(57)【要約】放射線によって生じる、細胞および／または被験体への損傷を、アルファ・チモシン・ペプチドの投与により処置または防止する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線損傷から被験体の細胞を防護するための処置の方法であって、このような処置を必要とする被験体に対し、放射線から防護する量のアルファ・チモシン・ペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
アルファ・チモシン・ペプチドは、チモシン・アルファ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重で前記被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約１〜５ｍｇの投与量で前記被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約１．６ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約３．２ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アルファ・チモシン・ペプチドは、照射の少なくとも約３時間前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アルファ・チモシン・ペプチドは、照射前に複数回にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アルファ・チモシン・ペプチドは、照射前に少なくとも約３回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アルファ・チモシン・ペプチドは、前記被験体に投与されて前記被験体の細胞への放射線損傷の治癒を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アルファ・チモシン・ペプチドは、チモシン・アルファ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ患者の体重の投与量で前記患者に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約１〜５ｍｇの投与量で前記患者に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約１．６ｍｇの投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
アルファ・チモシン・ペプチドは、約３．２ｍｇの投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルファ・チモシン・ペプチドは、注射または注入により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルファ・チモシン・ペプチドは、注射または注入により投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルファ・チモシン・ペプチドはポリマーに共役し、前記被験体におけるペプチドの血漿内半減期を増大させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルファ・チモシン・ペプチドはポリマーに共役し、前記被験体におけるペプチドの血漿内半減期を増大させる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年１１月２５日に出願された米国仮出願連続番号第６０／４２８，７４６号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
１．発明の分野
この発明は、放射線損傷から被験体、たとえば哺乳類および／またはその細胞を防護すること、または放射線によって生じた損傷の処置の分野に関する。
【０００３】
２．背景技術の説明
ヒトおよびその細胞は、癌の処置中に放射線に曝露され得、また、原子力事故、戦時、またはテロリストによる核攻撃の間等において不本意にまたは故意に放射線に曝露され得る。放射線損傷の処置に対しては、当該分野において公知のさまざまな製剤が存在し、放射線被曝によって生じた損傷を処置するために多くの試みがなされてきた。
【０００４】
当該技術では、放射線への曝露によって生じた損傷を治癒または防止するために、改良された方法および組成物が依然として必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
この発明に従い、放射線損傷から被験体および／または被験体の細胞を防護するための方法は、このような処置を必要とする被験体に対し、放射線から防護する量および／または放射線を処置する量のアルファ・チモシン・ペプチドを投与するステップを含む。
【０００６】
発明の詳細な説明
この発明は、アルファ・チモシン・ペプチドが、放射線損傷から被験体および／または被験体の細胞を防護するという発見に基づく。この発明は、被験体または細胞が放射線に曝露され、かつ、被験体が曝露前に処置を受ける状況、たとえば癌の処置中に適用することができる。この発明はまた、被験体が放射線に曝露され、かつ、この曝露後に処置を受ける状況（たとえば、原子力事故、戦時、またはテロリストによる核攻撃の間等）にも適用することができる。この発明は、放射線のイオン化および非イオン化の両方によって生じた損傷の防護または処置に適用することができる。
【０００７】
チモシン類は、胸腺由来のポリペプチド免疫調節因子の一類である。チモシン類は、リンパ球において成熟に関する事象を誘発して、Ｔ細胞の機能を増大させ、かつ、免疫欠如の再構築を促進することがこれまでに示されてきた。チモシン・アルファ１（ＴＡ１と呼ばれることもある）は、２８個のアミノ酸からなる、分子量が３１００の胸腺ペプチドであり、免疫調節性を有し、仔ウシ胸腺のチモシン・フラクション５から本来分離した天然物と相同である。その生物学的作用は、Ｔリンパ球の機能を増大させることを含み、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を調節すること、インターフェロンの産生を刺激すること、Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の活性を誘発すること、ならびに胸腺細胞の分化を刺激することを含む。チモシン・アルファ１はまた、ＭＨＣクラス（Class）Ｉの発現を上方制御することが示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明は、一実施形態に従い、放射線損傷から被験体の細胞を防護するための処置の方法であり、このような処置を必要とする被験体に対し、放射線から防護する量のアルファ・チモシン・ペプチドを含む組成物を投与するステップを含む。
【０００９】
アルファ・チモシン・ペプチドは、天然ＴＡ１に加え、天然ＴＡ１のアミノ酸配列を有する合成ＴＡ１および組換え型ＴＡ１を含む、チモシン・アルファ１（ＴＡ１）ペプチドを含み、合成ＴＡ１および組換え型ＴＡ１のアミノ酸配列は、天然ＴＡ１のアミノ酸配列と実質的に同様であるか、または、その短縮された配列形態であり、生物学的に活性なそれらの類似体は、置換されたか、抹消されたか、延長されたか、置換えられたか、または変更された配列を有し、これらの配列は、ＴＡ１の配列と実質的に同様である対生物活性を有し、たとえば、ＴＡ１由来のペプチドは、ＴＡ１との十分なアミノ酸相同性を有し、それによってＴＡ１由来のペプチドは、ＴＡ１と実質的に同じ活性かつ実質的に同じ態様で機能する。好ましいアルファ・チモシン・ペプチドは、チモシン・アルファ１である。
【００１０】
投与は、注射、定期的な注入、持続的な注入等を含む任意の好適な方法によって行なわれ得る。
【００１１】
一実施形態によると、皮下注射されたＴＡ１の血漿内半減期がわずかに約２時間であるため、ＴＡ１等のアルファ・チモシン・ペプチドは、実質的により長い処置期間にわたり、患者の循環器系において実質的に持続した態様で有効量のアルファ・チモシン・ペプチドを維持するように患者に投与される。この発明に従い、より一層長い処置期間が企図されるが、この発明の実施形態は、少なくとも約６時間、１０時間、１２時間、またはそれよりも長い時間の処置期間にわたり、患者の循環器系において実質的に持続した態様で有効量のアルファ・チモシン・ペプチドを維持するステップを含む。他の実施形態において、処置期間は少なくとも約１日に及び、複数日、たとえば１週間以上にも及ぶ。しかしながら、上で規定した、有効量のアルファ・チモシン・ペプチドが患者の循環器系において実質的に持続した態様で維持される処置は、同じ持続期間または異なる持続期間を有する、処置を行なわない期間によって分断され得る。
【００１２】
一実施形態に従い、アルファ・チモシン・ペプチドは、処置期間中に、たとえば静脈内注入によって持続的に患者に注入され、患者の循環器系において実質的に持続した態様で有効量のアルファ・チモシン・ペプチドを維持する。この注入は、ミニポンプ等の任意の好適な手段により実施され得る。
【００１３】
代替的に、アルファ・チモシン・ペプチドの注射による投与計画は、患者の循環器系において有効量のアルファ・チモシン・ペプチドを実質的に持続した態様で維持するように管理され得る。注射による好適な投与計画は、１時間、２時間、４時間、６時間ごと等の注射を含み、処置期間中に患者の循環器系において実質的に持続した態様で有効量のチモシン・ペプチドを維持することができる。
【００１４】
アルファ・チモシン・ペプチドを持続的に注入する間に、投与が実質的により長い期間にわたって行なわれることが企図されるが、一実施形態に従い、アルファ・チモシン・ペプチドの持続的な注入は、少なくとも約１時間の処置期間にわたって行なわれる。より好ましくは、持続的な注入は、より長い期間、たとえば、少なくとも約６時間、８時間、１０時間、１２時間またはより長い時間にわたって行なわれる。他の実施形態において、持続的な注入は、少なくとも約１日、および、１週間以上等の複数日にわたって行なわれる。
【００１５】
好ましい実施形態において、アルファ・チモシン・ペプチドは、製剤学的に許容され得
る液体担体、たとえば、注射用水、生理的濃度の生理食塩水等内に含有される。
【００１６】
この発明はまた、生理的に活性な共役体の投与も含み、この生理的に活性な共役体は、この共役体が患者に投与される際に患者の血清内におけるアルファ・チモシン・ペプチドの半減期を増大させる材料と共役するアルファ・チモシン・ペプチドを含む。この材料は、実質的に非抗原性ポリマーであることが考えられる。好適なポリマーは、その分子量が約２００〜３００，０００の範囲内、好ましくは約１，０００〜１００，０００の範囲内、より好ましくは約５，０００〜３５，０００の範囲内、最も好ましくは約１０，０００〜３０，０００の範囲内であり、約２０，０００の分子量が特に好ましい。
【００１７】
また、含まれる高分子物質は、好ましくは室温において水溶性である。このようなポリマーの非限定的な一覧には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール等のポリアルキレン酸化物ホモポリマーと、ポリオキシエチレン化ポリオルと、そのコポリマーと、その水溶性が維持されるならば、そのブロックコポリマーとが含まれる。実質的に非抗原性であるこれらのポリマーの中でも、１個の原子が活性化されてアルキルを末端に有するポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、たとえば、モノメチルを末端に有するポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が企図される。ｍＰＥＧに加え、Ｃ１−４アルキル末端ポリマーもまた有用であると考えられる。
【００１８】
ＰＡＯベースのポリマーの代替例として、事実上非抗原性の材料、たとえば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマー等を用いることができる。当業者は、上述の一覧が単に例示的なものであり、ここに記載する品質を有するすべてのポリマー材料が企図されることを認識するであろう。この発明の目的のために、「事実上非抗原性の」とは、当該技術において非毒性であり、かつ、哺乳類においてはっきりと認め得るほどの免疫原性応答を惹起しないものと認識されるすべての材料を意味する。
【００１９】
ポリマーは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、特に好ましいポリマーである。
【００２０】
ポリマーは、任意の好適な方法により、アルファ・チモシン・ペプチドに共役され得る。ポリマーをペプチドに共役させるための例示的な方法は、米国特許第４，１７９，３３７号、第４，７６６，１０６号、第４，９１７，８８８号、第５，１２２，６１４号、および第６，１７７，０７４号に加え、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ  ９５／１３０９０号に開示されており、これらのすべては、この明細書において引用により援用される。
【００２１】
チモシン・アルファ１は、ポリマーがアミノ基と共役するための、５個の異なる部位を有し、１つの部位または複数の部位において１つのポリマーまたは複数のポリマーが共役され得る。
【００２２】
一実施形態によると、分子量が４０，０００のＰＥＧは、チモシン・アルファ１（ＴＡ１）等のアルファ・チモシン・ペプチドのＮ末端に共役される。これは、当該技術で公知であるように、適切な側鎖保護基を用いて、不溶性高分子担体ビーズ上に固相ペプチドを合成することによって行なわれ得る。
【００２３】
ビーズ上においてアルファ・チモシン・ペプチドの合成が完了した後に、保護されたペプチドは、Ｎ末端に遊離アミノ基を残した状態でビーズから開裂し、この遊離アミノ基が、分子量が４０，０００のＰＥＧと反応する。その後、この発明のこの実施形態に従って側鎖保護基が除去されて、共役体を形成する。
【００２４】
アルファ・チモシン・ペプチドのチモシン・アルファ１（ＴＡ１）の分離、特徴付け、および使用は、たとえば、米国特許第４，０７９，１２７号、米国特許第４，３５３，８２１号、米国特許第４，１４８，７８８号、および米国特許第４，１１６，９５１号に記載されている。
【００２５】
好適な投与量のアルファ・チモシン・ペプチドは、１６ｍｇ／ｋｇ体重／日以上もの量で投与され得る。アルファ・チモシン・ペプチドの好ましい投与量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にあり、例示的な投与量は、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００２６】
一実施形態に従い、放射線から防護する有効量は、約０．１〜１０ｍｇ、好ましくは約１〜５ｍｇの範囲内の量のアルファ・チモシン・ペプチドを含む投与量である。さらに例示的な投与量は、約１．６ｍｇおよび３．２ｍｇの量のアルファ・チモシン・ペプチドを含む。
【００２７】
上述の投与量は、組成物内に存在するアルファ・チモシン・ペプチドのみを反映しており、このアルファ・チモシン・ペプチドに共役するポリマーの重量は反映しない。
【００２８】
好ましい実施形態において、アルファ・チモシン・ペプチドは、製剤学的に許容され得る液体担体、たとえば注射用水内に含有される。しかしながら、アルファ・チモシン・ペプチドを含有する製剤学上の投与単位は、任意の好適な経路による投与用に、任意の好適な態様で配合されてよい。
【００２９】
アルファ・チモシン・ペプチドは、放射線への曝露前に被験体に投与される場合、好ましくは照射の少なくとも約３時間前に被験体に投与される。特定の実施形態において、アルファ・チモシン・ペプチドは、照射前の複数回にわたり、たとえば、照射前の２回、３回、４回またはそれよりも多くの回数にわたり、被験体に投与される。
【００３０】
アルファ・チモシン・ペプチドは、照射後に被験体に投与される場合、好ましくは照射後できるだけ速やかに投与され、好ましくは、照射後複数回にわたって投与される。たとえば、アルファ・チモシン・ペプチドは、照射直後、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間ごと、１日に３回、１日に２回、毎日、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回等に投与され得る。投与は、注射、注入、または他の方法によって行なわれ得る。
【００３１】
この実施形態によると、この発明は、処置方法であり、この方法では、アルファ・チモシン・ペプチドがこの被験体に投与されて、被験体の細胞への放射線損傷の治癒を促す。
【００３２】
処置を受けるべき被験体は、放射線に曝露されたか、または曝露され得る任意の哺乳動物の被験体、たとえば、ヒト被験者または患者であることが考えられる。
【００３３】
限定を意図しない以下の実施例により、この発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００３４】
細胞は、放射線被爆により損傷を受けるか、または殺傷され得る。したがって、小腸の幹細胞およびクローン形成性細胞を放射線に曝露して処置および監視を行ない、この処置の効果を観察した。小腸の各腺窩に４から１６個の実際の幹細胞が存在すると考えられている。実際の幹細胞がすべて殺傷された場合に腺窩を再生させ得るクローン形成性細胞のさらなる予備もまた存在する。したがって、これらのクローン形成性細胞の生存が、腺窩の生存、および、細胞傷害の後の無傷の上皮性裏層の回復の鍵になる（腺窩の生存を確実にするために、僅か１個のクローン形成性細胞が生き残るだけでよく、したがって、無傷
の上皮組織が保持される）。増殖因子および関連する分子を用いて、これらの細胞の、細胞傷害性因子に対する感受性を操作することができ、それによって胃腸粘膜炎および口腔粘膜炎の重篤度を低下させることができる。細胞傷害性損傷の前に与えられた因子は、クローン形成性細胞の数を増大させ得（それによってクローン形成性細胞の生存の確率を高め）、または、このような細胞の細胞周期を停止するように作用し得る（それによってこのような細胞の、損傷または死に対する耐性を高める）。損傷後に与えられた因子は、幹細胞の早期の増幅または増殖を開始させ、したがって再生の過程の速度を高め得る。両方のプロトコルの組合せにより、上皮組織に最大の防護を提供することができる。したがって、この研究は、チモシンの効果、または、放射線により誘発された損傷からクローン形成性細胞、すなわち腺窩を防護する効果を調べる。
【００３５】
３６匹の成体雄ＰＤＦ１マウス（１０〜１２週齢）を用い、これらの動物を６つのグループに分けて以下のように処置した。すなわち、（１）対照マウス、（２）照射した未処置のマウス、（３）照射の３時間前にチモシン３ｍｇ／ｋｇを腹注したマウス、（４）照射の３時間前に賦形剤を腹注したマウス、（５）照射前の３日間にわたり、１日に３回チモシン３ｍｇ／ｋｇを腹注したマウス、および（６）照射前の３日間にわたり、１日に３回賦形剤を腹注したマウス、である。
【００３６】
これらの注入は、９：００（３回の処置）または１２：００（１回の処置）に行なわれた。３日目の３：００において、１回照射線量が１３Ｇｙ（グレイ（Gray））のＸ線照射を用いて腸の損傷を誘発した。
【００３７】
照射の４日後にこれらの動物を屠殺した。小腸を切除し、組織学的分析用の処理を行なう前にカルノア（Carnoy）固定液で固定した。３ｕｍの切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。照射を受けた切片では、１つ以上のクローン形成性細胞を有する、生存する腺窩をはっきりと視認することができる。これらの領域以外では、間充織が完全に表皮剥離を起こしており、これらの動物を５日以上生かしておくと、粘膜炎により下痢を発症して死亡するであろう。
【００３８】
各動物につき、１０箇所の腸の周径を分析した（１グループにつき６０箇所）。周径は、腸の所定の長さに相当するため、長さの好都合な基線単位である。１つの周径につき生存している腺窩の数を得点化し、１グループについての平均を求めた。Ｈ＆Ｅで強く染色された１０個以上の細胞（パネート細胞は除く）を含む腺窩と、パイエル（Peyer）板を含まない無傷の周径とのみを得点化した（パイエル板は、通常の周径内の腺窩の数と、損傷から生き延びる腺窩の能力との両方に影響を及ぼす）。
【００３９】
腺窩の平均幅（その幅が最大の地点において測定）もまた測定し、腺窩の大きさの差による得点化の誤差を補正した。この補正は、以下のように適用された。すなわち、補正した腺窩の数／周径＝未処置の対照グループにおける腺窩の平均幅／処置された動物における腺窩の平均幅×処置グループにおける、生存する腺窩の平均数。
【００４０】
すべての動物が処置後も生存し、明らかな有害反応を呈示しなかった。チモシンを１回投与したグループにおいて、生存レベルは、賦形剤を１回投与したグループと同様であった。賦形剤のグループのうち１匹の動物は、放射線に対する感受性がわずかに低かったため、より多くの腺窩が生存し（補正後７．９）、グループの補正平均値を２．４から３．５に引き上げた。この動物を除外していれば、１回投与におけるチモシンの防護作用を示唆するものになったであろう（２．４ｖｓ３．３）。しかしながら、１３Ｇｙのみのグループにおいて腺窩の生存に同様の変動があり、賦形剤を３回投与したグループが３．０の平均値を有するため、１回投与による処置の効果は小さいか、またはごく僅かであることが考えられる。
【００４１】
３回投与によるチモシンの処置が、特に興味深い。対照グループにおける３に比べ、補正された腺窩生存率５．３が認められたが、これは、１．７７の防護係数に等しい（生存する腺窩の７７％の増大）。
【国際調査報告】
2006507349.tif 000002