(57)【要約】本発明は、一般に所望のポリペプチドを作製するための組換え方法に関する。これらの方法は、低減されたレベルのそのアイソフォーム不純物を含むポリペプチド生成物を生じる。特に、本発明は、（１）そのアイソフォーム不純物が低減した成長ホルモンを調製するための組換え方法、並びに（２）同様に、そのアイソフォーム不純物が低減した成長ホルモンアンタゴニスト（例えば、ペグビソマント）及びそのタンパク質中間体を調製するための組換え方法に関する。より具体的には、本発明の方法によって減少されるアイソフォーム不純物は、それぞれ、成長ホルモン及び成長ホルモンアンタゴニスト（又はその中間体）の、トリスルフィドアイソフォーム不純物及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、前記不純物をメルカプト化合物と接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドのトリスルフィドアイソフォームである、方法。
【請求項２】
（ｂ）前記ポリペプチドを生成するために前記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、前記増殖させるステップが、前記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）精製されたポリペプチドを得るために前記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）前記精製されたポリペプチドをペグ化するステップ
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記メルカプト化合物が、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記メルカプト化合物が、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記メルカプト化合物が、システイン、又はシステインとシスチンとの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記メルカプト化合物が、システイン、又はシステインとシスチンとの組合せを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記接触させるステップ（ａ）において、前記トリスルフィドアイソフォームを、前記トリスルフィドアイソフォームの前記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、前記システイン又はシステインとシスチンとの組合せと接触される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、キレート剤を、（１）前記不純物、（２）前記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）前記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドのトリスルフィドアイソフォームである、方法。
【請求項１１】
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、金属塩を、（１）前記不純物、（２）前記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）前記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドのトリスルフィドアイソフォームである、方法。
【請求項１２】
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、キレート剤を、（１）前記不純物、（２）前記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）前記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【請求項１３】
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、金属塩を、（１）前記不純物、（２）前記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）前記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【請求項１４】
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、キレート剤を、（１）前記不純物、（２）前記成長ホルモンポリペプチド、（３）前記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【請求項１５】
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記不純物の前記量を減少させるのに十分な条件下で、金属塩を、（１）前記不純物、（２）前記成長ホルモンポリペプチド、（３）前記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、前記不純物が前記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が本明細書中で参考により援用される、その対応する仮特許出願第６０／４０６５５３号（２００２年８月２８日出願）に対する優先権を主張する、非仮出願である。
【０００２】
本発明は、一般に所望のポリペプチドを作製するための組換え方法に関する。これらの方法は、低減されたレベルのそのアイソフォーム不純物を含むポリペプチド生成物を生じる。特に、本発明は、（１）低減されたそのアイソフォーム不純物を有する成長ホルモンを調製するための組換え方法、並びに（２）同様に、そのアイソフォーム不純物が低減した成長ホルモンアンタゴニスト（例えば、ペグビソマント）及びそのタンパク質中間体を調製するための組換え方法に関する。より具体的には、本発明の方法によって減少されるアイソフォーム不純物は、それぞれ、成長ホルモン及び成長ホルモンアンタゴニスト（又はその中間体）のトリスルフィドアイソフォーム不純物及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物である。
【背景技術】
【０００３】
ペグビソマント（Ｓｏｍａｖｅｒｔ（登録商標）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏｒｐ．）は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである。これは、構造的に変更されたヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）のアナログである。ペグビソマントのタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６）のアミノ酸配列は、９つの位置で、ｈＧＨのアミノ酸配列とは異なる。具体的なアミノ酸置換は、以下のとおりである：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ及びＩ１７９Ｔ。当該分野で十分認識されるように、最初の文字（すなわち、Ｈ１８Ｄの「Ｈ」）は、その番号の位置（すなわち、Ｈ１８Ｄの「１８」によって示される場合、１８番目のアミノ酸位置）での、二番目の文字（すなわち、Ｈ１８Ｄの「Ｄ」）によって示されるアミノ酸で置換された、ｈＧＨの配列中のアミノ酸を示す。したがって、Ｈ１８Ｄは、野生型ｈＧＨアミノ酸配列の１８番目のアミノ酸位置での、アミノ酸ｈｉｓのアミノ酸ａｓｐによる置換を示す。
【０００４】
図１Ａは、ペグビソマント（ＰＥＧ  Ｂ−２０３６）のタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６）のアミノ酸配列構造を模式的に示し、アスタリスクは、ポリエチレングリコールポリマー（「ＰＥＧ」単位）結合の可能性のある部位を示す。さらに、ペグビソマントのタンパク質成分／中間体（ＰＥＧ単位の結合を有さないＢ−２０３６）のアミノ酸配列表は、本明細書中で配列番号１として特定される。比較のために、ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列表は、本明細書中で配列番号２として特定される。両方の配列表が、本明細書中で提供される。ｈＧＨの配列については、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、「Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ８１７：２０５−２１４（１９９８）もまた参照されたい。
【０００５】
構造的に、ペグビソマントは、主に４〜６個のＰＥＧ単位が共有結合されるタンパク質（１９１アミノ酸残基を含む）である。ペグビソマントのタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６）の分子量は、２１，９９８ダルトンである。ペグビソマントの各ＰＥＧ単位の分子量は、約５０００ダルトンである。それにより、ペグビソマントの主な分子量は、約４２，０００ダルトン（４ＰＥＧ単位／分子）、４７，０００ダルトン（５ＰＥＧ単位／分子）及び５２，０００ダルトン（６ＰＥＧ単位／分子）である。
【０００６】
アゴニストに関して、理論に束縛されないが、単一のｈＧＨ分子がその隣接する（かつ同一の）２つの受容体分子に結合する際に、内因性ｈＧＨがその受容体を活性化して、ホルモン媒介性の受容体ホモ二量体化を誘導すると考えられる。米国特許第５８４９５３５号及び同第６０５７２９２号を参照されたい。ｈＧＨの活性は、その隣接する（かつ同一の）２つの受容体を、同じｈＧＨ分子上の２つの別個の結合部位（部位１及び部位２）にわたって結合させるその能力に依存する。これらのｈＧＨ結合部位（部位１及び部位２と称される）は、ｈＧＨ依存的なホモ二量体化を仲介する２つの隣接する（かつ同一の）ｈＧＨ受容体に結合する順序を反映するために、１及び２と番号付けられる。
【０００７】
さらに、理論に束縛されないが、ペグビソマントは、細胞表面上のヒト成長ホルモン受容体（「ＧＨ受容体」）に選択的に結合し、その際、ペグビソマントは、内因性ヒト成長ホルモンの結合を遮断し、それによってヒト成長ホルモンのシグナル伝達を妨害すると考えられる。ペグビソマントのタンパク質部分（「成分」又は「中間体」とも称される）への（ｈＧＨと比較した）構造的改変により、ペグビソマントがｈＧＨ分子とｈＧＨ受容体との間の相互作用を競合的に遮断することが可能である。ペグビソマントは、ＧＨ受容体に結合し、したがって、受容体が占拠されるので、ＧＨ結合を遮断する。これらの構造的改変は、受容体の二量体化を防止し、結果として、シグナル伝達は生じない。ｈＧＨ分子とｈＧＨ受容体との間の、必要とされる密な相互作用をそのように遮断することによって、ペグビソマントは、ｈＧＨ受容体のｈＧＨ媒介性のホモ二量体化を遮断し、ペグビソマントにそのアンタゴニスト活性を与える。
【０００８】
このアンタゴニストは、手術、放射線療法及び／又は他の従来の医療治療に適切に応答しない患者、或いはこれらの治療を許容できない患者における先端肥大症が含まれるがこれに限定されない症状を治療するために使用される。さらに、ペグビソマントのタンパク質部分（Ｂ−２０３６）への構造的改変は、ペグビソマントに、ｈＧＨよりも低い、プロラクチン受容体に対する結合親和性を示させ、それによって、ペグビソマントの使用に関連する、望ましくない乳汁分泌関連の副作用を最低限に抑える。
【０００９】
ペグビソマントのタンパク質中間体部分（Ｂ−２０３６）は、成長ホルモン受容体アンタゴニスト（Ｂ−２０３６）についての遺伝子を保有するプラスミドの添加によって遺伝子改変されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌の株によって合成される。次いで、Ｂ−２０３６は微生物細胞から回収されて、精製される。次いで、精製されたＢ−２０３６はペグ化されて、ペグビソマント（ＰＥＧ  Ｂ−２０３６）を生成する。米国特許第５８４９５３５号及び同第６０５７２９２号は、受容できない高いレベルのそのトリスルフィドアイソフォーム不純物及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成を、如何にして減少、低減、排除、逆転及び／又は防止するかについての詳細はないものの、Ｂ−２０３６を作製する方法及び１種又は複数のＰＥＧ単位をＢ−２０３６に結合体化させるための方法を記載している。
【００１０】
Ｂ−２０３６を作製するための従来の組換え製造方法を使用したときに遭遇する問題の１つは、そのアイソフォーム不純物（例えば、その脱ｐｈｅアイソフォーム及びトリスルフィドアイソフォーム）の形成である。この脱ｐｈｅアイソフォーム不純物は、Ｂ−２０３６分子がそのアミノ末端フェニルアラニンを失ったアイソフォーム不純物である。Ｂ−２０３６の−ＮＨ２末端に隣接する対象のアミノ末端フェニルアラニン残基（すなわち、文字「Ｆ」によって示される）を示す、図１Ａを参照されたい。トリスルフィドアイソフォーム不純物は、Ｂ−２０３６分子がその分子内に「トリスルフィド架橋」を形成する過剰の硫黄原子を含むアイソフォーム不純物である。図１Ｂ中の四角い囲みを参照されたい。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｆｏｒｍｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４７：３１１−３２１（１９９６）及びＡ．Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３６５−３７３（１９９４）もまた参照されたい。理論に束縛されないが、これらのアイソフォーム不純物は、典型的に、遺伝子改変された宿主細胞における細胞増殖（例えば、発酵）及びＢ−２０３６の発現（合成及び分泌）の間、並びに／又はＢ−２０３６タンパク質の抽出及び精製の間に発生すると考えられる。
【００１１】
特定の不純物に関して、国際出願ＷＯ  ９４／２４１５７（１９９４年１０月２７日公開）は、本来のｈＧＨと比較して過剰の硫黄原子を含むｈＧＨの疎水性誘導体を開示している。ＷＯ  ９４／２４１５７の第３頁、第３〜１０行を参照されたい。ｈＧＨの疎水性誘導体の過剰の硫黄原子は、「トリスルフィド架橋」を形成して、ｈＧＨのトリスルフィド改変体を生じる。ＷＯ  ９４／２４１５７の第７頁、第１１〜１６行を参照されたい。ＷＯ  ９４／２４１５７参考文献は、このｈＧＨトリスルフィド改変体が、メルカプト化合物（例えば、システイン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール又はジチオトレイトール）でこのｈＧＨトリスルフィド改変体を処理することによって、その本来のｈＧＨ形態に転換されて戻り得ることをさらに記述している。ＷＯ  ９４／２４１５７の第４頁及び第５頁を参照されたい。
【００１２】
国際出願ＷＯ  ９６／０２５７０（１９９６年２月１日公開）は、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム又はアルカリ土類金属亜硫酸塩（例えば、亜硫酸マグネシウム又は亜硫酸カルシウム）のいずれかを使用して、ｈＧＨのトリスルフィド改変体を、その本来の形態に転換して戻すための別の方法を記載している。ＷＯ  ９４／２４１５７の第４頁、第１７〜２１行を参照されたい。
【００１３】
国際出願ＷＯ  ００／０２９００（２０００年１月２０日公開）、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｏｗ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｔｒｉｓｕｌｆｉｄｅｓ」は、「組換えペプチド（例えば、タンパク質及びより小さいペプチドの両方）の生成における、トリスルフィドの量の低減のための方法」を考察しており、「本発明は、組換えペプチドの生成におけるトリスルフィドの量が、形成された成長ホルモンのトリスルフィドの、その本来形態への転換によって、以前に示唆したように、すでに発酵の間又は発酵の後であってもなくても、好ましくは過剰の、金属塩の添加によって低減され得るという、新規かつ予期しなかった知見に基づく」ことを考察している（強調を付した）。ＷＯ  ００／０２９００の第２頁、第２１〜２７行を参照されたい。このＷＯ  ００／０２９００参考文献は、「このタンパク質は、任意の組換えタンパク質であり得るが、好ましくは、ヒト及び動物の両方であり得る組換え成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びブタ成長ホルモン（ｐＧＨ））である」ことを、さらに記述している（強調を付した）。ＷＯ  ００／０２９００の第３頁、第４〜６行を参照されたい。
【００１４】
国際出願ＷＯ  ０２／０５７４７８（２００２年７月２５日公開）、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌｓ」は、宿主細胞を還元剤及び界面活性剤と接触させることによって、この宿主細胞からタンパク質を放出させる方法に関する。この参考文献は、還元剤の目的が、「その本来コンフォメーションでのタンパク質の回収を促進する」ことであると記述している。ＷＯ  ０２／０５７４７８の第２頁、第１６〜１８行を参照されたい。さらに、ＷＯ  ０２／０５７４７８は、「この１種又は複数の還元剤は、ジスルフィド結合を還元し、かつ／又はその還元形態においてスルフヒドリル残基を維持する…薬剤」であることを記載しており、「任意のこのような還元剤が使用され得る。１つの好ましい実施形態において、使用される１種又は複数の還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）；ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）；システイン（Ｃｙｓ）及びトリス２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）からなる群より選択される」ことを記載している（強調を付した）。ＷＯ  ０２／０５７４７８の第３頁、第２４行〜第４頁、第４行を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、上記の参考文献は、成長ホルモンアンタゴニスト（例えば、ペグビソマント又はそのタンパク質部分であるＢ−２０３６）に付随するアイソフォーム不純物形成の防止、逆転、低減又は排除に関して記載していない。したがって、そのアイソフォーム不純物（トリスルフィド及び／又は脱ｐｈｅ）の形成を減少、減弱、防止、最小化、逆転及び／又は排除する、Ｂ−２０３６を作製する改善された方法についての必要性が存在する。同様に、これらの参考文献は、成長ホルモンの脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成の検出、減弱、最小化、逆転、低減又は排除についても記載していない。したがって、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成を減少、減弱、防止、最小化、逆転及び／又は排除する、成長ホルモンを作製する改善された方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の、その望ましくないアイソフォーム不純物のレベルが減少している、組換え成長ホルモンアゴニスト、組換えヒト成長ホルモンアゴニスト、組換え成長ホルモンアンタゴニスト及び／又は組換えヒト成長ホルモンアンタゴニストを作製するための改善された方法を提供することが必要とされていることに鑑みて、本発明は、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物及び／又はトリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルが減少している、組換え成長ホルモン（ヒト成長ホルモンが含まれるが、これに限定されない）及び組換え成長ホルモンアンタゴニスト（ヒト成長ホルモンアンタゴニストが含まれるが、これに限定されない）を生成するための改善された方法に関する。
【００１７】
組換え成長ホルモン（ｈＧＨが含まれるが、これに限定されない）に関して、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成は、それぞれ、（１）キレート剤又は（２）金属塩の十分な添加によって減少される。
【００１８】
組換え成長ホルモンアンタゴニスト（ヒト成長ホルモンアンタゴニストが含まれるが、これに限定されない）に関して、そのトリスルフィドアイソフォーム不純物は、このトリスルフィドアイソフォーム不純物と、それぞれ、（１）メルカプト化合物、（２）キレート剤、（３）金属塩、（４）金属塩と共にメルカプト化合物、又は（５）キレート剤との接触後であるがキレート剤の不在下での、メルカプト化合物、との間の十分な接触によって、減少される。
【００１９】
組換え成長ホルモンアンタゴニスト（ヒト成長ホルモンアンタゴニストが含まれるが、これに限定されない）に関して、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成は、それぞれ、（１）キレート剤又は（２）金属塩の添加によって減少される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
用語「成長ホルモンアンタゴニスト」及び「成長ホルモン受容体アンタゴニスト」は、成長ホルモンの、その成長ホルモン受容体への結合を阻害又は拮抗して、成長ホルモンの生物学的効果を遮断するポリペプチド（これに限定されない）を含む。好ましくは、この「成長ホルモンアンタゴニスト」又は「成長ホルモン受容体アンタゴニスト」は、Ｂ−２０３６又はその改変体である。このような「改変体」には、成長ホルモン受容体アンタゴニスト活性を（それぞれ）有する、そのホモログ（特に、Ｂ−２０３６に対する、保存的アミノ酸置換、付加又は欠失を有するホモログ）、アナログ、フラグメント、偽ペプチド、抗体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
用語「成長ホルモンアゴニスト」及び「成長ホルモン受容体アゴニスト」は、その成長ホルモン受容体に結合し、かつこれを活性化するポリペプチド（これに限定されない）を含む。好ましくは、この「成長ホルモンアゴニスト」又は「成長ホルモン受容体アゴニスト」は、ヒト成長ホルモン又はその改変体である。このような「改変体」には、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を（それぞれ）有する、ホモログ（特に、ヒト成長ホルモンに対する、保存的アミノ酸置換、付加又は欠失を有するホモログ）、アナログ、フラグメント、偽ペプチド、抗体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
用語「成長ホルモン及びそのアンタゴニスト」とは、成長ホルモンアゴニスト（すなわち、「成長ホルモン」）及び成長ホルモンアンタゴニスト（すなわち、「及びそのアンタゴニスト」）をいう。
【００２３】
用語「及び」は、適切な場合又は必要な場合、該当する不純物（例えば、トリスルフィドアイソフォーム不純物又は脱ｐｈｅアイソフォーム不純物）のレベルの所望の減少を生じる方法を記載するために、「及び」又は「又は」を意味し得る。
【００２４】
用語「又は」は、適切な場合又は必要な場合、適切な不純物（例えば、トリスルフィドアイソフォーム不純物又は脱ｐｈｅアイソフォーム不純物）のレベルにおける所望の減少を生じる方法を記載するために、「及び」又は「又は」を意味し得る。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、他のように指示されない限り、用語「減少」（又はその見かけの変化）は、適切なアイソフォーム不純物の量を、その不純物がトリスルフィドアイソフォーム不純物であるか又は脱ｐｈｅアイソフォーム不純物であるかにかかわらず、排除、最小化、低減、防止及び／又は減弱することを意味する。
【００２６】
他のように指示されない限り、用語「宿主細胞」（又はその見かけの変化）とは、組換えＢ−２０３６又は組換えｈＧＨが形成され得る任意の宿主細胞をいう。したがって、この宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞又は微生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又は酵母細胞までも）であり得る。この宿主細胞は、その中で所望の組換えＢ−２０３６タンパク質成分又は組換えｈＧＨを生じるのに十分な宿主細胞であることに留意することが重要である。したがって、この宿主細胞が、目的のＢ−２０３６タンパク質成分又は組換えｈＧＨ或いはそれらの「改変体」を組換え生成できるものである限り、この宿主細胞が何であり得るかについて制限はない。
【００２７】
さらに、本明細書中で使用する場合、他のように指示されない限り、用語「増殖（ｇｒｏｗｉｎｇ）」（又はその見かけの変化（例えば、増殖（ｇｒｏｗｔｈ））には、発酵及び培養、又は所望の量の組換えＢ−２０３６タンパク質成分若しくは組換えｈＧＨを産生するのに十分なように、他の方法で宿主細胞を増殖させることを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
さらに、他のように指示されない限り、本発明は、組換えＢ−２０３６及び組換えＰＥＧ  Ｂ−２０３６に関して記載されるが、本発明は、それが哺乳動物成長ホルモン又はそのアンタゴニスト、ヒト成長ホルモン又はそのアンタゴニスト、或いはウシ成長ホルモン又はそのアンタゴニストなどであっても、任意の組換え成長ホルモンアゴニスト、組換え成長ホルモンアンタゴニストで使用され得ることが、理解される。
【００２９】
ペグビソマント（ＰＥＧ  Ｂ−２０３６）は、組換え宿主細胞（例えば、組換えの、遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）において生成される組換えタンパク質（Ｂ−２０３６）のペグ化形態である。Ｂ−２０３６タンパク質は、細胞増殖（例えば、発酵による）及び発現（合成及び分泌）の間に生成される。その生成後、Ｂ−２０３６は単離され（例えば、ホモジナイズ化による）、その後精製される（例えば、抽出、遠心分離、逆相クロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィー、並びに緩衝液交換による）。しかし、Ｂ−２０３６タンパク質の組換え生成の間に留意されるように、Ｂ−２０３６の望ましくないアイソフォーム不純物が形成され、この不純物は、Ｂ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物である。
【００３０】
留意されるように、図１Ａは、どのアミノ酸が各文字の位置に存在するかを示す標準的な一文字略号を用いた、Ｂ−２０３６のアミノ酸配列を示す。参考として、文字とその関連するアミノ酸との間の対応を示す、以下の表１を参照されたい。
【００３１】
【表１】
2006517091.tif 000002
さらに、Ｂ−２０３６のアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号１として提供され、アミノ酸配列ｈＧＨは、本明細書中で配列番号２として提供される。
【００３２】
１．組換え成長ホルモンアンタゴニスト及びそのトリスルフィドアイソフォーム不純物
図１Ｂは、Ｂ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物のアミノ酸配列構造を示す。特に、このトリスルフィドアイソフォーム不純物は、Ｂ−２０３６タンパク質成分の位置１８２及び１８９のシステイン間の架橋中に、過剰の硫黄原子を含む。
【００３３】
ａ．メルカプト化合物による、トリスルフィドアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、選択されたメルカプト化合物と、組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物との接触は、システイン−Ｓ−Ｓ−Ｓ−システイントリスルフィド架橋の、そのシステイン−Ｓ−Ｓ−システイン本来形態へ戻った転換を生じると考えられる。さらに、これもまた理論に束縛されないが、メルカプト化合物の存在は、トリスルフィド架橋自体のさらなる形成を防止することが可能である。
【００３４】
典型的に、このメルカプト化合物は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製したタンパク質は、好ましくはペグ化されて、ＰＥＧ  Ｂ−２０３６（ペグビソマント）を生じる。ペグ化手順については、米国特許第５８４９５３５号を参照されたい。
【００３５】
任意のメルカプト化合物が本発明に関して使用され得、このメルカプト化合物は、Ｂ−２０３６タンパク質成分と、そのトリスルフィドアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくはＢ−２０３６の収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な好ましいメルカプト化合物には、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明との使用に適切な他のメルカプト化合物は、以下の参考文献中で示される：（１）Ｊ．Ｈｏｕｋ及びＧ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｉｏｌ−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ」、Ｊ．Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９：６８２５−６８３６（１９８７）；（２）Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｍ．、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｌｆｈｙｄｒｏ  Ｇｒｏｕｐ  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第１版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７３）。特に、本発明との使用に適切な例示的なメルカプト化合物の表については、上記項目（１）で特定したＨｏｕｋらの表ＩＩを参照されたい。
【００３７】
適切なメルカプト化合物のうち、システイン、又はシスチン（二量体化したシステイン）と組み合わせたシステインが、最も好ましい。本発明との使用に適切なシステイン、及びシステインとシスチン（存在する場合、二量体化したシステイン）との組合せの量は、形成されたその最も高い平衡濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均平衡濃度）の少なくとも約１０％、このトリスルフィドアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、トリスルフィドアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い平衡濃度（又はその最も高い平均平衡濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切なシステインと任意のシスチンとを組み合わせた初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約５ｍＭである。
【００３８】
緩衝液中にメルカプト化合物を提供することが好ましい。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しないか、又はＢ−２０３６タンパク質成分が一旦形成されるとそれを分解しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい緩衝液はトリスである。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なおより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約４〜約９、約７．５〜約８．５、又は約７．５〜約８．０の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。注目すべきことに、より高い濃度のメルカプト化合物が使用される場合、より高いレベルのｐＨ（例えば、約９．５程度の高さ）が許容され得る。したがって、例えば、Ｂ−２０３６に対して大過剰のシステインが使用される場合、この緩衝液のｐＨは、約９．５程の高さであり得る。
【００３９】
上記のように、緩衝液中にメルカプト化合物を提供することが好ましい。さらに、緩衝液中のメルカプト化合物の量は、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対するメルカプト化合物のモル数のモル比が、約０．５〜約１，０００であるようにすべきである。使用されるメルカプト化合物がシステインの組合せ、及び必要に応じて、シスチンと組み合わせたシステインである場合、これは特に当てはまる。或いは、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対するメルカプト化合物のモル数のモル比は、それぞれ、約１〜約１，０００、約１〜約５００、又は約１〜約１０であり得る。
【００４０】
典型的には、メルカプト化合物とＢ−２０３６タンパク質成分との間の（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００４１】
さらに、緩衝液、メルカプト化合物及びその他の成分（Ｂ−２０３６が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、メルカプト化合物がＢ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に添加された後、好ましくは約０℃〜約２５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約８℃に維持される。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、メルカプト化合物及びＢ−２０３６などを含む）の温度を、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【００４２】
さらに、Ｂ−２０３６成分とメルカプト化合物との接触時間は、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約２４時間、又は約１時間〜約４時間にわたるべきである。
【００４３】
典型的に、メルカプト化合物とＢ−２０３６成分との間の十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は１００リットル〜約３００リットルの体積を有する。他の適切な例示的な体積は、１６０リットル〜約５００リットルのいずれかであり得る。
【００４４】
メルカプト化合物とＢ−２０３６成分との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（１つの増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、メルカプト化合物、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつＢ−２０３６タンパク質成分のいかなる分解もが最小化されるような速度であるべきである。
【００４５】
ｂ．キレート剤による、トリスルフィドアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、選択されたキレート剤と、（１）トリスルフィドアイソフォーム不純物、（２）組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６、（３）宿主細胞細胞成分（アンタゴニストの組換え生成について）、及び（４）（１）〜（３）のすべての組合せとの接触は、システイン−Ｓ−Ｓ−Ｓ−システイントリスルフィド架橋の、そのシステイン−Ｓ−Ｓ−システイン本来形態へ戻った転換、又は不純物レベルの減少を生じると考えられる。さらに、これもまた理論に束縛されないが、キレート剤の存在は、トリスルフィド架橋自体のさらなる形成を防止することが可能である。
【００４６】
典型的に、このキレート剤は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製されたタンパク質は、好ましくはペグ化されて、ＰＥＧ  Ｂ−２０３６（ペグビソマント）を生じる。ペグ化手順については、米国特許第５８４９５３５号を参照されたい。
【００４７】
任意のキレート剤が、本発明に関して使用され得、このキレート剤は、Ｂ−２０３６タンパク質成分と、そのトリスルフィドアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくはＢ−２０３６の収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な好ましいキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例示的なキレート剤には、デフェロキサミン、ジチオカーブナトリウム（Ｄｉｔｉｏｃａｒｂ  Ｓｏｄｉｕｍ）、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、サクシマー及びトリエンチンが含まれるが、これらに限定されない。エデト酸ナトリウムは、ＥＤＴＡの塩形態であることに留意されたい。
【００４８】
本発明との使用に適切な他のキレート剤は、以下の参考文献中で示される：（１）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（編者）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，ｐ．ＴＨＥＲ−１９（「ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ」以下）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）及び今日までのそのそれぞれのすべての引き続く版；（２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（３）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第２１改訂（第１６版）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（４）ＳＩＧＭＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２−２００３）；並びに（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００−２００１）及びその（２００２−２００３）の版。
【００４９】
適切なキレート剤のうち、ＥＤＴＡが最も好ましい。本発明との使用に適切なキレート剤の量は、形成されたその最も高い平衡濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均平衡濃度）の少なくとも約１０％、このトリスルフィドアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、トリスルフィドアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い平衡濃度（又はその最も高い平均平衡濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切なＥＤＴＡの初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ〜約５ｍＭである。
【００５０】
緩衝液中にキレート剤を提供することが好ましい。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しないか、又はＢ−２０３６タンパク質成分が一旦形成されるとそれを分解しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい緩衝液はトリスである。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なおより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約６〜約９、約６．５〜約７．５、又は約７．２〜約７．５の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。
【００５１】
上記のように、緩衝液中にキレート剤を提供することが好ましい。さらに、緩衝液中のキレート剤の量は、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対するキレート剤のモル数のモル比が、約１〜約１，０００であるようにすべきである。或いは、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対するキレート剤のモル数のモル比は、それぞれ、約２０〜約１，０００、約５０〜約２５０、又は約６０〜約１１０であり得る。
【００５２】
典型的に、キレート剤とＢ−２０３６タンパク質成分との間の（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００５３】
さらに、緩衝液、キレート剤及びその他の成分（Ｂ−２０３６が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、キレート剤がＢ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に添加された後、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に維持される。好ましくは、温度が約４℃であるキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の添加の際に、Ｂ−２０３６を含むホモジネートの温度は、ホモジナイズ化の際に約３０℃まで上昇することに留意されたい。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、キレート剤及びＢ−２０３６などを含む）の温度を、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【００５４】
さらに、Ｂ−２０３６成分とキレート剤との接触時間は、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間にわたるべきである。
【００５５】
典型的に、キレート剤とＢ−２０３６成分との間の十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は約１００リットル〜約３００リットルの体積を有する。他の適切な例示的な体積は、１６０リットル〜約５００リットルのいずれかであり得る。
【００５６】
キレート剤とＢ−２０３６成分との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、キレート剤、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつＢ−２０３６タンパク質成分のいかなる変性もが最小化されるような速度であるべきである。
【００５７】
ｃ．金属塩による、トリスルフィドアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、選択された金属塩と、（１）トリスルフィドアイソフォーム不純物、（２）組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６、（３）宿主細胞細胞成分（アンタゴニストの組換え生成について）、及び（４）（１）〜（３）のすべての組合せとの接触は、システイン−Ｓ−Ｓ−Ｓ−システイントリスルフィド架橋の、そのシステイン−Ｓ−Ｓ−システイン本来形態へ戻った転換、又は不純物レベルの減少を生じると考えられる。さらに、これもまた理論に束縛されないが、金属塩の存在は、トリスルフィド架橋自体のさらなる形成を防止することが可能である。
【００５８】
典型的に、この金属塩は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製されたタンパク質は、好ましくはペグ化されて、ＰＥＧ  Ｂ−２０３６（ペグビソマント）を生じる。ペグ化手順については、米国特許第５８４９５３５号を参照されたい。
【００５９】
任意の金属塩が、本発明に関して使用され得、この金属塩は、Ｂ−２０３６タンパク質成分と、そのトリスルフィドアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくはＢ−２０３６の収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な金属塩には、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。本発明との使用に適切な好ましい金属塩には、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
適切な他の金属塩は、以下の参考文献に述べられている：（１）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（編者）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，ｐ．ＴＨＥＲ−１９（「ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ」以下）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（３）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第２１改訂（第１６版）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（４）ＳＩＧＭＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２−２００３）；並びに（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００−２００１）及びその（２００２−２００３）の版。
【００６１】
本発明との使用に適切な金属塩のうち、リン酸ナトリウム、ＺｎＣｌ２及びそれらの組合せもまた、好ましい。本発明との使用に適切な金属塩の量は、形成されたその最も高い濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均濃度）の少なくとも約１０％、このトリスルフィドアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、トリスルフィドアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い濃度（又はその最も高い平均濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切な金属塩（例えば、リン酸ナトリウム）の初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【００６２】
緩衝液中に金属塩を提供することが好ましい。しかし、リン酸ナトリウムは、緩衝液及び適切な金属塩の両方として作用し得る。しかし、さらなる適切な金属塩が、リン酸ナトリウム緩衝液に添加され得る。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しないか、又はＢ−２０３６タンパク質成分が一旦形成されるとそれを分解しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なおより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約４〜約９、約４．５〜約７．５、又は約５．５〜約７．５の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。
【００６３】
金属塩が緩衝液中に提供された後（又はＮａＰの場合、ＮａＰ溶液は、金属塩及び緩衝液の両方として作用する）、緩衝液（又はこれもまた緩衝液として作用するＮａＰ溶液）中の金属塩の量は、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対する金属塩のモル数のモル比が、約１〜約１０，０００であるようにすべきである。或いは、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対する金属塩のモル数のモル比は、それぞれ、約３００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、又は約５００〜約２５００であり得る。
【００６４】
典型的に、金属塩とＢ−２０３６タンパク質成分との（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００６５】
さらに、緩衝液、金属塩及びその他の成分（Ｂ−２０３６が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、金属塩がＢ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に添加された後、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に維持される。金属塩（例えば、ＮａＰ）を用いたホモジナイズ化の際に、ホモジネートの温度が上昇し得ることに留意されたい。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、金属塩、Ｂ−２０３６、及び必要に応じてメルカプト化合物などを含む）の温度を、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【００６６】
さらに、Ｂ−２０３６成分とキレート剤との接触時間は、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間にわたるべきである。
【００６７】
典型的に、金属塩とＢ−２０３６成分との間の十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約２，０００リットル、又は２００リットル〜約１，５００リットルの体積を有する。
【００６８】
金属塩とＢ−２０３６成分との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、金属塩、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつＢ−２０３６タンパク質成分のいかなる分解もが最小化されるような速度であるべきである。
【００６９】
２．組換え成長ホルモンアンタゴニスト及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物
ａ．キレート剤による、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６へのキレート剤の添加は、そのレベルにおける実際の低減及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成の防止のいずれかによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルにおける減少を生じると考えられる。
【００７０】
典型的に、このキレート剤は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製されたタンパク質は、好ましくはペグ化されて、ＰＥＧ  Ｂ−２０３６（ペグビソマント）を生じる。ペグ化手順については、米国特許第５８４９５３５号を参照されたい。
【００７１】
任意のキレート剤が、本発明に関して使用され得、このキレート剤は、Ｂ−２０３６タンパク質成分と、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくはＢ−２０３６の収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な好ましいキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例示的なキレート剤には、デフェロキサミン、ジチオカーブナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、サクシマー及びトリエンチンが含まれるが、これらに限定されない。エデト酸ナトリウムは、ＥＤＴＡの塩形態であることに留意されたい。
【００７２】
本発明との使用に適切な他のキレート剤は、以下の参考文献中で示される：（１）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（編者）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，ｐ．ＴＨＥＲ−１９（「ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ」以下）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（３）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第２１改訂（第１６版）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（４）ＳＩＧＭＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２−２００３）；並びに（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００−２００１）及びその（２００２−２００３）の版。
【００７３】
適切なキレート剤のうち、ＥＤＴＡが最も好ましい。本発明との使用に適切なキレート剤の量は、形成されたその最も高い平衡濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均平衡濃度）の少なくとも約１０％、この脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い平衡濃度（又はその最も高い平均平衡濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切なＥＤＴＡの初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ〜約５ｍＭである。
【００７４】
緩衝液中にキレート剤を提供することが好ましい。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しないか、又はＢ−２０３６タンパク質成分が一旦形成されるとそれを分解しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい緩衝液はトリスである。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なおより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約６〜約９、約６．５〜約７．５、又は約７．２〜約７．５の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。
【００７５】
上記のように、緩衝液中にキレート剤を提供することが好ましい。さらに、緩衝液中のキレート剤の量は、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対するキレート剤のモル数のモル比が、約１〜約１，０００であるようにすべきである。或いは、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対するキレート剤のモル数のモル比は、それぞれ、約２０〜約１，０００、約５０〜約２５０、又は約６０〜約１１０であり得る。
【００７６】
典型的に、キレート剤とＢ−２０３６タンパク質成分との間の（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００７７】
さらに、緩衝液、キレート剤及びその他の成分（Ｂ−２０３６が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、キレート剤がＢ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に添加された後、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に維持される。好ましくは、温度が約４℃であるキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の添加の際に、Ｂ−２０３６を含むホモジネートの温度は、ホモジナイズ化の際に約３０℃まで上昇することに留意されたい。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、キレート剤及びＢ−２０３６などを含む）の温度を、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【００７８】
さらに、Ｂ−２０３６成分とキレート剤との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間にわたるべきである。
【００７９】
典型的に、キレート剤とＢ−２０３６成分との間の十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は約１００リットル〜約３００リットルの体積を有する。他の適切な例示的な体積は、１６０リットル〜約５００リットルのいずれかであり得る。
【００８０】
キレート剤とＢ−２０３６成分との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、キレート剤、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつＢ−２０３６タンパク質成分のいかなる変性もが最小化されるような速度であるべきである。
【００８１】
ｂ．金属塩による、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６への金属塩の添加は、そのレベルの実際の低減及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成の防止のいずれかによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルにおける減少を生じると考えられる。
【００８２】
典型的に、この金属塩は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製されたタンパク質は、好ましくはペグ化されて、ＰＥＧ  Ｂ−２０３６（ペグビソマント）を生じる。ペグ化手順については、米国特許第５８４９５３５号を参照されたい。
【００８３】
任意の金属塩が、本発明に関して使用され得、この金属塩は、Ｂ−２０３６タンパク質成分と、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくはＢ−２０３６の収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な金属塩には、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。本発明との使用に適切な好ましい金属塩には、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明との使用に適切な他の金属塩は、以下の参考文献中で示される：（１）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（編者）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，ｐ．ＴＨＥＲ−１９（「ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ」以下）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（３）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第２１改訂（第１６版）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（４）ＳＩＧＭＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２−２００３）；並びに（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００−２００１）及びその（２００２−２００３）の版。
【００８５】
本発明との使用に適切な金属塩のうち、リン酸ナトリウム、ＺｎＣｌ２及びそれらの組合せもまた、好ましい。本発明との使用に適切な金属塩の量は、形成されたその最も高い濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均濃度）の少なくとも約１０％、この脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い濃度（又はその最も高い平均濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切な金属塩（例えば、リン酸ナトリウム）の初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【００８６】
緩衝液中に金属塩を提供することが好ましい。しかし、リン酸ナトリウムは、緩衝液及び適切な金属塩の両方として作用し得る。しかし、さらなる適切な金属塩が、リン酸ナトリウム緩衝液に添加され得る。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なおより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約４〜約９、約４．５〜約７．５、又は約５．５〜約７．５の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。
【００８７】
金属塩が緩衝液中に提供された後（又はＮａＰの場合、ＮａＰ溶液は、金属塩及び緩衝液の両方として作用する）、緩衝液（又はこれもまた緩衝液として作用するＮａＰ溶液）中の金属塩の量は、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対する金属塩のモル数のモル比が、約１〜約１０，０００であるようにすべきである。或いは、Ｂ−２０３６タンパク質のモル数に対する金属塩のモル数のモル比は、それぞれ、約３００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、又は約５００〜約２５００であり得る。
【００８８】
典型的に、金属塩とＢ−２０３６タンパク質成分との間の（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００８９】
さらに、緩衝液、金属塩及びその他の成分（Ｂ−２０３６が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、金属塩がＢ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に添加された後、好ましくは、約０℃〜約３５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に維持される。金属塩（例えば、ＮａＰ）を用いたホモジナイズ化の際に、ホモジネートの温度が上昇し得ることに留意されたい。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、金属塩、Ｂ−２０３６、及び必要に応じてメルカプト化合物などを含む）の温度を、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【００９０】
さらに、Ｂ−２０３６成分と金属塩との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間にわたるべきである。
【００９１】
典型的に、金属塩とＢ−２０３６成分との間の十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約２，０００リットル、又は２００リットル〜約１，５００リットルの体積を有する。
【００９２】
金属塩とＢ−２０３６成分との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、金属塩、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつＢ−２０３６タンパク質成分のいかなる分解もが最小化されるような速度であるべきである。
【００９３】
３．組換え成長ホルモン及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物
ａ．キレート剤による、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、組換え成長ホルモンへのキレート剤の添加は、そのレベルにおける実際の低減及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成の防止のいずれかによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルにおける減少を生じると考えられる。
【００９４】
典型的に、このキレート剤は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換え成長ホルモンタンパク質を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、成長ホルモンタンパク質を精製することが好ましい。
【００９５】
任意のキレート剤が、本発明に関して使用され得、このキレート剤は、成長ホルモンタンパク質と、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくは成長ホルモンの収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な好ましいキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例示的なキレート剤には、デフェロキサミン、ジチオカーブナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、サクシマー及びトリエンチンが含まれるが、これらに限定されない。エデト酸ナトリウムは、ＥＤＴＡの塩形態であることに留意されたい。
【００９６】
本発明との使用に適切な他のキレート剤は、以下の参考文献中で示される：（１）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（編者）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，ｐ．ＴＨＥＲ−１９（「ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ」以下）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（３）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第２１改訂（第１６版）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（４）ＳＩＧＭＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２−２００３）；並びに（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００−２００１）及びその（２００２−２００３）の版。
【００９７】
適切なキレート剤のうち、ＥＤＴＡが最も好ましい。本発明との使用に適切なキレート剤の量は、形成されたその最も高い平衡濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均平衡濃度）の少なくとも約１０％、この脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い平衡濃度（又はその最も高い平均平衡濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切なＥＤＴＡの初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ〜約５ｍＭである。
【００９８】
緩衝液中にキレート剤を提供することが好ましい。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しないか、又はＢ−２０３６タンパク質成分が一旦形成されるとそれを分解しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい緩衝液はトリスである。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なお一層好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約６〜約９、約６．５〜約７．５、又は約７．２〜約７．５の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。
【００９９】
上記のように、緩衝液中にキレート剤を提供することが好ましい。さらに、緩衝液中のキレート剤の量は、成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）のモル数に対するキレート剤のモル数のモル比が、約１〜約１，０００であるようにすべきである。或いは、成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）のモル数に対するキレート剤のモル数のモル比は、それぞれ、約２０〜約１，０００、約５０〜約２５０、又は約６０〜約１１０であり得る。
【０１００】
典型的に、キレート剤と成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）との間の（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中の成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【０１０１】
さらに、緩衝液、キレート剤及びその他の成分（成長ホルモンタンパク質が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、好ましくは、キレート剤が成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞又はその溶解物に添加された後、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に維持される。好ましくは、温度が約４℃であるキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の添加の際に、成長ホルモンを含むホモジネートの温度は、ホモジナイズ化の際に約３０℃まで上昇することに留意されたい。成長ホルモンタンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、キレート剤及び成長ホルモンタンパク質などを含む）の温度を、成長ホルモンタンパク質のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【０１０２】
さらに、成長ホルモンタンパク質とキレート剤との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間にわたるべきである。
【０１０３】
典型的に、キレート剤と成長ホルモンタンパク質との十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は約１００リットル〜約３００リットルの体積を有する。他の適切な例示的な体積は、１６０リットル〜約５００リットルのいずれかであり得る。
【０１０４】
キレート剤と成長ホルモンタンパク質との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、キレート剤、成長ホルモンタンパク質及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつ成長ホルモンタンパク質成分のいかなる分解もが最小化されるような速度であるべきである。
【０１０５】
ｂ．金属塩による、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
理論に束縛されないが、組換え成長ホルモンへの金属塩の添加は、そのレベルにおける実際の低減及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成の防止のいずれかによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルにおける減少を生じると考えられる。
【０１０６】
典型的に、この金属塩は、宿主細胞の増殖の間又は増殖の後（或いは、増殖の間及び増殖の後）に、所望の組換え成長ホルモンタンパク質成分を合成する宿主細胞に添加される。さらに、増殖させるステップ及び接触させるステップを実施した後に、成長ホルモンタンパク質を精製することが好ましい。
【０１０７】
任意の金属塩が、本発明に関して使用され得、この金属塩は、成長ホルモンタンパク質成分と、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と共に接触した場合（好ましくは、適切な混合による）、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを、好ましくは成長ホルモンの収率を下げることなく（又は実質的に下げることなく）減少させるのに十分なものである。本発明との使用に適切な金属塩には、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。本発明との使用に適切な好ましい金属塩には、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明との使用に適切な他の金属塩は、以下の参考文献中で示される：（１）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１２版、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（編者）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，ｐ．ＴＨＥＲ−１９（「ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ」以下）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａｒｔｈｕｒ  Ｏｓｏｌ（編者）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（３）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、第２１改訂（第１６版）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）及び今日までのその各々のすべての引き続く版；（４）ＳＩＧＭＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２−２００３）；並びに（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００−２００１）及びその（２００２−２００３）の版。
【０１０９】
本発明との使用に適切な金属塩のうち、リン酸ナトリウム、ＺｎＣｌ２及びそれらの組合せもまた、好ましい。本発明との使用に適切な金属塩の量は、形成されたその最も高い濃度（又は複数のバッチを平均した場合、その最も高い平均濃度）の少なくとも約１０％、この脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を減少させるのに十分な量であるべきである。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量における減少は、形成されたその最も高い濃度（又はその最も高い平均濃度）の、それぞれ、少なくとも約２０％、３０％、４０％又は５０％である。本発明との使用に適切な金属塩（例えば、リン酸ナトリウム）の初期濃度は、好ましくはそれぞれ、少なくとも約０．１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【０１１０】
緩衝液中に金属塩を提供することが好ましい。しかし、リン酸ナトリウムは、緩衝液及び適切な金属塩の両方として作用し得る。しかし、さらなる適切な金属塩が、リン酸ナトリウム緩衝液に添加され得る。好ましくは、この緩衝液は、本発明との使用に適切な緩衝液、すなわち、Ｂ−２０３６タンパク質成分の形成を防止しないか、又はＢ−２０３６タンパク質成分が一旦形成されるとそれを分解しない緩衝液である。本発明と合わせた使用に適切な緩衝液には、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい初期緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、なおより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、そして最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切な緩衝液が使用され得る。好ましくは、これらの緩衝液は、それぞれ、約４〜約９、約４．５〜約７．５、又は約５．５〜約７．５の範囲のいずれかの、増殖培地のｐＨを維持するのに十分である。
【０１１１】
金属塩が緩衝液中に提供された後（又はＮａＰの場合、ＮａＰ溶液は、金属塩及び緩衝液の両方として作用する）、緩衝液（又はこれもまた緩衝液として作用するＮａＰ溶液）中の金属塩の量は、成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）のモル数に対する金属塩のモル数のモル比が、約１〜約１０，０００であるようにすべきである。或いは、成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）のモル数に対する金属塩のモル数のモル比は、それぞれ、約３００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、又は約５００〜約２５００であり得る。
【０１１２】
典型的に、金属塩と成長ホルモンタンパク質（例えば、ｈＧＨ）との（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに）十分な接触（宿主細胞内又は宿主細胞から完了した）の後、この緩衝液中の成長ホルモンタンパク質は、それぞれ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【０１１３】
さらに、緩衝液、金属塩及びその他の成分（成長ホルモンタンパク質が含まれるが、これに限定されない）と共に、増殖培地の温度範囲は、好ましくは、金属塩を成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞又はその溶解物に添加した後、約０℃〜約３５℃の温度で維持されるべきである。また、好ましくは、成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞及び／又はその宿主細胞由来の溶解物の温度は、それぞれ、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に維持される。金属塩（例えば、ＮａＰ）を用いたホモジナイズ化の際に、ホモジネートの温度が上昇し得ることに留意されたい。成長ホルモンタンパク質の変性が、約４０＋℃で生じることに留意することが重要である。したがって、ホモジネート（すなわち、宿主細胞、増殖培地、緩衝液、金属塩、成長ホルモンタンパク質、及び必要に応じてメルカプト化合物などを含む）の温度を、成長ホルモンタンパク質のタンパク質変性温度より低い温度に維持することが望ましい。
【０１１４】
さらに、成長ホルモンタンパク質と金属塩との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに十分な時間にわたるべきである。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを減少させるのに適切な例示的な接触時間は、それぞれ、少なくとも約３０分間、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間にわたるべきである。
【０１１５】
典型的に、金属塩と成長ホルモンタンパク質との間の十分な接触の後、同じものを含む緩衝液は、それぞれ、約１リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約２，０００リットル、又は約２００リットル〜約１，５００リットルの体積を有する。
【０１１６】
金属塩と成長ホルモンタンパク質との接触の間に関心が持たれ得る他のパラメータには、混合速度のようなものが含まれる。この混合速度は、形成され得る起泡の量を最小化しつつ、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、緩衝液、金属塩、成長ホルモンタンパク質及び任意の他の成分の）均質混合物を形成するのに十分な速度であるべきである。当業者は、十分な混合速度がどうあるべきかを容易に決定し得る。明らかに、この混合速度は、温度が上記の範囲内に維持され、かつ成長ホルモンタンパク質成分のいかなる分解もが最小化されるような速度であるべきである。
【０１１７】
発明の実施形態
実施形態１
遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、上記不純物をメルカプト化合物と接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドのトリスルフィドアイソフォームである、方法。
【０１１８】
実施形態２
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態１に記載の方法。
【０１１９】
実施形態３
（ｃ）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態２に記載の方法。
【０１２０】
実施形態４
（ｄ）上記精製されたポリペプチドをペグ化するステップ
をさらに含む、実施形態３に記載の方法。
【０１２１】
実施形態５
上記メルカプト化合物が、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインからなる群より選択される、実施形態２に記載の方法。
【０１２２】
実施形態６
上記メルカプト化合物が、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインからなる群より選択される、実施形態１に記載の方法。
【０１２３】
実施形態７
上記メルカプト化合物が、システイン、又はシステインとシスチンとの組合せを含む、実施形態５に記載の方法。
【０１２４】
実施形態８
上記メルカプト化合物が、システイン、又はシステインとシスチンとの組合せを含む、実施形態６に記載の方法。
【０１２５】
実施形態９
上記接触させるステップ（ａ）において、上記トリスルフィドアイソフォームを、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記システイン又はシステインとシスチンとの組合せと接触させる、実施形態７に記載の方法。
【０１２６】
実施形態１０
上記期間が、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態９に記載の方法。
【０１２７】
実施形態１１
上記接触させるステップ（ａ）において、上記トリスルフィドアイソフォームが、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記システインと接触される、実施形態８に記載の方法。
【０１２８】
実施形態１２
上記期間が、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態１１に記載の方法。
【０１２９】
実施形態１３
上記メルカプト化合物が緩衝液中に提供される、実施形態１に記載の方法。
【０１３０】
実施形態１４
上記メルカプト化合物が緩衝液中に提供される、実施形態２に記載の方法。
【０１３１】
実施形態１５
上記システイン、又はシステインとシスチンとの組合せが、緩衝液中に提供される、実施形態７に記載の方法。
【０１３２】
実施形態１６
上記システイン、又はシステインとシスチンとの組合せが、緩衝液中に提供される、実施形態８に記載の方法。
【０１３３】
実施形態１７
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液が、少なくとも約０．１ｍＭの、システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度を有する、実施形態１５に記載の方法。
【０１３４】
実施形態１８
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液が、少なくとも約０．１ｍＭの、システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度を有する、実施形態１６に記載の方法。
【０１３５】
実施形態１９
上記システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態１７に記載の方法。
【０１３６】
実施形態２０
上記システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態１８に記載の方法。
【０１３７】
実施形態２１
上記システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度が、約１ｍＭ〜約５ｍＭである、実施形態１９に記載の方法。
【０１３８】
実施形態２２
上記システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度が、約１ｍＭ〜約５ｍＭである、実施形態２０に記載の方法。
【０１３９】
実施形態２３
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態１３に記載の方法。
【０１４０】
実施形態２４
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態１４に記載の方法。
【０１４１】
実施形態２５
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。
【０１４２】
実施形態２６
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態１６に記載の方法。
【０１４３】
実施形態２７
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２３に記載の方法。
【０１４４】
実施形態２８
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２６に記載の方法。
【０１４５】
実施形態２９
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２５に記載の方法。
【０１４６】
実施形態３０
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２４に記載の方法。
【０１４７】
実施形態３１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態２９に記載の方法。
【０１４８】
実施形態３２
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態２８に記載の方法。
【０１４９】
実施形態３３
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態３１に記載の方法。
【０１５０】
実施形態３４
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態３２に記載の方法。
【０１５１】
実施形態３５
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態１に記載の方法。
【０１５２】
実施形態３６
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２に記載の方法。
【０１５３】
実施形態３７
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２５に記載の方法。
【０１５４】
実施形態３８
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２６に記載の方法。
【０１５５】
実施形態３９
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液が、少なくとも約０．１ｍＭの、システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度を有する、実施形態３８に記載の方法。
【０１５６】
実施形態４０
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液が、少なくとも約０．１ｍＭの、システインとシスチンとを組み合わせた初期濃度を有する、実施形態３７に記載の方法。
【０１５７】
実施形態４１
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中のシステインとシスチンとの上記組合せと上記Ｂ−２０３６とが、約０．５〜約１０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対するシステインとシスチンとを組み合わせたモル数のモル比を有する、実施形態３７に記載の方法。
【０１５８】
実施形態４２
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中のシステインとシスチンとの上記組合せと上記Ｂ−２０３６とが、約０．５〜約１０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対するシステインとシスチンとを組み合わせたモル数のモル比を有する、実施形態３８に記載の方法。
【０１５９】
実施形態４３
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態３７に記載の方法。
【０１６０】
実施形態４４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態３８に記載の方法。
【０１６１】
実施形態４５
上記Ｂ−２０３６濃度が、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである、実施形態４３に記載の方法。
【０１６２】
実施形態４６
上記Ｂ−２０３６濃度が、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである、実施形態４４に記載の方法。
【０１６３】
実施形態４７
上記Ｂ−２０３６濃度が、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態４５に記載の方法。
【０１６４】
実施形態４８
上記Ｂ−２０３６濃度が、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態４６に記載の方法。
【０１６５】
実施形態４９
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態３７に記載の方法。
【０１６６】
実施形態５０
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態３８に記載の方法。
【０１６７】
実施形態５１
上記ｐＨが約７．５〜約８．５である、実施形態４９に記載の方法。
【０１６８】
実施形態５２
上記ｐＨが約７．５〜約８．５である、実施形態５０に記載の方法。
【０１６９】
実施形態５３
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約２５℃の温度で維持される、実施形態３７に記載の方法。
【０１７０】
実施形態５４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約２５℃の温度で維持される、実施形態３８に記載の方法。
【０１７１】
実施形態５５
上記温度が約２℃〜約８℃である、実施形態５３に記載の方法。
【０１７２】
実施形態５６
上記温度が約２℃〜約８℃である、実施形態５４に記載の方法。
【０１７３】
実施形態５７
上記接触させるステップ（ａ）が、少なくとも約３０分間の時間にわたって実施される、実施形態３７に記載の方法。
【０１７４】
実施形態５８
上記接触させるステップ（ａ）が、少なくとも約３０分間の時間にわたって実施される、実施形態３８に記載の方法。
【０１７５】
実施形態５９
上記時間が約１時間〜約２４時間である、実施形態５７に記載の方法。
【０１７６】
実施形態６０
上記時間が約１時間〜約２４時間である、実施形態５８に記載の方法。
【０１７７】
実施形態６１
上記時間が約１時間〜約４時間である、実施形態５９に記載の方法。
【０１７８】
実施形態６２
上記時間が約１時間〜約４時間である、実施形態６０に記載の方法。
【０１７９】
実施形態６３
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態３７に記載の方法。
【０１８０】
実施形態６４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態３８に記載の方法。
【０１８１】
実施形態６５
上記体積が約１０Ｌ〜約５００Ｌである、実施形態６３に記載の方法。
【０１８２】
実施形態６６
上記体積が約１０Ｌ〜約５００Ｌである、実施形態６４に記載の方法。
【０１８３】
実施形態６７
上記体積が約１００Ｌ〜約３００Ｌである、実施形態６５に記載の方法。
【０１８４】
実施形態６８
上記体積が約１００Ｌ〜約３００Ｌである、実施形態６６に記載の方法。
【０１８５】
実施形態６９
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、キレート剤を、（１）上記不純物、（２）上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）上記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドのトリスルフィドアイソフォームである、方法。
【０１８６】
実施形態７０
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態６９に記載の方法。
【０１８７】
実施形態７１
（ｃ）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態７０に記載の方法。
【０１８８】
実施形態７２
（ｄ）上記精製されたポリペプチドをペグ化するステップ
をさらに含む、実施形態７１に記載の方法。
【０１８９】
実施形態７３
上記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡからなる群より選択される、実施形態７０に記載の方法。
【０１９０】
実施形態７４
上記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡからなる群より選択される、実施形態６９に記載の方法。
【０１９１】
実施形態７５
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態７３に記載の方法。
【０１９２】
実施形態７６
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態７４に記載の方法。
【０１９３】
実施形態７７
上記接触させるステップ（ａ）において、上記トリスルフィドアイソフォームが、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記ＥＤＴＡと接触される、実施形態７５に記載の方法。
【０１９４】
実施形態７８
上記期間が、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態７７に記載の方法。
【０１９５】
実施形態７９
上記接触させるステップ（ａ）において、上記トリスルフィドアイソフォームが、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記ＥＤＴＡと接触される、実施形態７６に記載の方法。
【０１９６】
実施形態８０
上記期間が、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態７９に記載の方法。
【０１９７】
実施形態８１
上記キレート剤が緩衝液中に提供される、実施形態６９に記載の方法。
【０１９８】
実施形態８２
上記キレート剤が緩衝液中に提供される、実施形態７０に記載の方法。
【０１９９】
実施形態８３
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供される、実施形態７５に記載の方法。
【０２００】
実施形態８４
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供される、実施形態７６に記載の方法。
【０２０１】
実施形態８５
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態８３に記載の方法。
【０２０２】
実施形態８６
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態８４に記載の方法。
【０２０３】
実施形態８７
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態８５に記載の方法。
【０２０４】
実施形態８８
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態８６に記載の方法。
【０２０５】
実施形態８９
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、実施形態８７に記載の方法。
【０２０６】
実施形態９０
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、実施形態８７に記載の方法。
【０２０７】
実施形態９１
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約２ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態８９に記載の方法。
【０２０８】
実施形態９２
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約２ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態８９に記載の方法。
【０２０９】
実施形態９３
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態８１に記載の方法。
【０２１０】
実施形態９４
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態８２に記載の方法。
【０２１１】
実施形態９５
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態８３に記載の方法。
【０２１２】
実施形態９６
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態８４に記載の方法。
【０２１３】
実施形態９７
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態９３に記載の方法。
【０２１４】
実施形態９８
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態９６に記載の方法。
【０２１５】
実施形態９９
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態９５に記載の方法。
【０２１６】
実施形態１００
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態９４に記載の方法。
【０２１７】
実施形態１０１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態９９に記載の方法。
【０２１８】
実施形態１０２
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態９８に記載の方法。
【０２１９】
実施形態１０３
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態１０１に記載の方法。
【０２２０】
実施形態１０４
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態１０２に記載の方法。
【０２２１】
実施形態１０５
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態６９に記載の方法。
【０２２２】
実施形態１０６
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態７０に記載の方法。
【０２２３】
実施形態１０７
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態９５に記載の方法。
【０２２４】
実施形態１０８
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態９６に記載の方法。
【０２２５】
実施形態１０９
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態１０７に記載の方法。
【０２２６】
実施形態１１０
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態１０８に記載の方法。
【０２２７】
実施形態１１１
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡと上記Ｂ−２０３６とが、約１〜約１，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対するＥＤＴＡのモル数のモル比を有する、実施形態１０７に記載の方法。
【０２２８】
実施形態１１２
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡと上記Ｂ−２０３６とが、約１〜約１，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対するＥＤＴＡのモル数のモル比を有する、実施形態１０８に記載の方法。
【０２２９】
実施形態１１３
上記モル比が約２０〜約１，０００である、実施形態１１１に記載の方法。
【０２３０】
実施形態１１４
上記モル比が約２０〜約１，０００である、実施形態１１２に記載の方法。
【０２３１】
実施形態１１５
上記モル比が約５０〜約２５０である、実施形態１１３に記載の方法。
【０２３２】
実施形態１１６
上記モル比が約５０〜約２５０である、実施形態１１４に記載の方法。
【０２３３】
実施形態１１７
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態１０７に記載の方法。
【０２３４】
実施形態１１８
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態１０８に記載の方法。
【０２３５】
実施形態１１９
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態１１７に記載の方法。
【０２３６】
実施形態１２０
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態１１８に記載の方法。
【０２３７】
実施形態１２１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態１０７に記載の方法。
【０２３８】
実施形態１２２
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態１０８に記載の方法。
【０２３９】
実施形態１２３
上記ｐＨが約６．５〜約７．５である、実施形態１２１に記載の方法。
【０２４０】
実施形態１２４
上記ｐＨが約６．５〜約７．５である、実施形態１２２に記載の方法。
【０２４１】
実施形態１２５
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態１０７に記載の方法。
【０２４２】
実施形態１２６
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態１０８に記載の方法。
【０２４３】
実施形態１２７
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態１２５に記載の方法。
【０２４４】
実施形態１２８
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態１２６に記載の方法。
【０２４５】
実施形態１２９
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態１０７に記載の方法。
【０２４６】
実施形態１３０
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態１０８に記載の方法。
【０２４７】
実施形態１３１
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態１２９に記載の方法。
【０２４８】
実施形態１３２
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態１３０に記載の方法。
【０２４９】
実施形態１３３
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態１０７に記載の方法。
【０２５０】
実施形態１３４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態１０８に記載の方法。
【０２５１】
実施形態１３５
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態１３３に記載の方法。
【０２５２】
実施形態１３６
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態１３４に記載の方法。
【０２５３】
実施形態１３７
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、金属塩を、（１）上記不純物、（２）上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）上記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドのトリスルフィドアイソフォームである、方法。
【０２５４】
実施形態１３８
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態１３７に記載の方法。
【０２５５】
実施形態１３９
（ｃ）必要に応じて、上記不純物をメルカプト化合物とさらに接触させるステップ、及び
（ｃ’）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態１３８に記載の方法。
【０２５６】
実施形態１４０
（ｄ）上記精製されたポリペプチドをペグ化するステップ
をさらに含む、実施形態１３９に記載の方法。
【０２５７】
実施形態１４１
上記金属塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１３８に記載の方法。
【０２５８】
実施形態１４２
上記金属塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１３７に記載の方法。
【０２５９】
実施形態１４３
上記金属塩が、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１４１に記載の方法。
【０２６０】
実施形態１４４
上記金属塩が、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態１４２に記載の方法。
【０２６１】
実施形態１４５
上記金属塩が、リン酸ナトリウム及びＺｎＣｌ２からなる群より選択される、実施形態１４３に記載の方法。
【０２６２】
実施形態１４６
上記金属塩が、リン酸ナトリウム及びＺｎＣｌ２からなる群より選択される、実施形態１４４に記載の方法。
【０２６３】
実施形態１４７
上記接触させるステップ（ａ）において、上記トリスルフィドアイソフォームが、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記金属塩と接触される、実施形態１３７に記載の方法。
【０２６４】
実施形態１４８
上記期間が、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態１４７に記載の方法。
【０２６５】
実施形態１４９
上記接触させるステップ（ａ）において、上記トリスルフィドアイソフォームが、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記金属塩と接触される、実施形態１３８に記載の方法。
【０２６６】
実施形態１５０
上記期間が、上記トリスルフィドアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態１４９に記載の方法。
【０２６７】
実施形態１５１
上記金属塩が緩衝液中に提供される、実施形態１３７に記載の方法。
【０２６８】
実施形態１５２
上記金属塩が緩衝液中に提供される、実施形態１３８に記載の方法。
【０２６９】
実施形態１５３
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの金属塩初期濃度を有する、実施形態１５１に記載の方法。
【０２７０】
実施形態１５４
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの金属塩初期濃度を有する、実施形態１５２に記載の方法。
【０２７１】
実施形態１５５
上記金属塩初期濃度が、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態１５３に記載の方法。
【０２７２】
実施形態１５６
上記金属塩初期濃度が、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態１５４に記載の方法。
【０２７３】
実施形態１５７
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態１４５に記載の方法。
【０２７４】
実施形態１５８
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態１４６に記載の方法。
【０２７５】
実施形態１５９
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態１５１に記載の方法。
【０２７６】
実施形態１６０
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態１５３に記載の方法。
【０２７７】
実施形態１６１
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０２７８】
実施形態１６２
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態１３８に記載の方法。
【０２７９】
実施形態１６３
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態１６０に記載の方法。
【０２８０】
実施形態１６４
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態１５９に記載の方法。
【０２８１】
実施形態１６５
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態１６３に記載の方法。
【０２８２】
実施形態１６６
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態１６４に記載の方法。
【０２８３】
実施形態１６７
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記リン酸ナトリウムが、少なくとも約０．１ｍＭのリン酸ナトリウム初期濃度を有する、実施形態１６５に記載の方法。
【０２８４】
実施形態１６８
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記リン酸ナトリウムが、少なくとも約０．１ｍＭのリン酸ナトリウム初期濃度を有する、実施形態１６６に記載の方法。
【０２８５】
実施形態１６９
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩と上記Ｂ−２０３６とが、約３００〜約１０，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対する金属塩のモル数のモル比を有する、実施形態１６３に記載の方法。
【０２８６】
実施形態１７０
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の金属塩と上記Ｂ−２０３６とが、約３００〜約１０，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対する金属塩のモル数のモル比を有する、実施形態１６４に記載の方法。
【０２８７】
実施形態１７１
上記モル比が、約５００〜約５，０００である、実施形態１６９に記載の方法。
【０２８８】
実施形態１７２
上記モル比が、約５００〜約５，０００である、実施形態１７０に記載の方法。
【０２８９】
実施形態１７３
上記モル比が、約５００〜約２５００である、実施形態１７１に記載の方法。
【０２９０】
実施形態１７４
上記モル比が、約５００〜約２５００である、実施形態１７２に記載の方法。
【０２９１】
実施形態１７５
上記金属塩がリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムである、実施形態１５３に記載の方法。
【０２９２】
実施形態１７６
上記金属塩がリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムである、実施形態１５４に記載の方法。
【０２９３】
実施形態１７７
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態１７５に記載の方法。
【０２９４】
実施形態１７８
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態１７６に記載の方法。
【０２９５】
実施形態１７９
上記金属塩初期濃度が約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態１７７に記載の方法。
【０２９６】
実施形態１８０
上記金属塩初期濃度が約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態１７８に記載の方法。
【０２９７】
実施形態１８１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態１６３に記載の方法。
【０２９８】
実施形態１８２
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態１６４に記載の方法。
【０２９９】
実施形態１８３
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態１８１に記載の方法。
【０３００】
実施形態１８４
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態１８２に記載の方法。
【０３０１】
実施形態１８５
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約４〜約９のｐＨを有する、実施形態１６３に記載の方法。
【０３０２】
実施形態１８６
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約４〜約９のｐＨを有する、実施形態１８４に記載の方法。
【０３０３】
実施形態１８７
上記ｐＨが約５．５〜約７．５である、実施形態１８５に記載の方法。
【０３０４】
実施形態１８８
上記ｐＨが約５．５〜約７．５である、実施形態１８６に記載の方法。
【０３０５】
実施形態１８９
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態１６３に記載の方法。
【０３０６】
実施形態１９０
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態１６４に記載の方法。
【０３０７】
実施形態１９１
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態１８９に記載の方法。
【０３０８】
実施形態１９２
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態１９０に記載の方法。
【０３０９】
実施形態１９３
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態１６３に記載の方法。
【０３１０】
実施形態１９４
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態１６４に記載の方法。
【０３１１】
実施形態１９５
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態１９３に記載の方法。
【０３１２】
実施形態１９６
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態１９４に記載の方法。
【０３１３】
実施形態１９７
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態１６３に記載の方法。
【０３１４】
実施形態１９８
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態１６４に記載の方法。
【０３１５】
実施形態１９９
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態１９７に記載の方法。
【０３１６】
実施形態２００
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態１９８に記載の方法。
【０３１７】
実施形態２０１
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、キレート剤を、（１）上記不純物、（２）上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）上記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【０３１８】
実施形態２０２
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態２０１に記載の方法。
【０３１９】
実施形態２０３
（ｃ）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態２０２に記載の方法。
【０３２０】
実施形態２０４
（ｄ）上記精製されたポリペプチドをペグ化するステップ
をさらに含む、実施形態２０３に記載の方法。
【０３２１】
実施形態２０５
上記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡからなる群より選択される、実施形態２０２に記載の方法。
【０３２２】
実施形態２０６
上記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡからなる群より選択される、実施形態２０１に記載の方法。
【０３２３】
実施形態２０７
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態２０５に記載の方法。
【０３２４】
実施形態２０８
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態２０６に記載の方法。
【０３２５】
実施形態２０９
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記ＥＤＴＡと接触される、実施形態２０７に記載の方法。
【０３２６】
実施形態２１０
上記期間が、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態２０９に記載の方法。
【０３２７】
実施形態２１１
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記ＥＤＴＡと接触される、実施形態２０８に記載の方法。
【０３２８】
実施形態２１２
上記期間が、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態２１１に記載の方法。
【０３２９】
実施形態２１３
上記キレート剤が緩衝液中に提供される、実施形態２０１に記載の方法。
【０３３０】
実施形態２１４
上記キレート剤が緩衝液中に提供される、実施形態２０２に記載の方法。
【０３３１】
実施形態２１５
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供される、実施形態２０７に記載の方法。
【０３３２】
実施形態２１６
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供される、実施形態２０８に記載の方法。
【０３３３】
実施形態２１７
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態２１５に記載の方法。
【０３３４】
実施形態２１８
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態２１６に記載の方法。
【０３３５】
実施形態２１９
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態２１７に記載の方法。
【０３３６】
実施形態２２０
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態２１８に記載の方法。
【０３３７】
実施形態２２１
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、実施形態２１９に記載の方法。
【０３３８】
実施形態２２２
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、実施形態２２０に記載の方法。
【０３３９】
実施形態２２３
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、２ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態２２１に記載の方法。
【０３４０】
実施形態２２４
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、２ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態２２２に記載の方法。
【０３４１】
実施形態２２５
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態２１３に記載の方法。
【０３４２】
実施形態２２６
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態２１４に記載の方法。
【０３４３】
実施形態２２７
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態２１５に記載の方法。
【０３４４】
実施形態２２８
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態２１６に記載の方法。
【０３４５】
実施形態２２９
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０３４６】
実施形態２３０
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２２６に記載の方法。
【０３４７】
実施形態２３１
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２２７に記載の方法。
【０３４８】
実施形態２３２
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態２２８に記載の方法。
【０３４９】
実施形態２３３
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態２２９に記載の方法。
【０３５０】
実施形態２３４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態２３０に記載の方法。
【０３５１】
実施形態２３５
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態２３３に記載の方法。
【０３５２】
実施形態２３６
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態２３４に記載の方法。
【０３５３】
実施形態２３７
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２０１に記載の方法。
【０３５４】
実施形態２３８
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２０２に記載の方法。
【０３５５】
実施形態２３９
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２２７に記載の方法。
【０３５６】
実施形態２４０
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２２８に記載の方法。
【０３５７】
実施形態２４１
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態２３９に記載の方法。
【０３５８】
実施形態２４２
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態２４０に記載の方法。
【０３５９】
実施形態２４３
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡと上記Ｂ−２０３６とが、約１〜約１，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対するＥＤＴＡのモル数のモル比を有する、実施形態２３９に記載の方法。
【０３６０】
実施形態２４４
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡと上記Ｂ−２０３６とが、約１〜約１，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対するＥＤＴＡのモル数のモル比を有する、実施形態２４０に記載の方法。
【０３６１】
実施形態２４５
上記モル比が約２０〜約１，０００である、実施形態２４３に記載の方法。
【０３６２】
実施形態２４６
上記モル比が約２０〜約１，０００である、実施形態２４４に記載の方法。
【０３６３】
実施形態２４７
上記モル比が約５０〜約２５０である、実施形態２４５に記載の方法。
【０３６４】
実施形態２４８
上記モル比が約５０〜約２５０である、実施形態２４６に記載の方法。
【０３６５】
実施形態２４９
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態２３９に記載の方法。
【０３６６】
実施形態２５０
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態２４０に記載の方法。
【０３６７】
実施形態２５１
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態２４９に記載の方法。
【０３６８】
実施形態２５２
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態２５０に記載の方法。
【０３６９】
実施形態２５３
上記Ｂ−２０３６濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態２４９に記載の方法。
【０３７０】
実施形態２５４
上記Ｂ−２０３６濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態２５０に記載の方法。
【０３７１】
実施形態２５５
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態２３９に記載の方法。
【０３７２】
実施形態２５６
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態２４０に記載の方法。
【０３７３】
実施形態２５７
上記ｐＨが約６．５〜約７．５である、実施形態２５５に記載の方法。
【０３７４】
実施形態２５８
上記ｐＨが約６．５〜約７．５である、実施形態２５６に記載の方法。
【０３７５】
実施形態２５９
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態２３９に記載の方法。
【０３７６】
実施形態２６０
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態２４０に記載の方法。
【０３７７】
実施形態２６１
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態２５９に記載の方法。
【０３７８】
実施形態２６２
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態２６０に記載の方法。
【０３７９】
実施形態２６３
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態２３９に記載の方法。
【０３８０】
実施形態２６４
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態２４０に記載の方法。
【０３８１】
実施形態２６５
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態２６３に記載の方法。
【０３８２】
実施形態２６６
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態２６４に記載の方法。
【０３８３】
実施形態２６７
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態２３９に記載の方法。
【０３８４】
実施形態２６８
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態２４０に記載の方法。
【０３８５】
実施形態２６９
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態２６７に記載の方法。
【０３８６】
実施形態２７０
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態２６８に記載の方法。
【０３８７】
実施形態２７１
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、金属塩を、（１）上記不純物、（２）上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチド、（３）上記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【０３８８】
実施形態２７２
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態２７１に記載の方法。
【０３８９】
実施形態２７３
（ｃ）必要に応じて、上記不純物をメルカプト化合物とさらに接触させるステップ、及び
（ｃ’）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態２７２に記載の方法。
【０３９０】
実施形態２７４
（ｄ）上記精製されたポリペプチドをペグ化するステップ
をさらに含む、実施形態２７３に記載の方法。
【０３９１】
実施形態２７５
上記金属塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態２７２に記載の方法。
【０３９２】
実施形態２７６
上記金属塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態２７１に記載の方法。
【０３９３】
実施形態２７７
上記金属塩が、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態２７５に記載の方法。
【０３９４】
実施形態２７８
上記金属塩が、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態２７６に記載の方法。
【０３９５】
実施形態２７９
上記金属塩が、リン酸ナトリウム及びＺｎＣｌ２からなる群より選択される、実施形態２７７に記載の方法。
【０３９６】
実施形態２８０
上記金属塩が、リン酸ナトリウム及びＺｎＣｌ２からなる群より選択される、実施形態２７８に記載の方法。
【０３９７】
実施形態２８１
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記金属塩と接触される、実施形態２７１に記載の方法。
【０３９８】
実施形態２８２
上記期間が、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態２８１に記載の方法。
【０３９９】
実施形態２８３
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記金属塩と接触される、実施形態２７２に記載の方法。
【０４００】
実施形態２８４
上記期間が、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも５０％減少させるのに十分である、実施形態２８３に記載の方法。
【０４０１】
実施形態２８５
上記金属塩が緩衝液中に提供される、実施形態２７１に記載の方法。
【０４０２】
実施形態２８６
上記金属塩が緩衝液中に提供される、実施形態２７２に記載の方法。
【０４０３】
実施形態２８７
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの金属塩初期濃度を有する、実施形態２８５に記載の方法。
【０４０４】
実施形態２８８
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの金属塩初期濃度を有する、実施形態２８６に記載の方法。
【０４０５】
実施形態２８９
上記金属塩初期濃度が、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態２８７に記載の方法。
【０４０６】
実施形態２９０
上記金属塩初期濃度が、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態２８８に記載の方法。
【０４０７】
実施形態２９１
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態２８６に記載の方法。
【０４０８】
実施形態２９２
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態２８５に記載の方法。
【０４０９】
実施形態２９３
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態２８５に記載の方法。
【０４１０】
実施形態２９４
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態２８６に記載の方法。
【０４１１】
実施形態２９５
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２７１に記載の方法。
【０４１２】
実施形態２９６
上記成長ホルモンアンタゴニストポリペプチドが、配列番号１のＢ−２０３６を含む、実施形態２７２に記載の方法。
【０４１３】
実施形態２９７
上記金属塩が、リン酸ナトリウムを含む、実施形態２９５に記載の方法。
【０４１４】
実施形態２９８
上記金属塩が、リン酸ナトリウムを含む、実施形態２９６に記載の方法。
【０４１５】
実施形態２９９
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記リン酸ナトリウムが、少なくとも約０．１ｍＭのリン酸ナトリウム初期濃度を有する、実施形態２９７に記載の方法。
【０４１６】
実施形態３００
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記リン酸ナトリウムが、少なくとも約０．１ｍＭのリン酸ナトリウム初期濃度を有する、実施形態２９８に記載の方法。
【０４１７】
実施形態３０１
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記金属塩と上記Ｂ−２０３６とが、約３００〜約１０，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対する金属塩のモル数のモル比を有する、実施形態２９５に記載の方法。
【０４１８】
実施形態３０２
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記金属塩と上記Ｂ−２０３６とが、約３００〜約１０，０００の、Ｂ−２０３６のモル数に対する金属塩のモル数のモル比を有する、実施形態２９６に記載の方法。
【０４１９】
実施形態３０３
上記モル比が、約５００〜約５，０００である、実施形態３０１に記載の方法。
【０４２０】
実施形態３０４
上記モル比が、約５００〜約５，０００である、実施形態３０２に記載の方法。
【０４２１】
実施形態３０５
上記モル比が、約５００〜約２５００である、実施形態３０３に記載の方法。
【０４２２】
実施形態３０６
上記モル比が、約５００〜約２５００である、実施形態３０４に記載の方法。
【０４２３】
実施形態３０７
上記金属塩がリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムである、実施形態２８７に記載の方法。
【０４２４】
実施形態３０８
上記金属塩がリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムである、実施形態２８８に記載の方法。
【０４２５】
実施形態３０９
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態３０７に記載の方法。
【０４２６】
実施形態３１０
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態３０８に記載の方法。
【０４２７】
実施形態３１１
上記金属塩初期濃度が約２５ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウムである、実施形態３０９に記載の方法。
【０４２８】
実施形態３１２
上記金属塩初期濃度が約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態３１０に記載の方法。
【０４２９】
実施形態３１３
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態２９５に記載の方法。
【０４３０】
実施形態３１４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記Ｂ−２０３６が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＢ−２０３６濃度を有する、実施形態２９６に記載の方法。
【０４３１】
実施形態３１５
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態３１３に記載の方法。
【０４３２】
実施形態３１６
上記Ｂ−２０３６濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態３１４に記載の方法。
【０４３３】
実施形態３１７
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約４〜約９のｐＨを有する、実施形態２９３に記載の方法。
【０４３４】
実施形態３１８
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約４〜約９のｐＨを有する、実施形態２９４に記載の方法。
【０４３５】
実施形態３１９
上記ｐＨが約５．５〜約７．５である、実施形態３１７に記載の方法。
【０４３６】
実施形態３２０
上記ｐＨが約５．５〜約７．５である、実施形態３１８に記載の方法。
【０４３７】
実施形態３２１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態２９５に記載の方法。
【０４３８】
実施形態３２２
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記Ｂ−２０３６が、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態２９６に記載の方法。
【０４３９】
実施形態３２３
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態３２１に記載の方法。
【０４４０】
実施形態３２４
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態３２２に記載の方法。
【０４４１】
実施形態３２５
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態２９５に記載の方法。
【０４４２】
実施形態３２６
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態２９６に記載の方法。
【０４４３】
実施形態３２７
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態３２５に記載の方法。
【０４４４】
実施形態３２８
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態３２６に記載の方法。
【０４４５】
実施形態３２９
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態２９５に記載の方法。
【０４４６】
実施形態３３０
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記Ｂ−２０３６が、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態２９６に記載の方法。
【０４４７】
実施形態３３１
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態３２９に記載の方法。
【０４４８】
実施形態３３２
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態３３０に記載の方法。
【０４４９】
実施形態３３３
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、キレート剤を、（１）上記不純物、（２）上記成長ホルモンポリペプチド、（３）上記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【０４５０】
実施形態３３４
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態３３３に記載の方法。
【０４５１】
実施形態３３５
（ｃ）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態３３４に記載の方法。
【０４５２】
実施形態３３６
上記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡからなる群より選択される、実施形態３３３に記載の方法。
【０４５３】
実施形態３３７
上記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡからなる群より選択される、実施形態３３４に記載の方法。
【０４５４】
実施形態３３８
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態３３６に記載の方法。
【０４５５】
実施形態３３９
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態３３７に記載の方法。
【０４５６】
実施形態３４０
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記ＥＤＴＡと接触される、実施形態３３８に記載の方法。
【０４５７】
実施形態３４１
上記期間が、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態３４０に記載の方法。
【０４５８】
実施形態３４２
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記ＥＤＴＡと接触される、実施形態３３９に記載の方法。
【０４５９】
実施形態３４３
上記期間が、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態３４２に記載の方法。
【０４６０】
実施形態３４４
上記キレート剤が緩衝液中に提供される、実施形態３３３に記載の方法。
【０４６１】
実施形態３４５
上記キレート剤が緩衝液中に提供される、実施形態３３４に記載の方法。
【０４６２】
実施形態３４６
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供される、実施形態３３８に記載の方法。
【０４６３】
実施形態３４７
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供される、実施形態３３９に記載の方法。
【０４６４】
実施形態３４８
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態３４６に記載の方法。
【０４６５】
実施形態３４９
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態３４７に記載の方法。
【０４６６】
実施形態３５０
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態３４８に記載の方法。
【０４６７】
実施形態３５１
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態３４９に記載の方法。
【０４６８】
実施形態３５２
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、実施形態３５０に記載の方法。
【０４６９】
実施形態３５３
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭである、実施形態３５１に記載の方法。
【０４７０】
実施形態３５４
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、２ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態３５２に記載の方法。
【０４７１】
実施形態３５５
上記ＥＤＴＡ初期濃度が、２ｍＭ〜約１０ｍＭである、実施形態３５３に記載の方法。
【０４７２】
実施形態３５６
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態３４４に記載の方法。
【０４７３】
実施形態３５７
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態３４５に記載の方法。
【０４７４】
実施形態３５８
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態３４６に記載の方法。
【０４７５】
実施形態３５９
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態３４７に記載の方法。
【０４７６】
実施形態３６０
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態３５６に記載の方法。
【０４７７】
実施形態３６１
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態３５７に記載の方法。
【０４７８】
実施形態３６２
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態３５８に記載の方法。
【０４７９】
実施形態３６３
上記緩衝液がトリスを含む、実施形態３５９に記載の方法。
【０４８０】
実施形態３６４
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態３６０に記載の方法。
【０４８１】
実施形態３６５
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記トリス緩衝液が、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのトリス濃度を有する、実施形態３６１に記載の方法。
【０４８２】
実施形態３６６
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態３６４に記載の方法。
【０４８３】
実施形態３６７
上記トリス濃度が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、実施形態３６５に記載の方法。
【０４８４】
実施形態３６８
上記成長ホルモンが、配列番号２のポリペプチドｈＧＨを含む、実施形態３３３に記載の方法。
【０４８５】
実施形態３６９
上記成長ホルモンが、配列番号２のポリペプチドｈＧＨを含む、実施形態３３４に記載の方法。
【０４８６】
実施形態３７０
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態３６８に記載の方法。
【０４８７】
実施形態３７１
上記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態３６９に記載の方法。
【０４８８】
実施形態３７２
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．０１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態３７０に記載の方法。
【０４８９】
実施形態３７３
上記ＥＤＴＡが緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記ＥＤＴＡが、少なくとも約０．１ｍＭのＥＤＴＡ初期濃度を有する、実施形態３７１に記載の方法。
【０４９０】
実施形態３７４
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記ＥＤＴＡと上記ｈＧＨとが、約１〜約１，０００の、ｈＧＨのモル数に対するＥＤＴＡのモル数のモル比を有する、実施形態３７０に記載の方法。
【０４９１】
実施形態３７５
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記ＥＤＴＡと上記ｈＧＨとが、約１〜約１，０００の、ｈＧＨのモル数に対するＥＤＴＡのモル数のモル比を有する、実施形態３７１に記載の方法。
【０４９２】
実施形態３７６
上記モル比が約２０〜約１，０００である、実施形態３７４に記載の方法。
【０４９３】
実施形態３７７
上記モル比が約２０〜約１，０００である、実施形態３７５に記載の方法。
【０４９４】
実施形態３７８
上記モル比が約５０〜約２５０である、実施形態３７６に記載の方法。
【０４９５】
実施形態３７９
上記モル比が約５０〜約２５０である、実施形態３７７に記載の方法。
【０４９６】
実施形態３８０
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記ｈＧＨが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ濃度を有する、実施形態３６８に記載の方法。
【０４９７】
実施形態３８１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記ｈＧＨが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ濃度を有する、実施形態３６９に記載の方法。
【０４９８】
実施形態３８２
上記ｈＧＨ濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態３８０に記載の方法。
【０４９９】
実施形態３８３
上記ｈＧＨ濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態３８１に記載の方法。
【０５００】
実施形態３８４
上記キレート剤が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態３６８に記載の方法。
【０５０１】
実施形態３８５
上記キレート剤が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約６〜約９のｐＨを有する、実施形態３６９に記載の方法。
【０５０２】
実施形態３８６
上記ｐＨが約６．５〜約７．５である、実施形態３８４に記載の方法。
【０５０３】
実施形態３８７
上記ｐＨが約６．５〜約７．５である、実施形態３８５に記載の方法。
【０５０４】
実施形態３８８
上記キレート剤が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記ｈＧＨが、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態３６８に記載の方法。
【０５０５】
実施形態３８９
上記キレート剤が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記ｈＧＨが、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態３６９に記載の方法。
【０５０６】
実施形態３９０
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態３８８に記載の方法。
【０５０７】
実施形態３９１
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態３８９に記載の方法。
【０５０８】
実施形態３９２
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態３６８に記載の方法。
【０５０９】
実施形態３９３
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態３６９に記載の方法。
【０５１０】
実施形態３９４
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態３９２に記載の方法。
【０５１１】
実施形態３９５
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態３９３に記載の方法。
【０５１２】
実施形態３９６
上記キレート剤が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記ｈＧＨが、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態３６８に記載の方法。
【０５１３】
実施形態３９７
上記キレート剤が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記ｈＧＨが、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態３６９に記載の方法。
【０５１４】
実施形態３９８
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態３９６に記載の方法。
【０５１５】
実施形態３９９
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態３９７に記載の方法。
【０５１６】
実施形態４００
細胞成分を含む、遺伝子改変された宿主細胞における成長ホルモンポリペプチドの組換え生成において生成される不純物の量を減少させるための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記不純物の上記量を減少させるのに十分な条件下で、金属塩を、（１）上記不純物、（２）上記成長ホルモンポリペプチド、（３）上記細胞成分、及び（４）これらの組合せと接触させるステップ
を含み、上記不純物が上記ポリペプチドの脱ｐｈｅアイソフォームである、方法。
【０５１７】
実施形態４０１
（ｂ）上記ポリペプチドを生成するために上記宿主細胞を増殖させるステップ
をさらに含み、上記増殖させるステップが、上記接触させるステップ（ａ）の前又はその間のいずれかに実施される、実施形態４３０に記載の方法。
【０５１８】
実施形態４０２
（ｃ）必要に応じて、上記不純物をメルカプト化合物とさらに接触させるステップ、及び
（ｃ’）精製されたポリペプチドを得るために上記ポリペプチドを精製するステップ
をさらに含む、実施形態４０１に記載の方法。
【０５１９】
実施形態４０３
上記金属塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態４００に記載の方法。
【０５２０】
実施形態４０４
上記金属塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態４０１に記載の方法。
【０５２１】
実施形態４０５
上記金属塩が、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態４０３に記載の方法。
【０５２２】
実施形態４０６
上記金属塩が、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛及びこれらの組合せからなる群より選択される、実施形態４０４に記載の方法。
【０５２３】
実施形態４０７
上記金属塩が、リン酸ナトリウム及びＺｎＣｌ２からなる群より選択される、実施形態４０５に記載の方法。
【０５２４】
実施形態４０８
上記金属塩が、リン酸ナトリウム及びＺｎＣｌ２からなる群より選択される、実施形態４０６に記載の方法。
【０５２５】
実施形態４０９
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記金属塩と接触される、実施形態４００に記載の方法。
【０５２６】
実施形態４１０
上記期間が、脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態４０９に記載の方法。
【０５２７】
実施形態４１１
上記接触させるステップ（ａ）において、上記脱ｐｈｅアイソフォームが、上記脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約１０％減少させるのに十分な期間にわたって、上記金属塩と接触される、実施形態４０１に記載の方法。
【０５２８】
実施形態４１２
上記期間が、脱ｐｈｅアイソフォームの上記量を少なくとも約５０％減少させるのに十分である、実施形態４１１に記載の方法。
【０５２９】
実施形態４１３
上記金属塩が緩衝液中に提供される、実施形態４００に記載の方法。
【０５３０】
実施形態４１４
上記金属塩が緩衝液中に提供される、実施形態４０１に記載の方法。
【０５３１】
実施形態４１５
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの金属塩初期濃度を有する、実施形態４１３に記載の方法。
【０５３２】
実施形態４１６
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの金属塩初期濃度を有する、実施形態４１４に記載の方法。
【０５３３】
実施形態４１７
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態４１５に記載の方法。
【０５３４】
実施形態４１８
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態４１６に記載の方法。
【０５３５】
実施形態４１９
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態４１７に記載の方法。
【０５３６】
実施形態４２０
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態４１８に記載の方法。
【０５３７】
実施形態４２１
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態４１３に記載の方法。
【０５３８】
実施形態４２２
上記緩衝液が、トリス、ホスフェート、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン及びヒスチジンからなる群より選択される、実施形態４１４に記載の方法。
【０５３９】
実施形態４２３
上記成長ホルモンが、配列番号２のポリペプチドｈＧＨを含む、実施形態４００に記載の方法。
【０５４０】
実施形態４２４
上記成長ホルモンが、配列番号２のポリペプチドｈＧＨを含む、実施形態４０１に記載の方法。
【０５４１】
実施形態４２５
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態４０７に記載の方法。
【０５４２】
実施形態４２６
上記金属塩がリン酸ナトリウムを含む、実施形態４０８に記載の方法。
【０５４３】
実施形態４２７
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記リン酸ナトリウムが、少なくとも約０．１ｍＭのリン酸ナトリウム初期濃度を有する、実施形態４２５に記載の方法。
【０５４４】
実施形態４２８
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記リン酸ナトリウムが、少なくとも約０．１ｍＭのリン酸ナトリウム初期濃度を有する、実施形態４２６に記載の方法。
【０５４５】
実施形態４２９
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩と上記ｈＧＨとが、約３００〜約１０，０００の、ｈＧＨのモル数に対する金属塩のモル数のモル比を有する、実施形態４２３に記載の方法。
【０５４６】
実施形態４３０
上記接触させるステップ（ａ）の前に、上記緩衝液中の上記金属塩と上記ｈＧＨとが、約３００〜約１０，０００の、ｈＧＨのモル数に対する金属塩のモル数のモル比を有する、実施形態４２４に記載の方法。
【０５４７】
実施形態４３１
上記モル比が、約５００〜約５，０００である、実施形態４２９に記載の方法。
【０５４８】
実施形態４３２
上記モル比が、約５００〜約５，０００である、実施形態４３０に記載の方法。
【０５４９】
実施形態４３３
上記モル比が、約５００〜約２５００である、実施形態４３１に記載の方法。
【０５５０】
実施形態４３４
上記モル比が、約５００〜約２５００である、実施形態４３２に記載の方法。
【０５５１】
実施形態４３５
上記金属塩がリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムである、実施形態４１５に記載の方法。
【０５５２】
実施形態４３６
上記金属塩がリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムである、実施形態４１６に記載の方法。
【０５５３】
実施形態４３７
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態４３５に記載の方法。
【０５５４】
実施形態４３８
上記金属塩初期濃度が約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭである、実施形態４３６に記載の方法。
【０５５５】
実施形態４３９
上記金属塩初期濃度が約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態４３７に記載の方法。
【０５５６】
実施形態４４０
上記金属塩初期濃度が約２５ｍＭ〜約１００ｍＭである、実施形態４３８に記載の方法。
【０５５７】
実施形態４４１
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記ｈＧＨが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ濃度を有する、実施形態４２３に記載の方法。
【０５５８】
実施形態４４２
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記ｈＧＨが、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ濃度を有する、実施形態４２４に記載の方法。
【０５５９】
実施形態４４３
上記ｈＧＨ濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態４４１に記載の方法。
【０５６０】
実施形態４４４
上記ｈＧＨ濃度が、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、実施形態４４２に記載の方法。
【０５６１】
実施形態４４５
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約４〜約９のｐＨを有する、実施形態４１３に記載の方法。
【０５６２】
実施形態４４６
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液が約４〜約９のｐＨを有する、実施形態４１４に記載の方法。
【０５６３】
実施形態４４７
上記ｐＨが約５．５〜約７．５である、実施形態４４５に記載の方法。
【０５６４】
実施形態４４８
上記ｐＨが約５．５〜約７．５である、実施形態４４６に記載の方法。
【０５６５】
実施形態４４９
上記金属塩が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記ｈＧＨが、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態４２３に記載の方法。
【０５６６】
実施形態４５０
上記金属塩が緩衝液中に提供され、かつ上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液及び上記ｈＧＨが、約０℃〜約３５℃の温度で維持される、実施形態４２４に記載の方法。
【０５６７】
実施形態４５１
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態４４９に記載の方法。
【０５６８】
実施形態４５２
上記温度が約２℃〜約１５℃である、実施形態４５０に記載の方法。
【０５６９】
実施形態４５３
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態４２３に記載の方法。
【０５７０】
実施形態４５４
上記接触させるステップ（ａ）が、約１時間〜約４８時間の時間にわたって実施される、実施形態４２４に記載の方法。
【０５７１】
実施形態４５５
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態４５３に記載の方法。
【０５７２】
実施形態４５６
上記時間が約５時間〜約１５時間である、実施形態４５４に記載の方法。
【０５７３】
実施形態４５７
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記ｈＧＨが、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態４２３に記載の方法。
【０５７４】
実施形態４５８
上記接触させるステップ（ａ）の後に、上記緩衝液中の上記ｈＧＨが、約１Ｌ〜約５０００Ｌの体積を有する、実施形態４２４に記載の方法。
【０５７５】
実施形態４５９
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態４５７に記載の方法。
【０５７６】
実施形態４６０
上記体積が約２００Ｌ〜約１５００Ｌである、実施形態４５８に記載の方法。
【０５７７】
実施形態４６１
上記接触させるステップ（ａ）が、メルカプト化合物の不在下で実施される、実施形態６９に記載の方法。
【０５７８】
実施形態４６２
上記接触させるステップ（ａ）が、上記キレート剤の不在下でメルカプト化合物と接触させるステップの前に、上記キレート剤と接触させるステップをさらに含む、実施形態６９に記載の方法。
【０５７９】
実施形態４６３
上記メルカプト化合物が、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインからなる群より選択される、実施形態４６２に記載の方法。
【０５８０】
実施形態４６４
上記メルカプト化合物が、システイン、又はシスチンと組み合わせたシステインを含む、実施形態４６３に記載の方法。
【０５８１】
実施形態４６５
上記接触させるステップ（ａ）が、メルカプト化合物と合わせて上記金属塩と接触させるステップをさらに含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０５８２】
実施形態４６６
上記メルカプト化合物が、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインからなる群より選択される、実施形態４６５に記載の方法。
【０５８３】
実施形態４６７
上記メルカプト化合物が、システイン、又はシスチンと組み合わせたシステインを含む、実施形態４６６に記載の方法。
【０５８４】
実施形態４６８
上記接触させるステップ（ａ）が、上記金属塩の不在下又は存在下でメルカプト化合物と接触させるステップの前に、上記金属塩と接触させるステップをさらに含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０５８５】
以下は、例として提示され、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。本明細書中で引用される書籍、雑誌、雑誌記事、特許又は任意の他の刊行物に対するすべての引用は、本明細書中で参考として明示的に援用される。
【実施例１】
【０５８６】
メルカプト化合物による、成長ホルモンアンタゴニスト（ＧＨＡ）のトリスルフィドアイソフォーム不純物の減少
Ｂ−２０３６−トリスルフィドレベルの低減を、Ｂ−２０３６精製方法において、保持液１（以下のフローチャート１を参照されたい）を使用して達成した。Ｂ−２０３６を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉの発酵を、米国特許第５８４９５３５号においてＣｕｎｎｉｎｇｈａｍらによって記載されるように実施した。第１の抽出ステップ及び精製ステップ（以下のフローチャート１中の保持液１を得る前に実施したすべてのステップ（例えば、すべての再懸濁及びホモジナイズ化、２相抽出、逆相クロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィー））を、添付のフローチャート１に記載されるように実施した。第１の限外濾過／ダイアフィルトレーションステップの後、生成物は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液（約１５０Ｌ）中に、３．７ｇ／Ｌのタンパク質濃度で存在した。生成物溶液の温度を、２〜８℃に冷却し、これを、２〜８℃に冷却した、新たに調製した２００ｍＭ  トリス、２０ｍＭシステイン（ｐＨ８．０）緩衝液の１０分の１体積の添加（約１５Ｌ）で処理した。Ｂ−２０３６／システイン溶液を２〜８℃で維持し、１７４分間混合した。次いで、この混合物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  ５限外濾過メンブレンを使用して１３１Ｌまで濃縮し、６倍体積の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）でダイアフィルトレーションした。次いで、得られた生成物で、以下のフローチャート１に記載されるような、Ｂ−２０３６精製方法の残りを行った。
【０５８７】
システインインキュベーションの前に、Ｂ−２０３６／トリスルフィドレベルを、３．７面積％と測定した。システインインキュベーションの直後に、そのレベルは、２．０面積％に低下した（約４６％の減少）。
【０５８８】
【表２−１】
2006517091.tif 000003
【表２−２】
2006517091.tif 000004
【表２−３】
2006517091.tif 000005
【０５８９】
【表３−１】
2006517091.tif 000006
【表３−２】
2006517091.tif 000007
【実施例２】
【０５９０】
キレート剤による、成長ホルモンアンタゴニストのトリスルフィドアイソフォーム不純物の減少
フローチャート１を参照して、１６５Ｋｇの凍結ＧＨＡ細胞ペーストを、約１０１３リットルの、１５０ｍＭ  トリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に添加した。この細胞ペーストの解凍が終了したら（安定なＡ５５０読取りによって決定）、この混合物を、Ｎｉｒｏホモジナイザーに９５０＋／−５０Ｂａｒで、２５０ｌ／時間の名目上の流速で通過させた。そのホモジネートを、温度を２４℃と３３℃との間に維持したタンク中で収集した。硫酸アンモニウム及びＰＥＧ−４６００を、溶解物混合物に添加して、両方の化合物の１０％（ｗ／ｗ）の濃度を形成した。得られた２相混合物を６０〜１２０分間混合し、次いで、これらの相を、液体／液体の固体排出遠心分離にこの溶液をかけることによって分離した。所望の生成物を含んだ上相を収集し、「脱脂」フィルタ、「デプス型」フィルタ及び０．２μｍフィルタからなるフィルタ列を介して濾過した。その濾液を、３つの別個の手提げ中に収集し、それぞれのサンプルを、Ｂ−２０３６−トリスルフィドについて分析した。これらのレベルは、３．１〜３．８面積％の範囲であった。次いで、得られた物質を、実施例１のフローチャートに概説される手順を使用して、バルク中間体へと処理した。
【０５９１】
比較として、上記の手順によって処理された（しかし、溶解緩衝液中にＥＤＴＡ成分（キレート剤）を含まず、かつ保持液１のシステイン処理を用いなかった）ロット由来のサンプルは、上記のフローチャート１の方法全体の最後に、３．２〜６．４面積％の範囲のトリスルフィドレベル（ｎ＝１０）を生じ、平均は５．１であった。ＥＤＴＡが溶解緩衝液中に含められ、かつ保持液１のシステインインキュベーションステップを実施した場合、フローチャート１の方法全体の最後に、トリスルフィドレベルは１．５面積％であった。
【実施例３】
【０５９２】
金属塩による、成長ホルモンアンタゴニストのトリスルフィドアイソフォーム不純物の減少
以下のフローチャート２を参照して、１６５Ｋｇの凍結細胞ペーストを、約１０１３リットルの１００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に添加した。この細胞ペーストの解凍が終了したら（安定なＡ５５０読取りによって決定）、この混合物を、Ｎｉｒｏホモジナイザーに９５０＋／−５０ｂａｒで、２５０ｌ／時間の名目上の流速で通過させた。そのホモジネートを、温度を２４℃と３３℃との間に維持したタンク中で収集した。硫酸アンモニウム及びＰＥＧ−４６００を、溶解物混合物に添加して、両方の化合物の１０％（ｗ／ｗ）の濃度を形成した。得られた２相混合物を６０〜１２０分間混合し、次いで、これらの相を、液体／液体の固体排出遠心分離にこの溶液をかけることによって分離した。所望の生成物を含んだ上相を収集し、「脱脂」フィルタ、「デプス型」フィルタ及び０．２μｍフィルタからなるフィルタ列を介して濾過した。この物質で、以下のフローチャート２に記載されるような、Ｂ−２０３６方法の残りを行った。処理の最後に存在するＢ−２０３６−トリスルフィドのレベルは、１．４面積％であった。これは、通常の溶解緩衝液（１５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．２）で処理したＢ−２０３６ロット（ｎ＝１０）について、３．２〜６．４面積％（平均＝５．１面積％）のＢ−２０３６−トリスルフィドレベルと同等であった。
【０５９３】
【表４−１】
2006517091.tif 000008
【表４−２】
2006517091.tif 000009
【表４−３】
2006517091.tif 000010
【実施例４】
【０５９４】
キレート剤による、成長ホルモンアンタゴニストの脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
フローチャート１を参照して、１６５Ｋｇの凍結細胞ペーストを、約１０１３リットルの、１５０ｍＭ  トリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に添加した。この細胞ペーストの解凍が終了したら（安定なＡ５５０読取りによって決定）、この混合物を、Ｎｉｒｏホモジナイザーに９５０＋／−５０Ｂａｒで、２５０ｌ／時間の名目上の流速で通過させた。そのホモジネートを、温度を２４℃と３３℃との間に維持したタンク中で収集した。硫酸アンモニウム及びＰＥＧ−４６００を、溶解物混合物に添加して、両方の化合物の１０％（ｗ／ｗ）の濃度を形成した。得られた２相混合物を６０〜１２０分間混合し、次いで、これらの相を、液体／液体の固体排出遠心分離にこの溶液をかけることによって分離した。所望の生成物を含んだ上相を収集し、「脱脂」フィルタ、「デプス型」フィルタ及び０．２μｍフィルタからなるフィルタ列を介して濾過した。その濾液（上相濾過の後に得た；フローチャート１を参照されたい）を、３つの別個の手提げ中に収集し、各々のサンプルを、Ｂ−２０３６／脱ｐｈｅについて分析した。これらのレベルは、３．２〜６．３面積％の範囲であった。比較として、フローチャート１に従うさらなる処理は、Ｂ−２０３６  脱ｐｈｅレベルを、保持液３の０．３面積％にまでさらに低減させた。このさらなるＢ−２０３６  脱ｐｈｅレベルの低減を、第２のアニオン交換クロマトグラフィーステップの生成物収集パラメータによって達成した。溶解緩衝液がＥＤＴＡを含み、かつイオン交換クロマトグラフィーステップの収集手順が実行されると、ＥＤＴＡ（例えば、１５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２）なしかつ上記の収集手順なしで処理したＢ−２０３６ロット（ｎ＝１０）についての４．６〜１６．２面積％（平均＝１０．２面積％）の最終方法レベルと比較して、０．３面積％のＢ−２０３６／脱ｐｈｅレベルが得られた。
【実施例５】
【０５９５】
金属塩による、成長ホルモンアンタゴニストの脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
フローチャート２を参照して、１６５Ｋｇの凍結細胞ペーストを、約１０１３リットルの１００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に添加した。この細胞ペーストの解凍が終了したら（安定なＡ５５０読取りによって決定）、この混合物を、Ｎｉｒｏホモジナイザーに９５０＋／−５０ｂａｒで、２５０ｌ／時間の名目上の流速で通過させた。そのホモジネートを、温度を２４℃と３３℃との間に維持したタンク中で収集した。硫酸アンモニウム及びＰＥＧ−４６００を、溶解物混合物に添加して、両方の化合物の１０％（ｗ／ｗ）の濃度を形成した。得られた２相混合物を６０〜１２０分間混合し、次いで、これらの相を、液体／液体の固体排出遠心分離にこの溶液をかけることによって分離した。所望の生成物を含んだ上相を収集し、「脱脂」フィルタ、「デプス型」フィルタ及び０．２μｍフィルタからなるフィルタ列で濾過した。その濾液を、３つの別個の手提げ中に収集し、各々のサンプルを、Ｂ−２０３６／脱ｐｈｅについて分析した。これらのレベルは、６．０〜９．４面積％の範囲であった。比較として、フローチャート２に従うさらなる処理は、Ｂ−２０３６／脱ｐｈｅレベルを、保持液２の０．８面積％にまでさらに低減させた。このさらなるＢ−２０３６／脱ｐｈｅレベルの低減を、第２のアニオン交換クロマトグラフィーステップに従う生成物収集パラメータによって達成した。溶解緩衝液がリン酸ナトリウムを含み、かつ第２のイオン交換クロマトグラフィーステップの収集手順が実行されると、リン酸ナトリウム（例えば、１５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２）なしかつ上記の収集手順なしで処理したＢ−２０３６ロット（ｎ＝１０）についての４．６〜１６．２面積％（平均＝１０．２面積％）の最終方法レベルと比較して、０．８面積％のＢ−２０３６／脱ｐｈｅレベルが得られた。
【実施例６】
【０５９６】
キレート剤による、成長ホルモンアゴニストの脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
ＥＤＴＡを含む緩衝液中で、成長ホルモンアゴニストを発現する新鮮な組換え細胞又は凍結組換え細胞を懸濁する。次いで、ホモジナイズ化のような方法、又は部分的に、浸透圧ショック若しくは凍結／解凍のような方法のいずれかによって、細胞を完全に破壊して、成長ホルモンアゴニストを放出させる。次いで、２相抽出、固体／液体遠心分離又は濾過によって、破壊した溶液を分離する。一連の液体クロマトグラフィーステップによって、このアゴニストを精製する。
【実施例７】
【０５９７】
金属塩による、成長ホルモンアゴニストの脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の減少
リン酸ナトリウム含む緩衝液中で、成長ホルモンアゴニストを発現する新鮮な組換え細胞又は凍結組換え細胞を懸濁する。次いで、ホモジナイズ化のような方法、又は部分的に、浸透圧ショック若しくは凍結／解凍のような方法のいずれかによって、細胞を完全に破壊して、成長ホルモンアゴニストを放出させる。次いで、２相抽出、固体／液体遠心分離又は濾過によって、破壊した溶液を分離する。一連の液体クロマトグラフィーステップによって、このアゴニストを精製する。
【図面の簡単な説明】
【０５９８】
【図１Ａ】配列番号１に対応するＢ−２０３６のアミノ酸配列を示す図である。図１Ａ中のアスタリスク（＊）は、Ｂ−２０３６の各分子へのＰＥＧ単位の共有結合のための９つの可能性のある部位を示す。９つの可能性のある部位が特定されているものの、９つすべての部位がＰＥＧ単位に共有結合する必要がないことに留意されたい。好ましくは、１分子のＢ−２０３６当たり４〜６のＰＥＧ単位が存在する。
【図１Ｂ】その所望の形態（「本来ＧＨＡ」と称する）と比較した、Ｂ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物（「トリスルフィド（＋３２  ａｍｕ）」と称する）の構造を示す図である。
【配列表】
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【図１Ｂ】
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【国際調査報告】
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