(57)【要約】本発明は、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体、例えば置換体活性化配列を有するそれらを提供する。修飾されたヘプシン分子は、置換体活性化配列で切断され、それにより、天然に存在する野生型ヘプシン分子の機能的活性を示す、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を生成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換体活性化配列を含んで成る、単離され、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体。
【請求項２】
前記置換体活性化配列が、図17の野生型活性化配列RIVGGを置換する請求項１記載の単離された分子。
【請求項３】
前記置換体活性化配列が、図18に示されるようなDDDDKIVGGである請求項１記載の単離された分子。
【請求項４】
図18に示されるようなアミノ酸配列を有する請求項１記載の単離された分子。
【請求項５】
前記置換体活性化配列が、配列番号１〜４のいずれか１つである請求項１記載の単離された分子。
【請求項６】
前記置換体活性化配列が、プロテアーゼにより認識され、そして切断される請求項１記載の単離された分子。
【請求項７】
前記置換体活性化配列が、セリンプロテアーゼにより認識され、そして切断される請求項１記載の単離された分子。
【請求項８】
前記置換体活性化配列が、タイプIIトランスメンブランプロテアーゼにより認識され、そして切断される請求項１記載の単離された分子。
【請求項９】
前記置換体活性化配列が、エンテロキナーゼにより認識され、そして切断されるDDDDK-IVGG（配列番号３）である請求項１記載の単離された分子。
【請求項１０】
前記置換体活性化配列が、トロンビン、第Xa凝固因子、フリン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、アエロシン、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（HAT）、肥満細胞トリプターゼ、MBL−結合セリンプロテアーゼ（MASP-1及びMASP-2）、コリン、MT-SP1/マトリプターゼ、TMPRSS2又はスタブル−スタブロイド（Stubble-stubboid）により認識され、そして切断される請求項１記載の単離された分子。
【請求項１１】
シグナルペプチド配列をさらに含んで成る請求項１記載の単離された分子。
【請求項１２】
前記シグナルペプチド配列が、細菌、菌類、昆虫、植物又は動物である請求項11記載の単離された分子。
【請求項１３】
前記シグナルペプチドが、IgKシグナル配列である請求項11記載の単離された分子。
【請求項１４】
エピトープ標識をさらに含んで成る請求項１記載の単離された分子。
【請求項１５】
前記エピトープ標識が、アミノ酸標識である請求項14記載の単離された分子。
【請求項１６】
前記エピトープ標識が、ヒスチジン又はシステインである請求項14記載の単離された分子。
【請求項１７】
前記エピトープ標識が、V5又はフラッグである請求項14記載の単離された分子。
【請求項１８】
原核生物又は真核生成物源からである請求項１記載の単離された分子。
【請求項１９】
前記真核生物が哺乳類である請求項18記載の単離された分子。
【請求項２０】
前記哺乳類が、ウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、魚類、羊、昆虫、サル又はヒト動物である請求項19記載の単離された分子。
【請求項２１】
プロテアーゼにより切断された置換体活性化配列を含んで成る、活性化され、修飾されたヘプシン分子。
【請求項２２】
サンプルにおけるヘプシン切断活性を検出するための方法であって、請求項21記載の機能的活性ヘプシン分子と基質とを、前記機能的活性ヘプシン分子が前記基質を切断する条件下で接触せしめ、そして前記基質切断生成物を検出し、それにより、ヘプシン切断活性を示すことを含んで成る方法。
【請求項２３】
前記基質が、色原性又は蛍光原性基質である請求22記載の方法。
【請求項２４】
前記基質が、N-ベンゾイル-Leu-Ser-Arg-pNA. HCl, N-ベンゾイル-Ile-Glu-Phe-Ser-Arg-pNA. HCI, 又は N-ベンゾイル-Phe-Val-Arg-pNA. HCIである請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記置換体活性化配列が切断され、それにより、修飾され、活性化されたヘプシン分子を生成する請求項１記載の単離され、修飾されたヘプシン分子。
【請求項２６】
請求項１又は25記載の修飾されたヘプシン分子をコードする単離された核酸分子。
【請求項２７】
請求項26記載の核酸分子に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る相補的核酸分子。
【請求項２８】
DNA又はRNAである請求項25記載の核酸分子。
【請求項２９】
ペプチド核酸分子（PNA）である請求項26記載の核酸分子。
【請求項３０】
ホスホロチオエート誘導体分子である請求項26記載の核酸分子。
【請求項３１】
放射性ラベル、酵素、発色団及び蛍光体から成る群から選択された化合物により検出できるシグナルを直接的に又は間接的に生成するためにラベルされる請求項26記載の核酸分子。
【請求項３２】
請求項26記載の核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、BAC, YAC, PAC又はファゲミドである請求項32記載のベクター。
【請求項３４】
適切な宿主細胞に請求項32記載のベクターを含んで成る宿主ベクターシステム。
【請求項３５】
前記適切な宿主細胞が、原核又は真核細胞である請求項34記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３６】
前記原核細胞が、細菌細胞である請求項35記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３７】
前記真核細胞が、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞である請求項35記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３８】
前記昆虫細胞がSf21である請求項37記載の宿主ベクターシステム。
【請求項３９】
図９, 10又は11に示されるようなDNA配列。
【請求項４０】
修飾されたヘプシン分子をコードする核酸分子のサンプルにおける存在を検出するための方法であって、前記サンプルと、請求項26記載の核酸分子とを接触せしめ、そして前記核酸分子と前記サンプルにおける構成成分との間で、又は前記相補的核酸分子と前記サンプルにおける構成成分との間で形成される複合体を検出することを含んで成り、ここで前記複合体がサンプルにおける修飾されたヘプシン分子をコードする核酸分子の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項４１】
前記構成成分が、RNA又はcDNA分子である請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルが、組織、細胞又は生物学的流体である請求項40記載の方法。
【請求項４３】
前記生物学的流体が、尿、血清又は粘液質である請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣である請求項42記載の方法。
【請求項４５】
対象において免疫応答を誘発するための方法であって、請求項１記載の修飾されたヘプシン分子を前記対象に投与することを含んで成る方法。
【請求項４６】
請求項１記載の修飾されたヘプシン分子を対象に投与することを含んで成る、抗体の生成方法。
【請求項４７】
前記対象が、ヘプシンノックアウトマウスである請求項46記載の方法。
【請求項４８】
修飾されたヘプシン分子を結合する、抗体、又はそのフラグメント又は誘導体。
【請求項４９】
請求項48記載の抗体のFab, F(ab’)2又はFvフラグメント。
【請求項５０】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である請求項48記載の抗体。
【請求項５１】
請求項48記載の抗体の抗原−結合領域を含んで成る組み換えタンパク質。
【請求項５２】
請求項48記載の抗体により結合されるエピトープと同じエピトープへの結合のために競争する抗体。
【請求項５３】
キメラ抗体である請求項48記載の抗体。
【請求項５４】
前記キメラ抗体が、ヒト領域及びネズミ領域を含んで成る請求項53記載の抗体。
【請求項５５】
ヒト型化抗体である請求項48記載の抗体。
【請求項５６】
中和抗体である請求項48記載の抗体。
【請求項５７】
請求項１記載の修飾されたヘプシン分子のイディオタイプ抗体。
【請求項５８】
治療剤に連結される請求項48記載の抗体を含んで成る免疫接合体。
【請求項５９】
前記治療剤が細胞毒性である請求項58記載の免疫接合体。
【請求項６０】
前記細胞毒性剤が、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシン、アクチノマイシンD、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素（PE）A、PE40、アブリン、グルココルチコイド及び放射性同位体から成る群から選択される請求項59記載の免疫接合体。
【請求項６１】
請求項48記載の抗体を生成するハイブリドーマ。
【請求項６２】
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託され、そしてATCC PTA-4561と命名されたハイブリドーマ。
【請求項６３】
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託され、そしてATCCと命名されたハイブリドーマ。
【請求項６４】
請求項61記載のハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗体。
【請求項６５】
請求項48記載の抗体及び適切なキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
【請求項６６】
請求項１記載の分子及び適切なキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
【請求項６７】
前記適切なキャリヤーが、リン酸緩衝溶液、水、エマルジョン、油/水エマルジョン、湿潤剤、無菌溶液、賦形剤、澱粉、ミルク、糖、クレー、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸の塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、植物脂肪又は油、ガム及びグリコールから成る群から選択される請求項65又は66記載の医薬組成物。
【請求項６８】
リポソーム、ポリマー組成物、又はポリマー微小球として配合される請求項65又は66記載の医薬組成物。
【請求項６９】
錠剤、被覆された錠剤又はカプセルとして配合される請求項65又は66記載の医薬組成物。
【請求項７０】
ヘプシン分子を結合するために請求項48記載の抗体とサンプルとを接触せしめることを含んで成る、ヘプシン分子を結合するための方法。
【請求項７１】
サンプルと請求項48記載の抗体とを接触せしめ、そしてサンプルにおけるヘプシン分子と前記抗体との結合を検出することを含んで成る、ヘプシン分子の検出方法。
【請求項７２】
前記検出が、複合体が前記ヘプシン分子と前記抗体との間で形成されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記複合体がサンプルにおけるヘプシン分子の存在を示す請求項71記載の方法。
【請求項７３】
対象におけるヘプシン分子の存在を検出するための方法であって、請求項48記載の抗体を前記対象に投与し、そして前記対象におけるヘプシン分子と前記抗体との結合を検出することを含んで成る方法。
【請求項７４】
前記検出が、複合体が前記ヘプシン分子と前記抗体との間で形成されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記複合体が対象におけるヘプシン分子の存在を示す請求項73記載の方法。
【請求項７５】
対象においてヘプシンを発現する癌の診断方法であって、前記対象からのサンプルにおけるヘプシン分子の量を、請求項48記載の抗体を用いて定量的に決定し、そして正常対象からのサンプルにおけるヘプシン分子の量を比較することを含んで成り、前記対象からのサンプルと前記正常対象からのサンプルとの間のヘプシン分子の計量できるほどの異なった量が前記対象においてヘプシンを発現する癌の存在を示唆することを特徴とする方法。
【請求項７６】
対象においてヘプシン分子を発現する癌の予後の測定方法であって、前記対象からのサンプルにおけるヘプシン分子の量を、請求項48記載の抗体を用いて定量的に決定し、そして正常対象からのサンプルにおけるヘプシン分子の量を比較することを含んで成り、前記対象からのサンプルと前記正常対象からのサンプルとの間のヘプシン分子の計量できるほどの異なった量が前記対象においてヘプシンを発現する癌の予後を示唆することを特徴とする方法。
【請求項７７】
対象においてヘプシン分子を発現する癌の経路をモニターするための方法であって、請求項48記載の抗体を用いて、前記対象からの第１サンプルにおけるヘプシン分子の量を定量的に決定し、そしてそのようにして、決定された量と、前記対象からの第２サンプルに存在するヘプシン分子の量とを比較することを含んで成り、ここで前記第１及び第２サンプルが異なった時点で対象から得られ、第１及び第２サンプルにおけるヘプシン分子の量の差異が、前記対象においてヘプシン分子を発現する癌の経路の表示であることを特徴とする方法。
【請求項７８】
ヘプシン分子を発現する細胞の増殖を阻害するための方法であって、前記細胞の増殖を阻害するために、請求項48記載の抗体と前記細胞とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項７９】
ヘプシンを発現する細胞の殺害方法であって、前記細胞を殺害するために、請求項48記載の抗体と前記細胞とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項８０】
ヘプシンを発現する癌細胞の転移を阻害するための方法であって、前記癌細胞と、請求項48記載の抗体とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項８１】
ヘプシンを発現する癌細胞の脈管形成を阻害するための方法であって、前記癌細胞と、請求項48記載の抗体とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項８２】
前記細胞が、前立腺、前立腺癌、前立腺癌の転移、肝臓、肝臓癌、肝臓癌の転移、腎臓、腎臓癌、腎臓癌の転移、膵臓、膵臓癌、膵臓癌の転移、胃、胃癌、胃癌の転移、甲状腺、甲状腺癌、甲状腺癌の転移、精巣、精巣癌、精巣癌の転移、卵巣、卵巣癌、又は卵巣癌の転移からである請求項78又は79記載の方法。
【請求項８３】
内因性ヘプシンを認識する抗体の生成方法であって、対象に修飾されたヘプシン分子を投与し、そして抗体を生成することを含んで成る方法。
【請求項８４】
請求項１記載の分子を含んで成るワクチン。
【請求項８５】
請求項26記載の核酸分子を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体、例えば置換体活性化配列を有するそれらに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景：
ヘプシンは、相同性に基づくクローニング方法を用いて、ヒト肝癌HepG2細胞ライブラリーから最初に同定されたトランスメンブランセリンプロテアーゼである（Leytus, S. P. , K. R. Loeb, F. S. Hagen, K. Kurachi, 及び E. W. Davie. 1988. A novel trypsin-like serine protease (hepsin) with a putative transmembrane domain expressed by human liver and hepatoma cells. Biochemistry, 27 (3): 1067-74）。ほとんどのトリプシン様セリンプロテアーゼのように、野生型ヘプシンは、チモーゲンとして合成される。ヘプシンcDNAは、417個のアミノ酸ポリペプチドをコードする。そのアミノ末端で、ヘプシンは、細胞質ドメイン及び内在性トランスメンブランドメインを含む。ヘプシンの細胞外領域においては、カルボキシル末端で、マクロファージスカベンジャー受容体−様ドメイン及びトリプシン−様プロテアーゼドメインが存在する。
【０００３】
ヘプシンの全体的なトポロジーは、コリン（Yan, W. , N. Sheng, M. Seto, J. Morser, and Q. Wu. 1999. Corin, a mosaic transmembrane serine protease encoded by a novel cDNA from human heart. J Biol Chem. 274 (21): 14926-35; Yan, W. , F. Wu, J. Morser, and Q. Wu. 2000. Corin, a transmembrane cardiac serine protease, acts as a pro-atrial natriuretic peptide-converting enzyme. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 97 (15): 8525-9）、エンテロキナーゼ（Kitamoto, Y. , X. Yuan, Q. Wu, D. W. McCourt, and J. E. Sadler. 1994. Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortment of domains. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (16): 7588-92）、MT−SP１/マトリプターゼ（Takeuchi, T. , M. A. Shuman, and C. S. Craik. 1999. Reverse biochemistry: use of macromolecular protease inhibitors to dissect complex biological processes and identify a membrane-type serine protease in epithelial cancer and normal tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20): 11054-61 ; Lin, C. Y. , J. Anders, M. Johnson, Q. A. Sang, and R. B. Dickson. 1999. Molecular cloning of cDNA for matriptase, a matrix-degrading serine protease with trypsin-like activity. JBiol Chem. 274 (26): 18231-6）、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（Yamaoka, K. , K. Masuda, H. Ogawa, K. Takagi, N. Umemoto, and S.Yasuoka. 1998. Cloning and characterization of the cDNA for human airway trypsin-like protease. JBiol Che7n. 273 (19): 11895-901）、TMPRSS2（Paoloni-Giacobino, A. , H. Chen, M. C. Peitsch, C. Rossier, and S. E. Antonarakis. 1997. Cloning of the TMPRSS2 gene, which encodes a novel serine protease with transmembrane, LDLRA, and SRCR domains and maps to 21q22. 3. Genomics. 44 (3): 309-20）、及びスタブル−スタブロイド（Appel, L. F. , M. Prout, R. Abu- Shumays, A. Hammonds, J. C. Garbe, D. Fristrom, and J. Fristrom. 1993. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11): 4937-41）を包含する、トリプシンスーパーファミリーの他のタイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼ（Hooper, J. D. , J. A. Clements, J. P. Quigley, and T. M. Antalis. 2001. Type II transmembrane serine proteases. Insights into an emerging class of cell surface proteolytic enzymes. JBiol Chem. 276 (2): 857-60）のトポリジーに類似する。
【０００４】
生化学的研究は、活性化されたヘプシンが、塩基性残基、例えばアルギニン及びリシンの後のペプチド結合を切断する、トリプシン−様基質特異性を有する酵素であることを示す（Kurachi, K. , A. Torres-Rosado, and A. Tsuji. 1994. Hepsin. Methods Enzymol. 244: 100-14; Wu, Q. 2001. Gene targeting in hemostasis. Hepsin. Front Biosci. 6: D192-200）。組み換えヘプシンの発現及び特徴化は、タンパク質が約51kDaの見掛け分子質量を有する一本鎖分子として合成されることを示す。
【０００５】
トリプシン消化実験は、ヘプシンがタイプIIトランスメンブランタンパク質であることを確かめた（Kazama, Y. , T. Hamamoto, D. C. Foster, and W. Kisiel. 1995. Hepsin, a putative membrane-associated serine protease, activates human factor VII and initiates a pathway of blood coagulation on the cell surface leading to thrombin formation. J Biol Chem. 270 (1): 66-72; Tsuji, A. , A. Torres-Rosado, T. Arai, M. M. Le Beau, R. S. Lemons, S. H. Chou, and K. Kurachi. 1991. Hepsin, a cell membrane-associated protease. Characterization, tissue distribution, and gene localization. J Biol Chem. 266 (25): 16948-53）。
【０００６】
今日まで、ヘプシンの生理学的機能は解明されていない。インビトロ実験は、ヘプシンが血液凝固（Kazama, Y. , T. Hamamoto, D. C. Foster, and W. Kisiel. 1995. Hepsin, a putative membrane-associated serine protease, activates human factor VII and initiates a pathway of blood coagulation on the cell surface leading to thrombin formation. J Biol Chem. 270 (1): 66-72）、肝細胞増殖（Torres- Rosado, A., O. S. KS, A. Tsuji, S. H. Chou, and K. Kurachi. 1993. Hepsin, a putative cell- surface serine protease, is required for mammalian cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (15): 7181-5）、及び受精（Vu, T. K. H. , R. W. Liu, C. J. Haaksma, J. J. Tomasek, and E. W. Howard. 1997. Identification and cloning of the membrane-associated serine protease, hepsin, from mouse preimplantation embryos. J Biol Chem. 272 (50): 31315-20）において役割を演じることを示唆している。
【０００７】
しかしながら、２種の独立したノックアウト実験は、ヘプシン−欠失マウスが生存し、出産し、そして正常に成長したことを示した（Wu, Q. , D. Yu, J. Post, M. Halks-Miller, J. E. Sadler, and J. Morser. 1998. Generation and characterization of mice deficient in hepsin, a hepatic transmembrane serine protease. J Clin Invest. 101 (2): 321-6; Yu, I. S. , H. J. Chen, Y. S. Lee, P. H. Huang, S. R. Lin, T. W. Tsai, and S. W. Lin. 2000. Mice deficient in hepsin, a serine protease, exhibit normal embryogenesis and unchanged hepatocyte regeneration. Throb Haenaost. 84: 865-70）。止血又は肝臓機能の明白な欠陥は、ヘプシン−欠失マウスにおいて同定されなかった。それらの結果は、ヘプシンがマウスにおける胚成長、又は正常肝臓及び止血機能の維持のためには必須でないことを示す。
【０００８】
ヘプシンは、いくつかのヒト組織、例えば肝臓、腎臓及び前立腺において発現される（Kurachi, K. , A. Torres-Rosado, and A. Tsuji. 1994. Hepsin. Methods Enzymol. 244: 100-14; Wu, Q. 2001. Gene targeting in hemostasis. Hepsin. Front Biosci. 6: D192-200）。ヘプシンmRNAは、肝臓において最も多量に発現される。低レベルのヘプシンmRNA発現がまた、他の組織、例えば腎臓、甲状腺、膵臓、精巣及び前立腺においても検出された。
【０００９】
正常組織のおけるその発現の他に、ヘプシンmRNA発現はまた、いくつかのタイプの癌、例えば肝癌、卵巣癌及び腎臓癌にも報告されている（Torres- Rosado, A. , O'Shea, KS, A. , Tsuji, S. H. Shou, and K. Kurachi. 1993. Hepsin, a putative cell- surface serine protease, is required for mammalian cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (15): 7181-5; Leytus, S. P. , K. R. Loeb, F. S. Hagen, K. Kurachi, and E. W. Davie. 1988. A novel trypsin-like serine protease (hepsin) with a putative transmembrane domain expressed by human liver and hepatoma cells. Biochemistry. 27 (3): 1067-74; Tanimoto, H. , Y. Yan, J. Clarke, S. Korourian, K. Shigemasa, T. H. Parmley, G. P. Parham, and O. B. TJ. 1997. Hepsin, a cell surface serine protease identified in hepatoma cells, is overexpressed in ovarian cancer. Cancer Res. 57 (14): 2884-7; Zacharski, L. R. , D. L. Omstein, V. A. Memoli, S. M. Rousseau, and W. Kisiel. 1998. Expression of the factor VII activating protease, hepsin, in situ in renal cell carcinoma [letter]. Thromb Haemost. 79 (4): 876-7）。
【００１０】
最近、何人かの別々の研究者が、ヘプシンmRNAが、正常な前立腺組織又は良性前立腺過形成（BPH）におけるそのmRNAに比較して、進行した前立腺癌において高くアップレギュレートされていることを見出した（Luo, J. , D. J. Duggan, Y. Chen, J. Sauvageot, C. M. Ewing, M. L. Bittner, J. M. Trent, and W. B. Isaacs. 2001. Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia : molecular dissection by gene expression profiling. Cancer Res. 61 (12): 4683-8; Magee, J. A. , T. Araki, S. Patil, T. Ehrig, L. True, P. A. Humphrey, W. J. Catalona, M. A. Watson, and J. Milbrandt. 2001. Expression profiling reveals hepsin overexpression in prostate cancer. Cancer Res. 61: 5692-5696; Welsh, J. B. , L. M. Sapinoso, A. 1. Su, S. G. Kern, J. Wang-Rodriguez, C. A. Moskaluk, H. F. Frierson, and G. M. Hampton. 2001. Analysis of gene expression identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer. Cancer Res. 61: 5974-5978; Dhanasekaran, S. M. , T. R. Barrette, D. Ghosh, R. Shah, S. Varambally, K. Kurachi, K. J. Pienta, M. A. Rubin, and A. M. Chinnaiyan. 2001. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature. 412 (6849): 822-6; Stamey, T. A. , J. A. Warrington, M. C. Caldwell, Z. Chen, Z. Fan, M. Mahadevappa, J. E. McNeal, R. Nolley and Z. Zhang. 2001. Molecular genetic profiling of Gleason grade 4/5 prostate cancers compared to benign prostatic hyperplasia. J Urol. 166 (6): 2171-7; Ernst, T. , M. Hergenhahn, M. Kenzelmann, C. D. Cohen, M. Bonrouhi, A. Weninger, R. Klaren, E. F. Grone, M. Wiesel, C. Gudemann, J. Kuster, W. Schott, G. Staehler, M. Kretzler, M. Hollstein and H. J. Grone. 2002. Decrease and gain of gene expression are equally discriminatory markers for prostate carcinoma: a gene expression analysis on total and microdissected prostate tissue. Am J Pathol. 160 (6): 2169-80）。
【００１１】
それらの研究においては、9,900以上の遺伝子を包含するAffymetrixチップを用いて、ヘプシンmRNA発現が、正常な前立腺組織又はBPHにおいてよりも進行した前立腺癌組織において30〜42倍高いことが見出されている。ヘプシンmRNAの過剰発現は、患者の予後の測定と反比例すると思われる。
【００１２】
癌におけるヘプシンmRNA過剰発現の発見は、ヘプシンが腫瘍関連の脈管形成又は癌侵入及び転移に寄与することを示唆する。セリンプロテアーゼは、成長因子−様活性を有することが知られている。例えば、トロンビンは、血管線維芽細胞及び平滑筋細胞のための有能なマイトジェンである（Fenton, J. W. d. 1986. Thrombin. Ann N Y Acad Sci : 485: 5-15）。
【００１３】
さらに、いくつかの成長因子、例えば肝細胞成長因子（HGF）及び成長阻止−特異的遺伝子６（Gas6）の生成物が、血液凝固プロテアーゼと著しい配列及び構造類似性を共有する（Nakamura, T. , T. Nishizawa, M. Hagiya, T. Seki, M. Shimonishi, A. Sugimura, K. Tashiro, and S. Shimizu. 1989. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor. Nature, 342 (6248): 440-3; Manfioletti, G. , C. Brancolini, G. Avanzi, and C. Schneider. 1993. The protein encoded by a growth arrest- specific gene (gas6) is a new member of the vitamin K-dependent proteins related to protein S, a negative coregulator in the blood coagulation cascade. Mol Cell Biol. 13 (8): 4976-85）。
【００１４】
HGFは、いくつかの上皮器官、例えば肝臓及び胎盤の成長のために不可欠である（Schmidt, C. , F. Bladt, S. Goedecke, V. Brinkmann, W. Zschiesche, M. Sharpe, E. Gherardi, and C. Birchmeier. 1995. Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. Nature. 373 (6516): 699-702; Uehara, Y., O. Minowa, C. Mori, K. Shiota, J. Kuno, T. Noda, and N. Kitamura. 1995. Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature. 373 (6516): 702-5）。
【００１５】
セリンプロテアーゼのように、ヘプシンは、癌細胞の増殖を刺激する成長因子として作用することができる。実際、ヘプシンは、培養における肝細胞増殖のために必須であることが報告されている（Torres- Rosado, A., O. S. KS, A. Tsuji, S. H. Chou, and K. Kurachi. 1993. Hepsin, a putative cell- surface serine protease, is required for mammalian cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (15): 7181-5）。他方では、ヘプシンは、ペプチド成長ホルモンの活性化のためのプロセッシング酵素として作用することができる。
【００１６】
前−心房性ナトリウム排泄増加性ペプチドコンバーターゼとしてのコリンの最近の発見は、タイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼがペプチドホルモンの活性化において重要であることを示唆する（Yan, W. , N. Sheng, M. Seto, J. Morser, and Q. Wu. 1999. Corin, a mosaic transmembrane serine protease encoded by a novel cDNA from human heart. J Biol Chem. 274 (21): 14926-35; Yan, W. , F. Wu, J. Morser, and Q. Wu. 2000. Corin, a transmembrane cardiac serine protease, acts as a pro-atrial natriuretic peptide-converting enzyme. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 97 (15): 8525-9）。
【００１７】
さらに、ヘプシンはまた、そのタンパク質分解活性により直接的に、又は他のマトリックスメタロプロテナーゼの活性化により間接的に、細胞外マトリックスタンパク質の変性に寄与することができる。細胞外マトリックスタンパク質のタンパク質分解消化は、腫瘍進行及び転移における決定的な段階である（Mignatti, P. , and D. B. Rifkin. 1993. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. PhysiolRev. 73 (1) : 161-95）。
【００１８】
ヘプシンが実際、癌進行において決定的である場合、それは、次の理由のために薬物開発のための卓越した標的物を表す。第１に、ヘプシンはトリプシン−様セリンプロテアーゼである。トリプシン−様セリンプロテアーゼは、医薬的薬物標的である（Drews, J. , 2000, Drug Discovery: a historical perspective. Science 287: 1960-4）。第２に、ヘプシンは循環において治療剤に容易に接近できる細胞表面タンパク質である。第３に、ヘプシンの阻害は、ヘプシン−欠失マウスが生存し、受精でき、そして正常に成長するので、最少の副作用を有することが予測される。
【００１９】
天然に存在する、すなわち野生型ヘプシン分子は、まだ同定されていない活性トリプシン−様プロテアーゼにより、及び他のタイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼにより認識され、そして切断される活性化配列を包含する。従って、天然に存在するヘプシン分子のチモーゲン形は、他のプロテアーゼにより活性化される。さらに、活性化されると、天然に存在するヘプシン分子の活性化された形は、短時間生存し、抗−ヘプシン抗体の生成を困難にする。従って、安定したヘプシン分子について必要である。
【発明の開示】
【００２０】
要約：
本発明は、野生型ヘプシン活性化配列とは異なる置換された活性化配列を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体、及び安定した修飾されたヘプシン分子をコードし、発現し、そして使用するための方法を提供する。
１つの態様においては、修飾されたヘプシン分子は、野生型ヘプシン活性化配列とは異なる、置換された活性化配列を含んで成る、修飾されたヘプシンチモーゲン、又はそのフラグメント又は誘導体である。
【００２１】
さらに、もう１つの態様においては、修飾されたヘプシン分子は、活性化され、修飾されたヘプシン、又はそのフラグメント又は誘導体であり、ここで野生型ヘプシン活性化配列とは異なる、置換された活性化配列が、切断され、ヘプシンが活性化される。
本発明は、非ヘプシン分子に融合される、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を含んで成る融合分子を提供する。１つの態様において、非ヘプシン分子は、エピトープ標識又はレポーター分子である。本発明はさらに、修飾されたヘプシン融合分子をコードし、発現し、そして使用するための方法を提供する。
【００２２】
本発明は、第２の異なった源から単離されたヘプシン分子の一部に融合される、第１の源から単離されたヘプシン分子の一部を含んで成るキメラ分子を提供する。本発明はさらに、キメラヘプシン分子をコードし、発現し、そして使用するための方法を提供する。
本発明はまた、抗−ヘプシン抗体、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト融合された、ヒト、インターナリゼーション、中和、抗−イディオタイプ抗体、免疫学的活性を有する組み換えタンパク質、又は標的ポリペプチドを結合する免疫接合体も提供する。本発明はさらに、抗−ヘプシン抗体の生成及び使用方法を提供する。
【００２３】
本発明は、適切な宿主細胞中に導入される、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んで成るベクターを含んで成る宿主ベクターシステムを提供する。本発明はさらに、宿主−ベクターシステムの製造及び使用方法を提供する。
本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー、及び本発明の組成物を含んで成る医薬組成物を提供する。１つの態様においては、医薬組成物は、本発明のヘプシン分子と混合される医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る。もう１つの態様においては、医薬組成物は、抗−ヘプシン抗体と混合される医薬的に許容されるキャリヤーを含んで成る。
【００２４】
本発明は、１）本発明の組成物と相互作用し、競争し、そして/又は阻害する分子を同定し、２）本発明の組成物を特徴づけ、３）細胞及び/又は組織におけるヘプシン発現を局在化し、４）細胞及び/又は組織サンプルにおけるヘプシンの存在を検出し、そして５）細胞及び/又は組織サンプルにおけるヘプシンの量を定量化するアッセイを提供する。
前記に記載されるような組成物を含んで成るキットはまた、本発明により包含される。１つの態様においては、本発明の１又は複数の組成物を含んで成るキットは、ヘプシンインヒビターを同定するためにスクリーニングアッセイに使用される。もう１つの態様においては、本発明の１又は複数の組成物を含んで成るキットは、活性化されたヘプシン分子を同定するためにスクリーニングアッセイに使用される。
【００２５】
本発明の組成物の使用方法が提供される。ヘプシン組成物は、ヘプシンと相互作用し、阻害し、そして/又は競争する分子を同定し、そして単離するために使用され得る。本発明の組成物は、ヘプシンを局在化し、そして/又は特徴づけるために使用され得る。組成物はまた、ヘプシンの過剰−、過少−及び/又は異常−発現に関連する疾病を処理するために使用され得る。
本発明の抗体の使用方法は、抗体がヘプシンを発現するか又は過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するか、又はその細胞を殺害する、ペプシン関連の疾病、例えば癌を処理するための方法；ヘプシンの精製方法；ヘプシンを発現する細胞を単離し、そして/又は富化するための方法；及び免疫組織化学的染色方法を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の特定の記載：
定義：
本出願に使用されるすべての科学的及び技術的用語は、特にことわらない限り、当業界において通常使用される意味を有する。本出願において使用される場合、次の用語又は句は、次のような特定される意味を有する。
【００２７】
本明細書において使用される場合、“ヘプシン”とは、活性化部位を有する、細胞質、トランスメンブラン及び細胞外ドメイン（また、本明細書においては、外ドメインとも言及される）を有するトランスメンブランポリペプチド分子、そのフラグメント又は誘導体を言及する。用語“ヘプシン”とは、野生型ヘプチン、例えばヘプチンチモーゲン、活性化されたヘプシン分子、及びそのフラグメント又は誘導体；及び修飾されたヘプシン分子、例えば修飾されたヘプシンチモーゲン、修飾され、活性化されたヘプシン分子及びそのフラグメント又は誘導体を包含する。
【００２８】
本明細書において使用される場合、“野生型”とは、それぞれ、天然に存在する分子と同じヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列を有する核酸又はポリペプチド分子を言及する。野生型ヘプシンポリペプチド分子は、図17又はLeytus など. , (1988 Biochemistry 27: 1067-1074に示されるような天然に存在するヘプシンのアミノ酸配列、又はそのいずれかのフラグメント又は一部を有する。野生型ヘプシンは、その細胞外ドメインにおける活性化部位の切断に基づいて活性化されるチモーゲン、すなわち酵素前躯体として合成される。
【００２９】
本明細書において使用される場合、用語“活性”とは、機能又は作用を有する分子を言及する。活性は、基質を認識し、結合し、切断し、そして/又は修飾する酵素活性を包含し、ここで前記分子が酵素、例えばプロテアーゼである。
本明細書において使用される場合、用語“チモーゲン”とは、同起源のプロテアーゼによる切断に基づいて、活性化された分子を生成する活性化配列を有する前躯体ポリペプチド分子を言及する。チモーゲンの例は、エンテロキナーゼによる切断に基づいて活性化されるようになる、エンテロキナーゼ置換体活性化配列を含んで成る修飾されたヘプシンチモーゲンである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語“活性化配列”とは、同起源のプロテアーゼにより切断され、そして切断される場合、分子を生物学的活性にし、例えばプロテアーゼ活性できる分子におけるアミン酸配列を言及する。活性化された分子においては、活性化配列は切断される。ヘプシン分子における活性化配列の例は、RIVGGである。
本明細書において使用される場合、用語“置換体活性化配列”とは、野生型分子に見出される活性化配列を置換するアミノ酸配列を言及する。置換体活性化配列の例は、ヘプシンにおける天然に存在する活性化配列RIVGGにより置換されるDDDDK-IVGGである。
【００３１】
本明細書において使用される場合、用語“修飾された”とは、天然に存在する、すなわち野生型アミノ酸又はヌクレオチド配列とは異なるアミノ酸又はヌクレオチド配列を有する分子を言及する。例えば、修飾されたヘプシン分子は、置換体活性化配列を含むことができる。修飾された分子は、野生型分子の機能又は活性を保持することができる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語“誘導体”とは、野生型分子のいずれかの修飾又は変更を意味する。誘導体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アミノ酸及び/又はヌクレオチド配列における保存性又は非保存性置換、例えば他のアミノ酸、ヌクレオチド、アミノ酸類似体又はヌクレオチド類似体による置換；１又は複数のアミノ酸及び/又はヌクレオチドの欠失；１又は複数のアミノ酸及び/又はヌクレオチドの挿入；及び前−及び/又は後−翻訳修飾。誘導体分子は、その親分子と配列類似性及び/又は活性を有することができる。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語“プロテアーゼ“とは、分子を認識し、そして分子における活性化配列を切断する種類の酵素を言及する。プロテアーゼは、内部ペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼであり得る。他方では、プロテアーゼは、ポリペプチド又はタンパク質分子のN末端又はC末端からペプチド結合を加水分解するエキソペプチダーゼであり得る。プロテアーゼは、活性化配列を受け、そして切断する触媒部位を形成するためのコンホメーションに折りたたむ。
本明細書において使用される場合、用語“触媒部位”とは、活性化配列を受け、そして切断する折りたたまれたプロテアーゼにおける領域を言及する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語“リガンド”とは、ヘプシンと相互作用するいずれかの分子を言及する。リガンドは、ヘプシンを認識し、そしてそれに結合する分子であり得る。他方では、リガンドは、ヘプシンにより認識され、そして結合される分子であり得る。例えば、ヘプシンが結合し、そして切断する基質は、リガンドであり得る。もう１つの例においては、ヘプシンに結合し、そしてそれを切断する分子はリガンドであり得る。抗−ヘプシン抗体はまた、リガンドであり得る。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語“セリンプロテアーゼ”とは、酵素における触媒部位の一部を形成するユニークセリン残基の存在により特徴づけられる種類のプロテアーゼ酵素を言及する。一般に、個々のセリンプロテアーゼメンバーは、異なった基質特異性を有する。
本明細書において使用される場合、第１のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第１及び第２の配列の比較が、それらが正確に等しいことを示す場合、それぞれ第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列に対して配列“同一性”を有すると言われる。
【００３６】
本明細書において使用される場合、第１のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、２種の配列の比較が、それらが少数の配列差異を有する（すなわち、第１及び第２の配列がほぼ同一である）ことを示す場合、第２の配列に対して“類似する”と言われる。例えば、２つの配列は、それらの２種の配列間で異なるヌクレオチド又はアミノ酸の％が約60％〜99.99％である場合、お互いに対して類似すると思われる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語“相補的”とは、塩基対を形成し、それにより、二本鎖核酸分子の形成を介在するために、水素結合を通して結合する能力を有するプリン及びピリミジンヌクレオチド塩基を有する核酸分子を言及する。次の塩基対が相補性に関連される：グアニン及びシトシン；アデニン及びチミジン；及びアデニン及びウラシル。相補性は、二本鎖核酸分子を含んで成るすべての塩基対、又はそれ自体に折りたたまれた一本鎖核酸分子を含んで成るすべての塩基対に適用される。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語“保存性”とは、類似する化学性質を有する異なったアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を言及する。保存性アミノ酸置換は、いずれか他の疎水性アミノ酸によるいずれか疎水性（例えば、非極性）アミノ酸の置換；又はいずれか他の親水性アミノ酸によるいずれか親水性（極性、荷電されていない）アミノ酸の置換；又はいずれか他の正の電荷のアミノ酸によるいずれか正しい荷電されたアミノ酸の置換；又はいずれか他の負に荷電されたアミノ酸によるいずれか負に荷電されたアミノ酸の置換（TE Creighton,"Proteins"WH Freeman and Company, New York）。
【００３９】
アミノ酸置換は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：いずれか他のそれらの疎水性アミノ酸によるイソロイシン（I）、バリン（V）及びロイシン（L）のいずれかの置換；グルタミン酸（E）によるアスパラギン酸（D）の置換及び逆も真であり；アスパラギン（N）によるグルタミン（Q）の置換及び逆も真であり；及びトレオニン（T）によるセリン（S）の置換及び逆も真である。他の置換はまた、特定のアミノ酸の環境、及びタンパク質の三次構造における役割に依存して、保存性であると見なされ得る。
【００４０】
例えば、グリシン（G）及びアラニン（A）、又はグリシン（G）及びセリン（S）は時折、アラニン（A）及びバリン（V）と同じように、交換可能的であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（M）は、時折ロイシン及びイソロイシン並びに時々バリンと交換され得る。リシン（K）及びアルギニン（R）は、アミノ酸残基の有意な特徴がその電荷であり、そしてそれらの２種のアミノ酸残基の異なったpKが有意でない位置において、時折交換可能である。さらに他の変化が、特定の環境において保存性であると見なされ得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語“非保存性”とは、異なった化学性質を有する異なったアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を言及する。非保存性置換は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：グリシン（G）により置換されるアスペラギン酸（D）；リシン（K）により置換されるアスパラギン（N）；又はアルギニン（R）により置換されるアラニン（A）。
本明細書において使用される場合、用語“可溶性”とは、細胞に結合されないいずれかの分子、又はそのフラグメント及び誘導体を言及する。可溶性分子は、循環することができる。可溶性分子は典型的には、トランスメンブランを欠いている。可溶性分子は典型的には、細胞外ドメインを含む。
【００４２】
アミノ酸残基についての一文字コードは次のものを包含する：A = アラニン, R = アルギニン, N = アスパラギン, D = アスパラギン酸, C = システイン, Q = グルタミン, E = グルタミン酸, G = グリシン, H = ヒスチジン, I = イソロイシン, L = ロイシン, K = リシン, M = メチオニン, F = フェニルアラニン, P =プロリン, S =セリン, T = トレオニン, W = トリプトファン, Y = チロシン, V = バリン。
【００４３】
本明細書に記載される発明はより十分に理解され得るよう、次の記載が示される。
本発明の分子：
本発明の修飾されたヘプシン分子は、修飾されたヘプシンチモーゲン及び活性化され、修飾されたヘプシン分子、又はそれらのフラグメント又は誘導体と包含する。それらの修飾されたヘプシン分子は、それらが、切断される場合、修飾されたヘプシン分子を活性化する置換された活性化配列を含んで成るので、有用である。本発明の修飾されたヘプシン分子は、安定性であり、そして抗−ヘプシン抗体を生成するために使用され得る。
【００４４】
その種々の観点においては、本発明は次のものを提供する：修飾されたヘプシン分子、例えば修飾されたヘプシンチモーゲン、活性化され、修飾されたヘプシン、又はそれらのフラグメント又は誘導体；修飾されたヘプシン分子をコードする核酸分子、又はそのフラグメント又は誘導体；組み換えDNA分子；形質転換された宿主細胞；宿主−ベクターシステム；抗−ヘプシン抗体；本発明の組成物を用いるための方法；本発明の組成物の生成方法；アッセイ；免疫療法；トランスジェニック動物；修飾されたヘプシンのインヒビター；及び免疫組織化学、免疫学及び核酸に基づくアッセイ。
【００４５】
修飾されたヘプシン分子：
ヘプシン分子の活性化は、触媒的活性酵素、すなわち活性ヘプシンを生成するために、天然に存在する活性化配列R−IVGGにおけるArg162−Ile163間のペプチド結合の切断により進められ得る。
本発明の修飾されたヘプシン分子、例えば修飾されたヘプシンチモーゲン、活性化され、修飾されたヘプシン、又はそれらのフラグメント又は誘導体は、置換体活性化配列を含んで成る。
【００４６】
置換体活性化配列は、修飾され、活性化されたヘプシン分子を生成するプロテアーゼ、例えば同起源のプロテアーゼによる修飾されたヘプシン分子の切断を可能にするであろう、修飾されたヘプシン分子における既知活性化配列を提供する。１つの態様においては、修飾されたヘプシン分子は、アミノ酸Arg162を置換するアミノ酸配列DDDDKを含んで成るエンテロキナーゼにより特異的に認識される置換活性化配列を含んで成る。そのチモーゲン形での修飾されたヘプシン分子とエンテロキナーゼ、例えば組み換えエンテロキナーゼとの接触が、置換体活性化配列を切断し、そしてその活性化された形での修飾されたヘプシン分子を生成する。
【００４７】
置換体活性化配列の例は、前記に記載される。その置換体活性化配列の配列及び長さは、所望する同起源のプロテアーゼによる修飾されたヘプシンチモーゲンの切断を可能にし、それにより、活性化され、修飾されたヘプシンを生成するために選択される。
本発明の活性化され、修飾されたヘプシン分子は、天然に存在する野生型の活性化されたヘプシンの機能的活性を示す。天然に存在する野生型の活性化されたヘプシンの機能的活性は、第VII a因子を生成するために、タンパク質基質、例えば第VII 因子上の配列Arg-Ileの認識及び切断である（Y Kazama, など. , 1995 J Biol Chem 270: 66-72）。類似する態様において、活性化され、修飾されたヘプシンはプロテアーゼとして機能し、そして野生型の活性化されたヘプシンと同じ基質を認識し、そして切断することができる。
【００４８】
本発明の実施によれば、本発明の修飾されたヘプシン分子は、天然に存在する野生型ヘプシン分子の構造と同じか又は類似する折りたたまれた構造を有することができる。例えば、天然に存在する野生型ヘプシンプロテアーゼの活性化され、修飾されたヘプシンは、野生型の活性化されたヘプシンにより認識される基質を受け、そして切断するための触媒部位を可能にするコンホメーションに折りたたまれ得る。
十分な長さの存在するヒトヘプシン分子（図17）（SP Leytus, など., 1988 Biochemistry 27: 1067-1074; K Kurachi, など. , 1994 Methods Enzymol 244: 100-114）は次のものを包含する：１）アミノ酸残基１−17を包含する細胞質ドメイン；２）アミノ酸残基18−44を包含するトランスメンブランドメイン；及び３）45−417を包含し、そして活性化配列及び触媒部位を含んで成る細胞外ドメイン。
【００４９】
本発明は、天然に存在するヘプシン分子のフラグメント又は誘導体を含んで成る、修飾されたヘプシン分子を提供する。修飾されたヘプシン分子のフラグメント又は誘導体は、いずれかの組み合わせ又は順序で結合され、そして/又は連結される、上記のドメインのいずれかの部分を含むことができる。
１つの態様においては、修飾されたヘプシン分子は、図17に示される配列のアミノ酸残基45−417を包含する、天然に存在するヒトヘプシン分子の細胞外ドメインを含んで成る。もう１つの態様にいては、修飾されたヘプシン分子は、エンテロキナーゼ、又は他のプロテアーゼ認識配列、例えばエンテロキナーゼ認識配列を含むよう修飾された天然に存在するヘプシン分子の細胞外ドメインを含んで成る。そのような態様は、それらはトランスメンブランドメインを欠いているので、典型的には可溶性分子である（図18）。
【００５０】
本発明は、天然、合成、半合成又は組み換えのいずれかの源から誘導されたか又は単離され、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。
源は、原核生物又は真核生物を包含する。真核生物源は、動物、植物、菌類又は原生生物を包含する。動物源は、哺乳類、例えばウシ、ブタ、ネズミ（S Kawamura, など. , 1999 Eur J Biochem 262: 755-764; D Farley, など. , 1993 Biochem Biophys Acta 1173: 350-352）、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト（SP Leytus,など. , 1988 Biochemistry 27: 1067-1074）、羊、魚類、鳥類又は昆虫を包含する。
【００５１】
本発明の修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体は、原核又は真核宿主細胞において生成される組み換え分子として発現されるか、又は合成分子として生成され得る。１つの態様においては、組み換え修飾されたヘプシン分子は、修飾されたヘプシン分子を包含する封入体を生成する細菌宿主細胞から単離され得る（N Yamaguchi, など. 2002, The J of Biol Chem 277: 6806-6812; Takeuchi など, 1999, PNAS 96: 11054-11061）。ヘプシン分子を単離するための他の方法がまた使用され得る（Wu など, 1991, PNAS 88: 6775-6779）。もう１つの態様においては、修飾されたヘプシン分子は、バキュロウィルス感染された昆虫細胞から単離され得る（Smith など 1983 J Virol 46: 584; EK Engelhard, など, 1994 Proc Nat Acad Sci 91: 3224-7）。
【００５２】
修飾されたヘプシンの精製：
本発明の修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体は、当業界において良く知られている方法により精製され得る。それらの精製方法は、次のものを包含する：修飾されたヘプシン分子を選択的に結合する抗体を用いての親和性クロマトグラフィー；修飾されたヘプシン分子に結合されるエピトープ標識、例えばHis標識、V5標識又は他のよく知られている標識を選択的に結合する抗体を用いての親和性クロマトグラフィー（Marchak, D. R. , など. , 1996 in:"Strategies for Protein Purification and Characterization", Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.）；イオン交換クロマトグラフィー；及びゲル濾過クロマトグラフィー。単離及び精製の性質及び程度は、意図される使用に依存するであろう。例えば、精製され、修飾されたヘプシン分子は、修飾されたヘプシン分子へのリガンド又は抗体の結合を妨げる他のタンパク質又は、分子を実質的に有さないであろう。
【００５３】
融合分子：
本発明は、非ヘプシン分子コード配列に融合される修飾されたヘプシン分子を含んで成る融合分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。
本発明の融合分子は、エピトープ標識、例えばヒスチジン（His）標識又はV5標識、FLAG標識、インフルエンザヘマグルチニン（HA）標識、Mye標識、VSV-G標識又はチオレドキシン（Trx）標識に融合される修飾されたヘプシン分子を包含する。標識された融合分子は、修飾されたヘプシン分子の単離及び/又は精製の促進のために有用である（Marshak, D. R. , など., 1996 in:"Strategies for Protein Purification and Characterization"pp 396）。
【００５４】
本発明の融合分子は、レポーター分子に融合される修飾されたヘプシン分子を包含する。レポーター分子は、十分な長さのタンパク質、又はそのフラグメント又は誘導体であり得る。通常使用されるレポーター分子は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（BFP）を包含する。
【００５５】
他の融合分子構成は、マルトース結合タンパク質（MBP）、S−標識、Lex A DNA結合ドメイン（DBD）融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、及びヘルペス単純ウィルス（HSV）B16タンパク質融合体を包含することができる。
融合分子はまた、修飾されたヘプシン分子と非ヘプシン分子との間に位置する切断部位を包含するよう構築され得、その結果、修飾されたヘプシン分子は非ヘプシン分子から切断され、そして精製され得る。切断部位は、次の酵素のための認識配列を含むことができる：エンテロキナーゼ、コリン、MT−SP/マトリプターゼ、トリプシン、キモトリプシン、ヒト気道トリプシン−様プロテアーゼ（HAT）、肥満細胞トリプターゼ、エラスターゼ、プラスミン、カリクレイン、TMPRSS2、MBL−結合のセリンプロテアーゼ（MASP-1及びMASP-2）、スタブル−スタブロイド、フリン、トロンビン又は第Xa因子。
【００５６】
キメラポリペプチド：
本発明は、第２の異なった源から単離されたヘプシン分子のフラグメントに融合される、第１源から単離されたヘプシン分子のフラグメントを包含する、キメラ分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。前記第１及び第２源は、哺乳類、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、モンキー、サル、羊又はヒト、又は他の源、例えば魚類、鳥類又は昆虫を包含するいずれかの源からであり得る。
【００５７】
修飾されたキメラヘプシン分子を形成するために使用される１又は複数のヘプシンフラグメントは、エンテロキナーゼ活性化配列を含むよう修飾され得る。１つの態様においては、修飾されたキメラヘプシン分子は、第２源からのヘプシン分子の細胞質ドメインに融合される、第１源からヘプシン分子の細胞外ドメイン（置換体活性化配列を含む）を含んで成る。もう１つの態様においては、修飾されたキメラヘプシン分子は、第２源からのヘプシン分子の細胞外ドメインのフラグメントを含んで成り、ここでこのようにして形成されるキメラヘプシン分子は置換体活性化配列を含む。
【００５８】
アミノ酸類似体及び変更されたポリペプチド：
本発明はさらに、アミノ酸類似体を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。アミノ酸類似体は、化学的に合成され得、そして右または左形、又はペプチド擬似体を包含する。
【００５９】
本発明はまた、N−又はO−グリコシル化されたアミノ酸残基を包含する、後−翻訳経路により又は化学合成により変更される修飾されたヘプシン分子を提供する。ポリペプチドのN−末端は、アシル化された又はアルキル化された残基を包含するよう変更され得る。ポリペプチドのC−末端は、エステル化された又はアミド化された残基を含むよう変更され得る。非末端アミノ酸残基は、アミノ酸、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン酸、リシン、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン及びシステインの変更を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６０】
配列変異体：
本発明は、天然に存在するヘプシン分子の細胞外ドメインにおける配列変動を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。当業者が理解するように、いずれかの数のアミノ酸は、単独で又は他のアミノ酸と組合して変更され得、そして修飾されたヘプシン分子はまだそれらの機能的活性を保持するであろう（例えば、同起源のプロテアーゼにより切断され、そして/又はその基質を切断する）。修飾されたヘプシン分子の細胞外ドメインの配列変異体は次のものを包含する：アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、変異体形、対立遺伝子形、相同体及びオルト体。
【００６１】
アミノ酸置換：
修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体は、アミノ酸置換を包含する。修飾されたヘプシン分子の細胞外ドメインは、保存性又は非保存性アミノ酸置換を有することができる。どの及びいかに多くのアミノ酸残基が修飾されたヘプシン分子の細胞外ドメインにおいて置換され得るかの決定における案内は、天然に存在するヘプシン分子の性質に見出され得る。それらの性質は、アミノ酸の長さ、物理的長さ、又は折りたたまれたコンホメーションを包含する。それらの性質は、予測（例えば、アミノ酸配列に基づいて）及び/又は実験（例えば、X−線結晶学に基づいて）により誘導され得る。置換されたアミノ酸は、変異体の修飾されたヘプシン分子の性質が天然に存在するヘプシン分子の性質と同一であるか又はそれに類似するよう選択される。
【００６２】
変異体形：
本発明はまた、ヘプシン分子の細胞外ドメインの変異体形を有する修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体も提供する。前記変異体は、野生型ヘプシン分子の細胞外ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。突然変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入、付加、切断、又はタンパク質のプロセッシング又は切断誤差を包含する。変異体は、野生型ヘプシン分子と同じが又は類似する機能的活性を有することができる。
【００６３】
対立遺伝子変異体：
本発明は、天然に存在するヘプシン分子の対立遺伝子変異体を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座で存在する異なった遺伝子によりコードされる分子である。
【００６４】
相同体：
本発明は、天然に存在するヘプシン分子の相同体を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。相同体は、同じ遺伝子座からであるが、しかし異なった染色体上のヌクレオチド配列によりコードされる分子である。相同体は、同じか又は類似する機能的活性を有することができる。
【００６５】
オルト体：
本発明は、天然に存在するヘプシン分子のオルト体を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。オルト体は、異なった種からのヌクレオチド配列によりコードされるヘプシン分子である。オルト体は、野生型ヘプシン分子と同じか又は類似する機能的活性を有することができる。
【００６６】
置換体活性化配列：
本発明は、天然に存在する活性化配列を置換する置換体活性化配列をそれぞれ含む、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。置換体活性化配列は、ヘプシン分子の天然に存在する活性化配列とは異なる。例えば、ヒトヘプシン分子の天然に存在する活性化配列は、アミノ酸配列R−IVGGを含んで成る（A Torres-Rosado, など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7181-7185; K Kurachi, など. , 1994 Methods Enzymol 244: 100-114）。置換体活性化配列は、同起源のプロテアーゼにより認識され、そして切断される。
【００６７】
置換体活性化配列は、いずれかの種、特に哺乳類源、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、羊又はヒト、又は他の源、例えば魚類、鳥類又は昆虫からのプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列であり得る。
置換体活性化配列は、プロテアーゼ、例えばいずれかのセリンプロテアーゼ、トリプシンファミリーのいずれかのメンバー、いずれかのトリプシン−様プロテアーゼ、及びいずれかのタイプIIトランスメンブランプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列であり得る。
【００６８】
活性化配列は、次の酵素により認識され、そして切断されるアミノ酸配列であり得る（AJ Barrett, ND Rawlings, JF Woessner (eds), 1998, Handbook of ProteolyticEnzymes, Academic Press, London）：エンテロキナーゼ；トロンビン；凝固第Xa因子；フリン；トリプシン；キモトリプシン；クラスターゼ；トロンビン；プラスミン；カリクレイン；アクロシン；ヒト気道トリプシン−様プロテアーゼ（HAT）（K Yamaoka, など. 1998 J Biol Chem 273: 11895-11901）；肥満細胞トリプターゼ；MBL−結合されたセリンプロテアーゼ（MASP−１及びMASP-2）（Matsushita, など. 2000 The Journal of Immunology 164: 2281-2284）；コリン（W Yan, など. , 1999 J Biol Chem 274: 14926-14935, W Yan, など. , 2000 Proc Natl Acad Sci USA 97: 8525-8529）；MT-SP1/マトリプターゼ（T Takeuchi, など. , 1999 Proc Natl Acad Sci 96: 11054-11061; CY Lin, など. , 1999 J Biol Chem274: 18231-18236）；TMPRSS2（A Paoloni-Giacobina, など. , 1997 Genomics 44: 309-320）；及びスタブル−スタブロイド（LF Appel, など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 4937-4941）。
【００６９】
１つの態様においては、置換体活性化配列は、TMPRSS3プロテアーゼ又はエピセリアミンプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列、例えば配列LKTPR−VVGG（配列番号１）（A Paoloni-Giacobino, など. , 1997 Genomics 44: 309-320; B Lin, など. , 1999 Cancer Res 59: 4180-4184）；又はMT−SP1プロテアーゼ又はエピチンプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列、例えばTRQAR-VVGG（配列番号２）（M Kim, など. , 1999 Immunogenetics 49: 420-428）であり得る。
【００７０】
もう１つの態様においては、置換体活性化配列は、エンテロキナーゼプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列、例えば配列DDDDK−IVGG（配列番号３）（Y Kitamoto, など. , 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91: 7588-7592; ER La Vallie, など. , 1993 J Biol Chem 268: 23311-23317）であり得る。もう１つの態様においては、置換体活性化配列は、アミノ酸配列DDDDK−I（配列番号４）を含んで成る、ヒト又はウシエンテロキナーゼにより認識され、そして切断される。
【００７１】
変異置換体活性化配列：
本発明はまた、上記及び図18に記載される置換体活性化配列の配列変動を有する置換体活性化配列を含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。置換体活性化配列は、置換されたアミノ酸が類似する構造又は化学的性質を有する、保存性アミノ酸置換を有することができる。変異体は、非保存性変化を有する。変異置換体活性化配列は、同起源のプロテアーゼによる、折りたたまれた修飾されたヘプシン分子の切断を可能にし、それにより活性化され、修飾されたヘプシン分子を生成するよう選択される。
【００７２】
置換体活性化配列の長さ：
本発明は、約２〜約10個の長さのアミノ酸残基のサイズ範囲の置換体活性化配列を含んで成る修飾されたヘプシン分子を提供する。１つの態様においては、置換体活性化配列は、約２〜約６個の長さのアミノ酸である。
置換体活性化配列は、折りたたまれた野生型ヘプシン分子において活性化配列の同じか又は類似する距離に及ぶよう選択され得る。１つの態様においては、置換体活性化配列は、修飾されたヘプシン分子の機能的活性に影響を及ぼさないであろう。
【００７３】
どの及びいかに多くのアミノ酸残基が置換体活性化配列において変更され得るかの決定における案内は、折りたたまれた修飾されたヘプシン分子における活性化配列により拡張される距離において見出され得る。折りたたまれた野生型ヘプシン分子における活性化配列を拡張する距離は、野生型ヘプシン分子のアミノ酸配列から推定され、そして/又は野生型ヘプシン分子のX−線結晶構造から実験的に得られる。
【００７４】
例えば、野生型ヒトヘプシンのアミノ酸配列（A Torres-Rosado, など., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7181-7185; K Kurachi, など. , 1994 Methods Enzymol 244: 100-114）は、折りたたまれたヒト野生型ヘプシン分子における活性化配列を拡張する距離を予測するための基礎として使用され得る。残基RIVGGを包含する、野生型ヒトヘプシン分子の活性化配列は、５個のアミノ酸残基の線状長さに及ぶ（図17）。
【００７５】
本発明の核酸分子：
修飾されたヘプシン分子をコードする核酸分子：
本発明は、“修飾されたヘプシンポリヌクレオチド配列”、“ヘプシン配列”、“ヘプシン分子配列”、又は“本発明の核酸分子”として本明細書において言及される、本発明の修飾されたヘプシン分子をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る、種々の単離され、及び組み換えの核酸分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。本発明はまた、修飾されたヘプシン分子のフラグメント又は誘導体をコードするポリヌクレオチド配列も提供する。本発明はさらに、関連するポリヌクレオチド分子、例えば相補的な修飾されたヘプシンポリヌクレオチド配列、又はその一部、及び本発明の核酸分子に対してハイブリダイズするそれらを提供する。
【００７６】
修飾されたヘプシンポリヌクレオチド配列は好ましくは、単離された形で存在し、そしてDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、及び関連する分子、及びそれらのフラグメントを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ゲノムDNA、cDNA、リボザイム及びアンチセンスRNA又はDNA分子、並びに天然源から誘導されるか又は合成されるかにかかわらず、二者択一の主鎖又は塩基に基づいての核酸分子が特に企画される。
本発明の核酸分子は、本発明の修飾されたヘプシン分子、及び/又はそのフラグメント又は誘導体をコードし、ここで前記コードされた、修飾されたヘプシン分子は、天然に存在するヘプシン分子の類似するか又は同一の機能活性を示す。
【００７７】
１つの態様においては、修飾されたヘプシン分子をコードする単離されたヌクレオチド配列は、図９に示され、位置996でコドンaggで開始し、そして位置2123でのコドンctcで終結する。さらに、図９の核酸配列は、位置924−995でタンパク質分泌のためのシグナル配列をコードし、そして位置2124−2198でV5及び６−His tag配列をコードする。
もう１つの態様においては、図10に示される単離されたヘプシン配列は、位置1225でのaggで開始し、そして位置98でのctcで終結する、修飾されたヘプシン分子をコードする。図10の核酸配列1297−1226は、シグナル配列をコードし、そして配列97−23はV5及び６−His Tag配列をコードする。
【００７８】
図11に示される単離されたヘプシン配列は、位置907でのcaaで開始し、そして位置98でのctcで終結する、修飾されたヘプシン分子をコードする。核酸配列979−908はシグナル配列をコードし、そして配列97−23はV5及び６−His Tag配列をコードする。
図10に示され、そしてpCEP4W/hepEKとして命名されたヌクレオチド配列の生物学的サンプルを、ブダペスト条約の規定下でアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）(ATCC), 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209に、2002年９月30日に寄託し、そしてATCC受託番号（PTA−4733）を得た。
【００７９】
本発明の実施によれば、本発明の核酸分子は、修飾されたヘプシンヌクレオチド配列の単離された十分な長さの又は部分的長さの分子又はオリゴマーであり得る。本発明のヘプシン配列は、本発明の修飾されたヘプシン分子のすべて又は一部、例えば細胞質ドメイン、トランスメンブランオメイン及び/又は細胞外ドメインをコードすることができる。細胞外ドメインは、置換体活性化配列を含んで成る。
【００８０】
単離された核酸分子：
本発明の核酸分子は好ましくは、単離された形で存在し、ここで前記核酸分子は修飾されたヘプシン分子配列以外の配列を有する汚染性核酸分子から実質的に分離される。当業者は、単離された、修飾されたヘプシン分子配列を得るために核酸単離方法を容易に使用することができる。例えば、Sambrook など. , in:"Molecular Cloning" (1989)を参照のこと。本発明はまた、組み換えDNA技法又は化学合成方法により生成される、単離された、修飾されたヘプシン分子配列も提供する。本発明はまた、種々の哺乳類種、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、羊又はヒト、又は他の源、例えば魚類、鳥類又は昆虫から単離されたヌクレオチド配列を提供する。
【００８１】
単離された核酸分子は、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、及び関連する分子、修飾されたヘプシン分子をコードする修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子、、又はそのフラグメント又は誘導体及び修飾されたヘプシン分子をコードする核酸分子に対してハイブリダイズするそれらを包含する。好ましい核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に同一か又は類似するヌクレオチド配列を有する。ゲノムDNA、RNA、例えば小さな干渉性RNA, cDNA、リボザイム及びアンチセンス分子が特に企画される。
【００８２】
同一及び類似するヌクレオチド配列：
本発明は、本明細書に開示される修飾されたヘプシン分子配列と同一か又は類似するポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。従って、ポリヌクレオチド配列は、図9−11に記載されるように、特定の修飾されたヘプシン分子配列と同一であり得る。他方では、ポリヌクレオチド配列は、開示される配列に類似することができる。
【００８３】
本発明の１つの態様は、修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列と配列同一性又は類似性を示す核酸分子、例えば図9−11に示されるように、本発明の配列と少なくとも60〜99.9％の配列類似性及び100％までの配列同一性を有する分子を提供する。もう１つの態様は、約75％〜99.9％の配列類似性を示す核酸分子を提供し、そしてもう１つの態様は、約86％〜99.9％の配列類似性を有する分子を提供する。さらにもう１つの態様は、図９−11に示されるように、本発明の修飾されたヘプシン分子配列と100％の配列同一性を有する分子を提供する。
【００８４】
相補的ヌクレオチド配列：
本発明はまた、図9−11、17−18に記載されるような配列に対して相補的である核酸分子も提供する。相補性は、十分であっても又は一部であっても良い。十分に相補的であるヌクレオチド配列は、図9−11及び17−18のいずれか１つに記載されるような完全なヘプシン配列に対して相補的である。一部相補的であるヌクレオチド配列は、図9−11及び17−18のいずれか１つに記載されるような配列の一部のみに対して相補的である。相補的分子は、アンチセンス核酸分子を包含する。アンチセンス分子は、RNA干渉（RNAi）、DNA干渉、細胞の増殖の阻害、又は天然に存在するヘプシン分子を発現するか、又は修飾されたヘプシン分子を発現する細胞の殺害のために有用である（A Torres-Rosado, など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7181-7185）。相補的分子はまた、小さな干渉性RNA（siRNA）も包含する（Elbashir など, 2001, Nature 411: 494-498; Hammond et al, 2001, Nature Review 2: 110-119）。
【００８５】
ハイブリダイズする核酸分子：
本発明はさらに、図9−11及び17−18のいずれか１つに示されるような本発明の修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列に対して選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。ハイブリダイズする核酸分子は、高い緊縮性のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる。典型的には、標準の高い緊縮条件下でのハイブリダイゼーションは、約70％〜約100％、配列相補的において異なる２種の相補的核酸分子間で生じるであろう。核酸分子間での高い緊縮性のハイブリダイゼーションは、例えば同一性の程度、ハイブリダイゼーションの緊縮性、及びハイブリダイズする鎖の長さに依存することは当業者に明らかである。高い緊縮性のハイブリダイゼーションを行うための方法及び配合は、当業界において良く知られており、そしてSambrook, など. , in:"Molecular Cloning" (1989)に見出され得る。
【００８６】
一般的に、緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、（１）洗浄のために低いイオン強度及び高い温度、例えば50℃での0.015MのNaCl/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％SDSを使用するか；又は（２）ハイブリダイゼーションの間、42℃で、750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウムと共に、変性剤、例えばホルムアミド、例えば50％（v/v）のホルムアミド、及び0.1％のウシ血清アルブミン/0.1％Ficoll/0.1％ポリビニルピロヂドン/50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）を使用するそれらの条件である。
【００８７】
緊縮条件のもう１つの例は、50％のホルムアミド、５×SSC（0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム、５×Denhardt’s溶液、音波処理されたサケ精子DNA（50mg/ml）、0.1％のSDS、及び10％の硫酸デキストランの42℃での使用、及び0.2×SSC及び0.1％のSDSによる42℃での洗浄を包含する。当業者は、明確且つ検出できるハイブリダイゼーションシグナルを得るために緊縮条件を容易に決定し、そして変えることができる。
【００８８】
核酸フラグメント：
本発明はさらに、本発明の修飾されたヘプシン分子配列のフラグメント、例えば本明細書に開示され、そして図９−11及び18のいずれか１つに示されるような修飾されたヘプシン分子配列の一部を有する核酸分子を提供する。フラグメントのサイズは、その意図される使用により決定されるであろう。例えば、フラグメントが置換体活性化配列を含んで成る、天然に存在する野生型ヘプシン分子の細胞外ドメインを含んで成る修飾されたヘプシン分子をコードするよう選択される場合、当業者は、このドメインをコードするのに十分に大きいポリヌクレオチドフラグメントを選択するであろう。フラグメントが核酸プローブ又はPCRプライマーとして使用される場合、そのフラグメントの長さは、プロービング又はプライミング方法の間、比較的少数の誤った陽性を得るよう選択される。
【００８９】
本発明の核酸分子、そのフラグメント、及び本発明のプローブ及びプライマーは、種々の分子生物学的技法、例えばライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーン、又は遺伝子転写及び/又は発現の分析のための手段としてのmRNA転写物の検出及び定量化のために有用である。前記プローブ及びプライマーは、DNA、RNA又はDNA又はRNA分子の誘導体であり得る。少なくとも15個の塩基対のプローブ又はプライマーの長さが、理論的及び実施上の考慮により示唆されている（Wallace, B. and Miyada, G. 1987 in:"Oligonucleotide Probes for the Screening of Recombinant DNA Libraries"in: Methods in Enzymology. 152: 432-442, Academic Press）。
【００９０】
選択ハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプライマーとして特に有用である修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列のフラグメントは、当業界において知られている方法を用いて、修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列から容易に同定され得る。例えば、修飾されたヘプシン分子転写体の一部を結合し、そして/又は検出するPCRプライマー組は、アメリカ特許第4,965,188号記載されるPCR方法により製造され得る。本発明のプローブ及びプライマーは、当業者に良く知られている方法により調製され得る（Sambrook, など., 前記）。プローブ及びプライマーは、化学合成方法により合成され得る（Gait, M. J. 1984 in :"Oligonucleotide Synthesis", IRL Press, Oxford, England）。
【００９１】
本発明の１つの態様は、本発明の核酸分子又はそのいずれかの特定部分の特異的増幅を可能にする、修飾されたヘプシン分子配列に対して相補的である核酸プライマーを提供する。もう１つの態様は、修飾されたヘプシン分子配列、又はそのいずれかの部分に対して、選択的に又は特異的にハイブリダイズするために相補的である核酸プローブを提供する。
他方では、修飾されたヘプシン分子配列のフラグメントは、非ヘプシン分子配列に融合される修飾されたヘプシン分子配列を有する組み換え融合遺伝子を構成するために使用され得る。
【００９２】
融合遺伝子配列：
本発明は、非ヘプシン分子配列に融合される（例えば、連結又は結合される）修飾されたヘプシン分子配列を包含する融合遺伝子配列を提供する。修飾されたヘプシン分子配列は、非ヘプシン分子配列に整合して作用可能に融合される。
本発明の融合遺伝子配列は、エピトープ標識、例えばヒスチジン（His）標識、V5標識、FLAG標識インフルエンザヘマグルチニン（HA）標識、Myc標識、VSV-G標識及びチオレドキシン（Trx）標識（但し、それらだけには限定されない）に融合される修飾されたヘプシン分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００９３】
本発明の融合遺伝子配列は、十分な長さの又は部分的長さのレポーター遺伝子配列、例えばグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（GEP）（但し、それらだけには限定されない）に融合される修飾されたヘプシン分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００９４】
本発明の融合遺伝子配列は、DNA分子を結合するか、又は他の細胞分子、例えばマルトース結合タンパク質（MBP）、S−標識、Lex A DNA結合ドメイン（DBD）の融合体、GAL4 DNA結合ドメイン融合体、及びヘルペス単純ウィルス（HSV）BP16タンパク質融合体（但し、それらだけには限定されない）を結合する、タンパク質又はそのフラグメントをコードする遺伝子配列に融合される修飾されたヘプシン分子をコードするヌクレオチドを包含する。
【００９５】
本発明の融合遺伝子配列は、切断部位成分をコードする遺伝子配列に融合される修飾されたヘプシン分子をコードするヌクレオチド配列を包含する。切断部位は、修飾されたヘプシン分子コード配列と、切断配列との間に位置する。切断部位成分は、ヘプシントロンビン及び第Xa因子認識配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００９６】
キメラヌクレオチド配列：
本発明は、組み換えのキメラ性修飾されたヘプシン分子をコードするキメラ遺伝子配列を提供する。キメラヌクレオチド分子は、第２の異なった源から単離されたヘプシン分子の一部に融合される第１源から単離されたヘプシン分子の一部をコードする。キメラ分子は、整合して、作用可能に融合されるキメラポリペプチドをコードする。
【００９７】
１つの例においては、キメラヌクレオチド分子は、第２源からのヘプシン分子の細胞質ドメインに融合される、第１源からのヘプシン分子の細胞外ドメインをコードし、ここで前記細胞外ドメインは、置換体活性化配列を含む。もう１つの例においては、キメラヌクレオチド分子は、第２源からのヘプシン分子の細胞外ドメインの残る部分に融合される、第１源からのヘプシン分子の細胞外ドメインの一部をコードし、ここで前記キメラ分子は置換体活性化配合を有する細胞外ドメインを含む。
【００９８】
コドン使用変異体：
本発明は、開示される修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列とは異なるが、コードされる修飾されたヘプシン分子の予測されるポリペプチド配列又は生物学的活性を変更しない単離されたコドン−使用変異体を提供する。例えば、多くのアミノ酸は１つよりも多くの三文字コドンにより示される。同じアミノ酸を特定するコドンは、遺伝子コードにおける縮重のために生じる。アミノ酸、すなわちアルギニン（R）をコードするヌクレオチドコドンCGT, CGG, CGC及びCGA；又はアミノ酸、すなわちアスパラギン酸（D）をコードするコドンGAT及びGACが例として挙げられる。従って、プロリンは、それらの特異的ヌクレオチド配列においては異なるが、しかし同一の配列を有するタンパク質分子をまだコードしている１又は複数の核酸分子によりコードされ得る。アミノ酸コード配列は次の通りである：
【００９９】
【表１】
2006507813.tif 000002
【０１００】
コドン−使用変異体は、組み換えDNA技法により生成され得る。コドンは、宿主細胞により使用されるコドンの頻度に従って、特定の原核発現宿主における修飾されたヘプシン分子転写体又は修飾されたヘプシン分子の生成のレベルを最適化するよう選択され得る。修飾されたヘプシン分子をコードするヌクレオチド配列を変更するための他の理由は、より所望の性質、例えば延長された半減期又は高められた安定性を有するRNA転写体の生成を包含する。それぞれの修飾されたヘプシン分子をコードする多数の修飾された変異体ヘプシン分子ヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、単離され得る。
【０１０１】
従って、本発明は、開示される修飾されたヘプシン分子をコードするか、又は修飾されたヘプシン分子の生物学的活性を有する分子をコードする、あらゆる可能性ある組み合わせのヌクレオチド配列を生成するためにあらゆる可能なトリプレットコドンの選択を提供する。この特定の態様は、図9−11及び17−18のいずれか１つに記載のような配列とは異なる単離されたヌクレオチド配列を提供し、その結果、個々の変異体ヌクレオチド配列は図9−11及び17−18に記載されるアミノ酸配列と配列同一性を有するヌクレオチドをコードする。
【０１０２】
変異体ヌクレオチド配列：
本発明は、本発明の修飾されたヘプシン分子のいずれかの変異体形をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子を提供する。変異体ヌクレオチド配列は、修飾されたヘプシン分子の細胞外ドメインの変異体形をコードする。変異体ヌクレオチド配列は、本発明の修飾されたヘプシン分子内の置換体活性化配列の変異体形をコードする。１つの態様においては、変異体ヌクレオチド配列は、天然に存在する野生型ヘプシン分子と同じか又は類似する機能的活性を有する変異体の修飾されたヘプシン分子をコードする。
【０１０３】
本発明の変異体ヌクレオチド配列は、保存性又は非保存性アミノ酸置換を含む。変異体ヌクレオチド配列は、突然変異、例えばアミノ酸置換、欠失、挿入、付加、切断、又はタンパク質のプロセッシング又は切断誤差を包含する。変異体ヌクレオチド配列は、天然に存在するヘプシン分子の対立遺伝子、相同体又はオルト体変異体を包含する。
【０１０４】
誘導体核酸分子：
本発明の核酸分子はまた、DNA又はRNA分子、及びアンチセンス分子とは異なる誘導体核酸分子を包含する。誘導体分子は、一本鎖DNA又はRNAに、塩基対−依存性態様で結合する、ペプチド核酸（PNA）、及び非核酸分子、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート及びメチルホスホネート分子を包含する（PC Zamecnik, など., 1978 Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 280284; PC Goodchild, など. , 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4143-4146）。ペプチド核酸分子は、アミノ酸残基、例えばリシン及びアミノ基が付加されている核酸オリゴマーを含んで成る。
【０１０５】
抗−遺伝子剤と称するそれらの小さな分子は、核酸のそれらの相補的（鋳型）鎖に結合することにより転写体延長を停止する（PE Nielsen, など. , 1993 Anticancer Drug Des 8: 53-63）。DNA、RNA及びそれらの類似体の合成方法の再考は、Oligonucleotides and Analogues, eds. F Eckstein, 1991, IRL Press, New York; Oligonucleotide Synthesis, ed. MJ Gait, 1984, IRL Press, Oxford, Englandに見出され得る。さらに、アンチセンスRNA技法のための方法は、アメリカ特許第5,194,428号及び第5,110,802号に記載される。当業者は、本明細書に記載される修飾されたヘプシン分子ポリヌクレオチド配列を用いて、それらの種類の誘導体核酸分子を容易に得ることができる。例えば、"Innovative and Perspectives in Solid Phase Synthesis" (1992) Egholm, など. pp 325-328 又はアメリカ特許第5,539, 082号を参照のこと。
【０１０６】
ラベルされた核酸分子：
本発明は、検出できるマーカーにより結合されるか又はラベルされた本発明の核酸分子を提供する。検出できるマーカーの例は、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発行化合物、金属キレーター又は酵素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ラベルされた核酸分子を生成するための技法は良く知られており、例えばSambrookなど. , in Molecular Cloning (1989)を参照のこと。
【０１０７】
組み換え核酸分子：
本発明は、本明細書に記載されるように、修飾されたヘプシン分子をコードするヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体を包含する組み換えDNA分子（rDNA）を提供する。本明細書において使用される場合、rDNA分子は、インビトロでの分子操作にゆだねられたDNA分子である。組み換えDNA分子を生成するための方法は、当業者において良く知られている（Sambrook など. , Molecular Cloning (1989)を参照のこと）。１つの態様においては、本発明の組み換えDNA分子は、１又は複数の発現制御配列及び/又はベクター配列に作用可能に結合される。
【０１０８】
ベクター：
本発明の核酸分子は、組み換えベクター分子を生成するために、ベクターに結合される修飾されたヘプシン分子をコードする、ポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体をそれぞれ含んで成る組み換え分子であり得る。
【０１０９】
用語、ベクターは、プラスミド、コスミド、BAC、YAC、PAC及びファゲミドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは、適切な宿主細胞内でのrDNAの複製を指図するレプリコンを含んで成る自律的に複製するベクターであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中への組み換えベクターの組み込みを指図する。種々のウィルスベクター、例えば多くの良く知られているレトロウィルス及びアデノウィルスベクターがまた使用され得る（Berkner 1988 Biotechniques 6: 616-629）。
【０１１０】
本発明のベクターは、原核又は真核宿主細胞における修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体の発現を可能にする。ベクターは、挿入される修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列の転写を可能にする発現制御要素、例えばプロモーター配列を含んで成る発現ベクターであり得、そして適切な宿主細胞における結合された修飾されたヘプシン分子配列の発現（例えば、転写及び/又は翻訳）を調節するために使用され得る。
【０１１１】
発現制御要素は、種々の起源のもの、例えば天然に存在するもの及び合成のものであり得る。天然に存在する要素は、細胞又はウィルス起源のものであり得る。発現制御要素は、当業界において知られており、そして誘発性プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター及び他の転写調節要素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１２】
翻訳に包含される他の発現制御要素は、当業界において知られており、そしてシャイン−ダルガルノ配列（例えば、原核宿主細胞）、及び開始及び終結コドンを包含する。外因性転写要素及び開始コドンは、種々の起源、すなわち天然及び合成源のものであり得る。
細胞の環境刺激又は増殖培地により調節されるプロモーター、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素異化に関連する酵素、及びマルトース及びガラクトース利用を担当する酵素のための遺伝子からのそれらのプロモーターが誘発できる。
【０１１３】
プロモーター、例えば酵素β−因子、アルコールオキシダーゼ、サイトメガロウィルス及びPGHは、構成的であり得る。再考に関しては、Ausubelなど (1987 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N. Y. ) 及び Grant など (1987 Methods in Enzymology 153: 516-544)を参照のこと。
転写の効率は、使用する細胞系に適切なエンハンサーの封入により増大され得る（Scharf, D. , など, 1994 Results Probl. Cell. Differ. 20: 125-62; Bittner, など. , 1987 Methods in Enzymol. 153: 516-544）。ウィルスプロモーターは、SV40初期プロモーター、又はレトロウィルスベクターのLTR内に含まれるプロモーターを包含する。他のウィルスプロモーターは、サイトロメガロウィルスプロモーターを包含する（M Boshart, など. , 1985 Cell 41: 521-530）。
【０１１４】
発現ベクターに使用するための通常使用される真核生物制御配列は、哺乳類細胞、例えばCMVプロモーター及びトリ肉腫ウィルス（ASV）（πLNベクター）と適合できるプロモーター及び制御配列を包含する。他の通常使用されるプロモーターは、サルウィルス40（SV40）からの初期及び後期プロモーター（Fiers, など., 1973 Nature 273: 113）、又は他のウィルスプロモーター、例えばポリオーマアデノウィルス２及びウシ乳頭腫ウィルスに由来するそれらのプロモーターを包含する。誘発性プロモーター、例えばhMTII（Karin, など. , 1982 Nature 299: 797-802）がまた使用され得る。
【０１１５】
酵素ベクターのための転写制御配列は、解糖酵素の合成のためのプロモーターを包含する（Hess など. , 1968) J Adv Enzyme Reg. 7: 149; Holland など. , 1978 Biochemistry 17: 4900）。当業界において知られている追加のプロモーターは、CDMSベクターにおいて供給されるCMVプロモーター（Toyama and Okayama 1990 FEBS 268: 217-221）；３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Hitzeman など. , 1980 J Biol Chem 255: 2073）；及び他の解糖酵素のためのそれらのベクターを包含する。
【０１１６】
特定の翻訳開始シグナルがまた、修飾されたヘプシン分子配列の効果的翻訳のために必要とされ得る。それらのシグナルは、ATG−開始コドン及び隣接する配列を含む。天然に存在するヘプシン分子のATG−開始配列又は上流の配列が、適切な発現ベクター中に挿入され得る。他方では、合成ATG−開始コドン及び他の配列が使用され得る。ATG−開始コドンは、挿入体配列の翻訳を確保するために、正しく読み枠を整合して存在すべきである。
【０１１７】
発現制御要素は、コード配列の3’末端で配置され得る。それらの配列は、メッセンジャーRNAを安定化するよう作用することができる。そのようなターミネーターは、いくつかの酵素由来の及び哺乳類遺伝子におけるコード配列に続いて3’末翻訳領域に見出される。
発現ベクターは、薬物耐性、例えばカナマイシン、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子生成物をコードする少なくとも１つの選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。
【０１１８】
発現ベクターは、いずれかのマーカー遺伝子を含むことができる。それらは、それぞれ、tk−マイナス又はaprt−マイナス細胞に使用され得る、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（M Wigler など. , 1977 Cell 11: 223-32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（I Lowy など. , 1980 Cell 22: 817-23）遺伝子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。また、抗代謝物、抗生物質又は除草剤耐性が、選択のための基礎として使用され、例えばメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（M Wigler など. , 1980 Proc Natl Acad Sci 77: 3567-70）、アミノグリコシドネオマイシン及びG−418に対する耐性を付与するnpt（F Colbere-Garapin など. , 1981 J. Mol. Biol. 150: 1-14）、及びクロロスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するals又はpat（LE Murry, in: McGraw Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill New York N. Y. , pp 191-196）が使用され得る。
【０１１９】
追加の選択可能遺伝子、例えばトリプトファンの代わりにインドールの細胞による使用を可能にするtrpB、又はヒスチジンの代わりにヒスチノールの細胞による使用を可能にするhisDが記載されている（Hartman, and Mulligan 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51）。最近、可視マーカーの使用が普及しており、そしてアントシオニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体の同定のみならず、また特定のベクターシステムに寄与できる一時的又は安定したタンパク質発現の量の定量化のために広く使用される（CA Rhodes など. , 1995 Methods Mol. Biol. 55: 121- 131）。
【０１２０】
ベクターはまた、外因性DNA配列の便利な挿入を可能にする複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含んで成る。本発明の修飾されたヘプシン分子をコードする組み換え発現ベクターを生成するための方法は、当業界において良く知られている（T Maniatis, など. , 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; F Ausubel, など. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N. Y.）。
【０１２１】
修飾されたヘプシン分子を生成するために使用される発現ベクターは、真核生成物宿主細胞と適合できる。そのベクターは、脊椎動物細胞と適合できる。それらのベクターは、発現制御要素、例えば哺乳類遺伝子又は哺乳類ウィルスからのプロモーター及び/又はエンハンサーを包含する。他の発現ベクターは、哺乳類遺伝子又は哺乳類ウィルスからの組織−又は細胞−特異的プロモーター及び/又はエンハンサーを包含する。
【０１２２】
発現ベクターは、他の真核生物宿主細胞、例えば昆虫、植物又は酵母細胞と適合できる。発現ベクターは、発現制御要素、例えば昆虫細胞における発現のためのバキュロウィルスポリヒドリンプロモーターを包含することができる。植物細胞（例えば、熱ショック、RUBISCO、貯蔵タンパク質遺伝子）、ウィルスプロモーター又はリーダー配列、又は植物ウィルスに由来するプロモーター及び/又はエンハンサーがまた使用され得る。
【０１２３】
真核生物細胞発現ベクターは、当業界において良く知られており、そしていくつかの市販源、例えばPSVL 及び pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC,＃31255)、及び類似する真核生物発現ベクターから入手できる。真核生物宿主細胞のための発現ベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：哺乳類宿主細胞のためのベクター、例えばBPV-1; pHyg ; pRSV ; pSV2; pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2; pRc/RSV; pSFVl (Life Technologies); pVPakc ベクター; pCMV ベクター; pSG5 vectors (Stratagene); レトロウィルス ベクター (例えばpFB ベクター (Stratagene)) ; pCDNA-3 (Invitrogen)又はその修飾された形；アデノウィルスベクター；アデノ関連ウィルスベクター；バキュロウィルスベクター。真核生物宿主細胞のための他の発現ベクターは、酵母のためのpESCベクター（Stratagene）及び昆虫細胞における発現のためのpFastBac（Bibco/BRL, Rockville, MD）を包含する。
【０１２４】
発現ベクターは、細菌宿主細胞における発現のための発現制御要素を含むことができる。それらの発現制御要素は、環境条件、例えば熱ショックにより、又は剤、例えばイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（例えば、IPTG）の付加により誘発され得る（N Yamaguchi, など. 2002 The J of Biol Chem 277: 6806-6812）。原核生物の細胞発現ベクターは、当業界において良く知られており、そしていくつかの市販源から入手できる。例えば、pGEX ベクター (Promega, Madison, WI), pTrcHisB ベクター (Invitrogen), pET ベクター (例えば, pET-21, Novagen Corp. ), BLUESCRIPT ファゲミド (Stratagene, LaJolla, CA), pSPORT (Gibco BRL, Rockville, MD), 又は ptrp-lac ハイブリッドが、細菌宿主細胞において修飾されたヘプシン分子を発現するために使用され得る。
【０１２５】
宿主−ベクターシステム：
本発明はさらに、適切な宿主細胞中に導入される、修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列、又はそのフラグメント又は誘導体を含んで成る、ベクター、プラスミド、ファゲミド、BAC、YAC又はコスミドを含んで成る宿主−ベクターシステムを提供する。
宿主−ベクターシステムは、本発明の修飾されたヘプシン分子を転写し、そして/又は発現する（例えば、生成する）ために使用され得る。種々の発現ベクター/宿主システムが、修飾されたヘプシン分子配列を担持し、そして発現するために使用され得る。宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。
【０１２６】
真核生物宿主細胞：
細胞中に修飾されたヘプシン核酸配列を導入するための方法：
適切な真核生物宿主細胞の例は、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は動物細胞、例えば哺乳類細胞を包含する。
修飾されたヘプシン分子を発現するために使用され得る発現システムは、昆虫システムである。１つのそのようなシステムにおいては、オートグラファ・カリホルニア（Autographa californica）核多角体病ウィルス群（AcNPV）がスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞又はトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫において外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。
【０１２７】
修飾されたヘプシン分子をコードする配列は、ウィルスの非必須領域、例えばポリヒドリン遺伝子中にクローン化され、そしてポリヒドリンプロモーターの制御下に配置され得る。修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列の好結果をもたらす挿入は、ポリヒドリン遺伝子を不活性にし、そしてコートタンパク質を欠いている組み換えウィルスを生成する。次に、組み換えウィルスが、修飾されたヘプシン分子が発現され得る、S.フルギペルダ細胞又はトリコプルシア幼虫を感染するために使用され得る（Smith など 1983 J Virol 46: 584; EK Engelhard, など, 1994 Proc Nat Acad Sci 91: 3224-3227）。
【０１２８】
哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づく発現システムが使用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列が、後期プロモーター及び三分節系リーダー配列を有するアデノウィルス転写/翻訳ベクター中に連結され得る。ウィルスゲノムの非必須E1又はE3領域における挿入は、感染された宿主細胞において修飾されたヘプシン分子を発現できる生存ウィルスをもたらす（Logan and Shenk 1984 Proc Natl Acad Sci 81: 3655-59）。
【０１２９】
さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウィルス（RSV）エンハンサーが、哺乳類宿主細胞において発現を高めるために使用され得る。これまでの研究においては、子供ハムスター腎臓（BHK）細胞が、リン酸カルシウム介在性トランスフェクション方法を用いて、ヒトヘプシンcDNAを含んで成るプラスミドによりトランスフェクトされた。そのトランスフェクトされたBHK細胞は、第VII 因子を活性化したヒトヘプシンを発現する（Y Kazama,など. , 1995 J Biol Chem 270: 66-72）。
【０１３０】
酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、多くのベクター、例えば構成又は誘発性プロモーター、例えばβ−因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHが使用され得る。再考に関しては、Ausubel など (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N. Y.) 及び Grant など (1987 Methods in Enzymology 153: 516-544)を参照のこと。
【０１３１】
植物発現ベクターが使用される場合、修飾されたヘプシン分子をコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかにより駆動され得る。例えば、ウィルスプロモーター、例えばCaMVの35S及び19Sプロモーター（Brisson, など. , 1984 Nature 310: 511-514）が、単独で、又はTMVからのオメガリーダー配列と組合して使用され得る（Takamatsu, など. , 1987 EMBO J 6: 307-311）。他方では、植物プロモーター、例えばRUBISCO (Coruzzi など 1984 EMBO J 3: 1671-1680; Broglie など 1984 Science 224: 838-843)の小サブユニット、又は熱ショックプロモーター（J Winter and RM Sinibaldi 1991 Results Probl Cell Differ 17: 85-105）が使用され得る。
【０１３２】
さらに、宿主細胞株は、挿入された修飾されたヘプシン分子ヌクレオチドの発現を調節するか、又は所望する態様で、発現されるタンパク質をプロセッシングするその能力について選択され得る。発現された、修飾されたヘプシン分子のそのような修飾は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アセチル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアセチル化。タンパク質の前駆体形（例えば、プレプロタンパク質）を切断する後−翻訳プロセッシングはまた、正しい挿入、折りたたみ及び/又は機能のためにも重要であり得る。異なった宿主細胞、例えばCHO、HeLa、MDCD、293、WI38、等は、そのような後−翻訳活性のための特異的細胞機構及び特徴的機構を使用し、そして導入される外来性タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確保するために選択され得る。
【０１３３】
原核生物宿主細胞：
適切な原核生物宿主細胞の例は、属、例えばエスシェリチア（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトコーカス（Streptococcus）及びストレプトミセス（Streptomyces）からの細菌株を包含する。例えば、天然に存在するヘプシンを生成するためにこれまで使用されて来た（Y Kazama, など. , 1995 J Biol Chem 270: 66-72）E.コリXL-1 Blue細胞（Stratagene）はまた、修飾されたヘプシン分子を生成するために使用され得る。
【０１３４】
細菌系においては、多くの発現ベクターが、修飾されたヘプシン分子のために意図される使用に依存して選択され得る。例えば、多量の修飾されたヘプシン分子が抗体の誘発のために必要とされる場合、可溶性であり、そして容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指図するベクターが所望される。そのようなベクターは、多機能E.コリクローニング及び発現ベクター、例えばBLUESCRIPT（Stratagene）を包含し、ここで修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列が、アミノ末端Metのための配列、及びガラクトシダーゼの続く７個の残基と読み取り枠を整合してベクター中に連結され、その結果、ハイブリッドタンパク質が生成される。他のベクターは、pINベクター（Van Heeke & Schuster 1989 J Biol Chem 264: 5503-5509）及び同様のものを包含する。
【０１３５】
pGEXベクター（Promega, Madison Wis.）はまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来性タンパク質を発現するためにも使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着により、続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製され得る。そのようなシステムで製造されたタンパク質は、興味あるクローン化されたタンパク質が意図的にGST成分から開放され得るよう、ヘパリン、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むよう企画される。
【０１３６】
修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための方法は、使用されるベクターのタイプ及び使用される宿主系に依存するよく知られた方法である。例えば、脊椎動物細胞においては、核酸配列は、次の種々の方法を用いて、ベクター中に導入される：リン酸カルシウム介在性DNAトランスフェクション（Graham and Van der Eb 1973 Virology 52: 456-467; M Wigler, など 1977 Cell 11: 223-232）又は他のカチオン介在性トランスフェクション方法、エレクトロポレーション（E Neuman, など 1982 EMBO J 1: 841-845）、マイクロインジェクション（WF Anderson, など 1980 Proc Natl Acad Sci USA 77: 5399-5403; MR Cappechi 1980 Cell 22: 479-488; A Graessman, など 1979 J Virology 32: 989-994）、又は脂質小胞におけるDNAの封入を包含する脂質方法（M Schaefer-Ridder 1982 Science 215: 166-168）。他の方法は、粒子ガン方法を包含する。さらに他の方法は、後期プロモーター及び三分節系リーダー配列を含んで成るアデノウィルス転写/翻訳ベクターの使用を包含する。
【０１３７】
核酸配列は、核酸配列によりコードされるタンパク質を発現できる生存ウィルスを創造するために、アデノウィルスゲノムの非必須E1又はE3領域に挿入され得る（Logan and Shenk 1984 Proc Natl Acad Sci 81: 3655- 59）。他方では、レトロウィルストランスファー方法が使用され得る（E Gibloa, など 1986 BioTechniques 4: 504-512）。
【０１３８】
植物細胞は、直接的DNA形質転換又は病原体介在性トランスフェクションにより導入され得る。そのような技法の再考に関しては、Hobbs, S. in: McGraw Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill New York N. Y. , pp 191-196; or Weissbach and Weissbach (1988) in: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York N. Y. , pp 421-463を参照のこと。他方では、植物の細胞は、金属粒子を用いる粒子ガン方法により導入され得る。
【０１３９】
原核生物宿主細胞は、エレクトロポレーション又は塩処理方法により核酸分子と共に導入される（Cohen など. , 1972 Proc Acad Sci USA 69: 2110; Maniatis, T. , など. , 1989 in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。
【０１４０】
形質転換された細胞の選択：
修飾されたヘプシン分子ヌクレオチド配列と共に導入される細胞は、当業界において良く知られている技法により同定され得る。細胞は、選択され、溶解され、そしてそれらのDNA含有物がDNAゲルブロット方法又は類似する方法を用いて、導入された配列の存在について試験される（Southern 1975 J Mol Biol 98: 503; Berent など. , 1985 Biotech 3: 208）。他方では、本発明の細胞から生成されるタンパク質は、生化学アッセイ又は免疫学的方法によりアッセイされ得る。
【０１４１】
いずれかの数の選択システムが、導入された（例えば、形質転換された又はトランスフェクトされた）細胞を回収するために使用され得る。導入された細胞は、それぞれ、tk−マイナス又はaprt-マイナス細胞に使用され得る、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（Wigler, M. ,など. , 1977 Cell 11: 223-32）又はアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I. など. , 1980 Cell 22: 817-23）遺伝子の発現に基づいて選択され得る。
【０１４２】
また、抗代謝物、抗生物質又は除草剤耐性が、選択のための基礎として使用され、例えばメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（M Wigler など. , 1980 Proc Natl Acad Sci 77: 3567-70）、アミノグリコシドネオマイシン及びG−418に対する耐性を付与するnpt（F Colbere-Garapin など. , 1981 J. Mol. Biol. 150: 1-14）、及びクロロスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するals又はpatが使用され得る。
【０１４３】
追加の選択可能遺伝子、例えばトリプトファンの代わりにインドールの細胞による使用を可能にするtrpB、又はヒスチジンの代わりにヒスチノールの細胞による使用を可能にするhisDが記載されている（Hartman, and Mulligan 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51）。最近、可視マーカーの使用が普及しており、そしてアントシオニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体の同定のみならず、また特定のベクターシステムに寄与できる一時的又は安定したタンパク質発現の量の定量化のために広く使用される（CA Rhodes など. , 1995 Methods Mol. Biol. 55: 121- 131）。
【０１４４】
抗体：
本発明はさらに、抗体、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト適合された、ヒト、インターナリゼーション、中和、抗−イディオタイプ抗体、それらの免疫学的活性フラグメント又は誘導体、免疫学的活性を有する組み換えタンパク質、及び標的ポリペプチドを結合する免疫接合体を提供する。用語“標的ポリペプチド”とは、本明細書において使用される場合、本発明の修飾されたヘプチン分子、いずれかの天然に存在するヘプシン分子、又はそれらのフラグメント又は誘導体のいずれかを言及する。
【０１４５】
本発明の抗体は、それらの標的ポリペプチドのいずれかに選択的に結合し、そして非標的ポリペプチドには結合しないであろう（又は弱く結合するであろう）。本発明の抗体は、天然に存在する標的ポリペプチド又は組み換え標的ポリペプチドに結合することができる。本発明の抗体は、細胞により発現される標的ポリペプチドを結合することができる。細胞により発現される標的ポリペプチドは、細胞表面、膜結合された、又は分泌された形を包含する。本発明の抗体は、標的ポリペプチド上の１又は複数のドメイン、例えば細胞質、トランスメンブラン及び/又は細胞外ドメインを結合することができる。抗体は、それらの生来の形及び/又は変性された形で標的ポリペプチドのいずれかに結合することができる。
【０１４６】
本発明の抗体は、標的ポリペプチドを発現するか又は生成する、対象からの細胞又は組織サンプルを結合することができる。そのような細胞又は組織は、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣細胞又は組織を包含する。抗体は、標的ポリペプチドを過剰発現する、対象からの細胞又は組織サンプル、例えば前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣細胞を結合することができる。本発明の抗体は、標的ポリペプチドを発現するか又は過剰発現する、対象からの癌細胞又は組織サンプル、例えば前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣、卵巣、又はそれらの転移した癌細胞からの癌細胞を結合することができる。
【０１４７】
抗体が指図される標的ポリペプチドの領域又はエピトープが意図される適用により変化することは、当業者に理解される。例えば、細胞上で発現されるような細胞表面又は膜結合された標的プロペプチドを検出するために使用される抗体は、細胞表面又は膜結合された標的ポリペプチド上の接近できるエピトープに向けられるべきである。そのような抗体はまた、分泌された形の標的ポリペプチド、例えば対象の血清に存在する標的ポリペプチドを検出するために有用である。他のエピトープ、例えば細胞質ドメインを認識する抗体は、細胞内の標的ポリペプチドを検出するために有用である。
【０１４８】
本発明の抗体は、標的ポリペプチドのいずれかの部分、例えば細胞質ドメイン、トランスメンブランドメイン及び/又は細胞外ドメイン、又はそのいずれかの部分を認識し、そして結合することができる。標的ポリペプチドは、本発明の修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体のいずれかである。
１つの態様においては、本発明の抗体は、図18に示されるように位置１のアルギニンで開始し、そして位置376のロイシンで終結するアミノ酸配列を含んで成る修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を認識し、そして結合することができる。
【０１４９】
もう１つの態様においては、本発明のモノクローナル抗体は、ブタペスト条約の規定下で、2002年７月25日に、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）(ATCC), 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209に寄与され、そしてATCC受託番号PTA−4561を得た、14C7と称するハイブリドーマ細胞系により生成されるそれらのモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体14C7は、位置１でのアルギニンから開始し、そして位置376でのロイシンで終結する、図18に記載されるような本発明の修飾されたヘプシン分子を認識し、そして結合し、そしてIgG1-κイソタイプである。
【０１５０】
もう１つの態様においては、本発明のモノクローナル抗体は、ブタペスト条約の規定下で、2003年９月30日に、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）(ATCC), 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209に寄与され、そしてATCC受託番号（    ）を得た、94A7と称するハイブリドーマ細胞系により生成されるそれらのモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体94A7は、位置45でのアルギニンから出発し、そして位置417でのロイシンで終結する、図17に記載されるようなヘプシン分子、及び位置１でのアルギニンから出発し、そして位置376でのロイシンで終結する、図18に記載されるような本発明の修飾されたヘプシン分子を認識し、そして結合し、そしてIgG2A-κイソタイプである。
【０１５１】
本発明は、単離された抗体を提供する。単離された抗体は、結合、検出、診断、イメージング及び/又はモニター方法を妨げる汚染成分から分離される。好ましい抗体は、当業界において知られているいずれかの方法を用いて精製される。抗体は、いずれかの源、例えばウサギ、羊、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、モンキー、サル及びヒトからのものであり得る。
さらなる態様においては、本発明の抗体は、ヘプシンノックアウト動物、例えばヘプシンノックアウトマウスを免疫化することにより製造される（アメリカ特許第5,981,830号）。もう１つの態様においては、動物は機能的又は修飾されたヘプシン遺伝子を含んで成る。
【０１５２】
ポリクローナル抗体：
本発明の抗体は、免疫原上の異なってエピトープ、例えば免疫原として使用される標的ポリペプチドに対して向けられた異なった抗体集団を含むポリクローナル調製物であり得る。
【０１５３】
ポリクローナル抗体は、当業界において良く知られている方法により生成され得る。ポリクローナル抗体は、免疫原（抗原）及び適切なアジュバントの複数回の注射により、動物、通常哺乳類を免疫化することにより生成される（Harlow and Lane, 1988, in: 4antibodies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press）。注射は、皮膚内、皮下又は腹腔内であり得る。免疫原の投与は一般的に、当業界において理解されるように、適切な期間及び適切なアジュバントの使用による動物中への注射により行われる。免疫化スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の適切度を決定するために取られ得る。Dunberの方法が、ポリクローナル抗体を生成するために使用され得る（BS Dunbar and ED Schwoebel 1990 Methods Enzymol 182: 663-670）。
【０１５４】
一般的に、いずれかの抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル及び同様のもの）が、単離された標的ポリペプチド、又はフラグメントを免疫原として用いて生ぜしめられ得る。さらに、免疫原は、V5、His、マルトース結合タンパク質、GST又はヒトIgに融合される標的ポリペプチドのすべて又は一部を含む融合タンパク質であり得る。例えば、ポリクローナル抗体は、マルトース結合タンパク質に融合されるヒトヘプシンの細胞外ドメインを有する融合タンパク質を用いて、これまで生ぜしめられて来た（Y Kazama, など. , 1995 J Biol Chem 270: 66-72）。標的ポリペプチドを発現するか又は過剰発現する細胞がまた、免疫化のために使用され得る。同様に、標的ポリペプチドを発現するよう構築されたいずれかの細胞が使用され得る。
【０１５５】
十分な長さの標的ポリペプチドが、ポリクローナル抗体を生成するために免疫原として使用され得る。他方では、標的ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列が、抗体を生成するためのそれらのポリペプチドの特定領域を選択するために使用され得る。例えば、それらのアミノ酸配列の疎水性度及び親水性度の分析が、親水性領域を同定するために使用され得る。免疫原構造、及び他の領域及びドメインを示すそれらのアミノ酸配列は、当業界において知られている種々の他の方法（Rost, B. , and Sander, C. 1994 Protein 19: 55-72）、例えばChou-Fasman, Garnier- Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz or Jameson-Wolf分析を用いて容易に同定され得る。
【０１５６】
それらの残基を含むフラグメントは特に、修飾されたヘプシン分子を結合する抗体の生成において適切である。ポリクローナル抗体は、標的ポリペプチドの細胞質、トランスメンブラン及び/又は細胞外ドメインの配列を有する１又は複数の合成ペプチドを用いて生成され得る。ポリクローナル抗体は、触媒ドメインの配列を有する３種の合成ペプチドを用いて、これまで生成されて来た（A Torres-Rosado, など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7181-7185）。
【０１５７】
免疫原の調製方法、及びキャリヤー、例えばBSA、KLH又は他のキャリヤータンパク質とタンパク質との免疫原性接合体の調製方法は、当業界において良く知られている。
動物は典型的には、免疫原混合物を生成するために増強キャリヤー調製物、例えばフロイント完全アジュバント、又は凝集剤と共に、免疫応答を誘発できる、約１μg〜約1mgの免疫原を用いて免疫化される。免疫原混合物は、複数部位で動物中に注射され得る。動物は、フロイント完全アジュバント（又は他の適切なアジュバント）中、元の量の免疫原の約1/5〜1/10の量を含む、低い量の免疫原混合物の少なくとも１回の続く投与により追加免疫化され得る。典型的には、動物は放血され、血清が特定の抗体力価を決定するためにアッセイされ、そして動物が再び追加免疫化され、そして抗体の力価がもはや上昇しなくなるまで、アッセイされる。
【０１５８】
１つの態様においては、本発明のポリクローナル抗体は、ヘプシンノックアウト動物、例えばヘプシンノックアウトマウスを免疫化することにより製造される（アメリカ特許第5,981,830号）。もう１つの態様においては、動物は、機能的又は修飾されたヘプシン遺伝子を含んで成る。前記動物は、ウサギ、羊、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、モンキー、サル又はヒトのいずれかを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１５９】
ポリクローナル抗体血清が、良く知られている方法を用いて集められるか、又は抗体画分がIgG企画を得るために、免疫グロブリン分子、例えばプロテインAを選択的に結合する親和性マトリックスによるクロマトグラフィー処理により富化され得る。富化されたポリクローナル抗体はさらに、免疫親和性クロマトグラフィー、例えば固相−結合の免疫原を用いて富化され得る。例えば、富化されたポリクローナル抗体画分は、固相−結合された免疫複合体を形成するために、抗体分子と免疫原が免疫反応するのに十分な時間、固相−結合された免疫原と接触せしめられる。結合された抗体は、下降するpH又は上昇するイオン強度の緩衝液を用いて、標準の技法により固相から溶出される。溶出された画分はアッセイされ、そして特異的抗体を含むそれらの画分が組み合わされる。
【０１６０】
モノクローナル抗体：
本発明の抗体は、特異的抗原部位を結合するモノクローナル抗体であり得る。本発明のモノクローナル抗体の例は、47A5,14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1, 72H6, 90C1, 85B11, 40F1,7H3, 27E3, 1A12, 及び 94A7として本明細書において記載される抗体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６１】
免疫原を調製し、そして動物を免疫化するための方法は、上記に記載されている。１つの態様においては、本発明のモノクローナル抗体は、ヘプシンノックアウト動物、例えばヘプシンノックアウトマウスを免疫化することにより製造される（アメリカ特許第5,981,830号）。もう１つの態様においては、動物は機能的又は修飾されたヘプシン遺伝子を含んで成る。動物は、ウサギ、羊、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、モンキー、サル又はヒトのいずれかを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６２】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (1975 Nature 256: 495-497; Brownなど. 1981 J Immunol 127: 539-46; Brown など. , 1980 J Biol Chem 255: 4980-83; Yeh など. , 1976 Proc Natl Acad Sci USA 76: 2927-31; Yeh など. , 1982 Int J Cancer 29: 269-75)により最初に記載されるハイブリドーマ技法、又はヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor など. , 1983 Immunol Today 4: 72）、又はEBV−ハイブリドーマ技法（Cole など. , 1985 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96）、又は細胞、動物細胞又は植物細胞における組み換えDNA方法（アメリカ特許第4,816,567号）、又はファージ抗体ライブラリー（Clackson, など. , 1991 Nature 352: 624-628; Marks,など. , 1991 J Mol Biol 222: 581-597）により生成され得る。
【０１６３】
モノクローナル抗体は、RIMMS (KE Kilpatrick, など. , 1997 Hybridoma 16: 381-389)と称する反復性複数部位免疫化方法を用いて製造され得る。他の方法は、Bcl-2及び免疫リンパ球により、安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞系を融合することによる親和性成熟モノクローナル抗体の生成を包含する（KE Kilpatrick, など. , 1997 Hybridoma 16: 381-389）。
【０１６４】
所望する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、抗原が標的ポリペプチドである免疫アッセイによりスクリーンされ得る。所望する抗体を分泌する適切なハイブリドーマ細胞が同定される場合、細胞は、インビトロで又は腹水における生成により培養され得る。次に、所望するモノクローナル抗体が、培養上清液から又は腹水上清液から回収される。
【０１６５】
キメラ性：
本発明のキメラ抗体は、異なった種からの抗体、又は抗体種類又はサブクラスに連結される、１つの種からの抗体部分（例えば、免疫グロブリン部分）、又は特定の抗体種類又はサブクラスを含んで成る。キメラ抗体は、複数種起源のCDR移植された抗体として生成され得る。キメラ抗体の部分は、いずれかの源、例えばウシ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、ネコ、モンキー、サル、魚類、鳥類又はヒトからのものであり得る。特に、キメラ抗体の部分は、ウサギ、羊、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、モンキー、サル及びヒトからであり得る。
【０１６６】
例えば、キメラ抗体の１つの部分は、１つの種の不変の免疫グロブリン部分を包含し、そしてもう１つの部分は可変領域（例えば、抗原組み合わせ領域）を包含する。キメラ抗体は、ヒト部分及び非ヒト部分を含んで成る。不変領域は、ヒト由来し、そして可変領域は、非ヒト種、例えばネズミ種に由来することができる。キメラ抗体は、当業者において知られている方法により生成され得る（Morrison など. , 1985 Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851; Takedaなど. , 1985 Nature 314: 452; Cabilly など. , アメリカ特許第4, 816,567 号; Boss など. , アメリカ特許第4,816, 397号）。キメラ抗体は、１つの種からの超可変ループ領域、及びもう１つの種からの不変骨格領域を含んで成る。ヒト領域を含んで成るキメラ抗体は、それらが非ヒト不変領域及び可変領域を有する抗体よりも、ヒト対象に対して、たぶん低い抗原性であるので、有用である。
【０１６７】
本発明のキメラ抗体はまた、いくつかの明確な抗原結合特異性を有するキメラタンパク質である抗体を含んで成る（例えば、抗−TNP：Boulianne など., 1984 Nature 312: 643; 及び 抗-腫瘍抗原: Sahagan など. , 1986 J Immunol 137: 1066）。本発明はまた、異なったエフェクター機能（Neuberger など. , 1984 Nature 312: 604）、もう１つの種からの免疫グロブリン不変領域及びもう１つの免疫グロブリン鎖の不変領域（Sharon など. , 1984 Nature 309: 364; Tan など. , 1985 J Immunol 135: 3565-3567）を有するキメラタンパク質を提供する。遺伝子修飾を標的化するために相同組み換えを用いて、抗体分子を修飾し、そしてキメラ抗体分子を生成するための追加の方法は記載されている（Fell など. , 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: 8507-8511）。
【０１６８】
一般的に、キメラ抗体を生成するために使用される方法は、次の段階を包含することができる：
ａ）抗体分子の抗原結合をコードする正しい遺伝子セグメントを同定し、そしてクローン化し；この遺伝子セグメント（H鎖のためのVDJ、可変、多様性及び連結領域、又はL鎖のためのVJ、可変、連結領域として、又は単にV又は可変領域として知られている）は、cDNA又はゲノム形のいずれかで存在することができ；
ｂ）不変領域又はその所望する一部をコードする遺伝子セグメントをクローン化し；
【０１６９】
ｃ）前記不変領域により前記可変領域を連結し、その結果、完全なキメラ抗体が、転写され、そして翻訳され得る形でコードされ；
ｄ）この構成体を、選択マーカー及び遺伝子制御領域、例えばプロモーター、エンハンサー及びポリ（A）付加シグナルを含んで成るベクター中に連結し；
ｅ）この構成体を細菌において増幅し；
ｆ）このDNAを、真核細胞（ほとんどは、しばしば哺乳類リンパ球）中に導入し（トランスフェクション）；
ｇ）選択マーカーを発現する細胞を選択し；
ｈ）所望するキメラ抗体を発現する細胞についてスクリーンし；そして
ｉ）適切な結合特異性及びエフェクター機能について試験する。
【０１７０】
ヒト型化抗体：
本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリンからの抗体部分を含んで成るヒト型化抗体を包含する。１つの態様においては、ヒト型化抗体は、ヒトからの超可変性ループ領域及び/又は不変骨格領域を含んで成る。１つの態様においては、ヒト型化抗体は、非ヒト種からの超可変ループ領域及びヒトからの不変骨格領域を含んで成る。ヒト型化抗体は、ヒトからの免疫グロブリン不変領域の少なくとも一部を含んで成る。
【０１７１】
ヒト型化抗体は、いずれかの既知方法に従って、例えば１又は複数の非ヒト抗体CDRを、対応するヒト抗体配列により置換することにより製造され得る（Teng など. , 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80: 7308-7312; Kozbor など. , 1983 Immunology Today 4: 7279; Olsson など., 1982 Meth Enzymol 92: 3-16; Jones 1986 Nature 321-522-525; Riechmann, など. , 1988 Nature 332: 323-329; Verhoeyen など. , 1988 Science 239: 1534-1536; Presta 1992 Curr Op Struct Biol 2: 593-596; Carter など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285; Sims など. , 1993 J Immunol 151: 2296）。
【０１７２】
本発明はまた、より十分にヒト適合されているか、又は十分にヒト適合されている抗体を提供する。それらの抗体は、当業界において知られている方法を用いて生成され得る（Vaughan など. , 1998 Nature Biotechnology 16: 535-539; Griffiths and Hoogenboom,"Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries", in: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from Combinatorial Libraries Id. , pp 65-82; PCT 特許出願W098/24893号, Jakobovits など., published December 3,1997 ; Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4): 607-614）。
【０１７３】
ヒト抗体を生成するための他の方法は、インビトロでの抗原に対してヒトリンパ球を感作するための抗原として、修飾されたヘパリン分子チモーゲン又は修飾されたヘプシンプロテアーゼ、又はそのフラグメント又は誘導体の使用、続くEBV−形質転換又はマウス又はヒトリンパ球による前記高原−感作されたリンパ球のハイブリダイゼーションを包含する（Borrebaeck など., 1988 Proc Natl Acad Sci USA 85: 3995-99）。
【０１７４】
他方では、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリンH及びL鎖遺伝子を発現できないが、しかしヒトH及びL鎖遺伝子を発現できるマウスを用いて生成され得る。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体により通常の態様で免疫化される。トランスジェニックマウスにより所有されるヒト免疫グロブリントランスジーンは、B細胞分化の間、転位し、そして続いて、クラス−スイッチ組み換え及び体細胞突然変異を受ける。
【０１７５】
従って、この技法を用いて、治療的有用なIgG, IgA及びIgB抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するためにこの技法の概略については、Lonberg and Haszar (1995 Int Rev Immunol 13: 65-93)を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技法の詳細な論議は、アメリカ特許第5,625, 126号; 第5,633, 425号;第 5,569, 825号; 第5,661, 016号; 及び第 5,545, 806号に見出され得る。
【０１７６】
インターナリゼーション抗体：
本発明の抗体は、細胞上の標的ポリペプチドへの結合に基づいて、細胞に侵入する（例えば、内在化する）インターナリゼーション抗体であり得る。細胞中に侵入するインターナリゼーション抗体は、細胞の増殖を阻害するか、又は細胞を殺害することができる。従って、インターナリゼーション抗体は、治療方法、例えば細胞増殖を阻害し、そして/又は細胞の死を誘発するために有用である。抗体のインターナリゼーションは、I125ラベルされた抗体を用いて分析され得る（Wolff など. , 1993 Cancer Res. 53: 2560-2565）。
【０１７７】
本発明のインターナリゼーション抗体は、細胞に侵入する速度を示す。この速度は、細胞がインターナリゼーション抗体と接触せしめられる時間から出発するか、又は対象がインターナリゼーション抗体を投与する時間から出発して測定され得る。１つの態様においては、インターナリゼーション抗体は、約24時間以内、又は約12時間以内、又は約１時間以内での細胞侵入する速度を示す。好ましいインターナリゼーション抗体は、細胞との接触後、約30〜60分以内に、又はより好ましくは、約30分以内で細胞に侵入する。それらの態様においては、インターナリゼーションの速度は、細胞がインターナリゼーション抗体と接触せしめられる時間から、又は対象がインターナリゼーション抗体を投与される時間から測定され得る。
【０１７８】
中和抗体：
本発明は、特異的抗原を標的化するために、中和抗体、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。標的抗原を有する基質又はサンプルへの中和抗体、又はそのフラグメント又は誘導体の投与は、標的抗原の作用、工程及び/又は能力を非効果的にすることができる。中和抗体、又はそのフラグメント又は誘導体は、標的抗原により結合される分子の作用、工程及び/又は能力を非効果的にすることができる。
【０１７９】
中和抗体、又はそのフラグメント又は誘導体は、細胞作用、工程及び/又は能力、例えば細胞周期、細胞分化、細胞増殖を阻害することができる。本発明の１つの態様においては、中和抗体は、ヘプシン分子の切断及び/又は活性化を阻止する（例８を参照のこと）。もう１つの態様においては、本発明の中和抗体は、活性化されたヘプシンのその基質の認識、結合及び/又は切断を阻害する。本発明の中和抗体の例は、1A12及び94A7のような本明細書に記載されるモノクローナル抗体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１８０】
組み換えタンパク質：
さらに、本発明は、本発明の抗体の機能的活性を示す（例えば、標的ポリペプチド、例えば野生型又は修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を結合する）組み換えタンパク質を提供する。本発明の組み換えタンパク質は、組み換えタンパク質を発現するよう構築された細胞により生成され得る。組み換えタンパク質は、従来の抗体を生成するために使用される方法、例えばポリクローナル技法、ハイブリドーマ技法、及び/又はファージライブラリー技法により生成され得る（RD Mayforth and J Quintans 1990 New Eng J Med 323: 173-178; TA Waldmann 1991 Science 252: 1657-1662; G Winter and C Milstein 1991 Nature 349: 293-299; SL Morrison 1992 Ann Rev Immunol 10: 239-266）。
【０１８１】
本発明の組換えタンパク質は、標的ポリペプチドを結合する一本鎖ポリペプチド分子であり得る。抗体のFv部分のH及びL鎖は、単一のヌクレオチド配列によりコードされ、そしてリンカー配列を包含する（Bird など. 1988 Science 242: 423-426; Huston など. 1988 Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883）。
組換えタンパク質は、一特異的であるか、又は二特異的であり得る。二特異的タンパク質は、標的ポリペプチドを結合する１つの部分、及び異なった標的タンパク質を結合する１つの部分を有するであろう。一特異的タンパク質は、標的ポリペプチドを結合する１つの部分を有する。
【０１８２】
競争的に阻害する抗体：
本発明は、標的ポリペプチドへの本発明の抗体のいずれかの免疫特異的結合を競争的に阻害する抗体を提供する。競争阻害抗体は、本発明の抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合することができる。それらの抗体は、例えば本発明の抗体のいずれかを用いて通常の競争アッセイにより同定され得る（Harlow, E. and Lane, D. 1988 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。
【０１８３】
例として、競争アッセイは、競争ELISAアッセイであり得る。競争ELISAアッセイは、標的ポリペプチド（例えば、野生型又は修飾されたヘプシン、又はそのフラグメント又は誘導体）によりマイクロタイタープレートのウェルの被覆を包含し、任意の段階は候補体抗体とのプレインキュベーション、マイクロタイタープレートと本発明のラベルされた抗体との接触を包含する。ラベルされた抗体は、例えば検出でき且つ/又は測定できるラベル、例えばビオチンによりラベルされた本発明の抗体であり得る。
【０１８４】
標的ポリペプチドに結合される本発明のラベルされた抗体の量は、同じエピトープへの結合のために競争する（例えば、同じエピトープを結合することから本発明のラベルされた抗体を阻止する）候補体抗の能力と間接的に関係している。本発明の結合される、ラベルされた抗体の量は測定され得る。候補体抗体は、それが本発明のラベルされた抗体の少なくとも約20％、又は少なくとも約20〜50％、又は少なくとも50％又はそれ以上の結合を阻止する場合、競争阻害抗体であると考慮される。他の競争アッセイが行われ得ることは、当業者により理解される。
【０１８５】
抗−イディオタイプ抗体：
本発明は、標的ポリペプチドを模倣する抗−イディオタイプ抗体を提供する。抗−イディオタイプ抗体は、本発明の抗体のいずれか上のイディオタイプを結合する。
抗−イディオタイプ抗体を生成するための方法は当業界において良く知られている（Wagner など. , 1997 Hybridoma 16: 33-40; Foon など. , 1995 J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn など. , 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76）。そのような抗−イディオタイプ抗体は、腫瘍抗原に対して向けられる他の抗−イディオタイプ抗体により現在、実施されるように、抗−イディオタイプ治療に使用され得る。
【０１８６】
抗体フラグメント：
本発明はまた、標的ポリペプチドを認識し、そして結合する抗体フラグメントを包含する。免疫学的に反応性のフラグメント、例えばFab, Fab’又はF(ab’)2フラグメントの使用は、それらのフラグメントが一般的に、完全な免疫グロブリンよりも低い免疫原性であるので、特に治療の場合、しばしば好ましい。抗体フラグメントは、損なわれていない抗体の一部、例えば損なわれていない抗体の抗原−結合又は可変領域を含んで成る。抗体フラグメントは、損なわれていない抗体の不変領域を含んで成る。
【０１８７】
抗体フラグメントは、Fab, F(ab’)2又はFvフラグメント（アメリカ特許第5,641,870号；Zapata,など. 1995 Protein Eng 8: 1057-1062）、また標的ポリペプチドを結合する一本鎖抗体及び組換えタンパク質を包含する。抗体フラグメントは、Fab及びFcフラグメントを生成するために損なわれていない抗体のパパイン消化により、又はF(ab’)2フラグメントを生成するためにヘプシン消化により生成され得る。
【０１８８】
さらに、抗体エフェクター機能は、癌に対する抗体の治療効果を増強するために修飾され得る。例えば、システイン残基は、Fc領域中に構築され、鎖間ジスルフィド結合の形成、及びインターナリゼーション、ADCC及び/又は補体−介在性細胞殺害のための増強された能力を有するホモダイマーの生成を可能にされる（Caron など. , 1992 J Exp Med 176: 1191-1195; Shopes, 1992, J. Immunol. 148: 2918- 2922). Homodimeric antibodies can also be generated by cross-linking techniques known in the art (Wolffetal., 1993 Cancer Res. 53: 2560-2565）。
【０１８９】
ラベルされた抗体：
本発明は、検出できるマーカーによりラベルされる、抗体、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト適合された、ヒト、インターナリゼーション、中和、抗−イディオタイプ抗体、免疫学的活性のそれらのフラグメント、免疫学的活性を有する組換えタンパク質、及び免疫接合体を提供する。検出できるマーカーは、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発行化物、発色団、金属キレーター、ビオチン又は酵素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１９０】
本発明のラベルされた抗体は、生物学的サンプル及び/又は診断イメージング方法において標的ポリペプチドを検出するために種々の免疫学的アッセイにおいて特に有用である。そのようなアッセイは一般的に、標的ポリペプチドを認識し、そして結合する１又は複数のラベルされた抗体を含んで成り、そして当業界において良く知られている種々の免疫学的アッセイ形、例えば種々のタイプの沈殿、凝集、補体固定、競争、阻害、放射性イムノアッセイ（RIA）、酵素結合されたイムノソルベントアッセイ（ELISA）、酵素結合された免疫蛍光アッセイ（ELIFA）（H Liu など. 1998 Cancer Research 58: 4055-4060）、免疫組織化学アッセイ及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
さらに、標的ポリペプチドを発現する細胞を検出する免疫学的イメージング方法、例えば本発明のラベルされた抗体を用いてのラジオシンチグラフィーイメージング方法（但し、それだけには限定されない）がまた提供される。
【０１９１】
接合された抗体：
本発明の抗体、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト適合された、ヒト、インターナリゼーション、中和、抗−イディオタイプ抗体、免疫学的活性のそれらのフラグメント、免疫学的活性を有する組換えタンパク質、又はそのフラグメントが、治療剤、例えば細胞毒性剤に接合され、それにより免疫接合体がもたらされる。例えば、治療剤は、抗腫瘍薬物、トキシン、放射性活性剤、サイトカイン、リンホカイン、オンコスタチン、第２抗体又は酵素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。さらに、本発明は、本発明の抗体が、プロドラッグを細胞毒性薬物に転換する酵素に結合される１つの態様を提供する。
【０１９２】
細胞毒性剤の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：リシン、リシンA−鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ビヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンD、ジフテリアトキシン、エピチロン、シュードモナス内毒素(PE)A、PE40, アブリン、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアミシン、サパオナリン常備インヒビター、マイタンシノイド、グルココルチコイド、及び化学治療剤、並びに放射性同位体。
【０１９３】
適切な放射性同位体は、次のものを包含する：アンチモン-124、アンチモン-125、砒素-74、バリウム-103、バリウム-140、ベリリウム7、ビスマス-j206、ビスマス-207、カドミウム-109、カドミウム-115m、カルシウム量-45、セリウム-139、セリウム-141、セリウムー144、セシウム137、クロム-51、コバルト-56、コバルト-57、コバルト-58、コバルト60、コバルト-64、エルビウム-169;  ユウロピウム-152、ガドリニウム-153、金-195、金-199、ハフニウム-175、ハフニウム-181、インジウム-111、沃素-123、沃素-131、イリジウム-192、鉄-55、鉄-59、クリプトン-85、リード-210、ルテチウム-177、マンガン-54、水銀-197、水銀-203、モリブデン-99、ネオジウム-147、ネプツニウム-237、ニッケル-63;  ニオビウム-95、オスミウム185+191、パラディアム-103、プラチナ-195m、プラセオジム-143、プロメチウム-147、プロトアクチニウム-233、ラジウム-2226、レニウム-186、ルビジウム-86、ルテニウム-103、ルテニウム106、スカンジウム-44、スカンジウム-46、セレニウム-75、銀-110m、銀-11、ナトリウム-22、ストロンチウム-85;  ストロンチウム-89、ストロンチウム90、イオウ35、タンタル-182、テクネチウム-99m、テルル-125、テルル-132、タリウム-170、タリウム-204、トリウム-228、トリウム-232、スズ-113、チタニウム-44、タングステン-185、バナジウム-48、バナジウム-49、イッテルビウム-169、イットリウム88、イットリウム-90、亜鉛-65、およびジルコニウム-95。抗体はまた、プロドラッグをその活性形に転換することができる抗癌プロドラッグ活性化酵素に接合され得る。
【０１９４】
抗体に治療剤を接合するか又は連結するための技法は良く知られている（Arnon など. , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld など. (eds), pp 243-56 (Alan R Liss, Inc 1985); Hellstrom など. ,"Antibodies For Drug Delivery", in: Controlled Drug Delivery (2nd Ed), Robinsonなど. (eds), pp 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in: Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera など. (eds), pp. 475-506 (1985); 及び Thorpe など.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immune. Rev, 62: 119- 58 (1982); Sodee など. , 1997, Clin Nuc Med 21: 759-766）。ある環境下で、例えばカルボジイミド試薬を用いての直接的な接合が使用され得；他の場合、連結試薬、例えばPierce Chemical Co., Rockford, ILにより供給されるそれらの試薬が効果的である。
【０１９５】
抗体の放射性ラベリングは、キレート化剤中に挿入される放射性核種と共に、抗体に共有結合されるキレート化剤を用いて達成される。好ましいキレート化剤は、Srivagtavaなど. Nucl. Med. Bio. 18: 589-603,1991 及び McMurry など., J. Med. Chem. 41: 3546-3549,1998. 又はいわゆるNOTAキレート由来の、 published in H. Chong, K. など. , J. Med Clietn. 45: 3458-3464,2002（すべて、引用により本明細書に組み込まれる）に示される。
【０１９６】
二官能価キレート化剤p-SCN-ベンジル−DPTA（Brechbiel など. Inorg. Chem. 25: 2772-2781,1986）の誘導体、例えば（シクロヘキシル-DTPA (CHX-A"-DTPA, Wuなど., Bioorg Med. Chem. 10: 1925-1934,1997) 及び MX-DTPA (1B4M-DTPA, McMurry など. , J. Med. Chem., 41: 3546-3549, 1998),並びに1,4, 7- トリアザシクロノナン-N, N', N"-トリ酢酸  (NOTA) (Chong など. J. Med. Chem. 45: 3458- 3464,2002）が、RG1抗体への放射性同位体の接合のために特に好ましい。接合は、Nikula など. Nucl. Med. Biol. 3: 387-390,1995の方法により達成され得る。
【０１９７】
免疫シンチグラフィーのための検出できるマーカーとして使用するために、次のものが特に好ましい：放射性同位体111In又は99mTc。陽電子放出性断層撮影法のための好ましい検出できるマーカーは、43Sc, 44Sc, 52Fe, 55Co, 68Ga, 64Cu, 86Y及び94mTcである。免疫療法に関しては、β−放出性放射性同位体46Sc, 47Sc, 48Sc, 72Ga, 73Ga, 90Y, 67Cu, l09Pd, 111Ag, 149Pm, 153Sm, l66Ho, l77Lu, l86Re, 及び l88Re、及びα−放出性同位体211At, 2llBi, 212 Bi, 213 Bi 及び 2l4Biが使用され得る。90Y, l77Lu, 72Ga, l53Sm, 67Cu 及び 2l2Biが好ましく、そして90Y及び177Luが特に好ましい。
【０１９８】
免疫接合体は、標的ポリペプチドを発現する細胞に治療剤を標的化するために使用され得る（ES Vitetta, など. , 1993 Immunotoxin Therapy, in: DeVita, Jr. , V. T. et al., eds, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed. , JB Lippincott Co. , Philadelphia, 2624-2636）。
【０１９９】
医薬組成物及びキット：
本発明は、当業者に知られている許容できるキャリヤー又はアジュバントと共に混合される本発明の分子を含んで成る医薬組成物を提供する。医薬組成物は好ましくは、本発明の分子と共に組み合わされる場合、その分子の活性を保持し、そして対象の免疫系と非反応性であるいずれかの材料を含む、適切なキャリヤー及びアジュバントを含む。
【０２００】
それらのキャリヤー及びアジュバントは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カルシウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、リン酸緩衝溶液、水、エマルジョン（例えば、油/水エマルジョン）、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基材の物質及びポリエチレングリコール。
【０２０１】
他のキャリヤーはまた、無菌溶液、錠剤、例えば被覆された錠剤及びカプセルを包含する。典型的には、そのようなキャリヤーは、賦形剤、例えば澱粉、ミルク、糖（例えば、スクロース、グルコース、マルトース）、一定のタイプのクレー、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、タルク、植物脂肪又は油、ガム、グリセロール、又は他の既知賦形剤を包含する。そのようなキャリヤーはまた、風味及び着色添加剤又は他の成分を含むことができる。そのようなキャリヤーを含んで成る組成物は、良く知られている従来の方法により配合される。そのような組成物はまた、種々の脂質組成物、例えばリポソーム内に、及び種々のポリマー組成物、例えばポリマー微小球に配合され得る。
【０２０２】
本発明の組成物を、遊離形又は医薬的に許容できる形で含んで成るキットがさらに提供される。キットは、その投与のための説明書を含んで成る。本発明のキットは、本発明のいずれかの方法に使用され得る。
【０２０３】
修飾されたヘプシン分子の結晶構造：
本発明は、本発明の修飾されたヘプシン分子の結晶及び/又は分子構造を提供する。修飾されたヘプシン分子は、例えば配列番号９−11として本明細書に記載される組換えプラスミドから発現される。発現されたタンパク質は、当業者に知られているプロトコール及び条件に従って結晶化され得る（A. McPherson, 1999, Crystallization of Biological Macromolecules, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ISBN: 0879696176; A. Ducruix and R. Giege, 1999, Crystallization of Nucleic acids and Proteins: A Practical Approach, 2nd Edition, Oxford University Press; ISBN: 0199636788）。
【０２０４】
修飾されたヘプシン結晶が形成されると、結晶は、当業者に知られているプロトコール及び条件に従って、X−線結晶学により分析され得る（J Drenth, 1999, Principles of Protein X-ray Crystallography, 2nd Edition, Springer Verlag; ISBN: 0387985875）。X−線結晶学により集められた回折データが分析され、そして修飾されたヘプシン分子の構造を構成するために使用され得る（G. Rhodes, 2000, Crystallography Made Crystal Clear, 2nd Edition, Academic Press; ISBN: 0125870728; A. Leach, 2001, Molecular Modelling: Principles and Applications, 2nd Edition, Prentice Hall; ISBN: 0582382106）。結晶及びその結晶から得られる情報は、前記に記載されるように、ヘプシンリガンドをスクリーンするか、又はそれを企画するために使用され得る。さらに、ヘプシンの分子構造は、前記に記載のようにして、ヘプシン誘導体を企画するために使用され得る。
【０２０５】
方法：
本発明はまた、前記記載の組成物を用いての方法を含んで成る。
修飾されたヘプシン分子の検出：
当業者は、当業界において知られている酵素アッセイを行うことにより、修飾されたヘプシン分子の存在について容易にアッセイすることができる。１つの態様においては、酵素アッセイは、次の段階を含んで成る：１）活性化された修飾されたヘプシン分子を生成するために、置換体活性化配列を認識し、そして切断する活性化プロテアーゼと、チモーゲン形での修飾されたヘプシン分子とを接触する段階；２）切断された基質を生成するために、活性化された修飾されたヘプシン分子とオリゴペプチド基質とを接触する段階；及び３）切断された基質の存在を検出する段階。オリゴペプチド基質は、蛍光放出を通して、切断された基質の検出を可能にする蛍光剤に連結され得る（N Yamaguchi, など. , 2002 The J Biol Chem 277: 6806-6812）。
【０２０６】
機能的活性の修飾されたヘプシン分子の存在を検出するための方法は、ザイモグラフィーゲル方法におけるゼラチン又はカゼインの切断の検出を包含する（Lin など. , 1997, JBC 272: 9147-52; N Yamaguchi, など. , 2002 The J Biol Chem 277: 6806-6812）。
機能的活性の修飾されたヘプシン分子の存在を検出するための他の方法は、本明細書の例セクションん記載される方法を用いて行われ得る。
【０２０７】
それらの方法のいずれかは、活性部位インヒビター、例えばp-アミジノフェニルメタンスルホニル弗化物塩酸塩、ロイペプチン又はアンチパインの存在下で行われ得る（J Kraut, 1977, Ann Rev Biochem 46: 331-358）。他のインヒビターは、修飾されたヘプシン分子における置換体活性化配列の同起源のプロテアーゼによる認識及び/又は切断を競争的に阻害する剤を包含する。インヒビターはまた、置換体活性化配列を認識し、そして結合する抗体を包含することができる。
【０２０８】
ヘプシンリガンドの検出：
本発明のもう１つの観点は、ヘプシンリガンド、すなわちヘプシン分子に結合するか、又はそれにより結合され、そして/又はヘプシン分子の生物学的活性を調節する、興味ある剤及び細胞構成成分を同定するためのスクリーニング方法に関する。そのようなスクリーニング方法の１つの目的は、ヘプシンの生物学的活性の変化、例えば活性化又は阻害を引き起こし、それにより、リガンド及び/又はヘプシンの異常細胞発現に関連する疾病を低めるヘプシンリガンドを同定することである。もう１つの目的は、ヘプシン調節により、活性化又は阻害が影響され、それにより、リガンド及び/又はヘプシンの異常細胞発現に関連する疾病を低めるヘプシンリガンドを同定することである。
【０２０９】
本発明は、野生型ヘプシン分子の活性を阻害することが知られている化合物により阻害される、野生型ヘプシン分子の同じか又は類似する機能的活性を有する、修飾されたヘプシン分子を提供する。本発明の修飾されたヘプシン分子は、ヘプシン、例えばヘプシンのインヒビターと相互作用するか、それと競争するか、そして/又はそれを調節するリガンドを同定するためにスクリーニングアッセイに使用され得る。
【０２１０】
１つの態様においては、スクリーニングアッセイは、次の段階を含んで成る：ラベルされた、修飾されたヘプシン分子と、試験剤又は細胞抽出物とを、前記試験剤又は細胞抽出物の成分と、前記修飾されたヘプシン分子との会合（例えば、結合）を可能にする条件下で接触し；そして前記修飾されたヘプシン分子と結合する剤又は成分を含んで成る複合体が形成されるかどうかを決定する段階。スクリーニング方法は、高処理能力のスクリーニング方法への使用のために適切である。
【０２１１】
修飾されたヘプシン分子と剤との結合は、分子量の移動又は結合の修飾されたヘプシン分子の生物学的活性の変化、又は２−ハイブリッドシステムにおけるレポーター遺伝子の発現を用いてアッセイされ得る（Fields, S. and Song, O., 1989, Nature 340: 245-246）。剤/細胞成分が修飾されたヘプシン分子に結合するかどうかを同定するために使用される方法は、使用される、修飾されたヘプシン分子の性質に主に基づかれるであろう。例えば、ゲル遅延アッセイは、剤が修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体に結合されるかどうかを決定するために使用され得る。
【０２１２】
他方では、免疫検出及びバイオチップ（例えば、アメリカ特許第4,777,019号）技法は、修飾されたヘプシン分子と共に使用するために採用され得る。修飾されたヘプシン分子と結合する剤を同定するためのもう１つの方法は、免疫型細胞からの糖脂質抽出物を用いるTCLオーバーレイアッセイを用いる（K. M. Abdullah, など. , 1992 Infect. Immunol. 60: 56-62）。当業者は、特定の剤が本発明の修飾されたヘプシン分子に結合するかどうかを決定するために多くの知られている技法を容易に用いることができる。
【０２１３】
１つの態様においては、ヘプシンリガンドは、本発明のラベルされた、修飾されたヘプシン分子を結合することにより検出され得る。ラベルは、当業界において知られているそれらのラベル、例えば放射性同位体ラベル、蛍光ラベル及び他のものを包含する。そのようにして検出されるヘプシンリガンドは、可溶性であり、又は対象からの細胞又は組織サンプルに結合され得る。ヘプシンリガンドはまた、対象からの腫瘍細胞又は腫瘍組織に存在するか、又は過剰発現され得る。
【０２１４】
もう１つの態様においては、複合体の一部としての修飾されたヘプシン分子の生物学的活性は、ヘプシン活性のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するための手段として分析され得る。
例えば、CD22（D. Sgroi,など. , 1993 J. Biol. Chem. 268: 7011-7018; L. D. Powell, など. , 1993 J. Biol. Chem. 268: 7019- 7027）を結合する細胞成分を単離するために使用される方法は、固定された抗−修飾されたヘプシン抗体を有する親和性カラムと細胞抽出物とを接触することにより、修飾されたヘプシン分子に結合する細胞表面糖タンパク質を単離するために適合され得る。
【０２１５】
もう１つの例においては、色原体及び/又は蛍光原性基質に基づくアッセイ、例えばLottenbergなど. (Lottenberg, R. , Christensen, U. , Jackson, C. , and Coleman, P. L. , 1981, Methods Enzymol, Assay of coagulation proteases using peptide chromogenic and fluorogenic substrates, 80: 341-361) 又は Phillips など (Phillips, G. , Davey, D. D. , Eagen, K. A. , Koovakkat, S. K. , Liang, A. , Ng, H. P. , Pinkerton, M. , Trinh, L. , Whitlow, M. , Beatty, A. M., and Morrissey, M. M. , 1999, J Med Chem, Design, synthesis, and the activity of 2,6- diphenoxypyridine-derived factor Xa inhibitors, 42 (10): 1740-56)により記載されるそれらのアッセイは、活性化された、修飾されたヘプシンプロテアーゼの存在を検出するために行われ得る。他方では、同じアッセイが、候補体化合物のライブラリーから興味ある化合物を同定するために使用され得、ここで前記興味ある化合物は修飾されたヘプシンプロテアーゼの活性を阻害する。
【０２１６】
スクリーニングアッセイに使用され得るヘプシン阻害化合物は、４−アミジオフェニルメチルスルホニル弗化物、アプロチニン、抗トロンビンIII （Kazama など, J. Biol. Chem., 1995,270 : 66-72）、ロイペプチン、アンチパイン、Nα−トシル−L−リシンクロロメチルケトン及び大豆トリプシンインヒビター（Zhukov など. , Biochim Biophys Acta, 1997,1337 : 85-95）を包含する。
【０２１７】
アッセイのもう１つの態様は、酵母２−ハイブリッドシステム（Fields, S. and Song, O., 前記）を用いての、又は結合−捕獲アッセイ（Harlow, 前記）を用いての、修飾されたヘプシン分子に結合する剤及び細胞構成成分のスクリーニングを包含する。一般的に、酵母２−ハイブリッドシステムは、レポーター遺伝子を担持する酵母宿主細胞おいて行われ、そしてDNA結合ドメイン及び転写活性化ドメインを有するGAL転写因子のモジュール調整した性質に基づかれる。２−ハイブリッドシステムは、DNA結合ドメインを含んで成る組換えタンパク質と、モジュラー転写因子の転写活性を再構成し、それによりレポーター遺伝子の発現を引き起こす転写活性ドメインを含んで成るもう１つの組換えタンパク質との間の物理的相互作用に依存する。
【０２１８】
２−ハイブリッドシステムに使用される組換えタンパク質のいずれかは、ヘプシン結合パートナーをスクリーンするために、修飾されたヘプシンコードの配列を含むよう構成され得る。酵母２−ハイブリッドシステムは、cDNA発現ライブラリー（G. J. Hannon, など. 1993 Genes and Dev. 7: 2378-2391）、ランダムaptmerライブラリー（J. P. Manfredi, など. 1996 Molec. And Cell. Biol. 16: 4700-4709）、又は半−ランダムaptmerライブラリー（M. Yang, など. 1995 Nucleic Acids Res. 23: 1152-1156）を、ヘプシンリガンドについてスクリーンするために使用され得る。
【０２１９】
本発明のもう１つの態様は、ヘプシンリガンドをスクリーンし、そして/又はその企画を助け、すなわちそのようなリガンドを合理的に企画するために、本発明の修飾されたヘプシン分子の結晶構成を用いることを包含する。
【０２２０】
例えば、ヘプシンを結合する剤をスクリーンするためには、本発明の修飾されたヘプシン分子を用いてのX−線結晶学が使用され得る。修飾されたヘプシン分子は結晶化され得、そして可能性ある結合剤がその結晶に暴露され得る。他方では、本発明の修飾されたヘプシン分子が、溶液での可能性ある結合剤に暴露され、そして修飾されたヘプシン分子が結合剤により同時結晶化され得る。次に、X―線回析データが得られ、そして前記剤が、リガンド/受容体複合体を形成するために修飾されたヘプシンに結合するかどうかを決定するために、結晶構造が解明される。
【０２２１】
さらに、X−線結晶学が、ヘプシンリガンドの企画を助けるか又は存在するリガンドを修飾するために使用され得る。修飾されたヘプシン分子が結晶化され、そして回析データが標準のX−線結晶学を用いて得られる。このX−線結晶学データは、修飾されたヘプシン分子の構造を提供する。分子構造が知られると、その構造は、リガンドの今後の機能について特別に企画された個々の性質を包含する種々の性質を有するヘプシンリガンドを企画するために使用され得る。他方では、ヘプシン構造データにより、既知ヘプシンリガンドは、所望する特性を付加するために修飾され得る。例えば、ヘプシンリガンドは、その結合特異性、親和性、生物学的活性及び/又は安全性プロフィールにおいて修飾され得る。
【０２２２】
スクリーニングアッセイに使用される修飾されたヘプシン分子は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：単離された、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体；修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体をコードするヌクレオチド配列；修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を発現するよう変更された細胞；修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を発現するよう変更されている細胞の画分；ヘプシン抗体、例えば抗−イディオタイプ抗体。
【０２２３】
修飾されたヘプシン分子との結合及び/又は修飾されたヘプシン分子の活性の調節について試験されるべき候補体剤は、例えばペプチド、小分子、及びビタミン誘導体、並びに炭水化物であり得る。当業者は、修飾されたヘプシン分子への結合について試験される剤の構造性質に関して制限は存在しないことを容易に理解するであろう。１つの種類の剤は、ペプチド剤であり、このアミノ酸配列は修飾されたヘプシン分子のアミノ酸配列に基づいて選択される。小ヘプチド剤は、修飾されたヘプシン分子の競争インヒビターとして作用することができる。
【０２２４】
修飾されたヘプシン分子との結合及び/又は修飾されたヘプシン分子の活性の調節について試験される候補体剤は、ランダムに又は合理的に選択され得る。
本明細書において使用される場合、剤は、その剤が修飾されたヘプシン分子の特定配列を考慮しないでランダムに選択される場合、ランダムに選択される。ランダムに選択された剤の例は、キメラライブラリー、ヘプチド組み合わせライブラリー、生物の増殖ブイヨン、又は植物抽出物のメンバーである。
【０２２５】
本明細書において使用される場合、剤は、その剤が標的部位の配列、及び/又は剤の作用に関してのそのコンホメーションに基づかれる非ランダム基礎に基づいて選択される場合、合理的に選択される。剤は、修飾されたヘプシン分子を構成するペプチド配列を用いることにより、合理的に選択され得る。例えば、合理的に選択されたペプチド剤は、そのアミノ酸配列が修飾さたヘプシン分子の選択されたフラグメントと同一であるペプチドであり得る。
【０２２６】
修飾されたヘプシン分との結合、及び/又は修飾されたヘプシン分子の活性の調節について試験されるべき細胞抽出物は、細胞又は組織の水性抽出物、細胞又は組織の有機抽出物、又は部分的に精製された細胞画分であり得る。当業者は、本発明のスクリーニング方法に使用される細胞抽出物の源に関して制限は存在しないことを容易に認識することができる。
【０２２７】
ヘプシン誘導体の企画：
本発明のもう１つの態様においては、X−線結晶学データに由来するヘプシンの分子構造が、ヘプシン誘導体を企画するために使用され得る。本発明の修飾されたヘプシン分子が結晶化され、そして回析データが標準のX−線結晶学技法を用いて得られる。ヘプシン分子の構造が決定され、そしてモデルが形成され得る。ヘプシン分子の性質は、ヘプシン分子構造に基づいてヘプシン誘導体を形成するよう修飾され得る。１つの例においては、ヘプシン分子中への突然変異の導入が、ヘプシン誘導体を製造することができる。そのように修飾されたヘプシン誘導体は、変更された性質、例えば変更された結合特異性、親和性、生物学的活性及び/又は安全性プロフィールを有することができる。
さらに、ヘプシン誘導体が製造されると、ヘプシン誘導体に対するリガンド及び/又は抗体が生成され得る。
【０２２８】
本発明の抗体の使用：
標的ポリペプチドに対する本発明の抗体の反応性は、多くの良く知られている方法、例えばウェスターンブロット、ELISA及びFACS分析により、適切な場合、種々の標的ポリペプチドのいずれか１つ、又は種々の標的ポリペプチドのいずれか１つを発現する細胞、又はその抽出物を用いて確立され得る。種々の標的ポリペプチドは、天然に存在するヘプシン分子、又は本発明の修飾されたヘプシン分子のいずれかを包含する。抗体は、種々のインビトロアッセイ、例えば補体−介在性の腫瘍細胞溶解、抗体−依存性細胞毒性（ADCC）、抗体−依存性マクロマージ−介在性細胞毒性（ADMMC）、腫瘍細胞増殖及び同様のものにより特徴づけられ得る。
【０２２９】
本発明の抗体は、サンプルにおける標的ポリペプチドのいずれか１つの存在を検出するための方法に使用され得る。サンプルは、組織及び生物学的流体、例えば組織抽出物、尿、血液、血清、粘液質及び痰を包含する。例えば、免疫蛍光方法は、抗−ヘプシン、ポリクローナル抗体を用いて、調製された組織切片におけるヘプシンを検出するためにこれまで使用されて来た（A Torres-Rosado, など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7181-7185）。
【０２３０】
本発明の抗体はまた、標的ポリペプチドを発現するか又は過剰発現する、癌細胞又は転移した癌細胞の診断、イメージング及び/又はモニターのために有用である。検出方法は、対象からの細胞上の、又は組織サンプル又は調製された組織サンプルスライスにおける標的ポリペプチドの存在の検出を包含する。それらの方法は、当業界において良く知られている種々の免疫学的アッセイ形、例えば種々のタイプの沈殿、凝集、補体固定、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合されたイムノソルベントアッセイ（ELISA）、酵素結合された免疫蛍光アッセイ（ELIFA）（H Liu など. 1998 Cancer Research 58: 4055-4060）、免疫組織化学分析及び同様の方法を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２３１】
さらに、癌を検出できる免疫学的イメージング方法、例えば本発明のラベルされた抗体を用いての放射性シンチグラフィーイメージング方法がまた、本発明により提供されるが、但しそれらだけではない。イメージング方法は、インジウム−11又は他の同位体を用いての免疫シンチグラフィー、例えば再発性及び転移性前立腺癌を検出するために使用される方法を包含する（Sodee など. , 1997 Clin Nuc Med 21: 759-766）。
【０２３２】
本発明の抗体は、標的ポリペプチドを発現するか又は生成する細胞を検出するために使用され得る。そのような細胞は、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣細胞を包含する。抗体は、標的ポリペプチドを過剰発現する細胞、例えば前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣細胞を結合することができる。
本発明の抗体は、対象における標的ポリペプチドを発現する組織サンプルにおける標的ポリペプチドを検出するために使用され得る。抗体は、組織サンプルにおける標的ポリペプチドの過剰発現を検出するために使用され得る。そのような組織サンプルは、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣細胞からのサンプルを包含する。
【０２３３】
本発明の抗体は、標的ポリペプチドを発現するか又は過剰発現する癌細胞、例えば前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣又は卵巣細胞からの癌細胞、又はそれらの転移した癌細胞を検出することができる。
抗体はまた、癌の処理方法においても有用であり、ここで前記抗体は、標的ポリペプチドを発現するか又は過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するか又は癌細胞を殺害する。親和性−精製された抗−ヒトヘプシンポリクローナル抗体が、ヘプシンを発現する肝癌細胞（例えば、Hepg2細胞）の増殖を阻害することは、インビトロ方法において、これまで示されている（A Torres-Rosado, など. , 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 7181-7185）。
【０２３４】
抗体はまた、種々の標的ポリペプチド、例えば天然に存在するヘプシン分子又は本発明の修飾されたヘプシン分子のいずれかを精製するための方法にも使用され得る。標的ポリペプチドを精製するための１つの方法は、固体マトリックスに結合された本発明の抗体を、標的ポリペプチドを有する溶解物又は他の溶液と共に、標的ポリペプチドへの抗体の結合を可能にする条件下でインキュベートし；不純物を排除するために前記固体マトリックスを洗浄し；そして結合された抗体から標的ポリペプチドを溶離することを含んで成る。
【０２３５】
本発明の抗体は、抗体に基づく細胞分類及び/又は親和性精製技法を用いて、標的ポリペプチドのいずれか１つを発現する細胞（例えば、ヘプシン−陽性細胞）を、単離するか又は富化するために使用され得る。腫瘍細胞上の標的ポリペプチドのいずれか１つの存在（単独で、又は他の細胞表面マーカーと組合して）が、他の細胞と腫瘍細胞とを区別し、そして/又は単離するために使用され得る。標的ポリペプチドを発現するか又は過剰発現する細胞は、前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣、卵巣からの正常細胞及び癌細胞、又はそれらの転移腫瘍細胞を包含する。
【０２３６】
本発明の抗体を用いて単離されるか又は富化される、標的ポリペプチドのいずれか１つを発現する細胞が、培養において、又は動物モデル（例えば、SCID又は他の免疫欠失マウス）において異種移植腫瘍として増殖され、それにより、比較的均質な細胞集団の増殖又は他の表現型特徴に対する種々のトランスジーン又は候補体治療化合物の評価を可能にする。それらの単離されたか又は富化された細部はまた、癌疾病の進行、例えば前立腺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、精巣、卵巣の癌、又はそれらの転移腫瘍細胞の進行に対する生物学的関連性を有する遺伝子生成物をコードする核酸分子の調製物を単離するためにも使用され得る。
【０２３７】
本発明の抗体は、癌を有する対象からの細胞の数を拡張するために、種々の標的ポリペプチドのいずれか１つを発現する腫瘍細胞を単離するか又は富化するために使用され得る。この場合、例えば、癌を有する対象からの限定された生検サンプルを、拡張し、そして種々の汚染性を細胞を混乱しないで、診断及び予後遺伝子、タンパク質、染色体異常、遺伝子発現プロフィール、又は他の適切な遺伝子型及び表現型特徴の存在について試験され得る。さらに、そのような細胞は、動物モデルにおける腫瘍攻撃性及び転移能力について評価され得る。同様に、患者−特異的癌ワクチン及び細胞免疫療法剤が、そのような細胞調製物から製造され得る。
【０２３８】
本発明の抗体は、細胞表面を点状に染色する免疫学的方法に使用され得、このことは、種々のヘプシンポリペプチドのいずれか１つが細胞表面の特定領域に局在され得ることを示唆する。小胞及びシンゴ脂質（shigolipid）−コレステロールラフトを含むそれらのミクロドメインは、シグナルトランスダクション及び分子輸送において決定的な役割を演じると思われる。例えば、GP1−固定されたタンパク質は、細胞表面の界面活性剤−不溶性糖脂肪質−富化されたミクロドメイン（DIGS）に密集することが知られている。
【０２３９】
本発明の利点：
ヘプシンの生理学的活性化物質は、未知であり、酵素的活性ヘプシンの生成を困難にする。この問題を回避するために、本発明は、天然に存在する野生型ヘプシン分子の活性化配列を置換する置換体活性化配列をそれぞれ含んで成る、修飾されたヘプシン分子、又はそのフラグメント又は誘導体を提供する。そのような安定して発現される、修飾されたヘプシン分子は、所望する酵素による修飾されたヘプシンチモーゲンの認識及び切断の後、修飾されたヘプシン分子の活性化を可能にする。本発明の修飾されたヘプシン分子はまた、修飾された及び野生型のヘプシン分子の両者を認識する抗−ヘプシン抗体の生成のために使用され得る。
【実施例】
【０２４０】
次の例は、本発明を例示し、そして当業者を助けるために提供される。例は、本発明の範囲を制限するものではない。
例１：
次のセクションA−Gは、ヒト対象からの正常（すなわち、非前立腺癌）サンプル、良性前立腺過形成及び前立腺癌を有する対象からのサンプル、及び種々の前立腺癌細胞系からのサンプルにおけるヘプシンmRNA転写体の発現を検出するために使用される方法の記載を提供する。
【０２４１】
A）    正常ヒト組織サンプルにおけるヘプシンmRNAのノザンブロット分析：
次は、正常ヒト組織サンプルにおけるヘプシン分子mRNA転写体の発現を検出するために使用されるノザンブロット方法の記載を提供する。
正常ヒト組織におけるヘプシンmRNAのレベルの発現のノザンブロット分析を、種々のヒト組織からの約２μgのポリA＋RNAを有するClontechからの多重組織RNAブロット（カタログ番号7760−１、7767−１及び7766−１）を用いて行った。
【０２４２】
十分な長さのヘプシンプローブがRT−PCR増幅により生成される：オリゴヌクレオチドプライマー（センス5’− AGA GGC AGT GAC ATG GCG CAG AAG GAG GGT−3’及びアンチセンス5’− TGG AGG CTG CGC AGC GAG AAG−3’）を、公開されているヒトヘプシンcDNA配列（Leytus など. (1988) Biochemistry. 27 (3): 1067-74）に基づいて企画した。ヒトヘプシンの完全なコード領域に及ぶcDNAフラグメントを、RT−PCRに基づく方法（cDNA Cycle Kit, Invitrogen）を用いて、ヒト肝癌HepGg2細胞由来の全RNAから増幅した。PCR生成物を、pCRベクター（Invitorogen）中にサブクローン化し、そして配列決定した。cDNAフラグメントを、可溶性形のヒトヘプシンを発現する追加のプラスミドベクターの構成のために鋳型として使用した。
【０２４３】
ブロットを、50％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、１％SDS及びブロッキング剤（Intergen S4040）を含むHybrisol溶液10mlにより42℃で２時間、プレハビブリダイズした。ブロットを、Rediprime II Random Prime Labeling System (Amersham RPN1633)を用いて、[α-32P]dCTPによりラベルされた十分な長さのヒトヘプシンcDNAプローブによりプローブした。ブロットを、42℃で一晩ハイブリダイズし、そして２×SSC、0.2％SDSにより45℃で30分間、１×SSC、0.2％SDSにより55℃で30分間、及び0.2×SSC、0.2％SDSにより60℃で30分間、洗浄した。
【０２４４】
ブロットを、ホスホイメージングプレートに一晩、暴露し、そしてプレートをFujiホスホイメージャーにおいて展開した（図１）。サンプル負荷のための対照として、グロットを取り除き、そしてGAPDH cDNAプローブ（Clontech）により再プローブした。ヘプシン及びGAPDHバンド、Fuji MacBASプログラムを用いて定量化した。
ノザンブロット分析は、ヘプシンmRNA転写体が、肝臓、腎臓、膵臓、胃、甲状腺、前立腺及び精巣に由来する組織サンプルに存在した（図１）。
【０２４５】
B）    正常ヒト組織サンプルにおけるヘプシンmRNAのPCR分析：
次は、正常ヒト組織サンプルにおけるヘプシン分子mRNA転写体の発現を検出するためのPCR検出方法の記載を提供する。
種々の正常ヒト組織からのRNAサンプルを、下記表２に示されるように全RNAとして購入した：
【０２４６】
【表２】
2006507813.tif 000003
【０２４７】
Taqman（商標）(ABI Applied Biosystems)に基づく定量性RCRアッセイを用いて、種々の組織サンプルに由来する全RNAサンプルに存在する−RNAのレベルを検出した。２組のヘプシン−特異的プライマー及びプローブを企画し、そしてAtugen USAにより合成した。プローブは、蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチドであった。その3’末端を、tamra−接合し、そして5’末端をFAM（６−カルボキシ−フルオレセイン）ラベルした。蛍光は、個々のヘプシンアンプリコンが製造されるにつれて、個々のPCRサイクルにより放出される。定量化は、個々のサイクルでのアンプリコンの生成と共に蛍光の上昇する放出に基づかれた。２組のプライマープローブを用いた。第１組のプライマープローブを、アンプリコンが、エキソン内に存在するよう企画した。第２組のプライマープローブを、エキソン−エキソン境界を交差するよう企画した。
【０２４８】
【表３】
2006507813.tif 000004
【０２４９】
【表４】
2006507813.tif 000005
【０２５０】
PCR増幅を、次の条件下で行った：48℃で30分；95℃で10分；95℃で15秒及び60℃で１分、40サイクル。
相対的PCR定量化を、ABI PRISM 7700 Detection Systemを用いて行った。図２に示されるデータは、LNCaPサンプルにおけるサンプルヘプシン転写発現の相対的発現としてグラフに示され、そしてヘプシンアンプリコンが製造されるにつれて、PCRサイクル当たりに放出される蛍光の量に基づかれている。
図２は、Taqman PCRに基づく分析により定量化される場合、肝臓及び腎臓からのサンプルにおいて高レベルのヘプシンmRNAを示した。
【０２５１】
C）前立腺癌患者からのRNAサンプルのノザン分析：
次は、正常前立腺、良性前立腺過形成、一次前立腺癌及び進行した前立腺癌におけるヘプシンmRNA転写体の発現を検出するために使用されるノザンブロット分析の記載を提供する。
全RNAサンプルは、前立腺癌患者からであった。正常前立腺組織のRNAサンプルは、Biochain Institute inc. から購入された。良性前立腺過形成（BPH）、及び一次及び進行した前立腺癌を有する患者からのRNAサンプルは、市販源、例えばClentechから得られた。
【０２５２】
全RNAサンプルは、Qiagen RNAemsy方法を用いて精製された。10μgの全RNAを、ホルムアルデヒド−包含負荷緩衝液において変性し、次にアガロースゲルを通して電気流動により分解した。ゲルを一定の70ボルトで４時間、実施し、次に20×SSC緩衝液における毛管作用により、ナイロン膜（NEN GeneScreen Hybridization Transfer Membrane）上に一晩トランスファーした。RNAを、UV照射によりブロット上に架橋した。ノザンブロットを、上記セクション（A）に記載のようにして、ブローブし、そして処理した。ノザンブロットの結果は、図３の上方パネルに示される。
【０２５３】
GAPDHに比較してのヘプシンmRNAの量の折り目−増加が図３の下方パネルに示されている。
ヘプシンmRNA転写体レベルは、ノザンブロット上で、正常サンプル、一次前立腺癌サンプル又は良性前立腺過形成（BPH）サンプルにおいてよりも進行した前立腺癌サンプルにおいて有意に高かった（約６倍）。
【０２５４】
D）良性前立腺過形成及び進行した前立腺癌サンプルに比較しての前立腺癌細胞系におけるへプシンmRNAのPCR分析：
次は、良性前立腺過形成及び進行した前立腺癌サンプルに比較してLNCaP細胞系におけるヘプシンmRNA転写体を検出するために使用される定量PCR検出方法の記載を提供する。
良性前立腺過形成を有する患者からの全RNAサンプル、又はグレアソン等級３又は４の前立腺癌を使用した。BPH＝良質前立腺過形成；GR3＝ガレアソン等級3；GR4＝ガレアソン等級4．全RNAサンプルを、Qiagen RNA easy方法を用いて、その製造業者により説明されるようにして精製した。
【０２５５】
上記セクションBに記載されるプライマー及びプローブ組１及び２を、このPCR分析のために使用した。PCR方法は、上記セクションBに記載される方法に従って行われた。
相対的PCR定量化を、ABI PRISM 7700 Detection Systemを用いて行った。図４に示されるデータは、LNCaPサンプルにおけるサンプルヘプシン転写体発現の相対的発現としてグラフ化され、そしてヘプシンアンプリコンが製造されるにつれて、PCRサイクル当たり放出される蛍光量に基づかれている。
定量化結果は、グレアソン等級4として分類された組織からの前立腺サンプルが、低いグレアソン等級で分類された組織よりも高いレベルのヘプシンmRNA転写体を有する傾向があったことを示した（図４）。
【０２５６】
E）前立腺細胞系からのRNAサンプルのノザン分析：
次は、前立腺細胞系におけるヘプシンmRNA転写体の発現を検出するために使用されるノザンブロット方法の記載を提供する。
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（American Type Culture Collection）(ATCC)から入手した：PC3, DU145, HepG2, LNCaP, PZ HPV7, CA HPV10 及び MDA PCa 2b。BPH1細胞は、University of California, San Franciscoから入手された。
【０２５７】
全RNAを、RNeasy Maxi Kit (Qiagen)を用いて、前記細部系から単離した。細胞をトリプシン処理し、そしてPBSによりすすぎ、次にグアニジンイソチオシアネートを含む緩衝液において均質化した。等体積の70％エタノールを、前記均質物に添加し、そしてPBSによりすすぎ、次にグアニジンイソチオシアネートを含む緩衝液において均質化した。等体積の70％エタノールを、前記均質物に添加し、そしてその混合物を、キットに供給されているフィルター上に負荷した。全RNAを、シリカゲル基材の膜上に固定した。この膜を、キットに供給される緩衝液により数度、洗浄し、次に全RNAをRNアーゼ−フリーの水により溶出する。
【０２５８】
全RNAを、エタノール及び酢酸ナトリウムにより沈殿せしめ、そしてペレットを70％エタノールにより洗浄した。RNAペレットをRNアーゼ−フリーの水に再懸濁し、そして定量化した。個々の細胞系からの全RNA10μgを、上記セクションAに記載のようにして、電気泳動及びノザン分析のためにアガロースゲル上に負荷した。ノザン分析の結果は、図５Aに示される。対照として、アガロースゲルを臭化エチジウムにより染色し、等サンプル負荷を示した（図4の下方パネルに示される）。
ノザンブロットアッセイは、LNCaP, MDA Pea 2b、及びヒト肝癌細胞系HEPG2細胞におけるヘプシンmRNA転写体の存在を検出した（図５の上方パネル）。
【０２５９】
F）前立腺癌細胞系におけるヘプシンmRNAのPCR分析：
次は、種々の前立腺癌細胞系におけるヘプシンmRNA転写体を検出するために使用される定量的PCR検出方法の記載を提供する。
PreC細胞は、Cloneticsから購入された正常細胞系である。BPH1細胞は、UCSFでのDr. Cuhraから入手された。細胞系PC3, DU1145及びMDA Pca 2b細胞は、ATCCからであった。
【０２６０】
PC-3細胞は、62才の男性白人からの等級IVの前立腺癌の骨転移から開始され、そしてアンドロゲン無関係である。MDA Pca 2b細胞は、前立腺のアンドロゲン無関係腺癌を有する63才の男性黒人の骨転移から確立された。LNCaP細胞は、前立腺のアンドロゲン依存性腺癌を有する40才の男性白人のリンパ節転移から確立された。全RNAを、Qiagen RNA easyキットを用いて組織から精製した。
上記セクションBに記載されるプライマー及びプライマー組１及び２を、このPCR分析のために使用した。PCR方法を、上記セクションBに記載される方法に従って行った。
【０２６１】
相対的PCR定量化を、ABI PRISM 7700 Detection Systemを用いて行った。図６に示されるデータは、LNCaサンプルにおけるサンプルヘプシン転写体発現の相対的発現としてグラフにされ、そしてヘプシンアンプリコンが製造されるにつれて、PCRサイクル当たりに放出される蛍光の量に基づかれている。
２組のプライマープローブによるPCR分析は、LNCaP及びMDA Pca 2B細胞におけるヘプシンmRNA転写体を検出した（図６）。
【０２６２】
G）DHTにより処理された細胞からのRNAサンプルのノザン分析：
次は、ジヒドロテストステロン（DHT）により処理されたか又は処理されていない細胞におけるヘプシンmRNA転写体の発現を検出するために使用されるノザンブロット方法の記載を提供する。
前立腺癌細胞系LNCaPwoを、ATCCから入手した。LNCaP細胞を、アンドロゲンに対するヘプシンmRNA発現の応答を研究するために、ジヒドロテストステロン（Sigma A 8380）により処理した。集密性細胞を、木炭−ストリップされたFBSを含む増殖培地において24時間、培養した。DHTを、10nMで個々のフラスコンに添加した。対照細胞に関して、エタノールをビークル対照として添加した。細胞を24又は72時間インキュベートした。
【０２６３】
全RNAを、Rnesy Maxiキット（Qiagen）を用いて、上記セクションAに記載のようにして行った。結果は、図７Aに示される。
GAPDHに比較してのヘプシンmRNAの量の折り目−増加を、上記セクションCに従って行った。図７Bに示される結果は、ヘプシンmRNA転写体レベルが、DHTにより処理されたLNCaP細胞において高められたことを示唆した。
【０２６４】
例２：
次は、ヒトヘプシンcDNAを増幅し、そして修飾されたヘプシン分子をコードする組換えDNA分子を生成するために使用される方法の記載を提供する。
ヒトヘプシンcDNAの増幅：
オリゴヌクレオチドプライマー（センス5’− AGA GGC AGT GAC ATG GCG CAG AAG GAG GGT−3’及びアンチセンス5’− TGG AGG CTG CGC AGC GAG AAG−3’）を、公開されているヒトヘプシンcDNA配列に基づいて企画した（Leytus など. (1988) Biochemistry. 27 (3): 1067-74）。ヒトヘプシンの完全なコード領域に及ぶcDNAフラグメントを、RT-PCRに基づく方法（cDNA Cycle Kit, Invitrogen）を用いて、ヒト肝癌HepG2細胞に由来する全RNAから増幅した。PCR生成物を、pCRベクター（Invitrogen）中にサブクローン化し、そして配列決定した。cDNAフラグメントを、可溶形のヒトヘプシンを発現する追加のプラスミドベクターの構成のための鋳型として使用した。
【０２６５】
プラスミドpAcGP67/hepED：
ヘプシンの十分な長さのエクト−ドメイン、すなわちプロテアーゼドメイン及びスキャベンジャー受容体ドメインを含む細胞外ドメインのクローニングを行った。ヘプシン細胞外ドメインを、カルボキシ末端でのV5及びHis標識を用いて、バキュロウィルストランスファーベクターpAcGP67a中にクローン化した（PharmingenからのpAcGP67は、３個の読み取り枠において利用でき；骨格pAcGP57aを使用した）。
【０２６６】
pcDNA 3.1/His (Invitrogen, San Diego)からのV5及び6His標識のPCR増幅を、上流プライマー（V5HisFor--5' CAGCTCGAATTCGGTAAGCCTATCCCT 3'）及び下流プライマー（V5HisRev-5' GATGCGGCCGCTTTAAACTCAATGGTG 3'）を用いて行った。
ヘプシンのPCR増幅を、上流プライマー（NXhpsnfor--5' CATATGCCCGGGAGGAGTGACCAGGAG 3'）及び下流プライマー（hpsnrev-5' CTTACCGAATTCGAGCTGGGTCACCAT 3'）を用いて行った。
【０２６７】
PCR増幅を次の条件下で行った：94℃、１サイクル；94℃で30秒、68℃で１分、40サイクル；70℃で７分、１サイクル；4℃での維持。好都合なポリメラーゼ（プルーフリーディング）を、製造業者（Clontech）の提案するプロトコールにより使用した。
アンプリコン、ベクター及び挿入体を、１％TAEアガロースゲル上で展開し、そしてゲル−単離した。ゲル単離されたフラグメント、ベクター及び挿入体を、Not I/XmaIにより消化した。ベクター及び挿入体フラグメントをさらに精製し、消化された末端を除き、次にpOUT10（すなわち、Pharmingen からのpAcGP67a ）におけるNotI/XmaI部位中に連結した。組換えプラスミドを用いて、DH5α細胞を形質転換した。
【０２６８】
プラスミドpAcGP67/hepED/EK：
ヘプシンの細胞外ドメイン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする組換えDNA分子pAcGP67/hepED/EKを、前記のクローニング方法により生成した。組換えプラスミドの図は、図８に示される。
ヘプシンEDEK配列（エンテロキナーゼ認識配列を有するヘプシンエクトドメイン）を、ヘプシンフラグメントのPCR増幅、前記フラグメントの続く制限酵素消化、及びpIVEXベクター中への連結により、pIVEX（Roche Molecular Biochemicals）中にクローン化した。pIVEXヘプシンEXにおけるヘプシンEDEK挿入体を、XmaI/NotI部位でpAcqp67（Pharmingen）中にサブクローン化した。
【０２６９】
pAcgP67-ヘプシンEKを、Baculogoldトランスフェクション（Pharmingen）を用いて昆虫細胞中にトランスフェクトし、そしてウィルスを単離した。
プラスミド構成体によりコードされるヘプシン分子の発現を、抗−His抗体を用いて、ウェスターンブロットにより試験した。
【０２７０】
プラスミドpIRESpuro2W/hepEK：
ヘプシン挿入体を有するプラスミド構成体pIRESpuro2W/hepEKを、CHO細胞においてヘプシンED/EKを発現するために生成した（図９）。（ED＝エクトドメイン＝細胞外ドメイン；EK＝エンテロキナーゼ切断部位）。
【０２７１】
可溶性ヘプシンED/EKをコードするcDNAを、hepBspElF (CTGATCCGGAcAGGAGTGACCAGGAGCCGC) 及び hepR2 (GCCGGGTC CCAGGAAAGGA)のプライマー対を用いて、PCR生成物として増幅した。前記に記載されるpAcGP67/hepED/EKは、鋳型として作用した。PCR生成物を、上記に記載される発現ベクターpIRESpuro2W中にクローニングするために、BspEI＋NotIにより消化した。このPCRフラグメントは、ヘプシンED/EK及び２種の標識：V5及び６−HIｓを含む。
【０２７２】
Igκシグナル配列を、次のプライマーを用いて、pSecTag2A (Invitrogen)からPCR増幅した：IgκF (gatcgatatcgccaccatggagacagacacactcctgctat gggtactgctgctctgggttccagg) 及び IgκR (atcgTCCGGAGCGTCACCAGTGGAACCT GGAACCCAGAGCAGCAGt)。EcoRV及びBspEIを用いて、連結のための適合できる末端を創造した。
pIRESpuro2W（Clontechから本来購入されたpIRESpuro2の誘導体）を、EcoRI/NotIにより線状化し、そしてベクター主鎖として使用した。
pIRESpuro2W/hepEKを、pIRESpuro2W中への上記制限されたPCRフラグメント（Igκシグナル配列、ヘプシンED/DK）の三段階連結（Fast-Link DNA連結キット、Epicentre）により構成した。
【０２７３】
プラスミドpCEP4W/hepEK：
プラスミドpCEP4 (Invitrogen) を、XhoI部位でウッドチャック肝炎ウィルス後−転写調節要素（WPRE）を挿入することにより修飾した。この修飾されたプラスミドを、pCEP4Wと命名した。
pIRESpuro2W/hepEKからのKpnI-hepEK-NotIフラグメントを、pCEP4WのKpnI/NotI部位中にクローン化し、ヘプシン293EBNA細胞（Edge Biosystems）の一般的発現のためにpCEP4W/hepEK（図10）を創造した。
【０２７４】
プラスミドpCEP4W/hepEK36 (すなわち、pCEP4W/hep36)：
可溶性ヘプシンED/EK（hep36）のセリンプロテアーゼドメインをコードするcDNAフラグメントを、プライマーhep36 F (GAGATCCGGACCAAG ACTGTGGCCGTAGGAAGCTG) 及び hep36 R (GCCGGGTCCCAGGAA AGGA)を用いて、pAcGP67/ヘプシンED/EKからPCR増幅した。pCEP4W/hepEKにおけるヘプシンED/EKフラグメント（BspEI〜NotI）を、Hep36のPCR生成物により置換し、構成体pCEP4W/hepEK36（図11）を創造した。
【０２７５】
pBACSurf-Hepsin-gp64：
ヘプシンEDを、pBacSurf1 (Novagenからのバキュロウィルストランスファープラスミド)のKpnI部位中にクローン化した。この構成体は、gp64へのヘプシンエクトドメインの融合をもたらす。
ヘプシンエクトドメイン上にフランキングKpnI部位を配置しているプライマーを合成した：srfhepfor2 (5'TGCAGGTACCTAGGAGTGACCAGGAGCCGCTG 3'); srfheprev2 (5' CCGGGGTACCAGCTGGGTCACCATGCCGCTGGC 3')。
プライマーを用いてのPCR増幅反応を、次の条件下で行った：94℃で４分７×：94℃で30秒、68℃で２分、40×；68℃で10分、１×、反応緩衝液は、Clontech taqポリメラーゼcDNA緩衝液を含んだ。
【０２７６】
トランスファープラスミドが野生型ウィルスと組換えを起こす場合、gp64−ヘプシンタンパク質がgp64により同時発現される。野生型ウィルスは、エンベロープ糖タンパク質gp64を生成する。野生型ウィルスDNAによるトランスファープラスミドの組換えは、それが別々の及び独立したプロモーターにより駆動されるので、gp64−融合タンパク質の生成をもたらす。従って、gp64及びgp64−ヘプシンタンパク質の両者が発現される。このプラスミドから発現される分子は、抗体生成のためのマウスを免疫化するために、後で使用された。
【０２７７】
例３：
次は、真核細胞における修飾されたヘプシン分子を生成し、そして単離するために使用される方法の記載を提供する。
293EBNA細胞におけるヘプシンED/EK及びヘプシンプロテイナーゼドメインの発現：
293EBNA細胞（Edge Biosystems）の一時的トランスフェクションを、pCEK4W/hepEK 及び pCEK4W/hepEK36により行った。
【０２７８】
294EBNA細胞の懸濁培養物を、回転フラスコにおいて293SFMII (LTI Cat. No. 11686086)に維持した。トランスフェクションの日、細胞を、Ca2+フリーのDMEMにより２度、洗浄し、そしてトランスフェクション培地（2％FBS、2mMのL−グルタミン及び1mMのピルビン酸ナトリウムにより補充された、Ca2+フリーのDMEM懸濁液）を含む3Lの回転フラスコにおいて、0.5×106個の細胞/ml×1Lの密度に希釈した。細胞をインキュベーターに戻し、そしてトランスフェクションを準備した。
【０２７９】
すべての細胞及び細胞培養材料は、Invitrogenからであった。一時的なトランスフェクションを、X−tremeGENE Ro1539トランスフェクション試薬（Roche）により、その製造業者のプロトコールに従って行った。基本的に、0.4mgのDNA及び100mlのDMEM Ca2+フリーの培地を混合し；２分後、1mlのRo1539を添加する。次に、DNA/Ro1539混合物を、室温で40分間インキュベートし、複合体形成を可能にした。再び混合し、そしてその混合物を、予備調製された細胞に添加する。細胞を、発現されたヘプシンを収穫する前、４日間37℃でインキュベートする（図12）。
【０２８０】
12ウェルプレートにおける提案されたDNA/脂質割合は0.8/8/ウェルであり、ところが回転フラスコにおいては、1ml細胞当たり0.2〜0.4μgである。最適化を、その割合を変えることにより12−ウェルプレートにおいて行った。
細胞がトランスフェクトされると、HEK−293EBNA細胞の懸濁培養物は、4mMのL−ブルタミンにより補充された293SFMIIに維持され得る。
【０２８１】
昆虫細胞におけるバキュロウィルス−介在システムを用いてのヘプシンの発現：
細胞トランスフェクション：
pAcGP67-HepsinED 及び pAcGP67-HepsinEDEKを用いて、昆虫細胞Sf21をトランスフェクトした。
昆虫細胞Sf21を、Grace培地（Invitrogen, Catalog ＃11605）＋5％FBSを含む6ウェルプレートに、１×106の濃度でプレートした。細胞を、室温で0.5時間インキュベートすることにより、プレートへの結合を可能にした。
ヘプシン分子を含んで成るバキュロウィルストランスファーベクターのトランスフェクションのためのBaculoGold キット (Pharmingen)を用いて、２つのウェルからの培地を除去し、そして0.5mlの溶液Aにより置換した。
【０２８２】
無菌の微小遠心分離管において、2μgのプラスミドDNA（(pAcGP67-HepsinED 又は pAcGP67- HepsinEDEK）を、キットに供給される線状バキュロウィルスDNA5μlと共に混合した。その混合物を、0.5mlの溶液Bを添加する前、５分間、放置した。ウィルス混合物を、Grace培地に希釈し、そして溶液Aにおける細胞に滴下した。プレートを、室温で１〜４時間、揺動プラットホーム上に置いた。この後、培地を細胞から除去し、そして5％FBSと共に、Grace培地中、１％アガロースを、ウェルの個々に添加した。細胞を、27℃で３〜６日間、又はプラークが出現するまで、インキュベートした。
５日後、上清液のサンプルを集めた。組換えウィルスの濃度を滴定し、そしてウィルスプラークを、６ウェルプレートにおけるSf21昆虫細胞を感染するために採取した。
【０２８３】
発現のためのアッセイ：
４日後、感染された細胞及び上清液を集めた。ペレットを、PBSを用いて元の体積に再懸濁した。1mMのDTTを有する、等体積の２×サンプル緩衝液を、5μlの細胞懸濁液又は上清液と共に混合した。サンプルを煮沸し、そして４〜20％ゲルSDS Page上に負荷し、そしてウェルターンブロットを生成した。
【０２８４】
ウェスターンブロット：
図13に示されるようなウェスターンブロットを、昆虫細胞のバキュロウィルス感染により発現されるヘプシンを分析するために、次の態様で生成した。
【０２８５】
細胞からの50μlのならし培地を収穫し、ベンチトップ遠心分離機において最高速度で１分間、回転し、上清液を新しい管に移し、50μlのSDSサンプル緩衝液を添加し、回転せしめ、95℃に5分間、加熱する。SDS実施緩衝液（0.025Mのトリス塩基、0.192Mのグリシン、0.1％SDS）中、トリ−グリシンゲルに、ウェル当たり20μlまでのサンプルを負荷する。ブロモフェニコール染料がゲルの末端まで走行するまで、180Vでゲルを運転する。ニトロセルロース膜の次にゲルを配置し、そしてウェスターントランスファー装置（XCELL II、Invitrogen）を通して300mAMPの電流で45分間、実施することにより、ゲルからニトロセルロースにタンパク質をトランスファーする。TTBS中、5％粉乳により１時間阻止する。
【０２８６】
ウェスターンブロットを、ホースラディシュペルオキシダーゼに接合される抗−V5（抗−V5−HRP）（TTBS＋1％BSAにおける１:5000の希釈溶液）にブロットを１時間、暴露することによりブローブした。ブロットをTTBSにより３度、10分/個々の洗浄で、次にTBSにより10分間、１度、洗浄する。10mlの個々のECL試薬（Amersham Pharmacia Biotech）においてブロットを１分間インキュベートすることによりウェスターンブロットを展開し、最少30分間、フィルムに暴露する（図13、左側のパネル）。
組換えヘプシンの発現及び単離の結果は、図12のウェスターンブロットに示され、ここで組換えヘプシンタンパク質がバキュロウィルス感染された昆虫細胞において発現されることが示されている。
【０２８７】
例４：
次は、活性化された、修飾されたヘプシンプロテアーゼを生成するためにエンテロキナーゼ処理により、図14に示されるように、修飾されたヘプシン分子を活性化するために使用される方法、及び活性化されたヘプシンを検出するために使用される方法の記載を提供する。
【０２８８】
エンテロキナーゼによるヘプシンの活性化：
上記例４に記載されるように、フェニル−HICカラム上で精製される、修飾されたヘプシン分子は、約330mMの硫酸アンモニウム、150mMの塩化ナトリウム、50mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）の最終溶液剤（HIC溶離剤）に存在した。これを、150mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）により１：２に希釈し、そして約0.3g/lに濃縮した。
濃縮された、修飾されたヘプシン分子を、エンテロキナーゼ（Roche Diagnostics GmbH 1 351 311）により室温で一晩、85：１の修飾されたヘプシン分子：エンテロキナーゼの質量比で処理した。エンテロキナーゼは、除去されるか、又は活性化反応の後、存続する。
【０２８９】
修飾されたヘプシン分子を、種々の条件（pH4.5−7.5）下でのエンテロキナーゼ処理により活性化することができる。低いpHは、低い自己−分解をもたらす。
活性化された、修飾されたヘプシン分子を、100mMのHepes, 100mMのNaCl（pH7.4）により100nMに希釈し、そして1.25mlのアリコートを低温バイアルに配置し、そしてそのバイアルを、−80℃での貯蔵のために液体窒素により瞬時に凍結した。
【０２９０】
活性化されたヘプシンの検出：
ヘプシンの生理学的基質は知られていないが（Wu, Frontiers in Bioscience 2001; 6: dl92-200）、しかしながら、ヘプシンは、インビトロで血液凝固第VII 因子（FVII）を活性化することが報告されている（Kazama など. J. Biol. Chem. 1995; 270: 66-72）。
【０２９１】
細胞に基づくアッセイが、細胞表面上でのヘプシンの活性を検出するために確立された。このアッセイにおいては、ヒト組換えヘプシンは、子供ハムスター腎臓（BHK）細胞において安定して発現された。ヘプシン発現細胞（約８×105）又は対照BHK細胞を、精製されたヒト血漿FVII（0.2μg/ml）を含むリン酸緩衝溶液（pH7.4）において37℃で30分間インキュベートした。FVIIaへのFVIIの転換を、分子の切断を検出するために羊抗−ヒトFVII抗体を用いてのウェスターンブロットにより、又はFVIIaの活性を検出するために色原体基質（S-2266, H-D-Val-Leu-Arg-pNA-2HCl）に基づくアッセイにより分析した。このアッセイは、細胞表面上でのヘプシンの活性を測定し、そして細胞表面ヘプシンと相互作用するインヒビターをスクリーンするために使用され得る。
【０２９２】
例５：
次は、修飾されたヘプシン分子を結合する抗体を生成し、そして特徴づけるために使用される方法の記載を提供する。
ヘプシン−ED−EKタンパク質に対する抗体の生成：
エンテロキナーゼ切断部位、V5標識及び６×His標識を有する生来の（すなわち、非変性の）ヘプシンエクトドメインを含んで成る免疫原ヘプシン−ED−EKを、上記のようにプラスミドpAcGP67/hepED/EKからの昆虫細胞において発現した。タンパク質を、セファロースTMに結合される抗−V5を有する親和性カラムを用いて精製した。
【０２９３】
２種のヘプシンノックアウトマウス（アメリカ特許第5,981,830号）（１匹の雌及び１匹の雄）を、Rapid Immunization Multiple Sites (RIMMS) 方法 (Kilpatrick, K. E. , など. , 1997, Hybridoma, Volume 16, Number 4)を用いて、生来のヘプシン−エクトドメインにより免疫化した。マウスを初めに、RIBI アジュバント(ImmunoChem Research, Inc. )中、10μgのヘプシン/マウスにより免疫化し、次に5μgのヘプシン/マウスにより４度、追加免疫化した。
【０２９４】
次に、雌のマウスの免疫化を、生来のヘプシン−ED−EKタンパク質によりさらに2度、追加免疫化した。免疫化された雌のマウス＃１タンパク質を、融合のために選択した。雄のマウスの免疫化を、SDS−変性されたヘプシン−ED−EKタンパク質により２度、追加免疫化した（前記タンパク質は、１％SDSにおいて10分、変性され、そして90℃で煮沸された）。すべての追加の免疫は、RIMMS方法により行われた。
免疫原、すなわち抗原（Ag）を、次のスケジュールに従って、排出リンパ節に対して近位の12の部位で皮下注射した。
【０２９５】
ヘプシン−ED−EKタンパク質免疫化スケジュール：
第１日目：予備出血せしめ、マウスの数を数え、そして第１回の免疫化10μg/マウスを行う、RIMMS（65μl のヘプシンタンパク質＋500μl のRIBI 2x, ＋500μlの NaCl）；
第４日目：第１回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（35μl のヘプシンタンパク質＋500μl のRIBI 2x＋500μl のNaCl）；
第６日目：第２回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（35μl のヘプシンタンパク質＋500μl のRIBI 2x＋500μl のNaCl）；
第８日目：第３回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（35μl のヘプシンタンパク質＋500μl のRIBI 2x＋500μl のNaCl）；
第11日目：第４回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（35μl のヘプシンタンパク質＋500μl のRIBI 2x＋500μl のNaCl）、尾の静脈からの出血。
【０２９６】
ヘプシン−ED−gp64融合タンパク質に対する抗体の生成：
バキュロウィルス表面発現のヘプシン、すなわちヘプシン−ED−gp64融合タンパク質を、上記例２に記載されるpBACSurf-Hepsin-gp64組換えプラスミドを用いて発現した。融合タンパク質を、セファロースTMに結合される抗−V5を有する親和性カラムを用いて単離した。
ヘプシンノックアウトマウス（アメリカ特許第5,981,830号）（２匹の雌及び１匹の雄）を、pBacSurf ヘプシン-gp64発現されたタンパク質により、RIMMSプロトコールを用いて免疫化した。マウスを最初に、RIBIアジュバント中、10μgのヘプシン/マウスにより免疫化し、次に次のスケジュールに従って、5μgのヘプシン/マウスにより４度、追加免疫した。
【０２９７】
pBacSurf ヘプシン-gp-64融合タンパク質免疫化スケジュール：
第１日目：予備出血せしめ、マウスの数を数え、そして第１回の免疫化10μg/マウスを行う、RIMMS（150 μlのpBACSurf-ヘプシン-GP64＋450μlのRIBI 2x＋450μlのNaCl）；
第４日目：第１回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（75μlのBacSurf-ヘプシン-GP64 融合タンパク質＋500μlのRIBI 2x＋500μlのNaCl）；
第６日目：第２回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（75μlのBacSurf-ヘプシン-GP64 融合タンパク質＋500μlのRIBI 2x＋500μlのNaCl）；
第８日目：第３回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（75μlのBacSurf-ヘプシン-GP64 融合タンパク質＋500μlのRIBI 2x＋500μlのNaCl）；
第11日目：第４回の追加免疫、5μg/マウス、RIMMS（75μlのBacSurf-ヘプシン-GP64 融合タンパク質＋500μlのRIBI 2x＋500μlのNaCl）、尾の静脈からの出血。
【０２９８】
ELISAアッセイ：マウスポリクローナル血清力価：
2個のDynatech Immulon II ELISAプレートを、100ng/ウェル（100μl/ウェル）のヘプシン−ED−EKタンパク質により被覆した。被覆緩衝液、すなわち50mMの炭酸ナトリウム（pH9.6）を用いて、“生来”（1％SDSにおける90℃での5分間の煮沸を伴わない）又は“変性された”形（1％SDSにおける90℃での5分間の煮沸を伴う）のいずれかでのヘプシン−ED−EKタンパク質によりウェルを被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、PBS、0.1％ Tween−20により３度、洗浄し、そしてPBS、0.1％ Tween−20中、1mg/mlのBSAにより、室温で30分間、阻止した。
【０２９９】
96−ウェル組織培養プレートに、１：500,000に希釈されたマウス血清を添加する（希釈はPBS, 0.1% Tween−20中、1mg/mlのBSAにおいて行われた）。血清を37℃で１時間インキュベートし、PBS、0.1％ Tween−20により3度、洗浄した。ヤギ−抗−マウスIgG（PBS, 0.1% Tween−20中、1mg/mlのBSAにおいて１:10,000で特異的なγ鎖）を、ウェルに添加し、そして37℃で30分間インキュベートした（Sigma カタログ＃A3673, ロット＃018H916）。個々のウェルを、PBS, 0.1％ Tween−20により3度、洗浄し、100μlのPierce TMBキットにより３分間、展開し、そして100μlの１Mの硫酸により停止した。
【０３００】
ヘプシン−ED−EKタンパク質により免疫化されたマウスは、ウェスターンブロット上で、低められていない形及び変性されていない形でのヘプシンを認識する血清ポリクローナル抗体を有した。ポリクローナル抗体は、ウェスターンブロット上のSDS変性されたヘプシン−ED−EKタンパク質を認識しなかった。
【０３０１】
力価レベル：
タンパク質  雌＃１：力価＞1:500,000血清希釈度。
タンパク質  雌＃２：力価＞1:500,000血清希釈度。
タンパク質  雄：力価＞1:100,000血清希釈度。
BacSurf免疫化されたマウスのいずれも、眼に見える血清抗体力価を有さなかった。BacSurf免疫化されたマウスは、ウェスターンブロット又はELISA（生来のみ）分析により、変性された又は生来の形のヘプシンを認識しなかった。この結果は、SacSurf RIMMS論文に報告されるように、予測された。
【０３０２】
マウス抗−ヒト−ヘプシンMAb：
ハイブリドーマを生成するためのPEG融合方法：
タンパク質免疫化されたマウス雌＃１及び２は、生来の変性されていないヘプシン−ED−EKタンパク質に対して、ELISA、FACS及びウェスターンブロット陽性であるポリクローナル血清抗体を有する。雄のタンパク質免疫化されたマウスは、生来の及び変性されたヘプシン−ED−EKタンパク質の両者に対して、ELISA及びウェスターンブロット陽性であるポリクローナル血清抗体を有する。免疫化に基づくデータ及び注意については上記を参照のこと。
【０３０３】
マウス骨髄腫細胞（P3x63Ag8.653 マウス骨髄腫, LN2 ID＃;20164）を、15mlの管において、10mlの暖かなIMDM＋10％ FBS中に融解し、そして800rpmで8分間、回転せしめた。上清液を除去し、そして細胞を、１つのT−75フラスコにおいて20mlのIMDM＋10％FBSに接種した。
P3x63Ag8.653細胞を、標準の方法に従って継代培養した。手短には、継代培養は次のものを包含した。
【０３０４】
継代＃２：T−75フラスコにおける細胞は80％集密性及び95％生存性である。前記細胞を1：3の比でT-150フラスコを接種し、IMDM＋1％FBS及びHT培地を用いて60mlにする。T−75を再接種し、IMDM＋1％FBS及びHT培地により20mlにする。
継代＃３−７：T−150フラスコにおける細胞は90％集密性及び95％生存性である。前記細胞を1：3の比でT-150フラスコにそれぞれ分け、IMDM＋1％FBS及びHT培地を用いて60mlにする。
【０３０５】
培地成分：
100×２−メルカプトエタノール（２−ME）：
100mlのDI H2O Gibcoカタログ番号15230−162、
100×トランスフェリン（1mlの10mg/ml）：
9mlのIMDM塩（GIBCO CAT#12440-053；無菌濾過された；1000×＝1mg/ml）
【０３０６】
IMDM＋10％FBS：
IMDM 450ml GIBCO CAT #12440-053
FBS 50ml HYCLONE AHL9123熱不活性化されていない。
L-GLU 5ml 200mM Gibco
1000×トランスフェリン0.5ml
２−ME 5ML
カナマイシン 5ML SIGMA K-0129 LOT#51K2381
無菌フィルター0.22μm及び4℃での貯蔵。
【０３０７】
IMDM＋1％FBS：
550mlのIMDM塩及び5.5mlのFBS、及び上記すべての成分を、上記と同じ体積を持ち手添加する。
HT IVIAL SIGMA H-0137を添加する。
無菌フィルター0.22μm及び4℃での貯蔵。
【０３０８】
血清フリー培地：
400mlのIMDM＋4mlのカナマイシン及び4mlの２−メルカプトエタノール、上記と同じ成分。
赤血球細胞溶解溶液：（Sigma カタログ番号R−7757）。
ポリエチレングリコール（PEG）溶液：
65℃で溶解し、そして4mlのIMDM塩を添加し、無菌濾過し、そして融合まで、65℃で維持する。ポリエチレングリコール（PEG）：Sigmaカタログ番号P−2906。
P3xAg8.653骨髄腫細胞を、標準の方法を用いて、PEG融合のために調製した。手短には、300mlの骨髄腫細胞を、４個のT−150フラスコからプールした。細胞を計数し、800RPMで室温で８分間、回転し、IMDM血清フリー培地により洗浄し、そしてさらに２度、洗浄した。骨髄細胞を、25mlのIMDM血清フリー培地に再懸濁した。
【０３０９】
脾臓細胞を、標準の方法に従って調製した。手短には、マウスを、CO2窒息及び頸部脱臼により殺害した。血液を、心臓を刺すことにより収穫し、凝固しそして10,000RPMで10分間、回転した。約1mlの完全な血液を、個々のマウスから収穫した。リンパ節及び脾臓を収穫した。脾臓細胞及びリンパ細胞を、10mlのIMDM血清フリーの培地中に収穫した。脾臓細胞及びリンパ細胞を、大きな粒状物から分離した。脾臓細胞及びリンパ細胞を、800RPMで８分間、回転した。上清液をアスピレートし、そして軽くかきまぜた。脾臓細胞/リンパ細胞ペレットに含まれる赤血球細胞を、1mlのPBSによるアンダーレイを伴って、赤血球細胞溶解緩衝液により溶解し、これは１分以内に行われた。次に、800RPMで８分間、回転し、上清液及びFBSを除去し、10mlのIMDM血清フリー培地にペレットを再懸濁し、細胞を計数し、そして800RPMで８分間、回転した。
【０３１０】
PEG融合方法に関しては、骨髄腫及び脾臓細胞を、50mlの円錐状YESにおいて１骨髄腫細胞：５脾臓細胞の比で組合し、そしてIMDM血清培地により50mlに満たした。細胞を800RPMで８分間、回転し、ペレットを水浴において２分間、37℃に暖め、次にペレットをゆるくした。PEG細胞融合段階を、37℃の水浴において行った。1mlの50％PEGを１分間にわたって添加し、そして軽く混合した。細胞を室温で２分間、400RPMで回転した。細胞に、4.5mlのIMDM、20％FBS完全培地を3分間にわたって添加した（アミノプテリン（A）を伴わない）。細胞に、5mlのIMDM、20％FBS完全培地を2分間にわたって添加した（アミノプテリン（A）を伴わない）。細胞を室温で800RPMで5分間、回転した。上清液を除去した。ペレットを、35mlのIMDM、20％FBS完全培地に再懸濁した。（HTを伴い、そしてアミノプテリン（A）を伴わない）。細胞を、軽く逆にし、そして混合しながら、37℃で30分間アニーリングした。
【０３１１】
細胞のプレート：
融合＃１：融合された細胞（タンパク質雌＃１）を、IMDM＋20％FBS完全培地及びHT中、650mlのプレート体積に希釈し、そしてウェル当たり125μlでプレートした。融合された細胞をプレートした。合計約1.25×108細胞を、融合＃１及びウェル当たり約2.4×104個の細胞のために使用した。
融合＃２：融合された細胞（タンパク質雄）を、IMDM＋20％FBS完全培地及びHT中、286mlのプレート体積に希釈し、そしてウェル当たり125μlでプレートした。融合された細胞をプレートした。合計約5.5×107細胞を、融合＃２及びウェル当たり約2.4×104個の細胞のために使用した。
【０３１２】
骨髄腫及び脾臓細胞の電気融合：
電気融合方法に関しては、BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001を使用した。BTXプロトコール0116を、グルコースの代わりにマンニトールを使用するために修飾した。1つの50mlの円錐状管において細胞（１：５の比のP3x63Ag8.653：脾臓細胞）を組合し、そしてIMDM血清フリー培地により50mlまで充填した。800rpmで８分間、回転せしめる。1mlの融合緩衝液（0.3Mのマンニトール、0.1mMのCa2+及び0.1mMのMG2+、pH7.0）に再懸濁する。
【０３１３】
電気融合の設定：配列振幅：29V；時間：10秒；場強度：90V/cm；エレクトロポレーション振幅：640V；パルス幅：30μ秒；電極：BTX Microslide P/N 453（32mmのギャップ）；場強度：2kV/cm。最適な振幅を、ECM201上で振幅を調節しながら、倒立顕微鏡下で配列をモニターすることにより決定した。フードにおいては、カバーと共に95％エタノールへの含浸、蒸発によるフードにおける続く乾燥により、BTX Microslide P/N 453（3.2mmのギャップ）を滅菌する。95％エタノールに浸すことによりミクログラバーケーブルを滅菌する。無菌のバスツールピペットを用いて、最大1mmの、マイクロスライド電極間の細胞溶液をピペットで取る。
【０３１４】
マイクロスライド上に無菌カバーを配置する。マイクロスライドのポストにマイクログラバーケーブルを結合する。新しく開放され、そして空にされる無菌プラスチックバッグにカバーと共にマイクロスライドを置く。開放側を折りたたみ、そしてテーピングすることによりドッグを閉じ、そしてバッグからのマイクログラバーケーブルの延長を可能にする。BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001の次に倒立顕微鏡を配置する。マイクロスライドを滅菌し、そして倒立顕微鏡に遮断バッグを結合する。マイクロスライドの突然の移動を防ぐためにケーブルをステージに結合する。BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001にマイクログラバーケーブルを結合する。
【０３１５】
BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001上の自動開始ボタンを押す。細胞の配列を、倒立顕微鏡を用いてモニターすることができる。BTX Enhancer 400 Graphic Pulse Display上のACパルスをモニターし、そして表示のコピーをプリントする。電気融合の後、フード中の無菌バッグからマイクロスライドを注意して除く。無菌パスツールピペットを用いて、細胞を注意して吸引し、そしてそれらを、35mlのIMDM＋20％FBS完全ハイブリドーマプレート培地、及びHTに配置する。
【０３１６】
電極間の空間を融合緩衝液により２度、無菌バスツールピペットを用いて洗浄し、いずれの残留する細胞も除去する。それらの細胞を保持し、そしてそれらを、前に収穫された細胞に添加する。マイクロスライドは現在、次の融合のために準備できている。すべての細胞が融合されるまで、前の段階を反復する。35mlのIMDM＋20％FBS完全ハイブリドーマプレート培地、及びHTにおいて37℃で最少30分間、細胞をアニーリングする。６分ごとに軽く逆にする。
【０３１７】
電気融合：
融合＃３：
タンパク質免疫化された雌マウス＃１細胞の電気融合を２つのバッチにおいて行い、ここで第１のバッチは1.0mlの細胞を有し、そして第２のバッチは0.5mlの細胞を有した。すべての細胞を組合した。細胞を、ウェル当たり約5.4×104個の細胞の高密度でプレートした。IMDM + 20% FBS Complete Media 及び HTにおいて287.5mlのプレート体積に融合＃３（タンパク質雌＃１、電気融合）を希釈し、そしてウェル当たり125μlでプレートする。細胞を23のプレートにプレートした。
【０３１８】
融合＃４：
タンパク質免疫化された雄マウス細胞の電気融合を、1.0mlの細胞を有する１つのバッチにおいて行った。細胞を、ウェル当たり約2.6×104個の細胞の高密度でプレートした。IMDM + 20% FBS Complete Media 及びHTにおいて262.5mlのプレート体積に融合＃４（タンパク質雄、電気融合）を希釈し、そしてウェル当たり125μlでプレートする。細胞を21のプレートした。
【０３１９】
例６：
次は、上記例５に記載される抗体のウェスターンブロット分析を行うために使用される方法の記載を提供する。
ポリクローナル抗体：
２−ウェル準備用ゲル12％トリ−グリシン（Invitrogen, #EC6009）を、ウェスターンブロットのために使用した。準備用ゲルサンプル溶液を、4.5μgのタンパク質、1μlの修飾されたヘプシンチモーゲン、124μlの水、125μlの２×サンプル緩衝液（Invitorogenn, #LC2676）、及び20％β−メルカプトエタノールを用いて調製した。サンプル溶液を、100℃に５分間、加熱し、次に氷上で３分間、冷却した。250μlのサンプル溶液を、ゲル上に負荷した。ゲルを、トリス−グリシン走行緩衝液（Inbitorogen, #LC2675）において、200Vで１時間、展開した。
【０３２０】
タンパク質を、Novexトランスファー装置において、7Vで一晩、PVDF膜上にトランスファーし、すなわちブロットした。膜を、リン酸緩衝液、0.1％Tween（PBST）及び5％粉末ミルクにおいて4日目、阻止した。1：500希釈度のポリクローナル血清を、室温で２時間、膜と共にインキュベートした。膜を、PBSTにより２度、それぞれ10分間、洗浄した。第２洗浄の最後で、第２抗体（Pierce, カタログ＃31944、抗マウスIgG/IgM, 1：5,000）を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。膜を、前に記載のようにして洗浄し、次に5mlのAmershame-ECL＋溶液において１分間インキュベートした。膜をプラスチックラップにより被覆し、そしてフィルム（Kadak Bio-Max MR）に１及び5分間、感光し、次に現像した。
【０３２１】
モノクローナル抗体：
２−ウェル準備用ゲル12％トリ−グリシン（Invitrogen, #EC6009）を、ウェスターンブロットのために使用した。準備用ゲルサンプル溶液を、4.5μgのタンパク質、1μlの修飾されたヘプシンチモーゲン（4.5μl/μlの濃度）、124μlの水、125μlの２×サンプル緩衝液（Invitorogenn, #LC2676）、及び20％β−メルカプトエタノールを用いて調製した。サンプル溶液を、100℃に５分間、加熱し、次に氷上で３分間、冷却した。250μlのサンプル溶液を、ゲル上に負荷した。
【０３２２】
ゲルを、トリス−グリシン走行緩衝液（Inbitorogen, #LC2675）において、200Vで１時間、展開した。タンパク質を、Novexトランスファー装置において、7Vで一晩、PVDF膜上にトランスファーした。ブロットを、リン酸緩衝液、0.1％Tween（PBST）及び5％粉末ミルクにおいて4日目、阻止した。600μlの上清液、すなわちハイブリドーマならし培地を、個々のハイブリドーマのための個々のスロットに添加した。上清液を、室温で２時間、膜と共にインキュベートした。
【０３２３】
膜を、PBSTにより２度、それぞれ10分間、洗浄した。第２洗浄の最後で、第２抗体（Pierce, カタログ＃31944、抗マウスIgG/IgM, 1：5,000）を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。膜を、前に記載のようにして洗浄し、次に5mlのAmershame-ECL＋溶液において１分間インキュベートした。膜をプラスチックラップにより被覆し、そしてフィルム（Kadak Bio-Max MR）に１及び5分間、感光し、次に現像した。
次の８種のモノクローナル抗体はヘプシンに結合する：47A5,14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 及び 72H6（図15A−D）。
【０３２４】
例７：
次は、上記例５に記載される抗体についての結合親和性及び反応動力学的定数（KD, ka及びkd）を決定するために使用される、動力学的分析を行うために使用されるBiacore方法の記載を提供する。
【０３２５】
マウスFcに対して特異的なウサギポリクローナル抗体を、第一アミンカップリングを通してCM5 Sensor Chipに共有結合し、そしてマウス抗−ヘプシンモノクローナル抗体を免疫化するために使用した。次に、いくつかの濃度の精製されたヘプシンを、表面上に通し、固定化された抗体への結合を可能にした。ヘプシン結合は、計測器によれば、表面プラスモン共鳴（SPR）における上昇と相互関係した。ヘプシン−抗体複合体の放出を、表面上に緩衝液を通し、そしてSPRにおける低下を測定することにより、同様にして測定した。
【０３２６】
ウサギ抗−マウスFc表面を、標準の第一アミンカップリング方法及び100μg/mlの抗体濃度を用いて調製した。上記例5に記載されるプロテインG−精製された抗体（例えば、94A7）を、HEPES緩衝液、すなわちHBS−EP（Biocore, BR-1001−88）において200nMに記載した。この緩衝液をまた、アッセイを通して移動相として使用した。使用される、精製されたヘプシンタンパク質を293細胞において発現し、そしてエンテロキナーゼにより、活性化した。次の４種の濃度のヘプシンをアッセイに使用した：45, 22.5, 11.25, 5.625及び0nM。このアッセイに使用される遅い速度は、１分当たり10μlであった。先端を、10mMのグリシン（pH1.8）を用いて、個々のサイクル間で再生し、捕獲された抗体及び抗体−結合されたヘプシンを除去し、続くサイクルの準備のための固定された抗−マウス抗体を残した。
【０３２７】
この方法、及び測定器と共に供給されるBiaEvaluation 3.0ソフトウェアを用いて、会合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）及び平衡定数（KD）を、会合及び解離相を適合するために１：１Langmuirモデルを用いて計算した。２種の抗体、1A12及び94A7についての速度定数は下記に記載される。
【０３２８】
【表５】
2006507813.tif 000006
【０３２９】
例８：
次は、上記例５に記載される抗体の活性を中和するためのアッセイを行うために使用される方法の記載を提供する。
抗体中和を、ヘプシン発現のBHK細胞（すなわち、対照細胞）と共に精製された抗体をプレインキュベートし、そして次に、第VII 因子を用いて細胞に対するヘプシン活性をアッセイすることにより試験した。
【０３３０】
典型的なアッセイ条件は次の通りであった：
1.75×106個の細胞を、トリス懸濁液pH7.4（50mM）、NaCl（150mM）、CaCl2（2.5mM）、PEG6000（0.1％）において第VII 因子（10μg）と共に37℃で20分間インキュベートした。その後、その懸濁液を遠心分離し、細胞を除去し、そして上清液をVII a活性についてアッセイした。これを、同じ緩衝液において色原体基質S−2266（Chromogenix）（1.6mM）を用いて実施した。酵素活性を、0.D.405を15分間にわたって測定することにより追跡した（例えば、図19を参照のこと）。
【０３３１】
例９：
次は、前立腺患者からの組織サンプルにおける天然に存在するヘプシン分子の発現を検出するために使用される免疫組織化学方法の記載を提供する。
前立腺患者からの組織サンプルを、パラフィンに包埋し、スライスし、そして顕微鏡スライド上に配置した。スライドをキシレンに３度、及び100％及び95％エチルアルコールにそれぞれ２分間３度、浸し、そしてPBSにより洗浄した。スライドを、Peroxo-Block (Zymed Lab)において１分間インキュベートし、そしてPBSにより洗浄した。スライドを、タンパク質ブロッキング溶液（Dako）において10−15分間インキュベートした。スライドを次の抗体又は対照溶液において室温で一晩インキュベートした。
【０３３２】
ポリクローナル抗体染色：
1/500希釈度でのマウス＃10モノクローナル抗体−ヘプシン抗体免疫−血清を、ヒト前立腺腫瘍組織を染色するために使用した（図16A；左側パネル）。プレ−免疫−血清、すなわちマウス＃９のために、免疫化の前、マウスから採取された血清を、ヒト前立腺腫瘍組織を染色するために負の対照として使用した（図16A：右側のパネル）。
【０３３３】
モノクローナル抗体染色：
マウスモノクローナル抗体−ヘプシン抗体培養物上清液、すなわち抗−ヘプシンモノクローナル抗体11C1を含むハイブリドーマ細胞系からの上清液を、ヒト前立腺腫瘍組織を染色するために使用した（図16B；右側パネル；図16C）。細胞培養物培地を、ヒト前立腺腫瘍組織を染色するために負の対照として使用した（図16B；左側のパネル）。
【０３３４】
スライドをPBSにより洗浄し、そして2μg/mlでの抗−マウスビオチニル化された第二抗体と共に45分間インキュベートした。スライドをPBSにより洗浄し、そしてストレプタビジン接合されたホースラディシュペルオキシダーゼ（2μg/ml）において室温で40分間インキュベートした。スライドをPBSにより洗浄した。
スライドを、NeoRed Substrate キット (Vector Laboratories, Inc)を用いて、８−10分間、展開した。スライドをPBSにより洗浄した。スライドを、QSヘモトキシリンを用いて１分間、対比染色し、そして水により洗浄した。
スライドを、95％、100％エタノール及びキシレンにより３度、それぞれ１分間、脱水した。スライドを顕微鏡下で調べた。
【０３３５】
例10：
次は、蛍光−活性化された細胞分離（FACS）を用いて、細胞表面ヘプシン分子を発現する細胞の存在を検出するための方法の記載を提供する。FACS分析は、80％集密性HEPG2細胞の１つのT150及び１つのT75フラスコを使用することができる。HEPG2は、ヘプシン遺伝子をクローン化するために、Leytusにより最初に使用されたヒト肝癌由来の細胞系である（Leytus など. , 1988, Biochemistry. 27 (3): 1067-74; Knowles など. , 1980, Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science 209: 497-499; Fair and Bahnak, 1984, Human hepatoma cells secrete single chain factor X, prothrombin, and antithrombin III. Blood 64: 194-204; Darlington など. , 1987, Growth and hepatospecific gene expression of human hepatoma cell in a defined medium. In Vitro Cell Dev Biol. 23: 349-354）。
【０３３６】
細胞を、リン酸緩衝溶液（PBS, Mg2+及びCa2+を有さない）によりすすぐ。20〜30mlの細胞解離緩衝液（Invitorogen ,＃1351−014）をフラスコに添加し、フラスコ表面から細胞を解放する。分離された細胞を遠心分離し、ペレット化し、そして15mlの氷冷却されたPBSに再懸濁した。細胞を、6.1×106個の細胞/mlのアリコートに分け、そしてペレットに遠心分離する。細胞を、100μlのPBSにおいて１：100で一次抗体（下記を参照のこと）に再懸濁する。細胞を氷上で１時間インキュベートし、そしてPBSにより２度、洗浄する。
【０３３７】
細胞を、二次抗体（PBS中、1：100のフルオレセイン−抗−マウスIgG H+L, Vector Laboratories, Inc., #F1-2000）と共にインキュベートし、氷上で30分間インキュベートし、そしてインキュベーションの後、PBSにより２度、洗浄する（洗浄当たり1ml）。細胞を350μlのPBSに再懸濁し、FACS管にトランスファーし、そして5μlのプロビジウムヨウ素を個々のサンプルに添加する。次に、個々のサンプルを、FACS機械上で読み取る。
【０３３８】
一次抗体（例えば、ポリクローナル、マウス抗−血清）は次のものを包含する：予備−出血された雄マウス；HEPG2−免疫化された雄マウス；予備−出血されたマウス＃１：HEPG2−免疫化された雌マウス＃１；予備−出血された雌マウス＃２；及びHEPG2−免疫化された雌マウス＃2。
【０３３９】
例11：
次は、活性化された、修飾されたヘプシンプロテアーゼの存在を検出するための、及び/又は候補体化合物のライブラリーから興味ある化合物を同定するための色原体及び蛍光原の基質に基づくアッセイを行うために使用される方法の記載を提供し、ここで興味ある化合物が修飾されたヘプシンプロテアーゼの活性を阻害する。
【０３４０】
活性化され、修飾されたヘプシンの検出：
修飾されたヘプシン分子を、セファロースTMに結合される抗−V5を有する親和性カラムを用いて精製する。
V5−精製された、修飾されたヘプシン分子の活性化は、5mMのトリス、25mMのNaCl、約pH8.08でのEkMax緩衝液中、2μMの修飾されたヘプシン分子、３単位/mlのエンテロキナーゼ（EkMax, Invitrogen）を含む。ヘプシン活性を、種々の時点で調べる。エンテロキナーゼは、除去されるか、又はヘプシンが活性化された後、活性化混合物に生存することができる。
【０３４１】
活性化され、修飾されたヘプシンプロテアーゼの存在は、100mMのヘルペス、100mMのNaCl（pH7.4）中、1nM又は5nMの修飾されたヘプシンプロテアーゼ及び200μMの基質を室温で包含するアッセイにおいて検出され、そしてMolecular Devices SpectraMax 250上で405nmでモニターされる。
【０３４２】
アッセイは、pH7.4で384−ウェルプレートにおいて行われた。修飾された、活性化されたヘプシンプロテアーゼ（例えば、上記例４に記載されるエンテロキナーゼ反応により活性化された）を、色原体基質Val-Leu-Arg-pNA (Chromogenix, カタログ番号S-2266)と反応せしめる。このアッセイにおいては、修飾されたヘプシンプロテアーゼは、パラ−ニトロ−アラニン（pNA）を生成し、405nmでの吸光度をもたらす。アッセイ緩衝液は、100nMのHEPES（pH7.4）、100mMのNaClを含む。修飾されたヘプシンプロテアーゼの濃度は250pMであり、基質濃度は40μMであり、そして候補体化合物は2μMでスクリーンされる。アッセイは90分間、行われ、そして反応は5μlの0.15NのHCl の添加により停止される。405nmでの吸光度は、Wallac“Victor V”を用いて読み取られる。
色原体基質はChromogenixから入手される。種々の基質についての反応動力学定数は、表2に表される。
【０３４３】
ヘプシンインヒビターの検出：
修飾されたヘプシンプロテアーゼの阻害活性を示す化合物を同定するためのスクリーニングアッセイは、ヘプシン−阻害活性について分子をスクリーニングすることにより行われる。
Beriex化合物ライブラリーからの約460,000個の分子を、ヘプシンインヒビタースクリーンにおいて試験する。
【０３４４】
初期の確められていないヒットから、少数の化合物を、再試験に基づいて確める。確められていないヒットは、その特定化合物（化合物は、それらのそれぞれのライブラリープールにおいて２度、出現する）のx位置とｙ位置との間の平均の点から少なくとも60％、ヘプシン活性を阻害したいずれかの化合物として定義される。x結果とｙ結果との間の最大可能デルタ値は20％である。確められたヒットは、IC50値≦10μM及びヒル傾斜＜2.0を有するものとして定義される。
【図面の簡単な説明】
【０３４５】
【図１】図１は、例１に記載されるように、正常ヒト組織におけるヘプシンmRNAレベルのノザンブロット分析を示す。
【図２】図２は、例１に記載されるように、正常ヒト組織におけるヘプシンmRNAレベルのTaqman PCR分析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、例１に記載されるように、前立腺癌におけるヘプシンmRNAレベル；正常及び前立腺癌におけるヘプシンmRNAレベルの比較を示す。A）正常、良性前立腺過形成、一次前立腺癌及び進行した前立腺癌サンプルにおけるヘプシンmRNAレベルのノザンブロット分析；B）正常、良性前立腺過形成、一次前立腺癌及び進行した前立腺癌サンプルにおけるヘプシンmRNAレベルのの折り目−増加を示すグラフ。
【図４】図４は、例１に記載されるように、前立腺癌細胞系（LNCaP）、前立腺良性過形成及び進行した前立腺癌サンプルにおけるヘプシンmRNAのTaqman PCR分析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、前立腺由来の細胞系におけるヘプシンmRNAレベルのノザン分析を示す。A）例１に記載されるような、種々の前立腺−由来の細胞系におけるヘプシンmRNAレベルのノザンブロット分析；B）等サンプル負荷を示すために臭化エチジウムにより染色される、図5Aに示されるノザンブロットを生成するために使用されるアガロースゲルの写真。
【図６】図６は、例１に記載されるような、種々の前立腺−由来の細胞系におけるヘプシンmRNAレベルのTaqman PCR分析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ジヒドロテストステロン（DHT）によるLNCaP細胞におけるヘプシンmRNAレベルのアップ−レギュレーションを示す。A）例１に記載されるような、ジヒドロテストステロンにより処理されたLNCaP細胞におけるヘプシンmRNAレベルのノザンブロット分析；B）例１に記載されるような、ジヒドロテストステロンにより処理された細胞におけるヘプシンmRNAレベルでの折り目−増加を示すグラフ。
【図８】図８は、ヒトヘプシン分子及び修飾されたヘプシン分子の図示である。上部）ヒトヘプシン分子、例えば細胞質、トランスメンブラン及び細胞外ドメイン；A）修飾されたヘプシン分子、例えばシグナルペプチド配列、置換体活性化配列を有する細胞外ドメイン及びエピトープ標識。
【図９】図９は、例２に記載されるような、エンテロキナーゼ切断部位を有する修飾されたヒトヘプシン分子の細胞外ドメインをコードするプラスミドpIRESpuro2W/hepEK（配列番号５）のヌクレオチド配列を示す。下にある括弧は、アミノ酸をそれぞれコードするコドン（３個のヌクレオチド）を示す。不完全コドンは、次の行の開始に重なり合う。不完全コドンにより表されるアミノ酸は、その次のドットにより示され、その結果、その同じアミノ酸が次の行の開始で２度、同定される。当業者は、アミノ酸が３種のヌクレオチドによりコードされることを認識し、そして従って、重なり合うコドンによりコードされるアミノ酸が２度、命名されることを十分に理解するであろう。
【図１０】図10は、例２に記載されるような、エンテロキナーゼ切断部位を有する修飾されたヒトヘプシン分子の細胞外ドメインをコードするプラスミドpCEP4W/hepEK（配列番号６）のヌクレオチド配列を示す。図９におけるように、不完全コドンは、次の行の開始に重なり合う。従って、不完全コドンにより表されるアミノ酸は、その次のドットにより示され、その結果、その同じアミノ酸が次の行の開始で２度、同定される。従って、重なり合うコドンによりコードされるアミノ酸が２度、命名される。
【図１１】図11は、例２に記載されるような、エンテロキナーゼ切断部位と共に修飾されたヒトヘプシン分子の細胞外ドメインのフラグメントをコードする、pCEP4W/hepEK36（配列番号７）としても知られているプラスミドpCEP4W/hep36のヌクレオチド配列を示す。図９のように、不完全コドンは、次の行の開始に重なり合う。従って、不完全コドンにより表されるアミノ酸は、その次のドットにより示され、その結果、その同じアミノ酸が次の行の開始で２度、同定される。従って、重なり合うコドンによりコードされるアミノ酸が２度、命名される。
【図１２】図12は、例３に記載されるような、293EBNAにおいて発現される修飾されたヘプシン分子のウェルターンブロットを示す。
【図１３】図13は、例３に記載されるような、バキュロウィルス感染された昆虫細胞において発現される単離され、修飾されたヘプシン分子を示すウェスターンブロットを示す。
【図１４】図14は、例４に記載されるような、活性ヘプシン酵素を生成するためにヘプシンEDEKタンパク質のエンテロキナーゼ（EKMax）プロセッシングを示すウェスターンブロットである。
【図１５Ａ】図15Aは、例６に記載されるような、モノクローナル抗体11C1及び47A5がヘプシンに結合することを示すウェルターンブロットである。
【図１５Ｂ】図15Bは、例６に記載されるような、モノクローナル抗体38E2 及び 31C1がヘプシンに結合することを示すウェルターンブロットである。
【図１５Ｃ】図15Cは、例６に記載されるような、モノクローナル抗体46D12, 37G10及び 14C7がヘプシンに結合することを示すウェルターンブロットである。
【図１５Ｄ】図15Dは、例６に記載されるような、モノクローナル抗体72H6 及び 14C7がヘプシンに結合することを示すウェルターンブロットである。
【図１６Ａ】図16Aは、例９に記載されるようヒト前立腺腫瘍組織の免疫組織化学的染色を示す。左側パネル：前立腺腫瘍組織を染色するためにヘプシンノックアウトマウスからの予備免疫化されたマウス血清を用いての対照染色。右側のパネル：修飾されたヘプシン分子により免疫化されたヘプシンノックアウトマウスから生成される抗−ヘプシンマウスモノクローナル抗体血清による前立腺腫瘍組織の染色。
【図１６Ｂ】図16Bは、例９に記載されるようヒト前立腺腫瘍組織の免疫組織化学的染色を示す。左側のパネル：培養培地のみによる前立腺腫瘍組織の染色（対照）。右側のパネル：抗−ヘプシンマウスハイブリドーマ11C1からの培地による前立腺癌組織の染色。
【図１６Ｃ】図16Cは、抗−ヘプシンモノクローナル抗体11C1による、例９に記載されるような、ヒト前立腺腫瘍組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１７】図17は、野生型ヘプシンのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ヘプシンエクトドメインは、位置45でのアルギニンにより開始し、そして位置417でのロイシンで終結する。トランスメンブランドメインは、位置18でのバリンで開始し、そして位置44でのロイシンで終結する。細胞質ドメインは、位置１でのメチオニンで開始、そして位置17でのリシンで終結する。
【図１８】図18は、可溶性の修飾されたヘプシン（Hep−ED−EK）、すなわちエンテロキナーゼ置換体活性化配列、及びV5及び6His標識を有するヘプシンエクトドメインのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。ヘプシンエクトドメインは位置１でのアルギニンで開始し、そして位置376でのロイシンで終結する。V5及び6His標識配列は、位置377でのグルタミン酸で開始し、そして位置401でのヒスチジンで終結する。
【図１９】図19は、例５に記載されるようにして生成された、精製されたモノクローナル抗体によるヘプシン活性の中和を示す棒グラフである。
【図１】
2006507813.tif 000007
【図２】
2006507813.tif 000008
【図３】
2006507813.tif 000009
【図４】
2006507813.tif 000010
【図５】
2006507813.tif 000011
【図６】
2006507813.tif 000012
【図７】
2006507813.tif 000013
【図８】
2006507813.tif 000014
2006507813.tif 000015
2006507813.tif 000016
2006507813.tif 000017
2006507813.tif 000018
2006507813.tif 000019
2006507813.tif 000020
2006507813.tif 000021
2006507813.tif 000022
2006507813.tif 000023
2006507813.tif 000024
2006507813.tif 000025
2006507813.tif 000026
2006507813.tif 000027
2006507813.tif 000028
2006507813.tif 000029
2006507813.tif 000030
2006507813.tif 000031
2006507813.tif 000032
2006507813.tif 000033
2006507813.tif 000034
2006507813.tif 000035
2006507813.tif 000036
2006507813.tif 000037
2006507813.tif 000038
2006507813.tif 000039
2006507813.tif 000040
2006507813.tif 000041
2006507813.tif 000042
2006507813.tif 000043
2006507813.tif 000044
【図１２】
2006507813.tif 000045
【図１３】
2006507813.tif 000046
【図１４】
2006507813.tif 000047
【図１５Ａ】
2006507813.tif 000048
【図１５Ｂ】
2006507813.tif 000049
【図１５Ｃ】
2006507813.tif 000050
【図１５Ｄ】
2006507813.tif 000051
【図１６Ａ】
2006507813.tif 000052
【図１６Ｂ】
2006507813.tif 000053
【図１６Ｃ】
2006507813.tif 000054
【図１７】
2006507813.tif 000055
【図１８】
2006507813.tif 000056
【図１９】
2006507813.tif 000057
【配列表】
2006507813000001.app
【国際調査報告】
2006507813.tif 000058
2006507813.tif 000059
2006507813.tif 000060