(57)【要約】植物のストレス耐性を改良する方法および組成物を開示する。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＭＹＢ８転写因子（ＨＯＳ１０としても知られる）が、低温、渇水、浸透圧ストレス、植物ホルモンのアブシジン酸および塩分に対する植物ストレス応答の調節に関与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレスに対する植物の応答を改良する方法であって、
（ａ）ヌクレオチド配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、前記植物に加えるステップと、
（ｂ）植物において前記ＤＮＡ分子を発現させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子は配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子は前記植物ゲノムに安定して組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ストレスは、低温、浸透圧ストレス、渇水、およびアブシジン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドは配列番号１に記載のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＨＯＳ１０転写因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記植物は単子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＨＯＳ１０と異なる経路の転写因子をコードする他の少なくとも１つのＤＮＡ分子を加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＯＳ１０タンパク質（配列番号１）をコードする組換え核酸を含むトランスジェニック植物であって、前記植物内での前記タンパク質の発現が高まることにより前記植物の低温耐性が高まるトランスジェニック植物。
【請求項９】
前記ＨＯＳ１０タンパク質は配列番号１を含むアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
前記植物は単子葉植物である、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む植物種子。
【請求項１２】
ＨＯＳ１０ポリペプチドをコードする、単離された核酸配列（配列番号２）と操作可能に連結された、植物細胞において機能するプロモーターを含む発現カセットであって、前記植物細胞内での前記ポリペプチドの発現を増強することにより前記植物の低温耐性が高まる発現カセット。
【請求項１３】
前記プロモーターはストレス誘導性である、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記ストレス誘導プロモーターは、ＡＢＡ誘導プロモーター、膨圧誘導プロモーター、およびエチレン応答プロモーターからなる群から選択される、請求項１３に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記プロモーターは、ウイルス外被タンパク質プロモーター、植物組織特異的プロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ｎｏｓプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、チューブリンプロモーター、ナピンプロモーター、アクチンプロモーター、ｃａｂプロモーター、ＰＥＰ  Ｃａｓｅプロモーター、７Ｓ−α’−コングリシニンプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、トマトＥ８プロモーター、パタチンプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター、大豆種子タンパク質グリシニンプロモーター、大豆栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージＳＰ６プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、および根細胞プロモーターからなる群から選択される、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１６】
ＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む植物ベクターであって、植物における前記ポリペプチドの発現により前記植物の低温耐性が高まる植物ベクター。
【請求項１７】
ＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む宿主植物細胞であって、植物における前記ポリペプチドの発現により前記植物の低温耐性が高まる宿主植物細胞。
【請求項１８】
ＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む植物ベクターであって、植物における前記ポリペプチドの発現により前記植物の塩分耐性が高まる植物ベクター。
【請求項１９】
ＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む宿主植物細胞であって、植物における前記ポリペプチドの発現により前記植物の塩分耐性が高まる宿主植物細胞。
【請求項２０】
ストレスに対する植物の応答を改良する方法であって、
（ａ）ヌクレオチド配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ分子を、前記植物に加えるステップと、
（ｂ）少なくとも第２のＤＮＡ分子を加えるステップと、
（ｃ）植物において前記第１のＤＮＡ分子および前記第２のＤＮＡ分子を発現させるステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記第１のＤＮＡ分子および前記第２のＤＮＡ分子の発現が異なるシグナル伝達経路で制御される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ストレスに対する植物の応答を改良する方法であって、
（ａ）ヌクレオチド配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、前記植物に加えるステップと、
（ｂ）植物において組織特異的プロモーターの下で前記ＤＮＡ分子を発現させるステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記組織特異的プロモーターは、根特異的プロモーター、花特異的プロモーター、果実特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、茎特異的プロモーター、および葉柄特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
[0001]渇水、土壌塩分、および不利な温度などの環境因子は、植物ストレスを引き起こし、植物の生産性を減少させる。非生物的なストレスによる、米、小麦、およびトウモロコシなどの主要作物の収穫量の損失は、深刻な経済的および政治的要素を示し、多くの国々の食糧不足の一因となる。これらの制限を克服し、植物の生産性を増加させるために、ストレス耐性植物を開発する必要がある。ストレス耐性を高める遺伝子の選択を試みる従来の育種戦略は、ストレス耐性の形質が植物育種計画による改良を遅らせ、予測不可能にさせる複合的な遺伝的形質であるため、ある程度の成果を収めるにすぎなかった。
【０００２】
[0002]植物のほとんどが、渇水や不利な温度などの環境の悪条件に対して自身を守る戦略を発達させてきた。例えば、植物が不利な高い生育温度にさらされると、通常のタンパク質合成を減少させ、熱ショックタンパク質を急速に合成し始める。同様に、植物における低温順化は、凍結防止剤として働く親水性タンパク質の合成に関わる。多くの植物は、浸透圧ストレスから植物組織を保護すると考えられるタンパク質を高レベルに蓄積することにより、渇水および塩分ストレスに対応する。しかし、このストレス条件の過酷さや持続期間が強烈であるか、または長期にわたる場合、植物の発達、生育、ほとんどの作物の収穫量における悪影響は顕著である。渇水および高塩濃度に連続的にさらされると、植物代謝に大きな変化が起こる。この代謝の摂動は結局、細胞死をもたらし、その結果、収穫量が減少する。
【０００３】
[0003]一般的なストレスシグナル伝達経路はシグナル認識で始まり、続いて、二次メッセンジャー（例えば、イノシトールリン酸および活性酸素種）が産生される。この二次メッセンジャーは、細胞内Ｃａ２＋レベルを調節することができ、細胞保護に直接関わるタンパク質または特異的ないくつかのストレス調節遺伝子を制御する転写因子を対象とするタンパク質リン酸化反応系をしばしば誘発することができる。この遺伝子の産物は、調節分子、例えばアブシジン酸（ＡＢＡ）、エチレン、およびサリチル酸などの植物ホルモンの産生に関与する可能性がある。この調節分子は、次に２回目のシグナル応答を伝えることができる。
【０００４】
[0004]植物ホルモンのアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ、ＡＢＡ）は、渇水および塩分ストレスに対する応答を含む様々な生理的過程を調節する。ＡＢＡは水不足の条件下で産生され、気孔の閉鎖を起こし、渇水および塩分ストレスに対する耐性をもたらす。
【０００５】
[0005]特定の転写因子の発現を変えることにより、植物のストレス耐性に大きく影響を与えることができる。例えば、転写因子Ｃ−ＢＯＸ結合因子−１（Ｃ−ＢＯＸ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＦＡＣＴＯＲ−１）（ＣＢＦ１）の過剰発現により、植物の低温ストレスに対する耐性が高まる。転写因子の脱水応答性エレメント結合−１Ａ（ＤＥＨＹＤＲＡＴＩＯＮ−ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥ  ＥＬＥＭＥＮＴ  ＢＩＮＤＩＮＧ−１Ａ）（ＤＲＥＢ１Ａ）の誘導発現も、渇水、塩分および低温などのいくつかのストレス条件に対する耐性を向上させる。
【０００６】
[0006]ストレスシグナル伝達は、関連する全てのシグナル伝達分子の適切な空間的および時間的な協調を必要とする。ＭＹＢ（元々、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）の形質転換決定因子として同定された）遺伝子は、真核生物の大きな転写調節因子群を含み、様々な生物学的機能に関与する。ＭＹＢタンパク質の共通点は、動物、植物および酵母間で保存されている機能的なＤＮＡ結合ドメイン（ＭＹＢドメイン）の存在である。一般的に、ＭＹＢドメインは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３と呼ばれる、１から３個の不完全（同一ではない）反復から成る。各反復は、約５０アミノ酸長であり、第２および第３のヘリックスがヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）ＤＮＡ結合構造を形成する３つのヘリックスを含む。ＭＹＢタンパク質は、ＭＹＢドメイン以外にほとんど配列相同性を示さず、ドメイン内の反復の数に基づいてサブファミリーに分類される。
【０００７】
[0007]植物において、一部のＭＹＢ遺伝子が特徴付けられており、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）では１００個を超える遺伝子が同定された。動物とは対照的に、多くの植物ＭＹＢ遺伝子はＲ２Ｒ３−ＭＹＢサブファミリーに属する。植物ＭＹＢ遺伝子は、植物生育、ホルモンシグナル伝達および代謝の多くの側面の調節に関与することがわかっている。ｃ−Ｍｙｂ（細胞増殖）に関連する「古典的な」ＭＹＢ因子は、動物、植物および他の高等真核生物における細胞周期の制御に関与する可能性がある。植物のＭＹＢタンパク質の機能は、二次代謝の調節、細胞形態形成の制御ならびに分裂組織形成および細胞周期の調節などを含む。
【０００８】
（開示の概要）
[0008]植物のストレス耐性経路に関与する遺伝子の調節因子、特に転写因子は、たった１個の遺伝子が耐性表現型をもたらす遺伝子のカスケード全体を活性化することができるので、植物の耐性操作をするのに有用である。
【０００９】
[0009]ストレスに対する植物応答を改良する方法は、
（ａ）ヌクレオチド配列が配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、植物に移入するステップと、
（ｂ）植物においてそのＤＮＡ分子を発現させるステップと
を含む。当該ＤＮＡ分子は、植物ゲノムに安定して組み込まれるか、または一時的に発現される配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。さらに応答を改良するために、ストレスに対する植物の応答を改良する他のＤＮＡ分子も移入してもよい。
【００１０】
[00010]ストレスは、低温、浸透圧、渇水またはアブシジン酸であってよい。
【００１１】
[00011]ポリペプチドは、配列番号１に記載のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＨＯＳ１０転写因子である。当該植物は単子葉植物または双子葉植物である。
【００１２】
[00012]トランスジェニック植物は、ＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含み、植物内でのそのタンパク質の発現が高まることにより植物の低温耐性が高まる。植物は単子葉植物または双子葉植物であってよい。
【００１３】
[00013]植物の種子は、配列番号1に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む。
【００１４】
[00014]発現カセットは、ＨＯＳ１０ポリペプチドをコードする、単離された核酸配列（配列番号２）と操作可能に連結された植物細胞において機能するプロモーターを含むことにより、植物細胞内でのそのポリペプチドの発現を増強させ、植物の低温耐性が高まる。
【００１５】
[00015]プロモーターは、ストレス誘導性、例えば、ＡＢＡ誘導プロモーター、膨圧誘導プロモーター、およびエチレン応答プロモーターであってよい。
【００１６】
[00016]プロモーターは、ウイルス外被タンパク質プロモーター、植物組織特異的プロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ｎｏｓプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、チューブリンプロモーター、ナピンプロモーター、アクチンプロモーター、ｃａｂプロモーター、ＰＥＰＣａｓｅプロモーター、７Ｓ−α’−コングリシニンプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、トマトＥ８プロモーター、パタチンプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター、大豆種子タンパク質グリシニンプロモーター、大豆栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージＳＰ６プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、および根細胞プロモーターであってよい。
【００１７】
[00017]植物ベクターはＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含み、植物におけるそのポリペプチドの発現により植物の低温耐性が高まる。
【００１８】
[00018]宿主植物細胞はＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む。植物細胞におけるそのタンパク質の発現により植物の低温耐性が高まる。
【００１９】
[00019]植物ベクターはＨＯＳ１０ポリペプチド（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む。植物におけるそのポリペプチドの発現により植物の塩分耐性が高まる。
【００２０】
[00020]宿主植物細胞はＨＯＳ１０タンパク質（配列番号１）をコードする組換え核酸を含む。植物細胞におけるそのポリペプチドの発現により植物の塩分耐性が高まる。
【００２１】
[00021]ストレス耐性の研究に使用されるモデル植物はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である。キメラのＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣトランス遺伝子および高感度ビデオ画像技術を含む遺伝学的スクリーニングを用いて、複数のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のストレス応答変異体を単離した。ＲＤ２９Ａプロモーターは、低温、浸透圧ストレスおよびＡＢＡ応答性であった。ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣトランス遺伝子を発現する生物発光シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を用いて、高塩分、低温およびＡＢＡによるストレス応答遺伝子の誘導を改変した複数のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体を同定した。この変異体は、様々な非生物ストレスまたはＡＢＡ処理に応答して、構成的（ｃｏｓ）、高度（ｈｏｓ）、または低度（ｌｏｓ）レベルで改変されたＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ遺伝子の発現を示した。
【００２２】
（定義）
[00022]「プロモーター」は、転写の開始点から上流および／または下流に位置する核酸分子の領域または配列を指し、ＲＮＡポリメラーゼならびに転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与する。「植物プロモーター」は、植物細胞で転写を開始させることができるプロモーターである。このプロモーターは、植物遺伝子または他の生物、例えば植物細胞に感染可能なウイルスから得ることができる。ストレス誘導プロモーターは、外因性ストレス応答、例えば塩分、渇水および低温に応じて、操作可能に連結された異種配列から転写を開始させることができる植物プロモーターを指す。このプロモーターは機能するのに全長である必要はない。
【００２３】
[00023]「操作可能に連結された」とは、プロモーターと別の核酸分子の間の機能的な連結を指し、このプロモーター配列が当該他の配列に対応するＲＮＡの転写を開始させる。
【００２４】
[00024]「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖分子を形成する順番に並べられた一連のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基を指す。
【００２５】
[00025]「植物」は、全植物体、シュート栄養器官／構造体（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花器官／構造体（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、内胚乳、および種皮など）および果実（成熟した子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、トリコームなど）、ならびに同一物の後代を含む。本発明の方法で利用できる植物類は、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ、および多細胞藻を含む、形質転換法の影響を受けやすい高等植物および下等植物の類と概ね同等である。異数体、多数体、二倍体、ハプロイドおよび半接合体など様々な倍数レベルの植物を含む。
【００２６】
[00026]「組換え」とは、人工組換えポリヌクレオチド、あるいは人工組換えポリヌクレオチドのコピーまたは相補体を指す。例えば、別のポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、人工組換えの結果として他のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含んでもよい。
【００２７】
[00027]「遺伝子」は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質をコードする他のＤＮＡ、またはＲＮＡ分子、および発現の調節に関与するそのコード配列に隣接する領域を指す。
【００２８】
[00028]２つの核酸またはポリペプチド配列との関連において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ上で最大に一致するように並べたとき、同一である２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージを用いるとき、同一でない残基の位置がしばしば保存的アミノ酸置換により異なり、その位置でアミノ酸残基が類似する化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されることにより分子の機能特性を変えないことが認識されている。このような保存的置換で異なる配列を、「配列類似性」または「類似性」を有すると言う。
【００２９】
[00029]本明細書中で使用するｈｏｓ１０−１（およびｍｙｂ８−１）はＴ−ＤＮＡ挿入により生じる変異体ＤＮＡ分子を指す。ｈｏｓ１０（ｍｙｂ８）は対応する遺伝子を指す。ＨＯＳ１０（ＭＹＢ８）はｈｏｓ１０（ａｔｍｙｂ）遺伝子がコードするポリペプチドを指す。ＨＯＳ１０は、ＡｔＭＹＢ８または単なるＭＹＢ８と同義語である。
【００３０】
（開示の詳細な説明）
[00037]本発明の開示の概念を、本明細書中の図面および説明により詳細に例示し、記載するが、これらの例示および説明は例であり特徴が制限されるものではないと考えるべきであり、例示的な実施形態を示して記載するに過ぎず、本発明の開示の思想の範囲内でもたらされる全ての変更および修正が保護されるべきであると理解される。
【００３１】
[00038]ＨＯＳ１０は、ＲＤ２９Ａを含むストレス応答遺伝子の負の調節因子であると思われる。特徴付けのために、低温、ＡＢＡまたはＮａＣｌに応答して、ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ遺伝子の誘導を上昇させる変異体ｈｏｓ１０−１を選択した（図１）。この変異に関与する遺伝子座をＴＡＩＬ−ＰＣＲにより同定したが、ｈｏｓ１０は、ＡｔＭＹＢ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ２０７９９１、遺伝子識別Ａｔ５ｇ３５５１５）に相当するＲ２Ｒ３型ＭＹＢ転写因子をコードしている。構成的に、または渇水などのストレス反応に応答して（例えば、ＡＢＡ誘導プロモーターの下で）、ｈｏｓ１０を発現するトランスジェニック植物は、ｈｏｓ１０を発現しないかまたは低レベルで発現する植物より、外部ストレスに対して抵抗性または耐性を示す。
【００３２】
[00039]図１は、低温、ＡＢＡ、およびＮａＣｌに応答したとき、野生型苗よりもｈｏｓ１０−１において、ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ発現が顕著に高いことを示す。ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣの発現は、室温下でも野生型よりｈｏｓ１０−１で高い。ｈｏｓ１０−１変異体は、低温、ＡＢＡまたは浸透圧ストレスに応答して、ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ発現を強める。（Ａ）ではＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ発現を、発光強度（カウント／植物）として定量的に測定した。野生型苗およびｈｏｓ１０−１苗について、室温、あるいは０℃で２４時間、１００Ｍ  ＡＢＡを３時間、または３００ｍＭ  ＮａＣｌを５時間処理後に得られた発光イメージを示す。右のスケールバーは暗色（最低）から白色（最高）の発光強度を示す。（Ｂ）は（Ａ）で示される発光イメージの定量化を示す。データは、２０の個々の苗由来の発光強度の平均を示す。誤差バーは標準偏差を示す。
【００３３】
[00040]ｈｏｓ１０−１変異植物は低温、塩分およびＡＢＡ処理に対して高い感受性を示すため、ＨＯＳ１０（ＭＹＢ８）の発現により、これらのストレス反応に対する抵抗性または耐性が増強される。例えば、ｈｏｓ１０−１変異植物のＨＯＳ１０ポリペプチドの異所性発現により、空ベクターで形質転換したｈｏｓ１０−１変異植物と比較して、低温処理に対する耐性が高まった（実施例１）。
【００３４】
[00041]耐凍性アッセイにおいて、ｈｏｓ１０−１変異植物は冷凍に対して劇的に感受性を示した（図２）。ｈｏｓ１０−１変異植物は低温順化が不完全である（図２）ため、冷凍感受性表現型をもたらした。（Ａ）では生育チャンバーで４週生育させた野生型およびｈｏｓ１０−１植物を、光条件（１６時間明条件、８時間暗条件）下、８日間４℃で低温順化させた後、冷凍処理（−８℃で４時間）した。冷凍処理７日後に写真を撮影した。（Ｂ）は（Ａ）で示した冷凍処理７日後に生存している植物の統計分析である。誤差バーは標準偏差を示す（ｎ＝６０）。（Ｃ）は電解質漏出アッセイである。植物を８日間４℃にさらすことにより低温誘導順化を成し得た。ｈｏｓ１０−１（Ａ）、低温順化させたｈｏｓ１０−１、野生型（Ａ）、低温順化させた野生型を示す。誤差バーは標準偏差を示す（ｎ＝８）。
【００３５】
[00042]組織特異的な形式によるｍｙｂ８（ｈｏｓ１０）の発現も本発明の開示の範囲内にある。例えば、根特異的プロモーターの下でのｍｙｂ８（ｈｏｓ１０）の発現により、植物の根でｍｙｂ８（ｈｏｓ１０）の選択的発現が起こり、高塩分または凍結から根細胞を保護する。根特異的プロモーターには、例えばエンドウ豆由来メタロチオネイン様遺伝子ＰｓＭＴＡのプロモーター（Ｆｏｒｄａｍ−Ｓｋｅｌｔｏｎら、１９９７年）などがある。植物プロモーターのシス作用性植物調節配列の他の例は、http://rarge.gsc.riken.go.jp/cdna/promoter/およびＨｉｇｏら（１９９９年）に記載されている。
【００３６】
[00043]花または他の任意の花の部分のｍｙｂ８（ｈｏｓ１０）の組織特異的発現により、凍結に対する耐性が高まる。例えば、花弁または萼片特異的プロモーターの制御下での発現により、不利な温度状況の間に耐凍性がもたらされる。ペチュニア由来カルコン合成酵素（ＣＨＳ）プロモーターは、花弁特異的プロモーターの一例である。
【００３７】
[00044]果実、葉、茎、葉柄または他の任意の植物部分におけるｍｙｂ８（ｈｏｓ１０）の組織特異的発現により凍結に対する耐性が高まる。
【００３８】
[00045]ｈｏｓ１０−１変異植物で観察されるＲＤ２９Ａの高度の誘導は、過感受性によるフィードバック応答に起因する可能性がある。この変異体がストレス処理に高い感受性を示し、ＲＤ２９Ａなどのストレス応答遺伝子が容易に活性化され、減少した変異体のストレス耐性を補うからである。ＨＯＳ１０は、ストレス耐性およびストレス遺伝子発現の両方に重要であるようである。
【００３９】
[00046]ｈｏｓ１０−１変異は、ＡＢＡ感受性および水分の損失に影響するようである（図３）。ｈｏｓ１０−１変異体の種子発芽はＡＢＡ阻害に対して過感受性を示し（左パネル）、ｈｏｓ１０−１変異植物は、水不足条件下でより多くの水分を失う（右パネル）。誤差バーは標準偏差を示す（左パネルはｎ＝５、右パネルはｎ＝８）。
【００４０】
[00047]ｈｏｓ１０−１変異は変異植物の塩分感受性に影響するようである（図３）。ｈｏｓ１０−１植物は、以下に示すようにＮａＣｌおよびＬｉＣｌに対して過感受性を示す。（Ａ）ＭＳ培地または８０ｍＭ  ＮａＣｌを補足したＭＳ培地で生育したｈｏｓ１０−１苗および野生型苗；（Ｂ）ＮａＣｌに対するｈｏｓ１０−１苗および野生型苗の用量反応性。データは相対的な根の生育を示す（０ｍＭ  ＮａＣｌにおける生育を１００％とする）；（Ｃ）ＬｉＣｌに対するｈｏｓ１０−１苗および野生型苗の用量反応性。（Ｂ）および（Ｃ）の誤差バーは標準偏差を示す（ｎ＝１６）；（Ｄ）ｈｏｓ１０−１苗および野生型苗におけるＮａ＋蓄積。誤差バーは標準誤差を示す（ｎ＝８）；（Ｅ）ｈｏｓ１０−１苗および野生型苗におけるＫ＋蓄積。誤差バーは標準誤差を示す（ｎ＝８）。
【００４１】
[00048]ｈｏｓ−１０遺伝子座をＴＡＩＬ−ＰＣＲにより同定したが、これはＲ２Ｒ３型ＭＹＢ転写因子をコードしている。野生型ａｔｍｙｂ８遺伝子は、ｈｏｓ１０−１変異体を補完することができた（図５）。
【００４２】
[00049]ｈｏｓ１０−１／ｍｙｂ８−１変異植物におけるａｔｍｙｂ８（ｈｏｓ１０）発現は、凍結に対する耐性を復活させた（図６）。ｈｏｓ１０遺伝子の構造および変異型である翻訳開始コドンに対するＴ−ＤＮＡ挿入位置を図６に示す。（Ａ）黒い長方形はエキソンを示し、直線はイントロンを示す。ｈｏｓ１０−１／ｍｙｂ８−１変異体に挿入されたＴ−ＤＮＡを示す；（Ｂ）は推定されるｈｏｓ１０遺伝子を含むゲノム断片がｈｏｓ１０−１／ｍｙｂ８−１変異体を補完したことを示す。冷凍処理（−８℃で３時間）８日後に写真を撮影した。ｍｙｂ８−１＋ベクター、補完に用いた空ベクターで形質転換したｍｙｂ８−１）；ｍｙｂ８−１＋ＭＹＢ８、野生型ａｔｍｙｂ８遺伝子で形質転換したｍｙｂ８−１；（Ｃ）ｈｏｓ１０（ａｔｍｙｂ８）を他の種由来の配列と比較した配列アラインメント。
【００４３】
[00050]染色体の融合部位および融合されたコピー数に応じて、トランスジェニック植物は、構成的に、または刺激に反応して様々なレベルでトランス遺伝子を発現する可能性がある。トランス遺伝子の融合が無作為であるため、トランスジェニック植物が様々なレベルで発現する可能性がある。標準的なＲＴ−ＰＣＲまたは他の任意の定量法を用いて、所望の発現レベルで選択され、安定して形質転換されたトランスジェニック植物を得ることができる。
【００４４】
[00051]複数の遺伝子座由来の遺伝子により渇水および低温生育ストレスを管理してもよい。例えば、ＲＤ２９Ａ遺伝子のプロモーター領域で同定されたシス作用性エレメントは、渇水および低温の両方に応答する。この脱水応答性エレメント（ＤＲＥ）は脱水応答遺伝子の発現調節に必要とされる。ＣＢＦ遺伝子は、それらのプロモーターにＣ−リピート／ＤＲＥ配列を含むい複数の遺伝子の発現を制御する転写活性化因子をコードする。ＭＹＣおよびＭＹＢタンパク質などの他の転写調節因子は、ｒｄ２２遺伝子の脱水およびアブシジン酸（ＡＢＡ）誘導発現における活性化因子である。ｒｄ２２遺伝子のプロモーターは、塩基性ヘリックス・ループヘリックスタンパク質ＭＹＣのための２つの近接位置の認識部位を有する６７ｂｐ断片を含む。ｒｄ２２遺伝子のプロモーターにはＭＹＢの推定認識部位もある。３つの認識部位はすべてｒｄ２２の脱水誘導発現のシス作用性エレメントとして機能する。したがって、植物では、複数のシグナル伝達経路でその発現を調節または始動する複数の遺伝子が発現していると考えられる。
【００４５】
[00052]適切なプロモーターは、以下のうちの任意の１つ、または植物で機能し、ｈｏｓ１０遺伝子の発現を可能にする任意のプロモーターである。ウイルス外皮タンパク質プロモーター、組織特異的プロモーター、単子葉植物プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ｎｏｓプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、チューブリンプロモーター、ナピンプロモーター、アクチンプロモーター、ｃａｂプロモーター、ＰＥＰＣａｓｅプロモーター、７Ｓ−α’−コングリシニンプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、トマトＥ８プロモーター、パタチンプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター、大豆種子タンパク質グリシニンプロモーター、大豆栄養貯蔵タンパク質プロモーター、バクテリオファージＳＰ６プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、ＰＭプロモーター、根細胞プロモーター、ＡＢＡ誘導プロモーター、または膨圧誘導プロモーター、および他の任意のストレス誘導プロモーター。ストレス誘導プロモーターが特に有用である。一時的に活性化するストレス誘導植物プロモーターの例は、米国特許第６４１４２２１号明細書に記載されている。
【００４６】
[00053]植物ベクターは、ＨＯＳ１０（ＡｔＭＹＢ８）タンパク質をコードする、単離された核酸を含む。植物細胞におけるこのタンパク質の発現により、植物細胞の低温、渇水、および塩分耐性が高まる。植物ベクターは、植物細胞で機能するプロモーターをさらに含むことができる。
【００４７】
[00054]トランスジェニック植物はＨＯＳ１０タンパク質をコードする、単離された核酸（配列番号２）を含む。植物細胞内でバックグラウンドレベルを超える高められたタンパク質発現により、植物細胞の低温、渇水、および塩分耐性が高まる。
【００４８】
[00055]本発明で開示するトランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であってよい。単子葉植物の例は、トウモロコシ、米（Ｒｉｃｅ）、ライムギ、キビ、小麦、オオムギ、ソルガム、カラスムギ、バナナ、およびランである。双子葉植物の例は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、キャベツ、ポテト、トマト、タバコ、オレンジおよび他の柑橘類果物類、スカッシュ、綿（ｃｏｔｔｏｎ）、茶、大豆および他の全てのマメ科植物、カシュー、ピスタチオ、リンゴ、モモ、イチゴである。
【００４９】
[00056]シグナル伝達経路は、単子葉植物と双子葉植物で保存されている。いくつかの重要なシグナル伝達経路が、双子葉植物と単子葉植物の間で保存されている。例えば、ストレス応答におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードは、単子葉植物と双子葉植物で保存されている。さらに、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、トマト（Ｔｏｍａｔｏ）、タバコ（Ｔａｂａｃｃｏ）および米（Ｒｉｃｅ）由来ＭＹＢ８（ＨＯＳ１０）相同体は、顕著な構造的類似性を示す（図６Ｃ）。アブシジン酸（ＡＢＡ）およびエチレンなどの植物ホルモンが介したシグナル伝達メカニズムも、植物種間で保存されている。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などの双子葉植物由来のいくつかの遺伝子は、米などの単子葉植物で機能的に発現されている。構成的に、または誘導プロモーターもしくは組織特異的プロモーターの下でのＭＹＢ８（ＨＯＳ１０）のトランスジェニック発現により、単子葉植物と双子葉植物の両方においてストレスに対する耐性が高まる。
【００５０】
[00057]種子は、ＨＯＳ１０ポリペプチドをコードする、単離された核酸を含む。植物細胞内のポリペプチドの発現により、植物細胞の低温、渇水、および塩分耐性が高まる（配列番号１）。
【実施例】
【００５１】
（実施例１  ｈｏｓ１０−１変異植物におけるＨＯＳ１０の発現によるストレス感受性の補完）
[00058]標準的な形質転換法により、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下の野生型ｈｏｓ１０遺伝子を含む発現ベクターを用いて、ｈｏｓ１０−１／ｍｙｂ８−１変異植物を形質転換した。図６（Ｂ）は、推定上のｈｏｓ１０遺伝子を含むゲノム断片がｈｏｓ１０−１／ｍｙｂ８−１変異体を補完したことを示す。冷凍処理（−８℃で３時間）８日後に写真を撮影した。この処理サンプルは、ｍｙｂ８−１＋ベクター、空ベクターで形質転換したｍｙｂ８−１（補完に使用）、ｍｙｂ８−１＋ｍｙｂ８、野生型ｈｏｓ１０遺伝子で形質転換したｍｙｂ８−１であった。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下の野生型ｈｏｓ１０遺伝子を用いて形質転換したｈｏｓ１０−１変異体は、冷凍条件に対して感受性を示さなかった。
【００５２】
（実施例２  ＨＯＳ１０の過剰発現による植物の低温耐性の増強）
[00059]３５Ｓプロモーターのみ含むベクターで形質転換した植物（６）、形質転換されていない植物（７）およびｈｏｓ１０遺伝子を駆動する３５Ｓプロモーターを含むベクターで形質転換した植物（１〜５）を１週間、低温（４℃）で順化させた。次に、植物を０℃〜−１６℃の冷凍温度に２４時間さらした。植物の全てが生存した最低温度を記録し、各トランスジェニック系統の低温耐性とした。ＨＯＳ１０コード配列ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、コントロール（ベクターのみで形質転換した）と比較して、ＨＯＳ１０遺伝子の発現を評価した。
【００５３】
【表１】
2006522608.tif 000002
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ実験の結果（表１）は、形質転換していない植物と比較したときの、３５Ｓプロモーターの下でＨＯＳ１０を発現する植物の相対吸光度ユニットを示す。例えば、非形質転換植物（系統ｎｏ．７；表１）の吸光度ユニットを基本値（＋）として使用し、ＨＯＳ１０過剰発現植物におけるＨＯＳ１０の相対発現を計算した。
【００５５】
（材料と方法）
形質転換
【００５６】
[00060]組換え発現カセットを提供するために、本発明の開示において同定されたＤＮＡ断片が単離され、植物細胞で機能する少なくとも１つのプロモーターとコンバインさせる。組換えＤＮＡ断片を含む発現カセットを、本領域の技術を熟知する者に知られる方法で任意の標準的な発現ベクターにサブクローニングする。適切な発現ベクターには、原核細胞および／または真核細胞で自己複製するプラスミドなどがある。発現ベクターを、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、エレクトロポレーション、微粒子銃、タングステン微粒子およびリポソーム法などの現在利用可能な方法で原核細胞または真核細胞に導入する。このベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはアグロバクテリウムなどの原核細胞に導入する。通常、発現ベクターにコードされる選択マーカーまたはスクリーニングマーカーを用いて、形質転換細胞を選択する。トランスジェニック単子葉植物を作成する方法は、米国特許第６２８１４１１号明細書に記載されており、その開示を方法の参照により本明細書に組み込む。
【００５７】
[00061]発現カセットまたはベクターを、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む植物細胞に導入する。形質転換に使用される植物細胞、組織または器官には、花、カルス、未熟胚、分裂組織、配偶子組織、または懸濁培養細胞などがある。植物の形質転換を促進するタンパク質をコードする他の組換えＤＮＡ分子を導入してもよい。形質転換植物細胞を植物で再生し、その植物を、高塩分、利用可能水分の減少または不利な温度などのストレス条件下で生育または繁殖するその能力について試験する。植物の種類、遺伝子発現レベル、および組換えＤＮＡ断片がコードするタンパク質の活性に応じて、組換えＤＮＡを植物へ導入するにより、ストレス条件に対する耐性または抵抗性の表現型を植物に与える。
【００５８】
[00062]導入された組換えＤＮＡ断片を形質転換植物細胞で発現させ、その後得られた細胞に安定的に（体細胞におよび交配によって）維持される。ベクターは、植物細胞において組換えＤＮＡ断片を導入、維持および発現する能力を持ち、その組換えＤＮＡは、植物および動物、細菌、真菌、酵母またはウイルスなどの様々な生物源から得られる。さらに、このベクターを多種多様の植物細胞に導入する。
【００５９】
[00063]アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドのＴ−ＤＮＡを用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、タバコ、ポテトおよびアルファルファなどの双子葉植物における外来遺伝子の導入および発現が行われた。組換えＤＮＡ法により、多種多様の外来ＤＮＡをアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに導入することができる。組換えＴｉプラスミドを含む細菌の感染後、外来ＤＮＡを宿主植物染色体に挿入し、遺伝子操作された細胞を作成し、その後、遺伝子操作された植物を作成する。別の方法は、遺伝子ベクターとしての毛根誘発（Ｒｉ）プラスミドの導入である。さらに、モデル系としてＴｉプラスミドを用いて、単子葉植物用の形質転換ベクターを人工的に構築することが可能である。マイクロインジェクション、あるいは単子葉植物のプロトプラストとＴ領域を含む細菌のスフェロプラストの融合など、その後、植物核ＤＮＡに組み込むことができる人為的な方法でＴｉプラスミドを単子葉植物に導入してもよい。選択マーカーおよび本明細書において記載される異種遺伝子発現カセットを、植物における操作のために設計された適切な発現ベクターに配置してもよい。適切なベクターは、例えば米国特許第５８８８７８９号明細書および米国特許第５８８９１８９号明細書に記載されている。
【００６０】
[00064]植物ゲノムに挿入ＤＮＡを移入することができる他の核酸分子、例えば、ＣａＭＶまたはジェミニウイルスのようなＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およびウイロイドなどの植物病原菌、オルガネラ（例えば、クロロプラストまたはミトコンドリア）の染色体外ＤＮＡエレメントのような不安定な植物ゲノム構成成分由来のＤＮＡ分子、または核にコードされる制御エレメント、安定した植物ゲノム構成成分由来のＤＮＡ分子（例えば、導入されたＤＮＡをオルガネラゲノムおよび核ゲノムに組み込み、正常に複製し、自己複製し、細胞分裂および植物の有性生殖で正常に分離し、植物の後代に受け継がれることを可能にする複製開始点および他のＤＮＡ配列）またはトランスポゾンに、組換えＤＮＡを導入することによって、組換えＤＮＡ断片を用いた植物細胞の形質転換を行ってもよい。
【００６１】
[00065]感染性プラスミドを有する微生物、感染性ウイルス、リポソームの使用、機械的なまたはレーザービーム法によるマイクロインジェクション、染色体全体または染色体断片、エレクトロポレーション、および微粒子銃によって、組換えＤＮＡを植物細胞または組織に直接的に送達してもよい。例えば、所望の植物種の部分由来のカルス細胞または任意の他の適切な組織を、様々な標準的方法（例えば、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム、プロトプラスト融合、または微粒子銃）により、少なくとも対象の組換えＤＮＡ断片、選択マーカー、および適切なプロモーターを含む発現カセットで形質転換する。適切な転写調節領域（プロモーター）は、渇水、塩分、および高温などの様々なストレス反応に応答して、転写を調節する植物プロモーターを含む。
【００６２】
[00066]ｈｏｓ１０−１変異体の単離：活性化タギングベクターｐＳＫＩ０１５（Ｚｈｕら、２００２年）を用いるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介（ＧＶ３１０１株）Ｔ−ＤＮＡ形質転換により、野生型とされるホモ接合型トランス遺伝子ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ（Ｉｓｈｉｔａｎｉら、１９９７年）を発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物（Ｃ２４生態型）に突然変異を起こした。Ｉｓｈｉｔａｎｉら（１９９７年）が記載したようなＣＣＤカメラを用いた発光イメージングにより、低温、ＡＢＡ、および／または浸透圧ストレスに応じてＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣの発現が改変された変異体をスクリーニングするのに、Ｔ２植物の種子を使用した。
【００６３】
[00067]耐凍性：土壌で生育させたロゼット段階（ｒｏｓｅｔｔｅ  ｓｔａｇｅ）の野生型およびｈｏｓ１０−１植物を耐凍性試験に使用した。低温順化処理のため、植物を長日性光周期（１６時間明条件、８時間暗条件）下で４℃の低温室に放置した。十分に発育したロゼット葉を用いて、基本的にＳｕｋｕｍａｒａｎとＷｅｉｓｅｒ（１９７２年）ならびにＲｉｓｔｉｃとＡｓｈｗｏｒｔｈ（１９９３年）に記載したように、凍結処理による電解質漏出を測定した。簡単に述べると、各処理において、２００μｌのＨＰＬＣグレードＨ２Ｏを含む試験管に１つの切除した葉片を入れ、その試験管を０℃の温度設定でプログラム可能な冷却浴（モデルＲＴＥ−２１０、Ｔｈｅｒｍｏ  ＮｅｓＬａｂ、ニューハンプシャー州ポーツマス）内に置いた。各温度処理に対し８反復行った。バス温度を、３０分後に１℃低下する割合で−１０℃まで低下させるようにプログラムした。設定温度に達すると、この試験管をバスから取り出し、迅速に氷水に移し、一晩かけて徐々に解凍した。その後、この試験管に５ｍｌのＨＰＬＣ  Ｈ２Ｏを加え、２４時間振とうし、溶液の伝導率を電気伝導率計（モデル３５、ＹＳＩ  Ｃｏ．、オハイオ州）で測定した。その後、その葉片を含む試験管を加熱し、４０分間ボイルした。室温まで冷却後、溶液の伝導率を再度測定した。ボイル後の伝導率を上回るボイル前の伝導率の割合により電解質漏出の割合を算出した。
【００６４】
[00068]生育チャンバーの土壌で生育させた３週目の野生型およびｈｏｓ１０−１植物を、低温順化のために、最初に長日性光周期条件下、４℃で１週間インキュベートした。この低温順化後、植物を−８℃で４時間凍結させた。この処理終了後、迅速にこの植物を４℃に移し、一晩インキュベートして凍結土壌を徐々に解凍させた。７日後に植物の損傷を記録した。
【００６５】
[00069]ＨＯＳ１０遺伝子のクローニング：ｈｏｓ１０−１植物に挿入したＴ−ＤＮＡの左ボーダー（ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）に隣接するＤＮＡ断片を、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｌｉｕら、１９９５年；Ｚｈｕら、２００２年）により単離し、記載されたように（Ｚｈｕら、２００２年）クローニングベクターｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）にサブクローニングした。単離断片全体の配列を決定した。Ｔ−ＤＮＡダイアグノーシスＰＣＲ（Ｚｈｕら、２００２年）を行うために以下のプライマー対を設計した：順方向、５’−ＡＣＡＡＡＴＣＧＡＧＴＣＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣ−３’；逆方向、５’−ＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣＧ−３’。
【００６６】
[00070]ＨＯＳ１０のコード領域を、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲで増幅した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、野生型植物（コロンビア生態型）から総ＲＮＡを抽出し、ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ合成に総ＲＮＡ３μｇを使用した。ＨＯＳ１０のための遺伝子特異的プライマーは以下の通りであった：順方向、５’−ＡＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧ−３’（下線がＳａｃＩ部位）および逆方向、５’−ＡＣＧＴＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＧＡＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＡＧＡＴＣ−３’（下線がＸｂａＩ部位）。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングすることにより、ｃＤＮＡクローン１０−１３３が生じ、この挿入部分の配列をシークェンシングにより確認した。その後、クローン１０−１３３からＨＯＳ１０を放ち、ＳａｃＩ部位およびＸｂａＩ部位の間でバイナリーベクター９９−１にクローニングすることにより、ＣａＭ３５Ｓプロモーターの下でＨＯＳ１０の発現カセットが生じた。このコンストラクトを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介（ＧＶ３１０１株）Ｔ−ＤＮＡ形質転換により、ｈｏｓ１０−１変異植物に導入した。ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に耐性である一次形質転換体を、土壌に移して十分に生育させた。この形質転換体の後代を、ＣＣＤカメラを用いてＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ発現および上述の耐凍性について試験した。
【００６７】
[00071]イオン含量測定および塩分ストレス試験：種子を表面滅菌（15分間の２％次亜塩素酸ナトリウム処理）し、１％寒天で固化したムラシゲ・スクーク（ＭＳ）基礎塩混合物、２％スクロースを含む培地（ｐＨ５．７）に播種した。播種後に種子を４℃で２から４日間層化した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変異体の特徴付けのために、ＭＳに何も添加しないか、あるいは４０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００ｍＭのＮａＣｌ、または５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭのＬｉＣｌを添加した。発芽培地で生育させた３週間目の苗（ｎ＝４０〜６０）を、１／２濃度のＭＳ塩２００ｍｌ、２％スクロース（ｐＨ５．７）を含む５００ｍｌフラスコに移した。このフラスコを冷却蛍光灯（１６時間明条件、８時間暗条件）下、２２℃、１２０ｒｐｍで振とうした。２日後、ＮａＣｌを、所望の最終ＮａＣｌ濃度になるように添加し、苗をさらに２日間生育させた。その後、苗を刈り取り、過剰量の脱イオンＨ２Ｏで洗い流し、４８時間６５℃で乾燥させて重量を測定した。その後、基本組織（各３００ｍｇ）を０．１Ｍ硝酸で４時間抽出し、ろ紙（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でろ過した。原子吸光分析装置（モデルＳｐｅｃｔｒＡＡ−１０、Ｖａｒｉａｎ、オーストラリア、スプリングベール）により、Ｎａ＋またはＫ＋含量を決定した。
【００６８】
[00072]種子発芽および水分損失：表面滅菌したｈｏｓ１０−１種子および野生型種子を、ペトリ皿内の水または様々な濃度のＡＢＡに浸したろ紙上に播いた。休眠を打破するために、このペトリ皿を4℃で３日間暗条件に保管後、発芽のために室温の明条件下に置いた。種子は根が出現した時点で発芽したとみなされた。
【００６９】
[00073]無処理またはＡＢＡ処理（１００μＭ  ＡＢＡ、３時間）の土壌生育ｈｏｓ１０−１植物および野生型植物から分離した苗条を実験台上に置き、３時間以上水分を損失させた。この水分損失を元の新鮮重量の割合で示した。
【００７０】
[00074]以下の文献を、本発明の開示に用いたプロトコルに関する範囲内において参照により組み込む。
Ｆｏｒｄａｍ−Ｓｋｅｌｔｏｎら（１９９７年）、ＧＵＳ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ５’ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅａ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ＰｓＭＴＡ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４、６５９〜６６８頁
Ｈｉｇｏら（１９９９年）、Ｐｌａｎｔ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＰＬＡＣＥ）  ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２７、２９７〜３００頁
Ｉｓｈｉｔａｎｉら（１９９７年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９（１１）、１９３５〜１９４９頁
Ｌｉｕら（１９９５年）、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｔ−ＤＮＡ  ｉｎｓｅｒｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８、４５７〜４６３頁
ＲｉｓｔｉｃとＡｓｈｗｏｒｔｈ（１９９３年）、Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｌｅａｆ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｌ．（Ｈｅｙｎ）ｃｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｄ  ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １７２、１１１〜１２３頁
ＳｕｋｕｍａｒａｎとＷｅｉｓｅｒ（１９７２年）、Ａｎ  ｅｘｃｉｓｅｄ  ｌｅａｆｌｅｔ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｐｏｔａｔｏ  ｆｒｏｓｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ、Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．７、４６７〜４６８頁
Ｚｈｕら（２００２年）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４（１２）、３００９〜３０２８頁
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】[00030]ポリペプチドＨＯＳ１０が、低温、植物ホルモンのアブシジン酸（ＡＢＡ）、または浸透圧ストレスのいずれかに応答して、ＲＤ２９Ａ：：ＬＵＣ発現を負に制御することを示す図である。野生型（ＷＴ）は縦割り区分の左半分であり、ＨＯＳ１０−１は右半分である。変異体ＨＯＳ１０−１植物細胞はより多くの発光を発現する。（Ａ）は発光比較を示し、（Ｂ）は定量化した発光を示す。
【図２】[00031]ｈｏｓ１０−１変異体が、冷凍処理の影響を受けやすいことを示す図である。（Ａ）は植物生育比較を示し、（Ｂ）は相対的な生存の統計分析を示し、（Ｃ）は電解質漏出アッセイを示す。
【図３】[00032]ｈｏｓ１０−１変異体の種子発芽が、ＡＢＡ阻害に過感受性であり（左パネル）、ｈｏｓ１０−１変異植物が水不足条件下でより多くの水分を失う（右パネル）ことを示す図である。誤差バーは標準偏差を示す（左パネルではｎ＝５、右パネルではｎ＝８）。
【図４】[00033]（Ａ）および（Ｂ）はｈｏｓ１０−１変異植物がＮａＣｌに対して過感受性であり、（Ｃ）はＬｉＣｌに対して過感受性であり、（Ｄ）は変異苗がより多くのＮａ＋を蓄積することを示し、（Ｅ）はＫ蓄積にはほとんど相違がないことを示す図である。
【図５】[00034]（Ａ）〜（Ｅ）は、ｈｏｓ１０−１植物の生育異常を示す図である。各写真の右側が変異体であり、左側は野生型植物である。
【図６】[00035]（Ａ）はｈｏｓ１０−１遺伝子座におけるＴ−ＤＮＡの挿入位置を示し、（Ｂ）は野生型ｈｏｓ１０遺伝子によるｈｏｓ１０−１変異体表現型の補完を示し、（Ｃ）は様々な植物種におけるＨＯＳ１０（ＡｔＭＹＢ８）を比較した配列アラインメントを示す図である。ＨＯＳ１０はＲ２Ｒ３型ＭＹＢ転写因子をコードする。矢印は、Ｒ２ドメインとＲ３ドメインの境界を表す。
【図７】[00036]（Ａ）はＡｔＭＹＢ８転写因子（ＨＯＳ１０）のアミノ酸配列（配列番号１）を示し、（Ｂ）はそのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。
【図１】
2006522608.tif 000003
【図２】
2006522608.tif 000004
【図３】
2006522608.tif 000005
【図４】
2006522608.tif 000006
【図５】
2006522608.tif 000007
【図６】
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【図７】
2006522608.tif 000009
【配列表】
2006522608000001.app
【国際調査報告】
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2006522608.tif 000011
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