(57)【要約】本発明は、排出タンパク質のファミリーをコードするｙｈｃＲＱＰオペロンの操作を通じて、宿主細胞からの芳香族カルボン酸の産生を増大させる方法を提供する。さらにｙｈｃＲＱＰ中の遺伝子の全部またはサブセットのアップレギュレーションは、芳香族カルボン酸の毒性に対する耐性を高めることが分かった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）芳香族カルボン酸を産生し、
ｉｉ）少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子を含んでなる
宿主細胞を提供し、そして
ｂ）少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子の発現をアップレギュレートすることで、芳香族カルボン酸の収率が増大される、
ことを含んでなる、該芳香族カルボン酸を産生する宿主細胞からの芳香族カルボン酸の収率を増大させる方法。
【請求項２】
ａ）少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子を含んでなる宿主細胞を提供し、そして
ｂ）少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子の発現をアップレギュレートすることで、芳香族カルボン酸に対する宿主細胞の抵抗性が増大される、
ことを含んでなる、芳香族カルボン酸に対する宿主細胞の抵抗性を増大させる方法。
【請求項３】
少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子が該宿主細胞に内在性である請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子が該宿主細胞にとって異種性である請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、細菌、酵母、菌・カビ類、および植物よりなる群から選択される請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が腸内細菌である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、およびシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）よりなる属の群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項８】
芳香族カルボン酸が、パラ−ヒドロキシ安息香酸、パラ−ヒドロキシケイ皮酸、ケイ皮酸、サリチル酸、安息香酸、および１−ナフトエ酸よりなる群から選択される請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子が、配列番号１〜４よりなる群から選択される少なくとも１つの単離された核酸分子に作動可能に連結する少なくとも１つの適切なプロモーターを含んでなる請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子に作動可能に連結する適切なプロモーターを含んでなる請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子がマルチコピープラスミド上に発現する請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのｙｈｃＱ遺伝子および少なくとも１つのｙｈｃＰ遺伝子が強力なプロモーターのコントロール下にある請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
強力なプロモーターが、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃよりなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ｉ）配列番号１〜４よりなる群から選択される単離された核酸分子、および
ｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６５℃における、および２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで洗浄、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳでの２回目の洗浄、の条件下で（ｉ）とハイブリダイズする、単離された核酸分子
よりなる群から選択される核酸配列を有する単離された核酸分子、
および
ｂ）プロモーター
を含んでなり、
プロモーターが単離された核酸分子に対して異種性である、
排出タンパク質をコードするキメラ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は２００３年１月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／４４０，７６０号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より具体的には本発明は、芳香族カルボン酸の排出タンパク質の推定上の排出トランスポーター（ＰＥＴ）ファミリーのメンバーをコードする新しい遺伝子に関与する。
【技術背景】
【０００３】
様々な天然芳香族カルボン酸が、工業用途において有用であることが分かっている。パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ＰＨＣＡ）およびパラ−ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢＡ）などの化合物は高価値であり、液晶ポリマー（ＬＣＰ）産生のためにモノマーとして使用されても良い化合物である。ＬＣＰは、ガラス遷移温度と等方性液体への遷移温度との間で中間相またはメソ相を示す、あるいは特定の濃度および温度範囲で少なくとも１つのメソ相を有するポリマーである。これらのメソ相内の分子は液体のように挙動して流れるが、結晶の異方性も示す。ＬＣＰは液晶ディスプレイ中、そして電子、電気通信、および航空宇宙用途のための高速コネクタおよびフレキシブル回路中で使用される。滅菌放射線に対するそれらの抵抗性、およびそれらの高い酸素および水蒸気バリア特性のために、ＬＣＰは医学装置で、そして薬品および食品包装で使用される。
【０００４】
ＰＨＣＡおよびＰＨＢＡの化学合成法は知られている。しかし化学合成は合成に要する高いエネルギーおよび必要とされる大規模な生成物精製のために高価である。これらの化合物の生物学的産生は、問題に安価で簡単な解法を提供する。
【０００５】
組換え微生物から芳香族カルボン酸を生成するいくつかの方法が、文献で述べられている（例えば本願と所有権者を同じくする特許文献１、特許文献２、および特許文献３を参照されたい）。しかし商業用途のためには、これらの分子の産生を最適化することが有利であろう。産生を最適化する１つの経路は、収率を増大することである。これらの芳香族カルボン酸の多くは産生宿主細胞にとって有毒であるため、別の経路は、最終生成物が宿主細胞に及ぼす毒性効果を最小化することかもしれない。これらの双方の問題に対処できるかもしれない遍在性のタンパク質のファミリーが、排出タンパク質である。
【０００６】
生体分子の細胞産生は、産生菌株において排出輸送タンパク質の発現を最適化することである程度最適化できる。例えば有毒生成物の排出系の増大した発現は、所望の速度、力価および収率を達成するのに重大な意味を持つかもしれない。
【０００７】
２００を超える輸送タンパク質ファミリーが同定されており、１００を超えるこれらの輸送タンパク質ファミリーが細菌中に存在する（非特許文献１）。少なくとも４つの薬剤抵抗性輸送体のスーパーファミリーが細菌中に存在することが知られている。これらのスーパーファミリーは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）スーパーファミリー、主要促進性（Ｍａｊｏｒ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリー、薬剤／代謝産物輸送体（Ｄｒｕｇ／Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）スーパーファミリー（非特許文献２）、および抵抗性−根粒形成−細胞分裂（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−Ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）ファミリーである。
【０００８】
排出系の過剰発現またはプラスミドベクターからのその発現は、多様な有毒物質に対する細菌の増大した抵抗性をもたらす一方、排出系の不活性化は抗生物質および有毒物質に対する感受性の増大を引き起こす（非特許文献３；非特許文献４）。このような排出系は、広範な細菌においてますます認識されてきている。様々な輸送タンパク質の比較アミノ酸配列分析、および機能アッセイにより、いくつかの輸送タンパク質の明確なファミリーおよびスーパーファミリーの同定が可能になった。
【０００９】
チェン（Ｃｈｅｎ）に付与された（特許文献４）および（特許文献５）（２００１年５月）は、溶剤および抗生物質の推定上の排出タンパク質をコードする遺伝子の単離を開示する。シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ  ）（「Ｐ．メンドシナ（Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）」）から単離された推定上の排出タンパク質が、溶剤耐性に関わる排出系を調べるために使用される。増大したレベルのパラ−ヒドロキシ安息香酸を含有する培地中で、推定上の排出タンパク質をコードする変化したレベルの遺伝子を含有するＰ．メンドシナ菌株を培養することは、パラ−ヒドロキシ安息香酸の蓄積をもたらす。推定上の排出タンパク質は、主要促進性（Ｍａｊｏｒ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリー中のタンパク質の徴候である、高度に保存された領域またはモチーフを含有する。
【００１０】
パラ−ヒドロキシ安息香酸に対する排出ポンプの変異を含有する細菌細胞の耐性は、パラ−ヒドロキシ安息香酸排除におけるこれらの排出ポンプの関与の徴候である（非特許文献５；非特許文献６）。シュードモナス・ピュチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（「Ｐ．ピュチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）」）では、２つの排出ポンプＴｔｇＡＢＣおよびＴｔｇＤＥＦが、パラ−ヒドロキシ安息香酸の排除に関わっていることが推測される。これらの排出ポンプの変異は、細胞膜の増大した硬性との連携で、Ｐ．ピュチダ菌株におけるパラ−ヒドロキシ安息香酸の蓄積をもたらす。
【００１１】
これもまたＰ．ピュチダから単離されるタンパク質ＰｃａＫは、パラ−ヒドロキシ安息香酸の流入に関与する輸送体である（非特許文献７）。主要促進性（Ｍａｊｏｒ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリーのメンバーであるこの輸送体は、細胞外パラ−ヒドロキシ安息香酸に対する走化性にも関与する。しかしＰｃａＫは細胞中に安息香酸を輸送しない。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）」）における野生型ＰｃａＫタンパク質の発現は、ＰｃａＫ変異を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と比べてパラ−ヒドロキシ安息香酸の増大した蓄積をもたらす。
【００１２】
１９９４年３月８日にシバノ（Ｓｈｉｂａｎｏ）らに付与された（特許文献６）は、多様な微生物におけるフザリン酸抵抗性に関係する遺伝子について述べる。具体的にはフザリン酸を分解または無毒化できる遺伝子が開示される。フザリン酸抵抗性に関与することが仮定される遺伝子の１つがｆｕｓＢであり、ＰＥＴ  ｙｈｃＰ遺伝子といくつかの相同性を有する（非特許文献８）。
【００１３】
本願出願人らは、「チューナブル遺伝子発現および代謝産物センシングのためのレギュレーター／プロモーター（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ）」と題された、共有される同時係属出願、特許文献７を参照によってここに編入する。
【００１４】
近年バイオインフォマティクス技術を使用して、細菌、酵母、および緑色植物中のタンパク質のＰＥＴファミリーが同定された（非特許文献９）。
【００１５】
【特許文献１】米国特許第１０／４３９，４７９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３６８，８３７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５２１，７４８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２２５，０８９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２３５，８８２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２９２，６４３号明細書
【特許文献７】米国特許出願第６０／４４０９６５号明細書
【非特許文献１】セイアー（Ｓａｉｅｒ）ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２：２６５〜２７４（１９９８）
【非特許文献２】ジャック（Ｊａｃｋ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３６２０〜３６３９（２００１）
【非特許文献３】リー（Ｌｉ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：２９８７〜２９９１（１９９８）
【非特許文献４】ラモス（Ｒａｍｏｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：３３２３〜３３２９（１９９８）
【非特許文献５】ゴドイ（Ｇｏｄｏｙ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：５２８５〜５２９２（２００１）
【非特許文献６】ラモス−ゴンザレス（Ｒａｍｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：４３３８〜４３４１（２００１）
【非特許文献７】ＤｉｔｔｙおよびＨａｒｗｏｏｄ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：５０６８〜５０７４（１９９９）
【非特許文献８】Ｐａｕｌｓｅｎら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５６：１〜８（１９９７）
【非特許文献９】Ｈａｒｌｅｙおよびセイアー（Ｓａｉｅｒ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１９５〜１９８（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって解決すべき問題は、最終生成物の増大した有毒性によって産生宿主を損なうことなく、芳香族カルボン酸の産生を高めることである。本願出願人らは、ｙｈｃＲＱＰオペロンによってコードされる排出タンパク質のファミリーが、細胞から培地へのカルボン酸の流動を増大させ、細胞に対するカルボン酸最終生成物の有毒性を低下させるという発見を通じて前述の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ｙｈｃＲＱＰオペロンによってコードされる排出タンパク質のファミリーのアップレギュレーションを通じた、芳香族カルボン酸の産生の促進に関する。オペロン要素は宿主細胞に内在性であっても良く、または標準組換え技術によって導入されても良い。このオペロンのアップレギュレーションの追加的な利点は、宿主細胞が得る、芳香族カルボン酸最終生成物に対する抵抗性の増大である。
【００１８】
したがって
ａ）ｉ）芳香族カルボン酸を産生し、
ｉｉ）ｙｈｃＲＱＰオペロンを含んでなる遺伝子の全てまたはサブセットを含んでなる
宿主細胞を提供し、そして
ｂ）ｙｈｃＲＱＰオペロンを含んでなる遺伝子の全てまたはサブセットの発現をアップレギュレートすることで芳香族カルボン酸の収率が増大する、
ことを含んでなる、該芳香族カルボン酸を産生する宿主細胞からの芳香族カルボン酸の収率を増大させる方法を提供することが本発明の目的である。
【００１９】
同様に本発明は、
ａ）ｙｈｃＲＱＰオペロンを含んでなる遺伝子の全てまたはサブセットを含んでなる宿主細胞を提供し、そして
ｂ）ｙｈｃＲＱＰオペロンを含んでなる遺伝子の全てまたはサブセットの発現をアップレギュレートすることで、芳香族カルボン酸に対する宿主細胞の抵抗性が増大する、
ことを含んでなる、芳香族カルボン酸に対する宿主細胞の抵抗性を増大させる方法を提供する。
【００２０】
好ましい実施態様では、宿主細胞は腸内細菌である。
【００２１】
配列番号１〜４よりなる群から選択される核酸配列、およびプロモーターを有する単離された核酸分子を含んでなり、プロモーターが単離された核酸分子と異種性である、本発明の方法の実施のために有用なキメラ遺伝子がさらに提供される。
【００２２】
配列説明
本出願の一部をなす以下の詳細な説明、および添付の配列説明から、本発明をより完全に理解できる。
【００２３】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ
ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に適合し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２４】
配列番号１は、ｙｈｃＰ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号２は、ｙｈｃＱ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号３は、ｙｈｃＱＰオペロンのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号４は、ｙｈｃＲＱＰオペロンのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号５は、ＹｈｃＰタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号６は、プライマーｙｈｃＲＱＰ_ｌｅｆｔ_９０７のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号７は、プライマーｙｈｃＲＱＰ_ｒｉｇｈｔ_９０７のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号８はプライマーｙｈｃｐ_ｌｅｆｔ_９２８のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号９は、プライマーｙｈｃＱ_ｒｉｇｈｔのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１０は、プライマーｙｈｃＱ−ｌｅｆｔのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１１は、プライマーｙｈｃＲ_ｒｉｇｈｔ−９２８のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号１２は、プライマーｙｈｃＰ−Ｌｅｆｔのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号１３は、プライマーｙｈｃＰ−Ｒｉｇｈｔのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号１４は、プライマーＫａｎ−２ＦＰ（ＰＣＲ）のヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号１５は、プライマーＫａｎ−２ＲＰ（ＰＣＲ）のヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号１６は、プライマーＹｈｃＰ_ＴｎＳｅｎｓｅのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号１７は、プライマーＹｈｃＰ_ＴｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号１８は、プライマーＫａｎ−２ＦＰ−１のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号１９は、プライマーＫａｎ−２ＲＰ−１のヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号２０は、プライマーＹｈｃＳ．Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号２１は、プライマーＹｈｃＳ．Ｒのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、ｐＨＢＡ、ｐＨＣＡ、およびケイ皮酸（ＣＡ）をはじめとする様々な芳香族カルボン酸の促進された産生方法に関する。これらの化合物は一般に液晶ポリマー中におけるモノマーとして有用であり、それらの生物生産は、既存の化学プロセスに対して商業的に好ましい代用品を提供する。
【００４６】
本願出願人らは、具体的に参照した参考文献の全体を本開示中に編入する。
【００４７】
本開示の文脈において、いくつかの用語が使用される。
【００４８】
「ｐＨＢＡ」という用語は、パラ−ヒドロキシベンゾエートとしても知られているパラ−ヒドロキシ安息香酸の略語である。
【００４９】
「ｐＨＣＡ」という用語は、パラ−ヒドロキシシンナマートとしても知られているパラ−ヒドロキシケイ皮酸の略語である。
【００５０】
「ＣＡ」という用語は、シンナマートとしても知られているケイ皮酸の略語である。
【００５１】
「ＭＩＣ」という用語は、最小阻害濃度の略語である。
【００５２】
「単離された核酸分子」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸分子は、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなっても良い。
【００５３】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態がその他の核酸分子とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件につ
いては良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（参照によって全体をここに編入する）（以下「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェント条件は、遠縁の生物からの相同的配列などの中程度に類似の断片をスクリーンするため、そして機能的酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの高度に類似した断片をスクリーンするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェント条件を決定する。１つの好ましい条件の組は、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェント条件の組はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させたこと以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェント条件の組は、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の最終洗浄を使用する。別のストリンジェント条件の組は、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でハイブリダイゼーションし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回目の洗浄を含む。
【００５４】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸をハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは技術分野でよく知られた変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、同上）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためには、ミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を定める（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、同上）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは、少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さは少なくともヌクレオチド３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で、必要に応じて調節できることを認識する。
【００５５】
「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定が得られるのに十分な、そのポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる、アミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）お
よび単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸分子を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸分子の特定の同定および／または単離ができるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、１つまたは複数の特定細菌タンパク質をコードする、部分的または完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の利益を享受して、開示された配列の全てまたはかなりの部分を当業者に知られている目的のために使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに上で定義されるようなこれらの配列のかなりの部分を含んでなる。
【００５６】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べる。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に同様の核酸配列に相補的な単離された核酸分子も含む。
【００５７】
「パーセント同一性」と言う用語は、技術分野で知られているように、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野で「同一性」とは、場合によっては、このような配列のストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ）Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）、「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｗ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９３）、「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第一部、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、（１９９４）、「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｙ）」（フォン・ハインェ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８７）、「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９１）で述べられるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最大の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。２個の配列間の同一性および類似性を判定する好ましいコンピュータプログラム法としては、それらの標準デフォルト値がｇａｐ形成ペナルティ＝１２およびｇａｐ延長ペナルティ＝４である、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用するＧＣＧプログラムパッケージにあるＧＣＧパイルアッププログラム（デュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４〜２４４８（１９８８））が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給元から一般に入手できる（「ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎ
ｆ．、Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｄ．（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ）ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、２０８９４；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））。パーセント同一性を判定する別の好ましい方法は、ヨッタン−ハイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）アルゴリズムを使用するＤＮＡＳＴＡＲタンパク質アライメントプロトコル法による（ハイン（Ｈｅｉｎら）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６〜６４５（１９９０））。アラインメントのためのヨッタン−ハイン（Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ）法のデフォルト変数は、複数アラインメントではｇａｐペナルティ＝１１、ｇａｐ長さペナルティ＝３、対合アラインメントではｋｔｕｐｌｅ＝６である。一例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチドあたり５点までの変異を含んでも良いこと以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の５％までのヌクレオチドが、欠失しまたは別のヌクレオチドで置換されていても良く、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドの数が、参照配列中に挿入されていても良い。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端部位で生じても、あるいはこれの末端部位間のあらゆる位置で、参照配列中の、または参照配列中の１つまたは複数の隣接するグループ中のヌクレオチドに個別に挿入されて生じても良い。同じように参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が参照アミノ酸の各１００個のアミノ酸あたり５個までのアミノ酸の変化を含むこと以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意味する。換言すると参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中の５％までのアミノ酸残基が欠失しまたは別のアミノ酸で置換されていても良く、あるいは参照配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸の数が、参照配列中に挿入されていても良い。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端部位で生じても、あるいはこれらの末端部位間のあらゆる位置で参照配列中の、または参照配列中の１つまたは複数の隣接するグループ中の残基間に個別に挿入されて生じても良い。
【００５８】
「パーセント相同性」と言う用語は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性の程度を指す。第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列と同一である場合、第１および第２のアミノ酸配列は１００％相同性を示す。あらゆる２個のポリペプチド間の相同性は、どちらかの配列の特定部位の整合アミノ酸総数の一次関数であり、例えば２個の配列のどちらかのアミノ酸総数の半分が同一ならば、２個の配列は５０％の相同性を示すと言われる。
【００５９】
「合成核酸断片」は、当業者に知られる手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして、遺伝子断片を形成し、次にそれを酵素的に構築して所望の遺伝子全体を構成する。「化学的に合成された」とは、ＤＮＡ配列に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づくことができる。
【００６０】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’
非コード配列）制御配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸分子を指す。「天然遺伝子」は、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列される制御配列およびコード配列を含んでなっても良い。
【００６１】
「ゲノム」は、生物体中に含有される全遺伝的情報（例えば染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）を指す。「内在性遺伝子」は、生物体ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、宿主生物体中に常態では見られないが、遺伝子移入によって宿主生物体に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物体に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。「構造的な遺伝子」とは、タンパク質のアミノ酸配列、あるいはリボソームＲＮＡまたは転移ＲＮＡをコードする遺伝子を指す。「オペロン」は、共に転写されたいくつかの構造的な遺伝子から構成されるコントロール可能な転写単位を指す。
【００６２】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでも良い。
【００６３】
「プロモーター」とは、コード配列または機能ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなっていても良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが、当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に限定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。
【００６４】
遺伝子発現の文脈で使用される「異種性」とは、特定の環境にとって「外来性」であるものに関する。したがって「異種性遺伝子」または「異種性核酸分子」とは、特定の宿主またはゲノムにとって外来性または非天然の核酸分子を意味する。さらにキメラ遺伝子はコード核酸と作動可能に連結する異種性調節領域を含んでなっても良く、プロモーターはコーディング領域からの全く異なるゲノムからであっても良く、あるいは単に同一ゲノムの別の部分からでも良いが、コーディング領域に対しては非天然である。「異種性タンパク質」は宿主細胞にとって外来性のタンパク質であり、典型的に異種性遺伝子によってコードされる。
【００６５】
「宿主細胞」は、その中に外因性ポリヌクレオチド配列が導入された（例えば、形質転換または形質移入された）細胞、すなわち異種性核酸分子を指す。宿主細胞は、典型的に例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌などの原核生物細胞であり、酵母、昆虫、両生類、緑色植物、または哺乳類細胞などの妥当なレギュレーター遺伝子が存在する真核生物細胞であっても良い。
【００６６】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流である完全にプロセスされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの転写一次産物のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響するかもしれない。翻訳リーダー配列の例については、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５（１９９５）で述べられている。
【００６７】
「３’非コード配列」はコード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えられる制御シグナルをコードするその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。異なる３’非コード配列の利用が、インゲルブラヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：６７１〜６８０（１９８９）によって例証されている。
【００６８】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないかもしれないが、それでもなお細胞過程に影響する、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００６９】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸分子上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列と作動可能に連結し、そのコード配列の発現に影響する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動可能に連結できる。
【００７０】
「発現」と言う用語は、本発明の核酸分子から誘導されたセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」とは、正常なまたは非形質転換生物中の産生レベルを超える、遺伝形質転換生物における遺伝子産物の産生を指す。「コ−サプレッション」とは、同一のまたは実質的に類似の外来性または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００７１】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノムの中への核酸分子の転移を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え生物」と称される。
【００７２】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖
ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共に、プロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【００７３】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ断片増幅のために使用される技術である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，８００，１５９号明細書）。
【００７４】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（以下サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）で述べられている。
【００７５】
本発明は、ｙｈｃＲＱＰによってコードされる排出タンパク質のファミリーが、芳香族カルボン酸を産生する宿主細胞からの当該物質の産生を促進する能力を有するという発見に関する。さらにこれらの排出タンパク質がアップレギュレートされる場合、宿主細胞がカルボン酸最終生成物による毒性に対する増大した耐性を有することが分かっている。
【００７６】
ＹｈｃＰ排出ポンプ
ＹｈｃＰポンプは、系統発生的ファミリーであり、そのいずれのメンバーについても排出ポンプとして機能することはこれまで実証されていなかった。このタンパク質ファミリーの予測される膜形態は、その他の特徴づけられる輸送タンパク質とは異なる。植物では、これらのタンパク質は、６個の予測されるＮ−末端膜貫通領域および大型のＣ−末端細胞質領域を有する。酵母およびグラム陰性細菌では、これらのタンパク質は、大型細胞質領域がある６個の膜貫通領域の２つの反復単位としてまとめられる、１２個の予測される膜貫通領域を有する。したがってＹｈｃＰは新しい排出機序を表す。
【００７７】
本願出願人らは、（２個のその他の同時転写された遺伝子ｙｈｃＱおよびｙｈｃＲと共に）ｙｈｃＰ遺伝子の発現が、ｐＨＢＡ、ｐＨＣＡ、およびＣＡなどの芳香族カルボン酸による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の処理に際して高度にアップレギュレートされることを観察し、この観察の結果として、このような分子がＹｈｃＰ排出ポンプの基質であるかもしれないことが推測された。これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｙｈｃＰ  ｎｕｌｌ変異が、ｐＨＢＡおよびｐＨＣＡに対して高感応性であることを示すことで実証された。さらにマルチコピープラスミド上での非天然プロモーターからのｙｈｃＲＱＰオペロンの発現は、ｐＨＣＡに対する増大した抵抗性を与えるので、この排出系の操作が大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）の耐性を増大できることが実証される。情報科学分析は、細菌、酵母、および植物中に推定上の排出輸送タンパク質のクラスを同定した（ハーレー（Ｈａｒｌｅｙ）ＫＴおよびセイアー（Ｓａｉｅｒ）ＭＨ、Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１９５〜１９８（２０００））。しかし、本願出願人らの知る限りでは、この機能の実験的証拠は公開されておらず、基質についての予測もなされていない。
【００７８】
一般に生体分子の細胞産生は、産生宿主中の排出輸送タンパク質の発現を最適化することで、ある程度最適化できることが知られている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｈｃＲＱＰオペロンのマルチコピー発現は、外因性に添加されたｐＨＣＡに対する増大した抵抗性をもたらす。おそらくｐＨＣＡ生合成に対する遺伝子を発現する宿主におけるこの排出系の同様の操作は、同様に細胞内で産生されるｐＨＣＡに対する増大した耐性をもたらすであろう。したがってこれと、これに関連した排出輸送系を使用して、有毒生成物に対する産生生物体の耐性を増大させることで、速度、力価、および収率を改善しても良い。細胞バイオマスに含有される生成物は回収されないことが多いので、細胞外生成物の量を最大化することも生体分子の回収率を高めることができる。さらにそれらの生合成に伴う酵素発現の阻害因子または抑制因子である分子の増大した排出は、より高レベルの産生を可能にする。他方、バイオプロセスにおける中間体である化合物の排出を減少させることで、代謝経路の効率を改善できる。したがってＰＥＴタンパク質レベルを増大させるまたは減少させることによる宿主細胞の操作を使用して、所望の生体分子の細胞外産生を最大化できる。ＰＥＴファミリーである大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＹｈｃＰに関係したタンパク質は、細菌、酵母、および緑色植物に見つかっている。したがって排出タンパク質のこのファミリーのメンバーは、小型分子の産生を最適化するために、原核生物および真核生物双方のシステムを操作するのに有用であるかもしれない。
【００７９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｈｃＰ排出ポンプは、比較的狭い範囲の基質特異性を有する。この特異性は、広範囲の分子を排出するいくつかの多薬剤排出ポンプとは対照的である。より特異的な排出ポンプの利点は、細胞外への輸送のために分子の小さなセットを標的にできることである。ＰＥＴファミリーのその他のメンバーは、異なる基質特異性を有しそうであり、したがってこのタンパク質ファミリーのその他のメンバーによって、その他のクラスの分子の輸送が可能かもしれない。さらに変性タンパク質をもたらす、変異誘発、遺伝子シャフリング、またはその他の方法を場合によっては適用して、このファミリー中のこの排出ポンプの基質範囲を変更できる。
【００８０】
排出タンパク質のこのファミリーは、操作される宿主菌株における最適化された小型分子産生のために、原核生物および真核生物双方のシステムを操作するのに有用かもしれない。これらの排出ポンプの発現は、排出ポンプ遺伝子が強力なプロモーター配列のコントロール下にある宿主菌株中で、キメラの遺伝的コンストラクトを形成することで増大できる。発現レベルは、マルチコピープラスミドへのクローニングと、引き続く宿主菌株への形質転換などによって、排出遺伝子のコピー数を増大させることによっても増大できる。得られる増大したレベルの排出タンパク質は、同族の小型分子基質の増大した排出をもたらし、それは小型分子に対する産生宿主の耐性を改善し、小型分子の細胞外収率を増大させ、小型分子による酵素阻害を低下させることが期待される。反対に、分子が所望の生成物分子への代謝経路における中間体である場合など、小型分子を産生宿主細胞内に保つことが有利であれば、適切な排出ポンプの発現を低下させることが望ましい。これは排出ポンプをコードする遺伝子の変異によって実行できる。
【００８１】
芳香族カルボン酸を産生するように操作されている産生菌株において、適切な排出遺伝子を強力なプロモーターのコントロール下、またはマルチコピープラスミド上、あるいはその双方に置くことは、芳香族カルボン酸の増大した細胞外濃度をもたらし、それによって収率が増大する。
【００８２】
宿主細胞から毒素を除去することは、有毒分子を細胞から汲み出す排出ポンプの発現レベルを増大させることで実行できる。毒素を産生する、または細胞外で毒素に曝露する宿主細胞において、適切な排出遺伝子を強力なプロモーターのコントロール下、またはマルチコピープラスミド上、あるいはその双方に置くことは、宿主細胞からの毒素のより迅速な除去に帰結する。これは毒素の除去速度を増大させ、毒素に対する宿主細胞の耐性を改善する。
【００８３】
内在性ｙｈｃＲＱＰオペロン
本発明において、芳香族カルボン酸を産生する宿主で、既存の相同的ｙｈｃＲＱＰオペロンを有する細胞を使用しても良い。文献においてこのようないくつかのオペロンが同定されている。例えばｙｈｃＲＱＲオペロンは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）ら、「腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の完全なゲノム配列および実験室菌株Ｋ−１２とのゲノム比較（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｋ−１２）」ＤＮＡ  Ｒｅｓ．８（１）、１１〜２２（２００１））；エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パークヒル（Ｐａｒｋｈｉｌｌ）ら「疫病の原因物質ペスト菌のゲノム配列、（Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、ｔｈｅ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｏｆ
ｐｌａｇｕｅ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ４１３（６８５５）、５２３〜５２７（２００１））；シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（ウェイ（Ｗｅｉ）ら「シゲラ・フレクスナー血清型２ａ菌株２４５７Ｔの完全なゲノム配列および比較ゲノム科学（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２ａ  Ｓｔｒａｉｎ  ２４５７Ｔ）」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１（５）、２７７５〜２７８６（２００３））；およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（マクレランド（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ）ら、「サルモネラ・エンテリカ血液型亜型ティフィリウムＬＴ２の完全なゲノム配列（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２）」；Ｎａｔｕｒｅ  ４１３（６８５８）、８５２〜８５６（２００１））などの多様な腸内細菌において知られている。当業者は、本オペロンの相同体を有する生物体が、本発明の方法において機能することが期待されることを理解するであろう。したがってこの様式で、上述したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）菌株を使用しても良い。本発明で使用するのに適した宿主細胞としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、およびシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
本発明で特に適切なのは、細菌の腸内クラスのメンバーである。腸内細菌は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバーであり、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などのメンバーを含む。これらはグラム陰性の０．３〜１．０×１．０〜６．０ｍｍの直鎖状桿菌（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｒｏｄ）であり、周毛性鞭毛によって運動性であり（テイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）を除く）、または非運動性である。これらは酸素の存在および不在下で生育し、ペプトン、肉抽出物、そして（通常は）マッコンキー培地
上で良好に生育する。いくつかはＤ−グルコースを唯一の炭素源として生育する一方、その他はビタミンおよび／またはミネラルを必要とする。それらは呼吸性および発酵性代謝を有する化学有機栄養性であるが、好塩性ではない。Ｄ−グルコース、その他の炭水化物、およびポリヒドロキシルアルコールの発酵中に、酸、そしてしばしば可視性ガスが生成する。それらはオキシダーゼ陰性であり、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）０グループ１およびゼノラブダス・ネマトフィルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）を除いて、カタラーゼ陽性である。（エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎａ）のいくつかの菌株を除いて）硝酸塩は亜硝酸塩に還元される。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は、３８〜６０ｍｏｌ％（Ｔｍ、Ｂｄ）である。大部分の属内の種からのＤＮＡは、互いに、そして科の基準種である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に少なくとも２０％の関連性がある。注目すべき例外は、そのＤＮＡがその他の属からの種と１０〜２０％の関連性があるエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｉｃａ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、およびエドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）種である。エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）を除いて、試験した全ての種は腸内細菌共通抗原を含有する（「ベルジーの系統的細菌学マニュアル（Ｂｅｒｇｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」Ｄ．Ｈ．ベルジー（Ｂｅｒｇｙ）ら、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９８４）。
【００８５】
ｙｈｃＲＱＰ相同体の単離
本ｙｈｃＲＱＰオペロン相同体を含んでなる宿主細胞が、本発明で使用するのに適していることは明らかである。しかし本オペロンを有する新しい菌株を発見し、あるいは非天然宿主細胞においてより高い機能性を有する新しい排出コード遺伝子を同定することが所望される場合、文献および本開示で提供される配列情報を使用して、このような相同体を同定し単離することが可能である。
【００８６】
特定のｙｈｃＲＱＰオペロンが同定され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離されている。配列番号１はｙｈｃＰ遺伝子の核酸配列を表し、配列番号２はｙｈｃＱ遺伝子の核酸配列を表し、配列番号３はｙｈｃＱＰ遺伝子の組み合わせの核酸配列を表し、配列番号４はｙｈｃＲＱＰオペロンの核酸配列の全体を表す。
【００８７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列の相同体または文献で言及されるその他のものが、分子生物学における現在の慣行に基づいて容易に同定でき、このような相同体が本発明において等しく適用できて有用であることは、当業者には明らかである。例えば当業者は、本発明の核酸分子を使用して、相同的ＰＥＴ（推定上の排出トランスポーター）タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を同一または別の細菌種から単離しても良い。配列−依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、技術分野でよく知られている。配列−依存プロトコルの例としては、核酸増幅技術（例えばＰＣＲまたはリガーゼ連鎖反応）の様々な使用によって例証されるように、核酸ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかとしてのＰＥＴ遺伝子は、当業者によく知られているやり方を用いて、本核酸分子の全てまたは一部のタンパク質をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の細菌からのライブラリーをスクリーンして、直接単離できる。本ＰＥＴ遺伝子配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で知られている方法によって、デザインでき合成できる（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）同上）。さらにランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳、または末端標識技術、または利用できる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写系を使用したＲＮＡプローブなどの当業者に知られている方法によって、配列全体を直接使用してＤＮＡ
プローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部または全長を増幅できる。得られる増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切なストリンジェント条件下で完全長のｃＤＮＡまたはゲノム断片を単離できる。
【００８９】
さらにポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本核酸分子の２本の短い断片を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同的ＰＥＴ遺伝子をコードするより長い核酸分子を増幅しても良い。またポリメラーゼ連鎖反応は、１つのプライマーの配列が本核酸分子から誘導され、その他のプライマーの配列がｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸のトラクトの存在を利用する、クローン化された核酸分子のライブラリーにおいて実施しても良い。代案としては、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいても良い。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８〜９００２（１９８８））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））から商業的に入手できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム系を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５６７３〜５６７７  （１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３：２１７〜２２０（１９８９））。３’および５’ＲＡＣＥ手順によって生成した生成物を組み合わせて、完全長のｃＤＮＡ作り出すことができる（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １：１６５（１９８９））。
【００９０】
代案としては、相同体の同定のために、ハイブリダイゼーション試薬としてｙｈｃＲＱＰ配列を用いても良い。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。プローブは典型的に、検出する核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動しても良く、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的である必要がある。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくても良い。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【００９１】
ハイブリダイゼーション方法は良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加しても良い。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの感応性でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ
Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢
酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【００９２】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約２０〜６０％容積、好ましくは３０％容積の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ範囲約６〜９）、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％の界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識のキャリア核酸、例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡなどの断片化核ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および場合により約０．５〜２％重量／容積のグリシンも含まれる。ポリエチレングリコールなどの多様な極性水溶性剤または膨潤剤をはじめとする容積排除剤、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性糖ポリマーなどその他の添加剤を含めても良い。
【００９３】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補的な固定核酸プローブを有する。
【００９４】
芳香族カルボン酸の促進された産生
ｙｈｃＲＱＰオペロンを含んでなる宿主細胞がひとたび同定され、または構築されると、そのアップレギュレーションを操作する必要がある。これは妥当な遺伝子をマルチコピープラスミド上に配置させ、細胞を形質移入することで実行しても良い。代案としては、オペロンが宿主細胞のゲノム中に常在性である場合、遺伝子ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃからのプロモーターなどの強力なプロモーターをオペロン上流に挿入することで、アップレギュレーションをもたらしても良い。
【００９５】
多様な細胞が自然に芳香族カルボン酸を産生する。これらの多くは、ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｉｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、燕麦（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草の実作物、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、亜麻、硬木の木、軟木の木、および飼い葉などの緑色植物である。
【００９６】
その他の細胞は、芳香族カルボン酸を産生するように操作されなくてはならないかもしれない。このような操作の多様な方法が開示されている（例えば参照によってここに編入する米国特許第６，３６８，８３７号明細書および同第６，５２１，７４８号明細書を参照されたい）。本発明で特に適切な芳香族カルボン酸としては、パラ−ヒドロキシ安息香
酸、パラ−ヒドロキシケイ皮酸、ケイ皮酸、サリチル酸、安息香酸、および１−ナフトエ酸が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００９７】
特に断りのない限りあらゆる部および百分率が重量を基準とし、度数が摂氏である以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示すが、例証のためにのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特性を確認でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更と修正を実施して、それを様々な用途と条件に適合させることができる。
【００９８】
一般方法
実施例で使用した標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ（１９８７）で述べられている。
【００９９】
実施例で使用した形質導入のための標準遺伝的方法は技術分野で良く知られており、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）Ｊ．Ｈ．、「分子遺伝学実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９７２）で述べられている。
【０１００】
略語の意味は以下の通り。「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｎＬ」はナノリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ＲＬＵ」は相対光単位を意味し、「ＣＦＵ」はコロニー形成単位を意味する。
【０１０１】
培地および培養条件：
細菌培養の維持と生育に適した材料および方法は、「分子遺伝学実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」ジェフリーＨ．ミラー（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９７２）；「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ
Ｎ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、ｐｐ．２１０〜２１３、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８１）；またはトーマスＤ．ブルック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）「生物工学：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版（１９８９）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡにある。特に断りのない限り、細菌細胞の生育および維持のために使用したあらゆる試薬および材料は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティックシステムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ））、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、またはミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０１０２】
ＬＢ培地は、１リットルの培地当たり以下を含有する。バクト−トリプトン（１０ｇ）、バクト−酵母抽出物（５ｇ）、およびＮａＣｌ（１０ｇ）。
【０１０３】
フォーゲル−ボナー培地は、１リットルの培地当たり以下を含有する含有する。０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸・１Ｈ２Ｏ、１０ｇのＫ２ＨＰＯ４、および３．５ｇのＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ。
【０１０４】
最小Ｍ９培地は、１リットルの培地当たり以下を含有する。Ｎａ２ＨＰＯ４（６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ）、およびＮＨ４Ｃｌ（１ｇ）。
【０１０５】
上の培地を滅菌のためにオートクレーブし、次に１０ｍＬの０．０１Ｍ  ＣａＣｌ２および１ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＯをＭ９培地に添加した。０．０００１％のビタミンＢ１（チアミン）をフォーゲル−ボナーおよびＭ９培地の双方に添加した。炭素源およびその他の栄養素およびサプリメントを実施例で述べたようにして添加した。あらゆる添加物は培地に添加する前に事前滅菌した。
【０１０６】
分子生物学技術：
制限酵素消化、ライゲーション、形質転換、およびアガロースゲル電気泳動法は、上のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）で述べられるようにして実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）Ｂ．「ＰＣＲプロトコル：現行の方法と応用（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」第１５巻（１９９３）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪにある。
【０１０７】
実施例１：推定上の排出トランスポーターの排出機能の証拠
ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＴｎ５トランスポゾンに基づくトランスポゾーム系を使用して、トランスポゾン挿入変異の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライブラリーを構築した。トランスポゾームは、ＥＺ：：ＴＮ＜Ｋａｎ−１＞トランスポゾンおよびＥＺ：：ＴＮトランスポザーゼから構成されるタンパク質−ＤＮＡ複合体である。ＥＺ：：ＴＮトランスポザーゼはトランスポゾンの末端に結合し、それは安定したシナプス複合体の形成を容易にする。トランスポゾームは、標的ＤＮＡへのＥＺ：：ＴＮ＜Ｋａｎ−１＞トランスポゾンの挿入を開始するためにＭｇ＋２を必要とする。細胞のＭｇ＋２のレベルは、トランスポゾームを活性化す
るのに十分である。したがって細胞中へのトランスポゾームの電気穿孔は、細菌ゲノム中へのＥＺ：：ＴＮ＜Ｋａｎ−１＞トランスポゾンの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）挿入を可能にする。
【０１０８】
ＥＺ：：ＴＮ＜Ｋａｎ−１＞トランスポゾームをカリフォルニア州カールズバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からの電気穿孔コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αＥ細胞中に電気穿孔した。電気穿孔に続いて、細胞をインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＳＯＣ培地中で通気して１時間、３７℃で生育させた。引き続いて細胞をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（ＬＢ＋Ｋａｎ）を含有するＬＢ寒天プレート上に平板培養して、３７℃で一晩培養した。個々のコロニーを１５０μＬのＬＢ＋Ｋａｎを含有する９６−ウェルのマイクロタイタープレートに接種して、３７℃で一晩培養した。
【０１０９】
「単一プライマーＰＣＲ」を使用して、各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスポゾン変異のアイデンティティを求めた。ＥＺ：：ＴＮ＜Ｋａｎ−１＞トランスポゾンの一端に相補的な単一ＤＮＡプライマーを使用して、ＰＣＲ生成物を生成した。引き続いて、第２のＤＮＡプライマー（内部でＰＣＲプライマーに隣接して位置する）を使用して、ＰＣＲ生成物を配列決定した。ＰＣＲ反応で使用したＤＮＡプライマーは、Ｋａｎ−２ＦＰ（ＰＣＲ）（配列番号１４）またはＫａｎ−２ＲＰ（ＰＣＲ）（配列番号１５）のどちらかであり、ＤＮＡ配列決定に使用したＤＮＡプライマーは、それぞれＫａｎ−２ＦＰ（ＰＣＲ）（配列番号１４）またはＫａｎ−２ＲＰ（ＰＣＲ）（配列番号１５）のどちらかであった。ＰＣＲ反応条件は次のとおりであった。（１）９４℃、１５分間（２）２０サイクル−９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、３分間（３）３０サイクル−９４℃、３０秒間；４０℃、３０秒間；７２℃、２分間（４）３０サイクル−９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、２分間（５）７２℃、７分間。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からのキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して、ＤＮＡ配列決定のためにＰＣＲ反応を準備した。
【０１１０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体中への１つのＴＮ＜Ｋａｎ＞挿入は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの配列に関して３，３８５，４０９ヌクレオチドの箇所であった。したがってこの挿入は、ｙｈｃＰ遺伝子の３’末端から１５５３ヌクレオチドであり、それは長さにおいて１９６８ヌクレオチドである。この挿入位置は、プライマーＹｈｃＰ_ＴｎＳｅｎｓｅ（配列番号１６）およびＹｈｃＰ_Ｔｎアンチセンス（配列番号１７）によるＰＣＲ増幅を使用して確認された。ＰＣＲとｙｈｃＰ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞変異を有する菌株からのテンプレートとの反応の生成物は、ほぼ１．６ｋｂであった。ｙｈｃＰ＋菌株からのテンプレートを使用したコントロールＰＣＲ反応では、ＰＣＲ生成物はほぼ０．３ｋｂであった。
【０１１１】
この変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２４４３のパラ−ヒドロキシ安息香酸（ｐＨＢＡ）に対する感受性をその他の点では同質遺伝子型の親菌株ＤＨ５αＥと比較した。２．５ｍＬのＬＢ軟寒天を使用したＬＢ寒天プレート上に蒔いたＬＢ培地中の０．１ｍＬの一夜培養物を使用して、生育阻害ゾーン試験を実施した。シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からの９０μｍｏｌのｐＨＢＡナトリウム塩を含有するディスクを取り囲む生育阻害ゾーンを３７℃で２４時間の培養後に測定した。表１に示す結果は、ｐＨＢＡに対するｙｈｃＰ変異株の高感受性を実証する。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２４４３のファージ溶解産物を使用して、カナマイシン抵抗性へのＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍ媒介形質導入によって、ｙｈｃＰ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５（ミズーリ州セントルイスのワシントン医学大学のダクラス・バーグ（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｂｅｒｇ）博士から得た）中に導入した。得られるカナマイシン抵抗性被形質導入体の１つをＤＰＤ２４４４と称した。この菌株をｐＨＢＡおよびｐＨＣＡに対する感受性について、その他の点では同質遺伝子型の親菌株ＭＧ１６５５と比較した。この試験では、炭素源として０．４％グルコースを有するフォーゲル−ボナー合成培地中において、３７℃で１００μＬの培養物を一晩生育させた後、完全な生育阻害をもたらす一連の２倍希釈からの最低濃度として、ＭＩＣ（最小阻害濃度）を求めた。表２はｐＨＢＡおよびｐＨＣＡに対するｙｈｃＰ変異株の高感受性を実証する。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
この実施例からの結果を情報科学分析によって予測される排出機能に照らして解釈すると、ｐＨＢＡおよびｐＨＣＡが基質である排出ポンプをｙｈｃＰ遺伝子がコードするという、説得力のある証拠を提供する。したがってこの排出ポンプの不在は、ｐＨＢＡまたはｐＨＣＡの細胞間濃度増大をもたらし、それは次に高感応性表現型として現れる。
【０１１６】
実施例２：ｐＨＣＡに対する高抵抗性を与える排出トランスポーターおよび隣接する遺伝子の操作
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｈｃＰ遺伝子は、同一転写方向を有する２個の隣接する遺伝子、ｙｈｃＱおよびｙｈｃＲと共に同時転写されることが予測される。この推定上のオペロン中の遺伝子の順序はｙｈｃＲＱＰである。ｙｈｃＱの生成物は、いくつかのその他のメンバーが排出系中で機能することが知られている「膜融合タンパク質」ファミリーのメンバーであるので、それは細胞排出中で機能することが予測されている。さらにｙｈｃＱの生成物は、グラム陰性細菌の外膜を超える分子の排出のために使用されるチャンネルであるＴｏｌＣタンパク質中に見られるのと同様のα−らせんバレルを有することが予測されている。しかし予測される構造体の有意性は未知である。予測されるオペロンｙｈｃＲの第３の遺伝子は、機能の予測が立っていないタンパク質をコードする。
【０１１７】
プラスミドｐＤＥＷ６６８は、マルチコピープラスミド中でｔｒｃプロモーターのコン
トロール下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｈｃＲＱＰオペロンを含有した。このプラスミドを構築するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして、そしてプライマーｙｈｃＲＱＰ_ｌｅｆｔ_９０７（配列番号６）およびｙｈｃＲＱＰ_ｒｉｇｈｔ_９０７（配列番号７）を使用して、ＰＣＲ増幅によってｙｈｃＲＱＰオペロンを得た。
【０１１８】
ｙｈｃＲＱＰ_ｒｉｇｈｔ_９０７プライマーは、増幅されたＤＮＡがｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にクローン化された際にＮ−末端融合タンパク質が形成しないよう、ひいては天然ＹｈｃＲタンパク質が発現するようにデザインされた。ｙｈｃＲＱＰ_ｒｉｇｈｔ_９０７プライマーはまた、挿入されたＤＮＡの方向を定めるのに使用されるＥｃｏＲＩ部位を有した。ｙｈｃＲＱＰ_ｌｅｆｔ_９０７プライマーは、ｙｈｃＰの終止コドンを含有するよう、ひいては融合タンパク質でなく天然ＹｈｃＰタンパク質を発現するようにデザインされた。
【０１１９】
３２１７ｂｐＰＣＲ生成物は、ウィスコンシン州マディソンのタカラ（ＴａＫａＲａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＥｘＴａｑＴＭ、および以下の条件を使用して増幅反応から得られた。９４℃で５分間、３５サイクルの（９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間）、および７２℃で１５分間。ＰＣＲ反応の生成物は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲクリーンアップキットを使用して、製造元の使用説明書に従って精製し、次に販売元が提供するプロトコルに従って、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）中にライゲートした。インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０の形質転換およびアンピシリン抵抗性についての選択後、個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した。サイズ４．４ｋｂ（ベクター）および３．２ｋｂ（挿入断片）の２つの断片が得られた１個のプラスミドをｐＤＥＷ６６８と称した。正しい向きのｙｈｃＲＱＰオペロンの存在は、ｐＤＥＷ６６８中の挿入ＤＮＡ末端のＤＮＡ配列分析によって確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５への形質転換によって、プラスミドｐＤＥＷ６６８およびインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのコントロールプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）／ｌａｃＺを移動させ、アンピシリン抵抗性について選択して、ＤＰＤ３３１４およびＤＰＤ３３１３菌株をそれぞれ作り出した。
【０１２０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ３３１３およびＤＰＤ３３１４に対するｐＨＣＡのＭＩＣを求めた。ＭＩＣは、炭素源として０．４％グルコースを有するフォーゲル−ボナー合成培地中での３７℃における１００μＬの培養物の一晩の生育後に、完全な生育阻害をもたらす一連の２倍希釈の最小濃度として定義された。ｔｒｃプロモーターがＩＰＴＧ不在下でかなりの活性を有するので、ＩＰＴＧは培地に添加しなかった。表３の結果は、ｙｈｃＲＱＰオペロンのマルチコピー発現が、非変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５に、ｐＨＣＡに対する２倍に増大した抵抗性をもたらすことを示す。この結果は、この新しい排出トランスポーターの操作を通じて、ｐＨＣＡに対する増大した耐性が達成できることを実証する。
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
実施例３：ｙｈｃＲＱＰ発現のレギュレーターを欠く高感応性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｙｈｃＳ遺伝子は、積極的作用調節分子のＬｙｓＲファミリーの特徴づけらていないメンバーをコードする。この遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中でｙｈｃＲＱＰオペロンのすぐ隣に位置する。ｙｈｃＳ  ｎｕｌｌ変異を使用して、ＹｈｃＳがｙｈｃＲＱＰの発現をコントロールする可能性を試験した。この変異は、実施例１で述べた変異ライブラリー中に見つかった。ｙｈｃＳトランスポゾン変異は、ＰＣＲ増幅プライマーＫａｎ−２ＦＰ（ＰＣＲ）（配列番号１４）およびＤＮＡ配列決定プライマーＫａｎ−２ＦＰ−１（配列番号１８）を使用して同定した。トランスポゾン変異は、遺伝子−特異的プライマーを使用して確認した。ＹｈｃＳ．Ｆ（配列番号２０）およびＹｈｃＳ．Ｒ（配列番号２１）およびトランスポゾン−特異的プライマーＫａｎ−２ＦＰ−１（配列番号１８）およびＫａｎ−２ＲＰ−１（配列番号１９）。
【０１２３】
ｙｈｃＳ遺伝子のサイズは約９２９塩基対である。ｙｈｃＳ遺伝子内のトランスポゾン挿入部位は、ｙｈｃＳの５’末端から約３３０塩基対離れている。ＹｈｃＳ．ＦおよびＫａｎ−２ＲＰ−１プライマーによって実施されるＰＣＲ反応からは約５５０塩基対のＰＣＲ断片が生じ、ＰＣＲプライマーＹｈｃＳ．ＲおよびＫａｎ−２ＦＰ−１からはサイズが＜４００塩基対のＰＣＲ生成物が得られた。
【０１２４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２４１０は、ｙｈｃＳ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞変異を含むＤＨ５αＥである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５のｙｈｃＳ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞変異がある誘導体は、菌株ＤＰＤ２４１０上で生育したファージをドナーとして使用して、Ｐ１ｃｌｒ１００Ｃｍ媒介形質導入およびカナマイシン抵抗性に関する選択によって作られた。得られた被形質導入体の１つにおけるＤＰＤ２４３３と称されるｙｈｃＳ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞変異の存在は、ＰＣＲ増幅によって確認された。
【０１２５】
プラスミドｐＤＥＷ６５５は、推定上のｙｈｃＲＱＰオペロンのプロモーター領域およびｙｈｃＲ遺伝子全体およびｙｈｃＱ遺伝子の５’末端を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの配列に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体のヌクレオチド３３８５８２９および３３８６７６１間のセグメントをｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子親プラスミドｐＤＥＷ２０１にライゲートして構築した（ゴニー（Ｇｏｎｙｅ）ら米国特許出願公報第２００３０２１９７３６号明細書）。したがってこの遺伝子融合はｙｈｃＱ遺伝子、および結果的にそれと共に同時転写されたあらゆるその他の遺伝子の発現を報告する。プラスミドｐＤＥＷ６５５を形質転換によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５およびＤＰＤ２４３３に移し、アンピシリン抵抗性について選択し、菌株ＤＰＤ２４３６およびＤＰＤ２４３７をそれぞれ作り出した。ｐＨＢＡに対するこれらの２つの菌株のバイオルミネセンスの応答を試験した。ｐＨＢＡをナトリウム塩形態で含有するｐＨ７．０の５０μＬのＬＢ培地に、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地中の一夜培養物からの３７℃で活
発に生育するあらかじめ希釈したＬＢ培地中の培養物のアリコート（５０μＬ）を添加した。いくつかの濃度のｐＨＢＡを試験した。表４は、細胞をｐＨＢＡ含有培地に添加した３０分後のこれらの２つの宿主菌株の応答を示す。ｙｈｃＳ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞変異は、試験した全ての濃度においてｐＨＢＡ処理によって誘導された発現のアップレギュレートをほとんど完全に排除した。
【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
ｙｈｃＳ変異中のｙｈｃＲＱＰ発現誘導のほぼ完全な欠如は、このレギュレーターを欠く細胞が、ｐＨＢＡの排出において効率に劣るかもしれないことを示唆する。これは、炭素源としてグルコースを含む固化フォーゲル−ボナー培地上のｐＨＢＡのナトリウム塩（８０μモル／ディスク）によってもたらされる生育阻害ゾーンのサイズを測定して、ゾーン内の生育程度をスコアすることで試験された（表５）。
【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
ｙｈｃＳ変異を含有する菌株は、ｐＨＢＡに対して高感応性であった。
【０１３０】
実施例４：ＹｈｃＰ排出トランスポーターの基質特異性
実施例１は、ｙｈｃＰ遺伝子に機能損失変異を含有する菌株が、ｐＨＢＡおよびｐＨＣＡに対して高感応性であることを実証した。この結果は、ｙｈｃＰが、これらの２個の分子が基質である排出ポンプをコードするという強力な証拠を提供した。この排出系の基質をさらに特徴づけるために、その他の分子をこの遺伝的試験で試験した。すなわちｙｈｃＰ排出ポンプの見込まれる基質は、それに対してｙｈｃＰ変異株が、その他の点では同質の遺伝子型のコントロール菌株と比べて高感応性である化合物である。表現型マイクロアレイＴＭ１−２０を使用して、カリフォルニア州ヘイワードのバイオログからの（Ｂｉｏｌｏｇ  Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））多数の化学物質による阻害について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２４４４（ｙｈｃＰ−）およびＭＧ１６５
５（ｙｈｃＰ＋）を試験した。この技術の基本は、最近の出版物（ボクナー（Ｂｏｃｈｎｅｒ）ら、Ｇｅｎｏｍ  Ｒｅｓ．、１１：１２４６〜１２５５（２００１））で述べられている。２４０種の化合物についてそれぞれ４種類の濃度で、化学物質感受性試験を行った。これらの化学物質は、アクリフラビン、ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、９−アミノアクリジン、フザリン酸、サリチル酸、フェニルエタノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ペンタクロロフェノール、クマリン、ＤＬ３−フェニル乳酸、およびケイ皮酸などの芳香族およびヘテロ環式分子を含んだ。いくつかの弱酸およびプロトンの流動を乱すその他の化合物をはじめとする、多数の抗生物質およびその他の抗菌化合物も含まれた。試験された２４０種の内で、ケイ皮酸が、菌株ＤＰＤ２４４４がＭＧ１６５５と比べて高感応性である唯一の化合物であった。ＭＧ１６５５（菌株１４）と比べた菌株ＤＰＤ２４４４（菌株１６）の増大した感受性に関する報告を下の表６に示す。
【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
ケイ皮酸の−８３というスコアは、生育阻害における２つの菌株間のわずかであるが再現可能な違いと一致する。試験されたその他の２３９種の各化合物に対するこれらの２種の菌株間の違いの欠如は、ＹｈｃＰ排出ポンプが、特定の芳香族カルボン酸に対して高度な特異性を有することを示唆する。
【０１３３】
炭素源としてグルコースを含み、生存度の指標として０．０１％のテトラゾリウムバイオレットが添加されたフォーゲル−ボナー培地中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ｙｈｃＰ＋）およびＤＰＤ２４４４（ｙｈｃＰ−）の生育阻害について、さらに別の化合物を試験した。透明９６−ウェルマイクロプレートのウェルに、５０μＬの容積で各化学物質の一連の２倍希釈を作成した。これらのウェルに、新鮮な培地中であらかじめ５００倍に希釈した、炭素源としてグルコースを含む５０μＬのフォーゲル−ボナー培地中のＭＧ１６５５またはＤＰＤ２４４４のいずれかの一夜培養物を添加した。プレートを振盪せずに３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。各ウェル中の紫色を視覚的にスコアした。４＋のスコアは、化学物質無しのコントロールウェルと同等の完全な紫色を示唆した。３＋、２＋、または１＋のスコアは、減少したの紫色の量を示唆した。−のスコアは、色の完全な不在を示唆した。ＭＩＣは完全な色の不在をもたらした試験された最小濃度として定義された。菌株間の違いのランクは、ＤＰＤ２４４４４に対するＭＩＣの濃度で所定の化学物質を含有するウェル中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に対する顔料の色のスコアとして定義された。ＭＧ１６５５が色を有さない場合スコアは０であった。ＭＧ１６５５が１＋のスコアであった場合スコアは１であり、２＋のスコアであった場合スコアは２であった。表７はこれらの条件で試験された化合物に関するデータをまとめる。
【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
この試験では、２つの菌株間の信頼できる違いは、２つの菌株間においてＭＩＣに少なくとも２倍および少なくとも２ランクの双方の違いがあるものである。この試験ではケイ皮酸による２つの菌株の生育阻害におけるわずかな違いが観察されたが、差違の程度は、ｐＨＢＡまたはｐＨＣＡ処理で得られたものよりもはるかに小さかったことに留意されたい。したがってこの遺伝的試験によってＹｈｃＰ排出ポンプの基質として定義される化合物は、ｐＨＢＡ、ｐＨＣＡ、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、および２−ヒドロキシシンナマートである。したがってこの排出系は、特定の芳香族カルボン酸に対して高度な特異性を有するようである。
【０１３６】
実施例５：排出機能のために必要とされるｙｈｃＲＱＰオペロン構成要素
ｙｈｃＳ調節変異のｐＨＢＡ高感受性（実施例３に示す）は、マルチコピープラスミドから発現されるｙｈｃＲＱＰ遺伝子機能の都合の良いアッセイを可能にする。したがって排出機能のためにこのオペロンのどの構成要素が必要であるのかを定義するために、ｔｒｃプロモーターのコントロールの下に様々な挿入された遺伝子を含有するｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）の誘導体を保有する菌株ＤＰＤ２４３３（ｙｈｃＳ−）のｐＨＢ
Ａ−感受性を試験した。
【０１３７】
プラスミドｐＤＥＷ６７３は、マルチコピープラスミド中のｔｒｃプロモーターのコントロールの下に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｈｃＱＰ遺伝子を含有した。このプラスミドを構築するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして、およびプライマーｙｈｃＰ_ｌｅｆｔ_９２８（配列番号８）およびｙｈｃＱ_ｒｉｇｈｔ（配列番号９）を使用して、ＰＣＲ増幅によってｙｈｃＱＰ遺伝子を得た。
【０１３８】
ｙｈｃＱ_ｒｉｇｈｔプライマーは、増幅されたＤＮＡをｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にクローン化した際に、Ｎ−末端融合タンパク質が形成せず天然ＹｈｃＱタンパク質が発現するようにデザインされた。ｙｈｃＱ_ｒｉｇｈｔプライマーは、挿入されたＤＮＡの配向性を定めるのに使用されたＥｃｏＲＩ部位も有した。ｙｈｃＰ_ｌｅｆｔ_９２８プライマーはｙｈｃＰの終止コドンを含有し、融合タンパク質でなく天然ＹｈｃＰタンパク質を発現するようにデザインされた。タカラ（ＴａＫａＲａ）からのＥｘＴａｑＴＭおよび以下の条件を使用して、２９２２ｂｐの生成物を増幅反応から得た。９４℃で５分間、３５サイクルの（９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間）、そして７２℃で１５分間。ＰＣＲ反応の生成物は、発売元が提供するプロトコルに従って、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターと共にライゲーション中で直接使用した。インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０の形質転換とアンピシリン抵抗性ついての選択後、個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した。サイズ４．４ｋｂ（ベクター）および２．９ｋｂ（挿入断片）の２つの断片が帰結した１つのプラスミドをｐＤＥＷ６７３と称した。正しい配向性にあるｙｈｃＱＰ遺伝子の存在は、ｐＤＥＷ６７３中の挿入ＤＮＡの末端のＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０１３９】
プラスミドｐＤＥＷ６７５は、マルチコピープラスミド中のｔｒｃプロモーターのコントロール下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｈｃＲＱ遺伝子を含有した。このプラスミドを構築するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして、およびプライマーｙｈｃＱ_ｌｅｆｔ（配列番号１０）およびｙｈｃＲ_ｒｉｇｈｔ_９２８（配列番号１１）を使用して、ＰＣＲ増幅によってｙｈｃＲＱ遺伝子を得た。
【０１４０】
ｙｈｃＲ_ｒｉｇｈｔ_９２８プライマーは、増幅されたＤＮＡをｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にクローン化した際に、Ｎ−末端融合タンパク質が形成せず天然ＹｈｃＲが発現するようにデザインされた。ｙｈｃＲ_ｒｉｇｈｔ９２８プライマーは、挿入されたＤＮＡの配向性を定めるのに使用されたＥｃｏＲＩ部位も有した。ｙｈｃＱ_ｌｅｆｔプライマーはｙｈｃＱの終止コドンを含有し、融合タンパク質でなく天然ＹｈｃＱタンパク質を発現するようにデザインされた。タカラ（ＴａＫａＲａ）からのＥｘＴａｑＴＭおよび以下の条件を使用して、１２２９ｂｐの生成物を増幅反応から得た。９４℃で５分間、３５サイクルの（９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間）、そして７２℃で１５分間。ＰＣＲ反応の生成物は、発売元が提供するプロトコルに従って、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターと共にライゲーション中で直接使用した。インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０の形質転換とアンピシリン抵抗性ついての選択後、個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した。サイズ４．４ｋｂ（ベクター）および１．２ｋｂ（挿入断片）の２つの断片が帰結した１つのプラスミドをｐＤＥＷ６７５と称した。正しい配向性にあるｙｈｃＲＱ遺伝子の存在は、ｐＤＥＷ６７５中の挿入ＤＮＡの末端のＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０１４１】
プラスミドｐＤＥＷ６６８、ｐＤＥＷ６７３、ｐＤＥＷ６７５、およびコントロールプラスミド、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）／ｌａｃＺを形質転換によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ２４３３に移し、アンピシリン抵抗性について選択して、菌株ＤＰＤ３３１７、ＤＰＤ２４５５、ＤＰＤ２４５７、およびＤＰＤ３３１６をそれぞれ作り出した。下の表８は、炭素源として０．４％グルコースを含む固化フォーゲル−ボナー培地上のｐＨＢＡのナトリウム塩（８０μモル／ディスク）によってもたらされる生育阻害ゾーンの結果（２回実験の平均）を示す。
【０１４２】
【表８】
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【０１４３】
これらの結果は、ｙｈｃＱおよびｙｈｃＰのみのマルチコピー発現が、ｙｈｃＳ変異のｐＨＢＡ感受性を完全に逆転するのに十分であり、ｙｈｃＲが排出系の必要な構成要素でないことを示唆するが、ｙｈｃＳ菌株においては低レベルのｙｈｃＲ発現が可能であるため、ｙｈｃＲの役割は完全には除外できないことを示す。
【０１４４】
排出系の構成要素としてのｙｈｃＱに関する必要条件を試験するために、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｔａｃプロモーターから発現されるｙｈｃＰ遺伝子を含有するｐＤＥＷ６５９を使用した。ｐＤＥＷ６５９を構築するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５からの染色体ＤＮＡをテンプレートとして、およびプライマーＹｈｃＰ−Ｌｅｆｔ（配列番号１２）およびＹｈｃＰ−Ｒｉｇｈｔ（配列番号１３）を使用して、ＰＣＲ増幅によってｙｈｃＰ遺伝子を得た。
【０１４５】
得られるＰＣＲ生成物の方向性クローニングのために、ＹｈｃＰ−ＬｅｆｔプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するようにデザインされ、ＹｈｃＰ−ＲｉｇｈｔプライマーはＥｃｏＲＩ部位を含有するようにデザインされた。タカラ（ＴａＫａＲａ）からのＥｘＴａｑＴＭおよび以下の条件を使用して、１９９２ｂｐの生成物を増幅反応から得た。９４℃で５分間、３０サイクルの（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間）、そして７２℃で７分間。ＰＣＲ反応の生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。制限酵素消化はまた、ｐＫＫ２２３−３もおよそ２：１（挿入断片：ベクター）のモル比で含有した。３７℃で１．５時間のインキュベーションに続いて、６５℃で２０分間のインキュベーションによって酵素を不活性化した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して、販売元の使用説明書に従って、酵素を引き続いて除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、精製された制限酵素生成物を１６℃で一晩ライゲートした。ライゲーションに続いて、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ消化を使用して、挿入ＤＮＡなしにベクターを直線化した。アンピシリン
抵抗性についての選択を使用した、ニュージャージー州ピスカタウェイのアマーシャム・ファーマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０５の形質転換のために、この選択消化からのＤＮＡを使用した。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。２ｋｂのＤＮＡが挿入された１個のプラスミドをｐＤＥＷ６５９と称した。形質転換およびアンピシリン抵抗性についての選択によって、このプラスミドおよびその他を様々な宿主菌株に配置させた。ｐＨＢＡの生育阻害ゾーンを上のようにして試験した。結果を表９に示す。
【０１４６】
【表９】
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【０１４７】
これらの結果は、プラスミドｐＤＥＷ６５９からのｙｈｃＰのマルチコピー発現がｙｈｃＰ変異株のｐＨＢＡ−感受性を逆転するのに十分であり、ひいてはｙｈｃＰがこのプラスミドから発現されることを示す。しかしプラスミドｐＤＥＷ６５９からのｙｈｃＰのマルチコピー発現は、ｙｈｃＳ変異のｐＨＢＡ感受性を逆転するのに十分でない。したがってｙｈｃＱは排出系の機能のために必要とされる。ｙｈｃＰ変異株の高感受性は、排出機能のためのｙｈｃＰの必要条件を実証することにも留意されたい。
【０１４８】
したがって我々は、ｙｈｃＰおよびｙｈｃＱ双方の生成物がこの芳香族カルボン酸排出系の機能のために必要であるが、ｙｈｃＲの生成物はおそらく必要とないと結論した。
【０１４９】
実施例６：ｙｈｃＱＰの排出機能のためにｔｏｌＣ−コード外膜要素が必要でないという遺伝的証拠
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他のグラム陰性細菌中の多くの排出ポンプは、３部系からなる。排出トランスポーターである内膜タンパク質は、「膜融合タンパク質ファミリー」からの周辺タンパク質、および「外膜要素ファミリー」からの外膜タンパク質と共に作動することが多い。ＹｈｃＱは「膜融合タンパク質ファミリー」のメンバーであるため、この排出系が「外膜要素ファミリー」のメンバーと共に機能することが期待されるかもしれない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、ｔｏｌＣが、いくつかの異なる排出系と共に
作動することが示されている「外膜要素ファミリー」メンバーをコードする。したがってＴｏｌＣは、ＹｈｃＰおよびＹｈｃＱと共に機能して、芳香族カルボン酸の排出を提供する可能な候補である。しかし、下で述べる遺伝的実験は、ＹｈｃＰおよびＹｈｃＱと共に機能するＴｏｌＣの役割を支持しない。
【０１５０】
これらの遺伝的結果は、一連の変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株それぞれのｐＨＢＡ感受性を試験して得られた。菌株ＤＰＤ１８１８は、バックグラウンドにおいてＭＧ１６５５にｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０変異を保有する。これはｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０変異を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＥ１１２上で培養したＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍファージを使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（バン・ダイク（Ｖａｎ  Ｄｙｋ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４１４−１４２０（１９９４））の形質導入、およびテトラサイクリン抵抗性についての選択によって構築された。上述の菌株ＤＰＤ２４４４は、ｙｈｃＰ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞の変異を保有する。菌株ＤＰ２４４６は、ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０およびｙｈｃＰ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞の双方の変異を保有する。この菌株は、菌株ＤＰＤ２４４３上で培養したファージによるＤＥ１１２のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍ媒介形質導入、およびカナマイシン抵抗性についての選択を使用して構築された。これらの各変異株をＬＢ培地中で３７℃で一晩培養した。一夜培養物を使用して、ｐＨＢＡのナトリウム塩を様々な濃度で含有するＬＢ培地に接種した。９６−ウェルマイクロプレートのウェル中の最終容積は１００μＬであり、接種物の最終希釈は１対１０００であった。このマイクロプレートを覆って３７℃で７時間インキュベートし、次に室温で３日間インキュベートした。次に各ウェル中の生育を視覚的にスコアした。結果を表１０に示す。
【０１５１】
【表１０】
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【０１５２】
ｔｏｌＣ変異だけでｐＨＢＡに対する高感受性が与えられる。これはＴｏｌＣチャンネルを使用する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の１つ以上のｐＨＢＡ排出ポンプの存在と一致する。ＹｈｃＰ／ＹｈｃＱ排出系が機能するためにＴｏｌＣを必要とする場合、ｔｏｌＣ変異株のｐＨＢＡ感受性はｙｈｃＰ変異以上であることが期待される。さらに２つの変異の加算性は期待されない。同一系の構成要素中におけるこの変異の上位性の遺伝的原理の例証的な実例は、ＴｏｌＣチャンネルを使用することが知られているＡｃｒＡ／ＡｃｒＢ排出ポンプによって提供される。ａｃｒＡに変異を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ドデシル硫酸ナトリウムおよびノボビオシンに対して高感応性である一方、ｔｏｌＣ変異株はａｃｒＡ変異株よりもより高度の感受性を有する。ａｃｒＡおよびｔｏｌＣの双方に変異を保有する菌株は、ｔｏｌＣ単一変異と同等の感受性を有する。対照的に、ｙｈｃ
Ｐ変異によって与えられるｐＨＢＡの高感受性の程度は、幾分ｔｏｌＣ変異によって与えられるものを超え、ｔｏｌＣおよびｙｈｃＰの二重変異は、いずれの変異単独よりもさらに高感応性である。したがってこれらの結果は、ＹｈｃＰ排出ポンプがＴｏｌＣの独占的使用を必要としないことを示唆する。
【０１５３】
追加的な実験は上の結論と一致する。この実験では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５、およびそれから誘導されたｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０変異がある菌株ＤＰＤ１８１８（この実施例で上述される）、ｙｈｃＳ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞変異があるＤＰＤ４２３３（実施例３で述べた）、ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０およびｙｈｃＳ：：ＴＮ＜Ｋａｎ＞の双方の変異を保有するＤＰＤ２４３５を使用した。後者の菌株は、菌株ＤＰＤ２４１０上で培養したファージによるＤＥ１１２（実施例３で述べた）のＰ１ｃｌｒ１００Ｃｍ媒介形質導入、およびカナマイシン抵抗性についての選択を使用して構築した。これらの４つの菌株は、コントロールのためにインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯ（登録商標）／ｌａｃＺで、そしてｙｈｃＲＱＰオペロンを発現するｐＤＥＷ６６８（実施例２で述べた）で、それぞれ形質転換された。２１時間で３７℃のインキュベーション後に、マイクロプレート中の１００μＬ容積中の生育を視覚的に評価して、ｐＨＢＡのＭＩＣを求めた。０．４％のグルコースを含むフォーゲル−ボナー最小培地を使用した。ｐＨＢＡのナトリウム塩を最終濃度に１００ｍＭに添加して、ｐＨＢＡの一連の３：４希釈を試験した。接種物は、２５μｇ／ｍＬのアンピシリン添加以外は同一の培地中で培養された、各プラスミド含有菌株の一夜培養物の炭素源として０．４％のグルコースを含む５０μＬのフォーゲル−ボナー培地中の１：５００希釈であった。表１１は、目に見える生育がない最小濃度として定義されるｐＨＢＡのＭＩＣを示す。
【０１５４】
【表１１】
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【０１５５】
コントロールプラスミドを保持する菌株の感受性を比べると、ｙｈｃＳおよびｔｏｌＣの二重変異は、ｐＨＢＡに対してどちらの単一変異よりもさらに高感応性である。この結果は、その発現がＹｈｃＳ機能を必要とする、ＴｏｌＣおよびＹｈｃＱＰ排出系の独立した機能に一致する。さらにｙｈｃＲＱＰを発現するプラスミドは、ｔｏｌＣ変異宿主菌株中において完全なｐＨＢＡ抵抗性を与えた。この結果はまた、ＹｈｃＱＰ排出ポンプ機能のためにＴｏｌＣが必要とされないことを示唆する。
【０１５６】
全体的にこれらの結果は、ＴｏｌＣを使用するものと、使用しないＹｈｃＰ／ＹｈｃＱ系の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の少なくとも２つのｐＨＢＡ排出系の存在に一致すると解釈できるかもしれない。したがってＹｈｃＰ／ＹｈｃＱ排出系の特色は、ＴｏｌＣチャンネル−トンネルを使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の多くの排出ポンプからの違いによって強調される。
【０１５７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム、ＣｕｓＣ、ＹｏｈＧ、またはＹｊｃＰ中に存在するその他の推定上の外膜要素ファミリーメンバーの１つが、ＹｈｃＰ／ＹｈｃＱ排出系と共に作動するかは現時点では不明である。代案としてはこの排出系は、排出のために別のタイプの外膜タンパク質を使用するかもしれず、あるいは外膜構成要素を必要としないかもしれない。
【０１５８】
実施例７：ｙｈｃＲＱＰのマルチコピー発現はさもなければ殺菌性である条件下での細胞生育を可能にする
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｈｃＲＱＰｐＨＣＡ排出系を保有するプラスミドｐＤＥＷ６６８（実施例２で述べた）を形質転換によってバージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の米国微生物系統保存機関から得た大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ＃７００９２６．ｌｏｔ＃２６６０７００）中に移動させ、菌株ＤＰＤ４０５７を形成した。コントロールのために、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＴＯＰＯO／ｌａｃＺもまた同一宿主菌株に入れて菌株ＤＰＤ４０５５を作成した。４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．２６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．４２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７．０、１ｍｇ／Ｌのチアミン、５０ｍｇ／Ｌのクエン酸、７．５ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．９５ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．９ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．０ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／Ｌのグルコース、および２５μｇ／ｍＬのアンピシリンからできた合成培地中で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＰＤ４０５５およびＤＰＤ４０５７を３７℃で一晩培養した。翌日、７．５、５．０、３．３、２．２、１．５、または０ｇ／ＬのｐＨＣＡを含有する同一培地１．０ｍＬが入った試験管に、１０μＬの一夜培養物を接種した。これらの試験管を暗中でローラードラム上において３７℃で１〜２日間培養した。接種の２１時間後に、ＤＰＤ４０５７を接種した５．０ｇ／ＬｐＨＣＡが入った試験管では、目に見える生育があった。対照的に、菌株ＤＰＤ４０５５は２．２ｇ／ＬｐＨＣＡで目に見える生育をしたが、それを超えると生育がなかった。したがってこれらの条件下では、ｙｈｃＲＱＰのマルチコピー発現によるｐＨＣＡ耐性の２．３倍の改善が観察された。
【０１５９】
４８時間のインキュベーション後に、希釈物をＬＢプレート上に蒔いて、７．５ｇ／ＬｐＨＣＡの存在下で生育する培養物のＣＦＵ／ｍＬを求めた。菌株ＤＰＤ４０５５は２×１０２ＣＦＵ／ｍＬを有した。菌株ＤＰＤ４０５７は８×１０７ＣＦＵ／ｍＬを有した。各培養物に対する接種物は２×１０７ＣＦＵ／ｍＬであった。したがって７．５ｇ／ＬのｐＨＣＡは、マルチコピーｙｈｃＲＱＰ遺伝子が無い菌株に対して殺菌性効果を有した。対照的に、マルチコピーｙｈｃＲＱＰを保有する培養物ではＣＦＵ／ｍＬが増大した。この結果はこの排出系がｐＨＣＡ耐性において果たす重大な役割を再度強調する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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