(57)【要約】本発明は一般に、変異体ＩｇＥタンパク質に関する。特に、本発明は、未改変のＩｇＥタンパク質に比較して可撓性の減少した重鎖を有し、結果として特定の構造状態にされた、改変されたＩｇＥタンパク質に関する。本発明はまた、ＩｇＥグリコシル化変異体の三次元モデルに関する。本発明はまた、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαに対するＩｇＥタンパク質の結合を阻害する化合物を産生し、および単離するための本発明のタンパク質の使用に関する。本発明のタンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明に含まれる。ＩｇＥのそのレセプターへの結合を阻害する化合物もまた、含まれる。本発明はまた、本発明のタンパク質および／または化合物を含む治療組成物およびキットならびにこのような組成物およびキットを使用して動物を処置する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された変異体ＩｇＥタンパク質であって、ここで、該変異体ＩｇＥタンパク質の変異体ＩｇＥＨＣタンパク質は、未改変のＩｇＥタンパク質中の未改変ＩｇＥＨＣタンパク質の空間移動性と比較して低減された空間移動性を有し、ここで、該未改変ＩｇＥＨＣタンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項２】
前記変異体ＩｇＥタンパク質が、開いた高次構造または閉じた高次構造に制約された、請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項３】
前記変異体ＩｇＥＨＣタンパク質のＣε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基が、２３Å以上の残基間距離を達成し得ない、請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項４】
前記変異体ＩｇＥＨＣタンパク質のＣε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基が、固定された約１３Åと２３Å未満との間の残基間距離を有する、請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質であって、ここで、該変異体ＩｇＥタンパク質は、前記ＩｇＥＨＣタンパク質のＣε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基が、約１３Åの距離、約１４Åの距離、約１５Åの距離、約１６Åの距離、約１７Åの距離、約１８Åの距離、約１９Åの距離、約２０Åの距離、約２１Åの距離、約２２Åの距離、または約２２Åと２３Å未満との間の距離からなる群から選択された残基間距離を有する高次構造に制約される、単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項６】
前記変異体ＩｇＥタンパク質が、配列番号１１に対して少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣタンパク質を含み、ここで、配列番号１１の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位に対応する該タンパク質中のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項７】
前記変異体ＩｇＥタンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む未改変ＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質に対して惹起された抗体に結合する、請求項６に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項８】
前記変異体ＩｇＥＨＣタンパク質が、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質。
【請求項９】
配列番号１０に対して少なくとも約８０％同一である核酸配列を含む、単離された核酸分子であって、ここで、配列番号１０のヌクレオチド４〜６、７〜９、１０〜１２、１３〜１５、１６〜１８、１９〜２１、２２〜２４または２５〜２７に対応する該核酸配列のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする、核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド４〜６のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
（ｂ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド７〜９のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
（ｃ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド１０〜１２のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
（ｄ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド１３〜１５のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
（ｅ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド１６〜１８のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
（ｆ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド１９〜２１のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
（ｇ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド２２〜２４のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；および
（ｈ）配列番号１０に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列であって、ここで、該核酸配列のヌクレオチド２５〜２７のコドンがシステインまたはメチオニンをコードする、核酸配列；
からなる群から選択された核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項１１】
請求項９に記載の単離された核酸分子であって、ここで、前記核酸配列が、配列番号１１と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、ここで、配列番号１１の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位に対応する該タンパク質のアミノ酸が、システインまたはメチオニンであって、ここで、該タンパク質が配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して惹起された抗体に結合する、核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸配列が、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６からなる群から選択される、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１１に対して少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質であって、ここで、配列番号１１の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位に対応する該タンパク質のアミノ酸がシステインまたはメチオニンであって、ここで、該タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して惹起された抗体に結合する、タンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離されたタンパク質であって、ここで、該タンパク質が、以下：
（ａ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の２位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の３位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の４位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の５位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の６位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の７位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の８位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；および
（ｈ）配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このようなアミノ酸配列の９位のアミノ酸がシステインまたはメチオニンである、アミノ酸配列；
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１６】
以下からなる群から選択される方法であって：
（ａ）ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を阻害する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質または請求項１３に記載の単離されたタンパク質を、ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質の存在下で、推定阻害化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）該推定阻害化合物が、請求項１に記載の該変異体ＩｇＥタンパク質または請求項１３に記載の該単離されたタンパク質の、該ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質への結合を阻害するか否かを決定する工程
を包含する方法；ならびに、
（ｂ）閉じた高次構造中に存在するかまたは閉じた高次構造を生じるかのどちらかの、ＩｇＥに結合する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質または請求項１３に記載の単離されたタンパク質を、ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質の存在下で、推定阻害化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）該推定阻害化合物が、請求項１に記載の該変異体ＩｇＥタンパク質または請求項１３に記載の該単離されたタンパク質に結合するか否かを決定する工程
を包含する方法からなる群から選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記変異ＩｇＥ分子が、配列番号１１に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣの分子を含み、ここで、配列番号１１の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位に対応する前記タンパク質中のアミノ酸がシステインまたはメチオニンであって、ここで、該タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して惹起された抗体に結合する、方法。
【請求項１８】
ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を阻害する単離された化合物であって、該化合物が、請求項１６に記載の方法によって同定される、化合物。
【請求項１９】
前記化合物がＩｇＥの開いた型には結合しない、請求項１８に記載の単離された化合物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の化合物および賦形剤を含有する組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物を投与する工程を包含する、ＩｇＥによって媒介される疾患から動物を防御するための方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質または請求項１３に記載の単離されたタンパク質、および請求項１に記載の単離された変異体ＩｇＥタンパク質または請求項１３に記載の単離されたタンパク質に化合物が結合するか否かを決定するための手段を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、変異体免疫グロブリンε（ＩｇＥ）タンパク質およびこのようなタンパク質の３次元モデルに関する。本発明はまた、アレルギーの予防および処置ならびに動物における免疫反応の調節に有用である化合物を同定するための変異体タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
抗体Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）は、分泌された抗体の特異性を免疫系の種々の細胞に結びつけることにより、免疫反応において重要な役割を演じる。多くの細胞型（マクロファージ、肥満細胞、好酸球および好塩基球を含む）が、その表面上に膜結合型ＦｃＲを発現する。アレルゲン結合抗体のＦｃＲへの結合は、これらの細胞に対する抗原特異性を提供し、活性化に基いてさらに、免疫反応の細胞特異的メディエーター（例えば、インターロイキン、炎症のイニシエーター、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ヒスタミンまたは細胞傷害性タンパク質）を放出する。ＦｃＲの養子特異性は、これらのレセプターを発現する細胞型の多様性に抗体抗原認識部位の多様性を結びつけることにより、病原体除去のための組合せ方法を可能にする。
【０００３】
ＦｃＲに開始される機構は、感染性疾患に対する通常の免疫ならびにアレルギー、抗体媒介性腫瘍識別、自己免疫疾患および免疫反応が異常である（すなわち、適切に調節されていない）他の疾患において重要である。トランスジェニックマウスを用いた最近の実験は、ＦｃＲが、免疫反応（抗体に関する細胞毒性および免疫複合体の生成に関連した炎症性カスケード（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈら、１９９８、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏ  １６、４２１〜４３２を参照のこと）を含む）の重要な工程を制御することを示した。ＩｇＧに結合するレセプター（集合的にＦｃｇＲとして公知であるＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩおよびＦｃｇＲＩＩＩ）は、種々の炎症反応を媒介し、Ｂ細胞活性化を調節し、また、過敏反応を誘発する。高親和性Ｆｃεレセプター（ＩｇＥレセプターまたはＦｃεＲＩとしても公知である）は、肥満細胞の活性化およびアレルギー反応の誘発およびアナフィラキシーショックに関連する。ＦｃεＲＩα鎖（ＦｃεＲＩα）に対するノックアウトマウスは、ＩｇＥ媒介性アナフィラキシーを起こすことができない（例えば、Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７５、９６９〜９７６を参照のこと）が、ＦｃｇＲはまだ、肥満細胞を活性化し得る（例えば、Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９、９１５〜９２５；Ｏｅｔｔｇｅｎら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０、３６７〜３７０を参照のこと。）。ＦｃεＲＩはまた、血小板および好酸球から抗寄生虫反応を誘発し、ならびにＴ細胞の活性化のために、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路に抗原を送達することを示した；例えば、Ｇｏｕｎｎｉら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６７、１８３〜１８６；Ｊｏｓｅｐｈら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、２２１２〜２２１８；Ｍａｕｒｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、２７３１〜２７３９を参照のこと。ＦｃεＲＩのβサブユニットは、遺伝的研究において喘息と関連していた；例えば、Ｈｉｌｌら、１９９６、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５、９５９〜９６２；Ｈｉｌｌら、１９９５、Ｂｍｊ  ３１１、７７６〜７７９；Ｋｉｍら、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．４、４６〜４８；Ｍａｏら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．５３、５４〜５６；Ｓｈｉｒａｋａｗａら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７、１２５〜１２９を参照のこと。集団の有意な画分（約２０％）は、アレルギーに感染され得、そして今世紀は、喘息の本質的な増加が認められた。ＦｃεＲＩに対するＩｇＥ結合は、種々のアレルゲンに対する反応において必須の事象であるので、ＦｃεＲＩ／ＩｇＥ相互作用の阻害を目的とする治療計画は、これらの疾患に対する有用な処置を提供し得る。例えば、ＩｇＥを標的し、レセプター結合をブロックするモノクローナル抗体は、治療潜在力を示した；例えば、Ｈｅｕｓｓｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９、８０５〜８１３を参照のこと。
【０００４】
ＦｃεＲＩは、肥満細胞、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞および血小板の表面上で、四量体（ａｂｇ２）または三量体（ａｇ２）膜結合レセプターとして見出される。ＦｃεＲＩのα鎖はまた、ＦｃεＲＩαと呼ばれ、高い親和性（約１０９〜１０１０モル／Ｌ（Ｍ）のＫＡ）でＩｇＥ分子に結合し、単一のＣ末端膜貫通アンカーの前の終止コドンの導入による可溶性の１７２アミノ酸のＩｇＥ結合フラグメントとして分泌され得る；例えば、Ｂｌａｎｋら、１９９１、Ｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、２６３９〜２６４６（これは、１７２アミノ酸の可溶性ＩｇＥ結合フラグメントの分泌を記載する）を参照のこと。ヒトＦｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、７個のＮ結合型グリコシル化部位を含む。ＦｃεＲＩαのグリコシル化は、レセプターの分泌および安定性に影響するが、ＩｇＥ結合は必要としない；例えば、ＬａＣｒｏｉｘら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０、３２１〜３３０；Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、８２４９〜８２５６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１２７３６〜１２７４３；Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら、１９９３、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３２９、２２３〜２２６を参照のこと。ＦｃεＲＩのβ鎖およびγ鎖は、シグナル伝達モジュールである。
【０００５】
これまでの研究者は、ヒトＦｃεＲＩαに対するタンパク質をコードする核酸配列を開示してきた；例えば、Ｌｅｄｅｒによる米国特許第４，９６２，０３５号（１９９０年１０月９日に発行）；Ｋｉｎｅｔらによる米国特許第５，６３９，６６０号（１９９７年６月１７日に発行）；Ｋｏｃｈａｎら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６、３５８４；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、１９０７〜１９１１；およびＰａｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１、６１６６〜６１７４を参照のこと。ヒトＦｃεＲＩβ鎖およびヒトＦｃεＲＩγ鎖をコードする核酸分子に対する核酸配列が報告されている；それぞれ、Ｋｕｓｔｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、１２７８２〜１２７８７；Ｋｕｓｔｅｒら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、６４４８〜６４５２を参照のこと。イヌのＦｃεＲＩαタンパク質、マウスのＦｃεＲＩαタンパク質、ラットのＦｃεＲＩαタンパク質、ネコのＦｃεＲＩαタンパク質およびウマのＦｃεＲＩαタンパク質をコードする核酸分子に対する核酸配列が報告されている；それぞれＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号Ｄ１６４１３；Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２０４８９（コードされたタンパク質配列を表す）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３６０６；ＦｒａｎｋらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２７２０８（１９９８年６月２５日公開、本明細書中では、ＷＯ９８／２７２０８と呼ばれる）；およびＷｅｂｅｒらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３８９７４（１９９９年８月５日公開、本明細書中では、ＷＯ９９／３８９７４と呼ばれる）を参照のこと。さらに、ＦｃεＲＩαタンパク質を使用するＩｇＥ抗体を検出する方法が、ＦｒａｎｋらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２３９６４（１９９８年６月４日公開、本明細書中では、ＷＯ９８／２３９６４と呼ばれる）；ＷＯ９８／２７２０８、前述；ＦｒａｎｋらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４５７０７（１９９８年１０月１５日公開、本明細書中では、ＷＯ９８／４５７０７と呼ばれる）およびＷＯ９９／３８９７４、前述に報告されている。ＷＯ９８／２３９６４、ＷＯ９８／２７２０８、ＷＯ９８／４５７０７およびＷＯ９９／３８９７４はそれぞれ、本明細書中で、その全体が参考として援用される。
【０００６】
ＩｇＥは、４つのポリペプチド鎖：２つの同一の重鎖（Ｈ鎖）および２つの同一の軽鎖（Ｌ鎖）からなるという点で、全ての免疫グロブリン分子に共通である一般的な全体構造を共有する（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ、１９９６、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに総説され、これは、その全体が参考として援用される）。２つの重鎖（非グリコシル化形態では、それぞれ約６５ｋＤａの分子量を有する）は、ジスルフィド結合で結合している。各重鎖はさらに軽鎖に結合し、各軽鎖は、約２５ｋＤａの分子量を有し、最終的には４鎖分子を生じる。重鎖および軽鎖の両方が、別々の配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、その領域における配列が同一のアイソタイプの異なる抗体間で変動する可変ドメイン（ＶＬと呼ばれる）およびその領域における配列が同一のアイソタイプの異なる抗体間で定常なままである定常ドメイン（ＣＬと呼ばれる）を含む。重鎖中の配列ドメインの数は、異なるアイソタイプ間で異なる。ＩｇＥの重鎖ポリペプチドは、１つの可変配列ドメイン（ＶＨと呼ばれる）からなる５つの配列ドメインおよび４つの定常配列ドメイン（Ｃε１〜Ｃε４と呼ばれる）を有する。ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、抗原認識に関与するが、それに対して重鎖の定常ドメインは、分子に対する免疫グロブリンクラスの特有の機能特性（例えば、レセプター結合）を与え、分子が５つの主要な免疫グロブリンクラスのどれに属するかを決定する。
【０００７】
重鎖および軽鎖タンパク質成分に加えて、全ての免疫グロブリンはまた、ポリペプチド鎖中のアミノ酸に共有結合した単純な側鎖および複雑な側鎖の形態の顕著な量の炭水化物を含有する。炭水化物側鎖は通常、Ｎ−グリコシド結合により結合しているが、Ｏ−グリコシド結合も観察されている。一般に、炭水化物側鎖は、重鎖の定常ドメインの１つに位置する結合によって、分子のタンパク質部分に結合するが、この原則に対する例外も観察されている。グリコシド結合の数は、免疫グロブリン型間および免疫グロブリン型内で異なるが、一般には、ＩｇＥは、完全免疫グロブリン分子に対して平均５つのオリゴ糖を有すると考えられる。
【０００８】
ＩｇＥ抗体は、重鎖の定常ドメインに存在するアミノ酸配列を介して細胞レセプターＦｃεＲＩαおよびＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）と相互作用する。ＦｃεＲＩαまたはＩｇＥのそれぞれのタンパク質の結合（すなわち、その間の相互作用）に関与するＦｃεＲＩαまたはＩｇＥのどちらかのアミノ酸の同定を試みるための突然変異誘発および交換技術（ｓｗａｐｐｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用するいくつかの報告、他のＩｇスーパーファミリーメンバーに対する相同性に基いてＦｃεＲＩαタンパク質のモデル化を試みる報告およびこのような結合を明白に阻害する化合物を同定する報告があり：例えば、Ｃｏｏｋら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６、１５５７９〜１５５８８；Ｈｕｌｅｔｔら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１５２８７〜１５２９３；Ｈｕｌｅｔｔら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０、２１１８８〜２１１９４；Ｍａｌｌａｍａｃｉら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２２０７６〜２２０８３；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９３、前出；Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら、１９９３、前出；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２５、３８７〜３９２；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．３、４１９〜４２６；ＣｈｅｎｇらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４００３３（１９９７年１０月３０日公開）；Ｇｏｕｌｄらによる米国特許第５，１８０，８０５号（１９９３年１月１９日発行）；Ｇｏｕｌｄらによる米国特許第５，６９３，７５８号（１９９７年１２月２日発行）；ＧｏｕｌｄらによるＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／０１６４３（１９９６年１月２５日公開）；ＧｏｕｌｄらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１４７７９（１９９５年６月１日公開）を参照のこと。個々の分子ならびにＩｇＥ／ＦｃεＲＩα複合体の最近の結晶学的な試験は、ＩｇＥとＦｃεＲＩα間の相互作用に関与する特定のアミノ酸を明らかにした；例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２６２４６、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２０００年５月１１日公開；米国特許公開番号２００３０００３５０２−Ａ１、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００３年１月２日公開；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６９２５３  Ａ３、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００１年９月２０日公開；米国公開番号第２００１００３９４７９号、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００１年１１月８日公開およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８６１  Ａ３、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００１年９月２０日公開（これらは、それぞれ本明細書にその全体が参考として援用される）を参照のこと。これらの研究により生み出された三次元モデルは、ＦｃεＲＩａのＩｇＥに対する結合が、ＦｃεＲＩα中のアミノ酸とＣε２／Ｃε３リンカー領域（可撓性リンカー領域とも呼ばれる）中のアミノ酸およびＩｇＥ重鎖のＣε３ドメイン中のアミノ酸との相互作用によって媒介されることを示した。さらに、ＩｇＥの三次元モデルは、ＩｇＥの重鎖が可撓性であり、少なくとも２つの固有の構造（閉じた高次構造および開いた高次構造）をとり得ることを示す。２つの構造は、開いた高次構造中ではさらに離れ、閉じた高次構造中ではより近づくＣε３ドメインの相対的な空間配向性によ���一部区別され得る。閉じた高次構造では、Ｃε３−Ｃε４のドメイン間の角度は、相同なＩｇＧ−Ｆｃドメイン間（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら、１９７６；Ｈａｒｒｉｓら、１９９９）またはＦｃεＲＩ−結合ＩｇＥ−Ｆｃ（開いた高次構造、Ｇａｒｍａｎら、２０００）で観察されるより鋭角である。さらに、２つのＣε３ドメインの相互に対する相対的な配置およびＣε４ドメインに対する相対的な配置は変化している。閉じた高次構造では、ＩｇＥ−Ｆｃ  Ｃε３ドメインは、共により近づき、相互に対してわずかに回転している。さらに、Ｃε３  Ａ鎖の第１残基（Ｎ末端アミノ酸）間の距離は、わずか約１３Å〜約２２Åである。ＩｇＥ−Ｆｃの開いた高次構造において距離が２３Åまで増加すると、その距離は、ＩｇＧ２ａ−ＦｃのＣγドメイン間で観察される２２Åに類似する（Ｈａｒｒｉｓら、１９９７）。開いた高次構造と閉じた高次構造との間の変化において、各Ｃε３ドメインの上端は、２量体軸を越えて他のＣε３ドメインの方へ約１０Å移動し、同一鎖のＣε４ドメインの方へ８Å移動する。
【０００９】
ＩｇＥ／ＦｃεＲＩα複合体の研究は、ＩｇＥ−Ｆｃ分子が、ＦｃεＲＩαに結合する場合に開いた高次構造であることを明らかにした。ＩｇＥ−Ｆｃ構造の大きな構造変化は、輪を高親和性レセプターであるＦｃεＲＩと相互作用するＣε３ドメインに再配向する。ＦｃεＲＩに結合する輪の大きな動きは、レセプターと相互作用する閉じたＩｇＥ−Ｆｃ高次構造に十分に位置しないことを示唆する。開いた型では、レセプター結合輪は露出され、結合残基は、ＦｃεＲＩαとの相互作用に利用可能である大きな凹型の表面を表す。一部これらのデータに基いて、ＩｇＥ分子が例えば化合物の結合のために、閉じた高次構造に制約される場合、これらの閉じたＩｇＥ分子は、ＦｃεＲＩαに結合し得ないことが予測される。さらにこれらのデータを使用して、ＩｇＥを閉じた高次構造に固定し、それによってそのレセプターへの結合を防止するＩｇＥに結合する化合物の生成に有用であるツール（例えば、変異体タンパク質）を設計することが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
今日までの研究は、ＩｇＥおよびＦｃεＲＩαの構造ならびにそれらの相互作用の性質についての情報を提供してきたが、アレルギーを処置し、診断し、そして免疫反応を調節するための化合物の発見および生成に関して有用である特定のツールに対する必要性は残っている。動物におけるアレルギーを予防し、また処置し、かつ他の免疫反応を調節するための安全かつ有効な化合物も必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、一般的に変異体、ＩｇＥ重鎖タンパク質、変異体ＩｇＥＨＣタンパク質を含むＩｇＥタンパク質およびこのような変異体ＩｇＥタンパク質の三次元モデルに関する。特に、本発明は、天然の分子と比較して可撓性が減少した重鎖を有する変異体ＩｇＥタンパク質に関し、結果として特定の構造状態に制約される。本発明はまた、ＩｇＥグリコシル化変異体の三次元モデルに関する。ＩｇＥ変異体およびＩｇＥＨＣ変異体は、例えば動物におけるＩｇＥ媒介免疫反応を調節する化合物を単離または生成するために使用され得る。本発明はまた、ＩｇＥのＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαへの結合を阻害する化合物を生成および単離するための本発明の変異体ＩｇＥＨＣおよび変異体ＩｇＥタンパク質の使用に関する。本発明のタンパク質をコードする核酸分子ならびにこのような核酸分子を含む細胞および組換えウイルスも本発明に含まれる。ＩｇＥのＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαへの結合を阻害する化合物もまた、含まれる。本発明はまた、治療化合物ならびに本発明のタンパク質および／または化合物を含むキットならびにこのような組成物およびキットを使用する動物を処置するための方法を含む。従って、本発明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２６２４６、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２０００年５月１１日公開；米国特許公開番号２００３０００３５０２−Ａ１、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００３年１月２日公開；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６９２５３  Ａ３、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００１年９月２０日公開；米国特許公開番号２００１００３９４７９、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００１年１１月８日公開およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８６１  Ａ３、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、２００１年９月２０日公開の教示に基く。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に変異体ＩｇＥタンパク質、変異体ＩｇＥＨＣタンパク質およびこのような変異体ＩｇＥタンパク質の三次元モデルに関する。本発明の記載において、本明細書で使用される特定の用語は、以下のように定義される：
本明細書で使用される場合、用語「ａ」または「ａｎ」（１つの）実体とは、１つ以上のその実体をいう；例えば、「ａ」タンパク質とは、１つ以上のタンパク質または少なくとも１つのタンパク質をいう；別の例として、「ａ」核酸分子とは、１つ以上の核酸分子または少なくとも１つの核酸分子をいう。従って、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つ以上の」および「少なくとも１つの」とは、本明細書では、相互変換可能に使用され得る。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」とは、本明細書では、相互変換可能に使用され得ることに注意されたい。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩｇＥ重鎖」、「ＩｇＥＨＣ」および「ＩｇＥＨＣタンパク質」とは、相互変換可能に使用され得、任意の動物由来のＩｇＥ  Ｆｃレポーター結合部位を含むタンパク質をいい、従ってＣε４の少なくとも一部を有するかまたは有さない、少なくともＣε３の一部を含む。ＩｇＥＨＣタンパク質は、全長免疫グロブリンε（ＩｇＥ）重鎖、ＩｇＥ重鎖の全長Ｆｃ領域、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαに結合するＩｇＥ  Ｆｃ領域のフラグメントまたはＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαに結合するＩｇＥ  Ｆｃ領域のフラグメントを含む任意のタンパク質であり得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥＣε３」、「Ｃε３」および「Ｃε３ドメイン」とは、相互変換可能に使用され得、全長ＩｇＥ重鎖タンパク質の３番目の定常領域ドメインをいう。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥＣε４」、「Ｃε４」および「Ｃε４ドメイン」とは、相互変換可能に使用され得、全長ＩｇＥ重鎖タンパク質の４番目の定常領域ドメインをいう。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥＣε３／Ｃε４」とは、少なくとも一部のＩｇＥＣε３および少なくとも一部のＩｇＥＣε４を含むタンパク質をいう。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃε２／Ｃε３リンカー領域」とは、第２定常ドメインと第３定常ドメインとの間のアミノ酸セグメントをいう。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥ  Ｆｃ領域」とは、第２、第３および第４定常ドメイン（Ｃε２、Ｃε３およびＣε４）からなるＩｇＥ重鎖の領域をいう。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥタンパク質」とは、単独でまたは１つ以上のＩｇＥ軽鎖と組み合わせて、少なくとも１つ以上のＩｇＥＨＣタンパク質を含む分子をいう。ＩｇＥタンパク質の１つの例は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含むＩｇＥ抗体であり、別の例では、ＩｇＥＨＣ二量体である。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「未改変の」とは、ＩｇＥタンパク質に適用される場合、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣを含有するＩｇＥタンパク質のＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩα結合活性と同一であるＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩα結合活性を有するＩｇＥタンパク質をいう。ＩｇＥＨＣの核酸分子および関連する核酸分子（すなわち、このようなＩｇＥＨＣをコードする核酸分子）に適用される場合、用語「未改変の」とは、配列番号１１のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ＩｇＥＨＣもしくは関連核酸分子により保有される機能特性と同一の機能特性を有するＩｇＥＨＣ核酸分子および関連核酸分子をいう。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「変異体」とは、ＩｇＥタンパク質、ＩｇＥＨＣタンパク質および未改変のＩｇＥタンパク質に類似する配列を有する関連核酸分子、ＩｇＥＨＣタンパク質およびそれらの未改変の対応物とは機能的に異なる関連核酸分子をいう。特に、変異体ＩｇＥタンパク質、変異体ＩｇＥＨＣの核酸分子および関連核酸分子（すなわち、このようなＩｇＥＨＣをコードする核酸分子）は、未改変の対応物と同一の様式ではＦｃεＲＩに結合しない。変異体は天然から単離され得るか、または操作の結果として作製され得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、それらの天然の環境から取り出されたＩｇＥタンパク質、ＩｇＥＨＣタンパク質および関連核酸分子をいう。従って、用語「単離された」は、ＩｇＥタンパク質、ＩｇＥＨＣタンパク質および関連核酸分子が精製される程度を必ずしも範囲を反映しない。単離されたＩｇＥタンパク質、ＩｇＥＨＣタンパク質または関連核酸分子は、その天然の源から入手し得るか、または組換え技術を使用して、および／または化学的合成もしくは化学的改変の使用によって作製され得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「閉じた高次構造」とは、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαへのＩｇＥタンパク質の結合を防止するように、ＩｇＥＨＣタンパク質の定常ドメインが配向されるＩｇＥタンパク質の三次元構造をいう。閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質は、Ｃε３ドメインのＮ末端アミノ酸が、２３オングストローム（Å）未満離れているＩｇＥＨＣタンパク質を有する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「開いた高次構造」とは、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαへのＩｇＥ分子の結合を可能にするように、ＩｇＥＨＣタンパク質の定常ドメインが配向されるＩｇＥタンパク質の三次元構造をいう。開いた高次構造のＩｇＥタンパク質は、Ｃε３ドメインのＮ末端アミノ酸が少なくとも２３Å離れているタンパク質である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「空間移動性」とは、それらの相互の相対的な位置および／または残りのＩｇＥタンパク質を移動する（ｍｏｖｅ）かまたは移す（ｓｈｉｆｔ）ＩｇＥＨＣタンパク質の能力をいう。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「低減した空間移動性」とは、開いたか、または閉じたかのどちらか１つの高次構造に存在し、かつ、ＩｇＥタンパク質が代わりの高次構造をとり得ないようにＩｇＥＨＣタンパク質の動きが制限されるＩｇＥタンパク質をいう。例えば、低減した空間移動性を有する閉じた高次構造中のＩｇＥは、その構造を変化し得ないので、Ｃε３ドメインのＮ末端アミノ酸は少なくとも２３Å離れている。同様に、用語「制約された」とは、開いたか、または閉じたかのどちらか１つの高次構造であるＩｇＥをいい、代わりの構造をとり得ないことをいう。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥの開いた型の変異体」（ＩｇＥｏｆｍ）とは、開いた高次構造に制約され、閉じた高次構造を適用し得ないように空間移動性が低減した変異体ＩｇＥタンパク質をいう。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥの閉じた型の変異体」（ＩｇＥｃｆｍ）とは、閉じた高次構造に制約され、開いた高次構造を適用し得ないように空間移動性が低減した変異体ＩｇＥタンパク質をいう。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＥグリコシル化変異体」（ＩｇＥｇｍ）とは、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位のアミノ酸配列がもはやＮ結合型グリコシル化部位ではない（すなわち、変異部位が、Ｎ結合型グリコシル化方法によりもはやグリコシル化され得ない）ように変化した変異体ＩｇＥタンパク質をいう。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「ＦｃεＲＩαタンパク質の細胞外ドメイン」とは、細胞外の環境に曝露され、ＩｇＥ抗体のＦｃドメインに結合するＦｃεＲＩ  α鎖の一部である。このようなＦｃεＲＩα細胞外ドメインは、（ａ）成熟ＦｃεＲＩα鎖の第１アミノ酸から膜貫通領域の開始部分の前の最後のアミノ酸まで伸長するドメインである完全な細胞外ドメイン、もしくは機能的に等価であって、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインを含み、そして、ＦｃεＲＩαタンパク質が天然で結合するようなＩｇＥ抗体に対して類似した親和性を示す細胞外ドメインであるかまたは、（ｂ）（ａ）の細胞外ドメインの任意のフラグメントであって、ここで、そのフラグメントは、ＩｇＥ抗体のＦｃドメインに結合する能力を保持するフラグメントであり得る。
【００３１】
１つの局面では本発明は、未改変ＩｇＥタンパク質中のＩｇＥＨＣのタンパク質の空間移動性と比較して低減した空間移動性を有するＩｇＥＨＣのタンパク質を含む単離された変異体ＩｇＥタンパク質を提供する。適切な変異体ＩｇＥタンパク質は、ＩｇＥタンパク質内のＩｇＥＨＣ  Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの空間移動性が、ＩｇＥＨＣのタンパク質の改変によって制限されたＩｇＥタンパク質である。未改変ＩｇＥタンパク質のＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの前述の結晶学的な分析は、これらのドメインがＩｇＥタンパク質内で移動し、ＩｇＥタンパク質を少なくとも２つの構造：開いた高次構造または閉じた高次構造の一つをとらせ得ることを示した。閉じた高次構造では、２つの重鎖のＣε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基（これは、配列番号１１の位置９のアミノ酸に対応し、それ自体、全長ヒトＩｇＥ重鎖タンパク質の位置３３６に対応する）は、約１３Åの残基内距離を有するが、開いた高次構造では、２つのＣε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基は、少なくとも２３Åの残基内距離を有するように位置する。ＩｇＥタンパク質はＦｃεＲＩαに結合する場合、開いた高次構造中に存在し、構造データに基くと、閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質は、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαに結合し得ないことが予測される。
【００３２】
本発明の１つの実施形態は、ＩｇＥタンパク質が閉じた高次構造に制約されるように改変されたＩｇＥＨＣを含む変異体ＩｇＥタンパク質である。閉じた高次構造に制約されたＩｇＥタンパク質は、Ｃε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基が、２３Å未満しか離れていないＩｇＥＨＣタンパク質を有し；このような変異体ＩｇＥタンパク質は、２３Å以上の残基間距離を可能にするように十分に収縮し得ない。本発明の適切なＩｇＥタンパク質は、ＩｇＥＨＣ  Ｃε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基が、約１３Å〜２３Å未満の残基間距離を達成し得るＩｇＥタンパク質を含む。従って、本発明の有用な変異体ＩｇＥタンパク質は、ＩｇＥＨＣ  Ｃε３ドメインのＮ末端アミノ酸残基が、約１３Å以下、約１４Å以下、約１５Å以下、約１６Å以下、約１７Å以下、約１８Å以下、約１９Å以下、約２０Å以下、約２１Å以下または約２２Å以下または２３Å以下の残基間距離を達成し得るＩｇＥタンパク質を含む。このような変異体ＩｇＥタンパク質は、天然源から単離され得るかまたは未改変ＩｇＥタンパク質、ＩｇＥＨＣタンパク質および／または関連核酸分子の研究室操作により生成され得る。ＩｇＥタンパク質を改変するための適切な方法は、当業者に公知であって、ＩｇＥＨＣタンパク質の化学的改変または酵素による改変、所望の構造を与える変異体タンパク質を生成するようなＩｇＥＨＣタンパク質配列の変化、ＩｇＥＨＣタンパク質をコードする核酸分子およびこれらの組合せの変化が挙げられるがこれらに限定されず；これらの方法の実施例は、本明細書中により詳細に記載される。特に有用な変異体ＩｇＥタンパク質は、閉じた高次構造に制約され、開いた高次構造をとれず、結果としてＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαに結合し得ないＩｇＥタンパク質である。
【００３３】
本発明の１つの実施形態は、配列番号１１と少なくとも５０％同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体ＩｇＥＨＣを含む変異体ＩｇＥタンパク質であって、ここで、変異体ＩｇＥＨＣのアミノ酸配列は、ＩｇＥＨＣタンパク質が架橋共有結合を形成し、それによってＩｇＥタンパク質中にこのようなＩｇＥＨＣタンパク質の動きを制約することを可能にするように改変されている。形成する適切な結合の型は、ジスルフィド結合である。同一性％および類似性％を決定するための方法は、当業者に周知である。変異体ＩｇＥタンパク質の例としては、配列番号１１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣを含むが、ここで、配列番号１１の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、または９位に対応するＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインかまたはメチオニンである、ＩｇＥタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明の変異体ＩｇＥタンパク質は、以下：
（ａ）配列番号１３、ここで、配列番号１３の２位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｂ）配列番号１５、ここで、配列番号１５の３位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｃ）配列番号１７、ここで、配列番号１７の４位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｄ）配列番号１９、ここで、配列番号１９の５位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｅ）配列番号２１、ここで、配列番号２１の６位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｆ）配列番号２３、ここで、配列番号２３の７位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｇ）配列番号２５、ここで、配列番号２５の８位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；そして、
（ｈ）配列番号２７、ここで、配列番号２７の９位に対応する前記ＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣを含む。特に有用な実施形態において、変異体ＩｇＥタンパク質は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣを含む。
【００３５】
本発明はまた、変異体ＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質が、未改変のＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質の空間移動性と比較して、低減した空間移動性を有するように改変された単離された変異体ＩｇＥＨＣを提供する。適切な変異体ＩｇＥＨＣは、開いた高次構造または閉じた高次構造に制約されたＩｇＥタンパク質を誘導するものであって、ここで閉じた高次構造が好ましい。本発明の適切なＩｇＥＨＣタンパク質の変異体は、配列番号１１と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、ここで、ＩｇＥＨＣは、２つ以上のＩｇＥＨＣタンパク質の間の共有結合を形成することを可能にし、それによって、ＩｇＥタンパク質内でのこのようなＩｇＥＨＣタンパク質の動きを制約するように改変されている。好ましい変異体ＩｇＥＨＣタンパク質は、配列番号１１を含むＩｇＥＨＣとの親和性を有するＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαともはや結合しないが、ＩｇＥＨＣタンパク質の他の機能（例えば、未改変ＩｇＥＨＣに対する免疫応答を誘発する能力および未改変ＩｇＥＨＣを使用して産生された抗体に結合する能力）は保持している。未改変
もしくは変異体のＩｇＥタンパク質もしくはＩｇＥＨＣまたは関連する核酸分子は、本発明の変異体ＩｇＥもしくは変異体ＩｇＥＨＣまたは関連する核酸分子を産生するように改変を受け得る。改変を受けるべき好ましいタンパク質または核酸分子は、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、ネズミ、ヒツジ、ウシまたはブタを含む哺乳動物のタンパク質または核酸分子が好ましい。特に好ましいのは、より好ましいヒトタンパク質または核酸分子を含むヒト、ネコ、イヌまたはウマのタンパク質または核酸分子である。ＩｇＥＨＣタンパク質が鎖間共有結合（例えば、ジスルフィド結合が挙げられるがこれに限定されない）の形成を可能にするように改変する方法は、当業者に公知であって、その方法としては、ＩｇＥＨＣタンパク質の化学的および／または酵素的改変、タンパク質の使用または組換え技術およびこれらの組合せの使用を介したＩｇＥＨＣタンパク質配列の変化が挙げられるが、これらに限定されない。形成するための適切な結合の型は、ジスルフィド結合である。閉じた高次構造に制約されるように改変されたＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質を誘導する改変の任意の方法が、本発明のＩｇＥＨＣタンパク質およびＩｇＥタンパク質を産生するために使用され得る。特に有用な実施形態は、約１３Å以下、約１４Å以下、約１５Å以下、約１６Å以下、約１７Å以下、約１８Å以下、約１９Å以下、約２０Å以下、約２１Å以下、約２２Å以下または約２３Å未満離れた改変されたＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質中のＣε３ドメインのＮ末端アミノ酸を生じるようにＩｇＥＨＣを改変する実施形態である。
【００３６】
改変の有用な方法の一つの実施例は、化学的処理または酵素的処理である。適切な化学処理または酵素処理が、当業者に公知であって、その方法としては、例えば、グリコシル化反応、ミリスチル化反応、ビオチン化反応、還元反応、酸化反応、プロテアーゼ反応などが挙げられるが、これらに限定されない。適切な処理は、ＩｇＥＨＣタンパク質を架橋し、それによってＩｇＥタンパク質を、閉じた高次構造の中に改変されたＩｇＥＨＣを含むように制約する処理である。
【００３７】
１つの実施形態において、ＩｇＥＨＣは、アミノ酸配列を変えることによって改変される。変異体ＩｇＥＨＣは、未改変のＩｇＥＨＣ配列と比較して１つ以上の配列の相違を有する場合があり、これらの配列の相違は、天然に生じるか、または、ＩｇＥＨＣタンパク質もしくはこのような、ＩｇＥＨＣをコードする核酸分子の実験室的操作（例えば、置換、挿入、欠失）を介して導入され得る。閉じた高次構造に制約される変異体ＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質を生じるＩｇＥＨＣアミノ酸配列における変化はいずれも適している。このような配列変化は、閉じた高次構造に制約されたＩｇＥタンパク質を生じるＩｇＥＨＣの任意の位置になされ得る。改変を行うのに特に適した位置は、Ｃε２／Ｃε３リンカー領域、Ｃε３ドメインおよび／またはＣε４ドメインにおける位置である。例えば、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの２００１年１１月８日に公開された米国特許公開番号２００１００３９４７９−Ａ１およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらの２００３年１月２日に公開された米国特許公開番号２００３０００３５０２−Ａ１によると、ヒトＩｇＥＨＣＣε３ドメインは、配列番号１１のアミノ酸９〜１０７までに及び、これは、全長ヒトＩｇＥＨＣのアミノ酸３３６〜４３４までに対応し、この番号は、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９７８、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ４１、３〜２５の番号方式を使用し、これは本明細書中にその全体が参考として援用される。一方で、Ｃε４ドメインは、配列番号１１のアミノ酸１１４〜２２０までに及び、これは、全長ヒトＩｇＥＨＣのアミノ酸４４１〜５４７までに対応し、この番号は、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９７８、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ４１、３〜２５の番号方式を使用する。以下のように、ＩｇＥＣε３／Ｃε４は、配列番号１１のアミノ酸配列９〜２２０に延びる。適切な実施形態は、Ｃε２／Ｃε３リンカー領域のアミノ酸配列が、アミノ酸の付加、置換または欠失によって変えられたＩｇＥＨＣである。例えば、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの２００１年１１月８日に公開された米国特許公開番号２００１００３９４７９−Ａ１およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらの２００３年１月２日に公開された米国特許公開番号２００３０００３５０２−Ａ１によると、ＩｇＥＨＣＣε２／Ｃε３リンカー領域は、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎらの番号方式を使用すると、配列番号１１のアミノ酸１〜８までに及び、これは、全長ヒトＩｇＥＨＣのアミノ酸３２８〜３３５までに対応する。架橋アミノ酸を置換または挿入する特に好ましい位置としては、配列番号１１のアミノ酸の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位が挙げられるがこれらに限定されない。これらの位置番号は、配列番号１１のアミノ酸位置をいい、これらのアミノ酸は、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９７８、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ４１、３〜２５の番号方式を使用して、一般的に、全長ＩｇＥＨＣのアミノ酸Ａ３２９、Ｄ３３０、Ｓ３３１、Ｎ３３２、Ｐ３３３、Ｒ３３４、Ｇ３３５およびＶ３３６といわれ、そしてそれらに対応することに留意すべきである。同一の変異体は、全長ＩｇＥＨＣの対応するアミノ酸において、またはＩｇＥ  Ｆｃ領域フラグメントのみもしくは他のタンパク質内に含まれるＩｇＥ  Ｆｃ領��フラグメントの対応する位置内で作製され得る。
【００３８】
改変の特に有用な様式は、システイン残基またはメチオニン残基のＩｇＥＨＣへの導入である。このような導入は、その配列へのさらなるアミノ酸残基（すなわち、システインまたはメチオニン）の挿入から生じ得るかまたはシステインもしくはメチオニン中に存在するアミノ酸残基の変換から生じ得る。このような変異体を作製する方法は、当業者に公知である。１つのこのような方法は、ＩｇＥＨＣ核酸分子の操作（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失および／または置換による）を介して、所望の変異体ＩｇＥＨＣをコードする核酸分子を産生する。核酸分子は、当業者に公知の種々の技術（例えば、部位特異的変異誘発、化学的処理、制限酵素消化、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ＰＣＲ変異形成、オリゴヌクレオチド混合物の合成および核酸分子の混合物を「構築する（ｂｕｉｌｄ）」するための混合基のライゲーション、インビトロ進化または指向された進化およびこれらの組合せ）を使用して改変され得る。このような技術の使用は、当業者に公知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００３９】
１つの実施形態において、変異体ＩｇＥＨＣは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一のアミノ酸配列を含むが、配列番号１１の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位に対応するこのＩｇＥＨＣのアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである。１つの実施形態において、本発明のＩｇＥＨＣは、以下：
（ａ）配列番号１３、ここで、配列番号１３の２位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｂ）配列番号１５、ここで、配列番号１５の３位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｃ）配列番号１７、ここで、配列番号１７の４位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｄ）配列番号１９、ここで、配列番号１９の５位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｅ）配列番号２１、ここで、配列番号２１の６位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｆ）配列番号２３、ここで、配列番号２３の７位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｇ）配列番号２５、ここで、配列番号２５の８位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；および、
（ｈ）配列番号２７、ここで、配列番号２７の９位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一のアミノ酸配列を含む。本発明の特に有用なＩｇＥＨＣタンパク質は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣタンパク質である。
【００４０】
本発明の１つの実施形態は、閉じた高次構造に制約されたＩｇＥタンパク質を産生するための方法であって、この方法は、：（ａ）未改変のＩｇＥＨＣをコードする核酸分子の核酸配列を変える工程；および（ｂ）閉じた高次構造に制約された変異体ＩｇＥタンパク質を産生するために、改変されたＩｇＥＨＣ核酸分子を使用する工程を包含する。好ましい実施形態において、核酸配列は、１つ以上のシステイン残基がＩｇＥＨＣタンパク質中に導入されるように改変される。より好ましい実施形態において、核酸配列は、配列番号１１の位置２、３、４、５、６、７、８および／または９に対応する位置にシステイン残基を有するタンパク質をコードするように改変される。
【００４１】
本発明はまた、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を欠く、単離された変異体ＩｇＥＨＣタンパク質を提供する。ヒトＩｇＥＨＣは、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を少なくとも３つ有することが知られている。例えば、ヒトＩｇＥＨＣは、潜在的に、配列番号１１のアミノ酸４４、５６および／または６７でグリコシル化され得、これは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９７８、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ４１、３〜２５の番号方式を使用すると、全長ＩｇＥのアミノ酸３７１、３７３および３９４に対応する。本発明の有用な実施形態は、細胞のグリコシル化機構がその部位で炭水化物部分に付着しないように、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位の１つ以上の配列が改変された、単離された変異体ＩｇＥＨＣである。適した改変としては、アミノ酸置換、欠失および付加が挙げられる。このような改変を行なう方法は、当業者に公知であって、例えば、ＩｇＥＨＣをコードする核酸配列を変化させる工程が挙げられる。作製するための有用な改変は、配列番号１１の４４位〜４６位、および／または、配列番号１１の５６位〜５８位の１つ以上のアミノ酸を改変する改変である。特に有用な実施形態は、配列番号１１の４４位のアスパラギンおよび／または配列番号１１の５６位のアスパラギンをアスパラギン以外のアミノ酸で置換した、単離された変異体ＩｇＥＨＣである。適した実施形態としては、配列番号１１と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一のアミノ酸配列を含む、単離された変異体ＩｇＥＨＣタンパク質が挙げられるが、ここで、配列番号１１の４４位および／または５６のアミノ酸は、アスパラギンではない。特に適した実施形態は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、単離された変異体ＩｇＥＨＣである。また、改変された部位でのグリコシル化を防止するために、１つ以上のグリコシル化部位が改変された、変異体ＩｇＥＨＣを含む変異体ＩｇＥタンパク質も企図される。
【００４２】
本発明はまた、改変された部位でのグリコシル化を防止するために、１つ以上のグリコシル化部位が改変された、変異体ＩｇＥＨＣを含む変異体ＩｇＥタンパク質の三次元モデルを提供する。このようなモデルは、開いた高次構造または閉じた高次構造の変異体ＩｇＥタンパク質を説明し得、そして、ＩｇＥのＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαへの結合を阻害する化合物を設計、または発見するために使用され得る。
【００４３】
本発明の１つの実施形態は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子である。有用な核酸分子としては、配列番号１１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一のアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣをコードする核酸分子が挙げられるが、配列番号の１１位置、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位または９位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである。特に有用な核酸分子としては、以下；
（ａ）配列番号１３、ここで、配列番号１３の２位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｂ）配列番号１５、ここで、配列番号１５の３位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｃ）配列番号１７、ここで、配列番号１７の４位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｄ）配列番号１９、ここで、配列番号１９の５位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｅ）配列番号２１、ここで、配列番号２１の６位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｆ）配列番号２３、ここで、配列番号２３の７位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；
（ｇ）配列番号２５、ここで、配列番号２５の８位に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；および、
（ｈ）配列番号２７、ここで、配列番号２７の位置９に対応するこのＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基は、システインまたはメチオニンである；からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一であるアミノ酸配列を含む変異体ＩｇＥＨＣをコードする核酸分子を含む。好ましい核酸分子は、配列番号２、配列番号８、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣをコードする核酸分子である。
【００４４】
本発明において有用な核酸分子は、例えば、組換え核酸技術または化学合成によって産生され得る。本発明の核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの誘導体であり得る。本発明の核酸分子としては、対立遺伝子の改変体を含む天然形態、特定の宿主内での発現に最適化された核酸分子ならびに、ヌクレオチド挿入、欠失、置換および／または転移によって改変された他の核酸分子が挙げられる。本発明の有用な核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％同一である核酸配列を含む核酸分子であって、ここで、この核酸配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を構成するＩｇＥＨＣタンパク質に対して免疫反応を誘発するタンパク質をコードする。
【００４５】
本発明の１つの実施形態は、以下：
（ａ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の２位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
（ｂ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の３位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の４位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
（ｄ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の５位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の６位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の７位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
（ｇ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の８位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；および
（ｈ）配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約１００％同一である核酸配列であって、配列番号１０の９位のコドンに対応するこの核酸配列中のコドンが、システインまたはメチオニンをコードする核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子である。３ヌクレオチドからなり、そして、配列番号におけるコドンの位置に対する参照が、そのコドンを構成する３ヌクレオチド構成を指すことは、当業者に周知であることに留意すべきである。例えば、配列番号１０の２位のコドンへの言及は、配列番号１０のヌクレオチド４〜６を指す。好ましい核酸分子は、上記特徴を有する核酸分子であって、そして、機能を有するタンパク質をコードし、これらの機能としては、抗原結合、配列番号１１のアミノ酸を含むＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質に対する免疫応答の誘発および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＩｇＥＨＣを含むＩｇＥタンパク質に対して惹起された抗体の結合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の適した核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８から選択される核酸配列を含む核酸分子である。
【００４７】
本発明の１つの実施形態は、転写制御配列に作動可能に結合した核酸分子を含む組換え分子である。作動可能に結合したとの言い回しは、宿主生物に形質転換された場合に、分子が発現され得るような様式での核酸分子の転写制御配列への結合をいう。適切な宿主生物は、本発明の核酸分子から発現を指向し得る任意の生物である。本明細書で使用される場合、発現ベクターとは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであって、代表的には、細胞を形質転換し得、特定の核酸分子の発現に影響し得るプラスミドまたはウイルスゲノムのどちらかである。本発明の好ましい組換え分子としては、調節配列（例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点および組換え微生物と適合可能で、かつ、本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列）を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸張および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御する配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列）である。適切な転写制御配列としては、少なくとも１つの本発明の組換え微生物中で機能し得る任意の転写制御配列が挙げられる。種々のこのような転写制御配列が、当業者に公知であって、例としては、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージλ（例えば、λＰＬ、本明細書ではλＰＬともいわれる）およびバクテリオファージλｐＲ（本明細書中では、λＰＲともいわれる）ならびに融合物（例えば、プロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、ＳＰ０１、α接合因子、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、抗生物質耐性遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ、メチル栄養性酵母微生物、昆虫細胞またはタンパク質の発現に有用な他の細胞における遺伝子発現を制御し得る他の配列が挙げられるが、これらに限定されない；この一覧は、さらに多くの転写制御配列が公知であるとして制限されることを意図しないことに留意すべきである。好ましい組換え分子としては、昆虫細胞のプロモーターに作動可能に結合した本発明のＩｇＥＨＣをコードする核酸分子が挙げられる。
【００４８】
本発明の別の実施形態としては、組換えベクターが挙げられ、この組換えベクターは、少なくとも１つの本発明の単離された核酸分子を含み、その核酸分子は、宿主細胞中へ核酸分子を送達し得る任意のベクター中に挿入される。このような組換えベクターは、異種の核酸配列を含み、この核酸配列は、天然には本発明の核酸分子に隣接して見出されない核酸配列であって、好ましくは、この核酸分子が由来する種以外の種に由来する。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかであり得、原核生物由来または真核生物由来のどちらかであって、代表的には、ウイルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、本発明のＩｇＥ核酸分子のクローニング、配列決定および／または他の操作に使用され得る。
【００４９】
本発明の１つの実施形態は、本発明の核酸分子で形質転換した宿主細胞である組換え細胞である。好ましい組換え分子は、本発明の組換え分子を含む。
【００５０】
組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子の転写される効率、生じた転写産物が翻訳される効率および翻訳後の改変の効率を操作することによって、形質転換した核酸分子の発現を改善するために使用され得る。本発明の核酸分子の発現を増加させるために有用な組換え技術としては、高コピー数のプラスミドに作動可能に結合する核酸分子、核酸分子の１つ以上の宿主細胞染色体への融合、ベクター安定配列のプラスミドへの添加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドンユーセージに対応する本発明の核酸分子の改変、転写物を不安定化する配列の欠失、ならびに発酵の間の組換え酵素産生から組換え細胞増殖を一時的に分離するコントロールシグナルの使用が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の発現された組換えタンパク質の活性は、このようなタンパク質をコードする核酸分子の断片化、改変または誘導体化によって改善され得る。
【００５１】
本発明のＩｇＥＨＣの１つの実施形態は、融合タンパク質である。本発明での使用に適した融合断片としては、多量体を形成するために２つ以上の本発明のＩｇＥＨＣタンパク質を結合し得る；タンパク質の安定性を向上し得る；ＩｇＥＨＣタンパク質の精製を促進し得る；および／またはＩｇＥタンパク質もしくはＩｇＥＨＣタンパク質に対する免疫応答に影響し得る断片が挙げられるが、これらに限定されない。適切な融合断片は、所望の機能（例えば、安定性の向上を与える、タンパク質に対する免疫原性の向上を与える、および／またはタンパク質の精製を簡単にする）を有する任意の大きさのドメインであり得る。融合断片は、本発明のＩｇＥＨＣのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に結合し得、このようなタンパク質の直接的な発見を可能にするために、切断に対して感受性になり得る。融合タンパク質は好ましくは、ＩｇＥＨＣタンパク質のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のどちらかに結合する融合断片を含むタンパク質をコードする融合核酸分子で形質転換した組換え細胞を培養することによって産生される。好ましい融合断片としては、金属結合ドメイン（例えば、ポリヒスチジン断片）、免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃレセプターまたは相補的タンパク質抗体の結合ドメイン）、糖結合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン）および／または「タグ」ドメイン（例えば、少なくともβガラクトシダーゼの一部分、ｓｔｒｅｐタグペプチド、Ｔ７タグペプチド、ＦｌａｇＴＭペプチドまたはモノクローナル抗体のようなドメインに結合する化合物を使用して精製され得る他のドメイン）が挙げられる。より望ましい融合断片としては、金属結合ドメイン（例えば、ポリヒスチジン断片）、マルトース結合ドメイン、ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｔａｍｐａ、ＦＬから入手可能である）およびＳ１０ペプチドが挙げられる。
【００５２】
本発明の変異体ＩｇＥＨＣタンパク質または変異体ＩｇＥタンパク質を産生するために有効な培養条件としては、有効培地、バイオリアクター、タンパク質産生を可能にする温度条件、ｐＨ条件および酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。有効培地とは、本発明の変異体ＩｇＥＨＣタンパク質または変異体ＩｇＥタンパク質を産生するために、その中で細胞が培養される任意の培地をいう。このような培地は、代表的に、同化炭素源、同化窒素源、および同化リン酸塩源ならびに適切な塩、無機塩類、金属および他の栄養分（例えば、ビタミン）を含有する。本発明の組換え細胞は、従来的な発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレート中で培養され得る。培養は、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞または他の培養に適した細胞に適した、温度、ｐＨおよび酸素含有量で実施され得る。このような培養条件の決定は、当業者の知識の範囲内である。
【００５３】
産生に使用されるベクターおよび宿主系に依存して、生じる本発明のタンパク質は、組換え細胞内に残存し得るか、培養培地もしくは発酵培地中に分泌され得るか、または２つの細胞膜の間の空間に分泌され得る。好ましい実施形態では、タンパク質は、培地中に存在し、従って細胞から容易に分離され得る。
【００５４】
本発明のタンパク質は、種々の精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動および差示的可溶化が挙げられるがこれらに限定されない）を使用して精製され得る。本発明のタンパク質は、好ましくは「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、診断ツール、治療ツールもしくは予防ツールまたはスクリーニングツールとしてのタンパク質の有効な使用を可能にする純度をいう。
【００５５】
本発明のＩｇＥＨＣタンパク質またはＩｇＥタンパク質ならびに未改変のＩｇＥＨＣタンパク質またはＩｇＥタンパク質の、ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質に選択的に結合する能力は、当該分野で公知の方法（例えば、本明細書およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２６２４６（２０００年５月１１日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００３０００３５０２−Ａ１（２００３年１月２日公開）、ＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６９２５３Ａ３（２００１年９月２０日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００１００３９４７９号（２００１年１１月８日公開）およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８６１Ａ３（２００１年９月２０日公開）に開示されるが、これらに限定されない）によってアッセイされ得る。本明細書中で使用される場合、用語ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質に選択的に結合するとは、他のＦｃＲタンパク質に実質的に結合し得ることなく、ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質に優先的に結合するタンパク質の能力をいう。好ましくは、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαは、少なくとも約１０８ｌ／ｍｏｌ（Ｍ−１）、より好ましくは、少なくとも約１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、少なくとも約１０１０Ｍ−１の親和性（ＫＡ）でＩｇＥタンパク質に結合する。本発明の変異体タンパク質の結合活性を、未改変のタンパク質の結合活性と比較する方法も当該分野で公知であり、その方法としては、本明細書およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２６２４６（２０００年５月１１日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００３０００３５０２−Ａ１（２００３年１月２日公開）、ＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６９２５３Ａ３（２００１年９月２０日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００１００３９４７９号（２００１年１１月８日公開）およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８６１Ａ３（２００１年９月２０日公開）に開示される方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明はまた、ＩｇＥタンパク質に結合する化合物を同定し、それによって、閉じた高次構造中にＩｇＥタンパク質を配置し、拘束し、維持するかまたは安定化する（すなわち、このような化合物は、閉じた高次構造中のＩｇＥタンパク質に結合するかまたは閉じた高次構造を生じるＩｇＥタンパク質に結合する）ための方法を包含する。このような化合物が、ＩｇＥタンパク質のＦｃεＲＩへの結合を阻害することが好ましい。このような化合物を同定するための方法が、本発明の未改変もしくは変異体であるＩｇＥＨＣタンパク質もしくはＩｇＥタンパク質を使用し得ることが理解されるべきである。従って、以下に考察した方法は、変異体ＩｇＥタンパク質の使用を引用し得るが、本発明の変異体ＩｇＥＨＣタンパク質も使用され得ることが理解されるべきである。
【００５７】
１つの実施形態は、ＩｇＥタンパク質の閉じた形態を結合する化合物を同定するための方法であって、上記方法は、（ａ）閉じた形態に制約された変異体ＩｇＥタンパク質と候補化合物と接触させる工程；および（ｂ）このような候補化合物がＩｇＥ閉じた形態の変異体に結合するか否かを決定する工程を包含する。好ましい実施形態において、このような候補化合物（ＩｇＥタンパク質の閉じた形態に結合すると仮定する）は、次いで、このような候補化合物が、ＩｇＥとこのようなＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質との結合を阻害するか否かを決定するために、ＩｇＥおよびＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質と接触される。別の好ましい実施形態において、このような候補化合物（ＩｇＥタンパク質の閉じた高次構造に結合すると仮定する）は、候補化合物が開いた高次構造のＩｇＥに結合するか否かを決定するために、開いた高次構造のＩｇＥタンパク質とも接触される。別の実施形態は、ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を阻害する化合物を同定するための方法であって、この方法は、（ａ）閉じた形態に制約された変異体ＩｇＥタンパク質を、ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質の存在下で、候補化合物と接触させる工程；および（ｂ）このような候補化合物が、ＦｃεＲＩタンパク質またはＦｃεＲＩαタンパク質へのＩｇＥタンパク質の結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する。
【００５８】
好ましい化合物は、閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質に選択的に結合する化合物である。本明細書中で使用される場合、用語ＩｇＥタンパク質の閉じた高次構造に選択的に結合するとは、他のタンパク質または分子（開いた高次構造のＩｇＥタンパク質を含む）に実質的に結合し得ることなく、ＩｇＥタンパク質の閉じた高次構造に優先的に結合する化合物の能力をいう。ＩｇＥタンパク質に選択的に結合し得る化合物はまた、本明細書中では、ＩｇＥ結合化合物ともいわれる。特に好ましい化合物は、閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合するが、開いた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合しない（このようなＩｇＥが閉じた高次構造をとるのを誘導する場合を除いて）化合物であって、かつ、ＩｇＥタンパク質のＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩαへの結合を阻害する化合物ではない。
【００５９】
適切な結合アッセイは、当業者に公知であって、結合複合体を形成するのに適した条件下、およびこのような条件を最適化するための当業者に公知の方法で行なわれ、このような条件としては、例えば、適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間が挙げられる。例えば、Ｗｉｎｇｆｉｌｅｄら、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（これは本明細書中にその全体が参考として援用される）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、ＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２６２４６（２０００年５月１１日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００３０００３５０２−Ａ１（２００３年１月２日公開）、ＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６９２５３Ａ３（２００１年９月２０日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００１００３９４７９号（２００１年１１月８日公開）およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８６１Ａ３（２００１年９月２０日公開）および実施例１を参照のこと。化合物のＩｇＥタンパク質への結合を検出するために有用なアッセイの例としては、酵素結合型免疫アッセイ、放射免疫測定、蛍光免疫アッセイ、化学蛍光アッセイ、側方流動アッセイ、凝集アッセイ、微粒子ベースのアッセイ（例えば、粒子（例えば、磁気粒子またはラテックスもしくはポリスチレンビーズのようなプラスチックポリマーが挙げられるが、これらに限定されない）を使用する）、免疫沈降アッセイ、ＢｉｏＣｏｒｅＴＭアッセイ（例えば、金コロイドを使用する）および免疫ブロッティングアッセイ（例えば、ウエスタンブロット）が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、当業者に周知である。アッセイが、どのように使用されるかに依存して、定性的な結果または定量的な結果を得るために使用され得る。いくつかのアッセイ（例えば、凝集、粒子分離および免疫沈降）は、例えば、目または機械（例えば、検出可能マーカーを必要とせずに濃度計または分光光度計によって、）のいずれかによって、視覚的に観察され得る。他のアッセイでは、結合（すなわち、アッセイの結合成分の１つに対する検出可能マーカーの結合）は、複合体の形成を検出するのを補助する。検出可能マーカーの例としては、放射性標識、酵素、蛍光標識、化学発光標識、色素体標識またはリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。リガンドとは、別の分子に選択的に結合する分子をいう。好ましい検出可能マーカーとしては、フルオレセイン、放射性同位元素、アルカリホスファターゼなどのホスファターゼ、ビオチン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼおよびビオチン関連化合物もしくはアビジン関連化合物（例えば、ストレプトアビジンまたはＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｌｄ、ＩＬから入手可能である））が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は、一つ以上の化合物を同時に試験するために使用され得る。好ましい方法は、１つより多い化合物を同時に試験し、多数の候補化合物を同時に分析するため��スクリーニング方法を包含し得る。どの化合物が閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合するか、どの化合物が開いた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合するか、どの化合物がＩｇＥタンパク質をそのレセプターへの結合から阻害するか、どの化合物が閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合しないか、および、どの化合物が開いた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合しないかを決定するために、このようなアッセイを最適化することは当業者の能力の範囲内である。
【００６０】
閉じた高次構造のＩｇＥタンパク質に結合する適切な化合物は、天然に産生される化合物であり得るか、または合成により産生される化合物であり得、それらとしては、タンパク質、炭水化物、有機分子、基質アナログおよび他の大きい分子または小さい分子が挙げられる。このような化合物は、例えば、化学的ライブラリーまたはファージディスプレイライブラリーなどをスクリーニングすることによって同定され得る。
【００６１】
１つの実施形態において、候補化合物の混合物がカラムに適用され、そのカラムには、開いた高次構造のＩｇＥタンパク質が固定化されている。カラムを貫流する化合物（開いた高次構造のＩｇＥに結合しない化合物）は回収され、閉じた高次構造のＩｇＥを固定化した第２カラムに適用される。ＩｇＥタンパク質のこの形態に結合しない化合物は、カラムを貫流する。閉じた高次構造のＩｇＥに結合する化合物は次いで、さらなる分析のためにカラムから溶出される。
【００６２】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明のＩｇＥ結合化合物、本発明のタンパク質またはこれらの同一の組合せを含む治療組成物を包含する。治療組成物に含まれる好ましい化合物は、ＩｇＥの閉じた形態に結合する化合物および／またはＩｇＥに結合する場合に、ＩｇＥを開いた高次構造中での存在から制限し、それによってＩｇＥをＦｃεＲＩへの結合から阻害する化合物である。治療組成物に含まれる特に好ましい化合物は、ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を阻害する化合物である。本発明の治療組成物は、処置される動物が許容し得る賦形剤中に処方化され得る。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液、Ｈａｎｋ溶液および他の水性の生理的に平衡化した塩溶液が挙げられる。非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）も使用され得る。他の有用な処方物としては、増粘剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含有する懸濁液が挙げられる。賦形剤はまた、少量の添加剤（例えば、等張性および化学的安定性を向上する物質）を含有し得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられ、防腐剤の例としては、チメロサールまたはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方物は、注射可能な液体または適切な液体中に、注射のための懸濁液または溶液として取り込まれ得る固体のいずれかであり得る。従って、投与の前に、滅菌水または生理食塩水が添加され得る非液体処方物中では、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、防腐剤などを含み得る。
【００６３】
本発明の１つの実施形態では、治療組成物は、キャリアを含有し得る。キャリアとしては、処置されるべき動物内で、治療組成物の半減期を増加させる化合物が挙げられる。適切なキャリアとしては、ビヒクルの放出を制御するポリマー、生分解性移植物、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明の１つの実施形態は、本発明の組成物をゆっくりと動物内に放出し得る制御放出処方物である。本明細書中で使用される場合、制御放出処方物は、制御放出ビヒクル中の本発明の組成物を含む。適切に制御放出ビヒクルとしては、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透性ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、脂肪球（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）および経皮送達系が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の他の放出を制御された処方物としては、動物に投与される場合に、インサイチュで、固体またはゲルを形成する液体が挙げられる。好ましい制御放出処方物としては、生分解性すなわち生物侵食され得る（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）ものが挙げられる。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の治療組成物は、ＩｇＥの所望でない効果を予防するために、このような組成物をこのような動物に投与することによって、ＩｇＥによって媒介される疾患から動物を防御するために使用され得る。Ｉｇ媒介性疾患の１つの例は、アレルギーである。１つの実施形態において、本発明の治療組成物は、動物内のＩｇＥの活性および／または量を低減させるために投与される。このような投与としては、経口適用、静脈内適用、筋肉内適用、眼内適用、粘膜適用、鼻腔内適用、皮下適用、または経皮適用が挙げられ得るが、これらに限定されない。投与の好ましい経路は、皮下である。動物を、ＩｇＥにより媒介される疾患から防御するために、本発明の治療組成物が、ＩｇＥによって媒介される疾患から動物を防御し得るように、有効な様式で動物に投与される。本発明の治療組成物は、疾患の前に疾患を予防するために、動物に投与され得、そして／または疾患が生じた後に動物に投与され得る。本発明の治療組成物の実際の用量、投与レジメンおよび投与経路は、当業者によって決定され得る。さらなる教示は、例えば、ＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２６２４６（２０００年５月１１日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００３０００３５０２−Ａ１（２００３年１月２日公開）、ＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６９２５３Ａ３（２００１年９月２０日公開）、Ｊａｒｄｅｔｚｋｙらの米国特許公開番号第２００１００３９４７９号（２００１年１１月８日公開）およびＪａｒｄｅｔｚｋｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８６１Ａ３（２００１年９月２０日公開）に提供される。
【００６６】
本発明の１つの実施形態は、本発明の変異体ＩｇＥＨＣタンパク質またはＩｇＥタンパク質を備えるキットである。このようなキットは、ＩｇＥタンパク質、好ましくは、閉じた高次構造中のＩｇＥタンパク質に結合する化合物、または、このような化合物がＩｇＥに結合する場合に、この化合物が開いた高次構造を維持するかまたは達成するのを防止するかまたは制限する化合物を同定するために使用される。このようなキットはまた、チューブ、瓶、試薬、シリンジ、印刷物、包装などを備え得る。
【００６７】
以下の実施例は、例示目的で提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例は、当業者に公知の多数の組換えＤＮＡ技術およびタンパク質化学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）を含む。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
この実施例は、ＩｇＥＨＣタンパク質のいくつかのシステイン変異体またはＩｇＥＨＣタンパク質の構築および結合能力を記載する。
【００６９】
（Ａ．ＩｇＥＨＣシステイン変異体の構築）
配列番号１１を有する未改変のＩｇＥＨＣタンパク質中のシステインを置換することにより、いくつかの変異体ＩｇＥＨＣタンパク質を作製した。この置換により、鎖間のジスルフィド結合の潜在的な形成が可能になる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異形成を以下のように使用して、変異体タンパク質を作製した。
【００７０】
配列番号１０をテンプレートとして有する未改変（ｕｎｍｏｄ）ＩｇＥＨＣ核酸分子を使用し、標準的条件下で、種々の位置にシステイン残基を作成する変異を導入した５’プライマーを使用して、変異体ＩｇＥＨＣ核酸分子をＰＣＲにより増幅した。５’プライマーは以下のとおりである。
【００７１】
【化１−１】
2006500923.tif 000002
【００７２】
【化１−２】
2006500923.tif 000003
【００７３】
それぞれの変異体ＩｇＥＨＣ核酸分子を発現ベクターｐＡｃＧＰ６７Ａ（カタログ番号２２１２２ＯＰ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）中に連結した。成熟（シグナル配列を切断した）タンパク質のＮ末端のコード配列は、ＤｏｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＢｅｎｎｉｃｈ、１９７８、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ４１、３〜２５の番号方式を使用すると、成熟ＩｇＥのＣ３２８に対応するＣを有するＡＤＰＣＡＤである。プラスミドを、標準的プロトコルを使用して、昆虫（ＨＩ−５）の昆虫細胞に形質転換し、発現させ、生じたタンパク質をウエスタンブロット解析を使用して分析した。
【００７４】
（Ｂ．未改変ＩｇＥＨＣタンパク質および変異体ＩｇＥＨＣタンパク質のウエスタンブロット分析）
昆虫細胞での発現の後、ＩｇＥＨＣタンパク質をウエスタンブロット分析により分析した。感染細胞の上清のサンプルを、還元剤（例えば、５ｍＭ  ＤＴＴ）を含むかまたは含まないＰＡＧｅサンプル緩衝液に添加した。このサンプルを次いで、煮沸し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。分離後、タンパク質をイモビロン膜に移し、標準的ウエスタンブロットプロトコルを使用し、ヤギ抗ヒトポリクローナル抗ＩｇＥ抗体（カタログ番号０７５−１００４、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を結合したアルカリホスファターゼを使用してタンパク質を可視化した。この分析の結果を図３に示す。
【００７５】
（Ｃ．変異体ＩｇＥＨＣタンパク質のＦｃεＲＩαを結合する能力）
未改変ＩｇＥＨＣタンパク質および変異体ＩｇＥＨＣタンパク質のＦｃεＲＩαタンパク質を結合する能力を、以下のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して比較した。
【００７６】
マイクロタイタープレートの壁をＰＢＳ中のヒトＦｃεＲＩα（米国特許公開番号ＵＳ−２００１−００３９４７９−Ａ１に開示されるように作製した）で被覆し、そのプレートを一晩４℃でインキュベートした。このプレートをＷＡＳＨ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、ＢＬＯＣＫ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中５％脱脂粉乳）を使用して室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。このプレートをＷＡＳＨ緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのＩｇＥＨＣ（ＢＬＯＣＫ緩衝液中で０．５〜０．０６５までに希釈した未改変ＩｇＥＨＣまたは変異体ＩｇＥＨＣのどちらか）をプレートの種々のウェルに添加した。半数のサンプルに、５ｍＭのＤＴＴを添加した。次いで、このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＷＡＳＨ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗ヒトポリクローナル抗ＩｇＥ抗体（カタログ番号０７５−１００４、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）（ストック溶液の１：１０００希釈物を使用する）を結合した１００μｌのアルカリホスファターゼを、各ウェルに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、ＷＡＳＨ緩衝液で３回洗浄し、水で３回リンスし、その後、各ウェルに５０μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を添加した。このプレートを、ＲＴで３０〜６０分間インキュベートし、その後、０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ添加することにより、反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、このプレートを、４５０ｎＭで読みとった。その結果を以下の表１に示す。
【００７７】
（表１）
【００７８】
【表１】
2006500923.tif 000004
【００７９】
これらのデータは、その配列中に置換されたシステイン残基を有するＩｇＥＨＣタンパク質を示し、この置換によって、鎖間のジスルフィド結合の形成が可能になり、ヒトＦｃεＲＩαタンパク質に結合する能力が低減する。
【００８０】
（実施例２）
この実施例は、ヒトＩｇＥのＣε３／Ｃε４ドメインのグリコシル化変異体の結晶の生成および分析を記載する。
【００８１】
（Ａ．ＩｇＥ  Ｆｃ−Ｃε３／Ｃε４  ＣＨＯ変異体の構築）
ＩｇＥ−Ｆｃ領域Ｃε３／Ｃε４ドメインタンパク質中のグリコシル化部位でのグリコシル化を防止するために、これらの部位の配列を改変した新規変異体ＩｇＥ−Ｆｃタンパク質を作製した。以下のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異形成を使用して、ＣＨＯ変異体を作製した。
【００８２】
ＩｇＥ（配列番号１０）のＩｇＥ  Ｃε３／Ｃε４ドメインをコードする核酸分子をテンプレートとして使用して、５’核酸分子および３’核酸分子を２つの別のＰＣＲ反応で作製した。プライマーＨＩＧＥＦＣ１ｂ（これは、配列５’ＴＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧＧ３’を有する）（配列番号３によって示される）は、ＳｎａＢＩ制限酵素認識部位を含み、成熟配列のＤ３３０に対応するＤを有するＶＤＳＮＰＲのＮ末端配列（ＳｎａＢＩでの制限消化の後）を有するＦｃタンパク質の一部をコードする。プライマーＮ３７１Ｑ（これは、配列５’ＡＣＴＧＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＧＧＴ３’を有する）（配列番号４によって示される）は、固有のＸｈｏＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位を導入し、３７１位のアスパラギンをグルタミンに変化する変異を含む。プライマーＮ３８３ＱおよびＨＩＧＥＦＣ２Ｂを使用して、３’核酸分子を合成した。プライマーＮ３８３Ｑ（これは、配列５’ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧ３’を有する）（配列番号５によって示される）は、固有のＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入し、３８３位のアスパラギンをグルタミンに変化する変異を含む。プライマーＨＩＧＥＦＣ２Ｂ（これは、配列５’ＴＣＴＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧ３’を有する）（配列番号６によって示される）は、Ｌｙｓ５４７で、Ｆｃ配列を終止し、ＮｏｔＩ制限酵素認識部位を含む。標準ＰＣＲ条件を使用して、５’核酸分子および３’核酸分子を産生し、ゲル精製し、次いで、制限酵素ＳｎａＢＩおよびＸｈｏＩ（５’フラグメント）またはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ（３’フラグメント）で消化した。次いで、消化した核酸分子を一緒にそのＸｈｏＩ部位で連結し、グリコシル化部変異を含むＣε３／Ｃε４ドメインをコードする核酸分子（配列番号７によって示される）を産生した。新規に構築した核酸分子の翻訳は、３７１位および３８３位のグリコシル化認識部位を欠くタンパク質（配列番号８によって示される）を生じる。
【００８３】
昆虫細胞における発現に関しては、炭水化物変異体に対してＣε３／Ｃε４ドメインをコードする新規に構築した核酸分子を、プライマーＩｇＥＣＡＢａｃおよびプライマーＨＩＧＥＦ２ｂを使用して、増幅した。プライマーＩｇＥＣＡｂａｃ（これは、配列５’ＴＡＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＧＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ３’を有する）（配列番号９によって示される）は、発現ベクターｐＡｃＧＰ６７Ａ（カタログ番号２２１２２ＯＰ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）中のシグナル配列の後ろに、核酸分子のクローニングのためのＢａｍＨＩ部位を含む。成熟（シグナル配列の切断された）タンパク質のＮ末端のコードされる配列は、ＡＤＰＣＡＤであり、成熟ＩｇＥのＣ３２８に対応するＣを有する。増幅後、核酸分子をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、ｐＡｃＧＰ６７Ａベクター中に連結した。
【００８４】
（Ｂ．ＣＨＯ変異体タンパク質の発現、精製および結晶化）
ＩｇＥ−Ｆｃ  ＣＨＯ変異体タンパク質を発現し、等質になるまで精製し、結晶化した。変異体タンパク質の発現、精製、結晶化、特徴づけおよびデータ収集およびリファインメントは、米国特許公開番号ＵＳ−２００１−００３９４７９−Ａの実施例１および実施例２に記載されているように行なった。３つの新規結晶を産生し、これらの結晶から得たデータを表２に示す。
【００８５】
（表２  ＣＨＯ変異体ＩｇＥタンパク質結晶に関するデータ）
【００８６】
【表２】
2006500923.tif 000005
【００８７】
結晶１から得たデータコレクションおよびリファインメントの統計値を以下の表３に示す。
【００８８】
ｍ１０＿ｂｉ５０ＣＨＯ＿ｍ２５＿ｂｉ５＿ｍ３５＿Ｐ＋ＥＢＡ．ｐｄｂに基づいた統計値
【００８９】
【表３】
2006500923.tif 000006
【００９０】
結晶２から得たデータコレクションおよびリファインメントの統計値を以下の表４に示す。
【００９１】
ｍｉｍ３００＿ｃ３１．ｐｄｂに基づいた統計値
【００９２】
【表４】
2006500923.tif 000007
【００９３】
結晶３から得たデータコレクションおよびリファインメントの統計値を以下の表５に示す。
【００９４】
ｍ２００＿ｂｉｌ４ｖ３＿ｂｇ１０＿ｂｄ８＿ｍ２５０＿ＢＥ＿ｎｅｗ．ｐｄｂに基づいた統計値
【００９５】
【表５】
2006500923.tif 000008
【００９６】
（Ｃ．ＩｇＥ  Ｆｃ領域Ｃε３／Ｃε４ドメイン変異体タンパク質構造の記述）
新規結晶形態は、ＩｇＥ−Ｆｃ構造変化についてのさらなる情報を明らかにし、この情報は、Ｃ３ドメインが開いた高次構造と閉じた高次構造との間の種々の中間構造をとり得ることを示す。興味深いことに、閉じた高次構造に存在するＣ３ドメインは一般的に、より類似し、おそらくそのために、その構造の可撓性がより制限される。対照的に、開いた高次構造に近いＣ３ドメインは、種々の広範な側部−側部構造をとり、このことは、開いた高次構造のドメインの動きに対する制限はほとんどないことを示唆する。これらの差異は、薬物設計および種々の形態への結合に影響を有し得、実験を節約するために重要であり得る。
【００９７】
ＩｇＥ−Ｆｃのこれらのさらなる結晶形態の決定によって明らかにされた構造全体の分析は、ＩｇＥ−Ｆｃ内のいかなる力学的な動きが、レセプターの結合および解離と結びつき得るかを示唆する。例えば、ＩｇＥ−Ｆｃの構造変化は、レセプター結合部位１および２との結合および遊離における顕微鏡レベルでの工程では重要なようである。さらに、構造全体の分析は、ＩｇＥ  Ｃｅ２ドメインとの相互作用が、どのようにしてこのような構造の可撓性の制限に関与し、レセプターへの結合速度およびレセプターからの解離速度に作用するかを示唆する。これらの複数の結晶形態で観察されたＣｅ３ドメインの動きおよび構造配置の範囲は、ＩｇＥのレセプターへの結合をブロックし、結合状態から解離状態へ刺激するための可能なモデルおよびアプローチを制限する、一連の好ましい配置を確立する。
【００９８】
本発明の種々の実施形態が詳細に記載されるが、これらの実施形態の改変および適合が、当業者に思い浮かぶことは明らかである。しかし、このような改変および適合が、特許請求の範囲に示される本発明の範囲内であることは、明白に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、開いた高次構造および閉じた高次構造のＩｇＥ−Ｆｃにおける鎖間距離および残基間距離の比較を示す。図１ａは、閉じた高次構造のＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの側面図を示す。図１ｂは、閉じた高次構造のＣε３ドメインの平面図を示す。実線は、各鎖のＮ末端アミノ酸（残基３３６）間の１３Åの間隙を示す。図１ｂは、開いた高次構造のＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの側面図を示す。図１ｄは、開いた高次構造のＣε３ドメインの平面図を示す。実線は、各鎖のＮ末端アミノ酸（残基３３６）間の２３．５Åの間隙を示す。
【図２】図２は、ＩｇＥＨＣ変異体中に生成されたシステイン残基により形成され得る潜在的なジスルフィド結合（例えば、アミノ酸位置３２９および３３５におけるジスルフィド結合が示される）を強調する開いたＩｇＥ高次構造および閉じたＩｇＥ高次構造の略図を示す。図２ａは、閉じた高次構造中のＣε４ドメインおよびＣε３ドメインの残基３２９〜３３６を示す。実線は、各重鎖の残基３３５間のジスルフィド結合を示す。図２ｂは、開いた高次構造中のＣε４ドメインおよびＣε３ドメインの残基３２９〜３３６を示す。実線は、各重鎖の残基３２９間のジスルフィド結合を示す。
【図３】図３は、還元条件下および非還元条件下でＰＡＧｅにより分離されたＩｇＥＨＣシステイン変異タンパク質のウエスタンブロットを示す。各レーンの上の数は、鎖間のジスルフィド結合を形成する能力を有するシステインに変換されたＩｇＥＨＣ中のアミノ酸残基を示す。タンパク質単量体および二量体の位置は、図の左側の矢印により示される。図３ａは、非還元条件下で分析した場合に、単量体形態および二量体形態のどちらにも存在するタンパク質を示す。図３ｂは、ＩｇＥ−Ｆｃタンパク質が、還元条件を受ける場合に、それらが全てモノマー型で存在することを示す。
【配列表】
2006500923.tif 000009
2006500923.tif 000010
2006500923.tif 000011
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2006500923.tif 000038
【図１】
2006500923.tif 000039
【図２】
2006500923.tif 000040
【図３】
2006500923.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月15日(2005.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006500923000001.app
【国際調査報告】
2006500923.tif 000042
2006500923.tif 000043
2006500923.tif 000044
2006500923.tif 000045