(57)【要約】合成による核酸配列決定。各ステップが合成されたストランド内への取込みのため考えられるヌクレオチド相補性クラスのうちの単数又は複数のものを提供する段階を含み、各ステップセットが４つの考えられるヌクレオチド相補性クラスの全てを提供するステップを含み、反復するステップセット内の鋳型ストランドに相補的な第２のストランドのプライミングを受けた合成。最初に、考えられる４つのヌクレオチド相補性クラスのうちの３つを、次に第４のヌクレオシチド相補性クラスを単独で、個別に合成されたストランド内への取込みのために提供することができる。同様に、ステム部分及び第１及び第２のループ部分から成り、該ステム部分が第１のストランド及び第２のストランドから成り、第１のストランド及び第２のストランドは長さが等しく、相補性で、合わせてアニールされており、第１のループ部分が第２のストランドの５′末端に第１のストランドの３′末端を接合させ、第２のループ部分が第１のストランドの５′末端に第２のストランドの３′末端を接合させ、かくして遊離５′又は３′末端を全くもたなくなっているＤＮＡ分子、及び特に配列決定におけるその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの核酸について配列及び／又は塩基組成情報を決定する方法において、
（ｉ）第１のストランドにアニールされた核酸の遊離３′末端が、鋳型依存性核酸ポリメラーゼにより核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内にヌクレオチドを鋳型配列依存的に取込むことによって核酸鋳型に相補的な核酸のストランドの伸張を可能にする、核酸鋳型を含む第１のストランドを含む核酸を提供する段階；
（ｉｉ）該核酸の塩基組成又は配列を示す情報を得ることができるようにする核酸鋳型に相補的な核酸のストランドを伸張させるため、所望の回数だけ反復させられるか又はその他の単数又は複数のステップのセットを組合わせて実施される、単数又は複数のステップセットを実施する段階であって、
１つのステップが、
（ａ）−  １つの核酸鋳型を含む第１のストランドを含む核酸、
−  該核酸鋳型の第１のストランドにアニールされた１つの核酸ストランドの前記遊離３′末端及び
−  鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、の存在下で、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内へのヌクレオチドの核酸ポリメラーゼによる鋳型依存性取込みのための１、２、３又は４個のヌクレオチドから選択されたヌクレオチドを提供する段階であって、ここで各々の前記ヌクレオチドが天然のヌクレオチドであるか又は核酸ストランドの遊離３′末端で核酸ストランド内への核酸ポリメラーゼによる鋳型依存性取込みの能力をもつヌクレオチド類似体であり、各々の前記ヌクレオチド相補性クラス内でヌクレオチド及びヌクレオチド類似体が、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）のうちの１つに対し相補的である段階、
及び
（ｂ）取込まれていないヌクレオチドを除去するか又は不活性化する段階、
を含み、
１セットのステップ内で、
−  ４つのヌクレオチド相補性クラス全てから選択されたヌクレオチドが提供され、鋳型依存性取込みのために利用可能であり、
−  少なくとも１つのステップにおいて、２つ以上、任意には２、３又は４個のヌクレオチド相補性クラスから選択されたヌクレオチドが提供され、鋳型依存性取込みのために利用可能であり、ヌクレオチド相補性クラスのうちの少なくとも１つの中のヌクレオチドは、該核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれている場合、核酸鋳型に相補的な核酸のストランドのさらなる伸長を可能にし、
−  任意には、２つ以上のステップにおいていかなるヌクレオチド相補性クラスも提供されず；かつ
４つの相補性クラス全てから選択されたヌクレオチドが１つのステップで提供された場合には、該ヌクレオチド相補性クラスのうちの１、２又は３個の中のヌクレオチドは、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれた場合、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド及び多数のコピーが存在するならば存在する全てのコピーのさらなる伸長を防ぐことになる；
実施段階、
（ｉｉｉ）前記ステップの多数のセットを実施し、ステップセットを反復させかつ／又は異なるステップセットと組合せた形でステップセットを実施する段階、
（ｉｖ）取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量がセットとして決定されている各々のセット内の少なくとも１つのステップ内で核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量を決定することにより、少なくとも１つのステップセット内で核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量を決定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
１つのステップセット内で、第１ステップにてヌクレオチド相補性クラスのうちの３つ又は２つから選択されたヌクレオチドが提供され、第２のステップにて残りの１つ又は２つのヌクレオチド相補性クラスから取られたヌクレオチドが提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量が決定されている複数のステップセット内の第１及び第２のステップ内で取込まれた１又は複数のヌクレオチドの数量を決定する段階を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
取込まれたヌクレオチドの数量が決定されている複数のセット内の各ステップ内で取込まれたヌクレオチドの数量を決定する段階を含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つのステップセット内で、第１のステップで３つのヌクレオチドが提供され、第２のステップで１つのヌクレオチドが提供される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１のステップで取込まれたヌクレオチドの性質及び数量を決定する段階を含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１のステップで提供されたヌクレオチドが各々異なる形で標識される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第２のステップで提供されたヌクレオチドが標識される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧに相補的な４つのヌクレオチドが各々異なる形で標識される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオチドが蛍光標識されている、請求項７、８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレオチドの標識は、ヌクレオチドが核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれた時点で無効化される、請求項７、８、９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレオチドの標識は、該ヌクレオチドが核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれた時点で該ヌクレオチドから解裂又は放出される、請求項７、８、９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれた単数又は複数のヌクレオチドから解裂又は放出された標識の性質及び／又は数量を決定する段階を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップセットのサイクル中の各々のステップセット内で、第１のステップで３つのヌクレオチドが提供され、第２のステップで１つのヌクレオチドが提供される、該ステップセットサイクルを実施する段階を含んで成る、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複数のサイクルの各々の内部で、全てのステップセットの全ての第２のステップで提供された１つのヌクレオチドが同じであり、各サイクル内の全てのステップセットの全ての第２ステップ内で提供される１つのヌクレオチドがその他の３サイクル内の全てのステップセットの全ての第２のステップ内で提供される１つのヌクレオチドと異なっている、前記核酸のためのステップセットの４つのサイクルを実施する段階を含んで成る請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１つのステップセットがさらに、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内へのヌクレオチドの取込みを停止する単数又は複数のブロックされたヌクレオチドを提供する段階を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１つのステップセットが付加的に、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内へのヌクレオチドの誤取込みを阻害する単数又は複数の非取込み性阻害物質ヌクレオチドを提供する段階を含んで成る、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
核酸鋳型がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、核酸ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド類似体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
核酸鋳型がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、核酸ポリメラーゼがＤＮＡ依存性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼであり、ヌクレオチドがリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸鋳型がリボ核酸（ＲＮＡ）であり、核酸ポリメラーゼが逆転写酵素であり、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド類似体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸鋳型が多数のコピーの形で提供されている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸増幅反応により核酸鋳型の多数のコピーを提供する段階を含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸増幅反応が、ローリングサークル増幅を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
−  ステム部分並びに第１及び第２のループ部分から成るＤＮＡ分子を提供する段階であって、該ステム部分は第１のストランド及び第２のストランドから成り、該第１のストランド及び第２のストランドは長さが等しく、互いに相補的であり、かつアニールされており、配列及び／又は塩基組成情報が所望されている領域を含んでおり、第１のループ部分は、第１のストランドの３′末端を第２のストランドの５′末端に接合させ、第２のループ部分は第１のストランドの５′末端に第２のストランドの３′末端を接合させ、かくしてＤＮＡ分子は、遊離５′又は３′末端を全く持たないようになっており、ループ部分がローリングサークル増幅のためのプライマ結合部位を含み、ループ部分が配列決定のためのプライマ結合部位を含む、段階；
−  前記核酸鋳型として役立つように核酸の多数のコピーを提供するべくローリングサークル増幅を実施する段階；
を含んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸鋳型が固体支持体に付着させられる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
１つのアレイ内で固体支持体に対し多数の異なる核酸鋳型が付着されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
核酸鋳型がアニーリングを介して、固体支持体に付着されているプライマに対し付着されている、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量の決定分析により１つの核酸の配列を決定する段階を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
１つのステップが複数の異なるヌクレオチドの鋳型依存性取込みを可能にする、ステップ式のヌクレオチドの取込みを特徴とする、合成による核酸配列決定方法。
【請求項３０】
ステップが、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）に相補的なヌクレオチドから成るグループの中から選択された３つの異なるヌクレオチドの鋳型依存性取込みを可能にし、別のステップが、該グループの残りの核酸の鋳型依存性取込みを可能にする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法を制御するようにプログラミングされたコンピュータプロセッサ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のコンピュータプロセッサ用のプログラムを担持するコンピュータ読取り可能なデバイス。
【請求項３３】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法の実施から１つの核酸についての配列及び／又は塩基組成情報を提供するようにプログラミングされたコンピュータプロセッサ。
【請求項３４】
請求項３３に記載のコンピュータプロセッサのためのプログラムを担持するコンピュータ読み取り可能デバイス。
【請求項３５】
単数又は複数の試薬容器に入った予め混合された試薬の単数又は複数のセットを内含する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法を実施するのに適した試薬キットにおいて、
−  各々の予め混合された試薬のセットが、
・  ４つの相補的クラスから取られたヌクレオチド、
・  複数の、任意には２、３又は４個の相補性クラスから取られたヌクレオチドを収納する容器、
を含み、相補性クラスのうちの少なくとも１つのクラスの中のヌクレオチドが、核酸鋳型に相補的な核酸のストランドに取込まれた場合に、該核酸鋳型に相補的な核酸のストランドのさらなる伸長を可能にし、
−  ４つの相補性クラス全てから取られたヌクレオチドが単一の容器に入って提供される場合には、相補性クラスのうちの１、２又は３個のものの中のヌクレオチドは、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれた場合、核酸鋳型に相補的な核酸のストランドのさらなる伸長を防止する、
試薬キット。
【請求項３６】
−  取込まれた又は放出された標識を検出することのできるイメージングコンポーネント、
−  １ステップセットあたり少なくとも１回、イメージングコンポーネントにとってアクセス可能であるような形で単数又は複数の付着された鋳型を保持するための反応チャンバ、
−  反応チャンバに対し試薬を提供するための試薬分配システム、
を含んで成る、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法を実施するための計器。
【請求項３７】
反応チャンバが付着された鋳型を提供し、イメージングコンポーネントは、少なくとも１００／cm2、任意には少なくとも１，０００／cm2、少なくとも１０，０００／cm2又は少なくとも１００，０００／cm2の密度でこの鋳型を解像できる、請求項３６に記載の計器。
【請求項３８】
イメージングコンポーネントが、光電子増倍管、フォトダイオード、電荷結合素子、ＣＭＯＳイメージングチップ、近視野走査顕微鏡、透視野共焦点顕微鏡、広視野落射照明顕微鏡及び全反射顕微鏡から成るグループの中から選択されたシステム又はデバイスを利用する、請求項３５又は３６に記載の計器。
【請求項３９】
イメージングコンポーネントが蛍光標識を検出する、請求項３５又は３６に記載の計器。
【請求項４０】
イメージングコンポーネントが、レーザー誘導された蛍光を検出する、請求項３９に記載の計器。
【請求項４１】
反応チャンバが、透明な表面、フタ及び試薬分配システムに該反応チャンバを付着させるためのポートを含む閉鎖された構造であり、透明な表面が内部表面上に鋳型分子を保持し、イメージングコンポーネントが該透明な表面を通してイメージングできる、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の計器。
【請求項４２】
ステム部分並びに第１及び第２のループ部分から成るＤＮＡ分子において、該ステム部分は第１のストランド及び第２のストランドから成り、該第１のストランド及び第２のストランドは長さが等しく、互いに相補的であり、かつアニールされており、第１のループ部分は、第１のストランドの３′末端を第２のストランドの５′末端に接合され、第２のループ部分は第１のストランドの５′末端に第２のストランドの３′末端を接合され、かくして遊離５′又は３′末端を全く持たないようになっているＤＮＡ分子。
【請求項４３】
ループ部分がローリング−サークル増幅のためのプライマ結合部位を含む、請求項４２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４４】
ループ部分が配列決定のためのプライマ結合を含む、請求項４２又は４３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４５】
任意には固体支持体に付着されたプライマに対するアニーリングを介して、固体支持体に付着された、請求項４２、４３又は４４に記載の多数の異なるＤＮＡ分子のアレイ。
【請求項４６】
−  ５′末端及び３′末端を有する第１のストランド及び５′末端及び３′末端を有する第２のストランドから成る２本鎖ＤＮＡ分子を提供する段階、及び
−  第２のストランドの５′末端に対し第１のストランドの３′末端を接合させるべく第１のリンカーをライゲートし、第１のストランドの５′末端に第２のストランドの３′末端を接合するべく第２のリンカーをライゲートする段階であって、リンカーがヘヤピン構造である段階、
を含んで成る、請求項４２、４３又は４４に記載のＤＮＡ分子の作製方法。
【請求項４７】
ＤＮＡ鋳型の多数のコピーを含む伸長されたＤＮＡ分子を生成するべく、請求項４３又は４４に記載のＤＮＡ分子上でローリングサークル増幅を実施する段階を含んで成る、ＤＮＡ鋳型の多数のコピーを生成する方法。
【請求項４８】
ＤＮＡ鋳型の多数のコピーを含む多数の伸長されたＤＮＡ分子を生成するべく、請求項４３又は４４に記載の多数のＤＮＡ分子上でローリングサークル増幅を実施する段階を含んで成る、多数のＤＮＡ鋳型の多数のコピーを生成する方法。
【請求項４９】
ローリングサークル増幅プライマ又はＤＮＡ分子が固体支持体に付着されている、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
伸長されたＤＮＡ分子内部のＤＮＡ鋳型の多数のコピー内の相補的ストランド間のアニーリングにより、伸長されたＤＮＡ分子を縮合させる段階をさらに含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５１】
伸長されたＤＮＡ分子が固体支持体上で縮合される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
伸長されたＤＮＡ分子内部の単数又は複数のＤＮＡ鋳型の多数のコピーを配列決定する段階をさらに含む、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、核酸配列決定に関する。本発明は、特に、遊離３′末端を伴う核酸ストランドが、配列情報が望まれている鋳型を含有する核酸にアニールされ、配列情報を提供するヌクレオチド取込みの決定を伴う第２のストランドの合成をプライムするために使用される、「合成による配列決定」（ＳＢＳ）に関する。本発明は一部には、既存の配列決定技術に付随するさまざまな問題を克服し標準的な試薬及び器具を用いてたった１日できわめて大量の配列を得ることができるようにする「クロマ配列決定」と呼ばれるものの中で非ブロック化ヌクレオチドを使用できるようにする的確な概念に基づいている。好ましい実施形態は、付加的な利点の達成を可能にする。本発明は同様に、配列分析用のアルゴリズム及び技術及び配列決定のための器具及びシステムにも関する。本発明は、当該技術分野において容易に利用可能な標準的なベンチトップ機器のみを使用して、膨大な配列決定の作業努力を自動化することを可能にする。
【０００２】
本発明には、任意には複数のヌクレオチド相補性クラスを付加する段階を少なくとも１つのステップが含んでいる２つ以上のステップでの、各ステップが合成されたストランド内への取込みのため考えられるヌクレオチド相補性クラスのうちの単数又は複数のもの、ただし任意には全てよりも少ないものを提供する段階を含み、各ステップセットが４つの考えられるヌクレオチド相補性クラスの全てを提供するステップを含む、反復するステップセット内の鋳型ストランドに相補的な第２のストランドのプライミングを受けた合成が関与する。好ましくは、これには、まず第１に合成されたストランド内への取込みのため４つの考えられるヌクレオチド相補性クラスのうちの３つを提供する段階、次に第４のヌクレオチド相補性クラスを単独で個別に提供する段階が関与する。ストランド伸長は、その他のヌクレオチドが存在しないことから、例えば第４のヌクレオチドの提供の時点で最後のヌクレオチド取込みステップと共に停止する。２回の停止の間のヌクレオチドの数及び任意にはその種類の決定は、鋳型の塩基組成及び／又は配列についての情報の急速な決定を可能にする。一度に単一の「停止ヌクレオチド」が使用される場合、伸長を停止させるために４つの異なるヌクレオチドの各々を用いて４回のランを実施することで、きわめて迅速かつ容易に完全な鋳型配列を決定するのに用いることのできる情報が提供される。
【０００３】
ゲノミック研究では、数多くの異なる方法が使用されているものの、直接的配列決定が群を抜いて最も価値の高いものである。実際、配列決定を充分効率良く行える場合には、ゲノミックスにおける主要な科学的問題のうちの３つ（配列の決定、遺伝子型特定及び遺伝子発現分析）全てに対処することが可能であろう。モデル種を配列決定でき、個体を全ゲノム配列決定により遺伝子型特定でき、かつ、ｃＤＮＡへの転換及び配列決定（各々のｍＲＮＡのコピーの数を直接計数する）によりＲＮＡ集団を徹底的に分析することが可能であろう。
【０００４】
配列決定により対処できる科学的及び医学的問題のその他の例としては、エピゲノミクス（メチル化されていないシトシンからウリジンへの重亜硫酸塩転換と次に転換されていない鋳型配列に対する結果として得られた配列の比較による、ゲノム内のメチル化シトシンの研究）、（酵母２ハイブリッド実験内で得られた配列決定ヒットによる）タンパク質−タンパク質相互作用、（染色体免疫沈降の後に得られたＤＮＡフラグメントの配列決定による）タンパク質−ＤＮＡ相互作用そしてその他多数、が含まれる。かくして、ＤＮＡ 配列決定のための効率の高い方法が望まれている。
【０００５】
しかし、マイクロアレイ及びＰＣＲフラグメント分析といったような補助的方法に置換わるためには、非常に高い配列決定処理能力が必要とされる。例えば、生きた細胞には、各々平均約２０００塩基の長さの約３００，０００個の伝令ＲＮＡコピーが含まれる。かくして、たった１個の細胞内でさえＲＮＡを完全に配列決定するためには、６億個のヌクレオチドをプローブする必要がある。沢山の異なる細胞型から成る複雑な組織においては、細胞型特異的写しがさらに希釈されることから、このタスクは一層むずかしくなる。これらの需要を満たすためには、ギガベースの一日処理能力が必要となる。以下の表は、各実験について必要とされる処理能力についてのいくつかの推定値を示す（相反する指示のないかぎり、ヒト）：
【０００６】
実験                                      処理能力
ゲノム配列（新規、１０ｘ）                  ３０Ｇｂｐ  
全ゲノム多形性                                ３Ｇｂｐ
完全ハプロタイプマップ（２００の個体）    ６００Ｇｂｐ  
遺伝子発現                                ６００Ｍｂｐ
エピゲノミクス                                ３Ｇｂｐ
一千万個のタンパク質相互作用              ４００Ｍｂｐ
全生物圏（１属あたり１種）              〜３００Ｔｂｐ
【０００７】
本発明は、上述のこと全てを、適正なコストで手の届く範囲内に置くものである。
【０００８】
ＤＮＡ配列決定方法
蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いたSangerの配列決定（Sanger et al. ＰＮＡＳ７４ 第１２号；５４６３−５４６７，１９７７）は、最も広く使用されている方法であり、９６毛管さらには３８４毛管のシーケンサで自動化に成功している。しかしながら、該方法は、鋳型の各々の塩基位置に対応する多数のフラグメントの物理的分離に依存し、かくして、超ハイスループット配列決定（現行の最高の計器は一日あたり最高２００万個の配列ヌクレオチドを生成する）まで容易に拡張可能ではない。
【０００９】
配列は、一連のプローブから選択されたプローブで標的ポリヌクレオチドを探査することにより間接的に得ることもできる。
【００１０】
ハイブリダイゼーションによる配列決定は、或る長さまでの考えられる全ての配列を表わす一連のプローブを使用し（すなわち、ｋがマイクロアレイ表面上に適合し得るプローブの数により制限されるものとして１組の全ｋ量体；１００万個のプローブでは、ｋ＝１０を用いることができる）、鋳型をハイブリッド形成させる。プローブセットから鋳型配列を再構築するのは、複雑であり、ハイブリダイゼーション反応速度が本来予測不可能なものであることかつより大きい鋳型を配列決定するのに必要とされるプローブの数の組合せ的爆発によってさらに困難になっている。たとえこれらの問題を克服できたとしても、各々の鋳型について何百万ものプローブを担持する１つのマイクロアレイが必要とされアレイは通常再使用不可能であることから、処理能力は必然的に低いものとなる。
【００１１】
ナノ細孔配列決定（ＵＳ Genomics, 米国特許第６，３５５，４２０号明細書）は、長いＤＮＡ分子が２つの反応チャンバを分離するナノ細孔を通って強制されるにつれて、結合したプローブをチャンバ間の伝導度の変化として検出できるという事実を利用している。考えられる全てのｋ量体のサブセットでＤＮＡを装飾することにより、部分配列を演繹することが可能である。これまで、ナノ細孔アプローチにより完全な配列を得るための実現可能な戦略は全く提案されていないが、それが可能であったならば、原則的に驚異的な処理能力（３０分以内で約１個のヒトゲノム）が達成可能であると思われる。
【００１２】
合成による配列決定（ＳＢＳ）のためにさまざまなアプローチが設計されてきた。
【００１３】
配列決定処理能力を増加させるためには、例えばガラス表面又は類似の反応チャンバ上で並行して多数の鋳型上の各塩基の取込みを視覚化させることができることが望ましいと思われる。これは、ＳＢＳによって達成される（例えばMalamede et al, 米国特許第４８６３８４９号明細書、Kumar 米国特許第５９０８７５５号明細書を参照のこと）。ＳＢＳに対する２つのアプローチが存在する。つまり各々の取込まれたヌクレオチドから開放された副産物が検出されるか、又は永久的に付着された標識が検出されるかである。
【００１４】
パイロ配列決定（例えば、国際公開第９３２３５６４号パンフレット）は、無機二リン酸塩（ＰＰｉ）の形で各々の取込まれた単量体の副産物を検出することにより鋳型の配列を決定する。全ての鋳型分子の反応を同期化された状態に保つためには、一度に１つずつ単量体が付加され、次の付加の前に取込まれていない単量体が分解される。しかしながら、単独重合体サブ配列（同一単量体のラン）は、多数の取込みを防止できないことから問題を提起する。同期化は（鋳型の小さい画分における取込み欠如又は該取込みが結局は真のシグナルを圧倒することになるため）、最終的に失敗に終り、最高の現行システムは、約２００，０００塩基／日の組合わされた処理能力で約２０〜３０塩基しか読みとることができない。
【００１５】
Sanger 配列決定法が各々の鋳型について１つの精巧な器具（すなわち毛管）を必要とする一方で、パイロ配列決定は、単一の反応チャンバ内での並列化に容易に従うことができる。米国特許第６２７４３２０号明細書は、そのとき並列に進捗できるパイロ配列決定反応内で分析された光ファイバに付着された縦列反復された線形１本鎖ＤＮＡ分子を生成するための、ローリングサークル増幅の使用について記述している。原則的に、かかるシステムの処理能力は、表面積（鋳型分子数）、反応速度及びイメージング機器（解像度）によってのみ制限される。しかしながら、ＰＰｉが検出可能な信号に変換される前に検出器から遠くへ拡散しないようにする必要性は、すなわち、反応部位の数が実際上制限されなくてはならないということを意味している。米国特許第６２７４３２０号明細書中では、各々の反応は、光ファイバの先端部にある小型反応容器内で発生するように制約され、かくしてファイバ１本あたりの配列数を１に制限している。
【００１６】
さらに一層制限的であるのは、パイロ配列決定によって達成される短かい読取り長（＜３０ｂｐ）である。かかる短い配列は、全ゲノム配列決定では直接有用でなく、複雑な平衡化反応セットが読取り長をはるかに拡張するのを困難にしている。最高１００ｂｐの読取り長が報告されたことは、極くたまにしかも特定の鋳型についてしかなかった。
【００１７】
放出された標識の検出を伴う類似のスキームが米国特許第６２５５０８３号明細書中に記述されている。ヌクレオチドの逐次的付加及びそのときエキソヌクレアーゼで解裂される標識の検出を伴うスキームが国際公開第０１／２３６１０号パンフレット中で記述されている。
【００１８】
放出された標識又は副産物を検出することのもつ主要な利点は、鋳型がその後のステップにおいて無標識状態にとどまるという点にある。しかしながら、シグナルは、鋳型から遠くに拡散することから、マイクロアレイといったような固体表面上でこのような配列決定スキームを並行化するのは困難であり得る。
【００１９】
放出された副産物を検出する代りに、成長する重合体に付加されるにつれて各々の取込まれた核酸鋳型Ｄを検出することができる。原則として、かかるスキームは、パイロ配列決定と同じように進められる（一度に１つの塩基を付加し、４個の天然ヌクレオチドの間で反復させる）が、代りに標識されたヌクレオチド類似体（すなわち蛍光）を使用することになる。一例を挙げると、Polony 配列決定（Mitra ＲＤ，Church ＧＭ., Nucleic Acids Res １９９９．１２月１５日；２７（２４）；ｅ３４「数多くの個々のＤＮＡ分子のインサイチュ局在性増幅及び接触複製」）は、蛍光標識されたヌクレオチドの逐次的付加に基づいている。
【００２０】
各々の取込まれたヌクレオチドに付着した標識を検出することは、各ステップで生成されるシグナルを除去し、減算するか又は次のステップの準備として物理的に消光しなければならないという点で、さらに問題を提起する。かかる除去は、例えば光退色することによってか又はヌクレオチドと標識の間に解裂可能なリンカーを用いることによって達成可能である。例えばPolony 配列決定は、ヌクレオチドと蛍光色素の間にジチオールリンカーを担持する特別に設計された蛍光ヌクレオチドを使用する。未公開の観察結果によると、該リンカーは、少なくとも９９.８％の純粋なヌクレオチドまでジチオトレイトールといったような還元剤を用いて効率良く解裂され得る。
【００２１】
ＳＢＳ方法における読取り長は主として各ステップ内に発生する同調性の喪失によって制限されることから、配列決定反応に対し４つのヌクレオチド全てを付加しそれでもなお１つの塩基の各々の取込みの間に反応を中止する能力を保持することができることが望ましいと思われる。このようにして、４つのヌクレオチドは全てつねに利用可能となり（かくして読取込み率を制限する）、なおかつ各々の取込まれた塩基を監視することが可能となる。
【００２２】
多数の研究者が独立して、時に塩基付加配列決定戦略（ＢＡＳＳ）と呼ばれる解決法を考案してきている。反応は、３′ブロックされた単量体の使用により、一度に複数のステップに取りかかることがないように防止されているが、ブロックは不安定であり（例えば光解裂可能であるか又は化学分解可能である）従って次の合成ステップの準備として３′−ＯＨ基を露呈することが可能である。
【００２３】
ＢＡＳＳには次の段階が含まれる：
１．  １本鎖鋳型及びアニールされた５プライマを提供する段階；
２．  ３′−ＯＨ−ブロックされた蛍光ヌクレオチドを付加する段階；
３．  ポリメラーゼを付加し、単一のヌクレオチドを取込む段階；
４．  蛍光を読取る段階；
５．  例えば光解裂によりブロック基を除去する段階；
６．  ステップ２〜５を反復する段階。
【００２４】
この主題についての変形形態は、エキソヌクレアーゼを用いて除去される永久的に３′−ＯＨでブロックされたヌクレオチド（国際公開第１／２３６１０号、国際公開第９３／２１３４０号パンフレット）又は官能性３′−ＯＨ基に復元され得る不安定な３′−ＯＨブロックされたヌクレオチド（米国特許第５３０２５０９号明細書、国際公開第 ００／５０６４２号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第９３／０５１８３号パンフレット）を使用する。
【００２５】
ＢＡＳＳスキームは全て、以下の共通点を有する。
・  合成が一度に複数のステップを開始するのを防ぐために、ブロック済み又は終止ヌクレオチドが用いられる。
・  各ステップで取込まれるヌクレオチドは同様に、通常は蛍光色素を用いて標識される。
・  各サイクルの終りで、次のサイクルの準備として、ブロック部分（又は全終端ヌクレオチド）は除去される。
【００２６】
これらの必要条件が合わさって、ＢＡＳＳにおいて用いられる酵素に対して厄介な要求が課せられる。すなわち、
・  これらの酵素は、その３′（ここでは通常酵素によって修飾が寛容されていない）で同時にブロックされ蛍光標識されているヌクレオチドを受入れなくてはならない。
・  これらは、全ての鋳型のうちの無視できる画分しか各サイクル内で同調性から外れていないようにするべく効率上充分なこのようなヌクレオチドを取込まなくてはならない。
・  これらは、かかるヌクレオチドの塩基・対合を緊縮的に弁別する能力を有していなくてはならない。
・  これらは、ブロック基又は終結ヌクレオチドを早期に除去してはならない。
【００２７】
これまで誰もＢＡＳＳを作動させることができなかったという事実は、これらの問題点が克服不可能なものであることを示唆している。例えば（Metzker et al.「新規の３′修飾済みデオキシリボヌクレオシド５′−トリホスフェートによるＤＮＡ合成の終結」、Nucleic Acids Res １９９４：２２（２０）：４２５９−６７）においては、調査された８個の酵素のうち、いずれも、蛍光標識の付加的な複雑さがない場合でさえ、３′−ブロックされたｄＵＴＰ及び３′−ブロックされたｄＣＴＰの両方を寛容する能力をもたなかった。かくして、４つのヌクレオチド全ての３′ブロックされ蛍光標識されたバージョンを受容できる１つの酵素を発見することは、ほとんど望みがないものと思われる。
【００２８】
結論としては、取込みによる配列決定方法を有効にできたとしたならば、１つの表面に並列に付着された何百万個もの鋳型を恐らく配列決定できることだろう。放出された標識ではなくむしろ取込まれた標識を検出することのもつ主たる魅力は、１つの表面上に反応を並列化させることができるという点にある。例えば、１０×１０cmの表面上では、かかるシステムは（１鋳型／１０μｍというポワソン分布を仮定して）１サイクルあたり６０秒で例えば３７００万個の鋳型上において最高６００，０００ｂｐ／秒で配列決定し、５０Ｇｂ／２４時間を達成する能力をもつことができると思われる。原則的に、このようなシステム上では毎日１０個のヒトゲノムを配列決定することができるだろう。該システムのコストは、蛍光スキャナに匹敵するものとなり、ランニングコストは、現行のSangerシーケンサのものに匹敵すると思われる。
【００２９】
そのゴールを達成するための主要な残る障害は、まず第１に、ＳＢＳ内の読取り長が大きなゲノムを配列決定する上で有用となるには短かすぎること、そして第２に、１つの表面上で充分に高い密度で鋳型を置くための信頼性ある方法が開発されていないことにある。
【００３０】
本発明はさまざまな態様で、先行技術の問題を巧く解決するものである。
【００３１】
本発明は、以前に記述されてきた合成による配列決定方法の問題点の大部分を回避しながら、この方法を改善する新規の配列決定戦略の開発に基づくものである。これは、並列化が容易で、各単量体の取込みを直接視覚化し（すなわちいかなるサイズ分画も必要とされない）、長い読取り長の可能性を提供する戦略である。
【００３２】
本発明は、ＳＢＳ方法では、これまで仮定されてきたことに反して、（パイロ配列決定又は国際公開第１／２３６１０号パンフレットの場合のように一度に１つずつ塩基を付加することによってか又はＢＡＳＳの場合のようにブロックされたヌクレオチドを使用することにより）各位置で中止する必要がないということの認識に基づくものである。
【００３３】
その代り、配列決定は、特定の「停止」ヌクレオチドの各々の出現から次の出現まで飛び超えて、ホッピングにより進行し得る。介入するヌクレオチドは標識されていてよい。停止ヌクレオチドは標識されていてよい。こうして、ブロック基が使用されるスキーム（この場合各々のステップは生産性のあるものであるがデブロックには問題がある）及び同期化が１度に１個塩基を付加することによって達成されるスキーム（この場合、デブロックは、大部分のステップを非生産的にし、同調性喪失問題を深刻にするという犠牲を払って回避されている）の間の理想的な妥協案でありうる１つの改良が提供される。同様に、ＢＡＳＳの場合と比較して、本発明はブロック基と同じヌクレオチド上に標識を置く必要性を無くする。
【００３４】
本発明の１つの態様は、１つのステップが潜在的に複数のヌクレオチドの取込みを可能にする、ステップ式のヌクレオチドの取込みを特徴とする、合成による配列決定を提供している。
【００３５】
好ましい実施形態においては、１つのステップは潜在的に、基礎にある鋳型配列に応じて、４つの考えられるヌクレオチドのうちの３つの取込みを可能にする。好ましくは、別の１つのステップが第４の考えられるヌクレオチドすなわち第１のステップにおいて潜在的に取込まれ得た３つ以外の残りの１つのヌクレオチドの取込みを可能にする。
【００３６】
その他の実施形態においては、少なくとも１つのステップが複数の、ただし考えられるヌクレオチド全てよりは少ないヌクレオチドの取込みを可能にする、４つのヌクレオチド全ての取込みを１つのステップセット内で可能にするべく、異なるステップが実施される。以下でさらに詳述するように、先行技術の方法は、共に「１−１−１−１」プロセスとして要約できる、反復され得る１つのセット内の４つの別々の反復されるステップを有し、各ステップが原則として４つ（基礎を成す鋳型配列に応じて取込まれるヌクレオチドの実際の数）のヌクレオチドのうちのわずか１つだけの取込みを可能にするものとしてか、或いは、各ステップ内の４つのヌクレオチドのうちの１つのみの取込みを同じく可能にする４つのブロックされたヌクレオチド全てを含む反復される単一のステップを有するものとして、要約可能である。「４」プロセスとして要約できる、原則として４つのヌクレオチド全ての取込みを可能にする単一のステップは、配列決定されたストランドが直ちに鋳型の端部に重合されることになるため、配列決定のためには有用ではない。異なる実施形態において本発明は、「４」又は「１−１−１−１」以外のパターンに適合するステップ式のヌクレオチドの取込みを特徴とする、合成による配列決定方法の実施を可能にする。かくして、好ましい実施形態においては、すでに言及した通り、「３−１」に適合する１つのステップセットでヌクレオチドが取込まれる。その他の実施形態では、１つのステップセットが「２−２」又は「１−２−１」に適合するか、又はヌクレオチドが１つのステップセット内で反復されうる不規則なパターン（例えば「２−２−３」）に適合する。ステップセットは、望まれる通りに反復される。その上、異なるパターンをもつステップセットの組合せを作ることもできる。
【００３７】
本発明の１つの態様に従うと、１つの核酸について配列及び／又は塩基組成情報を決定する方法において、
（ｉ）核酸鋳型の第１のストランドにアニールされた核酸の遊離３′末端が、鋳型依存性核酸ポリメラーゼにより核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内にヌクレオチドを鋳型配列依存的に取込むことによって核酸鋳型に相補的な核酸のストランドの伸張を可能にする、核酸鋳型を含む第１のストランドを含む核酸を提供する段階；
（ｉｉ）該核酸の塩基組成又は配列を示す情報を得ることができるようにする核酸鋳型に相補的な核酸のストランドを伸張させるため、所望の回数だけ反復させられるか又はその他の単数又は複数のステップのセットを組合わせて実施される、単数又は複数のステップセットを実施する段階であって、
１つのステップが、
（ａ）−  １つの核酸鋳型を含む第１のストランドを含む核酸、
−  該核酸鋳型の第１のストランドにアニールされた１つの核酸ストランドの前記遊離３′末端及び
−  鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、
の存在下で、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内へのヌクレオチドの核酸ポリメラーゼによる鋳型依存性取込みのための１、２、３又は４個のヌクレオチドから選択されたヌクレオチドを提供する段階であって、ここで各々の前記ヌクレオチドが天然のヌクレオチドであるか又はＤＮＡストランドの遊離３′末端でＤＮＡストランド内への核酸ポリメラーゼによる鋳型依存性取込みの能力をもつヌクレオチド類似体であり、各々の前記ヌクレオチド相補性クラス内でヌクレオチド及びヌクレオチド類似体が、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）のうちの１つに対し相補的である段階、
及び
（ｂ）取込まれていないヌクレオチドを除去するか又は不活性化する段階、
を含み、
１セットのステップ内で、
−  ４つのヌクレオチド相補性クラス全てから選択されたヌクレオチドが提供され、鋳型依存性取込みのために利用可能であり、
−  少なくとも１つのステップにおいて、２つ以上、任意には２、３又は４個のヌクレオチド相補性クラスから選択されたヌクレオチドが提供され、鋳型依存性取込みのために利用可能であり、ヌクレオチド相補性クラスのうちの少なくとも１つの中のヌクレオチドは、該核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれている場合、核酸鋳型に相補的な核酸のストランドのさらなる伸長を可能にし、
−  任意には、２つ以上のステップにおいていかなるヌクレオチド相補性クラスも提供されないか、又は、各々のヌクレオチド相補性クラスが、ステップセットのうちの１つ以下のステップ内で提供されており；かつ
４つの相補性クラス全てから選択されたヌクレオチドが１つのステップで提供された場合には、該ヌクレオチド相補性クラスのうちの１、２又は３個の中のヌクレオチドは、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれた場合、核酸鋳型に相補的な核酸のストランド及び多数のコピーが存在するならば存在する全てのコピーのさらなる伸長を防ぐことになる；
実施段階、
（ｉｉｉ）前記ステップの多数のセットを実施し、ステップセットを反復させかつ／又は異なるステップセットと組合せた形でステップセットを実施する段階、
（ｉｖ）取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量がセットとして決定されている各々のセット内の少なくとも１つのステップ内で核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量を決定することにより、少なくとも１つのステップセット内で核酸鋳型に相補的な核酸のストランド内に取込まれたヌクレオチドの性質及び／又は数量を決定する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００３８】
指摘した通り、本発明は、サイズ分画の無い配列決定を可能にする。
【００３９】
（配列情報及び／又は塩基情報が望まれている）核酸（例えばＤＮＡ）鋳型の第１のストランド５′にアニールされた核酸の遊離３′末端は、第１のストランドにアニールされたプライマ（例えばオリゴヌクレオチドプライマ）により提供されてもよいし、又、第１のストランドにアニールされた第２のストランド内でニックにより提供されてもよいし（この場合、当初核酸鋳型にアニールする第２のストランドの部分は伸長に変位又は分解される）、又はセルフループつまりループバックして、セルフプライミングを可能にする第１のストランドの連続部分により提供されてもよい。
【００４０】
ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を、その塩基対合特性によって定義づけすることができる。かくして天然アデノシンと相補的に取込むことになる全てのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、かくして、チミンのヌクレオチド相補性クラスに属し、天然グアニンに相補的に取込むものは、シトシンのヌクレオチド相補性クラスに属し、天然チミンに相補的に取込むものは、アデノシンのヌクレオチド相補性クラスに属し、天然シトシンに相補的に取込むものは、グアニンのヌクレオチド相補性クラスに属する。ヌクレオチド相補性クラスはかくして、鋳型特異的重合との関係におけるヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の論理的特性を記述し、定義する。
【００４１】
ヌクレオチドは、潜在的に、鋳型依存性ポリメラーゼによる取込みのため、反応培地内に提供されることにより取込みを許される。
【００４２】
核酸鋳型はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得、核酸ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド類似体であり得る。
【００４３】
核酸鋳型はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得、核酸ポリメラーゼはＤＮＡ依存性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼであり得、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド類似体であり得る。
【００４４】
核酸鋳型はがリボ核酸（ＲＮＡ）であり得、核酸ポリメラーゼは逆転写酵素であり得、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド類似体であり得る。
【００４５】
本発明のさまざまな態様の好ましい実施形態においては、複数の異なるヌクレオチドが潜在的に取込まれる１つのステップ内で用いられるヌクレオチドは、標準ヌクレオチドの中から選択される。
【００４６】
本発明のさまざまな態様のいくつかの好ましい実施形態においては、異なるヌクレオチドのうちの１つだけが潜在的に取込まれる１つのステップで用いられるヌクレオチドは、標準ヌクレオチドの中から選択されたヌクレオチドである。
【００４７】
その他の実施形態においては、本書のその他の場所でさらに論述されているように修飾されたヌクレオチド又は類似体を利用することが可能である。
【００４８】
本発明で利用されるヌクレオチドは、標識されていてよく、標識作業は蛍光標識を含み得る。（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの相補性クラスの間のような）異なるヌクレオチドを、異なる標識、例えば異なる色であり得る異なる蛍光標識で、標識することができる。
【００４９】
指摘した通り、本発明は、４又は１−１−１−１以外のスキームでのヌクレオチドの取込みを特徴とする合成による配列決定方法を提供する。
【００５０】
かくして好ましくは、取込みスキームはまず最初に、２又は３個のヌクレオチドの潜在的取込みを可能にし、その後一般に、取込まれていないヌクレオチドを除去するための洗浄ステップの後、別のステップで、取込みスキームは２個のヌクレオチド又は１個のヌクレオチドの潜在的取込みを可能にする。ステップセットの組合せを作って全体的反応スキームを提供することができる。
【００５１】
当然のことながら、当該技術分野において利用可能な知識及び技術に従って、ＤＮＡストランドの３′末端で鋳型依存性核酸取込みを実施するために、反応培地内に適切な条件が提供される。
【００５２】
１つの実施形態においては、本発明は、その第１ストランド５′にアニールされた核酸ストランドの遊離３′末端（例えばアニールされたプライマ）がＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡストランドの合成を可能にするＤＮＡ鋳型を提供する段階、鋳型に相補的な伸長ステップ内へのヌクレオチドの取込みのための条件下でポリメラーゼの存在下で第１ステップにて標識済みヌクレオチド（「介入」ヌクレオチドと呼ばれる）のセットを付加する段階、及びそれに続いて、取込まれなかったヌクレオチドを除去するべく洗浄し、その後伸長ステップＤ内へのヌクレオチドのプライマベースの取込みのための条件下でポリメラーゼの存在下で第２のステップ内で第２の標識済みヌクレオチド（「停止」ヌクレオチド）セットを付加する段階、それに続いて、取込まれなかったヌクレオチドを除去するべく洗浄し取込まれたヌクレオチドの標識を見極める段階、といったステップ又はステップセットの１サイクルを含む方法を提示している。該ステップセットは、望まれるだけの回数又はサイクル数だけ反復可能である。
【００５３】
かくして、各ステップで、取込まれたヌクレオチドの数（順序ではなく）が決定される。異なるヌクレオチドのための標識が区別可能である場合、各々の取込まれたヌクレオチドの数（順序ではなく）は、決定され終っていることになる。
【００５４】
この要領で、すなわち標識の決定によって得られた取込まれたヌクレオチドについての情報は、クロマと呼ばれる。クロマは、標準的ＤＮＡ 配列であるが、
・  それはサイン配列としても使用され得、既知のＤＮＡ配列に整列させることができる。
・  （通常）４つのこのような配列のセットを（以下で詳しく説明するように）標準ＤＮＡ配列内に再組立てすることができる。
【００５５】
本発明の実施形態及びクロマの概念は、介入ヌクレオチドとしてｄＡ、ｄＣ及びｄＧを使用し例えば、
ｄＴ［ｌＡ，２Ｃ，１Ｇ，ｌＴ］−［２Ａ，２Ｃ，１Ｇ，３Ｔ］−［２Ａ，２Ｃ，ｌＧ，ｌＴ］−［０Ａ，ｌＣ，０Ｇ，ｌＴ］
と記される停止ヌクレオチドとしてｄＴを用いることによって得られる標準的配列を参照して例示することができる。なおここで、カッコ内の数字は、その標識強度によって測定されるようなｄＴの各々の出現の間の各々の介入するヌクレオチドの存在量、とそれに加えて連続するｄＴの数を示している。
【００５６】
複数のＤＮＡ配列が例えば
ＡＣＣＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＡＣＡＧＣＴＣＴ
ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＣＴ、等．．．
といったデータを生成し終えている可能性がある。
【００５７】
原配列を明確に決定するべく（停止ヌクレオチドとして引き続いて４つのヌクレオチドの各々を用いて）４つのこのような配列読取りから得られた情報又はクロマを使用する塩基コール戦略が、以下で提供されている。
【００５８】
１つの態様においては、本発明の好ましい実施形態が、以下の段階を含む方法（スキームＩ）を提供している：
１．  プライマとして作用するべく３′末端をもつアニールされたＤＮＡを伴う１本鎖鋳型を提供する段階。
２．  鋳型に相補的な少なくとも１つのヌクレオチド（「停止ヌクレオチド」と呼ばれる）が標識されたヌクレオチドセットから排除されるような形で選択された単数又は複数の標識されたヌクレオチド（「介入ヌクレオチド」と呼ばれる）のセットを付加する段階。通常、区別可能な標識を担持する３つのヌクレオチドが付加される（第４の天然ヌクレオチドは停止ヌクレオチドである）。
３．  任意には、単数又は複数のブロックヌクレオチド（標識されたヌクレオチドとは異なる）を付加する段階。これらは同様に「停止ヌクレオチド」でもある。例としては、照明を受けた時点で３′−ＯＨを残す光解裂性基を担持し得る３′−０修飾済みヌクレオチド又はその他の修飾、アクリルヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドが含まれる。
４．  任意には、標識された又はブロックヌクレオチドのセット内にいかなる補体ももたない鋳型位置における読込みを防ぐのに役立つ、単数又は複数の取込みしない阻害物質ヌクレオチド（標識されたヌクレオチド及びブロックされたヌクレオチドと異なるもの）を付加する段階。例としては、５′−ジ−及びモノ−リン酸塩ヌクレオチド、５′−（アルファ−ベータ−メチレン）三リン酸塩ヌクレオチドが含まれる。
５．  成長するストランドにヌクレオチドを付加させる条件下で適切なポリメラーゼと共にインキュベートする段階。
６．  取込まれていないヌクレオチドを洗い去る段階。
７．  ステップ３で何らかのブロックヌクレオチドが付加された場合には
ａ．  例えば光解裂、酵素転換又は化学反応により、ブロック部分を除去する段階。
ｂ．  代替的には、ブロックされていないヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ処理及びその後の取込みにより全ヌクレオチドを置換する段階（例えば国際公開第１／２３６１０号、９３／２１３４０号パンフレット）。
８．  鋳型内に存在する全てのヌクレオチドに確実に補体が確保されるようにするのに必要とされる残留ヌクレオチド（「停止ヌクレオチド」）を付加し、成長するストランドにヌクレオチドを付加させる条件下で（必ずしもステップ５と同じでない）ポリメラーゼと共にインキュベートする段階。停止ヌクレオチドは、任意には、標識され得かつ／又は３′ブロックされ得る（例えばＢＡＳＳの場合のように）。
９．  取込まれていないヌクレオチドを洗い去る段階。
１０．  各々の標識されたヌクレオチドの存在及び／又は数量を検出する段階。
１１．  任意には標識及び／又は３′ブロック基を除去するか又は無効化する段階。例えば、蛍光標識を光退色させることができる。
１２．  所望の数のサイクルが完了するまでステップ２〜１１を反復する段階。
【００５９】
かかる配列決定方法は、その単純さと同時にそれがロバストな同期化方法を提供できることを理由として、固相上の並列化に特に適している。新鮮なプライマでステップ１から再開することにより、スキームを多数回反復することが可能である。
【００６０】
ステップ３及び８内で付加されたヌクレオチドは、それらが（ブロックされるか又は不在であることによって）ステップ５内でその補体を超えて進行するべく重合を防止するため、停止ヌクレオチドと呼ばれている。例えば、ステップ１から４回反応が実施される場合、４つの天然ヌクレオチドの各々を停止ヌクレオチドとして使用することが可能である。
【００６１】
プライマは、鋳型に対する塩基相補性によってアニールし、遊離３′末端を残し、この末端に、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって１つずつヌクレオチドを付加することができる。指摘した通り、２本鎖ＤＮＡ分子の１本のストランドをニックすることによってか又は１本鎖の遊離３′末端がセルフプライミングのためにループバックできるようにすることによって、遊離３′末端を生成することができる。
【００６２】
注：「標識された」分子という語は、純粋な標識された分子ならびに標識された分子とされていない分子の混合物を内含するものとして考えられるものとする。例えば、標識されたｄＴＴＰは、フルオレセインで標識されたｄＴＴＰ又はそれと標識されていない標準のｄＴＴＰの混合物であり得る。標識されたものとされないものの最適な比率は、次のような複数の因子によって決定される。
・  計器のノイズを克服するのに充分なシグナルを得る必要性。例えば、Rerkin Elmer Scan Array, ２.５ 蛍光色素／画素は、ノイズレベルの３倍のシグナルを生成する。
・  蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ、この結果として１つの蛍光色素がもう１つの蛍光色素を消光させることになる）を回避するため多数の蛍光色素を至近距離に置くことを避ける必要性。ＦＲＥＴは、距離の６乗で崩壊するが、数個のヌクレオチドの範囲にわたりなお重大であり得る。
・  （かさ高い蛍光色素の立体効果によって阻害され得る）ポリメラーゼによるその後のヌクレオチド取込みの阻害を回避するべく多数の蛍光色素を至近距離に有することを避ける必要性。
・  もう１つのオプションとして、例えば標識されたアクリル又はジデオキシヌクレオチドを用いることによってか又は３′−ＯＨ上又はその近くに標識を置くことによって、標識されたヌクレオチド画分に成長する鎖を強制的に終結させることもできる。標識されたヌクレオチドが全てのヌクレオチドのわずかな画分のみを構成しているかぎり、終結によりひき起こされるシグナルの喪失は、有意でないものにとどまり、一方修飾されたヌクレオチドに対する酵素の親和性が低いことによってひき起こされる同調性の喪失は、完全に回避できる。
【００６３】
該発明人らの研究室での作業によって、標識されたヌクレオチドのうちの２.５％以下が巧く作用することがわかった（以下の例を参照のこと）。鋳型が１００ｂｐの配列の１０００の縦列反復されたコピーであると仮定すると、鋳型１つあたり少なくとも２５の蛍光色素が各々の取込まれたヌクレオチドについて得られる（すなわち各々の鋳型が１画素以内である場合、Perkin Elmer ScanArray上でノイズレベルの１０倍を上回る）。平均的サイクル１回で４回のヌクレオチドが取込まれると仮定すると、標識は平均１０００塩基離して間隔どりされ、消光及びポリメラーゼ阻害の両方を回避する。
【００６４】
本発明のさらなる実施形態においては、スキームＩ（例えば）は、ポリメラーゼについての制約のいくつかを緩和させるＢＡＳＳの１つの変形形態を可能にする。停止ヌクレオチドが標識されずにブロックされている一方で、介入ヌクレオチドのセットが標識されているもののブロックされていない場合には、４つのヌクレオチド全てを、単一のステップで混合物として付加し、次に上述の通りに洗浄し走査することができる。ブロックされたヌクレオチド及び標識されたヌクレオチドの両方を受諾するポリメラーゼを使用することもでき、そうでなければ、異なるポリメラーゼを用いて、第１ステップで標識された介入ヌクレオチドを付加し、第２のステップでブロックされた停止ヌクレオチドを付加することもできる。このような修飾されたスキーム用のクロマは、いかなる取込みも伴わない隣接するサイクルとして単独重合体が検出され、それらが各々、単一の停止ヌクレオチドが取込まれている状態で終結し、かくして一回のみのランで単独重合体を満たすのではなくむしろそれを段階的に走査する、という点において、異なっている。
【００６５】
このようなスキームにおいては、光解裂可能な蛍光色素（以下参照）ならびに光解裂可能な３′−ブロック基を使用することが望ましいかもしれない。代替的には、穏やかな化学処理により除去可能なブロック基、例えばKamal et al.（Tetrahedron Letters １９９９，第４巻、ｐ３７１〜３７２）内に記述されているアリル基を使用することもできる。
【００６６】
特に単純な実施形態においては、本発明の１態様は次の段階を含む１つの方法（スキームＩＩ）を提供する：
１．  プライマとして機能するため、アニールされたＤＮＡストランド上に遊離に３′末端を伴う１本鎖鋳型を提供する段階；
２．  例えば区別可能な蛍光標識といった区別可能な標識を担持する３つのヌクレオチドを付加する段階、
３．  任意には、（標識されたヌクレオチドとは異なる）単数又は複数の取込みしない阻害物質ヌクレオチドを付加する段階。その例としては、５′−ジ及びモノ−リン酸塩ヌクレオチド、５′−（アルファ−ベーターメチレン）三リン酸塩ヌクレオチドが含まれる。
４．  成長するストランドにヌクレオチドを付加させる条件下で適切なポリメラーゼと共にインキュベートする段階。
５．  取込まれていないヌクレオチドを洗い去る段階。
６．  残りのヌクレオチド（例えば蛍光標識で標識されているもの）を付加し、成長するストランドにヌクレオチドを付加させる条件下で、（必ずしもステップ５と同じでない）ポリメラーゼと共にインキュベートする段階。
７．  取込まれていないヌクレオチドを洗い去る段階。
８．  各々の標識されたヌクレオチドの存在及び数量を検出する段階。
９．  標識を（例えば、必ずしも全てのサイクルにおいてではなく光退色させること又はジスルフィドリンクを解裂させるため例えばジチオトレイトールで化学処理することにより）標識を無効化する段階。
１０．  所望のサイクル数が完了するまで、ステップ２−７を反復する段階。
【００６７】
例えば、ステップ２でｄＡ／ｄＧ／ｄＣ（例えば赤／緑／青で標識される）を使用し、次にステップ６でｄＴ（例えば黄で標識される）を付加することができる。ステップ４では、鋳型内にｄＡが最初に出現するまで任意の数のｄＡ、ｄＧ及びｄＣを付加し、次に相補性ヌクレオチドが不在であることを理由にして停止することになる。ｄＡ／ｄＧ／ｄＣについてステップ８において読取られる蛍光（例えば赤／緑／青）は、各々のｄＴの間のｄＡ、ｄＧ及びｄＣの数に正比例することになり、一方取込まれたｄＡについての蛍光（例えば黄）は、中断されていないｄＴｓの数に正比例することになり、スペクトル分離の後に、各貢献を定量化することができる。得られた配列は一般に各々のｄＴ間のｄＡ、ｄＧ及びｄＣの数（順序ではなく）を与える４つの数字のシーケンスとして記すことができる。
【００６８】
例えば、配列ＡＣＧＣＴＡＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＴＴＣ（すなわち鋳型ＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＡＡＧ）は、［１Ａ，２Ｃ，１Ｇ，１Ｔ］−［２Ａ，２Ｃ，１Ｇ，１Ｔ］−［２Ａ，２Ｃ，１Ｇ，２Ｔ］−［０Ａ，１Ｃ，０Ｇ，０Ｔ］として記すことができる。
【００６９】
４つの可能性の間で停止ヌクレオチドを変動させてスキームＩＩに従った４つの異なる反応を実施することにより、４つの反応のうちの１つの中で各々の異なる塩基に１つの停止が存在することを保証することができる。
【００７０】
蛍光色素は使用が便利なものであるが、全ての蛍光色素が退色させ易いものではない。上述の手順では、各サイクルについてそれらを除去、不活性化又は減算できるかぎりにおいて、その他の種類の標識を使用することができる。しかしながら、さらなる実施形態においては、標識のより広い選択を可能にするために、除去（例えば蛍光色素の光退色）を、任意には例えば以下の通りの完全再開で置き換えることもできる。
【００７１】
最初に、１つのサイクルを、標識された（例えば蛍光）ヌクレオチドで実施する。新たに合成されたＤＮＡストランドを例えばホルムアミド処理により除去し、プロセスを再開するために新鮮なプライマをアニールする。今度は、標識されていないヌクレオチドで１サイクルを実施し、その後、標識されたヌクレオチドで１サイクルを実施する。該プロセスを、毎回連続してより多くの未標識ヌクレオチドサイクルで反復する。このようにして、各再開における最後のサイクルのみがいつも標識され、かくして（例えば蛍光色素を退色させるため）先行サイクルから標識を除去する必要がなくなる。
【００７２】
これと同じアプローチは、テープレコーダの読取りヘッドを動かすのと幾分か似た要領で、対象でない領域の上を飛び超すためにも使用可能である。
【００７３】
光退色に対する代替案として、ヌクレオチドと蛍光色素の間で解裂可能なリンカーを担持する修飾された蛍光ヌクレオチドを使用することができる。例えば、ジチオトレイトールといったような還元剤によって効率良く解裂され得る、ジスルフィド結合を担持するこのようなヌクレオチドがこれまでに記述されてきた（化学構造を含めた詳細については、例えばhttp;/cbcg．lbl.gov/Genome9/Talks/mitra.pdfといったブラウザを用いてインタネット上で見い出すことのできる、配列決定及び遺伝子型特定のためのpolony技術に関するRob Mitra及びGeorge Churchの研究を参照のこと）。同様にして、Li et al.（ＰＮＡＳ２００３、第１０巻、No.２ ｐ４１４−４１９）も、感光性２−ニトロベンジルリンカーを含む光解裂可能な蛍光ヌクレオチドについて記述している。
【００７４】
スキームＩＩに従った方法は、次のような多数の利点の達成を可能にする：
・       ４つの反応のうちの１つが各々の鋳型位置で停止する（単独重合体を無視）ことから、ｎ個の塩基を配列決定するのに必要とされるサイクルの数は、（一度に単一の塩基が付加され、その位置で相補的である確率は５０％未満であるため）大部分のサイクルが非生産的である現行のＳＢＳ方法と比べ、ｎ回である。
・       合成は４つの反応の各々についてプライマから再開されることから、サイクル数によって決定的に左右される因子が問題となる可能性は４分の１となる。特に、同調性喪失が何回ものサイクルの後に起こるが、全ての鋳型は４つの反応の各々について有効に再同期化されることから、類似の条件（例えば以下参照）下でＳＢＩ又はパイロ配列決定に比べ４倍の塩基を読取ることができる。
・       完全配列を必要としない利用分野（すなわち遺伝子発現用のサイン配列決定、エピゲノミクス用メチルシトシン配列決定ならびに特定のＳＮＰ用のＳＮＰ分析）では、４つの反応のうちの１つだけから得られた部分配列を使用することができる。得られた配列は、１サイクルにつき１塩基対と等価の情報を含んでいる。以下スキームＩＩＩを参照のこと。別々の反応におけるｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴの各々の組成物について得ることのできるデータの例示に関しては、図１も同様に参照のこと。これらのうちのいずれもが、例えば複数の可能な配列（例えばｄＡ ヌクレオチドの差を伴うもの）のいずれが試験試料内に存在するかを見極めるためといった所望の目的にとって充分なものであるかもしれない。
・       単独重合体ストレッチがつねに４回測定され、それらはＳＢＩ又はパイロ配列決定の場合よりも容易に適正に塩基コールできるものとなる。
【００７５】
塩基コールアルゴリズムＩ（基本戦略）
本開示のこの節では、開示された通りの停止及び介入ヌクレオチドの使用が関与する方法を用いて得られる情報からの配列の同定に関する本発明の態様の実施例について記述する。
【００７６】
４つの可能性の間で停止ヌクレオチドを変動させてスキームＩＩに従って４つの異なる反応を実施することにより、４つの反応のうちの１つにおける各々の異なる塩基に１つの停止が存在することを保証することができる。下表は、４つの停止ヌクレオチドの各々を用いて４つのサイクル内で配列ＡＣＧＣＴＡＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣ（鋳型ＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＡＧ）から得られると思われる結果つまりクロマを示す。
【００７７】
停止 得られる配列（最初の４サイクル）：
【表１】
2006517798.tif 000002
【００７８】
左から右へ読むと、第１のヌクレオチドはＡでなくてはならない（Ａについての第１のステップはその他の塩基のいずれについても全く蛍光を与えず、従っていかなる介入ヌクレオチドも無く終結されていなくてはならないため）ということが容易にわかる。対応するエントリを除去し、Ａを書き記すと、以下のようになる。
【００７９】
停止 得られる配列：
【表２】
2006517798.tif 000003
配列：  Ａ
【００８０】
ここで、左側の唯一の一貫したエントリは、それが１つのＡだけの存在を表わすことから、Ｃについてのものである。対応するエントリを除去し、Ｃを書き記すと、次のものが得られる。
【００８１】
停止 得られる配列：
【表３】
2006517798.tif 000004
配列：  ＡＣ
【００８２】
ここで、左側の唯一の一貫したエントリはＧについてのものである。
【００８３】
停止 得られる配列（最初の４サイクル）：
【表４】
2006517798.tif 000005
配列：  ＡＣＧ
【００８４】
ここで、左側の唯一の一貫したエントリは、それが、それまでのところ存在する配列と一貫性ある先行するＣとこれらとの間に１つのＧのみを表わしていることから、Ｃについてのものである。
【００８５】
このようにして続けていくと、最終的に全配列が得られる：
ＡＣＧＣＴＡＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣ
【００８６】
実際、各々のステップにおいて介入ヌクレオチドから得られる蛍光の合計が各々の停止ヌクレオチド間の合計距離を評価し、一方停止ヌクレオチドからの蛍光は中断されなかった停止ヌクレオチドの数を評価すること、そして、従って４つの反応のセットから配列をつねに決定できることが容易にわかる。この事実は、図１を参照しながらさらに例示される。
【００８７】
図１中の４本のラインを横断する視覚的ランによって配列を「読取る」ことができる。単に（例えば蛍光といった測定された標識の規模による）各サイクル中に取込まれた停止ヌクレオチドの数及び（ここでも測定された標識の規模による）各サイクル中に取込まれた介入ヌクレオチドの数を決定し、停止ヌクレオチドとして４つの異なるヌクレオチドの各々を用いて４回のランの各々についての結果を並べることによって、配列を得ることが可能である。しかしながら好ましくは、例えば以下で論述されるように標識の規模の測定における誤差を許容する、配列の非常に迅速かつ精確な決定を可能にする情報の縮退を提供するべく、各ラン内の介入ヌクレオチドの性質（これは同一性を意味しうる）が見極められる。
【００８８】
塩基コールアルゴリズムＩＩ
測定誤差に直面して最適な配列を見い出すため、例えば動的プログラミング、最小二乗最適化及び／又は正規表現などを用いて、より高度な塩基コールアルゴリズムを実装することができる。かかるアルゴリズムは同様に、利用可能な情報の冗長度をよりうまく活用することもできる。換言すると、同じヌクレオチドの各々の出現の間の測定上の長さだけを用いる代りに、かかるアルゴリズムは、３つの介入ヌクレオチドの各々の予想存在量と観察された存在量の間の差を最小にする最適な配列を見い出すことになる。
【００８９】
発明人は、２０〜２５％のノイズにも関わらずうまく機能する作業動的プログラミングアルゴリズムを提供した。それはまず最初に、各ステップの３つの介入ヌクレオチドの各々の予想存在量と観察された存在量の差を最小にするように、動的プログラミングを用いて４つの測定シリーズの多重アラインメントを実施する。その後、最小二乗最適化を用いて、４つの利用可能な距離測定に基づく各々の単独重合体ストレッチの最も確率の高い長さが見い出される。
【００９０】
用語と定義
単独重合体というのは、１つの特定のヌクレオチドの中断されていない配列である。単独重合体配列は、反復した文字としてではなく数字として単独重合体が記されているＤＮＡ 配列である。すなわち、ＡＣＣＧＧＴは、ＡＣＧＴと記され、単独重合体長１．２．２．１を有する。
【００９１】
停止ヌクレオチドとして４つの天然ヌクレオチドの各々を用いて、スキームＩといった本発明の方法を４回反復することにより、得られる測定値セットをクロマとする。かくしてこのクロマは、サイクル、停止ヌクレオチド及び測定されたヌクレオチドによりインデキシングされた測定値の三次元アレイである。例えば、各々の停止ヌクレオチドについて１０サイクルが実施される場合、クロマは１０（サイクル数）×４（停止ヌクレオチド数）×４（測定されたヌクレオチドの数）の数字を含むことになり、場所｛４，「Ａ」，「Ｃ」｝における数は、サイクル番号４で停止ヌクレオチドとしてアデノシンが使用された場合シトシンについての測定された蛍光となる。便宜上、ｘについてのクロマを停止ヌクレオチドとしてｘで得られた測定値を含む完全なクロムのサブセットとする。かくして、Ａについてのクロムは、完全クロマの４分の１である。
【００９２】
Ｎを各々の反復内で実施されたサイクル数とする。従って、クロマは、標識測定値から誘導された４×４×Ｎの数字である。
【００９３】
コールされた配列がヌクレオチド 配列 Ｓ0，Ｓ1，…Ｓk（ここで各々のＳは〔Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ〕のうちの１つである）の配列であるとする。塩基コールの最終目的は、クロマを仮定して最適のコールされた配列を見い出すことにある。便宜上、我々は単独重合体ストレッチを同じ塩基の反復によってではなく１つの数量として表わす。換言すると、我々は、コールされた配列内の各々の位置ｉに、塩基Ｓｉの推定上の反復数を与える数量ｑｉを結びつける。一貫性をもたせるため、我々は、全てのｎについて、Ｓn+1≠Ｓnとなるように配列を制約する。
【００９４】
塩基コール段階Ｉ、動的プログラミング
塩基コールの最終目的は、クロマ配列を仮定して最適なコール対象配列を見い出すことにある。しかしながら、かなり小さなｋについてさえ非常に大きい数字である長さｋの考えられるコール対象配列が４×３k-1個存在する（ｋ＝２０では、４０億以上の考えられるコール対象配列が存在する）。有用な塩基コールアルゴリズムを見い出すために、問題の複雑性は削減される。
【００９５】
コール対象配列は、各ヌクレオチドの出現数によって分類され得る。例えば、塩基計数｛１，２，０，４｝は、１つのＡ、２つのＣｓ、Ｇｓ無し、４つのＴｓを含むあらゆるコール対象配列に対応する。かかる配列の１例としてはＴＣＴＡＴＣＴがある。
【００９６】
本発明に従って提供されたアルゴリズムは、いくつかの単純なケースにおいて最適なコール対象配列を容易に誘導でき、再帰によりさらに単純なものからよりむずかしいケースを誘導できるという事実を活用している。
【００９７】
いくつかの単純なケースは、解決が容易である。塩基計数｛０，０，０，０｝は、空のコール対象配列に対応する。計数｛１，０，０，０｝は、コール対象配列「Ａ」にのみ対応し得、Ｃ、Ｇ及びＴについても同様である。
【００９８】
ただし、塩基計数｛１，１，１，１｝は「ＡＣＧＴ」、「ＴＣＧＡ」そしてその他の多数のものに対し得る。このような場合、最適なコール対象配列を見い出すためにクロマを使用できる。
【００９９】
塩基計数｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝をもつあらゆるコール対象配列が、クロマの特定のサブセットすなわち、Ａのためのクロマのｉ回のサイクル、Ｃについてのクロマのｊ回のサイクル、Ｇについてのクロマのｋ回のサイクル及びＴについてのクロマのｌ回のサイクルを内含するサブセットに正確に対応しなければならない、という点に留意されたい。従ってコール対象配列のため予測されたクロマを実際の測定されたクロマと比較することができる。｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝のための最適なコール対象配列は、その予測されたクロマが実際に測定されたクロマの関連サブセットに最も類似していたものとなるだろう。類似性は、例えば、差の合計、二乗差の合計、ピアソン補正係数などとして、数多くの方法で測定され得る。類似性は、評点としてすなわち最小にするべき誤差評点又は最大にするべき類似性評点として報告可能である。
【０１００】
一般的なケース｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝は直接解決できない。しかしながら｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝についての最適なコール対象配列は、多くとも４つの異なる方法、すなわち、｛ｉ−１，ｊ，ｋ，ｌ｝についての最適な配列に対し「Ａ」を付加することによって、｛ｉ，ｊ−１，ｋ，１｝についての最適な配列に対し「Ｃ」を付加することによって、｛ｉ，ｊ，ｋ−１，１｝についての最適な配列に対し「Ｇ」を付加することによって、又は｛ｉ，ｊ，ｋ，１−１｝についての最適な配列に対して「Ｔ」を付加することによって、より短かい配列から生成可能である。
【０１０１】
多くとも４つの拡張部分のいずれが最適であるかは、（上述のように予測されたクロマを実際のクロマと比較することによって）評点を計算することによって、及び最小（又は使用される尺度に応じて最大）を選ぶことによって見い出すことができる。以下では、いかにしてこれを行なうことができるかを示しているが、差しあたり、かかる評点が発見されたと仮定する。
【０１０２】
新たにコールされた塩基についてのｑを、クロマから得た実際の測定値に設定する。例えば「Ａ」での拡張部分（すなわち｛ｉ−１，ｊ，ｋ，ｌ｝から｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝まで）を考慮する場合、ｑは場所｛ｉ，「Ａ」，「Ａ」｝におけるクロマ、すなわち停止ヌクレオチドとしてアデノシンが使用された場合のサイクルｉ内の標識されたアデノシンの測定数量から得られる。
【０１０３】
かくして、｛ｉ，ｊ，ｋ，１｝のための最適なコール対象配列は、つねに、コール対象塩基より１つ少ないものを含む配列の最適な拡張部分を見い出すことによって見い出すことができる。このとき、手順は｛１，０，０，０｝といったような自明のケースに到達するまで、より短かいケースの各々について反復可能である。従って、同じ単純な手順を再帰的に適用することにより任意の長さの最適なコール対象配列を見い出すことがつねに可能である。副産物として、クロマ内で測定される通りの単独重合体長ｑｉが得られる。
【０１０４】
次のようなわずかな制約があてはまる：
・       配列は、任意の塩基をゼロより少ない数含むことができない。従って「Ｔ」で｛ｉ，ｊ，ｋ，−ｌ｝を拡張することによって｛ｉ，ｊ，ｋ，０｝についての最適なコール対象配列を見い出すことはできない。この制約のため、全ての再帰は、究極的に｛０，０，０，０｝つまり空の配列で終わらなくてはならない。
・       全てのｎについてＳn+1≠Ｓnであるというコール対象配列に対する我々の制約は、｛ｉ−１，ｊ，ｋ，ｌ｝についての最適なコール対象配列が「Ａ」で終わる場合には、「Ａ」で拡張できず、その他の塩基についても同様である、ということを暗に意味している。
・       一部のケースでは、いかなる拡張部分も不可能であり得る。例えば、｛２，０，０，０｝は、もう１つの「Ａ」での｛１，０，０，０｝の拡張部分によって生成され得ない。このようなケースでは、いかなるコール対象配列も存在しない。
【０１０５】
類似性評点は、段階的に計算可能である。これらは、１サイクルしか異ならないことから、｛ｉ−１，ｊ，ｋ，ｌ｝についての評点を、｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝についての評点の計算の際に再使用することができる等々。これは、各々の｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝についての最適なコール対象配列の長さならびに実行評点を追跡することによって達成可能である。例えば｛ｉ−１，ｊ，ｋ，１｝から｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝までの考えられる拡張部分（すなわち「Ａ」による拡張部分）を検討している場合、「Ａ」についての余分のサイクルに対応する予測されたクロマの一部分を計算することしか必要ではない。これは、最近の「Ａ」まで戻ってコール対象配列中の介入塩基を検討することによって計算できる。｛ｉ−１，ｊ，ｋ，ｌ｝についての最適なコール対象配列がわかっていることから、それをどのように得たかもわかる。特に、各々の介入ヌクレオチドについて、測定された数量ｑがわかる。これらを「Ｃ」、「Ｇ」及び「Ｔ」の各々について、最近の「Ａ」に至るまでずっと加算して、予測されたクロマ内の欠如したサイクルについての予測を得る。これらの予測と実際に測定されたクロマの中の対応するサイクルの間の差（すなわち、二乗差など）はこのとき、実行評点に加算される。正規化された評点は、このとき、コール対象配列の長さにより実行評点を除したものを計算することによって得ることができる。
【０１０６】
ここで、｛３，２，２，２｝についての最適なコール対象配列を計算するためには、｛２，２，２，２｝｛１，２，２，２｝などについての評点を計算することがなお必要であるという点に留意されたい。しかしながら、全体的な最良の配列を見い出すためには、各々が評点の再計算を｛０，０，０，０｝まで戻させることになる幾分かの限界（たとえば｛Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ｝）までの全ての可能性を系統的に検討しなければならず、従って、組合せ的爆発が残る。しかしながら、動的プログラミングがこのような組合せ的爆発を回避する賢明な方法である。
【０１０７】
評点が計算された時点でつねにそれが４次元Ｎ×Ｎ×Ｎ×Ｎマトリクス内での再使用のために保管されるような形で、１つのアルゴリズムを使用することができる。かくして、｛３，２，２，２｝のための最適なコール対象配列が計算される場合、｛２，２，２，２｝、｛１，２，２，２｝などについての評点は、そのマトリクス内に保管されることになる。例えば｛２，２，２，２｝についての評点が後に再び必要となった時点で、再帰を全て回避することができ、単に予め計算された結果をそのマトリクスから取り戻すことができる。こうして、非常に効率の良い実装が提供される。３4N個の考えられるコール対象配列を検討する代りに、Ｎ4個の可能性を検討する必要がある。例えばＮ＝２０の実用的システム内では、問題は約１０38の計算から１６０，０００まで低減され、アルゴリズムは実現不能から高効率へと変わる。
【０１０８】
本書で開示されている通りのアルゴリズムにより高い信頼性でコールされ得る最長の配列は、Ｎ個の１つの塩基の単独重合体、Ｎ個を上回る１つの塩基及びＮ個未満のその他の塩基を有するものである。このことは、１つの停止塩基においてＮを超過している場合、欠如している塩基は、３つのその他のものにより残された穴の中に行かなくてはならないことから、なおもその配列をコールすることができる。しかし、第２の１つの塩基においてＮを超過した場合、残りの塩基により残された穴は、明確な形で埋められ得ない。限界は絶対ではなく、全クロマから部分的配列をなおも得ることができる。
【０１０９】
利用分野に応じて、（なかんづく）、最高｛Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ｝までの任意の｛ｉ，ｊ，ｋ，ｌ｝のための最適な配列、｛Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ｝についての最適な配列又は１つのインデックスがＮであるものの中から最適な配列を報告するよう選択することができる。以下の例では、後者が使用された。この選択は、読取り長が精度より選好されるか、及び部分配列を受け入れることができるか否かといったような因子により左右される。
【０１１０】
塩基コール段階ＩＩ、最小二乗（任意）
段階Ｉの結果は、コール対象配列Ｓ0、Ｓ1、…Ｓn及び対応する単独重合体長ｑ0、ｑ1、…ｑnである。我々は、各ｑを最も近い整数に四捨五入し、結果としてのＤＮＡ配列をスペルアウトすることによって、これを従来の形で完全に書くことができる。しかしながら、ｑｉについてより優れた推定値を見い出すのに使用できるより多くの情報がクロマの中に存在する。結局のところ、各々の停止塩基の測定された単独重合体の長さは、単一の測定値であるが、コール対象配列内の各々の位置は実際には４回（各々の停止塩基について一回）測定された。
【０１１１】
１つの例がこのことを明確にしている。
ＡＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＴＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣ
という配列を考慮されたい。配列中の位置８で発生する「ＡＡＡ」３重項は、Ａについてのクロムの第３のステップ内で直接測定されることになり、３．４３、といったような概数となる。測定誤差が大きい場合、測定された数量を１つの整数に四捨五入する方法についてあらゆるケースにおいて確信をもつことは困難であり得る。
【０１１２】
しかしながら、「ＡＡＡ」３重項は、同じくＣについてのクロマの第４ステップ、Ｇについてのクロマの第２ステップ、Ｔについてのクロマの第２ステップにも同じく貢献する。２つのケース（Ｃ及びＴについてのクロマ）で、この３重項は、実際には単独で測定され、一方第３のケースでは、それは先行する単一のＡと合わせて測定される。例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴのクロムについてそれぞれ、関係する測定値は、３.４３、３.１、４.２及び２.９であった。我々は、無作為測定誤差の効果を低減させるためにこれらの付加的な測定値を利用したいと考えている。
【０１１３】
再び単独重合体長ｑ0，ｑ1，…ｑnを考慮されたい。段階Ｉで得られた単一の数字を受け入れる代りに、我々は、ｑについての付加的な情報を記述する１組の連立方程式セットを形成することができる。上述の３重項は、それが８番目の単独重合体であることから、ｑ8である。同様にして、先行するＡは、ｑ5である。ここで以下のように、先行パラグラフからの情報を記すことができる。
ｑ8＝３.４３（Ａについてのクロマより）
ｑ8＝３.１（Ｃについてのクロマより）
ｑ5＋ｑ8＝４.２（Ｇについてのクロマより）
ｑ8＝２.９（Ｔについてのクロマより）
【０１１４】
コール対象配列内の各々の位置について類似の要領で進めることが可能である。結果として得られる連立方程式系は、例えば最小二乗最適化を用いて解くことができ、この解は、クロマ内の全ての測定値に最も良く整合する単独重合体長ｑ0，ｑ1，…ｑnのセットを提供する。
【０１１５】
誤差許容型塩基コールアルゴリズムの例
下表は、各々の停止ヌクレオチドの１０のサイクルについての鋳型のクロマ配列決定のシミュレーション結果を示す（配列決定されたストランドが示されている）；
ＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＡ
【０１１６】
各々のブロックは、指示された停止ヌクレオチドについてのクロマを示し、各々の行は、１塩基の単位での左側に示されたヌクレオチドについて得られた（シミュレートされた）測定値を示し、各列は、最初に３つ、次に１つのヌクレオチドを付加する段階を含むサイクルである。例えば、太字の４つの数字は、停止ヌクレオチドとしてｄＡＴＰを伴うクロマ内の第１のサイクル内で得られた測定値を示す。鋳型は１つのＡで始まることから、Ａだけがゼロと著しく異なるシグナルを提供する。
【表５】
2006517798.tif 000006
【０１１７】
以上で記述された動的プログラミングアルゴリズムを用いた塩基コールは、適正であるＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＴＡＧＣＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧという（単独重合体）を示さない）コール対象配列を同定した。最も近い整数まで四捨五入することにより単独重合体を拡大させることで、これも又適正であり、鋳型の４１ｂｐを網羅するＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＧが生成される。かくして、クロマ配列決定のわずか１０回のサイクル内で、そして有意な測定誤差（この場合１０％ＣＶ）の存在下で、４１塩基対の配列情報を得ることが可能である。
【０１１８】
一定の与えられたアルゴリズムの誤差許容度を査定するために、１０％のＣＶに対応する無作為ノイズを伴って１００回のシミュレーションから成る１シリーズが、与えられた鋳型上でランされた。１００のコール対象配列の全て及び１００の拡大された配列の全てが適正であった。それらのうちの５９が、長さ４１ｂｐであり、一方残りは鋳型からの付加的なＴを内含していた。かくして、提示された通りのアルゴリズムは、生産的であると共に、実験的分散にかかわらず、誤差許容度の高いものである。
【０１１９】
ヌクレオチド付加スキーム
ＳＢＳにおいては、ヌクレオチドは一度に１つずつ取込まれなくてはならず、そうでなければ少なくともＢＡＳＳの場合のように、一度に１つずつ取込むように強制されなくてはならない。しかしながら、以上で示された通り、１つのＤＮＡ配列に到達するべくその他のヌクレオチド付加スキームを使用することが可能であり、いくつかは、ＳＢＳの制限（例えば同調性の喪失）を回避するのにより適している。この節では、考えられる全てのヌクレオチド付加スキームを検討し、標準スキームが見方によっては、考えられる最悪のものであることを示す。
【０１２０】
ヌクレオチド付加スキームは、ＳＢＳ反応にヌクレオチドを付加するための１つの規則である。これは単数又は複数のヌクレオチドの付加が関与する一連のステップから成る。この節では、純粋に阻害物質として付加されたあらゆるヌクレオチド又はその他の何らかの理由で取込みされ得ないあらゆるヌクレオチドを無視するものとする。又、アデノシンと塩基対合する能力をもつあらゆるヌクレオチドを「Ｔ」と呼ぶ（又は同様にして、シトシン、グアニン、チミジンについてはＧ、Ｃ、Ａ）。特定の利用分野では、天然ヌクレオチドの類似体又は誘導体を使用することができるが、配列決定の目的では、ヌクレオチド付加スキームの論理を決定するのは、その塩基対合能力である。この事実を表示するため、多数の塩基対合能力をもつヌクレオチド類似体又は誘導体を、「ＡＣ」、「ＧＣＴ」などと表わすことが可能である。
【０１２１】
反復スキームは、基本的パターンを反復するヌクレオチド付加スキームである。再開を伴う反復スキームは、基本パターンを反復し基本パターンの変形を用いて新鮮なプライマで再開するヌクレオチド付加スキームである。天然のスキームは、４つの塩基全てが付加されてしまうまで反復されるスキームである。
【０１２２】
自然反復スキームの間で、４つのヌクレオチド全てが第１のステップで付加されることを表わす「４」は縮退しており、配列決定のために使用することはできない。
【０１２３】
スキーム「１−１−１−１」は、先に開示されたＳＢＳ方法全てが使用している標準スキームである。４つのヌクレオチド全てが同時に付加され得るものの、これらは解裂可能なブロック基を理由として強制的に１つずつ取込むようになっていることから、ＢＡＳＳでさえもこのカテゴリの中に入る。
【０１２４】
スキーム１−１−１−１は、最も非生産的なスキームである。このことは、各々の生産的ステップの後、鋳型上の次のヌクレオチドが可能性ある３つ（すなわち、配列決定されたばかりの塩基とは異なる３つ）のもののうちの１つであり得るが単一の塩基しか付加されない、という事実からもわかる。その結果として、これは同調性の喪失により最も影響されるスキームである。
【０１２５】
本発明に従った方法は、本書に開示されている通り、スキーム３−１である。これは完全に生産的なスキームである（ヌクレオチドは、一定の与えられたステップに欠如しているヌクレオチドがその後のステップで付加されることから、全てのステップで取込まれることが保証されている）。Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの間で単一のヌクレオチドを変動させることによって与えられる３−１の４つの変形形態が存在する。以上で示されているように、これら４つの変形形態は、標的配列で再構築するために使用可能である。
【０１２６】
スキーム２−２は、もう１つの考えられる完全に生産的なスキームである。このスキームには、ＡＣ−ＧＴ、ＡＧ−ＣＴ及びＡＴ−ＧＣに対応する３つの変形形態しかなく、その他全ての組合せは、単なる反転である。
【０１２７】
１つのスキームが原配列を（場合により再開によって）つねに再構築できることを保証するための最小限の必要条件とは何か。基本的に、必要なのは、標的配列内の単独重合体がその２つの隣接重合体から分離可能でなくてはならないということである。換言すると、各々の単独重合体は、その左側の隣接重合体を排除する少なくとも１つのヌクレオチド取込みステップ及びその右側隣接重合体を排除するものの一部分でなくてはならない。スキーム１−１−１−１では、全ての単一ステップは、この特性を有し、従って配列はつねに再構築可能である。
【０１２８】
スキーム３−１では、４つの可能な変形形態全てで再開することにより、各々の単独重合体が、その他のいかなるヌクレオチドも含まないステップの一部であることが保証される。原則として、４つの変形形態のうち絶対に必要であるのは３つだけである。というのもこの場合、一部のステップで３つの塩基が単独で付加されることになり、こうしてこれらが自動的に第４のものと分離されるからである。かくして、スキーム３−１は、実験的ノイズに直面して（例えば以上に示したような動的プログラミングにより）塩基コールを改善するために使用可能なスキーム１−１−１−１内に存在しない冗長な情報を生成する。かくして、これは、１−１−１−１よりもさらに生産的であるばかりでなく、より誤差許容度が高いものである。
【０１２９】
スキーム２−２は、３回の再開を超えて、同じく１つの配列をコールするのに充分な情報を生成する。各々のヌクレオチド対がＡＣ−ＧＴ、ＡＧ−ＣＴ及びＡＴ−ＧＣのうちの少なくとも１つにおいて分離可能であることは容易にわかる。かくして、３−１により生成される追加の情報が努力に値するものである可能性はあるものの、スキーム２−２は、場合によって最もコンパクトでかつ充分に生産性あるものである。幾分かの冗長性はなおも存在し（ヌクレオチドが異なる標識を備えている場合）、かくしてスキーム２−２の誤差許容度は、１−１−１−１と３−１の間の中間である。
【０１３０】
特殊な状況では、不規則な（非反復式）スキームも同様に有用であり得る。配列の一部がわかっている場合、その他の場合には可能であると思われるよりも迅速に対象となっていない部分を飛び超えるために不規則なスキームを使用することが可能であり、又そうでなければ、塩基コール誤差をさらに低減するためにさらに一層冗長なデータを生成するのにこれらの部分を使用することもできるだろう。
【０１３１】
結論としては、我々が調査したヌクレオチド付加スキームのうち、３−１は最も生産的で誤差許容度が高く、一方（幾分か驚くべきことではあるが）、従来のスキーム１−１−１−１は最も生産的でなく、誤差を発生しやすいものである。
【０１３２】
サイン配列決定
サイン配列決定のために有用である本発明の１つの態様のもう１つの実施形態は、以下の段階を含む方法（スキームＩＩＩ）を含んで成る：
１．  アニールされたプライマで１本鎖鋳型を提供する段階。
２．  例えば蛍光標識といった標識を担持するものを１つ含めた３つのヌクレオチドを付加する段階。
３．  任意には、単数又は複数の取込みしない阻害物質ヌクレオチド（標識されたヌクレオチドとは異なる）を付加する段階。例としては、５′−ジ及びモノリン酸塩ヌクレオチド、５′−（アルファ−ベータ−メチレン）三リン酸ヌクレオチドが含まれる。
４．  ヌクレオチドを成長するストランドに付加させる条件で適切なポリメラーゼと共にインキュベートする段階。
５．  標識されたヌクレオチドの存在及び数量を検出する段階。
６．  例えば光退色により標識を無効化する段階（必ずしも全サイクルにおいてではない）。
７．  残りのヌクレオチドを付加し、ヌクレオチドを成長するストランドに付加させる条件下でポリメラーゼ（必ずしもステップ５と同じとはかぎらない）と共にインキュベートする段階。
８．  所望の回数のサイクルが完了してしまうまで、ステップ２〜７を反復する段階。
【０１３３】
例えば、ステップ２で蛍光ｄＣ及び標準のｄＡ／ｄＧを使用し、次にステップ７でｄＴを付加することができる。ステップ４は、このとき、鋳型内でｄＡが最初に出現するまで任意の数のｄＡ、ｄＧ及びｄＣを付加し、次にいかなる相補的なｄＴヌクレオチドも存在しないことを理由として停止することになる。ステップ５で読取られた蛍光は、ｄＴの各対の間のｄＣの有無を明らかにすることになる。一般に、Ｔｓの各々の連続する対について、間に単数又は複数のＣｓが存在したか否かを表示する２進数配列として、得られた配列を記すことができる。
【０１３４】
例えば、配列ＡＣＧＣＴＡＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣは１１１１と書かれ、配列ＡＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＴＴは１１０００と書かれる。一般にこのような配列は、サイクルあたり１／２塩基対と等価の情報を含む。２４サイクルは１２ｂｐのサイン配列と等価であり、例えばヒトトランスクリプトーム内でユニークなものとなる。既存の配列データべース及び配列アラインメントアルゴリズムを、分析のため、かかる２進サインに容易に適合させることができる。
【０１３５】
スキームＩＩＩは、定性的測定しか必要でないことから、実装が特に容易である。例えば、スキームＩＩＩは、蛍光相関分光法を用いて単一の分子を配列決定するのに特に適している。
【０１３６】
ＰＰｉ検出を用いたクロマ配列決定
もう１つの実施形態においては、本発明の１態様は、（標識されたヌクレオチドを使用する代りに）無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の開放を監視する段階を含む１つの方法（スキームＩＶ）を提供している（例えば国際公開第９３／２３５６４号パンフレット参照）。かかる方法は、以下の段階を含み得る。
１．  アニールされたプライマで１本鎖鋳型を提供する段階。
２．  介入ヌクレオチドのセット（すなわち、考えられる４つのヌクレオチドのうち２つ以上でかつ全てよりは少ないもの）を付加する段階。
３．  任意には、単数又は複数の取込みしない阻害物質ヌクレオチド（介入ヌクレオチドとは異なる）を付加する段階。例としては、５′−ジ及びモノリン酸塩ヌクレオチド、５′−（アルファ−ベータ−メチレン）三リン酸ヌクレオチドが含まれる。
４．  （例えば国際公開第９３／２３５６４号パンフレットに記述されているように）、取込みを監視する一方で、ヌクレオチドを成長するストランドに付加させる条件で、適切なポリメラーゼと共にインキュベートする段階。
５．  停止ヌクレオチドのセットを付加し、（例えば国際公開第９３／２３５６４号パンフレットに記述されているように）、取込みを監視する一方で、ヌクレオチドを成長するストランドに付加させる条件下で、ポリメラーゼ（必ずしもステップ５と同じではない）と共にインキュベートする段階。
６．  所望の回数のサイクルが完了してしまうまで、ステップ２〜５を反復する段階。
【０１３７】
ここでも又、停止ヌクレオチドとして４つの天然ヌクレオチドの各々を用いてスキームを反復することができる。標準的パイロ配列決定と比べて、このプロトコルは、（ヌクレオチド付加の順序の変更及び塩基コールに対する必要な変更を除いて）標準プロトコルに対するいかなる修正もなく、読取り長の４倍の増大を提供する。
【０１３８】
以下の例は、同調性の喪失の意義及びクロマ配列決定スキームを用いることのもつ影響を示している。それは、パイロ配列決定法及びクロマ配列決定法の両方で配列決定された標的ＤＮＡの結果を示す。全ての鋳型の一定の画分が、各々の取込むステップにおいて同調性を喪失することが仮定されている。ＳＢＩにおいては、ステップは単一の塩基の付加である。飛越し配列決定においては、ステップは交互に３つ又は１つの塩基の付加である。付加的には、クロマ配列決定は、停止ヌクレオチドとして４つの天然ヌクレオチドの各々を用い、新鮮なプライマで３回再開する。
【０１３９】
標的配列（クロマ配列決定により達成される最終ヌクレオチド（単複））は、各々のステップＮについて大字で示されている。
【表６】
2006517798.tif 000007
【０１４０】
パイロ配列決定
同調性喪失までの停止４０回
反応ステップ    ４０
反  応      結果
【表７】
2006517798.tif 000008
合計配列  ：２０ｂｐ
【０１４１】
クロマ配列決定
同調性喪失までの停止４０回
反応ステップ１６０（すなわち各停止塩基４０）
反応          結果
【表８】
2006517798.tif 000009
再開し、〔ｇｔａ  ｃ〕、〔ｔａｃ  ｇ〕及び〔ａｃｑ  ｔ〕で反復する。
合計配列：  ８８ｂｐ＋２７ｂｐ部分配列
【０１４２】
結論としては、クロマ配列決定は、同調性の喪失の問題を回避し、４倍以上長い読取り長を達成する。
【０１４３】
固相クロマ配列決定
該方法を自動化し及び並列化するために、本発明の実施形態に従って２つの主要なアプローチが提供されている。
【０１４４】
第１のアプローチは、アレイ化された又はその他の形で配置された鋳型を使用し、数多くの鋳型を同一性が保たれた状態で配列決定しなければならない場合に適している。
【０１４５】
第２のアプローチは、固体支持体に対する無作為付着を使用し、多数の配列を１つのライブラリから無作為に得なくてはならない場合に有用である。
【０１４６】
アレイ化された鋳型を配列決定するための本発明の１態様の実施形態に従った方法は、以下の段階を含む方法（スキームＶ）を提供している：
１．  各々鋳型分子を、
ａ．  直接的に又は、
ｂ．  その鋳型とハイブリッド形成するか又はその他の形で鋳型との親和力を有するプライマ又はリンカーを結合することにより間接的に、
結合する能力をもつ、一定数の活性領域又は活性表面を提供する固体支持体を提供する段階、
２．  各位置にどの鋳型が置かれたかを追跡しながら、１本鎖鋳型を各々の活性領域又は活性表面に付加する段階。このとき、各々の領域は、スポットのあるマイクロアレイの場合のように、数多くの同一のｓｓＤＮＡ 鋳型で構成されることになる。
３．  任意にはプライマを付加する（或いは、固体支持体からリンカーを使用する）段階。
４．  例えば、スキームＩ−ＩＶのいずれかに従って、本発明に従って並行して全ての鋳型を配列決定する段階。
５．  各々の同定された鋳型について１つの配列を得る段階。
【０１４７】
リンカー（ステップ１ｂ）は、全ての活性領域において同じである必要はない。複合混合物から特定の鋳型を探し出して、１つのライブラリのサブセットを配列決定する可能性を提供するために、異なるリンカーを使用することができる。
【０１４８】
スキームＶの処理能力は、鋳型を付加するのに用いられる器具の解像度によって制限される。標準的なマイクロアレイ化機器を用いて、１平方センチメートルあたり数千の鋳型密度が可能である。
【０１４９】
より高い処理能力が必要とされ鋳型同一性が重要である場合、もう１つのアプローチを使用することができる。
【０１５０】
本発明の１態様のさらなる実施形態は、以下の段階を含む方法（スキームＩＶ）として提供される：
１．  （好ましくは検出機器に適した密度で）無作為の位置において付着された少なくとも部分的に１本鎖である鋳型分子を担持する固体支持体を提供する段階。ここで各々の鋳型は、任意には、もとの鋳型に付着された又はこの鋳型に近接した（少なくともその他のいずれかの鋳型分子よりも近い）標的配列の多数のコピーを含むように増幅されている。
２．  本発明（例えばスキームＩ−ＩＶのいずれか）を用いて、鋳型を並行して配列決定し、標識されたヌクレオチドを並行して検出する段階。
【０１５１】
高密度で増幅された鋳型を提供するためのアプローチが数多く存在する。例えば、ローリングサークル増幅を以下のように使用することが可能である：
ａ．  好ましくは共有結合を介して付着された、付着済みプライマを伴う表面（例えばガラス）を提供する。或いは又、共有結合の代りに、非常に強い非共有結合（例えばビオチン／ストレプトアビジン）を使用することもできる。
ｂ．  好ましくは検出機器に適した密度で円形鋳型を付加する。
ｃ．  プライマに対し鋳型をアニールする。
ｄ．  各位置で表面に付着された長い１本鎖縦列反復鋳型を生成するようにローリングサークル増幅を用いて増幅する。
【０１５２】
Lizardi et al.は、「等温ローリングサークル増幅を用いた突然変異検出及び単一分子計数」（Nature Genetics 第１９巻、ｐ２２５）について記述している。
【０１５３】
この手順に対する修正には、付加的な複製フォークを生成し生成物収量を増大させるべく逆プライマを提供する段階が含まれる。ＲＣＡに対する代替的方法には、固相ＰＣＲ（Adessi et al.「固相ＤＮＡ増幅：プライマ付着及び増幅メカニズムの特徴づけ」Nucleic Acids Research ２０００；２８（２０）；８７ｅ）及びゲル内ＰＣＲ（「Polonies」、米国特許第６４８５９４４号明細書及びMitra Ｒ.Ｄ、Church ＧＭ、「数多くの個々のＤＮＡ分子のインサイチュ局在化増幅及び接触複製」Nucleic Acids Research １９９９；２７（２４）；ｅ３４）が含まれる。
【０１５４】
「適切な密度」は好ましくは、処理能力を最大にするもの、例えば、可能なかぎり多くの検出器（又は１つの検出器内の画素）が単一の鋳型分子を検出することを保証する限界希釈である。任意の標準アレイ上では、完全な限界希釈は、全ての位置のうちの３７％に、単一の鋳型を保持させ、（ポワソン分布の形状を理由として）、残りは、全く保持しないか又は２つ以上を保持することになる。
【０１５５】
例えば、２５μｍの画素サイズを伴うTyphoon９２００上では、３５×４３cmの反応チャンバは２億４０００万画素を保持する。限界希釈（ポワソン分布）では、これらのうちの３７％が単一の鋳型を保持する、すなわち８９００万の鋳型を保持することであろう。各鋳型上で５０塩基を配列決定することにより、５０サイクル内で、１.７Ｇｂの配列が生成される。走査時間を４５分として、一日の処理能力は約３Ｇｂｐであり、これはヒトゲノムの全配列に相当する。
【０１５６】
固相ローリングサークル増幅に適した鋳型は、下流側アプリケーションに適した配列を提供しながら、（鋳型配列のコピー数に関して）収量を最適化すべきである。一般に、小さな鋳型が好ましい。特に、鋳型は、２０〜２５ｂｐのプライマ結合配列及び４０〜１５０ｂｐのインサートで構成され得る。プライマ結合配列は、ＲＣＡを開始するためと同時に配列決定反応をプライムするための両方に使用できると思われ、そうでなければ、鋳型は、別々の配列決定プライマ結合部位を含むことができると思われる。インサートは、所望の配列を含有するのに充分長いものにとどまりながら、できるかぎり小さいものであるべきである。例えば単一の停止ヌクレオチドを用いて１０サイクルの配列を実施する場合、平均して４０個の塩基がプローブされ、かくして、鋳型は、プライマ結合配列の配列決定を防ぐため少なくとも充分な余裕分だけ、４０個の塩基を超える長さを有していなくてはならない。
【０１５７】
ローリングサークル増幅された鋳型から生成されたシグナルを増大させるためには、それらを凝縮する必要があるかもしれない。ＲＣＡ生成物は基本的にもとの円形鋳型の１０００個さらには１００００個もの縦列レプリカから成る１本鎖ＤＮＡ分子であることから、分子は非常に長いものとなる。例えば、ローリングサークル増幅を用いて１０００倍増幅された１００ｂｐの鋳型は、約３０μｍとなり、かくして（５μｍの画素解像度を仮定すると）数個の異なる画素を横断してそのシグナルを広げることになる。さらに低い解像度の計器を用いることは、薄いｓｓＤＮＡ生成物が、３０μｍ画素の部域のきわめてわずかな部分しか占有せず従って検出不可能であり得ることから、有用ではないかもしれない。かくして、より小さな部域へとシグナルを凝縮することができるということが望ましい。
【０１５８】
（上述のLizardi et al）においては、ローリングサークル増幅生成物は、エピトープ標識されたヌクレオチド及び多価の抗体を架橋剤として用いることによって凝縮される。さらにもう１つの態様においては、本発明は、もともと２本鎖のＤＮＡを配列決定する場合特に便利である単純な一変形形態を提供する。
【０１５９】
発明のさらなる一態様として、本発明に従った方法において使用するための鋳型調製のためには、例えば８０ｂｐという短かいものであり得るｄｓＤＮＡ鋳型を、ヘヤピンループを担持するリンカーオリゴヌクレオチドにライゲートさせて、擬似２本鎖ループ構造又はダンベル形状を形成する。このような構造においては、ＲＣＡ及びその後の配列決定反応の両方のためのプライマ結合部位をヘヤピンループ内に置くことが可能である。両方のストランドを同時に配列決定するのを避けるために、ＲＣＡによる増幅のため及び配列決定のために異なるプライマを用いることにより、両端部に異なるヘヤピンループを有する鋳型のみを配列決定することになるよう保証することができる。かくして、少なくとも１つのＲＣＡプライマ結合部位を有する鋳型のみが増幅されることになり、少なくとも１つの配列決定プライマ結合部位を有する鋳型のみが配列決定されることになる。
【０１６０】
かかる鋳型のＰＣＡ生成物はどこでも部分的に２本鎖となることから、それは、より小さな部域へと凝縮するジグザグ構造へと折畳みし戻されることになる。しかしながら、プライマ結合部位はどこでも１本鎖ＤＮＡとして露呈されていることから、プライマアクセスに問題はない。以下の例は、かかる鋳型が５−１０cmまでの産物をＲＣＡ後に形成することを示している。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドを１つの表面に固定化させるためには、数多くの異なるアプローチが記述されてきた（例えば、Lindroos et al.「オリゴヌクレオチドアレイ上のミニ配列決定；固定化化学の比較」、Nucleic Acids Rresearch ２００１；２９（１３）ｅ.６９を参照のこと）。例えば、ビオチニル化されたオリゴをストレプトアビジンでコーティングされたアレイに付着させることができ、ＮＨ2修飾されたオリゴをエポキシシラン誘導体化された又はイソチオシアネートコーティングされたスライドガラスに共有結合によって付着させることができ、又、スクシニル化されたオリゴをペプチド結合によりアミノフェニル又はアミノプロピル由来のガラスにカップリングさせることができ、又チオール／ジスルフィド交換反応によりメルカプトシラン化されたガラス上に固定化させることができる。文献中にはさらに多くのことが記述されてきた。
【０１６２】
自動化されたハイスループット配列決定用の器具
本発明に従った方法は、任意には熱制御を伴う検出器上又は検出器内に設置された反応チャンバを通して一定数の試薬溶液を反復させることにより簡単に実施することができるため、自動化に特に適している。
【０１６３】
一つの例においては、検出器は、例えばレーザー励起、帯域通過濾波及び光電子増倍管検出により作用することのできる蛍光スキャナである。例えば、Scan Array Express（Perkin Elmer）がこのような計器である。それは、５μｍ／画素の解像度で顕微鏡スライドを走査し、１画素あたりわずか２蛍光色素の検出能力をもち、最高２０分（４色で）の走査時間を有する。かかる計器上の日々の配列決定処理能力は最高１.７Ｇｂｐとなる。
【０１６４】
反応チャンバは、次のものを提供する：
・     走査ヘッドのための容易なアクセス。
・     閉鎖された反応チャンバ。
・     反応チャンバから試薬を射出し除去するための入口。
・     チャンバに空気が出入りできるようにするための出口。
【０１６５】
Scan Array Expressといったような標準マイクロアレイスキャナ内に挿入するのに適した、図３に示されている通りの標準のマイクロアレイスライドフォーマットで反応チャンバを構築することが可能である。該反応チャンバはスキャナ内部に挿入され得、全配列決定反応中、そこにとどまることができる。ポンプ及び試薬フラスコ（例えば図４に示されているようなもの）が、一定のプロトコルに従って試薬を供給し、コンピュータがポンプ及びスキャナの両方を制御し、反応と走査の間で交替する。任意には、反応チャンバは温度制御されてもよい。
【０１６６】
試薬の流れを導くため電動通気孔にディスペンサユニットが連結され得、システム全体は、コンピュータの制御下で作動させられている。統合されたシステムは、スキャナ、ディスペンサ、通気孔、及びタンクならびに制御用コンピュータで構成されることになる。
【０１６７】
本発明のさらなる態様に従うと、
−  取込まれた又は放出された標識を検出することのできるイメージングコンポーネント、
−  １ステップセットあたり少なくとも１回、イメージングコンポーネントにとってアクセス可能であるような形で単数又は複数の付着された鋳型を保持するための反応チャンバ、
−  反応チャンバに対し試薬を提供するための試薬分配システム、
を含んで成る、本発明の方法を実施するための計器が提供されている。
【０１６８】
反応チャンバは付着された鋳型を提供し、イメージングコンポーネントは、少なくとも１００／cm2、任意には少なくとも１０００／cm2、少なくとも１０，０００／cm2又は少なくとも１００，０００／cm2の密度でこの鋳型を解像することができる。
【０１６９】
イメージングコンポーネントは、光電子増倍管、フォトダイオード、電荷結合素子、ＣＭＯＳイメージングチップ、近視野走査顕微鏡、透視野共焦点顕微鏡、広視野落射照明顕微鏡及び全反射顕微鏡から成るグループの中から選択されたシステム又はデバイスを利用することができる。
【０１７０】
イメージングコンポーネントは蛍光標識を検出することができる。
【０１７１】
イメージングコンポーネントは、レーザー誘導された蛍光を検出することができる。
【０１７２】
本発明に従った計器の１実施形態においては、反応チャンバは、透明な表面、フタ及び試薬分配システムに該反応チャンバを付着させるためのポートを含む閉鎖された構造であり、ここで透明な表面は内部表面上に鋳型分子を保持し、イメージングコンポーネントは該透明な表面を通してイメージングすることができる。
【０１７３】
例Ｉ−インサイチュ鋳型増幅
４μｌ中１００ｐmol／μｌで２つの５′−リン酸化オリゴヌクレオチド（ＴＧＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＡＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＴＡＴＴＴＣＡＴＡＣＴ及びＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡ）をアニールし、２μｌのＴ４ライゲーション緩衝液、０.３μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１.５Weiss ユニット；Fermentas）及び７μｌの水を付加し、１時間３７度でインキュベートすることにより、円形１本鎖鋳型を調製した。次にリガーゼを１０分間６５度でインキュベートして不活性化させた。
【０１７４】
１００μｌのＭＯＰＳ（Sambrook et al,「分子クローニング」第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press ２００１）中で５分間１０μＭのプライマをインキュベートすることによって、５′末端アミノ（−ＮＨ）部分を担持するプライマＡ５０Ｔ，７ＲＣ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＧＣ）を、Greinerシリル化マイクロアレイスライドに付着させ、２.５mgのＮａＢＨ4で１mlのＰＢＳ／エタノール中で５分間還元させ、まずは０.２％のドデシル硫酸ナトリウム中で、次に精製水で洗い流した。
【０１７５】
その後、乾燥させたスライドを、２μｌのｄＵＴＰ−Ｃｙ３（最終１００μＭ，Perkin Elmer）、各々２μｌのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ（全て最終１ｍＭ、ＮＥＢ）、４μｌのシーケナーゼ緩衝液、１μｌのシーケナーゼ（１３μ、Amersham Biosciences）、４μｌの水及び１μｌの鋳型と共にローリングサークル増幅のためにインキュベートした。かくして、標識されたヌクレオチドは全ヌクレオチドの約２.５％であった。２時間３７°でのインキュベーションの後、スライドを水中で洗い流し、Perkin Elmer Scan Array Express上で走査した。結果は、各々増幅した鋳型を表わす多数の明るいスポットであった。同様に、結果は、２.５％の標識頻度がこのフォーマットで容易に検知できることをも示している（実際、数多くのスポットが検出器を飽和している）。
【０１７６】
スライドの一部分の拡大によって、５μｍの画像中の画素サイズでは、大部分の増幅された鋳型が１つ又は少数の画素を占有していることが示された。このサイズでは、異なる鋳型分子についてスキャナ上の画素のきわめて大きな割合を使用し、かくして最大の処理能力を確保することができた。白色画素が検出器を完全に飽和させ、２.５％未満で標識作業が検出可能となるのに充分以上のものであることを示している。鋳型は１６０ｂｐであったことを考えると、２.５％の標識作業は、クロマ配列決定反応のために予想される範囲内で鋳型コピー１つあたり約４つの取込み済みヌクレオチドを表わす。
【０１７７】
例ＩＩ−単一ステップ配列決定反応
１０ｐmol／μｌでDynal結合／洗浄緩衝液（Dynal, Norway）中でインキュベートすることにより、Greiner ストレプトアビジン−コーティングされたマイクロアレイスライドに、ビオチニル化されたＴ７プライマ（ＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ）を付着させた。５mmの広い穴のアレイを含むゴムフィルム上に接着することにより、スライド上にウェルを作り上げた。ＴＯＰ２．１プラスミド（Clontech）を沸とうさせ、氷上で冷却し、次に２０fmol／μｌで各ウェルに付加した。１５分間室温でインキュベートした後、スライドを１５分間結合／洗浄中で洗浄した。
【０１７８】
４μｌのＥcoＰol緩衝液、各々０.４μｌずつのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ（最終１００μＭ）、０.４μｌのｄＵＴＰ−Ｃｙ３（最終１０μＭ、Perkin Elmer）、２μｌのクレノウエキソ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）及び４０μｌまでの水を２つのウェルに付加し、水とクレノウを置換する同一の混合物をさらに２つのウェルに付加した。１０分間インキュベートし、結合／洗浄中で１５分間２回洗浄した後、スライドをTyphoon９２００上で走査した。
【０１７９】
鋳型（Clontech ＴＯＰＯ０２．１）を考えると、予想された成果は、取込み済みの２ｄＴＴＰである。図２は、標識されたｄＴＴＰが取込まれたこと及び（クレノウを省略する反応中で蛍光により与えられるように）得られたシグナルがバックグラウンドを著しく超えるものであったということを明らかに表わす結果を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】停止ヌクレオチドとして（左側に示されている）天然のヌクレオチドの各々を用いたクロマ配列決定法で配列決定された鋳型（最上行、配列決定されたストランドを示す）を例示している。各々のクロマ配列は、（介入する塩基の数を測定する）一連のダッシュ及び（中断されていない停止ヌクレオチドの数を測定する）文字として示されている。図面から、読取りを並べることにより、配列を読取ってもとの配列を回復させることができるということは明白である。
【０１８１】
【図２】例ＩＩのヌクレオチド取込み検定において、この図は、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ）を伴う及び伴わないｄＴＴＰ（Ｃｙ３内で標識されたもの）、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰの取込みの試みの後の（任意単位内の）蛍光を示している。予測される成果は、２つの取込まれたｄＴＴＰであり、図は明らかに、バックグラウンドノイズを超える取込みを高い信頼性で検出するのに充分な信号がかかる取込み事象から生成されるということを実証している。
【０１８２】
【図３】標準のマイクロアレイスキャナ内での固相クロマ配列決定に適した反応チャンバの１実施形態を例示している。この図は、鋳型をスポットするか又は無作為に付着することのできる２５×７５mmの標準スライドガラス（１）を用いたチャンバアセンブリを示している。ゴムガスケット（２）が反応中チャンバに対してガラスを密封している。入口（３）及び出口（４）ポートはコネクタ（５）を介して、図４に例示されている通りの試薬分配システムに連結されている。
【０１８３】
【図４】図３の反応チャンバ内でクロマ配列決定を実施するのに適した試薬分配システムの１実施形態を例示する。１０方バルブ（１）がチャンバ（２）内外への試薬の分配及び廃棄（６）を可能にし、任意の与えられたクロマ配列決定スキームによって必要とされる通りの異なる試薬及び洗浄緩衝液を最高８個の試薬容器（３）が収納し得る。シリンジポンプ（４）及びバルブ（１）は、完全に自動化したシステムを得るべく、スキャナ（５、スライドホルダーの部分図も示されている）と合わせて、容易に電動式かつコンピュータ制御式にすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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