(57)【要約】喘息およびアレルギー状態を処置しそれから防御するための方法および製品を提供する。方法および製品は、ある種の制御性Ｔ細胞を誘導し、in vitroおよびin vivoで免疫抑制効果を示す、ある種の天然および合成の両性イオンポリマーに関連する。
2006522135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における喘息以外のアレルギー状態を処置する方法であって、喘息以外のアレルギー状態を有する対象に、該アレルギー状態を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで、該ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、前記方法。
【請求項２】
モチーフが、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与することが、対象の気道にポリマーのエアロゾルを送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象に、ポリマーを用いる処置を必要とする以外の症状は認められない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリマーが多糖類である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリマーが細菌性莢膜多糖類である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリマーがＰＳＡ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリマーがＰＳＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリマーがＰＳＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリマーが肺炎連鎖球菌莢膜多糖類１（ＣＰ１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリマーが脱Ｎ−アセチル化チフス菌Ｖｉ抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマーがアミノ化ペクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリマーが合成ペプチドグリカン化合物１５である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリマーがペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマーが（Ｋ−Ｄ）ｎであって、式中ｎは１０〜１００の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマーが［Ｋ−（Ｘａａ）ｍ−Ｄ］ｎであって、式中、各Ｘａａは独立して任意の中性アミノ酸であり、ｍは０〜８の整数であり、そしてｎは１〜１００の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、対象に対し、グルココルチコイド、抗ヒスタミン薬および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗アレルギー薬を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
投与することが、喘息以外のアレルギー状態を有する対象に、該アレルギー状態を処置するための複数用量の単離されたポリマーを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
同定されたアレルゲンに関連するアレルギー状態を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）同定されたアレルゲンに関連するアレルギー状態を有する対象を前記アレルゲンに暴露すること；および
（ｂ）前記対象に対して、前記アレルギー状態を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与すること、を含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、
前記方法。
【請求項２０】
暴露が、投与に先立って行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
暴露が、投与の後に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
暴露および投与が実質的に同時に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
対象における喘息を処置する方法であって、
喘息を有する対象に、喘息を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、
前記方法。
【請求項２４】
モチーフが、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリマーが、ＣＰ１または合成ペプチドグルカン化合物１５以外のポリマーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
対象に、ポリマーを用いる処置を必要とする以外の症状は認められない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
投与することが、対象の気道にポリマーのエアロゾルを送達することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ポリマーが多糖類である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ポリマーが細菌性莢膜多糖類である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
ポリマーがアミノ化ペクチンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
ポリマーが合成ペプチドグリカン化合物１５である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
ポリマーがペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
ポリマーが（Ｋ−Ｄ）ｎであって、式中ｎは１０〜１００の整数である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
ポリマーが［Ｋ−（Ｘａａ）ｍ−Ｄ］ｎであって、式中、各Ｘａａは独立して任意の中性アミノ酸であり、ｍは０〜８の整数であり、そしてｎは１〜１００の整数である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
方法が、対象に対し、グルココルチコイド、βアドレナリン作動薬、メチルキサンチン、抗コリン作動薬、クロモリン、ネドクロミル、抗ヒスタミン薬、および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗喘息薬を投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
投与することが、喘息以外のアレルギー状態を有する対象に、該アレルギー状態を処置するための複数用量の単離されたポリマーを投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を、前記アレルゲンに暴露すること；および
（ｂ）前記対象に対して、喘息を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与すること、を含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、
前記方法。
【請求項３８】
暴露が、投与に先立って行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
暴露が、投与の後に行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
暴露および投与が実質的に同時に行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生を誘導する方法であって、
制御性Ｔ細胞を単離すること；および
制御性Ｔ細胞を有効量の単離ポリマーに接触させて、該制御性Ｔ細胞によるＩＬ−１０の産生を誘導すること、を含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、
前記方法。
【請求項４２】
ポリマーが多糖類である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ポリマーが細菌性莢膜多糖類である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ポリマーがアミノ化ペクチンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ポリマーが合成ペプチドグリカン化合物１５である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＤ４＋細胞での誘導性副刺激分子（ＩＣＯＳ）の発現を誘導する方法であって、
ＣＤ４＋細胞を有効量の単離ポリマーに接触させてＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現を誘導すること、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分であり；および
ＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現の増加を測定すること、ここで、接触後のＩＣＯＳの発現が接触前のＩＣＯＳの発現を上回っている場合はＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現は増加している、
を含む、前記方法。
【請求項４７】
モチーフが、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ポリマーが多糖類である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ポリマーが細菌性莢膜多糖類である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
ポリマーがＰＳＡ１である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
ポリマーがＰＳＡ２である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
ポリマーがＰＳＢである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
ポリマーが肺炎連鎖球菌莢膜多糖類１（ＣＰ１）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
ポリマーが脱Ｎ−アセチル化チフス菌Ｖｉ抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
ポリマーがアミノ化ペクチンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
ポリマーが合成ペプチドグリカン化合物１５である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する方法であって、
ナイーブＴ細胞集団を単離すること；および
前記ナイーブＴ細胞集団を有効量の単離ポリマーに接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導すること、を含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、
前記方法。
【請求項５８】
ナイーブＴ細胞集団を抗原と接触させることをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ナイーブＴ細胞集団を、外部から供給されるインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、またはＩＬ−２およびＩＬ−１５の組合せと接触させることをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する方法であって、
Ｔ細胞集団を単離すること；および
前記Ｔ細胞集団を有効量の単離ポリマーに接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導すること、を含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、
前記方法。
【請求項６１】
ポリマーが多糖類である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ポリマーが細菌性莢膜多糖類である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
ポリマーがアミノ化ペクチンである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
ポリマーが合成ペプチドグリカン化合物１５である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
Ｔ細胞集団を抗原と接触させることをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
Ｔ細胞集団を、外部から供給されるインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、またはＩＬ−２およびＩＬ−１５の組合せと接触させることをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
対象における、アレルギー状態または喘息以外の抗原特異的免疫応答を抑制する方法であって、アレルギー状態または喘息以外の抗原特異的応答の抑制が必要な対象に対して、（ａ）抗原および、（ｂ）前記対象における前記抗原に対する免疫応答を抑制するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、前記方法。
【請求項６８】
抗原の投与が、ポリマーの投与に先立って行われる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
抗原の投与が、ポリマーの投与の後に行われる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
抗原の投与およびポリマーの投与が実質的に同時に行われる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
ポリマーの投与が、複数用量のポリマーの投与を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
抗原およびポリマーを含む抱合体を含む組成物であって、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、前記組成物。
【請求項７３】
B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位のポリマーのエアロゾル製剤を含む、医薬組成物であって、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、前記医薬組成物。
【請求項７４】
ポリマーが多糖類である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
ポリマーが細菌性莢膜多糖類である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
ポリマーがＰＳＡ１である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７７】
ポリマーがＰＳＡ２である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７８】
ポリマーがＰＳＢである、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７９】
ポリマーが肺炎連鎖球菌莢膜多糖類１（ＣＰ１）である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８０】
ポリマーが脱Ｎ−アセチル化チフス菌Ｖｉ抗原である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８１】
ポリマーがアミノ化ペクチンである、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８２】
ポリマーが合成ペプチドグリカン化合物１５である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８３】
モチーフが、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８４】
ポリマーがペプチドである、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８５】
ポリマーが（Ｋ−Ｄ）ｎであって、式中ｎは１０〜１００の整数である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８６】
ポリマーが［Ｋ−（Ｘａａ）ｍ−Ｄ］ｎであって、式中、各Ｘａａは独立して任意の中性アミノ酸であり、ｍは０〜８の整数であり、そしてｎは１〜１００の整数である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８７】
アレルギー状態を処置するためのエアロゾル製剤を治療的に有効な量含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８８】
アレルギー性喘息を処置するためのエアロゾル製剤を治療的に有効な量含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８９】
アレルギー状態の処置に有用な他の剤をさらに含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項９０】
他の剤が、グルココルチコイド、抗ヒスタミン薬および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗アレルギー薬である、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
喘息の処置に有用な他の剤をさらに含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項９２】
他の剤が、グルココルチコイド、βアドレナリン作動薬、メチルキサンチン、抗コリン作動薬、クロモリン、ネドクロミル、抗ヒスタミン薬、ＩＬ−１０、および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗喘息薬である、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
容器を含むエアロゾル送達システムであって、該容器が、内部、該容器内部と流体接続しているエアロゾル発生器、および該容器内部内に配置された請求項７３に記載の医薬組成物を有する、前記エアロゾル送達システム。
【請求項９４】
エアロゾル送達システムが、ポリマーの送達のための計量吸入器である、請求項９３に記載のエアロゾル送達システム。
【請求項９５】
エアロゾル送達システムが、ポリマーの送達のための乾燥粉末吸入器である、請求項９３に記載のエアロゾル送達システム。
【請求項９６】
エアロゾル送達システムが、ポリマーの送達のための噴霧吸入器である、請求項９３に記載のエアロゾル送達システム。
【請求項９７】
エアロゾル送達システムが、ポリマーを上皮へ局所的に送達するためのスプレーディスペンサーである、請求項９３に記載のエアロゾル送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年３月３１日に出願された米国仮出願第60/459,056号の利益を主張し、該仮出願の全体は本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は免疫学の分野に関する。特に、本発明は免疫応答の抑制に有用な方法および組成物に関する。本発明は、制御性Ｔ細胞の誘導のための免疫調節性両性イオンポリマーが関与する方法、使用および組成物、並びに喘息およびアレルギーの処置を提供する。
【０００３】
発明背景
細菌細胞の表面から精製されたある種の多糖類は、腹腔内膿腫、腹腔内敗血症、および術後癒着の形成などの炎症モデルにおいて試験された場合、in vivoで防御効果を示す（米国特許第5,679,654号および第5,700,787号；公開された国際特許出願WO 96/07427、WO 00/59515、およびWO 02/45708。莢膜全体から精製された場合、Bacteroides fragilis、黄色ブドウ球菌、および肺炎連鎖球菌由来のある種の多糖類は、それらを多くの多糖類抗原から区別させているユニークな特徴を有する。これらの分子は高分子量でらせん状であり、その性質は両性イオン性である。Wang Y et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:13478-81；Brubaker JO et al. (1999) J Immunol 162:2235-42: Tzianabos AO et al. (1995) Infect Immun 62:4881-6；Tzianabos AO et al. (1995) J Clin Invest 96:2727-31；Kalka-Moll WM et al. (2000) J Immunol 164:719-24；Tzianabos AO et al. (2000) J Biol Chem 275:6733-40。
【０００４】
ほとんどの細菌性多糖類は中性または負に荷電しており、Ｔ細胞非依存性抗原と考えられる。Abbas AK et al. (2003) Cellular and Molecular Immunology, Saunders, Philadelphia。しかし、これらの多糖類はその両性イオン性の性質により、ＣＤ４＋Ｔ細胞との相互作用に何らかの形で関与することが示唆されている。Tzianabos AO et al. (1993) Science 262:416-9；Tzianabos AO et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:9365-70。両性イオン多糖類がin vitroでＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することは、Ｔ細胞の増殖ならびにサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０の産生を促進するそれらの能力についての報告により支持されている。さらに、多糖類が誘導したＴ細胞により、防御効果がin vivoで適合的に伝達されることが報告されている。公開された国際特許出願WO 00/59515；Kalka-Moll WM et al. (2000) J Immunol 164:719-24；Tzianabos AO et al (2000) J Biol Chem 275:6733-8。しかし、これらの分子が正確にはいかにしてＴ細胞を活性化するか、またはそれらがいかにして防御効果を示すかについては、まだ明確になっていない。
【０００５】
本発明の概要
喘息およびアレルギー状態を処置しそれに対して防御するための方法および製品が提供される。これらの方法および組成物は、ある種の莢膜多糖類および合成ペプチドを含む、ある種の両性イオンポリマーが、ＣＤ４＋Ｔリンパ球でＩＣＯＳを誘導し、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ細胞）の発生を促進することを本発明者らが発見したことに部分的に関連している。本明細書に開示されるように、両性イオンポリマーにより誘導されるＴｒｅｇ細胞は、膿瘍および癒着の形成、炎症性腸疾患、および気道過敏症（喘息）を含む多くの炎症およびアレルギー状態に対して、防御を付与し伝達することができる。
【０００６】
本発明により、ある種の両性イオンポリマーがＣＤ４＋Ｔ細胞でＩＣＯＳを誘導し、Ｔｒｅｇ細胞の発生（development）を促進することが偶然発見された。他の前の報告によれば、ＩＬ−１０分泌Ｔｒｅｇ細胞は、外部から供給されるＩＬ−１０と、未成熟の樹状細胞（ＤＣ）、またはある種の免疫抑制剤、特に１，２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３およびデキサメタゾンとの存在下で、Ｔ細胞を培養することにより生成可能である。Groux H et al. (1997) Nature 389:737-42；Jonuleit H et al. (2001) J Exp Med 193:1285-94；Barrat FJ et al. (2002) J Exp Med 195:603-16。これらの過去の報告のいずれにも、本発明の両性イオンポリマーが、ＩＣＯＳの発現を誘導すること、またはＴｒｅｇ細胞の発生を促進することに用いられ得ることは、開示または示唆されていない。
【０００７】
両性イオンポリマーがＩＬ−１０の分泌を促進することは既に理解されていたが、ＩＬ−１０の源および重要性は知られていなかった。さらに、ＩＬ−１０は高度に多面的なサイトカインであることが広く認識されているため、ＩＬ−１０分泌の状況は非常に重要である。例えば、ＩＬ−１０のみでは、喘息を悪化させるかまたは処置することの両方が可能であることが報告されている。両性イオンポリマーのＩＣＯＳを誘導する能力の重要性は、ＩＬ−１０の存在下でのＴｒｅｇ細胞の発生における、ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬシグナリングの重要な役割の報告による。Akbari O et al. (2002) Nat Med 8:1024-32。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−１０の源であることに加えて、本発明においても重要な役割を果たすと考えられる。
【０００８】
本発明により、両性イオン多糖類ポリマーは、ペプチドアレルゲンに対する交差防御効果を誘導できることもまた、偶然発見された。
さらに、本発明により、両性イオンペプチドポリマーは、無関連のように見えるペプチドアレルゲンに対して交差防御効果を誘導できることが偶然発見された。
１つの態様おいて、本発明は、対象における喘息以外のアレルギー状態を処置する方法を提供する。この側面による方法は、喘息以外のアレルギー状態を有する対象に、該アレルギー状態を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位（repeating unit of charge motif）を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【０００９】
１つの態様において、モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
１つの態様において、対象には、ポリマーを用いる処置を必要とする以外の症状は認められない。
本発明のこの側面により、１つの態様において、投与することは、対象の気道にポリマーのエアロゾルを送達することを含む。
１つの態様において、この方法は、対象に対し、グルココルチコイド、抗ヒスタミン薬および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗アレルギー薬を投与することをさらに含む。種々の態様において、抗アレルギー薬は、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、クロルシクリジン、クロルフェニラミン、塩酸ジフェンヒドラミン（ＢＥＮＡＤＲＹＬ（登録商標）、Parke-Davis）、塩酸フェキソフェナジン（ＡＬＬＥＧＲＡ（登録商標）、Aventis）、塩酸ヒドロキシジン（ＡＴＡＲＡＸ（登録商標）、Pfizer）、ロラタジン（ＣＬＡＲＩＴＩＮ（登録商標）、Schering）、塩酸プロメタジン（ＰＨＥＮＥＧＲＡＮ（登録商標）、Wyeth-Ayerst）、ピリラミン、または抗ＩｇＥ抗体（オマリズマブ；ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、Genentech/Novartis）である。
【００１０】
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは多糖類である。本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは細菌性莢膜多糖類（bacterial capsular polysaccharide）である。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーはＰＳＡ１である。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーはＰＳＡ２である。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーはＰＳＢである。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは肺炎連鎖球菌莢膜多糖類１（ＣＰ１）である。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは脱Ｎ−アセチル化チフス菌Ｖｉ抗原である。
【００１１】
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーはアミノ化ペクチン（すなわち、アミノ化ポリガラクツロン酸）である。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは化合物１５（公開された国際特許出願WO 03/075953）として知られている、合成ペプチドグルカンである。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは、ＣＰ１または合成ペプチドグルカン化合物１５以外のポリマーである。
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーはペプチドである。１つの態様において、ペプチドは、約１．２ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。
【００１２】
本発明のこの側面および他の全ての側面による１つの態様において、ポリマーは（Ｋ−Ｄ）ｎであり、ここでＫはリジンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、ｎは１０〜１００の整数である。本発明のこの側面および他の全ての側面により、１つの態様において、ポリマーは［Ｋ−（Ｘａａ）ｍ−Ｄ］ｎであり、ここでＫはリジンであり、各Ｘａａは独立して任意の中性アミノ酸であり、ｍは０〜８の整数であり、Ｄはアスパラギン酸であり、そしてｎは１〜１００の整数である。
本発明のこの側面による１つの態様において、投与することは、複数用量の単離されたポリマーを投与することを含む。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、同定されたアレルゲンに関連するアレルギー状態を有する対象を処置する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、（ａ）同定されたアレルゲンに関連するアレルギー状態を有する対象を、前記アレルゲンに暴露すること、および（ｂ）前記対象に、前記アレルギー状態を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与すること、のステップを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
本発明のこの側面による種々の態様において、暴露することは、投与に先立ち、投与の後に、または実質的に投与と同時に行われる。
【００１４】
１つの側面において、本発明は、対象における喘息を処置する方法を提供する。この側面による方法は、喘息を有する対象に、喘息を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
本発明のこの側面による１つの態様において、ポリマーは、ＣＰ１または合成ペプチドグルカン化合物１５以外のポリマーである。
本発明のこの側面による１つの態様において、対象には、ポリマーを用いた処置を必要とする以外の症状は認められない。
【００１５】
本発明のこの側面による１つの態様において、投与することは、対象の気道にポリマーのエアロゾルを送達することを含む。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法は、対象に対し、グルココルチコイド、βアドレナリン作動薬、メチルキサンチン、抗コリン作動薬、クロモリン、ネドクロミル、抗ヒスタミン薬、および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗喘息薬を投与することをさらに含む。種々の態様において、抗喘息薬は、ジプロピオン酸ベクロメタゾン（ＶＡＮＣＥＲＩＬ（登録商標）、Schering）、フルニソリド（ＡＥＲＯＢＩＤ（登録商標）、Forest）、プロピオン酸フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ（登録商標）、GlaxoSmithKline）、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド（ＡＺＭＡＣＯＲＴ（登録商標）、Aventis）、硫酸アルブテロール（ＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）、GlaxoSmithKline；ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（登録商標）、Schering）、エピネフリン、塩酸イソプロテレノール、硫酸メタプロテレノール（ＡＬＵＰＥＮＴ（登録商標）、Boehringer Ingelheim）、テルブタリン（ＢＲＥＴＨＩＮＥ（登録商標）、ＬＡＭＩＳＩＬ（登録商標）、Novartis）、臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（登録商標）、Boehringer Ingelheim）、テオフィリン、クロモリン、ネドクロミル、または抗ＩｇＥ抗体（オマリズマブ；ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、Genentech/Novartis）である。
【００１６】
本発明のこの側面による１つの態様において、投与することは、複数用量の単離されたポリマーを投与することを含む。
１つの側面において、本発明は、同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を処置する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、（ａ）同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を、前記アレルゲンに暴露すること、および（ｂ）前記対象に、喘息を処置するための有効量のポリマーを投与すること、のステップを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００１７】
本発明のこの側面による種々の態様において、暴露することは、投与に先立ち、投与の後に、または実質的に投与と同時に行われる。
１つの側面において、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、制御性Ｔ細胞を単離すること、および、制御性Ｔ細胞を有効量のポリマーに接触させて、該制御性Ｔ細胞によるＩＬ−１０の産生を誘導すること、のステップを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００１８】
１つの側面において、本発明はまた、ＣＤ４＋細胞での誘導性副刺激分子（ＩＣＯＳ）を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は以下のステップを含む：ＣＤ４＋細胞を有効量のポリマーに接触させてＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現を誘導すること、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である；および、ＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現の増加を測定すること、ここで、接触後のＩＣＯＳの発現が接触前のＩＣＯＳの発現を上回っている場合は、ＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現は増加している。
【００１９】
１つの側面における本発明は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、ナイーブＴ細胞集団を単離すること、および、前記ナイーブＴ細胞集団を有効量の単離ポリマーに接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導すること、のステップを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、ナイーブＴ細胞集団を抗原と接触させるステップを含む。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、ナイーブＴ細胞集団を、外部から供給されるインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、またはそれらの組合せと接触させるステップを含む。
【００２０】
１つの側面における本発明は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、制御性Ｔ細胞集団を単離すること、および、前記制御性Ｔ細胞集団を有効量の単離ポリマーに接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導すること、のステップを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、制御性Ｔ細胞集団を抗原と接触させるステップを含む。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、制御性Ｔ細胞集団を、外部から供給されるインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、またはそれらの組合せと接触させるステップを含む。
【００２１】
１つの側面において本発明は、対象における抗原特異的免疫応答を抑制する方法を提供し、ここで該抗原特異的応答とは、アレルギー状態または喘息以外のものである。本発明のこの側面による方法は、アレルギー状態または喘息以外の抗原特異的応答の抑制が必要な対象に対して、（ａ）抗原および（ｂ）前記対象における前記抗原に対する免疫応答を抑制するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００２２】
本発明のこの側面による種々の態様において、抗原の投与は、ポリマーの投与に先立ち、その後に、または実質的に同時に行われる。
１つの態様において、ポリマーを投与することは、ポリマーの複数用量を投与することを含む。
１つの側面において、本発明は、抗原およびポリマーを含む抱合体を含む組成物であって、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である、前記組成物を提供する。
【００２３】
１つの側面において、本発明は医薬組成物を提供する。本発明のこの側面による医薬組成物は、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含むポリマーであって、ここで該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である前記ポリマーの、エアロゾル製剤を含む。
１つの態様において組成物は、アレルギー状態の処置のための、治療的に有効量のエアロゾル製剤を含む。
１つの態様において組成物は、アレルギー性喘息の処置のための、治療的に有効量のエアロゾル製剤を含む。
【００２４】
１つの態様において、医薬組成物はさらに、アレルギー状態の処置に有用な他の剤を含む。種々の態様において、他の剤は、グルココルチコイド、抗ヒスタミン薬および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗アレルギー薬である。
１つの態様において、医薬組成物はさらに、喘息の処置に有用な他の剤を含む。種々の態様において、他の剤は、グルココルチコイド、βアドレナリン作動薬、メチルキサンチン、抗コリン作動薬、クロモリン、ネドクロミル、抗ヒスタミン薬、ＩＬ−１０、および抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される抗喘息薬である。
【００２５】
さらなる側面において、本発明はエアロゾル送達システムを提供し、該エアロゾル送達システムは容器を含み、該容器は、内部、該容器内部と流体接続しているエアロゾル発生器、および該容器内部内に配置された、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位のポリマーを含み、ここで該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。エアロゾル送達システムは、単一用量または複数用量を送達するように作製することができる。１つの態様において、容器は、計量吸入器である。１つの態様において、容器は、乾燥粉末吸入器である。他の態様において、容器は、噴霧吸入器である。さらに他の態様において、容器は、鼻の上皮または他の気道の上皮へ局所的に送達するためのスプレーディスペンサーである。１つの態様において、エアロゾル送達システムは、アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤をさらに含む。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１０を産生するＣＤ４５ＲＢｌｏＴｒｅｇ細胞を誘導することが、in vivoまたはin vitroにおいて望ましい場合に、一般に常に有用である。より具体的には、本発明は、対象におけるアレルギーまたは喘息状態を、予防を含み処置することが望ましい場合に常に有用である。
本発明者らは前に、全て特定の電荷モチーフによって特徴付けられるある種の天然の両性イオン多糖類、改質多糖類およびペプチドが、Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２およびＩＬ−１０の産生を促進すること、並びに多くの細菌、膿瘍および癒着形成に対する防御を誘導することに用い得ることを見出した。Tzianabosらに発行された米国特許第5,679,654号および第5,700,787号、および公開された国際特許出願WO 00/59515を参照のこと；これらの全内容は、本明細書に参照として組み込まれる。
【００２７】
本発明によれば、これらと同一および関連する両性イオンポリマーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導してＩＣＯＳを発現させ、ＩＬ−１０分泌Ｔｒｅｇ細胞の確立および増殖を促進することが発見された。これらのＴｒｅｇ細胞は、ＩＬ−１０を産生するものとしてのみでなく、対象における炎症反応もしくは炎症状態、またはアレルギー反応もしくはアレルギー状態を予防し抑制することに関与可能な、免疫抑制細胞としても重要である。本発明の特徴的な１側面として、両性イオンポリマーは、対象のアレルギー状態の処置および予防に有用であることが見出されている。本発明の特徴的な１側面として、両性イオンポリマーは、喘息の処置および予防に有用であることが見出されている。
【００２８】
本発明の１つの側面において、アレルギー状態を有する対象を処置する方法が提供される。この側面による方法は、アレルギー状態を有する対象に、該アレルギー状態を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで、該ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００２９】
本発明のこの側面および他の全ての側面により有用なポリマーは、以下にさらに詳細に記述される。簡潔に述べると、それらは、多糖類（ＰＳＡを含む）および非多糖類ポリマーの両方を含む両性イオンポリマーである。これらのポリマーは、天然のポリマー、天然ポリマーの改変形態、または天然には見出されない他のポリマーであってよい。
本明細書において「アレルギー状態」すなわち「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対する獲得過敏性を指す。アレルギー状態は、アレルギー性喘息、花粉症（季節性鼻炎）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、じんましん、食物アレルギー、および他のアトピー状態を含むが、これに限定されない。
【００３０】
「アレルゲン」は、敏感な対象においてアレルギー反応または喘息反応を誘導することのできる物質を指す。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、イエダニ、ダスト、真菌胞子、ラテックス（ゴム製品）、および薬物（例えばペニシリン）を含むことができる。天然の動物および植物アレルゲンの例は、以下の属に特異的なタンパク質を含む：イヌ属（カニスファミリアリス）；ヒョウダニ属（例えばコナヒョウダニ）；ネコ属（Felis domesticus）；アンブロシア属（Ambrosia artemiisfolia）；ドクムギ属（例えばドクムギまたはLolium multiflorum）；スギ属（スギ）；アルテルナリア属（Alternaria alternata）；ハンノキ属（Alder）；ハンノキ属（Alnus）（Alnus gultinosa）；カバノキ属（Betula verruscosa）；カシ属（Quercus alba）；オリーブ属（オリーブ）；ヨモギ属（Artemisia vulgaris）;オオバコ属（例えばヘラオオバコ）;ヒカゲミズ属（例えばParietaria officinalisまたはParietaria judaica）；チャバネゴキブリ属（例えばチャバネゴキブリ）；ミツバチ属（例えばApis multiflorum）；イトスギ属（例えばCupressus semipervirens、Cupressus arizonicaおよびCupressus macrocarpa）；ビャクシン属（例えばJuniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communisおよびJuniperus Juniperus ashei）；クロベ属（例えばThuya orientalis）；ヒノキ属（例えばヒノキ）；ゴキブリ属（例えばワモンゴキブリ）；カモジグサ属（例えばAgropyron repens）；ライムギ属（例えばライムギ）；コムギ属（例えばコムギ）；カモガヤ属（例えばカモガヤ）；ウシノケグサ属（例えばFestuca elatior）；イチゴツナギ属（例えばPoa pratensisまたはPoa compressa）；カラスムギ属（例えばカラスムギ）；シラゲガヤ属（例えばシラゲガヤ）；ハルガヤ属（例えばハルガヤ）；オオカニツリ属（例えばArrhenatherum elatius）；Agrostis属（例えばコヌカグサ）;オオアワガエリ属（例えばオオアワガエリ）；クサヨシ属（例えばクサヨシ）；スズメノヒエ属（例えばアメリカスズメノヒエ）；モロコシ属（例えばSorghum halepensis）；およびスズメノチャヒキ（例えばコスズメノチャヒキ）。アレルゲンはまた、アレルギーおよび喘息の実験動物モデルに用いられるようなペプチドおよびポリペプチドも含み、これらにはオボアルブミン（ＯＶＡ）およびマンソン住血吸虫卵抗原を含む。
【００３１】
本明細書において、「対象」は、ヒトまたは他の哺乳類を指し、マウス、ラット、ウサギ、および非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない。
本明細書において「アレルギー状態を有する対象」は、アレルギー状態が存在するか、またはアレルギー状態発生への素因が既知かもしくは疑われる対象を指す。従って、これらの対象は活性化されたアレルギー状態または潜在的なアレルギー状態を有し得る。アレルゲンが既知である必要はない。しかし、ある種のアレルギー状態は季節的または地理的環境因子と関連し、これらは対象には明らかである場合もあるが、その必要性はない。１つの態様において、アレルギー状態は、実験目的のために対象において意図的に誘発される。
【００３２】
本発明のこの側面による１つの態様において、対象は、ポリマーによる処置を必要とする以外の適応病兆は認められない。この態様において、対象は、以下を有さない：感染症、手術、トラウマ、または膿瘍もしくは手術による癒着形成に関連する他の疾患またはリスク因子；Ｔｈ１細胞応答性疾患（インスイリン依存型糖尿病、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、炎症性腸疾患、同種移植の拒絶反応）；特定抗原に対する不適当なＩｇＧ抗体反応を特徴とする疾患（急性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、関節リューマチを含む自己免疫性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；狼瘡）、ＡＩＤＳ、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、およびある種の形態の甲状腺炎）。
【００３３】
本発明の特徴として、ポリマーは、アレルギー状態を有する対象に対して、アレルギー状態を処置するために繰り返しおよび／または長期に投与することができる。以下に記載されるように、繰り返しおよび／または長期の投与は、何日も、何週間も、何ヶ月も、または何年間にも渡って実施することができる。１つの態様において、ポリマーは定期的に繰り返して、例えば毎日または毎週、投与される。１つの態様において、ポリマーは、症状に応じて繰り返し投与される。
【００３４】
１つの側面において、本発明は、同定されたアレルゲンに関連するアレルギー状態を有する対象を処置する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、（ａ）同定された抗原に関連するアレルギー状態を有する対象を、前記アレルゲンに暴露すること、および（ｂ）前記対象に、前記アレルギー状態を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。同定されたアレルゲンに関連するアレルギー状態を有する対象を、このアレルゲンに暴露するステップは、能動的または受動的であってよい。すなわち、能動的暴露は、対象に対して意図的にアレルゲンを投与することを含んでよい；受動的暴露は、対象がアレルゲンに、偶然または環境的接触をすることを含んでよい。特定の態様において、暴露するステップは、ポリマーの投与なしで、対象にアレルギー反応を誘導するのに有効な量の既知のアレルゲンを対象に投与することを特に含む。
【００３５】
種々の態様において、対象をアレルゲンに暴露するステップは、この対象に対する、アレルギー状態を処置するために有効な量のポリマーを投与するステップに先立って、その後に、またはそれと同時に、実施することができる。さらに、暴露の経路および投与の経路は、同じでも、または異なっていてもよい。
１つの側面において、本発明は、アレルギー状態の処置に用いるための医薬の製造における、両性イオンポリマーの使用を提供する。両性イオンポリマーは本明細書の他の部分で記載されているものであり、ここでの使用は、対象のアレルギー状態の処置に用いるために、ポリマーまたはそれらの水和物もしくは薬学的に許容し得る塩の有効量を、薬学的に許容し得る担体中に配置することを含む。使用は、アレルギー状態の処置に用いるのに好適なポリマーの単位用量の製造を含んでよい。アレルギー状態は任意のアレルギー状態であって、上に挙げた任意のアレルギー状態またはアトピー状態を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
１つの側面において本発明は、対象における喘息を処置する方法を提供する。この側面による方法は、喘息を有する対象に対して、喘息を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
１つの態様において、前記モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００３７】
１つの態様において、ポリマーは、ＣＰ１または合成ペプチドグルカン化合物１５以外のポリマーであって、下記に記載のものである。
本明細書において「喘息」は、一過性の呼吸器系の疾患で、気道の炎症および狭窄並びに、吸入した剤に対する気道の反応性の増加を特徴とするものである。喘息は、必ずしもそうではないが、しばしば、アトピー性またはアレルギー性症状と関連する。喘息の症状は、呼吸困難、咳、および喘鳴を含むことが広く認められている；一般にはこれら３症状全てが共存するが、これらの共存は喘息の診断に必要ではない。
本明細書において「喘息を有する対象」は、新しく発症または再発した喘息が、急性に憎悪している対象、または喘息の履歴を有する対象、または喘息発症への素因が既知かもしくは疑われる対象を指す。従って、喘息を有する対象とは、活性化した喘息を有するか、または無症候で急性の憎悪の間であってもよい。１つの態様において、喘息を有する対象は、アレルギー症状に関連する喘息、すなわちアレルギー性喘息を有する対象である。
【００３８】
本発明のこの側面による１つの態様において、対象には、上記のように、ポリマーによる処置を必要とする以外の症状は認められない。
本発明のこの側面による１つの態様において、投与することは、対象の気道にポリマーのエアロゾルを送達することを含む。この態様における両性イオンポリマーは、対象における喘息状態を処置するために、該対象の気道に投与される。本明細書において、「対象の気道」は、該対象の呼吸器系の任意の好適な誘導またはガス交換表面を指す。かかる気道は、一般的に、気管、気管支、細気管支（blonchioles）、および終末細気管支および呼吸細気管支を含むが、これに限定されない。１つの態様において、気道は、鼻の上皮である。ポリマーのエアロゾルの気道への送達は、一般に、エアロゾルの吸入を含む。吸入は受動的でもよく、または加圧エアロゾル送達システムもしくはデバイスにより支援することもできる。本発明のポリマーを含む治療剤の気道への投与は、エアロゾルまたはスプレーデバイスまたは送達システムを用いることにより、便利に実現可能である。かかるエアロゾルおよびスプレー送達システムおよびデバイスの例は、当分野によく知られており、計量吸入器、乾燥粉末吸入器、超音波噴霧器、他の液体噴霧器、鼻スプレーなどを含む。
【００３９】
本発明のポリマーはまた、アレルギーまたは喘息の処置に用いるための、鼻の上皮への投与用の点鼻薬として製剤化することができる。
本発明の特徴として、ポリマーは、繰り返しおよび／または長期に、喘息を有する対象に喘息の処置のために、投与することができる。以下に記述するように、繰り返しまたは長期の投与は、何日も、何週間も、何ヶ月も、または何年間にも渡って実施することができる。１つの態様において、ポリマーは定期的に繰り返して、例えば毎日または毎週投与される。１つの態様において、ポリマーは、症状に応じて繰り返し投与される。
【００４０】
１つの側面において、本発明は、同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を処置する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、（ａ）同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を、前記アレルゲンに暴露すること、および（ｂ）前記対象に、喘息を処置するための有効量の単離されたポリマーを投与することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。同定されたアレルゲンに関連する喘息を有する対象を、このアレルゲンに暴露するステップは、能動的または受動的であってよい。すなわち、能動的暴露は、対象に対して意図的にアレルゲンを投与することを含んでよい；受動的暴露は、対象がアレルゲンに、偶然または環境的接触をすることを含んでよい。特定の態様において、暴露するステップは、ポリマーの投与なしで、対象に喘息の急性増悪を誘導するのに有効な量の既知のアレルゲンを対象に投与することを特に含む。
【００４１】
種々の態様において、対象をアレルゲンに暴露するステップは、この対象に対して喘息を処置するために有効な量のポリマーを投与するステップに先立って、その後に、またはそれと同時に、実施することができる。さらに、暴露の経路および投与の経路は、同じでも、または異なっていてもよい。
１つの側面において、本発明は、喘息の処置に用いるための医薬の製造における、両性イオンポリマーの使用を提供する。両性イオンポリマーは本明細書の他の部分で記載されているものであり、ここでの使用は、対象の喘息の処置に用いるために、ポリマーまたはそれらの水和物もしくは薬学的に許容し得る塩の有効量を、薬学的に許容し得る担体中に配置することを含む。使用は、喘息の処置に用いるのに好適なポリマーの単位用量の製造を含んでよい。１つの態様において、喘息はアレルギー性喘息である。
【００４２】
本発明のある側面は、アレルギー状態の処置または喘息の処置のために、有効量のポリマーを対象に投与することを含む。本明細書において「有効量」は、一般に、それのみでまたはさらなる用量と一緒に所望の反応を促進する組成物の量を指す。本発明の組成物については、本明細書において「有効量」は、それのみでまたはさらなる用量と一緒に所望の反応を促進する、本発明の調整物の量を指す。従って、有効量は、単一の投与で提供されることができるが、そうである必要はない。また本明細書において、ある状態の「処置のための有効量」は、対象における状態もしくは状態に関連する副作用の発生を予防する、進行を遅延させる、改善する、または取り除くのに十分な量を指す。処置される状態に関して治療的に有効な量とは、状態を処置するために有効な量を指す。
【００４３】
従って、対象のアレルギー状態を処置するための有効量は、対象におけるアレルギー状態もしくはアレルギー状態に関連する副作用の発生を予防する、進行を遅延させる、改善する、または取り除くのに十分な量である。同様に、対象の喘息を処置するための有効量は、対象における喘息もしくは喘息に関連する副作用の発生を予防する、進行を遅延させる、改善する、または取り除くのに十分な量である。当業者は、対象のアレルギー状態または喘息を予防または緩和するために設計された処置の有効性を、承認された臨床技術および検査室測定を用いてどのようにして評価するかを認識している。
例えば、アレルギー状態および喘息はＩｇＥと関連する。従って、アレルギーと喘息のよく知られた臨床的兆候および症状のモニタリングに加えて、臨床医は、本発明の方法によって処置されるべき対象における血清ＩｇＥを測定できる。血清ＩｇＥの減少は、処置の有効性の客観的な測度を提供することが期待される。血清よりも便利さは劣るが、ＩｇＥは気管支肺胞（ＢＡＬ）洗浄液においても測定可能である。
【００４４】
本発明の前述の側面によるある態様において、ポリマーは、アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤の投与と共に投与される。アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤は、ポリマーの投与の前に、後に、またはそれと同時に投与することができる。さらに、ポリマーおよび他の剤は、同じ経路または異なる経路で投与できる。従って、本発明は、ポリマーおよび、アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤が繰り返しベースで投与される場合に、異なる剤を同一または異なるスケジュールで用いることを包含する。アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤は、それのみでアレルギー状態または喘息の処置に有効な量で、またはそれより少ない量で、投与することができる。１つの態様において、ポリマーおよびアレルギー状態または喘息の処置に有効な他の剤は、ポリマーと他の剤の両方を含む単一の医薬組成物において提供される。従って、ポリマーおよびアレルギー状態または喘息の処置に有効な１種または２種以上の他の剤を含む「カクテル」が意図される。
【００４５】
アレルギー状態の処置に有効な剤は、以下を含むが、これらに限定されない：グルココルチコイド、例えばプレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン；抗ヒスタミン薬、特にＨ１受容体遮断抗ヒスタミン薬、例えばクロルシクリジン、クロルフェニラミン；塩酸ジフェンヒドラミン（ＢＥＮＡＤＲＹＬ（登録商標）、Parke-Davis）、塩酸フェキソフェナジン（ＡＬＬＥＧＲＡ（登録商標）、Aventis）、塩酸ヒドロキシジン（ＡＴＡＲＡＸ（登録商標）、Pfizer）、ロラタジン（ＣＬＡＲＩＴＩＮ（登録商標）、Schering）、塩酸プロメタジン（ＰＨＥＮＥＲＧＡＮ（登録商標）、Wyeth-Ayerst）、およびピリラミン；並びに抗ＩｇＥ抗体（オマリズマブ；ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、Genentech/Novartis）。
【００４６】
喘息の処置に有効な剤は以下を含むが、これらに限定されない：グルココルチコイド、例えばジプロピオン酸ベクロメタゾン（ＶＡＮＣＥＲＩＬ（登録商標）、Schering）、フルニソリド（ＡＥＲＯＢＩＤ（登録商標）、Forest）、プロピオン酸フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ（登録商標）、GlaxoSmithKline）、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびトリアムシノロンアセトニド（ＡＺＭＡＣＯＲＴ（登録商標）、Aventis）；上記の抗ヒスタミン薬；βアドレナリン作動薬、例えば硫酸アルブテロール（ＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）、GlaxoSmithKline；ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（登録商標）、Schering）、エピネフリン、塩酸イソプロテレノール、硫酸メタプロテレノール（ＡＬＵＰＥＮＴ（登録商標）、Boehringer Ingelheim）、およびテルブタリン（ＢＲＥＴＨＩＮＥ（登録商標）、ＬＡＭＩＳＩＬ（登録商標）、Novartis）；抗コリン作動薬、例えば臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（登録商標）、Boehringer Ingelheim）；メチルキサンチン、例えばテオフィリン；クロモリン；ネドクロミル；および抗ＩｇＥ抗体（オマリズマブ；ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、Genentech/Novartis）。ＩＬ−１０それ自体は、喘息を処置する他の剤として有用であることができる。
【００４７】
サイトカインなどの他の免疫調節剤は、本発明のポリマーと共に送達することができ、ポリマーとサイトカインを含む「カクテル」が考えられる。考えられるサイトカインは、本発明によるポリマーの投与から生じる有益な効果を増強するものである。サイトカインは、リンパ球を含む細胞の増殖と成熟を支援する因子である。サイトカインは、Ｔ細胞に直接的に、または、他の細胞を介してＴ細胞に間接的作用することができる。サイトカインの添加は、本発明の方法を実施することによって、in vivoで促進されるサイトカインの活性を増加させると考えられている。かかるサイトカインの１つはＩＬ−１０である。これに関して特に興味深い他のサイトカインは、ＩＬ−２およびＩＬ−１５である。他のサイトカインは、限定はされないがＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびリンホトキシンを含む。
【００４８】
１つの側面において、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、制御性Ｔ細胞を単離すること、および制御性Ｔ細胞を有効量のポリマーと接触させて制御性Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生を誘導することを含み、ここで該ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００４９】
本明細書において、「制御性Ｔ細胞」すなわち「Ｔｒｅｇ細胞」は、大量のＩＬ−１０を分泌するが、ＩＬ−４およびＩｌ−１３はもしあったとしても少量にしか分泌しない、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の１つのタイプを指す。Akbari O et al. (2002) Nat Med 8:1024-32。Ｔｒｅｇ細胞と、Ｔｈ２およびＴｈ１ＣＤ４＋Ｔ細胞の３種類のＴ細胞は全てＩＬ−１０を分泌することが報告されているが、しかしＴｒｅｇ細胞は後２者の細胞からは区別される。本明細書で開示されるように、Ｔｒｅｇ細胞は、そのＩＣＯＳの発現および限定されたＣＤ４５ＲＢ（ＣＤ４５ＲＢｌｏ）の発現によりさらに特徴付けられる。Ｔｒｅｇ細胞は、末梢寛容において重要な役割を果たすと考えられている。これらの細胞は、制御性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞とも呼ばれることがあり、抗原特異的Ｔ細胞活性化の強力な抑制剤として作用する。
【００５０】
１種以上のタイプの制御性Ｔ細胞が現在報告されている。最近の概説では、Jonuleit H et al. (2003) J Immunol 171:6323-7およびShevach EM (2002) Nat Immunol 2:389-400を参照のこと。Ｔｒｅｇ細胞の１つのタイプは、天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞であり、これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞前駆体から直接、胸腺でのポジティブセレクションの間に胸腺上皮細胞との中反応性相互作用の影響の下で生成される。これらの細胞は全末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の５〜１０％を占めると報告されている。誕生の３日後までに胸腺を摘出されたマウスにはこの細胞集団が欠如しており、種々の自己免疫疾患を特徴的に発症する。Suri-Payer E et al. (1998) J Immunol 160:1212-8。新鮮単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、in vitroでの同種または多クローン性活性化に低応答性であることが報告されている。しかし、それらは共培養において従来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を抑制することが報告されており、この抑制は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞がそのＴ細胞抗原受容体を通して活性化された場合にのみ起こる。天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するその抑制効果を、少なくともin vitroで、溶解性の抑制サイトカインとは独立した、厳密に細胞接触依存性の様式で示すと報告されており、その機構はまだ完全には解明されていない。Jonuleit H et al. (2003) J Immunol 171:6323-7。
【００５１】
Ｔｒｅｇ細胞の第２のタイプは、誘導されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞である。これらのＴｒｅｇ細胞は、天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞とは対照的に、その抑制効果を、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを含む溶解性抑制サイトカインの分泌が関連する、細胞接触非依存性の様式で示す。これらの細胞は二次サプレッサーＴ細胞であり、胸腺ではなく末梢において発生する。誘導されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は少なくとも２種類のサブタイプを含むと考えられている：大量のＩＬ−１０を産生するが、僅かな量のＴＧＦ−βしか産生しないＴｒ１細胞、およびほぼＴＧＦ−βのみを産生するＴｈ３細胞である。Ｔｒ１細胞はまた文献において、１型制御性Ｔ細胞、およびＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇ細胞とも呼ばれる。本発明の一部として、これらのＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞とは異なって、ＩＣＯＳを発現することおよびＣＤ４５ＲＢｌｏであることが見出された。これらのＴｒｅｇ細胞は、ナイーブＴ細胞から、抗原への繰り返しの暴露または抗原の刺激により誘導することができる。Groux H et al. (1997) Nature 389:737-42。代替的にＩＬ−１０分泌Ｔｒｅｇ細胞は、in vitroで、外因性の大量のＩＬ−１０と、未成熟の樹状細胞（ＤＣ）、または１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３とデキサメタゾンとの組合せを含むある種の免疫抑制剤との存在下で、Ｔ細胞を培養することにより生成された。Groux H et al. (1997) Nature 389:737-42；Jonuleit H et al. (2001) J Exp Med 193:1285-94；Barrat FJ et al. (2002) J Exp Med 195:603-16。これらin vitroの方法の各々は、望ましくない副作用および技術的な要請のため、in vivoで用いるには限られた価値しかない可能性がある。活性化されたＴｒ１細胞の上清物は、樹状細胞のアロ抗原特異的増殖を導く能力を大きく減少させる。Groux H (2003) Transplantation 75:8S-12S。さらに、活性化されたヒトＴｒ１細胞の上清物は、ＩＬ−１０に依存する様式で、in vitroでのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｒ１細胞への分化を促進することが報告されている。Roncarolo MG et al. (2001) Immunol Rev 182:68-79。
【００５２】
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、抗原提示およびマクロファージ活性化の反応を抑制する能力を介した抗炎症特性を有する、多面的サイトカインである。これはまた、Ｂ細胞活性化と自己抗体産生において役割を果たす。サイトカインのＩＬ−１０ファミリーは、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＭＤＡ７およびＩＬ−２２を含む。初めに記したように、ＩＬ−１０は、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、および単球／マクロファージ系細胞により産生される。Tan JC et al. (1993) J Biol Chem 268:21053-9。Akbari O et al. (2003) Nature Med 8:1024-32には、Ｔｈ１細胞が分泌するＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を調整し、Ｔｈ２による気道の活動亢進および喘息の抑制に関連する可能性があることが示されている。しかし、ＩＦＮ−γはまた、肺の炎症を悪化させることで疾患の重篤度に寄与する。驚くべきことには、マウスの呼吸器系統をアレルゲンに暴露した後、Ｔｒｅｇ細胞が発生して、一般にはＴｈ２サイトカインと考えられる高レベルのＩＬ−１０を産生した。Ｔｒｅｇ細胞は、前もって感作されたマウスにおいて、アレルゲンが誘導した気道の活動亢進を抑制した。Akbari O et al. (2003) Nature Med 8:1024-32では、ＩＬ−１０は当初はＴｈ２応答の極性化（polarization）に関与するかも知れないが、免疫応答の後期には抑制的役割を果たして、Ｔｈ２が駆動する炎症活性を弱める可能性があることが示唆されている。
【００５３】
ＩＬ−１０の産生は、試料中に存在するＩＬ−１０メッセンジャーＲＮＡまたはＩＬ−１０ポリペプチドの量を定量化するのに適した任意の方法を用いて測定することができる。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの量は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、好適なオリゴヌクレオチドプライマーおよび当業者によく知られた技術を用いて測定することができる。１つの態様において、細胞内で発現されたＩＬ−１０ポリペプチドの量は、フローサイトメトリー法を用いて測定することができる。フローサイトメトリーは、ＩＬ−１０に特異的に結合し、随意的に蛍光タグを含む抗体の使用を含む。抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体は、商業的供給業者から入手可能である。他の態様において、細胞により発現されたＩＬ−１０ポリペプチドの量は、酵素免疫蛍光測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価することができ、これのための試薬およびキットは商業的供給業者から入手可能である。さらに他の態様において、細胞により発現されたＩＬ−１０ポリペプチドの量は、ＩＬ−１０とその受容体との相互作用に直接的または間接的に基づく生物学的検定法を用いて評価することができる。生物学的検定法はin vivo検定法またはin vitro検定法のどちらでもよい。
【００５４】
１つの側面において、本発明はまた、ＣＤ４＋細胞での誘導性副刺激分子（ＩＣＯＳ）の発現を誘導する方法も提供する。本発明のこの側面による方法は以下を含む：ＣＤ４＋細胞を有効量の単離ポリマーに接触させて、ＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現を誘導すること、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である；および、ＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現の増加を測定すること、ここで、接触後のＩＣＯＳの発現が接触前のＩＣＯＳの発現を上回っている場合は、ＣＤ４＋細胞でのＩＣＯＳの発現は増加している。
【００５５】
ＩＣＯＳは、Ｔ細胞で発現されるＣＤ２８に関連する、最近記述された誘導性副刺激分子である。Hutloff A et al. (1999) Nature 397:263-6。ＩＣＯＳの同種リガンドであるＩＣＯＳＬは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現する。ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬ相互作用は、Ｔ細胞によるＩＬ−１０分泌を誘導する。Sharpe AH et al. (2002) Nat Rev Immunol 2:116-26。ヒトＩＣＯＳのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られており、GenBankからそれぞれアクセッション番号NM_012092およびAJ277832；NP_036224およびCAC06612により公的に利用可能である。
【００５６】
ＩＣＯＳの発現は、試料中に存在するＩＣＯＳメッセンジャーＲＮＡまたはＩＣＯＳポリペプチドの量を定量化するのに適した任意の方法を用いて測定することができる。ｍＲＮＡの量は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、好適なオリゴヌクレオチドプライマーおよび当業者によく知られた技術を用いて測定することができる。１つの態様において、細胞により発現されたＩＣＯＳポリペプチドの量は、フローサイトメトリー法を用いて測定することができる。他の態様において、細胞により発現されたＩＣＯＳポリペプチドの量は、蛍光顕微鏡法により評価することができる。フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡法は共に、ＩＣＯＳに特異的に結合し、随意的に蛍光タグを含む抗体の使用を含む。抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体は商業的供給業者から入手可能である。他の態様において、細胞により発現されたＩＣＯＳポリペプチドの量は、ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬ相互作用に直接的または間接的に基づく生物学的検定法を用いて評価することができる。生物学的検定法はin vitro検定法またはin vivo検定法のどちらでもよい。かかる検定法の例は以下の例の節に示される。
【００５７】
１つの側面において本発明は、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、ナイーブＴ細胞集団を単離すること、および、前記ナイーブＴ細胞集団を有効量の単離ポリマーに接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。本明細書において、Ｔ細胞集団を単離することは、一般に、全血、脾臓、またはリンパ球の他の任意の源から、単離された細胞集団の少なくとも８０％がＴ細胞であるようにＴ細胞集団を単離することを指す。１つの態様において、Ｔ細胞は、単離された細胞集団の少なくとも９０％を占める。１つの態様において、Ｔ細胞は、単離された細胞集団の少なくとも９５％を占める。１つの態様において、Ｔ細胞は、単離された細胞集団の少なくとも９８％を占める。血液細胞または脾細胞の混合群からＴ細胞を単離する方法は当分野に知られており、例えば、ナイロンウール上でのポジティブまたはネガティブセレクションと組み合わせた細胞分類および密度勾配遠心分離法を含む。本発明のこの側面による方法は、随意的に、接触のステップの後に、得られたＴｒｅｇ細胞を他の細胞から分離するステップを含むことができる。本発明の他の側面におけるのと同様に、本発明のこの側面により有用なポリマーは、以下にさらに詳細に記述される両性イオンポリマーの任意の１つまたは組合せであってよい。
【００５８】
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、例えば細胞を両性イオンポリマーと接触させる際に連続的に、ナイーブＴ細胞集団を抗原と接触させることを伴う。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、ナイーブＴ細胞集団を、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を支援または促進するのに効果的な外部から供給されるサイトカインと接触させることを伴う。１つの態様において、方法はさらに、ナイーブＴ細胞集団を、外部から供給されるＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２とＩＬ−１５の組合せと接触させることを伴う。これらのサイトカインは、種々の商業的供給業者より、精製された組み換えタンパク質として得ることができる。それらは、Ｆｃ融合タンパク質または他の安定化形態、例えば、全て当分野に知られている、ＰＥＧ化（PEGylated）ＩＬ−２またはＩＬ−１５として供給されることができる。
【００５９】
本発明のこの側面による１つの態様において、ナイーブＴ細胞集団を単離するステップは、天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を本質的に含まないナイーブＴ細胞集団を単離することを含む。これは、ポジティブまたはネガティブセレクションを通して、例えば、標準の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）法を用いて、ＣＤ４もしくはＣＤ２５でのゲーティング、またはＣＤ４およびＣＤ２５で被覆した磁気ビーズを用いて、行うことができる。従ってこの態様による方法は、ＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞との接触なしに誘導することを伴う。この態様による方法は、誘導されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞集団を、かかる細胞の誘導のための方法において有用であると前に記載された剤の影響なしに、誘導することを伴うことができ、ここでかかる剤とはすなわち、大量の外因性のＩＬ−１０を、未成熟の樹状細胞（ＤＣ）と、または１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３およびデキサメタゾンの組合せを含むある種の免疫抑制剤と共に用いるものである。Groux H et al. (1997) Nature 389:737-42；Jonuleit H et al. (2001) J Exp Med 193:1285-94；Barrat FJ et al. (2002) J Exp Med 195:603-16。
代替的な方法においては、ナイーブＴ細胞を含む一般の細胞集団を本明細書に記載の有効量の単離ポリマーと接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導し、次に、増殖した制御性Ｔ細胞を一般の細胞集団から単離する。
【００６０】
１つの側面において本発明は、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、制御性Ｔ細胞集団を単離すること、および、前記制御性Ｔ細胞集団を有効量の単離ポリマーに接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導することを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。本発明のこの側面による方法は、随意的に、接触のステップの後に、得られたＴｒｅｇ細胞を他の細胞から分離するステップを含むことができる。本発明の他の側面におけるのと同様に、本発明のこの側面により有用なポリマーは、以下にさらに詳細に記述される両性イオンポリマーの任意の１つまたは組合せであってよい。
【００６１】
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、例えば細胞を両性イオンポリマーと接触させる際に連続的に、制御性Ｔ細胞集団を抗原と接触させることを伴う。
本発明のこの側面による１つの態様において、方法はさらに、制御性Ｔ細胞集団を、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を支援または促進するのに効果的な、外部から供給されるサイトカインと接触させることを伴う。１つの態様において、方法はさらに、制御性Ｔ細胞集団を、外部から供給されるＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２とＩＬ−１５の組合せと接触させることを伴う。これらのサイトカインまたはそれらの対応するＦｃ融合タンパク質もしくは他の安定化形態は、上記のようにして製剤化され利用可能である。
【００６２】
本発明のこの側面による１つの態様において、制御性Ｔ細胞集団を単離するステップは、天然のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を本質的に含まない制御性Ｔ細胞集団を単離することを含む。従ってこの態様による方法は、ＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞との接触なしに誘導することを伴う。この態様による方法はまた、誘導されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞集団を、かかる細胞の誘導のための方法において有用であると前に記載された剤の影響なしに、誘導することを伴うことができ、ここでかかる剤とはすなわち、大量の外因性のＩＬ−１０を、未成熟の樹状細胞（ＤＣ）と、または１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３およびデキサメタゾンの組合せを含むある種の免疫抑制剤と共に用いるものである。Groux H et al. (1997) Nature 389:737-42；Jonuleit H et al. (2001) J Exp Med 193:1285-94；Barrat FJ et al. (2002) J Exp Med 195:603-16。
代替的な方法においては、制御性Ｔ細胞を含む一般の細胞集団を本明細書に記載の有効量の単離ポリマーと接触させて制御性Ｔ細胞の増殖を誘導し、次に、増殖した制御性Ｔ細胞を一般の細胞集団から単離する。
【００６３】
本発明の方法により誘導された、Ｔｒｅｇ細胞の拡大された集団は、免疫応答の抑制の必要がある対象に投与することができる。例えば、本発明の方法により誘導された、Ｔｒｅｇ細胞の拡大された集団（一般には処置すべき対象に由来する）は、本明細書に記載のように、アレルギー状態を有する対象または喘息を有する対象に投与することができ、アレルギー状態または喘息を処置することができる。アレルギー状態またはアレルギー反応を有する対象の場合、Ｔｒｅｇ細胞の投与は、対象におけるアレルギー状態またはアレルギー反応に関連するアレルゲンに対象を暴露するのに先立って、それと本質的に同時に、またはその後に行われる。対象をアレルゲンに暴露することは、受動的、例えば、アレルゲンとの偶然の環境的接触であってよく、または能動的、例えばアレルゲンを対象に対して意図的に投与することを介してもよく、これは例えば注入またはエアロゾル投与による。喘息を有する対象の場合、投与は、急性の喘息の憎悪に先立って、それと本質的に同時に、またはその後に行うことができる。さらに、アレルギー性喘息を有する対象の場合、Ｔｒｅｇ細胞の投与は、対象を、対象におけるアレルギー性喘息と関連するアレルゲンに暴露するのに先立って、それと本質的に同時に、またはその後に行うことができる。アレルゲンへの暴露は、上述のように受動的または能動的であってよい。
【００６４】
本明細書において、免疫応答の抑制が必要な対象とは、以下から選択された状態または疾患を有する対象を含むが、これに限定されない：膿瘍、術後癒着、敗血症、関節リューマチ、重症筋無力症、炎症性腸疾患、結腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、冠動脈疾患、糖尿病、肝線維症、乾癬、湿疹、急性呼吸急迫症候群、急性炎症性膵臓炎、内視鏡的逆行性胆道膵管造影法誘発膵臓炎、火傷、冠状動脈および大脳動脈および抹消動脈のアテローム発生、虫垂炎、胆嚢炎、憩室炎、内蔵線維症、創傷治癒、皮膚瘢痕形成疾患（skin scarring disorder）、肉芽種性疾患、喘息、壊疽性膿皮症、スイート症候群（Sweet’s syndrome）、ベーチェット症候群、原発性硬化性胆管炎、および細胞、組織または器官の移植。
【００６５】
１つの態様において、ナイーブＴ細胞を免疫応答を抑制することが必要な対象から単離し、本明細書に記載の有効量のポリマーと接触させてＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、これで得られる未分類の細胞集団の有効量を前記対象に投与して、前記対象における免疫応答を抑制する。他の態様において、ナイーブＴ細胞を免疫応答を抑制することが必要な対象から単離し、本明細書に記載の有効量のポリマーと接触させてＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、これで得られるＴｒｅｇ細胞を処置細胞から分離し、そして次に、単離したＴｒｅｇ細胞集団の有効量を前記対象に投与して、前記対象における免疫応答を抑制する。
【００６６】
１つの態様に置いて、Ｔｒｅｇ細胞を免疫応答を抑制することが必要な対象から単離し、本明細書に記載の有効量のポリマーと接触させてＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、そして次に、これで得られるＴｒｅｇ細胞の拡大集団の有効量を前記対象に投与して、前記対象における免疫応答を抑制する。
１つの態様において、ポリマーは、ＣＰ１または合成ペプチドグルカン化合物１５以外のポリマーである。
一般にＴ細胞の増殖は、試料中に存在するＴ細胞の数を定量化するのに好適な任意の方法を用いて測定することができる。必要に応じてＴ細胞は単離することができ、Ｔ細胞の数は、例えば、３［Ｈ］チミジン取り込み反応の測定、フローサイトメトリー、および当業者によく知られた任意の技法により測定することができる。これらの方法は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を測定する目的のために適合可能である。例えば本明細書で開示されているように、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋、ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４５ＲＢｌｏであり、細胞内ＩＬ−１０染色陽性である。
【００６７】
１つの側面において本発明は、対象における抗原特異的免疫応答を抑制する方法を提供し、ここで抗原特異的応答は、アレルギー状態または喘息以外のものである。本発明のこの側面による方法は、アレルギー状態または喘息以外の抗原特異的応答の抑制が必要な対象に対して、（ａ）抗原および（ｂ）有効量のポリマーを投与して前記対象における前記抗原に対する免疫応答を抑制するステップを含み、ここで前記ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
【００６８】
種々の態様において、抗原の投与は、ポリマーの投与の前に、後に、または同時に行うことができる。さらに、抗原投与の部位およびポリマー投与の部位は、同じでも異なっていてもよい。さらにまた、抗原投与の様式およびポリマー投与の様式は、同じでも異なっていてもよい。
本発明の特性として、ポリマーは、この場合は抗原の投与と共に、抗原に対する対象の免疫応答を抑制するために、繰り返しおよび／または長期投与することができる。以下に記載するように、繰り返しまたは長期投与は、何日も、何週間も、何ヶ月も、または何年間にも渡って実施することができる。１つの態様において、ポリマーは定期的に繰り返して、例えば毎日または毎週、投与される。１つの態様において、ポリマーは、症状に応じて繰り返し投与される。
【００６９】
１つの態様において、抗原は、ポリマーとの抱合体として存在する。本明細書において、抱合体は、異なる組成物が物理的または化学的に直接または間接に互いに結合している、２種または３種以上の異なる組成物の任意の組合せを指す。１つの態様に置いて、異なる組成物、例えば抗原およびポリマーは、共有結合によって化学的に結合している。結合が間接的である場合は、その間に挿入されたリンカー部分、または２つの異なる組成物を結合する他のものが存在することができる。多糖類とペプチド（またはポリペプチド）の間の共有結合を作る方法は当分野によく知られており、ペプチドとペプチドを共有結合する方法と同様である。
【００７０】
本発明のこの側面による１つの態様において、対象は、ポリマーによる処置を必要とする以外の適応は認められない。この態様において、対象は、以下を有さない：感染症、手術、トラウマ、または膿瘍もしくは手術による癒着形成に関連する他の疾患またはリスク因子；Ｔｈ１細胞応答性疾患（インスリン依存型糖尿病、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、炎症性腸疾患、同種移植の拒絶反応）；特定抗原に対する不適当なＩｇＧ抗体反応を特徴とする疾患（急性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、関節リューマチを含む自己免疫性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；狼瘡）、ＡＩＤＳ、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、およびある種の形態の甲状腺炎）。
【００７１】
１つの側面において、本発明は、新規な組成物を提供する。本発明のこの側面による組成物は抗原とポリマーの抱合体を含み、ここで該ポリマーは、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。抱合体組成物中の抗原とポリマーは、物理的または化学的に、直接または間接に関連する。１つの態様において、抗原とポリマーは、共有結合を介して化学的に関連する。１つの態様において、抗原とポリマーは、２つを結合するリンカー部分を介して化学的に関連する。１つの態様において、抗原およびポリマーは、リポソームまたは他の類似の送達ビヒクルと一緒にまたはその内部で、物理的に関連している。
一般に抗原は、Ｔ細胞抗原受容体、抗体、またはＢ細胞抗原受容体により特異的に結合できる任意の物質である。抗原性物質は、ペプチド、タンパク質、炭化水素、脂質、リン脂質、核酸、自能性薬物およびホルモンを含むが、これらに限定されない。抗原性物質はさらに特に、アレルゲン、癌抗原、および微生物抗原と分類される抗原を含む。抗原はまた、自己抗原も含む。
【００７２】
抗原は、細菌、ウィルス、真菌または寄生虫を含む、感染性微生物剤あるか、これらに由来する抗原であってよい。感染性細菌の例は以下を含む：ヘリコバクターピロリ菌、ライム病ボレリア、レジュネラ・ニューモフィラ菌、マイコバクテリア（例えば、結核菌、鳥型結核菌、M. intracellulare、M. Kansasii、およびM. gordonae）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌（Ａ型連鎖球菌）、Streptococcus agalactiae（Ｂ型連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、大便連鎖球菌、Streptococcus bovis、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター菌、腸球菌、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム、豚丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、Enterobacter aerogenes、肺炎杆菌、Pasturella multocida、バクテロイデス種、Eusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、レプトスピラ、およびイスラエル放線菌。
【００７３】
感染性ウィルスの例は以下を含む：レトロウィルス科（ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を含むが、これに限定されない）；ピコルナウィルス科（例えば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロウィルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）；Calciviridae（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウィルス科（例えば、ウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）；フラビウィルス科（例えば、デング熱ウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）；コロナウィルス科（例えば、コロナウィルス）；ラブドウィルス科（例えば、水泡性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス）；フィロウィルス科（例えば、エボラウィルス）；パラミクソウィルス科（例えば、パラインフルエンザウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス）；オルソミクソウィルス科（例えば、インフルエンザウィルス）；ブニアウィルス科（例えば、ハンタウィルス、ブニアウィルス、フレボウィルス、およびナイロウィルス）；アレナウィルス科（出血熱ウィルス）；レオウィルス科（例えば、レオウィルス、オルビウィルスおよびロタウィルス）；ビルナウィルス科；ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）；パルボウィルス科（パルボウィルス）；パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）；アデノウィルス科（殆どのアデノウィルス）；ヘルペスウィルス科（１型単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）およびＨＳＶ−２、水痘ウィルス、、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウィルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）；およびイリドウィルス科（例えばアフリカブタ熱ウィルス）；および未分類のウィルス（例えば、海綿状脳症の病因菌、デルタ肝炎の菌（Ｂ型肝炎ウィルスの欠陥付随体と考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の菌（クラス１＝内部的に伝達；クラス２＝非経口的に伝達（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウィルス、およびアストロウィルス）。
【００７４】
感染性真菌の例は、これらに限定されないが以下を含む：クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマチス、およびカンジダ・アルビカンス。
抗原は、癌抗原であってよい。本明細書において癌抗原は、腫瘍または癌細胞表面に関連し、抗原提示細胞の表面で発現された場合に、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との関連で免疫応答を誘発することができる、ペプチドまたはタンパク質などの化合物である。癌抗原は癌細胞から、癌細胞の粗抽出物を調製することにより、例えばCohen PA et al. (1994) Cancer Res 54:1055-8に記載のようにして、抗原を部分的に精製することにより、組み換え技術により、または既知の抗原のデノボ合成により、調製することができる。癌抗原は、遺伝子組み換え的に発現される抗原、それらの免疫原性部分、または腫瘍全体または癌細胞を含むが、これらに限定はされない。かかる抗原は、組み換えにより、または当分野に知られている任意の他の方法により、単離するかまたは調製することができる。
【００７５】
癌抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を潜在的に促進することができる抗原である。これら抗原のいくつかは正常細胞によりコーディングされるが、必ずしも発現されるわけではない。これらの抗原は、正常細胞において通常はサイレント（すなわち発現されない）であり、分化のあるステージにおいてのみ発現されるもの、胚抗原または胎児性抗原などの一時的に発現されるものとして特徴づけられる。他の癌抗原は、オンコ遺伝子（例えば活性化ｒａｓオンコ遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば突然変異体ｐ５３）、内部欠損または染色体転座による融合タンパク質などの、突然変異細胞遺伝子によってコーディングされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウィルスのウィルス遺伝子によってコーディングされ得る。腫瘍抗原の例は以下を含む：ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシン・デアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、直腸結腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびその免疫抗原性のエピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫抗原性のエピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ，ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸(または大腸)ポリープ症タンパク質（ＡＰＣ）、ホドリン（fodrin）、コネクシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウィルスタンパク質などのウィルス性産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコーディング核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、およびｃ−ｅｒｂＢ−２。
【００７６】
癌または腫瘍およびかかる腫瘍に関連する腫瘍抗原は（限定するものではないが）以下を含む：急性リンパ球性白血病（ｅｔｖ６；ａｍａｌ１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頚癌（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３グリコプロテイン）、肝細胞癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、メラノーマ（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、癌胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫抗原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３グリコプロテイン）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頚部および食道の扁平上皮癌（ヒトパピローマウィルスタンパク質などのウィルス性産物）、睾丸（精巣）癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、およびメラノーマ（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２１ｒａｓ；ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７）。
【００７７】
１つの側面において、本発明は医薬組成物を提供する。本発明のこの側面による医薬組成物は、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位を含むポリマーのエアロゾル製剤を含み、該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。
ある態様においては、医薬組成物は、アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤を、エアロゾル製剤におけるポリマーに混合または抱合されてさらに含む。アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤は上に記載されている。
本明細書において「エアロゾル製剤」は、気道上皮に送達するのに好適な活性成分の液滴または粒子を含む、任意の好適な製剤を指す。液滴または粒子は、一般に直径２〜２０μｍの範囲である。エアロゾル製剤は一般に、治療的に有効な量のポリマーおよび薬学的に許容し得る担体、および随意的に噴霧剤を、容器またはエアロゾル送達システム内に含有する。この状況における治療量は、標的組織へのエアロゾルの送達に伴う一定の非効率性を考慮する。
【００７８】
１つの側面において、本発明はエアロゾル送達システムを提供し、該エアロゾル送達システムは容器を含み、該容器は、内部、該容器内部と流体接続しているエアロゾル発生器、および該容器内部内に配置された、B. fragilis多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有の電荷モチーフの繰り返し単位のポリマーを含み、ここで該モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分並びに、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分である。エアロゾル送達システムは、単一用量または複数用量を送達するように作製することができる。１つの態様において、吸入器は計量吸入器である。１つの態様において、吸入器は、乾燥粉末吸入器である。他の態様において、吸入器は、噴霧吸入器である。さらに他の態様において、吸入器は、鼻の上皮または他の呼吸器系上皮へ局所的に送達するためのスプレーディスペンサーである。１つの態様において、エアロゾル送達システムは、アレルギー状態または喘息の処置に有用な他の剤をさらに含む。
【００７９】
１つの態様において、エアロゾル送達システムは、規定形状の複数開口を有する開口板を振動させるように構成および配置された振動要素を含み、ここで該開口板の１つの側面または表面は、ポリマーの溶液または懸濁液と流体接続している。例えば、米国特許第5,758,637号、米国特許第5,938,117号、米国特許第6,014,970号、米国特許第6,085,740号、米国特許第6,205,999号を参照のこと：これらの内容全体は参照として組み込まれる。開口板を振動させるための振動要素の起動により、溶液または懸濁液のポリマーを含む液体が複数開口部から引き出されて、規定範囲の液滴（すなわち粒子）サイズを有する低速エアロゾルが生成される。
このタイプのエアロゾル発生器の例は、Aerogen, Inc., Sunnyvale, Californiaから市販されている。
【００８０】
他の態様において、エアロゾル送達システムは、溶液または懸濁液中のポリマーを含む加圧容器を含む。加圧容器は一般に絞り弁に接続された作動装置を有し、この作動装置の起動により、容器内の溶液または懸濁液中のポリマーの規定量が、エアロゾルの形態で容器から分配される。このタイプの加圧容器は、当分野では、噴霧剤駆動計量吸入器（ｐＭＤＩまたは単にＭＤＩ）としてよく知られている。ＭＤＩは一般に、作動装置、絞り弁、および、微細化された薬剤の懸濁液もしくは溶液、液化噴霧剤および界面活性剤（例えばオレイン酸、三オレイン酸ソルビタン、レシチン）とを保持する加圧容器を含む。歴史的には、これらのＭＤＩは一般に、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、およびジクロロテトラフルオロメタンを含むクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）を噴霧剤として用いる。噴霧剤のみでは比較的弱い溶媒である場合には、エタノールなどの共溶媒が存在してもよい。より新しい噴霧剤としては、１，１，１，２−テトラフルオロエタンおよび１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンを含むことができる。ＭＤＩの起動により、一般に、体積２０〜１００μＬで５０μｇ〜５ｍｇの用量の活性剤が、速い速度（３０ｍ／秒）で１００〜２００ミリ秒間送達される。
【００８１】
他の態様において、エアロゾル送達システムは、溶液または懸濁液中のポリマーを含む貯蔵容器と流体接続された、空気ジェット噴霧器または超音波噴霧器を含む。噴霧器（空気ジェットまたは超音波）は、第一に、歩行不能な患者の救急処置並びに幼児および小児において用いられる。噴霧化のための空気ジェット噴霧器は、小型の圧縮空気ポンプが利用可能であるために携行可能であると考えられているが、これは比較的大型で不便なシステムである。超音波噴霧器は、一般に圧縮空気源が不要であるため、携行がより容易であるという利点を有する。噴霧器は非常に小さい液滴および高い質量出力を提供する。噴霧化によって投与される用量は、ＭＤＩにおける用量より非常に大きく、液体貯蔵容器のサイズが制限されるために、短い一期間の治療となる。
【００８２】
空気ジェット噴霧器からエアロゾルを生成するために、圧縮空気がオリフィスを通り毛管の開口端上に強制的に通されて、低圧力の領域を作り出す。液体製剤が管を通って引き出されて空気ジェットと混合され、液滴を形成する。噴霧器内のバッフルが大きい液滴を除去する。気流中の液滴のサイズは、圧縮空気の圧力に影響される。市場で入手可能な種々の空気ジェット噴霧器は同じようには機能しない。このことは、液滴サイズ、噴霧器からの総出力、および患者の決定因子に依存する、噴霧化されたエアロゾルの臨床的有効性に影響を及ぼす。
【００８３】
超音波噴霧器は、刺激を与えられると機械的に振動するセラミック圧電性結晶によって液体チャンバー内に集中される、高周波超音波（すなわち、１００ｋＨｚ以上）を用いてエアロゾルを発生させる。Dennis JH et al. (1992) J Med Eng Tech 16:63-68; O’Doherty MJ et al. (1992) Am Rev Respir Dis 146:383-88。ある場合には、インペラーが噴霧器から粒子を噴出させるか、またはエアロゾルは患者によって直接吸入される。超音波噴霧器は、空気ジェット噴霧器より高い出力能力があり、このためにエアロゾル薬剤療法において頻繁に用いられている。超音波噴霧器を用いて形成される液滴は周波数に依存し、空気ジェット噴霧器により送達されるものより粗い（すなわち、ＮＭＡＤが高い）。液体に導入されるエネルギーは温度の上昇を引き起こすことができ、これは気化を引き起こし、時間と共に濃度の変化をもたらす。この時間による濃度変化はジェット噴霧器でも見られるが、これは蒸発による水分の損失のためである。
【００８４】
噴霧器における溶液または懸濁液製剤の選択は、ＭＤＩに対するのと同様である。選択された製剤は、総質量出力および粒子サイズに影響する。噴霧器製剤は一般に、水と共溶媒（エタノール、グルセリン、プロピレングリコール）、および溶解性と安定性の改善のために添加される界面活性剤とを含む。通常、浸透物質を添加して、低浸透圧または高浸透圧溶液による気管支収縮を予防する。Witeck TJ et al. (1984) Chest 86:592-94；Desager KN et al. (1990) Agents Actions 31:225-28。
【００８５】
さらに他の態様において、エアロゾル送達システムは、粉末形態のポリマーを含む貯蔵容器と流体接続している乾燥粉末吸入器を含む。乾燥粉末吸入デバイスは、ＭＤＩ製品におけるクロロフルオロカーボン（フロンガス）の国際的な規制への対応として、一定の適用に対しては最終的にＭＤＩの代替となるであろう。とりわけ、このデバイスは、呼吸に適するサイズ範囲のその負荷の一部のみを送達することができる。粉末吸入器は通常、含んでいる薬剤の約１０〜２０％のみを、呼吸に適する粒子として散布する。代表的な乾燥粉末吸入デバイスは２つの要素からなる：粉末製剤の単位用量を吸い込まれた空気流へと散布する吸入器具、およびこれらの用量を分配するための粉末製剤の貯蔵容器。貯蔵容器は一般に、２種類の異なるタイプを用いることができる。バルク貯蔵容器は、約２００用量までの個別の用量の送達に対して、正確な量の粉末を分配することを可能とする。単位用量貯蔵容器は、必要に応じて吸入用の個別用量（例えば、ブリスター・パッケージまたはゼラチンカプセル形態で提供される）を供給する。携帯用デバイスは、カプセル／ブリスター・パッケージを破って開けるか、または原粉末を負荷するように操作され、次に患者の吸気で散布が行われるようにデザインされる。空気流は、粉末を分解しエアロゾル化する。多くの場合、患者の吸気による空気流はデバイスを始動させ、乾燥粉末を分散させ分解するエネルギーを供給し、肺に到達する医薬の量を決定する。
【００８６】
乾燥粉末発生器は、粉末の物理的および化学的特性により様々である。これら吸入器は、２００μｇ〜２０ｍｇの範囲の用量を計量するよう設計される。これらのデバイスにおける薬剤粉末の調製は非常に重要である。これら吸入器の粉末には、ＭＤＩの懸濁液にも要求される効率的なサイズの減少が必要である。微細化された粒子は流動して、粗い粒子よりも不均一に分散される。従って、微細化された薬剤粉末は、不活性担体と混合することができる。この担体は通常α−ラクトース一水和物であり、なぜならばラクトースには、種々の粒子サイズがあり特性化されているからである。Byron PR et al. (1990) Pharm Res 7 (suppl):S81。担体粒子は治療剤より大きな粒子サイズを有しており、賦形剤が気道に入るのを防ぐ。患者がマウスピースから吸入した際に乱気流が生成されると、２つの粒子の分離が起こる。この吸気の乱気流は一定量のエネルギーを供給して、粒子間の結合力および粒子表面の接着力に打ちつ勝って微細化粒子を空中に浮遊させる。空気中での薬剤粒子の高い濃度は乾燥粉末の発生によって容易に実現できるが、出力の安定性および凝集し荷電した粒子の存在は共通の問題である。非常に小さな粒子では、それらの結合のエネルギーを増加させる静電気力、ファンデルワールス力、毛管力、および機械的力のために、散布は困難である。
本発明と共に用いるのに好適な乾燥粉末吸入器エアロゾル発生器の例は、Fisons Corp., Bedford, MassachusettsからのSpinhaler粉末吸入器である。
【００８７】
本発明において有用なポリマー
本発明において有用な両性イオンポリマーの一部は、両者ともにTzianabosらに発行された米国特許第5,679,654号および第5,700,787号、および公開された国際特許出願WO 00/59515およびWO 03/075953に記載されており、これらの内容の全体は本明細書に参照として組み込まれる。簡単に述べると、これらは、特定の電荷モチーフを包含することを特徴とする多糖類、ペプチドおよび合成ペプチドグリカンを包含する。必要なモチーフは本来、多糖類の繰り返し単位上の正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分および負に荷電した部分を含み、例えば、B. fragilisの莢膜多糖類Ａ（ＰＳＡ）に特有のものであることが確認された。この同じ電荷モチーフは次に、ペプチドポリマーとの関連で作用することが示された。
【００８８】
本明細書において「ポリマー」は、リンケージによって共に結合されている個別の単位の直線状の主鎖を有する化合物である。用語「主鎖」は、ポリマー化学の分野における通常の意味を与えられる。ポリマーは、必要な電荷モチーフを有する限り、主鎖の組成において同種または異種であってよい。ある態様においては、ポリマーは当分野で従来知られているポリマーとは異なることができ、これは、本発明のポリマーが、主鎖に組み込まれた非ポリマー化合物を有することができるからである。例えば、本発明のポリマーは、２組のアミノ酸を結合する有機リンカーを含む領域以外は、完全にアミノ酸によって組成されてよい。１つの態様において、ポリマーは主鎖の組成において同種であり、例えば、ペプチド、多糖類、および核酸を含む。本明細書において「ペプチド」は、結合したアミノ酸のポリマーである。本明細書において「オリドペプチド」は、２個〜約５０個のアミノ酸のペプチドポリマーである。従ってペプチドは一般に、ポリペプチドおよびオリゴペプチドの両方を指す。本明細書において「多糖類」は、結合した糖類のポリマーである。本明細書において「核酸」は、結合したヌクレオチドのポリマー、例えばデオキシリボ核酸またはリボ核酸である。
【００８９】
ポリマーは電荷モチーフの繰り返し単位で構成することができる。例えば、ポリマー全体を電荷モチーフの繰り返しで構成することができる。本明細書で「単位」は、当分野で知られている意味のポリマーの基礎単位を指すものとして、一環一貫して用いられる。各単位は、１つまたは複数（すなわち１組）のサブユニットを含むことができ、ここでサブユニットは個別の部分、例えば糖類、アミノ酸、ヌクレトチド等である。繰り返し単位で構成されるポリマーは、該ポリマー内で少なくとも２回生じているところの単位によって全体が構成されるものである。ポリマーの繰り返し単位は、同一または非同一の繰り返し単位であってよい。本明細書において「同一の繰り返し単位」は、全てのサブユニットが同一の組成を有し、かつ他のサブユニットの組のサブユニットと同一の順序で位置されている、ポリマー内で繰り返されるサブニットの組である。本明細書において「非同一の繰り返し単位」は、全てのサブユニットが同一の組成を有してはいない、および／または他のサブユニットの組のサブユニットと同一の順序で位置されていない、ポリマー内で繰り返されるサブニットの組である。非同一の繰り返し単位のサブユニットの幾つかは、全てのサブユニットが同一でない限りにおいて、他の組のサブユニットと同一の順序および／または同一の位置を有することができる。この発明の文脈において用いられる場合、非同一の繰り返し単位を有するポリマーとは、全てが非同一の繰り返し単位を有することができるもの、または同一と非同一の繰り返し単位の組合せを有することができるものである。
【００９０】
ポリマーは、少なくとも２個の繰り返し電荷モチーフを含む。本明細書において「繰り返し電荷モチーフ」は、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分および、負に荷電したアミノ部分から構成されるモチーフである。モチーフは、二重に荷電した単一のサブユニット、または複数のサブユニットであって、１つのサブユニットが正に荷電した有離アミノ遊離アミノ基を有し、第２のサブユニットが負の電荷を有するものから構成されることができる。異なるサブユニットに電荷が存在する場合、サブユニットは互いに隣接してもよく、または介在サブユニットによって分離されてもよい。１つの態様において、介在サブユニットは中性サブユニットである。中性サブユニットは、正の電荷または負の電荷を有さないサブユニットである。モチーフの荷電されたサブユニットは、任意の数のサブユニットにより分離することができるが、１０個未満の中性サブユニットによるのが好ましい。繰り返し電荷モチーフは、ポリマー内で任意の配置で存在することができる。例えば、中性サブユニットにより分離された２個の繰り返し電荷モチーフを有するポリマーにおいて、ポリマーは以下の順序を有することができる：正の電荷、負の電荷、中性サブユニット、負の電荷、そして最後に正の電荷。代替的に、ポリマーは以下の順序でもよい：正の電荷、負の電荷、中性サブユニット、正の電荷、そして最後に負の電荷、等。
【００９１】
本明細書において、「正に荷電された遊離のアミノ部分（positively charged free amino moiety）」は１級アミンを指す。本明細書において、「負に荷電された部分」は任意の負に荷電された基を指し、カルボキシル、リン酸塩、ホスホン酸塩、硫酸塩、およびスルホン酸塩を含むが、これらに限定されない。１つの態様において、負に荷電された部分はカルボキシル基である。遊離のアミノ基を有する正に荷電されたアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アルパラギン（Ｎ）、およびヒスチジン（Ｈ）を含むが、これに限定されない。負に荷電されたアミノ酸は、アルパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むが、これに限定されない。
ポリマーは少なくとも２個の繰り返し電荷モチーフを有するが、一般には２より多い任意の数を有することができる。ポリマー全体は、例えば、繰り返し電荷モチーフから構成されることができる。代替的に、ポリマーは、２と、ポリマー全体が構成される繰り返し電荷モチーフの数（これは当然、ポリマーのサイズに依存する）の間の任意数の繰り返し電荷モチーフから構成することができる。ポリマーは例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５個等の繰り返し電荷モチーフを有することができる。
【００９２】
繰り返し電荷モチーフの間の領域は、繰り返し電荷モチーフ、他の単位、またはこれらの混合により構成することができる。この領域は例えば、中性の介在配列であってよい。介在配列は、ポリマーの他の単位と同じタイプの単位であってもよく、または完全に異なっていてもよい。例えば非ポリマーの有機部分であってもよい。
１つの態様において、ポリマーは最大１０個の糖類の繰り返し単位から形成される多糖類であることができ、ここで各繰り返し単位は、少なくとも１個の遊離アミノ部分および、カルボキシル、リン酸塩およびホスホン酸塩からなる群から選択される負に荷電した部分を含む。随意的に、ポリマーには、B. fragilis莢膜多糖類複合体の一部としての複合体形成がない。ある態様において、多糖類は最大５個の糖類の繰り返し単位から形成される。かかる多糖類は天然に存在し、単離することができる。かかる多糖類の１つは、B. fragilis莢膜多糖類複合体の莢膜多糖類Ａ（ＰＳＡ）である。天然のＰＳＡは複合体の形態でのみ存在し、B. fragilis莢膜多糖類Ｂ（ＰＳＢ）に固く結合されている。単離されたＰＳＡまたは単離されたＰＳＢと異なり、Ａ：Ｂ莢膜多糖類複合体は、他の細菌による感染に対する交差防御を引き起こさないことが以前に見出された。従って、１つの態様において、本発明は、B. fragilis莢膜多糖類複合体の一部としての複合体形成のない、単離されたＰＳＡの投与を意図する。
【００９３】
本発明による有用な多糖類はまた、必要なモチーフを有していない天然の多糖類から合成することもできる。例えば、ある天然に存在する多糖類は、各繰り返し単位に、負に荷電された基および少なくとも１個のＮ−アセチル部分を有する。かかる多糖類は脱Ｎ−アセチル化してＮ−アセチル部分を遊離アミノ部分に変換でき、それによって、本発明に従って使用するために必要な構造モチーフを作り出すことができる。他の天然に存在する多糖類は、還元によって遊離アミノ部分を形成するイミン基を含み、それにより、負に荷電した基と一緒に、本発明の有用性に必要な構造モチーフを作りだしている。
従って本発明は、各単位が、カルボキシル、リン酸塩およびホスホン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つの負に荷電した部分を有している、最大１０個の糖類の繰り返し単位を有する多糖類を選択することによる、医薬の製造方法を意図する。各繰り返し単位はまた、遊離アミノ部分を形成するように改変できる部分も含む。かかる改変された多糖類は、次に薬学的に許容し得る担体と混合して、好ましくは、対象をアレルギー状態または喘息から防御するための有効用量を形成する量にする。
【００９４】
本発明による有用な多糖類は、必要な荷電された基を含む天然の多糖類を含む。これらの多糖類は、細菌由来であってよい。莢膜多糖類を得るための出発原料として用いられる細菌は、多数の源から市場で入手可能である。例えば、B. fragilis、NCTC9343およびATCC23745は、National Collection of Type Cultures (London, England)およびAmerican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)から入手可能である。多糖類Ａおよび多糖類Ｂは、上記の細菌から、Pantosti A et al. (1991) Infect Immun 59:2075-82のプロトコルに基づき、以下の例の節に記載するように少し修正を加えて精製することができる。
天然の多糖類に加えて、少なくとも１つのＮ−アセチル糖および少なくとも１つのウロン酸（負に荷電したカルボキシル基を有する糖）からなる多糖類繰り返し単位は、本発明の免疫応答を生成するように改変することができる。少なくとも１つのＮ−アセチル糖および少なくとも１つのウロン酸を含む多糖類繰り返し単位は、脱Ｎ−アセチル化して遊離のアミノ基を生成することができ、従って、正しい電荷モチーフの多糖類を生み出す。脱Ｎ−アセチル化可能な分子には、チフス菌莢膜多糖類（Ｖｉ抗原）、大腸菌Ｋ５莢膜多糖類、黄色ブドウ球菌５型莢膜多糖類、Ｂ群連鎖球菌ＩＩＩ型莢膜多糖類、およびRhizobium melilotiエキソポリサッカライドＩＩを含む。
【００９５】
遊離のカルボキシル基に加えてイミン基を有する細菌性多糖類は、本発明の免疫応答を生成させるために改変して用いることができる。多くの緑膿菌のＯ特異的側鎖はイミン基を有する。イミン部分を含むこれらの多糖類に対して、遊離アミノ基を、当業者に知られた従来の化学技法により形成することができる。１つの好適な方法は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の使用を含む。イミン基は水素化ホウ素ナトリウムで還元して遊離アミノ基（ＮＨ３＋）を生成することができる。これは、５ｍｇより多い水素化ホウ素を、室温で２時間攪拌しながら蒸留水中に溶解した多糖類に添加して実施する。混合物は次に水に対して透析し、凍結乾燥させる。水素化ホウ素ナトリウムで還元して遊離アミノ基を生成できる化合物の例は、緑膿菌フィッシャー７（Fischer7）である。
本発明において有用な多糖類は、１種以上の多糖類の混合物として送達することができる。混合物は、数種類の多糖類からなることができる。
【００９６】
上記のように、天然の多糖類を改変して本発明で有用な免疫調節剤を生成することができる。チフス菌は、ガラクトサミンウロン酸の繰り返しモノマーから全体が形成されている莢膜多糖類（Ｖｉ抗原）を有する。この酸は、カルボキシル部分およびＮ−アセチル部分を含む。Ｎ−アセチル部分は改変して遊離アミノ基を生成させ、各モノマー繰り返し単位が正および負に荷電された基の両方を有するようにすることができる。
複合体である多糖類が存在し、本発明において有用な免疫調節剤を生成するよう改変することができる。大腸菌Ｋ５莢膜多糖類は、グルクロン酸とグルコサミンが１−４結合で共に結合している複合体の繰り返し単位から形成される。グルクロン酸はカルボン酸部分を保持し、グルコサミンは遊離アミノ基を形成するよう改変可能なＮ−アセチル基を保持する。かかる改変が行われた場合、負に荷電した部分（第１糖上）および遊離アミノ基（第２糖上）の両方を有する複合体繰り返し単位が形成される。
【００９７】
三量体である多糖類が存在し、本発明において有用な免疫調節剤を生成するよう改変することができる。黄色ブドウ球菌５型莢膜多糖類は、マンノサミンウロン酸−フコサミン（fucosamine）−フコサミンの三量体の繰り返し単位で形成される。マンノサミンウロン酸はカルボン酸部分を保持し、フコサミンは遊離アミノ基を形成するよう改変可能なＮ−アセチル部分を保持する。かかる改変が行われた場合、負に荷電した部分（第１糖上）および少なくとも１つの正に荷電した部分（第２糖および第３糖上）を有する三量体繰り返し単位が形成される。同様の様式で、緑膿菌Ｏ抗原は、本発明において有用な免疫調節剤を生成するよう改変することができる。例としては、カルボン酸部分および遊離アミノ基を形成するように改変可能なイミン部分を保持する三量体を含む。フィッシャー免疫型７、Lanyi-BerganＯ２ａ、Ｏ２ｂおよびLanyi-BerganＯ２ｄおよび２ｆは、第１糖および第２糖にカルボン酸部分を、そして第１糖にイミン部分を有する三量体繰り返し単位から形成される多糖類を有する。（第３糖は荷電部分を有さない；全ての糖はまた、Ｎ−アセチル部分も保持する）。例えば、第１糖は、遊離アミノ部分およびカルボン酸部分の両方を保持するよう改変することができる。同様に、Ｎ−アセチル基は、本発明に従って有用な異なる配置を生成するように改変可能である。
【００９８】
四量体および五量体などの、より長い繰り返し単位を有する多糖類もまた、上記のようにして改変可能である。十量体までの繰り返し単位が、本発明に従って有用であると考えられる。さらに、側鎖糖を含む繰り返し単位もまた有用であり、遊離のアミノ部分および負に荷電した部分のどちらかまたは両方がかかる側鎖に位置するものを含む。さらに、荷電した部分を保持するかかる側鎖は糖である必要はないが、ただし１つの態様においては、繰り返し単位の少なくとも主鎖は糖のみからなっている。
ある態様において、繰り返し単位は３個までの遊離アミノ基を有し、１つの態様においては、２個までのかかる基を有する。１つの態様においては、各遊離アミノ基には少なくとも１つの負に荷電した基が存在する。
出発原料はさらに、細菌由来である必要はない。カルボン酸部分およびＮ−アセチル基またはイミン基を保持する任意の多糖類が、上記のようにして改変可能である。
【００９９】
特定の例が化学名および構造式と共に、Tzianabos et al.に発行された米国特許第5,679,654号および第5,700,787号に提供されている。
脱Ｎ−アセチル化は、当業者によく知られた従来の化学的技法により実施できる。１つの好適な方法は、水素化ホウ素ナトリウムと共に、またはこれなしで、アルカリを用いる方法を含む。多糖類２０ｍｇを、２ＭのＮａＯＨ（３ｍｌ）に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（５０ｍｇ）を添加する。溶液を５時間、１００℃で熱する。酸による中和の後に、溶液を蒸留水に対して寒中で透析し、乾燥凍結する。DiFabio JL et al. (1989) Can J Chem 67:877-82。
【０１００】
天然の多糖類もまた、改変なしで本発明の方法において、および本発明の医薬製剤の形成に、用いることができる。非限定的な例としては、ゾンネ赤痢菌Ｉ相リポ多糖類Ｏ抗原；肺炎連鎖球菌Ｉ型莢膜多糖類（ＣＰＩ）；および、肺炎連鎖球菌群抗原Ｃ物質を含み、これらはTzianabos et al.に発行された米国特許第5,679,654号および第5,700,787号に記載されている。
糖主鎖のみを有さないが、本発明に従って有用であると考えられる多糖類は、クルーズトリパノソーマ・リポペプチドホスホグリカンである。
改変なしで用いることのできる天然の多糖類は改変して、遊離アミノ部分、負に荷電した部分または他の部分を含む種々の部分を選択的に付加、除去、または修飾することができる。例としては、存在するＮ−アセチル基またはイミン基を改変することにより遊離アミノ部分を加えること、またはアルコール基からヒドロキシメチル基を形成することが含まれる。
【０１０１】
本発明に従って有用な多糖類は、市場源から入手可能であり、または細菌、真菌、海草などの天然源から単離および抽出することができる。以下は、細菌性多糖類およびかかる多糖類の単離ならびに調製の詳細を記した参考文献のリストである：
前に単にＰＳＡと呼んだBacteroides fragilisＰＳＡ１は、１個のカチオン性遊離アミンおよび１個のアニオン性カルボン酸塩を各繰り返し単位に含有する、四糖類繰り返し単位を有する。Tzianabos AO et al. (1992) J Biol Chem 267:18230-5；米国特許第5,679,654号および第5,700,787号。
Bacteroides fragilisＰＳＡ２は、マンノヘプトース、Ｎ−アセチルマンノサミン、３−アセトアミド−３，６−ジデオキシグルコース、２−アミノ−４−アセトアミド−２，４，６−トリデオキシガラクトース、フコース、および３−ヒドロキシブタン酸を含む四糖類繰り返し単位を有する。Wang Y et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:13478-83；Kalka-Moll WM et al. (2001) Infect Immun 69:2339-44。ＰＳＡ２は両性イオン性であり、各繰り返し単位に１個のカチオン性遊離アミンおよび１個のアニオン性カルボン酸塩を含有する。
【０１０２】
Bacteroides fragilisＰＳＢは六糖類繰り返し単位を有し、１個のカチオン性遊離アミンおよび２個の負の電荷を各繰り返し単位に含有する。Tzianabos AO et al. (1992) J Biol Chem 267:18230-5；米国特許第5,679,654号および第5,700,787号。
チフス菌莢膜（Ｖｉ抗原）、Szu SC et al. (1991) Infect Immun 59:4555-61。
大腸菌Ｋ５莢膜、Vann W et al. (1981) Eur J Biochem 116:359-64。
黄色ブドウ球菌５型莢膜、Fournier J-M et al. (1987) Ann Inst Pasteur Microbiol 138:561-7。
Rhizobium melilotiエキソポリサッカライドＩＩ、Glazebrook J et al. (1989) Cell 54:661-72。
Ｂ群連鎖球菌ＩＩＩ型、Wessels MR et al. (1987) J Biol Chem 262:8262-7。
緑膿菌フィッシャー７Ｏ特異的側鎖、Knirel YA et al. (1987) Eur J Biochem 167:549-61。
ゾンネ赤痢菌Ｏ特異的側鎖、Kenne L et al. (1980) Carbohydr Res 78:119-26。
肺炎連鎖球菌Ｉ型莢膜、Lindberg B et al. (1980) Carbohydr Res 78:111。
肺炎連鎖球菌群抗原、Jennings HJ et al. (1980) Biochemistry 10:4712-9。
【０１０３】
他の態様において、ポリマーは、少なくとも２個の繰り返し電荷モチーフを有するペプチドであってよく、ここで繰り返し電荷モチーフは、正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分および負の電荷からなり、ここで、少なくとも２個の繰り返し電荷モチーフの正に荷電した有離アミノ遊離アミノ部分は、少なくとも８個のアミノ酸残基の距離により分離されている。１つの態様において、繰り返し電荷モチーフは、アミノ酸の繰り返しセットとして存在する。１つの特定の態様において、繰り返し電荷モチーフは、リジン（Ｋ）−アスパラギン酸（Ｄ）の繰り返し、すなわち、（Ｋ−Ｄ）ｎの繰り返しセットとして存在する。１つの態様において、繰り返し電荷モチーフは、リジン（Ｋ）−（Ｘａａ）ｍ−アスパラギン酸（Ｄ）の繰り返し、すなわち、［Ｋ−（Ｘａａ）ｍ−Ｄ］ｎの繰り返しセットとして存在し、ここでＫ、Ｘａａ、Ｄ、ｍおよびｎは上記定義の通りである。
本発明の実践において有用なのは、公開された国際特許出願WO 03/075953に記載されている合成ペプチドグリカンポリマー化合物１５である。化合物１５の調製および検証の方法は、この刊行物の例１に提供されている。
本発明の方法、使用および組成物に従って有用な任意の両性イオンポリマーは、随意的に、ポリマーの水和物として、ポリマーの薬学的に許容し得る塩として、またはこれらの混合物として存在することができる。
【０１０４】
投与
投与する場合、本発明の製剤は、薬学的に許容し得る溶液で適用される。かかる製剤は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合する担体、補助剤、および随意的に他の治療成分をルーチンに含有することができる。
ポリマーは、そのまま（ストレートで）、または薬学的に許容し得る塩の形態で投与できる。医薬に用いる場合、塩は薬学的に許容し得るものでなければならないが、しかし非薬学的に許容し得る塩も、薬学的に許容し得るそれらの塩を製造するために便利に用いることができ、これらも本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬学的に許容し得る塩は、これに限定はされないが、以下の酸から製造されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐトルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、スクシン酸、ナフタレン２スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に許容し得る塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、例えばカルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩として製造することができる。
【０１０５】
好適な緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％Ｗ／Ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％Ｗ／Ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％Ｗ／Ｖ）；並びにリン酸および塩（０．８〜２％Ｗ／Ｖ）を含む。好適な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％Ｗ／Ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％Ｗ／Ｖ）；およびチメロサール（０．００４〜０．０２％Ｗ／Ｖ）を含む。
本発明のポリマー製剤は、随意的に薬学的に許容し得る担体中に含有された、有効量のポリマーを有する医薬組成物であることができる。本明細書において用語「薬学的に許容し得る担体」は、ヒトまたは他の動物への投与に好適な、１種または２種以上の、適合性の固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、または封入物質を意味する。
本発明において、用語「担体」は、活性成分がそれに組み合わされて適用を容易にする、天然または合成の有機または無機成分を指す。医薬組成物の要素はまた、所望の薬学的効率を実質的に損なう相互作用がない様式において、本発明のポリマーと混合、およびお互いに混合することが可能である。
【０１０６】
非経口投与に好適な組成物は、受容者の血液と等張性であってよいポリマーの無菌水性製剤を便利に含む。用いることのできる許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液を含む。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として便利に用いられる。この目的のために、任意の無刺激性の不揮発性油を用いることができ、合成のモノ−またはジグリセリドを含む。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、注入物の製造において使用が見出されている。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内等の投与に好適な担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに見い出せる。
サイトカインなどの他の免疫調節剤は、本発明のポリマーと共に送達することができ、ポリマーとサイトカインとを含む「カクテル」が意図される。意図されるサイトカインは、本発明のポリマーを投与することによる有益な効果を増強するものである。サイトカインは、リンパ球を含む細胞の増殖および成熟を支援する因子である。ここで本発明に重要なのは、Ｔ細胞の発生を調節するものであり、本発明の方法がＴ細胞介在と見られるからである。サイトカインは、Ｔ細胞に直接または他の細胞を介して間接に作用することができる。サイトカインの添加は、本発明の方法を実施することにより、in vivoで促進されるサイトカインの活性を増加させると考えられる。１つの態様において、サイトカインはインターロイキン１０である。
【０１０７】
アレルギー状態および喘息の処置に有用な他の剤は、本発明のポリマーと共に送達することができ、ポリマーおよび他の剤を含む「カクテル」が意図される。考えられる他の剤は、本発明のポリマーを投与することによる有益な効果を増強するものである。より具体的には，他の剤は、グルココルチコイド、βアドレナリン作動薬、メチルキサンチン、抗コリン作動薬、クロモリン、ネドクロミル、抗ヒスタミン薬、ＩＬ−１０、および抗ＩｇＥ抗体から選択することができる。かかる剤の特定の例は上に開示されている。これらの他の剤の多くは、エアロゾル製剤としてすでに利用可能である。
本発明の製剤は有効量を投与される。投与の方法およびポリマーの分子量に依存して、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量のポリマーが有効である。絶対量は、用量の回数ならびに、年令、物理的状態、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメータを含む、種々の因子に依存する。これらの因子は当業者によく知られているものであり、ルーチンの実験を超えない範囲内で扱うことができる。
【０１０８】
例えば、喘息の処置用のマウスへのＣＰ１の投与は、皮下投与の場合は約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量が、肺へのエアロゾルによる投与の場合は約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量が効果的であることが見出された。
本発明の医薬組成物の複数用量が意図される。本発明は、例えば、３週間にわたる複数用量のポリマーの投与が有効であることが示された。例えば、マウスにおいて、１日３回の用量により達成された抑制活性は、一般に最後の用量から１４日以内に弱まることが見出された。従って、アレルギーや喘息などの慢性状態に対しては、本発明は特に、何日、何週間、何ヶ月または何年もの期間にわたる、単独でまたは補助療法と共に行うポリマーの長期投与の方法を含む。１つの態様において、ポリマーは対象に対して毎日投与される。種々の態様において、ポリマーは対象に対して、１日おきに、２日おきに、３日おきに、４日おきに、５日おきに、週に２回、または週に３回、投与される。１つの態様において、ポリマーは対象に対して毎週投与される。１つの態様において、ポリマーは対象に対して隔週で投与される。ここにリストされていない他のスケジュールもまた、互いに２週間以内に少なくとも２回の用量を含む限りにおいて、本発明で意図される。かかる他のスケジュールは定期的である必要はなく、替わりに、例えば処置される状態の症状に応じて導かれてもよい。
【０１０９】
一般に種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の方法は、もちろん、選択される特定の多糖類、処置される特定の状態、および治療の効力に必要な用量に依存する。本発明の方法は、一般に、医学的に許容し得る任意の投与方法を用いて実施することができ、これは、臨床的に許容し得ない副作用を誘発することなく、免疫応答の有効な調節をもたらす任意の方法を意味する。投与方法は、経腸的および非経口経路を含む。用語「経腸的」は、限定することなく、特に経口を含む。用語「非経口」は、限定することなく、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、および腹腔内注射および注入技法を含む。粘膜、局所的、病変内、および経皮投与もまた、投与の非経口投与に含まれる。
【０１１０】
上記のように本発明により、限定はしないが特に喘息の処置の方法のために、エアロゾル送達システムが特に意図される。エアロゾル送達は特に、吸入による肺気道送達および、例えば吸入またはガス注入(insufflation)による鼻腔内送達の両方を含む。
組成物は、単位用量形態において便利に提供され、薬学分野でよく知られた任意の方法により調製することができる。全ての方法は、活性ポリマーを１種または２種以上の補助成分を含む担体と関連させるステップを含む。一般に組成物は、液体の担体、細かく分割された固体の担体、またはその両方とポリマーを均一かつ密接に関連させ、次に必要に応じて製品を形作ることにより、製造される。ポリマーは凍結乾燥させて保存し、使用時に再構成することができる。
【０１１１】
他の送達システムは、徐放性、遅延放出または持続放出送達システムを含むことができる。かかるシステムは、本発明のポリマーの繰り返し投与を避けることができ、対象および医師の利便性を増加させる。多種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。それらは以下を含む：ポリマーベースのシステム、例えばポリ乳酸およびポリグリコール酸、ポリ無水物およびポリカプロラクトン；脂質の非ポリマーシステムであって、例えばコレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸などのステロール、またはモノ、ジ、およびトリグリセリドなどの中性脂肪を含むもの；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；従来の結合剤および賦形剤を用いたワックス被覆の圧縮錠剤、部分融合インプラント等。特定の例は以下を含むがこれに限定はされない：（ａ）ポリマーがマトリクス内の形態で含まれる侵食システムであって、米国特許第4,452,775号(Kent)；第4,67,014号(Nestor et al.)；および第4,748,034号と第5,239,660号(Leonard)に見出されるもの、並びに（ｂ）活性要素が制御された速度でポリマーに浸透する分散システムであって、米国特許第3,832,253号(Higuchi et al.) および第3,854,480号(Zaffaroni)に見出されるもの。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを用いることができ、それらの幾つかは移植に適合されている。
【０１１２】
例
多糖類の細菌の源、単離および改変
B. fragilis NCTC 9343およびATCC 23745は初めに、National Collection of Type Cultures (London, England)またはAmerican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)から入手した。微生物は使用まで、−８０℃でペプトンイーストまたは脳心臓注入ブロス（brain heart infusion broth）中で保存し、前に記載のようにして嫌気的に増殖させた。Pantosti et al. Infect Immun 59:2075 (1991)。B. fragilis NCTC 9343またはATCC 23745からのＣＰＣを、熱フェノール／水抽出により単離し、続いてＰＳＡの精製を前に記載のようにして行った。Tzianabos, A et al. J Biol Chem 267:18230 (1992)。
肺炎連鎖球菌Ｉ型莢膜多糖類１（ＣＰ１）および他の肺炎球菌多糖類を、ＡＴＣＣから得た。
多糖類を化学的に改変することによる電荷を変えた分子の生成は、前に記載した。Taylor R et al. (1972) Biochemistry 11:1383（カルボジイミド還元）；Baumann H et al. (1992) Biochemistry 31:4081（Ｎ−アセチル化および脱アミノ化）。
【０１１３】
肺炎連鎖球菌１型ＣＰ（ＣＰ１）による、手術後の外科的癒着の抑制
ラット（１群あたり１０匹）に対して、生理食塩水（１００μｌ）、ペクチン（ポリガラクトウロン酸、生理食塩水１００μｌ中に１００μｇ）、または肺炎連鎖球菌１型ＣＰ（２個のガラクトウロン酸残基および１つの２−アセトアミド−４−アミノ−２，４，６−トリデオキシガラクトースを有する三糖類繰り返し単位、８０ｋＤａ、生理食塩水１００μｌ中に１００μｇ）を用いて皮下的に、外科的操作の−２４時間、０時間、および＋２４時間において処置した。癒着は、前述と同様にして、さらに幾らかの修正を加えて誘発した。Kennedy R et al. (1996) Surgery 120:866-70。簡単に述べると、腹腔に３ｃｍの正中切開を行い、盲腸を露出させた。盲腸を点状出血が見られるまで外科用ガーゼで擦過した。盲腸を腹腔内に挿入し、その傍の腹壁を同様に擦過した。この手順に続いて、ラットの殺菌した盲腸内容物（０．５ｍｌ）を、前述のように腹腔内に加えた。Onderdonk AB et al. (1982) J Clin Invest 69:9-16。創傷を４．０絹縫合で閉じた。動物を６日後に殺して、癒着形成を調べた。癒着は、前述のように０〜５のスケールで以下のように点数付けした：０、癒着なし；１、薄い膜状の癒着；２、２個以上の薄い癒着；３、中心を有する厚い癒着；４、平面的に付着した厚い癒着；および５、非常に厚い血管新生化癒着（vascularized adhesion）または、２個以上の平面状の癒着。Kennedy R et la. (1996) Surgery 120:866-70。
Ｔ細胞移植試験
生理食塩水または多糖類で処置した動物から単離した脾臓Ｔ細胞を分画し、計測し、心臓内経路を介して移植した。
【０１１４】
例１
両性イオン多糖類による術後癒着形成の減少はＴ細胞およびＩＬ−１０に依存する
雄のルイスラット（Lewis rat）に、盲腸擦過手術の−２４、０、および＋２４時間において、生理食塩水またはＣＰ１（５０μｇ／ラット）を皮下注射した。６日後にこれらの動物の癒着形成について調べ、上述のように癒着の重篤度スコアを調べた。結果を図１Ａに示す。左図：生理食塩水で処置した動物は、盲腸およびその傍の腹壁を含む、多数の高密度の血管新生化癒着を示した。右図：ＣＰ１で処置したラットは、それより数が少なく重篤度も低い癒着を示した。
図１Ｂは、ＣＰ１が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に依存する様式で癒着形成を防ぐことを示す。左図：ＣＰ１または対照として非両性イオン多糖類であるＰＧで処置したルイスラットの癒着スコア。各点は１匹の動物を示し、バーはスコアの中央値を示す。ＣＰ１で処置した動物は、生理食塩水またはＰＧで処置した動物より、有意に低い癒着スコアを示した（Ｐ＜０．００１）。中図：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、生理食塩水、ＣＰ１またはＰＧで同様の様式で処置し、盲腸擦過手術を行った。ＣＰ１で処置した動物は、生理食塩水またはＰＧで処置した動物より、有意に低い癒着スコアを示した（＊Ｐ＜０．００１）。右図：ＣＰ１で処置したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の移植は、生理食塩水で処置した動物からのＣＤ４＋Ｔ細胞を受領した動物と比べて、防御をもたらした（＊Ｐ＝０．００１）。
【０１１５】
図１Ｃは、癒着の予防におけるＩＬ−１０の役割を示す。左図：ＣＰ１は、生理食塩水またはＰＧの処置に比べ、マウスの腹腔においてＩＬ−１０を誘導する。動物（ｎ＝５／群）は、３日間連続して５０μｇのＣＰ１またはＰＧで処置し、最終投与の後３日間、腹水を採取した。ＩＬ−１０のレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。ＣＰ１は、生理食塩水またはＰＧの処置に比べて、高レベルのＩＬ−１０を誘発した（＊Ｐ＜０．０２）。右図：ＣＰ１による防御は、抗ＩＬ−１０処置によって無効となる。マウスは、上記のように生理食塩水またはＣＰ１により処置し、腹腔内経路を介してＩＬ−１０に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で処置した（２００μｇ、盲腸擦過手術からｔ＝０、２４、４８および７２時間において）。ＩＬ−１０特異的モノクローナル抗体による処置により、ＣＰ１で処置しアイソタイプ対照抗体を受領した動物と比べて、有意に高い癒着スコアが得られた（＊Ｐ＜０．００１）。
図１Ｄは、ＣＰ１で処置したＩＬ−１０−ｌ−マウスが、同腹子の野生型（ＷＴ）対照マウスと比べて、癒着形成に対して防御されなかったことを示す（＊Ｐ＝０．００３）。
【０１１６】
例２
外科的癒着の予防におけるＴｒｅｇ細胞の役割
マウスをＣＰ１またはＰＧで処置し（５０μｇ／用量を皮下経路を介して）、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、フローサイトメトリーによりＣＤ４５ＲＢ表面発現および細胞内ＩＬ−１０レベルを解析した。結果を図２Ａに示す。上段の図：ＣＰ１による処置は、Ｔｒｅｇ細胞の割合を増加させ、一方ＣＤ４５ＲＢｈｉＴ細胞の割合を減少させる。ＰＧによる処置はこの割合に影響を及ぼさない（処置の４日後を示す）。下段の図：ＣＰ１による処置はＣＤ４５ＲＢｌｏ細胞からのＩＬ−１０の産生を増加させ、一方ＰＧは影響を及ぼさない。ＩＬ−１０産生は処置４日後にピークとなった。
図２Ｂは、ＣＰ１による処置は、Ｔｒｅｇ細胞からのＩＬ−４またはＩＦＮ−γを誘発しないことを示す。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞は、処置後毎日解析した。４日後からの結果を示す。
【０１１７】
図２Ｃは、Ｔｒｅｇ細胞が、ＩＬ−１０に依存した様式で癒着形成に対する防御を伝達することを示す。左図：マウス群を、上記のように生理食塩水またはＣＰ１により処置し、脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞を最終処置の１日後に単離した。細胞をＣＤ４５ＲＢ特異的抗体で染色し、高（ｈｉ）または低（ｌｏ）発現の集団をＦＡＣＳにより単離した。各集団を次に、心臓内経路を介して移植し、２４時間後に動物に盲腸擦過手術を施した。生理食塩水またはＣＰ１で処置した動物からＣＤ４５ＲＢｈｉＴ細胞を受領した動物は、癒着を発生した。癒着はまた、生理食塩水で処置した動物からＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞を受領した動物でも発生した。ＣＰ１で処置した動物からＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞を受領した動物は、生理食塩水で処置した動物からＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞を受領した動物より、有意に低い癒着スコアを有していた（＊Ｐ＜０．００１）。右図：ＩＬ−１０特異的抗体による処置は、ＣＰ１で処置した動物から採取したＴｒｅｇ細胞により伝達された防御を無効にした。ＣＰ１で処置した動物からのＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞は、ＩＬ−１０に特異的なモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照抗体により１日後に処置されたナイーブな受容動物へ移植された。アイソタイプ対照抗体で処置されたＴｒｅｇ細胞を受領したマウスには、ほとんど癒着がなかった。しかし、マウスへＴｒｅｇ細胞の移植により付与された防御は、ＩＬ−１０特異的抗体による処置によって無効化された（＊アイソトープ対照処置と比較して＊Ｐ＝０．０００２）。
【０１１８】
例３
Ｔｒｅｇ細胞により付与された防御におけるＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬ相互作用の役割
図３Ａは、ＣＰ１がin vivoでＣＤ４＋Ｔ細胞でのＩＣＯＳの発現を誘導することを示す。マウスをＣＰ１またはＰＧで上述のようにして処置し、膵臓Ｔ細胞を単離し、ＩＣＯＳおよびＣＤ４発現について染色した。ＣＰ１はＣＤ４＋Ｔ細胞でのＩＣＯＳの発現を誘導し、最終投与の４日後に最大となった。ＰＧはこれらの細胞でのＩＣＯＳの発現を誘発しなかった。
図３Ｂの左図は、ＩＣＯＳＬ抗体がＣＰ１による防御を無効化することを示す。マウスは、癒着を誘導する前に生理食塩水またはＣＰ１で処置した。ＣＰ１で処置したマウスには、腹腔内経路を介して手術の０、４８および９６時間後に、ＩＣＯＳＬに特異的なモノクローナル抗体（４００μｇ／マウス）またはアイソタイプ対照抗体も与えた。ＣＰ１およびアイソタイプ対照抗体で処置したマウスは、ＩＣＯＳＬに特異的なモノクローナル抗体で処置したマウスに比べて、有意に少なくまた重篤度の低い癒着を有した（アイソタイプ対照処置に比べてＰ＝０．０００３）。
【０１１９】
図３Ｂの中央図は、ＩＣＯＳ−ｌ−マウスがＣＰ１の処置によって防御されないことを示す。ＷＴおよびＩＣＯＳ−ｌ−マウスを、癒着を誘導する前に、上述のようにして生理食塩水またはＣＰ１で処置した。ＣＰ１で処置したＩＣＯＳ−ｌ−動物は、同様に処置したＷＴ動物より低い癒着スコアを示した（Ｐ＝０．００２）。
図３の右図は、ＩＣＯＳＬ抗体は、ＣＰ１で処置したマウスからのＴｒｅｇ細胞による防御を無効化することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを上述のようにしてＣＰ１で処置し、１日後にＦＡＣＳにより脾臓からＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞を採取した。Ｔｒｅｇ細胞を、心臓内経路を介してナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの２つの群に移植し、２４時間後に動物に盲腸擦過手術を行った。被移植動物には、手術の０、４８、および９６時間後に、ＩＣＯＳＬ特異的抗体またはアイソタイプ対照抗体（４００μｇ／マウス）を腹腔内経路を介して与えた。動物の各群は６日後に癒着を評価した。ＩＣＯＳＬ抗体による処置は、アイソタイプ対照抗体による処置と比べて、Ｔｒｅｇ細胞の移植により付与された防御を無効化した（Ｐ＝０．０００６）。
【０１２０】
例４
Ｔｒｅｇ細胞はＩＣＯＳに依存する様式でＣＰ１に応答しＩＬ−１０を産生する
図４Ａは、ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０産生を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを上述のようにしてＣＰ１またはＰＧで処置し、ＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞を最終投与後の異なる時点において単離した。細胞はＩＣＯＳ表面発現および細胞内ＩＬ−１０産生について染色し、解析のためにＣＤ４Ｔ細胞上でゲーティングした。ＣＰ１による処置は、ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ細胞からのＩＬ−１０産生を誘導した。この応答はＰＧで処置したマウスからのＴｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０産生より大幅に高かった。ＣＰ１で処置したマウスからのＩＣＯＳ−Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−１０を産生しなかった。
図４Ｂは、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０産生はＣＰ１に特異的であり、ＩＣＯＳに依存することを示す。ＷＴおよびＩＣＯＳ−ｌ−マウスを、ＣＰ１（５０μｇ、皮下経路を介して）により処置し、１０日後にＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞を単離し、照射された自己抗体提示細胞と共にin vitroで培養した。細胞をＣＰ１またはＰＧ（２０μｇ／ｍｌ）で刺激し、培養液の上清液を培養の６日または８日後に採取して、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０の定量を行った。ＣＰ１により刺激されたＷＴマウスからのＴｒｅｇ細胞は、ＩＣＯＳ−ｌ−マウスからのＴｒｅｇ細胞より高いレベルのＩＬ−１０を産生した。この反応はＣＰ１に特異的であり、なぜならば、ＰＧはＷＴまたはＩＣＯＳ−ｌ−Ｔｒｅｇ細胞からＩＬ−１０を誘発しなかったからである。in vivoでＰＧで処置され、in vitroでこのポリマーにより刺激された動物からのＴｒｅｇ細胞は、これらの試験においてＩＬ−１０を産生しなかった。
【０１２１】
例５
ＰＳＡは喘息を改善できる
両性イオン多糖類の喘息を予防する機能を評価するため、ＰＳＡを、確立されたアレルギー性喘息のマウスモデルにおいて試験した。Mojtabavi N et al. (2002) J Immunol 169:4788-96。４群の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）を感作し、オバルブミン（ＯＶＡ）でチャレンジして、実験的に喘息を誘発した。指定されたマウスの実験群は、エアロゾル化または皮下注射によるＰＳＡで処置した。指定の対照マウス群は、無処置か、または生理食塩水の皮下注射で処置した。動物群および実験計画を表１に示す。
全マウスの感作は、０日における生理食塩水４ｍｌ中のＯＶＡ２００μｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）注入および、２１日後における同一のブーストを含む。Ｂ群のマウスでのＰＳＡによるエアロゾル処置は、１〜２７日の間に、超音波噴霧器によりエアロゾル化した０．０１％ＰＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）５００μｇを週に３回投与することを含む。Ｃ群におけるＰＳＡによる皮下処置は、エアロゾル処置と同じスケジュールで、０．１％ＰＳＡ（ＰＳＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液）を１００μｌ、皮下（ｓ．ｃ．）注射することを含む。
【０１２２】
表１．喘息モデルプロトコル
【表１】
2006522135.tif 000003
全マウスについてのチャレンジは、２８および２９日後に１日２回６０分間、超音波噴霧器による１％ＯＶＡ（１ｇ／１００ｍｌ）のエアロゾル投与を含む。
【０１２３】
動物は、最終のエアロゾルチャレンジの４８〜９６時間後に殺して、肺組織病理、血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０について評価する。
ＯＶＡ特異的ＩｇＥの測定には、ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＥ（LO-ME-3; Serotec, Oxford, U.K.）で４℃で１晩被覆する。プレートを洗浄し、２％ＢＳＡ／０．０５％Tween 20で３７℃にて２時間ブロックする。滴定した血清を室温で２時間インキュベートする。洗浄の後、ビオチン化したＯＶＡを加え、プレートを１時間インキュベートする。プレートを洗浄後、ユウロピウム（Ｅｕ３＋）−ストレプトアビジン（Delfia; Wallac, Turku, Finland）を各ウェルに加える。増強溶液（enhancement solution）（１００μｌ；Delfia）を加え、蛍光定量法を用いて３４０ｎｍ励起および６１４ｎｍ発光にて、Ｅｕ３＋放出を測定する。
【０１２４】
ＢＡＬ液サイトカインの測定には、致死的に麻酔したマウスにカニューレを挿入し、ＰＢＳ１ｍｌで１〜３回洗浄する。各マウスからのＢＡＬ液をプールし、ＩＬ−１、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Endogen, Woborn, MA）にて定量する。
肺組織病理試験では、ＢＡＬの後に、気管をＰＢＳおよび続いて４％のホルマリンで還流する。パラフィンに埋め込まれた４μｍの肺切片を、形態染色用にＨ＆Ｅにて、およびムコ多糖体染色用にパス染色で染色する。
気道過敏性（ＡＨＲ）は、意識のある抑制なしのマウスにおいて、全身プレチスモグラフィ（Buxco Electronics, Sharon, CT）で公開された方法を用いて計測する。Hamelmann E et al. (1997) Am J Respir Crit Care Med 156:766-75。
【０１２５】
例６
両性イオンペプチドはＴ細胞活性化を誘導する
両性イオン電荷モチーフのＴ細胞活性化における役割を示すため、ダイペプチド繰り返し単位を合成して、ＰＳＡの繰り返し単位構造を模倣した。この目的のために、リジン（Ｋ）およびアスパラギン酸（Ｄ）による異なる繰り返し単位サイズ、（Ｋ−Ｄ）ｎを合成し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を促進するそれらの機能を試験した。
ペプチド（Ｋ−Ｄ）ｎは、Rainin Symphonyペプチド合成装置で、４−アルコキシベンジルアルコール（ＰＡＣ）樹脂（PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA）とＦｍｏｃ化学を用いて合成した。アミノ酸は、カップリングのために２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルウリニウム六フッ化リン酸塩（ＨＢＴＵ）で活性化した。調製したペプチドは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により解析した。質量スペクトルはVoyagerＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計上に得た。プロトンＮＭＲスペクトルは、BruckerＡＭＸ５００装置でプロトン周波数５００ＭＨｚにて得た。両方の解析により、ペプチドは予想された構造であることが確認された。
【０１２６】
Ｔ細胞増殖分析は、ヒトleukopac（匿名の血小板ドナーからの廃棄白血球）から得た細胞で行った。単核細胞は、フィコール−ヒパーク（ficall-hypaque）沈降により分離して、赤血球および多形核白血球（polymorphonuclear leukocyte）を除去した。Ｔ細胞、Ｂ細胞および単核細胞からなる単核層は、ナイロンウールカラムを通過させることによりＢ細胞および単球を減少させた。これらの細胞の一部は、ナイロンウール上に載せる前に保存して、セシウム源６．４ｋＲａｄ、４．８分間の照射の後に自己支持細胞として用いた。ナイロンを通過した、９８％ＣＤ３陽性より大（ＦＡＣＳ分析により決定）の細胞は、キラー細胞として用いるか、または抗体でさらに減少させ、続いて磁気ビーズによるネガティブセレクションによって、ＣＤ４（ＯＫＴ４）またはＣＤ８（ＯＫＴ８）とした。Finberg RW et al. (1992) J Immunol 149:2055-60；Haregewoin A et al. (1989) Nature 340:309-12。種々のサイズの（Ｋ−Ｄ）ｎペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を、照射ＡＰＣ（２．５ｘ１０５／２００μｇ）と共に、１２日間Ｕ底９６穴プレート（Corning-Costar Corp., Cambridge, MA）でＲＰＭＩ１６４０および５％胎児性子牛血清（fetal calf serum）を用いて共培養したヒトＴ細胞（５ｘ１０4細胞／２００μｌ）に加えた。Nguyen LH et al. (1992) J Virol 66:7067-72。チフス菌１型ＣＰ（２０μｇ／ｍｌ）を陽性対照として含めた。６日後、細胞を、１ｍＣｉの３Ｈチミジン／ウェルで、採取の６時間前に鼓動させ（pulsed）、細胞増殖を測定した。細胞をよく洗浄し、採取し、放射能取り込み量を液体シンチレーションで計測した。データは、３個のウェルの平均±標準誤差のｃｐｍ単位で表した。
【０１２７】
１５、２０または２５個の繰り返し単位からなる（Ｋ−Ｄ）ｎペプチドはそれぞれ、Ｔ細胞活性化をin vitroで促進した。反応は、１０個の繰り返しのペプチドでより少なかった。１０未満の繰り返し単位からなるペプチド（１〜５の繰り返し）はＴ細胞の増殖を促進しなかった。対照ペプチド、ポリ−Ｌ−リジンもまた、Ｔ細胞の増殖を促進しなかった。これらのデータは、多糖類以外の両性イオン繰り返し単位のポリマーはＴ細胞活性化を促進し、この活性化はポリマーの繰り返し単位のサイズに依存することを明白に示す。
【０１２８】
例７
両性イオンペプチド（Ｋ−Ｄ）ｎは喘息を改善することができる
喘息を予防する両性イオンオリゴペプチドの機能を評価するために、例５のプロトコルに従い、ＰＳＡを（Ｋ−Ｄ）ｎで置き換えて実施する：ここで整数は１０〜２５の数値である。
【０１２９】
例８
ＣＰ１は喘息を改善することができる
両性イオン多糖類の喘息予防の機能を評価するために、確立されたアレルギー性喘息のマウスモデルにおいてＣＰ１を試験した。Mojtabavi N et al. (2002) J Immunol 169:4788-96。３群の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり８匹）を、オバルブミン（ＯＶＡ；ミョウバン中に１０μｇ、ｉ．ｐ．）で感作し、２１日後に同じ用量でブーストした。ブーストの７日後から、マウスを、エアロゾル化したＯＶＡ（１％のＯＶＡを６０分間、１日２回で２日間）または生理食塩水（６０分間、１日２回で２日間）でチャレンジした。最後のチャレンジの２日後、心穿刺で得た血液から血清を採集し、マウスを殺して肺組織病理、ＯＶＡ特異的ＩｇＥおよび血清ＩＬ−１３の評価を行った。この実験の間、マウスの個別の群にはＣＰ１（１００μｌ中に１００μｇ、ｓ．ｃ．、週に３回）または生理食塩水（１００μｌ、ｓ．ｃ．、週に３回）を投与した。第４群の８匹のマウスは感作させず、生理食塩水処置および生理食塩水チャレンジを行った。動物の群および実験計画を表２に示す。
【０１３０】
表２．喘息モデルプロトコル
【表２】
2006522135.tif 000004
【０１３１】
ＯＶＡ特異的ＩｇＥの測定のために、ＥＬＩＳＡプレートを抗マウスＩｇＥ（ＬＯ−ＭＥ−３；Serotec, Oxford, U.K.）１０μｇ／ｍｌで、４℃にて１晩被覆した。プレートを洗浄し、２％ＢＳＡ／０．０５％Tween 20で、３７℃で２時間ブロックした。滴定した血清を室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化したＯＶＡを加えて、プレートを１時間インキュベートした。ユウロピウム（Ｅｕ３＋）−ストレプトアビジン（Delfia; Wallac, Turku, Finland）を、プレートを洗浄した後に各ウェルに加えた。増強溶液（１００μｌ；Delfia）を加え、蛍光定量法を用いて３４０ｎｍ励起および４５０ｎｍ発光にて、Ｅｕ３＋の放出を測定した。
ＩＬ−１３を、ＩＬ−１３特異的ＥＬＩＳＡ（ＲおよびＤシステム）を用いて測定した。
肺の組織病理検査では、気管をＰＢＳおよび続いて４％のホルマリンで還流した。パラフィンに埋め込まれた４μｍの肺切片を、形態染色用にヘマトキシリンおよびエオジンにて、およびムコ多糖体染色用にパス染色で染色した。
【０１３２】
代表的な結果を図５〜図８に示す。
図５に示すように、ＣＰ１の処置は、気道過敏性のマウスにおいてＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルを低減した。ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、ＣＰ１で処置したマウスでは、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスに比べて、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＥが有意に減少した（ｐ＝０．０００１、フィッシャーの直接確率検定による）。事実、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、ＣＰ１で処置したマウスのＯＶＡ特異的血清ＩｇＥレベルは、ＯＶＡで感作し生理食塩水でチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスより、感作なしで生理食塩水でチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスにより類似していた。
【０１３３】
図６に示すように、ＣＰ１による処置は気道過敏性のマウスにおける血清ＩＬ−１３レベルを低減させた。ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、ＣＰ１で処置したマウスは、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスに比べて、有意に低い血清ＩＬ−１３を有していた（ｐ＝０．０３、ターキークラマーの多重比較検定による）。事実、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、ＣＰ１で処置したマウスの血清ＩＬ−１３レベルは、感作なしで生理食塩水でチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスのそれと本質的に等しかった。
図７に示すように、ＣＰ１による処置は、気道過敏性と関連する好酸球の湿潤および杯細胞の湿潤を低減させた。Ａ、ＢおよびＣ群各々から２匹のマウスを試験したところ（表２参照）、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスにおいて、ＣＰ１で処置した対応する群に比べて少なくとも２倍多い好酸球の湿潤の存在を示した（図７Ａ）。同様に、Ａ、ＢおよびＣ群各々から同じ２匹のマウスを試験したところ（表２参照）、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、生理食塩水で処置したマウスにおいて、ＣＰ１で処置した対応する群に比べて少なくとも２倍多い杯細胞の湿潤の存在を示した（図７Ｂ）。図８は、ＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、生理食塩水で処置したマウス（左図）およびＯＶＡで感作しＯＶＡでチャレンジし、ＣＰ１で処置したマウス（右図）の代表的なＰＡＳ染色切片を示す。ＣＰ１で処置したマウスは、生理食塩水で処置したマウスより少ない面積の杯細胞の湿潤を有していた。
【０１３４】
例９
in vitroでのＴｒｅｇ細胞の拡大
マウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を得て、自己照射抗原提示細胞（ＡＰＣ）を有する９６穴プレートにおいて培養した。Ｔ細胞およびＡＰＣはそれぞれ、個々のウェルに２ｘ１０５細胞／ウェルで加えた。細胞は、２０μｇ／ｍｌの両性イオン多糖類（ＺＰＳ）ＰＳＡ、ＩＬ−２（０．５ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１５（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）と共に、１週間培養した。１週間後、新鮮なＡＰＣ、サイトカイン、および多糖類を上記の濃度で加えた。このサイクルを合計３回繰り返した。この過程の後、ＺＰＳ刺激に応答してＩＬ−１０を産生する、ＣＤ４５ＲＢｌｏフェノタイプを有するＺＰＳ特異的Ｔｒｅｇ細胞が優勢であることが見出された（ウェルにおいて細胞の５０％）。ＩＬ−１０は、フローサイトメトリーで細胞内サイトカイン染色により計測した。
【０１３５】
例１０
細胞内サイトカイン解析
ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２を用いたプレインキュベーションによりＦｃ受容体をブロックした後、Ｔ細胞をＦＩＴＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、またはＰＥによりラベルされたｍＡｂｓによって、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＢ、もしくはＩＣＯＳまたは対応するアイソトタイプ対照抗体について染色した。細胞内サイトカイン解析を上述のようにして行った。Akbari O et al. (2002) Nat Med. 8:1024-32。簡潔に述べると、細胞を洗浄し、固定し、Cytofix/Cytoperm溶液および１’Perm/Wash溶液（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）を用いて透過性とし、次に、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、もしくはＩＬ−１０または対応するアイソタイプ対照に特異的なＰＥ−Ｃｙ５またはＰＥ複合モノクローナル抗体を用いて染色した。染色された細胞は、Coulter EPICS XL（登録商標）血球計算器（Beckman Coulter）で、CELL Quest（登録商標）（Becton Dicknson）およびWinMDI2.8解析ソフトウェア（Scripps Research Institute）を用いて解析した。全ての抗原はBD PharMingen (San Diego, CA)から入手した。
【０１３６】
等価物
上記の書面の明細書は、当業者が本発明を実践するのを可能とするのに十分であると考えられる。本発明は、提供された例によってその範囲を限定されず、これは、これらの例が本発明の１つの側面の単一の例示を意図しており、他の機能的に等価な態様も本発明の範囲であるためである。本明細書に示されたものおよび記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が前述の記載から当業者には明白となり、それらも付属のクレームの範囲に包含される。本発明の利点および目的は、必ずしも本発明の各態様により包含されるものではない。
本明細書に引用された全ての参考文献、特許および特許広報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１Ａ】両性イオン多糖類ＣＰ１による術後癒着形成の低減を示す１組の写真である。左および右の図は、それぞれ生理食塩水およびＣＰ１の処置に対応する。
【図１Ｂ】生理食塩水、ＣＰ１、または非両性イオン対照多糖類ＰＧで処置された動物における癒着スコア（左図、ラット；中図、マウス）、および生理食塩水またはＣＰ１で処置されたマウスから移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞で処置されたマウスにおける癒着スコア（右図）を示すグラフである。＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｃ】癒着の予防におけるＩＬ−１０の役割を示す１組のグラフである。左図、＊Ｐ＜０．０２；右図、＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｄ】生理食塩水またはＣＰ１で処置された野生型（ＷＴ）およびＩＬ−１０−ｌ−マウスにおける癒着スコアを示すグラフである。＊Ｐ＝０．０３。
【図２Ａ】ＣＰ１またはＰＧで処置されたマウスから単離され、表面のＣＤ４５ＲＢ（上図）および細胞内ＩＬ−１０（下図）について染色されたＣＤ４＋Ｔ細胞の、フローサイトメトリーによる解析結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】ＣＰ１のin vivo投与の４日後に測定された、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＴ細胞におけるＩＬ−４（左）およびＩＦＮ−γ（右）のフローサイトメトリーによる解析結果を示す１組のグラフである。
【図２Ｃ】生理食塩水またはＣＰ１で処置されたマウスから移植されたＣＤ４５ＲＢｈｉまたはＣＤ４５ＲＢｌｏ細胞で処置されたマウスにおける癒着スコア（左図）、および抗ＩＬ−１０抗体の存在下における、移植されたＣＤ４５ＲＢｌｏ細胞の防御効果の無効化（右図）を示す、１組のグラフである。左図、＊Ｐ＜０．００１；右図、＊Ｐ＝０．０００２。
【図３Ａ】生理食塩水、ＣＰ１、またはＰＧのin vivo投与後の、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ発現についてのフローサイトメトリーによる解析結果を示す、一連の３つのグラフである。
【図３Ｂ】癒着スコアにおけるＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬ相互作用の役割を示す一連の３つのグラフである。＊Ｐ＝０．０００６。
【０１３８】
【図４Ａ】ＣＰ１またはＰＧによる処置の後の、ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０産生についてのフローサイトメトリーによる解析結果を示す、一連のグラフである。
【図４Ｂ】ＣＰ１またはＰＧによる処置の後の、野生型（ＷＴ）およびＩＣＯＳ−ｌ−マウスから得たＴｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０産生を示すグラフである。
【図５】抗原で感作し、ＣＰ１または対照（生理食塩水）による処置後に、エアロゾル化した抗原でチャレンジしたマウスにおける、抗原特異的ＩｇＥレベルを示す棒グラフである。ＣＰ１で処置したマウス（１群当たりＮ＝８）は、生理食塩水で処置したマウスと比べて、抗原特異的ＩｇＥが有意に減少した（Ｐ＝０．０００１）。
【図６】抗原で感作し、ＣＰ１または対照（生理食塩水）による処置後に、エアロゾル化した抗原でチャレンジしたマウスにおける、血清ＩＬ−１３レベルを示す棒グラフである。ＣＰ１で処置したマウス（１群当たりＮ＝８）は、生理食塩水で処置したマウスと比べて、血清ＩＬ−１３が減少した。
【図７Ａ】抗原で感作し、ＣＰ１または対照（生理食塩水）による処置後に、エアロゾル化した抗原でチャレンジしたマウスから得た肺切片における、好酸球浸潤を示す棒グラフである。各棒は１匹のマウスからの結果を示す。ＣＰ１で処置したマウス（１群当たりＮ＝８）は、生理食塩水で処置したマウスと比べて好酸球浸潤が減少した。
【図７Ｂ】抗原で感作し、ＣＰ１または対照（生理食塩水）による処置後に、エアロゾル化した抗原でチャレンジしたマウスから得た肺切片における、杯細胞浸潤を示す棒グラフである。各棒は１匹のマウスからの結果を示す。ＣＰ１で処置したマウス（１群当たりＮ＝８）は、生理食塩水で処置したマウスと比べて杯細胞浸潤が減少した。
【図８】抗原で感作し、ＣＰ１（右図）または対照（生理食塩水；左図）による処置後に、エアロゾル化した抗原でチャレンジしたマウスから得た肺切片における、杯細胞浸潤が並ぶ細気管支を示す１組の顕微鏡写真である。ＣＰ１で処置したマウスは、生理食塩水で処置したマウスと比べて杯細胞浸潤の面積が減少した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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