(57)【要約】本発明は薬物依存症の治療におけるアセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物の使用に関し、本願発明は該薬物を有効成分とする、薬物依存症の治療用医薬組成物、該薬物を用いて薬物依存症を治療する方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物を有効成分とする薬物依存症を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
薬物依存症がモルヒネ型、アルコール型、バルビツール酸型、アンフェタミン型、コカイン型、大麻型、有機溶剤型、カート型、幻覚剤型から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項３】
薬物依存症がモルヒネまたはコカインに起因する、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
薬物依存症がアルコールに起因する、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
薬物がコリン作動性アルカロイド、コリンエステラーゼ阻害剤またはコリンエステルである、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
コリン作動性アルカロイドがピロカルピン、オキソトレモリンまたはセビメリンである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
コリンエステラーゼ阻害剤が、フィゾスチグミン、タクリンおよびタクリン類似体、ファシクリン、メトリホナート、ヘプチルーフィゾスチグミン、リバスティグミン、ノルピリドスチグミン、ノルネオスチグミン、フペラジン、アンベノニウム、エンドロフォニウム、イソフルロフェート、ネオスチグミン、ピリドスチグミン、ジスチグミン、ドネペジル、およびこれらの塩、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を維持している誘導体またはプロドラッグから選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
コリンエステラーゼ阻害剤がガランタミン、エピガランタミンおよびノルガランタミンならびにそれらの類似体、塩および誘導体から選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項９】
薬物が血液脳関門を通過しうるものである、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
薬物が実質的にアセチルコリンの作用を昂進および脱抑制する請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容しうるアセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物の治療有効量を、薬物依存症の患者に投与することからなる、薬物依存症を治療する方法。
【請求項１２】
アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物の、薬物依存症治療剤の製造における使用。
【請求項１３】
候補薬物をアセチルコリンの作用を増強または脱抑制する能力に関し検索することからなる薬物依存症の治療剤のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物依存症の治療に関し、さらに詳しくは、中枢神経における神経伝達物質であるアセチルコリンの作用を昂進または脱抑制しうる薬物を含有する、薬物依存症の治療のための医薬組成物、また、そのような薬物を用いて薬物依存症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物依存は様々なタイプの依存性薬物が原因で引き起こされる疾患であり、依存症に悩む患者は、世界中で３，０００万人を越えると推定されている。薬物依存に関連した社会的機能の障害や器質性精神障害（器質性精神病）が社会問題化し、多大の費用が必要となることから、その有効な対策が世界規模で求められている。
【０００３】
薬物依存には、ある薬物を摂取したいという止めがたい欲求を示す精神依存と、生体がある薬物の影響下に在ることに適応した結果、その薬物が体内から消退して薬理作用が減弱もしくは消失したときに精神的および身体的に現れる病的な症候（離脱症状）としての身体依存とがある。
【０００４】
これら依存症の発症における脳内報酬系の関与が指摘されている。脳内報酬系は動物の脳内自己刺激行動を引き起こす部位として同定されるもので、快感や動機付け、多幸感をもたらす機能を担っている。依存性薬物の多くが脳内報酬系を賦活し、使用者に快感をもたらすこと、原因物質である薬物が体内から消失した後にも強い影響を残し続けることなどが薬物依存症の治療を極めて困難にしている。依存性薬物は、その症状に応じて、モルヒネ型、アルコール型、バルビツール酸型、アンフェタミン型、コカイン型、大麻型、有機溶剤型、カート型、幻覚剤型などに分類されるが、一般に薬物依存を起こす物質として知られているのは、コカイン、アヘン類（ヘロインやモルヒネなど）、アルコール、アンフェタミン（またはアンフェタミン様物質）、カフェイン、大麻、幻覚剤、吸入剤、ニコチン、フェンシクリジン（またはフェンシクリジン様物質）、鎮静剤、催眠剤及び抗不安薬などである。しばしば、一人の患者が１つ以上の物質に依存している。
【０００５】
依存性薬物の多くが１回の使用で依存を引き起こし、一度影響を受けると薬物摂取をやめた後も長期間、症状が持続する例があることが、薬物依存症を脳の慢性疾患としてとらえれている理由である。さらに、この様な薬物の過剰摂取は生体に重大な影響を及ぼし、時に死に導くことさえある。
【０００６】
本明細書中、「薬物依存」は米国精神科協会のＤＳＭ‐ＩＶ障害分類の判定基準による物質関連障害、すなわち物質使用障害と物質誘発性障害を含む。
【０００７】
現時点では薬物依存症に対する有効な治療法はほとんどない。コカインとアンフェタミン依存には精神療法が行われているが効果に乏しく、また内科的治療法は存在しない。ドーパミンのアゴニストおよびアンタゴニストの適用が考えられているが、治療効果は少ない。コカインとアンフェタミンが誘発する精神病性障害に対して抗精神病薬が対症療法として用いられている。アヘン類やニコチン依存に対してはメタドンやニコチンパッチなどの代替物質による維持療法が行われるが、離脱症状の防止には有効であっても依存は続いている状態である。また、アルコール依存の離脱症状に対して用いられるベンゾジアゼピンは、アルコール依存そのものの治療には効果がない。さらに、アルコール依存のリハビリテーション治療期に用いられる嫌酒薬であるジスルフィラムは、アルコールと同時摂取すると有害な反応を引き起こすことから、必ず精神療法や行動療法とともに用いなければならないという不都合がある。米国で認可された治療薬であるオピオイド受容体拮抗薬のナルトレキソンの有効性も未だ確立されていない。
【０００８】
薬物依存と密接な関係にある脳内報酬機能に関る重要な脳内部位は、腹側被蓋野(VTA)、側坐核(NAc)、青斑核、内側前脳束である。特に、腹側被蓋野から側坐核に投射するドーパミン作動性神経系が報酬系の機能発現に中心的な役割を果たしている（図１）。図１は中脳辺縁系のドーパミン作動性経路を示す図である。図１が示すように、脳内報酬機能は腹側被蓋野から放出されたドーパミンが側坐核に作用することにより発現する。コカインは側坐核の神経細胞のドーパミン輸送体を阻害することにより側坐核のドーパミンの濃度を上昇させ、またアヘン類、アンフェタミン、およびアルコールも側坐核のドーパミンの濃度を上昇させることが知られており、これら依存性薬物による薬物依存症誘発の作用機序として、側坐核におけるドーパミン濃度の上昇が指摘されている。
【０００９】
このような観点から、ドーパミンおよび、ドーパミン作動性神経系と間接的に関係のあるセロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸などの神経伝達物質、その受容体、該受容体と関連する細胞内情報伝達系等を標的にした薬物も検討されてきたが、未だ薬物依存症に有効な物質は開発されていない。
【００１０】
一方、側坐核内にはドーパミンとは別の神経伝達物質であるアセチルコリンを産生するアセチルコリン産生細胞が存在する。本発明者らはこの側坐核アセチルコリン産生細胞を選択的に除去する方法を確立し、アセチルコリンがドーパミンに対して拮抗作用を有すること、側坐核アセチルコリン産生細胞を除去したマウスにおいては、側坐核のアセチルコリンの低下によってコカインに対する感受性が上昇することを示した（PNAS, 98: 13351-13354（2001））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の状況に鑑み、従来の薬物依存症の治療薬開発の試みとは異なる観点から薬物依存症の有効な治療手段を開発することを目的として鋭意、研究を重ねてきた。そして、側坐核のアセチルコリン濃度と薬物依存症の発症との関係に着目して種々検討し、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物が薬物依存症の治療に有用であることを見出した。
【００１２】
即ち、本発明は、
（１）アセチルコリン(ACh)の作用を昂進または脱抑制する薬物を有効成分とする薬物依存症を治療するための医薬組成物、
（２）薬物依存症がモルヒネ型、アルコール型、バルビツール酸型、アンフェタミン型、コカイン型、大麻型、有機溶剤型、カート型、幻覚剤型から選択される（１）記載の組成物、
（３）薬物依存症がモルヒネまたはコカインに起因する、（２）記載の医薬組成物、
（４）薬物依存症がアルコールに起因する、（２）記載の医薬組成物、
（５）薬物がコリン作動性アルカロイド、コリンエステラーゼ(ChE)阻害剤またはコリンエステルである、（１）から（４）のいずれかに記載の医薬組成物、
（６）コリン作動性アルカロイドがピロカルピン、オキソトレモリンまたはセビメリンである、（５）記載の医薬組成物、
（７）コリンエステラーゼ阻害剤が、フィゾスチグミン、タクリンおよびタクリン類似体、ファシクリン、メトリホナート、ヘプチルーフィゾスチグミン、リバスティグミン、ノルピリドスチグミン、ノルネオスチグミン、フペラジン、アンベノニウム、エンドロフォニウム、イソフルロフェート、ネオスチグミン、ピリドスチグミン、ジスチグミン、ドネペジル、およびこれらの塩、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を維持している誘導体またはプロドラッグから選択される、（５）記載の医薬組成物、
（８）コリンエステラーゼ阻害剤がガランタミン、エピガランタミンおよびノルガランタミンならびにそれらの類似体、塩および誘導体から選択される、（５）記載の医薬組成物、
（９）薬物が血液脳関門を通過しうるものである、（１）から（８）のいずれかに記載の医薬組成物、
（１０）薬物が実質的にアセチルコリンの作用を昂進および脱抑制する（１）から（９）のいずれかに記載の医薬組成物
（１１）薬学的に許容しうるアセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物の治療有効量を、薬物依存症の患者に投与することからなる、薬物依存症を治療する方法、
（１２）アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物の、薬物依存症治療剤の製造における使用、および
（１３）候補薬物をアセチルコリンの作用を増強または脱抑制する能力に関し検索することからなる薬物依存症の治療剤のスクリーニング法などに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者等は、初めて脳の側坐核（nucleus accumbens）のコリン作動神経系の昂進作用または脱抑制作用が、薬物依存の治療につながると発見した（後述の実験例参照）。
本発明の薬物依存症治療用組成物は、精神依存および／または身体依存を示す薬物依存症の治療に有効であり、また、逆耐性を示す対象に対しても優れた効果を示すことから、広範な薬物依存症に対して用いることができる。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物を有効成分とし、これに通常の医薬用賦形剤または希釈剤を配合して調製される。
【００１５】
本明細書中、「薬物依存（症）（drug dependence）」とは当該技術分野で通常用いられる意味を有し、薬物を使用しているものがある薬物に対して精神依存（psychological dependence）および／または身体依存(physical dependence)状態にあることを意味する。精神依存とは、依存性薬物に対する強い欲求から、その使用を意思で制御できない状態を指し、身体依存とは、不眠、不安、痙攣発作、幻覚等の症状を示し、依存性薬物の中断または減少による退薬症候（withdrawal syndrome）や離脱症状（abstinence syndrome）を引き起こす状態を指す。
【００１６】
薬物依存症は一般に、その原因物質によってモルヒネ型、アルコール型、バルビツール酸型、アンフェタミン型、コカイン型、大麻型、有機溶剤型、カート型、幻覚剤型に分類される。
【００１７】
本発明の医薬組成物は原因となる依存性薬物の種類にかかわらず使用しうるが、依存性薬物がモルヒネ型、アルコール型、バルビツール酸型、コカイン型の薬物である場合に優れた効果が期待でき、特に依存性薬物がモルヒネ、コカイン、アルコールである場合により優れた効果が期待できる。
【００１８】
また、「アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物」とはアセチルコリンの作用を昂進するか、脱抑制する作用を有する薬物であり、コリン作動薬と総称される。それらには、(1)コリン作動性アルカロイド、(2)抗コリンエステラーゼ薬（コリンエステラーゼ阻害物質）、および(3)コリンエステル類（例えばアセチルコリン、メタコリン、カルバコール、ベタネコール等のムスカリン受容体またはニコチン受容体に作用する薬物）が含まれ、本発明には、血液脳関門を通過し、神経伝達システム内で活性であり、かつ薬学的に許容されるものであれば、任意の薬物を用いることができる。中でもコリン作動性アルカロイドおよび抗コリンエステラーゼ薬が好ましく、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストおよびコリンエステラーゼ阻害物質が特に好ましい。本明細書中では、便宜上、これらの薬物を単に「コリン作動薬」と呼称することもある。
【００１９】
コリン作動性アルカロイドは、ムスカリン、ピロカルピン、オキソトレモリンおよびセビメリンなどムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストであって、当該技術分野で既知のものから適宜選択することができる。
【００２０】
抗コリンエステラーゼ薬（コリンエステラーゼ阻害物質）は、当該技術分野で既知のものから適宜選択することができ、フィゾスチグミン、タクリンおよびタクリン類似体、ファシクジン、メトリホナート、ヘプチルーフィゾスチグミン、リバスティグミン、ノルピリドスチグミン、ノルネオスチグミン、フペラジン、ドネペジル、アンベノニウム、エドロホニウム、イソフルロフェイト、ピリドスチグミン、ジスチグミンおよびこれらのいずれかの塩、誘導体およびプロドラッグ、並びにガランタミン、エピガランタミンおよびノルガランタミンおよびそれらの類似体、塩および誘導体を挙げることができ、なかでもドネペジル、ガランタミンおよびそれらの塩が好ましい。
【００２１】
コリン作動薬は、血液脳関門の通過を可能にし、さらにはバイオアベイラビリティーを向上させるために安定性や溶解性を改善させる目的で適当な塩、エステル、プロドラッグ等の誘導体に変換して用いることができる。
【００２２】
コリンエステラーゼ阻害剤であるガランタミン類はヒガンバナ科（Amaryllidaceae）のスノードロップの球根から単離される第三級アルカロイドである（Pharmac. Thr., 68: 13-128 (1995)）。
【００２３】
本発明には、天然起源、化学合成により得られるもの、ガランタミンの活性を維持している誘導体等など、任意の入手可能なガランタミンが有用である。そのような化合物、合成方法は既知であり、例えば特表２００１−５１３４９７A（WO99/07359）、特表２００２−３２６９５９A(EP0879596,US5633238)等に記載されている。
【００２４】
また、本発明には、ドネペジルまたはその活性を維持している誘導体等、入手可能なドネペジルが有用である。そのような化合物および合成方法は既知であり、例えば特開平１１−１７１８６１A、特表２００２−５２５２６４A等に記載されている。
【００２５】
なお、本発明に使用するコリンエステラーゼ阻害剤がガランタミンに機能的に類似した誘導体である場合、それらは、下記記載のインビトロ法（Thomsen and Kewitz, Life Sciences, 46: 1553-1558（1990）, Thomsen  et al. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 26: 469-475（1988））による測定で、ブチルコリンエステラーゼよりもアセチルコリンエステラーゼに対して少なくとも１０倍の選択性、好ましくは少なくとも２０倍の選択性、より好ましくは少なくとも４０倍の選択性、最も好ましくは少なくとも５０倍の選択性を有している化合物として定義づけられる。
【００２６】
例えば、ガランタミンヒドロブロミドは、ThomsenおよびKewitz（Life Sciences, 46: 1553-1558（1990））に記載された条件の下で試験すると、５０倍の選択性を示す。従って、ある薬物が本発明における「アセチルコリンの作用を昂進、または脱抑制する」薬物であるか否かは、ガランタミンヒドロブロミドの例に示されるように、Thomsenらのインビトロ法で測定した時、ブチルコリンエステラーゼよりもアセチルコリンエステラーゼに対して少なくとも１０倍の選択性、好ましくは少なくとも２０倍の選択性、より好ましくは少なくとも４０倍の選択性、最も好ましくは少なくとも５０倍の選択性を有することを基準に決定される。
【００２７】
また、本発明に使用するコリンエステラーゼ阻害剤がドネペジルまたはその誘導体である場合、そのようなコリンエステラーゼ阻害剤は、ブチルコリンエステラーゼよりもアセチルコリンエステラーゼに対して少なくとも１０倍の選択性、好ましくは１００倍の選択性、より好ましくは１０００倍の選択性を有している。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、活性成分であるコリン作動薬（ドネペジルまたはガランタミン、その誘導体またはそれらの塩等）に、必要に応じて１種以上の薬学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤を配合し、常法に従い経口または非経口投与に適した適当な剤形に製剤化される。投与経路（経口または静脈、筋肉または皮下経路の注射または埋め込み装置による髄腔内投与を含む）に応じて、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液、トローチ、ペッサリー、クリーム、坐剤またはパッチなどの経皮配合物、たとえば、クリーム、軟膏もしくはローション等の任意の剤形をとることができる。これらは当業者既知の方法で調製される。
【００２９】
例えば、錠剤は、活性成分と補助成分を一緒に圧縮又は打錠成型して得られる。補助成分としては、製剤的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例、トウモロコシでん粉）、充填剤（例、ラクトース、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例、でん粉グリコール酸ナトリウム）又は滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム）などが用いられる。錠剤は既知の方法でコーティングされてもよい。シロップ剤、液剤、懸濁剤などの液体製剤の場合、例えば、懸濁化剤（例、メチルセルロース）、乳化剤（例、レシチン）、保存剤などを用いる。注射用製剤の場合、溶液、懸濁液、油性もしくは水性乳濁液またはその様なもののいずれでもよく、これらは懸濁安定剤又は分散剤などを含有していてもよい。吸入剤として使用する場合は吸入器に適応可能な液剤として用いる。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、保存、運搬の利用者の便宜、コンプライアンス等を考慮して経口および経皮経路が好ましい。
【００３１】
コリン作動薬の投与量は、選択された薬物の種類、投与形態、患者の症状、年令、体重、性別、あるいは併用される薬物（あるとすれば）などにより異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、経口投与の場合、１日２〜１００mg、好ましくは１日５〜７０mg、より好ましくは１０〜３０mgの範囲とすることができる。非経口投与の場合、１日０.１〜１００mg、好ましくは１日５〜１００mg、より好ましくは１日１０〜５０mg、さらに好ましくは１日５〜３０mgの範囲とすることができる。より低い用量から始めることがしばしば好ましい。ガランタミンなどの経皮投与の用量は経口投与とほぼ同等である。
【００３２】
本発明の組成物には1またはそれ以上のコリン作動薬を含有させることができ、さらに、必要に応じて他の薬物を併用してもよい。そのような薬物として、ドーパミン受容体拮抗薬、例えばハロペリドールを挙げることができる。併用する薬物は、本発明におけるコリン作動薬と単一製剤として、もしくは分けて製剤化され、本発明の医薬組成物と同時に、もしくは別に投与される。
【００３３】
本発明に従って依存症患者を治療するには、上記のようにして得られる医薬組成物を、治療を必要とする患者に適当な経路および方法で投与する。そのような方法は当業者に既知である。
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これらは単なる例示であり本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実験例１  側坐核のコリン作動性細胞を破壊したマウスにおけるモルヒネ精神依存に対する感受性試験
コリン作動性細胞除去マウス（ＩＴ−ｔｇ）の作成
側坐核におけるアセチルコリン濃度低下の依存性薬物（薬物依存を引き起こす薬物）に対する感受性への影響を検証するため、側坐核のアセチルコリン産生細胞（コリン作動性細胞）を破壊したコリン作動性細胞除去マウス（ＩＴ−ｔｇ）を作成した。側坐核のコリン作動性細胞を選択的に破壊するために、トランスジェニックマウスとイムノトキシンとしてAnti-Tac(Fv)-PE38を用いるイムノトキシンによる細胞標的法（ＩＭＣＴ）を用いた（小林ら、PNAS, 92: 1132-1136(1995);渡辺ら、Cell, 95: 17-27(1998)）。Anti-Tac(Fv)-PE38は、ヒト・インターロイキン２型受容体αサブユニット(ｈIL-2Rα)に対するモノクローナル抗体の可変領域と緑膿菌外毒素をもとに開発された組み換え融合蛋白であり、Chaudharyらの方法(Nature, 339: 394-397(1989))によって、大腸菌BL21より精製できる。Anti-Tac(Fv)-PE38はｈIL-2Rαを発現する細胞を特異的に認識するイムノトキシンであり、蛋白合成を阻害することで、ｈIL-2Rαを発現する細胞を選択的に脱落させる。そこで、側坐核のコリン作動性細胞に特異的にｈIL-2Rαを発現するトランスジェニックマウスにAnti-Tac(Fv)-PE38を局所投与することによって、側坐核のコリン作動性細胞を選択的に破壊する方法を開発した。側坐核では、コリン作動性細胞にのみ代謝型グルタミン酸受容体２型(mGluR２)が発現する。そこで本発明者等らは、渡辺ら(Cell, 95: 17-27 (1998))に記載の方法に従い、マウスmGluR２遺伝子上流域18.3キロ塩基対をプロモーターとしてｈIL-2Rαと緑色蛍光蛋白(GFP)の融合蛋白(ｈIL-2Rα/GFP)を発現させたトランスジェニックマウスを作成した。野生型およびトランスジェニックマウスはC57B6/J系を用いた。９−１３週齢のトランスジェニックマウスの側坐核に、頭骸骨の大泉門より前方1.5mm、側方0.8mm、深さ3.5mmにガラス針の先端を置き、0.5マイクロリットルのリン酸バッファー生理食塩水に10ngのイムノトキシンを含む溶液を、３分間かけて投与した（疋田らPNAS, 98: 13351-13354（2001））。イムノトキシンを投与し２週間後に、脳のアセチルコリン合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼに対する抗体による免疫組織化学法において検証すると、トランスジェニックマウスの側坐核において７０％以上のコリン作動性細胞の減少が認められた。イムノトキシンによる細胞破壊はアセチルコリン産生細胞に特異的であり、側坐核においてドーパミン神経終末、GABA作動性投射細胞、パルブアルブミン陽性細胞などに数の変化はみられなかった。また、ドーパミンとその代謝物である、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）とホモバニリン酸（HVA）の濃度は変化せずに、アセチルコリン濃度を正常値の２３％にすることができた（金子ら、Science, 289, 633-637, （2000）)。上記のイムノトキシンで処置したトランスジェニックマウスをコリン作動性細胞破壊マウス（IT-tg）として実験に用いた。
【００３５】
イムノトキシンそのものは野生型マウスに投与してもアセチルコリン産生細胞に影響を与えないとされており(疋田らPNAS, 98: 13351-13354（2001）)、野生型マウスとトランスジェニックマウスの側坐核の両側にイムノトキシンを投与した。
【００３６】
A．場所嗜好試験
コリン作動性細胞破壊マウス（IT-tg）と野生型マウス（IT-wt）を用い、その行動を調べることによって、側坐核アセチルコリン濃度の減少が依存性薬物に対する感受性に与える影響を検証した。
【００３７】
Anti-Tac(Fv)-PE38（IT）をマウスの側坐核に投与して２週間後に、IT-tgとIT-wtの両方のマウスに対して、モルヒネによる条件付け場所嗜好試験（CPP）を行った。条件付け場所嗜好試験は、依存性薬物を投与すると実験動物は投与された環境と結びつけて、その環境に長く滞在するようになる(場所嗜好性を獲得する)ことを利用して、依存性薬物に対する精神依存の程度を定量化する方法であり、例えばケルツらの方法(Nature, 401： 272-276, (1999))に従い、実施できる。条件付け場所嗜好試験には、中央に小さな部屋を配し、両側に壁の色と床の形状が異なる大きな部屋を連結させた、３つの部屋で構成される装置を用いた。条件付け前（０日目）に３つの部屋を３０分間、マウスを自由に行き来させた。次の日より、３日間、以下の条件付けを行った。３つの部屋をつなぐ２つの扉を閉めて３つの部屋を区切った後に、まず生理食塩水をマウスの腹腔内に投与後すぐに、大きな部屋の１つに入れ、２０分間、放置した。この４時間後に、1mg/kgないしは5mg/kgの塩酸モルヒネを腹腔内投与し、すぐに別の側の大きな部屋に入れ、２０分間、放置した。この３日間の条件付けが終了した翌日に、中央の小さな部屋にマウスを入れ、扉を開放して、３つの部屋を３０分間自由に行き来させた。マウスが両側の大きな部屋に滞在した時間（秒）を赤外線装置によって測定した。IT-tgマウスとIT-wtマウスのモルヒネに対する精神依存を、モルヒネを用いて条件付けした部屋の滞在時間から、生理食塩水を用いて条件付けした部屋の滞在時間を減算した値として定量化した(IT-tg;8-10例、IT-wt;7-12例)。以降の行動実験の結果は図に示すように棒グラフあるいは折れ線グラフで示した。各群の平均値を、エラーバーで表した標準誤差とともに示した。統計分析は分散分析法によった。多重比較検定はScheffe法によった。
【００３８】
モルヒネ側、生理食塩水側のそれぞれに滞在した時間（秒）の差（モルヒネ側−生理食塩水側）を求め、縦軸に記載した。IT-tgとIT-wtは条件付けする前には共に場所嗜好性は示さなかった(図２ａ、条件付前)。図２ａから、１mg/kgのモルヒネで３日間条件付けした場合、IT-wtは場所嗜好性を示さなかったのに対して、IT-tgはこの量のモルヒネで条件付けした部屋に対して有意な場所嗜好性を示した(図２ａ、条件付後, *P<0.05の有意差)ことが判る。一方、５mg/kgのモルヒネで３日間条件付けした場合はIT-wt、IT-tgともに場所嗜好性を示した。したがって、コリン作動性細胞を破壊し、側坐核のアセチルコリン濃度の低下させることにより、場所嗜好性試験において、モルヒネ依存の感受性が上昇することが明らかになった。
【００３９】
同様の実験において、モルヒネに代えてコカインを用いた場合、コカイン5mg/kgあるいは10mg/kgで３日間条件付けしたとき、IT-tgはIT-wtよりもコカインで条件付けした部屋に強い場所嗜好性を示した(P<0.01の有意差、疋田らPNAS, 98: 13351-13354（2001））。
上記の結果は、側坐核のアセチルコリン濃度低下が、モルヒネ、コカイン等の依存性薬物への感受性を上昇させることを示している。
【００４０】
B．場所嫌悪試験
モルヒネ依存の状態から断薬を行うと、離脱症状と共に不快感を生じる。モルヒネの負の報酬効果、離脱症状に対する側坐核のアセチルコリンの濃度低下の影響を条件付け場所嫌悪(CPA)試験を用いて検証した。条件付け場所嫌悪試験は、例えばムルトラらの方法（Nature, 405: 180-183, (2000)）に従い、実施できる。モルヒネを毎日２回、４日間（1-4日目）にわたって、10mg/kgより、10mg/kgずつ段階的に増量して40mg/kgまで腹腔内投与することによりマウスをモルヒネ依存の状態とした。場所条件付けは第５日目に、上記Aと同じ装置を用いて施行した。50mg/kgのモルヒネを投与した１時間後に生理食塩水を投与し、すぐに大きな部屋の１つに入れ、２０分間、放置した。この４時間後に、50mg/kgのモルヒネを投与し、さらに１時間後にオピオイド受容体拮抗薬であるナロキソン1mg/kgを腹腔内投与し、すぐに別の側の大きな部屋に入れ、２０分間、放置した。この場所条件付けの翌日に中央の小さな部屋にマウスを入れ、扉を開放して、３つの部屋を３０分間自由に行き来させた。マウスが両側の大きな部屋に滞在した時間（秒）を赤外線装置によって測定した。IT-tgマウスと、IT-wtマウスのモルヒネ断薬による負の報酬効果を、ナロキソンを用いて条件付けした部屋の滞在時間から、生理食塩水を用いて条件付けした部屋の滞在時間を減算した値（ナロキソン側−生理食塩水側）として定量化した(各8例)。条件付けする前にはIT-tgとIT-wtは共に場所嗜好性は示さなかった(図２ｂ、条件付前)。条件付け後ではIT-tgとIT-wtは共にナロキソンによる断薬を用いて条件付けした部屋に対する場所嫌悪を示したが、IT-tgはより強い場所嫌悪を示した(図２ｂ、条件付後、*P<0.05の有意差)。したがって、側坐核のアセチルコリン濃度低下により、モルヒネ断薬による負の報酬効果が増強されることが明らかとなった。上記の結果は、アセチルコリン濃度の低下を抑制する薬剤がモルヒネ断薬による不快感の軽減に有用であることを示唆している。
【００４１】
実験例２  コリン作動性細胞を破壊したマウスにおけるモルヒネ離脱症状
モルヒネの連続投与により身体依存を生じる。モルヒネ断薬による離脱症状は依存症治療の障壁になっている。身体依存に対する側坐核のアセチルコリン濃度の低下の影響を、ナロキソンを用いて、モルヒネ断薬による離脱症状の程度を観察することによって検証した。実験例１Bと同様にマウスのモルヒネ依存の状態を作成した。第５日目に、50mg/kgのモルヒネを投与した１時間後に、生理食塩水あるいはナロキソン1mg/kgを投与して２０分間、マウスのモルヒネ離脱症状である跳躍の回数を数えた(各8例)。この離脱症状は、ナロキソンを投与したIT-tgマウスとIT-wtマウス（対照）の両方で観察された。しかし、IT-tgマウスはIT-wtマウスよりも有意に跳躍回数が多かった(図３、*P<0.05の有意差)。したがって、側坐核のアセチルコリン濃度低下により、モルヒネ断薬による離脱症状が増強されることが明らかになった。上記の結果は、側坐核のアセチルコリンの濃度低下を抑制する薬剤がモルヒネ断薬による離脱症状の軽減に有用であることを示唆するものである。
【００４２】
実施例１  アセチルコリン濃度低下の抑制がモルヒネ精神依存に及ぼす影響
A．野生型マウスを用いる場所嗜好試験
実験例１Aにおいて、側坐核におけるアセチルコリン濃度低下がモルヒネへの感受性を増強することを示した。この実施例では、コリンエステラーゼ阻害剤であるドネペジルを用いてアセチルコリン濃度低下の抑制によるモルヒネ依存の治療の可能性を検証した。９−１３週齢の野生型マウスに対して、実験例１Aと同様にして、１日5mg/kgのモルヒネ投与により３日間の場所条件付けを行った。この条件付けのモルヒネ投与の２０分前に生理食塩水あるいは1mg/kgないし3mg/kgの塩酸ドネペジルを腹腔内投与した(各7-11例)。どの濃度のドネペジルであってもモルヒネによる場所嗜好性の程度を有意に軽減できた(図４ａ、**P<0.01の有意差)。この結果、ドネペジルによるアセチルコリン濃度低下の抑制が、モルヒネ精神依存を軽減しうることが明らかになった。これは、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬剤がモルヒネ依存の治療に有効であることを証明するものである。
【００４３】
B．コリン作動性細胞破壊マウスを用いる場所嗜好試験
IT-tgマウスとlT-wtマウス（対照）において、アセチルコリン濃度低下の抑制によるモルヒネ精神依存への影響を検証した。5mg/kgのモルヒネ投与により３日間の場所条件付けを行い、この条件付けのモルヒネ投与の２０分前に生理食塩水あるいは1mg/kgの塩酸ドネペジルを投与した(各7-9例)。IT-wtでは、ドネペジルによってモルヒネによる場所嗜好性が有意に減少した(図４ｂ、**P<0.01の有意差)。それに対して、IT-tgでは、ドネペジルによってモルヒネによる場所嗜好性を抑えることができなかった(図４ｂ)。上記の結果から、ドネペジルによるモルヒネ精神依存の軽減が、側坐核のコリン作動性細胞が産生するアセチルコリンの分解を抑制することによるものと解釈される。すなわち、側坐核のコリン作動性細胞が産生するアセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬物が、最もモルヒネの場所嗜好性作用の軽減を示した。
【００４４】
実施例２  アセチルコリン濃度低下の抑制がコカイン精神依存に及ぼす影響 
A．コカイン依存に対するドネペジルの予防効果
側坐核アセチルコリン産生細胞の除去による側坐核のアセチルコリン濃度の低下によってコカインに対する感受性が上昇することは明らかにされている(Hikida et al., PNAS, 98: 13351-13354（2001）)。ここでは、アセチルコリン濃度低下の抑制による薬物依存の治療の可能性がコカイン依存においても適応できるかを検証する。９−１３週齢の野生型マウスに対して、実施例１Aと同様にして、10mg/kgのコカインにより３日間の場所条件付けを行った。この条件付けのモルヒネ投与の２０分前に生理食塩水あるいは1mg/kgないし3mg/kgの塩酸ドネペジルを腹腔内投与した(各7-11例)。どの濃度のドネペジルであってもコカインによる場所嗜好性の程度を軽減できた(図５ａ、**P<0.01の有意差)。この結果は、ドネペジルによる側坐核におけるアセチルコリン濃度低下の抑制がコカイン精神依存を軽減しうることを示している。即ち、アセチルコリンの作用の昂進または脱抑制する薬剤がコカイン精神依存の治療に有効であることが示された。
【００４５】
B．コカイン連続投与による逆耐性に対するドネペジルの予防効果
連日コカインを投与すると、逆耐性現象と呼ばれる行動量の増大がみられる（Hikida et al., PNAS, 98:, 13351-13354(2001)、Koob, Neuron, 16, 983-896 (1996)）。逆耐性現象は薬物依存の発症に重要な機構と考えられている。IT-tgマウスでは、IT-wtマウスと比べて、連日のコカイン投与による行動量がより増大した(Hikida et al., PNAS, 98: 13351-13354（2001）)。即ち、アセチルコリンの濃度低下により、逆耐性現象が大きくなることが示された。ここでは、アセチルコリン濃度の低下の抑制によって、逆耐性現象を防ぐことができるかどうかを検証した。
【００４６】
９−１３週齢の野生型マウスを３日間、行動量測定用のチャンバーに入れ馴れさせた。その後、毎日１回、10mg/kgのコカインを腹腔内投与し、すぐにチャンバーに入れ１０分間の行動量（移動量）を赤外線装置を用いて測定し、行動距離に換算した。コカイン投与の１０分前に、生理食塩水あるいは1mg/kgのドネペジルを投与した(各１０例)。生理食塩水を前処置した群では、行動量の増大が観察されたのに対して、ドネペジルを前処置した群では、行動量の上昇が全くみられなかった(図５ｂ)。反復測定分散分析法による統計処理で、前処置によりF=20.7, P<0.001の有意差を生じた。コカイン投与日それぞれにおいても、第１日目はP<0.05の、第２−５日目はP<0.01の有意差を生じた。したがって、ドネペジルの前処置により、コカインによる行動量の増大および逆耐性の形成を抑えることができた。このことは、アセチルコリン濃度低下の抑制によって、コカイン依存の発症を抑制できることを示しており、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬剤が薬物依存の予防効果を持つことを証明するものである。
【００４７】
C.コカイン依存に対するドネペジルおよびガランタミンの治療効果
アセチルコリン濃度低下の抑制によるコカイン依存の治療の可能性を検証した。９−１３週齢の野生型マウスに５日間にわたって、毎日１回、10mg/kgのコカインが腹腔内投与された。マウスに行動量の増大がみられ、コカイン依存の状態のモデルとなった。第6日目に、生理食塩水あるいは1mg/kgのドネペジルあるいは1mg/kgのガランタミンを前処置し、その１０分後に10mg/kgのコカインを腹腔内投与した後、１０分間にわたり行動量を測定した(各5-12例)。ドネペジルあるいは、別種類のアセチルコリンエステラーゼ阻害薬であるガランタミンを前処置すると、第6日目にみられるコカインによる行動量の増大を有意に抑制した(図５ｃ、***P<0.001、**P<0.01の有意差)。この結果、すでにコカイン依存の状態になっていても、アセチルコリン濃度低下の抑制によりコカインによる異常行動を減少させうることが示された。このことは、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬剤がコカイン依存の乱用期においても、治療効果を持つことを示している。
【００４８】
D．側坐核におけるコリン作動性細胞より産生されるアセチルコリンの昂進によるコカイン依存に対するドネペジルによる治療効果
ここでは、側坐核におけるコリン作動性細胞より産生されるアセチルコリンのコカイン異常行動に対する影響を検証した。C と同様に、IT-wtマウスおよびIT-tgマウスにおいて、５日間にわたって、毎日１回、10mg/kgのコカインを腹腔内投与した。第6日目に、生理食塩水あるいは1mg/kgのドネペジルを前処置し、その１０分後に10mg/kgのコカインを腹腔内投与しチャンバーに１０分間入れ行動量を測定した(各7-11例)。IT-wtではドネペジルの前処置がコカイン異常行動を有意に減少させた(図５ｄ、*P<0.05の有意差)。それに対して、IT-tgではドネペジルの前処置の影響を認めなかった。この結果は、コリンエステラーゼ阻害剤の作用が、コリン作動性細胞が産生するアセチルコリンを標的として、側坐核におけるアセチルコリンの作用を昂進することにより、コカイン異常行動が減少されたことを証明している。
【００４９】
E．コカインによる異常行動の再発に対するドネペジルの抑制効果
連日のコカイン投与により引き起こされた逆耐性現象は、その後、長期間断薬しても存続する。このことは、薬物依存者が長期間断薬しても、再び薬物摂取を行ってしまう再発(relapse)の機構として重要視されている。そこで、ドネペジルのコカイン依存再発に対する予防効果を後述のとおり検証した。９−１３週齢の野生型マウスに６日間にわたって、毎日１回、10mg/kgのコカインを腹腔内投与し、コカイン依存を確立した。その後、５日間(第７-１１日)、コカインの投与を中止し、ホームケージにて飼い続けた。第１２日目に生理食塩水あるいは1mg/kgのドネペジルを前処置し、その１０分後に10mg/kgのコカインを腹腔内投与しチャンバーに１０分間入れ行動量を測定した(各6例)。生理食塩水を前処置した群では、第１２日目のコカイン投与により第1日目よりも強い異常行動がみられ、コカインの長期断薬後も逆耐性が維持されていることが分かった(図５ｅ)。それに対して、ドネペジルを前処置した群では、第１２日目のコカイン投与の後、異常行動がみられなかった(図５ｅ、生理食塩水を前処置した群と比較し、***P<0.001の有意差)。この結果は、アセチルコリン濃度低下の抑制によるコカイン異常行動の再発の抑制予防効果を示している。このことは、薬物依存のリハビリテーション期において、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する薬剤が再発の予防に有用であることを示している。
【００５０】
実施例３  アセチルコリン受容体刺激によるコカイン精神依存の軽減
ここでは、アセチルコリン受容体刺激によるコカイン精神依存への影響を検証した。It-tgマウスにおいて、外来性のアセチルコリンアゴニストのコカイン依存に対する予防効果を検証した。ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストであるピロカルピンを使用し、ピロカルピン投与前には、ピロカルピンの末梢組織への作用を防ぐために、メチルアトロピン（２mg/kg）をIT-tgマウスに投与した。その後、5mg/kgのコカインにより3日間の場所条件付けを行った。場所嗜好性試験においては、コカイン投与の２０分前に生理食塩水またはピロカルピン(100mg/kg)が投与された(各6-13例)。生理食塩水で全処理されたIT-tgでは、5mg/kgのコカインに対して強い場所嗜好性を示した(図６)。それに対して、ピロカルピンの前処置によってコカインによる場所嗜好性を有意に抑えることができた(図６、生理食塩水の前処置群に対して**P<0.01の有意差)。コリンエステラーゼ阻害剤と同様に、側坐核アセチルコリン濃度低下によって、コカイン精神依存に対する感受性が増加している状態においても、アセチルコリン受容体アゴニストによってコカイン精神依存が軽減できることが示された。したがって、コリン作動性細胞の減少によって、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬の効果が乏しい場合(実施例1Bを参照)においても、アセチルコリン受容体を刺激する薬剤によってアセチルコリンの機能を補充・亢進させることが薬物依存症治療に有効であることが明らかになった。
【００５１】
実施例４  アセチルコリン濃度低下の抑制によるアルコール精神依存の軽減効果
上述の実施例は、アセチルコリン濃度低下の抑制がコカインまたはモルヒネ依存に対し効果的であることを示している。ここでは、アセチルコリン濃度低下を抑制する医薬組成物のアルコール依存に対する治療効果を検証した。It-wtマウス(9-13週齢)を用い、実施例１と同様に、３日間にわたり２０％（V/V）のエタノール(10mg/kg)が腹腔内投与された。場所嗜好性試験においては、エタノール投与の２０分前に生理食塩水もしくはドネペジル(1mg/kg)が投与された(各7例)。結果としてドネペジルによる前処置はエタノールの条件付けによる場所嗜好性を有意に軽減し(図７、生理食塩水で前処置した群と比べ*P<0.05の有意差)、ドネペジルによるアセチルコリンの濃度低下の抑制がアルコールの精神依存を軽減できることが明らかにした。したがって、アセチルコリンの作用を昂進または脱抑制する医薬組成物がアルコール依存の治療に有用であることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、従来、有効な治療法がなかった薬物依存症の治療手段が提供される。本発明の医薬組成物は精神依存のみならず身体依存を伴う薬物依存症に有用であり、薬物依存に起因する様々な社会問題の解決に貢献しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は中脳辺縁系の側坐核を示す模式図である。側坐核は、薬物依存の原因となる重要な神経基質である。側坐核の神経活性は腹側被蓋野から分泌されたドーパミンだけではなく、側坐核のコリン作動性細胞より放出されたアセチルコリンによって制御される。
【００５４】
【図２】図２は、実験例１に記載の、側坐核におけるコリン作動性細胞を除去することによりおこるアセチルコリン濃度低下が依存性薬物への感受性に及ぼす影響を調べるための試験の結果を示している。図中、“IT”は、イムノトキシンを示し、“IT-tg”はコリン作動性神経細胞除去マウス、“IT-wt”はコントロールとして用いられたITが投与された野生型マウスである。IT-tgマウスは、イムノトキシン細胞標的法(IMCT）に従いイムノトキシンを導入することにより選択的に側坐核のコリン作動性神経細胞を除去したトランスジェニックマウスである。図２ａは場所嗜好（CPP)試験の結果を示しており、該試験はマウスにモルヒネまたは生理食塩水を投与した後、一定の異なる部屋（場所）へ入れ、モルヒネの報酬効果と（モルヒネに関連づけられた）部屋の環境的特徴の関係を連合学習するという操作によりモルヒネによる場所条件付けを行い、条件付け終了後の自由移動期間中に動物がそれぞれの場所に滞在した時間（秒）を測定することにより行った。場所嗜好性はモルヒネ側に滞在した時間と生理食塩水側に滞在した時間との差（秒）で表される（縦軸）。図２ｂは場所嫌悪（CPA)試験の結果を示しており、マウスをモルヒネ依存性にした後、モルヒネ投与後にオピオイド受容体拮抗薬であるナロキソンまたは生理食塩水を投与することにより条件付けを行いモルヒネの禁断症状を発生させた。場所嫌悪性もまた自由移動期間中に動物がナロキソン側に滞在した時間と生理食塩水側に滞在した時間との差（秒）で表される（縦軸）。
【００５５】
【図３】図３は、実験例２に記載の、コリン作動性細胞除去マウスと野生型マウスにおいて、アセチルコリン濃度の低下が依存性薬物への身体依存に及ぼす影響を調べるための試験の結果を示している。図２の場合と同様に、コリン作動性細胞除去マウス（IT-tg）と野生型マウス（IT-wt）をモルヒネに対して身体依存性にし、これらのマウスに、モルヒネ投与後にナロキソンまたは生理食塩水を投与し、離脱症状（跳躍）の発現回数を観察した。
【００５６】
【図４】図４は、実施例１に記載の、モルヒネ精神依存に対するコリンエステラ−ゼ阻害薬の効果を調べるための場所嗜好性試験の結果を示している。図４aは、野生型マウスに対してモルヒネ投与前にドネペジルを投与した場合の場所嗜好性への影響を示す図である。図４ｂはコリン作動性細胞除去マウス(IT‐tg)と野生型マウス(IT‐wt)に対してモルヒネ投与前にドネペジルまたは生理食塩水を投与した場合の場所嗜好性への影響を示す図である。
【００５７】
【図５】図５は、実施例２に記載の、コカインを用いて行った試験の結果を示している。図５ａは上記図４ａと同様、野生型マウスにおけるコカイン依存に対するドネペジルの効果を場所嗜好性で表した図である。図５ｂはコカイン連続投与による逆耐性に対するドネペジルの前処理効果を行動量の変化で表した図である。移動距離（cm x 103）は、行動量の変化の指標として測定された。図５ｃはコカイン依存性野生型マウスに対するドネペジルおよびガランタミンの効果を行動量で表した図である。図５ｄはコリン作動性細胞除去マウス（IT-tg）と野生型マウス(IT‐wt)におけるコカイン連続投与による行動量の増大を示す図である。図５ｅはコカインに対して逆耐性を有する野生型マウスを長期間断薬した後、コカインを再投与した場合の異常行動に対するドネペジルの効果を示す図である。
【００５８】
【図６】図６は、実施例３に記載の、コリン作動性細胞除去マウス（IT-tg）におけるコカイン精神依存に対する、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストであるピロカルピンの効果を調べるための場所嗜好性試験の結果を示す図である。
【００５９】
【図７】図７は、実施例４に記載の野生型マウスにおけるアルコール依存に対するドネペジルの効果を調べるための場所嗜好性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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