(57)【要約】本発明は概括的に胃癌での遺伝子発現変化に関するものである。本発明は、具体的には正常胃組織と比較して胃癌組織で差異を伴って発現されるｍＲＮＡ種に相応するヒト遺伝子ファミリーに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１７または１９を含む分離された核酸分子；
（ｂ）配列表の配列番号４、１４または１８のアミノ酸配列をコードする分離された核酸分子；
（ｃ）配列表の配列番号３または１７の全長にわたって少なくとも約９２％のヌクレオチド配列相同性を有して胃癌で発現される蛋白質をコードする分離された核酸分子；
（ｄ）配列表の配列番号１３の全長にわたって少なくとも約９５％のヌクレオチド配列相同性を有して胃癌で発現される蛋白質をコードする分離された核酸分子；及び
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の核酸分子の相補物を包含する分離された核酸分子；
からなる群より選択される分離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が配列表の配列番号３のヌクレオチド１７４−５８４を含むものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が配列表の配列番号３のヌクレオチド１７４−５８４から構成されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が配列表の配列番号３のヌクレオチド１７４−５８７を含むものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項５】
核酸分子が配列表の配列番号５のヌクレオチド３８−８９２から構成される核酸分子；及び
配列表の配列番号５のヌクレオチド３８−８９５から構成される核酸分子；
からなる群より選択されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項６】
核酸分子が配列表の配列番号７のヌクレオチド５３−８９２から構成される核酸分子；及び
配列表の配列番号７のヌクレオチド５３−８９５から構成される核酸分子；からなる群より選択されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項７】
核酸分子が配列表の配列番号９のヌクレオチド６５−８９２から構成される核酸分子；及び
配列表の配列番号９のヌクレオチド６５−８９５から構成される核酸分子；からなる群より選択されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項８】
核酸分子が配列表の配列番号１１のヌクレオチド９２−８９２から構成される核酸分子；及び
配列表の配列番号１１のヌクレオチド９２−８９５から構成される核酸分子；
からなる群より選択されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項９】
核酸分子が配列表の配列番号１３のヌクレオチド４９−１４３４を含むものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項１０】
核酸分子が配列表の配列番号１３のヌクレオチド４９−１４３７から構成されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項１１】
核酸分子が配列表の配列番号１３のヌクレオチド４９−１４３７を含むものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項１２】
核酸分子が配列表の配列番号１７のヌクレオチド７５−５７５を含むものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項１３】
核酸分子が配列表の配列番号１７のヌクレオチド７５−５７５から構成されるものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項１４】
核酸分子が配列表の配列番号１７のヌクレオチド７５−５７２を含むものである請求項１に記載の分離された核酸分子。
【請求項１５】
核酸分子が一つ以上の発現調節要素に作動可能に連結されている請求項１〜１４のいずれか一つに記載の分離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の分離された核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の核酸分子を含有するように形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞が原核宿主細胞と真核宿主細胞とからなる群より選択されるものである請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞を上記核酸分子によってコードされるポリペプチドまたは蛋白質が発現される条件の下で培養することを含むポリペプチドまたは蛋白質の製造方法。
【請求項２１】
宿主細胞が原核宿主細胞と真核宿主細胞とからなる群より選択されるものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法によって製造された分離されたポリペプチドまたは蛋白質。
【請求項２３】
（ａ）配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４または１８のアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号４と少なくとも約９２％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
（ｃ）配列表の配列番号４のアミノ酸３１−１３７から構成される分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
（ｄ）配列表の配列番号６、８、１０または１２の少なくとも１０個のアミノ酸の断片を含む分離されたポリペプチド；
（ｅ）配列表の配列番号６、８、１０または１２の保存されたアミノ酸置換を含む分離されたポリペプチド；
（ｆ）配列表の配列番号６、８、１０または１２の自然発生アミノ酸配列変異体を含む分離されたポリペプチド；
（ｇ）配列表の配列番号６、８、１０または１２と少なくとも約７５％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチド；
（ｈ）配列表の配列番号１４と少なくとも約９５％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチドまたは蛋白質；及び
（ｉ）配列表の配列番号１８と少なくとも約９２％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
からなる群より選択される分離されたポリペプチドまたは蛋白質。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリペプチドまたは蛋白質または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドまたは蛋白質と結合する分離された抗体または抗原−結合抗体断片。
【請求項２５】
抗体がモノクロナールまたはポリクロナール抗体である請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
核酸を発現する細胞を薬剤に露出させて；
薬剤が核酸の発現を調節するのか否か決定して、蛋白質をコードする核酸の発現を調節する薬剤を同定すること；
を含む請求項２３に記載の蛋白質、配列表の配列番号２、２０または２２のアミノ酸配列を含む蛋白質、またはＭｓｔ１蛋白質またはＭｓｔ１スプライス変異体蛋白質をコードする核酸の発現を調節する薬剤を同定する方法。
【請求項２７】
蛋白質を発現する細胞を薬剤に露出させて；及び
薬剤が蛋白質の水準または少なくとも一つの活性を調節するのか否か決定して、蛋白質の水準または少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定すること；
を含む請求項２３に記載の蛋白質、配列表の配列番号２、２０または２２のアミノ酸配列を含む蛋白質、またはＭｓｔ１蛋白質またはＭｓｔ１スプライス変異体蛋白質の水準または少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定する方法。
【請求項２８】
薬剤が蛋白質の一つの活性を調節するものである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
蛋白質を可能な結合相手に露出させて；及び
可能な結合相手が蛋白質と結合するのか否か決定して、蛋白質に対する結合相手を同定すること；
を含む請求項２３に記載の蛋白質または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含む蛋白質に対する結合相手を同定する方法。
【請求項３０】
蛋白質をコードする核酸の発現を調節する有効量の薬剤を投与することを含む、請求項２３に記載の蛋白質、配列表の配列番号２、２０または２２のアミノ酸配列を含む蛋白質、Ｍｓｔ１蛋白質またはＭｓｔ１スプライス変異体をコードする核酸の発現を調節する方法。
【請求項３１】
蛋白質の少なくとも一つの活性を調節する有効量の薬剤を投与することを含む、 請求項２３に記載の蛋白質、配列表の配列番号２、２０または２２のアミノ酸配列を含む蛋白質、Ｍｓｔ１蛋白質またはＭｓｔ１スプライス変異体蛋白質の少なくとも一つの活性を調節する方法。
【請求項３２】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の核酸を含有するように変形された非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３３】
核酸分子がコード蛋白質の発現を防止する突然変異を含むものである請求項３２に記載の形質転換動物.
【請求項３４】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の核酸分子またはＭｓｔ１蛋白質またはＭｓｔ１スプライス変異体蛋白質をコードする核酸分子、または請求甲２３に記載の蛋白質、または配列表の配列番号２、２０または２２のアミノ酸配列を含む蛋白質またはＭｓｔ１蛋白質またはＭｓｔ１スプライス変異体蛋白質の発現水準を決定するのを含む、対象における疾患状態を診断する方法。
【請求項３５】
疾患状態が胃癌である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
疾患状態が進行性胃癌である請求項３４に記載の方法.
【請求項３７】
疾患状態が悪性新生物である請求項３４に記載の方法.
【請求項３８】
悪性新生物が軟質組織、骨、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、腎臓、喉頭、肝、肺、大網、卵巣、膵臓、直腸、甲状腺、子宮筋層、前立腺、皮膚、小腸、膀胱、脾臓または胃で発生するものである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
スプライス変異体が配列表の配列番号１３または配列表の配列番号１４のものである請求項１６〜２１、２４及び２５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４０】
希釈剤、及び
（ａ）配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０または２２のアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号４と少なくとも約９２％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
（ｃ）配列表の配列番号４のアミノ酸３１−１３７から構成される分離されたポリペプチドまたは蛋白質；
（ｄ）配列表の配列番号６、８、１０または１２の少なくとも１０個のアミノ酸の断片を含む分離されたポリペプチド；
（ｅ）配列表の配列番号６、８、１０または１２の保存されたアミノ酸置換を含む分離されたポリペプチド；
（ｆ）配列表の配列番号６、８、１０または１２の自然発生アミノ酸配列変異体を含む分離されたポリペプチド；
（ｇ）配列表の配列番号６、８、１０または１２と少なくとも約７５％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチド；
（ｈ）配列表の配列番号１４と少なくとも約９５％のアミノ酸配列相同性を示す分離されたポリペプチド；
からなる基から選択される分離されたポリペプチドまたは蛋白質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概括的に正常胃組織と比較して胃癌患者からの胃組織における遺伝子発現の変化に関するものである。本発明は具体的に、正常組織と比較して進行性胃癌及び他の悪性新生物で差異を伴って発現されるヒト遺伝子ファミリーに関するものである。
【０００２】
背景技術
胃癌
米国では毎年約２４，０００名の新しい胃癌患者が診断されている。過去６０年間で胃癌発生率は著しく減少されてきているが、胃癌は依然として明らかにされていない因子によって誘発される深刻な疾患である。似たような状況の下で、ある人は胃癌が発病し、他の人はそうではない。
【０００３】
普通、胃癌は５５才を越える人から発生し、男子のほうが女子より２倍高い。このような類型の癌は米国では多くないが、人たちが乾燥、ピクリング、薫製または塩処理によって保存された飲食（食べ物）をたくさん食べている日本、韓国、中南米、東ヨーロッパ一部でより多い。反対に、新鮮な果物と野菜の摂取はこの疾患から保護することができる。
【０００４】
胃癌は胃のすべての部分で発病する可能性があり、胃の全体及び／または別の器官に広がりうる。また、胃癌は胃壁に沿って成長する可能性があり、食道や小腸に広がりうる。癌が胃壁を通じて成長する場合、隣接するリンパ節、肝、膵臓と結腸に広がりうる。胃癌は卵巣、肺、及び遠く離れたリンパ節にまでさらに広がりうる。胃癌が身体の別の部分に転移する場合、これらの癌細胞は元来の腫瘍にあるものと同じ類型のものである。言い換えれば、肝に転移された細胞は依然胃癌細胞である。卵巣に広がって一つ以上の卵巣腫瘍を引き起こす腫瘍細胞はクルーケンベルグ（Krukenberg）腫瘍として知られており、卵巣細胞でない形質変換された胃細胞から構成されている。
【０００５】
胃癌の兆候は非特異性であるため、初期に見つけることが難しい。兆候は消化不良、胸焼け、腹痛、吐気及び嘔吐、下痢または便泌、食欲不振、虚弱疲労、便中に混ざった血または血を吐く患者から検地される出血を含む。診断は通常患者が液体バリウム追跡物質を摂取後に行われる上部胃腸管と食道のレントゲン写真によって遂行される。胃内視鏡を用いた胃と食道の内視鏡も遂行することができる。非正常的な組織が発見されれば、胃内視鏡によって生検を行うことができる。生検標本に癌細胞が現れれば、周囲リンパ節を生検し、肝臓と膵臓のような周囲器官を、ＣＴ撮影を通じて検査して、疾患の程度または段階を決定する。胃癌の治療方法は別類型の癌に用いられるもの、［できれば、隣接するリンパ節の除去と共に、発病器官の除去（一部または全体胃切除）、化学療法、放射線療法及び免疫療法（癌細胞を攻撃する免疫系成分を刺激）］に似ている（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｎｅｔ.ｎｃｉ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｙｐｅｓ.ｈｔｍｌ）。初期胃癌はほとんど兆候がないため、普通、診断は治療が効果的でない、疾患が進行された段階後に行われる。
【０００６】
胃癌の分子変化
胃癌の発病及び進行と関連した胃細胞の分子変化に関してはほとんど知られていない。従って、胃癌の発病と進行と関連した新しい分子的マーカーの同定の必要と供に、遺伝子発現水準での変化を調べる必要がある。さらに、仲裁（intervention）が胃癌進行を中止または遅延させることに成功すると期待される場合、この疾患の初期兆候を正確に診断する手段を確立する必要がある。胃癌の初期兆候を正確に診断する一つの方法は、独特に疾患進行と関連するマーカーを明らかにすることである（Kimら(2001), Oncogene 20:4568-4575参照)。同様に、胃癌進行を防止または中断させる治療法の開発は胃の中での癌への形質転換と成長とを担当する遺伝子の確認に依存する。
発明の開示
【０００７】
本発明は正常組織と比較して進行性胃癌（ＡＧＣ）及び他の悪性新生物から差異を伴って発現される新しい遺伝子ファミリーの発見に基づいたものである。本発明は配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１７または１９を含む分離された核酸分子；配列表の配列番号４、１４または１８のアミノ酸配列をコードする分離された核酸分子；配列表の配列番号３または１７の全長にワタッテ少なくとも約９２％の核酸配列相同性を示して胃癌で発現される蛋白質をコードする分離された核酸分子、配列表の配列番号１３の全長にわたって少なくとも約９５％のヌクレオチド配列相同性を示して胃癌で発現される蛋白質をコードする分離された核酸分子、及び上記核酸分子中のいずれかの相補物を含む分離された核酸分子を含む。
【０００８】
さらに、本発明は分離された核酸分子を含むベクターを含む、一つ以上の発現調節要素に作動可能に連結された核酸分子を含む。本発明は本発明の核酸分子を含有するように形質転換された宿主細胞及び本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞を蛋白質が発現される条件下で培養する段階を含む蛋白質製造方法をさらに含む。
【０００９】
本発明は、さらに、配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４または１８のアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド、配列表の配列番号６、８、１０または１２の少なくとも１０個のアミノ酸を含む分離されたポリペプチド、配列表の配列番号６、８、１０または１２の保存的アミノ酸置換を含む分離されたポリペプチド、及び配列表の配列番号６、８、１０または１２の自然発生アミノ酸配列変異体を含む分離されたポリペプチドからなる群より選択される分離されたポリペプチドを提供する。また、本発明のポリペプチドは配列表の配列番号４の配列と少なくとも約９０％のアミノ酸配列相同性、好ましくは、配列表の配列番号４の配列と少なくとも約９２−９５％、より好ましくは、少なくとも約９５−９８％の配列相同性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。また、本発明のポリペプチドは配列表の配列番号６、８、１０または１２の配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％のアミノ酸配列相同性、好ましくは、配列表の配列番号６、８、１０または１２の配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０−９５％、最も好ましくは、少なくとも約９５−９８％の配列相同性を持つポリペプチドを含む。また、本発明のポリペプチドは配列表の配列番号１４及び１８に示した配列とそれぞれ少なくとも約９５％及び約９２％のアミノ酸配列相同性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。
【００１０】
本発明は、さらに、モノクロナール及びポリクロナール抗体を含み、本発明のポリペプチドと特異的に結合する分離された抗体または抗原−結合抗体断片を提供する。
【００１１】
本発明は、さらに、核酸分子を発現する細胞を薬剤に露出させて；薬剤が上記核酸分子の発現を調節するか否かを決定して蛋白質をコードする核酸分子の発現を調節する薬剤を同定することを含む、本発明の蛋白質をコードする核酸分子の発現を調節する薬剤を同定する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、蛋白質を発現する細胞を薬剤に露出させて；薬剤が上記蛋白質の水準または少なくとも一つの活性を調節するか否かを決定して、蛋白質の水準または少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定することを含む、本発明の蛋白質の水準または一つ以上の活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、蛋白質を可能な結合相手に露出させて；可能な結合相手が上記蛋白質と結合するか否かを決定して、蛋白質の結合相手を同定する段階を含む、本発明の蛋白質の結合相手を同定する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、さらに、蛋白質をコードする核酸分子の発現を調節する有効量の薬剤を投与する段階を含む、本発明の蛋白質をコードする核酸分子の発現を調節する方法を提供する。また、本発明は本発明の蛋白質の少なくとも一つの活性を調節する有効量の薬剤を投与する段階を含む、本発明の蛋白質の少なくとも一つの活性を調節する方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明を本発明の核酸分子を含有するように変形された非ヒトトランスジェニック動物、または本発明のコードされたポリペプチドの発現が防止できるように突然変異された核酸分子を含有するように変形された非ヒトトランスジェニック動物を含む。
【００１６】
また、本発明は配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３または１７の全部または一部を含む遺伝子の全部または一部がノック・アウト（knocked out）または動物ゲノムから欠失された非ヒトトランスジェニック動物を含む。
【００１７】
本発明は、さらに、対象から組織、血液、尿またはその他のサンプルを得て、本発明の核酸分子または本発明のポリペプチドの発現水準を決定する段階を含む、胃癌またはその他の悪性新生物を診断する方法を提供する。
本発明は、さらに、希釈剤及び配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４または１８のアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド、配列表の配列番号４の配列と少なくとも約９０％のアミノ酸配列相同性、好ましくは、配列番号４の配列と少なくとも約９２−９５％、より好ましくは、少なくとも約９５−９８％の配列相同性を持つアミノ酸配列を持つ分離されたポリペプチド、配列番号６、８、１０または１２の少なくとも１０個のアミノ酸断片を含む分離されたポリペプチド、配列表の配列番号６、８、１０または１２の自然的に発生するアミノ酸配列変異体、配列表の配列番号６、８、１０または１２の配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％のアミノ酸配列相同性、好ましくは、配列表の配列番号６、８、１０または１２の配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０−９５％、最も好ましくは、少なくとも約９５−９８％配列相同性を持つアミノ酸配列を持つ分離されたポリペプチド、配列表の配列番号１４の配列と少なくとも約９５％のアミノ酸配列相同性を持つ分離されたポリペプチド、または配列表の配列番号１８の配列と少なくとも約９２％のアミノ酸配列相同性を持つ分離されたポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドまたは蛋白質を含む組成物を含む。
【００１８】
発明を遂行するための最良の形態
Ｉ．一般的な記述
本発明は正常ヒト組織と比較してヒト胃癌組織及び他の悪性新生物から差異に伴って発現される新しい遺伝子ファミリーの同定に部分的に基づく。これらの遺伝子ファミリーは配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１７、１９及び２１のヒトｃＤＮＡを含む。
【００１９】
本発明の遺伝子及び蛋白質はサンプルから胃癌を検出するか、または胃癌の進行をモニターする診断剤やマーカーとして用いられる。また、これらは遺伝子発現または活性を調節する薬剤の標的に用いられる。例えば、胃癌の過増殖過程を含み、腫瘍成長と関連した生物学的過程を調節する薬剤を同定することができる。
【００２０】
II．具体的な態様
Ａ．胃癌と関連した蛋白質
本発明は分離された蛋白質、蛋白質のアレル変異体、及び蛋白質の保存的アミノ酸置換体を提供する。ここで使われるように、“蛋白質”または“ポリペプチド”とは、部分的に配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８に示したヒトアミノ酸配列を持つ蛋白質を指す。また、この用語は上記具体的に言及したものと若干相異するアミノ酸配列を持つ自然的に発生するアレル変異体及び蛋白質を指す。アレル変異体は上記言及したものと若干異なるアミノ酸配列を持っていても依然として同一または類似なこれらの蛋白質と関連された生物学的機能を有する。
【００２１】
ここで使われるように、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８のヒトアミノ酸配列と関連した蛋白質ファミリーはヒトだけでなく有機体から分離された蛋白質を含む。これらの蛋白質と関連した蛋白質ファミリーの他の構成員を同定して分離するのに用いられる方法は下記通りである。
【００２２】
本発明の蛋白質は好ましくは分離された形態である。ここで使われるように、蛋白質は物理的、機械的または化学的方法を用いて普通蛋白質と関連した細胞成分らから蛋白質を除去するとき分離されると言われる。当業者は分離された蛋白質を得るための標準的な精製方法を容易に用いることができる。
【００２３】
さらに、本発明の蛋白質は配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８のスプライス変異体及び挿入、欠失または保存的アミノ酸置換変異体を含む。ここで使われるように、保存的変異体は蛋白質の生物学的機能に否定的な影響を及ぼさないアミノ酸配列上の変化を指す。置換、挿入または欠失は変化された配列が蛋白質と関連した生物学的機能を防止するか、破壊するとき蛋白質に否定的な影響を及ぼすとされる。例えば、あるときには蛋白質の全体電荷、構造または疎水性／親水性性質を生物学的活性に否定的な影響を及ぼさずに、変化させることができる。従って、アミノ酸配列を、例えば蛋白質の生物学的活性に否定的な影響を及ぼさずに、ポリペプチドをより疎水性か、または親水性にするために変化させることができる。
【００２４】
通常、ＬＢＦＬ３０１によりコードされた蛋白質ファミリーのアレル変異体、保存的置換変異体、及び構成員は配列表の配列番号２または４の配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％のアミノ酸配列相同性、より好ましくは、少なくとも約８０−９０％、より好ましくは、少なくとも約９２−９５％、最も好ましくは、少なくとも約９５−９８％の配列相同性を持つアミノ酸配列を持ち得る。ＬＢＦＬ３０４によりコードされる蛋白質ファミリーのアレル変異体、保存的置換変異体、及び構成員は配列表の配列番号６、８、１０または１２の配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％のアミノ酸配列相同性、より好ましくは、少なくとも約８０％以上、さらに好ましくは、少なくとも約９０−９５％、最も好ましくは、少なくとも約９９または９９．５％の配列相同性を持つアミノ酸配列を持ち得る。ＬＢＦＬ３０５またはＬＢＦＬ３０６によりコードされる蛋白質ファミリーのアレル変異体、保存的置換変異体、及び構成員は配列表の配列番号１４または１８の配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％以上のアミノ酸配列相同性、より好ましくは、少なくとも約８０−９０％、さらに好ましくは、少なくとも約９２−９４％、最も好ましくは、少なくとも約９５％、９８％または９９％以上の配列相同性を持つアミノ酸配列を持ち得る。ここで、このような配列に関する相同性は配列を整列し、必要ならば、空間を導入して最大パーセント相同性を得るようにした後、保存的置換は配列相同性の一部として見なさずに、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８と同じの候補配列上のアミノ酸残基のパーセントとして定義される（関連指数に対してはＢ欄を参照のこと）。融合蛋白質、またはペプチド配列へのＮ−末端、Ｃ−末端または内部延長、欠失または挿入は相同性への影響として解釈されないものとする。
【００２５】
従って、本発明の蛋白質は配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８のアミノ酸配列を持つ分子；これらの蛋白質の少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５個以上のアミノ酸残基の連続的な配列を持つその断片；一つ以上のアミノ酸残基が上記コーディング配列内か、そのＮ−またはＣ−末端に挿入されたアミノ酸配列変異体；及び少なくとも一つの残基により置換された上記配列のアミノ酸配列変異体、または上記したようなその断片を含む。また、このような断片はペプチドまたはポリペプチドといい、明らかな親水性部位だけでなく抗原性部位、公知の蛋白質領域に相応するアミノ酸配列部位として確認された蛋白質の機能的部位を含有することができる。これらの部位はいずれもＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ）のような普遍的に利用可能な蛋白質配列分析ソフトウェアを使用して容易に確認することができる。
【００２６】
さらに、予想される変異体は、例えば相同的組換え、部位−特異的またはＰＣＲ突然変異による予定された突然変異を含むもの、ウサギ、マウス、ラット、豚、牛、羊、馬及び非ヒト霊長類を含むが、これらに制限されない別の動物種の相応する蛋白質、及び蛋白質ファミリーの対立形質またはその他の自然的に発生する変異体（例えば、全てここに参照として引用されるＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ_１２８００２、ＸＭ_１２９３６５、ＮＭ_０２１４２０、ＮＭ_１３３９７１（ＤＮＡ配列）及びＮＰ_５９８７３２（蛋白質配列）に相応するマウス蛋白質に対して類似性を示すマウス同族体)を含む。付加的な変異体は蛋白質が置換、化学的、酵素的、またはその他の適切な手段により自然的に発生するアミノ酸以外の部位（例えば、酵素や放射性同位元素のような検出可能な部位）で共有的に変形された誘導体を含む。
【００２７】
さらに、本発明は本発明の蛋白質またはポリペプチド及び希釈剤を含む組成物を提供する。適当な希釈剤は水性または非水性溶媒またはこれらの配合物が挙げられ、蛋白質またはポリペプチドの安全性、溶解度、活性、及び／または貯蔵性に寄与する付加的な成分、例えば、水溶性塩またはグリセロールが挙げられる。
【００２８】
後述するように、蛋白質ファミリーの構成員は、（１）蛋白質の水準や少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定し、（２）蛋白質の結合相手を同定し、（３）ポリクロナールまたはモノクロナール抗体を誘発するための抗原として、（４）治療薬剤または標的として、（５）胃癌及び他の過増殖性疾患の診断剤やマーカーとして用いることができる。
【００２９】
Ｂ．核酸分子
さらに、本発明は好ましくは、分離された形態、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８を持つ蛋白質及びここに記載された関連した蛋白質をコードする核酸分子を提供する．ここで使われるように、“核酸”は上記定義のような蛋白質やペプチドをコードするか；そのようなペプチドをコードする核酸に相補的であるか；適宜にストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７の核酸とハイブリダイズして安定に結合されているか；配列表の配列番号２または４のペプチド配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％、好ましくは、配列表の配列番号２または４のペプチド配列と少なくとも約８０−９０％、より好ましくは、少なくとも約９２−９５％、最も好ましくは少なくとも約９５−９８％を共有するポリペプチドをコードするか；配列表の配列番号１または３のオープン・リーディング・フレームにわたって少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも約８０−９０％、より好ましくは、少なくとも約９２−９５％、さらに好ましくは、少なくとも約９５−９８％のヌクレオチド配列相同性を示すか；配列表の配列番号６、８、１０または１２のペプチド配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、最も好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％、９９.５％の相同性を共有するポリペプチドをコードするか；配列表の配列番号５、７、９または１１のオープン・リーディング・フレームにわたって少なくとも５０％、６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、さらに好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％以上のヌクレオチド配列相同性を示すか；配列表の配列番号１４または１８のペプチド配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも約８０−９０％、より好ましくは、少なくとも約９２−９４％、最も好ましくは、少なくとも約９５％、９８％、９９％以上の相同性を共有するポリペプチドをコードするか；配列表の配列番号１３または１７のオープン・リーディング・フレームにわたって少なくとも約５０％、６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも約８０−９０％、より好ましくは、少なくとも約９２−９４％、さらに好ましくは、少なくとも約９５％、９８％、９９％以上のヌクレオチド配列相同性を示すＲＮＡやＤＮＡとして定義される。
【００３０】
さらに、本発明は配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７の相補物に特異的にハイブリダイズする分離された核酸分子、特にオープン・リーディング・フレームにわたって特異的にハイブリダイズする分子を含む。配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７の相補物に特異的にハイブリダイズするそのような分子は典型的にストリンジェントなハイブリダイズ条件下でハイブリダイズする。
【００３１】
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びアンチセンス分子、及び自然的なソースから由来されたか合成されたとしても、代替バックボーンに基づくか、代替塩基を含む核酸が具体的に考案される。しかし、本発明に係る蛋白質をコードする核酸と適切にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか相補的なものを含むそのようなハイブリダイズまたは相補的核酸は、さらにいかなる先行技術核酸に比べても新規で非自明なものとして定義される。
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列水準での相同性または同一性は配列類似性サーチのために作られたプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)分析（Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-3402、及びKarlin et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:2264-2268、いずれも参照として全体引用）により決定される。ＢＬＡＳＴプログラムにより使われるアプローチは、まず問題配列とデータベース配列と間に、ギャップのある、なしで、類似な断片を考慮した後、確認されたあらゆるマッチの統計学的有意性を評価し、最後に、あらかじめ選ばれた有意性境界を満足させるマッチのみを要約するものである。配列データベースの類似性サーチにおける基本的な争点を議論するためには、参照として全部を引用するAltschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129を参考にしたい。ヒストグラム、記載、配列、予測（即ち、データベースに対するマッチを報告するための統計学的有意性境界）、カットオフ、マトリックス及びフィルタ（低い複雑度）のためのサーチパラメーターが基本セッティングである。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘにより使われる基本採点マトリックスは長さが８５個ヌクレオチドまたはアミノ酸を越える問題配列のために推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Henikoff et al., （1992） Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919, 全体を参照として引用）。
【００３２】
Ｂｌａｓｔｎのために、採点マトリックスはＭ（即ち、マッチされる残基対に対する補償点数）対Ｎ（即ち、ミスマッチされる残基に対する罰点）の比率により設定され、Ｍ及びＮの基本値はそれぞれ５及び−４である。４個のｂｌａｓｔｎ指数が下記のように調整された：Ｑ＝１０（空間を造る罰点）；Ｒ＝１０（空間を延長させる罰点）；ｗｉｎｋ＝１（問題に沿って毎ｗｉｎｋ番目位置で単語ヒットを作る）；及びｇａｐｗ＝１６（空間がある配列を作るＷｉｎｄｏｗｓ幅を設定する）。同等なＢｌａｓｔｐ指数セッティングはＱ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；及びｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用できる配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較はＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（空間を作る罰点）及びＬＥＮ＝３（空間を延長させる罰点）を使用して蛋白質比較で同等なセッティングはＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。
【００３３】
“ストリンジェントな条件”は、（１）洗浄のために低いイオン強度と高い温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ＳＤＳを使用するか、（２）ハイブリダイズ中のホルムアミドのような変性化剤、例えば４２℃で０．１％子牛血清アルブミンを持つ５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  ＮａＣｌを持つｐＨ６．５の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを使用するものである。別の例は、４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランでハイブリダイズし、４２℃、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄するものである。当業者は清潔で検出可能なハイブリダイズ信号を得るために厳格度条件を適切に決定し、変化させることができる。好ましい分子は上記条件下で配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７の相補物とハイブリダイズし、機能的または全長蛋白質をコードするものである。より好ましいハイブリダイズ分子は上記条件下で配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７のオープン・リーディング・フレームの相補鎖とハイブリダイズするものである。
【００３４】
ここで使われるように、核酸分子は核酸分子が異なるポリペプチドをコードする汚染核酸分子から実質的に分離されるとき、“分離された”という。
さらに、本発明は開示された核酸分子の断片を提供する。ここで使われるように、核酸分子の断片はコーディングまたは非コーディング配列の小さい部分を指す。断片の大きさは意図する用途により決定され得る。例えば、断片を蛋白質の活性部分をコードするために選択するならば、その断片は蛋白質の機能的部位（ら）をコードするのに十分に大きい必要がある。例えば、予想される抗原性部位に相応するペプチドをコードする断片を製造することができる。断片を核酸プローブまたはＰＣＲプローブとして使用しようとするならば、その断片長さはプロビング／プライミング中の相対的に少ない偽陽性を得るように選択される。（Ｈ欄での議論を参照）。
【００３５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプローブや特異的プライマーとして、または本発明の蛋白質をコードする遺伝子配列を合成するのに使われる本発明の核酸分子の断片（即ち、合成オリゴヌクレオチド）は化学的技術、例えばMatteucci et al., （(1981) Jam Chem Soc 103:3185-3191）の ホスホラミダイト方法によるか、自動化された合成方法を利用して容易に製造することができる。また、より大きいＤＮＡ断片は遺伝子の様々なモジュール断片を決定した後、オリゴヌクレオチドを結紮して完全な変形された遺伝子を作るオリゴヌクレオチド基の合成のような、よく知られた方法によって容易に製造することができる。
【００３６】
さらに、本発明の核酸分子は診断及びプローブ目的のために検出可能な標識を含有するように変形できる。様々な標識が当業界に知られ、ここに記載されたコードする分子と共に容易に使用され得る。適当な標識はビオチン、放射性標識または蛍光標識ヌクレオチドなどを含が、これらに制限されるものではない。当業者は本発明の核酸分子の標識された変異体を得るために、いずれの標識も容易に使用できる。
【００３７】
Ｃ． 他の関連する核酸分子の分離
上記したように、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７を持つ核酸分子の同定及び特性糾明で当業者はここに記載された配列だけでなくその蛋白質ファミリーの他の構成員をコードする核酸分子を分離することができる。さらに、現在開示された核酸分子で当業者は配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８を持つ蛋白質だけでなくその蛋白質ファミリーの他の構成員をコードする核酸分子を分離することができる。
【００３８】
例えば、当業者は容易に配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８のアミノ酸配列を利用して適切な細胞から製造された発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを製造することができる。典型的には、精製された蛋白質（下記のような）で免疫化されたウサギのような哺乳動物からのポリクロナール抗血清またはモノクロナール抗体を使用して哺乳動物ｃＤＮＡまたはラムダｇｔｌｌライブラリーのようなゲノム発現ライブラリーをプローブして、蛋白質ファミリーの他の構成員に対する適切なコーディング配列を得ることができる。クローニングｃＤＮＡ配列は融合蛋白質として発現されるか、それ自体の調節配列を利用して直接発現されるか、酵素発現のために使われる特定宿主に好適な調節配列を用いた制作物によって発現され得る。
【００３９】
あるいは、ここに記載されたコーディング配列の一部を合成し、ある哺乳類有機体からの蛋白質ファミリーの構成員をコードするＤＮＡを検索するためのプローブとして使用することができる。約１８−２０ヌクレオチドを含有する（６−７個のアミノ酸をコードする）オリゴマーを製造してゲノムＤＮＡやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして過度な水準の偽陽性を除去するためのストリンジェントな条件または十分な厳格度の条件下でハイブリダイゼーションを得ることができる。
【００４０】
さらに、オリゴヌクレオチドプライマー対をコードする核酸分子を選別的にクローニングするための重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するために製造することができる。そのようなＰＣＲプライマーを使用するためのＰＣＲ変性／アニーリング／延長サイクルは当業界によく知られ、他のコード核酸分子を分離するのに使用するために容易に好適化させることができる。
【００４１】
蛋白質ファミリーの他の構成員をコードする核酸分子はまたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.,  (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-3402）； ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Zhang et al., (1998) Nucleic Acids Res 26:3986-3990）、３Ｄ−ＰＳＳＭ（Kelly et al., (2000) J Mol Biol 299(2):499-520）；及びその他コンピュータ分析方法（Shi et al., (1999) Biochem Biophys Res Commun 262(1): 132-138及びMatsunami et al., (2000) Nature  404(6778):601-604）を含むが、これらに制限されなく、どんな利用可能なコンピュータ方法を利用して存在するゲノムまたは他の配列情報で確認され得る。
【００４２】
Ｄ．核酸分子を含有するｒＤＮＡ分子
さらに、本発明はコーディング配列を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡｓ）を提供する。ここで使われるように、ｒＤＮＡ分子はｉｎ  ｓｉｔｕで分子的に操作されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は当業界によく知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001を参照したい。好ましいｒＤＮＡ分子で、コードＤＮＡ配列は発現調節配列及び／またはベクター配列に作動可能に連結される。
【００４３】
当業界によく知られたように、本発明の配列をコードする蛋白質ファミリー中の一つに作動可能に連結されるベクター及び／または発現調節配列の選択は所望の機能的性質、例えば、蛋白質発現及び形質転換される宿主細胞に直接的に依存する。本発明により考案されたベクターは少なくとも複製または宿主染色体への挿入、好ましくはｒＤＮＡ分子に含まれた構造遺伝子の発現も誘導できる。
【００４４】
作動可能に連結された蛋白質コーディング配列の発現を調節するのに使われる発現調節要素が当業界に知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌信号、及びその他の調節要素を含むが、これらに制限されない。好ましくは、誘導性プロモーターは宿主細胞培地中の栄養素に反応するように、容易に調節される。
【００４５】
一例で、コード核酸分子を含有するベクターは原核生物レプリコン（replicon）、即ち、それにより形質転換された細菌宿主細胞のような原核宿主細胞の染色体の他に存在する組換えＤＮＡ分子の自己複製及び維持を誘導する能力を持つＤＮＡ配列を含む。そのようなレプリコンは当業界によく知られている。また、原核生物レプリコンを含むベクターは発現が薬物耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含むことができる。典型的な細菌薬物耐性はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【００４６】
原核生物レプリコンを含むベクターは追加でＥ．ｃｏｌｉのような細菌宿主細胞でコード遺伝子配列の発現（転写及び解読）を誘導できる原核生物またはバクテリオファージプロモーターを含むことができる。プロモーターはＲＮＡ重合酵素の結合と転写が起きるようにするＤＮＡ配列により形成された発現調節要素である。細菌宿主と両立可能なプロモーター配列は典型的に本発明のＤＮＡ断片を挿入するための便利な制限位置を含有するプラスミドベクターから提供されている。そのようなベクタープラスミドの典型的な例は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Richmond，CA）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びＰｈａｒｍａｃｉａ（Piscataway, NJ)から入手可能なｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。
【００４７】
真核細胞、好ましくは胃細胞のような脊髄動物細胞と両立可能な発現ベクターがコーディング配列を含有するｒＤＮＡ分子を形成するのに使われ得る。ウイルスベクターを含む真核細胞発現ベクターが当業界によく知られ、いくつかの商業的入手先から利用可能である。典型的には、所望のＤＮＡ断片を挿入するための便利な制限位置を含有する、そのようなベクターが提供されている。そのようなベクターの典型的な例は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Pharmacia）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（International Biotechnologies, Inc.）、ｐＴＤＴ１（ATCC, #31255）、ここに記載されたベクターｐＣＤＭ８、その他の真核生物発現ベクターである。ベクターは必要な場合、胃細胞特異的プロモーターを含むように変形することができる。
【００４８】
さらに、本発明のｒＤＮＡ分子を製作するのに使われる真核細胞発現ベクターは真核細胞で効果的な選別可能なマーカー、好ましくは薬物耐性選別マーカーを含むことができる。好ましい薬物耐性マーカーは発現がネオマイシン耐性を起こす遺伝子、即ち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ （ｎｅｏ）遺伝子である（Southern et al., (1982) J Mol Anal Genet 1:327-341）。あるいは、選別可能なマーカーは別途のプラスミド上に存在でき、２つのベクターは宿主細胞の共同−形質感染によって導入され、選別マーカーに適当な薬物中で培養することによって選別される。
【００４９】
Ｅ．外生的に供給されたコード核酸分子を含有する宿主細胞
さらに、本発明は本発明の蛋白質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核または真核細胞でありうる。本発明の蛋白質発現のために有用な真核細胞は、細胞株が細胞培養方法と両立可能で発現ベクターの増殖と遺伝子産物の発現と両立可能な以上、制限されない。好ましい真核宿主細胞は酵母、昆虫及び哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、猿またはヒト細胞株のような脊髄動物細胞を含むが、これらに制限されるものではない。好ましい真核宿主細胞はＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能な中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、及びその他の真核組織培養細胞株を含む。
【００５０】
どんな原核宿主も本発明の蛋白質をコードするｒＤＮＡ分子を発現するのに用いることができる。好ましい原核宿主はＥ．ｃｏｌｉである。本発明のｒＤＮＡ分子への適切な宿主細胞の形質転換は使用するベクターの類型と使用する宿主システムに典型的に依存する、よく知られた方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関して、電気穿孔と塩処理方法が典型的に使われる（例えば、Cohen et al., (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2110;及び上記Sambrook et al.,を参照したい）。ｒＤＮＡを含有するベクターへの脊髄動物細胞の形質転換に関して、電気穿孔、カチオン性脂質または塩処理方法が典型的に使われる。例えば、Graham et al., (1973) Viro l52:456; Wigler et al., (1979) Proc Natl Acad Sci USA 76;1373-1376を参照したい。
【００５１】
成功的に形質転換された細胞、即ち、本発明のｒＤＮＡを含有する細胞は選別マーカーの選別をはじめとする、よく知られた技術によって確認することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入から生成された細胞は単一コロニーを形成するようにクローニングできる。これらのコロニーから細胞を収穫、溶菌し、そのＤＮＡ含量をSouthern, (1975) J Mol Biol 98:503またはBerent et al., (1985) Biotech 3:208に記載されたような方法を利用してｒＤＮＡの存在に対して調べするか、免疫学的方法を通じて細胞から生産された蛋白質をアッセイする。
【００５２】
Ｆ．ｒＤＮＡ分子を用いた組換え蛋白質の生産
さらに、本発明はここに記載された核酸分子を用いて本発明の蛋白質を製造する方法を提供する。一般用語として、組換え形態の蛋白質の生産は典型的に下記段階を含む。
【００５３】
最初に、本発明の蛋白質をコードする核酸、例えば、配列表の配列番号１、配列表の配列番号３、配列表の配列番号５、配列表の配列番号７、配列表の配列番号９、配列表の配列番号１１、配列表の配列番号１３、配列表の配列番号１７、配列表の配列番号１のヌクレオチド１３１−８６２または１３１−８５９、配列表の配列番号３のヌクレオチド１７４−５８７または１７４−５８４、配列表の配列番号５のヌクレオチド３８−８９２または３８−８９５、配列表の配列番号７のヌクレオチド５３−８９２または５３−８９５、配列表の配列番号９のヌクレオチド６５−８９２または６５−８９５、配列表の配列番号１１のヌクレオチド９２−８９２または９２−８９５、配列表の配列番号１３のヌクレオチド４９−１４３７または４９−１４３４、または配列表の配列番号１７のヌクレオチド７５−５７５または７５−５７２を含むか、または、必須成分として構成されるか、構成される核酸分子を得る。コーディング配列がこれらのオープン・リーディング・フレームのようにイントロンによってされない場合、これは任意の宿主での発現にも直接的に好適である。
【００５４】
その後、好ましくは、核酸分子は上記したような適当な調節配列と作動可能に連結され、蛋白質オープン・リーディング・フレームを含有する発現単位を形成する。発現単位は適当な宿主を形質転換するのに使われ、形質転換された宿主は組換え蛋白質の生産を可能にする条件下で培養される。任意に組換え蛋白質は培地または細胞から分離され；蛋白質の回収及び精製は若干の不純物に耐えられる一部の場合は必要としないかも知れない。
【００５５】
上記それぞれの段階は、様々な方法で行える。例えば、所望のコーディング配列をゲノム断片から得て、適切な宿主で直接使用することができる。様々な宿主で作動可能な発現ベクターの製作は、上記したような適当なレプリコンと調節配列を用いて達成される。調節配列、発現ベクター、及び形質転換方法は遺伝子を発現するのに用いられる宿主細胞の類型に依存し、既に詳細に議論したことがある。適当な制限位置は正常に利用可能でない場合、これらのベクターに挿入するための切断可能な遺伝子を提供するためにコーディング配列の端に添加される。当業者は組換え蛋白質を生産するための本発明の核酸分子の使用のために当業界に知られた、どんな宿主／発現システムも容易に好適化することができる。
【００５６】
Ｇ．結合相手同定方法
本発明の他の態様は、本発明の蛋白質の結合相手を分離して同定する方法を提供する。一般に、可能な結合相手と本発明の蛋白質の結合を可能にする条件下で本発明の蛋白質を可能な結合相手または細胞抽出物または分画と混合する。混合後、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質または本発明の蛋白質と結合された他の分子を混合物から分離する。その後、本発明の蛋白質と結合された結合相手を除去し、さらに、分析する。結合相手を確認して分離するために、全体蛋白質、例えば、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８の全体アミノ酸配列を含む蛋白質を使用する。あるいは、その蛋白質の断片を使用することができる。
【００５７】
ここで使われるように、細胞抽出物は溶菌または破砕された細胞から製造された粗製物または分画を指す。細胞抽出物の好ましい出処はヒト胃癌から由来した細胞または形質転換された胃細胞、例えば、胃癌からの生検組織または組織培養細胞である。あるいは、細胞抽出物を正常組織または利用可能な細胞株、特に胃−由来の細胞株から製造され得る。
【００５８】
細胞抽出物を得るために様々な方法が用いられる。細胞を物理的または化学的破砕方法を利用して破砕できる。物理的破砕方法の例は、超音波及び機械的剪断（shearing）を含が、これらに制限されるものではない。化学的溶菌方法の例は、界面活性剤溶菌及び酵素溶菌を含むが、これらに制限されるものではない。当業者は本方法として使用するための抽出物を得るために細胞抽出物を製造する方法を容易に好適化できる。
【００５９】
一旦、細胞抽出物を製造すれば、蛋白質と結合相手の結合が起こりうる条件下で抽出物を本発明の蛋白質と混合する。様々な条件が使用でき、ヒト細胞の細胞質で発見される条件を緊密に似た条件が最も好ましい。浸透圧、ｐＨ、温度、用いられた細胞抽出物の濃度のような特徴を蛋白質と結合相手の結合を最適化するために変化させることができる。
【００６０】
適切な条件下で混合した後、結合された複合体を混合物から分離する。様々な技術が混合物を分離するのに用いられる。例えば、本発明の蛋白質に特異的な抗体を使用して結合相手複合体を免疫沈殿させることができる。あるいは、クロマトグラフィー及び密度／沈降遠心分離のような標準化学的分離技術が用いられる。
【００６１】
抽出物中で発見される非結合細胞成分を除去した後、結合相手を複合体から通常的な方法を利用して解離することができる。例えば、解離は混合物の塩濃度やｐＨを変化することによって達成できる。
【００６２】
混合抽出物から結合された結合相手を分離することを手助けするために、本発明の蛋白質を固相保持体上に固定することができる。例えば、蛋白質をニトロセルロースマトリックスやアクリルビーズに付着させることができる。蛋白質の固相保持体への付着は抽出物中で発見される他の成分からペプチド／結合相手対を分離することを手助けする。確認された結合相手は単一蛋白質であるか、２以上の蛋白質の複合体でありうる。あるいは、結合相手はTakayama et al., (1997) Methods Mol Bio l69:171-184またはSauder et al., (1996) J Gen Viro l77:991-996の方法によってＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを利用して確認するか、エピトープタグ蛋白質またはＧＳＴ融合蛋白質を通じて確認することができる。
【００６３】
あるいは、本発明の核酸分子を酵母２−ハイブリッドシステムまたは他のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質−蛋白質検出システムが用いられる。酵母２−ハイブリッドシステムは、他の蛋白質相手対を確認するのに使われており、ここに記載された核酸分子を使用するために容易に適合化することができる。
【００６４】
Ｈ．胃癌関連遺伝子をコードする核酸発現を調節する薬剤の同定方法
本発明の他の態様は、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２または１８のアミノ酸配列を持つ蛋白質、Ｍｓｔ１蛋白質または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を持つ蛋白質と同じ本発明のスプライス変異体のような本発明の蛋白質をコードする核酸の発現を調節する薬剤を同定する方法を提供する。Ｍｓｔ１蛋白質またはスプライス変異体をコードする核酸発現を調節する薬剤は胃癌治療に特別な用途を持つかもしれない。そのようなアッセイは本発明の核酸の発現水準変化をモニターリングするのに用いられるどんな手段も利用できる。ここで使われるように、薬剤は細胞で核酸の発現をアップ−またはダウン−調節できれば、本発明の核酸の発現を調節できるという。
【００６５】
一つのアッセイ形態で、配列表の配列番号１のヌクレオチド１３１−８６２、または配列表の配列番号３のヌクレオチド１７４−５８７、配列表の配列番号５のヌクレオチド３８−８９５、配列表の配列番号７のヌクレオチド５３−８９５、配列表の配列番号９のヌクレオチド６５−８９５、配列表の配列番号１１のヌクレオチド９２−８９５、配列表の配列番号１３のヌクレオチド４９−１４３７または４９−１４３４、配列表の配列番号１７のヌクレオチド７５-５７５及び／または５’及び／または３’調節要素といかなるアッセイ可能な融合相手間のリポーター遺伝子融合を含有する細胞株を製造できる。ホタルがルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をはじめとする数多くのアッセイ可能な融合相手が知られ、容易に利用可能である（Alam et al., (1990) Anal Biochem1 88:245-254）。その後、レポーター遺伝子融合を含有する細胞株を適切な条件及び時間下で試験しようとする薬剤に露出させる。薬剤に露出されたサンプルと対照サンプル間にレポーター遺伝子の差異を伴う発現で本発明の核酸の発現を調節する薬剤を同定する。
【００６６】
付加的なアッセイ形態を配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８を持つ蛋白質のような本発明の蛋白質をコードする核酸の発現を調節する薬剤の能力をモニターリングするために使用することができる。例えば、ｍＲＮＡ発現を見た発明の核酸とのハイブリダイズによって直接モニターリングすることができる。細胞株を適切な条件及び時間の下で試験しようとする薬剤に露出させ、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡをSambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に記載されたものと同様の標準方法によって分離する。
【００６７】
好ましい細胞はヒト胃組織、例えば、胃癌患者からの胃生検組織または培養細胞から由来したものである。ＡＴＣＣ胃癌細胞株カタログ番号ＮＣＩ−ＳＮＵ−１６、ＣＲＬ−１８６３、ＨＴＢ−１０３、ＣＲＬ−１７３９及びＣＲＬ−１８６４のような細胞株が用いられる。あるいは、他の利用可能な細胞または細胞株を使用することができる。              
【００６８】
薬剤に露出された細胞と対照細胞と間のＲＮＡ発現水準の差を検出するためのプローブを本発明の核酸から製造することができる。高厳格度の条件下で標的核酸のみとハイブリダイズするプローブを設計することが必須的ではないが、好ましい。高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが高い厳格度の条件下で形成される。従って、アッセイ条件の厳格度はハイブリッドを形成するために２核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を決定する。厳格度はプローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッド間の安全性の差を最大化するように選択しなければならない。
【００６９】
本発明の核酸から当業界に知られた方法を通じてプローブを設計することができる。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量とプローブ長さがプローブの標的配列への結合に影響を及ぼすことがある。プローブ特異性を最適化する方法は上記Sambrook et al., またはAusubel et al., Short Protocolsin Molecular Biology, Fourth Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999から普遍的に利用可能である。
【００７０】
ハイブリダイズ条件はそれぞれのプローブのために要求されるように、Sambrook ら 及びAusubel ら の方法のような公知の方法を利用して変形することができる。総細胞性ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡが濃厚化されたＲＮＡのハイブリダイズをどんな利用可能な形態でも遂行することができる。例えば、総細胞性ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡが濃厚化されたＲＮＡを固相保持体に固定して固相保持体を本発明の配列の少なくとも一つ、または一つの一部を含む少なくとも一つのプローブにプローブが特異的にハイブリダイズする条件下で露出させる。あるいは、本発明の配列の少なくとも一つまたは一つの一部を含む核酸断片をシリコンチップ、多孔性ガラスウエハーまたは膜のような固相保持体に固定できる。その後、固相保持体を固定された配列が特異的にハイブリダイズする条件下でサンプルからの総細胞性ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡに露出することができる。そのような固相保持体及びハイブリダイズ方法は例えば、Ｂｅａｔｔｉｅ,（１９９５）ＷＯ９５／１１７５５に開示されたように、広く利用可能である。無処理された細胞集団及び薬剤に露出された細胞集団のＲＮＡサンプルに特異的にハイブリダイズする特定プローブの能力を調べることによって、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８の配列を持つ蛋白質をコードする核酸の発現をアップ−またはダウン−調節する薬剤を同定する。
【００７１】
また、ｍＲＮＡの定量及び定性分析のためのハイブリダイズをＲＮａｓｅ保護アッセイ（即ち、RPA, Ma et al., (1996) Methods 10:273-238参照）を利用して遂行することができる。簡略には、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ及びファージ特異的ＤＮＡ依存的ＲＮＡ重合酵素プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡ重合酵素）を含む発現ビヒクルをファージプロモーター下流、ｃＤＮＡ分子の３’末端で線形化し、該線形化された分子を、続けて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるｃＤＮＡの標識されたアンチセンス転写物の合成のための鋳型として用いられる。その後、標識された転写物を８０％ホルムアミド、４０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．４、０.４Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中で、一晩、４５℃でインキュベートして分離されたＲＮＡの混合物（即ち、総または分画化されたｍＲＮＡ）にハイブリダイズする。その後、生成されたハイブリッドを４０μｇ／ｍＬ  リボヌクレアーゼＡ及び２μｇ／ｍＬ  リボヌクレアーゼを含む緩衝液で分解させる。外来蛋白質の不活性化及び抽出後、サンプルを分析用ウレア／ポリアクリルアミドゲル上にロードする。
【００７２】
別のアッセイで、本遺伝子産物の発現に影響を及ぼす薬剤を同定するために、本発明の遺伝子産物を生理的に発現する細胞または細胞株を、まず、確認する。そのように同定された細胞及び／または細胞株は適切な表面伝達メカニズム及び／または細胞質カスゲードと薬剤の外生的接触に関して転写装置の調節の精巧性が維持されるように必要な細胞機構を含むと予想される。さらに、そのような細胞または細胞株は本遺伝子産物にユニークな一つ以上の抗原性断片に融合された本遺伝子産物をコードする構造遺伝子の作動可能な非−解読５’プロモーター−含有末端を含む発現ビヒクル（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）で形質導入または形質感染され、上記断片は上記プロモーターの転写調節下にあり、分子量が自然発生ポリペプチドと区別されるか、さらに免疫学的に区別されるタグまたは別の検出可能なマーカーを含むポリペプチドとして発現される。そのような方法は当業界によく知られている（上記Sambrook eらを参照）。
【００７３】
その後、上記概括したような形質導入または形質感染された細胞または細胞株を適切な条件下で薬剤と接触させる。例えば、薬剤学的に許容可能な賦形剤中の薬剤を生理学的ｐＨのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理学的ｐＨのイーグルス平衡塩類溶液（ＢＳＳ）、ＰＢＳまたはＢＳＳ包含血清またはＰＢＳまたはＢＳＳ包含調節培地のような水溶性生理学的緩衝液及び／または３７℃でインキュベーション血清中の細胞と接触させる。上記条件は当業者によって必要に応じて調節することができる。細胞を薬剤と接触させた後、細胞を破砕し、溶菌物のポリペプチドを分画し、ポリペプチド分画をプールし、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈澱またはウェスタンブロット）によってさらに加工される抗体と接触させる。“薬剤−接触された”サンプルから分離された蛋白質プールを賦形剤のみを細胞と接触させた対照サンプルと比較して“薬剤−接触された”サンプルから免疫学的に生成された信号の増加または減少を薬剤の有効性を識別するのに用いる。
【００７４】
Ｉ．胃癌関連蛋白質の水準または少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定する方法
本発明の他の態様は、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２または１８のアミノ酸配列を持つ蛋白質、Ｍｓｔ１蛋白質または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を持つ蛋白質のような本発明のスプライス変異体のような本発明の蛋白質の水準や少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。そのような方法やアッセイは所望の活性をモニターリングするか、検出するいかなる手段が利用できる。
【００７５】
一つの形態で、非露出された対照細胞集団と比較して試験しようとする薬剤に露出された細胞集団と間の本発明の蛋白質の相対的量をアッセイすることができる。この形態で、特異的抗体のようなプローブを相異な細胞集団で蛋白質の差異を伴う発現をモニターリングするのに用いる。適切な条件及び時間の下で細胞株または集団を試験しようとする薬剤に露出させる。細胞溶菌物を露出された細胞株または集団及び対照、非露出された細胞株または集団から製造することができる。その後、細胞性溶菌物をプローブで分析する。
【００７６】
十分な長さである場合、または所望するか、免疫原性を増加させるために必要な場合、適切な担体に包接された本発明のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を利用して適切な免疫化プロトコルで適切な哺乳類宿主を免疫化することによって、抗体プローブを製造する。ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他の担体蛋白質のような担体との免疫原性包接体を製造する方法は当業界によく知られている。いくつかの状況では、例えば、カルボジイミド試薬を利用する直接的包接が効果的であり；他の状況では、Pierce Chemical Co.（Rockford, ＩＬ）により供給されるような結合試薬がハプテン（hapten）に対する接近可能性を提供するのに好ましいことがある。ハプテンペプチドは、例えば、担体に対する結合を容易にするためにシステイン残基によりアミノまたはカルボキシル末端で伸張されるか、システイン残基が中間に存在しうる。一般に免疫原の投与は当業界に知られているように適当なアジュバントを使用して適当な時間をかけた注射により遂行される。免疫化一定の間、抗体力価を求めて抗体形成の適宜性を決定する。
【００７７】
このような方法により生産されたポリクロナール抗血清が一部用途には満足できる一方、薬剤学的組成物としては、モノクロナール調製物を使用することが好ましい。所望のモノクロナール抗体を分泌する不滅化された細胞株を一般的に知られているように、KohlerとMilsteinの標準方法（(1975) Nature 256:495497）またはリンパ球または脾臓細胞の不滅化を遂行する変形方法を利用して製造できる。所望の抗体を分泌する不滅化された細胞株を抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドまたは蛋白質である免疫アッセイによってスクリーニングする。所望の抗体を分泌する適切な不滅化細胞培養物を同定すれば、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは複数液での生産によって培養することができる。
【００７８】
その後、所望のモノクロナール抗体を培養上清または複数上清から回収する。完全な抗体だけでなく免疫学的に有意な（抗原−結合）部分を含有するモノクロナール抗体の断片やポリクロナール抗血清を拮抗剤として用いられる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片のような、免疫学的に反応性の（抗原−結合）抗体断片の使用が、これら断片が全体免疫グロブリンほど免疫原的でないので、特に治療的次元で好ましい。
【００７９】
また、抗体または抗原−結合断片を組換え手段によって現在の技術を利用して製造できる。また、所望の部位の蛋白質に特異的に結合する抗体部位をヒト化抗体のような、多重種起源を有するキメラコンテキストで製造することができる。
【００８０】
上記方法でアッセイされる薬剤は無作為に選別されるか、合理的に選別または設計される。ここでは、本発明の蛋白質単独またはその結合された基質、結合相手などとの結合に関与する特異的な配列を考慮せずに、無作為に薬剤を選別した時、薬剤を無作為的に選別したという。無作為的に選別された薬剤の例は化学的ライブラリーまたはペプチド複合ライブラリー、または有機体の増殖ブロスを使用するものである。
【００８１】
ここで、標的部位の配列及び／または薬剤の作用と関連したその形態を考慮して非−無作為的根拠で薬剤を選択する時、薬剤を合理的に選別または設計したという。これらの部位を構成するペプチド配列を使用して薬剤を合理的に選別したり合理的に設計することができる。例えば、合理的に選別されたペプチド薬剤はアミノ酸配列がある機能的コンセンサス部位と同一であるか、その誘導体リンペプチドでありうる。
【００８２】
本発明の薬剤は、例えば、炭水化物だけでなくペプチド、小分子、ビタミン誘導体でありうる。優性陰性蛋白質、これらの蛋白質をコードするＤＮＡ、これらの蛋白質に対する抗体、これらの蛋白質のペプチド断片またはこれらの蛋白質の摸倣体（mimic）を細胞に導入し、機能に影響を及ぼすことができる。本明細書で“摸倣体”とは、親ペプチドと化学的に異なるが、親ペプチドと形態的機能的に類似する構造を提供するためにペプチド分子の一つまたはいくつかの部位を変形させたことを指す（参照 Grant, Molecular Biology and Biotechnology, Meyers, ed., pp.659-664、VCH Publishers, Inc., New York、1995）。当業者は本発明の薬剤の構造的性質に関して制限が無いことを容易に認識することができる。
【００８３】
本発明のペプチド薬剤は、当業界に知られたように、標準固相（または溶液相）ペプチド合成方法を利用して製造され得る。また、これらのペプチドをコードするＤＮＡは商業的に利用可能なオリゴヌクレオチド合成装置を利用して合成されるか、標準組換え生産システムを利用して組換え的に生産され得る。非−遺伝子−コードアミノ酸を含む場合、高相ペプチド合成を用いた生産が必要である。
【００８４】
別の相違する部類の本発明の薬剤は、本発明の蛋白質の決定的な位置と免疫反応する抗体である。抗体薬剤は適当な哺乳類対象を抗原性部位として抗体によって標的化しようとする蛋白質の部位を含有するペプチドで免疫化させることによって得られる。
【００８５】
Ｊ．胃癌関連蛋白質の発現または少なくとも一つの活性を調節する薬剤の使用
実施例で提供されるように、本発明の配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２または１８のアミノ酸配列を持つ蛋白質、及びＭｓｔ１または配列表の配列番号１４のアミノ酸配列を持つ蛋白質のようなＭｓｔ１スプライス変異体蛋白質及び核酸のような、本発明の蛋白質及び核酸は胃癌組織から差異的煮に発現される。アゴニストまたは拮抗剤のような、蛋白質の発現または蛋白質の少なくとも一つの活性をアップ−またはダウン−調節するか、変化させる薬剤が蛋白質の機能と活性関連された生物学的及び病理学的過程を調節するのに用いられる。
【００８６】
例えば、２種類型の薬物がＭｓｔ１、配列表の配列番号１３及び１４に関連した遺伝子を通じて作用するものと示されている（例えば、ジーンバンク登録番号ＮＭ_００６２８２、核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列表の配列番号１５及び１６として与えられている）。第１に、骨粗鬆症及び他の骨疾患を治療するのに使われる薬物であるビスホスホネートが破骨細胞上に直接作用してアポトーシス（apoptosis）の中Ｍｓｔ１のカスパーゼ切断を誘導するものと明らかになっている、第２に、サイトトリエニン（cytotrienin）Ａが白血病、乳癌及び肺癌を治療するのに使われる抗癌薬物である（米国特許第6,251,885号）。サイトトリエニンＡはサイトトリエニンＡ−誘導されたアポトーシスの中Ｍｓｔ１を活性化することが明らかになっている（Watabe et al., (2000) J Biol Chem 275:8766-8771）。
【００８７】
本明細書で、対象は本発明の蛋白質により媒介された病理学的または生物学的過程の調節が必要な、ある哺乳動物でありうる。用語“哺乳動物”は哺乳類網に属する個体に定義される。本発明はヒト対象を治療するのに特に、有用である。
【００８８】
病理学的過程は有害な影響を及ぼす生物学的過程のカテゴリーを指す。例えば、本発明の蛋白質の発現は胃細胞の増殖や過形成と関連がありうる。本明細書で、薬剤が上記過程の程度や重症度を減少させる時、薬剤は病理学的過程を調節するという。例えば、本発明の蛋白質の発現や少なくとも一つの活性をアップ−またはダウン−調節するか、変化させる薬剤の投与によって胃癌を防止するか、疾患進行を調節することができる。
【００８９】
本発明の薬剤は単独、または特定病理学的過程を調節する別の薬剤との配合物として提供され得る。例えば、本発明の薬剤は他の公知された薬物と併用投与できる。本明細書で、２薬剤を同時に投与するか、薬剤が同時に作用するようにする方式で独立的に投与する場合、２薬剤を併用投与するという。
【００９０】
本発明の薬剤は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮または口腔経路を通じて投与できる。あるいは、または同時に、投与は経口投与することができる。投与容量は受恵者の年齢、健康、体重、併用治療の種類、存在する場合、治療の頻度、及び所望の効果の性質によって左右され得る。
【００９１】
さらに、本発明は本発明の蛋白質発現または少なくとも一つの活性を調節する一つ以上の薬剤を含有する組成物を提供する。個々の要求は変化し、各成分の有効量の最適の範囲の決定は当業界の技術範囲内にある。典型的な容量は０.１〜１００μｇ／ｋｇ体重を含む。好ましい容量は０．１〜１０μｇ／ｋｇ体重を含む。最も好ましい容量は０．１〜１μｇ／ｋｇ体重を含む。
【００９２】
薬理学的に活性である薬剤と共に、本発明の組成物は活性化合物の作用部位への伝達のために薬剤学的に用いられ、活性化合物の製剤への加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適当な薬剤学的に許容される担体を含みうる。非経口投与のための適当な製剤は水溶性形態、例えば、水溶性塩形態の活性化合物の水溶液を含む。また、適切な油状注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与できる。適当な親油性溶媒またはビヒクルは脂肪油、例えば、ゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えば、エチルオールレートまたはトリグリセリドを含む。水性注射懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、ソルビトール、及び／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質を含有しうる。任意に、懸濁液はまた安定化剤を含有することができる。リポソームをまた薬剤を細胞に伝達するためにカプセル化するのに利用することもできる。
【００９３】
本発明に係る全身投与用薬剤学的製剤は腸内、非経口または局所投与のために製剤化され得る。実際に、３種類型の製剤すべてを同時に使用して活性成分の全身投与を達成することができる。
【００９４】
経口投与のために適当な製剤は硬質または軟質ゼラチンカプセル、丸剤、コーチング錠をはじめとする錠剤、エリキシル、懸濁剤、シロップまたは吸入剤及びそれらの放出制御形態を含む。
【００９５】
本発明の方法を実行する際に、本発明の化合物は単独または併用して、または他の治療または診断剤と併用して使うことができる。特定の好ましい態様で、本発明の化合物は一般的に許容される医療慣行に従って、これらの状態のために典型的に処方される他の化合物らと共に共同投与することができる。本発明の化合物はｉｎ  ｖｉｖｏで、普通、ヒト、羊、馬、牛、豚、犬、猫、ラットとマウスで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使われ得る。
【００９６】
Ｋ．形質転換動物
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７のｃＤＮＡ配列、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１８のポリペプチド配列をコードするオープン・リーディング・フレームまたは少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５個以上のアミノ酸残基の連続した配列を持つその断片に相応する突然変異、ノック−アウトまたは変形された遺伝子を含有する形質転換動物、また本発明に含まれる。形質転換動物は組換え、外生的またはクローニングされた遺伝物質が実験的に導入された遺伝的に変形された動物である。このような遺伝物質は多くの場合“トランスジーン”と言及される。トランスジーンの核酸配列、この場合、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７形態は、特定核酸配列が正常には発見されないゲノム位置またはトランスジーンの正常位置に導入することができる。トランスジーンは標的動物の種と同一であるか、他の種のゲノムから由来した核酸配列から構成され得る。
【００９７】
一部態様で、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７を含む遺伝子の全部または一部が欠失された形質転換動物が製作され得る。配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７に相応する遺伝子が一つ以上のイントロンを含有する場合、全体遺伝子−あらゆるエキソン、イントロン及び調節配列−が欠失され得る。あるいは、全体遺伝子より小さく欠失され得る。例えば、一つのエキソン及び／またはイントロンを欠失して、変形された形態の本発明の蛋白質を発現する動物を創製することができる。
【００９８】
用語“生殖細胞株形質転換動物”とは、遺伝子変形または遺伝的情報が生殖細胞株に導入され、形質転換動物が遺伝情報を子孫に伝達する能力を持つ形質転換動物を指す。そのような子孫が事実上、そのような変形または遺伝情報の一部または全部を持っているのであれば、これらも形質転換動物である。
【００９９】
変形または遺伝情報は受恵者が属する動物種に対して外来であるか、特定受恵者個体にのみ外来であるか、受恵者が既に所有している遺伝情報でありうる。最後の場合、変形されるか導入された遺伝子は元来遺伝子と異なるように発現され得る。
【０１００】
形質転換動物は形質感染、電気穿孔、微細注射、胚芽茎細胞での遺伝子標的化及び組換えウイルス及びレトロウイルス感染を含む様々な相異な方法によって生産され得る（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，６０２，３０７号；Mullins et al., (1993) Hypertension 22: 630-633; Brenin et al., (1997) Surg Onco l6: 99-110; Recombinant Gene Expression Protocols (Methodsin Molecular Biology、Vol.62), Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997）。
【０１０１】
活性化された発癌遺伝子配列を発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）；猿ＳＶ４０Ｔ−抗原を発現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現が欠如されたもの（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン機能不全を示すもの（米国特許第５,７２３，７１９号）；血圧調節に関与する少なくとも一つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然的に発生するアルツハイマー病を示す状態とより大きな類似性を示すもの（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞付着を媒介する能力が減少されたもの（米国特許第５，６０２，３０７号）；牛の成長ホルモン遺伝子を持つもの（Clutter et al., (1996) Genetics 143:1753-1760）；または、完全なヒト抗体反応を示すことができるもの（McCarthy (1997) Lancet 349:405）を含む数多くの組換えまたは形質転換マウスが生産されてきた。
【０１０２】
マウスとラットが大部分の形質転換実験で選択される動物として残っている反面、一部の場合、他の動物種を使用することが好ましいか、必要な場合もある。形質転換過程が羊、ヤギ、豚、犬、猫、猿、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、牛及びテンジクネズミをはじめとする様々な非−ネズミ類動物で成功的に使われてきた（例えば、Kim et al., (1997) Mol Reprod Dev 46:515-526; Houdebine, (1995) Reprod Nutr Dev 35:609-617; Petters (1994) Reprod Fertil Dev 6:643-645; Schnieke et al., (1997) Science 278:2130-2133; 及びAmoah, (1997) J Animal Science 75:578-585を参照したい）。
【０１０３】
核酸断片を組換え可能な哺乳類細胞に導入する方法は、多重核酸分子の同時−形質転換を好むどんな方法も使用できる。形質転換動物を生産する詳細な過程は米国特許第５,４８９,７４３号及び米国特許第５，６０２，３０７号の開示内容をはじめとして、当業者に容易に利用可能である。
【０１０４】
Ｌ．診断方法
本発明の遺伝子及び蛋白質は同じ類型の非−癌性組織と比較して胃癌組織と別の悪性新生物から差異的に発現されるので、本発明の遺伝子と蛋白質を用いて、そのような癌を診断するか、モニターリングするか、または疾患進行を追跡するのに使われ得る。本発明の核酸分子または蛋白質を利用して、胃癌を含む、癌を診断する一つの手段は生検標本のような、生きている対象から組織を得ることを含む。
【０１０５】
分子生物学的道具の使用は法廷技術で普遍的ものとなっている。例えば、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１７の配列の全部または少なくとも一部を含む核酸プローブを法廷／病理学的標本で核酸分子の発現を決定するのに使用することができる。さらに、転写プロファイル分析を遂行するいかなる手段によってでも核酸アッセイを遂行することができる。核酸分析に加えて、本発明の法廷医学的方法は本発明の蛋白質、特に配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０を含む蛋白質を標的化して、遺伝子のアップ−またはダウン−調節を決定することができる（Shiverick et al., (1975) Biochim Biophys Acta 393:124-133）。
【０１０６】
本発明の方法は組織をコラゲナーゼまたは他のプロテアーゼで処理して組織を細胞溶菌がよく起こるようにすることを含むことができる（Semenov et al., (1987) Biull Eksp Biol Med 104:113-116）。さらに、分析のために胃の違う部分から生検サンプルを得ることが可能である。
【０１０７】
本発明の核酸または蛋白質分子を検出するアッセイはあらゆる利用可能な形態であり得る。核酸分子の典型的なアッセイはハイブリダイズまたはＰＣＲ基礎形態を含む。本発明の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドの典型的なアッセイはｉｎ  ｓｉｔｕ結合アッセイなどのようなあらゆる利用可能な形態の抗体プローブの使用を含む（Harlow & Lane, Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988参照）。好ましい態様で、アッセイを適切な調節下で行う。
【０１０８】
また、上記方法は他の組織または器官、例えば、本発明の核酸分子の発現が検出される組織で疾患状態を探知するプロトコル及び方法を含む他の診断プロトコルに使われ得る。
【０１０９】
これ以上の記載無しで、上記記載及び下記例示的実施例を利用して、当業界で通常的技術を持った者は本発明の化合物を製造して利用し、請求された方法を実施できるものと信じる。従って、下記実施例は本発明の好ましい態様を具体的に示すが、残りの開示内容を任意の方法式で制限することとして解釈しない。
【０１１０】
実施例
実施例１ａ
進行性胃癌で差異を伴って発現されるｍＲＮＡの同定
材料及び方法
患者組織サンプルは進行性胃癌と診断された４７〜６８才の、４名の男子と１名の女子を含む、５名の韓国人患者から由来した。それぞれの患者に対して、組織を胃の２部分、胃癌及び癌がない部分から得てワンセットの生検サンプルを作った。それぞれの組織サンプルの組織学的分析を行い、サンプルを非−腫瘍及び腫瘍カテゴリーに分離した。
【０１１１】
若干の変形と共に、サンプル製造プロトコルはアフィメトリクス遺伝子チップ（Affymetrix Gene Chip）発現分析マニュアルに従った。まず、凍結組織をＳｐｅｘ  Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ  ６８００プリーザーミルを利用して粉末に粉砕した。その後、総ＲＮＡをトリゾール（Life Technologies）を使用して抽出した。各サンプルの総ＲＮＡ収率（平均組織重量  ３００ｍｇ）は２００−５００μｇであった。次に、ｍＲＮＡをオリゴテックスｍＲＮＡミディキット（Oligotex mRNA Midikit）（Qiagen）を利用して分離した。ｍＲＮＡを最終体積４００μＬに湧出されたので、エタノール沈澱段階が濃度を１μｇ／μＬにするのに必要であった。１−５μｇ のｍＲＮＡを利用して、二本鎖ｃＤＮＡをスーパースクリプトチョイスシステム（Super Script Choice system）（Gibco-BRL）を利用して作った。第１鎖ｃＤＮＡ合成をＴ７−（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドでプライミングした。その後、ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出して最終濃度１ μｇ／μＬ にエタノール沈殿した。
【０１１２】
２μｇ のｃＤＮＡから、ｃＲＮＡを標準過程によって合成した。ｃＲＮＡをビオチン標識するために、ヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰ及びＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（Enzo Diagnostics）を反応に添加した。３７℃ で６時間インキュベートした後、標識されたｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキットプロトコル（Qiagen）によって洗浄した。その後、ｃＲＮＡを９４℃で３５分間断片化した（５×断片化緩衝液：２００ｍＭ  トリス−アセテート（ｐＨ８．１）、５００ｍＭ  ＫＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ）。
【０１１３】
５５μｇの断片化ｃＲＮＡを４５℃ ハイブリダイズオーブンで６０ｒｐｍ、２４時間アフィメトリクスヒトゲノムＵ９５及びＵ１３３セットアレイ上でハイブリダイズした。チップを洗浄してアフィメトリクスフルイディクスステーションＪＥ（Affymetrix fluidics stations）でストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ）（Molecular Probes）で染色した。染色を増幅するために、ＳＡＰＥ溶液を染色段階中間に抗−ストレプトアビジンビオチン化抗体（Vector Laboratories）と共に添加した。プローブアレイに対するハイブリダイズを蛍光スキャニング（Hewlett Packard Gene Array Scanner）により検出した。ハイブリダイズとスキャニングに次いで、マイクロアレイ映像を品質管理のために分析し、ハイブリダイズ信号で主要チップ欠陥または異常を探し出した。全てのチップがＱＣを通過した後、データをＵ９５に対してアフィメトリクスマイクロアレイスイート（ｖ４．０）、及びＬＩＭＳ（ｖ１．５）またはＵ１３３に対してアフィメトリクスマイクロアレイスイート（ｖ５．０）、及びＬＩＭＳ（ｖ３．０）を使用して分析した。
【０１１４】
腫瘍及び非腫瘍の胃サンプル間の遺伝子の差異を伴う発現を、下記統計学的方法を使用してアフィメトリクスヒト遺伝子チップセット、Ｕ９５及びＵ１３３を利用して決定した。（１）それぞれの遺伝子に対して、Ｕ９５に対するアフィメトリクス遺伝子チップ平均差をそれぞれの遺伝子チップ要素に対して“不在”（＝未検出）、“存在”（＝検出）または“警戒”（＝不在なのか存在なのか不明確である）コールを作るアフィメトリクスマイクロアレイスイート（ｖ４．０）によって決定した。Ｕ１３３に対した信号値を不在、存在または警戒コールを作るアフィメトリクスマイクロアレイスイート（ｖ５．０）によって決定した。（２）腫瘍及び非腫瘍のいずれの胃サンプルで少なくとも１０％の存在コール及び腫瘍または非腫瘍の胃サンプル群で少なくとも４０％の存在コールの基準を利用し、遺伝子セットを追加分析のために選別した。（３）Ｕ９５データの平均差異値に基づいて、遺伝子セットを高発現群と低発現群の２群に分けた。高発現の群は腫瘍及び非腫瘍サンプルの全部で５以上の平均差異値を持つ遺伝子を包含した。残りの遺伝子は低発現群に含まれた。平均差異値を高発現群に対してはログスケールに変換したが、低発現群に対しては変換しなかった。Ｕ１３３データに対しては、信号値を全て発現水準にもかかわらずログスケールに変換させた。（４）分散分析（ＡＮＯＶＡ）方法をデータ分析のために使用した（Steel et al., Principles and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach, Third Ed., McGraw-Hill, 1997）。最終分析前に、ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ接近法を外れ検出のために使用した。一度に一つのサンプルをＡＮＯＶＡ分析から除外して、分析から特定サンプルの除去が最終結果に有意な影響を及ぼすのか否かを決定した。その場合には、その特定サンプルを最終分析から除いた。外れ検出後、０．０５以下のｐ−値で差異に伴って発現される遺伝子リストをＡＮＯＶＡによって作成した。アフィメトリクス遺伝子チップＵ１３３チップセットからのデータを類似の過程で分析した。（５）二つの付加的な基準をＵ９５から作られた遺伝子リストで遺伝子数を減少させるために使用した。第１に、幾何平均値を非腫瘍対照群サンプルと腫瘍疾患群サンプルと間に比較して発現水準で少なくとも２．０〜倍増加または減少を示す遺伝子セットを得た。第２に、変化配水とｐ−値の比率は４００以上でなければならない。
【０１１５】
結果及び分析
ａ）ＬＢＦＬ３０１遺伝子ファミリー：
チップデータの分析結果、正常胃組織からのサンプルと比較して胃癌サンプルでマーカーＬＢＦＬ３０１の発現が有意にアップ−調節されるものと示された（１３．７５−倍；ｐ＝０．０１７２）。これらの結果はＬＢＦＬ３０１のアップ−調節が胃癌を診断することができることを示す。
ＬＢＦＬ３０１（配列表の配列番号１または３）の発現水準は、それぞれアフィメトリクス  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）  Ｕ９５及びＵ１３３上のチップ配列断片番号４８７７４_ａｔ及び２２５６８１_ａｔにより測定できる。正常対照組織と比較した様々な悪性新生物での４８７７４_ａｔ及び２２５６８１_ａｔの発現水準を変化倍数と変化の方向（アップ−またはダウン−調節）も表示されている表１ａに示した。１．５超過の変化倍数が有意とみなされた。
【表１】
2006508644.tif 000002
【表２】
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【０１１６】
表２は組織類型によるアフィメトリクス遺伝子チップを用いた実験から収集された差異を伴う発現データを要約したものである。チップをスキャニングし、全部名称が“An Automated Computer-based Algorithm for Organizing and Mining Gene Expression Data Derived from Biological Samples with Complex Clinical Attributes”であり、皆本明細書に参照として引用される関連した出願６０／３３１，１８２、６０／３８８，７４５及び６０／３９０，６０８に記載されているＧＸスキャンアルゴリズムによってデータを分析した。
【表３】
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【０１１７】
チップ配列断片番号４８７７４_ａｔに対するサンプル結合により決定される遺伝子チップ発現結果を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ（Perkin-Elmer）を利用する定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検証した。特異的アフィメトリクス断片（４８７７４_ａｔ）のｓｉｆ配列から設計されたＰＣＲプライマーをアッセイに使用した。それぞれのＲＮＡサンプルの標的遺伝子（１０ｎｇの総ＲＮＡ）を外生的にスパイクされた参照遺伝子に相対的にアッセイした。この目的のために、テトラサイクリン耐性遺伝子を外生的に添加されたスパイクとして使用した。この接近法は一定の量のＴｅｔスパイクサイクル閾値（Ｃｔ）値に対して相対的な標的ｍＲＮＡのＣｔ値によって測定される相対的発現を提供する。このサンプルパネルはＵ９５遺伝子チップ上での正常及び進行性胃癌組織ＲＮＡを含む。また、遺伝子チップ上で分析されないいくつかの新しいサンプルを定量的ＲＴ−ＰＣＲによる発現検証のために使用した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは進行性胃癌で観察されたＬＢＦＬ３０１のアップ−調節を確認することができた。
【０１１８】
ｂ）ＬＢＦＬ３０４遺伝子ファミリー：
チップデータの分析結果マーカーＬＢＦＬ３０４の発現が正常胃組織からのサンプルと比較し、ＡＧＣサンプルから有意的にアップ−調節されることが示された（Ｕ９５に対し３．５−倍、ｐ＝２．５４×１０−３；Ｕ１３３に対し６．１３倍、ｐ＝２．４３×１０−４）。このデータはＬＢＦＬ３０４のアップ−調節が胃癌を診断することができることを示す。
ＬＢＦＬ３０４（配列表の配列番号５、７、９または１１）の発現水準をアフィメトリクス  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）  Ｕ９５条のチップ配列断片番号３５８３２_ａｔ及びアフィメトリクス  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）  Ｕ１３３条の２１２３４４_ａｔ、２１２３５３_ａｔ、及び２１２３５４_ａｔによって測定することができる。正常対照組織と比較した様々な悪性新生物での５１２６３_ａｔ、２１２３４４_ａｔ、２１２３５３_ａｔ、及び２１２３５４_ａｔの発現水準を変化倍数と変化の方向（アップ−及びダウン−調節）も表示されている表１ｂに示した。１．５超過の変化倍数が有意と見なされた。
【０１１９】
チップ配列断片番号３５８３２_ａｔに対したサンプル結合により決定される、ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現結果を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ（Perkin-Elmer）を利用する定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）によって検証した。特定Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（３５８３２_ａｔ）の配列情報ファイルから設計されたＰＣＲプライマーをアッセイに使用した。それぞれのＲＮＡサンプル（１０ｎｇの総ＲＮＡ）の標的遺伝子を外生的にスパイク参照遺伝子に対して相対的にアッセイした。この目的のために、テトラサイクリン耐性遺伝子を外生的に添加されるスパイクとして使用した。この接近法は一定量のＴｅｔスパイクサイクル閾値（Ｃｔ）に対する標的ｍＲＮＡのＣｔ値によって測定される相対的発現を提供する。サンプルパネルはＵ９５  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ上で分析された正常胃（正常）及び進行性胃癌（ＡＧＣ）組織ＲＮＡを含む。また、ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で分析されないいくつかの新しいサンプルをＱ−ＲＴ−ＰＣＲによる発現検証のために使用した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは正常胃生検サンプルに比べてＡＧＣで観察されたＬＢＦＬ３０４のアップ−調節を確認することができた。
【表４】
2006508644.tif 000005
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
2006508644.tif 000010
【表１０】
2006508644.tif 000011
【表１１】
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【表１２】
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【０１２０】
ｃ）ＬＢＦＬ３０５遺伝子ファミリー：
チップデータの分析結果、正常胃組織からのサンプルと比較して胃癌サンプルでマーカーＬＢＦＬ３０５の発現が有意にアップ−調節されることが示された（Ｕ９５  ＧｅｎｅＣｈｉｐを利用して２．２− 倍；ｐ＝０．００５１；Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐを利用して２．１４倍、ｐ＝０．０１０９）。これらの結果はＬＢＦＬ３０５のアップ−調節が、胃癌を診断することができることを示す。
【０１２１】
ＬＢＦＬ３０５（配列表の配列番号１３）の発現水準は、それぞれアフィメトリクス   ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５及びＵ１３３条のチップ配列断片番号５３８５８_ａｔ及び２２５３６４_ａｔによって測定することができる。差異を伴う発現データを組織類型によるアフィメトリクス遺伝子チップを用いた実験らから収集し、皆名称が“An Automated Computer-based Algorithm for Organizing and Mining Gene Expression Data Derived from Biological Samples with Complex Clinical Attributes”であり、皆本明細書に参照として引用される関連した出願６０／３３１，１８２、６０/３８８，７４５及び６０/３９０，６０８に記載されているＧＸスキャンアルゴリズムにより分析した。正常対照組織と比較した様々な悪性新生物での５３８５８_ａｔ及び２２５３６４_ａｔの発現水準は変化倍数と変化の方向（上向き−または下向−調節）も表示されている表１ｃに示した。１．５超過の変化倍数が有意と見なされた。
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【０１２２】
チップ配列断片番号５３８５８_ａｔに対するサンプル結合により決定される、遺伝子チップ発現結果を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ（Perkin-Elmer）を利用する定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）によって検証した。特定Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（５３８５８_ａｔ）の配列情報ファイルから設計されたＰＣＲプライマーをアッセイに使用した。それぞれのＲＮＡサンプル（１０ｎｇの総ＲＮＡ）の標的遺伝子を外生的にスパイク参照遺伝子に相対的にアッセイした。この目的のために、テトラサイクリン耐性遺伝子を外生的に添加されるスパイクとして使用した。この接近法は一定量のＴｅｔスパイクサイクル閾値（Ｃｔ）に対する標的ｍＲＮＡのＣｔ値段によって測定される相対的発現を提供する。サンプルパネルはＵ９５  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ上で分析された正常胃（正常）及び進行性胃癌（ＡＧＣ）組織ＲＮＡを含む。また、ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で分析されないいくつかの新しいサンプルをＱ−ＲＴ−ＰＣＲによる発現検証のために使用した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは正常胃生検サンプルに比べてＡＧＣで観察されたＬＢＦＬ３０５のアップ−調節を確認することができた。
【０１２３】
ｄ）ＬＢＦＬ３０６遺伝子ファミリー：
チップデータの分析結果、正常胃組織からのサンプルと比較して胃癌サンプルでマーカーＬＢＦＬ３０６の発現が有意にアップ−調節されることが示された（Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐを利用して３．２７倍、ｐ=０．００２１７）。これらの結果はＬＢＦＬ３０６のアップ−調節が胃癌を診断できることを示す。
【０１２４】
ＬＢＦＬ３０６（配列表の配列番号１７、１９または２１）の発現水準はそれぞれアフィメトリクス   ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）  Ｕ９５及びＵ１３３上のチップ配列断片番号５７８６１_ａｔ及び２２３２５１_ｓ_ａｔによって測定できる。差異を伴う発現データを組織類型によるアフィメトリクス遺伝子チップを用いた実験から収集し、皆名称が“An Automated Computer-based Algorithm for Organizing and Mining Gene Expression Data Derived from Biological Samples with Complex Clinical Attributes”であり、皆本明細書に参照として引用される関連した出願６０/３３１，１８２、６０／３８８，７４５及び６０/３９０，６０８に記載されているＧＸスキャンアルゴリズムによって分析した。正常対照組織と比較した様々な悪性新生物での２２３２５１_ａｔの発現水準は変化倍数と変化の方向（上向き−または下向−調節）も表示されている表１ｄに示されている。１．５超過の変化倍数が有意に見なされた。その結果、ＬＢＦＬ３０６の発現が胃癌だけでなく膀胱、結腸、食道、腎臓、大網、膵臓、直腸及び軟質組織でアップ−調節され、この遺伝子ファミリーの発現が乳房、子宮内膜及び小腸癌でダウン−調節されることが示された。
【０１２５】
配列表の配列番号１７または１９または２１を持つ全長ｃＤＮＡをＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒｃ（登録商標）ＤＮＡ陽性選別システムキット（Invitrogen）を利用して得た。生成されたｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに転換させ、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ１０Ｂ）を形質転換するために使用し、最長ｃＤＮＡをスクリーニングした。陽性選別を遺伝子−特異的プライマーを用いたＰＣＲによって確認した後、ｃＤＮＡクローンをＤＮＡ配列分析した。
ノーザンブロット分析を遂行してＬＢＦＬ３０６に相応するｍＲＮＡ転写体の大きさを決定した。様々なヒト組織からの総ＲＮＡを含有するノーザンブロットを使用して（ＣｌｏｎＴｅｃｈ  Ｈ１２）、ＬＢＦＬ３０６−ＧＥ２（配列表の配列番号２１）を無作為プライマー方法によって放射性標識とブロットをプローブするために使用した。ブロットを６５℃でＣｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液でハイブリダイズし、室温で０．１％  ＳＤＳを含有する０．１Ｘ  ＳＳＣで洗浄した。ノーザンブロットは大きさが約１．５ｋｂであるこの遺伝子の単一転写体を示した。これはやはり約１．５ｋｂである全長クローンの挿入物大きさに相応するものである。
【０１２６】
チップ配列断片番号２２３２５１_ｓ_ａｔに対するサンプル結合により決定される、ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現結果を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）
アッセイ（Perkin-Elmer）を利用する定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）によって検証した。特定Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（２２３２５１_ｓ_ａｔ）の配列情報ファイルから設計されたＰＣＲプライマーをアッセイに使用した。それぞれのＲＮＡサンプル（１０ｎｇの総ＲＮＡ）の標的遺伝子を外生的にスパイク参照遺伝子に相対的にアッセイした。この目的のために、テトラサイクリン耐性遺伝子を外生的に添加されるスパイクとして使用した。この接近法は一定量のＴｅｔスパイクサイクル閾値（Ｃｔ）に対する標的ｍＲＮＡのＣｔ値によって測定される相対的発現を提供する。サンプルパネルはＵ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で分析された正常胃及び進行性胃癌組織ＲＮＡを含む。また、ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で分析されないいくつかの新しいサンプルをＱ−ＲＴ−ＰＣＲによる発現検証のために使用した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは正常胃生検サンプルに比べてＡＧＣで観察されたＬＢＦＬ３０６のアップ−調節を確認することができた。
【表１６】
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【０１２７】
実施例２
差異を伴う発現ｍＲＮＡ種に相応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＢＦＬ３０１、ＬＢＦＬ３０４、ＬＢＦＬ３０５及びＬＢＦＬ３０６）のクローニング
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１７、１９または２１の 全長ｃＤＮＡをオリゴ−プリング方法によって得た。簡略には、遺伝子−特異的オリゴをＬＢＦＬ３０１、ＬＢＦＬ３０４、ＬＢＦＬ３０５またはＬＢＦＬ３０６の配列に基づいて設計した。オリゴをビオチンで標し、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの過程によって完全分化された胃アデノカルチノーマライブラリー（ＮＣＩ  ＣＧＡＰ  Ｇａｓ４）またはＪｕｒｋａｔ細胞から製造されたライブラリーから２μｇの一本鎖プラスミドＤＮＡ（組換え  ｃＤＮＡ）とハイブリダイズするのに使用した。ハイブリダイズｃＤＮＡをストレプトアビジン−包接されたビーズにより分離して加熱し、溶出した。溶出されたｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ１０Ｂ）を形質転換するのに使用して最長ｃＤＮＡをスクリーニングした。陽性選別を遺伝子−特異的プライマーを利用するＰＣＲによって確認した後、ｃＤＮＡクローンをＤＮＡ配列分析した。
【０１２８】
上記検出された差異を伴う調節されたｍＲＮＡに相応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１７、１９及び２１に示した。配列表の配列番号１で、ｃＤＮＡは１２７２個塩基対（１２５５個塩基対及びポリＡ  尾部）を含む。配列表の配列番号３で、ｃＤＮＡは１３５５個塩基対（１３３４個塩基対及びポリＡ  尾部）を含む。ＬＢＦＬ３０４に対するいくつかの可能な開始コドンがあり、これらを配列表の配列番号５、７、９及び１１で指定された。配列表の配列番号１３のｃＤＮＡは６４０５個塩基対（６３６９個塩基対及びポリＡ  尾部）を含む。配列表の配列番号１７に相応するｃＤＮＡは１２９９個塩基対（１２８４個塩基対及びポリＡ  尾部）を含む。配列表の配列番号１９に相応するｃＤＮＡは２４５１個塩基対（２４３５個塩基対及びポリＡ  尾部）を含む。配列表の配列番号２１に相応するｃＤＮＡは１１９４個塩基対（１１７８個塩基対及びポリＡ  尾部）を含む。
【０１２９】
配列表の配列番号１、ヌクレオチド１３１−８５９（終止コドンを含んで１３１−８６２）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは２４３個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号１によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示した。
【０１３０】
配列表の配列番号３、ヌクレオチド１７４−５８４（終止コドンを含んで１７４−５８７）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは１３７個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号３によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号４に示した。配列表の配列番号４の蛋白質配列は配列表の配列番号４の最後１３個アミノ酸はユニークな反面、最初１２４個アミノ酸は配列表の配列番号２のものと同様である。図１に示すように、配列表の配列番号４に相応する蛋白質配列の末端はオープン・リーディング・フレームで終止コドンを導入する４５−ｂｐ挿入物によって生成される。
【０１３１】
配列表の配列番号２と４はキモトリプシンセリンプロテアーゼファミリー信号（Ｓ１）及びＮＵＤＩＸヒドララーゼファミリー信号と若干似ている。キモトリプシンセリンプロテアーゼファミリー信号（Ｓ１）は３個のドメインを含み、第３番目ドメインは配列表の配列番号４にない。また、２つの蛋白質はいずれもコラーゲン三重螺旋繰返領域を含む。
【０１３２】
図２と３は配列表の配列番号２と４のアミノ酸配列の疎水性分析結果を示している。親水性部位は上記したように、抗原性ペプチドを製造するのに使用することができる。両方の配列はいずれも長さが約３０個アミノ酸であり、最も疎水性である部分がアミノ酸番号２０周囲で示される疎水性Ｎ−末端を持つ。ＳＰＳｃａｎ（ＧＣＧ  Wisconsin Package）による追加蛋白質配列分析結果、アミノ酸位置１−３０からの疎水性部位が分泌信号ペプチドであると明らかになった。
【０１３３】
配列表の配列番号５、ヌクレオチド３８−８９２（終止コドンを含む３８−８９５）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは２８５個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号５によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号６に示した。配列表の配列番号６はキモトリプシンセリンプロテアーゼファミリー信号（Ｓ１）と若干似ている。図４は配列表の配列番号６のアミノ酸配列の疎水性分析結果を見せている。親水性部位は上記したように、抗原性ペプチドを製造するのに使用することができる。
【０１３４】
配列表の配列番号７、ヌクレオチド５３−８９２（終止コドンを含む５３−８９５）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは２８０個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号７によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号８に示した。配列表の配列番号８の蛋白質配列は配列表の配列番号８が配列表の配列番号６のＮ−末端で、最初５個のアミノ酸が欠如されていることを除いては、配列表の配列番号６のものと同様である。
【０１３５】
配列表の配列番号９、ヌクレオチド６５−８９２（終止コドンを含む６５−８９５）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは２７６個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号９によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号１０に示した。配列表の配列番号１０の蛋白質配列は配列表の配列番号１０が配列表の配列番号６のＮ−末端の最初９個アミノ酸が欠如されていることを除いては、配列表の配列番号６のものと同様である。
【０１３６】
配列表の配列番号１１、ヌクレオチド９２−８９２（終止コドンを含む９２−８９５）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは２６７個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号１１によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号１２に示した。配列表の配列番号１２の蛋白質配列は配列表の配列番号１２が配列表の配列番号６のＮ−末端の最初１８個アミノ酸が欠如されていることを除いては、配列表の配列番号６のものと同様である。
【０１３７】
配列表の配列番号１３、ヌクレオチド４９−１４３４（終止コドンを含む４９−１４３７）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは４６２個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号１３によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号１４に示した。
【０１３８】
ＢＬＡＳＴ検索結果と２配列間の高い水準の相同性はＬＢＦＬ３０５がＭｓｔ１（例えば、配列表の配列番号１６）のスプライス変異体であることを暗示する。配列されたアンダーラインのアミノ酸残基は配列表の配列番号１４と配列表の配列番号１８の差異点を示す。Ｍｓｔ１の公開された研究に基づいて、配列表の配列番号１４はキナーゼドメイン（アミノ酸位置１−２９９)（Creasy et al., (1996) J Biol Chem 271:21049-21053）、次いで、キナーゼ機能を調節する作用をする調節ドメイン（アミノ酸位置３００−４６２）（Creasy et al., (1996) J Biol Chem 271: 21049-21053）を含む。また、アミノ酸位置３２６−３２７と３４９−３５０と間に二つのカスパーゼ切断位置（Graves et al., (2001) J Biol Chem 276:14909-14915）と、一つのＮＥＳドメイン（アミノ酸位置３６１−３７０)（Ura et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 98:10148-10153）が存在する。配列表の配列番号１６と比較して、配列表の配列番号１４は第２のＮＥＳ領域（配列表の配列番号１６のアミノ酸位置４４１−４５１）（Ura et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 98:10148-10153）がない。また、配列表の配列番号１４は自己−結合のために要求される（Creasy et al., (1996) J Biol Chem 271:21049-21053）多量体化領域（Mst１のアミノ酸位置４３１−４８７）を含まない。面白いことに、ＮＯＲＥ、推定Ｒａｓ作用因子（Khokhlatchev et al., Curr Biol 12:253-265）との相互作用のために要求されるＭｓｔ１の部位（配列表の配列番号１６のアミノ酸位置４４９−４８７）は配列表の配列番号１４には存在しない。
図５は配列表の配列番号１４のアミノ酸配列の疎水性分析結果を示す。親水性部位は上記したように抗原性ペプチドを製造するのに使われる。
【０１３９】
配列表の配列番号１７、ヌクレオチド７５−５７２（終止コドンを含む７５−５７５）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは１６６個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号１７によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号１８に示した。図７は配列表の配列番号１８のアミノ酸配列の疎水性分析結果を示す。親水性部位は上記したように抗原性ペプチドを製造するのに使われる。
配列表の配列番号１９、ヌクレオチド７８−１３３７(終止コドンを含む７８−１３４０）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは４２０個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号１９によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号２０に示した。図８は配列表の配列番号２０のアミノ酸配列の疎水性分析結果を示す。親水性部位は上記したように抗原性ペプチドを製造するのに使われる。
【０１４０】
配列表の配列番号１９、ヌクレオチド７８−７３７（終止コドンを含む７８−７４０）のｃＤＮＡヌクレオチド配列内のオープン・リーディング・フレームは２２０個アミノ酸の蛋白質をコードする。配列表の配列番号２１によってコードされる予想される蛋白質に相応するアミノ酸配列は配列表の配列番号２２に示した。図９は配列表の配列番号２２のアミノ酸配列の疎水性分析結果を示す。親水性部位は上記したように抗原性ペプチドを製造するのに使われる。
ＧＣＧウィスコンシンパッケージソフトウェアを用いたｈｍｍｅｒｐｆａｍによって決定されたように、３ＬＢＦＬ３０６クローン、ＥＦ３（配列表の配列番号１７）、ＧＣ７（配列表の配列番号１９）及びＧＥ２（配列表の配列番号２１）は皆多重アンキリン（ankyrin）繰返を含む。アンキリン繰返はＥＦ３、ＧＣ７及びＧＥ２でアミノ酸残基５７〜８９、９１〜１２３及び１２４〜１５６のである。これらの三つアンキリン繰返に加えて、ＧＣ７は残基１５７〜１９０に付加的なアンキリン繰返を含む。
【０１４１】
ノーザンブロットによる分析をＬＢＦＬ３０１、ＬＢＦＬ３０４及びＬＢＦＬ３０５に相応するｍＲＮＡ転写体の大きさを決定するために行った。様々なヒト組織からの総ＲＮＡを含有するノーザンブロット（ClonTech）を使用して、クローンＣＨ４（配列表の配列番号３）、クローンＥＡ１０（配列表の配列番号５、７、９または１１）及びＬＢＦＬ３０５（配列表の配列番号１３）を無作為プライマー方法によって放射性標識し、ブロットをプローブ化するのに使用した。ブロットを６５℃でＣｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液中でハイブリダイズし、室温で０．１％  ＳＤＳ含有０．１Ｘ  ＳＳＣで洗浄した。ノーザンブロットはそれぞれの遺伝子に対して大きさが約１．５７ｋｂ（ＬＢＦＬ３０１）、２．６ｋｂ（ＬＢＦＬ３０４）及び７．９５ｋｂ（ＬＢＦＬ３０５）である単一転写体を示す。これらはクローンＣＨ４（１．３５５ｋｂ）、クローンＥＡ１０（配列表の配列番号５、７、９または１１）、及びＬＢＦＬ３０５（６.５ｋｂ）の挿入物の大きさに相応する。クローンＡＤ１２（配列表の配列番号１）の配列をプローブとして使用する場合、クローンＡＤ１２中の挿入物大きさ１．２７２ｋｂに相応する１．４４ｋｂの転写物が検出された。
【０１４２】
様々な正常組織でＬＢＦＬ３０１、ＬＢＦＬ３０４、ＬＢＦＬ３０５またはＬＢＦＬ３０６の発現を検出するために、電子ノーザンブロット（ｅ−ノーザン）を下記のように製造した。実施例１のチップと方法を利用して、表３に収録されたように、正常組織パネルからのｍＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５ヒトＧｅｎｅＣｈｉｐとハイブリダイズした。実験結果を表３に示した。それぞれの組織類型に対して、存在または不在にてコールサンプルの数をサンプルセット中のサンプル総数と共に示した。また、各組織類型で中央値と第２５番目及び第７５番目の百分位数を収録した。面白いことに、この遺伝子が胃癌でアップ−調節にされるが、ＬＢＦＬ３０１またはＬＢＦＬ３０４の発現は大部分の正常胃サンプルでは検出されなかった。また、ＬＢＦＬ３０５とＬＢＦＬ３０６は大部分の試験された正常胃サンプルで発現されるが、発現水準が大部分の試験された他の正常組織に比べて低かった。この観察はＬＢＦＬ３０１、ＬＢＦＬ３０４、ＬＢＦＬ３０５またはＬＢＦＬ３０６が下記で議論されるように、胃癌を検出またはスクリーニングするための診断剤やマーカーとして用いられることを指す。ＬＢＦＬ３０１の発現水準は皮膚組織、胎盤、脂肪、動脈、膀胱、骨、乳房及び軟質組織順で高いことが示された。この遺伝子は肝や脳と心臓の大部分の部位で検出されないが、低い水準の発現が表３ａに収録された大部分の他の組織で検出された。ＬＢＦＬ３０４の発現水準は動脈、大網、子宮、子宮内膜、子宮筋層と前立腺で最も高いことが示された。ＬＢＦＬ３０５の発現水準は兔疫体系の器官（白血球細胞、リンパ節、脾臓及び甲状腺）に次いで、虫垂、動脈、骨、肺で最も高いことが示された。依然として低い水準の発現が表３ｃに収録された大部分の他の組織で検出された。ＬＢＦＬ３０６の発現水準は免疫体系器官（例えば、リンパ節、脾臓及び甲状腺）及び生殖体系（例えば、乳房、子宮内膜、前立腺及び子宮）で最も高が示された。
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【０１４３】
実施例３
胃癌スクリーニングのためのＬＢＦＬ３０１、ＬＢＦＬ３０４、ＬＢＦＬ３０５またはＬＢＦＬ３０６ｍＲＮＡの検出
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１７、１９または２１に相応するｍＲＮＡの発現水準を実施例１に記載したように、即ち、遺伝子チップ上でｍＲＮＡサンプルをスクリーニングすることによって、または実施例２に記載したように、即ち、ノーザンブロット上のｍＲＮＡサンプルをスクリーニングすることによって、胃組織生検サンプルで決定する。あるいは、悪性または陽性状態の非−胃過増殖組織からのサンプルも分析する。胃癌患者と健常人からの胃組織サンプルを陽性及び陰性対照として使用することができる。遺伝子発現を分析するどんな手段を使用しても、正常対照のものより高い発現水準は、胃癌または胃癌発病可能性の指標である。
【０１４４】
本発明を、上記実施例を参照して詳細に記述したが、本発明の要旨を逸脱しなない限り、様々な変形が加えることができることを理解するべきである。従って、本発明は下記請求範囲によってのみ制限される。この出願に引用された特許、特許出願及び公開文献らは、いずれもその全体を以って参照としてここに引用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】遺伝子ＬＢＦＬ３０１のスプライス変異体である配列表の配列番号１（クローン  ＡＤ１２）及び配列表の配列番号３（クローン  ＣＨ４）の配列差を示すダイヤグラムである。
【図２】ＬＢＦＬ３０１、変異体ＡＤ１２のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質（配列表の配列番号２）の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【図３】ＬＢＦＬ３０１、変異体ＣＨ４のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質（配列表の配列番号４）の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【図４】ＬＢＦＬ３０４の最長オープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質(配列表の配列番号６）の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【図５】ＬＢＦＬ３０５のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質(配列表の配列番号１４）の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【図６】３個のＬＢＦＬ３０６クローンの相対的配列位置を示すものである。
【図７】クローン番号ＬＢＦＬ３０６−ＥＦ３のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質（配列表の配列番号１８）の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【図８】クローン番号ＬＢＦＬ３０６−ＧＣ７（配列表の配列番号２０）のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【図９】クローン番号ＬＢＦＬ３０６−ＧＥ２(配列表の配列番号２２）のオープン・リーディング・フレームによりコードされる蛋白質の疎水性プロットである。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ及びＧｏｌｄｍａｎなどの方法によって分析を行った。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月11日(2005.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2006508644.tif 000092
2006508644.tif 000093
2006508644.tif 000094