(57)【要約】本発明は、Ｖａｖ阻害因子の使用を含む、細胞、組織または器官の同種または異種移植のレシピエントにおける急性または慢性移植片拒絶、炎症または自己免疫疾患または悪性増殖性疾患の予防または処置方法を提供する。さらに提供されるのは、Ｖａｖ阻害因子、Ｖａｖ阻害因子を含む用途、医薬組成物および治療的組合せ、およびそれらのスクリーニング方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞、組織または器官の同種または異種移植のレシピエントにおける急性または慢性移植片拒絶、（ｉｉ）それを必要としている対象における炎症または自己免疫疾患、（ｉｉｉ）血管損傷後の血管移植片狭窄、再狭窄および／または血管閉塞、または、（ｉｖ）それを必要としている対象における悪性増殖性疾患の予防または処置方法であって、レシピエントに治療的有効量のＶａｖタンパク質阻害因子を投与する段階を含む方法。
【請求項２】
細胞、組織または器官の同種移植のレシピエントにおける急性または慢性移植片拒絶の予防、処置または阻害用、または、炎症または自己免疫疾患または悪性増殖性疾患の処置用の医薬を製造するための、Ｖａｖタンパク質阻害因子の使用。
【請求項３】
Ｖａｖタンパク質がＶａｖ−１である、請求項１または請求項２に記載の方法または使用。
【請求項４】
Ｖａｖタンパク質阻害因子、および、免疫抑制剤、免疫調整剤または抗炎症剤または化学療法剤から選択される少なくとも１つの第２の物質を含む治療的組合せ。
【請求項５】
物質をＶａｖ１またはＶａｖ２阻害因子として同定するためのスクリーニング方法であって、ＲｈｏまたはＲａｃＧＴＰアーゼのグアニンヌクレオチド交換の速度を、（ａ）その物質、および（ｂ）Ｖａｖ１またはＶａｖ２、またはそれらの活性なフラグメントもしくは突然変異体の存在下で判定する段階を含み、その物質の存在下でのグアニンヌクレオチド交換の速度の低下は、その物質がＶａｖ１またはＶａｖ２阻害因子であることを示すものである、方法。
【請求項６】
（ａ）その物質、および（ｂ）Ｖａｖ１またはＶａｖ２、またはそれらの活性なフラグメントもしくは突然変異体の存在下で、ＧＴＰアーゼにおける蛍光標識化グアニンヌクレオチドと非標識化グアニンヌクレオチドの交換速度を測定する段階を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
（ｉ）ＧＴＰアーゼを蛍光標識化グアニンヌクレオチドとインキュベートすること、および、
（ｉｉ）
（ａ）その物質
（ｂ）Ｖａｖ１またはＶａｖ２、またはそれらの活性なフラグメントもしくは突然変異体、および
（ｃ）非標識化グアニンヌクレオチド
の存在下で、蛍光の変化を測定すること、
を含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
高処理量スクリーニングに適する、請求項６または請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項６ないし請求項８のいずれかに記載のスクリーニング方法により得ることができるＶａｖ１またはＶａｖ２阻害因子。
【請求項１０】
Ｖａｖタンパク質阻害因子およびそのための１またはそれ以上の医薬的に許容し得る希釈剤または担体を含む、請求項１に記載の方法において使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、移植に、そして移植された移植片の生存能力を助長することに、並びに炎症および自己免疫疾患および悪性増殖性疾患に関する。ある態様では、本発明は、移植片拒絶（例えば、急性または慢性移植片拒絶）の阻害方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、移植片拒絶（例えば、急性または慢性移植片拒絶）を、移植片のレシピエントに治療的有効量のＶａｖタンパク質阻害因子を投与することにより阻害することに関する。
【０００３】
Ｖａｖタンパク質には、Ｖａｖ１、Ｖａｖ２およびＶａｖ３が含まれる。Ｖａｖ１は、ヒト腫瘍ＤＮＡによる線維芽細胞形質転換の間にその癌化形態で最初に同定された、９５ｋＤａのシグナル伝達タンパク質である（Katzav et al. 1989, EMBO J. 8: 2283-2290）。Ｖａｖ１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１６３１６、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５４９８およびＲｅｆ.Ｓｅｑ番号ＮＭ＿００５４２８に見出され得る。Ｖａｖ１は、専ら造血および栄養芽細胞で発現され、ＴＣＲ、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）および様々なサイトカイン受容体の刺激を含む様々な刺激に応答して、迅速にチロシンでリン酸化される（Romero & Fischer, 1996, Cell. Signaling 8: 545-553; Collins et al. 1997, Immnol. Today 18: 221-225）。Ｖａｖ１はまた、タンパク質キナーゼＡによりセリン４４０でもリン酸化され、それはＶａｖ１活性化を抑制する（ＷＯ９９／６２３１５）。Ｖａｖ１は、低分子ＧＴＰアーゼのＲＨＯ／ＲＡＣファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として機能し、カルシウム動員、アクチン重合、受容体のクラスター形成およびＴ細胞における免疫シナプス形成を調節する（Turner & Billadeau 2002, Nat. Rev. Immunol 2(7): 476-86）。この参考文献およびそこで引用されている参考文献は、Ｖａｖ１−／−およびＶａｖ２−／−ノックアウトマウスも論じている。Ｖａｖ２およびＶａｖ３もＧＥＦであるが、より広い発現パターンを有する。
【０００４】
Ｖａｖ１は、Ｖａｖ２およびＶａｖ３にも見出される数々のドメインからなる。ＤＢＬ相同性（ＤＨ）ドメインは、ＲａｃおよびＲｈｏ−ＧＴＰアーゼと物理的に相互作用し、ＧＴＰとＧＤＰの交換を促進する。ＳＲＣ相同２（ＳＨ２）ドメインは、受容体チロシンキナーゼおよびアダプタータンパク質中のリン酸化チロシン残基の認識に関連し、Ｖａｖ１の活性化受容体への共役を導く。酸性モチーフ（Ａｃ）は、ＶａｖのＧＥＦ活性の自己阻害に重要である。カルポニン相同（ＣＨ）ドメインは、マルチサブユニット免疫認識受容体（multi-subunit immune-recognition receptor）の下流のカルシウム動員におけるＶａｖのＧＥＦ活性の調節に関与する。プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインは、ＤＨドメインとの細胞内相互作用を用いて、そしてホスファチジルイノシトールの結合により、ＧＥＦ活性の調節に関与する。ジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインも、ＧＥＦ活性の活性化に関与する。Ｖａｖ１のプロリンリッチ（ＰＲ）領域は、ＳＨ３ドメインが成長因子受容体結合タンパク質２（ＧＲＢ２）に結合できるように、Ｖａｖ１中のＳＲＣ相同３（ＳＨ３）ドメインと相互作用する。Ｖａｖ１のＳＨ２ドメインによるリン酸化チロシン残基の認識は、Ｖａｖ１のＡｃドメインのチロシンリン酸化を促進でき、ＤＨドメインＧＥＦ活性の活性化を導くことができる。
【０００５】
好ましくは、Ｖａｖタンパク質の阻害因子は、Ｖａｖ１阻害因子である。「Ｖａｖ１阻害因子」は、Ｖａｖ１タンパク質のある（即ち、１またはそれ以上の）機能を阻害できる物質またはリガンド（例えば、分子、化合物）を意味する。例えば、阻害因子は、Ｖａｖ−１がＲａｃおよび／またはＲｈｏ−ＧＴＰアーゼに結合するのを阻害し得、かつ／または、Ｖａｖ−１のＧＥＦ活性を阻害し得る。あるいは、Ｖａｖ１機能の阻害因子は、Ｖａｖ１がＶａｖ−１機能の活性化因子に結合するのを阻害し得、かつ／または、Ｖａｖ１に媒介されるシグナル伝達を阻害し得る。ある実施態様では、阻害因子は、Ｖａｖ１中の１またはそれ以上のＳＨ２ドメインと活性化受容体との相互作用を阻害し得、かつ／または、Ｖａｖ１のチロシンリン酸化を阻害し得る。別の実施態様では、阻害因子は、Ｖａｖ１のＳＨ３ドメインのＧＲＢ２への結合を妨げ得る。Ｖａｖ２およびＶａｖ３の阻害因子は、類似のメカニズムでＶａｖ２およびＶａｖ３の機能を阻害し得る。
【０００６】
従って、Ｖａｖ１に媒介される過程および細胞の応答（例えば、Ｔおよび／またはＢ細胞の活性化、カルシウム動員、アクチン重合、受容体のクラスター形成、Ｔ細胞における免疫シナプス形成）は、Ｖａｖ１機能の阻害因子により阻害できる。本明細書で使用するとき、「Ｖａｖ１」は、Ｖａｖまたはｐ９５ｖａｖとしても知られる天然産生のＶａｖ１（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト（ホモ・サピエンス）のＶａｖ１）を表し、Ｖａｖ１の機能的活性を保持している対立遺伝子変異体およびスプライスバリアントなどの天然産生の変異体を包含する。
【０００７】
好ましくは、Ｖａｖ１機能の阻害因子は、例えば、有機低分子、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチドまたはペプチド模倣物である化合物である。
【０００８】
タンパク質の例には、例えば、抗体、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、およびそれらの抗原結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ）が含まれる。Ｖａｖ１結合抗体の例は、Ｖａｖ（Ｃ−１４）、Ｖａｖ（Ｈ−２１１）、Ｖａｖ（Ｄ−７）、Ｖａｖ（１１０−３２０）、Ｖａｖ（Ｅ−４）、ｐ−Ｖａｖ（Ｔｙｒ１７４）−Ｒであり、これらはＶａｖ１またはリン酸化Ｖａｖ１に対して生成されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA から入手可能である。抗原結合フラグメントは、酵素的切断により、または組換え技法により産生できる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、各々ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントを生成できる。
【０００９】
必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼも、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントの生成に使用できる。抗体は、１またはそれ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入された抗体の遺伝子を使用して、様々な切断形で産生することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ'）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、その重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計できる。一本鎖抗体、およびキメラ、ヒト、ヒト化または霊長類化（ＣＤＲ移植）、またはベニヤ（veneered）抗体、並びに異なる種に由来する部分を含むキメラ、ＣＤＲ移植またはベニヤ一本鎖抗体なども、本発明および用語「抗体」に包含される。これらの抗体の様々な部分を、常套の技法により化学的に一緒に繋ぎ合わせることができるか、または、遺伝子工学の技法を使用して連続的タンパク質として調製できる。例えば、キメラまたはヒト化の鎖をコードする核酸を発現させ、連続的タンパク質を産生できる。例えば、Cabilly et al., U.S. P. 4,816,567; Cabilly et al., EP 0,125,023 B1; Boss et al., U.S. P. 4,816,397; Boss et al., EP 0,120,694 B1; Neuberger, M.S. et al., WO86/01533; Neuberger, M.S. et al., EP 0,194,276 B1; Winter, U.S. P. 5,225,539; Winter, EP 0,239,400 B1; Queen et al., EP 0 451 216 B1; および Padlan, E.A. et al., EP 0 519 596 A1 参照。また、霊長類化抗体に関して、Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992)、そして、一本鎖抗体に関して、Ladner et al., U.S. P. 4,946,778 and Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426 (1988) 参照。
【００１０】
ヒト化抗体は、標準的方法を使用する合成または組換えＤＮＡ技法または他の適する技法を使用して産生できる。ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）配列も、ＰＣＲ突然変異導入法を使用して過去のヒト化可変領域に由来するＤＮＡ鋳型などのヒトまたはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列を変更し、構築できる。これらまたは他の適する方法を使用して、変異体も容易に産生できる。ある実施態様では、クローン化した可変領域に突然変異導入でき、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択できる。
【００１１】
哺乳動物（例えば、ヒト）Ｖａｖ１に特異的な抗体は、単離された、かつ／または組換えのヒトＶａｖ１またはその部分（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの、適切な免疫原に対して生成できる。例えば、抗体は、ＳＨ２ドメインを含むＶａｖ１の部分に対して、または、ＤＨドメインを含むＶａｖ１の部分に対して、または、リン酸化または非リン酸化Ｖａｖ１に対して生成させ得る。抗体は、また、適する宿主（例えば、マウス、ラット）を、活性化Ｔ細胞などのＶａｖ１を発現する細胞で免役することにより生成させられる（例えば、U.S. P. 5,440,020 参照、その全技法を出典明示により本明細書の一部とする）。加えて、形質移入細胞などの組換えＶａｖ１を発現する細胞を、免疫原として、または、Ｖａｖ１に結合する抗体のスクリーニングにおいて、使用できる（例えば、Chuntharapai et al., J. Immunol., 152; 1783-1789 (1994); U.S. P. 5,440,021 参照）。
【００１２】
免役する抗原の調製並びにポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生は、任意の適する技法を使用して実施できる。モノクローナル抗体が望ましい場合、ハイブリドーマは一般的に、適する不死細胞株（例えば、ＳＰ２／０またはＰ３Ｘ６３Ａｇ８.６５３などの骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合することにより産生できる。抗体産生細胞、好ましくは、脾臓またはリンパ節から得たものを、関心のある抗原で免疫された動物から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離でき、限界希釈によりクローン化できる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適するアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択できる。
【００１３】
必要な特異性の抗体を産生または単離する他の適する方法を使用でき、これには、例えば、組換え抗体をライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から選択する方法が含まれる。ヒト抗体のレパートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例えば、XenoMouse（商標）(Abgenix, Fremont, CA)) を、適する方法を使用して産生できる。
【００１４】
用語「ペプチド」は、本明細書で使用するとき、約２個ないし約９０個のアミノ酸残基からなり、あるアミノ酸のアミノ基が別のアミノ酸のカルボキシル基にペプチド結合により連結している化合物を表す。好ましいペプチド配列は、短く（例えば３個ないし２０個のアミノ酸長）、十分な程度に細胞膜を横断できるように、親油性である。ペプチドは、例えば、酵素または化学的切断により天然タンパク質に由来するか、またはそれから取り出すことができ、あるいは、常套のペプチド合成技法（例えば、固相合成）または分子生物学の技法を使用して調製できる（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) 参照）。「ペプチド」は、任意の適するＬ−および／またはＤ−アミノ酸、例えば、一般的なα−アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン）、非−α−アミノ酸（例えば、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン）、および普通ではないアミノ酸（例えば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン）を含むことができる。ペプチド上のアミノ、カルボキシルおよび／または他の官能基は、遊離（例えば、修飾されていない）であることも、適する保護基で保護されていることもできる。アミノおよびカルボキシル基に適する保護基および保護基を付加または除去する手段は、当分野で知られており、例えば、Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991 に開示されている。ペプチドの官能基は、当分野で知られている方法を使用して、誘導体化（例えば、アルキル化）することもできる。
【００１５】
阻害因子は、Ｖａｖ１のＲａｃおよび／またはＲｈｏ−ＧＴＰアーゼへの結合を阻害し得、かつ／または、Ｖａｖ１のＧＥＦ活性を阻害し得る。そのような阻害因子は、Ｖａｖ１のＧＴＰアーゼへの結合を妨げる抗体、Ｖａｖ１のＤＨドメインに見出されるペプチド配列、またはＲａｃもしくはＲｈｏ−ＧＴＰアーゼ中のＶａｖ１への結合に関与する配列を含み得る。あるいは、阻害因子は、アロステリックな阻害因子であってもよく、それは、ＤＨドメインから離れたＶａｖ１の部位に結合し、そして、ＧＥＦ活性を阻害するように、ＤＨドメインに対する効果を発揮するのを防止する。
【００１６】
適する阻害性ペプチドには、Ｖａｖ１のＳＨ２ドメインに結合し、その結果Ｖａｖ１の活性化受容体への共役を阻害することにより、Ｖａｖ１のリン酸化を妨げるペプチドも含まれ得る。例えば、阻害性ペプチドは、Ｖａｖ１のＳＨ２ドメインに認識される配列を模倣するチロシンリン酸化ペプチド配列、例えば、配列ｐＴｙｒ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（ここで、Ｘａａは、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＧｌｕである）を含むペプチドであり得、但し、阻害性ペプチド自体はＶａｖ１チロシンリン酸化および／または活性化を導かない。そのような阻害性ペプチドには、Ｖａｖ１が結合する受容体チロシンキナーゼおよびアダプタータンパク質に見出される配列、例えば、そのような受容体の細胞質ドメインに由来するチロシンリン酸化配列、例えば、Ｔ細胞受容体、ＦｃεＲ受容体、ＩｇＭ受容体、ｐ１４５ｃ−ｋｉｔ、Ｉｌ−２受容体、ＩＦＮα受容体、ＳＬＰ７６（ＳＨ２ドメインを含有する白血球の７６ｋＤａタンパク質）、Ｂ細胞リンカー（ＢＬＮＫ；ＳＬＰ６５／ＢＡＳＨ）またはＣＤ１９に見出されるＳＨ２結合配列が含まれる。代替的実施態様では、阻害因子は、Ｖａｖ１のＳＨ２ドメインに存在する配列を含むペプチドであり得、例えば、配列ｐＴｙｒ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏおよび／または上記の受容体チロシンキナーゼ／アダプタータンパク質の１つにあるチロシンリン酸化配列と相互作用し、それによりＶａｖ１の活性化受容体／アダプタータンパク質への結合を阻止できる、Ｖａｖ１中の配列である。例えば、阻害因子のペプチドは、ヒトＶａｖ１タンパク質の残基６７１−７６５に見出される配列を含み得る。
【００１７】
あるいは、阻害因子は、Ｖａｖ１のＳＨ３ドメインがＧＲＢ２に結合するのを妨げるペプチド、例えば、ＷＯ９５／２６９８３に開示の通り、ＧＲＢ２に見出されるＳＨ３結合ドメインまたはＶａｖ１のＳＨ３ドメインに見出されるＧＲＢ２結合ドメインを含むペプチドであり得る。
【００１８】
さらなる実施態様では、阻害因子は、Ｖａｖ１上のリン酸化部位、例えば、Ｔｙｒ１７４リン酸化部位を模倣することにより、Ｖａｖ１のリン酸化を妨げるか、または、リン酸化部位に会合するペプチドであり得る。あるいは、阻害因子は、例えばＷＯ９９／６２３１５に記載の通り、例えばＳｅｒ４４０でのＶａｖ１のセリンリン酸化の増強因子であり得る。
【００１９】
さらなる実施態様では、阻害因子は、自己阻害性配列、例えば、Ｖａｖ１のＡｃドメインに見出されるＶａｖ１の活性化を阻害する配列を含むペプチドであり得、但し、それは、チロシンリン酸化されない。
【００２０】
これらの実施態様における使用に適するペプチド配列は、例えば、上記で明確に同定されるか、または、上記の議論の通りの方法により産生されるような、Ｖａｖ１と抗Ｖａｖ１抗体を有する他の分子成分との相互作用を探索することにより同定し得る。例えば、Ｖａｖ１のＲｈｏ−ＧＴＰアーゼへの結合を特異的に阻害する抗Ｖａｖ１モノクローナル抗体は、Ｖａｖ１機能の阻害因子として使用し得るＶａｖ１中の短いペプチド配列（例えば、ＤＨドメイン中のもの）を同定するのに使用し得る。
【００２１】
用語「ペプチド模倣物」は、本明細書で使用するとき、ポリペプチドではないが、それらの構造の様相を模倣する分子を表す。例えば、Ｖａｖ１を阻害できるペプチドと同じ官能基を有するポリサッカライドを調製できる。ペプチド模倣物は、例えば、Ｖａｖ１に結合するか、または結合するであろう実施態様のペプチド物質の三次元構造を確立することにより設計できる。ペプチド模倣物は、結合成分または成分群および主鎖または支持構造の少なくとも２つの成分を含む。
【００２２】
結合成分は、Ｖａｖ１と、例えば、リガンド結合部位のアミノ酸（群）またはそれに近いアミノ酸（群）と、反応または複合体形成するであろう（例えば、疎水性またはイオン性相互作用を介して）化学的原子または基である。例えば、ペプチド模倣物中の結合成分は、Ｖａｖ１のペプチド阻害因子のものと同じであることができる。結合成分は、Ｖａｖ１のペプチド阻害因子中の結合成分と同じかまたは類似のやり方でＶａｖ１と反応する原子または化学基であることができる。ペプチド中の塩基性アミノ酸のペプチド模倣物の設計で使用するのに適する結合成分の例は、アミン類、アンモニウム類、グアニジン類およびアミド類などの窒素含有基またはホスホニウム類である。酸性アミノ酸のペプチド模倣物の設計で使用するのに適する結合成分の例は、例えば、カルボキシル、低級アルキルカルボン酸エステル、スルホン酸、低級アルキルスルホン酸エステルまたは亜リン酸もしくはそのエステルである。
【００２３】
支持構造は、結合成分または成分群に結合すると、ペプチド模倣物に３次元配置を与える化学成分である。支持構造は、有機でも無機でもよい。有機支持構造の例には、ポリサッカライド、有機合成ポリマーのポリマーまたはオリゴマー（ポリビニルアルコールまたはポリ乳酸など）が含まれる。支持構造がペプチド主鎖または支持構造と実質的に同じ大きさおよび容積（dimension）を有するのが好ましい。これは、ペプチドおよびペプチド模倣物の原子および結合の大きさを算出または測定することにより決定できる。ある実施態様では、ペプチド結合の窒素は、酸素または硫黄で置換でき、それによりポリエステル主鎖を形成できる。別の実施態様では、カルボニルは、スルホニル基またはスルフィニル基で置換でき、それによりポリアミドを形成できる（例えば、ポリスルホンアミド）。ペプチドの逆アミド（reverse amide）を作成できる（例えば、１またはそれ以上の−ＣＯＮＨ−基を−ＮＨＣＯ−基に置換する）。また別の実施態様では、ペプチド主鎖は、ポリシラン主鎖で置換できる。
【００２４】
これらの化合物は、既知方法により製造できる。例えば、ポリエステルのペプチド模倣物は、ヒドロキシル基をアミノ酸上の対応するα−アミノ基に置換し、それによりヒドロキシ酸を調製し、続いてそのヒドロキシ酸をエステル化し、場合により副反応を最小にするために塩基性および酸性の側鎖をブロックすることにより調製できる。適切な化学合成経路は、一般的に、ペプチド模倣物の所望の化学構造を決定する際に容易に同定できる。
【００２５】
ペプチド模倣物を合成し、数個ないし多数の別個の分子種を含むライブラリーに集めることができる。そのようなライブラリーは、コンビナトリアル・ケミストリー（combinatorial chemistry）の周知方法を使用して調製でき、本明細書に記載の通りにスクリーニングしてライブラリーがＶａｖ１機能を阻害する１またはそれ以上のペプチド模倣物を含むか否かを判定できる。次いで、そのようなペプチド模倣物アンタゴニストを、適する方法により単離できる。
【００２６】
Ｖａｖ１の１またはそれ以上の機能を阻害できる有機低分子は、下記のスクリーニング方法を使用して、ライブラリーから有機化合物をスクリーニングすることにより同定し得る。適する有機低分子は、上記のいかなるメカニズムによっても、例えば、Ｖａｖ１の受容体チロシンキナーゼへの結合を阻害することにより、Ａｃドメインによる自己阻害を模倣することにより、自己阻害形態を安定化することにより、または、好ましくは、Ｖａｖ１のＲｈｏまたはＲａｃＧＴＰアーゼへの結合を阻害することにより、および／または、Ｖａｖ１のＧＥＦ活性を阻害することにより、Ｖａｖ１の機能を阻害し得る。
【００２７】
ある物質（例えば、タンパク質、ペプチド、天然産物、有機低分子、ペプチド模倣物）のＶａｖ１機能を阻害する能力は、適するスクリーニング（例えば、高処理量アッセイ）を使用して判定できる。好ましくは、アッセイは、Ｖａｖ１存在下でのグアニンヌクレオチド交換の速度、例えば、適するＧＴＰアーゼ、例えばＲｈｏＡまたはＲａｃＧＴＰアーゼにおける（即ち、それに結合した）ＧＴＰとＧＤＰの交換の速度に対する、試験しようとする物質の効果を判定する段階を含む。物質の存在下でのグアニンヌクレオチド交換速度の低下は、Ｖａｖ１阻害因子を示すものである。好ましいＶａｖ１阻害因子は、グアニンヌクレオチド交換の速度を、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低下させる物質として同定し得る。
【００２８】
Ｖａｖ１は、例えば、適切なキナーゼによるリン酸化により、または、自己阻害性Ａｃドメインの切断により活性化され得る。あるいは、使用するＶａｖ１タンパク質は、別途の活性化段階なしでアッセイを行うのに十分な構成的活性を示し得る。例えば、本方法は、例えばＤＨドメイン（例えば、ヒトＶａｖ１の残基１８１−３７５）を含む、構成的に活性なＶａｖ１のフラグメント、または、構成的に活性なＶａｖ１の突然変異体、例えば、位置１７４のチロシン残基がフェニルアラニンに置き換えられたＹ１７４Ｆ突然変異体、を使用することを含み得る。任意のＶａｖ１のフラグメントまたは突然変異体を、それが活性である、即ち、活性化されて全長Ｖａｖ１により示されるものと実質的に類似するＧＥＦ活性を示す能力がある、との条件で、使用し得る。
【００２９】
例えば、Ｒａｃ−１ＧＴＰアーゼは、蛍光標識化ＧＤＰ（例えば、Molecular Probes から入手可能なＢＯＤＩＰＹ標識化ＧＴＰ／ＧＤＰ類似体）を充填されてもよい。次いで、ＧＴＰおよびＶａｖ１の存在下で、または、ＧＴＰ、Ｖａｖ１および試験しようとする物質の存在下で、蛍光消失速度を測定する。ＧＴＰのみを添加する場合、ＧＴＰがＧＴＰアーゼ中で蛍光ＧＤＰと交換するに従い、蛍光はゆっくりと減少する。Ｖａｖ１は、ＧＴＰとＧＤＰの交換を促進することにより、蛍光消失速度を高める。Ｖａｖ１の阻害因子は、Ｖａｖ１およびＧＴＰの存在下での速度と比較して、蛍光消失速度を低下させる。好ましいＶａｖ１阻害因子は、蛍光消失速度を少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低下させる物質として同定し得る。
【００３０】
あるいは、蛍光標識化ＧＤＰをＧＴＰアーゼに添加するときに、Ｖａｖ１存在下の蛍光増大速度を測定し、Ｖａｖ１および試験しようとする物質の存在下の蛍光増大速度と比較し得る。Ｖａｖ１は、蛍光増大速度を高める。Ｖａｖ１の阻害因子は、蛍光増大速度を低下させる。好ましいＶａｖ１阻害因子は、蛍光増大速度を少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低下させる物質として同定し得る。
【００３１】
代替的実施態様では、蛍光標識化ＧＤＰ類似体を、蛍光標識化ＧＴＰで置き換えてもよい。蛍光標識化ＧＴＰは、ＧＴＰアーゼにより切断されて蛍光標識化ＧＤＰを産生する。次いで、その交換を、非標識化ＧＴＰを用いて測定し得る。さらなる代替的実施態様では、ＧＴＰアーゼを非標識化ＧＤＰで充填し、蛍光標識化ＧＴＰを添加し、蛍光の増大をＶａｖ１の存在下で測定する。阻害因子の存在下で、蛍光増大速度は低下する。
【００３２】
ある実施態様では、アッセイは以下の段階を含む：
−蛍光標識化ＧＤＰ（例えば、Molecular Probes から入手可能なＢＯＤＩＰＹ標識化ＧＴＰ／ＧＤＰ類似体、例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＧＤＰ）を、ＧＴＰアーゼＲａｃ１（下記の通りに産生する）と一緒にインキュベートする。ヌクレオチドのＲａｃ１への結合は、蛍光の増大を導く。なぜなら、蛍光標識のグアニン塩基による分子内クエンチングが、後者がＧＴＰアーゼの結合ポケットに刺さると克服されるからである。この結合反応は、Ｖａｖ１などの適切なグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を反応混合物に含めることにより加速できる（図１参照）。
【００３３】
−過剰の非標識化ＧＴＰの添加は、同時に蛍光の減少を伴うＧＴＰアーゼからの蛍光ＧＤＰの置換をもたらす。この交換反応は、ヌクレオチド交換因子Ｖａｖ１により加速される（図１参照）。
【００３４】
−Ｖａｖ１活性を、交換反応の時定数から、あるいは、適切に選択された時点でのサンプル中の蛍光強度をＶａｖ１の有無で比較することにより、判定できる。Ｖａｖ１阻害因子は、ヌクレオチド交換因子の触媒効果を妨害するので、検出可能である。故に、阻害因子の存在下で、図１の曲線の形は、「＋Ｖａｖ１」について示されたものから、「−Ｖａｖ１」について示されたものに移動する。
【００３５】
上記方法で使用するためのＲａｃ１およびＶａｖ１は、クローニング、組換えタンパク質の発現および生成などの標準的技法により入手し得る。
【００３６】
ある実施態様では、Ｒａｃ１は以下の通りに調製する。全長（ａａ２−１９２）ヒトＲａｃ１（ＲｅｆＳｅｑ Ｎｒ.ＮＭ＿００６９０８）をコードするインサートを、ｐＥＴシリーズ (Novagen) に由来する、親和性精製用のチオレドキシン、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６−タグなどのＮ末端タグおよび PreScission Protease (APBiotech) の切断部位を有する標準的発現プラスミドにクローン化する。インサートのコード領域は、上記の全てのタグに対してＣ末端側に位置する。発現は、BL(21) DE3 Tuner (Novagen) などの様々な大腸菌の系統で実行する。そのＤＥ３エレメントはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡを含み、組換えタンパク質の高い発現レベルを可能にする。発現は、標準的条件下、ＬＢ培地中、ＩＰＴＧによる誘導、そして様々なインキュベーション時間および温度で実行する。細菌は、２ｌエルレンマイヤーシェーカーフラスコ中で増殖させる。精製は、第１段階として親和性クロマトグラフィー（Ｈｉｓ６−タグにはＮｉ−ＮＴＡ、ＧＳＴタグ付きタンパク質にはＧＳＨセファロース）により実施する。さらなる精製は、サイズ除去、イオン交換、疎水性相互作用などの古典的クロマトグラフィー技法により行い得る。タンパク質は、そのタグがまだ付着したままで使用されるか、または、タグはタンパク質分解的切断および切り離されたタグのクロマトグラフィー的分離により除去される。
【００３７】
ある実施態様では、上記方法で使用するためのＶａｖ１は、以下の通りに入手する。全長（ａａ２−８４５）ヒトＶａｖ１をコードするインサートを、FastBac シリーズ (Invitrogen) に由来する、親和性精製用のＮ末端タグのＧＳＴおよびＨｉｓ６並びに PreScission Protease (APBiotech) の切断部位を有する標準的発現プラスミドにクローン化する。あるいは、ＭＢＰおよびＮｕｓＡのＮ末端タグを使用してもよい。インサートは、上記の全てのタグに対してＣ末端側に位置する。バキュロウイルスの生成用のバクミド（bacmid）は、大腸菌中の組換えにより生成し、大量プラスミド精製キット (Qiagen) で精製する。タンパク質をバキュロウイルスに感染した昆虫細胞で発現させるので、第１段階として、Ｓｆ２１単層昆虫細胞の感染により、十分量のバキュロウイルスを生成しなければならない。一度所望量のウイルスが得られたら、細胞をスピナーフラスコまたは Wave Bioreactor 中で増殖させることによりタンパク質をHi Five 懸濁昆虫細胞中で産生させる。精製は、第１段階として親和性クロマトグラフィー（Ｈｉｓ６タグにはＮｉ−ＮＴＡ、ＧＳＴタグ付きタンパク質にはＧＳＨセファロース）により実施する。さらなる精製は、サイズ除去、イオン交換、疎水性相互作用などの古典的クロマトグラフィー技法により行い得る。タンパク質は、そのタグがまだ付着したままで使用されるか、または、タグはタンパク質分解的切断および切り離されたタグのクロマトグラフィー的分離により除去される。
【００３８】
Ｖａｖ１のＤＨドメインを含むポリペプチド、例えばヒトＶａｖ１の残基１８１−３７５は、同様の方法を使用して、大腸菌で産生してもよい。
【００３９】
代替的アッセイとして、試験しようとする物質が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体により誘導されるＶａｖ１含有細胞（例えば、胸腺細胞）のアポトーシスを阻害する能力を測定することにより、Ｖａｖ１阻害因子を同定し得る。このアッセイは、Ｖａｖ１−／＋胸腺細胞は抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体による刺激の後にアポトーシスするが、Ｖａｖ１−／−胸腺細胞はアポトーシスし損ねるという観察に基づく。このアッセイは、非毒性で細胞透過性の物質のみが同定されるという利点を有する。試験しようとする化合物がアポトーシスを阻害する能力を、Ｖａｖ１−／＋およびＶａｖ１−／−細胞において比較し得る。
【００４０】
Ｖａｖ１阻害因子を同定するためのさらなるアッセイ方法には、Ｖａｖ１活性化の下流の細胞内効果に基づく方法、例えば、カルシウム動員、ＣＤ６９発現またはアクチン重合（ＥＹＦＰ−アクチンを使用して細胞骨格の再編成を測定する）のアッセイが含まれる。そのようなアッセイ方法は、その物質がＶａｖ１の阻害を介して作用するのか、または下流の事象に対して作用するのかを同定するために、上記の通りのグアニン交換のアッセイ方法と併せて使用してもよい。
【００４１】
さらなる実施態様では、Ｖａｖ１阻害因子のアッセイ方法は、標識を使用しない（label-free）液体クロマトグラフィー−質量分析をベースとする高処理量スクリーニング方法、例えば、SpeedScreen を含む。そのような方法は、親和性選択を利用して、続いてサイズ除去クロマトグラフィーおよび微小孔（microbore）−液体−クロマトグラフィー／エレクトロスプレー−イオン化質量分析により、Ｖａｖ１に結合する物質の同定を可能にする。
かくして同定されたＶａｖ１阻害因子は、本発明の方法で使用するのに適する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「移植片」は、第１の哺乳動物（またはドナー）から得られ、第２の哺乳動物（またはレシピエント）、好ましくはヒトに、移植できる器官および／または組織および／または細胞を表す。用語「移植片」は、例えば、皮膚、眼または眼の部分（例えば、角膜、網膜、レンズ）、筋肉、骨髄、または骨髄の細胞性成分（例えば、幹細胞、前駆細胞）、心臓、肺、心肺、肝臓、腎臓、膵臓（例えば、島細胞、β−細胞）、副甲状腺、腸（例えば、大腸、小腸、十二指腸）、神経組織、骨および脈管構造（例えば、動脈、静脈）を包含する。移植片は、適する哺乳動物（例えば、ヒトまたはブタ）から得ることができ、または、ある種の状況下では、細胞、例えば、胚性、皮膚または血液細胞および骨髄細胞をインビトロで培養することにより移植片を産生できる。移植片は、好ましくはヒトから得る。
【００４３】
腎臓、心臓、肝臓および肺の器官移植は、末期の器官疾患の処置として、現在定例的に実施されている。同種移植片並びに異種移植片の移植が実施されてきた。しかしながら、長期の慢性拒絶の問題のために、器官移植は、まだ不可逆的な器官疾患に対する恒久的解決ではない。また、急性拒絶の処置用の改善された物質に対する要望もある。
【００４４】
進行性かつ不可逆的な移植片の機能不全として現れる慢性拒絶は、術後一年目で既に見られる場合もある器官移植物の消失の主原因である。慢性拒絶の臨床的問題は、移植物の生存時間から明らかである；腎臓同種移植片の約半分が移植後１０年前後で失われ、同様の値が心臓同種移植片を有する患者で観察される。
【００４５】
慢性拒絶は、移植片に対する免疫反応のみならず、移植された器官の血管壁の損傷に対する応答（「損傷応答」反応）も役割を果たす、多要因の過程と考えられる。最悪の予後を伴う慢性拒絶の変形は、移植脈管障害とも呼ばれる動脈硬化症様の変化、移植片血管疾患、移植片アテローム性動脈硬化症、移植冠疾患などである。この血管の病変は、なかんずく内皮により合成される成長因子の影響下での平滑筋細胞の遊走および増殖を特徴とする。血液由来の幹細胞の新生内膜組織の前駆体としての寄与が最近立証された。また、なかんずく宿主の抗体または抗原抗体複合体により誘導される反復性内皮損傷を介して、内膜の増殖および肥厚、平滑筋細胞肥大の修復を介して、最終的に漸進的な管腔の閉塞に進むように見える。高血圧症、高脂血症、高コレステロール血症などのいわゆる非免疫学的要因も役割を果たす。
【００４６】
慢性拒絶は、知られている効果的な治療または予防様式がないので、無情かつ制御不可能であるように見える。故に、慢性移植片血管疾患の顕在化を予防、制御または逆転するのに効果的な処置への要望が存在し続けている。
【００４７】
自己免疫および炎症疾患には、例えば、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病およびそれらに伴う疾患、血管炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、乾癬、グレーブス甲状腺眼症、円形脱毛症など、アレルギー性疾患、例えば、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎／結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、潜在的異常反応を伴うこともある炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎、内因性喘息、炎症性肺損傷、炎症性肝損傷、炎症性糸球体損傷、アテローム性動脈硬化症、骨関節炎、刺激物接触性皮膚炎、およびさらなる湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、免疫介在性障害の皮膚的顕在化、炎症性眼疾患、乾性角結膜炎、心筋炎または肝炎が含まれる。
【００４８】
悪性増殖性疾患には、例えば、非固形腫瘍、特に、白血病およびリンパ腫、よりことさらに、Ｔ細胞白血病およびＴ細胞リンパ腫が含まれる。Ｔ細胞白血病およびリンパ腫には、Ｔ細胞前リンパ球性（prolymphotic）白血病、Ｔ細胞顆粒リンパ球性白血病、攻撃型ＮＫ細胞白血病、有毛細胞白血病、鼻および鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫およびセザリー（Sezary）症候群、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫非特異型、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＨＴＬＶ１＋）、未分化大細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ球増殖性障害、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫（＋腸疾患）、および肝脾ガンマ／デルタＴ細胞リンパ腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００４９】
本発明の独特な知見に従い、以下のものが提供される：
１.１  細胞、組織または器官同種移植のレシピエントにおける急性移植片拒絶の予防または処置方法であって、該レシピエントに治療的有効量の哺乳動物（例えばヒト）Ｖａｖタンパク質阻害因子を投与する段階を含む方法；
【００５０】
１.２  組織または器官同種移植のレシピエントにおける、例えば慢性拒絶を回避、低減または制限するための、慢性拒絶の予防または処置方法であって、該レシピエントに治療的有効量の哺乳動物（例えばヒト）Ｖａｖタンパク質阻害因子を投与する段階を含む方法；
【００５１】
１.３  組織または器官同種移植のレシピエントにおける、例えば移植脈管障害、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症などの移植片血管疾患を予防または処置する方法であって、該レシピエントに治療的有効量の哺乳動物（例えばヒト）Ｖａｖタンパク質阻害因子を投与する段階を含む方法；
【００５２】
１.４  例えば経皮経管的血管形成術などのカテーテル術（catherization procedure）または血管剥離術（vascular scraping procedure）に起因する血管損傷後の血管移植片狭窄、再狭窄および／または血管閉塞を、それを必要としている対象において予防または処置する方法であって、該対象に治療的有効量の哺乳動物（例えばヒト）Ｖａｖタンパク質阻害因子を投与することを含む方法；
【００５３】
１.５  炎症または自己免疫疾患を、それを必要としている対象において予防または処置する方法であって、該対象に治療的有効量のＶａｖタンパク質阻害因子を投与する段階を含む方法；
【００５４】
１.６  悪性増殖性疾患を、それを必要としている対象において予防または処置する方法であって、該対象に治療的有効量のＶａｖタンパク質阻害因子を投与する段階を含む方法；
【００５５】
１.７  （ａ）細胞、組織または器官同種移植のレシピエントにおける急性または慢性移植片拒絶、（ｂ）血管損傷に続く血管移植片狭窄、再狭窄および／または血管閉塞、または（ｃ）炎症、自己免疫または悪性増殖性疾患を、予防、処置または阻害するための、Ｖａｖタンパク質阻害因子の使用；
【００５６】
１.８  （ａ）細胞、組織または器官同種移植のレシピエントにおける急性または慢性移植片拒絶、（ｂ）血管損傷に続く血管移植片狭窄、再狭窄および／または血管閉塞、または（ｃ）炎症、自己免疫または悪性増殖性疾患を、予防、処置または阻害するための医薬の製造のための、Ｖａｖタンパク質阻害因子の使用；
【００５７】
１.９  上記１.１ないし１.６で定義されるいずれかの方法において使用するための、哺乳動物（例えばヒト）Ｖａｖタンパク質阻害因子（例えばＶａｖ１阻害因子）を、そのための１またはそれ以上の医薬的に許容し得る希釈剤または担体と一緒に含む、医薬組成物。
【００５８】
移植拒絶の予防または処置における阻害の標的としてのＶａｖ−１の有用性は、遺伝子組換えＶａｖ−１不全マウスでの研究において立証される。例えばＶａｖ−２不全マウスを使用して、以下の方法を繰り返し得る。
【００５９】
Ａ.１  異所性血管心臓同種移植
Corry et al. 1973, Transplanation 16 (4), 343-350 に記載の通りに、Balb/c (H-2d, Charles River, Wiga) マウスをドナーとして、そして全体的ＭＨＣおよびｍＨミスマッチを含むＶａｖ−１ ｋｏマウスおよび野生型マウスをレシピエントとして使用して、異所性心臓移植を実施する。Ｖａｖ−１ ｋｏノックアウトマウスを Fischer et al. 1998, Curr. Biol. 8, 554-562 に記載の通りに生成させる。簡単に述べると、イソフルランを使用して動物を麻酔する。ドナーマウスの腹部下大静脈を介するヘパリン処理および同時の大動脈を介する脱血に続き、胸部を切開し、心臓を急速に冷却する。大動脈を結紮し、第一分岐部の遠位で切離し、右腕頭動脈を最初の分岐で切離する。左肺動脈を結紮切離し、右側を切離する。他の全ての血管を遊離させ、結紮切離し、ドナーの心臓を氷冷塩水に移す。腎下方腹部大動脈および静脈の遊離および相互結紮（cross-clamping）により、レシピエントを準備する。１１／０単一繊維縫合糸を使用して、ドナーの右腕頭動脈とレシピエントの大動脈との間、および、ドナーの右肺動脈からレシピエントの大静脈へ、移植片を端側吻合で移植する。鉗子を除去し、移植片を後腹部に繋ぎ止め、腹部内容物を温かい塩水で洗浄し、動物を閉じ、温めながら回復させる。
【００６０】
移植片を毎日の腹部触診によりモニターし、触診可能な心室性収縮がなくなったら、拒絶されたとみなす。
【００６１】
Ａ.３  処置群
以下の処置群のいずれかに動物をランダムに割り振る（群当たりｎ＝５）：
（ａ）Ｂａｌｂ／ｃ−ｔｏ−Ｖａｖ−１ノックアウト；
（ｂ）Ｂａｌｂ／ｃ−ｔｏ−Ｖａｖ−１野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）。
【００６２】
Ａ.４  心臓同種移植片の生存−表１
【表１】
2006525248.tif 000002
心臓同種移植片の生存は、Ｖａｖ−１不全マウスで野生型対照と比較して顕著に増大する（表１に示す）。
【００６３】
Ａ.５.１  組織病理学および免疫組織化学
冠血管の再構築をスコア付けすることにより、移植片生存＞１００日間の心臓同種移植片について、血管再構築の程度を評価する。
【００６４】
４％緩衝化ホルマリン中で組織を固定し、パラフィンに包埋する；３−４μｍ厚の移植片切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、Van Gieson 染色して内弾性板を可視化する。間質細胞性の拒絶を、拒絶なし、穏やかな、中度の、または激しい拒絶とスコア付けする。血管内膜の厚さを、なし、穏やか、中度、激しいとスコア付けする。
【００６５】
免疫組織化学的分析をパラフィン切片で実施する。平滑筋アクチンに対する一次抗体（ＳＭＡ，クローン１Ａ４, DakoCytomation, Denmark, １：２５希釈）、ラット抗ヒトＣＤ３（Ｔ細胞、クローンＣＤ３−１２, Serotec, UK, １：２００希釈）およびラット抗マウスＦ４／８０（マクロファージ、クローンＣＩ：Ａ３−１, Serotec, UK, １：１００希釈）およびラット抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ細胞、クローンＲＡ３−６Ｂ２, Serotec, １：１００００希釈）を使用して、ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ反応を実施する。平滑筋細胞および浸潤したＣＤ３＋、Ｆ４／８０＋およびＣＤ４５＋細胞の準定量的分析を、Leica DMR 顕微鏡を使用して実施する。
【００６６】
個々のＮＩ値を平均し、平均±ＳＥＭとして報告する。処置群の平均に対して試験する仮説は、一元配置分散分析を使用して実施し、確率値を報告する。統計的有意は、ｐ＜０.０５とする。
【００６７】
Ａ.５.２  心臓同種移植片の組織学
Ｖａｖ−１＋／＋レシピエントは、僅か７−８日後に激しい急性細胞性拒絶を示す。Ｖａｖ−１−／−の移植片の分析は、生存＞１００日間の穏やかな間質性拒絶のみを示す。
【００６８】
Ａ.６  移植マウス由来の血液のＦＡＣＳ分析および血液学
死体解剖中に、ＦＡＣＳ分析のために全血をヘパリン被覆チューブに試料採取する。さらに、２５０μｌの全血を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ２５０μｌを含有するＥＤＴＡ被覆チューブに試料採取し、混合後、Nucleic Acid Purification Lysis Solution (Applied Biosystems #4305895）５００μｌを添加し、０.５分間ボルテックスし、−２０℃で凍結する。３分の１の血液試料は、Ｈ１血液学のために取る。
【００６９】
脾細胞および末梢血を、Ｂ６ ＷＴマウスおよびＶａｖ１ノックアウトマウスから、標準的操作を使用して調製し、２０００００細胞／ウェルおよび様々な刺激（表２に示す）を使用して、１６時間のエクスビボ刺激に付す。細胞を免疫表現型に分け、３または４色の流動細胞計測法を使用してＣＤ６９発現の観点から刺激の程度を判定する。
【００７０】
ＷＴおよびＶａｖ１不全マウスの脾細胞または末梢血リンパ球を様々な刺激に付すと、Ｖａｖ１不全Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）およびＶａｖ１不全Ｂ細胞（Ｂ２２０＋）は、ＦＡＣＳで測定される活性化マーカーＣＤ６９の顕著に低い発現を示す。同様の結果が脾臓および末梢血由来のＴおよびＢ細胞について得られる。Ｖａｖ１不全は、Ｔ細胞活性化およびＴ依存性Ｂ細胞活性化を阻止することが立証される。
【００７１】
表２−ＣＤ６９発現ＴおよびＢ細胞
【表２】
2006525248.tif 000003
【００７２】
急性または慢性拒絶における哺乳動物（例えばヒト）Ｖａｖタンパク質阻害因子の有用性、並びに本明細書の上記で特定される疾患および症状の処置における有用性は、例えば、本明細書の下記の方法に従う動物試験で、そして、例えば、移植された器官または組織が、定例的な生検制御に付され得、心臓移植の場合はさらに超音波スキャンに付され得る病院で、立証され得る。
【００７３】
Ｂ.１  急性拒絶
例えば、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスをドナー動物として、そして例えばＣＢＡ（Ｈ−２ｋ）マウスをレシピエントとして使用する。既知操作に従い心臓をドナーから取り出し、冷却塩水（４℃）中で保存する。レシピエント動物をイソフルランで麻酔する。腎下方腹大動脈および下大静脈を露出させる。血管を筋膜から３−５ｍｍの長さにわたり剥離し、結紮し、いかなる小さい分岐も切離する。血管を最初に近位で、次いで遠位で閉鎖する。動脈切開および静脈切開を実施し、管腔にヘパリン処理生理塩水を流し込む。端側大動脈吻合、次いで、ドナーの右肺静脈からレシピエントの下大静脈への端側吻合を実施する。遠位の結紮、次いで近位の結紮を取り除く。縫合線を漏出について確認する。次いで、移植片を後腹部に繋ぎ止める。腹部を温かい塩水（３７℃）で洗い流し、傷を閉じる。移植片の機能を腹部触診により毎日モニターする。移植片が鼓動を停止したら、拒絶を結論づける。
【００７４】
動物を以下の処置の１つに付す：Ｖａｖ１阻害因子単独、または、Ｖａｖ１およびＶａｖ２の阻害因子の組合せ。このアッセイにおいて、Ｖａｖ１阻害因子または組み合わせたＶａｖ１／Ｖａｖ２阻害因子で処置した動物で、移植片機能の改善が達成される。
【００７５】
Ｂ.２  慢性拒絶
ドナーマウス（例えばＣ３Ｈ）を、イソフルランで麻酔し、左右の頸動脈を単離し、剥離する。動物を脱血し、ヘパリン処理塩水１００Ｉ.Ｕ.／ｍｌを流し込み、いかなる残存する血液も除去する。次いで、各頸動脈を遠位と近位の分岐に出来るだけ近いところで取り出し、ヘパリン処理塩水で再度すすぎ、４℃で保存する。レシピエントマウス（例えばＢ６）を上記の通りに麻酔し、気管の側方にある左内頚動脈を単離する。近位の微小血管のクリップおよび遠位のクリップを施す。クリップ間の中程で適切な長さを摘除し、移植片を代わりに置き、長さに合わせて整形する。端々吻合を実施する。遠位のクリップを最初に、次いで近位のものを除き、止血を確実にし、皮膚を閉じる。完全に回復するまで、動物を遠赤外線下に置く。
【００７６】
動物を以下の処置の１つに付す：Ｖａｖ１阻害因子単独、または、Ｖａｖ１およびＶａｖ２の阻害因子の組合せ。
【００７７】
５ないし８週で動物を犠牲にし、頸動脈を、２ｍｌの冷却リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で、次いで２ｍｌの冷却灌流固定液（ＰＢＳ０.０１Ｍ中、２.５％グルタルアルデヒド、２％ホルマリン）で灌流する。次いで、頸動脈を切り取り、組織学的評価のために染色する。形態計測的分析は、中膜および内膜の厚さの測定を含む。形態学的変化の定性的分析は、単核細胞の外膜浸潤および壊死（空胞変性、細胞の肥大）、中膜中の平滑筋細胞（ＳＭＣ）核の数、ＳＭＣの壊死および単核細胞の内膜浸潤をスコア付けすることを含む。このアッセイにおいて、Ｖａｖ１阻害因子または組み合わせたＶａｖ１／Ｖａｖ２阻害因子で処置した動物で、移植片機能の改善が達成される。
【００７８】
Ｂ.３  血管形成
バルーンカテーテル損傷のラットモデルで、血管形成の研究を行う。本質的に Powell et al. (1989) により記載された通りに、バルーンカテーテル処置を０日目に実施する。イソフルラン麻酔下で、Fogarty 2F カテーテルを左総頚動脈に導入し、均一な内皮剥離（de-endothelialization）を達成する。次いでカテーテルを取り除き、結紮を外頸動脈の周りに設置して出血を防止し、動物を回復させる。例えば１２匹の RoRo ラット（４００ｇ、約２４週齢）の２群を研究に使用する：１つの対照群とＶａｖ１阻害因子を受容する１つの群であり、ラットは完全にランダム化する。バルーン損傷の２日前（−３日目）に開始して、研究終了、即ちバルーン損傷の１４日後まで、Ｖａｖ１阻害因子を点滴により投与する。次いで、ラットをイソフルランで麻酔し、０.１Ｍリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７.４）で、次いで１５分間リン酸緩衝液（ｐＨ７.４）中の２.５％グルタルアルデヒドで灌流する。頸動脈を切り取り、周りの組織から分離し、７％ショ糖を含有する０.１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７.４）に浸し、終夜４℃でインキュベートする。次いで、翌日、製造業者の推奨に従い、頸動脈を Technovit 7100 に包埋する。中膜、新生内膜および管腔の横断面の面積を、画像分析システム (MCID, Toronto, Canada) を利用して形態計測学的に評価する。
【００７９】
Ｖａｖタンパク質阻害因子（例えばＶａｖ１阻害因子）を、例えば、同種移植片の急性または慢性拒絶、炎症または自己免疫障害または悪性増殖生疾患の処置または予防のために、単独の有効成分として、または、他の免疫調整措置の薬物または他の抗炎症剤と一緒に投与し得る。例えば、それらを、カルシニュリン阻害因子、例えば、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ、ＦＫ−５０６、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１；ｍＴＯＲ阻害因子、例えば、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５、ＡＰ２３８４１またはＴＡＦＡ−９３；コルチコステロイド類；シクロホスファミド；アザチオプリン；メトトレキセート；ＥＤＧ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０またはその類似体；レフルノミド（leflunomide）またはその受容体；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリン（deoxyspergualine）またはその類似体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、白血球受容体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、またはそれらのリガンド、例えばＣＤ１５４、に対するモノクローナル抗体；または他の免疫調整化合物、例えば、ＣＴＬＡ４またはその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組換え結合分子、例えば、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列（例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ６８６２９）またはその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ）に連結したＣＴＬＡ４またはその突然変異体の細胞外部分の少なくとも一部、または他の接着分子阻害因子、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストを含むｍＡｂまたは低分子量阻害因子；化学療法剤、例えば抗悪性腫瘍剤、または癌治療の佐剤として使用される物質、例えばアロマターゼ阻害因子、抗エストロゲン剤、トポイソメラーゼＩ阻害因子、トポイソメラーゼＩＩ阻害因子、微小管活性剤、アルキル化剤、抗悪性腫瘍的抗代謝剤、白金（platin）化合物、タンパク質キナーゼ、特に非受容体チロシンキナーゼの活性を低減させる化合物、およびさらなる抗血管形成化合物、ゴナドレリンアゴニスト、抗アンドロゲン剤、ビスフォスフォネート化合物、トラスツズマブ、および種々の抗癌剤、例えば６−チオグアニジン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジンまたはブレオマイシン；または、ジフテリアまたはシュードモナス毒素部分およびその融合タンパク質をＴ細胞に標的化するのに適する標的化部分（例えば抗ＣＤ３抗体）を含む抗Ｔ細胞免疫毒素融合タンパク質、例えばＤＴ３８９−ｓＦｖ（ＵＣＨＴ１）、ｓｃＦｖ（ＵＣＨＴ１）−ＰＥ３８および（Ａｌａ）ｄｍＤＴ３９０−ｂｉｓＦｖ（ＵＣＨＴ１＊）（これらはＷＯ０１／８７９８２、ＷＯ００／４１４７４またはＵＳ特許出願番号０９／５７３，７９７に記載の通りに製造および投与でき、これらの内容を出典明示により本明細書の一部とする）、またはＥＰ５１７８２９に開示され、商標ＯＮＴＡＫで市販されているキメラジフテリア免疫毒素と組み合わせて使用してよい。
【００８０】
さらなる態様では、阻害因子は、Ｖａｖ２阻害因子である。「Ｖａｖ２阻害因子」は、Ｖａｖ２のある（即ち、１またはそれ以上の）機能を阻害できる物質またはリガンド（例えば、分子、化合物）を意味する。従って、阻害因子は、Ｖａｖ２のＧＥＦ活性を、またはＶａｖ１と同様に、Ｖａｖ２の他のいかなる機能も、阻害し得る。好ましくは、Ｖａｖ２機能の阻害因子は、例えば、有機低分子、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチドまたはペプチド模倣物である化合物である。Ｖａｖ２結合抗体の例は、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA から入手可能なＶａｖ２（Ｄ−７）およびＶａｖ２（Ｐ−１８）である。他の抗Ｖａｖ２抗体は、抗Ｖａｖ１抗体のために上記した方法と同様に産生し得る。ペプチド、ペプチド模倣物および有機低分子のＶａｖ２阻害因子も、Ｖａｖ１阻害因子のために上記したものと同様のプロセスにより産生し得る。Ｖａｖ２阻害因子は、Ｖａｖ１に関して上記した通りの方法で使用し得る。
【００８１】
Ｖａｖ２阻害因子は、Ｖａｖ１の代わりにＶａｖ２を使用する以外は上記の通りのグアニンヌクレオチド交換アッセイにより同定し得る。さらなる態様では、本発明は、１つのＶａｖ１阻害因子および１つのＶａｖ２阻害因子を含む治療的組合せを提供する。Ｖａｖ１とＶａｖ２の両方を阻害することができる物質を同定するために、そのようなアッセイでＶａｖ１阻害因子をＶａｖ２阻害活性についてさらにスクリーニングしてもよい。従って、ある態様では、阻害因子は組み合わされたＶａｖ１およびＶａｖ２阻害因子であり、これは、Ｖａｖ１とＶａｖ２の両方を阻害することができる単一の物質を意味する。１つの組み合わされたＶａｖ１／Ｖａｖ２阻害因子の使用、または１つのＶａｖ１阻害因子および１つのＶａｖ２阻害因子の組み合わされた投与は、ＴおよびＢ細胞の両方の機能、活性および／または増殖の阻害が望ましい症状を処置する場合に好ましい。
【００８２】
個体に投与するＶａｖタンパク質阻害因子またはさらなる薬物の量は、全般的健康状態、年齢、性別、体重、用いる化合物、投与様式、処置しようとする症状の重篤さなどの、個体の特徴によって決まる。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な投与量を決定できる。典型的には、有効量は、成人で１日当たり約０.１ｍｇないし１日当たり約１００ｍｇの範囲にあり得る。抗体およびその抗原結合フラグメント、特にヒト、ヒト化およびキメラ抗体および抗原結合フラグメントは、しばしば、他のタイプの治療剤よりも低頻度で投与できる。例えば、そのような抗体の有効量は、約０.０１ないし５または１０ｍｇ／ｋｇの範囲で、日毎に、週毎に、２週毎に、月毎に、またはそれより低い頻度であり得る。
【００８３】
Ｖａｖタンパク質阻害因子（例えばＶａｖ１阻害因子）は、いかなる常套の経路でも、特に、経腸、例えば経口、例えば飲用液剤、錠剤またはカプセル剤の形態で、または非経腸、例えば、注射可能液剤または懸濁剤の形態で、または局所で、投与し得る。Ｖａｖ阻害因子は、中性の化合物として、または、医薬的に許容し得る塩、例えば、適する酸または塩基を用いて得られる塩として、投与し得る。
【００８４】
前記に従い、本発明は、なおさらなる態様を提供する：
５. 治療的有効量のＶａｖタンパク質阻害因子（例えばＶａｖ１阻害因子）および少なくとも１つの第２の薬物物質を、例えば同時または連続的に、共に投与することを含み、該第２の薬物物質が、例えば上記に示した通りの免疫抑制剤、免疫調整剤または抗炎症剤または化学療法剤である、上記の通りの方法。
【００８５】
６. ａ）Ｖａｖタンパク質阻害因子（例えばＶａｖ１阻害因子）およびｂ）免疫抑制剤、免疫調整剤または抗炎症剤または化学療法剤から選択される少なくとも１つの第２の物質、を含む治療的組合せ、例えばキット。成分ａ）および成分ｂ）は、同時または連続的に使用し得る。キットは、その投与のための指示書を含んでもよい。
【００８６】
７. 治療的有効量のＶａｖ１阻害因子およびＶａｖ２阻害因子を、例えば同時または連続的に、共に投与することを含む、上記の通りの方法。
【００８７】
８. ａ）Ｖａｖ１阻害因子およびｂ）Ｖａｖ２阻害因子、を含む治療的組合せ、例えばキット。成分ａ）および成分ｂ）は、同時または連続的に使用し得る。キットは、その投与のための指示書を含んでもよい。
【００８８】
９. 物質をＶａｖ１阻害因子として同定するためのスクリーニング方法であって、ＲｈｏまたはＲａｃＧＴＰアーゼのグアニンヌクレオチド交換の速度を、（ａ）その物質、および（ｂ）Ｖａｖ１またはその活性なフラグメントもしくは突然変異体の存在下で判定することを含み、その物質の存在下でのグアニンヌクレオチド交換の速度の低下は、その物質がＶａｖ１阻害因子であることを示すものである、方法。
【００８９】
１０. 物質をＶａｖ２阻害因子として同定するためのスクリーニング方法であって、ＲｈｏまたはＲａｃＧＴＰアーゼのグアニンヌクレオチド交換の速度を、（ａ）その物質、および（ｂ）Ｖａｖ２またはその活性なフラグメントもしくは突然変異体の存在下で判定することを含み、その物質の存在下でのグアニンヌクレオチド交換の速度の低下は、その物質がＶａｖ２阻害因子であることを示すものである、方法。
【００９０】
１１. 上記の方法により得られるＶａｖ１またはＶａｖ２阻害因子。
【００９１】
図１は、ＲａｃＧＴＰアーゼおよびＢＯＤＩＰＹ−ＧＤＰを使用する、Ｖａｖ１の存在下または非存在下のＶａｖ１阻害因子のグアニンヌクレオチド交換アッセイにおける、蛍光の経時的変化を示す。
【００９２】
ここで、以下の非限定的実施例を参照して、本発明をより正確に記載する。
実施例１
Ｂｏｄｉｐｙ−ＧＤＰ／Ｒａｃ−１会合アッセイ
１５３６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.０中の、
【表３】
2006525248.tif 000004
を添加する。０.４ｐｍｏｌ（最終濃度２００ｎＭ）組換えヒトＲａｃ−１を各ウェルに反応開始と同時に添加し、最終体積を各ウェル２μｌとする。様々な試験化合物を各ウェルに添加する。対照のウェルは、上記の成分の各々を含有するが、（ａ）試験化合物を含まない、または（ｂ）試験化合物もＶａｖ−１も含まない。
【００９３】
プレートを３０分間２５℃でインキュベートする。次いで、励起波長４８８ｎｍおよび５３０ｎｍでの測定を使用して、蛍光プレートリーダー中で、各ウェルについて同時に蛍光を測定する。
【００９４】
測定される蛍光は、対照のウェル（ａ）Ｖａｖ−１を含有し、阻害因子を含有しない、で最高である。より低い（ベースライン）蛍光は、対照ウェル（ｂ）Ｖａｖ−１を含まない、で記録される。試験化合物として有効なＶａｖ−１阻害因子を含有するウェルは、対照ウェル（ａ）より低い蛍光を示すので同定し得る。
【００９５】
実施例２
Ｂｏｄｉｐｙ−ＧＤＰ／Ｒａｃ−１解離アッセイ
組換えヒトＲａｃ１を蛍光標識化グアニンヌクレオチドで充填するために、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５中の３２μＭの組換えヒトＲａｃ１、１０００μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、８ｍＭ ＤＴＴおよび５００μｌの４８０ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＤＰを合わせ、３時間室温でインキュベートする。次いで、この混合物６００ｎｌを、２０８０ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。その中では、６００ｎｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５中の３μＭ ｖａｖ１、４００μＭ ＧＴＰが、試験しようとする化合物と既に予めインキュベートされている。対照のウェルは、（ａ）試験化合物を含まない、または（ｂ）試験化合物もＶａｖ−１も含まない。
【００９６】
次いで、プレートを２５℃でインキュベートする。反応開始３０分後に各ウェルで共焦点または非共焦点蛍光リーダーを使用して、反応を開始したのと同じ順番で各ウェルの蛍光読み出しを得ることにより、蛍光を判定する。励起／検出の波長は、実施例１の通りである。
【００９７】
測定される蛍光は、対照のウェル（ａ）Ｖａｖ−１を含有し、阻害因子を含有しない、で最低である。より高い蛍光は、対照ウェル（ｂ）Ｖａｖ−１を含有しない、で記録される。試験化合物として有効なＶａｖ−１阻害因子を含有するウェルは、対照ウェル（ａ）と比較して上昇した蛍光に基づいて同定できる。
【００９８】
さらなる実施例では、会合または解離の変化幅（dynamic range）（測定時の対照ウェル（ａ）と（ｂ）との間の蛍光の差異）を最大にするために、異なる試験化合物濃度（例えば１０μＭ、５０μＭ）、異なる温度（例えば３７℃）および異なるインキュベーション時間（例えば１５分間、１２０分間）で、実施例１および２の方法を繰り返してもよい。他のプレート形式を使用してもよく、会合および解離アッセイの両方とも、同時または連続的蛍光検出のいずれを使用して実施してもよい。Ｖａｖ−１の代わりに組換えヒトＶａｖ−２を用いる同様のアッセイを使用して、Ｖａｖ−２阻害因子を同定し得る。
【００９９】
さらなる実施態様では、上記の実施例を、全長Ｖａｖ−１の代わりに、（ａ）ＤＨドメインを含むＶａｖ−１の切断型突然変異体、または、（ｂ）Ｙ１７４Ｆ突然変異体を使用して繰り返してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ＲａｃＧＴＰアーゼおよびＢＯＤＩＰＹ−ＧＤＰを使用する、Ｖａｖ１の存在下または非存在下のＶａｖ１阻害因子のグアニンヌクレオチド交換アッセイにおける、蛍光の経時的変化を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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