(57)【要約】本発明は形質転換細胞におけるカロテノイド蓄積を調節し、所定態様では前記細胞の着色を調節するカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターによるパイナップル細胞及び植物体の形質転換方法を提供する。本発明は形質転換細胞からのパイナップル植物体の再生も可能にする。更に、本発明はカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを導入したパイナップル細胞及び植物体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積の調節方法であって、少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを前記パイナップル細胞に導入する段階を含み、前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を調節する前記方法。
【請求項２】
前記パイナップル細胞が胚形成細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パイナップル細胞が器官形成細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記パイナップル細胞が胚形成カルス細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パイナップル細胞が器官形成カルス細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記パイナップル細胞がＳｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅ細胞、Ｒｅｄ  Ｓｐａｎｉｓｈ細胞、Ｐｅｒｏｌｅｒａ細胞、Ｐｅｒｎａｍｂｕｃｏ細胞、及びＰｒｉｍａｖｅｒａ細胞から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積に比較して前記パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を増加させる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積に比較して前記パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を減少させる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、δ−カロテン、γ−カロテン、α−カロテン、β−カロテン、アポカロテナール、リコペン、カンタキサンチン、ゼアサンチン、及びルテインから構成される群から選択される１種以上のカロテノイドの蓄積を調節する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の有機分子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の無機分子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが前記パイナップル細胞のゲノムに安定的に組込まれる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが選択マーカーに連結されている請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが構成的プロモーターに機能的に連結されている請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが誘導的プロモーターに機能的に連結されている請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、及びε−ヒドロキシラーゼから構成される群から選択される少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のセンス核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のアンチセンス核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド転写因子をコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドプロモーター及び／又は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドエンハンサーをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも１種のプロモーター及び／又は少なくとも１種のエンハンサーと相同組換えする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが植物カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが細菌カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル細胞に対して異種の少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル細胞の少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチドに相同の少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがアグロバクテリウムによる送達を使用して前記パイナップル細胞に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが花粉による送達、前記パイナップル細胞の少なくとも１個のプロトプラストへの直接核酸導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、花房のマクロインジェクション、ひげによる受精、レーザーパーフォレーション、及び超音波から構成される群から選択される少なくとも１種の核酸送達技術を使用して前記パイナップル細胞に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法により作製されたパイナップル細胞。
【請求項３１】
前記パイナップル細胞が少なくとも１種の分裂組織細胞を培養することにより作製された器官形成細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記分裂組織細胞が非頂端分裂組織細胞である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養が前記分裂組織細胞を培養して少なくとも１本のシュートを発生させる段階と、前記シュートからの少なくとも１個の外植片を培養して前記器官形成細胞を発生させる段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記パイナップル細胞から少なくとも１種のパイナップル植物体を再生する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記パイナップル細胞がパイナップル細胞集団を含み、方法が更に
（ｉ）前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを含む前記パイナップル細胞集団の１以上のメンバーを選択する段階と；
（ｉｉ）前記メンバーから１種以上のパイナップル植物体を再生する段階と；
（ｉｉｉ）前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル植物体におけるカロテノイド蓄積に対するカロテノイド蓄積の改変について前記パイナップル植物体をスクリーニングする段階を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記カロテノイド蓄積の改変が前記パイナップル植物体の果実組織に実質的に特異的である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記パイナップル植物体を微細繁殖させる段階を更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法により作製されたパイナップル植物体。
【請求項３９】
パイナップル植物体着色の改変方法であって、少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを少なくとも１種のパイナップル植物体に導入する段階を含み、前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル植物体における少なくとも１種のカロテノイドの蓄積を調節することにより前記パイナップル植物体の前記着色を改変する前記方法。
【請求項４０】
前記パイナップル植物体がＳｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅ植物体、Ｒｅｄ  Ｓｐａｎｉｓｈ植物体、Ｐｅｒｏｌｅｒａ植物体、Ｐｅｒｎａｍｂｕｃｏ植物体、及びＰｒｉｍａｖｅｒａ植物体から構成される群から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル植物体における着色カロテノイド蓄積に比較して前記パイナップル植物体における着色カロテノイド蓄積を増加させる請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル植物体における着色カロテノイド蓄積に比較して前記パイナップル植物体における着色カロテノイド蓄積を減少させる請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記着色カロテノイドがフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、δ−カロテン、γ−カロテン、α−カロテン、β−カロテン、アポカロテナール、リコペン、カンタキサンチン、ゼアサンチン、及びルテインから構成される群から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の有機分子を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の無機分子を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがＤＮＡを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがＲＮＡを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが前記パイナップル植物体のゲノムに安定的に組込まれる請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが構成的プロモーターに機能的に連結されている請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが誘導的プロモーターに機能的に連結されている請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが前記カロテノイド生合成ポリペプチドの果実特異的発現を促進するプロモーターに機能的に連結されている請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、及びε−ヒドロキシラーゼから構成される群から選択される少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のセンス核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のアンチセンス核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド転写因子をコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドプロモーター及び／又は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドエンハンサーをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも１種のプロモーター及び／又は少なくとも１種のエンハンサーと相同組換えする請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが植物カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが細菌カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル植物体に対して異種の少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル植物体の少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチドに相同の少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル植物体に注入される請求項３９に記載の方法。
【請求項６３】
前記着色の改変が前記パイナップル植物体の果実組織に実質的に特異的である請求項３９に記載の方法。
【請求項６４】
前記パイナップル植物体を微細繁殖させる段階を更に含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６５】
請求項３９に記載の方法により作製されたパイナップル植物体。
【請求項６６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを少なくとも１種のパイナップル細胞に導入し、前記細胞から前記パイナップル植物体を再生する請求項６６に記載の方法。
【請求項６７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがアグロバクテリウムによる送達を使用して前記パイナップル細胞に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが花粉による送達、前記パイナップル細胞の少なくとも１個のプロトプラストへの直接核酸導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、花房のマクロインジェクション、ひげによる受精、レーザーパーフォレーション、及び超音波から構成される群から選択される少なくとも１種の核酸送達技術を使用して前記パイナップル細胞に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを導入したパイナップル細胞であって、前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を調節する前記パイナップル細胞。
【請求項７０】
前記パイナップル細胞が胚形成細胞である請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７１】
前記パイナップル細胞が器官形成細胞である請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７２】
前記パイナップル細胞が胚形成カルス細胞である請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７３】
前記パイナップル細胞が器官形成カルス細胞である請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７４】
前記パイナップル細胞がＳｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅ細胞、Ｒｅｄ  Ｓｐａｎｉｓｈ細胞、Ｐｅｒｏｌｅｒａ細胞、Ｐｅｒｎａｍｂｕｃｏ細胞、及びＰｒｉｍａｖｅｒａ細胞から構成される群から選択される請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積に比較して前記パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を増加させる請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積に比較して前記パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を減少させる請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、δ−カロテン、γ−カロテン、α−カロテン、β−カロテン、アポカロテナール、リコペン、カンタキサンチン、ゼアサンチン、及びルテインから構成される群から選択される１種以上のカロテノイドの蓄積を調節する請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の有機分子を含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項７９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の無機分子を含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８０】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがＤＮＡを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがＲＮＡを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが選択マーカーに連結されている請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８３】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが構成的プロモーターに機能的に連結されている請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８４】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが誘導的プロモーターに機能的に連結されている請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、及びε−ヒドロキシラーゼから構成される群から選択される少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のセンス核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８７】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のアンチセンス核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８８】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド転写因子をコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項８９】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドプロモーター及び／又は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドエンハンサーをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントが少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも１種のプロモーター及び／又は少なくとも１種のエンハンサーと相同組換えする請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９０】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが植物カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９１】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが細菌カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９２】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９３】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル細胞に対して異種の少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９４】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが前記パイナップル細胞の少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチドに相同の少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９５】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターがアグロバクテリウムによる送達を使用して前記パイナップル細胞に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９６】
前記カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターが花粉による送達、前記パイナップル細胞の少なくとも１個のプロトプラストへの直接核酸導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、花房のマクロインジェクション、ひげによる受精、レーザーパーフォレーション、及び超音波から構成される群から選択される少なくとも１種の核酸送達技術を使用して前記パイナップル細胞に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む請求項６９に記載のパイナップル細胞。
【請求項９７】
請求項６９に記載の前記パイナップル細胞から再生されたパイナップル植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（著作権申告）
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（ｅ）に従い、出願人は本開示の一部が著作権保護の対象となる内容を含んでいることを申告する。著作権者は特許文献又は特許開示が特許商標局の特許ファイル又は記録通りに複製されることに異議ないが、それ以外については如何なる著作権も留保する。
（関連出願とのクロスリファレンス）
【０００２】
本願は米国予備出願第６０／４３１，３２３号（出願日２００２年１２月６日）の優先権を主張し、その開示内容全体を参考資料として全目的で本明細書に組込む。
【背景技術】
【０００３】
多くの果物や野菜には健康によい種々の植物化学物質が含まれている。疫学、臨床及び実験室研究によると、種々のカロテノイドは冠状動脈性心臓病（Ｂａｒｔｏｎ−Ｄｕｅｌｌ（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｓｔ，５：３４７−３５６）、所定の癌（Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ（１９９９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９１：３１７−３３１）、及び加齢黄斑変性（Ｓｅｄｄｏｎら（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２７２：１４１３−１４２０）等の慢性疾患の発症を低減する。従って、植物におけるカロテノイド生合成を遺伝子操作により調節すると、作物の栄養品質が変化すると考えられる。
【０００４】
パイナップル植物体（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ科のＡｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）は熱帯単子葉植物であり、葉は堅く、周囲にとげがあり、内側に湾曲しており、短い茎に小さな結実しない密集した長円状頭花をつける。多くの種のパイナップル植物体の果実はヒト消費用に使用されている。これらの種としてはＳｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅ、Ｒｅｄ  Ｓｐａｎｉｓｈ、Ｐｅｒｏｌｅｒａ、Ｐｅｒｎａｍｂｕｃｏ、及びＰｒｉｍａｖｅｒａが挙げられる。植物体は自家不和合性であり、果実を生産する間の期間が長い。従って、従来の育種で果実品質及び他の農業形質を改善することは困難であった。
【０００５】
上記から明らかなように、カロテノイドレベルを改変したトランスジェニックパイナップル植物体が望ましい。特に、果実組織におけるカロテノイドレベルの高いパイナップル植物体が得られるならば、この重要な作物の栄養品質が向上するであろう。更に、特に製品差別化のためには着色を改変した遺伝子組換えパイナップル植物体が望ましい。本発明のこれらの特徴及び他の種々の特徴は以下の開示を精読することにより理解されよう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要約）
本発明はパイナップル植物体におけるカロテン生産に関する。より具体的には、本発明はパイナップル細胞又は植物体におけるカロテノイド生合成を調節する発現レギュレーターによりパイナップル細胞又は植物体を遺伝子組換えする方法を提供する。特に、本発明はパイナップル植物体着色、特に果実組織着色の改変方法に加えて、パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積の調節方法を提供する。更に、本発明はパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を調節するカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを導入したパイナップル細胞を提供する。これらのパイナップル細胞から再生されたパイナップル植物体も提供する。
【０００７】
１側面において、本発明は少なくとも１種のパイナップル細胞（例えば胚形成細胞、器官形成細胞、胚形成カルス細胞、器官形成カルス細胞等）におけるカロテノイド蓄積の調節方法に関する。本方法は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをパイナップル細胞に導入する段階を含む。カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積に比較してパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を増減させることにより、パイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を調節する。所定態様では、パイナップル細胞は少なくとも１種の分裂組織細胞（例えば非頂端分裂組織細胞等）を培養することにより発生させた器官形成細胞である。これらの態様の所定のものでは、培養は分裂組織細胞を培養して少なくとも１本のシュートを発生させる段階と、シュートからの少なくとも１個の外植片を培養して器官形成細胞を発生させる段階を含む。
【０００８】
少なくとも１種のパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積の調節方法はパイナップル細胞（例えば胚形成細胞、器官形成細胞等）から少なくとも１種の植物体を再生する段階を更に含む。例えば所定態様では、パイナップル細胞はパイナップル細胞集団を含み、方法は（ｉ）カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを含むパイナップル細胞集団の１以上のメンバーを選択する段階と；（ｉｉ）前記メンバーから１種以上のパイナップル植物体を再生する段階と；（ｉｉｉ）カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル植物体におけるカロテノイド蓄積に対するカロテノイド蓄積の改変についてパイナップル植物体をスクリーニングする段階を更に含む。所定態様では、カロテノイド蓄積の改変はパイナップル植物体の果実組織に実質的に特異的である。方法はパイナップル植物体を微細繁殖させる段階を更に含む。
【０００９】
別の側面では、本発明はパイナップル植物体着色の改変方法に関する。本方法は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを少なくとも１種のパイナップル植物体に導入する段階を含み、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはパイナップル植物体における少なくとも１種のカロテノイド（例えばリコペン、β−カロテン等）の蓄積を調節し、パイナップル植物体の着色を改変する。即ち、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル植物体における着色カロテノイド蓄積に比較してパイナップル植物体における着色カロテノイド蓄積を増減させる。一般に、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを少なくとも１種のパイナップル細胞に導入し、この細胞からパイナップル植物体を再生する。所定態様では、着色の改変はパイナップル植物体の果実組織に実質的に特異的である。場合により、これらの方法はパイナップル植物体を微細繁殖させる段階を更に含む。
【００１０】
更に別の側面では、本発明は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを導入したパイナップル細胞（例えば胚形成細胞、器官形成細胞、胚形成カルス細胞、器官形成カルス細胞等）を提供する。カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをもたないパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積に比較してパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を増減させる。本発明は更にパイナップル細胞から再生されたパイナップル植物体を提供する。
【００１１】
本発明のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは場合により有機（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）又は無機分子を含む。例えば所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントはパイナップル細胞又は植物体のゲノムに安定的に組込まれる。一般に、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントは構成的又は誘導的プロモーターに機能的に連結されている。所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントはカロテノイド生合成ポリペプチドの果実特異的発現を促進するプロモーターに機能的に連結されている。例えば、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは場合により例えばイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、ε−ヒドロキシラーゼ等から選択される少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド（例えば植物カロテノイド生合成ポリペプチド、細菌カロテノイド生合成ポリペプチド、人工進化カロテノイド生合成ポリペプチド等）をコードする少なくとも１個の核酸セグメントを一般に含む。更に、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは場合によりパイナップル細胞もしくは植物体に対して異種であるか又はパイナップル細胞もしくは植物体の少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチドに相同である少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む。
【００１２】
カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは本発明のトランスジェニックパイナップル細胞及び植物体において種々の方法でカロテノイド蓄積を行う種々の態様を含む。例えば、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは場合により少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に対応する少なくとも１個のセンス又はアンチセンス核酸セグメントを含む。センス及びアンチセンス核酸セグメントを使用すると、例えば抑制される酵素の基質であるカロテノイドの蓄積を行うためのカロテノイド生合成経路から選択されたカロテノイド生合成酵素の発現を抑制することができる。所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは形質転換細胞で発現されると、ターゲットカロテノイド生合成遺伝子の発現を亢進する少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチド転写因子をコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含む。他の態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドプロモーター及び／又は少なくとも１種のカロテノイド生合成ポリペプチドエンハンサーをコードする少なくとも１個の核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントは所望により遺伝子の発現を増減するように少なくとも１種の内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子の少なくとも１種のプロモーター及び／又は少なくとも１種のエンハンサーと相同組換えする。
【００１３】
本発明のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはほぼ任意送達技術を利用してパイナップル細胞又は植物体に導入される。例えば所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはアグロバクテリウムによる送達を使用してパイナップル細胞又は組織に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む。他の態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは例えば花粉による送達、前記パイナップル細胞の少なくとも１個のプロトプラストへの直接核酸導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、花房のマクロインジェクション、ひげによる受精、レーザーパーフォレーション、超音波等から選択される少なくとも１種の核酸送達技術を使用してパイナップル細胞又は植物体に導入される少なくとも１個の核酸セグメントを含む。所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはパイナップル植物体に注入される。
【００１４】
図１Ａ〜Ｃはカロテノイド生合成経路の諸側面を模式的に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定態様に限定されないとと理解すべきである。また、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。特に指定しない限り、単位、乗数、及び記号は国際単位系（ＳＩ）により提案されている形態で記載する。数値範囲は範囲の両端値を含むものとする。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には（例えば組織等の形態の）２個以上の細胞を含み、他の用語についても同様である。更に、特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されていると同一の意味をもつ。以下に定義する用語とその文法的変形は明細書全体を参照することにより一層明確になる。
【００１６】
「核酸」なる用語はヌクレオチド鎖に対応させることができるモノマー単位の任意物理的連鎖を意味し、例えばヌクレオチドポリマー（例えば典型的ＤＮＡ又はＲＮＡポリマー）、ＰＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド（例えば生体ＲＮＡ又はＤＮＡには一般的でないヌクレオチドを溶解状態で含むオリゴヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド）、及び／又は同等物が挙げられる。核酸は例えば１本鎖でも２本鎖でもよい。特に指定しない限り、本発明の特定核酸配列は指定配列以外に相補的配列も意味する。核酸なる用語は例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡｉ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと同義に使用する。
【００１７】
「核酸配列」なる用語は核酸セグメントにおけるヌクレオチドの順序と呼称を意味する。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」とは文脈に応じてヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇ等又は天然もしくは人工ヌクレオチドアナログ）のポリマー又はヌクレオチドポリマーを表す文字列である。所与核酸又は相補的核酸は任意特定ポリヌクレオチド配列から決定することができる。
【００１９】
２種の核酸は同一配列をもつとき、又は一方の核酸が他方と相補的であるとき、又は一方の核酸が他方のサブ配列であるとき、又は一方の配列が他方から天然もしくは人工操作により誘導されるときに相互に「対応」する。
【００２０】
「遺伝子」なる用語は生物学的機能に関連する任意核酸セグメントの意味で広義に使用される。従って、遺伝子はコーディング配列と、場合によりその発現に必要な調節配列を含む。遺伝子は更に場合により例えば他の蛋白質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡ又はＲＮＡセグメントを含む。遺伝子は各種起源から得ることができ、例えば該当起源からのクローニングや公知又は予想配列情報からの合成が挙げられ、所望パラメーターをもつように設計された配列でもよい。
【００２１】
「核酸セグメント」なる用語は少なくとも２５ヌクレオチド長、通常は少なくとも１００ヌクレオチド長、一般に少なくとも２００ヌクレオチド長、典型的には少なくとも３００ヌクレオチド長、より典型的には少なくとも４００ヌクレオチド長、最も典型的には少なくとも５００ヌクレオチド長のポリヌクレオチド又は転写可能なその類似体を意味する。例えば、核酸セグメントとしては全長遺伝子（例えばフィトエンシンターゼ等のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子）、又は前記遺伝子のサブ配列が挙げられる。
【００２２】
「Ｔ−ＤＮＡ」なる用語は核酸セグメントを植物細胞に導入するためにアグロバクテリウムから移動させ、植物細胞に導入することができる核酸セグメントを意味する。
【００２３】
「連結」なる用語は相互に隣接しており、２個のアミノ酸コーディング領域を結合することが必要な場合には隣接して同一読み枠内にある核酸セグメントを一般に意味する。「連結」なる用語は相互に同時分離される核酸も意味する。更に、「機能的に連結」なる用語は２個以上の核酸セグメント間の機能的連結を意味する。例えば、プロモーター配列が核酸セグメントの転写を開始及び媒介するときに、プロモーターとポリペプチドをコードする核酸セグメントは機能的に連結されている。
【００２４】
「カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーター」なる用語はこれを導入する細胞においてカロテノイド生合成に直接又は間接的に作用する有機又は無機分子を意味する。例えば、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはこれを導入して発現させる細胞においてカロテノイド蓄積を増加させるカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸セグメントとすることができる。
【００２５】
「発現」なる用語は本発明の核酸セグメントから誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写と蓄積を意味する。発現とはポリペプチド（例えばカロテノイド生合成ポリペプチド）へのｍＲＮＡの翻訳を意味する場合もある。例えば本発明の所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチドは根、種子、果実等の予め選択された植物貯蔵器官で発現され、この植物貯蔵器官における１種以上のカロテノイド（例えば天然カロテノイド）の蓄積を増加させる。従って、「果実特異的発現」なる用語は例えば形質転換パイナップル植物体の「果実組織に実質的に特異的な」カロテノイド蓄積の改変を生じるように、例えば導入されるカロテノイド生合成ポリペプチドの発現が本発明のパイナップル植物体の果実組織に実質的に限定されることを意味する。
【００２６】
「プロモーター」なる用語は遺伝子の発現調節エレメントを提供し、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してこの遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列又はＤＮＡ配列群上の認識部位を意味する。「構成的プロモーター」なる用語は関連遺伝子の継続的転写を可能にする無制御下のプロモーターを意味する。「誘導的プロモーター」なる用語は細胞外分子（例えば遺伝子によりコードされる酵素の基質）等の別の物質又はインデューサーの存在下に関連遺伝子の転写を可能にする制御下のプロモーターを意味する。
【００２７】
「選択マーカー」なる用語はその発現によりマーカー遺伝子を含む細胞を識別できるようにする遺伝子を意味し、例えばコードされるポリペプチド以外にマーカー遺伝子を含む核酸セグメント（例えばＴ−ＤＮＡ）が挙げられる。例えば、選択マーカー遺伝子産物は細胞集団を有効量の除草剤に接触させると、形質転換されている細胞のみが生存し続けるように、形質転換細胞に除草剤耐性を付与することができる。
【００２８】
「センス核酸セグメント」なる用語は一般にコーディング核酸セグメントを意味する。これに対して、「アンチセンス核酸セグメント」なる用語は一般にセンス核酸セグメントの相補的配列を意味する。
【００２９】
「転写因子」なる用語は転写プロセス（即ちＤＮＡセグメントのＲＮＡコピーの作製）を調節する任意因子を意味する。通常は酵素又は他の蛋白質、補酵素、ビタミン、又は別の有機分子である。
【００３０】
「エンハンサー」なる用語は遺伝子から所定距離に配置した場合でも遺伝子の発現に正の影響を与えるＤＮＡ配列を意味する。
【００３１】
２種の核酸の各々に由来する配列が子孫核酸で結合しているときに２種の核酸は「組換え」られている。
【００３２】
核酸セグメントはパイナップル植物体又は細胞のゲノムに非一過的に導入されるときにゲノムに「安定的に組込まれる」。例えば、パイナップル染色体に永久的に組込まれる異種核酸セグメントは対応するパイナップル細胞又は植物体のゲノムに安定的に組込まれる。
【００３３】
「形質転換」なる用語は核酸セグメントを植物体又は植物細胞に導入することを意味し、導入の結果として核酸セグメントが遺伝的に安定して伝達されるか又は核酸セグメントが植物体もしくは植物細胞のゲノムに単に一過的に存在するかを問わない。形質転換核酸セグメントを含むパイナップル細胞又は植物体を「トランスジェニック」、「組換え」、又は「形質転換」パイナップル細胞又は植物体と言う。
【００３４】
核酸セグメント等のポリヌクレオチド配列は別の種に由来する場合には生物又は第２のポリヌクレオチド配列に対して「異種」であり、同一種に由来する場合には元の形態又は天然形態から改変されている。例えば、異種コーディング配列に機能的に連結されたプロモーターとは、そのプロモーターが由来する種とは異なる種に由来するコーディング配列を意味し、同一種に由来する場合には、天然対立遺伝子変異体とは異なるコーディング配列を意味する。
【００３５】
核酸は共通祖先配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。相同性は２種以上の核酸間の配列類似性から推測されることが多い。これは突然変異と自然淘汰の結果として長期間にわたって共通祖先配列から２種以上の子孫配列が誘導されるにつれて自然に発生する。人工相同配列は種々の方法で作製することができる。例えば、核酸配列をｄｅ  ｎｏｖｏ合成し、選択した親核酸配列と異なる配列の核酸を得ることができる。例えばクローニング中や化学的突然変異誘発中に行われるように核酸配列を相互に人工的に組換え、相同子孫核酸を作製することにより人工相同性を作り出すこともできる。コードされる遺伝子産物に生じるアミノ酸配列変異を最小限にしながら類似性の高い核酸部分の頻度と長さを増加するように、他の点では異なる核酸間のコーディング配列の一部又は全部を合成により調整するように遺伝コードの冗長を使用して人工相同性を作り出すこともできる。このような人工相同性は同一配列部分の頻度を少なくとも３塩基対長増加することが好ましい。同一配列部分の頻度を少なくとも４塩基対長増加することがより好ましい。一般に２種の核酸は配列類似性を示す場合に共通祖先をもつと予想される。しかし、相同性を立証するために必要な厳密な配列類似性レベルは当分野では多様である。一般に、本開示の目的では、２種の配列間即ち２種の配列の任意箇所で直接組換えが生じるために十分な配列一致があるときに２種の核酸配列は相同であるとみなす。
【００３６】
「コードする」なる用語は１種以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。この用語は開始又は停止コドンを必要としない。アミノ酸配列はポリヌクレオチド配列により提供される任意読み枠でコードすることができる。
【００３７】
「ベクター」なる用語は細胞で複製することができるか及び／又は他の核酸セグメントの複製を生じるようにこれらのセグメントを機能的に連結することができる染色体外エレメントを意味する。このようなエレメントは任意起源に由来する１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの線状又は環状の自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列とすることができ、（例えば１種以上のプロモーターとカロテノイド生合成酵素をコードする１種以上の遺伝子を含む）核酸セグメントを適当な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することが可能な構築物に多数のヌクレオチド配列を結合又は組換えしている。ベクターの１例はプラスミドである。ベクター又はベクターシステム（例えばバイナリーベクターシステム、トライナリーベクターシステム等）は例えばカロテノイド生合成酵素をコードする遺伝子に加え、パイナップル細胞又は植物体の形質転換を助長するエレメント、形質転換パイナップル細胞における導入遺伝子の発現を亢進するエレメント（例えばプロモーター）、形質転換パイナップル細胞の選択を助長するエレメント（例えば選択マーカー、レポーター遺伝子等）等のエレメントを含むことができる。「発現ベクター」なる用語はベクター内で遺伝子に機能的に連結されているときに遺伝子（例えばカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子）の発現を調節することが可能な染色体外エレメントを意味する。
【００３８】
「ポリペプチド」なる用語は２個以上のアミノ酸残基を含むポリマー（例えばペプチド又は蛋白質）を意味する。ポリマーは更にラベル、クエンチャー、保護基等の非アミノ酸エレメントを含むことができ、場合によりグリコシル化等の修飾を含むことができる。ポリペプチドのアミノ酸残基は天然でも非天然でもよく、置換されていなくても、修飾されていなくても、置換されていても、修飾されていてもよい。
【００３９】
「カロテノイド生合成ポリペプチド」なる用語はカロテノイド生合成経路における少なくとも１段階を触媒する生体触媒又は酵素を意味する。カロテノイド生合成ポリペプチドとしては、例えばゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、ε−ヒドロキシラーゼ等が挙げられる。
【００４０】
「ポリペプチド配列」なる用語はポリペプチドにおけるアミノ酸の順序と呼称を意味する。
【００４１】
「人工進化カロテノイド生合成ポリペプチド」なる用語は１種以上のダイバーシティ誘導技術を使用して作製された蛋白質−触媒又は酵素（例えばフィトエンシンターゼ等）を意味する。例えば、本発明の実施で使用される人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドは場合により（例えば帰納的組換え等により）１種以上のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする２種以上の核酸を組換えるか、又は（例えば部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、帰納的集合突然変異誘発等を使用して）カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする１種以上の核酸を突然変異させることにより作製される。親カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸は転写及び翻訳メカニズムを介して親カロテノイド生合成ポリペプチド（例えば非人工進化ないし天然フィトエンシンターゼ）に対応するアミノ酸配列を生産するポリヌクレオチド又は遺伝子を含む。「人工進化カロテノイド生合成ポリペプチド」なる用語は更に２種以上の親に由来する識別可能な成分配列（例えば機能的ドメイン等）を含むキメラ酵素も意味する。本発明の実施で使用される人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドは一般に例えば天然カロテノイド生合成ポリペプチドよりも高い効率で産物を生産するように進化させる。
【００４２】
「内在」なる用語は生物又は系内で天然に生産又は合成される物質を意味する。例えばパイナップル植物体又は細胞では、内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子は植物体又は細胞内で天然に生産（例えば発現）される。
【００４３】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列が同一であるかあるいは最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合に同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドが特定百分率であることを意味する。
【００４４】
「配列類似性の高い」領域とは（例えば手動又は例えばデフォルトパラメーターに設定した汎用プログラムＢＬＡＳＴを使用することにより）最大対応するように整列させた場合に第２の選択領域と９０％以上一致する領域を意味する。「配列類似性の低い」領域は（例えば手動又はデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用することにより）最大限に対応するように整列させた場合に第２の選択領域との一致度が３０％以下、より好ましくは４０％以下である。
【００４５】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、例えば配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％であることを意味する。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって実質的一致度が存在することが好ましく、少なくとも約１００残基長の配列の領域にわたることがより好ましく、少なくとも約１５０残基にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。所定態様では、配列はコーディング領域の全長にわたって一致している。
【００４６】
「サブ配列」又は「フラグメント」とは核酸又はアミノ酸の完全配列の任意部分である。
【００４７】
「ゲノム」なる用語は生物の染色体核酸を意味する。本明細書で使用する場合、ゲノムはプラスチドゲノム（例えばクロロプラストゲノム等）も含む。
【００４８】
「アグロバクテリウム」なる用語はＴ−ＤＮＡを移動させ、パイナップル細胞等の植物細胞に選択的に導入することが可能な細菌アグロバクテリウムの種、亜種、又は株を意味する。例えば、アグロバクテリウムは場合によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓであるが、より一般にはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである。
【００４９】
「胚形成細胞」なる用語は胚形成組織又は胚形成カルスに由来する細胞を意味する。
【００５０】
「胚形成カルス」なる用語は明確な構造をもたない未分化の組織又は細胞であるが、胚を発生して植物体に成長することが可能な分化の進んだ組織（例えば胚形成組織）を形成する可能性のある組織又は細胞を意味する。
【００５１】
「胚形成組織」なる用語は未成熟体細胞胚を含む組織化構造をもつ組織を意味する。未成熟体細胞胚は成熟培地で培養することにより成熟させることができる。成熟体細胞胚は発芽培地に移すと植物体に成長することができる。成熟体細胞胚は最終的に体細胞に由来する構造であり、形態的及び発生的に接合体胚と似ており、適当な増殖培地に移すと、根と茎の両者の極をもつ小植物に成長することができる。「体細胞」なる用語は配偶子以外の多細胞生物の細胞である。
【００５２】
「器官形成細胞」なる用語は器官形成組織に由来する細胞を意味する。
【００５３】
「器官形成カルス」なる用語は例えば組織培養で単一器官形成細胞から誘導され得る比較的未分化の細胞の不定形塊をもつ組織を意味する。
【００５４】
「器官形成組織」なる用語は器官形成するように誘導できる組織、即ちその後、完全植物体を生成するように発根させることができるシュート等の植物器官を形成することができる組織を意味する。
【００５５】
「分裂組織」なる用語は類似細胞又は分化して組織と器官を発生する細胞に分裂することが可能な細胞を含む形成植物組織を意味する。
【００５６】
「分裂組織細胞」なる用語は植物分裂組織に由来する細胞を意味する。
【００５７】
「非頂端分裂組織細胞」なる用語は頂端分裂組織に由来せず、側部ないし側芽分裂組織及び非頂端分裂組織外植片の培養により分裂組織となった細胞に由来し得る分裂組織細胞を意味する。
【００５８】
「パイナップル植物体」なる用語はＢｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ科の植物体、例えばＡｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓを意味する。「パイナップル細胞」なる用語はパイナップル植物体に由来する細胞を意味する。
【００５９】
パイナップル植物体の「再生」なる用語は発根したシュートを含むパイナップル植物体の形成を意味する。
【００６０】
「有効量」なる用語は胚形成又は器官形成カルス又は組織の発生等の所望結果を達成するために十分な量を意味する。
【００６１】
「カロテノイド」なる用語は炭化水素のカロテン類とその酸素化誘導体（即ちキサントフィル）を意味する。
【００６２】
「カロテノイド生合成経路」又は「カロテン生産」なる用語は１種以上のカロテノイドを生産する触媒活性の組み合わせを意味し、一般には酵素によるものを意味する。
【００６３】
「選択」なる用語は１種以上の植物体又は細胞が１種以上の該当性質（例えば選択マーカー、カロテノイドレベルの増減、着色改変等）をもつと識別するプロセスを意味する。例えば、選択プロセスは特定遺伝子型をもつものの成長を助長する条件下に生物をおく段階を含むことができる。更に、集団の１以上のメンバーの１種以上の性質を試験するように集団をスクリーニングすることができる。集団の１以上のメンバーが該当性質をもつと識別される場合には、これを選択する。選択は集団からメンバーを単離する段階を含むことができるが、これは必ずしも必要ではない。更に、選択とスクリーニングは同時に実施することができ、そうすることが多い。
【００６４】
「スクリーニング」なる用語は集団を異なる群に分離するプロセスを意味する。スクリーニングプロセスは一般に１種以上の植物体又は細胞の１種以上の性質を試験する段階を含む。例えば、典型的なスクリーニングプロセスとしては１以上の集団の１以上のメンバーの１種以上の性質を試験する方法が挙げられる。
【００６５】
「集団」なる用語は少なくとも２個の別個の細胞又は植物体の集合を意味する。
（ＩＩ．概説）
【００６６】
本発明は一般にはパイナップル細胞及び植物体の遺伝子組換え方法に関する。本発明のトランスジェニックパイナップルは特に既存種に比較して栄養品質が改善される。より具体的には、本発明は外来カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターをパイナップル細胞又は植物体に選択的に導入することにより得られる遺伝子組換えパイナップル細胞及び植物体を提供する。カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはパイナップル細胞におけるカロテノイド蓄積を調節し、所定態様では、これらの細胞の着色も調節する。カロテノイドレベルの改変に加え、果実の甘み、酸味、肉質、及び成熟特性等の消費者に重視される他の形質も本明細書に記載する方法により改変することができる。場合により、細菌病耐性の改善、ウイルス病耐性の改善、及び／又は昆虫及び線虫耐性の改善等の他の農業形質も本発明の細胞及び植物体に付与される。
【００６７】
所定態様では、本発明の方法は適切なパイナップル外植片材料の使用を含み、外植片材料をアグロバクテリウム細胞と接触させることにより遺伝子組換えする。アグロバクテリウム細胞は例えばカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸セグメントのパイナップル細胞導入を媒介する。カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを細胞又は植物体に導入する他の技術も場合により使用される。本発明は更にアグロバクテリウム細胞と同時培養するための胚形成又は器官形成細胞の形成を誘導する段階に適した培養培地も提供する。例えば所定態様では、形質転換胚形成細胞を選択し、これらの細胞から胚を形成する。胚を発芽させてシュートを形成し、発根させて完全な植物体とすることができる。
【００６８】
パイナップル植物体を形質転換及び再生する各種器官形成アプローチも場合により使用する。例えば、本発明は分裂組織パイナップル細胞（例えば非頂端分裂組織細胞等）を培養して器官形成パイナップル細胞を発生させる段階を含む形質転換パイナップル細胞の作製方法を提供する。これらの方法は更にカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを器官形成パイナップル細胞に導入して形質転換器官形成パイナップル細胞を発生させる段階を含む。更に、本発明は分裂組織パイナップル細胞を培養してシュートを発生させる段階を含む形質転換パイナップル細胞の作製方法も提供する。これらの方法は更にシュートから外植片を培養して器官形成パイナップル細胞を発生させる段階を含む。所定態様では、これらの外植片は非頂端分裂組織パイナップル細胞を含む。更に、これらの方法はカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターを器官形成パイナップル細胞に導入して形質転換器官形成パイナップル細胞を発生させる段階も含む。これらの器官形成方法は一般に更に形質転換器官形成パイナップル細胞からパイナップル植物体を再生する段階を含む。本発明のこれらの側面及び他の側面を以下に記載する。
（ＩＩＩ．カロテノイド）
【００６９】
本発明の数種の態様では、パイナップル細胞におけるカロテノイド発現を調節することによりパイナップル細胞における着色、及び／又はカロテノイド蓄積を調節する。カロテノイドは炭化水素の類（カロテン）とその酸素化誘導体（キサントフィル）である。これらの４０炭素（Ｃ４０）テルペノイドは各々８個の結合イソプレン（Ｃ５）単位を含み、２個の中心メチル基が１，６位の関係となり、残りの非末端メチル基が１，５位の関係となるようにイソプレノイド単位の配置が分子の中心で逆転している。α−カロテン、β−カロテン、アポカロテナール（β−アポ−８’−カロテナール）、リコペン（ψ，ψ−カロテン）、及びカンタキサンチン（４，４’−ジケト−β−カロテン）等のカロテノイドは食品着色剤として広く使用されており、多くのカロテノイドはプロビタミンＡ活性を湿す。本開示全体を通して慣用名と略称を使用し、一般に慣用名を先に記載した後に括弧内にＩＵＰＡＣ勧告半組織名を記載する。
【００７０】
植物中のカロテノイドはプラスチドにおけるイソペンテニル二リン酸合成に関与するメバロン酸非依存経路を介して形成されるイソプレノイドである（Ｆｒａｓｅｒら（２００２）“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｆｒｕｉｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１０９２−１０９７）。ゲラニルゲラニル二リン酸は遍在イソプレノイド経路に由来し、トコフェロールとフィロキノンに加えてカロテノイドの前駆物質である。特に、ゲラニルゲラニル二リン酸はイソペンテニル二リン酸と場合によりジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、又はファルネシル二リン酸を含む種々の反応で生産することができる。図１Ａ〜Ｃはカロテノイド生合成経路の諸側面を模式的に示す。図面から明らかなように、２０炭素原子前駆物質ゲラニルゲラニル二リン酸（Ｉ）からフィトエン（７，８，１１，１２，７’，８’，１１’，１２’−オクタヒドロ−ψ，ψ−カロテン）（ＩＩ）への二量化は酵素フィトエンシンターゼ（Ａ）により触媒されるカロテノイド生合成の最初の前駆段階である。フィトエン（ＩＩ）はそれ自体は無色であるが、着色カロテノイドの前駆物質である。次の２酵素（フィトエンデサチュラーゼ（Ｂ）とζ−カロテンデサチュラーゼ（Ｃ））は夫々中間体フィトフルエン（７，７’，８，８’，１１，１２−ヘキサヒドロ−ψ，ψ−カロテン）（ＩＩＩ）を介してフィトエン（ＩＩ）を脱飽和し、中間体ニューロスポレン（７，８−ジヒドロ−ζ，ζ−カロテン）（Ｖ）を介してζ−カロテン（７，８，７’，８’−テトラヒドロ−ζ，ζ−カロテン）（ＩＶ）を脱飽和する。
【００７１】
ζ−カロテンデサチュラーゼ（Ｃ）の産物はリコペン（ψ，ψ−カロテン）（ＶＩ）であり、その後、β−カロテン（β，β−カロテン）（ＩＸ）又はα−カロテン（ＸＩＩ）に環化することができる。リコペンは熟したトマト等の各種果実に特徴的な赤色を付与する。図１Ｂに示すように、リコペン（ＶＩＩ）からβ−カロテン（ＩＸ）への環化はリコペンβ−シクラーゼ（Ｄ）により触媒される反応で中間体γ−カロテン（ＶＩＩＩ）を介して行われる。β−カロテンはビタミンＡ生産の前駆物質としてマーガリンやバター等の製品の着色剤として多く使用されており、最近では所定種の癌に予防効果があることが報告されている。β−カロテンヒドロキシラーゼ（Ｅ）により触媒されるβ−カロテンの水酸化はゼアサンチン（β，β−カロテン−３，３’−ジオール）（Ｘ）を生じる。ゼアキサンチンは家禽産業で着色剤として多く使用される黄色色素である。図１Ｃはリコペンε−シクラーゼ（Ｆ）とリコペンβ−シクラーゼ（Ｄ）を触媒として中間体δ−カロテン（ε，ψ−カロテン）（ＸＩ）を介してα−カロテン（ＸＩＩ）を生じるリコペン（ＶＩＩ）の環化を模式的に示す。α−カロテン（ＸＩＩ）はβ−カロテンヒドロキシラーゼ（Ｅ）とε−ヒドロキシラーゼ（Ｇ）を触媒として水酸化され、ルテイン（３，３’−ジヒドロキシ−α−カロテン）（ＸＩＩＩ）を生じる。別のシクラーゼを生合成経路に組込むことにより環化パターンを変え、他の下流修飾酵素によりカロテノイド構造を更に誘導体化することもできる。
【００７２】
一般に、カロテノイドの生合成経路は各種生物で研究されており、生合成経路は細菌から高等植物に至る生物で解明されている。例えば葉では、カロテノイドは通常はクロロプラストのグラナに存在し、光保護機能を提供する。β−カロテンとルテインが主なカロテノイドであり、ビオラキサンチンとネオキサンチンが少量存在する。カロテノイドは通常はクロロフィルの消失と共に花弁の成長中のクロモプラストに蓄積する。花弁に加え、クロロプラストから成長するにつれて果実クロモプラストにもカロテノイドが出現する。カロテノイドはニンジンの根やジャガイモ塊茎のクロモプラストにも存在する。β−カロテンは商業用ニンジン及びサツマイモの両者に存在する主色素であり、通常はごく少量のキサントフィルも存在する。例えばＢｒｉｔｔｏｎ，“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，”ｐ．１３３−１８２，ｉｎ  Ｔ．Ｗ．Ｇｏｏｄｗｉｎ（Ｅｄ．），Ｐｌａｎｔ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）参照。
【００７３】
トランスジェニック植物における植物フィトエンシンターゼ（Ｐｓｙ１）遺伝子の過剰発現又は発現阻害により果実のカロテノイドレベルを改変できることも研究により示されている。例えば、Ｂｉｒｄら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６３５−６３９；Ｂｒａｍｌｅｙら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３４３−３４９；及びＦｒａｙら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５８９−６０２参照。カロテノイド生合成遺伝子はＥｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ（Ｍｉｓａｗａら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６７０４−６７１２）；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（国際出願第ＷＯ９１／１３０７８号，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８７：９９７５−９９７９）；Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ２１６：２５４−２６８，Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１）；及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｈｏｓｈｉｎｏら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：３１５０−３１５３）等の種々の生物からもクローニングされている。
【００７４】
カロテノイドとカロテン生産は更に例えばＢｒｉｔｔｏｎら（Ｅｄｓ．）Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ：Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｖｏｌ．１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９５），Ｂｒｉｔｔｏｎら（Ｅｄｓ．）Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９６），Ｂｒｉｔｔｏｎら（Ｅｄｓ．）Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，Ｖｏｌ．１ａ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９５），Ｐｆａｎｄｅｒら（Ｅｄｓ．）Ｋｅｙ  ｔｏ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８７），Ｐａｓｓｗａｔｅｒら（Ｅｄｓ．）Ｂｅｔａ−Ｃａｒｏｔｅｎｅ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ：Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｋｅａｔｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．（１９９９），Ｂａｕｅｒｆｅｉｎｄ（Ｅｄ．）Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ａｓ  Ｃｏｌｏｒａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎ  ａ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８１），Ａｂｅｌｓｏｎら（Ｅｄｓ．）Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２１３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）、及びＡｂｅｌｓｏｎら（Ｅｄｓ．）Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２１４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９３）にも記載されている。カロテノイドに関するその他の詳細は例えばＢｅｎｄｉｃｈ（１９８９）“Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１１９：１１２−１１５，Ｂｒｉｔｔｏｎ（１９９５）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：１５５１−１５５８，Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら（１９８９）“Ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ，”Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７４：５３２−５３８，Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら（１９９１）“Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｓ，ａｎｄ  ｔｈｉｏｌｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５３：１９４Ｓ−２００Ｓ，Ｍａｎｇｅｌｓら（１９９３）“Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｆｒｕｉｔｓ  ａｎｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ：ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｉｃ  ｄａｔａ，”Ｊ．Ａｍ．Ｄｉｅｔ．Ａｓｓｏｃ．，９３：２８４−２９６，Ｎｉｓｈｉ��ｏ（１９９８）“Ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，”Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４０２：１５９−１６３，Ｏｎｇら（１９９２）“Ｎａｔｕｒａｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｉｌｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１３：１４２−１６７，Ｐｆａｎｄｅｒ（１９９２）“Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１３：３−１３，及びＳｎｏｄｄｅｒｌｙ（１９９５）“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｖｉｔａｍｉｎｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６２（ｓｕｐｐｌ）：１４４８Ｓ−１４６１Ｓに記載されている。
（ＩＶ．カロテノイド生合成ポリペプチドをコードするターゲット配列）
【００７５】
本発明のカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは場合により種々の無機又は有機分子を含む。所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸セグメントである。本明細書に記載する方法に従ってパイナップル細胞又は植物体を形質転換するためには場合によりほぼ任意のこのような核酸セグメントが利用される。従って、利用可能な全公知核酸を記載するには及ばない。場合によりパイナップル細胞又は植物体に導入されるカロテン生産関連核酸セグメントは一般に例えばイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、ε−ヒドロキシラーゼ等をコードする。本明細書に記載する方法の実施に場合により利用されるカロテノイド生合成遺伝子の例と関連配列に関する文献情報を以下に記載する。
【００７６】
カロテノイド合成が可能な生物であり、このような生合成の試みに使用される遺伝子起源はＥｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａである。Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａは通性嫌気性生物である腸内細菌科のグラム陰性細菌である。Ｅｒｗｉｈｉａ属は一般に３群に分けられる。３群のうち、ｈｅｒｂｉｃｏｌａ群は一般にカロテノイドであることが判明した黄色色素を形成する種（例えばＥｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）を含む。これらの細菌は植物表面に腐生細菌として存在し、多くの植物病原体に起因する傷害で二次生物として存在する。これらは土壌、水中にも存在し、更にヒト等の動物体内の日和見病原体として存在する場合もある。
【００７７】
国際出願公開第ＷＯ９１／１３０７８号（公開日１９９１年９月５日）は数種の単細胞及び多細胞生物で数種のカロテノイド分子を作製するためにＥｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａに由来する遺伝子を使用することを記載している。より詳細には、国際出願公開第ＷＯ９１／１３０７８号は構成的カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むベクターとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによるＤＮＡ導入を使用した高等植物におけるフィトエン生産の増加を記載している。タバコリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ又はＲＢＣＳ）のトランジット（シグナル）ペプチドにそのＮ末端を連結したフィトエンシンターゼをコードする遺伝子の導入も、カロテノイドが一般に合成される場である植物クロロプラストに酵素を導入する方法として報告されている。国際出願公開第ＷＯ９１／１３０７８号は更に上記トランジットペプチド遺伝子と、β−カロテンの高クロロプラストレベルを得るために植物でリコペンをβ−カロテンに変換するリコペンシクラーゼの遺伝子を含む遺伝子を導入するためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用することを記載している。更に、ヨーロッパ特許出願第０  ３９３  ６９０  Ａ１号（公開日１９９０年１０月２４日）はカロテノイド分子を作製するために別のＥｒｗｉｎｉａ種であるＥｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ  ２０Ｄ３（ＡＴＣＣ  １９３２１）に由来するＤＮＡを使用することを報告している。更に、本発明はパイナップル植物体の果実組織等の高等植物貯蔵器官にカロテノイド分子を蓄積するための酵素フィトエンシンターゼをコードするＥｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ＥＨＯ−１０（ＡＴＣＣ３９３６８、別称Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｖｕｌｎｅｒｉｓ）に由来するＤＮＡを場合により使用する。
【００７８】
本明細書に記載する方法で場合により使用されるカロテノイド関連配列に関するその他の情報を以下に記載する。
【００７９】
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ
パイナップル細胞又は植物体を形質転換するために場合により使用されるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする配列は、例えばＲ．Ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｈａｈｎら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：６１９−６２４とその引用文献）（アクセション番号Ｕ４８９６３及びＸ８２６２７）、Ｃｌａｒｋｉａ  ｘａｎｔｉａｎａ（アクセション番号Ｕ４８９６２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（アクセション番号Ｕ４８９６１）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（アクセション番号Ｕ２１１５４）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（アクセション番号Ｘ１７０２５）、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（アクセション番号Ｘ１４２３０）から単離されている。
【００８０】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ
本明細書に記載する形質転換で場合により使用されるゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする配列としては、例えばＥ．Ｕｒｅｄｏｖｏｒａ（Ｍｉｓａｗａら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６７０４−６７１２及び国際出願第ＷＯ９１／１３０７８号）に由来するものや、ホワイトルピン（Ａｉｔｋｅｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１０８：８３７−８３８）、ピーマン（Ｂａｄｉｌｌｏら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：４２５−４２８）及びアラビドプシス（Ｓｃｏｌｎｉｋ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌｙ（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０４：１４６９−１４７０；Ｚｈｕら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：３５７−３６１）等の植物に由来するものが挙げられる。
【００８１】
フィトエンシンターゼ
本発明で場合により利用されるフィトエンシンターゼをコードする配列としては、例えばＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕフィトエンシンターゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ２２０２１８（Ｋｉｍら“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｉｔｒｕｓ，”未公開）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕフィトエンシンターゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＢ０３７９７５（Ｉｋｏｍａら（２００１）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｉｔｒｕｓ  ｆｒｕｉｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ．１１１：２３２−２３８）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉフィトエンシンターゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ１５２８９２（Ｃｏｓｔａら“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｃｉｔｒｕｓ，”未公開）、Ｃ．ａｎｎｕｕｍフィトエンシンターゼｐｓｙ１  ｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｘ６８０１７（Ｒｏｍｅｒら（１９９３）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６（３）：１４１４−１４２１）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍフィトエンシンターゼ（ＰＳＹ２）ｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｌ２３４２４（Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９３）“ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ＰＳＹ２，ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｏｍａｔｏ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３４）：２５７１８−２５７２１）、Ｃ．ｍｅｌｏフィトエンシンターゼＰＳＹ１  ｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｚ３７５４３（Ｋａｒｖｏｕｎｉら（１９９５）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｌｏｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，”  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７（６）：１１５３−１１６２）、及びトマトフィトエンシンターゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｍ８４７４４（Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９２）“Ａ  ｔｏｍａｔｏ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｒｕｉｔ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（８）：５０３６−５０３９）に対応するものが挙げられる。
【００８２】
フィトエンシンターゼ配列起源の他の例としては、例えばＥ．Ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、及び他の植物が挙げられる（Ｍｉｓａｗａら（１９９０）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６７０４−６７１２，アクセション番号Ｄ９００８７，国際出願第ＷＯ９１／１３０７８号，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１６：２５４−２６８，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”ｉｎ  Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐら（Ｅｄｓ．），Ａｎｏｘｙｇｅｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：９９７５−９９７９，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１４：２９７−３１１，Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７５１８−２７５２１，Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５０３６−５０３９，Ｂｒａｍｌｅｙら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：２９１−３４３，Ｒａｙら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４０１−４０４，Ｒａｙら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１０５８７，Ｒｏｍｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，Ｋａｒｖｏｕｎｉら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：１１５３−１１６２，アクセション番号Ｕ３２６３６，Ｚ３７５４３，Ｌ３７４０５，Ｘ９５５９６，Ｄ５８４２０，Ｕ３２６３６，Ｚ３７５４３，Ｘ７８８１４，Ｘ８２４５８，Ｓ７１７７０，Ｌ２７６５２，Ｌ２３４２４，Ｘ６８０１７，Ｌ２５８１２，Ｍ８７２８０，Ｍ３８４２４，Ｘ６９１７２，Ｘ６３８７３，Ｘ６０４４１，及びＡｒｍｓｔｒｏｎｇ（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１  ７６：４７９５−４８０２とその引用文献）。
【００８３】
フィトエンデサチュラーゼ
本発明の方法に従ってパイナップル細胞又は植物体を形質転換するために場合により使用されるフィトエンデサチュラーゼをコードする配列の例としては、例えばＣ．ａｎｎｕｕｍフィトエンデサチュラーゼｐｄｓ１  ｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｘ６８０５８（Ｈｕｇｕｅｎｅｙら（１９９２）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｆｌｕｅｎｅ  ａｎｄ  ｚｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｉｎ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：３９９−４０７）、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍフィトエンデサチュラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｘ５９９４８（Ｐｅｃｋｅｒら（１９９２）“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｔｏ  ｚｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｉｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｏｍａｔｏ  ｆｒｕｉｔ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１１）：４９６２−４９６６）、Ｚｅａ  ｍａｙｓフィトエンデサチュラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｌ３９２６６（Ｈａｂｌｅら（１９９５）“Ｍａｉｚｅ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｍａｐｓ  ｎｅａｒ  ｔｈｅ  ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ５  ｌｏｃｕｓ，”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８（３）：１３２９−１３３０）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍフィトエンデサチュラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｍ８８６８３（Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９９３）“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｏｍａｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５（４）：３７９−３８７）、及びダイズフィトエンデサチュラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｍ６４７０４（Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｆ  ａ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ，ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８（１５）：６５３２−６５３６）に対応するものが挙げられる。
【００８４】
フィトエンデサチュラーゼ配列起源の他の例としては例えばＥ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ（Ｍｉｓａｗａら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６７０４−６７１２、及び国際出願第ＷＯ９１／１３０７８号）（アクセション番号Ｌ３７４０５，Ｘ９５５９６，Ｄ５８４２０，Ｘ８２４５８，Ｓ７１７７０，及びＭ８７２８０）等の細菌に由来するものや、トウモロコシ（Ｌｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：２６９−２７９）、トマト（Ａｒａｃｒｉら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：７８９）、及びＣａｐｉｓｕｍ  ａｎｎｕｕｍ（ピーマン）（Ｈｕｇｕｅｎｅｙら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：３９９−４０７）（アクセション番号Ｕ３７２８５，Ｘ５９９４８，Ｘ７８２７１，及びＸ６８０５８）等の植物に由来するものが挙げられる。
【００８５】
ζ−カロテンデサチュラーゼ
本発明で場合により使用されるζ−カロテンデサチュラーゼをコードする配列としては、例えばＣｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ζ−カロテンデサチュラーゼ（ｚｄｓ遺伝子）ｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＪ３１９７６２（Ｍａｒｃｏｓら“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｉｎａｌａｔｅ，ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｒｕｉｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｙｅｌｌｏｗ  ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ＡＢＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ，”  未公開）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ζ−カロテンデサチュラーゼＣｉｔ−ＺＣＤ  ｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＢ０７２３４３（Ｋａｓａｉら“Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ｚｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ，”未公開）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ζ−カロテンデサチュラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ１９５５０７（Ｂａｒｔｌｅｙら（１９９９）“Ｚｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１９５５０７）ｆｒｏｍ  ｔｏｍａｔｏ，”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１（４）：１３８３）、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ  ζ−カロテン／ニューロスポレンデヒドロゲナーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｘ８９８９７（Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈら（１９９９）“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｙｐｅ  ｚｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５（１）：３７６−３８３）、及びＺｅａ  ｍａｙｓ  ζ−カロテンデサチュラーゼ前駆物質ｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ０４７４９０（Ｌｕｏら（１９９９）“Ａ  Ｍａｉｚｅ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｚｅｔａ  ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０４７４９０），”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０（４）：１２０６）に対応するものが挙げられる。
【００８６】
リコペンβ−シクラーゼ
本発明の方法に従ってパイナップル細胞又は植物体を形質転換するために場合により使用されるリコペンβ−シクラーゼをコードする配列の例としては、例えばＣｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓリコペンβ−シクラーゼ遺伝子に対応するアクセション番号ＡＹ０９４５８２（Ｘｕら“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｂｅｔａ−ｃｙｃｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｄ  ｆｌｅｓｈ  ｎａｖｅｌ  ｏｒａｎｇｅ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｔａｉｌ−ＰＣＲ，”未公開）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓリコペンβ−シクラーゼ遺伝子に対応するアクセション番号ＡＦ２４０７８７（Ｘｕら“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｂｅｔａ−ｃｙｃｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ｏｒａｎｇｅ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ），”未公開）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍクロモプラスト特異的リコペンβ−シクラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ２５４７９３（Ｒｏｎｅｎら（２０００）“Ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｍａｐ−ｂａｓｅｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｏｌｄ−ｇｏｌｄ  ｃｏｌｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（２０）：１１１０２−１１１０７）、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍリコペンβ−シクラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｘ８６４５２（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９９６）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８（９）：１６１３−１６２６）に対応するものが挙げられる。
【００８７】
リコペンε−シクラーゼ
本発明で場合により使用されるリコペンε−シクラーゼをコードする配列としては、例えばＣｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉリコペンε−シクラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ４８６６５０（Ｃｏｓｔａら（２００２）ｄｉｒｅｃｔ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ，ＵＳＡ）、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａリコペンε−シクラーゼ（ｌｅｃ）ｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ４６３４９７（ＤｅＳｏｕｚａら“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，”未公開）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａリコペンε−シクラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ３２１５３８（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（２００１）“Ｏｎｅ  ｒｉｎｇ  ｏｒ  ｔｗｏ？  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｎｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｂｙ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｖａｒｅｐｓｉｌｏｎ−ｃｙｃｌａｓｅｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（５）：２９０５−２９１０）、及びＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍリコペンε−シクラーゼｍＲＮＡに対応するアクセション番号Ｙ１４３８７（Ｒｏｎｅｎら“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｒｕｉｔ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ，”未公開）に対応するものが挙げられる。
【００８８】
β−カロテンヒドロキシラーゼ
本発明の方法に従ってパイナップル細胞又は植物体を形質転換するために場合により使用されるβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードする配列の例としては、例えばＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ染色体１０  ＢＡＣ  ＯＳＪＮＢａ００５３Ｃ２３ゲノム配列に対応するアクセション番号ＡＣ０９２３８９（Ｂｕｅｌｌら“Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １０  ＢＡＣＯＳＪＮＢａ００５３Ｃ２３  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，”未公開）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｉｅｒａβ−カロテンヒドロキシラーゼ（ｂｃｈｌ）遺伝子に対応するアクセション番号ＡＦ４９９１０８（Ｙｏｕｎｇら“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｐｅｖｉｎｅ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ），”未公開）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  β−カロテンヒドロキシラーゼ（ＣＨＸ２）ｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ３１５２８９（Ｋｉｍら（２００１）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｃｉｔｒｕｓ，”Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１６１（５）：１００５−１０１０）、及びＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  β−カロテンヒドロキシラーゼ（ＣＨＸ１）ｍＲＮＡに対応するアクセション番号ＡＦ２９６１５８（Ｋｉｍら（２００１）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｃｉｔｒｕｓ，”Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１６１（５）：１００５−１０１０）に対応するものが挙げられる。
【００８９】
ε−ヒドロキシラーゼ
本発明で場合により使用されるε−ヒドロキシラーゼをコードする配列としては、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ染色体１，下部アーム完全配列に対応するアクセション番号ＡＥ００５１７３（Ｔｈｅｏｌｏｇｉｓら（２０００）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（６８１４）：８１６−８２０）とＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ染色体１，上部アーム完全配列に対応するアクセション番号ＡＥ００５１７２（Ｔｈｅｏｌｏｇｉｓら（２０００）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（６８１４）：８１６−８２０）に対応するものが挙げられる。
【００９０】
更に、カロテン生産微生物からのカロテノイド生合成酵素クラスターの核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のアクセション番号Ｍ８７２８０（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  Ｅｈｏ１０）、Ｄ９００８７（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、Ｕ６２８０８（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｄ５８４２０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）及びＭ９０６９８（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  Ｅｈｏ１３）等から得ることができる。
（Ｖ．人工進化カロテノイド生合成ポリペプチド）
【００９１】
本発明の所定態様では、人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドを使用してトランスジェニックパイナップル細胞及び植物体におけるカロテノイド蓄積を調節する。例えば、触媒効率の増加、基質特異性の増加、及び／又は同等物等の所望形質又は性質を獲得するように上記に例示したターゲットカロテノイド生合成配列の任意のものを人工的に進化させることができる。人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドを作製するために使用可能な種々の人工ダイバーシティ誘導法が利用可能であり、文献に記載されている。これらの方法を別々又は組み合わせて使用し、核酸の変異体と、核酸変異体によりコードされるカロテノイド生合成蛋白質の変異体を作製することができる。これらの方法は個別でも総合しても個々のカロテノイド生合成核酸及び蛋白質、あるいはカロテノイド経路全体又は前記経路の選択部分を構築又は迅速に進化させる強力で広く適用可能な方法を提供する。これらの方法の産物は本発明の形質転換方法で使用することができる。
【００９２】
特に、本明細書に記載するか又は当分野で公知の他のダイバーシティ誘導方法の任意のものを利用することにより、一般にカロテノイド生合成酵素をコードする核酸を選択もしくはスクリーニングするのに使用されるか又は触媒効率の増加等の望ましい性質を付与する１種以上の核酸を作製することができる。これは、当分野で公知の任意アッセイにより例えば自動又は自動化可能なフォーマットで検出できる任意活性を識別することにより実施することができる。実施者の判断に応じて種々の関連（又は非関連）性質を順次又は平行して評価することができる。
【００９３】
本発明の形質転換方法で場合により使用される人工進化カロテノイド生合成ポリペプチドは多種多様の技術を使用して誘導することができる。例えば、２種以上の親配列から誘導される識別可能な成分（例えば蛋白質ドメイン）を含むキメラ酵素を使用することができる。例えば、各種フィトエンシンターゼのドメインを識別し、キメラ子孫フィトエンシンターゼに付加するものを選択することができる。キメラ酵素設計に有用な各種配列比較アルゴリズム及び他のツールについて以下に詳述する。
【００９４】
人工進化酵素は更にカセット突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発（例えばＢｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；及びＫｕｎｋｅｌ（１９８７）“Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）参照）、化学的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位飽和突然変異誘発、帰納的集合突然変異誘発等の種々の突然変異誘発法を使用して開発することができる。例えば、エラープローンＰＣＲを使用して核酸変異体を作製することができる。例えばエラープローンＰＣＲを使用し、ＰＣＲ産物の全長に沿って高い点突然変異率が得られるようにＤＮＡポリペプチドのコピー忠実度を低くした条件下でＰＣＲを実施する。このような技術の例は例えばＬｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５及びＣａｌｄｗｅｌｌら（１９９２）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３に詳細に記載されている。更に突然変異誘発技術の１例として、２本鎖ＤＮＡ分子の小領域を例えば天然配列と異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置換する方法で場合によりカセット突然変異誘発を使用する。合成オリゴヌクレオチドは例えば完全及び／又は部分ランダム天然配列を含むことができる。カセット突然変異誘発に関するその他の詳細は例えばＷｅｌｌｓら（１９８５）“Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ”Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３に記載されている。突然変異誘発により分子ダイバーシティを誘導する方法の別例は帰納的集合突然変異誘発法であり、蛋白質突然変異誘発用アルゴリズムを使用してアミノ酸配列の異なるメンバーからなる表現型の関連する突然変異体の種々の集団を作製する。この方法はフィードバックメカニズムを使用して組み合わせカセット突然変異誘発の連続ラウンドをモニターする。このアプローチの例はＡｒｋｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５に記載されている。上記突然変異誘発技術はカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸にダイバーシティを誘導するために場合により使用される所定方法の例証に過ぎない。突然変異誘発によりダイバーシティを誘導する他の多くのアプローチも周知であり、これらのアプローチも本発明の方法に適切である。
【００９５】
上記に記載したもの等のカロテノイド生合成ポリペプチドをコートする核酸は場合により帰納的配列組換えプロトコール等の各種組換え反応の基質としても使用される。これらの技術の多くは例えばＣｈａｎｇら（１９９９）“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７９３−７９７，Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１，Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４３６−４３８，Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５−３１９，Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）“Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐａｃｅ”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５４９−５５３、及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１等の種々の刊行物に記載されている。
【００９６】
上記ダイバーシティ誘導方法（例えばキメラ酵素設計及び合成、帰納的配列組換え等）の多くは出発配列間の相同性レベルを測定する段階を含む。例えば、配列比較と相同性測定のプロセスでは、ある配列（例えば組換えしようとする遺伝子配列のフラグメント又はサブ配列）を参照配列として使用し、他の試験核酸配列をこれと比較することができる。この比較は配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により実施することができる。アルゴリズムを使用する馬合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを特定する。こうすると、アルゴリズムは特定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験核酸配列の配列一致度百分率を計算する。
【００９７】
本発明の目的では、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター計算（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視により適切な配列比較を実行することができる。一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００１年補遺）参照。配列一致度及び配列類似度百分率を測定するのに適切な検索アルゴリズムの別の例は例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから世界ウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を通して公共入手可能である。
【００９８】
突然変異誘発、ライブラリー構築及び他のダイバーシティ誘導法に用いるキットは市販されている。例えば、キットは例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット、及びＣｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）２本鎖部位特異的突然変異誘発キット）、Ｂｉｏ／Ｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば上記Ｋｕｎｋｅｌ法を使用）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば５プライム３プライムキット）、Ｇｅｎｐａｋ  Ｉｎｃ．、Ｌｅｍａｒｇｏ  Ｉｎｃ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ、及びＡｎｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．から市販されている。
（ＶＩ．核酸作製）
【００９９】
上記のもの等のカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸セグメントは所定のＤＮＡ合成技術、ＤＮＡ増幅、ヌクレアーゼ消化等を含む種々の方法又はその組み合わせを使用して作製することができる。核酸データベースから入手可能な検索可能な配列情報を核酸セグメント及びベクター選択及び／又は設計プロセス中に利用することができる。アクセス可能な公共データベース／検索サービスの例はＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）、Ｅｎｔｒｅｚ（登録商標）、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＧＳＤＢ、ＮＤＢ及びＮＣＢＩである。これらのデータベースは一般にインターネット又は各種ゲノム情報作製及び／又は保存専門企業から契約により入手可能である。これらのデータベースや他の有用なデータベースは容易に入手可能であり、当業者に公知である。
【０１００】
本発明の方法のいずれかで使用するポリヌクレオチドの配列はマキサム−ギルバート法、サンガージデオキシ法、及びハイブリダイゼーションによるシーケンシング法等の当業者に周知の技術を使用しても容易に実施することができる。これらの方法の一般記載については、例えばＳｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５）及びＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）参照。Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＤＮＡ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５６０−５６４，Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）“ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｃｈａｉｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７，Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１９９１）“Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５９−６７，及びＰｅａｓｅら（１９９４）“Ｌｉｇｈｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：５０２２−５０２６も参照。
【０１０１】
上記カロテノイド生合成酵素をコードする核酸セグメントは例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５のホスホトリエステル法を使用して化学的技術により作製することができる。当然のことながら、コーディング配列を化学的に合成することにより、単に天然アミノ酸残基配列をコードする塩基を適当な塩基で置換するだけで任意所望修飾を行うことができる。しかし、一般には従来記載されている配列を含む核酸セグメントが好ましい。更に、カロテノイド生合成酵素をコードする核酸セグメントは場合によりこれらの遺伝子を含む既存組換えＤＮＡ分子（プラスミドベクター）からも得られる。これらのプラスミドの所定のものはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２から入手可能である。
【０１０２】
本発明の核酸セグメント及び構築物又はベクターは分子クローニング法等の当分野で公知の多数の技術により作製することができる。発現ベクター等の組換え核酸の構築に適した多種多様のクローニング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法が当業者に周知である。本発明で使用するのに適したベクターについて以下に詳述する。突然変異誘発等の本発明で有用な分子生物学技術を記載した一般教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９９）（“Ｂｅｒｇｅｒ”）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２０００）（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２０００年補遺）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法により当業者が実施するために十分な技術の例としてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のＲＮＡポリメラーゼ法（例えばＮＡＳＢＡ）が挙げられ、これらはＢｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、及びＡｕｓｕｂｅｌに加え、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９０）（“Ｉｎｎｉｓ”）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ３６−４７；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７，及びＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅核酸のその他のクローニング法は米国特許第５，４２６，０３９号（Ｗａｌｌａｃｅら）に記載されている。ＰＣＲによる大型核酸の増幅法はＣｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５とその引用文献に要約されており、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが作製されている。制限消化、ＰＣＲ増幅及び逆転写酵素とポリメラーゼを使用するシーケンシングに適した２本鎖ＤＮＡにほぼ任意ＲＮＡを変換できることも当業者に自明である。いずれも前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＢｅｒｇｅｒ参照。
【０１０３】
本発明のベクター構築物に加える核酸配列の単離は当分野で公知の多数の技術により実施することができる。例えば、公知配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーで所望遺伝子を同定することができる。プローブを使用してゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせ、同一種又は別種で相同遺伝子を単離することができる。あるいは、酵素に対する抗体を使用し、対応するコーディング配列のｍＲＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１０４】
あるいは、増幅技術を使用して該当核酸（例えばカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子）を核酸サンプルから増幅することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用してゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから所望遺伝子の配列を直接増幅することができる。ＰＣＲ及び他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法は、例えば発現させる蛋白質をコードする核酸配列をクローニングするため、サンプル中の所望ｍＲＮＡの存在の検出用プローブとして核酸を使用するため、核酸配列決定のため、又は他の目的のためにも有用であると思われる。ＰＣＲの概論についてはＩｎｎｉｓ，前出参照。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは技術文献に記載されているような周知技術により合成することもできる。例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓら（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８，及びＡｄａｍｓら（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１参照。その後、相補鎖を合成し、適当な条件下で鎖を相互にアニールするか、又はＤＮＡポリメラーゼと適当なプライマー配列を併用して相補鎖を付加することにより２本鎖ＤＮＡセグメントを得ることができる。
【０１０６】
プローブとして（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法で遺伝子プローブとして）使用されるオリゴヌクレオチドは一般に、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８に記載されているような自動合成器を使用してＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２に記載されている固相ホスホロアミダイトトリエステル法により化学的に合成される。本発明の核酸構築物又はベクターで使用されるオリゴヌクレオチドは注文製造し、当業者に公知の各種商業ソースから注文することもできる。
（ＶＩＩ．ベクター）
【０１０７】
本発明の形質転換パイナップル細胞及び植物体を作製するにはほぼ任意ベクター又はベクターシステムを使用することができる。所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする核酸セグメントをプラスミド又はプラスミドシステム（例えばバイナリーシステム、トライナリーシステム、シャトルベクターシステム等）の形態のベクターに機能的に連結する。場合により本発明で使用するのに適した所定プラスミドシステムの例は例えば米国特許第５，９７７，４３９号（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，発行日１９９９年１１月２日）、５，９２９，３０６号（Ｔｏｒｉｓｋｙら，発行日１９９９年７月２７日）、５，１４９，６４５号（Ｈｏｅｋｅｍａら，発行日１９９２年９月２２日）、６，１６５，７８０号（Ｋａｗａｓａｋｉ，発行日２０００年１２月２６日）、６，１４７，２７８号（Ｒｏｇｅｒｓら，発行日２０００年１１月１４日）、４，７６２，７８５号（Ｃｏｍａｉ，発行日１９８８年８月９日）、及び５，０６８，１９３号（Ｃｏｍａｉ，発行日１９９１年１１月２６日）に記載されている。
【０１０８】
本明細書に記載する例えば発現カセットの形態の核酸セグメントは一般に５’−３’転写方向に転写及び翻訳開始領域、該当ＤＮＡ配列（例えばカロテノイド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子）、並びにパイナップル植物体で機能的な転写及び翻訳終結領域を含む。終結領域は転写開始領域に内在するものでもよいし、目的ＤＮＡ配列に内在するものでもよいし、別の起源に由来するもでもよい。オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終結領域等の適切な終結領域はＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミから入手可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら，（１９９１），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，（１９９１），Ｃｅｌｌ，６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら，（１９９１），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら，（１９９０），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら，（１９９０），Ｇｅｎｅ，９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら，（１９８９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉら，（１９８７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１５：９６２７−９６３９）も参照。
【０１０９】
所定態様では、本発明のカロテノイド生合成遺伝子は発現のためにクロロプラスト等のプラスチドにターゲティングされる。そこで、カロテノイド生合成遺伝子がプラスチドに直接装入されない場合には、発現カセットは該当遺伝子をプラスチドに誘導するためのトランジットペフチドをコードする遺伝子を更に含む。このようなトランジットペフチドは当分野で公知である。例えばＶｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１参照。本発明で有用な植物カロテノイド遺伝子は天然又は異種トランジットペフチドを利用することができる。
【０１１０】
本発明の構築物は更に該当ヌクレオチド配列に機能的に連結された植物翻訳コンセンサス配列（Ｊｏｓｈｉ，Ｃ．Ｐ．，（１９８７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：６６４３−６６５３）、イントロン（Ｌｕｅｈｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｂｏｔ，（１９９１），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２５：８１−９３）等の他の必要な任意レギュレーターを加えてもよい。
【０１１１】
所定態様では、５’リーダー配列を発現カセット構築物に加える。このようなリーダー配列は翻訳を促進するように作用することができる。翻訳リーダーは当分野で公知であり、例えばＥＭＣＶリーダー（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ５’非コーディング領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）等のピコルナウイルスリーダー；例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ａｌｌｉｓｏｎら，（１９８６））、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５４：９−２０）等のポティウイルスリーダー；ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｐ．，（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスのコート蛋白質ｍＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．，（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ，Ｄ．Ｒ．ら，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，ｐａｇｅｓ  ２３７−２５６）；及びトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ，Ｓ．Ａ．ら，（１９９１），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら，（１９８７），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．８４：９６５−９６８も参照。
【０１１２】
該当ＤＮＡ配列を発現させる場所によっては、パイナップル植物体優先コドン、あるいはクロロプラスト優先コドンをもつ配列を合成することが望ましい場合がある。パイナップル植物体優先コドンは特定該当植物種において最大量で発現される蛋白質中の最高頻度のコドンから決定することができる。ヨーロッパ特許出願第０３５９４７２号及び０３８５９６２号；国際出願第ＷＯ９１／１６４３２号；Ｐｅｒｌａｋら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３２４−３３２８；並びにＭｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８参照。こうして、ヌクレオチド配列をパイナップル植物体での発現に最適化することができる。当然のことながら、遺伝子配列の全部又は任意部分を最適化又は合成することができる。即ち、合成又は部分最適化配列も使用できる。クロロプラスト優先遺伝子の構築については、例えば米国特許第５，５４５，８１７を参照されたい。
【０１１３】
発現カセットを作製する際には、適正な向きで適宜適正な読み枠にＤＮＡ配列を配置するように各種ＤＮＡフラグメントを操作することができる。この目的では、アダプター又はリンカーを使用してＤＮＡフラグメントを結合してもよいし、他の操作を使用して適切な制限部位の提供、必要以上のＤＮＡの除去、制限部位の除去等を行ってもよい。このために、挿入、欠失又は置換（例えばトランジション又はトランスバージョン）を行う場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、切除、ライゲーション等を利用することができる。
【０１１４】
本発明のベクターは更に一般にプロモーター等の発現調節エレメントを含む。プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼ結合とポリペプチドコーディング遺伝子の発現を誘導できるようにカロテノイド生合成ポリペプチドコーディング遺伝子を発現ベクターに機能的に連結する。ポリペプチドコーディング遺伝子の発現に有用なプロモーターとしては例えばＰｏｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１９及びＯｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０（１９８５）に記載されているような誘導的プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーターと、例えばＣｈｕａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１７４−１８１に記載されているような時間的に制御されるプロモーター、空間的に制御されるプロモーター及び時間と空間的に制御されるプロモーターが挙げられる。
【０１１５】
どの発現ベクターを選択するか、例えばどの予め選択された器官特異的プロモーターにポリペプチドコーディング遺伝子を機能的に連結するかは、所望される機能的性質（例えば蛋白質発現の位置と時機）によって異なる。本発明の実施に有用なベクターはパイナップル植物体のゲノムに組込まれ、複製を誘導することが可能であり、更に、機能的に連結される核酸セグメントに含まれるカロテノイド生合成ポリペプチドコーディング遺伝子の発現を誘導することも可能である。当分野で周知の通り、発現ベクター全体が宿主植物ゲノムに組込まれるのではなく、一部のみが組込まれる。それでも、ベクターは発現し易くするために組込まれると言う。
【０１１６】
本発明の所定態様では、構築物は結合核酸配列に加えてプロモーター、エンハンサーエレメント、及びシグナリング配列等のエレメントを含む。プロモーターの例としてはＣａＭＶプロモーター、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子に由来するプロモーター、ユビキチンプロモーター、及びｒｏｌＤプロモーターが挙げられる。エンハンサーエレメントの例は例えば米国特許第６，２７１，４４４号（発行日２００１年８月７日，名義人ＭｃＢｒｉｄｅら）に記載されている。シグナリング配列の例としては限定されないが、クロロプラストトランジットペフチド等の組織特異的トランジットペフチドをコードする核酸配列が挙げられる（例えばＺｈａｎｇら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７（１）：１４−２１参照）。
【０１１７】
所定態様では、コードされる配列の発現をパイナップル植物体の全組織で誘導する高度又は低度構成的植物プロモーターを使用することができる。このようなプロモーターは殆どの環境条件及び発生又は細胞分化状態で活性である。構成的プロモーターの例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’−又は２’−プロモーターや、当業者に公知の各種植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が挙げられる。遺伝子の過剰発現が望ましくない状況では、発現レベルを低くするように低度構成的プロモーターを使用することができる。高レベルの発現が求められる場合には、強度プロモーター（例えばｔ−ＲＮＡもしくは他のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、又はカリフラワーモザイクウイルスプロモーター等の強度ｐｏｌ  ＩＩプロモーター）を使用することができる。
【０１１８】
あるいは、植物プロモーターを環境制御下においてもよい。このようなプロモーターを本発明では「誘導的」プロモーターと言う。誘導的プロモーターにより転写を行うことができる環境条件の例としては病原体攻撃、嫌気性条件、又は光の存在が挙げられる。
【０１１９】
所定態様では、本発明の構築物に組込まれるプロモーターは「組織特異的」であり、従って、果実組織等の所定組織のみで所望遺伝子が発現されるような発生制御下におかれる。パイナップル植物体に内在する１種以上の核酸配列を構築物に組込む態様では、トランスフェクトした植物で遺伝子の発現を誘導するためにこれらの遺伝子に由来する内在プロモーター（又はその変異体）を使用することができる。本明細書に記載する人工進化核酸等の異種構造遺伝子の発現を誘導するためにも組織特異的プロモーターを使用することができる。
【０１２０】
上記プロモーターに加え、植物で機能する細菌由来プロモーターとしてはオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター及び天然Ｔｉプラスミドに由来する他のプロモーターか挙げられる（Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３参照）。ウイルスプロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ及び１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターが挙げられる（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）。他の植物プロモーターとしてはリブロース−１，３−ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターとファセオリンプロモーターが挙げられる。Ｅ８遺伝子や他の遺伝子に由来するプロモーター配列を使用してもよい。Ｅ８プロモーターの単離と配列はＤｅｉｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３３１５−３３２７に詳細に記載されている。
【０１２１】
本発明の構築物を作製する際には、プロモーターと結合核酸セグメント以外の配列も使用することができる。正常ポリペプチド発現が所望される場合には、コーディング領域の３’末端のポリアデニル化領域を付加することができる。ポリアデニル化領域は天然遺伝子、種々の他の植物遺伝子、又はＴ−ＤＮＡに由来するものを利用できる。
【０１２２】
パイナップル植物体における遺伝子発現に有用な典型的ベクターは当分野で周知であり、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８７）Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：２５３−２７７（１９８７）に記載されているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターが挙げられる。これらのベクターは植物組込みベクターであり、形質転換されると、ベクターはベクターＤＮＡの一部をパイナップル植物体のゲノムに組込む。Ｔｉプラスミドによる組込みベクターでは、宿主植物染色体に組込まれる領域はＴｉプラスミドの右端と左端の間の領域である。
【０１２３】
本発明で有用なＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターの例はＳｃｈａｒｄｌら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１：１−１１  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：８４０２−８４０６のプラスミドｐＫＹＬＸ６及びｐＫＹＬＸ７てある。プラスミドｐＫＹＬＸ６は中間構築物用に設計された大腸菌ベクターであり、プラスミドｐＫＹＬＸ７はクローニングされた遺伝子の組込み用に設計されたＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターである。改変ベクターｐＫＹＬＸ６１及びｐＫＹＬＸ７１は元のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩフラグメント多重クローニング部位領域の代わりにＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ及びＳｓｔＩ部位を含む。本発明で有用な別のベクターはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から市販されているプラスミドｐＢＩ１０１．２である。プラスミドｐＫＹＬＸ７、ｐＫＹＬＸ７１及びｐＢ７１０１．２はｖｉｒ遺伝子をもつ別のベクターとＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで併用されるバイナリーベクターである。本発明では例えばトライナリーベクターシステム等の別のベクターシステムも場合により使用される。別の植物形質転換システムは形質転換されると腫瘍ではなく毛根を誘導するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを利用する。例えば、国際公開第ＷＯ８８／０２４０５号（公開日１９８８年４月７日）は植物を形質転換するためにＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株Ａ４及びそのＲｉプラスミドとＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｒａｓベクターｐＡＲＣ８又はｐＡＲＣ１６を併用することを記載している。アグロバクテリウムによる形質転換については以下に詳述する。
【０１２４】
レトロウイルス発現ベクターの使用も考えられる。本明細書で使用する「レトロウイルス発現ベクター」なる用語はレトロウイルスゲノムの長い末端反復配列（ＬＴＲ）領域に由来するプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。本発明のカロテノイド産物には食品製造及び着色に関連するものがあるので、レトロウイルス発現ベクターは真核細胞で複製できないことが好ましい。レトロウイルスベクターの構築と使用は例えばＶｅｒｍａの国際公開第ＷＯ８７／００５５１号とＣｏｃｋｉｎｇら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２５９−６２に記載されている。
【０１２５】
所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させるために使用されるベクターは形質転換パイナップル細胞に選択表現型を付与する植物選択マーカーを含む。挿入するＤＮＡセグメント上の選択植物マーカー遺伝子は通常は選択培地で形質転換胚形成又は器官形成組織又はカルスの生存と発生を可能にする機能をコードする。通常、選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードし、適切な遺伝子としては抗生物質スペクチノマイシン耐性をコードする遺伝子（例えばａａｄＡ遺伝子）、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシン又はゲネチシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシン耐性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害するように作用する除草剤、特にスルホニル尿素型除草剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えばこのような耐性を誘導する突然変異、特にＳ４及び／又はＨｒａ突然変異を含むアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤（例えばホスフィノトリシン又はバスタ）に対する耐性をコードする遺伝子（例えばｂａｒ遺伝子）、あるいは当分野で公知の他の同様の遺伝子が挙げられる。ｂａｒ遺伝子は除草剤バスタに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質カナマイシン及びゲネチシンに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子は除草剤クロロスルフロンに対する耐性をコードする。スルホニル尿素型除草剤に対する耐性に基づく選択が好ましい。グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）又はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）に基づく選択マーカーも場合により使用され、例えばＭａｎｔｉｓら（２０００）“Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅａｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，”  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １８：３１９−３３０に詳細に記載されている。
【０１２６】
所望耐性遺伝子を組込んだ形質転換植物細胞の選択方法は当分野で周知である。例えば、マーカーがスルホニル尿素耐性である場合には、一般に適当な濃度のスルホニル尿素型除草剤（例えば１〜１０００μｇ／ｌ、好ましくは約５〜１００μｇ／ｌの範囲のクロロスルフロン）を選択培地に加える。ＮＰＴＩＩ遺伝子を含むゲネチシン耐性パイナップル細胞又は組織の選択には、一般に１０〜５０ｍｇ／ｌのゲネチシンを培地に加える。ａａｄＡ遺伝子を含むスペクチノマイシン耐性細胞又は組織は一般にスペクチノマイシン２００〜１０００ｍｇ／ｌを加えた培地で選択される。
【０１２７】
多くのカロテノイドは着色しているので、これらのカロテノイド産物は可視化し、その特徴的スペクトル及び他の分析方法により測定することができる。従って、カロテノイド生合成酵素をコードする遺伝子は形質転換細胞の目視選択を可能にするマーカー遺伝子として使用することができる。特に、このような形質転換細胞は一般にカロテノイドレベル増加の結果として黄色〜オレンジ色〜赤色を示す。所定態様では、他の分析技術を使用して形質転換パイナップル細胞を選択することもでき、例えば質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ＮＭＲスペクトロスコピー、及び慣用ハイブリダイゼーション技術が挙げられる。
【０１２８】
相補的付着末端又は平滑末端を介してＤＮＡをベクターに機能的に連結するために各種の方法が開発されている。例えば、挿入する核酸セグメントとベクターに相補的ホモポリマー領域を付加することができる。その後、ベクターと核酸セグメントを相補的ホモポリマーテール間の水素結合により結合し、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１２９】
あるいは、１個以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを使用して核酸セグメントを組込み発現ベクターと結合することもできる。平滑末端核酸分子のライゲーションを触媒することが可能な酵素（例えばバクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ）の存在下に大過剰量の合成リンカー分子と共に平滑末端核酸セグメントをインキュベートすることにより、合成リンカーを平滑末端核酸セグメントと結合する。従って、反応産物はその末端に合成リンカー配列をもつ核酸セグメントである。これらの核酸セグメントを次に適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、合成リンカーの末端と適合性の末端を生成する酵素で切断しておいた組込み発現ベクターにライゲーションする。各種制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーがＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）をはじめとする多数の業者から市販されている。
【０１３０】
導入されるＤＮＡセグメントはパイナップル植物体におけるカロテノイドレベルの改変に加え、新規パイナップル植物形質を提供するため、既存パイナップル植物形質を強化するため、又はパイナップル植物体により示される表現型の発現を他の方法で改変するために選択された１種以上の遺伝子を更に含むことができる。このような付加形質としては除草剤耐性、殺虫剤耐性、耐病性、環境耐性（例えば熱、低温、干ばつ、塩分）、形態、成長特徴、栄養含量、味、収穫高、園芸特徴、消費者（品質）形質等が挙げられる。導入することができる遺伝子の例としてはパイナップルの特定疾病又は害虫に対する耐性を付与するか又は感受性を低下させるための遺伝子が挙げられる。このような遺伝子の例としてはフザリウム病、コナカイガラムシ疫病、マーブリング病及び線虫に対する感受性を低下させるものが挙げられる。
（ＶＩＩＩ．カロテノイド生合成調節ストラテジー）
【０１３１】
導入する機能的遺伝子はパイナップル果実着色の改変等の所望表現型を付与するポリペプチドをコードする構造遺伝子とすることができる。あるいは、，機能的遺伝子はパイナップル植物体内における内在遺伝子の転写及び／又は発現を抑制、亢進、又は他の方法で改変するように転写及び／又は翻訳制御に役割を果たす調節遺伝子でもよい。例えば所定態様では、導入されるカロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは形質転換細胞で発現されると、ターゲットカロテノイド生合成遺伝子の発現を亢進するカロテノイド生合成ポリペプチド転写因子をコードする核酸セグメントである。他の態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターはカロテノイド生合成ポリペプチドプロモーター及び／又はカロテノイド生合成ポリペプチドエンハンサーをコードする核酸セグメントを含み、前記核酸セグメントは内在カロテノイド生合成ポリペプチド遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサーと相同組換えし、所望に応じて遺伝子の発現を増減させる。
【０１３２】
例えば、内在植物遺伝子の発現を抑制する多数の技術（例えばセンスもしくはアンチセンス抑制又はリボザイム）で各種ＤＮＡ構築物を使用することができる。遺伝子発現のアンチセンスＲＮＡ阻害は報告されている。例えばＳｈｅｅｈｙら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８０５−８８０９、及びＨｉａｔｔら，米国特許第４，８０１，３４０号参照。内在遺伝子の発現を調節するためのセンス抑制の使用の例については、Ｎａｐｏｌｉら（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９，及び米国特許第５，０３４，３２３号参照。
【０１３３】
触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムも遺伝子発現を阻害するために使用することができ、遺伝子が阻害されるよりも上流のカロテノイド生合成経路に位置する選択されたカロテノイドの蓄積を行うために場合により使用される。ほぼ任意ターゲットＲＮＡと特異的に対合し、特定位置でホスホジエステルバックボーンを切断することによりターゲットＲＮＡを機能的に不活性化するリボザイムを設計することができる。この切断を行う際にリボザイム自体は変化しないので、リサイクルして他の分子を切断できるため、真の酵素であると言える。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を付加すると、ＲＮＡ切断活性が付与され、従って構築物の活性が増加する。
【０１３４】
多数の類のリボザイムが同定されている。リボザイムの１類は植物で自己切断及び複製することができる多数の小環状ＲＮＡに由来する。ＲＮＡは単独（ウイロイドＲＮＡ）又はヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）と共に複製する。例えばアボカドサンブロッチウイロイドに由来するＲＮＡや、タバコ輪斑病ウイルス、アルファルファ一過性条斑病ウイルス、ベルベットタバコ斑紋病ウイルス、ｓｏｌａｎｕｍ  ｎｏｄｉｆｌｏｒｕｍ斑紋病ウイルス、及びサブタレニアンクローバー斑紋病ウイルスに由来するサテライトＲＮＡが挙げられる。ターゲットＲＮＡ特異的リボザイムの設計と使用はＨａｓｅｌｏｆｆら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されている。
【０１３５】
アンチセンス抑制についても、導入される配列は一次転写産物に対して全長である必要はなく、完全にプロセシングされたｍＲＮＡでもよい。一般に、高い相同性を使用するほど短い配列の使用を補うことができる。更に、導入される配列は同一イントロン又はエキソンパターンをもつ必要はなく、非コーディングセグメントの相同性も同様に有効であり得る。一般に、約３０又は４０ヌクレオチド〜約２０００ヌクレオチドの配列を使用すべきであるが、少なくとも約１００ヌクレオチドが好ましく、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、少なくとも約５００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【０１３６】
更に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）とも言う）を場合により利用してパイナップル細胞及び植物体におけるカロテノイド蓄積を調節する。ＲＮＡｉはメッセンジャーＲＮＡを破壊することによりターゲット遺伝子の効果を選択的に無効にする。ターゲットｍＲＮＡを破壊することにより、蛋白質合成を妨害し、それによりターゲット遺伝子を有効に「サイレンシング」する。所定態様では、このプロセスは一方の鎖がターゲットｍＲＮＡと実質的に同一である２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される。従って、本発明の所定態様では、カロテノイド生合成ポリペプチド発現レギュレーターは２本鎖ｄｓＲＮＡの生産を開始するためにパイナップル細胞に導入された後にＲＮＡｉプロセスの一環として小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解される核酸セグメントを含む。この結果、ターゲットｍＲＮＡが破壊され、カロテノイド生合成ポリペプチドをコードする内在遺伝子等のターゲット遺伝子の発現が有効にサイレンシングされる。ＲＮＡｉに関するその他の詳細は例えば米国特許第６，５７３，０９９号（発明の名称「ターゲット遺伝子の発現を遅延又は抑制するための遺伝子構築物（ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＳ  ＦＯＲ  ＤＥＬＡＹＩＮＧ  ＯＲ  ＲＥＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＴＡＲＧＥＴ  ＧＥＮＥ）」、発行日２００３年６月３日、名義人Ｇｒａｈａｍ）や、例えばＡｒｅｎｚら（２００３）“ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｎｃｉｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｏ  ａ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ？”  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ．９０（８）：３４５−５９，Ｗａｎｇら（２００３）“ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｗｅａｐｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ，”Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９（８）：１６５７−６１，及びＬａｖｅｒｙら（２００３）“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．６（４）：５６１−９に記載されている。ターゲット遺伝子サイレンシングを実施するために利用することができる注文核酸セグメントもＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、Ｂｅｎｉｔｅｃ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｓｔ  Ｌｕｃｉａ，ＡＵ）等の各種製造業者から市販されている。
【０１３７】
導入する機能的遺伝子はその天然形態から改変されることが多い。例えば、上記センス及びアンチセンス構築物は天然遺伝子の転写産物の全部又は一部を転写可能なセグメントの５’末端でプロモーター配列に機能的に連結し、転写可能なセグメントの３’末端で（ポリアデニル化配列を含む）別の遺伝子の３’配列と機能的に連結していることが多い。当業者に自明の通り、プロモーター配列は既に記載されている多数の植物活性配列の１つとすることができる。あるいは、転写活性なセグメントと連結するように他の植物活性プロモーター配列を特に誘導することもできる。プロモーターはパイナップルに内在性のものでもよいし、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ユビキチン１プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｉｅｎｓｅｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）、又はＳｍａｓプロモーター（Ｎｉら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６６１−６７６）等の外来起源に由来するものでもよい。付加する３’末端配列はノパリンシンターゼ又はオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するものが好ましく、あるいは別の植物遺伝子に由来するものでもよく、あまり好ましくはないが、他の任意真核遺伝子に由来するものでもよい。
【０１３８】
上述のように、例えばカロテノイド生合成酵素をコードする核酸セグメント（例えば第１の該当遺伝子）で形質転換されたパイナップル細胞及び植物体ではカロテノイド生産を亢進することができる。場合により、これらの導入されたカロテノイド生合成遺伝子の発現によりこの生合成活性が亢進すると、特定カロテノイドの生産と蓄積に経路を転換することができる。転換は一般に少なくとも１種の第２の該当遺伝子の使用を含む。例えば、第２の遺伝子は特定カロテノイドの生産を誘導するための遺伝子をコードすることもできるし、あるいは、特定カロテノイドの蓄積用経路を停止するための遺伝子をコードすることもできる。特定カロテノイドの生産を誘導するためには、所望カロテノイドの経路におけるカロテノイド生合成遺伝子の発現を使用する。これらの方法ではターゲットパイナップル植物体の内在又は外来遺伝子を場合により使用し、例えばＥｒｗｉｎｉａ種やＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ種をはじめとする細菌等の植物以外の起源のカロテノイド生合成遺伝子が挙げられる。これらの目的に使用することができるカロテノイド生合成遺伝子の例については上記に詳述した通りである。特定カロテノイド化合物を蓄積するために経路を停止するには、第２の遺伝子はターゲット植物の（例えば内在又は外来）遺伝子転写を阻害し、阻害された遺伝子によりコードされる酵素は所望カロテノイド化合物を改変することができる。阻害は阻害する遺伝子の転写により実施することができ、遺伝子の向きはセンス（同時抑制）又はアンチセンスのいずれでもよい。パイナップル植物体におけるカロテノイド蓄積を改変させるための他のセンス及びアンチセンスストラテジーについては上述した通りである。
【０１３９】
更に、ゼアキサンチン、ゼアキサンチンジグルコシド、カンタキサンチン、及びアスタキサンチン等のβ−カロテンから誘導されるカロテノイドをより高レベルで蓄積するようにパイナップル植物体のカロテノイド組成を改変するためには、α−カロテン及びα−カロテンから誘導される他のカロテノイド（例えばルテイン）の蓄積を防止するようにリコペンε−シクラーゼを阻害することができる。リコペンε−シクラーゼの阻害に加え、第２の遺伝子の発現亢進を利用して特定β−カロテン誘導カロテノイドの蓄積を増加することもできる。例えば、β−カロテンヒドロキシラーゼの発現亢進はゼアキサンチン生産に有用であり、β−カロテンヒドロキシラーゼとケト誘導酵素の発現亢進はアスタキサンチン生産に有用である。あるいは、リコペンを蓄積するためには、リコペンβ−シクラーゼ又はリコペンε−シクラーゼとリコペンβ−シクラーゼの阻害を実施してリコペンからα−及びβ−カロテンへの変換を低下させることができる。
【０１４０】
パイナップル細胞及び植物体におけるカロテノイド生合成を所望通りに転換するために場合により種々の遺伝子が使用される。これらの例としては限定されないが、ゼアキサンチン生産にはβ−カロテンヒドロキシラーゼ又はｃｒｔＺ（Ｈｕｎｄｌｅら（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１５：３２９−３３４，アクセション番号Ｍ８７２８０）；カンタキサンチン生産にはｃｒｔＷ（Ｍｉｓａｗａら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６５７５−６５８４，ＷＯ９５／１８２２０，ＷＯ９６／０６１７２）又はβ−Ｃ−４−オキシゲナーゼ（ｃｒｔＯ；Ｈａｒｋｅｒら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０４：１２９−１３４）等のケト導入酵素をコードする遺伝子；アスタキサンチン生産にはｃｒｔＺ及びｃｒｔＷ又はｃｒｔＯ；ルテイン生産にはε−シクラーゼとε−ヒドロキシラーゼ；ルテイン及びゼアキサンチン生産にはε−ヒドロキシラーゼとｃｒｔＺ；β−カロテン生産亢進にはアンチセンスリコペンε−シクラーゼ（アクセション番号Ｕ５０７３８）；リコペン生産にはアンチセンスリコペンε−シクラーゼとリコペンβ−シクラーゼ（Ｈｕｇｕｅｎｅｙら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８：４１７−４２４，Ｃｕｍｉｉｎｇｈａｍ  Ｊｒら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：１６１３−１６２６，Ｓｃｏｌｎｉｋら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３４３，アクセション番号Ｘ８６４５２，Ｌ４０１７６，Ｘ８１７８７，Ｕ５０７３９及びＸ７４５９９）；フィトエン生産にはアンチセンス植物フィトエンデサチュラーゼ等が挙げられる。
【０１４１】
こうして、該当特定カロテノイド化合物の生産を亢進するように経路を改変することができる。このような化合物としては限定されないが、α−クリプトキチンチン、β−クリプトキチンチン、ζ−カロテン、フィトフルエン、ニューロスポレン等が挙げられる。本発明の方法を使用すると、カロテノイド経路における任意該当化合物をパイナップル植物体の果実等の選択貯蔵器官において高レベルで生産することができる。
【０１４２】
場合により、例えば前駆物質化合物から制御対象の特定カロテノイドへの変換を防止するアンチセンスＤＮＡ配列でパイナップル細胞を形質転換することにより特定カロテノイドレベルを低下させるように経路を操作することもできる。
【０１４３】
本発明では例えば第１の該当遺伝子、又は第１及び第２の該当遺伝子を含むパイナップル植物体を作製するための任意ストラテジーを場合により利用する。例えば、第２の該当遺伝子を使用して第１の該当遺伝子の導入と同時にパイナップル植物体を形質転換することができる（同時形質転換）。場合により、既に第１の該当遺伝子で形質転換されているパイナップル植物体に第２の該当遺伝子を導入してもよいし、あるいは、第１の該当遺伝子を発現する形質転換パイナップル植物体と第２の該当遺伝子を発現する形質転換パイナップル植物体を交配して両者遺伝子をもつ子孫を作製することもできる。
（ＩＸ．パイナップル外植片材料）
【０１４４】
本明細書に記載する方法によると、ほぼ任意パイナップル種を形質転換することができる。所定態様では、パイナップル外植片材料はＳｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅ系、Ｓｐａｎｉｓｈ系（例えばＲｅｄ  Ｓｐａｎｉｓｈ）、Ｐｅｒｏｌｅｒａ系、Ｐｅｒｎａｍｂｕｃｏ系、及びＰｒｉｍａｖｅｒａ系等のヒト消費に一般に使用されている品種から得られる。缶詰パイナップル、他のパイナップル加工品、及び生パイナップルの生産用に最も重要な品種はＳｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅである。これらの品種の多くでは各種地理的地域で現地生産に適応するように多数のクローンが樹立されている。Ｓｍｏｏｔｈ  Ｃａｙｅｎｎｅクローンのうちでは、Ｃｈａｍｐａｋａクローンが缶詰及び生パイナップルの生産に広く使用されている。
【０１４５】
初代外植片は植物の任意分裂組織領域とすることができ、例えば花形成前の植物の主及び補助分裂組織（頂端）や、果実のクラウンの主及び補助分裂組織が挙げられる。これらの領域を植物から切り取り、本明細書に記載するような当業者に周知の標準方法により滅菌し、人工培地で滅菌培養物を作製する。このような培養物は一連の増殖段階により長期間（例えば数週間、数カ月間又は数年間）維持することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏシュート培養物の作製と維持に適した培地は例えばＤｅＷａｌｄら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：５３５−５３７；Ｗａｋａｓａら（１９７８）Ｊａｐａｎ  Ｊ  Ｂｒｅｅｄ  ２８：１１３−１２１；Ｍａｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｒａｎｇａｎ（１９８１）Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔ  １４：２２７−２３４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａら（１９８１）Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔ  １５：２３Ｓ−２３８；Ｆｉｔｃｈｅｔ（１９９０）Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ  ２７５：２６７−２７４；Ｂｏｒｄｏｌｏｉ  ａｎｄ  Ｓａｒｍａ（１９９３）Ｊ  Ａｓｓａｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ３５：４１−４５；及びＦｉｒｏｏｚａｂａｄｙ  ａｎｄ  Ｍｏｙ（２００３）“Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｎｅａｐｐｌｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｖｉａ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（印刷中）に記載されている。
【０１４６】
本発明の所定態様では、ＤＮＡ送達のターゲットであるパイナップル細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖させたパイナップルシュートの葉の基部（即ち葉脚）又は茎の切片からまず採取し、ＤＮＡ送達段階前に培養増殖させる。本明細書で使用する「葉脚」なる用語はパイナップルのシュートの茎につながる葉の部分を意味する。
【０１４７】
胚形成カルスもしくは組織、又は器官形成カルスもしくは組織を誘導するためには、例えばオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、及びアブシジン酸等の合成植物ホルモンの選択された組み合わせを添加した特定人工培地に葉又は葉脚等の滅菌外植片を移す。例えば、合成オーキシンは一般に例えばピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロ−２−ピリジンカルボン酸）、ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）、ＮＡＡ（２−ナフタレン酢酸）、ＮＯＡ（ナフトキシ酢酸）等から選択される。使用可能なサイトカイニンの例としては限定されないが、ＢＡ（ベンジルアデニン）、ＢＡＰ（ベンジルアミノプリン）、ＴＤＺ（チジアズロン）、ゼアチン、カイネチン等が挙げられる。胚形成及び器官形成細胞培養は当分野で周知である。例えば、体細胞胚形成細胞培養及び本発明の方法で使用するのに適した他の側面に関するその他の詳細は例えば米国特許第５，９５２，５４３号（発明の名称「遺伝子組換えパイナップル植物体及びその作製方法（ＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＤ  ＰＩＮＥＡＰＰＬＥ  ＰＬＡＮＴＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＩＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ）」，発行日１９９９年９月１４日、名義人Ｆｉｒｏｏｚａｂａｄｙら）とその引用文献及びＦｉｒｏｏｚａｂａｄｙら（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（投稿中）に記載されている。器官形成細胞培養に関するその他の詳細は例えば国際出願公開第ＷＯ０１／３３９４３号（発明の名称「植物形質転換方法（Ａ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＰＬＡＮＴ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮ）」，Ｇｒａｈａｍら，公開日２００１年５月１７日）、米国特許第５，９０８，７７１号（発明の名称「サルビア種の再生方法（ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＡＬＶＩＡ  ＳＰＥＣＩＥＳ）」，発行日１９９９年６月１日，名義人Ｌｉｕら）、米国特許第６，２４２，２５７号（発明の名称「多数の生育可能な綿の木をＩＮ  ＶＩＴＲＯ作製するための組織培養方法（ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  Ａ  ＬＡＲＧＥ  ＮＵＭＢＥＲ  ＯＦ  ＶＩＡＢＬＥ  ＣＯＴＴＯＮ  ＰＬＡＮＴＳ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ）」，発行日２００１年６月５日，名義人Ｔｕｌｉら）、Ｃｒｏｙ（Ｅｄ．）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．（１９９３），Ｊｏｎｅｓ（Ｅｄ．）Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）とその引用文献に記載されている。
【０１４８】
当業者に自明の通り、多種多様の胚形成及び器官形成細胞を本明細書に記載する核酸セグメントの送達と形質転換イベントの選択用ターゲット細胞として使用することができる。例えば、本発明の核酸セグメントは胚形成又は器官形成に伴って葉、葉脚、及び茎切片の細胞に送達することができる。更に、場合により、胚形成カルスもしくは組織又は器官形成カルスもしくは組織の発生直後に核酸セグメントを細胞に送達する。あるいは、胚形成又は器官形成材料を維持し、選択期間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖させた後に核酸セグメントを胚形成又は器官形成細胞に送達することもできる。
（Ｘ．核酸セグメントＤＮＡ送達）
【０１４９】
本発明のトランスジェニックパイナップル細胞は各種発生段階（例えば各種胚形成及び器官形成段階）で形質転換される。更に、本発明の核酸セグメントは多数の当分野で公知の方法でパイナップル細胞に導入することができる。一般に、植物細胞の適切な形質転換方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウムによる形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５−９２１）、弾道的粒子加速ないし遺伝子銃（Ｓａｎｆｏｒｄら，米国特許第４，９４５，０５０号；及びＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６）、花粉による送達（Ｚｈｏｕら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：４３３，Ｄｅ  Ｗｅｔら（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎら（Ｅｄｓ．），Ｌｏｎｇｍａｎ，ｐ．１９７；Ｈｅｓｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１０７：３６７；及びＬｕｏら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．７：６９）、パイナップル細胞のプロトプラストへの直接核酸導入（Ｃａｂｏｃｈｅら（１９８４）Ｃｏｍｐｔｅｓ  Ｒｅｎｄｕｓ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２９９，ｓｅｒｉｅｓ  ３：６６３）、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９及びＲｅｉｃｈら（１９８６）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ．４：１００１）、花房のマクロインジェクション（Ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２７４）、ひげによる受精（Ｄｕｎａｈａｙ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：４５２−４６０及びＦｒａｍｅら（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：９４１−９４８）、レーザーパーフォレーション（Ｗｅｂｅｒ（１９８８）Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ７５：３５）、及び超音波（Ｚｈａｎｇら（１９９１）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ．９：９９４）が挙げられる。
【０１５０】
更に、アグロバクテリウムによる導入は核酸セグメントを植物組織全体に導入することができ、無傷の植物体をプロトプラストから再生する必要がないため、遺伝子を植物細胞に導入するために広く適用可能である。植物細胞にＤＮＡを導入するためにアグロバクテリウムによる発現ベクターを使用することは当分野で周知である。例えばＦｒａｌｅｙら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３：６２９及びＲｏｇｅｒｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：２５３−２７７に記載されている方法を参照されたい。更に、Ｔ−ＤＮＡの組込みは転位をほとんど生じない比較的正確な方法である。導入するＤＮＡの領域は境界配列により規定され、干渉ＤＮＡ又は核酸セグメントは通常はＳｐｉｅｌｍａｎｎら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：３４及びＪｏｒｇｅｎｓｅｎら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：４７１により記載されているように植物ゲノムに導入される。
【０１５１】
上記のような現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは大腸菌とアグロバクテリウムで複製することができるので、Ｋｌｅｅら，Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｈｏｈｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，（Ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８５）ｐｐ．１７９−２０３に記載されているように簡便に操作することができる。
【０１５２】
更に、アグロバクテリウムによる遺伝子導入用ベクターの最近の技術的進歩により、ベクターにおける遺伝子及び制限部位の配置が改善され、各種ポリペプチドコーディング遺伝子を発現することが可能なベクターを容易に構築できるようになった。例えば、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：２５３に記載されているベクターは挿入したポリペプチドコーディング遺伝子を直接発現させるようにプロモーターとポリアデニル化部位に挟まれた便利なマルチリンカー領域をもち、本発明の目的に適している。適切なベクターについては上記に詳述した通りである。
【０１５３】
本発明の所定態様では、外来ＤＮＡを挿入したアグロバクテリウム株を使用して異種核酸セグメントをＴ−ＤＮＡエレメントに導入する。組抱えＴ−ＤＮＡエレメントはアグロバクテリウム細胞から植物細胞へのＤＮＡ送達に必要なビルレンス機能をもつＴｉ−プラスミドの一部でもよいし、Ｔ−ＤＮＡエレメントを配置するプラスミドとは別個のプラスミドにビルレンス機能をもたせてもよい（バイナリーベクターと言う）。大腸菌とアグロバクテリウムの両者で複製することができるこれらの各種バイナリーベクターは上記引用文献に記載されている。同時培養法の１例では、同時培養前にアグロバクテリウムを２〜７×１０８細胞／ｍｌの濃度まで増殖させ、１〜６×１０８細胞／ｍｌ、好ましくは２〜５×１０８細胞／ｍｌまで希釈する。一般に１〜５日間、好ましくは２〜３日間アグロバクテリウムをパイナップル組織と同時培養する。
【０１５４】
適切なアグロバクテリウム株としてはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが挙げられる。野生型株も使用することができるが、Ｔｉプラスミドの腫瘍誘導配列を除去した両種の「武装解除」誘導体が好ましい。適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株としては、例えばＨｏｏｄら（（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１２９１−１３０１）により記載されているようなＥＨＡ１０１、Ｈｏｅｋｅｍａら（（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９−８０）により記載されているようなＬＢＡ４４０４、及びＫｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ（（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４：３８３−９６）により記載されているようなＣ５８（ｐＭＰ９０）が挙げられる。好ましいＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株はＢｉｒｏｔら（Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５：３２３−３５）により記載されているような１５８３４である。
【０１５５】
Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に導入するのに適した同時培養培地でパイナップル胚形成又は器官形成組織又はカルスとＤＮＡセグメントを挿入したアグロバクテリウム細胞を同時培養する。核酸セグメントを挿入したアグロバクテリウム株を作製した後に、通常は培養してからカルス又は組織と共にインキュベーションする。アグロバクテリウムは当業者に周知の方法により固体又は液体培地で培養することができる。例えば米国特許第５，２６２，３１６号参照。
【０１５６】
あるいは、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、及びこれらの処理の組み合わせに基づく方法を使用して植物プロトプラストの形質転換を行うこともできる。例えばＰｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３；Ｌｏｒｚら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１７８；Ｆｒｏｍｍら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３１９：７９１；Ｕｃｈｉｍｉｙａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４：２０４；Ｃａｌｌｉｓら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１：１１８３；Ｍａｒｃｏｔｔｅら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４；Ｗａｎｇら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：６９１−６９６；及びＦｅｎｎｅｌｌら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１１：５６７−５７０参照。
【０１５７】
プロトプラストから首尾よく再生することができない植物種を形質転換するには、核酸セグメントを無傷の細胞又は組織に導入するための他の方法を利用することができる。例えば、「粒子銃」ないし高速微粒子衝撃技術を利用することができる。このような技術を使用する場合には、Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：８５０２；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３；及びＶａｓｉｌら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：６６７−６７４に記載されているように核酸セグメントを小金属粒子の表面に付け、細胞壁を通して細胞質内に輸送する。金属粒子は数層の細胞層を貫通するので、組織外植片の内部の細胞を形質転換することができる。組織外植片の形質転換はプロトプラスト段階で継代する必要がないため、トランスジェニック植物体の作製速度が上がる。
【０１５８】
核酸セグメントはＺｈｏｕら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１：４３３；Ｈｅｓｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎ  Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１０７：３６７；Ｌｕｏら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，６：１６５に記載されているように花粉への直接ＤＮＡ導入により植物に導入することもできる。ポリペプチドコーディング遺伝子の発現はＰｅｎａら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５．：２７４に記載されているように植物の生殖器官への核酸セグメントの注入により得ることができる。Ｎｅｕｈａｕｓら（１９８７）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７５：３０；及びＢｅｎｂｒｏｏｋら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｂｉｏ  Ｅｘｐｏ  １９８６，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ．，ｐｐ．２７−５４（１９８６）により記載されているように核酸セグメントを未成熟胚の細胞に直接注入し、乾燥した胚を再水和することもできる。
【０１５９】
あるいは、植物プラスチドを直接形質転換することもできる。クロロプラストの安定的形質転換が高等植物で報告されている。例えばＳｖａｂら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７；Ｓｔａｕｂら（１９９３）Ｅｍｂｏ  Ｊ．１２：６０１−６０６参照。この方法は選択マーカーを含む核酸セグメントの粒子銃による送達を利用し、相同組換えにより核酸をプラスチドゲノムにターゲティングする。このような方法では、プラスチド遺伝子発現はプラスチド遺伝子プロモーターの使用により実施することができ、あるいは、サイレントプラスチドに導入したトランスジーンをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるもの等の選択プロモーター配列から発現するように配置し、トランス活性化することにより実施することもできる。サイレントプラスチド遺伝子は核酸発現構築物に由来する特定ＲＮＡポリメラーゼの発現とトランジットペフチドの使用によるプラスチドへのポリメラーゼのターゲティングにより活性化される。このような方法では、核酸によりコードされ、プラスチドに特異的なＲＮＡポリメラーゼを使用し、適切な植物組織特異的プロモーターから発現させることにより組織特異的発現が得られる。このようなシステムはＭｃＢｒｉｄｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
（ＸＩ．トランスジェニックパイナップル植物体の再生と微細繁殖）
【０１６０】
核酸セグメントの送達後、胚形成又は器官形成細胞を培地に移すが、培地には選択物質（例えば除草剤等）を添加してもよく、選択物質はその発現産物が選択物質の作用を防止できるような遺伝子（例えば選択マーカー）を導入していないパイナップル細胞の増殖を阻止できるものとする。選択マーカーについては上記に詳述した通りである。培養期間後、一般に増殖し続ける胚形成又は器官形成カルス又は組織を増殖が減速又は終了した胚形成又は器官形成カルス又は組織から分離する。
【０１６１】
単一植物プロトプラスト又は種々の外植片からの植物の再生は当分野で周知である。例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈら（Ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）参照。所定態様では、再生及び増殖プロセスは形質転換細胞及びシュートを選択する段階と、形質転換シュートから発根させる段階と、小植物を土壌で成長させる段階を含む。例えば、葉外植片からアグロバクテリウムにより導入された遺伝子を含む植物の再生はＨｏｒｓｃｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１に記載されているように実施することができる。この方法では、Ｆｒａｌｅｙら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３に記載されているように形質転換下の植物種にシュートの再生を誘導する培地で選択物質の存在下に形質転換細胞を増殖させる。この方法では一般に２〜４週間以内にシュートが発生した後に、選択物質と細菌増殖を防止するための抗生物質を含有する適当な発根誘導培地にこれらの形質転換シュート移す。パイナップルでは、葉脚を使用して器官形成材料を作製し（Ｆｉｒｏｏｚａｂａｄｙ  ａｎｄ  Ｍｏｙ（２００３）“Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｎｅａｐｐｌｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｖｉａ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，印刷中）、その後、これらの材料をアグロバクテリウムと接触させると、恐らく選択後にトランスジェニック器官形成材料を形成することができる。その後、これらの材料からシュートと完全植物体を形成させる。所定態様では、形質転換植物シュートを形成するには胚形成カルスの形質転換が好ましい。形質転換シュートを選択物質の存在下で発根させて小植物を形成した後に土壌又は他の発根用媒体に移植する。
【０１６２】
本発明の方法で使用するのに適した植物再生、微細繁殖、及び他の側面に関するその他の詳細は例えば米国特許第５，９５２，５４３号及びＷＯ０１／３３９４３（前出）、米国特許第５，５９１，６１６号、６，０３７，５２２号、ヨーロッパ特許公開第６０４６６２（Ａ１）号及び６７２７５２（Ａ１）号、並びにＷＯ０１／１２８２８に記載されている。Ｋｙｔｅら，Ｐｌａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｅｓｔ  Ｔｕｂｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，Ｔｉｍｂｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９６），Ｈｕｄｓｏｎら，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｅｓｔｅｒ’ｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ（２００１），Ｂａｊａｊ（Ｅｄ．）Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  Ｉ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．（１９９２），Ｊａｉｎ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｈａｐｌｏｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６），及びＤｅｂｅｒｇｈら（Ｅｄｓ．），Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９１）も参照されたい。
【０１６３】
場合により、本発明のカロテノイド生合成ポリペプチドは当分野で周知の多数の方法の任意のものにより形質転換パイナップル細胞培養又は形質転換パイナップル植物体組織（例えば果実組織等）から回収及び精製することができ、このような方法としては硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。場合により、機能的産物を回収するために蛋白質をリフォールディングする必要がある。上記以外にも各種精製方法が当分野で周知であり、例えばＳａｎｄａｎａ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｂｏｌｌａｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ（１９９６）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９６）；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９３）；及びＪａｎｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（１９９８）に記載されている方法が挙げられる。
（ＸＩＩ．実施例）
【０１６４】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を制限するものではない。
【０１６５】
培地は文字と数字で指定し、使用した培地成分を文字で示した後に特定成分の濃度を表す数字を記載する。例えば、Ｂ２Ｎ２は６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ又はＢ）とα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ又はＮ）を加えたＭＳ培地である。下記実施例に記載する培地組成に関するより具体的な詳細（成分濃度等）は以下に記載する。
（実施例１）
タンジェリンに由来するフィトエンシンターゼ（ＰＳＹ）遺伝子のパイナップル（トランスジェニック株１６．５．９）への導入
１．柑橘類からのＰＳＹ遺伝子の単離
ｉ．プライマー設計
【０１６６】
ＰＳＹ−Ｎａｖａｌ（アクセション番号Ｇｉ  ５９５９８５９）の配列情報に基づいて２種のプライマーを設計した：
フォワードプライマーＰＳＹ−Ｆ：５’−ａａａ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ａｔｇ  ｔｃｔ  ｇｔｔ  ａｃａ  ｔｔｇ  ｃｔｇ  ｔｇｇ−３’
リバースプライマーＰＳＹ−Ｒ：５’−ｇａｔ  ａｔｅ  ｔｔａ  ａｇｅ  ｃｔｔ  ａｃｔ  ｇｇｔ  ａｔａ  ｔａｔ  ｔｃｔ  ｔｇ−３’。
ｉｉ．ＲＮＡ単離
【０１６７】
Ｔｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）でタンジェリン葉組織から全ＲＮＡを抽出した。抽出は製造業者の手順に従って実施した。
ｉｉｉ．逆転写反応
【０１６８】
反応容量２０μｌ中で全ＲＮＡ１μｇと１０μＭ  ＰＳＹ−Ｒプライマー１μｌを使用して逆転写を実施した。
ｉｖ．ＰＳＹ遺伝子を単離するためのＰＣＲ
【０１６９】
以下の反応混合物でＰＳＹ−Ｆ及びＰＳＹ−Ｒプライマーを使用してＰＣＲを実施した：
ＰＳＹ−Ｆ（１０μＭ）：１μｌ
ＰＳＹ−Ｒ（１０μＭ）：１μｌ
逆反応液：１μｌ
ＤＮＴＰ（１０ｍＭ）：１μｌ
１０×緩衝液：２．５μｌ
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ：０．２μｌ
水を加えて２５μｌ。
【０１７０】
ＰＣＲプログラムは９２℃で２分間変性させた後に、
９２℃で３０秒、
５５℃で２０秒、
７２℃で１．５分
を３５サイクルとした。
ｖ．ＰＣＲフラグメントのクローニング
【０１７１】
ＰＣＲ反応産物又はフラグメントを０．８％アガロースゲルで泳動させた。ＰＣＲフラグメントを切り出し、Ｑｉａｇｅｎのゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製した。次にフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，ＷＩ，ＵＳＡ）にクローニングした。Ｔ７及びＭ１３−Ｒプライマーを使用してシーケンシングを実施した。
２．シュート培養物の作製
【０１７２】
コスタリカの農場で生育させたデルモンテゴールドＭＤ−２パイナップルのクラウンから単離した分裂組織を使用してシュート培養物を作製した。要約すると、クラウンから葉を手で抜いて捨て、クラウン（〜３×５ｃｍ）の芯又は茎を水洗し、３３％  Ｃｌｏｒｏｘ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で２５分間撹拌下に表面を滅菌し、滅菌水で２回濯いだ。器具を頻繁に火炎滅菌しながら初生葉を１枚ずつ抜くことにより側部分裂組織とクラウン先端分裂組織を芯から切り離した。分裂組織ドームと、２〜３枚の小さな初生葉と、茎芯１ｃｍ３を含むクラウン先端分裂組織外植片をシュート培地Ｂ２Ｎ２±ＣＣに置床した。茎芯１ｃｍ３と共に側部分裂組織も単離し、同一培地で培養した。ＣＣ（カルベニシリンとセフォタキシム各５００ｍｇ／ｌ）を使用して内在微生物汚染を根絶した。培養物を２８℃で連続光照射下にインキュベートした。培養開始から９日後に組織をＢ２Ｎ２＋Ｎに継代した。ナイアシン（Ｎ，４０ｍｇ／ｌ）を使用して内在酵母及び真菌汚染を根絶した。２０日後にクラウン先端葉が伸びていたので、これらを引き抜いてクラウン先端分裂組織の増殖を促進し、新鮮なＢ２Ｎ２＋ＮＡ培地に移した。更にアンピシリンＢ（Ａ，５ｍｇ／ｌ）を使用して残留内在酵母及び真菌汚染を根絶した。更に２週間後に芽が形成され（外植片当たり２〜３個）、次いで新しい小さいシュートが発生し、シュートクラスターを形成した。培養開始から合計４か月後にシュートクラスターを液体Ｂ１．５Ｎ．５培地に移し、月１回継代しながら保存した。
３．アグロバクテリウムとの同時培養のための外植片の前処理
【０１７３】
迅速に成長するシュートを外植片として使用した。長い葉（＞１５ｍｍ）の先端を切り落とし、小さい外植片とした。シュートを縦方向に切断して４〜６個の切片とし、Ｐ１０Ｔ１．１Ｂ６（６％バナナ果肉添加）で８日間前処理（培養）した。葉脚と芯切片を作製し、同時培養のためにアグロバクテリウムと混合した。
４．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養及び作製
【０１７４】
バイナリーベクターシステムを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１（Ｈｅｌｌｅｎｓ（２０００）“ｐＧＲＥＥＮ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｎｄ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｔｉ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：８１９−８３２参照）を形質転換に使用した。ベクターシステムはクロロスルフロン耐性を付与するためのｓｕｒＢ遺伝子とフィトエンシンターゼ遺伝子を発現させるためのｐｓｙ遺伝子を含むベクターｐＤＭから構成した。細菌を凍結グリセロールから取出し、培養し、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを加えた１．５％  Ｂａｃｔｏａｇａｒで凝固させたＬ−ブロス培地に保存した。同時培養の１日前に、ループを使用して固体培地から細菌を掻き取り、液体ＭｉｎＡｓｕｃ培地に懸濁し、シェーカー（１２０ｒｐｍ）で２８℃にて１日間培養した。同時培養前にスペクトロフォトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−５０）を使用して細菌濃度を測定した処、４×１０８細胞／ｍｌであった。
５．同時培養培地での同時培養
【０１７５】
細菌を容量比４：１（植物組織：アグロバクテリウム細胞）で葉脚及び芯切片１７０本と混合し、組織をドライブロットし、同時培養培地Ｐ１０Ｔ２．２Ａｓ３００の表面に載せた７．０ｃｍ滅菌Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｇ６グラスファイバー濾紙に混合物を加えた。プレートをパラフィルムで密閉し、２４℃に環境制御したインキュベーターに入れ、暗所で３日間保存した。
６．回収、選択及び植物再生
【０１７６】
同時培養後に組織（１５〜２０個／プレート）を回収培地Ｐ１０Ｔ１．１Ｃａｒｂ５００に移し、低強度光条件下に７日間回収した（１６時間／日）。次に、外植片を選択培地Ｐ１０Ｔ２．２Ｃａｒｂ３００ＣＳ５に移し、１７日後に細菌増殖が観察されたらＰ１０Ｔ２．２Ｃａｒｂ５００ＣＳ５に移し、高強度光条件下にインキュベートした（１６時間／日）。カルベニシリンを使用して残留アグロバクテリウム及びクロロスルフロン（ＣＳ）を根絶し、形質転換細胞を選択した。選択培地では、組織の大半は３〜６週間以内に茶変したが、組織の一部のセクターは正常なままであり、緑色の正常な形態形成組織を形成するように増殖し始めていた。形態形成組織はＢ３Ｎ．２Ｃａｒｂ１００ＣＳ１０培地で３０日以内にトランスジェニックシュートを形成した。次に、これらをＢ１Ｃａｒｂ１００ＣＳ１０に移して伸長させた。シュートの一部をガラス化した後、Ｂ１Ａ１％Ｃａｒｂ１００ＣＳ１０に移し、１４日間培養して伸長成長シュートを形成した。
７．形質転換の確認
【０１７７】
シュートが形質転換されたことを各種手段により確認した：１．ＣＳ耐性シュート又は初生シュートは致死レベルのＣＳの存在下に正常で緑色のままであった。２．ＣＳ耐性シュート又は初生シュート（２〜５ｍｇ／耐性片）をＧＵＳアッセイ用にサンプリングした。形質転換組織は青色染色し、非形質転換組織は青色染色しなかった。例えばＰＣＲやサザンブロッティング分析を使用して組織の形質転換を分子レベルで試験することもできる。
８．微細繁殖とトランスジェニック植物体の作製
【０１７８】
個々のシュート又は小さいシュートクラスターをＧＡ−７キューブに入れた１５ｍｌ液体培地Ｂ１Ｃａｒｂ１００ＣＳ２０に移し（２〜３クラスター／キューブ）、繁殖及び増殖させた。場合により、３０日後にシュートクラスターを微細繁殖させ、Ｂ１．５Ｎ．５ＣＳ２０（逆選択物質不添加）に数カ月保存してもよい。個々のシュート（４〜６ｃｍ長）を分離し、液体発根培地Ｎ．５ＩＢＡ．５ＣＳ１０又はＮ．５ＩＢＡ．５ＣＳ２０（逆選択物質不添加）で２−４週間培養し、完全植物体を作製した。その後、植物体を土壌に移植し、徐々に環境に馴化させ、温室条件に移すことができる。
（実施例２）
タンジェリンに由来するフィトエンシンターゼ（ＰＳＹ）遺伝子のパイナップル（１３．１８．２）への導入
１．柑橘類からのＰＳＹ遺伝子の単離
【０１７９】
実施例１に同じ。
２．材料組織の作製
ｉ．シュート培養物の作製
【０１８０】
実施例１に同じ。
ｉｉ．アグロバクテリウムとの同時培養のための外植片の前処理
【０１８１】
上記のように４か月間培養した迅速に成長するシュートを外植片として使用した。長い葉（＞１５ｍｍ）の先端を切り落とし、小さい外植片とした。シュートを縦方向に切断して３〜８個の切片とし、Ｐ２Ｔ１０Ａ培地で１０日間前処理（培養）した。葉脚と芯切片を作製し、再び同一培地で６２日間前処理した後に別の前処理培地に移した。初生シュートを含む形態形成組織をもつ切片をＴ１．１Ｉ．１培地で２４日間継代培養した。次に器官形成組織をＢ３Ｎ．２培地で２２日間継代培養した後、３〜５ｍｍ切片に切断してＢ２Ｎ２培養で７日間培養した後、同時培養のためにアグロバクテリウムと混合した。
３．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養及び作製
【０１８２】
バイナリーベクターシステムを含む上記Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１を形質転換に使用した。上記のように、ベクターｐＤＭはクロロスルフロン耐性を付与するｓｕｒＢ遺伝子とフィトエンシンターゼ遺伝子を発現するｐｓｙ遺伝子を含む。細菌を凍結グリセロールから取出し、培養し、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを加えた１．５％  Ｂａｃｔｏａｇａｒで凝固させたＬ−ブロス培地に保存した。同時培養の１日前に、ループを使用して固体培地から細菌を掻き取り、液体ＭｉｎＡｓｕｃ培地に懸濁し、シェーカー（１２０ｒｐｍ）で２８℃にて１日間培養した。同時培養前にスペクトロフォトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−５０）を使用して細菌濃度を測定した処、１．７×１０９細胞／ｍｌであった。
４．同時培養培地での同時培養
【０１８３】
細菌を容量比４：１（植物組織：アグロバクテリウム細胞）で混合し、組織をドライブロットし、同時培養培地Ｂ３Ｎ．２ＡＳ３００の表面に載せた７．０ｃｍ滅菌Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｇ６グラスファイバー濾紙に混合物を加えた。プレートをパラフィルムで密閉し、２４℃に環境制御したインキュベーターに入れ、暗所で３日間保存した。
５．回収、選択及び再生
【０１８４】
同時培養後、組織（２０〜２５個／プレート）を回収培地Ｂ３Ｎ．２Ｃａｒｂ５００及びＢ３Ｎ．２ＣＥＦ４００に移し、低強度光条件下に７日間回収した（１６時間／日）。次に、外植片を選択培地Ｂ２Ｎ２ＣＥＦ４００ＣＳ５に移し、高強度光条件下に２５日間インキュベートした（１６時間／日）後にＢ３Ｎ．２ＣＥＦ４００ＣＳ５に移し、月１回継代しながら保存した。セフォタキシムを使用して残留アグロバクテリウム及びクロロスルフロン（ＣＳ）を根絶し、形質転換細胞を選択した。選択培地では、組織の大半は４〜６週間以内に茶変したが、組織の一部のセクターは正常なままであり、緑色の正常な形態形成組織を形成するように増殖し始めていた。実施例１に記載したように植物体を再生させた。
６．形質転換の確認
【０１８５】
実施例１に同じ。
７．微細繁殖とトランスジェニック植物体の作製
【０１８６】
実施例１に同じ。
【表１】
2006508681.tif 000002
【０１８７】
組織培養用培地では、ｐＨは約５〜７．５の範囲とすべきであり、約５．６が好ましい。培地はオートクレーブ滅菌後に使用するが、特定成分については濾過滅菌してからオートクレーブ滅菌後に添加する。
ＭＳ
ＭＳ塩                              １Ｘ
Ｂ５ビタミン                        １Ｘ
スクロース                          ３０ｇ／ｌ
ＭＥＳ                              ６００ｍｇ／ｌ
Ｇｅｌ−ｒｉｔｅ（登録商標）        ２．５ｇ／ｌ
ｐＨ                                ５．７
Ｂ１．５Ｎ．５
ＭＳ培地＋
ＢＡ                                １．５ｍｇ／ｌ
ＮＡＡ                              ０．５ｍｇ／ｌ
Ｂ２Ｎ２
ＭＳ培地＋
ＢＡ                                ２ｍｇ／ｌ
ＮＡＡ                              ２ｍｇ／ｌ
Ｂ２Ｎ２＋ＣＣ
ＭＳ培地＋
ＢＡ                                ２ｍｇ／ｌ
ＮＡＡ                              ２ｍｇ／ｌ
カルベニシリン                      ５００ｍｇ／ｌ
セフォタキシム                      ５００ｍｇ／ｌ
Ｂ２Ｎ２ＣＥＦ４００ＣＳ５
ＭＳ培地＋
ＢＡ                                ２ｍｇ／ｌ
ＮＡＡ                              ２ｍｇ／ｌ
セフォタキシム                      ４００ｍｇ／ｌ
クロロスルフロン                    ５μｇ／ｌ
Ｂ２Ｎ２＋Ｎ
Ｂ２Ｎ２＋
ナイスタチン                        ４０ｍｇ／ｌ
Ｂ２Ｎ２＋ＮＡ
Ｂ２Ｎ２培地＋
ナイスタチン                        ４０ｍｇ／ｌ
アンホテリシンＢ                    ５ｍｇ／ｌ
Ｂ３Ｎ．２
ＭＳ＋
ＢＡ                                ３ｍｇ／ｌ
ＮＡＡ                              ０．２ｍｇ／ｌ
Ｂ３Ｎ．２ＡＳ３００
Ｂ３Ｎ．２＋
アセトシリンゴン                    ３００μＭ
Ｂ３Ｎ．２ＣＡＲＢ５００
Ｂ３Ｎ．２＋
カルベニシリン                      ５００ｍｇ／ｌ
Ｂ３Ｎ．２ＣＥＦ４００
Ｂ３Ｎ．２＋
セフォタキシム                      ４００ｍｇ／ｌ
Ｂ３Ｎ．２ＣＥＦ４００ＣＳ５
Ｂ３Ｎ．２Ｃｅｆ４００＋
クロロスルフロン                    ５μｇ／ｌ
Ｐ２Ｔ１０Ａ
Ｇｅｌ−ｒｉｔｅに代えて寒天を添加したＭＳ＋
ピクロラム                          ２ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        １０ｍｇ／ｌ
Ｐ１０Ｔ１．１Ｂ６
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        １．１ｍｇ／ｌ
バナナ果肉                          ６％
Ｐ１０Ｔ１．１ＣＡＲＢ５００
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        １．１ｍｇ／ｌ
カルベニシリン                      ５００ｍｇ／ｌ
Ｐ１０Ｔ２．２
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        ２．２ｍｇ／ｌ
Ｐ１０Ｔ２．２Ａ
Ｇｅｌ−ｒｉｔｅに代えて寒天を添加したＰ１０Ｔ２．２
Ｐ１０Ｔ２．２ＡＳ３００
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        ２．２ｍｇ／ｌ
アセトシリンゴン                    ３００μＭ
Ｐ１０Ｔ２．２ＣＡＲＢ３００ＣＳ５
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        ２．２ｍｇ／ｌ
カルベニシリン                      ３００ｍｇ／ｌ
クロロスルフロン                    ５μｇ／ｌ
Ｐ１０Ｔ２．２ＣＡＲＢ５００ＣＳ５
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
チジアズロン                        ２．２ｍｇ／ｌ
カルベニシリン                      ５００ｍｇ／ｌ
クロロスルフロン                    ５μｇ／ｌ
Ｐ１０Ｂ．５
ＭＳ＋
ピクロラム                          １０ｍｇ／ｌ
ＢＡ                                ０．５ｍｇ／ｌ
Ｎ．５１．５  ＬＩＱＵＩＤ
Ｇｅｌ−ｒｉｔｅを添加しないＭＳ＋
ＮＡＡ                              ０．５ｍｇ／ｌ
ＩＢＡ                              ０．５ｍｇ／ｌ
Ｔ１．１Ｉ．１
ＭＳ＋
チジアズロン                        １．１ｍｇ／ｌ
ＩＢＡ                              ０．１ｍｇ／ｌ。
【０１８８】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１Ａ】カロテノイド生合成経路の諸側面を模式的に示す。
【図１Ｂ】カロテノイド生合成経路の諸側面を模式的に示す。
【図１Ｃ】カロテノイド生合成経路の諸側面を模式的に示す。
【図１Ａ】
2006508681.tif 000003
【図１Ｂ】
2006508681.tif 000004
【図１Ｃ】
2006508681.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月31日(2005.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
バイナリーベクターシステムを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１を形質転換に使用した。ベクターシステムはクロロスルフロン耐性を付与するためのｓｕｒＢ遺伝子とフィトエンシンターゼ遺伝子を発現させるためのｐｓｙ遺伝子を含むベクターｐＤＭから構成した。細菌を凍結グリセロールから取出し、培養し、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを加えた１．５％  Ｂａｃｔｏａｇａｒで凝固させたＬ−ブロス培地に保存した。同時培養の１日前に、ループを使用して固体培地から細菌を掻き取り、液体ＭｉｎＡｓｕｃ培地に懸濁し、シェーカー（１２０ｒｐｍ）で２８℃にて１日間培養した。同時培養前にスペクトロフォトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−５０）を使用して細菌濃度を測定した処、４×１０８細胞／ｍｌであった。
５．同時培養培地での同時培養
【国際調査報告】
2006508681.tif 000006
2006508681.tif 000007