい。例えば、ヒトにおいて、Th1-関連抗体の測定値は、IgG1及び／又はIgG3の測定値を必然的に伴う。
【００６９】
「Th2-関連抗体」は、その産生及び／又は増加がTh2免疫反応に関連している抗体である。例えば、IgG1は、マウスのTh2-関連抗体である。本発明の目的に関して、Th2-関連抗体の測定値は、１又は複数のこのような抗体の測定値であってもよい。例えば、ヒトにおいて、Th2-関連抗体の測定値は、IgG2及び／又はIgG4の測定値を必然的に伴う。
【００７０】
例えばサイトカイン産生、抗体産生、又はヒスタミン放出のような、機能又は活性を「抑制」又は「阻害」することは、注目の条件もしくはパラメーター以外、その他の点は同じ条件と比較して、あるいは別の条件と比較して、機能又は活性を低下することである。例えば、ヒスタミン放出を抑制する免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原を含有する組成物は、例えば、抗原単独により誘導されたヒスタミン放出と比べて、ヒスタミン放出を低下する。別の例として、抗体産生を抑制する免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原を含有する組成物は、例えば抗原単独により産生された抗体の程度及び／又はレベルと比べ、抗体の程度及び／又はレベルを低下する。
【００７１】
「血清タンパク質」とは、無病の哺乳類、特に無病のウシの血清中に通常に見られるタンパク質である。最も一般的な血清タンパク質は血清アルブミンである。
【００７２】
本願明細書において使用される用語「含んで成る(comprising)」及びその同族語は、それらの包括的意味において使用され；すなわち用語「含む(including)」及びそれに相当する同族語と同等である。
【００７３】
本発明の組成物
本発明は、個体の免疫反応を調節するための免疫調節配列（ＩＭＰ）を提供する。本発明の組成物は、免疫調節ポリヌクレオチド単独(あるいは、２又はそれ以上の免疫調節ポリヌクレオチドの組合せ)、あるいは別の免疫調節物質、例えばペプチド、抗原（後述する）及び／又は追加のアジュバントと複合して含んで成る。本発明の組成物は、免疫調節ポリヌクレオチド及び医薬として許容される賦形剤を含んで成ることができる。緩衝剤を含む医薬として許容される賦形剤は、当該技術分野において周知である。Remingtonの「The Science and Practice of Pharmacy」第20版、Mack Publishing社(2000)。
【００７４】
投与時に、抗原、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、及び任意にアジュバントを含んで成る組成物は、この抗原に対する免疫反応の強化につながり、その結果ＩＭＰ及び抗原を単独で含んで成る組成物の結果と比べて、増強された免疫反応を生じる。アジュバントは、当該技術分野において公知であり、かつ水中油型乳剤、油中水型乳剤、ミョウバン(アルミニウム塩)、リポソーム、並びにポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼン及びポリラクチド/ポリグリコシドを含むが、これらに限定されるものではないマイクロ粒子を含むが、これらに限定されるものではない。更にその他の適当なアジュバントは、MF59、DETOX（登録商標）(Ribi)、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリルリピドA、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Bサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、並びに例えばTakahashiらの論文(Nature、344:873-875 (1990))に説明されたもののような免疫刺激複合体(ISCOM)に加え、脂質ベースのアジュバント及び他の本願明細書において説明されたものを含むが、これらに限定されるものではない。獣医学的用途及び動物における抗体産生のためには、フロイントのアジュバント(完全及び不完全の両方)のマイトジェン成分を使用することができる。
【００７５】
本発明のＩＭＰは、特定の適応症のために、他の療法と組合せることもできる。例えば、ＩＭＰに加え、本発明の組成物はマラリア患者の場合クロロキンのような抗マラリア薬を、リーシュマニア症患者の場合ペンタミジン及び／又はアロプリノールのようなリーシュマニア殺傷薬を、結核患者の場合イソニアジド、リファンピン及び／又はエタンブトールのような抗マクロバクテリア薬を、あるいはアトピー(アレルギー)患者の場合アレルゲン脱感作物質を含んで成ることもある。
【００７６】
本明細書に記載のように、本発明の組成物はＩＭＰを含んでもよく、且つ、１又は複数の追加の免疫療法剤(すなわち、免疫系を介して作用し及び／又は免疫系に由来する物質)、例えば、限定しないが、サイトカイン、アジュバント及び抗体を更に含んで成ることもある。治療用抗体の例は、ガンに関連して使用されるもの(例えば、抗−腫瘍抗体)。例えば後述するものを含む。
【００７７】
免疫調節ポリヌクレオチド
本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む少なくとも８塩基の長さの少なくとも１つのパリンドローム配列（すなわちパリンドローム）を含む。ＩＭＰはまた、前記ポリヌクレオチドの５’末端又はその付近に少なくとも１つのＴＣＧトリヌクレオチド配列も含む（すなわち、５’−ＴＣＧ）。場合によっては、当該パリンドローム配列は５’−ＴＣＧの全部又は一部を含む。
【００７８】
ＩＭＰは、当該技術分野において説明されており、かつサイトカイン分泌、抗体産生、NK細胞活性化及びＴ細胞増殖のような、免疫反応の様々な側面を示している標準アッセイを用いて、容易に同定することができる。例えば、Ｗオ９７／２８２５９；ＷＯ９８／１６２４７；ＷＯ９９／１１２７５；Kriegら、Nature、374:546-549 (1995)；Yamamotoら、(1992a)；Ballasら、(1996)；Klinmanら、(1997)；Satoら、(1996)；Pisetsky、(1996a)；Shimadaら、Jpn. J. Cancer Res.、77:808-816 (1986)；Cowderyら、J. Immunol.、156:4570-4575 (1996)；Romanら、(1997)；Lipfordら、(1997a)；ＷＯ９８／５５４９５及びＷＯ００／６１１５１を参照のこと。従って、これらの方法及び他の方法を用い、免疫調節ＩＭＰを同定、試験及び／又は確認することができる。
【００７９】
ＩＭＰは、１０塩基又は塩基対よりも大きい長さであってもよく、好ましくは１５塩基又は塩基対よりも大きい、より好ましくは２０塩基又は塩基対よりも大きい長さであってもよい。
【００８０】
本願明細書において明確に伝達されるように、本明細書に記載の式に関して、いずれか及び全てのパラメーターは、独立して選択されることが理解される。例えば、ｘ＝０〜２であるならば、ｙは、ｘ値(又は式中の選択可能な他のパラメーター)とは無関係に、独立して選択することができる。
【００８１】
態様によって、ＩＭＰは、ａ）少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドを含む少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、当該ＣＧジヌクレオチドが０，１，２，３，４又は５塩基互いに離れているパリンドローム配列、及びｂ）前記ポリヌクレオチドの５’末端から０，１，２又は３塩基の位置にある（ＴＣＧ）y配列であって、ｙが１又は２であり、且つ（ＴＣＧ）y配列の３’末端が前記パリンドローム配列の５’末端から０，１，又は２塩基離れている（ＴＣＧ）y配列、を含んで成る。態様によっては、（ｂ）の（ＴＣＧ）y配列のＣＧジヌクレオチドは、（ａ）のパリンドローム配列内の少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドのうちの１つに相当することがある。態様によっては、前記パリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドは互いに１，３又は４塩基離れている。本発明の幾つかのＩＭＰにおいて、本段落に記載されていようと、又は本願のどこかに記載されていようと、パリンドローム配列は、２／３未満がＧ及びＣという塩基組成を有する。態様によっては、パリンドローム配列は１／３超がＧ及びＣという塩基組成を有する。
【００８２】
態様によって、ＩＭＰは、ａ）少なくとも２つのＣＧジヌクレオチドを含む少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列であって、当該ＣＧジヌクレオチドが０，１，２，３，４又は５塩基互いに離れているパリンドローム配列、及びｂ）前記ポリヌクレオチドの５’末端から０，１，２又は３塩基の位置にある（ＴＣＧ）y配列であって、ｙが１又は２である（ＴＣＧ）yを含み、ここで、前記パリンドローム配列は（ＴＣＧ）y配列の全部又は一部を含み、及び（ｂ）の（ＴＣＧ）y配列のＣＧジヌクレオチドは、（ａ）のパリンドローム配列内のＣＧジヌクレオチドのうちの１つに相当することがある。好ましくは、幾つかの態様において、パリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドは互いに１，３又は４塩基離れている。
【００８３】
従って、態様によっては、ＩＭＰは式５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1ＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５５）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的ヌクレオシドであり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。ＩＭＰは、８塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、（Ｘ1ＣＧＸ1’（ＣＧ）p）配列のうちの少なくとも１つを含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は最初の（Ｘ1ＣＧＸ1’（ＣＧ）p）配列の５’Ｘ1である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。態様によっては、ｐ＝０である場合、Ｘ1はＡ又はＴのいずれかである。
【００８４】
態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１】
2006512096.tif 000003
を含んで成る。
【００８５】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５７）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、並びにＸ3及びＸ3’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、少なくとも８塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２４）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列を更に含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２４）配列の最初の５’Ｘ1である。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２４）配列の５’Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。態様によっては、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のうち少なくとも２つはＡ又はＴのいずれかである。
【００８６】
態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化２】
2006512096.tif 000004
を含んで成る。
【００８７】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５８）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、Ｘ3及びＸ3’、並びにＸ4及びＸ4’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、１０塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２６）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号２２５）を含んで成るパリンドローム配列を更に含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２６）配列の５’Ｘ1である。。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２６）配列の５’Ｘ1及びＸ2である。Ｗ＝−３のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから３番目（すなわち、最後から３番目）、後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２６）配列の５’Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。態様によっては、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4のうち少なくとも３つはＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4のうち少なくとも２つはＡ又はＴのいずれかである。
【００８８】
態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化３】
2006512096.tif 000005
を含んで成る。
【００８９】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６２）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、８塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）配列の最初の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は最初の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）配列の５’Ｘ1である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０．１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化４】
2006512096.tif 000006
を含んで成る。
【００９０】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号１６１）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、少なくとも８塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）配列の最初の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基はＣＧであり、且つ最初の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）配列の５’ＣＧである。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０．１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化５】
2006512096.tif 000007
を含んで成る。
【００９１】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５９）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、並びにＸ3及びＸ3’、は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、１０塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２１７）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’）（配列番号２１６）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２１７）配列の５’Ｘ1である。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号２１７）配列の５’Ｘ1及びＸ2である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。幾つかの態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。幾つかの態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のうちの少なくとも２つはＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化６】
2006512096.tif 000008
を含んで成る。
【００９２】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１５６）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、８塩基の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）配列の５’Ｘ1である。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）配列の５’Ｘ1及びＸ2である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。幾つかの態様において、Ｘ1及びＸ2はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。
【００９３】
態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化７】
2006512096.tif 000009
【化８】
2006512096.tif 000010
【化９】
2006512096.tif 000011
を含んで成る。
【００９４】
態様によっては、配列番号１５６の式を含んで成るＩＭＰにおいて、Ｘ1Ｘ2はＡＡではない。態様によっては、配列番号１５６の式を含んで成るＩＭＰにおいて、Ｘ1はＡではない従って、態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１０】
2006512096.tif 000012
【化１１】
2006512096.tif 000013
を含んで成る。
【００９５】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６０）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、Ｘ3及びＸ3’、Ｘ4及びＸ4’、並びにＸ5及びＸ5’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、１２塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２１９）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号２１８）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２１９）配列の５’Ｘ1である。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２１９）配列の５’Ｘ1及びＸ2である。Ｗ＝−３のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから３番目（すなわち、最後から３番目）、後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２１９）配列の５’Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。幾つかの態様において、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、及びＸ5のうちの少なくとも３つはＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１２】
2006512096.tif 000014
を含んで成る。
【００９６】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６３）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、並びにＸ2及びＸ2’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、８塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２０）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２０）配列の５’Ｘ1である。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２０）配列の５’Ｘ1及びＸ2である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。幾つかの態様において、Ｘ1及びＸ2はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１３】
2006512096.tif 000015
を含んで成る。
【００９７】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号１６４）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、並びにＸ3及びＸ3’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、１０塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２２）配列の最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号２２１）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−１のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の３’塩基は、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２２）配列配列の５’Ｘ1である。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２２）配列の５’Ｘ1及びＸ2である。Ｗ＝−３のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから３番目（すなわち、最後から３番目）、後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基は、それぞれ、最初の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号２２２）配列の５’Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。幾つかの態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。幾つかの態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3のうちの少なくとも２つはＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１４】
2006512096.tif 000016
を含んで成る。
【００９８】
態様によっては、ＩＭＰは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号１６５）（ここで、Ｎはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３であり、ｙ＝１〜４であり、ｗ＝−２、−１、０、１又は２であり、ｐ＝０又は１であり、ｑ＝０、１又は２であり、且つｚ＝１〜２０であり、Ｘ1及びＸ1’、並びにＸ2及びＸ2’は自己相補的であり、且つ、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’Ｔは前記ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３塩基にある）の配列を含んで成ることがある。当該ＩＭＰは更に、８塩基以上の長さのパリンドローム配列であって、少なくとも１つの（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）（配列番号２２３）配列の最初の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ）を含んで成るパリンドローム配列、を含んで成る。Ｗ＝−２のＩＭＰにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の後ろから２番目（すなわち、最後から２番目）及び最終（すなわち、最後）の３’塩基はＣＧであり、且つ最初の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）（配列番号２２３）配列の５’ＣＧである。態様によっては、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列はパリンドローム配列から０，１又は２塩基離れている。他の態様において、パリンドローム配列は（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の全部又は一部を含む。幾つかの態様において、Ｘ1及びＸ2はそれぞれＡ又はＴのいずれかである。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１５】
2006512096.tif 000017
を含んで成る。
【００９９】
ｙ＝２以上である本明細書に記載のモチーフ（すなわち、配列番号１５５〜１６５）のいずれかを含んで成るＩＭＰについては、（ＴＣＧ（Ｎq））のｙの繰り返しのそれぞれの（Ｎq）は独立して選択される。例えば、ｙ＝２のＩＭＰにおいて、最初のＴＣＧ（Ｎq）は、Ｎ＝Ａであり、且つｑ＝１であってもよく、且つ第二のＴＣＧ（Ｎq）は、ＩＭＰのこの部分が．．．ＴＣＧＡＴＣＧ．．．．である場合にはｑ＝０であってもよい。本明細書に記載のモチーフ（すなわち、配列番号１５５〜１６５）のいずれかを含んで成るＩＭＰの幾つかの態様において、ｘは好ましくは０又は１である。本明細書に記載のモチーフ（すなわち、配列番号１５５〜１６５）のいずれかを含んで成るＩＭＰの幾つかの態様において、ｙは好ましくは１又は２である。本明細書に記載のモチーフ（すなわち、配列番号１５５〜１６５）のいずれかを含んで成るＩＭＰの幾つかの態様において、ｗは好ましくは０である。本明細書に記載のモチーフ（すなわち、配列番号１５５〜１６５）のいずれかを含んで成るＩＭＰの幾つかの態様において、ｚは好ましくは１，２，３，４，５，６，７又は８である。
【０１００】
上述のとおり、ＩＭＰは少なくとも８塩基の長さの少なくとも１つのパリンドローム配列を含む。態様によっては、ＩＭＰは少なくとも以下の長さ（塩基）：１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０の少なくとも１つのパリンドローム配列を含む。態様によっては、パリンドローム配列は、ＩＭＰにおいて少なくとも１回繰り返される。態様によっては、パリンドローム配列はまた、もしあるのであれば（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’の塩基も含む。
【０１０１】
免疫調節ポリヌクレオチドは修飾を含むことがある。ＩＭＰの修飾は、当業界で知られている任意のもの、限定しないが、３’ＯＨ又は５ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾を含む。種々のそのような修飾は後述する。修飾された塩基には、修飾された塩基が、ワトソンクリックの塩基対合を介してその天然成分について同一の特異性を維持する（例えば、ＩＭＰのパリンドローム部分が尚も自己相補的である）限り、ＩＭＰのパリンドローム配列に含まれることがある。
【０１０２】
ＩＭＰは直鎖であっても、環状であってもよく、あるいは、環状部分を含んでもよく、そして／あるいはヘアピンループを含んでもよい。態様によっては、ＩＭＰは以下の環状配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１６】
2006512096.tif 000018
を含んで成る。
【０１０３】
ＩＭＰは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであってもく、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡあるいは他の修飾されたポリヌクレオチドも同様である。態様によっては、ＩＭＰは以下の二本鎖配列：
【化１７】
2006512096.tif 000019
を含んで成る。
【０１０４】
ＩＭＰは天然の又は修飾された非天然の塩基を含んでもよく、且つ修飾された糖、リン酸塩、及び／又は末端を含んでもよい。例えば、ホスホジエステル結合に加え、リン酸塩の修飾には、限定しないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミダイト（架橋又は非架橋）、ホスホトリエステル及びホスホロジチオエートを含み、且つ、あらゆる組み合わせで使用されうる。他のリン酸塩以外の結合も使用されうる。態様によっては、本発明のポリヌクレオチドはホスホジエステルバックボーンのみを含んで成る。態様によっては、ＩＭＰはリン酸塩バックボーンにおいてリン酸結合の組み合わせを含んで成る。例えば、ホスホジエステルとホスホロチオエートの結合の組み合わせである。例えば、態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す）：
5'-TCGTCGAAACGTTTCGACAGT （配列番号６２）、全てのホスホロチオエート結合；
5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGA （配列番号８８）、 全てのホスホジエステル結合；
5'-TsCsGsTTCGAACGTTCGsAsAsCsGsA （配列番号８９）、ホスホロチオエート／ホスホジエステルキメラ；
5'-GsGsTCGAACGTTCGAGsGsGsGsGsG （配列番号２６）、ホスホロチオエート／ホスホジエステルキメラ； 
5'-TsCsGsTCGAACGTTCGAGsGsGsGsGsG （配列番号３３）、ホスホロチオエート／ホスホジエステルキメラ； 
5'-TsCsGsTGCATCGATGCAGGsGsGsGsG （配列番号３４）、ホスホロチオエート／ホスホジエステルキメラ、
を含んで成る。
【０１０５】
当業界で知られている糖の修飾、例えば２’−アルコキシ−ＲＮＡアナログ、２’−アミノ−ＲＮＡアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ及び２’−アルコキシ-もしくはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ並びに本願明細書において説明された他のものも行われることがあり、且つ任意のリン酸塩の修飾と組合せられることがある。塩基修飾の例（下文で更に論じる）は、ＩＭＰのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引基の付加(例えば、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン)、並びにＩＭＰのウラシルのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引基の付加(例えば、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシル)を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、ＷＯ９９／６２９２３を参照のこと。上述のとおり、パリンドローム配列における塩基修飾の使用は、ワトソンクリックの塩基対合に関与する塩基の自己相補的能力を妨害しないはずである。しかしながら、パリンドローム配列の外側の修飾された塩基は、この制限無しに使用されうる。例えば、態様によっては、ＩＭＰは以下の配列：
5'-uCGuCGAACGTTCGAGATG （配列番号２１）、ｕ＝２’−Ｏ−メチル−ウリジン；
5'-TcGTCGAACGTTCGAGATG （配列番号２２）、ｃ＝２’−Ｏ−メチル−シチジン；
5'-TCGTcGAACGTTCGAGATG （配列番号２３）、ｃ＝２’−Ｏ−メチル−シチジン；
5'-TBGTBGAABGTTBGAGATGAT （配列番号２８）、Ｂ＝５−ブロモ−２’−デオキシシチジン、
を含んで成る。
【０１０６】
ＩＭＰは、限定しないが、酵素的方法、化学的方法及びより大きいヌクレオチド配列の分解を含む、当該技術分野において周知の技術及び核酸合成装置を用いて合成することができる。例えば、Ausubelら(1987)；及び、Sambrookら(1989)の論文を参照のこと。酵素的に集成された場合は、個々のユニットは、例えばT4 DNA又はRNAリガーゼのようなリガーゼにより、ライゲーションすることができる。米国特許第５，１２４，２４６号。オリゴヌクレオチド分解は、米国特許第４，６５０，６７５号に例示されたように、ヌクレアーゼへオリゴヌクレオチドを曝すことにより実現することができる。
【０１０７】
ＩＭＰはまた、常用のポリヌクレオチド単離手法を用いて単離することもできる。このような手法は、限定しないが、共有のヌクレオチド配列を検出するためのプローブのゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーへのハイブリダイゼーション、共有の構造特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、及びポリメラーゼ連鎖反応による特定の天然配列の合成を含む。
【０１０８】
環状免疫調節ポリヌクレオチドは、単離されるか、組換え法により合成されるか、又は化学的に合成され得る。環状ＩＭＰが単離又は組換え法により得られた場合は、当該ＩＭＰは、好ましくはプラスミドであろう。比較的小さい環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、参考文献に説明された方法のいずれかを用い行うことができる。例えば、Gaoらの論文（Nucleic Acids Res.、23:2025-2029 (1995))；及び、Wangらの論文(Nucleic Acids Res.、22:2326-2333(1994))を参照のこと。
【０１０９】
多くのＩＭＰの二重鎖（すなわち、二本鎖）及びヘアピン型はダイナミックな平衡状態にあり、但し、ヘアピン型は通常低いポリヌクレオチド濃度及びより高い温度を好む。共有結合的鎖間又は鎖内架橋は、熱、イオン、ｐＨ、及び濃度が誘導する高次構造の変化に対し、それぞれ二本鎖又はヘアピンの安定性を増大させる。化学的架橋は、物理化学的特徴づけ及び生物学的特徴づけのために、ポリヌクレオチドを二重鎖又はヘアピン型のいずれかにロックするために使用されうる。高次構造上均一で且つ最も活性な型（二重鎖又はヘアピン型のいずれか）に「ロック」されている架橋型ＩＭＰは、それらの架橋されていない対応物よりも潜在的に活性なことがある。従って、本発明の幾つかのＩＭＰは、共有結合的鎖間及び／又は鎖内架橋を含む。
【０１１０】
二重鎖ＤＮＡを化学的に架橋する種々の方法が当業界で知られている。あらゆる架橋法が、架橋されたポリヌクレオチド産物が所望の免疫調節活性を保持する限り使用されうる。
【０１１１】
１つの方法が、例えば二重鎖又はヘアピンの末端にある２つの対立するチミジン間にジスルフィド架橋をもたらす。この架橋法の場合、注目のオリゴヌクレオチドは、５’−ＤＭＴ−Ｎ３−（ｔＢｕ−ＳＳ−メチル）チミジン−３’−ホスホラミダイト（「Ｔ*」）で合成される。ジスルフィド架橋を形成するために、混合のジスルフィド結合が還元され、オリゴヌクレオチドが精製され、鎖がハイブリダイズされ、そして化合物が空気で酸化されて、ヘアピン型の場合には鎖内架橋を、又は二重鎖型の場合には鎖間架橋を形成せしめる。あるいは、オリゴヌクレオチドは最初にハイブリダイズされ、次に還元され、精製され、そして空気で酸化されることがある。そのような方法及び他の方法は、例えば、Glick et al. (1991) J. Org. Chem. 56: 6746-6747, Glick et al. (1992) J. AＭＣhem. Soc. 114: 5447-5448, Goodwin et al. (1994) Tetrahedron Letters 35: 1647-1650, Wang et al. (1995) J. 4in. Chem. Soc. 117: 2981-2991, Osborne et al. (1996) Bioorgafaic & Medicinal Chemistry Letters 6: 2339- 2342 and Osborne et al. (1996) J. AＭＣhem. Soc. 118: 11993-12003に記載されている。
【０１１２】
５’−ＤＭＴ−Ｎ３−（ｔＢｕ−ＳＳ−エチル）チミジン−３’−ホスホラミダイト（「Ｔ*」）が架橋のために組み込まれうるポリヌクレオチド配列の例には、以下のものが含まれる。配列番号２７アナログ（5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT*-3', 配列番号２７アナログ１）の３’末端及び配列番号２９アナログ（5'-T*TCATCTCGAACGTTCGACGA-3', 配列番号２９アナログ１）の５’末端にＴ*を組み込むことで、配列番号２７アナログの３’末端に２つの鎖の二重鎖が架橋するであろう。配列番号１１３アナログの２つの位置にＴ*を組み込むことで、２つの架橋が二重鎖を形成し、あるいは単一の架橋を形成し、ヘアピン型が維持されるであろう。例えば、配列5'-TCGT*AACGTTCGAACGTTCGAACGTTT*-3 (配列番号１１３アナログ１)のヘアピン構造への折り畳み及び置換されたＴ残基における架橋の形成は、以下の二次構造を有する架橋ポリヌクレオチドをもたらすであろう。
【化１８】
2006512096.tif 000020
前記配列のそのようなヘアピン構造又は二重鎖構造は、遊離の５’−ＴＣＧを有するが、２つの位置（３’末端及び５’−末端から４塩基）に拘束されるであろう。
【０１１３】
別の架橋法は、二重鎖又はヘアピン構造内のオフセット残基間にジスルフィド架橋を形成する。この架橋法の場合、注目のオリゴヌクレオチドは変換可能なヌクレオシド（市販のもの、例えばGlen Researchから販売されているもの）で合成される。この方法は、例えば、Ａ−Ａジスルフィド又はＣ−Ａジスルフィド架橋を利用し、他の塩基を通じての結合も可能である。ジスルフィド修飾ポリヌクレオチドを形成するために、前記交換可能なヌクレオシドを含むポリヌクレオチドは、シスタミン（又は他のジスルフィド含有アミン）と反応させられる。ジスルフィド架橋を形成するために、混合のジスルフィド結合が還元され、オリゴヌクレオチドが精製され、鎖がハイブリダイズされ、そして化合物が空気で酸化されて、ヘアピン型の場合には鎖内架橋を、又は二重鎖型の場合には鎖間架橋を形成せしめる。あるいは、オリゴヌクレオチドは最初にハイブリダイズされ、次に還元され、精製され、そして空気で酸化されることがある。そのような方法及び他の方法は、例えば、Ferentz et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 4000-4002 and Ferentz et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 9006-9014.に記載されている。
【０１１４】
オフセットＮ６−シスタミン−２’−ｄＡ（Ａ*）残基が二重鎖を架橋するために使用されているポリヌクレオチド配列の例には以下のものが含まれる。配列5'-TCGTCGAACGTTCGAGA*TGAT-3'、配列番号１９１の３’末端及びその相補鎖5'-ATCA*TCTCGAACGTTCGACGA-3'、配列番号１９２の５’末端にＡ*を組み込むことは、配列番号１９１の３’末端に２つの鎖の二重鎖における架橋を許容するであろう。そのような修飾もヘアピン構造を架橋するのに使用されうる。
【０１１５】
オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチドを作成する技術は、当該技術分野において公知である。ホスホジエステル連結を含む天然のDNA又はRNAは、一般に適当なヌクレオシドホスホロアミダイトの、３’−末端で固相支持体に結合された成長するオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基への逐次結合、それに続く中間体亜リン酸トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化により合成される。一旦所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されたならば、当該オリゴヌクレオチドは、支持体から取除かれ、リン酸トリエステル基は、リン酸ジエステルへと脱保護され、かつこれらのヌクレオシド塩基は、水性アンモニア又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、「Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties」(Agrawal編集)中のBeaucageの「オリゴデオキシヌクレオチド合成」(1993)、Humana Press社、トトワ、NJ；Warnerら、DNA、3:401 (1984)及び米国特許第４，４５８，０６６号を参照のこと。
【０１１６】
ＩＭＰはまた、リン酸塩が修飾されたオリゴヌクレオチドも含み、その一部は、ポリヌクレオチドを安定化することがわかっている。従って、一部の態様は、安定化された免疫調節ポリヌクレオチドを含む。修飾されたリン酸結合又は非リン酸結合を含むポリヌクレオチドの合成も、当該技術分野において公知である。総説については、「Oligonucleotides as Therapeutic Agents」(D.J. Chadwick及びG. Cardew編集)中のMatteucciの「Oligonucleotide Analogs: an Overview」、John Wiley and Sons社、ニューヨーク、NY(1997)を参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて糖又は糖アナログ部分に結合することができるリン誘導体(又は修飾されたリン酸基)は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホン酸アルキル、ホスホロチオエート、ホソホロジチオエート、ホスホロアミデートなどであってもよい。前述のリン酸アナログの調製及びそれらのヌクレオチドへの組込み、修飾されたヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドも、それ自身公知であり、かつ本願明細書においては詳細には説明していない。Peyrottesら、Nucleic Acids Res.、24:1841-1848 (1996)；Chaturvediら、Nucleic Acids Res.、24:2318-2323 (1996)；及び、Schultzら、Nucleic Acids Res.、24:2966-2973 (1996)。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程が硫酸化工程により置き換えられること以外は、天然のオリゴヌクレオチドについて先に説明されたものと同様である(Zon、「Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties」(Agrawal編集)中の「Oligonucleoside Phosphorothioates」(1993)、Humana Press社、165-190頁)。同様に、ホスホトリエステル(Millerら、JACS、93:6657-6665 (1971))、結合していないホスホロアミデート(Jagerら、Biochem.、27:7247-7246 (1988))、N3'からP5'へのホスホロアミデート(Nelsonら、JOC、62:7278-7287 (1997))及びホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)のような、他のリン酸アナログの合成も説明されている。その他の非リン酸ベースの修飾されたオリゴヌクレオチドも、使用することができる(Stirchakら、Nucleic Acids Res.、17:6129-6141 (1989))。ホスホロチオエート骨格を持つオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を伴うものよりもより免疫原性であってもよく、かつ宿主への注射後の分解に対してより抵抗性があるように見える。Braunら、J. Immunol.、141:2084-2089 (1988)；及び、Latimerら、Mol. Immunol.、32:1057-1064 (1995)。
【０１１７】
本発明において使用されるＩＭＰは、１又は複数のリボヌクレオチド(唯一の又は主要な糖成分としてのリボースを含む)、デオキシリボヌクレオチド(主要な糖成分としてデオキシリボースを含む)を含むことができ、又は当該技術分野において公知であるように、修飾された糖又は糖アナログを、ＩＭＰ内に組み込むことができる。従ってリボース及びデオキシリボースに加え、この糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース及び糖「アナログ」シクロペンチル基であってもよい。この糖は、ピラノシル又はフラノシル型中にあってもよい。ＩＭＰにおいて、糖部分は、好ましくはリボース、デオキシリボース、アラビノース又は２’−０−アルキルリボースのフラノシドであり、かつ糖は、各々の複素環式塩基に、α又はβいずれかのアノマー立体配置において結合することができる。糖の修飾には、限定しないが、２’−アルコキシ-RNAアナログ、２’−アミノ-RNAアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、及び２’−アルコキシ-又はアミノ-RNA/DNAキメラを含む。例えばＩＭＰ中の糖修飾は、２’−Ｏ−メチル−ウリジン及び２’−Ｏ−メチル−シチジンを含む。これらの糖又は糖アナログ及び各「ヌクレオシド」（ここで、前記糖又は糖アナログは、複素環式塩基（核酸塩基）に結合している）の調製は、当然知られており、かつこのような調製が具体例に関係する程度以外は、本願明細書において説明の必要はない。糖修飾を行い、かつＩＭＰの調製におけるリン酸修飾と組合せることもできる。
【０１１８】
ＩＭＰに組み込まれている複素環式塩基、又は核酸塩基は、天然の主要なプリン及びピリミジン塩基であってもよい、(すなわち前述のような、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン及びグアニン)に加え、前記主要塩基の天然の及び合成の修飾であってもよい。従って、ＩＭＰは２’−デオキシウリジン及び／又は２−アミノ−２’−デオキシアデノシンを含むことがある。
【０１１９】
当業者は、様々な複素環式塩基及び様々な糖部分(及び糖アナログ)を含む多数の「合成」非天然のヌクレオシドが、当該技術分野において利用可能であること、並びに他の本発明の基準が満たされる限りは、ＩＭＰは、天然の核酸の主要な5種の塩基成分以外に、1種又は数種類の複素環式塩基を含むことができることを認めるであろう。しかし好ましくは、ＩＭＰ中の複素環式塩基は、ウラシル-5-イル、シトシン-5-イル、アデニン-7-イル、アデニン-8-イル、グアニン-7-イル、グアニン-8-イル、4-アミノピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2,3-d]ピリミジン-3-イル基を含むが、これらに限定されるものではなく、ここでプリンは、ＩＭＰの糖部分に９位置で、ピリミジンに１位で、ピロロピリミジンに７位で、そしてピラゾロピリミジンに１位で結合している。
【０１２０】
ＩＭＰは、少なくとも１つの修飾された塩基を含んでもよい。本願明細書において使用される用語「修飾された塩基」は、「塩基アナログ」と同義語であり、例えば「修飾されたシトシン」は、「シトシンアナログ」と同義語である。同様に「修飾された」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本願明細書において、ヌクレオシド又はヌクレオチド「アナログ」と同義語として定義される。塩基修飾の例は、ＩＭＰのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引部分の付加を含むが、これに限定されるものではない。好ましいこの電子求引部分はハロゲンである。このような修飾されたシトシンは、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、5-フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、5-ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、ウラシル、及びいずれか他のピリミジンアナログ又は修飾されたピリミジンを含むが、これらに限定されるものではない。塩基修飾の他の例は、ＩＭＰのウラシルのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引部分の付加を含むが、これらに限定されるものではない。好ましいこの電子求引部分はハロゲンである。このような修飾されたウラシルは、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
塩基修飾のその他の例は、限定しないが、２−アミノ−アデニン、６−チオ-グアニン、２−チオ−チミン、４−チオ-チミン、５−プロピニル−ウラシル、及び４−チオ-ウラシルを含む、塩基への1個又は複数のチオール基の付加を含む。塩基修飾の他の例は、限定しないが、Ｎ４−エチルシトシン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン及び５−ヒドロキシシトシンを含む。例えば、Kandimalla et al. (2001) Bioorg Med. Chem. 9: 807-813を参照のこと。態様によっては、ＩＭＰは以下の配列（パリンドローム配列に下線を引いた）：
【化１９】
2006512096.tif 000021
を含んで成る。
【０１２２】
実施例１で例示するとおり、低濃度で二重鎖型を維持するＩＭＰは、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−αの産生を刺激しうる傾向にある。架橋を通じた二重鎖ポリヌクレオチド型の安定化は上述したとおりである。相補配列が二重鎖の型にある場合、ある修飾された塩基も二重鎖の安定性を増大させることができる。例えば、２−アミノ−ｄＡ（市販のもの、例えばGlen Researchから販売されているもの）は、ｄＡとＴの間に形成される場合、２つの水素結合の代わりに、Ｔと３つの水素結合を形成する。配列番号２７のアナログである配列番号１８８は、配列番号２７の５個のｄＡ塩基の位置に５個の２−アミノ−ｄＡを含み、且つそれ自身と、配列番号２７より強力な二重鎖を形成する（サイズ排除クロマトグラフィーデータ）。これらの修飾塩基の組み込みは、Ｔｍを修飾あたり約３℃上昇させる。本明細書において実施例１に例示するように、配列番号１８８はまた、ヒトＰＢＭＣが０．８μｇ／ｍｌのＩＭＰで処理された場合に配列番号２７と比べてＩＦＮ−αの産生をより誘導した。二重鎖の配列番号８８４は、一本鎖の配列番号１８８と比べてＩＦＮ−αの産生を約３倍誘導した。
【０１２３】
塩基が修飾されたヌクレオシドの調製、及び塩基が修飾されたヌクレオシドを前駆体として使用する修飾されたオリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第４，９１０，３００号、第４，９４８，８８２号、及び第５，０９３，２３２号に開示されている。これらの塩基-修飾されたヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかの位置へ化学合成により組込まれるようにデザインされている。オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかの位置に存在する、このような塩基-修飾されたヌクレオシドは、ペプチド又は他の抗原の結合のための位置として利用することができる。これらの糖部分が修飾されたヌクレオシドも説明されており(米国特許第４，８４９，５１３号、第５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号、第５，１１８，８０２号を含むが、これらに限定されるものではない。)、かつ同様に使用することができる。
【０１２４】
態様によっては、免疫調節ポリヌクレオチドは、ほぼ下記の長さ未満である(塩基又は塩基対において):10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；60;50;40;30;25；20;15;14;13;12;11;10。一部の態様において、免疫調節ポリヌクレオチドは、ほぼ下記の長さより大きい(塩基又は塩基対において)：10；11;12;13;14;15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。あるいは、免疫調節ポリヌクレオチドは、下記の上限：10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；60;50；40;30;25；20;15;14;13;12;11;10、及び下記の独立して選択された下限：10；11;12;13;14;15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500を有するサイズ範囲のいずれかであってもよく、ここで下限は上限未満である。態様によっては、ＩＭＰは好ましくは約２００塩基以下の長さである。
【０１２５】
本発明は更に、本明細書に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを作成する方法を提供する。当該方法は、本明細書に記載のもののいずれかである。例えば当該方法は、ＩＭＰを合成することができ(例えば、固相合成を用いて)、かつ更に精製工程を含むことができる。精製法は当該技術分野において公知である。他の調製法は、免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原の組合せを含む。
【０１２６】
抗原
抗原は、免疫調節ポリヌクレオチドと同時投与することができ、及び／又は免疫調節ポリヌクレオチド及び抗原を含んで成る組成物において(及びこれらの組成物の調製において)使用することができる。
【０１２７】
態様によっては、抗原はアレルゲンである。組換えアレルゲンの例を表１に示す。多くのアレルゲンの調製は、当該技術分野において周知であり、ブタクサ花粉アレルゲン抗原B(Amb a 1) (Rafnarら、J. Biol. Chem.、266:1229-1236 (1991))、牧草アレルゲンLol p 1 (Tamboriniら、Eur. J. Biochem.、249:886-894 (1997))、主チリダニアレルゲンDer p1及びDer PII (Chuaら、J. Exp. Med 、167:175-182 (1988)；Chuaら、Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.、91:124-129 (1990))、ペットのネコアレルゲンFel d I (Rogersら、Mol. Immunol.、30:559-568 (1993))、白樺花粉Bet v1 (Breitenederら、EMBO J.、8:1935-1938 (1989))、ニッポンスギアレルゲン Cryj 1及びCryj 2 (Kingetsuら、Immunology、99:625-629 (2000))、及び他の樹木花粉からのタンパク質抗原(Elsayedら、Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl.、204:17-31 (1991))の調製を含むが、これらに限定されるものではない。表示のように、樹木由来のアレルゲンは公知であり、樺、ビャクシン、ニッポンスギ由来のアレルゲンを含む。牧草花粉からのin vivo投与のためのタンパク質抗原の調製は、報告されている。
【０１２８】
態様によっては、アレルゲンは食物アレルゲンであり、ピーナッツアレルゲン、例えばAra h I (Stanleyら、Adv. Exp. Med Biol.、409:213-216 (1996))；クルミアレルゲン、例えばJug r I (Tueberら、J. Allergy Clin. Immunol.、101:807-814 (1998))；ブラジルナッツアレルゲン、例えばalbumin (Pastorelloら、J. Allergy Clin. Immunol.、102:1021-1027 (1998)；エビアレルゲン、例えばPen a I (Reeseら、Int. Arch. Allergy Immunol.、113:240-242 (1997))；卵アレルゲン、例えばオボムコイド(Crookeら、J. Immunol.、159:2026-2032 (1997))；ミルクアレルゲン、例えばウシβ-ラクトグロブリン(Selotら、Clin. Exp. Allergy、29:1055-1063 (1999))；サカナアレルゲン、例えばパルブアルブミン(Van Doら、Scand J. Immunol.、 50:619-625 (1999)；Gallandら、J. Chromatogr. B. Biomed Sci. Appl.、706:63-71 (1998))を含むが、これらに限定されるものではない。態様によっては、アレルゲンは、ラテックスアレルゲンであり、これはHev b 7 (Sowkaら、Eur. J. Biochem.、255:213-219 (1998))を含むが、これらに限定されるものではない。表１は使用することができるアレルゲンの例示的なリストを示す。
【０１２９】
【表１】
2006512096.tif 000022
【表２】
2006512096.tif 000023
【表３】
2006512096.tif 000024
【表４】
2006512096.tif 000025
【０１３０】
態様によっては、抗原は、感染性物質由来であり、原生動物、細菌、真菌(単細胞及び多細胞を含む)、及びウイルス感染性物質を含む。適当なウイルス抗原の例は、本願明細書に説明されており、かつ当該技術分野において公知である。細菌は、ヘモフィルス・インフルエンザ(Hemophilus influenza)、マイコバクテリウム・チューバーキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)及びボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)を含む。原生動物の感染性物質は、マラリア原虫、リーシュマニア種、トリパノソーマ種及び住血吸虫種を含む。真菌は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を含む。
【０１３１】
態様によっては、抗原は、ウイルス抗原である。ウイルスポリペプチド抗原は、HIVタンパク質、例えばHIV gagタンパク質(膜アンカー(MA)タンパク質、コアキャプシド(CA)タンパク質及びヌクレオキャプシド(NC)タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。)、HIVポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス(M)タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオキャプシド(NP)タンパク質、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コアタンパク質(HBcAg)、肝炎eタンパク質(HBeAg)、B型肝炎DNAポリメラーゼ、C型肝炎抗原などを含むが、これらに限定されるものではない。インフルエンザワクチン接種を考察している参考文献は、Scherle及びGerhard、Proc. Natl. Acad Sci. USA、85:4446-4450 (1988)；Scherle及びGerhard、J. Exp. Med、164:1114-1128 (1986)；Granoffら、Vaccine、11:S46-51 (1993)；Kodihalliら、J. Virol、71:3391-3396 (1997)；Ahmeidaら、Vaccine、11:1302-1309 (1993)；Chenら、Vaccine、17:653-659 (1999)；Govorkova及びSmimov、Acta Virol.、41:251-257 (1997)；Koideら、Vaccine、13:3-5 (1995)；Mbawuikeら、Vaccine、12:1340-1348 (1994)；Tamuraら、Vaccine、12:310-316 (1994)；Tamuraら、Eur. J. Immunol.、22:477-481(1992)；Hirabayashiら、Vaccine、8:595-599 (1990)である。他の抗原ポリペプチドの例は、類属-又は亜類属-特異的抗原であり、これは多くの感染性物質について公知であり、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)及びポックスウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
多くの抗原性ペプチド及びタンパク質が知られており、かつ当該技術分野において利用可能であり；他のものは常用の技術を用いて同定することができる。腫瘍形成に対する免疫感作又は存在する腫瘍の治療に関して、免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞(生存又は放射線照射したもの)、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原のタンパク質サブユニット、例えばHer-2/neu、MartI、癌胎児性抗原(CEA)、ガングリオシド、ヒト乳脂肪球(milk fat globule)(HMFG)、ムチン(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前立腺特異抗原(PSA)及びチロシナーゼを含む。免疫ベースの避妊剤は、ＩＭＰと共に投与された精子タンパク質を含んで成ることにより形成することができる。Leaら、Biochim. Biophys. Acta、1307:263 (1996)。
【０１３３】
減弱された及び不活化されたウイルスは、本願明細書における抗原としての使用に適している。これらのウイルスの調製は、当該技術分野において周知であり、かつ多くは市販されている(例えば、「医家向け医薬品便覧(PDR)」(1998)、52版、Medical Economics Company, Inc.参照のこと)。例えば、ポリオウイルスは、IPOL（登録商標）(Pasteur Merieux Connaught社)及びORIMUNE（登録商標）(Lederle Laboratories社)として、A型肝炎ウイルスは、VAQTA（登録商標）(Merck社)として、麻疹ウイルスはATTENUVAX（登録商標）(Merck社)として、ムンプスウイルスはMUMPSVAX（登録商標）(Merck社)として、及び風疹ウイルスはMERUVAX（登録商標）II(Merck社)として市販されている。加えて、減弱された及び不活化されたウイルス、例えばHIV-1、HIV-2、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非-ヒトパピロマウイルス並びにスローブレインウイルスが、ペプチド抗原を提供することができる。
【０１３４】
態様によっては、抗原は、例えばワクシニア、アデノウイルス、及びカナリアポックスのようなウイルスベクターを含む。
【０１３５】
抗原は、当該技術分野において公知の精製技術を用いて、それらの給源から単離することができ、より都合よくは、組換え法を用いて生成しうる。
【０１３６】
抗原性ペプチドは、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、減弱又は不活化されたウイルス、細胞、微生物、又はこのようなペプチドの断片を含むことができる。免疫調節ペプチドは、天然であるか、又は化学的もしくは酵素的に合成され得る。当該技術分野において公知のあらゆる化学合成法が適している。液相ペプチド合成を用いて、中程度のサイズのペプチドを構築することができ、もしくはペプチドの化学的構築のために、固相合成を使用することができる。Athertonら、Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem.、362:833-839 (1981)。タンパク質分解酵素も、ペプチド生成のためのアミノ酸の結合に利用することができる。Kullmann、Enzymatic Peptide Synthesis、CRC Press社、(1987)。あるいは、このペプチドは、細胞の生化学的機構を用いて、もしくは生物学的給源からの単離により得ることができる。組換えDNA技術は、ペプチド産生のために利用することができる。Hamesら、Transcription and Translation: A Practical Approach、IRL Press社、(1987)。ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーのような、標準の技術を用いて単離することもできる。
【０１３７】
好ましくは、これらの抗原は、ペプチド、脂質(例えば、コレステロールを除くステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、Ｈ．インフルエンザワクチンにおいて使用されるもののような多糖類、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、化学的及び酵素的方法を使用する単離及び合成を含む、当該技術分野において公知のいくつかの方法により得ることができる。多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質など、特定の場合において、この分子の抗原性部分は、市販されている。
【０１３８】
対象の組成物及び当該組成物を使用する方法において有用なウイルス抗原の例は、HIV抗原を含むが、これに限定されるものではない。このような抗原は、gpl60、gp120及びgp41を含むが、これらに限定されるものではない、これらのHIVエンベロープ糖タンパク質由来の抗原を含むが、これらに限定されるものではない。HIV遺伝子及び抗原に関する多くの配列が公知である。例えば、Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Databaseが、HIVのヌクレオチド及びアミノ酸配列を収集し、管理し(curate)、かつ注釈を付けている。このデータベースは、インターネットにおいて、http://hiv-web.lanl.gov/でアクセスすることができ、かつ毎年刊行されており、Human Retroviruses and AIDS Compendium (例えば、2000年版)を参照のこと。
【０１３９】
感染性物質由来の抗原は、例えば、天然のウイルス又は細菌抽出物から、感染性物質により感染した細胞から、精製したポリペプチドから、組換えにより産生したポリペプチドから及び／又は合成ペプチドから、当該技術分野において公知の方法を用いて得ることができる。
【０１４０】
ＩＭＰ−抗原
抗原と共に使用する場合、ＩＭＰは、多くの方法で抗原と共に投与することができる。一部の態様において、ＩＭＰ及び抗原は、互いに空間的近傍で、又は混合して(すなわち、溶液中)投与することができる。以下に説明するように、空間的近傍は、多くの方法により達成することができ、これは複合(連結)、キャプシド封入、プラットフォームへの付着(affixation)又は表面への吸着による。一般に、且つ最も好ましくは、ＩＭＰ及び抗原は、ＩＭＰ及び抗原の混合物としての投与と比べ、生じた免疫反応が増強されるのに有効な距離で近傍に会合されている。
【０１４１】
態様によっては、ＩＭＰは、抗原と接合される。当該ＩＭＰ部分は、様々な方法、例えば共有結合的及び／又は非共有結合的相互作用で複合体の抗原部分とカップリングされることがある。
【０１４２】
前記部分の間の連結は、ＩＭＰの３’又は５’末端か、もしくははＩＭＰ内部位置の適当な修飾された塩基で作成される。この抗原がペプチドでありかつ適当な反応基(例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を含む場合は、これは、シトシン残基のＮ4アミノ基と直接反応することができる。ＩＭＰのシトシン残基の数及び位置に応じて、1又は複数の残基での特異的なカップリングが達成されうる。
【０１４３】
あるいは、例えば当該技術分野において公知であるような修飾されたオリゴヌクレオシドは、ＩＭＰのいずれかの末端に、又は内部位置に、組み込むことができる。これらは、脱ブロッキングされた場合に、注目の抗原上に存在する又は結合した様々な官能基と反応性であるような、ブロッキングされた官能基を含むことができる。
【０１４４】
抗原が、ペプチド又はポリペプチドである場合、この接合体の一部は、ＩＭＰの３’−末端へ固形支持体化学により結合することができる。例えば、ＩＭＰ部分は、支持体上に予め合成されたポリペプチド部分に追加することができる。Haralambidisら、Nucleic Acids Res.、18:493-499 (1990a)；及び、Haralambidisら、Nucleic Acids Res.、18:501-505 (1990b)。あるいはＩＭＰは、３’−末端から伸びている切断可能なリンカーを介して固相に接続されるように、合成することができる。ＩＭＰの支持体からの化学的切断時に、末端チオール基は、そのオリゴヌクレオチドの３’−末端に残留する(Zuckermannら、Nucleic Acids Res.、15:5305-5321 (1987)；及び、Coreyら、Science、238:1401-1403 (1987))か、又は末端アミノ基は、オリゴヌクレオチドの３’−末端に残留する(Nelsonら、Nucleic Acids Res.、17:1781-1794 (1989))。アミノ基に対するアミノ-修飾されたＩＭＰの複合は、Benoitらの論文(Neuromethods、6:43-72 (1987))に説明されたように実行することができる。カルボキシル基に対するチオールで修飾されたＩＭＰの接合は、Sinahらの著書((1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press社)に説明されたように行うことができる。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖への付属したマレイミドを保持するオリゴヌクレオチドのカップリングは、Tungらの論文(Bioconjug. Chem.、2:464-465 (1991))に記載されている。
【０１４５】
前記接合体のペプチド又はポリペプチド部分は、合成時にオリゴヌクレオチドへ組込まれるアミン、チオール、又はカルボキシル基を介してＩＭＰの５’末端に結合することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固相支持体上に固定されている場合、その一端に保護されたアミン、チオール、又はカルボキシルを、他端にホスホラミダイトを含む連結基は、５’−ヒドロキシルへ共有結合されている。Agrawalら、Nucleic Acids Res.、14:6227-6245 (1986)；Connolly、Nucleic Acids Res.、13:4485-4502 (1985)；Kremskyら、Nucleic Acids Res.、15:2891-2909 (1987)；Connolly、Nucleic Acids Res.、15:3131-3139 (1987)；Bischoffら、Anal. Biochem.、164:336-344 (1987)；Blanksら、Nucleic Acids Res.、16:10283-10299 (1988)；及び、米国特許第４，８４９，５１３号、第５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号、及び第５，１１８，８０２号。脱保護に続き、アミン、チオール、及びカルボキシル官能性を、オリゴヌクレオチドをペプチドへ共有結合するために使用することができる。Benoitら(1987)；及び、Sinahら(1991)。
【０１４６】
ＩＭＰ−抗原接合体も、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び／又はファンデルワールス引力のような、非共有結合的相互作用を介して形成することができる。
【０１４７】
非共有結合的に連結した接合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有結合的相互作用を含むことができる。ビオチニル基は、例えば、ＩＭＰの修飾された塩基へ結合することができる。Rogetら、Nucleic Acids Res.、17:7643-7651 (1989)。ストレプトアビジン部分を前記ペプチド部分に組み込むことは、ストレプトアビジンが接合したペプチド及びビオチニル化されたオリゴヌクレオチドの非共有結合的に結合した複合体の形成を可能にする。
【０１４８】
非共有結合的会合も、ＩＭＰ及び帯電したアミノ酸のような抗原内の残基に関連しているイオン相互作用を介して、又はオリゴヌクレオチド及び抗原の両方と相互作用することができる帯電した残基を含むリンカー部分の使用を介して生じることができる。例えば、非共有結合的接合は、一般に負帯電したＩＭＰとペプチドの正帯電したアミノ酸残基、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジン残基の間に生じ得る。
【０１４９】
ＩＭＰと抗原の間の非共有結合的複合は、それらの天然のリガンドとしてDNAと相互作用する分子のDNA結合モチーフを介して生じることができる。例えば、このようなDNA結合モチーフは、転写因子及び-DNA抗体で見られる。
【０１５０】
脂質に対するＩＭＰの連結は、標準の方法を用いて形成することができる。これらの方法は、オリゴヌクレオチド-リン脂質複合体の合成(Yanagawaら、Nucleic Acids Symp. Ser.、19:189-192 (1988))、オリゴヌクレオチド-脂肪酸接合体の合成(Grabarekら、Anal. Biochem.、185:131-135 (1990)；及び、Starosら、Anal. Biochem.、156:220-222 (1986))、及びオリゴヌクレオチド-ステロール接合体の合成(Boujradら、Proc. Natl. Acad Sci. USA、90:5728-573 1(1993))を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
オリゴ糖に対する前記オリゴヌクレオチドの連結は、標準の公知の方法を用いて形成することができる。これらの方法は、オリゴ糖が免疫グロブリンの一部であるようなオリゴヌクレオチド-オリゴ糖接合体の合成を含むが、これらに限定されるものではない。O'Shannessyら、J. Applied Biochem.、7:347-355 (1985)。
【０１５２】
環状ＩＭＰのペプチド又は抗原への連結は、複数の方法で形成することができる。環状ＩＭＰが、組換え的又は化学的方法を用いて合成される場合は、修飾されたヌクレオシドが適している。Ruth、「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」、IRL Press社、(1991)。その後標準の連結技術を用い、環状ＩＭＰを抗原又は他のペプチドへ接続することができる。Goodchild、Bioconjug. Chem.、1:165 (1990)。環状ＩＭＰが、組換え的又は化学的方法を用い、単離・合成される場合、この連結は、抗原又は他のペプチドに組込まれている反応基(例えば、カルベンラジカル)の化学的活性化、又は光による活性化により形成することができる。
【０１５３】
ペプチド及び他の分子のオリゴヌクレオチドへの結合に関する追加的方法は、米国特許第５，３９１，７２３号；Kessler、「Nonradioactive labeling methods for Nucleic Acids」、Kricka(編集)、Nonisotopic DNA Probe Techniques、Academic Press社(1992)；及び、Geogheganら、Bioconjug. Chem.、3:138-146 (1992)に見ることができる。
【０１５４】
ＩＭＰは、別の方法で抗原と近傍に会合することもできる。一部の態様において、ＩＭＰと抗原は、封入により近傍に会合される。別の態様において、ＩＭＰと抗原は、プラットフォーム分子への連結により近傍に会合される。「プラットフォーム分子」(「プラットフォーム」とも称される)は、ＩＭＰ及び抗原の結合を可能にする部位を含む分子である。他の態様において、ＩＭＰと抗原は、表面、好ましくは担体粒子への吸着により近傍に会合する。
【０１５５】
態様によっては、本発明の方法は、その複合体が標的に利用可能になるまで、ＩＭＰ及び第一の抗原の近傍での会合を維持することができる封入剤(又は、このような封入剤を含んで成る組成物)を利用する。好ましくは、ＩＭＰ、抗原及び封入剤を含んで成る組成物は、アジュバント水中油型乳剤、マイクロ粒子及び／又はリポソームの形状である。より好ましくは、ＩＭＰ例えば共有結合的及び／又は非共有結合的相互作用-免疫調節分子を封入しているアジュバント水中油型乳剤、マイクロ粒子及び／又はリポソームは、約0.04μｍ〜約100μｍのサイズの粒子状であり、好ましくは下記の範囲のいずれかである：約0.1μｍ〜約20μｍ；約0.15μｍ〜約10μｍ；約0.05μｍ〜約1.00μｍ；約0.05μｍ〜約0.5μｍである。
【０１５６】
コロイド状分散系、例えばミクロスフェア、ビーズ、高分子複合体、ナノカプセル及び脂質-ベースのシステム、例えば水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームが、ＩＭＰ−含有組成物の効果的封入を提供することができる。
【０１５７】
組成物は、更に、広範な成分により構成される。これらには、限定しないが、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造(LMS)、ポリエチレングリコール(PEG)、及び他のポリマー、例えばポリペプチド、糖ペプチド、及び多糖などが含まれる。
【０１５８】
成分の封入に適したポリペプチドには、限定しないが、当該技術分野において公知のいずれかが含まれ、且つ脂肪酸結合タンパク質が含まれる。修飾されたポリペプチドは、様々な修飾を含み、これには、限定しないが、グリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化及び水酸化を含まれる。本願明細書において使用されるように適当なポリペプチドは、それらの免疫調節活性を保存するためにＩＭＰ含有組成物を保護するようなものである。結合タンパク質の例は、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン(BSA)及びエンドウマメアルブミンを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５９】
他の適当なポリマーは、医薬分野において公知のいずれかであってもよく、天然のポリマー、例えばデキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、及び多糖、並びに合成ポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。天然のポリマーの例は、タンパク質、糖ペプチド、多糖、デキストラン及び脂質を含む。追加のポリマーは合成ポリマーであってもよい。本発明における使用に適した合成ポリマーの例には、限定しないが、ポリアルキルグリコール（ＰＡＧ）、例えばＰＥＧ、ポリオキシエチレンポリオール（ＰＯＰ）、例えばポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）、ポリトリメチレングリコール（ＰＴＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリヒドロキシエチレンメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミノ酸、ポリウレタン及びポリホスファゼンが含まれる。この合成ポリマーは、直鎖又は分枝鎖で、置換又は未置換のホモポリマー、コポリマー又は2種以上の異なる合成モノマーのブロックコポリマーであってもよい。
【０１６０】
本発明の組成物を封入する際に使用するためのＰＥＧは、化学物質供給業者から購入するか、もしくは当業者に公知の技術を使用し合成するかのいずれかである。
【０１６１】
本願明細書において使用される用語「ＬＭＳ」は、極性脂質の極性ヘッド基が界面の水相に面するように配置され、膜構造を形成している積層脂質粒子を意味する。ＬＭＳの例は、リポソーム、ミセル、渦巻形(cochleate)(すなわち一般には円柱状リポソーム)、μエマルション、単層ベシクル、多層ベシクルなどを含む。
【０１６２】
本発明の好ましいコロイド状分散系はリポソームである。リポソームで封入した抗原で免疫感作したマウスにおいて、リポソームは、抗原に対するTh1-型免疫反応を増強するように見える。Aramakiら、ワクチン、13:1809-1814 (1995)。本願明細書において使用される「リポソーム」又は「脂質ベシクル」は、少なくとも1種及び恐らく1種より多い二層脂質膜に結合した小さいベシクルである。リポソームは、リン脂質、糖脂質、脂質、コレステロールのようなステロイド、関連分子、又はそれらの組合せから、音波処理、押出、又は脂質-界面活性剤複合体からの界面活性剤の除去を含むが、これらに限定されるものではない当該技術分野において公知の技術により、人工的に作成される。リポソームは、更に組織標的化成分のような、追加の成分を任意に含むこともできる。「脂質膜」又は「脂質二重層」は、脂質からのみなる必要はないが、追加的にいずれか適当な他の成分を含んで成ることができ、これはコレステロール及び他のステロイド、脂溶性化学物質、いずれかの長さのタンパク質、及び膜の一般構造が1個の疎水性コアを挟んでいる2個の親水性表面のシートであるならば、他の両親媒性分子を含むが、これらに限定されるものではないことが理解される。膜構造の一般的考察に関しては、「The Encyclopedia of Molecular Biology」、J. Kendrew(1994)を参照のこと。適当な脂質に関しては、例えば、Lasicの「Liposomes: from Physics to Applications」、(1993)、Elsevier、アムステルダムを参照のこと。
【０１６３】
ＩＭＰ含有組成物を含むリポソームを調製する方法は、当該技術分野において知られている。脂質ベシクルは、いずれか適当な当該技術分野において公知の技術により調製することができる。方法は、マイクロカプセル封入、マイクロフルイダイゼーション、ＬＬＣ法、エタノール注入、フレオン注入、「バブル」法、界面活性剤透析、水和、音波処理、及び逆相蒸発を含むが、これらに限定されるものではない。Watweら、Curr. Sci.、68:715-724 (1995)において検証。最も望ましい属性を提供するために、技術を組合せることができる。
【０１６４】
本発明は、組織又は細胞標的化成分を含むＬＭＳの使用を包含している。このような標的化成分は、無傷の動物、臓器、又は細胞培養物へ投与された場合に、ある組織又は細胞部位で、他の組織又は細胞部位に優先してその蓄積を増強するＬＭＳの成分である。標的化成分は、一般にリポソーム外側から接近可能であり、従って好ましくは外側表面に結合されるか、又は外側脂質二重層に挿入されるかのいずれかである。標的化成分は、特にペプチド、より大きいペプチド領域、細胞表面分子もしくはマーカーに特異的抗体、又はそれらの抗原結合断片、核酸、炭水化物、複合炭水化物の領域、特別な脂質、又は薬物のような小分子、ホルモン、又は前述の分子のいずれかに結合したハプテンであってもよい。細胞型に特異的な細胞表面マーカーに対し特異性を伴う抗体は、当該技術分野において公知であり、かつ当該技術分野において公知の方法により容易に調製される。
【０１６５】
ＬＭＳは、治療的処置が向けられる細胞型、例えば免疫反応を調節する及び／又はこれに参加する細胞型に対して標的化することができる。このような標的細胞及び器官は、ＡＰＣ、例えばマクロファージ、樹状細胞及びリンパ球、リンパ構造、例えばリンパ節及び脾臓、並びに非リンパ構造、特にそこに樹状細胞が認められるものを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６６】
本発明のＬＭＳ組成物は、追加的に界面活性剤を含んで成ることができる。界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、両親媒性、又は非イオン性でありうる。好ましい界面活性剤の種類は、非イオン性界面活性剤であり；特に好ましいのは、水溶性のものである。
【０１６７】
ＩＭＰと抗原がプラットフォーム分子への連結により近傍で会合しているような態様において、このプラットフォームは、タンパク質性又は非タンパク質性(すなわち有機性)でありうる。タンパク質性プラットフォームの例は、アルブミン、ガンマグロブリン、免疫グロブリン(IgG)及びオボアルブミンを含むが、これらに限定されるものではない。Borelら、Immunol. Methods、126:159-168 (1990)；Dumasら、Arch. Dematol. Res.、287:123-128 (1995)；Borelら、Int. Arch. Allergy Immunol.、107:264-267 (1995)；Borelら、Ann. N.Y. Acad Sci.、778:80-87 (1996)。プラットフォームは、ＩＭＰ及び抗原の両方への結合に適合するために、多価(すなわち、1個より多い結合、又は連結部位を含む)である。ポリマー性プラットフォームの別の例は、デキストラン、ポリアクリルアミド、フィコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、及びポリD-グルタミン酸/D-リシンである。
【０１６８】
プラットフォーム分子を使用する原理は、当該技術分野においてよく理解されている。一般に、プラットフォームは、ＩＭＰ及び抗原の適当な結合部位を含むか、又はこれを含むように誘導体化される。加えて、又は代わりに、ＩＭＰ及び／又は抗原は、誘導体化され、適当な連結基を提供する。例えば、単純なプラットフォームは、ペプチドのような二官能性リンカー(すなわち、2個の結合部位を有する)である。更なる例を下文で論じる。
【０１６９】
プラットフォーム分子は、治療的有効性を付与するために、生物学的に安定化され、すなわち時間から日から月のin vivoでの排泄半減期を示し、かつ定義された組成の合成1本鎖で構成されることが好ましい。これらは一般に、分子量が約200〜約1,000,000の範囲であり、好ましくは下記の範囲のいずれかである：約200〜約500,000；約200〜約200,000；約200〜約50,000(又は、例えば30,000未満)。結合価プラットフォーム分子の例は、例えばポリエチレングリコール(PEG；好ましくは、分子量約200〜約8000を有する)、ポリ-D-リシン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、D-グルタミン酸及びD-リシン(比3:2)のようなポリマーである。使用することができる他の分子は、アルブミン及びIgGである。
【０１７０】
本発明における使用に適した他のプラットフォーム分子は、米国特許第５，５５２，３９１号に開示されたような、化学的に定義された、非-ポリマー性結合価プラットフォーム分子である。本発明における使用に適した他の均質な化学的に定義された結合価プラットフォーム分子は、誘導体化された2,2'-エチレンジオキシジエチルアミン(EDDA)及びトリエチレングリコール(TEG)である。
【０１７１】
追加の適当な結合価のプラットフォーム分子は、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノβシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリスリトール、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)及び1,4,7,10-テトラアザシクロデカン(Cyclen)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１７２】
一般に、これらのプラットフォームは、標準の化学合成技術により作成される。PEGは、誘導体化されかつ多価に作成されなければならず、これは標準の技術を用いて実現される。PEG、アルブミン、及びIgGのような複合体合成に適した一部の物質は、市販されている。
【０１７３】
ＩＭＰ及び抗原のプラットフォーム分子への接合は、多くの方法で達成することができ、典型的には抗原及びＩＭＰプラットフォーム及びプラットフォーム分子に対する１又は複数の架橋剤及び官能基を含む。プラットフォーム及びＩＭＰ及び抗原は、適当な連結基を有さなければならない。連結基は、標準の合成化学技術を用いて、プラットフォームに追加される。連結基は、標準固相合成技術又は組換え技術のいずれかを用い、ポリペプチド抗原及びＩＭＰに追加することができる。組換え法は、リンカーに結合するために翻訳後修飾が必要とされ、かつこのよう方法は当該技術分野において知られている。
【０１７４】
一例として、ポリペプチドは、ポリペプチドのプラットフォームへの結合部位として利用される、アミノ、カルボキシル又はスルフヒドリル基のような官能基を含むアミノ酸側鎖部分を含む。このような官能基を有する残基は、このポリペプチドが既にこのような基を含まないならば、ポリペプチドへ追加することができる。このような残基は、固相合成技術又は組換え技術により組み込むことができ、これらの技術はいずれもペプチド合成の技術分野においては周知である。このポリペプチドが炭水化物側鎖(又は抗原は炭水化物である場合)、官能性アミノ、スルフヒドリル及び／又はアルデヒド基は、通常の化学によりその中に組み込むことができる。例えば、一級アミノ基は、シアノボロ水素化ナトリウムの存在下での、酸化された糖のエチレンジアミンとの反応により組み込むことができ、スルフヒドリルは、システアミンジヒドロクロリドの反応、それに続く標準のジスルフィド還元試薬による還元により、導入することができ、一方アルデヒド基は、過ヨウ素酸酸化の後生成される。同様の様式において、プラットフォーム分子は更に、適当な官能基を既に含まない場合、官能基を含むように誘導体化してもよい。
【０１７５】
様々な長さの親水性リンカーは、ＩＭＰ及び抗原をプラットフォーム分子に結合させるために有用である。適当なリンカーは、エチレングリコールの直鎖のオリゴマー又はポリマーを含む。このようなリンカーは、下記式のリンカーを含む：
R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)MCO2R2(式中、n=０〜２００、m=１又は２であり、R1=H又は保護基、例えばトリチルであり、R2=H又はアルキル又はアリールであり、例えば、４−ニトロフェニルエステルである)。これらのリンカーは、アミド結合を介したアミノ基を含む第二分子へのチオエーテルを介して、ハロアセチル、マレインアミドなどのようなチオール反応基を含む分子の結合において有用である。これらのリンカーは、結合の順番に関して柔軟であり、すなわちチオエーテルは最初又は最後に形成することができる。
【０１７６】
ＩＭＰと抗原が表面上に吸着することにより近傍に会合している態様において、この表面は、無機又は有機性のいずれかのコアで生成した担体粒子(例えば、ナノ粒子)の形状であってもよい。このようなナノ粒子の例には、限定しないが、ナノ結晶粒子、アルキルシアノアクリレートの重合により作成されたナノ粒子及びマロン酸メチリデンの重合により作成されたナノ粒子が含まれる。ＩＭＰと抗原が吸着されうる別の表面には、限定しないが、活性炭素粒子及びタンパク質-セラミックナノプレートが含まれる。担体粒子の他の例は、本願明細書に提示する。
【０１７７】
吸着された分子を細胞に送達することを目的としたポリヌクレオチド及びポリペプチドの表面への吸着は、当業界で周知である。例えば、Douglasら、Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst.、3:233-261 (1987)；Hagiwaraら、In Vivo、1:241-252 (1987)；Bousquetら、Pharm. Res.、16:141-147 (1999)；及び、Kossovskyら、米国特許第5,460,831号を参照のこと。好ましくは、吸着体表面を含む材料は、生分解性である。表面に対するＩＭＰ及び／又は抗原の吸着は、非共有結合的相互作用、例えばイオン性及び／又は疎水性相互作用を介して生じることがある。
【０１７８】
概して、表面電荷、粒子サイズ及び分子量などの、ナノ粒子のような担体の特徴は、重合条件、モノマー濃度及び重合過程時の安定化剤の存在によって決まる(Douglasら、1987)。担体粒子の表面は、例えば、表面コーティングにより修飾することができ、ＩＭＰ及び／又は抗原の吸着を可能に又は増強する。吸着されたＩＭＰ及び／又は抗原を伴う担体粒子は更に他の物質でコーティングすることができる。このような他の物質の付加は、例えば対象に一回投与される粒子の半減期を延長することができ、そして／あるいは特異的細胞型又は組織に対し粒子を標的化することができ、これらは本明細書に記載のとおりである。
【０１７９】
ＩＭＰ及び抗原が吸着され得るナノ結晶表面が説明されている(例えば、米国特許第５，４６０，８３１号参照)。ナノ結晶コア粒子(直径が１μｍ又は未満)は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び／又は他の医薬物質の吸着を促進する表面エネルギー修飾層により被覆される。米国特許第５，４６０，８３１号に開示されているように、例えば、コア粒子は、オリゴヌクレオチドの吸着を促進する表面でコーティングされ、そしてその後、例えば、脂質-抗原混合物の形で、抗原調製物でコーティングされる。このようなナノ粒子は、ＩＭＰの内層及び抗原の外側層を保持する、ナノメーターサイズの粒子の自己-集成する複合体であり、典型的には０．１μｍの規模である。
【０１８０】
別の吸着表面は、アルキルシアノアクリレートの重合により作成されたナノ粒子である。アルキルシアノアクリレートは、アニオン性重合の過程により酸性化された水性媒質中において重合することができる。重合条件に応じて、小粒子は、２０〜３０００ｎｍの範囲のサイズを有する傾向があり、かつこれは特異的表面特徴及び特異的表面電荷を有するナノ粒子を作成することが可能である(Douglasら、1987)。例えば、オリゴヌクレオチドは、テトラフェニルホスホニウムクロリド又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドなどの第4級アンモニウム塩のような疎水性カチオンの存在下において、ポリイソブチル-及びポリイソヘキシルシアノアクリレートナノ粒子に吸着することができる。これらのナノ粒子へのオリゴヌクレオチド吸着は、核酸鎖の負帯電したリン酸基と疎水性カチオンの間のイオン対の形成により媒介されるように見える。例えば、Lambertら、Biochimie、80:969-976 (1998)、Chavanyら、Pharm. Res.、11:1370-1378 (1994)；Chavanyら、Pharm. Res.、9:441-449 (1992)。ポリペプチドは、ポリアクリルシアノアクリレートナノ粒子に吸着することもできる。例えば、Douglasら、1987；Schroederら、Peptides、19:777-780 (1998)参照。
【０１８１】
別の吸着表面は、マロン酸メチリデンの重合により作成されたナノ粒子である。例えば、Bousquetらの論文(1999)で説明されているように、ポリ(マロン酸メチリデン2.1.2)ナノ粒子に吸着したポリペプチドは、最初は静電気力により、その後疎水力による安定化により吸着されるようである。
【０１８２】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体
ＩＭＰは、免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体の形で投与することができる。従って、本発明は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る組成物を提供する。
【０１８３】
本発明において有用なマイクロキャリアは、サイズが約１５０、１２０又は１００μｍであり、より一般的には約５０〜６０μｍ未満のサイズであり、好ましくは約１０μｍ未満のサイズであり、かつ純水には不溶性である。本発明において使用されるマイクロキャリアは、好ましくは生分解性であるが、非生分解性マイクロキャリアも許容できる。マイクロキャリアは、通常「ビーズ」又は他の粒子のような固相であるが、生分解性ポリマー又は油分を含んで成る水中油乳剤のような液相のマイクロキャリアも意図している。マイクロキャリアとしての使用が許容できる広範な生分解性及び非生分解性材料は、当業界において知られている。
【０１８４】
本発明の組成物又は方法において使用するためのマイクロキャリアは、通常サイズが約１０μｍ未満(例えば、平均直径が約１０μｍ未満のもの、又は粒子の少なくとも約９７％が１０μｍスクリーンフィルターを通過するもの)であるか、又はナノキャリア(すなわち、約１μｍ未満のサイズのキャリア)を含む。好ましくは、マイクロキャリアは、上限約９、７、５、２又は１μｍ又は９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００又は１００ｎｍを、及び独立して下限約４、２、又は１μｍもしくは約８００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、又は１０ｎｍから選択され、ここで下限は上限未満であるサイズを有するものが選択される。一部の態様において、マイクロキャリアは、サイズ約１．０〜１．５μｍ、約１．０〜２．０μｍ又は約０．９〜１．６μｍを有する。ある好ましい態様において、マイクロキャリアは、サイズ約１０ｎｍ〜約５μｍ又は約２５ｎｍ〜約４．５μｍ、約１μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ又は約４．５μｍを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい態様は、約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ又は約２００ｎｍのナノキャリアを含む。
【０１８５】
固相生分解性マイクロキャリアは、生分解性ポリマー、例えば、限定しないが：生分解性ポリエステル、例えばポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、及びそれらのコポリマー(ブロックコポリマーを含む)並びにポリ(乳酸)及びポリ(エチレングリコール)のブロックコポリマー；ポリオルトエステル、例えば、3,9-ジエチリデン-2,4,8,10-テトラオキサスピロ[5.5]ウンデカン(DETOSU)ベースのポリマー；ポリ無水物、例えばセバシン酸のような比較的親水性モノマーをベースにしたポリ(無水)ポリマー；ポリ無水イミド、例えばグリシン又はアラニンのようなアミノ酸を組み込んでいるセバシン酸-由来のモノマー(すなわち、アミノ-末端の窒素がイミド結合によりセバシン酸に連結されている)をベースにしたポリ無水ポリマー；ポリ無水エステル；ポリホスファゼン、特にカルボン酸基の生成を介してポリマー骨格の分解を触媒することができる加水分解感受性エステル基を含む、ポリ(ホスファゼン)(Schachtら、Biotechnol. Bioeng.、1996:102(1996))；並びに、ポリアミド、例えばポリ(乳酸-コ-リシン)から作成することができる。
【０１８６】
マイクロキャリアを製造するための広範な非生分解性材料も知られており、これはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、デキストラン、ハイドロキシアパタイト、ラテックス、金、並びに強磁性又は常磁性の材料を含むが、これらに限定されるものではない。ある態様においては、金、ラテックス及び／又は磁気ビーズは除く。ある態様において、マイクロキャリアは、第二の材料(例えば、ポリスチレン)に封入された第一の材料(例えば、磁気材料)で作成することができる。
【０１８７】
固相ミクロスフェアは、当該技術分野において公知の技術を用いて調製することができる。例えば、これらはエマルション-溶媒抽出／蒸発技術により調製することができる。一般に、この技術において、生分解性ポリマー、例えばポリ無水物、ポリ(アルキル−α−シアノアクリレート)及びポリ(α−ヒドロキシエステル)、例えばポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(Ｄ、Ｌ−乳酸−コ-グリコール酸)及びポリ(カプロラクトン)などが、塩化メチレンのような適当な有機溶媒に溶解され、エマルションの分散相（ＤＰ）を構成する。ＤＰは、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような溶解した界面活性剤を含んで成る過剰容量の水性連続相（ＣＰ）への高速ホモジナイゼーションにより乳化される。ＣＰ中の界面活性剤は、孤立しかつ適当なサイズのエマルション液滴を形成することを確実にする。その後有機溶媒が、ＣＰに抽出され、かつ引き続きこの系の温度を上昇することにより蒸発させる。その後固形マイクロ粒子は、遠心又は濾過により分離され、かつ例えば凍結乾燥又は真空の適用により乾燥され、その後４℃で貯蔵される。
【０１８８】
乾燥したミクロスフェアの平均サイズ、分布及び表面荷電のような物理化学特性は、決定することができる。サイズ特性は、例えば、動的光散乱技術により決定することができ、かつ表面電荷は、ゼータ電位を測定することにより決定した。
【０１８９】
液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴、及び生分解性ポリマー又は油分を組み込んでいる、他の液体又は油ベースの粒子を含む。ある態様において、生分解性ポリマーは界面活性剤である。他の態様において、液相マイクロキャリアは、スクアレン又は植物油のような生分解性油分の封入のために、生分解性である。ひとつの好ましい液相マイクロキャリアは、水中油型乳剤内の油滴である。好ましくは、マイクロキャリアとして使用される水中油型乳剤は、スクアレンのような、生分解性置換体を含んで成る。
【０１９０】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、マイクロキャリア表面に結合したＩＭＰを含有し(すなわち、ＩＭＰは、ＭＣ中に封入されていない)、かつ好ましくは各マイクロキャリアに結合したＩＭＰの複数の分子を含んで成る。ある態様において、様々なＩＭＰの混合物は、マイクロキャリアと複合され、その結果このマイクロキャリアは1種よりも多いＩＭＰ種に結合される。ＩＭＰとＭＣの間の結合は、共有結合的又は非共有結合的でありうる。当業者に理解されるように、ＩＭＰは、修飾されるか又は誘導体化されることがあり、かつこのマイクロキャリア組成物は、選択及び／又は修飾され、ＩＭＰ／ＭＣ複合体形成にとって望ましい結合の望ましい型に適合する。
【０１９１】
共有結合したＩＭＰ／ＭＣ複合体は、当該技術分野において公知の共有結合的架橋技術を用いて連結することができる。典型的には、ＩＭＰ部分は、追加部分(例えば、遊離アミン、カルボキシル又はスルフヒドリル基)の組込み又は修飾された(例えば、ホスホロチオエート)ヌクレオチド塩基の組込みのいずれかにより修飾され、ＩＭＰ部分がマイクロキャリアに連結され得る部位を提供する。この複合体のＩＭＰ及びＭＣ部分の間の連結は、ＩＭＰの３’又は５’末端に、又はＩＭＰの内部位置で適当に修飾された塩基に生じることができる。このマイクロキャリアは一般に修飾され、それを介して共有結合が形成される部分を組み込んでいるが、このマイクロキャリア上に通常存在する官能基を利用することもできる。ＩＭＰ／ＭＣは、共有複合体の形成を可能にする条件下(例えば、架橋剤の存在下での条件、又はＩＭＰと共有結合を形成するであろう活性化部分を含む活性化されたマイクロキャリアの使用による条件)での、ＩＭＰのマイクロキャリアと一緒のインキュベーションにより形成される。
【０１９２】
広範な架橋技術が、当該技術分野において公知であり、かつアミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基と反応性のクロスリンカーを含む。当業者には明らかであるように、架橋剤及び架橋プロトコールの選択は、ＩＭＰ及びマイクロキャリアの立体構造に加え、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の望ましい最終的な立体構造によって決まるであろう。クロスリンカーは、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性のいずれかである。ホモ二官能性クロスリンカーが使用される場合、このクロスリンカーは、ＩＭＰ及びＭＣの同じ部分を活用し(例えば、ＩＭＰ及びＭＣの両方が1個又は複数の自由アミンを含む場合、アルデヒドクロスリンカーは、ＩＭＰ及びＭＣの共有連結に使用することができる。)。ヘテロ二官能性クロスリンカーは、ＩＭＰ及びＭＣ上の異なる部分を利用する(例えば、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ＩＭＰ上の自由スルフヒドリルとＭＣ上の自由アミンが共有結合的に連結するように使用される)、かつ内部−マイクロキャリア結合の形成を最小化することが好ましい。ほとんどの場合において、マイクロキャリア上の第一の架橋部分及びＩＭＰ上の第二の架橋部分を介して架橋することが好ましく、ここで第二の架橋部分は、このマイクロキャリア上には存在しない。ＩＭＰ／ＭＣ複合体を形成するひとつの好ましい方法は、ヘテロ二官能性架橋剤とのインキュベーション、その後の反応に適した条件下でのＩＭＰ及び活性化されたＭＣをインキュベーションすることによるＩＭＰ／ＭＣ複合体の形成によるマイクロキャリアの「活性化」である。このクロスリンカーは、反応性部分の間に「スペーサー」アームを組み込むことができるか、もしくはクロスリンカー内の2個の反応性部分が直接連結され得る。
【０１９３】
ある好ましい態様において、ＩＭＰ部分は、マイクロキャリアへの架橋について、少なくとも１つの自由スルフヒドリル(例えば、５’−チオール修飾された塩基又はリンカーにより提供される)を含むと同時に、このマイクロキャリアは、自由アミン基を含む。ヘテロ二官能性クロスリンカーは、これら２つの基(例えば、マレイミド基及びＮＨＳ−エステルを含むクロスリンカー)と反応性であり、その結果スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシラートが、ＭＣの活性化に使用され、その後ＩＭＰへ共有結合的に架橋され、ＩＭＰ／ＭＣ複合体を形成する。
【０１９４】
非共有結合的ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、非共有結合又は相互作用により連結することができ、これは結合対がＩＭＰ及びＭＣに連結する場合は一般的であるような、イオン(静電気力)結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力、又は２又はそれ以上の異なる相互作用の組合せを含む。
【０１９５】
好ましい非共有結合ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、疎水性もしくは静電気力(イオン性)相互作用、又はそれらの組合せにより、典型的には複合体化される(例えば、ＩＭＰとＭＣに結合したポリヌクレオチド間の塩基対形成を介した結合対を使用する)。ポリヌクレオチド骨格の親水性の性質のために、複合体を形成するために疎水性相互作用に依存するＩＭＰ／ＭＣ複合体は、一般に高度に疎水性の部分を組み込むには、この複合体のＩＭＰ部分の修飾が必要である。好ましくは疎水性部分は、生体適合性、非免疫原性であり、かつこの組成物が意図された個体において天然に生じる(例えば、哺乳類、特にヒトにおいて認められる)。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、コレステロールのようなステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分のＩＭＰへの連結法は、当然ＩＭＰの立体構造及び疎水性部分の同一性によって決まるであろう。この疎水性部分は、ＩＭＰ内の都合の良い部位、好ましくは５’又は３’末端のいずれかに付加することができ；コレステロール部分がＩＭＰへ付加される場合、コレステロール部分は、通常の化学反応を用い、好ましくはＩＭＰの５’末端に付加される(例えば、Godardら、Eur. J. Biochem.、232:404-410 (1995)参照)。好ましくは、疎水性結合により連結されたＩＭＰ／ＭＣ複合体における使用のためのマイクロキャリアは、油滴又は疎水性ポリマーのような疎水性材料から作成することができるが、疎水性部分を含むように修飾された親水性材料も利用することができる。マイクロキャリアがリポソーム又は管腔(lumen)を有する他の液相マイクロキャリアである場合、ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、ＭＣ調製過程時のＩＭＰの封入を避けるために、ＭＣ調製後にＩＭＰ及びＭＣを混合することにより形成される。
【０１９６】
静電気力結合により結合した非共有結合的ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、典型的には高度い負電荷のポリヌクレオチド骨格を示す。従って、非共有結合的に結合したＩＭＰ／ＭＣ複合体における使用のためのマイクロキャリアは、一般に生理的ｐＨ(例えば、約ｐＨ６．８〜７．４)で、正帯電(カチオン性)である。このマイクロキャリアは、正電荷を元来有するが、通常正電荷を有さない化合物から生成されたマイクロキャリアは、誘導体化されるか、もしくはさもなければ正帯電(カチオン性)となるよう修飾される。例えば、マイクロキャリアの作成に使用されるポリマーは、1級アミンのような、正帯電した基を付加するように誘導することができる。あるいは正帯電した化合物は、製造時に、マイクロキャリア製剤に混入することができる(例えば、正帯電した界面活性剤を、ポリ(乳酸)/ポリ(グリコール酸)コポリマーの製造時に使用し、得られるマイクロキャリア粒子上に正電荷を付与することができる。)。
【０１９７】
本願明細書に記載のとおり、カチオン性ミクロスフェア、カチオン性脂質又はポリマーを調製するために、例えば１，２−ジオレオイル−１，２，３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）又はポリリシンは、これらの相の溶解度に従い、ＤＰ又はＣＰのいずれかに添加される。
【０１９８】
本明細書に記載のとおり、ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、好ましくは水性混合物中における、ポリヌクレオチド及びこれらの粒子のインキュベーションによる、カチオン性ミクロスフェア上への吸着により行うことができる。このようなインキュベーションは、周囲温度(室温)(例えば、およそ20℃)又は冷蔵下(例えば、4℃)を含む、所望の条件下で実行することもできる。カチオン性ミクロスフェア及びポリヌクレオチドは、比較的迅速に会合するので、インキュベーションは、５、１０、１５分又はそれ以上、一晩又はそれ以上を含む、いずれか都合の良い時間間隔であってもよい。例えば、ＩＭＰは、ポリヌクレオチド及び粒子の4℃で一晩の水性インキュベーションによりカチオン性ミクロスフェア上に吸着することができる。しかし、カチオン性ミクロスフェア及びポリヌクレオチドは自然発生的に会合するので、ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチド及びＭＣの単純な同時投与により形成することができる。ミクロスフェアは、ポリヌクレオチド会合の前後のサイズ及び表面電荷を特徴とすることができる。その後選択されたバッチは、例えば本明細書に記載の、確立されたヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、及びマウスの脾細胞アッセイにおいて、適当なコントロールに対する活性について評価することができる。この処方は更に、適当な動物モデルについても評価することができる。
【０１９９】
ヌクレオチド塩基対合により連結された非共有結合的ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、従来の方法論を用いて作成され得る。一般に、塩基対形成したＩＭＰ／ＭＣ複合体は、ＩＭＰと少なくとも部分的に相補的である、結合した、好ましくは共有結合したポリヌクレオチド(「捕獲ポリヌクレオチド」)を含むマイクロキャリアを使用し作成される。ＩＭＰ及び捕獲ヌクレオチドの間の相補性のセグメントは、好ましくは少なくとも６、８、１０又は１５個のコンティグ塩基対、より好ましくは少なくとも２０個のコンティグ塩基対である。この捕獲ヌクレオチドは、当該技術分野において公知のいずれかの方法により、ＭＣへ結合することができ、かつ好ましくは５’又は３’末端においてＩＭＰと共有結合される。
【０２００】
他の態様において、結合対は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体におけるＩＭＰとＭＣの連結のために使用することができる。この結合対は、受容体及びリガンド、抗体及び抗原（又はエピトープ）、又は高親和性（例えば、約１０-8未満のＫｄ）で結合するいずれか他の結合対であってもよい。好ましい結合対のひとつの型は、ビオチン及びストレプトアビジン又はビオチン及びアビジンであり、これらは非常に密な複合体を形成する。ＩＭＰ／ＭＣ複合体結合を媒介するために結合対を使用する場合、ＩＭＰは、典型的には、結合対のひとつのメンバーとの共有結合により誘導体化され、かつＭＣは、結合対の他方のメンバーにより誘導体化される。これら2種の誘導体化された化合物の混合物は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の形成を生じる。
【０２０１】
多くのＩＭＰ／ＭＣ複合体の態様は、抗原を含まず、ある態様はＩＭＰ／ＭＣ複合体療法の対象である疾患又は障害に関連した抗原を除く。更なる態様において、ＩＭＰも、１又は複数の抗原分子に結合することができる。抗原は、様々な方法で、ＩＭＰ／ＭＣ複合体のＩＭＰ部分に結合することができ、これは例えばＷＯ９８／１６２４７に開示されたような、共有結合的及び／又は非共有結合的相互作用を含む。あるいは抗原は、マイクロキャリアへ連結することができる。ＩＭＰに結合した抗原を含むＩＭＰ／ＭＣ複合体中の抗原とＩＭＰの間の連結は、本願明細書に説明されかつ当該技術分野において公知の技術により作成され、これは直接共有結合、クロスリンカー部分(スペーサーアームを含み得る)を介した共有結合的複合、特異的結合対を介した非共有結合的複合(例えば、ビオチン及びアビジン)、静電気力による非共有結合的複合、又は疎水結合を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２０２】
陽イオン性縮合剤及び安定化剤とのＩＭＰ複合体
ＩＭＰは、レシピエントの免疫反応を調節するために、陽イオン性縮合剤、ＩＭＰ、及び安定化剤を含んで成る組成物（すなわち、ＣＩＳ組成物）として投与されうる。米国特許第６０／４０２，９６８号を参照のこと。態様によっては、ＣＩＳ組成物は抗原及び／又は脂肪酸も含んで成ることがある。
【０２０３】
本発明のＣＩＳ組成物は、典型的には粒子型で存在する。当業者に自明なとおり、本発明のＣＩＳ粒子組成物は、異なるサイズの粒子群から成るであろう。この自然発生的なばらつきにより、本発明の組成物の粒子「サイズ」は、範囲で、又は最大若しくは最小の直径として起債されうる。粒子は、粒子の少なくとも９５％（質量当たり）が指定の寸法に合致する場合、特定のサイズであるとみなされる（例えば、粒子の少なくとも９７％が２０μｍ未満の直径である場合、前記組成物は２０μｍ未満の直径の粒子から成るとみなされる）。粒子サイズは、当業界で知られている任意な常用の方法、例えば濾過（例えば、カットオフサイズより大きい粒子を捕獲するための「デプス」フィルターの使用）、動的光散乱、電子顕微鏡、例えばＴＥＭ（特にフリーズフラクチャー処理と組み合わせたもの）及びＳＥＭ等により測定されうる。
【０２０４】
好ましくは、本発明のＣＩＳ組成物は、約５０μｍ未満の直径、更に好ましくは約２０μｍ未満の直径である粒子を含んで成るが、態様によっては、当該粒子は約３，２又は１μｍ未満の直径であろう。好ましい粒子サイズは、約０．０１μｍ〜５０μｍ、０．０２〜２０μｍ、０．０５〜５μｍ、そして０．０５〜３μｍの直径を含む。
【０２０５】
ＣＩＳ組成物の成分は、当該組成物中種々の比率／量で存在することがあるが、安定化剤及び任意の成分、例えば脂肪酸及び抗原の量は比較的不変なままであり、但し、安定化剤は概して約０．１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の範囲にわたり、脂肪酸は約０〜０．５％の範囲にわたり、そして抗原濃度は約０．１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜約１００μｇ／ｍＬ、更に好ましくは約１０〜５０μｇ／ｍＬの範囲にわたる。ＩＭＰ及び陽イオン性縮合剤の量及び比率は、本発明の組成物のより大きな変動範囲にさらされる。ＩＭＰの量は、ＩＭＰの分子量に応じてある程度まで変化し、そして概して約５０μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲にわたる。陽イオン性縮合剤は、概してＩＭＰよりも過剰に（質量の観点による）、概して約１：２（ＩＭＰ：陽イオン性縮合剤）〜約１：６、更に好ましくは約２：５〜１：５の比率で存在する。
【０２０６】
ＣＩＳ組成物の粒子サイズは、多数の変動因子による。当該組成物における粒子サイズ分布は、陽イオン性縮合剤対ＩＭＰの比率を変えることにより調節されうる。例えば、ＩＳＳ／０．４％Ｔｗｅｅｎ８５／０．４％オレイン酸／ポリミキシンＢを加えた例示的な組成物において陽イオン性縮合剤対ＩＭＰの比率を変えることで、平均粒子サイズは陽イオン性縮合剤：ＩＭＣ＝１の際に約１．５μｍであるものが、陽イオン性縮合剤：ＩＭＰ＝１０の際には約４５μｍに変わりうる。
【０２０７】
態様によっては、ＣＩＳ組成物は、陽イオン性縮合剤、ＩＭＰ及び、非イオン性界面活性剤である安定化剤を含んで成る。他の態様において、前記組成物は、膜破壊陽イオン性リポペプチド（好ましくはポリミキシン、更に好ましくはポリミキシンＢ）、ＩＭＰ及び安定化剤を含んで成る。態様によっては、安定化剤は血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。この態様のクラスの例示的組成物は、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ８５を安定化剤として利用し、任意な追加の安定化剤としてオレイン酸を含む。
【０２０８】
態様によって、ＣＩＳ組成物は、陽イオン性縮合剤とＩＭＰと非イオン性界面活性剤である安定化剤とを組み合わせる工程により生成される免疫調節粒子を含んで成る。他の態様において、本発明の組成物は、膜破壊陽イオン性リポペプチド（好ましくはポリミキシン、更に好ましくはポリミキシンＢ）と、ＩＭＰと安定化剤とを組み合わせる工程により生成される免疫調節粒子を含んで成る。態様によっては、安定化剤は血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。
【０２０９】
態様によっては、ＣＩＳ組成物は、ＩＭＰと非イオン性界面活性剤である安定化剤とを組み合わせ、それによりＩＭＰ／安定化剤混合物を形成させ、そして陽イオン性縮合剤とＩＭＰ／安定化剤混合物とを組み合わせる工程により形成される免疫調節粒子を含んで成る。他の態様において、本発明の組成物は、ＩＭＰと非イオン性界面活性剤である安定化剤とを組み合わせ、それによりＩＭＰ／安定化剤混合物を形成させ、そして膜破壊陽イオン性リポペプチド（好ましくはポリミキシン、更に好ましくはポリミキシンＢ）とＩＭＰ／安定化剤混合物とを組み合わせる工程により形成される免疫調節粒子を含んで成る。態様によっては、安定化剤は血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。
【０２１０】
態様によっては、ＣＩＳ組成物は、陽イオン性縮合剤と、ＩＭＰと非イオン性界面活性剤である安定化剤とを含んで成る免疫調節粒子を含んで成る。他の態様において、本発明の組成物は、膜破壊陽イオン性リポペプチド（好ましくはポリミキシン、更に好ましくはポリミキシンＢ）、ＩＭＰ及び安定化剤を含んで成る免疫調節粒子を含んで成る。態様によっては、安定化剤は血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。
【０２１１】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を用いる方法において有用な陽イオン性縮合剤は、生理的ｐＨ（すなわち約７．０〜約７．５のｐＨ）で正荷電の分子である。好ましくは、本発明において使用される陽イオン性縮合剤は双性イオン又はポリカチオンであり、すなわち、分子当たり１より多い正電荷を有する。本発明において有用な陽イオン性縮合剤には、親水性又は両親媒性ポリカチオンが含まれる。
【０２１２】
好ましい陽イオン性縮合剤には：（ａ）膜破壊陽イオン性リポペプチド、例えば、限定しないが、ポリミキシン、例えば、ポリミキシンＡ、ポリミキシンＢ（例えばポリミキシンＢ1及びポリミキシンＢ2）、ポリミキシンＣ、ポリミキシンＤ、ポリミキシンＥ（コリスチンとしても知られている）、ポリミキシンＫ、ポリミキシンＭ、ポリミキシンＰ、ポリミキシンＳ及びポリミキシンＴ、サークリン、例えばサークリンＡ、サークリンＢ、サークリンＣ、サークリンＤ、サークリンＥ及びサークリンＦ、オクタペプチン、アンホテリシン、例えばアンホテリシンＢ、及びアシル化ペプチド、例えばオクタノイル−ＫＦＦＫＦＦＫＦＦ及びアシルＫＡＬＡ（オクタノイル−ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＥＡＣＥＡ；（ｂ）膜破壊陽イオン性ペプチド、例えば、限定しないがポリミキシンＢノナペプチド、セクロピン、例えばセクロピンＡ、セクロピンＢ及びセクロピンＰ１、ＫＦＦＫＦＦＫＦＦ及びＫＡＬＡ（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ）；（ｃ）一本鎖陽イオン性界面活性剤、例えば、限定しないがセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ベンジルジメチル−アンモニウムブロミド（ＢＤＡＢ）、ＣｐｙｒＢ（セチル−ピリジニウムブロミド）、ＣｉｍＢ（セチルイミダゾリウムブロミド）、及びポリカチオンポリマー、例えば、限定しないがポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、を含む。態様によっては、陽イオン性縮合剤は膜破壊陽イオン性リポペプチド、好ましくはポリミキシン、更に好ましくはポリミキシンＢである。態様によっては、陽イオン性縮合剤として、脂肪酸エステル（すなわち脂質）及び二本鎖陽イオン性界面活性剤が除かれることがある。
【０２１３】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を用いる方法において有用な安定化剤には、水に懸濁可能であり、且つ水の表面張力を地下させるものが含まれるが、水溶性であり、そして／あるいは水に完全に混和する安定化剤が好ましい。多数の安定化剤群が本発明の組成物及び方法において有用であり例えば、タンパク質（好ましくは親水性タンパク質）、非イオン性界面活性剤、ポリマー性界面活性剤（例えば、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン）、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤及び脂肪酸を含むが、態様によっては、血清タンパク質（特にウシ血清タンパク質）、脂肪酸、及び／又はイオン性界面活性剤が安定化剤の定義から除外されることがある。
【０２１４】
あらゆるタンパク質が本発明の安定化剤として使用されることがある。態様によっては、安定化剤は、抗原として意図されていないタンパク質（下文の考察を参照のこと）であり；これらの態様において、当該タンパク質は、前記組成物の対象のレシピエントと同一の種から由来するのが好ましい（例えば、前記組成物がヒトにおける使用が意図されている場合、安定化剤として使用するタンパク質はヒトタンパク質であるのが好ましい）。血清アルブミンは、前記態様における安定化剤として有用な例示的タンパク質である。他の態様において、抗原は、当該抗原が必要とされない場合、安定化剤として利用され、そして通常、対象のレシピエントと種が適合しない。本発明の組成物及び方法において有用な抗原は後述する。
【０２１５】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を用いる方法において有用な非イオン性界面活性剤には、グルカミド(glucamide)、例えばデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）及びジメチルドデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、例えばポリオキシエチレン（１０）ドデシルエステル（ＧｅｎａｐｏｌＣ１００）、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３０）、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル（ＬＵＢＲＯＬ（登録商標）ＰＸ）、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５２）、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５６）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５８）ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７２）、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７６）、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７００）、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）９２）、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）９７）、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）９８）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）8（Ｇｅｎａｐｏｌ８０）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−１２７、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）9（Ｔｈｅｓｉｔ）、ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（８）イソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５）、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオリオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５）、ポロキサマー１８８、及びポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（ＮｏｎｉｄｅｔＮＰ４０）、アルキルマルトシド界面活性剤、例えばシクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、及びシクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デカノイルスクロース、グルコピラノシド、例えばメチル６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−ａ−Ｄ−グルコピラノシド（ＨＥＣＡＭＥＧ）及びアルキルグルコピラノ��ド、例えばｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、アルキルチオグルコピラノシド、例えばｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、アルキルマルトピラノシド、例えば、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド及びｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド、ジギチオニン(digitionin)、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ヘプタン１，２，３−トリオール、ｎ−オクタノイル−β−Ｄ−グルコシルアミン（ＮＯＧＡ）、ｎ−オクタノイルスクロース、ポロキサマー（ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、例えばポロキサマー１８８及びポロキサマー４０７、及びスルフォベタミン、例えばＳＢ−１０、ＳＢ−１２及びＳＢ−１４並びにｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、を含む。好ましい安定化剤には、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、特にポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート及びポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエートが含まれる。
【０２１６】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を用いる方法において有用な陰イオン性界面活性剤には、カプリル酸及びその塩、ケノデオキシコール酸及びその塩、コール酸及びその塩、デカンスルホン酸及びその塩、デオキシコール酸及びその塩、グリコデオキシコール酸及びその塩、ラウロイルサルコシン及びその塩、ｎ−ドデシルサルフェート及びその塩（例えば、ナトリウム塩及びリチウム塩）、タウロケノデオキシコール酸及びその塩、タウロコール酸及びその塩、タウロリトコール酸及びその塩、並びにタウロウルソデオキシコール酸及びその塩、が含まれる。
【０２１７】
陽イオン性界面活性剤には、セチルピリジニウム及びその塩、セチルトリメチルアンモニア及びその塩、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニア及びその塩、例えばドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルアンモニウムイミダゾリン、第４級イミダゾリン、及びテトラデシルトリメチルアンモニア及びその塩、例えばテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドが含まれる。
【０２１８】
安定化剤としての使用のために選択される界面活性剤は、好ましくは、油／水乳化性界面活性剤とみなされるものである。油／水乳化性界面活性剤は当業界で知られており、そして通常約８〜約１８の疎水性／親油性バランス（ＨＬＢ）値を特徴とする。好ましくは、粒子組成物に組み込まれた界面活性剤は、約１０〜約１６、更に好ましくは約１１〜約１５のＨＬＢ値を有する（例えば、ポリエチレングリコールソルビタンモノレエートのＨＬＢ＝１５．４；ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテルのＨＬＢ＝１３．５；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエートのＨＬＢ＝１１）。
【０２１９】
態様によっては、ＣＩＳ組成物はまた、１又は複数の脂肪酸、又はその塩を追加成分として含むことがある。脂肪酸を安定化剤成分として、そして脂肪酸を前記組成物の追加成分として利用する態様において、安定化剤として利用される脂肪酸は、「追加」成分として使用される脂肪酸と異なるであろう。本発明のＣＩＳ組成物において有用な脂肪酸は４〜３０個の炭素原子のサイズに及ぶことがあり、そして不飽和（例えば、ステアリン酸）、一価不飽和（例えば、オレイン酸）、又は多価不飽和（例えばリノレン酸）であってもよいが、一価不飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸が通常好ましい。
【０２２０】
態様によっては、ＣＩＳ組成物は、少なくとも４，５，６，８，１０，１５，１８、又は２０個の炭素原子であって、且つ約３０，２５，２０，１９，１５又は１０未満の炭素原子を炭素鎖長を有する脂肪酸を組み込むであろう。従って、態様によっては、本発明で利用する脂肪酸は、約４〜３０、５〜２５、１０〜２０、又は１５〜２０個の範囲の長さの炭素原子を有する炭素鎖を有することがある。
【０２２１】
ＣＩＳ組成物において有用な脂肪酸には、限定しないが、アラキドン酸、デカン酸、ドコサン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ヘプタデカン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ラウリン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、ノナデカン酸、ノナン酸、オクタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペンタデカン酸、ステアリン酸、テトラコサン酸、トリコサン酸、トリデカン酸、及びウンデカン酸が含まれる。ＣＩＳ組成物における使用にとって好ましい脂肪酸には、オレイン酸、パルミトレイン酸、及びリノール酸が含まれる。
【０２２２】
本発明の幾つかの態様において、抗原はＣＩＳ組成物中に組み込まれ、あるいはＣＩＳ組成物と一緒に投与される。抗原を組み込んでいるこれらのＣＩＳ組成物は、粒子組成物自体に抗原を組み込むか、あるいは粒子組成物が懸濁されている溶液中に溶解又は懸濁されうる。あらゆる抗原が本発明のＣＩＳ組成物中に組み込まれ、あるいは当該組成物と一緒に同時投与されうる。
【０２２３】
本発明の方法
本明細書に記載のとおり、本発明のＩＭＰは、特に、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−α及びＩＦＮ−ωの産生を刺激し、Ｂ細胞の増殖を刺激し、そして／あるいは形質細胞様樹状細胞を活性化して分化させることがある。本発明のＩＭＰはまた、他のサイトカイン、ケモカイン及び活性化関連タンパク質、例えば、限定しないがＩＰ−１０（インターフェロン誘導タンパク質１０ｋＤａ）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４及びＭＨＣクラスＩＩの産生も刺激しうる。本発明のＩＭＰはまた、ＩＦＮ−α誘導遺伝子、限定しないが、２，５−オリゴアデニル酸合成酵素（２，５−ＯＡＳ）、インターフェロン刺激遺伝子−５４Ｋ（ＩＳＧ−５４Ｋ）及びグアニル酸結合タンパク質−１（ＧＢＰ−１）の発現を刺激しうる。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドはまた、形質細胞様樹状細胞のアポトーシスを遅らせるシグナルを提供しうる。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドはまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性も刺激しうる。従って、本発明のＩＭＰは、個体の免疫反応を調節するのに特に有効である。
【０２２４】
本発明は、個体、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの免疫反応を調節する方法であって、本明細書に記載のＩＭＰを個体に投与することを含んで成る方法を提供する。免疫調節は、Ｔｈ１−型免疫反応の刺激及び／又はＴｈ２−型免疫反応の阻害又は減弱を含むことがある。ＩＭＰは、免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。本願明細書に記載のように、免疫反応の調節は、体液性及び／又は細胞性であってもよく、且つ当該技術分野における標準の技術を用い、且つ本願明細書に記載のように測定される。
【０２２５】
例えば、動物又は細胞集団、例えば哺乳類、任意にヒト、血球（例えば、ＰＢＭＣ、リンパ球、樹状細胞）、気管支肺胞洗浄細胞、又は他の細胞若しくはＩＳＳ反応細胞を含む細胞集団、の免疫反応の調節は、前記細胞を、本明細書に記載のＩＭＰ又はＩＭＰ含有組成物（例えば、ＩＭＰ、ＩＭＰと抗原、ＩＭＰ−抗原接合体、ＩＭＰ／マイクロキャリアー複合体等）と接触させることにより達成される。調節は、あらゆる形態の接触、例えば、限定しないが細胞とＩＭＰのin vitroでの同時インキュベーション、哺乳類（例えば実験動物）の皮膚にＩＭＰを塗布すること、及び非経口投与により達成されうる。
【０２２６】
動物又は細胞集団の免疫反応は、あらゆる方法、例えば１又は複数のＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＰ−１０、ＩＳＧ−５４Ｋ、ＭＣＰ−１の発現の増大、又は免疫刺激の遺伝子発現プロファイルの特徴の変化、並びにＢ細胞増殖及び樹上細胞の成熟のような反応、で検出されうる。細胞集団の免疫反応を刺激する能力は、多数の用途、例えば免疫抑制剤のためのアッセイ系におけるもの、を有する。
【０２２７】
多数の個体が本明細書に記載の免疫調節ポリヌクレオチドを受けるのに適している。好ましくは、必ずしも必要ではないが、個体はヒトである。
【０２２８】
態様によっては、前記個体は、アレルギー又はアレルギー-誘発型喘息のような、Ｔｈ２−型免疫反応に関連した障害に罹患している。ＩＭＰの投与は、免疫調節を生じ、１又は複数のＴｈ１−型反応に関連したサイトカインのレベルを上昇し、これはアレルゲンに対する個体の反応に関連したＴｈ２−型反応の特徴の低下を生じ得る。Ｔｈ２−型反応に関連した障害を伴う個体の免疫調節は、障害の１又は複数の症候の軽減又は改善を生じる。障害が、アレルギー又はアレルギー-誘発型喘息である場合、１又は複数の症候の改善は、下記の１又は複数の軽減を含む：鼻炎、アレルギー性結膜炎、循環血中IgEレベル、循環血中ヒスタミンレベル及び／又は「レスキュー」吸入療法の要件 (例えば、投与量測量式吸入器又はネブライザーにより投与される吸入型アルブテロール)。
【０２２９】
更なる態様において、本発明の免疫調節療法に対する個別の対象は、ワクチンを受けている個体である。このワクチンは、予防的ワクチン又は治療的ワクチンのいずれかであってもよい。予防的ワクチンは、個体がリスクを有するであろう障害に関連した１又は複数のエピトープ(例えば、結核の予防的ワクチンとしてのＭ．テュバキュローシス(M. tuberculosis)抗原)を含んで成る。治療的ワクチンは、個体が罹患している特定の障害に関連した１又は複数のエピトープ、例えば、結核患者におけるＭ．テュバキュローシス(M. tuberculosis)又はＭ．ボビス(M. bovis)表面抗原、アレルギーの個体における個体がアレルギーを示す抗原(すなわち、アレルギー脱感作療法)、癌の個体由来の腫瘍細胞(例えば、米国特許第５，４８４，５９６号に開示)、又は癌患者における腫瘍関連抗原などを含んで成る。下記実施例３に示されるように、肝炎ウイルス抗原であるB型肝炎表面抗原(HBsAg)と複合したＩＭＰの投与は、HBsAg単独の投与に比べ、霊長類における抗-HBsAg抗体力価の増大を生じる。
【０２３０】
前記ＩＭＰは、ワクチンと一緒に与えることができ(例えば、同じ注射、又は同時であるが個別の注射により)、もしくはＩＭＰは、個別に投与することができる(例えば、ワクチンの投与前又は投与後、少なくとも１２時間)。ある態様において、ワクチンの抗原は、ＩＭＰへの共有結合又は非共有結合のいずれかにより連結された、ＩＭＰの一部である。免疫調節ポリヌクレオチド療法のワクチンを受けている個体への投与は、ＩＭＰを伴わずにワクチンを受ける個体と比べ、Ｔｈ１−型反応に偏向したワクチンに対する免疫反応を生じる。Ｔｈ１−型反応への偏向は、ワクチン中の抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応、増大したＩＦＮ−γ及び他のＴｈ１−型反応に関連したサイトカイン、ワクチンの抗原に特異的なＣＴＬの産生、ワクチンの抗原に特異的なIgEの低下又は減弱されたレベル、ワクチンの抗原に特異的なＴｈ２−関連抗体の減少、及び／又はワクチンの抗原に特異的なTh1-関連抗体の増加により認められる。治療的ワクチンの場合、ＩＭＰ及びワクチンの投与は、このワクチンが治療を意図した障害の１又は複数の症候の回復を生じる。当業者には明らかであるように、正確な症状及びそれらの改善の方法は、治療されることが求められる障害に応じて決まるであろう。例えば、治療的ワクチンが結核に関するものである場合、ワクチンを伴うＩＭＰ治療は、咳、胸膜又は胸壁の疼痛、発熱及び／又は当該技術分野において公知の他の症状の軽減を生じる。ワクチンがアレルギー脱感作療法において使用されるアレルゲンである場合、この治療は、アレルギー症状の軽減(例えば、鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgEの循環血中レベル、及び／又はヒスタミンの循環血中レベルの低下)を生じる。
【０２３１】
他の本発明の態様は、癌又は感染症のような、予め存在する疾患又は障害を有する個体の免疫調節療法に関する。ほとんどの癌は、体内の他の細胞では認められないような腫瘍-関連及び／又は腫瘍特異抗原を発現するので、癌は、免疫調節の魅力的標的である。腫瘍細胞に対するTh1-型反応の刺激は、免疫系による腫瘍細胞の直接及び／又はバイスタンダーの殺傷を生じ、これは癌細胞の減少及び／又は症状の軽減につながる。癌を有する個体へのＩＭＰの投与は、腫瘍細胞に対するＴｈ１−型免疫反応の刺激を生じる。このような免疫反応は、腫瘍細胞を、細胞性免疫系細胞(例えば、ＣＴＬ)もしくは体液性免疫系の構成要素の直接作用によるか、又は免疫系により標的化された細胞に隣接する細胞に対するバイスタンダー作用のいずれかにより、殺傷される。例えば、Choら、Nat. Biotechnol.、18:509-514 (2000)参照。癌の状況において、ＩＭＰの投与は更に、１又は複数の例えば抗-腫瘍抗体のような追加の治療的物質の投与、化学療法様式及び／又は放射線療法を含み得る。抗-腫瘍抗体断片及び／又はそれらの誘導体、並びにモノクローナル抗-腫瘍抗体、それらの断片及び／又は誘導体を含むが、これらに限定されるものではない、抗-腫瘍抗体は、癌療法におけるこのような抗体試薬の投与のように、当該技術分野において公知である(例えば、RITUXAN（登録商標）（リツキシマブ）；HERCEPTIN（登録商標）（トランスツヅマブ）)。１又は複数の追加の治療的物質の投与は、ＩＭＰの投与の前、後及び／又は同時に行ってもよい。
【０２３２】
本発明の免疫調節療法は、感染症、特に体液性免疫反応に耐性のある感染症(例えば、マイコバクテリア感染症及び細胞内病原体により惹起された疾患)を伴う個体にも有用である。免疫調節療法は、細胞病原体(例えば、細菌又は原生動物)により、又は亜細胞病原体(例えば、ウイルス)により引き起こされた感染症の治療のために使用することができる。ＩＭＰ療法は、結核(例えば、Ｍ．テュバキュローシス(M. tuberculosis)及び／又はＭ．ボビス(M. bovis)感染症)、ハンセン氏病(すなわち、Ｍ．レプラ(M. leprae)感染症)、又はＭ．マリナム(M. marinum)もしくはＭ．ウルセランス(M. ulcerans)感染症のようなマイコバクテリア疾患に罹患した個体に投与することができる。ＩＭＰ療法は更に、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、B型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス、及びパピローマウイルスによる感染症を含む、ウイルス感染症の治療にも有用である。マラリア(例えば、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)及び／又は四日熱マラリア原虫(P. malariae)による感染症)、リーシュマニア(例えば、リーシュマニア・ドノバン(Leishmania donovani)、リーシュマニア・トロピカ(L. tropica)、Ｌ．メキシカナ(L. mexicana)、Ｌ．ブラジリエンシス(L. braziliensis)、Ｌ．ペルビアナ(L. peruviana)、Ｌ．インファンタム(L. infantum)、Ｌ．チャガシ(L. chagasi)、及び／又はＬ．アエチオピカ(L. aethiopica)による感染症)、及びトキソプラズマ症(すなわち、トキソプラスモシス・ゴンジイ(Toxoplasmosis gondii)による感染症)などの細胞内寄生体により引き起こされた疾患も、ＩＭＰ療法による恩恵がある。ＩＭＰ療法は、更に住血吸虫(すなわち、住血吸虫(Schistosoma)属、例えばビルハルツ住血吸虫(S. haematobium)、マンソン住血吸虫(S. mansoni)、日本住血吸虫(S japonicum)、及びメコン住血吸虫(S. mekongi)などの吸血虫による感染症)及び肝吸血虫(すなわち、肝吸虫(Clonorchis sinensis)による感染症)のような寄生虫病の治療にも有用である。感染症に罹患した個体へのＩＭＰの投与は、感染症の症状の回復を生じる。一部の態様において、前記感染症はウイルス疾患ではない。
【０２３３】
本発明は更に、個体においてＴｈ１−関連サイトカインのうちの少なくとも１つを増加又は刺激する方法を提供し、これは、IL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ及びIFN-αを含む。幾つかの態様において、本発明は、個体、特にＩＦＮ−γレベルの増大を必要とする個体のＩＦＮ−γを増大又は刺激する方法であって、有効量のＩＭＰを前記個体に投与することによりＩＮＦ−γが増大する方法、を提供する。ＩＦＮ−γの増大を必要とする個体は、ＩＦＮ−γの投与に一般的に反応する障害を有する者である。そのような障害には、多くの炎症性疾患、例えば、限定しないが潰瘍性大腸炎を含む。その様な障害はまた、多くの繊維病、例えば、限定しないが特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにＩＦＮ−γの投与によって改善され得る他の症状を含む。本発明のＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、ＩＦＮ−γレベルの増大をもたらし、そして１又は複数の症候の回復、１又は複数の症候の安定化、あるいはＩＦＮ−γに応答する病気の進行の予防（例えば、追加の病変又は症候の軽減又は排除）をもたらす。
【０２３４】
本発明の方法は、前記障害のための標準的な対処を構成する他の治療、例えばＩＰＦにおける抗炎症剤の投与、例えば全身性コルチコステロイド治療（例えば、コルチゾン）と一緒に実施されうる。
【０２３５】
幾つかの態様において、本発明は、個体、特にＩ型インターフェロンレベルの増大を必要とする個体のＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−ωを増大させる方法であって、有効量のＩＭＰを投与することにより、Ｉ型インターフェロンレベルが増大する方法、を提供する。幾つかの態様において、本発明は、個体、特にＩＮＦ−αレベルの増大を必要とする個体のＩＦＮ−αを増大させる方法であって、有効量のＩＭＰを投与することにより、ＩＦＮ−αレベルが増大する方法、を提供する。ＩＦＮ−αの増大を必要とする個体は、一般にＩＦＮ−α、例えば組換えＩＦＮ−αの投与に反応する障害、例えばウイルス感染及びガンを有する者である。より高レベルのＩＦＮ−αの産生の増大が所望とされる幾つかの態様においては、ＩＭＰは少なくとも以下の長さ（塩基長）：１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８又は３０の少なくとも１つのパリンドローム配列を含み、そして態様によっては、ＩＭＰは、３０塩基超の長さを有する少なくとも１つのパリンドローム配列を含む。
【０２３６】
本発明のＩＭＰの投与は、ＩＦＮ−αレベルの増大をもたらし、且つ１又は複数の症候の回復、１又は複数の症候の安定化、及び／又はＩＦＮ−αに反応する障害の進行の防止もしくは遅延をもたらす(例えば、追加の病巣又は症状の軽減又は消失)。発明の方法は、前記障害のための標準的な対処を構成する他の治療、例えばウイルス感染のための抗ウイルス剤の投与と一緒に実施されうる。
【０２３７】
有効量のＩＭＰを個体に投与することによる、IgE-関連障害を有する個体におけるIgEのレベル、特に血清レベルを低下する方法も提供される。このような方法において、免疫調節ポリヌクレオチドは、単独で投与するか(例えば、抗原を伴わず)、又はアレルゲンのような抗原と共に投与することができる。IgEの減少は、IgE-関連障害の１又は複数の症候の回復を生じる。このような症候は、鼻炎、結膜炎、アレルゲンに対する感受性の低下、アレルギーの個体におけるアレルギー症状の低下、又はアレルギー反応の重症度の低下などの、アレルギー症状を含む。従って、本発明は、個体においてアレルギー状態を治療する方法も提供する。一部の態様において、アレルギー状態を治療する方法は、特定量又は特定用量の抗原と共に、免疫調節ポリヌクレオチドを投与することを含む。いずれか追加の抗原投与と共に、投与される抗原の量又は用量は、治療の間に(従来の脱感作療法と)同じに維持されるか、減少されるか、又は増加されることができる。
【０２３８】
態様によっては、本発明は、個体、特にＣＴＬの数及び／又は活性の増大を必要とする個体のＣＴＬ産生を刺激する方法であって、ＣＴＬ産生が増大するように有効量のＩＭＰを前記個体に投与することを含んで成る方法、を提供する。ＣＴＬ産生の増大を必要とする個体は、一般にＣＴＬ活性に反応する障害を有する者である。このような障害は、癌及び細胞感染症を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のＩＭＰの投与は、ＣＴＬレベルの増大を生じ、かつ１又は複数の症候の回復、１又は複数の症候の安定化及び／又はＣＴＬ活性に反応する障害の進行の防止又は遅延(例えば、追加の病巣又は症状の軽減又は消失)を生じる。
【０２３９】
本発明の方法は、本明細書に記載のあらゆる態様、例えば免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体の形態でのＩＭＰ(抗原を伴う又は伴わない、もしくは投与経過にわたり抗原を伴う又は伴わない)、もしくは抗原と近傍で会合しているＩＭＰの投与を含む。
【０２４０】
当業者に自明なように、本発明の方法は、ＩＭＰが投与される特定の適応症についての他の療法と組合せて実践することができる。例えば、ＩＭＰ療法は、マラリア患者のためのクロロキノンのような抗-マラリア薬と複合して、リーシュマニア患者のためのペンタミジン及び／又はアロプリノールのようなリーシュマニア殺傷薬と複合して、結核患者のためのイソニアジド、リファンピン及び／又はエタンブトールのような抗-マイコバクテリア薬と複合して、又はアトピー(アレルギー)患者のためのアレルゲン脱感作療法と複合して投与することができる。
【０２４１】
本願明細書に記載のとおり、ＩＭＰの投与は更に、サイトカイン、アジュバント及び抗体(抗体断片及び／又は誘導体及びモノクローナル抗体、それらの断片及び／又は誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。)を含むがこれに限定されない、１又は複数の追加の免疫療法剤(すなわち、免疫系に作用する物質及び／又は免疫系に由来する物質)の投与を含むことができる。治療的抗体の例は、ガンの状況において使用されるもの(例えば、抗腫瘍抗体)を含む。このような追加の免疫療法剤の投与は、本願明細書に記載の全ての方法に適用される。
【０２４２】
ＩＭＰは、アジュバントと組合せて投与することもできる。抗原とＩＭＰ及びアジュバントの投与は、その抗原に対する免疫反応の増強作用につながり、その結果ＩＭＰ及び抗原のみを含んで成る組成物から生じるものと比べ、増強された免疫反応を生じ得る。アジュバントは、当該技術分野において公知であり、かつ水中油型乳剤、油中水型乳剤、ミョウバン(アルミニウム塩)、リポソーム並びに、ポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼン及びポリラクチド/ポリグリセリドを含むが、これらに限定されるものではないマイクロ粒子を含むが、これらに限定されるものではない。同じくその他の適当なアジュバントは、MF59、DETOX（登録商標）(Ribi)、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁調製物、モノホスホリルリピドA、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Bサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、並びにTakahashiらの論文(Nature、344:873-875 (1990))に記載のような免疫刺激複合体(ISCOM)に加え、脂質-ベースのアジュバント及び本願明細書において説明された他のものを含むが、これらに限定されるものではない。獣医学用途及び動物における抗体産生のために、フロイントのアジュバント(完全及び不完全の両方)のマイトジェン成分を使用することができる。
【０２４３】
投与及び免疫反応の評価
本明細書に記載のように、ＩＭＰは、その他の医薬物質及び／又は免疫原性物質及び／又は免疫刺激物質と一緒に投与することができ、かつそれらの生理的に許容できる担体と一緒にすることができる(従って本発明はこれらの組成物を含む)。ＩＭＰは、本明細書に記載されたもののいずれかであってもよい。
【０２４４】
従って、ＩＭＰは、他の免疫療法剤、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体と組合せて投与することができる。
【０２４５】
全ての免疫原性組成物のように、特定のＩＭＰ製剤の免疫学的有効量及び投与法は、個体、どのような状態を治療するか、及び当業者には明白な要因を基に変更することができる。考慮されるべき要因は、抗原が投与される場合のその抗原性、ＩＭＰがアジュバントと共に又はこれに共有結合されて投与されるかどうか、送達分子及び／又は抗原、投与経路及び投与される免疫感作用量の数を含む。このような要因は、当該技術分野において公知であり、かつ当業者は、必要以上の実験を行うことなくこれらを決定することができる。適当な用量範囲は、免疫反応の望ましい調節(例えば、ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−γの刺激)を提供するものである。抗原に対する免疫反応が望ましい場合、適当な用量範囲は、この抗原に対する望ましい免疫反応の調節を提供するものである。一般に、用量は、投与されるＩＭＰ含有組成物の全量よりもむしろ、患者へ投与されるＩＭＰの量により決定される。ＩＭＰの有用な用量範囲は、送達されるＩＭＰの量で与えられる場合、例えば、ほぼ下記のいずれかであってもよい：1〜500μg/kg、100〜400μg/kg、200〜300μg/kg、1〜100μg/kg、100〜200μg/kg、300〜400μg/kg、400〜500μg/kg。各患者に投与される絶対量は、バイオアベイラビリティ、クリアランス率及び投与経路のような薬学的特性によって決まる。
【０２４６】
特定のＩＭＰ製剤の有効量及び投与法は、個々の患者、望ましい結果及び／又は障害の種類、疾患の病期及び当業者に明らかな他の要因を基に変動することができる。特定の用途に有用な投与経路は、当業者にとって自明である。投与経路は、局所的、皮膚的、経皮、経粘膜、経表皮、非経口、経胃腸管、及び経鼻咽頭並びに経気管支及び経肺胞を含む経肺を含むが、これらに限定されるものではない。適当な用量範囲は、血液レベルにより測定された組織濃度約1〜10μｍを達成するのに十分なＩＭＰ含有組成物を提供するものである。各患者に投与される絶対量は、バイオアベイラビリティ、クリアランス率及び投与経路のような薬理学的特性によって決まる。
【０２４７】
本明細書に記載のとおり、ＡＰＣ及び高濃度のＡＰＣを伴う組織は、ＩＭＰの好ましい標的である。従って、哺乳類皮膚及び／又は粘膜へのＩＭＰの投与は、ＡＰＣが比較的高濃度で存在する場合に、好ましい。
【０２４８】
本発明は、生理的に許容できるインプラント、軟膏剤、クリーム剤、リンス剤(rinse)及びゲル剤を含むが、これらに限定されるものではない、局所適用に適したＩＭＰ製剤を提供する。局所投与は、例えば、その中に送達システムが分散された包帯又は絆創膏によるか、送達システムの切開部又は開放創傷への直接投与によるか、又は関心のある部位に方向付けられた経皮的投与装置によることができる。ＩＭＰがその中に分散されたクリーム剤、リンス剤、ゲル剤又は軟膏剤は、局所用軟膏剤又は創傷充填剤としての使用に適している。
【０２４９】
皮膚投与の好ましい経路は、侵襲性が最も少ないものである。これらの手段の中で、経皮的送達、表皮的投与及び皮下注射が好ましい。これらの手段で表皮投与は、皮内組織中に存在することが予想される比較的高いＡＰＣ濃度にとって好ましい。
【０２５０】
経皮投与は、ＩＭＰを皮膚浸透及び血流へ侵入させることが可能であるクリーム剤、リンス剤、ゲル剤などの塗布により達成される。経皮的投与に適した組成物は、直接皮膚に塗布される又は経皮的装置のような保護的担体(いわゆる「パッチ」)に組込まれる、医薬として許容される懸濁剤、油剤、クリーム剤及び軟膏剤を含むが、これらに限定されるものではない。適当なクリーム剤、軟膏剤などの例は、例えば、「医師用卓上参考書」に見ることができる。
【０２５１】
経皮的送達について、イオン浸透法が適当な方法である。イオン浸透による輸送は、数日又はそれ以上の期間について破壊されていない皮膚を通してそれらの製品を連続して送達する市販のパッチを用いて達成することができる。この方法の使用は、比較的高濃度の医薬組成物の制御された輸送を可能にし、組合せ薬剤の注入を可能にし、かつ吸収促進剤の同時使用を可能にする。
【０２５２】
本方法における使用に関して例証されたパッチ製品は、General Medical社(ロサンジェルス、CA)の登録商標製品であるLECTRO PATCHである。この製品は、貯蔵電極を中性pHに電気的に維持し、かつ異なる濃度の用量を投与するため、連続及び／又は定期的に投与するように適合することができる。このパッチの調製及び使用は、LECTRO PATCH製品に添付された、製造業者の書面による取扱説明書に従い行わねばならず；これらの取扱説明書は、この参照により本願明細書に組入れられている。他の閉塞性パッチシステムも適している。
【０２５３】
経皮的輸送のために、低周波数の超音波送達も、適した方法である。Mitragotriら、Science、269:850-853 (1995)。低周波数(約1MHz)の超音波の適用は、高分子量のものを含む、治療的組成物の全般的に制御された送達を可能にする。
【０２５４】
表皮的投与は、刺激物質に対する免疫反応を惹起するのに十分なように、表皮の最も外側層を機械的又は化学的に刺激することに本質的に関連する。特に、この刺激は、刺激部位にＡＰＣを引き起こすのに十分でなければならない。
【０２５５】
例示的な機械的刺激手段は、皮膚を刺激しかつ刺激部位にAPCを誘起するために使用することができる多数の直径が非常に狭く短い尖叉(tine)を利用し、この尖叉の末端から移されたＩＭＰを取り込む。例えば、Pasteur Merieux社(リヨン、仏)により製造されたMONO-VACC旧ツベルクリン検査は、ＩＭＰ含有組成物の導入に適した装置を含む。
【０２５６】
装置(Connaught Laboratories社、スウィフトウォーター、PAにより、米国において頒布された)は、片方の端にシリンジ式プランジャー及び他方に尖叉ディスクを備えたプラスチック製容器からなる。この尖叉ディスクは、表皮細胞の最も外側層を単に引っ掻く長さの、多数の直径が非常に狭く短い尖叉を支えている。MONO-VACCキットのこれらの各尖叉は、旧ツベルクリンにより被覆されており；本発明において、各針は、免疫調節ポリヌクレオチド製剤の医薬組成物により被覆されている。この装置の使用は、この装置製品に備えられた製造業者の書面による取扱説明書に従うことが好ましい。この態様において使用することができる同様の装置は、アレルギー試験を行うために現在使用されているものである。
【０２５７】
ＩＭＰの表皮投与の別の適当な方法は、表皮の最も外側の細胞を刺激する化学物質の使用により、その結果その領域に対するＡＰＣを誘引するのに十分な免疫反応が惹起される。例は、Noxema社により商標NAIRで販売されている、市販の局所的脱毛クリームにおいて使用されるサリチル酸のような、ケラチノサイト溶解物質である。この方法は、粘膜における上皮投与を達成するためにも使用することもできる。化学的刺激剤は、機械的刺激剤と組合せて適用することもできる(例えば、MONO-VACC型尖叉が化学的刺激剤によっても被覆されている場合に生じるように)。このＩＭＰは、化学的刺激剤も含む担体中に懸濁するか、又はそれらと同時投与することもできる。
【０２５８】
非経口投与経路は、電気的(イオン導入法)、又は中心静脈系への直接注射のような直接注入、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下への注射を含むが、これらに限定されるものではない。非経口投与に適したＩＭＰの製剤は、一般にＵＳＰ水又は注射用水中で製剤化され、かつ更にｐＨ緩衝液、塩増量剤、保存剤及び他の医薬として許容される賦形剤を含有してもよい。非経口注入のための免疫調節ポリヌクレオチドは、注射用生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水のような、医薬として許容される滅菌等張液中で製剤化することができる。
【０２５９】
投与の胃腸管経路は、摂食及び経直腸を含むが、これらに限定されるものではない。本発明は、経口摂取のための医薬として許容される散剤、丸剤、又は液剤、並びに直腸投与のための坐剤を含むが、これらに限定されるものではない、消化器投与に適したＩＭＰ製剤を含む。当業者に明らかであるように、丸剤又は坐剤は、該組成物の嵩高を提供するために、更に医薬として許容される固形物、例えばデンプンを含む。
【０２６０】
鼻咽頭及び肺投与は、吸入により達成されるものを含み、かつ鼻腔内、気管支内及び肺胞内経路のような送達経路を含む。本発明は、エアゾール形成のための液体懸濁剤に加え乾燥散剤吸入送達システムのための散剤型を含むが、これらに限定されるものではない、吸入による投与に適したＩＭＰ製剤を含む。ＩＭＰ製剤の吸入による投与に適した装置は、アトマイザー、蒸気吸入器、ネブライザー、及び乾燥散剤吸入送達装置を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２６１】
当業界で周知なように、本明細書に記載された投与経路に使用される液剤又は懸濁剤は、下記の成分を１又は複数含んで成ることがある：無菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；殺菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、並びに張度を調節する物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような、酸又は塩基により調節することができる。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、ディスポーザル注射器、又は反復投与用バイアル中に封入することができる。
【０２６２】
当業界で周知なように、注射用途に適した医薬組成物は、無菌水溶液(水溶性)又は懸濁液及び無菌注射液もしくは分散液の用時調製用の無菌散剤を含む。静脈内投与に関して、適当な担体は、生理的食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）(BASF社、パルシパニー、NJ)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、かつ容易に注射器から排出される程度に流動性でなければならない。製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、かつ細菌及び真菌などの微生物の混入作用に対して保護されなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、並びにそれらの適当な混合物を含んで成る、溶媒又は分散媒であってもよい。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合に必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの、様々な抗菌剤及び抗真菌剤により達成することができる。組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物中に吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含んで成ることによりもたらされ得る。
【０２６３】
当業界で周知なように、滅菌した注射可能な溶液は、活性化合物を必要量、適当な溶媒中に、先に列記した成分の１つ又は組合せと共に混入し、必要ならば引き続き濾過滅菌することにより、調製することができる。一般に、分散剤は、基本的分散媒及び先に列記したものから必要な他の成分を含んで成る無菌の担体に活性化合物を混入することにより、調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製法は、活性成分に加え追加的な所望の成分の先に滅菌濾過した溶液から、それらの散剤を生成せしめる、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２６４】
送達経路の選択は、誘起された免疫反応を調節するために使用することができる。例えば、インフルエンザウイルスベクターが筋肉内又は表皮(遺伝子銃)経路で投与される場合、IgG力価及びCTL活性は同じであるが；しかし、筋肉接種は、主にIgG2aを生じるが、表皮経路はほとんどIgG1である。Pertmerら、J. Virol.、70:6119-6125 (1996)。従って当業者は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの異なる投与経路により誘起された免疫原性のわずかな差異を利用することができる。
【０２６５】
上述の組成物及び投与法は、本発明のＩＭＰ製剤の投与法を説明するが、これらに限定されるものではない。様々な組成物及び装置を作成する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本願明細書においては詳細には説明しない。
【０２６６】
ＩＭＰに対する免疫反応の分析(定性及び定量の両方)は、当業界において公知の方法によってもよく、これは抗原特異的抗体産生(特異的抗体サブクラスの測定)、CD4+ T細胞、NK細胞又はCTLのようなリンパ球の特異的集団の活性化、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−ω、ＴＮＦ−α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MIG又はMIP-3βのようなサイトカイン及びケモカインの産生及び／又はヒスタミンの放出の測定を含むが、これらに限定されるものではない。特異的抗体反応を測定する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を含み、かつ当業界で周知である。CD4+ T細胞のようなリンパ球の特異型の数の測定は、例えば、蛍光標示式細胞分取器(FACS)により実行することができる。特定の細胞集団の活性化の測定は、マーカー、例えば細胞表面マーカーであって、特定の細胞型の活性化に特異的なものの発現を決定することにより達成することができる。細胞マーカーの発現は、例えば、特定のマーカーのＲＮＡ発現又は細胞表面発現を、例えばＦＡＣＳ解析により測定することにより測定されうる。細胞傷害性及びCTLアッセイは、例えば、Razら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:9519-9523 (1994))及びChoら(2000)の論文に説明されたように実施することができる。サイトカイン濃度は、例えば、ELISAにより測定することができる。樹状細胞の成熟の測定は、例えば、HartomannらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9305-9310に記載のように実施することができる。免疫原に対する免疫反応を評価するためのこれら及び他のアッセイは、当該技術分野において周知である。例えば、「Selected Methods in Cellular Immunology」、(1980)、Mishell及びShiigi編集、W.H. Freeman and Co.を参照のこと。
【０２６７】
ＩＭＰに対する免疫反応の分析(定性及び定量の両方)はまた、サイトカイン、ケモカイン及び／又はサイトカイン、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＩＦＮ−αにより誘導される他の分子であって、産生がＩＭＰにより刺激されるもの、のレベルを測定することによることもある。従って、本発明のＩＭＰはまた、ＩＦＮγ及び／又はＩＦＮ−α誘導サイトカイン、ケモカイン及び炎症タンパク質、例えば、限定しないがＩＰ−１０（インターフェロン誘導タンパク質１０ｋＤａ）、ＩＦＮ−γにより誘導されるモノカイン、及び単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の発現を刺激しうる。ＩＭＰに対する免疫反応はまた、サイトカイン、ケモカイン及び／又は抗ウイルス活性を有することが知られているほかの分子、例えば２，５−オリゴアデニル酸合成酵素（２，５−ＯＡＳ）、インターフェロン刺激遺伝子−５４Ｋ（ＩＳＧ−５４Ｋ）及びグアニル酸結合タンパク質−１（ＧＢＰ−１）、のレベルを測定することにより分析することもできる。従って、抗ウイルス分子及びＩＦＮ−γ及び／又はＩＦＮ−αにより誘導される分子は、ＩＭＰ活性のマーカーとして使用することができる。そのようなインターフェロン誘導分子の産生及び／又は遺伝子発現の測定は、当業界で知られている任意の方法、例えば、限定しないがＥＬＩＳＡ及びＲＮＡ産生を測定するための定量ＰＣＲによってもよい。
【０２６８】
好ましくは、Ｔｈ１−型反応は、刺激され、すなわち誘起され、そして／あるいは増強される。本発明を参照すると、Ｔｈ１−型免疫反応の刺激は、ＩＭＰで処理した細胞からのサイトカイン産生を、ＩＭＰで処理しないものと比較・測定することにより、in vitro又はex vivoにおいて決定することができる。細胞のサイトカイン産生を決定する方法は、本願明細書において説明された方法及び当該技術分野において公知の方法を含む。ＩＭＰ処理に反応して産生されたサイトカインの種類は、細胞によるＴｈ１−型又はＴｈ２−型偏向(biased)免疫反応を示す。本願明細書において使用される用語「Th1-型偏向」サイトカイン産生は、刺激因子の存在下におけるTh1-型免疫反応に関連したサイトカイン産生の、刺激が存在しない場合のそのようなサイトカインの産生に比べて、測定可能に増大した産生を意味する。このようなＴｈ１−型偏向サイトカインの例は、IL-2、IL-12、IFN-γ及びIFN-αを含むが、これらに限定されるものではない。対照的に、「Ｔｈ２−型偏向サイトカイン」は、Ｔｈ２−型免疫反応に関連したものを意味し、かつIL-4、IL-5、及びIL-13を含むが、これらに限定されるものではない。ＩＭＰ活性の決定に有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主及び／又は細胞株から単離された初代細胞、好ましくはAPC及びリンパ球、更により好ましくはマクロファージ及びＴ細胞を含む。
【０２６９】
Ｔｈ１−型免疫反応の刺激も、ＩＭＰで処理した宿主において測定することができ、限定しないが：(1)抗原曝露の前後に測定したIL-4又はIL-5レベルの低下；又は、任意にＩＭＰなしで抗原刺激した、もしくは刺激しかつ曝露したコントロールと比較して、ＩＭＰ処理した宿主におけるIL-4又はIL-5の低下した(又は存在しないことさえもある)レベルの検出；(2)抗原曝露前後のIL-12、IL-18及び／又はIFN(α、β、又はγ)のレベルの増加；又は、ＩＭＰ処理した宿主における、ＩＭＰなしで抗原刺激した、もしくは刺激し且つ曝露したコントロールと比較して、より高いレベルのIL-12、IL-18及び／又はIFN(α、β、又はγ)の検出；(3)ＩＭＰ処理した宿主における「Ｔｈ１−型偏向」抗体産生のＩＭＰで処理しなかったコントロールとの比較；及び／又は、(4)抗原曝露前後に測定した抗原特異的IgEのレベルの低下；又は、ＩＭＰなしで抗原刺激した、もしくは抗原刺激しかつ曝露したコントロールと比較して、ＩＭＰで処理した宿主における抗原特異的IgEのより低い(又は存在しないことさえもある)レベルの検出、を含む当業界で知られている方法により決定することができる。様々なこれらの決定は、本願明細書において説明された方法又は当該技術分野において公知の方法を使用する、ＡＰＣ及び／又はリンパ球、好ましくはマクロファージ及び／又はT細胞により産生されたサイトカインの、in vitro又はex vivoにおける決定により行うことができる。これらの決定の一部は、本願明細書において説明された方法又は当業界で知られている方法を使用する、抗原特異的抗体のクラス及び／又はサブクラスの測定により行うことができる。
【０２７０】
ＩＭＰ処理に反応して産生された抗原特異的抗体のクラス及び／又はサブクラスは、細胞によるＴｈ１−型又はＴｈ２−型偏向の免疫反応を示す。本願明細書において使用される用語「Th1-型偏向」抗体(すなわち、Ｔｈ１関連抗体)の産生は、測定可能に増加したＴｈ１−型免疫反応に関連した抗体の産生を意味する。１又は複数のＴｈ１関連抗体を測定することができる。このようなＴｈ１−型偏向抗体の例は、ヒトIgG1及び／又はIgG3(例えば、Widheら、Scand J. Immunol.、47:575-581 (1998)、及びde Martinoら、Ann. Allergy Asthima Immunol.、83:160-164 (1999))、並びにマウスのIgG2aを含むが、これらに限定されるものではない。対照的に、「Th2-型偏向抗体」は、Th2-型免疫反応に関連したものを意味し、かつヒトIgG2、IgG4及び／又はIgE(例えば、Widheら、(1998)及びde Martinoら、(1999)参照)及びマウスのIgG1及び／又はIgEを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２７１】
ＩＭＰの投与の結果生じるＴｈ１−型偏向サイトカイン誘導は、増強された細胞性免疫反応、例えばNK細胞、細胞傷害性キラー細胞、Ｔｈ１ヘルパー及び記憶細胞により行われるものなどを生じる。これらの反応は、ウイルス、真菌、原生動物寄生体、細菌、アレルギー疾患及び喘息に加え腫瘍に対する予防的又は治療的ワクチンにおける使用に関して特に有益である。
【０２７２】
一部の態様において、Ｔｈ２反応は、抑制される(低下される)。Ｔｈ２反応の抑制は、例えば、Ｔｈ２−関連したサイトカイン、例えばIL-4及びIL-5のレベルの低下、Ｔｈ２−関連抗体のレベルの低下、更にはアレルゲンに反応したIgE低下及びヒスタミン放出の低下により、決定することができる。
【０２７３】
本発明のキット
本発明はキットを提供する。ある態様において、本発明のキットは、一般に本明細書に記載のような、ＩＭＰを含んで成る１又は複数の容器を含んで成る。当該キットは更に、本明細書に記載の方法(例えば、免疫調節、感染症の１又は複数の症候の回復、IFN-γレベルの増加、IFN-αレベルの増加、又はIgE-関連障害の回復)のいずれかのための、ＩＭＰの使用に関する適当な一連の取扱説明書であって、通常は書面による取扱説明書を含んで成ることがある。
【０２７４】
前記キットは、いずれか都合の良い、適当なパッケージに包装されたＩＭＰを含んで成ることがある。例えば、このＩＭＰが、乾燥製剤(例えば、凍結乾燥した又は乾燥散剤)であるならば、弾力性のある密栓のついたバイアルが通常使用され、その結果このＩＭＰは、液体の弾力性のある密栓を通した注入により、容易に再懸濁することができる。弾性のない取り外し可能なクロージャーのついたアンプル(例えば、密封したガラス)又は弾性のある密栓が、ＩＭＰの液体製剤のためには最も都合良く使用される。同じく、吸入器、点鼻投与装置(例えば、アトマイザー)又はミニポンプのような注入装置などの特定の装置と組合せて使用するための包装も意図される。
【０２７５】
ＩＭＰの使用に関連した取扱説明書は、一般に意図された使用法に関する用量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。ＩＭＰの容器は、単位量、バルク包装(例えば、反復投与量包装)又はサブユニット量であってもよい。本発明のキット内に供給された取扱説明書は、典型的にはラベル又は添付文書(例えば、キットに含まれた紙片)に記載された取扱説明書であるが、機械で読取り可能な取扱説明書(例えば、磁気保存ディスク又は光保存ディスク上に保持された取扱説明書)も許容される。
【０２７６】
一部の態様において、前記キットは更に、抗原(又は、１又は複数の抗原)を含み、これはＩＭＰと同じ容器(製剤)中に包装してもしなくともよい。抗原は本願明細書で説明している。
【０２７７】
ある態様において、本発明のキットは、免疫調節ポリヌクレオチド/マイクロキャリア複合体(ＩＭＰ／ＭＣ)の形状でＩＭＰを含んで成り、かつ更には本明細書に記載のいずれかの方法(例えば、免疫調節、感染症の１又は複数の症候の回復、IFN-γレベルの上昇、IFN-αレベルの上昇、又はIgE-関連障害の回復)についてのＩＭＰ／ＭＣ複合体の使用に関する一連の取扱説明書、一般には書面による取扱説明書を備えることができる。
【０２７８】
一部の態様において、ＩＭＰ／ＭＣ複合体を生成するための材料を含む本発明のキットは、一般にＩＭＰ及びＭＣの個別の容器を含むが、ある態様において、予め生成されたＭＣよりもむしろ、ＭＣ生成の材料が供給される。ＩＭＰ及びＭＣは、好ましくは供給されたＩＭＰ及びＭＣの混合時に、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の形成を可能にする形で供給される。この構成は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体が非共有結合により連結された場合に、好ましい。この形態は更に、ＩＭＰ及びＭＣがヘテロ二官能性クロスリンカーにより架橋される場合にも好ましく；ＩＭＰ又はＭＣのいずれかが、「活性化された」形で供給される(例えば、ヘテロ二官能性クロスリンカーに連結され、その結果ＩＭＰと反応性の部分が利用可能である)。
【０２７９】
液相ＭＣを含んで成るＩＭＰ／ＭＣ複合体のキットは、好ましくは液相ＭＣを生成する材料を含む１又は複数の容器を含んで成る。例えば、水中油型乳剤ＭＣのためのＩＭＰ／ＭＣキットは、油相及び水相を含む１又は複数の容器を備えることができる。この容器の内容物は乳化され、ＭＣを生成し、これはその後ＩＭＰ、好ましくは疎水性部分を組み込むように修飾されたＩＭＰと混合することができる。このような材料は、水中油型乳剤の作成のための油及び水、又は凍結乾燥されたリポソーム成分(例えば、リン脂質、コレステロール及び界面活性剤の混合物)の容器に加え、水相(例えば、医薬として許容される水性緩衝液)の容器を含む。幾つかの態様において、本発明のキットは、陽イオン性縮合剤−ＩＭＰ−安定化剤（ＣＩＳ）組成物の形態のＩＭＰを、本明細書に記載のような任意の免疫調節ＣＩＳ粒子組成物を含んで成る１又は複数の容器中に含んで成る。あるいは、当該キットは、本発明のＣＩＳ組成物の成分の容器を含んで成る。この態様の構成は、ＩＭＰ／安定化剤混合物の容器及び陽イオン性縮合剤の容器を有するキット並びにＩＭＰの容器、安定化剤の容器、及び陽イオン性縮合剤の容器を有するキットを含む。当該キットは更に、適当な一連の説明書であって、一般的に書面の説明書であり、本明細書に記載の方法のいずれかについてのＣＩＳ粒子組成物の使用に関するもの（例えば、免疫調節、感染症の１又は複数の症候の回復、IFN-γレベルの上昇、IFN-αレベルの上昇、又はIgE-関連障害の回復）を含んで成ることもある。ＣＩＳ組成物の成分の容器を含んで成るキットの態様は、概して、本明細書に開示されている方法に従い、ＣＩＳ組成物の生成のための説明書を含むであろう。ＣＩＳ組成物及び／又は本発明のＣＩＳ組成物の成分に加え、キットの態様はまた、本明細書に開示されている方法に従い、ＣＩＳ組成物の生成のための説明書及び本明細書に記載の方法のいずれかについての免疫調節ＣＩＳ組成物の使用のための説明書も同封することがある。
【０２８０】
以下の実施例は、限定しないが、本発明を例証するために提供される。
【０２８１】
実施例
実施例１：免疫調節ポリヌクレオチドによるヒト細胞の免疫調節
免疫調節ポリヌクレオチド（ＩＭＰ）又は、免疫調節配列を含まないポリヌクレオチド（5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'（配列番号２））を含むコントロール試料、ＳＡＣ及び培地単独がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する免疫調節活性について試験された。スタンダードの免疫調節ポリヌクレオチドである5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA（配列番号１）も試験された。特に断らない限り、試験したポリヌクレオチドは十分に修飾されたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである。
【０２８２】
末梢血は、ボランティアから、ヘパリン処理した注射器を用い静脈穿刺することにより採取した。血液は、FICOLL（登録商標）(Amersham Pharmacia Biotech社)クッション上に積層し、遠心した。FICOLL（登録商標）境界面に位置したＰＢＭＣを収集し、その後冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)により2回洗浄した。これらの細胞を再懸濁し、かつ４８又は９６ウェルプレートにおいて、10％熱失活ヒトAB血清並びに50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、300μg/mLグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、及び1xMEM非必須アミノ酸(NEAA)を含む、RPMI 1640中で、2x106細胞/mLで培養した。
【０２８３】
前記細胞を、被試験試料（ＩＭＰ又はコントロール）の存在下で０．２〜２０μg/mlに及ぶ量で24時間培養し、その後無細胞培地を各ウェルから収集し、かつIFN-γ及びIFN-α濃度についてアッセイした。IFN-γ及びIFN-αは、BioSource International社のCYTOSCREEN（登録商標）ELISAキットを用い、製造業者の取扱説明書に従いアッセイした。通常、試験試料は４人のヒトのドナー由来のＰＢＭＣで試験した。
【０２８４】
ＩＭＰは、ヒトＰＢＭＣによるIFN-γ及び／又はIFN-α分泌を刺激した。ヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、IFN-γのバックグラウンドレベルは、ドナーごとに、実に有意に変動し得る。しかしIFN-αのような他のサイトカインは、概して活性化の安定したパターンを示し、かつ未刺激条件下で慣習的に低いバックグラウンドレベルを示している。このようなＰＢＭＣによるアッセイ由来の結果の例を表２〜７に要約する。
【０２８５】
用量漸増アッセイにおいて、４人のドナー由来のＰＢＭＣは、０．２〜２０μｇ／ｍｌの上述の配列番号２７で刺激された。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの量は上述の通りアッセイされ、そして４人のドナー由来の結果は平均され、そして平均の結果を表２に提示する。
【０２８６】
【表５】
2006512096.tif 000026
【０２８７】
表２に提示されている結果から分かるように、ＩＦＮ−αの産生を誘導する能力は、ＩＭＰの用量が低下するにつれ増大し、そして用量と共に活性化低下した後、約３〜８μｇ／ｍｌの最適値になった。更なるアッセイがこの結果を追認した。
【０２８８】
４人のドナー由来のＰＢＭＣを２０μｇ／ｍｌのＩＭＰ又はコントロールで刺激し、そしてＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ産生の刺激は上述の通り評価した。ポリヌクレオチドの中でも：
【化２０】
2006512096.tif 000027
が試験された。
【０２８９】
各ドナー由来のＰＢＭＣからのサイトカイン産生の結果を平均し、そして平均の結果を表３に提示する。
【０２９０】
【表６】
2006512096.tif 000028
【表７】
2006512096.tif 000029
【０２９１】
表３に提示するように、ＩＭＰスタンダードである配列番号１よりもＩＦＮ−αの産生を刺激したＩＭＰは、当該ポリヌクレオチドの５’末端又はその付近に少なくともＴＣＧ配列（５’−ＴＣＧ配列）を、そして当該５’−ＴＣＧ配列の隣又はその３塩基以内のいずれかに少なくとも８塩基長のパリンドローム配列を含む。通常、ＩＦＮ−γ産生の刺激はＩＦＮ−α産生の刺激を反映しているが、ＩＦＮ−γ刺激の変動範囲はＩＦＮ−αより少なかった。パリンドローム配列と５’−ＴＣＧとが離れているポリヌクレオチドにおいて、この離れていることが第二のＴＣＧトリヌクレオチド（例えば、配列番号１４を参照のこと）によるものであるか、あるいはそれと重複していることによるものであることがＩＮＦ−αの産生にとって好ましい。上述のように５’−ＴＣＧを含むがパリンドローム配列を含まないＩＭＰは非常に低レベルのＩＦＮ−γを誘導し、そしてＩＦＮ−α産生は誘導しなかった（例えば、配列番号１８及び１１を参照のこと）。６〜８塩基のパリンドロームを含むが５’−ＴＣＧを含まないＩＭＰは、ＩＦＮ−ガンマを誘導したが、ＩＦＮ−αはごく低レベルであった（例えば、配列番号１及び４を参照のこと）。特に、前記ポリヌクレオチドの５’末端から最大３塩基除去されたＴＣＧ及び少なくとも１０塩基長のパリンドローム配列を含むＩＭＰは、５’−ＴＣＧを含まないＩＭＰスタンダードである配列番号１と比較して、特に高レベルのＩＦＮ−αを誘導した（例えば、配列番号２４及び８を参照のこと）。
【０２９２】
ＩＦＮ−α産生の刺激に対するＩＭＰ用量依存性を試験するためにアッセイが実施された。本アッセイで試験されたＩＭＰは、ポリヌクレオチド内のパリンドローム配列の位置及び／又は５’末端の少なくとも１つのＴＣＧ配列の位置が変更された。試験したポリヌクレオチドの中でも、ＣＧジヌクレオチド及び５’−ＴＣＧ配列を有するが、８塩基以上の長さのパリンドローム配列を有さないものは幾つかあった（例えば、配列番号１１；配列番号１８；5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT（配列番号３））。ＣＧジヌクレオチド及び８塩基以上の長さのパリンドローム配列を有するが５’−ＴＣＧトリヌクレオチドを有さないポリヌクレオチドも試験した（例えば、配列番号１；配列番号４；5'- ATCATCTCGAACGTTCGACGA（配列番号２９）；5'- AACGTTCGAACGTTCGAACGTTT（配列番号６７）；5'-TCAACGTTCGAACGTTCGAACGTT（配列番号６８）；5'-GACGATCGTCGACGATCGTC（配列番号８５））。４人のドナー由来のＰＢＭＣは、０．８、４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰ又はコントロールで刺激した。ＩＦＮ−α産生の刺激は上述のとおり評価し、そして４人のドナー由来の平均した結果を表４にて報告する。
【０２９３】
【表８】
2006512096.tif 000030
【表９】
2006512096.tif 000031
【０２９４】
表４に提示した結果は、少なくとも８塩基長の長さのパリンドローム配列及びポリヌクレオチドの５’末端又はその付近の少なくとも１つのＴＣＧ配列がヒトＰＢＭＣ由来ＩＦＮ−αの刺激にとって重要であることを支持している。
【０２９５】
ＩＦＮ−α産生の刺激に対するＩＭＰ用量依存性を試験するための別のアッセイが実施された。本アッセイで試験したＩＭＰは、ポリヌクレオチドにおけるＣＧジヌクレオチド及び５’−ＴＣＧ配列の存在について変更した。試験したポリヌクレオチドの中でも、パリンドローム配列を有するが、ＣＧジヌクレオチドを有さず（例えば、配列番号２；5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA（配列番号９０）、5'-TCAGTCAGTCAGCTGACTGACTGA（配列番号９６））、そして／あるいは5'-TCG配列（例えば、配列番号１、９０、９６；5'-ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG（配列番号９２）、5'-AACAACAACGTTGTTGTT（配列番号９５）、5'-ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG（配列番号２５）、5'- AACAACAACGTTGTTGTT（配列番号９４）)を有さないものが幾つかあった。更に本アッセイで試験したものには、ポリヌクレオチド5'-TCGTTGCAAGCTTGCAACGA（配列番号９１）があった。ＩＭＰのうち幾つかは、リン酸バックボーン組成を変更した。３人のドナー由来のＰＢＭＣは、０．８、４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰ又はコントロールのいずれかで刺激した。ＩＦＮ−α産生の刺激は、上述のとおり３人のドナー由来のＰＢＭＣを落ちいて評価し、そして３人のドナーについての平均した結果を表５にて報告する。
【０２９６】
【表１０】
2006512096.tif 000032
【表１１】
2006512096.tif 000033
【０２９７】
表５に提示した結果から分かるように、高度に活性な配列である配列番号４２のＣＧジヌクレオチドのＧＣジヌクレオチドへの反転は、ＩＦＮ−αを誘導する配列番号９０の能力を不能にする。同様に、ＣＧジヌクレオチドを有さない配列番号９６のパリンドロームポリヌクレオチドも不活性である。
【０２９８】
表５で分かるように、２つの代表的なホスホジエステルポリヌクレオチド、配列番号２５及び配列番号９４、並びにそれらの十分に修飾されたホスホロチオエート版、配列番号９２及び配列番号９５はそれぞれ、ヒトＰＢＭＣからＩＦＮ−αを誘導するのに活性ではなかった。配列番号２５及び９２は複数のＣＧジヌクレオチドを含むとともにモチーフＡＡＣＧＴＴを含むが、それらはＴＣＧ又は少なくとも８塩基のパリンドローム配列を含まない。配列番号９４及び９５は１８塩基のパリンドロームであり、且つ１つのＣＧジヌクレオチドを含むが、ＴＣＧトリヌクレオチドを含まない。従って、これらのポリヌクレオチドは本明細書に記載のモチーフに適合しない。
【０２９９】
配列番号２６，３０，３２，及び３３であって、全てのホスホロチオエート結合を含むもの（配列番号３０及び３２）又はキメラホスホロチオエート／ホスホジエステル結合を含むもの（配列番号２６及び３３）は、ヒトＰＢＭＣから大量のＩＦＮ−αを誘導した。配列番号３４（キメラホスホロチオエート／ホスホロジエステル結合を含むもの）及び９３（全ホスホロチオエート結合）は共に、ヒトＰＢＭＣからＩＦＮ−αを誘導した。
【０３００】
ＩＦＮ−αの刺激に対するパリンドローム配列の長さの効果を試験するアッセイにおいて、４人のドナー由来のＰＢＭＣは、２μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰあるいはコントロールのいずれかで刺激され、ＩＦＮ−α産生の刺激は上述のように評価され、そして平均した結果を表６にて報告する。ポリヌクレオチドの中でも5'-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG（配列番号２０）及び5'-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG（配列番号１９）が試験された。
【０３０１】
【表１２】
2006512096.tif 000034
【０３０２】
表６に提示する結果は、少なくとも８塩基の長さのパリンドローム配列及びポリヌクレオチドの５’末端又はその付近の少なくとも１つのＴＣＧ配列の、ヒトＰＢＭＣ由来ＩＦＮ−αの刺激のための重要性を支持している。
【０３０３】
種々の１２塩基のパリンドロームを有するＩＭＰのＩＦＮ−α刺激活性を試験するアッセイにおいて、４人のドナー由来のＰＢＭＣが０．８，４又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰ又はコントロールで刺激され、ＩＦＮ−α産生の刺激は上述のとおり評価され、そして平均した結果を表７にて報告する。
【０３０４】
【表１３】
2006512096.tif 000035
【表１４】
2006512096.tif 000036
【０３０５】
表７にて提示した結果は、１２塩基のパリンドロームを有する、試験したＩＭＰのうちいずれかがヒトＰＭＢＣ由来のＩＮＦ−αを刺激するのに活性であったことを示唆している。これらのＩＭＰは、配列TCGX1X2CGX2'X1'CGA（配列番号１９８）（ここで、ＣＧＣＧ、ＣＣＧＧ及びＧＣＧＣの流れは別として、Ｘ1及びＸ2についてのヌクレオチドの制限はなく、これらは免疫刺激配列又は免疫中和(immuneneutralizing)配列として既述されている(Krieg et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636)。例えば、配列番号４９及び５０はＩＦＮ−αを刺激するのに活性であり、且つ配列ＣＧＣＧを含む。配列番号４９は上述の配列番号１６１を含む免疫調節ポリヌクレオチドを例示する。配列番号５０は上述の配列番号１６２を含む免疫調節ポリヌクレオチドを例示する。
【０３０６】
より長いパリンドロームを有するＩＭＰほど、特に少量のＩＭＰ量で、ヒトＰＢＭＣからより高レベルのＩＦＮ−αを誘導した。図１に示すアッセイの結果で分かるように、配列番号１７２に反応して細胞から産生されたＩＦＮ−αの量は、０．４μｇ／ｍｌの用量のＩＭＰで配列番号１１３、配列番号２７及び配列番号１よりも有意に高かった。また、配列番号１７２に反応して産生されたＩＦＮ−αの量は、０．８μｇ／ｍｌのＩＭＰの用量で配列番号２７及び配列番号１よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。ＩＭＰのパリンドロームの長さは、配列番号１７２において２８塩基、配列番号１１３において２２塩基、配列番号２７において１２塩基、そして配列番号１において８塩基である。
【０３０７】
別のアッセイにおいて、全体のＩＭＰの長さ及びＩＭＰのパリンドロームの長さがヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α産生の誘導について比較された。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号１、配列番号２、配列番号１２、配列番号２７、
【化２１】
2006512096.tif 000037
が試験された。４人のドナー由来のＰＢＭＣが０．８，４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰあるいはコントロールで刺激され、そしてＩＦＮ−αの産生の結果は上述のとおり評価した。４人のドナーについての各ＩＭＰ濃度での平均した結果を表８にて報告する。
【０３０８】
【表１５】
2006512096.tif 000038
【０３０９】
表８にて提示した結果は、試験したポリヌクレオチドについて、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α産生を刺激するためのポリヌクレオチドの最小の全長は約１２塩基であって、約１０塩基の長さのパリンドロームを有するものであることを示唆している。従って、より高レベルのＩＦＮ−αの産生が望まれる一部の態様において、ＩＭＰは少なくとも以下の長さ（塩基長）：１０，１２，１４，１６，１８２０，２２，２４，２６，２８又は３０の少なくとも１つのパリンドローム配列を含み、そして態様によっては、ＩＭＰは３０塩基超の長さを有する少なくとも１つのパリンドローム配列を含む。
【０３１０】
別のアッセイにおいて、３人のドナー由来のＰＢＭＣは０．８，４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰ又はコントロールで刺激された。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−ω産生の刺激は上述のとおり評価された。ＩＦＮ−ωはPBL Biomedical LaboratoriesのＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイされ、そしてＩＦＮ−ωの検出の下限及び上限はそれぞれ４８ｐｇ／ｍｌ及び６０００ｐｇ／ｍｌであった。ＩＦＮ−βはBioSourceのＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイされ、検出の上限及び下限はそれぞれ１２ＩＵ／ｍｌ及び３０４６ＩＵ／ｍｌであった。各ＩＭＰ濃度での３人のドナーについての平均の結果を表９にて報告する。
【０３１１】
【表１６】
2006512096.tif 000039
【０３１２】
表９で分かるように、本発明のＩＭＰは、ＩＦＮ−αの産生と同様、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−ωの産生を刺激する。上述のアッセイにおいて、ＩＦＮ−βは検出されなかった。
【０３１３】
別のアッセイにおいて、ポリヌクレオチドの二重鎖の形態が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α産生の誘導について二重鎖でない形態と比較された。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号１、配列番号、配列番号９０、配列番号２７、及び5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA（配列番号１８２−配列番号２７と配列番号２９の二重鎖）が試験された。３人のドナー由来のＰＢＭＣは、０．４，０．８，４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰあるいはコントロールで刺激され、そしてＩＦＮ−αの産生の結果は上述のとおり評価した。前記二重鎖は、同一の合計量のポリヌクレオチドを用いて一本の配列と比較された（例えば、４μｇ／ｍｌの配列番号２７は、２μｇ／ｍｌの配列番号２７及び２μｇ／ｍｌの配列番号２９を含む４μｇ／ｍｌの二重鎖の配列番号１８２と比較された）。各濃度での３人のドナーについての平均の結果を表１０にて報告する。
【０３１４】
【表１７】
2006512096.tif 000040
【０３１５】
表１０にて分かるように、配列番号２７の二重鎖の形態の配列番号１８２は、より少量のＩＭＰ量でＩＦＮ−α産生を刺激するのに、配列番号２７よりも活性である。より多くの量では（４及び２０μｇ／ｍｌ）、配列番号２７は、ややより刺激的であった。
【０３１６】
別のアッセイにおいて、修飾塩基を含むポリヌクレオチドと修飾塩基を有さないポリヌクレオチドは、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α産生の誘導について比較された。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号１、配列番号２、5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT（配列番号２７）及び 5'-TCXTCXAACXTTCXAGATGAT（Ｘ＝７−デアザ−ｄＧである。配列番号１９３）が試験された。配列番号２７と配列番号１９３は、配列番号２７の４個のｄＧがデアザ−ｄＧに置換されていることを除き、同一のヌクレオチド配列を有する。４人のドナー由来のＰＢＭＣが０．８，４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰあるいはコントロールで刺激され、そしてＩＦＮ−α産生の結果は上述のとおり評価された。各ＩＭＰ濃度での４人のドナーについての平均の結果を表１１にて報告する。
【０３１７】
【表１８】
2006512096.tif 000041
【０３１８】
表１１で分かるように、配列番号１９３は、０．８μｇ／ｍｌの量を除き、配列番号２７に匹敵するＩＦＮ−α刺激活性を有する。
【０３１９】
修飾塩基を含むポリヌクレオチドの一本鎖及び二本鎖の形態は、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α産生の誘導における活性についてアッセイされた。ポリヌクレオチドの中でも、一本鎖及び二本鎖の配列番号１、一本鎖の配列番号２、一本鎖の配列番号２９．一本鎖及び二本鎖の配列番号２７、一本鎖及び二本鎖の配列番号１８７、一本鎖及び二本鎖の配列番号１８８、一本鎖及び二本鎖の配列番号１８９、一本鎖及び二本鎖の配列番号１９０、一本鎖の配列番号１９４、並びに一本鎖の配列番号１９７が試験された。配列番号１８７，１８８，１８９，１９０，１９４及び１９７は、注記する置換を除き、配列番号２７と同一のヌクレオチド配列を有する：5'-TCGTCGAA*CGT*TCGAGATGAT (A* = ２−アミノ−ｄＡ；T* =２−チオ−ｄＴ）（配列番号１８９）；
5'-TCGTCGA*A*CGT*T*CGAGATGAT (A* = ２−アミノ−ｄＡ；T*=２−チオ−ｄＴ)（配列番号１９０）；
5'-TCG*TCG*AACG*TTCG*AG*ATG*AT (G* = 7−デアザ−８−アザ−ｄＧ）（配列番号１８７）；
5'-TCG*AACG*TTCG*AACG*TTCG*AACG*TT (G* =７−デアザ−８−アザ−ｄＧ）（配列番号１９４）；
5'-TCGTCGA*A*CGTTCGA*GA*TGA*T (A* =２−アミノ−ｄＡ）（配列番号１８８）；
5'-TCGA*A*CGTTCGA*A*CGTTCGA*A*CGTT (A* =２−アミノ−ｄＡ）（配列番号１９７）。
【０３２０】
８人のドナー由来のＰＢＭＣは、０．２，０．４，０．８，１．６，４．０又は８μｇ／ｍｌのＩＭＰあるいはコントロールで様々に刺激され、そしてＩＦＮ−α産生の結果は上述のとおり評価された。二重鎖は、同一の合計量のポリヌクレオチドを用いて一本の配列と比較された（例えば、４μｇ／ｍｌの配列番号２７は、２μｇ／ｍｌの配列番号２７及び２μｇ／ｍｌの配列番号２９を含む４μｇ／ｍｌの二重鎖の配列番号１８２と比較された）。各濃度での８人のドナーについての平均の結果を表１２にて報告する。
【０３２１】
【表１９】
2006512096.tif 000042
【０３２２】
表１２で分かるように、ＩＭＰにおける幾つかの修飾塩基の使用は、ＩＦＮ−α刺激活性を有するポリヌクレオチドをもたらすことがある。１８３を除き、これらの結果はまた、相補配列との二重鎖ポリヌクレオチドの形成は、ＩＦＮ−α産生の刺激について、特により少量で、高度に活性なＩＭＰをもたらす。それら自身で二重鎖を形成し得ないポリヌクレオチド、例えば配列番号１８９と１９０はわずかにＩＦＮ−αを誘導し、一方、より長い配列（例えば、配列番号１７２、２８塩基のパリンドロームを有する３０量体）及び二重鎖の配列番号１８２は、より多くのＩＦＮ−αを、配列番号２７及び２８塩基未満の長さのパリンドロームを有する他のＩＭＰよりも少量（例えば、０．４及び０．８μｇ／ｍｌ）で誘導した。本明細書で論じたように、幾つかの修飾塩基は形成した二重鎖の安定性を増大させうる。
【０３２３】
実施例２．免疫調節ポリヌクレオチドによるヒトＢ細胞の活性化
ヒトＢ細胞を活性化させるＩＭＰの能力は、ＩＭＰとのインキュベーションに応じてのＢ細胞の増殖及びＩＬ−６産生を測定することにより決定した。ヒトＰＢＭＣは、ＣＤ１９ＭＡＣＳビーズ（Miltenyi Biotec)とインキュベートし、そしてマグネットを通過させ、ポジティブ選択を通じてＣＤ１９+Ｂ細胞を分離した（ＦＡＣＳで決定した場合９８％超のＣＤ１９+）。増殖アッセイのために、Ｂ細胞を９６ウェルの丸底プレート内で１ｘ１０5／ウェル（５ｘ１０5／ｍｌ）に培養した。細胞を３つ一組で、２μｇ／ｍｌＩＭＰ又はコントロールと一緒に７２時間インキュベートした。培養期間の終了時、プレートを3Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル、Amersham）でパルスラベルし、そして更に８時間インキュベートした。プレートを続いて回収し、そして標準的な液体シンチレーション技術を用いて放射能の取り込みを決定し、そしてデータを秒当たりカウント（ｃｐｍ）で回収した。ＩＬ−６分泌については、Ｂ細胞を４８ウェルプレート中５μｇ／ｍｌＩＭＰ又はコントロールを含む０．５〜１ｘ１０6／ウェルで培養し、そしてＣｙｔｏＳｅｔ抗体対とともにＥＬＩＳＡを用いて、取扱説明書（BioSource）に従いＩＬ−６についてアッセイした。最大／最小検出限界は４０００／２ｐｇ／ｍｌであった。
【０３２４】
表１３に提示したＢ細胞増殖アッセイの結果は、各ドナー由来の細胞についての３つ一組の細胞増殖のｃｐｍ値の平均及び全ドナーのｃｐｍの平均である。表１３に提示するＢ細胞ＩＬ−６アッセイの結果は、各ドナーの細胞から産生したＩＬ−６の量及び全ドナーの平均値である。
【０３２５】
【表２０】
2006512096.tif 000043
【０３２６】
表１３に提示した結果から、ＣＧジヌクレオチを含む化合物はＢ細胞の増殖及びＩＬ−６の産生を誘導した。表９に提示した結果から分かるように、免疫調節ポリヌクレオチドにおける良好なＢ細胞刺激活性はＣＧジヌクレオチドの存在に依存するが、高度なＩＦＮ−α誘導のためには本明細書に記載のより特化したモチーフを必要とすることはないようである。
【０３２７】
別のアッセイにおいて、ポリヌクレオチドの二重鎖の形態は、Ｂ細胞の活性化について二重鎖でない形態と比較された。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号１、配列番号９０、配列番号２７、及び配列番号１８２−配列番号２７と配列番号２９の二重鎖が試験された。３人のドナー由来のＢ細胞は、１．０又は５．０μｇ／ｍｌのＩＭＰ又はコントロールでそれぞれ刺激され、そして細胞増殖及びＩＬ−６産生の結果は上述の通り評価された。各ＩＭＰ濃度での３人のドナーについての平均の結果を表１４にて報告する。
【０３２８】
【表２１】
2006512096.tif 000044
【０３２９】
表１４に提示した結果から、配列番号２７の二重鎖の形態の配列番号１８２は、ＩＬ−６産生及び細胞増殖を刺激することで測定されるＢ細胞の活性化において配列番号２７とほぼ同等である。
【０３３０】
実施例３：免疫調節ポリヌクレオチドによるマウス細胞の免疫調節
免疫調節ポリヌクレオチド又はコントロールポリヌクレオチドは、マウス脾細胞に対する免疫調節活性についてアッセイされた。試験したポリヌクレオチドは、十分に修飾されたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドであった。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号１（ポジティブコントロール）及び配列番号２（ネガティブコントロール）を試験した。
【０３３１】
BALB/cマウス脾臓の断片を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したコラゲナーゼ/ジスパーゼ(0.1U/mL/0.8U/mL)で、37℃で45分間消化し、その後消化した断片を強制的に金属スクリーンを通すことにより、機械的に分散した。分散した脾細胞は、遠心によりペレット化し、その後新鮮な培地中に再懸濁した(10％ウシ胎仔血清に加え、50ユニット/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mMグルタミン、及び0.05mMβ-メルカプトエタノールを含むRPMI 1640)。
【０３３２】
マウス脾細胞を、96ウェルプレートのウェルに分注し(7x107細胞/ml)、37℃で1時間インキュベーションした。100μLの2x濃度の試験試料及びコントロールを添加し、これらの細胞を更に２４時間インキュベーションした。各試験試料又はコントロールは２つ一組で試験した。培地を各ウェルから収集し、そして試験する前に−８０℃で凍結させた。収集した培地を融解させ、そしてサイトカイン濃度についてＥＬＩＳＡで試験した。ポリヌクレオチドは、5.0、1.0及び0.1μg/mlを含む様々な濃度で試験した。ポリヌクレオチドの中でも、5'-TGACTGTGAACGTTCGAAATGA（配列番号３６）及び5'-TGACTGTGAACGTTCGAAGTGA（配列番号３７）を試験した。コントロール試料には、培地単独及びPANSORBIN（登録商標）加熱殺菌ホルマリン固定したスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)(SAC)(CalBiochem社)を含めた。
【０３３３】
ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γはサンドウィッチフォーマットのＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。マウス脾細胞アッセイ由来の培地は、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０又は抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体(Nunc)でコーティングしたマイクロタイタープレート中でインキュベートした。結合したサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２又はＩＦＮ−γ）は、ビオチン化した抗サイトカイン抗体（抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０又は抗ＩＦＮ−γ）及びストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合二次抗体を用いて検出し、色素生産性ペルオキシダーゼ基質である３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いてペルオキシダーゼの存在下発色させ、そして450ｎｍでの吸光度をEmax精密マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社)を用いて測定することにより定量した。４５ｐｇ／ｍｌ未満のＩＬ−６の値は４５ｐｇ／ｍｌの値が割り当てられた（すなわち、４５＝＜４５）。３６ｐｇ／ｍｌ未満のＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０の値は３６ｐｇ／ｍｌの値が割り当てられた（すなわち、３６＝＜３６）。５４ｐｇ／ｍｌ未満のＩＦＮ−γの値は５４ｐｇ／ｍｌの値が割り当てられた（すなわち、５４＝＜５４）。
【０３３４】
表１５及び１６は、ＩＭＰによるサイトカイン産生についてのアッセイの結果を要約する。ＣＧジヌクレオチドを含む免疫調節ポリヌクレオチドは、概して、高度なＩＦＮ−α誘導ために本明細書に記載したより特化したモチーフの存在とは無関係に、マウス脾細胞によるＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γを刺激した。
【０３３５】
【表２２】
2006512096.tif 000045
【表２３】
2006512096.tif 000046
【表２４】
2006512096.tif 000047
【０３３６】
【表２５】
2006512096.tif 000048
【表２６】
2006512096.tif 000049
【表２７】
2006512096.tif 000050
【０３３７】
表１５及び１６に提示した結果から、ＣｐＧモチーフを含む全ての化合物が、マウス脾細胞からのＩＬ−１２の産生を誘導し、そして全部ではないがその大部分のＣｐＧモチーフ含有化合物がマウス脾細胞からのＩＬ−６及びＩＦＮ−γの産生を誘導した。表１５及び１６に提示した結果から分かるように、マウス脾細胞に対する免疫調節ポリヌクレオチドのＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ刺激活性は概してＣＧジヌクレオチドの存在に依存するが、高度のＩＦＮ−α誘導のためには、本明細書に記載のより特化したモチーフを必要としないようである。
【０３３８】
実施例４：免疫調節ポリヌクレオチドによるインターフェロン誘導遺伝子発現の刺激
本明細書で証明するとおり、免疫調節ポリヌクレオチドはＰＢＭＣからＩＦＮ−γ及び／又はＩＦＮ−αの産生を誘導しうる。ＩＭＰは、追加のサイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子及び他の遺伝子のｍＲＮＡ発現を誘導するために、定量ＰＣＲ技術、ＴａｑＭａｎ技術を用いて、ヒトＰＢＭＣ上での活性についてアッセイされた。試験したポリヌクレオチドは、十分に修飾されたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号（ポジティブコントロール）及び配列番号２（ネガティブコントロール）を試験した。
【０３３９】
ヒトＰＢＭＣは実施例１に記載のとおりに調製した。細胞を試験試料（ＩＭＰ又はコントロール）の存在下５μｇ／ｍｌで２４時間培養した。全ＲＮＡをQiagen RNeasy Mini Protocol (Qiagen)を用いて抽出し、そしてオリゴｄＴ(Promega)、ランダムヘキサマー(Promega)、及びSuperScript RT II (Invitrogen)を用いてｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを１：１０に希釈し、そしてQuantiTect SYBR green PCR master mix (Qiagen)及びネイキッドプライマー(Operonで合成)又はQuantiTect probe PCR master mix (Qiagen)及びプローブで標識したPDARプライマー(Applied BioSystems).のいずれかを用いてＰＣＲを実施した。反応はGeneAmp5700 Sequence Detector (PE BioSystems)を用いて実施した。
【０３４０】
合成プライマーの配列の例は以下の通りである（５’から３’へと列記する）：
【化２２】
2006512096.tif 000051
【０３４１】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−３、及びＭＩＰ−３βは、PE BioSystemsが提供するＰＤＡＲを用いて測定した。各遺伝子の閾値のサイクル（ＣT）値は式１．８(UBQ-GENE)（１００，０００）（ここで、ＵＢＱは３つ一組のユビキチンのランの平均ＣTであり、ＧＥＮＥは注目の遺伝子の２回一組のランの平均ＣTであり、且つ１００，０００は全ての値を０超にするための因子として任意に選択される。各実験のネガティブコントロールとしての培地のみでの刺激は１の値を割り当てられ、そして全てのデータはネガティブコントロールに対する誘導の倍数として表現する。
【０３４２】
表１７は、ＩＭＰの配列番号２７に応じた、ＰＢＭＣに由来するサイトカイン、ケモカイン及び炎症タンパク質遺伝子の発現についてのアッセイの結果を要約する。ポリペプチド5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGG（配列番号１５４）も試験した。データは、培地のコントロール（１．０の値を付す）に対する誘導の倍数の平均としてＳＥＭとともに示す。
【０３４３】
【表２８】
2006512096.tif 000052
【０３４４】
表１７に示すとおり、配列番号２７は、ケモカインＩＰ−１０、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＩＧ、及びＭＩＰ−３βの発現を強力に誘導した。ＩＬ−１αの発現は配列番号２７の存在で低下した。更に、配列番号２７は、ＩＦＮ−α誘導遺伝子２，５−オリゴアデニル酸合成酵素（２，５−ＯＡＳ）、インターフェロン刺激遺伝子−５４Ｋ（ＩＳＧ−５４Ｋ）及びグアニル酸結合タンパク質−１（ＧＢＰ−１）の発現を著しく増大させた。
【０３４５】
これらのアッセイにおいて、配列番号２７のＩＭＰは、ケモカインＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、又はケモカインＢＣＡ−１、ＩＬ−８、ＬＰＴＮ、ＭＣＰ−１、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＭＩＰ−３ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＡＲＣの発現ｍＲＮＡレベルに対して有意な効果を有さなかった。
【０３４６】
実施例５：免疫調節ポリヌクレオチドによるＮＫ細胞溶解活性の刺激
本発明のＩＭＰは、ＩＭＰのスタンダードと比較して向上したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性を刺激する。ＮＫ細胞溶解活性は、Ｋ５６２標的細胞の溶解を介してアッセイした。要約すると、ＰＢＭＣは、１０ｍｇ／ｍｌのＩＭＰ（予め求めた至適量）又はネガティブコントロールポリペプチドで４８時間培養液中で刺激した。処理したＰＢＭＣは、続いて、一定の範囲のエフェクター：標的比で、51Ｃｒを添加したＫ５６２腫瘍標的細胞と４時間共培養した。細胞溶解時に放出された51Ｃｒは、ＴｏｐＣｏｕｎｔＮＸＴシンチレーションカウンター(Packard)で測定し、そして秒当たりカウント（ｃｐｍ）で記録した。
【０３４７】
２人の異なるＰＢＭＣドナー由来のＮＫ細胞刺激の結果を図２に示す。アッセイに使用したＩＭＰは、配列番号１、配列番号９０、配列番号２７、配列番号１７２及び配列番号１１３である。ＩＭＰのパリンドロームの長さは、配列番号１７２が２８塩基、配列番号１１３が２２塩基、配列番号２７が１２塩基、そして配列番号１が８塩基である。ＩＭＰでないコントロールの配列番号９０は、２０塩基の長さのパリンドロームを有するが、５’−Ｃ，Ｇ−３’配列を含む。この実験において、１２塩基以上の長さのパリンドロームを有するＩＭＰは、８塩基の長さのパリンドロームを有するＩＭＰスタンダードである配列番号１と比較して、増大した規模にまでＮＫ細胞溶解活性を刺激した。
【０３４８】
本発明は、明確性及び理解を目的として例示及び実施例によりやや詳細に説明しているが、当業者にとっては、若干の変更及び修飾が実施されうることは自明であろう。従って、説明及び実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０３４９】
【図１】図１は、４つの異なるＩＭＰ：配列番号１，２７，１１３及び１７２の量の変化に応じてヒトＰＢＭＣから産生されたＩＦＮ−αの量（ｐｇ／ｍｌ）を表すグラフである。
【図２】図２は、ＩＭＰで刺激されたＮＫ細胞溶解活性を表すグラフを含む。
【図１】
2006512096.tif 000053
【図２】
2006512096.tif 000054
【配列表】
2006512096000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月9日(2005.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
ＩＭＰは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであってもく、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡあるいは他の修飾されたポリヌクレオチドも同様である。態様によっては、ＩＭＰは以下の二本鎖配列：
【化１】
2006512096.tif 000055
を含んで成る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
５’−ＤＭＴ−Ｎ３−（ｔＢｕ−ＳＳ−エチル）チミジン−３’−ホスホラミダイト（「Ｔ*」）が架橋のために組み込まれうるポリヌクレオチド配列の例には、以下のものが含まれる。配列番号２７アナログ（5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT*-3', 配列番号１８５）の３’末端及び配列番号２９アナログ（5'-T*TCATCTCGAACGTTCGACGA-3', 配列番号１８６）の５’末端にＴ*を組み込むことで、配列番号２７アナログの３’末端に２つの鎖の二重鎖が架橋するであろう。配列番号１１３アナログの２つの位置にＴ*を組み込むことで、２つの架橋が二重鎖を形成し、あるいは単一の架橋を形成し、ヘアピン型が維持されるであろう。例えば、配列5'-TCGT*AACGTTCGAACGTTCGAACGTTT*-3 （配列番号２２７)のヘアピン構造への折り畳み及び置換されたＴ残基における架橋の形成は、以下の二次構造を有する架橋ポリヌクレオチドをもたらすであろう。
【化２】
2006512096.tif 000056
前記配列のそのようなヘアピン構造又は二重鎖構造は、遊離の５’−ＴＣＧを有するが、２つの位置（３’末端及び５’−末端から４塩基）に拘束されるであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
好ましい陽イオン性縮合剤には：（ａ）膜破壊陽イオン性リポペプチド、例えば、限定しないが、ポリミキシン、例えば、ポリミキシンＡ、ポリミキシンＢ（例えばポリミキシンＢ1及びポリミキシンＢ2）、ポリミキシンＣ、ポリミキシンＤ、ポリミキシンＥ（コリスチンとしても知られている）、ポリミキシンＫ、ポリミキシンＭ、ポリミキシンＰ、ポリミキシンＳ及びポリミキシンＴ、サークリン、例えばサークリンＡ、サークリンＢ、サークリンＣ、サークリンＤ、サークリンＥ及びサークリンＦ、オクタペプチン、アンホテリシン、例えばアンホテリシンＢ、及びアシル化ペプチド、例えばオクタノイル−ＫＦＦＫＦＦＫＦＦ（配列番号１８２）及びアシルＫＡＬＡ（オクタノイル−ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＥＡＣＥＡ（配列番号１８３）；（ｂ）膜破壊陽イオン性ペプチド、例えば、限定しないがポリミキシンＢノナペプチド、セクロピン、例えばセクロピンＡ、セクロピンＢ及びセクロピンＰ１、ＫＦＦＫＦＦＫＦＦ（配列番号１８２）及びＫＡＬＡ（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号１８４））；（ｃ）一本鎖陽イオン性界面活性剤、例えば、限定しないがセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ベンジルジメチル−アンモニウムブロミド（ＢＤＡＢ）、ＣｐｙｒＢ（セチル−ピリジニウムブロミド）、ＣｉｍＢ（セチルイミダゾリウムブロミド）、及びポリカチオンポリマー、例えば、限定しないがポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、を含む。態様によっては、陽イオン性縮合剤は膜破壊陽イオン性リポペプチド、好ましくはポリミキシン、更に好ましくはポリミキシンＢである。態様によっては、陽イオン性縮合剤として、脂肪酸エステル（すなわち脂質）及び二本鎖陽イオン性界面活性剤が除かれることがある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１３】
別のアッセイにおいて、ポリヌクレオチドの二重鎖の形態が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α産生の誘導について二重鎖でない形態と比較された。ポリヌクレオチドの中でも、配列番号１、配列番号、配列番号９０、配列番号２７、及び5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA（配列番号２７と配列番号２９の二重鎖）が試験された。３人のドナー由来のＰＢＭＣは、０．４，０．８，４．０又は２０μｇ／ｍｌのＩＭＰあるいはコントロールで刺激され、そしてＩＦＮ−αの産生の結果は上述のとおり評価した。前記二重鎖は、同一の合計量のポリヌクレオチドを用いて一本の配列と比較された（例えば、４μｇ／ｍｌの配列番号２７は、２μｇ／ｍｌの配列番号２７及び２μｇ／ｍｌの配列番号２９を含む４μｇ／ｍｌの二重鎖と比較された）。各濃度での３人のドナーについての平均の結果を表１０にて報告する。
【国際調査報告】
2006512096.tif 000057
2006512096.tif 000058
2006512096.tif 000059
2006512096.tif 000060