(57)【要約】核内受容体CARの発現および／または活性をモジュレーションすることにより甲状腺ホルモン代謝またはコレステロールおよび脂質代謝を改変する物質の同定方法を提供する。そのような物質を含有する組成物、ならびに対象における甲状腺ホルモン代謝またはコレステロールおよび脂質代謝を改変するためのそのような物質の使用方法を提供する。そのような物質の投与は肥満、コレステロール血症および脂質異常症のような状態の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーファン核内受容体CARの発現または活性を試験物質がモジュレーションする能力を測定することを含んでなる、甲状腺ホルモン代謝またはコレステロールおよび脂質代謝を改変する試験物質を同定するための方法。
【請求項２】
製薬上許容される製剤中にCARの発現または活性をモジュレーションする物質を含んでなる、甲状腺ホルモン代謝またはコレステロールおよび脂質代謝を改変するための組成物。
【請求項３】
該物質がCARの発現または活性を抑制または軽減する、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
対象における甲状腺ホルモン代謝を改変するための方法であって、それを要する対象に請求項2記載の組成物を投与することを含んでなる方法。
【請求項５】
対象におけるコレステロールおよび脂質代謝を改変するための方法であって、それを要する対象に請求項3記載の組成物を投与することを含んでなる方法。
【請求項６】
肥満、高コレステロール血症または脂質異常症に罹患した対象に請求項3記載の組成物を投与することを含んでなる、対象における肥満、高コレステロール血症および脂質異常症の治療方法。
【請求項７】
該対象が肥満を罹患しており、CARの発現または活性を抑制または軽減する物質を含む組成物を抗肥満剤と組合せて投与する、請求項6記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺ホルモン代謝、コレステロールおよび脂質代謝ならびに基礎代謝率を改変するための核内受容体CARのモジュレーターを含む組成物および該組成物の使用方法に関する。本明細書に示されているとおり、CARリガンドは、この受容体を発現する組織における甲状腺ホルモン代謝の選択的モジュレーションのための手段を提供する。肝臓のような組織における甲状腺ホルモン代謝をモジュレーションすることにより、基礎代謝率ならびにコレステロールおよび脂質代謝を調節することができる。したがって、肥満、高コレステロール血症および脂質異常症を含む（これらに限定されるものではない）種々の状態の治療において、CARのモジュレーターを含む組成物を使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺ホルモンは、エネルギー恒常性および代謝の主要調節因子である。甲状腺ホルモンのレベルは、視床下部／下垂体／甲状腺軸上の甲状腺ホルモンのフィードバック阻害（Yen, P. M. Physiol. Rev. 2001 81:1097-1142）、脂肪組織によるレプチン分泌（Iossaら, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2001 25(3):417-25）、末梢組織によるT4からT3への脱ヨウ素化の増加または減少、ならびにT4およびT3から、より弱い活性であり且つより容易に排泄される代謝産物への肝および腎代謝（Larsen, P. R.およびS. H. Ingbar (1992). The Thyroid Gland, in "Textbook of Endocrinology" Philadelphia, W.B. Saunders Co.）を含む幾つかのメカニズムにより厳密に制御されている。甲状腺ホルモンは実質的にすべての組織においてその作用を現して、同化作用および異化作用の全身性増強を引き起こす。最終的には、甲状腺ホルモンの作用は核内受容体TRαおよびTRβの結合および活性化により媒介される。最も強力な甲状腺ホルモン受容体リガンドはT3であり、その調節は、栄養ストレスに直面した際の全体的なカロリー平衡を維持するために非常に重要である。
【０００３】
肝臓は甲状腺ホルモンの代謝において中心的な役割を果たしており、複数の代謝経路が明らかにされている（Wu, S.-Y.およびT. J. Vissar編, (1993). Thyroid Hormone Metabolism: Molecular Biology and Alternate Pathways. Boca Raton, FL, CRC Press）。肝臓においては、T4からT3への変換のほとんどはI型脱ヨード酵素により触媒され、それはT4の外輪（outer ring）脱ヨウ素化を触媒してT3を与え、また、内輪（inner ring）脱ヨウ素化を触媒して逆T3（rT3）を与える。特異的なスルホトランスフェラーゼは、脱ヨード酵素活性に対するその作用により、この過程の調節において中心的な役割を果たしている。甲状腺ホルモン基質のフェノール性ヒドロキシルの硫酸化はI型脱ヨード酵素の活性を劇的に改変する。ラットI型脱ヨード酵素を使用した研究において、T4硫酸化は外輪脱ヨウ素化活性を検出不能レベルにまで減少させるが、内輪脱ヨード酵素活性を劇的に増加させること（Vmax/KMは130倍以上増加）が判明した。内輪脱ヨード酵素活性は、甲状腺ホルモン受容体に対してそれほど強くない活性を有し典型的には更に抱合され急速に消失する産物である硫酸化rT3の産生を引き起こす。
【０００４】
肝臓においては甲状腺ホルモンのその他の代謝的運命も重要である。一例としては、UDP-グルクロニルトランスフェラーゼによる、特にUGT1ファミリーのメンバーによる甲状腺ホルモンの抱合が挙げられる。グルクロン酸抱合はその甲状腺ホルモン抱合物の水溶性を増加させ、それによりその胆汁排泄および尿排泄を増加させる（BurchellおよびCoughtrie Pharmacol. Ther. 1989 43:261-89）。また、甲状腺ホルモンは脱アミノ化、側鎖の脱カルボキシル化、グルタチオンとの抱合および甲状腺ホルモンエーテル結合の切断によりプロセシングされる。これらの種々の経路の作用の1つは、多種多様な甲状腺ホルモン代謝産物を産生することであり、それらのうちの多くは活性であるが、その詳細な作用は十分には理解されていない。これらの種々の経路のもう1つの作用は、T3のレベルを減少させることである。甲状腺ホルモン代謝に対する肝臓の寄与を考慮すると、これらの種々の経路の調節の理解は、エネルギー恒常性を完全に理解するために決定的に重要である。
【０００５】
また、肝甲状腺ホルモンレベルの変化は、肝臓内の遺伝子発現のモジュレーションを介して、コレステロールおよび脂質代謝に影響を及ぼす（Fengら, Mol. Endocrinol. 2000 14(7):947-955）。甲状腺ホルモンの増加はコレステロールレベルおよび血漿トリグリセリドの減少を引き起こす。これは、1つには、肝低密度リポタンパク質受容体の発現の増加により媒介されるクリアランス比の上昇（Scarabottoloら, Atherosclerosis 1986 59(3):329-333）、ならびにコレステロールエステル輸送タンパク質（Bertiら, Metabolism 2001 50(5): 530-6）、リポタンパク質リパーゼ、肝リパーゼ（Valdemarssonら, Acta Endocrinol. (Copenh) 1983 104(1):50-6; Ridgway, N.およびDolphin, P.J. Biochim. Biophys. Acta 1984 796(1):64-71; Ridgway, N. D.およびDolphin, P.J. J. Lipid Res. 1985 26(11):1300-13）およびレシチン:コレステロールアセチルトランスフェラーゼ（Bertiら, Metabolism 2001 50(5):530-6; Hulsmannら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977 79(3):784-8）のような特異的脂質低下肝酵素の増加によるものである。これらの遺伝子の調節は絶食のような種々の生理的攻撃中に厳密に制御される。カロリー平衡、コレステロールおよび脂質代謝におけるこれらの経路の重要性のため、肝甲状腺ホルモン代謝のモジュレーションは薬理学的に重要であろう。
【０００６】
オーファン核内受容体であるCARはNR1I3とも称され、主として、甲状腺ホルモン代謝の主要部位である肝臓、腸および腎臓内で発現される。1,4-ビス-[2,-(3,5-ジクロロピリジルオキシ)]ベンゼン（TCPOBOP）およびフェノバルビタールのようなCARアクチベーターは、未知のメカニズムにより、げっ歯類におけるT4レベルに影響を及ぼすことが示されている。ラットにおいては、フェノバルビタールおよび高用量のTCPOBOPはT4のグルクロン酸抱合の増加を招いて、T4の循環レベルの減少をもたらす（Barter, R.A.およびKlaassen, C.D. Toxicol. Appl. Pharmacol.  1992 113:36-42）。この減少は、甲状腺刺激ホルモン（TSH）レベル（Kolaja, K. L.およびKlaassen, C.D. Toxicol. Sci. 1998 46(1):31-7）、甲状腺細胞増殖を増加させるのに、および腫瘍プロモーターと共処理されたラットにおける発癌率を増加させるのに十分なものである（Diwanら, Carcinogenesis 1996 17(1):37-43）。
【０００７】
CARは主として異物センサーとして機能すると提示されており、CARの異物センシング特性を特徴づけるために種々の研究が行われている。CARは、生体異物に応答して、Cyp2bおよびCyp3a遺伝子（Honkakoskiら, Mol. Cell. Biol. 1998 18(10):5652-8; Xieら, Genes Dev. 2000 14(23):3014-23; Zelkoら,  Biochem. Biophys. Res. Comm.  2000 277:1-6）、およびグルクロン酸抱合酵素UDP-グルクロニルトランスフェラーゼUGT1A1（Sugataniら, Hepatology 2001 33(5):1232-8）をコードする遺伝子の発現を直接的に誘導する。これらの遺伝子の産物は、一般には、生体異物基質の代謝およびクリアランスに関与している。遺伝子破壊実験はこのモデルを支持しており、このことは、CARノックアウトマウスが、正常マウスと比較して、外的因子（例えば、麻酔剤ザキサゾラミン）に対して感受性であることを示している（Weiら, Nature 2000 407(6806):920-3）。したがって、CARにより誘導される遺伝子、CARのリガンド活性化スペクトルおよび遺伝的解析は、生体異物防御におけるCARの役割を支持している。
【０００８】
WO 01/51045は、CAR媒介障害の治療用の治療剤を同定するためのスクリーニングアッセイを開示している。特に、高コレステロール血症のような障害を治療するためのCARアゴニストの使用が示唆されている。
【０００９】
CARは、絶食に応答して、肝臓内の甲状腺ホルモン代謝のモジュレーションを介して、全体的なエネルギー恒常性にも関与していることが、本発明において見出された。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明の1つの目的は、CARの発現および／または活性のモジュレーションを介して、甲状腺外組織内の甲状腺ホルモン代謝を改変する、および／または基礎代謝率および／またはコレステロールおよび脂質代謝を調節する新規治療剤を同定するための方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう1つの目的は、甲状腺外組織内の甲状腺ホルモン代謝のモジュレーションおよび／または基礎代謝率およびコレステロールおよび脂質代謝の調節に有用であるCARの発現および／または活性を改変する物質を含んでなる組成物を提供することにある。好ましい実施形態においては、該物質は、CARの発現および／または活性のアンタゴニストである。本発明の組成物は、肥満、コレステロール血症および脂質異常症を含む（これらに限定されるものではない）状態の治療において使用することができる。
【００１２】
本発明のもう1つの目的は、CARの活性および／または発現をモジュレーションする物質を対象に投与することを含んでなる、該対象における甲状腺外組織内の甲状腺ホルモン代謝をモジュレーションするための方法を提供することにある。甲状腺ホルモン代謝がモジュレーションされうる、CARを発現する甲状腺外組織の具体例には、肝臓、骨格筋、心臓、脳、腎臓および腸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明のもう1つの目的は、CARの活性および／または発現をモジュレーションする物質を対象に投与することを含んでなる、該対象における基礎代謝率またはコレステロールもしくは脂質代謝を調節するための方法を提供することにある。好ましい実施形態においては、該物質はCARの発現および／または活性のアンタゴニストである。
【００１４】
本発明の更にもう1つの目的は、CARの活性および／または発現をモジュレーションする物質を対象に投与することを含んでなる、該対象における基礎代謝率の改変またはコレステロールもしくは脂質代謝の改変に関連した状態の治療方法を提供することにある。好ましい実施形態においては、該物質は、CARの発現および／または活性のアンタゴニストである。基礎代謝率の改変またはコレステロールもしくは脂質代謝の改変に関連した状態の具体例には、肥満、高コレステロール血症および脂質異常症が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
発明の詳細な説明
甲状腺ホルモンは、コレステロール、血漿脂質レベルおよびエネルギー利用に対して強い影響を及ぼす。このホルモンの代謝をモジュレーションする物質は、肥満、脂質異常症および高コレステロール血症を含む（これらに限定されるものではない）種々の状態の治療に有用であると予想される。
【００１６】
本発明は、オーファン核内受容体CARの発現および／または活性の改変を介して、対象において、オーファン核内受容体CARを発現する甲状腺外組織内の甲状腺ホルモン代謝をモジュレーションするための、ならびに基礎代謝率およびコレステロール・脂質代謝を調節するための新規組成物、および該組成物の使用方法に関する。CARを発現する甲状腺外組織の具体例には、肝臓、骨格筋、心臓、脳、腎臓および腸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
CARの活性化に応答して様々に発現されるマウス肝遺伝子の広範な解析を行った。AFFYMETRIX（登録商標）チップ技術を使用して、mRNA定常状態レベルの変化を評価した。13,000個を超える完全長遺伝子およびESTクラスターを表すAFFYMETRIX（登録商標）GeneChipマウスゲノムアッセイ（Mu11kセット）を使用した。このセットの一次配列源はUnigeneおよびTIGRデータベースの組合せであった。CARアゴニスト1,4-ビス-[2,-(3,5-ジスクロロピリジルオキシ)]ベンゼン（TCPOBOP）で、CAR核内受容体の選択的かつ強力な活性化が観察された。TCPOBOPはマウスCARの強力かつ選択的なアクチベーターであり、in vivo層別遺伝子発現研究のための有用な化学的手段である。
【００１８】
これらの実験においては、5％ ジメチルスルホキシド（DMSO）およびトウモロコシ油中の1mg/kg TCPOBOPで3匹のマウスを腹腔内処理した。対照マウス（n = 3）にはビヒクルのみを与えた。各マウスに24時間間隔で2回の注射を行った。2回目の注射の後、肝臓を採取した。したがって、全処理時間は28時間であった。Trizol法を用いて、肝臓から全mRNAを単離し、Affymetrixチップに対するハイブリダイゼーションのためのプローブを該全ｍRNAから調製した。結果はAffymetrixマイクロアレイ・バージョン4.0ソフトウェア一式により解析した。
【００１９】
全体として、13,000個を超える遺伝子のうちの264個が、TCPOBOP処理に対する発現における2倍以上の変化（増加または減少）を示した。Affymetrixチップデータに基づけば、2個のmRNA、すなわち、CYP2B10 mRNAおよびCYP3A1 mRNAが、発現におけるそれぞれ40倍および20倍のアップレギュレーションを示した。I、IIおよびIII相代謝に関与する他の遺伝子、および甲状腺ホルモン代謝に関与する複数の遺伝子の上昇が観察された。
【００２０】
例えば、初期Affymetrixデータは、2つのスルホトランスフェラーゼmRNAがTCPOBOP処理により改変されることを示した。スルホトランスフェラーゼ活性は甲状腺代謝において重要であるため、該既知マウススルホトランスフェラーゼ遺伝子のすべての発現に対するTCPOBOPの効果を調べた。調べたスルホトランスフェラーゼの組には、N-SULT、SULT-X1、SULT-X2、アリールスルホトランスフェラーゼ、フェニルスルホトランスフェラーゼ、ヒドロキシステロイドスルホトランスフェラーゼ、SULT-B1およびSULT1E1が含まれた。これらの8個のスルホトランスフェラーゼ遺伝子のうちの3個がTCPOBOPにより誘導された。ノーザンブロット分析は、N-SULTが11.5倍増加し、SULT-X1が10.0倍増加することを示した。SULT-X2は30倍増加することが、RTQ-PCRを用いて示された。脱ヨード酵素I型活性と共役したスルホトランスフェラーゼ活性は、T4から、T3ではなくrT3に変換される比率を増加させた。
【００２１】
肝甲状腺ホルモンの抱合および肝臓からの輸出に関与する他の遺伝子も調べた。抱合、例えばグルクロニシルおよびグルタチオン輸送は、肝臓内の甲状腺ホルモンの消失において重要な役割を果たしている。TCPOBOPはUDP-グルクロニシルトランスフェラーゼ1A1における1.6倍の増加を引き起こし、いくつかのグルタチオン-Sトランスフェラーゼ（GST）遺伝子を増強することが、RTQ-PCRを使用して見出された。すなわち、GSTシータ1-1およびGST mu1-1においては2.7倍の増加が、GST mu5-5においては4.7倍の増加が、そしてGST-Yにおいては7.5倍の増加が観察された。TCPOBOPは、グルクロン酸抱合、グルタチオン共役および硫酸化代謝産物の効率的な担体である側底輸送体mrp3の発現をも発現を増加させた（Keppler, D.およびKonig, J. Semin. Liver Dis. 2000 20(3):265-72）。
【００２２】
検出された遺伝子変化の幾つかは肝T31レベルを低下させると予想された。例えば、Affymetrixチップデータは、Na+/K+輸送ATPアーゼをコードする遺伝子における、有意な、2倍を超える減少を予想させた。この遺伝子は、確立されたT3標的遺伝子であり、細胞エネルギー利用に対するT3の作用において決定的に重要な役割を果たしている。この遺伝子の発現における減少はT3レベルに対するTCPOBOPの間接的効果であると考えられている。
【００２３】
甲状腺ホルモンレベルの急性低下を引き起こす生理的状態は絶食である。CARアクチベーターTCPOBOPにより誘導される同じ遺伝子が絶食によっても誘導されるかどうかを評価するための実験を行った。絶食試験は24時間行った。この試験中、全血清T3およびT4レベルにおける予想された減少が観察された。
【００２４】
該TCPOBOP研究において調べた幾つかの遺伝子の発現も調べた。該スルホトランスフェラーゼ遺伝子のうち、SULT-X1、N-SULT、SULT 1E1、SULT 1B1およびアリールスルホトランスフェラーゼを調べた。TCPOBOPにより誘導されないスルホトランスフェラーゼmRNA（SULT-1E1、SULT-1B1およびアリールスルホトランスフェラーゼ）は絶食によっても誘導されず、一方、TCPOBOP、N-SULTおよびSULT-X1により誘導されるスルホトランスフェラーゼは絶食によっても誘導されることが判明した。興味深いことに、TCPOBOPおよび絶食により誘導されるスルホトランスフェラーゼにおいては概日リズムが観察されたが、TCPOBOPまたは絶食により誘導されないスルホトランスフェラーゼにおいては観察されなかった。もう1つの標的遺伝子UGT-1A1は、TCPOBOP処理および絶食の両方の後で同様の誘導パターンを示した。
【００２５】
CARが活性化されるかどうかを直接的に確認するための実験も行った。CARアクチベーターに関する確立された代替マーカーはCYP2B10 mRNAの発現である。Cyp2b10遺伝子は、CARに結合するフェノバルビタール応答配列（PBREM）を含有し、in vitroレポーター研究においてCARにより活性化される。CYP2B10 mRNAの発現を24時間の時間経過にわたって調べたところ、それは絶食の18時間後に増加することが判明した。24時間までに、CAR mRNAも1.6倍増加した。
【００２６】
CARにより調節されるそれらの2つのスルホトランスフェラーゼは概日リズムをも示し、昼間よりも夜間（摂食が生じる時）に、より活性であることにより理解されるとおり、CARにより調節されるスルホトランスフェラーゼ遺伝子は、通常、摂食調節に連関しているらしい。このタイプの概日リズムは、コレステロール代謝に関与する遺伝子であるCyp7aにおいても見られる。スルホトランスフェラーゼで観察されたとおり、Cyp7a発現の概日リズムは絶食によっては破壊されない（Laveryら, Mol. Cell Biol. 1999 19(10):6488-6499）。Cyp7aの概日リズムは、ロイシンジッパー型転写因子である概日調節因子DBP（アルブミンD部位結合性タンパク質）により決定される（Laveryら, Mol. Cell Biol. 1999 19(10):6488-6499; Wuarinら, J. Cell Sci. Suppl. 1992 16:123-7）。SULT-XIおよびSULT-Nは、他の代謝的に関連した遺伝子（例えば、Cyp7a）と共に、DBPにより協同的に概日的に調節されている可能性がある。これらの遺伝子の概日リズムは、これらの遺伝子が、Cyp7aの場合と同様に、食餌およびエネルギー利用と密接に関連していることを示唆している。
【００２７】
したがって、これらの実験からのデータは、CARが甲状腺ホルモン代謝の調節において何らかの役割を担っていることを示している。CARのこの役割は、通常の甲状腺ホルモン調節メカニズムの様式に課され、CARを発現する甲状腺外組織を特異的に標的化する。肝臓は、本発明において研究されている標的組織であるが、骨格筋、心臓、脳、腸および腎臓のようなCARを発現する他の組織も同様の作用を示すと予想される。
【００２８】
したがって、本発明は、CARの発現および／または活性をモジュレーションする試験物質の能力に基づく甲状腺ホルモン代謝のモジュレーションのための組成物を同定するための新規方法を提供する。CARの発現および／または活性を抑制または軽減する試験物質はCARのアンタゴニストとも称され、甲状腺ホルモンの代謝の軽減が望ましい疾患の治療に有用であると予想される。したがって、本発明はまた、CARの発現および／または活性をモジュレーションする物質を含んでなる組成物、ならびに対象において甲状腺ホルモン代謝を改変するための、これらの物質の使用方法に関する。
【００２９】
本発明の目的においては、「モジュレーション」、「モジュレーションする」または「モジュレーター」は、CARに関連した生理的状態またはパラメーターを調節、調整または改変することを意味する。モジュレーションの具体例には、CARの遺伝子の発現または活性の増強または軽減、この核内受容体の発現の時機の改変、甲状腺ホルモン代謝の増強または軽減、ならびに基礎代謝率および／またはコレステロールもしくは脂質代謝の改変が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態においては、CARの発現および／または活性が抑制または軽減され、それにより甲状腺ホルモンの代謝の軽減が生じる。
【００３０】
本発明の目的における「改変する」または「改変」は、CARの発現および／または活性のモジュレーターの投与後のT3およびT4のような甲状腺ホルモンのレベルが、該モジュレーターの投与前のこれらの甲状腺ホルモンのレベルと比較して増加または減少することを意味する。
【００３１】
本発明の目的における「物質」または「試験物質」は、CARの発現および／または活性を増強または軽減する任意の分子を包含する意である。最も好ましいのは、CARの発現および／または活性のアンタゴニストである分子である。好ましい実施形態においては、該物質は小さな有機分子である。該分子がCARに対するリガンドであることも好ましい。
【００３２】
CARのリガンドを同定するための種々のアッセイを用いることができる。  
例えば、本発明の組成物中で使用するリガンドは、Parks, D.J. 1999. Science 284:1365-1368およびWO 00/25134に記載のFRETアッセイのようなアッセイを用いる化合物ライブラリーのスクリーニングにより常套的に同定することができる。FRETアッセイは、第1の位置に位置する供与部を含むサンプル部分を、第2の位置に位置する受容部にさらして、該供与部において第1電子遷移を誘発しうる第1波長で発光させる工程を含み、ここで、該供与部は、ランタニドキレートと該キレートに結合しうるランタニドとの複合体を含み、該供与部の発光と受容部の吸収とのスペクトル重複は、受容部の発光における検出可能な増加により検出される、該供与部から該受容部へのエネルギー転移を可能にするのに十分なものである。FRETアッセイに使用する種々のコアクチベーターが記載されている。具体例には、ステロイド受容体複合体（Steroid Receptor Complex）（SRC1）、CREB結合性タンパク質（CBP）およびレチノイド相互作用性タンパク質（Retinoid Interacting Protein）（RIP 140）が含まれるが、これらに限定されるものではない。リガンドが該受容体のリガンドポケットに結合すると、該コアクチベーターが受容体-コアクチベーター複合体を形成する。コアクチベーターに関する現在のモデルは、リガンドがリガンド結合性ドメイン（LBD）に結合してアクチベーションファンクション（activation function）2（AF-2）を適切にフォールディングさせ、該リガンドを該ポケット内に捕捉するというものである。該リガンドの捕捉により新たな境界（LXXLLモチーフ）が形成されて、該コアクチベーターがAF-2と相互作用するのを可能にする。したがって、AF-2はリガンド依存性トランス活性化において重要である。誘導因子またはアゴニストが結合すると、それは転写的に活性となり、一方、インヒビターまたはアンタゴニストの結合は該受容体補因子相互作用を妨げる。
【００３３】
CARまたはCARのリガンド結合性ドメインが単独で又は融合タンパク質として存在する無細胞結合アッセイを行うことも可能である。これらのアッセイにおいては、CARまたはCARのリガンド結合性ドメインを、検出可能な標識（例えば、放射能または蛍光標識）を好ましくは含有する試験物質と共にインキュベートする。ついで、種々の技術（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、Sehadex G50スピンカラム）の使用またはヒドロキシアパタイト樹脂上での捕捉）のいずれかを用いて、CARまたはそのリガンド結合性ドメイン（遊離体または試験物質との結合体）を遊離試験物質から分離する。ついでCARまたはそのリガンド結合ドメインに結合した試験物質の量を該標識の検出により測定する。
【００３４】
CARまたはそのリガンド結合性ドメインに結合した放射能標識試験物質を検出するためのもう1つのアプローチはシンチレーション近接（proximity）アッセイ（SPA）である。このアッセイにおいては、ビーズ（または他の粒子）をシンチレーションに含浸させ、CARまたはそのリガンド結合性ドメインを捕捉しうる分子でコーティングする（例えば、ビオチン化CARリガンド結合性ドメインを捕捉するために、ストレプトアビジンコート化ビーズを使用することができる）。放射能標識試験物質とCARまたはそのリガンド結合性ドメインとの複合体がSPAビーズの表面上に捕捉されて、該放射能標識がシンチラントに十分に接近してシグナルを放出した場合にのみ、放射能計数が検出される。このアプローチは、遊離試験物質を結合体から分離することを要しないという利点を有する（Nicholsら, Anal. Biochem. 257:112-119 (1998)）。
【００３５】
また、試験物質がCARリガンド結合性ドメインと相互作用するかどうかを判定するためのアッセイを競合結合アッセイにより行うことができる。このアッセイにおいては、CARまたはそのリガンド結合性ドメインを、CARと相互作用することが知られている化合物（この化合物は、好ましくは、検出可能な標識（例えば、放射能または蛍光標識）を含有する）と共にインキュベートする。試験物質を該反応に加え、CARまたはそのリガンド結合性ドメインへの結合に関して標識化合物と競合するその能力に関してアッセイする。遊離既知（標識）化合物を結合体から分離する工程を用いる標準的なアッセイ形式、またはSPA形式を用いて、試験化合物の競合能を評価することが可能である。
【００３６】
試験物質がCARを活性化して甲状腺ホルモン代謝を増強するかどうかを確認するために、CARのリガンド結合性ドメインを（例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ヒスチジンタグまたはマルトース結合性タンパク質との）融合タンパク質として調製する（発現させる）。融合タンパク質およびコアクチベーター（それらの一方または両方は、好ましくは、検出可能な標識、例えば放射能標識または蛍光タグで標識されている）を試験物質の存在下および非存在下でインキュベートし、融合タンパク質へのコアクチベーターの結合の度合を測定する。試験物質の存在下の相互作用の誘導はCARのアクチベーターを示す。
【００３７】
本発明によるCAR活性化アッセイは、CAR結合性ドメインにより認識されるDNA結合部位のコピーの1以上を含むレポーター系および完全長CARを使用して行うことができる。しかし、より好ましくは、該活性化アッセイは、確立されたキメラ受容体系を使用して行う。例えば、CARのリガンド結合性ドメインを、例えば酵母転写因子GAL4のDNA結合性ドメインまたはエストロゲンもしくはグルココルチコイド受容体のDNA結合性ドメインに融合させることができる。キメラ（例えば、GAL4-SHPキメラ）用の発現ベクターをレポーター構築物と共に宿主細胞（例えば、CV-1、HuH7、HepG2またはCaco2細胞）内にトランスフェクトすることができる。レポーター構築物は、レポーター遺伝子（例えば、CAT、SPAPまたはルシフェラーゼ）の発現を駆動する該キメラ中に存在する結合性ドメイン（例えば、GAL4 DNA結合部位）により認識されるDNA結合部位の1以上（例えば、5個）のコピーを含みうる。ついで、該構築物を含有する細胞をビヒクルのみ又は試験物質を含有するビヒクルで処理し、レポーター遺伝子の発現のレベルを測定する。このアッセイでは、試験物質の存在下のレポーター遺伝子の発現の増強は、試験物質がCARを活性化してグルコース産生のインヒビターとして機能しうることを示す。
【００３８】
CARのリガンドを同定するのに適したもう1つの形式は酵母ツーハイブリッドである。これは、酵母内で行う、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための確立されたアプローチである。ベイト（餌）に相当するタンパク質#1はDNA結合性ドメイン（例えば、GAL4）とのキメラとして酵母内で発現される。プレデター（捕食体）に相当するタンパク質#2は強力な転写活性化ドメインとのキメラとして同じ酵母内で発現される。ベイトとプレデターとの相互作用はレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたはβガラクトシダーゼ）の活性化または選択マーカー（例えば、LEU2遺伝子）の調節を引き起こす。このアプローチは、例えば、CARとコアクチベータータンパク質（例えば、SRCI、TIFI、TIF2、ACTR）またはその断片のような他のタンパク質とのリガンド依存性相互作用を検出するためのスクリーニングとして用いることができる（Fieldsら, Nature 340:245-2.46 (1989)）。
【００３９】
前記アッセイにおいて試験されうる適当な試験物質には、組合せライブラリー、定められた化学物質および化合物、ペプチドおよびペプチド模擬体、オリゴヌクレオチドおよび天然物ライブラリー、例えばディスプレイ（例えば、ファージディスプレイライブラリー）および抗体産物が含まれる。
【００４０】
典型的には有機分子、好ましくは、50〜2500ダルトンの分子量を有する小さな有機分子がスクリーニングされる。候補産物は、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む生体分子である。そのような物質は、合成および天然化合物のライブラリーを含む多種多様な起源から得られる。さらに、公知の薬理学的物質を一定（directed）の又はランダムな化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などに付して、構造類似体を得ることが可能である。
【００４１】
試験物質を、例えば反応当たり10種の物質の初期スクリーニングにおいて使用し、抑制または活性化を示すこれらのバッチの物質を個々に試験することができる。試験物質は、1nM〜1000μM、好ましくは1μM〜100μM、より好ましくは1μM〜10μMの濃度で使用することが可能である。好ましくは、試験物質の活性を、既知アクチベーターまたはインヒビターにより示された活性と比較する。インヒビターとして作用する試験物質は、好ましくは、該受容体の活性の50％の抑制を引き起こす。あるいは、アクチベーターとして作用する試験物質は、好ましくは、既知アクチベーターを使用して得られる最大活性の50％を示す。
【００４２】
CARの発現および／または活性のモジュレーターとして同定された物質は、甲状腺ホルモン代謝を改変するために対象に投与することができる。物質が甲状腺ホルモン代謝を改変する能力は多数の状態において有用であると予想される。  
例えば、抗肥満療法およびそれに伴う体重減少効果は恒常性抵抗性メカニズムにより妨げられる（Spiegelman, B.M.およびFlier, J.S. Cell 2001:104(4):531-43）。甲状腺ホルモンレベルの減少は、そのような療法の有効性を減少させる1つのメカニズムである。本明細書に記載の実験は、CARが、甲状腺ホルモン代謝を調節する遺伝子に対するその作用を介して、この効果に寄与することを示している。したがって、体重減少療法に対する恒常性抵抗性の決定的成分は、CARモジュレーター、特に、CARの発現および／または活性のインヒビターまたはアンタゴニストと、他の抗肥満物質との組合わせの投与により除去されうるであろう。
【００４３】
CARのモジュレーターは、コレステロール代謝における有益な変化を引き起こさせるためにも使用することができる。本明細書に示すとおり、CARアゴニストは甲状腺ホルモン代謝の態様を調節し、そしてこれはコレステロールの代謝に影響を及ぼすことが公知である。したがって、CARのモジュレーションはコレステロールレベルに間接的な影響も及ぼすと考えられる。さらに、CARを標的とすることは、（甲状腺ホルモン受容体を直接の標的とするのとは対照的に）、CARを発現する組織（主として肝臓、腸および腎臓）において選択的組織効果を得るという利益を有する。CARは、胆汁酸の硫酸化およびクリアランスを増加させることにより、コレステロールの低下に影響を及ぼしうる。したがって、CARの発現および／または活性を抑制または拮抗する物質は、コレステロールレベルを低下させるのに、および／または胆汁酸のクリアランスを増加させるのに有用であると予想される。
【００４４】
CARのモジュレーターは、LDL/HDL代謝における有益な変化を引き起こさせるためにも使用することができる。CARリガンドは、肝LDL受容体およびリポタンパク質リパーゼのようなLDLの低下に関与する特異的T3標的遺伝子を間接的にモジュレーションする。本明細書に示されているとおり、絶食に対する正常な生理的応答におけるCARの役割は、CARが、甲状腺ホルモンレベルを改変することに加えて、コレステロールおよび脂質代謝に関与する遺伝子のサブセットを直接的にモジュレーションすることを示している。したがって、CARの発現および／または活性のアンタゴニストは、LDLレベルを低下させるのにも有用であると予想される。
【００４５】
本発明の物質を含む組成物に関する投与計画および適当な投与経路の選択は、本明細書に記載されているようなin vitroおよびin vivoアッセイにおける該物質の薬理学的活性に基づき、当業者により常套的に決定されうる。本発明の組成物は、甲状腺ホルモン代謝が改変されるようにCARの発現レベルまたは活性をモジュレーションするのに有効である量の物質を含むことが好ましい。この有効量は、本明細書に記載されているようなスクリーニングアッセイにおいてin vitroで及び動物モデルにおいてin vivoで確認されるその活性に基づき、それぞれの特定された物質ごとに常套的に決定することができる。有効量の確認は、それを要する対象において、該対象における甲状腺ホルモンレベルに対する該物質の効果をモニターすることにより行うことができる。対象における甲状腺ホルモンレベルをモニターするための方法はよく知られており、当業者により常套的に行われる。
【００４６】
CARのモジュレーターとして同定された本発明の物質は、甲状腺ホルモン代謝のモジュレーションに適した任意の経路により対象に投与するための製薬上許容される組成物に製剤化することができる。適当な医薬製剤には、経口、直腸、鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（筋肉内、皮下、静脈内および罹患組織への直接的な投与を含む）投与に適した形態、または吸入もしくは通気による投与に適した形態が含まれる。該製剤は、適当な場合には、簡便な別個の投与単位として提供され、薬学の分野でよく知られた任意の方法により製造されうる。すべての方法は、該活性物質を液体もしくは微細化固体担体またはその両方と一緒にし、ついで、必要に応じて、該産物を所望の製剤に成型する工程を含む。
【００４７】
経口投与に適した医薬製剤は、所定量の該活性物質をそれぞれが含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤を含む（これらに限定されるものではない）簡便な別個の単位として；散剤または顆粒剤として；溶液剤（水剤）、懸濁剤または乳剤として提供されうる。該活性物質は丸剤、舐剤またはパスタ剤としても提供されうる。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤のような通常の賦形剤を含有しうる。錠剤は、当技術分野でよく知られた方法に従いコーティングされうる。当技術分野で公知の時限放出（timed-release）製剤も適しているかもしれない。経口液体製剤は、例えば、水性または油性の懸濁剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であることが可能であり、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで還元するための乾燥製品として提供されうる。そのような液体製剤は、懸濁化剤、非水性ビヒクル、例えば食用油、または保存剤のような通常の添加物を含有しうる。
【００４８】
CARのモジュレーターとして同定された本発明の物質は、注射、例えばボーラス注射または連続注入のような非経口投与用に製剤化されることが可能であり、アンプル、予め充填されたシリンジ、小容量の注入または複数投与用の容器中の単位投与形（添加された保存剤を含有する）として提供されうる。非経口投与用の活性物質を含む製薬上許容される組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳剤の形態をとることが可能であり、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤のような製剤化物質を含有しうる。あるいは、該有効成分は、無菌固体の無菌単離により又は溶液からの凍結乾燥により得られる、発熱物質を含有しない無菌水のような適当なビヒクルで使用前に還元される粉末形態でありうる。
【００４９】
表皮への局所投与には、CARのモジュレーターとして同定された本発明の物質を軟膏剤、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮パッチとして製剤化することが可能である。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、適当な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して水性または油性基剤で製剤化することができる。ローション剤は水性または油性基剤で製剤化することが可能であり、一般には、1以上の乳化剤、安定剤、懸濁剤、増粘剤または着色剤を含有するであろう。口腔内への局所投与に適した製剤には、芳香化基剤（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント）中に活性物質を含むロゼンジ；不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア中に有効成分を含むトローチ剤；ならびに適当な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄剤が含まれる。眼への局所投与の場合には、該活性物質は、適当な無菌の水性または非水性ビヒクル中の溶液剤または懸濁剤に製剤化されうる。バッファー（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムまたは二ナトリウム エデアート）のような添加剤、およびヒプロメロース（hypromellose）のような増粘剤を含有させることも可能である。
【００５０】
担体が固体である、直腸投与に適した医薬製剤は、好ましくは、単位投与坐剤として提供される。適当な担体には、カカオ脂、および当技術分野で一般に使用されている他の物質が含まれ、該坐剤は、活性物質と軟化または溶融担体との混合ならびにそれに続く冷却および成型により、簡便に形成されうる。
【００５１】
膣投与に適した製剤は、活性物質に加えて、適当であることが当技術分野で知られているそのような担体を含有する膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡または噴霧剤として提供されうる。
【００５２】
鼻腔内投与の場合には、CARのモジュレーターとして同定された本発明の物質は、液体噴霧剤もしくは分散散剤として又は滴剤の形態で使用することができる。滴剤は、1以上の分散剤、可溶化剤または懸濁化剤をも含む水性または非水性基剤で製剤化することができる。液体噴霧剤は加圧パックから簡便に運搬される。
【００５３】
吸入による投与の場合には、CARのモジュレーターとして同定された本発明の物質は、通気器、噴霧器もしくは加圧パック、またはエアゾール噴霧剤を運搬するための他の簡便な手段により運搬されうる。加圧パックは、適当なプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を含みうる。加圧エアゾールの場合には、一定量を送出するための弁を設けることにより、投与単位が定められうる。
【００５４】
あるいは、吸入または通気による投与の場合には、本発明の活性物質は、乾燥粉末組成物、例えば、CARをモジュレーションする物質とラクトースまたはデンプンのような適当な基剤との粉末混合物の形態をとりうる。該粉末組成物は、吸入器または通気器の補助により該粉末が外へ出ることにより投与されうる単位投与形、例えばゼラチンのカプセル剤、カートリッジまたは発疱パックとして提供されうる。  
望ましい場合には、前記製剤のいずれかは、CARのモジュレーターとして同定された本発明の物質の徐放をもたらすように適合化されうる。
【００５５】
CARの発現および／または活性をモジュレーションする物質を含む本発明の医薬組成物は、他の治療剤と組合せて使用することが可能である。  
治療における使用に必要な本発明の物質の量は、もちろん、投与経路、治療される状態の性質ならびに治療対象の年齢および状態に応じて様々となるであろう。本明細書中では「治療的に有効な量または濃度」と称されるそのような量の選択は、最終的には、担当医師の判断に委ねられる。しかし、一般には、CARの発現および／または活性をモジュレーションする物質の治療的に有効な量を与える本発明の医薬組成物の適当な用量は、約0.1〜300mg/kg体重/日、特に、約1〜100mg/kg体重/日の範囲となろう。経口投与のための適当な投与単位は、一般には、約1〜約250mg、より好ましくは25〜250mgの活性物質を含有する。
【００５６】
肥満、高コレステロール血症または脂質異常症の治療において使用する場合には、CARの発現および／または活性のアンタゴニストを含む医薬組成物は、前記経路のいずれかにより、好ましくは経口経路または注射により投与することができる。70kgの哺乳動物に対する1日量は、典型的には、本発明の活性物質で約5mg〜5グラムの範囲内となろう。
【国際調査報告】
2006500909.tif 000002