(57)【要約】均一なヒドロゲル粒子を製造するための装置、システム、および方法を開示する。本発明のシステムは、供給ステーション、計量デバイス、新規なヒドロゲル粒子形成装置、および急冷ステーションを収容する。
2006512084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）壁とキャビティとを有するハウジングと、
（ｂ）ヒドロゲル形成懸濁液をハウジングキャビティ内に導入するための、ハウジングの壁の少なくとも１つの入口と、
（ｃ）ヒドロゲル形成懸濁液をハウジングキャビティから押出すことができる１つまたは複数の押出穴を備えた面を有する押出ダイと、
（ｄ）少なくとも１つの切断ブレードを含んでなる切断アセンブリであって、切断ブレードが、各押出穴を横切って移動するとき、ヒドロゲル粒子形成懸濁液が押出穴を出るときにヒドロゲル粒子形成懸濁液を個別のヒドロゲル粒子に切断し、切断ブレードが、押出ダイの面と密に近接し、直線状に、回転するように、または往復するように移動する、切断アセンブリと、
（ｅ）場合により、ハウジングキャビティ内に収容されたドライブシャフトと、
（ｆ）場合により、ドライブシャフトを支持する、ハウジングキャビティ内の１つまたは複数のベアリングと、
（ｇ）場合により、ドライブシャフトと接触する１つまたは複数のシールと、
（ｈ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を混合するための、ハウジングキャビティ内の混合デバイスと、
（ｉ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を分配するための、ハウジングキャビティの１つまたは複数の半径方向のスロットと、
（ｊ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を押出ダイに移動させるための、ハウジングキャビティ内の内部ポンプと
を含んでなるヒドロゲル粒子形成装置。
【請求項２】
（ａ）ヒドロゲル形成懸濁液を収容するための、少なくとも１つの供給ステーションと、
（ｂ）請求項１に記載のヒドロゲル粒子形成装置と、
（ｃ）供給ステーションからヒドロゲル形成懸濁液を受け、それをヒドロゲル粒子形成装置に送出するための、供給ステーションおよびヒドロゲル粒子形成装置に連結された移送ラインを有する計量デバイスと、
（ｄ）急冷流体を収容する急冷ステーションと
を含んでなるヒドロゲル粒子形成システムであって、
ヒドロゲル粒子形成装置が急冷流体中に少なくとも部分的に沈められ、ヒドロゲル形成懸濁液がヒドロゲル粒子形成装置から急冷流体中に押出されて、ヒドロゲル粒子を形成する、ヒドロゲル粒子形成システム。
【請求項３】
計量デバイスが容積計量ポンプである請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
切断アセンブリが、回転可能に取付けられ、かつ、切断アセンブリが急冷流体中で回転するとき急冷流体を混合するための複数の混合ブレードをさらに含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
成分を、ヒドロゲル粒子形成装置に導入される前に混合するための少なくとも１つの混合デバイスをさらに含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
混合デバイスが供給ステーションに配置される請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
混合デバイスが計量デバイスの移送ラインに配置される請求項５に記載のシステム。
【請求項８】
急冷ステーションが、ヒドロゲル粒子を収集するための傾斜表面と、急冷流体が急冷ステーションを出るとき急冷流体を収集するための少なくとも１つの付加的な収集溜めとをさらに含んでなり、ヒドロゲル粒子が傾斜表面上に収集された後、急冷流体が付加的な収集溜めから急冷ステーション内に再循環されて戻される請求項２に記載のシステム。
【請求項９】
急冷流体または添加剤または両方を収容するための少なくとも１つの付加的な供給ステーションと、付加的な供給ステーションから急冷流体または添加剤を受け、それをヒドロゲル粒子形成装置に送出するための、付加的な供給ステーションおよびヒドロゲル粒子形成装置に連結された移送ラインを有する計量デバイスとをさらに含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項１０】
ドライブシャフトがハウジングキャビティに回転可能に取付けられる請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
ドライブシャフトがハウジングキャビティに回転可能に取付けられる請求項２に記載のシステム。
【請求項１２】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスがドライブシャフトによって駆動される請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスがドライブシャフトによって駆動される請求項２に記載のシステム。
【請求項１４】
押出ダイが中央開口部を収容し、ドライブシャフトが押出ダイの中央開口部を通って延在し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在するときドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
押出ダイが中央開口部を収容し、ドライブシャフトが押出ダイの中央開口部を通って延在し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在するときドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項２に記載のシステム。
【請求項１６】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスが、回転可能に取付けられたドライブシャフトによって駆動され、押出ダイが、ドライブシャフトが延在する中央開口部を収容し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在する場合にドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスが、回転可能に取付けられたドライブシャフトによって駆動され、押出ダイが、ドライブシャフトが延在する中央開口部を収容し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在する場合にドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項２に記載のシステム。
【請求項１８】
押出穴が押出ダイの面上に均一に隔置される請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
押出穴が押出ダイの面上に均一に隔置される請求項２に記載のシステム。
【請求項２０】
切断アセンブリが回転可能に取付けられるとき、押出穴が円形アレイに配列される請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
押出穴が略円形断面を有する請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
押出ダイの面が、ヒドロゲル形成懸濁液との高い接触角を有する材料で処理されるか構成され、材料が、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
押出ダイの面が、ヒドロゲル形成懸濁液との高い接触角を有する材料で処理されるか構成され、材料が、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される請求項２に記載のシステム。
【請求項２４】
押出ダイが、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される絶縁性材料から構成される請求項１に記載の装置。
【請求項２５】
押出ダイが、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される絶縁性材料から構成される請求項２に記載のシステム。
【請求項２６】
切断アセンブリが、傾斜タービンおよび平坦タービンから選択される請求項１に記載の装置。
【請求項２７】
切断アセンブリが、傾斜タービンおよび平坦タービンから選択される請求項２に記載のシステム。
【請求項２８】
ハウジングキャビティ内の内部ポンプが、遠心ポンプ、スクリューポンプ、または容積式ポンプである請求項１に記載の装置。
【請求項２９】
ハウジングキャビティ内の内部ポンプが、遠心ポンプ、スクリューポンプ、または容積式ポンプである請求項２に記載のシステム。
【請求項３０】
混合デバイスが、機械的ミキサおよび静的ミキサよりなる群から選択される請求項１に記載の装置。
【請求項３１】
混合デバイスが、機械的ミキサよりなる群から選択される請求項１６に記載のシステム。
【請求項３２】
装置が加熱デバイスによって加熱される請求項１に記載の装置。
【請求項３３】
供給タンク、装置、計量デバイス、急冷ステーション、またはシステムの少なくとも１つが、独立して、少なくとも１つの加熱デバイスによって加熱される請求項２に記載のシステム。
【請求項３４】
加熱デバイスが、サーマルマスヒータ、トレースシステム、ジャケット付システム、および循環する熱い気体または液体を備えたエンクロージャから選択される請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
加熱デバイスが、サーマルマスヒータ、トレースシステム、ジャケット付システム、および循環する熱い気体または液体を備えたエンクロージャから選択される請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
ヒドロゲル形成懸濁液が、ヒドロゲル溶液と、生体触媒とを含んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項３７】
ヒドロゲル形成懸濁液が、ヒドロゲル溶液と、生体触媒とを含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項３８】
生体触媒が、全細胞懸濁液、細菌細胞、菌・カビ類、藻類、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、オルガネラ、精製または部分精製酵素製剤、および適切な緩衝液溶液中の多酵素複合体よりなる群から選択される請求項３６に記載の装置。
【請求項３９】
生体触媒が、全細胞懸濁液、細菌細胞、菌・カビ類、藻類、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、オルガネラ、精製または部分精製酵素製剤、および適切な緩衝液溶液中の多酵素複合体よりなる群から選択される請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
ヒドロゲル粒子を製造するための方法であって、
（ａ）ヒドロゲル形成懸濁液を収容する供給ステーションを提供し、
（ｂ）供給ステーションに連結された移送ラインを有し、かつ供給ステーションから請求項１に記載のヒドロゲル粒子形成装置内へのヒドロゲル材料を受ける計量デバイスによって、ヒドロゲル形成懸濁液を計量供給し、装置が急冷流体中に少なくとも部分的に沈められ、
（ｃ）ヒドロゲル形成懸濁液をヒドロゲル粒子形成装置を通して急冷流体中に押出し、そして
（ｄ）押出されたヒドロゲル形成懸濁液をヒドロゲル粒子形成装置によって個別のヒドロゲル粒子に切断する
順次工程を含んでなる方法。
【請求項４１】
ヒドロゲル形成懸濁液が、ヒドロゲル溶液と、生体触媒とを含んでなる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
生体触媒が、全細胞懸濁液、細菌細胞、菌・カビ類、藻類、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、オルガネラ、精製または部分精製酵素製剤、および適切な緩衝液溶液中の多酵素複合体よりなる群から選択される請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子中のヒドロゲルの体積を制御することによって均一な質量のヒドロゲル粒子形成を可能にする粒子形成装置、システム、および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲル粒子は、一般に、クロマトグラフィプロセスのための、および発酵または触媒用途のための微生物細胞を固定化するための担体材料として使用される。ヒドロゲル粒子は、また、一般にヒドロゲル「ビーズ」と呼ばれる。
【０００３】
微生物細胞、すなわちバイオマスの１タイプを、ヒドロゲル中に固定化することは、微生物細胞酵素安定性を向上させ、バイオマスの再使用を可能にし、有効反応器容積を増加させ、連続プロセス操作、および／またはバイオマス−液体分離の単純化を可能にするという利点がある。バイオマスを固定化することは、清澄にされたブロスが連続的にまたは半連続的に除去されるときにバイオマスが反応器内で維持される連続発酵に特に有用である。それは、反応物および生成物が周囲の液体中にある間、酵素または微生物細胞がヒドロゲル中に維持される酵素反応にも有用である。
【０００４】
製造プロトコルを簡単にし、かつ産業用途のための費用効果を向上させるために、均一なサイズおよび形状のヒドロゲル粒子またはビーズが望ましい。
【０００５】
従来のヒドロゲル粒子形成技術は、ヒドロゲル溶液の溶液流れ特徴を用いて、小滴を生成する。さらに、従来の技術は、ヒドロゲル／バイオマス混合物の溶液流れ特徴を用いて、小さい穴、液体流れ、またはスピニングディスクから小滴を生成する。これらの方法における小滴形成は、粘度および表面張力などの溶液特徴によって影響される。ヒドロゲルの質および細胞懸濁液のバッチのばらつきは、小滴形態のばらつきをもたらし、不均一な粒子の製造をもたらす。当業者は、適度に均一な粒子を製造するために、これらの材料のばらつきを補償するように、処理条件および／または溶液組成物を注意深く調整しなければならない。調整がなければ、粒子は、別個の均一な球状小滴としてではなく、テールスレッド、広いサイズ分布、またはマルチビーズストリングで形成される。
【０００６】
上で言及された粒子形成技術に加えて、生細胞を多孔性材料内に物理的に閉じ込めるためのさまざまな方法が知られている。
【０００７】
非特許文献１は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）および塩化リチウム（ＬｉＣｌ）中のセルロース溶液をメタノールまたはイソプロパノールに滴状に加えることによるビーズ形態のヒドロゲルの調製を開示している。生体触媒およびヒドロゲル溶液混合物流れに与えられる粘度、表面張力、および剪断力を含む、効率的な小滴形成に重要なパラメータが説明されている。
【０００８】
非特許文献２は、細胞固定化のためのアルギン酸カルシウムの単分散ビーズの使用を開示している。この方法は、その生成物が細胞の形状およびサイズに強く依存する層流ジェット崩壊技術に基いている。
【０００９】
非特許文献３は、廃水からウランを除去するために、緑膿菌ＣＳＵ−凍結乾燥バイオマス粉末の固定化マトリックスとして、アルギン酸塩、ポリアクリルアミド、ポリスルホン、およびポリウレタンを含むさまざまな材料を選別した。それらのプロセスは、油カラムの上に回転ノズルを使用することによって、向上した小滴生成効率で緑膿菌ＣＳＵ−ポリウレタンヒドロゲル粒子を製造することを伴う。このプロセスは、不活性希釈および／または粘度低減試薬としてのアセトンの使用を必要とする。
【００１０】
非特許文献４は、合成での使用のための生体触媒を固定化することを説明している。著者らは、室温および１つのニードル操作のみでのアルギン酸塩操作を示している。
【００１１】
非特許文献５では、球状ビーズを製造するためのカプセル化／固定化技術としてのジェット切断方法を開発した。ビーズの体積は、切断工具が支持されていない流体を打つので溶液特性によって影響される。
【００１２】
非特許文献６は、細胞固定化のための小さい単分散アルギン酸塩ビーズを製造するためのドロップ形成技術を説明している。それらは、従来のドリップ方法、気体剪断、およびキャピラリジェット崩壊技術での振動を用い、すべての方法は、ヒドロゲル／生体触媒特性によって影響される。
【００１３】
特許文献１（カーラート（Ｋａｈｌｅｒｔ）ら）は、ヒドロゲル／バイオマス混合物特性によって影響される剪断ドロップ形成方法を用いて生体触媒ビーズを製造するための装置を記載している。
【００１４】
特許文献２は、粒子の単離のための傾斜表面を有する連続ヒドロゲル急冷システムであって、油／水粒子形成技術を用いることによって急冷流体が再循環される連続ヒドロゲル急冷システムを記載している。形成された粒子の分離、および急冷流体を再循環させてシステム内に戻すことのその説明について、この引例を引用によりここに援用する。
【特許文献１】米国特許第４，６３９，４２３号明細書
【特許文献２】ドイツ特許ＤＤ  ２５３  ２４４  Ａ１号明細書
【非特許文献１】オリベイラ（Ｏｌｉｖｅｉｒａ）ら（ジャーナル・オブ・アプライド・ポリマー・サイエンス（Ｊ．  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、６０：６３−７３（１９９６））
【非特許文献２】ブランデンベルガー（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ）ら（バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  ）１５：３６６−３７２（１９９９））
【非特許文献３】フー（Ｈｕ）ら（バイオテクノロジー・プログレス１３：６０−７０（１９９７））
【非特許文献４】トランパー（Ｔｒａｍｐｅｒ）ら（オランダ、ワーヘニンゲンの農業大学の食品科学学部（Ｊ．  Ｄｅｐ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｕｎｉｖ．，  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，  Ｎｅｔｈ．）トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）３（２）：４５−５０（１９８５））
【非特許文献５】プルベ（Ｐｒｕｂｅ）ら（バイオテクノロジー・テクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１２  ２：１０５−１０８（１９９８））
【非特許文献６】サイフェルト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら（バイオテクノロジー・プログレス１３：５６２−５６８（１９９７））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記ビーズ製造技術はすべて、ビーズサイズを規定するためにヒドロゲル／生体触媒混合物の特性に依存する。さらに、技術の多くは、実験室規模でのみ示され、より大規模の製造に容易にスケールアップされない。
【００１６】
ヒドロゲル／バイオマス混合物の特性と無関係であるように粒度が制御されるビーズ形成技術がないと考えられる。
【００１７】
ヒドロゲル／生体触媒混合物特性と無関係である、均質で、均一なサイズおよび形状の粒子を製造するためのシステムが必要である。さらに、ヒドロゲル特性のバッチのばらつきと無関係であり、かつ、任意の粘度または表面張力で、微生物細胞懸濁液、抽出物、または酵素などの任意の生体触媒に適用して、別個の均質な粒子を形成することができるシステムが必要である。さらに、高生産率（ｗｔ．ビーズ／オリフィス／単位時間）で均一な物理特性を有するヒドロゲル粒子の製造を可能にするプロセスおよび装置が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、
（ａ）ハウジング壁［３］と少なくとも第１のハウジングキャビティ［５］とを有するハウジング［２］と、
（ｂ）ヒドロゲル形成懸濁液をハウジングキャビティ［５］内に導入するための、ハウジング壁［３］の少なくとも１つの入口［４］と、
（ｃ）ヒドロゲル形成懸濁液がハウジングキャビティ［５］から押出される１つまたは複数の押出穴［７］を備えた面［１０］を有する押出ダイ［６］と、
（ｄ）少なくとも１つの切断ブレード［９］を含んでなる切断アセンブリ［８］であって、切断ブレード［９］が、各押出穴［７］を横切って移動するとき、ヒドロゲル粒子形成懸濁液が押出穴［７］を出るときにヒドロゲル粒子形成懸濁液を個別のヒドロゲル粒子に切断し、切断ブレード［９］が、押出ダイの面［１０］と密に近接し、直線状に、回転するように、または往復するように移動する、切断アセンブリ［８］と、
（ｅ）場合により、ハウジングキャビティ［５］内に収容されたドライブシャフト［３１］と、
（ｆ）場合により、ドライブシャフト［３１］を支持する、ハウジングキャビティ［５］内の１つまたは複数のベアリング［３２］と、
（ｇ）場合により、ドライブシャフト［３１］と接触する１つまたは複数のシール［３３］と、
（ｈ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を混合するための、ハウジングキャビティ［５］内の混合デバイス［３４］と、
（ｉ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を分配するための、ハウジングキャビティ［５］の１つまたは複数の半径方向のスロット［３５］と、
（ｊ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を押出ダイ［６］に移動させるための、ハウジングキャビティ［５］内の内部ポンプ［３９］とを含んでなる向上したヒドロゲル粒子形成装置［１］に関する。
【００１９】
本発明は、また、
（ａ）ヒドロゲル形成懸濁液を収容するための、少なくとも１つの供給ステーション［２１］と、
（ｂ）上述されたようなヒドロゲル粒子形成装置［１］と、
（ｃ）供給ステーション［２１］からヒドロゲル形成懸濁液を受け、それをヒドロゲル粒子形成装置［１］に送出するための、供給ステーション［２１］およびヒドロゲル粒子形成装置［１］に連結された移送ライン［３７］を有する計量デバイス［２２］と、
（ｄ）急冷流体を収容する急冷ステーション［２３］とを含んでなるヒドロゲル粒子形成システム［２０］であって、ヒドロゲル粒子形成装置［１］が急冷流体中に少なくとも部分的に沈められ、ヒドロゲル形成懸濁液がヒドロゲル粒子形成装置から急冷流体中に押出されて、ヒドロゲル粒子を形成する、ヒドロゲル粒子形成システム［２０］に関する。
【００２０】
ヒドロゲル粒子を製造するための方法であって、
（ａ）ヒドロゲル形成懸濁液を収容する少なくとも第１の供給ステーション［２１］を提供し、
（ｂ）供給ステーション［２１］に連結された移送ライン［３７］を有し、かつ供給ステーションから上述されたようなヒドロゲル粒子形成装置［１］内へのヒドロゲル材料を受ける計量デバイス［２２］によって、ヒドロゲル形成懸濁液を計量供給し、装置が［１］急冷流体中に少なくとも部分的に沈められ、
（ｃ）ヒドロゲル形成懸濁液をヒドロゲル粒子形成装置［１］を通して急冷流体中に押出し、そして
（ｄ）ブレード［９］が押出穴［７］を横切って移動するとき、押出されたヒドロゲル形成懸濁液がヒドロゲル粒子形成装置の押出穴［７］を出るときに、押出されたヒドロゲル形成懸濁液を切断アセンブリ［８］のブレード［９］で個別のヒドロゲル粒子に切断する順次工程を含んでなる方法も請求される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、クロマトグラフィ、発酵、または生体触媒用途のための均一で均質なヒドロゲル粒子を製造するための新規な装置、システム、および方法を提供する。
【００２２】
本発明のヒドロゲル粒子形成装置［１］は、１）１つまたは複数の入口［４］を備えたハウジング壁［３］とハウジングキャビティ［５］とを有するハウジング［２］と、２）１つまたは複数の押出穴［７］を収容する押出ダイ［６］と、３）１つまたは複数の切断ブレード［９］を有する切断アセンブリ［８］とを含む。
【００２３】
本発明は、また、１）ヒドロゲル形成懸濁液を供給するための供給ステーション［２１］と、２）計量デバイス［２２］と、３）本発明のヒドロゲル粒子形成装置［１］と、４）急冷流体を収容する急冷ステーション［２３］と含んでなり、粒子形成装置［１］の押出ダイ部分が、常に、急冷流体より下に少なくとも部分的に沈められる装置である、向上したヒドロゲル粒子形成システム［２０］を提供する。
【００２４】
本発明は、ヒドロゲル形成懸濁液の押しのけ容積によって、および粒子中のヒドロゲルの体積を制御することによって、均一な粒子を生成する。本発明は、ヒドロゲル粒度を規定するためにヒドロゲル／生体触媒混合物の特性に依存しない。代わりに、ここで形成されるヒドロゲル粒子の粒度は、ある押しのけ容積の押出されたヒドロゲル形成懸濁液を限られたジオメトリに切断することによって定められる。結果として、この方法は、原料バッチのばらつきの影響をより受けにくい。さらに、本発明のシステムは、産業プロセスのための触媒ヒドロゲル粒子のより費用効果的な製造を可能にする。さらに、本発明の新規な装置、システム、および方法は、高生産率（ｗｔ．ビーズ／オリフィス／単位時間）で、均一な物理特性を有するヒドロゲル粒子の製造を可能にする。
【００２５】
ここで製造される粒子のサイズおよび形状は、体積流量および切断速度によって規定され、ヒドロゲル／生体触媒混合物特性と無関係である。次に、結果として生じる固定化生体触媒粒子をさまざまなプロセスで使用して、特定の望ましい最終製品を製造してもよい。
【００２６】
当業者は、均一なヒドロゲル粒子、および微生物細胞、浸透性微生物細胞、酵素などの固定化に依存するいかなるプロセス、反応または一連の反応も、本発明のシステムを使用することから利益を得てもよいことを認めるであろう。
【００２７】
したがって、本発明は、特定の細胞懸濁液もしくは発酵バッチ、または特定の粘度を有する細胞懸濁液に限定されないが、ヒドロゲル粒子中に閉じ込められたときに向上した値を有してもよいいかなる生体触媒にも適用してもよい。本発明の１つの特に有用な用途は、酵素触媒の製造である。
【００２８】
本発明において、ダイを出るヒドロゲル形成懸濁液は、熱可塑性ポリマーと比較して非常に低い粘度を有する。熱可塑性ポリエステルの水中ペレット化に精通した熟練工は、そのような低粘度流体のペレット化に精通していないであろう。熱可塑性ポリマー処理に必要な高剪断乱流急冷流体戦略は、ヒドロゲル粒子形成に適用することができない。高剪断急冷流体混合と関連する粒子崩壊問題に対処するために、本発明は、水中粒子形成方法を用いて、ヒドロゲル／生体触媒系の急冷速度と一致する剪断速度におけるヒドロゲルポリマーの急冷、および結果として生じるゲルの機械的強度を達成して、均一で均質な粒子を製造する。
【００２９】
この開示において、いくつかの用語および略記が使用される。次の定義は、本発明の範囲および実施を理解するために提供される。
【００３０】
ここで使用されるような「ヒドロゲル粒子形成装置」という用語は、ハウジング［２］と、押出ダイ［６］と、切断アセンブリ［８］とを含んでなる本発明の装置を指す。
【００３１】
ここで使用されるような「ヒドロゲル粒子形成システム」という用語は、供給タンク［２１］と、計量デバイス［２２］と、ヒドロゲル粒子形成装置［１］と、急冷ステーション［２３］とを含んでなる装置を指す。
【００３２】
「遊離細胞」という用語は、固定化されていない細胞を指す。
【００３３】
「生体触媒」という用語は、全細胞懸濁液、細菌細胞、菌・カビ類、藻類、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、オルガネラ、または精製もしくは部分精製酵素製剤、または適切な緩衝液溶液中の多酵素複合体を指す。生体触媒は、生存可能なまたは生存不能な細胞を含有してもよい。細胞は、成長細胞または静止細胞であってもよい。「生体触媒」および「バイオマス」という用語は、交換可能に使用される。
【００３４】
「生体触媒ビーズ」という用語は、酵素が、１つの酵素、酵素の組合せとして、または生存可能な微生物細胞として、反応を触媒するのに利用可能であるように、生体触媒（または生体触媒の成分）を含有するヒドロゲル粒子を指す。
【００３５】
「ヒドロゲル溶液」という用語は、急冷操作の結果としてゲルを形成するポリマー溶液またはポリマーもしくはポリマー形成モノマーの混合物を指す。本発明に有用なヒドロゲル溶液としては、粘性高分子電解質溶液（たとえば、カラギナン、アルギン酸塩、硫酸セルロース、ペクチネート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、フルセララン（ｆｕｒｃｅｌｌａｒａｎｅ）、キトサン）、ゲル化可能なポリマー溶液（たとえば、アガロース、寒天、ゼラチン、カードラン）、および非水性ポリマー溶液（たとえば、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「ヒドロゲル粒子」という用語は、ヒドロゲル溶液を急冷操作にかけたときに生じる粒子を指す。「ヒドロゲル粒子」、「粒子」、および「ビーズ」という用語は、交換可能に使用される。
【００３７】
「ヒドロゲル形成懸濁液」という用語は、ヒドロゲル溶液と、場合により生体触媒との混合物を指す。ヒドロゲル形成懸濁液は、ヒドロゲル溶液および生体触媒に加えられるように急冷流体または他の添加剤をさらに含んでなることができる。
【００３８】
「感温性ヒドロゲル」という用語は、温度変化によってゲルを形成し、かつ溶液粘度が急に増加する適度のゲル点を有するヒドロゲル溶液を指す。カラギナンが、そのような感温性ヒドロゲルの例である。
【００３９】
「急冷操作」という用語は、ヒドロゲル溶液のゲル化を開始する方法を指す。急冷操作としては、温度の急冷、適切なカチオンの存在、ゲル化もしくは重合のための開始剤の存在、または溶解度の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「急冷流体」という用語は、ヒドロゲル溶液のゲル化を開始する液体を指す。急冷流体は、適切な温度において流体であり、および／または、ヒドロゲル溶液が、急冷流体に曝されるとゲル化されるように、適切なカチオンもしくは他の化合物を含有する。適切な急冷流体を選択するために、関心のある特定のヒドロゲル溶液、およびゲル化の機構を考慮する必要がある。特定のポリマー溶液のための特定の急冷流体が周知であり、「酵素および細胞の固定化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ）」、ゴードン・エフ・ビッカースタッフ（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）（編）、「固定化生体触媒：概論（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ：  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、ヴィンフリート・ハルトマイヤー（Ｗｉｎｆｒｉｅｄ  Ｈａｒｔｍｅｉｅｒ）、または「固定化細胞：技術および応用（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、インディアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２９（２）：８３−１１７（１９８９年６月）に例示されている。
【００４１】
「急冷化合物」という用語は、ヒドロゲル溶液と相互作用してヒドロゲル構造を作る、急冷流体中に存在するイオン化合物または共有結合性化合物を指す。
【００４２】
「粒子形成領域」という用語は、押出ダイ［１０］の面に近接し、切断ブレード［９］の移動によって押し流される急冷流体の体積を指す。急冷流体のこの領域は、ヒドロゲル溶液が押出ダイ［６］を出て、別個の粒子に切断されるところに配置される。
【００４３】
「容積計量デバイス」という用語は、流体の体積流れを所望の速度で制御してもよいような、容積式ポンプ、またはポンプもしくは他の圧力源と流量計（例、質量、体積、または速度）および流れ調節デバイス（すなわち、制御バルブ）との組合せを指す。
【００４４】
「切断アセンブリ」という用語は、直線状、回転、または往復（前後の運動を意味する）であることができる推進システムと、切断ブレード［９］と、ブレードを、押出穴［７］に近接して、押出ダイ［１０］の面と直接接触してまたは押出ダイ［１０］の面に非常に近くに保つために必要なハードウェアとの組合せを指す。
【００４５】
「バッフル」という用語は、たとえば切断ブレードなどの、流体を通って移動する物体を指す「撹拌機」と比較して、たとえばコンテナ壁などの、流体中で静止したままである物体を指す。
【００４６】
「混合デバイス」という用語は、流体中の混合の質を向上させる、静的または機械的撹拌デバイスを指す。
【００４７】
「均質な粒子」という用語は、粒子の質量または体積の粒子間の一致の均一性を指す。
【００４８】
「ヒドロキシアパタイト」という用語は、（Ｃａ５（ＯＨ）（ＰＯ４）３）の式を有する水酸化リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を指す。
【００４９】
ここで図１を参照すると、本発明のヒドロゲル粒子形成装置［１］の一実施形態の長手方向の断面図が示されている。この装置は、ヒドロゲル形成懸濁液、急冷流体、または他の添加剤の１つもしくはそれ以上の流れが装置に入る１つもしくはそれ以上の入口または供給口［４］を有するハウジング壁［３］によって囲まれたハウジングキャビティ［５］を収容するハウジング［２］を含んでなる。装置［１］は、１つまたは複数の押出穴［７］を備えた面［１０］を有する押出ダイ［６］を収容する。装置は、ヒドロゲル形成懸濁液が押出穴［７］を出るときヒドロゲル形成懸濁液を個別の粒子に切断するための切断アセンブリ［８］をさらに含んでなる。切断アセンブリ［８］の切断ブレード［９］は、一般に、直線移動、回転移動、または往復移動を有するが、いかなる他の移動も本発明の範囲内で動作可能である。図１は、切断ブレード［９］の回転移動を示す。製造された個別のヒドロゲル粒子［５０］は、図１に示されている。
【００５０】
ここで図２を参照すると、本発明のヒドロゲル粒子形成装置［１］の別の実施形態の概略図が示されている。この図は、ハウジングキャビティ［５］内に収容された任意のドライブシャフト［３１］を示す。場合により、ドライブシャフト［３１］は、回転するように取付けられる。場合により、ハウジングキャビティ［５］内の１つまたは複数のベアリング［３２］が、動作中のドライブシャフト［３１］を支持する。装置は、また、場合により、ドライブシャフト［３１］に沿った、ハウジングキャビティ［５］からの懸濁液の外方の流れを制限するために、ドライブシャフト［３１］の周りに１つまたは複数のシール［３３］を含んでなる。それが入口［４］を通ってハウジングキャビティ［５］に入るとき、ヒドロゲル形成懸濁液は押出ダイ［６］に移動する。場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を混合するために、混合デバイス［３４］をハウジングキャビティ［５］内に含めてもよい。図２は、混合デバイス［３４］としてピンミキサを示す。場合により、ハウジングキャビティ［５］は、ハウジングキャビティ［５］内の向上した材料分配のために、半径方向のスロット［３５］をさらに含む。
【００５１】
再び図１を参照すると、押出ダイ［６］は、ヒドロゲル形成懸濁液が押出される１つまたはいくつかの押出穴［７］またはオリフィスを収容する。押出穴［７］は、エンドプレートに穴をあけることによって構成してもよい。押出穴は、押出ダイの面［１０］上に均一に隔置してもよいし、任意の幾何学的構成に配列してもよい。図２に示された好ましい実施形態において、押出穴は、回転可能に取付けられた切断アセンブリ［８］とともに使用されるとき円形アレイに配列される。押出穴［７］は、任意の断面領域を有してもよいが、一般に円形断面を有する。
【００５２】
ヒドロゲル混合物が押出穴［７］を出るとき、ヒドロゲル材料は切断ブレードアセンブリ［８］によって切断される。このように、単位時間あたり一定の体積が各ノズルから出るように、一定の体積のヒドロゲル形成懸濁液が押出ダイ［６］を通って均一に計量供給される。切断ブレードアセンブリ［８］は、１つのブレードまたは複数のブレード［９］を収容してもよい。好ましい実施形態において、ドライブシャフト［３１］が押出ダイ［６］の中央開口部［３６］を通って延在するとき、切断アセンブリ［８］はドライブシャフト［３１］上に回転可能に取付けられる。好ましい切断ブレード［９］は、傾斜タービンブレードの形態である。タービンブレードの傾斜は、好ましくは約４５度である。切断ブレード［９］は、計量供給された量の押出されたヒドロゲル混合物が限られたジオメトリに切断されるように、押出穴［７］に近接して押出ダイの面［１０］に非常に近く、穴を過ぎて移動する。
【００５３】
ここで図３を参照すると、本発明のヒドロゲル粒子形成システム［２０］の一実施形態が示されている。簡単な形態において、本発明のシステムは、少なくとも、ヒドロゲル形成懸濁液が撹拌されながら水および微生物（または細胞）と組合されて均一なヒドロゲル形成懸濁液を形成する、典型的には供給タンクである第１の供給ステーション［２１］と、一定の体積の懸濁液が供給ステーション［２１］から移送ライン［３７］を通って本発明の粒子形成装置［１］の入口（図示せず）内に計量供給される計量デバイス［２２］と、急冷流体を収容するための溜めまたは容器である急冷ステーション［２３］とを含んでなる。粒子形成装置［１］は、急冷流体中でヒドロゲル形成懸濁液が押出され切断が行われるように、急冷流体中に少なくとも部分的に沈められる。押出された懸濁液は急冷流体と直接接触し、したがって、ヒドロゲル形成懸濁液は、切断ブレード［９］によって切断されるのに十分な強度を生じる。図３に示されたシステムのジオメトリは、ヒドロゲル粒子形成装置［１］が、急冷流体中に完全に沈められる代わりに、急冷流体中に部分的に沈められるだけなので、温度急冷ヒドロゲル用途に特によく適している。
【００５４】
場合により、押出ダイの面［１０］の表面は、ヒドロゲル形成懸濁液が表面を濡らさず、したがって、きれいな切断が達成されるように、ヒドロゲル形成懸濁液との高い接触角を有する材料で処理される。「接触角」とは、１滴の流体と固体表面との間の角度を意味する。切断ブレード［９］の移動は、急冷流体を循環させ、切断ゾーンからの新たに切断されたヒドロゲル粒子［５０］の除去を容易にする。
【００５５】
このシステムの一実施形態において、当業者は、さらに、結果として生じる粒子の質を損なうことなく、急冷流体の移動によって生じた粘性抵抗による粒子の伸長を低減するために、ヒドロゲル混合物を押出ダイ［６］を通して押出す前にヒドロゲル形成懸濁液の粘度が増加されるように、十分な量の急冷化合物を含有する急冷流体を、別々に、または生体触媒、ヒドロゲル溶液とともに、および／または他の添加剤とともに、ハウジングキャビティ［５］に導入することができる。これを達成するために、システムは、図３上の供給ステーション［２１］のものに対する付加的な供給ステーション（図示せず）、および図３上の計量デバイス［２２］のものに対する計量デバイス（図示せず）が加えられて、急冷流体をヒドロゲル粒子形成装置［１］上の第２の入口［４］内に供給することを可能にするように設計することができる。結果として生じる押出物は、より高い粘度を有し、循環する急冷流体に対する形状感度を低減し、ヒドロゲル粒子形成装置［１］を通る、より高い流量を可能にする。
【００５６】
当業者は、粒子形成装置から任意の望ましい粒度または製造率を達成するために、供給チャネルと、ダイ、ダイ穴、切断ブレードとの比、ならびに１ダイ穴あたりの体積流量、および切断速度を、必要に応じて変えてもよいことを認めるであろう。このシステムは、小さい粒子が望ましい場合に特に有用であり、従来のドリッピング方法、気体剪断方法、または振動ジェット崩壊方法によって処理されるヒドロゲル流体特徴は、望ましい粒子より大きい粒子をもたらす。ヒドロゲル粒子形成システム［２０］は、また、ドリッピング方法が好ましくない粘性ヒドロゲル溶液に有用である。１穴あたりの最大製造率は、実験的に定めなければならず、特定の条件におけるヒドロゲル形成懸濁液と急冷流体特徴との相互作用によって、および、循環する急冷流体によって、形成するヒドロゲル粒子に課される粘性抵抗力によって制限される。さらなる実施形態において、最小の粒子伸長で高い製造率を得るために、急冷ステーション［２３］内の粒子形成装置［１］の位置決め、および急冷流体を送るための補助撹拌機またはバッフル［３８］の追加を調整することができる。
【００５７】
当業者は、粒子形成の頻度に対する循環される急冷流体の量を、異なった切断ブレード設計および任意の撹拌機またはバッフル［３８］を用いて制御してもよいことを認めるであろう。変化は、回転表面の傾斜および／または断面積を変えること、穴［７］の数あたりのブレード［９］の数を変えること、または同様の急冷流体混合および循環の変化を含む。装置［１］は、切断ブレードアセンブリ［８］が粒子形成領域の近くの急冷流体の循環を調節するように修正することができる。調整は、急冷ステーション［２３］の粒子形成および急冷ゾーンの近くの急冷流体混合の強度を変える。沈められた切断ブレード［９］は、切断機能を行いながら、急冷流体の撹拌機として機能する。粘性抵抗および粒子の伸長を最小にするために、急冷流体の低い混合強度が、低粘度ヒドロゲル形成懸濁液に好ましい。粒子形成領域を過ぎる急冷流体の高い線速度が、粒子にかかる粘性抵抗が重要な問題でない、より高い粘度のヒドロゲル系に好ましく、より高い製造率を達成することができる。特定のブレードジオメトリを、特定の要件に合うように注意深く調整することができる。切断ブレードアセンブリ［８］および混合デバイス［３４］アセンブリは、たとえば、傾斜ブレードタービン、平坦ブレードタービン、マリンタイプ混合インペラ、および多くの他のものなどの多くの設計から選択することができる。インペラのタイプを変更することに加えて、ブレード［９］の傾斜および面積を変えて、循環を増加または減少させてもよい。
【００５８】
一実施形態において、供給ステーション［２１］、計量デバイス［２２］、移送ライン［３７］、およびヒドロゲル粒子形成装置［１］は、感温性粘度／ゲル点を有するヒドロゲル溶液（カラギナンまたはアガロースなど）が粒子形成前にゲル点より高く維持されるように加熱される。加熱を、たとえば電気加熱テープによって達成することができるか、または、アセンブリ全体を加熱されたエンクロージャ内に配置することができ、加熱されたエンクロージャは、アセンブリ全体を所望の温度で維持する。他の例としては、電気カートリッジヒータ［４１］を備えたサーマルマス［４０］（たとえば、アルミナ、銅、真鍮）、熱い流体（たとえば、水、蒸気、油）を循環させてもよいトレースシステムまたはジャケット付システム、および循環する熱い気体（たとえば、空気、窒素、ヘリウム）または液体を備えたエンクロージャが挙げられる。
【００５９】
さらなる実施形態において、粒子形成前にヒドロゲルおよび生体触媒懸濁液の均質性を向上させるために、ヒドロゲル粒子形成装置［１］のハウジングキャビティ［５］は、混合デバイス［３４］を組入れる。本発明に使用することができる混合デバイス［３４］のタイプとしては、当該技術において一般に知られているような機械的ミキサ（マドック（Ｍａｄｄｏｃｋ）ミキサ、パイナップル（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ）ミキサ、ギアミキサ、ピンミキサなど）または静的ミキサが挙げられるが、これらに限定されない。ミキサのさらなる例が、ペリーの化学技術ハンドブック第７版（Ｐｅｒｒｙ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、アール・エイチ・ペリー（Ｒ．Ｈ．  Ｐｅｒｒｙ）ら（１９９７）、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）に記載されている。ピンミキサが、混合デバイス［３４］として図２に示されている。図２に示された装置の実施形態において、１つのドライブシャフト［３１］が、切断ブレードアセンブリ［８］およびピンミキサ［３４］の両方に動力供給するために使用される。同様に、本発明のヒドロゲル粒子形成システムは、また、場合により、たとえば実施例４で説明されるように、プロセスに沿った任意のポイントで、１つもしくはそれ以上の混合デバイスを組入れてもよい。混合デバイスの選択によって、処理されている特定のヒドロゲル形成懸濁液の特定の要件を満たすように、混合の強度を調整することができる。細胞破壊を防止または促進しながら、均質なヒドロゲル形成懸濁液が得られる。図２に示されているように、本発明のヒドロゲル粒子形成装置［１］は、より高い粘度の材料を押出穴［７］に押込み、より高い粘度のヒドロゲルの処理を可能にするために、ハウジングキャビティ［５］内に、遠心ポンプ、スクリューポンプ、またはギアポンプなどの内部ポンプ［３９］を含むように修正することができる。
【００６０】
感温性ヒドロゲル処理の熱損失を管理するための熱絶縁ダイを使用して、操作コスト、および温度偏差による押出ダイ［６］内のゲル形成の傾向を低減してもよい。絶縁性化合物を使用して押出ダイ［６］を構成して、急冷流体の熱損失を低減し、かつ、カラギナンおよびアガロースなどの、感温性ゲル点を有するヒドロゲル溶液のためのシステムの操作性を向上させることができる。熱絶縁押出ダイ［６］のために本発明に使用することができる絶縁性材料のタイプとしては、熱可塑性または熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化された熱可塑性または熱硬化性ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、および金属、ならびに当業者に一般に知られている他の絶縁性材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明のシステム［２０］は、さらに、連続的な粒子分離および急冷流体の再循環のために設計することができる。そのような実施形態において、急冷ステーション［２３］は、穴、スロット、またはスクリーンなどの小さい開口を有する傾斜表面を横切る、急冷ステーション［２３］からの急冷流体／粒子混合物の回収を可能にするように修正され、それにより、急冷流体は傾斜表面を通り、一方、ヒドロゲル粒子は傾斜面の頂部を横切って収集コンテナ内に入る。次に、急冷流体を付加的な溜めに収集し、再使用のために元の急冷ステーション内に戻すことができる。
【００６２】
好ましい実施形態において、２つの混合供給ステーション（図示せず）および容積計量供給システム（図示せず）が、ヒドロゲル粒子形成装置のハウジングに取付けられ、ヒドロゲル溶液および生体触媒を別々に供給してもよく、したがって、粒子形成前の、微生物または酵素のヒドロゲル溶液への接触時間を最小にする。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、外部源からの酵素を、遊離または固定化微生物に結合するためのシステムを提供する。結果として生じる系は、微生物の生体触媒特性を別の源からの付加的な酵素と組合せる共固定化酵素／細胞系をもたらす。関連した実施形態において、本発明のシステムを使用して混合培養物を固定化することによって、共固定化を達成することもできる。
【００６４】
当業者に明らかであろう利益の１つは、本発明の装置、システム、および方法を、小さい実験室の準備装置のために用いて、および商業用途にスケールアップして、均一なヒドロゲル粒子を製造することができることであり、というのは、装置およびシステム構成要素を、サイズを調整することができ、特に望ましい用途によってのみ制限することができるからである。
【００６５】
本発明を次の実施例でさらに例示する。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、また、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明のさまざまな変更および修正を行って、それをさまざまな用途および条件に適合させることができる。
【実施例】
【００６６】
略記
略記の意味は、次の通りである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ（ｓ））を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍｍ３」は立方ミリメートルを意味し、「ｖ：ｖ」は体積あたりの体積を意味し、「ｍＰａｓ（ｃｐｓ）」はミリパスカル秒（センチポアズと同じ）を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ｒｐｍ」は１ｍｉｎあたりの回転数を意味し、「ｐｓｉｇ」は１平方インチ（ゲージ）あたりのポンドを意味し、「℃」は度摂氏を意味し、「１分あたりのｃｃ」は立方センチメートル／分を意味する。
実施例１
制御体積アルギン酸塩切断
粒子形成システムを図３のように構成し使用して、酵素活性を有する微生物を含有するヒドロゲル粒子を製造した。８Ｌのステンレス鋼供給容器に撹拌機を備え付け、供給容器を漸進的なキャビティ容積式ポンプ（シーペックス（Ｓｅｅｐｅｘ）（登録商標）ポンプ、モデル００３−１２  ＭＤＣ、ドイツのシーペックス・シーバーガー・ゲーエムベーハー＆カンパニー（Ｓｅｅｐｅｘ  Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．，  Ｇｅｒｍａｎｙ））に連結した。ポンプからの出力を、インラインフィルタ（直列の２３０および１４０ミクロンのワイヤメッシュストレーナ要素を収容するニュープロ（ＮｕＰｒｏ）（登録商標）「Ｆ」シリーズ、オハイオ州ウィロビーのニュークリア・プロダクツ・カンパニー（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，  ＯＨ））に連結し、次に、図２に示された粒子形成デバイスに連結した。粒子形成デバイスを、ダイ面が急冷流体の表面より下になるように、８Ｌの急冷流体コンテナより上に吊った。
【００６７】
アルギン酸塩溶液を、供給容器内でアルギン酸塩（ＦＭＣプロタナル（Ｐｒｏｔａｎａｌ）（登録商標）ＬＦ１０／６０、溶液粘度＝水中１％について２０〜７０ｍＰａｓ（ｃｐｓ）、ノルウェーのＦＭＣバイオポリマー・コーポレーション（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗａｙ））８２．５ｇを脱イオン水１７１７グラムと組合せることによって調製し、均質な混合物が得られるまで混合した。
【００６８】
アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（アメリカタイプ培養物コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）５５７４６）の細胞懸濁液を、撹拌バーでビーカー内で凍った細胞ペースト（２４．５％ｄｃｗ）９１８ｇを０．６５モルＮａＣｌ塩溶液２８２ｇと組合せることによって調製し、均質な混合物が得られるまで６０ｍｉｎ間混合した。
【００６９】
細胞懸濁液を、アルギン酸塩溶液を収容する供給容器に加え、均質な混合物が得られるまで３０ｍｉｎ間混合し、次に、容器を窒素で１０ｐｓｉｇに加圧した。移送ラインのバルブを開け、ポンプを開始し、１１３ｍＬ／ｍｉｎの流れを送出するように設定した。流れを、１つの供給口を使用する粒子形成装置を通して送った。第２の供給口は使用せず、キャップを付けてオフにされた（ｃａｐｐｅｄ  ｏｆｆ）。ドライブシャフトの速度を７６０ｒｐｍに設定した。アルギン酸塩細胞混合物は、ピンミキサ、および８の直径３／１６インチの穴を収容する押出ダイを通って進んだ。切断アセンブリは８のブレードを収容した。使用された急冷流体は０．２Ｍ塩化カルシウム塩溶液であった。
【００７０】
１穴あたりの体積流れが１４．１ｍＬ／穴／ｍｉｎであり、切断速度が５７６０切断／穴／ｍｉｎであることがわかると、計算された１粒子あたりの体積は２．４４ｍｍ３であった。結果として生じる粒子を収集し、体積を、２．０８ｍｍ３、計算された体積の８５％であることを測定した。アルギン酸塩粒子が、カルシウムイオンを含有する溶液中で収縮することが知られている。次に、切断速度を５７６０切断／穴／ｍｉｎで維持し、１穴あたりの体積流れを２２．６ｍＬ／穴／ｍｉｎに増加させ、計算された１粒子あたりの体積を３．９４ｍｍ３に増加させた。結果として生じる粒子を収集し、体積を３．３ｍｍ３であることを測定し、これは、計算された体積の８４％であり、予期された１粒子あたりの体積の実験誤差の十分範囲内である。
実施例２
アルギン酸塩粘度を増加させることの効果
設備および手順は、使用されたアルギン酸塩が、タイプＦＭＣプロタナル（登録商標）ＬＦ２０／４０（ノルウェーのＦＭＣバイオポリマー・コーポレーション）、ＬＦ１０／６０より高い粘度（水中１％について１００〜２００ｍＰａｓ）を有する水溶液を生成するアルギン酸塩であった以外は、実施例１と同じであった。粒子形成システムを通して処理されると、非常に安定した動作が達成され、粒子形状が非常に均一であった。体積が２．２３ｍｍ３の粒子を、１１ｍＬ／ｍｉｎ／穴の、１穴あたりの体積流れで製造した。
【００７１】
同じ材料を従来のドロップ形成システムを通して処理しようと試みた。均一なドロップを製造するために、体積流れを０．１ｍＬ／ｍｉｎ／穴以下に制限した。これらの粒子は直径３ｍｍの球であった。これは、粒子形成装置が、従来のドロップ形成システムで達成することができるより小さい粒子を、高粘度ヒドロゲル形成懸濁液から、かなり高い粒子製造率で製造することができることを示した。
実施例３
カラギナンを使用して高温でシステムを操作すること
実施例１で説明された粒子形成システムを、熱交換器、第２の供給タンク、容積計量デバイスとしてのギアポンプ、および電気熱テープを加えることによって修正した。供給タンク、容積計量デバイス、静的ミキサ、移送ライン、および粒子形成装置を、感温性粘度／ゲル点を有するヒドロゲル溶液が粒子形成前にゲル点より高く維持されるように加熱した。
【００７２】
カラギナン（ＦＭＣ  ＲＧ３００、ノルウェーのＦＭＣバイオポリマー・コーポレーションから入手可能）１５０ｇおよび脱イオン水２８５０ｇを、元の供給容器内で３０ｍｉｎ間、均質な混合物が生じるまで混合することによって、カラギナンペーストを調製した。カラギナンペーストを、混合しながら約８０℃に加熱し、カラギナンが流体になりゲルがなくなるまで６０ｍｉｎ間保持した。次に、結果として生じるカラギナン溶液を６０〜６５℃に冷却した。
【００７３】
細胞懸濁液を、ビーカー内で撹拌バーで凍った細胞ペースト（２２．１％ｄｃｗ）１２７０ｇを０．８７Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液溶液２２７ｍＬと混合することによって調製し、均一に混合されるまで６０ｍｉｎ間混合した。次に、それを第２の供給容器（撹拌４Ｌステンレス鋼）に移送した。
【００７４】
細胞懸濁液を、２５ｍＬ／ｍｉｎの体積流量で、熱交換器を通してポンピングし（シーペックス（Ｓｅｅｐｅｘ）（登録商標）ポンプ、モデル００３−１２  ＭＤＣ、ドイツのシーペックス・シーバーガー・ゲーエムベーハー（Ｓｅｅｐｅｘ  Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ  ＧｍｂＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））、熱交換器は、出口で懸濁液を５０℃に加熱した。カラギナン溶液を、６０〜６５℃の温度および３７ｍＬ／ｍｉｎの体積流量でポンピングし（マイクロポンプ（ＭｉｃｒｏＰｕｍｐ）（登録商標）ギアポンプ、ワシントン州バンクーバーのマイクロポンプ・インコーポレイテッド（ＭｉｃｒｏＰｕｍｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  ＷＡ））、インライン静的ミキサ（コッホ（Ｋｏｃｈ）（登録商標）−ＳＭＸ、スイス、ウィンタートゥールのスルザー・ケムテック（Ｓｕｌｚｅｒ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｗｉｎｔｅｒｔｈｕｒ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））内で細胞懸濁液と組合せた。静的ミキサを出る流れを、１つの供給口を使用する粒子形成装置を通して送った。第２の供給口は使用せず、キャップを付けてオフにされた。ドライブシャフトの速度を１８０ｒｐｍに設定した。カラギナン／細胞懸濁液は、ピンミキサ、および８の３／１６インチの穴を収容する押出ダイを通って進んだ。切断アセンブリは８のブレードを収容した。この実験に使用された急冷流体は、０．２５モルＫＨＣＯ３塩溶液であった。
【００７５】
粒子形成装置（１８ｍｌ）の作業体積は、カラギナン／生体触媒混合物の質量流れとともに、２０ｓｅｃ未満の粒子形成デバイス内の平均細胞滞留時間をもたらした。細胞溶液熱交換器、静的ミキサ、および移送ライン内の滞留時間と組合せて、細胞を、２ｍｉｎ以下の間高温に曝した。保管および計量の間ヒドロゲル溶液をゲル温度より十分に高く維持することに加えて、設備のコールドスポットによる早すぎるゲル化を回避した。
【００７６】
選択された操作条件において、結果として生じる粒子は、急冷流体循環流れの粘性抵抗によって伸長された。
実施例４
カラギナン溶液調製要件を簡単にするためのパイプ内の連続的な流れ加熱／冷却カラギナン
この実施例は、２つの流体が粒子形成装置デバイスのピンミキサ内で混合されるように、静的ミキサを除去し、粒子形成デバイス上の両方の供給口を使用する以外は、実施例３と同様である。さらに、カラギナンペーストを、室温で保持し、容積式ポンプで熱交換器を通してポンピングして、温度を８０℃に上昇させ、静的混合しながら十分な時間の間８０℃で保持して、ゲルを除去し、次に、粒子形成デバイス内に供給するために６０℃に冷却する。
【００７７】
粒子形成デバイスの作業体積は、混合物の質量流れとともに、２０ｓｅｃ未満の粒子形成装置内の平均細胞滞留時間をもたらす。細胞溶液熱交換器および移送ライン内の滞留時間と組合せて、酵素細胞を、１ｍｉｎ以下の間高温に曝す。
実施例５
押出ダイを出る前に急冷剤を導入することによって感温性ヒドロゲル混合物の粘度を増加させて、急冷流体の粘性抵抗による粒子の伸長を低減する
この実施例は、ヒドロゲル溶液の粘度が増加されるように、加熱されたカチオン急冷流体を粒子形成装置上の新たな第３の供給口内に供給することを可能にするために、第３の供給タンク、容積計量デバイス、およびプレヒータを加える以外は、実施例４と同様である。結果として生じる溶液（たとえば、カラギナン／ヒドロゲル溶液）のより高い粘度は、循環する急冷流体の粘性抵抗による粒子変形が低減されるので、より高い粒子形成率を可能にする。結果として、カラギナン／生体触媒混合押出物が、より高い粘度を有する。さらに、それは、循環する急冷流体乱流に対する低減された形状感度を有する。
実施例６
エタノール製造のために、ヒドロキシアパタイトを、酵母細胞を含有するカラギナンビーズに組入れることが、エタノール製造率およびビーズ一体性を向上させる
設備および手順は、最終ビーズが５ｗｔ％のヒドロキシアパタイトを含有するように、最初の加熱後、十分な量でヒドロキシアパタイトをカラギナン溶液に加える以外は、実施例３と同様である。この実施例の細胞懸濁液は、最終ビーズが０．５％の乾燥重量の酵母を含有するように、エタノール製造に適した十分な酵母を含有する。結果として生じる粒子は、ヒドロキシアパタイトまたは遊離細胞を使用せずに調製された粒子より高いエタノール製造率をもたらす。
実施例７
内部遊離カルシウムイオンを使用することによって、ヒドロゲル材料の粘度を増加させること
この実施例は、カルシウム源がクエン酸カルシウムである以外は、実施例１と同様である。クエン酸カルシウムを、第２の供給タンク計量システムを使用して加え、使用して、１．２部のクエン酸カルシウムを、第１の供給タンク内で調製される２％アルギン酸塩／０．５％乾燥酵母細胞混合物１００部に加える。第３の供給タンクおよび計量システムが、１部のＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを、移送ライン、または粒子形成装置のハウジングキャビティ内に計量供給するために必要である。結果として生じる粒子は、発酵性能に影響を及ぼすことなく、外部カルシウム急冷を用いて製造された粒子に対して、向上したゲル強度を有する。より強い粒子は、エタノール発酵の速度を向上させ、したがって、より大規模の操作、および微生物からのエタノールの向上した分離を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明のヒドロゲル粒子形成装置の一実施形態の長手方向の断面の概略図である。
【図２】本発明のヒドロゲル粒子形成装置の別の実施形態の長手方向の断面の概略図である。
【図３】本発明のヒドロゲル粒子形成システムの概略図である。
【図１】
2006512084.tif 000003
【図２】
2006512084.tif 000004
【図３】
2006512084.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月14日(2004.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）壁とキャビティとを有するハウジングと、
（ｂ）ヒドロゲル形成懸濁液をハウジングキャビティ内に導入するための、ハウジングの壁の少なくとも１つの入口と、
（ｃ）ヒドロゲル形成懸濁液をハウジングキャビティから押出すことができる１つまたは複数の押出穴を備えた面を有する押出ダイと、
（ｄ）少なくとも１つの切断ブレードを含んでなる切断アセンブリであって、切断ブレードが、各押出穴を横切って移動するとき、ヒドロゲル粒子形成懸濁液が押出穴を出るときにヒドロゲル粒子形成懸濁液を個別のヒドロゲル粒子に切断し、切断ブレードが、押出ダイの面と密に近接し、直線状に、回転するように、または往復するように移動する、切断アセンブリと、
（ｅ）場合により、ハウジングキャビティ内に収容されたドライブシャフトと、
（ｆ）場合により、ドライブシャフトを支持する、ハウジングキャビティ内の１つまたは複数のベアリングと、
（ｇ）場合により、ドライブシャフトと接触する１つまたは複数のシールと、
（ｈ）ヒドロゲル形成懸濁液を混合するための、ハウジングキャビティ内の少なくとも１つの混合デバイスと、
（ｉ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を分配するための、ハウジングキャビティの１つまたは複数の半径方向のスロットと、
（ｊ）場合により、ヒドロゲル形成懸濁液を押出ダイに移動させるための、ハウジングキャビティ内の内部ポンプと、
（ｋ）ハウジングキャビティ内に生体触媒を導入するための、要素（ｂ）の入口供給口から独立した、ハウジングの少なくとも１つの供給口と
を含んでなるヒドロゲル粒子形成装置。
【請求項２】
（ａ）ヒドロゲル形成懸濁液を収容するための、少なくとも１つの供給ステーションと、
（ｂ）請求項１に記載のヒドロゲル粒子形成装置と、
（ｃ）供給ステーションからヒドロゲル形成懸濁液を受け、それをヒドロゲル粒子形成装置に送出するための、供給ステーションおよびヒドロゲル粒子形成装置に連結された移送ラインを有する計量デバイスと、
（ｄ）急冷流体を収容する急冷ステーションと
を含んでなるヒドロゲル粒子形成システムであって、
ヒドロゲル粒子形成装置が急冷流体中に少なくとも部分的に沈められ、ヒドロゲル形成懸濁液がヒドロゲル粒子形成装置から急冷流体中に押出されて、ヒドロゲル粒子を形成する、ヒドロゲル粒子形成システム。
【請求項３】
計量デバイスが容積計量ポンプである請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
切断アセンブリが、回転可能に取付けられ、かつ、切断アセンブリが急冷流体中で回転するとき急冷流体を混合するための複数の混合ブレードをさらに含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
成分を、ヒドロゲル粒子形成装置に導入される前に混合するための少なくとも１つの混合デバイスをさらに含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
混合デバイスが供給ステーションに配置される請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
混合デバイスが計量デバイスの移送ラインに配置される請求項５に記載のシステム。
【請求項８】
急冷ステーションが、ヒドロゲル粒子を収集するための傾斜表面と、急冷流体が急冷ステーションを出るとき急冷流体を収集するための少なくとも１つの付加的な収集溜めとをさらに含んでなり、ヒドロゲル粒子が傾斜表面上に収集された後、急冷流体が付加的な収集溜めから急冷ステーション内に再循環されて戻される請求項２に記載のシステム。
【請求項９】
急冷流体または添加剤または両方を収容するための少なくとも１つの付加的な供給ステーションと、付加的な供給ステーションから急冷流体または添加剤を受け、それをヒドロゲル粒子形成装置に送出するための、付加的な供給ステーションおよびヒドロゲル粒子形成装置に連結された移送ラインを有する計量デバイスとをさらに含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項１０】
ドライブシャフトがハウジングキャビティに回転可能に取付けられる請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
ドライブシャフトがハウジングキャビティに回転可能に取付けられる請求項２に記載のシステム。
【請求項１２】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスがドライブシャフトによって駆動される請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスがドライブシャフトによって駆動される請求項２に記載のシステム。
【請求項１４】
押出ダイが中央開口部を収容し、ドライブシャフトが押出ダイの中央開口部を通って延在し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在するときドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
押出ダイが中央開口部を収容し、ドライブシャフトが押出ダイの中央開口部を通って延在し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在するときドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項２に記載のシステム。
【請求項１６】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスが、回転可能に取付けられたドライブシャフトによって駆動され、押出ダイが、ドライブシャフトが延在する中央開口部を収容し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在する場合にドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
ハウジングキャビティ内の混合デバイスが、回転可能に取付けられたドライブシャフトによって駆動され、押出ダイが、ドライブシャフトが延在する中央開口部を収容し、切断アセンブリが、ドライブシャフトが中央開口部を通って延在する場合にドライブシャフト上に回転可能に取付けられる請求項２に記載のシステム。
【請求項１８】
押出穴が押出ダイの面上に均一に隔置される請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
押出穴が押出ダイの面上に均一に隔置される請求項２に記載のシステム。
【請求項２０】
切断アセンブリが回転可能に取付けられるとき、押出穴が円形アレイに配列される請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
押出穴が略円形断面を有する請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
押出ダイの面が、ヒドロゲル形成懸濁液との高い接触角を有する材料で処理されるか構成され、材料が、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
押出ダイの面が、ヒドロゲル形成懸濁液との高い接触角を有する材料で処理されるか構成され、材料が、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される請求項２に記載のシステム。
【請求項２４】
押出ダイが、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される絶縁性材料から構成される請求項１に記載の装置。
【請求項２５】
押出ダイが、熱可塑性および熱硬化性ポリマー、鉱物およびガラス強化ポリマー、セラミックス、フォーム、鉱物、酸化物、ならびに金属から選択される絶縁性材料から構成される請求項２に記載のシステム。
【請求項２６】
切断アセンブリが、傾斜タービンおよび平坦タービンから選択される請求項１に記載の装置。
【請求項２７】
切断アセンブリが、傾斜タービンおよび平坦タービンから選択される請求項２に記載のシステム。
【請求項２８】
ハウジングキャビティ内の内部ポンプが、遠心ポンプ、スクリューポンプ、または容積式ポンプである請求項１に記載の装置。
【請求項２９】
ハウジングキャビティ内の内部ポンプが、遠心ポンプ、スクリューポンプ、または容積式ポンプである請求項２に記載のシステム。
【請求項３０】
混合デバイスが、機械的ミキサおよび静的ミキサよりなる群から選択される請求項１に記載の装置。
【請求項３１】
混合デバイスが、機械的ミキサよりなる群から選択される請求項１６に記載のシステム。
【請求項３２】
装置が加熱デバイスによって加熱される請求項１に記載の装置。
【請求項３３】
供給タンク、装置、計量デバイス、急冷ステーション、またはシステムの少なくとも１つが、独立して、少なくとも１つの加熱デバイスによって加熱される請求項２に記載のシステム。
【請求項３４】
加熱デバイスが、サーマルマスヒータ、トレースシステム、ジャケット付システム、および循環する熱い気体または液体を備えたエンクロージャから選択される請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
加熱デバイスが、サーマルマスヒータ、トレースシステム、ジャケット付システム、および循環する熱い気体または液体を備えたエンクロージャから選択される請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
ヒドロゲル形成懸濁液が、ヒドロゲル溶液と、生体触媒とを含んでなる請求項２に記載のシステム。
【請求項３７】
生体触媒が、全細胞懸濁液、細菌細胞、菌・カビ類、藻類、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、オルガネラ、精製または部分精製酵素製剤、および適切な緩衝液溶液中の多酵素複合体よりなる群から選択される請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
ヒドロゲル粒子を製造するための方法であって、
（ａ）ヒドロゲル形成懸濁液を収容する供給ステーションを提供し、
（ｂ）供給ステーションに連結された移送ラインを有し、かつ供給ステーションから請求項１に記載のヒドロゲル粒子形成装置内へのヒドロゲル材料を受ける計量デバイスによって、ヒドロゲル形成懸濁液を計量供給し、装置が急冷流体中に少なくとも部分的に沈められ、
（ｃ）ヒドロゲル形成懸濁液をヒドロゲル粒子形成装置を通して急冷流体中に押出し、そして
（ｄ）押出されたヒドロゲル形成懸濁液をヒドロゲル粒子形成装置によって個別のヒドロゲル粒子に切断する
順次工程を含んでなる方法。
【請求項３９】
ヒドロゲル形成懸濁液が、ヒドロゲル溶液と、生体触媒とを含んでなる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
生体触媒が、全細胞懸濁液、細菌細胞、菌・カビ類、藻類、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、オルガネラ、精製または部分精製酵素製剤、および適切な緩衝液溶液中の多酵素複合体よりなる群から選択される請求項３９に記載の方法。
【国際調査報告】
2006512084.tif 000006
2006512084.tif 000007
2006512084.tif 000008