(57)【要約】膜を標識する化合物、組成物および方法が開示されている。式Ｇ−Ｌ−Ｅの化合物が記述され、ここで、Ｇは、親油性基であり、Ｌは、開裂可能連鎖であり、そしてＥは、電気泳動基である。これらの化合物は、膜と会合し、そして開裂誘発部分で開裂でき、それにより、検出可能電気泳動基を放出する。１局面では、本発明の化合物が均質アッセイ形式で使用されるときはいつでも、開裂可能連鎖Ｌは、開裂誘発部分により生じる短命活性種（例えば、酵素、増感剤など）により、開裂される。
2006508907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物：
Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ
であって、ここで：
Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；
Ｌは、開裂可能リンカーである；
Ｅは、電気泳動タグである；そして
ｍは、１より大きく１００より小さい整数である、
化合物。
【請求項２】
前記脂質膜が、細胞から誘導される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記脂質膜が、リポソームである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｇが、アルキル基、リン脂質または膜貫通ドメインである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｇが、アルキル基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記アルキル基が、約１０個〜２０個の炭素原子を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記アルキル基が、直鎖である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記アルキル基が、脂環族である、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
前記開裂可能連鎖が、酸化不安定性連鎖である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記酸化不安定性連鎖が、オレフィン、チオエーテル、セレノエーテル、チアゾール、オキサゾールおよびイミダゾールからなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記酸化不安定性連鎖が、以下の構造：
【化１】
2006508907.tif 000010
を有するオレフィンであり、ここで、Ｒ１〜Ｒ４は、別個に、水素、ヘテロ原子、アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、アリールオキシ、アリール、置換アリール、ヒドロキシアリールまたは置換ヒドロキシアリール、アシルオキシアリールまたは置換アシルオキシアリール、シリルオキシアリールまたは置換シリルオキシアリール、アミノアリールまたは置換アミノアリール、およびスルホンアミドアリールまたは置換スルホンアミドアリールからなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１個が、ヘテロ原子である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ヘテロ原子が、Ｏ、ＳまたはＮである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１〜Ｒ４の２個が、ヘテロ原子である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ヘテロ原子が、別個に、Ｏ、ＳまたはＮである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ヘテロ原子が、Ｏである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
前記ヘテロ原子が、Ｓである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｅが、蛍光性水溶性有機化合物であり、該有機化合物が、約１５０〜５０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｅが、（Ｍ、Ｄ）形状を有し、ここで、Ｄが、蛍光染料であり、ここで、Ｍが、移動度調節部分であり、該移動度調節部分が、結合または有機分子であり、該有機分子が、１００個までの水素以外の原子を有し、該原子が、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素およびイオウからなる群から選択される、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
前記電気泳動タグＥが、次式：
Ａ−Ｍ−Ｄ
により定義され、ここで：
Ａは、以下である：−Ｃ（＝Ｏ）Ｒであって、ここで、Ｒは、脂肪族、芳香族、脂環族または複素環であり、１個〜８個の炭素原子および０個〜４個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群から選択される；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ；−ＳＯ２Ｈ；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６Ｈ５）であって、ここで、ｎは、２〜１２の範囲である；
Ｄは、蛍光染料である；そして
Ｍは、結合または有機分子であり、該有機分子は、１００個までの水素以外の原子を有し、該原子は、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素およびイオウからなる群から選択され、ここで、Ｅの全分子量は、約１５０〜約５０００ダルトンの範囲内である、
請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｄが、フルオレセイン染料である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記フルオレセインが、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
次式の化合物：
【化２】
2006508907.tif 000011
であって、ここで：
Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；
Ｒは、検出可能部分を含む；そして
ｍおよびｍ’は、別個に、１〜１０から選択される整数である、
化合物。
【請求項２４】
Ｇが、以下：
Ｘ−（（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３）ｎ’
であり、ここで、Ｘは、直接結合、Ｏ、ＳまたはＮである：
ｎは、５と２５の間の整数である；そして
ｎ’は、１または２である、
請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｘが、Ｏであり、そしてｎ’が、１である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｘが、Ｎである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
ｎ’が、２である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒが、蛍光性水溶性有機化合物を含み、該有機化合物が、約１５０〜２５００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒが、フルオレセイン染料である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｇが、コレステロール、ビタミンＤ、植物ステロールおよびステロイドホルモンからなる群から選択されるステロールである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｇが、コレステロールである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｇが、プロゲステロン、テストステロンおよびエストロンからなる群から選択されるステロイドホルモンである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｇが、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびスフィンゴシンからなる群から選択される、請求項２３に記載の化合物。
【請求項３４】
次式：
Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ
を有する複数の化合物を含有する混合物であって、ここで：
Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；
Ｌは、開裂可能リンカーである；
Ｅは、電気泳動タグである；
ｍは、１より大きく１００より小さい整数である；そして
ここで、該複数の化合物の各化合物のＥは、個々に検出可能である、
混合物。
【請求項３５】
Ｇが、アルキル基である、請求項３４に記載の混合物。
【請求項３６】
前記アルキル基が、約１０個〜３０個の炭素原子を有する、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３７】
前記アルキル基が、直鎖である、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３８】
前記アルキル基が、脂環族である、請求項３５に記載の混合物。
【請求項３９】
前記開裂可能連鎖が、酸化不安定性連鎖である、請求項３４に記載の混合物。
【請求項４０】
前記酸化不安定性連鎖が、オレフィン、チオエーテル、セレノエーテル、チアゾール、オキサゾールおよびイミダゾールからなる群から選択される、請求項３９に記載の混合物。
【請求項４１】
Ｅが、蛍光性水溶性有機化合物であり、該有機化合物が、約１５０〜２５００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項３４に記載の混合物。
【請求項４２】
Ｅが、（Ｍ、Ｄ）形状を有し、ここで、Ｄが、蛍光染料であり、ここで、Ｍが、移動度調節部分であり、該移動度調節部分が、結合または有機分子であり、該有機分子が、１００個までの水素以外の原子を有し、該原子が、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素およびイオウからなる群から選択される、請求項４１に記載の混合物。
【請求項４３】
Ｅが、次式：
Ａ−Ｍ−Ｄ
により定義され、ここで：
Ａは、以下である：−Ｃ（＝Ｏ）Ｒであって、ここで、Ｒは、脂肪族、芳香族、脂環族または複素環であり、１個〜８個の炭素原子および０個〜４個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群から選択される；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ；−ＳＯ２Ｈ；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６Ｈ５）であって、ここで、ｎは、２〜１２の範囲である；
Ｄは、蛍光染料である；そして
Ｍは、結合または有機分子であり、該有機分子は、１００個までの水素以外の原子を有し、該原子は、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素およびイオウからなる群から選択され、ここで、Ｅの全分子量は、約１５０〜約５０００ダルトンの範囲内である、
請求項４１に記載の混合物。
【請求項４４】
Ｄが、フルオレセイン染料である、請求項４３に記載の混合物。
【請求項４５】
次式の化合物：
Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ
で標識した脂質膜であって、ここで：
Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；
Ｌは、開裂可能リンカーである；
Ｅは、電気泳動タグである；そして
ｍは、１より大きく１００より小さい整数である、
脂質膜。
【請求項４６】
前記化合物が、前記膜の構造に取り込まれている、請求項４５に記載の脂質膜。
【請求項４７】
前記脂質膜が、個々の細胞を含む、請求項４５に記載の脂質膜。
【請求項４８】
前記脂質膜が、複数の細胞集団から構成される組織を含む、請求項４５に記載の脂質膜。
【請求項４９】
前記脂質膜が、リポソームを含む、請求項４５に記載の脂質膜。
【請求項５０】
Ｇが、アルキル基である、請求項４５に記載の脂質膜。
【請求項５１】
前記アルキル基が、約１０個〜２０個の炭素原子を有する、請求項５０に記載の脂質膜。
【請求項５２】
前記アルキル基が、直鎖である、請求項５０に記載の脂質膜。
【請求項５３】
前記アルキル基が、脂環族である、請求項５０に記載の脂質膜。
【請求項５４】
前記開裂可能連鎖が、酸化不安定性連鎖である、請求項４５に記載の脂質膜。
【請求項５５】
前記酸化不安定性連鎖が、オレフィン、チオエーテル、セレノエーテル、チアゾール、オキサゾールおよびイミダゾールからなる群から選択される、請求項５４に記載の脂質膜。
【請求項５６】
各Ｅが、別々に検出可能である、請求項４５に記載の脂質膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／３９９，０４７号（これは、２００２年７月２６日に出願された）および第６０／４４１，０３４号（これは、２００３年１月１７日に出願された）から優先権を主張しており、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、組成物、処方、および膜の標識化方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
天然または人工のリガンドに対する細胞膜レセプタータンパク質の結合挙動の決定は、多くの生物学的研究および医学的研究にとって重要である。標的または薬物発見の分野において、ハイスループットスクリーニングの努力は、標的特定的な結合因子、アゴニスト、またはアンタゴニストを単離することにとって重要である。これらの治療学的標的または診断的標的の多くは、天然または合成の結合分子によって認識されるときに、その細胞の中でシグナル伝達事象および遺伝子制御事象のネットワークを誘引する細胞表面抗原であり、これらの事象によって、疾患の発症または維持において重要な細胞応答を生じるものである。標的抗原はまた、細胞の表面に分化して存在し、かつ、組織または器官における特有の生理学的状態または疾患の進行を示し得る。これらの細胞表面の標的を研究するときに、標的特異的な結合因子の単離は、分子レベルでの検出および摂動にとって非常に貴重なツールを提供する。
【０００４】
細胞レセプターについてのアッセイは、通常、リガンド−レセプター相互作用に、基づいていた。このアッセイにおいては、そのリガンドが標識され、かつ、そのレセプターに結合した標識されたリガンドの量が、測定される。アッセイのタイプとしては、生体マーカーに対するモノクローナル抗体および正常細胞においては見出されない疾患細胞に特異的な治療標的についてスクリーニングすること、および様々な細胞株において組換えタンパク質として内因的に発現するかまたは過剰発現する表面抗原にとって特異的なリガンドまたは薬理学的因子についてスクリーニングすることが挙げられる。このようなアッセイは、細胞物質からアッセイされるレセプタータンパク質を分離する複雑な手順をしばしば包含し、したがって、リアルタイムで実施され得ない。さらに、数種のリガンドまたはレセプターを標識することが必要であり得る。なぜならば、レセプターは、通常、１種の抗原決定基に対してのみ特異的であるからである。
【０００５】
ＷＯ０１／４２４８９は、親油性の官能基を付与されたナノクリスタルを使用して膜を標的化する脂質膜の蛍光検出のための方法を記載する。次いで、この標的化された膜は、励起光源に対して曝露され、そして、この励起されたナノクリスタルから放出された蛍光が検出される。米国特許第６，３７５，９３０号の光力学的療法では、光感受性テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）が、エストラジオールまたはコレステロールに結合体化される。次いで、赤血球または白血球が、それらの結合体とともに充填される。この結合体は、光に曝露されると、分解して、その内容物を沈殿させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、細胞の分析に対して蛍光基質を使用することにおいて、いくつかの欠点が存在する。例えば、その細胞を損なうことなしに、その外側の細胞膜を介してその基質を取得することは困難である。さらに、細胞漏洩（ｃｅｌｌ  ｌｅａｋａｇｅ）の問題がある。したがって、フルオロセインジ−６２−ガラクトピラノシドの酵素による加水分解の後に、その得られたフルオロセインは、その細胞から迅速に流れ出てしまい、結果として、約１０分間という半減期を伴う。したがって、膜を標識するための組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
１局面では、本発明は、次式の化合物に関する：
Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ
ここで：Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；Ｌは、開裂可能リンカーである；Ｅは、電気泳動タグである；そしてｍは、１より大きく１００より小さい整数である。
【０００８】
本発明の他の局面は、次式の化合物に関する：
【０００９】
【化３】
2006508907.tif 000003
ここで、Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；Ｒは、検出可能部分を含む；そしてｍおよびｍ’は、別個に、１〜１００から選択される。ある局面では、前記親油性部分（Ｇ）は、次式を有する：
Ｘ−（（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３）ｎ’
ここで、Ｘは、直接結合、Ｏ、ＳまたはＮである：ｎは、５と２５の間の整数である；そしてｎ’は、１または２である。
【００１０】
本発明のさらに他の局面は、次式を有する複数の化合物を含有する混合物に関する：
Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ
ここで：Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；Ｌは、開裂可能リンカーである；Ｅは、電気泳動タグである；ｍは、１より大きく１００より小さい整数である；そして、ここで、該複数の化合物の各化合物のＥは、個々に検出可能である。
【００１１】
本発明の他の局面は、次式の化合物で標識した脂質膜に関する：
Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ
ここで、Ｇは、脂質膜に取り込むことができる親油性部分である；Ｌは、開裂可能リンカーである；Ｅは、電気泳動タグである；そしてｍは、１より大きく１００より小さい整数である。
【００１２】
本発明の他の局面は、本発明のＧ−Ｌ−ＥまたはＧ−（Ｌ−Ｅ）ｍの内部移行に関する。１局面では、これらの化合物は、脂質二重層（例えば、無傷細胞の細胞膜）に取り込まれている。そのように標識した細胞は、次いで、リガンド（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）に晒すことができる。このリガンドと細胞上のレセプタとの相互作用は、本発明の親油性化合物の内部移行を誘発する。細胞の表面にある電気泳動タグは、この開裂可能リンカーの開裂により放出でき、放出された電気泳動タグの量は、対照と比較できる。異なるリガンドの効果は、そのようにして、定量できる。
【００１３】
他の局面では、式Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍにより一般に定義された本発明の化合物は、親油性部分を含み、これらの部分は、捕捉部分および捕捉剤（例えば、ビオチンおよびアビジン）によって、開裂可能連鎖および電気泳動タグに結合される。好ましくは、本発明のこのような化合物は、次式により定義される：
Ｇ−（ｂ１）（ｂ２）−（Ｌ−Ｅ）ｍ
ここで、Ｇ、Ｌ、Ｅおよびｍは、上で定義したとおりであり、ｂ１は、捕捉部分であり、そしてｂ２は、親油性部分Ｇと開裂可能連鎖Ｌと電気泳動タグＥとの間で強力な非共有結合を形成する部分である。本実施態様の化合物は、好都合には、モジュラー形状で生成され得る。例えば、Ｇ−ｂ１という形状の化合物は、多くの異なる細胞または膜と併用され得、そしてｂ２−（Ｌ−Ｅ）ｍという形状の化合物は、特定の標識を提供するように、付加され得る。１局面では、本発明の組成物は、Ｇ−ｂ１形状の１種またはそれ以上の化合物と共に、ｂ２−（Ｌ−Ｅ）ｍ形状の複数またはセットの化合物を含む。
【００１４】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して、明らかとなる。それに加えて、本明細書中では、種々の参考文献が示され、これらは、特定の手順または組成物をさらに詳細に記述し、従って、それらの内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
以下で定義した以外は、本明細書中で使用する用語は、それらの一般に認められた科学的な意味を有する。標準的な化学用語の定義は、Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（１９９２）「ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．」Ｖｏｌｓ．Ａ  ａｎｄ  Ｂ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを含めた参考資料で見られ得る。本発明の実施は、特に明記しない限り、当該技術分野の範囲内の質量スペクトル、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の通常の方法を使用する。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Ｇ  Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８０）「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．２，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｆｅｒ，ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照。
【００１６】
本明細書中で引用された全ての出版物、特許および特許出願の内容は、上記または下記のいずれかであれ、本明細書中で参考として援用されている。
【００１７】
本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈で明らかに指示がなければ、複数の指示物を含むことに注目しなければならない。それゆえ、例えば、「ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」の対象物は、２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドの混合物などを含む。
【００１８】
Ｉ．定義
本発明を記述する際に、以下の用語が使用され、そして以下で示すようにして、定義されると解釈される。
【００１９】
本明細書中で使用する「アルキル」との用語は、直鎖、分枝または環状の炭化水素鎖断片またはラジカルを意味し、これは、約１個と約５０個の間の炭素原子、さらに好ましくは、約１個と約２０個の炭素原子を含有する（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、アダマンチル、ノルアダマンチルなど）。８個またはそれより少ない炭素原子を有する直鎖、分枝または環状炭化水素はまた、本明細書中では、「低級アルキル」と呼ばれる。これらの炭化水素鎖は、さらに、１個またはそれ以上の不飽和度、すなわち、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を含み得る（例えば、ビニル、プロパルギル、アリル、２−ブテン−１−イル、２−シクロペンテン−１−イル、１，３−シクロヘキサジエン−１−イル、３−シクロヘキセン−１−イルなど）。すぐ上で記述したような二重結合を含有するアルキル基はまた、本明細書中では、「アルケン」と呼ばれる。同様に、三重結合を有するアルキル基はまた、本明細書中では、「アルキン」と呼ばれる。しかしながら、環状アルキル基に関する文脈で使用されているように、二重結合および／または三重結合の組合せは、その環状炭化水素鎖を芳香族にする結合配列を含まない。
【００２０】
本発明のアルキル置換基として有用なアルカンの代表的な例には、メタン、エタン、直鎖、分枝または環状異性体のプロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナンおよびデカンが挙げられ、メタン、エタンおよびプロパンが好ましい。本発明では、約３０個まで、または約５０個までの炭素原子を有するアルキル基が考慮される。置換アルキルの代表例には、本明細書中で記述した２個またはそれ以上の官能基により置換されたアルキル基が挙げられる。
【００２１】
本発明のアルケニル置換基として有用なアルケンの代表的な例には、エテン、直鎖、分枝または環状異性体のプロペン、ブテン、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテン、ノネンおよびデセンが挙げられ、エテンおよびプロペンが好ましい。本発明では、約３０個または５０個までの炭素原子および約５個までの二重結合、さらに好ましくは、約３個までの二重結合を有するアルケニル基が考慮される。
【００２２】
本発明のアルキニル置換基として有用なアルキンの代表的な例には、直鎖、分枝または環状異性体のプロピン、ブチン、ペンチン、ヘキシン、ヘプチン、オクチン、ノニンおよびデシンが挙げられ、エチンおよびプロピンが好ましい。本発明では、約３０個または５０個までの炭素原子および約５個または約３個までの三重結合を有するアルキニル基が考慮される。
【００２３】
本明細書中で使用する「ハロ」または「ハロゲン」は、置換基フルオロ、ブロモ、クロロおよびヨードを意味する。
【００２４】
本明細書中で使用する「カルボニル」とは、官能基−Ｃ（Ｏ）−を意味する。しかしながら、この基は、類似の電子特性および／または立体特性を有する周知の基（例えば、チオカルボニル（−Ｃ（Ｓ）−）；スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）−−）；スルホニル（−ＳＯ２−）；ホスホニル（−ＰＯ２−）およびメチンで置き換えられ得ることが分かる。他のカルボニル等価物は、有機化学の当業者に知られている。
【００２５】
本明細書中で使用する「アリール」との用語は、２０個またはそれより少ない炭素原子を有する環状芳香族炭化水素鎖を意味する（例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニルおよびアントリル）。このアリール基の１個またはそれ以上の炭素原子はまた、例えば、以下で置換され得る：アルキル；アリール；複素環；ハロゲン；ニトロ；シアノ；ヒドロキシル、アルコキシルまたはアリールオキシル；チオまたはメルカプト、アルキル−またはアリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキル−、ジアリール−またはアリールアルキルアミノ；アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニルまたはアリールアルキルアミノカルボニル；カルボキシル、またはアルキル−またはアリールオキシカルボニル；カルボキシアルデヒド、またはアリール−またはアルキルカルボニル；イミニル、またはアリール−またはアルキルイミニル；スルホ；アルキル−またはアリールスルホニル；ヒドロキシイミニル、またはアリール−またはアルコキシイミニル；カルバミド；またはチオカルバミド。それに加えて、アリール基の２個またはそれ以上のアルキルまたはヘテロアルキル置換基は、組み合わされて、縮合アリール−アルキルまたはアリール−ヘテロアルキル環系（例えば、テトラヒドロナフチル）を形成し得る。複素環基（例えば、ヘテロサイクルオキシ、ヘテロアリールオキシおよびヘテロアラルキルチオ）を含む置換基は、上記用語と同様に定義される。
【００２６】
このアリールは、その分子がベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、アントラセンなどに特有の環構造（すなわち、ベンゼンの６炭素環または他の芳香族誘導体の縮合６炭素環）を有する化合物であり得る。例えば、アリール基は、フェニルまたはナフチルであり得、本明細書中で使用する用語は、非置換アリールおよび置換アリールの両方を含み、この置換アリールは、１個またはそれ以上のニトロ、カルボキシ、スルホン酸、ヒドロキシ、オキシアルキルまたはハライド置換基で置換されている。この場合、このフェニルまたはナフチル上の置換基は、大環を形成する縮合工程後の合成工程で、付加され得る。
【００２７】
本明細書中で使用する「アラルキル」との用語は、上で定義したアルキル基により親構造に結合したアリール基を意味する（例えば、ベンジル、α−メチルベンジル、フェネチルなど）。
【００２８】
本明細書中で使用する「複素環」との用語は、１個またはそれ以上の炭素原子を非炭素原子（特に、窒素、酸素またはイオウ）で置き換えた上で定義した環状アルキルまたはアリール基を意味する。非芳香族複素環はまた、本明細書中では、「環状ヘテロアルキル」とも呼ばれる。芳香族複素環はまた、本明細書中では、「ヘテロアリール」とも呼ばれる。例えば、このような基には、フリル、テトラヒドロフリル、ピロリル、ピロリジニル、チエニル、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル；イソキサゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、ピリジル、ピリダジニル、トリアジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、キヌクリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、プリニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリルおよびベンゾキサゾリルが挙げられる。
【００２９】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物の２つ以上のサブユニットの化合物を言及するために、その幅広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合または例えば、エステル、エーテルなどの他の結合によって連結され得る。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、天然および／または非天然、あるいは合成のアミノ酸（グリシンおよびＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方を含む）のいずれか、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物をいう。ペプチド鎖が短い場合、３つ以上のアミノ酸のペプチドは、オリゴペプチドと通常呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、代表的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。全長タンパク質、アナログ、およびそれらのフラグメントが、この定義によって包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化など）を包含する。さらに、イオン化可能アミノ基およびカルボキシル基が分子中に存在する場合、特定のポリペプチドは、酸性塩または塩基性塩、あるいは中性形態として得られ得る。ポリペプチドは、供給源の生物から直接的に得られ得るか、または組換え的もしくは合成的に産生される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能標識」とは、検出可能な分子をいい、これには、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル；リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。この用語「蛍光剤」とは、所望の検出可能な範囲において蛍光を示し得る物質またはその一部をいう。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「固体支持体」とは、固体表面（例えば、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ガラスプレート、ナイロン、アガロース、アクリルアミドなど）をいう。
【００３２】
「リポソーム」とは、代表的には、１つ以上の同心性の層の形態（例えば、二重層）で、両親媒性の化合物のほぼ球形のクラスターまたは凝集物をいう。リポソームは、例えば、リンもしくはケイ素両親媒性化合物または従来の両親媒性化合物（脂質（例えば、イオン性脂質および／または非イオン性脂質）ならびに／あるいはリンおよび／またはケイ素両親媒性化合物および従来の両親媒性化合物の組合せを含む）から処方され得る。
【００３３】
「ミセル」とは、両親媒性化合物（リンまたはケイ素両親媒性化合物）ならびに従来の脂質から処方されるコロイド状の実体をいう。ミセルは、単層、六角形Ｈ２相構成または二重層構成を含み得る。
【００３４】
「抗体」とは、別の分子の特定の空間および極性の組織に特異的に結合し、それによってその特定の空間および極性の組織に相補的であるとして規定される免疫グロブリンを意味する。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、当該分野で周知の技術（例えば、宿主の免疫および血清の回収（ポリクローナル）または連続的なハイブリドーマ細胞株を調製し、そして分泌されるタンパク質を回収すること（モノクローナル）、または少なくとも、天然の抗体の特異的結合に必要されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその変異化バージョンをクローニングおよび発現することによる）によって調製され得る。抗体は、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含み得、この免疫グロブリンとしては、種々のクラスおよびアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなど）が挙げられる。そのフラグメントとしては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ得る。さらに、凝集物、ポリマーおよび免疫グロブリンの結合体またはそれらのフラグメントは、特定のポリペプチドに対する結合親和性が維持される限り、適切な場合、使用され得る。
【００３５】
「抗体結合組成物」とは、１つ以上の抗体を含み、抗体由来の結合特異性を誘導する分子または分子の複合体を意味する。抗体結合組成物としては、第１抗体が標的分子に特異的に結合し、そして第２抗体が、第１抗体の定常領域に特異的に結合する抗体対；標的分子に特異的に結合するビオチン化抗体および電気泳動タグまたは光増感剤のような部分を誘導体化されたストレプトアビジン；標的分子に特異的で、ポリマー（例えば、デキストラン）に結合された抗体（このポリマーは、電気泳動タグまたは光増感剤のような部分で誘導体化される）；標的分子に特異的で、ビーズ、またはマイクロビーズまたは他の固相支持体に結合される抗体（このビーズ、またはマイクロビーズまたは他の固相支持体は、電気泳動タグまたは光増感剤のような部分で誘導体化されるか、または後者を含むポリマーである）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「キャピラリー電気泳動」とは、キャピラリー管またはキャピラリープレートにおける電気泳動を意味し、ここで、この分離カラムの直径または分離プレートの厚みは、約２５〜５００ミクロンであり、分離媒体全体で効率的な熱の散逸を可能にし、結果として、媒体内で低い熱対流を可能にする。
【００３７】
「篩いマトリクス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）」とは、マトリクスを通る荷電種の電気泳動の移動を遅らせるのに有効な架橋または非架橋ポリマーを含む電気泳動媒体を意味する。
【００３８】
２つの分子または分子および分子の複合体の結合を参照して、「特異的」とは、他の分子を実質的にあまり認識しないことおよびこのような他の分子と安定な複合体を形成しないことと比較して、他のものに対するあるものへの特異的な認識、および安定な複合体の形成をいう。好ましくは、結合を参照して、「特異的」とは、ある分子が、他の分子または複合体と複合体を形成する程度に対して、特異性を有する分子または複合体と少なくとも５０％の複合体を形成することを意味する。一般的に、この分子または複合体は、２つの分子間に特異的な認識を生じる表面または空洞の領域を有する。特異的結合の例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび／または二重鎖の形成、細胞レセプターリガンド相互作用などである。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、複数の蛍光標識を参照して、用語「スペクトル的に分解可能」とは、標識の蛍光放射バンドが、十分に異なる、すなわち、十分に非重複であること、それぞれの標識が結合する電気泳動タグが、標準的な光検出システムによってそれぞれの標識によって生成される蛍光シグナルに基づいて区別され得る（例えば、バンドパスフィルターおよび光増倍管などのシステムを使用する）ことを意味し、これは、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号など、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１〜７６頁、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｌ，１０８５）によって例示される。
【００４０】
（ＩＩ．本発明を実行する様式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されない（これは、もちろん、変更され得る）ことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法が、本発明の特定の実施形態を記載する目的のみであり、制限することを意図しないこともまた理解されるべきである。
【００４１】
１つの局面において、本発明の化合物は、式Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍを含む。この化合物は、親油性基（Ｇ）、切断可能架橋（Ｌ）および電気泳動基（Ｅ）を含む。各親油性基は、それに結合した１つのＬ−Ｅを有し得るか、またはそれに結合したいくつかのＬ−Ｅ部分を有し得、ここで、ｍは、１と１０００との間、好ましくは、１と１００との間、より好ましくは、１と１０との間であり得る。１つより多くの電気泳動基が存在する化合物において、Ｅは、同じであっても異なっていてもよく、その結果、各Ｅは、個々に検出され得る。好ましくは、１つより多くの電気泳動基Ｅが１つの親油性基上に存在する場合は常に、各電気泳動基は、同じである。
【００４２】
本発明の組成物および化合物は、膜（例えば、細胞膜およびリポソーム）を標識するために使用され得る。このような使用において、１つ以上の電気泳動タグで標識された膜を形成した後に、切断誘導部分を、本発明の化合物上に切断可能な連結で近接させ、その結果、電位泳動タグが放出され、検出される。この方法は、図１Ａおよび１Ｂに示されるように、均一な形式または不均一な形式のいずれかで実行され得る。
【００４３】
図１Ａは、本発明の組成物を使用して、複数の細胞型のうち試験化合物の細胞表面結合親和性を決定するための例示的な方法を示す。図１Ａは、異なる細胞型の複数の細胞１０、１２、１４を示す。各細胞は、試験化合物（例えば、図においてレセプターＲ１）によって認識される表面部分を含んでも含まなくてもよい。各細胞型は、本発明の細胞特異的電気泳動プローブで標識される（ｅＴ１、ｅＴ２、ｅＴ３とも指定される）。プローブの親油性アンカー部分は、約１時間、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーションによって細胞膜内に組み込まれ得る。好ましくは、次いで、この細胞は、結合アッセイのために冷却（例えば、４℃）される。これらの低温において、細胞表面から細胞外環境への組み込まれた親油性プローブの漏れは、最小化され、そして異なる細胞集団の異なるプローブでの交差標識が避けられる。
【００４４】
図１Ａを参照し続けて、細胞の混合物が、試験化合物３０とともに、例えば、４℃で１時間インキュベートされる。図１Ａの実施形態において、アッセイが均一な様式で実行され、各試験化合物が、切断誘導基に直接または間接的に結合される（図において「ＰＳ」と指定される）。
【００４５】
切断誘導基は、試験化合物に直接的に連結され得るか、または試験化合物に結合する第２の化合物（任意の試験ＭＡＢと結合するのに有効な第２の抗体）に連結され得る。あるいは、試験化合物、または第２の抗体は、ビオチンで標識され得、この場合、この混合物は、ストレプトアビジン結合光増感剤とともにインキュベートされ得る。
【００４６】
切断誘導基は、制限された近接性内においてのみ、細胞上の電気泳動プローブの連結を切断するのに有効であり、結合した化合物と同じ細胞において有効である。例は、選択された活性化条件（例えば、光照射）において、短寿命の活性化学種（例えば、一重項酸素）を生成し得る増感基（３４によって示される）である。従って、このようなアッセイ混合物中での光増感剤（ＰＳ）基の活性化は、プローブがこの光増感基に近接する場合（すなわち、試験化合物が結合する同じ細胞表面上）のみ、電気泳動プローブを切断する。
【００４７】
図１Ａから理解され得るように、細胞への試験化合物の結合は、結合した増感基を、細胞表面に固着された電気泳動プローブの切断可能なリンカーに近接させて配置する。次いで、細胞混合物は、切断基を活性化するため、すなわち、活性光増感剤に照射するため（例えば、フタロシアニン増感剤について６４０〜８００ｎｍ）に処理され、結合した増感基の近位に一重項酸素を生成する。一重項酸素は、いかなる非結合溶液相増感剤とは対照的に、表面結合増感剤のみが、細胞に結合した電気泳動プローブを切断するのに有効であるのに十分短寿命である。このように反応は、試験化合物が結合する細胞上で電気泳動プローブ（例えば、図１Ａにおいてプローブ２０および２２）を選択的に切断し、特異的な「タグ」をこれらの細胞型を標識するプローブから放出する。
【００４８】
次いで、放出されるタグは、好ましくは、電気泳動によって分離および分析される。分離されるピークは、例えば、タグの蛍光標識の蛍光放射検出によって検出される。それぞれの細胞から放出されたｅＴａｇの分離特徴が公知であるので、複数のデータ出力（図１Ａにおいて概略的に示される）は、試験化合物が結合する細胞サンプルを同定するために使用され得る。ピークの強度はまた、試験化合物が１つより多くの細胞に結合する場合、試験化合物が異なる細胞に結合する相対的な程度を決定するために使用され得る。
【００４９】
好ましくは、電気泳動タグに使用される標識は、異なるタグのピーク高さまたは面積が、検出されるタグの数と直接相関し得るような標識である。例えば、１セットのプローブが、同じ標識および異なる移動度改変基（以下にさらに考察される）を使用し得る。
【００５０】
放出されるタグの移動度およびピーク特徴を構成するための標準を提供するために、既知の量の「標準」ｅＴａｇが試験アッセイに添加され得る。ポジティブコントロール抗体（例えば、抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ）もまた、異なる細胞サンプルとは異なるｅＴａｇの放出の検出を保証するために、含まれ得る。添加される既知の量の標準ｅＴａｇに対して、標準ｅＴａｇ（Ｔｓｔｄ）の測定されたピーク高さまたは曲線下面積（ＡＵＣ）は、エレクトログラムの測定されたピーク高さまたはＡＵＣから、試験ｅＴａｇおよびコントロールｅＴａｇの量を計算するために使用され得る。
【００５１】
このアッセイはまた、図１Ｂに示されるように、不均一な形式で実行され得る。不均一技術は、通常、結合したリガンドが、他のアッセイ成分（例えば、非結合細胞および非結合リガンド）から分離される分離工程を包含する。均一アッセイは、分離工程を必要としないが、分離工程を利用し得る。分離は、種々の方法で達成され得、各々が、結合細胞と非結合細胞とを区別する固体支持体に結合された試薬を利用する。固体支持体が、容器壁（例えば、マイクロタイタープレートウェル、キャピラリー、プレート、スライド、ビーズ（磁気ビーズ、リポソームなどを含む））であり得る。固体支持体の第１の特徴は、（１）非結合細胞からの結合細胞の分離を可能にし、（１）結合複合体の形成を妨害せず、他の決定の操作も妨害しないことである。
【００５２】
固体支持体は、直接的または間接的に細胞−リガンド複合体を結合し得る。直接的な結合について、表面は、試験結合化合物と共有結合を形成する種々の機能で活性化され得る。間接的な結合（これが好ましい）のために、表面は、試験化合物に非共有結合的に結合するか、または試験化合物に連結される中間化合物（例えば、ビオチン）に結合する。
【００５３】
不均一アッセイは、図１Ｂに図示される。上記のように、試験化合物を差示的に標識された細胞型に結合した後に、結合細胞は、非結合細胞から分離される。これは、例えば、親和性分子（例えば、ビオチン）に連結される試験化合物を使用し、そして親和性分子に対する結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）を含む表面上に結合した試験化合物を含む細胞を捕捉することによって達成され得る（図１Ｂに示される）。
【００５４】
非結合細胞および／または非結合リガンドは、一般的に、支持体を洗浄することによって除去される。粒子またはビーズが使用される場合、これらは、濾過、遠心分離、磁気分離などによって、洗浄前に上清から分離され得る。
【００５５】
次いで、捕捉された細胞を、上記のように処理して、結合した電気泳動プローブを切断する。この様式において、結合細胞上の電気泳動プローブの切断は、近位性に依存する必要はない。なぜなら、リガンドを有さない細胞は除去されているからである。従って、より大きな種々の切断プロトコルが使用され得る。切断は、上記のように増感剤を使用して、酸化的に不安定な結合を切断し得るが、種々の切断可能な連結基の種々のタイプの化学的、光化学的、または酵素的な切断（例えば、当該分野において公知である）を使用し得る。例えば、化学的に切断可能な連結の非限定的な例としては、ジスルフィド（代表的には、ジチオスレイトールを使用する、還元により切断可能）、アゾ基（ジチオネートで切断可能）スルホン（ジチオスレイトールを伴うかまたは伴わない、塩基性ホスフェートで切断可能）、グリコール（過ヨウ素酸塩によって切断可能）、およびエステル（加水分解によって切断可能）が挙げられる。光不安定性リンカーとしては、例えば、アゾ連結およびｏ−ニトロベンジルエーテルが挙げられる。
【００５６】
洗浄後、支持体を、ｅ−タグレポーターが放出される溶媒と組合せ得る。切断可能な結合および切断方法の性質に依存して、溶媒は、切断のための任意のさらなる試薬を含み得る。切断のための試薬が必要とされない場合、この溶媒は、簡便には、電気泳動緩衝液である。例えば、切断可能な連結が光不安定性である場合、この媒体は、ｅ−タグレポーターを緩衝液中に放出するために適切な波長の光で照射され得る。
【００５７】
切断試薬が電気泳動分析を妨害する場合、切断可能試薬溶液からｅ−タグレポーターを分離することが必要であり得る。ｅ−タグレポーターおよび試薬の性質に依存して、ｅ−タグレポーターは、イオン交換カラム、液体クロマトグラフィー、最初の電気泳動分離などを使用することによって、試薬から隔離され得る。あるいは、捕捉リガンドは、ｅ−タグ部分に結合されて、この混合物中の任意の妨害する成分を除去し得る。
【００５８】
プローブからの電気泳動タグの放出に続いて、タグは、上記のように、電気泳動によって分離され、分析される。
【００５９】
（親油性基（Ｇ））
１局面では、本発明の化合物は、親油性部分または親油性基（Ｇ）を含む。この親油性基は、本発明の化合物の全部または実質的に全部が溶液中で遊離しているよりもむしろ膜に結合しているように、膜に結合できる。この親油性部分または官能基は、それゆえ、親油性または脂質溶解性を与え、これは、それが結合する化合物の水による表面の濡れ性および水溶性を低下させる。親油性部分（Ｇ）は、１個〜５０個の炭素原子、通常、水素またはハロゲンで置換した炭素原子を含有でき、これには、アルキル、アルキリデンおよびアラルキルを挙げることができる。この親油性基または官能基は、通常、少なくとも５個の炭素原子、さらに普通には、少なくとも１０個の炭素原子、好ましくは、少なくとも１５個で５０個以下の炭素原子、さらに普通には、３０個以下の炭素原子を有する１個〜６個の直鎖または分枝鎖アルキル基を有する。このアルキル基は、通常、末端にあり、５員または６員環に結合され得、それには、脂環族、複素環または芳香族であり得る。この親油性部分は、さらに、光増感剤または化学発光化合物に結合され得る。それゆえ、この親油性基は、親油性基−（ＣＨ２）ｎＣＨ３のアルキル基を含有し、ここで、ｎは、１と５０の間の整数である。
【００６０】
この親油性部分の前駆体は、極性基を有するアルキル化合物であり得、それらは、炭化水素鎖の１個にて、単一官能性または複合群の官能性であり得る。この極性基は、Ｇを開裂可能連鎖部分（Ｌ）と結合するように働くことができる。この極性基は、アシル基、特に、カルボキシ基またはホスホリル基、ヒドロキシ基（これは、エーテルまたはエステル連結を形成するのに使用され得る）、アミノ基（これは、アルキルアミノ、アミド、アミジンなどを提供するように働き得る）、またはメルカプタン（これは、活性化オレフィンとチオエーテル基を形成するように働き得る）などであり得る。それゆえ、この親油性部分は、アルキル（ＣＨ２）、アミド、スルホンアミド、カルボキシアミド、カルボキシレートエステル、ウレタン、尿素またはチオ尿素を介して、この開裂可能連鎖部分に連結される。この親油性部分は、それゆえ、広範囲にわたる潜在的な脂肪族成分（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸またはステアリン酸、または置換または非置換スフィンゴシン）から選択できる。
【００６１】
【化４】
2006508907.tif 000004
他の局面では、親油性部分には、コレステロール；ステロイド（黄体ホルモン（例えば、プロゲステロン）、糖質コルチコイド（例えば、コルチゾール）、鉱質コルチコイド（例えば、アルドステロン）、アンドロゲン（例えば、テストステロンおよびアンドロステンジオン）、およびエストロゲン（例えば、エストロンおよびエストラジオール）を含めて）；糖脂質（例えば、セレブロシドまたはガングリオシド）；イソプレノイド側鎖を有する分子（例えば、ビタミンＫ２、補酵素Ｑ１０、葉緑素またはカロテノイド）；低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）などが挙げられる。一般に、本発明を実施する際には、開裂可能連鎖（Ｌ）に結合できるか結合するように変性できる任意のステロールが使用され得る。例えば、このようなステロールには、コレステロール、ビタミンＤ、植物ステロール（これには、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなどが挙げられるが、これらに限定されない）、ステロイドホルモンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の１局面では、Ｇは、両親媒性化合物、特に、リン脂質を表わす。これらのリン脂質は、アルキルポリオールのアルキルカルボン酸エステルをベースにしており、この場合、少なくとも１個の水酸基は、カルボン酸エステルで置換されており、この場合、このアルキル基は、上で定義したとおりである。このアルキル基は、それゆえ、約１個〜５０個の炭素原子、さらに普通には、約１０個〜２０個の炭素原子を有し得、これは、０個〜５個、さらに普通には、０個〜２個のエチレン性不飽和部位および少なくとも１個の水酸基（これは、ホスフェートで置換されて、リン酸エステルを形成する）を有し得る。このホスフェート基は、さらに、小脂肪族化合物（これは、二官能性またはそれ以上の官能性である）で置換され得、一般に、水酸基またはアミノ基を有する。それゆえ、この親油性部分には、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールまたはカルジオリピン）、およびスフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン）が挙げられ得る。代表的な親油性基は、図２で図示している。
【００６３】
他の局面では、Ｇは、ペプチド、さらに特定すると、親油性または油脂性ペプチドであり、これは、二重層（例えば、膜）と会合できる。油脂性ペプチドとは、一般に、脂質表面に対する親和性が約１０−６以下の解離定数Ｋｄで測定される任意のペプチドを意味する。油脂性ペプチドが化合物を膜内に固着する性能は、実験的に検証できるか、または公知のアルゴリズムを使用して、高い割合の親油性残基および比較的に少数の荷電残基に基づいて、予測できる。例えば、２０種の天然アミノ酸の疎水性および親水性特性を利用してタンパク質のアミノ酸配列からのヒドロパシー規模を定式化するコンピュータアルゴリズムの使用は、Ｋｙｔｅら、（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２  ａｎｄ  Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４−３８２８で記述されている。１局面では、この油脂性ペプチドは、本発明の化合物を膜に固着できる膜貫通ドメインであり得る。典型的には、この膜貫通ドメインは、１回またはそれ以上にわたって、脂質二重層全体に及ぶ。この膜貫通ドメインは、研究中のレセプタ（例えば、Ｇ−タンパク質レセプタ）から誘導でき、そして第二信号を提供できる。あるいは、本発明では、膜貫通ドメインには、人工的に設計したポリペプチド配列が使用できる。Ｇが膜貫通ドメインであるとき、それは、公知方法により（例えば、アミド結合を介して）、開裂可能連鎖（Ｌ）に結合できる。
【００６４】
（開裂可能連鎖（Ｌ））
開裂可能連鎖は、事実上、その構造を分解しないか放出された電気泳動タグＥの検出特性に影響を与えない条件下にて開裂され得る任意の化学結合基であり得る。膜固着した電気泳動プローブを均質アッセイフォーマットで使用するときはいつでも、開裂可能連鎖Ｌは、そのすぐ近傍の開裂可能連鎖だけが開裂されるように、短い距離にわたって作用する開裂剤により、開裂される。典型的には、このような試薬は、その試薬が短命活性種（これは、開裂可能連鎖に拡散して開裂を引き起こす）を生じるように、この反応混合物に物理的または化学的変化を作り出すことにより、活性化され得る。均質形式では、この開裂剤は、好ましくは、結合部分（例えば、抗体）に付着されるが、この結合部分は、この開裂剤の活性化前に、同じ膜内の膜固着した電気泳動プローブ（例えば、レセプタまたは類似の分子）の近傍にある特定の部位を標的にする。このような実施態様では、開裂剤は、本明細書中にて、「開裂誘発部分」と呼ばれており、これは、以下でさらに詳細に述べる。
【００６５】
非均質形式では、所望の特性を備えた標識対象（例えば、生体細胞、リポソームなど）は、このような特性を有しない対象から分離または単離される。それゆえ、本発明と併用するのに、開裂可能連鎖および開裂剤の広範な選択肢が利用できる。開裂可能連鎖は、局所的に作用する反応種（例えば、過酸化水素、一重項酸素など）との反応を受け易い連鎖だけでなく、反応混合物の全体にわたって作用する試薬（例えば、塩基不安定性連鎖、光開裂可能連鎖、酸不安定性連鎖、特定のプロテアーゼで開裂可能なペプチドなど）に影響され易い。このような連鎖を記述している参考文献には、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）；およびＳｔｉｌｌら、米国特許第５，５６５，３２４が挙げられる。代表的な開裂可能連鎖は、表１で示す。
【００６６】
【表１】
2006508907.tif 000005
例証的な開裂可能連結基および開裂可能試薬（Ｌ）は、電気泳動タグ（Ｅ）との結合点を示す。
【００６７】
【化５】
2006508907.tif 000006
【００６８】
【化６】
2006508907.tif 000007
１局面では、本発明では、市販の開裂可能試薬系が使用され得る。例えば、親油性アンカーと電気泳動タグとの間には、ヘテロ官能性試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）など（これらは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のような業者から入手できる）を使用して、ジスルフィド連鎖が導入され得る。このような連鎖により導入されたジスルフィド結合は、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプトエタノール、ホウ水素化ナトリウムなど）で処理することにより、切断できる。ジスルフィド結合の開裂を引き起こす還元剤の典型的な濃度は、１０〜１００ｍＭの範囲である。親油性アンカーと電気泳動タグとの間には、ホモ二官能性ＮＨＳエーテル架橋試薬、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）（Ｐｉｅｒｃｅ製）（これは、過ヨウ素酸ナトリウム（生理学的なｐＨで、４時間にわたって、１５ｍＭの過ヨウ素酸塩）での開裂を受けやすい中心シス−ジオールを含有する）を使用して、酸化的に不安定な連鎖が導入され得る。エステルスペーサ成分を含有する連鎖は、強力な求核試薬（例えば、ヒドロキシルアミン（例えば、０．１Ｎヒドロキシルアミン、ｐＨ８．５、３〜６時間、３７℃））で開裂され得る。このようなスペーサは、ホモ二官能性架橋剤（例えば、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）（これは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手できる））により、導入できる。塩基不安定性連鎖は、スルホン基を使って導入できる。開裂可能連鎖においてスルホン基を導入するのに使用できるホモ二官能性架橋剤には、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）および４，４−ジフルオロ−３，３−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）が挙げられる。開裂に代表的な塩基性条件には、３７℃で２時間のインキュベーションと共に０．２Ｍリン酸ナトリウム（これは、トリス塩基を加えることにより、ｐＨ１１．６に調節し、６Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳおよび２ｍＭ  ＤＴＴを含有する）が挙げられる。光分解可能連鎖には、Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄらの米国特許第５，９８６，０７６号で開示されたものが挙げられる。
【００６９】
１局面では、本発明の化合物が均質アッセイ形式で使用されるときはいつでも、開裂可能連鎖Ｌは、開裂誘発部分により生じる短命活性種（例えば、酵素、増感剤など）により、開裂される。代表的には、この短命活性種は、酸化剤（例えば、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素など）であり、そして開裂可能連鎖Ｌは、このような活性種の局所濃度が十分に高いときはいつでも、開裂される。このような酸化不安定性連鎖には、チオエーテル、セレノエーテル、オレフィンなどが挙げられる。１局面では、本発明のオレフィン連鎖には、以下の構造の部分が挙げられる：
【００７０】
【化７】
2006508907.tif 000008
ここで、Ｒ１〜Ｒ４は、炭素含有基であり、これはまた、ヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン）を含有し得る。例えば、Ｒ１〜Ｒ４は、別個に、水素、アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、アリールオキシ、アリール、置換アリール、ヒドロキシアリールまたは置換ヒドロキシアリール、アシルオキシアリールまたは置換アシルオキシアリール、シリルオキシアリールまたは置換シリルオキシアリール、アミノアリールまたは置換アミノアリール、およびスルホンアミドアリールまたは置換スルホンアミドアリールからなる群から選択できる。Ｒ１〜Ｒ４基のいずれかは、共に結合して、その二重結合の一面か二重結合を横切るかのいずれかで、１個またはそれ以上の環を形成し得る。Ｒ基の連結は、結合により得るか、または架橋を介し得、この架橋は、ヘテロ原子または炭素原子含有基（この基は、必要に応じて、１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する）であり得る。好ましくは、Ｒ基の１個は、電子供与性基であり、このオレフィンに、直接または共役二重結合を介して結合される。エノールエーテル、エネジオールエーテル、ビニルスルフィド、エナミンおよびＮ−アシレンアミンは、本発明で有用なオレフィンの例であり、この場合、そのヘテロアルキル置換基のヘテロ原子は、その二重結合に直接結合されている。Ｒ１〜Ｒ４基は、別個に、多種多様な置換基から選択される。好ましい置換基には、アリール基（例えば、フェニル基およびナフチル基）、式ＹＯＢのオキシ基（ここで、Ｙは、アリール、アルキル、アラルキル、シクロアルキルなどである）、式ＹＳＢのチオ基、式ＹＨＮＢのアミノ基、およびアルキル基（これは、そのアリル基位置にプロトンが存在しないように、選択される）が挙げられる。好ましくは、ヘテロ原子の存在がジオキセタンの形成を促進するので、少なくとも１個のＲ基は、ＹＯＢまたはＹＳＢ基である。Ｒ基の各々は、任意の置換基で置換され得、これらの置換基には、ハロゲン、アミン、アルコキシ、ヘテロアリールなどか挙げられる。Ｒ基の１個またはそれ以上は、補助蛍光体（例えば、アントラセン、ローダミン、フライオエスシン（ｆｌｙｏｅｓｃｉｎ）、クマリン、エリトロシン、アクリジン、ピレン、スチルベン、ニトロベンゾキサジアゾール、キノリン、アシドアクリジン、カルバゾール、フリオレセント（ｆｌｙｏｒｅｓｃｅｎｔ）シアニン、カルボシアニン、ピリジニウム塩、オキソノール、レゾルチン、およびこれらの基の誘導体だけでなく、フェニルおよびナフチル部分）を含有し得る。親油性部分（Ｇ）および電気泳動基（Ｅ）は、このオレフィンに、直接またはＲ基の２個を介して、結合できる。
【００７１】
さらに、Ｒ基の１個は、保護基を有し得、これは、もし除去されるなら、その前駆体から形成されたジオキセタン基の分解を誘発する。これらには、対応する酵素不安定性基質（例えば、ホスフェート（例えば、非酵素性化学物質（例えば、塩基、電子供与体など（例えばシリル保護ＯＨ基））の添加によって除去され得る基））が挙げられる。
【００７２】
それゆえ、本発明の１局面では、Ｌは、チオエーテルまたはそのセレン類似物；またはオレフィン（これは、炭素−炭素二重結合を含有し、ここで、二重結合のオキソ基への開裂により、電気泳動タグＥが放出される）である。例証的なオレフィンには、ビニルスルフィド、ビニルエーテル、エナミン、イミン（これは、その炭素原子にて、α−メチン（ＣＨ、少なくとも１個の水素原子を有する炭素原子）で置換されている）が挙げられ、この場合、このビニル基は、環内にあり得、このヘテロ原子は、環内にあり得るか、または環状オレフィン性炭素原子にて置換され得、このオレフィン性炭素原子に結合したヘテロ原子が、少なくとも１個で、そして４個まで存在している。得られたジオキセタンは、自然に分解するか、室温より高く（通常、約７５℃以下）加熱することにより、酸または塩基と反応させることにより、または光増感剤の存在下または非存在下にて光活性化することにより、分解され得る。このような反応は、以下の代表的な参考文献に記述されている：Ａｄａｍ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４，１２０６−１２０９，１９７２，Ａｎｄｏ，ら，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９７２，４７７−８，Ａｎｄｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２９，１５０７−１３，１９７３，Ａｎｄｏら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６，６７６６−８，１９７４，ＡｎｄｏおよびＭｉｇｉｔａ，前出、９７，５０２８−９，１９７５，ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＴｅｒａｏ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２１，１７３５−３８，１９７５，ＡｎｄｏおよびＷａｔａｎａｂｅ，前出、４７，４１２７−３０，１９７５，Ｚａｋｌｉｋａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３０，３５−４４，１９７９、ならびにＡｄａｍら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．３６，７８５３−４，１９９５。また、米国特許第５，７５６，７２６号を参照。
【００７３】
ジオキセタンの形成は、一重項酸素を活性化オレフィン（これは、そのオレフィンの一方の炭素原子にて、電気泳動タグ（ｅＴａｇ）で置換されており、また、他方の炭素原子にて、親油性結合部分で置換されている）と反応させることにより、得られる。例えば、米国特許第５，８０７，６７５号を参照のこと。これらの開裂可能連鎖は、以下の式により、描写され得る：
−Ｗ−（Ｘｎ）Ｃα＝Ｃβ（Ｙ）（Ｚ）−
ここで、Ｗは、結合、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｍ（安定な共有結合を形成する金属を意図している））または官能基（例えば、カルボニル、イミノなど）であり得、ＸまたはＣαに結合され得る；
少なくとも１個のＸは、脂肪族、芳香族、脂環族または複素環であり、そしてヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を介して、Ｃαに結合され、そして他のＸは、同一または異なり得、さらに、水素、脂肪族、芳香族、脂環族または複素環であり得、通常、芳香族または芳香族性複素環であり、ここで、１個のＸは、Ｙと一緒になって、環を形成し得、それらは、一般に、水素以外のものが約１個〜２０個の炭素原子、通常、１個〜１２個の炭素原子、さらに普通には、１個〜８個の炭素原子である場合に結合され、一方のＸは、０個〜６個、通常、０個〜４個のヘテロ原子に対して、他のＸは、少なくとも１個で、そして、６個まで、通常１個〜４個のヘテロ原子を有する；
Ｙは、Ｘの定義に入り、これは、通常、ヘテロ原子を介して、Ｃβに結合され、そして指示されているように、Ｘと一緒になって、複素環を形成し得る；
Ｚは、通常、上記のように、約４個〜１２個、通常、４個〜１０個の炭素原子および０個〜４個のヘテロ原子を有する芳香族（複素環芳香族を含めて）であり、これは、上記のように、直接またはヘテロ原子を介して、Ｃβに結合される；
ｎは、この電気泳動部分がＣαまたはＸに結合されるかどうかに依存して、１または２である；
ここで、ＹおよびＺの１個は、例えば、親油性部分Ｇへの連結基として働くか連結基を含めることにより、親油性部分に結合するかまたは親油性部分に結合される官能性を有する。
【００７４】
好ましくは、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、開裂時に電気泳動タグＥが下記のサイズ限度内に入るように、選択される。
【００７５】
式では描写されていないものの、１個またはそれ以上の電気泳動部分を１個または両方のＸに結合させることにより、単一の分子内に複数の電気泳動部分が存在し得る。
【００７６】
例証的な開裂可能連鎖には、Ｓ（ｅＴａｇ）−３−チオアクリル酸、Ｎ（ｅＴａｇ）−、Ｎ−メチル−４−アミノ−４−ブテン酸、Ｏ−（ｅＴａｇ）−、３−ヒドロキシアクロレイン、Ｎ−（４−カルボキシフェニル）−２−（ｅＴａｇ）−イミダゾール、オキサゾールおよびチアゾールが挙げられる。
【００７７】
Ｎ−アルキルアクリジニル誘導体（これは、その９位置で、次式の二価基で置換されている）もまた、重要である：
−（ＣＯ）Ｘ１（Ａ）−
ここで：
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＳｅ（通常、最初の３つのうちの１つ）からなる群から選択されるヘテロ原子である；そして
Ａは、少なくとも２個の炭素原子、通常、６個以下の炭素原子を有する鎖であり、これは、電気泳動タグレポーターで置換されており、この場合、好ましくは、Ａの他の原子価は、水素で満たされるが、この鎖は、他の基（例えば、アルキル、アリール、複素環基など）で置換され得る。Ａは、一般に、１０個以下の炭素原子を有する。
【００７８】
また、複素環化合物（例えば、ジヘテロシクロペンタジエンであって、これは、置換イミダゾール、チアゾール、オキサゾールなどで代表される）も、重要であり、この場合、これらの環は、通常、少なくとも１個の芳香族基で置換され、ある場合には、この電気泳動タグレポーターを放出するのに、加水分解が必要である。
【００７９】
テルル（Ｔｅ）誘導体もまた重要であり、この場合、Ｔｅは、Ｔｅ原子に対してβ位置の水素原子を有するエチレン基に結合されており、ここで、このエチレン基は、脂環式環または複素環の一部であり、それは、オキソ基を有し得、好ましくは、芳香環に縮合され、そしてＴｅの他の原子価は、この電気泳動タグレポーターに結合される。これらの環は、クマリン、ベンゾキサジン、テトラリンなどであり得る。
【００８０】
いくつかの代表的な開裂可能連鎖およびそれらの開裂生成物は、表１および図３で図示されている。チアゾール開裂可能連鎖である「−ＣＨ２−チアゾール−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−タンパク質」は、「−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ」部分を備えた電気泳動タグを生じる。好ましくは、ｎは、１〜１２、さらに好ましくは、１〜６の範囲である。オキサゾール開裂可能連鎖である「−ＣＨ２−オキサゾール−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−タンパク質」は、「−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ」部分を備えた電気泳動タグを生じる。オレフィン開裂可能連鎖は、上記電気泳動プローブ実施態様である「Ｇ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」に関連して示され、Ｄは、フルオレセイン染料である。このオレフィン開裂可能連鎖はまた、他の実施態様で使用され得る。例示したオレフィン連鎖の開裂により、以下の形状の電気泳動タグを生じる：「Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｍ−Ｄ」（ここで、「Ｒ」は、上で提供した電気泳動タグＥの一般的な記述の範囲内の任意の置換基であり得る）。好ましくは、Ｒは、電子供与性基である。例えば、Ｕｌｌｍａｎらの米国特許第６，２５１，５８１号；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ＝ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；など。さらに好ましくは、Ｒは、１個〜８個の炭素原子および０個〜４個のヘテロ原子（これらは、Ｏ、ＳおよびＮからなる群から選択される）を有する電子供与性基である。さらに好ましくは、Ｒは、−Ｎ（Ｑ）２、−ＯＱ、ｐ−［Ｃ６Ｈ４Ｎ（Ｑ）２］、フラニル、ｎ−アルキルピロリル、２−インドリルなどであり、この場合、Ｑは、アルキルまたはアリールである。図３のオレフィン開裂可能連鎖に対するさらなる参照では、置換基「Ｘ」および「Ｒ」は、開裂可能連鎖Ｌを記述している上式の置換基「Ｘ」および「Ｙ」と同等である。特に、Ｘは、好ましくは、モルホリノ、−ＯＲ’または−ＳＲ”であり、この場合、Ｒ’およびＲ”は、１個〜８個の炭素原子および０個〜４個のヘテロ原子（これらは、Ｏ、ＳおよびＮからなる群から選択される）を有する脂肪族、芳香族、脂環族または複素環である。好ましいチオエーテル開裂可能連鎖は、図３で図示されており、これは、「−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−」の形状を有し、ここで、ｎは、２〜１２の範囲、さらに好ましくは、２〜６の範囲である。チオエーテル開裂可能連鎖は、図４で示した前駆体化合物によって、親油性部分Ｇおよび電気泳動タグＥに結合され得る。親油性部分Ｇのアミノ基に結合するために、その末端ヒドロキシルは、通常の化学作用により、ＮＨＳエステルに変換される。このアミノ基との反応および結合後、そのＦｍｏｃ保護基は、除去されて、遊離アミンを生成し、これは、次いで、この電気泳動タグのＮＨＳエステルと反応される。
【００８１】
本発明の他の局面では、開裂部分Ｌは、「酵素開裂可能ペプチド」であり、これは、ペプチダーゼにより認識されるアミノ酸配列を含むペプチドである。酵素開裂可能ペプチドは、代表的には、約２個〜約２０個のアミノ酸長であるが、脂質二重層の表面の上に投射するのに十分な長さである。このようなペプチドは、当業者に周知であり、例えば、以下のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｌａ−Ａｌａ−、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−（配列番号２）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−（配列番号３）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号４）、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号５）、Ｓｅｒ−Ｓ  カルボキシル糖−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号６）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（配列番号７）、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（配列番号８）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−（配列番号９）、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−（配列番号１０）、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ（配列番号１１）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄｐａ−ＮＨ２（配列番号１２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１３）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−（配列番号１５）。
【００８２】
（電気泳動基（Ｅ））
本発明の１局面では、電気泳動タグＥは、水溶性有機化合物であり、これは、これらの活性種（特に、一重項酸素）に対して安定であり、そして検出基またはレポーター基を含む。そうでなければ、Ｅは、大きさおよび構造が大きく変わり得る。好ましくは、Ｅは、中性ｐＨで電荷を運び、そして約１５０〜約１０，０００ダルトン、さらに好ましくは、約１５０〜約５０００ダルトン、最も好ましくは、約１５０〜２５００ダルトンの範囲の分子量を有する。Ｅの好ましい構造は、以下でさらに詳細に記述する。好ましくは、この検出基は、電気化学信号、蛍光信号または発色信号を発生する。最も好ましくは、この検出基は、蛍光信号を発生する。本発明の組成物は、複数の電気泳動タグを含有し、これらは、本発明の多重化アッセイを実行するために、共に使用され得る。好ましくは、組成物中の複数の電気泳動タグは、少なくとも５個、さらに好ましくは、少なくとも１０個である。さらにより好ましくは、複数の電気泳動タグは、５個〜２００個の範囲、さらに好ましくは、５個〜１００個または５個〜７５個の範囲、または５個〜５０個または１０個〜３０個の範囲である。好ましくは、複数の組成物内の電気泳動タグは、それぞれ、タグの同じ基の他のメンバーに対して、独特の電荷−質量比および／または独特の光学特性のいずれかを有する。好ましくは、この光学特性は、蛍光特性（例えば、発光スペクトル、蛍光寿命など）である。さらに好ましくは、この蛍光特性は、発光スペクトルである。例えば、複数のタグの各電気泳動タグは、同じ蛍光発光特性を有し得るが、各々は、独特の電荷−質量比によって、互いとは異なる。他方、複数のタグの２個またはそれ以上の電気泳動タグは、同じ電荷−質量比を有し得るが、それらは、独特の蛍光特性（例えば、スペクトル的に分離可能な発光スペクトル）を有し、その結果、これらの複数のタグの全てのメンバーは、電気泳動分離と蛍光測定との組合せにより、識別可能である。
【００８３】
好ましくは、複数のタグ内の電気泳動タグは、電気泳動分離および蛍光により、検出される：好ましくは、実質的に同じ蛍光特性を有する電気泳動タグは、分離条件下にて、電気泳動図内で、別個のピークが形成されるように、異なる電気泳動移動度を有する。隣接するピークの異なり具合、すなわち、重複部分の欠如の尺度は、電気泳動解像度であり、これは、隣接するピークの最大値間の距離を、これらのピークの２つの標準偏差のうちの大きい方の４倍で割った値である。好ましくは、隣接ピークは、少なくとも１．０、さらに好ましくは、少なくとも１．５、最も好ましくは、少なくとも２．０の解像度を有する。所定の分離検出システムでは、所望の解像度は、そのメンバーが少なくともピーク分離量で異なる電気泳動移動度を有する複数の電気泳動タグを選択することにより得られ得、このような量は、当業者に周知のいくつかの要因に依存しており、これらの要因には、信号検出システム、蛍光部分の性質、これらのタグの拡散係数、シービングマトリックスの存在または不在、電気泳動装置の性質（例えば、チャンネルの存在または不在、分離チャンネルの長さなど）が挙げられる。好ましくは、本発明の複数の電気泳動タグは、通常のシービングマトリックスの存在下または不在下のいずれかにて、通常の毛細管電気泳動装置により、分離される。代表的な毛細管電気泳動装置には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３１０、３１００および３７００；Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）モデルＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００または４０００；ＳｐｅｃｔｒｕＭｅｄｉｘ遺伝子分析装置などが挙げられる。好ましくは、このような通常の装置では、複数の電気泳動タグの電気泳動移動度は、少なくとも１％、さらに好ましくは、少なくとも１〜１０％の範囲で、異なる。
【００８４】
電気泳動移動度は、ｑ／Ｍ２／３に比例しており、この場合、ｑは、その分子の電荷であり、そしてＭは、この分子の質量である。望ましくは、最も近い電気泳動標識間での定量条件下における移動度の差は、少なくとも約０．００１、通常、０．００２、さらに普通には、少なくとも約０．０１であり、０．０２またはそれ以上であり得る。
【００８５】
電気泳動タグＥの好ましい構造は、（Ｍ、Ｄ）であり、この場合、Ｍは、移動度調節部分であり、そしてＤは、検出部分である。「（Ｍ、Ｄ）との表記は、Ｍ部分およびＤ部分の順序が、いずれかの部分が開裂可能連鎖Ｌに隣接できるようであり得ることを示すために、使用される。すなわち、「Ｇ−Ｌ−（Ｍ、Ｄ）」とは、以下の２つの形状のいずれかの電気泳動プローブを示す：「Ｇ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」。
【００８６】
検出部分Ｄは、蛍光標識または染料、発色標識または染料、電気化学標識などであり得る。好ましくは、Ｄは、蛍光染料である。本発明で使用される代表的な蛍光染料には、水溶性ローダミン染料、フルオレセイン、４，７−ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン染料およびエネルギー移動染料が挙げられ、これらは、以下の参考文献で開示されている：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，８ｔｈ  ｅｄ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２００２）；Ｌｅｅら、米国特許第６，１９１，２７８号；Ｌｅｅら、米国特許第６，３７２，９０７号；Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第６，０９６，７２３号；Ｌｅｅら、米国特許第５，９４５，５２６号；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：２８１６−２８２２（１９９７）；Ｈｏｂｂ，Ｊｒ．，米国特許第４，９９７，９２８号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３１８，８４６号；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，米国特許第３，９３２，４１５号；Ｅｃｋｅｒｔら、米国特許第２，１５３，０５９号；Ｅｃｋｅｒｔら、米国特許第２，２４２，５７２号；Ｔａｉｎｇら、国際特許公報ＷＯ０２／３０９４４など。さらに特定の代表的な蛍光染料には、５−および６−カルボキシローダミン６Ｇ；５−および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−および６−カルボキシテトラメチルローダミン、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−および６−カルボキシ４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインが挙げられる。最も好ましくは、Ｄは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
【００８７】
Ｍは、一般に、規定の電気泳動システムにて、特定の電荷−質量比（すなわち、特定の電気泳動移動度）を有するかまたは有するように設計されている化学基または部分である。移動度調節部分の代表的な種類は、以下で述べる。この移動度調節部分は、質量調節領域および／または電荷調節領域または信号領域（これは、質量調節領域および電荷調節領域の両方として、作用する）を有し得る。上で述べたように、Ｄは、代表的には、複数または一組の異なる電気泳動プローブのうちで、共通しており、また、プローブの組間で異なっていてもよいが、放出された電気泳動タグの独特の電気泳動移動度に寄与している。好ましくは、放出された電気泳動タグ（ｍ、ｄ）は、約−０．００１〜０．５の範囲の電荷／質量比を有する。
【００８８】
Ｍの大きさ、構造および組成は、広く変えることができる。１つの組の特定のＭの選択に影響を与える設計因子には、（ｉ）所望の反応緩衝液および電気泳動分離媒体での溶解度、（ｉｉ）開裂剤の性質およびＭがその作用に対して安定かどうか、（ｉｉｉ）Ｍが、（Ｍ、Ｄ）にて、同じ組の電気泳動タグに対して異なる電荷／質量比を与えるかどうか、（ｉｖ）Ｍが、（Ｍ、Ｄ）にて、特定の電気泳動器具または特定の電気泳動分離媒体にて分離を可能にする電気泳動移動度を与えるかどうかなどの因子が挙げられる。１局面では、Ｍは、１個〜５００個の原子からなる有機部分であり、これらの原子は、炭素、酸素、水素、イオウ、窒素、リンおよびホウ素からなる群から選択される。好ましくは、このようなＭは、１個〜３００個の原子、さらに好ましくは、１個〜２００個の原子からなる。酸基が存在している場合、この移動度調節部分が存在している媒体のｐＨに依存して、種々のカチオンが酸基と会合し得る。これらの酸は、有機または無機であり得、それらには、カルボキシル、チオノカルボキシル、チオカルボキシル、ヒドロキサム酸、ホスフェート、ホスファイト、ホスホネート、ホスフィネート、スルホネート、スルフィネート、ホウ酸、硝酸、亜硝酸などが挙げられる。正電荷については、置換基には、アミノ（アンモニウムを含めて）、ホスホニウム、スルホニウム、オキソニウムなどが挙げられ、この場合、置換基は、一般に、約１個〜６個の炭素原子（ヘテロ原子１個あたりの炭素原子の全数）、通常、約１２個未満の炭素原子、通常、約９個未満の炭素原子を有する脂肪族基である。その側鎖には、アミン、アンモニウム塩、水酸基（フェノール性基を含む）、カルボキシル基、エステル、アミド、ホスフェート、複素環が挙げられる。Ｍは、ホモ−オリゴマーまたはヘテロ−オリゴマーであり得、これは、同一または異なる化学的特性を有する異なるモノマー（例えば、ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有する。
【００８９】
荷電した移動度調節部分は、一般に、負電荷または正電荷のみを有するが、特に、この移動度調節部分が結合する領域が荷電されており反対の電荷を有する場合、電荷の組合せを有し得る。これらの移動度調節部分は、オリゴマー形成のための異なる官能基を提供しかつ電荷を運ぶ単一のモノマーを有し得る。あるいは、２種のモノマーが使用され得る。置換ジオールが使用され得、この場合、これらの置換基は、荷電した二塩基酸である。このようなオリゴマーの例には、ジオールまたはジアミンの組合せ（例えば、２，３−ジヒドロキシプロピオン酸、２，３−ジヒドロキシコハク酸、２，３−ジアミノコハク酸、２，４−ジヒドロキシグルタル酸など）がある。これらのジオールまたはジアミノ化合物は、二塩基酸で連結でき、それらの二塩基酸には、上で示した無機二塩基酸だけでなく、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、炭酸などのような二塩基酸が挙げられる。エステルを使用する代わりに、アミドが使用され得、また、アミノ酸またはジアミンおよび二酸が使用され得る。あるいは、これらのヒドロキシルまたはアミンは、アルキレン基またはアリーレン基と連結され得る。
【００９０】
電荷を提供するか電荷を提供するように改変し得る置換基を有するモノマーを使用することにより、所望の電荷−質量比を有する移動度調節部分が提供され得る。例えば、セリンまたはスレオニンを使用することにより、それらの水酸基は、ホスフェートで改変され、負に荷電した移動度調節部分が提供され得る。アルギニン、リシンおよびヒスチジンを使って、正に荷電した移動度調節部分が提供される。オリゴマー形成は、適当な大きさの移動度調節部分を提供するために、通常の様式で、実行され得る。異なる移動度調節部分は、異なるオーダーのオリゴマー、一般に、１個〜２０個のモノマー単位、さらに普通には、約１個〜１２個のモノマー単位を有し得、この場合、１単位とは、１個または２個の異なるモノマーを有し得る繰り返し単位と解釈される。大抵の場合、オリゴマーは、核酸標的結合領域以外のものと併用される。これらのモノマー単位の多官能性は、他の部分と共役するのに使用され得る末端において、官能性を与え、その結果、反応に利用可能な官能性は、異なる官能性を与えるのに使用され得る。例えば、そのカルボキシル基を置換するためにアミノエチルチオールを備えたカルボキシル基は、活性化オレフィンと反応させるために、チオール官能基と併用できる。
【００９１】
約１個〜約３個の電荷を有するモノマーを使用することにより、分子量の変化と共に移動度を変化させるのに、少ない数のモノマーが使用できる。約２個〜４個の各官能基を有するポリオールポリカルボン酸（例えば、酒石酸、２，３−ジヒドロキシテレフタル酸、３，４−ジヒドロキシフタル酸、３，４−ジヒドロキシフタル酸など）が特に重要である。追加負電荷を提供するために、これらのモノマーは、二酸（例えば、リン酸誘導体）でオリゴマー化されて、リン酸ジエステルを形成し得る。あるいは、これらのカルボン酸は、ジアミンと併用されて、ポリアミドを形成できるのに対して、これらの水酸基は、エステル（例えば、リン酸エステル）またはエーテル（例えば、グリコール酸のエーテル）などを形成するのに使用できる。その移動度を変えるために、異なる分子量の種々の脂肪族基（例えば、ポリメチレン基、ポリオキシアルキレン基、ポリハロ脂肪族基または芳香族基）、ポリオール（例えば、糖）が使用され得、この場合、その移動度は、少なくとも約０．０１、さらに普通には、少なくとも約０．０２、さらに普通には、少なくとも約０．５だけ異なる。
【００９２】
別の局面では、（Ｍ、Ｄ）部分は、組合せライブラリの作成で使用される化学足場から構成される。例えば、以下の参考文献は、多様な移動度調節部分を生成する際に有用な足場化合物を記述している：ペプトイド（ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５、１９９１年１２月２６日）、コード化したペプチド（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２、１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０００９１、１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソメレ（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｅｓ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド）（Ｈｏｂｂｓ  ＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９−６９１３（１９９３）、ビニル様（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース足場を備えた非ペプチダルペプチドミメティック（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ、Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、小化合物ライブラリの類似の有機合成酵素（Ｃｈｅｎ、Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ、Ｃ．Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｄ．Ａ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））；Ｃｈｅｎｇら、米国特許第６，２４５，９３７号；Ｈｅｉｚｍａｎｎら、「Ｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．２：１７１−１７４（１９９７）；Ｐａｖｉａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４：６５９−６６６（１９９６）；Ｏｓｔｒｅｓｈら、米国特許第５，８５６，１０７号；Ｇｏｒｄｏｎ、Ｅ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５（１９９４）など。好ましくは、この局面では、Ｄは、足場上の置換基であり、そしてＭは、この足場の残りである。
【００９３】
さらに別の局面では、（Ｍ、Ｄ）部分は、１個またはそれ以上の同一または異なる通例または市販の連結試薬、架橋試薬および標識試薬から構成され、これらは、この合成の一部または全部について、特に、市販のＤＮＡまたはペプチド合成機を使用して、容易なアセンブリを可能にする。この局面では、（Ｍ、Ｄ）部分は、通常、ホスホジエステル結合およびアミド結合で連結されたサブユニットから構成される。アミド結合を形成する代表的な前駆体には、例えば、ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から市販されているようなＦｍｏｃ−またはＢｏｃ−保護アミノ酸前駆体およびそれらの誘導体が挙げられる。ホスホジエステル結合を形成する代表的な前駆体には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護ヘキサエチレングリコールホスホラミダイト、６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、２−［２−（４−モノメトキシトリチル）アミノエトキシ］エチル−（２−シアノエチル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、５’−フルオレセインホスホラミダイト、５’−ヘキサクロロ−フルオレセインホスホラミダイト、５’−テトラクロロ−フルオレセインホスホラミダイト、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、３（４、４’ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１−［５−（４、４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオレノメトキシカルボニルオキシペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、スクシンイミジルトランス４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル���セチルチオアセテート、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ−スクシンイミジルエステル、５−および６−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル、ビス−（４−カルボキシピペリジニル）スルホンローダミンジ（スクシンイミジルエステル）、５−および６−（（Ｎ−（５−アミノペンチル）アミノカルボニル）テトラメチルローダミン、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；Ｎ−ｇ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）；４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）および類似の試薬。上記試薬は、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌおよび類似の試薬業者から市販されている。通常の合成スキームでの上記試薬の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６））。特に、Ｍは、以下の試薬から構成され得る：ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−保護ヘキサエチレングリコールホスホラミダイト、６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、２−［２−（４−モノメトキシトリチル）アミノエトキシ］エチル−（２−シアノエチル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、３（４、４’ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１８−Ｏジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオレノメトキシカルボニルオキシペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプ��ピル）］−ホスホラミダイト、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；Ｎ−ｇ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）；および４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）。
【００９４】
Ｍはまた、公知の重合体サブユニット合成方法で調製された重合体鎖を含有し得る。選択した長さのポリエチレンオキシド含有鎖を形成する方法は、周知である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号を参照）。これらの方法（それは、規定した大きさのマルチサブユニット重合体単位を、直接または連結基を介して、互いにカップリングする工程を包含する）は、広範囲の重合体（例えば、ポリエーテル（例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポリエステル（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリペプチド、オリゴ糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリホスホネートおよびそれらのブロック共重合体（荷電または非荷電連結基で連結した複数のサブユニットの単位から構成された重合体を含めて））に適用できることが分かる。単独重合体に加えて、本発明に従って使用される重合体鎖には、選択した長さの共重合体（例えば、ポリエチレンオキシド単位をポリプロピレン単位と交互にした共重合体）が挙げられる。さらに、選択した長さおよびアミノ酸組成（すなわち、天然に生じるまたは人工のアミノ酸残基を含めて）のポリペプチドは、単独重合体または混合した重合体として、使用され得る。
【００９５】
別の局面では、（Ｍ，Ｄ）の検出部分は、エネルギー移動機構により、蛍光信号を生じる。好ましくは、この局面では、Ｄは、「Ｄ１−ｇ−Ｄ２」の形状を有し、ここで、Ｄ１およびＤ２は、分子の受容体−供与体対であり（例えば、Ｗｕら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８：１−１３（１９９４））、そしてｇは、Ｄ１およびＤ２を実質的に一定距離で維持する剛性リンカーである。剛性リンカーｇを選択する指針は、Ｗｕら（上で引用）および米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号；および同第６，００８，３７９号に見出され得る。Ｄ１またはＤ２のいずれかは、受容体であり得、他方は、その対の供与体分子であり得る。本発明と併用する代表的なエネルギー移動検出部分は、Ｌｅｅら、米国特許第５，９４５，５２６号；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：２８１６−２８２２（１９９７）；Ｔａｉｎｇら、国際特許公報ＷＯ０２／３０９４４などの参考文献で開示されている。好ましくは、剛性リンカーｇは、Ｄ１とＤ２の間の距離が１０〜１００オングストロームの範囲内で実質的に一定距離で維持されるように、選択される。その連鎖が一重項酸素の存在に対して安定であるという条件で、広範囲の連結基が使用され得る。好ましくは、Ｄ１およびＤ２は、フルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミン１１０、ローダミンＸ、テトラメチルローダミン、およびそれらのハロゲン化誘導体の組から選択される。さらに好ましくは、Ｄ１およびＤ２は、共に、フルオレセイン染料である。
【００９６】
１局面では、ｇは、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１およびＲ１−Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ−Ｒ３のいずれかから選択され得、後者は、Ｄ１およびＤ２に対するいずれかの配向で、存在している；ここで、Ｘ１は、Ｏ、ＳまたはＮＨである；Ｒ１は、（Ｃ１〜Ｃ５アルキルジル、Ｘ１、Ｃ（＝Ｏ））であり、括弧内の部分の任意の１個〜３個が任意の直線的な順序で配列されるようにされる；Ｒ２は、以下からなる群から選択される５〜６員環である：シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレン；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルジルである。
【００９７】
他の局面では、放出後、電気泳動タグＥは、次式により定義される：
Ａ−Ｍ−Ｄ
ここで：
Ａは、以下である：−Ｃ（＝Ｏ）Ｒであって、ここで、Ｒは、脂肪族、芳香族、脂環族または複素環であり、１個〜８個の炭素原子および０個〜４個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群から選択される；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ；−ＳＯ２Ｈ；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６Ｈ５）であって、ここで、ｎは、２〜１２の範囲である；
Ｄは、蛍光染料である；
Ｍは、上で記述したとおりであるが、但し、Ａ−Ｍ−Ｄの全分子量は、約１５０〜約５０００ダルトンの範囲内である。
【００９８】
他の局面では、複数の電気泳動タグが放出され、これらは、式（Ａ−Ｍ−Ｄ）ｍを有し、ここで、Ａ、ＭおよびＤは、上で定義したとおりであり、そしてｍは、２に等しいかそれより大きく約１０００未満の整数である。それゆえ、多重化には、ｍは、使用する異なる電気泳動タグの数に依存して、２、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれより大きくあり得る。好ましくは、ｍは、約５〜２０である。
【００９９】
好ましい局面では、Ｄは、フルオレセインであり、そしてＡ−Ｍ−Ｄの全分子量は、約１５０〜約２５００ダルトンの範囲である。
【０１００】
他の好ましい局面では、Ｄは、上記のように、「Ｄ１−ｇ−Ｄ２」の形状である。
【０１０１】
ある実施態様では、これらの電気泳動部分は、荷電している必要はなく、単に、質量が異なる。それゆえ、同一または類似のモノマーが使用でき、この場合、その官能基は、中性であるか、または中性にされる（例えば、カルボン酸のエステルおよびアミド）。また、これらの電気泳動部分は、同位体置換（例えば、２Ｈ、１８Ｏ、１４Ｃなど）により、変えられ得る。
【０１０２】
複数の電気泳動タグは、電荷を提供するためのオリゴペプチド、特に、２〜６個のモノマー、通常は２〜４個のモノマーのオリゴペプチドを含有し得、正電荷が、リジン、アルギニンおよびヒスチジンから生じるか、または負電荷が、アスパラギン酸およびグルタミン酸から生じるかの、いずれかである。もちろん、天然に存在するアミノ酸を使用する必要はなく、そして非天然または合成のアミノ酸（例えば、タウリン、リン酸置換されたセリンまたはスレオニン、Ｓ−ａ−スクシニルシステイン、ジアミンとアミノ酸との共オリゴマーなど）が使用され得る。
【０１０３】
本発明の１つの局面において、電荷を付与する部分は、好都合には、複数のアミノ酸からなるが、１〜５個の炭素原子を有するチオ酸および他のカルボン酸を含み得る。電荷を付与する部分は、１個の部分あたり約１〜約３０個、好ましくは、約１〜約２０個、より好ましくは、約１〜約１０個のアミノ酸を有し得、そしてまた、約１〜約３個のチオ酸または他のカルボン酸を含み得る。しかし、荷電していない部分領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎ）とともに使用される場合、荷電した部分領域は、一般に、約１〜約４個、頻繁には、約１〜約３個のアミノ酸を有する。上記のように、任意のアミノ酸（天然に存在するものおよび／または合成のもののいずれか）が使用され得る。
【０１０４】
別の局面において、Ｇ−Ｌ−Ｍ−Ｄは、以下の式によって表され得る：
Ｇ−Ｌ−（アミノ酸）ｎＢＬ＝−蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）
ここで、Ｌ＝は、結合、または水素以外の１〜２０原子の連結基であり、ｎは、１〜２０であり、そしてＬは、ポリペプチド結合部分に対する切断可能な結合である。この実施形態において、Ｇは、切断可能な結合によって、末端アミノ酸に結合する。この実施形態の一例は、説明によって、限定ではなく、蛍光体がフルオレセインであり、Ｌ＝が、フルオレセインのメタカルボキシルおよびリジンの末端アミン基を含むアミド結合の形態の結合であり、そしてＧがポリペプチド結合部分であるものである。
【０１０５】
別の局面において、移動度改変部分Ｍは、アルキレンまたはアラルキレン（約１〜約２個の脂肪族領域、および約１〜約２個の芳香族領域（一般に、ベンゼン）を有する、二価脂肪族を含む）の使用に依存し、ここで、この基は、置換されていても置換されていなくてもよく、通常は置換されておらず、約２〜約１６個、より通常には約２〜約１２個の炭素原子を有し得、ここで、移動度改変部分は、同じかまたは異なる蛍光体を、モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）に連結し得る。移動度改変部分は、カルボキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基で終結し得、エステルまたはアミドとして存在する。発蛍光団上の置換基を変化させることによって、少なくとも約５以上、通常は少なくとも約９の単位の質量を変化させ得、これによって、キャピラリー電気泳動における満足な分離を得ることが可能になる。さらなるバリエーションを提供するために、チオスクシンイミド基が使用され得、アルキレン基またはアラルキレン基を、窒素および硫黄において連結し、その結果、炭素原子の総数は、約２〜約３０個の範囲、より通常には、約２〜約２０個の範囲であり得る。上記基の代わりに、または上記基と組み合わせて、そして親水性を付加するために、アルキレンオキシ基が使用され得る。
【０１０６】
移動度改変部分の性質に加えて、すでに示されたように、標識の化学的特性および光学特性、エネルギー移動錯体の使用、移動度改変部分の化学的性質の変化（これは、移動度に影響を与え、例えば、フォールディング、溶媒および溶媒中のイオンとの相互作用などである）によって、多様性が達成され得る。本発明の１つの実施形態において、移動度改変部分は、オリゴマーであり得、ここで、移動度改変部分は、支持体上で合成され得るか、または適切な宿主においてクローニングもしくは発現によって産生され得る。好都合には、ポリペプチドは、１つのみのシステインまたはセリン／スレオニン／チロシン、アスパラギン酸／グルタミン酸、またはリジン／アルギニン／ヒスチジンが存在する位置（末端基以外）で産生され得、その結果、独特の官能基が存在し、この官能基は、異なって官能基化され得る。保護基を使用することによって、側鎖の官能基が、末端アミノ酸官能基と区別され得る。また、適切な設計によって、移動度改変部分上の異なる部位に存在する同じ官能基の間での優先的な反応を提供し得る。オリゴペプチドの調製のために合成を使用するかクローニングを使用するかは、移動度改変部分の長さに、かなりの程度で依存する。
【０１０７】
（電気泳動タグを用いて間接的に標識された親油性基）
上記で言及した通り、親油性部分は、以下の式によって例示される通りの捕捉部分および捕捉薬剤によって、切断可能な結合および電気泳動タグに対して間接的に結合され得る：
Ｇ−（ｂ１）（ｂ２）−（Ｌ−Ｅ）ｍ
ここで、Ｇ、Ｌ、Ｅおよびｍは、上記で定義した通りであり、ｂ１は、捕捉部分であり、ｂ２は、その対応する捕捉薬剤である。例示的な捕捉部分としては、ビオチン、イミノビオチン、ジアミノビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノールなどが挙げられる。ビオチンについての例示的な捕捉薬剤は、アビジンまたはストレプトアビジンである。ジゴキシゲニン、フルオレセインおよびジニトロフェノールについての例示的な捕捉薬剤としては、特異性モノクローナル抗体が挙げられる。好ましくは、この捕捉部分はビオチンであり、そして捕捉薬剤は、アビジンまたはストレプトアビジンのいずれかである。
【０１０８】
本発明の１つの局面では、この親油性基は、ビオチンに対してカップリングされ得る。次いで、この親油性ビオチン化合物は、以下の通り、二重層への取り込みにより、細胞、膜、リポソームなどに結合され得る。このようにして得られた標識細胞は、ビオチン結合部分（例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体）と接触され得る。１つの局面では、このビオチン結合部分は、電気泳動タグに共有結合され得る。別の局面では、このビオチン結合部分は、切断可能なリンカーを介して電気泳動タグに結合され得る。なお別の局面では、このビオチン結合部分は、第２ビオチンと接触され得、ここで、電気泳動部分は、切断可能なリンカーを介して第２ビオチンへと結合される。ビオチン結合部分への親油性ビオチンの結合は、以下に詳述するように、切断可能な薬剤を用いて切断可能なリンカーを切断し、それにより電気泳動タグを放出させることにより決定され得る。別の局面では、この標識された細胞、膜、リポソームなどは、エンドサイトーシス誘導剤に曝露され得、表面上に露出した残りの電気泳動タグは、切断剤で切断され得、そして放出可能なタグが検出および定量され、それにより、エンドサイトーシスの程度に関する情報が提供され得る。
【０１０９】
この親油性基は、ビオチンを用いて誘導体化され得る。ビオチンは、低分子量の、光学活性有機酸であり、その活性形態はｄ異性体である。ビオチン以外には、ビオシチン、ビオチンのＤ−スルホキシド、ビオチンのＬ−スルホキシド、ビオチンスルファンまたはデスチオビオチンが本発明において用いられ得る。ビオチンまたはそのアナログは、当該分野で公知の方法により、エステル結合、エーテル結合、アミド結合を介して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを介してなどにより親油性基に結合され得る。ビオチン化親油性基（ビオチン−Ｇ）は、膜二重層における配向および位置に関して非結合体化親油性基の基本的特徴を保持する。従って、このビオチン化親油性基は、レセプター（例えば、Ｇタンパク質共役レセプター）と、リガンド（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）との相互作用を研究するために用いられ得る。
【０１１０】
本明細書中に参考として援用される１つの局面では、ビオチン化親油性基（ビオチン−Ｇ）は、ビオチン結合部分に共有結合する。このビオチン結合部分は、ストレプトアビジンまたはアビジンであり得る。本発明のこの局面では、第１工程は、細胞膜、膜、リポソームまたはミセルへのビオチン−Ｇの取り込みを包含し、続いて第２工程は、このビオチン−Ｇへのアビジンまたはストレプトアビジンの結合である。ストレプトアビジン上には４つのビオチン結合部位が存在し、このことにより、ビオチンを含む細胞、膜またはリポソームは、過剰のビオチン−Ｇにおいて、ストレプトアビジンと凝集する。１つの局面では、膜またはリポソームに取り込まれるビオチン−Ｇの量は、アビジンまたはストレプトアビジンのカップリングを最大にしながらもこの凝集を防止するために力価測定され得る。ビオチン−Ｇについての値は、膜もしくはリポソームの約０．０５〜約０．８モル％であるか、またはより好ましくは、膜もしくはリポソームの約０．１〜約０．５モル％の範囲であり得る。別の局面では、必要に応じてＬ−Ｅで誘導体化したアビジンまたはストレプトアビジンと接触させた標識細胞膜は、別のビオチンと接触され得る。好ましくは、この第２ビオチンは、Ｌ−Ｅで誘導体化される。従って、細胞膜は、ビオチン−Ｇで標識され得、アビジンまたはストレプトアビジンと接触されて細胞−ビオチン−アビジン複合体を提供し得、次いでこの複合体は、電気泳動タグに結合された、ビオチン化された切断可能なリンカーにさらに接触され得る。ビオチン化されたこの切断可能なリンカーは、アビジンまたはストレプトアビジンに結合した切断可能なリンカーと同じであっても異なっていてもよい。従って、異なる条件下で切断される複数の切断可能なリンカーは、同じ細胞膜、リポソームまたはミセルとの異なる反応を研究するために用いられ得る。この形態のビオチン化電気泳動タグであるビオチン−Ｌ−Ｅは、本明細書中に参考として援用される、２００３年１月１６日出願の米国特許公開２００３／００１３１２６号に開示される。
【０１１１】
上記のプロセスは、図１Ｃに図示される。細胞（１３０１）は、親油性部分を有するビオチン（１３０４）（以下でビオチン−Ｇと呼ばれる）と合わされて、遊離のビオチンを含む膜を有する細胞（１３０６）の集団を形成する。この集団に、アビジンまたはストレプトアビジン（１３１０）を添加して、細胞表面上でビオチン−アビジン複合体またはビオチン−ストレプトアビジン複合体（１３１２）を形成させる。次いで、これらの細胞を、ビオチン化電気泳動タグと合わせて（１３１３）、この細胞または膜表面上に複合体（１３１２）を形成させる。
【０１１２】
（複数の電気泳動タグ）
個々の標的分子を含む結合事象のために、複数の電気泳動タグレポーターの放出を有することが、有利であり得る。ある意味において、これは、シグナルの増幅を生じる。親油性部分が、複数の結合部位（例えば、Ｌ−Ｅが結合され得る複数の官能基）を有する場合、複数の電気泳動タグが、構造Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍの化合物を提供するように結合され得る。例えば、各親油性部分（Ｇ）は、１分子当たり２〜１０００分子、好ましくは２〜３００分子、より好ましくは２〜１００分子、なお好ましくは約２〜約１０分子の検出可能な部分の放出を生じ得る部分に結合していてもよい。放出される各電気泳動タグ（Ｅ）は、同じであってもよく、または異なるＥ各々が検出可能なように異なっていてもよい。切断可能な部分が複数の結合部位を有する別の局面において、複数の電気泳動タグが、その結合部位に結合され得、それによって、構造Ｇ−Ｌ−（Ｅ）ｍの化合物を提供する。
【０１１３】
本発明の別の局面において、電気泳動タグ部分は、ハブに切断可能に結合され、そのハブには、親油性部分（Ｇ）もまた結合される。そのハブ核は、複数の官能基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ、エチレン、アルデヒドなど）を連結用部位として有する、多官能性材料（通常は、ポリマー）であり得る。この局面の化合物は、式−Ｐ−（Ｌ−Ｅ）ｍを有し、ここで、Ｐは、上記ハブを含む多官能性材料である。ハブ上に官能基は、結合されるべきＬ−Ｅ部分またはＧ部分上の官能基と反応性であるべきである。いくつかの官能基は、望ましくない副反応に関与するのに抵抗する能力が原因で、他のものよりも好ましい。上記ハブ核は、通常は、少なくとも約３５，０００の分子量であり、約１，０００万以上の分子量であり得るが、通常は、約６００，０００未満であり、より通常は、約３００，０００未満である。例示的ハブ核としては、多糖、ポリペプチド（例えば、ポリリジン）、ポリヌクレオチド、イオン交換樹脂などが挙げられる。このハブは、１つの局面において、分枝状リンカーであり、これは、Ｌ−Ｅ部分の結合用の複数の部位を有する。従って、このハブは、親油性部分を結合するための結合部位と、複数のＬ−Ｅ部分の結合用の複数の部位とを有する。別の局面において、例えば、分枝状リンカーが、親油性部分Ｇに共有結合したビオチンに結合した、ストレプトアビジンまたは同様の多価分子を含み得る。複数の電気泳動タグが、切断可能な結合によって、ビオチン化ポリマー骨格（例えば、アミノ−デキストラン）に結合される。この骨格は、その後、利用可能なビオチン結合部位を介して、膜結合型ストレプトアビジンに結合される。
【０１１４】
１つの実施形態において、上記ハブ核は、親水性ポリマーであり、一般的には、複数の部分の結合を可能にするための複数の官能基を備える付加ポリマーまたは縮合ポリマーである。本発明の試薬のために有用なポリマーの一種類は、親水性ポリマー（例えば、多糖ポリマー）を包含する。多糖（例えば、デキストラン、セファロース、ポリリボース、ポリキシロースなど）が、使用され得る。別の種類のポリマーは、親水性基であるかもしくは親水性基へと誘導体化され得る、置換エチレン型モノマーもしくは置換ブタジエン型モノマー（プロピレンのような短鎖不飽和モノマーが挙げられる）の付加重合から生じるポリマーである。そのエチレンに結合され得る適切な親水性基としては、ヒドロキシ、カルボキシ、ならびにそれらのエステルおよびアミド、アミンなどが挙げられる。アクリル酸モノマーが使用される場合、その酸は、重合の前または後に、適切な反応性基へと誘導体化され得る。従って、例えば、エチレングリコールとアクリル酸とから形成されるエステルは、ｅ−タグプローブの成分へと誘導体化するためのヒドロキシル基を提供する。他の適切なポリマーとしては、ポリアリルアミンおよびポリアリルアルコール（例えば、ポリビニルアルコール）が挙げられる。単一のモノマーから誘導されるポリマーを利用することに加えて、混合ポリマーもまた、使用され得る。この場合、親水性は、非反応性成分（例えば、ポリエチレングリコール）によって提供され得、それはさらに、ｅ−タグプローブの成分との反応のための適切な官能基を有するモノマーと重合される。そのようなポリマーは、ポリエチレングリコールとポリポリビニルアルコールとのコポリマーである。ハブのある具体的な例は、デキストランであり、そのデキストランには、デキストラン一分子当たり、約１０分子〜約３００分子のＥ−タグ部分が結合され得る。
【０１１５】
従って、本発明において、１以上のハブ分子は、親油性部分（Ｇ）によって脂質二重層に結合され得る。この電気泳動タグ部分は、切断可能な連結によってハブに結合され得る。切断誘導試薬に曝すと、複数の電気泳動タグレポーターは、その後の検出のために放出される。単一の電気泳動タグ部分または複数の電気泳動タグ部分が存在し得、一般に、約１〜約１０５の範囲、より通常は、約１〜約３００の範囲、より具体的には、約１〜約２０の範囲である。脂質二重層に結合される電気泳動タグ部分の数は、必要とされる感度、電気泳動タグ部分の溶解度、複数の電気泳動タグ部分のアッセイに対する影響などに依存する。
【０１１６】
（切断剤）
上記のように、切断可能な連結Ｌは、切断剤によって切断され、この切断剤は、切断可能な連結の化学的な性質、他のアッセイ成分が切断剤の存在下で安定であるか否か、膜固着電気泳動プローブが、均質なまたは不均質なアッセイフォーマットにおいて使用されるか否かなどを含む、いくつかの要因に依存して広く変化し得る。不均質アッセイ形式において、切断されようとしている連結は、インタクトなままであるように意図されているものから分離される場合、切断剤としては、酸、塩基、酸化剤（一重項酸素、過酸化水素などを含む）、還元剤、光、酵素（プロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む）、求核試薬などが挙げられ得る。このような形式において、分離後、切断試薬の選択は、切断可能な連結の化学的性質、切断剤の存在下での放出された電気泳動タグの安定性、切断工程において生成される複生成物の電気泳動分離および電気泳動タグの検出に対する影響などに依存する。一般に、不均質形式において、切断剤（例えば、光増感剤または酵素）は、その作用を局所化するために結合剤に結合される必要があるわけではない。他方、均質形式において、切断剤は、切断されることが意図される切断可能な連結の近位においてのみ作用しなければならない。好ましくは、これは、切断剤を結合剤（例えば、抗体、抗体結合組成物など）に結合することによって達成される。本明細書中で使用される場合、用語「切断誘導性部分」とは、切断剤の切断効果を局所化する目的で結合剤に結合される切断剤をいう。
【０１１７】
一局面において、切断誘導性部分は、好ましくは、酸化によって、切断可能な連結を切断し得る活性種を生成する基である。好ましくは、この活性種は、その生成部位の近位においてのみその切断誘導効果が存在するように、短期間の活性を示す化学種である。活性種はいずれも、その生成の近位を超えて大きくバックグラウンドを生成しないように、本質的に寿命が短期間であるか、またはその生成部位から短距離だけ離れて切断可能な連結と反応しないように、活性種と効率的に反応するクエンチャー化合物が使用される。例示的な活性種としては、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨ、およびヒドロキシラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキシドなどが挙げられる。酸化を引き起こす活性種の例示的なクエンチャーとしては、ポリエン、カロテノイド、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシン、ヒスチジン、およびグルタチオンのアミノ酸−ピロールＮ結合体などが挙げられる（例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１９：２２６−２４１（２０００））。
【０１１８】
切断誘導部分および切断可能連結に関する重要な考慮事項は、これらが標的タンパク質に結合し、増感剤によって生成される活性種が拡散し、その活性を失う場合に、切断可能な連結と相互作用し得る前に、そのときまで互いから取り除かれないことである。従って、切断可能な連結は、好ましくは、１０００ｎｍ内であり、好ましくは、結合した切断誘導性部分の２０〜１００ｎｍである。切断誘導性部分の有効範囲は、本明細書中で「有効接近（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）」といわれる。
【０１１９】
活性種の発生器としては、酵素（例えば、過酸化水素を生成するオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、キサンテンオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グリセリルホスフェートオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、およびアルコールオキシダーゼ）、ヒドロキシルラジカルを生成する西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成する、種々のデヒドロゲナーゼ、アンモニアを生成して高い局所ｐＨを生成するウレアーゼ）が挙げられる。１つの開裂は、硫黄またはセレンの酸化に基づき、ここでチオエーテル、スルホキシド、またはそのセレンアナログが活性基についてα位またはβ位に存在しており、この活性基は、ｅ−タグの放出可能な部分に接着されるか、またはｅ−タグの放出で酸化に供される、酸化された官能基を放出するように、活性基に対してα水素を酸性にし、塩基により取り除かれることを可能にする。あるいは、１つの酸化状態で安定であり、そして別の酸化状態で不安定である金属キレートが、使用され得る。他の化合物は、α置換されたメチルキノンを含み、これは、脱離基（例えば、スルホニル、オキシ、アミノなど）を介して結合される試薬の放出可能な部分を有する。
【０１２０】
増感剤は、誘導されて反応性中間体、または種、通常一重項酸素を生成し得る、分子、通常は化合物である。好ましくは、本発明に従って使用される増感剤は、光増感剤である。しかし、他の増感剤は、例えば、例として限定ではなく、外部照明源による活性化で一重項酸素を生成し得る他の物質および組成物、またはあまり好ましくないが、外部照明源による活性化なしで一重項酸素を生成し得る他の物質および組成物を含む、化学活性化されたもの（ｃｈｅｍｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）（例えば、酵素および金属塩）のように本発明で利用され得る。従って、例えば、モリブデン酸（ＭｏＯ４−）塩およびクロロペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼ＋臭化物イオンまたは塩化物イオンが、過酸化水素の一重項酸素および水への変換を触媒することが、示された。増感剤の上の例について、それぞれ、過酸化水素が、補助試薬として含まれ得、クロロペルオキシダーゼが、表面に結合され得、そしてモリブデン酸塩が、リポソームの水相に導入され得る。本発明の範囲内に含まれる他の増感剤は、本当の増感剤ではないが、熱、光、イオン化放射または化学的活性化による励起において、一重項酸素分子を放出する。このクラスの化合物の最も知られたメンバーとしては、エンドペロキシド（例えば、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペロキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペロキシドおよび５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン５，１２−エンドペロキシド）が挙げられる。これらの化合物の加熱またはこれらの化合物による光の直接の吸収が、一重項酸素を放出する。さらなる増感剤が、以下の参考文献に記載される：Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，３５５：２８７（１９９４）（ペルオキシダーゼおよびオキシゲナーゼ）；Ｋａｎｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：５９９１−５９９３（１９８３）（ラクトペルオキシダーゼ）；Ｐｉｅｒｌｏｔら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１９：３−２０（２０００）（エンドペロキシドの熱溶解）；など。
【０１２１】
結合剤（例えば、抗体）の開裂誘導部分への接着は、直接でも間接でもよく、共有結合でも非共有結合でもよく、そして文献中で一般に利用可能な周知の技術により達成され得る。例えば、‘‘Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，’’Ｉｃｈｉｏ  Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）；Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）を参照のこと。広範な種類の官能基が、利用可能であり、または組み込まれ得る。官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられる。広範な種類の化合物と結合する様式は、周知であり、そして文献中で詳細に例示される（上記を参照のこと）。結合基の結合剤への距離は、結合されている化合物の性質、特異的な結合特性における距離の効果などに依存して、広範に変動し得る。
【０１２２】
結合剤に接着されて複数の開裂誘導部分を有し、例えば、生成される活性種の数を増大することが、所望され得る。１つのアプローチにおいて、結合剤は、接着のための複数の部位（例えば、抗体、レクチンなど）を有する。開裂誘導部分の数をさらに増大するために、ハブ分子または中心部分が、利用される。このハブ中心部分は、多機能性物質であり、通常ポリマー性であり、結合のための部位として、複数の官能基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ、エチレン（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃ）、アルデヒドなど）を有する。例示的なハブ物質は、周知の技術を用いて結合剤（例えば、抗体）に接着され得るアミノデキストランである。好ましくは、次いで、開裂誘導部分のＮＨＳ−エステルが、接着のためにアミノデキストランと反応される。
【０１２３】
（開裂誘発部分としての光増感剤）
上述のように、本発明に従って好ましい開裂誘発部分は、一重項酸素を生じる光増感剤である。本明細書中で使用する「光増感剤」とは、光を吸着する分子であり、これは、光で活性化すると、分子酸素を一重項酸素に変換する。光増感剤は、共有結合または非共有結合を介して、クラス特異的試薬の結合剤に直接的または間接的に結合され得る。このような組成物（特に、結合剤としての抗体）を構成する指針は、例えば、光力学療法、免疫診断などの分野における文献で入手可能である。以下は、代表的な文献である：Ｕｌｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，５４２６−５４３０（１９９４）；Ｓｔｒｏｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４５：２９７−３２０（１９９４）；Ｙａｒｍｕｓｈら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１０：１９７−２５２（１９９３）；Ｐｅａｓｅら、米国特許第５，７０９，９９４号；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第５，３４０，７１６号；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第６，２５１，５８１号；ＭｃＣａｐｒａ，米国特許第５，５１６，６３６号など。
【０１２４】
同様に、本発明で使用するのに適当な光増感剤の特性および選択に関する文献には、指針がある。以下は、代表的な参考文献である：Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．Ｍｕｒｒａｙ．Ｓｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）；Ｂａｕｍｓｔａｒｋ，Ｓｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ，Ｖｏｌ．２（ＣＲＣ  ＰｒｅｓｓＩｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９８３）；およびＴｕｒｒｏ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，１９９１）。
【０１２５】
これらの光増感剤は、光で励起することにより、一重項酸素を発生する増感剤である。これらの光増感剤は、染料および芳香族化合物を含有し、通常、共有結合した原子から構成される化合物（これは、複数の共役二重結合または三重結合を有する）である。これらの化合物は、典型的には、約２００〜約１，１００ｎｍ、通常、約３００〜約１，０００ｎｍ、好ましくは、約４５０〜約９５０ｎｍの波長範囲の光を吸収し、その吸光度最大値において、励起波長で、約５００Ｍ−１ｃｍ−１、好ましくは、約５，０００Ｍ−１ｃｍ−１、さらに好ましくは、約５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する。酸素の不在下で以下の吸光度を生じる励起状態の寿命は、通常、少なくとも約１００ナノ秒、好ましくは、少なくとも約１ミリ秒である。一般に、この寿命は、本発明に従って、試薬内の連鎖の開裂を可能にするのに十分に長くなければならない。このような試薬は、通常、以下で述べる濃度で存在している。光増感剤の励起状態は、通常、その基底状態とは異なるスピン量子数（Ｓ）を有し、通常、基底状態が通常のように一重項（Ｓ＝０）のとき、三重項（Ｓ＝１）である。好ましくは、この光増感剤は、高い系間交差収率を有する。すなわち、光増感剤の光励起は、通常、少なくとも約１０％、望ましくは、少なくとも約４０％、好ましくは、約８０％より高い効率で、三重項状態を生じる。
【０１２６】
選択される光増感剤は、比較的に光安定性であり、好ましくは、一重項酸素と効率的には反応しない。最も有用な光増感剤には、いくつかの構造上の特徴が存在している。殆どの光増感剤は、少なくとも１個、頻繁には、３個またはそれ以上の共役二重結合または三重結合（これらは、剛性のしばしば芳香族の構造で保持されている）を有する。それらは、頻繁には、少なくとも１個の基を含有し、これは、系間交差（例えば、カルボニル基またはイミン基または重い原子（これは、周期表の３〜６列から選択され、特に、ヨウ素または臭素である））を加速するか、または伸長した芳香族構造を有し得る。
【０１２７】
光増感剤を光活性化して一重項酸素を発生するには、広範囲にわたる光源が利用可能である。その光源が実用的な持続時間にて十分な一重項酸素を生じるのに十分に強力である限り、多色光源および単色光源の両方が使用され得る。その照射の長さは、光増感剤の性質、開裂可能連鎖の性質、照射源の出力、および試料からの距離などに依存している。一般に、照射時間は、１マイクロ秒未満から約１０分間程度であり得、通常、約１ミリ秒〜約６０秒の範囲である。照射の強度および長さは、その光増感剤分子の少なくとも約０．１％、通常、その光増感剤分子の少なくとも約３０％、好ましくは、その光増感剤分子の実質的に全部を励起するのに十分であるべきである。
【０１２８】
代表的な光源には、限定ではなく例として、レーザー（例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザーおよびルビーレーザー）；光ダイオード；水銀、ナトリウムおよびキセノン蒸気ランプ；白熱ランプ（例えば、タングステンおよびタングステン／ハロゲン）；閃光灯などが挙げられる。本発明で利用され得る光増感剤の例には、上記特性を有するものがあり、そして以下の文献で列挙されている：Ｔｕｒｒｏ，Ｍｏｄｅｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（上で引用）；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｕｌｌｍａｎ，米国特許第５，５３６，８３４号；Ｌｉら、米国特許第５，７６３，６０２号；Ｕｌｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，５４２６−５４３０（１９９４）；Ｓｔｒｏｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４５：２９７−３２０（１９９４）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８６：６３５−６４５（１９９０）；Ｙａｒｍｕｓｈら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１０：１９７−２５２（１９９３）；Ｐｅａｓｅら、米国特許第５，７０９，９９４号；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第５，３４０，７１６号；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第６，２５１，５８１号；ＭｃＣａｐｒａ，米国特許第５，５１６，６３６号；Ｗｏｈｒｌｅ，Ｃｈｉｍｉａ，４５：３０７−３１０（１９９１）；Ｔｈｅｔｆｏｒｄ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐａｔｅｎｔ  ｐｕｂｌ．０４８４０２７；Ｓｅｓｓｌｅｒ  ｅｔａｌ，ＳＰＩＥ，１４２６：３１８−３２９（１９９１）；Ｍａｄｉｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２２：９０−９８（１９９０）；Ｐｏｌｏら、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９２：１−３（１９９２）；Ｄｅｍａｓら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．，Ａ２５：１１８９−１２１４（１９８８）など。代表的な光増感剤は、表１で列挙する。
【０１２９】
【表２】
2006508907.tif 000009
（Ｇ−Ｌ−Ｅ化合物の合成）
本発明の化合物は、上記のように、親油性基（Ｇ）、開裂可能連鎖（Ｌ）および電気泳動基（Ｅ）を含有する。構造Ｇ−Ｌ−Ｅを有する本発明の化合物は、例えば、以下で記述されているような当業者に公知の技術および物質を使用して、合成できる：Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ４ｔｈＥｄ．，（Ｗｉｌｅｙ  １９９２）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＹ  ３ｒｄＥｄ．，Ｖｏｌｓ．Ａ  ａｎｄ  Ｂ（Ｐｌｅｎｕｍ  １９９２）およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ２ｎｄＥｄ（Ｗｉｌｅｙ  １９９１）。本発明の化合物の出発物質は、標準的な技術および市販の前駆体物質（例えば、以下で入手できるもの）を使用して、得られる：Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．），Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．），Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ，Ｎ．Ｈ．），Ａｐｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．），Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｓ．Ｃ．），Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，．Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＴｒａｎｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）。
【０１３０】
本発明の化合物を合成するために本明細書中で記述した手順は、１つまたはそれ以上の保護および脱保護工程（例えば、アセタール基の形成および除去）を包含し得る。それに加えて、以下で開示した合成手順は、種々の精製（例えば、カラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、再結晶、蒸留、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）を含有できる。また、化学反応生成物を同定し定量するために化学分野で周知の種々の技術（例えば、プロトンおよびカーボン１３核磁気共鳴（１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ）、赤外および紫外分光法（ＩＲおよびＵＶ）、Ｘ線回折、元素分析（ＥＡ）、ＨＰＬＣおよび質量分析（ＭＳ））も、同様に、使用できる。保護および脱保護、精製および同定および定量方法は、化学分野で周知である。
【０１３１】
この電荷付与部分または移動度調節剤をペプチド鎖として形成する種類の合成を実行する化学作用は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｍａｒｇｌｉｎ，ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７０）３９：８４１−８６６。一般に、このような合成は、その反応に関与しない官能基を適当な保護基でブロックする工程を包含する。これらの遊離官能基は、次いで、反応されて、所望の連鎖を形成する。そのペプチドは、ｔｈｅ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８０）８５：２１４９−２１５４およびＨｏｕｇｈｔｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（ｉ９８０）１６：３１１−３２０のように、樹脂にて、生成できる。このペプチドは、次いで、公知技術に従って、この樹脂から除去される。
【０１３２】
ペプチドの合成に利用可能な多くの技術の要約は、以下で見られ得る：固相ペプチド合成について、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ら、”Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ（１９６９）；ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、（１９７３），ｖｏｌ．２，ｐ．４６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；および溶液合成について、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，ら、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９６５。
【０１３３】
一般的に、これらの方法は、成長しているペプチド鎖に、一以上のアミノ酸または、適切に保護されたアミノ酸の連続的な付加を包含する。通常、適切な保護基は、第一アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを保護する。保護されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸を次いで、アミド結合を形成するために適切な条件下で、不活性な固定支持体に対して結合させるか、もしくは、適切に保護された相補的な（アミノあるいはカルボキシル）基を有する、配列において次のアミノ酸を加えることにより溶液内で利用させ得る。その保護基は次いで、この新しく付加したアミノ酸残基から除去され、そして次のアミノ酸（適切に保護された）に次いで付加され、以下同様に続く。全ての望ましいアミノ酸を、適切な配列上に結合させた後、任意の残留する保護基（および任意の固定支持体）を、最終ペプチドを産生するために、連続的にまたは同時に除去する。保護基を、利用する特定の保護基に依存して、公知の方法に基づいて、要望どうりに除去する。例えば、保護基を、水素および活性炭担持パラジウム、液体アンモニウム中のナトリウムでの還元など；トリフルオロ酢酸、フッ化水素酸での加水分解など、により除去し得る。
【０１３４】
ホスホルアミダイトまたは関連する化学反応を使用する電気泳動用タグプローブの合成のため、多くのガイドを、参考文献：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第８版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２）；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４１５，７３２号；米国特許第４，４５８，０６６号；および米国特許第４，９７３，６７９号；などより得ることができる。これらの化学反応の多くは、電気泳動用プローブの成分を自動ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーなど）上で簡易に合成することを可能とする。
【０１３５】
移動度改変部分の一部としてのヌクレオチドを含む電気泳動用タグ因子の合成は、標準的なホスホルアミダイトの化学反応を使用する固相支持体上のアセンブリを介して容易にかつ能率的に達成し得る。結果としての移動度改変部分は、上記で議論されるように、標識および／またはポリペプチド結合部分に対して結合し得る。
【０１３６】
異なる電気泳動の移動度を有する前述の標識結合体は、誘導された結合部位を有する複数のポリペプチドの多重検出を可能とする。当然ながら、複数の測定を実施するため任意の複数の標識結合体を調製することは、本発明の範囲内である。
【０１３７】
（膜）
発明の実施に使用する膜は、細胞（例えば、細胞膜、核膜、ミトコンドリアの膜もしくは、他の細胞内の膜）から得られ得るか、または、ミセルおよびリポソームにより例示されるように人工的に作製され得る。本明細書中に記載される方法に使用される細胞は、原核生物、真核生物、もしくは原始細胞（ａｒｃｈｅｏｎ）を含む、任意の起源に由来し得るが、好ましくは、親油性である膜を含む。細胞は、生きていても、死んでいてもよい。多細胞生物から得た場合、細胞は、任意の細胞の種類であり得る。そのため、細胞は、培養細胞株または初代単離細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ）であり得、細胞は、哺乳動物、両性類、爬虫類、植物、酵母、細菌、スピロヘータまたは原生動物であり得る。細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ニワトリ、ウズラ、ヤギまたはイヌであり得る。細胞は、正常細胞、変異細胞、遺伝子操作した細胞、腫瘍細胞、選択した抗体の分泌に対して陽性であるハイブリドーマ、などであり得る。特に目的のものは、疾患原因遺伝子を差次的に発現する（過剰発現または過小発現する）タイプの細胞から得られる膜である。当業者に明らかであるように、様々な細胞株（例えば、ＣＨＯ）は、公的なまたは私的な貯蔵所から得られ得る。最大の寄託機関は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）であり、膨大な数の生物および組織サンプルに由来する良く特徴づけされた細胞株の様々なコレクションを提供する。
【０１３８】
多細胞生物由来の例示的な細胞タイプとしては、好酸性細胞、腺房細胞、松果体細胞、脂肪細胞、エナメル芽細胞、星状細胞、基底（幹）細胞、好塩基球、肝細胞、ニューロン、腫張表面細胞（ｂｕｌｇｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｅｌｌ）、Ｃ細胞、心筋細胞、房心細胞、主細胞、軟骨細胞、クラーラ細胞、円柱上皮細胞、黄体細胞、脱落膜細胞、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）、内分泌細胞（ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ）、内皮細胞、腸内分泌細胞、好酸球、赤血球、糸球体外メサンギウム細胞、胎生線維芽細胞、胎生赤血球、線維芽細胞、濾胞細胞、神経節細胞、巨大ベッツ細胞、杯細胞、有毛細胞、内耳有毛細胞、Ｉ型有毛細胞、肝細胞、内皮細胞、ライディヒ細胞、脂肪摂取細胞、肝実質細胞、リンパ球、リゾチーム分泌細胞、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、メラノサイト、血管間膜細胞、単球、筋上皮細胞、筋様細胞、頚粘液細胞、神経細胞、好中球、希突起神経膠細胞、卵母細胞、骨芽細胞、骨軟骨吸収細、破骨細胞、骨細胞、柱細胞、溝細胞（ｓｕｌｃａｌ  ｃｅｌｌ）、副甲状腺細胞、壁細胞、ペプシノゲン分泌細胞、周皮細胞、松果体細胞、下垂体細胞、プラスマ細胞、血小板、有足突起、精母細胞、プルキンエ細胞、錐体細胞、赤血球、網状赤血球、シュワン細胞、セルトーリ細胞、円柱細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ソマトスタチン細胞、腸内分泌細胞、精子細胞、精原細胞、精子、衛星細胞（ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ）、支持ダイテルス細胞（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｄｅｉｔｅｒ  ｃｅｌｌ）、支持ハンセン細胞（ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｈａｎｓｅｎ  ｃｅｌｌ）、表面細胞、表面上皮細胞、表面粘液細胞、汗腺細胞、Ｔリンパ球、卵胞膜黄体細胞、胸腺細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺細胞、移行上皮細胞、Ｉ型肺胞細胞、およびＩＩ型肺胞細胞、が挙げられる。
【０１３９】
細胞膜はまた、特定の疾患もしくは特定の疾患ステージに関連する細胞タイプから得られる。特定の疾患もしくは疾患ステージとの関連は、１つ以上の生物学的プロセス（例えば、細胞周期制御、細胞分化、アポトーシス、走化性、細胞の運動性、および細胞骨格再構成）における細胞の（ｃｅｌｌ＝ｓ）異常な挙動によって確立され得る。疾患細胞はまた、関連する疾患を引き起こす病原体（例えば、ＡＩＤＳに関するＨＩＶ、Ｂ型肝炎に関するＨＢＶ）の存在によって確認され得る。特定のタイプの細胞の異常な働きに関与する疾患のタイプとしては、自己免疫疾患、癌、肥満、高血圧、糖尿病、神経変性疾患および／もしくは筋変性疾患、心疾患、内分泌障害、ならびに任意のこれらの組み合わせが挙げられる（しかし、これに限定されない）。腫瘍細胞の例示的なタイプとしては、腺腫、癌腫、腺癌、線維腺腫、エナメル上皮腫、星状細胞腫、中皮腫、胆管癌、胆管線維腫、胆管腫、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、未分化胚細胞腫、脳室上衣腫、上皮腫、赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、線維腺腫、線維腫、線維肉腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、神経節芽細胞腫、神経膠腫、顆粒球性白血病、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、冬眠腺腫、組織球増殖症、角化棘細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ腫、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、骨髄脂肪腫、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経筋原細胞腫、歯牙腫、希突起神経膠腫、骨軟骨腫、骨腫、骨肉腫、乳頭腫、パラガングリオーマ、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、神経鞘腫、セミノーマ、奇形腫、莢膜細胞腫、および胸腺腫、が挙げられる。
【０１４０】
本発明の他の局面において、膜は、リポソームを含む。「リポソーム」は、１つ以上の脂質二重層を含む自己構築構造である。リポソームは通常リン脂質二重層からなるが、他の分子（例えば、コレステロールもしくは脂肪酸）もまたこの二重層構造内に含まれ得る。リポソームのリン脂質成分は、種々のリン酸グリセリルもしくはシリコン誘導体から構成される先端に結合する疎水性脂質末端を含む。リポソームは、したがって通常、１つもしくは２つの非極性（疎水性）アシル鎖に共有結合性に連結された極性（親水性）先端基領域を含む両親媒性脂質から作られる。疎水性アシル鎖と水性媒体との間の非常に好ましくない接触は脂質分子を再構成するように誘導し、これによって極性の先端基は水性媒体のほうに向けられ、一方アシル鎖は二重層の内に再度向かうと一般に考えられている。アシル鎖が水性媒体との接触する状態から効率的に保護される、非常に安定な構造が形成される。脂肪酸末端間の疎水性相互作用は、このように、水性溶液中にリポソーム二重層を生成する。より複雑なリポソーム構造においては、１つ以上の脂質二重層は、水性の区画を囲み得、そして２つの対向する両親媒性脂質分子の単層を含み得る。リポソームは、このように、カプセル化された水相を含む完全に閉じた二重層膜である。したがって、リポソームは、あらゆる多層状の小胞（水性の層によって分離される同心性の二重層膜）、もしくは単層の小胞（単一の二重層膜）であり得る。
【０１４１】
リポソームは、Ｂａｎｇｈａｍら、（１９６５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２の方法に従って、調製され得、リン脂質を、有機溶媒に懸濁し、次いで、反応容器に蝋状のリン脂質の沈殿物を残して乾燥するまで、エバポレートさせた。次いで、適切な量の水相を添加し、その混合物を膨潤させ、生じたリポソーム（多重層小胞と考えられる）を、機械的手段により分散させた。生じた膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）「尾部」が、二重層の中心に向いているのに対して、親水性（極性）「頭部」が水相に向いているような構造である。この技術は、ＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓおよびＭｉｌｌｅｒ、（１９６７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３５：６２４−６３８に記載される、超音波処理した小さな単層小胞の開発の基礎を提供する。通常、水溶液中のリン脂質の混合物は、自然に会合し、リポソーム構造を形成するが、リポソームの大きさおよび形を制御するための技術は、当該分野で公知である。
【０１４２】
（Ｇ−Ｌ−Ｅを用いた膜の標識化）
構造Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍを有する本発明の化合物は、二重層中に組み込むことによって、細胞、リポソームなどに結合され得る。理論に拘束されないが、Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ化合物は、脂質膜中に、リン脂質に類似する向きおよび様式で組み込まれ得る。ここで、炭化水素鎖を含む疎水性部分は、内側に向き得て、より親水性の実体Ｌ−Ｅは、外側に向き得る。従って、通常の細胞膜内での場合、本発明の化合物の炭化水素部分は、脂質環境に組み込まれ得るのに対して、親水性Ｌ−Ｅは、膜表面で、水性界面に露出され得る。従って、本発明の化合物は、膜内に組み込まれ得るのに対して、切断し得る結合および電気泳動部分は膜の表面に露出され、切断試薬（例えば、上記のように、一重項酸素）に接近可能である。本発明の化合物はまた、リポソームを標識するために使用され得る。有用なリポソームとしては、カチオン性リン脂質、中性リン脂質、脂質およびこれらの混合物が挙げられる。
【０１４３】
インタクトな細胞構造が必要な場合、細胞を標識するために使用される方法は好ましくは、細胞および膜の完全性の最小限の破壊を引き起こす。さらに、細胞は固定され、慣用的組織化学的手順または細胞化学的な手順で処理され得るが、この手順は好ましくは、標識化に影響しない。例えば、ターゲッティングペプチドまたはターゲッティングタンパク質、融合ペプチド（例えば、センダイウイルス、インフルエンザウイルス、日本の血液凝集性ウイルス（ＨＶＪ）由来）、ウイルスの外膜タンパク質、ポリカチオン性物質（例えば、ポリ−Ｌ−リジンまたはＤＥＡＥ−デキストラン）、気道上皮細胞の表面に結合する分子（抗体が挙げられる）、接着分子および増殖因子などのさらなる成分が含まれ得る。
【０１４４】
膜は、ＢａｒａｋおよびＷｅｂｂ（１９８１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９０：５９５〜６０４に記載される方法に従って、本発明の化合物を使用して標識され得る。代表的に、膜（例えば、インタクトな細胞）は、好ましくは、水性培体中で、本発明の化合物と接触される。水性培体は、水、水および有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ）またはこれらの混合物であり得る。そして、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ｔｒｉｓ緩衝液など）を含有し得る。膜と構造Ｇ−Ｌ−Ｅを有する化合物とを、１分間〜約１週間の間で、好ましくは、約１時間〜約７６時間の間で、より好ましくは、約２時間〜約４８時間の間で、またはその間の任意の整数値の時間で接触させる。この処方物はさらに、化学的処理または力学的処理（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などの界面活性剤の添加、振盪、攪拌またはエレクトロポレーションなど）に供され得る。あるいは、この処方物は、標識化を達成するまで、約３０℃〜５０℃まで、好ましくは、約３５℃〜約４０℃まで加熱され得る。標識化後、非結合の成分は、例えば、洗浄または遠心分離によって除去され得、そして、標識化された膜が単離され得る。
【０１４５】
（エンドサイトーシス）
本発明の１つの局面では、本発明の親油性化合物（例えば、一旦脂質二重層に組み込まれたＧ−Ｌ−Ｅ、Ｇ−（Ｌ−Ｅ）ｍ、ビオチン−Ｇなど）は、細胞によって、エンドサイトーシスされ得るか、または、吸収され得る（図４Ａ−図４Ｂ）。吸収された親油性化合物はまた、脂質を細胞膜と交換し得る。親油性化合物のエンドサイトーシスは、食作用性であるか、または外来の粒子を取り込み得る細胞内で生じる。食作用細胞が、親油性化合物を取り込む場合、その細胞は、それらをリソソームとして公知の細胞小器官内に移動させ、そこで、親油性化合物は分解され得る。あるいは、脂質交換は、個々の脂質分子の親油性化合物から原形質膜内への運搬（逆もまた、同様に）を含む。従って、一旦親油性化合物が細胞膜に結合すると、それらは、膜内に長時間維持され得るか、または、種々の細胞内膜に再分配され得る。
【０１４６】
本発明の１つの局面において、親油性化合物は、細胞をその細胞表面上でレセプターによって認識される分子に曝露し、能動的な取り込み手順が生じるのを可能にする（例えば、レセプター媒介性エンドサイトーシス）か、またはこの親油性化合物を強制的に細胞中に押し込むこと（例えば、一過性の透過化処理または高速注射）によって、細胞の内部に導入され得る。従って、この目的におけるレセプターリガンドの選択は、インターフェロン、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＤＣ、Ｉ−３０９、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＭＣＰ−３、ＳＤＦ−１、ＩＬ−１２、ＰＦ−４、葉酸塩、ビタミン、インスリン、ガラクトース、ＥＧＦ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＨＩＶ  １２０／４１などであり得る。
【０１４７】
内在性親油性化合物を有する細胞は、アッセイに供され得る。細胞膜に取り込まれた本発明の親油性化合物を有する細胞の初期サンプルは、選択的な力（例えば、熱、紫外線、浸透圧応力、剪断応力、選択培地、細胞増殖抑制剤もしくは細胞傷害剤など）の存在下または非存在下で増殖され得る。一定の増殖期間（例えば、細胞型および実施されるアッセイの型に依存して１分〜１週間）の後、希釈された標識を有する細胞の数が決定され得る。
【０１４８】
細胞膜を通して親油性化合物を輸送するための人為的手段の非限定的な例としては、化学薬品（例えば、界面活性剤）、酵素またはアデノシン三リン酸の作用；レセプター媒介性取り込みまたは輸送タンパク質媒介性取り込み；食作用；孔形成タンパク質（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）；微量注入；エレクトロポレーション；低浸透圧衝撃；あるいは最小限の物理学的破壊（例えば、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、またはパッチクランプ法）が挙げられる（米国特許第４，７４３，５４８号、同第４，７９５，８５５号、同第５，０６８，１９３号、同第５，１８８，９５８号、同第５，４６３，１７４号、５，５６５，３４６号、および同第５，５６５，３４７号を参照のこと）。
【０１４９】
親油性化合物を細胞中に導入するための１つの方法は、細胞中への親油性化合物の進入を促進するペプチド（例えば、細胞中へのウイルスの通過を促進するＨＩＶ−Ｔａｔペプチド）の用途を利用する；このＴａｔペプチドは、磁気ナノ粒子を哺乳動物細胞中に導入するために使用されている。本発明の親油性化合物で標識された細胞は、Ｔａｔペプチド配列単独か、あるいは他のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の親和性分子と共に曝露され得る。ペプチドとの標識細胞のインキュベーションは、親油性化合物がおそらくエンドサイトーシスを介して細胞に入るのを可能にする。
【０１５０】
親油性化合物を細胞中に導入するためのなお別の方法は、レセプター媒介性エンドサイトーシスのプロセスを使用する。従って、親油性化合物で標識された細胞膜は、タンパク質に曝露されて、レセプター媒介性エンドサイトーシスが引き起こされる。このタンパク質は、レセプター媒介性エンドサイトーシスを誘導するように仕向けるリガンド（例えば、トランスフェリン）および酸性条件下でエンドソームへの融合を誘導するタンパク質（例えば、ヘマグルチニン）、あるいはその活性を生じるのに十分なこのようなタンパク質のいくつかの部分を含み得る。レセプター媒介性エンドサイトーシスに使用されるリガンドはまた、特定の細胞標的化剤として作用し得る。細胞膜中に取り込まれた親油性化合物は、標的細胞の細胞質中に沈着される。
【０１５１】
別の方法において、本発明の新油性化合物は、細胞に孔を形成することによって細胞中に取り込まれ得る。この孔は、例えば、エレクトロポレーション、浸透圧衝撃によって、またはポロジェン（ｐｏｒｏｇｅｎ）の使用によって形成され得る。エレクトロポレーションは、外来物質（例えば、ＤＮＡ）を細胞中に誘導するための一般的な方法である（Ｈｕｉ、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、４８：２９−４０を参照のこと）。本発明のエレクトロポレーション法は、高電圧パルスを細胞に送達し、それによって細胞膜に孔を生成して、細胞中への親油性化合物の輸送を促進する工程からなる。このエレクトロポレーションプロセスは、以下の２つの主要な工程からなる：細胞膜の可逆的な分解、および透過化した細胞の回収。従って、電気的パラメーターおよびインキュベーションパラメーターは、膜を通しての親油性化合物の輸送を促進するように最適化される。一般的に、親油性化合物で標識された細胞（１〜１０１０細胞）は、エレクトロポレーションキュベットに置かれ得る。次いで、このキュベットは、適切な電源に接続され、細胞が、規定された大きさかつ長さの高電圧パルスに供される。この電圧、容量および抵抗は、細胞またはそのプロトコルの有効性に依存して、適切に変化され得る。例えば、電圧は、約１Ｖ〜約１００ｋＶの間、好ましくは１ｋＶ〜５ｋＶで変化され得、容量は、約０．１μｆ〜１００ｆの間、好ましくは約１μｆ〜５０μｆの間で変化され得、そして抵抗は、約０．１Ω〜およそ無限大に変化され得る。次いで、細胞は適切な培地中で回収可能にされるべきであり、そして首尾よくトランスフェクトした細胞が、適切な検出システムを使用して評価され得る。
【０１５２】
あるいは、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）は、ジギトニン、サポリン、または補体カスケードのメンバーであり得る。細胞を、ジギトニンで透過処理し得（Ｈａｇｓｔｒｏｍら（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１０：２３２３−３１およびＳｔｅｒｕｅ−Ｍａｒｒら（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｙｍｏｌ．２１９：９７−１１１に記載される）、細胞膜上の親油性化合物を細胞内に組み込ませ得る。
【０１５３】
図４Ａ〜図４Ｃに説明される本発明の例において、ＣＸＣＲ４（４０２）を発現するＣＥＭ細胞（４００）を、本発明のＧ−Ｌ−ＥまたはＧ−（Ｌ−Ｅ）ｍ（４０４、ここで、Ｅは図において「ｍＴ」と示される）のような親油性化合物に接触させる。ＣＸＣＲ４、ＣＸＣ／ＥＬＲ−ケモカイン間質性細胞誘導性因子−１（ＳＤＦ−１）（４０６）のレセプターは、上皮細胞上に見出される。ＣＸＣＲ４欠損マウスまたはＳＤＦ−１欠損マウスは、脈管形成欠損を有する。親油性基（Ｇ）は、細胞の細胞膜内に組み込まれ、そして電気泳動性タグ（「ｍＴ」）は、表面上に曝される（図４Ａ）。次いで、標識されたＣＥＭ細胞（４００）を、ＳＤＦ−１α（４０６）と接触させ、これにより、幾らかのＧ−Ｌ−ＥまたはＧ−（Ｌ−Ｅ）ｍの内在化（４０８）を引き起こす。次いで、ＳＤＦ−１α曝露細胞を、増感剤を付着させた抗体（４１２）と接触（４１０）させる。これは、ビオチン標識化抗ＣＸＣＲ抗体であり得る。このような抗体がその細胞表面標的に結合した後、これらを光に曝し（４１４）、電気泳動性タグを放出（４１６）させる。リガンドＳＤＦ−１αの存在下で放出される電気泳動性タグの量を、電気泳動による分離（４１８）後に、このような分離によって形成されるピーク（４２２）の定量によって測定し得る。この量を、リガンド非存在下で放出された電気泳動性タグの量（コントロール）と比較し得る。比較は、エレクトロフェログラム上の２つの実験環境に対応するピーク（４２０および４２２）の比較によってなされ得るか、または放出されたタグは別々に定量され得、次いで比較され得る。図５Ａおよび図５Ｂに示される結果は、細胞がＳＤＦ−１αリガンドに曝される場合、放出されるタグの量がより低く、そしてリガンドへの曝露の長さが延長するに従って、そしてリガンドの濃度が増加するに従って、放出されるタグの量が減少することを示す。この結果は、ＣＥＭ細胞の細胞膜内に組み込まれた親油性化合物が、細胞がリガンドに曝される場合に内在化することを示す。
【０１５４】
（放出された電気泳動性タグの分離）
上述のように、電気泳動性タグを１つ以上の物理的、化学的、および／または工学的な特徴に基づいて識別し得る分離技術によって、電気泳動性タグを分離するように設計される。好ましくは、このような分離技術は、電気泳動性タグ（および、その結果対応する分析物）の存在または非存在に関する定量的情報および定性的情報を提供し得る。１つの局面において、液層分離技術は、例えば、電気泳動性タグの混合物を含有する緩衝溶液、反応溶媒などは、独立した種類の電気泳動性タグの分離を生じるために処理され得る。
【０１５５】
通常、このような分離は、このような開始混合物から、それぞれの電気泳動性タグの増加した濃度の領域に相当する識別可能なピークまたはバンドを形成するまでの、経路に沿った電気泳動性タグの差次的な移動によって達成される。このような経路は、液体流動、電場、磁場などによって定義される。特定の分離技術の選択は、幾つかの因子に依存し、これらとしては、その技術を用いる経費および便宜、電気泳動性タグの化学的性質によって与えられる技術の解像度、分離されるべき電気泳動性タグの数、使用される検出様式の型などが挙げられる。好ましくは、電気泳動性タグは、電気泳動的に分離されるか、またはクロマトグラフ的に分離される。
【０１５６】
（Ａ．電気泳動的分離）
電気泳動のための方法は周知のものであり、そして当業者が特定の複数の電気泳動性タグを形成しかつ分離するために設計上の選択を行うための豊富な案内がある。以下は、電気泳動の例示的な参考文献である：Ｋｒｙｌｏｖら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２：１１１Ｒ−１２８Ｒ（２０００）；Ｐ．Ｄ．ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＪ．Ｃ．Ｃｏｌｂｕｒｎ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）；米国特許５，３７４，５２７号；同第５，６２４，８００号；同第５，５５２，０２８号；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ使用説明書，Ｒｅｖ．Ａ，１９９５年１月，第２章（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；など。１つの局面において、電気泳動性タグは、キャピラリー電気泳動によって分離される。当業者の権限内の設計上の選択としては、幾つかの市販のモデルからの機器の選択、分離媒体型および濃度、ｐＨ、所望の分離時間、温度、電圧、キャピラリー型および寸法、検出様式、分離される電気泳動タグの数などを含む操作条件の選択が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
本発明の１つの局面において、電気泳動的分離の間または後に、電気泳動性タグを、分離した化合物の蛍光シグナルおよび移動時間（または移動距離）の記録によってか、または関連する蛍光、および電気泳動性タグの移動の図表の構築（例えば、エレクトロフェログラム）によって検出または同定する。このような検出を実行するために、電気泳動性タグを、標準的手段（例えば、高強度の水銀蒸気ランプ、レーザーなど）によって発光させ得る。代表的に、電気泳動性タグを、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザーまたは固体ダイオードレーザーによって生成したレーザー光によって発光させる。次いで、蛍光シグナルを、例えば、光電子増倍管、電荷結合デバイスなどの光感受性検出器によって検出し得る。例示的な電気泳動検出系は、例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号；同第６，１４２，１６２号などの他の所に記載される。別の局面において、電気泳動性タグは、例えば、米国特許第６，０４５，６７６号に記載されるような電気化学的に検出され得る。
【０１５８】
電気泳動的分離は、移動度の相違に基づく、電場における分子の移動および分離を含む。電気泳動的分離の種々の形態としては、例として、非限定で、自由領域電気泳動（ｆｒｅｅ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ゲル電気泳動、等電点集束法、等速回転電気泳動、キャピラリー通電クロマトグラフィー、およびミセル界面動電クロマトグラフィーが挙げられる。キャピラリー電気泳動としては、電気分離、好ましくは界面動電流動が挙げられ、これらとしては、電気泳動性流動、誘電電気泳動性（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）流動および／または電子浸透流動が挙げられ、これらは、約１〜約２００μｍ、通常は約１０〜約１００μｍの断面径のチューブまたはチャネルにおいて実施される。キャピラリーは、長い独立したキャピラリーチューブもしくはウェル中のチャネル、またはシリコン、石英、ガラスもしくはプラスチックを含むフィルムであり得る。
【０１５９】
キャピラリー電気分離において、電気泳動タグを含む反応混合物のアリコートは、キャピラリーデバイスの一部であり得るかまたはキャピラリーデバイスに連結し得る電気分離チャネルに、そのアリコートを導入することによって電気分離に供される。このキャピラリーデバイスにおいて、増幅および他の反応が行なわれる。次いで、連結内の成分が泳動するように、チャネル内に含まれる導電性媒体に電位を印加する。一般的に、印加される電位は、当該分野に周知の方法に従って、所望の成分の電気分離を十分に達成する。当業者は、本発明に使用される既定の試薬のセットについて適切な電位、および／または開裂標識の性質、反応媒体の性質などを決定し得る。媒体および電位についてのパラメータを含む電気分離についてのパラメータは、通常、所望の成分を最大限分離するように最適化される。これは、実験的に達成され、十分に当業者の技術範囲内である。
【０１６０】
キャピラリー電気泳動カラムの分析に関連した任意の公知の方法（例えば、米国特許第５，５６０，８１１号（第１１欄、１９−３０行）、同第４，６７４，３００号、同第４，２７４，２４０号および５，３２４，４０１号に示される方法が挙げられ、この関連した開示を、本明細書中に参考として援用する）によって検出され得る。電気泳動分野の当業者は、広範囲に及ぶ電位または電場の強さ（例えば、１０〜１０００Ｖ／ｃｍ、さらに代表的には、約２００〜約６００Ｖ／ｃｍの電場）が使用され得ることを認知する。市販の系について、電圧の上限は、約４０〜約６０ｃｍの長さのキャピラリーに対して約３０ｋＶであり、約６００Ｖ／ｃｍの最大電場を与える。ＤＮＡについて、代表的には、キャピラリーは、電気浸透流を減らすようにコーティングされ、そしてキャピラリーの注入端、陰電位に維持される。
【０１６１】
検出の容易さのために、全ての装置を、光学的に透明なプラスチック材料から組み立て得、これは、一般的に、約１８０〜約１５００ｎｍ、通常には、約２２０〜８００ｎｍ、なお通常には、約４５０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の光の波長の伝達損失を低くさせる。適切な材料としては、融解シリカ、プラスチック、石英、ガラスなどが挙げられる。
【０１６２】
（Ｂ  クロマトグラフ分離）
本発明の１つの局面において、複数の電気泳動タグを、１つ以上の物理的な特徴（例えば、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性などが挙げられるが、これらに限定されない）に基づくクロマトグラフを用いた分離のために、設計する。クロマトグラフ分離技術を、パラメータ（例えば、カラムの型、固相、移動相など）に基づいて選択して、その後、単一の操作において明確なピークまたはバンドを形成するように分離され得る複数の電気泳動タグを選択する。幾つかの因子（例えば、検出される電気泳動タグの数（つまり、複数個の大きさ）、アッセイ中に生じる各々の電気泳動タグの推定数量、多重アッセイにおいて使用されるセットの候補となる、電気泳動タグ合成の利用度および容易さ、使用される検出様相およびＨＰＬＣ器具の有用性、信頼度、費用および操作の容易さ、カラム、ならびに溶媒が挙げられる）が、本発明において、どのＨＰＬＣを使用に選択するかを決定する。一般的に、限定された量の試料を分析するのに適していて、最高の分解分離度を提供するカラムおよび技術が、好ましい。そのような選択のためのガイダンスは、文献（例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）；Ｍｉｌｌｎｅｒ；「Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９），Ｃｈｉ−Ｓａｎ  Ｗｕ，「Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９９），およびＯｌｉｖｅｒ，「ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８９））において見出され得る。特に、手順は、クロマトグラフ分離の特定の条件（例えば、カラムの型、固相など）（例えば、Ｈａｂｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ，３８：３８６−３９２（２０００）；Ｏｕｔｉｎｅｎ  ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６：１９７−２０５（１９９８）；Ｌｅｗｉｓ  ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５９２：１８３−１９５および１９７−２０８（１９９２）；など）の体型的な開発および最適化に利用できる。
【０１６３】
１つの局面において、電気泳動タグ候補の初期選択は、代表的に選択されたカラムおよび固定相によって分離される分子の物理化学的な特性により支配される。次いで、この初期選択は、上記参考文献に記載されるような従来の最適化手順に従って、および特定の実施形態の分離目的について、より適切な候補電気泳動タグで置換することによって、経験的に改善される。１つの局面において、本発明の分離目的は、（ｉ）複数の電気泳動タグを、６０分未満の分離時間（より好ましくは４０分未満であり、そしてなおより好ましくは、１０〜４０分の間の範囲）で、識別可能なピークまたはバンドに分離すること、（ｉｉ）任意の対が少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも１．２５、およびさらにより好ましくは少なくとも１．５０の分解能を有するような、ピークまたはバンドを形成すること、（ｉｉｉ）分離の間の１５０ｂａｒ未満のカラム圧、（ｉｖ）２５℃〜９０℃の範囲（好ましくは、３５℃〜８０℃の範囲）の分離温度、および（ｖ）複数の識別可能なピークが、５〜３０の範囲内であり、全てのピークが同じクロマトグラム内にあることを包含する。本明細書中で使用される場合、２つのピークまたはバンドを参照していう「分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」は、２つのピークまたはバンド間の距離を、そのピークの平均基礎幅で割ったものである（例えば、Ｓｎｙｄｅｒら（前出））。
【０１６４】
クロマトグラフ法は、それらのクロマトグラフ特性に基づき、電気泳動タグを分離するのに使用される。クロマトグラフ特性は、例えば、規定された条件下、特定のクロマトグラフ媒体における電気泳動タグの保持時間、またはクロマトグラフタグが特定のクロマトグラフ媒体から溶出される特定の条件であり得る。電気泳動タグのクロマトグラフ特性はまた、規定された条件下、特定のクロマトグラフ媒体を用いてクロマトグラフィー分離される電気泳動タグの１つのグループまたはセットに含まれる電気泳動タグの溶出の順序、もしくは溶出パターンであり得る。電気泳動タグのクロマトグラフ特性は、電気泳動タグの物理的特性、ならびにクロマトグラフ媒体および移動相との相互作用により決定される。クロマトグラフについての規定された条件は、特定の移動相溶液、カラムのジオメトリ（カラムの直径および長さを含む）、カラム操作のｐＨ、流速、圧力、および温度、ならびに電気泳動タグの所望の分離を得るために変更され得る他のパラメータを含む。電気泳動タグ、または電気泳動タグのクロマトグラフ特性は、種々のクロマトグラフ法を用いて検出され得る。
【０１６５】
標準的な液体クロマトグラフ法が、電気泳動タグを分離するのに使用され得るが、高圧（または高性能）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、高い分解能、分析速度の向上、より高い再現性、および機器操作およびデータ分析の自動化の容易さという利点を提供する。ＨＰＬＣ法はまた、種々の物理化学的特性に基づく電気泳動タグの分離を可能にする。ＨＰＬＣは、関係の近いタグ間を識別するのに使用され得るので、類似の特性を有する電気泳動タグが同じ実験において一緒に使用され得る。得られる電気泳動タグを互いに識別可能であるので、ＨＰＬＣ法を用いて達成される高い程度の分解能は、大セットのタグプローブの使用を可能にする。大セットのタグプローブを検出する能力は、標的核酸および標的分析物の多検出を実施する場合に有利である。本明細書中で使用される場合、「ＨＰＬＣ」は、（ｉ）３００ｍｍまでの長さおよび５ｍｍまでの内部直径を有する強固な円柱形分離カラムを用い、（ｉｉ）分離カラムに詰められた５μｍまでの同じ直径を有する強固な球形粒子（例えば、シリカ、アルミナ等）を含む固相を有し、（ｉｉｉ）３５℃〜８０℃の範囲の温度および１５０ｂａｒまでのカラム圧で実施され、そして（ｉｖ）１μＬ／分〜４ｍＬ／分の範囲の流速を用いる、液相クロマトグラフィー分離をいう。ＨＰＬＣにおいて使用するための固相粒子は、（ｉ）平均粒子直径付近の狭いサイズ分散を有し、実質的に全ての粒子の直径が、平均の１０％内にあること、（ｉｉ）７０〜３００オングストロームの範囲の同じ孔サイズを有すること、（ｉｉｉ）５０〜２５０ｍ２／ｇの範囲の表面積を有すること、および（ｉｖ）１〜５／ｎｍ２の範囲の結合相密度（すなわち、保持リガンド数／単位面積）を有すること、でさらに特徴付けられる。
【０１６６】
１回の実験で検出される電気泳動タグのセットは、一般的に、質量、電荷、質量−電荷比、検出可能なタグ（例えば、異なる発蛍光団またはアイソトープ標識）、または他の固有の特徴により相違する、化学的に関連する分子の一群である。従って、電気泳動タグの化学的性質および一群の電気泳動タグ中の電気泳動タグ間の特定の相違点の両方が、サンプル中の電気泳動タグを分離するために適切なクロマトグラフィー媒体を選択する際に考慮され得る。
【０１６７】
逆相クロマトグラフィーは、化学的に結合した相が移動相よりも疎水性（非極性）であるクロマトグラフィー型である。これは、固定相が親水性（極性）であり、出発移動相が固定相よりも非極性である順相クロマトグラフィーと「逆」である。移動相の勾配（有機変更因子（通常は、アセトニトリルまたはメタノール）の濃度が増加する）が、逆相ＨＰＬＣにおいて一般的に使用される。これらの勾配は、疎水性が高くなる順序で、溶質分子を溶出する。本発明において、水溶性電気泳動タグを分離するのに使用される例示の移動相としては、水、ニトロメタン、メタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、酢酸、メトキシエタノール、ベンジルアルコール、アセトン等が挙げられるがこれらに限定されない。移動相は、無勾配で使用され得るか、または、連続的に変化する比率で組み合わされてカラムに送達され得る。後者の場合、通常２つの溶媒が、時間と共に直線的に変化する比率で組み合わされる（すなわち、勾配送達）。
【０１６８】
種々の移動相添加物が、電気泳動タグの分離を改善する異なる選択性を提供するよう使用され得る。例えば、イオン対形成試薬が、逆相ＨＰＬＣ法において使用され得る。例示的なイオン対形成試薬としては、アニオン性イオン対形成試薬であるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、およびカチオン性イオン対形成試薬であるリン酸テトラブチルアンモニウムが挙げられる。
【０１６９】
逆相ＨＰＬＣは、有機分子、オリゴヌクレオチド、ペプチド、およびポリペプチドを含む、種々のタイプの電気泳動タグを分離するのに使用され得る。逆相ＨＰＬＣは、互いに関係の近いペプチドまたはポリペプチド電気泳動タグを分離するのに特に有用である。電気泳動タグを分離するための、例示的な逆相クロマトグラフィー媒体としては、それらの表面に保持リガンド（例えば、フェニル基、シアノ基、またはＣ８〜Ｃ１８を含む基から選択される脂肪族基）が結合した粒子（例えば、シリカまたはアルミナ）が挙げられる。好ましくは、この粒子は、８０〜３００オングストロームの範囲の孔サイズを有する。
【０１７０】
ペプチドである電気泳動タグを分離するための、例示の逆相クロマトグラフィー媒体としては、Ｃ８〜Ｃ１８の範囲の脂肪族保持リガンドがその表面に結合しており、かつ６０〜８０オングストロームの孔サイズを有する粒子が挙げられる。電気泳動タグを分離するのに有用な市販の調製物としては、例えば、Ａｐｅｘ  ＷＰオクタデシルＣ１８、オクチルＣ８、ブチルＣ４、およびフェニル、Ａｑｕａｐｒｅｐ  ＲＰ−３０００Ｃ４およびＣ８、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＷＰ  オクタデシルＣ１８、オクチルＣ８、ブチルＣ４、およびジフェニルが挙げられる。
【０１７１】
ＨＰＬＣによる分離の前に、サンプルは、例えば、粒子状物質またはレポータータグ以外の分子を除去するため、分画され得るかまたはプレ分離工程に供され得る。サンプルを分画するための標準的な生化学法（例えば、遠心分離、沈降、濾過、および抽出）に加えて、種々のＨＰＬＣプレカラムまたはガードカラムが、この目的で使用され得る。
【０１７２】
分離された電気泳動タグは、種々の分析法（電気泳動タグの固有の特性（例えば、吸光度、蛍光、または電気化学的特性）の検出、および電気泳動タグに結合された検出基または検出部分の検出が挙げられる）を用いて検出され得る。必須ではないが、クロマトグラフィー分離後の検出を容易にするため、種々の検出基または検出部分が、電気泳動タグに結合され得る。
【０１７３】
液体クロマトグラフィーにおいて使用する検出法は周知であり、市販されており、自動サンプリングおよび高スループットサンプリングに適合可能である。電気泳動タグの分析のために選択される検出法は、電気泳動タグが検出可能基または部分を含むか否か、使用される検出可能基のタイプ、および電気泳動タグおよび検出可能基の物理化学的特性（使用される場合）に依存する。蛍光、電解質の導電率、屈折率、および蒸発光散乱（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）に基づく検出方法が、種々のタイプの電気泳動タグを検出するのに使用され得る。
【０１７４】
種々の光学的検出器が、液体クロマトグラフィーによって分離された電気泳動タグを検出するのに使用され得る。紫外線（ＵＶ）／可視光線分光検出器を用いて核酸、ポリペプチド、ペプチド、ならびに他の高分子および低分子を検出する方法が周知であり、ＵＶ／可視光検出は、ＨＰＬＣ分析に最も広く使用されている検出法である。透明な極性の液体である移動相と共に使用される場合、赤外線分光光度法もまた、高分子および低分子を検出するのに使用され得る。
【０１７５】
可変波長検出器およびダイオードアレイ検出器が、市販されている２つの型のＵＶ／可視光分光光度計である。いくつかの可変波長ＵＶ検出器の有用な特徴は、ピークがフローセルを通過している間に、種々の波長で分光光度走査および正確な吸光度の読み取りを実施する能力である。ダイオードアレイ技術は、２つ以上の波長での吸光度測定を可能にするというさらなる利点を提供する。このことは、このような吸光度測定の比を算出することを可能にする。このような複数の波長での吸光度の割り当て（ｒａｔｉｏｎｉｎｇ）は特に、ピークが１つの電気泳動タグを表すのかまたは１つより多い電気泳動タグを表すのかを決定するのに役立つ。
【０１７６】
蛍光検出器はまた、蛍光電気泳動タグ（例えば、蛍光検出基を含むタグ、および最初から蛍光を有するタグ）を検出するのに使用され得る。代表的に、蛍光感度は相対的に高く、電気泳動タグが発蛍光団を含む場合に、他のスペクトル検出法に勝る利点を提供する。電気泳動タグは、検出可能な蛍光を最初から有し得るが、電気泳動タグが適切な蛍光検出基を含む場合、サンプル中の単一の電気泳動タグを検出することが可能となり得る。
【０１７７】
電気化学的検出法もまた、ＨＰＬＣによって分離される電気泳動タグを検出するのに有用である。電気化学的検出は、適切な電極での電気泳動タグの酸化反応または還元反応から生じる電流の測定に基づく。電流のレベルは電気泳動タグの濃度に直接比例するので、電気化学的検出は、所望の場合、定量的に使用され得る。
【０１７８】
質量分析法もまた、ＨＰＬＣにより分離された電気泳動タグを検出するのに使用され得る。質量分析計は、小さな質量の差を有するイオンを分解し、高い程度の精度および感度でイオンの質量を測定し得る。質量分析法は、当該分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ−７１６Ｒ（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと）。
【０１７９】
任意の検出法を用いて得られたデータの分析（例えば、スペクトル逆重畳積分法および定量分析）は、手作業で、またはコンピューター支援により行われ得、そして自動化方法を用いて実施され得る。種々のコンピュータプログラムが、ピーク積分、ピーク面積、高さ、および保持時間を決定するのに使用され得る。このようなコンピュータプログラムは、電気泳動タグの存在を定性的または定量的に決定する上で、簡便さのために使用され得る。ＨＰＬＣおよび対応する検出器と共に使用されるコンピュータプログラムは、当業者に周知であり、一般的に、市販のＨＰＬＣおよび検出システムと共に提供される。
【０１８０】
サンプル中に含まれる特定の電気泳動タグは、例えば、参照電気泳動タグの既知のクロマトグラフィー特性のデータベースとの比較により、またはピークを個々に積分する必要なくサンプル中の成分の同定を可能にするアルゴリズム法（例えば、クロマトグラフィーパターンマッチング）により決定され得る。サンプル中の電気泳動タグのアイデンティティーは、所望により、多数の電気泳動タグが同時に同定される場合、組み合わせ法により決定され得る。
【０１８１】
種々の市販のシステムが、電気泳動タグの高スループット分析によく適している。当業者は、電気泳動タグのＨＰＬＣ分析を自動化するのに有用な適切な設備（例えば、自動化サンプル調製システムおよび自動注入システム）を決定し得る。自動化方法は、例えば、多くのサンプルが処理される場合の電気泳動タグの高スループット分析または標的分析物を検出するための本発明の方法の多重適用のために使用され得る。本発明において使用するのに適した例示のＨＰＬＣ機器システムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。
【０１８２】
当業者は、電気泳動タグの信頼性のある分析を得るため（特に、分析が高スループット形式で実施される場合）に有用な品質制御手段を認識している。このような品質制御手段としては、外部および内部参照標準の使用、クロマトグラフピーク形状の分析、機器の性能評価、実験法の確認（例えば、直線性の範囲、サンプルの回収、サンプルの溶液安定性、および測定の精度を決定することによる）が挙げられる。
【０１８３】
本発明の別の局面において、電気泳動タグは、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）によって分離される。ＣＥＣにおいて、液相は、毛細管サイズのカラム（例えば、３０〜１００μｍの範囲の内径を有するカラム）を通じた電気浸透流により駆動される。ＣＥＣは、Ｓｖｅｃ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：１−４７（２００２）；Ｖａｎｈｏｅｎａｃｋｅｒら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：４０６４−４１０３（２００１）；および同様の参考文献に開示されている。ＣＥＣカラムは、従来の逆相ＨＰＬＣにおいて使用されるのと同じ固相材料を使用し得、さらに、いわゆる「モノリシックな（ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ）」粒子でない充填物を使用し得る。いくつかの形態のＣＥＣにおいて、圧力および電気浸透は、カラムを通じてサンプル含有溶媒を駆動する。
【０１８４】
（ＧＰＣＲ経路アッセイ）
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、薬物標的の最も重要なファミリーの一つである。Ｇタンパク質により媒介されるシグナル伝達系は、多くの生物（例えば、哺乳動物および酵母）で同定されている。ＧＰＣＲは、他の細胞外シグナルの中でも、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質、および光に反応する。ＧＰＣＲは、膜貫通ドメインを形成する７つの異なる疎水性領域（各々約２０〜３０アミノ酸長）により特徴付けられるタンパク質の大きなスーパーファミリーであると考えられている。そのアミノ酸配列は、スーパーファミリー全体にわたって保存されていないが、各々の系統学的に関連するサブファミリーは、新規のメンバーを同定および分類するのに使用され得る多くの高度に保存されたアミノ酸モチーフを含む。個々のＧＰＣＲは、特定のシグナル伝達経路を活性化するが、少なくとも１０個の異なるシグナル伝達経路が、ＧＰＣＲを介して活性化されることが公知である。例えば、β２−アドレナリンレセプター（βＡＲ）は、プロトタイプ哺乳動物ＧＰＣＲである。アゴニストの結合に応答して、βＡＲレセプターは、Ｇタンパク質（Ｇｓ）を活性化し、次いで、アデニレートシクラーゼおよびその細胞における環状アデノシン一リン酸の産生を刺激する。
【０１８５】
ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーは、Ｇタンパク質共役レセプターキナーゼ（ＧＲＫ）のリン酸化、それに続くアレスチン結合を伴う共通の機構を介して脱感作すると想定されている。タンパク質β−アレスチンは、Ｇタンパク質レセプターキナーゼによりリン酸化されたアゴニスト活性化レセプターに結合することによりＧＰＣＲシグナル伝達を調節する。β−アレスチンタンパク質は、レセプターインターナリゼーションの間、ＧＰＣＲに結合したままである。ＧＰＣＲとα−アレスチンとの間の相互作用は、いくつかの方法を用いて測定され得る。１つの例において、β−アレスチンタンパク質は、緑色蛍光タンパク質に融合され、タンパク質融合体が作製される（Ｂａｒａｋら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２  ４４：２７４９７−５００）。βアレスチンのＧＰＣＲへのアゴニスト依存性の結合は、蛍光顕微鏡によって可視化され得る。顕微鏡はまた、クラスリンコーティング窩へのＧＰＣＲ  β−アレスチン複合体のその後の移動を可視化するのにも使用され得る。生細胞におけるＧＰＣＲへのβ−アレスチンの結合を測定するための他の方法としては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移行）、ＢＲＥＴ（生物発光エネルギー移行）、または酵素補完（Ｒｏｓｓｉら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１６）：８４０５−１０）のような技術が挙げられる。
【０１８６】
現在、４００近くのＧＰＣＲが存在し、その中性リガンドおよび機能が公知である。これらの公知のＧＰＣＲ（それらの内因性リガンドに因んで命名されている）は、５つの主要なカテゴリーに分類されている：クラスＡ  ロドプシン様；クラスＢ  セクレチン様；クラスＣ  代謝調節性グルタメート／フェロモン；クラスＤ  真菌フェロモン；クラスＥ  ｃＡＭＰ（ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）。クラスＡの代表的なメンバーは、アミンレセプター（例えば、ムスカリン、ニコチン、アドレナリン、アデノシン、ドパミン、ヒスタミン、およびセロトニン）、ペプチドレセプター（例えば、アンジオテンシン、ブラジキニン、ケモカイン、エンドセリン、およびオピオイド）、ホルモンレセプター（例えば、卵胞刺激、ルトロピン、およびチロトロピン）、および感覚レセプター（ロドプシン（光）、嗅覚（匂い）、および味覚（味）レセプターが挙げられる）である。クラスＢの代表例としては、セクレチン、カルシトニン、ガストリン、およびグルカゴンレセプターが挙げられる。
【０１８７】
今日の多くの使用可能な治療薬は、ＧＰＣＲを標的化する。なぜならば、それらは、血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌物質分泌、および胃ぜん動速度を含む、生命の生理学的応答を媒介するからである（ＷｉｌｓｏｎおよびＢｅｒｇｓｍａ（２０００）Ｐｈａｒｍ．Ｎｅｗｓ  ７：１０５−１１４）。例えば、β−アドレナリンレセプターに対するリガンドは、過敏症、ショック、高血圧、低血圧、喘息、および他の状態の処置に使用される。さらに、疾患は、ＧＰＣＲの自発的な活性化の発生（ＧＰＣＲ細胞応答が、リガンドの非存在下で生成される）により引き起こされ得る。ＧＰＣＲのアゴニストである薬物は、この自発的な活性を減少させ（逆アゴニズムとして公知のプロセス）、重要な治療因子である。
【０１８８】
ＧＰＣＲの治療的重要性に起因して、ＧＰＣＲリガンド活性についての化合物の迅速なスクリーニングのための方法が望まれる。本発明は、概して、ＧＰＣＲ経路を調節（活性化または阻害、増強または抑制）する能力について、試験化合物および試験条件をスクリーニングする方法を提供し、一般に細胞におけるＧＰＣＲ経路の機能（例えば、オーファンＧＰＣＲの機能）を評価する方法を提供する。本発明の方法の別の局面において、式Ｇ−Ｌ−Ｅを有する化合物が、細胞膜に結合される。候補リガンドまたは候補リガンドのライブラリは、異なる波長で活性化される感作物質（例えば、光感作物質）に結合され得る。リガンドはレセプターに結合され、その後、光源により光感作物質の励起により、切断可能なリンカーが切断されて、電気泳動基が放出される。放出された電気泳動基は、上述のように、細胞外液で検出され得、これは、ＧＰＣＲ活性の調節（阻害または活性化）または細胞、細胞膜などにおけるＧＰＣＲの存在の指標となる。
【０１８９】
別の局面において、ＧＰＣＲレセプターを含む細胞は、本発明のＧ−Ｌ−Ｅ化合物で標識され得、リガンドは、飽和するまで適定される。非結合リガンドの濃度が算出され得、それによって、細胞表面上に存在するレセプターの量についての情報が提供される。結合が観察されない場合、ＧＰＣＲレセプターは、膜上に存在しないか、またはリガンドがレセプターと会合することができないかのいずれかである。
【０１９０】
従って、リガンドの結合は、同じ細胞中の検出可能なシグナルの変化を経時的（すなわち、試験化合物または試験化合物のライブラリの１つ以上のメンバーへの暴露前または暴露後）に比較することによって検出され得る。あるいは、試験細胞は、予め構築された標準と比較され得る。既知のモジュレーター（例えば、アゴニストまたはアンタゴニストリガンド）が利用可能な場合、本発明の方法は、候補ＧＰＣＲアゴニストおよびアンタゴニストについての化学化合物ライブラリをスクリーニングしこれらを研究するのに使用され得る。従って、本発明の方法は、容易に検出可能な結果を提供する。
【０１９１】
１つの局面において、本発明は、ＧＰＣＲ活性のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）既知のまたは未知のＧＰＣＲを発現する細胞を提供する工程であって、ここで、細胞が、式Ｇ−Ｌ−Ｅを有する化合物、本明細書中に開示される他の検出可能な標識、またはそれらの組み合わせで標識されている、工程；（ｂ）細胞を、試験化合物および切断試薬（例えば、一重項酸素）に暴露する工程；（ｃ）放出された標識からのシグナルを検出する工程；および（ｄ）試験化合物の存在下で生じたシグナルと、非存在下で生じたシグナルを比較する工程であって、ここで、シグナルの変化は、その化合物が、ＧＰＣＲのモジュレーターであることを示す、工程、を包含する。明らかなように、本発明の方法は、多重細胞アッセイ（例えば、２〜１００倍多重、より好ましくは、２〜２０倍多重）を同時に可能にするために使用され得る。
【０１９２】
別の局面において、本発明は、候補ＧＰＣＲモジュレーター化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ａ）細胞または細胞集団を、式Ｇ−Ｌ−Ｅの化合物および切断誘導部分と会合する工程；ｂ）細胞を、予め決定された濃度の試験化合物または試験化合物のライブラリの各メンバーに暴露する工程；ｃ）放出された標識からのシグナルを検出し、候補モジュレーターの存在下と非存在下における標識シグナルを比較する工程、を包含する。
【０１９３】
さらに別の局面において、本発明は、細胞または細胞集団を、ＧＰＣＲの存在についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）細胞または細胞集団を提供する工程；（ｂ）細胞または細胞集団を、本発明の膜係留電気泳動プローブと会合させる工程；（ｃ）細胞または細胞集団をＧＰＣＲに対する既知のアゴニストを含む試験溶液に暴露すること；（ｄ）切断可能なリンカーが切断され、電気泳動標識（Ｅ）が放出される条件に、細胞または細胞集団を暴露する工程；および（ｅ）放出された標識を検出する工程であって、ここで、該標識の放出は、このようなＧＰＣＲの存在を示す、工程、を包含する。好ましくは、上記方法において、このような公知のアンタゴニストは、図１Ａに示されるような切断誘導部分で標識される。スクリーニングされる細胞の集団は、上述されており、そして組織、器官、または生物をさらに含み得る。
【０１９４】
従って、本発明は、オーファンＧＰＣＲについてのモジュレーターを同定するための簡便な方法を提供する。オーファンＧＰＣＲは代表的に、配列比較ベースの方法により同定されるが、その同属リガンドは未知である新規レセプターである。４００〜５０００のオーファンＧＣＰＲが、ヒトゲノムにおいて、コードされ得ると概算される。これらは、新規薬物を開発するための広い能力を表している。
【０１９５】
（ＧＰＣＲを発現する細胞の調製）
ＧＰＣＲを発現する細胞を調製する方法は、記載されている。例えば、米国特許第６，０５１，３８６号、同６，０６９，２９６号、同６，１１１，０７６号、および同６，２８０，９３４号を参照のこと。一般的に、ＧＰＣＲをコードする相補的ＤＮＡが獲得され得、そして当該分野で周知の技術を用いて、適切な細胞宿主中で発現され得る。代表的には、一旦全長ＧＰＣＲ  ｃＤＮＡが獲得されれば、それは、機能的分析のために、哺乳動物細胞株、酵母細胞、両生類細胞、または昆虫細胞中で発現され得る。好ましくは、この細胞株は、ＧＰＣＲ発現について特徴付けられており、かつ必要に応じて下流のエフェクターへの機能的カップリングを可能にするＧタンパク質の広いレパートリーを含む哺乳動物細胞株である。このような細胞株の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株またはヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）株が挙げられる。ｃＤＮＡが発現される細胞は、本明細書中に開示される方法を用いてコード化され得、従って、多重リガンドスクリーニングが可能となる。次いで、発現されるレセプターは、種々の機能的アッセイにおいてスクリーニングされ得、上述のような活性化リガンドが同定される。
【０１９６】
（キット）
本発明の方法を実施するのに有用な試薬を含むキットもまた提供される。キットの成分は、ハウジングにより保持される。このキットを用いて本発明の方法を実施するための指示書がハウジングと共に提供され、そしてこれはハウジング内またはハウジング外に配置され得、そして指示を読み易くするように、ハウジングを形成する任意の表面の内側または外側に印刷され得る。１つの実施形態において、本発明のキットは、１つ以上の本発明の膜係留電気泳動プローブを備える。好ましくは、本発明のキットは、キット電気泳動プローブの各々が、キットの他の各々の電気泳動タグと異なる電気泳動特性および／または光学的特性を有する放出可能な電気泳動タグを有するように、２〜１００個の複数の膜係留電気泳動プローブ、より好ましくは、２〜５０個の複数の膜係留電気泳動プローブを備える。本発明のキットは、均一アッセイ形式または非均一アッセイ形式のいずれかのための材料を提供し得る。前者の実施形態において、キットは、好ましくは、消費者の目的の標的分子に特異的な抗体または抗体結合組成物に結合された、または結合するための切断誘導部分を含む。このような抗体または抗体結合組成物は、キットの成分として提供され得るか、またはそれは、消費者によって提供され得る。さらなる趣向において、このようなキットは、抗体または抗体結合組成物に結合された光感作物質を備える。後者の実施形態において、本発明のキットはさらに、所望の成分を有する膜を分離するための抗体または抗体結合組成物を備え得る（このような抗体または結合組成物は、その成分に特異的である）。このような後者の実施形態において、キットは、分離工程後に電気泳動タグを放出するための切断因子をさらに備え得る。別の実施形態において、本発明のキットは、複数の細胞株を備え、ここで、各々の細胞株の膜は、異なる本発明の膜係留電気泳動プローブを含む。好ましくは、このような複数の細胞株は、２〜１００個の異なる細胞株であり、より好ましくは、２〜５０個の異なる細胞株であり、さらにより好ましくは、２〜２０個の異なる細胞株である。上述のように、このようなキットは、均一または不均一アッセイ形式のいずれかのために提供され得、そして所望の特性を有する細胞株を他の細胞株から分離するための電気泳動タグを放出するために上記と同じ成分を備え得る。
【実施例】
【０１９７】
（ＩＩＩ．実施例）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。この実施例は、例示目的のためのみに提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０１９８】
（実施例１：親油性ｅＴａｇ  Ｐｒｏ２８−アミドの合成）
ＤＭＦ中での、５−カルボキシフルオレセインと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）との反応により、対応するＮＨＳエステルを得、次いで、これをエチレンジアミンで処理した。得られたアミンを、α−ブロモフェニル酢酸ＮＨＳエステルと反応させて、所望のα−ブロモ誘導体１を得た（図６Ａを参照のこと）。ＤＭＦ中で、１１−メルカプトウンデカン酸およびＥＴ３Ｎにより１を処理して、酸２を得た。最後に、２をそのＮＨＳエステルに変換し、その後、ジオクタデシルアミンと反応させることで、標的構造Ｐｒｏ２８−アミド（本明細書中でＰｒｏ２８とも称する）を得た。
【０１９９】
（実施例２：親油性ｅＴａｇ  Ｐｒｏ２９−アミドの合成）
５−アミノフルオレセインと、塩化α−ブロモフェニルアセチル（α−ブロモフェニル酢酸を塩化オキサルで処理することによって調製した）と反応させることで、ブロモ化合物３を得（図６Ｂを参照のこと）、次いで、これを、ＤＭＦ中で、３−メルカプトプロパン酸およびトリエチルアミンと反応させた。最後に、得られたα−チオ酸４を、上記のように、Ｐｒｏ２９−アミドに変換した。
【０２００】
（実施例３：親油性ｅＴａｇ  Ｐｒｏ３６−アミドの合成）
出発物質として５−カルボキシフルオレセインを用いるＰｒｏ３６−アミドの合成を、以下の通りに実施した（図６Ｃを参照のこと）。フルオレセイン誘導体を、１，１０−ジアミノデカンと縮合させて、障害の少ないカルボキシル基でアミド結合を形成させた。末端アミンを、Ｆｍｏｃ保護グリシンのＮＨＳエステルと反応させた。次いで、Ｆｍｏｃ保護アミンを脱保護し、α−ブロモフェニル酪酸のＮＨＳエステルと反応させた。３−メルカプトプロパン酢酸よるブロミドの求核置換、その後の酸のＮＨＳ活性化およびジオクタデシルアミンとの縮合により、この生成物を得た。
【０２０１】
新規の化合物および膜を標識するためのこの化合物の使用を開示した。前述の内容から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されているが、その意図および範囲から逸脱することなく種々の変更が成され得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の化合物を使用する均質アッセイ形式を図示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の化合物を使用する不均質アッセイ形式を図示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の１実施態様によるビオチン化部分およびアビジン化電気泳動タグの使用を図示している。
【図２】図２は、代表的な親油性基を描写している。
【図３Ａ】図３Ａは、酸化不安定性連鎖、および一重項酸素により媒介されるそれらの対応する開裂反応を図示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、酸化不安定性連鎖、および一重項酸素により媒介されるそれらの対応する開裂反応を図示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、酸化不安定性連鎖、および一重項酸素により媒介されるそれらの対応する開裂反応を図示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、酸化不安定性連鎖、および一重項酸素により媒介されるそれらの対応する開裂反応を図示している。
【図３Ｅ】図３Ｅは、酸化不安定性連鎖、および一重項酸素により媒介されるそれらの対応する開裂反応を図示している。
【図３Ｆ】図３Ｆは、酸化不安定性連鎖、および一重項酸素により媒介されるそれらの対応する開裂反応を図示している。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞膜に取り込まれた親油性電気泳動化合物のリガンド誘導内部移行を図示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、細胞膜に取り込まれた親油性電気泳動化合物のリガンド誘導内部移行を図示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、細胞膜に取り込まれた親油性電気泳動化合物のリガンド誘導内部移行を図示している。
【図５Ａ】図５Ａは、時間の関数および配位子濃度の関数としての標識化合物の内部移行速度を描写している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、時間の関数および配位子濃度の関数としての標識化合物の内部移行速度を描写している。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の数種の化合物を描写している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の数種の化合物を描写している。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の化合物の合成スキームを図示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の化合物の合成スキームを図示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、本発明の化合物の合成スキームを図示している。
【図１Ａ】
2006508907.tif 000012
【図１Ｂ】
2006508907.tif 000013
【図１Ｃ】
2006508907.tif 000014
【図２】
2006508907.tif 000015
【図３Ａ】
2006508907.tif 000016
【図３Ｂ】
2006508907.tif 000017
【図３Ｃ】
2006508907.tif 000018
【図３Ｄ】
2006508907.tif 000019
2006508907.tif 000020
2006508907.tif 000021
【図４Ｂ】
2006508907.tif 000022
【図４Ｃ】
2006508907.tif 000023
【図５Ａ】
2006508907.tif 000024
【図５Ｂ】
2006508907.tif 000025
【図６Ａ】
2006508907.tif 000026
【図６Ｂ】
2006508907.tif 000027
【図７Ａ】
2006508907.tif 000028
【図７Ｂ】
2006508907.tif 000029
【図７Ｃ】
2006508907.tif 000030
【配列表】
2006508907000001.app