(57)【要約】本発明は、合成遺伝子を産生、このような遺伝子のライブラリーの作製、ならびに、それらの遺伝子および対応するコードされたポリマーペプチドの操作および特徴づけのためのストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステムを提供する。１つの局面において、これらの合成遺伝子は、ポリケチドシンターゼポリペプチドをコードし得、そして、治療的学的に重要であるかまたは商業上重要である、ポリケチド化合物の産生を容易にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在する遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子であって、ここで、該合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なっており、ここで、
ａ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列と約９０％未満の同一性であり、そして／または
ｂ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列において存在しないかまたは特有ではない少なくとも１つの特有な制限部位を含み、そして／または
ｃ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列において存在する少なくとも１つの制限部位を有さない、
合成遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記ポリペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に由来する、合成遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記ポリペプチドセグメントは、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、およびＴＥから選択されるＰＫＳドメインを含む、合成遺伝子。
【請求項４】
１以上のＰＫＳモジュールをコードする、請求項３に記載の合成遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の合成遺伝子であって、Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される制限酵素認識部位のモジュールコード配列につき多くて１つのコピーを含む、合成遺伝子。
【請求項６】
請求項１に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列が、前記天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在する少なくとも１つのＩＩＳ型酵素制限部位を含まない、合成遺伝子。
【請求項７】
天然に存在するＰＫＳ遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子であって、ここで、該合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在するＰＫＳ遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とはことなり、かつ、以下：
ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ  Ｉ部位；
ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ  Ｉ部位；
ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ  Ｉ部位；
ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ  Ｉ部位；
ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ  Ｉ部位；
ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ  Ｉ部位；
ｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ  Ｉ部位；
ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ  Ｉ部位
のうち少なくとも２つを含む、合成遺伝子。
【請求項８】
請求項１に記載の合成遺伝子を含む、ベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
各々、請求項１に記載の合成遺伝子を含むベクターのライブラリー。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターであって、第１のＰＫＳモジュールをコードするオープンリーディングフレームならびに以下のａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のうちの１つ以上を含み、
ここで、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、
ａ）ＰＫＳ伸長モジュール；
ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；
ｃ）チオエステラーゼドメイン；および
ｄ）ペプチド間リンカー
である、ベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１３】
前記ベクターによってコードされるポリペプチドを含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞であって、機能的ポリケチドシンターゼを含み、前記ＰＫＳが、前記ベクターによってコードされるポリペプチドを含む、細胞。
【請求項１５】
ポリケチドを生成する方法であって、請求項１４に記載の細胞を、ポリケチドが産生される条件の下で培養する工程を包含し、ここで、該ポリケチドは、前記ベクターの非存在の下で該細胞によって産生されない、方法。
【請求項１６】
複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を含む遺伝子ライブラリーであって、ここで、該ライブラリーのモジュールコード遺伝子は、共通の制限部位を少なくとも１つ有しており、該制限部位は、各モジュール中で１回を超えて見出されず、そして、該ライブラリーにコードされるモジュールは、５つ以上の異なるポリケチドシンターゼタンパク質由来のモジュールに対応する、遺伝子ライブラリー。
【請求項１７】
前記モジュールコード遺伝子が、共通して少なくとも３つの制限部位を含む、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
請求項１６に記載のライブラリーであって、前記特有の制限は、
Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される、遺伝子ライブラリー。
【請求項１９】
請求項１６に記載のライブラリーであって、ここで、前記共通する少なくとも１つの制限部位は、以下
ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ  Ｉ部位；および／または
ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ  Ｉ部位；および／または
ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ  Ｉ部位；および／または
ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ  Ｉ部位；および／または
ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ  Ｉ部位；および／または
ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ  Ｉ部位；および／または
ｇ）ＫＲドメインののアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ  Ｉ部位；および／または
ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ  Ｉ部位
である、ライブラリー。
【請求項２０】
前記遺伝子が、クローンにングベクターまたは発現ベクターに含まれる、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項２１】
請求項２０に記載のライブラリーであって、各ＰＫＳモジュールコード遺伝子は、以下：
ａ）少なくとも第２のＰＫＳ伸長モジュール；または
ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；または
ｃ）チオエステラーゼドメインまたは
ｄ）ポリペプチド間リンカー
についてのコード配列をさらに含む、ライブラリー。
【請求項２２】
クローニングベクターであって、示された順序で、
ａ）ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１または
ｂ）Ｌ−ＳＩＳ−ＳＭ２Ｒ１
を含み、ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第１の選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素のための認識部位であり、そして、Ｌは、様々な制限酵素のための認識部位である、
クローニングベクター。
【請求項２３】
ＳＭ２およびＳＭ４が、薬物耐性を与える遺伝子である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１に記載のベクターおよびＲ１を認識する制限酵素を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載のクローニングベクターであって、ここで、前記ＳＩＳは、−Ｎｌ−Ｒ２−Ｎ２−を含み、ここで、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素のための認識部位であり、そして、これらは、同じであっても異なってもよく、Ｒ２は、Ｒ１またはＬとも異なる、制限酵素のための認識部位である、クローニングベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターおよびニック形成酵素を含む、組成物。
【請求項２７】
ベクターであって、以下：
ａ）ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌまたは
ｂ）Ｌ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌ 
であり、
ここで、２Ｓ１は、第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位であって、
ここで、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ制限酵素のための認識部位であり、そして、
Ｓｙは、シントンコード領域である、
ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターであって、Ｓｙが、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをを含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項２６に記載のベクターおよび２Ｓ１または２Ｓ２のいずれかを認識するＩＩＳ型制限酵素を含む、組成物。
【請求項３０】
ベクターの同族対を含む組成物であって、ここで、該同族対は、
ａ）２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含む第１のベクターおよび
２Ｓ３を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ５−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒｌを含む第２のベクター；
または
ｂ）２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されるＬ−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含む、第１のベクターおよび
２Ｓ３を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されるＬ’−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒｌを含む第２のベクター
であり、
ここで、ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３、ＳＭ４は、異なる選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素についての認識部位であり、ＬおよびＬ’は、Ｒ１と同一でものであるか同じものもしくは異なるものであるか、または各々違うものであり、２Ｓ１、２Ｓ２’、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、ここで、２Ｓ１と２Ｓ２は、同じもではなく、２Ｓ３と２Ｓ４は、同じものではなく、そして、該２Ｓ２を伴う第１のベクターおよび該２Ｓ３を有する第２のベクターの消化によって、適合性の末端が生じる、
組成物。
【請求項３１】
２Ｓ１と２Ｓ３とは、同じであり、かつ２Ｓ２と２Ｓ４は、同じである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｓｙ１およびＳｙ２は、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードしている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ベクターであって、第１の選択マーカー、第１の制限酵素によって認識される制限部位（Ｒ１）、第１のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位および第２のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位に隣接するシントンコード領域を含み、
ここで、該第１の制限酵素および該第１のＩＩＳ型制限酵素を用いる該ベクターの消化によって、該第１の選択マーカーおよび該シントンコード領域を含むフラグメントが産生され、
該第１の制限酵素および該第２のＩＩＳ型制限酵素を用いる消化によって、該シントンコード領域を含み該選択マーカーを含まないフラグメントを産生する、ベクター。
【請求項３４】
ベクター対を使用して一連のＤＮＡ単位を連結するための方法であって、
ａ）ＤＮＡ単位の第１のセットを、各々第１の型の選択ベクターで提供し、該第１の選択ベクターは、第１の選択マーカーを含み、そして、ＤＮＡ単位の第２の単位を、各々第２の型の選択ベクターで提供し、該第２の選択ベクターは、該第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーを含む工程であって、ここで、該第１の方の選択ベクターおよび第２の方の選択ベクターは、該異なる選択マーカーに基づき得る、工程
ｂ）該第１セットからのＤＮＡ単位を該第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第３のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択マーカーを生成して、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；
ｃ）該第３のＤＮＡ単位を第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得るか、もしくは
該第３のＤＮＡ単位を第２のシリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、第２の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、
工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程であって、
該方法は、該第４のＤＮＡ単位を第２シリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または
該第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、
工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２のシリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得ことを包含し、
該方法は、該第４のＤＮＡ単位を第１のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または
該第３のＤＮＡ単位を、第１セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、前記所望されるクローンが、ＰＫＳドメインをコードする配列を含む、方法。
【請求項３８】
数個のＤＮＡ単位を連続して連結するための方法であって、
該方法は、以下のａ）〜ｅ）の工程：
ａ）アクセプターベクターフラグメントと、ドナーベクターフラグメントとを連結する工程を含む第１ラウンドの編成を実行する工程であって、
該アクセプターベクターフラグメントは、第１のシントンＳＡ０、連結可能末端ＬＡ０、シントンＳＡ０および隣接するシントンＳＤ０の接続部末端、ならびに別の連結可能末端ｌａ０を含み、
該ドナーベクターフラグメントは、第２のシントンＳＤ０、連結可能末端ＬＤ０、シントンＳＤ０およびシントンＳＡ０の接続部末端（ここで、ＬＤ０およびＬＡ０は、適合しており）、別の連結可能末端ｌｄ０（ここで、ｌｄ０とｌａ０は、適合性である）ならびに選択マーカーを含み、
ここで、ＬＡ０とＬＤ０が、連結され、ｌａ０とｌｄ０が連結され、それによって、該第１のシントンと該第２のシントンを連結し、それによって、シントンコード配列Ｓ１を含む第１のベクターを生成する工程；
ｂ）工程（ａ）における選択マーカーについて選択することによって該第１のベクターについて選択する工程；ならびに
ｃ）回数ｎの別のラウンドの編成を実施する工程であって、
ここで、ｎは、１〜２０の整数であり、ここで、Ｓｎは、編成の前のラウンドにおけるシントンを連結することによって生成されるシントンコード配列であり、そして、ここで、
編成の各々のラウンドｎは、以下の１）〜２）：
１）アクセプターベクターＡｎまたはドナーベクターＤｎのいずれかとして該第１のベクターまたは次のベクターを示すこと
２）制限酵素を用いてアクセプターベクターＡｎを消化して、アクセプターベクターフラグメントを生成することであって、該アクセプターベクターフラグメントは、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＤｎ＋１００との接続末端にある連結可能ＬＡｎ、および別の連結可能末端ｌａｎを含み、
該アクセプターベクターフラグメントをドナーベクターフラグメントに連結し、ここで、該ドナーベクターフラグメントは、シントンＳＤｎ＋１００、シントンＳＤｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端にある連結可能末端ＬＤｎ＋１００（ここで、ＬＡｎとＬＤｎ＋１００は適合性である）、別の連結可能末端ｌｄｎ＋１００（ここで、ｌａｎとｌｄｎ＋１００は適合性である）ならびに選択マーカーを含み、
ＬＡｎとＬＤｎ＋１００が、連結され、そして、ｌａｎおよびｌｄｎ＋１００が連結され、それによって次のベクターを生成すること、
あるいは、
制限酵素を用いてドナーベクターＤｎを消化して、ドナーベクターフラグメントを生成し、該ドナーベクターフラグメントは、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＡｎ＋１００との接続末端にある連結可能ＬＤｎ、および別の連結可能末端ｌｄｎおよび選択マーカーを含み、
該ドナーベクターフラグメントをドナーベクターフラグメントに連結し、ここで、該ドナーベクターフラグメントは、シントンＳＡｎ＋１００、シントンＳＡｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端の連結可能末端ＬＡｎ＋１００、別の連結可能末端ｌａｎ＋１００を含み、
ＬＡｎ＋１００とＬＤｎが、適合性であり、そして、連結され、そして、ｌｄｎとｌａｎ＋１００が連結され、それによって次のベクターを生成すること
を含む、工程
ｄ）工程（ｃ）の該ドナーベクターフラグメントの選択マーカーについて選択することによって次のベクターを選択する工程
ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）をｎ−１回繰り返し、それによってマルチシントンを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｄ）の前記選択マーカーが、その前の編成の選択マーカーと同じではなく、そして／または、次の編成工程の選択マーカーと同じではない、方法。
【請求項４０】
ｌａ０、ｌｄ０、ｌａｎ、ｌｄｎが同じであり、そして／またはＬＡ０、ＬＤ０、ＬＡｎ、ＬＤｎがＩＩＳ型制限酵素によって生成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記シントンであるＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００、およびＳＤｎ＋１００が、合成ＤＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、シントンであるＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００、およびＳＤｎ＋１００のうちの１つ以上が、マルチシントンである、方法。
【請求項４３】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）のマルチシントンが、ＰＫＳドメインを含むポリペプチドをコードする、方法。
【請求項４４】
ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）アセンブリＰＣＲによって複数のＤＮＡ単位を生成する工程であって、ここで、各ＤＮＡ単位は、該ＰＫＳモジュールの一部分をコードする工程；
（ｉｉ）予め決定された配列で、該複数のＤＮＡ単位を組み合わせてＰＫＳモジュールコード遺伝子を産生する工程
を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とフレームを一致させて前記モジュールコード遺伝子を組み合わせる工程であって、それによって、ＰＫＳオープンリーディングフレームを産生する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４６】
合成遺伝の設計に有用な制限酵素認識部位を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
複数の機能的関連のあるポリペプチドセグメントのためのアミノ酸配列を得る工程；
該アミノ酸配列を逆翻訳して、ポリペプチドセグメントの各々について複数のポリペプチドセグメントコード核酸配列を生成する工程；ならびに
該ポリペプチドセグメントの少なくとも約５０％で、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される制限酵素認識部位を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記機能的に関連するポリペプチドセグメントが、ポリケチドシンターゼのモジュールまたはドメインである、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記機能的に関連するポリペプチドセグメントが、ＰＫＳモジュールまたはドメインにおいて高い相同性をもつ領域である、方法。
【請求項４９】
異なるポリペプチドをコードする配列を含む複数の異なるＤＮＡ単位のハイスループット合成のための方法であって、以下：
各ＤＮＡ単位について、複数の重複しているオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、ポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ単位を生成して、ＰＣＲ増幅によってＵＤＧ含有リンカーを該ＤＮＡ単位の５’末端および３’末端に加え、それによって、連結されたＤＮＡ単位を生成する工程
を包含し、ここで、該同じＵＤＧ含有リンカーが、該異なるＤＮＡ単位に加えられる、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記複数状態が、異なる５０を超えるＤＮＡ単位を包含する、方法。
【請求項５１】
合成遺伝子を設計するための方法であって、該方法は、以下の工程：
参照アミノ酸配列を提供する工程；
宿主細胞のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたコドンのランダムな選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳する工程；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供する工程；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き、該合成遺伝子の配列を生成する工程；および
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化ヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成する工程；
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記合成遺伝子の配列を一緒に含む重複オリゴヌクレオチド配列のセットを生成する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、該合成遺伝子の配列上の制限部位の位置についての１以上のパラメーターが、選択された位置における１以上の予め選択された制限部位を含む、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法であって、ここで、制限部位を挿入する前記工程が、以下：
前記ランダム化ヌクレオチド配列における選択された制限部位の挿入について選択された位置を同定すること；
該選択された位置でのヌクレオチド配列の置換を実施して、その結果、選択された制限部位配列が、該選択位置で生成される工程；
該置換された配列をアミノ酸配列に翻訳する工程；
該翻訳されたアミノ酸が選択された位置で該参照アミノ酸配列と同一である置換を認める工程；ならびに
該翻訳されたアミノ酸配列が選択された位置で参照のことアミノ酸配列と異なる置換を認めない工程；
を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、
前記参照アミノ酸配列に同一である翻訳アミノ酸配列が、選択された位置で類似のアミノ酸とアミノ酸を置換することを包含する、方法。
【請求項５６】
前記参照アミノ酸配列が、天然に存在するアミノ酸セグメントのものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
合成遺伝子を設計するシステムであって、
該システムは、コンピュータプロセッサを備え、
該コンピュータプロセッサは、
参照アミノ酸配列を提供し；
宿主生物のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムなコドンの選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳し；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供し；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き；
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化したヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成し；そして、
該合成遺伝子の配列を一緒に含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットを生成するように
配置される、
システム。
【請求項５８】
合成遺伝子を設計するためのコンピュータ実行コードを含むコンピュータ読み取り可能記憶媒体であって、該設計は、
以下：
参照アミノ酸配列を提供し；
宿主生物のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムなコドンの選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳し；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供し；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き；
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化したヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成し；そして
該合成遺伝子の配列を一緒に含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットを生成するように
コンピュータが作動することを命令することによる、
コンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項５９】
シントンのヌクレオチド配列を分析するための方法であって、該方法は、以下：
合成遺伝子の配列を提供する工程であって、ここで、該合成遺伝子は、複数のシントンに分割される、工程；
複数のシントンサンプルの配列を提供する工程であって、ここで、該複数のシントンの各々が、ベクター中でクローニングされる、工程；
該ベクターの配列を挿入なしで提供する工程；
該クローンニングしたシントンの配列からベクター配列を取り除く工程；
該複数のシントンの配列のコンティグマップを構築する工程；
該配列のコンティグマップと該合成遺伝子の配列とを並置する工程；および
該複数のシントンの各々についてのアライメントの測定を程度を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、該方法は、以下：
１以上のシントン配列におけるエラーを同定する工程；および
アライメントの程度によるシントンの順位づけ、シントンサンプルの配列におけるエラー、修復され得るシントンの同一性からなる群より選択される１以上の情報を報告する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項６１】
合成遺伝子のハイスループット合成のためのシステムであって、以下：
アセンブリＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド含む少なくとも１つの供給源マイクロウェルプレート
アセンブリＰＣＲ増幅混合物のための供給源
ＬＩＣ伸長プライマー混合物ための供給源
オリゴヌクレオチド増幅のための少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレート
液体操作デバイスおよび
少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートを受容するように配置されたＰＣＲ増幅のための熱源
を備え、
該液体操作デバイスは、該供給源マイクロウェルプレートから複数の予め決定されたセットのオリゴヌクレオチドを取り出し；
該予め決定されたセットと、該少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中の増幅混合物とを組み合わせ；
ＬＩＣ伸長プライマー混合物を取り出し；そして
該ＬＩＣ伸長プライマー混合物と、少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中にあるアンプリコンと組み合わせる、
システム。
【請求項６２】
少なくとも２つのアセンブリベクターのための供給源をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６３】
オープンリーディングフレームベクターであって、該ベクターは、
以下のａ）〜ｃ）：
ａ）内部型：４−［７−＊］−［＊−８］−３；
ｂ）左エッジ型：４−［７−１］−［＊−８］−３；および
ｃ）右エッジ型：４−［７−＊］−［６−８］−３；  
から選択される構造を含み、
ここで、７および８は、適合性オーバーハング「＊」を生じるように切断するＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり；１および６は、必要に応じて存在するＩＩ型制限部位であり；そして、３および４は、８塩基対認識部位を有する制限酵素のための認識部位である、オープンリーディングフレームベクター。
【請求項６４】
１が、Ｎｄｅ  Ｉであり、６が、Ｅｃｏ  ＲＩであり、４が、Ｎｏｔ  Ｉであり、そして、３がＰａｃ  Ｉである、請求項６３に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府援助に関する声明）
本出願に開示される主題は、国立標準技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ＡＴＰ助成金番号７０ＮＡＮＢ２Ｈ３０１４の下の政府援助を用いて一部分が実行された。従って、米国政府は本発明において特定の権利を有し得る。
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下で、米国特許仮出願番号６０／４１４，０８５（２００２年９月２６日出願）に対する優先権（これらの内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を主張する。
（発明の分野）
本発明は、合成遺伝子生成のためのストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステム、このような遺伝子のライブラリーの生成、ならびに遺伝子および対応するコードポリペプチドの操作および特徴付けを提供する。１つの局面において、この合成遺伝子は、ポリケチドシンターゼポリペプチドをコードし得、そして治療的または商業的に重要なポリケチド化合物の生成を容易にし得る。本発明は、ヒト医学および獣医学、薬理学、農業、および分子生物学の分野において適用が見出される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ポリケチドは、真菌、菌糸細菌および他の生物によって生成される化合物の大きなファミリーを示す。多くのポリケチドは、治療に適切な活性および／または商業的に価値のある活性を有する。有用なポリケチドの例としては、エリスロマイシン、ＦＫ−５０６、ＦＫ−５２０、メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｙｃｉｎ）、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、オレアンドマイシン、ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）、ラパマイシン、スピノシン（ｓｐｉｎｏｃｙｎ）およびチロシンが挙げられる。
【０００３】
ポリケチドは、一連の濃縮およびポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）による改変によって２−炭素単位から天然では合成される。ポリケチドシンターゼは、複数の大きなポリペプチドから構成される多機能酵素複合体である。この複合体のポリペプチド成分の各々は、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。このオープンリーディングフレームは、典型的には、染色体上に一緒に集められている特定のＰＫＳに対応している。ＰＫＳの構造およびポリケチド合成の機構は、Ｃａｎｅら、１９９８，「Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−８に総説されている。
【０００４】
ＰＫＳポリペプチドは、多くの酵素ドメインおよびキャリアドメインを含み、これらとしては、充填工程および濃縮工程に関与するアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性、アシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）活性、およびβ−ケトアセチルシンターゼ（ＫＳ）活性；成長鎖の１３−炭素位置での改変に関与するケトレダクターゼ（ＫＲ）活性、脱水酵素（ＤＨ）活性およびエノイルレダクターゼ（ＥＲ）活性；ならびにＰＫＳからのポリケチドの放出に関与するチオエステラーゼ（ＴＥ）活性が挙げられる。これらのドメインの多様な組み合せは、「モジュール」と呼ばれる単位で組織される。例えば、エリスロマイシンの生成に関与する６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（６−ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ  Ｂ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（「ＤＥＢＳ」）は、３つの別個のポリペプチド上に６つのモジュール（１ポリペプチドあたり２つのモジュール）を含む。ＰＫＳモジュールの数、配列およびドメイン含有量は、ＰＫＳのポリケチド生成物の構造を決定する。
【０００５】
ポリケチドの重要性伝統的な化学的方法によるポリケチド化合物の生成の困難性および野生型細胞での典型的に低いポリケチドの生成を考えると、ポリケチド化合物を生成するための改善された手段または代替的な手段を発見することには相当な利益が存在する。この利益は、ＰＫＳ酵素をコードする遺伝子の組換えＤＮＡ技術によってクローニング、分析および操作によってもたらされる。得られた技術は、公知のＰＫＳ遺伝子クラスターを操作して、天然に存在するか、そうでなければポリケチドを生成しない宿主よりも高いレベルでＰＫＳによって合成されたポリケチドを生成することを可能にする。この技術はまた、ＰＫＳのドメインを不活性化することによっておよび／またはＰＫＳ遺伝子の操作ではＰＫＳにおいて通常見いだされないドメインを付加することによって、公知のＰＫＳ遺伝子クラスターから生成されるポリケチドに構造的に関連するが、それとは異なる分子を生成することを可能にする。
【０００６】
ＰＫＳ酵素機能の機序およびＰＫＳを操作するための方法の開発の詳細な理解は、新規のポリケチドの作製を容易にし得るが、現在、遺伝子操作による新規ポリケチドの作製には限界がある。このような限界の１つは、ＰＫＳ遺伝子の利用能である。多くのポリケチドが公知であるが、対応するＰＫＳ遺伝子の比較的わずかな部分のみがクローニングされ、操作に利用され得る。さらに、多くの場合において、目的のポリケチドを生成する生物は、多大な困難性および高い費用を伴ってのみ入手可能であり、実験室でこの生物を増殖させる技術およびこの生物が生成するポリケチドの生成のための技術は、未知であるか、または実施に多くの時間を費やす。また、たとえ所望のポリケチドについてのＰＫＳ遺伝子がクローニングされたとしても、それらの遺伝子は、特定の宿主細胞において所望される生成レベルをもたらすようには働かないかも知れない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ポリケチドを生成するＰＫＳをコードする遺伝子にアクセスすることなく、所望のポリケチドを生成する方法が存在すれば、これらの困難性の多くは、改善されるか、または完全に回避され得る。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の簡単な概要）
１つの局面において、本発明は、天然に存在する遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を提供する。この合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在す遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なる。１つの局面において、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、その天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列と約９０％同一であり、いくつかの実施形態では、約８５％未満同一または約８０％同一である。１つの局面において、この合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、少なくとも１つ（いくつかの実施形態においては、１を超える、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの）特有の制限部位を含み、これらは、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在しないかまたは特有のものではない。１つの局面において、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在する少なくとも１つの制限部位を含まない。本発明の実施形態において、その合成遺伝子によってコードされるポリペプチドセグメントは、天然に存在する遺伝子によってコードされる少なくとも５０連続したアミノ残基に対応する。
【０００９】
１つの実施形態において、そのポリペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼ  （ＰＫＳ）に由来し、ＰＫＳドメイン（例えば、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、およびＴＥを含む）または１以上のＰＫＳモジュールを含み得る。いくつかの実施形態において、その合成ＰＫＳ遺伝子は、モジュールコード配列あたり、高々１コピーの制限酵素認識部位を有し、この認識部位は、Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される。１つの実施形態において、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列中に存在するＩＩＳ型酵素制限部位（例えば、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、Ｂｓｒ  Ｄｉ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＥａｒＩ、ＳａｐＩ、Ｂｓｍ  ＢＩ、Ｂｓｐ  ＭＩ、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｆｕＡＩ、Ｆｏｋ  ＩおよびＡｌｗＩ）を含まない。
【００１０】
関連する実施形態において、天然に存在するＰＫＳ遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を提供し、ここで、その合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なり、ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ  Ｉ部位；ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ  Ｉ部位；ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ  Ｉ部位；ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ  Ｉ部位；ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ  Ｉ部位；ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ  Ｉ部位；ｇ）ＫＲドメインののアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ  Ｉ部位；ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ  Ｉ部位のうち少なくとも２つを含む。
【００１１】
関連する局面において、本発明は、本発明の合成遺伝子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。１つの実施形態において、そのベクターは、第１のＰＫＳモジュールをコードするオープンリーディングフレームを含み、そして、（ａ）ＰＫＳ伸長モジュール、（ｂ）ＰＫＳローディングモジュール、（ｃ）放出ドメイン（例えば、チオエステラーゼドメイン）およびｄ）ペプチド間リンカーを含む。
【００１２】
本発明の遺伝子またはベクターを含むかまたは発現する細胞、ならびに、それらのベクターによってコードされたポリペプチドまたは機能的ポリケチドシンターゼを含む細胞が、提供され、ここで、そのＰＫＳは、そのベクターによってコードされるポリペプチドを含む。１つの局面において、非天然アミノ酸配列を有するＰＫＳポリペプチドが、提供される。これらのポリペプチドは、そのドメインのカルボキシ端でジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎを含むＫＳドメイン；および／またはそのドメインのカルボキシ端にジペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒを含むＡＣＰドメインによって特徴付けられる。ポリケチドを作製するための方法が提供され、この方法は、ポリケチドが産生されるが、そのポリケチドは、そのベクターの非存在下でのその細胞によっては産生されない条件のもとで、合成ＤＮＡを含む細胞を培養する工程を包含する。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、異なるポリペプチドをコードする配列を含む複数の異なるＤＮＡ単位のハイスループット合成のための方法を提供し、この方法は、各ＤＮＡについて、複数の重複しているオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、ポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ単位を生成して、ＰＣＲ増幅によってＵＤＧ含有リンカーをそのＤＮＡ単位の５’末端および３’末端に加え、それによって、連結されたＤＮＡ単位を生成する工程を包含し、ここで、その同じＵＤＧ含有リンカーが、その異なるＤＮＡ単位に加えられる。実施形態において、その複数性は、５０の異なるＤＮＡ単位、１００を超える異なるＤＮＡ単位または５００を超える異なるＤＮＡ単位（シントン）を含む。関連する局面において、本発明は、ポリペプチドコード配列を含むベクターを産生するための方法を提供し、この方法は、連結依存性クローニング法を使用して連結されたＤＮＡ単位をベクターにクローニングする工程を包含する。
【００１４】
本発明は、遺伝子ライブラリーを提供する。１つの実施形態において、複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を含むライブラリーが提供される。ここで、このライブラリー中のモジュールコード遺伝子は、共通する少なくとも１つ（または、１を超える（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４、少なくとも５つ、または少なくとも６つ））の制限部位を有しており、この制限部位は、各モジュールにおいて高々１回見出され、そして、そのライブラリーにコードされたモジュールは、５以上の異なるポリケチドシンターゼタンパク質からのモジュールに対応する。遺伝子ライブラリーのためのベクターとしては、クローニングベクターおよび発現ベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、伸長モジュールを含み、かつ、第１のＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、およびポリペプチド間リンカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
関連する局面において、本発明は、上述のように複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を作製し、そして、各遺伝子を発現ベクターにクローニングすることによってＰＫＳモジュールコード遺伝子の発現ライブラリーの合成のための方法を提供する。このライブラリーは、例えば、少なくとも約５０または少なくとも約１００の異なるモジュールコード遺伝子を含む。
【００１６】
本発明は、編成について有用な種々のクローニングベクターを提供し、このベクターは、クローニングベクターであって、示された順序で、ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１または
Ｌ−ＳＩＳ−ＳＭ２Ｒ１を含み、ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第１の選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素のための認識部位であり、そして、Ｌは、様々な制限酵素のための認識部位である。本発明は、シントン配列を含むベクターをさらに提供し、このベクターは、ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−ＲｌまたはＬ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌであり、ここで、２Ｓ１は、第１のＩＩＳ型制限酵素であって、ここで、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ制限酵素のための認識部位であり、そして、Ｓｙは、シントンコード領域である。ベクターおよびＩＩＳ型制限酵素またはそのベクター上の部位を認識する他の制限酵素の組成物が、提供され、その組成物は、ベクター、キットのなどの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）対を含む。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、ベクターを提供し、このベクターは、第１の選択マーカー、第１の制限酵素によって認識される制限部位（Ｒ１）、第１のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限酵素によって認識される部位および第２のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位に隣接するシントンコード領域を含み、ここで、その第１の制限酵素およびその第１のＩＩＳ型制限酵素を用いるベクターの消化によって、その第１の選択マーカーおよびそのシントンコード領域を含むフラグメントが産生され、その第１の制限酵素およびその第２のＩＩＳ型制限酵素を用いる消化によって、該シントンコード領域を含み該選択マーカーを含まないフラグメントを産生する。１つの実施形態において、そのベクターは、第２の選択マーカーを含み、ここで、そのベクターを第１の制限酵素および第１のＩＩＳ型制限酵素で消化することによって、第１の選択マーカーおよびそのシントンコード領域を含むが、第２の選択マーカーおよびそのシントン領域を含まないフラグメントを生成し、そのベクターを第１の制限酵素および第２のＩＩＳ型制限酵素で消化することによって、第２の選択マーカーおよびそのシントンコード領域を含むが、第１の選択マーカーを含まないフラグメントを生成する。本発明は、隣接ＤＮＡ単位（シントン）を編成して、より大きな単位を合成する方法を提供する。例えば、本発明は、アセンブリＰＣＲによって複数の（すなわち、少なくとも３つの）ＤＮＡ単位を生成し、ここで、各ＤＮＡ単位が、ＰＫＳモジュールの一部分をコードする工程および予め決定された配列においてこの複数のＤＮ単位を組み合わせて、ＰＫＳモジュールコード遺伝子を生成する
ことによってＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を製作するための方法を提供する。１つの実施例において、本方法は、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とフレームを一致させて前記モジュールコード遺伝子を組み合わせる工程であって、それによって、ＰＫＳオープンリーディングフレームを産生する工程を包含する。
【００１８】
関連する実施形態において、本発明は、ベクター対を使用して一連のＤＮＡ単位を連結するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＤＮＡ単位の第１の単位を、各々、第１の型の選択ベクターで提供して、その第１の選択ベクターは、第１の選択マーカーを含み、そして、ＤＮＡ単位の第２の単位を、各々第２の型の選択ベクターで提供して、その第２の選択ベクターは、その第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーを含む工程であって、ここで、その第１の方の選択ベクターおよび第２の方の選択ベクターは、それらの異なる選択マーカーに基づき得る、工程、ｂ）その第１セットからのＤＮＡ単位をその第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第３のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択マーカーを生成して、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；ｃ）その第３のＤＮＡ単位を第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の方の選択ベクターを生成し、そして、第２の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得る工程による。１つの実施形態において、上記の工程（ｃ）は、その第３のＤＮＡ単位を、上記の第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程であって、その方法は、その第４のＤＮＡ単位を第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または該第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程をさらに包含する。１つの実施形態において、工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、その第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程であって、その方法は、第４のＤＮＡ単位を第１のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または第３のＤＮＡ単位を、第１セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、その第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程をさらに包含する。
【００１９】
関連する局面において、本発明は、一連のＤＮＡ単位を連結して、ＤＮＡ構築物を生成するための方法を提供して、この方法は、（ａ）第１の複数のベクターを提供して、これらのベクターの各々は、ＤＮＡ単位および第１の選択マーカーを含む工程；（ｂ）第２の複数のベクターを提供して、これらのベクターの各々は、ＤＮＡ単位および第２の選択マーカーを含む工程；（ｃ）（ａ）からのベクターを消化して、ＤＮＡ単位を含む第１のフラグメントおよびそのＤＮＡ単位を含まない少なくとも１つのさらなるフラグメントを生成する工程；（ｄ）  （ｂ）からのＤＮＡを消化して、ＤＮＡ単位を含む第２のフラグメントおよびそのＤＮＡ単位を含まない少なくとも１つのさらなるフラグメントを生成し、ここで、その第１のフラグメントおよびその第２のフラグメントのうちの１つだけが複製起点を含み、それらのフラグメントを連結して、（ｄ）からのＤＮＡ単位に連結された（ｃ）からのＤＮＡ単位を含む生成物ベクターを生成して、上記の第１の選択マーカーまたは第２の選択マーカーのいずれかについて選択することによってその生成物ベクターを選択する、工程；（ｅ）上記の生成物ベクターを消化して、ＤＮＡ単位およびそのＤＮＡ単位を含まない少なくとも１つのさらなるフラグメントを含む第３のフラグメントを生成する工程；  （ｄ）（ａ）または（ｂ）からのＤＮＡを消化して、ＤＮＡ単位を含む第４のフラグメントおよびそのＤＮＡ単位を含まない更なるフラグメントを生成して、ここで、第３のフラグメントおよび第４のフラグメントうちの１つだけが、複製起点を含む工程；（ｆ）第３のフラグメントおよび第４のフラグメントを連結して、（ｄ）からのＤＮＡ単位と連結した（ｅ）からのＤＮＡ単位を含む生成物ベクターを生成して、そして、第１の選択マーカーまたは第２の選択マーカーのいずれかについて選択することによってその生成物ベクターを選択する工程による。
【００２０】
別の局面において、オープンリーディングフレームベクターが提供され、このベクターは、内部型：４−［７−＊］−［＊−８］−３；左エッジ型：４−［７−１］−［＊−８］−３；および右エッジ型：４−［７−＊］−［６−８］−３；から選択される構造を含み、ここで、７および８は、適合性オーバーハング「＊」を生じるように切断するＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり；１および６は、必要に応じて存在するＩＩ型制限部位であり；そして、３および４は、８塩基対認識部位を有する制限酵素のための認識部位である。
【００２１】
別の局面において、合成遺伝の設計に有用な制限酵素認識部位を同定するための方法が提供される。その方法は、以下の工程：複数の機能的関連のあるポリペプチドセグメントのためのアミノ酸配列を得る工程；該アミノ酸配列を逆翻訳して、ポリペプチドセグメントの各々について複数のポリペプチドセグメントコード核酸配列を生成する工程；そのポリペプチドセグメントの少なくとも約５０％で、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される制限酵素認識部位を同定する工程を包含する。特定の実施形態において、その機能関連ペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼモジュールまたはドメイン（例えば、ＰＫＳモジュールまたはドメインにおける高相同性領域）である。
【００２２】
本発明に従う合成遺伝子を設計するための方法において、参照アミノ酸配列が提供され、その参照アミノ酸配列が、宿主細胞のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムコドン選択が使用されて、そのアミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳される。その合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータが提供され、そのランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在が取り除かれる。選択位置において１以上の選択された制限部位が、そのランダム化したヌクレオチド配列に挿入され、その合成遺伝子の配列が生成される。
【００２３】
本発明の１つの局面おいて、その合成遺伝子の配列を一緒に含む重複オリゴヌクレオチド配列のセットが生成される。
【００２４】
本発明の別の局面において、その合成遺伝子の配列上の制限部位の位置についての１以上のパラメーターが、選択された位置における１以上の予め選択された制限部位を含む。
【００２５】
本発明の別の局面において、その予め選択された制限部位の選択された位置が、シントン端、ドメイン端、およびモジュール端からなる群より選択される位置に対応する。
【００２６】
本発明の別の局面において、上記合成遺伝子の配列上に制限部位の位置についての１以上のパラメーターを提供する工程の後に、上記のランダム化したヌクレオチド配列において挿入され得る全ての可能な制限部位を予測して、必要に応じて、１以上の特有の制限部位を同定する。．
本発明の別の局面において、上記の合成遺伝子は、選択した長さの一連のシントンに分割され、ついで、各々のシントンの配列を含む重複したオリゴヌクレオチド配列が生成される。
【００２７】
本発明の別の局面において、重複オリゴヌクレオチド配列のセットが、（ａ）上記の合成遺伝子に対応するシントンコード領域を一緒に含むオリゴヌクレオチド配列および（ｂ）１以上のシントン隣接配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
本発明の別の局面において、１以上の特性試験が、上記の重複オリゴヌクレオチド日ア列の１セットについて実施され、それらの試験が、翻訳エラー、無効な制限位置、制限部位の正しくない位置、および異常プライミングからなる群より選択される。
【００２９】
本発明の別の局面において、各オリゴヌクレオチド配列は、選択された長さであり、上記の合成遺伝子の配列を一緒に含むオリゴヌクレオチドのセットの隣接するオリゴヌクレオチドとの予め決定された長さの重複を含む。
【００３０】
本発明の別の局面において、オリゴヌクレオチドの各々は、長さにして約４０ヌクレオチドであり、隣接するオリゴヌクレオチドに対して約１７ヌクレオチドと約２３ヌクレオチドの間の重複を含む。
【００３１】
本発明の別の局面において、重複オリゴヌクレオチド配列のセットを生成する工程は、配列特異性についてアライメントカットオフ値を提供すること、各オリゴヌクレオチド配列とその合成遺伝子の配列をアライメントすること。およびそのアライメント値を決定すること、およびそのアライメントカットオフ値よりも低いアライメント値を有するオリゴヌクレオチドを同定し、退けることを包含する。
【００３２】
本発明の別の局面において、重複オリゴヌクレオチド配列のセットを生成する工程が、配列特異性についてのアライメントカットオフ値を提供すること、その合成遺伝子の配列とオリゴヌクレオチド配列の各々とをアライメントすること、およびそのアライメント値を決定すること、およびそのアライメントカットオフ値よりも小さいアライメント値を備えるオリゴヌクレオチドを同定するかまたは退けることを包含する。
【００３３】
本発明の別の局面において、退けられたオリゴヌクレオチドにおけるエラー領域が、同定され、必要に応じて、そのエラー領域における１以上のヌクレオチドが、置換されて、その退けられたオリゴヌクレオチドのアライメント値が、そのアライメントカットオフ値よりも上昇される。
【００３４】
本発明の別の局面において、合成遺伝子またはシントンを含むオリゴヌクレオチドのオーダーリストが生成される。
【００３５】
本発明の別の局面において、制限部位を取り除く工程は、そのランダム化されたヌクレオチド配列における予め決定された部位の位置を同定すること、その制限部位のヌクレオチド配列における置換を受容するためにその制限部位のヌクレオチド配列を含む1以上のコドンの能力を同定することであって、ここで、このような置換は、（ａ）その制限部位を取り除き、そして、（ｂ）そのコドンと同一のアミノ酸をコードする、配列が改変されたコドンを生成し、そして、その同定されたコドンにおける制限部位の配列を変化させる。
【００３６】
本発明の別の局面において、制限部位を挿入する工程は、そのランダム化したヌクレオチド配列における選択した制限部位の挿入のための選択した位置を同定して、その結果、その選択した制限部位配列は、選択された位置で生成されること、その置換された配列をアミノ酸配列に翻訳すこと、その選択した位置においてその翻訳したアミノ酸配列がその参照アミノ酸配列に同一である置換を受容すること、そして、その選択した位置においてその翻訳したアミノ酸配列がその参照アミノ酸配列と異なる置換を退けることを含む。
【００３７】
本発明の別の局面において、その参照アミノ酸配列に同一である翻訳されたアミノ酸配列は、その選択された位置で類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を含む。
【００３８】
本発明の別の局面において、その合成遺伝子は、ＰＫＳモジュールをコードする。
【００３９】
本発明の別の局面において、その参照アミノ酸配列は、天然に存在するポリペプチドセグメント由来である。
【００４０】
本発明の別の局面において、この方法の1以上の工程は、プログラムされたコンピュータによって実施され得る。
【００４１】
本発明の別の局面において、コンピュータ読み取り可能記憶媒体は、本発明の方法を実行するためのコンピュータ実行可能コードを含む。
【００４２】
本発明に従うシントンのヌクレオチド配列を分析する方法において、合成遺伝子の配列が、提供され、この合成遺伝子は、複数のシントンに分割される。複数のシントンサンプルの配列がまた、提供され、その複数のシントンの各々シントンは、ベクターにクローニングされる。そして、挿入なくそのベクターの配列が、提供される。そのクローニングされたシントンの配列からのベクター配列は取り除かれ、そして、それらの複数のシントンの配列コンティグマップが構築される。この配列のコンティグマップは、その合成遺伝子の配列とアライメントされ、そして、その複数のシントンの各々についてのアライメントの程度が同定される。
【００４３】
本発明の別の局面において、1以上のシントン配列におけるエラーが同定され；そして、1以上の情報が報告され、それらの情報は、アライメントの程度によってシントンサンプルの順位付け、シントンサンプルの配列におけるエラー、修復され得るシントンの同一性からなる群より選択される。
【００４４】
本発明の別の局面において、複数のアライメントエラーについての統計学的レポートが準備される。
【００４５】
本発明に従った合成遺伝子のハイスループット合成のためのシステムは、アセンブリＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド含む少なくとも１つの供給源マイクロウェルプレート、ポリメラーゼおよびアセンブリＰＣＲについて有用な緩衝液を含む増幅混合物のための第１の供給源、ＬＩＣ伸長プライマー供給源、オリゴヌクレオチド増幅のための少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートを備える。液体操作デバイスが、複数の予め決定されたセットのオリゴヌクレオチドをマイクロウェルプレートから取り出し、その予め決定されたセットと、該少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中の増幅混合物とを組み合わせ、ＬＩＣ伸長プライマー混合物を取り出し、そのＬＩＣ伸長プライマー混合物と、少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中にあるアンプリコンと組み合わせる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（詳細な説明）
以下の概説は、読み手を補助するために提供される。以下の開示の構成は、便宜のためであり、特定の節における本発明の１つの局面の開示は、局面が他の異なって表示された節における開示に関連しないことを意味しない。
１．定義
２．導入
３．合成遺伝子の設計
４．遺伝子の合成
４．１シントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）の合成
４．２モジュール遺伝子の合成（編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ））
４．２．１アセンブリベクターにおけるクローニングシントン
４．２．２シントンのバリデーション
４．２．３方法Ｓ：結合ストラテジー、アセンブリベクターおよび選択スキーム
４．２．３．１結合ストラテジー
４．２．３．２アセンブリベクター
４．２．３．３選択スキーム
４．２．４方法Ｒ：結合ストラテジー、アセンブリベクターおよび選択スキーム
４．２．４．１結合ストラテジー
４．２．４．２アセンブリベクター
４．２．４．３選択スキーム
５．遺伝子設計およびジェムス（ｇｅｍｓ）（遺伝子モーフィングシステム（ｇｅｎｅ  ｍｏｒｐｈｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ））アルゴリズム
５．１ジェムス概要
５．２ジェムスアルゴリズム
５．３ソフトフェア実行
６．マルチモジュール構築物およびライブラリー
６．１導入
６．２．ＯＲＦベクターライブラリーの例示的な使用
６．３モジュールとリンカーの組み合せ
６．４例示的なＯｒｆベクター構築物
６．４．１アミノ末端およびカルボキシ末端アクセサリー単位または他のポリペプチド配列を含むＯｒｆベクター
６．４．２Ｏｒｆベクター合成
６．４．３例示的なＯｒｆベクター構築方法
７．天然に存在する組み合せに基づいたマルチモジュール設計
８．ドメインの置換
９．例示的な生成物
９．１合成ＰＫＳモジュール遺伝子
９．２ベクター
９．３ライブラリー
９．４データベース
１０．高スループットシントン合成および分析
１０．１合成の自動化
１０．２クロマトグラムの迅速な分析（ラクーン（Ｒａｃｏｏｎ））
１１実施例
１．遺伝子アセンブリプロトコルおよび増幅プロトコル
２．ライゲーション非依存性クローニング
３．クローン化したシントンの特徴づけおよび補正
４．ＰＫＳモジュールにおいて有用な制限部位の同定
５．Ｄｅｂｓモジュール２の合成
６．Ｅ．Ｃｏｌｉにおける合成Ｄｅｂｓモジュール２の発現
７．Ｅ．Ｃｏｌｉにおける合成ＤＥＢＳ遺伝子発現
８．２つのタンパク質の相対量の定量的測定方法
９．エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）シンターゼ遺伝子１の合成
（定義）
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーであるが、通常、少なくとも約５０残基を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドセグメント」は、目的のポリペプチド配列を参照するために使用され得る。ポリペプチドセグメントは、天然に存在するポリペプチド（例えば、ＤＥＢＳ  ＯＲＦ１遺伝子の生成物）、天然に存在するポリペプチドのフラグメントまたは領域（例えば、ＤＥＢＳモジュール１、ＤＥＢＳモジュール１のＫＳドメイン、リンカー、機能的に規定された領域、および任意の特定の機能または構造に一致していない任意に規定された領域）に対応し得るか、あるいは合成ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたは領域に必ずしも一致しない。「ポリペプチドセグメントコード配列」は、ポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチド配列（より大きなヌクレオチド配列から単離されるかまたはその中に含まれるかのいずれか）（例えば、ＤＥＢＳ１  ＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列）の一部分であり得；ポリペプチドセグメントは、より大きなポリペプチドまたは完全ポリペプチドに含まれ得る。一般に、用語「ポリペプチドセグメントコード配列」は、本発明の方法を使用して作製され得る、任意のポリペプチドコードヌクレオチド配列を含むことが意図される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「シントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）」および「ＤＮＡ単位」は、より大きな高分子（例えば、ＰＫＳモジュールコードポリヌクレオチド）を生成する他の２本鎖ポリヌクレオチドと組み合せた２本鎖ポリヌクレオチドをいう。シントンは、任意の特定の方法（例えば、アセンブリＰＣＲ）によって合成されるポリヌクレオチドに限定されず、全ての型の合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、クローン化ＤＮＡおよび天然に存在するＤＮＡを含む。いくつかの場合において、シントンの３つの異なる領域は、識別され得る（１つのコード領域および２つの隣接領域）。シントン編成の最終ＤＮＡ生成物に組み込まれるシントンの一部分（例えば、モジュール遺伝子）は、「シントンコード領域」と称され得る。シントンコード領域に隣接し、かつ生成ＤＮＡの一部ではないシントンの領域は、「シントン隣接領域」と称され得る。以下に記載されるように、シントン隣接領域は、制限酵素を用いる切断による編成の間、シントンコード領域から物理的に分離される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「マルチシントン（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｏｎ）」は、２つ以上のシントン（通常、４つ以上のシントン）の組み合わせ（例えば、ライゲーション）により形成されるポリヌクレオチドをいう。「マルチシントン」はまた、「シントン」（前述の定義を参照のこと）と称され得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「モジュール」は、ポリペプチドの機能単位である。本明細書で使用される場合、「ＰＫＳモジュール」は、天然に存在するＰＫＳ伸長モジュール、合成ＰＫＳ伸長モジュールまたはハイブリッドＰＫＳ伸長モジュールをいう。ＰＫＳ伸長モジュールは、ＫＳドメインおよびＡＣＰドメイン（通常、１モジュールあたり１つのＫＳおよび１つのＡＣＰ）を含み、時々ＡＴドメイン（通常、１つのＡＴドメインおよび時折２つのＡＴドメイン）（ここでＡＴ活性は、トランスで提供されないか、隣接モジュールから提供されない）を含み、そして時々、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、ＥＲドメイン、ＭＴ（メチルトランスフェラーゼ）ドメイン、Ａ（アデニル化）ドメイン、もしくは他のドメインの１つ以上を含む。ポリペプチドのアミノ末端以外で天然に存在するＰＫＳ伸長モジュールの記載において、用語「モジュール」は、ドメインと、あるＡＣＰドメインのＣ末端から次のＡＣＰドメインのＣ末端にほぼ延びるドメイン間結合領域（すなわち、モジュールを結合する配列を含み、図６に示されるモジュールのＳｐｅＩ−Ｍｆｅ  Ｉ領域に一致する）リンカーとのセットを称し得るか、あるいは、リンカー配列（例えば、図６に示されるモジュールのＭｆｅ−Ｘｂａ  Ｉ領域におおまかに一致する）を含まないセットを称し得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「モジュール」は、２つの意味における「ＰＫＳモジュール」よりもより一般的である。第一に、「モジュール」は、ＰＫＳに由来しない単位を含む任意の型の機能単位であり得る。第二に、ＰＫＳに由来する場合、「モジュール」は、「ＰＫＳモジュール」とＰＫＳの当該分野では通常呼ばない、ＰＫＳポリペプチドの機能単位（例えば、リンカー、ドメイン（チオエステラーゼまたは他の放出ドメインを含む）を包含し得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「マルチモジュール」は、２つ以上のモジュールを含む単一ポリペプチドをいう。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＫＳアクセサリ単位」（または「アクセサリ単位」）は、伸長モジュール以外のＰＫＳポリペプチド（またはポリケチド合成において機能する）領域もしくはドメインまたは伸長モジュールのドメインをいう。ＰＫＳアクセサリ単位の例としては、ローディングモジュール、ポリペプチド間リンカー、および放出ドメインが挙げられる。ＰＫＳアクセサリ単位は、当該分野で公知である。ＰＫＳローディングドメインについての配列は、市販されている（表１２を参照のこと）。一般に、ローディングモジュールは、ポリケチドを合成するために使用される第１の構築ブロックを結合し、第一の伸長モジュールにそれを移す役割を担う。例示的なローディングモジュールは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン（例えば、ＤＥＢＳのドメイン）；ＫＳＱドメイン、ＡＴドメイン、およびＡＣＰドメイン（例えば、チロシンシンターゼまたはオレアンドマイシンシンターゼのドメイン）；ＣｏＡリガーゼ活性ドメイン（アバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）シンターゼ、ラパマイシンまたはＦＫ−５２０  ＰＫＳ）またはＮＲＰＳ−様モジュール（例えば、エポチロンシンターゼ）からなる。リンカー（天然に存在するリンカーおよび合成リンカー）もまた、公知である。天然に存在するＰＫＳポリペプチドは、一般に、以下の２つのリンカーを含と解釈される：「ポリペプチド間リンカー」および「ポリペプチド内リンカー」。例えば、Ｂｒｏａｄｈｕｒｓｔら、２００３，「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ」Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０：７２３−３１；Ｗｕら、２００２，「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅｓ，ａｎｄ  ｌｉｎｋｅｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｔｏｉｎｔｅｒｍｏｄｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：５０５６−６６；Ｗｕら、２００１，「Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｍｏｄｕｌｅｓ」Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２３：６４６５−７４；Ｇｏｋｈａｌｅら、２０００，「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌｅｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．４：２２−７を参照のこと。例えば、特定のポリペプチド内配列結合伸長モジュール（例えば、図６に示されるモジュールのＳｐｅＩ−Ｍｆｅ  Ｉ領域に一致する）は、「ＡＣＰ−ＫＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎ」またはＡＫＬと称される。チオエステラーゼドメイン（ＴＥ）は、たいていのＰＫＳ分子（例えば、ＤＥＢＳ、チロシンシンターゼ、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）シンターゼ、ピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）シンターゼおよびソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）シンターゼ）において任意に見出され得る。他の鎖放出活性はまた、アクセサリ単位、例えば、ラパマイシンクラスター由来のｒａｐＰ遺伝子およびＦＫ５０６、ＦＫ５２０などに由来するホモログによってコードされるようなアミノ酸取り込み活性；テリファマイシン（ｔｈｅｒｉｆａｍｙｃｉｎ）およびゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳにおいて見出されるアミド形成活性；ならびに加水分解酵素または線形エステル形成酵素（ｌｉｎｅａｒ  ｅｓｔｅｒ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ）である。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「遺伝子」は、ポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ配列である。遺伝子はまた、さらなる配列（例えば、転写調節エレメント、イントロン、３’−非翻訳領域など）を含み得る。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「合成遺伝子」は、天然において見出されないポリペプチドセグメントコード配列を含む遺伝子であり、ここでポリペプチドセグメントコード配列は、少なくとも約３０アミノ酸残基長、一般的に少なくとも約４０アミノ酸残基長そしてしばしば少なくとも約５０アミノ酸残基長のポリペプチドまたはフラグメントまたはドメインをコードする。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「モジュール遺伝子」または「モジュールコード遺伝子」は、モジュールをコードする遺伝子をいい；「ＰＫＳモジュール遺伝子」は、ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子をいう。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「マルチモジュール遺伝子」は、マルチモジュールをコードする遺伝子をいう。
【００５８】
「天然に存在する」ＰＫＳ、ＰＫＳモジュール、ＰＫＳドメインなどは、天然に見出されるアミノ酸配列を有するＰＫＳ、モジュール、もしくはドメインである。
【００５９】
「天然に存在する」ＰＫＳ遺伝子またはＰＫＳモジュール遺伝子またはＰＫＳドメイン遺伝子は、天然に見出されるＰＫＳ遺伝子のヌクレオチド配列を有する遺伝子である。例示的な天然に存在するＰＫＳ遺伝子の配列は、公知である（例えば、表１２を参照のこと）。
【００６０】
「遺伝子ライブラリー」は、目的の個々のアクセス可能なポリヌクレオチドの収集物を意味する。ポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、プラスミドまたはファージ）、細胞（例えば、細菌細胞）中に、精製ＤＮＡまたは他の形態として維持され得る。ライブラリーメンバー（クローン、構築物、ポリヌクレオチドなどと多様に称される）は、修正および使用のための多様な様式（例えば、マルチウェル培養またはマイクロタイタープレート、バイアル、適切な細胞環境（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞））においてか、適切な保存培地（例えば、ｔｈｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）ＩＤＴＭ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃａｒｄ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）上で精製ＤＮＡ組成物としてか、あるいは他の多様な当該分野で公知なライブラリー形態において保存され得る。典型的には、ライブラリーは、少なくとも約１０メンバー、しばしば少なくとも約１００メンバー、好ましくは約５００メンバー、そしてなおより好ましくは少なくとも約１０００メンバーを有する。「個々にアクセス可能である」とは、選択されたライブラリーメンバーの局在が、メンバーがライブラリーから回収され得るように知られていることを意味する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「一致する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「一致している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」は、ポリペプチド間の関係を記載する。合成遺伝子によってコードされるポリペプチド（例えば、ＰＫＳモジュールまたはドメイン）は、同じアミノ酸配列を実質的に有する場合、天然に存在するポリペプチドに一致する。例えば、合成遺伝子によってコードされるＫＳドメインは、合成遺伝子によってコードされるＫＢドメインがＤＥＢＳのモジュール１のＫＳドメインと実質的に同じアミノ酸配列を有する場合、ＤＥＢＳのモジュール１のＫＳドメインと一致する。
【００６２】
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドの組換え操作を記載する場合、「〜に結合する（ｊｏｉｎｅｄ  ｔｏ）、「〜に結合する（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ）」および文法的に等価な表現の各々は、２つのＤＮＡ分子（または同一のＤＮＡ分子の２つの末端）のライゲーション（すなわち、５’−３’核酸共有結合の形成）をいう。
【００６３】
本明細書において使用される場合、隣接したＤＮＡ（例えば、隣接したシントン）を言う場合、「隣接した」は、天然に存在する遺伝子または合成遺伝子において連続して（または重なって）いる配列をいう。「隣接したシントン」の場合において、シントンコード領域の配列は、シントンにコードされる合成遺伝子に連続または重なっている。
【００６４】
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントの状況において「端」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントの末端の領域（すなわち、物理的な端）あるいはポリペプチド（例えば、ドメイン）またはポリヌクレオチド（例えば、ドメインコード配列）領域の範囲を定める境界付近をいう。
【００６５】
用語「結合端（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｅｄｇｅ）」は、隣接シントンに（例えば、各シントンにおける適合性のライゲーション可能末端の形成によって）結合されるシントンの領域を記載するために使用される。従って、シントンの「結合末端でライゲーション可能な末端」という言及は、隣接したシントンの適合性のあるライゲーション可能末端にライゲーションされている（またはライゲーションされ得る）末端を意味する。５つ以上のシントンを含む構築物において、たいていのシントンは、２つの結合端を有することが理解され得る。言及されている結合端は、文脈から明らかである。配列モチーフまたは制限酵素部位は、モチーフまたは部位がモジュール内の他のドメインの任意の末端（境界）よりも特定の末端（境界）により近い場合、モジュール内のＰＫＳドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端をコードするヌクレオチド配列の「付近」にある。配列モチーフまたは制限酵素部位は、モチーフまたは部位がモジュール内の任意のドメインの末端よりも特定の末端（境界）により近い場合、ＰＫＳモジュールのアミノ末端またはカルボキシ末端をコードするヌクレオチド配列の「付近」にある。ＰＫＳドメインの境界は、当該分野で公知の方法によって、類似の型（例えば、ＫＳ、ＥＲなど）の他のＰＫＳドメインの配列と、対象のドメインの配列とを整列させることによって、そして比較的高い同一性と比較的低い同一性との間の境界を確認することによって決定され得る。ＤｏｎａｄｉｏおよびＫａｔｚ，１９９２，「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ」Ｇｅｎｅ  １１１：５１−６０を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬＷのようなプログラムおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｉ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｐｋｓｄｂ．ｈｔｍｌで利用可能なプログラムが、整列のために使用され得る。いくつかの実施形態において、境界付近にあるモチーフまたは制限酵素部位は、境界から約２０アミノ酸残基以下である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「オーバーハング」は、２本鎖ポリヌクレオチドを言及する場合、通常の意味を有し、そして２本鎖ポリヌクレオチドの末端での、対をなさない１本鎖伸長をいう。
【００６７】
「配列特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ」または「配列特異的ニッキング酵素」は、二本鎖ＤＮＡ配列を認識して、１本のＤＮＡ鎖のみを切断する酵素である。例示的なニッキングエンドヌクレアーゼは、米国特許出願２００３０１０００９４  Ａ１の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＤＮＡ−ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ」に記載される。例示的なニッキング酵素としては、Ｎ．Ｂｂｖ  Ｃ  ＩＡ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩおよびＮ．Ａｌｗ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が挙げられる。
【００６８】
本明細書中で用いられる場合、「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、当該分野におけるその通常の意味を有する。制限エンドヌクレアーゼは、それらの特性を記載することおよび／または標準的命名法を用いて言及され得る。
（Ｒｏｂｅｒｔｓら，２００２，「Ａ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｇｅｎｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：１８０５−１２を参照のこと）。一般に、「ＩＩ型」制限エンドヌクレアーゼは、特異的ＤＮＡ配列を認識し、そしてその配列でのまたはその配列付近の一定の位置において切断して、５’−リン酸および３’−ヒドロキシルを生成する。パリンドローム配列を認識する「ＩＩ型」制限エンドヌクレアーゼは、時々、本明細書中で「従来の制限エンドヌクレアーゼ」といわれる。「ＩＩＡ型」制限エンドヌクレアーゼは、認識部位が非対称である、ＩＩ型のサブセットである。一般に、「ＩＩＳ型」制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの切断部位が、認識部位の外側にある、ＩＩＡ型のサブセットである。本明細書中で用いられる場合、「ＩＩＳ型」制限酵素に対する言及は、特にそうでないと示されない限り、両方のＤＮＡ鎖が認識部位の外側および制限部位の同じ側で切断されるＩＩＳ型酵素を言及する。本発明の１つの実施形態では、２〜４塩基の突出部を生成するＩＩＳ型酵素が選択される。例示的な制限エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられる：
【００６９】
【数１Ａ】
2006517090.tif 000002
【００７０】
本明細書中で用いられる場合、用語「連結可能末端」とは、連結され得る、２つのＤＮＡフラグメントの末端または同じ分子の末端をいう。「連結可能末端」とは、平滑末端および（一本鎖突出部を有する）「粘着末端」を包含する。２つの粘着末端は、これらがアニーリングして連結され得る場合、「適合性」である（例えば、各突出部が、３’−ヒドロキシルの突出部である場合；各々が、同じ長さ（例えば、４ヌクレオチド単位）の突出部である場合、および２つの突出部の配列が、互いの逆相補体である場合）。
【００７１】
本明細書中で用いられる場合、特に示されるかまたは文脈から明らかでない限り、「制限部位」とは、少なくとも５塩基対、通常は少なくとも６塩基対の長さの認識部位をいう。
【００７２】
本明細書中で用いられる場合、「独特の制限部位」とは、特定のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）または特定のポリヌクレオチド領域（例えば、モジュールをコードする部分、特定のベクター領域など）中に１回のみ存在する制限部位をいう。
【００７３】
本明細書中で用いられる場合、「有用な制限部位」とは、特定のポリヌクレオチドまたは特定のポリヌクレオチド領域中で、独特であるか、もし独特でないにしてもあるパターンおよび数で存在し、その結果、特定のポリヌクレオチドまたは特定のポリヌクレオチド領域（例えば、モジュール遺伝子）中でのその部位の全てでの消化が、あたかもその部位が独特であるかのように本質的に同じ結果を達成するかのいずれかの、制限部位をいう。
【００７４】
本明細書中で用いられる場合、「ベクター」とは、発現または複製のいずれかのために細胞中に組換え核酸を導入するために用いられ、かつ複製起点ならびに適切な転写制御配列および／または翻訳制御配列（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）ならびにベクター維持のための他のエレメントを有する、ポリヌクレオチドエレメントをいう。１つの実施形態では、ベクターは、自己複製性の環状の染色体外ＤＮＡである。このようなビヒクルの選択および使用は、当該分野で慣用的である。「発現ベクター」は、ベクター中に挿入されたＤＮＡ（例えば、調節配列（例えば、プロモーター領域）と作動可能に連結されたＤＮＡ配列）を発現し得るベクターを包含する。従って、発現ベクターとは、適切な宿主細胞中に導入された際に、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらす、組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築物（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター）をいう。
【００７５】
本明細書中で用いられる場合、特定のアミノ酸は、参照アミノ酸についての特定のアミノ酸の置換が、タンパク質の機能（例えば、生物学的活性）を実質的に改変しない場合、そのタンパク質において、参照アミノ酸に「類似」する。類似であるアミノ酸はしばしば、互いについて保存的置換である。以下の６群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：［アラニン；セリン；トレオニン］；［アスパラギン酸、グルタミン酸］、［アスパラギン、グルタミン］、［アルギニン、リジン］、［イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン］、および［フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン］。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙもまた参照のこと。
【００７６】
非リボソームペプチドシンターゼ、すなわち「ＮＲＰＳ」は、リボソーム依存性プロセスによって個々のアミノ酸を連結することによってペプチド産物を生成する酵素である。ＮＲＰＳの例としては、グラミシジンシンテターゼ、シクロスポリンシンテターゼ、サーファクチンシンテターゼなどが挙げられる。概説については、ＷｅｂｅｒおよびＭａｒａｈｉｅｌ，２００１，「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ」，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）．９：Ｒ３−９；Ｍｏｏｔｚら，２００２，「Ｗａｙｓ  ｏｆ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ」，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．３：４９０−５０４を参照のこと。
【００７７】
（規定）
用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「など」、「例示的な」、「例としては、以下が挙げられる」、「例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ（ｅ．ｇ．））」、「代表的に」などは、本発明の局面を例示することを意図するが、記載される特定の例に本発明を限定することを意図しない。従って、このような語句の各例は、あたかも、語句「しかし限定のためではない」が存在するかのように読み替えられ得る（例えば、「例えば、以下であるがこれらに限定されない…」）。
【００７８】
用語「モジュール」および「ドメイン」は一般に、ポリペプチドまたはポリペプチド領域を言及するが、用語「モジュール遺伝子」および「ドメイン遺伝子」または文法的等価物は、そのタンパク質をコードするＤＮＡをいう。この約束事に対する不注意での例外は、文脈から明らかである。例えば、「モジュール縁部での制限部位」とは、モジュール遺伝子のうちの、モジュールポリペプチド配列の縁部をコードする領域における制限部位をいうことが明らかである。
【００７９】
（２．緒言）
本発明は、遺伝子の合成、このような遺伝子のライブラリーの生成、ならびに遺伝子および対応するコードされたポリペプチドの操作および特徴付けのための、ストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステムに関する。特に、本発明は、大きなポリペプチドをコードする遺伝子の合成のための、新たな方法およびツールを提供する。合成され得る遺伝子の例としては、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のドメイン、モジュールもしくはポリペプチドをコードする遺伝子、非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）のドメイン、モジュールもしくはポリペプチドをコードする遺伝子、ＰＫＳおよびＮＲＰＳの両方のエレメントを含むハイブリッド、ウイルスゲノムなどが挙げられる。ポリケチドシンターゼ分子をコードする遺伝子は特に興味深いものであり、そして便宜のために、本開示全体を通して、ＰＫＳのモジュール、ドメインおよびポリペプチドをコードする遺伝子の設計および合成に対する参照がしばしばなされる。しかし、言及するかさもなければ文脈から明らかでない限り、本発明の局面は、任意の特定のクラスの遺伝子にもポリペプチドにも限定されない。本発明の方法が、大きな種々のポリヌクレオチドの設計および合成のために有用であることが読者によって理解される。
【００８０】
目的のポリペプチドをコードする合成遺伝子を生成するための本発明の方法は、以下の工程を包含し得る：
ａ）目的のポリペプチドセグメントをコードする遺伝子を設計する工程；
ｂ）この遺伝子の合成のために成分ポリペプチドを設計する工程；
ｃ）以下によってオリゴペプチドセグメントをコードする遺伝子を合成する工程：
ｉ）モジュール遺伝子の部分をコードするシントンを作製する工程；および
ｉｉ）シントンを一緒に「編成」て、目的のポリペプチドセグメントをコードするマルチシントン（すなわち、より大きなＤＮＡ単位）を生成する工程。目的のポリペプチドが、発現され得、組換えによって操作され得るなどのことが読者には明らかである。
【００８１】
本明細書中に開示される方法およびツールは、ポリケチドシンターゼ遺伝子の合成についての特定の適用を有し、そしてポリケチドの合成についての種々の新たな利点を提供する。上記で考察されるように、ポリケチドシンターゼにおけるモジュールの順序、番号およびドメインの内容は、ポリケチド生成物の構造を決定する。本明細書中に開示される方法を用いて、ＰＫＳモジュール（これら自体が、ドメインの種々の組み合わせを含む）の本質的に任意の組み合わせを含むポリペプチドをコードする遺伝子が、合成され得、クローニングされ得、そして評価され得、そして機能的ポリケチドシンターゼの産生に用いられ得る。このようなポリケチドシンターゼは、対応する遺伝子クラスターをクローニングすることも配列決定すること（培養不可能な生物または希少生物からの場合など、ＰＫＳ遺伝子が入手可能でない場合に有用である）もない、天然に存在するポリケチドの産生；産生されない（または何らかの任意の天然に存在するＰＫＳによって産生されることが公知ではない）新規ポリケチドの産生；公知のポリケチドのアナログの、より効率的な産生；遺伝子ライブラリーの産生、および他の用途に用いられ得る。
【００８２】
関連の局面では、本発明は、有用な制限部位が、機能的に規定されたコード領域（例えば、モジュール、ドメイン、リンカー領域またはこれらの組み合わせをコードする、配列）に隣接した、ＰＫＳモジュール（または他のポリペプチド）をコードする遺伝子のユニバーサル設計に関する。この設計は、多数の異なるモジュールが、共通のベクターセットにクローニングされること、または多様な複数のモジュラータンパク質（例えば、ドメインの置換による）操作および／もしくは発現を可能にする。
【００８３】
関連の局面では、本発明は、ＰＫＳモジュールの大きなライブラリーを提供する。
【００８４】
関連の局面では、本発明は、遺伝子合成に有用なベクターおよび方法を提供する。
【００８５】
関連の局面では、本発明は、合成遺伝子の設計に有用なアルゴリズムを提供する。
【００８６】
関連の局面では、本発明は、遺伝子合成に有用な自動化システムを提供する。
【００８７】
本発明は、アセンブリＰＣＲまたは他の方法（ここで、各ＤＮＡ単位は、ＰＫＳモジュールの一部をコードする）による複数のＤＮＡ単位を生成し、そしてこれらのＤＮＡ単位を所定の順序で組み合わせてＰＫＳモジュールコード遺伝子を生成することによって、ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を作製するための方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、モジュールコード配列を、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳポリペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とインフレームで組み合わせ、それによりＰＫＳオープンリーディングフレームを生成する工程を包含する。
【００８８】
ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子の合成のための本発明の方法は、以下の工程を包含し得る：
ａ）（例えば、特定のポリケチドの生産のため、またはモジュールのライブラリー中に含めるために）ＰＫＳモジュールを設計する工程
ｂ）所望のＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を設計する工程；
ｃ）遺伝子の合成のための成分オリゴヌクレオチドを設計する工程；
ｄ）このモジュール遺伝子を、以下によって合成する工程：
ｉ）このモジュール遺伝子の一部をコードするシントンを作製する工程；および
ｉｉ）シントンを一緒に「編成る」工程；
ｅ）モジュール遺伝子を改変する工程；
モジュール遺伝子および／または補助単位遺伝子を含むオープンリーディングフレームを作製する工程；
モジュールコード遺伝子のライブラリーを産生する工程；
ｆ）必要に応じて、他のポリペプチドと組み合わせた宿主細胞において、（ｄ）または（ｅ）由来のモジュール遺伝子を発現する工程。
これらの工程の各々を、以下の節で詳細に記載する。
【００８９】
（３．合成遺伝子の設計）
本発明の合成遺伝子のヌクレオチド配列は、遺伝子の性質および意図される用途に依存して変動する。一般に、これらの遺伝子の設計は、遺伝子によってコードされるべきポリペプチドまたはフラグメント（例えば、ＰＫＳモジュールまたはドメイン）のアミノ酸配列、および以下のうちの全てまたはいくつかを反映する：
ａ）意図される発現宿主のコドン優先度、
ｂ）合成遺伝子の特定の位置における有用な制限部位の存在（導入）、
ｃ）遺伝子または遺伝子の特定の領域における所望でない制限部位の非存在（除去）、
ｄ）本明細書中に開示される合成方法（特に、ハイスループット法）との適合性。
【００９０】
本発明の方法によって合成されるべき遺伝子を選択することに関して、種々の基準が実施者に利用可能である。主な考慮事項は、通常、遺伝子によってコードされるタンパク質である。例えば、天然に存在するドメイン、モジュール、リンカーもしくは他のポリペプチド単位または上記の組み合わせと同じかまたは実質的に同じ配列を有する、少なくとも一部をコードするタンパク質をコードする遺伝子が合成され得る。
【００９１】
目的のポリペプチドを選択したら、タンパク質をコードする多数の核酸配列は、アミノ酸配列の逆翻訳によって決定され得る。逆翻訳のための方法は周知である。以下に記載のとおり、本発明によれば、逆翻訳は、コドン使用頻度をランダム化し、そして必要に応じて選択されたコドン優先度または偏りを反映する様式で実施され得る。本発明の合成遺伝子は、種々の宿主において発現され得るので、意図される発現宿主のコドン優先度の考慮は、発現の効率についての利益を有し得る。
【００９２】
コドン優先度を考慮する際に、優先度の表が、公に入手可能な供給源から入手されてもよく、または実施者によって作成されてもよい。コドン優先度は、ある生物についての全ての報告された配列または推定された配列、あるいは配列のサブセット（例えば、ハウスキーピング遺伝子）に基づいて作成され得る。広範な種々の種についてのコドン優先度の表は、公に入手可能である。多くの生物についての表は、かずさＤＮＡ研究所において維持されるサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からのリンクから入手可能である。Ｅ．ｃｏｌｉについての例示的なコドン優先度を表１に示す。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについてのコドン表は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌにおいて見出され得る。コドン表が特定の宿主について入手可能でない場合、大部分の近縁生物について入手可能な表が用いられ得る。
【００９３】
【表１】
2006517090.tif 000003
【００９４】
＊フィールド［トリプレット］［１０００当たりの頻度］［番号］
特定の宿主（発現）生物のコドン優先度について考慮することに加えて、合成遺伝子のヌクレオチド核酸配列は、隣接する稀なコドンのクラスターまたは配列の重複領域を回避するように設計され得る。
【００９５】
適切な発現宿主は、コードされるタンパク質に依存する。ＰＫＳタンパク質については、適切な宿主としては、モジュラーポリケチドを元々生成するかまたはモジュラーポリケチドを生成し得るように操作された細胞が挙げられる。宿主としては、放線菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、真正細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、粘液細菌（例えば、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｋｅａｌｅｙら，１９９８，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  ｎｏｎｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｈｏｓｔｓ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：５０５−９；Ｄａｙｅｍら，２００２，「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｍｕｔａｓｅ−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：５１９３−２０１を参照のこと。
【００９６】
コドンの最適化は、遺伝子全体を通して、あるいは特定の領域（例えば、コードされるポリペプチドの第１のいくつかのコドン）においてのみ、用いられ得る。異なる実施形態では、特定の宿主についてのコドン最適化は、遺伝子の設計においては考慮されないが、コドンランダム化が用いられる。
【００９７】
代替の実施形態では、このタンパク質をコードする天然に存在する遺伝子のＤＮＡ配列は、合成遺伝子を設計するために用いられる。この実施形態では、天然に存在するＤＮＡ配列は、（例えば、制限部位を除去および導入するために）以下に記載のとおりに改変されて、合成遺伝子の配列が提供される。
【００９８】
本発明の合成遺伝子の設計はまた、遺伝子中の特定の位置に所望の制限部位を含めることおよび遺伝子におけるまたは遺伝子の特定の領域において、所望でない制限部位を除去すること、ならびに遺伝子を作製するために用いられる合成方法との適合性を包含する。しばしば、「所望でない」制限部位（例えば、Ｅｃｏ  ＲＩ部位）は、同じ部位が遺伝子、シントンなどの別の位置において（例えば）独特であることを確実にするために、１つの位置から除去される。これらの考慮事項は、本発明の合成遺伝子の合成および使用において用いられる方法およびツールの説明に従って、より容易に記載され、そして理解される。これらの方法およびツールは、以下の第４節において、部分的に記載され、遺伝子設計のさらなる局面は、第５節において考察される。
【００９９】
（４．遺伝子の合成）
本節は、合成遺伝子の産生のための方法を記載する。上記のとおり、本発明の１つの局面において、合成遺伝子の産生は、２以上の二重鎖ポリヌクレオチド（本明細書では、「シントン」と呼ばれる）を組み合わせ（「編成」）て、より大きなＤＮＡ単位（すなわち、マルチシントン）を生成する工程を包含する。より大きなＤＮＡ単位は、組換えベクター中にクローニング可能な実質的に任意の長さであり得るが、通常、約５００塩基対、約１０００塩基対、約２０００塩基対、約３０００塩基対、約５０００塩基対、約８０００塩基対、または約１００００塩基対という下限、および約５０００塩基対、約１００００塩基対、約２００００塩基対または約５００００塩基対という独立して選択される上限によって束縛された長さを有する（ここで、上限は、下限よりも大きい）。例示の目的のために、以下の考察は一般に、より大きなＤＮＡ単位がＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子の産生を言及する。しかし、本明細書中に記載される方法および材料が、任意の数のポリペプチドセグメントコードヌクレオチド配列（ＮＲＰＳモジュールおよび合成改変体をコードする配列、他のモジュラータンパク質のポリペプチドセグメントをコードする配列、他のタンパク質ファミリーからのポリペプチドセグメントをコードする配列、または目的の任意の機能的ＤＮＡ単位もしくは構造的ＤＮＡ単位が挙げられる）の合成に用いられ得ることが意図される。
【０１００】
本発明によれば、代表的合成ＰＫＳモジュール遺伝子は、約３００ｂｐ〜約７００ｂｐ（より頻繁には約４００ｂｐ〜役６００ｂｐ、通常は約５００ｂｐ）の長さの範囲のシントンを組み合わせることによって産生される。ＰＫＳモジュールの場合、天然に存在するＰＫＳモジュール遺伝子（および対応する合成遺伝子）は、約５０００ｂｐ隣にある。より一般的には、モジュールは、シントンによって産生する。隣接するシントンの間の配列の何らかの重複を可能にすることにより、１０〜１２個の５００ｂｐのシントンが代表的に組み合わされて、天然に存在するモジュールまたはその改変体をコードする５０００ｂｐのモジュール遺伝子が産生される。本発明の種々の局面では、一緒に「縫い合わされる」シントンの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０であり得るか、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０から選択される第１の整数と５、１０、２０、３０または５０から選択される第２の整数とによって決定される範囲であり得る（ここで、第２の整数は、第１の整数よりも大きい）。
【０１０１】
次の節は、シントン産生を記載する。以下の節４．２は、シントンを編成ることによるモジュール遺伝子の合成、ならびに編成に有用なベクターを記載する。
【０１０２】
（４．１  シントンの合成）
シントンは、種々の方法において産生され得る。モジュール遺伝子がいくつかのシントンを組み合わせることによって産生されるのとちょうど同じように、シントンは一般に、いくつかのより短いポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド）を組み合わせることによって産生される。一般に、シントンは、アセンブリＰＣＲ法を用いて産生される。有用なアセンブリＰＣＲストラテジーが公知であり、そして重複する一本鎖ポリヌクレオチドのセットをＰＣＲ増幅して、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを産生することを包含する（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら，１９９５，「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  オリゴｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３；Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら，１９９９，「ＰＣＲ−  ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ＋Ｔ−ｒｉｃｈ  ｍａｌａｒｉａｇｅｎｏｍｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２：１１１３−２０  ；ならびにＨｏｏｖｅｒおよびＬｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２，「ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓ：Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  オリゴｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４３）。あるいは、シントンは、他の方法（例えば、リガーゼベースの方法（例えば、ＣｈａｌｍｅｒおよびＣｕｒｎｏｗ，２００１，「Ｓｃａｌｉｎｇ  Ｕｐ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：２４９−２５２））によって調製され得る。
【０１０３】
シントンのオリゴヌクレオチド成分の配列が、シントンの配列を決定し、最終的にはシントンを用いて作製される合成遺伝子を決定することが読者には明らかである。したがって、オリゴヌクレオチド成分の配列は、以下である：（１）所望のアミノ酸配列をコードする、（２）通常、発現宿主についてのコドン優先度を反映する、（３）合成の間用いられるかまたは合成遺伝子において所望される制限部位を含む、（４）所望されない制限部位が合成遺伝子から除去されるように設計される、（５）合成法（例えば、アセンブリＰＣＲ）と一貫したアニーリング、プライミングおよび他の特徴を有する、ならびに（６）本明細書中に記載される他の設計考慮事項を反映する。
【０１０４】
長さが約５００ｂｐのシントンは、約２５個の４０塩基オリゴヌクレオチド（「４０まー」）のアセンブリ増幅によって便利に調製される。本発明のいくつかの実施形態では、ウラシル含有オリゴヌクレオチドが、シントンの末端（すなわち、シントン隣接領域）に付加されて、連結依存性クローニングを促進する（実施例１を参照のこと）。オリゴヌクレオチド自体は、本明細書中に記載される原理に従って設計され、従来の方法（例えば、ホスホルアミダイト合成）を用いて調製され得、そして／または多数の商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｏｐｅｒｏｎ）から入手され得る。精製されたオリゴヌクレオチドは、シントンアセンブリのために用いられ得るが、ハイスループット法については、オリゴヌクレオチド調製物は通常、脱塩されるが、ゲル精製されない（実施例１を参照のこと）。アセンブリおよび増幅の条件は、変異の導入（配列の誤り）を最小にするように選択される。
【０１０５】
（４．２  モジュール遺伝子の合成（編成））
シントンを組み合わせてモジュール遺伝子を生成するプロセスは、「編成」と呼ばれる。通常、少なくとも３つのシントンが組み合わされ、より頻繁には少なくとも５つのシントンが組み合わされ、そして最も頻繁には少なくとも８つのシントンが組み合わされる。本発明の編成方法は、ハイスループットシステムに適切であり、シントンフラグメントの精製の必要性を回避し、そして他の利点を有する。上記の通り、編成は、ＰＫＳ遺伝子モジュール（約５０００ｂｐ）の合成の文脈において記載されるが、これは、任意の大きな遺伝子の合成のために用いられ得る。例えば、編成は、２以上のＰＫＳモジュール遺伝子を組み合わせて、マルチモジュール遺伝子を調製するために、またはポリヌクレオチド（例えば、プロモーター配列およびＲＮＡコード配列）の種々の他の組み合わせのいずれかを組み合わせるために、用いられ得る。
【０１０６】
編成は、第１のベクターにおける第１のＤＮＡ単位（例えば、第１のシントンまたはマルチシントン）が、第１のベクターとは異なって選択可能である第２のベクターにおいて隣接するＤＮＡ単位（例えば、隣接シントンまたはマルチシントン）と組み合わされるプロセスによって、隣接するＤＮＡ単位（例えば、シントン）を連結することを包含する。２つのベクターの各々は、複製起点を含む（本明細書中で用いられる場合、「ベクター」に対する参照は、複製起点の存在を示す）。隣接するＤＮＡユニット（本明細書中以下、「シントン」）を含む２つのベクターは、時々、「コグネイト対」または「ドナー」ベクターおよび「アクセプター」ベクターと呼ばれる。編成プロセスでは、２つのベクターの各々は、シントン配列において適合性（通常、粘着性）の連結可能な末端を有する（シントンが連結によって接続されるのを可能にする）フラグメント作製するために、そして適合性（通常、粘着性）の連結可能末端をシントン配列の外側に作製するために、制限酵素を用いて設計され、その結果、２つのシントン含有ベクターフラグメントが連結されて、連結されたシントン配列（マルチシントン）を含む新たな選択可能ベクターが作製され得る。以下に詳細に記載される通り、本発明は、合成の間のフラグメント精製工程の必要のない、大きな遺伝子の迅速クローング法を提供する。編成方法は以下に記載され、そして図３、図５および図７に例示される。
【０１０７】
本発明の１つの局面において、連続していくつかのＤＮＡ単位を連結するための方法が提供され、この方法は、
ａ）第１のシントンＳＡ０を含むアクセプターベクターフラグメント、シントンＳＡ０とと隣接するシントンＳＤ０との分岐端にある連結可能な端ＬＡ０、および別の連結可能な端ｌａ０、ならびに、第２のシントンＳＤ０を含むドナーベクターフラグメント、シントンＳＤ０とシントンＳＡ０との分岐端にある別の連結可能な端ＬＤ０（ここで、ＬＤ０およびＬＡ０は、適合性である）、別の連結可能な端ｌｄ０（ここで、ｌｄ０およびｌａ０は適合性である）および、選択可能なマーカーを連結する工程を包含する、第１のステッチラウンドを実行する工程であって、ここで、ＬＡ０およびＬＤ０が連結され、ｌａ０およびｌｄ０が連結され、それによって、第１のシントンと第２のシントンとを連結し、それによって、シントンをコードする配列Ｓ１を含む第１のベクターを作製する、工程；
ｂ）（ａ）において選択可能なマーカーについて選択することによって第１のベクターを選択する工程；ならびに
ｃ）数ｎの追加のステッチラウンドを実行する工程であって、ここで、ｎは、１〜２０の整数であり、Ｓｎは、以前のステッチラウンドにおいてシントンを連結することにより作製されたシントンコード配列であり、そして、ｎ回のステッチの各ラウンドは、以下：１）アクセプターベクターＡｎまたはドナーベクターＤｎのいずれかとして、第１のベクターまたは次のベクターを設計する工程；２）制限酵素でアクセプターベクターＡｎを消化して、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＤｎ＋１００との分岐端における連結可能な端ＬＡｎを含むアクセプターベクターフラグメントを生成する工程；ならびに、アクセプターベクターフラグメントを、シントンＳＤｎ＋１００、シントンＳＤｎ＋１００とシントンＳｎとの分岐端における連結可能な端ＬＤｎ＋１００（ここで、ＬＡｎおよびＬＤｎ＋１００は適合性である）、別の連結可能な端ｌｄｎ＋１００（ここでｌａｎおよびｌｄｎ＋１００は適合性である）、および選択マーカーを含むドナーベクターフラグメントに連結する工程であって、ここで、ＬＡｎおよびＬＤｎ＋１００が連結され、ｌａおよびＩｄｎ＋１００が連結され、これによって、次のベクターを作製する工程か、または、制限酵素でドナーベクターＤｎを消化して、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎおよび隣接するシントンＳＡｎ＋１００の分岐端にある連結可能な端ＬＤｎ、別の連結可能な端ｌｄｎ、および選択可能なマーカーを含むドナーベクターフラグメントを生成する工程；ならびに、ドナーベクターフラグメントを、シントンＳＡｎ＋１００、シントンＳＡｎ＋１００およびシントンＳｎの連結端にある連結可能な端ＬＡｎ＋１００および別の連結可能な端ｌａｎ＋１００を含むアクセプターベクターフラグメントに連結する工程であって、ここで、ＬＡｎ＋１００およびＬＤｎは適合性かつ連結されており、ｌａｎ＋１００およびｌｄｎは適合性かつ連結されており、それによって、次のベクターを作製する、工程
ｄ）工程（ｃ）のドナーベクターフラグメントの選択可能なマーカーを選択することによって、次のベクターを選択する工程
ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）をｎ−１回繰り返し、それによって、マルチシントンを生成する工程
を包含する。
【０１０８】
種々の実施形態において、工程（ｄ）の選択可能なマーカーは、以前のステッチ工程の選択可能なマーカーと同じでなく、そして／または、次のステッチ工程の選択可能なマーカーとも同じでない；ｌａ０、ｌｄ０、ｌａｎ、ｌｄｎは、同じであり、そして／またはＬａ０、Ｌｄ０、ＬａｎおよびＬｄｎは、ＩＩＳ型制限酵素により作製され；シントンＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００およびＳＤｎ＋１００は、合成ＤＮＡであり；シントンＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００またはＳＤｎ＋１００の任意の１つ以上は、マルチシントンであり；ならびに／あるいは、工程（ｅ）のマルチシントン生成物は、ＰＫＳドメインを含むポリペプチドをコードする。
【０１０９】
編成のための２つの関連するアプローチが発明者らによって使用され、各々が、（１）アセンブリベクターにシントンをクローニングする工程、（２）隣接するシントンを連結する工程、および（３）所望の構築物を選択する工程を含む。第１の編成工程は、「方法Ｓ」と呼ばれるが、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位の使用により促進される（上記の通り）。第２の編成アプローチは、「方法Ｒ」と呼ばれるが、従来（ＩＩ型）の制限酵素についての認識部位によって促進される。
【０１１０】
本明細書中に記載される２つの編成アプローチは、連結工程に違いがあるが、アセンブリベクターへのクローニングおよび選択に同じ方法を使用する。これらの工程の各々は、以下に議論される。
【０１１１】
（４．２．１  アセンブリベクターにおけるシントンのクローニング）
用語「アセンブリベクター」は、遺伝子合成の編成工程に使用されるベクターを呼ぶために使用される。本発明の１つの局面において、アセンブリベクターは、シントンがクローニングされ得る（挿入され得る）「シントン挿入部位」すなわち「ＳＩＳ」を有する。ＳＩＳの構造は、使用されるクローニング法に依存する。シントン配列を含むアセンブリベクターは、「ふさがった」アセンブリベクターと呼ばれ得る。シントン配列がクローニングされていないアセンブリベクターは、「空の」アセンブリベクターと呼ばれ得る。
【０１１２】
シントンをクローニングする任意の方法は、ベクターのＳＩＳへのシントンの導入のために使用され得るが、自動化されたハイスループットクローニングについては、連結依存性クローニング（ＬＩＣ）法が好ましい。ＬＣについてのいくつかの方法が知られている；単鎖伸長ベースの方法およびトポイソメラーゼベースの方法が挙げられる（例えば、Ｃｈｅｎら、２００２，「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ−Ｆｒｅｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」ＢｉｏＴｅｃｈ  ３２：５１６−２０；Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎら、１９９２，「Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ」Ａｒｉａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０６：９１−９７；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．によるＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと）。１つのＬＩＣ法は、（ａ）シントンおよび（ｂ）ベクター上で、互いにアニーリングするために十分長い（しばしば１２塩基〜２０塩基）、単鎖の相補的なオーバーハングを作製する工程を包含する。シントンおよびベクターがアニーリングし、宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換されると、閉じた環状プラスミドが高収率で生成される。
【０１１３】
１つの実施形態において、３’オーバーハングまたは「ＬＩＣ伸長」が、ＰＣＲを使用してシントンに導入され、このＰＣＲプライマーは後に部分的に破壊される。この破壊は、ウラシル（Ｕ）残基をＰＣＲプライマーに（チミジンの代わりに）取込むこと、プライマーを上記のアセンブリＰＣＲの生成物の３’末端上に連結すること、そして、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ（ＵＤＧ）で消化することによって達成され得る。ＵＤＧは、糖骨格からウラシル残基を切断し、他の鎖の塩基を自由に、ベクター上の相補鎖と相互作用させる（例えば、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎら、１９９２を参照のこと）。代替的な方法は、穏やかな塩基またはＲＮＡｓｅで切断されるリボヌクレオチドを含有するプライマーを組み込む工程を包含する。
【０１１４】
シントンの端にある配列が、熟練者によって制御され得るので、単一の対のＵＤＧプライマーが、多数の異なるシントンのＬＩＣに使用され得、シントンの自動化され、かつ、ハイスループットなＬＩＣクローニングを可能にする。
【０１１５】
ベクター上に３’オーバーハングを作製するためのいくつかのオプションがまた存在する。上記のように。Ｔの代わりにＵを含有するプライマーを使用して、プラスミド全体を複製し、その後、ＵＤＧで処理することによって生成され得る。あるいは、一方の鎖にＵ’を含有する二重鎖フラグメントが、ベクターに連結され、その後、ＵＤＧで処理され得る。特に有用な方法は、二重鎖ＤＮＡを切断する制限酵素、および、配列特異的ニックエンドヌクレアーゼを用いて、およそ設計されたＳＩＳを消化することによって、ＬＩＣ伸長を生成することである。図１は、例として、ベクターｐＫＯＳ２９３−８８−１からのＵＤＧ−ＬＩＣシントン挿入部位を使用するこの技術を例示する。また、実施例２も参照のこと。ニックの入った、直鎖上のＤＮＡが、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理されて、小さなオリゴヌクレオチドを除去する（エキソヌクレアーゼＩＩＩは、３’→５’で切断し、３’オーバーハングがないことを証明する）。代替的な方法において、ベクター上の３’オーバーハングは、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩの作用によって生成される（実施例２を参照のこと）。「中央」制限部位は、制限エンドヌクレアーゼ、ニックエンドヌクレアーゼによる切断、その後の、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる消化が、相補的な３’オーバーハングを有するフラグメントへのアニーリングに適している３３’オーバーハングを生じるように、位置づけられる。通常、中央制限部位は、ベクター中の単一の固有の部位である。しかし、読者は、制限部位の対または組合せを使用して、同じ結果を達成し得ることを直ぐに理解する。
【０１１６】
代替的な実施形態において、ＳＩＳは、両方の鎖（例えば、従来の「ポリリンカー」）を切断する１つ以上の制限酵素についての他の認識部位を有し得、そして、シントンが、リガーゼ媒介性のクローニングによって挿入され得る。
【０１１７】
（４．２．２  シントンの評価）
大きな遺伝子のライブラリーのハイスループット合成は、多数の合成工程（例えば、オリゴヌクレオチドの合成から開始する工程）を必要とする。首尾よい結果（すなわち、所望の配列を有する遺伝子）の頻度を最大にするために、本発明は、合成プロセス全体にわたって、最適な評価工程を提供する。予測された配列を有するシントンを含むクローンを同定するために（例えば、オリゴヌクレオチド合成、アセンブリＰＣＲおよびＬＩＣの後に）、アセンブリベクターＤＮＡは、通常、いくつか（代表的には５以上）のクローンから単離され、配列決定される。実施例３を参照のこと。シントンサンプルは、所望の配列を有するクローンが見出されるまで、配列決定され得る。あるいは、少数の誤り（例えば、１または２の点変異のみ）を有するクローンが、部位指向型変異誘発（ＳＤＭ）を使用して矯正され得る。ＳＤＭのための１つの方法は、元の遺伝子合成において使用した４０マーのオリゴヌクレオチドを使用する、ＰＣＲベースの部位指向型変異誘発である。
【０１１８】
（４．２．３  方法Ｓ：連結ストラテジー、アセンブリベクターおよび選択スキーム）
上記のように、２つの異なる編成法「方法Ｓ」および「方法Ｒ」が、本発明者らによって使用されている。この節は、方法Ｓを記載する。
【０１１９】
（４．２．３．１  連結ストラテジー）
方法Ｓは、通常シントンのコード配列の外側にある（すなわち、シントンの側方領域）ＩＩＳ型制限酵素の認識部位（上記の通り）の使用を必要とする。方法Ｓにおいて、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位は、（例えば、アセンブリＰＣＲの間に）シントン側方領域内に導入され得る。この部位は、対応する制限酵素が、シントンコード領域における切断と、連結可能な端の生成を生じるように位置付けられる。例示の目的であり、制限はされないが、これは、以下に図解される（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位であり、Ｒ２およびＲ３での消化により、適合性の突出末端［（同じ長さおよび方向）オーバーハング］を生じる、ｖｗｗｗｗはアセンブリベクター領域であり、ｓｓｓｓｓｓｓｓは、シントンコード領域であり、ｓは、２つのシントンで同じ配列であり、ｏｏｏは、シントン側方領域である）。
【０１２０】
【化１】
2006517090.tif 000004
【０１２１】
この方法の１つの実施形態において、Ｒ１とＲ３が同じであり、Ｒ２とＲ３が同じである。このアプローチは、使用されるベクターの設計および編成プロセスを単純化する。代替的な実施形態において、ＩＩＳ型認識部位は、側方領域ではなく、シントンコード領域内に存在し得、提供される部位は、コード領域のコドン要件と一貫して導入され得る。
【０１２２】
２つのシントンにおいて同じ配列（「ｓ」）は通常、少なくとも３塩基対を含み、しばしば、少なくとも４塩基対を含む。１つの実施形態において、配列は、５’−ＧＡＴＣ−３’である。表２は、例示的なＩＩＳ型制限酵素および認識部位を示す。図２は、酵素としてＢｂｓＩおよびＢｓａＩをい使用する方法Ｓの連結方法を例示する。
【０１２３】
【表２】
2006517090.tif 000005
【０１２４】
（４．２．３．２  アセンブリベクター）
図３は、上記の連結方法が、選択ストラテジーとどのようにして組み合わされて、効率的に一連の隣接するシントンを連結するかを例示する。この実施形態において、隣接するシントン（または隣接するマルチシントン）の対が、同系対のベクターのＳＩＳ部位にクローニングされ、ここで、これらの対の２つのメンバーが、差次的に検出可能である。これらの選択ストラテジーは、次の節（４．３．２．３）により詳細に議論される。この節においては、編成において使用され得る例示的な同系ベクター対、ならびに、編成プロセスの間に作製される特定の中間体（ふさがったアセンブリベクター）を記載する。
【０１２５】
（ベクター対Ｉ）
１つの実施形態において、編成ベクターは、ｉ）シントン挿入部位（ＳＩＳ）；ｉｉ）両方のベクターに共通する、あるいは、各ベクターにおいて異なるが、適合性末端を生じる「右」制限部位（ＲＩ）；ｉｉｉ）各ベクターにおいて異なる第１の選択マーカー（ＳＭ２またはＳＭ３）；ｉｖ）各ベクターにおいて異なる第２の選択マーカー（ＳＭ４またはＳＭ５）；およびｖ）必要に応じて、両方のベクターに共通する第３の選択マーカー（ＳＭ１）を有する。ここで使用される慣習は、ＳＭ２とＳＭ４が対の第１のベクター上にあり、ＳＭ３とＳＭ５が対の第２のベクター上にあり、ＳＭ２〜５は、全て異なる。
【０１２６】
これらの要素の空間的配置は、以下であり得る：
（ＳＭ２またはＳＭ３）−ＳＩＳ−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ１  ［Ｉ］
ベクターＩにおいて、右の制限部位は、通常、ベクター中の固有の部位である。１つ以上の部位が存在する場合、さらなる部位は、さらなるコピーが、以下に記載し、図３Ａに例示するストラテジーに干渉しないように位置付けられる。［例えば、アクセプターベクターにおいて、Ｒ１部位は、固有であり得るか、または、固有でない場合、ＳＩＳ（またはシントン）、ＳＭ２／ＳＭ３部位を含有するベクターの部分が存在せず、ＳＩＳ（または、シントンの連結端）およびＲ１部位（すなわち、連結可能な端を生じるように切断されるＲ１）により境界を定められ得る。ドナーベクターにおいて、Ｒ１部位は、固有であり得るか、または、固有でない場合、ＳＩＳ（またはシントン）およびＳＭ４／ＳＭ５部位を含有するベクターの部分が存在せず、ＳＩＳ（またはシントンの連結端）およびＲ１部位（例えば、連結可能な端を生じるように切断されるＲ１）によって境界を定められ得る。
【０１２７】
Ｒ１部位は、連結可能な端（例えば、通常は突出末端）を形成する、任意のＩＩ型制限酵素についての認識部位であり得る。通常の認識配列は、少なくとも５ｂｐであり、しばしば、少なくとも６ｂｐである。１つの実施形態において、右の制限部位は、ＳＩＳの約１ｋｂ下流である。本発明の１つの実施形態において、ドナーベクターおよびアクセプターベクターのＲ１部位は、同じではないが、各々が、制限酵素によって切断されると、単純に適合性の突出末端を生じる。
【０１２８】
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＳは、部位特異的なニック挿入エンドヌクレアーゼによって認識される１対のニック挿入部位（通常は、同じエンドヌクレアーゼは両方のニック挿入部位を認識する）を有し、ニック挿入部位の間に位置付けられる配列、ならびに、制限ヌクレアーゼによって認識される制限部位（ニックが挿入されたＳＩＳを直鎖化し、これは上記のＬＩＣストラテジーに一致する）を有する、ＬＩＣに適切な部位である。１つの実施形態において、ニック挿入エンドヌクレアーゼは、Ｎ．ＢｂｖＣＩＡであり、これは、以下の配列を認識する（
【０１２９】
【化１−１】
2006517090.tif 000006
【０１３０】
＝ニック挿入部位）：
【０１３１】
【化２】
2006517090.tif 000007
【０１３２】
従って、１つの実施形態において、ベクター対Ｉベクターは、以下の構造を有し、ここで、Ｎ１およびＮ２は、ニック挿入酵素（通常は同じ酵素）についての認識部位であり、Ｒ２は、上記のようなＳＩＳ制限部位であり、そして、Ｒ１およびＳＭ１〜５は、上記の通りである。例えば、
（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ１    ［ＩＩ］
本発明の１つの実施形態において、ベクター対Ｉベクターは、シントンにより「ふさがれ」、以下の構造を有し、ここで、２つのＳ１および２つのＳ２は、ＩＩＳ型制限酵素についての認識部位であり、Ｓｙは、シントンコード領域であり、そして、Ｒ１およびＳＭ１〜５は、上記の通りである。例えば、
（ＳＭ２またはＳＭ３）−２Ｓ１−Ｓｙ−２Ｓ２−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ１    ［ＩＩＩ］
これは、編成のための有用な中間体構築物である。
【０１３３】
（ベクター対ＩＩ）
ベクター対ＩＩは、対において各ベクター上に１つのみの固有の選択可能なマーカーを必要とする（すなわち、ＳＭは１つのベクター上で見出されるが、他方では見出されない）が、さらなる選択可能なマーカーが必要に応じて含められ得る。１つの実施形態において、編成ベクターは、以下を有する：
ｉ）シントン挿入部位（ＳＩＳ）；
ｉｉ）ベクターＩについて上記のような「右の」制限部位（Ｒ１）（通常は、両方のベクターに共通する）；
ｉｉｉ）同じであっても異なっていてもよい、各ベクター上の「左の」制限部位（ＬまたはＬ’）；
ｉｖ）各ベクターで異なる、第１の選択マーカー（ＳＭ２またはＳＭ３）
ｖｉ）各ベクターで異なる、必要に応じた第２の選択マーカー（ＳＭ４またはＳＭ５）；ならびに
ｖｉ）両方のベクターに共通する、必要に応じた第３の選択マーカー（ＳＭ１）。
【０１３４】
これらの構成要素の空間的配置は、
（ＳＭ４またはＳＭ５）−（ＬまたはＬ’）−ＳＩＳ−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［ＩＶ］
であり得る。
【０１３５】
この実施形態において、右の制限部位（Ｒ１）および左の制限部位（ＬまたはＬ’）は、通常、ベクターにおける固有の部位である。これらが固有でない場合、以下に記載され、図３Ｂにおいて例示されるストラテジーと干渉しないように、さらなる部位が位置付けられる。任意のＩＩ型制限酵素についての認識部位が使用され得るが、代表的には、この認識配列は、少なくとも５ｂｐであり、しばしば、６ｂｐである。１つの実施形態において、右の制限部位は、ＳＩＳの約１ｋｂ下流である。
【０１３６】
ベクターはまた、宿主細胞におけるベクター機能に必要とされるか、または、ベクターの維持に有用な従来の要素を含む（例えば、ベクターは、１つ以上の複製起源、転写制御配列および／または翻訳制御配列（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）ならびに他の要素を含み得る）。
【０１３７】
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＳは、ベクター対Ｉの説明において上記のような部位特異的ニック挿入エンドヌクレアーゼにより認識される１対のニック挿入部位を備える配列を有するＬＩＣに適切な部位である。従って、１つの実施形態において、ベクター対ＩＩは、以下の構造を有し、ここで、Ｎ１およびＮ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｌ’ならびにＳＭ２および３およびＳＭ１〜５は、上記の通りである。例えば、
（ＬまたはＬ’）−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［Ｖ］。
【０１３８】
本発明の１つの実施形態において、ベクター対ＩＩは、ＳＩＳ部位においてクローニングされたシントンを含み、以下の構造を有し、ここで、２つのＳ１および２つのＳ２、Ｓｙ、Ｒ１、Ｌ、Ｌ’、ＳＭ２および３は、上記の通りである。例えば、
（ＬまたはＬ’）−２Ｓ１−Ｓｙ−２Ｓ２−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［ＶＩ］
図４は、例示的な編成ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２およびｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６の模式図である。
【０１３９】
（４．２．３．３  選択スキーム：２選択マーカースキーム）
示されるように、図３は、上に示される結合方法が、いかにして選択ストラテジーと組み合わされて、一連の隣接するシントン（または他のＤＮＡ単位）を効率的に連結し得るかを例示する。ベクター対Ｉを使用して（図３Ａ）、隣接するシントンがクローニングされている対のベクターは、Ｒ１（例えばＸｈｏＩ）および２つのＳ１または２つのＳ２（結合末端に最も近い部位）のいずれかで消化され、生成物が連結される。こうして、第１のシントンを含有するベクター（アクセプターベクター）が、３’−シントン末端および３’シントン末端の下流にあるＲ１に制限される。第２の３’隣接シントンを含有するベクター（ドナーベクター）は、５’シントン末端およびＲ１に制限される。得られた生成物を連結して、２つのシントンを含有するベクターを再構築し、抗生物質抵抗性マーカーＳＭ２およびＳＭ５によって選択する。ドナープラスミドおよびアクセプタープラスミドの両方に由来する固有の選択マーカーを有する陽性クローンについて選択することによって、正しいクローンのみが、２つのマーカーを有する。
【０１４０】
平行反応を実行することによって、４つの２シントンベクターを同時に調製して、４つの２シントンベクターを調製する。続いて、同じアプローチを用いて、４つの２シントンフラグメントを編成して、２つの４シントンフラグメントを作製し、次いで、２つの４シントンフラグメントを一緒に編成して、１つの８シントン生成物を作製する。例示のために、ベクター対は各々２つの固有のＳＭｓ（ＳＭ２、ＳＭ４およびＳＭ３、ＳＭ５）を有するものとする。配列Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３−Ｓ４−Ｓ５−Ｓ６−Ｓ７−Ｓ８（Ｓ１〜８がシントンである）の仮想８シントンモジュールを作製するために、表３にまとめるように、シントン１、４、６および７がＳＭ２＋ＳＭ４マーカーを有するベクター中にクローニングされ、シントン２、３、５および８がＳＭ３＋ＳＭ５マーカーを有するベクター中にクローニングされ得る。
【０１４１】
【表３】
2006517090.tif 000008
【０１４２】
１は、シントンがクローンにングされたベクターの特有のマーカーを示す。
【０１４３】
２は、シントンが組み合わされた後に選択するためのマーカーを示す。
【０１４４】
同じ手順がシントン３を含有するベクター（ＳＭ３、ＳＭ５）およびシントン４を含有するベクター（ＳＭ２、ＳＭ４）の２つのベクターに適用される。これは、ＳＭ３およびＳＭ４を含有する２シントンベクターを生じ、これらのマーカーについて選択可能である。続いて、シントン３および４を含有する２シントンインサートを、シントン１および２を含有する第１の２シントン中にクローニングして、ＳＭ２＋ＳＭ４ベクター内に４シントン生成物（１−２−３−４）を生じる。これは、シントン５、６、７および８を用いて繰り返され得、ＳＭ３＋ＳＭ５ベクター中に４シントンインサート（５−６−７−８）を生じる。この２つが、次いで、前記のように合わせられて、ＳＭ３ベクター内に８シントンモジュールを生じる。
【０１４５】
モジュールが、２ｎシントンを含むように設計することによって、そして、平行してシントン編成反応を進めることによって、完全なモジュールが、ｎ回の操作で構築され得ることが理解され得る。
【０１４６】
１対を組み合せる工程は、連結工程を最小限にし、従って、特に効率的にするが、方法Ｒについて図７に例示されるような他の組合せストラテジーが使用され得る。
【０１４７】
広範種々の選択マーカーおよび選択方法が、分子生物学において公知であり、選択に使用され得る。代表的には、マーカーは、ｃａｒｂ（カルベニシリン耐性）、ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）、ｋａｎ（カナマイシン耐性）、ｓｔｒｅｐ（ストレプトマイシン耐性）またはｃｍ（クロラムフェニコール耐性）のような薬剤耐性遺伝子である。他の適切な選択マーカーとしては、対抗選択可能なマーカー（ｃｓｍ）（例えば、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ａｒａＢ（リブロース感受性）およびｔｅｔＡＲ（テトラサイクリン耐性／フザリン酸過感受性をコードする））が挙げられる。多くの他の選択可能なマーカーが、当該分野で公知であり、かつ、使用され得る。
【０１４８】
（他のマーカースキーム）
代替的な選択ストラテジーは、ベクター対ＩＩを使用する。このストラテジーに従って、各ラウンドにおいて、２つのベクターが等量で混合され、結合されるべき２つのシントンの末端における制限部位に対応する、制限酵素Ｒ１、Ｌ（またはＬ’）およびＩＩＳ型酵素を用いて、同時に完全に消化され、その後連結される。図３Ｂにおいて、シントン１＋ＳＭ２を含有するベクターは、シントンの右端およびＲ１で切断され、シントン２＋ＳＭ３を含有するベクターは、シントンの左端およびＲ１およびＬ’で切断される。Ｌ’における切断は、このフラグメントの再連結を防止することが意図される。フラグメントの混合物は、連結され、形質転換され、そして、抗生物質上で細胞を増殖して、ＳＭ１およびＳＭ４について選択する。これらの選択条件下で、優性のクローンが、所望の２シントン生成物である。
【０１４９】
表３は、ベクター対ＩＩを使用して、配列１−２−３−４−５−６−７−８の仮想８シントンモジュールを編成するための選択スキームを示す。表４にまとめるように、シントン１、４、６および７が、ＳＭ２マーカーを有するベクター中にクローニングされ得、シントン２、３、５および８が、ＳＭ３マーカーを有するベクター中にクローングされ得る。
【０１５０】
【表４】
2006517090.tif 000009
【０１５１】
（４．２．４  方法Ｒ：アセンブリベクター、結合ストラテジーおよび選択スキーム）
（４．２．４．１  結合ストラテジー）
方法Ｒは、シントンのコード配列の端にあるＩＩ型制限酵素についての認識部位の使用を必要とする。隣接するシントンの端にある適合性（例えば、同一）の制限部位が切断され、一緒に連結される。例示の目的で、限定する意図はないが、これが、以下に模式化される（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は異なるＩＩ型制限酵素についての認識部位であり、ｗｗｗｖは、アセンブリベクター領域であり、ｓｓｓｓｓｓｓｓはシントンコード領域であり、ｏｏｏは、シントン側方領域である）。
【０１５２】
【化２Ａ】
2006517090.tif 000010
【０１５３】
ＳＭ２またはＳＭ３を有する特定のシントンの会合（モジュール内のその位置に依存する）およびシントンにおける制限部位の選択の両方が重要である。上記のように、シントンは、シントンの左右の端の両方に有用な制限部位を有するように設計され、これらの部位は、隣接するシントンの末端が共通（または適合性）の制限部位を共有するように選択される。例えば、配列１、２、３、４、５、６、７および８を含むシントンの編成によって、配列１−２−３−４−５−６−７−８を有するモジュールを調製するために、隣接するシントンの端は、以下のように共通の部位Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを共有し得る：Ａ−１−Ｂ、Ｂ−２−Ｃ、Ｃ−３−Ｄ、Ｄ−４−Ｅ、Ｅ−５−Ｆ、Ｆ−６−Ｇ、Ｇ−７−Ｈ、Ｈ−８−Ｘ。図５を参照のこと。
【０１５４】
この方法についての基本は、シントンの末端に固有の制限部位を含むシントン（および構成オリゴヌクレオチド）の設計である。このことは、（シントンの末端における）有用な制限部位の存在（挿入）およびシントンの内側におけるこれらの部位の不在（除去）の両方を必要とする。実施例４は、モジュールアミノ酸配列における破壊的な変化を生じることなく、シントンおよびモジュールにおいて操作され得る有用な制限部位を同定するためのストラテジーを記載し、１４０ＰＫＳモジュールの分析から得られる例示的な結果を提供する（図６および表８〜１２を参照のこと）。以下の５節は、所望のパターンの制限部位を有するシントンを生成するために使用され得るオリゴヌクレオチドの設計のための、コンピュータ実行可能なアルゴリズムを記載する。
【０１５５】
（４．２．４．２  アセンブリベクター）
方法Ｒは、方法Ｓについて有用なものと同じベクター対を使用して実行され得る。方法Ｒを使用して、ベクター対Ｉベクターは、ＳＩＳ部位にクローニングされたシントンを含み、以下の構造を有し得る（ここで、Ｒ３およびＲ４は、シントンの末端にある制限部位であり、他の略語は、以前に記載された通りである）：
−（ＳＭ４またはＳＭ５）−Ｒ３−Ｓｙ−Ｒ４−（ＳＭ２またはＳＭ３）−Ｒ１  ［ＶＩＩ］。
これは、編成に有用な中間体構築物である。
【０１５６】
（４．２．４．３  選択スキーム）
方法Ｓについて記載された選択スキームが、方法Ｒについて使用され得る。シントンの末端にある制限部位が、ベクターの制限部位ＬおよびＬ’における消化と適合性でるように設計されなければならないことが理解される。
【０１５７】
（５．遺伝子設計およびＧＥＭＳ（遺伝子モーフィングシステム）アルゴリズム）
本発明の合成遺伝子の設計、ならびに、遺伝子合成に使用され得るオリゴヌクレオチドの設計は、多数の因子を同時に考慮することを必要とする。例えば、本発明の合成モジュール遺伝子は、所望のアミノ酸配列および／または活性を有するポリペプチドをコードし、代表的には、
・特定の発現宿主のコドン嗜好（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を使用し、
・編成方法と矛盾する制限部位を含まず（例えば、編成法Ｓにおいて使用されるＩＩＳ型部位）、そして／または、編成方法と矛盾する制限部位を含まないシントンから構成され（例えば、編成方法Ｒにおいて使用されるＩＩ型部位）、そして／または、（以下に記載されるように）オープンリーディングフレームおよび遺伝子ライブラリーの構築と矛盾する制限部位を含まず、
・特定の位置（例えば、ドメイン末端、シントン末端、モジュール境界およびシントン内をコードする領域）において、有用な（例えば、固有の）制限部位または配列モチーフを含む。限定はされないが、シントン内の制限部位は、遺伝子合成または大きな遺伝子の他の修飾における誤りを校正するために使用される；シントン末端にある制限部位および／または配列モチーフは、ＬＩＣクローニング（例えば、ＵＤＧ−リンカーの付加）、編成に使用される；ドメイン末端にある制限部位は、ドメイン「交換」に使用され、モジュール末端にある制限部位は、モジュール遺伝子をベクター内にクローニングし、多モジュール遺伝子を合成するために使用される。これらの部位を多数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子に組み込むことによって、「モジュール」は、ベクターの共通セット内に容易にクローニングされ得、ドメイン（またはドメインの組合せ）がモジュール間に容易に移動され得、そして、他の遺伝子改変がなされ得る。
【０１５８】
大きな遺伝子の合成設計の間に遭遇する問題としては、宿主生物についての効果的なコドン最適化、タンパク質配列に影響を及ぼさない制限部位挿入および排除、ならびに、合成のための高品質なオリゴヌクレオチド成分の設計が挙げられる。
【０１５９】
合成遺伝子（ならびに構成シントンおよびオリゴヌクレオチド）の設計のためのコンピュータ実行可能なアルゴリズムは、この節に記載される。遺伝子モーフィングシステム（「ＧｅＭＳ」）は、遺伝子設計プロセスを単純化することを目的とする。
【０１６０】
（５．１  ＧｅＭＳ−概要）
ＧｅＭＳプロセスは、最初にＰＫＳ遺伝子を設計するために開発され、以下に記載される。このプロセスは、任意の遺伝子の設計のための構成要素を含む。簡便にするために、ＧｅＭＳプロセスは、特定のポリペプチドセグメントをコードする遺伝子を参照して記載される。ポリペプチドセグメントは、完全なタンパク質、構造的または機能的に規定されたフラグメント（例えば、モジュールまたはドメイン）、特定のシントンのシントンコード領域によってコードされるセグメント、または、目的のポリペプチドの任意の他の有用なセグメントであり得る。
【０１６１】
任意の遺伝子の設計に適用可能なＧｅＭＳプロセスは、一般的に、以下の特徴のうちのいくつかを有する：（ｉ）制限部位予測アルゴリズム；（ｉｉ）宿主生物ベースのコドン最適化；（ｉｉｉ）制限部位の自動アサインメント；（ｉｖ）入力としてＤＮＡまたはタンパク質配列を受容する能力；（ｖ）オリゴヌクレオチド設計および試験アルゴリズム；（ｖｉ）ロボットシステムのための入力生成；および（ｖｉｉ）オリゴヌクレオチドの展開表の生成。
【０１６２】
ＧｅＭＳは、いくつかの工程を実行して、インビトロ会合のために合成遺伝子を構築し、オリゴヌクレオチドを生成する。これらの工程の各々は、全体のプログラム実行パイプラインに密接に関連している。このことは、遺伝子設計が図８に示されるような高スループットなプロセスで行われることを可能にする。
【０１６３】
簡単に述べると、ＧｅＭＳプロセスは、（ｉ）参照ポリペプチドのアミノ酸配列、および（ｉｉ）制限部位または所望の配列モチーフの位置決めまたは同定のためのパラメータ、に関する入力８００で開始する。１つの実施形態において、参照ポリペプチドのＤＮＡ配列が入力され、そして対応するアミノ酸配列に翻訳される。アミノ酸／ＤＮＡ配列は、公然に利用可能なデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から入力されるが、１つの実施形態において、その配列は、ＧｅＭＳプロセスへの入力の前に、精度について（独立配列によって）検証される。図８の実施例において、本発明に従うＧｅＭＳプロセスは、第１の一連の工程８１０を包含し、ここで、アミノ酸配列は、対応するヌクレオチド配列を生成するための参照として使用され、このヌクレオチド配列は、参照ポリペプチドをコードする（「逆転写」）。第１の一連の工程におけるさらなるプロセスは、コドン無作為化を包含し、ここで、追加のヌクレオチド（これらは同一の（または類似の）アミノ酸をコードする）が、配列のある位置での各アミノ酸についての縮重コドンのランダム選択を使用して、参照ポリペプチドとして生成される。このプロセスは、必要に応じて、コドン利用について宿主発現生物の公知のバイアスに基づく、コドン使用の最適化を包含する。このソフトウェアによって生成されたコドン無作為化ＤＮＡ配列は、特定の位置での制限部位の導入についてさらに処理され、そしてその後の工程における部位の望ましくない発生が除去される。
【０１６４】
一連の工程８２０および８３０は、制限部位の選択および配列におけるそれらの位置の同定に応じた、制限部位の除去および挿入を包含する。１つの実施形態において、このプロセスは、ＧｅＭＳ制限部位予測アルゴリズムを使用して、配列におけるすべての可能性を有する制限部位を予測する。使用者が入力する予め決められたパラメータと内部決定との組み合わせに基づいて、アルゴリズムは、最適に位置決めされた（または空間をあけられた）制限部位を示唆し、この制限部位は、核酸配列中に導入され得る。これらの部位は、位置および空間に基づいて、（完全遺伝子、または遺伝子の部分内で）固有または有用であり得る（例えば、方法Ｒを使用するシントン編成に有用な部位、これは固有である必要はない）。別の実施形態において、使用者は、配列における好ましい制限部位の位置を入力する。
【０１６５】
一連の工程８２０において、ＧｅＭＳソフトウェアは、制限部位の発生を望まれない位置から除去する。このプロセスは、配列における特定の制限部位の構造を維持する。除去の後、第３の一連の工程８３０が、配列における特定の位置で、選択された制限部位を挿入する。次いで、ヌクレオチド配列は、一連の重複オリゴヌクレオチドに分けられ、この重複オリゴヌクレオチドは、インビトロでの一連のシントンへの会合のために合成され、このシントンは、次いで、一緒に編成されて最終的な合成遺伝子を含む。工程８４０およびシントンにおけるオリゴヌクレオチドの設計は、以下でより詳細に議論される多数の基準によって導かれる。設計の後、オリゴヌクレオチド配列は、工程８４０において、基準を満たす能力について試験される。ＧｅＭＳのストリンジェントな特性試験を通過するためのオリゴまたはシントンの失敗の事例において、完全遺伝子配列は、再び最適化されて、固有の新しい配列を生成し、この配列は種々の設計段階に供される。
【０１６６】
成功した設計は、工程８５０において、参照ポリペプチドのアミノ酸配列、制限部位誤りおよび突然変異に対する配列整合性を検証することによって確認される。このソフトウェアはまた、オリゴヌクレオチドの展開表を生成し、このオリゴヌクレオチドは、商業的な指示および自動システムへの入力として使用され得る形式である。
【０１６７】
ＧｅＭＳソフトウェアによるシントン設計のための全体のスキームは、図９の流れ図に示される。ＧｅＭＳソフトウェアに対する入力９１０としては、参照ポリペプチドセグメントのアミノ酸配列（またはポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ配列、一般に天然に存在する遺伝子の配列）を含むファイル（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ派生情報）が挙げられる。ＤＮＡ配列が、ＧｅＭＳへの入力である場合、対応するアミノ酸配列へのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳が実行される。入力は、必要に応じて、合成遺伝子の発現についての適切な宿主生物の同定、およびそのコドン使用についての優先傾向を含む。入力は、必要に応じて、（例えば、モジュール／ドメイン／シントン端で）遺伝子のヌクレオチド配列中に取り込まれることが望まれる注釈付きの制限部位または他の配列モチーフに関する１以上のリスト、および遺伝子から除去されかまたは排除されるべき注釈付きの制限部位（例えば、編成で使用されるＩＩＳ型酵素用の制限部位）を含み得る。使用者は、シントンサイズの利用可能範囲（代表的には、約３００塩基対〜約７００塩基対）、シントンの数（例えば、２ｎ、ここで、ｎ＝２〜５）、およびシントン側面配列（例えば、連結依存性のクローニング（例えば、「一般的な」ＵＤＧプライマーのアニーリング）に有用な配列）を入力し得る。
【０１６８】
工程９２０において、参照ポリペプチドセグメントのアミノ酸配列は、無作為に選択されたコドン（例えば、実質的に同一のタンパク質についてコードする（すなわち、対応する位置で同一または類似のアミノ酸についてコードする）第２のＤＮＡ配列）を使用して、ＤＮＡ配列に変換（逆転写）される。１つの実施形態において、コドンの無作為選択は、選択された宿主生物のコドン優先傾向を反映する。１つの実施形態において、コドン最適化および無作為化は省略され、そしてデータベースに由来するＤＮＡ配列が、その後の工程で直接処理される。コドン無作為化および最適化プロセスは、図１０Ａおよび１０Ｂ、ならびに添付の書類により詳細に記載される。
【０１６９】
１つの実施形態において、予め選択された制限部位およびそれらの位置が、工程９３０に入力される。次いで、工程９３２において、ＧｅＭＳプログラムが、指定された部位の挿入についての位置を同定し、そして特定の制限部位の望まれない発生が除去されるべき位置を同定する。以下の工程に従う別の実施形態において、制限部位の位置についての１以上のパラメータおよびその部位の指定された特性が、工程９３４に入力される。ＧｅＭＳは、工程９３６において、その配列内で可能性のあるすべての制限部位を同定する。プログラムはまた、工程９３６において、予め決められたパラメータ（例えば、空間、制限部位、型など）に従う固有の一連の制限部位を示唆する。１つの実施形態において、示唆された範囲は、シントンフラグメント境界内またはシントンフラグメント境界に隣接するそれらの存在について選択される。（上記の設計原則に基づく）モジュール、ドメイン末端、シントン連結部およびそれらの位置についての一般的な固有の制限部位または関連する規定配列が、工程９３６におけるプログラムによって同定される。使用者は、工程９３８において、示唆された制限部位および位置を受容するかまたは拒絶する。１つの実施形態において、使用者は、提案された制限部位を手動で入力し得る。
【０１７０】
工程９４０において、特定の位置（例えば、エッジ）での制限部位の一義性が、配列におけるこれらの部位の望ましくないすべての発生を除去することによって維持される。特定の位置で選択されたコドンは、同一の（または類似の）アミノ酸を指定する代替のコドンで置換されて、所望でない制限部位が除去される。
【０１７１】
この工程の後には、特定の位置での選択されたコドンの挿入が続き、工程９５０において制限部位が作製される。１つの実施形態において、使用者は、さらなる部位を含む余地および／またはＤＮＡ配列から特定の部位を削除する余地を保持する。
【０１７２】
制限部位の除去および挿入に従って生成されたＤＮＡ配列は、次いで、工程９６０において、予め決められたサイズおよび数を有するシントンコード領域のフラグメントに分割される。シントン側面配列は、ＬＩＣプライマー、制限部位または他のモチーフの追加についての配列モチーフに関する各々のシントン配列追加の決定に対して追加される。
【０１７３】
１つの実施形態において、特定のシントン内部位が、ＤＮＡ配列中に導入され、これはシントン内で固有である。これらは、シントン内で修復のために使用されるかまたは突然変異誘発のために使用される。各々のシントン配列は、工程９７０において、その２つの隣接尾ロゴヌクレオチドと特定の量の重複を有する、特定の長さの重複オリゴヌクレオチドとして生成される。いくつかの因子が、オリゴヌクレオチドの長さおよび重複の長さの決定に入る（例えば、合成効率、アニーリング条件、異常なプライミングなど）。オリゴヌクレオチドの長さは、約１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドであり得る。重複の長さは、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、または５０ヌクレオチドであり得る。重複の長さは、正確ではあり得ず、そして隣接するシントンを含むいくつかのオリゴヌクレオチド間で１、２、３、４または５の改変体が利用可能である。１つの実施形態において、各々のシントンは、隣接するオリゴヌクレオチド間で約２０塩基の重複を有する、重複４０マーのオリゴヌクレオチドとして設計される。重複は、一連のオリゴヌクレオチドにわたって、１７ヌクレオチドと２３ヌクレオチドとの間で変化し得る。同一のアニーリング温度に基づくこれらのオリゴヌクレオチドを設計するための選択肢もまた、利用可能である。
【０１７４】
以下で詳細に議論さるように、シントン（シントンコード領域およびシントン側面配列）の合成に使用される各々の一連のオリゴヌクレオチドは、工程９８０において１以上の特性試験に供され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー特異性に関する１以上の基準（増幅を妨げる二次構造の欠如、および参照配列に関する忠実性が挙げられる）の下で試験される。以下で議論されるように、確認はまた、会合された遺伝子についても行われる。
【０１７５】
任意の失敗が、工程９８２において、使用者が選択する２つの方針の選択を引き起こす：１）ランダムコドン生成プロトコル９８４の繰り返しならびにコドン除去９４０およびコドン挿入９５０からのプロセスの継続；および／または２）工程９８４において、問題のある領域中の予め決められたパラメータにより良く適合させるための、配列の手動調節。プロセスは、試験を通過していない特定のシントンについて（コドン最適化および無作為化工程９２０で始まり）繰り返されても、完全ポリペプチドセグメント配列について新規に行われてもよい。このプロセスによって生成される候補オリゴヌクレオチド配列は、再度、順に試験される。１０〜１２のシントン配列についての完全なオリゴヌクレオチドの組が、首尾良く生成され、完全な候補モジュール配列が、個々のシントンの再設計を誘発する可能性と共に、望まれる任意の方法（繰り返しなど）で検査され得る。必要に応じて、重複領域が除去されるが、ランダム選択手順は、起こりそうもない実質的な繰り返しの発生を起こす。必要に応じて、このソフトウェアはまた、配列を編集して、希少なコドンに関する集まった位置決めを除去する。各々の再設計が、ランダムなコドンの組を使用するので、シントンフラグメントは、相対的に少ない反復でこれらの試験を通過する。
【０１７６】
一旦、すべてのフラグメントが試験を通過すると、ＧｅＭＳは、フラグメントを予め決められた順序で再会合し、そして元々の入力配列との比較によって制限部位およびＤＮＡ配列を確認する。この完全性検査は、標的配列が意図された設計と一致し、そして望まれない部位が最終的なＤＮＡ配列に存在しないことを保証する。図９の方法の実施は、各々のフラグメントについてのオリゴヌクレオチドが、各々のシントンを表す別個のファイルに保存されるか、または合成遺伝子を表す完全な組として保存されることを可能にする。このソフトウェアはまた、工程９８６においてオリゴヌクレオチドの展開表を生成し得、これは、市販の順番で、自動システムのロボットに対する入力として使用され得る形式である。自動システムに対して入力される展開表としては、以下があげられ得る：（ａ）オリゴヌクレオチド位置（例えば、９６ウェルプレートのバーコード数およびプレート上のウェル位置のような帰属）；（ｂ）オリゴヌクレオチドの名前または称号；（ｃ）オリゴヌクレオチドを用いて合成されたモジュールの名前または称号；（ｄ）オリゴヌクレオチドを用いて合成されたシントンの帰属（ＰＣＲ会合用にプールされるべきオリゴヌクレオチドの識別）；（ｅ）モジュール内のシントンの数；（ｆ）シントン内のオリゴヌクレオチドの数；（ｇ）オリゴヌクレオチドの長さ；（ｈ）オリゴヌクレオチドの配列。使用者相互作用を伴う完全遺伝子設計プロセスは、数分で達成され得る。ＧｅＭＳは、高スループットなパイプライン構造を使用して、端末間統合を達成する。１つの実施形態において、ＧｅＭＳは、ウェブブラウザプログラムを通して実装され、グラフィックインタフェースを備える。
【０１７７】
設計プロセスを誘導するための少なくとも１組の規則が、システムのメモリーに入力され保存される。設計ソフトウェアは、一連の別個かつ独立に作動可能なルーチンを用いて作動し、このルーチンは、設計システムにおける別個の工程を処理し、１以上のサブルーチンからなる。
【０１７８】
これらの機能は、以下に詳細に記載される。首尾良い設計は、配列完全性、制限部位誤りおよびサイレント変異について再検査される。
【０１７９】
（５．２  ＧｅＭＳアルゴリズム）
本発明に従う方法は、以下のサブルーチンのうち１以上を実行し得るアルゴリズムを包含する。
【０１８０】
（１．コドン無作為化および最適化）  ＧｅＭＳは、コドン無作為化および最適化サブルーチンを使用し、これは、図１０Ａおよび１０Ｂに示される概略図である。１つの実施形態において、最適化−無作為化プログラムは、コドンの手動選択または天然のヌクレオチド配列の受容によって回避され得る。
【０１８１】
図１０Ａの概略図に示されるコドン最適化プロセスは、選択された宿主生物のコドン優先傾向データベース１０１２からの様々なアミノ酸に関する宿主コドン頻度（Ｆａａ＝頻度／１０００コドン）の入力１０１０で開始する。次いで、各々のコドンについてのコドン優先傾向（Ｎ）が、工程１０１４において算出される。１つの公知のコドン最適化手順（ＣＯＤＯＰ）において、コドン優先傾向Ｎが、以下のように算出される：Ｎ＝Ｆａａ１×ｎ／（Ｆａａ１＋Ｆａａ２＋Ｆａａ３．．．＋Ｆａａｎ）、ここで、ｎは同義語コドン（同一のアミノ酸についてのコドン）の数であり、Ｆａａ１〜Ｆａａｎは、各々の同義語コドンに関する１０００コドン当たりの割合である。（Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２（１１１３−２０）を参照のこと。）コドン最適化についての切り捨て値は、工程１０２０において使用者によって選択される。１つの実施形態において、その値は０．６である。切り捨て値は、宿主発現システムＧＣリッチの度合いに基づいて変更され得るか、または代謝特性および生化学的特性に基づいて各々のアミノ酸について異なり得る。理論的根拠は、ほとんどの希少なコドンを削除する切り捨て値を選択することである。１つの実施形態において、これは、改変されたコドン表の視覚検査、および好ましいコドンに影響を及ぼすことなくほとんどの希少なコドンを削除する切り捨て値を選択することによって行われる。各々のコドンは、工程１０２２において、切り捨て値以上のコドン優先傾向値について試験される。使用者が規定した切り捨て値以下のＮを有するすべてのコドンは、工程１０２４において拒絶される。各々のアミノ酸について、切り捨て値以上のＮ値を有するコドンがプールされ、そして工程１０３０において、Ｎ値の合計が１になるようにＮ値が正規化される。合成遺伝子についてのコドン優先傾向表が、工程１０４０において生成される。
【０１８２】
無作為化されかつ最適化された合成遺伝子配列を生成することおける最適化されたコドンの使用は、図１０Ｂの概略図に示されている。入力アミノ酸配列１０５２について、各々のアミノ酸についてのコドンの数が、工程１０５０において、合成コドン優先傾向表１０５４に基づいて算出される。配列中の各々のアミノ酸１０５２について、コドンは、工程１０６０において、アミノ酸について最適化されたコドンの選択から無作為に選別される。無作為に選択されたコドンは、工程１０７０において、新しい合成遺伝子配列を生成するために使用される。コドンが合成遺伝子配列で使用されるたびに、工程１０６２において、合成遺伝子優先傾向表１０５４中のアミノ酸について最適化されたコドンの選択から、そのコドンが削除される。合成遺伝子配列は、工程１０８０において、その翻訳されたアミノ酸配列と入力アミノ酸配列との比較によって確認される。その配列が同一である場合（１０８２）、その無作為化かつ最適化された合成遺伝子配列が、工程１０９０において報告される。その配列が同一でない場合、合成遺伝子配列中の誤りが、工程１０８４において報告される。１つの実施形態において、使用者は、類似のアミノ酸の置換を可能にするための選択を有する。別の実施形態において、その誤りは、その後の無作為化手順の補正を実行することについて分析される。
【０１８３】
（２．制限部位予測）  １つの実施形態において、制限酵素予測手順が、この段階で実行される。制限部位予測手順は、対応するアミノ酸配列に関して可能性のあるすべての有効なコドン組み合わせについて、ヌクレオチド配列におけるすべての制限部位を予測する。このプログラムは、使用者が特定した位置または間隔で、ＤＮＡ配列に沿って固有の制限部位を自動的に同定する。この手順は、モジュールおよび／またはシントンの初期設計において、および必要に応じて、予測された配列における誤りを検査することにおいて使用される。
【０１８４】
これらの手順の実行に従って、使用者は、１つの実施形態に従う出力の受容を示す。生成された制限部位の一覧が使用者によって受容される場合、プロセスは、ＧｅＭＳコドン最適化手順に移される。結果が使用者に受容可能でない場合、使用者が手動でパラメータを修正することを受容するまでサブルーチンが繰り返される。このプロセスは、受容を示すシグナルが使用者から得られるまで繰り返される。使用者が制限部位を受容した後、配列がＧｅＭＳモジュールにおける次の手順に移されて、その後の手順が実行される。
【０１８５】
（３．制限部位の除去）  ＧｅＭＳプログラムの工程９３２または９３８（図９を参照のこと）で選択された制限部位は、図１１に概略的に示されるように、コドン最適化遺伝子配列から除去される。
【０１８６】
本発明のプロセスのサブルーチンは、特定された選択された制限部位を除去し、無作為化し最適化した遺伝子配列と共に入力する（１１００）。サブルーチンは、工程１１００において、コドン最適化遺伝子配列における予め選択された制限部位を同定し、そしてそれらの位置を同定する。工程１１２０において、各々の所定の位置で、制限部位を含むオープンリーディングフレームが、配列を変える能力、および制限部位で影響を受けるコドンによってコードされるアミノ酸を変えることなく制限部位を除去する能力について試験される。リーディングフレームがオープンである場合、制限部位の第１のコドンが、制限部位配列を除去する様式で、同一または類似のアミノ酸をコードするコドンで置換される。しかし、第１のコドンが置換に不適合である場合、サブルーチンは、次の利用可能なコドンに移り、制限部位が除去されるまで継続される。制限部位は６ヌクレオチドまで含み得るので、部位の除去は、３つのアミノ酸コドンの分析を含み得る。制限部位の除去は、工程１１３０において、コードされるアミノ酸の特性を維持する様式で実行される。サブルーチンは、アミノ酸配列を変えることなく制限部位が除去された無作為化し最適化された遺伝子配列を生成する（１１４０）。
【０１８７】
（４．制限部位の挿入）  次のサブルーチンは、制限部位を導入するプロセスによって実行される。この工程は、図１２の概略図で示されるように、選択された位置でヌクレオチド塩基を置換し、アミノ酸配列を変えることなく、選択された制限酵素の制限部位を生成する。このサブルーチンにおいて、選択された制限部位が除去された無作為化しかつ最適化された遺伝子配列が、工程１２１０において、配列への挿入について選択された制限部位およびその位置と共に入力される。選択された挿入位置は配列中で同定され、そしてヌクレオチドは置換されて、工程１２２０において選択された位置で選択された制限部位を生成する。１つの実施形態において、制限部位によって作製された突出配列のみが、制限部位の代わりに挿入される。このような配列がシントン中に存在する場合、それはＩＩＳ型制限酵素によって間接的に切断されるので、生成された突出部がＩＩＳ型制限酵素で切断されたＤＮＡフラグメントとの連結のために利用可能であり、相補的な重複が生成される。置換された配列が翻訳され、得られたアミノ酸配列が、工程１２３０において参照アミノ酸の配列（図１０Ｂの１０５２を参照のこと）と比較される。置換された配列が翻訳され、得られたアミノ酸配列が、工程１２３０において参照アミノ酸の配列（図１０Ｂの１０５２を参照のこと）と比較され、アミノ酸配列の同定について比較される。工程１２４０において、置換配列でコドン重複のアミノ酸特異性が変化したことが見出される場合、工程１２４０Ａにおいて、コドン表が、アミノ酸配列および置換配列の両方とのコドン互換性、ならびに制限部位および他のモチーフに関する所望の形式あるいは他の形式との互換性について再試験され得る。任意の互換性コドンが見出される場合、（例えば、コドン表における使用の相対的確立によって）使用者の優先度に従ってこのようなコドンの一覧から１つが選択され、そして望ましくないコドンの代わりとして挿入される；プログラムは１２４０に戻る。アミノ酸配列が変えられ、そして工程１２４０Ａに記載される手順によって修復不可能な場合、プログラムは工程１２４２に進む。工程１２４２において、使用者は、工程１２４４における出力を拒絶し、かつ選択された位置でヌクレオチド置換の工程を繰り返す選択肢を有する。１つの実施形態において、使用者は、工程１２４６において、アミノ酸を類似のアミノ酸に置き換え、そして手動で出力を受容する。次いで、制限部位の導入に従って生成された配列は、工程１２５０において、翻訳誤りについて検査される。選択された制限部位を有する無作為化し最適化された合成遺伝子配列が除去され、そして工程１２６０において挿入された他の選択された制限部位が提供される。上記のように、制限部位ではなく配列モチーフが「挿入」されるかまたは「削除」され得る（すなわち、オリゴヌクレオチド、シントンおよび遺伝子が特定の位置から配列モチーフを含むかまたは除外するために設計され得る）。例えば、配列同定の領域は、多重シントンの構築に有用であり（例えば、以下の節６．４．３における例示的構築方法２を参照のこと）、合成遺伝子の特定の位置で含まれ得る。
【０１８８】
（５．合成遺伝子またはシントンを構成するためのオリゴヌクレオチドの生成）
ＧｅＭＳへの入力は、それらの位置に沿ってドメイン端またはシントン端のいずれかとしてタグ化された各々の制限部位を有する。これらの基準に基づいて、プログラムパイプラインのこの工程１３２０（図１３を参照のこと）は、１つの実施形態において、完全遺伝子配列を多数のシントンに分割する。別の実施形態において、好ましいシントンサイズが入力される。重複オリゴヌクレオチド配列が、工程１３２０において生成されて、シントンコード領域ならびにシントン側面配列を構成する。
【０１８９】
合成遺伝子についてのオリゴヌクレオチドの生成は、図１３の概略図に示されている。合成遺伝子配列１３１２は、工程１３１０において、オリゴヌクレオチドの長さおよび隣接するオリゴヌクレオチドの重複の範囲を特定するパラメータに沿って入力される。合成遺伝子配列は、工程１３２０において、重複を有する特定の長さの複数のオリゴヌクレオチド配列に分割されて、選択された数の塩基が隣接鎖と対合することを可能にする。各々のオリゴヌクレオチドは、合成遺伝子配列１３１２と共に整列され、そしてその整列の程度が、工程１３３０で決定される。整列の程度（一致値）は、工程１３３２において、利用可能な整列の程度について予め決められた配列特異性切り捨て値と比較される。決定は、工程１３４０における配列の一致に基づいてなされる。一致値が特異性切り捨て値未満である場合、無効なオリゴヌクレオチドが同定され、誤りが工程１３４２で同定される。出力は、手動で破棄されるかまたは調整され得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチドの整列に関して全体の程度を調整するために増大するかまたは減少される。一致値が特異性切り捨て値を超える場合、確認されたオリゴヌクレオチドの一覧が生成される。
【０１９０】
１つの実施形態において、合成遺伝子はシントンである。シントンを含むオリゴヌクレオチドは、シントンコード領域ならびにシントン側面配列に特異的なオリゴヌクレオチドを含む。各々のシントンは、各々がいずれの側面における２つの隣接オリゴヌクレオチドと相補配列の重複を有する一連のオリゴヌクレオチドとして設計されたオリゴヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドの長さの選択は、いくつかの因子（特定の長さのオリゴヌクレオチド合成の有効性および正確性、会合ＰＣＲ中のプライミングの有効性、アニーリング温度および翻訳有効性）を考慮する。好ましい実施形態において、サイズが４０マーの各オリゴヌクレオチドは、隣接オリゴヌクレオチドとの約２０ヌクレオチドの重複と共に選択される。各々のオリゴヌクレオチドは、２つのおよそ等しい半体として設計され、ここで、各々の半体は、２つの隣接オリゴヌクレオチドとの相互作用についての基準（例えば、アニーリング、プライミング）を満たしていなければならず、この隣接オリゴヌクレオチドは、各々の半体と重複し、４０マー配列の選択は、その長さのオリゴヌクレオチドの化学合成の精度にさらに反映する。
【０１９１】
本発明は、ＰＣＲ反応による重複オリゴヌクレオチドの会合に関するが、オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡリガーゼとＤＮＡポリメラーゼ酵素との組み合わせによって酵素的に会合され得ることが企図される。このような実施形態において、より長いオリゴヌクレオチドが、より短い重複と共に使用され得る。その重複は、その２つの隣接オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの領域間で５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドのギャップで離れていることが企図される。このようなギャップは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって修復され得、次いで、オリゴヌクレオチドによって構成されるシントンが、ＤＮＡリガーゼ媒介反応によって会合され得る。
【０１９２】
（６．オリゴヌクレオチド設計基準）  適切なオリゴヌクレオチドの組の設計は、多数の基準に基づかれる。この設計で使用される２つの基準は、アニーリング温度およびプライマー特異性である。
【０１９３】
（６Ａ．最適アニーリング温度）：アニーリング温度（好ましくは６０〜６５℃）およびオリゴヌクレオチド重複長について使用者が規定した範囲が入力される。温度を増大するために、オリゴヌクレオチド重複長のサイズが増大され、逆の場合も同様である。ＧｅＭＳプログラムは、特定のアニーリング温度境界内でオリゴヌクレオチドを設計する。その基準は、単一のＰＣＲ反応によって会合されるべきオリゴヌクレオチドの完全な組に対する一定の（好ましくは、狭い範囲の）アニーリング温度である。アニーリング温度は、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ（Ｂｒｅｓｌａｕｌｅｒら、１９８６「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８３：３７４６−３７５０）およびＢａｌｄｉｎｏ（Ｂａｌｄｉｎｏ、１９８９、「Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＮ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｎｎ編）、１６８：７６１−７７７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）によって記載された最近接モデルを使用して測定される。自動的にオリゴヌクレオチド成分に塩基を加えるかまたは塩基を削除することよる、設計されたオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度範囲を狭くするためのさらなる方法もまた、実行される。
【０１９４】
（６Ｂ．プライマー特異性）：各々のシントン（またはシントン遺伝子）について生成される各々の重複オリゴヌクレオチド配列は、完全シントンに対するプライマー特異性試験に供される。最適なプライミングを保証するために、シントン中の各々のオリゴヌクレオチド配列が、完全シントン配列に対するアラインメントによって試験される。アラインメントは、オリゴヌクレオチド配列とシントンの配列との間でマッチ数とミスマッチ数とを比較することによって決定される。予め決められた値よりも高い程度で整列するオリゴヌクレオチドが、合成について選択される。１つの実施形態において、これは、位置１で開始して、シントン配列の長さを一度に１塩基スライドして、シントン配列に対してオリゴヌクレオチド配列を整列することによって実行される。
【０１９５】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、以下の一連の工程に従って使用に不適合であることが決定される。
【０１９６】
工程１：両方のオリゴヌクレオチド配列およびシントン参照配列の最後の３塩基を、それらが同一であるように整列させる。；
工程２：同じ位置で両方の配列において同一の塩基であるマッチと、整列された配列中のマッチおよびミスマッチの数を数える。
【０１９７】
工程３：重複およびアラインメントを形成する塩基の総数に対するマッチの割合を算出する。
【０１９８】
その割合が、使用者が規定した閾値０．７（または７０％）よりも大きい場合、そのオリゴヌクレオチドは合成に適切である。１つの実施形態において、閾値が使用者の規定した値よりも低いオリゴヌクレオチドは、その配列の手動改変に供されて、アラインメントの程度が増大され得、そして閾値要求を満たし得る。
【０１９９】
７．オリゴヌクレオチド特性試験：ソフトウェアは、各シントンのオリゴヌクレオチド間の、任意の望ましくない程度の異常なプライミングをチェックする。存在する場合、ソフトウェアはシントンを繰り返し再設計する。この再設計は、設計が改善されるまで起こる。困難な場合、ソフトウェアは結果を報告し、ユーザーが手動でエラーを修正するよう促す。
【０２００】
８．入力確認ルーチン：一つ以上のユーザーが入力する確認ルーチンは、シントン設計ルートンと平行して独立に実行するように遂行され得る。これらは、ユーザーに入力された指示の確認チェックを行う。これらのルーチンは、代表的に、ＧｅＭＳプロセスの工程の間にユーザーに入力された指示を確認し、そして部位予測アルゴリズム、フレームシフトおよびシントン境界に基づく制限酵素切断部位位置の確認を含む。入力段階でのエラーの同定は、ユーザーが誤った設計をもたらすあらゆる入力を与えることを防止する。
【０２０１】
９．出力確認ルーチン−−プログラム出力確認ルーチンは、設計されたシントンを確認するための時間を減少させるために使用され得る。これは、端から端までの設計プロセスが、ハイスループット様式で働くようにさせる。このプログラムは、設計されたシントンを再構築し、一方その正確な順序を維持し、シントン遺伝子を再生成する。次いで、新しい合成遺伝子がそのアミノ酸配列に翻訳されて、起こり得るエラーについて、元々の入力されたタンパク質配列と比較される。構築された配列に関する制限酵素切断部位パターンが、所望されたパターンと同様であると確認される。各設計されたシントン（シントン−特異的プライマーを含む）についての制限酵素切断部位パターンもまた、確認される。他の特性試験（望ましくないｍＲＮＡ二次構造および望ましくないリボソーム開始部位をについての試験を含む）が行われ得る。
【０２０２】
１０．ユーザーインターフェース。任意のウェブベースのソフトウェアの実行は、設計を完了するのに必要とされる工程数を最小化する、図式的なインターフェースを提供する。適用可能な場合、ユーザーは、設計プロセスに役立つ遺伝子配列、遺伝子機能、制限酵素切断部位などについてのウェブサイトおよび／もしくはデータベースへのスクリーン上でのリンクを提供される。
【０２０３】
これらは、パイプラインを決定し、そして合成遺伝子の各シントンに対して適切なオリゴヌクレオチドの一覧を出力する。
【０２０４】
（５．３  ソフトウェアの実行）
一つの実施形態において、ＧｅＭＳソフトウェアは、ウェブブラウザのアプリケーションの範囲内で行われて、それをプラットフォームに中立なシステムにさせるように実行される。その設計は、クライアント−サーバーモデルに基づき、共通ゲートウェイインターフェース（ＣＧＩ）標準を使用して実行される。
【０２０５】
ＧｅＭＳに関する全てのＣＧＩスクリプトおよびアプリケーションプログラムインターフェースは、Ｐｙｔｈｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．２で実行された。アプリケーションの開発、テストおよびホスト化は、ＲｅｄＨａｔ  Ｌｉｎｕｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ７．３が動いている１．０ＧＨｚ  Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩＩベースのプロセッササーバー上で行った。ウェブインターフェースは、Ａｐａｃｈｅ  ＨＴＴＰ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．０上で動く。
【０２０６】
ＧｅＭＳ  ＡＰＩにおけるアニーリング温度モジュールは、ＥＭＢＯＳＳソフトウェア分析パッケージ（Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．，２０００，「ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７６−７７）を利用して、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３７４６−５０）およびＢａｌｄｉｎｏ  （Ｂａｌｄｉｎｏ  Ｊｒ．，１９８９，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７）によって記載された最近隣接モデル（ｔｈｅ  ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｏｄｅｌ）を実行する。
【０２０７】
公共で利用可能なソフトウェア（例えば、ＤＮＡ  Ｂｕｉｌｄｅｒ（Ｂｕら、「ＤＮＡ  Ｂｕｉｌｄｅｒ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＤＮＡＷｏｒｋｓ（Ｄａｖｉｄ  Ｍ．ＨｏｏｖｅｒおよびＪａｃｅｋ  Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２「ＤＮＡＷｏｒｋｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｎｏ．１０，ｅ４３）、およびＣＯＤＯＰ（Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９９「ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ＋Ｔ−ｒｉｃｈ  ｍａｌａｒｉａ  ｇｅｎｏｍｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２：１１１３−２０））が、当業者によって構築されて、ポリケチドモジュールの自動設計のためにＧｅＭＳによって使用される、いくつか（全てではない）のタスクを達成し得る。
【０２０８】
一つの局面において、本発明は、本明細書中で記載されるような合成遺伝子の設計のために有用な工程もしくは方法を行うための、コンピュータが実行可能な指令を有する、コンピュータが読み取り可能な媒体を提供する。
【０２０９】
（６．マルチモジュール構築物およびライブラリ）
（６．１  導入）
本明細書中で開示された方法に従って設計および／もしくは生成された合成遺伝子は、（例えば、プロモーターおよび／もしくは他の調節エレメントに連結された後）発現され得る。本発明の一つの局面において、合成遺伝子は、別の合成遺伝子を有する単一のオープンリーディングフレーム中に連結されて、「融合ポリペプチド」をコードする。この融合遺伝子をコードするＤＮＡがそれ自身で合成遺伝子である（より小さな遺伝子の連結から生成される）ことが、認識される。関連する局面において、複数の異なるオープンリーディングフレームは同時発現されて（またはそれらのタンパク質産物がインビトロで組み合わせられて）、多タンパク質複合体を形成し得る。これは、天然に存在するポリケチドシンターゼのアナログである。これは、いくつかのポリペプチドの複合体であり、各々は、二つ以上のモジュールおよび／もしくは補助単位を含む。
【０２１０】
したがって、ポリケチドの生成に関して、本発明は、以下を検討する：（Ａ）ＰＫＳモジュールの組合せおよび／もしくは補助単位の組合せを含むポリペプチドをコードする合成遺伝子を生成する工程；（Ｂ）互いに結合して多ポリペプチド複合体を形成する、二つ以上の異なる（Ａ）のポリペプチドを発現する工程。
【０２１１】
ＰＫＳモジュールの組合せおよび／もしくは補助単位の組合せを含むポリペプチドをコードする合成遺伝子を生成するための方法は、上記（例えば、第４章）で議論された方法を用いて、設計および縫合（ｓｔｉｔｃｈ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ）することによって、この組合せをコードする遺伝子をともにコードするシントンを含む。あるいは、単一のポリペプチドの異なる部分をコードし得る二つ以上の合成遺伝子が、従来の組み換え技術（ライゲーション非依存的方法およびリンカー介在法、ならびに他の方法）によって、遺伝子配列中の特定の位置（例えば、モジュールの領域をコードする末端、ドメイン、補助単位など）に位置する（もしくはそこで操作される）部位および配列モチーフを使用して、結合され得る。本発明の設計および合成方法の一つの重要な新しい利点は、遺伝子配列を制御して、モジュール、ドメインなどのクローニングを容易にする能力である。これらの方法の特に有用な派生効果は、構造的もしくは機能的に同様な単位（例えば、モジュール、補助単位、リンカー、他の機能的ポリペプチド配列）をコードする遺伝子の、複数の大きなライブラリを作製する能力である。この制限酵素切断部位もしくは他の配列モチーフは、このライブラリの全てのメンバーの類似位置に配置される。例えば、ＰＫＳモジュール遺伝子は、その末端に独特の制限酵素切断部位を有して合成され（例えば、Ｘｂａ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉ部位）、ベクターの同じ部位へのクローニングを容易にする。
【０２１２】
関連する局面において、本発明は、ポリペプチド（このライブラリのメンバーによってかもしくは他のライブラリのメンバーによってコードされる他のポリペプチドに、このポリペプチドを結合させるようにする領域（リンカー）を含む）をコードする、複数の大きなライブラリ遺伝子を提供する。
【０２１３】
関連する局面において、本発明は、例えば、多くの異なるポリペプチドセグメントをコードする遺伝子の操作、発現、および分析のために使用され得るベクターおよびベクターセットを提供する。例えば、本発明は、マルチモジュール構築物をコードする遺伝子のライブラリの調整を容易にする有用なベクター（ＯＲＦベクターと呼ばれる）を提供する。
【０２１４】
以下の節は、ＰＫＳモジュールおよび付属的な単位をコードするＯＲＦ含むベクターおよび、ベクターライブラリーの製造ならびに使用についての例示的な方法を記載する。以下の節６．２は、どのようなライブラリーが使用され、分子と他のポリペプチド単位との間の相互作用を分析され得るのかを記載する。この節は、どのようなライブラリーが使用され得るのか図示することが意図され、そしてライブラリー構築の記述をより明らかにする。節６．３は、モジュールおよびリンカーの組み合わせを議論する。節６．４は、特定のＯＲＦベクターおよびこれらを構築するための方法を記載する。  
【０２１５】
（６．２．ＯＲＦベクターライブラリーの例示的な使用）
一つの局面において、本発明は、天然においては見出されない組み合わせにおいてＰＫＳモジュールをコードする遺伝子の発現のための方法を提供する。このような新規モジュールの構築は、新規ポリケチドの産生、公知ポリケチドのより効率的な産生を可能とし、そしてさらにＰＫＳモジュール、ドメインおよびリンカーの相互作用を支配する「ルール」を理解することを可能とする。「ヘテロの」モジュールの組み合わせ（すなわち、天然に相互作用しないモジュール）は、生産的または能率的なものではあり得ない。例えば、ヘテロモジュールの干渉において、この第一モジュールの生成物は、第二または続くモジュールについての天然の基質ではあり得ず、そしてこの受容モジュールは、外来の基質を能率的に受容し得ない。さらに、ポリケチド鎖のモジュール間の移送（一つのモジュールのＡＣＰチオールエステルからその隣のＫＳチオールエステルまで）は、効率的に生じ得ない。米国特許出願第２００３００６８６７６Ａ１号：ポリケチドシンターゼモジュールの有効性を媒介するための方法を参照のこと。本発明は、ベクターに対する方法、ライブラリー、ならびにモジュール、ドメイン、リンカーおよび生産的に機能する他のポリペプチドセグメントの能力を評価するための方法を提供する。
【０２１６】
本発明の一つの局面において、ベクターのライブラリーが調製され、ここでこのライブラリーの異なるメンバーは、異なる伸長モジュールを含む。本発明の一つの局面において、ベクターのライブラリーが調製され、ここでこのライブラリーのメンバーは、同一の伸長モジュールを含むが、異なる付属的な単位（例えば、異なるローディングモジュールおよび／または異なるリンカードメインおよび／または異なるチオエステラーゼドメイン）を含む。従って、本発明は、ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子の発現ライブラリーを合成するための方法を提供し、この方法は、複数の異なる合成ＰＫＳモジュールをコードする遺伝子（例えば、本明細書中に記載されるような）の作製および各遺伝子を発現ベクターへクローニングによる。一つの実施形態において、このライブラリーは、少なくとも約５０個または少なくとも約１００個の異なるモジュールをコードする遺伝子を含む。本発明の一つの局面において、このようなライブラリーは、対で使用され、ＰＫＳモジュールの対または組み合わせの間の生産的な相互作用を同定する。
【０２１７】
説明のために、本発明の技術のライブラリーの１つの適用は、（多くの可能なもののうちの）２つのＯＲＦベクターライブラリーを記載することによって説明され得る。この開示によってガイドされる当業者は、作製および使用去れ得る種々の匹敵するまたは類似のライブラリーを認識する。第１のＯＲＦライブラリーは、ローディングドメイン（ＬＤ）、ＰＫＳモジュール（Ｍｏｄ）、および左リンカー（ＬＬ）をコードするオープンリーディングフレームを含むベクターを含み、ここで、ライブラリーの異なるメンバーが、同じＬＤおよびＬＬをコードするが、異なるモジュールをコードする。すなわち：
［ＬＤ−Ｍｏｄ−ＬＬ］ｎ      ［例示のライブラリーＩ］
ここで、ｎは、通常、＞２０である。第２のＯＲＦライブラリーは、右リンカー（ＲＬ）、モジュール（Ｍｏｄ）、およびチオエステラーゼドメイン（ＴＥ）をコードするオープンリーディングフレームを含むベクターを含み、ここで、ライブラリーの異なるメンバーは、異なるモジュールをコードする。すなわち：
［ＲＬ−Ｍｏｄ−ＴＥ］ｎ      ［例示のライブラリーＩＩ］。
【０２１８】
用語「右リンカー」（ＲＬ）および「左リンカー」（ＬＬ）とは、２つのポリペプチドが会合し得るインターポリペプチドリンカーをいう。１つより多くのポリペプチドを含むポリケチドシンターゼの構築のために、移動のための適切なリンカーは、供与モジュールの適切なＣ末端アミノ酸配列を、受容モジュールのインターポリペプチドリンカーの適切なＮ末端アミノ酸配列と適合させることによって達成され得る。これは、例えば、ネイティブのＰＫＳにおいて存在するような対を選択することによってなされ得る。例えば、２つの任意の選択されたモジュールが、ＤＥＢＳのモジュール４のＣ末端部分およびＤＥＢＳのモジュール５のための連結配列のＮ末端部分を使用して、連結され得る。あるいは、リンカーの新規な組み合わせまたは人工リンカーが使用され得る。
【０２１９】
１つの実施形態において、説明のために、示される２つのライブラリーのそれぞれが、４つのメンバーを含み、各メンバーが、異なるモジュール（すなわち、モジュールＡ、Ｂ、ＣまたはＤ（「ＭｏｄＡ」、「ＭｏｄＢ」、「ＭｏｄＣ」、「ＭｏｄＤ」）をコードする遺伝子を含む。以下に示される８つの例示的なベクターのライブラリーを使用して、モジュールＡ、Ｂ、ＣまたはＤ（「ＭｏｄＡ」、「ＭｏｄＢ」、「ＭｏｄＣ」、「ＭｏｄＤ」）の全ての可能な組み合わせが、適切な発現ベクターへの移動後に機能について試験去れ得る。
【０２２０】
ＬＤ−ＭｏｄＡ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＡ−ＴＥ
ＬＤ−ＭｏｄＢ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＢ−ＴＥ
ＬＤ−ＭｏｄＣ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＣ−ＴＥ
ＬＤ−ＭｏｄＤ−ＬＬ    ＲＬ−ＭｏｄＤ−ＴＥ
ライブラリーＩおよびライブラリーＩＩからのモジュールの組み合わせ（例えば、対の組み合わせ）の機能について調べるために、適切な宿主（例えば、ＰＫＳ翻訳後修飾および基質Ｃｏ−Ａチオエステル産生を支持するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ）中に同時トランスフェクトし得、そして産物トリケチドを、適切な方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、または生物学的活性）によって分析され得る。あるいは、このライブラリーのメンバーは、個々に発現され得、ライブラリーＩ−ライブラリーＩＩの組み合わせは、インビトロでなされ得る。アフィニティータグおよび／または標識タグは、タンパク質単離、ならびにモジュールの組み合わせの活性および物理的相互作用について試験するためのモジュール構築物の一方の末端または両方の末端に付着され得る。
【０２２１】
産生性の組み合わせが同定される場合、産生性の対は組み合わせれて、新たな対の組み合わせで試験され得る。例えば、ＬＤ−ＭｏｄＡ−ＬＬ＋ＲＬ−ＭｏｄＡ−ＴＥが産生性である場合、構築物ＬＤ−ＭｏｄＡ−ＭｏｄＤ−ＬＬが合成され、ライブラリーＩＩのメンバーと組み合わせて試験され得る。同様に、第３のライブラリー（［ＬＬ−Ｍｏｄ−ＲＬ］ｎ構築物を含む）が使用され得る。本発明の方法によって入手可能な多くの他の有用なライブラリーが、本開示によってガイドされる当業者に明らかである。
【０２２２】
相補的なストラテジーにおいて、付属ユニットおよびモジュールの相互作用は、モジュール遺伝子を一定に保ちながら、付属ユニットを変える（例えば、異なるメンバーが同じ伸長モジュールをコードするが、異なるローディングモジュールまたはリンカーをコードするライブラリーを使用する）ことによって評価され得る。
【０２２３】
産生タンパク質−タンパク質相互作用の同定以外の使用のために、遺伝子ライブラリーが使用され得ることが明らかである。例えば、本明細書中に記載されるＯＲＦライブラリーのメンバーは、産生のため、他のライブラリー構築のための中間体として、および他の使用のために、使用され得る。
【０２２４】
（６．３  モジュールおよびリンカーの組み合わせ）
このセクションは、モジュール遺伝子が、ネイティブなまたは異種のリンカー配列とともにどのように発現され得るかを詳細に記載する。以下に記載されるように、本発明の有用な融合タンパク質は、多くのエレメントを含み得る。例えば、以下が挙げられる：
構築物番号      構造
１．        ＬＤ−Ｍｏｄ１−ＬＬ
２．        ＬＤ−Ｍｏｄ２−ＬＬＨ
３．        ＲＬ−Ｍｏｄ３−ＴＥ
４．        ＲＬＨ−Ｍｏｄ４−ＴＥ
５．        ＲＬ−Ｍｏｄ５−Ｍｏｄ６−ＬＬ
６．        ＬＤ−Ｍｏｄ７−＊−ＬＬ
ここで、「ＬＤ」は、ＰＫＳローディングモジュールを示し、「ＴＥ」は、チオエステラーゼドメインを示し、「ＲＬ」および「ＬＬ」は、ＰＫＳインターポリペプチドリンカーを示し、下付き文字「Ｈ」Ｈは、「異種」リンカーを示し、「＊」は、異種ＡＫＬ（ＡＣＰ−ＫＳリンカー、定義、セクション１を参照のこと）が存在することを示し、そして「Ｍｏｄ」は、種々のＰＫＳモジュールを示す。モジュールは、配列およびドメインの内容に関してだけではなく、インターポリペプチドおよびインターモジュラーリンカーの性質に関しても異なり得る。ＰＫＳリンカーについての一般的な考察は、上記セクション１おおびそこに引用される参考文献に提供される。簡単に述べると、異なるポリペプチドのＰＫＳ伸長モジュールは、見いだされる（または配置される）「インターポリペプチドリンカー」リンカー（すなわち、ＲＬおよびＬＬ）によって連結され得、そして同じポリペプチドの複数のＰＫＳ伸長モジュールが、ＡＫＬによって連結され得る。
【０２２５】
構築物において使用される伸長モジュールは、天然に存在するポリペプチドのアミノ末端またはそのアミノ末端以外のものに配置される天然に存在するモジュールに対応し得、そして合成遺伝子（例えば、Ｍｏｐ３）またはアミノ末端以外のもの（Ｍｏｄ６）によってコードされるポリペプチドのアミノ末端に配置され得る。
【０２２６】
モジュールをコードする合成遺伝子を含むＯＲＦにおいて、モジュールは、種々の異なるリンカーに結合され得ることが当業者に明らかである。例えば、天然に存在するモジュールに対応するモジュールは、天然に存在するモジュールと関連するインターポリペプチドまたは他のインターモジュラーリンカー配列をコードする配列と関連し得るか、または天然に存在するモジュールと関連しないインターポリペプチドまたは他のインターモジュラーリンカー配列（例えば、異種、人工、またはハイブリッドリンカー配列）をコードする配列と関連し得る。所望される最終の構築物に依存して、合成モジュールは、対応する天然に存在するモジュールのＡＫＬを含み得るかまたは含み得ないことが明らかである。簡便には、本発明の合成モジュールコード遺伝子またはライブラリーの遺伝子に必要に応じて配置されるＳｐｅ  ＩおよびＭｆｅ  Ｉ部位が使用されて、異なるＡＫＬでの置換のためにＡＫＬを追加、除去または交換し得る。
【０２２７】
（６．４例示的なＯＲＦベクター構築物）
上記のように、モジュールが、複合ポリペプチドの構築のために、「ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）ベクター」内にクローニングされ得る。多くの代替のストラテジーが明らかであるが、専門化したベクターが合成における異なる役割および合成遺伝子の発現に役立つことが一般的に簡便である。例えば、本発明の１つの実施形態において、シントンスティッチング（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）は、１つのベクターセット（例えば、アセンブリベクター）で行われ、モジュールおよび／または付属ユニットをコードする遺伝子は、異なるセットのベクター（例えば、ＯＲＦベクター）において組み合わされ、ポリペプチドは、第３のセットのベクター（発現ベクター）において発現される。しかし、他のストラテジーが、この開示によってガイドされる読者に明らかである。例えば、本発明のＯＲＦベクターは、発現ベクターとしても役立つように構成され得る。
【０２２８】
アセンブリベクターがＯＲＦベクターにクローニングする場合、アセンブリベクターの複数のシントンに隣接する有用な制限部位を含むアセンブリベクターを使用することが、しばしば簡便である。従って、有用なアセンブリベクターは、ＳＩＳのいずれかの側（従って、示されるアセンブリベクターに含まれるモジュールのいずれかの側）に位置づけられるセクション４に記載されるものに加えて、制限部位を含み得る。これらの隣接制限部位（「ＦＲＳ」）が通常、配列合成モジュール遺伝子に無い（すなわち、遺伝子設計の間に「除去される」）ので、まれな部位（例えば、８ｂｐ認識部位）を使用することが一般的に遊離である。
【０２２９】
以下に記載される方法の説明において、以下の略語は、説明のみのために使用される：１＝Ｎｄｅ  Ｉ部位、２＝Ｘｂａ  Ｉ部位、３＝Ｐａｃ  Ｉ部位、４＝Ｎｏｔ  Ｉ部位、５＝Ｓｐｅ  Ｉ部位、６＝Ｅｃｏ  ＲＩ部位、７＝Ｂｂｓ  Ｉ部位、８＝Ｂｓａ  Ｉ部位、＊＝共通配列モチーフ。以下の説明を考慮する場合、有用なベクターが示される特定の制限部位を有するもに制限されれないことを留意することが重要である。例えば、示される任意の部位が、異なる部位（同じ様式で機能し得る）を使用することによって置換され得る。例えば、ＩＩＳ型酵素によって認識される大多数の部位のいずれかが、部位７および８のために使用され得；種々の部位のいずれかが、部位３および４のために使用され得るが、まれな部位（例えば、７または８塩基対認識配列を有する）が好ましい。同様に、多くの部位が、Ｘｂａ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉの代わりに使用され得る。ただし、適合性の粘着性末端が、その部位の消化によって作製される（好ましくは、いずれの部位も、粘着性末端の連結の際に再生しない）。さらに、これらの部位の全てが有用であるものの、全てが本発明の方法において必要とされるわけではなく、これは、当業者に明らかである。多くの実施形態において、いくつかの部位のうちの１つが省略される。以下の考察において、アセンブリベクターからＯＲＦベクターへ移動される複数シントンが、時々、単純に「モジュール」と呼ばれる。
【０２３０】
（６．４．１  アミノ末端およびカルボキシ末端付属ユニットまたは他のポリペプチド配列を含むＯＲＦベクター）
マルチモジュール遺伝子を合成するために、以下の構造を有するＯＲＦベクターが、操作のために使用され得る：
【０２３１】
【化３】
2006517090.tif 000011
【０２３２】
ここで、
【０２３３】
【化３Ａ】
2006517090.tif 000012
【０２３４】
は、非ＰＫＳポリペプチドセグメント（例えば、ＮＲＰＳモジュール）またはＰＫＳ付属ユニットのような構造または機能ポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチド配列を示す。例えば、
【０２３５】
【化３Ｂ】
2006517090.tif 000013
【０２３６】
は、ローディングモジュールまたはインターポリペプチドリンカーをコードする遺伝子配列であり得、そして
【０２３７】
【化３Ｃ】
2006517090.tif 000014
【０２３８】
は、チオエステラーゼドメイン、他の放出ドメイン、インターポリペプチドリンカーなどをコードする遺伝子配列であり得る。例えば、１−２フラグメントがメチオニン開始コドンおよびＤＥＢＳローディングドメインをコードする合成遺伝子配列を含み、中心領域が、ＤＥＢＳモジュール２および３をコードする合成遺伝子配列を含み、そしてＣ末端領域が、ＤＥＢＳ  ＴＥドメインをコードする合成遺伝子配列を含むＯＲＦベクターは、ＤＥＢＳ  Ｎ−ＬＭ−ＤＥＢＳ２−ＤＥＢＳ３−ＴＥ−Ｃを含むポリペプチドをコードする（本明細書中に記載される全ての連続した合成ポリペプチドコード遺伝子が、互いにインフレームにある）。
【０２３９】
付属ユニットのコード配列は、公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）、そして合成付属ユニット遺伝子は、合成スティッチングおよび本明細書中に記載される方法によって作製され得る。このようなＮ末端領域およびＣ末端領域を有するＯＲＦベクターの構築のための方法は、以下に記載される。
【０２４０】
（６．４．２  ＯＲＦベクター合成）
このセクションは、交換可能なエレメントの遺伝子ライブラリーの構築のために有用な「ＯＲＦ２」型ベクターを記載する。これらの一般的な型のベクターは、以下を含む：
内部型      ４−［７−＊］−［＊−８］−３
左端型      ４−［７−１］−［＊−８］−３
右端型      ４−［７−＊］−［６−８］−３
括弧は、一旦７がとられると、７から＊への必要とされる距離が固定されるという事実を示すために使用される；同様に、一旦８がとられると、＊から８への必要とされる距離が固定される；そして残りの括弧の対［７−１］および［６−８］は、必要に応じて、以下に記載されるように、互いに対して有用に近位であるように選択され得る。３つのベクターを使用するために、認識部位が７および８である酵素は、［７−＊］または［＊−８］と記された全ての位置で相互に適合性の突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）産物を有し、好ましくは、ａ）等しい突出長さ（０であり得る）を有することによって；ｂ）それらの位置と同一の突出（もしあれば）を作り出す切断部位を有することによって［突出（もしあれば）におけるモジュールまたは付属遺伝子内の同一の配列が＊標識される］；およびｃ）切断部位が、オープンリーディングフレームと同様に適合性であることが必要とされる［その結果、＊（もしあれば）の２つの存在が、フレームに関して同じ位置を開始する；あるいは認識部位が７および８である酵素がブラントカッター（ｂｌｕｎｔ  ｃｕｔｔｅｒ）である場合、切断部位は、フレームに関して等しく配置されなければならない］ことによって達成される。
【０２４１】
１と標識された部位は、構築物の左端になり、その部位内で切断する酵素（例えば、Ｎｄｅ  Ｉ）のための制限認識部位であるように選択され得る。同様に、６と標識された部位は、構築物の右端になり、そしてその部位内で切断する酵素（例えば、Ｅｃｏ  ＲＩ）のための制限認識部位であるように選択され得る。この部位の対は、所望のように、最終の構築物を種々の発現ベクター内に移動させるために簡便な対であるように有用に選択される。構築方法自体は、１または６のいずれかが制限酵素認識部位であることを必要としないが、単純に、以下の条件で、切断がなされ得る場所を必要とする：
ａ）アセンブリ（ライブラリー）ベクターの１における切断は、ＯＲＦ構築作製の間に、ＯＲＦ構築ベクターファミリーの部位１において作製され得る切断と適合性である；
ｂ）アセンブリ（ライブラリー）ベクターの６における切断は、ＯＲＦ構築作製の間に、ＯＲＦ構築ベクターファミリーの部位６において作製され得る切断と適合性である；
ｃ）各場合において、ＯＲＦ構築ベクターへのライブラリーＯＲＦエレメントの移動の後に、７および８について選択されたＩＩＳ型酵素についての認識部位は、ベクター産物において独特である（存在する場合）。
【０２４２】
例えば、７についてのＩＩＳ型酵素を使用して、部位１を切断し得、移動のために使用され得る１における突出を作製する。
【０２４３】
（最初に規定されたＮ末端領域を有するＯＲＦベクターの構築）
左端型のライブラリーベクター（部位パターン４−［７−１］−［＊−８］−３を有する）を、１および３で切断し、そしてフラグメント１−［＊−８］−３を保存した；ＯＲＦベクター（最初に、部位パターン１−３−４−６を有する）を１および３で切断し、そしてフラグメント３−４−６−１をドナーフラグメント１−［＊８］−３に接続して、パターン１−［＊−８］−３−４−６を有するフラグメントを作製した。
【０２４４】
（最初に規定されたＣ末端領域を有するＯＲＦベクターの構築）
右端型のライブラリーベクター（部位パターン４−［７−＊］−［６−８］−３を有する）を、４および６で切断し、そしてフラグメント４−［７−＊］−６を保存した；ＯＲＦベクター（最初に、部位パターン１−３−４−６を有する）を４および６で切断し、そしてフラグメント６−１−３−４をドナーフラグメント４−［７−＊］−６に接続して、パターン１−３−４−［７−＊］−６を有するフラグメントを作製した。
【０２４５】
同じ方法による左端の構築を、先に構築された右端の存在化で行い得る。この場合、ドナーは、再び、左端型のライブラリーベクターである（部位パターン４−［７−１］−［＊−８］−３を有する）；およびアクセプターは、ここで、部位パターン１−３−４−［７−＊］−６を有するＯＲＦベクターである；再び、ドナーフラグメント１−［＊−８］−３は、アクセプターフラグメント１−３を置換する。
【０２４６】
同様に、同じ方法による右端の構築を、先に構築された左端の存在化で行い得る。この場合、ドナーは、再び、右端型のライブラリーベクターである（部位パターン４−［７−＊］−［６−８］−３を有する）；およびアクセプターは、ここで、部位パターン１−［＊−８］−３−４−６を有するＯＲＦベクターである；再び、ドナーフラグメント４−［７−＊］−６は、アクセプターフラグメント４−６を置換する。
【０２４７】
一旦、左端または右端が加えられると、その端は、他の端での伸長についての可能性を妨害することなく、標準的な内部伸長手順によって任意の回数、伸長され得る。左端および右端が加えられた後任意のときに、内部型のライブラリー遺伝子フラグメントによる左および／または右での任意の伸長とともに、この手順は、［＊−８］および［７−＊］のＯＲＦ構築ベクターを切断し、２つの＊部位に作製される突出（または、ブラント末端型ＩＩＳの場合、ブラント末端）を接続することによって終結され得る。
【０２４８】
内部型、左端型、および右端型の構築がまた、次のセクションで記載される「ＯＲＦ１」型ベクターにおいて、ＯＲＦ１ベクターおよびＯＲＦ２ベクターの制限部位における差異を考慮する上記方法の改変を使用して、なされ得ることが明らかである。
【０２４９】
（６．４．３  例示的なＯＲＦベクター構築方法）
このセクションは、マルチモジュール遺伝子を構築するための３つの例示的な方法を記載した。与えられる例は、上記のようなＯＲＦベクター中の構築を示すが、各アプローチの多くの改変が可能であり、示されるクローニングストラテジーが他の文脈で使用され得ることが当業者に明らかである。簡潔さのために、以下の方法は、セクション６．４．３において上で考察されるアミノ末端領域およびカルボキシ末端領域（例えば、補助ユニット）をコードする配列の存在無しで示される。しかし、このような領域の可能な包含は、読者に明らかである。
【０２５０】
（例示的構築方法１）
この例示的な方法において、独特のＮｏｔ  Ｉ部位（４）および独特のＥｃｏ  １部位（６）がシントン挿入部位に隣接するアセンブリベクターを使用する。従って、モジュール遺伝子は、各々が、（ａ）モジュール遺伝子がＮｏｔ  Ｉ部位もＥｃｏ  ＲＩ部位も含まないように設計される。さらに、ライブラリーの各モジュール遺伝子が、モジュールの５’／アミノ末端に、独特のＳｐｅ  Ｉ（５）部位およびモジュールの３’／カルボキシ末端に独特のＸｂａ  Ｉ部位（２）を有して設計されることがこの例において想定される（図６を参照のこと）。モジュール含有アセンブリベクターの構造は、以下のように記載され得る：
【０２５１】
【化４】
2006517090.tif 000015
【０２５２】
ここで、「モジュール」は、モジュール遺伝子をいい、括弧内の領域は、モジュール境界を示す（すなわち、この例において、部位５および２は、モジュール遺伝子内にある）。このようなモジュール含有アセンブリベクター（モジュールＡ、Ｂ、Ｃ、．．．を含む）のライブラリーは、以下のように記載され得る：
【０２５３】
【化５】
2006517090.tif 000016
【０２５４】
【化６】
2006517090.tif 000017
【０２５５】
など。ライブラリーのモジュール含有アセンブリベクターは、「アセンブリベクター」または「ライブラリーベクター」と呼ばれ得る。
【０２５６】
マルチモジュール遺伝子構築物を合成するために、ＯＲＦ（「オープンリーディングフレーム」）ベクターは、操作のために使用される。この例において、ＯＲＦベクターは、以下の構造を有し得る：
１−２−３−４−５−６−      ［ＯＲＦ１］
Ｎｄｅ  Ｉ部位（１）（メチオニン開始コドンを含む）は、簡便である。なぜなら、理解されるように、オープンリーディングフレームのアミノ末端の範囲を制限するために使用され得るからである；しかし、全ての実施形態において必要とされるわけではない（例えば、メチオニン開始コドンは、ＯＲＦベクターによって提供されるよりもむしろ、モジュール内に設計され得る）。この構築物のＰａｃ  Ｉ部位（３）は、制限分析に有用であるが、これもまた必要ではない（最終のＯＲＦ構築物にＰａｃＩ部位が無いことは、３−４によって範囲を制限された領域が、産生プロセスの間に首尾良く除去されたことを示す；以下を参照のこと）。
【０２５７】
ＯＲＦベクター内への第１のモジュール遺伝子（例えば、モジュールＡ遺伝子）を挿入するために、ＯＲＦベクターを、Ｎｏｔ  Ｉ（４）部位およびＳｐｅ  Ｉ（５）を用いて消化し、ライブラリーベクターを、Ｎｏｔ  Ｉ（４）部位およびＸｂａ  Ｉ（２）を用いて消化し、そしてライブラリーベクターの４−２フラグメントを、ＯＲＦベクター内にクローニングし、以下を産生させる：
【０２５８】
【化７】
2006517090.tif 000018
【０２５９】
。
【０２６０】
制限部位２および５は、連結した場合、両方の部位（２／５）を破壊する適合性の粘着性末端を有する。第２のモジュールを挿入するために、このプロセスが繰り返される；モジュールＡを含むＯＲＦベクターを、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＳｐｅ  Ｉ（５）で消化し、そして第２のライブラリーベクターの４−２フラグメントをＯＲＦベクター内にクローニングし、以下を産生する：
【０２６１】
【化８】
2006517090.tif 000019
【０２６２】
。
さらなるモジュール、付属ユニット、または他の配列を類似の様式で加え得る。
【０２６３】
（例示的な構築方法２）
第２の例示的な方法において、ＩＩＳ型制限酵素を使用する（セクション４において上記される）。この場合、ライブラリーのモジュール遺伝子含有アセンブリベクターの構造は、以下のように記載され得る：
【０２６４】
【化９】
2006517090.tif 000020
【０２６５】
ここで、７および８は、粘着性末端および適合性末端を形成し得るＩＩＳ型酵素についての認識部位（例えば、同じ長さおよび配向の突出を有する）であり、＊は、以下に記載されるように、共通の配列モチーフである。明瞭さのために、以下の考察において、７は、Ｂｂｓ  Ｉであり、８は、Ｂｓａ  Ｉである。この場合、モジュールは、（ａ）モジュール遺伝子がＢｂａ  Ｉ（７）部位もＢｓａ  Ｉ（８）も含まず、Ｎｏｔ  Ｉ（４）部位を含まないように設計される。
【０２６６】
ＩＩＳ酵素７および８の作用による粘着性末端および適合性末端の作製は、共通の配列モチーフが、モジュールの各末端に存在し得、そしてＩＩＳ型認識部位が、共通の配列モチーフの配列を有する突出を産生するように位置づけられることを必要とする。１つの実施形態において、モジュールの異なる末端に位置づけられる（例えば、図６において）、Ｘｂａ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉについての制限部位は、簡便さのために使用される。この実施形態において、共通の配列モチーフは、５’−ＣＴＡＧ−３’、Ｘｂａ  Ｉ（５’−Ｔ∧ＣＴＡＧＡ−３’／３’−ＡＧＡＴＣ∧Ｔ−５’）およびＳｐｅ  Ｉ部位（５’−Ａ∧ＣＴＡＧＴ−３’／３’−ＴＧＡＴＣ∧Ａ−５’）の両方の中心領域である。Ｂｂｓ  ＩおよびＢｓａ  Ｉによる切断は、適合性の粘着性末端（５’−ＮＮＮＮＣＴＡＧ−３’）を産生する。重要なことには、共通の配列モチーフが、制限部位（または任意の特定の制限部位）を必要とせず、任意の数のモチーフが使用され得ることが認識される。モジュール配列内への共通の配列モチーフの導入が、ライブラリーによってコードされるポリペプチドの機能（例えば、生物学的機能）を破壊することもまた認識される。本明細書中の他で考察されるように、Ｓｐｅ  Ｉ部位およびＸｂａ  Ｉ部位の導入は、この用件を満たすと予期される；代替は、例えば、Ａｌａ−Ａｌａをコードするモチーフ（周りの遺伝子配列と組み合わせて）である。
【０２６７】
マルチモジュール構築物を合成するために、以下の構造を有するＯＲＦベクターが使用され得る：
−１−＊−８−３−４−７−＊−６−      ［ＯＲＦ２］。
【０２６８】
第１のモジュール（例えば、モジュールＡ）をＯＲＦベクター内に挿入するために、ＯＲＦベクターを、Ｎｏｔ  Ｉ（４）部位およびＳｐｅ  Ｉ（７）を用いて消化し、ライブラリーベクターを、Ｎｏｔ  Ｉ（４）部位およびＢｓａ  Ｉ（８）を用いて消化する。モジュール含有フラグメント（Ｎｏｔ  Ｉ粘着性末端およびＳｐｅ  Ｉと適合性の第２の粘着性末端を備える）を、ＯＲＦベクター内にクローニングし、以下を産生する：
【０２６９】
【化１０】
2006517090.tif 000021
【０２７０】
。
【０２７１】
第２のモジュールを挿入するために、アセンブリベクターを、第１のモジュールについてのように消化し（例えば、
【０２７２】
【化１０Ａ】
2006517090.tif 000022
【０２７３】
を生じ）、そしてモジュールＡを含むＯＲＦベクターを、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＢｂｓ  Ｉ（７）を用いて消化し、以下を産生する：
【０２７４】
【化１１】
2006517090.tif 000023
【０２７５】
この構築物を、Ｂｂｓ  Ｉ（７）およびＢｓａ  Ｉ（８）の両方を用いて切断して、以下を産生し得る：
【０２７６】
【化１２】
2006517090.tif 000024
【０２７７】
。
【０２７８】
（例示的な構築方法３）
この例示的な方法において、独特のＮｏｔ  Ｉ部位（４）および独特のＰａｃ  Ｉ部位（３）が、シントン挿入部位に隣接するアセンブリベクターを使用して、ＰＫＳモジュール遺伝子のライブラリーを作製し、この各々が、（ａ）モジュール遺伝子がＮｏｔ  ＩもＰａｃ  Ｉも含まないように設計する。さらに、このモジュール遺伝子は、モジュール遺伝子の５’末端に独特のＳｐｅ  Ｉ（５）部位、およびモジュールの３’末端にＸｂａ  Ｉ部位（２）を有する。
【０２７９】
ライブラリー中のモジュール遺伝子含有アセンブリベクターの構造は、以下のように記載され得る：
【０２８０】
【化１３】
2006517090.tif 000025
【０２８１】
このようなアセンブリベクターのライブラリーは、以下のように記載され得る：
【０２８２】
【化１４】
2006517090.tif 000026
【０２８３】
例示的な方法３を使用して、モジュール遺伝子は、ベクターにおいて二方向で組み立てられ得る。例えば、モジュールＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅについてのベクター含有遺伝子を作製するために、モジュール遺伝子は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ；Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、Ａ；Ｃ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ａ；などの順序でベクターに個々に加えられ得る。
【０２８４】
以下の部位
１−２−３−４−５−６−      ［ＯＲＦ１］
を有するＯＲＦベクターを使用して、第１のモジュール遺伝子（Ａ）を、モジュールにおいてＮｏｔ  Ｉ（４）およびＸｂａ  Ｉ（２）を用いて切断し、Ｎｏｔ  Ｉ（４）およびＳｐｅ  Ｉ（５）を用いてＯＲＦベクターを消化することによって導入され得、以下
【０２８５】
【化１５】
2006517090.tif 000027
【０２８６】
を生じるか、あるいはアセンブリベクターにおけるＳｐｅ  Ｉ（５）およびＰａｃ  Ｉ（３）ならびにＯＲＦベクター中のＸｂａＩ  （２）およびＰａｃ  Ｉ（３）を用いて消化切断して、以下の生じる構築物を得ることができる：
【０２８７】
【化１６】
2006517090.tif 000028
【０２８８】
第２のモジュール遺伝子（モジュールＢ遺伝子）を構築物ＩＩＩのモジュールＡの左に加えるために、モジュールＢを含むアセンブリベクターを、Ｓｐｅ  Ｉ（５）およびＰａｃ  Ｉ（３）を用いて消化し、そしてモジュールＡ遺伝子を含むＯＲＦベクターを、ＸｂａＩ  （２）およびＰａｃ  Ｉ（３）を用いて消化し、以下を得る：
【０２８９】
【化１７】
2006517090.tif 000029
【０２９０】
次いで、さらなるモジュールを、モジュールＢの隣またはモジュールＡの隣のいずれかで、構築物（Ｖ）に加え得る。例えば、構築物：
【０２９１】
【化１８】
2006517090.tif 000030
【０２９２】
が作製され得る。構築物（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）は、Ｓｐｅ  Ｉ（５）およびＸｂａ  Ｉ（２）を用いて消化され、２−５フラグメントを除去し、単一のオープンリーディングフレームに連続モジュールを含むポリペプチドをコードする遺伝子を産生する。
【０２９３】
これらの方法を使用して作製されたモジュール含有オープンリーディングフレームは、ＯＲＦベクターから切り出され得、そして発現ベクター内に挿入される。例えば、上記の例において、オープンリーディングフレームは、Ｎｄｅ  Ｉ（１）およびＥｃｏ  ＲＩ（６）部位を使用して切り出され得る。
【０２９４】
上記例が、マルチモジュール遺伝子構築物の作製のためにアセンブリモジュールのライブラリーを使用するための能力を説明するためだけであることが理解される。制限部位、酵素、共通配列モチーフおよび切断部位の種々の他の組み合わせが、先の段落に示される結果を達成するために使用され得ることが認識される。例えば、ライブラリー（またはツールボックス）は、４つのモジュールおよび付属ユニット（例えば、上記［ＶＩ］およびＶＩＩ］のような構築物）の種々の組み合わせを含む不完全なＯＲＦを含み得る。
【０２９５】
【化１９】
2006517090.tif 000031
【０２９６】
このようなライブラリーは、例えば、産生的であることが公知であるかまたは産生的であるようであると考えられるモジュールの組み合わせを含み得る。このようなライブラリーを使用して、ＰＫＳモジュールまたはＮＲＰＳモジュールの活性、あるいは他のポリペプチドセグメントが、種々の環境で試験され得る。多くの有用なライブラリーが本明細書中に開示される方法によって可能にされ得ることが上記考察から明らかである。
【０２９７】
（７．天然に存在する組み合わせに基づくマルチモジュール設計）
ポリケチドシンターゼをコードする合成遺伝子の設計のための代替的ストラテジーまたは相補的ストラテジーは、Ｋｈｏｓｌａら、ＷＯ０１／９２９９１（「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ」に記載されるもに基づき、ここで、開始点は、所望のポリケチド（例えば、天然に存在するポリケチドまたは天然に存在するポリケチドの新規なアナログ）である。１つのストラテジーにおいて、所望のポリケチドの構造を、ポリケチドを「鋸歯」形式に変換し（すなわち、線形化され、任意の合成後改変が除去される）、そしてポリケチドを記載するストリングを作製するために、ポリケチドに見いだされる可能な２−炭素ケチドユニットのそれぞれに対応する一文字コードを割り当てることによってポリケチドコード（ストリング）を割り当てる。所望のポリケチドのケチドユニットを、ポリケチドを産生し得る可能なモジュールを決定することによってモジュールコードに変換する。次いで、モジュールコードを、公知のポリケチドシンターゼに対応するモジュールコードと整列させ（好ましくは、このような構造のデータベースのコンピュータ実行走査による）、天然において機能するモジュールの組み合わせを同定する。
【０２９８】
本発明の一つの実施形態において、モジュール配列の潜在的供給源は、公知のＰＫＳモジュールを有する所望のポリケチドを生成し得る概念的モジュールのアラインメントに基づいて選択される。アラインメントは、例えば、非ネイティブのモジュール間界面および／もしくはタンパク質間界面を最小化することによって、並べられ得る。例えば、構造ＬＤ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆを有する遺伝子を合成するため（ここで、ＬＤは、ローディングドメインであり、そしてＡ〜Ｅは、ＰＫＳモジュールである）、そのアラインメントは、表６に示された結果をもたらし得る。
【０２９９】
【表６】
2006517090.tif 000032
【０３００】
この例では、いくつかの供給源が、以下のモジュール配列：ＬＤ  Ａ、Ｂ−Ｃ、Ｄ−Ｅ−Ｆ、の各々について同定される。Ａ−ＢとＣ−Ｄとの接合部は、接続されて、機能的ＰＫＳを形成する。いくつかのモジュール配列は、他よりもよく目的にかない得る。例えば、配列＃２および＃３は、両方ともＢ−Ｃの供給源として役立ち得る；しかし、配列＃２では、Ｂの天然の基質は、Ａの産物であり、したがって、より生産性が高い可能性があり得る。
【０３０１】
（８．ドメインの置換）
いくつかの実施形態において、本発明は、機能ドメインの境界に有用な制限酵素認識部位を含む合成モジュール遺伝子のライブラリを提供する（例えば、図４を参照のこと）。これらの部位はライブラリ全体で共通であるため、「ドメイン交換」が容易に達成され得る。例えば、ＫＳドメインのＣ末端に独特のＰｓｔ  Ｉ部位を有し、かつＡＴドメインのＣ末端に独特のＫｐｎ  Ｉ部位を有するモジュール遺伝子（例えば、図４を参照のこと）において、これらのモジュールのＡＴドメインは除去されて、交換され得るこれらの部位に結合された遺伝子をコードする、異なるＡＴドメインに置換され得る。
【０３０２】
例えば、本発明の方法を用いて、１５０の合成モジュール遺伝子（各々は、異なる天然に存在するモジュール遺伝子に対応する）のライブラリが合成され得る。ここで、各合成遺伝子は、その遺伝子の５’末端に独特のＳｐｅ  Ｉ制限酵素認識部位を、その遺伝子の３’末端にＸｂａ  Ｉ制限酵素認識部位を、各ＫＳドメインコーディング領域の３’境界にＫｐｎ  Ｉ制限酵素認識部位を、そして各ＡＴドメインコーディング領域の３’境界にＰｓｔ  Ｉ制限酵素認識部位を有する。次いで、１５０モジュールのいずれかが、分析、操作および発現のため、一般的なベクターまたはベクターのセット中でクローン化され得、そしてドメインもしくはドメインの組み合わせの交換もしくは置換を可能にし得る。例えば、上記の例では、Ｋｐｎ  Ｉ部位およびＰｓｔ  Ｉ部位が、ＫＳドメインに続いてＡＴドメインを有する任意のモジュールで、ドメインを交換するために使用され得る。
【０３０３】
（９．例示的産物）
（９．１  合成ＰＫＳモジュール遺伝子）
一局面において、本発明は、基準ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子にコードされる配列は、天然に存在する、基準ポリペプチドセグメントをコードする遺伝子の配列とは異なる）。例えば、一つの実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳのドメインに対応するＰＫＳドメインをコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子にコードされる配列は、天然に存在するＰＫＳをコードする遺伝子の配列とは異なる）。例示的ドメインとしては、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、ＭＴ、およびＴＥが挙げられる。関連する実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳのＰＫＳモジュールの一部に対応するＰＫＳモジュールの少なくとも一部をコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子にコードされる配列は、天然に存在するＰＫＳをコードする遺伝子の配列とは異なり、そしてこのＰＫＳモジュールの一部は、少なくとも二つ、時には少なくとも三つ、そして時には少なくとも四つのＰＫＳドメインを含む）。関連する実施形態において、本発明は、天然に存在するＰＫＳのＰＫＳモジュールに対応するＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を提供する（ここで、この合成遺伝子にコードされる配列は、天然に存在するＰＫＳをコードする遺伝子の配列とは異なる）。一つの実施形態において、合成遺伝子をコードするポリペプチドセグメントは、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、もしくは少なくとも約１００の、連続した、天然に存在する遺伝子をコードするアミノ酸残基に対応する。
【０３０４】
合成コード配列と天然に存在するコード配列との間の差は、以下を包含し得る：（ａ）合成遺伝子のヌクレオチド配列が、天然に存在する遺伝子のそれと約９０％未満同一であり、時には約８５％未満同一であり、そして時には約８０％未満同一である；および／または（ｂ）合成遺伝子のヌクレオチド配列が、少なくとも一つの独特の制限酵素認識部位（天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列中には存在しないか、もしくは独特ではない）を含み；および／または（ｃ）合成遺伝子でのコドン使用頻度分布が、天然に存在する遺伝子のそれと実質的に異なる（例えば、合成遺伝子および天然に存在する遺伝子によってコードされるポリペプチド中で同一である各アミノ酸について、同じコドンが、その約９０％未満、時には約８０％未満、時には約７０％未満、使用される）；および／または（ｄ）その合成遺伝子のＧＣ含有量が、天然に存在する遺伝子のそれと実質的に異なる（例えば、％ＧＣが、約５％より多く、通常は約１０％より多く、異なる）。
【０３０５】
上記のアプローチにおいて、個々のドメイン、リンカー、ドメインの組み合わせ、およびモジュール全体のアミノ酸配列は、公知の（例えば、天然に存在する）ドメインおよびモジュールの配列に基づき（すなわち、対応し）得る。本明細書中で使用される場合、第一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、もしくは少なくとも六つの、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、およびＥＲから選択されるＰＫＳドメインをコードする配列）は、配列が実質的に同じである場合、第二のアミノ酸配列に対応する。本発明の種々の実施形態において、天然に存在するドメイン、リンカー、ドメインの組み合わせ、およびモジュールは、エリスロマイシンＰＫＳ、メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）ＰＫＳ、オレアンドマイシンＰＫＳ、ピクロマイシンＰＫＳ、ニダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ、スピラマイシンＰＫＳ、タイロシンＰＫＳ、ゲルダナマイシンＰＫＳ、ピマリシンＰＫＳ、ｐｔｅＰＫＳ、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）ＰＫＳ、オリゴマイシンＰＳＫ、ナイスタチンＰＫＳ、またはアンホテリシンＰＫＳのうちの一つに由来する。
【０３０６】
この状況において、アミノ酸配列は、それらが、少なくとも約９０％同一である場合、好ましくは、少なくとも約９５％同一である場合、さらにより好ましくは、少なくとも約９７％同一である場合、実質的に同じである。二つのアミノ酸配列間の配列同一性は、必要な場合ギャップを導入することにより、残基の整合性を最適化することによって、決定され得る。いくつかの有用な比較アルゴリズムの一つは、ＢＬＡＳＴである；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈら、１９９３，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ａｌｔｓｃｈｕｌｒａら、９９７，「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、を参照のこと。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４，「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−８０もまた参照のこと。（ＢＬＡＳＴおよびＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、または他のプログラムを用いる場合、初期設定パラメータが使用される。）
一局面において、本発明は、一つ以上のＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子（例えば、ＡＴ活性、ＡＣＰ活性、およびＫＳ活性をコードし、そして必要に応じて一つ以上のＫＲ活性、ＤＨ活性、およびＥＲ活性をコードする配列）を提供する。いくつかの実施形態において、この合成遺伝子は、モジュールをコードする配列あたり、多くとも一コピーの制限酵素認識部位（例えば、ＳｐｅＩ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＡｆｉＩＩ、Ｂｓｉ  ＷＩ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｎｇｏ  ＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、Ｂｓｓ  ＨＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ａｇｅ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、ＫａｓＩ、Ｍｌｕ  Ｉ、ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、Ｂｓｐ  Ｅ、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位）を有する。一つの実施形態において、本発明は、以下：ＰＫＳモジュールをコードする配列のアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｓｐｅ  Ｉ部位を有し；および／またはｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｍｆｅ  Ｉ部位を有し；および／またはｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近くに、Ｋｐｎ  Ｉ部位を有し；および／またはｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｍｓｃ  Ｉ部位を有し；および／またはｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近くに、Ｐｓｔ  Ｉ部位を有し；および／またはｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、ＢｓｒＢ  Ｉ部位を有し；および／またはｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ａｇｅ  Ｉ部位を有し；および／またはｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近くに、Ｘｂａ  Ｉ部位を有する、ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子をを提供する。本発明の合成遺伝子は、上記（ａ）〜（ｈ）のうちの少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つ、もしくは少なくとも八つを含み得る。
【０３０７】
関連する局面において、本発明は、本発明の合成遺伝子を含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。一つの実施形態において、本発明は、第一のＰＫＳモジュールならびに以下：（ａ）ＰＫＳ伸長モジュール；（ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；（ｃ）チオエステラーゼドメイン；および（ｄ）ポリペプチド間リンカー、のうちの一つ以上をコードする配列を含むベクターを提供する。例示的なベクターは、上記の７章に記載される。
【０３０８】
一局面において、本発明は、本発明の合成遺伝子もしくはベクターを含むか、またはこのようなベクターによってコードされるポリペプチドを含む細胞を提供する。関連する局面において、本発明は、機能的ポリケチドシンターゼ（少なくともその一部は、この合成遺伝子によってコードされる）を含む細胞を提供する。このような細胞は、例えば、培養もしくは発酵によってポリケチドを生成するために使用され得る。例示的な有用な発現システム（例えば、細菌および真菌細胞）は、上記の３章に記載される。
【０３０９】
（９．２  ベクター）
本発明は、本発明の方法（例えば、４章に記載された編成法、および７章に記載されたように構築されたマルチモジュールを用いた分析が挙げられる）に有用な多種多様なベクターを提供する。
【０３１０】
したがって、一局面において、本発明は、（ａ）ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１または（ｂ）Ｌ−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１を、示された順番でを含むクローニングベクターを提供する（ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第一選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第一と異なる第二選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素認識部位であり、そしてＬは、異なる制限酵素の認識部位である）。一つの実施形態において、ＳＩＳは、−Ｎ１−Ｒ２−Ｎ２−を含む（ここで、Ｎ１およびＮ２は、ニッキング酵素の認識部位であって、同じであってももしくは異なっていてもよく、そしてＲ２は、Ｒ１もしくはＬとは異なる制限酵素の認識部位である）。本発明はまた、このようなベクターならびにＲ１および／もしくはニッキング酵素（例えば、Ｎ．ＢｂｖＣ  ＩＡ）を認識する制限酵素を含む組成物を提供する。
【０３１１】
一局面において、本発明は、ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターを提供する（ここで、２Ｓ１は、第一のＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり、そしてＳｙは、シントンをコードする領域である）。一局面において、本発明は、Ｌ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターを提供する。一つの実施形態において、Ｓｙは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードする。一つの実施形態において、Ｂｂｓ  Ｉおよび／もしくはＢｓａ  Ｉは、ＩＩＳ型制限酵素として使用される。一つの実施形態において、本発明は、このようなベクターおよび２Ｓ１もしくは２Ｓ２のいずれかを認識するＩＩＳ型制限酵素を含む組成物を提供する。
【０３１２】
関連する局面において、本発明は、ベクターおよび２Ｓ１もしくは２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素（または、２Ｓ１を認識する第一のＩＩＳ型制限酵素および２Ｓ２を認識する第二のＩＩＳ型制限酵素）を含むキットを提供する。
【０３１３】
一実施形態において、本発明は、ベクターの同族対を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、「同族対」とは、本発明の編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）方法を実施するために組み合わせて使用され得る、一対のベクターを意味する。一実施形態において、上記組成物は、２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターと、２Ｓ１を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ５−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒ１を含むベクターとを含む。別の実施形態において、上記組成物は、２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＬ−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含むベクターと、２Ｓ１を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＬ’−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ３−Ｒ１を含むベクターとを含む。（ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３、ＳＭ４は、異なる選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素の認識部位であり、ＬおよびＬ’は、２つの異なる制限酵素の認識部位であり、各々は、Ｒ１と異なり、２Ｓ１および２Ｓ２は、２つの異なるＩＩＳ型制限酵素の認識部位であり、Ｓｙ１およびＳｙ２は、隣接するシントンであり、いくつかの実施形態において、これらのシントンは、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードし得る。）
関連する実施形態において、本発明は、第１選択マーカーと、第１制限酵素により認識される制限部位（Ｒ１）と、第１のＩＩＳ型制限酵素により認識される制限部位により隣接されるシントンコード領域と、第２のＩＩＳ型制限酵素により認識される制限部位とを含む、ベクターを提供し、上記第１制限酵素と第１のＩＩＳ型制限酵素とで上記ベクターを消化すると、上記第１選択マーカーと上記シントンコード領域とを含むフラグメントが生じ、上記第１制限酵素と上記第２のＩＩＳ型制限酵素とで上記ベクターを消化すると、上記シントンコード領域を含むが上記第１選択マーカーは含まない、フラグメントを生じる。一実施形態において、上記ベクターは、第２選択マーカーを含み、上記第１制限酵素と上記第１のＩＩＳ型制限酵素とでこのベクターを消化すると、上記第１選択マーカーと上記シントンコード領域を含むが上記第２選択マーカーは含まない、フラグメントを生じる。上記第１制限控訴と上記第２のＩＩＳ型制限酵素とで上記ベクターを消化すると、上記第２選択マーカーと上記シントンコード領域とを含むが上記第１選択マーカーは含まない、フラグメントを生じる。別の実施形態において、上記ベクターは、第３選択マーカーを含む。
【０３１４】
関連する局面において、本発明は、本明細書中に開示される方法のために有用な、ベクター、ベクター対、プライマー、および／または酵素を、キット形態で提供する。一実施形態において、上記キットは、編成方法において使用するための、上記のベクター対と、必要に応じて制限酵素（たとえば、ＩＩＳ型酵素）  とを備える。
【０３１５】
（９．３．ライブラリー）
一局面において、本発明は、本明細書中に記載される合成遺伝子の有用なライブラリー（「遺伝子ライブラリー」）を提供する。一例において、ライブラリーは、天然に存在するＰＫＳのモジュールに対応するモジュールをコードする、複数の遺伝子（たとえば、少なくとも１０個、よりしばしば少なくとも約１００個、好ましくは少なくとも約５００個、なおより好ましくは少なくとも約１０００個）を含み、上記モジュールは、１つより多くの天然に存在するＰＫＳを、通常は３個以上、しばしば１０個以上、時には１５個以上の天然に存在するＰＫＳを含む。一例において、ライブラリーは、１つより多くのポリケチドシンターゼタンパク質、通常は３個以上、しばしば１０個以上、時には１５個以上のポリケチドシンターゼタンパク質に由来するドメインに対応するドメインをコードする遺伝子を含む。一例において、ライブラリーは、１つより多くのポリケチドシンターゼモジュール、通常は５０個以上、時には１００個以上のポリケチドシンターゼモジュールに由来するドメインに対応するドメインをコードする遺伝子を含む。
【０３１６】
本発明のいくつかの局面において、上記ライブラリーのメンバーは、共有される特徴（例えば、共有される構造的特徴または機能的特徴）を有する。一実施形態において、上記共有される構造的特徴は、共有される制限部位（例えば、遺伝子中または遺伝子の指定された機能性ドメイン中で稀または独特である、共有される制限部位）である。例えば、一実施形態において、本発明のライブラリーは、遺伝子を含み、その遺伝子の各々は、ＰＫＳモジュールをコードし、上記遺伝子のモジュールコード領域は、少なくとも３つの独特な制限部位（例えば、Ｓｐｅ  Ｉ認識部位、Ｍｆｅ  Ｉ認識部位、Ａｆｉ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ  ＷＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ｎｇｏ  ＭＩＶ認識部位、Ｎｈｅ  Ｉ認識部位、Ｋｐｎ  Ｉ認識部位、Ｍｓｃ  Ｉ認識部位、Ｂｇｌ  ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ  ＨＩＩ認識部位、Ｓａｃ  ＩＩ認識部位、Ａｇｅ  Ｉ認識部位、Ｐｓｔ  Ｉ認識部位、Ｂｓｔ  ＢＩ認識部位、Ｋａｓ  Ｉ認識部位、Ｍｌｕ  Ｉ認識部位、Ｘｂａ  Ｉ認識部位、Ｓｐｈ  Ｉ認識部位、Ｂｓｐ  Ｅ認識部位、およびＮｇｏ  ＭＩＶ認識部位）を共有する。一実施形態において、本発明のライブラリーは、１つより多くのＰＫＳモジュール各々をコードする遺伝子を含み、各モジュールコード領域は、少なくとも３つの独特な制限部位を共有する。いくつかの実施形態において、共有される制限部位の数は、４より多いか、５つより多いか、または６つより多い。共有される制限部位の例示的部位および位置としては、ａ）上記モジュールコード配列のアミノ末端をコードする配列付近のＳｐｅ  Ｉ部位；および／またはｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＭｆｅ  Ｉ部位；および／またはｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列付近のＫｐｎ  Ｉ部位；および／またはｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＭｓｃ  Ｉ部位；および／またはｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列付近のＰｓｔ  Ｉ部位；および／またはｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＢｓｒＢ  Ｉ部位；および／またはｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＡｇｅ  Ｉ部位；および／またはｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列付近のＸｂａ  Ｉ部位が挙げられる。
【０３１７】
一局面において、上記ライブラリーの遺伝子は、クローニングベクターまたは発現ベクター中に含まれる。一局面において、ライブラリー中のＰＫＳモジュールコード遺伝子はまた、さらなる機能性ドメイン（例えば、１つ以上のＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはポリペプチド間リンカー）のインフレームコード配列を有する。
【０３１８】
（９．４．データベース）
一局面において、本発明は、配列情報を記憶しているコンピューター読出し可能な媒体を提供する。上記コンピューター読出し可能な媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードドライブ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読出専用記憶（ＲＯＭ）、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気テープなどが挙げられる。さらに、搬送波中（例えば、Ｉｎｔｅｒｎｅｔを含むネットワーク中）で具体化されるデータシグナルは、コンピューター読出し可能な記憶媒体であり得る。記憶された配列情報は、例えば、（ａ）本発明の合成遺伝子のＤＮＡ配列またはコードされるポリヌクレオチド、（ｂ）本発明のポリヌクレオチドのアセンブリのために有用なオリゴヌクレオチドの配列、（ｃ）本発明の合成遺伝子の制限地図であり得る。一実施形態において、上記合成遺伝子は、ＰＫＳドメインまたはＰＫＳモジュールをコードする。
【０３１９】
（１０．ハイスループットなシントン合成およびシントン分析）
（１０．１合成の自動化）
本明細書中に記載される遺伝子合成方法は、例えば、ハイスループットな遺伝子合成および遺伝子分析のためのコンピューター指向性ロボットシステムを使用して、自動化され得る。自動化され得る工程としては、シントン合成、シントンクローニング、形質転換、クローン採取（ｐｉｃｋｉｎｇ）、および配列決定が挙げられる。特定の実施形態についての以下の説明は、例示のためであって、本発明を限定することは意図しない。
【０３２０】
図１９に示されるように、本発明は、液体取り扱い機１２（例えば、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体取り扱い機；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）と、この液体取り扱い機１２に接続されたランダムアクセスホテル１４（例えば、ＣｙｔｏｍａｔＴＭ  Ｈｏｔｅｌ；Ｋｅｎｄｒｏ）とを備える、自動システム１０を提供する。液体取り扱い機１２は、システム１０中で使用されるマイクロプレートおよび他の容器を受容し得る複数の位置Ｐ１〜Ｐ１９を備える。下記に考察されそして図１９に示されるように、上記の位置のうちの多数が、さらなる機能を備える。ランダムアクセスホテル１４は、各々がオリゴヌクレオチド溶液を保有する１つ以上の供給源マイクロプレート、シントンアセンブリウェルを含む１つ以上のＰＣＲプレート１８、およびＬＩＣ伸長プライマー（例えば、ウラシル含有オリゴヌクレオチド）の１つ以上の（必要に応じた）供給源２０を貯蔵可能であり、そして、プレートおよびピペット先端を液体取り扱い機１２へと送達可能である。いくつかの実施形態において、上記ホテルは、＞５、１０＞、または＞２０個のマイクロプレート（例えば、＞５０、＞１００、または＞２００個の異なるオリゴヌクレオチド溶液）を含む。図１９の例において、供給源２０は、微量遠心管を備える。供給源２０はまた、バイアルまたは他の適切な任意の容器であり得る。ランダムアクセスホテル１４は、プライマー混合、ＰＣＲ関連手順、配列決定、および他の手順のために使用される。一実施形態において、液体取り扱い機１２は、位置Ｐ４にある加熱エレメント２２を備えるデッキ２１と、位置Ｐ１２にある冷却エレメント２３とを備える。デッキ２１はまた、図１９の例において位置Ｐ７に位置する、自動読み取りデバイス２４（例えば、バーコード読み取り機）を備え得る。システム１０はまた、サーマルサイクラー２６、プレートリーダー２８、プレートシーラー３１、およびプレート穿孔機３０を備える。上記読み取りデバイス２４は、データを追跡可能であり、上記第６節において考察されるような、ライブラリーの圧縮および拡大のためのヒット採取（ｐｉｃｋｉｎｇ）を可能にする。ヒット採取（ｐｉｃｋｉｎｇ）は、例えば、ユーザーの入力に従ってライブラリーからクローンを再配置するために有用であり得る。
【０３２１】
ランダムアクセスホテル３２は、ハイスループットプライマー（オリゴヌクレオチド）混合のために必要なプレート貯蔵を提供し、プラスミド調製および配列決定の間のユーザーの介入を減少させる。プレートリーダー２８は、サンプルのＤＮＡ濃度を測定するための分光光度計を備える。プレートリーダー２８から得られるデータは、配列決定の前にＤＮＡ濃度を正規化するために使用される。サーマルサイクラー２６は、遺伝子合成のために必要なＰＣＲ工程のための可変式温度インキュベーターとして役立つ。上記読み取りデバイス２４は、サンプル追跡のために組み込まれる。システム１０はまた、システム１０の中の異なるエレメントの間（例えば、液体取り扱い機１２と、ランダムアクセスホテル１４との間）を、サンプルおよびプレートを輸送するためのロボットアーム４０を備える。
【０３２２】
例示的のためであって如何なる限定としてでもないが、合成は、以下の様式で自動化され得る。
【０３２３】
（プライマー混合）  ロボットアーム４０が、液体取り扱い機１２に接続され、ランダムアクセスホテル１４から液体取り扱い機１２へと、１つ以上の供給源マイクロプレートおよびＰＣＲプレートを輸送する。液体取り扱い機１２は、適切な量の約２５種のオリゴヌクレオチドを、供給源マイクロプレート１６から、ＰＣＲプレート１８の「シントンアセンブリ」ウェルへと、各ウェルがシントンを生成するために必要な等モル量のプライマーを含むように、提供する。各プライマー混合物は、上記のような、異なるプライマー（オリゴヌクレオチド）を含むので、スプレッドシードプログラムが、どのプライマーがどのシントンアセンブリウェルに対応するかを決定するために、プライマーを同定して液体取り扱い機１２に必要なデータを抽出するために、必要に応じて利用される。一実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの位置および目的地を同定するＧＥＭＳ出力からのデータが、液体取り扱い機１２について対応する転移データを生成するために使用される。一実施形態において、ホテル１４は、マイクロウェル型プレートの異なるウェル中に、少なくとも約５０種、少なくとも約１００種、少なくとも約１５０種、少なくとも約２００種、または少なくとも約１０００種のオリゴヌクレオチド混合物を保有する。
【０３２４】
（ＰＣＲによるシントン合成）  一旦ＰＣＲプレート１８にプライマー混合物が充填されると、液体取り扱い機１２は、アセンブリＰＣＲ増幅混合物（ポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、および「シントンアセンブリ」のために必要な他の成分を含む）を、各ウェルに送達し、ＰＣＲが、その中で実施される。ロボットアーム４０は、ＰＣＲプレート１８を、プレートシーラー３１へと移動して、ＰＣＲプレート１８をシールする。シールした後、ＰＣＲプレート１８は、ロボットアーム１８によって、サーマルサイクラー２６へと移動される。
【０３２５】
ウラシルを含むＬＩＣ伸長物が、第２ＰＣＲ工程によって、液体取り扱い機１２によってＰＣＲ産物（アンプリコン）へと、添加される。この第２ＰＣＲ工程において、ＬＩＣ伸長物を含むプライマーが、各ウェルに添加され（ＬＩＣ伸長混合物）、「連結されたシントン」が調製される。
【０３２６】
シントンクローニング混合物は、連結されたシントンと、シントンアセンブリベクターとを、液体取り扱い機１２において合わせることによって、調製される。その後、各シントンクローニング混合物は、形質転換用のコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む姉妹プレートへと移される。この姉妹プレートは、冷却エレメント１２に位置する。形質転換後、各ウェル中の細胞は、ペトリ皿上に広げられ、これがインキュベートされて、単離クローンが形成される。
【０３２７】
細菌細胞培養物のインキュベーションの後、上記プレートは、インキュベーター５４から自動コロニー採取機５０（例えば、Ｍａｎｔｉｓ；Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）へとロボットアーム４０によって移される。自動コロニー採取機５０は、プレート上の５〜１０個の単離コロニーを同定し、それらを採取し、そしてそれらを、液体増殖培地を含む深ウェルタイタープレート５２の個々のウェルに配置する。
【０３２８】
液体増殖培地が、例えば、上記のように、配列決定用のＤＮＡを調製するために使用される。その後、液体取り扱い機１２は、両方の方向でプライマーを使用する配列決定反応を設定する。配列決定は、自動配列決定機（例えば、ＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡ配列決定機）を使用して実行される。
【０３２９】
その配列は、下記のように分析される。
【０３３０】
（１０．２．クロマトグラムの迅速な分析（ＲＡＣＯＯＮ）
遺伝子合成における障害は、シントンからのＤＮＡ配列決定データの分析であり得る。例えば、単一のシントンの配列分析には、両方の方向で５つのクローンを配列決定することが必要であり得る。一実施形態において、代表的ＰＫＳ遺伝子は、各々５つの順方向配列および５つの逆方向配列を用いる、１００個のシントンの分析（合計１０００個の配列）を含み得る。
【０３３１】
大きな遺伝子の合成における精度を確保するために、それらの結果の迅速な分析が、図１４の模式図に示されるようなＲＡＣＯＯＮプログラムによって実施される。合成遺伝子の配列（この合成遺伝子は、複数のシントンへと分割される）、上記複数のシントンの各シントンがベクター中にクローン化されているシントンクローンの配列、インサートを含まないベクターの配列が、プログラム１９１２に入力される。さらに、各シントン配列を特定のクローンまで追跡するＤＮＡ配列決定機追跡データもまた、提供される（１９１２）。すべての読み取りについて、ヌクレオチド配列は、各クローン化サンプルについて（塩基呼び出しにより）分析され（１９１０）、サンプル配列中に存在するベクター配列が、除去される（１９２０）。ハイスループット配列決定におけるデータ処理ソフトウェアの精度を改善するためおよびその精度の信頼可能な測定において、塩基呼び出しプログラム（ＰＨＲＥＤ）が、各塩基呼び出しについての誤りの確率を、追跡データからコンピューターにより得た特定のパラメータの関数として評価するために、使用される。完全な合成遺伝子セグメントを示す重複するシントンクローンの連結ライブラリーの相対次数を示す地図が、構築され（「コンティグマップ」）（１９３０）、そのコンティグ配列は、合成遺伝子１９４０の参照配列に対して整列される。上記プログラムは、各サンプルについての誤りおよび整列スコアを同定し（１９５０）、サンプルの順位付け、置換−挿入−欠失の誤り、選択または修復のために最も可能性がある候補を示す、包括的報告を作成する（１９６０）。
【０３３２】
単一シントンの調製は、両方の方向で５つのクローンを配列決定することを包含し得る。これらの配列が呼び出され、ベクター配列が、ＰＨＲＥＤ／ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨにより除去される。次に、これらの配列は、整列のためにＰＨＲＡＰへと送られ、ユーザーは、データを分析する：正確な（存在する場合は）配列が、望ましい配列との比較により選択され、他のものある誤りが、捕捉され、そして将来の統計的比較のために分析される。
【０３３３】
このＲａｃｏｏｎアルゴリズムは、このプロセスの冗漫な手動部分を自動化するために開発された。ＰＨＲＥＤは、ＤＮＡ配列決定機追跡データを読出し、塩基を呼び出し、それらの塩基に品質値を割り当て、それらの塩基呼び出しおよび品質値を記載してファイルを出力する。ＰＨＲＥＤは、ＳＣＦファイルおよびＡＢＩモデル３７３および３７７のＤＮＡ配列決定機ファイルから追跡データを読出し得、ファイル形式を自動検出する。塩基を呼び出した後、ＰＨＲＥＤは、いずれかのＦＡＳＴＡ形式、ＸＢＡＰに適切な形式、ＰＨＤ形式、またはＳＣＦ形式にて、配列をファイルへと書き出す。上記塩基についての品質値は、ＦＡＳＴＡ形式ファイルまたはＰＨＤファイルへと書き出され、これらのファイルは、アセンブルされた配列の精度を増加するためにＰＨＲＡＰ配列アセンブリプログラムにより使用され得る。Ｒａｃｃｏｎは、各クローンの順方向配列および逆方向配列を統合し、その複合体を、同じシントン由来の他のものと整列するために、ＰＨＲＡＰへと送る。このソフトウェアは、正確な配列を呼び出し、すべてのクローン中の誤りの位置、型（挿入、欠失、置換）および数を同定して集計する。これはまた、サイレント変異、アミノ酸変化、望ましくない制限部位、およびそのサンプルを不適格し得る他のパラメータも検出する。その後、ユーザーは、どのようにそのデータ（誤り分析、統計など）を使用するかを決定する。
【０３３４】
Ｒａｃｃｏｎの特徴としては、（ｉ）複数のデータ形式（ＳＣＦ、ＡＢＩ、ＥＳＤ）を読み取ること；（ｉｉ）塩基呼び出し、アライメント、ベクター配列除去およびアセンブリを実施すること；（ｉｉｉ）複数の９６ウェルプレートサンプルを分析することについてのハイスループット能力；（ｉｖ）１サンプル当たりの挿入、欠失、および置換、ならびにサイレント変異を検出すること；（ｖ）サイレント変異により生じる望ましくない制限部位を検出すること；（ｖｉ）さらなる分析用のデータベースに結果がダウンロードまたは記憶され得る、サンプルセットについての統計学的報告を作成することが挙げられる。
【０３３５】
このＲａｃｏｏｎシステムは、以下のソフトウェア成分を使用して実施される：Ｐｈｒｅｄ，Ｐｈｒａｐ，Ｃｒｏｓｓ＿Ｍａｔｃｈ（Ｅｗｉｎｇ  Ｂ，Ｈｉｌｌｉｅｒ  Ｌ，Ｗｅｎｄ  Ｍ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐ：Ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｒｅｄ  Ｉ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ８，１７５〜１８５（１９９８）；Ｅｗｉｎｇ  Ｂ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐ：Ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｒｅｄ  ＩＩ．  Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｌｉｔｉｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８，１８６＝１９４（１９９８）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．，Ｃ．ＤｅｓｍａｒａｉｓおよびＰ．Ｇｒｅｅｎ  ２００１．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｆｉｎｉｓｈ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ．１１（４）：６１４〜６２５）；Ｐｙｔｈｏｎ  ２．２  ａｓ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｉｐｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ（Ｐｙｔｈｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｍ．Ｂｅａｚｌｅｙ）；ＧｅＭＳ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（Ｋｏｓａｎ私有ソフトウェア）；Ａｐａｃｈｅ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．４４（ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐｄ．ａｐａｃｈｅ．ｏｒｇ）；およびＲｅｄ  Ｈａｔ  Ｌｉｎｕｘ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｄｈａｔ．ｃｏｍ）。
【０３３６】
（Ｒａｃｏｏｎアルゴリズム）
（工程Ｉ：データ集団）  ユーザーは、Ｒａｃｏｏｎプログラムに、生の配列決定データ、ベクター配列、およびサンプルを特定のシントンへとマッピングする参照ファイルを入力する。このプログラムは、各サンプルの実行フォルダを作成し、配列決定ファイルを（順方向および逆方向）を望ましいシントン配列とともに正確にそのフォルダ中に配置する。このプログラムは、合成遺伝子設計データを含むデータベースから関連シントン配列を見出すために、上記参照ファイルを使用する。
【０３３７】
（工程ＩＩ：塩基呼出し、ベクター配列決定および配列アセンブリ）  複数の読み取り値が、塩基呼出しソフトウェア（例えば、ＰＨＲＥＤおよびＰＨＲＡＰ（例えば、ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１７５〜１８５；ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１８６〜１９４；ならびにＧｏｒｄｏｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１９５〜２０２））を使用して分析されて、各配列決定ヌクレオチドについての確実性値が得られ得る。ｐｙｔｈｏｎスクリプトが、特定のシントンのクロマトグラムファイルを含む各サンプルフォルダに対して実行される。このスクリプトは、次いで、以下のプログラムを連続して実行する。
【０３３８】
（ＰＨＲＥＤ）  配列追跡における多色ピークに基づいてヌクレオチド配列を決定するための塩基呼出しソフトウェア。ＰＨＲＥＤは、ＤＮＡ配列決定追跡データを読み取り、塩基を呼び出し、品質値を塩基に割り当て、そしてその塩基呼出しおよび品質値を書き出してファイルを出力する（例えば、ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  ８：１８６〜１９４（１９９８）参照）。塩基を呼び出した後、ＰＨＲＥＤは、配列を、いずれかのＦＡＳＴＡ形式、ＸＢＡＰに適切な形式、ＰＨＤ形式、またはＳＣＦ形式でファイルへと書き出す。当業者は、特定の配列決定機器の出力に適合するヌクレオチド配列特徴付けプログラムを選択可能であり、種々の塩基呼出しプログラムを用いる分析のために配列決定機器の出力を適合可能である。
【０３３９】
（ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨ）  Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ配列整列アルゴリズムの実施。これは、各サンプルからベクター配列を除去するためにこの工程において使用される。
【０３４０】
（ＰＨＲＡＰ）  ショットガンＤＮＡ配列決定データをアセンブルするためのプログラムパッケージ。これは、読出し値の最高品質部分のモザイクとしてコンティグ配列を構築するために使用される。生じるアセンブリファイルは、比較および分析のための候補である。
【０３４１】
（工程ＩＩＩ：誤りの検出、サンプルの順位付け）  ｐｙｔｈｏｎスクリプトは、もとのシントン配列と、生じるアセンブリファイルとの間での各サンプルについての変動を決定する目的で、ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨを戻す。
【０３４２】
各シントンフォルダは、サンプルフォルダの集合物と、ＰＨＲＥＤ、ＰＨＲＡＰ、およびＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨにより作成される関連ファイルとを有する。ｐｙｔｈｏｎプログラムは、関連サンプルの各々を検出し、それらを、シントンと関連付ける。このプログラムは、出力ファイルからの必要な情報を探索し、上記サンプルを順位付けする。このプログラムは、サイレント変異を探索し、新たに導入された制限部位を点検し、そしてさらなる分析のために使用され得る報告を作成する。
【０３４３】
Ｒａｃｏｏｎは、大きなデータセットを迅速に処理することが可能である。約２００個のサンプルが、２分間未満で分析され得る。このことは、塩基呼出し、ベクタースクリーニング、誤りの検出、報告の作成を含んだ。これらの結果は、ＨＴＭＬファイルとして保存され得るか、または個々のサンプルの実行が、さらなる分析のためにデスクトップにダウンロードされ得る。
【実施例】
【０３４４】
（１１．実施例）
（実施例１）
（遺伝子のアセンブリおよび増幅のためのプロトコル）
本実施例は、遺伝子のアセンブリおよび増幅のためのプロトコルを記載する。
【０３４５】
（アセンブリ）
合成ＤＮＡフラグメントのアセンブリを、以前に開発された手順（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６４：４９〜５３；ＨｏｏｖｅｒおよびＬｕｂｋｏｗｓｋｉ  ２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４３）から適合させる。この遺伝子合成方法は、互いに２０ヌクレオチド重複するフラグメント全体の両方の鎖について、４０マーオリゴヌクレオチドを使用する。
【０３４６】
あるシントンについての等容量の重複オリゴヌクレオチドを、一緒に添加し、水で希釈して、最終濃度２５μＭ（合計）にする。上記オリゴ混合物を、ＰＣＲによりアセンブルする。アセンブル用のＰＣＲ混合物は、０．５μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５単位／μＬ、Ｒｏｃｈｅ）、１．０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５．０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０μｌの２５μＭ  Ｏｌｉｇｏ混合物、３８．５μｌの水である。アセンブリ用のＰＣＲ条件は、９５℃にて５分間の変性工程で始まり、その後、９５℃で３０秒間の変性、５０℃もしくは５８℃で３０秒間のアニーリング、および伸長温度７２℃で９０秒間を２０〜２５サイクル行う。
【０３４７】
（増幅）
上記アセンブリ反応のアリコートを採取し、それを増幅ＰＣＲ用のテンプレートとして使用する。増幅ＰＣＲにおいて、使用するプライマーの領域は、ＬＩＣ−ＵＤＧクローニングにおいて使用するために、ウラシル残基を含む。上記プライマーは、316−４−Ｆｏｒ＿Ｍｏｒｐｈ＿ｄＵ：
【０３４８】
【化２０】
2006517090.tif 000033
【０３４９】
である。ウラシル含有領域に、下線を付している。留意されるように、共通リンカー対を、シントンの縁に共通配列を設計することによって、多くの異なるシントンについて使用し得る。
【０３５０】
増幅ＰＣＲ用の反応混合物は、０．５μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１．０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５．０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）、１．０μｌの５０μＭ順方向Ｏｌｉｇｏストック、１．０μｌの５０μＭ逆方向Ｏｌｉｇｏストック、１．２５μｌのアセンブリ回ＰＣＲサンプル（テンプレート）および３７．２５μｌの水である。増幅用プログラムは、９５℃にて５分間の初期変性工程を含む。９５℃で３０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の伸長を２５サイクル、そして最終伸長が１０分間である。
【０３５１】
サンプルの増幅を、ゲル電気泳動により確認する。望ましいサイズが生成された場合は、そのサンプルを、ＵＤＧクローニングベクター中にクローン化する。増幅が作動しない場合、第２回のアセンブリを、実施する。これには、アセンブリ用ＰＣＲ混合物を使用する。このＰＣＲ混合物は、１６μＬの第１回アセンブリ０．５μＬ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、１．０μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、３．３μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０μｌのオリゴ混合物、および３５．２μＬの水である。第２回アセンブリ用のＰＣＲ条件は、上記第１アセンブリと同じである。第２アセンブリの後、増幅ＰＣＲを実施する。
【０３５２】
（実施例２）
（連結非依存性クローニング方法）
編成（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）ベクター中にシントンをクローニングするためのプロトコルは、ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２またはｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６を参照した下記に記載される。当該分野の知識を持つ読者は、異なる制限部位、異なるシントン挿入部位、または異なる選択マーカーを有するベクターを供給するために使用される変化を容易に同定する。
【０３５３】
（エキソヌクレアーゼＩＩＩ方法）
（ベクター調製）  ＵＤＧ−ＬＩＣ用のベクターを調製するために、１０μＬのベクター（１〜２μｇ）を、１μＬのＳａｃ  Ｉ（２０単位／μＬ）を用いて３７℃にて２時間消化する。１μＬｎｏニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣＩＡ（１０単位／μｌ）を添加し、そのサンプルを、６５℃にて２０分間インキュベートし、その後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、その消化緩衝液を水に交換する。そのサンプルを、２００単位のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）を用いて３０℃にて１０分間処理し、Ｑｉａｇｅｎ  ｑｕｉｋカラムにて精製し、最終容量３０μＬになるまで溶出する。サンプルを、ゲル電気泳動により分解について検査し、そして試験ＵＤＧクローニング反応のために使用して、クローニング効率を決定する。
【０３５４】
（フラグメントのＵＤＧクローニング）  上記合成遺伝子フラグメントをクローン化するために、それらのフラグメントを、ＬＩＣベクターの存在下にてＵＤＧで処理する。２μＬのＰＣＲ生成物（１０ｎｇ）を、最終反応容量１０μＬｎｉｔｅ，４μＬの事前処理ｄＵベクターの存在下で、１μＬ（２単位）のＵＤＧ（ＮＥＢ）を用いて３７℃にて３０分間処理する。
【０３５５】
生じた混合物を、氷上に２分間配置し、反応容量全体（１０μＬ）を、ＤＨ５α細胞中に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（すなわち、ＳＭ１）を含むＬＢプレート上で選択する。それらのプラスミドを、特徴付けとその後のクローニング工程のために精製する。  
【０３５６】
（エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ方法）
（ベクター調製）  上記ベクターを、ＳａｃＩを用いる消化により線状化する。ニック形成エンドヌクレアーゼ（１００単位Ｎ．ＢｂｖＣ  ＩＡ）を添加し、その混合物を、３７℃にて２時間インキュベートする。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により反応混合物から単離する。
【０３５７】
（ＵＤＧクローニング）  ２０ｎｇの線状化ベクター、１０ｎｇのＰＣＲ生成物、および１単位のＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからキットとして入手可能である、エンドヌクレアーゼＶＩＩとＵＤＧとの混合物）を、合わせ、３７℃にて１５分間インキュベートし、室温にて１５分間インキュベートし、そして氷上で２分間インキュベートし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換するために使用する。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、Ｍｅｌａｍｅｄｅら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２５５〜６４において記載される。
【０３５８】
（実施例３）
（クローン化したシントンの特徴付けおよび収集）
（クローンの同定）  正確なＰＣＲ生成物（例えば、配列の誤りを有さない）を含むクローンを同定するために、プラスミドＤＮＡを、いくつかの（代表的には、５個以上の）クローンから単離して配列決定する。任意の適切な配列決定法を使用し得る。一実施形態において、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｍｐｌｉｃａｓｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するローリングサークル増幅によって得られるＤＮＡを使用して、配列決定を実施する。Ｎｅｌｓｏｎら、２００２、「ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ，ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｕｐｐｌ：４４−７参照。一実施形態において、配列決定されるべきプラスミドを含む各コロニーを、１．４ｍＬのＬＢ培地中に懸濁し、１μｌを、増幅／配列決定反応において使用する。
【０３５９】
（配列分析）  配列決定後、結果を、意図される配列と整列して比較し得る。好ましくは、このプロセスを、ＲＡＣＯＯＮプログラム（下記）を使用して自動化して、各シントンに対応する配列を整列し後に正確な配列を同定する。
【０３６０】
（クローンの保存）  目的とするクローンを、回収および使用のための種々の様式（Ｓｔｏｒａｇｅ  ＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）ＩＤＴＭ  ＤＮＡライブラリーカード（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を含む）にて保存し得る。
【０３６１】
（配列エラーを正すための部位特異的突然変異誘発：）
シントンサンプルを、所望の配列を有するクローンが見出されるまで配列決定し得る。あるいは、１点または２点のみの変異を有するクローンが、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）を用いて矯正され得る。ＳＤＭの１つの方法は、元の遺伝子合成において使用された、４０マーのμリゴヌクレμチドを用いるＰＣＲベースの部位特異的変異誘発である。例えば、所望の標的配列由来の１点のみの変異を有するサンプルは、以下のように矯正される：シントンのアセンブリからのμリゴヌクレμチドの重複（これは、シントンのその部分に対応する）を同定し、そしてシントンの矯正のために用いた。エラーを含むサンプルＤＮＡを、ＰＣＲ方法に基づくＰｆｕを使用して、変異の領域を網羅する重複μリゴヌクレμチド（番号１および番号２）を用いて、増幅した（ＦｉｓｃｈｅｒおよびＰｅｉ，１９９７，「ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＰＣＲ−ｂａｓｅｄｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：５７０−７４）。反応混合物は、以下を含んだ：ＤＮＡテンプレート［５〜２０ｎｇ］、５．０μＬ；１０×Ｐｆｕ緩衝液、０．５μＬ；オリゴ番号１［２５μＭ］、０．５μＬ；オリゴ番号２［２５μＭ］、１．０μＬ；１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．０μＬ；Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、および５０μＬまでの水。ＰＣＲ条件は、以下のようであった：９５℃  ３０秒（熱感度の高いリガンドを用いたＰｆｕを用いる場合は、２分）、１２〜１８サイクルの、以下：９５℃  ３０秒、５５℃  １分間、６８℃  ２分間／ｋｂプラスミド長（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏの場合、１分／ｋｂ）。次に、メチル化（親）ＤＮＡを、ＰＣＲ反応物に１μＬ  ＤｐｎＩ（１０ユニット）を添加し、そして１時間３７℃でインキュベートすることによって、分解した。得られたサンプルを、コンピテントＤＨ５α細胞内に形質転換した。４つのクローン由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そして配列決定して、所望のクローンを同定した。
【０３６２】
（実施例４）
（ＰＫＳモジュールにおける有用な制限部位の同定）
ＰＫＳモジュールにおける有用な制限部位を同定するため、ＰＫＳ遺伝子からの１４０モジュールのアミノ酸配列を、分析した。理論上の制限部位を同定するための戦略が開発されている。この理論上の制限部位は、すなわち、モジュール配列に分裂的変更を生じないモジュールをコードする遺伝子の場所であり得、以下の診断基準のいくつかまたは全てを満たす：
１．部位は、遺伝子において約５００離れているか、そして／またはドメインまたはモジュール縁に存在し、
２．シントンからのモジュールの高処理アセンブリと両立可能であり（シントンは、しばしばモジュール内で独特であることに起因する）、
３．異なったモジュールの間に動揺に配置され、そして
４．ＰＫＳの機能（活性）を破壊しない。
【０３６３】
２つの型の制限部位を、同定した。部位の第１のセットは、端のドメインに位置するセットである（分子の端にあるＸｂａＩ部位およびＳｐｅＩ部位を含む）。部位の第２のセットは、シントンの端に位置し得るが、一般にドメインの端では見出されなかった。
【０３６４】
この実施例において記載される制限部位は、例示のみであり、さらなる異なった部位が、本明細書中に開示される方法によって同定され得、本発明の合成方法において使用され得る。
【０３６５】
１４のＰＫＳ遺伝子クラスターから取った１４０分子の選択された領域のアミノ酸配列を、並列した（図９参照）。次いで、ドメインの端に近く相同性の高い領域（すべての可能性のあるＤＮＡ配列に逆転写した場合、６塩基以上の制限部位が明らかになる）を、同定した。特定の場合（多くのＰＫＳモジュールに変化が見出された場合）、制限部位を配置するためのアミノ酸の保存的変化が認められた。稀に、制限部位を、推定ドメイン間配列（アミノ酸の変化が必須である）に配置した。このような場合、改変アミノ酸配列は、あるＰＫＳにおいて機能を邪魔しない。
【０３６６】
ＰＫＳモジュールの４つの共通の改変体（［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ］；［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ＋ＫＳ］；［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ＋ＫＳ＋ＤＨ］；［ＫＳ＋ＡＴ＋ＡＣＰ＋ＫＳ＋ＤＨ＋ＥＲ］）についての結果を、図４および表７〜１１に示す。制限部位の位置は、可能性のあるドメイン内の相同アミノ酸標的部位を言及し、そして６−ＤＲＢＳ遺伝子または６−ＤＲＢＳタンパク質のモジュール４（全ての６つの共通ドメインを含む）を言及する。後者について、参考として使用されたアミノ酸およびヌクレオチド配列の番号付けは、ＫＳドメインのＮ末端で見出される最初のＥＰＩＡＩＶ残基で始まる；相同なモチーフは、サンプル中の全ての１４０のＫＳドメインのＮ末端で見出される。
【０３６７】
【表７】
2006517090.tif 000034
【０３６８】
＊各モジュールの番号付けは、エリスロマイシンのモジュール４のＥ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｉ−Ｖのグルタミン酸（Ｅ）のアミノ酸に相同な部位のアミノ酸になる、ＫＳドメインのＮ末端で開始する。
【０３６９】
Ｍｆｅ  Ｉ部位は、ＫＳをコードする配列の左端近くに、ＫＳの最初のモチーフのＰＩＶに相同なトリペプチドをコードする９塩基の塩基２〜７を使用して、組み込まれる。１４０のＫＳの７０％は、アミノ酸内に変更を必要としない；残りの３０％は、保存的変更のみを必要とする［８１％Ｖ−＞Ｉ、１７％Ｌ−＞Ｉおよび２％ＭからＩ］。１４０  ＫＳドメインの１００％の右端に、保存的ＧＴ（塩基１２６７〜１２７２）が存在し、これは、ＫｐｎＩ制限部位についての配列によってコードされ得る。
【０３７０】
ＭｓｃＩ部位は、ＡＴコード配列の左端近く（塩基１５９０〜１５９５）に、サンプルにしたＡＴの１００％において見出されるＧＱジペプチドの部位で、組み込まれるＰｓｔＩ部位は、ＡＴの右側（塩基２６１１〜２６１７）に、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩが以前配置されていた位置で、ドメイン交換の後に機能的な欠失なく、配置される。この可変配列領域は、多くのモジュールにおいて、Ｙ−ｘ−Ｆ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−ｘ−Ｗモチーフによって同定され、ここで、「ｘ」は、任意のアミノ酸である；別の場合は、アラインメントは、常によく規定された等価な位置を産生する。このモチーフのすぐ右の２つのアミノ酸（Ｃ末端からＷ）は、ＰｓｔＩ部位を導入するために改変される。
【０３７１】
ＫＲを含むモジュールについて、ＡｇｅＩ部位は、ＴＧジペプチド（塩基４８９４〜５５４２）（試験配列の１３６ＫＲの１００％において見出される）に配置される。ＥＲドメインがモジュール内に存在する場合、ＢｓｒＢＩ部位は、左端（試験配列の１７のＥＲの１つを除き全てにおいて見出される（残りのＥＲは、サンプル中で唯一活性を有さないＥＲドメインである）保存的ＰＬジペプチド（塩基４０７２〜４９２９）をコードする）に配置される。ＥＲドメインおよびＫＳドメインは、４〜６アミノ酸でのみ分離されているため、ＫＲのＡｇｅＩ部位は、ＥＲの他の切除部位として寄与する。
【０３７２】
モジュールのカルボキシ末端において、ＸｂａＩ部位を、モジュールのＡＣＰのカルボキシ末端に隣接する、よく規定された位置に配置した。全てのＡＣＰの活性部位セリン（Ｓ）の右に、３６位および４０位に２つのロイシン（Ｌ）が存在する。４０位のロイシンの後の２つのアミノ酸（通常、活性部位セリンの後の４１位および４２位）のコドンを、ＸｂａＩの認識配列に変化させる（Ｃ末端）。
【０３７３】
天然に別に続くモジュールにおいて、ＳｐｅＩクローニング部位を、アミノ末端部位に組み込んだ。この部位は、ＸｂａＩについて上述した部位（通常、活性部位セリンの後の４１位および４２位）と類似し、この後に、ＫＳ中のＭｆｅＩ部位へのモジュラー間リンカーが続く。タンパク質のＮ末端に存在するモジュール（すなわち、左にＡＣＰは存在しない）において、ＳｐｅＩ〜ＭｆｅＩリンカー配列は必要なく、合成されたモジュールのセグメントは、Ｍｆｅｌ−ＸｂａＩのみで構成される。
【０３７４】
本発明が、特に、合成遺伝子の設計に有用な制限酵素認識部位を、以下によって同定するための方法を提供することが、理解される：（ｉ）複数の機能的に関連するポリペプチドセグメントについてのアミノ酸配列を得る工程；（ｉｉ）このアミノ酸を逆転写し、各ポリペプチドセグメントの核酸配列をコードする多数のポリペプチドセグメントを産生する工程；少なくとも約５０％のポリペプチドセグメントの核酸配列をコードする少なくとも１つのポリペプチドセグメントにおいて見出される制限酵素認識部位を同定する工程。好ましい制限酵素認識部位は、少なくとも約７５％のポリペプチドセグメントの、さらにより好ましくは少なくとも約８０％の、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の、そして時々約１００％のポリペプチドセグメントの、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される。機能的に関連するポリペプチドセグメントの例としては、ポリケチドシンターゼおよびＮＲＰＳモジュール、ドメインおよびリンカーが挙げられる。１つの実施形態において、機能的に関連したポリペプチドセグメントは、ＰＫＳモジュールまたはドメインにおいて、（すなわち、モジュールまたはドメインの全体の範囲よりもむしろ、）相同性の高い領域である。
【０３７５】
本発明はまた、以下によってポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を作製する方法を提供する：（ｉ）１、２、または３以上の制限部位を上述のように同定する工程、および（ｉｉ）制限部位の配列によって天然に存在する遺伝子と異なり、かつ（ｉｉｉ）必要に応じて、配列をコードするポリペプチドセグメントの他の領域からの制限部位の除去によって、天然に存在する遺伝子と異なるポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子を産生する工程。
【０３７６】
【表８】
2006517090.tif 000035
【０３７７】
【表９】
2006517090.tif 000036
【０３７８】
１つの実施形態において、各部位＃１は、第２モジュールの部位＃１１（または別の上流ニットからの等価のＸｂａＩ）と結合し得；そして各＃１１からＳｐｅＩへ結合し得る。従って、最終構築物中の＃１／＃１１は、ジペプチドＳｅｒＳｅｒをコードする１つの位置（この位置は、ネイティブのアミノ酸が相同なジペプチドＴｈｒＳｅｒに置換された場合において、以前に首尾よく利用されている）のみである。＃ｌａ、＃７および＃１／＃１１の部位を除き、アミノ酸の変更は必要ない。これらの３つの部位の各々において、上述の首尾よい変更の履歴を使用し得る。
【０３７９】
部位＃７において、任意のネイティブのジペプチドが、ＬｅｕＧｌｎと置換される。報告された配列において、この部位は、第１のアミノ酸がしばしば大型の疎水型である（Ｌｅｕのように）ことを除き、よく保存されていない。［Ｌ−＞Ｉ、Ｖ−＞Ｉ、Ｍ−＞Ｉ］
１つの局面において、本発明は、非天然網の配列を有するＰＫＳポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、カルボキシ末端にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎを含むＫＳドメインを含む；そして／またはＡＣＰドメインは、ドメインのカルボキシ末端にジペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒを含む。
【０３８０】
シントン端（ドメイン端ではない）に使用される制限部位は、制限部位がモジュール間で適合性であることを必要としない。表１０における特定の部位において、制限部位のリストが提供され、それにより、リストの１つの各部位（表９参照）についての場合の所定の数が、アミノ酸配列と適合する。
【０３８１】
【表１０】
2006517090.tif 000037
【０３８２】
【表１１】
2006517090.tif 000038
【０３８３】
特定の場合（＃６および＃ＥＲ２の部位を参照）において、構築物は、５’シントンについての１つの制限部位、および３’シントンの突出に適合する第２の制限部位を使用して設計される。これは、最終産物において所望されないシントンについての特定の制限部位の使用を可能にする（例えば、遺伝子構築物について、部位＃ＥＲ２におけるＸｂａＩは、＃１１における３’ＸｂａＩ部位の使用を妨げる）。
【０３８４】
【表１２】
2006517090.tif 000039
【０３８５】
ドメインの他の配列、ＰＫＳのモジュールおよびＯＲＦ、ならびにＰＫＳ様ポリペプチドは、公けのデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であって、以下の登録番号が例として、制限なく挙げられる。
【０３８６】
【数１−１】
2006517090.tif 000040
【０３８７】
【数１−２】
2006517090.tif 000041
【０３８８】
【数１−３】
2006517090.tif 000042
【０３８９】
【数１−４】
2006517090.tif 000043
【０３９０】
（実施例５）
（ＤＥＢＳモジュールの合成）
ＤＥＢＳモジュール２は、４３４４ｂｐのモジュールである。モジュールを、種々の長さ（３５０〜７００ｂｐの範囲）の１０のシントンを生じるように設計した。それぞれのシントンを調製し、合成結果を表１３に示す。ＤＥＢＳモジュール２の１０個のシントンを、従来の方法（例えば、３元連結反応）によって、単一のモジュールに会合し、所望の配列の存在を確認するために、二次配列決定を行なった。正確な配列を入手しなかったシントンに、最適化および誤りの検出のために、第一の試みを使用し、表１３のかっこ内の数は、２番目のセットの結果を示す。
【０３９１】
【表１３】
2006517090.tif 000044
【０３９２】
ａシントン００１−０４のアセンブリーに使用したオリゴを、ＨＰＬＣによって部分的に精製した。このシントンのアセンブリーのために、異なるポリメラーゼもまた、使用した。
【０３９３】
ｂシントン００１−０５および００１−０８に対する正確なアミノ酸配列を、受容可能なコドンユーセージを有するサイレント突然変異のみを含むサンプルを使用して得た。
【０３９４】
（実施例６）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける合成ＤＥＢＳ  ＭＯＤ２の発現）
高い１５−Ｍｅ−６ｄＥＢ産生を有するＥ．ｃｏｌｉ株のＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２遺伝子を、合成版（実施例５）で置換し、タンパク質発現およびポリケチド力価を比較した。使用した株は、安定なＲＳＦ１０１０ベースのベクター由来のＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２誘導体（ＫＳ５  Ｎ末端リンカー）および単一のｐＥＴベクター由来のＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３を発現する。バックグラウンド株（Ｋ２０７−３）は、染色体上で一体化したパンテテイン化およびＣｏＡチオエステル合成に必要な遺伝子を有する。Ｔ７プロモーターは、Ｍｏｄ２発現ならびにＤＥＢ２発現およびＤＥＢ３発現を制御する。
誘導された培養物は、１５−Ｍｅ−６ｄＥＢを産生するために、プロピルジケチド（ｐｒｏｐｙｌ  ｄｉｋｅｔｉｄｅ）を供給される。
【０３９５】
合成（２）および天然（１）の配列Ｍｏｄ２を発現する株は、発現の２５時間後（８ｍｇ／Ｌ）および４２時間後（２５ｍｇ／Ｌ）、識別不能なレベルの１５−Ｍｅ−６ｄＥＢを生成した。溶解タンパク質画分の定量的なＰＡＧＥ分析は、天然の配列遺伝子に対してかなり高い合成Ｍｏｄ２遺伝子由来のタンパク質発現を示した（図１５）。合成遺伝子由来の約３．２倍多いＭｏｄタンパク質が、２２℃での４２時間の発現後、観察された。より高い発現レベルにも関わらず等価な力価は、Ｍｏｄ２が使用された株では、以前の研究（公開されていない）から予測されるように制限して産生されていないことを示唆する。
【０３９６】
（方法：発現株構築物）
合成ＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２に対するＯＲＦを、以下の方法で作った。ＭＰＧ０１１（ＬＬＫ１）のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＯＲＦアセンブリーベクター内にライゲーションした（ｐＫＯＳ３３７−１５９−１）。次いで、ＭＰＧ００１のＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントである（ＤＥＢＳ  Ｍｏｄ２）をこのベクターのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にライゲーションした。生じるプラスミドのＡａｔＩＩ−ＭｆｅＩフラグメントを、ＭＰＧ００９由来のＡａｔＩＩ−ＭｆｅＩフラグメント（ＤＥＢＳ  Ｍｏｄ５）で置換し、ＫＳ５  Ｎ末端リンカー配列に付加した。Ｍｏｄ２  ＯＲＦを含むこのプラスミド（ｐＫＯＳ３７８−０１４）のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを。ｐＲＳＦ１０１０バックボーン中に挿入し、発現ベクターｐＫＯＳ３７８−０３０を作製した。使用したＥ．ｃｏｌｉ宿主株は、Ｋ２０７−３であって、これは、その染色体上で一体化したパンテテイン化およびＣｏＡチオエステル合成のためのｓｆｐ遺伝子、ｐｒｐＥ遺伝子、ｐｃｃＢ遺伝子およびａｃｃＡ１遺伝子を有する。合成（２）および野生型（１）Ｍｏｄ２株をそれぞれ作製するために、Ｔ７プロモーター制御の下で、ＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３に対する遺伝子を発現するｐＥＴベクターｐＢＰ１３０（Ｐｈｅｉｆｅｒら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１７９０−９２）を含むＫ２０７−３を、ｐＫＯＳ３７８−０３０およびｐＫＯＳ２０７−１４２ａ（ｐＲＳＦ１０１０中の野生型Ｍｏｄ２；Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙから）で形質転換した。合成および野生型Ｍｏｄ２構築物のタンパク質配列は、合成遺伝子における、操作する制限部位に必要な４置換（Ｌ９１４Ｑ、Ｇ１４６７Ｓ、Ｔ１４６８ＳおよびＰ１５５１Ｇ）を除いて同一である。
【０３９７】
（ＰＫＳ発現およびポリケチド分析）
Ｍｏｄ２＋ＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３遺伝子の発現のために、株を、３７℃で、中央対数期まで増殖させた。０．５ｍＭまでのＩＰＴＧの添加により発現が誘導され、５００ｍｇ／Ｌの２−メチル−３−ヒドロキシヘキサノイル−Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル（プロピルジケチド）、５ｍＭのプロピオン酸塩、５０ｍＭのコハク酸塩および５０ｍＭのグルタミン酸塩の添加により発現が供給された。誘導された培養物は、示した時間、２２℃でインキュベートした。各サンプリング時に、培養上清をエチルアセトンで抽出し、１５−Ｍｅ−６ｄＥＢ力価をＬＣ／ＭＳにより定量した（参照）。細胞を回収し、ＢＰＥＲＩＩ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解し、可溶性タンパク質を定量し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ；Ｐｉｅｒｃｅ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルを、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で定量的に画像化した。
【０３９８】
（実施例７）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける合成ＤＥＢＳ遺伝子の発現）
全長３０，８５２ｂｐのＤＥＢＳ  ＰＫＳ遺伝子クラスター（二重ドメイン、６伸長モジュールドメインおよびチオエステラーゼ放出ドメインを挿入する）を首尾よく合成した。この研究室で開発したＧｅＭＳソフトウェアを使用して、各モジュールおよびＴＥに対する構成オリゴヌクレオチドを設計した；全部で、約１６００〜４０マーのオリゴヌクレオチドを設計し、調製した。その設計は、高Ｅ．ｃｏｌｉ発現に最適なコドンを使用し、アセンブリーおよびモジュール交換を容易にするために、制限部位を組み込んだ。２３８ｂｐ〜７５４ｂｐの範囲の６７個のシントンを調製し、上記のようにしてクローン化した。発明者らは、ＵＤＧクローニングの９０より高い成功率および遺伝子アセンブリーの誤りの割合が１０００分の３であることを認めた。配列決定したクローンの平均２２％が正確であった。シントンを縫合方法（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ  ｓｅｗｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、所望のベクターを含む約７５％のクローンを有するモジュール内に構築した。モジュール００１（ＤＥＢＳモジュール２）を遺伝子合成の最初の試験に使用したので、誤りの割合（平均６．５の誤り／ｋｂ）は、これらのシントンについてはより高かった。
【０３９９】
モジュール２を実施例５に記載されるように調製した。次いで、残存するモジュールの多シントン成分を一緒に縫合し、図１６および図１７に示される方法に従って選択した。
【０４００】
ＤＥＢＳ遺伝子を有する１０個のライゲーションの実施例の実験セットにおいて、七個は、７／８または８／８の正しいライゲーション生成物を生じ、一個は、６／８の正しいライゲーション生成物を生じ、二つは、３／８および１／８の正しいライゲーション生成物を生じ；誤ったサンプルは全て、切断されずに残っていなければならないドナーベクターのサンプルであった。
【０４０１】
全てのＤＥＢＳサブユニット遺伝子を十分に合成し、全長ＯＲＦの中に構築した。これらの遺伝子を、活性および発現の試験のためにＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換する。合成および天然のＤＥＢＳ構成要素を、遺伝子合成コドンユーセージおよび個々のサブユニットに対する活性に対するアミノ酸置換の効果を決定するために種々の組合せで同時発現する（図４−２）。合成ＤＥＢＳ１は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で活性な形態で首尾よく発現した。合成コドン最適化サブユニットの総ＤＥＢＳ１発現は、天然の配列サブユニットより３倍以上高い。合成ＤＥＢＳ１の、天然のＤＥＢＳ２サブユニットおよびＤＥＢＳ３サブユニットとの同時発現は、天然のＤＥＢＳ１構築物と類似したレベルの６−ｄＥＢ生成物を補助する。
【０４０２】
合成遺伝子の三個のＤＥＢＳオープンリーディングフレームの配列は、以下の表１４Ｂに示される（それぞれの配列は、標識の付加を容易にするために含まれる３’ＥｃｏＲＩ部位を含む）。表１４Ａは、全体の配列の合成配列ならびにＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３の報告された配列に対する類似性とＤＥＢＳ１に対する修正した配列を示す。
【０４０３】
【表１４Ａ】
2006517090.tif 000045
【０４０４】
１．記載したものを除いて、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号で記録した。
【０４０５】
２．ＤＥＢＳ１を再配列決定し、Ｍ６３６７６に対する以下の変化を、合成ＤＥＢＳ１遺伝子の設計に使用した：最初のフレームシフトは、ＡＡＡ２６４９３の最初の１８アミノ酸を、代わりの７１アミノ酸Ｎ末端配列で置換する効果を有する；相補性フレームシフトを含む約１００ｂｐの領域に変化が存在し、それは、報告された配列の３２アミノ酸を異なる３３アミノ酸断片で置換する効果を有する。
【０４０６】
【表１４Ｂ−１】
2006517090.tif 000046
【０４０７】
【表１４Ｂ−２】
2006517090.tif 000047
【０４０８】
【表１４Ｂ−３】
2006517090.tif 000048
【０４０９】
【表１４Ｂ−４】
2006517090.tif 000049
【０４１０】
【表１４Ｂ−５】
2006517090.tif 000050
【０４１１】
【表１４Ｂ−６】
2006517090.tif 000051
【０４１２】
【表１４Ｂ−７】
2006517090.tif 000052
【０４１３】
【表１４Ｂ−８】
2006517090.tif 000053
【０４１４】
【表１４Ｂ−９】
2006517090.tif 000054
【０４１５】
【表１４Ｂ−１０】
2006517090.tif 000055
【０４１６】
（実施例８）
（二つのタンパク質の相対的な量の定量的な測定のための方法）
同じ細胞で発現された二つ以上のＰＫＳタンパク質の相対量を定量的に測定するために、二重ｍＡｂ技術を開発した。この方法に従って、各ＰＫＳタンパク質に対して異なるエピトープタグを用いて、二つの異なる標識をした抗体（例えば、ＣＹ３およびＣＹ５で標識した）の混合物を用いるウエスタンブロットにより、それらを同時に定量した。色素の比率は、発現した二つのタンパク質の相対的な化学量論の評価を提供する。
【０４１７】
この技術を開発するためのモデルシステムとして、発明者らは、いずれかの末端（５５ｋＤａのＡ〜Ｃ）を二つの異なるエピトープタグで標識したタンパク質（ｃｍｙｃ−Ａ〜Ｃ−ＦＬＳＧ−ＢＲＳ−Ｈｉｓ）を使用した。
【０４１８】
発明者らの最初の実験では、発明者らは、特に、μｇ以下の量で、ウエスタンブロット後のタンパク質に結合した二つのＭａｂの再現可能な比率を得るこが困難であった。従って、発明者らは、ｃｍｙｃ−Ａ〜Ｃ−ＦＬＡＧのドットブロットの使用を必要とする分析方法を開発することに努力した。以下に示すデータにおいて、二つの蛍光標識した抗体（ｃｍｙｃ−ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８およびＦＬＡＧ−Ｃｙ５）を同時に使用して、上に述べたＡ〜Ｃ構築物のドットブロットを定量した。ブロットを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒを使用して走査し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて分析を行なった。結果を表１５に示す。
【０４１９】
【表１５】
2006517090.tif 000056
【０４２０】
ｃｍｙｃ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体は、５０ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲の非常に正確な範囲の定量を提供する。ＦＬＡＧ−Ｃｙ５抗体は、５０ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲を超えて正確であって、１０００ｎｇレベルで明らかにシグナル飽和を受ける。ピーク面積の比率もまた、１０ｎｇ〜５００ｎｇの範囲を超えて安定であり、Ｎ末端の分解またはＣ末端の分解の検出を可能にし、また、タンパク質レベルの化学量論的な分析を可能にする。
【０４２１】
エピトープ標識したＤＥＢＳタンパク質を、定量的ウエスタン分析のためのエピトープ標識した標準として使用するために、発現させ、精製した。
【０４２２】
【表１６】
2006517090.tif 000057
【０４２３】
合成ＤＥＢＳモジュール２タンパク質（ｍｏｄ２）を、融合タンパク質（ｃ−ｍｙｃ−ｍｏｄ２−ｆｌａｇ−ｂｒｓ−ｈｉｓ）として、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ２０７−３で発現させた。モジュール２遺伝子の、タグ配列をコードする遺伝子を有する発現ベクター内へのクローニングを、合成遺伝子へのＥｃｏＲＩ部位の導入によって容易にした。Ｎ末端エピトープタグおよびＣ末端エピトープタグを有するＤＥＢＳモジュール２を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｋ−２０７−３内で、ＤＥＢ２およびＤＥＢ３と同時発現させた。２０時間および４０時間で、生成物培養物からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（各株の二つのコロニーを試験した）。ゲルを、サイプロレッドを用いて染色するか、またはエピトープタグ、ｃ−ｍｙｃ、フラッグおよびビオチンに対して指向した蛍光標識した抗体を使用して、ウエスタンブロットに供した。モノクローナル抗体を、二つの蛍光シグナルが同時にモニタリングできるように、蛍光色素（ａｌｅｘａ４８８およびａｌｅｘａ６４７）で標識した。
【０４２４】
（実施例９）
（エポシロンＰＫＳ遺伝子合成）
全長５４，４８９ｂｐのエポシロン合成遺伝子（二重ドメイン、９伸張モジュールおよびＤＥＢＳ遺伝子のチオエステラーゼを挿入する）を合成し、構築した。
【０４２５】
この遺伝子を、開発したＧｅＭＳソフトウェアの版を用いて設計した。モジュールを方法ＲおよびＩＩ型ベクターを使用して合成した。約５５ｋｂのＤＮＡを合成するために、遺伝子クラスターを、１５６ｂｐ〜７８１ｂｐの範囲の大きさの１１８のシントンフラグメントに切断した。３０００個のオリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸを用いてオリゴヌクレオチド混合物にプールし、そして、実施例１に記載される条件を使用して増幅を行なった。それらを、ＵＤＧ−ＬＩＣベクター中にクローニングし（方法ＲおよびＩＩ型ベクターを使用した）、ＵＤＧクローニングは、９０より高い成功率であった。各シントンに対して８個のコロニーを、１．５ｍＬ  ＬＢ／炭水化物中に、選別し、アリコートを、配列決定のためのサンプルを提供するためのＲＣＡ反応のテンプレートとして使用するために、採取した。ＥＰＯ遺伝子クラスターを構成する１１８個のシントン全てに対する正確な配列を含むクローンを得た。１１８のシントンに対する平均の誤りの割合は、２．４／１０００であり、配列決定した平均３２％のサンプルは正確であった。これは、ｋｂあたり３の誤りおよび２２％のみが正しいＤＥＢＳ遺伝子クラスターからの改善であった。１１８の内１０４（８８％）の正確なサンプルを、第１回の８個のサンプルの配列決定から得た；残りの１２個のシントンに対しては、さらなるクローンの配列決定後に正しい配列を見出した。配列決定を介して、正しいクローンを同定した後、保存した培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、モジュール中へのシントンの構築を、前述の縫合方法を用いて行なった。
【０４２６】
エポシロン合成酵素ポリペプチドＥｐｏＡをコードする合成ＯＲＦの配列を、以下の表１７Ｂに示す（各配列は、タグの付加を容易にするために含まれる３’ＥｃｏＲＩ部位を含む）。表１７Ａは、合成遺伝子のＤＮＡ配列と報告されたエポシロン合成酵素配列との間の全体の配列同一性を示す。
【０４２７】
【表１７Ａ−１】
2006517090.tif 000058
【０４２８】
【表１７Ａ−２】
2006517090.tif 000059
【０４２９】
１．ＧｅｎＢａｎｋで報告されているように、アクセション番号を示している。
【０４３０】
【表１７Ｂ−１】
2006517090.tif 000060
【０４３１】
【表１７Ｂ−２】
2006517090.tif 000061
【０４３２】
【表１７Ｂ−３】
2006517090.tif 000062
【０４３３】
【表１７Ｂ−４】
2006517090.tif 000063
【０４３４】
【表１７Ｂ−５】
2006517090.tif 000064
【０４３５】
【表１７Ｂ−６】
2006517090.tif 000065
【０４３６】
【表１７Ｂ−７】
2006517090.tif 000066
【０４３７】
【表１７Ｂ−８】
2006517090.tif 000067
【０４３８】
【表１７Ｂ−９】
2006517090.tif 000068
【０４３９】
【表１７Ｂ−１０】
2006517090.tif 000069
【０４４０】
【表１７Ｂ−１１】
2006517090.tif 000070
【０４４１】
【表１７Ｂ−１２】
2006517090.tif 000071
【０４４２】
【表１７Ｂ−１３】
2006517090.tif 000072
【０４４３】
【表１７Ｂ−１４】
2006517090.tif 000073
【０４４４】
【表１７Ｂ−１５】
2006517090.tif 000074
【０４４５】
【表１７Ｂ−１６】
2006517090.tif 000075
【０４４６】
【表１７Ｂ−１７】
2006517090.tif 000076
【０４４７】
本明細書中に引用される全ての出版物および特許文献は、このようなそれぞれの出版物または文献が具体的かつ個別に本明細書中で参考として援用されることが示されるように、本明細書中で参考として援用される。
【０４４８】
本発明は、特定の実施形態に関して詳細に記載されるが、当業者は、改変および改良が本発明の範囲および精神の範囲内であることを認識する。出版物および特許文献の引用は、任意のこのような文献が関連する先行技術であることを承認するものであることを意図せず、それが、同一物の内容または日付について任意の承認を構成することも意図しない。本発明は、記載された明細書の様式によって記載され、当業者は、本発明が種々の実施形態で実施され、前述の明細書が例示の目的のためであり、限定的ではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【０４４９】
【図１】図１は、ＤＵＧ−クローニングカセット（「クローニングリンカー」）およびニックエンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡを用いるライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）のためのベクター調製のスキームを示す。図１Ａ。ベクター調製に使用されるＵＤＧ−クローニングカセットＳａｃ  Ｉおよびニック酵素部位が標識される。図１Ｂ。ニックエンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡを用いるＬＩＣのためのベクター調製物のスキーム。
【図２】図２は、Ｉ型ＴＳ制限酵素としてＢｂｓ  ＩおよびＢｓａ  Ｉを用いる方法Ｓ結合方法を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ベクター対Ｉを用いる方法Ｓ結合方法を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ベクター対ＩＩを用いる方法Ｓ結合を示す。２Ｓｉ−４は、Ｉ型ＴＳ制限酵素について認識部位であり、Ａ、Ｂ、ＢおよびＣ、それぞれは、酵素についての切断部位である。
【図４】図４は、編成について有用なベクター対を示す。図４Ａ：ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２。図４Ｂ：ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６。両方のベクターは、Ｎ．Ｂｂｖ  ＣＩＡ制限部位を含むＵＤＧクローニングカセット、両方のベクターに共通の「右制限部位」（Ｘｈｏ  Ｉ部位）、各ベクターにより異なる「左制限部位」（例えば、Ｅｃｏ  ＲＶまたはＳｔｕ  Ｉ部位）、両方ベクターに共通の第１選択マーカー（カーベニシリン耐性マーカー）および各ベクターにより異なる第２の選択マーカー（クロラムフェニコール耐性マーカーまたはカナマイシン耐性マーカー）を含む。
【図５】図５は、ベクター対ＩＩを用いる方法Ｒ結合を示す。
【図６】図６Ａは、ｅｒｙモジュール４において見られるように、６つのＰＫＳドメインの完全相補体を有する複合制限マップを示す。大まかなサイズは、ＫＳ  ＝１．２、ＫＳ／ＡＴリンカー＝０．３、ＡＴ＝１．０、ＡＴ／ＤＨリンカー＝０．０３、ＤＨ＝０．６、ＤＨ／ＥＲリンカー＝０．８、ＥＲ＝０．８、ＥＲ／ＫＲリンカー＝０．０２、ＫＲ＝０．８、ＫＲ／ＡＣＰリンカー＝０．２、ＡＣＰ＝０．２．１Ｕｎｉｔ＝１ｋｂ；図６Ｂは、ＤＥＢＳ２を参照してシントンの端についての例示的な制限部位を示す。
【図７】図７は、モジュール１−２−３−４−５−６−７−８−９を作製するためのシントン１−９の編成についてのペアでない選択ストラテジーを示す。括弧は、シントンまたは所望のマルチシントンがクローニングされるベクターについての、選択マーカー（Ｋ＝カナマイシン耐性、Ｃｍ＝クロラムフェニコール耐性）ならびに左制限部位、ＬおよびＬ’、（Ｓ＝Ｓｔｕ  Ｉ制限部位、Ｅ＝Ｅｃｏ  ＲＶ制限部位）を示す。シントンは、以下の付着末端で結合される：１−２  ＮｇｏＭ  ＩＶ；２−  ３  Ｎｈｅ  １；３−４  Ｋｐｎ  Ｉ；４−５  Ｂｇｌ  ＩＩ；５−６  Ａｇｅ  Ｉ／Ｎｇｏ  ＭＩＶ；６−７  Ｐｓｔ  １；７−８  Ａｇｅ  Ｉ；８−９  Ｂｇｌ  ＩＩ。
【図８】図８は、ＧｅＭＳプロセスを示すフローチャートである。
【図９】図９は、ＧｅＭＳアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、合成遺伝子についてのコドン優先テーブルの生成を示すフローチャートである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ランダム化され、コドンに最適化された遺伝子配列を生成するためのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、制限部位除去アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、制限部位挿入アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、オリゴヌクレオチド設計についてのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、シントンＤＮＡ配列の迅速な分析のためのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１５】図１５は、ＤＥＢＳのＰＡＧＥ分析を示す。合成配列（ｓＭｏｄ２）および天然配列（ｎＭｏｄ２）Ｍｏｄ２株からの可溶性タンパク質抽出物を、誘導４２時間後にサンプル採集し、３〜８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭＷスタンダードの位置を右に示した。このゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。
【図１６Ａ】図１６は、合成ＤＥＢＳ遺伝子の構築物において使用される制限部位およびシントンを示す。１６Ａ  ＤＥＢＳ１  ＯＲＦ；１６Ｂ，ＤＥＢＳ２  ＯＲＦ，１６Ｃ  ＤＥＢＳ３  ＯＲＦ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１６Ａの続きである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１６Ｂの続きである。
【図１７Ａ】図１７は、合成ＤＥＢＳ遺伝子の構築のための編成および選択ストラテジーを示す。Ａ＝シントンクローニングベクター２９３−１７２−Ａ７６；Ｂ＝シントンクローニングベクター２９３−１７２−２。（Ａ）Ｍｏｄ００６（ＤＥＢＳ  ｍｏｄｌ）；（Ｂ）Ｍｏｄ００７（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ３）；（Ｃ）Ｍｏｄ００８（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ４）；（Ｄ）Ｍｏｄ００９（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ５）；（Ｅ）Ｍｏｄ０１０（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ６）。
【図１７Ｂ】図１７Ａの続き。
【図１７Ｃ】図１７Ｂの続き。
【図１７Ｄ】図１７Ｃの続き。
【図１７Ｅ】図１７Ｄの続き。
【図１８】図１８は、合成Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ＰＫＳ遺伝子の構築において使用される制限部位およびシントンを示す。
【図１９】図１９は、高スループット遺伝子合成および分析のための自動化システムを示す。
【図１】
2006517090.tif 000077
【図２】
2006517090.tif 000078
【図３Ａ】
2006517090.tif 000079
【図３Ｂ】
2006517090.tif 000080
【図４】
2006517090.tif 000081
【図５】
2006517090.tif 000082
【図６】
2006517090.tif 000083
【図７】
2006517090.tif 000084
【図８】
2006517090.tif 000085
【図９】
2006517090.tif 000086
【図１０Ａ】
2006517090.tif 000087
【図１０Ｂ】
2006517090.tif 000088
【図１１】
2006517090.tif 000089
【図１２】
2006517090.tif 000090
【図１３】
2006517090.tif 000091
【図１４】
2006517090.tif 000092
【図１５】
2006517090.tif 000093
【図１６Ａ】
2006517090.tif 000094
【図１６Ｂ】
2006517090.tif 000095
【図１６Ｃ】
2006517090.tif 000096
【図１８】
2006517090.tif 000097
【図１７Ａ】
2006517090.tif 000098
【図１７Ｂ】
2006517090.tif 000099
【図１７Ｃ】
2006517090.tif 000100
【図１７Ｄ】
2006517090.tif 000101
【図１７Ｅ】
2006517090.tif 000102
【図１９】
2006517090.tif 000103
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月15日(2005.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４９】
【図１−１】図１は、ＤＵＧ−クローニングカセット（「クローニングリンカー」）およびニックエンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡを用いるライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）のためのベクター調製のスキームを示す。図１Ａ。ベクター調製に使用されるＵＤＧ−クローニングカセットＳａｃ  Ｉおよびニック酵素部位が標識される。図１Ｂ。ニックエンドヌクレアーゼＮ．ＢｂｖＣ  ＩＡ（配列番号１２）を用いるＬＩＣのためのベクター調製物のスキーム。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きである。
【図２】図２は、Ｉ型ＴＳ制限酵素としてＢｂｓ  ＩおよびＢｓａ  Ｉを用いる方法Ｓ結合方法を示す（配列番号１３、１４、および１５）。
【図３Ａ】図３Ａは、ベクター対Ｉを用いる方法Ｓ結合方法を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ベクター対ＩＩを用いる方法Ｓ結合を示す。２Ｓｉ−４は、Ｉ型ＴＳ制限酵素について認識部位であり、Ａ、Ｂ、ＢおよびＣ、それぞれは、酵素についての切断部位である。
【図４−１】図４は、編成について有用なベクター対を示す。図４Ａ：ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−２。図４Ｂ：ベクターｐＫｏｓ２９３−１７２−Ａ７６。両方のベクターは、Ｎ．Ｂｂｖ  ＣＩＡ制限部位を含むＵＤＧクローニングカセット、両方のベクターに共通の「右制限部位」（Ｘｈｏ  Ｉ部位）、各ベクターにより異なる「左制限部位」（例えば、Ｅｃｏ  ＲＶまたはＳｔｕ  Ｉ部位）、両方ベクターに共通の第１選択マーカー（カーベニシリン耐性マーカー）および各ベクターにより異なる第２の選択マーカー（クロラムフェニコール耐性マーカーまたはカナマイシン耐性マーカー）を含む。
【図４−２】図４−２は、図４−１のつづきである。
【図５】図５は、ベクター対ＩＩを用いる方法Ｒ結合を示す。
【図６−１】図６Ａは、ｅｒｙモジュール４において見られるように、６つのＰＫＳドメインの完全相補体を有する複合制限マップを示す。大まかなサイズは、ＫＳ  ＝１．２、ＫＳ／ＡＴリンカー＝０．３、ＡＴ＝１．０、ＡＴ／ＤＨリンカー＝０．０３、ＤＨ＝０．６、ＤＨ／ＥＲリンカー＝０．８、ＥＲ＝０．８、ＥＲ／ＫＲリンカー＝０．０２、ＫＲ＝０．８、ＫＲ／ＡＣＰリンカー＝０．２、ＡＣＰ＝０．２．１Ｕｎｉｔ＝１ｋｂ；図６Ｂは、ＤＥＢＳ２を参照してシントンの端についての例示的な制限部位を示す。
【図６−２】図６−２は、図６−１のつづきである。
【図７】図７は、モジュール１−２−３−４−５−６−７−８−９を作製するためのシントン１−９の編成についてのペアでない選択ストラテジーを示す。括弧は、シントンまたは所望のマルチシントンがクローニングされるベクターについての、選択マーカー（Ｋ＝カナマイシン耐性、Ｃｍ＝クロラムフェニコール耐性）ならびに左制限部位、ＬおよびＬ’、（Ｓ＝Ｓｔｕ  Ｉ制限部位、Ｅ＝Ｅｃｏ  ＲＶ制限部位）を示す。シントンは、以下の付着末端で結合される：１−２  ＮｇｏＭ  ＩＶ；２−  ３  Ｎｈｅ  １；３−４  Ｋｐｎ  Ｉ；４−５  Ｂｇｌ  ＩＩ；５−６  Ａｇｅ  Ｉ／Ｎｇｏ  ＭＩＶ；６−７  Ｐｓｔ  １；７−８  Ａｇｅ  Ｉ；８−９  Ｂｇｌ  ＩＩ。
【図８】図８は、ＧｅＭＳプロセスを示すフローチャートである。
【図９−１】図９は、ＧｅＭＳアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図９−２】図９−２は、図９−１の続きである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、合成遺伝子についてのコドン優先テーブルの生成を示すフローチャートである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ランダム化され、コドンに最適化された遺伝子配列を生成するためのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、制限部位除去アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、制限部位挿入アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、オリゴヌクレオチド設計についてのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、シントンＤＮＡ配列の迅速な分析のためのアルゴリズムを示すフローチャートである。
【図１５】図１５は、ＤＥＢＳのＰＡＧＥ分析を示す。合成配列（ｓＭｏｄ２）および天然配列（ｎＭｏｄ２）Ｍｏｄ２株からの可溶性タンパク質抽出物を、誘導４２時間後にサンプル採集し、３〜８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭＷスタンダードの位置を右に示した。このゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。
【図１６Ａ】図１６は、合成ＤＥＢＳ遺伝子の構築物において使用される制限部位およびシントンを示す。１６Ａ  ＤＥＢＳ１  ＯＲＦ；１６Ｂ，ＤＥＢＳ２  ＯＲＦ，１６Ｃ  ＤＥＢＳ３  ＯＲＦ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１６Ａの続きである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１６Ｂの続きである。
【図１７Ａ】図１７は、合成ＤＥＢＳ遺伝子の構築のための編成および選択ストラテジーを示す。Ａ＝シントンクローニングベクター２９３−１７２−Ａ７６；Ｂ＝シントンクローニングベクター２９３−１７２−２。（Ａ）Ｍｏｄ００６（ＤＥＢＳ  ｍｏｄｌ）；（Ｂ）Ｍｏｄ００７（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ３）；（Ｃ）Ｍｏｄ００８（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ４）；（Ｄ）Ｍｏｄ００９（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ５）；（Ｅ）Ｍｏｄ０１０（ＤＥＢＳ  ｍｏｄ６）。
【図１７Ｂ】図１７Ａの続き。
【図１７Ｃ】図１７Ｂの続き。
【図１７Ｄ】図１７Ｃの続き。
【図１７Ｅ】図１７Ｄの続き。
【図１８−１】図１８は、合成Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ＰＫＳ遺伝子の構築において使用される制限部位およびシントンを示す。
【図１８−２】図１８−２は、図１８−１のつづきである。
【図１９】図１９は、高スループット遺伝子合成および分析のための自動化システムを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2006517090.tif 000104
【図１−２】
2006517090.tif 000105
【図２】
2006517090.tif 000106
【図４−２】
2006517090.tif 000107
【図５】
2006517090.tif 000108
【図６−１】
2006517090.tif 000109
【図６−２】
2006517090.tif 000110
【図７】
2006517090.tif 000111
【図８】
2006517090.tif 000112
【図９−２】
2006517090.tif 000113
【図１１】
2006517090.tif 000114
【図１４】
2006517090.tif 000115
【図１５】
2006517090.tif 000116
【図１６Ａ】
2006517090.tif 000117
【図１６Ｂ】
2006517090.tif 000118
【図１６Ｃ】
2006517090.tif 000119
【図１７Ａ】
2006517090.tif 000120
【図１７Ｂ】
2006517090.tif 000121
【図１７Ｄ】
2006517090.tif 000122
【図１７Ｅ】
2006517090.tif 000123
【図１８−２】
2006517090.tif 000124
【図３Ａ】
2006517090.tif 000125
【図３Ｂ】
2006517090.tif 000126
【図４−１】
2006517090.tif 000127
【図９−１】
2006517090.tif 000128
【図１０Ａ】
2006517090.tif 000129
【図１０Ｂ】
2006517090.tif 000130
【図１２】
2006517090.tif 000131
【図１３】
2006517090.tif 000132
【図１７Ｃ】
2006517090.tif 000133
【図１８−１】
2006517090.tif 000134
【図１９】
2006517090.tif 000135
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月11日(2006.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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