(57)【要約】本発明は、ザワークラウトから単離した乳酸菌である Lactobacillus sp.96/142 株を含むスターターを用いた植物由来材料の発酵に関する。該 Lactobacillus 株は Lactobacillus sakei という種に属すると考えられる。本発明の乳酸菌は植物材料に含まれるグルコシノレートを分解する。この細菌により産生された分解産物は、種々の特性の中で抗微生物特性を示し、健康促進効果を有すると考えられる。本発明はさらに、該 Lactobacillus 株を用いた、食品の組成を向上させるのに適した細胞外多糖の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野菜材料の発酵に適したスターターであって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むことを特徴とするスターター。
【請求項２】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）の純粋培養物。
【請求項３】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、野菜材料の発酵に適したスターター。
【請求項４】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、食品の組成を向上させるのに適した細胞外多糖の製造方法。
【請求項５】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、野菜材料に含まれるグルコシノレートの分解方法。
【請求項６】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、グルコシノレートから抗微生物化合物を製造する方法。
【請求項７】
野菜材料に含まれるグルコシノレートを分解する方法であって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むスターターで野菜材料を発酵させることを包含する方法。
【請求項８】
食品の組成を向上させるための細胞外多糖の製造方法であって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むスターターで、グルコシノレートを含有する野菜材料を発酵させることを包含する方法。
【請求項９】
野菜材料に含まれるグルコシノレートから抗微生物化合物を製造する方法であって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むスターターで野菜材料を発酵させることを包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を含むスターターを用いた、グルコシノレートを含有する植物由来材料の発酵および該乳酸菌に関する。乳酸菌により産生されたグルコシノレート分解産物は、種々の特性の中で抗微生物特性を示し、健康促進効果を有すると考えられる。
【０００２】
乳酸菌を利用した発酵による野菜の保存は、古くから存在する方法である。発酵製品の健康促進効果は、少なくとも部分的に腸の機能と関連し得る。乱れた腸内微生物叢に対するプロバイオティック乳酸菌のバランシング効果は、種々の効果の中でもよく知られており（Gorbach, 1990）、プロバイオティック乳酸菌は、血清コレステロールの減少、免疫応答の増強、そしてアレルギーの緩和を引き起こすと考えられる。さらに乳酸菌は、発癌性化合物を活性化する酵素の活性を低下させる（Sanders, 1998 および Ziemer and Gibson, 1998）。
【０００３】
癌細胞を使った研究（in vitro）と実験動物を使った研究（in vivo）から、キャベツ科植物に含まれるグルコシノレートとその分解産物は抗癌効果を示すことがわかっている（Nastruzzi et al., 1996、Leoni et al., 1997 および Zhang and Talalay, 1994）。グルコシノレートの分解産物は、Escherichia coli の増殖を阻害し（Brabban and Edvards, 1995）、さらに酵母である Saccharomyces cerevisiae、Torulopsis etchellsii、Hansenula mrakii および Pichia membranefaciens の増殖も阻害する（Kyung and Fleming, 1997）ことがわかっている。
【０００４】
現在では１００種超が知られているグルコシノレートとは、アミノ酸と糖からなる、硫黄および窒素を含有する二次植物性化合物である。グルコシノレートの重要性はまだわかっていないが、種々の機能の中で、硫黄収支の制御、発芽および植物防御に関与することがわかっている（Keskitalo, 2001）。グルコシノレートを含有するアブラナ科植物は、除草剤を使用した土壌を清浄化するのに用いることができる。グルコシノレートは本質的に非毒性であるが、グルコシノレートから生じる化合物は、高濃度では生物に有害となる場合もある（Jaakkola, 2001）。農薬と比較した場合のこのような化合物の利点は、植物の根からや植物リターによる土壌への拡散性および土壌中での速やかな分解性にある。したがって、このような化合物は、生物学的な植物保護に非常に適している（Jaakkola, 2001）。
【０００５】
キャベツ科植物に含まれるグルコシノレートとその分解産物は、食品の官能品質に影響を与える重要な成分である。グルコシノレートのある種の分解産物が健康状態に正の効果を示すことが判明したことによって、キャベツ科植物は機能性食品の材料候補としても注目されている。キャベツ科植物に含まれるグルコシノレートの組成および濃度は、キャベツ科植物の種および品種によって変化する。さらにグルコシノレートの濃度は、保存期間および保存状態の影響を受ける。グルコシノレートは酵素であるミロシナーゼによって分解され、野菜の処理方法は分解産物の量に影響を与える（de Vos and Blijleven, 1988、Slominski and Campbell, 1989、Sorensen, 1990、Rosa and Heaney, 1993、Yen and Wei, 1993 および Verkerk et al., 1997）。ザワークラウトの製造においては、グルコシノレートは２週間以内に分解される（Daxenbichler et al., 1980 および Tolonen et al., 2002）。
【０００６】
本発明は、植物材料の発酵に適したスターターに関し、該スターターはザワークラウトから単離した乳酸菌である Lactobacillus sp.96/142 株 を含む。本発明のスターターは、主としてキャベツ科植物の発酵を目的とする。
【０００７】
本発明はさらに上記 Lactobacillus 株に関し、この株は Lactobacillus sakei という種に属すると考えられる。
【０００８】
本発明の Lactobacillus sp.96/142 株は、利用可能な糖の発酵によって、種々の物質の中でも乳酸を産生し、これにより腐敗性微生物の増殖を阻害する。さらにこの株は、微生物の増殖を阻害する効果および抗癌活性と考えられる特性を有する、グルコシノレートの分解産物を産生する。Lactobacillus sp.96/142 株のプロバイオティックな特性を in vitro の実験で調べたところ、この株は、ｐＨ２では生育できないがｐＨ４では十分に生育能力を保持していることがわかった。したがってこの株は、特に自己産生細胞外多糖で自らを保護しているかマイクロカプセルに封入した場合には、腸内でも生存能力を保持することが期待される。腸におけるこの株の健康促進効果は、種々の能力の中でも、抗癌効果を有すると考えられる分解産物をグルコシノレートから産生する能力に基づくものである。さらに、乳酸の産生および腸内ｐＨの低減は、腸内叢のバランスを整えるよく知られた特性である。
【０００９】
スターターは、凍結乾燥粉末または野菜汁であらかじめ培養したもののいずれかの形態で、発酵させる材料に添加する。製品の官能品質および衛生品質に影響を与えるが、本発明の乳酸菌株のグルコシノレート分解活性を阻害することのない他の乳酸菌株を、スターターと共に加えることができる。本発明の株は中温菌なので、培養温度は１８〜３５℃に保持すべきである。
【００１０】
発酵させる材料は、新鮮な植物材料または熱処理した植物材料である。熱処理により、グルコシノレートを完全に分解することなく、植物自身のミロシナーゼ活性をほぼ完全に不活性化することができる（Ryhanen et al., 2001）。通常、材料には食塩を添加し、これにより微生物の増殖に必要とされる水分および栄養素を、植物の細胞や組織から浸透圧で除去する。
【００１１】
本発明を、以下の実験および例示、ならびに添付の図面に参照して、以下に詳細に説明する。
【００１２】
本明細書で使用した略語
ＩＴＣ      イソチオシアネート
ｄ．ｍ．    乾燥物
ｃｆｕ      コロニー形成単位
ｆ．ｗｔ．  新鮮重量
【００１３】
本発明の乳酸菌株の単離および特徴付け 
自然発酵したザワークラウトから、ＭＲＳ培地を用いて２３６種の乳酸菌株を単離した（De Man et al., 1960）。ザワークラウトの保存開始から６日後に汁を分離し、そこから Lactobacillus sp. 96/142 株を単離した。単離した株を、次の生理学的な試験と生化学的な試験に付した：グルコースからのガス発生、アルギニンの加水分解、乳酸の立体配置およびＡＰＩ試験（糖の発酵、表１）。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
これらの試験に加えて、この株をリボタイピング（VTT Biotechnology製）で同定したところ、Lactobacillus sakei であると考えられることがわかった。Rogosa SL 培地では、Lactobacillus sp. 96/142 株は乳酸のＬ（＋）−異性体をもっぱら産生した。しかしながらザワークラウトでは、乳酸の両方の異性体を同量産生した。ザワークラウトの発酵の際には、この株は細胞外多糖を豊富に産生した。細胞外多糖の形成は L. sakei の他の株でも見出されており、このような細胞外多糖は食品の組成を向上させるのに用いることができる（Degeest et al., 2001）。この株は、野菜から調製した液状食品の組成を向上させるのに非常に適するだろう。プロバイオティック細菌としての Lactobacillus sp. 96/142 株の実用性を in vitro の試験で調べた。Lactobacillus sp. 96/142 株は、ブタペスト条約に基づいて、２００２年１１月２２日にＤＳＭＺ寄託当局（ドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルトゥーレン、ＧｍｂＨ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH)）に、受託番号ＤＳＭ１５２９８として寄託した。
【００１６】
本発明の微生物株を用いて製造した製品の特性、この株の発酵における利用可能性とグルコシノレートの分解産物に与える影響に関する実験 
キャベツ（head cabbage）を用いた実験
実験系列１（２０００年〜２００１年）
乳酸菌の純粋培養物を用いてキャベツの発酵を研究した。発酵させたキャベツについては、酸の形成、微生物量と官能品質について分析し（表２）、ザワークラウトから有機溶媒で抽出した抽出物については、グルコシノレートの分解産物について分析した（Tolonen et al., 2002）（図１の１および２）。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
スターターを用いて発酵させたキャベツの品質は同等だったが、自然発酵させたキャベツの品質にはばらつきがあった。原料に含まれる酵母とカビの数は１００〜１，０００ｃｆｕ／ｍｌであり、腸内大腸菌群（coliform enterobacteria）の数は０〜１００ｃｆｕ／ｍｌであった。これらの増殖は、ザワークラウトの発酵を乳酸菌の純粋培養物で行った場合に阻害された。自然発酵したザワークラウトでは、酵母とカビの数は０〜１０ｃｆｕ／ｍｌであり、腸内大腸菌群の数は０〜１，０００ｃｆｕ／ｍｌであった。Leuconostoc sp. 78 株（ＤＳＭ１４４８６）と Lactobacillus sp. 2* 株（ＤＳＭ１４４８５）を用いたものの官能品質が最も高かった。
【００１９】
キャベツ（品種：レノックス）のグルコシノレート濃度を４年にわたり測定した（表３）。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
純粋培養物で発酵させたザワークラウトに含まれるグルコシノレートの揮発性分解産物を、図１の１および２に示す。Lactobacillus sp. 96/142 株で発酵させたザワークラウトに含まれる分解産物の総濃度は、他と比べて２〜３倍高かった。個々の分解産物のうち、特に３−メチルスルフィニルプロピル−ＩＴＣとアリル−ＩＴＣの濃度が Lactobacillus sp. 96/142 株では何倍も高かった。全ての発酵物において、インドールカルビノールとインドールアセトニトリルの濃度は検出限界よりも低かった（１０〜５０μｇ／１００ｇ ｆ．ｗｔ．）。インドールグルコシノレートはアスコルビゲン（ascorbigen）として生じ得るが、測定しなかった。グルコシノレートの分解産物の量は、出発原料の量と関係する。全ての処理物でゴイトリンの濃度は高かった（５００〜１，１００μｇ／１００ｇ ｆ．ｗｔ．）。
【００２２】
実験系列２（２００１年〜２００２年）
キャベツ（品種：レノックス）を、窒素施肥を行って（Ａ）、または窒素施肥を行わず（Ｂ）に生育時季にＭＴＴ造園（MTT Horticulture）で栽培した。栽培したキャベツに１０5〜１０6ｃｆｕ／ｇの Leuconostoc sp. 78 株、Lactobacillus sp. 2* 株または Lactobacillus sp. 96/142 株を加えることで発酵させた。キャベツは１４日間発酵させた。生育時季に窒素施肥せずに栽培したキャベツから製造したザワークラウトのほうが、施肥したキャベツよりも、ｐＨおよびグルコース量が高かった。また、Lactobacillus sp. 96/142 株を用いて製造したザワークラウトのｐＨおよびグルコース濃度（sugar）は、比較のために使用した Lactobacillus sp. 2* 株を用いて製造したキャベツより高かった（表４）。乳酸菌の数は１０7〜１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。腸内大腸菌群の増殖は阻害された。これらの結果によると、Lactobacillus sp. 96/142 株の至適ｐＨ範囲は Lactobacillus sp. 2* 株よりも高いので、この株の増殖は、ｐＨが約３．９に低下すると阻害される。
【００２３】
【表４】
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【００２４】
熟成ザワークラウト実験のキャベツを２回の品評会で評価した。品評会では、キャベツＡとキャベツＢの比較を、細菌株の比較となる、Lactobacillus sp. 2* 株対 Lactobacillus sp. 96/142 株の比較と Lactobacillus sp. 2* 株対 Leuconostoc sp. 78 株の比較と共に対で行った。キャベツＡは外観と香りが優れていた。両方の試験において最も好ましいものはキャベツＡ／L. plantarum 2* 株であることがわかった。キャベツＢの中では、Lactobacillus sp. 96/142 株は Lactobacillus sp. 2* 株よりも酸度が低く、芳香も少なかった（Kruskall-Wallis 検定によるＰ値はそれぞれ０．００１１および０．０３３）。
【００２５】
カリフラワーに関する実験
市販のカリフラワーの保存実験を、Lactobacillus sp. 96/142 株と Leuconostoc sp. 78 株を用いて２００１年８月２４日に実施した。すり下ろしたカリフラワーに１％の食卓塩および１０6ｃｆｕ／ｇのスターターを添加し、発酵を３日間行った。いずれの処理物においても、腸内大腸菌群の増殖は３日間阻害され、ｐＨは３．９〜４．０に低下した。Lactobacillus sp. 96/142 株は、カリフラワーに芳香と異常な味を付与し、それは Leuconostoc sp. 78 株を用いて製造した香り豊かでさわやかなカリフラワーとは異なっていた。グルコシノレートの量はキャベツに含まれるものよりもかなり少なく（表５）、その揮発性分解産物の量もそれに付随して少なかった（図２の１および２）。また、この実験では、Lactobacillus sp. 96/142 株は、Leuconostoc sp. 78 株よりも、３−メチルスルフィニルプロピル−ＩＴＣおよびアリル−ＩＴＣをかなり多量に産生した。さらに、Lactobacillus sp. 96/142 株は３−ＯＨ−２−ブタノンを豊富に産生したが、Leuconostoc sp. 78 株はそれを全く産生しなかった。
【００２６】
【表５】
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【００２７】
抗微生物活性に関する試験
この試験では、Lactobacillus sp. 2* 株、Leuconostoc sp. 78 株、Pediococcus sp. P45 株と Lactobacillus sp. 96/142 株を細菌株として用いて発酵したキャベツ汁の抗微生物活性を、指標株である Listeria monocytogenes、Micrococcus luteus、Escherichia coli と Candida lambica の増殖について試験した（図３のａ〜ｆ）。増殖は、種々の希釈率（１：１、１：５と１：１０）のキャベツ汁を用いて試験した。ザワークラウト汁のｐＨ値を６．５に調整することにより、発酵によって形成される酸が指標株の増殖に与える影響を消失させた。（発酵時間０時間で搾った）キャベツ汁単独では、指標株の増殖を阻害しなかった。M. luteus は各キャベツ汁でわずかに増殖し、対照でもわずかに増殖した。１：１と１：５の希釈率のキャベツ汁を用いた実験において、全ての細菌株が E. coli の増殖を効果的に阻害した。Lactobacillus sp. 96/142 株が他の植物由来の株と異なっていた点は、Lactobacillus sp. 96/142 株を用いて発酵させたキャベツ汁は細菌である L. monocytogenes の増殖は阻害しなかったが、酵母である C. lambica の増殖は効果的に阻害した点である（図３のｅおよびｆ）。細菌株である Leuconostoc sp. 78 株を用いて産生した汁は、酵母である C. lambica の増殖をある程度阻害した。希釈率が１：１０の時に全ての汁で指標株は対照と同様に増殖し、阻害効果は見られなかった。グルコシノレート分解産物の分析結果によると、Lactobacillus sp. 96/142 株は、他の試験株と比較して、強い抗微生物活性を示すことがわかっているアリルイソチオシアネートをより多く産生した。安息香酸ナトリウムと比べると、その効果はｐＨ５〜７の範囲で２０〜１００倍も高い（Kyung and Fleming, 1997）。
【００２８】
官能性に関する実験
この試験では、純粋培養物を用いて保存したザワークラウトと細菌株の混合物を用いて保存したザワークラウトの官能品質を比較した。得られた結果によると、Lactobacillus sp. 96/142 株はザワークラウトの味を損なうことはないが、最終的な製品は、Lactobacillus sp. 2* 株、Leuconostoc sp. 78 株と Pediococcus sp. P45 株を用いて製造した製品よりも、酸度が低く、芳香も少なかった。種々の割合で細菌株を組み合わせた結果、Lactobacillus sp. 96/142 株に上記細菌株の１種を１０％添加すると、得られる製品の味はよく、添加した純粋細菌株で保存した製品と見分けがつかないことが判明した。
【００２９】
寄託微生物
以下の微生物を、ブタペスト条約に基づいて、ＤＳＭＺ寄託当局（ドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルトゥーレン、ＧｍｂＨ；ドイツ国、Ｄ−３８１２４  ブラウンシュバイグ、メッシュロデル  ヴィーク  １ｂ）に寄託した。
微生物                        受託番号              寄託日
Lactobacillus sp. 96/142 株       ＤＳＭ１５２９８   ２００２年１１月２２日
【００３０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】２０００年〜２００１年にわたってキャベツを用いて実施した実験系列１を示す。１は、発酵したキャベツに含まれるグルコシノレート分解産物［（応答比×１００）／１００ｇ ｆ．ｗｔ．］である（平均値および標準偏差、ｎ＝３）。２は、グルコシノレート分解産物（μｇ／１００ｇ ｆ．ｗｔ．）である（平均値および標準偏差、ｎ＝３）。
【図２】カリフラワーを用いた発酵実験を示す。１は、発酵したカリフラワーに含まれるグルコシノレート分解産物［（応答比×１００）／１００ｇ ｆ．ｗｔ．］である。２は、発酵したカリフラワーに含まれるグルコシノレート分解産物（μｇ／１００ｇ ｆ．ｗｔ．）である。
【図３】指標株である E. coli、L. monocytogenes および C. lambica の発酵キャベツ汁における増殖を示す。これらの図では、マイクロタイタープレート上の細胞塊の光学密度の変化を、時間に対する吸光度（Ａ600）で示す。E. coli（ａおよびｂ）、L. monocytogenes（ｃおよびｄ）そして C. lambica（ｅおよびｆ）。汁の希釈率は、１：１（ａ、ｃおよびｅ）そして１：５（ｂ、ｄおよびｆ）。指標細菌の初期濃度は１０3ｃｆｕ／ｍｌであった。平均値および標準偏差を図に示す（ｎ＝３）。
【図１】
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【図２】
2006518208.tif 000008
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月11日(2005.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野菜材料の発酵に適したスターターであって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むことを特徴とするスターター。
【請求項２】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）の純粋培養物。
【請求項３】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、野菜材料の発酵に適したスターター。
【請求項４】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、野菜材料に含まれるグルコシノレートの分解方法。
【請求項５】
細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株（ＤＳＭ１５９２８）を用いた、グルコシノレートから抗微生物化合物を製造する方法。
【請求項６】
野菜材料に含まれるグルコシノレートを分解する方法であって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むスターターで野菜材料を発酵させることを包含する方法。
【請求項７】
野菜材料に含まれるグルコシノレートから抗微生物化合物を製造する方法であって、受託番号ＤＳＭ１５９２８の細菌株である Lactobacillus sp. 96/142 株を含むスターターで野菜材料を発酵させることを包含する方法。
【国際調査報告】
2006518208.tif 000011
2006518208.tif 000012
2006518208.tif 000013