(57)【要約】本発明は、ｐ４０のポリペプチドサブユニット、たとえばニワトリのＩＬ１２を含む新規な鳥類のサイトカインを提供する。さらに、このようなポリペプチドをコード化した核酸ならびにサイトカインまたは本発明のポリペプチドを含むアジュバントおよびワクチンを開示する。
2006507805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のポリペプチドサブユニット：
−配列番号１に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、
−配列番号２に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つを含むタンパク質。
【請求項２】
約４０ｋＤの見かけの分子量を有し、配列番号１、配列番号５、または配列番号７に表されるアミノ酸配列を有するサブユニットを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
−約４０ｋＤの見かけの分子量および配列番号１に表されるアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−３５ｋＤの見かけの分子量および配列番号２に表されるアミノ酸配列を有するサブユニット、
からなり、該サブユニットが結合している、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
次のポリペプチドサブユニット：
−配列番号１に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−配列番号２に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つをコード化した、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
−配列番号３に表される配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列
−配列番号４に表される配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列
からなる群より選択される核酸配列の少なくとも一つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項７】
請求項４若しくは５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項４から５のいずれか一項に記載の１以上のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベクター、および医薬適合性の担体を含有するアジュバント組成物。
【請求項９】
医薬適合性の担体とともに、鳥類の病原体に由来する活性物質および請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質を含有するワクチン組成物。
【請求項１０】
医薬適合性の担体とともに、鳥類の病原体に由来する活性物質および請求項４から５のいずれか一項に記載の１以上のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベクターを含有するワクチン組成物。
【請求項１１】
免疫賦活剤としての請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１２】
ワクチンアジュバントにおける請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１３】
医薬適合性の担体とともに請求項１に記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類の新規なサイトカイン、これらの新規なサイトカインをコード化しているＤＮＡ配列およびワクチンの目的のためのアジュバントにおけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
可溶性の分泌性分子の群−−まとめてサイトカインと称される−−は、免疫系細胞間の、および免疫系細胞と非免疫系細胞との間の重要な伝達シグナルの代表である。生物活性を発揮するためには、これらのサイトカインのうちのいくつかは、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）などのようなホモ二量体、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの分子のようなホモ三量体を形成する必要がある。単量体はわずかな生物活性を示すか、または全く生物活性を示さない。
【０００３】
現在、サイトカインは、ガン治療の際の薬物中および微生物による慢性感染症と闘う際の薬物中で用いられている。ワクチンを改善するために、アジュバント中の免疫賦活剤としてサイトカインを使用することも評価されている。
【０００４】
哺乳動物においては、ｐ４０タンパク質サブユニット複合体に基づいて、複合性のヘテロ二量体サイトカインの群が特定されてきた。哺乳動物のｐ４０成分は４０ｋＤのタンパク質を含んでおり、このタンパク質はｐ３５サブユニットとジスルフィド結合によって共有的に結合してインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）ｐ７０を形成する（ガブラー・ユー（Ｇｕｂｌｅｒ  Ｕ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １９９１，  ８８：  ４１４３−４１４７；ウォルフ・エスエフ（Ｗｏｌｆ  ＳＦ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１，  １４６：  ３０４７−３０８１；トリンチエリ・ジー（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ．）、Ｂｌｏｏｄ  １９９４，  １２：  ４００８−４０２７）。さらに、ｐ４０は、ｐ１９と結合した後に複合性のサイトカインＩＬ−２３を形成する可能性がある（ウィコウスキ・エムティー（Ｗｉｅｋｏｗｓｋｉ  ＭＴ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１  １６６：  ７５６３−７５７０）。ｐ４０は、ＩＬ−６、ｐ３５および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）と構造的に関連性を有する分子である（オップマン・ビー（Ｏｐｐｍａｎｎ  Ｂ）ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０００，  １３：  ７１５−７２５）。さらに、ｐ４０はホモ二量体を形成するかもしれない。このホモ二量体は、ＩＬ−１２  ｐ７０と競合してＩＬ−１２の高親和性受容体に結合し、そしてＩＬ−１２の生物活性を阻害すること（ハインゼル・エフピー（Ｈｅｉｎｚｅｌ  ＦＰ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９７，  １５８：  ４３８１−４３８８）、またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｈ１の発達によりＩＦＮ−γの産生を減少させるのではなく促進すること（ピコッティ・ジェイアール（Ｐｉｃｃｏｔｔｉ  ＪＲ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７，  １５８：  ６４３−６４８）のいずれかが示されている。
【０００５】
種々の哺乳類におけるインビボでのｐ４０の重要性が、組み換え型ｐ４０を用いて実証されてきた。８０ＫＤａのホモ二量体（ｐ４０）２のＩＬ−１２の拮抗的な特性が、リポ多糖類（ＬＰＳ）によって誘導されるＩＦＮ−γ依存性致死ショックモデルにおいて明瞭に実証された（マットナー・エフ（Ｍａｔｔｎｅｒ  Ｆ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  １９９７，  １１：  ４７３４−４７３７）。脳の小グリア細胞について、生物活性を示すＩＬ−１２  ｐ７０が存在しない場合でのヒトｐ４０の産生が実証された（デゴア−デハルベ・エムジー（Ｄｅ  Ｇｏｅｒ−ｄｅ  Ｈｅｒｖｅ  ＭＧ）ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２００１，  １４：  ８８−９６）。さらに、インビボの遺伝子ターゲティング手法を用いて、哺乳動物のｐ４０複合性サイトカインの生理的役割が詳細に記述されてきた。ｐ４０タンパク質が遺伝的に欠損したマウス（ｐ４０−／−）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓによる感染を受けた後の死亡率および細菌による臓器の負担が、ｐ４０を産生する能力を有するがｐ３５遺伝子を欠くマウス（ＩＬ−１２  ｐ３５−／−）よりも高いことを示すことが分かった（レーマン・ジェイ（Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｊ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１，  １６７：  ５３０４−５３１５）。正常な（野生型）マウスおよびＩＬ−１２  ｐ３５−／−マウスは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓカルメット−ゲラン（ＢＣＧ）による感染または肺結核の感染を無事に通過したのに対して、ＩＬ−１２が二重に欠損した（ｐ３５−／−  ＋  ｐ４０−／−）マウスは、Ｍ．  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ感染および結核感染に対して高い感受性を示した（ホルシャー・シー（Ｈｏｌｓｃｈｅｒ  Ｃ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１，  １６７：  ６９５７−６５６６）。感受性は、抗原特異的Ｔｈ１の応答および細胞障害性Ｔ細胞の応答の減少と関係があった。興味深いことに、組み換え型ｐ４０ホモ二量体を用いるインビボ治療によって、Ｍ．  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧが感染した二重欠損（ｐ３５−／−  ＋  ｐ４０−／−）マウスの表現型が抵抗性に戻った。このことは、マイコバクテリア感染における内因性および外因性ｐ４０の保護的役割および作用薬的役割を実証しており、この役割はＩＬ−１２  ｐ７０とは無関係である（ホルシャーら、２００１、上掲）。同様に、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓが感染したｐ４０−／−マウスは、ｐ３５−／−マウスよりも初期に死亡し、臓器の負担もさらに進行していた。このことは、ｐ４０サブユニットについての保護的役割がＩＬ−１２ヘテロ二量体とは無関係であることを再度示唆している（デッケン・ケイ（Ｄｅｃｋｅｎ  Ｋ．）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９８，  ６６：  ４９９４−５０００）。また、ｐ４０−／−マウスは細胞内の細菌Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＬＶＳ）の多量投与にも関わらず生き残ったが、細菌および進行した慢性感染症を無事に通過することはできなかった。ｐ３５−／−マウスが、多量だが致死量以下のＬＶＳ感染に対して容易に生き残ったこととは、際立って対照的であった。この研究から、ＬＶＳを無事に通過することはｐ４０に依存するが、ＩＬ−１２  ｐ７０には無関係であることが示唆される（エルキンス・ケイエル（Ｅｌｋｉｎｓ  ＫＬ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００２，  ７０：  １９３６−１９４６）。また、マウスのサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）感染の間に、ｐ３５−／−マウスは、ｐ４０−／−マウスとは対照的に表現型が変化することが示され、このことは、ｐ４０が、インビボでのＩＬ−１２の拮抗作用とは無関係でその作用に追加的な活性を有するかもしれないことを示唆する（カール・ジェイエイ（Ｃａｒｒ  ＪＡ）ら、Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  １９９９，  １９：  １１４５−１１５２）。
【０００６】
総合すれば、これらの実証研究は、哺乳動物における、細菌、寄生生物、真菌またはウイルス種の細胞内感染のほとんどをコントロールするのに必須の、ＩＦＮ−γ特有のＴヘルパー１型免疫応答の調節に関する、ｐ４０に基づくサイトカイン−−たとえば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および（ｐ４０）２−−の重要な役割を明らかにしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、哺乳動物のｐ４０に基づくサイトカインの鳥類での等価物に関する。
【０００８】
鳥類のサイトカインのクローニングおよび配列決定は、哺乳動物においてなされた同様の研究に遅れをとっている。わずかに鳥類の二、三種のサイトカインが現在までに特定された。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１８ならびに多数のプロ炎症性サイトカインがクローン化され、ニワトリにおけるＴｈ１様サイトカインネットワークの存在が実証された。哺乳動物のサイトカインとの配列のホモロジーが小さい−−たいてい３０から５０％程度−−ことから、哺乳動物のサイトカインの鳥類のホモログを特定するための古典的な手法は、たいていの場合通用しない。哺乳動物の配列に基づくプライマーを用いてのＰＣＲ増幅による特定は、極めて困難であり、かつ予測ができない（ヒルトン・エル・エス（Ｈｉｌｔｏｎ  Ｌ．  Ｓ．）ら、Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ２００２，  ８５：  １１９−１２８；ステーリ・ピー（Ｓｔａｅｈｌｉ  Ｐ．）ら、Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  ２００１，  ２１：  ９９３−１０１０）。いくつかの鳥類のサイトカインが利用可能になった時に、免疫調節物質としてまたはワクチンの効力を高める免疫アジュバントとしての、これらの考えられる用途を研究する作業を開始した。
【０００９】
消費および産卵のために先進国で生育されるほとんどのニワトリは、ワクチン接種されている。マレック病ウイルスおよびニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、鶏痘ウイルスに対するワクチン、ならびにコクシジウムワクチンをこれらに接種する。孵化前または孵化後のいずれかに、ワクチン接種を実施することができる。胚および新たに孵化した鳥の免疫系はまだ完全に発達し終えたわけではなく、孵化から２から３週間後の効果と同様の免疫応答を惹起することはできない。したがって、孵化前または孵化時に用いるワクチンを開発するためには、ワクチン接種後の鳥の免疫応答を高める物質が存在する必要がある。
【００１０】
本発明者らは、新規な鳥類のサイトカインについてのアミノ酸配列およびコード化した遺伝子配列の特定および配列決定に成功した。これらのタンパク質は、哺乳動物の対応物について知られている上記の目的にとって、特に鳥類のワクチンの効力を高めるために有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、次のポリペプチドサブユニット：
−配列番号１に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、
−配列番号２に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
を少なくとも一つを含むタンパク質を提供する。
【００１２】
配列番号１に表される配列は、約４０ｋＤの分子量を有するポリペプチドを表す。配列番号２に表される配列は、約３５ｋＤの分子量を有するポリペプチドを表す。
【００１３】
４０ｋＤの分子量を有するポリペプチドサブユニットを「ｐ４０」と称することとし、その一方３５ｋＤのサブユニットを「ｐ３５」と称することとする。配列番号１および２に表されるような配列は共に、ニワトリのＤＮＡ（ニワトリのｐ４０およびニワトリのｐ３５）に由来する。
【００１４】
哺乳動物のサイトカインについて上記に説明したように、複合体を含む種々のｐ４０が存在し得る。ｐ４０は単量体分子として、ホモ二量体分子として、またはヘテロ二量体分子として出現する可能性がある。ｐ４０サブユニットはｐ３５サブユニットとジスルフィド結合によって共有的に結合して、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を形成するかもしれない。さらに、ｐ４０は、ｐ１９と結合した後に複合性のサイトカインＩＬ−２３を形成するかもしれない。ｐ４０がその他のサイトカインのペプチド鎖と無差別に結合することは、ｐ４０と複合化する、現在まで特定されていないその他のサイトカインが存在することを示唆している。
【００１５】
従って、本発明によるところのタンパク質は、前記サブユニットのうちの一つのものの一コピーからなるタンパク質でもよく、サブユニットのうちの一つのもの、特にｐ４０のホモ二量体でもよく、またはサブユニット（ｐ４０もしくはｐ３５）のうちの一つと、別のペプチドのサブユニットとからなるヘテロ二量体でもよく、または両方（ｐ４０およびｐ３５）のサブユニットを含んでいてもよい。本発明は、たとえば、別の種に由来するｐ３５サブユニットまたはｐ４０サブユニットと一緒に、ニワトリのｐ４０サブユニットまたはｐ３５サブユニットを含むキメラタンパク質も包含する。キメラとしては、たとえば、ニワトリのｐ３５と、別の鳥類に由来するｐ４０さらには非鳥類の種に由来するものとが組み合わさったタンパク質でもよい。
【００１６】
たとえばジスルフィド結合によってｐ４０およびｐ３５が結合して一緒になると、同様に本発明の一部である鳥類のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を形成することになる。
【００１７】
本発明のタンパク質は、原則的には、種々の異なる目的のために用いることができ、哺乳動物の対応物に類似する鳥類のサイトカインである。本発明によるところのサイトカイン、特に鳥類のＩＬ−１２、とりわけニワトリのＩＬ−１２を、鳥類のワクチンにおいて免疫応答を高めるためのアジュバントとして用いてもよい。
【００１８】
タンパク質配列における軽微な改変が同等に有用であることは明白なことから、本発明は、配列番号１または配列番号２における配列に対して少なくとも８０％の類似性、または好ましくは少なくとも９０％の類似性、より好ましくは９５％の類似性、さらに好ましくは少なくとも９９％の類似性、最も好ましくは１００％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのサブユニットを含むタンパク質も提供する。
【００１９】
「類似性」という用語は、アミノ酸の違いを考慮したタンパク質間の類似性の程度を意味するが、大きさ、親油性、酸性度などがほとんど等しいことを考慮すれば、その異なるアミノ酸は、機能的に似たものである。ヘニコフ・エスおよびヘニコフ・ジェイジー（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＪＧ．）、Ｐ．  Ｎ．  Ａ．  Ｓ．  ＵＳＡ  １９９２，  ８９：  １０９１５−１０９１９に記載のＢｌｏｓｕｍ６２行列などの類似性のスコアリング行列を用いて配列のアラインメントを最適化することによって、類似性のパーセントを計算することができる。Ｂｌｏｓｕｍ６２類似性行列および、ニードルマンおよびブンシュのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９７０，  ４８：  ４４３−４５３）を用いる二つの配列の類似性のパーセントおよび最適なアラインメントの計算を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ、マジソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）のＧＡＰプログラムを用い、プログラムの初期設定パラメータを利用して実施することができる。
【００２０】
配列番号１および配列番号２のような配列を有するサブユニットの一方または両方の天然発生変異型を含むタンパク質を提供することは、本発明のさらなる側面である。配列番号１または配列番号２に規定されたポリペプチドに対して少なくとも８０％の類似性、好ましくは少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、さらに好ましくは少なくとも９９％の類似性そして最も好ましくは１００％の類似性の類似性を有するアミノ酸配列を有するサブユニットを含むこのようなタンパク質は、たとえば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウおよびハトなどの鳥類に由来する。
【００２１】
このような配列は配列番号５および７に示され、これらはそれぞれ、配列番号１に表されるニワトリのｐ４０のアミノ酸配列のアヒルおよびシチメンチョウの等価物を表す。
【００２２】
このような多型体および鳥類のホモログは、本発明によって利用可能となったタンパク質のクラスに含まれる。同様に本発明の一部であるタンパク質の変異体は、当該配列における（単数または複数の）アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加によるアミノ酸配列の変化を含んでもよい天然の変異体であり得る。本質的に生物活性および免疫学的活性を変化させるとは予想されないアミノ酸の置換が記述されてきた。関連するアミノ酸間でのアミノ酸の交換、または進化の過程で頻繁に生じてきた交換は、とりわけＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（デイホフ・エム・ディー（Ｄａｙｈｏｆ，  Ｍ．  Ｄ．）、タンパク質の配列および構造のアトラス、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，ワシントンＤ．Ｃ．１９７８，  ５：  ｓｕｐｐｌ．  ３を参照すること）。この情報に基づいて、リップマンとピアーソン（Ｌｉｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ）は、相同的なポリペプチド間で迅速かつ鋭敏にタンパク質を比較して機能的類似性を決定する方法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５，  ２２７：  １４３５−１４４１）。
【００２３】
その他の変異体は、たとえば、塩誘導体、アミド誘導体、エステル誘導体、特にＣ末端エステル誘導体、およびＮアシル誘導体などの機能的な変異体であり得る。さらに、インビボまたはインビトロで、たとえばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化などによって改変を受けたペプチドも含まれる。
【００２４】
ｐ４０サブユニットまたはｐ３５サブユニット（または両方）の機能的断片の一つだけを含むタンパク質は、同様に本発明の一部とみなされる。ポリペプチドの機能的断片とは、ポリペプチドの（単数または複数の）サブユニットの一部（または複数の部分）を少なくとも意味する断片であり、これ／これらのものは、たとえば単独でまたは異種の配列と融合して用いる場合に、サイトカインとして役立つことができ、そしてこの機能を実行できるタンパク質として不可欠である。従って、このような機能的断片は、それ自体が機能的なポリペプチドであってもよく、またはその他のポリペプチドと結合してキメラタンパク質を得た場合に機能的となるものでもよい。これらの機能的断片は、サブユニットの定義に含まれると理解されている。
【００２５】
断片は、とりわけＤＮＡについての制限エンドヌクレアーゼおよびポリペプチドについてのプロテアーゼを用いる前駆体分子の酵素的な切断によって、これを生産することができる。その他の方法としては、断片の化学合成またはＤＮＡ断片によるペプチド断片の発現が挙げられる。
【００２６】
ポリペプチドサブユニットは、アミノ酸（ａａ）配列の長さに基づいてそれぞれ４０ｋＤまたは３５ｋＤの見かけの分子量を有する。還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、正確な分子量を求めることができる。
【００２７】
本発明によるところの好ましいタンパク質は、配列番号１に規定されたタンパク質に対して少なくとも８０％の類似性、好ましくは少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、さらに好ましくは少なくとも９９％の類似性そして特に好ましくは１００％の類似性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドサブユニットを含むタンパク質である。本発明によるところのこのような好ましいタンパク質は、ｐ４０サブユニットを一つまたは二つ含んでもよい（すなわちｐ４０の単量体または二量体である）。この好ましい実施態様の範囲内のタンパク質は、ニワトリに由来するｐ４０サブユニットを含む。配列番号１のニワトリの配列に対して９９％を超える類似性を有するサブユニットの例は、それぞれ配列番号５および７に表されたアヒルおよびシチメンチョウのｐ４０の配列である。
【００２８】
特に有用なものは、鳥類のＩＬ−１２が得られるように、ｐ４０サブユニットがｐ３５サブユニットに（ジスルフィド結合によって）結合したタンパク質である。
【００２９】
特に好ましい実施態様においては、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するｐ４０サブユニットと、配列番号２に表されるアミノ酸配列を有するｐ３５サブユニットとが、たとえばジスルフィド結合によって結合したものからなるニワトリのＩＬ−１２を提供する。
【００３０】
様々な方法によって、ｐ３５サブユニットとｐ４０サブユニットとの結合を達成することができる。たとえば、ＩＲＥＳ（内部リボゾームエントリーセグメント）エレメントによって隔てられたｐ３５のｃＤＮＡおよびｐ４０のｃＤＮＡの両方を含むか、または単一のオープンリーディングフレームを形成するために、グリシン／セリンに富むコーディング領域（「ヒンジ」）を介して直接結合させたｐ３５のｃＤＮＡおよびｐ４０のｃＤＮＡの両方を含む発現ベクターを介して、ニワトリのＩＬ−１２を作製することができる。さらに、離れたプロモータのコントロール下で、ｐ３５のｃＤＮＡ配列またはｐ４０のｃＤＮＡ配列のいずれかを含む発現ベクターを用いて、ニワトリのＩＬ−１２を作製することができる。
【００３１】
ペプチド合成に関する公知の有機化学的方法を用いることによって、または組み換えＤＮＡ技術を用いて、本発明によるところのタンパク質、そのサブユニットまたは機能的断片の調製を達成する。この後者の方法には、ヌクレオチド配列を有する組み換え型ポリヌクレオチドを用いての発現を利用することによって、所望のペプチドを調製することが含まれる。このヌクレオチド配列は、宿主として適切な微生物において当該ペプチドの一つ以上をコード化している。
【００３２】
これらのポリヌクレオチドは、同様に本発明の一部である。
【００３３】
従って、本発明はさらに、次のポリペプチドサブユニット：
−配列番号１に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−配列番号２に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つをコード化した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
鳥類のＩＬ−１２をコード化したポリヌクレオチドは、たとえばヒンジをコード化した配列によって結合した両者の配列を含んでもよい。
【００３５】
ポリペプチドの機能的断片をコード化した所定の核酸（ｎａ）配列の断片は、同様に本発明の一部である。
【００３６】
たとえば、ポリペプチドのこのような機能的断片をコード化したポリヌクレオチドを、膜貫通領域および／またはシグナル配列をコード化したポリヌクレオチドと融合させてもよい。
【００３７】
本発明によって規定されたようなポリヌクレオチドは、特定された核酸配列と比較して核酸配列における変動を有するポリヌクレオチド、または多型性部位を有するポリヌクレオチドも含む。「変異体」を伴うポリヌクレオチドとは、特定された核酸配列とは異なるが、配列番号１および／または２に表されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性と類似の生物活性、たとえばサイトカイン活性を有するポリペプチドをなおもコード化したものという意味である。
【００３８】
変異体は、天然の変異体でもよく、または非天然の変異体でもよい。天然の変異体には、様々な鳥類におけるホモログが含まれる。突然変異の誘発によって、非天然型の変異体を導入してもよい。天然の変異体は対立遺伝子の変異体でもよい。対立遺伝子の変異体は、生物体の染色体上の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的な形態のうちの一つである。時々、ある特定の組織において、スプライシング変異体として遺伝子が発現し、５’ｍＲＮＡもしくは３’ｍＲＮＡの変化、または一以上のエキソン配列の挿入もしくは除外が生じる結果となる。これらの配列、ならびにこれらの配列によってコード化されるタンパク質のすべては、同一または同様の機能が期待され、そして本発明の一部を形成する。
【００３９】
対応するｍＲＮＡからの不完全な転写のせいで、単離されたｃＤＮＡ配列が不完全となってもよく、または完全なｃＤＮＡの断片を含むクローンを得てもよい。当該ｃＤＮＡ配列、たとえばＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）を完遂させるための種々の技術が、当技術分野において公知である。
【００４０】
特定された核酸配列の変異体であるところの核酸配列を有するポリヌクレオチドを、次の工程を含む方法によって単離してもよい：ａ）配列番号３または４に示されるような特定された配列の全部または一部を含むＤＮＡを、対象のポリヌクレオチドを高度に発現する鳥類の細胞から単離される（ゲノム）ＤＮＡまたはｃＤＮＡである核酸に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成させる工程；およびｂ）当業者によって知られた方法によって、当該核酸を単離する工程。
【００４１】
ハイブリッド形成の条件としては、高ストリンジェントが好ましい。
【００４２】
本発明によるところの「ストリンジェント」という用語は、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで温度が６５℃での洗浄条件を意味する；高ストリンジェントな条件とは、ＳＳＣを０．３×ＳＳＣに、より好ましくは０．１×ＳＳＣに減少させることを意味する。最初の二種の洗浄を、１５から３０分間に続けて二回行うことが好ましい。高ストリンジェントな条件下で洗浄する必要がある場合は、１５分間に一回、０．１×ＳＳＣによる洗浄を追加する。たとえば、７％のＳＤＳを含むｐＨ７．５の０．５Ｍのリン酸緩衝液中で６５℃にて一晩かけて、ハイブリッド形成を行うことができる。このようなハイブリッド形成法は、分子クローニングに関するあらゆる標準的な教科書、たとえば、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）、第三版；編集：サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ，  ２００１に開示されている。
【００４３】
別の方法として、本発明によって提供される核酸配列に由来するプライマーおよび／またはプローブを用いる核酸増幅の方法論が、単離方法に含まれるかもしれない。このようなプライマーおよび／またはプローブは少なくとも１５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである；好ましいオリゴは約２５〜５０ヌクレオチドを有するものである。
【００４４】
コンピュータ内の配列を、コンピュータデータベース内に含まれ得るその他の鳥類の配列と比較することによって、配列番号３および４に表される配列の変異体またはその他の鳥類のホモログを特定してもよい。ＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＳＴＦ  ２．１．２  ［Ｏｃｔ．−１９−２０００］）（オルチュル・エスエフ、ティーエル・マッデン、エーエー・シャフナー、ジェイ・チャン、ゼット・チャン、ダブリュー・ミラーおよびディージェイ・リプマン（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ＳＦ，  ＴＬ  Ｍａｄｄｅｎ，  ＡＡ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，  Ｊ  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  ＤＪ．  Ｌｉｐｍａｎ）、「ギャップ付きのＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新しい世代（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７，  ２５：  ３３８９−３４０２）を用いて、配列をデータベース中の配列と比較してもよい。
【００４５】
次のような方法の増殖のアッセイを利用して、本発明によるところのタンパク質の生物活性をインビトロで測定することができる：ＣＯＳ−７細胞またはニワトリの細胞−−たとえばＣＥＦ、ＨＤ−１１、ＤＴ４０など−−を直径が３５ｍｍの皿に、５×１０５細胞／ウェルにて播種してもよい。１６時間の培養期間の後、ニワトリのＩＬ−１２をコード化した１μｇのプラスミドＤＮＡＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）によって、製造メーカーの取扱説明書に従って、細胞の形質移入を行うことができる。ニワトリのＩＬ−１２を含む培地を、形質移入の７２時間後に集めることができる。ニワトリのＩＬ−１２の生物活性についてチェックするために、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）の増殖に基づくバイオアッセイを開発する必要がある。このために、形質移入される（単数または複数の）プラスミドによってコード化された、培地中に放出されるサイトカインの活性を、既に記載されたバイオアッセイ（ゲイトリー・エムケイ、チゾニッテ・アールおよびプレスキー・ディーエイチ（Ｇａｔｅｌｙ，  Ｍ．  Ｋ．，  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｋｙ，  Ｄ．  Ｈ．）、「ヒトおよびマウスのインターロイキン−１２の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ｐｐ．  ６．１６．１−６．１６．１５、ジェイイー・コリガン（Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）のプロトコールを適合化させて利用して分析してもよい。
【００４６】
マウスおよびヒトのＩＬ−１２について特に開発されたこのバイオアッセイにおいては、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ）を用いて分離したヒトのＰＢＬＳを、５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含むイスコフ培地中で２日間培養する。胚の形成を刺激するために、組み換え型ヒトインターロイキン−２を添加（５０単位／ｍＬ）し、そして細胞をさらに３日間培養する。細胞を洗浄し、９６ウェルプレートに播種し（２×１０４細胞／ウェル）、そして培地の存在下で形質移入された細胞を培養する。４８時間後、３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そしてインキュベーションを４時間継続する。その後、自動化セルハーベスターによって細胞を集める。組み込まれた放射能−−これは細胞の増殖についての指標であり、従ってＩＬ−１２の生物活性の指標である−−を、液体シンチレーションカウンターによって定量できる。
【００４７】
さらなる側面においては、本発明は、それぞれ配列番号１または２に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドサブユニットをコード化した核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１または２と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコード化したものであり、そしてさらに好ましいものは、配列番号１または２と少なくとも９７％の同一性を有するポリタンパク質をコード化したポリヌクレオチドであり、少なくとも９８％または９９％を有するポリペプチドをコード化したものがより好ましい。最も好ましいものは、配列番号１または２のポリペプチドをコード化したポリヌクレオチドである。遺伝コードが縮重しているせいで、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコード化したポリヌクレオチドを、異なる特定のコドンに利用してもよい。上記に規定されたポリペプチドをコード化したすべてのポリヌクレオチドは、本発明の一部であるとみなされる。
【００４８】
本発明によるところの特に好ましいポリヌクレオチドは、配列番号３または４の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、単離されたポリヌクレオチドである。より好ましいものは、配列番号３または４の全配列の全体に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドであり、そしてさらに好ましいものは、少なくとも９５％、好ましくは９９％の同一性を有するものであり、最も好ましくは１００％の同一性を有するものである。
【００４９】
このようなポリヌクレオチドとしては、配列番号３および／または４に表される核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１および／または２に表されるような配列を伴うポリペプチドをコード化したポリヌクレオチドは、配列番号３および／または４に表されるような核酸配列を含んでいてもよい。本発明のさらに好ましい実施態様においては、ポリヌクレオチドは配列番号３および／または４に表されるような核酸配列から成るものである。
【００５０】
配列番号３に表されるヌクレオチド配列と９９％を超えるホモロジーを示すポリヌクレオチドの例は、配列番号６および８に表される配列であり、それぞれアヒルおよびシチメンチョウのｐ４０についてのコーディング配列である。
【００５１】
本発明によるところのポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、好ましくはＤＮＡである。本発明によるところのＤＮＡをｃＤＮＡから得てもよい。あるいは、コーディング配列はゲノムＤＮＡでもよいかもしれず、またはＤＮＡ合成技術を用いて調製してもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、一本鎖の形態でも二本鎖の形態でもよい。一本鎖としては、コーディング鎖でも非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。
【００５２】
ポリヌクレオチドの定義の範囲には、改変されたＲＮＡまたはＤＮＡも包含される。核酸における塩基の改変を行ってもよく、イノシンなどの塩基を組み込んでもよい。その他の改変には、たとえば、バックボーンの改変が包含されてもよい。
【００５３】
「単離された」とは、ポリヌクレオチドが自然の状態から分離された、すなわちその自然環境から変化を受けたもしくは移動した、またはその両方という意味である。この分子は、この分子が現実に見い出される生物体の全体から分離され不連続となる。
【００５４】
「同一性％」とは、二以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係であって、それらの揃えられた配列間の比較に基づくものであると定義される。
【００５５】
公知の方法によって、同一性を計算することができる。同一性、またはホモロジー、本明細書で記載されるパーセントは、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．、マジソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）の下で実行されるＧＡＰプログラムを利用して計算可能なものである。
【００５６】
ポリペプチド配列を比較することについてのパラメータとしては、次のもの：アルゴリズム：ニードルマンおよびブンシュ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９７０，  ４８：  ４４３−４５３が挙げられる。
【００５７】
アミノ酸のアラインメントについての比較マトリックスとして、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列を用いた（ヘニコフおよびヘニコフ、上掲）次のパラメータを利用する：
ギャップペナルティー：８
ギャップ長ペナルティー：２
末端のギャップについてのペナルティーはなし。
【００５８】
用いてもよいヌクレオチド比較についてのパラメータ：
アルゴリズム：ニードルマンおよびブンシュ（上掲）。
【００５９】
比較マトリクス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０。
【００６０】
ギャップペナルティー：５０。
【００６１】
ギャップ長ペナルティー：３。
【００６２】
本発明によるところのＤＮＡは、インビボまたはインビトロで、コード化されたポリペプチドを十分な量、実質的に純粋な形態で発現させることにとって非常に有用となる。本発明によるところのポリヌクレオチドをコード化されたポリペプチドの発現に用いる場合、ポリヌクレオチドには、ポリペプチドまたはその機能的断片についてのコーディング配列に加えて、その他のコーディング配列−−たとえばリーダー配列またはマーカー配列などの融合部分−−が含まれてもよい。
【００６３】
ｐ４０に基づく複合性サイトカイン−−たとえば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３および（ｐ４０）２など−−を適用することによって、細胞性免疫および体液性免疫の両方に基づいた、微生物により誘導される進行中の免疫応答またはワクチンにより誘導される免疫応答を増強させることができるかもしれない。さらに、たとえば（ｐ４０）２の拮抗的な投与を利用しての、これらのサイトカインによって引き起こされる免疫学的カスケードにおける介入によって、ｐ４０に基づく分子の過剰産生が解除された後の不必要な病理学的免疫反応を防ぐことができるかもしれない。
【００６４】
本発明によるところの組み換え型タンパク質の産生に、本発明によるところのポリヌクレオチドを用いてもよい。たとえば鳥類の病原体に由来する免疫原性のタンパク質をコード化したその他の核酸配列と一緒に、ポリヌクレオチドを、ＤＮＡワクチンまたはベクターワクチンに用いてもよい。
【００６５】
本発明によるところのポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで、コード化されたポリペプチドを十分な量、実質的に純粋な形態で発現させることにとって非常に有用となる。本発明によるところのポリヌクレオチドを、コード化されたポリペプチドの発現に用いる場合、ポリヌクレオチドには、ポリペプチドまたはその機能的断片についてのコーディング配列に加えて、その他のコーディング配列−−たとえばリーダー配列またはマーカー配列などの融合部分−−が含まれてもよい。
【００６６】
多種多様の宿主細胞とクローン化媒体との組み合わせは、本発明によるところの核酸配列をクローニングに用いることにとって有用となる。本発明によるところのポリヌクレオチドを、適切な発現系−−たとえば細菌性の発現系（大腸菌ＤＨ５αなど）、ウイルス性の発現系（バキュロウイルスなど）、酵母の系（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ）または真核細胞（たとえば、Ｃｏｓ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＤ−１１細胞、ＤＴ４０細胞またはＣＥＦ細胞）−−内にクローン化してもよい。すべての系において、適切な構成的プロモータまたは誘導性プロモータのコントロール下にある適切なベクター内に、ポリヌクレオチドが最初にクローン化される。
【００６７】
従って、別の側面において、本発明は、本発明によるところのポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。適切なベクターは、たとえば、コスミド、細菌または酵母のプラスミド、宿主の範囲が広いプラスミドおよびプラスミドとファージすなわちウイルスＤＮＡとの組み合わせから得られるベクターである。染色体ＤＮＡから得られるベクターも含まれる。さらに、複製起点および／または優性な選択マーカーを本発明によるところのベクターに含むことができる。本発明によるところのベクターは、宿主細胞を形質転換することに適している。適切なクローニングベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＥＭＢＬおよびブルースクリプトプラスミドなどのプラスミドベクター、またはＨＶＴ（シチメンチョウのヘルペスウイルス）、ＭＤＶ（マレック病ウイルス）、ＩＬＴ（伝染性喉頭気管炎ウイルス）、ＦＡＶ（トリアデノウイルス）、ＦＰＶ（鶏痘ウイルス）、またはＮＤＶ（ニューカッスル病ウイルス）などのウイルスベクターである。
【００６８】
ポリペプチドまたはその機能的断片の発現に用いる場合、本願発明の組み換えベクターは、タンパク質をコード化した核酸配列に機能できるように結合した発現制御配列をさらに含んでもよい。
【００６９】
「機能できるように結合する」とは、ポリヌクレオチドが発現する際に、それらの通常の機能が発揮するように、コントロール配列が構成されている配置を意味する。
【００７０】
このような発現コントロール配列は一般的に、プロモータ配列と転写および翻訳を制御する配列および／または発現レベルを向上させる配列を含む。所望のポリヌクレオチドを転写し翻訳することができる限り、これらのコントロール配列のすべてが組み換えベクター内に存在する必要はない。当然のことながら、発現コントロール配列およびその他の配列は、選択された宿主細胞に応じて変化してもよく、または誘導できるものになり得る。このような発現コントロール配列は、当技術分野において周知であり、そして遺伝子転写を方向付けることが可能な、任意の真核生物の、原核生物の、もしくはウイルスのプロモータまたはポリＡシグナルにまで及ぶ。有用なプロモータの例としては、ＳＶ−４０プロモータ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８３，  ２２２：  ５２４−５２７）、メタロチオネインプロモータ（Ｎａｔｕｒｅ  １９８２，  ２９６：  ３９−４２）、熱ショックプロモータ（ベルミー（Ｖｏｅｌｌｍｙ）ら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  １９８５，  ８２：  ４９４９−４９５３）、ＰＲＶ  ｇＸプロモータ（メッテンライターおよびロー（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｕｈ）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９０，  ３０：  ５５−６６）、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモータ（米国特許第５，１６８，０６２号）、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモータ（ゴールマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  １９８２，  ７９：  ６７７７−６７８１）またはヒトの伸長因子１αもしくはユビキチンプロモータなどがある。
【００７１】
ポリヌクレオチドが適切なベクター内にクローン化された後、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２形質移入またはリポフェクチンなどの適切な方法を利用して、この構築物を細胞、細菌、または酵母内に単独で導入してもよい。バキュロウイルス発現系を用いる場合、ポリヌクレオチドを含むトランスファーベクターをバキュロの完全なゲノムと一緒に形質移入してもよい。
【００７２】
これらの技術のすべては当技術分野において周知であり、そして分子生物学の材料を製造することによって与えられたプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、および／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなど）に、および文献または参照する教科書に広範囲に記載されている。たとえば、ロドリゲス・アール・エルおよびディー・ティー・デンハルト（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｄ．  Ｔ．  Ｄｅｎｈａｒｄｔ）編、「ベクター：分子クローニングベクターの概説およびそれらの使用（Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ）」、バターワース、１９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編集：エフ・エム・オースベル  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｗｉｌｅｙ  Ｎ．  Ｙ．，  １９９５；分子クローニング：実験室の手引き、上掲；ならびにＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｖｏｌ．  １−４、第二版、１９９５、編集：グローバーおよびヘイムズ（Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ）、  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓがある。
【００７３】
本発明によるところのポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換された細胞は、同様に本発明の一部である。従って、別の側面においては、本発明は、発現した組み換え型ポリペプチドをコード化する、本発明によるところのポリヌクレオチドを含む細胞を特徴とする、組み換え型ポリペプチドを発現することができる細胞を提供する。
【００７４】
この文脈において、「組み換え型」という用語は、自然状態の細胞内では発現することのないポリペプチドを意味する。従って、本発明によるところのＤＮＡまたは発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の範囲内にある。作り出された宿主細胞を、たとえば、適切な選択、増幅または転写の誘導などのために改変することができる従来からの栄養素の培地内で培養することができる。温度、ｐＨ、栄養素などの培養条件は、当業者にとって周知である。
【００７５】
本発明によるところのベクターを用いて形質転換される細胞は、原核生物起源でも真核生物起源でもよく、好ましくは真核生物起源の細胞である。本発明によるところの真核細胞は、鳥類起源でもよく、非鳥類起源でもよい。非鳥類起源の細胞としては、たとえば、ＢＨＫ細胞、昆虫の細胞、ＨｅＬａ細胞またはＣＯＳ細胞である。好ましい細胞は鳥類の細胞であり、たとえばＣＥＦ細胞、ＨＤ−１１細胞またはＤＴ−４０細胞である。
【００７６】
本発明によるところの形質転換細胞には、ゲノム物質内に安定的に組み込まれた本発明によるところのポリヌクレオチド、または自己複製性ベクターの一部としてのそのポリヌクレオチドが含まれてもよい。
【００７７】
本発明によるところの細胞を数多く含む細胞培養は、同様に本発明の一部である。本発明によるところの細胞を用いて、ポリペプチドサブユニットまたは完全なタンパク質を発現させることができ、そして細胞培養物からその細胞を単離することができる。
【００７８】
ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットのそれぞれをコード化するヌクレオチド配列のクローニングによって、その他のサイトカインを含まない、純粋なタンパク質の産生が可能となる。このことは特に、本発明のタンパク質に特異的な抗体の産生に有用である。一般的に利用できる技術を介して、これらの特異的抗体を作製することができる。好ましい特異的抗体は、モノクローナル抗体である。従って、本発明では、ｐ４０サブユニットおよび／またはｐ３５サブユニットに特異的な抗体、またはニワトリのＩＬ−１２に特異的な抗体をさらに提供する。本発明によるところの抗体は、診断における使用またはたとえば、粗調製物から鳥類であるニワトリのＩＬ−１２などのタンパク質の単離や精製に適している。さらに、抗体を用いて、インビトロで産生するタンパク質の定量分析のためのアッセイ法、またはインビボのタンパク質レベルを定量測定するためのアッセイ法を開発することができる。
【００７９】
既述のように、本発明によるところのタンパク質およびポリヌクレオチドは、鳥類のワクチンに対する免疫応答を高めることに特に有用である（すなわち、これらをアジュバントとして、またはアジュバント内で用いてもよい）。
【００８０】
伝染病に対するワクチン接種によって、病原体による感染に関連する臨床症状を限定するような免疫応答を惹起することを目指している。誘発される免疫反応の正確なタイプが重要である。というのは、活性化することができる免疫メカニズムの多数のタイプは、特定の病原体をコントロールすることには適さないからである。ワクチン抗原に対する応答性が小さいことは、アジュバントと一緒に抗原を投与することによって克服することができる。アジュバントとは、抗原に対する免疫応答性を高めることに寄与する、抗原以外のワクチン製剤の成分として定義され、たとえば、アルミニウム塩、油のエマルジョン、ムラミルペプチドの誘導体、モノホスホリル脂質Ａ、リポソーム、ＱＳ２１（商標）、ＭＦ−５９（商標）、Ｉｓｃｏｍｓ（商標）などがある。
【００８１】
ワクチン接種後に活性化した細胞メカニズムおよび分子メカニズムは、ワクチン抗原と一緒に投与されるアジュバントの選択に強い影響を受ける。従って、最良の効果を提供する際に、アジュバントの選択は、ワクチン抗原自体の選択と同程度に重要である。
【００８２】
本発明によるところのタンパク質、とりわけニワトリのＩＬ−１２は、ワクチンに対する対象の免疫応答に及ぼす潜在的なアジュバントの効果を持っていてもよい。したがって、別の実施態様においては、本発明は、アジュバントとして有効な量の、本発明によるところのタンパク質、とりわけニワトリのＩＬ−１２を含有するアジュバント組成物を提供する。ワクチン製剤と一緒に、またはそれと連続して、アジュバント組成物を投与することができる。
【００８３】
本発明によるところの（単数または複数の）タンパク質を、ワクチン製剤中に含ませることができる。従って、別の実施態様においては、本発明は、少なくとも一種の活性物質、アジュバントとして有効な量の本発明によるところのタンパク質、好ましくはニワトリのＩＬ−１２、および医薬適合性の担体または賦形剤を含むワクチンを提供する。
【００８４】
本発明によるところのタンパク質を、（単数または複数の）ｐ４０サブユニットおよび／またはｐ３５サブユニットの全体、またはその断片を含む分子とすることができる。ただし、当該断片はサイトカインとして作用する能力を保持するものとする（たとえば、ワクチン内で用いた場合に、そのアジュバント能を保持していること）。
【００８５】
本発明によるところのアジュバント組成物は、本発明によるところのタンパク質、好ましくはニワトリのＩＬ−１２、および医薬適合性の担体を含有する。適切な製薬用の担体としては、水、生理食塩水などである。さらに、アジュバント組成物は、油のエマルジョン、アルミニウム塩、ムラミルジペプチドの誘導体、モノホスホリル脂質Ａ、リポソーム、ＱＳ２１（商標）、ＭＦ−５９（商標）、Ｉｓｃｏｍｓ（商標）などの一種以上のその他のアジュバントを含有していてもよい。本発明によるところのタンパク質を、その他のサイトカインと組み合わせて用いてもよい。
【００８６】
あるいは、本発明によるところのアジュバント組成物は、本発明によるところのタンパク質を発現させる能力を有するＤＮＡプラスミドを含有してもよい。当該ＤＮＡプラスミドは、転写制御配列に機能できるように結合した、本発明によるところのタンパク質、好ましくはニワトリのＩＬ−１２をコード化したＤＮＡ配列を含む。本発明によるところのタンパク質と組み合わせて用いられる、その他のサイトカインをコード化したヌクレオチド配列は、同一のＤＮＡプラスミド上に、または別個のプラスミド上に存在することができる。このようなＤＮＡアジュバント組成物を対象に投与した時点で、宿主細胞はそれを取り込み、そして接種されたＤＮＡ上のコード化された遺伝子を発現させる。その結果、本発明によるところのタンパク質、たとえばニワトリのＩＬ−１２をインビボで発現させる。
【００８７】
本発明によるところのワクチンは、少なくとも一種の活性物質とアジュバントとして有効な量、すなわちワクチン接種を受けた対象が、当該タンパク質を含まないワクチンと比較してより高められた免疫応答を生じさせる量の本発明によるところのタンパク質を含む。
【００８８】
本発明によるところのアジュバント組成物またはワクチンに要求される有効量は、用いる活性物質のタイプ、免疫化対象の病原体のタイプ、ならびにワクチン接種を受ける対象のタイプに左右される。有効量の決定は、熟練者の通常の技量の範囲内のことであろうし、そして一般的に０．００１から５００μｇ／投与の量となる。好ましい量は０．０１から５０μｇ／投与であり、より好ましくは０．１から５μｇ／投与である。
【００８９】
本発明によるところのワクチンに用いるための活性物質は、ウイルス起源、細菌起源または寄生生物起源であり得る。活性物質としては、病気を引き起こす病原体全体でもよく、または当該病原体から得られる成分からなるものでもよい。結果的に、活性物質は病原体全体であり、当該病原体は生きている病原体でもよく、または不活性化された病原体でもよい。生きている病原体は、当該病原体の弱毒化されたものか、または天然の穏やかな株のいずれかであると考えられる。不活性化された病原体は、化学的手段または物理的手段によって死滅した病原体であり、すなわち、不活性化されたまたは「死滅した」病原体はもはや複製する能力を持たない。化学的な不活性化のための適切な手段は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミンおよび誘導体などである。物理的な不活性化のための適切な手段は、ＵＶ照射、γ線照射、「熱ショック」、Ｘ線照射などである。あるいは、活性物質は、当該病気を引き起こす病原体、たとえば、精製タンパク質、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、リポ多糖類などから得られる一以上の成分から構成されてもよい。
【００９０】
活性物質としては、病原体または当該病原体から得られる選択された成分をインビボで発現させることができるＤＮＡプラスミドでもよい。さらに、ワクチンは、本発明によるところのタンパク質をインビボで発現させる能力を持つＤＮＡプラスミドを含んでもよい。当該タンパク質アジュバントをコード化したＤＮＡおよび当該病原体または選択された成分をコード化したＤＮＡは、一つの同一のプラスミド上に存在してもよく、または別個のプラスミドに存在してもよい。ＤＮＡワクチンを対象に投与した時点で、宿主細胞はそれを取り込み、そして当該活性物質ならびに本発明によるところの当該タンパク質をインビボで発現させることになる。ＤＮＡワクチンとしては、たとえば、米国特許第５，５８０，８５９号に記載されたものがある。
【００９１】
本発明によるところのアジュバント組成物またはワクチン組成物を製剤化するために用いることができる、医薬適合性の担体または賦形剤は無菌のものであって、生理学的に適合性を有するものであり、たとえば、水性の緩衝液、食塩水などがある。さらに、安定剤、防腐剤などをこれらの組成物に添加してもよい。
【００９２】
本発明の組成物は、経口投与または非経口投与に適した任意の形態を取ることができる。経口用途のためには、本発明によるところのアジュバント組成物またはワクチン組成物を、溶液、シロップ、懸濁液、錠剤、カプセルなどとして製剤化すればよい。非経口用途のためには、本発明によるところの組成物を懸濁液、溶液、分散液、エマルジョンなどの注射に適した形態に製剤化すればよい。当業者が日常的に使う手段によって、本発明によるところの組成物を調製する。
【００９３】
好ましい投与経路としては、筋肉注射、静脈注射、皮内注射、皮下注射などの非経口経路、および点鼻剤、目薬、（エアゾール）スプレーなどの粘膜経路である。
【００９４】
次の実施例は、本発明を当該実施例に限定することなく本発明を例証する。
【００９５】
（実施例）
すべての実施例についての材料および方法。
【００９６】
細胞培養とＬＰＳ処理。
【００９７】
ニワトリのセルラインＨＤ−１１（マクロファージ起源）およびＤＴ−４０（Ｂ−細胞起源）を、それぞれ、（１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリン、２ｍＭのグルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸塩を追加した）ＲＰＭＩ中で、ならびに（８％のウシ胎仔血清、２％のニワトリ血清、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１ｍＭのピルビン酸塩を追加した）ＤＭＥＭ中で、細胞懸濁物として培養した。リポ多糖類（ＬＰＳ）処理としては、５μｇ／ｍＬのＬＰＳで５時間、細胞のインキュベーションをすることが挙げられた。この処理の後、細胞をリン酸緩衝化食塩水で２回洗浄し、次いでＲＮＡを単離するために用いたり、または−７０℃で保存した。５％のＣＯ２で３７℃にて、加湿雰囲気で細胞を維持した。
【００９８】
哺乳動物のセルラインＣＯＳ−７（アフリカミドリザルの腎細胞）を、（１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１ｍＭのピルビン酸塩を追加した）ＤＭＥＭ中で培養した。
【００９９】
ニワトリ、アヒルおよびシチメンチョウの臓器とＬＰＳ処理。
【０１００】
三週齢の通常の白色レグホーン特異的病原体が無い（ＳＰＦ）ニワトリを、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ動物施設から入手し、そしてＳＰＦ条件下で収容した。動物には自由に水と食物を与えた。
【０１０１】
分離したてのニワトリ、アヒルまたはシチメンチョウの臓器−−すなわち脾臓および腎臓−−を、篩とハンクス緩衝液を用いてすりつぶした。室温で、１５００ｒｐｍで３分間かけて細胞をペレット化し、そして同じやり方で２回洗浄した。続いて、アヒルおよびシチメンチョウの細胞を用いてＲＮＡを単離した。１０％のニワトリ血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００単位／ｍＬのペニシリンを追加したＲＰＭＩでニワトリの細胞を再懸濁し、そして１６時間培養した。いくらかの細胞を、５μｇ／ｍＬのＬＰＳで５時間インキュベーションした。処理後、細胞をリン酸緩衝化食塩水で２回洗浄し、続けてＲＮＡの単離に用いたり、または−７０℃で保存した。５％のＣＯ２で４１℃にて、加湿雰囲気で細胞を維持した。
【０１０２】
ＲＮＡの単離。
【０１０３】
製造メーカーによって記載されたＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。１％のアガロースゲル上でＲＮＡの品質をチェックした。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲ反応、ＰＣＲ反応および配列の反応。
【０１０５】
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（商標）のプロトコール（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。新たに作製されたこのｃＤＮＡを、次にＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。このために、１μＬのＲＴ−ｃＤＮＡ反応（１０から２０ｎｇのプラスミドｃＤＮＡのテンプレート）を、０．５μＬの１単位／μＬのＳｕｐｅｒｔａｑ（商標）（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）、１μＬの１０ｎｇ／μＬの各プライマー、１．６μＬの２ｍＭのｄＮＴＰｓ、および２μＬの１０×ＳＴ  ＰＣＲ緩衝液（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）と混合し、最終的な量を２０μＬとした。反応サイクルの条件は、９４℃で２分間、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル、次いで最後の延長のために７２℃で２分間というものであった。Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＤｒｉｖｅ（商標）ベクター（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ，  Ｑｉａｇｅｎ）内またはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。
【０１０６】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。１０ｎｇのプラスミドのテンプレートを用いる一般的なＰＣＲ反応のために、上記と同じサイクルの条件を用いた。
【０１０７】
ＤＮＡ配列決定キット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５’および３’方向の両者におけるすべてのクローンの配列を広範囲に決定した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）４．０ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて配列を分析した。
【０１０８】
配列分析。
【０１０９】
配列分析としては、Ｂｌａｓｔ検索（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、シュワーベンハイム、ドイツからの国際的なサーバーを介するＩｎｔｅｒＢＬＡＳＴ）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）１０．２版（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ；ＧＣＧ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）４．０（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＯＭＩＧＡ（商標）２．０（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ．）およびＧｅｎｅＤｏｃ（商標）２．６（ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ）の利用が含まれた。
【０１１０】
ニワトリ（Ｃｈ）のＩＬ−１２  ｐ３５、ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０、ＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２およびネコ（Ｆｅ）のＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２の真核細胞発現構築物
ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５。全長ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５（クローンｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１）−−もともとはｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（チルナガル・ブイジー（Ｔｉｒｕｎａｇａｒｕ，  ＶＧ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０００，  ６６：  １４４）にクローン化されていたもの−−を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてｐｃＤＮＡ３から切り出し、そして真核細胞性発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する制限部位内にクローン化した。ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩのＣｈＩＬ−１２  ｐ３５断片も、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する制限部位内にクローン化して、アンチセンスのコントロール構築物を得た。
【０１１１】
ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０。ワクチン接種されたニワトリから単離された、プールされたＴ細胞およびＢ細胞から構築したｃＤＮＡライブラリーに存在し、そしてｐＤｒｉｖｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）内に再クローン化された全長ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０を、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＤｒｉｖｅから切り出し、そして真核細胞性発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する制限部位内にクローン化した。
【０１１２】
ＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２。マクモナグル（ＭｃＭｏｎａｇｌｅ）らによって記載された計画（Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ．  Ｊ．  ２００１，  ３３：  ６９３）によって、一本鎖のニワトリのＩＬ−１２分子を作製した。
【０１１３】
次のプライマーを用いて、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（上掲）からのＳＰＳｃａｎプログラムによって決定された、推定される３５アミノ酸のシグナルペプチド配列が伴わないＣｈＩＬ−１２  ｐ３５を増幅し、５’−ＢａｍＨＩの制限部位および３’−ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位に導入した：
【０１１４】
【化１】
2006507805.tif 000003
【０１１５】
ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０について、次のプライマーを用いて５’−ＮｏｔＩの制限部位および３’−ＢａｍＨＩの制限部位に導入した：
【０１１６】
【化２】
2006507805.tif 000004
【０１１７】
両方のＰＣＲ断片を別々にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化し、そして広範囲に配列を決定した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯから、ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片としてＣｈＩＬ−１２  ｐ４０を切り出し、そしてｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する制限部位内にクローン化した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯから、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてＣｈＩＬ−１２  ｐ３５を切り出し、そして［ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０］−［ｐｃＤＮＡ３．１（−）］構築物のｐ４０断片の下流の、対応する制限部位内にクローン化した。このことから、一本鎖のｐ４０−ｐ３５ヘテロ二量体構築物が生じる結果となった。この構築物の中では、ｐ４０鎖が、インフレームの状態にある（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−リンカーによって、ｐ３５鎖と結合していた；この分子をＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２と表した。
【０１１８】
ＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２。ネコのＩＬ−１２を、真核細胞性ｐＣｌ−ｎｅｏ（商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）（エル・ニコルソン博士（Ｄｒ．  Ｌ．  Ｎｉｃｏｌｓｏｎ）、グラスゴー大学獣医学スクール、英国）内にクローン化し、ＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２に類似の構築物を産生させた。
【０１１９】
ＣＯＳ−７細胞におけるｃＤＮＡクローンの一時的な発現
（製造メーカーによって記載されたように）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬を用いて、１．５μｇのそれぞれのｃＤＮＡ構築物でＣＯＳ−７細胞を形質移入し、そして（ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含まない）ＤＭＥＭと共に３ｃｍの皿の中で培養した。８時間後、形質移入された細胞を洗浄し、そしてペニシリン／ストレプトマイシンと１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した。３７℃／５％のＣＯ２で７２時間のインキュベーションの後、細胞培養の上清を集め、そして４℃にて１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離処理に付して、細胞の残骸を除去した。この上清を、ウェスタンブロットを介して分析し、そして直ちに用いるか、または−７０℃で保存した。
【０１２０】
ウェスタンブロット分析
形質移入されたＣＯＳ−７細胞からの細胞培養の上清を、４から１２％のＮｕ−ＰＡＧＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサイズ分画し、そしてニトロセルロースフィルタ上にブロットした（シュライヒャーおよびシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ））。ＰＢＳ中の３％のスキムミルク（ＭＰＢＳ）でウェスタンブロットをブロックし、続いて、ＭＰＢＳで１：３００に希釈したＦｅＩＬ−１２  ｐ４０ペプチドによって惹起されたポリクローナル抗体と共にインキュベーションを行った。ブロッキングおよび抗体のインキュベーションをそれぞれ１時間、室温で行った。十二分に洗浄（５分間を３回）した後、ＭＰＢＳで１：１０００に希釈したアルカリペルオキシダーゼ（ＡＰ）結合ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｂｉｏ）と共に、ブロットのインキュベーションを１時間室温で行った。洗浄（５分間を３回）後、結合したＡＰ標識化二次抗体を染色して可視化した。
【０１２１】
ニワトリ（Ｃｈ）のＩＬ−１２についての生物活性のアッセイ
ＣｈＩＬ−１２による脾臓のＣｈＩＦＮ−γの誘導についてのＮＯアッセイ。単離したてのニワトリの脾臓細胞を、１００μＬ中に０．５×１０６細胞／ウェルの密度にて、９６ウェルプレート内に三組播種し、そして、ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０、ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５が混合したＣｈＩＬ−１２  ｐ４０、ＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２、ＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２をコード化したｃＤＮＡクローンを形質移入したＣＯＳ−７細胞からの、または空のｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（ｍｏｃｋ）を形質移入したその細胞からの細胞培養の上清の５０μＬの一連の希釈物と共に、インキュベーションを行った。タンパク質を添加してから４８時間後に、上清（７５μＬ）を集め、そして生物活性を持つＣｈＩＦＮ−γの存在について分析した。このために、７５μＬの集めた上清と共に、１００μＬの１．５×１０６／ｍＬのＨＤ−１１細胞のインキュベーションを、３７℃で２４時間／５％のＣＯ２にて、９６ウェルプレート内で行った。グリースアッセイ法（ディング・エイエイチ（Ｄｉｎｇ，  ＡＨ）ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８８，  １４１：  ２４０７；スチュア・ディージェイおよびシーエフ・ナータン（Ｓｔｕｅｈｒ，  ＤＪ，  ａｎｄ  ＣＦ  Ｎａｔｈａｎ）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８９，  １６９：  １５４３）を利用して、ＣｈＩＦＮ−γによるＨＤ−１１細胞の活性化を培地上清中の亜硝酸塩の蓄積量の関数として測定した。
【０１２２】
ＣｈＩＬ−１２による脾臓細胞の増殖についてのアッセイ。７５μＬの上清（ＣｈＩＬ−１２による脾臓のＣｈＩＦＮ−γの誘導についてのＮＯアッセイの項を参照すること）を取り除いた後、５０μＬの培地および１８．５ｋＢｑのメチル−３Ｈ−チミジン（ウェルあたり２５μＬ）を、９６ウェルプレート中の残りの７５μＬに添加した。そして１８から２０時間、４１℃／５％のＣＯ２にてインキュベーションを行った。インキュベーションの後、ＬＫＢ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）βカウンターを用いて、組み込まれた放射能を計数した。
【０１２３】
統計分析
ＮＯ産生の平均間の違いの有意性、または細胞の増殖の平均間の有意性を、スチューデントのｔ−検定を利用して分析した。信頼性のレベルが９５％（Ｐ＜０．０５）なので、違いは有意であるとみなされた。
【実施例１】
【０１２４】
ニワトリのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニット（ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５）をコード化したクローンｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１の単離および配列分析
Ｃｏｎ  Ａで刺激されたニワトリのＴ細胞ｃＤＮＡライブラリー（チルナガルら、上掲）の高処理能力の配列決定プロジェクトから単離されたｃＤＮＡクローンｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１（図１を参照すること）のオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１〜６１８）の分析から、ヒトのＩＬ−１２  ｐ３５のｃＤＮＡ配列（全体のホモロジーが４３％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ６５２７１）、ヒツジの配列（全体のホモロジーが４５％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＡＦ１７３５５７）、ウマの配列（全体のホモロジーが４８％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ１１１３０）、ネコの配列（全体のホモロジーが４３％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ０７７６１）、ウシの配列（全体のホモロジーが４５％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＵ１４４１６）、マウスの配列（全体のホモロジーが４２％；ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ８６６７２）およびマーモットの配列（全体のホモロジーが４５％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＸ９７０１８９）に対する相同性が示された（図２を参照すること）。ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのＩＬ−１２  ｐ３５タンパク質に対する、ｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１をコード化するＣｈＩＬ−１２  ｐ３５タンパク質の複数のアラインメントから、それぞれ２７％、２５％、３０％、２４％、２５％、２９％および２１％というアミノ酸の全体のホモロジーが与えられる（図３を参照すること）。ｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１の最初の６４ａａ（１〜６４残基）を除去した場合、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのＩＬ−１２  ｐ３５タンパク質に対するホモロジーは、それぞれ３３％、３２％、３７％、２５％、３２％、３４％および２８％に向上し（図４を参照すること）、このことは、ｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１のＮ末端の断片の保存性がタンパク質の残りの部分ほど高くないことを示唆する。これらの配列のホモロジーに基づいて、本発明者らはクローンｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１はニワトリのＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットをコード化していると結論付ける。
【実施例２】
【０１２５】
ニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニット（ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０）をコード化しているクローンｐＮＤ８９の単離。
【０１２６】
マウスのインターロイキン１２  ｐ４０サブユニット（ＭｕＩＬ−１２  ｐ４０；ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８６６７１）のコーディング配列−−すなわちヌクレオチド３５〜１０４２−−を用いて、ｔＢｌａｓｔＸプログラムを利用して、ＵＭＩＳＴ／Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ／ＤｕｎｄｅｅニワトリＥＳＴ貯蔵データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｃｋ．ｕｍｉｓｔ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｈｉｃｋｅｎ＿ｄａｔａｂａｓｅ．ｃｇｉ）を検索した。ニワトリのＥＳＴ配列（クローンＩＤ：ＣｈＥＳＴ５８２ｐ２；ＥＳＴ名６０３６０３７０８Ｆ１；成熟した腎臓に由来するもの）を検索したところ、ＭｕＩＬ−１２  ｐ４０の配列のａａ  ２５１〜２７９と５１％の同一性、およびａａ  ３１０〜３２７と６６％の同一性が示された。このＣｈＥＳＴ５８２ｐ２クローンに対するＧｅｎｂａｎｋ登録番号は指定されておらず、そしてこのニワトリＥＳＴデータベースの所有者による、ＩＬ−１２の方向を指摘する注釈はなされていなかった。同一のニワトリＥＳＴデータベースにおいてこのＣｈＥＳＴ５８２ｐ２クローンを利用してデータベース検索を行った結果、より長いまたは全長クローンには至らなかった。Ｕ．  Ｄ．  Ｃｈｉｃｋ  ＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｃｋｅｓｔ．ｕｄｅｌ．ｅｄｕ／）において、ＭｕＩＬ−１２  ｐ４０（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８６６７１）のコーディング配列−−すなわちヌクレオチド３５〜１０４２−−を利用して同様のデータベース検索を行った結果、ＢｌａｓｔＮプログラムを用いての有効なヒットも得られず、ＣｈＥＳＴ５８２ｐ２クローンを利用した検索結果もより長いまたは全長クローンには至らなかった。
【０１２７】
特定されたＣｈＥＳＴ５８２ｐ２クローンは８４８ヌクレオチドの長さのものであり、このうちのヌクレオチド３〜２３３（このものは終止コドンを含む）は７６  ａａの長さのポリペプチドをコード化する（図５を参照すること）。推定されるＣｈＥＳＴ５８２ｐ２タンパク質の配列の複数のアラインメントから、ＭｕＩＬ−１２  ｐ４０の最もＣ末端側の部分（全体のホモロジーが３５％；ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ８６６７１）に対して、ならびにヒト（全体のホモロジーが４３％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ６５２７２）、ヒツジ（全体のホモロジーが４３％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＡＦ００４０２４）、ウマ（全体のホモロジーが４３％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ１１１２９）、ネコ（全体のホモロジーが４３％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ０７７６２）、ウシ（全体のホモロジーが４２％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＵ１１８１５）およびマーモット（全体のホモロジーが５１％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＸ９７０１９）を含めたその他のいくつかの種のＩＬ−１２  ｐ４０のＣ末端側の部分に対して、それが揃ったことが示された（図６を参照すること）。
【０１２８】
これらの高いホモロジーから、ＣｈＥＳＴ５８２ｐ２クローンがニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのＣ末端部分をコード化していることが分かる。
【０１２９】
ニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０タンパク質のサブユニット（ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０）の全長をクローン化するために、三種の研究方法を用いた。
【０１３０】
第一の研究方法においては、ヒト（ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ６５２７２）、アカシカ（ｒｅｄｄｅａｒ）（ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＵ５７７５２）、ウマ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ１１１２９）、ヒツジ（ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＡＦ００４０２４）、マウス（ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ８６６７１）およびマーモット（ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＸ９７０１９）の５’末端に基づいて、３種の縮重プライマー：
【０１３１】
【化３】
2006507805.tif 000005
および１種の特異的５’末端プライマー
【０１３２】
【化４】
2006507805.tif 000006
を設計した（図７を参照すること）。３’−ＣｈＥＳＴｐ５８２ｐ２プライマー
【０１３３】
【化５】
2006507805.tif 000007
（図５の２３３から２００位のヌクレオチドに相補的なもの）と組み合わせて、５μｇ／ｍＬのリポ多糖類（ＬＰＳ）で処理したまたは処理しなかったニワトリのＨＤ−１１（マクロファージ）細胞、ニワトリのＤＴ−４０（Ｂ）細胞、ニワトリの腎細胞およびニワトリの脾臓細胞から単離された全ＲＮＡに関して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。驚くべきことに、プライマーのどの組み合わせからも、ＰＣＲ産物が生じなかった。コントロールとして、５’末端ＣｈＥＳＴｐ５８２ｐ２プライマー
【０１３４】
【化６】
2006507805.tif 000008
（図５の１２から４１位のヌクレオチド）および３’末端ＣｈＥＳＴｐ５８２ｐ２プライマー（配列番号１７、上掲）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応を同時に実施した。このプライマーの組み合わせの結果、約２００ヌクレオチドのＰＣＲ断片を得た。これらの結果は、縮重プライマーを特異的な３’末端プライマーと組み合わせて、ヒト、アカシカ、ウマ、マウスまたはマーモットからの５’末端のＩＬ−１２  ｐ４０配列に基づくＲＴ−ＰＣＲ手法を利用することによって、ニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０の全長の分子を得ることは不可能であることを示唆する。
【０１３５】
第二の研究方法においては、本発明者らは、５μｇ／ｍＬのＬＰＳによって５時間刺激されたニワトリのＨＤ−１１（マクロファージ）細胞から構築されたＨＤ−１１のｃＤＮＡライブラリーから単離された、プラスミドのプールを用いた（シック・シー、シュナイダー・ケイ、スターヘリ・ピー、ワイニング・ケイシー（Ｓｉｃｋ  Ｃ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｋ，  Ｓｔａｅｈｅｌｉ  Ｐ，  Ｗｅｉｎｉｎｇ  ＫＣ）、ニワトリの新規ＣＸＣケモカインおよびＣＣケモカイン（Ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＣＸＣ  ａｎｄ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０００，  １２：  １８１−１８６）。このライブラリーにおいては、ｃＤＮＡ分子は、真核細胞性の発現ベクターｐｃＤＮＡ１のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間で一方向にクローン化されている。ｐｃＤＮＡ１ベクターの、ＥｃｏＲＩの制限部位の１１６  ｎｔ上流の５’末端プライマー
【０１３６】
【化７】
2006507805.tif 000009
（ベクターｐｃＤＮＡ１の２９１８から２９５１位のヌクレオチド）と、３’ＣｈＥＳＴ５８２ｐ２プライマー（配列番号１７、上掲）とのＰＣＲ反応においては、ｐＤｒｉｖｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）内にクローン化された約１０００ヌクレオチドのＰＣＲ断片を得た。
【０１３７】
第三の研究方法においては、本発明者らは、Ｔ細胞およびＢ細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーから単離されたプラスミドのプールを用いた。ここで、これらの細胞は、ワクチン接種されたニワトリから単離されプールされたものであった。このライブラリーにおいては、ｃＤＮＡ分子は、真核細胞性の発現ベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間で一方向にクローン化されている。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターの、ＮｏｔＩ制限部位の約１２０ヌクレオチド上流の５’末端プライマーと、３’ＣｈＥＳＴ５８２ｐ２プライマー（配列番号１７、上掲）とのＰＣＲ反応においては、ｐＤｒｉｖｅ内にクローン化された約１０００ヌクレオチドのＰＣＲ断片を得た。
【０１３８】
ｐＮＤ８９と表されるこのクローンが、その３’末端において約２００ｎｔのＩＬ−１２  ｐ４０断片を含んでいるかどうかを調べるために、テンプレートとしてｐＮＤ８９を用い、そして５’ＣｈＥＳＴｐ５８２ｐ２（配列番号１８、上掲）および３’ＣｈＥＳＴｐ５８２ｐ２プライマー（配列番号１７、上掲）を組み合わせて用いるＰＣＲ反応を行った。その結果、２２２  ｎｔの長さのＩＬ−１２  ｐ４０断片を含む約１０００ｎｔの長さのｐＮＤ８９のｃＤＮＡクローンを示す、約２００ヌクレオチドのＰＣＲ断片が示された。
【実施例３】
【０１３９】
ｃＤＮＡクローンｐＮＤ８９の配列分析
クローンｐＮＤ８９の配列を広範囲に決定した。これによって、（開始から終止までの）ｃＤＮＡクローンが９４８ヌクレオチドの長さであり、そして３１５  ａａのタンパク質をコード化していることが明らかになった（図８を参照すること）。オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１〜９４８）を含むｐＮＤ８９のｃＤＮＡ配列の分析から、ヒトのＩＬ−１２  ｐ４０のｃＤＮＡ配列（全体のホモロジーが５７％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ６５２７２）、ヒツジの配列（全体のホモロジーが５６％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＡＦ００４０２４）、ウマの配列（全体のホモロジーが５７％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ１１１２９）、ネコの配列（全体のホモロジーが５５％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＹ０７７６２）、ウシの配列（全体のホモロジーが５６％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＵ１１８１５）、マウスの配列（全体のホモロジーが５５％；ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＭ８６６７１）およびマーモットの配列（全体のホモロジーが５７％、ＥＭＢＬ／ＧｅｎｂａｎｋのＸ９７０１９）に対する相同性が示された（図９を参照すること）。ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのＩＬ−１２  ｐ４０タンパク質に対する、ｐＮＤ８９をコード化するＣｈＩＬ−１２  ｐ４０タンパク質の複数のアラインメントから、それぞれ４１％、４０％、４０％、４２％、３９％、３６％および４１％のアミノ酸のホモロジーが与えられる（図１０を参照すること）。配列分析からは、ａａ  ２０〜２１の間に切断部位を有するシグナルペプチドが存在する結果、２０  ａａのシグナルペプチドと２９５  ａａの成熟タンパク質が生じることが、さらに明らかになった。ＷＳＸＷＳボックス（ａａ  ３０５〜３１１）、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン（ａａ残基４１〜９４）およびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ａａ残基２２８〜３０８）−−これらは両者ともＩＬ−１２  ｐ４０の特徴である−−の存在が、類似性によって確認された。これらの配列のホモロジーから、クローンｐＮＤ８９がニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをコード化していることが分かる。
【実施例４】
【０１４０】
アヒルおよびシチメンチョウのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをそれぞれコード化しているクローンｐＮＤ１１５およびクローンｐＮＤ１１７の単離と配列分析。
【０１４１】
ニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０配列と、ニワトリとアヒル／シチメンチョウの間に存在する高いホモロジーを利用して、本発明者らはアヒルおよびシチメンチョウのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをクローン化しようとした。ニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０の５’末端プライマー
【０１４２】
【化８】
2006507805.tif 000010
（図８の１から２０位のヌクレオチド）とニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０の３’末端プライマー
【０１４３】
【化９】
2006507805.tif 000011
（図８の９４８から９２６位のヌクレオチドに相補的なもの）を組み合わせて、アヒル又はシチメンチョウの脾臓細胞および腎細胞のいずれかから単離された全ＲＮＡに関して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ反応から、約１０００  ｎｔのＰＣＲ断片を得、続いてこれをｐＣＲ２．１（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。アヒルのクローンをｐＮＤ１１５と表し、そしてシチメンチョウのクローンをｐＮＤ１１７とした。クローンｐＮＤ１１５およびクローンｐＮＤ１１７の配列を広範囲に決定したことから、両方の（開始から終止までの）ｃＤＮＡクローンが９４８ヌクレオチドの長さであり、そして３１５  ａａのタンパク質をコード化していることが明らかになった（図１１および１２を参照すること）。オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１〜９４８）を含むｐＮＤ１１５およびｐＮＤ１１７のｃＤＮＡ配列の分析から、両者とニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０のｃＤＮＡ配列との同一性は９９％を超えていることが示された（図１３を参照すること）。推定されるｐＮＤ１１５およびｐＮＤ１１７のタンパク質の複数のアラインメントから、ｐＮＤ１１５はニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０と同一であり、そしてｐＮＤ１１７とニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０タンパク質との同一性は９９％を超えていることが示された（図１４を参照すること）。ｐＮＤ１１５、ｐＮＤ１１７およびニワトリのＩＬ−１２  ｐ４０との間のホモロジーの小さな違いは、ｐＮＤ１１５およびｐＮＤ１１７についてのアミノ酸残基のサイレント変異および１アミノ酸残基の変化ｐＮＤ１１７をもたらすｃＤＮＡ配列におけるわずかな置換の結果である（図１４を参照すること）。三つの配列の高いホモロジーに基づいて、本発明者らは、クローンｐＮＤ１１５はアヒルのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをコード化し、そしてクローンｐＮＤ１１７はシチメンチョウのＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをコード化していると結論付ける。
【実施例５】
【０１４４】
組み換え型のニワトリ（Ｃｈ）ＩＬ−１２のキャラクタリゼイション
ＣＯＳ−７細胞の形質移入後（と同時）に分泌されるＣｈＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットおよびＣｈＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットを検出するために、ウェスタンブロット分析を用いた。このために、ネコ（Ｆｅ）のＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体を用いた。この抗ＦｅＩＬ−１２  ｐ４０ペプチド抗体を用いて、形質移入されたＣＯＳ−７細胞の上清中にＣｈＩＬ−１２  ｐ４０およびＣｈＩＬ−１２  ｐ４０ホモ二量体：ＣｈＩＬ−１２  ｐ８０（Ｃｈ（ｐ４０）２）を検出することができた（図１５、レーン１）。ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５およびＣｈＩＬ−１２  ｐ４０の両者によって形質移入されたＣＯＳ−７細胞からの上清中に、ヘテロ二量体ＣｈＩＬ−１２  ｐ７０タンパク質（ＣｈＩＬ−１２）（図１５、レーン４）を検出することができた。このことから、ｐ４０鎖およびｐ３５鎖が互いに作用してヘテロ二量体ＩＬ−１２  ｐ７０分子となることが示唆された。ＣｈＩＬ−１２  ｐ８０は全く検出されなかったか、または極めて少量しか検出されなかったので、ＣｈＩＬ−１２  ｐ７０の形成は、ホモ二量体のＣｈＩＬ−１２  ｐ８０の形成よりも効率的であった。さらに、アンチセンスＣｈＩＬ−１２  ｐ３５のｃＤＮＡまたは無関係のウイルスタンパク質（ＩＢＶ−Ｎ）をコード化したｃＤＮＡ構築物とＣｈＩＬ−１２  ｐ４０とのｃＤＮＡ同時形質移入の結果、ヘテロ二量体が形成されなかったので、ＣｈＩＬ−１２  ｐ７０の形成は特異的である（図１５、レーン５〜６）。
【実施例６】
【０１４５】
ニワトリのＩＬ−１２の生物活性：［１］ＣｈＩＬ−１２依存性のＣｈＩＦＮ−γの誘導
哺乳動物におけるＩＬ−１２活性の顕著な特徴は、Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γの誘導である。したがって、ＣＯＳ−７細胞で一時的に共発現した後に単離した種々のタンパク質の希釈物によってインキュベーションを行ったニワトリの脾臓細胞の、分離したての培地における、ＩＦＮ−γのレベルを評価した。ＨＤ−１１細胞とグリースアッセイ法を用いて、亜硝酸塩の蓄積量の関数として、ＣｈＩＦＮ−γを測定した。図１６に示されるように、わずかにヘテロ二量体ＣｈＩＬ−１２  ｐ７０（ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０とＣｈＩＬ−１２  ｐ３５とが同時形質移入したもの）が、ニワトリの脾臓細胞において、濃度に依存する様式でＩＦＮ−γを産生することができる。ｍｏｃｋベクターの形質移入またはＣｈＩＬ−１２  ｐ４０単独の形質移入では、ヘテロ二量体ＣｈＩＬ−１２  ｐ７０によるレベルにおおよそ匹敵するレベルに、ＣｈＩＦＮ−γの分泌を誘導することはできなかった。この次に、ＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２は有意な量のＣｈＩＦＮ−γを誘導しなかったので、ニワトリの脾臓細胞において、ＩＬ−１２に特異的な種だけがＩＦＮ−γを誘導することが明らかである。ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０およびＣｈＩＬ−１２  ｐ７０（ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０とＣｈＩＬ−１２  ｐ３５とが同時形質移入したもの）の間のＮＯ産生の違い、ならびにＣｈＩＬ−１２  ｐ７０とＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２との間のその違いは有意であった（Ｐ＜０．０５）。総合すれば、これらの結果から、ＣｈＩＬ−１２が生物活性を持ち、そしてニワトリの脾臓細胞を介するＩＦＮ−γの誘導はＣｈＩＬ−１２に依存することが示唆される。
【実施例７】
【０１４６】
ニワトリのＩＬ−１２の生物活性：［２］ＣｈＩＬ−１２−依存性のニワトリの脾臓細胞の増殖
ＩＬ−１２の別の特性−−いくつかのその他のサイトカインと共有する特性−−は、Ｔ細胞の増殖を誘導することである。単離したてのニワトリの脾臓細胞の種々のタンパク質に対する成長応答−−ＣＯＳ−７細胞で一時的に（同時）発現した後に単離したもの−−を、細胞増殖のアッセイによって測定した。わずかにヘテロ二量体ＣｈＩＬ−１２  ｐ７０（ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０とＣｈＩＬ−１２  ｐ３５とが同時形質移入したもの）が、ニワトリの脾臓細胞の増殖を誘導することができた（図１７）。最初の希釈物について観察された、相対的に増殖が少ないデータを、このパラメータについての過剰摂取の影響によって説明できるかもしれない。ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０単独であっても、ＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２であっても、同様の増殖応答を誘導することはできなかった。１／６の希釈物から、ＣｈｌＬ−１２  ｐ４０とＣｈＩＬ−１２  ｐ７０（ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０とＣｈＩＬ−１２  ｐ３５とが同時形質移入したもの）との間の増殖の違い、およびＣｈＩＬ−１２  ｐ７０とＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２とのその違いは有意となった（Ｐ＜０．０５）。総合すれば、これらの結果から、ＣｈＩＬ−１２が生物活性を持ち、そしてこの分子がニワトリの脾臓細胞の増殖を誘導する能力を有することが分かる。
【実施例８】
【０１４７】
ニワトリのＩＬ−１２の生物活性：［３］一本鎖のＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２の生物活性
一本鎖のＣｈＩＬ−１２  ｐ４０と一本鎖のＣｈＩＬ−１２  ｐ３５との同時形質移入の結果として、生物活性を持つＣｈＩＬ−１２  ヘテロ二量体（図１６および１７）の形成が示された後、一本鎖のＩＬ−１２分子（ＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２）が構築された。ＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２は一本鎖のｐ４０−ｐ３５ヘテロ二量体構築物であり、その中でＣｈＩＬ−１２  ｐ４０鎖は、インフレームの状態にある「ヒンジ」領域とも呼ばれる（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−リンカーによって、ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５鎖と結合している。ウェスタンブロット分析によって、ＣＯＳ−７細胞中の形質移入後のＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２の発現プロフィールがＦｅＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２のそれと匹敵することを示すことができた。単離したてのニワトリの脾臓細胞をＣｈＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２と一緒にインキュベーションした後、両方のＩＦＮ−γの放出ならびに細胞の増殖が観察された（図１８および図１９）。これらの実験の結果から、ニワトリのＩＬ−１２  ｆｌｅｘｉ構築物も生物活性を有することが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、クローンｐａｔ．  ｐｋ００５５．  ｃ１１（＝ＣｈＩＬ−１２  ｐ３５）のＤＮＡ配列およびタンパク質配列である。
【図２−１】図２−１は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ３５配列に対するニワトリのｐ３５のＤＮＡのホモロジーである。
【図２−２】図２−２は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ３５配列に対するニワトリのｐ３５のＤＮＡのホモロジーである。
【図３】図３は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ３５配列に対するニワトリのｐ３５のタンパク質のホモロジーである。
【図４】図４は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ３５配列に対するニワトリのｐ３５断片（アミノ酸６５〜２０５）のタンパク質のホモロジーである。
【図５】図５は、クローンＣｈＥＳＴ５８２ｐ２の配列である；５’および３’プライマー（それぞれ配列番号１８および１７）は下線が付されている。
【図６】図６は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ４０配列に対するニワトリのＣｈＥＳＴ５８２ｐ２のタンパク質のホモロジーである。
【図７】図７は、ＩＬ−１２  ｐ４０のＰＣＲ用の５’縮重プライマーである；配列番号１３から１６。
【図８】図８は、クローンｐＮＤ８９（＝ＣｈＩＬ−１２  ｐ４０）のＤＮＡ配列およびタンパク質配列である。
【図９−１】図９−１は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ４０配列に対するニワトリのｐ４０のＤＮＡのホモロジーである。
【図９−２】図９−２は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ４０配列に対するニワトリのｐ４０のＤＮＡのホモロジーである。
【図１０】図１０は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのｐ４０配列に対するニワトリのｐ４０のタンパク質のホモロジーである。
【図１１】図１１は、クローンｐＮＤ１１５（＝アヒルのＩＬ−１２  ｐ４０）のＤＮＡ配列およびタンパク質の配列である。
【図１２】図１２は、クローンｐＮＤ１１７（＝シチメンチョウのＩＬ−１２  ｐ４０）のＤＮＡ配列およびタンパク質の配列である。
【図１３】図１３は、アヒルおよびシチメンチョウのｐ４０配列に対するニワトリのｐ４０のＤＮＡのホモロジーである。
【図１４】図１４は、アヒルおよびシチメンチョウのｐ４０配列に対するニワトリのｐ４０のタンパク質のホモロジーである。
【図１５】図１５は、ニワトリのＩＬ−１２およびその他のｃＤＮＡ分子による形質移入後のＣＯＳ−７細胞培養上清のウェスタンブロット分析である（ｍｏｃｋ＝空ベクターコントロール）。
【図１６】図１６は、ニワトリのヘテロ二量体ＩＬ−１２依存性の、ＩＦＮ−γの誘導を示す図である（Ｆｅ＝ネコ；ｍｏｃｋ＝空ベクターコントロール）。
【図１７】図１７は、ニワトリのヘテロ二量体ＩＬ−１２依存性の、ニワトリの脾臓細胞の増殖を示す図である（Ｆｅ＝ネコ；ｍｏｃｋ＝空ベクターコントロール）。
【図１８】図１８は、ニワトリのＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２依存性の、ＩＦＮ−γの誘導を示す図である（Ｆｅ＝ネコ；ｍｏｃｋ＝空ベクターコントロール）。
【図１９】図１９は、ニワトリのＦｌｅｘｉ−ＩＬ−１２依存性の、ニワトリの脾臓細胞の増殖を示す図である（Ｆｅ＝ネコ；ｍｏｃｋ＝空ベクターコントロール）。
【配列表】
2006507805.tif 000012
2006507805.tif 000013
2006507805.tif 000014
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2006507805.tif 000021
2006507805.tif 000022
【図１】
2006507805.tif 000023
【図２−１】
2006507805.tif 000024
【図２−２】
2006507805.tif 000025
【図３】
2006507805.tif 000026
【図４】
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【図５】
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【図６】
2006507805.tif 000029
【図７】
2006507805.tif 000030
【図８】
2006507805.tif 000031
【図９−１】
2006507805.tif 000032
【図９−２】
2006507805.tif 000033
【図１０】
2006507805.tif 000034
【図１１】
2006507805.tif 000035
【図１２】
2006507805.tif 000036
【図１３】
2006507805.tif 000037
【図１４】
2006507805.tif 000038
【図１５】
2006507805.tif 000039
【図１６】
2006507805.tif 000040
【図１７】
2006507805.tif 000041
【図１８】
2006507805.tif 000042
【図１９】
2006507805.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月25日(2004.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のポリペプチドサブユニット：
−配列番号１に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、
−配列番号２に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つを含む単離されたタンパク質。
【請求項２】
約４０ｋＤの見かけの分子量を有し、配列番号１、配列番号５、または配列番号７に表されるようなアミノ酸配列を有するサブユニットを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
−約４０ｋＤの見かけの分子量および配列番号１に表されるアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−３５ｋＤの見かけの分子量および配列番号２に表されるアミノ酸配列を有するサブユニット、
からなり、該サブユニットが結合している、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
次のポリペプチドサブユニット：
−配列番号１に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−配列番号２に表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つをコード化した、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
−配列番号３に表される配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列
−配列番号４に表される配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列
からなる群より選択される核酸配列の少なくとも一つを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項７】
請求項４若しくは５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項４から５のいずれか一項に記載の１以上のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベクター、および医薬適合性の担体を含有するアジュバント組成物。
【請求項９】
医薬適合性の担体とともに、鳥類の病原体に由来する活性物質および請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質を含有するワクチン組成物。
【請求項１０】
医薬適合性の担体とともに、鳥類の病原体に由来する活性物質および請求項４から５のいずれか一項に記載の１以上のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベクターを含有するワクチン組成物。
【請求項１１】
免疫賦活剤としての請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１２】
ワクチンアジュバントにおける請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１３】
医薬適合性の担体とともに請求項１に記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
【国際調査報告】
2006507805.tif 000044
2006507805.tif 000045
2006507805.tif 000046