(57)【要約】本発明は、異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患、例えばある癌のような増殖性疾患を有する患者の同定および処置のための、該疾患を有する患者のＲａｆキナーゼ阻害剤での処置の効果のモニタリングのためのおよび患者における該疾患の診断のためのバイオマーカーとして有用なリンタンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患を有する患者の処置法であり、患者から得られた生物学的サンプル中の表１に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化の上昇したレベルを検出することにより、疾患を有する患者を同定し、該患者に有効量のＲａｆキナーゼ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患が癌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌が、黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、神経膠腫、腺癌、肉腫、乳癌、肺癌および肝臓癌からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
癌が黒色腫である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｏｐ１８のセリン２５残基またはセリン３８残基のリン酸化のレベルを検出する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｏｐ１８のセリン２５残基のリン酸化のレベルを検出する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
生物学的サンプルを、細胞または複数の細胞、組織または複数の組織、血液、血清、糞、尿、喀痰、羊水または骨組織生検サンプルから得る、請求項１記載の方法。
【請求項８】
生物学的サンプルが皮膚細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患の、Ｒａｆキナーゼ阻害剤投与による処置の効果をモニタリングする方法であり：
ａ)処置前に患者から得た生物学的サンプル中の、表１に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを測定し；
ｂ)処置後に患者から得た別の生物学的サンプル中の、リンタンパク質のリン酸化のレベルを測定し；そして
ｃ)両方のサンプル中のリンタンパク質のリン酸化のレベルを比較し、ここで、処置前に得た生物学的サンプル中のリンタンパク質のリン酸化のレベルと比較して、処置後に得た生物学的サンプル中のリンタンパク質のリン酸化のレベルの減少を処置の効果の指標とする、
ことを含む、方法。
【請求項１０】
異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患が癌である、請求項９記載の方法。
（請求項１２)
癌が、黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、神経膠腫、腺癌、肉腫、乳癌、肺癌および肝臓癌からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該測定段階が、抗体を利用する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
該抗体が、リン酸化癌タンパク質１８に結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患を診断する方法であり：
ａ)患者から得た少なくとも１個のタンパク質を含む試験生物学的サンプル中の、表１に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを検出し；そして
ｂ)試験生物学的サンプル中の少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルと、同患者または他の源から得た正常サンプル中のリンタンパク質のリン酸化を比較し、ここで、正常サンプルのリン酸化レベルと比較して、試験生物学的サンプル中の高いリン酸化のレベルを、患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患の存在の指標とする、
ことを含む、方法。
【請求項１４】
異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患が癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
癌が、黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、神経膠腫、腺癌、肉腫、乳癌、肺癌および肝臓癌からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
癌が黒色腫である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
Ｏｐ１８のセリン２５残基またはセリン３８残基のリン酸化のレベルを検出する、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
Ｏｐ１８のセリン２５残基のリン酸化のレベルを検出する、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
生物学的サンプルを、細胞または複数の細胞、組織または複数の組織、血液、血清、糞、尿、喀痰、羊水または骨組織生検サンプルから得る、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
生物学的サンプルが皮膚細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患の進行をモニタリングする方法であり、患者から得た生物学的サンプル中の表１に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを経時的に測定し、ここで、リンタンパク質のリン酸化レベルの経時的な上昇を患者の同疾患の進行の指標とすることを含む、方法。
【請求項２２】
異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患が癌である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
癌が、黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、神経膠腫、腺癌、肉腫、乳癌、肺癌および肝臓癌からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｏｐ１８のセリン２５残基またはセリン３８残基のリン酸化のレベルを測定する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
Ｏｐ１８のセリン２５残基のリン酸化を測定する、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
技術分野
本発明は、異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患、例えばある癌のような増殖性疾患を有する患者の同定および処置のための、該疾患を有する患者のＲａｆキナーゼ阻害剤での処置の効果のモニタリングのためのおよび患者における該疾患の診断のためのバイオマーカーとして有用なリンタンパク質に関する。
【０００２】
関連技術の説明
細胞は、その細胞外環境の種々の態様で、種々のシグナル伝達経路を使用して、核と連絡している。これらのシグナルの多くは、リン酸基の伝達を介して種々の因子を活性化させるタンパク質キナーゼにより伝達される。適当なキナーゼ活性の阻害によるシグナル伝達の混乱は、商品名Gleevec(米国で)として市販されているｂｃｒ−ａｂｌキナーゼの阻害剤であるイマチニブにより証明される通り、臨床的利点を有し得る。
【０００３】
ＭＡＰキナーゼシグナリング経路は、当分野で、細胞外環境から細胞核に、増殖のためのそのシグナルを伝達するための増殖因子のための経路の一つとして既知である。増殖因子は細胞膜に位置する経膜レセプターを活性化し、それが次にカスケードを開始し、それにより、Ｇ−タンパク質であるＲＡＳが活性化し、Ｒａｆキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼに高い親和性で結合し、細胞膜へのその移動を引き起こし、その場所でＲａｆ活性化が起こる。活性化Ｒａｆは次いでマイトージェン−活性タンパク質キナーゼキナーゼ(ＭＥＫ)をリン酸化および活性化し、それが次いで細胞外−シグナル−制御タンパク質キナーゼ(ＥＲＫ)をリン酸化および活性化する。活性化ＥＲＫは、細胞質標的をリン酸化し、種々の転写因子を活性化する場所である核に移動する。
【０００４】
ＲＡＦキナーゼファミリーは、Ｃ−ＲＡＦ(ＲＡＦ−１としても既知)、Ｂ−ＲＡＦおよびＡ−ＲＡＦと名付けられた３種のメンバーを有することが知られている。Ｂ−ＲＡＦキナーゼが、ヒト癌における数個の体細胞点変異の１個により一般に活性化され、試験した黒色腫細胞系の５９％を含む。Davies et al., Nature, Vol. 417, pp. 949-954 (2002)参照。ＲＡＦキナーゼ、特にＣ−ＲＡＦキナーゼならびに野生型および変異体Ｂ−ＲＡＦキナーゼ、特にＶ５９９Ｅ変異体Ｂ−ＲＡＦキナーゼの有効な阻害剤が本明細書に記載され、先に、米国公開出願２００２−００１０１９１に記載されている。
【０００５】
ＲＡＦキナーゼ阻害剤は、異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる増殖性疾患、特に脱制御／過活性化ＭＡＰＫ経路、またはＲＡＦキナーゼの変異の活性化により特徴付けられる癌、例えば、変異Ｂ−ＲＡＦを有する、とりわけ該変異Ｂ−ＲＡＦがＶ５９９Ｅ変異体である、黒色腫の処置のために、治療剤として有用である。
【０００６】
ＭＡＰＫ経路キナーゼの上記の上流キナーゼに関する知識は非常に増えてきているが、ＭＡＰキナーゼ経路により制御される下流標的リンタンパク質に関してはほとんど知られていない。Ｒａｆキナーゼ阻害剤のような治療剤に応答した、このような下流リンタンパク質およびこれらのリンタンパク質のリン酸化状態、すなわち、該タンパク質のリン酸化のレベルの同定は、ＭＡＰキナーゼ経路が、該治療剤により適切に制御されていることの証明に重要である。治療剤に応答した下流標的リンタンパク質およびそのリン酸化状態はまた癌のような疾患の同定および処置のための、疾患の進行および改善の診断およびモニタリングのための、および、治療剤が標的を十分に遮断しているかまたは活性化しているかの臨床的評価のための、バイオマーカーとして使用できる。
【０００７】
したがって、同分野において、Ｒａｆキナーゼ阻害剤のような治療剤に応答した、ＭＡＰキナーゼ経路により制御される下流リンタンパク質およびこれらのリンタンパク質のリン酸化状態の同定の必要性がある。
【０００８】
図面の簡単な説明
図１. Ｒａｆキナーゼ阻害剤１−(４−ｔ−ブチルアニリノ)−４−［(ピリジン−４−イル)−メチル］−イソキノリン(ＢＰＭＩ)で処置したＨＣＴ１１６細胞融解物の逆標識(Inverse Labeling)−ＭＳ分析。Ｏｐ１８  Ｓｅｒ２５リン酸化の下方制御が、ＢＰＭＩ処置により検出される。
【０００９】
図２. (Ａ)Ｒａｆキナーゼ阻害剤ＢＰＭＩで処置した腫瘍組織ＤＵ１４５の融解物の直接ＬＣ／ＭＳ分析(＊マウス血清アルブミン；○マウスヘモグロビン)；および(Ｂ)メチルエステル化／ＩＭＡＣ除去血液汚染物；インビボでＯＰ１８  Ｓｅｒ２５リン酸化の下方制御が確認される。
【発明の開示】
【００１０】
本明細書で引用するすべての特許出願、特許および文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【００１１】
“有効量”なる用語は、患者に投与したときに、異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患、例えば癌のような増殖性疾患の処置に有効である、ＢＰＭＩのようなＲａｆキナーゼ阻害剤の量を意味する。増殖性疾患の処置に関して、これは、疾患の症状の減少、腫瘍サイズの縮小、増殖性疾患(癌)の細胞の死、および、増殖性疾患の処置を示す当分野で既知の他のすべての指標を含む。
【００１２】
本発明は、リン酸化がＲａｆキナーゼ阻害剤での処置により下方制御されるものである、腫瘍細胞におけるリンタンパク質、癌タンパク質１８(Ｏｐ１８)、癌遺伝子ＥＭＳ１および熱ショック１１０kDタンパク質(表１参照)の同定に関する。特に、Ｏｐ１８のセリン２５残基のリン酸化が、Ｏｐ１８を含む細胞のＲａｆキナーゼ阻害剤での処置により下方制御され、Ｏｐ１８  セリン２５リン酸化の変化が、ＭＥＫのリン酸化状態の変化と定量的に相関する。Ｒａｆキナーゼ阻害剤に応答したこれらのリンタンパク質およびこれらのリンタンパク質のリン酸化状態は：１)ｉ異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患、例えば、癌のような増殖性疾患を有するか、発症するリスクを有する対象を同定し、次いで、同疾患を有しているか、発症するリスクを有する対象を、Ｒａｆキナーゼ阻害剤で処置するための；２)該疾患の処置におけるＲａｆキナーゼ阻害剤の効果を評価するための；および３)患者における疾患を診断し、このような患者の進行をモニタリングするための、バイオマーカーとして利用できる。
【００１３】
したがって、一つの局面において、異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患を有するか、発症するリスクを有する患者の処置法を提供する。該方法は：
ａ)患者から得られた生物学的サンプル中の表１に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化の上昇したレベルを検出することにより、疾患を有するかまたは発症するリスクを有する患者を同定し；そして
ｂ)該患者に有効量のＲａｆキナーゼ阻害剤を投与する
ことを含む。
【００１４】
一般に、異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患は、増殖性疾患、特に上昇したＲＡＦキナーゼ活性により特徴付けられる癌、例えば野生型Ｂ−またはＣ−ＲＡＦキナーゼを過剰発現するか、または活性化変異体ＲＡＦキナーゼ、例えば、変異体Ｂ−ＲＡＦキナーゼを発現するものである。変異ＲＡＦキナーゼが検出されている癌は、黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、神経膠腫、腺癌、肉腫、乳癌、肺癌および肝臓癌を含む。変異Ｂ−ＲＡＦキナーゼは、とりわけ多くの黒色腫において優勢である。
【００１５】
本発明によって、生物学的サンプルを、患者から、例えば、生検または切除術の結果として得て、表１または２に示す少なくとも１個のリンタンパク質が、上昇したリン酸化のレベル(同患者が、該疾患を有しているか、または発症するリスクを有する指標である)であるか否かを試験する。生物学的サンプルは、細胞または複数の細胞、組織または複数の組織、血液、血清、糞、尿、喀痰、羊水または骨組織生検サンプルから得ることができる。生物学的サンプル、例えば、腫瘍組織中のリンタンパク質のリン酸化の上昇したレベルは、生物学的サンプルのリン酸化レベルと、同じ個体または疾患を有していない対象から得た組織の正常サンプルにおけるリンタンパク質のリン酸化のレベルを比較することにより、検出できる。疾患を有していない対象から得たサンプルは、対象から試験サンプルを得るのと同時に得ることができ、または、以前にタンパク質のリン酸化のレベルが決定されている予め確立されたコントロールであってよい。
【００１６】
試験および正常サンプルにおけるリンタンパク質(複数もある)のリン酸化のレベルは、当分野で既知の技術により、例えば、サンプルを３２Ｐｉで標識し、該タンパク質(複数もある)に特異的な抗体を利用した、該タンパク質(複数もある)の免疫沈降またはウェスタン・ブロット分析を行うことにより、測定できる。２個のサンプル中のタンパク質のリン酸化のレベルを、また、米国公開出願２００２−００９０６５２に記載のような逆標識法を使用した、質量分析法により測定できる(実施例２および３も参照)。
【００１７】
好ましい態様において、リンタンパク質であるＯｐ１８のセリン２５残基またはセリン３８残基のリン酸化のレベルを、既知の方法により測定および検出する。
【００１８】
疾患を有していない対象由来の正常サンプルと比較して、該疾患を有することが疑われる、または該発症が疑われる患者の試験サンプルにおける上昇したリンタンパク質のリン酸化のレベルの検出により、次いで、Ｒａｆキナーゼ阻害剤を該患者に投与する。Ｒａｆキナーゼ阻害剤の投与が、リンタンパク質のリン酸化のレベルの下方制御をもたらす。リンタンパク質のリン酸化状態の下方制御を、患者からその後に得た試験サンプル中で検出し、下記のような処置の効果をモニターできる。
【００１９】
特に有用な態様において、Ｒａｆキナーゼ阻害剤は、式(Ｉ)
【化１】
2006525962.tif 000002
〔式中、
ｒは０−２であり；
ｎは０−２であり；
ｍは０−４であり；
Ｇは直接結合、低級アルキレン、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＳＯ２−、オキサ(−Ｏ−)、チア(−Ｓ−)または−ＮＲ−であるか、またはアシルオキシ、オキソ、ハロゲンもしくはヒドロキシで置換された低級アルキレンであり；
【００２０】
Ｊはアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルであり、ここで
アリールは、フェニル、ナフチル、フルオレニルおよびフェナントレニルのような、６−１４個の炭素原子を有する芳香族性ラジカルであり；
ヘテロアリールは、フリル、ピラニル、ピリジル、１,２−、１,３−および１,４−ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、オキサゾリル、キナゾリル、イミダゾリル、ピロリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、インドリル、イソインドリル、キノリル、イソキノリル、プリニル、シンノリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、プリニル、チアンスレニル、キサンテニル、アクリジニル、カルバゾリルおよびフェナジニルのような、４−１４個、とりわけ５−７個の環原子を有し、その中の１、２または３個の原子が、独立して、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択される、芳香族性ラジカルであり；
シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルのような、３−８個、好ましくは５−６個の環原子を有する飽和環状ラジカルであり；
ヘテロシクロアルキルは、ピペリジル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、ピロリジニルおよびピラゾリジニルのような、３−８個、好ましくは５−６個の環原子を有し、その中の１、２または３個の原子が、独立して、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択される、飽和環状ラジカルであり；
【００２１】
Ｑは、ハロゲン、非置換もしくは置換低級アルキル、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−ＮＲ２、−ＮＲＳ(Ｏ)２Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＳ(Ｏ)２Ｒ、−Ｓ(Ｏ)Ｒ２、−Ｓ(Ｏ)２Ｒ２、−ＯＣＯＲ２、−Ｃ(Ｏ)Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、−ＮＲ−ＣＯＲ２、−ＣＯＮ(Ｒ２)２、Ｓ(Ｏ)２Ｎ(Ｒ２)２、シアノ、トリ−メチルシラニル、非置換もしくは置換アリール、非置換もしくは置換ヘテロアリール(例えば、置換もしくは非置換イミダゾリルおよび置換もしくは非置換ピリジニル)、非置換もしくは置換シクロアルキル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル(例えば、置換もしくは非置換ピペリジニル、置換もしくは非置換ピペラゾリル、置換もしくは非置換テトラヒドロピラニルおよび置換もしくは非置換アゼチジニル)、−Ｃ１−４アルキル−アリール、−Ｃ１−４アルキル−ヘテロアリール、−Ｃ１−４アルキル−ヘテロシクリル、アミノ、モノ−またはジ−置換アミノからなる群から選択される、１または２個の炭素原子上の置換基であり；
【００２２】
ＲはＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ２は非置換もしくは置換アルキル、非置換もしくは置換シクロアルキル、フェニル、−Ｃ１−４アルキル−アリール、−Ｃ１−４アルキル−ヘテロアリールまたは−Ｃ１−４アルキル−ヘテロシクロアルキルであり；
ＸはＹ、−Ｎ(Ｒ)−、オキサ、チオ、スルホン、スルホキシド、スルホンアミド、アミド、またはウレイレン、好ましくは−ＮＨ−であり；
ＹはＨ、低級アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルであり；そして
【００２３】
Ｚはアミノ、モノ−またはジ−置換アミノ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、エーテル化またはエステル化ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、エステル化カルボキシ、アルカノイル、カルバモイル、Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイル、アミジノ、グアニジノ、メルカプト、スルホ、フェニルチオ、フェニル−低級アルキルチオ、アルキルフェニルチオ、フェニルスルフィニル、フェニル−低級アルキルスルフィニル、アルキルフェニルスルフィニル、フェニルスルホニル、フェニル−低級アルカンスルホニルまたはアルキルフェニルスルホニルであり、２個以上のラジカルＺ(ｍ＞２)が存在するとき、置換基Ｚは同一または異なる。〕
の化合物、または、１個またはそれ以上のＮ原子が酸素原子を有するとき、記載の化合物のＮ−オキシド
またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００２４】
式(Ｉ)の化合物はＲＡＦキナーゼを阻害し、この特性に基づき、薬への利用性を有する。
【００２５】
本明細書の内容の範囲内で、前記および後記に使用する一般的用語は、特記しない限り、下記の意味を有する。
【００２６】
“低級”なる用語は、最大７個(７個を含む)、とりわけ最大４個(４個を含む)の炭素原子を有するラジカルを意味し、当該ラジカルは、非分枝であるか、または、１箇所またはそれ以上で分枝している。
【００２７】
複数形の化合物、塩などの言及は常に１個の化合物、塩などを含むと理解されるべきである。
【００２８】
例えば、ｎ＝１であり、そしてＲが低級アルキルである式(Ｉ)の化合物(またはそのＮ−オキシド)に存在し得る不斉炭素原子は、(Ｒ)、(Ｓ)または(Ｒ,Ｓ)立体配置、好ましくは(Ｒ)または(Ｓ)立体配置を有し得る。二重結合または環の置換基は、ｃｉｓ(＝Ｚ)またはｔｒａｎｓ(＝Ｅ)形であり得る。したがって、本発明の化合物は、異性体混合物の形、または、純粋な異性体の形、好ましくは、エナンチオマー的に純粋なジアステレオ異性体の形であり得る。
【００２９】
指数ｒは好ましくは０または１である。それは２であってもよい。
指数ｎは好ましくは０または１、とりわけ０である。それは２であってもよい。
指数ｍは好ましくは０、１または２、とりわけ０、または１でもある。
好ましくは、Ｊは、少なくとも１個の、しかし３個を超えないＮを含む、ヘテロアリールである。
【００３０】
低級アルキルは、とりわけＣ１−４アルキル、例えば、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたは、とりわけ、メチルまたはエチル、または、低級アルキルとしてのＹの場合、それはとりわけイソペンチルであり得る。
【００３１】
アリールは好ましくは６−１４個の炭素原子を有する芳香族性ラジカル、とりわけフェニル、ナフチル、フルオレニルまたはフェナントレニルであり、記載のラジカルは、非置換であるか、または、１個またはそれ以上の置換基、好ましくは３個までの、特に、１個または２個の、特に、アミノ；モノ−またはジ−置換アミノ；ハロゲン；アルキル；置換アルキル；ヒドロキシル；エーテル化またはエステル化ヒドロキシル；ニトロ；シアノ；カルボキシ；エステル化カルボキシ；アルカノイル；カルバモイル；Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイル；アミジノ；グアニジン；メルカプト；スルホ；フェニルチオ；フェニル−低級アルキルチオ；アルキルフェニルチオ；フェニルスルフィニル；フェニル−低級アルキルスルフィニル；アルキルフェニルスルフィニル；フェニルスルホニル；フェニル−低級アルカンスルホニル；アルキルフェニルスルホニル；低級アルケニル、例えばエテニルおよびフェニル；低級アルキルチオ、例えばメチルチオ；低級アルカノイル、例えばアセチル；低級アルキルメルカプト、例えばメチルメルカプト(−Ｓ−ＣＨ３)；ハロ−低級アルキルメルカプト、例えばトリフルオロメチルメルカプト(−Ｓ−ＣＦ３)；低級アルカンスルホニル；ハロ−低級アルカンスルホニル、例えば、とりわけ、トリフルオロメタンスルホニル、ジヒドロキシボラ(−Ｂ(ＯＨ)２)およびヘテロシクリル；および、環の隣接炭素原子に結合した低級アルキレンジオキシから選択される置換基で置換されている；アリールは、好ましくは、非置換、または、アミノ；低級アルカノイルアミノ、とりわけアセチルアミノ；ハロゲン、とりわけフッ素、塩素または臭素；低級アルキル、とりわけメチル、またはエチルまたはプロピル；ハロ−低級アルキル、とりわけトリフルオロメチル；ヒドロキシ；低級アルコキシ、とりわけメトキシ、またはエトキシ；フェニル−低級アルコキシ、とりわけベンジルオキシ；およびシアノ、または(前記の置換基とは別にまたはそれに加えて)Ｃ８−１２アルコキシ、とりわけｎ−デシルオキシ；カルバモイル；低級アルキルカルバモイル、例えばＮ−メチル−またはＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイル；低級アルカノイル、例えばアセチルまたはフェニルオキシ；ハロ−低級アルキルオキシ、例えばトリフルオロメトキシまたは１,１,２,２−テトラフルオロエチルオキシ；低級アルコキシカルボニル、例えばエトキシカルボニル；低級アルキルメルカプト、例えばメチルメルカプト；ハロ−低級アルキルメルカプト、例えばトリフルオロメチルメルカプト；ヒドロキシ−低級アルキル、例えばヒドロキシメチルまたは１−ヒドロキシメチル；低級アルカンスルホニル、例えばメタンスルホニル；ハロ−低級アルカンスルホニル、例えばトリフルオロメタンスルホニル、フェニルスルホニル、ジヒドロキシボラ(−Ｂ(ＯＨ)２)、２−メチル−ピリミジン−４−イル、オキサゾール−５−イル、２−メチル−１,３−ジオキソラン−２−イル、１Ｈ−ピラゾール−３−イルまたは１−メチル−ピラゾール−３−イル；および、２個の隣接炭素原子に結合した低級アルキレンジオキシ、例えばメチレンジオキシからなる群から選択される、１個または２個の同一または異なる置換基で、とりわ��低級アルキル、とりわけメチル；ハロゲン、とりわけ塩素または臭素；およびハロ−低級アルキル、とりわけトリフルオロメチルからなる群から選択される、１個または２個の同一または異なる置換基で置換されている、フェニルである。アリールは好ましくはまたナフチルである。
【００３２】
ヘテロアリールは、好ましくは、結合している環において不飽和ヘテロ環式ラジカルであり、好ましくは単−または二−または三環式である；ここで、式(Ｉ)の分枝のラジカルに結合した環において、対応するアリールラジカルの１個またはそれ以上、好ましくは１−４個、とりわけ１または２個の炭素原子が、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子で置換されており、結合している環は、好ましくは４−１４個、とりわけ５−７個の環原子を有する；ここで、ヘテロアリールは、非置換、または、上記でアリールについて記載した置換基からなる群から選択される１個または２個、特に１−３個の、同一または異なる置換基により置換されている；そして、とりわけイミダゾリル、チエニル、フリル、ピラニル、チアンスレニル、イソベンゾフラニル、ベンゾフラニル、クロメニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、低級アルキル−置換イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリル、インダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、フェナンスリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナンスロリニルおよびフラザニルからなる群から選択されるヘテロアリールラジカルであり、これらのラジカルは、少なくとも１個のヘテロ原子を有する環を介して、式(Ｉ)の分子のラジカルに結合している；ピリジルがとりわけ好ましい。特に好ましいのは、また、ハロゲン、とりわけフッ素で置換されたインドリル、とりわけ６−フルオロインドール−３−イルである。
【００３３】
ヘテロアリールは、とりわけ、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１個または２個のヘテロ原子を有する５−または６−員芳香族性ヘテロ環であり、そのヘテロ環は、非置換であるか、または、とりわけ低級アルキル、例えばメチルで置換されていてよい；好ましいのは、さらに、２−メチル−ピリミジン−４−イル、１Ｈ−ピラゾール−３−イルおよび１−メチル−ピラゾール−３−イルから選択されるラジカルである。
【００３４】
ヘテロシクロアルキルは、とりわけ、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１個または２個のヘテロ原子を有する飽和５−または６−員ヘテロ環であり、そのヘテロ環は、非置換であるか、または、とりわけ低級アルキル、例えばメチルで置換されていてよい；好ましいのは、オキサゾール−５−イルおよび２−メチル−１,３−ジオキソラン−２−イルから選択されるラジカルである。
【００３５】
モノ−またはジ−置換アミノは、とりわけ低級アルキル、例えばメチル；ヒドロキシ−低級アルキル、例えば２−ヒドロキシエチル；フェニル−低級アルキル；低級アルカノイル、例えばアセチル；ベンゾイル；置換ベンゾイル(ここで、該フェニルラジカルは、非置換であるか、または、とりわけ、ニトロおよびアミノから、またはハロゲン、アミノ、Ｎ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルおよびカルバモイルから選択される１個またはそれ以上、好ましくは１個または２個の置換基で置換されている)；およびフェニル−低級アルコキシカルボニル(ここで、該フェニルラジカルは、非置換であるか、または、とりわけ、ニトロおよびアミノから、またはハロゲン、アミノ、Ｎ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルおよびカルバモイルから選択される１個またはそれ以上、好ましくは１個または２個の置換基で置換されている)からなる群から選択される１個または２個の同一または異なるラジカルで置換されているアミノである；そして、好ましくはＮ−低級アルキルアミノ、例えばＮ−メチルアミノまたはヒドロキシ−低級アルキルアミノ、例えば２−ヒドロキシエチルアミノ；フェニル−低級アルキルアミノ、例えばベンジルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ−フェニル−低級アルキル−Ｎ−低級アルキルアミノまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキルフェニルアミノ；低級アルカノイルアミノ、例えばアセチルアミノであるか；または、置換基はベンゾイルアミノおよびフェニル−低級アルコキシカルボニルアミノ(ここで、いずれの場合も、該フェニルラジカルは、非置換であるか、または、とりわけ、ニトロまたはアミノで、またはハロゲン、アミノ、Ｎ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルまたはカルバモイルで置換されているか、または前記のラジカルの群とは別に、またはそれに加えて、アミノカルボニルアミノで置換されている)からなる群から選択される。
【００３６】
ハロゲンはとりわけフッ素、塩素、臭素またはヨウ素、よりとりわけフッ素、塩素または臭素、特にフッ素および塩素である。
【００３７】
アルキルは、好ましくは最大１２個までの炭素原子を有し、とりわけ低級アルキル、よりとりわけメチル、またはエチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｔｅｒｔ−ブチルである。
【００３８】
置換アルキルは、ハロゲン、とりわけフッ素、およびまたアミノ、Ｎ−低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、Ｎ−低級アルカノイルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニルおよびフェニル−低級アルコキシカルボニルからなる群からとりわけ選択された１個またはそれ以上、とりわけ３個までの置換基を含み得る、直前に定義の通りのアルキルである。トリフルオロメチルが重要な置換アルキルである。
【００３９】
エーテル化ヒドロキシは、とりわけＣ８−２０アルキルオキシ、例えばｎ−デシルオキシ；低級アルコキシ(好ましい)、例えばメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシまたはｎ−ペンチルオキシ；フェニル−低級アルコキシ、例えばベンジルオキシまたはフェニルオキシでもあるか；または、前記の群とは別にまたはそれに加えて、Ｃ８−２０アルキルオキシ、例えばｎ−デシルオキシ；ハロ−低級アルコキシ、例えばトリフルオロメチルオキシまたは１,１,２,２−テトラフルオロエトキシである。
【００４０】
エステル化ヒドロキシは、とりわけ低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、低級アルコキシカルボニルオキシ、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ；またはフェニル−低級アルコキシカルボニルオキシ、例えばベンジルオキシカルボニルオキシである。
【００４１】
エステル化カルボキシは、とりわけ低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはエトキシカルボニル、フェニル−低級アルコキシカルボニルまたはフェニルオキシカルボニルである。
【００４２】
アルカノイルはとりわけアルキル−カルボニル、よりとりわけ低級アルカノイル、例えば、アセチルである。
【００４３】
Ｎ−モノ−またはＮ,Ｎ−ジ−置換カルバモイルは、とりわけ、末端窒素を、１個または２個の置換基である低級アルキル、フェニル−低級アルキルまたはヒドロキシ−低級アルキルで置換されている。
【００４４】
アルキルフェニルチオはとりわけ低級アルキルフェニルチオである。
アルキルフェニルスルフィニルはとりわけ低級アルキルフェニルスルフィニルである。
アルキルフェニルスルホニルはとりわけ低級アルキルフェニルスルホニルである。
ピリジルＹは好ましくは３−または４−ピリジルである。
【００４５】
非置換または置換シクロアルキルは、好ましくは、非置換であるか、アリールと同じ方法で、とりわけ、フェニルに関して定義の通りに置換されている、Ｃ３−８シクロアルキルである。好ましいのは、シクロヘキシル、またはシクロペンチルまたはシクロプロピルである。また好ましいのは、４−低級アルキル−シクロヘキシル、例えば４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシルである。
【００４６】
存在するとき、Ｚは好ましくはアミノ；ヒドロキシ−低級アルキルアミノ、例えば２−ヒドロキシエチルアミノ；低級アルカノイルアミノ、例えばアセチルアミノ；ニトロベンゾイルアミノ、例えば３−ニトロベンゾイルアミノ；アミノベンゾイルアミノ、例えば４−アミノベンゾイルアミノ；フェニル−低級アルコキシカルボニルアミノ、例えばベンジルオキシカルボニルアミノ；またはハロゲン、例えば臭素であり；好ましくは１個だけの置換基(ｍ＝１)、とりわけ直前に記載の置換基の１個、とりわけハロゲンが存在する。非常に特に好ましいのは、Ｚが存在しない(ｍ＝０)、式(Ｉ)の化合物またはそのＮ−オキシドである。
【００４７】
Ｇは好ましくは直接結合(すなわちＪと環の間の直接結合)またはメチレンである。
２個の隣接炭素原子に結合した、低級アルキレンジオキシ、例えばメチレンジオキシで置換されたフェニルの形のアリールは、好ましくは３,４−メチレンジオキシフェニルである。
【００４８】
式(Ｉ)の化合物のＮ−オキシドは、好ましくはイソキノリン環窒素またはＪ部分の窒素が酸素原子を有するか、または１個以上の記載の窒素原子が酸素原子を有する、Ｎ−オキシドである。
【００４９】
塩は、とりわけ式(Ｉ)の化合物、またはそのＮ−オキシドの薬学的に許容される塩である。
【００５０】
このような塩は、例えば、塩基性窒素原子を有する式(Ｉ)の化合物、またはそのＮ−オキシドにより、酸付加塩として、好ましくは有機または無機酸と形成され、とりわけ薬学的に許容される塩である。適当な無機酸は、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸(ＨＣｌ)；硫酸；またはリン酸である。適当な有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸またはスルファミン酸、例えば、酢酸；プロピオン酸；オクタン酸；デカン酸；ドデカン酸；グリコール酸；乳酸；２−ヒドロキシ酪酸；グルコン酸；グルコースモノカルボン酸；フマル酸；コハク酸；アジピン酸；ピメリン酸；スベリン酸；アゼライン酸；リンゴ酸；酒石酸；クエン酸；グルカル酸；ガラクタル酸；アミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、Ｎ−メチルグリシン、アセチルアミノ酢酸、Ｎ−アセチルアスパラギン、Ｎ−アセチルシステイン、ピルビン酸、アセト酢酸、ホスホセリン、２−または３−グリセロリン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、１−または３−ヒドロキシナフチル−２−カルボン酸、３,４,５−トリメトキシ安息香酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、メタン−またはエタン−スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１,２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１,５−ナフタレンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸またはＮ−メチル−、Ｎ−エチル−またはＮ−プロピル−スルファミン酸；または他の有機プロトン酸、例えばアスコルビン酸である。
【００５１】
カルボキシまたはスルホのような負に荷電したラジカルが存在するとき、塩基との塩、例えば、金属またはアンモニウム塩、例えばアルカリ金属；アルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩；アンモニアまたは適当な有機アミン、例えば３級モノアミン、例えば、トリエチルアミンまたはトリ(２−ヒドロキシエチル)アミンとのアンモニウム塩；またはヘテロ環式塩基、例えば、Ｎ−エチルピペリジンまたはＮ,Ｎ'−ジメチル−ピペラジンとの塩もまた形成できる。
【００５２】
塩基性基と酸性基が同じ分子中に存在するとき、式(Ｉ)の化合物、またはそのＮ−オキシドはまた分子内塩を形成できる。
【００５３】
単離または精製目的で、薬学的に許容されない塩、例えば、ピクリン酸塩または過塩素酸塩も使用することが可能である。所望により、医薬組成物の形の、薬学的に許容される塩または遊離化合物のみが治療的に使用され、したがって、これらが好ましい。
【００５４】
遊離形の新規化合物と、例えば、新規化合物の精製またはそれらの同定のための、中間体として使用できるそれらの塩を含む塩の形のものの密接な関係の観点から、前記および後記の遊離化合物に関する言及はまた、適当であり、予測される限り、対応する塩も含むと理解されるべきである。
【００５５】
低級アルキレンＧは、分枝または、好ましくは、非分枝であり、とりわけ分枝または、好ましくは、非分枝Ｃ１−Ｃ４アルキレン、とりわけメチレン(−ＣＨ２−)、エチレン(−ＣＨ２−ＣＨ２−)、トリメチレン(−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−)またはテトラメチレン(−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−)である。Ｇは好ましくはメチレンである。低級アルキレンＧは好ましくは非置換であるが、アシルオキシ、オキソ、ハロゲンまたはヒドロキシで置換されていてもよい。
【００５６】
式(Ｉ)の化合物(またはそのＮ−オキシド)は、それ自体で、または、１個またはそれ以上の他の治療剤と組み合わせて投与でき、固定された組み合わせの使用が可能であり、または、記載の化合物と１個またはそれ以上の他の化合物を時間的に交互の方法で、または、互いに独立して投与するか、固定された組み合わせと１個またはそれ以上の治療剤の組み合わせ投与が可能である。特に、腫瘍処置のための式(Ｉ)の化合物(またはそのＮ−オキシド)の投与は、化学療法剤(１個またはそれ以上の他の化学療法剤との、とりわけ細胞増殖抑制との、またはホルモン剤またはホルモン様活性を有する化合物との組み合わせ)、放射線療法、免疫療法、外科的処置またはこれらの組み合わせと組み合わせて、これらと並行して、またはこれらに加えて、行うことができる。長期投与は、長期治療は、上記の他の処置法との関連で、アジュバント療法として等しく可能である。腫瘍緩解後の状態を維持するための処置、または、例えば、危険な状態にある患者の場合の、化学予防的処置でさえも可能である。
【００５７】
記載の化合物を組み合わせることができる治療剤として、とりわけ、１個またはそれ以上のとりわけ抗増殖性、細胞増殖抑制または細胞毒性化合物、例えば、ポリアミン生合成の阻害剤、異なるタンパク質キナーゼ、とりわけタンパク質キナーゼＣの、または上皮細胞増殖因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼキナーゼのようなチロシンタンパク質キナーゼの阻害剤、血管内皮増殖因子のような増殖因子の阻害剤、サイトカイン、ＴＧＦ−βまたはＩＦＮ−βのような負の増殖調節剤、アロマターゼ阻害剤、ホルモンまたはホルモンアナログ、および慣用の細胞増殖抑制剤からなる群から選択される１個またはそれ以上の化学療法剤が考慮される。
【００５８】
記載の化合物は、ヒトの(予防的、および、好ましくは、治療的)処置だけでなく、他の温血動物、例えば、商品として有用な動物、例えば、マウス、ウサギまたはラット、またはモルモットのような齧歯類の処置にも意図される。
【００５９】
下記の好ましい式(Ｉ)の化合物の群において、上記の一般的定義からの置換基の定義を、例えば、より一般的な定義を、より具体的な、または、特に、好ましいとして示される定義で置換するために、好都合には使用してよい；いずれの場合も、上記で好ましいとして定義の、または、実施例の方法で記載の定義が好ましい。
【００６０】
Ｙが、４位をｔ−ブチルまたはトリフルオロメチルで置換されているフェニルである化合物が特に好ましい。
【００６１】
式(Ｉ)の特に重要な化合物は：
【化２】
2006525962.tif 000003
を含む。
【００６２】
本発明の化合物は、他の化合物に関して当分野でそれ自体既知の方法により、とりわけ米国公開出願２００２−００１０１９１に記載の通り製造できる。
【００６３】
他の局面において、患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患の、Ｒａｆキナーゼ阻害剤投与による処置の効果をモニタリングする方法が提供される。本方法は：
ａ)処置前に患者から得た生物学的サンプル中の、表１または２に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを測定し；
ｂ)処置後に患者から得た１個またはそれ以上の生物学的サンプル中の、リンタンパク質のリン酸化のレベルを測定し；そして
ｃ)処置前に得たサンプル中と、処置後に得たサンプル(複数もある)のリンタンパク質のリン酸化のレベルを比較し、ここで、処置前に得た生物学的サンプル中のリンタンパク質のリン酸化のレベルと比較して、処置後に得た生物学的サンプル中のリンタンパク質のリン酸化のレベルの減少を処置の効果の指標とする、
ことを含む。
【００６４】
処置前および処置後のサンプルのリン酸化のレベルは、リンタンパク質のリン酸化のレベルの検出に使用する方法に依存して、同時にまたは異なる時点で測定できる。
【００６５】
一つの局面において、リン酸化のレベルの測定は、表１または２から選択されるタンパク質に特異的な抗体を利用して達成し得る。
【００６６】
他の局面において、本発明はまた、哺乳類、例えば、ヒト由来のサンプル中の、表１または２から選択されるポリペプチドまたは核酸の存在を検出する方法であり、哺乳類由来のサンプルと、本明細書に記載のポリペプチドの１個に選択的に結合する抗体を接触させ、サンプル中の抗体とポリペプチドを含む反応複合体の形成を検出することによる、方法を提供する。サンプル中の複合体の形成の検出は、サンプル中のポリペプチドの存在または量を示す。
【００６７】
表１または２から選択されるタンパク質に結合する抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体調製について標準的な技術により製造できる。ポリクローナル抗体の製造のために、種々の適当な宿主動物(例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類)を、天然タンパク質、またはその合成変異体、または前記の誘導体の注射により免疫し得る。適当な免疫原性調製物は、例えば、表１または２から選択される組み換えにより発現されたタンパク質、または、表１または２の化学的に合成したポリペプチドを含み得る。本調製物はさらにアジュバントを含んでいてよい。免疫学的応答を増加させるために使用する種々のアジュバントは、フロインド(完全および不完全)、無機ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、表面活性物質(例えば、リゾレシチン、pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、ジニトロフェノールなど)、ヒトアジュバント、例えばカルメット・ゲラン菌およびコリネバクテリウム・パルバム、または類似の免疫刺激剤を含むが、これらに限定されない。所望により、表１または２からのタンパク質に対する抗体分子を、哺乳類から(例えば、血液から)単離し、さらに、タンパク質Ａクロマトグラフィーのような既知の方法により精製し、ＩｇＧフラクションを得ることができる。
【００６８】
抗体はまた、記載の活性または複数の活性を有する剛性抗体クローンに関するスクリーニングをするための、コンビナトリアルライブラリーを使用しても製造できる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体の可変領域の種々のフラグメント(Ｆｖ)を発現する、ファージを含むファージライブラリーのスクリーニングにより選択する。このようなファージライブラリーは、所望のリガンドに対して、アフィニティークロマトグラフィーにより選別できる(panned)。所望のリガンドに結合できるＦｖフラグメントを発現するクローンをリガンドに吸着させ、したがって、ライブラリー中の非結合クローンと分離する。次いで、結合したクローンをリガンドから溶出し、さらに、リガンド吸着／溶出の付加的サイクルにより富化できる。本発明の任意の抗体は、目的のファージクローンを選択するための適当なスクリーニング法の設計、続く、目的のファージクローンからのＦｖ配列およびKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3に記載の適当な定常領域(Ｆｃ)配列を使用した完全長抗体クローンの構築により、得ることができる。
【００６９】
患者のＲａｆキナーゼ阻害剤での処置の効果をモニタリングする方法の実施に際して、Ｒａｆキナーゼ阻害剤の増加したレベルの投与が、患者の処置後サンプル中のリンタンパク質のリン酸化のレベルを、検出されたよりも低く低下させるために、すなわち、Ｒａｆキナーゼ阻害剤の効果を増加させるために、望ましいことがある。あるいは、Ｒａｆキナーゼ阻害剤の少ない投与量が、タンパク質のリン酸化のレベルを検出されたよりも上昇させるために、すなわち、Ｒａｆキナーゼ阻害剤の効果を減少させるために、望ましいことがある。
【００７０】
異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患を有する患者の、Ｒａｆキナーゼ阻害剤の投与による処置の効果をモニタリングする方法は、さらに、Ｒａｆキナーゼ阻害剤と１個またはそれ以上の上記の抗増殖性、細胞増殖抑制または細胞毒性化合物の投与を含んでよい。
【００７１】
異なるＲａｆキナーゼ阻害剤の効果を、インビトロ細胞系を使用して、篩い分けおよび比較できる。一つの態様において、インビトロでのＲａｆキナーゼ阻害剤での処置の効果をモニタリングする方法であり：
ａ)表１または２に示す少なくとも１個のリンタンパク質を含む細胞のサンプルを、Ｒａｆキナーゼ阻害剤に暴露し；そして
ｂ)細胞のサンプル中の少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを、細胞のコントロールサンプル(処置なし)中のリンタンパク質のリン酸化のレベルと比較し、ここで、正常サンプルにおけるリン酸化のレベルと比較して、処置サンプルにおける減少したリン酸化のレベルをＲａｆキナーゼ阻害剤の効果の指標とする、
ことを含む、方法を提供する。
【００７２】
故に、一つの局面において本発明は、その中で、組み換え発現ベクターが表１または２からのタンパク質を発現する、細胞または宿主細胞に関する。本インビトロスクリーニングで使用するための適当な宿主細胞は、例えば、癌細胞系または単離された癌細胞、例えば肝腫瘍細胞、Ｓａｏｓ−２(ヒト肉腫細胞系)、Ｊｕｒｋａｔ(白血病Ｔ−細胞系)、ＨｅＬａ(ヒト頸癌細胞系)、ＴＩＬ系(黒色腫患者から得た)およびＭＤＡ２３１(乳癌細胞系)を含む。
【００７３】
一つの局面において、本発明の表１または２から選択されたタンパク質をコードする核酸を、哺乳類細胞中で、哺乳類発現ベクターを使用して、発現させる。組み換え哺乳類発現ベクターは、核酸の発現を、特定の細胞型において優先して指示できる(例えば、核酸を発現するために、組織特異的制御エレメントを使用する)。組織特異的制御エレメントは当分野で既知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的例は、アルブミンプロモーター(肝臓−特異的；Pinkert et al. (1987)Genes Dev 1:268-277)、リンパ−特異的プロモーター(Calame and Eaton(1988)Adv Immunol 43:235-275)、特にＴ細胞レセプターのプロモーター(WinotoおよびBaltimore(1989)EMBO J 8:729-733)および免疫グロブリンのプロモーター(Banerji et al. (1983)Cell 33:729-740;Queen and Baltimore(1983)Cell 33:741-748)、神経細胞−特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle(1989)PNAS 86:5473-5477)、膵臓−特異的プロモーター(Edlund et al. (1985)Science 230:912-916)、および乳腺−特異的プロモーター(例えば、乳漿プロモーター；米国特許４,８７３,３１６および欧州出願公開２６４,１６６)を含む。発育制御プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss(1990)Science 249:374-379)およびアルファ−フェトタンパク質プロモーター(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev 3:537-546)も包含される。
【００７４】
ベクターＤＮＡを、原核生物または真核生物宿主細胞に、慣用の形質転換またはトランスフェクション技術を介して挿入できる。本明細書で使用する“形質転換”および“トランスフェクション”なる用語は、外来核酸(例えば、ＤＮＡ)を宿主細胞に挿入するための当分野で認識されている種々の技術を言及することを意図し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクション、リポフェクション、または電気泳動を含む。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適当な方法は、Sambrook, et al. (Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、および他の研究室のマニュアルに見ることができる。
【００７５】
培養中の原核生物または真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を使用して、表１または２から選択されるタンパク質を製造(すなわち、発現)できる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を使用して、本発明の表１または２から選択されるタンパク質を製造する方法を提供する。一つの局面において、本方法は、本発明の宿主細胞(その中に、表１または２からのタンパク質をコードする組み換え発現ベクターが挿入されている)を、適当な培地中で、タンパク質が製造されるように培養することを含む。他の態様において、本方法はさらに培地または宿主細胞からタンパク質を単離することを含む。
【００７６】
他の局面において、患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患を診断する方法を提供する。該方法は：
ａ)患者から得た生物学的サンプル中の、表１または２に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを検出し；そして
ｂ)試験生物学的サンプル中の少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルと、同患者から得たまたは他の源(例えば、疾患を有していない対象から得たまたは以前にタンパク質のリン酸化のレベルが決定されている予め確立されたサンプル)から得た正常サンプルにおけるリンタンパク質のリン酸化のレベルを比較し、ここで、正常サンプルのリン酸化のレベルと比較して、試験生物学的サンプルの高いレベルを、患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患の存在の指標とする、
ことを含む。
【００７７】
該診断法において使用するための試験生物学的サンプルおよび正常(コントロール)サンプルの例は、上記の通りである。特に有用な態様において、Ｏｐ１８のセリン２５残基またはセリン３８残基の、および好ましくはＯｐ１８のセリン２５残基のリン酸化のレベルを、当分野で既知の方法により検出する。
【００７８】
さらに別の局面において、患者における異常なＭＡＰキナーゼシグナリング経路により特徴付けられる疾患の進行をモニタリングする方法を提供する。該方法は、患者から得た生物学的サンプル中の、表１または２に示す少なくとも１個のリンタンパク質のリン酸化のレベルを経時的に測定し、ここで、リンタンパク質のリン酸化のレベルの経時的な上昇を患者の同疾患の進行の指標とすることを含む。
【００７９】
下記実施例は、本発明を説明するために提供するが、いかなる方法でもその範囲を限定しない。
【実施例１】
【００８０】
ＨＣＴ１１６細胞融解物を使用した逆２Ｈ−標識
Ａ. 細胞培養および融解物調製
ヒト結腸直腸細胞系ＨＣＴ１１６細胞を、６−ウェルプレートで増殖する。回収前に、細胞を２０μＭのＲａｆ阻害剤ＢＰＭＩおよびＤＭＳＯコントロールで各々１.５時間処置する。次いで、細胞をＰＢＳで濯ぎ、５分、４℃で、１００μg／mL  Perfabloc／２μg／mL  アプロチニン／２μg／mL  ロイペプチン／１ｍＭ  ＮａＶＯ４／１０ｍＭ  ＮａＦを添加したDoriano融解緩衝液中で融解させる。融解物の上清を３,０００rmpで５分遠心分離した後に回収する。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ試薬を使用して測定し、融解物を、さらなる処置および分析の前に−８０℃で凍結する。
【００８１】
１μＬのＲＮａｓｅ  Ａ(２０mg／mL、Sigma, St Louis, MO)および１μＬのＲＮａｓｅ  Ｔ１(１０単位／mL、Invitrogen, Carlsbad, CA)を、各１mLの融解物(各々合計３mgのＨＣＴ１１６−ＤＭＳＯコントロールおよび３mgのＨＣＴ１１６−ＢＰＭＩ)に添加し、３７℃で半時間インキュベートして、ＲＮＡを分解させる。タンパク質を６Ｍ  グアニジン  ＨＣｌを使用して変性させ、続いて、２０ｍＭ  １,４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール(ＤＴＴ)で５８℃で４０分還元し、４０ｍＭ  ヨードアセトアミドで室温で３０分、暗所でアルキル化する。各タンパク質溶液をSlide-A-Lyzer(１０,０００ＭＷカットオフ、Pierce, Rockford, IL)透析カセットに移し、２から０Ｍ尿素／５０ｍＭ  重炭酸アンモニウムに対して透析し、小分子不純物を除去し、緩衝液を５０ｍＭ  重炭酸アンモニウムに変える。タンパク質分解を、修飾した、シークエンシンググレードのトリプシン(Promega, Madison, WI)を使用し、１：２００  トリプシン−対−タンパク質比(ｗｔ：ｗｔ)で、５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム中、３７℃で一晩行う。
【００８２】
ペプチド消化物を、Centricon Filters(１０,０００ＭＷカットオフ、Millipore, Bedford, MA)を通して濾過し、界面活性剤を含む大分子不純物を除去する。貫流物(ペプチド)を回収する。溶媒および重炭酸アンモニウムを、続いてSpeedVac乾燥により除去する。
【００８３】
Ｂ. メチルエステル化および逆標識
ｄ０−またはｄ３−メタノール性ＨＣｌ(２Ｍ)(メチルエステル化試薬)を、１６０μＬのアセチルクロライドを１mLの無水ｄ０−メチルアルコールまたはｄ３−メチル  ｄ−アルコールに、攪拌しながら滴下することにより調製する。１０分後、１mLのメチルエステル化試薬を１.５mgの凍結乾燥したペプチド混合物に添加する。反応を、各サンプルの２つの同じ量で並行して行い、それぞれ、一方はｄ０−試薬を使用し、他方はｄ３−試薬を使用する。反応を室温で３０分進行させる。過剰な試薬をSpeedVac乾燥により除去する。続いて、ペプチド混合物を水で再構成する。逆標識を、ｄ０−コントロールとｄ３−処置したもの(ＢＰＭＩ)およびｄ３−コントロールとｄ０−処置したものを混合することにより達成する。
【００８４】
Ｃ. ＩＭＡＣ
ホスホペプチドの富化を、２.１×３０mm  ＩＭＡＣカラム(POROS 20 MC, Applied Biosystems, Foster City, CA)上で行う。簡単に言うと、カラムを、水、１００ｍＭ  ＥＤＴＡの１Ｍ  ＮａＣｌ溶液、続いて水および１％酢酸で洗浄する。次いで、カラムを１００ｍＭ  ＦｅＣｌ３で活性化させる。SpeedVac乾燥し、１mgの逆標識したメチルエステル化ペプチド混合物(ｄ０およびｄ３由来の各５００μｇ)を、１％酢酸の５０％アセトニトリル／水溶液に溶解し、鉄−活性化ＩＭＡＣカラムにかける。非結合ペプチドを１％酢酸の５０％アセトニトリル／水溶液での洗浄により除去する。結合したホスホペプチドを、２％水酸化アンモニウムの５０％アセトニトリル／水溶液(ｐＨ約９から１０)で溶出する。酢酸を添加して溶離剤を中和し、その後SpeedVac乾燥する。ホスホペプチド混合物を、０.１％ギ酸で再構成し、下記の通りのキャピラリーＬＣ／ＭＳで分析する。
【００８５】
Ｄ. キャピラリーＨＰＬＣ
Swichosマイクロカラム−スイッチングモジュール(LC Packings, San Francisco, CA)を備えたUltimateキャピラリー／ナノＨＰＬＣ系(LC Packings, San Francisco, CA)を分析に使用する。分離を、３００−Åポアサイズの３μｍ  Ｃ１８  固定相(PepMap, LC Packings, San Francisco, CA)を充填した０.１８×１５０mm  キャピラリーカラムで行い、２μＬ／分の流速で操作する。移動相Ａは０.１％(ｖ／ｖ)ギ酸の水溶液および移動相Ｂは０.１％(ｖ／ｖ)ギ酸のアセトニトリル溶液からなる。使用前に、移動相を０.２２μｍ膜フィルター(Millipore, Bedford, MA)で濾過し、操作中、連続的にヘリウムでパージする。２０μＬサンプルループ(LC Packings, San Francisco, CA)を備えたＦＡＭＯＳマイクロオートサンプラーをサンプル注入に使用する。
【００８６】
１００μｇまたは１５０μｇの出発物質からのペプチドを含む１０μＬの各サンプルをＣ１８  トラップカラム(０.３×５mm、LC Packings, San Francisco, CA)にかける。ペプチドを最初に０.１％ギ酸で２０μＬ／分で３分洗浄し、次いで、キャピラリーＬＣカラム上に５％アセトニトリルを２μＬ／分を使用して溶出し、続いて５−４０％Ｂの６０分の応倍により、ペプチドをＬＣカラムからＱｔｏｆ  ＭＳに検出のために溶出させる。
【００８７】
Ｅ. 質量分析法  −  Ｑｔｏｆ  ＭＳ／ＭＳ
ＭＳ分析を、Ｚスプレー注入口を備えたQtof Ultima Global四重極−飛行時間質量分析計(Micromass, UK)で行う。キャピラリーＬＣのＱｔｏｆへのオンライン連結は、電子噴霧得三ターとしての２０μｍ  ｉ.ｄ. 融合シリカキャピラリーを使用した、ナノスプレーインターフェース(Micromass, UK)を介した。ＭＳ／ＭＳ分析のために、データ依存性獲得モード(前駆イオン強度および荷電状態に基づいたＭＳモードからＭＳ／ＭＳモードへの自動切り替え)を使用する。それは、１陽子性モードＭＳサーベイスキャンと、その後の５つの最も多く多重に荷電したイオン上のＭＳ／ＭＳを含む。
【００８８】
データベース検索
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを使用して、ＮＣＢＩｎｒタンパク質データベースを、ＭＡＳＣＯＴプログラム(Matrix Science, UK)を使用して検索する。これらの検索において、１４DaのＧｌｕ、ＡｓｐおよびＣ−末端の静的修飾(static modification)を選択する。Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒのリン酸化を、可変修飾と見なす。実験的ＭＳ／ＭＳスペクトルと、理論的ペプチドペプチドフラグメントのデータベースの比較により、かつ、適当なスコアリングアルゴリズムの使用により、配列だけでなくリン酸化の部位およびリンタンパク質の同一性も指定する情報を含む、最も近いマッチが、データベース検索から同定されることが期待される。すべての報告された配列について、スペクトルを手動で確認する。
【００８９】
安定な同位体標識が、メチルエステル化の時に達成される。メタノールと反応させた一方のサンプルとｄ３−メタノールで反応させた他方のサンプルの異なる標識が、リン酸化変化の情報に関する２つのホスホ−プロフィールの定量的比較を可能にする。
【実施例２】
【００９０】
逆標識法のＲａｆ−阻害剤ＢＰＭＩを使用した細胞試験への適用
細胞融解物を、Ｒａｆ阻害剤であるＢＰＭＩで処置するか、それ無しで処置する。ＤＭＳＯコントロールおよびＲａｆ阻害剤−処置ＨＣＴ１１６細胞融解物を、逆標識形態で処置し、消化し、メチルエステル化する。２個のペプチド混合物(ｄ３−処置と混合したｄ０−コントロール、およびｄ０−処置と混合したｄ３−コントロール、各形５００μｇ)の各々逆標識した１mgをＩＭＡＣで精製する。約３０％の各ＩＭＡＣ富化ホスホペプチド混合物を、次いで、キャピラリーＬＣ／ＭＳを使用して分析する。品質管理目的で、サンプル調製前に０.５％β−カゼインリンタンパク質を各サンプルに添加し、融解物調製、メチルエステル化、ＩＭＡＣ精製およびＬＣ／ＭＳ分析の全工程中、品質管理(ＱＣ)のための内部標準として役立てる。
【００９１】
図１は、本試験のＩＭＡＣ富化ホスホペプチドの逆標識−ＭＳ分析から得たＬＣ／ＭＳクロマトグラムを図説する。予期されるように、β−カゼインホスホペプチドＦＱｐＳＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫ(配列番号＿＿)およびその同位体アナログのメチルエステルに対応するｍ／ｚ  １０８０.５／１０９１.０および７２０.６／７２７.６の二重−および三重−荷電ペプチドイオンが、各サンプルで、すべて１０％偏差以内で軽および重同位体対の間のクロマトグラフピーク高で検出され、ホスホペプチドの各融解物サンプルからの一貫した回収を示唆する。最初のデータ分析は、ホスホペプチドの５００を超える同位体対を示す。これらのほとんどがほぼ同じ強度の二重項であることが判明し、処置したものとコントロールの細胞融解物の間のリン酸化の類似のレベルを示唆するが、１１個のホスホペプチドが、ＢＰＭＩ処置により下方制御される性質である、逆標識パターンを示すことが判明する(表１参照)。配列およびリン酸化の部位をその中の５個で明確にする。
【００９２】
【表１】
2006525962.tif 000004
Ｓ＊、Ｔ＊＝可能なリン酸化部位
【００９３】
ＢＰＭＩ処置によるリン酸化の下方制御が同定されたペプチドの中で、コンセンサス配列がリン酸化部位(ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ)の周りで明白であり、これは、それらが機構ベースの変化であり、結果の明白さに関連することを強く示唆する。図２の挿入図において示すように、薬剤処置細胞で明白に下方制御されることが示された一つのホスホペプチドを、癌タンパク質１８(Sathmin)のセリン２５リン酸化由来であると同定する。先の試験は、Ｏｐ１８のＳｅｒ２５が、Ｒａｆ経路の下流キナーゼであるマイトージェン−活性タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼの腫瘍な基質であることを示す(Marklund et al., J. Biol. Chem., Vol. 268, pp. 15039-15047(1993)参照)。より重要なことに、Ｏｐ１８のＳｅｒ２５リン酸化(ＭＳで測定)およびＭＥＫキナーゼリン酸化(抗ホスホＭＥＫ抗体およびウェスタン・ブロットで測定)の間の良好な量的相関が、いくつかの実験で観察される(データは示していない)。ＭＥＫは、Ｒａｆ経路におけるＲａｆの下流キナーゼである。
【００９４】
ホスホペプチドのカルボキシル基の数は、同位体対の質量の差異にしたがい、容易に計算できる。配列中のこの酸性残基の数の情報は、データベース検索(ＭＳ／ＭＳを使用)からのホスホペプチド配列割り当てのさらなる確認に使用できる。
【実施例３】
【００９５】
Ｒａｆ阻害剤ＢＰＭＩのインビボ試験への逆標識法の適用：腫瘍組織ＤＵ１４５分析
ホスホプロテオームマッピング法を、マウス腫瘍異種移植片の組織融解物における、Ｒａｆ阻害剤であるＢＰＭＩ(１時間処置、２００mg／kg  ｐ.ｏ.)のインビボ試験においてさらに試験／適用する。融解物のトリプシン処理物の直接分析は、組織中の血液に由来するようである、マウス血清アルブミンおよびヘモグロビンからの優勢なシグナルを確認する(図２Ａ参照)。
【００９６】
メチルエステル化／ＩＭＡＣ法は、組織サンプルからの血液汚染物を十分に除去する。図２Ｂに示すように、ＩＭＡＣ富化後の逆標識−ＭＳ分析は、癌タンパク質１８のＳｅｒ２５リン酸化の下方制御を明らかに検出し、細胞試験の発見を確認する。リン酸化のさらなる変化を検出し、それは、癌遺伝子ＥＭＳ１、マウスフェチュインおよび上皮カドヘリンを含む(表２参照)。
【００９７】
【表２】
2006525962.tif 000005
Ｓ＊、Ｔ＊＝可能なリン酸化部位
【００９８】
種々の修飾が、本明細書に記載の態様および／または実施例についてなし得ることは理解されよう。したがって、上記は限定するものと解釈してはならず、単に好ましい態様の例示と解釈すべきである。当業者は、添付の特許請求の範囲の範囲および精神に含まれる他の修飾を構想するであろう。
【実施例４】
【００９９】
Ｒａｆ−阻害剤−処置ＨＣＴ１１６細胞融解物のウェスタン・ブロット分析
ＨＣＴ１１６細胞を、上記実施例１のように調製し、Ｒａｆ阻害剤(ＢＰＭＩ)で１.５時間処置する。細胞をIncomplete Laemmli緩衝液(０.１Ｍ  Ｔｒｉｓ.Ｃｌ  ｐＨ  ７.０、４％ＳＤＳ、１０％グリセロール)に融解し、２５ゲージ針が付いたシリンジを通し、ゲノムＤＮＡを分裂する。融解物を５分沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質を次いでニトロセルロース膜に移す。膜を５％ミルクで１時間ブロックし、Ｓｅｒ２５リン酸化ＯＰ１８に特異的な抗体とさらに１時間インキュベートする。ホスホロ−Ｓｅｒ２５特異的ＯＰ１８抗体は、標準法を使用してウサギで惹起させ、当分野で既知の精製をする。ホスホロ−Ｓｅｒ２５特異的ＯＰ１８抗体の酸性のために使用したアミノ酸配列はＥＬＩＬｐＳＰＲＳＫＥＳＶＰＥＦＰ(配列番号＿)である。ブロットを３回ＴＢＳＴで各１５分洗浄し、次いで、抗−ウサギＨＲＰ−接合抗体と１時間インキュベートする。ブロットを３回ＴＢＳＴで各１５分洗浄し、抗体結合タンパク質を、SuperSignal West Dura Extended Duration基質(Piece Biotechnologies, Rockford, IL)を使用して標識する。リン酸化ＯＰ１８タンパク質を、ブロットをフィルム(Eastman Kodak, Rochester, NY)を通した暴露を介して検出する。
【０１００】
ＨＣＴ１１６細胞のＢＰＭＩでの処理は、Ｓｅｒ２５残基でのＯＰ１８リン酸化の阻害をもたらす(データは示していない)。１０μＭで、ＯＰ１８タンパク質のＳｅｒ２５残基のリン酸化はほとんど見られない。ＨＣＴ１１６細胞におけるＭＡＰＫ経路の阻害に関するＢＰＭＩのＩＣ５０値は５.３μＭである。ＢＰＭＩがＯＰ１８  Ｓｅｒ２５リン酸化を約５μＭのＩＣ５０で阻害するというさらなるデータも提供する。故に、ＭＡＰＫおよびＯＰ１８  Ｓｅｒ２５リン酸化の両方が、ｒａｆ阻害剤の同じレベルの量で阻害されるようである。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】Ｒａｆキナーゼ阻害剤１−(４−ｔ−ブチルアニリノ)−４−［(ピリジン−４−イル)−メチル］−イソキノリン(ＢＰＭＩ)で処置したＨＣＴ１１６細胞融解物の逆標識(Inverse Labeling)−ＭＳ分析。Ｏｐ１８  Ｓｅｒ２５リン酸化の下方制御が、ＢＰＭＩ処置により検出される。
【図２】(Ａ)Ｒａｆキナーゼ阻害剤ＢＰＭＩで処置した腫瘍組織ＤＵ１４５の融解物の直接ＬＣ／ＭＳ分析(＊マウス血清アルブミン；○マウスヘモグロビン)；および(Ｂ)メチルエステル化／ＩＭＡＣ除去血液汚染物；インビボでＯＰ１８  Ｓｅｒ２５リン酸化の下方制御が確認される。
【配列表】
2006525962.tif 000006
2006525962.tif 000007
2006525962.tif 000008
【図１】
2006525962.tif 000009
【図２】
2006525962.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月8日(2005.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006525962000001.app
【国際調査報告】
2006525962.tif 000011
2006525962.tif 000012
2006525962.tif 000013
2006525962.tif 000014
2006525962.tif 000015
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