(57)【要約】本発明は、ポリペプチドおよびこれらをコード化する核酸ならびに肝臓障害および腫瘍性疾患、特に肝臓および他の上皮組織の癌、アデノーマなどの良性肝新生物ならびに限局性結節性過形成（ＦＮＨ）および肝硬変などの他の増殖性肝臓障害の診断、防止、および／または処置へのその使用に関する。本発明は、更に、これらの障害を診断および処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載の配列を含む単離されたポリペプチド、またはその機能的変異体。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドをコードする単離された核酸、またはその変異体。
【請求項４】
核酸が、一本鎖または二本鎖ＲＮＡである、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
核酸が、配列番号１１記載の核酸を含む、請求項３記載の核酸。
【請求項６】
請求項３記載の核酸、および配列番号１〜９または配列番号４７によるポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される核酸を含むベクター。
【請求項７】
ベクターがノックアウト遺伝子構築物、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、および発現ベクターからなる群より選択される、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項３記載の核酸を含む細胞。
【請求項９】
請求項６記載のベクターを含む細胞。
【請求項１０】
細胞がトランスジェニック胎性非ヒト幹細胞である、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
請求項３記載の核酸を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
抗体が請求項１記載のポリペプチドに対して、または請求項３記載の核酸に対して作成されている、抗体またはその抗体断片。
【請求項１３】
請求項３記載の核酸に対して相補性である配列を有する核酸または請求項３記載の核酸の非機能的突然変異体変種を含む核酸。
【請求項１４】
相補性配列を有する核酸がアンチセンス分子またはＲＮＡ干渉分子である、請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１３記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
ベクターがプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、および発現ベクターからなる群より選択される、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１３記載の核酸を含む細胞。
【請求項１８】
請求項１５記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
請求項１記載のポリペプチド、配列番号１〜９または配列番号４７記載のポリペプチド、上記ポリペプチドの１つをコードする核酸、上記核酸の１つの変異体、および上記ポリペプチドの１つに対して作製された抗体または抗体断片からなる群より選択された少なくとも１つの化合物を、適切な添加剤または助剤と組合せてかまたは一緒に含む診断薬。
【請求項２０】
核酸が、プローブである、請求項１９記載の診断薬。
【請求項２１】
プローブが、ＤＮＡプローブである、請求項２０記載の診断薬。
【請求項２２】
請求項１記載のポリペプチド、配列番号１〜９または配列番号４７記載のポリペプチド、上記ポリペプチドの１つの機能的変異体、上記ポリペプチドの１つをコードする核酸、上記核酸の１つの変異体、上記核酸の１つの非機能的突然変異体変種である核酸、上記核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、上記核酸の１つを含むベクター、上記核酸の１つを含む細胞、上記ベクターを含む細胞、上記ポリペプチドの１つに対して作製された抗体または抗体の断片、上記ポリペプチドの１つの機能的変異体に対して作成された抗体または抗体の断片、上記抗体の１つをコードする核酸を含むベクター、上記抗体の１つをコードする核酸を含むベクターを含む細胞、および上記抗体断片の１つをコードする核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択された少なくとも１つの成分を、適切な添加剤または助剤と組合せてかまたは一緒に含む医薬組成物。
【請求項２３】
相補性配列を有する核酸が、アンチセンス分子またはＲＮＡ干渉分子である、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
配列番号１〜９または配列番号４７記載のポリペプチド、上記ポリペプチドの１つの機能的変異体、上記ポリペプチドの１つをコードする核酸、上記核酸の１つの変異体、上記核酸の１つの非機能的突然変異体変種である核酸、上記核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、上記ポリペプチドの１つに対して作成された抗体または抗体の断片、および上記ポリペプチドの１つの機能的変異体に対して作製された抗体または抗体の断片からなる群より選択された少なくとも１つの化合物が、患者のサンプル中で同定され、参照ライブラリーまたは参照サンプルの少なくとも１つの化合物と比較される、肝臓障害または上皮癌の診断の方法。
【請求項２５】
肝臓障害が、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、血色素症、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される障害である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
上皮癌が、肺、胃、腎臓、大腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
肝臓障害または上皮癌を患う患者を処置する方法であって、配列番号１〜９または配列番号４７記載のポリペプチド、上記ポリペプチドの１つの機能的変異体、上記ポリペプチドの１つをコード化する核酸、上記核酸の１つの変異体、上記核酸の１つの非機能的突然変異体変種である核酸、上記核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、上記核酸の１つを含むベクター、上記核酸の１つを含む細胞、上記ベクターを含む細胞、上記ポリペプチドの１つに対して作製された抗体または抗体の断片、上記ポリペプチドの１つの機能的変異体に対して作製された抗体または抗体の断片、抗体をコードする核酸を含むベクター、抗体をコードする核酸を含むベクターを含む細胞、および抗体断片をコードする核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分が、適切な添加剤または助剤と組合せてかまたは一緒に、処置の必要な患者に治療的有効量で投与される方法。
【請求項２８】
相補性配列を有する核酸が、アンチセンス分子またはＲＮＡ干渉分子である、請求項２７記載の処置の方法。
【請求項２９】
ＲＮＡ干渉分子が、二本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを発現するベクターの形で投与される、請求項２８記載の処置の方法。
【請求項３０】
ＲＮＡ干渉分子が、１５〜３０個のヌクレオチドからなる群より選択されるサイズ範囲を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
肝臓障害が、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、血色素症、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される障害である、請求項２７〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
上皮癌が、肺、胃、腎臓、大腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である、請求項２７〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
配列番号１〜９または配列番号４７の配列記載のポリペプチド、またはその機能的変異体に対する、肝臓障害または上皮癌を患う患者の免疫反応を刺激する方法であって、配列番号１〜９または配列番号４７の配列記載のポリペプチド、その機能的変異体、上記ポリペプチドの１つをコードする核酸、上記核酸の１つの変異体、上記核酸の１つを含むベクター、上記核酸の１つを含む細胞、および上記ベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、このような治療の必要な患者に治療的有効量で投与し、患者の免疫反応を刺激する方法。
【請求項３４】
患者から分離したサンプル中で異なって発現された配列番号１０〜配列番号１９記載の少なくとも１つの核酸、またはその変異体を、参照ライブラリーまたは参照サンプルに対して同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離したサンプル中の、配列番号１０〜配列番号１９記載の少なくとも１つの核酸、またはその変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記核酸の発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の同じ上記核酸の発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中の異なって発現された上記核酸を同定する工程と；
を含む方法。
【請求項３５】
肝臓障害または上皮癌を診断する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離したサンプル中の、配列番号１０〜配列番号１９記載の少なくとも１つの核酸、またはその変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記核酸の発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の該核酸の発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中の異なって発現された上記核酸を同定する工程と；
（ｄ）工程（ｃ）で同定した上記核酸を、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中の異なって発現された上記核酸と一致させる工程と；
を含み、
一致した核酸が、肝臓障害または上皮癌を患う患者を示す、
方法。
【請求項３６】
工程（ａ）で、少なくとも２つの核酸が、同定される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）で、上記核酸の検出が、ＰＣＲベース検出によるか、またはハイブリダイゼーションアッセイによる、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｂ）において、上記核酸の発現が、固相ベースのスクリーニング方法、ハイブリダイゼーション、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、およびＲＮａｓｅ保護アッセイからなる群から選択される方法によって比較される、請求項３５〜３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
患者から分離したサンプルが、肝臓組織、肝臓細胞、癌性形質転換を受けた別の器官からの組織、この器官からの細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択される、請求項３５〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
参照サンプルが、同じ患者の非罹患サンプルおよび別の対象者からの非罹患サンプルから選択された供給源より分離される、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
参照サンプルが、肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択される、請求項３５〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
参照ライブラリーが、工程（ａ）の上記核酸の肝臓障害特異的発現に関するクローンまたはデータを含む発現ライブラリーまたはデータベースである、請求項３５〜４１のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
病理参照サンプルが、肝臓障害または上皮癌を患う別の患者からの罹患サンプルから選択された供給源から分離される、請求項３５〜４２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
病理参照ライブラリーが、参照サンプルまたは参照ライブラリーでの対照発現に対する、肝臓障害または上皮癌を患う別の患者から分離されたサンプル中の工程（ａ）における上記核酸のディファレンシャル発現に関するデータを含むデータベースである、請求項３５〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
肝臓障害が、肝細胞癌、良性肝新生物、および肝硬変からなる群より選択される障害である、請求項３５〜４４のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
上皮癌が、肺、胃、腎臓、大腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である、請求項３５〜４４のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
参照ライブラリーまたは参照サンプルに対して、患者から分離されたサンプル中で異なって発現された配列番号１〜配列番号９または配列番号４７記載の少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能的変異体を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離されたサンプル中の、配列番号１〜配列番号９または配列番号４７記載の少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能的変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記ポリペプチドの発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の上記ポリペプチドの発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中の異なって発現された上記ポリペプチドを同定する工程と；
を含む方法。
【請求項４８】
肝臓障害または上皮癌を診断する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離されたサンプル中の、配列番号１〜配列番号９または配列番号４７記載の少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能的変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記ポリペプチドの発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の上記ポリペプチドの発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記ポリペプチドを同定する工程と；
（ｄ）工程（ｃ）で同定した上記ポリペプチドを、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中の異なって発現された上記ポリペプチドと一致させる工程と；
を含み、
一致したポリペプチドが、肝臓障害または上皮癌を患う患者を示す、
方法。
【請求項４９】
少なくとも２つのポリペプチドが、同定される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドが、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー技法、免疫ブロット分析、免疫組織化学、酵素ベース免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴、ＨＰＬＣ、質量分析法、免疫組織化学、および酵素ベース免疫アッセイからなる群より選択される方法によって検出される、請求項４８または４９記載の方法。
【請求項５１】
ポリペプチドが、二次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー分離技法、免疫ブロット分析、表面プラズモン共鳴、免疫組織化学、および酵素ベース免疫アッセイからなる群より選択される方法によって比較される、請求項４８〜５０のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
患者から分離したサンプルが、肝臓組織、肝臓細胞、癌性形質転換を受けた別の器官からの組織、この器官からの細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択される、請求項４８〜５１のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
参照サンプルが、同じ患者の非罹患サンプルおよび別の対象者からの非罹患サンプルから選択された供給源より分離される、請求項４８〜５２のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
参照サンプルが肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択される、請求項４８〜５３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
参照ライブラリーが、工程（ａ）の上記核酸の肝臓障害特異的発現に関するクローンまたはデータを含む発現ライブラリーまたはデータベースである、請求項４８〜５４のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
病理参照サンプルが、肝臓障害または上皮癌を患う別の患者からの罹患サンプルから選択された供給源から分離される、請求項４８〜５５のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
病理参照ライブラリーが、参照サンプルまたは参照ライブラリーでの対照発現に対する、肝臓障害または上皮癌を患う別の患者から分離されたサンプル中の工程（ａ）における上記ポリペプチドのディファレンシャル発現に関するデータを含むデータベースである、請求項４８〜５６のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
肝臓障害が、肝細胞癌、良性肝新生物、および肝硬変からなる群より選択される障害である、請求項４８〜５７のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
上皮癌が、肺、胃、腎臓、大腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である、請求項４８〜５７のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
患者が肝臓障害または上皮癌を発症するのを防止する方法であって、配列番号１〜９または配列番号４７記載のポリペプチド、その機能的変異体、上記ポリペプチドの１つをコードする核酸、上記核酸の１つの変異体、上記核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、上記核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、上記核酸の１つを含むベクターまたはその変異体、上記核酸の１つを含む細胞またはその変異体、および上記ベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分が、このような防止処置の必要な患者に治療的有効量で投与される方法。
【請求項６１】
薬理学的活性化合物を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）配列番号１〜９または配列番号４７記載の少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能的変異体を提供する工程と；
（ｂ）上記ポリペプチドに、薬理学的活性化合物であると思われる化合物を接触させる工程と；
（ｃ）工程（ａ）の上記ポリペプチドと薬理学的に活性であると思われる上記化合物との相互作用をアッセイする工程と；
（ｄ）工程（ａ）の上記ポリペプチドと直接または間接的に相互作用する、薬理学的に活性であると思われる上記化合物を同定する工程と；
を含む方法。
【請求項６２】
工程（ａ）の上記ポリペプチドがカラムに付着されるか、上記ポリペプチドが、アレイに付着されるか、電気泳動ゲルに含有されるか、膜に付着されるか、または細胞によって発現される、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
相互作用が、酵素または蛍光ベース細胞レポーター法によってアッセイされる、請求項６１または６２記載の方法。
【請求項６４】
相互作用が、表面プラズモン共鳴、ＨＰＬ、または質量分析法によってアッセイされる、請求項６１または６２記載の方法。
【請求項６５】
工程（ｄ）の直接または間接機能相互作用が、工程（ａ）における上記ポリペプチドの発現の誘発、上記ポリペプチドの発現の抑制、上記ポリペプチドの機能の活性化、上記ポリペプチドの機能の抑制からなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドおよびこれらをコード化する核酸ならびに肝臓障害および腫瘍性疾患、特に肝臓および他の上皮組織の癌、良性肝新生物、例えばアデノーマならびに他の増殖性肝臓障害、例えば限局性結節性過形成（ＦＮＨ）および肝硬変の診断、防止、および／または処置へのその使用に関する。本発明は、更に、これらの障害を診断および処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の発生は一般に、例えば増殖、アポトーシス（細胞死）、ストレスに対する反応および上皮／間質相互作用を含む、重要な細胞経路の活性を変化させる遺伝子変異を特徴とする。癌において調節解除された核酸の同定は、腫瘍性形質転換の機構への重要な新しい洞察を与えうることが、ますます認識されている。マクロ再生結節などの前癌状態における調節解除核酸発現の同定ならびに肝臓癌における「大きな」および「小さな」細胞変化は、悪性形質転換の初期事象の知識を提供する。同様に、肝臓におけるＦＮＨおよび肝硬変などの組織増殖および組織修復を特徴とする障害における調節解除遺伝子発現の同定は、増殖および悪性形質転換に包含される核酸を識別できる。このような調節解除核酸およびコード化された遺伝子生成物は共に、癌の新しい診断マーカーとしての可能性を有する。その上、これらの調節解除核酸の生成物はそれ自体、ヒト患者におけるこれらの障害の防止および／または処置での治療介入の標的である。
【０００３】
肝臓は、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、およびビタミンの代謝で重要な役割を果たす。効果的に診断、防止、または処置できない、肝細胞癌（ＨＣＣ）などの肝臓に影響を及ぼす多数の障害がある。ＨＣＣの検査は、癌における調節解除遺伝子発現の同定に特によく適している。このことは、ＨＣＣの組織サンプルが外科的に切除した腫瘍から得ることが可能であり、腫瘍が間質組織がほとんどない、境界が明らかな固形構造であるからである。
【０００４】
更に、先に記載したように、肝硬変、非腫瘍性症状と同様に良性および悪性腫瘍の比較分析の可能性がある。肝臓障害に関連する異なって発現された遺伝子を同定する技術の制限が克服できるならば、この比較手法は、成熟器官での（例えば肝硬変での）細胞増殖および組織修復の過程に特異的に関与する調節解除核酸の同定はもちろんのこと、過形成（ＦＮＨなど）ならびに良性および悪性新生物（例えばアデノーマおよびＨＣＣ）に関連する遺伝子発現変化の同定および識別を可能にする。ＨＣＣにおいて、新しくより優れた診断および治療能力への切迫した要求がある。肝臓癌の調節解除遺伝子が、胃腸管の他の癌と、そして確かに他の癌腫（上皮由来癌）と高度に関連性であるのは、これらの組織が共通の発生起源を共有するためである。
【０００５】
世界的に肝細胞癌（ＨＣＣ）は、最も一般的な悪性腫瘍に属し、約１００万件死亡／年を計上している（Ishakら, 1999. Atlas of Tumor Pathology. Fascicle 31. Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC）。
【０００６】
ＨＣＣなどの腫瘍性肝臓障害および他の多くの腫瘍の最終診断は、生検標本の組織病理学的評価に依存する。この侵襲性外科的措置は、一般に、症候が現れるまで行われず、そのとき疾患は、ほとんどの場合で進行段階にあるため、それにより治療介入の選択肢が制限される。それゆえ診断薬および診断方法を改善するための要求がある。加えて早期診断が不可欠であるが、晩期発症または特異的臨床症候の欠如によってさえ阻止される。診断時に大半のＨＣＣ腫瘍は、外科的切除をもはや受入れられない（被包性腫瘍または線維層状変種を除く）（Chen and Jeng, 1997, J.Gastroenterol. Hepatol.12: 329-34）；その上、これらは細胞増殖抑制療法に対して高度に耐性である（Kawataら, 2001 Br.J.Cancer 84: 886-91）。全体的に、通例、診断後１年以内に死に至る。それゆえＨＣＣの初期検知のマーカー、予後指標、および有効な防止および／または治療法が、この分野で非常に望ましい。
【０００７】
対照的に、結腸直腸癌において良く研究された状況とは異なり、肝臓アデノーマは、ＨＣＣの前駆病巣を示さない。同様に肝硬変および肝炎ウイルス感染は、ＨＣＣの明らかな危険因子であるが、これらの状態はＨＣＣ発症に必須ではない。ある肝臓病巣は、マクロ再生結節性過形成などのＨＣＣ前段階を示すが、これはまだ確認されていない（Shortell and Schwartz, 1991, Surg Gynecol Obstet.173: 426-31; Anthony, P. in MacSweenら, 編 Pathology of the Liver.2001, Churchill Livingstone, Edinburgh）。これらの障害は、肝臓切除および肝臓生検の組織病理学的調査によって診断されるが、これらの状態のより早期の、または非侵襲性検知の有効な方法は存在していない。さらに、これらの新生物の診断および予後マーカーに対する、およびこれらの障害の非侵襲性検知に対する即時の要求がある。
【０００８】
過去１０年間に複数の技術が、細胞内の多数の転写物の発現レベルを常に監視することを可能にしてきた（例えばSchenaら, 1995, Science 270: 467-470; Lockhartら, 1996, Nature Biotechnology 14: 1675-1680; Blanchardら, 1996, Nature Biotechnology 14, 1649; 1996, 米国特許第５，５６９，５８８号を参照）。転写物配列技術が、各種の障害状態においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子の同定に利用されてきた。複数の最近の研究は、ＨＣＣでの遺伝子発現の変化を検査するために、この技術を利用してきた。これらの研究は、対照に対して、ＨＣＣ細胞系およびＨＣＣ組織中の肝臓特異性タンパク質をコード化する遺伝子の調節解除（すなわち過剰および過小発現）をさまざまに明らかにした。その上、研究は、細胞サイクル制御、ストレス反応、アポトーシス、脂質代謝、細胞−細胞相互作用、ＤＮＡ修復、ならびにサイトカインおよび成長因子生成に必須の遺伝子を明らかにした（Graveelら, 2001, Oncogene 20: 2704-12; Kawaiら, 2001, Hepatology 33: 676-91; Lauら, 2000, Oncol.Res.12: 59-69; Nagaiら, 1998, Cancer 82: 454-61; Okabeら, 2001, Cancer Res 61: 2129-37; Salvucciら, 1999, Oncogene 18: 181-187; Shirotaら, 2001, Hepatology 33: 832-40; Tackels-Horneら, 2001, Cancer 92: 395-405; Wuら, 2001, Oncogene 20: 2674-3682; Xuら, 2001, Cancer Res.61: 3176-81）。しかしながら、これらの研究で報告された遺伝子発現パターンには、実験設計の相違により、および／またはＨＣＣ組織自体の不均一性により、ほとんど一致しない。その上、これらのＨＣＣの病因は、重要な因子である。Ｂ型およびＣ型慢性肝炎ウイルス感染は、ＨＣＣの主な要因であるが、アルコールによる損傷および慢性肝臓障害もＨＣＣを発生させることが認識されており、これら各種の病因による腫瘍の発症の原因となる機構は異なりやすい。総合すれば、現在までに、肝臓障害への介入を可能にする満足な診断薬および診断方法が開発されていない。
【０００９】
同じことが肝臓障害、および上皮癌の治療に当てはまる。例えばＨＣＣでは、切除および移植を除いて有効な治療選択肢がないが、これらの手法は、ドナー肝臓へのアクセスが制限され、患者への高度の危険と関連付けられた、ＨＣＣの早期段階においてのみ利用できる。加えてこれらの手法は、非常に費用がかかる。これらの癌は、大抵解毒での正常な肝機能および有害な化合物の移出により、化学療法にはごくわずかしか反応しない。化学塞栓、凍結療法、およびエタノール注射などの、複数の他の治療選択肢は、なお実験段階にあり、これらの有効性は確立されていない。外科的介入が最良の処置選択肢のままであるが、腫瘍の程度を精密に定義することはできない。したがってこの侵襲性措置は、処置の観点からすれば次善である。更に特異的な肝臓機能障害の早期診断の欠如は、大抵疾患の進行助長につながり、それは治療選択肢を更に混乱させ、これらの疾患による患者の死亡率を劇的に上昇させる（Jansen P.L., 1999, Neth.J.Med.55: 287-292）。それゆえ現在まで、肝臓障害および他の上皮癌に介入できるようにする満足のいく療法が開発されていない。更に最新技術においては、ディファレンシャル遺伝子発現によって明かされるような、ＨＣＣ前駆病巣、良性肝新生物、およびアルコール性肝臓疾患および肝硬変などの代謝性肝臓疾患などの、肝臓障害の各種サブタイプの認識は、開示されていない。本発明で評価された障害の一部の主要な疾患の特徴の概要を表１に与える。
【００１０】
【表１】
2006500074.tif 000002
【００１１】
本発明は、当分野に存在する制限を克服する、ポリペプチドおよびこれらをコード化する核酸ならびに肝臓障害、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、および上皮癌、前癌肝臓病巣、アデノーマなどの良性新生物、ならびに限局性結節性過形成（ＦＮＨ）および肝硬変などの、他の増殖性肝臓障害の診断、防止、および／または処置のためのその使用に関する。本発明は、このような核酸を含むベクターおよび細胞に、そして上記ポリペプチドおよび核酸に対して作成された抗体または抗体断片にも関する。
【００１２】
本発明は、更に、これらの障害を診断および処置する方法に関する。重複するが明確な形態的および臨床的特徴を持つ複数の障害の評価は、同定および識別に関する新しい情報ならびに本発明による、これらの疾患の極めて新しい治療方法を提供する。
【００１３】
本発明で採用された独自の手法は、非腫瘍性ヒト肝臓のプールと比較してＨＣＣで特異的にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子中で濃縮された疾患特異的ｃＤＮＡライブラリーの作成のために、別個の、病理学者が確認した肝臓癌の病態を利用する。ライブラリーは、ＨＣＣでの調節解除遺伝子発現のゲノム規模の表現であり、したがってすべての潜在的なＨＣＣ調節解除遺伝子を含む。多くの更なる別個の、病理学者が確認した肝臓癌サンプル（ＨＣＣ）および非悪性肝臓病巣からの標識された発現核酸を用いた、これらのライブラリークローンへの反復ハイブリダイゼーションは、ＨＣＣ中で高度に調節解除された核酸を示した。驚くべき発見は、この手法が、これまでに同定されていない調節解除核酸及び以前にＨＣＣと関連付けられなかった多くの調節解除核酸を提供し、その発現向上が他の新生物にも関連付けられることである。これらのＨＣＣ調節解除遺伝子およびタンパク質は、本発明の主題である。
【００１４】
スクリーニングおよび検証方法は、入念および明確なパラメータ選択により、それ自体既に独創的である。本発明による異なって発現された遺伝子の同定は、ヒト肝臓の障害での遺伝子発現変化の発現に関して、組織病理学的に識別された肝臓障害組織に依存する。実験用の非罹患の参照肝臓サンプルも、診断により確認した。
【００１５】
本発明の目的は、肝臓障害、肝臓癌、および／または上皮癌の診断方法によって解決され、ここで配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７の配列によるポリペプチド（表２）、その機能的変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載したポリペプチドの１つに対して作成された抗体または抗体の断片、またはその変異体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を、患者のサンプル中で同定して、参照ライブラリーの、または参照サンプルの少なくとも１つの化合物と比較する。
【００１６】
本発明の目的は、肝臓障害または上皮癌を患う患者を治療する方法によっても解決され、ここで配列番号１〜９および／または配列番号４７によるポリペプチド、先に記載したポリペプチドの１つの機能的変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、またはその機能的変異体、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載したベクターを含む細胞、先に記載したポリペプチドに対してまたはその機能変異体に対して作成された抗体または先に記載した抗体の１つの断片、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体断片をコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および先に記載した抗体断片をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、治療の必要のある患者に治療的有効量で投与する。
【００１７】
本発明の別の態様において、本発明によるポリペプチド、その機能変異体、ポリペプチドをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載したベクターを含む細胞、先に記載したポリペプチドの１つに対して作成された抗体、先に記載したポリペプチドの１つの機能変異体に対して作成された抗体、先に記載した抗体の１つの断片、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体断片の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および先に記載した抗体断片の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される、少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物を、治療の必要のある患者に治療的有効量で投与することが規定される。
【００１８】
本発明によるポリペプチドのアクセッション番号およびそのｃＤＮＡを表２に示す。
【００１９】
【表２】
2006500074.tif 000003
【００２０】
本発明によるこれらの核酸およびポリペプチドのサブセットは、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、上皮起源の他の癌において、そして好ましくは該当する正常なヒト組織においてではなく、特異的に発現または調節解除されることが示されている。これらの核酸は、好ましくは、配列番号１１〜１６および１９を含む（表６および図３に与える）。肝臓癌の調節解除核酸は、これらの組織が共通の発生起源を共有しているため、好ましくは胃腸管の他の癌と高度に関連性がある。結果として、これらの核酸およびコード化されたポリペプチドは、好ましくは、診断の診断方法、医薬組成物、およびこれらの上皮癌の防止および／または処置の方法にも同様に利用できる。
【００２１】
本発明によるポリペプチドおよび核酸は、参照サンプルと比較して、本発明による障害を患う患者から分離されたサンプルでは異なって発現されるという共通点を持つ。本発明によるポリペプチドおよび核酸の調節は、病理プロセスには必須であり、本発明による障害の診断、防止、および／または処置と直接および間接の関係にある。本発明によるポリペプチドおよび核酸は、現在までに既知の標的に属さないので、診断および療法への驚くべきおよび完全に新規な手法が本発明から生じる。
【００２２】
一般に、組織中で異なって発現された遺伝子の分析は、細胞培養システムの分析よりも、人為的な偽陽性クローンの形でのエラーを起こしにくい。既存の細胞培養システムが、組織中の病理過程の複雑さを十分にシミュレートできないという事実に加えて、培養環境における細胞挙動の変動が、実際の病理状態に関して疑わしい核酸およびポリペプチドの発現パターンを生じさせる。これらの問題は、正常および罹患ヒト組織での遺伝子発現を利用する手法によってより明白になりにくいが、複数の変数が再度、疾患に直接関連性であるディファレンシャル遺伝子発現の明らかな同定を混乱させる。例えば、異なって発現された核酸は、個人間の相違、代謝状態、および／または臨床処置パラダイムから生じることがある。更に、ｃＤＮＡマイクロアレイを使用する大規模な遺伝子発現の研究は、遺伝子発現における変動の細胞源を示していない。加えて、すべてまたは大半の遺伝子を含むディファレンシャル遺伝子発現の研究は、主要疾患関連の遺伝子発現の変化の識別を混乱させる、大量のデータを生成する。結果として、一般的にのみ定義された肝臓障害（例えば肝臓腫瘍）による組織からの遺伝子発現の大規模プロファイリングを含む手法は、疾患過程に関与する主要な遺伝子を明らかにしそうもなく、診断および治療介入への最良の標的となるのは、これらの主要な遺伝子である。
【００２３】
これらの問題により、スクリーニングの成功は、実験パラメータの選択に大きく依存している。使用した方法は、確立された方法に基づいて使用されるが、スクリーニングおよび検証方法は、入念および明確なパラメータ選択により、それ自体既に独創的である。本発明で利用した独自の手法は、非腫瘍性ヒト肝臓のプールと比較してＨＣＣで特異的にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた核酸中で濃縮された疾患特異性ｃＤＮＡライブラリーの作成のために、別個の、病理学者が確認した肝臓癌病態を利用する。実験用の非罹患の参照肝臓サンプルも、診断により確認して、個人間の変動から生じる偽陽性の検知を減少させるために３名のサンプルをプールした。参照肝臓プールおよび罹患肝臓（すなわちＨＣＣ）において同様のレベルで一般に発現された核酸は、サブストラクティブ・サプレッシブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）ｃＤＮＡライブラリーの作成によって除去された（Diatchenkoら, 1996, Proc.Natl.Acad. Sci.USA 93: 6025-6030）。これらのｃＤＮＡｓは、ＨＣＣでアップレギュレートおよびダウンレギュレートの両方をされた核酸について高度に濃縮されるが、異なって発現された核酸に相当しない。数千個の各ＳＳＨクローンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、カスタムｃＤＮＡマイクロアレイ内のガラススライドに付着させた。病理学者が確認した追加の肝臓障害によるＲＮＡを、マイクロアレイ上のプールされた非罹患肝臓ＲＮＡを用いて競合ハイブリダイゼーション用の蛍光標識ｃＤＮＡに変換する。ハイブリダイゼーション強度の生成率は、肝臓障害において特異的に調節解除された核酸を明らかにする。ディファレンシャル発現された遺伝子に関して高度に濃縮された候補ｃＤＮＡのプールを提供することに加えて、ＳＳＨライブラリーは、ゲノム規模で、全部でないにしても大半の異なって発現された遺伝子を、標準ｃＤＮＡライブラリーよりもはるかに少ないクローンと共に提示する。それによりこの特徴は、疾患で特異的に調節解除された核酸に集中する。本発明で作成されたＳＳＨライブラリーは、正常な肝臓では本質的に発現されず、それにより従来のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノム規模のｃＤＮＡマイクロアレイで提示されない核酸からのｃＤＮＡクローンを含む。
【００２４】
正常な肝臓と比較した肝臓障害組織における本発明による配列の過剰発現は、配列特異的定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって、ＲＮＡレベルの独立した分析により確認される（図２）。これらの検証実験において、本発明による配列の細胞ＲＮＡレベルに相当するＰＣＲ生成物は、特異的ＰＣＲ生成物の蛍光検知により監視する。蛍光シグナルは、ＴａｑＭａｎ手順の配列特性加水分解プローブオリゴヌクレオチド（プライマー）、またはＳＹＢＲグリーンなどの蛍光二本鎖ＤＮＡ結合染料のどちらかよって提供される。本発明による配列に相当するＰＣＲ生成物のレベルは、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンを含む「ハウスキーピング」遺伝子のレベルとの比較によって、実験可変性について正規化され、疾患中にまたは実験操作の後で比較的不変であると見なされる。これらのＱ−ＰＣＲ手順は、本発明による配列のレベルが、低分子干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチドによって実験的に低下した場合などの実験状況において、遺伝子発現のレベルを測定するためにも使用される（図６、表１０）。ＴａｑＭａｎ  Ｑ−ＰＣＲ分析に使用された参照遺伝子プライマーは、ＧＡＰＤＨ−ｐ１、配列番号５６；ＧＡＰＤＨ−ｐ２、配列番号５７；ＧＡＰＤＨ−ｐ３、配列番号５８；ｂＡｃｔｉｎ−ｐ１、配列番号５９；ｂＡｃｔｉｎ−ｐ２、配列番号６０；およびｂＡｃｔｉｎ−ｐ３、配列番号６１である。ＳＹＢＲグリーン分析に使用した参照遺伝子プライマーは、ｂＡｃｔｉｎ−ｐ４、配列番号６２；およびｂＡｃｔｉｎ−ｐ５、配列番号６３である。Ｑ−ＰＣＲ実験における、これらのハウスキーピング遺伝子に対するＲＮＡレベルの決定は、Ｐｆｆａｆｌ（Nucleic Acids Research(2001) May 1, 29(9): e45）の方法にしたがって実施した。これらの技法は、当業者に周知である。
【００２５】
更に本発明によるＨＣＣ調節解除遺伝子の発現は、静止細胞の血清刺激の８時間後および１２時間後のヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）の増殖に関連している（図８）。この発見は、本発明による発現の過剰発現が、肝臓癌などの増殖性肝臓障害にとって機能的に重要であるという示唆を裏付けている。
【００２６】
最先端と比較すると、これらのポリペプチドおよび核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期で、より高速の、および／または非侵襲性の診断を可能にする。本発明による核酸およびポリペプチドは、肝臓障害および上皮癌の診断、防止、および処置に利用できる。
【００２７】
本発明は、配列番号２による配列を含むポリペプチド、またはその機能変異体に関する。本発明は、ポリペプチドをコード化する核酸、またはその機能変異体、特に配列番号１１による核酸およびその変異体に関する。
【００２８】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは、配列番号２による配列からなる。別の好ましい実施態様において、核酸は、配列番号１１による配列からなる。
【００２９】
最先端と比較すると、これらのポリペプチドおよび核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期で、より高速の、および／または非侵襲性の診断を可能にする。
【００３０】
本発明の別の態様において、本発明は、配列番号１〜９および／または配列番号４７による少なくとも１つのポリペプチド、ポリペプチドの機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、機能変異体をコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載したベクターを含む細胞、先に記載したポリペプチドの１つに対して作成された抗体、先に記載したポリペプチドの１つの機能変異体に対して作成された抗体、先に記載した抗体の１つの断片、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体断片の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および／または先に記載した抗体断片の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む少なくとも１つの細胞の、本発明による障害の診断、防止、および／または処置への使用に関する。本発明の更なる実施態様は、以下で詳細に述べる。
【００３１】
肝臓障害および／または上皮癌の療法の最先端と比較した場合、これらの成分の使用は、驚くべきことに改良された、持続性の、および／または更に有効な、本発明による障害の診断、防止、および／または処置を提供する。
【００３２】
「ポリペプチド」という用語は、本発明によるポリペプチドの全長を指す。好ましい実施態様において、「ポリペプチド」という用語は、分離ポリペプチドおよび組換え方法によって、例えばサンプルからの分離および精製によって、ライブラリーをスクリーニングすることによって、および従来方法によるタンパク質合成によって、調製されるポリペプチドも含み、これらの方法はすべて、当業者に一般に既知である。ポリペプチド全体またはその一部は、好ましくは、例えばMerrifield技法などの従来の合成の助けによって合成することができる。別の好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドの部分を利用して抗血清または特異性モノクローナル抗体を得ることが可能であり、これは、本発明によるポリペプチドの更なる機能変異体を同定する目的で、コード化されたタンパク質配列を発現させるために調製された適切な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために使用できる。
【００３３】
「本発明によるポリペプチド」という用語は、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７によるポリペプチドを指す（表２）。
【００３４】
本発明の意味の範囲内のポリペプチドの「機能変異体」という用語は、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７の１つによるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの配列相同性、特に約７０％、好ましくは約８０％、特に約９０％、とりわけ約９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を有するポリペプチドを指す。このような機能変異体は、例えば、ヒト以外の生物から、好ましくは非ヒト哺乳類、例えばマウス、ラット、サルおよびブタを起源とする、本発明によるポリペプチドに対して相同性のポリペプチドである。機能変異体の他の例は、異なる個人における、生物の異なる器官における、または異なる生育相における、遺伝子の異なる対立遺伝子によってコード化されるポリペプチドである。例えば機能変異体は、非肝臓組織、例えば胚性組織から、ただし指定された機能を持つ肝臓障害に関与する細胞中での発現の後に分離された核酸によってコード化されたポリペプチドも含む。機能変異体は、好ましくは、天然または合成変異、特にこれらの配列によってコード化されたペプチドの活性を定量的に変化させる変異も含む。更に、このような変異体は、好ましくは、コード化遺伝子のディファレンシャルスプライシングより生じる。
【００３５】
「機能変異体」は、対応する本発明によるポリペプチドと本質的に同じ生物機能を有するポリペプチドを指す。このような生物機能は、機能アッセイにおいてアッセイすることができる。
【００３６】
候補ポリペプチドが、本発明によるポリペプチドの機能変異体であるかどうかを試験するために、一般に当業者に既知の機能アッセイで候補ポリペプチドを分析することが可能であり、そのアッセイは、対応する本発明によるポリペプチドの生物機能をアッセイするのに適している。このような機能アッセイは、例えば、細胞培養システム；遺伝子が除去（ノックアウト）されるマウスまたは候補ポリペプチドをコード化する遺伝子に関して遺伝子組換えであるマウスの産生；酵素アッセイなどを含む。候補ポリペプチドが、対応する本発明によるポリペプチドと本質的に同じ生物機能を示すか、または直接阻害する場合、候補ポリペプチドは、先に記載した配列同一性％のレベルに関する要求を満足するという条件で、対応するポリペプチドの機能変異体である。
【００３７】
更に「機能変異体」という用語は、候補の機能変異体ポリペプチドが配列同一性％のレベルに関する機能変異体の基準を満足しているという条件で、変異遺伝子から、またはディファレンシャルにスプライスされた遺伝子から発現されたポリペプチドを含めて、参照サンプルまたは参照ライブラリーに対して、肝臓障害または他の上皮癌を患う患者において好ましくは異なって発現されるポリペプチドを意味する。このような発現分析は、一般に当業者に既知の方法によって実施できる。
【００３８】
ポリペプチドの「機能変異体」は、それらが対応する本発明によるポリペプチドと本質的に同じ生物機能を有するという条件で、少なくとも約７〜約１０００個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも２０個の、最も好ましくは少なくとも５０個の、例えば少なくとも１００個の、例えば少なくとも２００個の、例えば少なくとも３００個の、例えば少なくとも４００個の、例えば少なくとも５００個の、例えば少なくとも６００個のアミノ酸の長さを持つ、本発明によるポリペプチドの部分でもよい。それらが対応する本発明によるポリペプチドと本質的に同じ生物機能を有するという条件で、約１〜３０個の、好ましくは約１〜１５個の、特に約１〜５個のアミノ酸の範囲の、本発明によるポリペプチドの欠損も含まれる。例えば第一のアミノ酸のメチオニンは、ポリペプチドの機能を著しく変化させることなく、非存在でありうる。また変異体には、翻訳後修飾、例えば脂質アンカーまたはホスホリル基が存在しても、非存在でもよい。
【００３９】
「配列同一性」は、２つの配列の同一性の程度（同一性％）を指し、ポリペプチドの場合では、例えば、Ｆｉｌｔｅｒがオフに設定され、ＢＬＯＳＵＭは６２である、ＢＬＡＳＴＰ  ２．０．１によって、核酸の場合では、例えばＢＬＡＳＴＮ  ２．０１４によって決定可能である（Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）。
【００４０】
「配列相同性」は、例えば、Ｆｉｌｔｅｒがオフに設定され、ＢＬＯＳＵＭは６２であるＢＬＡＳＴＰ  ２．０．１によって決定される、２つのポリペプチド配列の（陽性％）の類似性を指す（Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）。
【００４１】
「肝臓障害」という用語は、好ましくは肝臓の構造、生理機能、代謝性、および／または遺伝子活性に影響を及ぼす、好ましくは新しい肝臓細胞の産生に、および／または全体またはその一部としての肝臓の再生に、好ましくは過渡的に、一時的に、慢性的に、または永久的に病理的方法で影響を及ぼすあらゆる種類の障害を指し、それを含む。好ましくは遺伝性肝臓障害および腫瘍性肝臓障害も含まれる。肝臓障害は、更に、好ましくは、外傷、特にアルコール、薬物、または食中毒による中毒、放射線、感染、胆汁鬱滞、免疫反応によって、および遺伝性代謝性肝臓疾患によって引き起こされた肝臓障害を含むことが理解される。肝臓障害の好ましい例は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、およびヘモクロマトーシスを含む。好ましくは、自己免疫反応が本発明による少なくとも１つのポリペプチドに対して向けられた、自己免疫障害も更に含まれる。本発明の意味の範囲内で、「肝臓障害」という用語は、好ましくは、肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）、アデノーマなどの良性肝新生物および／またはＦＮＨも意味する。好ましくはＨＣＣは、好ましくは細胞内タンパク質封入体を特徴とする肝臓癌、脂肪肝を特徴とするＨＣＣ、および線維層状ＨＣＣを含めて、先に記載した障害のサブタイプを更に含む。例えば好ましくは前癌病巣、例えば肝細胞の細胞サイズの増大（「大細胞」変化）を特徴とするもの、および肝細胞の細胞サイズの縮小（「小細胞」変化）はもちろんのこと、マクロ再生（過形成）結節をも特徴とするものなどのも含まれる（Anthony, P.in MacSweenら, 編 Pathology of the Liver.2001, Churchill Livingstone, Edinburgh）。
【００４２】
本発明の意味の範囲内で「上皮癌」という用語は、肝臓以外のいずれかの器官、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房の腺癌を含み、一般に当業者に既知であるような標準診断手順によって識別される悪性腫瘍を発生させる、組織の上皮細胞成分が形質転換されるこれらの器官の障害を指す。
【００４３】
本発明の意味の範囲内で「本発明による障害」という用語は、先に定義したような上皮癌および肝臓障害を含む。
【００４４】
ポリペプチドの場合、「ポリペプチドのディファレンシャル発現」という用語は、参照サンプルまたは参照ライブラリーでのポリペプチドの発現と比較した、患者からの分離サンプル中のポリペプチドの発現の相対的なレベルを指す。発現は、一般に当業者に既知である方法によって判定できる。このような方法の例は、ポリペプチドに特異性の抗体を用いたポリペプチドの免疫組織化学または免疫ブロットまたはＥＬＩＳＡ検出を含む。ポリペプチドを標識する遺伝子操作によるポリペプチドの検出およびモデル系での発現のために導入遺伝子内のポリペプチドに標識することによってなどの、モデル系における検出も、好ましくは含まれる。
【００４５】
「サンプル」という用語は、肝臓組織または肝臓細胞、好ましくは悪性形質転換を受けた別の器官からの組織またはこの器官からの細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液または糞を含む生体物質を指す。
【００４６】
サンプルは、患者または別の対象者から、侵襲性または非侵襲性方法を含む方法によって分離できる。侵襲性方法は、一般に、当業者に既知であり、例えば穿刺によるサンプルの分離、切開した体からのまたは内視鏡器具によるサンプルの外科的除去を含む。最小限の侵襲性および非侵襲性方法も当業者に既知であり、例えば血液、血清、血漿、腹水、乳房水、および脳脊髄液、唾液、尿、精液、ならびに糞などの体液を収集することを含む。好ましくは、非侵襲性方法は、口、耳、鼻、直腸、尿道などの本来存在する体の開口部、および開放創以外の開口を通じて、患者または対象者の体に貫入または体を切開する必要がない。
【００４７】
「最小限に侵襲的な」手順という語は、好ましくは麻酔を必要とせず、診療所またはクリニックで日常的に実施可能であり、有痛性でないか、または名目的のみに有痛性である、患者サンプル物質を得るための、一般に特に当業者によって既知である方法を指す。最小限の侵襲性手順の最も一般的な例は、静脈穿刺である。
【００４８】
「参照サンプル」という用語は、患者から分離された所与のサンプル中での本発明による核酸および／またはポリペプチドのディファレンシャル発現を評価するために、適切な対照として作用するサンプルを指す；そのように適切な参照サンプルの選択は一般に、当業者に既知である。参照サンプルの例は、同じ患者の、または別の対象者からの非罹患器官または組織または細胞から分離されたサンプルを含み、ここで非罹患器官または組織または細胞は、肝臓組織または肝臓細胞、血液、あるいは先に記載したサンプルからなる群より選択される。肝臓障害を持つ患者から分離されたサンプルでの発現との比較のために、参照サンプルは、異なる患者の非罹患器官または組織または細胞から分離されたサンプルを含むことが可能であり、ここで肝臓障害組織または細胞は、先に挙げたサンプル群より選択される。その上、参照は、患者の年齢および性別に好ましくは一致した健常ドナーからのサンプルを含むことができる。
【００４９】
「参照ライブラリー」という用語は、発現された遺伝子を表すライブラリーを指し、そのライブラリーは、好ましくは非罹患肝臓組織または細胞から作成される。参照は、非罹患肝臓組織または細胞からのｍＲＮＡから由来することが可能であり、核酸の非罹患組織発現に関するデータを含むデータベースを含むことができる。肝臓に障害のある患者から分離されたサンプル中での、本発明による核酸またはポリペプチドの発現の比較のために、参照ライブラリーは、肝臓障害に罹患した肝臓組織または細胞から作成された発現ライブラリーおよび核酸の肝臓障害特異性発現に関するデータを含むデータベースを含むことができる。
【００５０】
「患者」という用語は、本発明の意味の範囲内で、生死にかかわらず動物、好ましくは哺乳類、およびヒトを含む。患者は、肝臓障害および／または他の上皮癌のどちらかを患っており、肝臓障害および／または他の上皮癌の状況で分析、予防措置、療法、および／または診断を受ける。
【００５１】
「対象者」という用語は、本発明の意味の範囲内で、肝臓障害および／または他の上皮癌を患っておらず、それゆえ患者における本発明による核酸および／またはポリペプチドのディファレンシャル発現の判定用に好ましい適切な対照となる、生死にかかわらず動物、好ましくは哺乳類、およびヒトを含む。
【００５２】
「有効な処置」という用語は、本発明の意味の範囲内で、好ましくは本発明による少なくとも１つの障害から患者を治療する、および／または障害に関連する少なくとも１つの症候、好ましくは３つの症候、更に好ましくは５つの症候、最も好ましくは障害に関連する１０個の症候に関して、患者の病理状態を；好ましくは過渡的、短期（ほぼ数時間〜数日）、長期（ほぼ数週間、数ヶ月、または数年）または永続的ベースで改善する処置を指し、ここで、全体的な効果が対照患者と比較して症候の著しい改善である限り、病理状態の改善は、好ましくは、程度が一定であるか、上昇するか、下降するか、連続的に変化または変動する。治療有効性および毒性、例えばＥＤ５０およびＬＤ５０は、細胞培養物または実験動物において標準薬理学的手順によって決定できる。治療効果と毒性効果の間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０によって表現できる。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。用量は、処置される個々の患者の年齢、体重、および状態はもちろんのこと、投与経路、投薬形ならびに投薬計画、および所望の結果にも合わせて調節する必要があり、正確な投薬量はもちろん、医師が決定すべきである。
【００５３】
実際の投薬量は、処置する障害の性質および重症度に依存し、医師の裁量の範囲内であり、所望の治療効果を生じさせるために、本発明の特定の状況に対する投薬量の滴定によって変化させることができる。しかしながら現在、個々の用量あたり活性成分約０．１〜５００mg、好ましくは約１〜１００mg、最も好ましくは約１〜１０mgを含む医薬組成物が治療上の処置に適していると考えられる。
【００５４】
活性成分は、１日あたり１回または数回の投薬で投与できる。ある例において、満足な結果は、静脈内（ｉ．ｖ．）および経口（ｐ．ｏ．）による０．１μg／kgという低い投薬量で得ることができる。好ましい範囲は、０．１μg／kg／日〜約１０mg／kg／日ｉ．ｖ．および１μg／kg／日〜約１００mg／kg／日ｐ．ｏ．である。
【００５５】
別の態様において、本発明は、配列番号１〜９および／または配列番号４７によるポリペプチド、またはその機能変異体を含む、融合タンパク質に関する。
【００５６】
「融合タンパク質」は、配列番号１〜９および／または配列番号４７による少なくとも１つのポリペプチド、その機能変異体または部分および一般に当業者に既知である、共有または、例えば水素結合などの非共有結合によって本発明によるポリペプチドに結合されたポリペプチド、ペプチド、および／またはペプチド類似物質から選択された少なくとも１つの成分Ａを含むポリペプチドを指す。融合タンパク質の成分Ａの好ましい例は、融合タンパク質のより容易な検出を促進するポリペプチド、ペプチドおよび／またはペプチド類似物質である；これらは、例えば「緑色蛍光タンパク質」、またはその変異体である。「ｈｉｓ−ｔａｇ」などの組換えタンパク質の精製を促進する融合タンパク質、またはタンパク質の免疫原性を上昇させる融合物も含まれる。
【００５７】
本発明による融合タンパク質は、当業者に一般に既知である方法によって生成できる。本発明による融合タンパク質は、肝臓障害および／または上皮癌の診断、防止、および／または処置に使用できる。
【００５８】
最先端と比較すると、これらの融合タンパク質は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された、持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。      
【００５９】
本発明による好ましい核酸は、配列番号１０〜配列番号１９の１つによる配列、またはその変異体を有する。特に本発明は、分離された本発明による核酸に関する。
【００６０】
最先端と比較すると、これらの核酸およびポリペプチドは、驚くべきことに、改良された、より感受性の高い、容易で、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された、持続性の、および／またはより有効な、肝臓障害および／または上皮癌の処置を可能にする。
【００６１】
「本発明による核酸」という用語は、配列番号１０〜配列番号１９に相当する核酸および／またはその変異体を指す。
【００６２】
「コード化核酸」という用語は、本発明による分離可能な生物活性ポリペプチドまたはその前駆物質をコード化するＤＮＡ配列に関する。ポリペプチドは、例えばレセプタ活性などの生物機能が本質的に維持される限り、配列の全長またはコード化配列のいずれかの部分の配列によってコード化することができる（機能変異体を参照）。
【００６３】
先に記載した核酸の配列中に例えば遺伝子コードの変性による小さな変化が存在しうること、またはコード化ポリペプチドの活性に著しい影響を及ぼすことなく、未翻訳配列を核酸の５’および／または３’末端に付着させられることが既知である。したがって本発明は、先に記載した核酸のいわゆる天然発生型および人工的に産生された「変異体」も含む。
【００６４】
好ましくは、本発明によって使用された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。特に本発明による核酸は、ＲＮＡ分子、好ましくは一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子でもよい。核酸の配列は、少なくとも１つのイントロンおよび／または１つのポリＡ配列を更に含むことができる。
【００６５】
本発明による核酸は、当業者に一般に既知である方法によって生成可能であり、以下でも詳細に説明されている。
【００６６】
「変異体」は、本発明の意味の範囲内で、ストリンジェントな条件下で参照配列を用いてハイブリダイズし、本発明による対応するポリペプチドと同様の活性を有する、ＤＮＡ配列に対して相補性であるすべてのＤＮＡ配列を指す。本発明による核酸も、そのアンチセンス配列の形で使用できる。
【００６７】
核酸の「変異体」は、好ましくは８０％、特に９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を備えた他の種からの相同体でもよい。
【００６８】
核酸の「変異体」は、その部分が本発明による対応するポリペプチドと同様の活性を持つ限り、少なくとも約８ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１６ヌクレオチド長、特に少なくとも約２１ヌクレオチド長、更に好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長、なお更に好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長を持つ、本発明による核酸の部分でもよい。このような活性は、先に記載した機能アッセイを用いてアッセイすることができる。
【００６９】
本発明の好ましい実施態様において、核酸は、本発明による核酸に対して相補性である配列を有する核酸、またはその変異体を含む。好ましくは核酸は、本発明による核酸の非機能的突然変異体、またはその変異体を含む。
【００７０】
特に本発明は、相補性配列を有する核酸に関し、そこで核酸は、アンチセンス分子またはＲＮＡ干渉分子である。
【００７１】
「核酸の非機能的突然変異体」という用語は、核酸の非機能的突然変異体によってコード化されたポリペプチドが、非変異ポリペプチドと比較して著しく低下または消滅した生物活性を示すように変異された、本発明による核酸に由来する核酸、またはその変異体を指す。核酸の非機能的突然変異体によってコード化されたポリペプチドのこのような活性は、機能変異体の評価について先に記載したような機能アッセイによって判定できる。本発明による核酸に由来するこのような非機能的突然変異体の作成およびスクリーニングは、当業者に一般に既知である。このような本発明による「核酸の非機能的突然変異体」は、患者において発現させることが可能であり、リボソームによるポリペプチド内への翻訳のための未変性ｍＲＮＡ分子との競合によって、標的とされた核酸の発現レベルを好ましくは消滅または低下させるであろう。
【００７２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションが、２．５ｘＳＳＣ緩衝液中で６０℃にて起こり、低い塩濃度の緩衝液中での３７℃での多数の洗浄工程後に安定を保つ条件を指す。
【００７３】
「核酸のディファレンシャル発現」という用語は、参照サンプルまたは参照ライブラリー中の核酸の発現と比較した、患者からの分離サンプル中の核酸の発現の相対レベルを指す。参照サンプルおよび参照ライブラリーの定義は、先に詳細に述べている。発現は、当業者に一般に既知である方法によって判定することができる。このような方法の例は、ＲＮＡブロット（ノザン）分析、ヌクレアーゼ保護、インサイチューハイブリダイゼーション、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ；定量的動態ＲＴ−ＰＣＲを含む）を含む。ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド・マイクロアレイもこのような方法に含まれる。
【００７４】
好ましい実施態様において、本発明による核酸は、非冗長性およびヒトＥＳＴ  ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースからの重複配列の同定によって組立てられる、ＯＢｃｌｌ  ｃＤＮＡ（配列番号１０）である。組立てられた配列配列番号に対応するＲＮＡのＨＣＣでの発現は、実験的に確認される。ＳＳＨ  ｃＤＮＡクローンとして同定された非罹患肝臓に対するＨＣＣにおいてアップレギュレートされた初期配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＬ０５０２０５に一致する。その配列の５’末端はＡＦ１３１７５５と重複する；この配列は、ＸＭ１１３７０３、ＡＫ０５５５２１およびＡＹ００４３１０によって、５’にて進行的に伸長される。後者の３つの配列は、ＯＢｃｌｌ．ｐｒ（配列番号１）をコード化する読取枠を含む。このｍＲＮＡ構築物を支持して、すべての重複ｃＤＮＡ配列を同じ染色体に局在化させることができる。更に約６キロ塩基対のｍＲＮＡを、ＨＣＣのＲＮＡブロット分析によって同定したが、正常肝臓ＲＮＡは、このクローンからのＳＳＨ配列をハイブリダイゼーションプローブとして使用しなかった（図４）。このクローンに対応する配列の発現は、肝臓またはＨＣＣにおいて、これまでに報告されていない。
【００７５】
好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドは、ＨＣＣ中で、非罹患肝臓（ＯＢｃｌｌ、配列番号１０）に対して平均２．９倍でアップレギュレートされることが確認されたｍＲＮＡから驚くべきことに同定される、ＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチド（配列番号１）である（表３Ａ／３Ｂを参照）。このポリペプチドをエンコードし、このｍＲＮＡと重複するｃＤＮＡ配列は、逆転写酵素ＰＣＲ分析にによって同定され、これらの核酸はＨＣＣ中で同様に増加される。このポリペプチド配列は、ＨＣＣでの増加レベルについて以前は認識されなかった。ＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドの配列から、２つの保存配列ドメインが、ＢＬＡＳＴ配列解析ツールによって利用できる保存ドメイン予測ＣＤＤアルゴリズム（Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）；ループスＬａポリペプチド型ＲＮＡ結合ドメイン（配列番号１、アミノ酸４７〜１２５）、および機能が未知のＧＴＰａｓｅ酵素ドメイン（配列番号１、アミノ酸９０〜２０３）を用いて同定できる。ＯＢｃｌｌ．ｐｒ配列はＧｅｎＢａｎｋ配列データベースで、細胞骨髄増殖性白血病レセプタ（ｃ−Ｍｐｌ）結合ポリペプチドに指定されている。骨髄増殖性白血病ウイルスレセプタ（トロンボポエチンレセプタとしても既知）の潜在的なモジュレーターであるが、このポリペプチドの機能的役割は、どの系においても説明されていない。同様に、このポリペプチドの発現パターンは開示されていない。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは、発現プロファイリングを受けた肝臓腫瘍２１例のうち１１例で（５２％）、非罹患肝臓に対して２倍超に増加される。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは同様に、プロファイルされた限局性結節性過形成（ＦＮＨ）４例のうち４例で（１００％）、少なくとも２倍に増加する（表３Ａ／３Ｂ）。この核酸および本発明による他の核酸で、発現に関するこの値は、２倍以上に増加しなかったサンプルからの値を含めて、ｃＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング実験を受けたＨＣＣサンプル２１個すべてからの発現値比を含む。
【００７６】
このｍＲＮＡの発現は、分析された他の癌腫においても、肝臓、腎臓、胃、肺、皮膚、およびその他を含む非罹患組織においても発現が検出されないため、肝臓障害に著しく特異性である（表６を参照）。Ｏｂｃｌｌ  ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号２２および配列番号２３を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドを用いて決定される。したがって驚くべきことにＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチド（配列番号１）およびポリペプチド（配列番号１０）をコード化する核酸それぞれの発現と、本発明による障害との間に、強力で特異性の相関があることが見出されている。したがって、ポリペプチドおよびコード化核酸は、本発明による障害の診断に、例えば過形成性（腫瘍性を含む）肝臓疾患と肝硬変との診断識別に利用できる。
【００７７】
更にこのＨＣＣ調節解除遺伝子の発現は、ヘパトーマ細胞の増殖と相関しており、静止細胞の血清刺激の８時間および１２時間後にそれぞれ、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系においてＯｂｃｌｌ  ｍＲＮＡの３．４倍および６．３倍の増加を示す（図８を参照）。
【００７８】
これらの結果は、ＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチド（配列番号１）およびポリペプチド（配列番号１０）をコード化する核酸が、本発明による障害の防止および療法で、特に過形成性（腫瘍性を含む）肝臓疾患の処置に利用できることを証明する。処置に関して、ＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、例えばＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片を、このような処置を必要とする患者に投与することによって低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＯＢｃｌｌ．ｐｒポリペプチドおよび／またはＯＢｃｌｌ核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【００７９】
別の好ましい実施態様において、本発明による核酸は、ＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチド（配列番号２）をコード化するコンパイル配列である、Ｏｂｃｌ５核酸（配列番号１１）である。
【００８０】
配列全体は、多数のＧｅｎＢａｎｋ発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース配列およびＧｅｎＢａｎｋゲノムデータベース配列から確立され、各セグメントは、ＨＣＣにおける発現について確認する。例えばｃＤＮＡマイクロアレイ上のこの核酸の配列は、非罹患肝臓参照に対して平均２４．７倍に増加される（表３Ａ／３Ｂ）。
【００８１】
このクローンに対応する部分配列の発現は、複数の組織および一部の腫瘍（胎児肝臓、結腸腺癌を含み、そして肝臓に局在化する腫瘍転移において）で報告されているが、本発明による配列全体は、これまでに発表されていない。したがってＯＢｃｌ５の増加した発現は、肝臓障害に対して完全に特異性である。ＯＢｃｌ５核酸も、推定ポリペプチドのコンパイル配列も、本発明による障害の好ましくはＨＣＣのレベル上昇が認識されていない。
【００８２】
本発明によるこの配列およびすべての配列の発現に関する情報は、パブリック・ドメイン・データベース（ＰｕｂＭｅｄおよびＳＯＵＲＣＥなど）の検索から得られる。本発明による配列のほとんどについて、雑誌記事は発表されていない。したがって自動配列決定ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンの相対的存在量は、本発明によるこの配列および他の配列の発現に関して、本明細書で引用された証拠を提供する。この情報は、ＵｎｉＧｅｎｅ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＧｅｎｅＭａｐ９９、ＲＨｄｂ、ｄｂＥＳＴ、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ、およびＬｏｃｕｓ−Ｌｉｎｋデータベースから管理されるデータを含む、「ＳＯＵＲＣＥ」（スタンフォード大学遺伝子学部が提供）などのデータベース経由でアクセスできる。
【００８３】
別の好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドは、この調節解除ｍＲＮＡ配列からの最大読み取り枠となるＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチド（配列番号２）である。このポリペプチド配列は、特徴付けられたポリペプチドに対する、または既知の構造モチーフに対する、認識された配列相同性を含有しない。このポリペプチドの発現のパターンは記載されていない。このポリペプチドを潜在的にコード化するＲＮＡの発現は、非罹患肝臓に対して検査されたＨＣＣ症例１００％で２倍以上に、プロファイルされた２１例のうち１７例（８１％）で８倍以上に増加する。非罹患肝臓に対するコード化ｍＲＮＡの発現増加も、肝臓アデノーマ、ＦＮＨ、および肝硬変肝臓において明白であるが、転写物は肝硬変において、あまり劇的にアップレギュレートされない。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは、非罹患のヒト肺、脳（皮質）、結腸、精巣組織で検出できるが、評価した他の大半の癌腫では検出されない（表６）。Ｏｂｃｌ５  ＲＮＡの発現レベルの独立ＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号２４および配列番号２５を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて判定される。ＯＢｃｌ５  ｃＤＮＡの高い発現特異性は、図２に示す正常組織および他の種の癌における発現パターンと比較して、ＨＣＣ、ＦＮＨにおける定量評価（Ｑ−ＰＣＲ）によって確認される。参照遺伝子としてのＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンの両方の並列検査を利用したＴａｑＭａｎ手順は、非腫瘍性肝臓と比較して、ＨＣＣおよびＦＮＨにおけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡ（配列番号１１）の大規模な過剰発現を確認する（図２）。これらのハウスキーピング遺伝子に関連して、Ｑ−ＰＣＲは、正常肝臓と比較してＯＢｃｌ５  ＲＮＡレベルが、肝臓癌およびＦＮＨにおいて上昇することと、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡレベルが他の組織において、および他の癌において、正常肝臓においてよりもはるかに低いことを明らかにする。ＴａｑＭａｎ分析では、ＯＢｃｌ５発現は、配列番号６６；配列番号６７；および配列番号６８（「加水分解」プローブ）を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーによって決定した。
【００８４】
更にインサイチューハイブリダイゼーション分析は、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡを用いて特異的にハイブリダイズするラジオアイソトープ標識ＯＢｃｌ５  ＲＮＡアンチセンスプローブを利用することにより、正常肝臓組織切片の限界シグナルに対して、ＨＣＣにおけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡの局在化を明確に示す（図５）。
【００８５】
したがってポリペプチドおよび／またはコード化ＲＮＡの過剰発現は、肝臓障害の診断に有用である。これらの結果は、ＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドならびにポリペプチド（配列番号１１）をコード化する核酸およびその機能変異体が、本発明による障害の、特にＨＣＣ、肝臓アデノーマ、ＦＮＨ、および肝硬変の診断、防止、および処置に利用できることを明確に証明する。
【００８６】
処置に関して、ＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはその機能変異体の；あるいはポリペプチドをコード化する核酸および／またはその機能変異体の発現が、例えばＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドを潜在的にコード化する、配列番号１１で定義された核酸および／またはその機能変異体と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉ＲＮＡ分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。
【００８７】
あるいは、処置は、ＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはその機能変異体の活性が、例えばＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはその機能変異体の活性を遮断する、ＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはその機能変異体に対して作成された抗体、あるいはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、ＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはその機能変異体；および／またはＯＢｃｌ５核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【００８８】
詳細な配列分析は、ＯＢｃｌ５  ｍＲＮＡと他の真核非コード化ＲＮＡとの配列類似性を明らかにした。加えて、このＲＮＡからのタンパク質生成物を検出するための多様な方法による複数の試みは、このような生成物を明らかにしていない。したがって、このＲＮＡは、ポリペプチドに翻訳されないが、機能（例えば調節）特性自体を有することができる。非コード化調節ＲＮＡの疾患関連性は、例えば真核生物ショウジョウバエにおける細胞増殖に関与する非コード化ＲＮＡ「ｂａｎ−ｔａｍ」の役割によって（Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, Russell RB, Cohen SM.Cell(2003)Apr4; 113(1): 25-36）、そして神経分化ｔ−４を阻害するために転写因子ＨＥＳ−１と相互作用するマイクロＲＮＡ−２３（Kawasaki, H.and Tiara, K.Nature(2003)423: 838-842）によって証明されるように、今や明白になってきている。
【００８９】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを用いたヒト肝臓癌細胞の増殖におけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡのレベルの低下（ノックダウン）は、肝臓障害、特に肝臓癌におけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡの発現増加のための機能的に重大な役割を裏付けている。この実験において、腫瘍サプレッサ遺伝子網膜細胞芽腫タンパク質１（ＲＢ１）をコード化するｍＲＮＡのレベルは、先に記載したようにＴａｑＭａｎ  Ｑ−ＰＣＲによって決定されたＯＢｃｌ５  ＲＮＡのレベルを減少させると同時に、数倍にアップレギュレートされる。ＲＢ１  ｍＲＮＡレベルは、プライマーＲＢ１−ｐ１（配列番号６４）およびＲＢ１−ｐ２（配列番号６５）を用いて、ＳＹＢＲグリーン定量ＰＣＲ分析によって決定する。したがってＲＢ１の負の調節によって、ＨＣＣにおけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡの発現増加は、腫瘍細胞増殖を促進する（図６）。
【００９０】
なお別の好ましい実施態様において、本発明による核酸は、ＩＫ２．ｐｒポリペプチド（配列番号３）をコード化する読み取り枠を含む、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ配列ＮＭ０２５１６０によって表されるＩＫ２核酸（配列番号１２）である。ＩＫ２．ｐｒポリペプチドは、本発明の別の実施態様である。このクローンに対応するＥＳＴ配列は、肝臓を含む複数の組織からのｃＤＮＡライブラリーで、および腺癌で報告されているが、配列は、これまでにＨＣＣに関与していない。このポリペプチドの発現は、どの細胞または組織でも述べられていない。ポリペプチド配列は、既知の機能を有していないが、配列は進化的によく保存される（予測ポリペプチドは、複数の哺乳類、ショウジョウバエ（Drosophila）および植物（シロイヌナズナ、Arabidopsis）に見出される）。ＣＤＤアルゴリズムは、本発明によるこのポリペプチド配列における複数のＷＤ４０型ポリペプチド−ポリペプチド相互作用ドメインを予測する。ＨＣＣ患者からの肝臓サンプルにおいて、このポリペプチドをコード化するＲＮＡの発現は、驚くべきことに、非罹患肝臓に対して、プロファイルした２１例のうち１５例（７１％）で平均値４．６７倍に増加した。非罹患肝臓に対するコード化ｍＲＮＡの発現増加も、肝硬変肝臓において明らかである（表３Ａ／３Ｂ）。非罹患肝臓に対する、このペプチドをコード化するｍＲＮＡの最高のディファレンシャル発現レベルは、ＦＮＨで観察される；プロファイルされた４例のうちの４例で８倍のアップレギュレーション。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡも、乳腺、肺および腎臓の癌腫を含む複数の他のヒト癌腫で、および検査した非罹患ヒト組織１７個の２個（乳房および腎臓）で発現される。ＩＫ２  ｍＲＮＡの発現レベルの、独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号２６および配列番号２７を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて決定された。
【００９１】
これらの結果は、このポリペプチドおよび／またはコード化ｍＲＮＡの過剰発現が、本発明による障害の診断、防止、および処置に、特にＨＣＣ、ＦＮＨ、肝硬変、および上皮由来新生物の診断に利用できることを証明する。処置に関して、ＩＫ２．ｐｒポリペプチドの、またはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、ＩＫ２．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＩＫ２．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＩＫ２．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＩＫ２．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＩＫ２．ｐｒポリペプチドおよび／またはＩＫ２核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【００９２】
なお別の好ましい実施態様において、本発明による核酸は、ＨＣＣ調節解除ｃＤＮＡクローンの配列となる、ＩＫ５核酸（配列番号１３）である。このクローンに対応する配列の発現は、複数の組織（肝臓を含む）および一部の腫瘍（下垂体および前立腺を含む）で報告されているが、配列がＨＣＣでアップレギュレートされることは、これまでに発表されていない。好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドは、ＩＫ５ｃＤＮＡ（配列番号１３）によってコード化されるＩＫ５．ｐｒポリペプチド（配列番号４）である。ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（アクセッション番号：ＮＭ００６４０７）から、ＪＷＡ、ビタミンＡ反応性ポリペプチドとして推定される。この推定ポリペプチドをコード化する遺伝子は、ビタミンＡを用いた培養細胞のシミュレーションから説明されているが、ポリペプチドの存在は、いずれの細胞または組織においても説明されておらず、機能は不明である。ＪＷＡは、更に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで細胞骨格関連ポリペプチドとして述べられている。ポリペプチドは、ＥＡＡＣ１グルタメートトランスポータと特異的に相互作用し、その活性を低減させるげっ歯類ポリペプチドとの相同性も共有する。この配列の保存ドメイン検索は、Ｇタンパク質情報伝達分子との相互作用を恐らく仲介する、プレニル化ｒａｂアクセプタ１ドメイン（ＰＲＡ１）の考えられる存在を示す。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現は、プロファイルした１００％のＨＣＣ症例において非罹患肝臓に対して、平均９．１４倍増加した。同様にコード化ｍＲＮＡの発現増加も、アデノーマおよびＦＮＨにおいて明らかである。コード化ｍＲＮＡ発現は、肝硬変肝臓においても、他の肝臓障害よりも低い程度でディファレンシャルに発現される。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは、肺、腎臓、および結腸ヒト癌腫で発現されるが、検査した非罹患ヒト組織１７例のうち１例のみである。ＩＫ５  ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号２８および配列番号２９を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて決定される。このポリペプチドおよび／またはコード化ｍＲＮＡの過剰発現は、肝臓癌を含む特異性上皮由来新生物を示すことができる。これらの結果は、ＩＫ５ｃＤＮＡ配列のディファレンシャルにアップレギュレートされた発現が、本発明による障害に対して高度に特異性であることを示す。
【００９３】
更にこのＨＣＣ調節解除遺伝子の発現は、肝臓癌細胞の増殖と相関しており、静止細胞の血清刺激の８時間および１２時間後それぞれで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系におけるＩＫ５  ｍＲＮＡの１０．９倍および４．３倍の増加を示す（図８を参照）。
【００９４】
したがって、ＩＫ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはコード化核酸は、本発明による障害の診断、防止、および処置に、特にＨＣＣ、アデノーマ、ＦＮＨ、肝硬変、および上皮由来新生物の診断に利用できる。処置に関して、ＩＫ５．ｐｒポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、ＩＫ５．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＩＫ５．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＩＫ５．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＩＫ５．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＩＫ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはＩＫ５核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【００９５】
なお別の好ましい実施態様において、本発明による核酸は、ＤＡＰ３．ｐｒポリペプチド（配列番号５）をコード化する、以前に開示された（アクセッション番号Ｘ８３５４４）ＤＡＰ３核酸（配列番号１４）である。本発明は、更に、培養細胞中で過剰発現された場合にアポトーシス細胞死の促進に関与してきた、死関連ポリペプチド３（ＤＡＰ３、配列番号５）に関する（Kissilら, 1995, J.Biol.Chem., 270: 27932-6）。
【００９６】
ポリペプチドは、ミトコンドリア２８Ｓリボソーム複合体に寄与する。そのため、このポリペプチドは、明らかに比較的低いレベルであるにかかわらず、すべてではないが多くの組織および細胞において遍在的に発現されやすい。内在性ＤＡＰ３の特異的機能は述べられていない（Cadvar Kocら, 2001, FEBS Lett., 492: 166-170）。ＤＡＰ３ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、肝臓における結腸腺癌転移で述べられているが（ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０５８９）、ＤＡＰ３核酸もＤＡＰ３ポリペプチドも本発明による障害、好ましくはＨＣＣのレベル上昇に関して認識されていない。
【００９７】
精製ゲノムＤＮＡの定量ＲＴ  ＰＣＴ（Ｑ−ＰＣＲ）増幅分析は、ＨＣＣ１０例のうち８例で約４〜６コピーを持つ肝臓癌でのＤＡＰ３遺伝子増幅を示唆し、そして非腫瘍性肝臓サンプル１３例（腫瘍近位および遠位肝硬変組織を含む）のうち１３例で増幅を示唆しない。これらの分析は、ＤＡＰ３ゲノムＤＮＡの相対量を正確に定量するために、プライマーＤＡＰ３−ｐ５（配列番号７１）、ＤＡＰ３−ｐ６（配列番号７２）および加水分解プローブＤＡＰ３ｐ−７（配列番号７３）を用いて、ＴａｑＭａｎ手順によって実施する。実際にＤＡＰ３遺伝子は、ＨＣＣにおいて増幅されることが頻繁に見出せる領域である、染色体１ｑに位置する（Buendia MA., Med Pediatr Oncol.(2002)Nov; 39(5): 530-5）。この発見は、遺伝子増幅として現れた正の選択力がＨＣＣにおけるＤＡＰ３  ＲＮＡを過剰発現させ、ＨＣＣにおけるＤＡＰ３の機能的に重要な役割を支持することを示唆している。
【００９８】
このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現は、プロファイルしたＨＣＣ２１例のうち１８例（８６％）で、非罹患肝臓に対して平均５．５倍増加する。コード化ｍＲＮＡの発現増加は、ＨＣＣにおいてよりも低い程度であるが、他の肝臓障害においても明らかである。ＤＡＰ３ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号３０および配列番号３１を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて決定される。正常肝臓と比較してＨＣＣで増加したＤＡＰ３ｍＲＮＡは、参照遺伝子としてβ−アクチンを使用したＳＹＢＲグリーン技法を用いてＱ−ＰＣＲ分析によって更に確認される。検査したＨＣＣ５例それぞれから分離したＲＮＡにおいて、ＤＡＰ３ｍＲＮＡ対β−アクチンｍＲＮＡのレベル比は、正常肝臓サンプル２例から分離したＲＮＡでのこれらの比と比較して上昇した（平均ＨＣＣ比  ＤＡＰ３ｍＲＮＡ対β−アクチンｍＲＮＡ＝１２．８；平均正常肝臓比  ＤＡＰ３ｍＲＮＡ対β−アクチンｍＲＮＡ＝１．０３）。ＤＡＰ３ｍＲＮＡレベルのＱ−ＰＣＲ分析は、配列番号６９および配列番号７０を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＳＹＢＲグリーン分析によって決定する。
【００９９】
ＤＡＰ３タンパク質の発現は、分析した他の癌腫においても、肝臓、腎臓、胃、肺、皮膚、およびその他を含む非罹患組織においても、発現は非常に低いか、検出されないため、ＨＣＣでは非常に特異的にアップレギュレートされる。ＨＣＣでのＤＡＰ３の他の機能的関与は、正常肝臓と比較した、そして他の正常および罹患組織と比較した、ＨＣＣでのＤＡＰ３タンパク質発現レベルの特異的上昇によって更に裏付けられる（表６および図７を参照）。低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ；配列番号５４および配列番号５５）を用いた肝臓癌細胞におけるＤＡＰ３ｍＲＮＡの実験的低減は、肝臓癌細胞の劇的な形態的および明らかな生化学的変化を生じるため、細胞は増大し、そして処置細胞からの標準方法によるＲＮＡおよびタンパク質抽出は不可能である。これらの発見は、更に、ＨＣＣでのＤＡＰ３増加の機能的重要性を裏付ける。
【０１００】
これらの結果は、ＤＡＰ３ｃＤＮＡ配列の、およびＤＡＰ３ｐｒ．ポリペプチドの強力にアップレギュレートされた発現が、本発明による障害、特にＨＣＣで非常に特異的であることを示す。したがってＤＡＰ３ポリペプチドおよび／またはコード化核酸は、本発明による障害の診断、防止、および処置に、特にＨＣＣの診断に利用できる。処置に関して、ＤＡＰ３ポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、例えばＤＡＰ３ポリペプチドコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＤＡＰ３ポリペプチドの活性が、ＤＡＰ３ポリペプチドの活性を遮断する、ＤＡＰ３ポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＤＡＰ３ポリペプチドおよびＤＡＰ３核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１０１】
別の好ましい実施態様において、本発明は、ＨＣＣアップレギュレートＬＯＣ５．ｐｒ仮説的ポリペプチド（配列番号６）およびポリペプチドをコード化する核酸ＬＯＣ５（配列番号１５）に関する。このｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡは、肝臓を含む複数のヒト組織からのｃＤＮＡライブラリーで同定されているが（上述したＳＯＵＲＣＥデータベースからの情報）、配列が本発明による障害、特にＨＣＣでアップレギュレートされることは、これまでに報告されていない。このｍＲＮＡの発現は、プロファイルしたＨＣＣ症例の７１％で非罹患肝臓に対して５倍増加する（表３Ｂ）。同様の分析が、このｃＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング手順を受けたＦＮＨおよび大多数の肝硬変肝臓における、このｍＲＮＡの発現増加を明らかにする。ｍＲＮＡは、他のヒト胃腸管癌腫で発現されるが、検査した非罹患ヒト組織１７例では脳および骨髄においてのみである。ＬＯＣ５ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号３２および配列番号３３を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーによって決定される。ＬＯＣ５．ｐｒ（配列番号６）は、予測された３０kDaポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋデータベースで、アクセッション番号ＮＰ＿０６０９１７．１）である。このポリペプチドの存在は、どの細胞または組織でも述べられていない。この予測されたポリペプチドにはどの機能も説明されておらず、ＣＤＤドメインアルゴリズムを用いた検索から、保存ドメインは明らかになっていない。これらの結果は、ＬＯＣ５ｃＤＮＡ配列の強力にアップレギュレートされた発現が、本発明による障害、特にＨＣＣ、ＦＮＨ、および多数の肝硬変肝臓で非常に特異的であることを示す。更に、このＨＣＣ調節解除遺伝子の発現は、肝臓癌細胞の増殖と相関しており、静止細胞の血清刺激の８時間および１２時間後それぞれで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系におけるＬＯＣ５ｍＲＮＡの３．７倍および８．８倍の増加を示す（図８を参照）。
【０１０２】
したがってＬＯＣ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはその機能変異体および／またはコード化核酸および／またはその変異体は、本発明による障害の診断、防止、および処置に、特にＨＣＣ、ＦＮＨ、および多数の肝硬変肝臓の診断に利用できる。処置に関して、ＬＯＣ５．ｐｒポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、ＬＯＣ５．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＬＯＣ５．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＩＫ５．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＬＯＣ５．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＬＯＣ５．ｐｒポリペプチドおよび／またはＬＯＣ５核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１０３】
更に好ましい実施態様において、本発明は、本発明によるＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチド（配列番号７）をコード化するＳＥＣ１４Ｌ２核酸ｃＤＮＡ（配列番号１６）に関する。ＳＥＣ１４Ｌ２ｍＲＮＡの発現は、多くの組織で述べられているが、このメッセージまたはコード化ポリペプチドの増加は、本発明による障害、特に肝臓障害または癌においては、これまでに報告されていない。ＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒ（配列番号７）は、酵母ｓｅｃポリペプチド１４のヒト相同体である。酵母分泌経路に関与するが、ポリペプチドまたはその相同体の明確な機能は、どの種でも述べられていない。このヒト配列は、トコフェロールに結合することも示唆されており、このポリペプチドがスクアレン転移、コレステロール生合成または、更に一般に細胞内輸送に関与することが予測されてきた（Zimmerら, 2000, J.Biol.Chem.275: 25672-25680）。このポリペプチド配列の発現は、ヒト細胞または組織では報告されていない。ポリペプチド配列は、考えられるＧポリペプチド結合およびホスホチジルイノシトール転移ドメインおよびコンセンサスＣＲＡＬＴＲＩＯドメインを含む。後者は、シス−レチナールＣＲＡＬモチーフを介してビタミン結合に関与してきた。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは、ＨＣＣサンプルの７１％において、プロファイルしたＦＮＨ疾患サンプルすべてにおいて、非罹患肝臓に対して５．１４倍以上の平均に増加するが、肝硬変サンプルのわずか半分のアデノーマでは増加しない（表３Ａ／３Ｂ）。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現は、腎臓および結腸癌腫および正常な膵臓において検出されたが、検査した他の正常組織では検出されなかった（表６）。ＳＥＣ１４Ｌ２  ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号３４および配列番号３５を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーによって決定する。更にこのＨＣＣ調節解除遺伝子の発現は、肝臓癌細胞の増殖に相関しており、静止細胞の血清刺激の８時間および１２時間後それぞれで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系におけるＳＥＣ１４Ｌ２  ｍＲＮＡの１０．６倍および１．９倍の増加を示す（図８を参照）。
【０１０４】
これらの結果は、ＳＥＣ１４Ｌ２  ｃＤＮＡ配列の強力にアップレギュレートされた発現が、本発明による障害、特にＨＣＣおよびＦＮＨで非常に特異的であることを示す。したがって、ＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドおよび／またはコード化核酸は、本発明による障害の診断、防止、および処置、特にＨＣＣ、ＦＮＨおよび好ましくは肝硬変の診断にも利用できる。処置に関して、ＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、ＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＳＥＣ１４Ｌ２．ｐｒポリペプチドおよび／またはＳＥＣ１４Ｌ２核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１０５】
更に好ましい実施態様において、本発明は、多くの組織および腫瘍で述べられている、ＳＳＰ２９．ｐｒまたはＡＰＲＩＬポリペプチドをコード化する核酸（配列番号１７）に関する。この推定腫瘍壊死ファミリメンバをコード化する遺伝子において、本発明による障害、特にＨＣＣにおいて上昇したレベルで発現されることは、これまでに報告されていない。更に本発明は、本発明による核酸（配列番号１７）によってコード化された銀染色２９kDaポリペプチド（ＳＳＰ２９．ｐｒ；配列番号８）に関する。ポリペプチドは、ＴＮＦサイトカインファミリに属すると考えられる、ロイシンリッチ分泌ポリペプチドとして同定されている。それはＡＰＲＩＬ（ロイシンが豊富な酸性ポリペプチド）としても既知であり、抗原仲介細胞反応に関与するロイシン・リッチ・リピート（ＬＲＲ）をＮ末端付近に含有する（Zhuら, 1997, Biochem.Mol.Biol.Int.42: 927-935; Mencingerら, 1998, Biochim.Biophys.Acta 1395: 176-80）。ＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドの発現は、ヒト細胞または組織においては報告されていない。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは、プロファイルされたＨＣＣ２１例のうち１７例で、非罹患肝臓に対して平均３．７７倍に増加する。驚くべきことに、このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡのレベルは、非罹患肝臓のプールよりも、銅毒性によって引き起こされた肝硬変において３０倍高い（表３Ａ／３Ｂ）。ｍＲＮＡレベルは、プロファイルされた他の肝臓障害において、非罹患肝臓に対してわずかに上昇し、このｍＲＮＡはそうでなければ、ここで発現プロファイリングを受けた正常および罹患組織においてまれにのみ検出される。ＳＳＰ２９  ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号３６および配列番号３７を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーによって決定される。更にこのＨＣＣ調節解除遺伝子の発現は、肝臓癌細胞の増殖に相関しており、静止細胞の血清刺激の８時間および１２時間後それぞれで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系におけるＳＳＰ２９  ｍＲＮＡの２．４倍および４．３倍の増加を示す（図８を参照）。これらの結果は、ＳＳＰ２９  ｃＤＮＡ配列の強力にアップレギュレートされた発現が、本発明による障害、特にＨＣＣ、およびある種の肝硬変疾患で非常に特異的であることを示す。
【０１０６】
したがってＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドおよび／またはコード化核酸は、本発明による障害の診断、防止、および処置、特にＨＣＣおよび肝硬変の診断に利用できる。処置に関して、ＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、ＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＳＳＰ２９．ｐｒポリペプチドおよび／またはＳＳＰ２９核酸は、驚くべきことに、、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする
【０１０７】
なお別の好ましい実施態様において、本発明は、ＨＳ１６核酸（配列番号１８）に関する。ＨＳ１６ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンは、結腸の腺癌を含む複数の組織で同定されているが、このｍＲＮＡも、コード化ポリペプチド（ＨＳ１６．ｐｒ、配列番号９）も、これまでに本発明による障害、特に肝臓障害またはＨＣＣに関与していない。本発明は、更に、ＨＳ１６をコード化するポリペプチドであって、１６．７kDaの推定ポリペプチド（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋデータベースでアクセッション番号ＮＰ＿０５７２２３）に関する。ポリペプチドの存在は、いずれの細胞または組織においても説明されておらず、その機能は述べられていないし、機能ドメインもＣＤＤアルゴリズムによって同定されない。このポリペプチドをコード化するｍＲＮＡは、すべて非罹患肝臓に対して、検査したＨＣＣ８例で少なくとも２．８倍以上に、そして検査した追加のＨＣＣサンプル４例ではほぼ２倍に増加する（表３Ａ／３Ｂ）。ＨＳ１６ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＰＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号３８および配列番号３９を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて決定される。これらの結果は、ＨＳ１６  ｃＤＮＡ配列の強力にアップレギュレートされた発現が、本発明による障害、特にＨＣＣに対して高度に特異性であることを示す。
【０１０８】
したがってＨＳ１６．ｐｒポリペプチドおよび／またはコード化核酸は、本発明による障害の診断、防止、および処置に、特にＨＣＣの診断に利用できる。処置に関して、ＨＳ１６．ｐｒポリペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸の発現が、例えば、ＨＳ１６．ｐｒポリペプチドをコード化する核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＨＳ１６．ｐｒポリペプチドの活性が、例えばＨＳ１６．ｐｒポリペプチドの活性を遮断する、ＨＳ１６．ｐｒポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＨＳ１６．ｐｒポリペプチドおよび／またはＨＳ１６核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１０９】
好ましい実施態様において、本発明による核酸は、非冗長性ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースからの重複配列の同定によって組立てられた、ＩＫ３  ｃＤＮＡ（配列番号１９）である。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて同定された、非罹患肝臓に対してＨＣＣでアップレギュレートされた初期配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの胎児脳ｃＤＮＡ（ＡＬ０４９３３８）に一致する。その配列は、ＸＭ＿１３１４６２（配列番号４７）；タンパク質チロシンホスファターゼレセプタＤ型（ＰＴＰＲＤ）をコード化するマウスｃＤＮＡと重複する。このマウスＰＴＰＲＤは、ヒトＰＴＰＲＤ転写単位と非常に相同であり、この肝臓癌調節解除ＲＮＡと相同がある領域は、このヒトＰＴＰＲＤ転写ユニット配列内に見出されない。したがって、このＨＣＣ調節配列が、ヒトＰＴＰＲＤをコード化することは、まだ述べられていない。あるいは、提供されたデータベース配列は、読み取り枠の欠失を説明するエラーを含むことがある。更に別の代案は、コード化されたポリペプチドがこの配列内の小型読み取り枠の１つから生じることである。また、このＲＮＡは、ポリペプチドに翻訳されないが、機能（例えば調節）特性自体を持つことができる。
【０１１０】
驚くべきことに、このｍＲＮＡからの配列は、正常なヒトの肝臓よりも、ＨＣＣではるかに高いレベルで表現される。さもなければ、このＲＮＡは、正常な脳、骨格筋、前立腺、および肝臓において低レベルでのみ発現される。このｍＲＮＡは、プロファイルされたＨＣＣサンプル２１例中１２例（５７％）で、非罹患肝臓に対して、平均３．８１倍以上に増加する。ＩＫ３はまた、検査したＦＮＨ４例のうち３例で、アデノーマで、および検査した肝硬変サンプル６例のうち５例で、非罹患肝臓に対して２倍以上に増加する（表３Ａ／３Ｂ）。ＩＫ３ｍＲＮＡの発現レベルの独立したＲＴ−ＰＣＲ分析は、配列番号４０および配列番号４１を含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーによって決定される。これらの結果は、ＩＫ３  ｃＤＮＡ配列の強力にアップレギュレートされた発現が、本発明による障害、特にＨＣＣ、ＦＮＨ、アデノーマ、および肝硬変で非常に特異的であることを示す。
【０１１１】
したがって、ＩＫ３ポリペプチドおよび／またはその機能変異体、および／またはコード化核酸、および／またはその変異体は、本発明による障害の診断、防止、および処置、特にＨＣＣ、ＦＮＨ、アデノーマ、および肝硬変の診断に利用できる。処置に関して、ＩＫ３によってコード化されるポリペプチドまたはＩＫ３核酸の発現が、例えばＩＫ３核酸と特異的に相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ干渉分子を投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することが好ましい。あるいは、ＩＫ３ポリペプチドの活性が、例えばＩＫ３ポリペプチドの活性を遮断する、ＩＫ３ポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片をこのような処置を必要とする患者に投与することによって、低減および／または阻害されるような処置を実施することができる。最先端と比較すると、このＩＫ３核酸は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１１２】
ＨＣＣを含むヒト肝臓障害からの組織において評価された、本発明による配列の非罹患肝臓参照サンプルのｃＤＮＡ発現レベルを、独立した２セットの実験を表示する表３Ａ／３Ｂに示す。表３Ｂの値は、発現レベルのｌｏｇ２比を示すのに対して、表３Ａは、特注ｃＤＮＡマイクロアレイへの競合ハイブリダイゼーションから得た、罹患サンプルと非罹患サンプルの間の非形質転換データである。ＨＣＣ＝肝細胞癌サンプル；ＨＣＣ（ＩＨＢ）＝ＨＣＣサンプルを含むイントラヒアリン体；ＦＮＨ＝限局性結節性過形成サンプル；Ｃｉｒｒｈ＝肝硬変サンプル。グループ（ＨＣＣ、ＦＮＨおよびＣｉｒｒｈ）ごとに各配列（配列番号１０〜１９）の平均；中央値（値の５０番目のパーセンタイル）および値の標準偏差が与えられる。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
ｃＤＮＡマイクロアレイ核酸発現値の概要を表４に示す。Mann-WhitneyのＵ検定を利用して、ＲＮＡ発現レベルを統計的に評価する：この検定は、対フラグ＝‘false’を用いたWilcoxon順位和両側検定と等しい（Hollander & Wolfe, 1973, Nonparametric statistical inference.New York: John Wiley & Sons, 27-33, 68〜75頁; Bauer, D.F., 1972, J.Amer.Statistical Assoc.67: 687-690）。発現値は通例、正規分布に適合しないため、値の平均は誤解されやすい。しかしながら中央値の解析は、大半の場合、特に大きなデータセットにおいて、実験値と参照値の間の有意差を証明する。実験中間＝実験（罹患）組織の中央値；実験四分位間＝四分位間範囲の実験値（中央値の＋／−２５番目のパーセンタイル）；対照中間＝対照（非罹患）組織サンプルの中央値；対照四分位間＝四分位間範囲の対照値（中央値の＋／−２５番目のパーセンタイル）；ｐ値＝実験値および対照値が有意に異なるという確率の統計的評価から得られた値。
【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
非腫瘍性肝臓疾患および肝臓癌における核酸発現値の比較を、表５Ａに示す。本発明による各核酸について、ＦＮＨ、肝硬変およびＨＣＣサンプルの間の比較のために、中間実験発現値の差に対してＰ値が与えられる。各核酸および比較について、０．０５以下のＰ値は、疾患群間の発現値の有意差を示す。有意性は、Wilcoxon順位和検定を用いて評価した。発現の統計的有意差は、疾患群間で明らかである。例えばＩＫ２の発現値は、３つの比較すべてで著しく異なる（０．０５未満のＰ値）。ＦＮＨサンプル群は小さく、値の大きな分布を示す。このことは、この群との比較での、より小さい有意差を説明する。
【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
表５ＢのMann-Whitney Uは、値が昇順で整列されるときに、第一群（ＨＣＣ）の値が第二群（それぞれＦＨＮおよびＣｉｒｒｈ）の値を超える回数を示す。Wilcoxon Wは、Mann-Whitney Wilcoxon順位和検定での、２つの群の大きい方の順位の和である。漸近有意性（Asymp. Sig.）（２tailed）は、両側検定のＰ値を与える。この統計解析は、表７に与えられ、図２に示された定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）データの統計によって検証された、ＯＢｃｌ５（ＨＣＣ対ＦＮＨ、ＨＣＣ対Ｃｉｒｒｈ）の発現パターンの全体的な傾向を決定するために利用する。
【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、リストに挙げた各組織の各調節解除核酸に対して特異性であるプライマーを用いて実施し、配列が各組織から作成されたＲＮＡ中で表現されるかどうか判定する。利用したすべての組織は、ＲＮＡ（およびｃＤＮＡ）作成への利用前に、診断によって確認する。表６において、「＋」記号は、遺伝子が組織内で発現されることを示し、「−」は、この遺伝子がこのＲＮＡサンプルからのｃＤＮＡ中に検出されないことを示す；そして空欄は、その遺伝子と組織との組合せに対して解析を行っていないことを示す。患者の年齢および性別を与える。追加のサンプル情報は、腫瘍ステージング値（Ｔ＝腫瘍サイズ）はもちろんのこと、腫瘍グレーディングスコア（Ｇ＝腫瘍細胞分化）も含む；大きい数字は、より大きく、あまり分化しなかった腫瘍をそれぞれ示す。組織ｃＤＮＡの正の対照は、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）からの増幅である。
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
本発明の別の好ましい実施態様において、本発明による核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Zheng and Kemeny, 1995, Clin.Exp.Immunol.100: 380-2; Nellen and Lichtenstein, 1993, Trends Biochem.Sci.18: 419-23; Stein, 1992, Leukemia 6: 967-74）および／またはリボザイム（Amarzguioui, ら1998, Cell.Mol.Life Sci.54: 1175-202; Vaishら, 1998, Nucleic Acids Res.26: 5237-42; Persidis, 1997, Nat.Biotechnol.15: 921-2; Couture and Stinchcomb, 1996, Trends Genet.12: 510-5）および／または低分子干渉二本鎖ＲＮＡ（Elbashirら, 2001, Nature 411: 494-98; Brummelkampら, 2002, Science 296: 550-553）の作成に使用できる。本発明の更に好ましい実施態様において、ＲＮＡ干渉分子（オリゴヌクレオチド）を使用して、本発明による核酸の安定性を低下させること、および／または、本発明による核酸の翻訳を抑制することが可能である。それゆえ例えば、細胞内の対応する遺伝子の発現は、インビボとインビトロの両方で減少させることができる。したがってオリゴヌクレオチドは、治療薬として適切でありうる。この方法は、例えば肝臓細胞に、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソームと複合体化する場合にも適している。プローブまたは「アンチセンス」オリゴヌクレオチドとしての使用では、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖オリゴヌクレオチドも、治療薬として適切でありうる。このアプローチによって、治療上標的にされる配列に対して相補性である配列を含む、短い配列または１５〜２２個のヌクレオチドの配列は、罹患組織に触れさせると、治療標的ＲＮＡ配列の発現レベルを劇的に低下または「ノックダウン」する役割を果たす。別の疾患でのｓｉＲＮＡ治療アプローチが近年報告され、肝臓障害、肝臓癌および他の上皮癌にも利用できる（Filleur S, Courtin A, Ait-Si_Ali S, Guglielmi J, Merle C, Harel-Bellan A, Clezardin P, Cabon F.Cancer Res.２００３年７月１５日; 63(14): 39-22）。
【０１２４】
好ましい実施態様において、本発明による核酸は、組換え法によって、ライブラリーのスクリーニングまたは患者または対象者から得たサンプルからの分離によって作成されてきた。本発明の別の好ましい実施態様において、本発明による核酸は、合成により作成されてきた。それゆえ本発明による核酸は、例えば配列番号１０〜配列番号１９で記述されたＤＮＡ配列を化学的に用いて、および／または、例えばホスホトリエステル法による遺伝子コードへの参照により、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７で記述されたタンパク質配列を用いて合成することができる（例えばUhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews 90: 543-584を参照）。
【０１２５】
別の好ましい実施態様において、本発明は、本発明による核酸または核酸の非機能的突然変異体である核酸、あるいは核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸に関し、それは分解に対して安定化させるために核酸への化学基の付加によって修飾されるため、細胞内で長期間に渡って核酸の高濃度が維持される（Beigelmanら, 1995, Nucleic acids Res.23: 3989-94; Dudycz, 1995，国際公開公報第９５／１１９１０号；Macadamら, 1998，国際公開公報第９８／３７２４０号；Reeseら, 1997，国際公開公報第９７／２９１１６号）。通例、このような安定化は、１つ以上のインターヌクレオチドリン基の導入によって、または１つ以上の非リンインターヌクレオチドの導入によって得ることができる。
【０１２６】
好ましい適切な修飾インターヌクレオチドは、UhlmannおよびPeymannに要約されている（1990 Chem.Rev.90, 544; Beigelmanら, 1995 Nucleic Acids Res.23: 3989-94; Dudycz, 1995，国際公開公報第９５／１１９１０号；Macadamら, 1998，国際公開公報第９８／３７２４０号；Reeseら, 1997，国際公開公報第９７／２９１１６号も参照）。
【０１２７】
更なる実施態様において、本発明は、本発明による核酸および／またはその変異体、あるいは核酸の非機能的突然変異体である核酸、あるいは先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸を含むベクターに関する。好ましくはベクターは、ノックアウト遺伝子構築物、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、発現ベクター、および／または遺伝子療法で利用できるベクターである。このような構築物の調製は、当業者に一般に既知である。
【０１２８】
本発明の意味の範囲内での「発現ベクター」は、好ましくは、少なくとも１つのプロモーターまたはエンハンサー、少なくとも１つの翻訳開始シグナルを含むすなわち少なくとも１つの調節要素、本発明による核酸または核酸の非機能的突然変異体である核酸または先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸の少なくとも１つ、１つの翻訳終了シグナル、転写終了シグナル、および真核生物での発現のためのポリアデニル化シグナルを含む。
【０１２９】
関係する遺伝子の発現では、一般に二本鎖ＤＮＡが好ましく、ポリペプチドをコード化するＤＮＡ領域が特に好ましい。真核生物の場合、この領域は、Ｋｏｚａｋ配列に位置する第一の開始コドン（ＡＴＧ）で始まり（Kozak, 1987, Nucleic Acids Res.15: 8125-48）、ＡＴＧと同じ読み取り枠内に位置する次の停止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）までである。原核生物の場合、この領域はShine-Dalgarno配列後の第一のＡＵＧ（またはＧＵＧ）で開始し、ＡＴＧと同じ読み取り枠内に位置する次の停止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）で終了する。
【０１３０】
ＨＣＣで異なって発現された遺伝子は、肝臓または肝臓癌遺伝子特異性調節配列を含有することができる。組織または疾患特異性遺伝子に見出されるこれらの非転写配列は含まれた治療および／または腫瘍細胞傷害性遺伝子の組織または疾患特異性発現を引き起こすために使用できる。これらの調節配列は、本発明による核酸または核酸の非機能的突然変異体である核酸または先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸の肝臓癌特異性発現に使用できる。このような調節配列のスクリーニングおよび作成は、当業者に一般に既知である。
【０１３１】
適切な発現ベクターは、原核または真核発現ベクターでありうる。原核発現ベクターの例は、E.coliでの発現のための、例えばベクターｓｐＧＥＭまたはｐＵＣ誘導体であり、真核発現ベクターの例は、Saccharomyces cerevisiaeでの発現のための、例えば昆虫細胞での発現のためのベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬｌ（Mumbergら(1994)Nucl.Acids Res., 22, 5767-5768）、例えば欧州特許登録特許第０１２７８３９号または欧州特許登録特許第０５４９７２１号で開示されているようなバキュロウイルスベクター、および哺乳類細胞での発現のための、例えばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ４０ベクターであり、すべて一般に入手可能である。形質移入後のＲＮＡ干渉の生成のための特異性ベクター、例えばｐＳＵＰＥＲベクター（Brummelkampら, 2002, Science 296: 550-553）も含まれる。
【０１３２】
一般に、発現ベクターは、各細胞に適したプロモーター、例えばＥ．ｃｏｌｉでの発現のためのｔｒｐプロモーター（例えば欧州特許登録特許第０１５４１３３号）、酵母での発現のためのＭＥＴ２５、ＧＡＬ  １またはＡＤＨ２プロモーター（Russelら(1983), J.Biol.Chem.258, 2674-2682; Mumberg，同上）、昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（例えば欧州特許登録特許第０１２７８３９号を参照）なども含有する。哺乳類細胞での発現では、例えば適切なプロモーターは、真核細胞内で、構成的で調節可能な組織特異的の、細胞サイクル特異的の、または代謝特異的の発現を可能にするプロモーターである。本発明による調節要素は、好ましくは、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサーおよび／またはリプレッサー配列である。
【０１３３】
真核生物での考えられる構成的発現を可能にする適切な調節要素の例は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩまたはウイルスプロモーターによって認識されるプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、または、例えばＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス；Leeら(1981)Nature 214, 228-232）からのＬＴＲプロモーターおよび、例えばアデノおよびアデノ様ウイルスＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶから由来する、更なるウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列である。
【０１３４】
真核生物における考えられる調節発現を可能にする調節要素の例は、対応するリプレッサーと組合せたテトラサイクリンオペレーターである（Gossenら, 1994, Curr.Opin.Biotechnol.5: 516-20）。
【０１３５】
翻訳開始シグナル、翻訳終了シグナル、転写終了シグナル、およびポリアデニル化シグナルは当業者に一般に既知であり、研究メーカーから容易に入手することができる。
【０１３６】
好ましくは、肝臓障害および／または上皮癌に関連する遺伝子の発現は、組織特異性プロモーターの制御下、例えばアルブミン、アルファフェトタンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アルファ−１アンチトリプシン、および相補性Ｃ５およびＣ８Ａ遺伝子などの肝臓特異的プロモーターの制御下で起こる（Schremら, 2002, Pharmacol.Rev.54 129-58; Pontoglioら, 2001, J.Expt.Med.194: 1683-1689）。本明細書に記載するようにＨＣＣにおいて高度に調節解除された遺伝子に関連する調節配列も、これらの障害において特異的な遺伝子発現のための好ましい方法を提供する。
【０１３７】
真核生物における考えられる組織特異的発現を可能にする調節要素の例は、ある細胞種でのみ発現されるタンパク質をコード化するこれらの遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーからの、プロモーターまたはアクチベーター配列である。      
【０１３８】
真核生物における考えられる代謝性特異的発現を可能にする調節要素の例は、低酸素状態によって、酸化的ストレスによって、グルコース欠乏によって、ホスフェート濃度によって、または熱ショックによって調節できるプロモーターである。
【０１３９】
真核生物における細胞サイクル特異的発現を可能にする調節要素の例は、以下の遺伝子：ｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５Ｂ、ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ−１〜Ｅ２Ｆ−５、Ｂ−ｍｙｂまたはＤＨＦＲのプロモーターである（Zwicker J.and Muller R., 1997, Trends Genet.13: 3-6）。細胞サイクル調節プロモーターの使用は、ポリペプチドの発現または本発明による核酸が増殖性細胞に制限される場合で特に好ましい。
【０１４０】
先に記載したような核酸、または核酸の非機能的突然変異体の導入およびそれゆえ形質移入、形質転換または感染による、真核または原核細胞でのポリペプチドの発現を可能にするために、核酸は、プラスミドとして、ウイルスまたは非ウイルスベクターとして存在できる。ここでの適切なウイルスベクターは特に：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびヘルペスウイルスである。ここでの適切な非ウイルスベクターは特に：ビロソーム、リポソーム、カチオン性脂質、またはポリリジン結合ＤＮＡまたは裸のＤＮＡである。
【０１４１】
本発明による使用に適したプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、およびコスミドも当業者に既知であり、研究メーカーから一般に入手できる。
【０１４２】
遺伝子療法で利用できるベクターの例は、ベクター、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＲＮＡウイルスのレプリコンに基づくベクターである（Lindemannら, 1997, Mol.Med.3: 466-76; Springerら, 1998, Mol.Cell.2: 549-58, Khromykh, 2000, Curr.Opin.Mol Ther.2: 555-569）。裸のＤＮＡは局所利用時に、または血液供給を通じて例えば肝臓細胞内に浸透可能であるため、真核発現ベクターは、単離された形態での遺伝子療法用途に適切である。
【０１４３】
最先端と比較すると、この融合構築物は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１４４】
別の態様において、本発明は、更に、本発明による核酸および／またはその変異体を含む細胞に関する。好ましくは細胞は、本発明によるベクターによって形質転換される。細胞は、好ましくは、核酸であって、本発明による核酸の非機能的突然変異体、またはその変異体のどちらかである核酸を含有する。特に細胞は、核酸であって、本発明による核酸の非機能的突然変異体、またはその変異体である核酸を含むベクターを含有する。好ましくは、細胞は、本発明による核酸に対して相補性である配列を有する核酸をコード化する核酸、またはその変異体を含有する。その上、細胞は、好ましくは、本発明による抗体または抗体の断片をコード化する核酸を含むベクターを含有する。本発明による細胞は、例えば、先に記載した核酸の少なくとも１つを含む肝臓細胞、または先に記載したベクターの１つを使用して形質転換された細胞でもよい。細胞は、原核または真核細胞、異種または自己細胞のどちらでもよい。原核細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、真核細胞の例は、一次肝細胞、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞などの肝細胞系、酵母細胞、例えばSaccharomyces cerevisiaeまたは昆虫細胞を含む。
【０１４５】
最先端と比較すると、本発明による細胞は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１４６】
本発明の好ましい実施態様において、細胞は、先に記載した少なくとも１つの本発明による核酸、少なくとも１つのベクター、少なくとも１つのノックアウト遺伝子構築物および／または少なくとも１つの発現ベクターを含む、トランスジェニック胎性非ヒト幹細胞である。
【０１４７】
細胞および／または幹細胞の形質転換の過程は、当業者に周知であり、例えば電気穿孔または微量注入を含む。
【０１４８】
別の態様において、本発明は、本発明による核酸および／またはその変異体、核酸の非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、ベクターの形の、ノックダウンまたはノックアウト遺伝子構築物の形の、および発現ベクターの形の先に記載した核酸の１つからなる群より選択される化合物を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳類の提供に関する。
【０１４９】
トランスジェニック動物は、一般に、核酸および／またはポリペプチドの組織特異的な発現増加を示し、例えばＨＣＣなどの肝臓障害および／または上皮癌の分析に、そしてこのような障害の治療方法の開発および評価に使用できる。トランスジェニック動物は、更に、本発明によるポリペプチドの生成に利用できる。動物によって生成されたポリペプチドは、例えば、動物の体液中で濃縮できる。本発明によるポリペプチドは、例えば、牛乳などの体液から分離できる。
【０１５０】
最先端と比較すると、このトランスジェニック非ヒト哺乳類は、驚くべきことに、肝臓障害および／または他の上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の分析および／または診断を可能にする。
【０１５１】
トランスジェニック動物の、特にトランスジェニックマウスの作成工程は同様に、ドイツ特許１９６  ２５  ０４９号および米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，６２５，１２２号；米国特許第５，６９８，７６５号；米国特許第５，５８３，２７８号および米国特許第５，７５０，８２５号から当業者に既知であり、例えば本発明による発現ベクターの胚または精母細胞への直接注入によって、または発現ベクターの受精卵の前核への注入によって、または発現ベクターの胚幹細胞への形質移入によって、または適切なレシピエント細胞への核移植によって生成できるトランスジェニック動物を含む（Polites and Pinkert, DNA Microinjection and Transgenic animal Production, 15〜68頁 in Pinkert, 1994, Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman, Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, 115〜146頁 in Pinkert, 1994, 同上; Wood, Retrovirus-Mediated Gene Transfer, 147〜176頁 in Pinkert, 1994, 同上; Monastersky, Gene Transfer Technology;  Alternative Techniques and Applications, 177〜220頁 in Pinkert, 1994, 同上）。
【０１５２】
先に記載した核酸をいわゆる「ターゲティングベクター」または「ノックアウト遺伝子構築物」に組み込む場合（Pinkert, 1994，同上）、胚幹細胞の形質移入および相同性組換えの後に、例えば一般にヘテロ接合性マウスとして、核酸の発現減少を示すノックアウトマウスを生成することが可能であり、これに対してホモ接合性マウスは、核酸の発現をもはや示さない。そのように生成された動物は、例えばＨＣＣなどの肝臓障害および／または上皮癌の分析にも使用できる。
【０１５３】
ノックアウト遺伝子構築物は、例えば米国特許第５，６２５，１２２号；米国特許第５，６９８，７６５号；米国特許第５，５８３，２７８号および米国特許第５，７５０，８２５号から当業者に既知である。
【０１５４】
更なる態様において、本発明は、提供される抗体またはその断片に関し、ここで抗体または抗体断片は、本発明によるポリペプチド、またはその機能変異体に対して、あるいはポリペプチドをコード化する核酸またはその変異体に対して作成される。
【０１５５】
最先端と比較すると、これらの抗体またはその断片は、驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断および／または改良された、持続性の、および／またはより有効な処置を可能にする。
【０１５６】
「抗体」または「抗体断片」という用語は、本発明により、遺伝子操作に作成および場合により修飾された抗体またはその抗原結合部分、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体、二重またはオリゴ特異性抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２断片なども意味するとして理解される（例えば欧州登録特許第０３６８６８４号、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第４，８１６，３９７号、国際公開公報第８８／０１６４９号、国際公開公報９３／０６２１３号、国際公開公報９８／２４８８４号を参照）。本発明による抗体は、例えば、肝臓障害、例えばＨＣＣおよび／または上皮癌などの本発明による障害の診断、防止、および／または処置に使用できる。
【０１５７】
本発明は、更に、例えば本発明による障害の診断および／または防止および／または処置のために、本発明による核酸またはその変異体によってコード化されるポリペプチドまたはその機能変異体に対して特異性の抗体または抗体断片、好ましくはポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成する方法に関する。工程は、当業者に一般に既知である方法にしたがって、哺乳類、例えばウサギを、本発明による核酸またはその変異体を用いて、あるいは本発明による少なくとも６アミノ酸長を有する、好ましくは８アミノ酸長を有する、特に少なくとも１２アミノ酸長を有する、ポリペプチドまたはその部分またはその機能変異体によって、適切な場合にはフロイントアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で免疫化することによって実施される（例えばHarlow and Lane, 1998, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, USA, Chapter 5, 53〜135頁を参照）。次に、免疫反応の結果として動物内で形成されたポリクローナル抗体は、一般に既知の方法にしたがって、例えばカラムクロマトグラフィーによって、血液から容易に分離および精製することができる。モノクローナル抗体は、例えばWinter & Milsteinの既知の方法にしたがって作成できる（Winter and Milstein, 1991, Nature 349: 293-299）。
【０１５８】
本発明は、更に、先に記載したポリペプチドに対して作成されており、先に記載したポリペプチドと特異的に反応する抗体または抗体断片に関し、ここで先に記載したポリペプチドの部分は、それ自体免疫原性であるか、あるいは、例えばウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの適切な担体に結合させてその免疫原性を上昇させることにより、免疫原性にするかのどちらかである。この抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのどちらかである；好ましくはそれはモノクローナル抗体である。
【０１５９】
なお更に本発明は、例えばKnappikら（2000, J.Molec.Biol.296: 57-86）に、またはChaddおよびChamow（2001 Curr.Opin.Biotechnol.12: 188-94）に記載されているような、組換え抗体発現ライブラリーからの本発明によるポリペプチドに対して特異性である抗体または抗体断片の産生および／または生成に関する。
【０１６０】
本発明の別の実施態様において、アレイが提供され、アレイは、本発明によるポリペプチド、その機能変異体、ポリペプチドをコード化する核酸、核酸の非機能的突然変異体およびポリペプチドに対して作成される抗体または抗体断片からなる群より選択される、少なくとも２つの化合物を含有する。あるいは、アレイは、少なくとも１つの本発明による成分を、腫瘍性または代謝性肝臓障害あるいは上皮癌に関与する先に記載した成分と組合せて含有することもできる。
【０１６１】
本発明の意味の範囲内で、「アレイ」という用語は、少なくとも２つの化合物が一次元、二次元または三次元配置で付着または結合される、固相またはゲル状担体を指す。このようなアレイは、当業者に一般に既知であり、顕微鏡ガラススライド、特にポリカチオン、ニトロセルロースまたはビオチンコーティングスライドなどのコーティングガラススライド、カバースリップ、および例えばニトロセルロースまたはナイロンを主成分とする膜などの膜の上に産生される。
【０１６２】
先に記載したアレイは、本発明による結合ポリペプチドまたはその機能変異体またはポリペプチドをコード化する核酸、またはその変異体、本発明による融合タンパク質あるいは本発明によるポリペプチドまたはその機能変異体に対して作成された抗体または抗体断片あるいは本発明によるポリペプチドまたはその機能変異体を発現する細胞あるいは少なくとも１つの本発明による核酸、またはその変異体を発現する少なくとも２つの細胞を含む。これらをコード化する核酸、またはその変異体は、アレイの一部でもよい。そのようはアレイは、肝臓障害、好ましくはＨＣＣ、および／または上皮癌の分析および／または診断に利用できる。
【０１６３】
本発明は、更に、本発明によるアレイを作成する方法に関し、本発明による少なくとも２つの化合物が担体材料に結合される。
【０１６４】
例えば固相化学および感光保護基に基づいてこのようなアレイを作成する方法は、一般に既知である（米国特許第５，７４４，３０５号）。このようなアレイは、物質または物質ライブラリーと接触させて、相互作用、例えば結合または高次構造の変化について試験することもできる。
【０１６５】
本発明は、更に、肝臓障害、好ましくはＨＣＣなどの本発明による障害の分析および／または診断のための、支持材料に固定されたアレイを作成するための工程に関し、そこでは少なくとも２つの核酸、少なくとも２つのポリペプチドあるいは少なくとも２つの抗体または抗体断片、および／または少なくとも２つの細胞、あるいは先に記載した成分の少なくとも１つが、先に記載したように、腫瘍性および代謝性肝臓障害または上皮癌に関連する他の成分と組合せて調製に使用される。このような工程により作成されたアレイは、本発明による障害の診断に利用することができる。
【０１６６】
別の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、またはその機能変異体、ポリペプチドをコード化する核酸、好ましくは配列番号１０〜１９による核酸、あるいは先に記載した核酸の１つの変異体、および本発明による抗体または抗体断片からなる群より選択された少なくとも１つの化合物を、適切な添加剤または助剤と組合せてまたは共に含有する診断薬に関する。
【０１６７】
最先端と比較すると、この診断は、驚くべきことに、肝臓障害および／または他の上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断を可能にする。
【０１６８】
本発明の意味の範囲内で「適切な添加剤」または「助剤」は、当業者に一般に既知であり、例えば生理的食塩水、脱塩水、ゼラチン、またはグリセロールベースタンパク質安定化試薬を含む。あるいは、本発明による核酸またはポリペプチドは、安定化のために凍結乾燥できる。
【０１６９】
別の例において、本発明による核酸配列に基づく診断キットを作成することができる。このようなキットは、循環系に内在する説明した障害の結果として改変されて、それにより検査患者の血清から検出可能である細胞を、特異的に検出するように設計できる。診断キットの追加の例は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、および特異的に反応する免疫細胞の検出を含む、本発明によるポリペプチドに対する免疫反応または特異的抗体の検出を含む。
【０１７０】
好ましい実施態様において、本発明による診断薬は、プローブ、優先的にはＤＮＡプローブを含有する。
【０１７１】
例えば本発明にしたがって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断薬を調製することが可能である。規定条件下で、好ましくは本発明による核酸に対して特異的なプライマーをＤＮＡプローブとして使用して、本発明の核酸配列に対して特異的なＰＣＲは、診断または治療目的のために得られた患者より分離されたサンプル中の本発明による特異的核酸の存在、および特に量の両方を監視するために利用される。これは、適切なプローブを利用した、例えば肝臓障害特異的または肝臓特異的遺伝子バンクからの例えば適切な遺伝子またはｃＤＮＡライブラリーからの分離によって、説明した核酸を得る更なる可能性を切り開く（例えばJ.Sambrookら, 1989, Molecular Cloning.A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 8章 8.1〜8.81頁、9章 9.47〜9.58頁および10章 10.1〜10.67頁を参照）。
【０１７２】
適切なプローブは、例えば、ヌクレオチド約５０〜１０００個の長さを有する、好ましくはヌクレオチド約１０〜約１００個の長さ、好ましくはヌクレオチド約１００〜約２００個の長さを有する、特にヌクレオチド約２００〜５００の長さを有するＤＮＡまたはＲＮＡ断片であり、その配列は、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７によるポリペプチド、およびその機能変異体、および好ましくは配列番号１０〜配列番号１９によるポリペプチドをコード化する核酸、およびその変異体に由来しうる。
【０１７３】
あるいは、好ましくは、由来核酸配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして適切であるオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
【０１７４】
これを使用して、先に記載した核酸またはこの一部をｃＤＮＡ、例えばＨＣＣ特異的ｃＤＮＡから増幅および単離することができる。適切なプライマーは、例えば、ヌクレオチド約１０〜１００個の長さを有する、好ましくはヌクレオチド約１５〜５０個の長さを有する、特にヌクレオチド１７〜３０個の長さを有するＤＮＡ断片であり、その配列は、配列番号１０〜配列番号１９による核酸からの、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７によるポリペプチドから由来しうる。このようなプライマーの設計および合成は、当業者に一般に既知である。プライマーは、更に、制限部位、例えばベクター内への組み込みに適した増幅配列、あるいは、例えば当業者に一般に既知である蛍光マーカーなどのマーカー分子が結合したした、他のアダプターまたはオーバーハング配列を更に含有できる。
【０１７５】
本発明の別の態様において、本発明による障害の診断の方法が提供され、そこでは配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７の配列によるポリペプチド、その機能変異体、ポリペプチドをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、およびポリペプチドに対して作成された抗体またはその抗体断片からなる群より選択された少なくとも１つの化合物が、患者のサンプル中で同定され、参照ライブラリーまたは参照サンプルの少なくとも１つの化合物と比較される。
【０１７６】
方法の好ましい実施態様において、肝臓の障害は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される。
【０１７７】
方法の好ましい実施態様において、上皮癌は、肝臓以外のいずれかの器官の、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である。
【０１７８】
最先端と比較すると、この診断は、驚くべきことに、改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の、肝臓障害および／または他の上皮癌の診断を可能にする。
【０１７９】
好ましくはサンプルは、先に記載した非侵襲性の方法によって患者から分離される。
【０１８０】
例えば、特異的調節解除遺伝子タンパク質のＥＬＩＳＡアッセイによる血清検出は、、調節解除遺伝子生成物に対する抗体の１つまたは群のどちらかの１つの応用であり、そこから診断スコアが、罹患患者からの罹患組織または血清で発現される遺伝子の組合せ、および発現レベルに基づいて導き出される。
【０１８１】
本発明による好ましい診断は、説明したポリペプチドまたは先に更に詳細に記載したその免疫原性部分を含有する。好ましくは、例えばニトロセルロースまたはナイロンの固相に結合されたポリペプチドまたはその部分は、例えば調査する体液、例えば血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液にインビトロで接触させて、それゆえ例えば患者の血液中に存在する例えば自己免疫抗体と反応させることができる。そこで抗体−ペプチド複合体は、例えば、標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出することができる。標識化は、例えば、呈色または化学発光反応を触媒するペルオキシダーゼなどの酵素を包含する。それゆえ存在する自己免疫抗体の存在および量は、色によって容易および迅速に検出できる。
【０１８２】
加えて診断は、患者から分離したサンプル中に存在する内在性抗体またはその断片を検知するを目的としており、その抗体またはその断片は、本発明によるポリペプチドに対して作成されている。このような自己免疫抗体の検出は、当業者に一般に既知である方法によって、例えば本発明によるポリペプチドまたはその機能変異体またはその部分をプローブとして用いた、免疫親和性アッセイによって実施できる。好ましくはこのような自己免疫抗体の存在は、本発明による障害を患う患者を示す。
【０１８３】
本発明の主題である更なる診断は、本発明による抗体そのものを含有する。これらの抗体を用いて、例えば関与する本発明によるポリペプチドが増加した量で存在するかどうかに関して組織サンプルを容易および迅速に調査して、それにより肝臓障害、例えばＨＣＣを含む考えられる疾患の指標を得ることができる。この場合、本発明による抗体は、好ましくは直接標識されるか、更に一般的には、例えばこれらは既に先に記載したように酵素または蛍光分子によってなど、特異的に二次抗体によって間接的に検出される。特異的抗体−ペプチド複合体はそれにより、例えば酵素呈色反応によって、容易および迅速に検出することができる。
【０１８４】
本発明のなお別の態様において、参照ライブラリーまたは参照サンプルに対して、患者から分離したサンプル中でディファレンシャルに発現された、配列番号１０〜配列番号１９による少なくとも１つの核酸、またはその変異体を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離したサンプル中で、配列番号１０〜配列番号１９による少なくとも１つの核酸、またはその変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記核酸の発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の同じ核酸の発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記核酸を同定する工程と；
を含む方法が提供される。
【０１８５】
最先端と比較すると、方法は、驚くべきことに、本発明による障害を診断するために有用な基準を提供する、改良された、より感受性の高い、容易で、より高速な、および／または非侵襲性の、異なって発現された本発明による核酸の同定を可能にする。
【０１８６】
好ましくは少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、または少なくとも７つの核酸が同定される。
【０１８７】
方法の別の好ましい実施態様において、上記核酸は、ＰＣＲベースの検出によって、またはハイブリダイゼーションアッセイによって検出される。
【０１８８】
方法の別の好ましい実施態様において、上記核酸の発現は、固相ベースのスクリーニング方法、ハイブリダイゼーション、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、およびＲＮａｓｅ保護アッセイからなる群から選択される方法によって比較される。
【０１８９】
方法の更に好ましい実施態様において、患者から分離したサンプルは、肝臓組織、肝臓細胞、癌性形質転換を受けた別の器官からの組織、この器官からの細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択される。
【０１９０】
好ましくは参照サンプルは、同じ患者の非罹患サンプルまたは別の対象者からの非罹患サンプルから選択された供給源より分離される。適切な参照サンプルの選択は、当業者に一般に既知である。特に、参照サンプルは、肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択できる。
【０１９１】
方法の別の好ましい実施態様において、参照ライブラリーは、好ましくは肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択されるサンプル中の、本発明による少なくとも１つの核酸の非罹患発現に関するクローンまたはデータを含む発現ライブラリーまたはデータベースである。
【０１９２】
本発明の別の態様において、肝臓障害および／または別の上皮癌を診断する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離したサンプル中で、配列番号１０〜配列番号１９および／または配列番号４７による少なくとも１つの核酸、またはその変異体の発現を検出するステ  ップと；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記核酸の発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル内での同じ核酸の発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記核酸を同定する工程と；
（ｄ）工程（ｃ）で同定した上記核酸を、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された上記核酸と一致させる工程と；
を含み、
一致した核酸が、肝臓障害および／または他の上皮癌を患う患者を示す、
方法が提供される。
【０１９３】
最先端と比較すると、診断のこの方法は、驚くべきことに、改良された、より感受性の高い、容易で、より高速な、および／または非侵襲性の、肝臓障害および／または他の上皮癌の診断を可能にする。
【０１９４】
好ましくは少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、または少なくとも７つの核酸が同定される。
【０１９５】
方法の別の好ましい実施態様において、上記核酸は、ＰＣＲベースの検出によって、またはハイブリダイゼーションアッセイによって検出される。
【０１９６】
方法の別の好ましい実施態様において、上記核酸の発現は、固相ベースのスクリーニング方法、ハイブリダイゼーション、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、およびＲＮａｓｅ保護アッセイからなる群から選択される方法によって比較される。
【０１９７】
方法の更に好ましい実施態様において、患者から分離したサンプルは、肝臓組織、肝臓細胞、癌性形質転換を受けた別の器官からの組織、この器官からの細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択される。
【０１９８】
好ましくは参照サンプルは、同じ患者の非罹患サンプルまたは別の対象者からの非罹患サンプルから選択された供給源より分離される。適切な参照サンプルの選択は、当業者に一般に既知である。特に、参照サンプルは、肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択できる。
【０１９９】
診断の方法の別の好ましい実施態様において、参照ライブラリーは、好ましくは肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液および糞からなる群より選択されるサンプル中の、本発明による少なくとも１つの核酸の非罹患発現に関するクローンまたはデータを含む発現ライブラリーまたはデータベースである。
【０２００】
診断の方法の別の好ましい実施態様において、病理参照サンプルは、別の患者からの罹患サンプルから分離される。後者の患者は、診断される本発明による障害を患っていると診断されている。適切な病理参照サンプルの選択は、当業者に一般に既知である。特に病理参照サンプルは、肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択できる。
【０２０１】
診断の本発明の別の好ましい実施態様において、病理参照ライブラリーは、診断中の患者を除いて、参照サンプルまたは参照ライブラリーでの対照発現に対する、本発明の方法で診断される本発明による障害を患う、少なくとも１人の患者から分離されたサンプル中の、本発明による少なくとも１つの核酸のディファレンシャル発現に関するデータを含むデータベースである。病理参照ライブラリーは、好ましくは、診断中の患者を除いて、参照サンプルまたは参照ライブラリーでの対照発現に対して本発明の方法で診断される本発明による障害を患う、少なくとも１人の患者から分離されたサンプル中で異なって発現される、本発明による核酸を含むディファレンシャル発現ライブラリーにも関する。適切な病理参照ライブラリーの選択は、当業者に一般に既知である。
【０２０２】
好ましくは肝臓障害は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される障害である。特に上皮癌は、肝臓以外のいずれかの器官の、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である。
【０２０３】
本発明の意味の範囲内で「核酸を検出する」という用語は、好ましくはサンプル中に存在する他の成分のバックグラウンドから本発明による核酸を発見、描出、分離する、またはその識別を可能にする方法を指す。このような方法は、当業者に一般に既知であり、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、ゲル電気泳動、ノーザンブロット、固相アレイ（遺伝子チップ）ベースの方法、ヌクレアーゼ保護方法を含む（Alberts, ら(2002)The Molecular Biology of the Cell, 4th ed.Garland, New York, USAで説明および引用）。
【０２０４】
本発明の意味の範囲内で、「工程（ａ）で検出された上記核酸の発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の同じ核酸の発現と比較する」という用語は、定量的または定性的レベルでの、ディファレンシャルディスプレイ、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、または特にＤＮＡチップハイブリダイゼーションなどの実験手順による、上記核酸の２つの群の発現の比較を指す。その上、先に定義したように、工程（ａ）で検出された上記核酸の実験データの、参照ライブラリー中の同じ核酸の発現との比較も本明細書に含まれている。
【０２０５】
「参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記核酸を同定する」という用語は、本発明の意味の範囲内で、以下の基準を満足する、参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して異なって発現された上記核酸を選択することを意味すると理解される：検出された上記核酸のディファレンシャル発現のレベルが、参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、約２倍以上、好ましくは約５倍以上、更に好ましくは約１０倍以上アップレギュレートされる。
【０２０６】
「工程（ｃ）で同定した上記核酸を、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された上記核酸と一致させる」という用語は、本発明の意味の範囲内で、工程（ｃ）で同定した上記核酸を、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された上記核酸と比較することを意味すると理解される。そこで病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された、工程（ｃ）で同定した上記核酸は一致され、すなわち上記同一対は、同定および割当される。病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中での上記核酸のディファレンシャル発現は、本発明による障害を示すため、サンプル中のディファレンシャル発現とのこのような一致は、患者がその障害を患っていることを示す。
【０２０７】
サンプルは、好ましくは、非侵襲性の、または静脈穿刺を含む、先に記載したような好ましくは最小限の侵襲性方法によって患者から分離される。
【０２０８】
本発明による診断の方法は、参照サンプルに対する、または参照ライブラリーに対する、肝臓障害および／または上皮癌を患う動物および／またはヒト患者から分離したサンプル中で検出された本発明による核酸の本質的に一致した発現パターンに基づいて、肝臓障害および／または上皮癌の初期検出、および／または障害の非侵襲性診断を可能にする。方法は、追加の利点を有し、肝臓障害の異なるサブタイプ、例えばＨＣＣのサブタイプなどを特徴付けるために、追加のおよび新規な診断パラメータも提供する。
【０２０９】
本発明による核酸の「実質的に一致した発現パターン」という用語は、比較された患者または対象者が同じまたは比較可能な病理状態または健康状態にそれぞれあるという条件で、患者間または対象者間で本質的に再現性である発現のパターンを指す。
【０２１０】
本発明のなお別の態様において、参照ライブラリーまたは参照サンプルに対して、患者から分離されたサンプル中で異なって発現された配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７による少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能変異体を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離されたサンプル中で、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７による少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記ポリペプチドの発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の上記ポリペプチドの発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記ポリペプチドを同定する工程と；
を含む方法が提供される。
【０２１１】
最先端と比較すると、この方法は、驚くべきことに、本発明による障害を診断するために有用な基準を提供する、改良された、より感受性の高い、容易で、より高速な、および／または非侵襲性の、異なって発現された本発明によるポリペプチドの同定を可能にする。
【０２１２】
好ましくは２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、または少なくとも７つのポリペプチドが同定される。
【０２１３】
サンプルは、好ましくは、非侵襲性の、または静脈穿刺を含む、先に記載したような好ましくは最小限の侵襲性方法によって患者から分離される。
【０２１４】
方法の別の実施態様において、サンプルは、先に更に定義したようなサンプルである。好ましくは参照サンプルは、先に定義したような参照サンプルである。
【０２１５】
方法の別の好ましい実施態様において、参照ライブラリーは、好ましくは肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択されるサンプル中の、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの非罹患発現に関するクローンまたはデータを含む発現ライブラリーまたはデータベースである。このようなデータベースは、本発明によるｃＤＮＡマイクロアレイ発現分析の結果として作成され、当業者に既知である。本発明により使用できる更なる参照ライブラリーは、上述されている。
【０２１６】
本発明の別の態様において、肝臓障害および／または上皮癌を診断する方法であって、以下の工程：
（ａ）患者から分離されたサンプル中で、配列番号１〜配列番号９および／または配列番号４７による少なくとも１つのポリペプチド、および／またはその機能変異体の発現を検出する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で検出された上記ポリペプチドの発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の上記ポリペプチドの発現と比較する工程と；
（ｃ）参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記ポリペプチドを同定する工程と；
（ｄ）工程（ｃ）で同定した上記ポリペプチドを、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された上記ポリペプチドと一致させる工程と；
を含み、
一致したポリペプチドが、肝臓障害および／または他の上皮癌を患う患者を示す、
方法が提供される。
【０２１７】
最先端と比較すると、診断のこの方法は、驚くべきことに、改良された、より感受性の高い、容易で、より高速な、および／または非侵襲性の、肝臓障害および／または他の上皮癌の診断を可能にする。
【０２１８】
好ましくは少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、または少なくとも７つのポリペプチドが同定される。
【０２１９】
本発明の意味の範囲内で「ポリペプチドを検出する」という用語は、好ましくはサンプル中に存在する他の成分のバックグラウンドから本発明によるポリペプチドを発見、描出、分離する、および／またはその識別を可能にする方法を指す。このような方法は、当業者に一般に既知であり、先に記載したように、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー技法、免疫ブロット分析、免疫組織化学、酵素ベース免疫アッセイ、質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、および／または抗体およびタンパク質アレイを含む（Ausubel, F.A.ら, 編 , 1990, Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, USA, 10章; Myszka and Rich 2000, Pharm.Sci.Technol.Today 3: 310-317）。好ましくは、タンパク質およびポリペプチドは、例えば物理剪断または超音波手段を用いた細胞の破砕によって、サンプルから調製される。タンパク質を還元剤処置および加熱によって変性および安定化して、タンパク質は電気泳動ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画する。
【０２２０】
本発明の意味の範囲内で、「工程（ａ）で検出された上記ポリペプチドの発現を、参照ライブラリーまたは参照サンプル中の同じポリペプチドの発現と比較する」という用語は、定量的または定性的レベルでの、二次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー分離技法、免疫ブロット分析、表面プラズモン共鳴、免疫組織化学、および酵素ベース免疫アッセイなどの実験手順による、ポリペプチドの２つの群の発現の比較を指す。二次元ゲル電気泳動では、すべてのペプチドは、最初に第一次元目の電気泳動の等電点によって、次に当業者に周知の方法にしたがってサイズによって分解される。その上、先に定義したように、工程１で検出した少なくとも１つのポリペプチドに関する実験データと、参照ライブラリー中のポリペプチドの発現との比較も、本明細書に含まれている。
【０２２１】
「参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、患者から分離したサンプル中で異なって発現された上記ポリペプチドを同定する」という用語は、本発明の意味の範囲内で、以下の基準を満足する、参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して異なって発現された上記ポリペプチドを選択することを意味すると理解される：検出されたポリペプチドのディファレンシャル発現のレベルが、参照ライブラリーまたは参照サンプルと比較して、約２倍以上、好ましくは約５倍以上、更に好ましくは約１０倍以上アップレギュレートされる。
【０２２２】
「工程（ｃ）で同定した上記ポリペプチドを、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された上記ポリペプチドと一致させる」という用語は、本発明の意味の範囲内で、工程（ｃ）で同定した上記ポリペプチドを、病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された上記ポリペプチドと比較することを意味すると理解される。そこで病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中で異なって発現された、工程（ｃ）で同定した上記ポリペプチドは一致され、すなわち上記同一対は、同定および割当される。病理参照サンプルまたは病理参照ライブラリー中での上記ポリペプチドのディファレンシャル発現は、本発明による障害を示すため、サンプル中のディファレンシャル発現とのこのような一致はそこで、患者がその障害を患っていることを示す。
【０２２３】
サンプルは、好ましくは、非侵襲性の、または静脈穿刺を含む、先に記載したような好ましくは最小限の侵襲性方法によって患者から分離される。
【０２２４】
方法の別の実施態様において、サンプルは、先に更に定義したようなサンプルである。好ましくは参照サンプルは、先に定義したような参照サンプルである。
【０２２５】
診断の方法の別の好ましい実施態様において、参照ライブラリーは、好ましくは肝臓組織、肝臓細胞、血液、血清、血漿、腹水、乳房水、脳脊髄液、唾液、尿、精液、および糞からなる群より選択されるサンプル中の、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの非罹患発現に関するクローンまたはデータを含む発現ライブラリーまたはデータセットである。
【０２２６】
本発明によるデータベースの例および本発明によって使用できる更なる実験参照ライブラリーは、上述されている。
【０２２７】
診断の方法の別の好ましい実施態様において、病理参照サンプルは、先に定義したような病理参照サンプルである。
【０２２８】
診断の方法の別の好ましい実施態様において、病理参照ライブラリーは、診断中の患者を除いて、参照サンプルまたは参照ライブラリーでの対照発現に対して本発明の方法で診断される本発明による障害を患う、少なくとも１人の患者から分離されたサンプル中の、本発明による少なくとも１つの上記ポリペプチドのディファレンシャル発現に関するデータを含むデータベースである。病理参照ライブラリーは、診断中の患者を除いて、参照サンプルまたは参照ライブラリーでの対照発現に対して本発明の方法で診断される本発明による障害を患う、少なくとも１人の患者から分離されたサンプル中で異なって発現される、本発明によるポリペプチドを含むディファレンシャル発現ライブラリーにも関する。適切な病理参照ライブラリーの選択は、当業者に一般に既知である。
【０２２９】
好ましくは肝臓障害は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される障害である。特に上皮癌は、肝臓以外のいずれかの器官の、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である。
【０２３０】
本発明による診断の方法は、参照サンプルに対する、または参照ライブラリーに対する、肝臓障害および／または上皮癌を患う動物および／またはヒト患者から分離したサンプル中で検出された本発明によるポリペプチドの本質的に一致した発現パターンに基づいて、肝臓障害および／または上皮癌の初期検出、および／または障害の非侵襲性診断を可能にする。方法は、追加の利点を有し、肝臓障害の異なるサブタイプ、例えばＨＣＣのサブタイプなどを特徴付けるために、追加のおよび新規な診断パラメータも提供する。
【０２３１】
本発明によるポリペプチドの「本質的に一致した発現パターン」という用語は、比較された患者または対象者が同じまたは比較可能な病理状態または健康状態にそれぞれあるという条件で、患者間または対象者間で本質的に再現性である発現のパターンを指す。
【０２３２】
本発明の別の態様において、本発明によるポリペプチド、その機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載したベクターを含む細胞、先に記載したポリペプチドの１つに対して作成された抗体または抗体の断片、先に記載した抗体をコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および先に記載した抗体断片をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を、適切な添加剤または助剤と組合せてまたは共に含む医薬組成物が提供される。好ましい実施態様において、医薬組成物は、本発明による少なくとも１つの細胞を、適切な添加剤または助剤と組合せてまたは共に含有する
【０２３３】
肝臓障害および／または他の上皮癌の療法の最先端と比較すると、本発明による医薬組成物は、驚くべきことに、改良された、持続性の、および／またはより有効な処置を提供する。
【０２３４】
医薬組成物は、本発明が意味するところで、肝臓障害および／または上皮癌を防止および／または処置するために使用できる薬剤を含む。医薬組成物は、例えば、細胞系、好ましくは真核系における特異的抗体遺伝子断片の発現により生成された安定化組換え抗体を含む。組換え抗体治療薬は、例えば罹患肝臓領域への、または静脈または動脈血管系への、または肝門脈系への注入によって送達される。注入は、治療有効性を達成するために、定期的な間隔で反復することができる。本発明による治療薬は、有効性を向上させるために、他の化学薬品、抗体、または他のいずれかの治療処理と組合せて利用することもできる。
【０２３５】
本発明は、本発明による障害、例えばＨＣＣの処置および／または防止のための医薬組成物を製造する工程にも関し、そこで、本発明によるポリペプチド、その機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載したベクターを含む細胞、先に記載したポリペプチドの１つに対して作成された抗体または抗体の断片、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および先に記載した抗体断片の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの化合物が、適切な添加剤と共に組合されるか、混合される。
【０２３６】
本発明は、更に、肝臓障害および／または上皮癌、例えばＨＣＣの処置および／または防止のためにこの工程によって製造された医薬組成物に関し、その医薬組成物は、本発明によるポリペプチド、その機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載した核酸の１つを含む細胞、先に記載したベクターを含む細胞、先に記載したポリペプチドの１つに対して作成された抗体または抗体の断片、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクター、先に記載した抗体の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および先に記載した抗体断片の１つをコード化する核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を、適当ならば適切な添加剤および助剤と共に含有する。本発明は、更に、肝臓障害、例えばＨＣＣおよび／または上皮癌の防止および／または処置のための本医薬組成物の使用に関する。
【０２３７】
好ましくは医薬組成物は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される肝臓障害の処置に利用される。特に医薬組成物は、肝臓以外のいずれかの器官の、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である上皮癌の処置に利用される。
【０２３８】
療法は、当業者に一般に既知である従来方法で、例えば本発明による医薬組成物の経口投与によって、または静脈注射を介しても実施できる。それゆえ、例えば生理的食塩水、脱塩水、安定剤、プロテイナーゼインヒビターなどの適切な添加剤または助剤を含む医薬組成物を投与することが可能である。
【０２３９】
本発明による少なくとも１つのポリペプチド、その機能変異体またはポリペプチドをコード化する核酸、またはその変異体を発現する細胞の使用に基づいた療法は、自己または異種細胞を使用して実施できる。好ましい細胞は、肝臓細胞、例えば肝臓細胞、肝臓生成幹または前駆細胞の初代培養物、あるいは血液細胞を含む。細胞は、適切な担体材料を用いて、組織、好ましくは血液に添加または肝臓に注入することができる。このような療法は、好ましくは、本発明によるポリペプチドの発現および／または放出時に、ポリペプチドが、処置を必要とする患者において免疫反応を刺激するという概念に基づく。
【０２４０】
好ましくは、治療アプローチは、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの機能および／または発現および／または本発明による少なくとも１つの核酸の機能および／または発現を抑制することに向けられている。発現および／または機能のこのような抑制は、好ましくは、標的化された核酸／ポリペプチドの発現および／または機能を著しく低下させる。発現および／または機能の抑制は、好ましくは、標的化核酸／ポリペプチドの発現および／または機能を除去する。標的化核酸／ポリペプチド発現および／または機能のこのような低下または除去は、当業者に一般に既知であるポリペプチド／核酸の発現および／または機能を判定する従来のアッセイを使用して決定できる。特に機能を判定するこのようなアッセイは、医薬組成物の投与前および投与後の、標的化核酸／ポリペプチドの生物活性を比較する方法を含む。好ましくは発現を判定するこのようなアッセイは、医薬組成物の投与前および投与後の、標的化核酸／ポリペプチドの発現のレベルを比較する方法を含む。
【０２４１】
このような療法は、好ましくは、本発明による核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、すなわち転写された本発明による核酸の翻訳を低下または停止させ、それにより標的化核酸／ポリペプチドの機能および／または発現を抑制するアンチセンス分子またはＲＮＡ干渉分子の使用によって実施される。好ましくは相補性配列を有するこのような核酸は、このような核酸を含むベクターまたは細胞の形で利用できる。療法はポリペプチドレベルで、本発明によるポリペプチドに対して作成された抗体または抗体断片の使用によって特に実施できる。抗体または抗体断片は、患者に直接投与されるか、または、好ましくは、抗体をコード化する核酸が、好ましくは細胞に含有されるベクターに含有されている。次に細胞またはベクターは、このような治療が必要な患者に投与できる。
【０２４２】
肝臓障害および／または他の上皮癌の療法の最先端と比較すると、本発明による処置の方法は、驚くべきことに、改良された、持続性の、および／または更に有効な処置を提供する。
【０２４３】
本発明は、更に、肝臓障害を患う患者を治療する方法に関し、ここでは本発明によるポリペプチド、その機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、ベクターを含む細胞、ポリペプチドに対して作成された抗体、抗体の断片、抗体をコード化する核酸を含むベクター、抗体をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞、および抗体断片をコード化する核酸を含むベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分が、場合により適切な添加剤および／または助剤と組合せてまたは共に、治療が必要な患者に治療的有効量で投与される。
【０２４４】
好ましくは、治療の方法は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される肝臓障害を対象とする。特に治療の方法は、肝臓以外のいずれかの器官の、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である上皮癌を対象とする。
【０２４５】
このような化合物または細胞を投与する方法は、先に詳細に説明されている。
【０２４６】
「治療的有効量」という用語は、先に定義したような「有効な治療」を生じる化合物の量の患者への投与を指す。化合物の治療的有効量の判定は、当業者に一般に既知である。
【０２４７】
治療のこのような方法は、先に記載したように肝臓障害および／または上皮癌の有効な治療を可能にする。
【０２４８】
本発明の別の態様において、本発明によるポリペプチド、またはその機能変異体に対する、肝臓障害および／または上皮癌を患う患者の免疫反応を刺激する方法が提供され、そこでは本発明によるポリペプチド、その機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、および先に記載したベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分がこのような治療が必要な患者に、患者の免疫反応を刺激するのに有効な量で投与される。
【０２４９】
障害および／または他の上皮癌の療法の最先端と比較すると、本発明による免疫反応を刺激する方法は、驚くべきことに、改良された、持続性の、および／または更に有効な免疫化を提供する。
【０２５０】
本発明の別の態様において、患者が、肝臓障害および／または上皮癌を発現するのを防止する方法が提供され、ここでは本発明によるポリペプチド、その機能変異体、先に記載したポリペプチドの１つをコード化する核酸、先に記載した核酸の１つの変異体、先に記載した核酸の１つに対して相補性である配列を有する核酸、先に記載した核酸の１つの非機能的突然変異体である核酸、先に記載した核酸の１つを含むベクター、先に記載した核酸の１つを含む細胞、および先に記載したベクターを含む細胞からなる群より選択される少なくとも１つの成分が、このような防止処置が必要な患者に治療的有効量で投与される。
【０２５１】
肝臓障害および／または他の上皮癌の療法の最先端と比較すると、本発明による防止の方法は、驚くべきことに、改良された、持続性の、および／または更に有効な予防措置を提供する。
【０２５２】
好ましくは免疫反応を防止する方法および／または刺激する方法は、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、慢性肝炎、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、肝細胞癌、良性肝新生物、および限局性結節性過形成からなる群より選択される肝臓障害を対象とする。特に好ましくは、免疫反応を防止する方法および／または刺激する方法は、肝臓以外のいずれかの器官の、好ましくは肺、胃、腎臓、結腸、前立腺、皮膚、および乳房からなる群より選択される器官の腺癌である上皮癌を対象とする。
【０２５３】
更なる態様において、本発明は、少なくとも１つの薬理学的活性化合物を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）配列番号１〜９および／または配列番号４７による少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能変異体を提供する工程と；
（ｂ）上記ポリペプチドに、薬理学的活性化合物であることが疑われる化合物を接触させる工程と；
（ｃ）工程（ａ）の上記ポリペプチドと薬理学的活性であることが疑われる上記化合物との相互作用をアッセイする工程と；
（ｄ）工程（ａ）の上記ポリペプチドと直接または間接的に相互作用する、薬理学的活性であることが疑われる上記化合物を同定する工程と；
を含む方法に関する。
【０２５４】
好ましくは、上記ポリペプチドは、カラムに付着された上記ポリペプチド、アレイに付着された上記ポリペプチド、電気泳動ゲルに含有された上記ポリペプチド、膜に付着された上記ポリペプチド、および細胞によって発現された上記ポリペプチドからなる群より選択される形で提供される。
【０２５５】
薬理学的活性が疑われる化合物と工程（ａ）の上記ポリペプチドの組換え融合タンパク質との相互作用が検出される、酵素および蛍光ベース細胞レポーターアッセイの群より選択される方法によって、相互作用をアッセイすることが好ましい。相互作用は、好ましくは、表面プラズモン共鳴、ＨＰＬＣ、および質量分析法によってもアッセイできる。好ましくは直接または間接相互作用は、上記ポリペプチドの発現の誘発、上記ポリペプチドの発現の抑制、上記ポリペプチドの機能の活性化、上記ポリペプチドの機能の抑制からなる群より選択される。
【０２５６】
「薬理学的活性物質」という用語は、本発明が意味するところで、適切な条件下で配列番号１〜９および／または配列番号４７によるポリペプチド、またはその機能変異体（配列番号１０〜１９によってコード化）と、適当な場合は適切な添加剤および／または助剤と共に相互作用することが可能である、これらの分子、化合物および／または組成物および物質混合物すべてを意味すると理解される。考えられる薬理学的活性物質は、簡単な化学（有機または無機）分子または化合物であるが、ペプチド、タンパク質またはその複合体を含むこともできる。薬理学的活性物質の例は、その薬理学的活性について分析されている化合物のライブラリーから由来する有機分子である。その相互作用によって、薬理学的活性物質は、インビボまたはインビトロでポリペプチドの発現および／または機能に影響を及ぼすか、または代わりに先に記載したポリペプチドに単に結合するか、またはそれらとの共有的または非共有的な方法の他の相互作用の一部になることができる。
【０２５７】
本発明によって使用できる適切な試験システムは、二重ハイブリッドシステムとの相互作用を同定することに基づいている（Fields and Stemglanz, 1994, Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas and Brent, 1998 TIBTECH, 16, 355-363）。この試験システムにおいて、細胞は、少なくとも１つの本発明によるポリペプチドおよびＧａｌ４またはＬｅｘＡなどの転写因子のＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質を発現する発現ベクターによって形質転換される。形質転換された細胞は、レポーター遺伝子も含有し、そのプロモーターは、対応するＤＮＡ結合ドメインへの結合部位を含有する。既知または未知のポリペプチドおよび例えばＧａｌ４または単純ヘルペスウイルスＶＰ１６からの活性化ドメインからなる第二の融合タンパク質を発現する、更なる発現ベクターを形質転換することによって、第二の融合タンパク質が調査した本発明によるポリペプチドと相互作用するならば、レポーター遺伝子の発現を大幅に増加させることができる。発現のこの増加は、第二の融合タンパク質を作成する目的で、例えば肝臓組織、または罹患肝臓組織からｃＤＮＡライブラリーを作成することによって、新しい相互作用パートナーを同定するために使用できる。好ましい実施態様において、相互作用パートナーは、配列番号１〜９および／または配列番号４７（配列番号１０〜１９によってコード化）によるポリペプチドまたはその機能変異体のインヒビターである。この試験システムは、本発明によるポリペプチドと相互作用パートナーとの間の相互作用を抑制する物質をスクリーニングするためにも使用できる。このような物質は、本発明によるポリペプチドの融合タンパク質および相互作用パートナーを発現させる細胞において、レポーター遺伝子の発現を減少させる（Vidal and Endoh, 1999, Trends in Biotechnology, 17: 374-81）。このようにして、肝臓障害および／または上皮癌の療法および／または防止に利用できる、新規な活性化合物を迅速に同定することが可能である。
【０２５８】
タンパク質の発現に影響を及ぼす薬理学的活性物質を同定するアッセイは、当業者に周知である（例えばSivarajaら, 2001，米国特許第６，１８３，９５６を参照）。それゆえ配列番号２によるポリペプチドまたはその機能変異体を発現する細胞は、遺伝子発現をインビトロで分析するための試験システムとして培養可能であり、肝臓細胞が優先される。遺伝子発現は、当業者に一般に既知の方法を用いて、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで分析される。この文脈では、１つ以上の推定上の薬理学的活性物質を細胞培養物に添加した後に存在する配列番号１〜９および／または配列番号４７（配列番号１０〜１９によってコード化）によるポリペプチドまたはｍＲＮＡの量を測定し、対照培養物中の対応する量と比較する。これは、例えば、細胞の溶解物中に存在するポリペプチドを検出するために使用できる、配列番号１〜９および／または配列番号４７（配列番号１０〜１９によってコード化）によるポリペプチド、またはその機能変異体に対して特異的に作成された抗体を用いて実施される。発現されたポリペプチドの量は、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットを使用して、当業者に一般に既知である方法によって定量できる。この文脈で、分析を高スループット方法として実施し、非常に多数の物質を、配列番号１〜９および／または配列番号４７（配列番号１０〜１９によってコード化）によるポリペプチドの発現のモジュレーターとしての適合性について分析することができる（Sivarajaら, 2001，米国特許第６，１８３，９５６号）。この文脈で、分析される物質は、しばしば非常に異質である、数千個の物質を含有可能な物質ライブラリー（例えばドイツ特許第１９８１６４１４号、ドイツ特許第１９６１９３７３号）から得ることができる。
【０２５９】
本発明はここで、図および実施例を用いて以下で更に説明し、本発明を本明細書に制限することなく、本発明の実施態様および特徴を示す。
【実施例１】
【０２６０】
ＨＣＣサブトラクトｃＤＮＡライブラリーの作成
ＲＮＡは、病理学者が確認したＨＣＣ腫瘍サンプル３個および病理学者が確認した非罹患ヒト肝臓サンプル３個から、標準方法にしたがってＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen）を用いて分離した（Chomczynski & Sacchi, 1987, Anal.Biochem.162: 156-159）。ｃＤＮＡライブラリーの作成に使用する組織は、商業研究を含めて、この物質の研究目的への利用に関して明確なインフォームドコンセントを与えた患者からのものである。ｍＲＮＡは、Clontech Laboratoriesによる「ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット」で与えられた説明書に記載されているように、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換した。ＨＣＣにおいて特異的に増加および減少したｃＤＮＡを濃縮するために、参照肝臓プールおよびＨＣＣで共通して同様のレベルで発現したｃＤＮＡを、このキットで与えられた説明書にしたがって、そしてDiatchenkoら（1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93: 6025-6030）に記載されているように、サブストラクティブ・サプレッシブ・ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）によって除去した。ＳＳＨ工程は、生じたｃＤＮＡ分子がＨＣＣでアップレギュレートおよびダウンレギュレートの両方をされた核酸配列を示すが、異なって発現された核酸配列を示さないように、両方の方向で実施した（ＨＣＣ  ｃＤＮＡから非罹患肝臓ｃＤＮＡをサブトラクトし、非罹患肝臓ｃＤＮＡからＨＣＣ  ｃＤＮＡをサブトラクトする）。加えて、ＨＣＣ組織において珍しいｍＲＮＡ転写物をよりよく示すために、正規化されたがサブトラクトされていないＨＣＣ  ｃＤＮＡライブラリーを作成した。これらのｃＤＮＡは別個にｐＣＲＩＩベクター（Invitrogen）内に、このプラスミド内への連結と、それに続くＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ電気穿孔コンピテント細胞（Stratagene）内への電気泳動形質転換によってクローニングした。クローニングは、ベクターおよびコンピテント細胞の供給者が説明するように実施した。クローニング済みの異なって発現されたｃＤＮＡを選択（アンピシリン）培地にプレーティングし、個々のクローンを分離した。各ＳＳＨライブラリーからはクローン９６０個を分離し、正規化ＨＣＣライブラリーからはクローン５７６個を分離し、培養物は９６ウェルマイクロタイタープレートで確立した。これらのｃＤＮＡクローンは共に、ヒトＨＣＣ組織に特異的なｍＲＮＡ発現の独自の表現を与える。
【実施例２】
【０２６１】
ＨＣＣ  ｃＤＮＡマイクロアレイの作成およびハイブリダイゼーション
先に記載のＳＳＨ  ｃＤＮＡライブラリークローンの培養物１mlを増幅し、ｃＤＮＡインサートを、ＤＮＡインサートに隣接するベクター配列に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。Ｍ１３フォワード（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’；配列番号２０）およびＭ１３リバースプライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’；配列番号２１）をクローンインサートのＰＣＲ増幅に利用した。細菌培養物５０マイクロリットルを９５℃で１０分間に渡って熱変性させて、細片を遠心分離によって除去し、上澄２μlを標準ＰＣＲ［１Ｘ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液、２．５mM  ＭｇＣｌ２、３７．５nM  各プライマー、０．５mM  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのそれぞれおよび１．５単位  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）］に含めた。反応条件は、９５℃にて５分間で、続いて９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて６０秒間を３５サイクル；次に続いて７２℃にて７分間であり、そして次に４℃に冷却した。ｃＤＮＡインサートの増幅は、０．４μg/ml  臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルでのＰＣＲ５％の電気泳動および１Ｘ  ＴｒｉｓアセテートＥＤＴＡ（ＴＡＥ；４０mM  Ｔｒｉｓ−アセテート、１mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）緩衝液中での泳動によって確認した。ＳＳＨクローン増幅インサート配列はそれぞれ、Genetic Microsystems 417cDNAアレイヤーロボットを使用して、シアリル化顕微鏡スライドガラス（ＧＡＰＳ  Ｃｏｒｎｉng）に付着させ、カスタムＨＣＣｃＤＮＡマイクロアレイを作成した。ｃＤＮＡインサートをスライドにスポットするプロトコルは、ｃＤＮＡ緩衝液の精製および調整なしでＰＣＲマイクロタイタープレートから直接スポットすることを除いて、Ｈｅｄｇｅらが発表したプロトコル（2000, Biotechniques 29: 548-560）に従った。ＳＳＨ  ｃＤＮＡクローンインサートに加えて、多数の対照ＤＮＡをハイブリダイゼーション反応の対照としてマイクロアレイにスポットした。更に、癌に関与することが以前報告された遺伝子に対応する公式に入手できるｃＤＮＡクローン約２０００個をGerman Genome Research Center(RZPD)から購入し、膨張、増幅させて、先に記載したようにこれらのマイクロアレイにスポットした。ハイブリダイゼーションプローブの作成では、更なるビ病態が確認された肝臓障害からの、および同じ量のプールされた罹患肝臓ＲＮＡからのＲＮＡ  ２０マイクログラムを、標準方法（Hedgeら, 2000, Biotechniques 29: 548-560）により、逆転写酵素を用いて、ｃｙ５−蛍光標識およびｃｙ３−蛍光標識ｃＤＮＡ（ｃｙ５−ＣＴＰおよびｃｙ３−ＣＴＰ、Pharmacia）にそれぞれ変換した。このプロトコルを使用して、これらの標識ｃＤＮＡをＨＣＣマイクロアレイに競合ハイブリダイズした。５Ｘ  ＳＣＣ（０．７５Ｍ  クエン酸ナトリウム、７５mM  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）；０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）中での４２℃における４５分間のプレハイブリダイゼーションの後、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳを含む緩衝液中で４２℃にてハイブリダイゼーションを一晩実施した。ハイブリダイズしたスライドは、ストリ��ジェントな条件（１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、４２℃にて２分間をそれぞれ２回；０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、室温にて４分間をそれぞれ２回；０．０５Ｘ  ＳＳＣ中で室温にて２分間をそれぞれ２回）で洗浄し、乾燥させ、製造者の勧告にしたがってGenetic Microsystems ４１８ｃＤＮＡマイクロアレイスキャナおよび付属のＩｍａｇｅｎｅ  ４．１画像分析ソフトウェアを用いて分析した。
【実施例３】
【０２６２】
本発明による核酸およびポリペプチドのディファレンシャル発現の独立した検証
ＲＮＡは、先に詳細に述べたようにヒト患者サンプルから分離した。この分析のＨＣＣサンプルは、ＨＣＣ  ＳＳＨライブラリーの作成に、またはｃＤＮＡマイクロアレイチップハイブリダイゼーションに利用したのと同じ患者からのものではない（上の実施例、表３Ａ／３Ｂ、４および図１）。非罹患肝臓組織での、本発明による核酸の発現を評価するために、ＨＣＣサンプルに加えて、独立した非罹患肝臓サンプルからＲＮＡを作成した。更に、他の正常ヒト組織および他のヒト癌での本発明による核酸の発現を評価するために、追加の非罹患および癌組織からＲＮＡを作成した。ＲＮＡ  １μgを、Superscript逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（それぞれ０．４mM）、７．５nM  ランダム６−ヌクレオチドプライマー（ヘキサマー）、１０mM  ジチオスレイトール、およびＲＮＡｓｅインヒビター１単位の中で当業界で既知の標準手順を用いて、一本鎖ｃＤＮＡに変換した（Sambrookら, Molecular Cloning, 2nded., 1989, Cold Spring Harbor Press, NY, USA, 5.52〜5.55頁）。そして本発明による核酸の存在または非存在は、ＰＣＲ実験において、本発明による各核酸に特異的なプライマー対を用いたｃＤＮＡからのこれらの配列の増幅により判定した。この分析に使用したプライマーを以下の表９に与える。
【０２６３】
【表９】
2006500074.tif 000016
【０２６４】
これらのプライマーは、本発明による障害の診断にも利用できるが、当業者は、所与の本発明による核酸に特異的な他のプライマーを設計してもよい。ＰＣＲは、ｃＤＮＡ  ０．５％、１Ｘ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液、２．５mM  ＭｇＣｌ２、３７．５nM  各プライマー、０．５mM  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰのそれぞれおよび１．５単位  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）を含んでいた。ＰＣＲ条件は、各プライマー対について必要に応じて最適化して、通例：９４℃で３分間、続いて９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間を３０サイクルで、次に４℃に冷却した。ｃＤＮＡインサートの増幅は、０．５μg/ml臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルでのＰＣＲ５〜１０％の電気泳動および１Ｘ  ＴｒｉｓアセテートＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液中での泳動によって確認した。ｃＤＮＡ合成前のサンプルのＲＮＡｓｅ処置を含むＲＴ−ＰＣＲの標準対照および逆転写酵素の省略は、これらの反応の特異性を決まって証明した。反応は、正しい分子サイズの別個のバンドがゲルに認められたかどうかに基づいて、発現（＋）または発現の非存在（−）について評価した。これらの条件下での非常に微弱な、または不明瞭なバンドは、（＋／−）で評価した。ＨＣＣおよび非罹患肝臓でのこれらの検証研究の概要を表６に与える。独立したＨＣＣおよび非罹患肝臓サンプルのこれらの分析を示すデータを図３に与える。
【０２６５】
定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）は、非罹患肝臓に対する、肝臓癌および他の肝臓障害での本発明による配列の過剰発現も検証した。これらの研究では、実施例５で詳細に説明し、図２および６に示した、ＴａｑＭａｎ加水分解プライマー方法およびＳＹＢＲグリーンインタカレート染料方法を利用した。
【０２６６】
本発明による核酸のディファレンシャル発現の追加の独立した検証を図４に示す。この場合、２つのＨＣＣサンプルから、および非罹患肝臓からのＲＮＡ  １５μgに、２．２Ｍ  ホルムアルデヒドおよび１Ｘ  ＭＯＰＳ緩衝液（１０mM  ４−モルホリンプロパンスルホン酸、１mM  ＥＤＴＡ、５mM  酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を含む１％アガロースゲルでの変性電気泳動分離を受けさせ、１Ｘ  ＭＯＰＳ緩衝液中で泳動させた。サイズ分画変性ＲＮＡを、すべて当業者に周知の手順にしたがって、ＲＮＡ（ノーザン）ブロット技法を用いてナイロン膜（Gene Screen、New England Nuclear）に移して、ＵＶ光を用いて膜に架橋した（Sambrookら, Molecular Cloning, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, NY, Press, NY, USA, 7.39〜7.52頁）。ＯＢｃｌｌおよびＯＢｃｌ５（配列番号１０および１１）のＳＳＨクローンからのｃＤＮＡクローンインサートは、前の実施例に記載したようにＰＣＲ増幅によって分離した。これらの配列に対応する一本鎖放射性標識ＲＮＡプローブは、このテンプレートから、ＳＰ６およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、１Ｘ標識緩衝液（０．５mM  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、１０mM  ジチオスレイトール、および適切なＲＮＡポリメラーゼ２０単位）中、α３２Ｐ−ＵＴＰの存在下で、３７℃にて３５分間に渡って合成した。生じたアンチセンスプローブは、対応するｍＲＮＡ配列に対して相補性であり、それゆえノザンブロットでｍＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズすることが予想される。反対にセンスプローブ配列は、ｍＲＮＡのそれと一致し、それによりｍＲＮＡにハイブリダイズしない。同一のノザンブロットは、２５０mM  第一リン酸ナトリウム、２５０mM  第二リン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、１mM  ＥＤＴＡおよび１％  ＢＳＡの１５ml中で、６８℃にて少なくとも３０分間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションでは、プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去して、先に記載したセンスおよび各アンチセンスＲＮＡプローブを含む同じ緩衝液１０mlと、６８℃にて一晩交換した。ＲＮＡブロットをストリンジェント条件（それぞれ室温にて１５分間、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回；それぞれ６８℃にて１０分間、１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回）下で洗浄し、乾燥させて、Ｘ線フィルムに暴露させてオートラジオグラフを作成した。図４に示すように、各アンチセンスプローブは別個のＨＣＣ  ＲＮＡに特異的にハイブリダイズするが、非罹患肝臓ＲＮＡにはごく弱くハイブリダイズするか、全くハイブリダイズしない。これらの結果の特異性は、ＯＢｃｌｌおよびＯＢｃＩ５の両方の対応するセンスプローブからの特異的シグナルの非存在によって示される。加えて、異なる分子量のＲＮＡは、ＯＢｃｌｌアンチセンスプローブによって明らかである。この結果は大抵、恐らく別のスプライシングによって作成された別個のｍＲＮＡ種を示す。これらの種は、この配列に対応する複数の異なるサイズのｃＤＮＡクローンが、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースで報告されるという発見に基づいて予想される。
【０２６７】
更にインサイチューハイブリダイゼーションは、ＮＮＬ組織サンプルと比較したときに、ＨＣＣにおける強力なＯＢｃｌ５  ＲＮＡ発現を明らかにする。Ｓ３５−標識プローブは、Fickertら（Am J Pathol.2002 Feb; 160(2): 491-9.）のプロトコルによって、ＲＮＡブロットに対して上述されたように合成する。インビトロ転写のテンプレートは、ＯＢｃｌ５  ３’ｃＤＮＡを含むプラスミドから増幅する。インビトロ転写テンプレートを作成するために利用したプライマー（MWG Biotech, Munich, Germany）は、両方のエクソン（ヌクレオチド９５〜４８４からの配列番号１１）を含むＯＢｃｌ５  ＲＮＡの３６５塩基に及ぶＴ７アンチセンスプローブのための、ＯＢｃｌ５−ｐ６フォワードプライマー（５’−ａａｔｃｔｇｃａａｇｃｃａｇｇａａｇａｇｔ−３’、配列番号４８）およびＭ１３ｆｏｒ（５’−ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇ−３’、配列番号２０）；および両方のエクソン（ヌクレオチド４３６〜１からの配列番号１１）を含むＯＢｃｌ５配列の４３６塩基に及ぶＳＰ６センスプローブのための、Ｍ１３ｒｅｖ（５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ−３’、配列番号２１）およびＯＢｃｌ５−ｐ７リバースプライマー（５’−ｔｃｔａｇｔｔｔｃａｇｔｔｔｔｇａｔｇａｔａｔｔｔｔｇ−３’、配列番号４９）である。これらのテンプレートＰＣＲを増幅するために、１０pM  フォワードプライマー、１０pM  リバースプライマー、１pM  ｄＮＴＰ（Invitrogen）、ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、５mM  ＭｇＣｌ２（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）、テンプレートプラスミドＤＮＡ  ２１７ng、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ  ２．５単位（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）を含むＰＣＲを、Applied Biosystems Gene Amp PCRシステム２７０を用いて、通例：９４℃にて３分間、９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて５０秒間で実施し、最後の工程を２５回反復し、続いて７２℃にて３分間、次に最終伸長を加えた。ＰＣＲ生成物中のＤＮＡの量は、Smart Spec 3000（ＢＩＯ−ＲＡＤ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて分光分析によって決定した。インビトロ転写アッセイは、各テンプレート２００ngを用いて、転写緩衝液（Boehringer Mannheim、ドイツ）、１００mM  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、それぞれ１mMのｒＮＴＰ、ＲＮＡｓｅインヒビター（Eppendorf、ドイツ、ハンブルク）、α−Ｓ３５−ＵＴＰ（Amersham Bioscience）、ＲＮＡポリメラーゼＳＰ６／Ｔ７（Boehringer Mannheim）の中で、３７℃にて２時間実施した。非組込みヌクレオチドの除去後（ＲＮＡｓｅフリーＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−２００ＨＲカラム、Amersham Bioscience、英国バッキンガムシャー）、テンプレートＤＮＡは、ＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅ  ２単位を用いて３７℃にて１０分間消化した。平均プローブサイズを得るために、加水分解緩衝液（４００mM  ＮａＨＣＯ３、６００mM  Ｎａ２ＣＯ３、１００mM  ＤＴＴ）を使用して、１５０bp加水分解を６０℃にて４２分間実施し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、１０mM  ＤＴＴおよび１％氷酢酸中で中和した。転写プローブは、ＬｉＣｌ／イソプロパノールによって沈殿させ、２５mM  ＤＴＴを含む５０％ホルムアミド中で再懸濁させた。ＨＣＣおよび非腫瘍性正常肝臓切片のパラフィン埋め込み組織学的検証サンプルをＭｉｃｒｏｍ  ＨＭ  ３５５Ｓ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Microm、ドイツ、ウォルドーフ）によって２．５マイクロメートルに切断し、スライド当たり２個の切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライド（Menzel-Glaser、ドイツ、ブラウンシュワイク）に載せた。すべての切片を一晩乾燥させた。乾燥切片を６０℃にて１時間加熱し、キシレン中で３０分間脱パラフィンした。１００％、９０％、７０％および５０％の勾配エタノール中で再水和を行い、続いてＴｒｉｓ緩衝液塩水（ＴＢＳ緩衝液）中で３分間の洗浄を４回行い、次に切片を４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ緩衝液）中で固定した。数回のＰＢＳ洗浄の後、切片を０．２Ｍ  ＨＣｌ中で１０分間変性させ、ＴＢＳ中で再度、３分間ずつ４回洗浄した。タンパク質消化は、ＣａＣ１２  ２mMを含むＴＢＳ中の、ＲＮＡｓｅフリープロテイナーゼＫ（F.Hoffman La Roche Ltd.スイス、バーゼル）中で、３７℃にて２０分間実施した。反応は、４℃のＴＢＳ中での５分間のスライドのインキュベーションにより停止させた。続いて切片を再度、室温にてＴＢＳ緩衝液中で４分間、３回洗浄し、無水酢酸を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８で１０分間インキュベートした。切片を５０％、７０％、９０％、１００％の勾配エタノール、最後にクロロホルムで脱水し、２時間空気乾燥させた。ハイブリダイゼーションでは、標識プローブ（切片当たり１×１０６ｃｐｍ；ＬＫＢＷａｌｌａｃ、１２１１  ＲＡＣＫＢＥＴＡ液体シンチレーションカウンタによって決定したプローブ放射能を、１２．５mM  ホスフェート緩衝液、ｐＨ６．８、１２．５mM  Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、１．２５ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、５０％ホルムアミド、１２．５％硫酸デキストラン、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１００nM  Ｓ−ｒＡＴＰ（Boehringer Mannheim）、酵母ｔＲＮＡ  ６０ng、およびポリ（Ａ）（Boehringer Mannheim）２０ngを含む、５０μl／切片のハイブリダイゼーション緩衝液で希釈した。切片は、２ｘ標準クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）、ｐＨ７、および５０％ホルムアミドを含む湿潤チャンバ内で、５２℃にて一晩ハイブリダイズした。次に、切片をホルムアミド緩衝液（１０mM  リン酸緩衝液、ｐＨ６．８、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、０．１ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、０．０７％β−メルカプトエタノール、および５０％ホルムアミド）で２回、それぞれ１時間および２時間洗浄した。その後、切片を１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡおよび０．０７％β−メルカプトエタノール中で１５分間、２回洗浄した。ＲＮＡｓｅ処理は、２０μg/ml  ＲＮＡｓｅ  Ａ（Boehringer Mannheim）を含む同じ緩衝液中で、３８℃にて３０分間実施し、ホルムアミド洗浄緩衝液を用いた更なる洗浄を３７℃にて一晩続けた。切片は続いて、２ｘＳＳＣおよび０．０７β−メルカプトエタノール中で４５℃にて３０分間洗浄し、０．１ｘＳＳＣおよび０．０７β−メルカプトエタノール中で４５℃にて更に３０分間洗浄した。その後、切片を５０％、７０％、９０％、１００％の勾配エタノール中で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドをＩｌｆｏｒｄ  Ｋ２フォトエマルジョン（Ilford Ltd. Mobberly、英国チェシャー）でコーティングした。露出１０、１４および１７日後、ＫｏｄａｋＤ  １９現像機（Eastman Kodak、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて現像を実施した。切片をヘマトキシリンによって対比染色し、水性封入剤に封入した（Aquatex-EM Science、ニュージャージー州ギブズタウン）。暗点を現像すると、エマルジョンからの銀粒子は、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを示す（図５）。相補性センスプローブは、アンチセンスプローブへの化学的類似性にもかかわらず、インサイチューでＯＢｃｌ５  ＲＮＡにハイブリダイズできない。したがってセンスプローブは、バックグラウンドシグナルのみが検出される負の対照（図５、パネルＡおよびＣ）として作用する。ＯＢｃｌ５  ＲＮＡはＮＮＬではわずかに検出され（図５に示す、パネルＢ）、ＨＣＣでは、多数の銀粒子スポットによって証明されるように、インサイチューで明確に示されている（図５、パネルＤ。
【０２６８】
更にタンパク質発現分析は、例えばＤＡＰ３タンパク質、すなわちＨＣＣ中で特異的にアップレギュレートされたＤＡＰ３ｍＲＮＡの機能生成物も、ＨＣＣでは高度に過剰発現されることを示す。各種組織でのＤＡＰ３タンパク質発現を検出するために、凍結組織（液体窒素中に保管）に由来するタンパク質抽出物を使用して、標準ウェスタンブロット分析を実施した、図７を参照。冷凍マイクロトーム（cyrocut, Leica CM3050）を使用して、切片５０μｍ（ＨＣＣ、正常肝臓および各種器官サンプル）を得て、検査中の組織の同一性および均一性は、各切断工程の間および後に、以前に採取したＨ＆Ｅ染色によって検証した。組織切片を２μg/ml  ロイペプチン、２μg/ml  ペプスタチン、２μg/ml  アプロチニン、１mM  フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）、および２mM  ジチオスレイトールを添加した氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０mM  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコール酸塩、１％ＮＰ−４０）中に再懸濁させ、氷上での超音波処理（５秒の２バースト）による均質化を続けた。氷上での２０分間のインキュベーションの後、溶解物を１３０００rpmで４℃にて１５分間、微量遠心機内で２回の遠心分離工程によって清澄にし、上澄を収集した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として用いて、Bradfordアッセイ（Biorad）によって決定した。等量のタンパク質（通例１０〜３０μg）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、Semidryブロッティング（ＴＥ７０，Amersham）により、ポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜（Hybond-P、Amersham）に電気泳動によって移した。膜は遮断溶液［ＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７mM  ＮａＣｌ、３mM  ＫＣｌ）中の５％ミルク］中で室温にて１時間遮断し、一次抗体溶液（ＴＢＳ−Ｔ／１％ミルク中で調製）によって、４℃にて一晩攪拌しながらインキュベートした。以下の抗体に対して特異性である抗体を使用した：ＤＡＰ３（１：１０００；ＢＤ  Transduction Laboratories）、およびβ−アクチン（１：５０００，Ｓｉｇｍａ）。一次抗体溶液の除去およびＴＢＳ−Ｔ中での複数回の洗浄の後、膜は、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）結合二次抗体（ウサギ抗マウス、１：１０００；Ｄａｋｏ）を用いて、室温にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ中での複数回の洗浄の後、化学発光（ＥＣＬ，Amersham）およびＸ線フィルムへの暴露によって検出を実施した（図７）。バンドの強度は、ChemiImager 5500ソフトウェア（Alpha Innotech）を用いて濃度測定によって分析し、各シグナルは、対応するβ−アクチンシグナルの強度に正規化した（表８）。
【０２６９】
これらのデータは、ＨＣＣにおける本発明による核酸およびポリペプチドの調節解除発現の独立した検証を与える。本発明による核酸およびポリペプチドの発現は、非罹患肝臓において存在するか、非常に低いレベルでのみ観測され、それによりｃＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって確認されたこれらの核酸のディファレンシャル発現を検証する。結果は、本発明による核酸およびポリペプチドを用いて、本発明による障害を診断、防止、および／または処置できるという、驚くべき証拠を与える。
【実施例４】
【０２７０】
肝臓癌（ヘパトーマ）細胞系の増殖において増加される、本発明による配列
ヒト肝臓癌細胞系（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ）は、５％ＣＯ２を含む湿潤インキュベータ内で３７℃にて、０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。細胞を約２０％コンフルエントまで分裂させ、続いて血清の非存在下で３日間培養することによって静止させた。飢餓期間の後、培地に１０％ＦＢＳを添加することによって細胞を刺激して増殖させた。ＲＮＡの作成およびＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）分析による細胞サイクルにおける細胞の位置の決定のために、細胞増殖の誘発の前および後（０、８および１２時間）に、サンプルを採取した。したがって、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって細胞サイクル分布を判定するために、細胞をトリプシン処理によって採取し、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、最後にＰＢＳ  ５００μl中で再懸濁させた。続いて、予備冷却メタノール５mlを添加した。−２０℃での１０分間のインキュベーションの後、細胞懸濁物をＰＢＳ中での３回の洗浄後にＦＡＣＳ分析に直接使用して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色緩衝液（DNA-Prep Stain, Part No. 6604452; Beckman Coulter）  ５００μl中で再懸濁させ、３７℃にて１５分間インキュベートした。最後に、１Ｍ  ＮａＣｌ  ７０μlを添加し、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメータ（Beckman Coulter）での分析前に、サンプルは光を遮断して氷上で保管した。非同期細胞集団から調製した細胞を参照として使用した。
【０２７１】
分離ＲＮＡを使用して、静止対増殖肝臓癌細胞における遺伝子の発現をｃＤＮＡマイクロアレイ分析によって監視した。実施例２に記載したような蛍光染料による標識の後、ＲＮＡを、細胞サイクル依存方法で発現されることが既知である対照遺伝子も含有する、特別に開発されたＨＣＣ特異的ｃＤＮＡマイクロアレイチップ上でハイブリダイズした。最後に、ＩｍａＧｅｎｅ  ４．１およびＧｅｎｅＳｉｇｈｔソフトウェアパッケージを使用してデータを解析した。血清の添加前に分離した０時間サンプルで得られたシグナルを参照として使用した。ｃＤＮＡ実験読み取り値からの血清刺激対静止発現値のｌｏｇ２変換比を図８に与える。
【０２７２】
これらのデータは、本発明による配列がヒト肝臓腫瘍細胞増殖と相関していることを示す。最先端と比較すると、これらの核酸およびポリペプチドはしたがって驚くべきことに、肝臓障害および／または上皮癌の改良された、より感受性の高い、より早期の、より高速な、および／または非侵襲性の診断を可能にする。
【実施例５】
【０２７３】
肝臓障害、特に肝臓癌における、本発明による配列の発現増加に関する機能的に重要な役割
詳細な配列分析は、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡと真核非コード化ＲＮＡとの間の配列類似性を明らかにした。加えて、このＲＮＡからタンパク質生成物を検出するための多様な方法を用いた複数の試みは、このような生成物を明らかにしていない。したがってこのＲＮＡは、ポリペプチド内に翻訳されないが、それ自体機能（例えば調節）特性を有する。TransMessenger Transfection Reagent Handbook(Qiagen, 10/2002）によるプロトコルを使用すると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを用いたヒト肝臓癌細胞の増殖におけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡのレベルの低下（ＯＢｃｌ５  ＲＮＡのｓｉＲＮＡ仲介ノックダウン）が行われる。二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドプローブ（表１０）は、ＯＢｃｌ５に対応するＲＮＡレベルのインサイチュー欠乏に対して設計され（配列番号１１）、Ｑｉａｇｅｎが提供している。
【０２７４】
【表１０】
2006500074.tif 000017
［＊これらのｓｉＲＮＡリボオリゴヌクレオチドに関する付随情報において、これらのリストでリボヌクレオチド／デオキシリボヌクレオチドキメラ分子を明示することはできないため、配列番号と共に示した配列は、各配列末端に２個の３’デオキシリボヌクレオチド（ｄＴＴ）「テール」を含まない。］
【０２７５】
ＨｅｐＧ２細胞（ウェル当たり３×ｌ０４細胞の密度）を播種して、３７℃にて２４時間インキュベートし、Oligofectamine試薬(Invitrogen）１．５μlおよび２０μＭ二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドストック溶液２．５μlを用いて製造者の説明（Invitrogenプロトコル）にしたがって形質移入した。インキュベーション２４時間後、全ＲＮＡを分離し、実施例２に記載したようなｃＤＮＡに逆転写した。したがってＰＣＲ生成物は、蛍光標識プライマーまたはＴａｑｍａｎプローブ加水分解系およびＳＹＢＲグリーンなどの蛍光二本鎖ＤＮＡインタカレート分子を含む、各種の蛍光ベースインジケータの包含によって監視した。実験は、製造者の説明  （ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）；5700 Sequence detection System, User Manual; PE Biosystems）にしたがって実施した。したがって、ＴａｑＭａｎ方法に基づくリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を、5700 Sequence Detection System(Applera）を用いて以下のように実施した：全ＲＮＡ  ５００ngを実施例３に記載したように実施し、最終体積３０μl中に各プライマー５〜８pmol/μlを含む、このｃＤＮＡテンプレートの１：４希釈をＱ−ＰＣＲに使用した（ＲＮＡ  ６．２５ngに相当）。Ｑ−ＰＣＲの温度は、４０サイクルを用いて製造者の説明にしたがって使用した。３通りの反応を実施した。
【０２７６】
ＳＹＢＲグリーン方法に基づくリアルタイムＱ−ＰＣＲ分析は、7000 Sequence Detection System(Applera）を用いて実施した。ＰＣＲは、先に記載したようにＲＮＡ  ６．２５ngに相当するｃＤＮＡを使用して、SYBR-Green Universal PCR Master Mix(Applera）によって実施し、最終体積３０μl中の各プライマー（ＲＢおよびβ−アクチン、反応サンプル中各プライマー１０pmol）の量を、製造者の説明にしたがって経験的に決定した。ＳＹＢＲ−ＲＴ−ＰＣＲの温度は、取扱説明書にしたがって使用した。これらの反応も、４０回サイクルさせ、３通りの反応を実施した。標的ＲＮＡレベル（この場合、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡ）のノックダウンのパーセンテージは、先に記載したように、ＴａｑＭａｎベース（使用したＧＡＰＤＨプライマー＝ＧＡＰＤＨ−ｐｌ、配列番号５６；ＧＡＰＤＨ−Ｐ２、配列番号５７；ＧＡＰＤＨ−ｐ３、配列番号５８）（使用したβ−アクチンプライマー＝ｂＡｃｔｉｎ−ｐｌ、配列番号５９；ｂＡｃｔｉｎ−ｐ２、配列番号６０；ｂＡｃｔｉｎ−ｐ３、配列番号６１）またはＳＹＢＲグリーン分析（ＳＹＢＲグリーン分析の参照として、使用したβ−アクチンプライマー＝ｂＡｃｔｉｎ−ｐ４、配列番号６２；ｂＡｃｔｉｎ−ｐ５、配列番号６３）のどちらかにおいて、参照としてのＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンｍＲＮＡレベルの並行Ｑ−ＰＣＲ決定を使用して、Ｑ−ＰＣＲによって決定した。ＲＮＡレベルの変化は、Pfaffl(Nucleic Acids Research(2001) May 1, 29(9): e45）に記載された方法にしたがって決定した。
【０２７７】
ＯＢｃｌ５  ＲＮＡのレベルがヘパトーマ細胞においてノックダウンされるこのような実験において、腫瘍サプレッサ遺伝子網膜芽細胞腫タンパク質１（ＲＢ１）をコード化するｍＲＮＡのレベルが、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡのレベルの低下時に、用量依存方式で数倍にアップレギュレートされることが判定された（図６）（使用したＲＢ１  Ｑ−ＰＣＲプライマー＝ＲＢ１−ｐ１、配列番号６４；ＲＢ１−ｐ２、配列番号６５）。明らかな結論は、ＨＣＣでのＯＢｃｌ５  ＲＮＡの発現増加がＲＢ１の負の調節を与え、したがって腫瘍細胞増殖を促進することである。それゆえｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた、増殖するヒト肝臓癌細胞におけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡのレベルの低下（ノックダウン）は、肝臓障害、特に肝臓癌におけるＯＢｃｌ５  ＲＮＡの発現増加のために機能的に重要な役割を裏付けている。
【０２７８】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、肝臓癌細胞においてＤＡＰ３ｍＲＮＡ（配列番号１４）をノックダウンするよう設計された、更なるこのような実験は、驚くべき形態的効果を与えた（ＤＡＰ３  ｓｉＲＮＡノックダウン研究に使用したオリゴ配列は、表１０に与えた）。他のｓｉＲＮＡオリゴを利用したことを除いて完全に同じように処置した細胞（スクランブル配列ｓｉＲＮＡオリゴ対照など）ではなく、ＤＡＰ３  ｓｉＲＮＡオリゴ処置細胞において、細胞体積の増大などを含む、細胞形態の実質的な変化が見られた。これらの処置細胞は、培養基質に対して付着性を維持していたが、ＲＮＡおよびタンパク質は、これらの実施例に記載した標準方法を使用してこのような処置細胞から抽出できないことが更に認められた。同時に完全に同じように処置した肝臓癌細胞における、同様のｓｉＲＮＡオリゴ処置を用いたこのような効果の欠如は、これらの観察が肝臓癌細胞でのＤＡＰ３  ｍＲＮＡレベルのノックダウンに特異的であることを示している。したがってＤＡＰ３  ｍＲＮＡの過剰発現は、肝臓癌細胞の生存性に不可欠である。これらの観察は、更に、肝臓腫瘍細胞におけるＤＡＰ３に関する機能上重要な役割を裏付けている。
【０２７９】
これらの結果は、更に、本発明による核酸および／またはポリペプチドを使用して、本発明による障害を診断、防止、および／または処置できるという驚くべき証拠を提供する。
【実施例６】
【０２８０】
ＨＣＣ特異的プローブを使用する診断方法
好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく、本発明による障害の診断方法を確立することができる。本発明の核酸配列の標準ＰＣＲ検出は、例えば患者の血流で循環するＨＣＣ腫瘍細胞を十分に同定することができる。しかしながら細針生検などからの、腫瘍生検物質における本発明の核酸配列の発現の検出も、この診断手順のための好ましい指標である。本発明の核酸配列、ＯＢｃｌ５（配列番号１１）は、例えば、大半の非罹患組織では検出されず、例えばＨＣＣにおいて比較的特異的に発現される。肝臓疾患のディファレンシャル診断へのこのようなアプローチの潜在的な識別力を示す、肝硬変およびＨＣＣにおけるこの核酸の発現増加も証明されている（図１、２、５および表５Ａ／Ｂ）。
【０２８１】
ＰＣＲ診断は、好ましくは、患者の物質から分離されたＲＮＡを約１pg、好ましくは少なくとも１００ng、更に好ましくは少なくとも１μg必要とする。好ましい利用において、ＲＮＡは、最小限の侵襲性静脈穿刺手順によって得た循環血からの、好ましくは白血球画分から標準手順にしたがって分離される。この好ましい場合では、手順は、血液循環系におけるＨＣＣ腫瘍細胞の存在を検出する。ＲＮＡは、肝臓生検物質から同様に分離できる。
【０２８２】
例えばＯＢｃｌ５の特異的検出では、ＰＣＲ診断は、患者サンプルから産生されたＲＮＡからのｃＤＮＡ合成のための特異的アンチセンスプライマー（プライマーＯＢｃｌ５−ｐｌ；５’−ＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＡＡＴＴＴＧ−３’；配列番号４２；配列番号１１のヌクレオチド３５０−３２７から）を含む、ＯＢｃｌ５核酸配列に特異的な複数のプライマーを含む。同様に、例えばＯＢｃｌ５−ｐ２（５’−ＡＧＧＡＡＧＡＧＴＣＧＴＣＡＣＧＡＧＡＡＣＣ−３’；配列番号４３；配列番号１１のヌクレオチド１０７〜１２８から）およびＯＢｃｌ５−ｐ３（５’−ＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＴＡＴＴＧＣＣ−３’；配列番号４４；配列番号１１のヌクレオチド３１３〜２８９から）などの特異的ＰＣＲプライマー。感受性、特異性、および品質管理は、ＯＢｃｌ５核酸インサートに対して特異的であり、およびプライマーＯＢｃｌ５−ｐ２および−ｐ３の内側（入れ子）である、追加のプライマーセット（例えば：ＯＢｃｌ５−ｐ４；５’−ＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＴＣ−３’；配列番号４５；配列番号１１のヌクレオチド１４７〜１６７から、およびＯＢｃｌ５−ｐ５；５’−ＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’；配列番号４６；配列番号１１のヌクレオチド２８０〜２６１から）の提供によって改良される。ＯＢｃｌ５  ｍＲＮＡレベルの定量評価も、ＴａｑＭａｎ  Ｑ−ＰＣＲを使用して、例えば：
ＯＢｃｌ５−８、配列番号６６（５’−ＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＣ−３’）；ＯＢｃｌ５−ｐ９、配列番号６７（５’−ＣＴＴＧＣＴＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴ−３’）；およびＯＢｃｌ５−ｐ１０、配列番号６８、（５’−ＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣ−３’）によって、図２に示すようにこのような検出方法で実施できる。
【０２８３】
ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡによる潜在的な汚染を除去するための、ＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅ−１（Roche）によるＲＮＡの消化の後に、患者ＲＮＡサンプルから作成した。この汚染の可能性は、ゲノムＤＮＡテンプレートから生じる（およびそれによりＯＢｃｌ５に対応するｍＲＮＡの発現を反映しない）ＰＣＲ生成物が、ＲＮＡ特異的ＰＣＲ生成物より大であるため、ＯＢｃｌ５遺伝子の異なるエクソンの配列からのＰＣＲ増幅用プライマーを含めることによって更に制御される。ｃＤＮＡ合成は、例えば、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６mM  ＭｇＣ１２、４０mM  ＫＣ１、および１０mM  ジチオスレイトール、ｐＨ  ８．５などの適切な緩衝液中にて、ＯＢｃｌ５特異的ＯＢｃｌ５−ｐｌ（約１μＭにて）によって、逆転写酵素［約２単位／反応でのＭａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Roche）など］を用いて初回刺激することができる。ｃＤＮＡ合成反応においては、それぞれ約１mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、約１〜１０単位／反応の胎盤ＲＮＡｓｅインヒビタ（Roche）などのＲＮＡｓｅインヒビタも必要である。ｃＤＮＡ合成は、好ましくは４２℃にて３０〜６０分間実施し、続いて９５℃にて１０分間加熱してＲＮＡテンプレートを変性させた。得られたｃＤＮＡは、血液（または肝臓生検サンプル）中でＯＢｃｌ５を検出するために、ＰＣＲのテンプレートとして利用できる。１０Ｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（５００mM  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．３、２５mM  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）；最終濃度がそれぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応）、およびＯＢｃｌ５−ｐ２、ＯＢｃｌ５−ｐ３、ＯＢｃｌ５−ｐ４、およびＯＢｃｌ５−ｐ５などのＯＢｃｌ５特異的プライマー（０．１〜１μＭ最終濃度）を含む、ＯＢｃｌ５のＰＣＲ検出に必要な追加試薬も、好ましくは提供される。例えばＯＢｃｌ５配列インサートを備えたＤＮＡなどの、ＰＣＲ増幅の正の対照も好ましくは含まれる（１〜１０ng／反応）。ＰＣＲは、例えば、９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて６０秒間の２２〜４０サイクルに渡って実施できる。先に示したように、好ましい追加の感受性および特異性は、元のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅した配列内に位置する追加のＯＢｃｌ５プライマーセットの利用によって、この診断手順で達成される。この場合、第一のＰＣＲ反応で利用された条件に似た条件下での続いてのＰＣＲは、好ましくはプライマーＯＢｃｌＳ−ｐ４およびＯＢｃｌ５−ｐ５を除いて、テンプレートＤＮＡとして第一のＰＣＲ  １〜１０μlを含む反応物中で入れ子配列を増幅するために利用された。あるいは、反応は、好ましくは、第一のプライマーセット（ＯＢｃｌ５−ｐ２およびＯＢｃｌ５−ｐ３）を用いて１０〜１５サイクル実施され、その後、次にこの反応物の１〜１０μlをテンプレートとして、プライマーｓＯＢｃｌ５−ｐ４およびＯＢｃｌ５−ｐ５（および含まれるすべての必要なＰＣＲ成分）と共に新たなＰＣＲ反応物中に含ませた。ＯＢｃｌ５特異的ＰＣＲ生成物の検出は、好ましくは、当業界で既知であり、前の実施例に記載したアガロースゲル電気泳動を利用した。診断には、このようなＰＣＲベースの診断試験のための対照として、好ましくは比較可能な体液または組織抽出物が含まれるべきである。これは、非罹患者からの血清または血漿および／または適切な動物モデルからの血清、血漿または組織抽出物を含みうる。プライマーＯＢｃｌＳ−ｐ４およびＯＢｃｌ５−ｐ５との反応の生成物などの、本発明による核酸のＰＣＲによって決定された発現が、対照に対して、患者から分離されたサンプル中でアップレギュレートされた場合、そして特にアップレギュレートされた発現が本質的に、図１に示したような障害特異的（平均）発現比に一致する場合、このような一致は、障害を患う患者を示す。
【０２８４】
この手法の変形も評価できる。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、RocheによるTitan one-tubeまたはCarboxydothermus  ＤＮＡポリメラーゼｏｎｅ−ｓｅｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステムによって提供されるような逆転写酵素活性と共に利用して、単一の反応容器内で連続的にまたは同時に実施できる。あるいはＰＣＲ生成物は、蛍光標識プライマーまたはＴａｑｍａｎプローブ加水分解系を含むＰＣＲ生成物の各種の蛍光ベースインジケータの包含によって、先に記載したようにＳＹＢＲグリーンなどの蛍光二本鎖ＤＮＡインターカレート分子を用いて監視することができる。ＰＣＲ生成物の蓄積は、本発明による核酸の発現の感受性定量評価を達成するために連続的に監視できるため、蛍光ベース手法は利点を与える。このことは、本発明による障害の血液または組織で上昇したが、非罹患患者および組織においてもより低いレベル存在する核酸で特に有利であるため、核酸の発現のレベルに関する定量情報が得られる。更にこの実施例と同様に、核酸発現レベルの正確な定量は、例えば肝硬変とＨＣＣとの間のディファレンシャル診断に寄与する。このデータと、疾患および疾患不在を示す提供された標準との比較は、このような診断手順に関する重要な利点を提供する。
【０２８５】
この診断方法の追加の変形は、本発明による複数の核酸および／または本発明による核酸の、障害に関与する他の核酸との同時検出を含む。更なる本発明による核酸のハイブリダイゼーションベースの診断検知も考えられる。この場合、好ましくはＲＮＡブロット、ＲＮＡｓｅ保護または患者細胞または組織生検サンプルへのインサイチューハイブリダイゼーションを利用するｍＲＮＡ検出も有効である。
【０２８６】
同様の方法およびその変形によって、本発明による核酸は、および／または本発明による核酸は他の核酸と共に、本発明による障害の診断に利用できる。
【実施例７】
【０２８７】
本発明によるポリペプチドの抗体検出による診断方法
本発明による障害の好ましい診断方法は、本発明によるポリペプチドに対して作成された抗体に基づく。例えば診断手順は、好ましくは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイによる、特異的にアップレギュレートされた遺伝子タンパク質の血清検出を利用する。簡単な形式では、診断アッセイは、好ましくは、ＯＢｃｌＳ．ｐｒ（配列番号２）またはＤＡＰ３（配列番号５）などの本発明によるポリペプチドに対して特異的な分離および精製された抗体によって完全にコーティングされた、マイクロタイタープレートまたはマイクロタイターウェルのストリップを含む。例えば抗体は、一般に例えばウサギで産生されるなどのアフィニティ精製ポリクローナル抗体、または当業界で確立された手順にしたがって一般にマウスで産生されるなどの精製モノクローナル抗体でもよい（Cooper, H.M.& Paterson, Y., (2000), In Current Protocols in Molecular Biology(Ansubel, F.A.ら, 編)11.12.1〜11.12.9頁, Greene Publ.& Wiley Intersci., NY); (Fuller S.A.ら, (1992), In Current Protocols in Molecular Biology(Ansubel, F.A.ら, 編)11.4.1〜11.9.3頁, Greene Publ.& Wiley Intersci., NY)。好ましくは抗体は、Knappikら(2000, J.Molec.Biol.296: 57-86)またはChaddおよびChamow(2001 Curr.Opin.Biotechnol.12: 188-94）に記載されているように、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー・パニングおよび精製から得た組換え抗体またはその断片でもよい。抗体コーティングは、好ましくは、リン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）などの標準コーティング溶液中の、１〜１００μg/mlの抗ＯＢｃｌ５．ｐｒ抗体または抗ＤＡＰ３．ｐｒ抗体の希釈物によって実現される。抗体は、好ましくは、マイクロタイターウェル（Nunc Maxisorp immunoplateなど）の吸収性表面に３７℃にて６０分間、あるいは室温または４℃にて一晩結合させた。コーティングしたウェルにサンプルを結合させる前に、ウェルは、好ましくは、リン酸緩衝液食塩水中の５％ウシ血清アルブミンまたは同じ緩衝液中で再懸濁させた５％脱脂粉乳などの濃縮タンパク質溶液中での、室温にて１５〜６０分間のインキュベートによって、非特異的結合を完全に遮断した。次に、好ましくは患者サンプル物質をマイクロタイターウェルに塗布して、遮断溶液中に希釈させて、検出の特異性を上昇させた。サンプルは、例えば、当業界で周知の方法にしたがって調製した、組織生検または外科的切除物からの血漿または血清またはタンパク質抽出物である（Smith, J.A.(2001)In, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.A.ら, 編)10.0.1〜10.0.23頁, Greene Publ.& Wiley Intersci., NY）。特に患者サンプルは、室温または４℃にて抗体コーティングウェルに３０−１２０分間（またはそれ以上）接触させた。非特異的相互作用タンパク質は、好ましくは、例えば０．０２〜０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−緩衝液食塩水などの標準洗浄緩衝液による徹底的な洗浄により除去した。洗浄は、好ましくは３〜１０分間に渡って実施し、３〜５回繰り返した。患者サンプル中のＤＡＰ３．ｐｒポリペプチドの検出は、例えば、先に記載したように産生された第二の独立した抗ＤＡＰ３．ｐｒ抗体との続いての結合反応によって実施し、標準２部位「サンドイッチ」型ＥＬＩＳＡにおいて、ＤＡＰ３．ｐｒポリペプチド上の特徴的なエピトープを識別した。第二の抗ＯＢｃｌ５．ｐｒ抗体またはＤＡＰ３．ｐｒ���体の結合は、例えば、室温にて３０〜６０分間、抗体内でウェルを（例えば遮断溶液中１〜１００μg/mlの濃度にて）インキュベートして、続いて前の工程と同様に徹底的に洗浄することによって実施した。第二の抗体は、好ましくはアルカリホスファターゼなどの適切な基質の存在下で、色素生産性または蛍光生産性反応生成物を生成できる酵素に直接結合できる。あるいは、例えば、そのように酵素に結合された抗種および抗アイソタイプ特異的第三抗体を利用して、標準分光分析プレートリーダー機器で検出可能である反応生成物を産生させる。反応生成物の現像では、（先のように）洗浄した抗体−抗原−酵素複合体を好ましくはRocheからのＡｔｔｏＰｈｏｓなどの色素生産性基質に室温にて約１０分間露出させて、反応を５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ５．５などの低ｐＨ緩衝液によって停止させるか、または代わりに直接アッセイすることができる。特異的に結合したＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドまたはＤＡＰ３．ｐｒポリペプチドの量は、例えば、分光光度計の適切な波長（この場合は４２０nm）での励起後の、各ウェルにおける酵素反応生成物の量の測定によって決定する。測定は、好ましくは、放射波長（この場合は５６０nm）においてプレートリーダーで行う。好ましくは診断には、例えば精製組換えＯＢｃｌ５．ｐｒポリペプチドまたはＤＡＰ３．ｐｒポリペプチドなどの、ＯＢｃｌ５タンパク質標準またはＤＡＰ３タンパク質標準が含まれる。このタンパク質標準の希釈シリーズは、当業界で周知であるように、反応の対照として、そしてポリペプチド発現レベルの比較のタンパク質標準曲線を導くために、好ましくはＥＬＩＳＡに同時に含まれる。特定の肝臓障害を示す、対応する濃度範囲は、好ましくは、診断で与えられるべきである。加えて、比較できる体液または組織抽出物も好ましくは、このようなＥＬＩＳＡ試験で対照として含まれるべきである。これは、好ましくは、非罹患者からの血清または血漿および／または適切な動物モデルからの血清、血漿、または組織抽出物を含む。このようなＥＬＩＳＡ検出診断は、当業界で一般的である（例えばHauschildら, 2001, Cancer Res.158: 169-77を参照）。ＥＬＩＳＡによって決定したサンプル：対照タンパク質レベルは、好ましくは、対照サンプルに対して、本発明による障害を患う患者の、病理学者が確認した組織で決定した、ＥＬＩＳＡ決定障害特異的タンパク質発現比値である。サンプル：対照のタンパク質レベルが障害特異的タンパク質発現比値と本質的に一致する場合、このような一致は、好ましくは障害を患う患者を示す。好ましくはこのような診断は、１つを超える本発明によるポリペプチドに対して実施される。
【０２８８】
更に診断は、本発明によるポリペプチドに対して作成された内在性抗体、あるいは患者から分離されたサンプル中に存在するその機能変異体またはその断片を検出することに向けられており、抗体またはその断片は、本発明によるポリペプチドに対して作成されている。このような自己免疫抗体の検出は、当業者に一般に既知である方法によって、例えば先に詳細に記載したＥＬＩＳＡなどの免疫親和性アッセイによって、本発明によるポリペプチドまたはその機能変異体またはその一部をプローブとして使用して実施できる。このような自己免疫抗体の存在は、本発明による障害を患う患者を示す。
【０２８９】
加えてまたはあるいは、少なくとも１つの本発明によるポリペプチドの免疫組織化学検出をベースとする関連診断キットを作成できる。このようなキットでは、例えば精製した抗体または本発明によるポリペプチドに特異的な抗体を、好ましくは患者の細胞または組織切片への抗体の結合を検出するために必要な試薬と共に含むことができる。これらの試薬は、例えば、好ましくは、例えば色素生産性基質の触媒作用が可能な触媒に結合された、またはフルオロフォア（例えばTexas Redなど）に結合された−本発明によるポリペプチドまたはその機能変異体に対して作成された−特異的抗種およびサブタイプ特異的二次抗体を含む。好ましくは酵素基質も洗浄およびインキュベーション緩衝液と同様に含まれる。このようなキットの追加の任意の成分は、正の対照組織、例えば肝臓の切片、あるいは正の組織対照としてポリペプチドを特異的に発現する細胞の充填ペレットからの組織または切片でもよい。与えられた説明は、本発明によるポリペプチドの検出のための抗原回復の好ましいおよび／または代わりの方法あるいは、例えばホルマリン固定およびパラフィン包埋組織物質よりも、凍結組織物質を利用すべきであるという指示を含む。この場合、氷冷アセトンへの１０分間の浸漬などの、凍結組織サンプル切片の固定のための勧告が好ましくは含まれる。更なる説明は、好ましくは、遺伝子生成物の検出で使用する抗体の濃度についての勧告はもちろんのこと、提供された免疫試薬への組織の暴露のための勧告および提案されたインキュベーション時間および温度も与える。３％正常ヒツジ血清を含むリン酸緩衝液食塩水を含む０．０１％〜０．１％ｔｗｅｅｎ−２０などの、抗体インキュベーション用の好ましい反応緩衝液も含むことができる。更に、リン酸緩衝液食塩水を含む０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を用いた、各５分間の洗浄４回などの、特異的抗体中でのインキュベーション前後の組織切の洗浄のための明細な条件が好ましくは含まれる。このような免疫組織化学検出プロトコルは、当業者に既知である。一般に、キットは、好ましくは、正および負の組織例からの特異的免疫組織化学染色結果の画像のパネルおよび特に、診断される障害を患う患者を示す結果を表示した表を、ユーザーガイドとして含む。このようなキットの利用は、好ましくは、本発明による先に記載した肝臓障害、肝臓癌、または上皮癌の診断を除外、支持または確認する。
【０２９０】
核酸ベース診断手法について先に規定したように、本発明によるポリペプチドの検出および／または定量に基づく診断は、このようなポリペプチドを１つ以上含む。その上、このようなポリペプチドの、本発明による障害に関与する他のペプチドとの同時検出は、このような診断で利用できる。
【０２９１】
本発明の組成物および工程に各種の修正が行えることは、当業者に明らかになるであろう。それゆえ本発明は、このような修正および変更が添付請求項およびその相当物の範囲内であるという条件で、それらを対象とすることが意図されている。本明細書で引用したすべての刊行物は、参照によりその全体が組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】ＨＣＣのＲＮＡ発現レベル  ＨＣＣ対非罹患肝臓ｃＤＮＡマイクロアレイ実験での発現値の要約ボックスプロットを与える。ボックスプロットは、ｌｏｇ２発現値比と、各ボックスの水平線によって示される中央値とのグラフ表示である。各ボックスの範囲は、四分位間を示す；ウィスカーは、四分位間の１．５倍を示す。この範囲に含まれない比は、小さい丸で示す。本発明による各核酸では、ＨＣＣで発現増加が明らかである。発現値は、患者と対照サンプルの間の発現の差が最も重大であるＯＢｃｌ５（配列番号１１）を除いて、同様の比で一貫して増加している。
【図２】正常組織および他の種類の癌と比較した場合の、ＨＣＣでのＯＢｃｌ５の発現特異性  ＯＢｃｌ５特異的ＰＣＲ生成物の量は、プライマーのＯＢｃｌ５−ｐ８、配列番号６６；ＯＢｃｌ５−ｐ９、配列番号６７；およびＯＢｃｌ５−ｐ１０、配列番号６８を使用して、Ｔａｑｍａｎ蛍光標識遺伝子特異的プローブの包含および加水分解によって監視する。定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＨＣＣ＝Ａ、ＦＮＨ＝ＢでのＯＢｃｌ５（配列番号１１）の発現の定量評価は、正常組織（Ｃ＝非腫瘍性（正常）肝臓；Ｄ＝肺正常；Ｆ＝結腸正常；Ｈ＝睾丸正常；Ｊ＝筋肉正常；Ｋ＝皮膚正常；Ｌ＝心臓正常；Ｍ＝腎臓正常）および他の癌（Ｅ＝肺癌；Ｇ＝結腸癌；Ｉ＝睾丸癌）の発現パターンと比較する。Mann-Whitney-U検定（異常に分布したデータに利用された非パラメータ検定）は、Wilcoxon検定としてオプションpaired =“false”を用いて実施され、２つの群の大きいほうの順位和を与え（ＨＣＣ）（＝Wilcoxon値、Ｗ）、そして表７に示すようなすべての組織サンプル（ＨＣＣ＝肝細胞癌；ＦＮＨ＝限局性結節性過形成；ＮＮＬ＝非腫瘍性（正常）肝臓；肺Ｎ＝肺正常；Ｃｏｌ  Ｎ＝結腸正常；Ｔｓｔ．Ｎ＝睾丸正常；Ｍｓ．Ｎ＝筋肉正常；皮膚Ｎ＝皮膚正常；Ｈｒｔ．Ｎ＝心臓正常；Ｋｄｎｙ．Ｎ＝腎臓正常）および他の癌（肺Ｃ＝肺癌；Ｃｏｌ．Ｃ＝結腸癌；Ｔｓｔ．Ｃ＝睾丸癌）でのＯＢｃｌ５分布の有意差（Ｐ値）を示す。
【０２９３】
【表１１】
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【０２９４】
【図３】独立ＨＣＣサンプルおよび対照での核酸（配列番号１０〜１９）の発現を示すＲＴ−ＰＣＲデータ  「ハウスキーピング」遺伝子グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の増幅は、ｃＤＮＡ品質を制御するために、各ｃＤＮＡテンプレートとの並列反応に含まれていた。３０〜４０回のＰＣＲサイクルを受けたＲＴ−ＰＣＲ反応生成物の５〜１０％をアガロースに装填し、臭化エチジウムで染色したＤＮＡゲルをここに描出した。ＨＣＣライブラリープールからの精製ＤＮＡは、本発明による各核酸の正の対照（Ｃ）として含まれる。この分析ではそれぞれの本発明による核酸について、２つの独立したＨＣＣサンプル（Ｈ）が１つの非罹患肝臓サンプル（Ｎ）とともに含まれていた。Ｍ＝分子量マーカー（１００bpラダー）。
【図４】ＲＮＡブロットによるディファレンシャル遺伝子発現の検証  ３つの非罹患肝臓（Ｌ）および２つのＨＣＣ組織（Ｈ）のプールからのＲＮＡサンプルの独立した評価は、図に示すように、ＲＮＡブロットオートラジオグラムのこの画像において、ＯＢｃｌｌ（配列番号１０）およびＯＢｃｌ５（配列番号１１）の発現増加を検証する。各配列に特異的なアンチセンス鎖プローブ（Ａ、上；特異的シグナル）および負の対照としての対応するセンス鎖プローブ（Ｂ、下）からの結果は、アンチセンスプローブによるハイブリダイゼーションの特異性を示す。
【図５】ＨＣＣ対ＮＮＬのＯＢｃｌ５  ＲＮＡ局在化  インサイチューハイブリダイゼーション分析は、肝細胞癌（ＨＣＣ）および非腫瘍性肝臓（ＮＮＬ）サンプルにおいてＯＢｃｌ５  ＲＮＡを検出する。放射性同位体標識アンチセンスプローブ（ａｓ）は、組織切片のＯＢｃｌ５  ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、オートラジオグラフィーエマルジョンによる切片の展開によって検出される。暗点は、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを示すエマルジョンからの展開された銀粒子である。相補性センスプローブは、アンチセンスプローブへの化学的類似性にもかかわらず、インサイチューでＯＢｃｌ５  ＲＮＡにハイブリダイズできない。したがってセンスプローブは、バックグラウンドシグナルのみが検出されるパネルＡおよびＣで負の対照として作用する。ＯＢｃｌ５  ＲＮＡはパネルＢに示したＮＮＬでわずかに検出され、パネルＤの多数の銀粒子スポットによって明示されるように、インサイチューでＨＣＣにて明確に示される。各パネルは、倍率２００倍（２００Ｘ）で示される。
【図６】ＯＢｃｌ５  ＲＮＡ発現のｓｉＲＮＡ仲介ノックダウン  ＨｅｐＧ２細胞は、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡ配列に対して特異的であるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによって、またはスクランブル配列であるが同一組成の、負の対照としてのオリゴヌクレオチドによって形質移入した（表１０）。これらの特異的オリゴヌクレオチドは、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡと相互作用して、それを不安定化し、それによって肝臓癌細胞中のこのＲＮＡのレベルを低下させ、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡレベルのノックダウンとして既知の工程である。負の対照によってスクランブルされたオリゴヌクレオチドは、次の実験読み出しのための対照参照ＲＮＡを提供するために、並行形質移入で使用する。Ｑ−ＰＣＲを利用して、３つの独立した実験（Ａ、ＢおよびＣ）から、スクランブルされたオリゴヌクレオチド形質移入（対照）細胞と比較して、特異的オリゴヌクレオチド形質移入細胞（実験）における、ＯＢｃｌ５  ＲＮＡおよび網膜細胞芽腫タンパク質１（ＲＢ１）ｍＲＮＡの発現のレベルを判定した。Ｙ軸は、ＯＢｃｌ５  ｍＲＮＡ残存活性（白色、左列）のｌｏｇ２パーセント値を表す；これに対してＲＢ１ｍＲＮＡ  ｌｏｇ２比の値は、ＯＢｃｌ５  ｓｉＲＮＡ形質移入対対照オリゴ形質移入ＨｅｐＧ２細胞でのＲＢ１ｍＲＮＡのレベルの倍増を示す（黒色、右列）。特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによって仲介されたＯＢｃｌ５  ＲＮＡの減少は、明らかである。対照細胞では上昇しないが、実験におけるＲＢ１ｍＲＮＡのレベル上昇は、ＯＢｃｌ５発現がこの腫瘍サプレッサｍＲＮＡのレベルを負に調節することを示唆する。
【図７】組織でのＤＡＰ３タンパク質発現  タンパク質抽出物は、ヒト組織におけるこれらのタンパク質の発現レベルを判定するために、ＤＡＰ３およびβ−アクチンタンパク質に特異的な抗体を用いた免疫ブロット分析を受ける。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体を用いたインキュベーションおよび化学発光ＨＲＰ基質による免疫複合体の検出の後、バンドの強度を濃度測定によって分析し、各シグナルをβ−アクチンシグナルの強度に正規化する。各レーンに示した組織を、これらの組織でのＤＡＰ３タンパク質レベルの定量分析も含む表８に定義する。これらの分析は、ＤＡＰ３タンパク質、すなわちＨＣＣで特異的にアップレギュレートされたＤＡＰ３  ｍＲＮＡの機能生成物も、ＨＣＣで高度に過剰発現されることを示す。
【０２９５】
【表１２】
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【０２９６】
【図８】ヘパトーマ細胞の増殖に相関するＨＣＣ調節解除遺伝子の発現  静止細胞の血清刺激の８時間（黒列）および１２時間（白列）後の、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）における本発明による標的遺伝子配列の増殖依存性発現。ｃＤＮＡマイクロアレイ実験読み取りからの血清刺激対静止発現値のｌｏｇ２変換比が提供される。静止肝臓癌細胞と比較した、増殖でのこれらの配列の発現レベルの実質的上昇は、これらの配列が肝臓癌細胞増殖にとって機能的に重要であることを示唆している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006500074.tif 000076
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月13日(2005.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006500074000001.app
【国際調査報告】
2006500074.tif 000077
2006500074.tif 000078
2006500074.tif 000079
2006500074.tif 000080
2006500074.tif 000081
2006500074.tif 000082
2006500074.tif 000083
2006500074.tif 000084