(57)【要約】P糖タンパク質を阻害するための薬剤を製造するためのコロイド状キャリヤーの使用であって、上記コロイド状キャリヤーが：−薬理活性物質をカプセル封入しまたは吸着し、且つ−コロイド状キャリヤー表面に結合したP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を含んでなる、上記使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
P糖タンパク質を阻害するための薬剤を製造するためのコロイド状キャリヤーの使用であって、上記コロイド状キャリヤーが
薬理活性物質をカプセル封入しまたは吸着し、且つ
コロイド状キャリヤー表面に結合したP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を含んでなる、上記使用。
【請求項２】
上記コロイド状キャリヤーが薬理活性物質とP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を選択した細胞に同時放出する、請求項１に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項３】
細胞の多剤耐性を減少させるための、請求項１または２に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項４】
上皮による吸収がP糖タンパク質によって減少する薬理活性物質の経口バイオアベイラビリティーを高めるための、請求項１−３のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項５】
コロイド状キャリヤーが、ナノスフェア、ナノカプセルまたは固形脂質ナノパーティクル、リポソーム、ミセル、ナノ懸濁液、ナノエマルション、またはスフェルライトのようなナノパーティクルである、請求項１−４のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項６】
ナノカプセルが脂質ナノカプセルである、請求項５に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項７】
界面活性剤がポリオキシエチレン残基を含んでなる、請求項１−６のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項８】
界面活性剤がポリエチレングリコール-660 12-ヒドロキシステアレートである、請求項１−７のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項９】
薬理活性物質が多剤耐性を受ける抗癌剤である、請求項１−８のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項１０】
薬理活性物質がビンブラスチン、コルチシン、パクリタキセル、エトポシド、ドセタキセル、ビンクリスチン、またはテニポシドから選択される、請求項９に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項１１】
選択した細胞が神経膠芽細胞腫、肝臓転移、結直腸癌細胞、肺癌細胞、黒色腫、前立腺癌細胞、乳癌細胞、または卵巣癌細胞である、請求項８または９に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項１２】
薬理活性物質がAIDSの治療を目的とするプロテアーゼインヒビターである、請求項１−８のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【請求項１３】
薬理活性物質がアジトロマイシン、クラリトロマイシン、エリトロマイシン、ロキシトロマイシン、ジリトロマイシン、クリンダマイシン、ダルフォプリスチン、およびテトラサイクリンから選択される抗生物質薬である、請求項１−８のいずれか一項に記載のコロイド状キャリヤーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、P糖タンパク質を阻害するためのコロイド状キャリヤーの表面におけるP糖タンパク質インヒビター界面活性剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
P糖タンパク質は、ABCファミリーの170KDaの膜貫通タンパク質成分である。その通常の役割は、毒素または生体異物が細胞中に入り込むのを停止させることによる上皮細胞における解毒システムであると考えられてきた。その発現は異なる個体間で変化し、これはまた患者の変化性の原因でもある。
【０００３】
P糖タンパク質は流出ポンプとして作用することが示されており、多くの薬剤(抗癌薬、抗生物質、抗鬱薬など)を細菌輸送タンパク質と同様な方法で細胞から排出する。多くの薬剤の有効性は、P糖タンパク質流出ポンプによって劇的に減少する。
【０００４】
特に、P糖タンパク質は、反復化学療法の後に多くの癌患者に生じる後天性多剤耐性症候群(MDR)に寄与する因子として周知である[Kartner et al., 1985; Robinson et al., 1987]。抗癌剤のほとんどは多剤耐性によって犯されている。
【０００５】
更に、AIDSの治療に用いられるプロテアーゼインヒビター(サクイナビール(Saquinavir)(登録商標)、インディナビール(Indinavire)(登録商標)など)のような相当数の薬剤は、経口投与後のバイオアベイラビリティーが極めて弱い。これもまた、P糖タンパク質流出ポンプの存在により十分な吸収を防止する消化管の上皮におけるP糖タンパク質の存在によって説明される。P糖タンパク質はほとんどのHIVプロテアーゼインヒビター(HPI)を輸送し且つそれらの経口バイオアベイラビリティーおよびリンパ球、脳、精巣および胎児浸透を減少させ、これらの薬剤の治療効力に対する主要制限効果を生じる可能性があることが明らかにされている[Huisman MT et al., 2002]。
【０００６】
コロイド状キャリヤーは薬剤を選択的に送達することによって薬剤の効力を増加させ且つ薬剤の副作用を減少させることができたが、この利点はP糖タンパク質流出ポンプの存在による多剤耐性によって選択した薬剤が影響を受けるときには極めて少なくなった。
【０００７】
PEG-HS(ソルトール(Solutole)(登録商標)HS 15またはポリエチレングリコール-660 12-ヒドロキシステアレート)は、多剤耐性を引き起こす癌細胞中のP糖タンパク質を阻害することが報告されている[Buckingham et al., 1995; Buckingham et al., 1996]。
【０００８】
総てのコロイド状キャリヤー調製法は、相分離または乳化法に基づいている。界面活性剤が、総てのそれらの手法では必要とされる。
【０００９】
両親媒性を有する界面活性剤であるPEG-HSをコロイド状キャリヤーの調製に応用することができることが、最近になり見出された。
【００１０】
これらの場合には、界面活性剤はその親油性残基によってキャリヤー表面に結合している。キャリヤー外表面にあるPEG-HS親水性ポリエチレングリコール鎖は、懸濁液におけるキャリヤー系を安定化している。更に、それらは立体反発作用を誘発し、キャリヤーのマクロファージ表面への接着過程を最小限にし、接近する血漿タンパク質に対する反発力を提供する。従って、それらは、他のオプソニン化妨害系由来であることが知られている細網内皮系による初期の摂取が起こらないようにすることができる。
【００１１】
表面に結合したPEG-HSのようなP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を含むコロイド状キャリヤーは、目標とする細胞に薬剤を放出し且つ上記P糖タンパク質インヒビター界面活性剤を放出することもできることを意外にも見出した。
【００１２】
意外なことには、界面活性剤はキャリヤー表面に固く結合しておらず、任意の種類の水性流体の存在によって拡散する。P糖タンパク質インヒビター界面活性剤は、これによって目標とする細胞中に放出され、それによってP糖タンパク質を阻害することができる。
【００１３】
従って、表面に結合したP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を含むコロイド状キャリヤーは、細胞の多剤耐性を減少させることができる。それらは、上皮による薬剤の吸収がP糖タンパク質流出ポンプによって減少する薬剤の経口バイオアベイラビリティーを高めることもできる。
【００１４】
これらのコロイド状キャリヤーは、選択した細胞に薬剤を送達し、1個の単一送達系の投与によってP糖タンパク質を阻害するという利点を有する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、P糖タンパク質を阻害するための薬剤を製造するためのコロイド状キャリヤーの使用であって、上記コロイド状キャリヤーが
薬理活性物質をカプセル封入しまたは吸着し、且つ
コロイド状キャリヤー表面に結合したP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を含んでなる、上記使用である。
【００１６】
このようなコロイド状キャリヤーは、薬理活性物質とP糖タンパク質インヒビター界面活性剤を選択した細胞中に同時放出することができる。薬理活性物質とP糖タンパク質インヒビター界面活性剤は、コロイド状キャリヤーから選択した細胞にほぼ同時に放出されるのが有利である。
【００１７】
一態様では、本発明は、このようなコロイド状キャリヤーの使用による細胞の多剤耐性の減少を提供する。
【００１８】
第二の態様では、本発明は、このようなコロイド状キャリヤーの使用により上皮による吸収がP糖タンパク質によって減少する薬理活性物質の経口バイオアベイラビリティーの増強を提供する。
【００１９】
表面にP糖タンパク質インヒビター界面活性剤が結合しているコロイド状キャリヤーは、位置特異的薬剤輸送を行うのに小さなキャリヤー粒度が必要であり且つ生物学的流出ポンプによって妨害される薬剤輸送における総ての応用について予め決定されている。
【００２０】
1つの主要な例は腫瘍治療での使用であり、神経膠芽細胞腫のような極めて希有な種類の腫瘍をキャリヤー粒度が小さなために選択することができ、通常の抗癌剤の有効性を通常は減少させるP糖タンパク質流出ポンプを阻害する。
【００２１】
従って、このようなコロイド状キャリヤーを癌研究のような薬剤送達用途に用いて、同時に、すなわち1個の単一送達系を投与することによって腫瘍細胞を選択して多剤耐性を阻害することができる。
【００２２】
これらの薬剤を装填したコロイド状キャリヤーは、膜タンパク質関連輸送系を阻害し且つ薬剤の細胞内濃度を高めることができる。
【００２３】
このようなコロイド状キャリヤーは、それらを細胞によって取り込んで薬剤を細胞中に放出するようにする必要がないという利点も有する。
【００２４】
更に、PEG-HSなどの多数のP糖タンパク質インヒビター界面活性剤が既に注射用処方物に用いられており、毒性が低いことが報告されており[Buckingham et al., 1995]、一方、他のP糖タンパク質インヒビター、例えば、ニフェジピンは同時投与することができるが、重篤な副作用を引き起こす可能性がある。
【００２５】
コロイド状キャリヤーの調製方法は、当業者には周知である。
【００２６】
本発明によれば、コロイド状キャリヤーはナノスフェア、ナノカプセルまたは固形脂質ナノパーティクルのようなナノパーティクルであってもよく、またはリポソーム、ミセル、ナノ懸濁液、ナノエマルション、またはスフェルライトであってもよい。
【００２７】
ナノパーティクルは、サブミクロン性(すなわち、<1μm)のコロイド系として一般に定義することができるが、必ずしもポリマー(生分解性または生物分解性でない)からなるものではない。
【００２８】
ナノパーティクルとしては、特にナノスフェア、ナノカプセル、および固形脂質ナノパーティクルが挙げられる。
【００２９】
ナノスフェアおよびナノカプセルなどのナノパーティクルの調製方法は、Couvreur et al., Eur. J. Pharm. Biopharm, 41(1) 2-13, 1995に開示されている。
【００３０】
ナノスフェアは、薬剤が粒子中に分散されているマトリックス系である。
【００３１】
ナノカプセルは、薬剤がポリマーまたは脂質膜によって囲まれたキャビティーに閉じ込められている系である(Couvreur et al.,「ナノカプセル技術。治療薬キャリヤー系における批判的総説(Nanocapsule technology; Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)」, 2002)。ナノカプセルの粒度は、通常は80-500nmの間にあることが見出されている。ナノカプセルは、界面に親油性および/または親水性界面活性剤を有するポリマーまたは脂質膜によって囲まれた液体コアから構成されている。ナノカプセルによって、薬剤の非経口投与(静脈内投与、筋肉内投与)または経口投与を行うことができる。ポリマー性ナノカプセルの調製方法は、P. Legrand et al., S. T. P. Pharma Sciences 9 (5) 411-418, 1999に開示されている。
【００３２】
本発明の一態様では、コロイド状キャリヤーはWO 01/64328号明細書に開示されている方法に準じて調製した脂質ナノカプセルである。この方法によって調製された脂質ナノカプセルは、室温で液体または半液体であり、室温で固体の本質的に脂質フィルムでコーティングされた本質的に脂質コアからなっている。ナノカプセルの平均粒度は150nm未満であり、好ましくは100nm未満であり、更に好ましくは50nm未満である。
【００３３】
固形の脂質ナノパーティクルは、トリグリセリドまたは脂肪酸のような固形脂質から調製されるナノスフェアである。
【００３４】
固形の脂質ナノパーティクルの調製方法は、W. Mehnert, Advanced Drug Delivery Reviews 47 (2001) 165-196に開示されている。
【００３５】
リポソームは、水相を封入している1以上のリン脂質二重層からなる球状小胞である。それらは、その粒度および脂質層の数によって大マルチラメラリポソーム(MLV)、小ユニラメラ小胞(SUV)、または大ユニラメラ小胞(LUV)として分類することができる。親水性薬剤を内部の水性コアに可溶化させることができ、親油性または両親媒性化合物を脂質二重層に組込むことができる。リポソームの調製方法は、Gregoriadis, G. (1993)「リポソーム技術(Liposomes Technology)」(第1巻、第2版) CRC Pressに開示されている。リポソームにより、薬剤の静脈内投与または経口投与を行うことができる。
【００３６】
ナノ懸濁液は、薬剤と乳化剤のみから構成されているコロイド粒子である。
【００３７】
ミセルは、親油性分子を水性媒質に閉じ込めることができる界面活性剤集合体である。それらは、水性コアや脂質二重層を含まない。
【００３８】
ナノエマルションは、サブミクロンエマルションである。ナノエマルションの調製方法は、Osborne DW, Middleton CA, Rogers RL,「アルコール不含ナノエマルション(Alcohol free nanoemulsions)」, J. Disp. Sci. Technol., 9, 415-423, 1988に開示されている。
【００３９】
スフェルライトは、同心的マルチラメラマイクロ小胞である。スフェルライトの調製方法は、米国特許第5,792,472号明細書、米国特許第6,103,259号明細書、およびFreund et al., Life Sciences 67 (2000) 411-419およびMignet et al.,「核酸研究(Nucleic Acid Research)」,第28巻, 第16刷, 2000年8月15日, 3134-3142頁に開示されている。
【００４０】
本発明によれば、コロイド状キャリヤーは界面活性剤であって、その少なくとも1種類がP糖タンパク質のインヒビターであるもの、すなわちP糖タンパク質と相互作用することによってP糖タンパク質流出ポンプを不活性化するものから調製される。
【００４１】
P糖タンパク質のインヒビターである界面活性剤は、両親媒性であるのが有利である。更に、それらは非イオン性界面活性剤である。更に好都合には、それらは、
TPGS(ポリエトキシル化コハク酸トコフェリル)、
Cremophor(登録商標)EL(ポリオキシエチレンヒマシ油またはポリエトキシル化ヒマシ油)
Tween(登録商標)20: ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
Tween(登録商標)40: ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート
Tween(登録商標)60: ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート
Tween(登録商標)80: ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
Pluronic(登録商標)P85およびL81(ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマー)
Triton X 100 (オクチルフェノールエトキシレート)
Nonidet P40 (ノニルフェニルポリオキシエチレングリコール)
のようなポリオキシエチレン残基を含んでなる脂肪酸エステル界面活性剤である。
【００４２】
好ましいP糖タンパク質インヒビター界面活性剤は、
Solutol(登録商標)HS 15 (ポリエチレングリコール 660 12-ヒドロキシステアレート, Coon et al., 1991)、
Cremophore(登録商標)EL (ポリオキシル35ヒマシ油, Schuurhuis et al., 1990)、
Tween(登録商標)80 (ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート, Riehm and Biedler, 1972)
である。
【００４３】
本発明によれば、界面活性剤はコロイド状キャリヤーの表面に結合しており、すなわち、これをその親油性残基によって表面に固定し、または弱い化学結合によって表面に吸着させることができる。
【００４４】
本発明によれば、薬理活性物質はコロイド状キャリヤーにカプセル化または吸着されている。
【００４５】
「カプセル化」とは、活性物質がコロイド状キャリヤー内部に含まれていることを意味する。
【００４６】
「吸着」とは、活性物質がコロイド状キャリヤーの外表面に吸着されていることを意味する。
【００４７】
本発明によりコロイド状キャリヤーにカプセル化された薬理活性物質は、P糖タンパク質流出ポンプによって細胞から放出される任意の薬理活性物質であることができる。有利には、これは、多剤耐性を受ける任意の薬剤であることができる。更に有利には、これは、多剤耐性を受ける任意の抗癌剤であることができる。
【００４８】
従って、薬理活性物質は、ビンブラスチン、コルチシン、パクリタキセル、エトポシド、ドセタキセル、ビンクリスチンまたはテニポシドのような抗癌剤であってもよい。
【００４９】
したかかほんによるコロイド状キャリヤーによって選択される細胞は、神経膠芽細胞腫、肝臓転移、結直腸癌細胞、肺癌細胞、黒色腫、前立腺癌細胞、乳癌細胞または卵巣癌細胞のような腫瘍細胞でよい。
【００５０】
経口投与後の多くの薬剤の有効性が極めて弱いのは、消化管の上皮にP糖タンパク質が存在し、これによって上皮による薬剤の十分な吸収がなされないからであると説明されてきている。
【００５１】
従って、薬理活性物質は、プロテアーゼインヒビターであってよい。普通の意味では、それはサキナビール(Saquinavir)(登録商標)またはインディナビール(Indinavir)(登録商標)のようなAIDS治療薬であることができる。
【００５２】
この薬理活性物質は、アジトロマイシン、クラリトロマイシン、エリトロマイシン、ロキシトロマイシン、ジリトロマイシン、クリンダマイシン、ダルフォプリスチンおよびテトラサイクリンのような抗生物質薬であることもできる。
【００５３】
下記の総ての説明において、
P-gp=P糖タンパク質
PEG-HS=ソルトール(Solutol)(登録商標)HS 15またはポリエチレングリコール660 12-ヒドロキシステアレート (Coon et al., 1991)、
LNC=WO 01/64328号明細書に開示されている方法に準じて調製した脂質ナノカプセル、
ブランクLNC=未装填の脂質ナノカプセル、すなわち、薬理活性物質を全くカプセル化していないLNC、
装填LNC=薬理活性物質をカプセル化している脂質ナノカプセル、
SPIbio(登録商標)試験系= SPIbio(Massy,フランス)によって製造されたP-gp薬剤相互作用アッセイキット、
SD=標準偏差、
F98細胞=CRL-2397、
9L細胞=ECACC 94110705、
PX=パクリタキセル
である。
【実施例】
【００５４】
材料および方法
ナノカプセルの調製
脂質ナノカプセルは、WO 01/64328号明細書に開示されている方法に準じて調製される。
【００５５】
総ての調製段階の前に、薬剤を超音波処理によって中性油に溶解させる。
【００５６】
その後、名目粒度が20、50、および100nmの様々なLNC処方物は、最近文献に報告された相反転処理の新規調製法に基づいている[Heurtault et al., 2001]。
【００５７】
簡単に説明すれば、様々な濃度の総ての成分(ホスファチジルコリン、PEG-HS、塩化ナトリウム、トリグリセリドおよび水)を混合し、マグネティックスターラー下で85℃まで加熱して、相転位温度を通過するようにする。次の冷却段階を、相転位ゾーンを再度完全に通過する55℃の温度まで行った。このサイクルを更に2回繰り返した後、蒸留水5mlを2℃で加えた。処方物を更に10分間攪拌した後、更に使用した。
【００５８】
薬剤放出動態およびPEG-HS放出の決定
LNCの直径が小さいため遠心分離によっては適当な時間間隔でLNCを分離することはできなかったので、LNCのイン・ビトロでの放出動態は透析法によって行った。薬剤を装填したLNC懸濁液3mlを透析管に入れ、250rpmの緩やかな磁気攪拌下で37℃の水槽中でリン酸緩衝液(pH 7.4)を含む100mlフラスコに挿入した。適当な間隔で、0.5mlの試料を採取して薬剤放出を評価し、新鮮な緩衝液0.5mlを入れ替えた。放出媒質中の薬剤の量を、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって決定した。
【００５９】
PEG-HS放出については、1mlのキャリヤー懸濁液を透析管に入れ、250rpmの緩やかな磁気攪拌下で37℃の水槽中でリン酸緩衝液(pH 7.4)を含む100mlフラスコに挿入した。適当な間隔で、0.5mlの試料を採取してリン酸緩衝液中の遊離PEG-HSについて評価した。PEG-HSの定量は、ヨウ化カリウムによる着色反応および500nmにおけるUV/VIS検出によって行った[McAllister and Lisk, 1951]。
【００６０】
P糖タンパク質相互作用実験
様々なLNC粒度およびLNCの水懸濁液の様々な希釈度の様々なバッチのブランクLNCを調製した。
【００６１】
【表１】
2006514662.tif 000002
【００６２】
様々なバッチのブランクLNCをP-gp薬剤相互作用アッセイキット(SPIbio(登録商標), Massy,フランス)に応用して、LNCと膜にあるP糖タンパク質との幾つかの種類の相互作用を決定した。
【００６３】
商業的に利用可能な試験は、供給業者の指示に従って行った。簡単に説明すれば、96穴プレートで異なるLNC処方物をP-gpを示す膜小胞と共に様々な濃度で20分間インキュベーションした。総ての測定は、ピルベートキナーゼとラクテートデヒドロゲナーゼの酵素カスケードに結合したP-gpのATPアーゼ活性に基づいており、NADHを340nmでのUVで定量した[Garrigues et al., 2000]。
【００６４】
これらの実験の前に、膜小胞をLNCの存在下でのそれらの安定性について試験した。
【００６５】
細胞培養
F98および9Lの神経膠腫細胞系を、ATCC(Manassas, VA, 米国)から得た。ウェル当たり約10,000個の細胞を、ポリ-D-リシンコーティングを施した24キャビティーウェルプレートに播種して、DMEM中で生育させた。
【００６６】
その後、細胞を、薬剤溶液またはブランクLNCまたは同等な薬剤または賦形剤濃度の薬剤を装填したLNCと共にインキュベーションした。用いたカプセル成分のいずれかの毒性による紛らわしい正の効果を防止するため、賦形剤を同等な量で加えた。これは、疑いなくPEG-HS濃度に相当する。
【００６７】
インキュベーション期間は、適当な処方物について96時間であった。
【００６８】
総ての処方物は、薬剤を2-2000μM/mlを含んでいた。
【００６９】
ブランクLNCは、薬剤を装填したLNCと比較して同等な質量の賦形剤を含んでいた。
【００７０】
治療期間後の細胞の生存を、MTT試験を用いて試験した[Carmichael et al., 1987]。
【００７１】
細胞毒性は、コントロール(未処理細胞)の百分率として表した。
【００７２】
星状細胞の一次ラット細胞培養物を、24ウェル中で約3週間増殖した。稀突起膠細胞を除去し、次にコンフルエント細胞を、キャリヤー処方物または遊離薬剤を同等な濃度で加えることによって細胞毒性試験に用いた。
【００７３】
結果および検討
P-gp阻害
結果を、図1に示す。
【００７４】
総ての結果は、4回の測定値の平均値±SDとして示す。
【００７５】
試験系自身のP-gp依存性ATPアーゼの基本活性を、1.0の値として用いた。
【００７６】
類似の標準は、ビンブラスチンおよびベラパミルからの追加の結果と共に試験系の基本活性によって与えられる。
【００７７】
試験したLNC試料は、ATPアーゼ活性で表す相対P-gp活性の減少を示した。この現象の考えられる原因は、P-gp阻害である。
【００７８】
SPIbio試験系では、軽微なLNC粒度依存性のP-gp阻害が観察された。
【００７９】
純粋なLNC懸濁液は、総てのカプセル粒度についてP-gp関連ATPアーゼ活性を有意に低下させることが分かった。
【００８０】
総てのバッチにおいて、この阻害は濃度が異なることにより若干変動し、ATPアーゼ活性に対するこの影響はLNC20処方物について有意であるだけであった。この明らかにされたP-gp関連ATPアーゼ阻害は、多剤耐性現象に対する効率的P-gpインヒビターであることが文献に記載されている遊離PEG-HSの活性に本質的に基づいている可能性がある。
【００８１】
界面活性剤はLNC表面に固く結合せず、任意の種類の水性流体の存在によって拡散する。この観点から、LNCは組込まれる薬剤および同時にそのP-gp阻害性界面活性剤 PEG-HSの貯蔵器として見ることができる。薬剤およびP-gpインヒビターの目標とする組織への複合送達により、そのような系の有効性を著しく増加させることができる。
【００８２】
LNC特性およびイン・ビトロでの薬剤およびPgp-インヒビター放出
様々なLNC処方物についてのリン酸緩衝液(pH 7.4, 37℃)中での累積薬剤放出率を表すことによるエトポシドから得られるイン・ビトロでの薬剤放出動態についての一例を、図2に示す。
Eto(LNC20, LNC50, LNC100)=エトポシドを装填した20nm、50nm、100nm LNCから放出されるエトポシドの重量百分率。
PEG-HS (LNC20, LNC50, LNC100)=エトポシドを装填した20nm、50nm、100nm LNCから放出されるPEG-HSの重量百分率。
【００８３】
この例から、抗癌剤の放出とP-gpインヒビターPEG-HSの放出の二重放出が起こることを明確に理解することができる。
【００８４】
初期界面活性剤質量の約35%であって、作用部位におけるP-gp阻害について有意な量が放出される。更に、キャリヤー系の安定性は界面活性剤野天医によっては妨げられない。
【００８５】
細胞培養実験
A) 図3および4 (エトポシド)および図5および6(パクリタキセル)に示される結果
Eto (LNC20, LNC50, LNC100) = エトポシドを装填した20nm、50nm、100nm LNC。
Eto溶液 = エトポシド溶液
Eto + PEG-HS溶液 = 遊離の投与されたエトポシドおよびPEG-HS溶液 (PEG-HS濃度は相当するLNC処方物の35%の値と同等であり、48時間かけてLNCから放出した後は自由に利用可能)、図2参照。
ブランク(LNC20, LNC50, LNC100) = 未装填の20nm、50nm、100nm LNC。
PX (LNC20, LNC50, LNC100) = パクリタキセルを装填した20nm、50nm、100nm LNC。
PX =パクリタキセル溶液。
PX + PEG-HS溶液 = パクリタキセル溶液およびPEG-HS溶液(PEG-HS濃度は相当するLNC処方物の35%の値と同等であり、48時間かけてLNCから放出した後は自由に利用可能)、図2参照。
【００８６】
96時間のインキュベーション時間の後に総ての試験した細胞系について薬剤溶液と薬剤を装填したLNCの間には有効性に明らかな差があった。
【００８７】
エトポシドについての細胞増殖阻害のIC50値は、F98についての25倍の細胞増殖阻害から9L細胞での有効性の8倍増加まで変化した。
【００８８】
パクリタキセルの場合には、その効果および差は遙かに著しいものであった。パクリタキセルを装填したLNCのF98細胞に対する効果は純粋な薬剤の約300倍であり、9L細胞での細胞増殖に対する阻害も薬剤の80倍であった。
【００８９】
様々なLNC直径について、効果の粒度依存強度が観察された。ブランクLNCの細胞毒性値は遊離で投与した薬剤溶液より常に低く、賦形剤の高い毒性を無視することができた。
【００９０】
B) 図7および8に示される結果
LNCの存在の付加的効果の貯蔵器理論を明らかにするため、細胞を非毒性濃度(1:1000の希釈倍率)のブランクLNCの存在下で遊離薬剤とインキュベーションした。この場合には、F98はこのような治療に対して一層高い感受性を示した(図7)。
【００９１】
更に、IC50値はLNC直径のこの効果に対する影響を示し、総ての細胞系について、最小のLNCが最も効率的であることが分かった。これは、遊離PEG-HSの絶対量が一層高い量で存在し(図2による)、P-gp阻害効果を増加させることによる可能性がある。このような結果は、LNC系のP-gp依存性有効性の仮説と調和している。
【００９２】
9LおよびF98と比較して、細胞増殖は、主として多剤耐性機構の阻害に基づくと思われる併用薬剤/ブランクLNCによって一層高度に影響を受けることが分かった[Matsumoto et al. 1992]。
【００９３】
9L細胞は、ごく僅かのP-gp発現しか示さず、一層低いP-gp依存多剤耐性を示すことを予想せざるを得ないことが文献に記載されている(Saito et al., 1991; Yamashima et al., 1993)。
【００９４】
一般に、ナノキャリヤーの癌細胞に対する作用様式は、2つの異なる経路を一体にしていると思われる。
【００９５】
P-gp依存性流出ポンプをPEG-HSでブロックした後、細胞質内部の薬剤濃度を増加させることによって、細胞死を増強することができる。この仮説は、図7に示される実験によって支持され、遊離薬剤と組み合わせたブランクLNCはF98細胞に対して明確な効果を示したが、9Lでは明確な効果は見られなかった。薬剤不含LNCの存在下でのこの一層高い有効性はP-gpブロッキング機構を証明しているが、特にP-gp発現が少ないかまたはないことが報告されている9L細胞では差が有意に低いからであった。しかしながら、9L実験では、LNCは遊離薬剤の8倍までの有効性を示している。従って、抗腫瘍活性は、第二の経路によって到達することもできる。これらのナノキャリヤーの粒度が非常に減少しているため、細胞への明らかな取り込みが起こったのである。この細胞内の薬剤キャリヤーの存在により、初期の研究でも報告されているような多剤耐性機構を回避することもできるかも知れない[Bennis et al., 1994; Hu et al., 1995]。
【００９６】
同等な用量のLNCを一次細胞培養物中のラット星状細胞に投与すると、遊離PXと比較してごく僅かだけ高い毒性しか有しないことが分かった。これらの観察は、ブランクまたはPX装填LNCについても同様であった。このような知見は、この新規な治療方法が無害であることを支持している。
【００９７】
結論
上記のなのキャリヤー系は、同一系から抗癌剤とP-gpインヒビターを組み合わせて放出することができ、これは癌における多剤耐性に対する応用に有利である。抗癌剤を閉じ込めた後、この新規な方法は神経膠細胞腫の細胞増殖を阻害することが分かっており、幾つかの症例では、LNCは溶液中の薬剤より20倍以上効率的であった。この系の独特な利点は、薬剤とインヒビターを両方とも同時に制御送達することであり、インヒビターは毒性が低く、追加成分の投与を必要としない。
【００９８】
文献
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】様々なキャリヤー濃度での様々なLNC処方物についてのSPIbio(登録商標)試験系を用いるP-gp相互作用実験。
【図２】pH 7.4および37℃のリン酸緩衝液放出媒質中での様々なエトポシドを装填したLNC処方物の放出曲線。
【図３】F98細胞中の同様な濃度の同等なブランクLNCまたはエトポシド溶液と比較した様々なバッチのエトポシドを装填したLNC。
【図４】9L細胞中の同様な濃度の同等なブランクLNCまたはエトポシド溶液と比較した様々なバッチのエトポシドを装填したLNC。
【図５】F98細胞中の同様な濃度の同等なブランクLNCまたはPX溶液と比較した様々なバッチのパクリタキセルを装填したLNC。
【図６】L9細胞中の同様な濃度の同等なブランクLNCまたはPX溶液と比較した様々なバッチのパクリタキセルを装填したLNC。
【図７】F98細胞中の純粋なエトポシド溶液または様々なバッチのブランクLNCと組み合わせたエトポシド溶液。
【図８】9L細胞中の純粋なエトポシド溶液または様々なバッチのブランクLNCと組み合わせたエトポシド溶液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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