(57)【要約】キメラ抗体と、キメラ抗体を含む融合タンパク質が開示される。前記抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ，ＣＤ−３０及びＧ２５０抗原に結合する。前記融合タンパク質は、腫瘍壊死因子の生物的活性部分又は、全長腫瘍壊死因子を含む。前記抗体の生成のために構成された発現ベクターと、これらの製造方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ化ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体軽鎖をコードする単離核酸分子であって、そのアミノ酸配列が、配列番号：３５のヌクレオチド１８８６〜２２０３によってコードされるアミノ酸配列が連結された、配列番号：３５のヌクレオチド１３５７〜１７５２によってコードされるアミノ酸からなる、
単離核酸分子。
【請求項２】
キメラ化ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体重鎖をコードする単離核酸分子であって、そのアミノ酸配列が、配列番号：３６のヌクレオチド１８３９〜２８２５によってコードされるアミノ酸配列が連結された、配列番号：３６のヌクレオチド１３５７〜１７６４によってコードされるアミノ酸からなる、
単離核酸分子。
【請求項３】
キメラ化ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体であって、
そのアミノ酸配列が、配列番号：３５のヌクレオチド１８８６〜２２０３によってコードされるアミノ酸配列に連結された、配列番号：３５のヌクレオチド１３５７〜１７５２によってコードされるアミノ酸からなる、軽鎖と、
そのアミノ酸配列が、配列番号：３６のヌクレオチド１８３９〜２８２５によってコードされるアミノ酸配列に連結された、配列番号：３６のヌクレオチド１３５７〜１７６４によってコードされるアミノ酸からなる、重鎖、とからなる、
キメラ化ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体。
【請求項４】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項１に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項５】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項２に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項６】
配列番号３５のヌクレオチド配列からなる、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項７】
配列番号３６のヌクレオチド配列からなる、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載の単離核酸分子、若しくは、請求項４に記載の発現ベクターで、トランスフォーム若しくはトランスフェクションされた、組換え細胞。
【請求項９】
請求項２に記載の単離核酸分子、若しくは、請求項５に記載の発現ベクターで、トランスフォーム若しくはトランスフェクションされた、組換え細胞。
【請求項１０】
配列番号：３５のヌクレオチド１３５７〜１７５２と、１８８６〜２２０３とを含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
配列番号：３６のヌクレオチド１３５７〜１７６４と、１８３９〜２８２５とを含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
また、請求項２に記載の単離核酸分子、若しくは、請求項５に記載の発現ベクターで、トランスフォーム若しくはトランスフェクションされた、請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、哺乳類動物のものである、請求項８若しくは９に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記哺乳類動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離核酸分子によってコードされる、キメラ化された軽鎖。
【請求項１６】
請求項２に記載の単離核酸分子によってコードされる、キメラ化された重鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年２月１３日出願の、ここにその全部を参考文献として合体させる出願第６０／３５５，８３８号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子免疫学の分野、一般に、タンパク質の発現に有用なベクター、特に、完全ヒト、ヒト化、及びキメラ抗体などの抗体、更に、真核細胞、特に哺乳動物細胞において、前記抗体とタンパク質又はタンパク質フラグメントを組み込んだ融合タンパク質、に関する。その結果得られる抗体と融合タンパク質も、本発明の特徴をなす。
【背景技術】
【０００３】
背景及び従来技術
ヒトの治療用にマウス抗体を使用することにおける１つの重大な問題は、それらによって、患者におけるその抗体の効力を低下させ、その連続投与を妨げるヒト抗マウス反応（ＨＡＭＡ）が即座に生じることである。他の、ヒト以外の種由来の抗体の投与でも類似の問題が生じる。この問題を克服する１つのアプローチは、所謂「キメラ」抗体を作り出すことである。これらは、マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むことができる（ブリアンヌ（Boulianne）他(1984) Nature 312(5995)：643-646；ここにその全部を参考文献として合体させる）。キメラ抗体はマウス配列を含み、ヒトにおいて抗マウス反応を引き出す可能性があるが（ロ・ブリオ（LoBuglio）他(1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 86(11)：4220-4224；ここにその全部を参考文献として合体させる）、血液病（例えば、非ホジキンリンパ腫；ヴィツィッヒ（Witzig）他(1999) J. Clin. Oncol. 17 (12)：3793-3803；ここにその全部を参考文献として合体させる）又は自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ、慢性炎症腸疾患；ファン・デン・ボッシュ（Van den Bosch）他，Lancet 356 (9244)：1821-2 (2000)、ここにその全部を参考文献として合体させる）の領域におけるキメラ抗体でのトライアルによって、ＦＤＡの承認が得られ、これらの分子が大きな臨床的な可能性と有効性を有するものであることが示されている。
【０００４】
最近の研究によって、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が関節リウマチ（ＲＡ） （クック（Cook）他，Arthitis Res. 2001, 3：293-298、ここにその全部を参考文献として合体させる）と、恐らくはその他の炎症性疾患及び状態の発生に役割を演じていることが示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、細胞におけるＧＭ−ＣＳＦとその効果を阻止する薬剤の開発が課題となるであろう。本発明は、前記ＧＭ−ＣＳＦ分子を標的にし、阻止能力を有するキメラ抗体を提供する。
【０００６】
治療用途においてキメラ抗体が益々使用されていることによって、その生産が好ましい哺乳動物細胞等の、真核細胞において、高収率の機能的なキメラ抗体を効果的かつ効率的に作り出す発現ベクターが求められている。本発明は、新規な発現ベクター、形質転換宿主細胞、そして哺乳動物細胞中でキメラ抗体を作り出すための方法、更に、それら抗体自身、及びそれらを含有する融合タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
本発明は、抗体、特に、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、および、これらを含有する融合タンパク質等のタンパク質の発現に有用な発現ベクターを提供する。軽鎖と重鎖との両方を発現することができる。本発明の前記発現ベクターは、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター／エンハンサー配列、内部リボソーム侵入サイト（ＩＲＥＳ）配列（米国特許第４，９３７，１９０号、ここにその全部を参考文献として合体させる）、前記発現ベクターを含有する細胞にネオマイシン耐性を与えるヌクレオチド配列、そしてシミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）の制御下で、前記発現ベクターを含有する細胞にアンピシリン耐性を与えるヌクレオチド配列、を含む。好適実施例において、前記ＥＦ１αプロモーター／エンハンサー配列は、キメラ軽鎖をコードするヌクレオチド配列の上流かつ近傍にある。
【０００８】
本発明の前記発現ベクターは、任意の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一好適実施例において、前記軽鎖可変領域はマウス由来であり、前記軽鎖定常領域はヒトカッパー又はヒトラムダである。更に好適な実施例において、前記キメラ軽鎖可変領域は、ＧＭ−ＣＳＦ，ＣＤ−３０又はＧ２５０に、特に好適な実施例においては、これらの分子のヒト形態に結合する、マウス抗体に由来するものである。
【０００９】
本発明は、更に、抗体、特に、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、および、これらを含有する融合タンパク質等のタンパク質の発現に有用な別の発現ベクターを提供する。この第２実施例は、前述したネオマイシン耐性配列の代わりに、周知の選択マーカーであるメトトレキセートに対する耐性を作り出すジヒドロ葉酸還元酵素又は“ｄｈｆｒ”をコードするヌクレオチド配列を含む点において第１実施例と異なる。この発現ベクターは、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体の重鎖又は軽鎖のような、抗体、又は、その一部をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一好適実施例において、前記可変領域はマウス由来であり、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１である、重鎖が発現される。更に好適な実施例において、前記キメラ重鎖可変領域は、ＣＤ−３０，ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ２５０に、好ましくはこれらのヒト形態に結合する、マウス抗体に由来するものである。
【００１０】
別実施例において、本発明は、本発明の前記発現ベクターのいずれか１つによってトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。一好適実施例において、宿主細胞、好ましくは、真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、が、キメラ免疫グロブリン軽鎖を含む発現ベクターと、キメラ免疫グロブリン重鎖を含む発現ベクターとによってトランスフォーム又はトランスフェクトされる。本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌、又は菌類細胞などの原核及び真核細胞を含む。一好適実施例において、前記宿主細胞は、ヒト又はチャイニーズ・ハムスター卵巣（“ＣＨＯ”）細胞である。
【００１１】
本発明は、又、本発明のトランスフォーム又はトランスフェクト宿主細胞を培養する工程を含む、キメラ免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の組換え生産のための方法を提供する。一実施例において、本発明の前記方法は、更に、前記キメラ免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の単離を含む。
【００１２】
本発明は、又、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ免疫グロブリンの組換え生産の方法であって、キメラ免疫グロブリン軽鎖を含む発現ベクターと、キメラ免疫グロブリン重鎖を含む発現ベクターとで、若しくは、両方の鎖をコードする発現ベクターとでトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程を含む方法も提供する。一実施例において、本発明の前記方法は、更に、前記キメラ重鎖及び軽鎖免疫グロブリンの自己組織化（self-assembly）と、前記キメラ免疫グロブリンの単離とを含む。これを達成するための方法は当該技術において周知である。
【００１３】
本発明は、又、本発明の前記方法によって産生された、キメラ免疫グロブリン軽鎖、重鎖、又は、構築された免疫グロブリンも提供する。別の実施例において、本発明は、本発明の前記キメラ免疫グロブリン軽鎖、又は、構築されたキメラ免疫グロブリンと、薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細説明
1. 定義
ここでの使用において、「キメラ」とは、ここでは、可変領域の重鎖と軽鎖は、ヒト由来ではなく、重鎖及び軽鎖の定常領域はヒト由来である、抗体などの免疫グロブリンを指す。
【００１５】
ここで使用される「ヒト化」とは、重鎖と軽鎖の抗原結合に直接関与しているアミノ酸、所謂、相補的決定領域（ＣＤＲ）はヒト由来ではなく、一方、免疫グロブリン分子の残り、可変重鎖と軽鎖の所謂フレームワーク領域と、重鎖と軽鎖の定常領域はヒト由来である、抗体などの免疫グロブリンを指す。
【００１６】
「完全ヒト化」とは、分子全体がヒト由来、又は、その抗体のヒト形態と同一のアミノ酸配列から構成される、抗体などの免疫グロブリンを指す。
【００１７】
「免疫グロブリン」又は「抗体」とは、高等哺乳類の糖タンパク群の任意のメンバーであり、免疫系の主要構成成分を指す。ここでの使用において、「免疫グロブリン」と「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって互いに結合した、二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖、とを含む。免疫グロブリン分子は、それぞれが、軽鎖と、重鎖の末端部分を含む抗原結合ドメイン、および補体結合等の種々の機能のために必要なＦｃ領域を含む。これら免疫グロブリンには５つのクラスがあり、Ｆｃ領域における、重鎖の一次構造がイムノグロブリンのクラスを決定する。具体的には、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミュー鎖がそれぞれ、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭに対応する。ここでの使用において、「免疫グロブリン」又は「抗体」は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューのすべてのサブクラスを含み、更に、４鎖免疫グロブリン構造の任意の天然（たとえば、ＩｇＡ及びＩｇＭ）又は合成の多量体をも指す。
【００１８】
「抗原結合フラグメント」、「抗原結合ドメイン」及び「Ｆａｂフラグメント」は、すべて、免疫グロブリン分子のパパイン消化によって得られ、ジスルフィド結合によって隣接する重鎖のＮ末端部分に連結された１つの完全な軽鎖から成る約４５ｋＤａのフラグメントを指す。ここでの使用において、「Ｆ（ａｂ）２フラグメント」とは、免疫グロブリン分子のペプシン加水分解によって作り出される約９０ｋＤａのタンパク質を指す。それは、Ｎ末端ペプシン開裂産物から構成され、ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ等の二価の免疫グロブリンの両抗原結合フラグメントを含む。「抗原結合フラグメント」も「Ｆ（ａｂ）２フラグメント」のいずれも、二つのジスルフィド結合によって連結され、補体結合のために必要な部位を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端半分を含む、免疫グロブリン分子のパパイン消化によって作り出される５０ｋＤａ  Ｆｃフラグメントを含まない。
【００１９】
「エピトープ」とは、抗原結合部位として作用する抗原の免疫学的決定基を指す。エピトープは、構造的なもの又は高次構造的なものでありうる。
【００２０】
「ハイブリドーマ」とは、培養腫瘍性リンパ球と、親細胞の特異的免疫能力を示す正常な、初回刺激を受けた感作Ｂ−又はＴ−リンパ細胞との細胞融合の産物を指す。
【００２１】
「重鎖」とは、種々のＩｇクラス、例えば、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，ＩｇＭを区別する抗原決定基と、補体結合、胎盤通過、粘膜分泌、及びＦｃレセプターとの相互作用のために必要なドメインとを含む免疫グロブリンの二つのタイプのポリペプチド鎖のうちの長く重い方を指す。
【００２２】
「軽鎖」とは、いずれかのクラスのＩｇ分子の二つのタイプのポリペプチド鎖の短く軽い方を指す。軽鎖も、重鎖と同様、可変と定常の領域を含む。
【００２３】
「重鎖可変領域」とは、抗原結合に関わり、軽鎖可変領域と組み合わされて免疫グロブリンの抗原結合ドメインを形成する重鎖のアミノ末端ドメインを指す。
【００２４】
「重鎖定常領域」とは、重鎖のカルボキシ末端部位である三つの重鎖ドメインの１つを指す。
【００２５】
「軽鎖可変領域」とは、抗原結合に関わり、重鎖と組み合わされて抗原結合ドメインを形成する軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。
【００２６】
「軽鎖定常領域」とは、各軽鎖の１つの定常ドメインを指す。軽鎖定常領域は、カッパー（κ）又はラムダ（λ）鎖から成る。
【００２７】
「マウス抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ１９／２抗体」とは、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対して特異的なマウスモノクローナル抗体を指す。この抗体は、周知であり、詳細に研究されている。ここにその両方を参考文献として合体させるデンプシー（Dempsey）他，Hybridoma 9：545-58(1990)；ナイス（Nice）他，Growth Factors 3：159-169 (1990)を参照。
【００２８】
「有効量」とは、所望の効果を生み出すのに必要な量を指す。
【００２９】
「抗体」とは、非共有結合的、特異的かつ、可逆的に対応の抗原に結合する免疫グロブリンファミリーの任意の糖タンパク質を指す。
【００３０】
「モノクローナル抗体」とは、抗体産生細胞の単一のクローンによって産生される免疫グロブリンを指す。ポリクローナル抗血清と異なり、モノクローナル抗体は、単一特異性（例えば、単一の抗原の単一のエピトープに対して特異的）である。
【００３１】
「顆粒細胞」は、好中球、好酸球、好塩基球を含む。
【００３２】
「ＧＭ−ＣＳＦ」とは、顆粒細胞、単球−マクロファージの産生、分化、機能を制御する糖タンパク質成長因子のファミリーを指す。その例は、但しそのような分子の唯一の形態ではないが、ここに参考文献として合体させる米国特許５，６０２，００７に見られる。
【００３３】
「炎症性状態」とは、特異的又は非特異的ないずれかの免疫応答を指す。例えば、特異的応答は、抗原に対する免疫応答である。特異的応答の具体例としては、ウイルスやアレルゲン等の抗原に対する抗体応答を含み、遅延型過敏症を含み、乾癬、喘息、遅延型過敏症、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ウイルス性肺炎、細菌性肺炎、等、を含む。非特異的反応は、マクロファージ、好酸球、好中球、等の白血球によって媒介される炎症性応答である。非特異的応答の具体例としては、蜂に刺された後の即時の腫脹、細菌感染部位における多形核（ＰＭＮ）白血球の集合、がある。本発明の範囲に含まれるその他の「炎症性状態」には、自己免疫疾患、例えば、乾癬、関節リウマチ、狼瘡、虚血後白血球媒介組織障害（再灌流障害）、凍瘡障害又はショック、急性白血球媒介肺損傷（急性呼吸窮迫症候群、別名ＡＲＤＳ）、喘息、外傷性ショック、感染性ショック、腎炎、急性及び慢性炎症、及び、ateriosclerosisや不適正血液凝固等の血小板媒介疾患、がある。
【００３４】
「薬剤的に許容可能な担体」とは、当該技術において標準的に使用される、任意の担体、溶媒、希釈剤、賦形剤（vehicle）、補形剤（excipient）、補助薬（adjuvant）、添加剤、保存剤、等、及びそれらの組み合わせを指す。
【００３５】
例えば、生理食塩溶液が、好適な担体であるが、本発明においてはその他の薬剤的に許容可能な担体が考えられる。そのような担体における、一次溶剤は、水性又は非水性のものとすることができる。担体は、ｐＨ、浸透圧、粘性、透明性、呈色、無菌性、安定性、溶解速度、および／又は臭い、を改変又は維持するための他の薬剤的に許容可能な補形剤を含むことができる。同様に、担体は、安定性、溶解速度、遊離、吸収、血液脳関門の貫通を改変又は維持するための更に別の薬剤的に許容可能な補形剤を含むことができる。
【００３６】
本発明の完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体は、従来の非毒性の薬剤的に許容可能な担体、補助薬および賦形剤を含む単位用量形態で、経口的、局所的、非経口的、直腸、又は吸引スプレーによって投与することができる。ここで、「非経口的」とは、輸液技術を含む、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、くも膜下腔内、そして、脳内投与、を指す。
【００３７】
本発明の完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体は、無菌媒体に含ませて非経口的に投与することができる。使用される賦形剤及び濃度に応じて、これら抗体は、その賦形剤中に懸濁又は溶解させることができる。好適には、局所麻酔薬、保存剤、及び緩衝剤などの補助剤を前記賦形剤に溶解させることができる。本発明の薬用組成物の最も好適に投与経路は、皮下、筋肉内、くも膜下腔内又は脳内投与である。本発明の他の実施例は、前記組成物を、単位用量形態又は多用量形態のいずれかにおける非経口投与用、又は直接注入用の製剤を処方するのに通常、かつ、一般的に使用されている単数又は複数の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
【００３８】
活性成分を、前記担体材料と組み合わせて、単一投与形態を作り出すのに必要な量、使用することができる。活性成分の量は、使用される抗体のタイプ、治療されるホスト、投与の特定形態、及び対象体が患う状態、に応じて異なる。好適には、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗ＧＭ−ＣＳＦ免疫グロブリンの量は、例えば、炎症応答を低減させる、又は、炎症性状態の症状を寛解させるのに十分な治療的有効量である。但し、当業者は、特定の患者に対する具体的な投与レベルは、利用される特定の免疫グロブリンの活性レベル、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄率、薬剤の組み合わせ、治療される特定の疾患の重症度、を含む種々の要因に応じて異なるものであることを理解するであろう。本発明の完全ヒト、ヒト化又はキメラ免疫グロブリンの投与は、単一又は複数の投与を必要とするものとすることができる。
【００３９】
但し、投与形態の如何に拘わらず、具体的投与量は、患者のおよその体重、又は体表面積に応じて計算される。考えられる製剤形態のそれぞれに対して投与を最適化するために必要な投与量計算を更に改善することは、過度の実験を必要とすることなく、特に、ここに開示される投与情報とアッセイとに鑑みて、当業者によってルーチン的に行われる。
【００４０】
更に説明するまでもなく、当業者は、以上の記載と、下記の具体例とを使用して、本発明の化合物を製造、利用し、クレームされている方法を実施することができるものと考えられる。従って、下記の実例は、本発明の好適実施例を具体的に指摘するものであって、本開示内容のその他の部分を、いかようにも限定するものではないと解釈される。
【実施例】
【００４１】
例１：１９／２重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）可変（Ｖ）領域遺伝子のクローニング方法
マウス１９／２抗体を産生するハイブリドーマからの全ＲＮＡを標準ＲＮＡ単離技術（チョムジンスキー（Chomczynski）他(1987) Anal. Biochem. 162：156-159、ここにその全部を参考文献として合体させる）を使用して取得した。一本鎖ｃＤＮＡを、市販の一本鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用し、重鎖と軽鎖との両方に対するｄ（Ｔ）１８でのプライミングにより作成した（レンナー（Renner）他 (1998) Biotechniques 25(5)：720-722、ここにその全部を参考文献として合体させる）。その結果得られたｃＤＮＡに対して、重鎖と軽鎖とに対するプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲを行った。重鎖と軽鎖との５’プライマーのヌクレオチド配列をそれぞれ、表１と表２とに示す。３’プライマーは表３に示されている。軽鎖プライマーは、Ｖ−Ｃ連結部から離れていないマウスカッパー定常領域内でハイブリダイズした。重鎖３’プライマーは、Ｖ−ＣＨ１連結部から離れていないマウス重鎖サブグループ１のＣＨ−１定常領域内でハイブリダイズした。
【００４２】
【表１】
2006500905.tif 000002
【００４３】
【表２】
2006500905.tif 000003
【００４４】
【表３】
2006500905.tif 000004
【００４５】
例２：１９／２マウスハイブリドーマからクローニングされたＩｇ配列
上述したクローニング法を使用して、マウス１９／２のＶＨ及びＶＬのＰＣＲ産物を、市販の製品および周知の技術を利用してクローニングした。マウス１９／２ＶＬ領域については、マウスカッパー定常領域プライマーとプライマーＭＫＶ２及びＭＫＶ７（配列識別番号１４＆１９）を使用してＰＣＲ産物を得た。マウス１９／２ＶＨ領域については、マウスガンマ定常領域プライマーとプライマーＭＨＶ２，ＭＨＶ５，ＭＨＶ７（配列識別番号２，５および７）を使用してＰＣＲ産物を得た。クローニングされたＶ−領域インサートの拡張ＤＮＡシークエンシングは、二つの異なる軽鎖配列と２つの異なる重鎖配列とを明らかにした。重鎖と軽鎖に対する擬似遺伝子は増幅され、標準配列解析によって排除した。重鎖と軽鎖の両方について新規な免疫グロブリンコード配列が検出された。これを配列識別番号２７，２８，２９及び３０とし、これらは、マウス１９／２重鎖可変領域（２７と２８）と軽鎖可変領域（２９と３０）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を表している。
【００４６】
例３：マウス１９／２重鎖リーダー配列
上述したプライマーによって得られた１９／２重鎖のリーダー配列のＤＮＡ配列を、データベースと比較したところ、１９／２ＨＣリーダー配列は、短く（１７のアミノ酸）、公開データベースに対してユニークであるようであった。具体的には、アミノ酸２，３及び５は、データベースではＳ，Ｗ及びＦであるのに対して、Ｅ，Ｌ及びＭであった。データベースとの比較で、Ｎ末端領域の親水性アミノ酸は、それぞれ、中性又は塩基性アミノ酸によって分離されてあったが、リーダー配列の分泌能力に対するこれらの変化の影響は不明であることから、この配列は更なる実験においてもこのままであった。
【００４７】
例４：マウス−ヒトキメラ遺伝子の構築
キメラ１９／２抗体を、マウス１９／２ＶＬとＶＨ領域がそれぞれ、ヒトカッパー及びガンマ−１定常領域に結合されるように構築した。ＰＣＲプライマーを使用して、マウス１９／２ＶＬ及びＶＨ領域をコードするｃＤＮＡ配列に隣接する５’及び３’配列を修飾した。１９／２軽鎖Ｖ領域に対して特異的なＰＣＲプライマーは、得られた１９／２軽鎖Ｖ領域遺伝子の配列を使用して設計される。次に、これらの適合マウス１９／２可変領域を、既にヒトカッパー（ｐＲＥＮ−Ｎｅｏ  ベクター）又はガンマ−１（ｐＲＥＮ−ＤＨＦＲ  ベクター）定常領域を含んでいる哺乳動物細胞発現ベクターにサブクローニングした。これらのベクターは、軽鎖と重鎖を効率的に転写するために、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター／エンハンサー配列の一部を使用している。これらのベクターは、更に、ＣＨＯ細胞における、ストリジェント、バイシストロン性発現と、選択マーカーの制御とを可能にするマルチクローニング部位に続くＩＲＥＳ配列も含んでいる。このベクター対を、ここに記載の全ての組換え実験、即ち、全てのキメラ抗体の製造、に使用した。前記発現ベクターは、ＰｍｅＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントとして挿入された前記可変領域を有するように設計された。ＰＣＲプライマーは、これらの制限部位を、Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの５’−（ＰｍｅＩ）及び３’−（ＢａｍＨＩ）末端に挿入するように構成された。更に、これらＰＣＲプライマーは、効率的な翻訳を可能にするために、標準コザック（Kozak）配列（コザック（Kozak）(1987)Nucleic Acids Res. 15(20)：8125-8148、ここにその全部を参考文献として合体させる）を前記軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡの両方の５’末端に導入するよう、かつ、前記定常領域にスプライシングされるように、可変領域の軽鎖と重鎖ｃＤＮＡの両方の３’末端にスプライス供与部位を導入するように設計された。前記キメラ１９／２軽鎖及び重鎖の構築に使用された前記ＰＣＲプライマーは、以下の通りであった。catgtttaaacgccfccaccatgggcttcaagatggagtca（５’末端、軽鎖可変領域、配列識別番号３１）；agaggatccactcacgtttcagttccacttggtcccag（３’末端、配列識別番号３２）；catgtttaaacgccgccaccatggagctgatcatgctcttcct（重鎖可変領域の５’末端に対するプライマー、配列認識番号３３）；agaggatccactcacctgaggagactctgagagtggt（重鎖可変領域の３’末端のプライマー：配列識別番号３４）。前記マウス１９／２ＶＬ及びＶＨ領域のＤＮＡ及びアミノ酸配列を、キメラ１９／２軽鎖及び重鎖の構築からの使用のために適合させた。それぞれ真核細胞発現ベクターｐＲＥＮ−Ｎｅｏ及びｐＲＥＮ−ＤＨＦＲにクローニングされたマウス１９／２軽鎖及び重鎖の全ＤＮＡ配列を、その結果得られ、キメラ分子となった軽鎖及び重鎖とともに、配列識別番号３５及び３６に示す。具体的には、配列識別番号３５において、ヌクレオチド１３５７−１７５６は、マウス軽鎖配列をコードし、ヌクレオチド１７６３−２２０６は、ヒトカッパー領域をコードする。この配列（１７６３−２２０６）内、イントロンとスプライス受容部位を構成する１２０塩基対領域は、ヌクレオチド１８８６から始まっている。配列識別番号３６の内、ヌクレオチド１３５７−１７７０が、スプライス受容部位を有するマウス９／２重鎖配列をコードする。ヌクレオチド１７７７−２８３３は、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする。この配列内において、前記コード領域の前に、６０塩基対イントロン領域及びスプライス受容部位がある。
【００４８】
例５
ここに記載の実験の目的は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）ＤＧ４４細胞中においてキメラ１９／２（ｃ１９／２）抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現する安定的な細胞ラインをつくり、分泌された抗体の結合特性をテストすることであった。これを行うために、ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞ラインＤＧ０４４を使用した。ここにその全部を参考文献として合体させるモリス（Morris）他(1990) Gene 94(2)：289-294を参照。前記ＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳとヒポキサンチン-チミジンを添加したＲＰＭＩ中で培養した。トランスフェクション用のＤＮＡを、市販製品とそこに提供されている指導書を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から精製した。全てのＤＮＡ調製物を制限酵素消化によって調べた。それぞれのベクターにおけるキメラ１９／２ｍＡｂ可変領域の配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０又はＬＩＣＯＲシーケンサーを使用して確認した。
【００４９】
キメラ１９／２ｍＡｂの重鎖及び軽鎖をコードするベクターを、電気穿孔（２７０Ｖ，９７５ｕＦ）を使用して、対数期増殖をしているＣＨＯ  ＤＧ４４細胞に同時にコトランスフェクションした。細胞は、１０ｃｍのシャーレに蒔かれ、標準培地で培養した。２４時間後、培地を収集し、１０％透析ＦＣＳ及び５００ｕｇ／ｍＬ  ジェネテシンを添加した新しいＲＰＭＩ培地と置き換えた。細胞死の初期段階が終わった後（７-１０日）、ＧＭＰ−グレードのメトトレキセートを、５ｎＭ濃度で添加し、その後の数週間に亘って１００ｎＭにまで次第に増加させた。増殖コロニーを選び出し、抗体産生について選抜を行った。
【００５０】
例６：可変鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、短時間、フルスピードにてエッペンドルフ微量遠心機で遠心分離した。ＰＢＳで一度洗浄し、再び、ペレット化した。前記細胞ペレットのＳＤＳ溶解とプロテイナーゼＫ処理後のエタノール沈殿によって、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００５１】
上述したプライマー対の１つと、ｄＮＴＰ類、緩衝液、Ｐｆｕポリメラーゼとを含む混合物を使用して、周知の方法でテンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用して、重鎖又軽鎖可変領域のいずれかを増幅した。その結果得られたＰＣＲ産物を、適当な制限酵素によって消化し、アガロースゲル電気泳動によって分析してその正体を確認した。
【００５２】
軽鎖のプライマー対は、
ttcttgaagt ctggtgatgc tgcc（配列識別番号３７）、
そして、
caagctagcc ctctaagactc ctcccctgtt（配列識別番号３８）、
である。
【００５３】
そして、軽鎖用、そして配列識別番号３７、
プラス、
gaactcgagt catttacccg gagacaggga gag（配列識別番号３９）、
重鎖用。
【００５４】
未消化重鎖ＰＣＲ産物は、１２００塩基対の予想サイズを有していたのに対して、軽鎖ＰＣＲ産物は、８００塩基対の予想サイズを有していた。正体は、ＢａｍＨＩでの制限酵素消化によって確認された。
【００５５】
例７：ＣＨＯ細胞上清中の構築されたＩｇＧ１／カッパー抗体を測定するドット−ブロット法
ＣＨＯ細胞ラインを、対応のプラスミドでトランスフェクトした。ジェネテシン耐性細胞が得られ、これらの細胞を、更に、メトトレキセート耐性について選択した。増幅の後、単一コロニーを選抜し、２４ウェルプレートへトランスファーした。培養上清のキメラＩｇＧを、３〜４日後、標準ドットブロットアッセイによってテストした。
【００５６】
すべての陽性コロニーをサブクローニングし、十分な抗体産生を達成するべく培養した。キメラ１９／２抗体を、前記上清から、プロテインＧカラム上で精製し、その組換えＧＭ−ＣＳＦとの特異的結合をウェスタンブロッティング（図１）及びＥＬＩＳＡ（図２）とによってテストした。
【００５７】
最後に、産生株細胞ラインの正体を、それらの重鎖と軽鎖可変領域の両方のＰＣＲ増幅を使用して確認した。キメラ１９／２ｍＡｂトランスフェクション細胞の重鎖可変領域ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列が確認された。
【００５８】
例８
細胞増殖と抗体産生を最適化するために、ＣＨＯ  ＤＧ４４／ｐＲＥＮｃ１９／２細胞ラインを先ず、１０％ＣＯ２雰囲気中で、３７℃で、１０％ＦＣＳを含有する市販のＩＭＤＭ中で培養した。次に、これらの細胞を、無血清培地中に引き離し、１０％ＣＯ２雰囲気中で、３７℃で、特注の培地、即ち、下記の添加剤を含むＩＭＤＭ  ＳＦＩＩ、中で培養した。
【００５９】
基礎ＩＭＤＭ培地                最終濃度
プルロニック F68             １．０ｍｇ／ｍｌ
Hypep 4601                   １．０ｍｇ／ｍｌ
Hypep 4605 DEV               ０．５ｍｇ／ｍｌ
HEPES                        ５．９５８ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＣＯ３                ３．０２４ｍｇ／ｍｌ
添加剤                          最終濃度
デキストラン硫酸           ５０．０μｇ／ｍｌ
プトレッシン             １００．０ｎＭ
Albumax I                    ２．０ｍｇ／ｍｌ
塩化コリン                   １．０ｍｇ／ｍｌ
微量元素
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．８μｇ／ｍｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      １．０μｇ／ｍｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ      ０．００２５μｇ／ｍｌ
Ｃ６Ｈ５ＦｅＯ７・Ｈ２Ｏ   ５．０μｇ／ｍｌ
ＩＧＦ−１                 ５０．０ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン           ３５．０μｇ／ｍｌ
エタノールアミン           ５０．０μＭ
メルカプトエタノール       ５０．０μＭ
【００６０】
培養上清を、無菌状態（asceptically）で収集し、次に、遠心分離によって清澄化した。次に、抗体を、５ｍｌプロテイン上での親和性クロマトグラフィーによって精製した。予め５０ｍＭ  トリス−ＨＣＬ，ｐＨ８中で平衡化しておいたセファローズ高速カラムを使用した。カラムを、この緩衝液で２０回洗浄し、結合したすべての抗体を、５０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０を使用して溶出し、その後直ぐに、溶出物を１Ｍ  トリスＨＣＬ，ｐＨ８を使用して中和させた。抗体を、遠心フィルターによって濃縮し、一晩４℃でＰＢＳ中で透析した。収率は約４〜５ｍｇ／リットルであった。これらの抗体の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での４〜２０％勾配を使用して、還元及び非還元条件の両方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。
【００６１】
精製された抗体は、非還元条件下では単一のバンドとして遊走し、予想された通り、還元条件下では重鎖と軽鎖とに分離した。
【００６２】
これらの抗体を更に、予めキャリブレーションを行ったＨＰＬＣカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー（０．５ｍｇ／ｍｌ）によって分析した。ランニングバッファー（５％  ｎ−プロパノル／ＰＢＳ（０．５Ｍリン酸塩、０／２５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を、カラム外温度である２２℃の温度で、０．２ｍｌ／分の流速で使用した。
【００６３】
この分析によって、１７９キロダルトンの算出分子量を有する、これら抗体の整合性が示された。
【００６４】
例９
この例に記載の実験は、前記抗体の結合活性を測定するために構成された。
【００６５】
市販のＢＩＡｃｏｒｅ２０００と、カルボキシメチルデキストラン（carboxymethyldetran）コーティングセンサーチップを使用してバイオセンサー分析を行った。前記チップは、コントロールブランクチャンネルとしてチャンネル４が確保された、標準アミノカップリング化学を使用した機器の、チャンネル１，２及び３上に、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦＫの１０００，３００又は１００ＲＶで誘導体化されていた。
【００６６】
前記キメラ抗体のサンプルを、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３．４ｍＭ  ｄｉ−ＮＡ−ＥＤＴＡ，０．００５％、Ｔｗｅｅｎ−２０）中で希釈し、そのアリコットを、前記センサーチップ上に１μｌ／分の流速で注入した。注入後、ＨＢＳ緩衝液が５分間、チップ表面上を流れることを許容することによって解離をモニタリングした。次に、結合した抗体をすべて希釈し、チップ表面を、サンプル間で、４０μｌの１００ｍＭ  ＨＣＬ，ｐＨ２．７を５μｌ／分の速度、注入することによって再生した。前記キメラ抗体の結合のカイネティクス解析を行うために、１−１０ｎＭの範囲で変化する濃度を、チップ表面上に注入し、見掛け上の会合（Ｋａ）と解離（Ｋｄ）速度定数を、Langmuir １：１結合モデルを使用して、Ｂ１Aevaluaton Ｖ３．１ソフトウエアを使用して、Ｒｍａｘの計算のためのグローバルとローカル設定で、計算した。
【００６７】
その結果、前記キメラ抗体は、マウス抗体よりも、ｒｈＧＭ−ＣＳＦに対して僅かに高い親和性を有することが示された。キメラ抗体についての算出Ｋａは、１００ＲＵのＧＭ−ＣＳＦを使用して、５．１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１であった。Ｋｄ測定を妨害し、そして非常に高い親和性を示し、分析物濃度の如何に拘わらず解離は観察されなかった。
【００６８】
前述したソフトウエアを使用した、Ｒｍａｘのグローバル設定によって、Ｋｄ＝１．９ｘ１０−５ｓ−１のｏｆｆ率と、２．６９ｘ１０１０Ｍ−１のキメラ抗体に対する高い親和性が得られた。
【００６９】
例１０
これらの実験は、前記抗体の結合活性と、それらが互いに交差反応するか否かの両方を調べるために構成された。
【００７０】
Ｎｕｎｃプレートを、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６，０．０５Ｍ）、５０μｌ／ウェル中で、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（１μＧｇ／ｍｌ）によってコーティングし、一晩４℃でインキュベートし、次に、室温で１時間、３％ＦＣＳ／ＰＢＳでブロッキングした。
【００７１】
各ウェルに、マウス又はキメラ抗体（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかの半対数（Ｈａｌｆ−ｌｏｇ）、連続希釈した三つ組の１００μｌサンプルを加え、１．０ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。室温で１時間のインキュベーション後、ホースラディシュペルオキシダーゼ（１０ｕｌ／ウェル  Ｆｃ特異性；１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中で１：１０００希釈）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＧを使用して結合した抗体を検出した。十分に洗浄したあと、結合した抗体を、ＡＢＴＳ基質（１００μｌ／ウェル）の添加によって可視化した。
【００７２】
マイクロプレートリーダーで４１５ｎｍでの光学密度を読み取った。
【００７３】
固相に抗体を結合させるためものと同じプロトコルを使用して、これらの抗体が互いに競合するか否かを測定した。前述した実験と同様、１０μｇ／ｍｌのマウス又はキメラ抗体のいずれかの半対数、連続希釈１００μｌサンプルを、三つ組で、２０μｇ／ｍｌの競合抗体と組み合わせ、次に、１００ｍｌのこの混合物を前記コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加した。インキュベーションを前述したように行い、又、前述したように、ホースラディシュペロキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＧを使用した。
【００７４】
その結果、これらの抗体は、事実、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦに対する結合において競合することが示された。結合曲線中のシフトは、過剰な競合抗体の添加によるものであった。このことは、共通のエピトープに対する結合、及び競合を示すものであった。
【００７５】
例１１
これらの実験は、前記抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の中和活性をテストするように構成された。二つのヒトＧＭ−ＣＳＦ依存細胞ライン、即ち、ＴＦ−１とＡＭＬ−１９３を使用した。０.５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの存在又は不在下で、成長曲線を確立し、生存細胞数を、０，１，２，３，５及び７日目に、トリパンブルー排除（Trypan Blue exclusion）によって測定した。
【００７６】
第１のバイオアッセイにおいて、０．０００３ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲の量の組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを、９６ウェル、マイクロタイタープレート中で、抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体と、３０μｇ／ｍｌの最終濃度で混合した。ＴＦ−１又はＡＭＬ−１９３細胞のいずれかを添加し（１０３細胞／ウェル）、プレートを３７℃で７日間インキュベートした。
【００７７】
前記インキュベーション期間後、ＤＮＡ増殖マーカーＭＴＳを、２０μｌ／ウェルで添加した。２時間後、Ａ４９０ｎｍでの光吸収を測定することによって、色素取り込みを測定した。
【００７８】
培地中のｒｈＧＭ−ＣＳＦの量の増加に伴って、ＭＴＳ色素取り込みの増加が観察された。ｒｈＧＭ−ＣＳＦ濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ以下の時に、前記キメラ抗体で、両細胞タイプの成長の抑制が観察され、０.３−１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦで顕著な細胞成長の抑制があった。
【００７９】
これに対して、前記マウス抗体は、ＡＭＬ−１９３細胞に対しては類似の作用を有していたものの、それは、ＴＦ−１細胞に対してはそれほど影響しなかった。これらの結果が図３と図４に示されている。
【００８０】
第２のバイオアッセイにおいて、ＴＦ−１及びＡＭＬ−１９３細胞は、０．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦの存在下で成長され、その培養培地に、次第に増大する量のマウス又はキメラ１９／２ｍＡｂs（０．００３−１００μｇ／ｍＬ）を添加し、７日間の培養後に中和活性を評価した。ＴＦ−１とＡＭＬ−１９３細胞とのそれぞれの結果が図５と図６に示されている。最初のバイオアッセイと一致して、キメラ１９／２は、ＧＭ−ＣＳＦ刺激細胞増殖の顕著な中和活性を示した。両方の細胞ラインにおいて、ｃｈ１９／２濃度の増加と、ＧＭ−ＣＳＦ中和活性との間で３μｇ／ｍＬで平坦化する直接的な相関関係が観察され、それ以上濃度を高めてもＴＦ−１又はＡＭＬ−１９３細胞増殖においてより大きな低減を生み出すことは出来なかった。これらの観察結果は、ＧＭ−ＣＳＦに対する、マウスｍＡｂの低い親和性、又は、結合部位における立体障害によるものかもしれない。
【００８１】
例１２
キメラＨＲＳ−３抗体を作り出すために追加の実験を行った。この抗体のマウス形態は、ここに参考文献として合体させるホムバック（Hombach）他，Int. J. Cancer 55：830-836(1993)に、記載されている。
【００８２】
前述のキメラ、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の生産のための前述したプロトコルを使用した。但し、これらの抗体は異なり、その配列は知られているので、異なるプライマーを使用した。これらのプライマーは、マウス重鎖及び軽鎖可変領域をコードする配列にスプライス部位を導入する作用を有し、これらを配列識別番号４４，４５，４６及び４７として示し、配列識別番号４４及び４５は重鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列であり、配列識別番号４６及び４７は軽鎖の対応の配列である。
【００８３】
これらのプライマーは以下の通りであった、
gcgccatggc ccaggtgcaa ctgcagcagt ca（配列識別番号４０）
そして、
cagggatcca ctcacctgag gagacggtga ccgt（配列識別番号４１）、
そして、軽鎖は
agcgccatgg acatcgagct cactcagtct cca（配列識別番号４２）
そして
cagggatcca actcacgtttg atttccagct tggt（配列識別番号４３）。
【００８４】
増幅後、マウス重鎖及び軽鎖可変領域を、ｐＲＥＮ  ＮｅＯとｐＲＥＮ−ＤＨＦＲ配列にクローニングした。これらをそれぞれ配列識別番号４８，４９に示す。このクローニングが可能であった理由は、増幅によって、ＰｍｅＩとＢａｍＨＩ制限部位が、配列識別番号４４の、ヌクレオチド１−７と、最後の６つのヌクレオチドに導入されたからである。対応する部位が、配列識別番号４８のヌクレオチド１３４０−１３４８及び１３５７−１３６２に見られる。同様に、ＰｍｅＩとＢａｍＨＩ制限部位は、配列識別番号４７のヌクレオチド１−８と最後の６つのヌクレオチドに導入され、それによりこのヌクレオチド配列を、配列識別番号４９の位置１３３７−１３４４及び１３４９−１３５４にクローニングすることができた。
【００８５】
前記キメラＨＲＳ−３抗体は、マウスＨＲＳ−３  ＶＬとＶＨ領域を、それぞれ、ヒトカッパー及びガンマ−１定常領域に結合させるように構成された。ＰＣＲプライマーを使用し、前記マウスＨＲＳ−３  ＶＬ及びＶＨ領域をコードするｃＤＮＡ配列に隣接する５’および３’配列を修飾した。修飾は、５’プライマー端部でのＮｃｏＩ部位の挿入と、定常領域にスプライスされるべき可変領域の軽鎖と重鎖とのｃＤＮＡの３’末端における、スプライス供与部位と、その後のＢａｍＨＩ制限部位との挿入を含むものであった。これらの適応（adapted）マウスＨＲＳ−３可変領域を、次に、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を介して、５’ＰｍｅＩ部位を有し（harboring） その後、５’コザック配列と、ヒト抗体リーダー配列が続く原核細胞ベクターにサブクローニングした。配列を、ＰｍｅＩ／ＢａｍＨＩ消化によって前記原核細胞ベクターから切断し、前述したようにヒトカッパー（ｐＲＥＮ−Ｎｅｏベクター）又はガンマ−１（ｐＲＥＮ−ＤＨＦＲベクター）定常領域を予め含んでいる哺乳動物細胞発現ベクターにサブクローニングした。
【００８６】
例１３
構成物が確立されると、それらを上述したようにＤＧＯ４４細胞にトランスフェクトした。
【００８７】
陽性のコロニーをサブクローニングし、培養して十分な抗体産生を達成し、その後、抗体を、Ｆｃフラグメントを介してプロテインＧカラム上で精製した。
【００８８】
精製された抗体を、レンナー（Renner）他，Eur. J. Immunol25：2027-35(1995)によって改変された、レムリ（Laemmli），Nature 227：680-5(1970)に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。異なる精製段階からのサンプルを、還元性又は非還元性緩衝液中で希釈し、それらを１０−１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動、その後、標準クーマシー染色によって分離した。
【００８９】
その結果は、還元性と非還元性溶液との両方において見られたバンド形成パターンによって示されているように、完全なキメラ抗体の生成と一致していた。
【００９０】
例１４
前記キメラＨＲＳ−３抗体の結合能力を、前述のレンナー（Renner）他に従って、フローサイトメトリーによって測定した。簡単に説明すると、ＣＤ−３０を発現した標的腫瘍ラインの１ｘ１０６の細胞をＰＢＳ中で二回洗浄し、次に、可変濃度の抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ又はＰＥのいずれかに共役した、軽鎖に対する二次抗体とインキュベートした。
【００９１】
その結果、トランスフェクションＣＨＯ細胞から精製された細胞培養上清由来の弱い結合と、精製抗体とのstring結合が示された。ＣＤ−３０陰性腫瘍細胞を使用した時には、結合は見られなかった。
【００９２】
例１５
前記キメラＨＲＳ−３抗体の抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）と補体依存毒性とを、前述のホムバック（Hombach）他と前述のレンナー（Renner）他とに記載されているようにユーロピウム放出アッセイを使用して測定した。
【００９３】
簡単に説明すると、前記ＡＤＣＣアッセイにおいては、末しょう血液リンパ細胞を二名（tow）の健全な提供者から単離し、１０，０００のユーロピウム標識ＣＤ−３０抗原陽性Ｌ５４０ＣＹ腫瘍細胞と、エフェクター：標的１０：１の比率で使用した。０μｇ／ｍｌのコントロールと同様、抗体を種々の濃度（１０，１，０．１および０．０１μｇ／ｍｌ）で添加した。その作用を、マウス抗体、二重特異性マウス抗−ＣＤ１６／ＣＤ３０抗体と、無関係なキメラＩｇＧ１抗体と比較した。ＣＤ３０陰性ラインも使用した。０．０２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）の添加後に、最大溶解を測定し、全てのアッセイを三つ組で行った。
【００９４】
その結果、ＡＤＣＣにおいて、前記キメラ抗体はマウス抗体よりも良好に実行されることが示された。
【００９５】
前記ＣＤＣアッセイにおいて、１０，０００のユーロピウム標識細胞（１００μｇ）（Ｌ５４０Ｙ）を、５０μｌの量で、５０，５，０．５又は０．０５μｇ／ｍｌの抗体とインキュベートした。新たに単離された補体（５０μｌ）を添加し、その混合物を２時間３７℃でインキュベートした。前記マウス抗体も、テストし、コントロールとして貢献した、抗ＣＤ−１６抗体とキメラ抗ＩｇＧ抗体も同様とし、ＣＤ−３０陰性細胞も同様にした。
【００９６】
前記ＡＤＣＣアッセイと同様、前記キメラ抗体は、テストされたその他全ての抗体よりも、溶解率において優れていた。
【００９７】
例１６
この例では、キメラＧ２５０特異的抗体と、腫瘍壊死因子（以後、”ＴＮＦ”という）との融合タンパク質の産生について詳述する。
【００９８】
Ｇ２５０は、現在、「炭酸脱水素酵素９」又は”ＣＡ９”又は”ＭＮ”とも呼ばれている抗原である。このＧ２５０抗原と、それに対応の抗体は、オースターウェイク（Oosterwijk）他，ＰＣＴ／ＵＳ８８／０１５１１によって、腎臓癌に関連するものとして記載された。前記Ｇ２５０抗体は、又、これまでいくつかの臨床試験の対象にもなっている（オースターウェイク（Oosterwijk）他，Int. J. Cancer 1986：10月15日、38(4)：489-491；ディヴギ（Divgi）他，Clin. Cancer Res. 1998：11月4日(11)：2729-739。
【００９９】
ザヴァダ（Zavada）他は一連の特許を交付されているが、その中で、Ｇ２５０抗原は”ＭＮ”又は”ＭＮ／ＣＡＩＸ”と称されている。ここにそのすべてを参考文献として合体させる、米国特許６，０５１，２２６；６，０２７，８８７；５，９９５，０７５および５，９８１，１７１１を参照。これらの特許は、この抗原についての詳細を提供し、それが見られる、頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮、（子宮）頸部、卵巣、および子宮内膜癌を含む、種々の腫瘍について記載している。
【０１００】
最近、イヴァノフ（Ivanov）他，Am. Journal of Pathology 158(3)：905-919(2001)は、腫瘍細胞と細胞ラインにおいてＣＡ９とＣＡ１２の調査を行った。
【０１０１】
マウスＧ２５０特異的抗体の軽鎖および重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列は知られており、これらは、内因性抗体リーダー配列を含む。前述の配列識別番号４８と４９である、使用されたベクターへのコード配列の導入のために必要な制限部位を導入するために、５’と３’領域との両方を修飾するためにＰＣＲプライマーを使用した。マウスＧ２５０重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列は配列識別番号５０に示され、アミノ酸配列は配列識別番号５１、軽鎖可変領域は配列識別番号５２、そしてアミノ酸配列は配列識別番号５３に示されている。配列識別番号５０と５２とのそれぞれの最初の８つのヌクレオチドは、ＰｍｅＩ制限部位を表す。前記ヌクレオチド配列によってコードされる最初の１９のアミノ酸は、前記リーダー領域を表し、最初の２４が軽鎖のリーダー配列を表す。配列識別番号５０と５２とのそれぞれの最後の６つのヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ制限部位である。前記ＨＲＳ−３キメラに使用したものと同じプロトコルを使用して、これらの可変領域を配列識別番号４６と４７にスプライスした。
【０１０２】
ヒトＴＮＦをコードするｃＤＮＡを得るために、ヒト白血球のｃＤＮＡライブラリーを使用した。末梢血リンパ球を、ＰＭＡで刺激し、ＴＮＦのｃＤＮＡを、標準法を使用して増幅した。ＴＮＦのｃＤＮＡが、Ｇ２５０重鎖のヒンジ領域の直後に位置するように、前記ｃＤＮＡ配列に制限部位を導入した。（Ｇｌｙ）Ｓｅｒコード配列によって二つを結合した。配列識別番号５４，５５は、ＴＮＦフラグメントのヌクレオチドとアミノ酸配列を示し、配列識別番号５６は、ヒトガンマ−１重鎖のあとにＴＮＦコード領域がきて、その直後に、ＩｇＧ１ヒンジ領域がくるコンストラクトを示している。
【０１０３】
配列識別番号５６内において、ヌクレオチド１４１９−１７５４は、その前に、６０塩基対のイントロン領域とスプライス受容部位とがくる、ＣＨ１およびヒンジドメインを含む、部分ヒトＧ１定常領域をコードする。前記リンカー、即ち（Ｇｌｙ）４ＳＥＲは、ヌクレオチド１７５５−１７６９によってコードされる。前記ヒトＴＮＦフラグメントのコード配列は、ヌクレオチド１７７６−２２９６に示されている。
【０１０４】
その結果得られたコンストラクトを、前述したように宿主細胞にトランスフェクトし、発現させた。尚、配列識別番号５６は前述した重鎖ベクターのバリアントを含み、それは、又は、前記ＣＨ１とヒンジ領域、その後に、ＴＮＦコード配列を含んでいる。
【０１０５】
前記ＨＲＳ−３キメラに対して述べたように、細胞をトランスフェクトし、培養し、前述した配列識別番号４０−４３のプライマーを使用して増幅を行った。増幅産物の予想サイズは、１１００塩基対であったが、このことは事実確認された。
【０１０６】
次に、前述したように、陽性コロニーをサブクローニングし、培養した。キメラＧ２５０−ＴＮＦ融合タンパク質を、５ｍｌのサンプルを使用して、溶出緩衝液（ＮａＣｌ，０→０．５Ｍ）（ｐＨ８）中で塩濃度を増大させて、ＤＥＡＥカラム上で陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。これら融合タンパク質の純度を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定した。キメラ融合タンパク質の産生と一致するそれぞれ４５ｋＤａと２８ｋＤａの二つのバンドが現れた。
【０１０７】
前記キメラ融合タンパク質の純度を、サンドイッチＥＬＩＳＡで確認した。簡単に説明すると、プレートを、親和精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ血清の１：６０００希釈物でコーティングし、一晩インキュベートした。次に、それらを、２％ゼラチンでブロッティングした。細胞培養上清又は精製抗体を、様々な濃度で添加し、その後、０．１μｇ／ｍｌで、ビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα特異的血清と接触させ、次に、標準ストレプトアビジンペルオキシダーゼ試薬で可視化した。
【０１０８】
前記ＥＬＩＳＡによって前記抗体の純度が確認された。
【０１０９】
例１７
前記キメラＨＲＳ−３抗体について、前述したように、今回は、前記融合タンパク質と、Ｇ２５０陽性腫瘍細胞とを使用してＦＡＣＳを行った。キメラＧ２５０抗体を陽性コントロールとし、無関係なキメラＩｇＧ１抗体を陰性コントロールとして、二つの異なる精製ランをテストした。
【０１１０】
その結果、前記キメラ融合タンパク質は、前記キメラ抗体と同様に結合したことが示された。Ｇ２５０陰性細胞を使用したときには結合は検出されなかった。
【０１１１】
例１８
これらの実験は前記融合タンパク質が細胞死を仲介するＴＮＦの能力を維持しているか否かを調べるように構成された。
【０１１２】
これは、ここに参考文献として合体させるレンナー（Renner）他，Eur. J. Immunol25：2027-2035(1995)に記載されているように、ＭＴＴアッセイを使用することによって達成された。ＷＥＨＩ細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。１８時間後、前記融合タンパク質、組換えＴＮＦ、キメラ２５０抗体又は陰性コントロール（単純（plain）培地）の無菌サンプルを、１．０ｘ１０５，１．０ｘ１０２，１．０ｘ１０-２，１．０ｘ１０-４および１．０ｘ１０-５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、その培養物を、更に４８−７２時間インキュベートした。すべての生存細胞を、アネキシン（Annexin）  Ｖ染色、フローサイトメトリーを含む標準方法によって検出した。これを行うために、１ｘ１０６のＷＥＨＩ細胞を、異なる抗体濃度で、一晩インキュベートし、色素陽性細胞を計数した。ＷＥＨＩ殺作用における抗体負荷腫瘍細胞（antibody loaded tumor cells）の効果を、市販のＰＫＨ−２６ＧＬ色素での事前染色によって測定した。
【０１１３】
前記キメラ融合タンパク質は、細胞の殺傷において組換えＴＮＦと同じくらい有効であることが判明した。
【０１１４】
例１９
ＴＮＦは、ヒト白血球によるＨ２Ｏ２放出を刺激することが知られている。そこで、前記キメラタンパク質をこの特性についてテストした。
【０１１５】
顆粒球を、標準法によって血液サンプルから単離し、それらを反応緩衝液（ＫＲＰＧ＝１４５ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，４．８ｍＭ  ＫＣｌ，０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．２ｍＭ  グルコース，ｐＨ７．３５）中で再懸濁させた。この混合物を、予め、顆粒球の接着を可能にするべくフィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ，２時間、３７℃）でコーティングしておいたプレートに添加した。この後、１００μｌの色素溶液（１０ｍｌ  ＫＲＰＧ＋５０μｌ  Ａ６５５０＋１０μｌホースラディシュペルオキシダーゼ）を添加し、１５分間、３７℃でインキュベートした。顆粒球を、３０，０００細胞／ウェル添加し、次に、緩衝液（ＫＲＰＧ），ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）、前記キメラ融合タンパク質（１μｇ／ｍｌ）プラス組換えヒトＩＦＮ−γ（１００μ／ｍｌ）、又は、前記融合タンパク質プラス組換えＩＮＦ−γ（前述した濃度で）を添加した。Ｈ２Ｏ２放出を、標準法を使用して、３時間測定した。
【０１１６】
前記ＰＭＡは、陽性コントロールとして作用した。前記キメラ融合タンパク質は、抗体単体よりも遥かに高いＨ２Ｏ２放出を誘導し、そのＨ２Ｏ２放出は、ＩＦＮ−γが添加された時には更に増加した。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ウェスタンブロッティングを解する組換えキメラ抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の結合を図示する図
【図２】ＥＬＩＳＡを介する前記抗体の結合を図示する図
【図３】ＧＭ−ＣＳＦ成長依存ＴＦ−１細胞に対する前記抗体の阻止作用を図示する図
【図４】ＧＭ−ＣＳＦ成長依存ＡＭＬ−１９３細胞に対する前記抗体の阻止作用を図示する図
【図５】一定量のヒトＧＭ−ＣＳＦの存在下におけるＴＦ−１細胞増殖に対する、次第に濃度の高めたマウス又はキメラ１９／２ｍＡｂｓの作用をテストするアッセイの結果を図示する図
【図６】ＡＭＬ−１５３細胞を使用した図５の実験の類似実験を図示する図
【図７】前記組換え抗体を調整するのに使用した二つの発現ベクターの概略マップを図示する図
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月9日(2004.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
キメラ化ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体であって、
そのアミノ酸配列が、配列番号：３５のヌクレオチド１８８６〜２２０３によってコードされるアミノ酸配列に連結された、配列番号：３５のヌクレオチド１３５７〜１７５２によってコードされるアミノ酸からなる、軽鎖と、
そのアミノ酸配列が、配列番号：３６のヌクレオチド１８３９〜２８２５によってコードされるアミノ酸配列に連結された、配列番号：３６のヌクレオチド１３５７〜１７６４によってコードされるアミノ酸からなる、重鎖、とからなり、
前記キメラ化ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ刺激細胞成長の活性を中和する、
キメラ化されたＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
増幅後、マウス重鎖及び軽鎖可変領域を、ｐＲＥＮ  ＮｅＯとｐＲＥＮ−ＤＨＦＲ配列にクローニングした。これらをそれぞれ配列識別番号４８，４９に示す。このクローニングが可能であった理由は、増幅によって、ＰｍｅＩとＢａｍＨＩ制限部位が、配列識別番号４６の、ヌクレオチド１−８と、最後の６つのヌクレオチドに導入されたからである。対応する部位が、配列識別番号４８のヌクレオチド１３４０−１３４８及び１３５７−１３６２に見られる。同様に、ＰｍｅＩとＢａｍＨＩ制限部位は、配列識別番号４４のヌクレオチド１−８と最後の６つのヌクレオチドに導入され、それによりこのヌクレオチド配列を、配列識別番号４９の位置１３３７−１３４４及び１３４９−１３５４にクローニングすることができた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
マウスＧ２５０特異的抗体の軽鎖および重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列は知られており、これらは、内因性抗体リーダー配列を含む。前述の配列識別番号４８と４９である、使用されたベクターへのコード配列の導入のために必要な制限部位を導入するために、５’と３’領域との両方を修飾するためにＰＣＲプライマーを使用した。マウスＧ２５０重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列は配列識別番号５０に示され、アミノ酸配列は配列識別番号５１、軽鎖可変領域は配列識別番号５２、そしてアミノ酸配列は配列識別番号５３に示されている。配列識別番号５０と５２とのそれぞれの最初の８つのヌクレオチドは、ＰｍｅＩ制限部位を表す。前記ヌクレオチド配列によってコードされる最初の１９のアミノ酸は、前記リーダー領域を表し、最初の２４が軽鎖のリーダー配列を表す。配列識別番号５０と５２とのそれぞれの最後の６つのヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ制限部位である。前記ＨＲＳ−３キメラに使用したものと同じプロトコルを使用して、これらの可変領域を配列識別番号４８と４９にスプライスした。


【国際調査報告】
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2006500905.tif 000058