(57)【要約】高周波低エネルギー超音波を用いて、液体媒体中の高増殖性、未分化またはウィルス感染細胞を処理、成長阻止、および中和するための装置および方法である。
2006514857.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液の処理装置であって、
高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞の懸濁液からなる流体を収容する区画室と、
１００ｋＨｚより高い周波数を有する超音波を、有意なキャビテーションを起こさせるまたは流体を有意に加熱するのに不十分な電力と持続時間で放出するように構成された放出器と、
区画室内の超音波場中に、１ｍｍ未満の平均径のマイクロバブルを放出するように構成されたマイクロバブル放出器とを含む装置。
【請求項２】
ガスマイクロバブルは、空気および酸素マイクロバブルからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
区画室は、哺乳動物から抽出した生理学的流体を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
生理学的流体は、血液、血漿、血清または脳脊髄液からなる群の１つ以上から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
ガスマイクロバブルの平均径は５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
ガスマイクロバブルの平均径は３０μｍ未満であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
マイクロバブル放出器は、区画室の基部に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
区画室は、超音波を連続的または間欠的に放出するように構成された複数の超音波放出器を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項９】
電磁波放射線放出器をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
電磁波放射線放出器は、紫外線（ＵＶＡ、ＵＶＢ、ＵＶＣ）、赤外線およびマイクロ波からなる群の１つ以上から選ばれる周波数の連続または間欠放射線を放出することを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
処理された生理学的流体中の高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞を回収するための装置をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞を回収するための装置は、フィルターおよびハイドロサイクロンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
超音波放出器に１Ｗ／ｃｍ２未満で電力を供給するように構成された発電機をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
電力は３０ｍＷ／ｃｍ３未満で生理学的流体に伝送されることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
生理学的流体中に懸濁された高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞の増殖を中和、除去および／または阻止する方法であって、
処理すべき生理学的流体を収容した区画室に１００ｋＨｚより高い周波数を有する超音波を放出することと、
平均径が１ｍｍ未満のガスマイクロバブルを、生理学的流体を収容する区画室内の超音波場内に放出することを含む方法。
【請求項１６】
ガスマイクロバブルはオゾンマイクロバブルでないことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ガスマイクロバブルは、空気および酸素マイクロバブルからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
生理学的流体は哺乳動物に投与されるか、および／または、哺乳動物から抽出されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
生理学的流体は、血液、血漿、血清および脳脊髄液から成る群より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ガスマイクロバブルの平均径は５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ガスマイクロバブルの平均径は３０μｍ未満であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
区画室に放出される超音波は定常場現象を生まないことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
主として可視領域内の電磁照射線を有する光を超音波場内に放出することをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
高増殖性細胞は、腫瘍細胞、骨髄細胞、幹癌細胞、および前癌細胞からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
高増殖性細胞は、白血病細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
方法は生体外で実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１Ｗ／ｃｍ２未満で超音波放出器に電力を供給することをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
電力は、生理学的流体に３０ｍＷ／ｃｍ３未満で伝送されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生理学的流体中の高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞を処理する方法であって、
処理すべき生理学的流体を収容した区画室に１００ｋＨｚより高い周波数を有する超音波を放出することと、
超音波およびマイクロバブルの放出が高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞における有意なアポトーシスを誘導するように、平均径が１ｍｍ未満のガスマイクロバブルを生理学的流体を収容する区画室内の超音波場内に放出することとを含む方法。
【請求項３０】
ガスマイクロバブルはオゾンマイクロバブルでないことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ガスマイクロバブルは、空気および酸素マイクロバブルからなる群より選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
生理学的流体は哺乳動物に投与されるか、および／または、哺乳動物から抽出されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
生理学的流体は、血液、血漿、血清および脳脊髄液から成る群より選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ガスマイクロバブルの平均径は５０μｍ未満であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ガスマイクロバブルの平均径は３０μｍ未満であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
区画室に放出される超音波は定常場現象を生まないことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
主として可視領域内の電磁照射線を有する光を超音波場内に放出することをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
高増殖性細胞は、腫瘍細胞、骨髄細胞、幹癌細胞、および前癌細胞からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
高増殖性細胞は、白血病細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
方法は生体外で実施されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
１Ｗ／ｃｍ２未満で超音波放出器に電力を供給することをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
電力は、生理学的流体に３０ｍＷ／ｃｍ３未満で伝送されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高周波数低エネルギー超音波を使用して液体媒体を処理することに関する。特定の実施形態において、本発明の装置および方法は生理学的流体中に懸濁された細胞内で有意なアポトーシスを誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞は超音波に曝露することによって損傷を受けることがある。例えば、超音波は不可逆的細胞損傷をもたらし、破壊的な細胞膜修飾を誘導することができる。いくつかの報告によれば、音圧場によって発生した気泡の崩壊によるキャビテーションが、超音波照射に続く細胞損傷の要因である可能性が示唆されている。またキャビテーションが、残留過酸化水素の作用によりＤＮＡ内の一本鎖破断を誘導することも示唆されている。
【０００３】
癌治療における超音波の使用は重要な課題となっている。超音波は、温熱療法や、光、放射線および化学治療と組み合わせて用いられてきた。悪性細胞は、上記の組み合わせ方法に対して、その正常細胞よりも影響を受けやすいことが知られている。ある分子（例えば、伝統的な光線感作物質や超音波感作物質）に対する直接照射（例えば超音波、レーザ、光）は、一重項酸素、スーパーオキシドラジカル、ヒドロペルオキシドまたは脂肪酸ラジカルなどの高い活性を有する酸素種であって、悪性細胞に選択的に作用して癌治療における重要な役割を果たしうる酸素種を発生させる効果を有する。
【０００４】
上述の治療は、照射源に基づいてＰＤＴ（光力学治療）と呼ばれるか、または超音波または超音波発光による場合には、ＳＤＴ（超音波力学治療）と呼ばれる。いずれの治療においても、光線感作物質を添加することが前提となる。ＳＤＴおよびＰＤＴによって誘導される一般的な効果は細胞生存性に関して異なるが、ＳＤＴ（特に超音波キャビテーション性に関して）とＰＤＴのいずれも活性な酸素化種をもたらし、細胞内チオールレベルを減少させる。紫外線Ａ（ＵＶＡ）によるＰＤＴの場合、Ｔヘルパー細胞のアポトーシスは一重項酸素の生成によって誘導されるが、この効果は本質的に光線感作物質（ＰＳ）の初期濃度と局所酸素濃度とに依存する。ＳＤＴについては、高いエネルギーが伴うために、細胞溶解が主たる現象となってしまい、おそらくは生き残り細胞への他の効果が隠れてしまっているようである。
【０００５】
Ｕｍｅｍｕｒａらに付与された米国特許第４，９７１，９９１号は、腫瘍細胞の治療に超音波を使用することを開示しているが、高い超音波出力レベルに依存しており、マイクロバブルの使用については記載していない。超音波およびマイクロバブルを記載した他の特許、例えばＤ’Ａｒｒｉｇｏに付与された米国特許５，２１５，６８０号は、個々の癌細胞ではなく、腫瘍を治療するために超音波のキャビテーションおよび熱的効果を使用することによるものであり、この範囲は処理の持続時間と数によって決定される。このタイプの処理では、高出力で長い照射時間を用いて、主として細胞溶解と壊死を起こさせる。Ｋｏｎｄｏ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７８（１）、６３〜７０頁、（２００２）を参照のこと。
【発明の開示】
【０００６】
図１は、本発明に記載されている超音波処理装置の一実施形態を示す図である。
【０００７】
図２は、超音波およびマイクロバブルによって懸濁液中の高増殖性細胞を処理するための装置を示した３つの図である。左側の図は装置の上面図であり、中央の図は前面図であり、右側の図は装置の側面図である。
【０００８】
図３は、細胞グルタチオンレベルに対する超音波処理の効果を示した棒グラフである。データは、未処理細胞と対照的なグルタチオンレベルを示した細胞の百分率で示されている。値は３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【０００９】
図４は、細胞カスパーゼ３活性に対する高周波数超音波の影響を示した棒グラフである。
【００１０】
図５は、Ｋ５６２細胞のクローニング効率に対する照射の影響を示した棒グラフである。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。
【００１１】
図６は、１回または３回の超音波処理から５時間後の、アポトーシスを起こしたＫ５６２細胞の百分率を示した棒グラフである。アポトーシスの比率は、アネキシンＶ染色後のフローサイトメトリーによって決定し、７回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。
【００１２】
図７は、時間および連続的超音波処理によるホスファチジルセリン分布の変化を示す点グラフである。１つの代表的な実験からの結果を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色した細胞の百分率で示している。
【００１３】
図８は、正常な単核球（ＭＮＣ）および白血病細胞（５人の患者から得たＮａｌｍ−６、ＫＧｌａ、ＨＬ−６０、および一次性白血病細胞）のアポトーシスに対する、超音波処理の影響を示した棒グラフ。結果は５回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【００１４】
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は多細胞生物の発達および健康の正常な要素である。アポトーシスは、成長、宿主防御、老化における中の組織のホメオスタシスを保証し、γ照射および紫外線曝露を含む広範なシグナルに応答して起こる。細胞は様々な刺激に応答して死ぬが、典型的には、アポトーシスの間に制御された様式で死ぬ。そのため、アポトーシスは、壊死と呼ばれるもう一つの細胞死の形態とは明確に区別され、壊死においては、非制御的細胞死が細胞溶解、炎症性反応およびおそらくは重篤な健康状の問題をもたらす。一方、アポトーシスは、細胞が自らの死において能動的な役割を果たすプロセスである。そのため、アポトーシスは細胞自殺と呼ばれることも多い。
【００１５】
細胞にアポトーシスを行うように指示する特定のシグナルを受けると、典型的に複数の明確な生化学的および形態学的変化が細胞内において起こる。例えば、カスパーゼとして知られるタンパク質のファミリーは典型的にはアポトーシスの初期段階において活性化される。これらのタンパク質は、細胞骨格内の構造タンパク質やＤＮＡ修復酵素などの核タンパク質を含む、正常な細胞機能に必要とされるキー細胞性基質を破壊または開裂する。カスパーゼは、核内のＤＮＡを開裂するＤＮａｓｅなどの他の分解酵素を活性化することもできる。一般に、アポトーシス性細胞死は、核膜の初期的変化、クロマチン濃縮、およびＤＮＡ断片化を特徴とする。これらの生化学的変化は細胞内に形態学的変化をもたらす。
【００１６】
本明細書中の教示は、液体媒体中に存在する高増殖性細胞（例えば腫瘍細胞）を中和、その成長を防止、または除去することのできる装置および方法に関するものである。より具体的な実施形態において、本明細書において提供する方法および装置は、生理学的流体などの懸濁液中の高増殖性細胞においてアポトーシスを誘導する。処理可能な生理学的流体としては、血液、血漿、血清、および、哺乳動物、ヒトなどを含む動物から抽出可能、および／または投与可能な脳脊髄液が挙げられる。
【００１７】
本明細書の教示による低エネルギー、高周波数超音波処理は、高増殖性細胞におけるアポトーシス効果を誘導することができる。これらの効果のなかには、例えば、ミトコンドリア膜への効果を有すること（ミトコンドリア電位の降下）、ホスファチジルセリン非対称性の損失、膜の脂質酸化の誘発（細胞性ＧＳＨレベルの減少）、形態学的変化、ＤＮＡ断片化、細胞質膜の損傷などが含まれる。さらに、低エネルギー超音波によって誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ３の活性化、カスパーゼ基質ＰＡＲＰのタンパク分解、および細胞中のｂｃｌ−２／ｂａｘ比の調節を伴うこともある。
【００１８】
特定の試験（実施例を参照）によって、壊死の量を制限しながら、アポトーシスが非常に迅速に誘導されることが確認された。
【００１９】
装置と方法
本発明の方法を具現するために用いることのできる装置の実施形態は、米国仮出願６０／４２３，３６８，米国出願番号１０／３５８４４５、およびＣｏｒｄｅｍａｎｓらに付与された米国特許６，５４０，９２２に見つけることができ、これらのそれぞれは、その全体を参照により本願に組み込む。高増殖性細胞の処理方法は、本発明の装置を用いて実施することができる。水性媒体（例えば生理学的流体）などの液体媒体を処理するために使用可能な装置の１つの特定の実施形態を図１に示す。ある実施形態において、処理すべき流体は高増殖性細胞を含む。他の実施形態において、処理すべき流体は、例えば診断後などに、高増殖性細胞を含む疑いのある生理学的液体であってもよい。ウィルスおよび／またはウィルス感染細胞を含んだ溶液のみならず、幹細胞などの完全に分化していない細胞も処理することができる。処理可能なウィルスの例としては、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ヘルペスウィルス、ハンタウィルス、インフルエンザ、およびエボラなどが挙げられる。
【００２０】
図１を参照して、本発明の装置は、好ましくは円筒状または矩形の断面形状を有する区画室２を有する。ある実施形態において、区画室２は被処理液体媒体を保持するリザーバ（図示せず）と連通していてもよい。別の実施形態において（例えば、ヒトまたは動物の生理学的流体を処理する場合）、本発明において提供する装置は、ヒトまたは動物の体に直接接続されたリザーバを含んでいない。このような実施形態は、ヒトまたは他の動物の体の体外処理中に生理学的流体を抽出するか、および／または投与する（例えば、再注入）ものを含む。したがって、ヒトなどの動物が、本発明において「リザーバ」とする任意の言及に相当する場合もある。
【００２１】
他の実施形態において、高増殖性細胞懸濁液を図２に示すような装置において処理することができる。この実施形態において、空気入口チューブ３をマイクロバブル放出器３として用いて、マイクロバブル５を区画室（またはポーチ）２０に収容された高増殖性細胞懸濁液２２に放出する。細胞懸濁液２２を収容した区画室（またはポーチ）２０は、例えば恒温槽などの水槽２４に浸漬させてもよい。
【００２２】
さらなる実施形態において、区画室２は（例えば、その壁に沿ってあるいは底面に隣接して）、区画室２内（好適には区画室２の中央に向けて）に超音波４を放出する１つ以上の高周波数超音波放出器１を含んでいる。他の実施形態において、容器は、ガスマイクロバブル５を放出するための１つ以上のマイクロバブル放出器３を含んでいてもよく、該マイクロバブル放出器は、区画室２内に放出された超音波４場内にガスマイクロバブル５が放出されるように配置される。
【００２３】
本発明において用いる「マイクロバブル」という用語は、１ｍｍ未満の平均径を持つガス気泡のことをいう。いくつかの実施形態において、直径は５０μｍ以下である。また別の実施形態において、マイクロバブルは３０μｍ未満の直径を有する。ある実施形態において、マイクロバブルは、空気、酸素およびオゾンマイクロバブルまたはその混合物から選ばれる。動作コストを低減するために、オゾンマイクロバブル以外の、例えば空気マイクロバブルなどのマイクロバブルを使用すると有益であるかもしれない。本発明の有益な実施形態は、細胞を処理するために熱効果の発生に依存しない。ある実施形態においては、安定化したマイクロバブルを使用することが細胞処理に効果的かもしれないが、好ましい実施形態においては、安定化マイクロバブルの使用は必須ではない。安定化マイクロバブルの一例としては、脂質境界（ｌｉｐｉｄ  ｂｏｕｎｄａｒｙ）マイクロバブルが挙げられる。
【００２４】
「高増殖性細胞」という用語は、比較的高速で分化、繁殖もしくは増殖する細胞のことをいい、癌細胞（例えば白血病細胞）、前癌細胞、腫瘍細胞、骨髄細胞および全能細胞も含まれる。
【００２５】
ある実施形態において、「液体媒体」という用語は、ヒトまたは動物に投与されうる、および／またはヒトまたは動物から抽出されうる生理学的液体のことをいう。特定の実施形態において、生理学的流体は処理後（例えば、生体外処理（ｅｘ  ｖｉｖｏ））に再注入される。ある実施形態において、「生理学的液体」という用語には、限定はされないが、血液、血清、頭脊柱、脳脊髄液、血漿などが含まれる。Ｔａｃｈｉｂａｎａらに付与された米国特許第５，４０１，２３７号は、生理学的流体の抽出および再投与方法を記載しており、この文献全体は参照により特に本願に組み込む。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明の方法および装置は、高増殖性細胞を処理するための低エネルギー、高周波数超音波を含む。「高周波数」という用語は、１００ｋＨｚを越え、数ＭＨｚまでの周波数のことをいう。ある実施形態において、使用する高周波数は、２００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚである。様々な実施形態において、超音波周波数は、２００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの間で選択することができる。好ましい実施形態において、使用する周波数は２００ｋＨｚ〜１．８ＭＨｚである。
【００２７】
本発明に記載の装置の様々な実施形態において、ガスマイクロバブル５を放出するためのマイクロバブル放出器３は、区画室２の基部１１（すなわち、区画室２の底面）に、マイクロバブルが、自然上昇により、または液体粒中のガスのエントレインメントにより移動するように配置される。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明に記載の装置および方法は、高増殖性細胞内でのアポトーシスを誘導する。健常細胞は、白血病細胞よりも高周波数超音波に対してはるかに感受性が低いことが判っている。この健常細胞と白血病細胞のあいだでの挙動の違いは、内在光線感作物質の局在化の違いと関係づけることができず、おそらくは例えばｐ５３の状態、シグナリング経路、および酸化性ストレスに対する耐性などの基本的な細胞機構の修飾によるものと考えられる。具体的には、アポトーシスは、癌（たとえば白血病）細胞、前癌細胞、腫瘍細胞、骨髄細胞、全能細胞などにおいて誘導することができる。
【００２９】
本教示は作用の詳細な機構によって限定されることはないが、より詳細な実施形態において、本発明において提供される装置および方法は、ＲＯＳ（反応性酸素種）、Ｈ・、 ・ＯＨおよびＨＯＯ・などのラジカルを発生することができ、前記ラジカルはＨ２Ｏ２を形成することもでき、該分子および／または前記ラジカルは高増殖性細胞に対して毒性を有することから、該細胞に不活性化および／または破壊をもたらす。超音波条件下において酸化性ストレスによってもたらされた脂質過酸化産物は、この生体機構に潜在的にも関与している。
【００３０】
超音波力学治療の間に一重項酸素が形成されていることはすでに証明されているが、これらのデータは長時間かつ「高エネルギー」超音波曝露を行って、直接熱分解による、または水溶媒の熱分解によって形成されたＨ・または・ＯＨラジカルとの反応によって、感作物質由来のフリーラジカルを蓄積させる場合にしか当てはまらない。
【００３１】
開示した方法及び装置を用いて発生させた種は、水分子に対する高周波数超音波の反応に由来すると考えられる。おそらくは、（特に酸素の存在下において）以下の反応が起こっていると考えられる。Ｈ２Ｏ→Ｈ・＋・ＯＨ  Ｈ・＋Ｏ２→ＨＯＯ・  ＨＯＯ・＋ＨＯＯ・→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２ ・ＯＨ＋・ＯＨ→Ｈ２Ｏ２
【００３２】
本発明に記載のようにプロセスをマイクロバブルの存在下において実施すれば、上記毒性種を発生するのに必要とされるエネルギーが有利に減少される。ある実施形態において、発電機は、超音波放出器に１Ｗ／ｃｍ２未満の電力を供給するように構成する。好ましい実施形態において、電力は約０．５Ｗ／ｃｍ２以下、あるいは、多くの有益な実施形態においては、約０．２５Ｗ／ｃｍ２以下で供給される。有益な実施形態において、放出器に印加される電力の上記レベルから一定体積の生理学的流体中に分散される電力は、３０ｍＷ／ｃｍ３未満である。いくつかの実施形態において、電力は約７ｍＷ／ｃｍ３で分散される。
【００３３】
ある実施形態においては超音波を連続的に与えてもよく、他の実施形態においては超音波をＯＮ／ＯＦＦサイクルを用いて間欠的に与えてもよい。当業者であれば、細胞の体積、細胞の種類および他の関連する変数に応じて効果的なＯＮ／ＯＦＦサイクル時間を決定することができるであろう。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明の教示は、腫瘍または新生物塊ではなく、懸濁液中の高増殖性細胞を処理することに関する。これらの実施形態において、本発明の教示は、個々の腫瘍部位における濃縮またはプールのためにマイクロバブルを使用することに依存しない。これにより、集合状態で発生していない不要な高増殖性細胞を処理することが可能となる。
【００３５】
本発明によって提供される方法および装置の別の利点は、高増殖性細胞を短時間の間に効率的に処理できることにある。特定の実施形態において、高増殖性細胞は１分以内に処理できる。より特定の実施形態においては、細胞は例えば５〜２０秒間を含む、３０秒以内に処理できる。
【００３６】
当該技術において周知のように、超音波作用の生物物理学的モードは、熱、キャビテーション、または非熱および非キャビテーション効果のいずれかを有するものとして分類される。重要な注目点として、上述の電力範囲と短い処理時間を用いることにより、有意な液体および／または細胞の加熱を回避することができ、熱によって発生する細胞死を殆どまたは全く無くすことができる。一例として、熱の影響を与えない処理には、４０°Ｃ、３５°Ｃ、および３０°Ｃ未満の温度で行われる処理が含まれる。電力レベルもまた、超音波による細胞膜損傷が実質的に回避されるように、有意な程度のキャビテーションが起こらないようなものとする。
【００３７】
高超音波電力下において、超音波場にマイクロバブルを注入することにより、超音波によって誘導されたキャビテーションバブル上にマイクロバブルが重なり、超音波発光の現象が増大し、励起される毒性種の数を倍増することができる。この現象は、超音波処理を、適切な大きさのマイクロバブルの存在と相乗的に組み合わせた場合に、巨視的に観察される。
【００３８】
さらなる実施形態において、本発明で提供する装置および方法は、超音波を特定のゾーンに供する必要がないという利点を有している。これは、処理装置が、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成された生成物（例えば形成されたラジカルおよびＨ２Ｏ２）を、処理すべき水性媒体のリザーバ６に向けて分散させることにより機能することが判っているためである。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明に記載の装置内の１つ以上の超音波４放出器１は、いかなる定在波現象も与えないように配向させる。例えば、ある実施形態において、１つ以上の超音波放出器は区画室２の軸９（この軸９に垂直でない鋭角）に関して、および液体の流れおよびマイクロバブル５の流れに関して斜めに配向することができる（図１を参照のこと）。この特徴により、区画室２内のすべてのマイクロバブル５を、区画室２内に静止ゾーンを設けることなく、統計的に同一の様式で処理することができるようになる。
【００４０】
本発明の装置および方法は、平均直径が１ｍｍ未満のガス状マイクロバブルを、被処理液体媒体中の高周波数超音波場に放出することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、マイクロバブルの直径は５０μｍ以下である。他の実施形態において、マイクロバブルは３０μｍ未満の直径を有する。ある実施形態において、マイクロバブルは空気、酸素およびオゾンマイクロバブルから選ばれる。他の実施形態において、マイクロバブルは、オゾンマイクロバブルではない。
【００４１】
他の実施形態によれば、本発明に記載の装置および方法は、超音波４場内の区画室２内へ、大半は可視範囲にある周波数の照射を行う光放出器１２（すなわち電磁波放射器）を含んでいてもよい。しかしながら、ある用途においては、ある特異的な高増殖性細胞を除去するために、紫外照射（例えば、ＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＣ型）、赤外、レーザー、電磁波などのような大半が不可視の周波数による電磁波放射を行うことが有益である。
【００４２】
超音波および随意で光照射と組み合わせた、場へのマイクロバブルの放射を含む処理は、生理学的流体などの液体媒体中に存在する高増殖性細胞を不活性化し、除去する際に特に有効であることが、最近になって予期せず発見された。発光の現象は、ある高増殖性細胞に対しては非常に毒性の高い一連の生化学反応をもたらしうるスーパーオキシドラジカルや一重項酸素などの非常に活性の高い酸化種の生産を促進することができる。有益な実施形態において、放射
はＯＮ／ＯＦＦサイクルによって間欠的に行われる。より特定の実施形態において、ＯＮ／ＯＦＦサイクルは約５．５ｍｓ／３ｍｓとすることができる。
【００４３】
発光はいわゆる感作分子（例えば、光線感作物質および超音波感作物質）の存在下において、ある癌細胞に対して抗腫瘍作用をもたらすように行うことができると知られている。このような分子としては、ポルフィリン、塩素、テトラサイクリン、メチレンブルー、フルオレセイン、アクリジン、ローダミンなどが挙げられる。これらの活性物質は、生物に注射され、若しくは経口投与され、続いて超音波発光によって活性化されることができる。活性化後、これらの物質は一重項酸素を生産することができ、該一重項酸素は、特に酸化性ストレスに起因する生化学プロセスにおいて基本的な役割を順次に果たす。具体的には、一重項酸素は、例えばタンパク質、脂質、アミノ酸およびヌクレオチドなどの様々な細胞成分を酸化することができる。
【００４４】
他の実施形態において、発光および／または放射を相乗作用させるために、固体粒子または固体表面を用いることもできる。これらの固体としては、例えばＴＩＯ２、クレイおよびセラミックが挙げられる。
【００４５】
様々な実施形態が、中和、高増殖性細胞の増殖の阻止、および／または生理学的媒体からの高増殖性細胞の除去を行うために、光線感作物質および／または超音波感作物質などの追加の化学製品を必要としない装置および方法に関している。処理すべき液体媒体に光線感作物質または超音波感作物質を加えることが常に必要なわけではない。これは、上記のような光線感作物質をすでに含んでいる生理学的流体（例えば血液）中に存在するある高増殖性細胞（例えば白血病細胞）上において、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて生成される発光が予期せず観察されているためである。
【００４６】
本発明において提供される装置および方法は、他の薬剤、例えば光線感作物質、超音波感作物質、化学療法剤、抗体、抗生物質とともに用いることができるが、提供される方法および装置の高増殖性細胞処理における効果は、他の化学物質、試薬または薬剤の使用に依存しないことに注目すべきである。したがって、本発明に記載される方法および装置は、化学物質、試薬、ホルモン、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、ＤＮＡワクチン、血管形成促進剤または薬剤を含む追加の物質なしで使用することができる。さらなる特定の実施形態において、本発明における教示は、これらの物質の細胞吸収に依存しない。
【００４７】
具体的には、本発明の教示によって得られる効果は、古典的な光線感作物質や超音波感作物質を必要とせずに達成することができる。ＰＤＴなどの技術によって得られる生理学的効果は、同時に照射量、使用する光線感作物質の性質、それらの濃度、およびそれらの局在性に依存する。感作物質は伝統的な処理では必要であるが、本発明で提供する教示に対しては不要であり、方法および装置が著しく簡略化される。
【００４８】
ある実施形態において、超音波作用の正味の効果は、局所濃度が高い構造の内在性光線感作物質に関係しているとみなされる。例えば、内在性光線感作物質は、リソソーム、ミトコンドリア、核膜、ゴルジ体、および小胞体のミクロソームなどの膜構造内に主として局在しており、該構造の相対面積は細胞膜表面のほぼ５０％を示す。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明に記載の装置および方法は、液体媒体を循環させ
るためのポンプ、ならびに好ましくは濾過、遠心分離または沈殿（サイクロンなど）によって液体媒体中に存在する高増殖性細胞を回収するための１つ以上の装置を含んでいてもよい。ある実施形態において、回収用のポンプおよび／または装置は、処理すべき液体媒体を収容したリザーバ（または動物）と区画室２の間に配置される。
【００５０】
ある実施形態において、本発明の装置および方法は、癌（例えば白血病）を有する疑いのある（例えば診断された）患者から、生理学的流体（例えば血液）を抽出するために用いることができる。抽出後、生理学的流体を高周波低エネルギー超音波および１ｍｍ未満の直径のガスマイクロバブルを用いて処理することができる。ある実施形態において、本方法は、癌細胞（例えば白血病）に対してアポトーシスを誘導する。高増殖性細胞が十分に中和されるか、増殖阻止されるか、除去されるように生理学的流体を処理した後、流体を患者に投与して戻す。これらの方法は、他のｅｘ  ｖｉｖｏ方法、例えば血液透析と同様に実施することができる。
【００５１】
血液処理する被検体に本発明に記載の装置の１つを取り付けることができる。ある実施形態によれば、被検体の血流を、被検体の腕の内瘻を介して本発明に記載の超音波装置に連結することができる。このことは、外科的に連結された動脈と静脈を有することを含意する。それらが接合されると、動脈からの強い血流が静脈を大きくする。この拡大された静脈に針を挿入して、被検体を超音波装置に連結する。
【００５２】
血流に対するアクセスを与える別の方法は、内部移植片を挿入することである。この手法において、針を挿入できる皮膚の下に配置された専用の配管の小片を用いて動脈を静脈に外科的に連結する。
【００５３】
他の実施形態において、血流へのアクセスを迅速に得ることが必要な場合、または腕の静脈が小さすぎて超音波処理のための十分な血液を提供することができない場合には、例えば、中心静脈カテーテルを用いることができる。この手法において、軟らかいチューブを首または鎖骨付近の大静脈内に外科的に挿入する。いくつかの実施形態において、この方法は永久アクセス部位が準備できるまでの一時的なものであるかもしれない。
【００５４】
本発明に記載の方法に従って処理できる非検者としては、任意の動物、例えばヒト、マウス、サル、イヌ、ブタなどを含む哺乳動物が挙げられる。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明の装置および方法は、低エネルギー高周波数超音波を用いて、細胞（例えば白血病細胞）内のアポトーシスを誘導することにより、高増殖性細胞を阻止、処理または中和する。高増殖性細胞内のアポトーシスを誘導することにより、ミトコンドリア電位の降下、ホスファチジルセリン非対称性の損失、形態学的変化、ＤＮＡ分断化、細胞質膜の損失などを含む一連の特徴的な事象をもたらすことができる。さらに、低エネルギー超音波によって誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ３の活性化、カスパーゼ基質ＰＡＲＰのタンパク分解、および細胞内のｂｃｌ−２／ｂａｘ比の調節を伴ってもよい。
【００５６】
さらなる方法は、超音波によって誘導される超音波化学発光を用いてアポトーシスを開始して、直接光照射からの光線感作された一重項酸素の生成をトリガーすることを包含する。古典的な超音波照射条件において、直接破壊キャビテーション効果が超音波発光より優勢であるが、該超音波発光は媒体中に注入された空気／液体界面の非存在下においてかなり弱い。したがって、キャビテーション効果を越えるように発光を増強するために、超音波と組み合わせてマイクロバブルを利用することが有益であるかもしれない。
【００５７】
以下の実施例では、高周波低エネルギー超音波を用いて細胞を処理すること、および前記細胞内でのアポトーシスの存在を示すための様々なアッセイ（評価）について説明する。
（実施例１）
【００５８】
細胞調製および高周波数超音波処理
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から入手したヒト白血病細胞系列（Ｋ５６２、Ｎａｌｍ−６、ＫＧｌａ、およびＨＬ−６０）を、１０％仔牛血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）および１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）中で培養した。白血病細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２、Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、迅速に実験に使用した。ヘパリン添加静脈血は、健常ボランティアおよび白血病患者から得た。単核球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）により分離した。
【００５９】
以下、細胞への超音波処理について説明する。ヒト白血病細胞系列（Ｋ５６２、ＨＬ−６０、ＫＧｌａ、およびＮａｌｍ−６）、一次性白血病細胞、および正常な単核球を、７ｍＷ／ｍＬの音響出力で、５．５ｍｓ／３ｍｓの照射（ＯＮ／ＯＦＦ）サイクルにおける種々の露出時間の間、１．８ＭＨｚの周波数の超音波で処理した。
【００６０】
恒温槽中（３７°Ｃおよび５％ＣＯ２）に１８時間おいた後、細胞をトリパンブルー排除アッセイによって細胞の生存率を首尾良く調べた。処理細胞に対してさらなる試験を行ったが、その詳細については以下の実施例に記載する。アポトーシスは、細胞形態、ホスファチジルセリン露出およびＤＮＡ分断化によって評価した。ミトコンドリア電位、グルタチオン含量、カスパーゼ３活性化、ＰＡＲＰ開裂、およびｂｃｌ−２／ｂａｘ比をフローサイトメトリーによって調べた。クローニング効率は、メチルセルロース中でのアッセイによって評価した。
（実施例２）
【００６１】
ＤＮＡ分断化に対する高周波数超音波の影響
ＤＮＡ分断化はアポトーシスに関連している。分解したＤＮＡによる細胞の定量化を、Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ、ＩらによってＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３９  （２）：２７１（１９９１）に記載される方法、およびＡｐｏｔａｒｇｅｔ迅速ＤＮＡラダー検出キット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて行った。細胞ペレット（１０６細胞）を２０Ｌの溶解バッファに再懸濁し、製品説明書に従ってＤＮＡを抽出した。ゲル電気泳動（１％アガロース）によって分離した後、ＤＮＡを解析した。正のコントロールとして、プレートをＵＶトランスイルミネータの直下に１０分間（５ｍＷ／ｃｍ２の強度）置くことにより、細胞にＵＶ光を照射した。その後、細胞を３７°Ｃで５時間および１８時間インキュベートしてから、アポトーシスを調べた。
【００６２】
浸透化処理後、細胞をＰＩおよびＲＮＡｓｅを含む溶液（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＮＡ−ｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ）とともにインキュベートした。試験管を４°Ｃで一晩、暗中放置してから、フローサイトメトリーによる分析を行い、アポトーシスに相当するサブＧ０ピークを同定した。
【００６３】
古典的ヌクレオソームＤＮＡラダーパターンが、紫外線で処理した細胞（ポジティブコントロール）および超音波で処理した細胞からのＤＮＡ試料中において観察された。ヌクレオソーム間ＤＮＡ開裂は、超音波処理から５時間後には辛うじて認められたが、１８時間後には明確になった（結果示さず）。さらに、ＤＮＡの分断化による核の数の増加は、処理から５時間後に、ＰＩ染色によって観察した。具体的には、１５％の処理細胞が分断化ＤＮＡを有しており、２％の未処理細胞が分断化ＤＮＡを有していた（データ示さず）。
（実施例３）
【００６４】
ミトコンドリア膜電位に対する高周波数超音波の影響
細胞アポトーシスのいくつかのモデルにおいて、ミトコンドリア膜電位（ΔＹｍ）の初期崩壊に続いて、ＤＮＡ分断化の進行が観察された。ΔＹｍに対する高周波数超音波処理の影響を測定するために以下のアッセイを行った。
【００６５】
ミトコンドリア電位は、Ａ．Ｍａｃｈｏら、Ｂｌｏｏｄ  ８６（７）：２４８１（１９９５）に公開されているプロトコルに従った細胞処理の直後にカチオン性蛍光色素ＤｉＯＣ６の取り込みにより評価した。
【００６６】
つまり、Ｋ５６２細胞（１０６／ｍＬ）を２．５ｎｍｏｌ／Ｌの３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）とともに３７°Ｃで１５分間インキュベートした後、フローサイトメトリー分析を行った。
【００６７】
超音波処理に伴って、低ΔＹｍを示す細胞集団が増加した（結果示さず）。ＤｉＯＣ６取り込みの減少を示した細胞集団を、処理から３０分後に調べたところ、ミトコンドリア電位の低下は超音波処理から５時間後に非常に明確であり、５０％を越える細胞が低ΔＹｍを有していた。上記の結果は、細胞性アポトーシスを証明するものである。
（実施例４）
【００６８】
細胞グルタチオンレベルに対する高周波数超音波の影響
アポトーシスの間にグルタチオンの減少がおこることが判っている。超音波処理後の細胞グルタチオン含量を測定するためのアッセイを行った。Ｄ．Ｗ．Ｈｅｄｌｅｙら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １５：３４９（１９９４）に記載されているように細胞内グルタチオンのレベルを測定するために、細胞トラッカーグリーンＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。
【００６９】
超音波処理の直後に、図３に示すように、未処理細胞中よりもＧＳＨのレベルが低い（>５０％の細胞が低レベルのＧＳＨを示している）サブ集団が現れた。連続処理の結果から、５時間後にＧＳＨの崩壊が大きくなっていることが示された。未処理細胞と比較したＧＳＨレベルを示す細胞の百分率で表されるこの結果は、高周波数超音波処理がＧＳＨ崩壊に関連していることを明確に実証するものである。
（実施例５）
【００７０】
細胞カスパーゼ３活性に対する高周波数超音波の影響
カスパーゼ３は、化学療法誘導性アポトーシスにおいて重要な役割を果たすことが判っている。具体的には、カスパーゼの活性化は、アクチン、ゲルソリン、またはＰＡＲＰなどの細胞性基質の開裂によって細胞死をもたらす。超音波誘導性アポトーシスにおけるカスパーゼ３の関与を直接調べるために、フローサイトメトリーおよび比色分析を用いてカスパーゼ活性を測定した。
【００７１】
具体的には、カスパーゼ３は、フィコエリトリン（ＰＥ）共役ポリクローナルウサギ抗体抗活性カスパーゼ３モノクローナル抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリー分析によって検出した。Ｆｉｘ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍキット（Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、室温で１５分間、細胞を固定し、浸透化処理した。次に、細胞を抗カスパーゼ３Ａｂで染色し、１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。カスパーゼ３の酵素活性は、Ａｐｏｔａｒｇｅｔカスパーゼ３／ｃｐｐ３２／比色分析プロテアーゼアッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を製造業者が示唆するように用いて測定した。カスパーゼ３活性化は、ウサギ抗ＰＡＲＰ開裂部位ＡＢ，ＦＩＴＣ共役物（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて間接的にＰＡＲＰ開裂によって評価した。
【００７２】
図４に示すように、高周波数超音波処理は、カスパーゼ３の活性化をもたらす。さらに、このプロテアーゼ活性は処理後１時間で最大となった。さらに、処理後２時間でＰＡＲＰの開裂が明確になり、未処理細胞の５％に対して、４０％の細胞がウサギ抗ＰＡＲＰＦＩＴＣによって染色された（結果示さず）。
（実施例６）
【００７３】
細胞のＢＣＬ−２／ＢＡＸ比に対する高周波数超音波の影響
ｂｃｌ−２ファミリーの様々なタンパク質が、アポトーシスの開始または阻止に関わっている。ｂｃｌ−２ファミリーの２つの主要メンバーであるｂｃｌ−２とｂａｘとが超音波によるアポトーシスの誘導に関与しているかどうかを判定するために以下のアッセイを行った。浸透化処理後、細胞をアイソタイプが一致するネガティブコントロールであるＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトｂｃｌ−２（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびｂａｘに対するポリクローナルウサギ抗体とともにインキュベートした。次に、ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｄａｋｏ）をｂａｘに加えた。ｂｃｌ−２およびｂａｘ発現を定量化するために、既知量の蛍光色素（Ｄａｋｏ）で標識したビーズ混合物を用いて、血球計数器をキャリブレーションした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、キャリブレーション曲線を用いて相当する可溶蛍光色素分子（ＭＥＳＦ）に変換した。
【００７４】
その結果（データ提供せず）、未処理細胞が高いレベルの抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−２タンパク質（４７±４×１０３ＭＥＳＦ）を発現し、この発現は単一モードのピークの蛍光のようであることが実証された。超音波処理の１時間後、ｂｃｌ−２タンパク質はすでにダウンレギュレートされていた。（１回または３回の超音波処理を行ったＫ５６２細胞において、それぞれ４０±０．９および３２±０．９×１０３ＭＥＳＦ）。処理から２時間後、ｂｃｌ−２発現は明らかに２モードに見え、細胞はｂｃｌ−２高（未処理細胞に比較して）またはｂｃｌ−２低表現型（１１±２×１０３ＭＥＳＦ）のいずれかを示す。
【００７５】
ｂｃｌ−２とは対照的に、プロアポトーシスタンパク質ｂａｘのレベルは、未処理細胞と比べて超音波で処理した細胞において高かった（処理済および未処理のＫ５６２に対して、それぞれ８５±０．５および４８±５×１０３ＭＥＳＦ）。したがってｂｃｌ−２／ｂａｘ比は、高周波数超音波処理の間に有意に低下し、細胞性アポトーシス（コントロール細胞については０．９８、超音波処理細胞については０．３８）が証明された。
（実施例７）
【００７６】
細胞ホスファチジルセリンのレベルに対する高周波数超音波の影響
アポトーシスの間、原形質膜の内側から外側へのホスファチジルセリン残基の反転、およびこの変化は、ＰＳ残基に結合するアネキシンＦＩＴＣを用いて検出することができる。以下、実施したアネキシンＶ結合アッセイについて説明する。アネキシンＶフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入したキットを用いて、業者が推奨するようにして行った。データは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム（図示せず）の平均蛍光強度の変化を示す点プロットによって表した。
【００７７】
上記結果から、ホスファチジルセリン分布の変化が時間によって異なることが示された。具体的にいうと、上記結果は、超音波処理が低百分率の細胞において原形質膜の損傷を誘発したことを示し、調べた超音波処理の壊死作用が非常に弱いことが実証された。興味深いことに、処理から２時間後にアポトーシス細胞の増加が観察された。処理から５時間後には、３５％の細胞がアネキシンＶ陽性であったことから、Ｋ５６２細胞におけるアポトーシスの超音波誘発が実証された。
（実施例８）
【００７８】
コロニー形成に対する高周波数超音波の影響
細胞生存性への影響に対する重要な証拠は、細胞が増殖してコロニーを形成することができないことである。以下に、クローニング効率への高周波数超音波照射の影響を測定するためにＫ５６２細胞に対して行ったクローン形成法について説明する。簡単にいうと、培養培地は、２０％ＦＣＳと最終濃度４％のメチルセルロースを添加したＩＭＤＭから成る。培養を５％ＣＯ２空気中、３７°Ｃでインキュベートし、５日後にコロニー（>２０細胞）を評定した。Ｋ５６２細胞系列のクローン形成効率は１６％であった。図５に示すように、１回および３回の処理後、Ｋ５６２細胞のクローニング効率には有意な低下（それぞれ２５％および４２％の阻止）が見られたことから、高周波数超音波に対する白血病細胞の感受性が確認された。
（実施例９）
【００７９】
アポトーシスに対する酸素スカベンジャーの影響
高周波数超音波によるアポトーシスの誘導に対する活性酸素スカベンジャーの影響を測定するために以下の手順を実施した。Ｋ５６２細胞をＬヒスチジン（１０ｍＭ）および／またはマンニトール（１００ｍＭ）とともにインキュベートした。いくらかの細胞は高周波数超音波によって処理し、他のものは処理しなかった。細胞アポトーシスは、アネキシンＶ／ＰＩアッセイによって検出した。表１に提供するような結果から、超音波によって誘導された細胞損傷は、ヒスチジンおよびマンニトールの存在下において著しく減少する（３回の連続処理によって誘導したアポトーシスをそれぞれ４３％および４７％阻止）ことが実証された。
【表１】
2006514857.tif 000003
【００８０】
マンニトールおよびヒスチジンの存在により、６０％を越えるアポトーシスの阻止がもたらされる。超音波処理によって誘導される細胞アポトーシスへの、これらの物質の効果は、超音波的に誘導された一重項酸素およびヒドロキシルラジカルがアポトーシスを誘導するための重要な媒介物であることを証明するものである。
（実施例１０）
【００８１】
細胞に対する高周波数超音波の連続処理の影響
超音波処理後、０．５、２、および５時間培養したＫ５６２細胞に対してフローサイトメトリーによる追跡を行った。１回の処理後、アポトーシス細胞のレベルはコントロール細胞の３倍であった（５時間培養後、処理済みおよび未処理細胞に対して、それぞれ２６％および８％）。５〜１０％の壊死効果も観察され、これは薬物または光力学的処理（ＰＤＴ）を用いた場合に見られるよりもはるかに下回る。同一条件（７ｍＷ／ｍＬ、２０秒）かつ異なる間隔での連続した照射により、Ｋ５６２細胞のアポトーシスは、１回および３回の連続処理後に、それぞれ３７±３％（ｐ＜０．０２）および４９±５％（ｐ＜０．０２）に増加した（図６）。連続処理後には、形態学的変化（例えば、細胞収縮、膜気泡化、クロマチン濃縮）も観察された（結果示さず）。図７は、細胞ホスファチジルセリンの量が、アネキシンＶアッセイによって検出されるように連続高周波数超音波処理後に増加していることを実証するものである。
（実施例１１）
【００８２】
様々な細胞系列に対する高周波数超音波の影響
Ｋ５６２に加えて、ＫＧｌａ（未成熟の最小分化急性骨髄性白血病芽球）、ＨＬ−６０  （前骨髄球性白血病）、およびＮａｌｍ−６（すべての細胞系列）を含む他の正常および悪性細胞系列に対しても、超音波処理の影響を調べた。図８に示した結果は、超音波に対する感受性は細胞の種類に依存するが、連続処理により、評価したすべての細胞系列に対するアポトーシス細胞の数が有意に増加することが実証された。
【００８３】
５人の患者からの単核球（過剰芽細胞を伴う不応性貧血［ＲＡＥＢ］１例、二次急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］１例、急性骨髄性白血病３例［ＦＡＢ：Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ］分類Ｍ３、Ｍ４、およびＭ４Ｅｏ）を、超音波で処理し、Ｆ．Ｌａｃｏｍｂｅ、Ｆ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：１８７８（１９９７）に記載のようにＣＤ４５発現に基づいて、混入している正常細胞から芽細胞を区別した。これらの細胞は、それらのホスファチジルセリン露出を調べるためにＦＩＴＣ−アネキシンによって標識しておいた。この方法により、超音波によって処理された白血病芽細胞と正常細胞のそれぞれのアポトーシス挙動を比較できるようになる。図８に示す結果からは、３回の処理の５時間後に３７±１８％を越えるアポトーシス細胞が観察され、一次性白血病細胞が超音波処理に対して感受性があることが実証された。
【００８４】
上記の説明は、本発明の教示のある実施形態を詳細に述べたものである。しかしながら、上記が文中にいかに詳細に記載されていようとも、本発明の装置および方法は多くの様式で実施することができる。上述したように、本発明の教示のある特徴または局面を記述する際の個々の用語の使用は、該用語がそれに関連する教示の特徴または局面の任意の特定の特徴を含んで限定されるように再度定義されることを含意するものとする。したがって、本発明の教示の範囲は、添付の請求項およびその任意の均等物によって解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明に記載されている超音波処理装置の一実施形態を示す図。
【図２】超音波およびマイクロバブルによって懸濁液中の高増殖性細胞を処理するための装置を示した３つの図。
【図３】細胞グルタチオンレベルに対する超音波処理の効果を示した棒グラフ。
【図４】細胞カスパーゼ３活性に対する高周波数超音波の影響を示した棒グラフ。
【図５】Ｋ５６２細胞のクローニング効率に対する照射の影響を示した棒グラフ。
【図６】１回または３回の超音波処理から５時間後の、アポトーシスを起こしたＫ５６２細胞の百分率を示した棒グラフ。
【図７】時間および連続的超音波処理によるホスファチジルセリン分布の変化を示す点グラフ。
【図８】正常な単核球（ＭＮＣ）および白血病細胞（５人の被検体から得たＮａｌｍ−６、ＫＧｌａ、ＨＬ−６０、および一次性白血病細胞）のアポトーシスに対する、超音波処理の影響を示した棒グラフ。
【図１】
2006514857.tif 000004
【図２】
2006514857.tif 000005
【図３】
2006514857.tif 000006
【図４】
2006514857.tif 000007
【図５】
2006514857.tif 000008
【図６】
2006514857.tif 000009
【図７】
2006514857.tif 000010
【図８】
2006514857.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月25日(2004.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液の処理装置であって、
高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞の懸濁液を含む流体を収容する区画室と、
有意なキャビテーションまたは流体を有意に加熱することを引き起こさずに、前記細胞中で、プログラムされた細胞死を生じるのに充分な持続時間で、３０ｍＷ／ｃｍ３未満の電力における１００ｋＨｚより高い周波数を有する超音波を、有意なキャビテーションを起こさせるまたは流体を有意に加熱するのに十分な電力と持続時間で放出するように構成された超音波放出器と、
区画室内の超音波場中に、１ｍｍ未満の平均径のマイクロバブルを放出するように構成されたマイクロバブル放出器とを含む装置。
【請求項２】
ガスマイクロバブルは、空気および酸素マイクロバブルからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
区画室は、哺乳動物から抽出した生理学的流体を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
生理学的流体は、血液、血漿、血清または脳脊髄液からなる群の１つ以上から選ばれることを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
ガスマイクロバブルの平均径は５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
ガスマイクロバブルの平均径は３０μｍ未満であることを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】
マイクロバブル放出器は、区画室の基部に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
区画室は、超音波を連続的または間欠的に放出するように構成された複数の超音波放出器を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項９】
電磁波放射線放出器をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
電磁波放射線放出器は、紫外線（ＵＶＡ、ＵＶＢ、ＵＶＣ）、赤外線およびマイクロ波からなる群の１つ以上から選ばれる周波数の間欠放射線を放出することを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
細胞懸濁液で処理された生理学的流体中の高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞を回収するための装置をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞を回収するための装置は、フィルターおよびハイドロサイクロンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
超音波放出器に１Ｗ／ｃｍ２未満で電力を供給するように構成された発電機をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
生理学的流体中に懸濁された高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞の増殖を中和、除去および／または阻止する方法であって、
３０ｍＷ／ｃｍ３未満の電力で処理される生理学的流体を収容した区画室に１００ｋＨｚより高い周波数を有する超音波を放出することと、
有意なキャビテーションまたは流体を有意に加熱することを引き起こさずに、超音波及びマイクロバブルの放出が、高増殖性、未分化またはウィルス感染した細胞中でプログラムされた細胞死を誘発するように、平均径が１ｍｍ未満のガスマイクロバブルを、生理学的流体を収容する区画室内の超音波場内に放出することとを含む方法。
【請求項１５】
ガスマイクロバブルはオゾンマイクロバブルでないことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ガスマイクロバブルは、空気および酸素マイクロバブルからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
生理学的流体は哺乳動物に投与されるか、および／または、哺乳動物から抽出されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
生理学的流体は、血液、血漿、血清および脳脊髄液から成る群より選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ガスマイクロバブルの平均径は５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ガスマイクロバブルの平均径は３０μｍ未満であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
区画室に放出される超音波は定常場現象を生まないことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
主として可視領域内の電磁波放射線を有する光を超音波場内に放出することをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
高増殖性細胞は、腫瘍細胞、骨髄細胞、幹癌細胞、および前癌細胞からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
高増殖性細胞は、白血病細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
１Ｗ／ｃｍ２未満で超音波放出器に電力を供給することをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
2006514857.tif 000012
2006514857.tif 000013
2006514857.tif 000014