(57)【要約】本発明は、可溶性エポキドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）インヒビターと血管平滑筋（ＶＳＭ）細胞を接触することによって、ＶＳＭ細胞の増殖を遅延または阻害し、アテローム性動脈硬化の発達または再発を遅延する方法を提供する。さらに、本発明の方法は、血管形成術後血管再狭窄および血管ステントの狭窄を遅延、または阻害するために使用され得る。さらに本発明の方法は、血液透析移植片ならびに他の天然血管移植片および合成血管移植片の狭窄を遅延または阻害するために使用され得る。本発明はさらに、ＶＳＭ細胞増殖を遅延または阻害するための医薬の製造のためのｓＥＨインヒビターの使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体において、血管平滑筋細胞の増殖を阻害するための医薬の製造のための、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターの使用。
【請求項２】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターが、尿素、カルバメートまたはアミドからなる群より選択されるファルマコフォアの誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ファルマコフォアが、アダマンタンおよび１２炭素鎖ドデカンに共有結合する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記インヒビターが、尿素の誘導体である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記尿素の誘導体が、アダマンチルドデシル尿素、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−ドデシル尿素（ＣＤＵ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の異性体からなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターが、脂質アルコキシド、親油性ジイミド、フェニルグリシドール、およびカルコンオキシドからなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記インヒビターが脂質アルコキシドである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記親油性ジイミドが、ジシクロヘキシルカルボジイミドである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記フェニルグリシドールが、Ｓ，Ｓ−４−ニトロフェニルグリシドールである、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記カルコンオキシドが、４−フェニルカルコンオキシドおよび４−フルオロカルコンオキシドからなる群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体において、血管平滑筋細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、該被験体に可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターが、尿素、カルバメートまたはアミドからなる群より選択されるファルマコフォアの誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ファルマコフォアが、アダマンタンおよび１２炭素鎖ドデカンに共有結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インヒビターが、尿素の誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記尿素の誘導体が、アダマンチルドデシル尿素、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−ドデシル尿素（ＣＤＵ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の異性体からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターが、脂質アルコキシド、親油性ジイミド、フェニルグリシドール、およびカルコンオキシドからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記インヒビターが脂質アルコキシドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記親油性ジイミドが、ジシクロヘキシルカルボジイミドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記フェニルグリシドールが、Ｓ，Ｓ−４−ニトロフェニルグリシドールである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記カルコンオキシドが、４−フェニルカルコンオキシドおよび４−フルオロカルコンオキシドからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体が、心臓発作を有する患者である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体が、冠状動脈バイパスを有する患者である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体が、血管形成術を受ける、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体が、動脈管腔にステントを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステントが、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料が、経時的にその周囲に該インヒビターを放出する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料が、シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）をさらに含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体が、血液透析移植片を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記移植片が、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料が、経時的にその周囲に該インヒビターを放出する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料が、シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）をさらに含有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体が、領域の周りで血流を増進するように移植された天然血管および合成血管を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体が、移植された合成血管を有し、該合成血管は、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料が、経時的にその周囲に該インヒビターを放出する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する材料が、シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）をさらに含有する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年１月２３日出願の米国特許出願第１０／０５６，２８４号に対して優先権を主張し、本明細書においてその内容を参考として援用する。
【０００２】
（連邦政府によって援助された研究開発においてなされる、発明の権利に対する陳述）
本発明は、米国国立衛生研究所の国立環境衛生科学研究所によって授与されたＲ３７ＥＳ０２７１０およびＰ４２ＥＳ０４６９９の政府援助によってなされた。政府は、本発明において、特定の権利を有する。
【０００３】
（コンパクトディスクにおいて提出される、「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリストの添付物の参照）
なし。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、血管平滑筋細胞増殖の遅延、または阻害、および結果として生じるアテローム性動脈硬化症の発症の遅延または阻害に関する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
エイコサノイドは、種々の細胞（脈管構造の細胞を含む）において、パラ分泌機能および自己分泌機能の両方を果たす。シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）、すなわち、エイコサノイドの１つのクラスを含むアラキドン酸のエポキシドは、シトクロムＰ−４５０系によって触媒される反応において、アラキドン酸から合成される、４つの位置異性体からなる（Ｃａｐｄｅｖｉｌａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、６：７３１−７３６（１９９２））。これらの化合物は、内皮細胞により合成され、そして動脈血管平滑筋（ＶＳＭ）細胞によって迅速に取り込まれる（Ｆａｎｇら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ、５７：３６７−３７１（１９９７）；Ｆａｎｇら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７９：７８４−７９３（１９９６）；Ｒｏｓｏｌｏｗｓｋｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２９９：２６７−２７７（１９９６））。
【０００６】
エポキシドヒドロキシラーゼは、広範に定義され、エポキシドを水の添加によってジオールに変換する酵素である（Ｆｒｅｔｌａｎｄら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０００年１２月１日；１２９（１−２）：４１．−５９．、１２９：４１−５９（２０００））。これらの酵素は、変異原性の生体異物の分解および解毒におけるその役割の見地において、広範に研究されているが、少なくとも、可溶性エポキシドヒドロラーゼはまた、ＥＥＴのジオールへの分解を触媒する能力に起因して、ＥＥＴレベルの制御において重要である（Ｃｈａｃｏｓら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２２３：６３９−６４８（１９８３））。ｓＥＨ活性の薬理学的な減少は、ＥＥＴレベルの二次的な増加を生じる（Ｙｕら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．；８７：９９２−９９８（２０００））。
【０００７】
種々のＥＥＴ位置異性体が種々の血管床において血管拡張または血管収縮のいずれかを生じること（Ｋａｔｏｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６１：Ｆ５７８−Ｆ５８６（１９９１）；Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６７：９７７−９８１（１９９０）；Ｉｍｉｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、７：２３６４−２３７０（１９９６））、そしてこれらが抗炎症特性を有すること（Ｎｏｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１２７６−１２７９（１９９９））が、研究によって確立されている。可溶性エポキシドヒドロラーゼの１つのインヒビターであるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｕｒｅａ）（ＤＣＵ）が自然発症高血圧ラットにおいて全身の血圧を低下させることが、示された（Ｙｕら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．；８７：９９２−９９８（２０００）；自然発症高血圧ラットは、通常の食餌および運動状態下であっても、高血圧であるように特に飼育されたラットの系統である）。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症は、心臓発作および脳卒中の主要な原因であり、合衆国、欧州および日本における全死亡率の５０％程度の原因である（Ｒｏｓｓ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ３６２：８０１−９（１９９３））。これは、内皮細胞および血管平滑筋（ＶＳＭ）による、炎症応答および増殖応答によって生じる。大多数の増殖因子、サイトカイン、および脈管調節因子が、このプロセスに関与すると考えられている（Ｒｏｓｓ、上記）。例えば、Ｌａｕｆｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：２１９２６−３１（１９９９））は、ＶＳＭ細胞の増殖が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼインヒビターによって減少することを見出した（おそらく、ＶＳＭ細胞ＤＮＡ合成の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）調節の阻害による）。
【０００９】
血管平滑筋細胞の増殖を減少または遅延するさらなる方法を有することは、有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な要約）
本発明は、血管平滑筋細胞の増殖を阻害する必要のある被験体において、血管平滑筋細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、被験体に対して、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）のインヒビターを投与する工程を包含する。特に、この方法は、インヒビターを投与する工程を包含し、ここでこの可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターは、尿素、カルバメート、またはアミドからなる群から選択されるファルマコフォアの誘導体である。好ましい実施形態の１つの群において、ファルマコフォアは、アダマンタンに対して、および１２炭素鎖ドデカンに対して共有結合する。１組の好ましい実施形態において、インヒビターは、尿素の誘導体である。この組の特定の好ましい実施形態において、尿素の誘導体は、アダマンチル（ａｄａｍａｎｔｙｌ）ドデシル尿素、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−ドデシル尿素（ＣＤＵ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の異性体からなる群から選択される。
【００１１】
別の組の実施形態において、インヒビターは、脂質アルコキシド、親油性ジイミド、フェニルグリシドール、およびカルコンオキシドからなる群から選択される。１組の好ましい実施形態において、インヒビターは、脂質アルコキシドである。この群の特定の好ましい実施形態において、脂質アルコキシドは、オレイン酸、リノール酸、またはアラキドン酸の、メチル、エチル、またはプロピルアルコキシドである。親油性ジイミドに関して、ジシクロヘキシルカルボジイミドが、好ましい。フェニルグリシドールに関して、ＳＳ−４−ニトロフェニルグリシドールが、好ましい。カルコンオキシドに関して、４−フェニルカルコンオキシド、および４−フルオロカルコンオキシドが好ましい。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態において、ｓＥＨインヒビターの投与を必要とする被験体は、心臓発作を有する人、冠血管バイパスを有する人、血管形成術を受ける人、または血管の管腔内にステント移植片を有する人である。動脈または静脈の管腔内にステントの移植片を有する人における実施形態において、ステントが可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する物質を含む場合が、好ましい。特定の好ましい実施形態において、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する物質は、そのインヒビターを、時間をかけて、その周囲に放出する。可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する物質は、さらにシス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を含むことが、さらに好ましい。
【００１３】
さらに好ましい実施形態において、ｓＥＨインヒビターの投与を必要とする被験体は、血液透析移植片を有する。移植片は、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する物質を含み得る。いくつかの実施形態において、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する物質は、そのインヒビターを、時間をかけて、物質の周囲に放出する。いくつかの好ましい実施形態において、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含む物質は、シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）をさらに含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、ｓＥＨインヒビターの投与を必要とする被験体は、領域周辺の血流を増強するために移植された、天然または合成の血管を有する。合成血管の移植片に関連する好ましい実施形態において、合成血管は、可溶性エポキシドヒドロラーゼのインヒビターを含有する物質を含み、そしてさらに好ましい実施形態において、その物質は、そのインヒビターを、時間をかけて、物質の周囲に放出する。その物質は、シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）をさらに含み得る。
【００１５】
（定義）
シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）は、シトクロムＰ４５０エポキシゲナーゼによって合成されるバイオメディエーターである。
【００１６】
エポキシドヒドロラーゼ（「ＥＨ；」ＥＣ  ３．３．２．３）は、エポキシドと称される三員環環状エーテルに水を添加する、αβヒドロラーゼフォールドファミリー中の酵素である。可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）は、内皮細胞および平滑筋細胞において、ＥＥＴを、ジヒドロキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴ）と呼ばれるジヒドロキシ誘導体に変換する酵素である。マウスｓＥＨのクローニングおよび配列決定が、Ｇｒａｎｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２３）：１７６２８−１７６３３（１９９３））において示されている。ヒトｓＥＨ配列の、クローニング、配列、およびアクセッション番号は、Ｂｅｅｔｈａｍら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０５（１）：１９７−２０１（１９９３））に示されている。この遺伝子の進化および命名法が、Ｂｅｅｔｈａｍら（ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４（１）：６１−７１（１９９５））において、考察されている。他に特定しない限り、本明細書において使用する場合、用語「可溶性エポキシドヒドロラーゼ」、および「ｓＥＨ」とは、ヒトｓＥＨをいう。
【００１７】
他に特定しない限り、本明細書において使用する場合、用語「インヒビター」とは、ヒトｓＥＨのインヒビターをいう。
【００１８】
（詳細な説明）
（序論）
驚くべきことに、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（「ｓＥＨ」）のインヒビターが、血管平滑筋（ＶＳＭ）細胞の増殖を阻害することが見出された。ｓＥＨインヒビターは、以前には、高血圧を減少させ、そして炎症を阻害することが見出されていたが、細胞増殖に対して公知の効果なしに、または明らかな効果なしに、高血圧を減少させるか、または炎症を減少させる大多数の薬剤が存在する。従って、ｓＥＨインヒビターが細胞増殖に対して効果を有すること、あるいは、効果を有する場合には、その効果が細胞増殖を促進するのかまたは阻害するのかを予測する理由は、存在しない。本発明を生じた研究は、ｓＥＨの阻害が、シス−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）のレベルを上昇させることを実証した。理論に拘束されることは望まないが、以下の研究は、このＥＥＴレベルの上昇は、ＶＳＭ細胞の細胞周期を妨げ、それによって細胞増殖を阻害することを示唆する。
【００１９】
可溶性エポキシドヒドロラーゼは、げっ歯類とヒトとの間で９０％を越える相同性を有する、単一の高度に保存された遺伝子産物を表す（Ａｒａｎｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３３８：２５１−２５６（１９９４））。実施例において報告される研究は、例示的なｓＥＨインヒビターである１−シクロヘキシル−３−ドデシル尿素（ＣＤＵ；この化合物はまた、Ｎ−シクロヘキシル、Ｎ’−ドデシル尿素としてもまた、記載され得る）が、顕著な細胞毒性なしに、ＶＳＭ細胞の増殖を阻害し、そしてＶＳＭ細胞特異的であることを実証する。ＶＳＭ細胞増殖は、アテローム性動脈硬化症の病態生理中の不可欠なプロセスであるので、これらの知見により、この化合物は、アテローム性動脈硬化症の遅延または阻害に適切である。ｓＥＨ酵素は、種々の尿素、カルバメート、およびアミド誘導体によって、インビトロで、選択的に、そして競合的に阻害され得る（Ｍｏｒｉｓｓｅａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９６：８８４９−８８５４（１９９９））。尿素、カルバメート、またはアミドファルマコフォア（本明細書において使用する場合、「ファルマコフォア」とは、ｓＥＨに結合するリガンドの構造の部分をいう）がアダマンタンおよび１２炭素鎖ドデカンの両方に共有結合する誘導体が、ｓＥＨインヒビターとして特に有用であることが見出されている。代謝的安定な誘導体が好ましい。なぜなら、それらは、インビボにおいてより大きな活性を有することが予測されるからである。Ｎ−アダマンチル（ａｄａｍａｎｔｙｌ）−Ｎ’−ドデシル尿素（「ＡＤＵ」）は、代謝的に安定であり、かつｓＥＨに対して特に高い活性を有する。（１−アダマンチル尿素、および２−アダマンチル尿素の両方を試験し、そしてｓＥＨのインヒビターとして、ほぼ同じ高い活性を有する）従って、アダマンチルドデシル尿素の異性体が、最も好ましいインヒビターである。
【００２０】
米国特許第５，９５５，４９６号（’４９６号特許）は、本発明の方法における使用のための、多数の適切なエポキシドヒドロラーゼインヒビターを示す。インヒビターの１つのカテゴリーとして、酵素の基質を模倣するインヒビターが挙げられる。脂質アルコキシド（例えば、ステアリン酸の９−メトキシド）は、この群のインヒビターの典型である。数十以上の脂質アルコキシド（オレイン酸（ステアリン酸アルコキシドとしてもまた公知）、リノール酸、およびアラキドン酸の、メチル、エチル、およびプロピルアルコキシドを含む）が、’４９６特許の出願以後、ｓＥＨインヒビターとして試験され、その全てがｓＥＨのインヒビターとして作用することが、見出された。
【００２１】
実施形態の別の群において、’４９６特許は、よりゆっくりと代謝される、酵素の代替的な基質を提供するｓＥＨインヒビターを示す。インヒビターのこのカテゴリーの例は、フェニルグリシドール（例えば、Ｓ，Ｓ−４−ニトロフェニルグリシドール）、およびカルコンオキシドである。’４９６特許は、適切なおよびカルコンオキシドとして４−フェニルカルコンオキシド、および４−フルオロカルコンオキシドが挙げられることを示している。フェニルグリシドールおよびカルコンオキシドは、安定なアシル酵素を形成すると考えられる。
【００２２】
尿素の誘導体は、ｓＥＨインヒビターの好ましい群を形成する、遷移状態模倣物である。この群の中において、ＤＣＵは、インヒビターとして特に好ましいが、ＣＤＵが、最も好ましい。いくつかの化合物（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（親油性ジイミド））は、ＤＣＵのような活性な尿素インヒビターに分解され得る。任意の特定の尿素誘導体または他の化合物を、標準的なアッセイ（例えば、本明細書の実施例において使用されるアッセイ）によって、そのｓＥＨを阻害する能力について、容易に試験し得る。
【００２３】
示されるように、カルコンオキシドは、酵素の代替的な基質として役立つ。本発明者らの研究は、カルコンオキシドが特定の構造に部分的に依存する半減期を有することを見出したが、群としては、カルコンオキシドは、比較的短い半減期を有する傾向がある（薬物の半減期は、通常、その薬物の濃度が、その最初の値の半分に低下する時間として規定される。Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：序論、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．（Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ，２０００）を参照のこと）。本発明の使用は、数日、数週間、または数ヶ月において測定され得る時間にわたるｓＥＨの阻害を意図するので、カルコンオキシド、および臨床医が好ましいと考えるよりも持続時間が短い半減期を有する任意の他のインヒビターが、ある期間にわたって薬剤の高い局所濃度を提供する適用において、好ましく使用される。例えば、インヒビターは、ある期間にわたってインヒビターを放出する物質において、提供され得る。ある期間にわたってインヒビターの高い局所濃度を可能にする投与方法が、以下に、より詳細に考察され、そして、短い半減期を有するインヒビターとともに用いるようには限定されないが、比較的短い半減期を有するインヒビターについて、これらは、好ましい投与方法である。
【００２４】
ＣＤＵの結果を鑑みて、Ｎ，Ｎ’−ドデシル−シクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）、およびｓＥＨの他のインヒビター、特に尿素のドデシル誘導体が、同様に、顕著な細胞毒性なしに、ＶＳＭ細胞増殖を阻害することが予想される。標準的なアッセイ（例えば、以下の実施例に示されるアッセイ）によって、任意の特定のインヒビターを試験して、インヒビターが被験体において使用できないほど、細胞に対して毒性を有するか否かを決定し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ｓＥＨ阻害は、ｓＥＨの量の減少を含み得る。従って、本明細書において使用する場合、ｓＥＨインヒビターは、ｓＥＨをコードする遺伝子の発現を阻害する核酸を包含し得る。
【００２６】
示されるように、ｓＥＨのインヒビターを使用して、ＶＳＭ細胞の増殖を阻害し得るか、または遅延し得る。そのような阻害は、アテローム性動脈硬化症のリスクを有する人（例えば、心臓発作を有した個体、または試験結果が、心臓への減少した血液循環を示した個体）の場合に有用である。
【００２７】
再狭窄は、最初の成功した血管形成または他の経皮介入後に血管が狭くなることであり、そして典型的には、血管壁に対する傷害によって生じる細胞増殖によって、生じる。典型的には、３〜６カ月内に、再狭窄は、患者の約４０〜５０％におい生じ、その割合は、血管形成術の部位での、罹患した血管の内壁上へのステントの配置によって、若干減少され得る。本発明の方法は、経皮介入を有した患者（例えば、狭くなった動脈を、再度開くため、あるいは再狭窄によって再度開いた通路が狭くなることを、減少させるか、または遅延させるための血管形成術）のために特に有用である。いくつかの実施形態において、動脈は、冠状動脈である。
【００２８】
血管形成術および他の経皮介入は、しばしば、血管内（ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ）ステントを配置して、血管を機械的に支持することによって、達成される。しかし、ステントの再狭窄は、第２の血管形成術または他の介入をしばしば必要とする、一般的な問題である。
【００２９】
再狭窄を減少する試みにおいて、種々のアプローチが用いられ、成功しているものも、そうでないものもある。例えば、ほぼ１１，５００人が、再狭窄を防ぐための薬物であるトラニラスト（ｔｒａｎｉｌａｓｔ）を使用する近年の臨床試験に登録した。登録者は、その薬物またはプラシーボの４つの投薬レジメンのいずれか１つを受けた。２００１年１２月に報告された結果は、処置レジメンのいずれかと、プラシーボ処置群との間で、再狭窄患者の割合に、差を示さなかった。別のアプローチにおいて、「近接照射療法」として公知の、γ線照射またはβ線照射を、再狭窄を減少するために、血管形成術またはステントの直近領域に導入する。例えば、Ｃｏｒｄｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マイアミ、ＦＬ）は、その「Ｃｈｅｃｋｍａｔｅ（登録商標）」γ供給源システムを用いて、ステント内の再狭窄の減少に成功したと、報告した。新たなステントは、照射処置の間に移植することはできないが、しかし、原子力規制委員会は、その手順の間、照射腫瘍専門医および物理学者の両方が同席することを必要としている。
【００３０】
ステントの再狭窄を減少することにおいて成功していると思われる、さらなるアプローチは、長時間にわたり放出される薬剤でステントをコートして、凝固またはステント封鎖の他の原因を減少することである。シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ラパマイシン、またはパクリタキセルでコートしたステントが、現在、ヒトでの試行中であり、統計学的に顕著な差異が、薬物を溶出するステントを用いて処置したヒトと、薬物を溶出しないステント（いわゆる、「裸の」ステント）で処置したヒトとの間で、再狭窄の発生において見られた。典型的には、薬物は、血管に適合性のポリマー中に包埋され、このことによって、ステントの長さにわたって、薬剤の予測可能な放出および制御された放出を可能にする。
【００３１】
移植可能な医療デバイス（例えば、ステント）のためのポリマー組成物、および制御された放出のためにポリマー中に薬剤を包埋する方法が、当該分野において公知であり、例えば、以下において教示される；米国特許第６，３３５，０２９号；同第６，３２２，８４７号；同第６，２９９，６０４号；同第６，２９０，７２２号；同第６，２８７，２８５号；および同第５，６３７，１１３号。ｓＥＨのインヒビターを、ステント上の、そのようなポリマー性コーティング中に配置して、制御された、局所的な放出を提供して、再狭窄を減少する。好ましい実施形態において、コーティングは、インヒビターをある期間にわたって放出し、好ましくは、数日間、数週間、または数ヶ月間にわたって放出する。選択される特定のポリマーまたは他のコーティングは、本発明の重要な部分ではない。
【００３２】
本発明の方法はまた、血管移植片の狭窄または再狭窄を遅延または阻害において有用である。そのような移植片は、典型的には、２つのタイプがある。第１に、バイパス外科手術または他の血管外科手術の過程において、１つ以上の患者静脈の部分が、しばしば、切り出され、そして所望の部位に移植され、閉塞領域中において、血流を増強する。この手順は、冠状動脈の場合において特に使用され、冠状バイパスとして公知である。血管移植片の狭窄を遅延または阻害することは、移植された血管が、増強された血管供給を続ける期間を延長すること、および、さらなる外科手術介入の必要を遅らせることにおいて、有用である。第２に、ＧｏｒｅＴｅｘ（登録商標）、プラスチック、または他の合成物質が、血管を付着する。例えば、腎不全を有する患者は、典型的には、血液透析の間の使用のために、動脈および静脈に付着した、合成の移植片が、提供される。血液透析移植片の狭窄は、移植が失敗する主要な原因であると考えられ、そしてＶＳＭ細胞増殖は、これら移植片の狭窄に寄与すると考えられる。約３００，０００万人のアメリカ人が、現在、血液透析を受け、そして血管へのアクセスの失敗が、これら患者の入院の主要な原因である。本発明の方法は、天然の血管移植片、および合成の血管移植片の狭窄の遅延または阻害において、有用である。ステントに関して上述したように、望ましくは、合成の血管移植片は、ｓＥＨインヒビターを長時間にわたって放出して、ＶＳＭ増殖、および移植片の結果としての狭窄を遅延または阻害する物質を含む。血液透析移植片は、特に好ましい実施形態である。
【００３３】
これらの使用に加えて、本発明の方法を使用して、心臓発作を有した患者の、または試験結果によって心臓発作のリスクを有することが示された患者の、血管の狭窄または再狭窄を遅延または阻害し得る。
【００３４】
好ましい実施形態の１つの群において、ｓＥＨインヒビターが投与され、高血圧を有さない患者中のＶＳＭ細胞の増殖を減少する。実施形態の別の群において、ｓＥＨインヒビターを使用して、高血圧について処置される患者中のＶＳＭ細胞の増殖を減少するが、ｓＥＨインヒビターではない薬剤をも用いる。
【００３５】
実施例において示されるように、ｓＥＨインヒビターは、細胞周期の部分を妨げる。従って、ｓＥＨインヒビターを使用して、不適切な細胞周期制御を示す細胞の増殖を妨げることができる。実施形態の１つの重要な組において、細胞は、ガン細胞である。そのような細胞をｓＥＨインヒビターと接触させることによって、そのような細胞の増殖を、遅延または阻害し得る。ｓＥＨインヒビターが任意の特定の型のガンの細胞の増殖を遅延するか否か、または阻害するか否かの決定は、当該分野において慣用的なアッセイ（実施例において教示されるものを含む）を使用して決定され得る。
【００３６】
ｓＥＨインヒビターの使用に加えて、ＥＥＴのレベルを、ＥＥＴを添加することによって、上昇し得る。本発明の過程において行われた研究において、ＥＥＴおよびｓＥＨインヒビターの両方に接触したＶＳＭ細胞がＥＥＴ単独またはｓＥＨインヒビター単独のいずれかに曝露された細胞よりも遅い増殖を示すことが、見出された。従って、所望される場合、ｓＥＨインヒビターによるＶＳＭ細胞の遅延または阻害は、ｓＥＨインヒビターにＥＥＴを添加することによって、増強され得る。ステントまたは血管移植片の場合、例えば、このことは、ｓＥＨインヒビターとともに、ＥＥＴをコーティング中に包埋し、その結果、ステントまたは移植片が一旦配置されると、両者が放出されることによって、都合よく達成され得る。
【００３７】
（エポキシドヒドロラーゼ活性についてのアッセイ）
エポキシドヒドロラーゼ活性を決定するための任意の多くの標準的なアッセイは、ｓＥＨの阻害を決定するために使用され得る。例えば、適切なアッセイは、Ｇｉｌｌら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３１，２７３−２８２（１９８３）；およびＢｏｒｈａｎら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３１，１８８−２００（１９９５）に記載される。適切なインビトロアッセイは、Ｚｅｌｄｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６４０２−６４０７（１９９３）に記載される。適切なインビボアッセイは、Ｚｅｌｄｉｎら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３３０：８７−９６（１９９６）に記載される。推定の天然の基質および代理基質の両方を使用するエポキシドヒドロラーゼについてのアッセイは、概説されている（Ｈａｍｍｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩＩ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ，（Ｌａｗ，Ｊ．Ｈ．およびＨ．Ｃ．Ｒｉｌｌｉｎｇ編、１９８５），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ．，ｐｐ．３０３−３１１およびＷｉｘｔｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，（Ｚａｋｉｍ，Ｄ．およびＤ．Ａ．Ｖｅｓｓｅｙ編、１９８５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−９３を参照のこと）。得られたジオール産物の水素結合への反応性または傾向に基づいて、いくつかのスペクトルに基づくアッセイが存在する（例えば、Ｗｉｘｔｒｏｍ（上記）、およびＨａｍｍｏｃｋ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：２９１−２９９（１９８５）およびＤｉｅｔｚｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：１７６−１８７（１９９４）を参照のこと）。
【００３８】
酵素はまた、酵素を固定するかまたはプローブ（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または他の試薬）で標識する、触媒部位への特異的リガンドの結合に基づいて、検出され得る。酵素は、ＥＥＴのその水和、Ｄｉｅｔｚｅら（１９９４）によって記載されるような着色した産物を与えるためのエポキシドのその加水分解、または放射性代理基質のその加水分解（Ｂｏｒｈａｎら、１９９５、上記）によってアッセイされ得る。
【００３９】
アッセイは、患者由来の適切なサンプルを使用して実施される。代表的には、このようなサンプルは、血液サンプルである。
【００４０】
（ｓＥＨ活性を阻害する他の手段）
ｓＥＨ活性または遺伝子発現を阻害する他の手段はまた、本発明の方法において使用され得る。例えば、ヒトｓＥＨ遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸分子は、ｓＥＨ遺伝子発現を阻害するために使用され得る。例えば、アンチセンス分子、リボザイムなどを使用して遺伝子発現を阻害するための手段は、当業者に周知である。核酸分子は、ＤＮＡプローブ、リボプローブ、ペプチド核酸プローブ、ホスホロチオエートプローブ、または２’−Ｏメチルプローブであり得る。
【００４１】
一般的に、特定のハイブリダイゼーションを確実にするために、アンチセンス配列は、標的配列に実質的に相補的である。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、標的配列に対して正確に相補的である。しかし、アンチセンスポリヌクレオチドはまた、ｓＥＨ遺伝子に対応する関連する標的配列に対する特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失、転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、または改変、あるいは、他の核酸配列または非核酸部分を含み得る。１つの実施形態として、アンチセンス分子は、三重らせん含有、または「トリプレックス」核酸を形成する。三重らせん形成は、例えば、標的遺伝子の転写を妨げることによって、遺伝子発現の阻害を生じる（例えば、Ｃｈｅｎｇら、１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１１０；ＦｅｒｒｉｎおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５４：１４９４；Ｒａｍｄａｓら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７３９５；Ｓｔｒｏｂｅｌら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６３９；ならびにＲｉｇａｓら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９１を参照のこと）。別の実施形態において、リボザイムが使用され得る（例えば、Ｃｅｃｈ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３２３；ならびにＥｄｇｉｎｇｔｏｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２５６およびＨｕら、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９４／０３５９６を参照のこと）。
【００４２】
アンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変、アナログなど）は、核酸を作製するための任意の適切な方法（例えば、本明細書中に開示され、そして当業者に公知である化学合成および組換え方法）を使用して作製され得る。１つの実施形態において、例えば、本発明のアンチセンスＲＮＡ分子は、新規の化学合成によって、またはクローニングによって調製され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡは、ベクター（例えば、プラスミド）中のプロモーターに作動可能に連結される逆方向でＥＨ遺伝子配列を挿入（連結）することによって作製され得る。プロモーターおよび好ましくは終結およびポリアデニル化シグナルが、適切に位置付けられる場合、非コード鎖に対応する挿入配列の鎖は、転写され、そして本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する。
【００４３】
オリゴヌクレオチドが非標準的な塩基（例えば、アデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジン以外のもの）または非標準骨格構造を使用して作製されて、所望の特性（例えば、増加したヌクレアーゼ耐性、より密接な結合、安定性または所望のＴｍ）を提供し得ることが理解される。オリゴヌクレオチドヌクレアーゼ耐性を与えるための技術としては、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１２６３３に記載されるものが挙げられる。幅広い種々の有用な改変されたオリゴヌクレオチドが作製され得、これには、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７）を有するオリゴヌクレオチド、または２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホトリエステルヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ホスホラミデートを組み込むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４４】
細胞膜を横切って所望の核酸をトランスロケーションする能力を有するタンパク質が記載されている。代表的には、このようなタンパク質は、膜−トランスロケーティングキャリアとして作用する能力を有する両親媒性サブ配列または疎水性サブ配列を有する。例えば、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切ってトランスロケートする能力を有する。ホメオドメインタンパク質（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）の最も短いインターナライズ可能なペプチドは、アミノ酸位置４３〜５８から、タンパク質の第３の螺旋であることが見出された（例えば、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：６２９−６３４を参照のこと）。別のサブ配列（シグナルペプチドのｈ（疎水性）ドメイン）は、類似の細胞膜トランスロケーション特性を有することが見出された（例えば、Ｌｉｎら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５−１４２５８を参照のこと）。このようなサブ配列は、細胞膜を横切ってオリゴヌクレオチドをトランスロケートさせるために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、このような配列で簡便に誘導体化され得る。例えば、リンカーは、オリゴヌクレオチドおよびトランスロケーション配列を連結するために使用され得る。任意の適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカーまたは任意の他の適切な化学リンカー）が使用され得る。
【００４５】
（治療投与）
ｓＥＨのインヒビターは、幅広い種々の経口投薬形態、非経口投薬形態および局所投薬形態で調製され得、そして投与され得る。好ましい形態において、本発明の方法における使用のための化合物は、注射、すなわち、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内、または腹腔内で投与され得る。ｓＥＨインヒビターはまた、吸入（例えば、鼻腔内）によって投与され得る。さらに、ｓＥＨインヒビターは、経皮的に投与され得る。従って、本発明の方法は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤、および選択されたインヒビターまたはそのインヒビターの薬学的に受容可能な塩を含む薬学的組成物の投与を可能にする。
【００４６】
ｓＥＨインヒビターから薬学的組成物を調製するために、薬学的に受容可能なキャリアは、固体または液体にいずれかであり得る。固体形態の調製物としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散可能な顆粒が挙げられる。固体キャリアはまた、希釈剤、興味矯臭剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料として作用し得る１つ以上の物質であり得る。
【００４７】
散剤において、キャリアは、微細に分割された固体であり、これは、微細に分割された活性成分を伴う混合物である。錠剤において、活性成分は、適切な割合で必要な結合特性を有するキャリアと混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。散剤および錠剤は、好ましくは、５％または１０％〜７０％の活性化合物を含む。適切なキャリアは、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。用語「調製物」は、カプセル（ここで、他のキャリアを伴うかまたは伴わない活性成分が、キャリアによって取り囲まれる（従って、このキャリアは、活性成分と関連する））を提供する、キャリアとしてのカプセル化材料を伴う活性化合物の処方物を含むことを意図する。同様に、カシェ剤およびロゼンジが含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびロゼンジは、経口投与に適切な固体投薬形態として使用され得る。
【００４８】
坐剤を調製するために、低融点ワックス（例えば、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物）が最初に融解し、攪拌することによって、活性成分がそこに均一に分散される。次いで、溶融した均一な混合物は、都合のよいサイズにされた型に注がれ、冷却され、それによって固化される。
【００４９】
液体形態調製物としては、溶液、懸濁液、および乳濁液（例えば、水または水／プロピレングリコール溶液）が挙げられる。非経口注射のために、液体調製物が、水性ポリエチレングリコール溶液中に溶液で処方され得る。
【００５０】
経口用途に適切な水溶液は、活性成分を水に溶解し、所望であれば、適切な着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、および濃化剤を添加することによって調製され得る。経口用途に適切な水性懸濁液は、水中に微細に分割された活性成分を粘性材料（例えば、天然または合成のガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の周知の懸濁剤）で分散することによって作製され得る。
【００５１】
使用直前に、経口投与のための液体形態処方物に転換されることが意図される固体形態調製物もまた含まれる。このような液体形態は、溶液、懸濁液および乳濁液を含む。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、緩衝剤、人工甘味剤および天然甘味剤、分散剤、濃化剤、可溶化剤などを含み得る。
【００５２】
薬学的調製物は、好ましくは、単位投薬形態である。このような形態において、その調製物は、活性成分の適切な量を含む単位用量にさらに分割される。その単位投薬形態は、包装された調製物であり得、その包装物は、別個の量の調製物（例えば、包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルもしくはアンプル中の散剤）を含む。また、単位投薬形態は、カプセル剤、錠剤、カシェ、またはロゼンジ自体であり得るか、または包装された形態にあるこれらのいずれかの適切な数であり得る。
【００５３】
用語「単位投薬形態」とは、本明細書中で使用される場合、ヒト被験体および動物のための単位投薬量として適切な、物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要な薬学的希釈剤、キャリアもしくはビヒクルと会合して、所望の薬学的効果をもたらすように計算された活性物質の所定の量を含む。本明細書は、本発明の新規な単位投薬形態について、本明細書中に詳細に開示されるように、本発明の特徴である（ａ）活性物質の特有の特徴、および達成される特定の効果、ならびに（ｂ）ヒトおよび動物において使用するためのそのような活性成分を調合することに関する当該分野で固有の制限、によって必然的に決められ、これらに直接依存する。
【００５４】
ｓＥＨインヒビターの治療的有効量は、ＶＳＭ細胞増殖を遅延または阻害することにおいて使用される。処置のための特定の化合物の投薬量は、当業者に周知の多くの要因に依存する。それらには、例えば、投与経路および特定の化合物の有効性が挙げられる。例示的な用量は、哺乳動物の体重１ｋｇあたり、約０．００１μＭ〜約１００ｍｇである。しかし、いくつかの用途において、例えば、そのインヒビターが、ポリマーコーティングステントに埋め込まれるかまたは複合体化され、ステント被覆から放出される場合、非常に低い全身濃度を維持しながら、有効な局所的濃度のインヒビターが、ステントの領域において達成されることに注目すべきである。さらに詳述することなく、当業者は、前述の説明を利用して、その最大限の程度まで本発明を実施し得ると考えられる。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、例示するために提供されるのであって、本願発明を限定するために提供されるのではない。
【００５６】
（実施例１）
この実施例は、本明細書中に報告される研究において使用される材料および方法を記載する。
【００５７】
（材料）
ヒト組換え血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）−ＢＢを、ＵＢＩ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から得た。マウスモノクローナルサイクリンＤ１抗体、ウサギポリクローナルサイクリンＥ抗体、およびサイクリンＡ抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た。ホスホ−ＭＡＰＫ抗体を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から得た。抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ＩｇＧを、ＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から得た。メチル−ＥＥＴを、アラキドン酸メチルエステルのメタクロロペルオキシ安息香酸による過酸酸化により合成し（Ｇｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８９：９６５−９７１（１９７９））、次いで、希塩基中で遊離酸へ加水分解した。化合物を、オープンカラムと高速液体クロマトグラフィーとの組み合わせにより精製した。構造割り当てを、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲにより支持し、純度および構造を、ＧＬＣ−ＭＳにより評価し（Ｆａｌｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８７：３５７−３６４（１９９０））、このことにより、ほぼ等量の８，９、１０，１１、および１４，１５の位置異性体が示された（５，６−ＥＥＴは、メチルエステルの加水分解の間に破壊された）。適切なアミンとイソシアネートとの反応、続いて再結晶化（Ｎｅｗｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，９２５：２２３−２４０（２００１））により、ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳにより支持される構造を有すると記載されるインヒビターを調製した。増強化学発光システムおよび［３Ｈ］チミジンのための試薬を、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から得た。全ての他の試薬を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【００５８】
（細胞培養）
継代３のヒト大動脈平滑筋細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）から得、ＭＣＢＤ１３１培地（２．５％  ＦＢＳ、５ｍｇ／Ｌ  ウシインスリン、２μｇ／Ｌ  ヒト組換えＥＧＦ、１μｇ／Ｌ  ヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（「ＰＤＧＦ」は、血小板由来増殖因子であり、これは、２つの鎖、すなわちＡ鎖とＢ鎖のダイマーから構成され、「ＰＤＧＦ−ＢＢ」は、２つのＢ鎖の２４．３ｋＤのホモダイマーである）、１００ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００ｕ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および２．５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを補充した）中で維持した。この細胞を、ＭＣＤＢ１３１培地（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、５０Ｕ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および２．５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを補充した）を含む休止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）培地中に入れることによって増殖停止した。この休止培地を、各実験の前に１〜２日間、毎日交換した。ＨＬ−６０細胞を、ＡＴＣＣからまたはＤ．Ｈｙｄｅ（ＵＣ  Ｄａｖｉｓ）から得た。ＨＬ−６０細胞を、２×１０５〜８×１０５細胞／ｍＬの間の細胞密度にて、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）（１０％  ウシ胎仔血清を補充した）中で培養した。
【００５９】
（増殖アッセイ）
［３Ｈ］チミジンの取り込みアッセイを行った。懸濁細胞の増殖を評価するために、細胞を、培養培地中で２×１０５細胞／ｍＬに再懸濁し、培地に、目的の化合物または対応するビヒクルを補充した。示される時間で、細胞密度を、光学顕微鏡および血球計算板を使用して評価した。接着性細胞の増殖を直接評価するために、２×１０４細胞を３５ｍｍ培養ディッシュにプレートし、一晩接着させた。次いで、その培地に、目的の化合物または対応するビヒクルを補充した。示される時間で、プレート中の細胞数を、細胞をトリプシン処理に供することにより計算し、細胞密度を、血球計算板を使用して光学顕微鏡により定量した。
【００６０】
（ウェスタンブロット）
示される時間の間に適切な化合物で処理した後、細胞を溶解し、タンパク質濃度をＬｏｗｒｙ法によって決定し、等量のタンパク質を電気泳動し、ウェスタンブロットした。
【００６１】
（核形態の評価）
細胞を、３５ｍｍ培養ディッシュに播種し、記載のように処理した。示される時間で、培地を吸引し、細胞培養ディッシュを、１０分間メタノールに対して逆にした。次いで、メタノール中に少なくとも１０分間浸漬した。細胞を、少量の無脂肪乾燥ミルクを含有する水中の１μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８で染色した。核形態を、蛍光顕微鏡により視覚的に評価した。
【００６２】
（チミジンの取り込み）
チミジンの取り込みを定量するために、２４ウェルプレート中の１ウェルあたり１．７３×１０４細胞を、分散させた。約１日後、細胞を、９μＭ  Ｎ，Ｎ’−ドデシル−シクロヘキシル尿素または対応するビヒクルとともに、約１時間プレインキュベートした。次いで、培地を、４０μＭ  ３Ｈ−メチル−チミジン（１ｍＣｉ／ｍＬ、２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に合わせた。示される時間で、培地を吸引し、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５００μＬの１Ｍ  ＮａＯＨとともに２０分間インキュベートした。混合物を、０．５ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌで中和し、液体シンチレーション計数のために、シンチレーション流体に希釈した。
【００６３】
（細胞膜の完全性および毒性の評価）
化合物の毒性を評価するために、細胞性トリパンブルー透過性によって示されるように、細胞を、３５ｍｍ皿にプレートした。２日後、この皿内の培地を、目的の化合物またはビヒクルを補充した新鮮な培地に取り換えた。処理後の指定時間にて、上清を取り除き、そしてトリプシンを使用して、接着性細胞を取り除いた。接着性細胞を取り除いた後、その細胞懸濁液を、上清とともにプールし、そして遠心分離した。得られた細胞ペレットを再懸濁し、そしてこのアリコートに、トリパンブルー溶液（標準の生理食塩水中０．４％）を加えた。約５分間のインキュベーション後、このサンプルを、光学顕微鏡検査によって評価した。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を評価するために、細胞を収集し、２４ウェルプレート上に置き、そして血清を、１〜２日間不足させた。試験化合物を加え、そして６５時間後、ＬＤＨ活性を測定するために、培地を取り除いた。Ｓｉｇｍａ  Ｔｏｘ−７インビトロ毒物学キットを使用するＮＡＤＨ酸化によって、ＬＤＨ活性を測定し、その培地中でのＬＤＨ活性の量として報告した。
【００６４】
（実施例２）
この実施例は、上記の材料および方法を使用して行った研究の結果を報告している。
【００６５】
（ＣＤＵは、ヒトＶＳＭ細胞増殖を阻害する）
脈管内容量および動脈の緊張を制御する複雑な系の統合によって、血圧を調節する。一貫して上昇する血圧は、アテローム性動脈硬化症を誘導し得る。このプロセスは、少なくとも部分的に、動脈の平滑筋細胞の異常な増殖に起因しており（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８０１−８０９（１９９３））、そして部分的に、全身性の炎症性状態に起因している（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，１３８：Ｓ４１９−Ｓ４２０（１９９９））。他方で、抗高血圧剤としての薬物の効果と、この薬物が脈管の平滑筋細胞の増殖の阻害に対する効果を有するか否かということの間に明白な関係は存在していない。例えば、多数の薬物が、高血圧症を処置するために使用されるが、それらの薬物のうちたとえあったとしてもわずかな薬物しか、ＶＳＭ細胞増殖を阻害しない。
【００６６】
ｓＥＨの最も強力なインヒビターのうちの１つは、１−シクロヘキシル−３−ドデシル尿素（ＣＤＵ、Ｋｉ＝２０±２ｎＭ）（Ｍｏｒｉｓｓｅａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９６：８８４９−８８５４（１９９９））であり、これは、基質の密な結合の遷移状態アナログとして作用するようである（Ａｒｇｉｒｉａｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９６：１０６３７−１０６４２（１９９９））。ヒトＶＳＭ細胞とともにインキュベートした場合、ＣＤＵは、細胞を刺激して、１．０〜２０μＭのＣＤＵ濃度にて、ＰＤＧＦ−ＢＢ（図１ａ）または１０％血清（図１ｂ）のいずれかを用いて増殖させた場合、ＤＮＡ合成の用量依存性阻害を示す。ＣＤＵによる細胞増殖の阻害は、トリプシン化細胞の直接計数によって確認されるように（図１ｃ）、１２μＭでの［３Ｈ］チミジンの取り込みの阻害に相当した。血清とＰＤＧＦ−ＢＢ刺激細胞との間のＣＤＵの効力の差異は、細胞複製機構へのアクセスを不可能にする、血清含有培地におけるＣＤＵのタンパク質結合の増加に起因するようである。なぜなら、組換えＰＤＧＦ−ＢＢを使用した実験は、有意により低量の血清タンパク質の存在下で行われるからである。ヒト包皮線維芽細胞における［３Ｈ］チミジンの取り込み（これは、ＶＳＭ細胞と類似の特徴を有する）をまた、ヒトＶＳＭ細胞の濃度と類似の濃度にて、ＣＤＵによって阻害した（図１ｄ）。
【００６７】
ＣＤＵがチミジンの細胞取り込みを減弱する１つの可能な手段は、その細胞へのチミジンの取り込みを阻害することによる（Ｇｒｉｎｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９４：１２１９−１２２４（２０００））。この事象は、ＤＮＡへのチミジンの取り込みと同義ではない。もし当てはまるなら、これは、細胞増殖の正確な尺度としての［３Ｈ］チミジンの使用を排除する。ＣＤＵが増殖とは無関係にチミジンの取り込みを阻害するか否かを評価するために、１２μＭ  ＣＤＵまたはＤＭＳＯビヒクルのいずれかの存在下で、数秒間から数分間の範囲の時間、ＶＳＭ細胞を、［３Ｈ］チミジンとともにインキュベートした。液体シンチレーション計数によるチミジンの取り込みの定量化は、チミジンの細胞取り込みが、ＣＤＵ処理にもＤＭＳＯビヒクル処理にも関係なく、同程度に生じることを示した（図１ｅ）。
【００６８】
ＣＤＵが、正常な間葉細胞以外の細胞型の増殖を阻害するか否かを決定するために、本発明者らは、他の関連していない細胞株の増殖に対するこの化合物の影響を評価した。ＨＬ−６０細胞は、モデルのヒト好中球に対する系として広範に使用されるヒト前骨髄球細胞株由来である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｌｏｏｄ，７０：１２３３−１２４４（１９８７）に総説される）。１２μＭ  ＣＤＵまたはその対応するビヒクルのいずれの存在下で播種されようとも、ＨＬ−６０細胞は、同程度まで増殖した（図２）。２０μＭまでのＣＤＵとともにインキュベートした場合、高度に転移性の胸部腫瘍由来の細胞（Ｍｅｔ−１）（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１１：６９−７７（１９９７））に対するＣＤＵの効果に類似する欠如が存在した。
【００６９】
（ＥＥＴは、ＣＤＵとともに作用して、ＶＳＭ細胞増殖を阻害する）
ｓＥＨの阻害は、ＤＣＵを注射したマウスにおいてＥＥＴの蓄積を生じるので（Ｙｕら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７：９９２−９９８（２０００））、ｓＥＨ減弱の効果は、種々のＥＥＴ領域異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）の添加によって複製されることが予測される。ＥＥＴ遊離酸の混合物（１：１：１）を含む溶液を、５〜１０μＭの濃度（総ＥＥＴ濃度）にて、２．５μＭおよび１０μＭのＣＤＵと、別々および同時の両方で、ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激性ＶＳＭ細胞に加えた。ＥＥＴとＣＤＵとの両方を別々に加えることによって、ＰＤＧＦ刺激性［３Ｈ］チミジンの取り込みが阻害され（図３）、そして両方の化合物を一緒に加えた場合、さらなる明白な影響はなかった。このことは、共通の作用機構を示唆する。
【００７０】
（ＣＤＵは、アポトーシスを引き起こさず、使用した用量において毒性ではない）
この研究において記述した結果のうちのいくつかは、ＣＤＵへの曝露の結果として細胞死をもたらし得る。ＣＤＵが、試験される条件下でヒトＶＳＭ細胞に対して毒性であり得る可能性を試験するために、直接的にかまたはｓＥＨの阻害を介してかのいずれかで、いくつかの技術を用いて、アポトーシスおよび一般的な細胞死を評価した。ＤＭＳＯビヒクルと比較した場合、１２μＭのＣＤＵで処理した細胞においてトリパンブルー排除以外に、変化は存在せず（８時間青色染色した３．４％のＣＤＵ処理細胞と比較した場合の、３．１％のＤＭＳＯ処理細胞；および、２４時間青色染色した３．０％のＣＤＵ処理細胞と比較した場合の、３．４％のＤＭＳＯ処理細胞）、そして類似の結果が、細胞をヘキスト３３２５８で染色した場合に得られた（図４ａ）。このことにより、アポトーシスは、［３Ｈ］チミジンの取り込みおよび細胞数において観察された減少の好ましくない原因となる。
【００７１】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、生存細胞に含まれており、その結果、培地中でのこの酵素の出現は、細胞が死滅して、このタンパク質を放出したことの指標となる。ＶＳＭ細胞を、１０μＭおよび２０μＭ（これらの濃度は、ＰＤＧＦ刺激後の増殖の有意な阻害を示した）にてＣＤＵの存在下または非存在下において、ＰＤＧＦ−ＢＢまたは１０％血清で処理した。培地中でのＬＤＨの出現を測定し、ＣＤＵの存在下におけるこれらの増殖刺激と比較した場合に、ＰＤＧＦで処理した細胞においても血清で処理した細胞においても変化がなかったことを見出した（図４ｂ）。このことは、これらの細胞におけるＣＤＵの毒性の欠如をさらに示した。ＭＴＴアッセイを使用して、４０μＭまでのＣＤＵとともにインキュベートした場合、Ａ５４９肺癌細胞においても、ＨＴ−２９結腸癌細胞においても、ＨＴＢ−３０乳癌細胞においても、ＬｎＣａｐ前立腺癌細胞においても、毒性はまた観察されなかった。
【００７２】
（ＣＤＵの添加時間は、細胞周期を探索する）
ＶＳＭ細胞周期のどの段階がＣＤＵによって阻害されるかを確認するために、マイトジェンに対するＣＤＵの添加時間の関数として、ＤＮＡ合成を試験した。ＣＤＵ（１０μＭ）を、ヒトＶＳＭ細胞に、ＰＤＧＦ−ＢＢと同時（時間＝０）およびＰＤＧＦの添加から２〜２０時間後の範囲の時点で加えた。ＶＳＭ細胞（この細胞周期を、ＰＤＧＦ刺激前の血清除去によって同期化させた）において、ＣＤＵをＰＤＧＦと同時およびＰＤＧＦの添加から６時間程度後で加えた場合に、増殖の類似の細胞阻害が存在した。最も著明な阻害は、４時間で生じた（図５）。これらのデータは、細胞周期阻害が、後期Ｇ１においてかまたはＧ１／Ｓ相転移にて作用するタンパク質の調節を介して生じることを示唆している（ＮｉｃＡｍｈｌａｏｉｂｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８２：３６８−３７６（１９９９））。
【００７３】
（ＣＤＵは、サイクリンＤ１レベルを弱めるが、ホスホ−ＭＡＰＫレベルを弱めない）
ＣＤＵは、細胞周期の移行を弱め（Ｇ１後期またはＧ１／Ｓ移行時の可能性が最も高い）、これは、毒性プロセスにもアポトーシスプロセスにも起因しないので、本発明者らは、次に、どのマイトジェンシグナル伝達事象がこの化合物によって変更されるかを求めた。本発明者らは、同様に、ＶＳＭ細胞の刺激後にＧ１後期においてマイトジェン（例えば、ＰＤＧＦ）を用いて活性され得る候補シグナル伝達タンパク質が、ＭＡＰ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードにおけるプロテインキナーゼならびにサイクリン／ｃｄｋ／ＣＫＩ複合体の成分を含むと推定した。
【００７４】
ＥＲＫ１／２のリン酸化は、Ｇタンパク質共役およびチロシンキナーゼ増殖因子の両方を用いた刺激の後の、ＶＳＭおよび他の細胞におけるシグナル伝達タンパク質のＭＡＰＫカスケードにおいて末端の事象として生じ、そしてその上流のキナーゼであるＭＥＫの阻害は、ＰＤＧＦ刺激ＶＳＭ細胞の静止をもたらす（Ｗｅｉｓｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７４：Ｃ１５２１−Ｃ１５２９（１９９８））。従って、ＥＲＫのリン酸化は、この経路における上流のシグナル伝達タンパク質（Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびＭＥＫが挙げられるがこれらに限定されない）の完全性の読み出しとして役立つ。ＣＤＵとともにインキュベートしたＶＳＭ細胞は、ＰＤＧＦ刺激ＥＲＫ４２／４４リン酸化における変化を示さず（図６）、このことは、顕著な増殖阻害にも拘わらず、ＣＤＵの存在下でのＰＤＧＦレセプター／ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の完全性の保持を実証した。
【００７５】
サイクリンは、種々の増殖刺激に応答してｃｄｋを活性化し、種々の細胞周期チェックポイントを通じてのその後の移行をもたらす、細胞周期調節タンパク質である。細胞周期調節サイクリンのレベルは、異なる時点で上昇し、この時点は、細胞周期における別個の事象に対応する（Ａｒｅｌｌａｎｏら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２９：５５９−５７３（１９９７））；従って、これらのタンパク質のレベルを調べることは、増殖インヒビターによって影響を受ける、周期中の事象を解明する有用なツールである。
【００７６】
増殖刺激後、サイクリンＤ１は増加し、そして増殖因子が存在する限り、上昇したままである。正の細胞周期調節因子としてのその役割と一致して、サイクリンＤ１は、プロトオンコジーンＰＲＡＤ１と同定された（Ｍｏｔｏｋｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：５１２−５１５（１９９１））。さらに、サイクリンＤ１およびサイクリンＥの両方の過剰発現が、Ｇ１期を有意に短縮することが実証されており（Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４：１６６９−１６７９（１９９４））、その結果、これらのサイクリンの減少は、Ｇ１の長期化およびその後の細胞周期阻害をもたらし得る。増殖因子の添加後、サイクリンＤ１はＧ１後期およびＳ期に増加し、Ｒｂのリン酸化、転写因子のＥ２Ｆ基からのＲｂの解離、およびその後の増殖調節遺伝子の転写活性化をもたらす（Ａｒｅｌｌａｎｏら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２９：５５９−５７３（１９９７））。ＰＤＧＦ−ＢＢで刺激し、そして１０μＭ  ＣＤＵを用いて６〜１８時間同時にインキュベートしたＶＳＭ細胞は、ＤＭＳＯビヒクル処理細胞と比較した場合、別のＧ１サイクリンであるサイクリンＥの影響は最小でありながら、サイクリンＤ１レベルの大いに減少した誘導を実証した（図７）。
【００７７】
（実施例３）
エイコサノイドは、脈管緊張の強力な調節因子として作用し、血圧制御と関連付けられており（Ｙｕら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７：９９２−９９８（２０００））、そして炎症状態の調節と関連付けられている（Ｎｏｄｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１２７６−１２７９（１９９９））。ＥＥＴは、生理学的濃度では、サイトカイン誘導性内皮細胞接着分子発現ならびに脈管壁への白血球接着を減少させる（Ｎｏｄｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１２７６−１２７９（１９９９））。これらの両方のプロセスは、アテローム性動脈硬化症の進行と密接に結びついている。外因性ＥＥＴならびにインビトロでのｓＥＨのインヒビター（これはまた、細胞のＥＥＴレベルを上昇させ得る）の添加が、ＶＳＭ細胞増殖を減少させるという、本明細書中に報告された知見は、この代謝経路が、ＶＳＭ細胞増殖を減少させるために利用され得ることを示す。
【００７８】
ｓＥＨは、インビボで機能して、ＥＥＴを代謝してそれらの対応するＤＨＥＴとする（Ｆａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１４８６７−１４８７４（２００１））。１つのｓＥＨインヒビターであるＤＣＵの、自然高血圧ラットへの注入は、血圧の低下をもたらした。さらに、これらの動物において、尿の１４，１５−ＥＥＴにおける増加および尿のＤＨＥＴにおける減少が存在し、これは、ｓＥＨに対してこのインビボでの設定で生じるＤＣＵの影響と一致した。ＣＤＵは、同様の尿ベースのｓＥＨインヒビターであり、類似の影響を有すると期待される。
【００７９】
本明細書中の結果は、ＥＥＴが、ブタの腎臓上皮細胞株および大動脈細胞株における増殖刺激因子であることが示された他の研究とは対照的である。ブタ大動脈ＶＳＭ細胞では、２μＭの外因性１４，１５−ＥＥＴの添加は、ＰＤＧＦ媒介ＤＮＡ合成を増加させることが報告され、そしてエポキシドヒドロラーゼの強力なインビトロでのインヒビターである４−フェニルカルコンオキシド（Ｍｕｌｌｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２１６：４２３−４３９（１９８２））は、ＰＤＧＦおよび外因性の市販のＥＥＴとともにインキュベートした場合、ブタ大動脈ＶＳＭ細胞における有糸分裂誘発において付加的な増加をもたらす（Ｆａｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２１（１９９８））。インビトロでのｓＥＨの強力なインヒビターであるが、カルコンオキシドは実際に、ゆっくりと代謝回転される、ｓＥＨについての基質である。この代謝回転およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼによるそれらの代謝、ならびにグルタチオンを用いる反応は、カルコンオキシドによって引き起こされる阻害を一過性にし（Ｍｏｒｉｓｓｅａｕら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５６：２１４−２２８（１９９８））、そしてこれらの実験と本明細書中で報告された結果との間の差を部分的に説明し得る。別の基は、種々のＥＥＴおよびそれらのスルホンイミド誘導体を用いたＬＬＣＰＫ細胞の有糸分裂誘発の刺激を示したが、この研究において、試験した１４，１５−ＥＥＴスルホンイミド誘導体は、これらの細胞において、２日間のインキュベーション後に、阻害効果を示した（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２９２５４−２９２６１（１９９８））。本明細書中の結果と比較しての、これらの不一致は、ＥＥＴの代謝における種の違い、または用いた外因性ＥＥＴ立体異性体の純度における違いに起因し得る。あるいは、本明細書中の遊離酸ＥＥＴの混合物の使用はまた、特定のレジオ異性体の使用とは対照的に、観察された違いを説明し得る。インビボでのＣＤＵの増殖阻害機能が、ｓＥＨに対するそのインビトロでの阻害影響とは独立し得ることもまた、考えられ得る。
【００８０】
種々のｓＥＨインヒビターの脂質可溶性は、インビボおよびインビトロの両方でのそれらの影響に、ならびに将来の動物試験およびヒト試験におけるこれらのインヒビターのバイオアベイラビリティーに、何らかの役割を果たすことがあり得る。特定の薬物のバイオアベイラビリティーは、大部分、細胞膜をまたがるその拡散および血清タンパク質へのその結合の関数である。これは、ＰＤＧＦ−ＢＢと比較したときの、血清によって刺激された細胞におけるＣＤＵによる阻害の減少の大きさを説明し得る（図１ａおよび図１ｂ）。ｓＥＨインヒビターの水溶性が増すことにより、これらを経口投与によってバイオアベイラブルにする。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（これはまた、ＶＳＭ細胞増殖を阻害する（Ｗｅｉｓｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，９：１８８０−１８９０（１９９９）））を暗示して、ｓＥＨインヒビターは、移植血管症（Ｋａｔｚｎｅｌｓｏｎら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６１：１４６９−１４７４（１９９６））および血管形成術後の再狭窄（Ｋｏｂａｓｈｉｇａｗａら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：６２１−６２７（１９９５））の処置において有用であると判明すると期待される。これらの両方のプロセスは、ＶＳＭ細胞の異常増殖によって特徴付けられる。インビボでの設定におけるこれらの化合物の安全性は、間葉細胞への相対的特異性という本明細書中での知見により支持される。なぜなら、ＨＬ−６０前骨髄球細胞およびＭｅｔ−１胸部腫瘍細胞の両方における増殖は、ＣＤＵによって影響を受けないからである。
【００８１】
ＣＤＵがＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化とは独立してＶＳＭ細胞増殖を減少させるという、本明細書中での知見は、このｓＥＨインヒビターが、このシグナル伝達分子の下流の事象に影響を与えることを示す。サイクリンＤ１は、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫによって正に調節され（Ｌａｖｏｉｅら，Ｐｒｏｇ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｓ．，２：４９−５８（１９９６））、そしてこれらの知見は、これが、ＣＤＵの標的であることを示す。これらのサイクリン分子は、それらのパートナーであるｃｄｋの活性を調節することにより、細胞周期における期移行を親密に制御する（Ａｒｅｌｌａｎｏら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２９：５５９−５７３（１９９７））。従って、これらのタンパク質は、細胞増殖によって特徴付けられる疾患（特に、癌）の処置のための標的として広範囲に利用されている（Ｙｕら，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：１０１７−１０２１（２００１））。サイクリンＤ１のレベルがＣＤＵにより低下されるがサイクリンＥのレベルは低下されないとの知見は、Ｇ１→Ｓ期モジュレーターとしてのこのサイクリンの役割と完全に一致する。これは、サイクリンＤ１タンパク質の量が、転写レベルで、ＣＤＵによって調節されないこと、およびこのタンパク質の細胞レベルを制御するのは、安定性の変更であることを示す。
【００８２】
ＶＳＭ細胞の増殖における尿素ｓＥＨインヒビターの著しい効果に起因して、これらの化合物が、アテローム硬化症を生じる疾患を遅延するかまたは阻害する独特の新しいアプローチを提供することを明らかにした。
【００８３】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、説明の目的ためのみであり、そしてそれらの観点から種々の改変および変化が当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために、それらの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１ａ】図１ａは、ＣＤＵのヒトＶＳＭ細胞における増殖の阻害を示す。ヒトＶＳＭ細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、１日間血清枯渇（示される場合以外）した。ＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）刺激直後、ＣＤＵまたはＤＭＳＯビヒクル（コントロールとして、チャート上で「ｃｏｎｔ」として示す）を、示される濃度で添加した。１８時間後、ＤＮＡ中へのチミジンの取り込みを、実施例１に記載するように、評価した。
【図１ｂ】図１ｂは、ＣＤＵのヒトＶＳＭ細胞における増殖の阻害を示す。ヒトＶＳＭ細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、１日間血清枯渇（示される場合以外）した。ヒトＶＳＭ細胞を、図１ａに示すように、しかし、細胞をＰＤＧＦ−ＢＢではなく１０％血清を用いて刺激し、増殖させ、チャレンジした。
【図１ｃ】図１ｃは、ＣＤＵのヒトＶＳＭ細胞における増殖の阻害を示す。ヒトＶＳＭ細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、１日間血清枯渇（示される場合以外）した。ＣＤＵ（１２μＭ）または等量のＤＭＳＯビヒクル（コントロールとして）を、１０％血清と同時に添加し、そして細胞をトリプシン処理後、血球計数器によって計数した。
【図１ｄ】図１ｄは、ＣＤＵのヒトＶＳＭ細胞における増殖の阻害を示す。ヒトＶＳＭ細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、１日間血清枯渇（示される場合以外）した。ヒト包皮線維芽細胞を、図１ａのＶＳＭ細胞と同様に処理し、そして［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの取り込みを評価した。
【図１ｅ】図１ｅは、ＣＤＵのヒトＶＳＭ細胞における増殖の阻害を示す。ヒトＶＳＭ細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、１日間血清枯渇（示される場合以外）した。示された濃度のＣＤＵを、血清を枯渇していない細胞に添加し、そしてチミジンの細胞への取り込みを、実施例１に記載されるように、その添加後示された時間において、評価した。誤差のバーは、標準偏差を示す；ＰＤＧＦ単独（図１ａおよび１ｄについて）、または血清単独（図１ｂについて）、またはＤＭＳＯ（図１ｅについて）と比較して＊ｐ＜０．０５。示されたデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。
【図２】図２は、ＣＤＵによる増殖の阻害が、一般的ではないことを示す。ヒト前骨髄球ＨＬ−６０を、血清含有培中でインキュベートし、そして、ＣＤＵ（１２μＭ）またはＤＭＳＯビヒクルをゼロ時間で添加した。ＣＤＵ添加の２４時間後および４８時間後、細胞を、血球計数器を用いて計数した。誤差のバーは、標準偏差を示す。示されたデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図３】図３はＥＥＴが、ＶＳＭ細胞増殖を阻害することを示す。ヒトＶＳＭ細胞を、図１のように、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、そして、血清枯渇した。ＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）を、コントロールウェル以外の全てに添加し、その直後、混合したＥＥＴおよび／またはＣＤＵを、総ＥＥＴの示された濃度で、添加した。［３Ｈ］チミジンを、少なくとも６時間のインキュベーションの間添加し、そしてそのＤＮＡへの取り込みを、材料および方法に記載されるように、評価した。誤差のバーは、標準偏差を示す；ＰＤＧＦ単独と比較して、＊ｐ＜０．０５。示されたデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図４ａ】図４ａは、ＣＤＵが、ＶＳＭ細胞に対して毒性ではないことを示す。連続的に増殖するヒトＶＳＭ細胞を、ＣＤＵ（１０μＭ）、ＤＭＳＯビヒクルとともに７２時間、またはカンプトテシン（陽性コントロールとして７μｇ／ｍｌ）とともに２時間インキュベートし、実施例１に記載されるようにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８を用いて染色し、そして蛍光顕微鏡によって可視化した（２００倍）。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＤＵが、ＶＳＭ細胞に対して毒性ではないことを示す。ヒトＶＳＭ細胞を、１０％血清またはＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）いずれかの存在下で、連続的に増殖させた。コンフルエントに達した際に、細胞を、示された濃度でＣＤＵとともにインキュベートし、そして培地中へのＬＤＨ放出を、実施例１に記載されるように測定した。
【図５】図５は、ＣＤＵが、分裂促進因子添加の８時間までに添加される場合、増殖を阻害することを示す。ヒトＶＳＭ細胞を、図１のように、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、そして、血清枯渇した。ＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）を、コントロールウェル以外の全てに添加し、そして、ＰＤＧＦ添加後の示された時点において、ＣＤＵ（１０μＭ）を添加した。ゼロ時間において、ＣＤＵおよびＰＤＧＦを同時に添加した。［３Ｈ］チミジンを、少なくとも６時間のインキュベーションの間添加し、そしてそのＤＮＡへの取り込みを、実施例１に記載されるように、評価した。誤差のバーは、標準偏差を示す；ＰＤＧＦ単独と比較して、＊ｐ＜０．０５。示されたデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図６】図６は、ＣＤＵが、ＶＳＭ細胞において、ＭＡＰＫシグナリングに影響を与えないことを示す。ヒトＶＳＭ細胞を、図１のように、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、そして、血清枯渇した。ＣＤＵ（１０μＭ）の存在下または非存在下において、ＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）を用いる刺激の４時間後、細胞を溶解し、そして等量のタンパク質を電気泳動し、そしてリン酸化−ＭＡＰＫ抗体を用いて、イムノブロットした。示されたデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図７】図７は、ＣＤＵが、サイクリンＤ１レベルを減少させることを示す。ヒトＶＳＭ細胞を、図１のように、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、そして、血清枯渇した。ＣＤＵ（１０μＭ）の存在下または非存在下において、ＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）を用いる刺激の４時間後、細胞を溶解し、そして同一の溶解物の等量のタンパク質を電気泳動し、そしてサイクリンＤ１またはサイクリンＥに対する抗体を用いて、イムノブロットした。示されたデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図１ａ】
2006502087.tif 000003
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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