(57)【要約】グルタミン残基で始まるアミノ酸配列をコードするリボヌクレアーゼＤＮＡを、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターに導入して、ＰｅｌＢリーダー配列で始まる組換えプラスミドＤＮＡを形成する。本組換えプラスミドＤＮＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主を形質転換させる。宿主細胞に存在するシグナルペプチダーゼ酵素は、シグナルプロセシングの際に、ｐｅｌＢリーダー配列を切断し、それにより、グルタミン残基をピログルタミン酸に自動的に環化させる。この方法において、リボヌクレアーゼは、直接生産される、すなわち最初のＮ末端のメチオニン残基を切断する別途の工程がなくても生産される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主で発現されると、配列番号１のリボヌクレアーゼの前駆体型をコードし、該前駆体型は、ピログルタミン酸に自動的に環化するＮ末端グルタミン残基を有する、配列番号４の遺伝子を含むプラスミド。
【請求項２】
発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
宿主で発現されると、配列番号５のリボヌクレアーゼの前駆体型をコードし、該前駆体型は、ピログルタミン酸に自動的に環化するＮ末端グルタミン残基を有する、配列番号６の遺伝子を含むプラスミド。
【請求項４】
発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項３に記載のプラスミド。
【請求項５】
宿主で発現されると、配列番号９のリボヌクレアーゼの前駆体型をコードし、該前駆体型は、ピログルタミン酸に自動的に環化するＮ末端グルタミン残基を有する、配列番号１０の遺伝子を含むプラスミド。
【請求項６】
発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主で配列番号４の遺伝子を発現することによって得られた組換えで生産されたタンパク質混合物であって、該混合物中のタンパク質の一種は、配列番号１のタンパク質であり、該混合物中のタンパク質のその他の一種は、配列番号１のタンパク質の環化型であり、該環化型は、Ｎ末端のピログルタミン酸残基を有する、上記混合物。
【請求項８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主で配列番号６の遺伝子を発現することによって得られた組換えで生産されたタンパク質混合物であって、該混合物中のタンパク質の一種は、配列番号５のタンパク質であり、該混合物中のタンパク質のその他の一種は、配列番号５のタンパク質の環化型であり、該環化型は、Ｎ末端のピログルタミン酸残基を有する、上記混合物。
【請求項９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主で配列番号１０の遺伝子を発現することによって得られた組換えで生産されたタンパク質混合物であって、該混合物中のタンパク質の一種は、配列番号９のタンパク質であり、該混合物中のタンパク質のその他の一種は、配列番号９のタンパク質の環化型であり、該環化型は、Ｎ末端のピログルタミン酸残基を有する、上記混合物。
【請求項１０】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主で発現されると、配列番号１のリボヌクレアーゼの保存的に改変された変異体をコードするプラスミドであって、保存的に改変された変異体は、ピログルタミン酸に自動的に環化するＮ末端のグルタミン残基を有する、上記プラスミド。
【請求項１１】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主で発現されると、配列番号５のリボヌクレアーゼの保存的に改変された変異体をコードするプラスミドであって、保存的に改変された変異体は、ピログルタミン酸に自動的に環化するＮ末端のグルタミン残基を有する、上記プラスミド。
【請求項１２】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主で発現されると、配列番号９のリボヌクレアーゼの保存的に改変された変異体を直接コードするプラスミドであって、保存的に改変された変異体は、ピログルタミン酸に自動的に環化するＮ末端のグルタミン残基を有する、上記プラスミド。
【請求項１３】
配列番号１のリボヌクレアーゼを組換えで生産する方法であって、
Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列、それに続いて配列番号４の遺伝子を有するプラスミドベクターから始める工程；
宿主中で該遺伝子を発現し、それによりリボヌクレアーゼを生産する工程；および、
シグナルプロセシングの際に、該ｐｅｌＢリーダー配列を、共に翻訳して、該宿主に存在するシグナルペプチダーゼ酵素によって切断させる工程、
を含み、それによって、該リボヌクレアーゼにおける最初のＮ末端のグルタミン残基が、ピログルタミン酸に自動的に環化する、上記方法。
【請求項１４】
配列番号５のリボヌクレアーゼを組換えで生産する方法であって、
Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列、それに続いて配列番号６の遺伝子を有するプラスミドベクターから始める工程；
宿主中で該遺伝子を発現し、それによりリボヌクレアーゼを生産する工程；および、
シグナルプロセシングの際に、該ｐｅｌＢリーダー配列を、共に翻訳して、該宿主に存在するシグナルペプチダーゼ酵素によって切断させる工程、
を含み、それによって、該リボヌクレアーゼにおける最初のＮ末端のグルタミン残基が、ピログルタミン酸に自動的に環化する、上記方法。
【請求項１５】
配列番号９のリボヌクレアーゼを組換えで生産する方法であって、
Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列、それに続いて配列番号１０の遺伝子を有するプラスミドベクターから始める工程；
宿主中で該遺伝子を発現し、それによりリボヌクレアーゼを生産すること；および、
シグナルプロセシングの際に、該ｐｅｌＢリーダー配列を、共に翻訳して、該宿主に存在するシグナルペプチダーゼ酵素によって切断させること、
工程を含み、それによって、該リボヌクレアーゼにおける最初のＮ末端のグルタミン残基が、ピログルタミン酸に自動的に環化する、上記方法。
【請求項１６】
配列番号４の遺伝子を構築する方法であって、該遺伝子は、配列番号１のリボヌクレアーゼをコードし、
ポリメラーゼ連鎖反応での増幅のためのテンプレートとして、ｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｍ２３Ｌ，Ｓ７２Ｃ）組換えプラスミドＤＮＡを用いる工程；および、
該ＤＮＡを、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドベクターにクローニングする工程、
を含む、上記方法。
【請求項１７】
クローニングする工程は、ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、それを、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に導入することによって行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号６の遺伝子を構築する方法であって、該遺伝子は、配列番号５のリボヌクレアーゼをコードし、
テンプレートとしてｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）組換えプラスミドＤＮＡから始める工程；
部位特異的変異誘発を用いて、該ＤＮＡの７２位でセリン残基をシステイン残基に置換し、それにより全長の突然変異ＤＮＡを生産する工程；および、
該突然変異ＤＮＡをｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドベクターにクローニングする工程、
を含む、上記方法。
【請求項１９】
クローニングする工程は、突然変異ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、それを、ｐＥＴ−２２b（＋）プラスミドのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に導入することによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１０の遺伝子を構築する方法であって、該遺伝子は、配列番号９のリボヌクレアーゼをコードし、
ポリメラーゼ連鎖反応での増幅のためのテンプレートとして、ｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）組換えプラスミドＤＮＡを用いる工程；および、
該ＤＮＡを、ｐＥＴ−２２b（＋）プラスミドベクターにクローニングする工程、
を含む、上記方法。
【請求項２１】
クローニングする工程は、ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、それを、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に導入することによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主で発現されると、Ｎ末端のグルタミン残基（これは自動的に環化して、ピログルタミン酸を形成する）を有するリボヌクレアーゼをコードする、ベクター。
【請求項２３】
リボヌクレアーゼは、配列番号１のリボヌクレアーゼである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
リボヌクレアーゼは、配列番号５のリボヌクレアーゼである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２５】
リボヌクレアーゼは、配列番号９のリボヌクレアーゼである、請求項２２に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）に関し、より特定には、ランピルナーゼ（ｒａｎｐｉｒｎａｓｅ）に関する。その最も近い意味において、本発明は、ランピルナーゼ、および、ランピルナーゼに密接に関連するタンパク質（このような密接に関連するタンパク質は、本発明において「変異体」および「ランピルナーゼ変異体」という）を生産するタンパク質をコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランピルナーゼとは、アルファセル社（Ａｌｆａｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，本発明の譲受人）が製造しているＲＮアーゼの一般名である（登録商標ＯＮＣＯＮＡＳＥ）。ランピルナーゼは、１０４残基からなるタンパク質であり、グルタミン（Ｇｌｎ）の自動的な環化により生産されるピログルタミン酸（＜Ｇｌｕ）のブロックされたＮ末端を有する。ランピルナーゼは、米国特許第５,５１９,２１２号で開示されている。ランピルナーゼは、特定のガン細胞系に対して活性があることが実証されており、現在、ヒトの臨床試験で試験中である。
【０００３】
また、ランピルナーゼ変異体は、臨床的にも興味深い。米国特許第６,２３９,２５７号（Ｂ１）は、特定のガン細胞系に対して活性な変異体を開示している。さらに、米国特許第６,１７５,００３号（Ｂ１）は、標的成分に特異的に結合するように設計されたシステイン化変異体を開示している。
【０００４】
米国特許第６,１７５,００３号（Ｂ１）は、２種の核酸を開示しており、これらは、発現および精製、それに続くインビトロにおける−１位でのＮ末端のメチオニン残基切断の後、組換えランピルナーゼおよび組換えシステイン化ランピルナーゼをそれぞれ生産する。この切断により、グルタミン残基はピログルタミン酸に自動的に環化するが、これは、ランピルナーゼの活性に必要であることが示されており、さらに、ランピルナーゼ変異体の活性に必要であると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ランピルナーゼおよびランピルナーゼ変異体を直接生産すること、すなわち、別途のインビトロの工程でＮ末端のメチオニン残基を切断することなく生産することが有利であるといえる。
【０００６】
従って、本発明の１つの目的は、ランピルナーゼおよびランピルナーゼ変異体を生産するのに用いることができる材料および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターは、望ましい遺伝子の発現の際に共に翻訳して切断される、埋め込み型のｐｅｌＢシグナルペプチド配列（「リーダー配列」）を有するという理解から生じている。この共に翻訳されることによる切断は、宿主細胞に存在するシグナルペプチダーゼ酵素によって行われ、それにより別途のインビトロでの切断工程を省くことができる。より特定には、第一のアミノ酸としてＮ末端グルタミンに関するコドンを含むランピルナーゼ遺伝子（または、ランピルナーゼ変異体の遺伝子）は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターのｐｅｌＢリーダー配列の上流に融合される。次に、得られたプラスミドは、発現宿主（有利には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞）で発現される。発現されたタンパク質は最初はそのＮ末端にｐｅｌＢリーダー配列とともに合成される。ただし、このｐｅｌＢリーダー配列は残存しない。これは、宿主細菌細胞は、シグナルペプチダーゼ酵素を含むためである。タンパク質はペリプラスムに運び出される際に、シグナルペプチダーゼ酵素はＮ末端のｐｅｌＢリーダー配列を切断する。これによって次に、発現されたタンパク質（ランピルナーゼまたはランピルナーゼ変異体）の第一のアミノ酸であるグルタミンをＮ末端でピログルタミン酸に自動的に環化させる。この方法で、グルタミン残基のピログルタミン酸への自動的な環化は自発的に起こり、別途の切断工程は必要ない。
【０００８】
従って、本発明によれば、発現宿主で発現されると、グルタミンがＮ末端残基であるリボヌクレアーゼをコードするプラスミドを開示する。次に、Ｎ末端グルタミンは自動的に環化して、ピログルタミン酸を形成する。有利には、発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞であり、遺伝子（ランピルナーゼまたはランピルナーゼ変異体の遺伝子）は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位でクローニングされる。
【０００９】
図面の簡単な説明
以下の説明のための非限定的な図面を用いて、本発明はさらによく理解される：
図１は、本発明の第一の好ましい実施形態を示すフローチャートである；
図２は、本発明の第二の好ましい実施形態を示すフローチャートである；および、
図３は、本発明の第三の好ましい実施形態を示すフローチャートである。
【００１０】
好ましい実施形態の詳細な説明
米国特許第６,１７５,００３号（Ｂ１）は、本発明の好ましい実施形態において出発材料として用いられる２種の組換えプラスミドを開示している。第一のプラスミドは、ｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｍ２３Ｌ，Ｓ７２Ｃ）という名称であり、これは、ｐＥＴ−１１ｄベクターにクローニングされたｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｍ２３Ｌ，Ｓ７２Ｃ）遺伝子で構成されている。この第一のプラスミドは、−１位にＮ末端のメチオニン残基、および、１位にグルタミン残基を有するタンパク質をコードする。この第一のプラスミドは、２位から、ランピルナーゼと同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする（ただし、ランピルナーゼの２３位に位置するメチオニン（Ｍｅｔ）残基は、ロイシン（Ｌｅｕ）残基に変更されており、ランピルナーゼの７２位に位置するセリン（Ｓｅｒ）残基は、システイン（Ｃｙｓ）残基に変更されている）。このコードされたタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１で示され、このコードされたタンパク質に関するヌクレオチド配列は、配列番号４で示される。ＰＣＲおよびその他の組換えＤＮＡ操作には、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ブランチバーグ，ニュージャージー州）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホヤ，カリフォルニア州）、および、ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ，マディソン，ウィスコンシン州）製の試薬を用いた。
【００１１】
第一の好ましい実施形態によれば、ＰＣＲプロトコールで使用するための２種のプライマーが設計される。これらは、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）、および、リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）である。フォワードＰＣＲプライマーは、平滑５’末端を生成し、リバースＰＣＲプライマーは、３’末端に、停止コドン、それに続いてＢａｍＨＩ制限部位を含む。
【００１２】
これらのプライマーは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅反応で、組換えプラスミドｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｍ２３Ｌ，Ｓ７２Ｃ）ＤＮＡのテンプレートを増幅するのに用いられる（図１，工程１０）。このＰＣＲ反応で、平滑５’末端と、３’末端にＢａｍＨＩ制限部位を有する全長遺伝子が生産される。この新しい遺伝子は、ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｍ２３Ｌ，Ｓ７２Ｃ）と命名した。次に、この遺伝子は、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングすることができる（図１，工程３０）。次に、得られたｐＥＴ２２ｂ−ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｍ２３Ｌ，Ｓ７２Ｃ）組換えプラスミドＤＮＡを用いて、発現宿主を形質転換させる（図１，工程４０）。適切な宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞である。その宿主から、タンパク質が発現される（図１，工程５０）。発現されたタンパク質は、Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列、それに続いて１位にグルタミン残基（Ｇｌｎ）を有する。宿主細胞に存在するシグナルペプチダーゼ酵素は、シグナルプロセシングの際に、ｐｅｌＢリーダー配列を切断し、それにより、グルタミン残基をピログルタミン酸（＜Ｇｌｕ）に自動的に環化させることができる（図５，工程５５）。
【００１３】
第二の本発明の好ましい実施形態は、上述の'００３特許で開示された第二の組換えプラスミド、すなわちｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）を用いる。この組換えプラスミドＤＮＡは、部位特異的変異誘発で処理される。これは、ｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）組換えプラスミドＤＮＡは、そのアミノ酸配列の７２位にセリン（Ｓｅｒ）残基を有するタンパク質をコードし、第二の好ましい実施形態において、コードされたＲＮアーゼのアミノ酸配列は、このセリン残基をシステイン（Ｃｙｓ）に変更することによってシステイン化されているためである。（この第二の好ましい実施形態によってコードされたアミノ酸配列は、配列番号５であり、コードされたタンパク質に関するヌクレオチド配列は、配列番号６である）。
【００１４】
第二の好ましい実施形態で用いられたプライマーは、２つの目的を達成するように選択される。第一の好ましい実施形態の場合と同様に、第二の好ましい実施形態は、遺伝子がｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングされるように設計され、この目的は、同じフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号２および配列番号３）を用いてによって達成される。加えて、上述の部位特異的変異誘発は、突然変異したフォワードＰＣＲプライマー（配列番号７）と、突然変異したリバースＰＣＲプライマー（配列番号８）を用いて行われる。第一の好ましい実施形態の場合と同様に、フォワードＰＣＲプライマーは、平滑５’末端を生産し、リバースＰＣＲプライマーは、停止コドン、それに続いて３’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含む（それにより、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位へのクローニングを可能にする）。突然変異したフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーは、７２位でのセリン（Ｓｅｒ）からシステイン（Ｃｙｓ）への突然変異を行う。
【００１５】
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた第一のＰＣＲ反応において（図２，工程７０）、組換えプラスミドｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）ＤＮＡが、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）、および、突然変異したリバースＰＣＲプライマー（配列番号８）を用いる場合のテンプレートとして用いられる。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた第二のＰＣＲ反応において（図２，工程８０）、組換えプラスミドｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）ＤＮＡが、リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）、および、突然変異したフォワードＰＣＲプライマー（配列番号７）を用いる場合のテンプレートとして用いられる。これらの第一および第二のＰＣＲ反応で、望ましい突然変異（７２位セリン残基がシステイン残基になった）を有するオーバーラップするＤＮＡフラグメントが生産される。次に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた第三のＰＣＲ反応において（図２，工程９０）、これらのオーバーラップするＤＮＡフラグメントを、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）、および、リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）と共に混合する。こにより、平滑５’末端、および、３’末端でＢａｍＨＩ制限部位の隣に停止コドンを有する全長遺伝子が生産される。この全長遺伝子は、ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｓ７２Ｃ）と命名した。次に、この新しいｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｓ７２Ｃ）遺伝子は、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングし（図２，工程１００）、ｐＥＴ２２ｂ−ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｓ７２Ｃ）組換えプラスミドを生産することができる。次に、得られたｐＥＴ２２ｂ−ｒＯｎｃ（Ｑ１，Ｓ７２Ｃ）組換えプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換させる（図２，工程１１０）。この宿主から、タンパク質が発現される（図２，工程１２０）。発現されたタンパク質は、Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列、それに続いて１位にグルタミン残基（Ｇｌｎ）を有する。宿主細胞に存在するシグナルペプチダーゼ酵素は、シグナルプロセシングの際に、ｐｅｌＢリーダー配列を切断し、それにより、グルタミン残基をピログルタミン酸（＜Ｇｌｕ）に自動的に環化させることができる（図２，工程１２５）。
【００１６】
第三の本発明の好ましい実施形態では、上述の第二の組換えプラスミド、すなわちｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）を用いて、ランピルナーゼをコードするアミノ酸配列（配列番号９）を生産する。ランピルナーゼに関するヌクレオチド配列は、配列番号１０である。
【００１７】
第三の好ましい実施形態はまた、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングされるように設計され、それゆえに、第一および第二の好ましい実施形態で用いたのと同じフォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）、および、リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）を用いる。
【００１８】
これらのプライマーは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅反応に用いられる。組換えプラスミドｐＥＴ１１ｄ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）ＤＮＡ（図３，工程１４０）が、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）、および、リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）を用いる場合のテンプレートとして用いられる（図３，工程１５０）。この方法は、平滑５’末端と、３’末端にＢａｍＨＩ制限部位を有する全長遺伝子を生産する。この新しい遺伝子は、ｒＯｎｃ（Ｑ１）と命名した。次に、この遺伝子は、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングすることができる（図３，工程１６０）。次に、得られたｐＥＴ２２ｂ−ｒＯｎｃ（Ｑ１）組換えプラスミドＤＮＡを用いて、発現宿主を形質転換させる（図３，工程１７０）。適切な宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞である。この宿主から、タンパク質が発現される（図３，工程１８０）。発現された組換えタンパク質は、Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列、それに続いてグルタミン（Ｇｌｎ）を有する。宿主に存在するシグナルペプチダーゼ酵素は、シグナルプロセシングの際に、ｐｅｌＢリーダー配列を切断し、それにより、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を自動的に環化させ、ピログルタミン酸を形成することができる（＜Ｇｌｕ）（図３，工程１８５）。
【００１９】
当業者であれば、実際問題として、全ての最初のグルタミン残基を実際に自動的にピログルタミン酸に確実に環化することは不可能であることが認識できる。このため、それぞれのこれらの好ましい実施形態において、示された工程の最終産物は、実際に、タンパク質の混合物である。 第一の好ましい実施形態において、最終産物は、実際に、配列番号１のタンパク質と配列番号１のタンパク質のＮ末端残基がピログルタミン酸である環化型の混合物である。同様に、第二の好ましい実施形態において、最終産物は、実際に、配列番号５のタンパク質と配列番号５のタンパク質のＮ末端残基がピログルタミン酸である環化型の混合物である。従って、第三の好ましい実施形態においても、最終産物は、実際に、配列番号９のタンパク質と配列番号９のタンパク質のＮ末端残基がピログルタミン酸である環化型の混合物である。最初の残基がグルタミンとして残存しているタンパク質は、精製で除去してもよいし、または、最初のグルタミン残基をピログルタミン酸に変換してもよい。
【００２０】
これらの好ましい実施形態において、ＰＣＲ反応は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ、発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞であり、ベクターは、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドであり、この新しい遺伝子は、そのベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングされる。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ，  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３），  ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミド、および、ＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の使用はいずれも好ましいが、これらは本発明に必須ではない。その代わりに、その他のポリメラーゼ、宿主、プラスミドおよび制限部位を用いてもよい。
【００２１】
同様に、本発明で開示された全ての実施形態で用いられたプライマーは、平滑５’末端と、３’末端にＢａｍＨＩ部位が隣にある停止コドンを有する全長ＤＮＡを生成する。これは、本発明で開示された全ての実施形態が、ＤＮＡがｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターのＭｓｃＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングされるように設計されているためである。このようなプライマーが好ましいが、これらは本発明に必須ではない。その他のベクターが用いられる場合、または、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドのその他の部位が用いられる場合、プライマーは、適切に変更させるものとする。
【００２２】
当業者であれば理解できることだが、明確にするために、本発明の説明から当業者既知の特定の詳細事項を省略してある。例えば、本発明で開示されたように好ましいｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターに遺伝子がクローニングされ、それをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント宿主細胞に組換えＤＮＡで形質転換した後、この宿主細胞は、要求どおりにリボヌクレアーゼが発現されるようにＩＰＴＧで誘導されなければならない。もちろん、その他のベクターおよび／または宿主細胞が用いられた場合、それらを誘導するのにその他の材料が用いられ得る。
【００２３】
当業者であれば理解できることだが、本発明で開示された遺伝子およびタンパク質の保存的な改変は、本発明の範囲内である。遺伝子が保存的な改変が関与する限り、これは、遺伝子コードが変化し、異なるコドンが同じアミノ酸残基をコードするためである。タンパク質の保存的な改変が関与する限り、これは、異なるアミノ酸残基が、極めて類似した特徴を有し得るため、および、保存的に改変されたタンパク質は、同じ、または高度に類似した特性を有し得るためである。
【００２４】
上記で本発明の好ましい実施形態の少なくとも１つを説明したが、この説明は限定的するものではなく、単に代表的なものである。本発明の範囲は、以下の請求項によってのみ定義される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第一の好ましい実施形態を示すフローチャートである。
【図２】本発明の第二の好ましい実施形態を示すフローチャートである。
【図３】本発明の第三の好ましい実施形態を示すフローチャートである。
【図１】
2006512082.tif 000002
【図２】
2006512082.tif 000003
【図３】
2006512082.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月2日(2005.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006512082000001.app
【国際調査報告】
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