(57)【要約】ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量；およびｉｉ）インターフェロンまたはインターフェロンをコードするポリヌクレオチドの有効量を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系の調節を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および、
ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子
：を含む製品。
【請求項２】
Ｔ細胞活性の調節のための、請求項１に記載の製品。
【請求項３】
喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発される免疫系の異常、または感染症の治療のための、請求項１または請求項２に記載の製品。
【請求項４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄ、またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から４のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤＳＬまたはＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１から４のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項８】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、少なくとも１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、少なくとも１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも２個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、少なくとも１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）１〜５個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意にＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全部または一部；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
：を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意にＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全部または一部；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
：を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意にＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全部または一部；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
：を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｄｅｌｔａ ＤＳＬおよび／またはＥＧＦドメインを含む、請求項１から１４のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ ＤＳＬおよび／またはＥＧＦドメインを含む、請求項１から１４のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ヒトＤｅｌｔａ ＤＳＬおよび／またはＥＧＦドメインを含む、請求項１から１４のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１８】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ヒトＪａｇｇｅｄ ＤＳＬおよび／またはＥＧＦドメインを含む、請求項１から１４のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項１９】
インターフェロンを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項２０】
インターフェロンがＩ型インターフェロンである、請求項１９に記載の製品。
【請求項２１】
インターフェロンがアルファインターフェロンである、請求項２０に記載の製品。
【請求項２２】
インターフェロンがベータインターフェロンである、請求項２０に記載の製品。
【請求項２３】
インターフェロンがヒトインターフェロンである、請求項１９から２２のうちいずれか１つに記載の製品。
【請求項２４】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量；および
ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量
：を、同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法。
【請求項２５】
免疫系の調節における同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための：
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子；
の組み合わせ。
【請求項２６】
インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせで、免疫系を調節することにおける使用のための、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子。
【請求項２７】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子；
の組み合わせの、免疫系の調節のための薬剤の製造における使用。
【請求項２８】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の使用。
【請求項２９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子、および、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子を含む医薬キット。
【請求項３０】
第1の処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する段階；および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【請求項３１】
第1の処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階；および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫機能の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第９８／２０１４２号パンフレットは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の操作を、免疫療法にならびにＴ細胞媒介性疾患の予防および／または治療に用いる方法を記載する。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、腫瘍によって誘導されたＴ細胞系の異常、および感染症を標的とすることができる。
【０００３】
また、抗原特異的寛容を他のＴ細胞へ伝達することができる調節Ｔ細胞の一種を生じることが可能であることも示されており、伝染性寛容と呼ばれる過程である（国際公開第９８／２０１４２号パンフレット）。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の説明およびそれによって影響される条件は、たとえば、下記の我々の公開されたＰＣＴ出願に見出すことができる；
ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（出願日１９９７年１１月６日、国際公開第９８／２０１４２号；出願日１９９６年１１月７日の英国特許第９６２３２３６．８号、出願日１９９７年７月２４日の英国特許第９７１５６７４．９号、および出願日１９９７年９月１１日の英国特許第９７１９３５０．２号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（出願日１９９９年１２月１５日、国際公開第００／３６０８９号；出願日１９９９年１２月１５日の英国特許第９８２７６０４．１号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（出願日２０００年１１月１７日、国際公開第０１３５９９０号；出願日１９９９年１１月１８日の英国特許第９９２７３２８．６号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３５０３（出願日２００１年８月３日、国際公開第０２／１２８９０号；出願日２０００年８月４日の英国特許第００１９２４２．７号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２４３８（出願日２００２年５月２４日、国際公開第０２／０９６９５２号；出願日２００１年５月２５日の英国特許第０１１２８１８．０号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３８１（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１２１１１号；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５５．１号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３９７（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１２４４１号；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５３．６号、出願日２００２年４月５日の英国特許第０２０７９３０．９号、出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８２．８号および出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８３．６号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１１３１７号；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５３．６号、出願日２００２年４月５日の英国特許第０２０７９３０．９号、出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８２．８号および出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８３．６号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４３９０（出願日２００２年９月２７日、国際公開第０３／０２９２９３号；出願日２００１年９月２８日の英国特許第０１２３３７９．０号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３７（出願日２００２年１１月１３日、国際公開第０３／０４１７３５号；出願日２００１年１１月１４日の英国特許第０１２７２６７．３号、出願日２００２年７月２５日のＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６号、出願日２００２年９月７日の英国特許第０２２０８４９．４号、出願日２００２年９月１０日の英国特許第０２２０９１３．８号および出願日２００２年９月２７日のＰＣＴ／ＧＢ０２／００４３９０号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３３（出願日２００２年１１月１３日、国際公開第０３／０４２２４６号；出願日２００１年１１月１４日の英国特許第０１２７２７１．５号および出願日２００２年９月１０日の英国特許第０２２０９１３．８号の優先権を主張）。
【０００５】
ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８号（国際公開第９８／２０１４２号）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３号（国際公開第００／３６０８９号）、ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１号（国際公開第０１３５９９０号）、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３５０３号（国際公開第０２／１２８９０号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２４３８号（国際公開第０２／０９６９５２号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３８１号（国際公開第０３／０１２１１１号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３９７号（国際公開第０３／０１２４４１号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６号（国際公開第０３／０１１３１７号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４３９０号（国際公開第０３／０２９２９３号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３７号（国際公開第０３／０４１７３５号）およびＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３３号（国際公開第０３／０４２２４６号）のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【０００６】
ホイネ（Ｈｏｙｎｅ）Ｇ．Ｆ．他（１９９９） Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１８：１２２−１２４；Ｈｏｙｎｅ 他 （２０００） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：２８１−２８８；Ｈｏｙｎｅ Ｇ．Ｆ．他 （２０００） Ｉｎｔｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：１７７−１８５；Ｈｏｙｎｅ，Ｇ．他（２００１） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８２：２１５−２２７もまた参照される；そのそれぞれもまた参照により本開示に含まれる。
【０００７】
米国特許出願公開第２００２００３４５００Ａ１号明細書（レビングス（Ｌｅｖｉｎｇｓ））は、たとえば移植術関係で有用であると言われているＴｒ１細胞の収量を増加させるための方法を記載する。
【０００８】
本発明は、免疫系を調節するためのさらなる方法を提供することを目指す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の最初の一態様によると、免疫系の調節（抑制または活性化）を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子を含む製品が提供される。
【００１０】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量、およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節（抑制または活性化）する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節における、同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との組み合わせが提供される。
【００１２】
本発明の別の一態様によると、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と、同時に、同時期に、別々にまたは順次に組み合わせての免疫系の調節における使用のための、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が提供される。
【００１３】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための薬剤の製造における、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との組み合わせの使用が提供される。
【００１４】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための薬剤の製造における、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と、同時に、同時期に、別々にまたは順次に組み合わせての、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の使用が提供される。
【００１５】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子、およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子を含むキットが提供される。 
【００１６】
本発明の別の一態様によると、第1の処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する；および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量を投与する段階を（任意の順序で）含む、免疫系を調節するための方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の一態様によると、第1の処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する；および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階を（任意の順序で）含む、免疫系を調節するための方法が提供される。
【００１８】
本発明の方法、製品、および用途は、生物学的または治療的効果の促進を提供する。ここで用いられる「生物学的または治療的効果の促進」の語は、たとえば、効力の増大、有効性の増大、副作用の減少、活性スペクトルの改善、などを含む。 
【００１９】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子とは相乗的に作用し、相乗作用的に有効な量で用いられる。相乗作用は任意の生物学的にまたは治療上関係する性質、エフェクター活性に現れる可能性があるが、典型的には、たとえば、ＩＬ−１０といったサイトカインの発現の相乗的な調節に現れる。
【００２０】
好ましくは免疫系の調節は免疫療法を含む。
【００２１】
好ましくは免疫系の調節はＴ細胞活性の調節を含む。
【００２２】
一実施形態では免疫系の調節はＴ細胞活性の低下を含む。たとえば、免疫系の調節は、エフェクターＴ細胞活性の低下、たとえばヘルパー（ＴＨ）および／または細胞傷害性（ＴＣ）Ｔ細胞活性の低下を含みうる。適切には免疫系の調節は、Ｔｈ１および／またはＴｈ２免疫反応の低下を含みうる。
【００２３】
別の一実施形態では、免疫系の調節はＴ細胞活性の増大を含みうる。
【００２４】
適切には免疫系の調節は、たとえばＴｒｌまたはＴｈ３調節Ｔ細胞といった調節Ｔ細胞の生成、または調節Ｔ細胞の活性を増大することを含む。
【００２５】
適切には免疫系の調節は、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＴＮＦ−アルファといったサイトカインの発現の調節（増加または減少）を含む。 
【００２６】
適切には免疫系の調節はＩＬ−１０発現の増加（好ましくは相乗的な増加）を含む。
【００２７】
適切には免疫系の調節は、ＩＬ−５またはＴＮＦ−アルファといった選択されたサイトカインの発現の低下を含む。
【００２８】
適切には免疫系の調節は、ＩＬ−１０発現の増加とＩＬ−５発現の減少を有する免疫調節サイトカインプロファイルを生じさせることを含む。
【００２９】
適切には免疫系の調節は、免疫反応を調節する（増加させるかまたは減少させる）ことを含む。 
【００３０】
好ましくは免疫系の調節は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発される免疫系の異常、または感染症の治療を含む。
【００３１】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子はＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができる物質（「Ｎｏｔｃｈ受容体作用因子」）である。適切にはたとえばその調節因子は、Ｎｏｔｃｈリガンドまたは、Ｎｏｔｃｈリガンドの生物学的に活性な断片または誘導体でありうる。
【００３２】
Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することができる他の物質、たとえばＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができるペプチドミメティック（特に天然に存在するＮｏｔｃｈリガンドのミメティック）、抗体および小さい（たとえば合成）有機分子もまた、Ｎｏｔｃｈの活性化因子と考えられる。 
【００３３】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、ここで用いられる「ミメティック」の語は、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化合物を含む。 
【００３４】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、融合タンパク質を含みうるかまたは融合タンパク質をコードしうる。たとえば、調節因子はＮｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＥＩセグメントを含む融合タンパク質を含みうるかまたはコードしうる。
【００３５】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦＣセグメント（たとえばＩｇＧ１ＦｃまたはＩｇＧ４ＦＣ）を含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００３６】
適切なそのような融合タンパク質は、たとえば国際公開第９８／２０１４２号パンフレットの実施例２に記載されている。ＩｇＧ融合タンパク質は、たとえば、米国特許第５４２８１３０号明細書（ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））に記載のように、本分野で既知である通り調製することができる。
【００３７】
別の一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、抗体、たとえば抗Ｎｏｔｃｈ抗体、適切には抗ヒトＮｏｔｃｈ抗体（たとえばヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４に結合する抗体）を含むことができる。
【００３８】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬまたはＥＧＦドメイン、またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含むタンパク質またはポリペプチドを含むかまたはコードする。
【００３９】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ反復モチーフ、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも３ないし１５、たとえば少なくとも５ないし１０個のＥＧＦ反復モチーフを含むかまたはコードする。適切にはそのＤＳＬおよびＥＧＦ配列は哺乳類配列であるかまたは哺乳類配列に対応する。好ましい配列は、哺乳類配列、好ましくはヒト配列を含む。
【００４０】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。
【００４１】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｄｅｌｔａまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｄｅｌｔａまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、ＳＥＲＲＡＴＥ／ＪＡＧＧＥＤまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、ＳＥＲＲＡＴＥ／ＪＡＧＧＥＤまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４３】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４４】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４５】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流構成成分の発現または活性をアップレギュレートすることができるポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４６】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、抗体、抗体断片または抗体誘導体、または、抗体、抗体断片または抗体誘導体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４７】
本発明の別の一態様によると、免疫系によるＩＬ−１０産生を高めるための、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との組み合わせの用途が提供される。 
【００４８】
本発明の別の一態様によると、寛容を促進することができるリンパ球または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を作製する方法であって、患者または患畜から得られたリンパ球またはＡＰＣを（ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および（ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と共にインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００４９】
適切にはその方法は、患者または患畜から得られたリンパ球またはＡＰＣを、（ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および（ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の存在下でＡＰＣとインキュベートすることを含む。
【００５０】
本発明の別の一態様によると、Ｔ細胞に寛容を誘導することができるＡＰＣを作製する方法であって、ＡＰＣを（ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および（ｉｉ）インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と接触させることを含む方法が提供される。
【００５１】
本発明の別の一態様によると、寛容を促進することができるリンパ球またはＡＰＣを作製する方法であって、患者または患畜から得られたリンパ球またはＡＰＣを、上記の通り作製されたリンパ球またはＡＰＣとインキュベートすることを含む方法が提供される。適切にはそのような方法ではそのリンパ球またはＡＰＣをｅｘ−ｖｉｖｏでインキュベートすることができる。
【００５２】
適切には抗原または抗原決定基（抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド）もまた、本発明の方法、用途および製品の一部として投与することができる。
【００５３】
一実施形態では抗原または抗原決定基は、自己抗原またはその抗原決定基、または、自己抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
【００５４】
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、アレルゲンまたはその抗原決定基、または、アレルゲンまたはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
【００５５】
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、移植抗原またはその抗原決定基、または、移植抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
【００５６】
別の一実施形態では抗原または抗原決定基は腫瘍抗原またはその抗原決定基、または、腫瘍抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
【００５７】
別の一実施形態では抗原または抗原決定基は病原体抗原またはその抗原決定基、または、病原体 抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
【００５８】
「調節する」、「調節」および「調節している」などの語は、関係する効果、反応、またはシグナル伝達を増加および減少させることの両方を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態を、非限定的な実施例を用いて、および添付の図を参照して、より詳細に説明する。
【００６０】
本発明の実施は、別に指示されない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献に説明されている。たとえば、Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９，『分子クローニング；実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第二版、１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、 Ｆ．Ｍ．他 （１９９５および定期補遺；『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）９，１３，および１６章，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク；Ｂ．ロー（Ｒｏｅ）、Ｊ．クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）およびＡ．カーン（Ｋａｈｎ）、１９９６，『ＤＮＡ単離および配列決定；基幹技術』（ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社；Ｊ．Ｍ．ポラック（Ｐｏｌａｋ）およびジェームスＯ’Ｄ．マクジー（Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ）、 １９９０，『Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；原理と実践』（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）；オックスフォード大学出版会；Ｍ．Ｊ．ゲイト（Ｇａｉｔ）（編集）、１９８４，『オリゴヌクレオチド合成；実践的手法』（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｉｒｌ出版（Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄ．Ｍ．Ｊ．リリー（Ｌｉｌｌｅｙ）およびＪ．Ｅ．ダールベルク（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、１９９２，『酵素学の方法；ＤＮＡ構造パートＡ；ＤＮＡの合成および物理分析』（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；およびＪ．Ｅ．コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）、Ａ．Ｍ．クルイスビーク（Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ）、Ｄ．Ｈ．マーグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）、Ｅ．Ｍ．シェバッハ（Ｓｈｅｖａｃｈ）およびＷ．ストロバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）（１９９２および定期補遺；『免疫学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク）を参照。これらの一般的文献のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【００６１】
疑いを避けるため、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および脊椎動物名は互いに交換可能に用いられ、すべてのホモログは本発明の範囲内に含まれる。
【００６２】
インターフェロンおよびインターフェロンをコードするポリヌクレオチド
たとえば米国特許第６２９９８６９号明細書（ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））に記載の通り、インターフェロンはウイルスまたはある種の他の物質に進入された細胞によって放出される相対的に小さい一本鎖糖タンパク質である。インターフェロンは現在３つの主要な種類に分類されており、白血球インターフェロン（インターフェロン−アルファ、α−インターフェロン、ＩＦＮ−α）、線維芽細胞インターフェロン（インターフェロン−ベータ、β−インターフェロン、ＩＦＮ−β）、および免疫インターフェロン（インターフェロン−ガンマ、γ−インターフェロン、ＩＦＮ−γ）とされている。ウイルス感染に反応して、リンパ球は主にアルファ−インターフェロン（より少ない量の、一般にオメガインターフェロン、ＬＰＮ−ωと呼ばれる異なる種類のインターフェロンと共に）を合成する一方、線維芽細胞の感染は通常、β−インターフェロンを誘導する。インターフェロンα、β、およびωは、ＭＨＣクラスＩ抗原を誘導することが知られていて、Ｉ型インターフェロンと呼ばれ、一方、ＩＦＮ−γはＭＨＣクラスＩＩ抗原発現を誘導し、またＩＩ型インターフェロンとも呼ばれる。
【００６３】
ＩＦＮ−αの異なる変異体をコードする多数の異なる遺伝子が同定されている。以前に同定されたアルファインターフェロン種は２つの主要な種類であるＩとＩＩに分類され、ＩとＩＩのそれぞれが複数の別個のタンパク質を含む（バロン（Ｂａｒｏｎ）他，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，１７９０１９０ （１９９０）；ナガタ（Ｎａｇａｔａ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２８７，４０１−４０８ （１９８０）；ナガタ（Ｎａｇａｔａ）他 ，Ｎａｔｕｒｅ ２８４，３１６−３２０ （１９８０）；ストロイリ（Ｓｔｒｅｕｌｉ）他 ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９，１３４３−１３４７ （１９８０）；ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）他 ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０，２０−２６ （１９８１） ；ローン（Ｌａｗｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２，１１５９−１１６２ （１９８１） ；ウルリッヒ（ＵＬＬＲＩＣＨ）他 ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５６，４６７−４８６ （１９８２） ；ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ）他 ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ２９９，７−２８ （１９８２）；ルント（Ｌｕｎｄ）他 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，２４３５−２４３９ （１９８４） ；カポン（Ｃａｐｏｎ）他 ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，７６８ （１９８５） ）。さまざまなＩＦＮ−α種は、ＩＦＮ−αＡ（ＩＦＮ−α２）、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣ、ＩＦＮ−αＣ１、ＩＦＮ−．αＤ（ＩＦＮ−α１）、ＩＦＮ−αＥ、ＩＦＮ−αＦ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＦＮ−αＨ、ＩＦＮ−αＩ、ＩＦＮ−αＪ１、ＩＦＮ−αＪ２、ＩＦＮ−αＫ、ＩＦＮ−αＬ、ＩＦＮ−α４Ｂ、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７４、ＩＦＮ−α７６、ＩＦＮ−α４ａ）、ＩＦＮ−α８８、およびこれらの種の対立遺伝子を含む。
【００６４】
ヒトでは、ＩＦＮ−アルファサブタイプは、１６６−１７２アミノ酸のすべてが近縁であるタンパク質をコードする約２０個の遺伝子の多遺伝子ファミリーを包含する。この多様性とは対照的に、ヒトインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）遺伝子は１つしかなく、また１６６アミノ酸のタンパク質をコードする。すべてのＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ベータ（また一般にＩ型インターフェロンファミリーともいう）は、さまざまな細胞型に幅広く分布する１３０ｋＤの糖タンパク質である共通の高親和性細胞表面受容体に結合するように見える。Ｉ型インターフェロンは、受容体サブユニットｉｆｎａｒ１およびｉｆｎａｒ２を含む複合体、およびそれらに随伴するＪａｎｕｓチロシンキナーゼＴｙｋ２およびＪａｋ１によって認識され、これは転写因子ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２を活性化し、転写因子複合体ＩＳＧＰ３（インターフェロン刺激化遺伝子因子３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｆａｃｔｏｒ ３））の形成に繋がる[リー（Ｌｉ）他 ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ８０ （８−９）；７０３−２０ （１９９８）；ナドー（Ｎａｄｅａｕ）他 ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４ （７）；４０４５−５２ （１９９９）]。
【００６５】
ＩＦＮを産生する主要な細胞型は；リンパ球、単球およびマクロファージ（ＩＦＮ−アルファについて）；線維芽細胞および一部の上皮細胞およびリンパ芽球腫細胞（ＩＦＮ−ベータについて）；および活性化Ｔリンパ球（ＩＦＮ−ガンマについて）である。
【００６６】
インターフェロンは当初、バフィーコート白血球および線維芽細胞といった天然の起源から、インターフェロン産生を増加させる既知の誘導物質を任意に用いて、産生された。インターフェロンはまた組み換えＤＮＡ技術によっても産生することができる。
【００６７】
組み換えＩＦＮ−アルファＡ（ｒＩＦＮ−αＡ，別名ＩＦＮ−α２）のクローニングおよび発現は、ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２８７，４１１ （１９８０）によって記載された。ｒＩＦＮ−αＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＫおよびＬのアミノ酸配列は、コードするヌクレオチド配列と共に、ペストカ（Ｐｅｓｔｋａ）によってＡｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２１，１ （１９８３）に記載されている。ｒＩＦＮ−αＥ、ＩおよびＪのアミノ酸配列および基礎となるヌクレオチド配列は、１９８２年１月２０日公開の英国特許第２，０７９，２９１号明細書に記載されている。さまざまなＩＦＮ−αのハイブリッドもまた知られており、たとえば前出のペストカ（Ｐｅｓｔｋａ）他によって開示されている。ナグカタ（Ｎａｇｃａｔａ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２８４，３１６（１９８０）は、ｒＩＦＮ−αＤとは１１４位のアミノ酸１個が異なるポリペプチド（未成熟型の）をコードしたＩＦＮ−α遺伝子の発現を記載した。同様に、ｒＩＦＮ−αＡとは２３位のアミノ酸１個が異なるポリペプチドを生じるＩＦＮ−α遺伝子（ｒＩＦＮ−α２という）のクローニングおよび発現が、１９８１年７月１５日公開の欧州特許出願公開第３２１３４号明細書に記載された。
【００６８】
たとえば、ヒトＩＦＮアルファの１つの型についてのアミノ酸配列が、下記の通りＧｅｎＢａｎｋに報告されている（登録番号Ｍ５４８８６）；
ＭＡＬＴＦＡＬＬＶＡＬＬＶＬＳＣＫＳＳＣＳＶＧＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫＩＳＬＦＳＣＬＫＤ
ＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬ
ＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶ
ＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥ 
【００６９】
同様に、たとえば、ヒトＩＦＮベータ−１の１つの型についてのアミノ酸配列が、下記の通りＧｅｎＢａｎｋに報告されている（登録番号Ｍ２８６２２）；
ＭＴＮＫＣＬＬＱＩＡＬＬＬＣＦＳＴＴＡＬＳＭＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳＳＮＦＱＣＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫ
ＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＳＴＧＷＮＢＴＩＶＥＮＬＬＡ
ＮＶＹＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＢＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹＬＫＡＫＥＹＳ
ＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮ
【００７０】
他のインターフェロン配列が、たとえば、登録番号Ｊ００２１０（アルファ−ｄ）、Ｘ６６１８６（アルファ−２）、Ｋ０２０５５（アルファ−ＷＡ）、Ｍ２７３１８（アルファ−Ｍ１）、Ｍ１１００３（アルファ−ＩＩ−１）、Ｍ１２３５０（アルファ−Ｆ）、Ｋ０１９００（アルファ２０１型）およびＭ３４９１３（アルファ−Ｊ１）にて提供される。
【００７１】
成熟ｒＩＦＮ−βのクローニングおよび発現は、ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４０５７ （１９８０）によって記載されている。成熟ｒＩＦＮ−γのクローニングおよび発現は、グレイ（Ｇｒａｙ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２９５，５０３ （１９８２）によって記載されている。ＩＦＮ−ωは、カポン（Ｃａｐｏｎ）他 ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，７６８ （１９８５）によって記載されている。ＩＦＮ−τはホエーリー（Ｗｈａｌｅｙ）他 ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０８６４−８ （１９９４）によって同定され開示されている。
【００７２】
既知のＩＦＮ−α、−β、および−γのすべてが、複数のシステイン残基を含む。これらの残基は、分子間ジスルフィド結合を形成することができるスルフヒドリル側鎖を含む。たとえば、成熟組み換えｒＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列は１，２９，９８および１３８位にシステイン残基を含む。ウェッツェル（Ｗｅｔｚｅｌ）他，Ｎａｔｕｒｅ ２８９，６０６（１９８１）は、１位と９８位のシステイン残基間、および２９位と１３８位のシステイン残基間に分子内ジスルフィド結合を割り当てた。
【００７３】
さまざまなインターフェロンを特異的に結合する抗体もまた本分野でよく知られている。たとえば、抗α−インターフェロン作用因子抗体がツクイ（Ｔｓｕｋｕｉ）他，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，１１２９０１１３９ （１９８６）；デュアルテ（Ｄｕａｒｔｅ）他，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，２２１− ２３２ （１９８７）；バラソエイアン（Ｂａｒａｓｏａｉａｎ）他 ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，５０７−５１２ （１９８９）；エクスリー（Ｅｘｌｅｙ）他 ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５，２２７７−２２８０ （１９８４）；シアラー（Ｓｈｅａｒｅｒ）他 ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，３０９６−３１０１ （１９８４）；アルカン（Ａｌｋａｎ）他，Ｃｉｂａ Ｇｅｉｇｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １１９，２６４−２７８ （１９８６）；ノル（Ｎｏｌｌ）他 ，Ｂｉｏｍｅｄ．ＢＩＯＣＨＩＭ．Ａｃｔａ ４８，１６５−１７６ （１９８９）；ヘルツォーク（Ｈｅｒｔｚｏｇ）他 ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１０ （Ｓｕｐｐｌ．１） （１９９０）；コンツェク（Ｋｏｎｔｓｅｋ）他 ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．（ｓｐｅｃｉａｌ ｉｓｓｕｅ） ７３−８２ （１９９１）、および１９８３年１２月２７日発行の米国特許第４，４２３，１４７号明細書によって報告されている。
【００７４】
Ｉ型インターフェロンの作用は、細胞表面上のＩＦＮ−αａ受容体複合体との結合によって媒介されるように見える。この受容体は、ＩＦＮ−αＲ１（ウゼ（Ｕｚｅ）他，Ｃｅｌｌ ６０，２２５−２３４[１９９０]）およびＩＦＮ−αＲ２（ノビック（Ｎｏｖｉｃｋ）他 ＣＥＬＬ ７７，３９１−４００ [１９９４]）と同定される、それぞれ２種類および３種類のスプライス変異体を有する、少なくとも２つの異なるサブユニットで構成される。ＩＦＮ−αＲ２は既知の型のインターフェロンの結合サブユニットであり、一方、ＩＦＮ−αＲ１はより高い親和性の結合およびシグナル伝達に寄与する。リガンド結合による受容体の結合は、Ｊａｎｕｓファミリーキナーゼ（ＪＡＫ）および原形質潜在シグナル伝達因子および転写（ＳＴＡＴ）タンパク質の活性化因子を、チロシンリン酸化によって活性化する。活性化されたＳＴＡＴは複合体の形で核へ移行して、ＩＦＮ−刺激化遺伝子（ＩＳＧＳ）の認識エンハンサー配列と相互作用し、対応する転写活性化および生物学的反応に結びつく（ダーネル（ＤＡＲＮＥＬＬ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，１４１５−２１（１９９４））。 
【００７５】
ここで用いられる「インターフェロン」の語は、天然に存在するインターフェロンおよびその生物学的に活性な断片、誘導体、ホモログおよび変異体を含む。また、抗体、小分子、およびペプチドミメティックといった、対応する活性を有する人工の同等物も含む。
【００７６】
好ましくは、「インターフェロン」はＩ型またはＩＩ型インターフェロンをいい、アルファ、ベータ、ガンマ、およびオメガと一般に呼ばれるもの、およびその混合物を含み、共通配列を含む。インターフェロンは幅広い市販品から入手可能であり、多数の適応の治療について承認されている。インターフェロンは天然起源由来でありうるが、しかし適切には組み換え産物である。本発明の目的のためには、「インターフェロン」の語はまた、特に米国特許第５，５８２，８２４号明細書、第５，５９３，６６７号明細書、および第５，５９４，１０７号明細書で開示されるように、たとえば生物学的活性の性質に影響することなく安定性を高めるために配列修飾が導入されているインターフェロンのキメラ型または突然変異型といった、インターフェロン活性を有するポリペプチドまたはその断片、誘導体、複合体、ホモログおよび変異体も含む。
【００７７】
たとえば、ＩＦＮ−ベータ配列の変異体、用途、および作製手順はよく知られている；たとえば米国特許第４，４５０，１０３号；第４，５１８，５８４号；第４，５８８，５８５号；第４，７３７，４６２号；第４，７３８，８４４号；第４，７３８，８４５号；第４，７５３，７９５号；第４，７６９，２３３号；第４，７９３，９９５号；第４，９１４，０３３号；第４，９５９，３１４号；第５，１８３，７４６号；第５，３７６，５６７号；第５，５４５，７２３号；第５，７３０，９６９号；第５，８１４，４８５号；第５，８６９，６０３号明細書およびそれらの参考文献を参照。
【００７８】
一実施形態では、たとえば、本発明における用途のためのインターフェロンは、ここで特定されるＩ型インターフェロン配列に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列類似性、好ましくは配列同一性を有しうる。
【００７９】
一実施形態では、インターフェロンは、ここで特定されるＩＦＮ−アルファ配列に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列類似性、好ましくは配列同一性を有しうる。
【００８０】
一実施形態では、インターフェロンは、ここで特定されるＩＦＮ−ベータ配列に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列類似性、好ましくは配列同一性を有しうる。
【００８１】
インターフェロンはグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよいことが理解される。 
【００８２】
好ましくは本発明で用いられるインターフェロンは、Ｉ型インターフェロン、好ましくはアルファ−インターフェロンであるかまたはその活性を有する。好ましくはインターフェロンはヒトインターフェロンであるかまたはヒトインターフェロンに由来する。
【００８３】
たとえば米国特許第６１５４７２９号明細書で報告される通り、ＩＦＮは炎症性疾患、ウイルス性疾患、および悪性疾患といった症状において治療的価値を有することが示されている（たとえば、デスミター（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ）他 ，Ｌａｎｃｅｔ ２ （７９８７）；６４５−７ （１９７６）；マコワー（Ｍａｋｏｗｅｒ）およびワドラー（Ｗａｄｌｅｒ），Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６ （６）；６６３−７１ （１９９９）；ストルゼベッカー（Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ）他 ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９ （１１）；１２５７−６４ （１９９９）；ゼイン（Ｚｅｉｎ），Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４ （４）；２２９−４１ （１９９８；ムシュ（Ｍｕｓｃｈ）他 ，Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｅｔｅｒｏｌｏｇｙ ４５ （２４）；２２８２−９４ （１９９８） ；ワドラー（Ｗａｄｌｅｒ）他 ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．４ （５）；３３１−７ （１９９８）を参照）。 ＩＦＮ−ベータは市販薬であり（バーレックス社（Ｂｅｒｌｅｘ）製のベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（登録商標）、およびバイオジェン（Ｂｉｏｇｅｎ）社製のアボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）（登録商標））、多発性硬化症（ＭＳ）の治療における用途について承認されている（アルナソン（Ａｒｎａｓｏｎ），Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ５３ （８）；３４４−５０，（１９９９）；コミ（Ｃｏｍｉ）他 ，Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．１ （６）；３１７−２０ （１９９６）；アーポス（Ａａｐｐｏｓ），Ｌａｎｃｅｔ ３５３ （９１７１）；２２４２−３ （１９９９））。ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された組み換えＩＦＮ−ベータであって、１６５アミノ酸（最初のメチオニンを欠く）を含み、１７位にシステインの代わりにセリンを含むように遺伝子組み換えされている。ベータセロンはＩＦＮ−ベータの非グリコシル化型である。アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）はヒトＩＦＮ−ベータであって、１６６アミノ酸を含み、組み換えＤＮＡ技術によってＣＨＯ細胞で産生される。アボネックスはＩＦＮ−ベータのグリコシル化型である。また、近年の研究は、有望なＩＦＮ有効性を、Ｂ型およびＣ型肝炎といったある種のウイルス疾患、およびがんで示している。 
【００８４】
ヒトでの使用に関して承認された市販のインターフェロンは、たとえば；インターフェロンアルファ−２ａ（ロフェロンＡ（Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ）（登録商標）、より入手可能）；インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）（登録商標）、米国ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）より入手可能）；インターフェロンアルファｃｏｎ−１ （インファジェン（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ）（登録商標）、米国インターミューン社（ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ）より入手可能）；インターフェロン アルファ−ｎ３ （ヒト 白血球由来） （アルフェロンＮ（Ａｌｆｅｒｏｎ Ｎ）（登録商標）、米国ヘミスフェリクス・バイオファーマ社（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ）より入手可能）；インターフェロンベータ−１ａ（レビフ（Ｒｅｂｉｆ）（登録商標）、米国セロノ／ファイザー社（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒ）より入手可能）；およびインターフェロンガンマ−１ｂ（アクチミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）（登録商標）、米国インターミューン社（ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ）より入手可能）を含む。
【００８５】
インターフェロンは、たとえばＰｅｇインターフェロンアルファ−２ａ（ペガシス（Ｐｅｇａｓｙｓ）、米国ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）より入手可能）およびＰＥＧインターフェロンアルファ−２ｂ（ＰＥＧ−イントロン（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）、米国シェリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）より入手可能）の場合のように、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といったポリマーと結合した誘導体化された形でも用いることができる。ＰＥＧといった物質の結合は、インターフェロンをより長く体内に留まらせ、したがってインターフェロンの作用を延長させる。これらおよび他の誘導体もまたここで用いられる「インターフェロン」の語の意味に含まれることが理解される。
【００８６】
本発明の製品および方法は、たとえば自己免疫疾患、マイコバクテリア疾患、神経変性疾患、寄生虫疾患、およびウイルス製疾患を治療するのに用いることができる。特に本発明は、関節炎、糖尿病、狼瘡、および多発性硬化症といった自己免疫疾患、ハンセン病および結核といったマイコバクテリア疾患、脳炎およびクロイツフェルト−ヤコブ症候群といった神経変性疾患、マラリアといった寄生虫疾患、および子宮頸がん、性器ヘルペス、Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ、およびＨＳＶ−１および２といったウイルス性疾患を治療するための方法を提供する。
【００８７】
インターフェロン誘導因子
本発明の一実施形態では、インターフェロン誘導因子を、インターフェロンまたはインターフェロンをコードするポリヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、用いることができる。
【００８８】
「インターフェロン誘導因子」の語は、インターフェロン合成および／または放出を増加させる（誘導する）任意の物質を含む。たとえばポリＩ；Ｃといったポリヌクレオチドのような、インターフェロンのさまざまな誘導因子が既知である。適切には、低分子量の、経口投与可能なインターフェロン誘導因子を用いることができる。そのような誘導因子は本分野でよく知られており、たとえば、チロロン（ｔｉｒｏｌｏｎｅ）（米国特許第３５９２８１９号明細書；アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）他，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７４ １７ ；１１５０−１１５６）およびキノロン誘導体であるイミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（サベッジ（Ｓａｖａｇｅ）他；Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６ ７４；１４８２−１４８６）がある。 
【００８９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路またはその標的シグナル伝達経路の生物学的活性の変化または改変をいう。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の拮抗因子または阻害因子、すなわちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、遮断する化合物をいうことができる。そのような化合物は阻害因子または拮抗因子ということができ、便利である。代わりに、「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の作用因子、すなわちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、刺激またはアップレギュレートする化合物をいうことができる。そのような化合物はアップレギュレーターまたは作用因子ということができ、便利である。好ましくは、調節因子はＮｏｔｃｈシグナル伝達の作用因子であり、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体の作用因子である（たとえば、好ましくはヒトＮｏｔｃｈ受容体である、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４受容体の作用因子）。好ましくはそのような作用因子（「Ｎｏｔｃｈの活性化因子」）は、好ましくはヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４といったヒトＮｏｔｃｈ受容体を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体と結合しそれを活性化する。Ｎｏｔｃｈ受容体との結合および／またはその活性化は、たとえばここに記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ結合測定法および活性測定法を含む本分野で既知のさまざまな技術によって評価することができる。
【００９０】
たとえば、任意の特定の物質がＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するかどうか（たとえばＮｏｔｃｈの活性化因子またはＮｏｔｃｈ作用因子である）は、任意の適当な測定法の使用によって、たとえばロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット（たとえばその実施例８および９を参照）に記載された型のＨＥＳ−Ｌ／ＣＢＦ−１レポーター測定の使用によって、容易に決定することができる。逆に、拮抗因子活性は、たとえば、ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第０３／０１２４４１号パンフレットまたは国際公開第０３／０４１７３５号パンフレット（たとえば実施例１０、１１および１２を参照）に記載されたような、既知のＮｏｔｃｈシグナル伝達作用因子によってシグナル伝達を低下させることにおけるその物質の何らかの効果を監視することによって容易に決定することができる（すなわちいわゆる「拮抗因子」測定法で）。
【００９１】
本発明の活性物質はたとえば有機化合物またはその他の化学物質でありうる。一実施形態では、調節因子は２個以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物となる。ここで、「ヒドロカルビル基」の語は、少なくともＣおよびＨを含む基を意味し、また任意に１つ以上の他の適当な置換基を含みうる。そのような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環状基などを含みうる。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組み合わせは環状基を形成しうる。ヒドロカルビル基が２個以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、少なくとも２個の炭素は、適当な元素または基を介して結合することができる。このように、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含むことができる。適当なヘテロ原子は当業者に明らかとなり、たとえば、硫黄、窒素、および酸素を含む。調節因子候補は少なくとも１つの環状基を含みうる。環状基は、非融合型多環基といった多環基であることができる。一部の用途のためには、本物質は、別のヒドロカルビル基と結合した、前記環状基のうち少なくとも１つを含む。
【００９２】
好ましい一実施形態では、調節因子はアミノ酸配列またはその化学誘導体である。別の好ましい一実施形態では、調節因子はヌクレオチド配列であって、センス配列またはアンチセンス配列でありうる。調節因子はまた抗体であることができる。
【００９３】
「抗体」の語は、完全な分子および、抗原決定基と結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖといったその断片を含む。これらの抗体断片はその抗原または受容体と選択的に結合する能力の一部を保持し、たとえば下記を含む；
（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、酵素パパインを用いての完全な抗体の消化によって作製することができ、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を生じる；
（ｉｉ）Ｆａｂ’は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元して、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を生じることによって得ることができる；抗体分子あたり２個のＦａｂ’断片が得られる；
（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる；Ｆ（ａｂ’）２は２本のジスルフィド結合によって結びついた２個のＦａｂ’断片の二量体である；
（ｉｖ）ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域を融合した一本鎖分子として含む、遺伝子操作された断片を含む。
【００９４】
これらの断片を作製する一般的方法は本分野で既知である（たとえば、参照により本開示に含まれるハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），『抗体；実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク（１９８８）を参照）。
【００９５】
調節因子は合成化合物または天然の単離された化合物でありうる。 
【００９６】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は多量体化された形である。
【００９７】
たとえば、ビーズといった粒子状担体と結合したＮｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドの形のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第０３／０１１３１７号パンフレット（ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ））およびロランティス社の同時出願中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１５２５（２００３年４月４日出願）に記載されている（たとえば特にＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１５２５の実施例１７、１８、１９を参照）。
【００９８】
高分子担体と結合したＮｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドの形のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の同時出願中のＰＣＴ出願（２００３年８月１日出願、英国特許第０２１８０６８．５号の優先権を主張）に記載されている（たとえば特に、デキストラン複合体を開示するその実施例５を参照）。 
【００９９】
一形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節のための物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのタンパク質でありうる。
【０１００】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのタンパク質とは、Ｎｏｔｃｈの活性化、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流現象、下流標的遺伝子の転写調節、および他の非転写的下流現象（たとえば既存のタンパク質の翻訳後修飾）を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体を介したシグナル伝達に関与する分子を意味する。より具体的には、タンパク質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子の活性化を可能にするドメイン、またはそれをコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。 
【０１０１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の非常に重要な成分は、Ｎｏｔｃｈ受容体／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用である。このようにＮｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈリガンドまたは受容体またはそれらの結果として生じる切断産物の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路膜タンパク質またはＧ−タンパク質、またはプロテアーゼ、キナーゼ（たとえばセリン／スレオニンキナーゼ）、ホスファターゼ、リガーゼ（たとえばユビキチンリガーゼ）またはグリコシルトランスフェラーゼといったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路酵素の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。代替的にシグナル伝達は、転写因子といったＤＮＡ結合配列の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。
【０１０２】
本発明では、Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達は好ましくは特異的シグナル伝達を意味し、シグナル伝達が、サイトカインシグナル伝達といった何らかの他の顕著な干渉するかまたは競合する原因でなく、実質的に、または少なくとも主に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路から、および好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用から結果として生じることを意味する。好ましくはしたがってここで用いられる「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達」の語は、サイトカインシグナル伝達を除外する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を下記により詳細に説明する。 
【０１０３】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
【０１０４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達
Ｎｏｔｃｈ依存性転写活性化の主要な標的は、Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ複合体遺伝子（Ｅ[ｓｐｌ]）である。さらにこれらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接の標的であること、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達に反応して転写活性化されることが示されている。哺乳類Ｓｕ（Ｈ）ホモログＣＢＦ１と相互作用してそれを転写抑制因子から転写活性化因子へ変換するウイルスコアクチベータータンパク質であるＥＢＮＡ２との類推によって、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と共同して、Ｓｕ（Ｈ）と結合してＳｕ（Ｈ）がＥ（ｓｐｌ）および他の標的遺伝子の転写を活性化することを可能にする活性化ドメインに寄与しうる。Ｓｕ（Ｈ）はすべてのＮｏｔｃｈ依存性の決定に必要ではないこともまた注目すべきであり、これは、Ｎｏｔｃｈが他のＤＮＡ結合性転写因子と結合することによって、または細胞外シグナルを伝達する他の機構を用いることによって、一部の細胞運命選択を媒介することを示す。
【０１０５】
本発明の一態様によると、活性物質はＮｏｔｃｈ、またはＮｏｔｃｈのシグナル伝達能力を保持するその断片、またはＮｏｔｃｈのシグナル伝達能力を有するＮｏｔｃｈのアナログであることができる。
【０１０６】
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈのアナログ」の語は、Ｎｏｔｃｈのシグナル伝達能力を保持しているその変異体を含む。「アナログ」には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達能力を持つが、一般的にＮｏｔｃｈとは異なる進化的起源を有するタンパク質を含める。Ｎｏｔｃｈのアナログは、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０、またはＬＭＰ２Ａといった、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質を含む。
【０１０７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのタンパク質で、我々はＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の任意の１つ以上の成分を活性化することができる分子を意味する。
【０１０８】
一実施形態では、活性物質は、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈリガンドをコードするポリヌクレオチドでありうる。本発明で有用であるＮｏｔｃｈリガンドは、典型的にはたとえば造血幹細胞といったさまざまな哺乳類細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドと結合することができる内因性Ｎｏｔｃｈリガンドを含む。
【０１０９】
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈリガンド」の語は、Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して生物学的効果を生じることができる物質を意味する。ここで用いられるその語はしたがって、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ（たとえば哺乳類リガンドＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２およびホモログ）といった天然に存在するタンパク質リガンド（たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、脊椎動物、哺乳類由来）およびその生物学的に活性な断片およびＮｏｔｃｈ受容体に対する抗体、およびペプチドミメティック、天然リガンドに対して対応する生物学的作用を有する抗体および小分子を含む。好ましくはＮｏｔｃｈリガンドはＮｏｔｃｈ受容体と結合によって相互作用する。
【０１１０】
現在までに同定された哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの具体例は、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａまたはＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））；Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））およびＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ_０１６９４１−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））および米国特許第６１２１０４５号明細書（ミレニアム社（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ））、Ｄｅｌｔａ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４３８９４およびＡＦ２５３４６８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））；およびＳｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１およびＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７３４号パンフレット）Ｊａｇｇｅｄ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ７３９３６−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））およびＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＬＡＧ−２を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
【０１１１】
一実施形態では、活性化因子は構成的に活性であるＮｏｔｃｈ受容体またはＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン、またはそのような受容体または細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドであることができる。
【０１１２】
別の一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化因子はＮｏｔｃｈ受容体の下流で作用する。したがって、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化因子は構成的に活性であるＤｅｌｔｅｘポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることができる。
【０１１３】
本発明で有用であるＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の他の下流成分は、好ましくは構成的に活性な型での、Ｄｅｌｔｅｘによって触媒されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）といったＮｏｔｃｈのタンパク質分解切断に関与するポリペプチド、およびＮｏｔｃｈ標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチドを含む。
【０１１４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのポリペプチドとは、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として発現する任意のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの発現に関与する任意のポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意味する。
【０１１５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害のためのタンパク質またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドで、我々はＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の任意の１つ以上の成分、を阻害することができる分子を意味する。
【０１１６】
特定の一実施形態では、その分子はＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンド発現を低下または阻害することができる可能性がある。そのような分子はＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンド発現を低下または阻害することができる核酸配列でありうる。
【０１１７】
別の一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はＮｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節することができる分子でありうる。ある分子は、好ましくは治療的有効性を提供するのに十分な程度に、リガンドとのＮｏｔｃｈの相互作用を促進または阻害することができる場合、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節すると考えられる。
【０１１８】
好ましくは、阻害因子が受容体または受容体をコードする核酸配列である場合、受容体が活性化される。したがって、たとえば、その物質が核酸配列である場合、受容体は好ましくは発現された際に構成的に活性である。
【０１１９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子はまた、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流阻害因子、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現を妨げるかまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路によって抑制される遺伝子の発現を誘導する化合物も含む。そのようなタンパク質の例は、ＤｓｈおよびＮｕｍｂ、およびＮｏｔｃｈＩＣおよびＤｅｌｔｅｘの優性阻害型を含む。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害のためのタンパク質はまた、その存在がシグナル伝達経路を伝達するのでなく遮断するように改変されたＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の野生型成分の変異型も含む。そのような化合物の一例は、細胞内ドメインのタンパク質分解切断が不可能になるように改変されているＮｏｔｃｈ受容体である。
【０１２０】
任意の１つ以上の適当な標的−たとえばアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列−は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を調節することができる化合物および／または標的化分子を同定するために、さまざまな医薬スクリーニング技術の任意のものにおいて、用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液中で遊離しているか、固体担体上に付加されているか、細胞表面上に保持されているか、または細胞内に位置することができる。
【０１２１】
医薬スクリーニングのための技術は、ゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）の１９８４年９月１３日公開の欧州特許第０１３８８５５号明細書に記載の方法に基づくことができる。要約すると、多数の異なる小ペプチド候補調節因子または標的化分子が、プラスチックピンまたは何らかの他の表面といった固体基材上に合成される。ペプチド被験化合物を適当な標的またはその断片と反応させ洗浄する。結合物をその後に、たとえば本分野でよく知られた方法を適当に当てはめることによって、検出する。精製された標的はまた、医薬スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接被覆することができる。高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）用に有用であるプレートは、好ましくは９６、３８４、または３８４を超えるウェル／プレートを有するマルチウェルプレートとなる。細胞はまた、「芝生状(lawns)」として広げることができる。代替として、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉して固体担体上に固定化することができる。高処理量スクリーニングを、合成化合物について上述したように、有機候補調節因子および標的化分子を同定するために用いることができる。
【０１２２】
本発明はまた、標的と結合することができる中和抗体が、標的との結合について特異的に被験化合物と競合する、競合医薬スクリーニング分析も考慮する。
【０１２３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の成分と結合することができる抗体、ペプチドミメティックおよび小有機分子といった物質のスクリーニングおよび開発のための技術は本分野でよく知られている。これらは、シグナル伝達タンパク質を発現するためのファージディスプレイ系の使用、およびトランスフェクションした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその他の微生物の培養を用いて結合化合物候補の結合試験のためのタンパク質を産生することを含む（たとえば、Ｇ．セサリーニ（Ｃｅｓａｒｉｎｉ），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３０７（１）；６６−７０ （Ｊｕｌｙ １９９２）；Ｈ．グラム（Ｇｒａｍ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１６１；１６９−１７６ （１９９３）；およびＣ．サマー（Ｓｕｍｍｅｒ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９；３７５６−３７６０ （１９９２年５月）を参照）。他のライブラリおよびスクリーニング技術は、たとえば、米国特許第６２８１３４４号明細書（ファイロス（Ｐｈｙｌｏｓ））に記載されている。
【０１２４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達およびＮｏｔｃｈ受容体活性化
Ｎｏｔｃｈはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で、２つの異なるリガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅについての受容体として機能する膜貫通タンパク質として最初に記載された。脊椎動物は複数のＮｏｔｃｈ受容体およびリガンドを発現する（下記で考察）。少なくとも４種類のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、およびＮｏｔｃｈ−４）が現在までにヒト細胞で同定されている（たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３０８６０２，ＡＦ３０８６０１およびＵ９５２９９−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を参照）。
【０１２５】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は単一のポリペプチド前駆体として合成され、フリン様転換酵素による切断を受けて２つのポリペプチド鎖を生じ、それがさらにプロセシングされて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体は２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解産物のヘテロ二量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部から成るＮ末端断片、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化する、Ｎｏｔｃｈのタンパク質分解による切断段階は、ゴルジ装置で起こり、フリン様転換酵素によって媒介される。
【０１２６】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、最大３６個の上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復[Ｎｏｔｃｈ１／２＝３６、Ｎｏｔｃｈ３＝３４、およびＮｏｔｃｈ４＝２９]、３個のシステインリッチ反復（Ｌｉｎ−Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）反復）を含む細胞外ドメイン、および細胞質ドメインを含む１個の膜貫通サブユニットを含むヘテロ二量体分子として膜に付着している。Ｎｏｔｃｈの細胞質ドメインは６個のアンキリン様反復、１個のポリグルタミン鎖（ＯＰＡ）および１個のＰＥＳＴ配列を含む。ＲＡＭ２３という別の１個のドメインがアンキリン反復の近位側に存在し、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではＨａｉｒｌｅｓｓ抑制因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ）[Ｓｕ（Ｈ）]、脊椎動物ではＣＢＦ１として知られる転写因子との結合に関与している（タムラ（Ｔａｍｕｒａ）Ｋ，他（１９９５） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５ ；１４１６−１４２３（ＴＡＭＵＲＡ））。Ｎｏｔｃｈリガンドはまた、複数のＥＧＦ様反復を細胞外ドメイン中に、すべてのＮｏｔｃｈリガンドに特徴的であるシステインに富むＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ Ｌａｇ２）ドメインと共に示す（アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他 （１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８；２２５−２３２，アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４；７７０−７７６）。
【０１２７】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅといった細胞外リガンドの、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインのＥＧＦ様反復との結合によって活性化される。Ｄｅｌｔａは活性化のために時に切断を必要としうる。ＤｅｌｔａをＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼであるクズバニアン（Ｋｕｚｂａｎｉａｎ）によって細胞表面で切断することができ、その切断現象はＤｅｌｔａの可溶性の活性型を放出する。ヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発がん性変異体、別名ＴＡＮ−１は、短縮された細胞外ドメインを持つが、構成的に活性であり、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
【０１２８】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を媒介する。非常に顕著なことに、ｃｄｃ１０／アンキリン反復は、サプレッサー・オブ・ヘアレス(Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ)[Ｓｕ（Ｈ）]と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｂ細胞のエプスタイン・バーウイルス誘導性不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質であるＣ−プロモーター結合因子−１[ＣＢＦ−１]のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログである。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）はｃｄｃ１０／アンキリン反復と細胞質中で結合し、隣接する細胞上のリガンドであるＤｅｌｔａとのＮｏｔｃｈ受容体の相互作用の際に、核へ移動することが示されている。Ｓｕ（Ｈ）はいくつかの遺伝子のプロモーター中に見出される応答配列を含み、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路において重要な下流タンパク質であることが見出されている。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Ｈａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている。
【０１２９】
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）はまた、直接の核機能を有する（リーバー（Ｌｉｅｂｅｒ）他（１９９３）Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ ７（１０）；１９４９−６５ （Ｌｉｅｂｅｒ））。近年の研究は実際に、Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６個のｃｄｃ１０／アンキリン反復が核に到達し転写活性化に参加することを必要とすることを示している。Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部のタンパク質分解切断部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間と同定されている（部位３、またはＳ３という）（シュレーター（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ），Ｅ．Ｈ．他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８３）；３８２−６（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ））。核への進入のためにｃｄｃ１０／アンキリン反復を放出するタンパク質分解切断段階は、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）活性に依存すると考えられている。
【０１３０】
細胞内ドメインは核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリータンパク質であるＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ，Ｓｕ（Ｈ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ではＬａｇ−２）と転写活性化因子複合体を形成することが示されている（シュレーター（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）；シュトルール（Ｓｔｒｕｈｌ），Ｇ．他 （１９９８） Ｃｅｌｌ ９３（４）；６４９−６０ （Ｓｔｒｕｈｌ））。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体はその後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｋｅ）１および５といった標的遺伝子を活性化する（ワインマスター（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）Ｇ．（２０００） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０；３６３−３６９ （ＷＥＩＮＭＡＳＴＥＲ））。このＮｏｔｃｈの核機能はまた、哺乳類Ｎｏｔｃｈホモログについても示されている（ルー（Ｌｕ），Ｆ．Ｍ．他（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３（１１）；５６６３−７ （Ｌｕ））。
【０１３１】
Ｓ３プロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に反応してのみ生じる。初期のＮｏｔｃｈ受容体のゴルジにおける翻訳後修飾（ムンロー（Ｍｕｎｒｏ）Ｓ，フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）Ｍ．（２０００） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０；８１３−８２０ （Ｍｕｎｒｏ）；ユー（Ｊｕ）ＢＪ，他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０５；１９１−１９５ （Ｊｕ））は、少なくとも部分的に、２種類のリガンドのどちらが細胞表面上に発現されるかを調節するように見える。Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｌｉｎ／Ｎｏｔｃｈモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ（Ｆｒｉｎｇｅ）によって細胞外ドメインで修飾される。フリンジは、Ｏ−結合型フコース基をＥＧＦ様反復に付加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ＤＪ，他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６；３６９−３７５ （Ｍｏｌｏｎｅｙ）、ブルッカー（Ｂｒｕｃｋｅｒ）Ｋ，他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６；４１１−４１５ （Ｂｒｕｃｋｅｒ））。フリンジによるこの修飾はリガンド結合を妨げないが、リガンドに誘導されるＮｏｔｃｈにおける立体構造変化に影響しうる。さらに、近年の研究は、フリンジの作用はＮｏｔｃｈを修飾してＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドと機能性に相互作用することを妨げるが、優先的にＤｅｌｔａと結合することを可能にすることを示唆する（パニン（Ｐａｎｉｎ）ＶＭ，他 （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７；９０８−９１２ （Ｐａｎｉｎ）、ヒックス（Ｈｉｃｋｓ）Ｃ，他 （２０００） Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２；５１５−５２０ （Ｈｉｃｋｓ））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は単一のフリンジ遺伝子を持つが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Ｒａｄｉｃａｌ，ＭａｎｉｃおよびＬｕｎａｔｉｃ Ｆｒｉｎｇｅｓ）（アーヴィン（Ｉｒｖｉｎｅ）ＫＤ （１９９９） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．９；４３４−４４１ （Ｉｒｖｉｎｅ））。
【０１３２】
Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル伝達は、２つの異なる経路を介して起こりうる（たとえば図１を参照）。よりよく定義された経路は、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）のタンパク質分解切断を含み、ＮｏｔｃｈＩＣは核へ移動して、ＣＳＬファミリータンパク質のＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ，Ｓｕ（Ｈ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ではＬａｇ−２）と転写活性化因子複合体を形成する。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体はその後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｋｅ）１および５といった標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈはまた、タンパク質Ｄｅｌｔｅｘを含む細胞質亜鉛フィンガーが関与するＣＢＦ１−非依存的な方法でシグナル伝達することができる。ＣＢＦ１とは異なり、ＤｅｌｔｅｘはＮｏｔｃｈ活性化後に核へ移動しないが、Ｇｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節することができる。
【０１３３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子は、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓファミリーの遺伝子（特にＨｅｓ−１）、Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ[Ｅ（ｓｐｌ）]複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４およびＤｌｌ−１を含む。
【０１３４】
Ｄｅｌｔｅｘは、細胞内ドッキングタンパク質であり、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部との相互作用部位から離れる際にＳｕ（Ｈ）と置き換わる。Ｄｅｌｔｅｘは亜鉛フィンガーを含む細胞質タンパク質である（アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８；２２５−２３２；アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４；７７０−７７６；オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）Ｂ，ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）Ｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１；６５３−６６３ （Ｏｓｂｏｒｎｅ））。ＤｅｌｔｅｘはＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアンキリン反復と相互作用する。ＤｅｌｔｅｘはＧｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節することにより、Ｎｏｔｃｈ経路活性化を促進することを研究が示している（マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）他（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１（８）；２６３３−４４；マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）Ｋ，他（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９；７４−７８）。Ｄｅｌｔｅｘはまた、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部と結合することを妨げるドッキングタンパク質として作用する（マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ））。このように、Ｓｕ（Ｈ）は核内へ放出され、そこで転写調節因子として作用する。近年の証拠はまた、脊椎動物Ｂ細胞系において、Ｓｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１でなくＤｅｌｔｅｘが、Ｅ４７機能の阻害を担っていることを示唆する（オルデントリッヒ（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ）他（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８；２２３０−２２３９ （Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ））。Ｄｅｌｔｅｘの発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として、正のフィードバックループによってアップレギュレートされる。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｄｅｌｔｅｘ（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５３７００に見出される。
【０１３５】
ＨＥＳ−１（ＨＡＩＲＹ−ＥＮＨＡＮＣＥＲ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ−１）（タケバヤシ（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ）Ｋ．他（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（７）；１５０−６ （Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ））は、へリックス−ループ−へリックスの基本構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１はＣＤ４サイレンサー中の重要な機能部位と結合し、ＣＤ４遺伝子発現の抑制に結びつく。このように、Ｈｅｓ−１はＴ細胞運命の決定に強力に関与している。Ｈｅｓファミリーからの他の遺伝子は、Ｎｏｔｃｈ活性化によってもまた発現がアップレギュレートされるＨｅｓ−５（Ｓｐｌｉｔホモログの哺乳類エンハンサー）、およびＨｅｓ−３を含む。Ｈｅｓ−１の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｈｅｓ−１の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１６４６４に見出される。
【０１３６】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体[Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ]（ライマイスター（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ）Ｃ．他（１９９９）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ８５（１−２）；１７３−７ （Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ））は７個の遺伝子を含み、そのうちＥ（ｓｐｌ）およびＧｒｏｕｃｈｏだけが突然変異により目に見える表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）はＳｐｌｉｔ突然変異を促進する能力に因んで命名され、ＳｐｌｉｔはＮｏｔｃｈの別名である。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子はａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体遺伝子発現の調節を介してＤｅｌｔａを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。
【０１３７】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン産生を抑制することができる、Ｔｈ２細胞によって産生される因子としてマウスで最初に特徴づけられた。その後、ＩＬ−１０はマクロファージ、ケラチノサイト、Ｂ細胞、Ｔｈ０細胞、およびＴｈ１細胞を含む多数の他の細胞型によって産生されることが示された。ＩＬ−１０は、現在はウイルスＩＬ−１０と表されるエプスタイン−バーｂｃｒｆ１遺伝子と大きなホモロジーを示す。いくつかの免疫刺激効果が報告されているが、ＩＬ−１０は主に免疫抑制性サイトカインと考えられている。Ｔ細胞応答のＩＬ−１０による阻害は、抗原提示細胞の付帯機能の低下を通じて主に媒介される。ＩＬ−１０は特に、マクロファージによる数々の炎症促進性サイトカインの産生を抑制すること、および共刺激分子およびＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害することが報告されている。ＩＬ−１０はまた、好中球および好酸球といった他の骨髄細胞に対して抗炎症作用を発揮する。Ｂ細胞に対しては、ＩＬ−１０はアイソタイプ転換および増殖に影響する。より近年に、ＩＬ−１０は調節Ｔ細胞の誘導において、およびその抑制作用の可能な媒介因子として、役割を果たすことが報告された。ＩＬ−１０がＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の直接の下流の標的かどうかは不明であるが、その発現はＮｏｔｃｈ活性化と一致して強くアップレギュレートされることが見出されている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ整理番号ＧＩ１０４１８１２に見出される。
【０１３８】
ＣＤ−２３は、Ｂ細胞活性化および増殖のための重要な分子であるヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）である。ＣＤ−２３はＩｇＥに対する低親和性受容体である。さらに、短縮型分子を分泌することができ、その後、強力な細胞分裂誘起性増殖因子として機能する。ＣＤ−２３の配列はＧｅｎＢａｎｋ整理番号ＧＩ１７８３３４４に見出される。 
【０１３９】
ＣＴＬＡ４(Ｔリンパ球活性化タンパク質４）は、Ｔ細胞の表面上に見出される付属分子であり、気道炎症細胞動員の調節およびアレルゲン吸入後のＴヘルパー細胞分化に役割を果たすと考えられている。ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子のプロモーター領域はＣＢＦ１応答配列を有し、その発現はＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ４の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１５００６に見出される。
【０１４０】
Ｄｌｘ−１（ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ−１）（マクギネス（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ）Ｔ．他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅｓ ３５（３）；４７３−８５ （ＭｃＧｕｉｎｅｓｓ））発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１０００−３に見出される。
【０１４１】
ＣＤ−４発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。ＣＤ−４抗原の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ００６９６６に見出される。
【０１４２】
上記の通り、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーは、Ｔ細胞運命決定に影響する細胞−細胞シグナル伝達現象に関与する。このシグナル伝達において、ＮｏｔｃｈＩＣは核に局在化し、活性化された受容体として機能する。哺乳類ＮｏｔｃｈＩＣは転写抑制因子ＣＢＦ１と相互作用する。ＮｏｔｃｈＩＣ ｃｄｃ１０／アンキリン反復はこの相互作用に必須であると提案されている。シェ（Ｈｓｉｅｈ）他 （Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６（３）；９５２−９５９）は、マウスＮｏｔｃｈＩＣのＮ末端１１４アミノ酸領域はＣＢＦ１相互作用ドメインを含むとさらに示している。また、ＮｏｔｃｈＩＣは核内のＤＮＡに結合したＣＢＦ１を標的にし、抑制ドメインの遮蔽によりＣＢＦ１媒介抑制を止めることによって作用すると提案されている。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）不死化タンパク質ＥＢＮＡもまた、ＣＢＦ１拘束および抑制の遮蔽を利用して、ＣＢＦ１に抑制されたＢ細胞遺伝子の発現をアップレギュレートすることが知られている。このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の模倣が、ＥＢＶに導かれる不死化に関与する。ストローブル（Ｓｔｒｏｂｌ）ら（Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４（４）；１７２７−３５）は、同様に「ＥＢＮＡ２はしたがって、活性化されたＮｏｔｃｈ受容体の機能的同等物とみなしうる」ことを報告する。このカテゴリに入る他のＥＢＶタンパク質は、ＢＡＲＦ０（クサノ（Ｋｕｓａｎｏ）およびラーブ・トルアブ（Ｒａａｂ−Ｔｒｕａｂ）（２００１） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５（１）；３８４−３９５ （Ｋｕｓａｎｏ ａｎｄ Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ））およびＬＭＰ２Ａを含む。
【０１４３】
Ｎｏｔｃｈリガンドおよびホモログ
上記の通り、現在までに同定された哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの例は、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））およびＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｓｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１およびＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７３４号パンフレット）、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＬＡＧ−２を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。 
【０１４４】
「ホモログ」によって、たとえば上述のような既知のＮｏｔｃｈリガンドのうち任意の１つと、アミノ酸または核酸配列ホモロジーのどちらかである配列ホモロジーを示す遺伝子産物を意味する。典型的には、既知のＮｏｔｃｈリガンドのホモログは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、適切には少なくとも１００個のアミノ酸、またはＮｏｔｃｈリガンドの全長の配列にわたって、少なくとも２０%、好ましくは少なくとも３０%、対応する既知のＮｏｔｃｈリガンドとアミノ酸レベルで同一である。２つ以上のアミノ酸または核酸配列の間の配列ホモロジーを計算するための技術およびソフトウェアは本分野でよく知られている（たとえばｈｔｔｐ；／／ｗｗｗ．ＮＣＢＩ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖおよびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，『分子生物学の最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９５）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を参照）。
【０１４５】
上記の通り、現在までに同定されたＮｏｔｃｈリガンドは、タンパク質のアミノ末端に２０ないし２２アミノ酸を含む診断的なＤＳＬドメインを（Ｄ＝Ｄｅｌｔａ、Ｓ＝Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌ＝Ｌａｇ２）、および細胞外表面上に１６まで、またはそれ以上のＥＧＦ様反復を有する。したがって、Ｎｏｔｃｈリガンドのホモログはまた、Ｎ末端にＤＳＬドメインを、および細胞外表面上に１６まで、またはそれ以上のＥＧＦ様反復を含むことが好ましい。 
【０１４６】
加えて、適当なホモログは好ましくはＮｏｔｃｈ受容体と結合する能力がある。結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合測定法を含む、本分野で既知であるさまざまな技術によって評価することができ、また受容体の活性化（作用因子または部分作用因子の場合）は、たとえば、本文書の実施例および、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット（ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ））に記載された通りの測定法の使用によって測定することができる。 
【０１４７】
Ｎｏｔｃｈリガンドのホモログは、いくつかの方法によって、たとえばゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリを、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする核酸のすべてまたは一部を含むプローブを用いて、中等度または高度に厳密な条件下で（たとえば０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃ないし約６０℃にて）プロービングすることによって同定することができる。代替として、ホモログはまた、保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログの中の配列を標的とするように設計されたプライマーを一般的に使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。そのプライマーは１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いた配列クローニングに使用されるよりも低い厳密条件下で用いられる。
【０１４８】
ポリペプチド物質は、哺乳類細胞から精製するか、適当な宿主細胞における組み換え発現によって得るか、または購入することができる。代替として、当該ポリペプチドをコードする核酸構造を用いることができる。別の一例として、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅといったＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンドの過剰発現は、ＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａ遺伝子といった内因性遺伝子を活性化することができる核酸構造の導入によって引き起こすことができる。特に、遺伝子活性化は、標的細胞のゲノム中のＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａプロモーターといった天然プロモーターの代わりに異種プロモーターを挿入する、相同組み換えの利用によって達成することができる。
【０１４９】
本発明の活性化する分子は、別の一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ−タンパク質発現または細胞膜上の提示またはシグナル伝達経路を修飾することができる可能性がある。標的細胞表面上の完全に機能するＮｏｔｃｈ−タンパク質の提示を促進する物質は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＫｕｚｂａｎｉａｎ遺伝子の産物といったマトリクスメタロプロテイナーゼ（ドクツ（Ｄｋｕｚ）他（１９９７）Ｃｅｌｌ ９０；２７１−２８０ （Ｄｋｕｚ））および他のＡＤＡＭＡＬＹＳＩＮ遺伝子ファミリーメンバーを含む。
【０１５０】
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
上記で考察した通り、Ｎｏｔｃｈ リガンドは典型的にはいくつかの特徴的なドメインを含む。さまざまな天然に存在するヒトＮｏｔｃｈリガンドについての一部の予想／候補ドメイン位置（前駆タンパク質中のアミノ酸番号付けに基づく）を下記に示す：
【０１５１】
【表１】
2006507240.tif 000002
【０１５２】
【表２】
2006507240.tif 000003
【０１５３】
【表３】
2006507240.tif 000004
【０１５４】
【表４】
2006507240.tif 000005
【０１５５】
【表５】
2006507240.tif 000006
【０１５６】
ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる：
【化１】
2006507240.tif 000007
【０１５７】
好ましくはＤＳＬドメインは下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる：
【化２】
2006507240.tif 000008
ここで：
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはヒスチジンといった芳香族アミノ酸残基である；
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンといった非極性アミノ酸残基である；
ＢＡＳは、アルギニンまたはリジンといった塩基性アミノ酸残基である；および
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンといった酸またはアミドアミノ酸残基である。
【０１５８】
好ましくはＤＳＬドメインは下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる：
【化３】
2006507240.tif 000009
（ここでＸａａは任意のアミノ酸であることができ、Ａｓｘはアスパラギン酸またはアスパラギンのどちらかである）。
【０１５９】
さまざまな起源に由来するＮｏｔｃｈリガンドからのＤＳＬドメインの整列を図３に示す。
【０１６０】
使用するＤＳＬドメインは、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０１６１】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６２】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６３】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６４】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６５】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６６】
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含む、さまざまなタンパク質、およびＥＧＦおよびＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドで見つかっている（フュリーおよびフュリー（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ），１９８８，Ｃｅｌｌ ５３；５０５−５１８）。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸといった細胞外タンパク質で（リーズ（Ｒｅｅｓ）他，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．７；２０５３−２０６１；フュリーおよびフュリー（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ），１９８８，Ｃｅｌｌ ５３；５０５−５１８）、他のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子で（クヌースト（Ｋｎｕｓｔ）他，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ．７６１−７６６；ロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）他，１９８８，Ｃｅｌｌ ５５；１０４７−１０５９）、およびトロンボモジュリン（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）他，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６；１８９１−１８９７）およびＬＤＬ受容体（ズドホフ（Ｓｕｄｈｏｆ）他，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８；８１５−８２２）といった一部の細胞表面受容体タンパク質で見つかっている。タンパク質結合部位が、トロンボモジュリンおよびウロキナーゼ中のＥＧＦ反復ドメインにマッピングされている（クロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）他，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３；５９９３−５９９６；アペラ（Ａｐｐｅｌｌａ）他，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２；４４３７−４４４０）。 
【０１６７】
ＰＲＯＳＩＴＥによって報告された通り、典型的なＥＧＦドメインは、（ＥＧＦにおいて）ジスルフィド結合に関与すると示されている６個のシステイン残基を含みうる。主構造は、二本鎖のβ−シートに続くループとその後のＣ末端の短い二本鎖のシートであると提案されているが必ずしも必要ではない。保存されたシステインの間のサブドメインは、典型的なＥＧＦ様ドメインの下記の模式図に示す通り、長さが大きく異なる；
【化４】
2006507240.tif 000010
ここで；
’Ｃ’；ジスルフィド結合に関与する保存されたシステイン。
’Ｇ’；しばしば保存されたグリシン
’ａ’；しばしば保存された芳香族アミノ酸
’ｘ’；任意の残基
５番目と６番目のシステインの間の領域は、２個の保存されたグリシンを含み、そのうち少なくとも１個は大部分のＥＧＦ様ドメイン中に通常存在する。
【０１６８】
使用するＥＧＦ様ドメインは、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはＥＧＦ様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０１６９】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７０】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７１】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７２】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７３】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７４】
実際問題として、任意の特定のアミノ酸配列が別の配列と少なくともＸ%同一であるかどうかは、従来は既知のコンピュータープログラムを用いて決定することができる。たとえば、クエリー配列と対象配列との間の最良の全体の一致は、全体配列整列ともいうが、ブルトラグ（Ｂｒｕｔｌａｇ）他（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６；２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムといったプログラムを用いて決定することができる。配列整列では、クエリー配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは、両方ともアミノ酸配列である。全体配列整列の結果は、パーセント同一性として与えられる。
【０１７５】
「ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン」の語は、Ｎｏｔｃｈリガンド配列の、Ｎ末端からＤＳＬドメインの開始までの部分を意味する。この語は天然に存在するドメインに対応する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、およびミメティックを含むことが理解される。
【０１７６】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７７】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７８】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７９】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８０】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８１】
ここで用いられる「異種アミノ酸配列」または「異種ヌクレオチド配列」の語は、天然の配列またはそのコード配列には見出されない配列を意味する（たとえばＮｏｔｃｈリガンド配列の場合には、天然のＮｏｔｃｈリガンド配列には見出されない）。典型的には、たとえば、そのような配列は、ＩｇＦｃドメイン、またはＶ５Ｈｉｓタグといったタグでありうる。
【０１８２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害のためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体またはＮｏｔｃｈリガンドと相互作用し、好ましくは結合して、内因性Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用（「Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用」ともいう）に干渉するが受容体を活性化しない、または活性化するが内因性Ｎｏｔｃｈリガンドよりも程度が低い物質でありうる。そのような物質は、「Ｎｏｔｃｈ拮抗因子」または「Ｎｏｔｃｈ受容体拮抗因子」ということができる。好ましくはその阻害因子はリンパ球およびＡＰＣといった免疫細胞で、好ましくはリンパ球で、好ましくはＴ細胞で、Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用を阻害する。
【０１８３】
適切には、たとえば、一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび１個以上のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。
【０１８４】
代替的に、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、リガンド結合に関与するＮｏｔｃｈ細胞外ドメインの全部または一部、たとえば、好ましくはヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４のＥＧＦドメインに対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有する１個のＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。好ましくは少なくとも２個以上のそのようなＥＧＦドメインが存在する。このような物質は、内因性Ｎｏｔｃｈリガンドと結合することができ、それによってそのようなリガンドによるＮｏｔｃｈ活性化を阻害することができる。 
【０１８５】
たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のそのような阻害因子は、ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、および、ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。
【０１８６】
たとえば、ＩｇＦｃドメインと融合したＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外ドメインを含むさまざまな融合タンパク質／キメラが、たとえばＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能であり、たとえば下記の通り；Ｎｏｔｃｈ−１ラット組み換えラットＮｏｔｃｈ−１／Ｆｃキメラ、（カタログ番号１０５７−ＴＫ−０５０）；Ｎｏｔｃｈ−２組み換えラットＮｏｔｃｈ−２／Ｆｃキメラ、（カタログ番号１１９０−ＮＴ−０５０）；およびＮｏｔｃｈ−３マウス組み換えマウスＮｏｔｃｈ−３／Ｆｃキメラ、（カタログ番号１３０８−ＮＴ−０５０）。
【０１８７】
他のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路拮抗因子／阻害因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の成分間の相互作用を阻害する抗体、たとえばＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈタンパク質）またはＮｏｔｃｈリガンドに対する抗体を含む。
【０１８８】
したがって、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することなくＮｏｔｃｈ受容体と結合する抗体、適切にはヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４と結合する抗体であって、それによって正常なＮｏｔｃｈ−リガンド相互作用に干渉することで、内因性Ｎｏｔｃｈリガンドによる結合した受容体の活性化を低下させるかまたは阻害する抗体でありうる。
【０１８９】
代替として、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、Ｎｏｔｃｈリガンドと結合する抗体、適切にはヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３および／またはＤｅｌｔａ４またはヒトＪａｇｇｅｄ１および／またはＪａｇｇｅｄ２と結合する抗体であって、それによって正常なＮｏｔｃｈ−リガンド相互作用に干渉することで、結合したリガンドの内因性Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用を低下させるかまたは阻害する抗体でありうる。
【０１９０】
たとえば、ＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドに対する抗体は、米国特許第５６４８４６４号明細書、米国特許第５８４９８６９号明細書、および米国特許第６００４９２４号明細書（エール大学／インペリアル・キャンサー・テクノロジー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））に記載されており、その本文は参照により本開示に含まれる。
【０１９１】
Ｎｏｔｃｈ受容体に対して作製された抗体もまた、国際公開第００２０５７６号パンフレット（その本文は参照により本開示に含まれる）に記載されている。たとえば、この文書はヒトＮｏｔｃｈ−１ ＥＧＦ様反復１１および１２に対する抗体の作製を開示する。たとえば、特定の実施形態で、国際公開第００２０５７６号パンフレットは、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５４を有しＡ６で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５６を有しＣｌｌで表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、およびＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５５を有しＦ３で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体を開示する。
【０１９２】
抗ヒト−Ｊａｇｇｅｄ１抗体はＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）から整理番号ＭＡＢ１２７７１（クローン１８８３２３）として入手可能である。
【０１９３】
適当な核酸配列は、アンチセンス構造、たとえばアンチセンスＮｏｔｃｈリガンド構造およびＮｏｔｃｈリガンド発現のアップレギュレーターの発現を低下または阻害するように設計されたアンチセンス構造をコードする核酸配列を含みうる（上記参照）。アンチセンス核酸は合成一本鎖ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチドであることができる。しかし、より好ましくは、アンチセンスは遺伝子ベクターの導入の結果として患者自身の細胞で産生されたアンチセンスＲＮＡである。ベクターは、宿主細胞へのベクターの導入に際して、目的の特異性のアンチセンスＲＮＡの産生を担う。
【０１９４】
好ましくは、本発明における用途のための核酸配列は、ＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａ、好ましくはＳｅｒｒａｔｅ１およびＳｅｒｒａｔｅ２、同様にＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３およびＤｅｌｔａ４発現を、樹状細胞といったＡＰＣにおいて阻害することができる。特に、その核酸配列は、ＡＰＣｓまたはＴ細胞においてＳｅｒｒａｔｅ発現を阻害できるがＤｅｌｔａ発現は阻害できない、または、Ｄｅｌｔａ発現を阻害できるがＳｅｒｒａｔｅ発現は阻害できないことがありうる。代替的に、本発明における用途のための核酸配列は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞といったＴ細胞、または、Ｄｅｌｔａを発現する免疫系の他の細胞におけるＤｅｌｔａ発現を阻害することができる（たとえば細胞表面受容体の刺激に反応して）。特に、その核酸配列は、Ｔ細胞においてＤｅｌｔａ発現を阻害することができるがＳｅｒｒａｔｅ発現は阻害できないことがありうる。特に好ましい一実施形態では、その核酸配列はＴ細胞およびＡＰＣの両方でＮｏｔｃｈリガンド発現を阻害することができ、たとえばＡＰＣにおいてＳｅｒｒａｔｅ発現を、およびＴ細胞においてＤｅｌｔａ発現を阻害することができる。
【０１９５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害のための分子はまた、Ｎｏｔｃｈ−タンパク質発現または細胞膜上の提示またはシグナル伝達経路を改変することができるポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドも含む。完全に機能する細胞膜タンパク質としての提示を減少させるかまたはそれに干渉する分子は、ヒドロキサム酸（ｈｙｄｒｏｘｙｍａｔｅ）系阻害因子といったＭＭＰ阻害因子を含むことができる。
【０１９６】
ＮｏｔｃｈとＮｏｔｃｈリガンドとの間の相互作用を低下させるために用いることができる他の物質は、外因性ＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンドまたはその機能性誘導体である。そのようなＮｏｔｃｈリガンド誘導体は、好ましくはＮ末端にＤＳＬドメインを、および好ましくは約１４個までまたはそれ以上、たとえば約３ないし８個のＥＧＦ様反復を細胞外表面上に有する。ｈＪａｇｇｅｄ１のＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ＬＡＧ−２ドメインに対応するペプチド、および、ｈＪａｇｇｅｄ１の細胞外部分の可溶性型を発現しているＣＯＳ細胞由来の上清は、Ｎｏｔｃｈ１の阻害においてＪａｇｇｅｄ１の作用を模倣することが見出された（リー（Ｌｉ））。
【０１９７】
ポリペプチド、タンパク質、およびアミノ酸配列
ここで用いられる「アミノ酸配列」の語は、「ポリペプチド」の語および／または「タンパク質」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「ペプチド」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「タンパク質」の語と同義である。
【０１９８】
「ペプチド」は通常、アミノ酸１０個ないし４０個の長さ、好ましくはアミノ酸１０個ないし３５個の、短いアミノ酸配列をいう。
【０１９９】
アミノ酸配列は適当な起源から調製および単離することができ、または合成によって作製することができ、または組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０２００】
本発明で有用な「タンパク質」の定義内で、問題のタンパク質がその内因性機能の少なくとも１つを保持するような方法で、特定のアミノ酸残基を修飾することができ、そのような修飾タンパク質を「変異体」という。変異体タンパク質は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも一個のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって修飾されうる。
【０２０１】
典型的には、修飾された配列が、必要な標的活性を、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する能力を保持するという条件で、アミノ酸置換を、たとえば１、２または３ないし１０または２０個の置換を行うことができる。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含みうる。
【０２０２】
本発明で有用であるタンパク質はまた、サイレント変異を生じおよび機能的に等価のタンパク質を結果として生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しうる。標的または調節機能が保持される限り、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または残基の両親媒的性質における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行いうる。たとえば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含む；および、同様の親水性値を有する、非荷電の極性頭部基を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【０２０３】
参照を簡略にするために、主要な天然に存在するアミノ酸の１文字記号および３文字記号（およびその対応するコドン）を下記に示す；
【表６】
2006507240.tif 000011
【０２０４】
保存的置換は、たとえば下記の表に従って行うことができる。２列目で同一区分にあり、および好ましくは３列目で同一行にあるアミノ酸は互いに置換が可能である；
【表７】
2006507240.tif 000012
【０２０５】
ここで用いられる「タンパク質」の語は、一本鎖ポリペプチド分子、および個々の構成ポリペプチドが共有または非共有的方法によって結合している複数ポリペプチド複合体を含む。ここで用いられる「ポリペプチド」および「ペプチド」の語は、モノマーがアミノ酸であってペプチドまたはジスルフィド結合を介して結びついているポリマーをいう。サブユニットおよびドメインの語はまた、生物学的機能を有するポリペプチドおよびペプチドをいうことができる。本発明で有用なペプチドは、少なくとも標的またはシグナル伝達調節能力を有する。「断片」はまた変異体でありその語は典型的には、結合測定法で対象であり、その結合相手が既知であるかまたは測定可能な、タンパク質の選択された領域をいう。「断片」はしたがって、完全長ポリペプチドの一部、たとえば長さが約８ないし約１５００アミノ酸、典型的には長さが約８ないし約７４５アミノ酸、好ましくは約８ないし約３００、より好ましくは約８ないし約２００アミノ酸、およびさらにより好ましくは長さが約１０ないし約５０または１００アミノ酸であるアミノ酸配列をいう。「ペプチド」は好ましくはアミノ酸１０個ないし４０個の長さ、好ましくはアミノ酸１０個ないし３５個の、短いアミノ酸配列をいう。
【０２０６】
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発といった標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。挿入を行う場合は、挿入部位の両側に天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域と共に挿入部をコードする合成ＤＮＡ。配列を適当な酵素を用いて切断することができ、合成ＤＮＡを切断部に繋ぐことができるように、隣接領域は、天然に存在する配列中の部位に対応する便利な制限部位を含む。コードされたタンパク質を作製するために、ＤＮＡをその後に本発明にしたがって発現させる。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について本分野で既知である数々の標準技術の単なる例であり、他の既知の技術もまた用いることができる。
【０２０７】
ヌクレオチド配列の変異体もまた作製することができる。そのような変異体は好ましくはコドンが最適化された配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡ安定性、および、したがって遺伝子発現を増大させる方法として本分野で既知である。遺伝子コードの冗長性は、いくつかの異なるコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性があることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、およびセリンはそれぞれ、６種類の異なるコドンによってコードされる。異なる生物はその異なるコドンの使用に優先性を示す。たとえば、ＨＩＶといったウイルスは、多数の稀なコドンを用いる。稀なコドンが対応する一般的に用いられる哺乳類コドンで置換されるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳類標的細胞における当該配列の発現増加を達成することができる。哺乳類細胞およびさまざまな他の生物について、コドン用法表は本分野で既知である。
【０２０８】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
【０２０９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子または抗原／抗原決定基がヌクレオチド配列を含む場合、それは適切には、哺乳類細胞における発現のためにコドンを最適化されたものでありうる。好ましい一実施形態では、そのような配列は全体が最適化されている。
【０２１０】
核酸およびポリヌクレオチド
一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、ポリヌクレオチド、たとえばＤｅｌｔａまたはＳＥＲＲＡＴＥといったＮｏｔｃｈリガンドまたはその活性部分をコードするポリヌクレオチドであることができる。適切には、たとえば、そのようなポリヌクレオチドは、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦドメイン、好ましくは少なくとも３個のＥＧＦドメインをコードすることができる。好ましくはそのポリヌクレオチドはまた、Ｎｏｔｃｈリガンド膜貫通ドメインおよび好ましくはまたＮｏｔｃｈリガンド細胞内ドメインもコードすることができる。
【０２１１】
そのようなポリヌクレオチドは、たとえばＤＮＡワクチン接種などといった従来のＤＮＡ配送手法によって投与することができ、または注射することができ、または他の方法でたとえば針を用いない系によって配送することができる。非ウイルス配送機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物（ＣＦＡｓ）およびその組み合わせを含む。そのような配送機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。
【０２１２】
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも長さ１０塩基で最大１０，０００塩基以上のヌクレオチドの高分子型で、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾形をいう。その語はＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖型、およびタンパク質核酸（ＰＮＡ）といった誘導体化型も含む。
【０２１３】
これらは標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて構築することができる。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであることができ、好ましくはＤＮＡである。ＲＮＡである場合は、操作はｃＤＮＡ中間体を用いて実施することができる。一般的に、第一の領域をコードする核酸配列が調製され、適当な制限部位が５’および／または３’末端に与えられる。便利に配列はｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１９を基礎とするプラスミドベクターといった標準の実験ベクター中で操作される（下記参照）。適当な技術の正確な詳細については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他著の『分子クローニング』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（コールド・スプリング・ハーパー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），１９８９）または同様の標準的参考書を参照することができる。
【０２１４】
第二の領域をコードする核酸は同様に、類似のベクター系において提供することができる。
【０２１５】
核酸の起源は、公表文献または、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータバンクへの参照によって確認することができる。目的の第一または第二の配列をコードする核酸は、起源が材料を提供してくれる場合は学術的起源または商業起源から、または配列データのみが利用可能である場合は適当な配列を合成またはクローニングすることによって、入手することができる。一般的にこれは問題の遺伝子のクローニングを記載する文献情報源を参照することによって行うことができる。
【０２１６】
代替として、利用可能な配列データが限られている場合、または、既知の核酸と相同であるか、でなければ関連した核酸を発現したい場合は、本分野で既知である核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として、典型的な核酸を特徴づけることができる。
【０２１７】
数々の異なるヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明に用いられる同一のタンパク質をコードすることができることが当業者に理解される。加えて、当業者は、通常の技術を用いて、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質に影響しないヌクレオチド置換を行って、標的タンパク質または本発明のＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質が発現される任意の特定の宿主生物のコドン用法を反映することができることが理解される。
【０２１８】
一般的に、本発明で用いられるヌクレオチド配列に関する「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」の語は、結果として生じるヌクレオチド配列がＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子をコードし対応する活性を保持するという条件で、当該配列からまたは当該配列への一個（以上）の核酸の、任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。
【０２１９】
上記に示す通り、配列ホモロジーに関して、好ましくは参照配列に対して少なくとも４０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%のホモロジーが存在する。より好ましくは少なくとも９５%、より好ましくは少なくとも９８%のホモロジーが存在する。ヌクレオチドホモロジー比較は上記の通り実施することができる。好ましい配列比較プログラムは上記のＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムである。初期設定のスコアリングマトリクスは同一のヌクレオチドごとに１０、およびミスマッチごとに−９の一致値を有する。初期設定のギャップ生成失点は−５０であり、初期設定のギャップ延長失点はヌクレオチド当たり−３である。
【０２２０】
本発明はまた、選択的に参照配列、またはその任意の変異体、断片または誘導体、または上記のいずれかの相補鎖とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも長さが１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さが２０、３０、４０または５０ヌクレオチドである。
【０２２１】
ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、「それによって、核酸鎖が相補鎖と塩基対形成により結びつく過程」およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施される増幅の過程を含むものとする。
【０２２２】
ここに示すヌクレオチド配列と、またはその相補鎖と、選択的にハイブリダイズすることができる、本発明で有用であるヌクレオチド配列は、一般的に、ここに示す対応するヌクレオチド配列と、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、たとえば少なくとも４０、６０または１００以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも７５%、好ましくは少なくとも８５または９０%、およびより好ましくは少なくとも９５%または９８%相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、好ましくはそのヌクレオチド配列と少なくとも８０または９０%およびより好ましくは少なくとも９５%相同である、そのヌクレオチド配列と相同な領域を含む。
【０２２３】
「選択的にハイブリダイズ可能な」の語は、プローブとして用いられるヌクレオチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブとハイブリダイズすることが見出されている条件下で用いられることを意味する。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、たとえば、スクリーニングされているｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡライブラリ中に存在する他のヌクレオチド配列のために起こりうる。この現象において、バックグラウンドとはプローブとライブラリの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生じる、標的ＤＮＡとで観察される特異的相互作用よりも強度が１０倍小さい、好ましくは１００倍小さいシグナルのレベルを意味する。相互作用の強度は、たとえば３２Ｐを用いてプローブを放射性標識することによってたとえば測定することができる。
【０２２４】
ハイブリダイゼーション条件は、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）（１９８７，『分子クローニング技術の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に示された通り、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、下記に説明する「厳密性」を与える。
【０２２５】
最大の厳密性は典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じる；高い厳密性はＴｍの約５℃ないし１０℃下で；中等度の厳密性はＴｍの約１０℃ないし２０℃下で；および低い厳密性はＴｍの約２０℃ないし２５℃下で生じる。当業者によって理解される通り、最大厳密性のハイブリダイゼーションを用いて同一のヌクレオチド配列を同定または検出することができる一方、中等度（または低）厳密性ハイブリダイゼーションを用いて類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０２２６】
好ましい一態様では、本発明は、厳密条件下で（たとえば６５℃および０．１ｘＳＳＣ{１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合は、二重鎖の両方の鎖が、個別にまたは組み合わせで、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列もまた本発明の範囲内に含まれることが理解される。 
【０２２７】
ヌクレオチド配列はいくつかの方法で得ることができる。ここに記載された配列の変異体は、たとえばある範囲の起源から作製されたＤＮＡライブラリをプロービングすることによって得ることができる。加えて、他のウイルス／細菌または細胞ホモログ、特に哺乳類細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、および霊長類細胞）で見出される細胞ホモログを得ることができ、そのようなホモログおよびその断片は一般的に、ここで配列一覧中に示された配列と選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリまたはそれから作製されたｃＤＮＡライブラリをプロービングし、そのようなライブラリを、参照ヌクレオチド配列の全部または一部を含むプローブを用いて、中等度ないし高厳密性の条件下でプロービングすることによって得ることができる。同様の検討が、本発明で有用なアミノ酸および／またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。
【０２２８】
変異体および系統／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重(degenerate)ＰＣＲを用いて得ることができる。保存された配列は、たとえば、いくつかの変異体／ホモログに由来するアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。配列の整列は、本分野で既知であるソフトウェアを用いて実施することができる。たとえばＧＣＧウィスコンシン・パイルアップ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐ）プログラムは広く用いられている。縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つ以上の縮重部位を含み、既知の配列に対する単一の配列プライマーを使用する配列クローニングに用いられるよりも低い厳密性条件で用いられる。
【０２２９】
代替として、そのようなヌクレオチド配列は、特徴づけられた配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえば、ヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞についてコドン優先性を最適化するため、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされるＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の活性を変化させるため、他の配列変化が望まれる可能性がある。
【０２３０】
本発明で有用であるＤＮＡポリヌクレオチドといったヌクレオチド配列は、組み換えによって、合成によって、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。配列はまた標準的技術によってクローニングすることができる。一般的に、プライマーは、目的の核酸配列の、一度にヌクレオチド一個の段階的製法を含む合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は本分野で容易に利用可能である。
【０２３１】
より長いヌクレオチド配列は、一般的に組み換え手段を用いて、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて作製される。これは、クローニングを望む標的配列の領域に隣接する一対のプライマー（たとえば約１５ないし３０ヌクレオチドの）を作製し、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、目的領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、増幅された断片を単離し（たとえばアガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）、増幅されたＤＮＡを回収することを含む。増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターへクローニングすることができるように、プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。より大きな遺伝子については、この方法で一部を別々にクローニングし、その後に繋いで完全な配列を形成することができる。
【０２３２】
タンパク質およびポリペプチド発現
組み換え産生のためには、宿主細胞を遺伝子操作して発現系または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はデービス（Ｄａｖｉｓ）他およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他といった多数の標準的な実験手引書に記載された通りの、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染といった方法によって実施することができる。そのような方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで薬物配送系として使用することもできることが理解される。
【０２３３】
適当な宿主の代表的な例は、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞といった細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞といった真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞といった昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞といった動物細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞といったＴ細胞株；Ａ２０細胞といったＢ細胞株；および植物細胞を含む。
【０２３４】
本発明で有用なポリペプチドを産生するためには、幅広い発現系を用いることができる。そのようなベクターは、中でも、染色体由来、エピソーム由来、およびウイルス由来ベクター、たとえば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入配列由来、酵母染色体配列由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０といったパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、オーエスキー病ウイルスおよびレトロウイルスといったウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファージミドといったプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子に由来するもののようなその組み合わせに由来するベクターを含む。発現系構造は、発現を調節すると共に引き起こす調節領域を含むことができる。一般的に、ポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現するためにおよび／または宿主においてポリペプチドを発現するために適当な任意の系またはベクターを、この際に発現のために用いることができる。適当なＤＮＡ配列は、たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他に示されたもののような幅広い既知で通常の技術のうち任意のものによって発現系に挿入することができる。
【０２３５】
翻訳されたタンパク質の、小胞体内腔へ、細胞膜周辺腔へ、または細胞外環境への分泌のために、適当な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であることができ、または異種シグナルであることができる。
【０２３６】
本発明における使用のための活性物質は、組み換え細胞培養から、硫安またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法によって回収および精製することができる。非常に好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性する場合は、タンパク質再折りたたみのための技術を用いて活性立体構造を再生することができる。
【０２３７】
測定法
ある物質を、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド発現を調節するのに用いることができるかどうかは、適当なスクリーニング測定法を用いて測定することができる。
【０２３８】
たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に適当なＨＥＳ−１／ルシフェラーゼレポーター測定法は、たとえば、バーナム・フィニー（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ）他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３，４３１３−４３１８（２０００）に記載されている。 
【０２３９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はまた、タンパク質測定法によって、または核酸測定法によって監視することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解切断、および細胞核へのその移動に繋がる。ここでいう「検出可能なシグナル」は、Ｎｏｔｃｈの切断された細胞内ドメインの存在に帰することができる任意の検出可能な徴候であることができる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、切断されたＮｏｔｃｈドメインの細胞内濃度を測定することによって、タンパク質レベルで評価することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化はまた、一連の下流の反応を触媒し、ある種の明確な遺伝子の発現のレベルの変化に繋がる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、たとえば特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することによって、核酸レベルで評価することができる。本発明の好ましい一実施形態では、測定法はタンパク質測定法である。本発明の別の好ましい一実施形態では、測定法は核酸測定法である。
【０２４０】
核酸測定法を用いることの利点は、核酸測定法は高感度であり少量の試料を分析することができることである。
【０２４１】
任意の時間に測定された、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、対応する遺伝子のその時点での発現レベルを反映する。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、免疫系のＴ細胞の間接的測定によって測定することができる。特に、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１および／またはＩＬ−１０ｍＲＮＡのレベルの上昇はたとえば誘導された免疫反応不顕性を示しうる一方、Ｄｌｌ−１またはＩＦＮ−γｍＲＮＡのレベルまたはＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３といったサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルの上昇は反応性の改善を示しうる。
【０２４２】
さまざまな核酸測定法が既知である。既知であるかまたは後に開示される任意の従来の技術を用いることができる。適当な核酸測定法の例は下記に示され、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ブロッティング、分光分析、レポーター遺伝子測定法、遺伝子チップアレイおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
【０２４３】
特に、遺伝子の存在、増幅および／または発現は、試料中で直接に、たとえば、従来のｍＲＮＡの転写を定量するサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、適当に標識化されたプローブを用いて測定することができる。当業者は必要に応じて、これらの方法をどのように改変しうるかを容易に考えることができる。
【０２４４】
ＰＣＲは最初は、不純な試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。その技術は、反応溶液を繰り返し加熱および冷却してプライマーを標的配列とアニーリングさせる温度サイクル、および複製娘鎖の形成のためのそれらのプライマーの伸長に基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いた最初のｃＤＮＡ鎖の生成に、ＲＮＡテンプレートを用いる。ｃＤＮＡはその後、標準のＰＣＲ手順に従って増幅する。合成および変性の繰り返しサイクルの結果として、生じる標的ＤＮＡのコピー数の指数的増加が起こる。しかし、反応成分が限られてくるにつれ、増幅の速度は低下して停滞状態に達し、その後はＰＣＲ産物の正味の増加はほとんどまたは全く無い。核酸標的の開始コピー数が多いほど、この「終点（エンドポイント）」に到達するのは早い。
【０２４５】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグまたは蛍光色素で標識化されたプローブを用い、一定数のサイクル後の産物蓄積の測定のためでなく、蓄積していくＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量測定のためのエンドポイントＰＣＲとは異なる。反応は、標的配列の増幅が蛍光の有意な増加によって最初に検出される際のサイクル反応中の時点によって特徴づけられる。
【０２４６】
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮａｓｅ保護）測定法は、溶液中の特定のＲＮＡの定量のための極めて高感度な技術である。リボヌクレアーゼ保護測定法は、標的として細胞ＲＮＡ全体またはポリ（Ａ）−選択されたｍＲＮＡについて実施することができる。リボヌクレアーゼ保護測定法の感度は、高い比活性で放射性標識された相補ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物プローブの使用に由来する。プローブおよび標的ＲＮＡは溶液中でハイブリダイズされ、その後、混合物は希釈されてリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理され、残っている一本鎖ＲＮＡすべてが分解される。プローブのハイブリダイズした部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動とその後のオートラジオグラフィーによって可視化することができる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるため、リボヌクレアーゼ保護測定法を用いてｍＲＮＡ特性を正確にマッピングすることができる。プローブが標的ＲＮＡに関して過剰なモル数でハイブリダイズされるならば、結果として生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。 
【０２４７】
遺伝子発現はまた、レポーター系を用いて検出することができる。そのようなレポーター系は、発現系、たとえば監視される遺伝子の調節下にある、容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出および選別が可能である蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰおよびルシフェラーゼである。別の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカー、すなわち細胞表面上に発現されしたがって容易に同定可能であるタンパク質である。
【０２４８】
一般的に、レポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナル伝達を検出するために有用なレポーター構造は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（１９８９）の一般的教示に従って構築することができる。典型的には、本発明に記載の構造は、目的の遺伝子によるプロモーター、およびたとえばＧＦＰまたはルシフェラーゼのような目的のレポーター構造をコードするコード配列を含む。ＧＦＰおよびルシフェラーゼをコードするベクターは本分野で既知でありまた市販されている。
【０２４９】
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上記に例示された通り、本分野で既知である任意の技術によって実施することができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによって選別することができる。全般的参考には、『フローサイトメトリーおよびセルソーティング：実験の手引き』（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９９２）Ａ．ラドブルーフ（Ｒａｄｂｒｕｃｈ）（編）、スプリンガー・ラボラトリー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、を参照。
【０２５０】
フローサイトメトリーは、細胞を研究および精製するための強力な方法である。フローサイトメトリーは特に免疫学および細胞生物学で幅広い用途を見出している：しかし、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多数の分野で応用することができる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（蛍光活性化細胞選別）を表し、「フローサイトメトリー」と相互に交換可能に用いられる。ＦＡＣＳの原理は、液体の細流中にある個々の細胞に一種類以上のレーザー光線を通過させると、光の散乱が起こり蛍光色素がさまざまな周波数で光を放出することである。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気シグナルに変換し、電気シグナルはソフトウェアで処理されて、当該細胞についてのデータを生成する。明確な特徴を持つ細胞の部分集団を特定して、懸濁液から非常に高純度で（〜１００％）自動的に選別することができる。 
【０２５１】
ＦＡＣＳを用いて、ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡをトランスフェクションした細胞における遺伝子発現を測定することができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接的に、または、当該構造中のレポーター遺伝子を用いることによって間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例はβ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼ活性はＦＡＣＳによって、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）といった蛍光基質を用いて検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、酵素によって切断されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕捉される。１つの酵素がしたがって大量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰ構造を発現している細胞は基質の添加無しで蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが同一のチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの突然変異体が入手可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置では、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって２種類のトランスフェクションを同時に測定することができる。
【０２５２】
細胞選別の別の方法もまた使用することができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現している細胞を個別に同定することができ、そのため細胞をその後に手作業でまたはＦＡＣＳ選別を用いて選別することができる。ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブは、上記に示す教示に従って、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（１９８９）によって記載された一般的手順を用いて調製することができる。 
【０２５３】
好ましい一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な、ＦＡＣＳ細胞選別に使用することができる蛍光団と結合した、アンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０２５４】
遺伝子発現および同一性についての情報を、いわゆる遺伝子チップアレイまたは高密度ＤＮＡアレイを用いて得るための方法もまた記載されている（チー（Ｃｈｅｅ））。これらの高密度アレイは、診断および予測診断目的に特に有用である。Ｉｎ Ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）もまた利用することができる（カミリ（Ｃａｍｉｌｌｉ））。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較して、たとえば治療または疾患の際にアップレギュレートされる遺伝子を特定する。
【０２５５】
タンパク質測定法を用いることの利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる測定法技術は当業者によく知られている。そのような測定法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、ＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡ測定法を含む。
【０２５６】
上述の通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はまた、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第００／３６０８９号パンフレットに記載されるように、容易に調製することができる。
【０２５７】
ある物質を、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節するために用いることができるかどうかは、たとえば、英国特許第０１１８１５３．６号の優先権を主張する国際公開第０３／０１１３１７号パンフレット（ロランティス社（ＬｏｒａｎｔｉｓＬｔｄ））に記載されるように、適当なスクリーニング測定法を用いて判断することができる。
【０２５８】
上述の通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はまた、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第００／３６０８９号パンフレットに記載されるように、容易に調製することができる。
【０２５９】
初回抗原刺激を受けたＡＰＣおよびリンパ球の調製
本発明の一態様によると、免疫細胞を用いて抗原またはアレルゲンを提示することができるおよび／または免疫細胞を処理してＮｏｔｃｈ、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、ＤＭＥＭまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清といった血清の存在下で、培養することができる。サイトカインの最適濃度は滴定によって決定することができる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の調節因子、およびインターフェロンを、その後典型的には培地に、目的の抗原（または抗原決定基）と共に、添加する。抗原は、当該物質の前、後、またはそれと実質的に同時に、添加することができる。細胞は典型的には、当該物質および抗原と共に、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、好ましくは少なくとも１２または少なくとも２４時間、約３７℃にて培養する。必要に応じて、細胞の少量を、標的遺伝子発現の調節について上記の通り試験することができる。代替として、国際公開第９８／２０１４２号パンフレットに記載の通り、細胞活性はＴ細胞活性化の阻害によって、表面マーカー、サイトカイン分泌または増殖を監視することで測定することができる。
【０２６０】
上で述べた通り、ＡＰＣ中でポリペプチドの発現を可能にする条件下でポリペプチドをコードする核酸構造／ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をＡＰＣへ投与することができる。同様に、抗原をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってＡＰＣへ導入することができる。結果として生じる、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のレベル上昇を示すＡＰＣがこれで使用可能な状態である。
【０２６１】
下記の技術はＴ細胞に関して説明されているが、Ｂ細胞にも等しく適用可能である。使用した技術は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されること以外は、ＡＰＣ単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたＡＰＣをまず作製し、次いでそれをＴ細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、それを沈澱させＰＢＳで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。これは、たとえばＡＰＣについて用いられたのとは異なる物質でＴ細胞を処理したい場合に、ＡＰＣに用いられた別の物質とＴ細胞が接触させられることがないという利点を有する。代替として、Ｔ細胞をＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する第一の物質（または物質の組）とインキュベートし、洗浄し、再懸濁し、次いでＡＰＣを調節するために用いられた物質およびＴ細胞を調節するために用いられた物質の両方の非存在下で、初回抗原刺激を受けたＡＰＣとインキュベートすることができる。代替的に、抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）といったＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）と共にまたはそれ無しで、Ｔ細胞をＡＰＣの非存在下で培養して初回抗原刺激することができ、または代替的にＴ細胞をＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば四量体）で活性化することができる。
【０２６２】
インキュベートは典型的には、適当な培地中で３７℃にて、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３または６または１２または２４時間またはそれ以上とする。免疫寛容の誘導といった免疫反応の改変は、続いてＴ細胞に抗原を負荷し、ＡＰＣに曝露されていない対照細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって測定することができる。
【０２６３】
この方法で初回抗原刺激を受けたＴ細胞またはＢ細胞は、本発明にしたがって、他のＴ細胞またはＢ細胞において免疫寛容を誘導するのに用いることができる。
【０２６４】
治療可能な症状
好ましくは免疫系の調節はＴ細胞活性の調節による。特に、本発明はＴ細胞に媒介される疾患および感染の治療に用いることができる。Ｔ細胞によって媒介されると説明されうる疾患状態または感染状態は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発されるＴ細胞系の異常、および、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコッカス、Ｂ型インフルエンザ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、麻疹、Ｃ型肝炎または回虫によって引き起こされるものといった感染症のいずれか１つ以上を含むがこれらに限定されない。このように、治療または予防されうる、Ｔ細胞によって媒介される特定の症状は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、および糖尿病を含む。本発明はまた、臓器移植術または骨髄移植術に用いることができる。
【０２６５】
上記に示す通り、本発明は、自己免疫疾患といった免疫疾患、または、同種異系移植片拒絶といった移植片拒絶の治療に有用である。
【０２６６】
治療されうる疾患の例は、一般に自己免疫疾患と呼ばれる一群を含む。自己免疫疾患の範囲は、臓器特異的疾患（たとえば甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症）から、慢性関節リウマチまたはエリテマトーデスのような全身性疾患にわたる。他の疾患は、アレルギー反応のような免疫過敏性を含む。 
【０２６７】
より詳細には：臓器特異的自己免疫疾患は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、いくつかの型の貧血（再生不良性、溶血性）、自己免疫肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を含む。
【０２６８】
全身性自己免疫疾患は：慢性関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症および全身性硬化症、シェーグレン症候群、分類不能結合組織症候群、抗リン脂質症候群、さまざまな型の血管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛、本態性（混合）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬および乾癬性関節炎、好酸球性または非好酸球性びまん性筋膜炎、多発性筋炎および他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、さまざまな型の炎症性皮膚炎を含む。
【０２６９】
疾患のより広範囲のリストは；慢性関節リウマチを含む関節炎を含む不必要な免疫反応および炎症、過敏性、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫疾患に伴う炎症、アテローム性硬化症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に伴う炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および消化管の他の疾患に伴う炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および／または炎症性関連婦人科疾患、後部ブドウ膜、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜強膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫および炎症性要素、眼外傷の炎症性要素、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、たとえば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕、眼インプラントに対する免疫および／または炎症反応、および他の免疫および炎症性関連眼疾患、自己免疫疾患または症状に伴う炎症、または、中枢神経系（ＣＮＳ）または任意の他の臓器の両方で、免疫および／または炎症抑制が有益である疾患、パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆症候群、ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、症状、またはＣＮＳ疾患、脳卒中（ｓｔｏｋｅｓ）の炎症性要素、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫および炎症性要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性 神経障害、亜急性 神経障害、慢性 神経障害、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病（ｃｈｏｒａ）、重症筋無力症、特発性頭蓋内圧亢進症、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染の炎症性要素、筋萎縮症および筋ジストロフィーの炎症性要素、および、中枢および末梢神経系の免疫および炎症性関連疾患、症状または疾患、外傷後炎症、敗血性ショック、感染症、手術または臓器の炎症性合併症または副作用、遺伝子治療のたとえばウイルスキャリヤーの感染による炎症性および／または免疫合併症および副作用、または体液性および／または細胞性免疫反応を抑制または阻害するための、ＡＩＤＳに関連する炎症、単球または白血球増殖性疾患、たとえば白血病を、単球またはリンパ球の量を減らすことによって治療または改善すること、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織といった天然または人工細胞、組織、および臓器の移植術の場合に移植片拒絶の防止および／または治療のため、を含む。
【０２７０】
本発明はまたがん治療法において有用である。本発明は特に、腺がん、たとえば小細胞肺がん、および腎臓、子宮、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、膀胱、卵巣、大腸および乳房のがんに関して有用である。
【０２７１】
本発明は、感染症を治療するために、たとえばいわゆる予防ワクチンおよびいわゆる治療ワクチンに用いることができることが理解される。 
【０２７２】
たとえば、予防ワクチンは、未感染の対象に感染防御免疫を提供して将来の感染成立に対する防御を提供するために用いることができる。 
【０２７３】
逆に、治療ワクチンは、たとえば、感染が（たとえば急性または慢性感染のどちらかとして）成立した後に、その感染に対する免疫反応を高めるために用いることができる。適切には、治療ワクチンは、たとえば細菌感染症（結核のような）、マラリア感染症のような寄生虫感染症、またはウイルス感染症（ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはＨＩＶ感染症のような）であることができる慢性感染症と戦うために用いることができる。
【０２７４】
顕著な罹患率および早期死亡を伴う慢性感染症の例は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎といったヒト肝炎ウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および慢性肝炎、肝硬変、および肝がんを引き起こすＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む（米国特許第５７３８８５２号明細書を参照）。
【０２７５】
ウイルス性感染性物質によって引き起こされる慢性感染症の他の例は、ヒトレトロウイルスによって生じるものを含む；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１ およびＨＩＶ−２）；およびＴ細胞白血病および脊髄症を引き起こすヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）。多くの他の感染症、例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含むヒトヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）および６型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−６）といった他の多数の感染はしばしば宿主機構によって根絶されずに、それどころか慢性化してこの状態で疾患を引き起こす可能性がある。ヒトパピローマウイルスの慢性感染は子宮頸がんを伴う。多数の他のウイルスおよび他の感染性物質は細胞内で複製し、宿主防御機構がそれらを排除できない場合は慢性化しうる。これらは、病原性原虫（たとえば、ニューモシスチス・カリニ（Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（マラリアの原因）、およびトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ））、細菌（たとえば、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ （たとえば結核の原因である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、サルモネラおよびリステリア）、および真菌（たとえば、カンジダおよびアスペルギルス）を含む。 
【０２７６】
医薬組成物
好ましくは本発明の活性物質（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドおよび／またはインターフェロン誘導因子）は医薬組成物の形で投与される。当該医薬組成物は、ヒトおよび動物医学においてヒトまたは動物用途向けであることができ、また、１つ以上の活性物質に加えて、典型的には任意の１つ以上の、医薬品として許容される希釈剤、キャリヤー、または賦形剤を含む。治療的用途のための許容されるキャリヤーまたは希釈剤は医薬分野でよく知られており、たとえば、『レミントンの医薬科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．ＧＥＮＮＡＲＯ ｅｄｉｔ．１９８５）。マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（Ａ．Ｒ．ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、１９８５）に記載されている。医薬キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医薬実務に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。また、保存料、安定剤、色素および香料さえ、そのような医薬組成物中に提供することができる。保存料の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤もまた用いることができる。
【０２７７】
投与
典型的には、医師は個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。下記の投与量は、平均的な例の典型である。もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありうる。
【０２７８】
一実施形態では、本発明に用いられる治療剤を患者に直接ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。代替としてまたは加えて、当該治療剤を細胞（たとえばＴ細胞および／またはＡＰＣまたは幹細胞または組織細胞）にｅｘ ｖｉｖｏの方法で投与することができる。たとえば、Ｔ細胞またはＡＰＣといった白血球を、患者またはドナーから既知の方法で得て、本発明の方法でｅｘ ｖｉｖｏで処理／インキュベートし、その後、患者に投与することができる。
【０２７９】
一般的に、治療的に有効な一日量は、たとえば０．０１ないし５００ｍｇ／ｋｇ、たとえば０．０１ないし５０ｍｇ／治療される対象の体重ｋｇ、たとえば０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲になりうる。本発明の物質はまた、たとえば０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲である可能性が高い用量で、静脈輸液によって投与することができる。
【０２８０】
熟練した医師は、任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができる。好ましくは医薬組成物は単位用量剤形である。
【０２８１】
本発明の物質は、たとえば、経口、直腸内、経鼻、局所（皮内、経皮、エアロゾル、口内および舌下を含む）、膣内および非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与経路を含むがそれに限定されない、任意の適当な手段によって投与することができる。
【０２８２】
適切には活性物質は、上記の「医薬組成物」の見出しの下に記載の通りの、医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤と組み合わせて投与される。医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤は、たとえば、滅菌等張生理食塩水溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液であることができる。本発明の物質は、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤と適切に混合することができる。
【０２８３】
一実施形態では、化合物を経口的に活性な形に処方することが望ましい可能性がある。このように、一部の用途については、活性物質は、デンプンまたは乳糖といった賦形剤を含む錠剤の形で、または、カプセル剤または胚珠状で単独でまたは賦形剤と混合して、または、香料または着色料を含むエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、経口投与することができる。本物質を含む錠剤またはカプセル剤のような用量は、必要に応じて一度に１つずつまたは２個以上投与することができる。複合体を徐放性処方で投与することもまた可能である。
【０２８４】
代替としてまたは加えて、活性物質は吸入によって、経鼻的にまたはエアロゾルの形で、または坐剤またはペッサリーの形で投与することができ、または活性物質はローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に投与することができる。経皮投与の１つの選択手段は、皮膚パッチを用いることである。たとえば、活性物質はポリエチレングリコールまたは液体パラフィンの水系エマルジョンから成るクリームに取り入れることができ、たとえば重量で１ないし１０％の濃度で、白ロウまたは白色軟質パラフィン基剤と共に必要に応じて安定剤および保存料から成る軟膏に取り入れることができる。
【０２８５】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質／ポリペプチドといった活性物質もまた、ウイルス技術または非ウイルス技術によって投与することができる。ウイルス配送機構は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むがそれらに限定されない。非ウイルス配送機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物（ＣＦＡｓ）およびその組み合わせを含む。そのような配送機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。活性物質はまた、表皮または真皮またはその他の粘膜表面のような部位への配送のための粒子の弾丸配送（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｒｉｖｅｒｙ）といった、針を用いない系によって投与することができる。
【０２８６】
活性物質はまた、非経口的に、たとえば海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。
【０２８７】
非経口投与のためには、活性物質はたとえば、溶液を血液と等張にするための十分な塩または単糖といった他の物質を含みうるような、無菌水溶液の形で用いることができる。
【０２８８】
口内または舌下投与のためには、物質はたとえば、従来の方法で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形で投与することができる。
【０２８９】
対象（たとえば患者）への経口、非経口、口内および舌下投与のためには、活性物質およびその医薬品として許容される塩および溶媒和物の投与量レベルは、典型的には１０ないし５００ｍｇでありうる（一回または分割用量で）。このように、および例として、錠剤またはカプセル剤は、必要に応じて一度に１つずつまたは２つ以上の投与について、５ないし１００ｍｇの活性物質を含みうる。上記に示す通り、医師は個別の患者について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上記の投与量は平均的な例の典型である一方、もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありえ、そのような用量範囲は本発明の範囲内であることに注意する。
【０２９０】
当業者は任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができるため、記載の投与経路および投与量は単に指針として意図される。
【０２９１】
ここで用いられる治療または療法の語は、診断および予防用途を包含すると考える。
【０２９２】
本発明の治療は、ヒトの用途および獣医学用途の両方を含む。
【０２９３】
本発明の活性物質は、たとえば、免疫抑制剤、ステロイドまたは抗がん剤のような、他の活性物質と共に投与することができる。
【０２９４】
ｅｘ−ｖｉｖｏで処理される場合、本発明の修飾細胞は好ましくは患者のリンパ節への直接注射によって宿主へ投与される。典型的には１０４ないし１０８個の処理細胞、好ましくは１０５ないし１０７個の細胞、より好ましくは約１０６個の細胞が患者に投与される。好ましくは、細胞は濃縮された細胞集団から採取される。
【０２９５】
ここで用いられる「濃縮された」の語は、本発明の細胞集団に用いられるとき、天然に共存する他の細胞がより少ない、細胞のより均一な集団をいう。濃縮された細胞の集団は、本分野で既知であるいくつかの方法によって達成することができる。たとえば、Ｔ細胞の濃縮された集団は、Ｔ細胞上だけに見出される決定基に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティクロマトグラフィーを用いて得ることができる。
【０２９６】
濃縮された集団はまた、混合細胞懸濁液から、ポジティブ選択（目的の細胞だけを回収する）またはネガティブ選択（望ましくない細胞を除去する）によって得ることができる。特異的な細胞をアフィニティ材料上に捕捉するための技術は本分野でよく知られている（ウィグゼル（Ｗｉｇｚｅｌ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２８；２３，１９６９；メイジ（Ｍａｇｅ）他，Ｊ．Ｉｍｎｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１５；４７，１９７７；ウィソッキ（Ｗｙｓｏｃｋｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５；２８４４，１９７８；シュレンプ・デッカー（Ｓｃｈｒｅｍｐｆ−Ｄｅｃｋｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．，３２；２８５，１９８０；ミュラー・ジーブルク（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ）他，Ｃｅｌｌ，４４；６５３，１９８６）。
【０２９７】
成熟分化細胞に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体が、望ましくない細胞を除去するさまざまなネガティブ選択、たとえば、Ｔ細胞または悪性細胞をそれぞれ同種異系または自家骨髄移植片から除去するために用いられている（ジー（Ｇｅｅ）他，Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．８０；１５４，１９８８）。モノクローナル抗体および免疫磁気マイクロスフィアを用いたネガティブ選択によるヒト造血細胞の精製は、複数のモノクローナル抗体を用いて達成することができる（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）他，Ｂｌｏｏｄ，６３；９０４，１９８４）。 
【０２９８】
細胞の分離のための手順は、抗体被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、たとえば、補体およびサイトトキシンのような、モノクローナル抗体と結合させたかまたはモノクローナル抗体と組み合わせて用いる細胞毒性物質、および、たとえば、プレートのような固体マトリクスに結合させた抗体を用いる「パンニング（濃縮）」、または他の便利な技術を含むことができる。正確な分離を提供する技術は、蛍光活性化セルソーターを含み、これはたとえば、複数の色チャンネル、低角度および鈍光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、などといったさまざまな程度の高度機能を持つことができる。
【０２９９】
併用治療
本発明の活性物質が、他の活性物質、抗原または抗原決定基と共に投与される併用治療もまた本発明の範囲内にある。
【０３００】
「同時に」によって、活性物質が実質的に同一の時に、および好ましくは同一の処方中で一緒に、投与されることを意味する。
【０３０１】
「同時期に」によって、活性物質が近い時間に投与されることを意味し、たとえば、１つの物質がもう１つの物質の前または後約１分間以内から約１日以内に投与される。任意の同時期の時間が有用である。しかし、同時に投与されない場合、物質は約１分間以内から約８時間以内、および好ましくは約１ないし約４時間より短い間に投与される場合が多い。同時期に投与される場合、物質は好ましくは動物の同一の部位に投与される。「同一の部位」の語は正確な位置（ｅｘａｃｔ ｌｏｃａｔｉｏｎ）を含むが、しかし約０．５ないし約１５センチメートル以内、好ましくは約０．５ないし約５センチメートル以内であることができる。
【０３０２】
ここで用いられる「別々に」の語は、物質が、間隔を置いて、たとえば約１日ないし数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性物質はどちらの順序でも投与することができる。
【０３０３】
ここで用いられる「順次に」の語は、物質が順番に、たとえば分、時間、日、または週間隔で投与されることを意味する。必要に応じて、活性物質は規則的な反復サイクルで投与することができる。
【０３０４】
一実施形態では本発明に用いられる治療剤は、直接的に患者にｉｎ ｖｉｖｏ投与することができることが理解される。代替として、または加えて、当該物質はＴ細胞および／またはＡＰＣのような免疫細胞にｅｘ ｖｉｖｏの方法で投与することができる。たとえば、Ｔ細胞またはＡＰＣのような白血球を、患者またはドナーから既知の方法で入手し、ｅｘ ｖｉｖｏで本発明の方法で処理／インキュベートし、その後患者に投与することができる。加えて、投与経路の組み合わせを必要に応じて用いることができることが理解される。たとえば、適切な場合には、１成分（たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子）をｅｘ−ｖｉｖｏで投与することができ、他方をｉｎ ｖｉｖｏで投与することができ、また逆も可能である。
【０３０５】
化学的架橋化
化学的に結合した（架橋した）配列を、個別のタンパク質配列から調製し既知の化学結合技術を用いて結合させることができる。複合体は、たとえば従来の溶液相または固相ペプチド合成法を用いて組み立てることができ、末端アミノ基だけが脱保護された反応性形である完全に保護された前駆体が得られる。この官能基は次いでＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその適当な反応性誘導体と直接反応させることができる。代替として、このアミノ基を、カーゴ部分またはリンカーを有する、反応に適した別の官能基に変換することができる。このように、たとえば無水コハク酸とのアミノ基の反応は選択的に指定可能なカルボキシル基を与え、一方、システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長は、選択的に指定可能なチオール基を結果として生じる。適当な選択的に指定可能な官能基が配送ベクター前駆体中に一旦導入されると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその誘導体を、たとえばアミド、エステル、またはジスルフィド結合形成を介して結合することができる。利用することができる架橋化試薬は、たとえば、ミーンズ（Ｍｅａｎｓ），Ｇ．Ｅ．およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ），Ｒ．Ｅ．，『タンパク質の化学修飾』（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ホールデン・デイ社（Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ），１９７４，ｐｐ．３９−４３で考察されている。
【０３０６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達調節の調節因子は、必要に応じて、直接的に、または適切にはリンカー部分を介して間接的に、結合することができる。直接結合は、チオール、ヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基といった、調節因子（たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質）上の任意の便利な官能基を通じて生じうる。しばしば好ましい可能性がある間接結合は、連結部分を介して起こる。適当な連結部分は、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体およびスクシンイミド誘導体のような、二官能性および多官能性アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリールまたはアラルキルアルデヒド酸エステルおよび無水物、スルフヒドリルまたはカルボキシル基を含み、または臭化または塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステルまたはハロゲン化スルホンなどに由来することができる。
【０３０７】
修飾／ヒト化抗体
好ましくは、ヒト患者を治療するための用途向けの抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。抗体「ヒト化」技術は本分野でよく知られている。これらの技術は典型的には、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための、組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。
【０３０８】
米国特許第５８５９２０５号明細書に記載された通り、モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）をヒト化するための初期の方法は、１つの抗体の完全な可変領域を含む抗原結合部位が、別の抗体に由来する定常領域と結合している、キメラ抗体の産生を含んだ。そのようなキメラ化手順は欧州特許第Ａ−０１２０６９４号明細書（セルテック社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ））、欧州特許第Ａ−０１２５０２３号明細書（（ジェネテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）およびシティ・オブ・ホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ））、欧州特許第Ａ−０ １７１４９６号明細書（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、欧州特許第Ａ−０ １７３ ４９４号明細書（スタンフォード大学）、および国際公開第８６／０１５３３号パンフレット（セルテック社）に記載されている。たとえば、国際公開第８６／０１５３３号パンフレットは、マウスＭＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体分子を調製するための製法を開示する。
【０３０９】
欧州特許第Ａ−０２３９４００号明細書（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ））に記載された別の手法では、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）がヒト免疫グロブリンの可変領域の骨格領域に、部位特異的突然変異誘発によって長オリゴヌクレオチドを用いて移植される。そのようなＣＤＲ移植されたヒト化抗体は、ヒト化キメラ抗体よりも、それらが含む非ヒトアミノ酸配列の大幅に低い比率の点から、抗−抗体反応を生じる可能性が大幅に低い。リゾチームを認識するマウスＭＡｂおよびヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットＭＡｂがＣＤＲ移植によってヒト化された例が、ヴェルヘイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８）およびリーヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）他（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４，１９８８）によってそれぞれ記載されている。ヒトＴ細胞上の抗原に対するＣＤＲ移植抗体の作製もまた、国際公開第８９／０７４５２号パンフレット（英国医療審議会）に記載されている。
【０３１０】
国際公開第９０／０７８６１号パンフレットにおいて、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らはヒト化免疫グロブリンを設計するための４つの基準を提示している。第一の基準は、ヒトアクセプターとして、ヒト化する非ヒトドナー免疫グロブリンと著しく相同である特定のヒト免疫グロブリンに由来する骨格を用いるか、または多数のヒト抗体に由来する共通骨格を用いることである。第二の基準は、ヒト配列について骨格の特定残基でヒトアクセプター残基が稀であってドナー残基が典型的である場合は、アクセプターでなくドナーアミノ酸を用いることである。第三の基準は、ＣＤＲｓに直に隣接する位置では、アクセプターでなくドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。第四の基準は、ＣＤＲｓに直に隣接する位置では、アクセプターでなくドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。第四の基準は、アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルでＣＤＲｓの約３Ａ以内に側鎖原子を有し、抗原またはヒト化免疫グロブリンのＣＤＲｓと相互作用が可能であると予測される場合は、その骨格位置でドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。基準２、３、または４は基準１に加えて、またはその代替として適用することができ、また１つずつでまたは任意の組み合わせで適用することができる。
【０３１１】
抗原およびアレルゲン
一実施形態では、本発明の物質は、抗原または抗原決定基（またはそれをコードするポリヌクレオチド）と同時、別々または順次の組み合わせで投与することができ、そのような抗原または抗原決定基に対する免疫反応を修飾（上昇または低下）することができる。
【０３１２】
本発明での用途に適した抗原は、免疫系によって認識されうる、また一般的に抗原受容体によって認識される、任意の物質であることができる。好ましくは本発明に用いられる抗原は免疫原である。宿主が、以前に遭遇した抗原に再曝露される時、アレルギー反応が起こる。
【０３１３】
抗原に対する免疫反応は一般的に細胞性（Ｔ細胞媒介殺菌）または体液性（完全な抗原の認識を介した抗体産生）のどちらかである。免疫反応に関与するＴＨ細胞によるサイトカイン産生のパターンは、これらの反応型のどちらが優位になるかに影響を与えることができる；細胞性免疫（ＴＨ１）は高いＩＬ−２およびＩＦＮγとしかし低いＩＬ−４産生で特徴づけられる一方、体液性免疫（ＴＨ２）ではパターンは低いＩＬ−２およびＩＦＮγとしかし高いＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３である。分泌パターンは二次リンパ器官または細胞のレベルで調節されるため、特定のＴＨサイトカインパターンの薬理学的操作は、生じる免疫反応の種類および程度に影響を与えることができる。
【０３１４】
ＴＨ１−ＴＨ２バランスは、２つの異なる型のヘルパーＴ細胞の相対的な発現量をいう。２つの型は免疫系に対して大規模かつ相反する作用を有する。ある免疫反応がＴＨ１細胞を優先する場合、これらの細胞は細胞応答を推進し、一方でＴＨ２細胞は抗体に支配される応答を推進する。一部のアレルギー反応を担う種類の抗体はＴＨ２細胞によって誘導される。
【０３１５】
本発明に用いられる抗原またはアレルゲン（またはその抗原決定基）は、ペプチド、ポリペプチド、糖質、タンパク質、糖タンパク質、または、タンパク質複合体、細胞−膜調製物、完全な細胞（生存可能なまたは生存不能な細胞）、細菌細胞またはウイルス／ウイルス成分のような、複数の抗原性エピトープを含むより複雑な材料であることができる。特に、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症に関連）、コラーゲン（慢性関節リウマチに関連）、およびインシュリン（糖尿病）、またはＭＨＣ抗原またはその抗原決定基のような非自己組織の拒絶に関連する抗原、といった自己免疫疾患に関連することが知られている抗原を用いることが好ましい。初回抗原刺激を受けた本発明のＡＰＣおよび／またはＴ細胞が組織移植術手続に用いられる場合、抗原は組織ドナーから得ることができる。対象において発現される可能性がある抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチドもまた用いることができる。
【０３１６】
ＡＰＣおよびＴ細胞への核酸配列の導入
上記の通りのＴ細胞およびＡＰＣは、ＤＭＥＭまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清の存在下で、培養することができる。
【０３１７】
Ｔ細胞および／またはＡＰＣ中でポリペプチドの発現を可能にする条件下でポリペプチドをコードする核酸構造／ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をＴ細胞および／またはＡＰＣへ投与することができる。同様に、アンチセンス構造をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってＴ細胞および／またはＡＰＣへ導入することができる。
【０３１８】
好ましい一実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む調節配列に、調節可能に結合している。「調節可能に結合」の語は、記載の成分が、意図された方法でそれらが機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列と「調節可能に結合」した調節配列は、好ましくはコード配列の発現が対照配列と一致する条件下で達成されるような方法で繋げられている。
【０３１９】
プロモーターは典型的には、哺乳類細胞中で機能するプロモーターから選択されるが、原核プロモーターおよび、他の真核細胞中で機能するプロモーターを用いることができる。プロモーターは典型的にはウイルス遺伝子または真核遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、発現が起こる細胞のゲノムに由来するプロモーターであることができる。真核プロモーターについては、遍在的な形で（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターのように）または、代替として、組織特異的な形で（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターのように）機能するプロモーターであることができる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、および眼内の上皮細胞に特異的である、組織特異的プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、ｋｅｒａｔｉｎ１４、Ｗｎｔ−１およびロドプシンプロモーターである。好ましくは上皮細胞プロモーターＳＰＣが用いられる。また、たとえばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターのように、特定の刺激に反応するプロモーターであることができる。たとえばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターといった、ウイルスプロモーターもまた用いることができる。
【０３２０】
異種遺伝子の発現のレベルを、細胞の生涯の間に調節することができるように、プロモーターは誘導性であることもまた有利でありうる。誘導性とは、当該プロモーターを用いて得られた発現のレベルを調節することができることを意味する。
【０３２１】
上記のプロモーターのうち任意のものを、別の調節配列、たとえばエンハンサー配列の付加によって修飾することができる。２つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターもまた用いることができる。
【０３２２】
代替として（または加えて）、調節配列は、目的の遺伝子が本発明で有用な細胞でだけ発現されるように、細胞特異的であることができる。そのような細胞は、たとえば、ＡＰＣおよびＴ細胞を含む。
【０３２３】
必要に応じて、細胞の少量の一部を上記の通りＮｏｔｃｈシグナル伝達活性のアップレギュレーションについて試験することができる。細胞は、患者への投与のために調製、またはＴ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でインキュベートすることができる。
【０３２４】
免疫系の細胞
抗原提示細胞
状況によっては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は「専門の」抗原提示細胞である可能性があり、または抗原をＴ細胞へ提示するように誘導されうる別の細胞である可能性がある代替として、培養条件下で分化するかまたは活性化されてＡＰＣを生じるＡＰＣ前駆細胞を用いることができる。本発明のｅｘ ｖｉｖｏの方法に用いられるＡＰＣは、典型的には患者の体内で見出される腫瘍または末梢血から単離される。好ましくはＡＰＣまたは前駆細胞はヒト起源である。しかし、適当な核酸配列を同定および試験するための予備ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング手続にＡＰＣが用いられる場合は、たとえば健康な被験者といった任意の適当な起源に由来するＡＰＣを用いることができる。
【０３２５】
ＡＰＣは、表面上にＭＨＣ分子（クラスＩまたはＩＩ）を発現するように活性化されたかまたはトランスフェクションによって操作された、指状嵌入（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）ＤＣまたは濾胞ＤＣといった樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、または他の、上皮細胞、線維芽細胞または内皮細胞のような細胞型を含む。ＡＰＣの前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞、単球、線維芽細胞および内皮細胞を含む。ＡＰＣまたは前駆細胞は、培養条件によって修飾することができ、または、たとえば抗原提示に関与するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子および／または免疫増強作用を促進する選択されたサイトカイン遺伝子（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８など）との組み合わせのトランスフェクションによって、遺伝子操作することができる。そのようなタンパク質は、ＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＣＤ４０を含む。非常に好ましくはＤＣまたはＤＣ前駆細胞がＡＰＣの起源として含まれる。
【０３２６】
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの方法で単離／調製することができ、たとえばＤＣは末梢血から直接精製することができ、または、たとえばＧＭ−ＣＳＦを用いた処理による末梢血への移行後に、または骨髄から直接、ＣＤ３４＋前駆細胞から発生させることができる。末梢血から、接着性の前駆細胞をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（イナバ（Ｉｎａｂａ）Ｋ，他（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５；１１５７−１１６７（Ｉｎａｂａ））、または骨髄から、非接着性のＣＤ３４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａで処理することができる（コー（Ｃａｕｘ）Ｃ，他（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３６０；２５８−２６１（Ｃａｕｘ））。ＤＣはまた、サルスト（Ｓａｌｌｕｓｔｏ）およびランザベキア（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ）の方法（Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ （１９９４） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９；１１０９−１１１８）と同様に、精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて接着性細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で２時間処理して、ヒト提供者の末梢血から定型的に調製することができる。必要に応じて、これらから磁気ビーズを用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３＋、ＣＤ２＋Ｔ細胞を除去することができる（コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）ＲＳ，他（１９９８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５；７１８−７２２ （Ｃｏｆｆｉｎ））。培養条件は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４のような他のサイトカインを、樹状細胞または他の抗原提示細胞の維持および／または活性のために含むことができる。
【０３２７】
このように、ここで用いられる「抗原提示細胞など」の語は、ＡＰＣに限られないことが意図されると理解される。当業者は、Ｔ細胞集団に提示することができる任意の媒介物を用いることができることを理解し、便宜上ＡＰＣの語がこれらすべてをいうのに用いられる。上記に示す通り、適当なＡＰＣの好ましい例は、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞または脂質膜のような合成ＡＰＣを含む。
【０３２８】
Ｔ細胞
状況によっては、健常被験者といった任意の適当な起源由来のＴ細胞を、用いることができ、血液または他の起源（たとえばリンパ節、脾臓、または骨髄）から得ることができる。Ｔ細胞は任意に、標準的手順によって濃縮するかまたは精製することができる。Ｔ細胞は、同一のまたは別の個体から得られた、他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。代替として、全血を、または白血球が濃縮された血液または精製白血球を、Ｔ細胞および他の細胞型の起源として用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）を用いることが特に好ましい。代替として、ＣＤ８＋細胞のような他のＴ細胞を用いることができる。また、Ｔ細胞ハイブリドーマのような細胞株を用いることも便利である。
【０３２９】
免疫反応および寛容化の測定法
上に記載された測定法（「測定法」を参照）のうち任意のものを、免疫細胞における反応性低下および寛容化を測定または検出し、および、免疫反応の抑制および増大を臨床用途での使用のために検出するのに用いることができる。
【０３３０】
免疫細胞活性は、当業者に既知である任意の適当な方法によって監視することができる。たとえば、細胞傷害性活性を監視することができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は活性化後に細胞傷害性活性の増大を示す。したがって細胞傷害性の何らかの低下または安定化は、反応性の低下の徴候となる。
【０３３１】
一旦活性化されると、白血球はさまざまな新しい細胞表面抗原を発現する。ＮＫ細胞は、たとえば、トランスフェリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２５ ＩＬ−２受容体を活性化後に発現する。反応性低下はしたがってこれらの抗原の発現を監視することによって測定することができる。
【０３３２】
ハラ（Ｈａｒａ）他『ヒトＴ細胞活性化；ＩＩＩ，１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−酢酸、マイトジェンおよび抗原によるリン酸化２８ｋＤ／３２ｋＤジスルフィド結合初期活性化抗原（ＥＡ−１）の迅速誘導』（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ；ＩＩＩ，Ｒａｐｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ２８ ｋＤ／３２ｋＤ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｅａｒｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＥＡ−１） ｂｙ １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｍｉｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６４；１９８８（１９８６）、およびコスリッヒ（Ｃｏｓｕｌｉｃｈ）他『Ｔ細胞活性化の初期段階に関与する抗原（ＭＬＲ３）の機能的特徴づけ』（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＭＬＲ３） Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｓｔｅｐ ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），ＰＮＡＳ，８４；４２０５（１９８７）は、活性化の直後にＴ細胞上に発現される細胞表面抗原を記載している。これらの抗原、それぞれＥＡ−１およびＭＬＲ３は、２８ｋＤおよび３２ｋＤの主要成分を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１およびＭＬＲ３はＨＬＡクラスＩＩ抗原ではなく、ＭＬＲ３ ＭａｂはＩＬ−１結合を遮断する。これらの抗原は、活性化されたＴ細胞上に１８時間以内に出現し、したがって免疫細胞反応性を監視するために用いることができる。
【０３３３】
加えて、白血球反応性は、参照により本開示に含まれる欧州特許第０３２５４８９号明細書に記載の方法で監視することができる。要約すると、これは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９６２７で表されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に認識される細胞性抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「抗Ｌｅｕ２３」）を用いて達成される。
【０３３４】
抗Ｌｅｕ２３は、活性化されたおよび抗原刺激された白血球上の細胞表面抗原を認識する。活性化ＮＫ細胞上では、その抗原Ｌｅｕ２３は活性化後４時間以内に発現され、活性化後７２時間まで発現され続ける。Ｌｅｕ２３は、少なくとも２個のＮ結合型糖鎖を有する２４ｋＤサブユニットから構成されるジスルフィド結合ホモ二量体である。
【０３３５】
Ｌｅｕ２３のＮＫ細胞上での出現が細胞傷害性の発生と相関するため、およびＬｅｕ２３のある種のＴ細胞上での出現がＴ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、抗Ｌｅｕ２３は白血球の反応性を監視するのに有用である。
【０３３６】
免疫細胞反応性の監視のための技術のさらなる詳細は、参照により本開示に含まれる；『ナチュラルキラー細胞』（Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｃ．Ｅ．およびＪ．Ｏ’Ｄ．マクジー（ＭｃＧｅｅ）１９９２．オックスフォード大学出版会；トリンチエリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）Ｇ．『ナチュラルキラー細胞の生物学』（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ） Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ ｖｏｌ ４７ ｐｐ１８７−３７６；『免疫反応遺伝子ハンドブック』（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ）の７章『免疫反応のサイトカイン』（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）マク（Ｍａｋ）Ｔ．Ｗ．およびＪ．Ｊ．Ｌ．シマード（Ｓｉｍａｒｄ）１９９８に見出される。
【０３３７】
調節Ｔ細胞（およびＢ細胞）のｅｘ ｖｉｖｏ調製
下記の技術はＴ細胞に関して説明されているが、Ｂ細胞に等しく適用可能である。使用した技術は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されること以外は、ＡＰＣ単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたＡＰＣをまず作製し、次いでそれをＴ細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、それを沈澱させＰＢＳで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。このことは、たとえば、Ｔ細胞を異なる物質で処理したい場合、Ｔ細胞はＡＰＣに用いた別の物質と接触させられることがないという利点を有する。初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、初回抗原刺激を受けたＡＰＣはそれ自体が免疫反応を調節するかまたは免疫寛容を誘導することができ、おそらく初回抗原刺激を受けたＡＰＣとＴ細胞との間のＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を介してＴ細胞におけるＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンド発現の増加に繋がるため、Ｔ細胞に何らかの物質を投与することは必ずしも常に必要でない。
【０３３８】
インキュベートは典型的には、適当な培地中で３７℃にて、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３、６、１２、２４、４８時間または３６時間以上とする。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の進行は、上記の方法を用いて細胞の少量の一部について測定することができる。たとえばＤｅｌｔａの発現を指示する核酸構造をトランスフェクションしたＴ細胞を対照として用いることができる。免疫反応／寛容の調節は、たとえば、続いてＴ細胞に抗原を負荷し、ＡＰＣに曝露されていない対照細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって測定することができる。
【０３３９】
初回抗原刺激を受けたＴ細胞またはＢ細胞はまた、ＡＰＣの非存在下で同様の培養技術およびインキュベート時間を用いて、他のＴ細胞またはＢ細胞において免疫寛容を誘導するのに用いることができる。
【０３４０】
代替として、抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）といったＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）と共にまたはそれ無しで、Ｔ細胞をＡＰＣの非存在下で培養して初回抗原刺激することができ、または代替的にＴ細胞をＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば四量体）で活性化することができる。
【０３４１】
免疫寛容の誘導は、その後にＴ細胞に抗原を負荷し、ＡＰＣに曝露していない対照細胞と比較してＩＬ−２産生を測ることによって測定することができる。
【０３４２】
この方法で初回抗原刺激されているＴ細胞またはＢ細胞を、本発明にしたがって、別のＴ細胞またはＢ細胞において免疫寛容を促進または上昇させるのに用いることができる。
【０３４３】
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態をここで、非限定的な実施例を用いて、より詳細に説明する。
【実施例】
【０３４４】
［実施例１］
Ｎｏｔｃｈリガンド／ＩｇＧＦｃ融合タンパク質で被覆されたビーズの調製
Ｍ４５０ストレプトアビジン・ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）（登録商標）磁気ビーズ（米国ダイナル社（Ｄｙｎａｌ））を抗ヒト−ＩｇＧ４ビオチニル化モノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５５５８７９）で、抗体の存在下で３０分間室温にて回転することによって被覆した。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１ｍｌ）を用いて３回洗浄した。ビーズをさらにヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインと融合したヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインを含む融合タンパク質の形のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（ｈＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４；国際公開第０３／０４１７３５号パンフレット、実施例１を参照）と共に、２時間室温にてインキュベートし、その後ＰＢＳ（１ｍｌ）を用いて３回洗浄した。
［実施例２］
【０３４５】
ＩＦＮ−アルファおよびダイナル（Ｄｙｎａｌ）マイクロビーズ上に固定化されたＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４の存在下におけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生の調節。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール・パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）分離液（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて血液から精製した。要約すると、血液２８ｍｌをフィコール・パーク分離液２１ｍｌに重層し、１８〜２０℃にて４０分間４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いる前に３回洗浄した。
【０３４６】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの抗ＣＤ４マイクロビーズを用いて取扱説明書に従って、ポジティブ選択によって単離した。
【０３４７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を３連で９６ウェルプレート（平底）で、１０５ＣＤ４／ウェル／２００μｌにて、１０%ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびメルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。
【０３４８】
サイトカイン産生は、細胞を、ダイナル社からの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズを１：１比（ビーズ／細胞）にて用いて、またはプレートに結合した抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢＤバイオサイエンス社、２μｇ／ｍｌ）を用いて、刺激することによって誘導した。ヒト組み換えＩＦＮ−アルファ（ぺプロテック社（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＤｅｌｔａ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質で被覆されたビーズ（上記の通り調製）または対照ビーズを、一部のウェルに５；１比（ビーズ／細胞）にて添加した。
【０３４９】
３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気にての３日間のインキュベート後に上清を除去し、サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって、ファーミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のキットでそれぞれＩＬ−１０およびＩＬ−５用のＯｐｔＥＩＡセット・ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡセット・ヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）、およびＩＬ−２用のＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からのヒトＩＬ−２デュオセット（ＤｕｏＳｅｔ）（カタログ番号ＤＹ２０２）を取扱説明書に従って用いて評価した。
【０３５０】
結果を図７に示し、各々の場合のＩＬ−１０、ＩＬ−５、およびＩＬ−２レベルをそれぞれ図７Ａから７Ｃに示す。
［実施例３］
【０３５１】
さまざまな用量でのＩＦＮ−アルファの存在下におけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生の調節
ＩＦＮａをさまざまな異なる濃度すなわち０ｎｇ／ｍｌ、０．０４ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌおよび２５ｎｇ／ｍｌにて添加したという改変を加えて、実施例２の手順を繰り返し、そしてＩＬ−１０およびＩＬ−５のレベルを実施例２の場合のように３日間のインキュベート後に測定した。結果を図８に示す。
【０３５２】
結果から判る通り、単独で用いられたＤｅｌｔａビーズおよびＩＦＮａはそれぞれ、ＩＬ−１０産生において４倍および５．５倍の増加を誘導した。組み合わせて用いられた場合、Ｄｅｌｔａビーズの存在は、同じ作用を達成するのにＩＦＮ−ａ濃度を２５〜１２５倍低下させることを可能にした。さらに、ＩＬ−１０産生に対するＩＦＮａの作用はＩＦＮａ ５〜２５ｎｇ／ｍｌで横ばいになるように見えた一方、Ｄｅｌｔａビーズが存在した場合は、その水平状態を大きく上回ったＩＬ−１０産生の連続的増加があった。Ｄｅｌｔａビーズ単独について観察されたＩＬ−５における減少は、ＤｅｌｔａをＩＦＮａと組み合わせて使用した際にもまた存在したが、しかしＩＦＮａの有意な追加の作用は伴わなかった。
［実施例４］
【０３５３】
再刺激の作用
実施例２に記載の通り精製したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０μｇ／ｍｌ）、可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢＤバイオサイエンス社、２μｇ／ｍｌ）およびヒトＩＬ−２（ぺプロテック社（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）１００Ｕ／ｍｌ）を用いて刺激した。ヒト組み換えＩＦＮ−アルファ（ぺプロテック社、５ｎｇ／ｍｌ） および／またはヒトＤｅｌｔａ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質で被覆されたビーズ（上記の通り調製）または対照ビーズを、一部のウェルに５：１比（ビーズ／細胞）にて添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気にてインキュベートし、７日目および１４日目に正確に同一条件で再刺激した。
【０３５４】
１７日目に上清を除去し、サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって、ファーミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のキットでＩＬ−１０およびＩＬ−５用のＯｐｔＥＩＡセット・ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡセット・ヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）を取扱説明書に従って用いて評価した。結果を図９に示す。ＩＬ−１０およびＩＬ−５の産生に対する、上記の実施例３の場合と同様の作用が見られたことが分かる。
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【図面の簡単な説明】
【０３５５】
【図１】図１はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の模式図を示す。
【図２】図２はＮｏｔｃｈリガンドＪａｇｇｅｄおよびＤｅｌｔａの模式図を示す。
【図３】図３はさまざまなショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンド由来のＤＳＬドメインのアミノ酸配列の整列を示す。
【図４】図４はヒトＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３およびＤｅｌｔａ−４のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５はヒトＪａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２のアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は本発明においてＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子として使用することができるさまざまなＮｏｔｃｈリガンド融合タンパク質の模式図を示す。
【図７】図７は実施例１および実施例２の結果を示す。
【図８】図８は実施例３の結果を示す。
【図９】図９は実施例４の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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