(57)【要約】極めて小サンプル体積の検査を本発明で達成させられ得る。アレイを形成する複数のドメインが上に配置されたプローブが提供され、これは、好適にはナノアレイである。さらに分子及び分子間相互作用現象を検出する方法が提供され、被検物を回収し、分析し、また本発明のプローブを使用して細胞又は組織に物質を送達する。
2006512583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブを含むサンプルの分析装置であって、前記プローブの上に複数のドメインが配置され、かつ前記ドメインが、アレイを形成していることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記アレイが、ナノアレイである請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記ドメインが、薬物、薬物候補、化学基、脂質、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド種、炭水化物及びその組み合わせから成る群から選択される１種以上の生体分子を含む請求項１記載の装置。
【請求項４】
１種以上の前記ドメインと動作可能な状態で結合されているナノセンサーをさらに含む請求項１記載の装置。
【請求項５】
前記プローブが、マイクロカンチレバーを含む請求項１記載の装置。
【請求項６】
前記プローブが、二重要素プローブである請求項１記載の装置。
【請求項７】
前記プローブが、多重要素プローブである請求項１記載の装置。
【請求項８】
前記サンプルが、約５０フェムトリットル〜約１０マイクロリットルの体積からなる請求項１記載の装置。
【請求項９】
前記プローブ上に配置された少なくとも１種のマイクロディスラプターをさらに含む請求項１記載の装置。
【請求項１０】
少なくとも１種のマイクロディスラプターが、先端部又は先細部材を含む請求項９記載の装置。
【請求項１１】
前記プローブが、少なくとも１種の疎水性領域をさらに含む請求項１記載の装置。
【請求項１２】
前記プローブと動作可能な状態で結合された分子検出装置をさらに含む請求項１記載の装置。
【請求項１３】
前記分子検出装置が、走査トンネル顕微鏡、原子間力顕微鏡、質量分析計、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、ラマン分光計、赤外分光計、紫外分光計、電子系、電気化学系、光学系、磁気及び電磁気系、又は質量測定系である請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
分子間相互作用現象の検出方法であって、以下の工程、
（１）アレイで配置された複数のドメインを有するプローブとサンプルとを接触させる工程、
（２）インキュベーション期間を提供する工程、
（３）前記ドメインから非結合分子を洗浄する工程、及び
（４）分子間相互作用現象を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、少なくとも１種の細胞を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、少なくとも１種の細胞溶解物を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の１種以上の分子を検出する方法であって、以下の工程、
（１）前記サンプルを、複数のドメインが上に配置されたプローブと接触させる工程であって、前記ドメインが、アレイを形成し、また前記ドメインが、動作可能な状態で１種以上のナノセンサーに結合されている工程、及び
（２）１種以上の分子と１種以上のドメインとの結合を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
１種以上の細胞中の被検物を分析する方法であって、以下の工程、
（１）細胞をプローブ上に配置されたマイクロディスラプターで破壊させる工程であって、前記プローブが、その上に配置された複数のドメインを有し、また前記ドメインが、ナノアレイを形成する工程、
（２）細胞膜にナノアレイを通過させて、前記ナノアレイを細胞内空間に接触させる工程、及び
（３）１種以上の被検物とナノアレイとの結合を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記プローブを核膜に通過させ、前記ナノアレイを、核内空間に接触させる工程をさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブを亜細胞種に挿入する工程をさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記亜細胞種が、ゴルジ複合体、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、脂質ラフト及び細胞骨格系からなる群から選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種の被検物をサンプルから回収する方法であって、以下の工程、
（１）前記サンプルを、上に配置された複数のドメインを有するプローブと接触させる工程であって、前記ドメインが、アレイを形成する工程、及び
（２）前記分子ドメインから少なくとも１種の被検物を回収する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
少なくとも１種の物質を細胞に送達する方法であって、以下の工程、
（１）少なくとも１種の物質を、複数のドメインが上に配置されたプローブに可逆的に付着させる工程であって、前記ドメインがアレイを形成する工程、
（２）前記プローブを細胞膜に通して、細胞内空間を通過させる工程、及び
（３）少なくとも１種の物質を細胞内空間に放出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
少なくとも１種の物質をプローブに可逆的に付着させる方法であって、前記物質を前記ドメインに接触させて、結合現象を生じさせる請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１種の物質が、DNA、RNA、ペプチド種、化学種、薬物又は反応性種である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
可逆的付着が、少なくとも１種の物質を、少なくとも１種のドメインに、プロテアーゼ基質、光分解可能なテザー、化学反応性テザー、イオン反応性テザー又は感熱性テザーによってつなぐ工程を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
現場で分子間相互作用現象を検出する方法であって、以下の工程、
（１）サンプルを、アレイで配置された複数のドメインを有するプローブと接触させる工程、
（２）インキュベーション期間を提供する工程、及び
（３）分子間相互作用現象を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
細胞及び亜細胞(sub-cellular)レベルの両方で生体分子及び分子種間の相互作用の性質を理解することが、疾患を治療するための方針の研究にとって重要である。分子相互作用の性質を明らかにするための新生の方法は、マイクロアレイの使用を含む。マイクロアレイは、種々の分子種の空間的に、組織化されたドメインであり、配列された固体支持体上に典型的に構成され、迅速な検出及び分子間相互作用現象の特性を促進する。そのような現象は、生体分子、抗体及び抗原、酵素及び基質、及びレセプター及びリガンド及び生体化学及び無機分子現象を含む。
マイクロアレイ技術の一つの利益は、相対的に小領域における多大な試験部位を提供する能力である。付着ドメインの粒径、及び次には、完全なアレイは、試験され得るサンプル体積の限度の決定に特に重要である。
当業界に既知の従来のマイクロアレイを構築するための４種のやり方が存在する。これらの方法は、機械付着、現場(in situ)での光化学合成、「インクジェット」プリント及び電子的に駆動される付着を含む。容易に入手可能な機械付着技術は、直径25〜100μ以上のドメインを生成する。現場での光化学操作によって、分子種のアレイは、1〜10μ以上の寸法範囲で、空間的アドレスで構築できる。いわゆる「インクジェット」方法は、100μの範囲でドメインを生成する。電気付着は、付着電極を構築するために使用される方法によって粒径が制限されているドメインを生成し得る。典型的に、これは、多マイクロ直径寸法範囲にある。しかし、細胞及び亜細胞分子現象は、上記利用可能なドメインの大きさより何倍も小さい体積で生じる。非常に小さいサンプル体積を検査する(interrogate)装置及び方法によって、in vivo又は現場における、生細胞の直接的な分析が可能となる。
そのようなアレイ及び方法は、増加した処理能力を有し、アレイの生成及び利用に関連するコストを削減する。このアレイ及び方法によって、試験されるべき材料の増幅を必要とせずに、誰でも非常に小さいサンプル体積を分析することができる。ほとんどリアルタイムで、生細胞の分子現象又は組織の分子現象の分析方法は、さらに当業界の実質的進歩を表す。従って記載されるものは、単細胞又はそれより小さい内容物に一致する体積を有するサンプルの評価のための装置及び分析基盤であり、それは、ほぼリアルタイムの分析、増加した処理能力及び削減されたコストを提供する。
【０００２】
本発明は、複数のドメインが上に配置されたプローブを有するサンプルの分析装置を含み、ドメインは、アレイを形成する。好適には、このアレイは、ナノアレイである。このドメインは、薬物、化学基、脂質、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド種、炭水化物及びこれら構成要素の組み合わせからなる群から選択される生体分子を好適に含む。任意に、ナノセンサーは、１種以上のドメインと動作可能な状態で結合されている。
このプローブは、好適にはマイクロカンチレバーを含む。いくつかの態様において、このプローブは、二重要素プローブ又は多重要素プローブである。本発明のプローブのいくつかの態様は、プローブ上に配置された少なくとも１種のマイクロディスラプターを含む。任意に、少なくとも１種のマイクロディスラプターは、先端部又は先細部材を含む。本発明は、さらに少なくとも１種の疎水性領域を含むプローブを含む。さらに好適な分子検出装置がプローブと動作可能な状態で結合されている態様が記載される。好適な分子検出装置は、走査トンネル顕微鏡、原子間力顕微鏡、質量分析計、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、ラマン分光計、赤外分光計、紫外分光計、電子系、電気化学系、光学系、磁気及び電磁気系、又は質量測定系を含む。
本発明の別の特徴は、分子間相互作用現象の検出方法であって、サンプルを複数のドメインがアレイで配置されているプローブと接触させる工程、インキュベーション期間を提供する工程、上記ドメインから非結合分子を洗浄する工程及び分子間相互作用現象を検出する工程を有する方法を含む。好適には、このサンプルは、少なくとも１種の細胞又は少なくとも１種の細胞溶解物を含む。
【０００３】
さらにサンプル中の１種以上の分子を検出する方法であって、サンプルを複数のドメインが上に配置されたプローブと接触させる工程であって、前記ドメインがアレイを形成し、また上記ドメインが、動作可能な状態でナノセンサーを含む、１種以上のセンサーに結合されている工程、及び１種以上の分子と１種以上のドメインとの結合を検出する工程を含む方法も記載される。
本発明は、さらに細胞中の１種以上の被検物(analyte)を分析する方法であって、細胞をプローブ上に配置されたマイクロディスラプターで破壊させる工程であって、上記プローブ上に複数のドメインが配置され、また上記ドメインが、ナノアレイを形成する工程、細胞膜にナノアレイを通過させて、上記ナノアレイを細胞内空間に接触させる工程、及び１種以上の被検物とナノアレイとの結合を検出する工程、を含むことを特徴とする方法も提供する。好適には、この方法は、上記プローブを核膜を通過させて、上記ナノアレイを細胞内空間に接触させる工程をさらに含む。上記とは別に、この方法は、上記プローブを細胞小器官に挿入する工程を含み得る。分析に好適な細胞小器官は、ゴルジ複合体、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、脂質ラフト、細胞骨格系及び他のいずれの物理的又は化学的に定義できる細胞又は亜細胞ドメイン又は系からなる群から選択されるものである。
本発明は、少なくとも１種の被検物をサンプルから回収(retrieve)する方法であって、上記サンプルを複数のドメインが上に配置されているプローブと接触させる工程であって、上記ドメインがアレイを形成し、また上記ドメインから少なくとも１種の被検物を回収する工程、をさらに含む。
少なくとも１種の物質を細胞に送達する方法であって、少なくとも１種の物質を複数のドメインが上に配置されたプローブに可逆的に付着させる工程であって、上記ドメインが、アレイを形成する工程、上記プローブを細胞膜を通って細胞内空間に通過させる工程、及び少なくとも１種の物質を細胞内空間に放出する工程、を含むことを特徴とする方法も提供される。好適には、少なくとも１種の物質をプローブに可逆的に付着させる方法は、結合現象が生じさせるように上記物質をドメインに接触させる工程を含む。好適な物質は、薬物、化学基、脂質、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド種、炭水化物及びこれらの構成要素のいかなる組み合わせを含む。可逆的に付着させる好適な方法は、少なくとも１種の物質を少なくとも１種のドメインにプロテアーゼ基質によってつなぐ工程を含む。追加の方法は、光分解テザー、温度感性テザー、イオン感性(ionically sensitive)テザー、及び化学感性テザーが挙げられるがこれに限定されない。
【０００４】
（好ましい態様の詳細な説明）
非常に小さいサンプルの体積の検査(interrogation)は、本発明によって達成され得る。サンプルをアレイで解析するためのプローブを含む装置が提供される。本発明のプローブの使用の好適な方法も提供され得る。
プローブ
ここに用いられるように、「プローブ」の用語は、いかなる好適な機械的構造であって、その上にアレイが構成され、それは、サンプルの小体積に対応させるために用いられ得る構造を意味する。好適なプローブは、マイクロ加工構造を含む。「マイクロ加工構造」は、ミリメートル、サブミリメートル又はサブマイクロスケールの構造であり、限定的でないが、レーザアブレーション、電着、物理及び化学蒸着、フォトリソグラフィ、湿化学的及び乾燥エッチング、射出成形、電子線リソグラフィー、及びX-線リソグラフィーを含む当業界に公知な技術で生じる。本発明の用途の他の好適なプローブ構造は、生体微細構造、例えば、睫毛、蝸牛有毛細胞、鞭毛及びアクチンフィラメントを含む。マイクロカンチレバーは、本発明のプローブとしての用途に好適と考えられ、また１種以上の末端又は表面に固着されたいかなる上記構造を含み得る。カンチレバーのいかなる部分も、好適なアンカーポイントとして使用され得る。いくつかの場合、多重アンカーポイントが存在し得る。
【０００５】
任意に、本発明のプローブは、ここで使用されるように、細胞を破壊させるために好適な形状である「マイクロディスラプター」を含み得る。マイクロディスラプター形状の２種の機械的態様は、図１に例示及び描写されている。細胞の「破壊」は、細胞の内部に近接するいかなる好適な技術を含む。「破壊」としては、パンクチャー、貫通、摂動、振動、超音波処理及び溶解が挙げられるがこれに限定されない。マイクロディスラプターとしての用途に好適な構造又は形状は、先端又は先細部材、鋸歯状端、孔、環、球又は球状部材、リパーゼ又はプロテアーゼのような細胞膜の全体又は一部を消化できる酵素、細胞の浸透圧を変化できる低張又は高張組成物及び限定的でないが、光ダイオード、レーザー、電気源、温度源及び電波源を含む熱又は電磁エネルギー送達装置を含む。上に更なるディスラプターが配置されていないプローブが、マイクロ操作又は上記エネルギー、酵素又は組成物の送達によって細胞内部への接近に使用され得ることに留意すべきである。
本発明のプローブは、単一要素構造に限定されない。例えば、二重又は多重突起(pronged)プローブが、本発明の範囲に含まれる。多重突起プローブのそれぞれの要素、又は「歯」は、アレイを含み得る。隣接した突起上のアレイは、同一又は異なっていてよく、異なる種のドメイン、又は異種分子を有する。例えば、一つの突起は、DNA種のアレイを有し、隣接突起は、ペプチド種のアレイを有し得る。いくつかの突起には、その上にアレイが配置されてなくともよい。追加の突起は、存在すれば、上記として破壊の機能をさらに供給し得、またその上に配置されたマイクロディスラプターも含み得る。
本発明のプローブは、抗吸上(anti-wicking)特性を含んでもよく、毛管現象がアレイから離れたサンプルの汲み上げを防ぐ。好適な特性は、吸上に対する物理的障壁である疎水性ドメイン及び機械的構造を含む。疎水性ドメインは、プローブの表面に配置され、プローブの一体成分となり得る。疎水性ドメインは、プローブのいかなる部分からなり、好適にはサンプルとアレイ間の維持された接触を促進するために構築され得る。この観点において、疎水性ドメインは、親水性ドメインと組み合わせて使用されてよく、最も好適にはアレイに隣接して、又は基板として配置される。吸上を防ぐための用途に好適な機械構造は、O-環構造、マイクロダイク、マイクロ-壁、バンプ、突出部、穴、空洞、フィルター及び温度勾配を含む。
【０００６】
アレイ
ここで使用されるように、「アレイ」は、複数の既知の位置に配置される空間的に配置されたドメイン又は本発明のプローブ上の「アドレス」を意味する。「ナノアレイ」は、それぞれのドメインが、約100μ2(約5.6μの直径の円形ドメイン又は約10μの側寸法の四角ドメイン)の全領域を有するアレイであり、好ましくは約１μ未満の全領域である。「ドメイン」又は「分子ドメイン」又は「親和性ドメイン」は、限定的でないが、化学種、核酸やペプチドのような生物分子種、分子及び亜分子種のような固定化された種の明瞭な領域である。特定の非限定的な例は、抗体、DNA、RNA、正常又は異常に発現した細胞タンパク質、病原体及びそこから由来の抗原、反応性有機及び無機化学基及び多重成分複合体を含む。ここで使用されるように、「ペプチド種」は、単一アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド及び/又はタンパク質を含み得る。
ドメインは、固定化された種に結合されたナノセンサーをさらに含み得る。ここで使用される用語、「ナノセンサー」は、マイクロ以下のスケールで生じる相互作用現象又は分子作用を直接検出できるいかなるレポーターシステムを意味する。本発明で使用される好適なナノセンサーの構成は、ここで全体的に参考として組み込まれる「ナノスケールセンサー」という標題の同時継続出願シリアル番号09/974,755に記載される。つまり、ナノセンサーは、アレイ種の物理的な位置、質量、静電容量、伝導率又は抵抗、共振周波数、共振振幅、モルホロジー、運動エネルギー、局部温度、酸化/還元（レドックス）状態、構造一体性、結合エネルギー又は他の特性における、測定可能な変化を検出することによって、ナノスケール現象のモニタリングを提供する。ナノセンサーとしての用途に対する好適な構造としては、カーボンナノチューブ、フラーレン構造、ナノバー及びナノワイヤーが挙げられる。
アレイは、いかなる好適な方法論によってプローブ上に構築され得る。本発明の用途に好適な超小型化されたアレイの構築に使用される１つの技術は、ここで全体的に参考として取り込まれる標題「ナノスケール分子アレイヤー(arrayer)」の同時継続出願シリアル番号09/929,865に記載される。この技術は、プローブの操作に対して、圧電、機械、磁気又は他の方法により操作して、約１μm以下から10ナノメートル以下のドメインを付着し、再生する。要するに、アレイを構築するための好適な方法は、付着プローブに付着材料を負荷する工程及びプローブ、湿度制御装置、及び制御コンピューターの操作に対して、X、Y及びZ制御装置を有する装置を使用して材料を付着基板に移す工程を含む。アレイの構築に対して好適な装置の追加の任意成分は、フォースフィードバックモニター及び光学顕微鏡を含む。
本発明のいくつかのプローブの超小型化した特質によって、それぞれ、数マイクロのスケールでの寸法で及び1マイクロメートル未満〜10ナノメートル以下の、少なくとも２〜約２５０分子ドメインから形成された分子アレイによるアレイの構築が可能になった。
【０００７】
分子検出装置
ここで使用されるように、「分子検出装置」は、巨視的スケールで、顕微鏡の又は超顕微鏡的現象を報告するのに好適な装置を含む。微少スケールで生じる現象を測定する能力及び巨視的世界でこれらの現象を報告する能力は、明らかに有用である。マイクロ又はナノスケールレベルで生じる分子間相互作用現象の直接的検出に好適な装置は、走査プローブ顕微鏡である。走査プローブ顕微鏡の一つのタイプは、原子間力顕微鏡(「AFM」)である。原子間力顕微鏡において、尖った、マイクロ-スケールのプローブと、サンプルとの相互作用が、モニターされ、サンプルを通してプローブラスター走査として調整される。AFMプローブの動作の非常に良好な制御は、圧電性結晶を使用して達成される。AFMは、約２ナノメートル（又は以下）の側面の分解能及び１Å未満の垂直な分解能である。それは、真空下、可変湿度雰囲気下、又は生理的溶液下、実施され得、ほぼリアルタイムで、分子結合現象を同定及び測定できる。AFMの分解能は、非常に高く、さらにいくつかの場合、原子スケールであり得る。
【０００８】
その高空間分解能に加え、AFMは、ピコニュートン(pN)範囲の力を及ぼし、また検出することが出来る。これは、分子間及び分子内の現存する力に関連する力範囲である。従って、AFMは、分子間及び分子内結合、又は「破裂」力を測定し得る。これは、接近/収縮手順を通してAFMプローブの循環運動を繰り返すことによって達成される。さらに、AFMは、多彩な他の力及び現象、例えば、磁場、温度勾配及び粘弾性を測定し得る。
分子アレイの超小型化は、マイクロアレイ方法論の発展における次の工程である。超小型化を通して、処理能力の莫大な増加は、コスト削減に伴って達成され得る。さらに、超小型化によって、サンプル材料の回収に必要な方法が、実質的に非侵入性で、サンプルドナーの快適なレベルを大いに高め得るような小サンプル体積の利用が可能となる。例えば、苦痛の組織バイオプシーよりも、サンプルスワブ技術によって得られる微量細胞により同レベルの情報を提供し得る。アレイの超小型化によって、現場で、及びin vivoで、サンプル回収の必要なく、分子及び生体分子現象のリアルタイムでの検出が可能となる。それでもなお、現在まで、実行可能な方法論又はこれらの目的を達成させるための装置は記載されていない。
微視的な又は超顕微鏡的現象は、分子間及び分子内相互作用現象を含む。一つの測定可能な分子内現象は、「破裂現象」として既知であり、ここに分子内結合の破壊の誘起に必要な力として定義される。好適に測定され、また分子検出装置によって記録される他の典型的な現象は、ある分子種と別の分子種との共有、非共有、疎水性、静電又は水素結合を介する結合、又はこれらの組み合わせ又は他の結合機構含む。疾患及び治療の戦略に有用な非-制限的な例は、抗体-抗原相互作用、レセプター-リガンド相互作用及び酵素-基質相互作用を含む。
【０００９】
本発明の用途に好適な分子検出方法は、逆サイクリックボルタンメトリー及び電気プラットフォームを使用する他の方法を含み、圧電の、電気容量、電磁の及びレーザーベース装置が挙げられるがこれに限定されない。他の方法は、化学反応の使用、質量変化、結合力、酸化還元状態、構造保全性、蛍光、吸光度、急冷、局所構造変化、運動エネルギー、熱エネルギー、磁気又は電磁気反応性、ラジオエネルギー発生又は吸収、一般的エネルギー状態及び結合現象を記録するための放射能を含む。
先に述べたとおり、原子間力顕微鏡は、本発明の態様を実行するのに特に有用な一つの計測器である。他の好適な計測器としては、走査トンネル顕微鏡、質量分析計、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、ラマン分光計、赤外分光計、紫外分光計、電子系、電気化学系、光学系、磁気及び電磁気系、及び質量測定系が挙げられる。上記のように、ナノセンサーは、分子現象の記録に使用され得る。電気測定装置に対するカップリングナノセンサーは、限定的でないがアンプメーター、導電率計、抵抗計、又はオシロスコープを含むことにより、結合及び他の分子現象の巨視的検出が可能となる。
分子検出装置は、本発明のプローブと動作可能に結合され得る。ここで使用されるように、「動作可能に結合された」は、プローブと分子検出装置を結合させる電気、磁気、機械的、光学、圧縮空気の又は他の方法を意味し、分子相互作用現象の巨視的記録は、同時に、又はほぼリアルタイムでなされ得る。
【００１０】
方法
本発明のプローブは、現場で又は現場外(ex situ)で使用され得る。ここで、「現場で」の使用は、興味の部位でのアレイの導入時の分子又はサブ分子現象の直接的検出又は測定を意味する。例えば、現場の使用は、in vivoでのサンプルとプローブの検査を含む。対照的に、「現場外で」の使用は、プローブでの検査の前に、サンプルを興味の部位から除去することを意味する。
本発明のプローブは、図３で示されるように、単一の生細胞又は非生細胞を直接検査するのに使用され得る。単一の生細胞の分離方法は、当業界に既知である。例えば、ここに参考として取り込まれる米国特許第6,420,105号明細書は、細胞を回収出来る装置を使用して、それら細胞が、実質的に無傷のままであるように単細胞をその器官組織から単離し、収穫する方法を記載する。このプローブの位置決め及び動作は、圧電又は類似の動作制御装置を使用して達成される。いくつかの態様において、特に、亜細胞ドメイン、例えば、核、又は特にオルガネラ、例えばゴルジ体を標的とするのが可能である。好適に、先細部材又は他のマイクロディスラプター装置が上に配置されたプローブが、細胞に直接挿入され又は細胞に位置が合わされる。上記とは別に、プローブは、マイクロディスラプター装置なしで、細胞に入り、又は細胞は、検査の前にいかなる好適な方法によって溶解され得る。細胞環境の成分は、その後、プローブ上で分子アレイと接触できる。
いくつかの場合において、サンプル上にプローブによって付与された適用垂直力の量は、限定的でないが、歪みゲージ、光学レバー系、統合圧電抵抗性法、又は他の好適な方法等を使用して、プローブの屈曲の程度を観測することによって調節する。プローブの動作は、X、Y面及びZ面であり得る。さらに、超音波エネルギーは、プローブの迅速な振動によって伝達され得る。これらの動作は、圧電セラミック動作制御機構、機械的方法又は当業者に公知な他の方法を使用して達成される。
【００１１】
アレイは、いかなる好適な直接的又は間接的方法によってもサンプルと接触し得る。サンプルを接触させる間接的な方法の例は、図２で示されかつ描画されるように水性ブリッジ(aqueous bridge)の使用からなる。プローブ上の親水性及び疎水性ドメインは、サンプルとアレイ間の接触を維持するために有利にも使用され得る。水性ブリッジが使用される場合、サンプル上に配置された流体の小滴は、図２に示されるように、プローブと、細胞支持基板との間でつかまる。このサンプルは、プローブの動作とマイクロディスラプターとの接触により機械的に破壊される。このサンプルが、破壊されると、放出した材料は、水性ブリッジを通って拡散し、分子ドメインとプローブ上で接触する。アレイ上の特異的なキャプチャー薬剤は、サンプルに含有された目的の成分と結合する。上に議論されるように、結合現象は、種々の方法、例えばこれに限定されないが、原子間力顕微鏡法、蛍光、ラマン、赤外分散、質量分析、電気痕跡、又は機械的変化又はプローブ自体の共鳴特性によって観測される。
バイオマーカーは、本発明のプローブに対する好適な標的分子の一つの型である。ここで使用される、「バイオマーカー」は、特定の細胞、細胞型、細胞状態、器官の生理的状態、有機システム、又は全生物体、組織、組織型、組織状態、限定的でないが癌、薬物耐性、細胞毒性作用及び精神機能又は心理的機能に対する素因の識別子として使用され得る分子である。典型的に、バイオマーカーは、タンパク質であるが、細胞表面ペプチド、細胞内ペプチド、脂質、炭水化物部分、RNA転写物及び/又はDNA分子、化学基、及び/又は循環抗原であり得る。
【００１２】
本発明の方法を使用する分子解析のための別の好適な標的は、体液である。「体液」は、有機体又は有機体の組織から抽出され、排出され、又は分泌される液体物質であり得る。体液は、細胞を含んでも含まなくてもよい。本発明に関連する体液は、限定的でないが、全血、血漿、血清、尿、大脳髄液、涙、シノビアル(sinovial)体液、精液、粘液又は羊水が挙げられる。
本発明のプローブは、複合溶液から被検物を回収するためにさらに使用され得る。ここで使用される「被検物」は、いかなる物質、所定の分子、所定の生体分子、又は情報を求められている粒子を意味する。この観点で、本発明のアレイは、可逆的にプローブ上の直接的測定、又は放出及び更なる分析技術によるその後の測定に対して、被検物と結合できる分子ドメインを好適に含む。当業者によって理解されるように、この態様は、複合溶液の被検物を濃縮するためにも使用され得る。
本発明の更なる態様は、１種以上の物質を生細胞又は非生細胞、組織、又は有機体に送達する方法である。この態様において、アレイのドメインは、物質又は送達されるべき物質が「装填され」、その物質は、例えばプロテアーゼ不安定(labile)テザー分子によって分子ドメインに好適に接着され得る。好適なプロテアーゼ不安定テザー分子は、標的細胞、組織又は有機体に見出される１種以上のプロテアーゼによって加水分解される感受性のペプチド配列を含む。プロテアーゼ不安定テザー分子のいくつかの非制限的な例は、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼの短鎖ペプチド基質を含む。更なるテザー分子としては、限定的でないが、イオン感受性テザー（例えば、ロイシンジッパー、キレーター(EDTA)）、温度感受性テザー（例えば、PNA、DNA又はRNA）、光感受性テザー、又は化学感受性テザーが挙げられる。本発明のプローブによる送達に好適な物質は、遺伝子、コード配列を含むポリヌクレオチド、DNA複製、転写又は翻訳に関わる酵素、細胞代謝又は他のプロセスに関連する酵素、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、反応種、例えばフリーラジカル、薬物候補及び薬物が挙げられる。理解されるように、プローブの分子ドメインは、同一の物質又は異なる物質の多重分子の送達のために装填され得、これらは、呼応してもしなくてもよい。例えば、目的の遺伝子は、ホストDNAの好適な部位にそれをスプライシングし得る酵素と同時に生細胞に送達され得る。
本発明の追加の詳細は、以下の制限的でない例を参照することにより、より明らかとなる。
【実施例１】
【００１３】
マイクロカンチレバー上のタンパク質のプリント
約１μm径スポットサイズのタンパク質アレイは、ここに記載される方法を使用してマイクロカンチレバー上にプリントした。図４は、うさぎ免疫グロブリンG(IgG)がプリントされたAFMカンチレバーの２種の例を示す。IgGは、同時継続出願シリアル番号09/929,865に記載されるようにナノスケール分子アレイヤー（以降「ナノアレイヤー」）を使用して示されるパターン上で置いた。一旦プリントされると、IgGは、複合体を第二抗体、蛍光レポーター分子Alexa-594に結合した抗ウサギIgG抗体を形成することにより可視化され、また好適な波長フィルターを使用する蛍光顕微鏡で観測された。
金で被覆されたAFMカンチレバー（種々のバネ定数を有する二本足デザイン）が、ナノアレイヤーに置かれた。付着用具（表面に分子を配置するマイクロ加工装置）を、不揮発性塩を欠くが蒸留水中のグリセロール及び非イオン界面活性剤を含む溶液の1mg/mlの抗体の、ウサギIgGの溶液に浸漬することによって全装填(front-road)した。付着用具を装填液から取り出し、局所的湿度及び温度（室温で典型的な湿度＞50%RH）の注意深い制御の下、金被覆されたAFMプローブと接触させ、付着プロセスは、材料の付着用具から金属面への物理的移動によって達成した。このプロセスは、図で示されるパターンが達成されるまで繰り返した。金被覆したマイクロカンチレバーは、その後、Tris-HCl、pH7.2で100mMのカゼインを含有するブロッキング溶液に３０分間インキュベートし、そして、蒸留水で短くすすいだ。第二抗体と、次いで、Tris-HCl、pH7.2で50mM NaClを含有する緩衝溶液に添加し、室温で３０分間インキュベートした。カンチレバーを再度蒸留水で短くすすぎ、蛍光顕微鏡で観測した。明瞭なドメインに蛍光が存在するので、ウサギIgGが、期待通りカンチレバー上にプリントされたことが分かる。この実験は、単一細胞と同一寸法であるマイクロ加工された装置上に本発明を実施し、また生体分子パターンをプリントすることが実現可能なことを示した。
【００１４】
マイクロ加工装置上のタンパク質のプリント
別の態様において、タンパク質パターンを、特に別に構築したマイクロカンチレバー装置（「プローブ」）上にプリントした。このプローブは、本出願で開示される機械ディスラプターとしての鋭く尖った先を含んでいた。プローブの例を、図５に示す。
ウサギ及びマウスIgG(Jackson Immuno Research,ペンシルベニア州)の溶液をpH7.4で、リン緩衝生理食塩水（PBS）中1mg/mlまで希釈した。これらの溶液を非イオン界面活性剤、グリセロールを含むが不揮発性塩を含まないスポッティングバッファーと1:1で混合し、その各約0.5μlを、ハンドピペッティングで、ガラスカバーガラスに配置し、ナノアレイヤープリントステージに置いた。これらの溶液を、次いで、ナノアレイヤー中のフロントロードマイクロ加工付着用具に装填ドメインとして供給した。付着用具を紫外線(254nm)で３０分間処理し、用具の親水性を増加させることによって、装填工程を増強させた。この付着用具をサンプル溶液のスポットで、遠心端の浸漬によって装填した。抗体のアレイをプリントしようとするプローブを、二本スティックテープを使用するナノアレイヤープリントステージ上で固定化した。第一の抗体溶液のアレイは、付着用具とプローブ表面の間で時間制御機械的接触を使用してプリントした。付着用具をサンプル装填する間に蒸留水中で洗浄して、スポットした抗体の二次汚染から保護した。付着用具は、次いで第二抗体を再装填し、これを使用してプローブ上に第一に隣接して第二アレイを付着させた。この方法の結果を図６に示し、この方法を用いて単一プローブ上に形成された２つの３点アレイを示した。アレー化を室温で、55%相対湿度で、室温で実施した。
【００１５】
ポスト-付着処理
プリントした後、プローブをナノアレイヤー環境試験槽で、相対湿度70%で３時間インキュベートして、付着した抗体を完全にプローブ表面に結合させた。
加湿の後、表面を100mMカゼイン（蒸留水中）に、３０分間、室温で、浸漬し、次いで0.2%トウィーン-20(PBST)を含有するPBSで３回洗浄することによりブロックした。
【００１６】
光学-検出及びデータ回収
抗体スポットのモルホロジーを、Alexa-594抗マウス及びAlexa-488抗-ウサギ抗体により、付着した抗体を標識することによって評価した（分子プローブ）。プローブ上の抗体のアレイを標準的な蛍光顕微鏡上で読み取った（ニコンTE-2000倒立顕微鏡及びハママツORCA-ER1.3メガピクセル冷却CCDカメラ）。全体のナノアレイ実験からのデータを、40X又は60Xの対物レンズを使用して、単一画像で捕らえた。データをマイクロアレイ解析に対して特に開発され同様にナノアレイ解析に好適なMedia Cybernetics Array-Pro v.4.5ソフトウェアを使用して解析した。
【００１７】
生体分子をテザー（束縛）する表面化学
抗体又は他の生体材料をプローブへの成功の付着のために、表面化学は、均一の単層固定化、サンプルの分子標的に接近可能な生来の抗体状態の維持、アレイ安定性、及び極少量の背景結合を提供しなくてはならない。標準的なナノアレイの開発において、多重表面化学が、試験された。上記例に記載されたプローブ上への付着に対する非制限的化学的研究方法は、金被覆プローブ上のアミン反応性自己組織化単層膜(SAM)である。SAMは、つながれるべき分子上の第一アミンに特異的なスクシンイミド末端アルカンエチオレートから成る。これらの表面は、高タンパク質結合を示す一方、活性であるが、加湿によって容易に不活性化されて、非常に低い非特異的結合特性を有する表面を生成する。
プローブを水及びエタノール中で洗浄し、次いで、４５分間、紫外線及びオゾンで処理した（酸素との反応を介して局所的なオゾンを作り出す幅広の波長Hg-蒸気バルブ）。プローブを5nmのクロムで被覆し、その後イオンビームスパッターで10nmの金で被覆した。スパッターの直後、プローブを、1,4-ジオキサンに溶解したDSU（ジチオビス-スクシンイミジルウンデカノエート、DSU; Dojindo Molecular Technologies, Inc.、メリーランド州）の0.5mM溶液に浸漬し、３時間、室温でインキュベートした。プローブを洗浄し、1,4-ジオキサンで簡単に超音波処理し、風乾し、乾燥N2ガス下室温で貯蔵した。
関連した方法は、ポリエチレングリコールスペーサーとエポキシド末端を有するアルカンチオレートを有する化合物を使用することである。アルカンチオレートは、金の上に密な単分子層を形成し、PEGスペーサーは、非特異的タンパク質の吸着を阻害し、キャプチャー分子の回転自由度を可能にし、乱交雑なエポキシド官能基は、付着したタンパク質上の第一アミンと反応するだろう。未反応のエポキシドは、水の存在下加水分解して、卓越した非特異的吸着特性を有すべきジオールを得るだろう。この表面で実現するだろうキャプチャー分子の増加した回転自由度は、抗体を検出することによりサンプル分子の接近を積極的に影響を与え得、逆相適用に対して試験するだろう。
タンパク質及び他の生体分子のテザーに対する追加の方法は、限定的でないが、自発吸着、疎水性媒体吸着、共有カップリング硫黄-金結合、ポリエチレングリコールスペーサーと種々の末端化学の使用、シラン媒介共有結合、イオン結合、予め存在する分子層に対する静電結合及び生体分子結合、例えばタンパク質-タンパク質、タンパク質-核酸、レセプター-リガンド及び核酸-核酸相互作用を含む。
以下の予言的例は、本発明を用いて生成した装置の使用を示す。
【００１８】
出生前及び新生児のスクリーニング
少量の出生前（例えば羊膜の）又は新生児の材料が得られる。この材料は、血液サンプル、血清サンプル、体液、細胞サンプル又は遺伝子の又は生体マーカースクリーンが所望のいかなる他の生体サンプルでよい。血液の場合は、この材料のマイクロ液滴をスライドガラスにピペットで取ることによって調製し、これを湿潤環境で維持し、蒸発を防ぐ。ナノアレイプローブをマイクロ液滴の近傍に配置し、液滴に挿入して、液滴上の生体材料が、先端のチップ上の分子ドメインと接触が可能になる。好適なインキュベーション期間の後、プローブをマイクロ液滴から取り出し、アレイを洗浄し、また蛍光、原子間力顕微鏡、又は当業者に既知の他の方法によって分析する。
この例の別の態様において、少数の細胞を被験者から得、スライドガラスやシリコンチップのような好適な基板上の生状態で維持する。ナノアレイプローブを細胞膜を通して注意深く細胞に導入し、細胞の細胞質、核細胞質又は他の亜細胞位置内に材料と相互作用を可能にする。好適なインキュベーション期間の後、プローブを細胞から取り出し、上記のようにすすぎ、また評価する。
【００１９】
法医学
典型的な法医学サンプルは、細胞材料、体液及び痕跡量の化学物質を含む。本発明の一つの適用において、血液サンプルを、犯罪現場から回収する。増幅なしでのタンパク質に基づくバイオマーカースクリーン又はDNAフィンガープリント解析を完成するための材料は不十分である。一つの態様において、発明のプローブ上のタンパク質バイオマーカーアレイを、最少体積で再懸濁して（マイクロリットル未満）、低コピー数のタンパク質バイオマーカーを可能とする最高濃度を維持するサンプルに近傍させる。好適なインキュベーション期間の後、プローブを上記のように処理し、またタンパク質バイオマーカー特性を得、「サイン」として使用され得、容疑者を同定又は除外する。
【００２０】
最少浸潤癌診断学
多くの場合、診断の癌スクリーンのための生体材料の収集は、患者にとって非常に痛みを伴うプロセスである。これは、適切な試験にとって必要な相対的に大量の生体材料のために大きく依存している。マイクロプローブ上の超小型化されたアレイの使用により、診断スクリーンに対して要求される材料の量が減少し、患者の快適度を大いに高める方法論をもたらす。例えば、主な外科的処置でなく、疑わしい胸の腫瘍を得るために、相対的に小さい針を最少の不快感で腫瘍に挿入し、少数の疑わしい細胞を回収する。癌のバイオマーカー特異的なプローブを細胞に並列し、挿入又は破壊技術を癌特異的バイオマーカーに対し、細胞の内容を分析するために使用する。
悪性であると疑われた特定の組織（例えば、喉腫瘍）をスワビングして、上記のように検査し及び分析され得る少量の細胞を得ることによってサンプルをとることが想定される。
【００２１】
生物材料の細胞への送達及び放出
この例において、材料を回収するためのプローブを使用する他、逆の手順を実施する。プローブを種々の材料、例えばDNAスプライシング酵素を「装填」し、アレイ上の特異的部位に結合する。その後、このプローブを特異的細胞又は細胞群に挿入する。プロテアーゼ不安定テザー法を使用することによって、生物材料を細胞内に放出し、非常に細胞特異的方法で生物活性を実行することを可能にする。細胞に特異的な材料を多重送達することによって、それらが細胞に挿入され、混合されるまで、プローブ上に、未反応で、「休止」状態で、材料を保存することができる。これは、遺伝子治療態様のように、細胞部位特異的変性が要求される状況で、特に適用できることが好ましい。
【００２２】
遺伝子組換え解析
この例において、目的は、健康な遺伝子組換え動物に成長するための能力について少数の細胞を評価することである。胚芽が、正常で健康であることを仮定して、胚形成の初期分割段階で胚芽の成長を破壊させずに、単細胞を取り出すことが可能であることが公知である。
しかし、形態学的に正常である胚芽が、不健康又は死亡した新生児を生じる異常な遺伝子又は代謝異常を有し得る。これを避けるために、初期段階で胚芽のバイオマーカープロファイルを実行することが望ましい。このシナリオにおいて、このプローブは、正常な細胞成長及び機能を示すバイオマーカーの群に対する診断である。単細胞は、初期段階で胚芽から取り出される。プローブを細胞に挿入するか、又はそれを使用して細胞を破壊し、細胞内容物が、プローブ上に親和性ドメインとの相互作用できるようにする。プローブを、次いで処理し、バイオマーカースクリーンを使用して、欠損のある組換え動物を条件に合わせる場合の支出及び技術困難性に遭遇するずっと前に、胚芽の健康及び有用性について決定する。
【００２３】
複合体バイオプシースクリーニング
複合体組織から異なる細胞型を単離する有名な方法は、レーザーセル顕微解剖（「LCM」）として公知である。この方法において、レーザーを使用して、特異的細胞を接着性裏材に接着させ、裏材を、細胞をそのままにして取り出す。これらの細胞は、DNA含有量を増幅させるための従来のPCR法により処理され得るが、細胞数は、典型的にはるかに少なすぎるので、タンパク質の特性処理が出来ない。アレイ上に、所望のタンパク質特性化親和性剤を有する本発明のプローブを使用して、挿入又は破壊によって、これらの切開した細胞のタンパク質含有量を分析することができる。
本明細書及び添付されたクレームに使用されるように、単数形は、別に明らかに指示されてなければ、複数の対象を含むことに留意すべきである。従って、例えば、「生物現象」を検出する方法に対する言及は、多重生物学現象の検出方法を含む。「又は」の用語は、内容が、別の方法で明らかに記載しなければ、一般的に「及び/又は」を含む意味で使用されることに留意すべきである。
本明細書中の全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示す。すべての刊行物及び特許出願は、特別にまた個別に参考として示される。
本発明は、種々の特別なかつ好ましい態様及び技術に関連して記載される。しかし、本発明の意図及び範囲内にありながら、多くの多様性及び変更がなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のいくつかの態様の概略図であり、機械的なマイクロディスラプターの形態を示す。
【図２】マイクロディスラプター及び親水性及び疎水性ドメインを有する本発明のプローブとの水性ブリッジの使用を示す。
【図３】細胞内含有物の直接的な検査のための本発明の使用を示す。
【図４】タンパク質アレイを示す実験データを説明する、マイクロ加工された原子間力顕微鏡プローブカンチレバー上に形成された。アレイは、配置されたタンパク質に特異的なフルオロフォア結合抗体との反応により蛍光性にされる。このインセットは、明領域図であり、蛍光標識化の前の配置されたタンパク質ドメインを示す。
【図５】種々のマイクロ加工プローブの明領域図顕微鏡写真を示す。
【図６】図５に示される型のプローブに付着される２成分（２種のタンパク質）アレイの明領域図顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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