(57)【要約】本発明は、重篤患者を処置または治療するための救命薬を製造するための血液マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）レギュレーターの使用に関する。さらに、重篤度ＩＣＵ患者における死亡率を予測するためのＭＢＬの測定の使用を包含する。本発明の１つの別の態様は、集中治療室(ＩＣＵ)に入れられる患者の予防的および／または治療的処置におけるＭＢＬのモノマーおよびオリゴマーの使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重篤患者を処置または治療するための救命薬の製造のための、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）の使用。
【請求項２】
瀕死の重篤患者を処置または治療するための救命薬の製造のための、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）の使用。
【請求項３】
集中治療処置室（ＩＣＵ）内での生存率を増加するための医薬の製造のための、請求項１記載のＭＢＬの使用。
【請求項４】
重篤患者が病院内、例えば、集中治療室内に滞在する時間を軽減させるための医薬の製造のための、請求項１記載のＭＢＬの使用。
【請求項５】
「状態」が手術後の重篤である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
「状態」が外傷後の重篤である、請求項１記載の使用。
【請求項７】
ＭＢＬポリペプチドモノマーが哺乳類動物のＭＢＬポリペプチドモノマーである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
哺乳類動物のＭＢＬポリペプチドモノマーが、ヒトＭＢＬポリペプチドモノマーである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
該オリゴマーがトリマー、テトラマー、ペンタマーおよび／またはヘキサマーからなるオリゴマーの群から選択されるのが好ましい、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
該ＭＢＬが、少なくとも１つのマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドモノマー、または少なくとも１つのマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドモノマーを含んでいる少なくとも１つのマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドオリゴマーを含む、請求項１〜６いずれかに記載の使用。
【請求項１１】
該ＭＢＬが、少なくとも１つのマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドモノマーを含んでいる少なくとも１つのマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドオリゴマーを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
該医薬が、重篤患者の血液ＭＢＬレベルが２５０ng／ml以上に維持されるような方法で用いられる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
該医薬が、重篤患者の血液ＭＢＬレベルが５００ng／ml以上に維持されるような方法で用いられる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
該医薬が、重篤患者の血液ＭＢＬレベルが１０００ng／ml以上に維持されるような方法で用いられる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
該医薬が、重篤患者の血液ＭＢＬレベルが１０００ng／ml〜２０００ng／mlに維持されるような方法で用いられる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
該医薬が、ＩＣＵで別の処置前に個体に投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
該医薬が、別の処置と同時に、連続的にまたは別々に個体に投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
該医薬が、別の処置の前、間および後に個体に投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
該医薬が、予め決められた最低ＭＢＬポリペプチド血清レベル以下のＭＢＬポリペプチド血清レベルを有する重病患者におけるＭＢＬポリペプチド血清レベルのブースターである、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
該医薬が、個体の集中治療処置中の致命的な予後を予防するための、請求項１〜１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
重篤患者の死亡を防止するためのＭＢＬポリペプチド組成物を使用する方法であって、
次のステップ：
ｉ）個体におけるＭＢＬポリペプチドの血清レベルを決定すること、
ｉｉ）個体における集中治療の合併症の発生の確率を推定すること、所望により、
ｉｉｉ）ＭＢＬポリペプチド組成物を個体に投与すること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、重篤患者を処置または治療するための救命薬（life saving drug）を製造するための血液マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）レギュレーターの使用に関する。さらに、重篤ＩＣＵ患者における死亡率を予測するためのＭＢＬの測定値の使用を請求する。本発明の１つの別の態様は、集中治療室(ＩＣＵ)に入る患者の予防的および／または治療的処置におけるＭＢＬのモノマーおよびオリゴマーの使用である。
【０００２】
本発明の背景
長期化した重篤患者の死亡率は２０％を越えており、ほとんどの死亡が敗血症および多臓器不全を起因としている(Van den Berghe G et al. , N Engl J Med 2001; 345 (19): 1359-67; Takala J, et al. N Engl J Med 1999; 341 (11):785-92)。毎年、これらの病状は、アメリカ合衆国だけで５０００００以上の患者に影響する(Wheeler AP et al. N.Engl. J. Med. 1999; 340 (3): 207-14)。重篤中の重度の感染の増加は、臓器機能に対する過剰な全身性炎症応答の有害作用と同様処置可能である。
【０００３】
成人集団におけるＭＢＬの平均血清濃度は、１０００−２０００ ng/mlで、非常に変動が大きい(Turner MW and Hamvas RM. Rev.Immuno genet. 2000; 2 (3): 305-22)。血清濃度における患者間の差違は、基本的に遺伝子的要因によって生じる。エキソン１内と同様ＭＢＬ遺伝子のプロモーター領域でのポイントミューテーションは、高い発生率で起こる。結果として、ほぼ集団の３分の１は、５００ng/ml以下のＭＢＬ濃度を示し、その１０％以上は、５０ng/ml以下のＭＢＬ濃度を示す(Steffensen R, et al. J. Immunol. Methods 2000; 241 (1-2): 33-42)。通常、ＭＢＬレベルの対象内の変動は非常に少ないが(Hansen TK, et al. J. Clin.Endocrinol. Metab 2001; 86 (11): 5383-8)、血清濃度は急性期応答中に増加し(Thiel S, et al. Clin. Exp. Immunol. 1992; 90 (1): 31-5)、成長ホルモン(ＧＨ)投与(Hansen TK, et al. J. Clin. Endo- crinol. Metab 2001; 86 (11): 5383-8)によって特異的に誘導され得る。ＭＢＬの欠乏は、感染事象の増加と関連があるが(Super M, et al. Lancet 1989; 2 (8674): 1236-9; Koch A, et al. JAMA 2001 ; 285 (10): 1316-21; Summerfield JA, et al. BMJ 1997; 314 (7089): 1229-32; Garred P, et al Lancet 1995; 346 (8980): 941-3）、免疫系の過剰のために、他の共存する免疫異常が存在する場合、リスク増加が表面化する。これと一致して、癌の化学療法を受けている患者におけるＭＢＬの低レベルが、発熱性好中球減少の出現および重度な感染の頻度増加と関連があると最近報告されている(Neth O, Hann I, et al. Lancet 2001; 358 (9282): 614-8.; Peterslund NA, et al. Lancet 2001; 358 (9282): 637-8)。免疫適格の重篤患者におけるＭＢＬ濃度の減少に対する疾患の経緯への影響力は、いまだ試験されておらず、本発明の一つの目的である。
【０００４】
本試験では、ＭＢＬが重篤患者の予後にどのように影響するのかが調査された。処置に関係なく全ての患者において、ＭＢＬ濃度は集中治療の時間と共に有意に増加し(Ｐ＜0.0001)、この増加は、ベースラインＭＢＬ濃度に独立して上昇するが、生存者によるものであった。本試験では、低いＭＢＬレベルが、重篤患者における負の結果であった。ベースラインでのＭＢＬ濃度は、生存者中の濃度が非生存者のほぼ３倍であった(p=0.04)。
【０００５】
本発明は、重篤患者におけるＭＢＬレベルを、通常レベル、好ましくは２５０μg/1血清以上のレベル、より好ましくは、５００μg/ｌの血清以上のレベルまで、より好ましくは１０００ng/ml以上のレベルに、そして最も好ましくは１０００ng/ml〜２０００ng/mlのレベルに回復することが、集中治療室(ＩＣＵ)内の重篤患者の生存などの予後を改善するために使用され得ることを示す。しかし、本発明に従って、肝細胞を刺激して、ＭＢＬを合成および／または放出し、その結果、循環するＭＢＬレベルの増加を用いると同じ結果を得る活性なＭＢＬ誘導体または生物学的に活性な物質群の化合物が、同じ結果を得るということは当業者には明からであろう。
【０００６】
ＭＢＬは、様々な源から入手し得る。
マンナン結合レクチンは、Ｃａイオンの存在下でマンナンセファロース(セファロースマトリックス結合されたマンナン)でアフィニティークロマトグラフィーによって、1983年にヒト血清から最初に単離された(Kawasaki N. et al, J. Biochem (Tokyo), 1983, 94, 937-947)。アフィニティーカラムからＭＢＬの溶出が、ＥＤＴＡを用いて行われた。マンノース結合タンパク質の精製に関する改良された方法が、下記文献に記載されている：Ezewkowitz Raymond US 5270199; S. M. Tan et al Biochemical journal Vol. 319, no 2,15 October 1996, pages 329-332;R Koppel et al Journal of chromatography B.: Biomedical Applications. , vol. 662, no 2,1994 pages 191-196.; D. C. Kilpatrick Transfusion Medicine, vol. 7, no. 4,1997 pages 289-294 and WO99/64453 Laursen Inga。ＭＢＬは、Wild et al. , Biochem. J. , 210: 167-174 1983 または Drickamer et al. , J. of Bio. Chemistry, 261: 6878-6887 1986に記載のようにマンノース・セファロースカラムから溶出することによって単離され得る。ＭＢＬは、遺伝子工学的に処理された細胞において産生されうる。組み換体ＭＢＬは、哺乳類動物細胞、例えば、ミエローマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト肝細胞およびヒト胚腎臓(ＨＥＫ)細胞培養(Vorup-Jensen,-T et al. IntImmunopharmacol. 2001 Apr; 1 (4): 677-87)によって、または、例えばUS6337193に記載されているようにメタン産生酵母株でＭＢＬの発現によって、産生された(Ezekowitz, U. S. Pat. No. 5,270, 1999)。
【０００７】
臨床で使える等級のＭＢＬが得られ、点滴に対して安全であることが示されてきた。例えば、プールされたヒトドナー血清誘導ＭＢＬが、安全に患者に投与され得ることが長期疾患に罹った患者においてすでに示されている(Garred,-Peter ; et al.Pediatr-Puhnonol. 2002 Mar; 33 (3): 201-7)。さらに、本発明は、以前に免疫抑制状態とされていなかった(例えば、臓器移植後または疾患による免疫抑制されていない)ＩＣＵの重篤患者に対する有効なＭＢＬ治療を初めて明らかにする。
【０００８】
さらに、肝細胞を刺激して、ＭＢＬを合成および／または放出し、その結果、循環するＭＢＬレベルを増加させる生物学的に活性な物質の群の化合物は、予防的または治療的処置に使用し、その結果、ＩＣＵの重篤患者の生存率を改善し得ることは、当業者には明からであろう。成長ホルモンのようなＭＢＬの分泌を促進する活性を有する化合物は、本発明の時期以前にすでに充分に開示されていた(Hansen,-T-Ket al. J-Clin-Endocrinol-Metab. 2001 Nov; 86 (11): 5383-8)。
【０００９】
ＭＢＬの一般構造は、ＥＰ０３７５７３６Ｂ１（１９９８年５月１３日、１９９８年８月５日）に示されている。
【００１０】
核酸、例えばＭＢＬをコードするＤＮＡは、例えばＵＳ５２７０１９９に記載のような標準的な技術によって単離され得る。例えば、核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが構築され、Drickamer et al, J. Biol. Chem., 261: 6878 (1986)に記載されているようなゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのいずれかがプローブに使用され得る。あるいは、関連遺伝子由来のゲノムフラグメントがプローブとして用いられ得る。好ましくは、該プローブは、ＭＢＬの糖鎖結合ドメインの領域と相同である。この技術によって単離されたクローンは、遺伝子工学的に構築した核酸を含有する。一旦単離してから、ＭＢＬをコードする遺伝子は、組み換体ＭＢＬまたはそのペプチドフラグメントを製造するために有用である。さらに、該核酸は、修飾ペプチオドを発現するための標準技術によって修飾され得る。例えば、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーは、Woods ら（Proc Natl. Acad. Sci. USA. 5661,1982）によって説明されるような標準的技術によって構築された。
【００１１】
このライブラリーは、Ｄrickamer (J. Biol. Chem. 263: 9557,1988)に記載のようなＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、切断したゲル精製した放射性標識ラットＭＢＬ−ＣｃＤＮＡ配列を用いてプローブされた。かかるプローブは、非ストリンジェントな条件下で用いて潜在的に有用なクローンを同定した(Kwiatkowski et al. 323 Nature 455,1986 ; Messing et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:3642, 1977)。ＭＢＬｃＤＮＡクローンは、例えばヒトゲノムライブラリーのためのプローブとして使用される。かかるライブラリーは、例えば標準的な技術によって構築され、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしたクロ−ンが単離され得る。
【００１２】
ＭＢＬペプチドフラグメントの発現は、標準的方法によってなされ得る。例えば、ＭＢＬをコードするＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡの所望の領域は、上記クローンの１つから単離され、いくつかの標準的発現ベクターのいずれか１つに挿入される。発現のための好ましい領域は、海洋性 urchin A. crassispina の体腔液から単離された糖鎖結合レクチン (Giga et al. , J. Biol. Chem. 13: 6197,1987); チキン軟骨・コア・プロテオグリカンタンパク質(Shigaku et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5081,1986)およびＩｇＥ Ｆｃ 受容体(Ikuta et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 819,1987)をコードしている領域である。
【００１３】
このように発現されたペプチドまたはＭＢＬそれ自身に対する抗体は、標準技術によって産生され得る。それらは、モノクローナルまたはポリクローナルであり、動物の血清内または臨床診断テストにおいてペプチドの同定に有用であり得る。
【００１４】
多くの糖鎖結合タンパク質（レクチンなど）は、ヒトにおいてよく知られている。１つのグループはＣ型レクチンである。このＣ型レクチンは、カルシウム依存性の糖鎖認識ドメインである（Ｃ型ＣＲＤ)(Weis WI, Taylor ME and Drickamer K (1998) Immunological Reviews 163: 19-34)。マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）は、マンノース-結合レクチン、マンナン-結合タンパク質またはマンノース-結合タンパク質（ＭＢＰ) と同義であり、コレクチンと呼ばれているＣ型レクチンのサブグループに属する。これらの可溶性タンパク質は、コラーゲン軸に結合した３つのＣＲＤが存在しているサブユニットから構成される (Holmskov, U. , Malhotra, R. , Sim, R. B., and Jensenius, J. C. (1994) Immunol. Today 15: 67-74)。ＭＢＬは、広い範囲の微生物によって示される糖鎖と相互作用し、蓄積している証拠から、それは内在的免疫防御において重要な役割を果たすことを示す(Turner, M. W. (1996) Immunol. Today 17: 532-540)。
【００１５】
ＭＢＬは、糖鎖に結合すると補体系を活性化され得る。補体系は、３つの異なる経路を介して活性化される：標準的経路、代替経路およびＭＢＬを微生物によって示された糖と結合することによって開始されるマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）経路。代替経路およびＭＢＬ経路の成分は内在的免疫防御の一部であり、天然のまたは非クローナル、免疫防御とも呼ばれ、一方標準的経路は特定の免疫防御の抗体との協力を包含する(Janeway CA, et al (1999) Immunobiology, the Immune system in health and disease, Fourth Edition, Churchill Livingstone)。
【００１６】
ＭＢＬは、肝細胞によって肝臓内で合成され、血液中に分泌される。それは、細菌、酵母、寄生原生動物およびウイルス上の糖鎖構造物と結合し、末端の細胞溶解性の補体成分の活性化によって微生物を殺傷するか、または食作用の増進 (オプソニン化) により、その抗菌活性を示す。ＭＢＬのsertiform構造は、標準的経路における第一成分のイムノグロブリン結合副次的成分であるＣｌｑのブーケ様構造にいくらか類似している(Turner, M. W. (1996) Immunol. Today 17: 532-540)。Ｃｌｑは、２つのセリンプロテアーゼ、ＣｌｒおよびＣｌｓと関連し、Ｃｌ複合体を形成する。同様に、ＭＢＬは、セリンプロテアーゼＭＡＳＰ-１(Matsushita, M. and Fujita, T (1992). J. Exp. Med. 176: 1497-1502)、ＭＡＳＰ-２ (Thiel S, et al. Nature, 386 (6624): 506-510)、ＭＡＳＰ-３(Dahl MR, et al. Immunity. 2001; 15(1): 127-35)およびＭＡＰｌ９と呼ばれる別のタンパク質 (Stover CM, et alJ Immunol 162 : 3481-3490) と関連している。ＭＡＳＰ-１、ＭＡＳＰ-２およびＭＡＳＰ-３は、ＣｌｒおよびＣｌｓのものと同一のモジュラー構造を有する（Dahl MR, et al Immunity. 2001; 15(1) : 127-35）。ＭＢＬの糖鎖への結合は、ＭＡＳＰ-１、ＭＡＳＰ-２およびＭＡＳＰ-３の活性化を誘導する。次いで、活性化されたＭＡＳＰ-２は、補体ファクターＣ４およびＣ２の解裂によりＣ３変換酵素、Ｃ４ｂＣ２ｂを生じる(Thiel Set al (1997) Nature, 386 (6624): 506-510)。この研究報告は、ＭＡＳＰ-１がＣ３を直接活性化し得ることを示唆する(Matsushita M. et al J. Exp. Med. 1992; 176 (6): 1497-502)。ＭＡＳＰ-３の基質となりうるものは知られていない。ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の化学量論および活性化経路は全く知られていない。ＭＢＬは、別の動物、例えば齧歯類、畜牛、トリおよびサルにおいて特性分析されてきた。
【００１７】
ヒトＭＢＬタンパク質は、１８個までの同一の３２ｋＤａポリペプチド鎖から構成され(Lu, J. , et al. (1990) J. Immunol. 144: 2287-2294)、その各々は、３つのシステイン残基を含む２１個のアミノ酸の短いＮ末端セグメントを包含し、Ｇｌｎ残基に遮られたコラーゲン様モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｙの７回の反復が続き、別の１２回のＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復が続く。小さい３４個の残基「ネック−領域（neck-region）」は、Ｃ−末端の、９３個のアミノ酸のＣａ２＋依存性レクチンドメインを、分子のコラーゲン様部分と結合させる(Sastry, K. , et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 1175-1189)。
【００１８】
ポリペプチド鎖のコラーゲン様領域は、個々のサブユニット間と、各サブユニット中のポリペプチド鎖間との両方をジスルフィド架橋により共有結合され、これらのポリペプチド鎖からなるサブユニットと結合される(Turner, M. W. (1996) Immunol. Today 17: 532-540)。
【００１９】
しかし、これらのジスルフィド架橋の位置は、完全に解明されているわけではない。ＭＢＬの非還元条件下でＳＤＳＰＡＧＥ分析は、共有結合されたサブユニットの３x３、４x３、５x３および６x３複合体のブロックを推定的に示す２００ｋＤａ以上の見かけの分子量（ｍ.ｗ.)のバンドを示す(Lu, J. , et al. (1990) J. Immunol. 144: 2287-2294)。
【００２０】
天然のヒトＭＢＬタンパク質におけるサブユニットの実際の数は議論のまとである。超遠心分離の使用によって、Lipscombeらは、２５％のヒト血清ＭＢＬが２-３個のトリマーと６個のトリマーのサイズを達成する非常に小さなフラクションから作られることを示唆するデータを得た(Lipscombe, R. J. , et al. (1995) Immunology 85: 660-667)。相対的定量化は、化学ルミネセンスによって現像されるWestern blotの濃度計測によって実施された。イオン交換クロマトグラフィーィーからの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、共有結合したＭＢＬサブユニット鎖の優勢種がテトラマーからなるが、一方でペンタマーまたはヘキサマー複合体のみが補体を活性化したことがわかった(Lu, J., et al. (1990) J. Immunol. 144: 2287-2294. )。これに対して、ゲル浸透クロマトグラフィー分析法(ＧＰＣ)は、ＭＢＬがＣｌ複合体とサイズで比較し得ることを示唆する。ＧＰＣは、ＭＢＬ分子の形成中にタンパク質同士の弱い相互作用の重要性に関する試験を考慮し、また標準的なＭＢＬアッセイ技術と組合せて、ＧＰＣ画分中のＭＢＬ含量の公平な決定を考慮する条件下で実施され得る。
【００２１】
ヒト血清中のＭＢＬの濃度は、一般に遺伝学的に決定されるが、急性期反応中に３倍までの増加が報告されている（Thiel S. et al. (1992) Clin ExpImmunol 90 : 31-35)。構造変化を起こす３つの突然変異、さらにプロモーター領域内の２つの突然変異は、ＭＢＬ欠乏と関連している(Madsen, H. O. , et al. (1994) Immunogenetics 40: 37-44)。ＭＢＬ欠乏は、様々な感染に対する罹病性と関連している。異常かつ重篤な感染に罹患する５人の成人に関する試験は、３人が構造的ＭＢＬ突然変異についてホモ接合体であり、２人がヘテロ接合体であることを示した(Summerfield JA, et al (1995) Lancet 345: 886-889)。非ＨＩＶ関連免疫不全のためDanish National Hospitalに入院している２２９人の子供についての調査は、構造的ＭＢＬ突然変異体アレルに対するホモ接合体が、コントロール群で示されるものよりも１０倍高い頻度であることを示した(Garred P, et al. (1995) Lancet 346: 941-943)。ロンドンのSt Mary's Hospitalに連続入院した子供６１７人のアロタイプは、突然変異体アロタイプについてホモ接合性およびヘテロ接合性に関する頻度が、感染した患者が感染していない患者以上に有意に高いことを示した。(Summerfield JA, (1997) BioMed J 314: 1229-1232)。
【００２２】
ＭＢＬは、広範なオリゴサッカリドに結合し得る。ＭＢＬは自己決定子（self-determinants）を通常認識しないが、微生物上にある反復性糖鎖決定因子との相互作用に非常に適している。イン・ビトロで、酵母(Candida albicans および Cryptococcus neoformans)、ウイルス(ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＳＶ−２および様々なタイプのインフルエンザＡ)および多数の細菌は、ＭＢＬに認識されることを示した。ある細菌の場合、ＭＢＬとの結合は、カプセルの存在によって損なわれる(van Emmerik, LC, et al. (1994) Clin. Exp. Immunol. 97: 411-416)。しかし、被包性細菌(Neisseria meningitidis)は、ＭＢＬの強い結合を示し得る(Jack DL, et al. (1998) B. J Immunol 160: 1346-1353)。
【００２３】
ＭＢＬ欠乏者に感染する微生物は、細菌、ウイルスおよび真菌類起源からの多様な種を示す(Turner, M. W. (1996) Immunol. Today 17:532-540 ; Summerfield JA, et al. (1997) BioMed J 314: 1229-1232)。ＭＢＬは、ほとんどの細菌に対して一般的な防御分子であり得るし、なぜ非常に多くの細菌が非病原性であるかという理由であろう。
【００２４】
蓄積されたデータはＭＢＬの保護効果の概念を支持するが、いくつかの微生物、特に細胞内病原性による感染が、ＭＢＬ欠乏者よりもＭＢＬ充足者において高い頻度に達することを示唆している所見がある(Garred, P, et al. (1994) Eur. J. Immunogen. 21: 125-131 and Hoal-Van Helden EG, et al (1999) Pediatr Res 45:459-64 ; Hoal-Van Helden EG, et al. (1999) Pediatr Res 45: 459-64)。これは、動物試験の結果と一致しており、そこでＨＳＶ−２の数の増加が、ヒトＭＢＬで予め注射されたマウスの肝臓で見出された(Fischer, PB, et al. (1994) Scand J Immunol 39: 439-445)。
【００２５】
我々は、低いＭＢＬレベルが、非免疫抑制状態の重篤患者における予後に影響するかどうかを調べた。遅延性の重篤は、実質的な代謝攪乱および死亡の高リスクと関連している(Van den Berghe G. et al 2000; 143(1) : 1-13)。長期化した重篤患者のうちの死亡率は、２０％を越えており、ほとんどの死亡が敗血症および多臓器不全に関与している(Van den Berghe G, et al. N Engl J Med 2001 ; 345 (19): 1359-67; Takala J, et al. N Engl J Med 1999; 341(11) : 785-92)。毎年、これらの病状は、アメリカのみで５００,０００人以上の患者に影響する(Wheeler AP and Bernard GR. N.Engl.J. Med. 1999; 340 (3): 207-14)。重篤の間、感染が重度であるという強い感受性に加えて臓器機能に対する過剰な全身性炎症反応に関する有害作用が働いている。
【００２６】
以前、ＭＢＬ点滴は、免疫抑制状態の患者においてＭＢＬ欠乏を処置するために提案されてきた。免疫抑制状態とは、その通常の意味、すなわち感染に対する免疫応答を喚起し得ない個体において使用される。ＭＢＬ欠乏は、しばしば任意レベルの約５０ng/mlに定義される。このレベルは、様々なＭＢＬ試験アッセイの感受性と同一であることが多く、そのため該レベルは、実質的にＭＢＬが検出され得ないレベルとして設定されている。化学療法によって処置される患者の場合では、５００ng/mlのレベルは、この状態においてＭＢＬ欠乏を定義すると示唆されている。
【００２７】
本発明は、ＭＢＬをＩＣＵ入院患者に投与することにより、長期ＩＣＵ滞在中に免疫抑制状態でなかった患者の死亡リスクを低下し得ることを示す。問題の該患者は、５００ng/ml血清以下のＭＢＬレベルを有し得る。臨床で使える等級のＭＢＬは、利用し得るし、注入に対して安全であることが示されてきた(Garred, -Peter ; et aLPediatr-Pulmonol. 2002 Mar ; 33 (3): 201-7)。本来のＭＢＬと同様の構造および活性を有すると考えられる組み換え体ＭＢＬの生成物が達成されている(patent application PA 1999 00668/C5/KH)。
【００２８】
本発明の要約
本発明は、ＩＣＵに入院した個体の処置のために、天然起源、または組み換え技術またはその他のＭＢＬ産生細胞系によって産生された物質から精製されたＭＢＬの使用を特徴とする。ＭＢＬは、処置の開始前または後および適当であると考えられる継続時間の間に投与され得る。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、ＩＣＵに入院した個体、すなわち重篤患者に対する処置、またはＩＣＵへの入院との関連が知られている方法/処置(例えば、主要な外科手術)を理由とする長期ＩＣＵ入院のリスクがある個体の処置に関する。
【００３０】
従って、ＩＣＵ滞在中に生じる合併症は、問題の個体を炎症性症状および実際の死亡に関する高いリスクにさらしやすい。本発明によって、長期ＩＣＵ入院のリスクと関連があると知られている方法/処置(例えば、主要な外科手術)の前またはその間、該患者を予防的に処置することが可能である。長期ＩＣＵ入院のリスクと関連があると知られている処置の前またはその間に、ＩＣＵの合併症を予防的に処置することにより、敗血症由来の死亡率およびＩＣＵ滞在中に生じる敗血症のショックを低下させることが可能である。
【００３１】
別の態様において、本発明は、５００ng/ml以下のＭＢＬの血清レベルを初期に有する個体において、集中治療中に得られる状態の予防的、改善的または治療的処置のための医薬の製造において、少なくとも１つのマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドモノマー、または少なくとも１つのマンナン結合レクチン(ＭＢＬ)ポリペプチドモノマーを含有する少なくとも１つのオリゴマーを含む組成物の使用に関連する。
【００３２】
さらに別の態様において、この個体から得られる血漿または血清中のＭＢＬの濃度の測定および測定された濃度を基にした確率の評価により、ＩＣＵに入った個体における致命的な予後のリスクを予測するための方法を提供する。
【００３３】
定義
本明細書中「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）」なる用語は、ショック中に放出された炎症性のメディエーターに対する二次的な複数システム傷害を生じる初期発作のあとに起こる制御不能の疾患プロセスを指す。それは、感染または非感染であり得る、炎症または損傷に対する応答を意味し、次の２つを有することによって定義される：１）３８℃以上、または３６℃以下の体温、２）心拍数 ＞９０、３）呼吸数 ＞２０またはＰaco２＜３２torr、４）ＷＢＣ＞１２０００/mm３ または ＜４００００、または＞１０％バンド。
【００３４】
本明細書中「敗血症」なる用語は、上記記載のように「ＳＩＲＳ」を意味し、これは特に最初のショックフェーズに導く感染性傷害によって特に引き起こされる。
【００３５】
本明細書中「細菌」なる用語は、特に、血液培養によって検出される血液処置中の細菌の存在を意味する。 
【００３６】
本明細書中「敗血症ショック」なる用語は、他の原因が存在しないベースライン値から、心収縮ＢＰ＜９０mmまたは４０mm Hgの低下を有する敗血症を意味する。
【００３７】
本明細書中「重篤患者(ＣＩＰ)」なる用語は、疾患または損傷により急激に生命を脅かす１つのまたは多臓器不全をこうむるか、またはこうむるリスクを持っている患者、手術されて合併症を併発する患者、主要な手術をうける前の週の間に生命維持に絶対必要な臓器が手術されている患者を意味する。通常また好ましくは、これらの状態は、分単位の（minute）治療および／または観察を長期間必要とし、通常または好ましくは、病院の一部または類似施設である集中治療室(ＩＣＵ)において、質および即時性の点で集中治療の高いレベルを提供され得る。重篤とは、死が起こり得るか、切迫している患者の疾患または状態と説明され、そして該患者は、集中的な看護および医療ケアの供給のために、連続追跡の高い品質かつ量を特徴とする、集中治療室(ＩＣＵ)、病院施設または類似の施設内で、全てまたは部分的に経腸栄養下で維持される。より制限された意味において、本明細書における用語「重篤患者」とは、疾患または損傷により急激に生命を脅かす１つのまたは多臓器不全をこうむるか、またはこうむるリスクを持っている患者、あるいは手術されて合併症を併発する患者、を意味する。さらにより制限された意味において、本明細書において使用される用語「重篤患者」は、疾患または損傷により、急激に生命を脅かす１つのまたは多臓器不全をこうむるか、またはこうむるリスクを持つ患者を意味する。同様に、この定義は、同様の表現、例えば、「患者の重篤」および「患者が重篤」にも適用する。重篤患者の例は、心臓手術、脳手術、胸部手術、腹部手術、血管手術または移植の患者、または神経系疾患、脳外傷、呼吸不全、腹部腹膜炎、多発外傷、重症火傷または重症多発神経炎に罹った患者である。
【００３８】
実施態様の説明
適応
以前にＭＢＬ注入が免疫抑制状態患者のＭＢＬ欠乏を治療するのに提案されている。免疫抑制状態患者とは、通常の意味すなわち感染に対する免疫応答を誘起できない者の意で用いられる。ＭＬＢ欠乏は多くの場合、約５０ｎｇ／ｍｌなる任意のレベルで定義されている。このレベルは種々のＭＢＬ試験方法の感度と同じであることが多く、それゆえＭＢＬが実質的には検出できないレベルとして定められてきた。化学療法の治療を受けている患者の場合は、この条件で５００ｎｇ／ｍｌのレベルがＭＢＬ欠乏の定義として提案されている。
【００３９】
本発明によって、集中治療室（ＩＣＵ）入院患者に対するＭＢＬの投与が、長期ＩＣＵ滞在中に起こる敗血症および敗血性ショックから死亡のリスクを低減できる。問題になる患者は血清中のＭＢＬレベルが５００ｎｇ／ｍｌを下回り得る。
【００４０】
またＩＣＵ入院者の治療は、適切な抗生剤、抗ウイルス剤または抗真菌剤と併用して、彼らにＭＢＬを投与することによっても実施され得る。  
【００４１】
殊に外科的または医薬治療によって長期ＩＣＵ入院のリスクを負っている者は、ＩＣＵ滞在中に起こる合併症（敗血症、敗血性ショックまたは多臓器不全）から死亡を減らすために、治療の前、その間ならびに恐らくその後にも、ＭＢＬによる予防的治療の恩恵を受けうる。  
【００４２】
一般に、ＩＣＵに当てられ５００ｎｇ／ｍｌを下回るＭＢＬレベルの者はすべて、ＩＣＵ滞在中に起こる合併症（敗血症および敗血性ショック）から死亡リスクを減らすため、特定のＭＢＬレベルとは関係なくＭＢＬによる治療を受けるべきである。したがって、３００ｎｇ／ｍｌより少ないＭＢＬレベルの者、２００ｎｇ／ｍｌより少ないＭＢＬレベルの者、１００ｎｇ／ｍｌより少ないＭＢＬレベルの者、５０ｎｇ／ｍｌより少ないＭＢＬレベルの者のような、特に４００ｎｇ／ｍｌを下回るＭＢＬレベルの者は恩恵を受けうる。
【００４３】
このように本発明は特に血清中のＭＢＬレベルが０−５００ｎｇ／ｍｌの範囲にある者への治療薬剤を製造するための、ＭＢＬポリペプチドまたは血液ＭＢＬ増加因子の使用に関する。病態はＩＣＵでの治療が原因であるかもしれない。しかしながら病態はまた、長期ＩＣＵ滞在のリスクと関係していることが知られた外科的または医薬治療に起因しているかもしれない。
【００４４】
ＭＢＬ欠乏は獲得または先天性のいずれかの既知生成機構が存在しないのかもしれない。ＭＢＬレベルが５００ｎｇ／ｍｌを下回る者は、ＩＣＵが引き起こす病態を防ぐために、一般にＭＢＬ治療の恩恵を受けうる。
【００４５】
ひとつの実施態様にしたがって、本発明は重篤患者を処置または治療する救命薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００４６】
別の実施態様にしたがって、本発明は重篤患者を処置または治療する医薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００４７】
さらに別の実施態様にしたがって、本発明は患者が危篤状態になることを防ぐ医薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００４８】
さらなる実施態様にしたがって、本発明は重篤患者の生存率を高める医薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００４９】
さらなる実施態様にしたがって、本発明は重篤患者が病院内、例えばＩＣＵ内にとどまる時間を減らす医薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００５０】
さらなる実施態様にしたがって、本発明は特に重篤患者の敗血症および／またはそのメディエイターを予防または治療する医薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００５１】
さらなる実施態様にしたがって、本発明は死亡率、入院期間、菌血症、換気支援の必要性、および透析の必要性を減らす医薬を製造するための、ＭＢＬまたは血液ＭＢＬ促進剤の使用に関する。
【００５２】
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は心臓手術を必要とする患者である。  
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は脳手術を必要とする患者である。  
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は胸部手術を必要とする患者である。  
【００５３】
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は腹部手術を必要とする患者である。  
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は血管手術を必要とする患者である。  
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は移植手術を必要とする患者である。  
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は神経系疾患に罹った患者である。  
【００５４】
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は脳外傷に罹った患者である。
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は呼吸不全に罹った患者である。
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は腹膜炎に罹った患者である。
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は多発外傷に罹った患者である。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は重篤なやけどを負った患者である。
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は重篤な神経障害に罹った患者である。
本発明のさらなる実施態様において、重篤患者は人工呼吸器を必要とする患者である。
【００５６】
さらに本発明は、新規な有用性、新規な活性および／または新規な薬剤の適応に関する情報の提供により、被験者にてＭＢＬの循環レベルを刺激する物質またはその組成の販売方法に関する。このような血液ＭＢＬレギュレーターを販売するひとつの方法は、ＭＢＬが、またはＭＢＬを合成および／または放出するよう肝細胞を刺激しその結果ＭＢＬの循環レベルを高める因子が、重篤患者を処置すること、またはＩＣＵ入院中に起こる合併症（敗血症および敗血性ショック）から死亡率を減らすことに恐らく利用できることを人、例えば医師に伝えることであろう。また別に、血液ＭＢＬレギュレーターまたはＭＢＬを販売する方法は、上述の広告または情報を配布することによるであろう。なおそのメディアはパンフレット、顧客用の包装に使われる包装資材、薬剤と共に提供される印刷物／ちらし、または患者向きの情報、ラベル、ホームページ、映画、広告映画、ビデオおよび類似物である。    
【００５７】
本発明の請求範囲に包含される、血液ＭＢＬレギュレーターまたはＭＢＬを販売する別の方法は、本発明にしたがって血糖レギュレーターの新規な有用性、適応および作用に関する情報を提供するスピーカーを支援すること、または本発明にしたがって血液ＭＢＬレギュレーターまたはＭＢＬの新規な有用性、適応および作用に関する情報を提供する論文の著者を支援することである。他の変法としては、当業者には明白であるが、例えば上述のような配布および広告である。
【００５８】
ＭＢＬ
ＭＢＬ薬剤の製造に用いるＭＢＬ組成は入手可能などんなＭＢＬ源からも生産されうる。ＭＢＬ源は天然のＭＢＬであり得る。よってＭＢＬポリペプチドは生来の宿主生命体にて生産されので、このことはＭＢＬがＭＢＬ正常発現細胞によって生産されることを意味している。ＭＢＬ組成を生産するひとつの従来型の方法は、ヒトの体液、例えば血清または血漿からＭＢＬを抽出することによる。
【００５９】
別の態様にて、ＭＢＬポリペプチド・オリゴマーは、ＭＢＬポリペプチドを生来的には発現しない宿主生命体によって、例えば組み換え技術によって生産される。
【００６０】
最初の実施態様では、ＭＢＬ源は血清であり、これからＭＢＬ組成が血清、血漿、乳製品、初乳または同様のものを適切な精製方法、例えばマンノースまたはマンナン・マトリックスのような炭化水素誘導体のマトリックスを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製によって得られる。このような方法はＷＯ９９／６４４５３（出典明示により本明細書の一部とする）に論じられている。
【００６１】
ＭＢＬ薬剤の製造に用いられるＭＢＬ組成は、好ましくは血清中のＭＢＬのサイズ分布と本質的に同じサイズ分布、例えば血清中ＭＢＬのサイズ分布像に少なくとも８０％同じサイズ分布像を、より好ましくは血清中ＭＢＬのサイズ分布像に少なくとも９０％同じサイズ分布像を、より好ましくは血清中ＭＢＬのサイズ分布像に少なくとも９５％同じサイズ分布像をもつＭＢＬオリゴマー含む。
【００６２】
マトリックスはＭＢＬが結合する炭化水素または炭化水素の混合物で誘導化される。マトリックスは、好ましくはマンノース、フコース、Ｎ−アセチル−グルコサミンまたはグルコース誘導化マトリックス、例えば最も好ましくはマンノース・マトリックスである。
【００６３】
炭化水素誘導化マトリックスの選択性は、非誘導化マトリックスのようなマトリックスがＭＢＬペプチドに本質的に親和性をもたないことを保証することによって得られる。このことは、このようなマトリックスが炭化水素をもたないときに保証されうる。
【００６４】
マトリックスはクロマトグラフィーに適切ないかなる形であってもよく、多くはプラスチック・ビーズのようなビーズの形であってよい。
【００６５】
ＭＢＬ源をクロマトグラフィーに適用後、好ましくは、ＭＢＬを溶出せずに汚染タンパク質の除去または量を低減することになる組成、ｐＨおよびイオン強度を含む未変性の緩衝液を用いてカラムが洗浄される。このような緩衝液は、カルシウム・イオンを添加したＴＢＳ（１０ｍＭのトリス緩衝液、１４５ｍｌのＮａＣｌ、ｐＨ７.４）でありうる。ＭＢＬの溶出は、添加ＥＤＴＡと共に、ＴＢＳの如きＭＢＬの効率的な溶出が可能な選択的脱着剤でもって行われ、ＭＢＬオリゴマーが捕集される。このような精製方法は国際特許出願（ＷＯ００７０４３およびＷＯ９９３７６７）に記載されている。
【００６６】
好ましい態様では、臨床的品質等級のＭＢＬ組成は組み換え技術によって生産されるＭＢＬ源を用いて得られ、ここでのＭＢＬ源はＭＢＬ生産細胞由来の培地である。
【００６７】
このように本発明は、ヒト組み換えマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを生産するプロセスによって作られるＭＢＬを包含し、次のステップよりなる：
−  ヒトＭＢＬポリペプチドまたはそれと機能的に同等のものをコード化するＤＮＡ配列を含む遺伝子発現構成物を調製し、
−  その構成物で宿主細胞培養を変換し、
−  宿主培養細胞を培養し、それによって培地中へのポリペプチドの発現および分泌を得、ついで
−  ヒト組み換えＭＢＬポリペプチドを含む培地を得る。
【００６８】
ヒト組み換えＭＢＬポリペプチドを含む培地は次いで上述のように精製されうる。
【００６９】
遺伝子発現構成物は当業者に知られている従来型の方法、例えば米国特許第５,２７０,１９９号に記載のような方法で生産されうる。
【００７０】
別の実施態様で、遺伝子発現構成物はデンマーク特許出願ＰＡ１９９９００６６８号または「組み換えヒト・マンナン結合レクチン」と題する国際特許出願（ＷＯ００７００４３）に記載のように調製される。
【００７１】
発現は、好ましくは例えば哺乳類細胞中で行われ、発明にしたがって調製はＭＢＬ遺伝子および少なくとも一個のエクソン配列からイントロン配列を含む発現ベクターを使うことによりもたらされる。発現系としての形質転換動物に関してこの術語は、この関係において、ヒトＭＢＬ遺伝子またはフラグメント、またはその模造を含み発現するよう遺伝学的に修飾されている動物である。
【００７２】
精製方法に加えて、好ましいことに遺伝子発現構成物および宿主細胞もまた高級オリゴマーの生産に都合よく、この生産はヒトＭＢＬ遺伝子またはそれと機能的に同等のものから少なくとも一個のイントロン配列を含む遺伝子発現構成物を用いることで可能なことが分かっている。
【００７３】
特にＭＢＬ組成は集中治療室（ＩＣＵ）で治療された患者に起こる敗血症、敗血性ショックまたは多臓器不全の治療および／または予防に用いられる。このような患者は術後重症疾患、外傷後重症疾患をもつ患者かまたはＩＣＵ内で人工呼吸器を装着した患者である。
【００７４】
本発明の目的は、重篤患者の救命治療にＭＢＬ組成を使用することである。
本発明のさらなる目的は、重篤患者がＩＣＵにとどまる時間を短くするためにＭＢＬ組成を使用することである。
本発明の他の目的は、敗血症、敗血性ショックまたは多臓器不全の状態を抑えるためにＭＢＬ組成を使用することである。
【００７５】
本発明の他の目的は、重篤患者の診察の際に明らかな敗血性の病巣を伴う多臓器不全のリスクまたは可能性を減らすためにＭＢＬ組成を使用することである。
本発明の他の目的は、重篤患者の致死率、例えば院内致死率を減らすためにＭＢＬ組成を使用することである。
【００７６】
本発明の他の目的は、重篤患者の臓器代償療法および／または臓器不全（例えば腎不全）の可能性を減らすためにＭＢＬ組成を使用することである。
【００７７】
本発明の他の目的は、重篤患者の高ビリルビン血症の可能性を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
本発明の他の目的は、重篤患者の血液感染の可能性を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
本発明の他の目的は、重篤患者の炎症マーカーおよび／または炎症応答における障害の可能性を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
本発明の他の目的は、重篤患者の抗生剤の使用を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
【００７８】
本発明の他の目的は、反復ポジティブＥＭＧを受けている重篤患者の可能性を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
本発明の他の目的は、重篤患者の赤血球輸血の量を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
本発明の他の目的は、重篤患者の侵襲的治療の必要性を減らすためにＭＢＬ組成物を使用することである。
【００７９】
組成物
ＭＢＬを含む治療薬はアフィニティー・クロマトグラフィーから得られる溶出液を用いて生産されうる。しかし溶出液は使用前にさらなる精製ステップに付すことが好ましい。
【００８０】
ＭＢＬポリペプチド・オリゴマーに加えて、治療薬は薬学的に許容される担体物質および／または賦形剤を含んでいてよい。特に安定化剤はＭＢＬ蛋白質を安定化するため加えられてよい。安定化剤は糖アルコール、サッカリド、タンパク質および／またはアミノ酸である。安定化剤の例としてはアルブミンである。
【００８１】
他の従来型の添加剤は例えば適用剤型に応じて治療薬に加えられてよい。ひとつの実施態様では、治療薬は注射に適した形である。従来型の担体物質、例えば等張の生理食塩水が使われてよい。
【００８２】
他の実施態様では、治療薬は吸入用粉末、または局所適応用クリームもしくは液体のような肺投与に適した形である。  
【００８３】
投与経路はいかなる適切な経路でもよいが、例えば静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または皮内注射である。また本発明は肺または局所投与も想定している。
【００８４】
特にＭＢＬ組成物は先天的または獲得したＭＢＬ欠乏と関係する臨床症状の患者、またはこのような症状を発症するリスクのある患者において「ＩＣＵ合併症」を予防および／または治療するために投与されうる。
【００８５】
ＭＢＬ組成物は別の治療と同時に、連続して、または単独で投与されてもよい。
【００８６】
ＭＢＬ組成物は適切な用量で投与され、特にＩＣＵ内で投与され、ＩＣＵ滞在の一部、好ましくはＩＣＵ全期間を通して、少なくとも一週に一回、二回または三回維持される。
【００８７】
一用量あたり通常１−１００ｍｇ、例えば２−１０ｍｇ、多くは５−１０ｍｇが投与される。他の適応に対しては用量計画が変わってよい。
【００８８】
ＭＢＬ組成物の使用は、抗カビ薬、抗酵母薬、抗菌薬および／または抗ウィルス薬をさらに含むキットであってもよい。抗ウィルス薬はウィルスを弱化および／または除去できる薬剤である。
【００８９】
本発明はまたＩＣＵ合併症に罹った患者のリスクの予測マーカーとしてＭＢＬレベルの測定に用い、その結果治療の必要性の指標とする態様にも関する。特に５００ｎｇ／ｍｌより少ないＭＢＬレベルは、ＭＢＬによる治療を示す予測マーカーである。
【００９０】
このように本発明はまた、個体の「ＩＣＵ合併症」を予防および／または緩和するためのＭＢＬポリペプチド組成物の使用方法に関し、その方法は次のステップよりなる：
ｉ）個体のＭＢＬポリペプチドの血清中レベルを測定し、
ｉｉ）個体のＩＣＵ合併症が起こる確率を推定し、そして任意であるが、ＭＢＬポリペプチド組成を投与する。
【００９１】
ＭＢＬレベルは血清または血漿を用いて測定され、時間分解免疫蛍光試験（ＴＲＩＦＭＡ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは比濁法によって決定されうる。  
【００９２】
またＭＢＬレベルはＭＢＬ遺伝子の遺伝子型の分析から推定されうる。
【００９３】
本発明について種々の態様にて詳しく説明してきたが、加えて図１、図２、表１および、限定するものではないが、好ましい実施態様の例をあげて以下に説明する。
【００９４】
図の説明
図１：
長期にわたり（＞５日）集中治療を受けている患者のマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）濃度の連続測定値。バーは中央値を、箱は四分位範囲（ＩＱＲ）を、およびひげは第１０および第９０百分位数を表す。Ｐ値は数個の関連サンプルのフリードマン試験に関係する。
【００９５】
図２：
長期集中治療を受けている患者の、初日からのＭＢＬ濃度の相対変化（△％）。
【００９６】
実施例
次の例はＭＢＬ欠乏が集中治療室に入れられた者の予後に及ぼす影響の検討結果を示す。
【００９７】
研究母集団
研究はベルギー国ルーバンのルーバン大学、集中治療医学部に入院した、人工呼吸器をつけた２４３人の患者についての調査を包含する。本研究に含まれるすべての患者は５日より多く集中治療を受けた。
血液感染とは、体中心温度が３８.５℃を超えて急上昇した際に得た血液培養中に、厳密な基準（Weinstein M.P. et al., Clin. Infect. Dis., 1997; 24(4): 584-602）に従って汚染を排除したうえで、細菌性病原体が存在するものと目隠し研究者によって定義された。抗生剤の使用は全身的な抗生剤治療を行った総日数として記録された。白血球減少症（≦４０００ cells／μｌ）または白血球増加症（≧１２０００ cells／μｌ）があった日数、および低体温（≦３６℃）または高体温（≧３８℃）の症状発現があった日数も解析された。腎代償療法を必要とする急性腎不全の発生率が記録された。重篤な多発性神経障害の診断に、週一回のＥＭＧスクリーニングが実施された。死亡した全患者の死因は、主治医により臨床的に明らかにされ、治療の指示を知らなかった病理学者による検視で確認された。
【００９８】
ＭＢＬの測定
血清ＭＢＬの測定のため、血液検体はＩＣＵ入室（基準）後２４時間以内に採取され、それ以降集中治療の５日目および１５日目、および／または最終日（すなわち退院または死亡の日）に採血された。
【００９９】
血清ＭＢＬ濃度は時間分解免疫蛍光試験（ＴＲＩＦＭＡ）（Thiel S. et al., Immunology, 2002; 204）を用いて測定された。マイクロタイター・ウェル（fluoroNunc, Nunc, Denmark）はマンナンでコートし、次いで希釈した検体および標品とともに培養された。
【０１００】
洗浄後、ユウロピウム標識のモノクロナール抗ＭＢＬ抗体（１３１−１, Immunolex, Denmark； Wallac Oy, Finlandから得た試薬を用いユウロピウムで標識したもの）が加えられ、培養および洗浄後、蛍光の増加した溶液が加えられた（Wallac）。時間分解蛍光測定装置（Delfia 1232, Wallac）にてプレートが読まれた。ひとつの血漿を希釈し等分して−８０℃に保ち、検量曲線が作られた。この血漿中のＭＢＬ濃度（３.６μｇ／ｍｌ）は定量アミノ酸分析にて定量された、高度純化したＭＢＬとの比較によって測定された。
【０１０１】
ＭＢＬを分析するもうひとつのＴＲＩＦＭＡは、Ｉ００ｐｆリン酸緩衝液（０.１４ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７.４）中、５００ｎｇの抗ヒトＭＢＬ抗体（Ｍａｂ １３１−１、Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark）と室温にて一夜培養することにより、抗体でもってマイクロタイター・ウエル（fluoroNuc, Nunc, Karnstrup, Denmark）をコーティングすることである。Ｔｗｅｅｎを含む緩衝液（ＴＢＳ、０.１４ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、７.５ｍＭのＮａＮ３、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０でｐＨ７.４）にて洗浄後、検体（血清  １／２０）およびキャリブレーター希釈液は、０.５Ｍおよび１０ｍＭのＥＤＴＡに余分のＮａＣｌを含むＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎに加えられる。
【０１０２】
一夜４０℃にて培養および洗浄後、発現したユウロピウム標識の抗体（製造会社Wallac, Turku, Finland に従って、Ｅｕ含有キレートのイソチオシアナート−ベンゾイル−ジエチレン−トリアミン−四酢酸で標識された１２.５ｎｇのＭａｂ １３１−１）が、２５ｐＭのＥＤＴＡを含むＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎに加えられる。
２時間の培養および洗浄に続いて、蛍光の増加した溶液が加えられ（Wallc）、プレートが時間分解蛍光測定装置（Delfia 1232, Wallac）にて読まれる。検量曲線は等分して−８０℃に保たれたひとつの血漿を希釈して作られる。
【０１０３】
ＴＲＩＦＭＡ試験用に集めた血液はＥＤＴＡ（最終濃度：約１０ｍＭ）を含む真空ガラス管に引き込まれる。血漿は等分し試験まで−８０℃に保たれる。血漿標品は健常な血液提供者から同様にして得られる。患者は採血時に感染しないようにする。
【０１０４】
統計的分析
ＩＣＵに入院中の期間にわたるＭＢ濃度の変化がフリードマン試験によって解析された。両側確率値とのスピアマン順位相関は変数間の関連の強固度を評価するのに使われた。基準ＭＢＬレベルの結果因子（死亡率、急性腎不全、菌血症、抗生剤治療の長期必要性、多発性神経障害）に対する影響は、多変量ロジスティック回帰分析によって評価された。加えて多変量ロジスティック回帰分析は、時間とともにＭＢＬの変化が臨床的結果因子を説明するかどうかを評価することに使われた。データは特に断らない限り四分位範囲を伴う中央値として現わされ、統計的有意性はＰ＜０.０５とみなされた。すべての統計計算はマッキントッシュ用Statview ５.０.１（SAS Institute Inc., North Carolina, USA）にて行われた。
【０１０５】
結果
患者の特性と予後
研究に含まれる２４３人の患者のうち、４９人が集中治療中に死亡した。死因は明らかな感染性病巣、急性心血管虚脱および重度脳傷害を伴うかまたは伴わない多臓器不全であった。
菌血症は患者の２５％に起こった。患者は期間中央値１２日（ＩＱＲ６−２１）抗生剤の治療を受け、中央値６日（ＩＱＲ２−１３）に白血球減少症または白血球増加症が、そして中央値１０日（ＩＱＲ５−１６）に低体温および高体温があった。
【０１０６】
血清ＭＢＬ濃度
ＩＣＵに入院して、平均の血清ＭＢＬ濃度は８２０［ＩＱＲ２４１−１５１８］μｇ／ｍｌであったが、これは健康なデンマーク人および英国人被検者で実証されたレベルに匹敵する。基準ＭＢＬレベルが５００ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌを下回る患者数はそれぞれ４０％および８.９％であった。
【０１０７】
治療を受けた患者を解析すると、非生存者は生存者に比較してはっきりと低い基準ＭＢＬ濃度であることが明らかとなった（それぞれ３８７［ＩＱＲ １９０−１２８９］μｇ／ｍｌに対し８９７［ＩＱＲ ２４６−１６８６］μｇ／ｍｌ；Ｐ＝０.０４、表１）。ＭＢＬ濃度が５００ｎｇ／ｍｌを下回る患者の割合は、生存者間の３６％（Ｐ＝０.０２）に比べて非生存者間は５４％であった。ＭＢＬ濃度が２５０ｎｇ／ｍｌより低い患者の割合は、生存者間の２５％に比べて非生存者間は３４％で、またＭＢＬ濃度が５０ｎｇ／ｍｌより低い患者の割合は、生存者間の７％に比べて非生存者間は１４％であった。
【０１０８】
ＭＢＬ濃度は集中治療の時間につれはっきりと増加した（Ｐ＜０.０００１、図１＞。この上昇は基準ＭＢＬ濃度と無関係で、大部分は生存者に起因していた。菌血症を発症した患者は、菌血症を出現しなかった患者に比べ（Ｐ≦０.０２）、１５日目にＭＢＬレベルの相対的に低い増加が現れた。
【０１０９】
考察
長期化した重篤患者はかなりの代謝的および免疫学的異常、および死亡の高リスクと関係している（Van den Berghe G. et al., 2000; 143(1): 1-13; Van den Berghe G. et al., N. Engl. J. Med., 2001; 345(19): 1359-67; Takala J. et al., N. Engl. J. Med., 1999; 341(11): 785-92）。ＩＣＵ中のＭＢＬ濃度が低いことは集中治療を受けた患者に予後不良を予見し得ることを観察した。
【０１１０】
集中治療室に入った患者の三分の二より多くが、感染または組織障害のどちらかが原因で全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）（Brun-Buisson C., Intensive Care Med., 2000; 26: S64-S74）の徴候を現し、こういった患者のかなりの数がショックおよび多臓器不全に進行する。
【０１１１】
未発達の抗体蓄積をもつ子供（Koch,-A. et al., JAMA, 2001 Mar 14; 285(10): 1316-21）、ＡＩＤＳ患者（Kelly,-P. et al., Gastroenterology, 2000 Nov; 119(5):1236-42, Gastroenterology）、または化学療法もしくは幹細胞移植を受けている悪性腫瘍をもつ患者（Neth, -O. et al., Lancet, 2001 Aug 25; 358(9282): 614-8; Peterslund,-N-A., Koch,-C., Jensenius,-J-C., Thiel,-S., Lancet, 2001 Aug 25; 358(9282): 637-8; Mullighan,-Charles-G. et al., Blood, 2002 May 15; 99(10): 3524-9）のような、特に免疫抑制状態の患者においては、ＭＢＬレベルが低いことと感染リスクの増加との間に関連性があり得ることについて多くの刊行物が報告している。
【０１１２】
本発明において、以前に免疫抑制状態でなかった２４３人のＩＣＵ治療患者の動向分析から明らかとなったことは、免疫応答性のある重篤患者でＭＢＬレベルが低いことと関連した脆弱性に有利に、ＩＣＵ中のＭＢＬレベルは非生存者よりも生存者の方がほぼ３倍高かったことである。ＭＢＬの低レベルとＩＣＵ治療患者の予後との関係は、以前にPeterslund ら（Lancet, 2001 Aug 25; 358(9282): 637-8）が示唆したように、重篤なＭＢＬ欠乏に限られたばかりでなく、機能的ＭＢＬ欠乏の切捨てレベルとして＜５００ｎｇ／ｍｌを用いたときでさえ明らかであった。
【０１１３】
結論としてＭＢＬが低レベルであることは長期化した重篤患者の悪い予後を予見し得る。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、長期にわたり（＞５日）集中治療を受けている患者のマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）濃度の連続測定値を示す。
【図２】図２は、長期集中治療を受けている患者の、初日からのＭＢＬ濃度の相対変化（△％）を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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