(57)【要約】本発明の目的は、神経学的損傷の処置および予防のための代替的可能性を提供することである。この目的は、神経保護因子としてｔ−ＰＡ活性を阻害する物質の使用によって、達成される。本発明は、グルタミン酸レセプターのｔ−ＰＡ媒介性活性化の阻害因子、好ましくは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸レセプターのｔ−ＰＡ媒介性活性化の阻害因子の、神経保護因子としての使用に関する。特に好ましい本発明の実施形態において、プラスミノーゲン活性化因子ＤＳＰＡが、特に、興奮毒性に由来する状態の処置のために神経保護因子として使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸レセプターのｔ−ＰＡ媒介性活性化のインヒビター、好ましくは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸レセプターのｔ−ＰＡ媒介性活性化のインヒビターの、神経保護因子としての使用。
【請求項２】
前記グルタミン酸レセプターの興奮毒性に基づくニューロン損傷またはニューロン状態の処置または予防のための、請求項１に記載のインヒビターの使用。
【請求項３】
鬱状態または不安状態の処置のための、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
脳卒中の処置における使用によって特徴付けられる、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
以下の状態：振せん麻痺、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、糖尿病、疼痛状態、癲癇もしくは記憶障害の処置または予防によって特徴付けられる、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ｔ−ＰＡ活性を阻害するプロテアーゼの使用によって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
セリンプロテアーゼインヒビターによって、好ましくは、ニューロセルピン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ）またはプロテアーゼネキシンＩ（ＰＮ−Ｉ）によって特徴付けられる、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＤＳＰＡ、あるいは機能的および／もしくは構造的に該ＤＳＰＡに由来し得るＤＳＰＡ誘導体、ＤＳＰＡアナログまたはＤＳＰＡフラグメントの使用によって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
図１に示されるようなアミノ酸配列を有するＤＳＰＡ、または該ＤＳＰＡに対して少なくとも７０％、好ましくは、８０％〜９０％の相同性を有するＤＳＰＡ誘導体、ＤＳＰＡアナログもしくはＤＳＰＡフラグメントが使用される点で特徴付けられる、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
６２．５μｇ／ｋｇ超かつ１６０μｇ／ｋｇ未満の図１に示されるようなＤＳＰＡ、好ましくは、９０μｇ／ｋｇ〜１２５μｇ／ｋｇのＤＳＰＡ、特に好ましくは、９０μｇ／ｋｇのＤＳＰＡの投与量、または前記使用される誘導体、アナログもしくはフラグメントの生物学的等価性に依存してこれらに対して調整された投与量によって特徴付けられる、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
ＤＳＰＡまたは該ＤＳＰＡの誘導体、アナログもしくはフラグメントが、血栓崩壊因子と組み合わせて脳卒中の処置において神経保護因子として使用される点で特徴付けられる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
血栓崩壊因子としてのｔ−ＰＡによって特徴付けられる、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経学的損傷（特に、メチル−Ｄ−アスパルテート（ａｓｐａｒａｔ）型のグルタミン酸レセプター（以下の本明細書中において、ＮＭＤＡグルタミン酸レセプター）の過剰な活性化に、間接的または直接的に寄与可能な損傷）の治療および予防のための神経保護因子に関し、そして、本明細書中で参考として援用される、独国特許出願第１０３  ３７  ０９８．６号、同第１０３  ２０  ３３６．２号および同第１０３  ５２  ３３３．２号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
用語「神経保護因子」とは、本発明の文脈において、神経細胞の細胞損傷からの保護ならびに／または神経変性プロセスおよびニューロン効力損傷の解消に寄与する、治療剤または活性成分を意味する。
【０００３】
神経保護因子の開発において、実質的な努力は、特に、興奮性神経伝達物質レセプターの活性の上昇（神経毒性）に対して神経細胞を保護するか、またはその過剰な活性化を調節するグルタミン酸レセプターアンタゴニストの同定および／またはそのさらなる開発に向けられている。レセプターアンタゴニストの最も重要な群は、グルタミン酸レセプターのＮＭＤＡ型を阻害するＮＭＤＡアンタゴニストである。このことに関して、以下のアゴニストの間で区別されている：グルタミン酸結合部位に対して作用する競合的ＮＭＤＡアンタゴニスト（例えば、２−アミノ−５−ホスホノペンタノエート（（Ｄ）−ＡＰ５）および（＋／−）−４−（４−フェニルベンゾイル）ピペラジン−２，３−ジカルボン酸（ＰＢＰＤ））、上記レセプターのイオンチャネルをブロックするＮＭＤＡレセプターチャネルブロッカー（例えば、ＭＫ−８０１，メナンチンおよびケタミン）、グリシン結合部位に対して作用し、コアゴニストであるグリシンの結合を阻害するＮＭＤＡアンタゴニスト（例えば、ＧＶ９６７７１Ａ）およびレセプター刺激性ポリアミンの結合を阻害するポリアミン部位アンタゴニスト（例えば、イフェンプロジル（ｉｆｅｎｐｒｏｄｉｌ））。
【０００４】
グルタミン酸レセプターの３つのクラス（ＡＭＰＡ、カイネートおよびＮＭＤＡレセプター）は、それらの各々が、グルタミン酸依存性イオンチャネルとして作用し、最も重要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸のシナプス後シグナルを導く。ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターは、様々なレセプターサブタイプの形態で、脳全体に広がっており、そして中枢神経系（ＣＮＳ）の機能のための重要な興奮性神経伝達物質レセプターとして、不可欠である。
【０００５】
近年、ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターの分子生物学が詳細に調査されている。このことから、これらのレセプターが、１つ以上のＮＲ２サブユニットおよび（より一般的ではないが）ＮＲ３サブユニットと組み合わせたＮＲ１サブユニットからなることが明らかとなった（Ｄａｓ，Ｓ．ら：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＮＭＤＡ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｉｎｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＮＲ３，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３（１９９８），３７７−３８１；Ｃｈａｔｔｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．ら：Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＲ３  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５（２００２），７９３−７９８）。
【０００６】
Ａ〜Ｄの４つの形態が存在する上記ＮＲ２サブユニットだけでなく、特に、ＮＲ１サブユニットの選択的スプライスバリアントもまた、ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターの薬理学を決定する。ＮＲ１およびＮＲ２Ａは、ＣＮＳにおいて遍在的に発現され、一方、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２ＣおよびＮＲ２Ｄは、より一般的ではなく存在するかまたは脳の特定の領域においてのみ存在する。上記レセプターサブタイプの構成におけるこの差異は、選択的に作用するアンタゴニストによる治療アプローチを可能にする。
【０００７】
ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターの複合体活性化を担うのは、興奮性神経伝達物質としてシナプス前で放出されるグルタミン酸、および調節性神経伝達物質およびコアゴニストとしてのグリシンである。上記レセプターの活性化は、カルシウムイオンの流入を引き起こし、そして（特に刺激が延長される場合）複雑な細胞シグナルの活性化と関連する。これらは、特に、ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化ならびに複数の遺伝子の活性化およびシナプス可塑性（神経可塑性）をもたらし、これらは、記憶プロセスおよび学習プロセスのために不可欠な基盤を示す。
【０００８】
ＮＭＤＡレセプターおよびＮＭＤＡアンタゴニストの一般的な薬理学の総説は、Ｋｅｍｐ，Ｊ．Ａ．およびＭｃＫｅｒｎａｎ，Ｒ．Ｍ．：ＮＭＤＡ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｖ．２００２，Ｖｏｌ．５，補遺，１０３９−１０４２による刊行物において得られ、これは、本明細書中で参考として援用される。
【０００９】
上記レセプターの過剰な活性化およびそれらに付随するＣａ２＋流入の増加は、逆に、Ｃａ２＋依存性細胞代謝（エネルギー代謝を含む）の大規模な妨害を導く。Ｃａ２＋依存性異化酵素は、特に、続いて生じる細胞死を担っていると考えられている（Ｌｅｅ，Ｊｉｎ−Ｍｏｏら，「Ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」；Ｄｅｎｎｉｓ  Ｗ．Ｃｈｏｉ「Ｇｌｕｔａｍａｔ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」）。このプロセスは、興奮毒性として公知である。
【００１０】
興奮毒性は、上記グルタミン酸レセプターの過剰な活性化に基づくので、一般的に、上記グルタミン酸レセプターのアンタゴニストは、全てのＣＮＳ障害、またはニューロンがこのプロセスに脅かされているか、もしくはこのプロセスによって損傷されている、ニューロン状態の治療および／または予防の能力を有している。これらの「状態」としてはまた、脳卒中の間に生じる大脳虚血および神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病）が挙げられ、この疾患の本質的な原因は、過剰なグルタミン酸ではなく、興奮毒性損傷に対する感受性の増大である。最終的に、興奮性シグナル経路の過剰な活性に基づく障害（例えば、癲癇および神経障害性疼痛）もまた、グルタミン酸レセプターアンタゴニストを使用可能な領域である。
【００１１】
他の使用は、例えば、疼痛状態（特に、慢性的な疼痛）の処置、依存性障害の処置、精神医学的障害の処置ならびに学習および記憶の刺激にまで広がる。
【００１２】
アンタゴニストは、上記レセプターを、競合的または非競合的に阻害し得る。上記競合的アンタゴニストが、例えば、天然アゴニストであるグルタミン酸およびグリシンによってレセプター活性化を阻害するのに対し、上記非競合的アンタゴニストは、アゴニストの存在または濃度にかかわらず、例えば、イオンチャネルをブロックすることによって上記レセプターを阻害する。上記ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターの競合的阻害（アンタゴニズム）は、例えば、２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸塩（ＡＰＶ）または２−アミノ−５−ホスホノヘプタノエート（ＡＰＨ）によって可能である。非競合的阻害は、対照的に、上記チャネルのフェンシクリジン側に結合する物質（例えば、フェンシクリジン、ＭＫ−８０１、デキストロファンまたはケタミン）によって達成され得る。
【００１３】
しかし、神経保護因子としてのＮＭＤＡアンタゴニストの使用に対する今日までの臨床的研究は、特に、脳卒中および外傷性脳損傷の場合、所望される結果を有していない（Ｋｅｍｐ，Ｊ．Ａ；Ｋｅｗ，Ｊ．Ｎ．Ｃ．；Ｇｉｌｌ，Ｒ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１４１（Ｊｏｎａｓ，Ｐ．およびＭｏｎｙｅｒ，Ｈ．編）４９５−５２７（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９９）；Ｌｅｅｓ，Ｋ．Ｒ．ら：Ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ｇａｖｅｓｔｉｎｅｌ）ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＧＡＩＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ＳＴＲＯＫＥ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．ＧＡＩＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ３５５（２０００），１９４９−１９５４；Ｓａｃｃｏ，Ｒ．Ｌ．ら．Ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｓｔｒｏｋｅ：ＧＡＩＮ  Ａｍｅｒｉｃａｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ  ２８５（２００１），１７１９−１７２８）。
【００１４】
脳卒中の場合の神経保護の試みにおいて今日まで成功がなかったのは、特に、おそらく、既知の神経保護因子が、組織損傷部位を透過し、そこでそれらの効果を示すためには、必ず血栓崩壊因子と組み合わされなければならないという事実に起因し得る。さらに、所望される効果を達成するために、既知のＮＭＤＡグルタミン酸レセプターアンタゴニストの充分に大きい用量を投与することは、かなりの副作用があるので、通常は不可能である。これは、それらが、高用量では、特に、幻覚および血圧の顕著な上昇を引き起こすからである。後者は、もちろん、特に、脳卒中患者に対しては特に危険である。
【００１５】
さらに、上記既知のグルタミン酸レセプターアンタゴニストは、しばしば、神経保護のために必要な投与量において、受容できないほど強力な麻酔（ｂｅｔａｕｂｅｎｄｅ  ｂｉｓ  ｎａｒｋｏｔｉｓｃｈｅ）効果を有する。従って、多くのＮＭＤＡアンタゴニスト（例えば、フェンシクリジンおよびケタミン）は、本来、麻酔の目的のために開発された。
【００１６】
従って、レセプター選択的ＮＭＤＡアンタゴニストによるこれらの副作用を回避するための試みがなされている。これらの試みから、ＮＲ２Ｂ選択的アンタゴニストであるイフェンプロジル（ｉｆｅｎｐｒｏｄｉｌ）が、有利な効果を有し、脳卒中の動物モデルにおいて、顕著に副作用が減少することが明らかになった（Ｇｏｔｔｉ，Ｂ．ら，Ｉｆｅｎｐｒｏｄｉｌ  ａｎｄ  ＳＬ  ８２．０７１５  ａｓ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｎｔｉ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｉｌ．Ｅｘｐ．Ｔｅｒ．２４７（１９８８），１２１１−１２２１）。その時以来、上記ＮＲ２Ｂサブユニットの多くのさらなるアンタゴニスト（例えば、ＣＰ−１０１６０６、Ｒｏ  ２５−６９８１およびＲｏ  ６３−１９０８）が、記載されている（Ｋｅｍｐ，Ｊ．Ａ．；Ｋｅｗ，Ｊ．Ｎ．Ｃ．；Ｇｉｌｌ，Ｒ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １４１（Ｊｏｎａｓ，Ｐ．およびＭｏｎｙｅｒ，Ｈ．編）４９５−５２７（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９９）；Ｇｉｌｌ  Ｒ．ら：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＯ６３−１９０８（１−［２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｏｘｙ）−ｅｔｈｙｌ］−４−（４−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｙｌ）−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−４−０１），ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｏｔｙｐｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒａｔａｔｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０２（２００２），９４０−９４８）。これらはまた、上記動物モデルにおいてほとんど副作用を有さずに、神経保護効果を確かに示した。しかし、これらのポジティブな結果は、外傷性脳損傷における臨床的研究では確かめられ得なかった。むしろ、ＣＰ−１０１６０６は、繰返し失敗した（Ｐｆｉｚｅｒからのプレスリリース、２００１年１０月）。さらに、脳卒中において細胞損傷を減少するための適切な神経保護因子の探索と関連する特別な問題は、上記神経保護因子が、血栓のバリアを克服し、そして上記損傷組織領域へと浸透するためには、フィブリン溶解因子／血栓崩壊因子と組み合わせられなければならないことである（上記を参照のこと）。通常投与される血栓崩壊因子は、ｔ−ＰＡであり、これは、脳卒中の処置のために現在のところ承認されている、唯一の血栓崩壊因子である。
【００１７】
しかし、Ｎｉｃｏｌｅらの調査から、ｔ−ＰＡが、興奮毒性において重要な役割を担うことが知られている（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｏ；Ｄｏｃａｇｎｅ  Ｆ  Ａｌｉ  Ｃ；Ｍａｒｇａｉｌｌ  Ｉ；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ＥＴ；Ｖｉｖｉｅｎ  ＤおよびＢｕｉｓｓｏｎ  Ａ．２００１；Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；ｉｎ：Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，５９−６４）。このことによると、脱分極した皮質ニューロンは、ｔ−ＰＡを分泌し、このｔ−ＰＡは、上記ＮＭＤＡ型グルタミン酸レセプターのＮＲ１サブユニットと相互作用し、そしてそれを切断する。このことは、上記レセプター活性の活性化と関連している。従って、ｔ−ＰＡの投与は、細胞損傷性興奮毒性に寄与する。重要なことは、ｔ−ＰＡの神経毒性効果である。従って、脳卒中と関連する細胞損傷の予防および処置のための神経保護因子の開発は、上記脳卒中により引き起こされる細胞損傷を調節するだけでなく、また、血管を再び開くための治療剤の投与によって引き起こされるかもしくは増大される損傷を考慮に入れ得る、特別なチャレンジに直面している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明の目的は、神経学的損傷の処置および予防のための代替的可能性を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この目的は、神経保護因子としてｔ−ＰＡ活性を阻害する物質の使用によって、達成される。用語「阻害」は、この関係において、ｔ−ＰＡ活性の減少または低下をもたらす全ての効果を包含する。これは、例えば、競合的阻害または非競合的阻害、ｔ−ＰＡ分解の促進あるいはｔ−ＰＡ発現における他の低下（抑制）を包含し得る。用語インヒビターとは、対応して、細胞におけるｔ−ＰＡ活性の減少を引き起こす全ての物質をいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ｔ−ＰＡ活性は、特に、上記グルタミン酸レセプター（特に、ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプター）の活性化として定義される。上記神経保護因子による上記グルタミン酸レセプターの活性化の低下は、好ましくは、上記神経保護因子の投与において影響を受ける組織の細胞へのＣａ＋＋流入を決定することによって測定される。Ｃａ＋＋視覚化のためのアッセイは、当業者に公知であり、そして第ＩＩ節の実施例３に示される。
【００２１】
ｔ−ＰＡインヒビターは、広く公知である。従って、例えば、上記ｔ−ＰＡ活性が、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ）により調節されることは公知である。同様に、ｔ−ＰＡは、プロテアーゼセルピンまたはプロテアーゼネキシンＩ（ＰＮ−Ｉ）により阻害され得る。これらのインヒビターは、各々の場合、生理学的状況においてｔ−ＰＡを阻害する、セリンプロテアーゼインヒビターである。しかし、それらは、神経保護因子として、本発明に従って使用される。
【００２２】
本発明に従って、生理学的インヒビターの転写速度の増大を介して、上記ｔ−ＰＡ活性を間接的に低下することもまた、可能である。従って、例えば、ＰＡＩ−１の転写を刺激することが公知であるＴＧＦ−β（トランスホーミング増殖因子β）を投与することが可能である。
【００２３】
特に好ましい本発明の実施形態において、プラスミノーゲン活性化因子ＤＳＰＡ（デスモテプラーゼ（ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ））が、特に、興奮毒性に由来する（病理学的）状態の処置のために神経保護因子として使用される。ＤＳＰＡは、その異性体とともに、特に、米国特許第５，８３０，８４９号および同第６，００８，０１９号において詳細に記載されている。ＤＳＰＡの組み換え体の調製は、米国特許第５，７３１，１８６号において開示されている。これらの刊行物は、ＤＳＰＡの構造、機能および提供を開示する目的のために、本明細書中で参考として援用される。
【００２４】
特に好ましく使用されるデスモテプラーゼ異性体の一次構造は、図１に示される（ＤＳＰＡα１）。しかし、本発明に従って、同じ機能を有する他のＤＳＰＡ異性体を使用することもまた、可能である。これらは、同様に、上記米国特許において開示されている。これらのプラスミノーゲン活性化因子を、本明細書中の以下に、そこに関連するＤＳＰＡα１に限定することなく、ＤＳＰＡまたはデスモテプラーゼとして一律に言及する。
【００２５】
本発明に従って、天然の精製ＤＳＰＡおよび組み換えＤＳＰＡの両方を使用することが可能である。同様に、それらがＤＳＰＡの神経保護効果を示す限り、ＤＳＰＡの誘導体またはフラグメントを使用することが可能である。従って、用語「ＤＳＰＡ」は、本明細書中で、天然ＤＳＰＡまたは組み換えＤＳＰＡ、および実質的に同じ機能を有するそれらの誘導体、アナログまたはフラグメントのための総称的な用語として理解される。
【００２６】
ＤＳＰＡの、用語「誘導体、アナログまたはフラグメント」は、特に、天然ＤＳＰＡの特徴的な特性（特に、天然ｔ−ＰＡに対して上昇したフィブリン特異性）を機能的に示す、全てのタンパク質またはペプチドを包含する。ｔ−ＰＡに対して上記上昇したＤＳＰＡのフィブリン特異性は、ＷＯ  ０３／０３７３６３に開示されている。上記ＤＳＰＡ誘導体およびＤＳＰＡアナログは、好ましくは、図１に示されるＤＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは、８０％〜９０％の相同性を有する。
【００２７】
ＤＳＰＡの本発明に従う驚くべき神経保護効果は、動物実験およびインビトロ実験において同定され、これらの実験において、ＤＳＰＡが、神経毒性を有さないだけでなく、それがｔ−ＰＡの神経毒性を解消することから、神経保護効果をも有するということを示すことができた。このことから、ＤＳＰＡが、ｔ−ＰＡのアンタゴニストとして作用することが認識された。さらに、高濃度のＤＳＰＡが、それが単独で投与された場合でさえ（すなわち、ｔ−ＰＡを外部から投与することなく）、ＮＭＤＡに誘導されるニューロン損傷の減少を導くことを示すことができた。
【００２８】
ＤＳＰＡの神経保護効果を実験的に調査するために、マウス胎仔から単離された皮質ニューロンの培養物を、ＮＭＤＡを用いて処理し、従って、その結果ニューロン細胞死を誘導した。ＮＭＤＡに加えて、上記培養物培地は、種々の量のｔ−ＰＡおよび／またはＤＳＰＡを含有した。これらのインビトロ実験により、ｔ−ＰＡが、ＮＭＤＡにより誘導される細胞死の増強をもたらすのに対し、ＤＳＰＡは、この効果を引き起こさないことが示された（図２）。一方、ＤＳＰＡを、ｔ−ＰＡとともに投与した場合、ｔ−ＰＡ単独と比較して、ＮＭＤＡに誘導される細胞死が有意に減少した（図３）。さらに、このことから、ＤＳＰＡが、ｔ−ＰＡにより増強されるニューロン細胞損傷の顕著な濃度依存的減少を可能にすることが、明らかとなった。
【００２９】
ＤＳＰＡまたはｔ−ＰＡの事前投与に対するＣａ＋＋流入を決定するために、調査をさらに実施した。なぜなら、上記グルタミン酸レセプターの活性化により引き起こされるＣａ＋＋流入の減少は、各々の試験物質による神経保護の指標であることが公知であるからである。ＤＳＰＡによる神経保護はまた、これらの実験においても確認された。なぜなら、ＤＳＰＡは、細胞中への上記Ｃａ＋＋流入を増大せず、上記ｔ−ＰＡの損傷効果を解消したからである（図４）。
【００３０】
ＤＳＰＡの神経保護効果のメカニズムは、未だ確実には理解されていない。しかし、ＤＳＰＡの神経保護効果は、ＤＳＰＡは、ｔ−ＰＡのように上記グルタミン酸レセプターに結合するが、後者を分解せず、そして従って、活性化しないという事実に由来し得る。従って、ＤＳＰＡは、それ自体、上記興奮毒性に寄与せず、そして恐らく、ｔ−ＰＡによる上記レセプターの活性化をブロックする。
【００３１】
ＤＳＰＡの神経保護因子としての適性は、特に、１９９５年から公知であるｔ−ＰＡの神経毒性に鑑みて、驚くべきことである。ＤＳＰＡおよびｔ−ＰＡは、かなりの機能的一致および構造的一致を有するから、従って、ＤＳＰＡもまた神経毒性であることが予測されていた。
【００３２】
ＤＳＰＡまたはその誘導体もしくはフラグメントの本発明に従う使用の特別な有用性は、ＤＳＰＡの驚きをもって見出された神経保護効果に起因して、血栓溶解特性および神経保護特性の両方を有する治療剤を使用可能であるという事実に基づく。
【００３３】
この有用性は、脳卒中の処置において特に効力を発揮する。なぜなら、脳卒中と関連する組織損傷は、特に、内因性ｔ−ＰＡおよび治療目的で適切な部位に投与されるｔ−ＰＡの神経毒性副作用に起因するからである。ＤＳＰＡの神経保護効果を介して、少なくとも、ｔ−ＰＡのこれらの損傷効果を解消することが可能である。
【００３４】
本発明の特に有用な実施形態において、従って、ＤＳＰＡは、血栓崩壊因子（例えば、ｔ−ＰＡ）と組み合わせて、脳卒中の処置において神経保護因子として投与され得る。従って、患者のためにｔ−ＰＡの治療的有用性を利用し、同時に、神経保護因子としてのＤＳＰＡにより、その神経毒性副作用を中和するか、またはそうでなくとも、少なくとも緩和することが可能である。
【００３５】
神経保護因子として本発明に従って使用される物質は、非常に多くの病理学的状態の処置のために使用され得る（上記を参照のこと）。可能な使用としては、神経変性障害（例えば、振せん麻痺、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病および糖尿病）の処置、疼痛状態の処置、依存性障害の処置、神経学的障害および精神病学的障害（例えば、癲癇、行動障害、鬱、不安状態および記憶妨害、ならびに認知機能の全般的改善）、および筋萎縮性側索硬化症の処置が挙げられる。上記ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターの過剰な活性化は、これらの障害または状態の各々の病理学において重要な部分を担う。
【００３６】
初期の臨床試験において、患者の情動状態に対して、本発明に従って使用され得る神経保護因子の治療効力を示すことはまた、既に可能となっている。この研究において、ＤＳＰＡを用いて処置された患者の情動状態（鬱状態および不安状態）が試験された。
【００３７】
用語「鬱」は、本明細書中で、広く定義される（すなわち、それは、外部の状態に対する適切な応答として見なされ得ない全ての情動障害または精神障害を包含し、それらの発症に対する生理学的背景または薬理学的背景にかかわらない）。用語「鬱」はまた、特に、不安状態も包含する。従って、用語「抗鬱剤」とは、広くこれらの障害の処置のための治療剤をいう。
【００３８】
臨床研究が実施され、急性虚血性脳卒中におけるＤＳＰＡα１の臨床的効果および安全性が評価された（本明細書中以下の、急性虚血性脳卒中、ＤＩＡＳ研究におけるデスモテプラーゼ）。これは、プラセボコントロール無作為第ＩＩ相二重盲検試験であり、ここで、ＤＳＰＡは、脳卒中症状の発症後３時間〜９時間以内に、患者に静脈内投与された。
【００３９】
４６人の患者が、彼らの脳卒中により作用されている脳の領域が、不可逆的に損傷されているか、またはそうでなければ部分的に損傷されているか、あるいは脳の危険に曝されている領域が、まだ救済され得るかどうかに従って選択され、この研究の第１部に参加した。脳の以前に損傷された領域が、血栓崩壊因子を用いた再灌流により潜在的に救済され得る患者のみが、この研究に含まれた。上記患者は、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）によって選択された。
【００４０】
上記４６人の研究された患者のうち、１６人の患者は、プラセボを用いて処置された。他の３０人は、デスモテプラーゼ製品を受容し、１７人の患者は、２５ｍｇの活性成分を用いて処置され、そして１３人の患者は、３７．５ｍｇまたは５０ｍｇの活性成分を用いて処置された。
【００４１】
上記プラセボ処置患者のうちの５６％超が、鬱を訴えた。これらの鬱は、各々の処置した医師により、明らかに鬱として診断されたが、さらなる情報の欠如に起因して、特定の鬱の現れに対して、明瞭な指定を保証することは不可能であった。従って、この鬱症候群は、各々の場合に処置した医師により、「鬱ＮＯＳ」（すなわち、「別に特定されない」）として分類された。
【００４２】
従って、上記プラセボ処置患者の半数より多くが、これらの特定されない鬱を示したのに対し、比較するデスモプテラーゼ処置群におけるそれらによって作用された患者の割合は、全体で１６．７％にすぎなかった。
【００４３】
５６人の患者が、特に、６２μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇのＤＰＳＡ、またはプラセボを用いて処置され、この研究の第２部に参加した。上記研究の第２部の結果は、再灌流および鬱頻度の減少の両方に関して、上記第１部の結果を確かなものとした。
【００４４】
これらの結果に基づいて、ＤＳＰＡα１のための好ましい投与量は、情動障害の処置のために、６０μｇ／ｋｇ超かつ１６０μｇ／ｋｇ未満、特に、９０μｇ／ｋｇ〜１２５μｇ／ｋｇである。しかし、上記情動障害の減少はまた、より高い投与量を用いても可能である。
【００４５】
上記投与量は、他のＤＳＰＡ異性体、またはそうでなければＤＳＰＡの誘導体、アナログもしくはフラグメントの使用においては、それらと異なり得る。上記投与量は、これらの場合、各々の使用される物質の生物学的等価性に基づいて、有利に適合される。
【００４６】
この低い投与量は、特に、ｉ．ｖ．ボーラス投与により単一の処置を実施する場合、脳卒中に続く鬱（脳卒中後の鬱）のために有利である。次いで、９０μｇ／ｋｇのＤＳＰＡでさえ、充分であり得る。ずっとより低い投与量は、（亜）慢性的使用に対して充分であり得る。これは、特に、本発明に従って使用され、そして内因性ｔ−ＰＡ生成の抑制を引き起こすｔ−ＰＡインヒビターに対して適用する。一方、上記投与量は、上記ＮＭＤＡレセプターにおいて競合的阻害を引き起こすインヒビターに対して好ましい。より急性でない病理学的状態のために有利であるのは、皮下処方物、経口処方物または吸入処方物である。
【００４７】
ヒトにおける上記情動状態および学習行動のためのｔ−ＰＡの重要性は、公知である。従って、ｔ−ＰＡは、健康なヒトの学習行動において正の部分を担う（Ｐａｗｌａｋ  ２００２および２００３）。同様に、ｔ−ＰＡ欠損マウス変異体に対する調査から、扁桃におけるｔ−ＰＡが、ストレス誘発性不安状態のための重要な因子に相当し（Ｐａｗｌａｋら  ２００３）、そして不安の誘発において不可欠である（Ｐａｗｌａｋ  ２００３）ことが公知である。一方、鬱の発症は、いわゆるニューロン可塑性と関連しているようであり、このニューロン可塑性によって、身体は、ストレス（例えば、損傷）に応答し得る。このプロセスは、今日までの知見に従うと、特に、上記ｔ−ＰＡ媒介性グルタミン酸レセプター活性化により調節されている。
【００４８】
まとめて考えると、上記公知の調査により、ストレスまたは損傷を介して放出される上記内因性ｔ−ＰＡが、シナプス後細胞のためのシグナルを示し、そして可塑性ニューロン変化のためのトリガーとして作用することが明らかである。
【００４９】
神経可塑性の基礎をなすメカニズムは、恐らく、いわゆる長期増強（ＬＴＰ）および長期抑圧（ＬＴＤ）を包含する。ＬＴＰは、ニューロンの高頻度の興奮およびそれによって誘導される脱分極の増大によって誘導される。この長期増強は、ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターのグルタミン酸依存性活性化に基づき、Ｃａ＋＋放出の上昇を引き起こす。カルシウム濃度の上昇は、シナプス効力の上昇をもたらし、そして従って、特定の環境に対する適合を可能とする。
【００５０】
ＬＴＤは、先に生じるＬＴＰの「埋め合わせ」として、またはそうでなければ、新たに低頻度の電気的刺激によって誘導され得る。従って、ＬＴＰのように、そのメカニズムは、上記ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターの活性化に基づく。しかし、このことは、適度なＣａ＋＋流入、そして従って、シナプス効力の減少のみを引き起こす。このことは、抑圧を引き起こす。
【００５１】
現在では、ｔ−ＰＡが、上記ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターに結合し、そしてそれを分解し、そして従って、それを活性化することが公知である。このことは、Ｐａｗｌａｋらによって観察された、ｔ−ＰＡによるニューロン可塑性に対する影響のための、基礎を形成し得る。長期増強の発達および長期抑圧の発達の両方が、放出ｔ−ＰＡ量の関数として説明可能である。
【００５２】
従って、本発明に従うＤＳＰＡの神経保護効果に対する記載される調査から、ＤＳＰＡが、上記ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターの活性化を、アンタゴニストとしてブロックし、そして従って、結果として長期抑圧を解消し得ることが推論され得る。
【００５３】
シナプス活性（そして従って、ＬＴＰおよび／またはＬＴＤ）に対するＤＳＰＡおよびｔ−ＰＡの効果の差異はまた、ニューロン細胞に対するカルシウム動員実験から明らかである（上記を参照のこと）。これらのインビトロ実験により、ニューロン細胞のｔ−ＰＡを用いた処理が、ＮＭＤＡ依存性カルシウム放出を引き起こすのに対し、ＤＳＰＡを用いた同じ処理は、上記細胞内カルシウム濃度に対して効果を有さないことが示されている（図４を参照のこと）。ｔ−ＰＡにより引き起こされる濃度の上昇は、コントロール群と比較して、３０％であった。
【実施例】
【００５４】
（例示的実施形態）
（Ｉ．臨床研究（ＤＩＡＳ））
情動障害（鬱状態および不安状態）に対するＤＳＰＡの効果についてのＤＩＡＳ研究の結果を、図５に要約する。
【００５５】
（ＩＩ．マウス皮質ニューロンに対するインビトロ調査）
（一次皮質哺乳動物ニューロンの培養）
妊娠したスイス白色マウス（Ｓｗｉｓｓ  ｗｈｉｔｅ  ｍｉｃｅ）（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｈｏｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を妊娠期間の１４日目〜１６日目で犠牲にし、そしてその子宮を取り出した。滅菌状態下でその胎仔を取り出し、その頭部を切断し、その脳を露出させて、そして解剖顕微鏡（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏ．）下で、マイクロジセクション（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）によってその大脳新皮質（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｎｅｃｏｒｔｉｃｅｓ）を解剖した。上記解剖は、３ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有するハンクスの平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５．３７ｍＭ  ＫＣｌ，４．１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，４４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，０．１３ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ  ピルビン酸塩，１３ｍＭ  Ｄ（＋）グルコースおよび０．００１ｇ／Ｌ  フェノールレッド）（ｐＨ  ７．４）中で、氷上で実施した。脳膜および血管を注意深く取り除いた。その組織を、プラスチックピペットのチップを用いて破壊して小片にし、そのフラグメントを収集するために、１０００ｇの速度で短時間遠心した。上記フラグメントのペレットを、トリプシン（０．２ｍｇ／ｍｌ）およびデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ，８８０Ｕ／ｍｌ）を含有する暖かい（３７℃）ＨＢＳＳ（３ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）に再懸濁し、そして３７℃で５分間、振盪水浴中でインキュベートした。上記フラグメントの消化を、トリプシンインヒビター（８３．２μｇ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ（８８０Ｕ／ｍｌ）およびＭｇＳＯ４（１．２２ｍＭ）を含有する等量のＨＢＳＳ（３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）を添加することによって停止し、そして１０００ｇで５分間遠心した。その上清を、吸引除去し、そしてトリプシンインヒビター（０．５２ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ（８８０Ｕ／ｍｌ）およびＭｇＳＯ４（２．７ｍＭ）を含有するＨＢＳＳを、上記ペレットに添加した。上記組織を、トリチュレーション（内径２４の針を用いて、１５パス）によって分離し、そして１０００ｇで５分間遠心した。その上清を吸引除去し、そしてその細胞を、２％  Ｂ２７  補充物（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、０．５ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％  透析ウシ胎仔血清（ｄＦＣＳ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ；ＮＢＭ）（本明細書中以下で、完全ＮＢＭと呼ぶ）中に再懸濁した。上記懸濁液の細胞密度および培養収率を、繰り返されたヘモサイトメーターチャンバー中での細胞計数によって見出した。上記細胞を、各々の場合、ＮｕｎｃＴＭ（Ｄｅｎｍａｒｋ）２４サンプルプレートまたは９６サンプルプレート中で、０．３×１０６細胞／サンプルチャンバーまたは０．１２×１０６細胞／サンプルチャンバーの密度で接種し、０日目（０  ｄｉｖ）のインビトロ時間として規定した。上記プレートを、細胞接着を促進するために、ポリ���Ｄ−リジン（５０μｇ／ｍｌ）で事前にコーティングした。このコーティングを、３７℃、一晩のインキュベート後に除去した。２４時間後（１細胞分裂）、完全ＮＢＭを、ｄＦＣＳを含まない完全ＮＢＭ（２．５％  Ｂ２７補充物）によって置換した。血清を含まない完全ＮＢＭの半分を、３〜４分裂ごとに置換した。上記細胞を、ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃に維持し、そして倒立位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＩＭＴ−２）によって試験した。上記細胞培養物の形態学を、進行した細胞損傷として記録するために、写真を撮った（Ｋｏｄａｃｏｌｏｒ  Ｇｏｌｄ  １００  Ｉｓｏ  ｆｉｌｍ）。全ての操作工程を、（別に示さなければ）室温で実施した。
（１．ＮＭＤＡ誘導性ニューロン細胞死に対するｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの効果）
ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡによるＮＭＤＡ誘導性細胞死の増加を、上記プロトコールに従って、培養した上記皮質ニューロンに対してＮＭＤＡ（３０μＭまたは７０μＭ）を添加することによって試験し、そしてその培養物を、さらに２４時間インキュベートした。誘導された細胞死の程度を、比較としてＴＸ−１００による完全溶解液を用いて、遊離乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を決定することによって測定した（図２）。次いで、上記ＮＭＤＡを、各々の場合、増加した濃度のｔ−ＰＡ（５ｎＭ、５０ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ）またはＤＳＰＡ（５ｎＭ、５０ｎＭ、５００ｎＭ）存在下で上記培養物に添加し、そして上記細胞死を類似の様式で決定した。
【００５６】
３０μＭまたは７０μＭのＮＭＤＡの添加は、両方のＮＭＤＡ濃度で有意な細胞死を引き起こす（図２を参照のこと）。増加した濃度のｔ−ＰＡ存在下、誘導された細胞死率の増加が見られるが、各々の場合、最も高い５００ｎＭのｔ−ＰＡ濃度のみである（図２を参照のこと）。対照的に、ＤＳＰＡによっては上記ＮＭＤＡ誘導性細胞死の促進は見られず、特に、高ＤＳＰＡ濃度では、上記ＮＭＤＡ誘導性細胞死の減少さえ見られる。ＮＭＤＡの非存在下、ニューロン細胞死は、ｔ−ＰＡによってもＤＳＰＡによっても誘導されない（図２を参照のこと）。
【００５７】
（２．ＤＳＰＡによるｔ−ＰＡ誘導性細胞死の減少）
ＤＳＰＡの添加が、上記ＮＭＤＡ誘導細胞死のｔ−ＰＡに誘導される促進を解消し得るかどうかを見出すために、さらなるインビトロ実験を実施した。この目的のために、各々の場合、７０μＭ  ＮＭＤＡを、５００ｎＭの一定ｔ−ＰＡ濃度ならびに５ｎＭ、５０ｎＭおよび５００ｎＭの増加するＤＳＰＡ濃度の存在下、皮質ニューロンの一次培養物に添加した（図３）。上記培養物において生じる細胞損傷の程度を、２４時間のインキュベーション後の遊離乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量に基づいて、再び決定する。
各々の場合、ＮＭＤＡ（７０μＭ）を、５００ｎＭの一定ｔ−ＰＡ濃度ならびに増加するＤＳＰＡ濃度（５ｎＭ、５０ｎＭ、５００ｎＭ）で、皮質ニューロンの一次培養物に添加し、そして上記ニューロン細胞死を、２４時間後の遊離ＬＤＨ量に基づいて決定した。このことにより、増加するＤＳＰＡ濃度によって誘導されるニューロン細胞死の、ｔ−ＰＡ依存性刺激の阻害が明らかとなった。
【００５８】
（３．Ｃａ＋＋動員実験）
細胞内カルシウム濃度を、Ｆｌｕｏ−３／ＡＭを用いたアッセイによって調査した。この目的のために、皮質ニューロンを、９日間培養し（上記を参照のこと）、そしてＨＥＰＥＳ緩衝化された生理食塩溶液中の１０μＭ  Ｆｌｕｏ−３／ＡＭで充填した。この生理食塩溶液は、３７℃で１時間、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．６２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび６ｍＭ  グルコース（ｐＨ  ７．４）を含有した。色の分散を容易にするために、ＤＭＳＯ（１％）および０．２％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を添加した。
【００５９】
上記細胞を、上記ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて洗浄し、このＨＥＰＥＳ緩衝液は、色がその緩衝液から消失することを防ぐために、１ｍＭ  フロセミド（その後は全ての緩衝液中で用いられた）を含有した。上記細胞の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、そのようにしてベースラインを得るために洗浄後に、そして処理時間（５分）の間、４８５／５３０ｎｍ（励起／放射）で測定した。ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  ａｓｃｅｎｔフルオロメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を、このために使用した。
【００６０】
図４に示すように、上記ＮＭＤＡ処理単独で、１分後のカルシウム濃度の有意な上昇を引き起こした（Ｐ＜０．０５）。これらのカルシウム濃度は、上記細胞を、上記ＮＭＤＡを添加する前に５分間、ｔ−ＰＡ（３０μｇ／ｍｌ；５００ｎＭ；Ｐ＜０．０５）を用いて事前に処理した場合、さらに３０％まで上昇した。
【００６１】
これらの結果は、Ｎｉｃｏｌｅら（２００１）による報告と一致し、ここで、ｔ−ＰＡの事前の添加は、ＮＭＤＡによる上記カルシウム放出をさらに増加した。ｔ−ＰＡ単独の処理は、遊離カルシウムイオン濃度の変化を引き起こさなかった。一方、ＮＭＤＡ添加前に５分間、ＤＳＰＡを用いて上記ニューロン細胞を事前に処理することは、ＮＭＤＡ単独の添加によって達成される程度を超えて上記カルシウム濃度を変化させなかった。従って、ＤＳＰＡ単独では、上記細胞内カルシウム濃度に対して効果を有さなかった。
【００６２】
（参考文献のリスト）
【００６３】
【表１】
2006525277.tif 000002
2006525277.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】記載なし。
【図２】記載なし。
【図３】記載なし。
【図４】記載なし。
【図５】記載なし。
【図１】
2006525277.tif 000004
【図２】
2006525277.tif 000005
【図３】
2006525277.tif 000006
【図４】
2006525277.tif 000007
【図５】
2006525277.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月2日(2005.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸レセプターのｔ−ＰＡ媒介性活性化のインヒビター、好ましくは、ＮＭＤＡ型グルタミン酸レセプターのｔ−ＰＡ媒介性活性化のインヒビターの、ヒトにおける鬱状態または不安状態の処置のための、使用。
【請求項２】
ｔ−ＰＡ活性を阻害するプロテアーゼの使用によって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
セリンプロテアーゼインヒビターによって、好ましくは、ニューロセルピン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ）またはプロテアーゼネキシンＩ（ＰＮ−Ｉ）によって特徴付けられる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＤＳＰＡ、あるいは機能的および／もしくは構造的に該ＤＳＰＡに由来し得る、ＤＳＰＡ誘導体、ＤＳＰＡアナログまたはＤＳＰＡフラグメントの使用によって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
図１に示されるようなアミノ酸配列を有するＤＳＰＡ、または該ＤＳＰＡに対して少なくとも７０％、好ましくは、８０％〜９０％の相同性を有するＤＳＰＡ誘導体、ＤＳＰＡアナログもしくはＤＳＰＡフラグメントが使用される点で特徴付けられる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
６２．５μｇ／ｋｇ超かつ１６０μｇ／ｋｇ未満の図１に示されるようなＤＳＰＡ、好ましくは、９０μｇ／ｋｇ〜１２５μｇ／ｋｇのＤＳＰＡ、特に好ましくは、９０μｇ／ｋｇのＤＳＰＡの投与量、または前記使用される誘導体、アナログもしくはフラグメントの生物学的等価性に依存してこれらに対して調整された投与量によって特徴付けられる、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
ＤＳＰＡまたは該ＤＳＰＡの誘導体、アナログもしくはフラグメントが、血栓崩壊因子と組み合わせて脳卒中の処置において神経保護因子として使用される点で特徴付けられる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
血栓崩壊因子としてのｔ−ＰＡによって特徴付けられる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＤＳＰＡ、あるいは機能的および／もしくは構造的に該ＤＳＰＡに由来し得る誘導体、アナログまたはフラグメントの、ヒトにおける神経保護因子としての使用。
【請求項１０】
鬱状態または不安状態の処置のための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
以下の状態：振せん麻痺、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、糖尿病、疼痛状態、癲癇もしくは記憶障害のうちの１つの処置または予防によって特徴付けられる、請求項９に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月13日(2006.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006525277000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月9日(2006.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸レセプターの組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）媒介性活性化のインヒビターを含有する、ヒトにおける鬱状態または不安状態の処置に使用するための、組成物。
【請求項２】
前記グルタミン酸レセプターが、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸レセプターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記インヒビターがｔ−ＰＡ活性を阻害するプロテアーゼである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼインヒビターである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記セリンプロテアーゼインヒビターが、ニューロセルピン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ）またはプロテアーゼネキシンＩ（ＰＮ−Ｉ）からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＡＩが、デスモテプラーゼ（ＤＳＰＡ）、あるいは機能的および／もしくは構造的に該ＤＳＰＡに由来し得る、誘導体、アナログまたはフラグメントである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＤＳＰＡが、（ａ）図１に示されるようなアミノ酸配列を有するＤＳＰＡ、または（ｂ）該アミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同性を有するＤＳＰＡ誘導体、ＤＳＰＡアナログもしくはＤＳＰＡフラグメント、または（ｃ）該アミノ酸配列に対して少なくとも８０〜９０％の相同性を有するＤＳＰＡ誘導体、ＤＳＰＡアナログもしくはＤＳＰＡフラグメントのいずれかより選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記アミノ酸配列に示されるようなＤＳＰＡの投与量が、（ａ）６２．５μｇ／ｋｇ超かつ１６０μｇ／ｋｇ未満のＤＳＰＡ、または（ｂ）９０μｇ／ｋｇ〜１２５μｇ／ｋｇのＤＳＰＡ、または（ｃ）９０μｇ／ｋｇのＤＳＰＡであるか、あるいは該ＤＳＰＡの誘導体、アナログもしくはフラグメントの生物学的等価性に依存して該ＤＳＰＡの投与量に対して調整された投与量である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
ＤＳＰＡまたは該ＤＳＰＡの誘導体、アナログもしくはフラグメントを血栓崩壊因子と組み合わせて含有する、脳卒中の処置において神経保護因子として使用するための、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記血栓崩壊因子がｔ−ＰＡである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＤＳＰＡ、あるいは機能的および／もしくは構造的に該ＤＳＰＡに由来し得る誘導体、アナログまたはフラグメントを含有する、ヒトにおいて神経保護因子として使用するための組成物。
【請求項１２】
鬱状態または不安状態の処置において使用するための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記神経保護が、以下の状態：振せん麻痺、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、糖尿病、疼痛状態、癲癇もしくは記憶障害のうちの１つのための処置または予防である、請求項１１に記載の組成物。
【国際調査報告】
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