(57)【要約】プロテインキナーゼＦｙｎ（例えばＲｈｏ−キナーゼ阻害剤またはプロテインキナーゼＣｓｋの阻害剤）を用いたシグナル伝達経路のモジュレーターの、腫瘍疾患の処置、特に神経芽細胞腫の療法のための使用を、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＦｙｎを介してのシグナル伝達経路のモジュレーターの、腫瘍疾患の予防および／または処置のための使用。
【請求項２】
神経芽細胞腫の処置における、請求項１に記載のモジュレーターの使用。
【請求項３】
モジュレーターが、活性Ｆｙｎにより直接的に、または間接的に阻害される酵素の阻害剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
腫瘍細胞におけるＦｙｎ活性の増大をもたらす、請求項１または２に記載のモジュレーターの使用。
【請求項５】
モジュレーターが、プロテインキナーゼＣＳＫの阻害剤である、請求項１または２に記載のモジュレーターの使用。
【請求項６】
モジュレーターが、Ｒｈｏ−キナーゼの阻害剤である、請求項１〜４のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【請求項７】
モジュレーターが、ＭＡＰ−ホスファターゼの阻害剤である、請求項１〜４のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【請求項８】
モジュレーターが、プロテインキナーゼＣの活性化因子である、請求項１〜４のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【請求項９】
Ｆｙｎ−キナーゼのタンパク質分解的変質をインビボで阻害する、請求項１または２に記載のモジュレーターの使用。
【請求項１０】
モジュレーターが、Ｆｙｎに拮抗するホスファターゼの阻害剤である、請求項１または２に記載のモジュレーターの使用。
【請求項１１】
Ｆｙｎによるシグナル伝達の増大に関与する、請求項１または２に記載のモジュレーターの使用。
【請求項１２】
プロテインキナーゼＦｙｎを介してのシグナル伝達経路のモジュレーターの、初期段階における腫瘍の転移の形成の抑制のための医薬の製造における使用。
【請求項１３】
腫瘍が、小児科の、または成人の腫瘍である、請求項９に記載のモジュレーターの使用。
【請求項１４】
組成物が、活性成分としてのモジュレーターを含むことに加えて、随意に担体物質および／またはアジュバントを含むことを特徴とする、医薬組成物の構成成分としての請求項１〜１３のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【請求項１５】
モジュレーターが、薬理学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物または薬理学的に許容し得る製剤の形態で存在することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【請求項１６】
モジュレーターが、モジュレーターおよび、生理学的条件下で除去される少なくとも１種の薬理学的に許容し得る保護基を含むプロドラッグの形態で存在することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【請求項１７】
モジュレーターを、経口的に、非経口的に、直腸内に、吸入により、経皮的に、または鼻腔内に投与することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載のモジュレーターの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍疾患の処置、特に神経芽細胞腫の療法における、プロテインキナーゼＦｙｎ（例えばＲｈｏ−キナーゼ阻害剤）を介してのシグナル伝達経路のモジュレーターの使用を記載する。
【０００２】
神経芽細胞腫は、小児期の間に生じる末梢交感神経系の悪性の癌症状である。これらは、小児期の最も頻繁な悪性の癌症状の１つである。毎年、ドイツで約１５０〜２００人の小児が、この腫瘍に罹患し、これは、進行した段階においては通常治療不能である。疾患の経過は、個別の場合において異なり、自発的退行から進行性の経過および転移の形成にわたる。腫瘍は、不随意機能、例えば心血管系および腸および膀胱機能を制御する自律神経系の前駆細胞から発生する。合計で、罹患した小児の約４０％が、最初の５年以内に死亡する。
【０００３】
乏しい予後の基礎として用いられる遺伝子的基準は、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅であり、この結果、腫瘍組織においてＮ−Ｍｙｃタンパク質の調節解除された発現がもたらされる。Ｎ−ｍｙｃは、遺伝子の発現をポジティブおよびネガティブの両方で制御することができる転写因子である。細胞培養モデルを用いて、Ｍｙｃタンパク質は、細胞成長および細胞増殖を共に調節することが示された。
【０００４】
現在の臨床的検査は、神経芽細胞腫のための予後を確立するにあたり、３つの基準を用いる：腫瘍段階、患者の年齢およびＭＹＣＮ遺伝子の増幅。しかし、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅は、信頼性のある基準ではない。その理由は、増幅されたＭＹＣＮ遺伝子を示さない腫瘍がまた発生し得るからである。
【０００５】
この意味において、本発明の問題は、腫瘍疾患、特に神経芽細胞腫における予後の確立および療法のための、神経芽細胞腫の増殖および分化を制御するシグナル伝達経路における遺伝子的差異を用いることである。
本発明の問題は、腫瘍疾患、特に神経芽細胞腫を処置する、有用な新規な方法を作成することにある。
【０００６】
マイクロアレイ分析により、全員が神経芽細胞腫に罹患している多くの患者からの任意数の試料中の多数の遺伝子の発現を、平行して測定する。次に、統計的分析を行い、ここで、臨床的パラメーターを、発現データと相関させ、この結果、原因として腫瘍進行に関与する遺伝子を、同定する。原因として腫瘍進行に関与する遺伝子を同定することにより、本発明者らは、疾患のための原因となる療法の可能性を開拓する。
【０００７】
同定された遺伝子の発現は、特定の腫瘍段階と相関する。驚異的なことに、大きい比率のこれらの遺伝子は、プロテインキナーゼＦｙｎを介して進行するシグナル伝達経路に属する。このシグナル伝達経路は、細胞培養物における細胞接着、細胞増殖および分化を調節することが知られている。細胞接着の変化は、転移の形成の原因である；細胞分化および増殖は、腫瘍成長自体を制御する。データを、独立した測定方法により立証することができることが、示される。ウエスタンブロット方法により、Ｆｙｎ−キナーゼの活性および／または発現と、腫瘍の段階との間に、関係があることが示された。すべての測定により、Ｆｙｎによるシグナル伝達が、進行した腫瘍段階においてスイッチオフされることが示される。発現分析は、転移の形成におけるＦｙｎシグナル伝達経路の作用を強調する。
【０００８】
さらに、本発明者らは、Ｆｙｎが、神経芽細胞腫における前記のプロセスにおいて原因となる作用を有することを実証する。２つの異なる神経芽細胞腫細胞系を用いて、Ｆｙｎの発現、即ちシグナル伝達の再活性化が、成長停止、増大した接着および培養物における神経芽細胞腫細胞の分化をもたらすことが、示される。従って、本発明者らは、Ｆｙｎによるシグナル伝達の損失が、述べた生物学的プロセスにおいて原因的であることを実証した。
【０００９】
神経芽細胞腫のヒト腫瘍試料のマイクロアレイ分析により、驚異的なことに、プロテインキナーゼＦｙｎを介したシグナル伝達経路が、腫瘍成長および転移の形成を調節することが見出された。さらに、Ｆｙｎによるシグナル伝達が、進行した腫瘍段階においてスイッチオフされることが、見出された。神経芽細胞腫において下方調節される(down-regulated)、Ｆｙｎ−キナーゼを介してのシグナル伝達経路の影響、特にＦｙｎを介してのシグナル伝達経路の（再）活性化は、神経芽細胞腫の処置における療法のための可能性を構成する。
【００１０】
プロテインキナーゼＦｙｎを介してのシグナル伝達経路のモジュレーターを用いることにより、本発明において、腫瘍成長および転移の形成を防止し、従って腫瘍疾患（特に神経芽細胞腫）を処置することが、可能である。
【００１１】
本発明の他の態様は、プロテインキナーゼＦｙｎを介してのシグナル伝達経路のモジュレーターであって、モジュレーターが、活性Ｆｙｎにより直接的に、または間接的に阻害される酵素の阻害剤である、前記モジュレーターに関する。
本発明の他の態様は、腫瘍細胞におけるＦｙｎ活性の増大をもたらすモジュレーターに関する。
本発明の他の態様は、モジュレーターが、プロテインキナーゼＣＳＫの阻害剤、Ｒｈｏ−キナーゼの阻害剤、ＭＡＰ−ホスファターゼの阻害剤またはプロテインキナーゼＣの活性化因子である、前記モジュレーターに関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、Ｆｙｎ−キナーゼのタンパク質分解的変質をインビボで阻害するモジュレーターに関する。
本発明の他の態様は、モジュレーターが、Ｆｙｎに拮抗するホスファターゼの阻害剤である前記モジュレーターに関する。
本発明の他の態様は、Ｆｙｎによるシグナル伝達の増大に関与するモジュレーターに関する。
【００１３】
さらに、本発明は、プロテインキナーゼＦｙｎを介してのシグナル伝達経路のモジュレーターの、初期段階における腫瘍の転移の形成の抑制のための医薬の製造における使用であって、腫瘍が、小児科の、または成人の腫瘍であることが可能である、前記使用に関する。
本発明は、さらに、組成物が、活性成分としてのモジュレーターを含むことに加えて、随意に担体物質および／またはアジュバントを含むことを特徴とする、医薬組成物の構成成分としての前記したモジュレーターの使用に関する。
【００１４】
本発明の他の態様は、モジュレーターが、薬理学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物または薬理学的に許容し得る製剤の形態で存在することを特徴とする、前記したモジュレーターに関する。
本発明の他の態様は、モジュレーターが、モジュレーターおよび、生理学的条件下で除去される少なくとも１種の薬理学的に許容し得る保護基を含むプロドラッグの形態で存在することを特徴とする、前記したモジュレーターに関する。
本発明の他の態様は、モジュレーターを、経口的に、非経口的に、直腸内に、吸入により、経皮的に、または鼻腔内に投与することを特徴とする、前記したモジュレーターに関する。
【００１５】
発明の詳説
この主題に対する対応する科学的研究は、B. Berwanger, O. Hartmann, E. Bergmann, S. Bernard, D. Nielsen, M. Krause, A. Kartal, D. Flynn, R. Wiedemeyer, M. Schwab, H. Schaefer, H. Christiansen and M. Eilers: "Loss of a FYN-regulated differentiation and growth arrest pathway in advanced stage neuroblastoma"、Cancer cell, Vol. 2, ２００２年１１月、３７７〜３８６頁中により刊行されており、この全部の内容を、参照する。
【００１６】
神経芽細胞腫の発生の分子的経過への見識を得るために、９４の個別の腫瘍組織試料の発現プロフィルを、ヒトユニジーン(Unigene)４６０８  ｃＤＮＡチップを用いて作成した。各々のチップを、基準として、ヒト神経芽細胞腫細胞系（ＳＨＥＰ）から由来するｃＤＮＡでハイブリダイズする。腫瘍を、これらが、全体として腫瘍段階の分布および腫瘍バンクのＭＹＣＮ増幅を反映するように、選択した。個別のスポットとアレイとの間の比較を可能にするために、各々のシグナルを、この背景に関して補正し、ｌｏｇ２−変換オン／オフ調節強度比を計算し、標準化した。調整したｐ値を有する２種の試料ｔ統計値を用いて、異なって発現された遺伝子を同定した(Callow et al., 2000)。調整されたｐ値は、同時に４６０８遺伝子の試験を補正し、不正確な遺伝子を検出する全体的な確率を評価する（方法を参照）。
【００１７】
本発明者らは、ＭＹＣＮ増幅（ｎ＝１７）および非増幅（ｎ＝７７）腫瘍を比較した際に、１２３の異なって発現された遺伝子を見出した（調整されたｐ値＜０．０５）。これらの遺伝子を、制御されていない、階層的な集団において用い、分析により、３つ以外のすべての腫瘍が、２つの群の１つに正確に割り当てられたことが示された。機能的な注釈により、ＭＹＣＮ増幅腫瘍においてスイッチオンされた遺伝子のほとんどが、タンパク質合成、代謝および細胞サイクルの調節において作用を奏するタンパク質をコードすることが示された；これは、細胞培養物における誘発可能な系を用いることにより作成されたマイクロアレイデータと整合する。これらの結果は、Ｍｙｃタンパク質が、両方の細胞成長およびまた細胞増殖を調節すること、並びに細胞培養物を用いて発生したモデルが、神経芽細胞腫の形成に拡張されることを示す。
【００１８】
細胞培養実験において（ｃ−）Ｍｙｃの標的遺伝子であると同定された一連の遺伝子の発現は、２つの群の腫瘍の間で顕著に異なっていた。ほとんどがＭＹＣＮ増幅腫瘍においてスイッチオフされた遺伝子の大きい群は、多段階シグナル伝達経路に関与するタンパク質をコードする。このことは、Ｍｙｃタンパク質が、シグナル伝達経路のためのネガティブのフィードバックシグナルを構成することを示す。驚異的なことに、ＭＹＣＮ増幅腫瘍において増大して出現する細胞サイクル遺伝子は、チェックポイント応答として、またはサイクルのＧ２もしくはＭ相において機能することが知られているタンパク質をコードし、これは、チェックポイント制御および細胞サイクルの後方におけるＭｙｃの新たな機能に向ける。
【００１９】
これらの遺伝子の調節解除は、簡単な方式において、ほとんどのＭＹＣＮ増幅腫瘍の進行した腫瘍段階を反映し得る（表１）。この可能性を排除するために、本発明者らは、段階４のＭＹＣＮ増幅と非増幅腫瘍との間のこれらの発現を比較した。本発明者らが分析したすべての遺伝子の発現は、腫瘍段階とは関係なく、ＭＹＣＮ増幅により調節された。逆に、調節解除は、Ｎ−Ｍｙｃによる直接の調節を反映し得る。この解釈は、多くのＥボックスが、ＭＡＤ２、ＣＥＮＰＥおよびＡＵＲＯＲＡ２遺伝子のプロモーターおよびイントロン中に存在するという事実と整合する（図１、欄ｅ）。クロマチン免疫沈殿により、実際に、Ｎ−Ｍｙｃが、インビボでＭＡＤ２遺伝子のＥボックスと結合することが示された。このことから、本発明者らは、本発明者らが同定した遺伝子の少なくともいくつかが、Ｎ−Ｍｙｃの直接の標的遺伝子であると結論づけた。
【００２０】
【表１】
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表１：本研究に参加する９４人の患者の臨床的パラメーター。年齢および段階は、高度に異種であり、数が少ないためにこれらを独立して分析することはできない。
【００２１】
最初の研究により、非ＭＹＣＮ増幅腫瘍の中で、段階２、３および４Ｓではなく、段階１および４が、これらの発現プロフィルにおいて差異を示すことが示された（データは示していない）。本発明者らは、段階１（ｎ＝１９）および段階４（ｎ＝２１）における腫瘍において異なって発現された、３６の表示的な遺伝子を見出した（調整されたｐ値＜０．２）。この遺伝子の群は、ＭＹＣＮ増幅腫瘍を非増幅腫瘍と区別する遺伝子の群と、わずかな重複を示した；遺伝子の機能的な注釈により、代謝およびタンパク質合成において作用を奏するタンパク質をコードする遺伝子は、ＭＹＣＮ増幅腫瘍に特有である遺伝子とは対照的に、明らかに、段階特異性遺伝子の群が存在しないことが示された。
【００２２】
対照的に、特徴的な百分率の異なって発現された遺伝子は、非レセプターチロシンキナーゼＦｙｎおよびアクチン細胞骨格によりシグナル移動に関与する遺伝子をコードする；これらの遺伝子は、神経芽細胞腫の進行した段階において、協調された方式で下方調節された。この群は、Ｆｙｎ自体、アクチンフィラメント結合タンパク質（ＡＦＡＰ）、ＳｒｃおよびＦｙｎキナーゼに結合し、後者を活性化するタンパク質；α−カテニン（ＣＴＮＮＡ１）、β−およびγ−カテニンへの結合がＦｙｎ依存性リン酸化により調節されるアクチン結合タンパク質；非レセプターチロシンキナーゼおよびアクチン細胞タンパク質トロポモジュリン(tropomodulin)およびＭＡＲＣＫＳによりシグナルを発生する、神経細胞接着タンパク質ＮＲＣＡＭを含む。
【００２３】
ウエスタンブロットにより、段階１と比較した、段階４の腫瘍におけるＦｙｎの減少された発現が確認された；さらに、この実験は、これと整合して、段階４の腫瘍と比較して、段階１のすべての腫瘍からの抽出物中のＦｙｎタンパク質のゆっくりとした移動を示し、これは、自己リン酸化された（活性な）形態が存在することを示す。ホスファターゼ処理により、異なる移動が、リン酸化の結果生じたことが確認された。これらの観察との画一性において、高いＦｙｎ−キナーゼ活性が、段階１の腫瘍からの組織試料において得られ、これについて、免疫複合体キナーゼアッセイを用い、これは、自己リン酸化およびまた外来性の基質、エノラーゼのリン酸化の両方を測定する(Wolf et al., 2001)。対照的に、段階４の腫瘍からの抽出物中のＦｙｎ−キナーゼ活性は、可変であり、平均して顕著に低かった。
【００２４】
Ｆｙｎが、神経芽細胞腫細胞の分化および細胞増殖の調節において作用を奏するか否かを試験するために、本発明者らは、一過性のトランスフェクションを用いて、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞−段階４の腫瘍から由来するヒト神経芽細胞腫細胞系においてＦｙｎを発現させた(Pahlman et al., 1981)。野生型Ｆｙｎの発現により、複数の神経突起および分化の明白な形態学的特徴の拡張が誘発された。細胞増殖のマーカータンパク質としてのサイクリンＡに向けられた抗体での染色により、活性Ｆｙｎを発現する細胞が、細胞サイクルから励起されたことが示された。対照的に、キナーゼ陰性対立遺伝子（ＦｙｎＫ２９９Ｍ）を発現する細胞は、形態学的分化の徴候を示さなかった。Ｆｙｎの活性化におけるＡＦＡＰの作用との適合性において、ＡＦＡＰの構成的に活性な対立遺伝子の発現により、活性Ｆｙｎに高度に類似する形態学的変化が誘発され、他方ＡＦＡＰのドミナントネガティブな対立遺伝子は、分化に影響しない。
【００２５】
本発明者らは、ＩＭＲ−３２細胞、増幅されたＭＹＣＮ遺伝子を有するヒト神経芽細胞腫細胞系における実験を繰り返した(Clementi et al., 1986)。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において得られた結果と同様に、活性Ｆｙｎ−キナーゼの発現により、神経突起拡張および細胞サイクル出口が誘発された。このことは、Ｆｙｎによる分化の誘発が、増幅されたＭＹＣＮ遺伝子の存在下においても生じることを示す。これは、ＦＹＮ、ＡＦＡＰ、ＮＲＣＡＭおよびＣＴＮＮＡ１の発現が、段階１における腫瘍に基づいて、ＭＹＣＮ増幅腫瘍および非増幅腫瘍において、等しく下方調節されるという発見と一致する。
【００２６】
総合的に、本発明者らは、一方がＭＹＣＮ遺伝子の増幅により制御され、第２のものが遺伝子発現の段階特異的プログラムである、神経芽細胞腫の発生を調節する２つの遺伝子的プログラムを同定した。２つのプログラムは、高い程度に、互いに独立している。その理由は、（ａ）遺伝子の２つの群は、重複をほとんど示さず、（ｂ）遺伝子は、腫瘍段階とは関係なくＭＹＣＮ増幅により下方調節され、（ｃ）腫瘍段階特異性遺伝子は、ＭＹＣＮ増幅とは関係なく下方調節されるからである。ＭＹＣＮの調節解除された発現により、細胞サイクルの進行およびまた細胞成長の両方に関与するタンパク質をコードする遺伝子が活性化され、ヒト腫瘍における多段階シグナルプロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子が抑制される。これらの発見は、特に、Ｍｙｃタンパク質が、細胞サイクルのＧ２相における遺伝子発現を制御し、チェックポイントプロセスに関与する遺伝子を活性化することを示す。
【００２７】
本発明者らのデータは、Ｆｙｎ−キナーゼが、神経芽細胞腫細胞の増殖および分化をインビボで調節することを示す；これは、同様に、段階に特異的な発現プロフィルが、生存の前兆となるという発見により支持される。個別の腫瘍段階の詳細な発現プロフィルにより、Ｆｙｎの下方調節は、段階１と２との間で最も顕著であることが示され、これは、局所的なリンパ節における転移の形成と相関する。Ｆｙｎおよびまた修正された細胞接着の下方調節により、インビボでの局所的な転移の形成が制御される。
【００２８】
活性なＦｙｎは、この機能を、多くの方法で発揮することができる：神経細胞において、非レセプターのチロシンキナーゼは、Ｒｈｏ−ＧＡＰをリン酸化し、この結果、Ｒｈｏの不活性化および分化の誘発がもたらされる。Ｆｙｎシグナル形成により阻害されるシグナル伝達経路中に分子があり、これにより、これらが、治療的介入のための候補となることが、見出された。本発明において、Ｆｙｎの下流にあるシグナル伝達経路に影響することにより、進行した段階の神経芽細胞腫への治療的方法が提供される。
【００２９】
Ｆｙｎシグナル伝達経路中の好ましい標的分子は、Ｆｙｎシグナル伝達により阻害されるものである。
好ましいモジュレーターは、活性Ｆｙｎにより直接的に、または間接的に阻害される酵素の阻害剤である。
【００３０】
さらに好ましいのは、腫瘍細胞（特に神経芽細胞腫）におけるＦｙｎ活性の増大をもたらすモジュレーターである。
特に好ましいのは、神経芽細胞腫において発現され、インビボでＦｙｎのネガティブな制御因子である、プロテインキナーゼＣＳＫの阻害剤である。
【００３１】
好ましいのは、さらに、インビボでＦｙｎ−キナーゼのタンパク質分解的変質を阻害するモジュレーター、例えばプロテアソーム（ＬＬＮＬ、ＭＧ１３２）の一般的阻害剤または関与するＥ３リガーゼの特異的阻害剤である。
さらに好ましいモジュレーターは、Ｆｙｎ、例えばＭＡＰ−キナーゼホスファターゼ１に拮抗するホスファターゼの阻害剤である。
【００３２】
また、好ましいのは、Ｆｙｎによるシグナル伝達における増大に寄与するモジュレーター、例えばＲｈｏ−キナーゼ阻害剤、ＭＡＰ−ホスファターゼ阻害剤またはプロテインキナーゼＣの活性化因子である。
本発明は、さらに、記載したモジュレーターの薬理学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物または薬理学的に許容し得る製剤を包含する。
【００３３】
薬理学的に許容し得る塩の例は、生理学的に許容し得る鉱酸、例えば塩酸、硫酸およびリン酸の塩または有機酸、例えばメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、乳酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸およびサリチル酸の塩である。本発明のモジュレーターを、溶媒和、特に水和させることができる。水和は、例えば、製造プロセスの間に、または最初に無水状態の化合物の吸湿性性質の結果として起こり得る。記載したモジュレーターが、不斉Ｃ原子を含む際には、これらは、ジアステレオマーの混合物、鏡像体の混合物の形態で、または光学的に純粋な化合物の形態で、存在し得る。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、活性成分として、少なくとも１種の記載したモジュレーターおよび随意に担体物質および／またはアジュバントを含む。
また本発明が関連するプロドラッグは、本発明のモジュレーターおよび、生理学的条件下で除去される少なくとも１種の薬理学的に許容し得る保護基、例えばアルコキシ、アラルキルオキシ、アシルまたはアシルオキシ基、例えばエトキシ、ベンジルオキシ、アセチルまたはアセトキシ基からなる。
【００３５】
本発明はまた、腫瘍疾患（特に神経芽細胞腫）の防止および／または処置のための医薬の製造におけるモジュレーターの使用に関する。一般的に、モジュレーターを、既知の、および許容し得る方法を用いて、個別に、またはすべての他の所望の治療剤と組み合わせて投与する。このような治療的に有用な剤を、以下の経路の１つにより投与することができる：例えばドラジェー、被覆錠剤、ピル、半固体物質、軟質もしくは硬質カプセル、溶液、エマルジョンまたは懸濁液の形態で経口的に；例えば注射可能な溶液の形態で非経口的に；座剤の形態で直腸内に；例えば粉末製剤もしくはスプレーの形態で吸入により、経皮的に、または鼻腔内に。このような錠剤、ピル、半固体物質、被覆錠剤、ドラジェーおよび硬質ゼラチンカプセルの製造のために、治療的に使用可能な生成物を、薬理学的に不活性な、無機または有機医薬担体物質、例えばラクトース、スクロース、グルコース、ゼラチン、麦芽、シリカゲル、デンプンまたはこれらの誘導体、滑石粉、ステアリン酸またはこの塩、脱脂乳(skimmed milk)粉末などと混合することができる。
【００３６】
軟質カプセルの製造のために、薬学的担体物質、例えば植物油、石油、動物または合成油、ろう、脂肪およびポリオールを用いることができる。液体溶液およびシロップの製造のために、薬学的担体物質、例えば水、アルコール、水性生理的食塩水溶液、水性デキストロース、ポリオール、グリセロール、植物油、石油および動物または合成油を用いることができる。座剤のために、薬学的担体物質、例えば植物油、石油、動物または合成油、ろう、脂肪およびポリオールを用いることができる。エアゾール製剤のために、この目的に適する圧縮ガス、例えば、酸素、窒素および二酸化炭素を用いることができる。薬学的に許容し得る剤はまた、保存および安定化のための添加剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、カプセル封入添加剤および酸化防止剤を含むことができる。
【００３７】
他の治療剤との組み合わせは、腫瘍疾患（特に神経芽細胞腫）の処置において常習的に用いられる他の活性成分を含むことができる。
上記した疾患の防止および／または処置のために、本発明のモジュレーターの用量を、広範囲内で変化させることができ、個別の要求に対して調整することができる。一般的に、１日あたり０．１μｇ〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの用量が好適であり、好ましい用量は、１日あたり０．５〜１０ｍｇ／ｋｇである。好適な場合において、用量はまた、述べた値より低いかまたは高いことができる。
【００３８】
例
Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤の例は、EP0370498、US4997834、EP0956865、US6218410、US4678783、US6153608、EP0885888、WO0168607およびWO0156988に記載されている。特に、ここでは、化合物Ｉ（ファスジル(fasudil)）、ＩＩ（ヒドロキシファスジル）、ＩＩＩおよびＩＶを述べることができる：
【化１】
2006500331.tif 000003
【００３９】
プロテインキナーゼＣの活性化因子の例は、化合物Ｖ、ユーロペプチド(Europeptide)の化合物EP-70905、天然の物質ブリオスタチン、テレオシジン、アプリシアトキシン並びにまたホルボールおよびインゲノールのエステルである。他の化合物、例えばＶＩおよびＶＩＩは、J. D. Winkler et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 296-300に記載されている。
【化２】
2006500331.tif 000004
【００４０】
ＭＡＰ−キナーゼホスファターゼ１阻害剤の例は、Maxima Pharmaceuticalsの化合物ＭＸ  ７０９１である。
ＣＳＫ阻害剤の例は、天然物質スタウロスポリンである。
【００４１】
材料および方法
マイクロアレイ実験
用いるチップは、Research Genetics (http://www.resgen.com)のｃＤＮＡセットｇｆ２００およびさらに、神経芽細胞腫の発生の予後に有効に適するとすでに前に記載した１００のｃＤＮＡを含む（詳細については、http://www.imt.unimarburg.deを参照）。各々のｃＤＮＡを、チップあたり２回スポットした。チップを、ＧＭＳ  ４１７アレイヤー(arrayer)を用いて、Hegde et al., 2000に記載されたようにして得た。
【００４２】
一連の１００の無秩序に選択した腫瘍の最初の組織化学的研究により、約９５％の腫瘍が、組織試料中に５％より少ない非腫瘍細胞を含むことが明らかになった（Bergmann et al., 2001を参照）。従って、ＲＮＡの製造の前に、腫瘍組織を精査するさらなる試行は、なされなかった。神経芽細胞腫組織およびＳＨＥＰからの全ＲＮＡを、キアゲン(Qiagen)ＲＮＡ単離キットを用いて、製造者の指示に従って単離した。４０μｇの全ＲＮＡを用いて、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光標識ｃＤＮＡを、刊行されたプロトコル(http://brownlab.stanford.edu)に従って得た。チップを、ＧＭＳ  ４１８蛍光スキャナーを用いて走査し、画像を、ＩＭＡＧＥＮＥ  ３．０ソフトウエアを用いて分析した。発現データを、ノーザンブロット分析またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＴアッセイのいずれかにより確認した。
【００４３】
標準化および品質制御
ImaGene  ３．０：ソフトウエアパラメーター、例えば「シグナル範囲」または「スポット検出しきい値」（詳細については、ImaGene使用者マニュアルを参照）を、本発明者らの実験における画像分析の前に、最大の再現性のために最適化した。各々のスポットについて、両方のチャンネルについての中央のシグナルおよび背景強度を、得る。スポット間の差異を決定するために、２つのチャンネルの補正された背景比を、計算し、ｌｏｇ２変換した。
【００４４】
２種の染料の蛍光強度を均衡させ、また実験の全体での発現レベルの比較を可能にするために、未加工のデータを標準化した。先ず、本発明者らは、ピン状の強度依存性標準化(Yang et al., 2002)を用いて、各々のチップに対する本来的なバイアスを補正した（lowess散乱プロットを一層平滑に）。第２の段階において、一般的な標準化を行って、各々のアレイについてのｌｏｇ比率を０に集中させた（一般的な染色およびスキャナー効果を考慮するために）。各々の遺伝子をチップ上に２回スポットしたため、平均のｌｏｇ比率Ｍを、複製から計算した。複製が、４倍よりも大きく異なっている場合、または背景強度が、シグナル強度よりも高い場合には、当該遺伝子を、アレイから排除した。
【００４５】
統計的分析
最終的なデータマトリックスは、９４の個別の腫瘍からの４６０８の標準化された遺伝子発現測定（ｌｏｇ２比率）からなっていた（欠落した値を含む）。２つの独立した群の間の発現プロフィルを比較するために、２つの試料ｔ統計値を、各々の遺伝子について用いた。複数の試験を考慮するために、本発明者らは、各々の遺伝子についての調整されたｐ値を計算し、この過程で、本発明者らは、減少(step-down)順列アルゴリズム（Westfall and Young, 1993, アルゴリズム４．１）を用いた。この方法は、以前にマイクロアレイに適用された(Callow et al., 2000)。順列アルゴリズムにより、族状(family-wise)誤差率（ＦＷＥＲ）に対する強力なチェックが提供され、変数（遺伝子）の相関が考慮される。この手順は、正規性推測に依存しない；ｔ統計値が、すべての遺伝子について漸近的に同一のゼロの分布を有する（かまたは、ｐ値が、遺伝子の全体の観察されたｔ統計値において単調である）ことが、推測される。
【００４６】
集団分析
集団分析の前に、各々の遺伝子の発現プロフィルを、平均の観察された値の減算により集中させた。次に、平均の結合階層的集団化を、遺伝子およびまたチップについて行い、この過程で、プログラムJ-Expressにおいて実行されたユークリッド距離測定基準を用いた(Dysvik and Jonassen, 2001)。
【００４７】
ウエスタンブロット、免疫沈殿、ホスファターゼ処理
以下の抗体を、ウエスタンブロット、免疫蛍光実験および免疫沈殿において用いた：α−Ｆｙｎ：（ｓｃ−４３４）；α−ｃｄｋ２（ｓｃ−１６３）、α−サイクリンＡ（ｓｃ−７５１）、すべてSanta Cruzから。神経芽細胞腫組織を、記載されたように溶解した(Bergmann et al., 2001)。
ホスファターゼ処理のために、５００μｇの細胞タンパク質を、プロテインＧビーズに結合した５μｇのＦｙｎ抗体と共に、一晩４℃でインキュベートした。免疫複合体を、λ−プロテインホスファターゼ（ＮＥＢ）またはλ−プロテインホスファターゼおよびホスファターゼ阻害剤のいずれかと共に、インキュベートした。免疫複合体を、１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより電気泳動的に分離し、ＰＶＤＦ膜に移送し、α−Ｆｙｎ抗体で検出した。
【００４８】
インビトロキナーゼアッセイ
５００μｇの細胞タンパク質を、プロテインＧビーズに結合した５μｇのα−Ｆｙｎ抗体で免疫沈殿させ、洗浄し、キナーゼアッセイ緩衝液中で平衡にし、１０μＣｉ  γ−ＡＴＰ(Amersham)および０．１２５ｍｇ／ｍｌのエノラーゼと共に１５分間インキュベートし、１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより電気泳動的に分離し、乾燥した。結果を、富士ホスフォイメージャー上で視覚化し、ビルデイッヒ(Bildeich)ソフトウエアを用いて定量した。
【００４９】
クロマチン免疫沈殿
クロマチン免疫沈殿を、前に記載されたようにして行った(Bouchard et al., 2001)。核抽出物を、プロテインＡおよびプロテインＧビーズに結合した３μｇのα−Ｎ−Ｍｙｃ抗体または対照抗体で、一晩４℃で免疫沈殿した。ＰＣＲ分析のために、プロチモジンアルファのイントロン１に特異的なプライマー対（正の対照として）およびまたＭＡＤ２遺伝子の示した領域を増幅するプライマー対を、用いた。プライマー配列は、要求に応じて入手可能である。
【００５０】
細胞培養実験
ＳＨ−ＳＹ５ＹおよびＩＭＲ−３２神経芽細胞腫細胞系を、１０％熱不活性化ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。野生型Ｆｙｎ（Ｆｙｎｗｔ）およびＦｙｎＫ２９９ＭをコードするＣＭＶ駆動発現構築物は、記載されている(Wolf et al., 2001)。ＡＦＡＰΔＬＺおよびＡＦＡＰΔ１８０−２２６をコードするプラスミドは、記載されている(Baisden et al., 2001)。一過性のトランスフェクションのために、細胞を、先ず、マトリゲル(Matrigel)(Becton-Dickinson)の１：５の希釈物で被覆したカバースリップ上で、６時間成長させた。トランスフェクションを、５μｇのＤＮＡおよびまたリポフェクチン(Lipofectin)試薬(Invitrogen)を用いることにより、行った。細胞を、６０時間後にパラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、モノクローナルα−Ｆｙｎ抗体(Santa Cruz)またはα−ＡＦＡＰウサギポリクローナル抗体(Baisden et al., 2001)で染色した。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【国際調査報告】
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