(57)【要約】改良された診断蛍光および反射に関するシステムおよび方法が記載されている。インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法は、光源−検出間距離に配置された少なくとも１つの収集ファイバを有する光ファイバプローブからの励起光を用いた照射の結果として組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出し、結果として得られた反射スペクトルに基づいて組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定する。インビボで組織サンプルの組織異常を検出する他の方法は、組織異常を示す一連の蛍光強度スペクトルを組織サンプルが生成するように選択される少なくとも１つの電磁放射線波長を用いてインビボで組織サンプルを照明し、その結果として得られる蛍光強度スペクトルを検出し、結果として得られた反射スペクトルに基づいて組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定することを含む。インビボで組織サンプルの組織異常を検出する更に他の方法は、前述した２つの方法を組み合わせることを含む。
2006517417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
光ファイバプローブからの励起光を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップと、
前記光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として、前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備え、
前記一連の反射スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記計算ステップは、前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記計算ステップは、前記反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
第１の電磁波長および第２の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が３７０〜４５０ｎｍから選択され、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記計算ステップは、前記蛍光スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
第１の電磁波長および第２の電磁波長を用いて、インビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３４０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４１０〜４２０ｎｍから選択され、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記計算ステップは、前記蛍光スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
第１の電磁波長および第２の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４００〜４５０ｎｍから選択され、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記計算ステップは、前記蛍光スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
単一電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記単一電磁波長が３７０〜４００ｎｍから選択され、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記計算ステップは、前記蛍光スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
第１の電磁波長、第２の電磁波長、及び第３の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３４０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が３５０〜３８０ｎｍの範囲から選択され、前記第３の電磁波長が４００〜４５０ｎｍの範囲から選択され、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記計算ステップは、前記蛍光スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
励起光、および第１の電磁波長、第２の電磁波長、及び第３の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４２０〜４３０ｎｍの範囲から選択され、前記第３の電磁波長が４６０〜４７０ｎｍの範囲から選択され、
光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備え、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルまたは前記一連の反射スペクトルまたは前記一連の蛍光強度スペクトルと前記一連の反射スペクトルとの組み合わせから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
励起光および第１の電磁波長、第２の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４６０ｎｍであり、
光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えるステップと、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルまたは前記一連の反射スペクトルまたは前記一連の蛍光強度スペクトルと前記一連の反射スペクトルとの組み合わせから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
励起光と第１の電磁波長の組および第２の電磁波長の組とを用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４７０ｎｍであり、
光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えるステップと、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルまたは前記一連の反射スペクトルまたは前記一連の蛍光強度スペクトルと前記一連の反射スペクトルとの組み合わせから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
励起光および第１の電磁波長、第２の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４７０〜４８０ｎｍの範囲から選択され、
光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えるステップと、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルまたは前記一連の反射スペクトルまたは前記一連の蛍光強度スペクトルと前記一連の反射スペクトルとの組み合わせから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択される請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
励起光および第１の電磁波長、第２の電磁波長、及び第３の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３５０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４２０〜４３０ｎｍの範囲から選択され、前記第３の電磁波長が４６０ｎｍであり、
光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えるステップと、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルまたは前記一連の反射スペクトルまたは前記一連の蛍光強度スペクトルと前記一連の反射スペクトルとの組み合わせから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択される請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法であって、
組織サンプルを用意するステップと、
励起光および第１の電磁波長、第２の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップであって、前記第１の電磁波長が３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長が４６０〜４７０ｎｍの範囲から選択され、
光ファイバプローブを用いて、前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップであって、前記光ファイバプローブが、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えるステップと、
前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、
前記一連の蛍光強度スペクトルまたは前記一連の反射スペクトルまたは前記一連の蛍光強度スペクトルと前記一連の反射スペクトルとの組み合わせから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択される請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記計算ステップは、７００ｎｍで一連の蛍光強度スペクトルを切り捨てる段階を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルを前処理することにより、患者間変動を減少させる段階を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記計算ステップは、前記一連の蛍光強度スペクトルおよび前記一連の反射スペクトルの主成分分析を行う段階を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と、分類する段階とを含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記計算ステップは、マハラノビス距離を使用して前記組織サンプルを選択する段階と分類する段階との結果を、相互検証する段階を更に含む請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府から資金援助を受けた研究および開発において生じる発明者に対する権利に関する供述］
本発明は、国際癌学会（ＰＯ１−ＣＡ８２７１０）によって与えられたＵＴ−オースティンに対する契約下で米国政府の支援により行われた。政府は本発明において特定の権利を有する場合がある。
【０００２】
本発明は、一般に、生物学的イメージングの分野に関する。特に、本発明は、例えば子宮頸癌等の組織異常の検出に関するものであるがこれに限定されない。具体的には、本発明の好ましい実施は、蛍光分光法、反射分光法、あるいは、蛍光分光法と反射分光法との組み合わせを使用することにより子宮頸癌を検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
子宮頸部上皮から収集された小さな細胞サンプルが専門家により顕微鏡で診断されるパパニコロースミアは、現在、子宮頸癌をスクリーニングして検出する最も包括的な手段である。パパニコロースミアは、子宮頸癌に起因する死亡率を減少させる場合には有効であるが、治験担当医師の技量に大きく依存している。実際に、パパニコロースミアを使用するスクリーニングにおける平均有病正診率および無病正診率はそれぞれ７３％および６３％である。
【０００４】
蛍光分光法は、子宮頸癌をスクリーニングして検出するための有効で且つ非侵襲な方法として研究されてきた。組織の蛍光分光法は、様々な光学的相互作用によって影響を受ける。組織の屈折率の変化および細胞核等の散乱により、光が散乱する。ヘモグロビン分子は、特定の波長における重要な光吸収体である。また、光は、蛍光を発する発色団によっても吸収される。ＮＡＤＨやフラビン等の生物学的な発色団は細胞代謝に密接に関与している。散乱、吸収、蛍光特性は、検査中の組織の重要な形態学的、細胞学的、組織病理学的な情報を伝える
【０００５】
多くの臨床試験により、蛍光分光法がインビボでの子宮頸部腫瘍のリアルタイムな検出に有望であることが分かってきた。一般に、これらの試験では、１〜３つの励起波長で蛍光発光スペクトルが測定され、これらのスペクトルの特徴に基づいて診断アルゴリズムが過去に遡って開発される。１つの研究は、３３７ｎｍの１つの励起波長を使用した９２％および９０％の有病正診率および無病正診率と、３３７ｎｍ、３８０ｎｍ、４６０ｎｍの３つの励起波長を使用した場合の８２％および６８％の有病正診率および無病正診率とをそれぞれ報告している。少なくとも１つのグループは、３３７ｎｍの励起で９３％および９４％の有病正診率および無病正診率を報告した。Ｒａｍａｎｕｊａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９６）によって開発された蛍光分光法アルゴリズムに基づいて、研究者は、子宮頸部上皮からの蛍光を複数の励起発光波長対（ペア）で画像化するシステムを開発した。この装置を用いて１００人超の患者を評価した。研究による最初のデータは、装置が９８％および９５．４％の有病正診率および無病正診率をもって前癌状態の子宮頸癌病変と正常組織とを識別することを示している。最近、反射および蛍光の両方を測定できる同様の装置を使用して、膣鏡で見ることができる子宮頸部上皮を測定した。膣鏡診設定で１３６人の患者を測定し、そのうちの１１１人が分析のために含まれていた。ＣＩＮ２またはそれ以上を有する子宮頸部を認識するためにアルゴリズムが得られた。有望な有病正診率および無病正診率（それぞれ９７％および７０％）が報告された。しかしながら、両方の研究では、アルゴリズムを得るために使用された同じデータセットからアルゴリズム結果が報告されており、したがって、オーバートレーニングの偏りに起因して有病正診率および無病正診率の評価が高くなる場合がある。
【０００６】
過去の研究の重要な限界は、励起波長の選択がソースの利用可能性または多くの異なる励起波長を調べる小さなインビトロでの研究に基づいているという点である。上皮組織の光学的特性がインビトロで異なり、そのため、異なる励起波長がインビボ研究に最適な場合があることは良く知られている。
【０００７】
最近、幾つかのグループは、インビボの多くの励起波長の蛍光発光スペクトルを測定できる分光システムを開発した。これらの発光スペクトルを集めて１つの励起発光行列（ＥＥＭ）をつくることができる。このＥＥＭは、励起波長および発光波長の両方に応じた蛍光強度を含んでいる。これらのシステムは、ＵＶ−可視スペクトル全体にわたって上皮組織の自己蛍光特性を特徴付けるための都合の良い方法を提供する。これらのリサーチレベルシステムによれば臨床試験によって診断に最適な励起波長を決定することができるが、これらのシステムは診療所診断に適していない。スケールの広い臨床実務に技術を適用させるには、僅かな数の最適な励起波長を使用する費用効率が高い装置が必要となる。
【０００８】
技術的欠点を考慮すると、蛍光ＥＥＭのインビボ測定を行って、これらのデータを分析することにより子宮頸部腫瘍の診断に最適な励起波長を決定するとともに、励起波長のこの組み合わせで有病正診率および無病正診率を評価することが有益である。また、反射測定において子宮頸部腫瘍の診断に最適な光源−検出間距離組み合わせを決定するとともに、反射光源−検出間距離と蛍光励起波長との最適な組み合わせを決定することが有益である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以下の実施形態の必要性がある。無論、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様において、方法は、組織サンプルを用意するステップと、光ファイバプローブからの励起光を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップと、前記光ファイバプローブを用いて、前記光ファイバプローブからの前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップと、前記一連の反射強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップとを含んでいる。前記光ファイバプローブは、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えている。
【００１１】
本発明の他の態様において、インビボで組織サンプルの組織異常を検出する方法は、組織サンプルを用意するステップと、第１の電磁波長および第２の電磁波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップと、各波長を用いた前記照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、前記一連の蛍光強度スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップとを含んでいる。前記第１の電磁波長は３３０〜３５０ｎｍから選択され、前記第２の電磁波長は３７０〜４５０ｎｍから選択される。本発明の他の態様において、前記第１の電磁波長は３３０〜３４０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４１０〜４２０ｎｍの範囲から選択され、前記第１の電磁波長は３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４００〜４５０ｎｍの範囲から選択され、あるいは、単一電磁放射線波長は３７０〜４００ｎｍの範囲から選択され、あるいは、３つの電磁放射線波長は、３３０〜３４０ｎｍ、３５０〜３８０ｎｍ、４００〜４５０ｎｍの範囲から選択される。
【００１２】
インビボで組織サンプルの組織異常を検出する本発明の更に他の方法は、組織サンプルを用意するステップと、光ファイバプローブからの励起光および第１、第２、第３の電磁放射線波長を用いてインビボで前記組織サンプルを連続的に照射するステップと、各波長を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の蛍光強度スペクトルを検出するステップと、前記光ファイバプローブを用いて、前記光ファイバプローブからの前記励起光を用いた照射の結果として前記組織サンプルから放出される一連の反射スペクトルを検出するステップと、一連の蛍光強度スペクトル及び／又は一連の反射スペクトルから、前記組織サンプルが正常であるか或いは異常であるかを決定するステップとを含んでいる。前記光ファイバプローブは、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離からなる群から選択された少なくとも１つの光源−検出間距離で配置された少なくとも１つの収集ファイバを備えている。前記第１の電磁波長は３３０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４２０〜４３０ｎｍの範囲から選択され、前記第３の電磁波長は４６０〜４７０ｎｍの範囲から選択される。本発明の他の態様において、前記第１の電磁波長は３５０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４２０〜４３０ｎｍの範囲から選択され、前記第３の電磁波長は４６０ｎｍである。本発明の他の態様においては、２つの波長が使用される。前記第１の電磁波長は３３０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４６０ｎｍであり、あるいは、前記第１の電磁波長は３３０〜３６０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４７０ｎｍであり、あるいは、前記第１の電磁波長は３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４７０〜４８０ｎｍである。本発明の他の態様において、前記第１の電磁波長は３３０〜３５０ｎｍの範囲から選択され、前記第２の電磁波長は４６０〜４７０ｎｍの範囲から選択され、２つの光源−検出間距離は、２５０μｍの距離、１．１ｍｍの距離、２．１ｍｍの距離、３．０ｍｍの距離から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
患者の年齢、人種、更年期状態等の生物学的変数に対して蛍光スペクトルを関連付けることができるかどうかを調べた分析を行った。その結果から分かることは、これらの変数の一部が重要であるが、データ処理方法が変数の影響を打ち消す可能性があるということである。しかしながら、これらの変数によって階層化される多数の試験からのデータにより、これらの生物学的変数を組み込み且つ高い有病正診率および無病正診率を有するアルゴリズムにつながる新たなデータ処理方法が可能となる場合がある。月経周期の全体にわたる変動（分散）に関して蛍光スペクトルを調べた。その結果から分かることは、月経周期の全体にわたって僅かな変動が生じるが、これらの変動が統計的に重要ではないとうことである。また、診断アルゴリズムは、月経周期の全体にわたって収集されたデータに対して適用されると同様にうまくいく。そのため、月経周期中に蛍光の測定を常に行うことができる。最適な診断性能を達成するためには、２つの励起波長のみからの発光スペクトルが必要であり、また、励起波長を加えても有病正診率および無病正診率が著しく増大しないことが分かった。この中間分析により、多スペクトル感応性のデジタルコルポスコープ（膣鏡）を設計するために必要な励起波長が得られた。また、反射分光法も重要な診断情報を含んでいる場合があり、また、蛍光分光法と反射分光法とを組み合わせると最良の識別能が得られることが分かった。ＨＧ病変を他のクラスからうまく識別するために、定量細胞学または定量組織学を使用することができる。前記識別能の基準として組織の構造変化が使用される。
【００１４】
蛍光分光法および反射分光法に基づいて診断・スクリーニングアルゴリズムの性能を高めて評価するために一連の臨床試験を行った。これによれば、無傷の子宮頸管から集められた蛍光発光に基づいて診断アルゴリズムにより組織サンプルを病的あるいは非病的なものとして分類できることが分かった。そのようなアルゴリズムは、熟練者によるコルポスコピー（膣鏡診）と同様の有病正診率およびそれよりも著しく改善された無病正診率をもって、正常組織を扁平上皮内病変（ＳＩＬ）から識別することができるとともに、軽度ＳＩＬを重度ＳＩＬから識別することができる。しかしながら、初期の臨床研究においては、１つの組織病理学的なカテゴリー内であっても、異なる患者から集められた蛍光スペクトルにおける変動が大きかった。例えば、正常組織のピーク蛍光強度は、患者間では５のファクタを超えて変動する可能性があるが、一人の患者内では標準偏差が一般に平均値の２５％未満となる。患者間におけるこの大きな変動により、初期のデータ分析はペアを組ませる方法で行われた。しかしながら、このペア分析を行うためには、各患者について、正常部位および異常部位を測定する必要があった。その後のデータ分析方法はペアデータの必要性を排除したが、現在の診断アルゴリズムは、患者間の変動の影響を減らすために、前処理の一部として、依然としてデータの正規化および平均スケーリングを必要とする。
【００１５】
組織蛍光スペクトルに対する生物学的変数の影響を調べるための分析を行った。この分析は、２つの既に公開された臨床試験から集められたデータを使用して行われた。前記２つの臨床試験のうち、一方の研究は、異常なパパニコロー（子宮癌）スミアを有するコルポスコピー臨床に晒される９５人の患者の３９５個の部位からスペクトルを測定したものであり、他方の研究は、スクリーニングについて自己紹介され且つ正常なパパニコロースミアを有していると思われる５４人の患者の２０４個の部位からスペクトルを測定したものである。診断アルゴリズムが形成されて詳細に説明された。この分析においては、年齢、人種、月経周期、月経状態（月経前、月経前後、月経後）、喫煙に関するデータが収集された。正規化されたデータおよび正規化されないデータに関する主成分の分析が比較された。年齢、更年期状態、人種、喫煙に基づいてＡＮＯＶＡが行われた。更年期状態では明らかな強度差が観察される。すなわち、閉経後の患者は高い発光強度を示している（図１）。この差の全てが年齢に起因するものではないが、年齢は強度にも影響を与えると思われ、年齢が高いと、発光強度が高くなる。白人女性は黒人女性と比較して発光強度が僅かに高かった（図２）。喫煙者および喫煙経験者は非喫煙者と比較して発光強度が僅かに高かった。生物学的変数に関連付けられた差は、これらの変数に関して適切に階層化する多くの研究において検査されても良い。これらの生物学的変数をデータの前処理において加えると、アルゴリズム性能および適用性を向上させることができる。
【００１６】
ここで説明した結果から明らかなように、スペクトルデータを表わす主成分における統計的に重要な差は、測定された組織の病理学診断が同じである場合であっても、患者の年齢や更年期状態等の要因によって生じる可能性がある。これは、様々な年齢の女性間で臨床的に見られるスペクトル変化における明確な生物学的根拠を示唆している。年齢の増加および更年期状態に伴う蛍光強度の増大は、コラーゲンおよびエラスチンを含むストロマから発生する信号の大きな比率と整合性が取れている。年輩の閉経後の女性にあっては、子宮頸部上皮が薄肉化し、その上、コラーゲンの架橋結合に変化が生じ得ることが知られている。蛍光スペクトルに対する生物学的変数の特有の影響を完全に理解するためには、多くのデータを用いて更なる統計学的研究を行う必要があるかもしれない。特に、年輩の閉経後の女性から膨大な数の測定値を得ることが必要かもしれない。被験者をその年齢およびホルモン状態に基づいて階層化することにより、データがこれらの変数にわたってうまく分配されるグループからのものとなるようにする臨床試験が継続中である。これにより、そのような患者間変動（分散）を明らかにできるアルゴリズムの形成およびトレーニングが可能となる。現在の前処理技術、正規化および平均スケーリング（mean-scaling）は限られている。これは、正規化がスペクトル間の強度差を無視し、平均スケーリングが等しい数の正常部位および異常部位を患者毎に必要とするためである。正規化を行うことなく患者の年齢または更年期状態に起因する差を明らかにできる他の前処理方法は、例えば、アルゴリズム性能および適用性を向上させることができる。
【００１７】
月経周期
子宮頸部前癌のスクリーニングおよび診断のための蛍光分光法は有望な結果を示した。臨床試験は、診断コルポスコピー臨床においては８６％および７４％の有病正診率および無病正診率を示すとともに、スクリーニング設定においては７５％および８０％の有病正診率および無病正診率を示している。診断設定およびスクリーニング設定の両方において、ピーク蛍光強度は患者間で大きく異なる。リアルタイム診断の有病正診率および無病正診率を更に向上させようとする場合には、この患者間変動性のソースを理解して制御する必要がある。一般に、患者内変動は患者間変動よりも小さい。しかしながら、これらの変動における生物学的根拠は良く理解されていない。先の研究は、人種および喫煙がこれらの変動の原因とならず、年齢および更年期状態が一因となり得ることを示していた。
【００１８】
本発明等は、子宮頸部の蛍光分光法における患者間変動の１つの考えられる理由、すなわち月経周期を評価した。異常なパパニコロースミアの病歴を持たない１０人の患者を、平均して３０日という彼らの月経周期の全体にわたって毎日診た。各患者の３つの子宮頸部部位から蛍光励起発光行列を測定した。図３は、３つの部位にわたって平均化された月経周期日と蛍光強度との間の関係を示している。どのスペクトル領域が月経周期日と共に変化したかを判断するために主成分分析（Principal Component Analysis）が使用された。前癌診断に対する月経周期の影響を評価するために分類を行った。主成分スコアおよびレドックス比率値の変化から分かるように、３４０〜３８０ｎｍ励起における蛍光発光スペクトルは、月経周期の全体にわたる子宮頸部上皮の細胞代謝に関連していると考えられる。しかしながら、これらの変化は統計的に重要ではない。信頼できる有病正診率を計算するためには、生検で判明したＳＩＬからのデータ点のみでは不十分である。したがって、月経周期は、患者内変動に影響を与えるが、重要なレベルの患者間変動を引き起こすとは考えられない。そのため、これを蛍光分光法に基づく光学的検出方法において制御する必要はない。なぜなら、月経周期とは無関係にアルゴリズムがうまく機能するからである。
【００１９】
診断蛍光試験および反射蛍光複合試験の中間分析
過去の研究の重大な制限は、励起波長の選択がソースの利用可能性または多くの異なる励起波長を調査する小さな体外研究に基づいていたという点である。これらの発光スペクトルを集めて励起発光行列（ＥＥＭ）にすることができる。励起発光行列は、励起波長および発光波長に両方に応じた蛍光強度を含んでいる。これらのシステムは、ＵＶ−可視スペクトル全体にわたって上皮組織の自己蛍光特性を特徴付けるための都合の良い方法を与える。この開示内容の１つの目的は、これらのデータを分析することにより、子宮頸部腫瘍形成の診断に最適な励起波長を決定するとともに、励起波長のこの組み合わせにおいて有病正診率および無病正診率を評価することであった。
【００２０】
蛍光励起発光行列（ＥＥＭ）は、生検を用いた先の診断蛍光反射分光法研究の最初の１４６人の患者の３５１個の部位から体内で測定された。データは、励起波長のどの組み合わせが最も高い有病正診率および無病正診率を伴う診断アルゴリズムをもたらすかどうかを判断するために分析された。図４は、子宮頸部において重要な組織病理学的カテゴリーを分類するアルゴリズムにおける励起波長の数の増大の影響を示している。図４は、７５％の固有ベクトル有意レベル（ＥＳＬ）で検査されたペアを成すクラスのそれぞれにおけるトップの２５個の励起波長組み合わせからの相互検証された有病正診率および無病正診率の平均および標準偏差を示している。一般に、一対のクラスのために形成されたアルゴリズムの性能は、その組み合わせで使用される励起波長の数が１つから２つへ増える際に向上するが、第３または第４の励起波長を加えても一般に診断性能は向上しない。当該組織病理学的カテゴリーは、扁平上皮正常領域（ＳＮ）、円柱上皮正常領域（ＣＮ）、軽度の扁平上皮内病変の領域（ＬＧ）、重度の扁平上皮内病変の領域（ＨＧ）であった。アルゴリズムは、ＳＮ対ＣＮ、ＳＮ対ＨＧＳＩＬ、ＣＮ対ＬＧＳＩＬを分離するためにうまく機能する。一方、ＳＮ対ＬＧＳＩＬおよびＣＮ対ＨＧＳＩＬの分離においては低い性能が観察される。
【００２１】
子宮頸部組織の組織病理学的クラス同士を識別するための最も有望な波長を選択するために、最も高い診断性能が得られた励起波長を調べた。全てのペアワイズ識別（ペアを成す識別）における７５％のＥＳＬでの２つの励起波長のトップの２５個の機能する（実行できる）組み合わせの各励起波長の発生頻度を示すヒストグラムを形成した。その結果が図５に示されている。図５は、ＳＮとＨＧＳＩＬとの間を識別するためのヒストグラムを示しており、３３０〜３５０ｎｍが最も頻繁に生じ、４２０〜４５０ｎｍの範囲の波長も頻繁に生じたことを示している。３３０〜３４０ｎｍ、３６０〜４００ｎｍ、４１０〜４６０ｎｍ励起が診断カテゴリーの全てのペア間を識別する最良の性能を生じ得ることが分かった。この研究においては、ＨＧＳＩＬであるサンプルの割合が性能に影響を及ぼす場合があることが分かった。また、ＬＧＳＩＬ（ＨＰＶ、ＣＩＮ１）およびＨＧＳＩＬ（ＣＩＮ２、ＣＩＮ３）内のサンプルの階層化も診断性能に影響を与えると考えられる。
【００２２】
すなわち、ＳＮ、ＣＮ、ＬＧＳＩＬ、ＨＧＳＩＬの蛍光ＥＥＭは、組織病理学的クラス間を識別するために使用できる特徴的な差を示す。組織学的分類のペア同士を識別するため、２つの励起波長からのデータが組み合わされる際に性能が高まることが分かった。しかしながら、第３または第４の励起波長からのデータを加えても、一般的には診断性能が向上しない。最良の識別は、平均して７０〜８０％の有病正診率および無病正診率をもって、ＳＮからのスペクトルとＣＮからのスペクトルとの間、ＳＮからのスペクトルとＨＧＳＩＬからのスペクトルとの間、ＣＮからのスペクトルとＬＧＳＩＬからのスペクトルとの間で見出された。
【００２３】
同様の分析方法を使用して、生検を用いた蛍光反射分光法の大きな診断試験からのデータの中間分析における反射分光法の診断可能性が調べられた。図６は、４つの異なる光源−検出間距離（位置０：２５０μｍの距離、位置１：１．１ｍｍの距離、位置２：２．１ｍｍの距離、位置３：３．０ｍｍの距離）における平均反射スペクトルを示している。スペクトルは、４２０ｎｍ、５４２ｎｍ、５７７ｎｍにおいてヘモグロビン吸収に起因する谷部を示している。平均スペクトルにおいては全ての位置で明らかな差が見られる。この場合、扁平上皮正常組織の反射率が最も高く、円柱上皮正常組織の反射率が最も低い。また、ＣＩＮ１〜３から反射率が徐々に減少する。
【００２４】
【表１】
2006517417.tif 000003
【００２５】
図７は、１、２、３、４の光源−検出間距離の最も良く機能する組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。診断性能は、１つの光源−検出間距離を使用する場合に高く、更なる光源−検出間距離からのデータが含まれている場合には著しく高まらない。表１は、相互検証によって有病正診率および無病正診率の最も高い合計を生じた光源−検出間距離の組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。
【００２６】
これらの有病正診率および無病正診率は、殆どのカテゴリーを区別するために蛍光のみを用いて得られた有病正診率および無病正診率を上回る。最良の結果は、扁平上皮正常組織対円柱上皮正常組織、円柱上皮正常組織対重度ＳＩＬ、円柱上皮正常組織対軽度ＳＩＬを識別する場合に得られる。
【００２７】
蛍光・反射分光法の組み合わせを検査するための同様の分析が行われた。マハラノビス距離に基づくアルゴリズムを使用して、４つの光源−検出間距離の中の最大で３つの反射特徴と１６個の励起波長の中の蛍光特徴との組み合わせを評価した。１つの最大値に正規化された蛍光スペクトルにより最良の結果が見出された。
【００２８】
図８は、１、２、３、４反射特徴および蛍光特徴の最も良く機能する組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。診断性能は、１つの光源−検出間距離を使用する場合に高く、更なる光源−検出間距離からのデータが含まれている場合には著しく高まらない。蛍光・反射分光法を組み合わせると、全てのカテゴリーを識別するための性能が向上するとともに、これらの技術の両方を組み合わせて評価する多くの試験を達成することが重要となる。
【００２９】
表２は、相互検証によって有病正診率および無病正診率の最も高い合計を生じた反射光源−検出間距離と蛍光励起波長との組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。なお、最良の結果は、扁平上皮正常組織と円柱上皮正常組織とを識別するため及び円柱上皮正常組織と軽度ＳＩＬとを識別するために蛍光分光法のみを使用することにより得られる。最良の結果は、円柱上皮正常組織と重度ＳＩＬとを識別するために反射のみを使用することにより得られるが、軽度および重度のＳＩＬから扁平上皮正常組織を識別するためには両方の技術が必要である。
【００３０】
【表２】
2006517417.tif 000004
【００３１】
先の研究において、蛍光分光法のみを用いて３４０、３８０、４６０ｎｍで得られた最も高い有病正診率および無病正診率は、それぞれ８６％および７４％であった。反射分光法と蛍光ＥＥＭ測定とを組み合わせるこれらの研究では、扁平上皮正常組織対軽度ＳＩＬを除き、全ての診断クラスの組み合わせにおいて有病正診率および無病正診率が向上していることに注目されたい。
【００３２】
生検を伴う大規模な診断試験で取得された定量的な組織病理学的データの中間分析も行われた。Ｈ＆Ｅ染色された連続部分の診断領域に対して、病理学者によりマッピングされたフォイルゲン染色された組織部分から定量的な画像が得られた。各生検において形態学的特徴を定量化するとともに、判別分析を実行することにより、組織病理学的に正常および異常な生検における各特徴の平均と標準偏差（ＳＤ）とを比較した。統計的に重要な差を有する６つの特徴が見出された。その後、これらの特徴は、各生検毎に標準的なスコアを得るために使用された。図９Ａは、ボックス僅差プロット内の診断カテゴリーのそれぞれにおける標準的なスコアの平均、標準誤差（ＳＥ）、標準偏差を示している。同様に、この分析は、フォイルゲン染色された部分から評価された構造的特徴を使用して繰り返された。この分析においては、４つの特徴が選択されるとともに、対応する標準的なスコアが計算され且つ病理学のグレードに対してプロットされた（図９Ｂ）。病変の重篤度が高まるにつれて、変化の明らかな連続状態が存在する。
【００３３】
ここで、幾つかの内容において様々な特徴を例示するのに役立つ以下の非制限的な実施例により、本発明の特定の実施形態について更に説明する。以下の実施例は、本発明を実施できる方法の理解を容易にするために挙げられている。
【実施例１】
【００３４】
材料および方法：反射のみ
計測
簡単に述べると、システムは、３つの主要な構成要素、すなわち、（１）キセノンアークランプを使用して広帯域励起光を供給する光源アセンブリと、（２）励起光を組織に対して方向付けるとともに発散反射光を収集する光ファイバプローブと、（３）ポリクロメータを有する光学アセンブリとから成る。図１４はシステムを示している。図１５に示されたプローブは、組織と直接に接触する状態で配置された９本の光ファイバ［２００μｍ直径、開口数（ＮＡ）＝０．２］を使用する。１本のファイバは広帯域照射を行う。４つの異なる光源−検出間距離（位置０：２５０μｍの距離、位置１：１．１ｍｍの距離、位置２：２．１ｍｍの距離、位置３：３．０ｍｍの距離）で９本の収集ファイバは発散反射光を収集する。
【００３５】
臨床測定
膣鏡診の後であって、生検の前に、光ファイバプローブを、検鏡を通じて押し進めて子宮頸部に軽く接触させた状態で配置した。最大で２つの膣鏡診的に異常な子宮頸部部位、扁平上皮で覆われた１つの膣鏡診的に正常な子宮頸部部位、目に見える場合には円柱上皮で覆われた１つの膣鏡診的に正常な子宮頸部部位からスペクトル測定値が得られた。スペクトル測定後、光ファイバプローブで検査した全ての部位を生検した。
【００３６】
各患者の２時間の測定内で、標準スペクトルが測定された。正の制御として、組織の光学的特性を模倣する１．０２μｍ直径のポリスチレンミクロスフェアから成る懸濁液（体積で６．２５％）を含む１ｃｍ経路長のキュベットから反射スペクトルを測定した。負の制御として、蒸留水の大きな容器内にプローブチップを浸漬させた状態で反射スペクトルを測定した。負の制御においては、ガラスと水との間の屈折率の僅かな不一致に起因して、非常に低いレベルの反射が予期される。低い信号レベルは、許容できるレベルの迷光、暗電流、あるいは、他のバックグラウンド信号源を示した。
【００３７】
耐久性の部分（permanent section）に関して生検が行われ、提出された。４ミクロン厚の部分を、ヘマトキシリン・エオジン・フォイルゲン染色液を用いて染色した。分光法の結果が見えなかった熟練した細胞学者および病理学者による診断のため、ごく普通に染色された全ての細胞学的および病理学的な試料が提出された。２人の細胞学者が各パパニコロースミアを読み取った。そして、研究細胞病理学者による意見が一致した診断を行うため、矛盾したケースが３回見直された。また、２人の病理学者も各生検を読み取った。この場合も、研究組織病理学者による意見が一致した診断を行うため、矛盾するケースが３回見直された。診断分類カテゴリーは、標準的な組織病理学的判断基準を使用して、正常組織、ＨＰＶ感染、１級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ１）、２級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ２）、３級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ３）、上皮内癌（ＣＩＳ）を含んでいた。正常組織は、膣鏡診の結果に基づいて、２つのカテゴリー、すなわち、正常扁平上皮（ＳＮ）と正常円柱上皮（ＣＮ）とに分けられた。ＬＧＳＩＬはＨＰＶおよびＣＩＮ１を含んでおり、ＨＧＳＩＬはＣＩＮ２、ＣＩＮ３、ＣＩＳを含んでいる。
【００３８】
データ処理および統計的分析
病理学的結果が見えなかった３人の調査官（治験担当医師）が全てのスペクトルを観察した。使用者または器具の誤用の形跡を示すスペクトル（例えばプローブの滑りといった）は、その後の分析から切り捨てた。ソーススペクトル、照度の変化、検出システムの波長に依存する応答の影響を排除するため、組織スペクトルは、ミクロスフェア基準から測定された対応するスペクトルによって分割された。この正規化は、それぞれの光源−検出間距離において行われた。この手続きにより、ミクロスフェア懸濁液中での光の伝搬に対する、組織中での光の伝搬を示すスペクトルが得られるが、ミクロスフェアの伝搬特性は、良く知られており、モンテカルロに基づくモデルを使用して容易に説明することができる。
【００３９】
１つの測定部位からの反射データは、光源−検出間距離の位置および発光波長の関数として較正された反射強度を含む行列として表される。４つのそれぞれの位置におけるスペクトルは、３５５ｎｍ〜６５５ｎｍの２．５ｎｍ区切りの発光波長に対応する１２１個の強度測定値を含む列ベクトルであった。
【００４０】
その後、反射スペクトルを分析し、子宮頸部で見つけられた異なるタイプの各組織を分けるためにどの光源−検出間距離が診断上において最も有用な情報を含んでいるかを判断した。ペアを成す診断カテゴリーの組み合わせのそれぞれを分離するためのアルゴリズムは、経膣鏡的生検の最も基準となる検査に対して形成され、評価された。診断クラスの全てのペアの比較においては、どのカテゴリーが分光分析的に異なっているかを判断することができるとともに、これらの違いがどこで最も大きいかを評価することができる。その後、この情報を使用して、多段階分類アルゴリズムを形成し、未知のサンプルの組織タイプをその反射スペクトルに基づいて決定することができる。アルゴリズム形成は、以下のステップ、すなわち、（１）分析のための光源−検出間距離の選択と、（２）主成分分析（ＰＣＡ）を使用したデータの削減（整理）と、（３）相互検証を用いたマハラノビス距離により特徴選択および分類とから成る。以下、各ステップについて詳細に説明する。
【００４１】
光源−検出間距離の最適な組み合わせを特定するため、一度に１個、２個、３個、４個とった場合に、全ての考えられる組み合わせを評価した。全部で１５個の組み合わせ（１個から成るものが４つ、２個から成る組み合わせが６つ、３個から成る組み合わせが４つ、４個から成る組み合わせが１つ）が考慮された。
【００４２】
ＰＣＡの前、当該光源−検出間距離における反射スペクトルを含む複数のベクトルが結び付けられた１つのベクトルにされた。これらのベクトルから、比較される２つの診断カテゴリーからの全ての測定値を含むデータ行列を形成した。その後、対応する分散行列の固有ベクトルを計算した。全ての変化のうち、最大で６５、７５、８５、９５％の割合を占めるこれらの固有ベクトルは、アルゴリズム形成のために保持された。全ての変化の残りの割合を占める一部は、固有ベクトル有意レベル（ＥＳＬ）として表される。各固有ベクトルにおいては、データ行列中の各サンプルについて、主成分スコアを計算した。
【００４３】
その後、２つの所定のクラスのうちの一方に対して１つのサンプルを割り当てるために分類関数が形成された。この分類は、ｎ次元空間内の１つのデータセットの平均（ｘm）から１つのデータポイント（ｘ）を分離する多変量尺度であるマハラノビス距離ｒ2に基づいていた。この距離は以下のように与えられる。
方程式１    ｒ2＝（ｘ−ｘm）’・Ｃx-1・（ｘ―ｘm）
ここで、Ｃxは分散行列である。分類される測定値と２つの組織病理学的カテゴリーとの間の多変量距離が計算された。また、サンプルは、それが多変量空間内で最も近いグループに対して割り当てられた。
【００４４】
分類の性能は、分析のために含められる主成分スコアによって決まる。固有ベクトルの利用可能な集合体から、最良の初期性能をもたらす１つの主成分スコアが特定された。その後、この性能を最も向上させたスコアが選択された。このプロセスは、主成分の付加によって性能がもはや向上しなくなるまで、あるいは、全ての成分が選択されるまで繰り返された。その後、光源−検出間距離の各組み合わせにおける有病正診率および無病正診率が組織病理学的診断に対して評価された。オーバートレーニングの危険性を減らすため、相互検証を使用してアルゴリズム性能を評価した。このプロセスでは、全データセットから１つのサンプルが一時的に除去され、残りのデータを用いて分類アルゴリズムが形成される。アルゴリズムは、確保されていたデータに対して適用される。データセット内の各サンプルが順々に確保され、各サンプルの分類結果を組織病理学的診断と比較することにより、有病正診率および無病正診率が計算された。すなわち、病変組織は扁平上皮正常組織または円柱上皮正常組織に対して陽性サンプルとみなされ、円柱上皮正常組織は扁平上皮正常組織に対して陽性サンプルとみなされた。全体の診断性能は、有病正診率および無病正診率の合計として評価された。
【実施例２】
【００４５】
結果：反射のみ
データセット
データセットは、適当であると思われた１６１人の患者の３２４個の部位からのスペクトルによって構成されていた。表３は、各診断カテゴリー内の測定数を示している。対応する扁平上皮正常カテゴリーまたは円柱上皮正常カテゴリー内には、急性的または慢性的な炎症あるいはメタプラシアを伴う組織が含まれていた。
【００４６】
【表３】
2006517417.tif 000005
【００４７】
反射スペクトル
４つの異なる光源−検出間距離位置における各診断カテゴリーについての平均反射スペクトルが図１６に示されている。各位置（０、１、２、３）は、光源−検出間距離が徐々に大きくなっており、そのため、組織の深さを徐々に深くして探っている。全てのスペクトルでは、４２０ｎｍ、５４２ｎｍ、５７７ｎｍにおいてヘモフロビン吸収に起因する谷部が見られる。光源−検出間距離が大きくなるにつれて、光の透過する深さが深くなることにより、長い波長における弾性散乱の相対的なレベルが高まる。各診断クラスの平均スペクトルは、全ての光源−検出間距離において異なる。全ての距離において、扁平上皮正常組織の平均反射率が最も大きい。すなわち、ＨＰＶからＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３へわたって平均反射強度が徐々に減少し、円柱上皮正常組織の平均反射率が最も小さい。異なる診断クラスの平均スペクトル間で最も大きい分離は、位置０において生じる。
【００４８】
統計的分析
図１７は、ＥＳＬが６５％において最も機能する（実行できる）１、２、３、４つの光源−検出間距離の組み合わせの有病正診率および無病正診率を示している。結果は、診断カテゴリーのペアを成す組み合わせについて別々に示されている。診断性能は、１つの距離のみを使用する場合に高く、更なる距離からのデータが含まれている場合にはそれほど高くならない。最良の性能は、８９％の有病正診率および７７％無病正診率をもってＳＮとＣＮとを識別する際、および、７５％の有病正診率および８９％の無病正診率をもってＣＮとＬＧＳＩＬとを識別する際に得られる。ＳＮとＬＧＳＩＬとを識別することが最も難しい。ＥＳＬが６５％から９５％まで大きくなっても、性能は向上しない（図１８）。
【００４９】
表４は、最良の性能をもたらした光源−検出間距離の組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。多くの位置の組み合わせは、ＳＮとＣＮとの識別およびＣＮとＬＧＳＩＬとの識別における良好な結果を一様に示していた。位置０、１は、ＳＮ対ＨＧＳＩＬを除き、組織タイプ間を識別するための全ての最適な組み合わせにおいて現れる。
【００５０】
【表４】
2006517417.tif 000006
【００５１】
検討
反射分光法の診断可能性の研究においては、４つの異なる光源−検出間距離の位置で子宮頸部内測定値が得られた。マハラノビス距離分類を使用することにより、どの光源−検出間距離が診断的に最も有用な情報を含んでいたかを判断した。その結果、考慮された最も低い固有ベクトル有意レベルで単一の光源−検出間距離を使用すると有病正診率および無病正診率が高くなり、更なる距離またはＥＳＬからのデータが含まれていると有病正診率および無病正診率があまり高くならないことが分かった。また、最も良く機能した位置の組み合わせにおいては、位置２、３の大きな光源−検出間距離よりも位置０、１の小さな光源−検出間距離の方が頻繁に現れる。位置０、１は、ＳＮ対ＨＧＳＩＬを除き、全てのペアワイズ識別（ペアを成す識別）において有効であると考えられる。
【００５２】
結果は、高い有病正診率（７２％、７２％）および高い無病正診率（８１％、８３％）をもってＨＧＳＩＬを扁平上皮正常組織および円柱上皮正常組織から識別できることを示している。これらの結果は、先の研究において決定されたものよりもＳＮをＨＧＳＩＬから識別する場合の有病正診率が僅かに低く且つ無病正診率が僅かに高いことを示している。この場合、１つの反射スペクトルの分析を使用すると、８２％の有病正診率および６７％の無病正診率が得られた。また、この研究では、同様の高い有病正診率（７５％）および無病正診率（８９％）をもって円柱上皮正常組織からＬＧＳＩＬを分離できるが、反射分光法を使用するとＬＧＳＩＬおよび扁平上皮正常組織の識別が困難になることが分かった。全てのケースにおいて、反射分光法に関与する無病正診率は、コルポスコピーに関して先に報告された無病正診率（４８％）よりも著しく高く、一方、有病正診率は、コルポスコピーに関して報告された有病正診率（９６％）よりも若干低かった。ここでの反射分光法に関して報告された有病正診率および無病正診率は、１つを除外する相互検証法（Leave-one-out cross validation法）に基づいている。理想的には、別個のトレーニングおよび検証の組を使用することにより、アルゴリズム性能の公平な評価を行うべきである。しかしながら、蛍光分光法を使用する先の研究は、相互検証が別個の検証の組を用いて性能の良好な評価を行うことを示していた。
【００５３】
円柱上皮組織の単細胞上皮厚さを考えると、その平均反射強度が様々な正常および形成異常状態で多層扁平上皮組織よりも低いことは驚くべきことではない。単層上皮により、多くの光を間質性組織に到達させて間質性組織中のヘモグロビンに吸収させることができる。他の全ての診断クラスは、多層扁平上皮であり、したがって、病気の進行と共に減少する強力な平均反射強度を示す。これは、前癌の重篤度が高まるにつれて脈管形成が増大することを見つけたデラスの結果と一致する。正常な子宮頸部上皮中の光伝搬のモンテカルロモデルを使用して評価した結果、４２０ｎｍ蛍光励起においては、位置０で検出された光子の平均透過深さは４５０μｍであり、位置３で検出された光子の平均透過深さは５５０μｍであった。同様に、５００ｎｍ蛍光励起においては、位置０で検出された光子の平均透過深さは６８０μｍであり、位置３で検出された光子の平均透過深さは１１８０μｍであった。これらのシミュレーションは、上皮厚が３５０μｍであり、４２０ｎｍにおいてμs,epitithelium値＝１０５ｃｍ-1、μa,epitithelium＝３ｃｍ-1、μs,stroma＝２８０ｃｍ-1、μa,stroma＝４０ｃｍ-1、５００ｎｍにおいてμs,epitithelium値＝８２ｃｍ-1、μa,epitithelium＝２ｃｍ-1、μs,stroma＝２３０ｃｍ-1、μa,stroma＝４ｃｍ-1であることを前提とした。これらのシミュレーションにおいて、上皮および間質の異方性係数（ｇ）はそれぞれ０．９５および０．８８であった。光ファイバの開口数（ＮＡ）は０．２２であった。上皮および間質の屈折率は１．４になると思われた。２層モデルにおけるＷｅｌｃｈ等による結果および検出モデリングにおけるＭｏｕｒａｎｔ等による結果を用いてコードを検証した。各散乱現象後に組織中における光子位置の軌道を維持することにより、光子が到達する最大深さを計算することができる。
【実施例３】
【００５４】
材料および方法：蛍光のみ
材料
コルポスコピー（膣鏡診）中、医師または看護士の膣鏡診者により、２つの膣鏡診的に正常な部位および１つの膣鏡診的に異常な部位が選択され、また、これらの３つの部位から蛍光ＥＥＭが測定された。これらの部位が扁平上皮または円柱上皮であるかどうか、あるいは、移行領域であるかどうかが注目された。
【００５５】
蛍光測定後、各部位が生検されて組織病理学的診断に用いられた。各パパニコロースミアは、その日の事例に割り当てられた細胞病理学者により読み取られ、その後、研究細胞病理学者によって調べられた。研究細胞学者による意見が一致した診断を行うため、矛盾したケースが３回見直された。各生検は、その日の事例に割り当てられた病理学者により読み取られ、その後、研究組織病理学者によって見直された。この場合も、研究組織病理学者による意見が一致した診断を行うため、矛盾するケースが３回見直された。標準的な診断基準が使用され、意見が一致した診断カテゴリーは、正常扁平上皮（ＳＮ）、正常円柱上皮（ＣＮ）、ＨＰＶ感染（ＨＰＶ）、１級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ１）、ＣＩＮ２、３級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ３）を含んでいた。初期の分析においては、ＨＰＶ感染およびＣＩＮ１がＬＧＳＩＬとして一括してグループ化され、ＣＩＮ２およびＣＩＮ３がＨＧＳＩＬとして一括してグループ化された。
【００５６】
計測
蛍光ＥＥＭを測定するために使用されるスペクトル分析（分光分析）システムについては既に詳細に説明した。簡単に言うと、システムは、５ｎｍのスペクトル分解能で３３０ｎｍ〜４８０ｎｍの範囲を１０ｎｍ毎に区切った１６個の励起波長において蛍光発光スペクトルを測定する。システムは、光ファイバプローブと、励起光を供給するためのモノクロメータおよびポリクロメータに結合されたキセノアークランプと、発光波長に応じて蛍光強度を記録するための熱電冷却されたＣＣＤカメラとを組み込んでいる。光ファイバプローブは、２ｍｍ直径の石英ファイバ上に先端が不規則に配置された２５個の励起ファイバおよび１２個の収集ファイバから成る。
【００５７】
測定
負の制御として、各日の始めに蒸留水で満たされた非蛍光ボトル内にプローブを浸漬させた状態でバックグラウンドＥＥＭが得られた。その後、各患者測定の始めに、ローダミン６１０（Ｅｘｃｉｔｏｎ，Ｄａｙｔｏｎ，ＯＨ）をエチレングリコール（２ｍｇ／ｍＬ）中に溶解させて成る溶液を収容する石英キュベットの表面上にプローブを配置した状態で、蛍光ＥＥＭが測定された。
【００５８】
検知システムの不均一なスペクトル応答を補正するため、研究の始めに、２つの較正されたソースのスペクトルが測定された。可視光においては、ＮＩＳＴ追跡可能較正タングステンリボンフィラメントランプが使用され、ＵＶにおいては重水素放電管が使用された（５５０Ｃ・４５Ｄ、Ｏｐｔｒｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ）。これらのスペクトルから補正因子が得られた。その後、患者からの暗電流が差し引かれたＥＥＭは、検知システムの不均一なスペクトル応答が補正された。較正されたフォトダイオード（８１８−ＵＶ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を使用して形成されたプローブチップで各励起波長における強度を測定することにより、異なる励起波長での蛍光励起光源の強度変化を補正した。
【００５９】
プローブを使用する前に、２０分間、Ｍｅｔｒｉｃｉｄｅ（Ｍｅｔｒｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いてプローブを消毒した。その後、水を用いてプローブを洗浄し、滅菌ガーゼを用いてプローブを乾燥させた。消毒されたプローブを膣内に案内して、プローブの先端を子宮頸部上皮と同一平面上に位置決めした。その後、３つの子宮頸部部位から蛍光ＥＥＭを測定した。プローブを配置する前に、正常組織と形成異常組織との間の光学的な差異を高める酢酸が子宮頸部上皮に対して加えられた。各ＥＥＭの測定に約２分を要した。
【００６０】
データ分析
分析前に病理学的結果が見えなかった３人の調査官（ＳＫＣ、ＵＵ、ＲＲＫ）が全てのスペクトルを調べた。器具の誤用またはプローブの滑りといった形跡を示すスペクトルは、その後の分析から切り捨てられた。
蛍光データを分析することにより、どの励起波長が診断上最も有用な情報を含んでいたかを判断するとともに、この情報に基づいて診断アルゴリズムを評価した。最初に、全てのペアを成す診断カテゴリーの組み合わせ同士を識別したアルゴリズムが検討された（表５）。
【００６１】
【表５】
2006517417.tif 000007
【００６２】
全ての診断クラスのペアを比べると、どのカテゴリーが分光学的に異なっているかを判断することができるとともに、これらの差異が最も大きい場所を評価することができる。その後、この情報を使用することにより、多段アルゴリズムを形成し、未知のサンプルの組織タイプをその蛍光スペクトルに基づいて決定することができる。この目的のため、最も良く機能する励起波長におけるスペクトルの一部を全ての励起波長における全ての考えられる発光スペクトルの組み合わせから選択する多変量判別技術に基づくアルゴリズムが形成された。以下に詳細に説明するこのアルゴリズムは、以下の主要なステップ、すなわち、（１）患者間変動を減少させるためのデータ処理、（２）データセットの次元数を減らすためのデータ削減（整理）、（３）診断性能が最大でトレーニングセットにおけるオーバートレーニングの可能性が最小な２つの所定のクラスを分類するため等級分け、（４）相互検証技術によるこれらのアルゴリズムの評価から成る。
【００６３】
１つの測定部位からの蛍光データは、励起波長および発光波長に応じた較正された蛍光強度を含む行列として表される。この行列の縦列は特定の励起波長における発光スペクトルに対応しており、この行列の横列は特定の発光波長における励起スペクトルに対応している。各励起スペクトルは、３３０ｎｍ〜４８０ｎｍの範囲を１０ｎｍ毎に区切った１６個の強度測定値を含んでいる。一方、各発光スペクトルは、励起波長に応じて、３８０ｎｍ〜９１０ｎｍの範囲を５ｎｍ毎に区切った５０〜１３０個の強度測定値を含んでいる。最後に、７００ｎｍの発光波長で発光スペクトルを切り捨てることにより、７００ｎｍを超えて存在する室内光に起因する非常に変わりやすいバックグラウンドを排除した。殆どの多変量データ分析技術はベクトル入力を必要とするため、分析前に、評価のために選択された励起波長で発光スペクトルを含む列ベクトルが切り落とされ、それにより、ノイズが多い末尾が切り捨てられた。その後、これらの列ベクトルが１つのベクトルに結び付けられた。
【００６４】
したがって、前処理方法を使用することにより、組織病理学的カテゴリー間の差を保ちつつ、組織病理学的カテゴリー間の差よりも大きくなり得る患者間の大きな強度変化すなわち患者間変動を減少させた。すなわち、結び付けられたベクトルにおける各発光スペクトルがその対応する最大強度まで正規化された。
【００６５】
次元数を減らすため、全てのデータセットに関してＰＣＡ（主成分分析）が行われた。最初に、各サンプルからの結び付けられたスペクトルベクトルを横列内に配置することにより、励起波長の各組み合わせについて、入力行列（投入行列）が形成された。その後、対応する分散行列の固有ベクトルを計算し、これにより主成分が生じた。アルゴリズム性能に対するＥＳＬ（固有ベクトル有意レベル）の影響を調べるため、全体の変動の６５％、７５％、８５％、９５％に関して固有ベクトル計算が使用された。ＥＳＬは、最初のｎ個の固有ベクトルの一次結合に起因するデータセットの全変動（分散）の一部を表している。これらの固有ベクトルに関与する主成分スコアが各サンプルについて計算された。
【００６６】
その後、２つの所定のクラスのうちの一方に対して１つのサンプルを割り当てるために分類関数が形成された。この分類は、ｎ次元空間内のデータセットの平均から１つのデータポイントを分離する多変量尺度であるマハラノビス距離に基づいていた。分類されるサンプルと２つの考えられる分類グループの平均との間の多変量距離が計算された。その後、サンプルは、この多変量空間内で最も近かったグループに対して割り当てられた。
【００６７】
分類の性能は、分析のために含められた主成分スコアによって決まる。６５％、７５％、８５％、９５％のＥＳＬにおける固有ベクトルの利用可能な集合体から、最良の初期の性能をもたらす１つの主成分スコアが特定された。その後、この性能を最も向上させたスコアが選択された。このプロセスは、主成分の付加によって性能がもはや向上しなくなるまで、あるいは、全ての成分が選択されるまで繰り返された。
【００６８】
その後、励起波長の各組み合わせにおけるアルゴリズムの有病正診率および無病正診率が組織病理学に基づく診断に対して評価された。全体の診断性能が有病正診率および無病正診率の合計として評価され、それにより、分類ミスの数が最小限に抑えられた。各サンプルに対応する診断がランダム化された後に同じデータセットから形成されたアルゴリズムの性能とトレーニングセット性能とを比較することによりオーバートレーニングの危険性が励起波長の各組み合わせについて評価された。各クラスにおけるサンプルの数は、診断ランダム化中に保たれた。これにより、当初のデータセットと同じ変動構造が１つのデータセットに与えられるが、この場合、診断性能は、見込まれる性能を超えないと思われる。その後、ランダム化された診断に基づいて診断アルゴリズムが形成された。各波長組み合わせについてランダム診断が５０回割り当てられ、５０個のケースの有病正診率および無病正診率の平均が計算された。理想的には、全く普通に分散されたデータの場合、有病正診率および無病正診率の合計は、全てのトレーニング有意レベルで、ランダム化された診断において１でなければならない。しかしながら、オーバートレーニングが生じると、この合計が１よりも大きくなる。１つから最大で４つの励起波長からの発光スペクトルの組み合わせが考慮された。装置を４つの波長に制限することにより、費用効率がかなり高い臨床分光システムを構成することができる。最適な励起波長の組み合わせを特定するため、１６個の励起波長から選択された最大で４つの波長の全ての組み合わせが評価された。これは、１つの励起波長から成る１６個の組み合わせ、２つの励起波長から成る１２０個の組み合わせ、３つの励起波長から成る５６０個の組み合わせ、４つの励起波長から成る１８２０個の組み合わせ、合計で２５１６個の組み合わせに相当する。その後、トップの２５個の波長組み合わせは、組織病理学的診断が正しいトレーニングセット性能と診断がランダムに割り当てられるトレーニングセット性能との間で性能が高い順にランク付けされた。この方法によれば、トップの波長組み合わせを、その信頼性の順に、すなわち、オーバートレーニング性向が欠如する順番でランク付けすることができる。
【００６９】
アルゴリズム性能のこれらの評価は、アルゴリズムを形成するために使用されるトレーニングセットに基づいているため、一方に偏っている。偏っていない性能評価を行って、トップの２５個の波長組み合わせのそれぞれの真の可能性を評価しなければならない。別個のトレーニング・検証セットを使用することにより、あるいは、相互検証の方法を使用することにより、性能評価におけるオーバートレーニングの影響を最小限に抑えることができる。相互検証方法においては、データセット全体からの１つのデータがトレーニングデータセットから一時的に除去され、残りのデータセットをトレーニングセットとして使用して分類アルゴリズムが形成される。データを確保するために新たな分類アルゴリズムが適用される。データセット内の各サンプルがテストデータとして使用され、各サンプルの分類結果を組織病理学的診断と比較することにより、有病正診率および無病正診率が計算された。この研究論文では、トップの２５個の波長組み合わせのうち、相互検証された有病正診率および相互検証された無病正診率の合計に基づくトップの１０個の組み合わせからの結果が与えられる。
【実施例４】
【００７０】
結果：蛍光のみ
この研究では、１４７人の患者からの全部で３７３個のＥＥＭが分析された。調べられた３７３個のＥＥＭのうち、２２個のＥＥＭは、器具の誤用（１０個の部位）およびプローブ移動（１２個の部位）に起因して分析に問題があると認められ、切り捨てられた。３５１個の残りのＥＥＭのうち、２３３個の部位は正常な扁平上皮部位であり、２３個は円柱上皮部位であり、６４個はＬＧＳＩＬであり、３１個はＨＧＳＩＬであった。６４個のＬＧＳＩＬ部位のうち、４６個はＨＰＶであり、１８個はＣＩＮ１であった。３１個のＨＧＳＩＬ部位のうち、１２個はＣＩＮ２部位であり、１１個はＣＩＮ３であり、８個は上皮内癌（ＣＩＳ）であった。２３３個の扁平上皮正常部位のうち、１０７個の部位は炎症及び／又はメタプラシアを有していた。４０個が炎症のみを示しており、１４個がメタプラシアのみを示していた。残りの５３個の部位は炎症およびメタプラシアの両方を有していた。２３個の円柱上皮正常部位のうち、１２個が炎症のみを示しており、１１個が炎症およびメタプラシアの両方を示していた。メタプラシアのみを示す円柱上皮部位はなかった。分析のために使用されたデータの組成が表６に示されている。
【００７１】
【表６】
2006517417.tif 000008
【００７２】
図１０は、正常な扁平上皮部位、正常な円柱上皮部位、ＨＧＳＩＬを有する部位を含む、同じ患者の異なる部位からの一般的な蛍光ＥＥＭを示している。蛍光ＥＥＭは、縦座標が励起波長で且つ横座標が発光波長となる地形図としてプロットされている。等高線は、蛍光強度が等しい点同士を接続している。幾つかの励起−発光最大値が存在する。すなわち、３５０ｎｍ励起にピークがあり、４５０ｎｍ発光は、共同因子ＮＡＤＨの発光およびコラーゲンの架橋結合と一致する。３７０ｎｍ励起においては、あまりはっきりとしない段部があり、５２５ｎｍ発光が共同因子ＦＡＤおよび構造蛋白質蛍光と一致している。また、ＨＧＳＩＬのＥＥＭには内因性ポルフィリンの蛍光が存在している。この場合、４１０ｎｍにおいて励起が最大となり、６３０ｎｍおよび６９０ｎｍにおいて発光が最大となる。ヘモグロビンが４２０ｎｍ、５４０ｎｍ、５８０ｎｍで蛍光を吸収すると、組織血管分布像は蛍光スペクトルに影響を与えることができ、これにより、３つの全てのＥＥＭで見られるように励起波長軸および発光波長軸と平行なＥＥＭの谷部が形成される。
【００７３】
【表７】
2006517417.tif 000009
【００７４】
表７は、トップの１０個の機能する単励起波長に基づくアルゴリズムにおける相互検証された有病正診率および無病正診率を示している。７５％のＥＳＬが使用されたが、全てのＥＳＬにおいて同様の結果が得られた。励起波長は、相互検証された有病正診率および無病正診率の合計の降順でリストアップされている。表７および表８は、２個および３個の波長組み合わせのそれぞれのトップ１０個の機能する組み合わせに基づくアルゴリズムにおける相互検証された有病正診率および無病正診率を示している。この場合も同様に、７５％のＥＳＬが使用されたが、全てのＥＳＬにおいて同様の結果が得られた。各表における励起波長組み合わせは、相互検証された有病正診率および無病正診率の合計の降順でリストアップされている。表７は、トップの４つの励起波長が同様の性能を有する一方で、残りの単励起波長においては有病正診率および無病正診率が落ち込んでいることを示している。しかしながら、２個の励起波長から成る組み合わせのうちのトップの１０個の組み合わせの殆ど（表８）および３個の励起波長から成る組み合わせの全て（表９）は同様の性能を有している。面白いことに、最良の性能を与える表７の４つの励起波長は、表８および表９に示されるトップの１０個の組み合わせの多くで現れる。
【００７５】
【表８】
2006517417.tif 000010
【００７６】
【表９】
2006517417.tif 000011
【００７７】
図１１は、子宮頸部において重要な組織病理学的カテゴリーを分類するアルゴリズムにおける励起波長の数を増大する効果を示している。図１１は、７５％のＥＳＬで検査されたクラスの各ペアにおけるトップの１０個の励起波長組み合わせからの相互検証された有病正診率および無病正診率の平均および標準偏差を示している。一般に、組み合わせで使用される励起波長の数が１つから２つへと増えると、クラスのペアのために形成されるアルゴリズムの性能が向上するが、第３または第４の励起波長を加えても一般に診断性能は向上しない。アルゴリズムは、ＳＮ対ＣＮ、ＳＮ対ＨＧＳＩＬ、ＣＮ対ＬＧＳＩＬを分離するために良好に機能する。一方、ＳＮ対ＬＧＳＩＬおよびＣＮ対ＨＧＳＩＬの分離においては低い性能が見られる。
【００７８】
図１２は、６５％、７５％、８５％、９５％のＥＳＬにおける３個および４個の励起波長から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせに基づく集合識別子の性能を示している。図１２Ａは、ＳＮとＣＮとを分離するための集合識別子における有病正診率（左）および無病正診率（右）を示している。３つのタイプの集合識別子の性能が示されている。すなわち、２５個の個々のトップの機能する励起波長組み合わせの大部分が、サンプルがＣＮであったことを示した場合、最初にサンプルはＣＮとして分類される。同様に、サンプルをＣＮとして分類するためにトップの機能する２５個の励起波長組み合わせのうちの８０％または１００％を必要とした分類子からの結果も示されている。この場合も同様に、励起波長の数が増えると、性能の変化は殆ど見られない。サンプルをＣＮとして識別するために必要とされた個々の識別子のパーセンテージが過半数から１００％へと増えると、無病正診率の減少は殆ど見られない。このことは、殆どの励起波長組み合わせが同じ分類を引き起こしたことを示している。最後に、２５個の個々の分類子の全てが一致する必要がある場合、９５％のＥＳＬで有病正診率が僅かに減少することに注目することが興味深い。これは、おそらく、このＥＳＬにおけるオーバートレーニングの偏りを反映している。
【００７９】
図１２Ｂは、ＳＮをＨＧＳＩＬから分離するための３個および４個の励起波長から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせに基づく集合分類子の性能を示している。サンプルをＨＧＳＩＬとして識別するために必要とされる個々の分類子の数が増大すると、有病正診率が減少するが、無病正診率はほぼ一定のままである。この場合も同様に、励起波長の数が３個から４個に増えても、性能の著しい向上は見られなかった。図１２Ｃは、ＣＩＮ２（左）およびＣＩＮ３（右）における集合分類子の有病正診率を示している。有病正診率は、３つの集合分類子においては、ＣＩＮ２におけるよりもＣＩＮ３における場合の方がかなり高い。これは、ＣＩＮ３を識別できる病理学者の能力と一致する。しかしながら、観察者間の意見の一致は、ＣＩＮ２の診断におけるよりもＣＩＮ３の診断における場合の方がかなり高い。
【００８０】
同様に、図１２Ｄは、ＣＮをＬＧＳＩＬから分離する集合分類子の性能を示している。この場合、サンプルをＬＧＳＩＬとして分類するために必要な個々の分類子の割合が５０％から１００％に増えても、有病正診率および無病正診率のいずれも殆ど変化しなかった。この場合も同様に、励起波長の数が３個から４個に増えても、診断性能は向上しなかった。ＬＧＳＩＬ（ＨＰＶ感染およびＣＩＮ１）を形成する２つのサブカテゴリーにおいて性能が変化したかどうかを検討するため、これらの２つのサブカテゴリーにおける有病正診率を個別に検査した。その結果が図１２Ｅに示されている。ＣＮとＨＰＶ（左）とを識別するための有病正診率は、ＣＩＮ１（右）におけるそれよりも高かった。このことは、ＣＮのスペクトルがＨＰＶ感染を伴う組織よりもＣＩＮ１を有する組織の方のスペクトルとかなり類似していることを示している。プロットは示されていないが、１つの励起波長を付加して４波長組み合わせにしても性能が向上しない場合、ＬＧＳＩＬをＳＮから識別するための集合分類子も同様の結果を示す。ＬＧＳＩＬにおけるサブカテゴリーの検査によれば、ＳＮからＨＰＶを分離する困難性が性能を制限するのが分かる。
【００８１】
子宮頸部組織の組織病理学的クラス間を識別できる最も有望な波長を選択するため、最も高い診断性能をもたらす励起波長が検討された。全てのペアワイズ識別のための７５％のＥＳＬでの２つの励起波長から成る組み合わせのうちのトップの１０個の機能する組み合わせにおける各励起波長の発生頻度を示すヒストグラムが形成された。その結果が図１３に示されている。図１３Ａは、ＳＮとＣＮとを識別するためのヒストグラムを示しており、３３０〜３４０ｎｍが最も頻繁に生じることを示している。また、４１０ｎｍおよび４２０ｎｍの波長も頻繁に生じる。図１３Ｂは、ＳＮとＬＧＳＩＬとを識別するためのヒストグラムを示している。この場合も、３３０〜３５０ｎｍ励起が頻繁に生じ、４００〜４５０ｎｍ励起も頻繁に生じる。図１３Ｃおよび図１３Ｄは、ＳＮとＨＧＳＩＬとを識別するため及びＣＮとＬＧＳＩＬとを識別するために同様の波長が有用であることを示している。図１３Ｅは、ＣＮとＨＧＳＩＬとを識別するために、３７０〜４００ｎｍの励起波長が最も有用であることを示している。
【実施例５】
【００８２】
材料および方法：反射および蛍光
計測
反射スペクトルを測定するために使用される分光システムについては既に詳細に説明した。簡単に述べると、システムは、３つの主要な構成要素、すなわち、（１）広帯域照明を供給するために使用され且つ蛍光励起光を供給するためにモノクロメータに結合されたキセノンアークランプと、（２）励起光を組織に対して方向付けるとともに発散反射蛍光発光を収集する光ファイバプローブと、（３）ポリクロメータを有する光学アセンブリおよびスペクトルデータを記録するための熱電冷却されたＣＣＤカメラとを組み込んでいる。図１４はシステムを示している。
【００８３】
図１５に示されたプローブは、組織と直接に接触する状態で配置された９本の空間的に離間された反射光ファイバ［２００μｍ直径、開口数（ＮＡ）＝０．２］によって取り囲まれるコア内で蛍光測定のための１本の光ファイバ束を使用する。蛍光ファイバ束は、ランダムに配置された２５本の照明ファイバおよび１２本の収集ファイバから成る。ファイバ束の先端にある１５ｍｍ長の石英が混入した要素［２００μｍ直径、（ＮＡ）＝０．２］は、ファイバを測定組織と直接に接触しないように分離し、それにより、束内の全てのファイバによって組織の同じ領域を照明し且つ当該領域から蛍光を収集できるようにする。３３０ｎｍ〜４８０ｎｍの範囲を１０ｎｍ毎に区切った蛍光励起波長および各発光スペクトルは、５ｎｍのスペクトル分解能を有している。９本の反射ファイバのうち、１本の励起ファイバは広帯域照明を行い、８本の反射収集ファイバは、かなり深い組織を検査するため、４つの異なる光源−検出間距離（位置０：２５０μｍの距離、位置１：１．１ｍｍの距離、位置２：２．１ｍｍの距離、位置３：３．０ｍｍの距離）で、発散反射光を収集する。１つの分光測定値は、２分間隔で順に測定された蛍光スペクトルおよび反射スペクトルから成る。
【００８４】
臨床測定
膣鏡診の後であって、生検の前に、光ファイバプローブを、検鏡を通じて押し進めて子宮頸部に軽く接触させた状態で配置した。最大で２つの膣鏡診的に異常な子宮頸部部位、扁平上皮で覆われた１つの膣鏡診的に正常な子宮頸部部位、目に見える場合には円柱上皮で覆われた１つの膣鏡診的に正常な子宮頸部部位から蛍光測定値および反射測定値の両方が得られた。スペクトル測定後、光ファイバプローブで検査した全ての部位を生検した。
【００８５】
各患者の２時間の測定内で、反射基準および蛍光基準からのスペクトルが測定された。正の制御として、組織の光学的特性を模倣する１．０２μｍ直径のポリスチレンミクロスフェアから成る懸濁液（体積で６．２５％）を含む１ｃｍ経路長キュベットから反射スペクトルを測定した。蛍光測定の正の制御のため、ローダミン６１０（Ｅｘｃｉｔｏｎ，Ｄａｙｔｏｎ，ＯＨ）をエチレングリコール（２ｍｇ／ｍＬ）中に溶解させて成る１ｃｍ経路長キュベット内の溶液から蛍光ＥＥＭを測定した。負の制御として、蒸留水の大きな容器内にプローブチップを浸漬させた状態で反射スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。
【００８６】
耐久性の部分に関して生検が行われて提出された。４ミクロン厚の部分をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）およびフォイルゲン染色液の両方を用いて染色した。組織診断分類カテゴリーは、正常組織、ＨＰＶ感染（ＨＰＶ）、１級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ１）、２級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ２）、３級子宮頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ３）、上皮内癌（ＣＩＳ）を含んでいた。正常組織は、膣鏡診の結果に基づいて、２つのカテゴリー、すなわち、正常扁平上皮（ＳＮ）と正常円柱上皮（ＣＮ）とに分けられた。ベテスダシステムにおいては、ＨＰＶおよびＣＩＮ１がＬＧＳＩＬと称されており、また、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、ＣＩＳがＨＧＳＩＬと称されていた。この分析では診断カテゴリーＳＮ、ＣＮ、ＬＧＳＩＬ、ＨＧＳＩＬが使用された。
【００８７】
データ処理および統計的分析
病理学的結果が見えなかった３人の調査官（治験担当医師）が全てのスペクトルを観察した。例えばプローブの滑りといった使用者または器具の誤用の形跡を示すスペクトルは、その後の分析から切り捨てられた。ミクロスフェア懸濁液反射基準および蛍光補正係数を使用して、ソーススペクトル、照度の変化、検出システムの波長に依存する応答の影響が補正された。ミクロスフェア懸濁液からの対応するスペクトルにより、各光源−検出間距離における反射スペクトルが正規化された。この手続きにより、ミクロスフェア懸濁液中での光の伝搬に対する、組織中での光の伝搬を示すスペクトルが得られるが、ミクロスフェアの伝搬特性は、良く知られており、モンテカルロ法に基づくモデルを使用して容易に説明することができる。較正されたフォトダイオード（８１８−ＵＶ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を使用してプローブチップで測定された励起波長強度を用いて、全ての励起波長における光源の照度変化を補正した。検知システムの不均一なスペクトル応答を補正するため、研究の始めに、２つの較正されたソースのスペクトルが測定された。可視光においては、ＮＩＳＴ追跡可能較正タングステンリボンフィラメントランプが使用され、ＵＶにおいては重水素放電管が使用された（５５０Ｃ・４５Ｄ、オプトエレクトロニクス・ラボラトリ社、オーランド、フロリダ州）。これらのスペクトルから補正因子が得られた。
【００８８】
１つの測定部位からの反射データは、光源−検出間距離の位置および発光波長の関数として較正された反射強度を含む行列として表される。４つの位置からのスペクトルは、３５５ｎｍ〜６５５ｎｍの２．５ｎｍ区切りの発光波長に対応する１２１個の強度測定値を含む列ベクトルである。１つの測定部位からの蛍光データは、励起発光行列（ＥＥＭ）として表される。この場合、較正された蛍光強度は励起・発光波長の関数として表される。この行列の縦列は各励起波長における発光スペクトルに対応しており、３８０ｎｍ〜９１０ｎｍ発光の範囲を５ｎｍ毎に区切った５０〜１３０個の強度測定値を含んでいる。励起波長は、３３０ｎｍ〜４８０ｎｍの範囲で１０ｎｍ毎に区切られている。７００ｎｍよりも大きい波長の蛍光発光スペクトルが切り捨てられることにより、７００ｎｍを超える非常に変わりやすいバックグラウンドが排除された。
【００８９】
その後、反射スペクトルおよび蛍光スペクトルを分析し、子宮頸部で見つけられた組織の各診断カテゴリーを分けるために、分類特徴と呼ばれるどの光源−検出間距離および励起波長が診断上において最も有用な情報を含んでいるかを判断した。ペアを成す各診断カテゴリーを分離するためのアルゴリズムは、経膣鏡的生検の最も基準になる検査に対して形成され評価された。診断カテゴリーの全てのペアの比較においては、どのカテゴリーが分光分析的に異なっているかを判断することができるとともに、どの分類特徴が最も大きい差を示しているかを評価することができる。アルゴリズム形成は、以下のステップ、すなわち、（１）分析のための分類特徴組み合わせに対応するデータ行列の形成と、（２）主成分分析（ＰＣＡ）を使用したデータの削減と、（３）マハラノビス距離を使用する相互検証を伴うデータ分類とから成る。
【００９０】
４つの光源−検出間距離および１６個の励起波長の中で最適な分類組み合わせを特定するため、２０個の特徴が一度に１個、２個または３個とられた時に全ての考えられる組み合わせが評価された。全部で１３５０個の組み合わせが考慮された。そのうち１２個の組み合わせは１個から成り、１９０個の組み合わせは２個から成り、１１４０個の組み合わせは３個から成る。
【００９１】
ＰＣＡの前、所定の組み合わせの分類特徴に対応する測定スペクトルの成分が結び付けられた１つのベクトルにされた。これらのベクトルから、ペアを成す分析のためのデータ行列が形成された。この場合、横列は、測定部位からの結び付けられたベクトルに対応している。分析されるペアからの測定値のみがまとめられて１つの行列にされた。その後、対応する分散行列の固有ベクトルを計算した。全ての変化のうち、最大で、６５、７５、８５、９５％の割合を占めるこれらの固有ベクトルは、アルゴリズム形成のために保持された。全ての変化の残りの割合を占める一部は、固有ベクトル有意レベル（ＥＳＬ）として表された。各固有ベクトルにおいては、データ行列中の各サンプルについて主成分スコアを計算した。
【００９２】
その後、２つの所定の診断カテゴリーのうちの一方に対して１つのサンプルを割り当てるために分類関数が形成された。この分類は、ｎ次元空間内の１つのデータセットの平均から１つのデータポイントを分離する多変量尺度であるマハラノビス距離に基づいていた。分類される測定値と２つの組織病理学的カテゴリーとの間の多変量距離が計算された。また、サンプルは、それが多変量空間内で最も近いグループに対して割り当てられた。
【００９３】
分類の性能は、分析のために含められる主成分スコアによって決まる。各ＥＳＬにおける固有ベクトルの利用可能な集合体から、最良の初期の性能をもたらす１つの主成分スコアが特定された。その後、この性能を最も向上させたスコアが選択された。このプロセスは、主成分の付加によって性能がもはや向上しなくなるまで、あるいは、全ての成分が選択されるまで繰り返された。その後、各分類特徴組み合わせにおける診断アルゴリズムの有病正診率および無病正診率が組織病理学的診断に対して評価された。病変組織は扁平上皮正常組織または円柱上皮正常組織に対して陽性サンプルとみなされ、円柱上皮正常組織は扁平上皮正常組織に対して陽性サンプルとみなされた。
【００９４】
分類特徴のどの組み合わせが有効であるかを決定するため、診断カテゴリーのペアの全てのサンプルを使用して分類アルゴリズムをトレーニングした。その後、そのトレーニングサンプルセットに対してアルゴリズムが検査された。セット内の各サンプルにはランダムな診断が与えられ、また、変更されたセットに対してアルゴリズムが実行された。オーバートレーニングの危険性を減らすため、ランダム化された診断が行われた。全ての組み合わせは、実際の診断と５０回のランダム化された診断試験との間の性能の差に関してランク付けされた。その後、トップの２５個のランキング組み合わせが更に評価された。オーバートレーニングの危険性を更に減らすため、相互検証を使用してトップの２５個の組み合わせのアルゴリズム性能を評価した。このプロセスでは、全データセットから１つのサンプルが一時的に除去され、残りのデータを用いて分類アルゴリズムが形成される。アルゴリズムは、確保されていたデータに対して適用される。データセット内の各サンプルが順々に確保され、各サンプルの分類結果を組織病理学的診断と比較することにより、有病正診率および無病正診率が計算された。したがって、各分類特徴組み合わせの診断性能は、相互検証された有病正診率および無病正診率の合計として評価された。
【実施例６】
【００９５】
結果：反射および蛍光
データセット
データセットは、反射分析および蛍光分析において適当であると思われた１６１人の患者の３２４個の部位からのスペクトルのセットによって構成されていた。表１０は、組織病理学的カテゴリーによって設定されたデータを示している。表１０中の記入事項は、データセットのための各診断カテゴリー内の測定値の数を示している。対応する扁平上皮正常カテゴリーまたは円柱上皮正常カテゴリー内には、急性的な炎症または慢性的な炎症あるいはメタプラシアを伴う組織が含まれていた。
【００９６】
【表１０】
2006517417.tif 000012
【００９７】
反射スペクトル
（ａ）正常扁平上皮、（ｂ）正常円柱上皮、（ｃ）ＣＩＮ３／ＣＩＳとして診断された３つの組織測定部位からの一般的な反射スペクトルおよび蛍光スペクトルが図１９に示されている。４つの異なる光源−検出間距離の位置における各部位毎の反射スペクトルが図１９の左の縦列に示されている。位置０、１、２、３は、光源−検出間距離が徐々に大きくなっており、そのため、組織の深さを徐々に深くして探っている。全てのスペクトルでは、４２０ｎｍ、５４２ｎｍ、５７７ｎｍにおいてヘモフロビン吸収に起因する谷部が見られる。光源−検出間距離が大きくなるにつれて、光の透過する深さが深くなることにより、長い波長における弾性散乱の相対的なレベルが高まる。一般に、反射強度はＳＮ組織から異常組織へと減少する。この場合、ＨＧＳＩＬにおいて最も著しい減衰が見られる。ＣＮ組織からの反射強度は、ＳＮ組織からの反射強度と比較して相対的に低い。
【００９８】
蛍光スペクトル
蛍光ＥＥＭスペクトルが図１９の右側の縦列に示されている。共同因子ＮＡＤＨ、ＦＡＤからの蛍光ピーク、構造蛋白質、ヘモグロビン吸収谷部がＥＥＭにおいて見られる。共同因子ＮＡＤＨからの蛍光は、３５０ｎｍ励起／４５０ｎｍ発光においてピークを含んでおり、一方、共同因子ＦＡＤは、３５０ｎｍおよび４５０ｎｍ励起において、５２５ｎｍ発光に沿ってピークを含んでいる。ポルフィリンからの蛍光が存在する場合には、当該蛍光は、４１０ｎｍ励起／６３０ｎｍ発光でピークとして現れる。ヘモグロビンに起因する吸収により、４２０ｎｍ、５４０ｎｍ、５８０ｎｍに沿って励起波長軸および発光波長軸と平行な谷部が生じる。
【００９９】
統計的分析
１個、２個、３個の分類特徴の組み合わせのうち１０個の最も機能する組み合わせの相互検証された平均有病正診率および無病正診率が図２０に示されている。結果は、ペアを成す各診断カテゴリーについて、個別に示されている。図２０Ａは６５％のＥＳＬにおける性能を示している。診断性能は、１つの特徴のみを使用する場合に高く、それぞれが更なる特徴を含んでいる場合には性能が僅かし向上しない。最良の性能は、ＳＮとＣＮとを識別する際に得られ、２つ又は３つの分離特徴を用いると、９４％の平均有病正診率および９０％の平均無病正診率に達する。ＳＮとＬＧＳＩＬとを識別することが最も難しい。この場合、最良の性能は、３つの分類特徴を使用すると、５８％の平均有病正診率および６４％の平均無病正診率を示す。点は、各分析を平均した最も良く機能する１つの組み合わせの有病正診率および無病正診率を示している。この場合も同様に、平均性能から分かるように、特徴の数を増やしても、診断性能の著しい向上は見られない。特徴を付加することにより実際に性能が減少した場合には、データのオーバートレーニングが考えられる原因である。また、ＥＳＬを６５％から９５％まで大きくしても、性能の著しい向上は見られない（図２０Ｂ）。
【０１００】
図２１は、反射スペクトルのみを分析するため、蛍光ＥＥＭのみを分析するため、反射と蛍光との組み合わせを分析するための、５つの最も機能する分類特徴の組み合わせの平均有病正診率および平均無病正診率を診断カテゴリーの各ペアについて示している。反射のみを分析する場合、各組み合わせについて、最大で４つの分類特徴が考慮された。一方、蛍光のみの分析および反射と蛍光との組み合わせの分析は、各組み合わせにおいて最大で３つの特徴に制限された。カテゴリーの全てのペアにおいて、反射のみの分析は良好な診断性能を示した。この場合、大きな増大は、反射のみの分析に対する蛍光のみの分析から見られた。反射特徴を蛍光特徴に加えると、反射と蛍光との組み合わせの分析によって示されるように、識別性能が適度に向上する。
【０１０１】
図２３は、蛍光および反射の両方が考慮される場合に、１個、２個、３個の特徴組み合わせのそれぞれにおける１０個の最も機能する特徴組み合わせの中で各分類特徴が累積的に現れる頻度を示している。結果は、診断カテゴリーの各ペアについて、別個に示されている。ＳＮとＣＮとを識別するために最も頻繁に含まれる分類特徴は、蛍光励起波長３３０〜３６０ｎｍ、４６０ｎｍである。同様に、ＨＧＳＩＬからＳＮを識別する場合およびＬＧＳＩＬからＣＮを識別する場合には、蛍光励起波長３３０〜３５０ｎｍ、４７０〜４８０ｎｍおよび蛍光励起波長３３０〜３６０ｎｍ、４７０ｎｍで頻繁に発生する。ＬＧＳＩＬからＳＮ組織を識別する場合、最も良く機能する特徴組み合わせにおいては、波長４２０〜４３０ｎｍに加えて、蛍光励起波長３５０〜３６０ｎｍ、４６０ｎｍも頻繁に現れる。ＧＳＩＬからのＣＮ組織の識別においては、反射光源−検出間距離０、１が最も頻繁に生じた。一般に、診断カテゴリー間の全てのペアワイズ識別においては、蛍光励起波長３３０〜３６０ｎｍ、４６０〜４７０ｎｍが重要であるが、全ての識別において分類特徴が際立って最適になっているとは思われない。ＨＧＳＩＬからのＣＮの識別においてのみ、反射特徴が重要だと考えられる。
【０１０２】
図２２においても同様に、診断カテゴリー間のペアワイズ識別のために最も良く機能する特徴組み合わせの中に最も頻繁に含まれることに関し、考慮される３つの分析、すなわち、反射のみの分析、蛍光のみの分析、反射と蛍光とを組み合わせた分析（組み合わせ分析）において優位を占める分類特徴の比較がなされている。これらの分類特徴は全て同一の患者部位から得られたものである。
【０１０３】
ペアを成す全ての蛍光のみの分析および反射と蛍光とを組み合わせた分析においては、３３０〜３６０ｎｍおよび４６０〜４７０ｎｍの範囲の蛍光励起波長のみが重要であると考えられる。この場合、重要性は、局所的な特徴の中の相対的な優位性および最小限の４つの発生によって表される。ペアを成す反射のみの対応する分析は、光源−検出間距離位置０、１が重要であることを示しているが、ＣＮ対ＨＧＳＩＬを除き、組み合わせ分析における蛍光特徴をもって考慮した場合、明らかに重要性を失う。ＣＮ対ＨＧＳＩＬの場合、反射のみの分析においては、反射光源−検出間距離位置０、３が重要であると考えられ、蛍光のみの分析においては、３６０〜４００ｎｍの範囲の蛍光励起波長が重要であると考えられる。これに対し、組み合わせ分析は、反射特徴０、１を重要であると見なすとともに、蛍光特徴４６０〜４７０ｎｍを重要であると見なし、いずれも個々の分析で選択された特徴とは異なる。しかしながら、図２３Ｅは、４６０〜４７０ｎｍの範囲の蛍光励起波長と３３０〜３５０ｎｍの範囲の蛍光励起波長との間の頻度の差が非常に僅かであることを示している。実際に、性能結果は、反射特徴０、１が蛍光励起波長の３３０〜３５０ｎｍの範囲または４６０〜４７０ｎｍの範囲と組み合わされる際に組み合わせ分析が同等に機能することを示している。
【０１０４】
また、全ての診断カテゴリーペア間の相違において最良の性能をもたらす特徴を選択するため、３特徴セットおよび４特徴セットに関して光源−検出間距離および励起波長が考慮された（表１１）。各３特徴セットについて、５つの診断カテゴリーペアのそれぞれにおいて最良の性能を与えたセットからの特徴の組み合わせが決定された。分類特徴組み合わせの比較からの全ての最良の性能は、一度に３つ又は４つの特徴から成るセットをとった場合、ＥＳＬ＝６５％における診断カテゴリー間のペアワイズ識別から得られた有病正診率および無病正診率性能値に基づいていた。
【０１０５】
【表１１】
2006517417.tif 000013
【０１０６】
５つの決定された組み合わせの有病正診率および無病正診率の平均によって各３特徴セットの全体性能が計算され、最も高い全体性能をもたらした３つの特徴から成るセットが選択された。この分析は、４特徴セットのそれぞれにおいても同様に行われた。４特徴セット分析の場合、蛍光励起波長３３０ｎｍ、３６０ｎｍ、４３０ｎｍ、４７０ｎｍが選択され、それにより、５つの診断カテゴリーペアにおいて、７８％の平均有病正診率および８１％の平均無病正診率が得られた。３特徴セット分析の場合、蛍光励起波長３３０ｎｍ、４３０ｎｍ、４７０ｎｍが選択され、それにより、７９％の平均有病正診率および７９％の平均無病正診率が得られた。両方のセットの場合で、有病正診率が５５％〜９４％の範囲であり、無病正診率が６３％〜９１％であった。
【０１０７】
表１１に特定された４分類特徴セットを使用した場合の、診断カテゴリーペアワイズ識別を使用する組織測定値の分類が図２４に示されている。診断カテゴリーの正確に分類された全ての組織測定値の平均スペクトルは、太黒線平均として示され、診断カテゴリー内の誤分類されたサンプルの個々のスペクトルが灰色線で示されている。誤分類された測定値は、測定値の分類における重要な因子がピーク配置／シフトであることを示している。ＳＮ対ＣＮにおいて、正確に分類されたＳＮサンプルにおけるピークは４５０ｎｍ発光を下回っている。これに対し、正確に分類されたＣＮサンプルにおけるピークは４５０ｎｍ発光を上回っている。異なる発光波長においても、殆ど全ての診断カテゴリー識別ペアにおいて同じ観察結果を得ることができる。ＣＮ対ＨＧＳＩＬにおいて、５３０ｎｍを超えるスペクトルの傾斜は、診断カテゴリー識別において重要であると思われる。
【０１０８】
検討
蛍光分光法と反射分光法とを組み合わせる診断可能性の研究では、４つの異なる光源−検出間距離位置、および１６個の蛍光励起波長における子宮頸部インビボ測定値が得られた。マハラノビス距離分類により、最も診断上有用な情報を含む分類組み合わせが決定された。結果は、考慮された最も低い固有ベクトル有意レベルで１つの分類特徴を使用する際に有病正診率および無病正診率が高くなることを示していた。第２の分類特徴を加えると、有病正診率および無病正診率が最大となったが、高いＥＳＬからのデータが含まれても著しい向上は見られなかった。また、考慮された蛍光励起波長のうち、３３０〜３６０ｎｍ、４６０〜４７０ｎｍが最も頻繁に現れ、また、最も良く機能した分類特徴組み合わせにおいては、考慮された光源−検出間距離のうち、小さい距離位置０、１が最も頻繁に現れる。しかしながら、更なる４３０ｎｍの蛍光励起波長は、ＬＧＳＩＬおよびＨＧＳＩＬの両方から扁平上皮正常組織を最も良く識別するために必要なものとして、最適な分類特徴の略全てにおいて含まれている。一方、位置０、１の光源−検出間距離は、最適な分類特徴セットのいずれにも現れなかった。これらは、ＨＧＳＩＬから円柱上皮正常組織を最も良く識別する際に使用できると期待された。
【０１０９】
結果は、考慮された最適化された、どちらも蛍光特徴のみから成る３つ又は４つの特徴セットのいずれも（表？？？？？）、ＨＧＳＩＬを高い有病正診率（８３％、７２％）および高い無病正診率（８０％、７８％）をもって扁平上皮正常組織および円柱上皮正常組織から識別することができたことを示している。これらの結果は、先の研究で見出されたＳＮ対ＨＧＳＩＬの識別において同様の有病正診率および高い無病正診率を示している。この場合、反射分光法の分析のみを使用して（８２％、８１％）の有病正診率および（６７％、７３％）の無病正診率が得られた。また、両方の全ての最適な特徴セットにおいては、４特徴セット（８７％、９４％）および３特徴セット（９０％、８３％）で僅かに高い有病正診率および無病正診率をもってＬＧＳＩＬを円柱上皮正常組織から分離できることが分かった。しかしながら、ＬＧＳＩＬと扁平上皮正常組織との識別が最も難しく、一方の全体の最適な特徴セットにおいて有病正診率が５５％で且つ無病正診率６３％であった。全ての場合において、反射分光法及び／又は蛍光分光法に関連付けられた無病正診率は、膣鏡診において先に報告されたそれよりも十分に高く（４８％）、一方、有病正診率はやや低かった。
【０１１０】
本発明の実際の用途および利点
技術的に価値を有する本発明の実際の用途は、子宮頸部前癌の検出におけるものである。本発明は、現在の技術を向上させ、それにより、前癌状態の患者の細胞をより正確に検出する。
【０１１１】
開示内容に照らして必要以上の実験を行うことなく、ここに開示された本発明の実施形態の全てを行って使用することができる。本発明は、ここに記載された理論的な説明によって限定されない。
【０１１２】
［引用文献］
以下の文献は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１１３】
【表１２Ａ】
2006517417.tif 000014
【表１２Ｂ】
2006517417.tif 000015
【表１２Ｃ】
2006517417.tif 000016
【表１２Ｄ】
2006517417.tif 000017
【表１２Ｅ】
2006517417.tif 000018
【表１２Ｆ】
2006517417.tif 000019
【表１２Ｇ】
2006517417.tif 000020
【表１２Ｈ】
2006517417.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】閉経前および閉経後の女性の３つの発光平均スペクトルを示しており、（ａ）はスクリーニング設定からのＳＮ部位であり、（ｂ）は診断設定からのＳＮ部位であり、（ｃ）は３３７ｎｍ、３８０ｎｍ、４６０ｎｍ励起（左から右に向かって）における診断設定からのＳＩＬ部位である。エラーバーは１つの標準偏差を示している。
【図２】診断設定における（ａ）ＳＮ部位および（ｂ）ＳＩＬ部位からの白人およびアフリカ系アメリカ人女性の平均スペクトルを示している。エラーバーは、±１標準偏差を示している。
【図３】１０人の患者の月経周期の全体にわたって毎日診た３４０ｎｍ励起、４４０ｎｍ発光での子宮頸部の扁平上皮細胞からの蛍光強度を示している。プロットは、各患者において各日に測定された３つの部位の平均蛍光強度であり、エラーバーは３つの部位の最大値および最小値を示している。青、緑、赤の点は、月経周期の生理期、増殖期、分泌期をそれぞれ示している。なお、データは、必ずしも測定日と同じではない月経周期日に対してプロットされている。
【図４】７５％のＥＳＬにおける組織病理学的カテゴリーのペアを成す組み合わせを区別するための２つ、３つ、４つの励起波長の組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせ及び単一の励起波長の全ての平均有病正診率および無病正診率を示している。暗灰色および明灰色のプロットがそれぞれ有病正診率および無病正診率である。エラーバーは±１標準偏差を示している。ＳＮ＝扁平上皮正常、ＣＮ＝円柱上皮正常、ＬＧ＝軽度扁平上皮内病変、ＨＧ＝重度扁平上皮内病変。
【図５】２つの励起波長から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせにおける各励起波長の発生頻度を示すヒストグラムを示している。ＥＳＬは７５％であった。ＳＮとＨＧＳＩＬとの間のペアワイズ識別に関して結果が示されている。
【図６】異なる光源−検出間距離のための組織タイプによる平均反射スペクトルを示している。１．０５μｍ直径のポリスチレンミクロスフェアを含む標準的な溶液からのスペクトルにより組織スペクトルが正規化された。
【図７】６５％のＥＳＬにおける組織病理学的カテゴリーのペアを成す組み合わせを区別するための２つ、３つ、４つの光源−検出間距離から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせ、及び単一の光源−検出間距離から得られた有病正診率および無病正診率を示している。青および茶色のバーがそれぞれ有病正診率および無病正診率である。ＳＮ＝扁平上皮正常、ＣＮ＝円柱上皮正常、ＬＧ＝軽度扁平上皮内病変、ＨＧ＝重度扁平上皮内病変。
【図８】６５％のＥＳＬにおける組織病理学的カテゴリーのペアを成す組み合わせを区別するための１つ、２つ、３つ、４つの反射スペクトルおよび蛍光スペクトルから成る組み合わせから得られた有病正診率および無病正診率を示している。青および茶色のバーがそれぞれ有病正診率および無病正診率である。ＳＮ＝扁平上皮正常、ＣＮ＝円柱上皮正常、ＬＧ＝軽度扁平上皮内病変、ＨＧ＝重度扁平上皮内病変。
【図９Ａ】フォイルゲン染色された組織病理学的組織部位から評価された形態学的特徴から計算された標準的なスコア（左）を示している。
【図９Ｂ】フォイルゲン染色された組織病理学的組織部位から評価された形態学的特徴から計算された標準的なスコア（右）を示している。
【図１０】（ａ）正常な扁平上皮部位、（ｂ）正常な円柱上皮部位、（ｃ）同じ患者からのＨＧＳＩＬの一般的な蛍光ＥＥＭを示している。縦座標に励起波長が示され、横座標に発光波長が示されている。等高線は蛍光強度が等しい点同士を接続している。
【図１１】７５％のＥＳＬにおける組織病理学的カテゴリーのペアを成す組み合わせを区別するための２つ、３つ、４つの励起波長から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせ及び単一の励起波長の全ての平均有病正診率および無病正診率を示している。暗灰色および明灰色のプロットがそれぞれ有病正診率および無病正診率である。エラーバーは±１標準偏差を示している。
【図１２】６５％、７５％、８５％、９５％のＥＳＬでの３つ及び４つの励起波長から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせから成る集合分類子における有病正診率および無病正診率を示している。ｘ軸ラベルは異なる組み合わせを示している。例えば、‘３ＳＩＧ６５’は６５％ＥＳＬにおける３波長組み合わせを示している。個々のアルゴリズムの５０％（破線）、８０％（点線）、１００％（実線）間で一致を必要とする集合分類子に関する結果が示されている。（ａ）ＳＮ対ＣＮ、（ｂ）ＳＮ対ＨＧＳＩＬ、（ｃ）ＳＮ対ＣＩＮ２およびＣＩＮ３、（ｄ）ＣＮ対ＬＧＳＩＬ、（ｅ）ＣＮ対ＨＰＶおよびＣＩＮ１を識別するアルゴリズムにおける結果が示されている。横座標に発光波長が示されている。等高線は蛍光強度が等しい点同士を接続している。
【図１３】２つの励起波長から成る組み合わせのうちのトップの２５個の機能する組み合わせにおける各励起波長の発生頻度を示すヒストグラムを示している。ＥＳＬは７５％であった。（ａ）ＳＮとＣＮとの間、（ｂ）ＳＮとＬＧＳＩＬとの間、（ｃ）ＳＮとＨＧＳＩＬとの間、（ｄ）ＣＮとＬＧＳＩＬとの間、（ｅ）ＣＮとＨＧＳＩＬとの間のペアワイズ識別に関して結果が示されている。
【図１４】可変励起光源アセンブリ、光ファイバ供給・収集プローブ、スペクトルマルチチャンネル分析器／ポリクロメータアセンブリを示している。
【図１５】プローブの先端部の概略図であり、［Ａ］は蛍光励起（暗灰色領域の白円）および収集（暗灰色領域の黒円）ファイバ束であり、［Ｂ］は反射照明ファイバ（白色領域の白円）であり、［位置０〜３］は反射収集ファイバ（白色領域の黒円）である。
【図１６】異なるソース−検出分類、すなわち、（ａ）位置０、（ｂ）位置１、（ｃ）位置２、（ｄ）位置３における組織診断分類による平均反射スペクトルを示している。エラーバーは±１標準偏差を示している。ポリスチレンミクロスフェア（１．０２μｍ直径）を６．２５％の体積率で含む懸濁液からの標準的なスペクトルによって組織スペクトルが正規化された。
【図１７】６５％のＥＳＬで組織病理学的カテゴリーの所定のペアを成す組み合わせにおいて、一度に１個、２個、３個、４個とった場合のトップの機能する光源−検出間距離組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。灰色および黒色のバーがそれぞれ有病正診率および無病正診率を示している。ＳＮ＝扁平上皮正常、ＣＮ＝円柱上皮正常、ＬＧＳＩＬ＝軽度扁平上皮内病変、ＨＧＳＩＬ＝重度扁平上皮内病変。
【図１８】９５％のＥＳＬで組織病理学的カテゴリーの所定のペアを成す組み合わせにおいて一度に１個、２個、３個、４個とった場合のトップの機能する光源−検出間距離組み合わせにおける有病正診率および無病正診率を示している。灰色および黒色のバーがそれぞれ有病正診率および無病正診率を示している。ＳＮ＝扁平上皮正常、ＣＮ＝円柱上皮正常、ＬＧＳＩＬ＝軽度扁平上皮内病変、ＨＧＳＩＬ＝重度扁平上皮内病変。
【図１９】システムを用いて測定された子宮頸部組織、すなわち、（ａ）正常扁平上皮、（ｂ）正常円柱上皮、（ｃ）上皮内癌、における一般的なインビボスペクトルを示している。左の縦列には、標準的なミクロスフェア溶液によって正規化された４つの異なる光源−検出間距離での反射スペクトルが示されている。右の縦列には、蛍光励起−発光行列データが示されている。
【図２０Ａ】６５％のＥＳＬにおいて４つの光源−検出間距離および１６個の励起波長の分類特徴が一度に１、２、３個と組み合わされた際の診断相違ペアにおけるトップの１０個の有病正診率（黒色）および無病正診率（灰色）の値の平均を示している。点は、最も良く機能する組み合わせの有病正診率／無病正診率を示している。
【図２０Ｂ】９５％のＥＳＬにおいて４つの光源−検出間距離および１６個の励起波長の分類特徴が一度に１、２、３個と組み合わされた際の診断相違ペアにおけるトップの１０個の有病正診率（黒色）および無病正診率（灰色）の値の平均を示している。点は、最も良く機能する組み合わせの有病正診率／無病正診率を示している。
【図２１】診断カテゴリーのペアを成す比較のそれぞれにおける、５つの最も良く機能する分類組み合わせの平均有病正診率（黒色）および無病正診率（灰色）を示している（ＥＳＬ＝６５％）。一度に最大で３つの特徴の組み合わせを選択する場合の反射スペクトルと蛍光スペクトルとの組み合わせ（Ｒ＋Ｆ）、一度に最大で３つの励起波長の組み合わせを選択する場合の蛍光スペクトルのみ（Ｆ）、一度に最大で４つの光源−検出間距離の組み合わせを選択する場合の反射スペクトルのみ（Ｒ）に関する結果が示されている。
【図２２】診断カテゴリー間のペアワイズ識別のために、一度に１、２、３個とった場合の１０個の特徴の最良の組み合わせを考慮して、特徴が含まれる頻度に関し優位を占める分類特徴を示している。反射のみ、蛍光のみ、反射／蛍光組み合わせの分析において最も重要な特徴が示されている。
【図２３】診断カテゴリー間、すなわち、（ａ）ＳＮ対ＣＮ、（ｂ）ＳＮ対ＬＧＳＩＬ、（ｃ）ＳＮ対ＨＧＳＩＬ、（ｄ）ＣＮ対ＬＧＳＩＬ、（ｅ）ＣＮ対ＨＧＳＩＬのペアワイズ識別のために一度に１、２、３個とった場合の１０個の特徴の最良の組み合わせを累積的に考慮した際の、分類特徴すなわち４つの反射ソース検出（ｓ−ｄ）距離位置および１６個の蛍光励起波長（λｅｘ）の頻度ヒストグラムを示している。ＥＳＬ＝６５％である。
【図２４】４つの特徴（３３０ｎｍ、３６０ｎｍ、４３０ｎｍ、４７０ｎｍ）のみを利用できる場合の、所定の診断ペアすなわち（ａ）ＳＮ対ＣＮ、（ｂ）ＳＮ対ＬＧＳＩＬ、（ｃ）ＳＮ対ＨＧＳＩＬ、（ｄ）ＣＮ対ＬＧＳＩＬ、（ｅ）ＣＮ対ＨＧＳＩＬにおける、最良の識別能を与える特徴組み合わせを使用した診断クラスの正確に分類された組織測定値の平均スペクトル（太い黒線）および各診断クラス内の誤分類された組織測定値の個々のスペクトル（細い黒線）を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2006517417.tif 000069
【図１６Ｃ】
2006517417.tif 000070
【図１６Ｄ】
2006517417.tif 000071
【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
2006517417.tif 000092
【図２４Ｅ】
2006517417.tif 000093
【国際調査報告】
2006517417.tif 000094