(57)【要約】本発明は固相サッカライド色素およびその製法を提供する。本色素は固体基質に共有結合したビスボロン酸である。本色素はサッカライド、特にグルコースと選択的に共役し、信号を示す。その信号はサッカライドの量に比例する。したがって、本発明の色素はサッカライドレベル、特に血液などの生物学的流体中のサッカライドレベルを測定し、監視するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式であらわされる化合物であって：
2006514680.tif 000003
上記式中、Ｑはフルオロフォアであり；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立的にリンカーアームおよび非リンカー置換基からなる群から選択され；
前記リンカーアームは約Ｃ３０以下の飽和または不飽和、置換または未置換、炭化水素であり、固相物質に共有結合し；
前記非リンカー置換基は水素、または約Ｃ２０以下の飽和または不飽和、置換または未置換炭化水素であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は同じかまたは異なり、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、置換アルキル、アシル、アルキルオキシおよびハロゲンからなる群から選択される化合物。
【請求項２】
Ｑが次式からなる群から選択され：
2006514680.tif 000004
上記式中、Ｒｎは水素、ハロゲン、アシル、アルキルオキシ、ニトロ、カルボン酸、およびカルボン酸エステルから独立的に選択される複数の置換基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
サッカライド共役結合時の励起ピークと発光ピークとの差が少なくとも約４０ｎｍである請求項１記載の化合物。
【請求項４】
分子の相対的蛍光強度が、グルコース濃度の生理的範囲を横切って約１．５より大きい請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記アシル基がアセチルである請求項２記載の化合物。
【請求項６】
Ｑが次式であらわされる請求項１記載の化合物。
2006514680.tif 000005
【請求項７】
前記リンカーアームが：
−Ｘ−Ｙ、−Ｘ−Ｏ−Ｙ、−Ｘ−ＮＨ−Ｙ、−Ｘ−Ｎ＝Ｙ、−Ｘ−ＮＲ−Ｙ、Ｘ−ＣＯ−Ｙ、−Ｘ−ＣＯＯ−Ｙ、−Ｘ−ＯＣＯ−Ｙ、−Ｘ−ＮＨＣＯ−Ｙ、−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｙ、−Ｘ−Ｎ＝Ｃ（Ｏ−Ｙ）２、−Ｘ−ＮＨＣＨ（ＮＨ２）−Ｏ−Ｙ、−Ｘ−Ｓ−Ｙ、−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ、−Ｘ−ＳＯ２ＮＨ−Ｙおよび−Ｘ−ＮＨＳＯ２−Ｙからなる群から選択され；
上記中、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルまたはアシル；
Ｘは飽和または不飽和炭化水素鎖；
Ｙは固相物質である請求項１記載の化合物。
【請求項８】
前記固相物質がセルロース、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリシロキサン、ナイロンおよびそれらのコポリマー類から選択される生体適合性ポリマーである請求項７記載の化合物。
【請求項９】
前記固相物質が再生セルロースまたはナイロンである請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
次式であらわされる化合物であって：
2006514680.tif 000006
上記式中、Ｑはフルオロフォアであり；
Ｒ１およびＲ２は同じであり、カルボキシアルキルおよびアルキルアミノ置換基からなる群から選択され、固相支持体物質に共有結合し；
Ｒ３は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、アルキルオキシ、ニトロ、カルボン酸およびカルボン酸エステルからなる群から選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同じかまたは異なり、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、アシル、アルキルオキシおよびハロゲンからなる群から選択される前記化合物。
【請求項１１】
Ｒ１およびＲ２が両方共−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ６Ｈ１２−ＮＨ２である請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１およびＲ２が両方共、サッカライド色素と固相物質との間にポリプロピレングリコール・スペーサを含む請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
次式であらわされる化合物であって：
2006514680.tif 000007
上記式中、Ｑはアントラセンであり；
Ｒ１およびＲ２は固相物質に共有結合したＣ１−Ｃ１２炭化水素であり；
Ｒ３はアセチルであり；
Ｒ４とＲ５、およびＲ６とＲ７はどちらも全部Ｈであるかまたは前記２対がそれぞれ縮合芳香環構造を形成する前記化合物。
【請求項１４】
サッカライド共役結合時の化合物の励起ピークおよび発光ピークの差が約４０ｎｍ以上である請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
化合物がサッカライド共役結合時に少なくとも約１．４の相対的強度の蛍光を有する請求項１３記載の化合物。
【請求項１６】
次式であらわされる化合物であって：
2006514680.tif 000008
上記式中、Ｑはアントラセンであり；
Ｒ１およびＲ２はＣ１−Ｃ１２の非リンカー炭化水素であり；
Ｒ３は重合固相支持体に共有結合する炭化水素リンカーアームを含むアミドであり；
Ｒ４とＲ５およびＲ６とＲ７はどちらも全てＨであるか、または前記２対がそれぞれ縮合芳香環構造を形成する前記化合物。
【請求項１７】
サッカライド共役結合時の前記色素の励起−発光差が約７０ｎｍ以上である請求項１４記載の化合物。
【請求項１８】
前記色素の蛍光の相対的強度がグルコースの生理的範囲を横切って約２.０である請求項１４記載の化合物。
【請求項１９】
重合固相支持体が再生セルロースまたは活性ナイロンである請求項１４記載の化合物。
【請求項２０】
生物学的流体中のサッカライド濃度を検出するためのセンサーであって、流体導管を有し、前記流体導管において請求項１記載の化合物が前記導管の内壁に共有結合し、前記化合物が前記導管を流れる流体と接触するようになっているセンサー。
【請求項２１】
生物学的流体中のサッカライド濃度を検出する方法であって、生物学的流体を請求項１記載の固定化合物と接触させ、前記化合物の蛍光の相対的強度を測定する方法。
【請求項２２】
請求項１記載の化合物を固定する方法であって、
次式であらわされる化合物：
2006514680.tif 000009
上記式中、Ｑはフルオロフォアであり；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は水素、約Ｃ３０以下のアミノ末端炭化水素および約Ｃ３０以下の炭化水素からなる群から、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つがアミノ末端炭化水素であるように独立的に選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同じかまたは異なり、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、アシル、アルキルオキシおよびハロゲンからなる群から選択される前記化合物を反応させ、
前記アミノ末端炭化水素をカルボキシル、カルボニル、臭化シアン、エポキシ、およびイソシアネートからなる群から選択される官能基で活性化されたポリマーと反応させることを含む方法。
【請求項２３】
活性化ポリマーがエチレンジアミンで架橋される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項１記載の化合物を固定する方法であって、
次式であらわされる化合物：
2006514680.tif 000010
上記式中、Ｑはフルオロフォアであり；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は水素、約Ｃ３０以下のカルボキシル末端炭化水素および約Ｃ３０以下の炭化水素からなる群から、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つがカルボキシル末端炭化水素であるように独立的に選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同じかまたは異なり、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、アシル、アルキルオキシおよびハロゲンからなる群から選択される前記化合物を反応させ、
前記カルボキシル末端炭化水素とアミノ活性化固相ポリマーとを反応させることを含む方法。
【請求項２５】
請求項１記載の化合物を固定する方法であって、
次式であらわされる化合物：
2006514680.tif 000011
上記式中、Ｑはフルオロフォアであり；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は水素、約Ｃ３０以下のアミノ末端炭化水素および約Ｃ３０以下の炭化水素からなる群から、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つがアミノ末端炭化水素であるように独立的に選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同じかまたは異なり、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、アシル、アルキルオキシおよびハロゲンからなる群から選択される前記化合物を反応させ、
前記アミノ末端炭化水素をイソシアネート活性化ポリプロピレングリコールと反応させ；前記ポリプロピレングリコールをエチレンジアミンで架橋することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のビスボロン酸をベースとするサッカライドセンサーに関するものである。上記センサーは蛍光誘導性電子伝達（ＰＥＴ）型のものである。上記センサーはポリマー基質上に固定され、患者のサッカライド濃度をモニターするために使用される医学的機器のサッカライドセンサーとして作成される。
【背景技術】
【０００２】
サッカライドは天然のエネルギー運搬体であり、細胞の生存のために必須であるJames, T.D. et al., J.Am. Chem. Soc., 117, 8982-8987(1995)（参照：Robertson, R.N., The Lively Membrane, Cambridge University Press, New York, 1983）。グルコース輸送の欠陥は種々の病的状態と関連し、グルコース濃度の変動は急性並びに慢性異常の前兆または兆候とみなすことができる（上述の著書参照）。このため、動物特にヒトにおいてグルコース濃度を検出し、モニターできることが非常に重要である。
【０００３】
サッカライドまたは糖類、例えばグルコースなどの分子的確認が信頼できる検出メカニズムであることは証明されている。おそらく、このような検出のために最も確実で効率的な装置は、分子内電子伝達（光誘導性電子伝達とも呼ばれる（ＰＥＴ））現象を利用するものである。
【０００４】
このような分子的確認をもたらす装置はサッカライドとの結合の際に構造的および蛍光的変化を両方示す。蛍光変化はサンプル中のサッカライド濃度に比例し、そのためこれらのセンサーまたは色素は定量測定のために利用できる。
【０００５】
これらのセンサーのなかでより多く普及しているのはボロン酸をベースとするサッカライドセンサーである。ボロン酸センサーは環状エステルの形の炭水化物のジオール官能基と強い可逆的共有結合をおこす。これらのセンサーはより弱い非共有結合または水素結合相互作用を含むその他のセンサー系よりすぐれている。
【０００６】
ボロン酸センサーはそれ自体に欠点がないわけではない。ボロン酸−サッカライド相互作用に基づく蛍光センサーの設計は、ボロン酸部分またはサッカライド部分のどちらかに見いだされる電子的変化が不十分なために難しいことが判明したJ.Am. Chem. Soc., 117, at 8983。シンカイ（Shinkai）のグループは、ボロン酸結合部位を修飾してボロン酸部分周囲に電子豊富な中心を形成することによって、例えばボロン酸部分と共に分子内五員環を形成する第四アミンを付加することによって、これらの欠点を克服できることを示した（上述の著書）。彼らはその後、９，１０−ビス−（アミノメチル）−アントラセン骨格が、分子内に完全なグルコース選択性クレフトを生成することによってグルコース選択的センサーとなることを示した（上述の著書）。これらの努力の結果、いわゆる“シンカイ色素”を生成した（図１Ａ）。
【０００７】
シンカイのグループの研究に基づいて、ノリルド（Norrild）のグループは他の糖質類に比較してグルコース分子に特異的であり、かつ中性ｐＨでグルコースに結合できる色素を作り出そうとしたEggert et al, J. Org. Chem., 64, 3846-3852, 1999。中性ｐＨでグルコースと結合するためには、ボロン酸はｐＫａ≦７でなければならない。このようなボロン酸センサー色素を作り出すには、それまで提案されていた色素の大部分が８から１０の範囲のｐＫａを有していることが、主な問題となった。
【０００８】
ノリルドらは、特に低いｐＫａを有するという観点から３−ピリジンボロン酸を選択し、アントラセン部分に結合した２つの３−ピリジンボロン酸部分を含むビス−ボロン酸を作成した。生成した“ノリルド”色素（図１Ｂ）は必要とされる低ｐＫａおよび水溶性を有し、同時にグルコースに選択的に結合するために最適な構造を有した。この色素はフルクトースやガラクトースに比べグルコースに対する選択的な蛍光反応があるとされる。
【０００９】
シンカイ色素もノリルド色素も溶液ベースの系である。溶液ベースの系はサッカライド結合の信号を出す分子内変化の自由度を大きくする。しかしながら、或る適用においては、固相色素を必要とする。固定により分子の自由度が減少し、その電気化学が変化する恐れがある。これは次に分子の蛍光に影響を与え、その有用性を低減させるかも知れない。すなわち固定は生理学的試験分野においては蛍光強度を減らし、または蛍光反応を減らすことがある。
【００１０】
この分野のサッカライドセンサーは一般に一つ以上の欠点を有する。例えば、公知のセンサーはサッカライド結合に反応した識別可能のシグナルを生成できるが、他のサッカライドに比べてグルコースに対して所望の特異性を提供しない。
【００１１】
さらに公知のサッカライドセンサーは所望の定量的反応に欠ける。すなわちサッカライド濃度が増加する際、蛍光はほんのわずか増加するに過ぎない。サッカライド濃度の関数としての相対的蛍光強度の勾配が大きく、生理学的に重要なサッカライド濃度範囲にわたって大きいままであるのが好ましい。濃度の関数として高い強度勾配を示すセンサーは、より信頼できる、より容易に見分けられるシグナルを生じ、それによって生産コストを実質的に減らすことができる。
【００１２】
さらに、検出または診断デバイスとしての蛍光の使用は顕著なストークスシフトによって有益である。ストークスシフトは蛍光物質の発光波長が蛍光を励起するのに使用される放射波長より長いという実験的法則から誘導される。ストークスシフトが小さければ、励起および発光のピークは非常に近似し、これら二つを見分ける精巧な光学機械およびフィルター装置に頼らなければならない。ストークスシフトが増加するにつれて、励起ピークの波長は発光ピークからさらに遠くに離れ、上記二者を区別するためのフィルターへの依存度は低減する。このことも、より経済的な装置の使用を容易にする。
【００１３】
ボロン酸ベースのサッカライドセンサーのグルコース特異性を改善し、および／またはセンサーの蛍光特性を改善し、および／またはこれらの伝統的溶液ベースの系を重合体基質に固定する試みにおいて、成功はごくわずかに限られていたE.g., Arimori, S., et al, Chem. Commun., 2001, 1836-1837。
【００１４】
サッカライド色素を開発する主な目的の一つは、相対的強度対サッカライド濃度の曲線の急峻な勾配を示す色素を作り出すことである。シンカイおよびノリルドは、溶液ベースの系において急峻な勾配を有するサッカライド色素を作成することが可能であることを証明した。しかしその後の研究により、これらの色素の固体基質への共有結合がこの勾配の実質的減少をおこすことが示された。その勾配の実質的喪失または削減を受けない固相共有結合サッカライド色素はこの分野ではいまだに開示されていない。
【００１５】
シンカイおよびノリルドの研究を固相構造にまで広げようと試みた研究者もいたが、直接血液接触法、または血液が体外を循環するｅｘ−ｖｉｖｏアプローチに使用できる系を作ることはできなかったWO 01/74968 A2およびWO 01/20334 A1。その研究は間質性流体腔のサッカライドを測定するために患者の皮膚下に挿入するシンカイ型とされる固相サッカライド色素の使用に焦点を置いている。米国特許第６，００２，９５４号および第６，０１１，９８４号も参照されたい。
【００１６】
当分野においては高いグルコース特異性を有するサッカライド色素が必要である。概念的には、このような高い特異性のグルコースセンサーは改善された蛍光特性を示す。固体基質への共有結合によって固定された際にそのような特異性と蛍光特性とを保持する色素も当業者には必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は固相サッカライド色素およびその製法を提供する。本発明はさらにこれらの色素を組み込んだ装置を提供する。これらの装置には、流体中のサッカライド濃度を検出およびモニターする本発明の固相色素を組み込んだ液体導管が含まれる。典型的な流体としては血液、血液フラクション、血漿、尿およびその他の生物学的流体または生物学的成分の抽出物があげられる。
【００１８】
本発明の目的において、用語“サッカライド色素”はサッカライドに可逆的に結合する分子であって、その分子はサッカライドとの結合および／またはサッカライドの遊離に関して識別し得る生理化学的変化を示すような分子を言う。好ましい実施形態において、前記生理化学的変化は蛍光、燐光、比色法などの分光法によって容易に確認できる。したがって生理化学変化はシグナル分子またはシグナル部分、例えばフルオロフォアまたは燐光性種の変化によってモニターできる。
【００１９】
用語“固相サッカライド色素”は固体基質または固相物質に共有結合するサッカライド色素を意味する。代表的基質は天然または合成有機ポリマー、およびセラミックスおよびガラスなどの無機物質である。
【００２０】
生体適合性であることが知られているポリマー類が好ましい。生体適合性であることが一般に知られているポリマーは、セルロース（例えばクプロファン（Ｃｕｐｒｏｐｈａｎ））、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリシロキサン、ナイロン（例えばビオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ））、およびそれらの共重合体などである。特に好ましいのは高度に生体適合性であることが知られているポリマー類、例えばセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリビニルアルコールなどである。
【００２１】
グルコースセンサー上の官能化炭化水素リンカーアームとの共有結合を容易にする使用できる官能基を有するポリマーも好ましい。ポリマー基質上の好ましい官能基はヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、ケトン、アミン、アミドおよびシアノである。
【００２２】
サッカライド色素が共有結合する固相はフィルム、シート、ペレット、フレーク、顆粒、微粒子、ミクロスフェアなど多くの異なる形に作ることができる。固相の好ましい物理的形およびサイズは目的の生成物に大きく依存する。
【００２３】
一実施形態において、サッカライド色素は固体基質上に固定される。上記固体基質を被検流体と接触させる。上記流体はガス、蒸気または液体でよい。流体との接触は流体床、カラム、または導管など任意の一般的手段によって行われる。上記流体は血液、血液フラクション、血漿、尿などの液体であるのが好ましい。流体が固体基質上のサッカライド色素に接触すると、色素は被検体、例えばグルコースの存在または不在、および好ましくはその量をシグナル化する。そのシグナルは比色法または分光法によって検出できる。そのシグナルを一般的機器に供給し、実時間読み取りによって、または累積結果をチャート、表またはグラフとして記録、表示することができる。
【００２４】
また別の実施形態において、製品は血液中のサッカライド濃度、特にグルコース濃度をモニターするための導管である。サッカライド色素はポリマー基質上に固定される。ポリマー基質は導管に組み込まれ、その際サッカライド色素がその導管を流れる流体と接触するようにする。導管はｅｘ−ｖｉｖｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏで血液またはその他の幾つかの生物学的流体のｉｎ−ｌｉｎｅ流路に組み込まれる。色素を走査またはモニターし、血液またはその他の生物学的流体中の被検体の濃度を検出する。
【００２５】
好ましい実施形態において、サッカライド色素は芳香族多環式フルオロフォアを含む。アントラセンが特に好ましい。その色素は図２に示す様態で窒素、ピリジンまたはフルオロフォアの芳香環を介して、固相に結合できる。
【００２６】
色素の蛍光特性、例えば励起および発光波長はフルオロフォアに依存し、特に芳香環の配列および芳香環上の置換に依存する。芳香族共役二重結合系の伸長、またはハロゲン、アシル、アルキルオキシ、ニトロ、カルボン酸、またはカルボン酸エステルの前記環への挿入は色素の蛍光特性を改善し、赤色シフトまたはストークシフトを起こすことができる。例えば、我々の結果から、シンカイ型色素のフルオロフォアとしてピレンを使用し、またはシンカイ型色素のアントラセンをアセチル置換すると、元のシンカイ色素、または溶解性シンカイ色素より強い蛍光（相対的強度）が得られることが判明した。これらの改善によりセンサー性能の感度および精度は高まる。
【００２７】
より詳細に述べると、ここに記載する操作は、前記共役色素の励起−発光差が約４０ｎｍ以上である固相サッカライド色素を与える。ここに使用する用語“共役色素”とは、色素のサッカライド結合部分が、あるサッカライドによって占有され、シグナルを発生する、というようなサッカライド色素を意味する。蛍光色素の場合、共役色素は蛍光を発生し、サッカライドの存在を示す。本発明の好ましい固相サッカライド色素はサッカライドと共役すると約４５ｎｍ以上の励起−発光差を有する。本発明の特に好ましい固相サッカライド色素は共役すると約７０ｎｍ以上の励起−発光差を有する。
【００２８】
その上、本発明の固相サッカライド色素はサッカライド結合で蛍光を増強した。好ましい実施形態は生理的範囲を横切って約１．５以上の相対的強度を有する。本発明の目的のためには、グルコースの生理的範囲は血液、血液フラクションまたは血漿１ｄｌあたり約５０ないし約５００ｍｇである。より好ましい実施形態はグルコースの生理的範囲を横切って約２．０以上の相対的強度を示すことができる。
【００２９】
図２により、モノ（ベンゼンボロン酸）およびビス（ベンゼンボロン酸）は両方共、基質上に固定できる有用なサッカライド検出分子である。その分子のサッカライド結合およびシグナル部分はリンカーアームによって固相に結合する。上記リンカーアームおよび非リンカー置換基は官能化され得る飽和または不飽和炭化水素である。上記炭化水素は枝分かれ鎖でも直鎖でもよく、その長さは非常に広範囲に変動する。鎖の長さは約Ｃ３０以下であるのが好ましい。官能基は固相と色素との共有結合のために保持または保護されている。或いは、他の官能基を用いて、両者が共有結合する前に固相および／または色素を誘導体化することができる。
【００３０】
リンカーアームおよび非リンカー置換基は炭化水素鎖としてここに記載されるとはいえ、この用語はここに使用されるように官能化炭化水素類を含み、少なくともアルキル、アルケニル、アルキニル、アルデヒド類、ケトン類、エーテル類、エステル類、アミン類、アミド類、カルボキシル、ハロ、アリール、アシルなどの部分を含む。種々の官能基が炭化水素リンカーアーム内で組合わせて存在することができ、炭化水素鎖の内部またはその末端または末端付近に存在することもできる。本発明のリンカーアームおよび非リンカー炭化水素は直鎖アルキル基でもよいし、炭化水素鎖の種々の部位で官能化されまたは枝分かれしていてもよい。
【００３１】
リンカーアームの炭化水素がアルキル、アミン、アミド、ケトン、エーテル、エステルおよび／またはそれらの組み合わせであるのが好ましい。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態は式１であらわされる化合物を含む：
2006514680.tif 000002
式１
【００３３】
式１により、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つ以上が固相に共有結合するためのリンカーアームであり；残りの基は水素、および種々の官能基でさらに活性化される飽和および不飽和炭化水素から選択される非リンカー置換基である。非リンカー置換基Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の炭化水素鎖の長さも変動し得るが、これもまた約Ｃ３０以下であるのが好ましい。
【００３４】
置換基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、置換アルキル、アシル、アルキルオキシ、およびハロゲンからなる群から選択される。置換基Ｒ４とＲ５、およびＲ６とＲ７は一緒になって縮合芳香環、例えばナフタレン、アントラセンなどを形成することができる。好ましい実施形態において、ビス−ボロン酸化合物はＱの周囲に対称性であり、芳香環または融合多環式芳香環を構成する。
【００３５】
Ｑはサッカライド結合および／または遊離をモニターするための検出可能のシグナルを与えるシグナリング部分である。好ましくはＱはフルオロフォア、燐光発生部分、比色部分または発光部分である。
【００３６】
Ｑは融合多環式芳香族フルオロフォアであるのが好ましい。好ましい例は図３に示すようにナフタレン、アントラセン、ピレン、１，２−ベンズアントラセン、および２，３−ベンズアントラセンである。いずれの環も１つ以上の官能基で置換できる。好ましい一実施形態において、Ｑはアセチル化アントラセンを有するフルオロフォア種である。
【００３７】
本発明のその他の実施形態を図２に示す。ここでリンカーアームの１つ以上が−Ｘ−Ｙ、−Ｘ−Ｏ−Ｙ、−Ｘ−ＮＨ−Ｙ、−Ｘ−Ｎ＝Ｙ、−Ｘ−ＮＲ−Ｙ、Ｘ−ＣＯ−Ｙ、−Ｘ−ＣＯＯ−Ｙ、−Ｘ−ＯＣＯ−Ｙ、−Ｘ−ＮＨＣＯ−Ｙ、−Ｘ−ＣＯＮＨ−Ｙ、−Ｘ−Ｎ＝Ｃ（Ｏ−Ｙ）２、−Ｘ−ＮＨＣＨ（ＮＨ２）−Ｏ−Ｙ、−Ｘ−Ｓ−Ｙ、−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ、−Ｘ−ＳＯ２ＮＨ−Ｙおよび−Ｘ−ＮＨＳＯ２−Ｙからなる群から選択される；上記中、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルまたはアシルであり、Ｘは飽和または不飽和炭化水素鎖であり；Ｙは、セルロース、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエーテルスルホンなどの生体適合性ポリマーから形成される固相である。
【００３８】
好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は種々の長さの炭化水素から形成される上記のリンカーアームである。これら２本のリンカーアームは、合成しやすいように同じであることが多いが、同じでも異なっていてもよい。
【００３９】
中間段階において、すなわち色素化合物を固体支持体に共有結合させる前に、上記色素化合物を少なくとも１つの官能基、例えばカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、シアノまたはハロゲン置換基を含むように改変し、固相への共有結合を容易にする。或いはリンカーアームを先ず最初に固相または色素化合物に結合してもよい。或いは色素化合物および固相の両方を、その両者間のどこかで形成される共有結合で誘導体化することができる。
【００４０】
同様に、その他の好ましい実施形態として、Ｒ３が一端はＱに、他端は固体支持体に共有結合する単一リンカーアームであるというものも挙げられる。さもなくば前記のように、Ｒ３リンカーは官能化できる飽和または不飽和炭化水素鎖であるのが好ましい。前記のように、炭化水素鎖の長さは非常に広範囲に変動し得るが、約Ｃ３０以下であるのが好ましい。炭化水素は直鎖アルキル基でもよく、或いは上記炭化水素鎖に沿った種々の部位において官能化され、または分岐していてもよい。前記のようにリンカーアームはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、シアノまたはハロゲン置換基によって官能化され、固相物質に共有結合できるのが好ましい。
【００４１】
Ｒ３リンカーアームは分子のフルオロフォア、発色団または燐光発生部分の種々の部位に共有結合できる。それがボロン酸置換基をほとんど妨害しない位置にあるのが好ましい。
【００４２】
Ｒ３が単一リンカーアームである場合、Ｒ１およびＲ２は低級アルキル置換基であるのが好ましい。ここに使用する用語“低級アルキル”とはＣ１−１２を意味する。
【００４３】
本発明の実施形態は式１の化合物を含む。式中、Ｑはフルオロフォア、クロモフォア、または燐光発生部分または発光部分である；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立的に、リンカーアームおよび非リンカー置換基からなる群から選択される；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は同じかまたは異なり、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、置換アルキル、アシル、アルキルオキシ、およびハロゲンからなる群から選択される。置換基Ｒ４とＲ５、およびＲ６とＲ７はそれぞれ一緒に、ナフタレン、アントラセンなどの縮合芳香環を形成することができる。上記のようにリンカーアームは、その他の官能基で誘導体化できる飽和または不飽和炭化水素であり、約Ｃ３０以下の長さであり、固相物質に共有結合する。非リンキング置換基は、水素または、任意にその他の官能基でさらに誘導体化された約Ｃ２０以下の飽和または不飽和炭化水素である。
【００４４】
生体適合性ポリマーはホモポリマーでもよく、または２種類以上のポリマーからなるコポリマーでもよい。色素は既存のポリマーに共有結合することができ、または反応性モノマーと、色素の１本以上のリンカーアーム上の官能基との反応によって色素−ポリマー複合体を形成することができる。
【００４５】
固定された固相色素を種々のセンサー生成物、例えば容器、導管または基板に組み入れることができる。上記固相色素を一般的な機械的または化学的手段で製品に固定することができる。例えばハウジング、容器、導管などを構成し、それを通過して被検流体が流れる、金属、ガラスまたはポリマー部分などの構造材料に上記固相色素複合体の重合固相部分を固定することができる。材料の選択によって、これらの部分は接着、融合、同時押出し、注型、成形することができ、またはそれ以外にスナップ、ねじ、スライド取り付けなどの機械的手段によって組み合わせることができる。
【００４６】
さらに、本発明は、上記固相物質を全体的な構成部品からなる製品またはその製品の一構成部品に組立てる前または加工後に、上記色素を上記固相物質に共有結合することができるという点で有用である。
【００４７】
センサーの保存法に関連して、上記センサーに接触する溶液は少なくとも１つのポリオールを含むことができる。ポリオール含有溶液を使用して、滅菌および保存中、センサー装置を保護することができる。
【００４８】
実施例
１．シンカイ・モノ−フェニルボロネート／単一アーム型
【００４９】
ＰＺ−３３と命名される色素、その合成、およびそれをクプロファン基質に固定する手段が図４に示される。
【００５０】
ＰＺ−３３はベンゼン部分とアントラセン部分との間の窒素架橋に結合したリンカーアームを有するように作られる。この溶解性色素は生理的範囲のサッカライドを検知するが、ｐＨおよびイオン強度に若干敏感である。この色素は固相型でも溶解型でも、滅菌、高湿度および高温にさらされた際の安定性が限られる。
【００５１】
リンカーアームによって再生セルロースフィルム（クプロファン）に結合した際、この色素はサッカライド感受性を保持する。しかしその勾配は溶液中の対応分子の勾配に比べて小さい。グルコースと結合するための時間的反応は非常に速く、１分間未満であるが、遊離は非常に遅い。貯蔵寿命および滅菌力に対する感度は溶解性分子と類似しているようにみえる。
【００５２】
ピレン・フルオロフォアを有する類似の化合物（Ｇ４７）も合成した。単一スペーサまたはリンカーアームを有する色素（Ｇ４７）を合成し、その後再生セルロースフィルム（クプロファン）に固定した。図５。生成したセンサーに関するグルコース反応曲線を図６に示す。
２．シンカイ・ビス−フェニルボロネート／二重アーム型
【００５３】
これらの色素はベンゼン部分とアントラセン部分との間の窒素架橋に結合した２本のリンカーアームを含むように作られる。図７。
【００５４】
アミノ−末端アームを有する色素はハロメチルアントラセン、フェニルボロン酸、およびリンカーアーム部分としてのモノ保護アルキルジアミンから合成される。カルボキシル末端アームを有する色素はリンカーアームとしてアミノ酸ｔ−ブチルエステルを用いて合成される。
【００５５】
これらの色素のグルコース反応はシンカイ・モノ−フェニルボロネート単一アーム型色素に比べて著しく改善される。これらの色素の固定は図８〜図１０に示される。
【００５６】
これらセンサーの幾つかのグルコース反応曲線はモノ−フェニルボロネート／単一アーム型より良かった。図１１。
【００５７】
固相は再生セルロースに限られない。例えばビス−フェニルボロネート／二重アーム型色素は共有結合によってウルトラバインド（Ｕｌｔｒａｂｉｎｄ）（商標）またはビオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）（商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）などの活性化ナイロン膜に効果的に固定される。図１２。これらの固定されたサッカライドセンサー膜は良好なグルコース反応を示す。
【００５８】
色素と固相との距離は異なる長さのスペーサを使用することによって調節できる。この距離は、固相上における色素とサッカライドとの反応に影響を与える。スペーサとしてのポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）の使用を図１３に示す。
【００５９】
上記色素を図１４に示すようにポリマーに組み入れることができる。イソシアネート末端ＰＰＧを色素で標識化し、それからエチレンジアミンによって架橋し、最後に色素固定ポリマーが形成された。
【００６０】
別の方法として、アミノ末端ＰＰＧをイソシアネート末端クロスリンカーによって架橋し、色素で標識化し、その後エチレンジアミン添加によってその反応を停止した。この後者の方法の一つの利点は、固相を任意の形または型に成形できることである。生成した色素−ポリマー複合体はフィルム、膜、または付形粒子に形造ることができ、または注入または塗り付けによってセンサーウェルまたはファイバーチップに適用できる。この方法によって形成された色素−ポリマー複合体は良好なグルコース反応を有する。図１５。
【００６１】
３．シンカイ・ビス−フェニルボロネート／単一アーム型
【００６２】
この種の色素はビス−フェニルボロネート色素の単一アーム結合を有する。この色素はフルオロフォアの芳香環に直接共有結合した１本のリンカーアームを有する。一実施形態において、上記色素には使用できるカルボキシル基があり、それによって共有結合固定することができる。アントラセンカルボン酸はアセチルアントラセンから誘導された。この色素のカルボキシル基はカルボジイミドを用いる縮合反応によってアミノ活性化固相に結合した。図１６。この単一アームフルオロフォア結合センサーは膜に固定され、図１７に示すような好ましい蛍光特性を示した。膜上に固定された単一アームフルオロフォア結合センサーのグルコース反応曲線を図１８に示す。
【００６３】
４．蛍光曲線の改善
【００６４】
アントラセンフルオロフォア上のアシル基の導入は、固体色素の蛍光特性を改善した。フリーデル−クラフト反応によってアセチル基を置換アントラセンに付加した。これに続く工程によって上記と同じ方法で、２本のアミノ末端アームを有するビス−フェニルボロネート型色素が生成した。アミノ末端リンカーアームを介するクプロファンへの固定は、シアノゲン−ブロミド活性化法によって行われた。図１９。
【００６５】
生成した固定センサーはアセチル基のない対応するセンサーより良い蛍光特性を有した。励起および発光ピークはより長波長の方にシフトし、より大きいストークスシフトを示した。現在市販されているＬＥＤ、光学フィルター類、または光検出器の特性を考慮すると、約５００ｎｍの発光ピークおよび約４００ｎｍ未満の励起ピークを有する固定されたセンサー化合物は光学的検出系に適している。図２０。
【００６６】
このセンサーは血液の生理的範囲にわたって良好なグルコース曲線も与えた。図２１。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１Ａは、シンカイ色素の構造を示す図であり、図１Ｂはノリルド色素である。
【図２】図２Ａは、固定されたシンカイ型色素の構造を示し、図２Ｂは固定されたノリルド型色素である。
【図３】図３は、本発明の化合物に有用な種々のフルオロフォアの構造を示す図である。
【図４】図４は、本発明のアントラセン含有シンカイ型モノフェニルボロネート化合物の合成概略図およびそれを固相に固定する方法を示す図である。
【図５】図５は、１本のリンカーアームを有する本発明のピレン含有シンカイ型モノフェニルボロネート化合物の合成概略図である。
【図６】図６は、図５に示すように合成、固定された化合物のグルコース反応曲線である。
【図７】図７は、ビス−フェニルボロネートアントラセン含有シンカイ型色素を作成、固定するための合成概略図である。
【図８】図８は、ビス−フェニルボロネートアントラセン含有シンカイ型色素を固定するための合成概略図である。
【図９】図９は、ビス−フェニルボロネートアントラセン含有シンカイ型色素を固定するための合成概略図である。
【図１０】図１０は、ビス−フェニルボロネートアントラセン含有シンカイ型色素を固定するための合成概略図である。
【図１１】図１１は、数種のビス−フェニルボロネートアントラセン含有シンカイ型色素の相対的強度を示す曲線である。
【図１２】図１２は、アミノ末端リンカーアーム前駆体を有するビス−フェニルボロネートアントラセン含有シンカイ型色素をナイロン固相物質と反応させて固定するための模式図である。
【図１３】図１３は、ビス−フェニルボロネートシンカイ型色素を、ポリプロピレングリコールスペーサを有する固相物質上に、前記色素と前記スペーサとの結合によって固定する合成概略図である。
【図１４】図１４は、アミノ末端リンカーアーム前駆体を有するシンカイ型色素をジ−ＮＣＯ末端ポリプロピレングリコールと反応させ、その後エチレンジアミンで架橋することによって固定し、固相シンカイ型色素が生成することを示す図である。
【図１５】図１５は、ビス−フェニルボロネートシンカイ型色素を作り、そのフルオロフォアに直接共有結合する単一リンカーアームで固相物質に固定する概略図を示す。
【図１６】図１６は、図１５の単一アームフルオロフォアセンサーの蛍光特性を示す。
【図１７】図１７は、図１５の単一アームフルオロフォアのグルコース反応曲線を示す。
【図１８】図１８は、二重アーム固定およびアセチル化フルオロフォアを有するビス−フェニルボロネートシンカイ型色素の合成および固定の概略図を示す。
【図１９】図１９は、図１８の色素の蛍光特性を示す。
【図２０】図２０は、図１８の色素のグルコース反応曲線を示す。
【図１】
2006514680.tif 000012
【図２】
2006514680.tif 000013
【図３】
2006514680.tif 000014
【図４】
2006514680.tif 000015
【図５】
2006514680.tif 000016
【図６】
2006514680.tif 000017
【図７】
2006514680.tif 000018
【図８】
2006514680.tif 000019
【図９】
2006514680.tif 000020
【図１０】
2006514680.tif 000021
【図１１】
2006514680.tif 000022
【図１２】
2006514680.tif 000023
【図１３】
2006514680.tif 000024
【図１４】
2006514680.tif 000025
【図１５】
2006514680.tif 000026
【図１６】
2006514680.tif 000027
【図１７】
2006514680.tif 000028
【図１８】
2006514680.tif 000029
【図１９】
2006514680.tif 000030
【図２０】
2006514680.tif 000031
【図２１】
2006514680.tif 000032
【国際調査報告】
2006514680.tif 000033