(57)【要約】  既知の抗腫瘍化合物CNDACのN4誘導体は、膵癌の治療において、特に補助治療として、さらに特に長期投与に関して有用である。2006528989.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の膵癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量の、1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を含んでなる医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、膵癌を治療する方法。
【請求項２】
投与される医薬組成物が経口投与に適する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与される医薬組成物のN4置換誘導体が、N4位を介して、置換可能なアルキル（1-20C）；アルケニル（2-20C）；アルキニル（2-20C）；アシルもしくは不飽和アシル（1-24C）である置換基と結合したCNDACを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記置換基がアシルまたは不飽和アシルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アシルがパルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸またはオレイン酸の残基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記CNDAC誘導体がCS-682（1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-パルミトイルシトシン）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が、前記の１つ以上の膵癌細胞を除去するように、化学療法、放射線療法および／または外科手術によって治療されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗腫瘍薬の投与を追加して含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
投与が少なくとも２か月にわたって継続される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与が少なくとも２週間にわたって継続される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与が毎日実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
単位用量のCNDACのN4置換誘導体を、少なくとも1つの製薬上許容される賦形剤と混合して含んでなる、膵癌の補助治療用にデザインされた医薬組成物。
【請求項１３】
前記誘導体がCS-682である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
経口投与に適した、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
経口投与に適した、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
有効な量の1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を、それを必要とする被験体において１つ以上の膵癌細胞の増殖を抑制する薬物を調製するための使用。
【請求項１７】
薬物が経口投与に適する、請求項１６の使用。
【請求項１８】
N4置換誘導体がN4位に置換を含んでなり、その置換基が置換可能なアルキル（1-20C）；アルケニル（2-20C）；アルキニル（2-20C）；アシルもしくは不飽和アシル（1-24C）である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記置換基がアシルまたは不飽和アシルである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記アシルがパルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸またはオレイン酸の残基である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記CNDAC誘導体がCS-682（1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-パルミトイルシトシン）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記被験体が、前記の１つ以上の膵癌細胞を除去するように、化学療法、放射線療法および／または外科手術によって治療されている、請求項１６に記載の使用。
【請求項２３】
薬物が抗腫瘍薬を追加して含んでなる、請求項１６に記載の使用。
【請求項２４】
薬物が少なくとも２か月にわたる投与に適する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２５】
薬物が少なくとも２週間にわたる投与に適する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
薬物が毎日の投与に適する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
１つ以上の膵癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量の、1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を含んでなる医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与し、それによって膵癌細胞において自己DNA鎖切断が引き起こされることを含んでなる、膵癌細胞において自己DNA鎖切断を引き起こす方法。
【請求項２８】
投与される医薬組成物が経口投与に適する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
投与される医薬組成物のN4置換誘導体が、N4位を介して、置換可能なアルキル（1-20C）；アルケニル（2-20C）；アルキニル（2-20C）；アシルもしくは不飽和アシル（1-24C）である置換基と結合したCNDACを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記置換基がアシルまたは不飽和アシルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アシルがパルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸またはオレイン酸の残基である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記CNDAC誘導体がCS-682（1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-パルミトイルシトシン）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体が、前記の１つ以上の膵癌細胞を除去するように、化学療法、放射線療法および／または外科手術によって治療されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
抗腫瘍薬の投与を追加して含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
投与が少なくとも２か月にわたって継続される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与が少なくとも２週間にわたって継続される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与が毎日実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
１つ以上の膵癌細胞の転移を抑制するのに有効な量の、1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を含んでなる医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、膵癌転移を抑制する方法。
【請求項３９】
１つ以上の膵癌細胞の外科的切除前、切除中、または切除後に投与が行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
１つ以上の膵癌細胞の放射線治療前、治療中、または治療後に投与が行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
投与される医薬組成物が経口投与に適する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
投与される医薬組成物のN4置換誘導体が、N4位を介して、置換可能なアルキル（1-20C）；アルケニル（2-20C）；アルキニル（2-20C）；アシルもしくは不飽和アシル（1-24C）である置換基と結合したCNDACを含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記置換基がアシルまたは不飽和アシルである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アシルがパルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸またはオレイン酸の残基である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記CNDAC誘導体がCS-682（1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-パルミトイルシトシン）である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、N4でのアシル化によってシチジンデアミナーゼの活性から保護されるシチジンのアナログを用いて膵癌を治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌は、ヒトの悪性腫瘍の中で最も致死的なものの１つであって、米国内だけでも死者は年間30,000人を越える。診断時に、典型的な例では、局所進行癌または遠隔転移が存在するため、切除可能と認められるのは前記癌の10%から15％に過ぎない。現在、進行膵癌の治療で最も一般的な方法は、静脈内投与される2’-デオキシシチジン ヌクレオシドアナログであるゲムシタビンによる治療であって、このアナログはヒト膵癌細胞のアポトーシスを引き起こし、腫瘍の増殖および進行を抑制することができる。しかしながら、最高の内科的または外科的治療技術をもってしても、膵管腺癌患者の治療結果は惨憺たるものである；集団として、この病気の患者の生存期間の中央値は21ヶ月に満たない。明らかに、新規の有効な治療方法が、この致命的な病気と闘うために必要とされている。
【０００３】
近年、新規ヌクレオシドアナログ、CS-682が発表され、いくつかの皮下に移植された固形腫瘍異種移植片において強力な抗腫瘍活性を有することが明らかになった（Kaneko, M.,et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. (1997)38 : 679）。CS-682は経口投与される1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル) シトシン（CNDAC）のN4-パルミトイル誘導体、すなわち2´-デオキシシチジンアナログであって、その抗腫瘍効果はDNAポリメラーゼを阻害する能力、およびDNA鎖内に活性代謝産物を組み込むことによって自己DNA鎖切断を引き起こす能力の両者によると考えられる（Hanaoka, K., et al., Int. J. Cancer (1999) 82: 226-236）。経口CS-682は、胃、肺、大腸および乳房の腫瘍細胞株を含めて、いくつかの腫瘍細胞株に対して親化合物より強い細胞傷害活性を示すことが明らかになっている。
【０００４】
CS-682の効果に関するこれまでの研究は、主として、in vivo細胞培養および非転移性皮下異種移植モデルにおいて、この薬物の有効性を示している。ただ１つの先行研究がCS-682の肝転移への影響を記載している（(Wu, M., et al., Cancer Res. (2003) 63 (10): 2477-82)。CS-682の膵癌への効果は明らかでない。
【発明の開示】
【０００５】
CS-682および同様に保護されるCNDACアナログは、膵癌の長期コントロールおよび抑制に有効であることが見出された。これは補助治療として、すなわち外科手術、化学療法もしくは放射線治療により最初に行われる腫瘍の除去を補う長期に渡る治療として、特に重要である。
【０００６】
したがって、ある態様において、本発明は、被験体において膵癌を治療する方法に関するものであって、その方法はそうした治療を必要とする被験体に、膵癌の増殖を抑制もしくは防止するのに有効な量の、1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を投与することを含んでなる。
【０００７】
別の態様において、本発明は、この治療を追加の治療薬の投与と併用することに関するものであって、被験体がすでに、たとえば外科手術によって、原発腫瘍を除去するように治療を受けた後に、この治療を施すことに関する。さらに別の態様において、本発明は、膵臓腫瘍の補助治療に有効な単位用量の前記シチジンアナログの医薬組成物に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、膵癌の補助治療用にデザインされた医薬組成物に関するが、この医薬組成物は、単位用量の、CNDACのN4置換誘導体を、少なくとも1つの製薬上許容される賦形剤と混合して含んでなる。
【０００９】
別の態様において本発明は、膵癌細胞において自己DNA鎖切断を引き起こす方法に関するが、その方法は、１つまたは複数の膵癌細胞の増殖を抑制するために有効な量の1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル) シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなり、それによって膵癌細胞において自己DNA鎖切断が引き起こされる。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、膵癌の転移を抑制する方法に関するものであり、その方法は、１つまたは複数の膵癌細胞の転移を抑制するために有効な量の1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル) シトシン（CNDAC）のN4置換誘導体を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法によれば、N4位で脱アミノ反応から保護されるシチジンアナログ誘導体、特にCNDAC誘導体は、特に手術や他の方法による原発腫瘍の除去を補助するものとして、膵癌を制御するための無毒で持続可能な治療に有用である。
【００１２】
本発明の化合物はシチジンアナログCNDACの誘導体である。この誘導体は、アシル化によって、またはアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基といった他の適当な保護基によって、シトシン部分のN4窒素が保護される。多不飽和アルケニルおよびアルキニル基も使用できる。しかしながら、N4窒素はアシル化によって、できれば長鎖脂肪酸によって保護されることが好ましい。このように、適当な保護基はアルキル（1-20C）；アルケニル（2-20C）；アルキニル（2-20C）；アシルおよび不飽和アシル（1-24C）を包含する。これらの基は、生理学的に適合する置換基、たとえばハロ、好ましくはフルオロ、アミノ、アルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、およびN4置換基の保護効果を損なうことのない、またはアナログの抗腫瘍効果を妨げない他の生理学的に適合する置換基によって、さらに置換されていてもよい。好ましい置換基は、ミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸およびオレイン酸といった、天然に存在する脂肪酸（不飽和脂肪酸を含む）の残基である。特に好ましいのは、すでに抗腫瘍薬として認められている化合物CS-682である；この誘導体において、置換基は、パルミチン酸から誘導されたアシル基である。したがって、本発明の好ましい化合物は、1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-ミリストイルシトシン；1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-ステアロイルシトシン；1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-パルミトイルシトシン；および1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-オレオイルシトシンを包含するがそれに限定されない。
【００１３】
上記化合物を合成する方法は、当業者によく知られている。たとえば、米国特許第5,691,319号を参照されたい。これは参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【００１４】
毒性がないためにこれらの化合物を長期間にわたって投与することができるので、膵臓腫瘍細胞の増殖およびその転移を抑止する、長期に渡る治療が可能となる。その上、これらの誘導体は経口投与が可能であって、そのことは長期ベースでその使用を容易にする。したがって、本発明の化合物は、数日、数週間、通常1-2週間、数ヶ月、通常1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23ヶ月以上から２年以上までの期間にわたって投与することができる。投与は毎日のように、または望ましい治療をもたらすために長期間にわたって繰り返す何らかの他のプロトコルによって実施することができる。
【００１５】
「治療」という用語は、膵臓腫瘍細胞の内在が確認された被験体において肯定的な結果に作用することを指す。肯定的な結果は、腫瘍の退縮、腫瘍増殖の抑制、転移形成の予防もしくは抑制、生存期間の延長、クオリティーオブライフの向上、または本発明の医薬品の投与から生じる他のいかなる肯定的な結果であってもよい。
【００１６】
「補助」治療は、原発腫瘍が化学療法、放射線療法および／または外科手術によって除去または抑制されている場合の治療を指す。したがって、本発明の方法による治療は、それが「補助」治療である場合、追加の抗腫瘍処置と併せて実施される。
【００１７】
数多くの化学療法薬が膵癌治療のために利用できる。そうした薬剤の例には、ゲムシタビン、イリノテカン、パクリタキセル、フラボピリドール、ドキソルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、エキサテカンなどがあるがそれらに限定されない。上記および他の薬剤を本発明の化合物と併用して、膵癌を治療することができる。
【００１８】
放射線療法も膵癌の治療によく用いられる。本発明の化合物を放射線療法の補助として使用して、両方の治療法の有効性を高めることができる。
【００１９】
本明細書に記載の誘導体化合物の投与量レベルは、誘導体それ自体の選択、被験体の症状の重篤度、投与法、被験体の全般的な健康状態、および主治医の判断によって決まる。１日あたり0.1-500 mg/kgの範囲の投与量、好ましくは１日当たり1-200 mg/kgが想定されるが、ただしいかなる特別な場合にもこの範囲外の投与量を指示することがあり得る。注射による送達、経粘膜投与経路、経皮投与経路（皮膚貼付剤、座剤、スプレー式点鼻薬を含める）などを含めて、どのような投与経路も用いることができるが、経口投与が被験体に便利で受容可能であるため好ましい。経口投与は、当技術分野で一般に了解されている、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、散剤、および風味付けされた組成物といった、経口摂取に適した製剤を用いる。本発明の化合物によって代表されるタイプの分子に適した製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出され、これは参考として本明細書に含めるものとする。
【００２０】
本発明の化合物は、毒性が低いため、長期間にわたって毎日投与することができる。詳細には、連日投与、すなわち１日当たり1-5回、好ましくは1-2回、さらに好ましくは１回の投与を必要とするプロトコルが好ましい。ある適当なプロトコルにおいて、たとえば、本発明の化合物は、被験体の体重に基づいて20 mg/kgとなる量の化合物をそれぞれ含有する、風味付けしたチュアブル錠（咀嚼錠）として、１日当たり1-2回投与される。したがって、70kgのヒトに向けてデザインされた単一錠は、約1.4 gの活性成分を含有することになる。たとえば食前食後に、もっと頻回により低用量を投与することは別の好ましいプロトコルとなる。
【００２１】
腫瘍の再発もしくは転移を予防または抑制するために必要である限り、治療を持続することができる。
【００２２】
下記の実施例は本発明を限定するものではなく、説明のために提供される。
【実施例１】
【００２３】
膵癌マウスモデルにおけるCS-682の効果
このモデルは、MIA-PaCa-2膵癌細胞株に由来する膵臓腫瘍を使用した。
【００２４】
A. モデルの作製
MIA-PaCa-2膵癌細胞株は、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から入手し、10%熱失活ウシ胎仔血清ならびに1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Gibco-BRL, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)を添加したDMEM培地中で維持し、5% CO2 インキュベーター内で37℃にて培養した。
【００２５】
pDsRed-2ベクター(Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA)を用いて、安定してRFPを発現するMIA-PaCa-2クローンを作製した。このベクターはRFPおよびネオマイシン耐性遺伝子を同一のバイシストロン性メッセージ上に発現する。pDsRed-2はPT67パッケージング細胞内で作製された。RFP形質導入は20%コンフルエントMIA-PaCa-2細胞をパッケージング細胞のレトロウイルス上清およびDMEMとともに24時間インキュベートすることによって開始された。この時点で、新培地を補充し、レトロウイルス非存在下で12時間、細胞を増殖させた。蛍光顕微鏡を用いた判定で、RFPの高レベル発現が達成されるまで、この手順を反復した。次にトリプシン／EDTAによって細胞を収集し、200μg/ml G418を含有する選択培地に継代した。G418の濃度を段階的に2000μg/mlまで増加させた。高レベルのRFPを発現するクローンを必要に応じてクローニングシリンダーで分離し、従来の培養法によって増殖させて移植した。RFP高発現クローンは、in vivoでのRFPの安定発現を求めて選択するために、継代10回の間、G418非存在下で単離された。
【００２６】
4-6週齢の雄ヌードマウス（NCr-nu）をHEPA（超高性能）フィルター処理されたラック上のバリア設備内で飼育した。動物には加圧滅菌した実験用齧歯動物飼料（Teckland LM-485; Western Research Products, Orange, CA）を給餌した。動物実験は、保証番号A3873-01のもとで、実験動物の取り扱いおよび使用に関するガイドライン（Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals）（NIH刊行番号85-23(NIH Publication Number 85-23)）にしたがって実施した。
【００２７】
赤色蛍光を発するヒト膵癌異種移植片は、手術による同所移植（SOI）によってヌードマウスにおいて確立された。簡単に述べると、ヌードマウスの皮下で増殖した対数増殖期のMIA-PaCa-2-RFP腫瘍を無菌的に切除した。壊死組織を切り取り、残りの健全な腫瘍組織をはさみで切断して、RPMI 1640培地中で1 mm3の小片に刻んだ。次にマウスを麻酔して
その腹部をアルコールで消毒した。その後、左上腹部傍腹直筋および腹膜を貫いて切開を行った。膵臓を注意深く露出し、２つの腫瘍片を単一の8-0外科縫合糸（Davis-Geck, Inc., Manati, Puerto-Rico）を用いて腺の中央に移植した。次に、膵臓を腹腔内に戻し、腹壁および皮膚を、6-0外科縫合糸を用いて２層に閉じた。すべての手順は、7×顕微鏡（Olympus）もしくは標準的な手術用ルーペを用いて行った。
【００２８】
B. 薬物の投与量、投与経路および投与スケジュール
CS-682（1-(2-C-シアノ-2-デオキシ-β-D-アラビノペントフラノシル)-N4-パルミトイルシトシン、三共株式会社、東京）を経口チューブによって投与した。最初の治療の前に、マウスをそれぞれ治療の目的に向けて、10匹からなる８グループに無作為に分けた。
【００２９】
グループ１はネガティブコントロールとし、治療を受けなかった。
【００３０】
グループ2, 3および4は、指定された各治療日に、それぞれ、１回投与量当たり40, 60および80 mg/kgのCS-682の投与を受けた。
【００３１】
グループ4, 5, 6および7は、指定された各治療日に２回、それぞれ、１回投与量当たり20, 30, 40および50 mg/kgのCS-682の投与を受けた。
【００３２】
投与は同所移植手術の５日後に開始し、死亡するまで週５日実施した。
【００３３】
C. 評価法
少なくとも週１回、外部からのin vivo全身イメージング、マウスは体重測定し、外部in vivoイメージングを受けた。これは470nmの光ファイバー照明で照射された蛍光ライトボックス内で行われた（Lightools Research, Encinitas, CA）。蛍光発光を、Hamamatsu C5810 3-チップ冷却カラーCCDカメラ（Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ）のロングパスフィルタGG475（Chroma Technology, Battleboro, VT）を通して集めた。1024 x 724ピクセルの高解像度画像が、IBM PCに直接とらえられ、またはビデオ出力を通して高解像度ソニーVCR SLV-R1000型（ソニー株式会社、東京、日本）に連続的に記録された。コントラストと明度について画像を加工し、Image Pro Plus 3.1 ソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)を用いて分析した。すでに記載されているように（Bouvet, M., et al., Cancer Res. (2002) 62:1534−1540）、蛍光を発する表面積を数値化することによって、全身腫瘍組織量のリアルタイム測定を行った。
【００３４】
直接イメージングおよびRFP蛍光顕微鏡法のために、発病前と思われるときにマウスを殺処分して調べた。安楽死後、それぞれのマウスは開腹および胸骨切開を施された。上記のようなライトボックス内でのRFP励起は、蛍光の可視化によって原発および転移性病変の識別を容易にした。全身の直視画像を作製した後、固形臓器を摘出してその表面をくまなく転移の徴候について検査した。その後、臓器を凍結し、約2 mm幅にスライスして断面サンプルとし、50W水銀ランプ電源を備えたLeica蛍光実体顕微鏡、LZ12型（Leica Microsystems, Inc., Bannockburn, IL）を用いて視認した。RFPの選択的な励起は、D425/60バンドパスフィルタおよび470 DCXRダイクロイックミラーによって生じた。蛍光発光は上記のHamamatsuカメラシステムによって集められた。
【００３５】
D. 統計分析
治療グループ間の相違を、ANOVA、ならびにStatistica(Statsoft, Inc., Tulsa, OK)によるStudent’s testを用いて評価した。Log rank 検定（log rank test）を用いたKaplan-Meier解析を使用して、生存期間および治療群の間の差を判定した。ｐ＜0.05は統計的に有意であると見なした。
【００３６】
上記の技術を使用して、下記の結果が得られた：
体重減少および毒性：１日１回40 mg/kgのCS-682投与で、図1Aおよび1Bに示すように体重の減少が認められた。図1Aは、40 mg/kg（黒丸）、60 mg/kg（菱形）、または80 mg/kg（四角）を使用した結果を示す。図1Bは20 mg/kg（四角）、30 mg/kg（三角）、および50 mg/kg（丸）をそれぞれ1日2回投与した結果を示す。体重の減少は１日当たり60mg/kgで起こるようであるが、この用量以下では、毒性は無視しうる。これより多い投与量では、体重はベースラインの80%を下回るまで減少した。こうした用量では、有意な数のマウスに毒性関連死が観察された。注目すべきは、40 mg/kgおよび60 mg/kgで１日１回の投与は、同じ用量を１日２回に分けて与えるよりも体重減少および毒性が少なかった。
【００３７】
生存期間：無処置のMIA-PaCa-2-RFP膵癌担癌マウスの生存期間の中央値は17日であった。CS-682の経口投与は、数回の投与で有意に生存期間を延長した。こうした結果を図２に示す。生存期間中央値は、対照群の17日から、20 mg/kgを１日２回、40 mg/kgを１日１回、および60 mg/kgを１日１回のCS-682投与で、それぞれ27日（p = 0.003）、35日（p = 0.0008）および36日（p = 0.002 ）に延びた。◆＝対照、（黒塗り丸）＝CS-682 20mg/kg、１日２回、（黒塗り三角）＝CS-682 60mg/kg、１日１回、（黒塗り四角）＝CS-682 40mg/kg、１日１回。1日当たり60mg/kgの処置群、および１日当たり20mg/kgを２回の処置群において数匹のマウスが毒性関連死をとげたと思われる事実にもかかわらず、有意な生存期間の延長が生じたが、それは、剖検時に測定された原発性および転移性腫瘍量がその致死性を説明するには不十分であったためである。生存期間の延長は、上記の３つの投与群で有意差はなかった（P = 0.19）。もっと高用量では、生存期間はCS-682の投与によって長くなることはなく、１日２回50mg/kgの投与量では生存18日、１日２回30mg/kgおよび40mg/kg、ならびに１日当たり80mg/kgの投与量では19日であった。
【００３８】
腫瘍の増殖および転移：腫瘍RFPの自己蛍光は、リアルタイムの経時的な全身イメージング、および全身腫瘍組織量の定量を可能にした。対照マウスにおいて、有意な、原発腫瘍の増殖および転移の広がりが、腫瘍の同所移植手術後最初の2週間以内に現れた（図３A）。SOI後第16日に、これらのマウスはいずれも、腹腔内の上下左右の４区分のすべてにおいて、RFP蛍光によって外部から可視化される播種性転移性疾患を有することが確認された。加えて、対照動物の100%において、移植後最初の16日以内に悪性の腹水の発生が認められた。
【００３９】
これに対して、CS-682で処置したマウスは、移植後第３週および第４週まで、有意な腫瘍の播種を示さなかった（図３A）。パネルは、腫瘍移植後第8、16および33日の、３つの処置群のそれぞれに属する代表的なマウスを示す。対照群では移植後最初の2週間以内に腹部の上下左右４区分のすべてで腫瘍の播種が現れた。１日当たり40 mg/kgおよび60 mg/kgのCS-682で処置したマウスでは、広範な腫瘍の転移は移植後第３および４週まで見られなかった。対照動物が腫瘍の腹腔内播種を大量に有することが認められた第16日まで、１日当たり40 mg/kgのCS-682で処置したマウスの90%は局所に限定された病変を有することが明らかになった。腹水の貯留も処置動物では頻度が低く、１日当たり40 mg/kgおよび60 mg/kgの用量で処置したマウスのそれぞれ50%および10%が、検査で、明らかな腹水を有していた。
【００４０】
RFP自己蛍光の数量化はそれぞれの投与量のリアルタイム比較をしやすくし（図３B）、１日２回20 mg/kg、１日当たり40mg/kg、および１日当たり60mg/kgの投与量で、膵癌の増殖を抑制することができるCS-682の能力を示した（各時点でのp<0.05）。値は、各処置群の生きた無傷の動物に関する外部RFP自己蛍光+/- S.E.の平均面積を表す（各時点でのp<0.05）。◆＝対照、（黒塗り丸）＝CS-682 20mg/kg、１日２回、（黒塗り三角）＝CS-682 60mg/kg、１日１回、（黒塗り四角）＝CS-682 40mg/kg、１日１回。
【００４１】
動物は死亡時に剖検し、その結果を図4A-4Cに示す。A、対照。B、CS-682 １日当たり40mg/kg。C、CS-682 １日当たり60mg/kg。原発腫瘍の広範な増殖、ならびに横隔膜、腹膜、肝臓、および腸間膜・門脈リンパ節への転移が、対照群のほとんどすべてのマウスにおいて明白に認められた。遠隔転移は、CS-682で処置したマウスでは、頻度が減少した。
【００４２】
無処置動物において剖検時に、脾臓（100%）、腸リンパ節（100%）、門脈リンパ節（90%）、肝臓（80%）、後腹膜（60%）、横隔膜（50%）、腎臓（30%）および肺（10%）で転移が発見された(図５)。これに対して、１日当たり40mg/kgのCS-682による処置は、横隔膜、門脈リンパ節、肝臓、腸リンパ節および腎臓における転移の発生を有意に抑制した。１日当たり40mg/kgを越える投与量は、剖検時に発見される転移数をさらに減少させたが、毒性の増加を伴った。
【００４３】
CS-682は原発膵臓腫瘍に対して増殖抑制効果を有すると思われたが、この効果は１日当たり40mg/kgでは有意ではなかった（図6）。剖検時に、対照マウスの原発腫瘍の平均重量は5.163 gであって、これは投与量40mg/kgのCS-682で処置されたマウスの原発腫瘍重量と統計学的には同様であった（3.935 g、p = 0.16）。毒性のあるもっと高用量のCS-682による処置は、原発腫瘍の増殖に対して有意な効果を有すると思われたが（１日当たり60mg/kgではp = 0.0004、１日２回20 mg/kgではP = 0.003）、このような用量は腫瘍選択性を失わせると考えられ、多大な毒性を伴った。
【実施例２】
【００４４】
転移性膵癌のマウスモデルにおけるCS-682補助療法の延命効果への影響
転移性膵癌の補助療法における経口CS-682の有効性を検討した。外科的切除の補助としてのCS-682の投与が、無処置、化学療法のみ、または外科的切除のみの動物と比較して、生存期間を延ばすことが明らかになった。下記に論じる研究は、上記のようにDiscosoma赤色蛍光タンパク質を高レベルに選択的に発現するように操作された、ヒト膵癌細胞株MIA-PaCa-2膵癌細胞株の悪性度の高いクローンを使用した。このような明白な蛍光モデルは、処置の過程を通じて全身腫瘍組織量の非侵襲的な定量を容易にした。
【００４５】
実験
A. モデルの作製
本研究で使用するMIA-PaCa-2膵癌細胞株および動物は、下記を除いて、実施例１に記載の通り作製した。MIA-PaCa-2-RFP腫瘍の同所移植後、原発膵癌の外科的切除を必要とする処置群のマウスをそれぞれ麻酔して手術に備えた。続いて腹膜を元の切開に沿って再び開き、隣接する構造を調べて、肉眼的な病変が膵臓に限局されることを確認した。肉眼で見える腫瘍をすべて、厳密な切離によって摘出した。6-0縫合糸を用いて止血を達成した。その後、２層縫合で腹部を閉じた。
【００４６】
同所移植手術の7日後、マウスを外科的切除によって治療すべきか、化学療法によって治療すべきか、または両方によって治療すべきかによって、マウスを無作為にそれぞれ10匹のマウスからなる８群に分けた。1-4群のマウスは外科的治療を行わなかった。１群のマウスは化学療法を受けず、したがってネガティブコントロールとなった。2-4群のマウスは、下記の治療スケジュールにしたがって、各治療日当たりそれぞれ40、50または60mg/kgの用量でCS-682の主治療を受けた。
【００４７】
5-8群のマウスは、単盲検の術者によって、同所移植の7日後に、原発腫瘍の外科的切除を受けた。5群のマウスは追加の化学療法を受けなかった；6-8群のマウスは、各治療日当たりそれぞれ40、50または60mg/kgの用量でCS-682補助治療を受けた。
【００４８】
CS-682は経口チューブによって投与した。CS-682による主治療、または補助治療は、腫瘍の同所移植の9日後（外科的切除を受けた場合にはその2日後）に開始され、全部で5週の間、または死亡するまで、治療１週間当たり5回の投与を受けることとした。下記に詳述するように、60mg/kgの投与を受けた群のマウスは長期に渡る治療に耐えず、治療スケジュールの変更を必要とした。これらの群では、CS-682はSOI後第1および第2週に9回の投与を受け、その後第4および第5週には10回の投与を受けたが、第3週の間は治療を中断した。
【００４９】
B. 外部in vivo全身イメージング
週２回、マウスは体重測定し、外部からのin vivoイメージングを受けた。これは470nmの光ファイバー照明で照射された蛍光ライトボックス内で行われた（Lightools Research, Encinitas, CA）。蛍光発光を、Hamamatsu C5810 3-チップ冷却カラー電荷結合素子カメラ（Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ）のロングパスフィルタGG475（Chroma Technology, Battleboro, VT）を通して集めた。1024 x 724ピクセルの高解像度画像が、IBM PCに直接とらえられ、またはビデオ出力を通して高解像度ソニーVCR モデルSLV-R1000型（ソニー株式会社、東京、日本）に連続的に記録された。コントラストと明度について画像を加工して、Image Pro Plus 3.1 ソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)を用いて分析した。蛍光を発する表面積を定量することによって、全身腫瘍組織量のリアルタイム測定を行った。
【００５０】
C.直接オープン・イメージングおよびRFP蛍光の顕微鏡による検査
マウスを発病前と思われるときに殺処分して検査した。安楽死後、それぞれのマウスは開腹および胸骨切開を施した。上記のようなライトボックス内でのRFP励起は、蛍光の可視化によって原発および転移性病変の識別を容易にした。全身直視画像を作製した後、固形臓器を摘出してその表面をくまなく転移の徴候について検査した。蛍光顕微鏡検査は50W水銀ランプ電源を備えたLeica蛍光実体顕微鏡、LZ12型（Leica Microsystems, Inc., Bannockburn, IL）を用いて行われた。RFPの選択的な励起は、D425/60バンドパスフィルタおよび470 DCXRダイクロイックミラーによって実現された。蛍光発光は上記のHamamatsuカメラシステムによって集められた。
【００５１】
D. 組織学的分析
代表的な原発腫瘍および転移を剖検時に摘出し、10%ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋して切片とした。その後、サンプルをBrightfield顕微鏡検査用標準H&E染色により処理した。
【００５２】
E. 統計分析
治療グループ間の差を、ANOVA、ならびにStatistica(Statsoft, Inc., Tulsa, OK)によるStudent’s testを用いて評価した。Log rank 検定（log rank test）によるKaplan-Meier解析を用いて、生存期間および治療グループ間の差を判定した。ｐ0.05は統計的に有意であると見なした。
【００５３】
結果
A. in vitroでのMIA-PaCa-2-RFPの形態学的特性および増殖特性
RFP発現MIA-PaCa-2細胞は、光学顕微鏡下で親MIA-PaCa-2細胞株と形態学的に同一であるように見えた。MIA-PaCa-2およびMIA-PaCa-2-RFP細胞の増殖速度は、統計学的に等しいことがあらかじめ明らかになった。原発および転移性MIA-PaCa-2-RFP膵臓腫瘍は、H&E染色で低分化型膵管腺癌の特徴を示した。
【００５４】
B. 毒性の分析
各マウスの体重および全体的な外観を、全身毒性の証拠として週２回監視して記録した。CS-682を投与されなかったマウスの体重は、死亡時まで一定の状態を維持するか、または腹腔内の腹水の貯留のため徐々に増加するかのいずれかであった。体脂肪の消耗が、背部の肩胛骨間において最も顕著であって、これが播種性疾患と併せて発生する共通の末期所見であった。
【００５５】
40mg/kgの投与では、CS-682による治療は有意な体重減少を伴わなかった。対照群と同様に、肩胛骨間の体脂肪の消耗が末期の所見であったが、播種性疾患がない場合には認められなかった。すべてのマウスの死亡は、長期治療を受けたマウスであっても、明らかに、薬物の毒性ではなく播種性膵癌によって起こった。
【００５６】
50mg/kg CS-682で治療した群において、長期に渡る薬物投与の効果は、もとの治療計画の変更を求めるには不十分であった。それにもかかわらず、肩胛骨間の萎縮を伴う体脂肪の中程度の減少が、2週間連続のCS-682治療後、播種性膵癌がない場合にもしばしば認められ、このことは長期に渡る薬物投与の累積的な影響を示す。この影響は深刻ではなく、有意な体重減少には至らなかった。それでも、補助治療群および主治療群のそれぞれ１匹のマウスが、いずれも全２週間の化学療法後に慢性薬物毒性によって死亡したと考えられた。
【００５７】
60mg/kg CS-682で治療したマウスには急性薬物毒性は観察されなかったが、始めの2週間にわたって、全マウスで累積的な悪影響が認められ、最初の9回の投薬後に薬物投与の終了が必要となった。この時までに、全動物において肩胛骨間の脂肪の消耗が激しいことが認められ、第20日までに15%の体重減となった。この時点で、CS-682の投与を第4週まで中断し、体脂肪および体重がいずれも同時に増加してすべての動物が回復するようにした後、治療を再開してさらに2週間行った。この治療方針によって、動物は１匹だけ第41日に死亡した。他のすべての動物において、播種性膵臓疾患がない場合には死亡は発生しなかった。
【００５８】
C. MIA-PaCa-2-RFP腫瘍増殖のin vivo特性
リアルタイムの蛍光全身光学イメージングは、ヒトMIA-PaCa-2-RFP膵臓腫瘍断片のSOI後、治療を受けないすべての動物において局所増殖および転移性増殖の進行を明らかにした。蛍光を発する原発腫瘍は移植後早くも5日で皮膚を通して目に見えるようになり、第10日までに動物の70%、第14日までに100%で見ることができた。遠位固形腫瘍転移および腹腔内での腹水の発生は、いずれも早期所見であって、第16日までに、それぞれ動物の60%および100%に認められた。外部から見ることのできる蛍光領域の非侵襲的な数量化測定は、in vivoでの腫瘍増殖曲線の作製を可能にしたが、この曲線は、無処置動物において、30日までに全マウスに病気による死亡をもたらす、著しい直線的腫瘍増殖速度を示し、生存期間の中央値は26日であった。剖検時に、横隔膜、腸および門脈リンパ管、後腹膜、腎臓および肝臓を含めて、複数の部位に転移が確認された。
【００５９】
D. 外科的切除
原発病変の早期の外科的切除は、わずかではあるが有意な生存期間の延長をもたらした（生存期間中央値、28日、P 0.03）。すべてのケースで、切除は、何らかの遠位転移の沈着が蓄積する前に行われ、膵臓病変の全体をすべて除去することを必要としたが、第10日に外部から見ることができる蛍光腫瘍領域は同時に有意に減少した（P 0.009）。にもかかわらず、手術の利益は明らかに一時的であった。再発の全身腫瘍組織量は、第10日のあと次第に増加し、第14日までに術前のレベルに達した。この時点で、腫瘍の腫大および播種は加速し、平均腫瘍増殖速度は無処置群で見られる速度と同様であった。予想通り、外科的切除は腹水の発生も遅らせ、わずかに20%の動物がこうした臨床所見を第16日に示した。
【００６０】
E. CS-682主治療
本発明者らの以前の結果（13）によれば、テストしたそれぞれの用量でのCS-682の主治療投与は、同所移植されたMIA-PaCa-2-RFP腫瘍を有するマウスの生存期間を有意に延長した（各用量についてP 0.05）。テストしたそれぞれの用量で、CS-682によって与えられる延命効果は同様であった（P 0.4）。CS-682の主治療投与によって、50および60mg/kgの用量で、全生存期間の有意な増加が、外科的切除のみを上回って達成された（それぞれP 0.045および0.03）。
【００６１】
早期腫瘍増殖のリアルタイム全身イメージングから、CS-682化学療法の、生存期間への好ましい効果がこの薬物による腫瘍増殖速度の有意な低減によって引き起こされることが確認された。主としてCS-682で治療したマウスは、移植後最初の2-3週間に渡って、外科手術で治療したマウスより腫瘍は大きかったが、CS-682の増殖抑制効果は腫瘍の外科的切除の一時的効果より長く続き、増殖曲線は21日に交差した。
【００６２】
F. 切除およびCS-682補助治療
生存期間の最大の増加は、外科切除後のCS-682の術後投与によって達成された。テストしたすべての用量で、この方法で治療したマウスは、治療対照よりも生存期間が有意に延長した（P 0.05）。50および60mg/kgの投与計画で、生存期間の延長は切除のみと比較しても有意であった（それぞれP 0.004および0.03）。生存期間の延長は、50mg/kgの投与量で最も顕著であった。この投与計画で、マウスの生存期間中央値は48日であり、30%は少なくとも60日間生存した。蛍光可視化によって、この併用療法の増殖抑制効果が明白となった：第23日に、無処置動物の40%が播種性疾患によってすでに死亡した後に、50mg/kgの補助治療群の動物の70%は、多くとも、腹部４区分の１つに限局された局所病変を有していた。この投与計画で特に長期間の生存（60日）を経験したマウスの30%において、化学療法の終了後10日まで遠位転移は見られず、その時点で、転移の発生が急に進み、最終的にマウスは播種性膵臓疾患によって死亡した。in vivoの腫瘍増殖曲線の作図は、腫瘍増殖の抑制に関して、外科的切除とCS-682の補助的な適用との間に明白な相乗作用を実証した。予想通り、腹水の発生も補助療法によって抑制され、動物のうちわずか20%が死亡時に液体貯留の徴候を示した。
【００６３】
開示された実施例は、開示された本発明を例示するためのものであって、本発明は特許請求の範囲の文言により限定されるべきものである。
【００６４】
関連出願の相互参照
【００６５】
本出願は、米国仮出願第60/472,529号、2003年5月21日出願、に対する優先権の利益を主張するものであり、これは参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【００６６】
連邦政府による資金援助に関する報告
本研究は米国国立がん研究所助成金P30 CA23100-1881およびR43-89779により一部資金援助を受けたので、連邦政府は本発明に対して一定の権利を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、相当量のCS-682を毎日投与しても体重にほとんど影響を与えず、したがって毒性がないことを示すグラフである。
【図２】図２は、CS-682を投与することによって延長した、MIA-PaCa膵癌を有するマウスの生存期間を示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、腫瘍増殖に関するCS-682投与の結果を示す。図３Ａは、赤色蛍光タンパク質（RFP）で標識された腫瘍の写真を時間との相関として示す。図３Ａに示すように、第16日に、対照マウスは腫瘍の広範囲におよぶ腫大を示したが、CS-682を投与したマウスでは第33日までこうした腫大は生じなかった。図３Ｂは、時間の関数としての、腫瘍面積の数値のグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、腫瘍増殖に関するCS-682投与の結果を示す。図３Ａは、赤色蛍光タンパク質（RFP）で標識された腫瘍の写真を時間との相関として示す。図３Ａに示すように、第16日に、対照マウスは腫瘍の広範囲におよぶ腫大を示したが、CS-682を投与したマウスでは第33日までこうした腫大は生じなかった。図３Ｂは、時間の関数としての、腫瘍面積の数値のグラフである。
【図４】図４Ａ-４Ｃは、対照マウス（４Ａ）、１日あたり40mg/kgのCS-682を投与したマウス（４Ｂ）、および１日あたり60mg/kgのCS-682を投与したマウス（４Ｃ）の剖検結果を示す。
【図５】図５は、原発腫瘍の転移に対するCS-682投与の影響を示す。
【図６】図６は、原発腫瘍重量に対するCS-682投与の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2006528989.tif 000009
【図６】
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【国際調査報告】
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