(57)【要約】本発明においては、各種の癌における癌の診断、癌の予後の判定および癌サブタイプの同定のための組成物および方法を開示する。また、本発明においては、癌の治療のための組成物および方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の転写モジュレーターの各々の少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含み、前記スプライス変異体の各々の発現が相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型の発現と区別され、且つ前記スプライス変異体の発現パターンが癌を指標し得ることを特徴とする、癌の診断方法。
【請求項２】
前記複数の転写モジュレーターの少なくとも１種の複数のスプライス変異体の発現を判定することをさらに含み、前記スプライス変異体の各々の発現が相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型の発現と区別され、且つ前記スプライス変異体の発現パターンが癌を指標し得る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種の転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することを含み、前記スプライス変異体の各々の発現が相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型の発現と区別され、且つ前記スプライス変異体の発現パターンが癌を指標し得ることを特徴とする、癌の診断方法。
【請求項４】
複数の転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することをさらに含み、前記スプライス変異体の各々の発現が相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型の発現と区別され、且つ前記スプライスの発現パターンが癌を指標し得る、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記スプライス変異体の発現パターンが、肺癌、胃腸癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、肉腫、内分泌腺癌、神経癌、膀胱癌、子宮頚癌、腎臓癌および造血器癌からなる群から選ばれる少なくとも１種の癌を指標し得る、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記転写モジュレーターの１種以上を、NRSF、MDM2 TSG、RREB、ZNF207、TTF-1、GTFIIIA、HES-6、HRY、Msx2、Neu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2からなる群から選択する、請求項１、２または４記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の転写モジュレーターを、NRSF、MDM2 TSG、RREB、ZNF207、TTF-1、GTFIIIA、HES-6、HRY、Msx2、Neu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2からなる群から選択する、請求項３記載の方法。
【請求項８】
１種以上の前記スプライス変異体を、ジーンバンク受託番号AF228045、NM 006878、NM 006879、NM 006880、NM 006880、AY207474、AI924329、NP 002946、AI870134、BAA23529、BAA23529、BC006221、BC006221、NM 003317、NM 003317、U14134、NP 002088、AK075040、BC039152、AF264785、X69295、D31771に示されている配列、および図４〜７に示すスプライス変異体ペプチド配列からなる群から選択する、請求項１、２または４のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記複数のスプライス変異体の１種を、ジーンバンク受託番号AF228045、NM 006878、NM 006879、NM 006880、NM 006880、AY207474、AI924329、NP 002946、AI870134、BAA23529、BAA23529、BC006221、BC006221、NM 003317、NM 003317、U14134、NP 002088、AK075040、BC039152、AF264785、X69295、D31771に示されている配列、および図４〜７に示すスプライス変異体ペプチド配列からなる群から選択する、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
前記スプライス変異体の発現パターンを同時に判定する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種のスプライス変異体発現の前記判定が、前記少なくとも１種のスプライス変異体をコード化する少なくとも１種のmRNAの発現を判定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種のmRNAの判定が、核酸アレーの使用を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のmRNAの判定が、RT-PCRの使用を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のスプライス変異体発現の前記判定が、サンプル中の自己抗体の存在を判定することを含み、該自己抗体が前記少なくとも１種のスプライス変異体に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記自己抗体の存在の判定が、前記自己抗体に特異的に結合するペプチドの使用を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、RTHSVGYGYHLVIFTRV、QETLDLDAGVSEH、SEQETLDYWKCT、MKEVLDAGVSEHS、ETLVRQESEDYS、KMVSKFLTMAVP、SPGCISPQPA、HMLTHTDSQSDAG、HKKLYTGLPPVPGA、PRFPAISRFMGPAS、APLPTAPGRKRRVLF、APLPSAPRRKRRV、AGGRSSPGRLSRR、HRYKMKRQAKDKA、AHPGHQPGSAGQSPDL、KRSLASHLSGYIP、EKREFGLSSQWIYP、VTPARRRTSLPAPLS、SPVAASVNTTPDK、SPVAATPASVNTTP、KESPAVPPEGASAG、KEASPLPAESASAG、GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGFおよびCKRLLFRRMYDRからなる群から選ばれたアミノ酸配列を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、RTHSVGYGYHLVIFTRV、QETLDLDAGVSEH、SEQETLDYWKCT、MKEVLDAGVSEHS、ETLVRQESEDYS、KMVSKFLTMAVP、SPGCISPQPA、HMLTHTDSQSDAG、HKKLYTGLPPVPGA、PRFPAISRFMGPAS、APLPTAPGRKRRVLF、APLPSAPRRKRRV、AGGRSSPGRLSRR、HRYKMKRQAKDKA、AHPGHQPGSAGQSPDL、KRSLASHLSGYIP、EKREFGLSSQWIYP、VTPARRRTSLPAPLS、SPVAASVNTTPDK、SPVAATPASVNTTP、KESPAVPPEGASAG、KEASPLPAESASAG、GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGFおよびCKRLLFRRMYDRからなる群から選ばれたアミノ酸配列から本質的になる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドアレーの使用をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記スプライス変異体の発現パターンが癌サブタイプを指標し得る、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
複数の転写モジュレーターの各々の少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含み、前記スプライス変異体の発現パターンが癌サブタイプを指標し得ることを特徴とする、癌の予後の判定方法。
【請求項２１】
少なくとも１種の転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することを含み、前記スプライス変異体の発現パターンが癌サブタイプを指標し得ることを特徴とする、癌の予後の判定方法。
【請求項２２】
a) 複数の転写モジュレーターの各々の少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定し；b) 当該患者に、１種以上の前記スプライス変異体の活性を抑制し得る生物活性剤を投与することを含み、各々のスプライス変異体の発現が相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型の発現と区別され、且つ前記スプライス変異体の発現パターンが癌を指標し得ることを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項２３】
a) 少なくとも１種の転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定し；b) 当該患者に、１種以上の前記スプライス変異体の活性を抑制し得る生物活性剤を投与することを含み、各々のスプライス変異体の発現が相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型の発現と区別され、且つ前記スプライス変異体の発現パターンが癌を指標し得ることを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項２４】
前記スプライス変異体の発現パターンが、肺癌、胃腸癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、肉腫、内分泌腺癌、神経癌、膀胱癌、子宮頚癌、腎臓癌および造血器癌からなる群から選ばれる少なくとも１種の癌を指標し得る、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の転写モジュレーターの１種以上を、NRSF、MDM2 TSG、RREB、ZNF207、TTF-1、GTFIIIA、HES-6、HRY、Msx2、Neu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2からなる群から選択する、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記転写モジュレーターを、NRSF、MDM2 TSG、RREB、ZNF207、TTF-1、GTFIIIA、HES-6、HRY、Msx2、Neu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2からなる群から選択する、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
１種以上の前記スプライス変異体を、ジーンバンク受託番号AF228045、NM 006878、NM 006879、NM 006880、NM 006880、AY207474、AI924329、NP 002946、AI870134、BAA23529、BAA23529、BC006221、BC006221、NM 003317、NM 003317、U14134、NP 002088、AK075040、BC039152、AF264785、X69295、D31771に示されている配列、および図４〜７に示すスプライス変異体からなる群から選択する、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のスプライス変異体の１種を、ジーンバンク受託番号AF228045、NM 006878、NM 006879、NM 006880、NM 006880、AY207474、AI924329、NP 002946、AI870134、BAA23529、BAA23529、BC006221、BC006221、NM 003317、NM 003317、U14134、NP 002088、AK075040、BC039152、AF264785、X69295、D31771に示されている配列、および図４〜７に示すスプライス変異体からなる群から選択する、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記生物活性剤が小干渉性RNAである、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３０】
前記生物活性剤がアンチセンス核酸である、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３１】
前記生物活性剤が小分子化学化合物である、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３２】
前記生物活性剤が、第１の転写モジュレーターの前記少なくとも１種のスプライス変異体に結合し得るおとりオリゴヌクレオチドである、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３３】
前記生物活性剤が、１種以上の前記スプライス変異体を直接ターゲッティングし、且つ前記１種以上のスプライス変異体に対して前記相応する１種以上の転写モジュレーターの野生タイプイソ型に上回って選択性である、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３４】
前記スプライス変異体発現の判定が、少なくとも１種の前記スプライス変異体をコード化する少なくとも１種のmRNAの発現を判定することを含む、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種のmRNAの発現の判定が、核酸アレーの使用を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種のmRNAの発現の判定が、RT-PCRの使用を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記スプライス変異体発現の判定が、サンプル中の自己抗体の存在を判定することを含み、該自己抗体が前記少なくとも１種のスプライス変異体に特異的に結合する、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３８】
前記自己抗体の存在の判定が、前記自己抗体に特異的に結合するペプチドの使用を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが、RTHSVGYGYHLVIFTRV、QETLDLDAGVSEH、SEQETLDYWKCT、MKEVLDAGVSEHS、ETLVRQESEDYS、KMVSKFLTMAVP、SPGCISPQPA、HMLTHTDSQSDAG、HKKLYTGLPPVPGA、PRFPAISRFMGPAS、APLPTAPGRKRRVLF、APLPSAPRRKRRV、AGGRSSPGRLSRR、HRYKMKRQAKDKA、AHPGHQPGSAGQSPDL、KRSLASHLSGYIP、EKREFGLSSQWIYP、VTPARRRTSLPAPLS、SPVAASVNTTPDK、SPVAATPASVNTTP、KESPAVPPEGASAG、KEASPLPAESASAG、GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGFおよびCKRLLFRRMYDRからなる群から選ばれたアミノ酸配列を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドが、RTHSVGYGYHLVIFTRV、QETLDLDAGVSEH、SEQETLDYWKCT、MKEVLDAGVSEHS、ETLVRQESEDYS、KMVSKFLTMAVP、SPGCISPQPA、HMLTHTDSQSDAG、HKKLYTGLPPVPGA、PRFPAISRFMGPAS、APLPTAPGRKRRVLF、APLPSAPRRKRRV、AGGRSSPGRLSRR、HRYKMKRQAKDKA、AHPGHQPGSAGQSPDL、KRSLASHLSGYIP、EKREFGLSSQWIYP、VTPARRRTSLPAPLS、SPVAASVNTTPDK、SPVAATPASVNTTP、KESPAVPPEGASAG、KEASPLPAESASAG、GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGFおよびCKRLLFRRMYDRからなる群から選ばれたアミノ酸配列から本質的になる、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ペプチドアレーの使用をさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
前記スプライス変異体の発現パターンが癌サブタイプを指標し得る、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項４３】
図４に示すヌクレオチド配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体をコード化する核酸。
【請求項４４】
請求項４３記載の核酸によってコード化されたアミノ酸配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体。
【請求項４５】
図５に示すヌクレオチド配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体をコード化する核酸。
【請求項４６】
請求項４５記載の核酸によってコード化されたアミノ酸配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体。
【請求項４７】
図６に示すヌクレオチド配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体をコード化する核酸。
【請求項４８】
請求項４７記載の核酸によってコード化されたアミノ酸配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体。
【請求項４９】
図７に示すヌクレオチド配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体をコード化する核酸。
【請求項５０】
請求項４９記載の核酸によってコード化されたアミノ酸配列を含む、転写モジュレータースプライス変異体。
【請求項５１】
請求項４４、４６、３８および５０記載の転写モジュレータースプライス変異体からなる群から選ばれた転写モジュレータースプライス変異体に特異的に結合する抗体。
【請求項５２】
請求項４４、４６、３８および５０記載の転写モジュレータースプライス変異体からなる群から選ばれた転写モジュレータースプライス変異体に特異的に結合する抗体に特異的に結合するが、相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型には特異的に結合しないペプチド。
【請求項５３】
GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGF、およびCKRLLRFRRMYDRからなる群から選ばれたアミノ酸配列を含む、請求項５２記載のペプチド。
【請求項５４】
GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGF、およびCKRLLRFRRMYDRからなる群から選ばれたアミノ酸配列から本質的になる、請求項５２記載のペプチド。
【請求項５５】
第１の転写モジュレーターのスプライス変異体を認識する自己抗体と結合し得る第１のペプチドおよび第２の転写モジュレーターのスプライス変異体を認識する自己抗体と結合し得る第２のペプチドを少なくとも含み；前記第１と第２のペプチドが前記第１と第２の転写モジュレーターの野生タイプイソ型を認識する各自己抗体には特異的に結合しないことを特徴とする、癌検出用の診断アレー。
【請求項５６】
転写モジュレーターの第１のスプライス変異体を認識する自己抗体と結合し得る第１のペプチドおよび前記転写モジュレーターの第２のスプライス変異体を認識する自己抗体と結合し得る第２のペプチドを少なくとも含み；前記第１と第２のペプチドが前記第１と第２の転写モジュレーターの野生タイプイソ型を認識する各自己抗体には特異的に結合しないことを特徴とする、癌検出用の診断アレー。
【請求項５７】
前記各ペプチドを固形支持体に拡散しないように結合させる、請求項５５または５６記載のアレー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写モジュレータースプライス変異体の発現、並びに癌の早期診断、予後診断および治療に関する。さらに、本発明は、癌の分子的特性決定および癌サブタイプの説明、並びに癌治療の最適化にも関する。さらに、本発明は、癌の治療方法および治療薬にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の早期および正確な検出、並びに腫瘍細胞の正確な特性決定は、有効な癌治療のためには極めて望ましい。しかしながら、画像形成および生化学マーカーの分析を含む方法のような多くの現行診断方法は、信頼性がなく、早期診断に対応していない。
種々の癌の分子特性を試験する多くの研究が報告されている。オリゴヌクレオチドおよびcDNAマイクロアレー (Bhattacharjee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(24):13790-13795 (2001)；Garber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(24):13784-13789 (2001)；Virtanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(19):12357-12362 (2002))、並びに遺伝子発現の連続分析(Nacht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(26):15203-15208 (2001))が、種々の癌タイプを分子的に特性決定するのに使用されている。さらに、特定のマーカーの発現は、特定の癌における予後診断と関連している(Beer et al., Nature Medicine, 8(8):816-824 (2002)；Volm et al., Clinical Cancer Res., 8:1843- 1848 (2002)；Wigle et al., Cancer Res., 62:3005-3008 (2002))。また、腫瘍細胞が同じ細胞タイプの正常細胞中には存在しないスプライス変異体mRNAを発現することも証明されている。ヒト発現型配列タグを使用する全ゲノムコンピュータスクリーンにより、25,000種以上の選択的にスプライシングされた転写体が同定され、そのうちの845種は癌に有意に関連している(Wang et al., Cancer Research 63:655-657 (2003))。
【０００３】
癌細胞と正常細胞間の遺伝子発現プロフィールの相違並びに癌細胞マーカーの存在は、癌細胞と正常細胞間の転写活性パターンの相違に部分的に由来している。同定された癌遺伝子の多くが転写因子をコード化していることは、良く知られている。さらに、ある種の腫瘍細胞が、発現中に正常に発現する転写モジュレーターを異所的に発現することも報告されている(Palm et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 72(1):30-39 (1999)；Lee et al., J. Mol. Neurosci., 15(3):205-214 (2000)；Lawinger et al., Nat. Med., 6(7):826-831 (2000)；Coulson et al., Cancer Res., 60(7):1840-1844 (2000)；Gure et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA., 97(8):4198-203 (2000))。WO 02/40716号は、種々の癌における多数の転写因子の発現プロフィールを詳細に開示し、転写因子のサブセットを発現する腫瘍サブタイプを説明している。
癌患者由来の血清の免疫反応を試験する研究も報告されている。発現cDNAライブラリーの血清学的分析を使用して腫瘍抗原を同定し、その中で、発現的に調節された転写因子が見出されている(Gure等、2000年)。さらに、WO 02/40716号は、発現的に調節された転写因子から誘導されたペプチドを使用して抗-転写因子自己抗体プロフィールを発生させることを開示し、腫瘍細胞中での転写因子の異所発現を詳述している。しかしながら、これらの転写因子は、腫瘍特異性ではなく、癌発症前に免疫系に暴露される可能性があるので、そのような転写因子に対する免疫反応性を使用しての癌診断は、偽陽性結果の発生によって妨害され得る。
種々の癌の分子特性についてのこの知識にもかかわらず、現在の診断マーカーおよび診断方法は、転移潜在力を有する侵襲性癌と患者の生存を脅かさない無痛性癌とを確実に区別することはできない。疾病の早期段階において癌の存在を検出するのに確実に使用し得る腫瘍特異性または腫瘍富化型分子マーカーは、驚異的な応用を有するであろう。さらに、特定の癌タイプの腫瘍細胞の分子フェノタイプを特性決定するのに確実に使用し得るマーカーも驚異的な用途を有するであろう。
【発明の開示】
【０００４】
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、腫瘍特異性または腫瘍富化型(“腫瘍特異性/富化型)である複数の転写モジュレータースプライス変異体の発現プロフィールを開示し、さらに、多くの癌タイプおよびサブタイプとの相関性を開示する。さらに、本発明は、複数のそのような転写モジュレータースプライス変異体の発現の判定により、癌の早期検出用の極めて高度の正確な診断指標が提供されることを立証する。さらに、本発明において開示するような適切な群の複数のそのような転写モジュレータースプライス変異体の発現の判定は、種々の癌タイプにおいて癌を指標し得る。即ち、本発明において開示する組合せとしての発現-判定方法を使用して、各種の癌を極めて高精度でもって診断し得る。本発明においてさらに開示するように、１連のそのような転写モジュレータースプライス変異体の発現の判定法は、癌サブタイプを同定し、それによって治療を最適化するのに確実に使用し得る。
各種の癌タイプにおける転写因子の発現は以前に報告され、さらに、そのような発現プロフィールの診断手段としての使用はWO 02/40716号に開示されているものの、本発明方法は、１つの点では、癌に対してより特異性であり、且つ、多くの腫瘍タイプにおいて、それら腫瘍タイプの野生タイプ同等物よりも高度に発現する転写モジュレーターの腫瘍富化型または腫瘍特異性スプライス変異体の発現プロフィールに対する信頼性によって区別される。即ち、本発明は、従来技術において開示されている診断法よりも感度および正確性の双方において高度な診断法を提供する。
さらに、個々の転写因子の特定のスプライス変異体の発現はある種の癌においては観察されているものの(例えば、Coulson等)、本発明は、転写モジュレーターをコード化する複数の遺伝子が腫瘍特異性/富化型であり各種の癌および腫瘍細胞タイプと関連するスプライス変異体を発現することを立証する。さらに、本発明において開示される方法は、複数のそのようなスプライス変異体に絞り込むことによっても従来技術と区別される。本発明において開示するように、適切な群の複数のそのような転写モジュレータースプライス変異体を使用して、癌タイプを網羅する極めて高精度でもって癌を診断し得る。
【０００５】
（課題を解決するための手段）
従って、本発明においては、癌を診断するための方法および組成物を開示する。さらに、本発明においては、癌サブタイプを診断するための方法および組成物を開示する。さらに、本発明においては、癌患者の予後を判定するための方法および組成物を開示する。さらに、本発明においては、癌の治療のための方法および組成物を開示する。
本発明において提供する診断方法は、転写モジュレーターの複数の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現を判定することを一般に含む。典型的には、少なくとも2種、より好ましくは少なくとも5種、さらにより好ましくは少なくとも10種の、多くの場合少なくとも15種、25種または50種の転写モジュレータースプライス変異体の発現を判定し、一般に約5000種よりも多くない、より好ましくは約1000種または500種よりも少ない、さらにより好ましくは約250種または100種よりも多くないそのようなスプライス変異体を本発明の方法において使用する。
好ましい実施態様においては、複数の転写モジュレーターの各々の少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定する。好ましい実施態様においては、少なくとも2種〜約1000種、より好ましくは少なくとも2種〜約500種、より好ましくは少なくとも2種〜250種、より好ましくは少なくとも2種〜約150種、より好ましくは少なくとも2種〜約100種、より好ましくは少なくとも2種〜約75種、より好ましくは少なくとも2種〜約50種、より好ましくは少なくとも2種〜約25種、より好ましくは少なくとも2種〜約10種の転写モジュレーターの少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定し、これら転写モジュレータースプライス変異体の各々の発現が癌を指標し得る。
もう１つの好ましい実施態様においては、転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定する。好ましい実施態様においては、転写モジュレーターの少なくとも2種〜約10または20種、より好ましくは少なくとも2種〜約5種のスプライス変異体の発現を判定し、これら転写モジュレータースプライス変異体の各々の発現が癌を指標し得る。
複数の転写モジュレータースプライス変異体の発現は、同時にまたは連続して判定し得る。
【０００６】
複数の転写モジュレータースプライス変異体の各々の発現は癌を指標し得るものの、各スプライス変異体は、全ての癌、全ての腫瘍細胞タイプ、または特定タイプの癌(例えば、前立腺癌、小細胞肺癌)を有する全ての患者において必ずしも発現されない。さらに、幾つかの実施態様においては、診断アッセイにおいて発現を判定する上記１群の転写モジュレータースプライス変異体には、発現していないと判定される１種以上(即ち、発現していると判定される複数以外の)もあるであろう。本発明において開示するように、高度に正確な癌診断を提供するのは、全体的発現パターン、即ち、個々のスプライス変異体ではない複数の転写モジュレータースプライス変異体の発現の組合せ判定である。即ち、陰性の発現結果は、本発明において開示する幾つかの診断アッセイにおける個々のスプライス変異体について得られるが、該アッセイ結果も癌を指標し得る(他の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現判定故に)。本発明においてさらに開示しているように、診断アッセイにおける転写モジュレータースプライス変異体発現の不存在は、癌サブタイプの同定において有用である。
複数の転写モジュレータースプライス変異体発現の判定から収集した情報が、本発明において例証しているように、単純に加法的でないことは、当業者にとって明白であろう。むしろ、本発明において開示する腫瘍富化型/特異性スプライス変異体発現の組合せ分析は、多くのそのようなスプライス変異体の発現が関連する癌の分子サブタイプを明らかにする。
即ち、本発明方法は、高度に正確な診断方法についてのニーズを満たし、腫瘍細胞の正確な特性決定および癌サブタイプの同定を提供する。
【０００７】
好ましい実施態様においては、癌サブタイプの診断方法を開示する。該方法は、転写モジュレーターの複数の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現を判定することを一般に含む。好ましい実施態様においては、上記方法は、複数の転写モジュレーターの少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含み、各スプライス変異体の発現の存在または不存在が癌サブタイプを指標し得る。もう１つの好ましい実施態様においては、上記方法は、転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することを含み、各スプライス変異体の発現の存在または不存在が癌サブタイプを指標し得る。好ましい実施態様においては、癌サブタイプは、その転移潜在力によって特性決定する。もう１つの実施態様においては、癌サブタイプは、その難治性挙動、とりわけその治療薬に対する耐性によって特性決定する。もう１つの好ましい実施態様においては、癌サブタイプは、その侵襲活性により特性決定する。
好ましい実施態様においては、上記方法は、転写モジュレータースプライス変異体ではなくて腫瘍細胞サブタイプの有用なマーカーであるさらなるマーカーの発現を判定することをさらに含む。そのようなマーカーの例としては、インテグリン類、レセプターチロシンキナーゼのような細胞外シグナルに対するレセプター類、非レセプターチロシンキナーゼ類、マトリックスメタロプロテイナーゼ類、並びにシグナル形質導入、細胞増殖、細胞運動、細胞粘着または細胞生存に役割を有することが知られている他の分子がある。
もう１つの好ましい実施態様においては、癌の予後の判定方法を開示し、該方法は、本発明において開示するような癌サブタイプを診断することを含む。好ましい実施態様においては、該方法は、当該技術において既知のさらなる予後診断指標の発現を判定することをさらに含む。
【０００８】
スプライス変異体発現の判定はmRNAまたはたんぱく質発現を判定することを含み得、これは、当該技術において既知の多くの方法のいずれかを使用して実施し得る。また、スプライス変異体発現の判定は、そのスプライス変異体を認識する自己抗体の存在を判定することも含み得る。
発現を判定する好ましい方法は、RT-PCRを使用して転写モジュレータースプライス変異体をコード化するmRNAの発現を判定することを含む。発現を判定するもう１つの好ましい方法は、オリゴヌクレオチドプローブを使用して転写モジュレータースプライス変異体をコード化するmRNAの発現を判定することを含む。とりわけ好ましい実施態様においては、上記オリゴヌクレオチドプローブは、アレー内に存在する。発現を判定するもう１つの好ましい方法は、転写モジュレータースプライス変異体を認識する自己抗体を検出し得るペプチドの使用を含む。該ペプチドは、転写モジュレーターの野生タイプイソ型に特異的に結合する自己抗体には特異的に結合しない。とりわけ好ましい実施態様においては、該ペプチドは、アレー内に存在する。
重要なことに、本発明において提供する方法は、転写モジュレーターのスプライス変異体の発現をこれら転写モジュレーターの“野生タイプ”イソ型の発現から識別する。本発明において開示するように、転写モジュレーターの多くの腫瘍特異性/富化型スプライス変異体は、非腫瘍細胞中で発現される野生タイプ同等物を有する。従って、スプライス変異体の野生タイプイソ型発現からの識別は、本発明において開示する診断方法の精度に有意に寄与する。
本発明において開示する方法において使用する好ましい転写モジュレーターは、腫瘍特異性/富化型であるスプライス変異体イソ型を有する転写モジュレーターである。とりわけ好ましい転写モジュレーターとしては、NRSF、MDM2、TSG、RREB、ZNF207、TTF-1、GTFIIIA、HES-6、HRY、Msx2、Neu、NeuroD1、Mash-1、Irx2がある。
【０００９】
転写モジュレーターの好ましいスプライス変異体は、その発現が、癌、とりわけ、肺癌(例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、胃腸癌(例えば、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、および胃腸管の他の領域の癌)、乳癌、前立腺癌、皮膚癌(例えば、基底細胞癌、黒色腫)、肉腫、内分泌腺癌(例えば、カルチノイド、インスリノーマ、甲状腺の癌)、神経癌（neural cancer) (例えば、神経芽細胞腫、グリア芽腫、髄芽腫、網膜芽腫)、膀胱癌、子宮頚癌、腎臓癌および造血器癌(例えば、リンパ腫、白血病)からなる群から選ばれた癌を指標し得るスプライス変異体である。また、発現の存在または不存在が癌サブタイプ、とりわけ、肺癌(例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、胃腸癌(例えば、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、および胃腸管の他の領域の癌)、乳癌、前立腺癌、皮膚癌(例えば、基底細胞癌、黒色腫)、肉腫、内分泌腺癌(例えば、カルチノイド、インスリノーマ、甲状腺の癌)、神経癌(例えば、神経芽細胞腫、グリア芽腫、髄芽腫、網膜芽腫)、膀胱癌、子宮頚癌、腎臓癌および造血器癌(例えば、リンパ腫、白血病)からなる群から選ばれた癌内のサブタイプを指標し得るスプライス変異体も好ましい。
本発明の方法において使用するのにとりわけ好ましい腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体としては、ジーンバンク受託番号AF228045、NM 006878、NM 006879、NM 006880、NM 006880、AY207474、AI924329、NP 002946、AI870134、BAA23529、BAA23529、BC006221、BC006221、NM 003317、NM 003317、U14134、NP 002088、AK075040、BC039152、AF264785、X69295およびD31771において開示されているスプライス変異体がある。また、とりわけ好ましいのは、図４〜７に開示しているNeu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体である。
腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体を認識する自己抗体を検出するのに使用する好ましいペプチドは、転写モジュレーターの相応する野生タイプイソ型に特異的に結合する自己抗体には特異的に結合しないペプチドである。とりわけ好ましいペプチドとしては、RTHSVGYGYHLVIFTRV、QETLDLDAGVSEH、SEQETLDYWKCT、MKEVLDAGVSEHS、ETLVRQESEDYS、KMVSKFLTMAVP、SPGCISPQPA、HMLTHTDSQSDAG、HKKLYTGLPPVPGA、PRFPAISRFMGPAS、APLPTAPGRKRRVLF、APLPSAPRRKRRV、AGGRSSPGRLSRR、HRYKMKRQAKDKA、AHPGHQPGSAGQSPDL、KRSLASHLSGYIP、EKREFGLSSQWIYP、VTPARRRTSLPAPLS、SPVAASVNTTPDK、SPVAATPASVNTTP、KESPAVPPEGASAGおよびKEASPLPAESASAGがある。
また、とりわけ好ましいのは、Neu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体に特異的に結合する自己抗体に特異的に結合する次のそれぞれのペプチドである：GHPQNLKDSELV、MNAEEBSLRNGG、MRCKRRLNSSGFおよびCKRLLFRRMYDR。
【００１０】
もう１つの好ましい実施態様においては、ペプチドアレーを開示し、該アレーは腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体由来の複数のペプチドを含み、これらのペプチドは、腫瘍特異性/富化型である転写モジュレータースプライス変異体に特異的に結合するこれらペプチドの能力によって特性決定する自己抗体に特異的に結合する。さらにまた、上記各ペプチドは、転写モジュレーターの野生タイプイソ型に特異的に結合する自己抗体には結合しない点でスプライス変異体特異性である。そのようなアレーは、癌診断における応用を見出しており、とりわけ、複数の転写モジュレータースプライス変異体の発現を同時に判定するのに使用し得る。好ましい実施態様においては、そのようなペプチドアレーは、本発明において開示するNeu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体に特異的に結合する自己抗体に特異的に結合するペプチドを含む。
もう１つの好ましい実施態様においては、腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体由来の複数のペプチドから本質的になるペプチドアレーを提供し、これらのペプチドは、腫瘍特異性/富化型である転写モジュレータースプライス変異体に特異的に結合するこれらペプチドの能力によって特性決定する自己抗体に特異的に結合する。さらにまた、上記各ペプチドは、転写モジュレーターの野生タイプイソ型に特異的に結合する自己抗体には結合しない点でスプライス変異体特異性である。好ましい実施態様においては、そのようなペプチドアレーは、本発明において開示するNeu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体に特異的に結合する自己抗体に特異的に結合するペプチドを含む。
【００１１】
また、好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドアレーを開示し、該アレーは、腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体をコード化するmRNAのヌクレオチド配列に由来する複数のオリゴヌクレオチドを含み、高緊縮条件(0.2×SSC、65℃)下にそのようなmRNAまたはその補体にハイブリッド化している。そのようなアレーは、癌診断における応用を見出しており、とりわけ、複数の転写モジュレータースプライス変異体の発現を同時に判定するのに使用し得る。好ましい実施態様においては、そのようなアレーは、本発明において開示するNeu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体をコード化するmRNAまたはその補体に対し実質的に相補性であるオリゴヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい実施態様においては、腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体をコード化するmRNAのヌクレオチド配列に由来する複数のそのようなオリゴヌクレオチドから本質的になるオリゴヌクレオチドアレーを提供する。好ましい実施態様においては、そのようなアレーは、本発明において開示するNeu、NeuroD1、Mash-1およびIrx2の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体をコード化するmRNAまたはその補体に対し実質的に相補性であるオリゴヌクレオチドを含む。
【００１２】
また、本発明においては、癌の治療法、および癌の治療において有用な治療薬を開示する。
上記治療方法は、複数の腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体の発現を判定することを一般に含み、上記転写モジュレータースプライス変異体の各々の発現が癌を指標し得、患者に、発現するのを判定する１種以上のそのようなスプライス変異体の活性を抑制し得る生物活性剤を投与することをさらに含む。好ましい実施態様においては、上記方法は、複数の転写モジュレーターの各々の少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含む。もう１つの好ましい実施態様においては、上記方法は、転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することを含む。上述の方法におけるように、腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現は、転写モジュレーターの相応する野生タイプイソ型の発現とは区別される。
好ましい実施態様においては、上記治療方法は、少なくとも2種〜約1000種、より好ましくは少なくとも2種〜約500種、より好ましくは少なくとも2種〜約250種、より好ましくは少なくとも2種〜約150種、より好ましくは少なくとも2種〜約100種、より好ましくは少なくとも2種〜約75種、より好ましくは少なくとも2種〜約50種、より好ましくは少なくとも2種〜約25種、より好ましくは少なくとも2種〜約10種の転写モジュレーターの少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含み、これら転写モジュレータースプライス変異体の各々の発現が癌を指標し得る。
【００１３】
もう１つの好ましい実施態様においては、転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定する。好ましい実施態様においては、転写モジュレーターの少なくとも2種〜約10種、より好ましくは少なくとも2種〜約5種のスプライス変異体の発現を判定し、これら転写モジュレータースプライス変異体の各々の発現が癌を指標し得る。
もう１つの好ましい実施態様においては、上記治療方法は癌サブタイプを診断することをさらに含み、該方法は複数の転写モジュレータースプライス変異体の発現を判定することを一般に含み、各スプライス変異体の発現の存在または不存在が癌サブタイプを指標し得る。好ましい実施態様においては、上記方法は、複数の転写モジュレーターの少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含み、各スプライス変異体の発現の存在または不存在が癌サブタイプを指標し得、患者に、発現するのを判定する１種以上のそのようなスプライス変異体の活性を抑制し得る生物活性剤を投与することをさらに含む。もう１つの好ましい実施態様においては、上記方法は、転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することを含み、各スプライス変異体の発現の存在または不存在が癌サブタイプを指標し得、患者に、発現するのを判定する１種以上のそのようなスプライス変異体の活性を抑制し得る生物活性剤を投与することをさらに含む。好ましい実施態様においては、癌サブタイプは、その転移潜在力によって特性決定する。もう１つの実施態様においては、癌サブタイプは、その難治性挙動、とりわけその治療薬に対する耐性によって特性決定する。もう１つの好ましい実施態様においては、癌サブタイプは、その侵襲活性により特性決定する。好ましい実施態様においては、上記方法は、転写モジュレータースプライス変異体ではなくて腫瘍細胞サブタイプの有用なマーカーであるさらなるマーカーの発現を判定することをさらに含む。そのようなマーカーの例としては、インテグリン類、レセプターチロシンキナーゼのような細胞外シグナルに対するレセプター類、非レセプターチロシンキナーゼ類、マトリックスメタロプロテイナーゼ類、並びにシグナル形質導入、細胞増殖、細胞運動、細胞粘着または細胞生存に役割を有することが知られている他の分子がある。
【００１４】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は癌および癌サブタイプの診断方法を提供し、該方法は、転写モジュレーターの複数の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現を判定することを一般に含む。本発明において開示し例証するように、極めて高精度の診断試験を提供し且つ癌サブタイプの分子同定をもたらすのは、複数の発現または発現パターン全体の組合せ判定である。
転写モジュレータースプライス変異体の“発現の判定”は、ある種の方法で、例えば、そのコード化mRNAの存在または翻訳たんぱく質産生物の存在についてアッセイすることにより、スプライス変異体の発現についてアッセイすることによって実施し得る。また、発現は、スプライス変異体発現の兆候についてアッセイすることによって直接判定し得る。例えば、スプライス変異体には特異的に結合するが野生タイプ転写モジュレーターには結合しない自己抗体についてのアッセイを実施し、その結果を使用してスプライス変異体が発現されたかまたは発現されていないかを推定することができる。
転写モジュレーターのイソ型を称するときの用語“野生タイプ”とは、必ずしも専らではないが非腫瘍細胞内で発現される或いは転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体イソ型に対してスプスされているイソ型を意味する。野生タイプイソ型は、多くの場合、発現的に調節されている。１種以上のイソ型が野生タイプにおけるこれらの基準を満たす場合、殆どの一般的なイソ型は、野生タイプイソ型と称する。
本明細書における用語“実質的に相補性”とは、プローブ配列がそのターゲット配列および/または他のプローブの相応する領域に十分に相補性であって選定された反応条件下においてハイブリッド化している状態を意味する。この相補性は完全である必要はなく、プローブ配列(例えば、検出配列)とその相応するターゲット配列または他のプローブ間のハイブリッド化を干渉するであろう任意の数の塩基対不整合が存在し得る。しかしながら、非相補性の度合が高くてプローブとそのターゲット間のハイブリッド化が少なくとも緊縮条件下においてさえも生じ得ない場合には、そのプローブ配列は、ターゲット配列に対し相補性でないとみなす。
【００１５】
スプライス変異体
遺伝子転写の優性産生物は、一次転写体と称し、mRNAに対するプレカーサーである。多くの一次転写体は、最終のmRNAにおいては官能性でない介入性ヌクレオチド配列を含有する。これらの介入性で非官能性配列はイントロンと称するのに対し、成熟mRNA中に保有される初期転写体の配列はエクソンと称する。従って、イントロンは転写後RNA操作中に切除されなければならない一次転写体の領域であり、エクソンはイントロン切除後に一緒に連結させる領域である。この切除と連結操作をRNAスプライシングと称する。実際のスプライシングは、snRNA類およびsnRNP類のような種々のたんぱく質およびリボヌクレオたんぱく質からなる大きい特定の複合体であるスプライセオソームによって行う。
スプライセオソームは、スプライス部位と称する２つのエクソン-イントロン境界における一次転写体の切断に関与する。一次転写体上のスプライス部位のヌクレオチド塩基は、常に同じである。エクソンの後の最初の２個のヌクレオチド塩基は常にGUであり、イントロンの最後の２個の塩基は常にAGである。２つの部位は異なる配列を有し、従って、２つの部位はイントロンの末端を方向的に定義していることに留意することが重要である。２つの部位は、イントロンに沿って左から右に向けて、即ち、5' (またはドナー)および3' (アクセプター)部位と命名される。
正常遺伝子の大多数は、単一タイプのスプライスされたmRNAを生ずる一次転写体として転写する。これらの場合、一次転写体のスプライシングに変化はなく、各転写体の同じイントロンがスプライシングされる。しかしながら、時には、ある種の遺伝子の一次転写体は交互スプライシングパターンを追従し、その場合、単一遺伝子が１種以上のmRNA配列を生ずる。
【００１６】
本発明の１つの実施態様においては、“スプライス変異体”は、スプライセオソームによって操作されるような同じ遺伝子に由来する種々のmRNA配列に関する。従って、“スプライス変異体”は、単一一次転写体を１以上の方法でスプライシングするあらゆる状態を包含し、従って、内部エクソンを置換、付加または欠落させたスプライシングパターンを含む。また、“スプライス変異体”は、イントロンを置換、付加または欠落させた状態も包含する。
mRNAスプライシングが、正常細胞と比較して、腫瘍細胞において変化を受けることを見出されている。従って、腫瘍細胞中でのスプライス変異体の発現は、正常細胞の発現とある形で異なる。腫瘍細胞のスプライシングにおける変化は、１以上の方法でもたらし得る。例えば、腫瘍は、正常細胞と異なり、スプライシングに必要な産生物(スプライシング因子、snRNAおよびsnRNP類)を発現し得る。スプライシングパターンにおける変化も腫瘍細胞中のある種の遺伝子のドナーおよびアクセプター配列の変異に関し得、それによって種々のスプライシング開始点および末端点を生じ得る。
スプライス変異体産生物(たんぱく質)と該産生物が由来する元の産生物との生理学活性は異なる。例えば、スプライス変異体は、逆の形で機能し得るか或いは全く機能し得ないであろう。さらに、スプライス変異体は、たんぱく質の生物学的活性には直接関係しない種々の性質の変化ももたらし得る。例えば、スプライス変異体は、改変された安定特性(半減期)、クリアランス速度、組織および細胞局在化、発現の一過性パターン、アップまたはダウン調節メカニズム、および作用薬または拮抗薬に対する応答を有し得る。
【００１７】
転写モジュレータースプライス変異体
用語“転写モジュレーター”は、広く解釈すべきであり、好ましい実施態様においては、遺伝子発現の調節において役割を果たす因子に関連する。ある実施態様においては、転写モジュレーターは、遺伝子座の構成的活性化を助長し得る。他の実施態様においては、転写モジュレーターは、転写の開始を助長し得る。さらに他の実施態様においては、転写モジュレーターは、転写体を操作し得る。以下は、転写モジュレーターとみなされる可能性ある因子の包括的な目録である。
転写モジュレーターは、クロマチン構造を変化させて目的のターゲット遺伝子への転写成分の受入れを可能にする因子を包含する。ATP依存性の形でクロマチンを摂動させる１群のプロモーター再構築性因子としては、NURF、CHRAC、ACF、SWI/SNF複合体、およびSWI/SNF関連(RUSH)たんぱく質がある。
もう１つの群の転写調節因子は、TATA結合性たんぱく質(TBP)含有および非含有(イニシエーター)複合体の収集に関与する。一般的な開始因子の例としては、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIFおよびTFIIHがある。これら一般的な開始因子の各々は、RNAポリメラーゼIIと密接に関連して機能すると考えられており、ポリメラーゼのそのプロモーターへの選択的結合において必要である。TATA結合性たんぱく質(TBP)；TBPホモログ類(TRP、TRF2)；これらたんぱく質の相互作用を、コアプロモーター要素TATAボックスまたはイニシエーター配列を認識し、他の転写機構が集合し得る骨格(scaffolding)を供給することによって調整するイニシエーターのようなさらなる因子も転写調節因子とみなされる。
【００１８】
さらに、プロモーター認識因子として、シグナルをエンハンサー結合アクチベーターから基本機構へ形質導入させ得るコアクチベーターとして、さらに、他のたんぱく質の酵素修飾因子としてさえも機能するTBP結合因子(TAF)類も転写モジュレーターである。転写モジュレーターの特定の例としては、TFIIA複合体 (TFIIAa、TFIIAb、TFIIAg)；TFIIB複合体 (TFIIB、RAP74、RAP30)；TAFIIA複合体 (TAFIIAa、TAFIIAb、TAFIIAg)；TAFIIB複合体 (TAFIIB、RAP74、RAP30)；TFIID複合体を形成するTAF類 (TAF1-15)；TAFIIE複合体 (TAFIIEa、TAFIIEb)；TAFIIF複合体 (p62、p52、MAT1、p34、XPD/ERCC2、p44、XPB/ERCC3、Cdk7、CyclinH)；RNAポリメラーゼII複合体 (hRPB1、hRPB2、hRPB3、hRPB4、hRPB5、hRPB6、hRPB7、hRPB8、hRPB9、hRPB10、hRPB11、hRPB12)等がある。
遺伝子特異性調節たんぱく質と真核生物の一般的転写装置間の保存界面として作用するメディエイターも転写モジュレーターであるとみなされる。典型的には、このタイプのメディエイター複合体は、正および負調節情報をエンハンサーおよびオペレーターからプロモーターに組込み、形質導入する。これらのメディエイターは、典型的には、RNAポリメラーゼIIを介して直接機能して、プロモーター依存性転写におけるその活性を調節する。TRAP、DRIP、ARC、CRSP、Med、SMCC、NATとのコアクチベーター複合体を形成するそのようなメディエイターの例としては、TRAP240/DRIP250；TRAP230/DRIP240；DRIP205/ CRSP200/TRIP2/PBP/RB18A/TRAP220；hRGR1/CRSP150/DRIP150/TRAP170；TRAP150；CRSP130/hSur-2/DRIP130；TIG-1；CRSP100/TRAP100/DRIP100；DRIP97；DRIP92/TRAP95；CRSP85；CRSP77/DRIP77/TRAP80；CRSP70/DRIP70；Ring3；hSRB10/hCDK8；DRIP36/hMEDp34；CRSP34；CRSP33/hMED7；hMED6；hSRB11/hCyclin C；hSOH1；hSRB7等がある。この群のさらなるモジュレーターとしては、ANPK、ARIP3、PIAS群 (PIASa、PIASb、PIASg)、ARIP4のようなアンドロゲンレセプター複合体のたんぱく質；N-CoRおよびSMRT群 (NCOR2/SMRT/TRAC1/CTG26/TNRC14/ SMRTE)、REA、MSin3、HDAC群 (HDAC5)のような転写コレプレッサー；およびPC4、MBF1のような他のモジュレーターがある。
【００１９】
もう１つの群の転写モジュレーターは、エンハンサー結合アクチベーターおよび配列特異性または一般的レプレッサーを含む。これらのモジュレーターの例としては、USF；AP4；E-たんぱく質類 (E2A/E12、E47、HEB/ME1、HEB2/ME2/MITF-2A,B,C/SEF-2/TFE/TF4/R8f)；TFE群 (TFE3、TFEB)；Myc、Max、Mad群；WBSCR14等のような非組織特異性bHLH類がある。
この群の転写モジュレーターのもう１つの例は、ニューロゲニン類(ニューロゲニン-1/MATH4c、ニューロゲニン-2/MATH4a、ニューロゲニン-3/MATH4b)；NeuroD (NeuroD-1、NeuroD-2、NeuroD-3(6)/ my051/NEX1/MATH2/Dlx-3、NeuroD-4/ATH-3/ NeuroM)；ATH類 (ATH-1/MATH1、ATH-5/MATH5)；ASH類 (ASH-1/MASH1、ASH-2/MASH2、ASCL-3/逆転型)；NSCL類 (NSCL1/HEN1、NSCL2/HEN2)；HAND類 (Hand1/eHAND/Thing-1、Hand2/dHAND/Thing-2)；メセンセファロン-オルファクトリー神経性bHLH類：COEたんぱく質 (COE1、COE2/Olf-1/EBF-LIKE3、COE3/Olf-1 Homol/Mmot1)等のようなニューロン富化bHLH類である。
この群の転写モジュレーターの他の例としては、OLIGたんぱく質類(Olig1、Olig2/プロテインキナーゼC結合性プロテインRACK17、Olig3)等；Id類 (Id1、Id2、Id3、Id4)、DIP1、HES (HES1、HES2、HES3、HES4、HES5、HES6、HES7、SHARP類 (SHARP1/DEC-2/eip1/Stra13、SHARP2/DEC-1/TR00067497_p)、Hey/HRTたんぱく質 (Hey1/HRT1/HERP-2/ HESR-2、Hey2/HRT2/HERP-1、HRT3)等のようなbHLH群の負調節剤のようなGlia富化bHLH類がある。Lyl群 (Lyl-1, Lyl-2)；RGS群 (RGS1、RGSRGS2/G0S8、RGS3/RGP3)；カプスリン；CENP-B；Mist1；Nhlh1；MOP3；Scleraxis；TCF15；bA305P22.3；Ipf-1/Pdx-1/Idx-1/Stf-1/Iuf-1/Gsf等のようなこのカテゴリーの転写モジュレーターに属する他のbHLH類も存在する。
Wnt経路に属する転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、b-カテニン；GSK3；Grouchoたんぱく質 (Groucho-1、Groucho-2、Groucho-3、Groucho-4)；TCF群 (TCF1A、B、C、D、E、F、G/ LEF-1、TCF3、TCF4)等がある。
【００２０】
Notch経路に属する転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、Delta、SerrateおよびJagged群 (Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2、Serrate2)；Notch群 (Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、TAN-1)；Bearded群 (E(spl)ma、E(spl)m2、E(spl)m4、E(spl)m6)；Fringe群 (Mfng、Rfng、Lfng)；Deltex/dx-1；MAML1；RBP-Jk/CBF1/Su(H)/KBF2；RUNX等がある。
TGFb/BMP経路に属する転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、コルジン(Chordin)；ノギン(Noggin)、ホリスタチン(Follistatin)、SMADたんぱく質 (SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SAMD5、SMAD6、SMAD7、SMAD8、SMAD9、SMAD10)等がある。
ソニック ヘッジホッグ経路に属する転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、SHH；IHH；Su(fu)；GLI群 (GLI/GLI1、Gli2、Gli3)；Zic群 (Zic/Zic1、Zic2、Zic3)等がある。
フォークヘッド/翼型ヘリックス転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、BF-1；BF-2/Freac4；Fkh5/Foxb1/HFH-e5.1/Mf3；Fkh6/Freac7等がある。
HMG転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、Soxたんぱく質 (Sox1、Sox2、Sox3、Sox4、Sox6、Sox10、Sox11、Sox13、Sox14、Sox18、Sox21、Sox22、Sox30)；HMGIX；HMGIC；HMGIY；HMG-17等がある。
【００２１】
ホメオドメイン転写因子経路も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、Evx群 (Evx1, Evx2)；Mox群 (Mox1、Mox2)；NKL群 (NK1、NK3、Nkx3.1、NK4)；Lbx群 (Lbx1、Lbx2)；Tlx群 (Tlx1、Tlx2、Tlx3)；Emx/Ems群 (Emx1、Emx2)；Vax群 (Vax1、Vax2)；Hmx群 (Hmx1、Hmx2、Hmx3)；NK6群 (Nkx6.1)；Msx/Msh群 (Msx-1、Msx-2)；Cdx (Cdx1、Cdx2)；Xlox群 (Lox3)；Gsx群 (ゴーセコイド(Goosecoid)、GSX、GSCL)；En群 (En-1、En-2)；HB9群 (Hb9/HLXB9)；Gbx群 (Gbx1、Gbx2), Dbx群 (Dbx-1、Dbx-2)；Dll群 (Dlx-1、Dlx-2、Dlx-4、Dlx-5、Dlx-7)；イロコイ(Iroquois)群 (Xiro1、Irx2、Irx3、Irx4、Irx5、Irx6)；Nkx (Nkx2.1/TTF-1、Nkx2.2/TTF-2、Nkx2.8、Nkx2.9、Nkx5.1、Nkx5.2)；PBC群 (Pbx1a、Pbx1b、Pbx2、Pbx3)；Prd群 (Otx-1、Otx-2、Phox2a、Phox2B)；Ptx群 (Pitx2、Pitx3/Ptx3)；XANF群 (Hesx1/XANF-1)；BarH群 (BarH、Brx2)；Cut；Gtx等がある。
POUドメイン因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、Brn2/XlPou2；Brn3a、Brn3b；Brn4/POU3F4；Brn5/Pou6F1；N-Oct-3；Oct-1；Oct-2、Oct2.1、Oct2B；Oct4A、Oct4B；Oct-6；Pit-1；TCFbeta1；vHNF-1A、vHNF-1B、vHNF-1C等がある。
ホメオドメインとLIM領域を有する転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、Isl1；Lhx2；Lhx3；Lhx4；Lhx5；Lhx6；Lhx7；Lhx9；LMO群 (LMO1、LMO2、LMO4)等がある。
対のボックス転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、Pax2；Pax3；Pax5；Pax6；Pax7；Pax8等がある。
ジンク フィンガー転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、GATA群 (Gata1、Gata2、Gata3、Gata4/5、Gata6)；MyT群 (MyT1、MyT1l、MyT2、MyT3)；SAL群 (HSal1、Sal2、Sall3)；REST/NRSF/XBR；カタツムリ(Snail)群 (スクラッチ(Scratch)/Scrt)；Zf289；FLJ22251；MOZ; ZFP-38/RU49；Pzf；Mtsh1/teashirt；MTG8/CBF1A-ホモログ；TIS11D/BRF2/ERF2；TTF-I相互作用性ペプチド21；Znf-HX；Zhx1；KOX1/NGO-St-66；ZFP-15/ZN-15；ZnF20；ZFP200；ZNF/282；HUB1；Finb/RREB1；核レセプター類 (リガンド型：ER群；TR群；RAR群、RXR群；PML-RAR群；PML-RXR群；オーハンレセプター類：Not1/Nurr；ROR；COUP-TF群 (COUP-TF1、COUP-TF2))等がある。
【００２２】
RINGフィンガー転写因子も本群の転写モジュレーターである。そのようなたんぱく質の例としては、KIAA0708；Bfp/ZNF179；BRAP2；KIAA0675；LUN; NSPc1；神経型(Neuralized)群 (neu/Neur-1、Neur-2、Neur-3、Neur-4)；RING1A; SSA1/RO52; ZNF173；PIAS群 (PIAS-a、PIAS-b、PIAS-g、PIAS-gホモログ)；パーキン群；ZNF127群等がある。
もう１つの群の転写モジュレーターとしては、損傷DNAの組換えおよび修復並びに減数分裂組換えに関与させるたんぱく質がある。そのようなたんぱく質の例としては、PCNA；RPA (RPA 14 kD、RPA結合性コアクチベーター)；RFC (RFC 140 kD、RFC 40 kD、RFC 38 kD、RFC 37 kD、RFC 36 kD、RFC/アクチベーター相同物RAD17)；RAD 50 (RAD 50、RAD 50末端切取り型、RAD 50-2)；RAD 51 (RAD 51、RAD 51 B、RAD 51 C、RAD 51 C末端切取り型、RAD 51 D、RAD 51 H2、RAD 51 H3、RAD 51相互作用性/PIR 51、XRCC2、XRCC3)；RAD 52 (RAD 52、RAD 52ベータ、RAD 52ガンマ、RAD 52デルタ)；RAD 54 (RAD 54、RAD 54 B、RAD 54、ATRX)；Ku (Ku p70/p80)；NBS1 (ニブリン)；MRE11 (MRE11、MRE11A、MRE11B)；XRCC4等がある。
もう１つの群の転写モジュレーターとしては、RNAポリメラーゼII転写複合体の１部である細胞サイクル進行特化成分に関連するたんぱく質がある。そのようなたんぱく質の例としては、E2F群 (E2F-1、E2F-3、E2F-4、E2F-5)；DP群 (DP-1、DP-2)；p53群 (p53、p63、p73)；mdm2；ATM；RB群 (RB、p107、p130)がある。
転写モジュレーターのさらにもう１つの群としては、RNAポリメラーゼII調節活性の１部でもあるキャッピング、スプライシングおよびポリアデニル化因子に関連するたんぱく質がある。スプライシングに関与する因子としては、Hu群 (HuA、HuB、HuC、HuD)；ムサシ(Musashi)1；Nova群 (Nova1、Nova2)；SRたんぱく質 (B1C8、B4A11、ASF SRp20、SRp30、SRp40、SRp55、SRp75、SRm160、SRm300)；CC1.3/CC1.4；Def-3/RBM6；SIAHBP/ PUF60；Sip1；C1QBP/GC1Q-R/HABP1/P32；スタウフェン(Staufen)；TRIP；Zfr等がある。ポリアデニル化因子としては、CPSF；誘発性ポリ(A)結合性たんぱく質(U33818)等がある。
【００２３】
もう１つの群の転写モジュレーターとしては、たんぱく質キナーゼ類がある。これらのたんぱく質の例としては、AGC群：AGC群I (環状ヌクレオチド調節型たんぱく質キナーゼ(PKAおよびPKg)群)；AGC群II (ジアシルグリセリン活性化型/リン脂質依存性たんぱく質キナーゼC (PKC)群)；AGC群III (PKAおよびPKC (RAC/Alt)たんぱく質キナーゼ群に関連)；AGC群IV (リボソームたんぱく質S6群をリン酸化させるキナーゼ類)；AGC群V (出芽酵母AGC関連たんぱく質キナーゼ群)；AGC群VI (リボソームたんぱく質S6群をリン酸化させるキナーゼ類)；AGC群VII (出芽酵母DB 2/20群)；AGC群VIII (顕花植物PVPk1たんぱく質キナーゼ相同物群)；AGCの他群(他のAGC関連キナーゼ群)；CaMK群：CaMK群I (Ca2+/CaMにより調節されるキナーゼ類および近縁関連物群)；CaMK群II (KIN1/SNF1/Nim1群)；CaMKの他群 (他のCaMK関連キナーゼ群)；CMGC群：CMGC群I (サイクリン依存性キナーゼ(CDK)類および近縁関連物群)；CMGC群II (ERK (MAP)キナーゼ群)；CMGC群III (グリコ−ゲンシンターゼキナーゼ3 (GSK3)群)；CMGC群IV (    カゼインキナーゼII群)；CMGC群V (CIk群)；CMGCの他群；たんぱく質-チロシンキナーゼ(PTK)類：(A) 非膜スパンニング：PTK群I (Src群)；PTK群II (Tec/Akt群)；PTK群III (Csk群)；PTK群IV Fes (Fps)群；PTK群V (Abl群)；PTK群VI (Syk/ZAP70群)；PTK群VIII (Ack群)；PTK群IX (巣粘着キナーゼ(Fak)群)；(B) 膜スパンニング：PTK群X (上皮細胞増殖因子レセプター群)；PTK群XI (Eph/Elk/Eckレセプター群)；PTK群XII (Axl群)；PTK群XIII (Tie/Tek群)；PTK群XIV (血小板由来増殖因子レセプター群)；PTK群XV (線維芽細胞増殖因子レセプター群)；PTK群XVI (インシュリンレセプター群)；PTK群XVII (LTK/ALK群)；PTK群XVIII (Ros/セブンレス(Sevenless)群)；PTK群XIX (Trk/Ror群)；PTK群XX (DDR/TKT群)；PTK群XXI (肝細胞増殖因子レセプター群)；PTK群XXII (ネマトーダKin15/16群)；PTK の他の膜スパンニングキナーゼ類(他のPTKキナーゼ群)；OPK群：OPK群I (Polo群)；OPK群II (MEK/STE7群)；OPK群III (PAK/STE20群)；OPK群IV (MEKK/STE11群)；OPK群V (NimA群)；OPK群VI (wee1/mik1群)；OPK群VII (転写制御に関与するキナーゼ群)；OPK群VIII (Raf群)；OPK群IX (アクチビン/TGFbレセプター群)；OPK群X (顕花植物推定レセプターキナーゼ類および近縁関連物群l)；OPK群XI (PSK/PTK“混合系”ロイシンジッパードメイン群)；OPK群XII (カゼインキナーゼI群)；OPK群XIII (PKN原核生物たんぱく質キナーゼ群)；OPKの他群(他のたんぱく質キナーゼ群)がある。
【００２４】
もう１つの群の転写モジュレーターとしては、サイトカインおよび増殖因子類がある。これらのたんぱく質の例としては、以下がある：骨形成たんぱく質：デカペンタプレジック(Decapentaplegic)たんぱく質(Dpp)、BMP2、BMP4；60A、BMP5、BMP6、BMP7/OP1、BMP8a/OP2 BMP8b/OP3；BMP3 (オステオゲニン)、GDF10；BMP9、BMP10、ドルサリン(Dorsalin)-1；BMP12/GDF7 BMP13/GDF6；GDF5；GDF3/Vgr2；Vg1、ウニビン(Univin)；BMP14、BMP15、GDF1、スクリュー(Screw)、ノーダル(Nodal)、XNrI-3、レーダー(Radar)、Admp；サイトカイン類：繊毛神経栄養因子(CNTF)群；白血病抑制因子；カルヂオトロフィン-1；オンコスタチン-M；インターロイキン-1群；インターロイキン-2群；インターロイキン-3 (IL-3)；インターロイキン-4 (IL-4)；インターロイキン-5 (IL-5)群；インターロイキン-6 (IL-6)群；インターロイキン-7 (IL-7)；インターロイキン-9 (IL-9)；インターロイキン-10 (IL-10)；インターロイキン-11 (IL-11)；インターロイキン-12 (IL-12)；インターロイキン-13 (IL-13)；インターロイキン-15 (IL-15)群；GM-CSF；G-CSF；レプチン；上皮細胞増殖因子；アンフィレグリン(Amphiregulin)；アセチルコリンレセプター誘発活性剤(ARIA)；ヘレグリン(Heregulin) (ニューレグリン(Neuregulin)) (NEU分化因子)；形質転換性増殖因子a (TGF-a)群；ニューレグリン2；ニューレグリン3；ネトリン(Netrin)1および2；線維芽細胞増殖因子(FGF)類：FGF-1 (酸性)；FGF 2 (塩基性)；FGF3/ int-2 (マウス乳腺腫ウィルス組込み部位(v-int-2)腫瘍遺伝子ホモログ)；FGF4/ヒト胃-1/hst/hst-1/ヘパリン結合性分泌性形質転換因子-1 (HSTF1)/カボシ肉腫FGF (ksFGF)/ K-FGF/ KS3由来の形質転換遺伝子；FGF5/線維芽細胞増殖因子関連たんぱく質コード化腫瘍遺伝子；FGF6/線維芽細胞増殖因子関連遺伝子/hst-2；FGF7、角化細胞増殖因子(KGF)；FGF8/アンドロゲン誘発増殖因子(AIGF)；FGF9/グリア活性化因子(GAF)；FGF10/角化細胞増殖因子2、KGF-2；FGF11/線維芽細胞増殖因子相同性因子3 (FHF-3)；FGF12/線維芽細胞増殖因子相同性因子1 (FHF-1)；FGF13/線維芽細胞増殖因子相同性因子2 (FHF-2)；FGF14/線維芽細胞増殖因子相同性因子4 (FHF-4)；FGF15；FGF16；FGF17/ FGF13；FGF18；FGF19；FGF20/ XFGF-20；FGF21；FGF22；FGF23；FGFH/線維芽細胞増殖因子相同物；C05D11.4/想定48.1 KDたんぱく質COD11.4；GDNF：アルテミン(Artemin)；グリアル誘導神経栄養因子(GDNF)；ニュールチュリン(Neurturin)；パーセフィン(Persephin)；ヘパリン結合性増殖因子：プレイオトロフィン(Pleiotrophin) (NEGF1)；ミドキン(Midkine) (NEGF2)；インシュリン様成長因子(IGF)：インシュリン様IGF1およびIGF2；ニューロトロフィン類：神経増殖因子(NGF)；脳由来神経栄養因子(BDNF)；ニューロトロフィン-3 (NT-3)；ニューロトロフィン-4/5 (NT-4/5)；ニューロトロフィン-6 (NT-6)群；チロシンキナーゼレセプターリガンド類：幹細胞因子；アグリン(Agrin)；FLT3L；マクロファージコロニー刺激因子-1 (CSF-1)；血小板由来増殖因子(PDGF)群；その他：ヘッジホッグ群(インディアンヘッジホッグ(Ihh)、デザートヘッジホッグ(Dhh)、ソニックヘッジホッグ(Shh))；Wnt群：WNT1/ INT；WNT2/ IRP、WNT2B/13；WNT3；WNT3A；WNT4；WNT5A、WNT5B；WNT6；WNT7A、WNT7B；WNT8A/ WNT8d、WNT8B；WNT10A、WNT10B；WNT11；WNT14；WNT15；WNT16イソ型；Wntシグナル化の負レギュレーター： Dickkopf (Dkk)群 (Dkk1、Dkk2、Dkk3、Dkk4)；フリスビー(Frisbee)；ケルベロス(Cerberus)；Wnt結合性因子：WIF類。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様においては、上記で列挙した転写モジュレーターの腫瘍特異性スプライス変異体を使用して腫瘍を分子レベルで分類することができる。他の好ましい実施態様においては、これらのスプライス変異体を使用して、診断し、予後診断を行い、治療を特定し、新生物状態を治療することができる。
癌診断のための方法および組成物
本発明においては、癌診断のための方法および組成物を開示する。該方法は、転写モジュレーターの複数の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現を判定することを一般に含む。好ましい実施態様においては、該方法は、複数の転写モジュレーターの少なくとも１種のスプライス変異体の発現を判定することを含み、各スプライス変異体の発現が癌を指標し得る。もう１つの好ましい実施態様においては、該方法は、少なくとも１種の転写モジュレーターの複数のスプライス変異体の発現を判定することを含む。
上記スプライス変異体の各々の発現は癌を指標し得るけれども、各々は、必ずしも、特定の癌の発症毎にまたは癌タイプ毎に発現されない。さらにまた、癌を指標し得る結果を提供する診断アッセイにおいて発現を判定するスプライス変異体の全てが、必ずしも発現されるものではない。むしろ、極めて高精度の本発明診断方法を提供するのは、複数の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の全体的発現パターンの判定である。さらに、これも本発明において例証しているように、１つの癌群のある種のサンプルにおける転写モジュレータースプライス変異体の負の発現結果の判定により、癌サブタイプの分子的同定が得られる。
本発明においては、１群の腫瘍富化型または腫瘍特異性である転写モジュレータースプライス変異体を開示し、その発現を判定し、そのような判定を癌の高度に正確な指標として使用し得る。これらの特定のスプライス変異体は、驚異的な利用性を有するけれども、他の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体も本発明方法における使用を意図する。本明細書において、本発明方法において有用であるそのような転写モジュレータースプライス変異体を同定する方法を例示する実施例を開示する。発現を判定する腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の数を増やすことによって、本発明方法の精度が向上し、重要なことには、癌サブタイプがより明白に定義され、新たなサブタイプが明らかにされることは、熟練者であれば認識し得るであろう。これらの要因のすべてが有効な癌治療にとって有利である。
【００２６】
また、本発明において例証しているように、適切な１群の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の発現の判定は、各種の癌タイプの診断において使用し得る。即ち、本発明は、各種の癌タイプに共通する分子的異常性を明らかにする。
さらに、発現を判定する腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の数を、１回で同時の発現判定または１連の発現判定が大多数の癌タイプおよびサブタイプのすべてを診断するに十分である点までに容易に増やし得ることは、熟練者であれば認識し得るであろう。
従って、本発明方法は、あらゆる起源の新生物または腫瘍の存在を診断するのに有用である。例えば、腫瘍は、肺癌(例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、胃腸癌(例えば、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、および胃腸管の他の領域の癌)、乳癌、前立腺癌、皮膚癌(例えば、基底細胞癌、黒色腫)、肉腫、内分泌腺癌(例えば、カルチノイド、インスリノーマ、甲状腺の癌)、神経癌(例えば、神経芽細胞腫、グリア芽腫、髄芽腫、網膜芽腫)、膀胱癌、子宮頚癌、腎臓癌および造血器癌(例えば、リンパ腫、白血病)に関連し得る。一般的なタイプの腫瘍の診断に加え、上述の新生物および腫瘍の分子的サブタイプを診断することは、本発明の好ましい実施態様である。
腫瘍診断の好ましい実施態様においては、医師は、本発明において提供するプライマーの１種を使用して腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体の発現を検出し得るであろう。もう１つの好ましい実施態様においては、医師は、新生物細胞からの癌を以下の情報源の１つから診断し得るであろう：血液、涙液、精液、唾液、尿、組織、血清、大便、啖、脳脊髄液および細胞溶解物からの上清。しかしながら、腫瘍の診断は、いずれの検体源からも、僅かに１個の腫瘍細胞により実施し得る。
スプライス変異体イソ型発現の判定およびその野生タイプ発現からの識別は、多くの方法によって実施し得る。自己抗体の検出に関しては、選択的スプライシングによって野生タイプイソ型と異なるコード配列を有するスプライス変異体を産生させた場合、該スプライス変異体イソ型に特異的な(即ち、野生タイプイソ型中に存在しない)ペプチドを使用して、患者血清を、該ペプチドを特異的に認識する自己抗体の存在について精査し、そのような抗体の存在が、転写モジュレーターの野生タイプイソ型の存在にかかわりなく、該スプライス変異体の存在を指標し得る。
【００２７】
mRNA検出に関しては、RT-PCR反応を、スプライス変異体mRNAの存在を野生タイプmRNAから識別するように設計し得る。選択的スプライシングにより野生タイプ転写体中に存在するヌクレオチド配列を削除する１つの実施態様においては、スプライス変異体中のスプライス接合部位に隣接したmRNA配列に相補性であるプライマーを使用して、上記接合部位を横切って第１産生物を産生させるPCR産生物を生成させ、同じプライマーが野生タイプ転写体と反応したときに異なるサイズを有する第２産生物を生ずるであろう。PCR産生物は、例えば、サイズによって区別し得、スプライス変異体mRNAの発現は、スプライス変異体由来のPCR産生物の存在から識別し得る。選択的スプライシングにより野生タイプ構築物中には存在しない配列を付加するもう１つの実施態様においては、スプライス変異体中の２つのスプライス接合部(その間に、非野生タイプ配列が存在する)の各々に隣接するmRNA配列に相補性のプライマーを使用して、上記スプライス変異体の各接合部位を横切って第１産生物を産生させるPCR産生物を生成させ、同じプライマーが野生タイプ転写体と反応したときに異なるサイズを有する第２産生物を生ずるであろう。この場合も、PCR産生物を識別して、スプライス変異体mRNAの発現を判定し得る。また、スプライス接合部の１つに隣接するmRNA配列に相補性の第１のプライマーを、スプライス変異体中に存在する非野生タイプ配列のセグメントに相補性の第２プライマーと一緒に使用することもできる。この場合、第２プライマーは野生タイプ構築物にハイブリッド化せず、PCR反応はスプライス変異体の存在下でしか産生物を生成しないであろう。好ましい実施態様においては、目的のスプライス接合部(１つ以上)に隣接するmRNA配列は、約50〜約100個のヌクレオチドのスプライス接合部内に最適に存在し得るが、スプライス接合部(１つ以上)からのそれより長いまたは短い距離も使用し得、そのような距離は他の実施態様によって包含されることは、当業者であれば認識し得るであろう。
PCR法は、当該技術において周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; New York; Eds. Ausubel et al., 1988/April 2003, Chapter 15, The Polymerase Chain Reactionを参照されたい。
【００２８】
さらに、mRNA検出に関しては、スプライス変異体に特異的な(即ち、野生タイプ転写体中には存在しない)配列にハイブリッド化したオリゴヌクレオチドプローブを使用して転写モジュレーターのスプライス変異体の発現を選択的に検出し得る。そのような試みは、選択的スプライシングによって転写モジュレーターの野生タイプイソ型中に存在しない配列挿入物を含有するスプライス変異体を産生させた場合に可能である。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、アレー中での使用に良好に適する。アレーは、複数のそのようなスプライス変異体特異性オリゴヌクレオチドプローブを含有し得、さらに、発現判定が癌診断または予後診断における用途を有するか、或いは適切な薬理遺伝学情報、例えば、患者が特定の薬物を代謝するかどうかを提供するさらなる因子のためのプローブも含有し得る。
核酸アレーの形成および使用は、当該技術において周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; New York; Eds. Ausubel et al., 1988/April 2003, Chapter 22, Nuceic Acid Arraysを参照されたい。
【００２９】
自己抗体検出基体
ELISA法およびアレー系たんぱく質検出法は、当業者にとって周知である。腫瘍富化型または腫瘍特異性転写モジュレータースプライス変異体に対して特異性の自己抗体の検出用ペプチドは、分離サンプル受入れ領域を有する不溶性支持体(例えば、マイクロタイタープレート、アレー等)に拡散しないように結合させ得る。不溶性支持体は、上記の組成物を結合させ得る任意の組成物から製造し得、可溶性物質から容易に分離され、また、スクリーニング方法全体と適合性である。そのような支持体の表面は、固形かまたは多孔質であり、任意の好都合な形状を有し得る。適切な不溶性支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレー、膜およびビーズ類がある。これらは、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン（登録商標）(TeflonTM)等から典型的に製造される。マイクロタイタープレートおよびアレーは、大量のアッセイを少量の試薬およびサンプルを使用して同時に実施し得るので、とりわけ好都合である。ある場合には、磁気ビーズ等を含ませる。特定の組成物の結合方法は、その方法が試薬類および本発明方法全体と適合性があり、組成物の活性を維持し、拡散性でない限り、重要ではない。好ましい結合方法としては、“粘着性”またはイオン性支持体への直接結合法、化学架橋法、表面上でのペプチド合成等がある。ペプチドの結合の後、過剰の未結合物質を洗浄により除去する。その後、サンプル受入れ領域は、ウシ血清ALB(BSA)、カゼインまたは他の無害なたんぱく質もしくは他の成分と一緒にインキュベーションすることによってブロッキングし得る。
【００３０】
癌サブタイプの診断および予後診断のための方法および組成物
開示した腫瘍の診断および分類方法を医師が使用して新生物症状の予後診断を行うことは、本発明のさらなる実施態様である。任意の特定の細胞タイプの発現段階を特異的な１群の活性転写モジュレーターの発現によって特性決定するので、転写モジュレータースプライス変異体の発現をアッセイすることにより、医師が特定の腫瘍の進行を予測しおよび/または継続中の治療処方の経過をモニターすることを可能にする。
診断および予後診断用キット
また、本発明は、本発明の診断および予後診断方法を実施するためのキットにも及ぶ。そのようなキットは、容易に入手し得る物質および試薬から調製し得る。例えば、そのようなキットは、任意の１種以上の次の物質を含み得る：酵素類、反応用チューブ、緩衝液、清浄剤、プライマー類およびプローブ類。これらの検査キットは、腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体の存在を検出するために使用すべき本発明において提供する１種以上のプライマー配列を含有するのが好ましい。好ましい実施態様においては、これらの検査キットは、医師が血液、涙液、精液、唾液、尿、組織、血清、大便、啖、脳脊髄液および細胞溶解物からの上清中の新生物細胞のサンプルを得ることができるようにする。もう１つの好ましい実施態様においては、これらの検査キットは、RNA抽出、RT-PCRおよびゲル電気泳動を実施するのに必要な装置も含む。アッセイを実施するための使用説明書もキット中に含ませ得る。
【００３１】
治療薬および治療方法
また、本発明においては、癌の治療方法およびこれらの方法において有用な生物活性剤も開示する。生物活性剤は、生物学的活性を有する薬剤である。詳細には、生物活性剤は、細胞内または生物体中の１種以上の分子と反応して細胞または生物体内に有効物を産生させ得る化学存在物である。
生物活性剤は、無数の化学分類群に及ぶが、典型的には、有機分子、好ましくは100ダルトン以上で約2,500ダルトン以下、より好ましくは100〜2000、より好ましくは約100〜約1250、より好ましくは約100〜約1000、より好ましくは約100〜約750、より好ましくは約200〜約500ダルトンの分子量を有する小有機化合物である。生物活性剤は、たんぱく質との構造的相互作用、とりわけ水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の官能性化学基を含む。生物活性剤は、多くの場合、１個以上の上記官能基によって置換された環状炭素または複素環構造および/または芳香族またはポリ芳香族構造を含む。また、生物活性剤は、ペプチド類、糖類、脂肪酸、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体類、構造的アナログ類またはこれらの組合せのような生体分子の中から見出されている。好ましい生物活性剤としては、ペプチド類、例えば、ペプチド擬態物がある。ペプチド擬態物は、例えば、WO 98/56401号に記載されているようにして調製し得る。
生物活性剤は、合成または天然化合物のライブラリーのような広範囲の源から得られる。例えば、数多くの手段が、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現のような広範囲の有機化合物および生体分子のランダムおよび直接合成において利用し得る。また、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物のライブラリーは、入手可能であり、或いは容易に調製し得る。さらに、天然のまたは合成的に調製されたライブラリーまたは化合物は、通常の化学的、物理的または生化学的手段により容易に修飾し得る。既知の薬理剤をアセチル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような直接のまたはランダム化学修飾に供して構造的アナログ類を調製することができる。
【００３２】
好ましい実施態様においては、生物活性剤は、有機化学成分または小分子化学組成物であり、広範囲の生物活性剤が文献において入手可能である。
もう1つの好ましい実施態様においては、生物活性剤は核酸である。“核酸”またはオリゴヌクレオチドまたは文法的等価物は、本明細書においては、一緒に共有結合した少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、ホスホジエステル結合を一般に含有するが、ある場合には、本明細書において概略するように、とりわけアンチセンス核酸またはプローブに関しては、例えば、ホスホルアミド(Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993)、およびその引用文献；Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970)；Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977)；Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986)；Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984)；Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988)；およびPauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986))、ホスホロチオエート(Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991)；および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989))、O-メチルホスホロアミジテ結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues:  A Practical Approach, Oxford University Press参照)、並びにペプチド核酸主鎖および結合(Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992)；Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992)；Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996)参照)を含む交互主鎖を有し得る核酸アナログもある(上記文献は、すべて参考として本明細書に合体させる)。他のアナログ核酸としては、ポジティブ主鎖(Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995))；非イオン性主鎖(米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号および第4,469,863号；Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991)；Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988)；Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994)；Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994)；Tetrahedron Lett., 37:743 (1996))、および米国特許第5,235,033号および第5,034,506号、並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されているもののような非リボース主鎖を有する核酸アナログがある。１種以上の炭素環糖類を含有する核酸並びに“封鎖型核酸”も核酸の定義に包含される(Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176参照)。数種の核酸アナログ類は、Rawls, C & E News, June 2, 1997, page 35に記載されている。これらの文献は、すべて本明細書に参考として明確に合体させる。リボースホスフェート主鎖のこれらの修飾を行って、標識のようなさらなる成分の付加を容易にすることができ或いはそのような分子の生理学的環境内での安定性および半減期を増大させ得る。さらに、天然産核酸類およびアナログ類の混合物も調製し得る。また、種々の核酸アナログ類の混合物、および天然産核酸とアナログ類の混合物も調製し得る。核酸は、明示されているように、一本鎖または二本鎖であり得、或いは二本鎖または一本鎖配列双方の部分を含有し得る。核酸は、DNA、ゲノムおよびcDNAの双方、RNAまたはハイブリッドであり得、その場合、核酸は、デオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドの任意の組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン(xathanine)、ハイポキサタニン、イソチトシン、イソグアニン��ような塩基の任意の組合せを含有する。
【００３３】
極めて好ましい生物活性剤の例を以下に説明するが、この説明を、本発明方法において有用な生物活性剤の組合せを限定するものであるとは如何なる形でも解釈してはならない。
(i) siRNA
転写モジュレーターの特異性イソ型、とりわけ転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体の活性の抑制は、短い干渉性RNA(siRNA)を使用して達成し得る。多くのデータは、特異性遺伝子およびイソ型の活性がsiRNAを使用して抑制され得ることを証明している。例えば、Bai et al., Nucleic Acids Res., 31:7264-70, 2003；Wall et al., Lancet., 362:1401-3, 2003；Zhang et al., Cell, 115:177-86, 2003；Quinn et al., Cancer Res., 63:6221-8, 2003を参照されたい。
(ii) アンチセンス
転写モジュレーターの特異性イソ型、とりわけ転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体の活性の抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して達成し得る。多くのデータは、特異性遺伝子およびイソ型の活性がアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して抑制され得ることを証明している。例えば、Manion et al., Cancer Biol Ther., 2:S105-14, 2003；Zhang et al., Proc Natl Acad Sci, 100:11636-41, 2003；Kabos et al., J Biol Chem., 277:8763-6, 2002を参照されたい。
(iii) イントラボディー類
イントラボディー(intrabody)類の使用は、当該技術において公知であり、例えば、Marasco, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 260:247-270, 2001；Wirtz et al., Prot. Sci. 8(11):2245-50 (1999)；Ohage et al. J. Mol. Biol. 291(5):1129-34；およびOhage et al. J. Biol. Chem. 291(5): 1119-28 (1999)を参照されたい。イントラボディー類は、転写モジュレータースプライス変異体の活性をその場で調節するのに使用し得る。
【００３４】
(iv) おとり核酸
転写モジュレーターの特異性イソ型、とりわけ、転写モジュレーターが核酸結合性たんぱく質である場合の転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体の活性の抑制は、スプライス変異体に特異的に結合し且つゲノムDNA中の調節要素のような負ターゲットへの結合を抑制する“おとり”オリゴヌクレオチドを使用して達成し得る。多くのデータは、特異性遺伝子およびイソ型の活性がおとりオリゴヌクレオチドを使用して抑制され得ることを証明している。例えば、Cho et al., Proc Natl Acad Sci, 99:15626-31, 2002；Ahn et al., Biochem Biophys Res Commun., 310:1048-53, 2003；Morishita, Curr Drug Targets, 4:2 p before 599, 2003を参照されたい。
(v) 優性ネガティブイソ型
転写モジュレーターの特異性イソ型、とりわけ転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体の活性の抑制は、転写モジュレーターの優性ネガティブイソ型を使用して達成し得る。転写モジュレーターの構造および転写モジュレーター内の個々のドメインの機能については多くが知られているので、スプライス変異体の機能は予測し得、スプライス変異体活性の抑制に対する優性ネガティブ法の適合性を評価し得る。基本的には、優性ネガティブイソ型は、ターゲットスプライス変異体の少なくとも１つの分子活性を他の活性を維持し且つスプライス変異体を少なくとも１つの点で機能的に不足しているイソ型で有効に置換させながら欠落させるように設計する。例えば、ターゲットスプライス変異体が同定可能なDNA結合性ドメイン、活性化ドメインおよびたんぱく質:たんぱく質相互作用モチーフを有する転写因子である場合、優性ネガティブは、たんぱく質:たんぱく質相互作用モチーフは維持するがDNA結合性ドメインは欠くように操作し得る。上記スプライス変異体に取って替わることにより、その優性ネガティブは、スプライス変異体パートナーとのたんぱく質:たんぱく質相互作用には関与するが、スプライス変異体が正常であるときのようにはDNAを結合できない。そのような優性ネガティブの設計は、bHLH転写因子インヒビターのId群に類似している。
【００３５】
(vi) 擬態性ペプチド
転写モジュレーターの特異性イソ型、とりわけ転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体の活性の抑制は、“擬態性ペプチド”を含有する細胞浸透性ペプチド(CPP)を使用して達成し得る。“擬態性ペプチド”は、転写因子の相互作用ドメインを擬態し、即ち、相互作用ドメインの機能を示し、この点でスプライス変異体と取って替わり得、上記CPPによって細胞中に輸送される。そのようなCPP-擬態性ペプチド接合体は、転写因子の活性を有効に調節することが証明されている。例えば、Krosl et al., Nat Med., 9:1428-32, 2003；Arnt et al., J Biol Chem., 15;277(46):44236-43, 2002；Kanovsky et al., Proc Natl Acad Sci, 98(22):12438-43, 2001を参照されたい。
(vii) 小分子
転写モジュレーターの特異性イソ型、とりわけ転写モジュレーターの腫瘍特異性または腫瘍富化型スプライス変異体の活性の抑制は、小分子を使用して達成し得る。小分子は、転写モジュレータースプライス変異体が有しその転写を調節する能力に寄与するあらゆる活性を干渉し得る。例えば、小分子は、核心に入り込むまたはDNAを結合する、或いはDNA結合性パートナーとヘテロダイマー化する、或いはコレセプター分子と相互作用する、或いは基本転写因子と相互作用する転写モジュレータースプライス変異体の能力を干渉し得る。多くのデータは、特異性遺伝子およびイソ型の活性が小分子を使用して抑制され得ることを証明している。例えば、Berg et al., Proc Natl Acad Sci, 99:3830-5, 2002；Bykov et al., Nat Med., 8:282-8, 2002を参照されたい。
(viii) 遺伝子治療
転写モジュレータースプライス変異体の発現により、腫瘍細胞に、特異な転写活性、とりわけDNA中の応答性要素によって介在される転写活性化活性が与えられる場合、そのような活性を活用して腫瘍細胞内に毒剤を選択的に発現させ得る。詳細には、そのような応答性要素の制御下に毒剤をコード化する遺伝子を含む組換え構築物を操作して細胞中に導入し、そこで、この構築物を上記特異な転写活性を有するそのような腫瘍細胞内で選択的に発現させる。毒剤としては、毒性のたんぱく質、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNA類がある。毒性たんぱく質およびペプチドは、細胞生存に対して有害なものである。
“活性を抑制する”とは、生物活性剤の不存在下で観察される活性レベルからの低下を意味し、検出し得ないレベルまでの活性の低下を含む。
【００３６】
製薬組成物および治療
上記生物活性剤は、単独または組合せて、特定の用途に応じて生体外(in vitro、ex vivo)および生体内(in vivo)で使用し得る。従って、本発明は、製薬上許容し得る担体と薬理学的に有効量の１種以上の上記生物活性剤を含む製薬組成物を投与することを意図する。この製薬組成物は、粉末剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、エアゾール剤、固形剤、ピル剤、錠剤、カプセル剤、ゲル剤、局所クリーム剤、座薬、経皮パッチ剤(例えば、経皮イオントフォレーゼにより)等として調製し得る。
本明細書において使用するとき、“製薬上許容し得る担体”は、製薬組成物の調製において、当業者にとって公知の任意の標準の製薬上許される担体を含む。即ち、製薬上許容し得る塩としてまたは接合体として存在するような生物活性剤それ自体を、或いは、適切な場合には、生物活性ペプチドをコード化する核酸ビヒクルを、製薬上許容し得る希釈剤、例えば、塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、水性エタノール中；または、グルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油類(植物油、動物油、合成油等)、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート80等の溶液中の製剤として、或いは適切な賦形剤中の固形製剤として調製し得る。他のタイプの適切な担体としては、当該技術において周知のように、リポソーム類、微粒子類、ナノ粒子類、ヒドロゲル類がある。
上記製剤は、殺菌剤、安定剤、緩衝液、乳化剤、防腐剤、甘味化剤、潤滑剤等を含み得る。投与が経口経路による場合、上記オリゴペプチドは、適切な腸溶性コーティーングを使用することにより、或いは他の適切な保護手段、例えば、微粒子またはpH感受性ヒドロゲルのようなポリマーマトリックス内での抑留により、分解から保護し得る。
賦形剤および希釈剤を含む適切な担体は、なかんずく、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA (17th ed., 1985)、およびHandbook of Pharmceutical Excipients, 3rd Ed, Washington DC, American Pharmaceutical Association (Kibbe, A.H. ed., 2000)において見出される；これらの文献は、その全体を参考として、本明細書に合体させる。本明細書において説明する製薬組成物は、当業者にとって周知の方法で(例えば、限定するものではないが、例えば、混合、溶解、粒状化、粉末化、乳化、カプセル化、内包化または凍結乾燥法のような当該技術における通常の手段により)調製し得る。
【００３７】
本明細書において説明する治療方法において使用する生物活性剤の濃度は、特定の目的における通常の手順に従い経験的に決定する。一般に、上記生物活性剤を治療目的で生体外または生体内で投与するには、上記生物活性剤は、薬理学的に有効な投与量で投与する。“薬理学的に有効量”または“薬理学的に有効な投与量”とは、所望の生理学的作用を生ずるに十分な量、または、とりわけ障害または疾病症状の治療において、障害または疾病の１以上の症状または発症の軽減または排除を含む所望の結果を達成し得る量である。
宿主に投与する有効投与量は、何を投与するか、予防または治療のような投与目的、宿主状態、投与方法、投与回数、投与間隔等に応じて変動する。有効投与量は、当業者であれば、経験的に決定し得、治療応答の度合において調整し得る。適切な投与量を決定するのに考慮すべき要因としては、限定するものではないが、対象者の大小および体重、対象者の年齢および性別、症状の重篤度、疾病段階、薬剤の伝達方法、薬剤の半減期および薬剤の有効性がある。考慮すべき疾病段階としては、疾病が再発性であるかまたは寛解期にあるかどうか、および疾病の進行度がある。治療上有効量における投与量および投与回数の決定は、当業者であれば精通していることである。
例えば、開始有効投与量は、細胞培養アッセイから最初に推定し得る。腫瘍細胞増殖および/または転写モジュレーターのスプライス変異体の発現を使用して上記生物活性剤の有効性をアッセイし得る。その後、投与量を動物モデルに調合して、細胞増殖アッセイによって決定するようなIC50濃度(アッセイする活性、例えば、細胞増殖の50％低下を達成する生物活性試薬の濃度)を含む循環濃度または組織濃度を発生させる。有用な動物モデルとしては、限定するものではないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、サル、およびチンパンジーがある。
さらに、毒性および治療有効性は、細胞培養アッセイおよび/または実験動物により、典型的にはLD50 (試験集団の50％に対する致死投与量)およびED50 (試験集団の50％における治療有効度)によって決定し得る。毒性と治療有効度の投与量比が治療指数である。好ましいのは、高治療指数を示す個々のまたは組合せた生物活性剤である。
【００３８】
本発明の目的においては、生物活性剤の投与方法は、治療する状態、生物活性剤の剤形、および製薬組成物に応じて選択する。生物活性剤の投与は、限定するものではないが、皮膚、皮下、静脈内、経口、局所、経皮、腹腔内、筋肉内および膀胱腔内のような種々の方法で実施し得る。例えば、微粒子、ミクロスフィアおよびマイクロカプセル製剤は、経口、筋肉内または皮下投与において有用である。リポソーム類およびナノ粒子は、静脈内投与においてさらに適している。製薬組成物の投与は、単一経路によるかまたは同時複数経路による得る。例えば、経口投与は、静脈内または非経口注入と一緒に行い得る。
１つの実施態様においては、投与方法は、粉末剤、錠剤、ピル剤またはカプセル剤の形の経口伝達による。経口投与用の製剤は、１種以上の生物活性剤を適切な賦形剤、例えば、糖類(例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール)、セルロース(例えば、でんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等)、ゼラチン、グリシン、サッカリン、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドンのようなポリマー類等と混合することによって調製し得る。ピル剤、錠剤またはカプセル剤は、胃内では無欠のままであるが腸内では溶解する腸溶性コーティーングを有し得る。種々の腸溶性コーティーングが当該技術において知られており、その多くは商業的に入手可能であり、限定するものではないが、メタクリル酸-メタクリル酸エステルコポリマー、ポリマーセルロースエーテル、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等がある。もう１つの実施態様においては、生物活性剤の経口製剤は、適切な希釈剤中で調製する。適切な希釈剤としては、水、塩水、リン酸緩衝生理食塩水、水性エタノールのような水性希釈剤；糖類(例えば、スクロース、マンニトールまたはソルビトール)の溶液；グリセリン；ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、シクロデキストリンの懸濁液等中の各種液体形(例えば、シロップ、スラリー、懸濁液等)がある。ある実施態様においては、油類、例えば、植物油、ピーナツ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、紅花油、大豆油等；オレアート、トリグリセリド等のような脂肪酸エステル類；オレイン酸コレステロール、リノレン酸コレステロール、ミルスチン酸コレステロール等のようなコレステロール誘導体；リポソーム類等のような親油性溶媒を使用する。
【００３９】
さらにもう１つの実施態様においては、投与は、皮膚、皮下、腹腔内、筋肉内および/または静脈内で実施する。生物活性剤を適切な投与用の水性媒質中に溶解または懸濁させる。さらに、注射用の製薬組成物は、親油性溶媒中で調製し得、これらの溶媒としては、限定するものではないが、上述したような、植物油、オリーブ油、ピーナツ油、ヤシ油、大豆油、紅花油等のような油類；オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル類；オレイン酸コレステロール、リノレン酸コレステロール、ミルスチン酸コレステロール等のようなコレステロール誘導体；リポソーム類がある。生物活性剤は、親油性溶媒中で直接または油/水エマルジョンとして調製し得る(例えば、Liu, F. et al., Pharm. Res. 12: 1060-1064 (1995)；Prankerd, R.J., J. Parent. Sci. Tech. 44: 139-49 (1990)；および米国特許第5,651,991号参照)。
また、伝達方式としては、持続性放出即ち長時間伝達方法があり、これらの方法は、当業者にとって周知である。本明細書において使用するときの“持続性放出”または“長時間放出”とは、上記伝達方式により、薬物治療量の生物活性剤を、1日以上、好ましくは1週間以上、ある場合には30日〜60日、またはそれ以上で投与することを意味する。長時間放出方式は、生分解性ポリマーのような埋め込み可能な固形物またはゲル類(例えば、Brown, D.M. et al., Anticancer Drugs, 7:507-513 (1996)参照)；蠕動ポンプおよびフルオロカーボン推進ポンプのようなポンプ類；浸透圧およびミニ浸透圧ポンプ等を含み得る。
データベースの開発
また、本発明においては、転写モジュレータースプライス変異体発現を癌フェノタイプおよび治療に対する応答と相関させるデータベースの構築も意図する。そのようなデータベースの確立により、癌治療の最適化が得られ、それによって正確な分子的な癌診断/予後診断が転写モジュレータースプライス変異体輪郭描写によって行われ、データベースの参照により、どの治療が患者にとって有益であり得るか、さらには、どの治療が有害な副作用を有しおよび/または患者に対し無効であり得るかが明白になる。
【００４０】
（実施例）
1．診断用に有用な転写モジュレーターの腫瘍特異性/富化型スプライス変異体の同定
種々の癌タイプに由来する遺伝子発現データを保有する多くの公的データベースは、よく知られている。例えば、National Center for Biotechnology InformationのESTデータベースは、示差ディスプレー試験において同定された発現配列タグ(EST)類の記録を収容しており、アップ調節され或いは各種の癌タイプに特異性であるEST類を含んでいる。
そのようなEST配列の同定に基づき、ゲノムデータベース(NCBIにおけるデータベースのような)を参照して相応する遺伝子を同定した。当該技術において保有されている知識を使用し、転写モジュレーターをコード化するマルチエクソン遺伝子であると、従って、癌に対して特異性であること或いは癌中で富化された転写モジュレータースプライス変異体を産生させる可能性を有することを閲覧によって決定した遺伝子を特定した。野生タイプ配列をベースとするmRNAの末端5' (開始点)と末端3' (停止点)の領域に対して特異性の各プライマーを、一次ヒト腫瘍細胞サンプルおよびヒト腫瘍細胞系のような各種の腫瘍細胞タイプから分離したRNAとのRT-PCR反応において使用した。野生タイプ由来産生物と異なるPCR産生物をシークエンシングし、腫瘍細胞中に発現した転写モジュレータースプライス変異体であると判定した。
この方法を使用して、ヒト遺伝子の神経型1(neuralized-1)、Irx-2、Mash-1およびNeuroD1の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体を同定した。これら新規なスプライス変異体核酸のヌクレオチド配列を図４〜７に示す。これらのスプライス変異体発現の判定において有用な各プライマーのヌクレオチド配列も各図面に示している。スプライス変異体のアミノ酸配列も示している。
【００４１】
さらに、以下のペプチド類を使用して、これらの新規なスプライス変異体に特異的に結合する自己抗体の発現を判定することできる。各ペプチドは、上記新規なスプライス変異体に結合(個々に)するが、相応する転写モジュレーターの野生タイプイソ型には結合しない。ペプチドGHPQNLKDSELVは、上記神経型スプライス変異体に特異的に結合し；ペプチドMNAEEBSLRNGGは、NeuroD1スプライス変異体に特異的に結合する。ペプチドMRCKRRLNSSGFは、Mash-1スプライス変異体に特異的に結合する。ペプチドCKRLLFRRMYDRは、Irx2aスプライス変異体に特異的に結合する。
好ましい実施態様においては、図４〜７に示す新規なスプライス変異体の検出において有用なペプチド類を開示する。もう１つの好ましい実施態様においては、上述の各ペプチドを含むペプチドアレーを開示する。もう１つの好ましい実施態様においては、複数のペプチド類を含むペプチドアレーを開示し、これらペプチド自体が上述の各ペプチドを含む。もう１つの好ましい実施態様においては、複数のペプチド類を含むペプチドアレーを開示し、これらペプチド自体が上述の各ペプチドから本質的になる。
個々の実験を実施して、特異的に発現させた、とりわけ腫瘍富化型/特異性である遺伝子を同定することは、熟練者であれば、認識し得るであろう。特異的に発現させた遺伝子の同定方法は、周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; New York; Eds. Ausubel et al., 1988/April 2003, Chapter 25, Discovery of Differentially Expressed Genesを参照されたい。この方法も、本発明に属する。
【００４２】
2．特定の腫瘍の分子的分類
以下の実施例は、特定タイプの腫瘍または新生物の分子的分類を実証する。特定群の腫瘍は、転写モジュレータースプライス変異体の発現パターンに基づき下位群に小分けする。これらの下位群は、診断および予後診断目的に使用し得る。さらに、下記で分類した腫瘍タイプは、新生物症状のための治療を特定し新生物症状を治療するのに使用し得る。
以下の実施例において使用するスプライス変異体の目録は、限定ではない。本発明において開示する方法を使用して、さらなるスプライス変異体を以下で例示するアレーに加えて分類系を拡大させ且つその特異性を増大させ得るであろう。本発明において開示した方法の拡張性にかかわらず、新たな転写モジュレータースプライス変異体の上記系への追加は、本発明の基本原理を変更するものではない。
実施例１：グリア芽腫細胞中での転写モジュレータースプライス変異体の発現
グリア芽腫細胞の生検サンプルを種々の源から取得し、RNAを抽出した。RT-PCRを使用して相応するDNA配列を増幅させて転写モジュレータースプライス変異体を同定した。
第１のストランドcDNAを、種々の細胞系由来の5〜10mgのmRNAをテンプレートとして使用して、逆転写酵素(SuperscriptII、Life Technologies社)により合成した。PCR反応は、製造業者の使用説明書に従い、テンプレートとしての1/10のRT反応およびGC-Rich PCR SystemまたはExpandTM Long Distance PCR Systemキット (Roche社)を含有する25ml容量で実施した。殆どの場合、DNAは、次の条件を使用して増幅させた：94℃(2分間)；94℃(30秒)の35〜40サイクル、56℃(40秒)、72℃(150秒)。プライマーのすべての組合せにおいて、アニーリング温度とサイクル数は、予め最適化させた。全ての増幅PCR産生物を、fmolR DNA Cycle Sequencing System (Promega社)を使用して、シークエンシングして偽陽性物を除外した。その後、増幅RT-PCR産生物を1.0〜1.2％のアガロースゲル上で分解させた。
これらの分析により、以下の遺伝子がグリア芽腫細胞中で腫瘍特異性スプライス変異体を発現させていることが明らかになった：ASH1、NeuroD1、NeuroD3、Oct2、NRSF/REST/XBR、神経型1、およびRAD51B。
【００４３】
各スプライス変異体の発現の基づき、正常細胞と腫瘍細胞間、さらにまた、多形性グリア芽腫(GBM)、未分化星状細胞腫のような種々のグレードの星状細胞腫とグレード2の星状細胞腫間の区別が可能になった。例えば、正常星状細胞がヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子ASH1の単一スプライス変異体を発現させるのに対し、GBMの大部分は1〜3種のスプライス変異体を発現させ、未分化星状細胞腫は正常と１種の変異体形のASH1 mRNAを発現させる(図１)。転写モジュレータースプライス変異体(複数)の発現に基づき、この分析は、サンプルがGBMの少なくとも３種の分子サブタイプを含むことを示した。サブタイプAは、正常ASH1、正常およびNΔ150 NeuroD3並びにNΔNHR1 Neuの発現を有するものとして特性決定し、サブタイプBは、NΔ200 ASH1、正常およびNΔ150 Oct2並びにNΔ60 NeuroD1の発現を有するものとして特性決定し、最後に、サブタイプCは、NΔ150、NΔ250、NΔ350 ASH1、正常Irx2a、Ni50 Rest/NRSF/XBRの発現を有するものとして特性決定した。
上記RNAは、全て、Timmusk et al., Neuron, 10:475-489 (1993)に記載されているようにして分離した。RT-PCR分析は、Palm et al., J. Neurosci., 8:1280-1296 (1998)におけるようにして実施した。(両文献は、その全てを参考として本明細書に合体させる)。下記のプライマーは、転写モジュレータースプライス変異体を分析するのに使用した。
【００４４】
表１：プライマー配列
2006524035.tif 000002
【００４５】
実施例２：非小細胞肺癌(NSCLC)細胞中での転写モジュレータースプライス変異体の発現
NSCLC細胞の細胞系および生検材料を使用してスプライス変異体の発現を判定した。NSCLCの分析は、実施例１に記載したようにして実施した。先ず、RNAを同じ細胞タイプの各種腫瘍源から抽出した。その後、RT-PCRを使用して相応するDNAを増幅させ、続いて、これをゲル電気泳動により操作した。このアッセイの結果を図２に示す。以下の遺伝子が、転写モジュレーターの腫瘍特異性スプライス変異体を発現させていた：NeuroD1、NeuroD3、Irx2、NRSF/REST/XBR、神経型 1、Oct2、およびSMAD-6。
全てのNSCLCサンプルが、NeuroD1およびNRSF/REST/XBR遺伝子の腫瘍特異性スプライス変異体を発現させている。従って、これら２つのマーカーを使用して生物学的試験標本においてNSCLC細胞を同定することができる。転写モジュレータースプライス変異体(複数)の発現に基づき、この分析は、サンプルがNSCLC腫瘍の少なくとも３種の分子下位群を含むことを示していた。サブタイプAは、正常Irx2a、NeuroD3、Oct2およびSmad 6の発現を有するものとして特性決定し、サブタイプBは、正常Irx2aおよびSmad 6、NΔ150 Oct2およびNΔ150 NeuroD3の発現を有するものとして特性決定し、サブタイプCは、正常Irx2a、Oct2、Smad 6およびNΔ150 NeuroD3の発現を有するものとして特性決定し、そして、サブタイプDは、正常Oct2、正常およびNΔ550 Irx2a、NΔ150 NeuroD3、正常およびNΔ650 Smad6の発現を有するものとして特性決定した。
【００４６】
実施例３：神経芽細胞腫細胞中での転写モジュレータースプライス変異体の発現
神経芽細胞腫の分析を実施例１および２におけるようにして実施した。RNAを同じ細胞タイプの各種腫瘍細胞から抽出した。その後、RT-PCRを使用して相応するDNAを増幅させ、続いて、これをゲル電気泳動により操作した。その結果を図３に示す。以下の遺伝子が、転写モジュレーターの腫瘍特異性スプライス変異体を発現させていた：NeuroD1、Ptx3、NRSF/REST/XBR、神経型 1、RAD52、およびRFC140。全ての神経芽細胞腫が、生物学的サンプルから神経芽細胞腫細胞を検出するのに使用し得る腫瘍特異性神経型およびNRSF/REST/XBRスプライス変異体(図３)を発現させていた。
実施例４：複数腫瘍タイプ中での転写モジュレータースプライス変異体の発現
上述したようにして、転写モジュレーター Ash-1、BMP-2、Irx-2a、神経型、NeuroD1、NeuroD3、Oct-2、RAD51B、RAD52、RFC140kD、REST、およびSMAD-6の組合せ由来の多数の腫瘍特異性/富化型スプライス変異体を、神経芽細胞腫、グリオーマ腫および非小細胞肺癌中で発現させる。さらに、多数のこれらスプライス変異体を前立腺癌細胞および乳癌細胞中で観察する。このデータは、転写モジュレーター発現パターンの変化が部分的に多数の異なる癌に共通し得ることを示唆している。本発明において開示したような腫瘍特異性/富化型転写モジュレータースプライス変異体の輪郭描写から収集した癌タイプ間の関連の確立は、治療薬設計の要素に組込むことができ、且つ治療の最適化に使用し得る。
【００４７】
サンプル調製
血液、眼漏、鼻汁、唾液、糞便、CSFおよび組織を、健常および疑わしい対象者から収集する。末梢血単核球(PBMC)を、抗凝血剤(例えば、CPD-A1R、Green Cross社、韓国)で処理した2mlの全血から、フィコール(Ficoll)-ナトリウムジアトリゾエート溶液上での遠心分離により分離する。
眼漏、鼻汁、唾液および糞便は、0.5mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により溶出させる。
痰サンプルは、肺胞肺マクロファージが存在しない場合または肺上皮細胞の濃度を希釈する顕著な炎症成分が存在する場合、評価には不十分であるとみなされる。
尿は、多くの場合、極めて少数の腫瘍細胞しか含有していない。これらの場合、処理前に、3.5mlまでのサンプルを140μlの最終容量に濃縮することを推奨する。濃縮尿サンプルは、12,000rpmで10分間の遠心分離により得られる。もう１つの用途においては、30ｍｌ〜100mlの尿サンプルを、10,000g、4℃、30分で回転させる。
脳脊髄液(CSF)は、0.5mlサンプルで採取し、遠心分離しない材料として処理する。
腫瘍組織は、生検または外科切除により得られる。例えば、切除および生検により得られた組織サンプルを、それぞれ、中性緩衝フォルマリン(NBF)中での潅流または浸漬により固定する。各腫瘍サンプルの１部を液体窒素中で凍結させ、残りの腫瘍組織をNBF中で固定し、パラフィン中に埋め込む；5μm切片を切取り、ヘマトキシリンとエオシンで染色してプレカーサー病変を特定する。切除を受けた患者から得られた肺葉を次のようにしてサンプリングした。腫瘍の周りの正常組織を、腫瘍の周辺に向かう全方法に及んでサンプリングする。およそ8個の別々の組織片をパラフィン中に埋め込み、区分化し、ヘマトキシリンとエオシンで染色してプレカーサー病変を特定する。病変を、世界保健機構基準に基づき分類する。生検からの遂次切片および切除において特定した病変を切断し(5〜10μm)、パラフィンを除去し、トルイジンブルーで染色して解剖を容易にする。ツベルクリンシリンジに取付けた25ゲージ針を使用して解剖用顕微鏡下で病変を取除いた。正常組織によるある種の病変の広範な汚染(例えば、SCC、腺腫、肺胞過形成)或いはある種の病変の小さいサイズ(<0.001 mm3)故に、正常そうに見える細胞を含ませて、十分なサンプルを残存させて後述するようにしてRT-PCRを確実に実施することが不可欠である。以降は、診断分析の目的が、異常スプライス変異体がこれらの病変中に存在するかどうかを判定することであり、それらの量を定量することではないので、正常組織“汚染物”の存在は許容される。病変が純粋で、実質的サイズを有し(>500個の細胞)、容易に解剖される場合には、その病変自体のみを顕微解剖することが可能である。
【００４８】
レーザーキャプチャー顕微解剖および免疫フェノタイピング
特定の細胞タイプのレーザーキャプチャー顕微解剖(LCM)と免疫フェノタイピング(表現パターン検査)を、生検材料からの不均質腫瘍細胞混合物からの単一細胞の分子分析に応用する。LCMプロトコールを以下に要約する：
1．生検材料を0.25％トリプシンで解離させる。分散細胞をコーティーングされていないガラススライドに細胞遠心分離により付着させる。100％エタノール中で5分間固定する。5分間風乾させる。
2．一般的な腫瘍抗原、例えば、CEA、PSAに対して、或いは共通NEマーカー(クロモグラニンA、シナプトフィシン、5-ヒドロキシトリプトファンレセプター、ソマトスタチンレセプター等)に対する抗体を使用して免疫染色する。(免疫染色に対する陰性対照は、一次抗体を正常血清で置換えることからなり、スライドの染色は生じない)。細胞をヘマトキシリンで明るく対抗染色する。無RNアーゼ(RNA分解酵素)水中3％グリセリン中に20分間放置する。
3．95％および100％エタノールで脱水する。キシレン中で10分間インキュベートする。
4．室温で風乾させる。LCMを、例えば、60mWのレーザー力および30mm直径のレーザービームを使用して実施する。
塩基性免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析
塩基性免疫蛍光染色とフローサイトメトリー分析プロトコールは、単一細胞レベルでの表面分子の分析に使用できる。最適濃度の蛍光色素接合一次抗体を実験的に測定しなければならない。染色の特異性を確認するためには、特異的に接合させた一次抗体を過剰量の未標識抗体でブロックするのが一般的である。また、組換えペプチドもブロッキングに使用し得る。
【００４９】
目的のターゲット細胞の調製
腫瘍組織を採集し、この組織を、10mlの染色用緩衝液(PBS、ウシ胎仔血清、およびアジ化ナトリウム)を使用し、シリンジのプランジャーで押圧することによってまたは２枚の急冷顕微鏡スライド間ですりつぶすことによって細片化する。
50mlの円錐管に移し、大きい凝集塊と破片を底に沈降させ或いは懸濁液をナイロンメッシュ(Falconカタログ番号2350)に通して単一細胞懸濁液を得る。
細胞懸濁液を4℃で4〜5分間(300〜400×g)遠心分離し、上清を廃棄する。
サンプルを50mlの染色用緩衝液中に再懸濁させ、細胞計数を行う。
細胞を再び回転させ、上清を廃棄し、細胞を染色用緩衝液中に2×107/mlで再懸濁させる。
細胞表面抗原を表面染色プロトコールに従い染色する。表面マーカーの選択は、腫瘍サンプルによる。
前以って測定した濃度の一次抗体を50μlの染色用緩衝液中に希釈し、各試験管またはマイクロタイタープレートのウェルに分配する。50μlの染色用緩衝液を染色しない即ち陰性対照試験管に分配する。
50μlの細胞懸濁液(106細胞に等しい)を各試験管またはウェルに添加し、穏やかに混合する。
氷浴上または冷蔵庫内で少なくとも20分間暗中でインキュベートする。抗体類とのインキュベーションの正確な条件を予備試験において決定する。
インキュベーション期間後、染色用緩衝液を添加する(試験管においては2ml、マイクロタイタープレートにおいては200μl)。
細胞を4℃で5分間(300〜400×g)遠心分離する。上清を吸引する。
合計3回の洗浄を2回繰り返す。
蛍光色素接合抗体を直接使用する場合には、染色細胞ペレットを500μの染色用緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメーター上に通す。
精製またはビオチン接合抗体を使用する場合には、各サンプルに対して50〜100μlの染色用緩衝液中で適切な第２工程(蛍光色素接合-第2抗体またはアビチン)を追加する。氷浴上または冷蔵庫内で15〜30分間暗中でインキュベートする。上記のようにして2回洗浄する。染色細胞ペレットを500μlの染色用緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメーター上に通す。
生存および死亡細胞の識別のためには、生死判定染料で染色する。
【００５０】
免疫キャプチャー法
コーティーング溶液中に希釈した100μlのキャプチャー抗体を適切なウェルに加える。抗原または抗体をコーティーング溶液中で希釈してそれらをマイクロプレートに固定させる。一般的に使用するコーティーング溶液は、50 mM炭酸ナトリウム、pH 9.6；20 mM Tris-HCl、pH 8.5；または10 mM PBS、pH 7.2である。1〜10μg/mlのたんぱく質濃度で通常十分である。
1時間室温でインキュベートする。
プレートを空にし、残留液を除去する。
300μlのブロッキング溶液を各ウェルに加える。一般的に使用するブロッキング剤は、BSA、脱脂乾燥ミルク、カゼイン、ゼラチン等である。異なるアッセイ系は、異なるブロッキング剤を必要とし得る。
5分間インキュベートし、プレートを空にし、残留液を除去する。
100μlの希釈抗原を各ウェルに加える。一次抗体は、1×ブロッキング溶液中で希釈して非特異結合の阻止を助長すべきである。0.1〜1.0μg/mlの濃度で通常十分である。
室温で1時間〜1夜インキュベートする。
プレートを空にし、残留液を除去する。
各ウェルを洗浄液で満たす。典型的には、Tween 20のような清浄剤(0.02％〜0.05%容量/容量)を含む0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水またはTris緩衝食塩水(pH 7.4)。
プレートを逆さにして空にし、残留液を除去する。
3〜5回繰り返す。
捕捉細胞を直ちにRNA抽出に供する。
【００５１】
RNA抽出
RNA抽出。好ましい実施態様においては、RNAを、試験および対照サンプルから、Timmusk et al., Neuron, 10: 475-489 (1993)に記載されているようにして抽出する。要するに、RNAを血液、大便、痰、尿のような固形または液体マトリックスから分離するためには、サンプルを、例えば、液体サンプルの100μl当り、5mlのグアニジニウム溶解緩衝液(4 M グアニジニウムイソチオシアネート、25 mM 酢酸ナトリウムpH 6.0および1 mM EDTA pH 8.0；0.1% DEPC-H2O；20% (w/v) N-ラウリルサルコシン 10 M；β-メルカプトエタノール；100 mM DTT；RNasin RNアーゼインヒビター (Promega社))中で均質化する。RNAを繰返しのピペット操作によって可溶化する。細胞溶解物を新しいチューブに移し、等割合(液体サンプルの100μl当り500μlの水飽和酸フェノール-クロロホルム)を細胞溶解物に加える。全RNAをさらなるエタノール沈降によって抽出する。ある用途においては、液体マトリックス(唾液)を、さらなる処理前に、先ず加熱処理する(60℃、15分)。これは、mRNA安定性に影響を与え得る或いはPCR手順を干渉し得る酵素(唾液性)を変性させることを目的とする。
【００５２】
遺伝子特異性RT-PCR
RT-PCRを使用するcDNA増幅は、Palm et al., J.  Neurosci., 8: 1280-1296 (1998)に記載されているようにして実施する。どのPCR反応にもおけるようにして、３複製サンプルを試験してPCR結果の正当性を確保する。諸成分およびサイクル操作は、個々のテンプレートおよびプライマーに依存する。
1．RNAペレットに、10μlのDEPC-H2Oと1μlのRNアーゼインヒビター (20 U/μlの(Perkin Elmer))を添加する。
2．RNAペレットを穏やかなタッピングにより再懸濁させる。
3．急速回転させる。
4．5μlを(+)および(-)RT反応のために2本の滅菌チューブに等分する。
5．サンプルの各バッチに対して、上記5μlサンプルRNAの代りに高品質RNAまたはDEPC-dH2O、のいずれかを使用し、以下のようにして、追加の対照チューブを調製する：
2006524035.tif 000003
6．十分容量の以下の+/-RTマスター反応混合物を全ての反応チューブ用に調製する：
2006524035.tif 000004
【００５３】
7．4.5μlまたは5.0μlのいずれかの上記関連マスター混合物を(+)および(-) RTチューブに等分する。
8．65℃で5分間、次いで25℃で10分間インキュベートする。
9．0.5μlのSuperscript II (SSII) 逆転写酵素 (Life Technologies社)を全ての(+) RTチューブのみに添加する。
10．全てのチューブを25℃で10分間、次いで37℃で40分間インキュベートする。
11．95℃で5分間インキュベートして上記SSIIを変性させる。
12．急速回転させる。
13．3μlの各cDNAサンプルを滅菌PCRチューブ中に等分する。
14．十分容量のPCRマスター反応混合物を全ての反応チューブ用に調製し、7μlを各チューブに加える。
PCRマスター反応混合物
1.0μlのPCR Buffer GC-Rich PCR SystemまたはExpandTM Long Distance PCR Systemキット(Roche社)
0.8μlのdNTP 250 μM (Roche社)
0.2μlのフォワード(Forward)プライマー
0.2μlのリバース(Reverse)プライマー
(必要な場合の、0.2μlのdCTP a-33P (またはa-32P))
0.2μlのポリメラーゼ、n U/μl、GC-Rich PCR SystemまたはExpandTM Long Distance PCR Systemキット(Roche社)、製造業者の使用説明書に従う
4.6 (4.4)μlのDEPC-dH2O
総容量 = 7μl
【００５４】
15．PCRサイクル操作条件：
好ましいPCRサイクル操作条件は、一般に、92℃での35サイクル、56℃での1分間のアニーリング、および72℃で1分間の合成である。特定の例は、以下のとおりである。
サイクル数          温度(℃)          時間
１                  94              2分
35〜45              94              30秒
X*                40秒
68または72    150秒
1                  68または72       10分
56は、使用するプライマーに依存するアニーリング温度である。
16．PCR産生物を4℃で保存するか、または工程5を続ける。
17．1〜2％アガロース6％ポリアクリルアミドシークエンシングゲル(PAGE)を、PCRをサイクルさせながら注入する。
18．サイクル操作を終えた後、2.5μlのサンプル緩衝液(5×)を各サンプルに添加する。
19．各サンプルを95℃で3分間変性させ、氷上に直接置く。
20．3.5μlのサンプルをゲル上に載せ、サンプルを所望の距離走らせる。
21．産生物を臭化エチジウム処理アガロースゲル上、或いはPAGEを使用する場合、乾燥ゲル上で可視化し、ホスホロイメージャースクリーンまたはフィルムに暴露させる。
必要に応じて、その後、分離した細胞集団からのRNAを、以下のような１連の確立されたマーカー遺伝子に対し特異性のプライマー類との逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって、純度についてさらに特性決定する：ビメンチン(間質細胞)、サイトケラチン 19 (腺上皮細胞)およびCD45 (炎症細胞/リンパ球)等。さらに、細胞のNE起源に対しより特異性のマーカー(クロモグラニンA、シナプトフィシン、5-ヒドロキシトリプトファンレセプター、ソマトスタチンレセプター等)も混入し得る。
【００５５】
実施例５：小細胞肺癌中の選択性スプライス変異体の分析
小細胞肺癌細胞中で発現させた調節遺伝子の選択性スプライス変異体を同定し、RT-PCR法を使用して、一次小細胞肺癌腫瘍の生検、リンパ節転移細胞および循環性腫瘍細胞におけるこれらスプライス変異体の発現を分析している。また、小細胞肺癌患者血清中の自己抗体の存在も分析した。RT-PCR分析においては、選択性スプライス連結部から50〜100bp 5'および3'に位置するプライマーを使用した。自己抗体を検出するためには、選択性スプライシングによって産生させた特異的なイソ型に相応する合成ペプチドを使用した。以下のマーカーを本試験において使用した(表２)。
表２
小細胞肺癌生検、血液サンプルおよび血清中のmRNA発現および自己抗体の存在を分析
するために使用した調節因子の選択性スプライス変異体および相応するペプチド配列
2006524035.tif 000005
【００５６】
RT-PCR分析
一次腫瘍細胞、リンパ節転移細胞および循環性癌細胞中での調節因子の選択性スプライス変異体の発現を、RT-PCR分析を使用して比較した(表３)
【表１】
2006524035.tif 000006
RT-PCR分析の結果は、一次腫瘍、リンパ節および血液細胞が同様なパターンの選択性スプライス変異体を発現しているのに対し、対照(健常)患者の肺、リンパ節および血液はこれらの選択性スプライス変異体を検出可能なレベルでは発現していないことを示している。また、これらのデータは、個々の患者が選択性スプライス変異体の種々の組合せを発現していることも示している。癌、リンパ節および血液における選択性スプライス変異体の発現の相違は、これらのスプライス変異体を使用して小細胞肺癌を検出し、診断し得ることを示唆している。
【００５７】
実施例６：選択性スプライシングにより産生させた調節因子のイソ型に対する自己抗体の分析
調節因子の選択性スプライス変異体に相応する抗原性ペプチドを合成し、これらのペプチドを使用して小細胞肺癌患者血液中の自己抗体の存在を分析した。結果は、小細胞肺癌患者が、特異的なエピトープを担持する調節因子イソ型に対する自己抗体を有することを明らかに実証している(表４)。
表４
ペプチドアレーを使用しての小細胞肺癌患者における自己抗体の分析
2006524035.tif 000007
SCLC 1：患者1〜５、SCLC 2：患者6〜10、SCLC 3：患者11〜1５、SCLC 4：患者16〜20、SCLC 5：患者21〜2５。
対照1〜5：無作為サンプル、プールした5名の患者。
0：検出し得ず、1：希釈1/10〜1/500、2：希釈1/1000〜1/10,000、3：希釈1/100,000〜1/1,000,000。
【００５８】
SCLC試験
転写因子の選択性スプライス変異体の分析は、一次腫瘍、リンパ節転移および循環性癌の各細胞が同様なスプライス変異体を発現していることを明らかに実証している。小細胞肺癌(SCLC)細胞中の多数の発現転写因子から、腫瘍細胞中で発現されたスプライス変異体の組合せを同定したのに対し、正常肺組織中の発現は検出され得ていない(表１参照)。
これら全ての選択性スプライス変異体が改変されたアミノ酸配列を有するたんぱく質をコード化するので、イソ型特異性配列に相応するペプチドを合成し、これらのペプチドを使用して、これらペプチドエピトープに対する自己抗体の存在を試験した。
イソ型特異性ペプチドに対する自己抗体を使用するSCLC検出のための最も情報の多いマーカーは、下記である：
マーカー ペプチド
NRSF                        RTHSVGYGYHLVIFTRV
MDM2A                       QETLDLDAGVSEH
MDM2C2                      ETLVRQESEDYS
TSG101                      KMVSKFLTMAVP
PREB1(2)                    HMLTHTDSQSDAG
ZNF207                      HKKLYTGLPPVPGA
TTF1(1)                     PRFPAISRFMGPAS
TTF1(3)                     APLPSAPRRKRRV
GTFIIA1                     KRSLASHLSGYIP
HES6                        VTPARRRTSLPAPLS
HRY (1)                     SPVAASVNTTPDK
MSX2(1)                     KESPAVPPEGASAG
【００５９】
SCLC一次腫瘍、リンパ節および循環性癌の各細胞中の転写因子の選択性スプライス変異体を分析するのに使用したプライマー類：
2006524035.tif 000008
【００６０】
実施例７：癌の早期検出における選択性スプライス変異体の輪郭描写
以下で説明する実施例は、癌に対する高リスク集団、とりわけヘビースモーカーに関する。しかしながら、本発明方法は、あらゆる高リスク群、例えば、癌の家族歴を有する群においても使用し得る。ヒトであれば、行動および/または遺伝子および/または環境要因がそれら自体癌に対する高リスクであることを示唆しているので、高リスク群に属する。
選択性スプライスmRNAによってコード化されたたんぱく質イソ型に対する自己抗体の存在についてのヘビースモーカーの分析
本試験の全体的目的は、高リスク群患者血液中の転写モジュレーターの選択性スプライス変異体に対する自己抗体の存在を分析し、１群の自己抗体の同定をベースとする肺癌の早期検出法を確証することである。血液は、1200名の高リスク群個々人から、さらに100名の肺癌患者(陽性対照)から集めた。転写モジュレーターの120種のスプライス変異体に対する自己抗体の存在を、アレー法を使用して同時に分析する。正常個々人と高リスク群個々人間の自己抗体プロフィールの相違を観察する。肺癌患者のそれと同様な自己抗体像が、有意数の患者において観察され、これら高リスク群個々人における肺癌の存在を示唆している。
当該試験の実験設計およびプロトコール
(i) 試験における個々人の選定
２群の個々人
(I) 高リスク群、ヘビースモーカー
本試験において選定される個々人は、下記の基準に相応しなければならない。
1．長期喫煙者：20〜25年、1日20本以上のシガレット
2．年齢：50歳以上
3．肺または他のいずれの腫瘍も診断されてないこと。
(II) 肺癌確定診断患者
【００６１】
血液の収集および血清の調製
5mlの血液を、各個々人から、静脈穿刺によりEDTAチューブ中に採取し、血漿を調製するのに使用する。血漿は、採血後直ぐに調製する。5mlの血液を170×gで5分間遠心分離し、その後、血漿を取出す。
血漿を等分し、-20℃で保存する。
自己抗体プロフィールの分析
分析方法：免疫原性ペプチドによるアレー分析
1) ペプチド：H2O中1mg/ml
ペプチドアレーを、ニトロセルロース被覆顕微鏡ガラス(Schleicher@Schuell)上にプリントする。
プリンティング後、アレーを風乾させる。
+4℃のブロッキング溶液中で１夜ブロッキングする。
ブロッキング溶液：PBS；0.1％ Tween 20；1％カゼイン；1％ヤギ血清；5mM EDTA。
2) アレーを試験血清と一緒にインキュベートし、1：50希釈する。希釈は、ブロッキング溶液中に行う。
3) PBS、0.1％ Tween 20で4回洗浄する。
4) 二次抗体：ペルオキシダーゼ(または、アルカリ性ホスファターゼまたは蛍光ラベル)に接合させたヤギ抗ヒトIgのブロッキング溶液中希釈物 (1：1000、Dako社)と一緒にインキュベートする。
5) PBS、0.1％ Tween 20で4回洗浄する。
6) ペルオキシダーゼに対する呈色反応
基質：
原溶液：ジアミノベンジジン(DAB、Sigma D-5637)、5mlのメタノール中10mg
5mlのメタノール中クロロナフトール 30mg
作用溶液、新鮮調製する：0.5 ml of DAB原溶液 + 0.5 mlのクロロナフトール原溶液 + 4 mlのPBS + 5μlのH2O2。
7) マイクロアレーのデンシトメトリー走査。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】星状細胞腫内でのAsh-1のスプライス変異体の発現を示す。RT-PCRを、神経幹細胞(NSC)、星状細胞、および星状細胞腫(A1、GBM1、GBM2、GBM3、GBM4、GBM5)由来のcDNAを使用して実施した。正常転写体と異常転写体の比較を右側に示す。略号：norm = 正常神経組織中でのAsh-1転写体；ND150、ND200、ND250、ND350 = 脳新生物中でのAsh-1スプライス変異体；これら下方転写体の分析においては、それぞれ、ATGと停止コドン間でおよそ150、200、250および350 bpの欠落が明らかになった。
【図２】肺癌中の各種発現レギュレーターのスプライス変異体の発現を示す。RT-PCRを、肺組織(対照)および肺新生物(LC1、LC2、LC3、LC4、LC5)に由来するcDNAを使用して実施した。正常Irx2a、NeuroD1、NeuroD3、Oct-2、Rest/NRSF/XBR、SMAD-6転写体とこれらそれぞれの異常転写体との比較を右側に示す。略号：norm = 正常組織中のIrx2a、NeuroD1、NeuroD3、Oct-2、Rest/NRSF/XBR、SMAD-6転写体；ND60、ND150、ND550、ND650 = それぞれ、肺新生物中のNeuroD1、NeuroD3、Oct-2、Irx2aおよびSMAD-6のスプライス変異体；これら下方転写体の分析においては、それぞれ、ATGと停止コドン間でおよそ60、150、550および650 bpの欠落が明らかになった；Ni50 = エクソン5と6の間に位置する50 bp挿入を有するRest/NRSF/XBRスプライス変異体。
【図３】神経芽細胞腫中の各種発現レギュレーターのスプライス変異体の発現を示す。RT-PCRを、神経幹細胞(NSCs)、成人海馬組織(HC ad)および神経芽細胞腫(NB1、NB2、NB3、NB4)に由来するcDNAを使用して実施した。正常Bmp-2、NeuおよびRest/NRSF/XBR転写体とこれらそれぞれの異常転写体との比較を右側に示す。略号：norm = 正常神経組織中のBmp-2、NeuおよびRest/NRSF/XBR転写体；ND200、ND400 = 神経芽細胞腫中のBmp-2のスプライス変異体；これら下方転写体の分析においては、ATGと停止コドン間でおよそ200および400 bpの欠落が明らかになった；NDNHR1 = NHR1ドメインをコード化する領域を欠落したNeuスプライス変異体；Ni50 = エクソン5と6の間に位置する50 bp挿入を有するRest/NRSF/XBRスプライス変異体。
【図４】ヒト神経型1遺伝子の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体のヌクレオチド配列を示す。また、該スプライス変異体の発現を判定するのに使用し得るプライマーも示す。また、該スプライス変異体のアミノ酸配列も示す。
【図５】ヒトNeuroD1遺伝子の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体のヌクレオチド配列を示す。また、該スプライス変異体の発現を判定するのに使用し得るプライマーも示す。また、該スプライス変異体のアミノ酸配列も示す。
【図６】ヒトIrx-2遺伝子の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体のヌクレオチド配列を示す。また、該スプライス変異体の発現を判定するのに使用し得るプライマーも示す。
【図７】ヒトMash-1遺伝子の新規な腫瘍特異性/富化型スプライス変異体のヌクレオチド配列を示す。また、該スプライス変異体の発現を判定するのに使用し得るプライマーも示す。また、該スプライス変異体のアミノ酸配列も示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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