(57)【要約】本発明はリン酸カルシウムのセラミックスおよび粉末の表面を修飾する方法に関する。本発明の方法は、培地中での熟成により上記セラミックスおよび粉末の表面での炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を引き起こすことを含む。本発明はまた、この修飾されたセラミックスおよび粉末をインビトロおよびインビボ細胞のトランスフェクションおよび三次元網目構造での細胞培養のために使用することにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム粉末またはリン酸カルシウムセラミックを、カルシウムおよびリン酸のイオンで飽和されていないリン酸緩衝液中で水和することからなる工程ａ）、および工程ａ）で得られた生成物を、カルシウムおよびリン酸のイオンで飽和されておらず、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを含有するリン酸緩衝液中に数分から数時間までの範囲内の時間浸漬することからなる工程ｂ）を含み、ｃ）その表面に結合したＤＮＡ分子を含有するリン酸カルシウム粒子を生成させる、ことを特徴とする、リン酸カルシウムのセラミックまたは粉末の表面にプラスミド形態のＤＮＡを結合させる方法。
【請求項２】
工程ａ）およびｂ）における緩衝液が０.１２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）からなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
浸漬を、１５〜５０℃の範囲内、好ましくは約３７℃の温度で少なくとも１、５、１０または３０分から約１２、２４または４８時間までの時間で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リン酸カルシウム粒子を細胞培養培地型の培地中に浸漬保持することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
リン酸カルシウム粒子をほぼ数分から数日間浸漬することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リン酸カルシウム粒子を１５〜５０℃、好ましくは約３７℃の範囲内の温度で浸漬することを特徴とする、請求項４および５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）を、細胞外液を模擬した培地または該核酸を含有する細胞培養培地型の培地により行い、該培地は該ＤＮＡに対して非変性性であって、かつカルシウムおよびリン酸イオンで飽和されていないものであり、この培地が該粉末およびセラミックの表面で炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を引き起こすことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）およびｂ）を同時にまたは逐次的に行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
リン酸カルシウム粒子に生理学的ｐＨ条件下でＤＮＡを結合させるための、請求項７および８のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１０】
トランスフェクションを受ける細胞を請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られた粒子と数時間ないし数週間接触させることからなる、単層または三次元で培養された分離細胞をトランスフェクトする方法。
【請求項１１】
トランスフェクションを受ける細胞を請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られた粒子と数時間ないし数週間接触させることからなる、培養組織断片に含まれている細胞をトランスフェクトする方法。
【請求項１２】
組織中または器官中に含まれているインビボ細胞のトランスフェクション用の薬剤を製造するための、請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られた粒子の使用。
【請求項１３】
非変性性条件下でその表面に炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を維持することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法から得ることができるリン酸カルシウムセラミックおよび粉末。
【請求項１４】
その表面に結合した核酸をさらに含有することを特徴とする、請求項１３に記載のリン酸カルシウムセラミックおよび粉末。
【請求項１５】
下記特性の少なくとも１つを有することを特徴とする、請求項１３または１４に記載のリン酸カルシウムセラミックおよび粉末：
−表面に存在する下記荷電基の特徴：ＰＯ4-、ＯＨ-，Ｃａ++；
−塩基性の表面ｐＨ；
−陰性の界面動電位；
−疎水性；
−０〜２００μｍ、特に８０〜１２５μｍおよび０〜２５μｍ、の範囲内の粒度。
【請求項１６】
高分子、セラミックまたは金属系で、好ましくは磁性の、別材料からなるコアをさらに含むことを特徴とする、請求項１３〜1５のいずれかに記載のリン酸カルシウムセラミックおよび粉末。
【請求項１７】
鉱物または高分子のマトリックス中、特にリン酸または硫酸カルシウムセメント中、に含有されている、請求項１３〜１６のいずれかに記載のリン酸カルシウム粉末を基材として形成された粒子。
【請求項１８】
インビトロ細胞のトランスフェクションのための、請求項１３〜１６のいずれかに記載のリン酸カルシウム粉末およびセラミックの使用。
【請求項１９】
インビボ細胞のトランスフェクション用薬剤の製造のための、請求項１３〜１６のいずれかに記載のリン酸カルシウム粉末およびセラミックの使用。
【請求項２０】
該粒子を凝集させる細胞性または細胞外マトリックスの形成と共に三次元でトランスフェクトずみ細胞を培養するための、請求項１３〜１６のいずれかに記載のリン酸カルシウム粉末およびセラミックの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の特徴を有するリン酸カルシウムセラミックの表面に結合（固定）させたＤＮＡのトランスフェクションのための方法に関する。この方法は、ＤＮＡの結合および細胞のトランスフェクションのためのその利用効率を改善するために塩溶液または細胞培地中である物質を調製する工程を含んでいる。本発明はまた、インビトロ（in vitro）またはインビボ（in vivo）細胞のトランスフェクションならびに三次元網目構造でのトランスフェクトずみ細胞の培養のために、修飾されたリン酸カルシウムセラミックおよび粉末を使用することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞への遺伝子のトランスフェクションは遺伝子治療における主要な工程である。いくつかの方法をさまざまな歩留りで使用することができる。それらはインビトロまたはインビボで使用することができる。
【０００３】
遺伝子治療のためには、細胞をインビトロでトランスフェクトし、次いで体内に、またはそれらが存在する器官もしくは組織に直接、再注入することができる (Evans, C.H., Robbins, P.D., 遺伝子治療の可能な整形外科的応用, J Bone Joint Surg, 77-A, 7:1103-1114)。
【０００４】
細胞のトランスフェクションに使用される各種の方法を次の表にまとめる。
【０００５】
【表１】
2006514655.tif 000002
【０００６】
遺伝子治療の臨床試験が始まってから約１５年たつが、結果は全体として次に述べるいくつかの理由により期待を裏切るものであった：
使用ベクターがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスまたは物理化学的処方組成物のいずれであるかに関係なく、標的細胞への遺伝子導入の効率は常に非常に低かった [A. Kahn, 遺伝子治療の十年間：失望と希望, Biofutur 202: 16-21, 2000]。治療用導入遺伝子の発現の持続時間は短いことが非常に多く、数週間に制限されるが、これは形質導入された細胞の優先的な排除を引き起こす免疫反応、その固有の長寿命、または挿入された遺伝子の発現を指令するＤＮＡ配列もしくはプロモーターの消滅のためである (Orkin, S.H., Motulsky, A.G., ＮＩＨ遺伝子治療研究投資の評価パネルの報告および勧告、www.nih.gov/news/panelrep.html)。
【０００７】
最後に、或る種のベクターは毒性作用を発現した。オルニチン・トランスカルバミラーゼによる治療の試験において、体内に注入されたアデノウイルスベクターの使用中に患者の死亡を生ずる事故が起こった (Smaglik, P., 遺伝子治療死亡後に何が誤まりであったかの研究者の思考、 The Scientist 13 [21]: 1 (1999)。
【０００８】
すなわち、あらゆる遺伝子治療の臨床試験の分析から、遺伝子導入の戦略には、ずっと効率が高く、より安全で、かつ治療効果が必要な細胞を優先的にトランスフェクトすることができるベクターが必要であることは明らかである (Orkin, S.H., Motulsky, A.G., ＮＩＨ遺伝子治療研究投資の評価パネルの報告および勧告、www.nih.gov/news/panelrep.html)。
【０００９】
ポリカチオン性(polycationic)高分子(ポリマー型)ベクターが開発されたのはこの理由からである。この種のベクターは固体であって、多様な形態、特にプラスミド形態、のＤＮＡを吸着することができる。それらは、それに接触した細胞を多様な歩留りでトランスフェクトするという特徴的な特色を有する。それらは、骨創傷治療を促進させる目的で、それに関係する疎性結合組織の細胞をトランスフェクトするためにインビボで使用された (S. Goldstein, J. Bonadio, 創傷治療のためのインビボ遺伝子導入法、The Regents of the University of Michigan, 匿名、米国特許第5,962,427号: 1-31, 1999, 遺伝子治療, A61K 48/00, 514/44)。
【００１０】
リン酸カルシウムとＤＮＡの共沈はインビトロ細胞のトランスフェクションに長年にわたって使用されてきた (E.T. Schenborn, V. Goiffon, 哺乳動物培養細胞のリン酸カルシウムトランスフェクション, M.J. Tymms編、ニュージャージー州トトワ: Humana Press Inc, 2000, p. 135-144; W. Song, D.K. Lahiri, 細胞をリン酸カルシウムと懸濁状態で混合することによるＤＮＡの効率的なトランスフェクション, Nucleic Acid Research 23 (17): 3609-3611, 1995; Y.-W. Yang, J.-C. Yang, 遺伝子キャリアとしてのリン酸カルシウム：電子顕微鏡法, Biomaterials, 18: 213-217, 1997)。
【００１１】
それらは、培地をカルシウムで過飽和にするために培地に塩化カルシウム溶液を投入し、ＤＮＡ分子が内包されたリン酸カルシウムを沈殿させることにより得られる。得られた複合粒子を次いで、多様なやり方でプラスミドを取り込み、輸送される遺伝子を発現する所定細胞による食作用を受けさせる。
【００１２】
しかし、このような共沈は重大な欠点がある。それらはインビボで使用するのは非常に難しい。なぜなら、開放系では過飽和を得ることが困難であるからである。さらに、この種の共沈は空間において局所化されたトランスフェクションを可能にすることができない。
【００１３】
リン酸カルシウムセラミックスは、リン酸カルシウムの粒子を懸濁状態で含有するスリップ（泥漿）を焼結することにより得られる材料である。それらは粒界により結合された結晶粒の集合体である (Frayssinet, P., Fages, J., Bonel G., Rouquet, N., 生物工学、マテリアルサイエンスおよび骨修復, European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology (1998) 8: 17-25)。
【００１４】
この材料は骨組織との特異的な生体適合性を示し、それにより、この材料は骨再建材料として、または骨形成細胞用のベクターとして、特に有用となる (P. Frayssinet, J.L> Trouillet, N. Rouquet, E. Azimus, A. Autefage (1993), 化学組成の異なるマクロポーラス(粗孔質)リン酸カルシウムセラミックの骨組込み, Biomaterials, 14, 6: 423-429)。
【発明の開示】
【００１５】
本発明に関して、本発明者らは、インビボおよびインビトロの両方の細胞、特に間葉細胞をトランスフェクトすることができるリン酸カルシウムのセラミックスおよび粉末類を開発した。これらのセラミックスの化学組成は変動することがある。なぜなら、それらの組成の中にいくつかのオルトリン酸塩、特にリン酸三カルシウム、骨組織の鉱物相に最も近い合成相であるヒドロキシアパタイト、およびリン酸八カルシウム、が入り込むことができるからである。これらのセラミックスは別の特徴的な特色を有しており、それらの表面特性は、とりわけ粉末の合成方式、焼成温度または各種痕跡量元素の存在といった、多様なパラメータに応じて非常に変動し易い。これらの各種因子は、特に表面電荷、ゼータ電位、およびリン酸カルシウムの網目における置換容量に影響を及ぼす。リン酸カルシウムセラミックスはまた、体内に移植されるか、又は細胞外液に匹敵する組成の塩類培地中に浸漬されると、その表面で炭酸化アパタイト（carbonated apatite）のエピタキシャル成長を示すという特徴的な特色を有する (M. Heughebaert, R.Z. LeGeros, M. Gineste, A. Guilhem, 非骨形成性部位に移植されたヒドロキシアパタイト(ＨＡ)セラミックス、物理化学的特性, J. Biomed Mat Res 22: 257-268, 1988)。これらの材料の生体適合性の性質があるとされてきたのはこの結晶成長によるものである。
【００１６】
核酸に対するリン酸カルシウムの吸着性は、ＤＮＡまたは或る種のＲＮＡを分離および精製するためにＨＡカラムでのクロマトグラフィーにおいて利用されたことがある。化学組成が同じであっても、クロマトグラフィーに使用した全てのヒドロキシアパタイト粉末が同じ核酸分離能を有するとは限らないことを理解することが重要である (A. Eon-Duval, ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるプラスミドＤＮＡの精製、第２回ヒドロキシアパタイト・カンファレンス抄録, サンフランシスコ, 2001年3月)。有機分子とヒドロキシアパタイトとの相互作用はこの鉱物の表面特性に依存し(M.J. Gorbunoff, ヒドロキシアパタイトカラムでのタンパク質クロマトグラフィー, Methods in Enzymology, vol 182, Academic Press Inc 1985: 329-339)、それはバッチごとに異なることがある。
【００１７】
この固体の表面での電荷の分布およびその水和容量がその表面での有機分子の吸着に大きな影響を及ぼすことが立証された (Norde, W., Lyklema, J., (1991) なぜタンパク質は界面を好むか, J Biomed Sci Polymer Edn 2, 183-202 (1991))。また、有機分子の溶媒のイオン強度およびｐＨも考慮に入れるべきである。
【００１８】
溶液状態のタンパク質と固体が反対の電荷を持っている場合、それらは互いに引きつけあう。少なくとも、タンパク質上の電荷と固体の表面の電荷がほぼ均衡しているなら。電荷が均衡していないなら、それは接触領域における電荷の蓄積を生じ、吸着にとってエネルギー的にとても望ましいとはいえない高い静電位を引き起こす。固体表面と有機分子が同じ電荷である場合にも似た状況が見られる。しかし、多くの場合は、それでも場合によっては吸着が起こるが、これは電荷の蓄積を妨げる吸着層の界面での溶液からのイオンの混入のためである。
【００１９】
疎水性は、特に三次および四次構造を有する有機分子において、電荷の分布に関与することから、吸着に影響を及ぼす。表面（分子または固体）の疎水性は吸着を促進することができる。
【００２０】
アパタイト類の電荷の分布および水和容量は、それらが正または負の表面電荷を有することがあり、かつ親水性または疎水性であることがあるため、有利な性質である。さらに、網目の置換が非常に多いと、表面の官能基が変動しうる。
【００２１】
本発明者らは、多様な形態のＤＮＡを結合して、それをトランスフェクションのために分離された細胞または体内に送り込むことができるヒドロキシアパタイト系のリン酸カルシウム粉末類を開発した。これらの粉末は、懸濁状態で液体またはゲルに注入してもよい。これらの粉末はまた、匙を用いて堆積させるか、または三次元網目構造内で培養された細胞のためのトランスフェクション用ベクターとして使用してもよい。これらのトランスフェクション特性を有するために、粉末は特異的な物理化学的特性を有する。組織化学により実証することができるガラクトシダーゼの遺伝子を保有するプラスミドによる分離または非分離細胞のトランスフェクションを判定することができる一連の実験を行った。粉末は、インビトロとインビボの両方の分離細胞および組織の両方をトランスフェクトすることができるのに特によく適した態様である。これらの粉末は、ＤＮＡのインターナリゼーションならびに細胞質内ヌクレアーゼからのその保護および核へのその移入を可能にする。
【００２２】
ヒドロキシアパタイト粒子の表面へのＤＮＡ（負電荷を持つ有機分子）の結合に関係するメカニズムは下記の可能性がある：
・該材料が正に帯電している場合には静電吸着。
【００２３】
・これらの材料の表面におけるエピタキシャル成長を通して現れ、カルシウムとリンで過飽和の培地において表面で起こる複雑な溶解／再沈殿過程から生ずる、炭酸化アパタイト層におけるＤＮＡ分子の共沈。
【００２４】
・界面相と溶液との間でのイオン交換。
材料にいったん結合すれば、ＤＮＡは細胞内に侵入するはずである。組成および表面特性は、生物学的培地中での材料の分解およびトランスフェクション用粒子の放出にとっても重要である。ＨＡセラミックスは粒界で分解を受け、エピタキシャル成長により材料の表面に現れる炭酸化アパタイト相はその材料とは異なる溶解度を有することが知られている。
【００２５】
他方、全てのリン酸カルシウムが細胞にトランスフェクトすることができるのではない。例えば、ＤＣＰＤまたは或る種の形態のＨＡまたはＴＣＰは、それをすることができないことを示している。それらの細胞毒性がその原因であることは間違いない。
【００２６】
これに対して、粉末およびセラミックの表面を培地中での成熟化により炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を生ずるように修飾（変性）すると、標識歩留りが向上する。
かくして、第１の側面において、本発明は、ＤＮＡ分子の存在下において、カルシウムおよびリンで飽和していない塩または培地中にてインキュベーションすることからなる工程を含むことを特徴とする、鉱物−ＤＮＡ複合体の作製方法に関する。この方法は、エピタキシャル成長により修飾されたセラミック表面への吸着により、または該材料の表面での共沈により、セラミック表面へのＤＮＡの結合（固定）を得ることを可能にする。このようなリン酸カルシウム粒子を、バイオテクノロジーで慣用されている細胞培養培地の種類の塩類培地または培養培地、特にＤＭＥＭに、１５〜５０℃、好ましくは約３７℃の温度で、少なくとも数分間、例えば、１、５、１０または３０分から約１２、２４、４８時間、ないし数日間以上までの時間で、浸漬する。その目的は、プラスミドと接触させる前またはその最中に、表面に炭酸化アパタイト層を形成することである。
【００２７】
或る特定の態様において、上記方法を、核酸、特にプラスミドと接触させる前に行う。別の態様では、該粉末類およびセラミックスの表面での炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を生ずるこの工程を、核酸を含有する培地中で行う。この形態では、表面修飾および核酸の結合は同時に達成される。
【００２８】
好ましくは粉末およびセラミックスを、核酸の結合の前またはこれと同時に、ＤＭＥＭ培地中に３７℃で４８時間浸漬する。
別の側面では、本発明は、リン酸カルシウム粉末またはリン酸カルシウムセラミックを、カルシウムおよびリン酸のイオンで飽和されていないリン酸緩衝液中で水和することからなる工程ａ）、および工程ａ）で得られた生成物を、カルシウムおよびリン酸のイオンで飽和されておらず、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを含有するリン酸緩衝液中に数分から数時間までの範囲内の時間浸漬することからなる工程ｂ）を含み、ｃ）その表面に結合したＤＮＡ分子を含有するリン酸カルシウム粒子を生成させる、ことを特徴とする、リン酸カルシウムのセラミックまたは粉末の表面にプラスミド形態のＤＮＡを結合させる方法に関する。
【００２９】
好ましくは、工程ａ）およびｂ）の緩衝液が、０.１２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）からなる。浸漬は、１５〜５０℃の範囲内、好ましくは約３７℃の温度で少なくとも１、５、１０または３０分から約１２、２４または４８時間までの時間で行う。さらに、リン酸カルシウム粒子を、ほぼ数分から数日間、１５〜５０℃、好ましくは約３７℃の範囲内の温度で細胞培養培地型の培地中に浸漬保持する。
【００３０】
従って、この方法では、水和は、好ましくは該粉末およびセラミックの表面で炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を引き起こすように細胞外液を模擬した溶液中にリン酸カルシウム粉末またはリン酸カルシウムセラミックを浸漬することからなる。これに関して、工程ｂ）は、細胞外液を模擬した培地または核酸を含有する細胞培養培地型の培地により行われ、該培地はＤＮＡに対して非変性性であって、かつカルシウムおよびリン酸イオンで飽和されていないものである。この培地は、該粉末およびセラミックの表面で炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を引き起こす。
【００３１】
工程ａ）およびｂ）は、同時にまたは逐次的に行うことができる。従って、本発明は、約３７℃で数分から数時間までの範囲内の時間で一本鎖または二本鎖ＤＮＡを含有する溶液を用いて行うことが可能である。
【００３２】
有利なことに、この方法により、ＤＮＡ分子に対して非変性性の条件下で、リン酸カルシウム粒子に生理学的ｐＨでＤＮＡを結合させることが可能となる。セラミックは多孔質のものでも、あるいは緻密なセラミックでもよい。
【００３３】
別の側面では、本発明は、トランスフェクションを受ける細胞を上記の方法により得られた粒子と数時間ないし数週間接触させることからなる、単層または三次元で培養された分離細胞をトランスフェクトする方法に関する。この方法は、培養組織断片に含まれている細胞をトランスフェクトすることもできる。得られた上記の粒子は、組織中または器官中に含まれているインビボ細胞のトランスフェクション用の薬剤を製造するのに特に有用である。
【００３４】
別の側面では、本発明は、特に、飽和しておらず生体高分子に対して非変性性である塩溶液中で、非変性性条件下において、その表面に炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長を維持することができることを特徴とする、上記の方法から得ることができるリン酸カルシウムセラミックおよび粉末に関する。
【００３５】
本発明はまた、その表面に結合した核酸をさらに含有するリン酸カルシウムセラミックおよび粉末にも関する。
これらの生成物は、インビトロおよびインビボ細胞のトランスフェクションに対して特に効率的である。
【００３６】
有利には、得られたリン酸カルシウムセラミックおよび粉末は、表面が修飾される前に下記特性の少なくとも１つを有する：
−表面に存在する下記荷電基の特徴：ＰＯ4-、ＯＨ-，Ｃａ++；
−塩基性の表面ｐＨ；
−陰性の界面動電位；
−疎水性；
−０〜２００μｍ、特に８０〜１２５μｍおよび０〜２５μｍ、の範囲内の粒度。
【００３７】
好ましくは、本発明の生成物は、上記のすべての特徴を含む。
さらに、上記のリン酸カルシウムセラミックおよび粉末は、高分子、セラミックまたは金属で、好ましくは磁性の別材料からなるコアを含んでいてもよい。
【００３８】
本発明はまた、上記のリン酸カルシウム粉末を基材として形成された粒子にも関し、この粒子は、鉱物または高分子マトリックス中、特に硫酸またはリン酸カルシウムセメント中に含有される。
【００３９】
別の側面では、本発明は、上記で定義されたセラミックの特徴を有する関節の人工器官にコーティングするセラミックに関する。
本発明はまた、細胞培養の担体として、特に担体を用いてトランスフェクトずみ細胞の三次元網目構造内での培養およびインビトロおよびインビボでの細胞のトランスフェクションのために、その表面にＤＮＡを保有する前記リン酸カルシウムセラミックおよび粉末を使用することにも関する。
【００４０】
以下の実施例は例示のために示す。それらは本発明の好適態様を構成するものである。
実施例１：使用した粉末の特徴
タイプＰ１５：比表面積が０.６２ｍ2／ｇの球形粉末。これは１１８０℃で焼成されたもので、その粒度は８０〜１２５μｍの範囲内であった。
【００４１】
タイプＰ１：比表面積が５８.８４ｍ2／ｇで、未焼成（粗製）の、粒度が０〜２５μｍの範囲内の任意形状の粉末。
使用した粉末の粒度の検討では、球形粉末（Ｐ１５）の方は明確な粒度範囲を有するのに対し、任意形状の粉末（Ｐ１）は、多量の微粒子を含む、ずっと広い粒度範囲を有することが示される。ゼロ電荷ｐＨは、粉末の焼成温度によって変動する。脱イオン水中で測定した粉末Ｐ１のゼータ電位は−２７.５ｍＶで、表面ｐＨは９.０８である。
【００４２】
粉末の焼結温度に依存してゼロ電荷ｐＨは変動し易いものの、生理学的ｐＨよりはかなり小さい値をとる。このことは、その焼結温度に関わりなく、粉末の界面動電位は、中性ｐＨでは負であることを意味する。
【００４３】
走査型電子顕微鏡により球形粉末を検査した結果は、粉末が結晶粒界を介して一体化した結晶粒からなることを示している。高倍率では結晶粒の表面の一部に表面不規則性が存在する。
【００４４】
【表２】
2006514655.tif 000003
【００４５】
実施例２：ＤＮＡをベクターに結合させる方法
ベクターは異なる２つの方法で作ることができる。
【００４６】
方法Ａ：ベクターをリン酸緩衝液中でプラスミドと直接インキュベートする方法である。それから数時間インキュベートを続けると、その表面が炭酸化アパタイトのエピタキシャル成長によって修飾される。その後、材料表面での共沈によって結合が起こる。
【００４７】
方法Ｂ：ベクターを塩溶液に数日間露出して表面を修飾する方法である。この修飾が平衡状態に達したら、次いで材料を、プラスミドを含有する溶液に入れる。その後、ＤＮＡの結合が修飾された材料の表面で起こると考えられる。
【００４８】
未修飾粒子の表面へのプラスミドの結合（方法Ａ）：
二重鎖ＤＮＡは、低濃度のリン酸緩衝液に溶解すると、ＨＡに対して著しい親和性を示す。それはより高濃度のリン酸緩衝液中で溶離する。表面積が１ｍ2となる量の粉末をペトリ皿にとる。それはタイプＡでは１.６１ｇ、タイプＢでは０.０１７ｇである。
【００４９】
・ｐＨ６.８の０.１２Ｍリン酸緩衝液１０ｍｌ中でＨＡ粉末（２ｍｌ／ｇ）を水和させる。１００℃で１５〜３０分間加熱する。
・室温で放置し、緩衝液を除去する。６０℃、ｐＨ６.８の０.１２Ｍリン酸緩衝液５〜１０ｍｌ中に再懸濁させ、デカンテーションにより分離し、６０℃の同じ緩衝液５ｍｌ中に再懸濁させる。
【００５０】
・核酸のサンプルを４０℃、ｐＨ６.８の０.１２Ｍリン酸緩衝液１ｍｌ中に加える（二重鎖核酸の溶離は、ＨＡをリン酸緩衝液(０.４Ｍ)０.５ｍｌで８〜１０回洗浄することにより行うこともできる）。
【００５１】
エピタキシャル成長により修飾された粒子の表面へのプラスミドの結合（方法Ｂ）：
・粒子をＤＭＥＭ培地、３７℃で４８時間インキュベートした。
・粒子をｐＨ６.８の０.１２Ｍリン酸緩衝液で洗浄する。
【００５２】
・ｐＨ６.８の０.１２Ｍリン酸緩衝液１ｍｌ中の核酸サンプルを４０℃で加える。
実施例３：インビトロでの細胞のトランスフェクション
以下の３つの細胞系を使用した：
・ラビットの成長軟骨
・ラビットの骨膜
・ラットの頭蓋冠細胞
これらは、コラーゲナーゼ溶液中でコラーゲンマトリックスを消化させた後、遠心分離することにより得られる。
【００５３】
３.１−未修飾表面を持つ材料
粉末（タイプＢ）の量はやはり同じ量である：１０ｍｇ。
トランスフェクション中、細胞は融合性ではなかった。細胞はＤ０（０日目）でトランスフェクトされ、Ｄ４、Ｄ２１およびＤ３０でガラクトシダーゼの発現について組織化学的な評価をまず行った。
【００５４】
Ｄ４（４日目）：
すべての細胞系が標識ゾーンを有している。粒子でトランスフェクトされたウェルでは、標識された細胞が粒子の周囲に集まっているが、一部はなお粒子から離れていた。この距離は、粒子が比表面積の高い破片を放出することにより説明することができる。そのような破片は、標識された細胞の集団の中央部において顕微鏡下で見ることができる。成長軟骨細胞は、絶対値で最もよく標識された系統である。
【００５５】
Ｄ２１（２１日目）：
軟骨細胞に関しては、トランスフェクトされた細胞の数が高い。ラットの頭蓋冠細胞は非常に陽性である。
【００５６】
Ｄ３０（３０日目）：
細胞は相対的な接触阻害を示し、事実上三次元化して、丸くなる。前記３群の細胞のほとんどが陽性である。陽性細胞の数と前記の成長速度から、プラスミドがある細胞から別の細胞に伝達されること、あるいはＤＮＡ粒子の放出が経時的に広がることを示しているようである。その反対の場合には陽性細胞の割合は非常に低くなるだろう。トランスフェクション用粒子の放出が徐々であることも考えられる。優先的に標識された細胞は粒子と接触状態にあるものである。
【００５７】
【表３】
2006514655.tif 000004
【００５８】
３.２−エピタキシャル成長により修飾された表面を持つ材料
培養の初期から細胞のほとんどが標識される。
【００５９】
３.２.１−半透膜の片面でのトランスフェクション
結晶粒を、細胞と接触状態で、または細胞叢（cellular lawn）から分離するポリカーボネート製の多孔質膜（０.２μｍ）により細胞から分離された状態で、沈殿させた。ガラクトシダーゼによる細胞標識をＤ４で組織化学的に評価する。
【００６０】
粒子と直接接触している細胞は散発的に標識される。粒子と接触していない（膜で隔てられた）細胞も標識される。従って、ポリカーボネート膜の細孔を通過するサイズが０.２μｍより小さいトランスフェクション用粒子が存在する。
【００６１】
３.２.２−３次元網目構造の細胞のトランスフェクション
上述した細胞系を培地中に懸濁させる。ベッドを培養皿の底に置く。この縣濁液を用いて、ガラクトシダーゼ遺伝子を保有するプラスミドに対するベクターであるマイクロビーズのベッドに接種する（１.５〜２×１０5個の細胞／ビーズ０.０５ｇ）。このベッドは培養皿の底に置かれている。細胞を１０〜１５日間培養する。ビーズを架橋し、凝集させる三次元の細胞層の生成が得られる。この層はまた多量のコラーゲンマトリックスを含有している。
【００６２】
観察日には、細胞は、さまざまな粒子を架橋し、それらを一体化している三次元網目構造を形成している。光学顕微鏡観察により、粒子の集団に含まれる細胞がガラクトシダーゼにより標識されていることが示される。
【００６３】
３.２.３−組織培養における細胞のトランスフェクション
標識に用いた材料：タイプＡ：比表面積０.６２ｍ2／ｇの球形粉末。これは１１８０℃で焼成されたもので、その粒度は８０〜１２５μｍである。粉末の量は、１皿あたり数十個の粒子である（Ｐ１５）。
【００６４】
数個のビーズを、あらかじめ浸漬せずにインキュベートした後、骨断片と接触状態に置いた(方法Ａ)。
骨断片は３日齢の新生ラットの大腿骨、脛骨および頭蓋冠から得られる。骨片をきれいにして、付着した軟組織を除去した。長骨は、３つの部分：２つの骨端と骨幹、に切断した。頭蓋冠は一辺が２〜３ｍｍの小さな断片に切断した。これらの各種の断片をＤＭＥＭ中３％寒天ゲルの表面に付着させた。その後、断片が液体−空気の界面に現れるように、培地（ＤＭＥＭ＋ＦＣＳ）を加えた。
【００６５】
ビーズを組織との接触状態に２〜３０日間保持し、その日に細胞のガラクトシダーゼ活性を実証してから、組織断片を作製した。
２日の接触では、散発的な標識ゾーンが識別可能である。標識は、ＨＡビーズと離間しておよび接触して起こっている。標識はまたこのような同じビーズと接触した状態でも起こる。
【００６６】
接触３０日では、骨断片の全体が目視で青に変化していた（図１）。
図１は、トランスフェクション用粉末の存在下に３０日間置いた骨組織培養物の拡大写真である。ガラクトシダーゼのプラスミドベクターによる細胞のトランスフェクションのために、骨断片は完全に青色である。反射光学顕微鏡を用いると、標識されていないゾーンを見ることはできない。ビーズはガラクトシダーゼとの反応により標識された１つのマトリックスをなした状態でくっついている。
【００６７】
３０日間培養された各種の骨組織サンプルの断片は、骨細胞（骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨膜細胞、骨膜細胞、破骨細胞）が標識されることを示している（図２は、全細胞がガラクトシダーゼによってトランスフェクトされたことを示す同一組織の組織学的断片（×３０）である）。
【００６８】
造血細胞系は標識されない。下記に留意すべきである。
・すべての骨細胞が標識される。
・それらは、その細胞からビーズまでの距離に関係なく標識される。
【００６９】
３.２.４−インビボでのトランスフェクション
４週齢の雄性ＮＺＷラビット１０匹からなる群をランダムに選択する。これらのラビットをＡ群とＢ群の２群に分ける。各群から１匹ずつのラビットを対照とする。
【００７０】
手術ゾーンの位置を下顎門歯の後側の左下顎骨とする。先行研究によって、骨が最も豊富であるこの部位を選択することが可能になっていたことに留意すべきである。Ｐ１５粉末タイプを使用した。方法ＡによりＤＮＡを結合した。
【００７１】
滅菌部分の設定と皮膚および粘膜の消毒後、柳葉刀を使って口内の前庭切開を行う。門歯の基部で下顎の骨部位に到達するように全厚の細長い１片を傾斜させる。３ｍｍのトレフィンを使って骨穿孔（bone effraction）を組織化する。作られた骨の欠損は、深さ２ｍｍ程度のものである。骨鋏を用いて骨弁を取り除く。試験する生体材料 (biomaterial)を５ｍｌの注射器を用いて吸い上げ、前記の骨の欠損部に、それを満たすように入れる。この生体材料を所定位置に保持するため、滅菌ガーゼを用いてわずかな力を加える。その後、元の位置に戻した骨弁を縫合する。
【００７２】
２匹の対照動物は、生体材料を付着させずに、別の対照側方（controlateral）手術を受ける。
ラビットを３〜６週で死亡させた。下顎骨を取り出し、エタノール中で固定し、メタクリル酸ヒドロキシエチル中に包埋した。５μｍ厚の切片を作り、ガラクトシダーゼ活性を確かめた。
【００７３】
・３週間の場合：
対照サイト：
組織学的切片は、柱状組織がほとんどないスポンジ状の骨を示し、その細孔を占拠しているのは非常に粗雑な間質組織である。破骨細胞の外観を持つ多核細胞が柱状組織の表面に存在する。これらの細胞はすべてガラクトシダーゼ反応により標識されている。同様に、すべての単核細胞も標識されている。それらの細胞だけが標識された細胞である。
【００７４】
移植サイト：
リン酸カルシウムビーズを貫通している切片は、ビーズが、その表面に多数の多核細胞を付着させながら、比較的緻密な結合組織の状態で包埋されていることを示す。すべての繊維芽または多核細胞がガラクトシダーゼにより標識されている。
【００７５】
切片がビーズから離れるようになっていると、標識された細胞の存在は非常に少なくなる。それでも、手術処置により崩壊されなかった組織構造物は興味深い情報を与える。歯の靭帯の繊維芽細胞は標識される。繊維芽細胞の外観を持つ細胞小島が存在し、それは柱状体の間で細孔の間質組織において標識されている。場合によっては、骨芽細胞系の細胞も標識されるようである。
・６週間の場合
肉眼で、ＨＡ結晶粒の周囲に標識が存在する。切片は陽性の間質細胞を示し、歯の靭帯の細胞および象牙芽細胞が遺伝子を発現している。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】トランスフェクション用粉末の存在下に３０日間保持した骨組織培養物の拡大写真。
【図２】全細胞がガラクトシダーゼによってトランスフェクトされたことを示す同一組織の組織学的断片の拡大写真（３０倍）。
【図１】
2006514655.tif 000005
【図２】
2006514655.tif 000006
【国際調査報告】
2006514655.tif 000007
2006514655.tif 000008
2006514655.tif 000009
2006514655.tif 000010
2006514655.tif 000011
2006514655.tif 000012
2006514655.tif 000013
2006514655.tif 000014
2006514655.tif 000015