(57)【要約】本発明は、肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得る方法に関する。本発明は、さらに、肥満細胞培養物または肥満細胞系統を培養することを含むヘパリンタイプの分子の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約0.2 ng/mlのIL-3と少なくとも約8 ng/mlのSCFと少なくとも約0.1 ng/mlのIL-4、10 ng/mlのIL-6および／または1 ng/mlのG-CSFとを含む培地中で幼体のブタまたは胎児からの骨髄幹細胞の集団を培養することを含む肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得る方法。
【請求項２】
ブタが約2日齢〜約6週齢の間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞が培地中に少なくとも約30日間維持されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法を用いて得ることができるブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項５】
Is二糖の量がIIs二糖の量より多く、IIs二糖の量がIIIs二糖の量より多くかつIIIs二糖の量がIVs二糖の量より多いヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とするブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項６】
ヘパリンのIs、IIs、IIIsおよびIVs二糖の間の各比に近いIs、IIs、IIIsおよびIVs二糖の間の各比を示すヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項７】
少なくとも30%のIs二糖を含むヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項８】
ヘパリンのIIs二糖とIIIs二糖との間の比に近いIIs二糖とIIIs二糖との間の比を示すヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項９】
1.3〜1.9の間のIIs二糖とIIIs二糖との間の比を示すヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項１０】
106細胞当たり少なくとも0.1μgのヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項１１】
約3〜8の間のIs二糖とIIs二糖との間の比を示すヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項１２】
少なくとも10 IU/mgより大きい抗-Xa活性を示すヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項１３】
少なくとも10 IU/mgより大きい抗-IIa活性を示すヘパリンタイプの分子を産生することを特徴とする請求項5に記載のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統。
【請求項１４】
2003年4月9日に、インスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズに番号I-3010で寄託されたブタの肥満細胞系統。
【請求項１５】
2003年4月9日に、インスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズに番号I-3011で寄託されたブタの肥満細胞系統。
【請求項１６】
2003年4月9日に、インスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズに番号I-3012で寄託されたブタの肥満細胞系統。
【請求項１７】
2003年4月9日に、インスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズに番号I-3013で寄託されたブタの肥満細胞系統。
【請求項１８】
2003年4月9日に、インスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズに番号I-3014で寄託されたブタの肥満細胞系統。
【請求項１９】
不死化タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項5〜8のいずれか1つに記載の培養物または系統。
【請求項２０】
c-kitをコードする核酸を含むことを特徴とする請求項5〜8のいずれか1つに記載の培養物または系統。
【請求項２１】
T抗原をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項5〜13のいずれか1つに記載の培養物または系統。
【請求項２２】
ヘパリンタイプの分子の硫酸化に作用する酵素をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項5〜13のいずれか1つに記載の培養物または系統。
【請求項２３】
3-OSTをコードする核酸を含むことを特徴とする請求項5〜13のいずれか1つに記載の培養物または系統。
【請求項２４】
請求項4〜23のいずれか1つに記載されるかまたは請求項1〜3のいずれか1つに記載のようにして得られるブタの肥満細胞培養物あるいは肥満細胞系統を培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法。
【請求項２５】
少なくとも約0.1 ng/mlのIL-4を含む培養液中にブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統を適切な培地中で培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法。
【請求項２６】
IL-4を過剰発現するブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得て、そしてこれらの細胞を適切な培養液中で培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法。
【請求項２７】
IL-4をコードする核酸でトランスフェクションされたブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得て、そしてこれらの細胞を適切な培養液中で培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法。
【請求項２８】
配列番号3の配列を有するC-末端を有することを特徴とするc-kitタイプのブタ起源のタンパク質。
【請求項２９】
配列番号2の配列と少なくとも99％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする請求項28に記載のタンパク質。
【請求項３０】
請求項28および29のいずれかに記載のタンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項３１】
配列番号1の配列と少なくとも99％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする請求項30に記載の核酸。
【請求項３２】
3-O-スルファターゼ活性を示すブタ起源のタンパク質。
【請求項３３】
配列番号4の配列と少なくとも95％の同一性を示す配列を含む請求項32に記載のタンパク質。
【請求項３４】
請求項32および33のいずれかに記載のタンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項３５】
配列番号5の配列と少なくとも95％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする請求項34に記載の核酸。
【請求項３６】
6-O-スルファターゼ活性を示すブタ起源のタンパク質。
【請求項３７】
配列番号6の配列と少なくとも90％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする請求項36に記載のタンパク質。
【請求項３８】
請求項36および37のいずれかに記載のタンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項３９】
配列番号7の配列と少なくとも95％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする請求項38に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項30、31、34、35、38および39のいずれか1つに記載の核酸を含む細胞。
【請求項４１】
請求項28、29、32、33、36および37のいずれか1つに記載のタンパク質を発現する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得る方法に関する。本発明は、肥満細胞培養物または肥満細胞系統を培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満細胞は、炎症性反応、特にアレルギーおよび過敏症の現象に関係する造血前駆体に由来する免疫系の細胞である。これらは結合組織、特に皮膚、腸粘膜および呼吸粘膜に位置する。
【０００３】
肥満細胞は約5〜25μmの間の直径を有する球形(rounded)の外観を有しかつ中心性もしくは中心を外れた(off-center)球形の単一の核を有する。また、これらは多くの異染性細胞質顆粒形成(metachromatic cytoplasmic granulations)を特徴とする。
これらの顆粒は、炎症誘発活性を有する種々の分子種、例えばヒスタミン、セロトニン、ヘパリンまたはコンドロイチン硫酸のようなプロテオグリカン、酵素、サイトカインならびに好酸球遊走因子および好中球遊走因子(eosinophil- and neutrophil-chemoattracting factors)を含む。これらの種は、肥満細胞活性化の間に放出される。
【０００４】
活性化の後に二次応答が開始され、この間に媒介物質、例えばロイコトリエン、プロスタグランジン、PAF (血小板活性化因子)、インターロイキン(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12およびIL-13)、サイトカイン(TGF-β、γ-IFN、GM-CSF)およびケモカイン(chimiokines) (MCP-1、IL8、RANTES)の合成が起こる。これらの全ての種は、炎症性プロセスを誘発しかつT-リンパ球依存性特異的免疫応答を設定することに寄与する。
【０００５】
肥満細胞培養物はヒトおよびマウスにおいて既に得られているが、ブタにおけるこのような樹立された培養物または系統の記載は従来技術にはない。
Razinら(J. Biol. Chem., 257, 7229〜7236, 1982)は、IL-3を含有する培養液を用いてマウス肥満細胞を得ることを記載している。
Wangら(Circ. Res., 84, 74〜83, 1999)は、ラットの胸腔および腹腔から得られる血清肥満細胞の単離を記載している。種々の分子種が産生されるが、肥満細胞がラットの大動脈平滑筋細胞と共培養されるときのみである。特許出願WO99/26983号は、非常に類似の研究を記載し、他の種に対する適用に関しては比較的不明確である。
【０００６】
細胞系統がマウスにおいて樹立された(Montgomeryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11327〜11331, 1992および特許出願WO90/14418号)が、これは肥満細胞腫からである。この腫瘍はブタでは非常に希である。
【０００７】
ヒトにおいては、肥満細胞培養物を得ることは困難であると証明されている。これは、線維芽細胞との共培養系を用いて最初に可能になった(Ishizakaら, Current Opinion in Immunology, 5, 937〜943, 1993)。次いで、他の著者らは腸管細胞(intestinal cells)から肥満細胞を得ることおよびこれらの細胞を培養で約6ヶ月間SCFの存在下に維持することに成功した(Bischoffら, J. Immunol., 159, 5560〜5567, 1997)。
測定された場合、これらの種々の文献の著者らは非常に少ないヘパリンタイプの化合物の産生を報告した。
【０００８】
ブタにおいては、Emeryら(Experimental Hematology, 24, 927〜935, 1996)は、骨髄から得られた細胞の培養物を7週間維持した。しかしながら、得られた培養物は種々の細胞タイプの混合物であり、肥満細胞の均質な培養物または系統ではないことがわかる。さらに、これらの培養物は肥満細胞の均質な培養物中に未分化の細胞を含有する。
Ashrafら(Veterinary Parasitology; 29, 134〜158, 1988)は、増幅可能な培養物を維持せずに、腸粘膜からブタの肥満細胞を単離している。さらに、単離された肥満細胞の特徴付けによりヘパリンが存在しないことを明らかにする。
【０００９】
ヘパリンはグリコサミノグリカン(GAG)ファミリーに属し、これはアミノ糖(D-グルコサミンまたはガラクトサミン)とウロン酸(D-グルクロン酸またはL-イズロン酸)とからつくられる二糖配列の反復を含む直線状多糖を含む。
ヘパリン硫酸とともにグルコースアミノグリカンサブファミリーに属するヘパリンの場合、アミノ糖はD-グルコサミンである。ウロン酸は、グルクロン酸(Glc)またはイズロン酸(Ido)のいずれかである。グルコサミンはN-アセチル化、N-硫酸化およびO-硫酸化されることができる。
【００１０】
通常、「ヘパリン」の用語は、80％より多いグルコサミン残基がN-硫酸化されかつO-サルフェートの数がN-サルフェートの数より多い高度に硫酸化された多糖を意図する。サルフェート／カルボキシレートの比は、ヘパリンについては通常、2より大きい。しかし、実際に、ヘパリンの構造は非常に不均質であり、非常に異なる割合を含み得る鎖が存在する。
【００１１】
全てのGAGと同様に、ヘパリンはプロテオグリカンの形で本質的に肥満細胞により合成される。
ヘパリン合成の第一段階は、セリンおよびグリシン残基の繰返しからなるセルグリシン(serglycine)タンパク質コアの形成である。ヘパリン鎖の伸長は四糖の添加および規則的に交互のグルコサミンとウロン酸の連続添加により起こる。
【００１２】
このようにして形成されたプロテオグリカンは、多くの連続する変換を受ける：N-脱アセチル化、N-硫酸化、D-グルクロン酸エピマー化およびO-硫酸化。
しかし、この完全な成熟はプロテオグリカンの一部分についてのみ起こり、このことがヘパリンの幅広い構造多様性を生み出し、その不均質性の原因となる。
【００１３】
次いで、多糖鎖はエンドグルクロニダーゼによりセルグリシンから切断される。次いでこれらの鎖は5000〜30000 Daの間の分子量を有する。これらは塩基性プロテアーゼと複合体を形成し、そして肥満細胞顆粒中に貯蔵される。ヘパリンは、肥満細胞の脱顆粒中にのみ放出される。
【００１４】
ヘパリンは特に止血において重要な生物学的役割を演じ、特に抗凝固剤および抗血栓剤として、治療に広く用いられる。
用いられるヘパリンのほとんどはブタの腸粘膜から単離され、ここからヘパリンはタンパク分解で抽出され、それに続いてアニオン交換樹脂で精製される(ヘパリンの製造の種々の方法についての概説には、DUCLOS, "L'Heparine: fabrication, structure, proprietes, analyse"; [Heparin: production, structure, properties, analysis]; Masson編, Paris, 1984)を参照)。
【００１５】
解重合およびクロマトグラフィーの後のブタのヘパリンの二糖の組成の分析により、ヘパリンを他のグリコサミノグリカンから区別することが可能になる。8つの主な二糖が特に区別される(図6)。硫酸化二糖であるIs、IIs、IIs、IVsは割合として最も豊富であり、主要なものはIsであってその量は40%を超え、好ましくは50%より多い。豊富さの順序は次いで二糖IIs、IIIsおよびIVsである。Is二糖とIIs二糖との間の比は3〜8の間である。
【００１６】
異なる起源の動物のバッチに由来するバッチ間のヘパリンの組成には、不均質性が観察され得る。この不均質性は生物学的活性に多様性を生じさせやすい。
さらに、ヘパリンの供給源としての動物の使用は、ヒトに伝染し得るウイルスの存在の可能性により危険性を構成する。
さらに、原材料の供給は不規則だと判明するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、より容易に制御し得る原材料の供給源を用いてこれらの問題点を克服し、量および質の点での供給の問題を回避することを提案する。
本出願人は、かなりの量で肥満細胞培養物から、ブタの腸粘膜から抽出されるヘパリンの特性に匹敵する特性を有しかつ再現性のあるヘパリンを産生することができることを示した。
本出願人は、ヘパリンタイプの分子の産生または成長因子に関する肥満細胞の独立性に重要な3つのタンパク質をコードする遺伝子が、ブタにおいては他の種の配列と異なる配列を示すことも証明した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の主題は、少なくとも約0.2 ng/mlの好ましくはブタのインターロイキン-3 (IL-3) (好ましくは少なくとも0.5 ng/ml、より好ましくは少なくとも2 ng/ml)と少なくとも約8 ng/mlの好ましくはブタの幹細胞因子(Stem Cell Factor；SCF) (好ましくは少なくとも約20 ng/ml、より好ましくは少なくとも80 ng/ml)と少なくとも約0.1 ng/mlの好ましくはブタのインターロイキン-4 (IL-4) (好ましくは少なくとも0.5 ng/ml、より好ましくは少なくとも1 ng/ml)、10 ng/mlの好ましくはブタのインターロイキン-6 (IL-6) (好ましくは少なくとも50 ng/ml、より好ましくは少なくとも100 ng/ml)および／または1 ng/mlの好ましくはブタのG-CSF (好ましくは少なくとも5 ng/ml、より好ましくは少なくとも10 ng/ml)とを含む培地(medium)中で、幼体のブタまたは胎児からの骨髄幹細胞の集団を培養することを含む肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得る方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
よって、産生培地はIL-3およびSCFを含む培地にIL-4、IL-6およびG-CSFの別々、対または3つ全ての組み合わせを含む。
これらの種々の因子がブタ起源であることが好ましいが、すなわちこれらの配列がブタにおける対応する因子の配列に由来するのが好ましいが、これらの少なくとも1つを別の起源の因子に置き換えることも可能である。
【００２０】
インターロイキン-4 (IL-4)は、ブタ起源のものが好ましいがマウスまたはヒト起源のものであってもよい。
本方法のある実施形態において、幹細胞が由来するブタは、約2日齢〜約6週齢の間である。しかし、本方法は、胎児またはより年老いたブタに由来する細胞に適用することができる。
有利には、細胞は少なくとも約30日間は培地中に維持される。
【００２１】
本発明の主題は、上記の方法を用いて得ることができるブタの肥満細胞培養物および肥満細胞系統でもある。
「肥満細胞」の用語は、他の特性の中でも、ヘパリンタイプの分子およびプロテアーゼ、例えばトリプターゼを含む異染性細胞質顆粒を示しかつそれらの表面に受容体、例えばc-kitとして知られるSCF受容体またはIgE受容体を発現する細胞を意味することを意図する。
【００２２】
本明細書において「培養物(culture)」の用語は、通常、インビトロで培養された細胞または細胞の集合を意味する。動物から採取された細胞または組織サンプルから直接生じた培養物は、「初代培養物」という。
【００２３】
「系統(line)」の用語は、継代培養の少なくとも1つの継代および通常はいくつかの連続する継代がうまく行なわれたときに用いられ、それに由来するいずれの培養物をも意図する(SCHAEFFER, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91〜101, 1990)。
【００２４】
さらに本発明の主題は、ブタのヘパリンのIIs二糖とIIIs二糖との間の比に近いIIs二糖とIIIs二糖との間の比を示すヘパリンタイプの分子を産生するブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統である。
「ヘパリンタイプの分子」の用語は、80％より多いグルコサミン残基がN-硫酸化されかつO-サルフェートの数がN-サルフェートの数より多い高度に硫酸化された多糖を意味することを意図する。
有利には、このような培養物または系統は、0.5〜5の間(好ましくは1〜2.5の間、より好ましくは1.3〜1.9の間)のIIs二糖とIIIs二糖との間の比を示すヘパリンタイプの分子および／または約3〜8の間(好ましくは4〜7の間、より好ましくは5〜7の間)のIs二糖とIIs二糖との間の比を示すヘパリンタイプの分子を産生する。
【００２５】
本発明によるブタの肥満細胞の樹立された培養物または系統は、少なくとも0.1μgのヘパリンタイプの分子/106細胞(好ましくは少なくとも1μgより好ましくは少なくとも10μg)も産生することができる。
有利には、このような培養物または系統は、Is二糖の量がIIs二糖の量より多く、IIs二糖の量がIIIs二糖の量より多くかつIIIs二糖の量がIVs二糖の量より多いヘパリンタイプの分子を産生する。
【００２６】
別の有利な実施形態によると、このような培養物または系統は、ヘパリンのIs、IIs、IIIsおよびIVs二糖の間の各比に近いIs、IIs、IIIsおよびIVs二糖の間の各比を示すヘパリンタイプの分子を産生する。
有利には、このような培養物または系統は、少なくとも30%のIs二糖(好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%)を含むヘパリンタイプの分子を産生する。
有利には、このような培養物または系統は、少なくとも10 IU/mg (好ましくは少なくとも20 IU/mg)より多い抗-Xa活性を示しおよび／または少なくとも10 IU/mg (好ましくは少なくとも20 IU/mg)より多い抗-IIa活性を示すヘパリンタイプの分子を産生する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態によると、このような系統は、2003年4月9日にインスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズ(Collection de Cultures de Microorganisms [Collection of cultures and microorganisms] (CNCM) 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France)にそれぞれ番号I-3010、I-3011、I-3012、I-3013、I-3014で寄託されたブタ肥満細胞系統である。
CNCMに寄託されたこれらの系統は、ヒトの治療におけるブタの細胞に由来する製品の使用に矛盾しない衛生要件を満足するブタから得られたという利点を有する。これらのブタは、防御された(protected)ブタ特定病原体不在(SPF)コロニーに由来する。
【００２８】
本発明による培養物および系統の特徴を向上させ得る因子をコードする遺伝子を含む核酸を、これらの細胞に導入することができる。「核酸」の用語は、DNAまたはRNAを意図して用いられる。有利には、核酸は相補DNAまたはゲノムDNAである。
このような因子は細胞の増殖を促進するかまたは細胞が産生する生物学的分子の組成、特にヘパリンタイプの分子の組成を調節するかのいずれかを可能にする。
【００２９】
これらは、不死化タンパク質(immortalizing proteins)、例えばシミアンウイルス40 (SV40) T抗原、ヒトパピローマウイルスHPVのE6およびE7タンパク質、アデノウイルスのE1Aタンパク質、エプスタイン-バーウイルスのEBNA2タンパク質またはHTLV-1ウイルスのTaxタンパク質をコードする遺伝子であり得る。テロメラーゼの触媒サブユニットTERTをコードする核酸も不死化遺伝子として用い得る。
【００３０】
SV-40ウイルスAgTを用いるのが好ましい。この抗原の相補DNAの配列は、GenBankで参照番号NC_001669の下で入手可能である。
これらは、細胞の増殖を許容するタンパク質、例えばG-CSF、SCFおよびインターロイキン(IL-3、IL-4およびIL-6)をコードする遺伝子でもあり得る。
【００３１】
最近、マウスおよびヒトの肥満細胞腫の研究により、c-kit受容体の構成性活性化の原因であるc-kit遺伝子の変異または欠損を同定することが可能になった。IC2早熟肥満細胞腫におけるV814で変異したc-kit遺伝子の発現は、これらの細胞の変換、すなわちSCF-非依存性増殖および腫瘍形成性の潜在能力の獲得を誘発する(Piaら, Blood, 87(8), 3117〜3123, 1996)。このような変異遺伝子を含む核酸をこれらの細胞に導入することができる。
【００３２】
これらは、ser/glyのようなタンパク質またはヘパリンタイプの分子の硫酸化に作用する酵素をコードする遺伝子であり得る。このような酵素はO-スルファターゼ、例えば3-O-スルファターゼまたは6-O-スルファターゼであり得る。
有利には、このような酵素は3-O-スルファターゼ-1 (3-OST-1)、好ましくはブタの3-O-スルファターゼ-1である。
【００３３】
これらの遺伝子を含む核酸は、これらの細胞に当業者に公知のいずれの方法、特にトランスフェクション、ヌクレオポレーションまたはエレクトロポレーションにより導入することができる。これらの遺伝子を有するレトロウイルスベクターをこれらの細胞をトランスフェクションするのに用いることもできる。
【００３４】
本発明の状況において、本出願人は3-OST、特に3-OST-1をコードする核酸の導入により、ブタ起源の肥満細胞の種類に関係なく、肥満細胞のヘパリンタイプの分子の組成を制御することができることを証明した。
よって、本出願人は、本発明の主題を上記の方法を用いて得られた肥満細胞に限定することを意図しない。よって、本発明の主題は、3-OSTをコードする核酸が導入されたブタ起源のいずれの肥満細胞である。
【００３５】
本出願人は、本発明の実行に用い得るブタ起源の3種のタンパク質の配列およびこれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列も決定した。
よって、本発明の主題は、配列番号3の配列を有するC-末端を有するc-kitタイプのブタ起源のタンパク質である。このようなタンパク質は、配列番号2の配列と少なくとも99％の同一性を示す配列を含み得る。好ましくは、このようなタンパク質は、位置40にグルタミン(Q)および／または位置173にリジン(K)を有する。
本発明の主題は、c-kitタイプのブタ起源のタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたは核酸でもある。このような核酸は、配列番号1の配列と少なくとも99％の同一性を示す配列を含む。
ブタのc-kitの完全配列を得ることは、当該技術の観点から明らかではなかった。
【００３６】
本発明の主題は、3-O-スルファターゼ活性を示すブタ起源のタンパク質でもある。このようなタンパク質は、配列番号5の配列のタンパク質と少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%のアミノ酸同一性を示す配列を含み得る。
【００３７】
本発明の主題は、3-OST活性を示すブタ起源のタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたは核酸でもある。このような核酸は、配列番号4の配列の核酸と少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%のヌクレオチド同一性を示す配列を含み得る。
ブタの3-OSTの配列を得ることは、当該技術の観点から明らかではなかった。単離されたブタの3-OSTは、予期せぬ特性を示しやすく、特に当業者に公知の他の種の3-OSTに比べてよりよい活性を示しやすい。
【００３８】
本出願の主題は、6-O-スルファターゼ活性を示すブタ起源のタンパク質でもある。このようなタンパク質は、配列番号7の配列のタンパク質と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%のアミノ酸同一性を示す配列を含み得る。
本発明の主題は、6-OST活性を示すブタ起源のタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたは核酸でもある。このような核酸は、配列番号6の配列の核酸と少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%のヌクレオチド同一性を示す配列を含み得る。
ブタ6-OSTの配列を得ることは、当該技術の観点において明らかではなかった。単離されたブタ6-OSTは、予期せぬ特性を示しやすく、特に当業者に公知の他の種の3-OSTに比べてブタ肥満細胞においてよりよい活性を示しやすい。
【００３９】
さらに、本出願の主題は、配列番号1、配列番号4または配列番号6の配列の核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸である。
【００４０】
本発明の目的のために、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の間の「パーセンテージ同一性」は、比較のウィンドウ(window of comparison)を介して最適に整列させた2つの配列を比較することにより決定することができる。よって、比較のウィンドウのヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部分は、2つの配列の最適な整列を得るために、参照配列(付加や欠失を含まない)に比べて付加または欠失(例えばギャップ)を含むことができる。
【００４１】
パーセンテージは、比較される2つの配列(核酸またはペプチド)について同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が観察される位置の数を測定し、そして2つの塩基またはアミノ酸残基の間に同一性がある位置の数を比較のウィンドウの中の位置の全体数で割り、そしてパーセンテージ配列同一性を得るためにその解に100をかけることにより算出される。
【００４２】
比較のための配列の最適な整列は、WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSINに含まれる既知のアルゴリズムを用いるコンピュータで行うことができる。
実例として、パーセンテージ配列同一性は、デフォルトパラメータのみを用いて(S. F Altschulら, J. Mol. Biol. 1990 215: 403〜410, S. F Altschulら, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389〜3402)、BLASTソフトウェア(1996年3月のBLAST 1.4.9、1998年2月のBLAST 2.0.4および1998年9月のBLAST 2.0.6の各バージョン)を用いて得ることができる。Blastは、Altschulらのアルゴリズムを用いて、参照の「リクエスト」配列に類似／相同な配列を検索する。用いるリクエスト配列およびデータベースはペプチドベースまたは核酸ベースであることができ、いずれの組み合わせも可能である。
【００４３】
本発明の目的のために、「高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下の条件を意味することを意図する。
1-メンブレンのプレハイブリダイゼーションおよび：
- 混合：サケ精子DNA 40μl (10 mg/ml) + ヒト胎盤DNA 40μl (10 mg/ml)。
- 96℃で5分間変性させ、次いで混合物を氷中に浸漬する。
- 2×SSCを除き、メンブレンを含むハイブリダイゼーションチューブ内へホルムアミド4 mlを注ぐ。
- 2つの変性DNAの混合物を加える。
- 回転させながら42℃で5〜6時間インキュベートする。
【００４４】
2-標識プローブ競合：
- 反復(repetition)の量に応じて10〜50μlのCot I DNAを標識して精製したプローブに加える。
- 95℃で7〜10分間変性させる。
- 65℃で2〜5時間インキュベートする。
3-ハイブリダイゼーション：
- プレハイブリダイゼーションミックスを除く。
- サケ精子DNA 40μl + ヒト胎盤DNA 40μlを混合し、96℃で5分間変性させ、次いで氷中に浸漬する。
- ハイブリダイゼーションチューブにホルムアミド混合物4 ml、2つのDNAの混合物および変性標識プローブ/Cot I DNAを加える。
- 回転させながら42℃で15〜20時間インキュベートする。
【００４５】
4-洗浄：
- 2×SSC中に周囲温度で1回洗浄してリンス。
- 65℃の2×SSCおよび0.1% SDSで室温で5分間、2回。
- 65℃の1×SSCおよび0.1% SDSで65℃で15分間、2回。
メンブレンをサランラップで包み露光する。
【００４６】
上記のハイブリダイゼーション条件は、20ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドで変化する長さの核酸分子の高ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適する。
上記のハイブリダイゼーション条件は、そのハイブリダイゼーションが所望される核酸の長さの関数として、または選択される標識化の種類の関数として当業者に公知の技術に従って調整できることは言うまでもない。
適切なハイブリダイゼーション条件は、例えばHAMESおよびHIGGINS (1985, "Nucleic acid hybridization: a practical approach", HamesおよびHiggins編, IRL Press, Oxford)による研究またはF. AUSUBELら(1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y)による研究に含まれる教示により調整することができる。
【００４７】
本発明の主題であるタンパク質は、当業者に公知のいずれの手段により得ることができる。しかし、これらは発現ベクターに任意に挿入されたこれらのタンパク質をコードする上記の核酸を有利に選択される細胞内で発現させ、続いて抽出および完全または部分的な精製を任意に行うことにより有利に得ることができる。
【００４８】
本発明は、本発明による核酸を含む組換えベクターにも関する。
有利には、このような組換えベクターは以下の核酸から選択される核酸を含む。
a) 配列番号5もしくは配列番号7の配列と少なくとも60%のアミノ酸同一性を有するタンパク質またはペプチド断片またはそれらの変異型をコードする核酸；
b) 配列番号1、配列番号4または配列番号6の配列を有する核酸を含む核酸またはその断片もしくは変異型；
c) 配列番号4または配列番号6の配列を有する核酸と少なくとも60%のヌクレオチド同一性を示す核酸またはその断片もしくは変異型；
d) 配列番号1、配列番号4または配列番号6の配列の核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸またはその断片もしくは変異型。
【００４９】
本発明の目的のために、「ベクター」の用語は、一本鎖または二本鎖の形であり得る環状または直鎖状のDNAもしくはRNA分子を意味することを意図する。
【００５０】
ある実施形態によると、発現ベクターは、本発明による核酸の他にその転写および／または翻訳を支配する調節配列を含む。
有利な実施形態によると、本発明による組換えベクターは以下の要素を特に含む。
(1) 挿入される核酸の発現を調節する要素、例えばプロモーターおよびエンハンサー；
(2) このようなベクターに挿入される本発明による核酸に含まれるコーディング配列であって、(1)で記載される調節シグナルと同相に(in phase)位置する配列；および
(3) 適切な転写開始および停止配列。
【００５１】
さらに、本発明によるベクターは、その増幅またはその発現が所望される細胞宿主内での1つ以上の複製起点、マーカーまたは選択マーカーを含み得る。
【００５２】
このような核酸を含むかおよび／またはこのようなタンパク質を発現する細胞は、本発明の主題を構成する。本発明は、上記のブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統を培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法にも関する。
【００５３】
IL-3、SCFおよびIL-4を含有する培地で本発明により得られる肥満細胞は、IL-3およびSCFだけを含有する培地中で得られる二糖構造よりよい二糖構造を示す。
【００５４】
本出願人は、培養液(culture medium)へのIL-4の添加により、IL-3およびSCFだけを含有するかまたはIL-3、SCFおよびIL-6またはIL-3、SCFおよびG-CSFを含有する培地で得られる細胞を用いて得られるものに比べて、ブタのヘパリンにより近い特徴を示すヘパリンタイプの分子を肥満細胞から得ることができることも示した。
【００５５】
よって、本発明は、少なくとも約0.1 ng/mlのIL-4 (好ましくは少なくとも約0.5 ng/ml、より好ましくは少なくとも約1 ng/ml)を含む培養液中にブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統を適切な培地中で培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法にも関する。
【００５６】
肥満細胞を、IL-4を過剰発現させるために改変することもできる。よって、本発明の別の主題は、IL-4をコードする核酸でトランスフェクションされたブタの肥満細胞培養物または肥満細胞系統を得て、そしてこれらの細胞を適切な培養液中で培養することを含むヘパリンタイプの分子を製造する方法である。このような肥満細胞はそれら自体が本発明の主題である。
【００５７】
これらは、当業者に公知のいずれの方法、特にIL-4をコードする遺伝子を含む核酸のトランスフェクション、ヌクレオポレーションまたはエレクトロポレーションにより得ることができる。これらの遺伝子を有するレトロウイルスベクターも細胞をトランスフェクションするのに用いることができる。IL-4の相補DNAの配列はBaileyら(Biochim. Biophys. Acta. 1171(3), 328〜330, 1993)により記載された。
【００５８】
本発明による細胞、系統および培養物は、それらが得られた条件下で培養に(in culture)維持することができる。これらは、SCF、GM-CSF、IL-3、IL-4および／またはIL-6の含量を減少させた培地中で培養に維持することもできる。しかし、これらはIL-4を含む培地中で維持されるのが好ましい。
【００５９】
これらの肥満細胞は、組み合わせてまたは独立して用いられる成長因子を補った規定培養液(MEMα/DMEM、RPMI、IMDMなど)中で培養されるのが好ましい。
培地には、ウシ血清を0.5%〜20% (v/v)の間の濃度で補うこともできる。
【００６０】
培養液へのウシ血清の添加は、培地のタンパク質濃度を減少させかつ動物起源の化合物の使用に関わる危険性を減少させるように、無血清培養液、例えばAIMV (INVITROGEN)の使用で置き換えることができる(KAMBEら, J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 2000)。
血清の添加および／または成長因子の使用に関する、細胞の非依存的な性質は、トランスフォーミング剤または不死化剤の作用を介する細胞の表現型の突然変異により得ることができる(TSUJIMURA, Pathology International, 46, 933〜8, 1996; PIAOおよびBERNSTEIN, Blood, 87(8), 3117-23, 1996)。
【００６１】
肥満細胞は、例えばGRIFFITHSら(Animal Cell Biology, Eds. Spier and Griffiths, Academic Press, London, vol. 3, 179〜220, 1986)により記載されるような、真核細胞のバルク培養のために開発された技術を用いて培養することができる。PHILIPSら(Large Scale Mammalian Cell Culture, FederおよびTolbert編, Academic Press, Orlando, U.S.A., 1985)またはMIZRAHI (Process Biochem, August, 9〜12, 1983)により記載されるような、m3より大きい容積のバイオリアクタを用いることができる。
【００６２】
培養は、VAN WEZEL (Nature, 216, 64〜65, 1967)により記載される技術に従って懸濁またはマイクロ支持体中で行うこともできる。
工業的規模でより単純に用いることができることから、真核細胞培養に通常用いられるバッチ培養系も用いることができる(VOGELおよびTODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 第2版, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A., 1997)。これらの系により得られる細胞密度は、通常、106〜5×106細胞/mlの間である。
【００６３】
バッチ培養の生産性は、GAG抽出およびヘパリン単離操作についてバイオリアクタから細胞の部分を除き(70%〜90%)、そして新しい培養を開始するために残りの細胞を同じバイオリアクタに残すことにより有利に増加させることができる。反復バッチ培養とよばれるこの培養の方法において、細胞の増殖期についての最適パラメータを細胞内でのGAGおよびヘパリンのより多い蓄積を許容するパラメータと区別することも可能である。
【００６４】
細胞を保持するかまたはしないパーフュージョン-フェド連続培養系(perfusion-fed continuous culture system)も用いることができる(VELEZら, J. Immunol. Methods, 102(2), 275〜278, 1987; CHAUBARDら, Gen. Eng. News, 20, 18〜48, 2000)。
【００６５】
本発明の状況において、特に、リアクタ内部の細胞の保持(retention)を許容し、バッチにより得ることができるものよりも多い増殖および生産となるパーフュージョン-フェド培養系を用いることができる。保持は、スピンフィルタ、中空糸または固体マトリックスタイプの保持システムにより達成できる(WANGら, Cytotechnology, 9, 41〜49, 1992; VELEZら, J. Immunol. Methods, 102(2), 275〜278, 1987)。
【００６６】
得られる細胞密度は、通常、107〜5×107細胞/mlの間である。バイオリアクタ内での培養は、オンライン測定センサを用いることにより、細胞増殖の物理化学的パラメータのよりよい制御を許容する：pH、pO2、Red/Ox、ビタミン、アミノ酸または炭素含有物質(例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース)のような成長物質、ラクテートまたは水性アンモニアのような代謝物など。
【００６７】
酪酸ナトリウムでの処理の後に肥満細胞のヘパリンタイプの分子の含量を量的および質的に増加させることも構想できる(Nakamuraら, Biochim. Biophys. Acta. 627, 60〜70, 1980)。
【００６８】
3〜14日間、好ましくは3〜5日間の培養の後に、通常、遠心分離またはろ過により培養液から細胞を回収して分離する。
種々の遠心分離システムを用いることができる。例えば、VOGELおよびTODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 第2版, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A.)に記載されたものを挙げることができる。
【００６９】
代わりに、または遠心分離と組み合わせて、細胞の平均径(5〜20μm)より小さい孔を有する膜を用い、同時に溶液／懸濁液中の他の化合物を通過させる接線マイクロろ過(tangential microfiltration)により分離を行うことができる。膜に印加される接線流速および圧力は、膜の詰まりを減少し分離操作の間の細胞の健全性(integrity)を保つために、ほとんどせん断力を生じない(5000 sec-1未満のレイノルズ数)ように選択される。
種々の膜を用いることができる。例えばスパイラル膜(AMICON, MILLIPORE)、フラット膜または中空糸(AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF)である。
【００７０】
孔、電荷またはグラフティングが、分離および培養液中に存在するであろう潜在的な混入物例えば細胞タンパク質、DNA、ウイルスまたはその他の巨大分子についての最初の精製を可能にする膜を選択することもできる。
【００７１】
ヘパリンが肥満細胞のいくつかの脱顆粒または溶解により細胞内容物から放出され、かつ分離工程のときに培養液中に存在する場合には、より小さい孔を有する膜の使用も構想できる。この場合、細胞の分離は、孔を有しかつヘパリンを濃縮して培地中に存在する他の種から分子量のサイズおよび任意に電荷または生物学的特性の関数としてヘパリンを分離できるように配置された1つ以上の膜での限外ろ過工程と組み合わせる。
【００７２】
この実施形態の状況において、膜のカットオフ閾値は1000〜5 KDaの間が好ましい。マイクロろ過に用いられるものに類似の膜システム、例えばスパイラル膜、フラット膜または中空糸を用いることができる。その電荷特性またはヘパリンに親和性を示すリガンド(例えば抗体、ATIII、レクチン)のグラフトによりヘパリンを分離し精製できる膜を有利に用いることができる。
【００７３】
しかし、ヘパリンを細胞内容物に保持することを可能にする細胞の製造および回収方法が通常、好ましく用いられる。
肥満細胞からのヘパリンの回収は、細胞の脱顆粒または溶解の後に行うこともできる。
脱顆粒は、肥満細胞の表面に存在する受容体に特異的なリガンドの結合により、例えばアレルゲンタイプの剤(例えばIgE Fcフラグメントまたはこのフラグメントのアナログ)の肥満細胞のIgE受容体への結合により引き起こすことができる。
【００７４】
他の剤を用いて肥満細胞の脱顆粒を引き起こすこともできる。これらの剤は、いくつかのカテゴリ、例えば細胞毒性の剤、酵素、多糖、レクチン、アナフィラトキシン、塩基性化合物(化合物48/80、サブスタンスPなど)またはカルシウム(イオノフォアA23187、イオノマイシンなど)に分類され得る [D. LagunoffおよびT. W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331〜51]。脱顆粒剤は、培養に維持される同じ細胞に繰返し用いることができる。この製造方法において、上清からの回収方法の単純化および培養での細胞の維持により、生産性が大きく増加する。
【００７５】
イオノフォアA23187の具体的な例において、肥満細胞の脱顆粒は、例えば2.106細胞/mlの肥満細胞を1〜100μg/mlの濃度のイオノフォアA23187で1分〜4時間の範囲の作用時間処理することにより誘導することができる。
【００７６】
肥満細胞の溶解は、例えば低張または高張の溶液を用いる浸透圧ショック、熱ショック(凍結／溶解)、機械的ショック(例えば超音波破砕または圧力変動)、化学物質の作用(NaOH、THESIT(商標)、NP40(商標), TWEEN 20(商標), BRIJ-58(商標), TRITON X(商標)-100など)または酵素溶解(パパイン、トリプシンなど)、あるいはこれらの方法の2種以上の組み合わせにより誘導することができる。
【００７７】
細胞溶解物からヘパリンを抽出して精製し、セルグリシンコアから多糖鎖を分離し、抽出溶媒中に存在する他のGAGからヘパリン鎖を分離するために、それ自体で公知であり、上記のDUCLOSによる手引のような一般的な研究において記載される動物組織からのヘパリンの抽出および精製において用いられる方法と類似の方法を用いることができる。
【００７８】
限定しない例として、核酸および細胞タンパク質からヘパリンを分離しかつこれを可溶化、すなわちセルグリシンコアとの結合を破壊するために：
- 細胞溶解物を1以上の酵素消化(プロナーゼ、トリプシン、パパインなど)に付すことができる；
- ヘパリン-タンパク質結合をサルフェートまたは塩化物の存在下にアルカリ溶媒中で加水分解することができる；
- GAG-タンパク質相互作用を解離させることができるイオン溶液の使用を補って、酸溶媒(例えば冷却条件下でトリクロロ酢酸と)中での処理を、細胞から生じる核酸およびタンパク質を破壊するために行うこともできる。
【００７９】
酵素加水分解の後に、可溶化ヘパリンを精製するためにグアニジンを用いる抽出を行うこともでき、ヘパリンは、例えば酢酸カリウム、四級アンモニウム、アセトンなどを用いて沈殿させることができる。
有利には、これらの精製工程は、1種以上のクロマトグラフィー工程、特にアニオン交換クロマトグラフィー工程を補うかまたは該工程で置き換えることができる。
【００８０】
本発明の主題は、本発明による方法を用いて肥満細胞培養物から得ることができるヘパリン調製物でもある。
動物組織から従来技術において得られるヘパリン調製物の生物学的特性に匹敵する生物学的特性を有する本発明によるヘパリン調製物は、ヘパリンの通常の適用のすべてに用いることができる。
【００８１】
図1A〜1Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での3週間の培養の後に得られた肥満細胞の抗トリプターゼ標識化を示す。濃いピークと淡いピークはそれぞれコントロール(抗体なし)と条件C1〜C8の下で得られた細胞に対応する。
【００８２】
図2A〜2Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での5週間の培養の後に得られた肥満細胞のIgE受容体の標識化を示す。斜線を引いたピーク、濃いピークおよび淡いピークはそれぞれ標識していない細胞(非肥満細胞性ブタ細胞)、コントロール細胞および条件C1〜C8の下で得られた細胞に対応する。
図3A〜3Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での7週間の培養の後に得られた肥満細胞の抗トリプターゼ標識化を示す。濃いピークと淡いピークはそれぞれコントロールと条件C1〜C8の下で得られた細胞に対応する。
【００８３】
図4A〜4Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での8週間の培養の後に得られた肥満細胞のFGF標識化を示す。濃いピークと淡いピークはそれぞれコントロールと条件C1〜C8の下で得られた細胞に対応する。
【００８４】
図5は、7週間の培養の間の種々の条件C1〜C8の下での培養物の増殖を示す。
図6は、ヘパリンのN-硫酸化二糖に相当するIs、IIs、IIIsおよびIVs二糖ならびに同種のアセチル化二糖Ia、IIa、IIIaおよびIvaの化学構造を表す。
図7は、条件C1、C7およびC8の下で得られた肥満細胞のリアクタ内での増殖を示す。
【００８５】
本発明は、以下の実施例により説明される。これらの例は説明のためにのみ与えられており、限定するとみなされるべきではない。
【実施例】
【００８６】
実施例
実施例1：幼体のブタの骨髄からの肥満細胞集団の単離および系統の産生
サンプルの採取に用いる動物は、防御されたブタ特定病原体不在(SPF)ブリーダーコロニー(MERIAL SA Lyon France)に由来する。4週齢および6週齢の子豚(それぞれPIおよびPIII)の胸骨を無菌的に回収し、次いで滅菌容器に入れて滅菌実験室に移動し、PBS (リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4)バッファー中で1/100に希釈した純粋な漂白剤の溶液およびPBSで連続的にリンスする。次に胸骨を切断して骨髄をシリンジを用いて取り出し、次いでPBSで希釈する。
【００８７】
骨髄懸濁物を滅菌ガーゼを通してふるいにかけ、40 mlのPBS中に希釈し、次いで400 gで10分間遠心分離する。細胞のペレットを5 mlのPBS中に採取し、次いで5 mlのFicoll (Dutscher) (1100 g×10分)で精製する。骨髄細胞を含むリングを回収し、PBS (14 ml、400 g×10分)中に2回リンスし、次いで計数するために2 mlのPBS中に採取する。胸骨当たり約1×108の全細胞である。
【００８８】
計数の後に、細胞を遠心分離して6ウェルの培養プレートのウェル当たり4 ml中に1〜3×106細胞/mlで、以下の成分を含む培地中に採取する：MEMα (Invitrogen)、15% ウシ胎児血清(PAA Laboratories)、100 IU/mlのペニシリン(Sigma)、100μg/mlのストレプトマイシン(Sigma)、2 ng/mlのブタr-IL-3 (Biotransplant)および80 ng/mlのブタr-SCF (Biotransplant)。
これらを培養に入れてすぐに、以下の表1に示すようにサイトカイン(1 ng/mlの組換えブタIL-4、R&D systems；100 ng/mlの組換えブタIL-6、R&D systems；10 ng/mlの組換えヒトG-CSF)を補った上記の培養液中で培養する。
【００８９】
【表１】
2006522597.tif 000002
【００９０】
培養プレートを38℃+/- 0.5℃および5% CO2雰囲気下でインキュベートする。
週に2回、8週間にわたって、各ウェルの培地を新鮮な培地と交換する。単離された細胞の肥満細胞の表現型は第2週から一定の間隔(第3週、第5週および第7週)で特性決定される。
上記のいくらかの条件の下で得られるブタの肥満細胞系統を、インスティティ・パスツールのコレクション  ド  カルチャーズ  ド  マイクロオーガニズムズ(CNCM)に2003年4月9日に寄託した。
番号I-3010、I-3011、I-3012、I-3013、I-3014の下で寄託されたこれらの系統は、それぞれ表1に記載の条件C1、C2、C3、C4およびC5の下で得られた。
【００９１】
各培養条件下の細胞の肥満細胞表現型の確認は、フルオロサイトメトリーによりIgE受容体およびトリプターゼのような特異的マーカーの存在を検出することにより証明される。FGFを用いる標識化の検出も行なって、肥満細胞のヘパリンへのFGFの結合部位を明らかにする。
【００９２】
トリプターゼの標識化
各条件からの細胞懸濁物のサンプル1 mlを採取する。各サンプルをPBSバッファー中での遠心分離により1回リンスし、次いで細胞を0.5%のBSA (ウシ血清アルブミン)および0.01%のアジ化ナトリウムを含有するPBS 400μl中に再懸濁する。
これらの細胞を、サンプル当たり200μlのcytofix/cytoperm溶液(Pharmingen)中に4℃で透過性にし、25分間インキュベートする。permawashバッファー(Pharmingen)中での2回のリンスの後、サンプルを4℃で30分間、1μgのトリプターゼ特異的マウスモノクローナル抗体(mouse anti-human mast cell tryptase；Chemicon)とインキュベートする。
【００９３】
permawashバッファーでの3回のリンスの後、FITC-標識抗マウスイムノグロブリンコンジュゲート(FITC-conjugated affinity pure goat antimouse IgG；Jackson Immunoresearch)と25分間インキュベーションすることにより標識を視覚化する。
抗トリプターゼ抗体とのインキュベーション以外は同じ手順に従って、二重のサンプルを調製する。これは、分析の間のFITC-標識コンジュゲートの非特異的結合による蛍光を差し引くためである。
【００９４】
最後のインキュベーションの最後に、細胞をpermawashバッファー中に2回リンスし、次いで1％ホルムアミド(Sigma)を補った冷PBSバッファー中に再懸濁する。
サイトフルオリメトリーによる分析をFACS (Faxcalibur Becton Dickinson)で行う。
【００９５】
IgE受容体の標識化
各条件から約2×105細胞のサンプルを採取し、PBS中に2回リンスし、次いで106細胞当たり2μgのイヌIgE (Monoclonal canine IgE；Bethyl)とインキュベートした。サンプルを37℃で3時間30分間インキュベートし、PBS中に2回リンスする。PBS中に再懸濁した後に、サンプルを106細胞当たり5μgのヤギ抗イヌIgE抗体(Goat anti Dog IgE affinity purified；Bethyl)と4℃で30分間インキュベートする。
【００９６】
インキュベーションの後、サンプルを再びPBS中に2回リンスし、次いでFITC-標識抗ヤギIgコンジュゲート(Donkey anti Goat/Sheep FITC；Serotec)と30分間インキュベートする。PBSバッファー中で2回のリンスの後、サンプルを再懸濁し、1％のホルムアミドを補ったバッファー中に固定する。上記と同様に、IgEとのインキュベーションを省略して二重のサンプルを作製するが、これは分析の間のFITC-標識コンジュゲートの非特異的結合による蛍光を差し引くためである。非肥満細胞性ブタ細胞(IRP)のサンプルも同じ条件下で標識化の特異性を確かめるために分析する。
【００９７】
FGF結合部位のラベリング
分析される細胞培養サンプルを96ウェルの円錐形の底のプレートにウェル当たり0.2×106の割合で分配し、次いで1400 rpmで4分間遠心分離する。細胞ペレットを5 g/lのウシアルブミンを含むPBS 100μl中でリンスし、次いで1400 rpmで4分間遠心分離する。2回の連続するリンスは同じ条件下で行う。
【００９８】
細胞ペレットをCytofix/Cytoperm 固定/透過バッファー(Pharmingen)中に希釈し、Perm/Washバッファー(Pharmingen) 100μlでリンスし、次いで1400 rpmで4分間、4℃で遠心分離する。3回の連続するリンスは同じ条件下で行う。
細胞ペレットを172 ng/mlの塩基性FGF (R&D systems)を含むPerm/Washバッファー100μl中に希釈し、氷上で30分間インキュベートする。細胞をPerm/Wash (商標)バッファー100μlでリンスして1400 rpmで4分間、4℃で遠心分離する。3回の連続するリンスは同じ条件下で行う。
【００９９】
細胞ペレットを1μgのビオチン結合抗-塩基性FGFマウスモノクローナル抗体(R&D systems)を含むPerm/Washバッファー100μl中に希釈し、氷上で30分間インキュベートする。細胞をPerm/Washバッファー100μlでリンスして1400 rpmで4分間、4℃で遠心分離する。3回の連続するリンスは同じ条件下で行う。
【０１００】
細胞ペレットをストレプトアビジン ペリジニン クロロフィルaタンパク質の溶液を含むPerm/Washバッファー100μl中に希釈し、氷上、暗中で20分間インキュベートする。細胞をPerm/Wash (商標)バッファー100μlでリンスして1400 rpmで4分間、4℃で遠心分離する。3回の連続するリンスは同じ条件下で行う。ペレットを5 g/lのウシアルブミン、0.01%のアジ化ナトリウムおよび1%のホルムアルデヒドを含む冷PBSバッファー150μl中で希釈する。細胞質内部の標識の存在をサイトフルオリメトリーにより検出する。
【０１０１】
抗FGF抗体とのインキュベーション以外は同じ手順に従って、二重のサンプルを調製する。これは、分析の間のFITC-標識コンジュゲートの非特異的結合による蛍光を差し引くためである。非肥満細胞性ブタ細胞(IRP)のサンプルも同じ条件下で標識の特異性を確かめるために分析する。
【０１０２】
図1、2、3および4は、それぞれ3、7および8週間培養した後に得られた肥満細胞の表現型の特性決定の結果を示す。
肥満細胞のマーカーであるIgE受容体およびトリプターゼについての細胞の陽性および特異的な標識化ならびにFGFの細胞内結合の検出が観察される。第3週の培養物からの細胞について行なった検出は、トリプターゼの存在について陽性である。条件1〜5の下での培養物は、第5週からのIgE受容体の標識化により明らかにされるように均質であり肥満細胞100%を含む。
第7週に、条件C1〜C5およびC7の下での培養物は100%均質であり、条件C6およびC8の下での培養物の均質性は50%を超える。
【０１０３】
電子顕微鏡分析
単離した細胞の特徴付けは電子顕微鏡観察によっても行なった。細胞は、多数の顆粒形成、大きい中心を外れた核および不均一な輪郭とともに肥満細胞の形態学的特徴を示す。
【０１０４】
単離の間の細胞増殖
規則的な間隔で、各条件(C1〜C8)の培養サンプルを採取し、0.4％のトリパンブルーを補ったPBSバッファーで希釈した後に顕微鏡下で計数する。
培養の最初の4週間(W1〜W4)の間に細胞濃度の減少が観察され、これはSCFで刺激されない骨髄細胞の死および溶解ならびに不均質な培養物から実質的に肥満細胞の培養物への経過に相当する。第5週(W5)からは培養物の増殖が観察され、これは肥満細胞特異的マーカーのより強い標識化に関係する。増殖はIL-4を含む培養条件について実質的により大きい(図5)。
【０１０５】
培養物のヘパリン含量のHPLCによる特徴づけ
15週間の培養および増幅の後、Linhardtら(Biomethods, 9, 183〜197, 1997)により記載されるプロトコルに従って肥満細胞のプロテオグリカン組成を分析するためにサンプルを採取した。サンプルは以下の方法で処理する。
タンパク質の分解：2×106細胞の細胞サンプルを遠心分離してPBSバッファー中に2回リンスする。各ペレットを10μlのアルカラーゼ(alcalase) (Novozymes)を補った蒸留水100μl中に採取し、次いで攪拌しながら60℃で5時間加熱する。次いでサンプルを0.5 M NaCl (Prolabo)を含む10 mM Trisバッファー、pH 7.0 (Prolabo) 200μlで希釈し、その後10,000 rpmで10分間遠心分離する。タンパク質分解工程は、細胞内容物を放出させかつタンパク質-多糖結合を解離させることを可能にする。
【０１０６】
抽出：各サンプルの上清を、96ウェルプレートフォーマットのSAX四級アンモニウム樹脂(100 mg/2 ml) (Thermohypersil)でのイオン交換により精製する。結合および0.5 M NaClを含むTrisバッファー、pH 7での洗浄の後、グリコサミノグリカン(GAG)を3 M NaClを含むTrisバッファー、pH 7.0 500μlで溶出する。
【０１０７】
脱塩化／濃縮：
次いでサンプルをゲル浸透カラム(NAP-5、Pharmacia)上で脱塩する。1 mlの容積での溶出後、サンプルを凍結乾燥により濃縮し、次いで蒸留水130μlに採取する。
【０１０８】
解重合
HPLC分析のために、GAGをヘパリナーゼI、IIおよびIII (Grampian enzymes)の混合物を用いて解重合する。各ヘパリナーゼの溶液をリン酸バッファー中で0.5 IU/mlに調整する。ヘパリナーゼI、II、III溶液は各ヘパリナーゼ溶液の容積について1/3の容積を混合することにより調製する。分析されるサンプル100μlについて、ヘパリナーゼ混合物15μlならびに0.73 mlの100%酢酸(Prolabo)、12.5 mgのウシアルブミン(Sigma)および39.5 mgの酢酸カルシウム(Prolabo)を蒸留水30 ml当たりに含有する酢酸バッファー10μlを加えた。
【０１０９】
HPLC分析
次いで、サンプルをWaters spherisorb SAX 5μm、250×3 mm、ThermohypersilカラムでのHPLCにより分析する。分析当たり50μlのサンプルを注入する、移動相バッファーは、2.5 mMリン酸二水素ナトリウム(Na2HPO4、Prolabo)で構成され、そのpHはオルトリン酸(H3PO4、Prolabo)で2.9に調整される。細胞サンプルから抽出されるGAGを構成する二糖の溶出を、1 Mの過塩素酸塩(NaClO4、Prolabo)を含む2.5 mM Na2HPO4バッファーの50分間での0〜100％の勾配で行う。二糖は保持時間により、標準ヘパリンサンプル(Aventis)と比較して234 nMでのUV により検出される。
【０１１０】
培養15週間後の細胞培養物の分析により、細胞内に大量のヘパリンタイプの化合物が存在することが明らかとなり、このことは単離された培養物の特異的に肥満細胞性の性質を証明する。
【０１１１】
ヘパリンを構成する主要な二糖は、Linhardtら(Biomethods, 9, 183〜197, 1997)により記載されるように、実際に見出される。
これらの二糖は、ヘパリンのN-硫酸化二糖に相当するIs、IIs、IIIsおよびIVs (化学構造を図6に示す)により主に代表される。同種のアセチル化二糖IIa、IIIaおよびIva (図6)も見出される。
【０１１２】
表2に各培養物について得られた組成を示す。
二糖構造の再現可能な修飾はIL-4の存在または不在の関数として得られ、この修飾はIIsおよびIIIs二糖のパーセンテージについて主に観察される。
【０１１３】
実施例2：系統の培養物およびヘパリンタイプの分子の産生の分析
単離された肥満細胞の二糖のプロフィールを、3つの培養液条件(C1、C7およびC8)について分析した。細胞を懸濁物中に増幅させ、100 mlスピナー中で培養した。
細胞培養
最初の細胞密度は2×105細胞／mlである。細胞を5% CO2雰囲気下で37℃でインキュベートし、計数を顕微鏡下で規則的な間隔で行う。
このようにして製造した培養物のサンプルを計数のときにヘパリンタイプの多糖含量のHPLC分析ならびに抗-IIaおよび抗-Xa生物学的活性の測定のために採取する。
これらの条件下で、最大の細胞密度は4〜6×105細胞/mlの間であり、指数関数的倍加時間は24〜48時間の間である。
図7は、第14継代の肥満細胞の増殖を示す。
【０１１４】
多糖の分析
3つの回収日(D4、D7およびD10)のサンプルのHPLC分析は、全ての培養物について、多糖に関してヘパリンタイプのプロフィールを示し、IL-4がIIs二糖とIIIs二糖の相対的パーセンテージに影響を有する。培養物の生産性はかなりであり、106細胞について2〜12μgの間である。
【０１１５】
比較により、マウス種の肥満細胞系統、例えばMontgomeryら(Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 11327〜11331, 1992)により記載されたMST細胞またはヒト肥満細胞系統HMC1 (Butterfield et al Leuk Res, 12(4),345〜355,1988)の培養は、本発明の主題であるブタの系統に比べて20〜200分の1のヘパリンタイプ化合物の生産性を示す(表3および4)。
【０１１６】
多糖の生物学的活性
因子XaおよびIIaの不活性化はヘパリンの特徴であり、それをヘパラン硫酸およびデルマタンから区別することを可能にする。用いられる方法は欧州薬局方第3版(1997)のモノグラフに記載されたものである。
【０１１７】
反応は3つの工程で起こる。
1：ATIII + ヘパリン                             [ATIII-ヘパリン]
2：[ATIII-ヘパリン] + 過剰の因子 +残存因子      [ATIII-ヘパリン-因子]
3：残存因子 + 発色団基質                        着色パラニトロアニリン
放出されるパラニトロアニリンの量はヘパリンの量に反比例する。
【０１１８】
抗-Xaまたは抗-IIaの量を、SPIM標準(標準国際ヘパリン(Standard International Heparin))で確立した検量線について測定する。この方法の感度は0.006 IU/mlである。
生物学的活性は、HPLCにより得られた二糖の定量を考慮に入れてIU/mgで表される。
【０１１９】
増殖期の最後の後に第10日の回収について行なわれた分析により、抗-Xaおよび抗-IIa生物学的活性が10〜25 IU/mgの間であることが明らかになる。
培養のこの段階について、2つの活性の間の比は1に近く、この比はブタの腸粘膜からの抽出物に由来するヘパリンに特徴的な比であることが注目される。
因子XaおよびIIaの不活性化の測定により得られる結果を表5にまとめる。
【０１２０】
【表２】
2006522597.tif 000003
【０１２１】
実施例3：単離した細胞の遺伝的改変
肥満細胞は、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオポレーションまたは感染の技法を用いて外因性の核酸を導入することにより遺伝的に改変することができ、これは導入された核酸の一過的または安定的な発現となる。安定的な発現の場合、DNAは細胞のゲノムに組み込まれるかまたはエピソームとして維持されることができる。
【０１２２】
1 ヌクレオポレーションおよびエレクトロポレーションによるトランスフェクション
安定的にトランスフェクションされた細胞は、以下に記載のヌクレオポレーション法を用い、ヌクレオポレーションの24〜72時間後に選択圧(ハイグロマイシン、ジェネティシン、ブラストサイジン、ピューロマイシンまたはゼオシン)をかけて得ることができる。選択剤に対する耐性は対象の遺伝子(gene of interest)および耐性遺伝子を有する原形質の組込みにより付与される。
【０１２３】
ヌクレオポレーション
この方法は、DNAを核内へ直接標的することを可能にするので用いるのが好ましい。
対数期の、好ましくは培養の3または4日後の1〜2×106肥満細胞を1000 rpmで5分間遠心分離し、ヌクレオフェクション溶液(Amaxa, Kit 8351) 100μl中に採取する。GFPをコードするプラスミドであるpcDNA3.1-eGFP 2〜4μgを細胞懸濁液に加える。次いで細胞をエレクトロポレーションキュベットに移し、特定のプログラム(例えばU14、T20およびT22 AMAXA)を用いる電気ショックに付す。
次いで細胞を予め37℃に加熱した完全培地2 mlに移し、37℃、5% CO2でインキュベートする。
【０１２４】
トランスフェクションの24〜48時間後に、細胞を1%パラホルムアルデヒド(Prolabo)で固定するために回収する。このために、培養物全体を1000 rpmで5分間遠心分離する。上清の除去後、細胞を1×PBS 4 ml中で洗浄して再び遠心分離する。細胞ペレットを1%パラホルムアルデヒド1 ml中に採取する。このようにして固定した細胞をサイトメータ(Cytomics FC 500、Beckman Coulter)で分析する。
上記のヌクレオポレーション条件により、50％を超える良好な細胞生存率を得ながら同時にブタの肥満細胞を30〜50％の間のトランスフェクション効率でトランスフェクションすることが可能になる。
【０１２５】
エレクトロポレーション
対数期の1〜5×106細胞を1〜30μgのDNAと接触させる。4 mmのエレクトロポレーションキュベットに移した細胞を氷上で5分間インキュベーションし、その後150 V〜400 Vの間の電圧で500〜960μF (Gene Pulser II、Biorad)のコンデンサを用いてエレクトポレーションする。エレクトロポレーションの後、細胞を氷上で5分間再びインキュベートし、次いで最後に完全培地5 mlに移して37℃、5% CO2でインキュベートする。
安定的に導入遺伝子を組み込んだ細胞を選択するプロセスは、上記と同じ技法を用い、プラスミドの組込みにより付与された選択剤耐性を用いる。
【０１２６】
2 ウイルスベクターを用いるトランスフェクション、汎親和性レトロウイルスベクターの使用
エレクトロポレーションおよびヌクレオポレーションによるトランスフェクションの方法の代替として、複製能欠損組換えレトロウイルスを用いることができる。例えば水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV-G)で偽型(pseudotyped)にしたベクターを用いることができ、これはブタの細胞に感染可能な汎親和性レトロウイルスベクターの産生を許容する。
【０１２７】
このトランスフェクションの方法において、ブタの肥満細胞内で発現されるかまたは該細胞内に組み込まれるべき対象の遺伝子を有するレトロウイルスベクターを、まず偽型エンベロープタンパク質(env- VSV-G)の産生のための遺伝子を除くベクター産生のための遺伝的要素(gagおよびpol)を含むGP-293 (Clontechプロトコル参照番号PT 3132-1)のようなパッケージング細胞を用いて産生する。
【０１２８】
レトロウイルスベクターの産生のときに、パッケージング細胞は、VSV-Gエンベロープ遺伝子をコードするプラスミドおよび選択遺伝子を有するかまたは有さずに対象の遺伝子をプロモーターの制御下にコードするレトロウイルスプラスミドと共トランスフェクションされる。
【０１２９】
実際には、GP-293細胞を指数増殖期にするために、トランスフェクションの前に48〜72時間培養におく。トランスフェクションの日に、培養液を新鮮な培地(106細胞当たり15〜20 ml)に交換し、VSV-Gプラスミド(106細胞当たり5〜20μg)と対象の遺伝子を有するプラスミド(106細胞当たり10〜30μg)とのリン酸カルシウムバッファー、pH7中の混合物を含む溶液1〜2 mlを培養液(1〜2 ml (Promega))に滴下する。
【０１３０】
次いで細胞を37℃または好ましくは32〜35℃の間の温度で16〜24時間再びインキュベートする。培養液を新鮮な培地に再び交換する。細胞を32〜35℃でさらに48時間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、新しく形成されたレトロウイルスベクターを含む培養上清を回収する。パッケージング細胞の感染からの上清の一部分を一定量に分けて−80℃で凍結し、他の部分を指数増殖期の肥満細胞の培養液と混合する。実際には、培養物の肥満細胞を遠心分離して、50％の新鮮な培地と50％の感染上清とを含む培地に再懸濁する。肥満細胞を32〜35℃で24時間インキュベートし、次いで培地を再び新鮮な培地に交換する。
【０１３１】
肥満細胞の感染の48〜72時間後にサンプルを採取して、コントロールがGFP (緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein))蛍光レポーターでの感染を含む場合にサイトフルオリメトリーにより、または対象の遺伝子での感染についてPCRにより分析する。サイトフルオリメトリーにより、トランスフェクション効率の測定は全細胞の20％を越える。
【０１３２】
トランスフェクションされた細胞の集団を、対象の遺伝子および耐性遺伝子を有するレトロウイルスベクターでトランスフェクションされた肥満細胞のみが続けて増殖するために培養液に細胞毒性剤(ハイグロマイシン、ピューロマイシン、G418、ゼオシン)を添加して選択する。この方法を通して、対象の遺伝子は安定的に組み込まれ、安定的に発現される。
【０１３３】
集団の選択およびクローニングの後に、選択剤を培地から除去し、同時に対象の遺伝子の発現を保持することができる。このようにして産生されたレトロウイルスベクターは宿主肥満細胞内で複製せず、よって複製ベクターの産生はない。
あるいは、発現が、所望のときに培養液に添加された化合物により対象の遺伝子の発現を制御するプロモーターの誘導に付されるベクターを用いることができる。
【０１３４】
実施例4：ブタc-kit遺伝子の単離
ブタc-kit遺伝子を、RNAの供給源としてブタの肝臓肥満細胞培養物から単離された全RNAを用いて以前に記載された手順(Piuら, CR Acad. Sci. Paris, 316, 772〜779, 1993)に従って3'-RACEにより単離した。
全RNA 2μgのcDNAへの逆転写を、5'/3' RACEキット(Roche)のプロトコルに従って、プライマとして配列番号8 5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv 3'の配列のOligodTアンカープライマとよばれるオリゴdTを用いて行なった。次いで、cDNAをExpand高忠実度システムキット(Roche)を用いてPCRにより増幅する。
【０１３５】
cDNA 1μlについて、配列番号9 5' gga att cct cga gag cag gaa cgt gga aag gag3'の配列のブタc-kit遺伝子の5'非コーディング領域(記載されたブタのc-kit配列、GenBank ref AJ223228に関して24〜42ヌクレオチド)に特異的にハイブリダイズするセンスプライマC15203と、オリゴdTプライマのレベルで3'位置に特異的にハイブリダイズする配列番号10 5' gac cac gcg tat cga tgt cga c 3'のPCRアンカープライマとよばれるアンチセンスプライマとを用いてPCRを行なった。10回のPCRサイクル、次いで25回のPCRサイクルを行った(サイクル1：94℃での変性を15秒、55℃でのハイブリダイゼーションを45秒および68℃での伸長を4分、サイクル2：94℃での変性を15秒、60℃でのハイブリダイゼーションを45秒および68℃での伸長を4分)。
【０１３６】
得られるPCR産物をQuiaquickゲル抽出キット(Quiagen)を用いて1%アガロース、1×TBEゲルで精製する。
第1のPCRと同じ第2のPCRを精製PCR産物の1/30を用いて、25回のサーマルサイクル(94℃での変性を15秒、60℃でのハイブリダイゼーションを45秒および68℃での伸長を4分)を適用することにより行う。第2のPCRの最後に、PCR産物をベクターpGEMTeasyにpGEM-T Easyベクターシステム(Promega)プロトコルに従ってクローニングするために再び精製する。
【０１３７】
次いで、ブタの遺伝子の配列を配列決定により部分的に決定する。得られるヌクレオチド配列は、配列番号1の配列である。導き出されるタンパク質配列は、配列番号2の配列である。この配列番号1の配列は、参照番号AJ 223228の下で記載される配列に比べると違いを示す。具体的には、C-末端に9つの付加的なアミノ酸を有し、ヌクレオチド配列に以下の違いが観察され、このことが2つのアミノ酸の改変に導く：
改変(AJ 223228に記載された配列に比較して)：
nt 237 t → g,：H → Q
nt 351 a → t
nt 523 a → c
nt 606 c → t
nt 609 g → a
nt 635 g → a,：R → K
nt 639 c → t
nt 663 c → g
nt 669 c → a
nt 2016 a→ g
nt 2865 c → t
【０１３８】
実施例5：ブタ3-OST遺伝子の3'コーディング配列の単離と配列決定
3-OSTをコードするブタの遺伝子の部分配列は、ESTライブラリから入手可能である(GenBank受理番号BF075483)。この配列のヒト配列との整列は、この配列が3'コーディング領域の約650 bpを欠失していることを示す。
ブタ3-OST遺伝子の欠如している部分は、RT-PCRと3'-RACEとを組み合わせて、RNAの供給源としてTrizolキット(Invitrogen)のプロトコルに従って単離したブタ肝臓RNAを用いて同定した。
【０１３９】
全RNA 2μgのcDNAへの逆転写をFirst Strand Synthesis Systemキット(Invitrogen)のプロトコルに従って、プライマとしてそれぞれ配列番号11 5'-GCA GCA GCC ACG TCG GG-3'および配列番号12 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3'の配列のオリゴヌクレオチドBS02およびBS03の混合物を用いて行なった。
【０１４０】
次いで、これらのcDNA 2μlを配列番号13 5'-CGG NGA CCG CCT NAT CAG-3'の配列のセンスプライマBS05と、配列番号14 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3'の配列のアンチセンスプライマBS06との存在下にKODホットスタートポリメラーゼ(Novagen)を用いるPCRにより増幅した。30回のサーマルサイクル(98℃での変性を15秒、60℃でのハイブリダイゼーションを30秒および68℃での伸長を30秒)の後に、277 bpの増幅断片をベクターpCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloningキット)にクローニングして配列決定した。
この断片の配列を用いて、3'-RACEにより全3'領域を単離するために2つのプライマBS21およびBS22を作製した。
【０１４１】
3'-RACEの枠組みの中で、InvitrogenからのFirst Strand Synthesis Systemキットのプロトコルに従って、プライマとして配列番号15 (5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T30 VN-3')のオリゴdT CDSIIIを用いてブタ肝臓RNA 1μlをcDNAに逆転写した。
【０１４２】
次いで、3-OSTをコードする遺伝子の3'領域を2回の連続するPCRにより増幅した。第1のPCRは、前に得られたcDNA 2μlに、配列番号16 5'-GCA CCC CCA GAT CGA CCC C-3'のセンスプライマBS21とアンチセンスプライマCDSIIIとを用いて行なった。30回のサーマルサイクルを行なった(94℃での変性を10秒、60℃でのハイブリダイゼーションを30秒および68℃での伸長を120秒)。次いで、第2のPCRを第1のPCRと同じ条件下で、第1のPCRからの産物1μlを、配列番号17 5'-CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3' の配列のセンスプライマBS22とアンチセンスプライマCDSIIIと用いて行なった。
【０１４３】
このようにして3'-RACEの最後に得られたPCR産物の配列決定により、ブタ3-OSTの3'配列および約250 bpの非コーディング領域の同定が可能であった。
【０１４４】
ブタ3-OST遺伝子の完全なコーディング相(phase)の単離
ブタ3-OSTの完全なコーディング相をクローニングするために、第一工程で得られた情報を用いてさらなるRT-PCR実験を行った。
RNAの供給源は、上記の工程と同じである。
【０１４５】
RNA 2μgをInvitrogenからのFirst Strand Synthesis Systemキットのプロトコルに従って、プライマとしてオリゴヌクレオチドdT24を用いてcDNAに逆転写した。
次いで、3-OSTをコードする遺伝子をPCRにより2つの工程で増幅した。第1のPCRは、遺伝子の3'非コーディング配列の部分を含む遺伝子の増幅を可能にし、第2のPCRは、Gatewayシステム(Invitrogen)に矛盾しないプライマを用いてコーディング配列を増幅することを可能にした。
【０１４６】
第1のPCRをcDNA 2μlに、ブタ3-OST遺伝子の5'非コーディング領域に特異的にハイブリダイズする5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3'の配列のセンスプライマBS10と、UTRのレベルで3'領域に特異的にハイブリダイズする5'-CAC CTA GTG TAC ACC ACA ATT TAC-3'の配列のBS30アンチセンスプライマとを用いて行なった。35回のサーマルサイクル(98℃での変性を10秒、64℃でのハイブリダイゼーションを30秒および68℃での伸長を150秒)を行なった。
【０１４７】
第2のPCRを、コーディング相を特異的に増幅させるためにPCR産物1μlについて行なった。このために、配列番号18 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGC ATG GCC GCG CTG CTC 3'の配列のセンスプライマBS31と配列番号19 5' GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TTT AGT GCC AGT CAA ATG TTC TGC C 3'の配列のアンチセンスプライマBS32とを用いた。用いたPCRのプログラムは第1のPCRに用いたものと同じである。
【０１４８】
次に、1 kbのPCR産物を、Gatewayクローニングテクノロジーキット、Invitrogenの手順に従ってエピソームベクターpE-IRES-neo2にクローニングした。ブタ遺伝子の配列をRNA配列決定により確認した。
得られたヌクレオチド配列は、配列番号4の配列である。導き出されたタンパク質の配列は配列番号5の配列である。
【０１４９】
実施例6：ブタ6-OST遺伝子の完全コーディング配列の同定
6-OSTをコードするブタ遺伝子の部分配列(ヒト配列のヌクレオチド682〜910)は、ESTライブラリ(GenBank受理番号BE235545)で入手可能である。
6-OST遺伝子の完全コーディング配列を、RNAの供給源としてTrizolキット(Invitrogen)のプロトコルに従って単離したブタ肝臓RNAを用いて2つのRT-PCR実験と5'および3'-RACE実験とを組み合わせることにより同定した。
【０１５０】
全RNA 80 ngのcDNAへの逆転写を、プライマとしてオリゴヌクレオチドdT24を用いてFirst Strand Synthesis Systemキット(Invitrogen)のプロトコルに従って行なった。
次いで、これらのcDNA 2μlを、配列番号20 5'-AGA TGA CTG GTC GGG CTG C-3'の配列のセンスプライマ386-03と、配列番号21 5'-CAA TGA TRT GGC TCA TGT AGT CC-3'の配列のアンチセンスプライマ386-01との存在下にKODホットスタートポリメラーゼ(Novagen)を用いるPCRにより増幅した。35回のサーマルサイクル(95℃での変性を15秒、60℃でのハイブリダイゼーションを30秒および68℃での伸長を2分)の後に、537 bpの増幅断片をベクターpCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloningキット)にクローニングして配列決定した。
【０１５１】
この断片の配列を、次のPCRと3'-RACEのために用いる3つのプライマ386-05、386-19および386-20を作製するのに用いた。
【０１５２】
上記で得られたcDNA 2μlを、配列番号22 5'-ATG GTT GAG CGC GCC AGC AAG TTC G-3'の配列のセンスプライマ386-07と、配列番号23 5'-GGT TAT TGG CCA GGT TGT AGG GGC-3'の配列のアンチセンスプライマ386-05との存在下にKODホットスタートポリメラーゼ(Novagen)を用いるPCRにより増幅した。30回のサーマルサイクル(95℃での変性を15秒、60℃でのハイブリダイゼーションを30秒および68℃での伸長を1分)の後に、718 bpの増幅断片をベクターpCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloningキット)にクローニングして配列決定した。
【０１５３】
この断片の配列を、5'-RACEのために用いる2つのプライマ386-24および386-26を作製するのに用いた。
【０１５４】
3'-RACEの枠組みの中で、Invitrogen からのFirst Strand Synthesis Systemキットのプロトコルに従って、プライマとして配列番号24 5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T30 VC-3'の配列のオリゴdT CDS-Cを用いてブタ肝臓RNA 1μlをcDNAに逆転写した。
【０１５５】
次いで、6-OSTをコードする遺伝子の3'領域を2つの連続するPCRにより増幅した。第1のPCRを、上記で得られたcDNA 2μlについて、配列番号25 5'-GGA CCT CTT CCA GCA GCG-3'の配列のセンスプライマ386-19とアンチセンスプライマCDS-CとをAdvantage 2ポリメラーゼミックス(Clontech)とともに用いて行なった。24回のサーマルサイクルを行なった(98℃での変性を7秒、62℃でのハイブリダイゼーションを10秒および68℃での伸長を2分)。次いで、第2のPCRを第1のPCRからの産物2μlについて、配列番号26 5'-GCT ATC AGT ACA AGC GGC AGC -3'の配列のセンスプライマ386-20とアンチセンスプライマCDS-Cとを用いて行なった。30回のサーマルサイクル(95℃での変性を7秒、62℃でのハイブリダイゼーションを10秒および68℃での伸長を2分)の後に、300 bpの増幅断片をベクターpCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloningキット)にクローニングして配列決定した。
この実験により、6-OSTの3'コーディング領域および非コーディング領域の約32 bpを同定することが可能であった。
【０１５６】
5'-RACEの枠組みの中で、ブタ肝臓RNA 2μlをInvitrogenからのFirst Strand Synthesis Systemキットのプロトコルに従って、プライマとして配列番号27 5'- CCA GGC TCA GCC CCG G-3'の配列のオリゴヌクレオチド386-28を用いてcDNAに逆転写した。
配列番号28 5'-p GTA GGA ATT CGG GTT GTA GGG AGG TCG ACA TTG CC-3'の配列のリン酸化オリゴヌクレオチドokib57を、ライゲーション(RNAリガーゼ、Roche)によりcDNAの5'にグラフトした。
【０１５７】
次いで、6-OSTをコードする遺伝子の5'領域を2つの連続するPCRにより増幅した。第1のPCRを、グラフトcDNA 2μlについて、プライマokib57にハイブリダイズする配列番号29 5'-GGC AAT GTC GAC CTC CCT ACA AC-3'の配列のセンスプライマokib58と、配列番号30 5'-TCA GCC CCG GGC CCG CG-3'の配列のアンチセンスプライマ386-24とをAdvantage 2ポリメラーゼミックスキットのプロトコルに従って用いて行なった。24回のサーマルサイクルを行なった(98℃での変性を10秒、64℃でのハイブリダイゼーションを10秒および72℃での伸長を2分)。次いで、第2のPCRを、第1のPCRからの産物0.5μlについて、配列番号31 5'-CTC CCT ACA ACC CGA ATT CCT AC-3'の配列のセンスプライマokib59と、配列番号32 5'-GCC CGC GTA CTG GTA GAG G-3'の配列のアンチセンスプライマ386-26とを用いて行なった。40回のサーマルサイクル(98℃での変性を10秒間、66℃での変性を10秒間および72℃での伸長を2分間)の後に、170 bpの増幅断片を配列決定した。この実験により、6-OSTの5'コーディング領域および約14 bpの非コーディング領域を同定することが可能であった。
【０１５８】
ブタ6-OST遺伝子の完全コーディング相の単離
ブタ6-OSTの完全コーディング相をクローニングするために、第一工程で得られた情報を用いてさらなるRT-PCR実験を行った。
RNAの供給源は、上記の工程と同じである。
【０１５９】
RNA 2μgを、First Strand Synthesis Systemキットのプロトコルに従って、プライマとしてオリゴヌクレオチドdT CDSIIIを用いてcDNAに逆転写した。
次いで、6-OSTをコードする遺伝子を、Gatewayシステム(Invitrogen)に矛盾しないプライマを用いてPCRにより増幅した。PCRは、cDNA 2μlについて、配列番号33 5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AGG ACA ATG GTG ACA CAT GCG GCG GC-3'の配列のセンスプライマ386-33と、配列番号34 5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC CTA CCA CTT CTC GAT GAT GTG GCT C-3'の配列のアンチセンスプライマ386-34とを用いて行なった。35回のサーマルサイクルを行なった(98℃での変性を5秒、66℃でのハイブリダイゼーションを20秒および72℃での伸長を1分30秒)。
【０１６０】
次いで、1 kbのPCR産物を、Gatewayクローニングテクノロジーキット、Invitrogenの手順に従って、エピソームベクターpE-IRES-neo2にクローニングした。ブタの遺伝子の配列を配列決定により確かめた。
得られたヌクレオチド配列は、配列番号6の配列であった。導き出されたタンパク質の配列は、配列番号7の配列であった。
【０１６１】
実施例7：ブタc-kit遺伝子を用いる本発明による系統の形質転換
増殖が長期においてSCF非依存性であると見られるブタ肥満細胞を得るために、変異c-kit遺伝子を用いて肥満細胞を形質転換することができる。
このために、優先的に、バリン556のグリシンへの改変の原因となる点突然変異を有するブタのc-kit遺伝子(c-kitG556遺伝子という)を用いることができ、この変異はマウスにおけるc-kitG559変異およびヒトにおけるc-kitG560と類似である。代わりに、アミノ酸TQLPYDH 570〜576が欠失しているc-kit遺伝子を用いることもできる。マウスでは、この欠失はアミノ酸573〜579、ヒトでは574〜580と類似である。同様に、c-kit遺伝子の種間の保存により、マウス、ヒトまたはウシの遺伝子あるいはブタの遺伝子と少なくとも80％の相同性を有するいずれのその他の遺伝子を用いることができる。この場合、マウスおよびヒトにおいてそれぞれアスパラギン酸のバリン814または816への改変の原因である点突然変異を用いることもできる。
【０１６２】
肥満細胞は、実施例4に記載の方法の1つにより、好ましくはヌクレオポレーションにより、変異c-kit遺伝子のコーディング相が強いウイルス性(CMV、RSV)または細胞性(EF1α)のプロモーターの制御下にクローニングされている組込みベクター(integrative vector)でトランスフェクションされる。このベクターは、変異c-kit遺伝子に加えて、抗生物質(ジェネティシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンなど)耐性をコードする遺伝子も有し得る。
【０１６３】
トランスフェクションの48時間後、細胞を計数し、遠心分離して選択抗生物質を補った完全培地に2×105 C/mlで播種する。選択の存在下に細胞を2〜3週間培養し、これが安定的にトランスフェクションされていない細胞を除くことを可能にする。この選択の期間の後に、細胞を増幅させる。
【０１６４】
次いで、細胞を変異c-kit遺伝子の組込みとその発現とを確かめるために、PCRおよびRT-PCRにより遺伝子的に分析する。SCFについての細胞の独立的な性質は、SCFを含まない培地中での変異c-kit遺伝子でトランスフェクションされた細胞の増殖を、SCF含有および非含有の培地中での空のベクターでトランスフェクションされた細胞の増殖と比較することにより証明される。
【０１６５】
このプロトコルの変形は、変異c-kit遺伝子のみを有するベクターを用いることにある。この場合、細胞は、選択剤を用いないが細胞を2×105 C/mlでSCF非含有培地に播種することにより、トランスフェクションの48時間後に選択される。トランスフェクションされていない細胞は、トランスフェクションされた細胞とは異なって、SCF非含有培地で増殖できない。
【０１６６】
実施例8：ブタ3-OST遺伝子を用いる本発明による系統のトランスフェクション
肥満細胞培養物由来のヘパリンタイプの分子の生物学的活性を増加させるために、3-OST-1 (3 O-スルファターゼ-1)をコードする遺伝子を安定的に過剰発現させることができる。
このために、ブタの遺伝子を用いることができる。あるいは、3-O-スルファターゼ活性をコードしかつブタの遺伝子と少なくとも80%の相同性を示す他の主からの遺伝子、特にマウス3-OST-1を用いることができる。
【０１６７】
肥満細胞を実施例4に記載のヌクレオポレーション法により、3-OST遺伝子のコーディング相が強いウイルス性(CMV、RSV)または細胞性(EF1α)のプロモーターの制御下にクローニングされている組込みベクターでトランスフェクションされる。このベクターは、3-OST遺伝子に加えて、抗生物質(ジェネティシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンなど)耐性をコードする遺伝子も有し得る。
【０１６８】
トランスフェクションの48時間後、細胞を計数し、遠心分離して選択抗生物質を補った完全培地に2×105 C/mlで播種する。選択の存在下に細胞を2〜3週間培養し、これが安定的にトランスフェクションされていない細胞を除くことを可能にする。この選択の期間の後に、細胞を増幅させる。
【０１６９】
細胞を変異c-kit遺伝子の組込みとその発現とを確かめるために、PCRおよびRT-PCRにより遺伝子的に分析する。
3-OSTの機能性は、トランスフェクションされていない肥満細胞により産生されたヘパリンと比較した、肥満細胞により産生されたヘパリンのHPLC分析により証明される。生成物の生物学的活性の分析により、因子Xaおよび因子IIaに関する生物学的特性の上昇を確認することができる。
【０１７０】
【表３】
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【０１７１】
【表４】
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【０１７２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図1A〜1Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での3週間の培養の後に得られた肥満細胞の抗トリプターゼ標識化を示す。
【図２】図2A〜2Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での5週間の培養の後に得られた肥満細胞のIgE受容体の標識化を示す。
【図３】図3A〜3Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での7週間の培養の後に得られた肥満細胞の抗トリプターゼ標識化を示す。
【図４】図4A〜4Hは、それぞれ条件C1〜C8の下での8週間の培養の後に得られた肥満細胞のFGF標識化を示す。
【図５】図5は、7週間の培養の間の種々の条件C1〜C8の下での培養物の増殖を示す。
【図６】図6は、ヘパリンのN-硫酸化二糖に相当するIs、IIs、IIIsおよびIVs二糖ならびに同種のアセチル化二糖Ia、IIa、IIIaおよびIvaの化学構造を表す。
【図７】図7は、条件C1、C7およびC8の下で得られた肥満細胞のリアクタ内での増殖を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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