(57)【要約】  本発明は、インターロイキン１８の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ線により誘導された損傷に関連する皮膚障害の予防、減少および治療のための薬剤を製造するためのインターロイキン１８の使用。
【請求項２】
前記障害がヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路の誘導により緩和および／または予防できる障害である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記障害がサンバーン、炎症、皮膚老化および皮膚癌を含む群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記障害がアポトーシスに関連する、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記ＵＶ線が２２０ｎｍから３５０ｎｍの波長範囲を少なくとも含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ＵＶ線が２５０ｎｍから３３０ｎｍの波長範囲を少なくとも含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記ＵＶ線が２９０ｎｍから３２０ｎｍの波長範囲を少なくとも含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記ＵＶ線が自然太陽光および／または人工太陽光に由来する、請求項５から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記薬物をそれを必要とする患者に適用することを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記適用が全身および／または局所である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記適用が薬学的に許容可能な担体の適用により、かつ／または薬学的に許容可能な担体の注射、好ましくは皮内注射によりなされる、請求項９から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記担体がリポソーム、軟膏、油剤、クリーム、乳剤および分散物を含む群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記局所適用が１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの用量範囲でなされる、請求項１０から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記全身適用が０．１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重の用量範囲でなされる、請求項１０から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記適用が１日に１回から８回なされる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
患者がＵＶ線に曝露される前、曝露される間および／または曝露後に前記適用がなされる、請求項９から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記必要とする患者が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項９から１６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１８の使用に関する。
【０００２】
環境の影響による皮膚障害の発生率は、近年急激に増加しているように思われる。化石燃料の燃焼またはプラスチック性物質の製造からの排出ガスを含めた種々の起源からの、これまで増加している数および種類の化学物質への曝露を別として、外部放射線もまた皮膚障害の発生にますます大きく関与している。これに関連して、自然源（すなわち太陽光線）ならびに人工源両方からのＵＶ線が、皮膚疾患及び皮膚障害の原因に主な役割を果たすと考えられている。ヨーロッパ、米国およびオーストラリアにおいて、黒色腫および非黒色腫性皮膚癌の両方の発生率が劇的に増加している。オゾン層の減少によるＵＶＢ線の増加した流入が、ある程度この現象に寄与しているおそれがあるが、ＵＶ誘導性皮膚癌の増加の主な理由は、確実に集団の挙動である。主としてレジャー活動における持続した変化が原因で、平均的集団の生涯累積ＵＶ線量は過去数十年に増加した（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＫｒｉｃｋｅｒ、２００１、Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  Ｂ．；６３（１−３）：８〜１８頁）。
【０００３】
実際、太陽光紫外線は陸生生物の皮膚に関して最も重要な環境影響の１つである。これは中波長域のＵＶ線（２９０〜３２０ｎｍ）に特にあてはまる。それは、サンバーンだけでなく上記の皮膚癌の発生率の大きな増加に関し、原因となる役割を果たすと考えられているのがこの領域であることによる。メカニズムの観点から、皮膚細胞に及ぼすＵＶ線の有害性は、その光線を曝露された皮膚細胞のＤＮＡ中で誘導される大規模な損傷により引き起こされると考えられている。ＤＮＡはＵＶＢ領域（２９０〜３２０ｎｍ）およびＵＶＣ領域（２００〜２９０ｎｍ）のＵＶ光を吸収する。ＵＶ線の吸収は、影響を受けたＤＮＡ分子中での傷害に付随しておこることが多い。２９０〜３２０ｎｍの範囲のＵＶ線は、主として２種の光の損傷、すなわちシクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）および（６−４）光産物を誘導する。正常な真核細胞ではこれらの光産物のほぼ大部分が、「ヌクレオチド除去修復」（ＮＥＲ）と一般に呼ぶメカニズムにより除去される。残ったＤＮＡ損傷は、影響を受けた細胞に悪性の異常を生じるおそれがあるため、ＮＥＲはこの上なく重要である。（ｄｅ  Ｌａａｔら、１９９９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：７６８〜７８５頁）。ＮＥＲメカニズムの重要性は、機能的ＮＥＲ系が存在しないことを特徴とする遺伝障害、つまり色素性乾皮症（ＸＰ）により印象的に実証されている。したがって、色素性乾皮症を患う患者は、皮膚癌の率の劇的な増加を示す（Ｋｒａｅｍｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１〜１４頁、１９９７）。真核生物と同じような原核生物およびウイルスのＮＥＲ系が、ＤＮＡ損傷を除去するために設計された特異的な酵素に存在する。例えばＤＮＡ修復の促進は、同じＵＶの生体作用を除去する外因性ＤＮＡ修復酵素の適用によっても達成できる。細菌ＤＮＡ修復酵素であるＴ４Ｎ５エンドヌクレアーゼは、リポソームに封入された場合に、免疫抑制、免疫抑制性サイトカインであるインターロイキン１０および炎症仲介物質である腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の放出を含む多様なＵＶ介在性現象をうまく逆転することが示された。（Ｗｏｌｆら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１１４：１４９〜１５６頁、２０００；Ｋｉｂｉｔｅｌら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６７：５４１〜５４６頁、１９９８）。類似の観察が、これも細菌起源の別の修復酵素であるフォトリアーゼでなされ、この酵素は光回復光の照明を受けて特異的にシクロブタン型ピリミジン二量体をもとに戻す。この修復プロセスを「光回復」とも呼ぶ（Ｓｔｅｇｅら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：１７９０〜１７９５頁）。細胞へのこれらの修復酵素の導入を、それらをリポソームに組み込んだ後に、これらのリポソームをＵＶ照射された培養細胞またはＵＶ照射された皮膚に適用することによって実施する。これらの修復酵素の局所適用は、慢性的にＵＶ照射されたマウスにおける皮膚腫瘍の発生率を有意に減少させることを示せた（Ｙａｒｏｓｈら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２、４２２７〜４２３１頁）。さらに、Ｔ４Ｎ５エンドヌクレアーゼの局所適用は、色素性乾皮症を有する��者が光線性角化症（ａｃｔｉｎｉｃ  ｃｅｒａｔｏｓｅｓ）を発症するリスクを有意に低下させる（Ｙａｒｏｓｈら、２００１、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：９２６〜９２９頁）。しかし、これらの方法はサンバーンおよび皮膚損傷の正常な治療への方法であることを見出せなかった。局所適用されたＵＶフィルターを使用することによる太陽光に対する通常の防御は、依然として皮膚に対するＵＶ誘導性損傷を予防する最も効果的な方法であることは明らかである。しかし、通常のＵＶフィルターは、それらがＵＶ吸収性の芳香環系であるならばアレルギー反応を起こすおそれがあるか、またはＵＶ線の単なる力学的遮断（例えば金属酸化物色素）によるもので効果的な防御をもたらさず、そのうえ着衣の汚染を引き起こすかのどちらかという望まざる副作用を有することが多い。
【０００４】
ＵＶが誘導するシクロブタン型ピリミジン二量体は、表皮内のサンバーン細胞としてｉｎ  ｖｉｖｏで出現するアポトーシス性角化細胞の形成に決定的な役割を果たす癌抑制遺伝子ｐ５３を活性化できる（Ｍｕｒｐｈｙら、２００１、Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０：１５５〜１６０頁）。機能的ｐ５３が欠乏したマウスは、ＵＶ照射された野生型マウスより、ＵＶ照射の曝露を受けて極めて少ないサンバーン細胞を発現した（Ｚｉｅｇｌｅｒら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：７７３〜７７６頁）。ＵＶ照射は、ＤＮＡ合成前にＤＮＡ修復できるようにＧ１期で細胞周期をｐ５３依存的に停止させる。これらの発見に基づいて、サンバーン細胞は損傷したＤＮＡを効果的に修復できず、その結果アポトーシスを受け、それによって悪性になるリスクを回避した角化細胞であると推定された。したがって、サンバーン細胞の形成は、ｐ５３の腫瘍抑制性に関してＵＶ誘導性皮膚癌の発現から個体を守るｐ５３調節性清掃現象であるとみなされ（Ｂｒａｓｈら、１９９６、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、１：１３６〜１４２頁）、ここにおいて突然変異した角化細胞はＵＶの腫瘍促進作用に感受性のはずであるが、野生型ｐ５３を有する他の細胞は一定量のＤＮＡ損傷を負荷した場合にアポトーシスにより除去されるはずである（Ｂｒａｓｈら、同）。ＵＶはｐ５３を好んで突然変異させることから（Ｂｒａｓｈら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０１２４〜１０１２８頁）、ＵＶは突然変異体、つまり耐損害性の角化細胞に対し選択圧を及ぼし、これによりこれらの細胞がクローン増殖して皮膚癌の前段階である光線性角化症を形成することを可能にしているおそれがある（Ｚｉｅｇｌｅｒら、同）。したがって、ＤＮＡ損傷の程度は、アポトーシスの主要なメディエイターであるためサンバーン細胞数と相関すると提示された（Ｚｉｅｇｌｅｒら、同）。ＤＮＡ修復の増加は、ＵＶ曝露に対する角化細胞のアポトーシス応答の減少も生じるはずである。この仮定の証拠は、上皮細胞（ＨｅＬａ）にＵＶ照射後にＤＮＡ修復が強化したことからもたらされた。リポソームに封入したＤＮＡ修復酵素フォトリアーゼの添加を介した光回復により、ＤＮＡ修復の促進を達成した。光回復はＵＶ曝露に対応して完全ではないが有意に低下したアポトーシス率を生じた（Ｋｕｌｍｓら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：７９７４〜７９７９頁）。リポソーム送達による修復酵素Ｔ４Ｎ５の局所適用が、マウスおよびヒトの両方におけるサンバーン細胞数を減少させたことを実証することにより、同様の結果がｉｎ  ｖｉｖｏで得られた（Ｗｏｌｆら、２０００、同；Ｓｔｅｇｅら、２０００、同）。まとめると、これらおよび上記のデータは核のＤＮＡ損傷がＵＶの生体作用の仲介に重要な役割を果たすことを明らかに示している。
【０００５】
最近の研究（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６〜３１頁）で、インターロイキン１２が細胞自体の修復系、具体的にはヌクレオチド除去修復系（ＮＥＲ）によるＤＮＡ修復を誘導することによりＵＶ線誘導性アポトーシスを抑制することを示した。ＩＬ−１２は免疫刺激性サイトカインであり、広い一連の作用を有する。インターロイキン１２は誘導後に末梢リンパ球により分泌される。それは主にＢ細胞から、わずかな部分ではＴ細胞から産生される。その構造の点ではインターロイキン１２は３５ｋＤａおよび４０ｋＤａのサブユニットを有する７０ｋＤａのヘテロ二量体タンパク質である（ＩＬ−１２Ａ＝３５ｋＤａ、アミノ酸１９７個；ＩＬ−１２Ｂ＝４０ｋＤａ、アミノ酸３０６個）。ヘテロ二量体はジスルフィド結合により形成し、その形成は生体活性に必須である。両サブユニットおよびそれらの相互作用は分子が正確に機能するために必須であると考えられる。それは、４０ｋＤａサブユニットのホモ二量体が拮抗した機能を示すからである（Ｇｅｒｍａｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ；１６（１０）：５００〜５０１頁）。
【０００６】
活性に関して、ＩＬ−１２はすでに上に指摘したように古典型の免疫刺激性サイトカインであり、一次免疫応答後の広範囲の反応に関与すると考えられている。ＩＬ−１２はフィトヘマグルチニンによる細胞活性化後にヒトリンパ芽球の増殖を刺激する。ＩＬ−１２はＣＤ５６陽性のＮＫ細胞を活性化し、さらにＴ細胞増殖を誘導する混合のリンパ球培養において同種刺激を有する抗ＣＤ３抗体と共に相乗作用を示す。さらに、ＩＬ−１２はＴヘルパー１型細胞（Ｔｈ１）の末梢リンパ球におけるＩＦＮ−γおよびインターロイキン２の合成を誘導することが示された。ＴＮＦ−αに対する抗体はナチュラルキラー細胞に対するＩＬ−１２の作用を抑制できるという発見に基づき、ナチュラルキラー細胞に及ぼすＩＬ−１２の作用はＴＮＦ−αにより仲介される。ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αは、ＩＬ−１２がＩＦＮ−γ応答を最大化するＩＦＮ−γ産生の共刺激因子である。さらに、ＩＬ−１２は末梢血中の単核細胞の増殖促進およびリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の発生促進にＩＬ−２と共に機能する。ピコモル濃度のＩＬ−１２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−２により増大したナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の増加に、ナノモル濃度のＩＬ−２と同じくらい有効である。さらに、ＩＬ−１２は多発性硬化症、接触過敏症および湿疹のような自己免疫疾患の病因に含まれていた（Ｒｉｅｍａｎｎら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（５）：１７９９〜１８０３頁；Ｌｅｏｎａｒｄら、１９９７、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７（５〜６）：５４５〜５５３頁）。ＩＬ−１２により、ＬＡＫ細胞の発生に必要なＩＬ−２の用量を減らすことができるので、ＩＬ−２が通常使用される養子免疫療法に潜在的役割を果たすと考えられている。ここにおいて、インターロイキン２に関連して重篤な有害副作用があり、それ故にＩＬ−２とＩＬ−１２との同時適用には大きな希望がある。ＩＬ−１２はｉｎ  ｖｉｖｏで多様な実験腫瘍の成長を阻害すること、およびＩＦＮ−γにより仲介されると考えられている抗血管形成作用を有することも示された。
【０００７】
上記から分かるように、そのような適用の結果が何であるかをはっきりとは予測できない、つまり関連する相互作用の多要因的性質が得られないので、ＩＬ−１２が様々な役割をもつことによるＩＬ−１２の医学的適用への使用を困難なものとしている。たとえ少ない程度でも、ＩＬ−１２を用いた実験から得られた洞察および知識を他のサイトカインに単純に移しかえることが可能である。さらに、ＩＬ−１２の使用はその高い費用により、また例えばその局所的適用を除外するようなその比較的大きなサイズによって、大幅に制限される。
【０００８】
太陽光の曝露後のＵＶ誘導性皮膚損傷の開始の予防ならびに皮膚癌および皮膚の早発老化の予防はまだ依然として解決すべきである。外部から適用された太陽光フィルターのような通常の手段は皮膚の損傷を実際に予防するが、いったん損傷が起こってしまうと役に立たない。クリーム、軟膏など、または繊維でできたカバーの形態での力学的遮断物について同じことが言え、繰り返すが、いったん損傷が起こったものには何も役に立たない。前記ＩＬ−１２の適用のような代替法は、追随して期待できる手段であることが証明されうるが、ＩＬ−１２の高い費用および皮膚への効果的な取り込みを阻害する大きな分子サイズのために実現可能とは考えにくい。
【０００９】
したがって、ＵＶが誘導する皮膚損傷の予防および／または治療の代替法を提供することが本発明の目的である。当業者で公知の他の方法よりも安価で実現可能性の高い、ＵＶ誘導性皮膚損傷の予防法および／または治療法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１０】
これらの目的は、ＵＶ線により誘導される損傷に関連した皮膚障害の予防、減少および治療に関する、薬剤の製造にインターロイキン１８を使用することにより解決される。
【００１１】
好ましくは、障害はヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路の誘導により緩和および／または予防できる障害である。
【００１２】
実施形態において、障害はサンバーン、炎症、皮膚老化および皮膚癌を含む群から選択される。
【００１３】
障害はアポトーシスに関連することが好ましい。
【００１４】
一実施形態において、ＵＶ線は波長２２０ｎｍから３５０ｎｍ、好ましくは２５０ｎｍから３３０ｎｍ、さらに好ましくは２９０ｎｍから３２０ｎｍの範囲を少なくとも含む。
【００１５】
一実施形態において、ＵＶ線は自然太陽光および／または人工太陽光に由来する。
【００１６】
好ましくは、使用は前記薬剤をそれを必要とする患者に適用することを含み、ここで適用は好ましくは全身および／または局所である。
【００１７】
一実施形態において、適用は薬学的に許容可能な担体の適用方法により、かつ／または注射、好ましくは薬学的に許容可能な担体の内皮注射によりなされ、ここで担体は好ましくはリポソーム、軟膏、油剤、クリーム、乳剤、および分散物を含む群から選択される。
【００１８】
一実施形態において、局所適用は１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの用量範囲でなされる。
【００１９】
一実施形態において、全身適用は０．１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重の用量範囲でなされ、ここで適用は好ましくは１日に１から８回なされる。
【００２０】
一実施形態において、適用は患者がＵＶ線に曝露される前、曝露される間および／または曝露後になされる。
【００２１】
好ましくは、必要とする患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００２２】
本発明の作製にあたり、インターロイキン１８がＵＶ光を照射された皮膚におけるＵＶ誘導性損傷を予防および／または治療できることを発明者らは示すことができた。その結果、インターロイキン１８がＵＶ線に通常関連するアポトーシスを減少させることができるかのように思われる。さらに、インターロイキン１８はＵＶ光を照射された角化細胞の長期生存をもたらすこともできる。さらに、ＵＶを照射されたマウスの皮膚はＩＬ−１８を注射された場合に、ＩＬ−１８の注射を行わなかった動物に比べてより少ないアポトーシス性角化細胞（サンバーン細胞（ＳＣ））を示した。どのような理論と結びつけることも欲さずに、ＵＶ誘導性アポトーシスの減少が真核細胞の修復系であるＮＥＲ系の付随した誘発の起因であると現在考えられている。ＵＶ誘導性アポトーシスの抑制がＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷の顕著な減少の原因と考えられ、これをサザンウェスタンドットブロット（下記）により示すことができた。ＩＬ−１８で処理されたか、または未処理のマウスの群におけるＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷の量はＵＶ照射直後で同じであったが、ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷は、インターロイキン１８で処理されたマウスの群において有意に減少した。同様の結果は免疫組織化学実験によりｉｎ  ｖｉｖｏでも見出すことができた。ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷はＵＶ照射直後のＩＬ−１８処理マウスまたは未処理マウスで同じであったが、ＤＮＡ損傷は照射の１８時間後に有意に減少した。そのような効果を野生型マウスで得ることができたが、機能的ＮＥＲ系を有さないマウス、すなわちＸｐａ遺伝子欠失を有するマウスでは得られなかったという事実は、ＮＥＲ修復系の関与を示している。これはさらに、インターロイキン−１８がＮＥＲ系を誘導することにより、ＵＶ照射により引き起こされたＤＮＡ損傷を減少させることによってＵＶ誘導性アポトーシスを予防できることを示している。ＤＮＡ損傷のそのような減少から、ＩＬ−１８は皮膚癌および皮膚の早発老化に対して予防作用を有する。このような作用はこれまでインターロイキン１２でのみ観察され、インターロイキン１２はインターロイキン１８とまったく機能的関連がないか、またはＮＥＲ系が明らかに関与しない分野でのみ関連しているため、これはなおさら驚くべきことである。
【００２３】
本明細書において使用するように、ヌクレオチド除去修復経路（ＮＥＲ）という用語は「ヌクレオチド除去修復系」および「ヌクレオチド除去修復メカニズム」という用語と互いに交換できるように使用され、例えばｄｅ  Ｌａａｔら、１９９９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１３：７６８〜７８５頁に記載された系を一般的に指す。
【００２４】
本明細書において使用するように、「アポトーシスに関連する障害」という用語は、細胞のアポトーシスにより引き起こされ、かつ／もしくはそれに付随する障害、および／または細胞のアポトーシスにおいて出現する障害を称することを意味する。
【００２５】
これから図を参照し、
図１は、ＩＬ−１８によるＵＶ誘導性アポトーシスの抑制を示し、
図２は、インターロイキン１８がＵＶ照射後の角化細胞の生存を可能にすることを示し、
図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１８によるＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷の減少を示し、
図４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１８によるＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷の減少を示し、
図５は  Ｘｐａ欠失マウスにおいてＩＬ−１８によるサンバーン細胞の減少が存在しないことを示す。
【００２６】
本発明を以下の特定の実施例によりこれから記述するが、これらの実施例は本発明を限定することではなく、単に例示することを意図する。
【００２７】
（実施例１）
細胞系ＫＢ（２×１０５／ｍｌ）に２５０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢ（２９０ｎｍ〜３２０ｎｍ）を照射した。ＵＶ照射の４時間前にヒト組換えＩＬ−１８（１５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた（ＵＶ＋ＩＬ−１８）。照射の１６時間後に、ＤＮＡ断片化の原理に依存したアポトーシス用のＥＬＩＳＡ法によりアポトーシス細胞死を測定した。ＤＮＡの断片化を検出するために、細胞死検出用ＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用した。細胞の細胞質中に放出されたモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの濃縮を、ビオチン化抗ヒストン抗体およびペルオキシダーゼ結合抗ＤＮＡ抗体により検出する。アポトーシスの割合はＹ軸に表した吸光の増加に反映される。吸光度を３回の平均±ＳＤとしてｙ軸に示す。スチューデントのｔ検定を使用して有意差を検定した。＊ｐ＜０．０５（ＵＶ＋ＩＬ−１８対ＵＶ）である。この実験の結果を、ＩＬ−１８がＵＶ誘導性アポトーシスを抑制することを示している図１に見ることができる。
【００２８】
（実施例２）
ＵＶ線（２５０Ｊ／ｃｍ２）の４時間前に野生型ヒト角化細胞を１５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８または等量の希釈剤で処理した。ＵＶ照射後に細胞をインターロイキン１８存在下および非存在下で培地に植えた。その２４時間後に培地をＩＬ−１８を加えない角化細胞成長培地と交換し、細胞を２１日間培養した。２１日後にコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、その結果を図２に示す。図２から、インターロイキン１８がＵＶ照射後の角化細胞の生存を可能にすることが明らかとなる。
【００２９】
（実施例３）
ＩＬ−１８（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（ＵＶ＋ＩＬ−１８）または非存在下（ＵＶ）でＫＢ細胞にＵＶ光１５０Ｊ／ｃｍ２（２９０〜３２０ｎｍ）を照射した。ＵＶ照射のそれぞれ１０分、３．５時間および６．５時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷（シクロブタン型ピリミジン二量体）に特異的に対する抗体を用いてサザンウェスタンドットブロット分析を実施した。Ｂｉｏｚｙｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ（Ｈｅｓｓｉｓｃｈ  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ、ドイツ連邦共和国）のＤＮＡ抽出プロトコルにしたがって１×１０６個の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。吸引によるドットブロット作製により正荷電したナイロン膜にゲノムＤＮＡ２μｇを移行させ、膜を８０℃で１５分間加熱することにより固定した。チミン二量体に対するモノクローナル抗体（Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、シアトル、ワシントン州）をサザンウェスタン分析に使用した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体を用いて検出を行った。本実験の結果を図３に示す。図３はＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷をＩＬ−１８により減少できることを示す。
【００３０】
（実施例４）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背中を剃毛し、６５０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢを背面照射した。ＵＶ線の３時間前に、ＩＬ−１８（ｂ，ｄ）３００ｎｇおよび等量（１００μｌ）の生理食塩水（ａ，ｃ）を皮内注射した。ＵＶ照射後１０分（ａ，ｂ）および１６時間（ｃ，ｄ）に皮膚生検を採取し、ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷（シクロブタン型ピリミジン二量体）に特異的に対する抗体を用いて免疫組織化学染色法を実施した。生検を緩衝７％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水し、パラフィンに包埋した。徐々に濃度を低下させたキシロールおよびエタノールでパラフィンを除去した後に、切片を０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍクエン酸ナトリウムを含む水溶液に浸してから１５分間マイクロ波処理し抗原エピトープのマスクをはずした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、ＰＢＳに溶かした０．１％Ｈ２０２および０．６％ナトリウム酸と共に２０分間温置することにより遮断した。ＰＢＳで洗浄してから、非特異的結合部位を２％ＢＳＡと共に３０分間室温で放置し、その後１％ＢＳＡで希釈した一次抗体と共に一晩放置することで遮断した。抗チミジン二量体抗体を１：２０００希釈で使用した。以下の試薬を用いて間接免疫ペルオキシダーゼ法により染色を実行した：ＰＢＳ、ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（未希釈、Ｄａｋｏ  ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｄａｋｏ、ハンブルグ、ドイツ）、０．０１％Ｈ２０２、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ．、セントルイス、ミズーリ州）。陰性対照は第一抗体の脱落を有する。染色した切片を通常の光学顕微鏡で評価した。本実験の結果を図４に示す。図４からみられるように、ＩＬ−１８によってＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷をｉｎ  ｖｉｖｏで減少させることができる。
【００３１】
（実施例５）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型）およびＸｐａ欠失マウス（Ｘｐａ  ＫＯ）の背中を剃毛し、３０００Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢを背面照射した。ＵＶ照射の３時間前に、インターロイキン１８（３００ｎｇ）を皮内注射した。ＵＶ照射の１６時間後に皮膚生検を採取し、アポトーシス性角化細胞（サンバーン細胞、ＳＣ）を皮膚６ｍｍあたりで計数した。ＳＣの形成を評価するために、皮膚のＵＶ曝露部から生検を採取し、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。組織切片（５μｍ）をヘマトキシリン・エオシンで染色し、通常の顕微鏡に挿入された１×１ｃｍ格子を用いて試料毎の表皮切片にわたり、縮んだエオシン好性細胞質および濃縮した核小体を示す表皮内のアポトーシス細胞として定義されるＳＣ数を計数した。６ｍｍの長さの表皮あたりのＳＣを計数した。各試料について少なくとも５視野を評価し、ＳＣ数（平均±ＳＤ）を計算した。スチューデントのｔ検定を使用して有意差を検定した。本実験の結果を図５に示す。図５によると、ＩＬ−１８はＸｐａ欠失マウスにおいてＵＶ誘導性アポトーシス（サンバーン細胞）を減少できないことから、ＮＥＲ経路の直接または間接誘導物質としてのＩＬ−１８の役割を意味している。
【００３２】
本明細書、特許請求の範囲および／または添付する図面に開示した本発明の特徴は、単独およびその任意の組合せの両方で多様な形式をとる本発明を実現するための資料となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＩＬ−１８によるＵＶ誘導性アポトーシスの抑制を示す。
【図２】図２は、インターロイキン１８がＵＶ照射後の角化細胞の生存を可能にすることを示す。
【図３】図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１８によるＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷の減少を示す。
【図４】図４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１８によるＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷の減少を示す。
【図５】図５は  Ｘｐａ欠失マウスにおいてＩＬ−１８によるサンバーン細胞の減少が存在しないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月28日(2004.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ線により誘導された損傷に関連する皮膚障害の予防、減少および治療のための薬剤を製造するためのインターロイキン１８の使用であって、前記障害がサンバーン、炎症および皮膚老化を含む群から選択される使用。
【請求項２】
前記障害がヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路の誘導により緩和および／または予防できる障害である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記障害がアポトーシスに関連する、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記ＵＶ線が２２０ｎｍから３５０ｎｍの波長範囲を少なくとも含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記ＵＶ線が２５０ｎｍから３３０ｎｍの波長範囲を少なくとも含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ＵＶ線が２９０ｎｍから３２０ｎｍの波長範囲を少なくとも含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記ＵＶ線が自然太陽光および／または人工太陽光に由来する、請求項４から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記薬物をそれを必要とする患者に適用することを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記適用が全身および／または局所である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記適用が薬学的に許容可能な担体の適用により、かつ／または薬学的に許容可能な担体の注射、好ましくは皮内注射によりなされる、請求項８から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記担体がリポソーム、軟膏、油剤、クリーム、乳剤および分散物を含む群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記局所適用が１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの用量範囲でなされる、請求項９から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記全身適用が０．１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重の用量範囲でなされる、請求項９から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記適用が１日に１回から８回なされる、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
患者がＵＶ線に曝露される前、曝露される間および／または曝露後に前記適用がなされる、請求項８から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記必要とする患者が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項８から１５のいずれかに記載の使用。
【国際調査報告】
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