(57)【要約】本発明は、Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、もしくはＬ−タロースから、またはＬ−グロノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−グロン酸）から、およびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−ガラクトン酸）から、Ｌ−アスコルビン酸を産生する方法における、ＥＰ０８３２９７４Ａ２に開示されたような、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アスコルビン酸を、Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、およびＬ−タロースからなる群より選択される基質から産生する、Ｌ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−アスコルビン酸の産生方法。
【請求項２】
Ｌ−アスコルビン酸を、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトン酸、Ｌ−イドノ−１，４−ラクトン、Ｌ−イドン酸、Ｌ−タロノ−１，４−ラクトン、およびＬ−タロン酸からなる群より選択される基質から産生する、Ｌ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−アスコルビン酸の産生方法。
【請求項３】
Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸をＬ−グロースから産生する、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸の産生方法。
【請求項４】
Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸をＬ−ガラクトースから産生する、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸の産生方法。
【請求項５】
（ａ）酵素をそれぞれの基質に接触させること、および（ｂ）その反応混合物から、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、およびＬ−ガラクトン酸からなる群より選択される産生物を単離することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１〜１２０時間、約１〜約９のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃の温度で実施する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
約２〜約８のｐＨにて、約１８℃〜約４２℃の温度で実施する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、Ｌ−タロース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、およびＬ−ガラクトン酸からなる群より選択される基質からＬ−アスコルビン酸を産生する方法におけるグルコノバクター  オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用であって、ここで、酵素Ｂが、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有する、使用。
【請求項９】
Ｌ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸を産生する方法における、グルコノバクター  オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用であって、ここで、酵素Ｂが、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有する、使用。
【請求項１０】
Ｌ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはガラクトン酸を産生する方法における、グルコノバクター  オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用であって、ここで、酵素Ｂが、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アスコルビン酸の産生方法における、ＥＰ０８３２９７４Ａ２に開示されているようなＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用に関する。
【０００２】
１９３４年に「ライヒシュタイン法」が確立されて以来、長年、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の生物工学的合成に関する実行可能性についての研究がなされてきた。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ遺伝子を有する微生物Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＭＳ４０２５またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンをビタミンＣに酸化する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、Ｄ−アラビノースおよびＬ−ガラクトースからそれぞれＤ−アラビノノ−１，４−ラクトンおよびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンの産生を触媒するＤ−アラビノースデヒドロゲナーゼを有する。しかし、中間体として別のＬ−ヘキソース、すなわち、ビタミンＣの立体配置（Ｃ４位およびＣ５位）に対応する立体配置を有する、Ｌ−イドース、Ｌ−グロース、およびＬ−タロースからの、生物学的なビタミンＣの産生の可能性を記載した報告は全くなかった。
【０００３】
本発明は、Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、もしくはＬ−タロースから、またはＬ−グロノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−グロン酸）から、およびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−ガラクトン酸）から、Ｌ−アスコルビン酸を産生する方法における、ＥＰ０８３２９７４Ａ２に開示されたような、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用を提供する。
【０００４】
本発明はまた、Ｌ−グロースまたはＬ−ガラクトースから、それぞれＬ−グロノ−１，４−ラクトンもしくはＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはその酸性型のＬ−グロン酸もしくはＬ−ガラクトン酸を産生する方法における、ＥＰ０８３２９７４Ａ２に開示されたような、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用も提供する。
【０００５】
参照として取り込んだＥＰ０８３２９７４Ａ２は、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有するＧ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素Ｂを開示する。
【０００６】
さらに、酵素Ｂのアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列がＥＰ０８３２９７４Ａ２に開示されており、本発明の配列表の配列番号２および配列番号１により示される。ＥＰ０８３２９７４Ａ２から、酵素Ｂが、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボソン、Ｄ−マンニトール、Ｌ−イドース、グリセロール、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−マンノン酸を、それぞれ、Ｄ−グルコネート、Ｌ−ソルボース、２−ＫＧＡ、Ｄ−フルクトース、Ｌ−イドン酸、ジヒドロキシアセトン、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、および５−ケト−Ｄ−マンノン酸に変換できることが知られている。
【０００７】
本発明は、Ｌ−アスコルビン酸を、Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、およびＬ−タロースからなる群より選択される基質から産生する、Ｌ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−アスコルビン酸の産生方法に関する。
【０００８】
Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、およびＬ−タロースのようなＬ−ヘキソースは希少な糖であり、基本的に化学的方法により製造され、商業的にはコストの高い化合物である。しかし、Ｌ−グロースおよびＬ−ガラクトースの生物学的調製が近年報告されている。Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素ＡによるＤ−ソルビトールからのＬ−グロースの産生が、ＥＰ０８３２９７４Ａ２に報告された。Ｌ−リボースイソメラーゼによるＬ−ソルボースからのＬ−グロースの産生は、米国特許第６，０３７，１５３号に開示された。Ｌ−ソルボースからのＬ−ガラクトースの産生は、Ｉｚｕｍｏｒｉら（日本生物工学会の２００１年会）により報告されている。この方法では、彼らは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉＳＴ−２４株のＬ−タガトースエピメラーゼによる「Ｌ−ソルボースからＬ−タガトースへの」反応（米国特許第５，８１１，２７１号）と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１４ａ株のＤ−アラビノースイソメラーゼによる「Ｌ−タガトースからＬ−ガラクトースへの」反応からなる２つの酵素的方法を組み合わせた。Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンは、Ｄ−グルコースから調製してもよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
（ａ）
（ｉ）反応混合物中において、Ｌ−グロースおよびＬ−ガラクトースからＬ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列もしくはそれと９０％同一であるアミノ酸配列またはその一部を有する酵素あるいはその機能的等価物に、Ｌ−グロースまたはＬ−ガラクトースを接触させることを含む、酵素によりＬ−グロースまたはＬ−ガラクトースからＬ−アスコルビン酸を産生するか、
（ｉｉ）反応混合物中において、Ｌ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトンを、Ｌ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列もしくはそれと９０％同一であるアミノ酸配列またはその一部を有する酵素あるいはその機能的等価物に、Ｌ−グロースまたはＬ−ガラクトースを接触させることを含む、酵素によりＬ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトンを、Ｌ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを産生するか、または
（ｉｉｉ）反応混合物中において、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンからＬ−アスコルビン酸を、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンからＬ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列もしくはそれと９０％同一であるアミノ酸配列またはその一部を有する酵素あるいはその機能的均等物に、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを接触させることを含む、酵素によりＬ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンからＬ−アスコルビン酸を産生し、
（ｂ）その反応混合物から、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、またはＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを単離する方法を提供する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、Ｌ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−アスコルビン酸の産生方法を提供することであり、これによりＬ−アスコルビン酸を、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトン酸、Ｌ−イドノ−１，４−ラクトン、Ｌ−イドン酸、Ｌ−タロノ−１，４−ラクトン、およびＬ−タロン酸からなる群より選択される基質から産生する。
【００１１】
さらなる実施形態において、本発明は、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸の産生方法を網羅し、これによりＬ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸を、Ｌ−グロースから産生する。
【００１２】
さらに、本発明の１つの態様は、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸の産生方法を提供することであり、これによりＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸を、Ｌ−ガラクトースから産生する。
【００１３】
前記した本発明による方法は、（ａ）酵素を、それぞれの基質に接触させること、および（ｂ）その反応混合物から、それぞれの産生物を単離することを含む。産生物がビタミンＣである場合、その基質は、Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、Ｌ−タロース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトン酸、Ｌ−イドノ−１，４−ラクトン、Ｌ−イドン酸、Ｌ−タロノ−１，４−ラクトン、およびＬ−タロン酸からなる群より選択される。産生物がＬ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸である場合、その基質はＬ−グロースである。産生物がＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸の場合、その基質はＬ−ガラクトースである。
【００１４】
本発明において、酵素の機能的均等価物は、当該技術分野で既知の化学的ペプチド合成により、または、当該技術水準で既知の方法により本明細書に開示したようなＤＮＡ配列に基づき組換え手段により作製し得る。このような分子の活性を一般に変化させないタンパク質およびペプチドのアミノ酸交換は、当該技術水準で既知である。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、ならびにこれらの逆である。
【００１５】
さらに、酵素のこのような機能的均等価物は、例えば配列表に開示されている配列番号１のＤＮＡ配列およびその相補鎖、またはその配列を含むもの、そのような配列もしくはその断片と標準的な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列、および遺伝子コードの変性のためにこのような配列と標準的な条件下でハイブリダイズしないが、まさに同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、によりコードされているアミノ酸配列を含み、ここで、機能的等価物が、
（ｉ）Ｌ−グロースからＬ−アスコルビン酸を、Ｌ−ガラクトースからＬ−アスコルビン酸を
（ｉｉ）Ｌ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−グロン酸）を、Ｌ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−ガラクトン酸）を、または
（ｉｉｉ）Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−グロン酸）からＬ−アスコルビン酸を、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−ガラクトン酸）からＬ−アスコルビン酸を
産生する酵素活性を有する。
【００１６】
ハイブリダイゼーションのための「標準的条件」は、この脈絡では、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般に使用する条件、または好ましくは、いわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくは当業者がよく知っているいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。さらに、当該技術分野で既知の方法により本明細書に開示したＤＮＡ配列に基づいて設計したプライマーを使用することによりポリメラーゼ連鎖反応により作製できるＤＮＡ配列もまた、本発明の目的である。本発明のＤＮＡ配列はまた、例えばＥＰ７４７４８３Ａ２に記載のようにも合成的に作製できる。
【００１７】
遺伝子の変異体は、遺伝子もしくは遺伝子を有する微生物を紫外線照射、Ｘ線照射、γ線照射などの変異原で処理するか、または亜硝酸、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは他の適切な変異原と接触させるか、または自発的変異によりもしくは当分野で知られているインビトロでの標準的な変異誘発法により生じるコロニーもしくはクローンを単離することにより調製できる。これらの多くの方法が種々の刊行物に記載されている。
【００１８】
本明細書に使用したように、「変異体」は、非天然ポリヌクレオチド配列またはその天然形から変化した（例えば、１〜１００個、好ましくは２０〜５０個、より好ましくは１０個未満のヌクレオチドの再配列または欠失または置換により）ポリヌクレオチド配列をコードする任意の遺伝子である。前記したように、このような非天然配列は、ランダム突然変異誘発、化学的突然変異誘発、自然的変異、ＵＶ照射、ＰＣＲによる変異導入、部位特異的突然変異誘発などにより得られ得る。好ましくは、実施例で示したアッセイ手順を使用して、変異していない親ポリペプチドと比べると、生成量の増加したまたは活性の向上したポリペプチドの発現が変異により生じる。このような変異細胞を作製し、スクリーニングし、同定する方法は、当該技術分野で公知である。
【００１９】
ポリペプチドをコードするＤＮＡＳ配列の供給体としての特に好ましいＧ．ｏｘｙｄａｎｓ株は、ＤＳＭ  Ｎｏ．４０２５でゲッティンゲン（ドイツ）のドイツ微生物および培養細胞収集局〔Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）〕に寄託されたが、これは１９８７年３月１７日にブダペスト条約の規約の下になされた。Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の同定特徴を有する微生物の生物学的および／または分類学的に均一な培養物もまた、ＤＮＡ配列の供給体となり得る。
【００２０】
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の継代培養液は、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２の下で、日本の通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。ＥＰ０２７８４４７Ｂ１は、この株の特徴を開示する。
【００２１】
このようにして決定した（コドン出現頻度を考慮する）ヌクレオチド配列の情報を使用することにより、（ｉ）Ｌ−グロースおよびＬ−ガラクトースからＬ−アスコルビン酸を、（ｉｉ）Ｌ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−グロン酸）を、Ｌ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−ガラクトン酸）を、または（ｉｉｉ）Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−グロン酸）からＬ−アスコルビン酸を、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン（およびその酸性型のＬ−ガラクトン酸）からＬ−アスコルビン酸を産生する活性を有し、Ｌ−グロースまたはＬ−ガラクトースからのビタミンＣ形成活性を有する、進化的に多岐にわたる酵素をコードする遺伝子を、前記ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列に従って合成もしたプローブを用いてのコロニーもしくはサザンハイブリダイゼーションにより、または、必要であれば、前記の情報に従って合成もしたプライマーを用いてのポリメラーゼ連鎖反応により、異なる生物から単離することができる。
【００２２】
さらに、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の酵素Ｂ遺伝子および前記に定義したその機能的均等物または変異体を有する組換え微生物を作製するための好ましい宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５、ならびにそれらの生物学的および／または分類学的に均一な培養物または変異体であり得る。
【００２３】
組換え発現ベクター上または宿主微生物の染色体ＤＮＡ上に、酵素Ｂおよびその機能的均等物の遺伝子または変異体を有する組換え微生物を作製するために、形質転換、形質導入、接合、および電気穿孔などの種々の遺伝子導入法を使用することができる。組換え微生物を作製する方法は、分子生物学の分野でよく知られている方法から選択してもよい。通常の形質転換システムを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに使用できる。形質導入システムもまた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに使用できる。接合システムは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓなどのグラム陽性およびグラム陰性細菌に広く使用することができる。抱合は液体培地または固体表面で起こり得る。好ましいレシピエントは、適切な組換え発現ベクターを用いて活性酵素Ｂを産生することができる、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓから選択される。接合ではレシピエントに、通常、選択マーカーを加え；例えば、ナリジクス酸またはリファンピシンに対する耐性を、通常、選択する。
【００２４】
本発明で提供される微生物は、好気的条件下で適切な栄養分を補充した水性培地中で培養してもよい。培養は、約１．０〜約９．０、好ましくは約２．０〜約８．０のｐＨで実施してもよい。培養期間は、ｐＨ、温度、および使用する栄養培地に応じて変化するが、通常、２〜５日間が良好な結果をもたらす。培養を実施するに適切な温度範囲は、約１３℃〜約４５℃、好ましくは約１８℃〜約４２℃である。
【００２５】
従って、前記したような本発明のビタミンＣの産生方法は、１〜１２０時間、約１〜約９のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃の温度で実施する。好ましくは、その方法は、約２〜約８のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃の温度で実施する。これらの条件はまた、本発明のさらなる実施形態として、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、またはＬ−ガラクトン酸の製造方法にも適用される。
【００２６】
培養培地は、同化可能な炭素源、消化可能な窒素源、および無機物質、ビタミン、微量元素、ならびに他の増殖促進因子などの栄養分を含むことが通常必要である。同化可能な炭素源の例には、グリセロール、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−ソルビトール、およびＬ−ソルボースが挙げられる。
【００２７】
酵母抽出液、肉抽出液、ペプトン、カゼイン、コーンスティープリカー（corn steep liquor）、尿素、アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩などの種々の有機または無機物質もまた窒素源として使用してもよい。無機物質として、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一鉄および塩化第二鉄、炭酸カルシウムなどを使用してもよい。
【００２８】
本明細書に使用したＬ−アスコルビン酸は、その物質が、遊離酸の形態として、またはＮａ塩、Ｋ塩、もしくはヘミカルシウム塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸カルシウム二水和物などの塩の形態として存在することを意味する。さらに、Ｌ−アスコルビン酸の濃度は、特記しない限り、遊離酸の形態として記載される。
【００２９】
本明細書に使用したＬ−グロノ−１，４−ラクトンおよびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンは、その物質がそれらのラクトン形態および／またはその酸性型として存在することを意味し、その両方が種々の物理化学的条件下で平衡状態で存在する。
【００３０】
本明細書に使用した「標準的なハイブリダイゼーション条件」という語句は、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般に使用する条件、または好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわゆる中程度のストリンジェントな条件、またはさらにより好ましくは当業者がよく知っているいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件を意味する。
【００３１】
例えば、以下のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の任意の組合せを、適宜、使用してもよい。
【００３２】
高ストリンジェントハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、穏やかに振とうしながら４２℃で一晩インキュベート。
【００３３】
高ストリンジェント洗浄：２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、室温で１５分間１回洗浄し、その後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、室温で１５分間さらに洗浄。
【００３４】
低ストリンジェントハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、穏やかに振とうしながら３７℃で一晩インキュベート。
【００３５】
低ストリンジェンシー洗浄：０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、室温で１５分間１回洗浄。
【００３６】
中程度のストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション反応が起こる温度および／または前記に示したような洗浄条件を変化させることにより得てもよい。
【００３７】
反応混合物中のＬ−アルドースおよびＬ−アルドノラクトンなどの基質の濃度は、他の反応条件に応じて変更することができるが、一般に、約１ｇ／ｌから約３００ｇ／ｌ、好ましくは約１０ｇ／ｌから約２００ｇ／ｌであってもよい。
【００３８】
反応は好気的に実施することができる。
【００３９】
反応において、酵素は、限定されないが、酵素溶液、無処置細胞（intact cell）、固定酵素などの任意の形態で使用でき、また固定細胞を使用してもよい。
【００４０】
反応後、Ｌ−アスコルビン酸またはＬ−アルドノラクトンを、反応液から、例えば薄層クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィーなどの種々の種類のクロマトグラフィーの組合せにより回収してもよい。反応生成物としてのＬ−アルドノラクトンはまた、本発明の反応混合物中に存在するので、精製せずにさらなる反応の基質として使用することもできる。
【００４１】
以下の実施例を、本発明の方法をさらに説明するために提供する。これらの実施例は単なる実例であり、いずれにしても本発明の範囲を限定するものではない。
【００４２】
実施例１：酵素Ｂ遺伝子を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９によるＬ−グロースからのＬ−グロノ−１，４−ラクトン／Ｌ−グロン酸の産生
酵素Ｂをコードする遺伝子をクローニングし、ｐＳＳ１０３ＲからベクターｐＴｒｃＭａｌＥにサブクローニングし、ＥＰ０８３２９７４Ａ２に記載のようなｐＴｒｃＭａｌＥ−ＥｎｚＢを作製した。ｐＴｒｃＭａｌＥ−ＥｎｚＢを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ培地中で３０℃で１５時間増殖させ、１００μｌの得られたブロスを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮なＬＢ培地に移し、３０℃で４時間インキュベートした。その後、ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭでその培養液に加え、その培養液をさらに３０℃で２時間培養した。ＩＰＴＧを添加していないｐＴｒｃＭａｌＥ−ＥｎｚＢを有するＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の対照培養も実施した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９を、前記したのと同じように対照株として使用し、ＩＰＴＧを添加して培養または添加せずに培養した。８ｍｌの培養液からの細胞を、遠心分離により収集し、１ｍｌの蒸留水に懸濁した。得られた細胞懸濁液を、２５０μｌの細胞懸濁液、１％の基質、０．３％のＮａＣｌ、１％のＣａＣＯ３、１μｇ／ｍｌのＰＱＱ、および１ｍＭのＰＭＳからなる４００μｌの反応混合物を用いた反応に使用し、この混合物を室温で１６時間インキュベートした。この実験で使用した基質はＬ−グロースであった。Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン＋Ｌ−グロン酸およびビタミンＣの量を表１を要約した。
【００４３】
【表１】
2006500049.tif 000002
【００４４】
実施例２：酵素Ｂ遺伝子を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９によるＬ−グロノ−１，４−ラクトン／Ｌ−グロン酸からのビタミンＣの産生
使用した基質が本実施例においてＬ−グロノ−１，４−ラクトンであったこと以外は、実施例１に記載のように実験を実施した。ビタミンＣの量を表２に要約した。
【００４５】
【表２】
2006500049.tif 000003
【００４６】
実施例３：酵素Ｂ遺伝子を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９によるＬ−ガラクトースからのＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン／Ｌ−ガラクトン酸の産生
使用した基質が本実施例においてＬ−ガラクトースであったこと以外は、実施例１に記載のように実験を実施した。Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン＋Ｌ−ガラクトン酸およびビタミンＣの量を表３に要約した。
【００４７】
【表３】
2006500049.tif 000004
【００４８】
実施例４：酵素Ｂ遺伝子を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９によるＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトン／Ｌ−ガラクトン酸からのビタミンＣの産生
使用した基質が本実施例においてＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンであったこと以外は、実施例１に記載のように実験を実施した。ビタミンＣの量を表４に要約した。
【００４９】
【表４】
2006500049.tif 000005
【００５０】
【表５】
2006500049.tif 000006
【配列表】
2006500049000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月31日(2004.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アスコルビン酸の産生方法であって、
（ａ）酵素を、Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、およびＬ−タロースからなる群より選択される基質に接触させること、および
（ｂ）その反応混合物からＬ−アスコルビン酸を単離すること、
を含み、
ここで、該酵素が、Ｌ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する方法。
【請求項２】
Ｌ−アスコルビン酸を、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、Ｌ−ガラクトン酸、Ｌ−イドノ−１，４−ラクトン、Ｌ−イドン酸、Ｌ−タロノ−１，４−ラクトン、およびＬ−タロン酸からなる群より選択される基質から産生する、Ｌ−アスコルビン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−アスコルビン酸の産生方法。
【請求項３】
Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸をＬ−グロースから産生する、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸の産生方法。
【請求項４】
Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸をＬ−ガラクトースから産生する、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸を産生する活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９０％同一であるアミノ酸配列を有する酵素を用いる、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはＬ−ガラクトン酸の産生方法。
【請求項５】
（ａ）酵素をそれぞれの基質に接触させること、および（ｂ）その反応混合物から、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、およびＬ−ガラクトン酸からなる群より選択される産生物を単離することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１〜１２０時間、約１〜約９のｐＨにて、約１３℃〜約４５℃の温度で実施する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
約２〜約８のｐＨにて、約１８℃〜約４２℃の温度で実施する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−グロース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−イドース、Ｌ−タロース、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン、Ｌ−グロン酸、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトン、およびＬ−ガラクトン酸からなる群より選択される基質からＬ−アスコルビン酸を産生する方法におけるグルコノバクター  オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用であって、ここで、酵素Ｂが、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有する、使用。
【請求項９】
Ｌ−グロースからＬ−グロノ−１，４−ラクトンまたはＬ−グロン酸を産生する方法における、グルコノバクター  オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用であって、ここで、酵素Ｂが、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有する、使用。
【請求項１０】
Ｌ−ガラクトースからＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンまたはガラクトン酸を産生する方法における、グルコノバクター  オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５の酵素Ｂの使用であって、ここで、酵素Ｂが、以下の物理化学的特性：
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００Ｄａの分子量；
（ｂ）第一級および第二級アルコールならびにアルデヒドに対する基質特異性；
（ｃ）約６〜約９のｐＨにおけるｐＨ安定性；
（ｄ）約８．０のｐＨにおいて最適ｐＨ；
（ｅ）Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋による阻害；
を有する、使用。
【国際調査報告】
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2006500049.tif 000008
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