(57)【要約】サキシフィリンを捕捉して前記サキシフィリンまたはそのリガンドの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを可能にする方法であって、（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介して直接的または間接的にビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；（３）ＰＳＴ部分を介して前記サキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サキシフィリンを捕捉して前記サキシフィリンまたはそのリガンドの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施可能とする方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介して直接的または間接的にビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固形支持体がアフィニティ精製の媒体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＳＴがサキシトキシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
サキシフィリンの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と；
（４）捕捉されたＰＳＴ複合体を介して、サキシフィリンの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する工程と
を含む方法。
【請求項９】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
固形支持体がアフィニティ精製の媒体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＳＴコンジュゲートを前記媒体に固定化した後に試料に暴露する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＳＴコンジュゲートを試料に暴露して、媒体に捕捉させるためにＰＳＴ複合体を形成させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
サキシフィリンの単離および精製のうち少なくともいずれかを実施するために、媒体か
らサキシフィリンを溶出させる工程を更に含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＳＴがサキシトキシンである、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＳＴに対する抗体、またはＰＳＴに結合するＲＮＡアプタマーを捕捉する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、前記抗体またはアプタマーを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介して抗体またはアプタマーに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と
を含む方法。
【請求項１９】
ビオチン／（ストレプト）アビジン系で使用される、ＰＳＴ部分を含んでなるＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチンに結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２０】
リンカーが、サキシトキシンのＣ１２もしくはＣ１３を介して、または他のＰＳＴの同等の部位を介してＰＳＴ部分に結合している、請求項１９に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２１】
リンカーが、デカルバモイルサキシトキシンのＣ１３を介して結合している、請求項２０に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２２】
リンカーが４原子以上を含んでなる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２３】
リンカーが５〜２０原子を有する、請求項２２に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２４】
リンカーが１１〜１８原子を有する、請求項２３に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２５】
ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合している請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体。
【請求項２６】
ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合している請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体。
【請求項２７】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合している、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２９】
請求項２８に記載の複合体を含むアフィニティ精製媒体。
【請求項３０】
請求項２８に記載の複合体を含む、ＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項３１】
固形支持体に共有結合しているサキシフィリンと、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートのサキシフィリンへの結合を検出する手段とを含むＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項３２】
ＰＳＴコンジュゲートが（ストレプト）アビジンに結合している、請求項３１に記載のＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項３３】
質量の増加を検出する、請求項３２に記載のＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麻痺性貝毒コンジュゲートに関する。詳細には本発明は、目的の分子、特にサキシフィリンおよびそのリガンドの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかにおける麻痺性貝毒コンジュゲートの使用に関するが、その使用は、それらに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる「サキシフィリン」は、麻痺性貝毒（またはＰＳＴ）の一種であるサキシトキシンに結合する能力によって特徴づけられる多種多様なポリペプチドである。用語「サキシフィリン」は、サキシトキシンの接頭辞「サキシ」と、サキシトキシンとの類似を示す接尾辞「フィリック」を含む造語である。サキシフィリンは、特定の化学構造や生理機能を共有しておらず、サキシフィリンの生理学的意義は、必ずしもサキシトキシンに結合することではないと思われる。例えば、いわゆる「ウシガエル・サキシフィリン」は、鉄結合タンパク質のトランスフェリン類とのアミノ酸配列同一性が５０％を超える分子であり、そのためトランスフェリンであるとも推定されている。ナトリウムチャネルもサキシトキシンに結合し、それゆえ「サキシフィリン」であるということもできる。いわゆるサキシフィリンは、フグの血液などの多様な供給源から単離されている。このタンパク質は、ナトリウムチャネルと同様にサキシトキシンおよびテトロドトキシンの両方に結合するが、ナトリウムチャネルとは異なり、このフグのタンパク質は親水性である。
【０００３】
ナトリウムチャネルと、フグ・サキシフィリンと、トランスフェリンとは、それぞれ異なる種類のサキシフィリンの一つである。これらの３種のサキシフィリンの間には、明確なアミノ酸配列相同性がない。しかし、それらを物理的性質に基づいて描写することができる。ナトリウムチャネルは、脂質膜に固定されているため疎水性であるが、他の二種は親水性である。トランスフェリン類のサキシフィリンは、サキシトキシンに結合するがテトロドトキシンには結合せず、ナトリウムチャネルおよびフグ・サキシフィリンは、サキシトキシンおよびテトロドトキシンの両方に結合する。これらの分子を区別するために用いられ得る更なる性質は、ネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）に結合する能力である。加えて、麻痺性貝毒として知られ、サキシトキシンに構造が類似している関連の毒素は非常に多く存在し、そのような分子は、サキシトキシンに様々な程度で結合する。
【０００４】
渦鞭毛藻由来の毒素を含む魚、甲殻類または軟体動物の摂取による麻痺性貝中毒は、死に至ることも多い重篤なヒト疾病をもたらす、世界的な問題である。この中毒は、麻痺性貝毒（ＰＳＴ）によって起こる。加えて、毒性淡水藻類のブルームが、麻痺性貝中毒を引き起こす同様の神経毒によって水道水を汚染する可能性もある。この毒素汚染水は、ヒト、家畜および野性生物にとって悲惨な結末をもたらす可能性がある。
【０００５】
ＰＳＴは、一般式（Ｉ）、すなわち
【０００６】
【化１】
2006517657.tif 000002
【０００７】
によって示される構造を備えている。
この系統の毒素は、４種の大きな分類に分けることができる。すなわち、強力な神経毒であり硫酸化されていないサキシトキシン；一箇所硫酸化されているゴニオトキシン（ＧＴＸ）；ＳＴＸまたはＧＴＸよりも毒性の低いＮ−スルホカルバモイル−１３−ヒドロスルフェートのＣトキシン；およびＣ１３上にフェノール基を含むＧＣトキシンである。
【０００８】
ＰＳＴの毒性は、電位依存性ナトリウムチャネルに結合する結果、ナトリウムイオンの流入を遮断し、従って神経筋伝達を遮断することである。これが、治療法のない呼吸器系の麻痺を引き起こす。ある麻痺性貝中毒の大発生においては、犠牲者の最大４０％が死亡
した。ＰＳＴの供給源である渦鞭毛藻は、赤潮として知られる藻類ブルームを周期的に形成する。商業的に重要な生物種または水産養殖技術を用いて生産される生物種をはじめとする軟体動物、魚および甲殻類は、これらの渦鞭毛藻を摂取して毒素を蓄積する可能性がある。個々の海洋動物が毒素を含むかどうか徹底的に検査して検出することは不可能であり、それゆえヒトが不注意に毒素を含む動物を摂取する危険性がある。従って、中毒の危険性を回避して社会的および経済的損失を防ぐために、摂取されるであろう生物種についてＰＳＴの存在をモニタリングする必要がある。
【０００９】
サキシトキシンについての改良アッセイが、本発明者らの同時係属の国際出願（国際公開公報第０２／４８６７１号パンフレット）に開示されている。その国際出願は、単離および精製されたサキシフィリン分子、例えばムカデ類のエトモスチグムス・ルブリペス（Ethmostigmus rubripes ）から単離されたサキシフィリンなどへの結合を利用して、試料中に存在する麻痺性貝毒の量について検出および測定の少なくともいずれかを実施する方法を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
結合性がムカデ類のサキシフィリンと同等以上の、他の供給源由来のサキシフィリンが利用できることが望ましい。しかしサキシフィリンは、単離および精製が困難な化合物群であることが立証されており、今日まで、十分に特性解析されているのはウシガエル・サキシフィリンだけである。サキシフィリンまたはそのリガンドを検出および特性解析するために、ＰＳＴを標識できることや、ＰＳＴを固形支持体に固定できることも望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、アビジン／ストレプトアビジン系を用いて、目的の分子、例えばサキシフィリンおよびそのリガンドを検出、特性解析、単離および／または精製可能とするために、サキシトキシンなどのＰＳＴをビオチン化する技術を開発した。該分子内にＰＳＴおよびビオチンの官能性が組み合わさることによって、アッセイの策定においてＰＳＴ／サキシフィリン結合活性と併せて活用し得る、（ストレプト）アビジン／ビオチン結合を用いる非常に多くの用途が実現される。
【００１２】
したがって本発明の一つの態様において、サキシフィリンを捕捉して前記サキシフィリンまたはそのリガンドの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施可能とする方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と、
を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の更なる態様において、サキシフィリンの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と；
（４）捕捉されたＰＳＴ複合体を介して、サキシフィリンの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する工程と、
を含む方法が提供される。
【００１４】
有利には、ビオチン部分は、アフィニティ精製の媒体として用いられる固定化（ストレプト）アビジン分子に結合する。この実施形態では、ＰＳＴコンジュゲートを、暴露する前に（ストレプト）アビジンに結合させることによって固相に固定化することができ、そして固定化ＰＳＴコンジュゲートを試料に暴露することによって反応混合物を生成することができる。別例として、ＰＳＴコンジュゲートを試料に暴露して溶液状態の反応混合物を形成し、該反応混合物を、例えばアフィニティカラムまたはビーズに固定化したストレプトアビジンに暴露して、溶液中で既に形成されているＰＳＴ複合体を捕捉することもできる。
【００１５】
適切なアフィニティマトリックスのいずれを用いてもよい。適切なアフィニティゲルは、巨大分子が固定化リガンドに最大限に接近できるように高い空隙率を有していなければならず、均一な寸法および剛性を有していて流動性が良く、機械的および化学的に安定でなければならない。典型的な不溶性支持体材料としては、セルロース、ポリスチレンゲル、架橋デキストラン、ポリアクリルアミドゲル、多孔質シリカ、アガロースおよびその誘導体、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）が挙げられる。カラムの調製は、当業者には理解されている標準的技術を用いて実施することができる。当業者には十分理解されていることであるが、結合したサキシフィリンの溶出は、緩衝液のｐＨ、イオン強度または温度などの条件を変更して、結合したサキシフィリンに対するマトリックスのアフィニティを低下させること、ならびに溶離緩衝液に競合リガンドを添加することのうち少なくともいずれかによって実施することができる。磁気ビーズまたはデンドリマー支持体をはじめとする任意の適切なビーズ支持体を同様の手法で用いてもよい。有利には、ビオチン部分を固定化（ストレプト）アビジン分子に結合させ、ＰＳＴバイオセンシングデバイスの捕捉プローブとして使用する。この実施形態では、ＰＳＴコンジュゲートを、暴露する前に（ストレプト）アビジンに結合させることによって固相に固定化することができ、固定化ＰＳＴコンジュゲートを、いずれも既知量のサキシフィリンおよびＰＳＴを含む試料に暴露することによって、反応混合物を生成することができる。別例として、ＰＳＴコンジュゲートを試料に暴露して溶解状態の反応混合物を形成し、該反応混合物を、例えば膜、マイクロカンチレバー（microlever）、電極または化学的に活性化されたガラス表面に固定化されたストレプトアビジンに暴露して、溶解中に既に形成されているＰＳＴ複合体を捕捉することもできる。その際、（ストレプト）アビジンに結合することによって固相に吸着されるＰＳＴ- サキシフィリン複合体の量は、試料中のＰＳＴの量に相関することになる。典型的なプラットフォームとしては、電気化学、光学、表面プラズモン共鳴、弾性波、マイクロカンチレバーおよびイオンチャネル切り替え型バイオセンサが挙げられる。
【００１６】
一実施形態において、本発明のＰＳＴコンジュゲートをプローブとして用いて、組織、細胞または他の部位でのサキシフィリンおよびそれらのリガンドの存在を検出することができる。サキシフィリンへの結合はＰＳＴ部分を介して行われ、検出はビオチン部分を介して従来の手法で行われる。例えば（ストレプト）アビジンの蛍光コンジュゲート、放射活性コンジュゲートまたは化学発光性コンジュゲートを用いることができる。（ストレプト）アビジンに適用しうる他の検出可能な標識としては、光媒介標識試薬または蛍光共鳴エネルギー伝達試薬に用いられ得るＣＭＮＢ−ケージドフルオレセインとのコンジュゲート、蛍光ミクロスフェア標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などが挙げられる。更に、酵素を使用する方法を検出に用いてもよく、従って用いられる（ストレプト）アビジンは、酵素とのコンジュゲ
ート、例えば（ストレプト）アビジンのアルカリホスファターゼとのコンジュゲート、ホースラディッシュペルオキシダーゼとのコンジュゲート、およびβガラクトシダーゼとのコンジュゲートなどであってもよい。抗（ストレプト）アビジン抗体（標識抗体または非標識抗体）を検出に用いてもよい。
【００１７】
別例として、サキシフィリンを、固相、例えば膜、マイクロカンチレバー、電極または化学的に活性化されたガラス表面に結合させてもよく、次いで標識したＰＳＴ複合体を捕捉させてもよい。その際、当業者には十分理解されるとおり、競合実験を行ってもよい。
加えて、本発明のコンジュゲートを用いて、ＰＳＴ特異的抗体、またはＰＳＴに結合するＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーをスクリーニングしてもよい。
【００１８】
したがって本発明の更なる態様において、ＰＳＴに対する抗体、またはＰＳＴに結合するＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーを捕捉する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、前記抗体またはアプタマーを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介して抗体またはアプタマーに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と
を含む方法が提供される。
【００１９】
有利にはＰＳＴは、サキシトキシンとして分類されるＰＳＴの一種であり、より特定すればサキシトキシンそのものである。
本発明の更なる態様において、ビオチン／（ストレプト）アビジン系で使用される、ＰＳＴ部分を含んでなるＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチンに結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートが提供される。
【００２０】
有利には、リンカーは、サキシトキシンのＣ１２もしくはＣ１３、または他のＰＳＴの同等の部位を介して、好ましくはＣ１３を通してＰＳＴに結合する。結合は、任意の適切な結合基を介して行われてもよいし、ＰＳＴ上の既存の官能基との反応によって、またはＰＳＴを修飾して導入された基との反応によって形成されてもよい。
【００２１】
適切な長さのリンカーを導入する適切な方法のいずれを用いてもよく、リンカーを伸長させるのに、多種多様な化学物質を用いることができる。
本発明の特に好ましい実施形態において、デカルバモイル化を用いてサキシトキシンそのもののＣ１３を介して結合が行われる。
【００２２】
一実施形態において、反応は、エステル結合の形成を含む。有利には、ｄｃＳＴＸをジカルボン酸（または対応する無水物）と反応させる。本発明の特に好ましい形態において、ジカルボン酸はコハク酸／無水物であり、それによってｄｃＳＴＸへミスクシネートが形成される。有利には、ジカルボン酸誘導体をビオチンのヒドラジン誘導体と反応させて、ビオチンをＰＳＴに結合させる。
【００２３】
別例として、ｄｃＳＴＸを、ビオチン誘導体に結合し得る官能基を含むイソシアネート、例えばビオチンのスルフヒドリル誘導体と反応し得るＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネートなどと反応させる。
【００２４】
当然のことであるが、リンカーが炭素鎖を含んでいてもよく、該炭素鎖は、官能基およ
び／またはヘテロ原子および／または環構造（シクロアルキル、複素環および芳香環構造など）によって中断されていてもよく、任意選択で置換されていてもよい。本発明の特に好ましい実施形態において、リンカーは、４原子長より長い（または同等の長さであってリンカー内に環構造が存在する）ため、あらゆるサキシフィリンの結合を促進する。しかし、結合のアフィニティはリンカーを伸長させることによって著しく向上し、５原子長以上のリンカーが、好ましい。さらに単なる経済的理由および実際には合成できないことからリンカーの長さには上限があり、５〜２０原子長のリンカーが好ましい。より好ましいのは、８〜１８原子長のリンカーであり、最も好ましいのは、１１〜１８原子長のリンカーである。理論に拘束されるのは望まないが、サキシフィリンの中には、ＰＳＴに結合するとコンホメーションが変化して結合反応の立体障害を起こすものがあり、これらの障害の程度は、サキシフィリンの性質に応じてサキシフィリン間で異なっていると考えられる。
【００２５】
本発明の更なる態様によれば、ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンと結合したＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体が提供される。
本発明の更なる態様によれば、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンと結合したＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体が提供される。
【００２６】
本発明の更なる態様によれば、上記のＰＳＴコンジュゲートを含むアフィニティ精製媒体が提供される。
本発明の更なる態様によれば、上記のＰＳＴコンジュゲートを備えたＰＳＴバイオセンシングデバイスが提供される。
【００２７】
本発明の更なる態様によれば、固形支持体に共有結合したサキシフィリンと、該サキシフィリンへのＰＳＴコンジュゲートの結合を検出する手段とを備えたＰＳＴバイオセンシングデバイスが提供される。
【００２８】
典型的には、ＰＳＴコンジュゲートが（ストレプト）アビジンに結合することにより、例えば結合時の質量の変化によって結合が検出となる。
本明細書において用いられる用語「麻痺性貝毒」またはＰＳＴは、先に示した一般式Ｉの化合物、またはその改変体であって、電位依存性ナトリウムチャネルに結合する能力を有する結果哺乳類への毒性を示すものを指す。
【００２９】
用語「ＰＳＴ残部」または「ＰＳＴ部分」が本明細書において用いられる場合、官能基が前駆体として除去される反応など（Ｃ１３でのデカルバモイル化またはＣ１２での還元によりサキシトキシノールを生成する反応など）の結合反応の後のＰＳＴの残りを指し、従って「ＰＳＴ残部」または「ＰＳＴ部分」は、反応生成物内に残存しているＰＳＴ由来の原子で構成されている。
【００３０】
本明細書において用いられる用語「ビオチン」は、化合物のビオチンそのもの、およびその誘導体であってアビジンまたはストレプトアビジンに結合する能力を保持しているもの、例えば（ストレプト）アビジンに対する可逆的結合が可能なデスチオビオチンおよびその誘導体を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「（ストレプト）アビジン」は、ポリペプチドのストレプトアビジンもしくはアビジンそのもの、またはストレプトアビジンもしくはアビジンの修飾形態（その断片を含む）であってビオチンに結合する能力を保持しているものを指す。具体的には、脱グリコシル化されたアビジンまたはストレプトアビジン、例えばビオチン結合タンパク質ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）（インビトロジェン（Invitrogen））、およびビオチンへの可逆的結合を可能にするために十分アフィニティを低下させた選択的ニ
トロ化アビジン誘導体（ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ（商標）、インビトロジェン）が考えられる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ビオチン残部」または「ビオチン部分」は、ビオチンそのものまたは用語「ビオチン」に包含されるビオチン誘導体の、先に定義したとおり結合反応の後の残りを指す。
【００３３】
「ビオチン／（ストレプト）アビジン系」または同等の用語は、本明細書で定義される（ストレプト）アビジンと、本明細書で定義されるビオチンとの結合相互作用を含む、アッセイ、標識反応、精製および合成などの任意の系であって、他の部分が含まれていてもよい。（ストレプト）アビジンの代わりに、抗ビオチン抗体をビオチンの検出に用いてもよい。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「サキシフィリン」は、サキシトキシンに結合する能力を特徴とする多種多様な機能を備えたタンパク質群の一つを指す。サキシフィリンとしては、この性質を備えたトランスフェリン、この性質を備えたナトリウムチャネルまたは他の疎水性もしくは膜結合性タンパク質、およびサキシトキシンとテトロドトキシンの両方に結合する親水性のタンパク質群、例えばフグ・サキシフィリンなどが挙げられるが、既知であれ未知であれ、そのタンパク質が通常の生理学的役割において機能するのであれば、供給源、化学的性質または化学構造には関係ない。本発明の態様が、これまで未知のサキシフィリンの検出、単離および特性解析に関することを前提とすれば、当然ながら、その用語を使用することによって、この性質を備えた既知の分子およびこれまで未発見の分子の両方が想定される。
【００３５】
この明細書および特許請求の範囲の全体を通して、言葉「含む（comprise, comprises ）」「含んでいる（comprising）」は、文脈が別の意味を必要とする場合を除き、非排他的な意味で用いられている。
【００３６】
当然のことであるが、本明細書内では多数の先行技術文献を参照するが、この参照によって、それらの文書のいずれかがオーストラリアまたは他国における当該技術分野の一般的共通知識の一部であると認められるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
（発明を実施するための形態）
【実施例１】
【００３８】
［ビオチン−リンク１１−ＳＴＸの合成、およびビオチン−リンク４−ＳＴＸの合成］
貝から単離したサキシトキシンを、密閉した真空排気ガラス管内にて６Ｍ  ＨＣｌ中、１１０℃で４時間加水分解することによって、デカルバモイルサキシトキシン（ｄｃＳＴＸ）に転化した。該溶液を凍結乾燥した。残渣を０．０５Ｍ酢酸に再溶解し、溶液をＣ１８固相抽出カートリッジに通した。Ｂｉｏｇｅｌ（登録商標）−Ｐ２クロマトグラフィによってｄｃＳＴＸを精製し、凍結乾燥した。
【００３９】
その後、ｄｃＳＴＸを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に再溶解し、温度１０℃およびｐＨ５．７±０．１を保持しながら、コハク酸無水物を２回逐次添加して（ｄｃＳＴＸ：コハク酸無水物の比は１：２０）１０℃で２時間反応させることによって、ｄｃＳＴＸ−ヘミスクシネートに転化した。その後、ｄｃＳＴＸヘミスクシネートをｄｃＳＴＸから分離して、溶離溶媒として０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ、および溶離溶媒として超純水を用いたＣａｒｂｏｇｒａｐｈ（商標）グラファイトカーボン固相抽出によって精製した。
【００４０】
その後、ｄｃＳＴＸへミスクシネートを完全に凍結乾燥し、ＨＡＴＵ（ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）４モル当量の存在下でビオチンヒドラジドまたはビオチンＬＣヒドラジドのうちいずれか４モル当量と室温で一晩反応させて、それぞれビオチン−リンク４−ＳＴＸおよびビオチン−リンク１１−ＳＴＸを生成させた。
【００４１】
その後、ビオチン−リンク４−ＳＴＸおよびビオチン−リンク１１−ＳＴＸを、親水性相互作用クロマトグラフィ−質量分析（ＨＩＣ  ＬＣ−ＭＳ）によって特性解析および精製したが、このときエレクトロスプレーイオン化インターフェース（ＨＶキャピラリー  ＋４ｋＶ、スキマー電圧  ４０Ｖ）を取り付けたＥｓｑｕｉｒｅ３０００＋（商標）四重極イオントラップ型質量分析計（米国マサチューセッツ州ビレリカ所在のブルカーダルトニクス（Bruker Daltonics）社）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＬＣを用いた。ＬＣによる分離は、５０％アセトニトリル：水中の２ｍＭギ酸アンモニウム、３．６ｍＭギ酸の定組成溶液を用いて、４０℃に維持したＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（商品名）カラム（５μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ内径；トーソーハス（TosoHass））によって１ｍＬ／分で実行した。精製した化合物を凍結乾燥し、更なる検査のために保存した。ビオチン−リンク１１−ＳＴＸの質量スペクトル（図１）は、ｍ／ｚ＝７１０．０±０．５Ｄａに一価のイオン、およびｍ／ｚ＝３５５．５±０．５Ｄａに二価のイオンの存在を示した。ビオチン−リンク４−ＳＴＸの質量分析（図２）は、ｍ／ｚ＝５９７．０±０．５Ｄａに一価のイオン、およびｍ／ｚ＝２９８．９±０．５Ｄａに二価のイオンの存在を示した。
【００４２】
図３に示すデータから、ビオチン−リンク１１−ＳＴＸがサキシフィリンに結合することが確認される。用いたレセプター結合アッセイについては、同時係属の国際出願の国際公開第０２／４８６７１号パンフレットに記載されており、同パンフレットの内容は、参照により本明細書に援用される。ろ過用９６穴マイクロタイタープレートを、０．３％ポリエチレンイミンで室温にて１時間プレコーティングした。エトモスチグムス・ルブリペス（Ethmostigmus rubripes ）生体から調製した野生型サキシフィリン（Ｅ．ｒ．ＳＸＦＮ）を、トリチウム標識サキシトキシン［３Ｈ］ＳＴＸ、ならびに数段階希釈したｄｃＳＴＸヘミスクシネートおよびビオチン−リンク１１−ＳＴＸの存在下、室温で1 時間インキュベートした。溶液をろ過し、サキシフィリンをフィルタ上に保持させた。測定されたシグナルは、フィルタ上の残留放射活性に対応し、サキシフィリンに結合した［３Ｈ］ＳＴＸの濃度に直接相関する。示したデータは、ビオチン−リンク１１−ＳＴＸおよびｄｃＳＴＸヘミスクシネートのいずれも、サキシフィリン結合について［３Ｈ］ＳＴＸと競合し得ることを示している。陽性および陰性対照は、それぞれｕｌｔｒａｐｕｒｅ（商標）水および非放射性の遊離サキシトキシンをテストすることによって得た。
【００４３】
【化２】
2006517657.tif 000003
【００４４】
【化３】
2006517657.tif 000004
【００４５】
【化４】
2006517657.tif 000005
【実施例２】
【００４６】
［ビオチン−リンク１８−ＳＴＸの合成］
貝から単離したサキシトキシンを、密閉した真空排気ガラス管内にて６Ｍ  ＨＣｌ中、１１０℃で４時間加水分解することによって、デカルバモイルサキシトキシン（ｄｃＳＴＸ）に転化した。溶液を凍結乾燥した。残渣を０．０５Ｍ酢酸に再溶解し、溶液をＣ１８固相抽出カートリッジに通した。Ｂｉｏｇｅｌ（登録商標）−Ｐ２クロマトグラフィによってｄｃＳＴＸを精製して、凍結乾燥した。残渣を無水ＤＭＦに再溶解し、過剰量のＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート）と室温で一晩反応させて、ＰＭＰＩ−ＳＴＸを生成させた。ＰＭＰＩ−ＳＴＸを、逆相ＨＰＬＣ−ＭＳによって精製した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）中で、システアミンと室温で３分間反応させた。最終生成物である、ビオチンのスルフヒドリル誘導体を、Ｃ１８固相抽出によって精製して、一晩凍結乾燥した。ＰＭＰＩ−ＳＴＸを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に再溶解し、過剰量のスルフヒドリルビオチンと室温で１５分間反応させて、ビオチン−リンク１８−ＳＴＸを生成させ、次いでＬＣ−ＭＳによって精製した。ビオチン−リンク１８−ＳＴＸを、エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）に連結した逆相クロマトグラフィおよび親水性相互作用クロマトグラフィの両方によって特徴づけた。質量スペクトルは、ｍ／ｚ＝４４４．２Ｄａに二価イオンの存在を示した。
【００４７】
【化５】
2006517657.tif 000006
【００４８】
【化６】
2006517657.tif 000007
【００４９】
【化７】
2006517657.tif 000008
【実施例３】
【００５０】
［アビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸ、ストレプトアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸ、アビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸ、およびストレプトアビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸ複合体の調製］
（ストレプトアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸおよびストレプトアビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸ）：  ３２４．８ｐｍｏｌのビオチン−リンク４−ＳＴＸおよび９０．４ｐｍｏｌのビオチン−リンク１１−ＳＴＸを、それぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で３０μｇのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）ストレプトアビジンと混合して、＋４℃で２時間インキュベートした。４００μＬの０．１％ギ酸を添加し、該溶液を５０００カットオフの微小透析用遠沈管を用いてろ過し、３０μＬに減量した。同じステップをもう一度繰り返した。その後、２００μＬの０．１％ギ酸を添加して、再度、溶液をろ過して３０μＬに減量した。水を用いて、最終的な容量を、ビオチン−リンク４−ＳＴＸについては６５μＬ（最終濃度５μＭ）、ビオチン−リンク１１−ＳＴＸについては９０μＬ（最終濃度１μＭ）に調整した。
【００５１】
（アビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸおよびアビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸ）：  ３２４．８ｐｍｏｌのビオチン−リンク４−ＳＴＸおよび９０．４ｐｍｏｌのビオチン−リンク１１−ＳＴＸを、それぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で５０μｇのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）アビジンと混合して、＋４℃で２時間インキュベートした。４００μＬの０．１％ギ酸を添加し、該溶液を５０００カットオフの微小透析用遠沈管を用いてろ過し、３０μＬに減量した。同じステップをもう一度繰り返した。その後、２００μＬの０．１％ギ酸を添加して、再度、溶液をろ過して３０μＬに減量した。水を用いて、最終的な容量を、ビオチン−リンク４−ＳＴＸについては６５μＬ（最終濃度５μＭ）、ビオチン−リンク１１−ＳＴＸについては９０μＬ（最終濃度１μＭ）に調整した。
【実施例４】
【００５２】
［競合実験］
９６穴ＧＦ／Ｂマイクロタイターフィルタープレート（ミリポア（Millipore ））を、
０．３％（ｗ／ｖ）ＰＥＩに少なくとも１時間予浸した後に、試薬を加えた。反応は全て、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｎＭ  ［３Ｈ］ＳＴＸおよび粗サキシフィリン抽出物の７０倍希釈物（総タンパク質濃度〜１０ｍｇ／ｍＬ）を含む総容量１５０μｌ中で実施した。約１時間かけて実験を平衡化させた後、膜を通して吸引した。ウェルを２００μｌの水で２回すすいだ。希釈系列物とした非標識ＳＴＸ、アビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸ、ストレプトアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸ（最大５００ｎＭ）、アビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸおよびストレプトアビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸ（最大１００ｎＭ）を、サキシフィリン結合部位に関して１．８ｎＭ  ［３Ｈ］ＳＴＸと競合させた（図４）。
【００５３】
［ＩＣ５０の計算］
競合曲線（図１）を、式（結合率＝［ＳＴＸ］ｎ／（［ＳＴＸ］ｎ＋ＩＣ５０ｎ）を用いてフィッティングした。ここで、傾き（Hill slope）はｎ＝１（ただしアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸについてはｎ＝０．８５、ストレプトアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸについてはｎ＝０．７）とし、ＩＣ５０は、５０％阻害を起こす濃度であり、［ＳＴＸ］は、サキシトキシンまたはサキシトキシン類似体の濃度である。
【００５４】
【表１】
2006517657.tif 000009
【００５５】
ビオチンとＳＴＸの間に４原子長を超えるリンカーを用いることにより、サキシフィリンへのアビジン．ビオチン−リンカー−ＳＴＸの結合が可能になるが、リンカーを１１原子長まで伸長させることによって、アフィニティが有意に向上する（ＩＣ５０が約５倍低下する）。アビジンの代わりにストレプトアビジンを用いると、リンカーの長さの影響が、より見易くなる。実際、ストレプトアビジンの結合部位の特定のコンホメーションが原因で、立体障害がストレプトアビジンによって増大することは周知である。ストレプトアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸは、５００ｎＭもの高濃度でも放射活性標識ＳＴＸに取って代わることはなく、サキシフィリンへのアフィニティが弱いことが示された（推定でＩＣ５０＞１．５μＭ）。これに対し、１１原子長のリンカーを使用すると、サキシフィリンへのストレプトアビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸの結合は強く、アビジン．ビオチン−リンク１１−ＳＴＸと同様のＩＣ５０となる（ＩＣ５０＝４．５ｎＭ）。
【実施例５】
【００５６】
［表面プラズモン共鳴によるサキシトキシンの検出］
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｘシステムを用いて、１４０μＬのビオチン−リンク１１
−ＳＴＸを、流速１μＬ／分にてストレプトアビジン・コーティング膜（ＳＡチップ、米国ウプサラ所在のビアコア（Biacore ）社）に固定化した。純粋なビオチン−ＬＣ−ヒドラジドを同様のチップ上の同一のストレプトアビジン膜に結合させることによって、参照用の膜を得た。その後、生理学的緩衝液（ｐＨ７．４）中のエトモスチグムス・ルブリペス（Ethmostigmus rubripes ）サキシフィリンの調製物を注入して、緩衝液で十分に洗浄した。標準サキシトキシンを注入し、参照シグナルとの比較によって、サキシフィリンの絶対置換量を測定した。図５のヒストグラムは、捕捉プローブとしてビオチン−リンク１１−ＳＴＸを用いた表面プラズモン共鳴による、１００ｐｐｂ〜１ｐｐｍのサキシトキシンの検出を示している。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例１で調製されたサキシトキシンコンジュゲートであるビオチン−リンク１１−ＳＴＸの質量スペクトルを示す図。
【図２】実施例２で調製されたサキシトキシンコンジュゲートであるビオチン−リンク４−ＳＴＸの質量スペクトルを示す図。
【図３】実施例１で合成された化合物と放射活性サキシトキシンとの、サキシフィリンレセプター結合アッセイにおける効果的競合を示すグラフ形態のデータ。本発明の化合物がサキシフィリンに結合することを示している。
【図４】実施例２で合成された複合体と放射活性サキシトキシンとの、サキシフィリンレセプター結合アッセイにおける効果的競合を示すグラフ。本発明の複合体がサキシフィリンに結合すること、およびリンカーの長さがサキシフィリンに対するアフィニティに影響を及ぼすことを示している。
【図５】サキシフィリンの捕捉プローブとしてストレプトアビジン・コーティング膜に固定化したビオチン−リンク１１−ＳＴＸを用いた表面プラズモン共鳴による標準的サキシトキシンの検出を示す図。
【図１】
2006517657.tif 000010
【図２】
2006517657.tif 000011
【図３】
2006517657.tif 000012
【図４】
2006517657.tif 000013
【図５】
2006517657.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月21日(2005.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サキシフィリンを捕捉して前記サキシフィリンまたはそのリガンドの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施可能とする方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介して直接的または間接的にビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、捕捉されたＰＳＴ複合体を形成させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固形支持体がアフィニティ精製の媒体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＳＴがサキシトキシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
サキシフィリンの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して
【請求項８】
媒体が、マトリックス、ビーズ、磁気ビーズ、デンドリマー、セルロース、ポリスチレンゲル、架橋デキストラン、ポリアクリルアミドゲル、多孔質シリカ、アガロースおよびｓｅｐｈａｒｏｓｅからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
固形支持体が、膜、マイクロカンチレバー、電極および化学的に活性化されたガラス表面からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サキシフィリンが検出可能な標識を担持している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ビオチン／（ストレプト）アビジン系で使用される、ＰＳＴ部分を含んでなるＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位がリンカーを介してビオチンに結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２０】
リンカーが、サキシトキシンのＣ１２もしくはＣ１３を介して、または他のＰＳＴの同等の部位を介してＰＳＴ部分に結合している、請求項１９に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２１】
リンカーが、デカルバモイルサキシトキシンのＣ１３を介して結合している、請求項２０に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２２】
リンカーが４原子以上を含んでなる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２３】
リンカーが５〜２０原子を有する、請求項２２に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２４】
リンカーが１１〜１８原子を有する、請求項２３に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項２５】
ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合している請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体。
【請求項２６】
ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合している請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体。
【請求項２７】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合している、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２９】
請求項２８に記載の複合体を含むアフィニティ精製媒体。
【請求項３０】
請求項２８に記載の複合体を含む、ＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項３１】
固形支持体に共有結合しているサキシフィリンと、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートのサキシフィリンへの結合を検出する手段とを含むＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項２２】
固形支持体がアフィニティ精製の媒体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
媒体が、マトリックス、ビーズ、磁気ビーズ、デンドリマー、セルロース、ポリスチレンゲル、架橋デキストラン、ポリアクリルアミドゲル、多孔質シリカ、アガロースおよびｓｅｐｈａｒｏｓｅからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＳＴコンジュゲートを前記媒体に固定化した後に試料に暴露する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＳＴコンジュゲートを試料に暴露して、媒体に捕捉させるためにＰＳＴ複合体を形成させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
サキシフィリンの単離および精製のうち少なくともいずれかを実施するために、固形支持体からサキシフィリンを溶出させる工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
サキシフィリンの単離および精製のうち少なくともいずれかを実施するために、媒体からサキシフィリンを溶出させる工程を更に含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガ
ラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
サキシフィリンが検出可能な標識を担持している、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＳＴコンジュゲートがサキシトキシンを含む、請求項１９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＳＴに対する抗体、またはＰＳＴに結合するＲＮＡアプタマーを捕捉する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位が５原子以上からなるリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、前記抗体またはアプタマーを含むと推定される試料および（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介して抗体またはアプタマーに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させる工程と
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
別例として、サキシフィリンを、固相に結合させてもよく、
ＰＳＴ特異的抗体、またはＰＳＴに結合するＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーを
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月29日(2005.4.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源の生物体から得られるサキシフィリンタンパク質とＰＳＴ部分とを結合させる方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位が５原子以上からなるリンカーを介して直接的または間接的にビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料および（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させる工程と
を含み、
前記ＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティが、４原子以下のリンカーを含んでなるＰＳＴコンジュゲートのＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティよりも高いことを特徴とする
方法。
【請求項２】
試料がさらにＰＳＴを含むと推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＳＴおよびサキシフィリンを、ＰＳＴ部分への結合について競合させる工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＳＴがサキシトキシンを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
（ストレプト）アビジンが固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合することにより固定化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
固形支持体がアフィニティ精製の媒体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
媒体が、マトリックス、ビーズ、磁気ビーズ、デンドリマー、セルロース、ポリスチレンゲル、架橋デキストラン、ポリアクリルアミドゲル、多孔質シリカ、アガロースおよびｓｅｐｈａｒｏｓｅからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
固形支持体が、膜、マイクロカンチレバー、電極および化学的に活性化されたガラス表面からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サキシフィリンが検出可能な標識を担持している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＳＴコンジュゲートがサキシトキシンを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
供給源の生物体から得られるサキシフィリンタンパク質の検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位が５原子以上からなるリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、サキシフィリンを含むと推定される試料に暴露して反応混合物を生成し、かつ（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させて、複合体を形成させる工程と；
（４）複合体を介して、サキシフィリンの検出、特性解析、単離および精製のうち少なくともいずれかを実施する工程と
を含み、
前記ＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティが、４原子以下のリンカーを含んでなるＰＳＴコンジュゲートのＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニ
ティよりも高いことを特徴とする
方法。
【請求項２０】
（ストレプト）アビジンが固定化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合することにより固定化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
固形支持体がアフィニティ精製の媒体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
媒体が、マトリックス、ビーズ、磁気ビーズ、デンドリマー、セルロース、ポリスチレンゲル、架橋デキストラン、ポリアクリルアミドゲル、多孔質シリカ、アガロースおよびｓｅｐｈａｒｏｓｅからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＳＴコンジュゲートを前記媒体に固定化した後に試料に暴露する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＳＴコンジュゲートを試料に暴露して、媒体に捕捉させるためにＰＳＴ複合体を形成させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
サキシフィリンの単離および精製のうち少なくともいずれかを実施するために、固形支持体からサキシフィリンを溶出させる工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
サキシフィリンの単離および精製のうち少なくともいずれかを実施するために、媒体からサキシフィリンを溶出させる工程を更に含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
固形支持体がバイオセンシングデバイスにおいて使用されるように構成されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を担持している、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サキシフィリンが固形支持体に共有結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
サキシフィリンが検出可能な標識を担持している、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＳＴコンジュゲートがサキシトキシンを含む、請求項１９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＳＴに対する抗体、またはＰＳＴに結合するＲＮＡアプタマーを捕捉する方法であって、
（１）ＰＳＴ部分を含むＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位が５原子以上からなるリンカーを介してビオチン部分に結合していることを特徴とするＰＳＴコンジュゲートを提供する工程と；
（２）ＰＳＴコンジュゲートを、前記抗体またはアプタマーを含むと推定される試料および（ストレプト）アビジンに暴露する工程と；
（３）ＰＳＴ部分を介して抗体またはアプタマーに結合させ、ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合させる工程と
を含み、
前記ＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティが、４原子以下のリンカーを含んでなるＰＳＴコンジュゲートのＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティよりも高いことを特徴とする
方法。
【請求項３８】
ビオチン／（ストレプト）アビジン系で使用される、ＰＳＴ部分を含んでなるＰＳＴコンジュゲートであって、ＰＳＴ部分のサキシフィリン結合部位以外の部位が５原子以上からなるリンカーを介してビオチンに結合していること、ならびに前記ＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティが、４原子以下のリンカーを含んでなるＰＳＴコンジュゲートのＰＳＴ部分のサキシフィリンに対する結合アフィニティよりも高いことを特徴とするＰＳＴコンジュゲート。
【請求項３９】
リンカーが、サキシトキシンのＣ１２もしくはＣ１３を介して、または他のＰＳＴの同等の部位を介してＰＳＴ部分に結合している、請求項３８に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項４０】
リンカーが、デカルバモイルサキシトキシンのＣ１３を介して結合している、請求項３９に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項４１】
リンカーが５〜２０原子を有する、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項４２】
リンカーが１１〜１８原子を有する、請求項４１に記載のＰＳＴコンジュゲート。
【請求項４３】
ＰＳＴ部分を介してサキシフィリンに結合している請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体。
【請求項４４】
ビオチン部分を介して（ストレプト）アビジンに結合している請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートを含んでなる複合体。
【請求項４５】
（ストレプト）アビジンが検出可能な標識を含む、請求項４４に記載の複合体。
【請求項４６】
検出可能な標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および酵素からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
酵素は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガ
ラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
（ストレプト）アビジンが固形支持体に共有結合している、請求項４４に記載の複合体。
【請求項４９】
請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の複合体を含むアフィニティ精製媒体。
【請求項５０】
媒体が、マトリックス、ビーズ、磁気ビーズ、デンドリマー、セルロース、ポリスチレンゲル、架橋デキストラン、ポリアクリルアミドゲル、多孔質シリカ、アガロースおよびｓｅｐｈａｒｏｓｅからなる群から選択される、請求項４９に記載のアフィニティ精製媒体。
【請求項５１】
請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の複合体を含む、ＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項５２】
固形支持体に共有結合しているサキシフィリンと、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のＰＳＴコンジュゲートのサキシフィリンへの結合を検出する手段とを含むＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項５３】
ＰＳＴコンジュゲートが（ストレプト）アビジンに結合している、請求項５２に記載のＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【請求項５４】
質量の増加を検出する、請求項５３に記載のＰＳＴバイオセンシングデバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
別例として、サキシフィリンを、固相、例えば膜、マイクロカンチレバー、電極または化学的に活性化されたガラス表面に結合させてもよく、次いで標識したＰＳＴ複合体を捕捉させてもよい。その際、当業者には十分理解されるとおり、競合実験を行ってもよい。
別の実施形態では、サキシフィリンが、標識、好ましくは検出に好適な標識を含むことが好ましい。標識は、蛍光標識、放射活性標識、化学発光標識、金コロイド、ラテックスビーズ、リポソーム、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、タンパク質、抗体（標識抗体または非標識抗体）および酵素からなる群から選択されることが好ましい。さらに好ましくは、酵素はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβガラクトシダーゼからなる群から選択される。
加えて、本発明のコンジュゲートを用いて、ＰＳＴ特異的抗体、またはＰＳＴに結合するＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーをスクリーニングしてもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
［ＩＣ５０の計算］
競合曲線（図４）を、式（結合率＝［ＳＴＸ］ｎ／（［ＳＴＸ］ｎ＋ＩＣ５０ｎ）を用
いてフィッティングした。ここで、傾き（Hill slope）はｎ＝１（ただしアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸについてはｎ＝０．８５、ストレプトアビジン．ビオチン−リンク４−ＳＴＸについてはｎ＝０．７）とし、ＩＣ５０は、５０％阻害を起こす濃度であり、［ＳＴＸ］は、サキシトキシンまたはサキシトキシン類似体の濃度である。


【国際調査報告】
2006517657.tif 000015
2006517657.tif 000016