(57)【要約】封入された治療薬を含有するリポソーム製剤のインビボ投与の際に補体活性化を減少する方法が記述される。該方法は、ポリエチレングリコール由来の中性リポポリマーを有するリポソームを提供することを含む。
2006519262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞形成脂質および式：
【化１】
2006519262.tif 000021
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は、８〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル鎖であり；
ｎ＝１０〜３００、
ＺはＣ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルエーテル、ｎ−メチルアミド、ジメチルアミド、メチルカーボネート、ジメチルカーボネート、カルバメート、アミド、ｎ−メチルアセトアミド、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボン酸エステル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルカーボネートおよびアリールカーボネートよりなる群から選択され；そして
Ｌは（ｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ−ＣＨ２−、（ｉｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（ｉｉｉ）−Ｘ−ＣＨ２−よりなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは酸素、ＮＨおよび直接結合から独立して選択され、ただし、Ｌが−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−である場合には、ＸはＮＨではない］
を有する１〜１０モルパーセントの間の中性リポポリマー；および残りの小胞形成脂質を含んでなるリポソームを含んでなる、封入された治療薬を含有するリポソームのインビボ投与の際にリポソームにより誘導される補体活性化を減少するための薬剤の製造に使用するリポソーム組成物。
【請求項２】
Ｘが酸素であり、そしてＹが窒素である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌがカルバメート連結（ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）、エステル連結もしくはカーボネート連結である請求項１もしくは請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｌが−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−（カルバメート連結）である請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
Ｚがヒドロキシもしくはメトキシである請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
該リポソームが１モルパーセント〜１０モルパーセントの間の中性リポポリマージステアロイル（カルバメート連結）ポリエチレングリコールを含む請求項１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
該リポソームが１モルパーセント〜１０モルパーセントの間の中性リポポリマーメトキシ−ポリエチレングリコール１，２ジステアロイルグリセロールを含有する請求項１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２の各々が８〜２４個の間の炭素原子を有する非分枝状アルキルもしくはアルケニル鎖である請求項１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ１およびＲ２の各々がＣ１７Ｈ３５であるいずれかの前記請求項に記載の組成物。
【請求項１０】
ｎが約２０〜約１１５の間である請求項１〜９のいずれか１つに記載の組成物。  
【請求項１１】
治療薬が化学療法薬である請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
該化学療法薬がアントラサイクリン系抗生物質である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
該化学療法薬がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンよりなる群から選択される請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該化学療法薬が白金含有化合物である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
該白金含有抗生物質がシスプラチンもしくはカルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト））白金、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’））白金、ネダプラチンおよびビス−アセタト−アンミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−白金（ＩＶ）よりなる群から選択されるシスプラチンアナログである請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでリポソームにより誘導される補体活性化を減少することに使用するリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、様々な治療目的のために、特に治療薬をこれらの薬剤のリポソーム配合物の全身投与により標的細胞に運ぶために用いられる。リポソーム−薬剤配合物は、制御された薬剤放出のような改善された薬剤送達特性の可能性を与える。リポソームが注入の部位から標的領域、細胞もしくは部位に到達するためには延長された循環時間が必要とされることが多い。それ故、リポソームが全身的に投与される場合、リポソームの血液循環寿命を延長するためにリポソームを非相互作用因子、例えば、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマーのコーティングで覆うことが望ましい。そのような表面を改変したリポソームは、「長期循環」もしくは「立体的に安定化した」リポソームと一般に呼ばれる。最も一般的な表面改変は、リポソームを構成する脂質の約５モルパーセントへの、典型的に１０００〜５０００の間の分子量を有する、ＰＥＧ鎖の結合である。例えば、非特許文献１およびその中の参考文献を参照。そのようなリポソームにより示される薬物動態学は、血液から迅速に取り除かれそして肝臓および脾臓に蓄積する傾向がある非表面改変リポソームと比較した場合に、（単核食細胞系、すなわちＭＰＳを介した）肝臓および脾臓によるリポソームの取り込みの用量非依存的減少および著しく長い血液循環時間を特徴とする（同文献）。
【０００３】
最も一般的に使用されそして市販されているＰＥＧで置換されたリン脂質は、極性頭部基で負に荷電しているホスファチジルエタノールアミン、通常はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に基づく。リポソームにおける負の表面電荷は、ある態様において、例えば細胞との相互作用において（例えば非特許文献２を参照）そして薬剤の漏出が起こり得るカチオン性薬剤の送達において（例えば非特許文献３を参照）不都合であり得る。
【０００４】
ある個体におけるあるリポソーム組成物のインビボ投与に起因する１つの認識されている問題は、補体活性化の誘導である（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。補体系は免疫系の体液部門の主要エフェクターであり、そしてほぼ３０個の血清および膜タンパク質からなる。初期活性化の後に、様々な補体成分は非常に調節された酵素カスケードにおいて相互作用して、抗原クリアランスおよび炎症反応の生成を促進する反応生成物を生成せしめる。補体活性化の２つの経路：古典的経路および代替経路がある。これら２つの経路は、様々な細胞、細菌およびウイルスを溶解する高分子膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を生成せしめる共通終末反応順序を共有する（非特許文献７）。
【０００５】
補体反応生成物は初期の抗原抗体反応を増幅し、そしてその反応をさらに効果的な防御に転化する。補体活性化の間に放出される様々な小さな拡散性反応生成物は限局性血管拡張を誘導し、そして食細胞を遊走的に集め、炎症反応をもたらす。抗原が補体反応生成物で覆われるようになるにつれて、それはこれらの補体生成物の受容体を保有する食細胞によりいっそう容易に貪食される（非特許文献７）。
【０００６】
補体活性化は、クローン結腸炎のシンチグラフィー診断に使用されるＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）リポソームドキソルビシンの市販されている製剤（ＤｏｘｉｌＲ、ＣａｅｌｙｘＲ）およびＰＥＧ化リポソーム製剤ＨＹＮＩＣ−ＰＥＧのような、インビボで投与されるリポソーム製剤により引き起こされる心臓血管窮迫（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ）において原因的役割を有することが報告されている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献８）。これらの製剤の注入の際に報告される症状には、呼吸困難、頻呼吸、低血圧および／もしくは高血圧、胸痛、背痛、顔面紅潮、頭痛ならびに悪寒のような、心肺窮迫が包含される（非特許文献５）。
【０００７】
リポソームにより誘導される補体活性化は多数の要因で異なり、そしてどの因子もしく
は因子の組み合わせが主要な原因因子であるかはまだ解明されていない。リポソームにより誘導される補体活性化は、脂質飽和度、コレステロール含有量、荷電したリン脂質の存在およびリポソームサイズで異なるようである（非特許文献９）。
【０００８】
インビボ投与の際に補体活性化応答を減少するリポソーム製剤を提供することは望ましい。
【非特許文献１】Ｌａｓｉｃ，Ｄ．ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．，Ｅｄｓ．，“ＳＴＥＡＬＴＨ  ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９５，ｐｐ．１０８−１００
【非特許文献２】Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１２８７５−１２８８３（１９９８）
【非特許文献３】Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３７２：２７２−２８２（１９９８）
【非特許文献４】Ｌａｖｅｒｍａｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１８（６）：５５１（２００１）
【非特許文献５】Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７９：Ｈ１３１９（２０００）
【非特許文献６】Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１５（１）：５７（１９９８）
【非特許文献７】Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９９７
【非特許文献８】Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１２（１＆２）：１６５（２００２）
【非特許文献９】Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５７（２）：１８５（１９９８）
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
１つの態様として、本発明には、封入された治療薬を含有するリポソームのインビボ投与の際にリポソームにより誘導される補体活性化を減少する方法が包含される。該方法は、小胞形成脂質および式：
【００１０】
【化１】
2006519262.tif 000003
【００１１】
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は、８〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル鎖であり；ｎ＝１０〜３００、ＺはＣ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルエーテル、ｎ−メチルアミド、ジメチルアミド、メチルカーボネート、ジメチルカーボネート、カルバメート、アミド、ｎ−メチルアセトアミド、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボン酸エステル、およびＣ１〜Ｃ３アルキルもしくはアリールカーボネートから選択される不活性末端基であり；そしてＬは（ｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ−ＣＨ２−、（ｉｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（ｉｉｉ）−Ｘ−ＣＨ２−よりなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは酸素、ＮＨおよび直接結合から独立して選択され、ただし、Ｌが−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−である場合には、ＸはＮＨではない］
を有する１〜１０モルパーセントの間、より好ましくは１〜５モルパーセントの中性リポポリマー；および残りの小胞形成脂質を含むリポソームを提供することを含んでなる。
【００１２】
１つの態様として、Ｘは酸素であり、そしてＹは窒素である。
【００１３】
別の態様として、Ｌはカルバメート連結、エステル連結もしくはカーボネート連結である。別の態様として、Ｌは−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−（カルバメート連結）である。
【００１４】
Ｚは、１つの態様として、ヒドロキシもしくはメトキシである。
【００１５】
中性リポポリマーは、好ましい態様として、ジステアロイル（カルバメート連結）ポリエチレングリコールもしくはメトキシ−ポリエチレングリコール１，２ジステアロイルグリセロールである。
【００１６】
別の態様として、Ｒ１およびＲ２の各々は、８〜２４個の間の炭素原子を有する非分枝状アルキルもしくはアルケニル鎖である。好ましい態様として、Ｒ１およびＲ２の各々はＣ１７Ｈ３５である。
【００１７】
さらに別の態様として、ｎは約２０〜約１１５の間である。
【００１８】
治療薬は、１つの態様として、化学療法薬である。典型的な薬剤には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなアントラサイクリン系抗生物質が包含される。他の典型的な薬剤には、シスプラチンもしくはカルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト））白金、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’））白金、ネダプラチンおよびビス−アセタト−アンミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−白金（ＩＶ）よりなる群から選択されるシスプラチンアナログのような白金含有化合物が包含される。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の下記の詳細な記述を添付の図面と併せて読むとさらに完全に理解される。
［発明の詳細な記述］
Ｉ．定義
本明細書において用いる場合、「中性リポポリマー」は、正味荷電を有さない、すなわち、たとえあったとしても、等しい数の正および負電荷が存在する、非荷電性のものである。
【００２０】
「小胞形成脂質」は、疎水性および極性頭部基部分を有し、そしてリン脂質により例示されるように、水において二重層小胞を自発的に形成することができるか、もしくは疎水性部分は二重層膜の内側の疎水性領域と接触しそして極性頭部基部分は膜の外側の極性表面に配向して、脂質二重層に安定に組み込まれる両親媒性脂質をさす。このタイプの小胞形成脂質には、典型的に１もしくは２本の疎水性アシル炭化水素鎖もしくはステロイド基が含まれ、そして極性頭部基で、アミン、酸、エステル、アルデヒドもしくはアルコールのような、化学的に反応性の基を含有することができる。このクラスに含まれるのは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）のようなリン脂質であり、ここで、２本の炭化水素鎖は典型的に約１４〜２２個の間の炭素原子の長さであり、そして様々な程度の不飽和度を有する。他の小胞形成脂質には、セレブロシドおよびガングリオシドのような糖脂質、ならびにコレステロールのようなステロールが包含される。本明細書に記述する組成物には、ＰＣおよびＰＥのようなリン脂質、コレステロール、ならびに本明細書に記述する中性リポポリマーが好ましい成分である。
【００２１】
「アルキル」は、炭素および水素を含有し、そして分枝鎖もしくは直鎖であることができる完全に飽和した１価の基をさす。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチルおよびイソプロピルである。「低級アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルにより例示されるような、１〜６個の炭素原子のアルキル基をさす。
【００２２】
「アルケニル」は、分枝鎖もしくは直鎖であることができ、そして１個もしくはそれ以上の二重結合を含有する、炭素および水素を含有する１価の基をさす。
【００２３】
略語：ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ｍＰＥＧ：メトキシ末端化（ｍｅｔｈｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ポリエチレングリコール；Ｃｈｏｌ：コレステロール；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＰＨＰＣ：部分水素化ホスファチジルコリン；ＰＨＥＰＣ：部分水素化卵ホスファチジルコリン；ＨＳＰＣ：水素化ダイズホスファチジルコリン；ＤＳＰＥ：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ＤＳＰもしくはＰＥＧ−ＤＳ：ジステアロイル（カルバメート連結）ＰＥＧ；ＡＰＤ：１−アミノ−２，３−プロパンジオール；ＤＴＰＡ：ジエチレンテトラミンペンタ酢酸；Ｂｎ：ベンジル。
ＩＩ．補体活性化を減少する方法
１つの態様として、本発明は、ヒトへのリポソーム製剤のインビボ投与の際に補体活性化の誘導を減少する方法を提供する。以下に記述するように、該方法には、中性リポポリマーもしくは別の態様として中性−両性イオンリポポリマーを含むリポソーム製剤を提供することが包含される。本発明にはまた、リポソーム製剤のインビボ投与の際に補体活性化の誘導を減少することに使用する中性リポポリマーもしくは別の態様として中性−両性イオンリポポリマーを含んでなるリポソーム組成物も包含される。本発明はさらに、被験体における補体活性化を減少することに使用する薬剤の製造のためのリポソーム組成物の使用を意図する。
【００２４】
Ａ．リポソーム製剤
本発明のＰＥＧで置換された中性リポポリマーは、以下に示す構造を有する：
【００２５】
【化２】
2006519262.tif 000004
【００２６】
ここで、
Ｒ１およびＲ２の各々は、８〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル鎖であり；
ｎは約１０〜約３００の間であり、
ＺはＣ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルエーテル、ｎ−メチルアミド、ジメチルアミド、メチルカーボネート、ジメチルカーボネート、カルバメート、アミド、ｎ−メチルアセトアミド、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボン酸エステル、およびＣ１〜Ｃ３アルキルもしくはアリールカーボネートよりなる群から選択される不活性末端基であり；そして
Ｌは（ｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ−ＣＨ２−、（ｉｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（ｉｉｉ）−Ｘ−ＣＨ２−よりなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは酸素、ＮＨおよび直接結合から独立して選択される。
【００２７】
末端基Ｚは、補体活性化を誘導するインビボ成分との最小の相互作用に関して選択される。Ｚは、好ましくは、水と結合する水素結合アクセプターとして作用しそして水素結合ドナーとして働くことができない部分である。Ｚに適当な典型的な不活性部分には、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、より好ましくはＣ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルエーテル、より好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキルエーテル、ｎ−メチルアミド、ジメチルアミド、メチルカーボネート、ジメチルカーボネート、カルバメート、アミド、ｎ−メチルアセトアミド、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、カルボン酸エステル、およびＣ１〜Ｃ３アルキルもしくはアリールカーボネートが包含される。好ましいＺ部分には、メトキシ、エトキシおよびｎ−メチルアセトアミドが包含される。
【００２８】
該リポポリマーは、立体的に安定化したリポソームにおいて頻繁に用いられる、ＰＥＧ−ＤＳＰＥのような、ＰＥＧ−リン脂質の荷電したリン酸連結の代わりに中性連結（Ｌ）を含む。Ｌは、正味電荷がゼロであるならば荷電部分を含有することができ、例えば、Ｌ
は両性イオンのものである。中性連結は、例えば、カルバメート、エステル、アミド、カーボネート、尿素、アミン、エーテル、硫黄もしくは二酸化硫黄であることができる。カーボネートおよびエステルのような、加水分解可能なもしくはそうでなければ切断可能な連結は、インビボで既定の循環時間の後にＰＥＧ鎖を取り除くことが望ましい用途において好ましい。この特徴は、リポソームがその標的に到達した後に薬剤を放出することもしくは細胞への取り込みを促進することにおいて有用であることができる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８９１，４６８号（１９９９）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／１８８１３号（１９９８））。
【００２９】
連結基に結合しているＰＥＧ基は、好ましくは、約１０００〜１５０００の間の分子量を有し；すなわち、ここで、ｎは約２０〜約３４０の間である。さらに好ましくは、分子量は、約１０００〜１２０００の間（ｎ＝約２０〜２７５）、そして最も好ましくは約１０００〜５０００の間（ｎ＝約２０〜１１５）である。Ｒ１およびＲ２基は、好ましくは１６〜２０個の間の炭素の長さであり、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ１７Ｈ３５（ＣＯＯＲがステアリル基であるように）が特に好ましい。
【００３０】
上記のように、リポソームへの非荷電性脂質の導入は、封入した両親媒性の弱塩基性もしくは酸性の薬剤の減少した漏出のような利点を与えることができる。別の利点は、標的細胞とそしてＰＥＳとリポソーム表面との相互作用を調節することにおけるより大きな柔軟性である（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１２８７５−１２８８３（１９９８））。ＰＥＧで置換された合成セラミドは、立体的に安定化したリポソームの非荷電性成分として使用されており（Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３７２：２７２−２８２（１９９８））；しかしながら、これらの分子は製造するのが複雑で且つ高価であり、そしてそれらは一般にリン脂質二重層ならびにジアシルグリセロリン脂質にパックしない。
【００３１】
リポポリマーは、標準的な合成方法を用いて製造することができる。例えば、カルバメート連結化合物（Ｌ＝−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−）は、ｍＰＥＧ（メトキシ−ＰＥＧ）の末端ヒドロキシルをｐ−ニトロフェニルクロロホルメートと反応させてｐ−ニトロフェニルカーボネートを生成せしめ、それを次に１−アミノ−２，３−プロパンジオールと反応させて中間カルバメートを生成せしめることにより、図１に示すように製造される。近接ジオール部分のヒドロキシル基を次にアシル化して最終生成物を生成せしめる。カーボネート連結生成物（Ｌ＝−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−）を製造するために、１−アミノ−２，３−プロパンジオールの代わりにグリセロールを使用して、同様の経路を用いることができる。カルバメート連結ジステアロイルおよびジエコサノイルリポポリマーの製造は、実施例１および２に記述されている。
【００３２】
図２Ａに示すように、エーテル連結リポポリマー（Ｌ＝−Ｏ−ＣＨ２−）は、ｍＰＥＧ−ＯＨの末端ヒドロキシルを塩化グリシジル（例えばエピクロロヒドリン）と反応させ、得られるエポキシドを加水分解し、そして得られるジオールをアシル化することにより容易に製造される。エステル連結リポポリマー（Ｌ＝−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−もしくは−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−）は、示すように、ｍＰＥＧ−ＯＨをグリセリン酸アセトニドの活性化誘導体（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボン酸）もしくは四炭素ホモログ、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−酢酸と反応させることにより、例えば図２Ｂに示すように製造することができる。次に、ジオールを脱保護し、そしてアシル化する。
【００３３】
ｍＰＥＧ−ＯＨの代わりに例えばＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９：１１７７−１１８３（１９８３）の方法により製造されるｍＰＥＧ−ＮＨ２を使用する対応する反応は、アミド、尿素もしくはアミン連結を有するリポポリマー（すなわち、ここで、Ｌ＝−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−もしくは−ＮＨ−ＣＨ２−）を製造するために用いることができる。
【００３４】
Ｌが−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−（ここで、ＸはＯもしくはＮＨである）である化合物は、それぞれ、１，２，３−プロパントリオールもしくは１−アミノ−２，３−プロパンジオール
と活性化カルボキシル末端ＰＥＧ（ヒドロキシル末端ＰＥＧの酸化および例えばニトロフェニルエステルへの転化もしくはＤＣＣとの反応によるカルボキシル基の活性化により製造する）との反応により製造することができる（図２Ｃ）。ケト連結化合物（すなわち、ここで、Ｘは直接結合である）は、例えば１−ブロモ−２，３−プロパンジオールアセトニドのグリニャール試薬とアルデヒド末端ＰＥＧ（ヒドロキシル末端ＰＥＧの穏やかな酸化により製造する）との縮合（図２Ｄ）、続いて非酸性条件下でのケトンへの酸化、およびジオールへのアセトニドの加水分解により製造することができる。各場合において、次にジオールを従来どおりアシル化する。
【００３５】
グリセロール部分に連結していないＰＥＧオリゴマーの末端（α末端；上記の基Ｚ）は、典型的にヒドロキシもしくはメトキシであるが、リポソームを特定の細胞もしくは組織タイプに向かわせることもしくはそうでなければ薬剤送達を促進することに使用する、中性リポポリマーへの様々な分子の結合を容易にするために、当該技術分野において既知である方法に従って官能化することができる。結合される分子には、例えば、ペプチド、糖、抗体もしくはビタミンを包含することができる。以下の実施例２〜３は、上記のものと同様の経路に従うが、分子の脂質部分の合成後にヒドロキシルに容易に転化されるｔ−ブチルエーテルもしくはベンジルエーテルのような基でα末端が置換される市販されているＰＥＧオリゴマーから出発するα−官能化リポポリマーの製造における段階を記述する。次にこの末端を、この場合にはｐ−ニトロフェニルカーボネートへの転化により活性化する。
【００３６】
別の典型的な中性リポポリマーを図５に例示する。中性−両性イオンポリマー−脂質の合成をポリマーＰＥＧおよび脂質ＤＳＰＧを用いて例示する。他の親水性ポリマーおよび他の脂質もまた使用できることが理解される；例えば、ｍＰＥＧアルデヒドでのホスファチジルエタノールアミンの還元的アルキル化。簡潔に言えばそして実施例４にさらに詳細に記述されているように、ＤＳＰＧを過ヨウ素酸ナトリウムで処理することにより酸化し、そして次にボラン−ピリジンの存在下でｍＰＥＧ−ＮＨ２と反応させて中性−両性イオンｍＰＥＧ−ＤＳＰＥポリマーを生成せしめた。両性イオンリポポリマーは、生理的ｐＨで正味の中性電荷を有する。それは中性であるリポソーム二重層を目的とし、リポソーム粒子における望ましくない電荷を除く。
【００３７】
Ｂ．リポソーム薬理動態学
長期循環リポソームは、１〜１０モル％、より好ましくは１〜５モル％、そしてより好ましくは３〜１０モル％の中性リポポリマー、もしくは中性−両性イオンポリマーを小胞形成脂質から成るリポソームに導入することにより形成される。例示するために、３〜５モル％のｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）もしくはカルバメート連結リポポリマーｍＰＥＧ２０００−ＤＳのいずれかを含むリポソームを実施例５に記述するように製造した。脂質の残りは、１．５：１のモル比のＨＳＰＣおよびコレステロールからなった。リポソームにマーカー１２５Ｉ−チラミニルイヌリンを充填した。各製剤のサンプルをマウスの尾静脈に注入し、そして実施例５に記述するように、様々な時間点で組織分布を決定した。血液、肝臓および脾臓に存在するレベルを表１Ａ〜１Ｃにそしてグラフで図３Ａ〜３Ｃに示す。データが示すように、ＰＥＧ−ＤＳを含有するリポソームの薬理動態学は、ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有するリポソームのものと非常に類似していた。
【００３８】
【表１】
2006519262.tif 000005
【００３９】
同様の研究によりＰＥＧ脂質を含有しないコントロール配合物に対する両方のＰＥＧ脂質の性能を比較した。図４は、ＰＥＧ脂質を含有しない（十字）、５モル％のＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（三角）もしくは５モル％のＰＥＧ２０００−ＤＳ（丸）を含有する２：１  ＨＳＰＣリポソームの血液における保持を示す。
【００４０】
５：５５：４０のモル比のｍＰＥＧ２０００−ＤＳ：ＰＨＰＣ：Ｃｈｏｌを含有するリポソームを用いてさらなる研究を行った。リポソームをインジウム−ＤＴＰＡ複合体の取り込みにより標識した。注入用量のパーセントを血液においてそして２４時間で様々な組織において決定した。結果を表２Ａ〜２Ｃに示す。再び、リポソームは、４時間後に注入用量の＞７０％、そして２４時間後に＞３０％の平均保持で、典型的な長期循環薬理動態学を示した。
【００４１】
【表２】
2006519262.tif 000006
【００４２】
５モル％のｍＰＥＧ２０００−ＤＳもしくはｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥおよび残りのＰＨＥＰＣを含有するリポソームを投与後２４時間まで血液に残留するパーセントに関して比較した。図４に示すように、薬理動態学は、２４時間後に約４０％の保持で、実質的に同一であった。
【００４３】
Ｃ．インビトロにおける補体活性化の測定
補体活性化の誘導への中性リポポリマーを含んでなるリポソーム製剤の影響を評価するために、実施例６に記述するように、１２種のリポソーム製剤および２種のミセル製剤を製造した。実施例６における表３は、これらの製剤の脂質組成を詳述する。簡潔に言えば
そして表４に関連して、製剤には下記のものが包含された：
製剤番号１、２、３：封入される薬剤、ドキソルビシン（ＤｏｘｉｌＲ）およびシスプラチンにおいてのみ異なる、同一の脂質組成の２種の薬剤充填リポソーム（製剤番号１および２）および同一の脂質組成のしかし封入される治療薬のない製剤、すなわち、偽薬（製剤番号３）；
製剤番号４：補体活性化の誘導へのＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥの量の影響は、０．６モル％のＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを有する製剤を同一であるがより高い（４．５モル％）量のＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥの製剤番号３と比較することにより評価した；
製剤番号５、６、７：ＰＥＧ−ＤＳＰＥの負電荷の影響は、負に荷電したＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが取り除かれ（製剤番号６）２種の中性リポポリマー：ＰＥＧ２０００−ＤＳ（製剤番号７）およびＰＥＧ２０００−ＤＳＧ（製剤番号６；ＤＳＧ＝ジステアロイルグリセロール；ｍＰＥＧ−ＤＳＧの図２Ａの構造を参照）で置換されたリポソーム製剤と製剤番号３（ＤｏｘｉｌＲおよびシスプラチンリポソーム製剤番号１および２に対する偽薬）を比較することにより調べた；
製剤番号８，９：補体活性化の誘導へのＰＥＧ部分のサイズの影響は、３５０ダルトン（製剤番号８）、２０００ダルトン（製剤番号３）および１２，０００ダルトン（製剤番号９）の異なるＰＥＧ分子量を有する負に荷電したＰＥＧ−ＤＳＰＥを有するリポソームを比較することにより調べた；
製剤番号１０：リポソーム形成リン脂質水素化ダイズホスファチジルグリセロール（ＨＳＰＧ）によって導入された負電荷を有するリポソームを、大きい頭部基を有するミセル形成リポポリマーＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥによって負電荷が導入されたリポソーム（製剤番号３）との比較のために製造した；
製剤番号１１、１２：リポソーム陽性コントロールとして、大きい粒子サイズのそして５０％（製剤番号１１）および７１％（製剤番号１２）のコレステロールモル比を有するＤＭＰＣ／ｃｈｏｌ／ＤＭＰＧからなるリポソーム（これらの製剤は、ブタにおける補体依存性心肺窮迫を包含する、補体系を活性化することにおいて非常に強力であるので）；
製剤番号１３，１４：他の脂質なしのＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが補体活性化を誘導するかどうかを決定するために、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（製剤番号１３）およびＰＥＧ２０００−ＤＳ（製剤番号１４）のミセルを製造した。
【００４４】
リポソーム形成リン脂質ＨＳＰＧによって導入された負電荷を有するリポソームは露出した負電荷を有し、一方、リポポリマーＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥによって負電荷が導入されたリポソームはＰＥＧ鎖により隠された負電荷を有するので、リポソーム製剤番号１０のリポソーム製剤番号３との比較は、露出した負電荷と隠された負電荷との間の違いの研究を与えた。
【００４５】
表４は、リポソームおよびミセル製剤を要約し、そしてサイズ、表面電荷（Ψ０）およびゼータ電位を示す。
【００４６】
【表３】
2006519262.tif 000007
【００４７】
実施例６に記述するように、補体活性化のインビトロ誘導は、様々なリポソーム製剤とヒト血清とのインンキュベーションの際に補体活性化のマーカーとしてＳタンパク質結合Ｃ最終複合体（Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＳＣ５ｂ−９）の形成を測定することにより決定した。典型的な研究として、リポソーム製剤を血清と混合し、そして３７℃で約３０分間インキュベーションした。反応を止め、そしてＳＣ５ｂ−９の量を酵素免疫測定法により決定した。製剤番号１、３、４、５、６、８、９および１０の結果を図６に示す。
【００４８】
図６は、示したリポソーム製剤のＳＣ５ｂ−９誘導を、リン酸緩衝食塩水とインキュベーションした細胞の基準ＳＣ５ｂ−９誘導のパーセントとして示す。リポソーム製剤５および６は、電荷に関して中性である（製剤番号６は中性リポポリマーＰＥＧ−ＤＳを含み、そして製剤番号５は中性脂質ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌからなる）。これらの中性製剤は、ＳＣ５ｂ−９形成における測定可能な変化をもたらさなかった。０．６％のＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを含有する製剤番号５もまた、補体活性化をほとんど引き起こさなかった。しかしながら、他のリポソーム製剤は全て、ＰＢＳコントロールと比較してＳＣ５ｂ−９の有意な上昇を引き起こした。「ＤｏｘｉｌＲ偽薬」製剤番号３および負に荷電したＨＳＰＧを含有するリポソーム製剤番号１０は、ＳＣ５ｂ−９形成の中等度の約２倍の上昇を引き起こし、ＤｏｘｉｌＲ製剤番号１は、ＳＣ５ｂ−９の非常に強い７倍の増加を引き起こした。これらのデータは、負電荷および特にＤｏｘｉｌＲにおけるドキソルビシンが補体活性化の要因であることを示唆する。この結果は、ＤｏｘｉｌＲリポソーム製剤番号１の同じ脂質組成およびサイズを有するシスプラチン充填リポソーム、リポソーム製剤番号２が全くもしくはわずかにしか補体活性化を引き起こさないことにより裏付けられた（データは示さない）。製剤番号７（製剤番号６に対して）におけるようにＨＳＰＣをＥＰＣで置換した場合、試験した血清の２／３において中等度のしかし有意な補体活性化が起こった。
【００４９】
製剤番号１３（ＰＥＧ２０００−ＰＥミセル）の補体活性化効果は、該ミセルをヒト血清に増加する濃度で加えることにより評価した。ミセルは、ＤｏｘｉｌＲ（製剤番号１）
が有意な活性化を引き起こした場合の条件下でいずれの血清においてもＳＣ５ｂ−９の有意な上昇を引き起こさなかった（データは示さない）。実際に、ミセルは、ＤｏｘｉｌＲ製剤番号１が補体活性化を引き起こしたものより１０倍高い濃度まで加えた。従って、二重層膜上の補体結合部位の空間的配置は、リポソームにより誘導される補体活性化におけるさらなる重要な因子であり得る。
【００５０】
Ｄ．インビボにおける補体活性化の測定
上記のリポソーム製剤により誘導される補体活性化を実施例７に記述するようにブタに該製剤を投与することによりインビボで評価した。ブタにおけるリポソームにより誘導される過敏性（ＨＳＲ）の根底にある多数の生理学的変化の統一された定量化のために、これらの反応をグレードＩからＩＶまで評価する採点システムを開発した。該採点システムは実施例７において詳述されており、そしてグレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶをそれぞれ反応なし、中等度、重度および致死反応の生理学的応答に指定する。異なるリポソームへのブタの心肺応答の用量依存性、頻度およびグレードを表５に要約する。
【００５１】
【表４】
2006519262.tif 000008
【００５２】
製剤番号１（ＤｏｘｉｌＲ）ならびに負に荷電したＰＥを含有するリポソーム（製剤番号８、９、１０）は、インビトロでヒト血清における強力な補体活性化因子であったという結果（図６）と一致して、これらの同じリポソームは、ブタにおける心肺窮迫の最も強力な誘導因子であり、３〜１５０ｎｍｏｌｅのリン脂質／ｋｇは、試験の＞９０％において重度〜致死反応を引き起こした。過敏性反応を引き起こす製剤番号１（ＤｏｘｉｌＲ）
の最小用量は、２ｍｇ／ｍＬのドキソルビシンおよび１２．８ｍｇ／ｍＬのリン脂質を含有する元のバイアルからの５０μＬであり、注入の最初の１５〜３０秒で血液にほぼ到達するヒト治療用量の１／４００〜１／１０００に相当する。ヒトにおけるそしてブタにおけるＤｏｘｉｌＲの反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の用量依存性は、実質的に同一であった。
【００５３】
インビトロ補体活性化とさらに一致して、同等用量の製剤番号３（偽薬ＤｏｘｉｌＲ）もまた、ブタにおいて過敏性反応を引き起こしたが、より低い比率（６７％）であり、一方、製剤番号４（ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）、製剤番号８（ＰＥＧ３５０−ＤＳＰＥ）および製剤番号６（ＰＥＧ２０００−ＤＳ）ならびに製剤番号１３、１４（ＰＥＧ２０００ミセル）は、より高い用量でさえ反応なしもしくは軽度反応を引き起こした。インビトロ補体活性化とブタ過敏性反応との間の唯一の明白な相違は、ヒト血清において全くもしくはわずかにしか補体活性化を引き起こさなかった製剤番号９（ＰＥＧ１２０００−ＤＳＰＥリポソーム）に対する３回の試験のうち２回の重度反応であった。
【００５４】
製剤番号６および製剤番号７は両方とも中性脂質から製造した。製剤番号６は、ＨＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＳで形成された。製剤番号７は、ＥＰＣおよびＰＥＧ−ＤＳＧ、市販されている中性リポポリマーで形成された（実施例６を参照）。しかしながら、これら２つの製剤のインビボ応答は、製剤番号７が試験動物において死をもたらすのに十分に重度の補体活性化の誘導をもたらした点において異なった。それに反して、製剤番号６への応答は、４匹の試験動物のうち３匹においてグレードＩすなわち最小応答であり、そして１匹の試験動物においてグレード０（反応なし）であった。この結果は、全ての中性リポポリマーが、リポソーム製剤のインビボ投与の際に引き起こされる補体活性化の誘導を減少することができるとは限らないことを示唆する。
【００５５】
ブタにおいて行った別の研究において、４種のリポソーム製剤を実施例８に記述するように製造した。これら４種の製剤の脂質組成および特性を表６に示す。
【００５６】
【表５】
2006519262.tif 000009
【００５７】
製剤番号１６、１７および１９は全て、ＨＳＰＣおよびコレステロールを含んだが、リポポリマーにおいて異なった。製剤番号１６は、上記の製剤番号３と同様に、ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含んだ。製剤番号１７はＰＥＧ−ＤＳを含み、そして製剤番号１９はＨＳＰＧを含んだ。
【００５８】
リポソーム製剤番号１６〜１９および製剤番号１（ＤｏｘｉｌＲ）を実施例８に記述するようにブタに投与した。肺動脈圧（ＰＡＰ）の３０〜３００％の上昇、全身動脈血圧（ＳＡＰ）の可変上昇および減少、続いて起こる徐脈性不整脈を伴うもしくは伴わない頻脈ならびにＨｂ酸素飽和度の減少を包含する、典型的な血流力学変化を注入後約３〜６分後で生じた。ある動物ではＰＡＰの大きな上昇のない重度の徐脈性不整脈において示される
心臓対肺（ｃａｒｄｉａｃ  ｖｓ．ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）応答の傾向が認められたが、通常、これらの変化は相互に比例した。
【００５９】
表７は、試験動物における血流力学変化を要約する。Ｐ１〜Ｐ１２の番号を付けた１２匹のブタをこの研究に使用し、そして個々の応答を表７に示す。個々のパラメーターの変化は、注入前基準に対するパーセンテージとして定量し、そして各リポソーム製剤への全体応答は、実施例７に記述するグレード採点システムに従って適宜評価した（なし（０）、最小（Ｉ）、軽度（ＩＩ）、重度（ＩＩＩ）および致死（ＩＶ））。製剤番号１（ＤｏｘｉｌＲ）からの５０〜１００マイクロリットルの注入は、９／９のブタにおいて重度〜致死心肺反応を引き起こし、一方、製剤番号１８（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ小胞）は、１００倍高い用量でさえ、試験した全ての６匹のブタにおいて反応を引き起こさなかった。製剤番号１６（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、製剤番号１９（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＨＳＰＧ）のように、４／５のブタにおいて軽度〜致死反応を引き起こした。本発明の中性リポポリマーを含んだ製剤番号１７（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳ）は、最も高い用量レベルでのみ誘導される軽度反応をもたらした。
【００６０】
【表６】
2006519262.tif 000010
【００６１】
本明細書に記述する研究において、ドキソルビシンもしくはシスプラチンを有するリポソーム製剤、または空の偽薬リポソームを研究のモデルとして選択した。中性リポポリマーＰＥＧ−ＤＳは、補体活性化の減少した誘導をもたらすという結果は、任意の封入された薬剤もしくは治療薬を含有するリポソーム製剤に適用可能であることが理解される。典型的な薬剤には、化学療法薬、抗ウイルス薬、抗微生物薬などが包含される。化学療法薬のドキソルビシンは、アントラサイクリン系抗生物質であり、そしてダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンのような他のそのような化合物が意図される。シスプラチンもまた、白金含有化学療法薬であり、そしてカルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト））白金、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラト（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’））白金、ネダプラチンおよびビス−アセタト−アンミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−白金（ＩＶ）が包含されるがこれらに限定されるものではない、当該技術分野において既知である様々なシスプラチンアナログのような他の白金
含有薬剤が意図される。しかしながら、本明細書における結果は、任意の薬剤もしくは治療薬に適用可能であると理解される。
【実施例】
【００６２】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明を説明するが、決して限定するものではない。
実施例１Ａ
ｍＰＥＧ−ＤＳ（ｍＰＥＧアミノプロパンジオールジステアロイル；α−メトキシ−ω−２，３−ジ（ステアロイルオキシ）プロピルカルバメートポリ（エチレンオキシド））の合成
ｍＰＥＧ２０００（２０ｇ、１０ｍｏｌ）の溶液をトルエン（５０ｍＬ、１２０℃）において共沸で乾燥させた。上記の溶液の温度が２５℃に達した後に、それをクロロギ酸ニトロフェニル（３．０１５ｇ、１５ｍｏｌ）で、続いてＴＥＡ（２．０１ｍＬ、１５ｍｏｌ）で処理した。この混合物を１  １／２時間反応させた。ＴＥＡ塩を濾過し、そして溶媒を除いて粗ｍＰＥＧ２０００−ニトロフェニルクロロホルメートを生成せしめ、これにアセトニトリル（５０ｍＬ）中のアミノプロパンジオール（３ｇ、３０ｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を室温で一晩攪拌した。不溶性物質を濾過により取り除き、そして溶媒を蒸発させた。生成物をイソプロパノールから２回再結晶化させた。収量：１３．７ｇ、６５％。１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ３．２３（ｓ，ＯＣＨ３，３Ｈ），３．６５（ｓ，ＰＥＧ，１８０Ｈ），４．０５（ｔ，ウレタンＣＨ２，２Ｈ），４．４２（ｔ，１０ＯＨ，１Ｈ），４．５７（ｄ，２０ＯＨ，１Ｈ）。
【００６３】
生成物、ｍＰＥＧ２０００アミノプロパンジオール（２．３ｇ、１．０８ｍｏｌ、２．１７ｍｅｑのＯＨ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶解し、そして共沸で乾燥させ、約１０ｍＬの溶液を除いた。溶液を室温まで冷却させた。ピリジン（４ｍＬ、２０％）をピペットにより加え、続いて塩化ステアロイル（１ｇ、４．３ｍｏｌ）を加えた。すぐに白色の沈殿が形成された。反応混合物を１２０℃で一晩還流し、そして冷却させた。反応フラスコの温度が約４０℃に達すると、ピリジン塩を濾過した。濾液を蒸発させた。生成物（ＰＥＧ２０００−ＤＳ）をイソプロパノール（２ｘ３０ｍＬ）から２回再結晶化させることにより精製し、そしてＰ２Ｏ５上で真空中で乾燥させた。
【００６４】
収量：２．２６ｇ、８０％。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール、９０：１０）：ｍＰＥＧアミノプロパンジオール  Ｒｆ＝０．２６６；ＰＥＧ−ＤＳ  Ｒｆ＝０．５３３。１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ０．８９（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ），１．２６（ｓ，ＣＨ２，５６Ｈ），１．５０（２ｔ，２ＣＨ２，４Ｈ），２．２４（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２  Ｃ＝Ｏ，４Ｈ），３．２３（ｓ，ＯＣＨ３，３Ｈ），３．５０（ｓ，ＰＥＧ，１８０Ｈ），４．００（ｄｄ，ＡＰＤのＣＨ２，１Ｈ），４．０２（ｔ、ＣＨ２ＯＣ＝Ｏ−Ｎ，２Ｈ），４．２０（ｄｄ、ＡＰＤのＣＨ２，１Ｈ），４．９８（ｍ，ＣＨＯＣ（Ｏ），１Ｈ），７．３４（ｍ，ＮＨ，１Ｈ）。
【００６５】
分子量７５０、５０００および１２０００のｍＰＥＧポリマーを用いてｍＰＥＧ−ＤＳを製造するために同様の方法を用いた。構造は、１Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析により確かめた。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）により決定した場合の分子量を以下に示す。
【００６６】
【表７】
2006519262.tif 000011
【００６７】
実施例１Ｂ
ＰＥＧ−ＤＥ（ｍＰＥＧアミノプロパンジオールジエコサノイル；α−メトキシ−ω−２
，３−ジ（エコサノイルオキシ）プロピルカルバメートポリ（エチレンオキシド））の合成
１００ｍＬの丸底フラスコにおいて、エコサン酸（ｅｃｏｓａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（５００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に溶解し、そして塩化オキサリル（１４７μｌ、１．６８ｍｍｏｌ）をピペットにより加えた。攪拌反応物に、１％のＤＭＦを加えた。ＤＭＦの添加の際に、気体を放出した（この気体との全ての接触は、回避されるべきであるので）。１０分後に、トルエンを蒸発させ、そして追加の２０ｍＬのトルエンを加え、そして蒸発させてあらゆる過剰の塩化オキサリルを除いた。残留物を１０ｍＬのトルエンに再溶解した。上記のように製造したｍＰＥＧ−アミノプロパンジオール（１．１９ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を溶液に加え、還流冷却器を取り付け、そして混合物を一晩還流した。ＴＬＣ（メタノールおよびクロロホルム、９：１）による分析は、反応が完了していることを示した。反応混合物を冷却した後、非溶解物質を濾過し、そして濾液を乾固させた（ｔａｋｅｎ  ｔｏ  ｄｒｙｎｅｓｓ）。生成物をイソプロパノールから３回再結晶化させることにより精製し、そしてＰ２Ｏ５上で真空中で乾燥させた。収量：１．０ｍｇ、７０％。１Ｈ  ＮＭＲ：（３６０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ０．８９（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ），１．２６（ｓ，ＣＨ２，脂質の６６Ｈ），１．５０（２ｔ，２ＣＨ２，４Ｈ），２．２４（ｔ，ＣＨ２ＣＨ２  Ｃ＝Ｏ，４Ｈ），３．２３（ｓ，ＯＣＨ３，３Ｈ），３．５０（ｓ，ＰＥＧ，１８０Ｈ），４．００（ｄｄ，ＡＰＤのＣＨ２，１Ｈ），４．０５（ｔ、ＣＨ２ｊＣＨ２Ｃ＋Ｏ，４Ｈ），３．２３（ｓ，ＯＣＨ３，３Ｈ），３．５０（ｓ，ＰＥＧ，１８０Ｈ），４．００（ｄｄ，ＡＰＤのＣＨ２，１Ｈ），４．０５（ｔ、ＣＨ２ＯＣ＝Ｏ−Ｎ，２Ｈ），４．２０（ｄｄ、ＡＰＤのＣＨ２，１Ｈ），４．９８（ｍ，ＣＨＯＣ（Ｏ），１Ｈ），７．３４（ｍ，ＮＨ，１Ｈ）ｐｐｍ。
実施例２
ｔ−Ｂｕ−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−スクシンイミドを経たｔ−Ｂｕ−Ｏ−ＰＥＧ−アミノプロパンジオールの製造
Ａ．ｔ−Ｂｕ−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−スクシンイミド
Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＬａｂｓからのｔＢｕ−Ｏ−ＰＥＧ−２０００（１０ｇ、５ｍｍｏｌ）を１２０ｍＬのトルエンに溶解し、そして約２０ｍＬの溶媒を除き、あらゆる水をディーン・スタークトラップに集めることにより共沸で乾燥させた。
【００６８】
溶液を室温に冷却し、そしてホスゲン（１５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で一晩反応させた。反応の完了後に、溶媒をロータリーエバポレーターにより除いた。約５０ｍＬの新しいトルエンを加え、そしてロータリーエバポレーターにより除いた。残留物を乾式トルエン（３０ｍＬ）および塩化メチレン（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．１ｍＬ、１４．９ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で一晩反応させ、この期間の後にＴＬＣにより反応は完了していた。
【００６９】
【表８】
2006519262.tif 000012
【００７０】
塩を反応混合物から濾過し、溶媒を蒸発により除き、そして固体をイソプロピルアルコールから２回再結晶化させ、そしてＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：９．２、８５％。１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３、３６０ＭＨｚ）δ１．２５（ｓ，ｔ−Ｂｕ，９Ｈ），２．８２（ｓ，ＣＨ２ＣＨ２，４Ｈ），３．６０（ｓ，ＰＥＧ，１８０Ｈ），４．４５（ｔ，ＣＨ２ＯＣＯＮＨ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【００７１】
Ｂ．ｔ−Ｂｕ−Ｏ−ＰＥＧ−アミノプロパンジオール
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のアミノプロパンジオール（３００ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔ−Ｂｕ−ＰＥＧ−ＯＳｃ（５ｇ、２．２９ｍｍｏｌ）を加え、そして一晩反応させた。全てのＮＨＳエステルを消費し、ＴＬＣ上で１つのスポットを示す混合物を生成せ
しめた。
【００７２】
【表９】
2006519262.tif 000013
【００７３】
前もって洗浄した酸性イオン交換樹脂（〜１ｇ）を反応混合物に加え、そして３０分間後に濾過により除いた。溶媒を除き、そして残留物を２００ｍＬのイソプロピルアルコールから再結晶化させた。固体を集め、そしてＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：４．２ｇ、８５％。１Ｈ  ＮＭＲ：（Ｄ６−ＤＭＳＯ、３６０ＭＨｚ）δ１．２５（ｓ，ｔ−Ｂｕ，９Ｈ），３．６８（ｓ，ＰＥＧ，１８０Ｈ），４．０３（ｔ，ＣＨ２ＯＣＯＮＨ，２Ｈ），４，４３（ｔ，１０ＯＨ，１Ｈ），４．５５（ｄ，２０ＯＨ，１Ｈ），６．９８（ｔ，ＮＨ，１Ｈ）ｐｐｍ。
実施例３
ｐ−ニトロフェニルカーボネート−ＰＥＧ−ＤＳの製造
Ａ．Ｂｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）
Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ＰｏｌｙｍｅｒｓからのＢｎ−Ｏ−ＰＥＧ−２０００（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＬＡ；５ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を１２０ｍＬのトルエンに溶解しそして約２０ｍＬの溶媒を除き、あらゆる水をディーン・スタークトラップに集めることにより共沸で乾燥させた。溶液を室温に冷却し、そして残りの溶媒を減圧下で蒸発させた。
【００７４】
残留物を３０ｍＬの塩化メチレン／酢酸エチル（６０：４０）に溶解し、そしてｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（７２９ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応を４℃で８〜１６時間実施した。この方法は反応を減速するが、ビスＰＥＧ−カーボネートの形成をなくす。ＧＦシリカプレート上のＵＶ可視スポットは、反応の完了を示した。
【００７５】
反応混合物を前もって洗浄した酸性および塩基性イオン交換樹脂で３０分間処理し、濾過し、そして完全に乾固させた。生成物をイソプロピルアルコールから再結晶化させ、そしてＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：４．４ｇ、８０％。
【００７６】
Ｂ．Ｂｎ−Ｏ−ＰＥＧ−アミノプロパンジオール
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のアミノプロパンジオール（２６０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、上記に製造するようなＢｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＰＣ（４．３ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、そして５時間反応させた。全てのＢｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＰＣを消費し、反応混合物はＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水  ９０：１８：２）上で１つのスポットを与えた。
【００７７】
反応混合物を５ｇの前もって洗浄した酸性イオン交換樹脂で３０分間処理し、濾過し、そして完全に乾固させた。生成物をイソプロピルアルコールから再結晶化させ、そしてＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：３．８ｇ、９１％。
【００７８】
Ｃ．Ｂｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ジステアロイル
Ｂｎ−Ｏ−ＰＥＧ−アミノプロパンジオール（３ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）、ステアリン酸（１．９４ｇ、６．７９ｍｍｏｌ）および触媒としてＤＰＴＳ（４−（ジメチルアミノ）ピリジニウム４−トルエンスルホネート）（４０８ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２０分間攪拌した。ジイソプロピルカルボジイミド（１．２８ｍＬ、８．１６ｍｍｏｌ）をピペットにより加え、そして混合物を一晩反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール、９０：１０）は、ジオールの完全な反応を示した。
【００７９】
塩基性イオン交換樹脂（〜５ｇ）を反応混合物に加えた。３０分の振盪後に、樹脂を濾過し、そして濾液を乾固させた。残留物をイソプロパノール（１００ｍＬ）から再結晶化させ、そしてＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：４ｇ、８０％。
【００８０】
Ｄ．ＨＯ−ＰＥＧ−ジステアロイル
Ｂｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ＤＳのベンジル基の脱保護のために２つの異なる方法をとった。
【００８１】
方法１．水素化分解：炭素上パラジウムによる脱保護
５ｍＬのメタノール中のＢｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ＤＳ（２１８ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（１１０ｍｇ）およびギ酸アンモニウム（１０７ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で一晩反応させた。
【００８２】
Ｐｄ／ＣをセライトＲ上の濾過により取り除き、そして濾液を乾固させた。残留物をクロロホルムに溶解し、そして飽和ＮａＣｌで３回洗浄した。クロロホルム相を集め、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。固体残留物をｔＢｕＯＨから凍結乾燥し、そして得られる粉末をＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：８０％、１７５ｍｇ。
【００８３】
方法２．四塩化チタンによる脱保護
塩化メチレン（１０ｍＬ）中のＢｎ−Ｏ−ＰＥＧ−ＤＳ（１．１８ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で５分間冷却した。四塩化チタン（３ｍＬ，２１．５ｍｏｌ、過剰）をオーブン乾燥したシリンジによって密封反応フラスコに移した。５分後に、氷浴を取り除き、そして脱保護反応を室温で一晩実施した。完全な脱保護は、ＧＦシリカＴＬＣプレート上の下方シフトしたスポット（出発物質に対して）により示された。
【００８４】
約４０ｍＬのクロロホルムを反応混合物に加え、そして混合物を４０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３を含有する分液漏斗に移した。混合物を穏やかに振盪し（エマルジョンの形成を防ぐために）、そしてクロロホルム層を集めた。この抽出を３回繰り返し、クロロホルム相を集め、そしてＴｉＣｌ４の完全な除去を保証するために飽和ＮａＨＣＯ３の新しい分でもう１回抽出した。集めたクロロホルム相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。
【００８５】
上記の残留物を１ｍＬのクロロホルムに溶解し、そしてシリカゲル（２００〜４００メッシュ、６０Å）の準備されたカラムに加えた。生成物が１０％メタノール／９０％クロロホルムで溶出するまでメタノールの２％増分添加により移動相（クロロホルム）の極性を増加した。生成物を集め、そして溶媒をロータリーエバポレーターにより除いた。固体をｔＢｕＯＨから凍結乾燥し、そしてＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収量：７０％、８００ｍｇ。
【００８６】
Ｅ．ｐ−ニトロフェニルカーボネート−ＰＥＧ−ＤＳ
反応フラスコ、攪拌子、シリンジおよび出発物質（上記で製造するような、ＨＯ−ＰＥＧ−ＤＳ）を反応の開始前に慎重に乾燥させた。
【００８７】
１０ｍＬの塩化メチレン／酢酸エチル（６０：４０）中のＨＯ−ＰＥＧ−ＤＳ（１．２ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（１３６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１８８μＬ、１．３５ｍｍｏｌ）を加えた。反応を４℃で（ビスＰＥＧ−カーボネートの形成をなくすために）８〜１６時間実施し、この期間の後にＧＦシリカゲルＴＬＣにより反応は完了していた。
【００８８】
【表１０】
2006519262.tif 000014
【００８９】
反応混合物を前もって洗浄した酸性および塩基性イオン交換樹脂で３０分間処理し、そして濾過した。濾液を完全に乾固させ、そして残留物をイソプロピルアルコールから再結晶化させた。固体をＰ２Ｏ５上で乾燥させた。収率：７０％。１Ｈ  ＮＭＲ：（Ｄ６−ＤＭＳＯ、３６０ＭＨｚ）δ０．８６（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ），１．２２（ｓ，ＤＳ，５６Ｈ），１．４８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２（ＣＯ），４Ｈ），２．２６（２ｘｔ，ＣＨ２ＯＣＯＮＨ，２Ｈ），４．０３＆４．２２（２ｘｄ，脂質のＣＨ２ＣＨ，２Ｈ），４．９７（Ｍ，脂質のＣＨＣＨ２），６．９８（ｔ、ＮＨ，１Ｈ），７．５５  ％８．３２（２ｘｄ，芳香族、４Ｈ）ｐｐｍ。
実施例４
ｍＰＥＧ−ＮＨ２および過ヨウ素酸塩で酸化されたＤＳＰＧの還元的アミノ化カップリングによる中性−両性イオンｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの製造
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ［（１−グリセロール）］もしくはジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ、２００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を酢酸ナトリウム食塩水バッファー（１．５ｍＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝５）に懸濁し、そして懸濁液を超音波処理しながら過ヨウ素酸ナトリウム（３４８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）で４時間処理した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝９０：１８：２）は、ＤＳＰＧが消費されたことを示した。不溶性生成物を遠心分離後に溶液から分離し、そして次に水（１ｍＬ）、水／アセトニトリル、１：１（２ｍＬ、２回）で、そして次にアセトニトリルのみ（１ｍＬ、３回）で洗浄した。生成物をＰ２Ｏ５上で真空中で１．５時間乾燥させた。ｍＰＥＧ−ＮＨ２（１ｇ、０．５ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を酸化されたＤＳＰＧにベンゼン（３ｍｌ）と加え、そして残留する水を除くために溶媒を回転蒸発させた。ベンゼン蒸発段階をもう２回繰り返した。乾式メタノール（６ｍＬ）および粉末分子ふるい（４Å、３２０ｍｇ）、続いてボラン−ピリジン（８Ｍ、１．６ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。反応混合物を２５℃で１５時間攪拌した。ＴＬＣによりリポポリマー生成物の形成が確かめられた。過剰の未反応のｍＰＥＧ−ＮＨ２を除くために、生成物混合物を水（３ｍＬ）で希釈し、ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒｅ  ＣＥ透析膜（ＭＷＣＯ  ３００，０００）に移し、そして４℃で食塩水溶液（〜５０ｍＭ、１０００ｍＬ、３回）に対して、そして次に脱イオン水（３回）に対して透析した。粗生成物（ＴＬＣにより、いくらかの酸化されたＤＳＰＧで汚染されている）を凍結乾燥し、そしてＰ２Ｏ５上で真空中で乾燥させ、そして溶離剤としてクロロホルムにおけるメタノール勾配（０〜１５％）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。純粋なリポポリマー生成物を含有する画分をプールし、そして蒸発させて１４１ｍｇ（２０％）の固体を生成せしめた。１Ｈ  ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８８（ｔ，ＣＨ３，６Ｈ）；１．２６（ｓ，ＣＨ２，５６Ｈ）；１．５８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ，４Ｈ）；２．２８（２ｘｔ，ＣＨ２ＣＯ，４Ｈ）；３．２（ｂｒ  ｍ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，１Ｈ）；３．３２（ｂｒ  ｍ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２，１Ｈ）；３．６（ｓ，ＰＥＧ〜１８０Ｈ）；４．１５（ｄｄ，トランスＰＯ４ＣＨ２ＣＨ，１Ｈ）；４．３５（ｄｄ，シスＰＯ４ＣＨ２ＣＨ，１Ｈ）；５．２（ｍ、ＰＯ４ＣＨ２ＣＨ，１Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、等しい４４ダルトン間隔で配置されそして２７７０ダルトンに中心があるイオンの釣鐘形分布を生成した（計算分子量：２８１３ダルトン）。
実施例５
ＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびＰＥＧ−ＤＳを含有するリポソームの製造および生体内分布研究
以下の比率：
【００９０】
【表１１】
2006519262.tif 000015
【００９１】
のＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−脂質の混合物から、溶解および溶媒の除去により、脂質フィルムを形成した。
【００９２】
フィルムを１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中の新しく調製した１２５Ｉ−チラミニルイヌリンにおいて水和させ、そして押し出して直径が１００〜１０５ｎｍのリポソームを生成せしめた。リポソームを０．２２μｍのミリポア（ＭＩｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）低タンパク質結合シリンジエンドフィルターを通した濾過により滅菌した。アリコートを計数して１２５Ｉの注入総数を決定した。脂質濃度は、リポソーム製剤のホスフェート含有量をアッセイすることにより決定し、そしてリポソーム製剤を２．５μｍｏｌ／ｍＬの最終濃度に滅菌バッファーにおいて希釈した。各マウスに０．５μｍｏｌのリン脂質を与えるように、マウスに０．２ｍＬの希釈したリポソームを尾静脈を介してｉ．ｖ．注入した。様々な時間点で、マウスをハロタン麻酔およびその後の頚椎脱臼により安楽死させ、血液を心出血
によりサンプリングし、そして血液および様々な臓器を１２５Ｉ計数に関してアッセイした。
実施例６
インビトロにおける補体活性化の測定
材料
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および卵黄レシチン（ＥＰＣ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入し、そして完全水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）および完全水素化ダイズホスファチジルグリセロール（ＨＳＰＧ）は、Ｌｉｐｏｉｄ  Ｉｎｃ．，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙからであった。全ての脂質は、＞９７％の純度を有した。ザイモサンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からであった。
【００９３】
市販用のＤｏｘｉｌＲは、ＡＬＺＡ  Ｃｏｒｐ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手し、そしてドキソルビシンＨＣｌ、２ｍｇ／ｍＬ（４．２２ｍＭ）、リポソーム脂質、１６ｍｇ／ｍＬ、硫酸アンモニウム、〜０．２ｍｇ／ｍＬ；ヒスチジン、１０ｍＭ（ｐＨ６．５）およびショ糖、１０％を含有した。脂質成分は、ＨＳＰＣ，９．５８ｍｇ／ｍＬ；Ｃｈｏｌ，３．１９ｍｇ／ｍＬ；ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ；３．１９ｍｇ／ｍＬ（総リン脂質、１２．８ｍｇ／ｍＬ、１３．３ｍＭ）を含んだ。
【００９４】
３５０ダルトン、２０００ダルトンおよび１２，０００ダルトンのＰＥＧ部分を有するＮ−カルバミル−ポリ（エチレングリコールメチルエーテル）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノール−アミントリエチルアンモニウム塩（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（それぞれ、０．３５Ｋ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ；２．０Ｋ  ＰＥＧ−ＤＳＰＥ；１２．０Ｋ  ＰＥＧ−ＤＳＰＥとも称する、ＰＥＧ３５０−ＤＳＰＥ；ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥおよびＰＥＧ１２０００−ＤＳＰＥ）は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。
【００９５】
ポリエチレングリコール（２０００ＤａのＰＥＧ部分）を有する３−メトキシポリエチレングリコール−オキシカルボニル３−アミノ−１，２−プロパンジオールジステアロイルエステル（２Ｋ−ＰＥＧ−ＤＳとも称する、ＰＥＧ２０００−ＤＳ）は、上記のように製造した。
【００９６】
３−メトキシ−ポリエチレングリコール１，２−ジステアロイルグリセロール（２Ｋ−ＰＥＧ−ＤＳＧとも称する、ＰＥＧ２０００−ＤＳＧ）（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＤＳＧ−２Ｈ）は、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ＆Ｆａｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。
【００９７】
ヒト血清は、健康なボランティアドナーから入手した。血清は、使用するまで−７０℃で保った。
方法
リン脂質濃度の決定：リン脂質濃度は、バートレット法の改変を用いて決定した。
【００９８】
粒子サイズ分布の決定：粒子サイズ分布は、ＡＬＶ−５０００／ＥＰＰ多重デジタルコレクターを有する高性能パーティクルサイザーＡＬＶ−ＮＩＢＳ／ＨＰＰＳ（ＡＬＶ−Ｌａｓｅｒ  Ｖｅｒｔｒｉｅｂｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ＧｍｂＨ，Ｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはＮｉｃｏｍｐモデル３７０（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）サブミクロンパーティクルサイザーのいずれかを用いて２５℃で動的光散乱により決定した。
【００９９】
リポソーム表面電荷（ψ電位）の測定：リポソームの表面電位を決定するために、広範囲のｐＨ値にわたるＨＣイオン化の程度を測定した。リポソームの３０μＬのアリコートを１．５ｍＬのバッファーに希釈した。ｐＨは、適切な量の濃水酸化ナトリウムおよび塩酸の添加により調整した。大型単層小胞（ＬＵＶ）の内側と外側との間のｐＨ平衡を保証するために全てのサンプルを水浴中で約５秒間超音波処理した。ＨＣイオン化状態を測定するために、ＨＣ蛍光励起スペクトルをＬＳ５５０Ｂ発光分光計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて室温（２２℃）で記録した。測定は２つの励起波
長：ｐＨ非依存性であり（等吸収点）そして脂質環境におけるＨＣの総量（非イオン化＋イオン化）を表す３３０ｎｍ、およびイオン化されたＨＣ−のみを示す３８０ｎｍで実施した。発光波長は、両方の励起波長で４５０ｎｍであった。２．５ｎｍの励起および発光帯域幅を用いた。各脂質組成物に対して、バルクｐＨの関数として励起波長３８０／３３０の比率の変化からＨＣの見かけのｐＫａを計算した。基準中性表面に対する、その見かけのプロトン結合定数を表す、ＨＣの見かけのｐＫａのシフトは、ＨＣフルオロフォアの近接環境における表面ｐＨおよび表面電位の指標となる。表面電位（ψ）の値は式：
【０１００】
【数１】
2006519262.tif 000016
【０１０１】
を用いて計算した。
【０１０２】
ゼータ電位の決定：ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００  ＨＡＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫを用いて２５℃で測定した。リポソームの４０μＬのアリコートを２０ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．７）に希釈し、そして溶液を０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通した。測定の原理は、以下のとおりである：電解質中の荷電粒子の懸濁液に電場がかけられると、異極性の電極に向かうそれらの運動の速度は、電場の強さ、誘電定数、媒質の粘度、およびゼータ電位に依存する。単位電場における粒子速度に対するゼータ電位の関係（電気泳動移動度）は、ヘンリー式：
【０１０３】
【数２】
2006519262.tif 000017
【０１０４】
［式中、ＵＥ＝電気泳動移動度、ｚ＝ゼータ電位、ε＝誘電定数、そしてη＝粘度］
により表される。ｆ（Ｋａ）は、電気二重層厚および粒子直径の関数である。水性媒質もしくは中等度の電解質濃度（１０ｍＭ  ＮａＣｌ）において、ｆ（Ｋａ）値は１．５であり、それをスモルコフスキー近似：
【０１０５】
【数３】
2006519262.tif 000018
【０１０６】
に使用する。２５℃で、ゼータ電位は：
【０１０７】
【数４】
2006519262.tif 000019
【０１０８】
として概算することができる。
【０１０９】
Ａ．リポソーム製剤
表３に示す様々な脂質組成を含んでなるリポソームを以下のように製造した。各配合物の脂質成分を第三級ブタノールに溶解した。清澄溶液を凍結乾燥した。粉末を１０ｍＬの熱い（６５℃）滅菌したパイロジェンフリーの食塩水において７０℃で２〜３分間ボルテックスすることにより水和させて多重層小胞（ＭＬＶ）を生成せしめた。ＭＬＶを６２℃でＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｓ  Ｉｎｃ．（以前はＬｉｐｅｘ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）からのＴＥＸ  ０２０  １０ｍＬバレル押し出し機を用いて、０．４および０．１μｍの細孔サイズのポリカーボネートフィルターを通して（各々１０回通して）２つの押し出し段階において小型化した。リポソーム製造の全ての段階は、無菌的に行った。リポソームを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）に懸濁した。全てのリポソーム製剤は無菌であり、そしてパイロジェンフリーであった。
【０１１０】
ミセルは、２Ｋ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくは２Ｋ−ＰＥＧ−ＤＳを２ｍｇ／ｍＬで食塩水において十分にボルテックス混合し、続いて０．２２μｍのフィルターを通して濾過することにより製造した。
【０１１１】
【表１２】
2006519262.tif 000020
【０１１２】
Ｂ．インビトロ補体活性化測定
リポソームを振盪水浴（８０サイクル／分）において希釈していないヒト血清とインキュベーションし、そして補体最終複合体ＳＣ５ｂ−９の形成を測定することにより補体活性化を概算した。典型的な実験として、１０μＬのリポソームをエッペンドルフチューブにおいて４０μＬの血清と混合し、それを次に振盪水浴（８０ｒｐｍの振盪速度）において３７℃で３０分間インキュベーションした。反応は、２０容量の１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および０．０１％チメロサール（ｐＨ７．４）（すなわち、ＥＤＴＡを補足したＳＣ５ｂ−９  ＥＬＩＳＡキットの「サンプル希釈剤」）を加えることにより停止した。ＳＣ５ｂ−９は、以前に記述されているように（Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９０：３００（１９９８））、酵素免疫測定法（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏ．，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により決定した。
実施例７
インビボにおける補体活性化の測定
実施例６に記述するように製造したリポソームを以下のようにブタに投与した。２５〜４０ｋｇの範囲の両方の性別のヨークシャーブタを入手した。動物をｉ．ｍ．ケタミン（５００ｍｇ）で落ち着かせ、そして麻酔器を用いて２％イソフルランで麻酔した。肺動脈楔入圧（ＰＡＰ）を測定するために肺動脈カテーテルを右内頸静脈を経て右心房を通って肺動脈に進めた。全身動脈圧（ＳＡＰ）は、大腿動脈において測定した。手術、器具類および血流力学分析の他の詳細は、以前に記述されているように行った（Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９：２３０２（１９９９））。
【０１１３】
各リポソーム製剤の示した量を１ｍＬのＰＢＳに希釈し、そしてカテーテル導入器によって頸静脈に、もしくは肺動脈カテーテルによって直接肺動脈に注入した。これらの注入方法は、血流力学変化を誘導することにおいて同等であった。リポソームを５〜１０ｍＬのＰＢＳで循環に流した。リポソーム反応の複合測定を与えるために、以下の生理的異常
の一つに関してモニターすることにより血流力学変化を任意の等級付けスキームにより定量した：
異常
ＰＡＰの上昇
全身動脈圧（ＳＡＰ）の上昇もしくは減少
心拍出量の減少
ＥＫＧ異常
吐き出されるＣＯ２の減少
心拍数の上昇もしくは減少
血漿ＴＸＢ２の上昇
肺および全身血管抵抗の上昇
顔面紅潮。
【０１１４】
ブタにおけるリポソームにより誘導される心臓血管反応を以下のように見積もった：
グレード          症状
０（なし）        ＥＣＧもしくは任意の血流力学パラメーターにおける有意な改変が
ない
Ｉ（最小）        以下のパラメーター：心拍数、ＥＣＧ、ＳＡＰ、ＰＡＰ、Ｈｂ酸素
飽和度の１つもしくはそれ以上における一時的な（＜２分）、＜２
０％の明らかに識別可能な変化
ＩＩ（軽度）      以下のパラメーター：心拍数、ＥＣＧ、ＳＡＰ、ＰＡＰ、Ｈｂ酸素
飽和度の１つもしくはそれ以上における一時的な（＜２分）、＞２
０％しかし＜５０％の変化
ＩＩＩ（重度）    上記のパラメーターの１つより多くにおけるさらに長時間の（１０
分まで）、＞５０％の変化、＋徐脈性不整脈
ＩＶ（致死）      致死反応：エピネフリンおよび／もしくは除細動を伴うＣＰＲを必
要とする４分以内の循環虚脱。典型的にＳＡＰは＜４０ｍｍＨｇに
減少し、ＰＡＰは最大（約６０ｍｍＨｇ）に上昇し、頻脈の後に不
整脈を伴う重度の徐脈が続き、心停止および死をもたらす。
実施例８
リポソーム製剤のインビボ特性化
４種のリポソーム（ＬＵＶ）製剤を製造した。リポソーム組成物および特性化を表６に記載する。配合物の各々を製造することにおいて、配合物の全ての脂質成分を第三級ブタノールに溶解した。清澄溶液を凍結乾燥した。粉末を１０ｍＬの熱い（６５℃）滅菌したパイロジェンフリーの食塩水において７０℃で１分間ボルテックスすることにより水和させてＭＬＶを生成せしめた。ＭＬＶを６２℃でＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｓ（以前はＬｉｐｅｘ），Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，ＣａｎａｄａからのＴＥＸ  ０２０  １０ｍＬバレル押し出し機を用いて０．４および０．４ミクロン細孔サイズのポリカーボネートフィルターを通して（各々１０回通して）２つの押し出し段階において小型化した。リポソーム製造の全ての段階は、無菌的に行った。
【０１１５】
市販用のＤｏｘｉｌＲを用いた（リン脂質濃度１３．３ｍＭ、１５０μｇのドキソルビシン／μｍｏｌリン脂質）。全ての他のリポソームは食塩水（０．９％ＮａＣｌ）において製造し、そして（ＮＨ４ＳＯ４）勾配を欠く。使用した全てのリポソームは、サイズ範囲１０５ｎｍ±３５ｎｍであった（表６を参照）。
【０１１６】
ＤｏｘｉｌＲおよび他の試験リポソームの示した量を１ｍＬのＰＢＳに希釈し、そして右心室に、もしくは肺動脈カテーテルによって直接ブタの肺動脈に注入した。リポソームを１０ｍＬのＰＢＳで循環に流した。以前の結果により、小リポソームボーラスの血流力学効果は、同じ動物において非タキフィラキシー（ｎｏｎｔａｃｈｙｐｈｙｌａｃｔｉｃ）でありそして定量的に数回再現可能であることが示され、従って、増加する量の同じタイプのリポソームを反応が起こるまで、もしくは反応がない場合には、ある所定の最高用量が試験されるまで各ブタに注入した。結果を表７に示す。
【０１１７】
本発明は特定の方法および態様に関して記述されているが、様々な改変を本発明からそれることなしに行うことができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本明細書においてＰＥＧ−ＤＳと称する、カルバメート連結非荷電性リポポリマーの製造の合成スキームを示す。
【図２Ａ−２Ｄ】エーテル、エステル、アミドおよびケト連結非荷電性リポポリマーの製造の合成スキームを示す。
【図３Ａ−３Ｃ】血液、肝臓および脾臓における３モル％のＰＥＧ−ＤＳ（図３Ａ）；５モル％のＰＥＧ−ＤＳＰＥ（図３Ｂ）；もしくは５モル％のＰＥＧ−ＤＳ（図３Ｃ）を含有するＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームの生体内分布を示すグラフである。
【図４】ＰＥＧ脂質を含有しない（十字）、５モル％のＰＥＧ−ＤＳＰＥ（三角）もしくは５モル％のＰＥＧ−ＤＳ（丸）を含有する水素化ダイズホスファチジルコリンリポソームの血液における保持を示すグラフである。
【図５】ホスファチジルエタノールアミンもしくはホスファチジルグリセロールのような、天然リン脂質由来の中性−両性イオンｍＰＥＧ−脂質コンジュゲートの製造の合成スキームを示す。
【図６】リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によるＳＣ５ｂ−９誘導のパーセンテージとして表される、製剤番号１、３、４、５、６、８、９および１０のＳＣ５ｂ−９誘導により測定した場合の、インビトロでヒト血清における補体活性化の誘導を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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