(57)【要約】本発明は、マーキング剤、微生物のゲノムに向けた前記マーキング剤の分子通過を促進する少なくとも１種の細胞浸透試薬を含む反応媒体を利用する微生物検出方法を対象とする。本発明は、前記マーキング反応媒体も同様に対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合により生体液中に存在する微生物の検出方法であって、
ａ）前記生体液の試料を採取し、
ｂ）マーキング剤、及び前記微生物の膜の細胞浸透試薬を含む、微生物マーキング用の反応媒体と、前記試料を接触させ、
ｃ）場合により前記試料中に存在するマークされた微生物を保持する可能性があるフィルタ上で、前記試料を濾過し、かつ
ｄ）マークされ、かつステップ（ｃ）でフィルタ中に保持された微生物を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
マーキング剤は、ＤＮＡ挿入化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ挿入剤は、シアニン誘導体、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ及び臭化エチジウムを含む群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
シアニン誘導体は、ピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ）及びＹＯＰＲＯ１からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
シアニン誘導体濃度は、０．００１％〜０．５％、好ましくは０．００３％〜０．０５％であり；ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウム濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
微生物の細胞浸透試薬は、少なくとも１種の透過化剤、洗剤、イオンキレート化剤、及び防腐剤の混合物を少なくとも含む溶液であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞浸透試薬において、最終試薬中の透過化剤、洗剤、イオンキレート化剤、及び防腐剤間の比率は、１×１０−４％／０．０３％／０．０２％／６×１０−４％〜２．５×１０−５％／０．８％／０．６％／０．０１５％であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
透過化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジギトニン、モネンシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム又は塩化ベンザルコニウムから選択されることを特徴とする請求項６又は７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＰＥＧ濃度は、０．０１％〜１％、かつ好ましくは０．０５％〜０．５％であり；ジギトニン濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌであり；モネンシン濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであり；ＰＥＩ濃度は、１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍｌであり；ヘキサメタリン酸ナトリウム濃度は、０．００５％〜１％、かつ好ましくは０．０１％〜０．１％であり；塩化ベンザルコニウム濃度は、０．００１％〜０．１％、かつ好ましくは０．００５％〜０．０５％であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
洗剤は、Ｎ−オクチル  β  Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）、サポニン、ツイーン、トリトン、Ｉｇｅｐａｌ及びＣＨＡＰＳを含む群から選択されることを特徴とする請求項６から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サポニン又はツイーン濃度は、０．００５％〜１０％、好ましくは０．０５％〜０．５％であり；ＮＯＧ濃度は、０．０１％〜１０％、好ましくは０．１％〜０．５％であり；トリトン濃度は、０．０００１％〜０．０５％、好ましくは０．０００８％〜０．００２％であり；Ｉｇｅｐａｌ濃度は、０．０１％〜２０％、好ましくは１％〜５％であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
イオンキレート化剤は、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含む群から選択されることを特徴とする請求項５から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＥＤＴＡ濃度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜７．５ｍＭであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
防腐剤は、ベタジン、セトリミド、ティーツリー油、テルピネン−４−オール、クロルヘキシジン、ポリミキシンＢ、及びリファンピシンを含む群から選択されることを特徴とする請求項５から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
クロルヘキシジン濃度は、０．０００５％〜０．５％、かつ好ましくは０．００１％〜０．０５％であり；セトリミド濃度は、０．０１％〜５％、かつ好ましくは０．０５％〜１％であり；ベタジン濃度は、０．０００１％〜０．００１％、かつ好ましくは０．０００５％〜０．００５％であり；ティーツリー油濃度は、０．０００１％〜０．１％、かつ好ましくは０．０００５％〜０．０５％であり；溶液の組成物中のテルピネン−４−オール濃度は、０．０５％〜１０％、かつ好ましくは０．５％〜５％であり；ポリミキシンＢ、及びリファンピシン濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
浸透試薬は、酵素及び／又はバクテリオシンを更に含むことを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
酵素は、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、かつ特には０．０５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度で使用されるリゾチームであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バクテリオシンは、好ましくは０．００５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、かつ特には０．００５μｇ／ｍｌ〜０．０５μｇ／ｍｌの濃度で使用されるナイシンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
浸透試薬は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、又はイオン（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、次亜塩素酸ナトリウム）又はショ糖を更に含むことを特徴とする請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＤＭＳＯ濃度は、０．０５％〜２０％、かつ好ましくは、０．５％〜５％であり；ショ糖濃度は、０．５％〜７０％、かつ好ましくは、５％〜２０％であり；次亜塩素酸ナトリウム濃度は、０．００１％〜５％、かつ好ましくは、０．００５％〜０．５％であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
微生物検出方法のステップｂ）は、２つの下位ステップｂ’）及びｂ’’で行われ、ステップｂ’）は、マーキング剤、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から選択され、好ましくは、ＰＥＩである透過化重合体を含む反応媒体と、試料を接触させることからなり；ステップｂ’’）は、少なくとも１種の洗剤、イオンキレート化剤、防腐剤、並びにナイシン、ジギトニン、モネンシン、ヘキサメタリン酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムから選択されるもう１種の透過化剤を含む混合物を、反応媒体に添加することからなることを特徴とする請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
マーキング剤、及び微生物の少なくとも１種の細胞浸透試薬を含むことを特徴とする微生物マーキング用反応媒体。
【請求項２３】
マーキング剤は、請求項２から５のいずれかに記載した通りであることを特徴とする請求項２２に記載の反応媒体。
【請求項２４】
微生物の細胞浸透試薬は、請求項６から２１のいずれかに記載した通りであることを特徴とする請求項２２に記載の反応媒体。
【請求項２５】
−１／２２０００のピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；
−最終濃度５．５μｇ／ｍｌのＰＥＩ；
−最終濃度４．５×１０−４％の二酢酸クロルヘキシジン；
−最終濃度０．１６％のＮ  オクチル  グルコピラノシド；
−最終濃度０．０１８μｇ／ｍｌのナイシン；
−最終濃度０．４５ｍＭのＥＤＴＡ；
−所望の最終量までのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含むことを特徴とする細胞浸透試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野に属し、かつ特には、微生物が存在し得る様々な媒体中での微生物の検出及び同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の微生物検出方法が開発され、種々の必要に応えた。例えば、医療試料の分析、農産物加工産業における品質管理、及び水処理検査を挙げることもできる。
【０００３】
理想的な微生物検出方法は、迅速、特異的（偽陽性がないこと）、高精度かつ利用が簡易であるべきである。それは、種々の媒体中での生きている微生物及び死んだ微生物の検出を可能にするであろう。結局、関与する細菌型を最初に同定することは、補足的な武器となるであろう。
【０００４】
皿（ｂｏｉｔｅ）上又は液相での培養方法により、大部分の媒体中での増殖相のあらゆる細菌の検出が高い精度で可能になる。理論上、培養後に陽性結果を得るためには、１種だけの細菌で十分であり、かつ液相培養は、オートメーション化可能である（Ａｕｂｅｒｔ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）。しかしながら、結果を得るために必要な時間は、時折非常に長くなる。例えば、プロピオニバクテリウム株の血液製剤中の検出は、４日以上の培養を必要とする（Ｂｒｅｃｈｅｒ  ＭＥ．ｅｔ  ａｌ．、２００１）。ミコバクテリウムに関して、その検出には２０日以上が、必要とされ得る（Ｓａｉｔｏｈ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、２０００）。同様に細菌の増殖は、単一又は濃縮されていても良く、かつ抗菌剤阻害因子を含む又は含まない、培地の選択によって大きな影響を及ぼされる。同様に、培養条件は、検出する株に特異的である。例えば、種々のインキュベーション温度及び好気又は嫌気条件を使用する。これらの方法により、微生物の同定は、培養に続く第２段階でなされねばならない。結局、死んだ又は回復不可能な細菌の検出は、このタイプの技術をもっては不可能である。
【０００５】
試料が陽性であると宣言するためには、数時間のインキュベーションで十分であるので、分子生物学技術を利用する方法は、迅速であり、かつ高精度で、反応あたり１０未満の微生物を検出する可能性を有する。
【０００６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的ＤＮＡに特異的な蛍光プローブを使用して、試料中の細菌汚染のリアルタイム検出を可能にする（Ｈｅ  Ｑ．ｅｔ  ａｌ．、２００２）。潜在的阻害因子の増幅反応に必要なポリメラーゼを保護するためには、この試料を精製することが必要である。例えば、血漿中では、多数のＰＣＲ阻害因子が見つかる（Ａｌ−Ｓｏｕｄ  ＷＡ．ｅｔ  ａｌ．、２０００）。この予備精製ステップのため、ＰＣＲを利用する微生物検出方法が、容易な使用プロセスではなくなる。同様に、白血球による貪食細菌を含んだ試料の場合に、いかなる微量の残余ＤＮＡであっても、試料の陽性をもたらすが、このことは、方法の特異性を大いに損なう。
【０００７】
ハイブリダイゼーション技術は、万能細菌検出及び／又は特異的検出を可能にする（Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄ  ＥＢ．ｅｔ  ａｌ．、１９９２；Ｐｏｐｐｅｒｔ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。ＰＣＲに関するように、試料調製ステップは、この方法においてまたも制約的、かつ限定的なステップである。残余核酸の存在は、またも偽陽性の根源である。
【０００８】
分子生物学技術の主な限界は、特異性が、属の検出のために十分に広く、かつそれにもかかわらず、偽陽性反応を回避するために、検出する微生物に特異的であるべきである、プライマー選択にある。様々なプライマーの混合は、一般的に必要であり、技術的制約を引き起こす。
【０００９】
細菌壁に向けられる抗体に頼る免疫組織化学又は免疫細胞化学的マーキング方法（酵素結合免疫吸着検定法、ＥＬＩＳＡ）は、抗体の特異性によって限定される。実際、今日までいかなる抗体も万能微生物検出を可能にしない。この技術は、正確に同定された細菌株に関してしか使用可能でない（Ｋａｋｉｎｏｋｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｇｕａｒｎｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、２００２）。この技術は、例えば、アセトン、ホルムアルデヒド及びメタノール型の溶剤を介在させる、試料の固定及び細胞浸透ステップを含む、分析する細胞又は組織を特別に調製することを同様に必要とする。
【００１０】
例えばグラム色素、又は生体色素若しくは蛍光色素を使用する比色分析に頼る顕微鏡法は、汚染に関与する細菌型の視覚による形態的同定を可能にする（Ｆａｚｉｉ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、２００２）。しかしながら、それらは精度が足りず、かつ視覚化を可能にするためには、多大な操作段階、並びに微生物の数日間の増殖を必要とする（Ｍｉｒｒｅｔｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、１９８２）。
【００１１】
細胞数測定の使用は、迅速かつ簡易に微生物を検出することを可能にする（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＤＴ．ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｏｋａｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、２０００）。
【００１２】
しかしながら、この方法の限界は、マーキング方法にある。実際、万能細菌検出を可能にしない標的株の壁に特異的な抗体か、挿入剤（核酸の対合塩基によって形成されるプレート間に挿入されることが可能な分子）型のＤＮＡマーカーが使用される。しかしながら、後者の選択肢は、マーカーを浸透させるために、壁を透過化することを目的とする細菌の予備操作を必要とする（Ｍａｒｉｅ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｏｋａｄａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、２０００）。これらの薬剤が、媒体中で特に精度が高く、かつイオン濃度及びｐＨの厳密に定義された条件においてのみ有効であることは、注目に値する（Ｍａｒｉｅ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、１９９６）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記に列挙した不都合を緩和するために、出願人は、あらゆる細菌、酵母、カビ及び寄生体に共通なマーカー、例えば特別な核配列に特異的でない、ＤＮＡ挿入化合物を利用する万能微生物検出方法を考え出した。
【００１４】
この検出方法は、あらゆる生体液に応用され得る。本発明の意味で、生体液とは、１種又は数種の微生物を含み得るあらゆる流体、例えばイオン媒体、培地、生理的媒体、例えば血液又はその誘導体、例えば濃縮血小板又は赤血球又は血漿を意味し、かつこのように種々の応用分野、例えば医療試料の分析、農産物加工産業における品質管理、又は水処理検査に関する。
【００１５】
好適には、本発明によれば、微生物の検出方法は、血液又はその誘導体、例えば濃縮血小板又は赤血球又は血漿に応用される。
【００１６】
本発明の対象である、微生物マーキング方法は、マーキング剤、微生物のゲノムに向けた前記マーキング剤の分子通過を、前記微生物の性質がいかなるものであろうと促進する細胞浸透剤を含む反応媒体を利用する。全く好適には、本発明のマーキング方法は、微生物、特に細菌の構造を完全に（ｉｎｔｅｇｒｅ）保存することを可能にする。
【００１７】
この反応媒体は：
−微生物がいかなるものであれ、微生物の細胞質膜、すなわち脂質二重層及び膜タンパク質；
−細胞質膜と接触するようになり、かつ場合により多糖類の表層で被覆されるペプチドグリカン又はムレインから、大部分がなるグラム陽性細菌壁；
−多くのリン脂質、リポタンパク質及びリポ多糖類を含み、タンパク質が見られる細胞周辺腔によって細胞質膜から分離され、かつ細孔が穿たれる、グラム陰性細菌外膜を通るマーキング剤の通過を可能にする。この壁は、細孔から浸透する物質を除き、大部分の物質を通さない。
【００１８】
この新規な微生物マーキング方法は、生きている微生物、及び死んだ又は回復不可能な万能微生物マーキングを可能にする。
【００１９】
このようにマークされた微生物の分析は、エピ蛍光顕微鏡による顕微鏡法、及び／又は流動細胞数測定、及び／又は固相細胞数測定によって蛍光で例えば実行可能である。
【００２０】
本発明の方法は、微生物を含む試料からの微生物の最初の調製を含む。微生物の形態を変化させ、かつ微生物を蛍光でマークすることなく、様々な試薬が、微生物に浸透するために同一ステップにおいて使用される。
【００２１】
本発明の方法は、大きな科の微生物：すなわち、桿状菌、球菌、胞子、酵母を視覚的に区別することを場合により可能にする、細胞生物学技術に従った分析のために、細菌の構造を完全に保存することを可能にする。
【００２２】
前記方法は、微生物の形状及び大きさに基づき、微生物の検出及び形態同定を同時に可能にする。この方法は、様々な生理的媒体、培地、及び／又はイオン媒体中の微生物検出に応用可能である。
【００２３】
好適には、前記方法は、血液又はその誘導体、例えば濃縮血小板又は赤血球又は血漿中の、微生物の形状及び大きさに基づき、微生物の検出及び形態同定を同時に可能にする。
【００２４】
万能微生物検出方法は、４又は５つのステップを含む。
【００２５】
水、緩衝液、生理的食塩水、培地、血液、血漿又は血液誘導体中の懸濁状微生物は、ＤＮＡ挿入剤及び少なくとも１種の細胞浸透試薬を含む単一の反応媒体の存在下に置かれる。
【００２６】
細胞浸透試薬とは、本発明によれば、少なくとも１種の透過化剤、洗剤、イオンキレート化剤、及び防腐剤の混合物を少なくとも含む溶液を意味する。
【００２７】
より正確には、本発明は、場合により生体液中に存在する微生物の検出方法であって、次のステップ：
ａ）前記生体液の試料を採取し、
ｂ）マーキング剤、及び前記微生物の膜の細胞浸透試薬を含む反応媒体と、前記試料を接触させ、
ｃ）場合により前記試料中に存在するマークされた微生物を保持する可能性があるフィルタ上で、前記試料を濾過し、かつ
ｄ）マークされ、かつステップ（ｃ）でフィルタ中に保持される微生物を検出することを含む方法を対象とする。
【００２８】
好ましくは、マーキング剤は、シアニン誘導体、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ及び臭化エチジウムを含む群から選択されるＤＮＡ挿入化合物である。好適には、シアニン誘導体は、ピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ）及びＹＯＰＲＯ１からなる群から選択される。それらの好ましい濃度に関して、シアニン誘導体濃度は、０．００１％〜０．５％（体積／体積）、好ましくは０．００３％〜０．０５％であり、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウム濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは１μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌである。
【００２９】
好ましくは、マーキング剤は、ピコグリーンである。
【００３０】
以下、明細書及び請求項において、かつ反対の指示がなければ実施例において、好ましい濃度とは、最終反応媒体「生体試料及び反応媒体（マーキング剤＋細胞浸透試薬）中で検討される生成物の濃度を意味する。当業者なら、例えば濃縮原液中で、浸透試薬の様々な成分の濃度を難なく適応させることができる。
【００３１】
好ましくは、微生物の細胞浸透試薬は、少なくとも１種の透過化剤、洗剤、イオンキレート化剤、及び防腐剤の混合物を少なくとも含む溶液である。
【００３２】
本発明によれば、最終試薬中の透過化剤、洗剤、イオンキレート化剤、及び防腐剤の（重量）百分率は、１×１０−４％／０．０３％／０．０２％／６×１０−４％〜２．５×１０−３％／０．８％／０．６％／０．０１５％である。
【００３３】
透過化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジギトニン、モネンシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムから選択される。
【００３４】
前記透過化剤の好ましい濃度は、以下の通りである：
−ＰＥＧ濃度は、０．０１％〜１％、かつ好ましくは０．０５％〜０．５％；
−ジギトニン濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ；
−モネンシン濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ；
−ＰＥＩ濃度は、１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍｌ；
−ヘキサメタリン酸ナトリウム濃度は、０．００５％〜１％、かつ好ましくは０．０１％〜０．１％；
−塩化ベンザルコニウム濃度は、０．００１％〜０．１％、かつ好ましくは０．００５％〜０．０５％。
【００３５】
好ましくは、透過化剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。
【００３６】
洗剤の中では、Ｎ−オクチル  β  Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）、サポニン、ツイーン、トリトン、Ｉｇｅｐａｌ及びＣＨＡＰＳを含む群の洗剤が好まれる。それらの好ましい濃度を、以下に詳述する：
−サポニン又はツイーン濃度は、０．００５％〜１０％、好ましくは０．０５％〜０．５％；
−ＮＯＧ濃度は、０．０１％〜１０％、好ましくは０．１％〜０．５％；
−トリトン濃度は、０．０００１％〜０．０５％、好ましくは０．０００８％〜０．００２％；
−Ｉｇｅｐａｌ濃度は、０．０１％〜２０％、好ましくは１％〜５％。
【００３７】
好ましくは、洗剤は、Ｎ−オクチル  β  Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）である。
【００３８】
イオンキレート化剤として、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含む群のイオンキレート化剤が好まれる。
【００３９】
好適には、イオンキレート化剤濃度は、０．０５％〜０．８％である。
【００４０】
好ましくは、イオンキレート化剤は、ＥＤＴＡである。
【００４１】
好適には、ＥＤＴＡ濃度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜７．５ｍＭである。
【００４２】
防腐剤は、ベタジン、セトリミド、ティーツリー油、テルピネン−４−オール、クロルヘキシジン、ポリミキシンＢ、及びリファンピシンを含む群から選択される。
【００４３】
好ましくは、防腐剤は、クロルヘキシジンである。
【００４４】
好適には、クロルヘキシジン濃度は、０．０００５％〜０．５％、かつ好ましくは０．００１％〜０．０５％である。
【００４５】
セトリミド濃度は、０．０１％〜５％、かつ好ましくは０．０５％〜１％である。
【００４６】
ベタジン濃度は、０．０００１％〜０．００１％、かつ好ましくは０．０００５％〜０．００５％である。
【００４７】
ティーツリー油濃度は、０．０００１％〜０．１％、かつ好ましくは０．０００５％〜０．０５％である。
【００４８】
テルピネン−４−オール濃度は、０．０５％〜１０％、かつ好ましくは０．５％〜５％である。
【００４９】
ポリミキシンＢ、及びリファンピシン濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００５０】
浸透試薬は、酵素又はバクテリオシンを更に含み得る。
【００５１】
酵素として、好ましくはリゾチームが使用され、かつバクテリオシンとして、好ましくはナイシンが使用される。
【００５２】
好適には、リゾチーム濃度は、０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌであり、かつナイシン濃度は、０．００５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００５μｇ／ｍｌ〜０．０５μｇ／ｍｌである。
【００５３】
細菌壁に効果的に浸透するために、本発明によれば、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、又はイオン（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、次亜塩素酸ナトリウム）又はショ糖を更に使用することができる。
【００５４】
ＤＭＳＯ濃度は、０．０５％〜２０％、かつ好ましくは、０．５％〜５％である。
【００５５】
ショ糖濃度は、０．５％〜７０％、かつ好ましくは、５％〜２０％である。
【００５６】
次亜塩素酸ナトリウム濃度は、０．００１％〜５％、かつ好ましくは、０．００５％〜０．５％である。
【００５７】
クエン酸カリウム濃度は、０．５ｍＭ〜２００ｍＭ、かつ好ましくは、５ｍＭ〜５０ｍＭである。
【００５８】
本発明の特殊な実施態様によれば、微生物検出方法のステップｂ）は、２つの下位ステップｂ’）及びｂ’’）で行われる。
【００５９】
ステップｂ’）で、マーキング剤、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から選択される透過化重合体を含む反応媒体と、試料を接触させる。好ましくは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する。
【００６０】
ステップｂ’’）で、少なくとも１種の洗剤、イオンキレート化剤、防腐剤、並びにナイシン、ジギトニン、モネンシン、ヘキサメタリン酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムから選択されるもう１種の透過化剤を含む混合物を、反応媒体に添加する。
【００６１】
本発明の方法のステップｂ）が、２つのステップｂ’）及びｂ’’）で行われる時、酵素が、ステップｂ’’）で添加される。
【００６２】
本発明は、マーキング剤及び微生物の細胞浸透試薬を含む微生物マーキング用反応媒体を同様に対象とする。
【００６３】
好ましくは、本発明によれば、微生物マーキング用反応媒体中に含まれるマーキング剤及び浸透試薬、並びにそれらの濃度又はそれらの成分の濃度は、本発明による検出方法で使用されるような、前述のものと同一である。
【００６４】
本発明による好ましい細胞浸透試薬は：
−１／２２０００のピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；
−最終濃度５．５μｇ／ｍｌのＰＥＩ；
−最終濃度４．５×１０−４％の二酢酸クロルヘキシジン；
−最終濃度０．１６％のＮ  オクチル  グルコピラノシド；
−最終濃度０．０１８μｇ／ｍｌのナイシン；
−最終濃度０．４５ｍＭのＥＤＴＡ；
−所望の最終量までのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００６５】
本発明は、添付図面を伴う、以下に示す実施例を用いて明らかにする。添付図面中、濃度は、浸透試薬中の濃度として示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
試料中の微生物検出方法は、２つのステップでの試料処理を利用して実行され得、第１のマーキング／細胞浸透ステップは、マーキング剤及び第１細胞浸透試薬を含む組成物を前記試料に添加し、インキュベーション段階後に、他の細胞浸透試薬を含む組成物を添加する第２ステップが続く。
【００６７】
かかる方法は、例えば以下に記載する手順に従って実施され得る。
【００６８】
３ミリリットルの処理する試料が、４０分間、１ミリリットルの第１細胞浸透／マーキング溶液（ピコグリーン０．５ｍｌ／ｌ、ＰＥＩ６０ｍｇ／ｌ、ＰＢＳ溶液）中でインキュベートされる。このステップは、外界温度で攪拌して行われる。
【００６９】
第２ステップで、マーキングを続行することを可能にする７ミリリットルの溶解組成物（ナイシン０．２ｍｇ／ｌ、ＮＯＧ２．５ｇ／ｌ、ＥＤＴＡ１．８６ｇ／ｌ、二酢酸クロルヘキシジン５０ｍｌｇ／ｌ）を添加する。インキュベーションは、外界温度で２０分間行われる。試料は次に、例えばポリカーボネート又はポリエステルの、黒色フィルタ上で濾過され、かつ固相細胞数測定によって分析される。
【００７０】
試料中の微生物検出方法は同様に、マーキング剤及び１種又は数種の細胞浸透剤を含む組成物を前記試料に添加して、唯一のステップでの試料処理を利用して、実行され得る。
【００７１】
かかる方法は、例えば以下に記載する手順に従って実施され得る。
【００７２】
８ミリリットルの処理する試料が、６０分間、外界温度で３ミリリットルの細胞浸透／マーキング溶液（ピコグリーン０．１７ｍｌ／ｌ、ＰＥＩ２０ｍｇ／ｌ、ＥＤＴＡ４．３４ｇ／ｌ、ナイシン０．４７ｍｇ／ｌ、ＮＯＧ５．８３ｇ／ｌ、二酢酸クロルヘキシジン１１６．７ｍｇ／ｌ）によってインキュベートされる。試料は次に、ポリカーボネートの黒色フィルタ上で濾過され、かつ固相細胞数測定によって分析される。
【００７３】
これらの処理全体は、開放装置、例えば管、又は注射器のような閉鎖装置、又は細菌分析のために血小板を調製する装置において一様に行われ得る（Ｈｅｍｏｓｙｓｔｅｍ、ｒｅｆ  ＳＰＫ０１）。
【００７４】
微生物検出。
マーキング／細胞浸透用反応媒体の最適な組成物の決定。
【００７５】
１−ナイシン存在下のマーキング。
マーキング剤の浸透を促進するための、透過化剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｎｔ）としてのナイシン単独の使用。
【００７６】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【００７７】
ナイシン溶液
蒸留水で、一連のナイシン希釈を調製する（２．５％重量／重量の原料）：
５０ｍｌの蒸留水中の０．１ｇのナイシン＝溶液５０μｇ
５０ｍｌの蒸留水中の０．０２ｇのナイシン＝溶液１０μｇ
５０ｍｌの蒸留水中の０．００４ｇのナイシン＝溶液２μｇ
【００７８】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
表皮ブドウ球菌（６８．２１）
１０４細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【００７９】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋７ｍｌのナイシン溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【００８０】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、固相細胞数測定で検出された細菌数、及び酵素検出方法に対して検出された細菌の率で示される。
【００８１】
これらの結果は、表皮ブドウ球菌及び大腸菌の検出に対するナイシン添加の影響を示し、かつ添付の図１Ａ及び１Ｂに図示される。
【００８２】
ナイシンの添加は、グラム＋の良好なマーキングを得ることを可能にすること、及び低い濃度が好ましいことを確認できる。
【００８３】
２−マーキング剤の浸透を促進するための、透過化剤としてのＥＤＴＡ単独の使用。
【００８４】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【００８５】
ＥＤＴＡ溶液
ＥＤＴＡ５ｍＭ：０．０９３ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの蒸留水。
【００８６】
ＰＢＳ、蒸留水、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブイヨン）媒体及び血漿で調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
表皮ブドウ球菌（ＣＩＰ６８．２１）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【００８７】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋様々な媒体中の３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋７ｍｌのＥＤＴＡ溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【００８８】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、蛍光細菌数で示される。
【００８９】
これらの結果は、様々なテスト媒体中で調製された表皮ブドウ球菌及び大腸菌の検出のための単独で使用されたＥＤＴＡの効果を示し、かつ添付の図２に図示される。
【００９０】
ＥＤＴＡ単独は、グラム＋及びグラム−細菌の正しいマーキングを可能にしないことを確認できる。
【００９１】
３−マーキング剤の浸透を促進するための、透過化剤としてのナイシン／ＥＤＴＡの組み合わせの使用。
【００９２】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【００９３】
ナイシン／ＥＤＴＡ溶液
ナイシン１０μｇ／ｍｌ：０．０２ｇのナイシン（２．５％重量／重量の原料）、全体で５０ｍｌの蒸留水
ＥＤＴＡ２０ｍＭ：０．３７２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの蒸留水。
０．２５；２．５；１２．５及び１８．７５ｍｌのＥＤＴＡ２０ｍＭにより、広い段階のＥＤＴＡを調製する（濃度段階０．１；１；５及び７．５ｍＭ）
５０、２５０、５００μＬ又は１ｍｌのナイシン１０μｇ／ｍｌを添加する（濃度段階０．０１；０．０５；０．１及び０．２μｇ／ｍｌ）
全体で５０ｍｌの蒸留水
【００９４】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【００９５】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋７ｍｌのナイシン又はナイシン／ＥＤＴＡ溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【００９６】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、固相細胞数測定で検出された細菌数、及び酵素検出方法に対して検出された細菌の率で示される。
【００９７】
これらの結果は、大腸菌の検出に対する、ＥＤＴＡに組み合わされるナイシン添加の影響を示し、かつ添付の図３に図示される。
【００９８】
マーキングが、ナイシン／ＥＤＴＡ混合物の存在下で行われた時の、細菌検出に対する相乗効果を確認できる。マークされた大腸菌細菌の率が、０．１μｇ／ｍｌのナイシン濃度、及び７．５ｍＭのＥＤＴＡで最大であることを同様に確認できる。
【００９９】
４−細菌を検出するための、細胞浸透試薬としてのナイシン／ＥＤＴＡの組み合わせの濃度の最適化。
【０１００】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【０１０１】
ナイシン／ＥＤＴＡ溶液
５０ｍｌの蒸留水中の０．０２ｇのナイシン（２．５％重量／重量の原料）すなわち１０μｇ／ｍｌ
ナイシン０．０５μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭ：２５０μｌのナイシン１０μｇ／ｍｌ＋０．１４０ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの蒸留水、
ナイシン０．１μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭ：５００μｌのナイシン１０μｇ／ｍｌ＋０．１４０ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの蒸留水、
ナイシン０．５μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭ：２．５ｍｌのナイシン１０μｇ／ｍｌ＋０．１４０ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの水。
【０１０２】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
表皮ブドウ球菌（ＣＩＰ６８．２１）
霊菌（ＣＩＰ１０３７１６）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【０１０３】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋様々な濃度の７ｍｌのナイシン／ＥＤＴＡ溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【０１０４】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、固相細胞数測定で検出された細菌数で示される。ＥＤＴＡ７．５ｍＭに組み合わされた、様々な濃度のナイシンの存在下でのグラム−細菌（大腸菌、霊菌）及びグラム＋細菌（表皮ブドウ球菌）の検出を示すこの実験の結果は、添付の図４に図示される。
【０１０５】
マークされた大腸菌細菌の率が、０．１μｇ／ｍｌのナイシン濃度で最大であること、及び濃度７．５ｍＭのＥＤＴＡに組み合わせた、濃度０．２μｇ／ｍｌのナイシンを使用する時に、テストした細菌全体がより良く検出されることを確認できる。
【０１０６】
５−ナイシン／ＥＤＴＡの存在下での細菌マーキングに対するｐＨの影響
【０１０７】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【０１０８】
ナイシン／ＥＤＴＡ溶液
ナイシン１０μｇ／ｍｌ：０．０２ｇのナイシン（２．５％重量／重量の原料）、全体で５０ｍｌの蒸留水
ＥＤＴＡ２０ｍＭ：０．３７２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの蒸留水、
１８．７５ｍｌのＥＤＴＡ２０ｍＭ
＋１ｍｌのナイシン１０μｇ／ｍｌ
全体で５０ｍｌの蒸留水
この溶液は、ｐＨ４．８である
ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８までＮａＯＨ（１Ｍ）によって緩衝する。
【０１０９】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
表皮ブドウ球菌（ＣＩＰ６８．２１）
霊菌（ＣＩＰ１０３７１６）
エンテロバクターエロゲネス（ＣＩＰ６０．８６Ｔ）
緑膿菌（ＣＩＰ７６１１０）
プロテウスミラビリス（ＣＩＰ１０４５８８）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【０１１０】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋様々なｐＨの７ｍｌのナイシン／ＥＤＴＡ溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【０１１１】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、検出された蛍光細菌数で示される。
【０１１２】
ナイシン０．２μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭの存在下でのＤＮＡ蛍光マーカーによる大腸菌検出に対するｐＨの影響を示すこの実験の結果は、添付の図５に図示される。
【０１１３】
所定の条件において、ｐＨの増加は、大腸菌のマーキングを改良しないことが確認できる。
【０１１４】
ｐＨ４．８で、ナイシン０．２μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭの存在下でのＤＮＡ蛍光マーカーによるグラム＋細菌、表皮ブドウ球菌、及びグラム−細菌、大腸菌、霊菌、エンテロバクターエロゲネス、緑膿菌、プロテウスミラビリスの検出は、添付の図６に図示される。
【０１１５】
４．８のｐＨ条件で、グラム（−）細菌のマーキングは、株毎に均一であることが確認できる。グラム（＋）表皮ブドウ球菌の検出は、グラム（−）のそれよりも高い。
【０１１６】
６−ナイシン／ＥＤＴＡ／Ｎ  オクチル  グルコピラノシドの組み合わせ
【０１１７】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【０１１８】
ナイシン／ＥＤＴＡ／ＮＯＧ溶液
ナイシン１００μｇ／ｍｌ：０．２ｇのナイシン（２．５％重量／重量の原料）、全体で５０ｍｌの蒸留水
ＥＤＴＡ１００ｍＭ：１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、全体で５０ｍｌの蒸留水、
Ｎ  オクチル  グルコピラノシド５％：５０ｍｌの蒸留水中、２．５ｇ
２０、１０、５又は２．５ｍｌのＮＯＧ、５％
＋３．７５ｍｌのＥＤＴＡ１００ｍＭ
＋０．１ｍｌのナイシン１００μｇ／ｍｌ
全体で５０ｍｌの蒸留水
この溶液は、ｐＨ４．８である。
【０１１９】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
表皮ブドウ球菌（ＣＩＰ６８．２１）
緑膿菌（ＣＩＰ７６１１０）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【０１２０】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋７ｍｌのナイシン／ＥＤＴＡ又はナイシン／ＥＤＴＡ／ＮＯＧ溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【０１２１】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、蛍光細菌数で示される。
【０１２２】
表皮ブドウ球菌（グラム＋）及び緑膿菌（グラム−）のマーキングを改良するために、ナイシン０．２μｇ／ｍｌ及びＥＤＴＡ７．５ｍＭと、微生物細胞浸透試薬としてのＮ  オクチル  グルコピラノシドを組み合わせる反応媒体の組成物による、この実験の結果は、添付の図７に図示する。
【０１２３】
０．２５％及び０．５％でのＮ  オクチル  グルコピラノシドの添加が、表皮ブドウ球菌及び緑膿菌のマーキングに関してプラスの効果を有することを確認できる。
【０１２４】
７−クロルヘキシジン存在下でのマーキング
細菌マーキング剤の浸透を促進するための、透過化剤としてのクロルヘキシジン単独を利用するテスト。
【０１２５】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【０１２６】
クロルヘキシジン溶液
二酢酸クロルヘキシジン５％：２０ｍｌの蒸留水中、１ｇ
０．０１％；０．００５％又は０．００１％の濃度段階を得るために、５０ｍｌの蒸留水中、５０、２５又は１０μｌの二酢酸クロルヘキシジン５％。
【０１２７】
ＰＢＳ、濃縮血小板、及び自己血漿で調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
表皮ブドウ球菌（ＣＩＰ６８．２１）
霊菌（ＣＩＰ１０３７１６）
緑膿菌（ＣＩＰ７６１１０）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【０１２８】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋様々な濃度の７ｍｌのクロルヘキシジン溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【０１２９】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、蛍光細菌数で示される。４８時間のペトリ皿上での計数が、基準方法の代わりとなる。
【０１３０】
大腸菌、緑膿菌、及び霊菌（グラム−細菌株）並びに表皮ブドウ球菌のマーキングを改良するために、細胞浸透試薬としてのクロルヘキシジンを含む反応媒体の組成物による、この実験の結果は、添付の図８に図示する。
【０１３１】
グラム−細菌検出のためのクロルヘキシジンの最適濃度は、０．００５％であることが確認できる。しかしながら、この濃度は、グラム＋細菌にとっては有害であり、グラム＋細菌は、破壊される。
【０１３２】
図９に図示するように、血漿の存在は、緑膿菌用マーカーの細胞浸透に対するクロルヘキシジンの効果を遮断することが確認される。生体液を含む様々な媒体中での万能マーキングに関して、クロルヘキシジン単独は、使用できない。
【０１３３】
８−クロルヘキシジン／Ｎ  オクチル  グルコピラノシドの組み合わせ
【０１３４】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製する。
【０１３５】
クロルヘキシジン／Ｎ  オクチル  グルコピラノシド溶液
二酢酸クロルヘキシジン５％：２０ｍｌの蒸留水中、１ｇ
Ｎ  オクチル  グルコピラノシド１％：５０ｍｌの蒸留水中、０．５ｇ
５０又は２５μｌの二酢酸クロルヘキシジン１％（０．００１％又は０．０００５％の最終濃度）
＋Ｎ  オクチル  グルコピラノシド、５％（最終濃度＝０．２５％）
全体で５０ｍｌの蒸留水。
【０１３６】
ＰＢＳ、及びアフェレーシスの濃縮血小板で調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）
表皮ブドウ球菌（６８．２１）
霊菌（ＣＩＰ１０３７１６）
緑膿菌（ＣＩＰ７６１１０）
１０３細菌／ｍｌの懸濁液を得るように、調合物を調節する。
【０１３７】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの細菌懸濁液
２２℃で１５分のインキュベーション
＋７ｍｌのクロルヘキシジン／ＮＯＧ溶液
０．４μｍの多孔度の黒色フィルタ上での濾過。
【０１３８】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、蛍光細菌数で示される。
【０１３９】
マーカーの透過化能及び浸透を増加させるために、ＮＯＧと組み合わせるクロルヘキシジンを含む反応媒体の組成物の存在下でのＤＮＡマーキング及びマークされた細菌の検出を示すこの実験の結果は、添付の図１０Ａ及び１０Ｂに図示する。
【０１４０】
最も高いクロルヘキシジン濃度は、最良の細菌マーキングを得ることを可能にすることが観察される。
【０１４１】
９−ＰＥＩ単独の存在下でのマーキング
【０１４２】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製し、かつＰＥＩを４０、８０、１００、１２０、１４０及び１６０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加する。
【０１４３】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
霊菌（ＣＩＰ１０３７１６）
【０１４４】
分析する試料
霊菌の最終濃度１０４／ｍｌを得るための濃縮血小板試料中の、＞１／２０の希釈の細菌懸濁液。
【０１４５】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの試料
２３℃で４５分のインキュベーション
５μｍの濾過（ＰＡＬＬ  ３２ｍｍフィルタ）
７ｍｌのＰＢＳ中での２０分のインキュベーション
０．４μｍの多孔度の濾過。
【０１４６】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、検出された蛍光細菌数で示される。
【０１４７】
ＤＮＡ蛍光マーカーによる霊菌検出に対する様々なＰＥＩ濃度の効果を示すこの実験の結果は、添付の図１１に図示する。
【０１４８】
細菌の最適な検出が、４０〜１００μｇ／ｍｌのＰＥＩ濃度段階によって得られることが確認できる。
【０１４９】
１０−ナイシン／ＥＤＴＡ／Ｎ  オクチル  グルコピラノシド／クロルヘキシジン／ＰＥＩの組み合わせ
この実験の目的は、大腸菌マーキングのための最適なＰＥＩ濃度段階を決定することである。
【０１５０】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製し、かつＰＥＩを１００、８０及び６０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加する。
【０１５１】
クロルヘキシジン／Ｎ  オクチル  グルコピラノシド／ＥＤＴＡ溶液
５００μＬの二酢酸クロルヘキシジン、０．５％（二酢酸クロルヘキシジン、最終５×１０−３％）
＋１ｍｌ又は５００μＬのＮ  オクチル  グルコピラノシド、２５％（Ｎ  オクチル  グルコピラノシド、最終０．５又は０．２５％）
＋５００μＬのナイシン２０μｇ／ｍｌ（ナイシン、最終０．２μｇ／ｍｌ）
＋５００μＬのＥＤＴＡ０．５Ｍ（ＥＤＴＡ、最終５ｍＭ）
全体で５０ｍｌのＰＢＳ。
【０１５２】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）、１０４細菌／ｍｌに濃度調節。
【０１５３】
分析する試料
細菌の最終濃度１０５／ｍｌを得るための濃縮血小板試料中の、３ｍｌの細菌懸濁液＋２７ｍｌの濃縮血小板、すなわち１／１０の希釈の細菌懸濁液。
【０１５４】
ＩＩ  方法
６０、８０又は１００μｇ／ｍｌのＰＥＩを有する１．２ｍｌのマーキング溶液
＋３ｍｌの試料
２３℃で４５分のインキュベーション
５μｍの濾過（ＰＡＬＬ  ３２ｍｍフィルタ）
０．５％又は０．２５％のＮＯＧを有する７ｍｌの細胞浸透溶液中での２０分のインキュベーション
０．４μｍの濾過（ワットマンモノカラー黒色フィルタ）。
【０１５５】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、検出された蛍光細菌数で示される。
【０１５６】
蛍光でのＤＮＡマーキング及び大腸菌検出に対するＰＥＩの効果を示すこの実験の結果は、添付の図１２に図示する。
【０１５７】
ＮＯＧ濃度がいかなるものであれ、６０μｇ／ｍｌのＰＥＩ濃度は、ＤＮＡマーカーの最適な浸透を可能にすることを確認できる。
【０１５８】
１１−様々な媒体中の万能細菌マーキング
【０１５９】
Ｉ  試薬
マーキング溶液
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）で、１／２０００のピコグリーン溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を調製し、かつＰＥＩを６０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加する。
【０１６０】
クロルヘキシジン／Ｎ  オクチル  グルコサミン（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）／ＥＤＴＡ／ナイシン溶液
５００μｌの二酢酸クロルヘキシジン、０．５％（二酢酸クロルヘキシジン、最終５×１０−３％）
＋５００μｌのＮ  オクチル  グルコピラノシド、２５％（Ｎ  オクチル  グルコピラノシド、最終０．２５％）
＋５００μｌのナイシン２０μｇ／ｍｌ（ナイシン、最終０．２μｇ／ｍｌ）
＋５００μｌのＥＤＴＡ０．５Ｍ（ＥＤＴＡ、最終５ｍＭ）
全体で５０ｍｌのＰＢＳ。
【０１６１】
ＰＢＳで調製する細菌懸濁液
大腸菌（ＣＩＰ１０５９０１）、１０４細菌／ｍｌに濃度調節
表皮ブドウ球菌（６８．２１）。
【０１６２】
分析する試料
細菌の最終濃度１０５／ｍｌを得るための生体液試料中の１／１０の希釈の細菌懸濁液、すなわち：
３ｍｌの細菌懸濁液＋２７ｍｌの蒸留水
３ｍｌの細菌懸濁液＋２７ｍｌのＰＢＳ
３ｍｌの細菌懸濁液＋２７ｍｌの培地（トリプトン大豆ブイヨン）
３ｍｌの細菌懸濁液＋２７ｍｌのヒト血漿
３ｍｌの細菌懸濁液＋２７ｍｌの濃縮血小板。
【０１６３】
ＩＩ  方法
１．２ｍｌのマーキング溶液＋３ｍｌの試料
２３℃で４５分のインキュベーション
５μｍの濾過
７ｍｌの細胞浸透溶液中での２０分のインキュベーション
０．４μｍの多孔度の濾過。
【０１６４】
ＩＩＩ  分析及び結果
濾過後、フィルタは、固相細胞数測定によって分析され、かつ結果は、検出された蛍光細菌数で示される。
【０１６５】
様々な媒体中での表皮ブドウ球菌及び大腸菌の検出を示すこの実験の結果は、添付の図１３に図示する。
【０１６６】
このように定義される配合は、様々なイオン媒体、培地及び生理媒体中のグラム＋細菌、及びグラム−細菌の検出を可能にする。この検出は、２つの細菌型に関して同程度である。
【０１６７】
（参考文献）
2006507010.tif 000002
2006507010.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】表皮ブドウ球菌及び大腸菌の検出に対するナイシン添加の影響を示す。結果は、固相細胞数測定で検出された細菌数（図１Ａ）、及び酵素検出方法に対し検出された細菌の率（図１Ｂ）で示す。
【図２】様々なテスト媒体中で調製された表皮ブドウ球菌、及び大腸菌検出のために単独で使用されるＥＤＴＡの効果を示す。
【図３】グラム−細菌（大腸菌）の検出を改良するために、様々な濃度のＥＤＴＡに組み合わせた、様々な濃度のナイシンのテスト結果を図示する。結果は、酵素検出方法に対する検出率で示す。
【図４】グラム−細菌（大腸菌及び霊菌）及びグラム＋細菌（表皮ブドウ球菌）を検出するために、７．５ｍＭの固定濃度のＥＤＴＡに組み合わせた、様々な濃度のナイシンのテスト結果を図示する。結果は、固相細胞数測定でフィルタ上に検出された細菌数で示す。
【図５】ナイシン０．２μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭの存在下で、ＤＮＡ蛍光マーカーによる大腸菌検出に対するｐＨの影響を図示する。
【図６】ｐＨ４．８で、ナイシン０．２μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭの存在下で、ＤＮＡ蛍光マーカーによるグラム−細菌、大腸菌、霊菌、エンテロバクターエロゲネス、緑膿菌、プロテウスミラビリスの検出を示す。
【図７】表皮ブドウ球菌（グラム＋）及び緑膿菌（グラム−）のマーキングを改良するために、ナイシン０．２μｇ／ｍｌ及びＥＤＴＡ７．５ｍＭと組み合わせた、細胞浸透試薬としてのＮ  オクチル  グルコピラノシドのテスト結果を示す。（Ｎ／Ｅ＝ナイシン０．２μｇ／ｍｌ／ＥＤＴＡ７．５ｍＭの溶液）。
【図８】大腸菌、緑膿菌、及び霊菌（グラム−細菌株）のマーキング並びに表皮ブドウ球菌に対する効果を改良するために、細胞浸透試薬としてのクロルヘキシジンによって得られた結果を示す。
【図９】様々な媒体中でのＤＮＡマーキング及び細菌（緑膿菌）検出を示す。
【図１０】クロルヘキシジンでのＤＮＡマーキング及び細菌検出を示し、かつマーカーの透過化能及び浸透を増加させるために、ＮＯＧと組み合わせる利益を証明する。図１０Ａは、ＰＢＳでの細菌懸濁液のマーキングを示す。図１０Ｂは、濃縮血小板での細菌懸濁液のマーキングを示す。
【図１１】ＤＮＡ蛍光マーカーによる霊菌検出に対する様々なＰＥＩ濃度の効果を示す。
【図１２】蛍光でのＤＮＡマーキング及び大腸菌検出に対するＰＥＩの効果を示す。
【図１３】様々な媒体中でのナイシン／ＥＤＴＡ／ＣＬＸ／ＮＯＧ／ＰＥＩを含むマーキング組成物の存在下での細菌、表皮ブドウ球菌及び大腸菌の検出結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月19日(2005.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合により生体液中に存在する微生物の検出方法であって、
ａ）シアニン誘導体であるマーキング剤、及び前記微生物の膜の少なくとも１種の細胞浸透剤を含む反応媒体と、前記生体液の試料を接触させ、
ｂ）場合により前記試料中に存在するマークされた微生物を保持する可能性があるフィルタ上で、前記試料を濾過し、かつ
ｃ）マークされ、かつステップ（ｂ）でフィルタ中に保持された微生物を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
好適にはピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ）及びＹＯＰＲＯ１からなる群から選択されるシアニン誘導体濃度は、０．００１％〜０．５％、好ましくは０．０１％〜０．１％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物の細胞浸透剤は、洗剤、酵素、バクテリオシン、イオンキレート化剤、固定剤、又は透過化剤を含む群から選択されることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
洗剤は、Ｎ−オクチル  β  Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）、サポニン、ツイーン、トリトン、Ｉｇｅｐａｌ及びＣＨＡＰＳを含む群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サポニン又はツイーン濃度は、０．００５％〜１０％、好ましくは０．０５％〜０．５％であり；ＮＯＧ濃度は、０．０１％〜１０％、好ましくは０．２５％〜０．５％であり；トリトン濃度は、０．０００１％〜０．０５％、好ましくは０．０００８％〜０．００２％であり；Ｉｇｅｐａｌ濃度は、０．０１％〜２０％、好ましくは１％〜５％であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵素は、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、かつ特には０．０５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度で使用されるリゾチームであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
バクテリオシンは、好ましくは０．００５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、かつ特には０．００５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの濃度で使用されるナイシンであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
イオンキレート化剤は、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含む群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ＥＤＴＡ濃度は、０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜７．５ｍＭであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
固定剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、ストレプトリジン  Ｏ、四酸化オスミウム及びオルトフタルアルデヒドから選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド濃度は、０．０５％〜１０％、かつ好ましくは０．５％〜２．５％であり；エタノール又はストレプトリジン  Ｏ濃度は、０．１％〜２０％、好ましくは１％〜５％であり；四酸化オスミウム又はオルトフタルアルデヒド濃度は、０．００５％〜１０％、好ましくは０．０５％〜１％であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
透過化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジギトニン、モネンシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム又は塩化ベンザルコニウムから選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＥＧ濃度は、０．０１％〜１％、かつ好ましくは０．０５％〜０．５％であり；ジギトニン濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌであり；モネンシン濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであり；ＰＥＩ濃度は、１０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、かつ好ましくは４０μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍｌであり；ヘキサメタリン酸ナトリウム濃度は、０．００５％〜１％、かつ好ましくは０．０１％〜０．１％であり；塩化ベンザルコニウム濃度は、０．００１％〜０．１％、かつ好ましくは０．００５％〜０．０５％であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応媒体の組成物は、
−好ましくはポリミキシンＢ、又はリファンピシンから選択される抗生剤、又は
−好ましくはベタジン、セトリミド、ティーツリー油、テルミネン（ｔｅｒｍｉｎｅｎｅ）−４−オール、及びクロルヘキシジンを含む群から選択される防腐剤、又は
−それらの混合物を更に含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
シアニン誘導体であるマーキング剤、及び微生物の少なくとも１種の細胞浸透剤を含むことを特徴とする微生物マーキング用反応媒体。
【請求項１６】
微生物の細胞浸透剤は、洗剤、酵素、バクテリオシン、イオンキレート化剤、固定剤、及び透過化剤を含む群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の反応媒体。
【請求項１７】
洗剤は、Ｎ−オクチル  β  Ｄ−グルコピラノシド（ＮＯＧ）、サポニン、ツイーン、トリトン、Ｉｇｅｐａｌ及びＣＨＡＰＳを含む群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の反応媒体。
【請求項１８】
酵素は、リゾチームであることを特徴とする請求項１６に記載の反応媒体。
【請求項１９】
バクテリオシンは、ナイシンであることを特徴とする請求項１６に記載の反応媒体。
【請求項２０】
イオンキレート化剤は、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の反応媒体。
【請求項２１】
固定剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、ストレプトリジン  Ｏ、四酸化オスミウム及びオルトフタルアルデヒドから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の反応媒体。
【請求項２２】
透過化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジギトニン、モネンシン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム又は塩化ベンザルコニウムから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の反応媒体。
【請求項２３】
−好ましくはポリミキシンＢ、又はリファンピシンから選択される抗生剤、又は
−好ましくはベタジン、セトリミド、ティーツリー油、テルミネン−４−オール、及びクロルヘキシジンを含む群から選択される防腐剤、又は
−それらの混合物を更に含むことを特徴とする請求項１５から２２のいずれかに記載の反応媒体。
【国際調査報告】
2006507010.tif 000017
2006507010.tif 000018
2006507010.tif 000019
2006507010.tif 000020
2006507010.tif 000021
2006507010.tif 000022