(57)【要約】本発明は、ヒト組み換えエンドオリゴペプチダーゼＡ（ｅｎｄｏｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ；ｈＥＯＰＡ）、ｈＥＯＰＡをコードするポリヌクレオチド（原核生物類および、ヒトを含む真核生物類でｈＥＯＰＡを発現させる。）；ｈＥＯＰＡのたんぱく分解活性を決定するための、またはペプチド類“溶解性受容体”としてまたはシャペロンとしての活性を評価するための、合成基質類の使用；他のたんぱく質との相互作用および複合体形成を妨げることができる、作用物質類、競合物質類および拮抗物質類として、オリゴペプチド結合活性の特異的抗体および阻害薬の使用およびその製造方法に関する。本発明はまた、中枢神経系の先天性、感染性および退行性病状における診断および／または使用、および精神医学的障害、認知障害、および行動機能障害に対し、天然、組み換え、化学的修飾または遺伝子組み換え形態の、そのたんぱく質の使用にも関する。本発明はまた、神経学的病状および組織の退行変性の治療のために抗体類およびそれらの誘導体類を含む、リガンドとＥＯＰＡとの相互作用の阻害薬類および競合物質類の使用を提案する。
2006524983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えエンドオリゴペプチダーゼＡ（ＥＯＰＡ）およびそのたんぱく質配列をコードするメッセンジャーＲＮＡの１次構造の決定方法であって、そのたんぱく質配列は特にヒトに由来し、
（ａ）グアニジンイソチオシアネートーフェノール−クロロフォルム抽出法を用いるか、または商品名Ｔｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）のような特定の試薬を用いて、幾つかの動物組織から総ＲＮＡを単離し；
（ｂ）予め充填されたオリゴ−ｄＴセルロースカラムまたはサスペンション中の樹脂を用い総ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを精製し；
（ｃ）変性アガロースゲル（１〜２．５％のフォルムアルデヒドを含む）中での電気泳動により、得られたメッセンジャーＲＮＡの質を分析し、次いでエチジウムブロマイド、または他の核酸色素で染色し、フォトドキュメンテーションし、ハイブリダイゼーションにより分析(ノーザンブラット分析)を行い；
（ｄ）得られたメッセンジャーＲＮＡを逆転写させ、相補的ｃＤＮＡ鎖を合成し；
（ｅ）得られた二本鎖ｃＤＮＡを、その“インビトロ”増幅を可能とする、プラスミドベクター、コスミドまたはファージベクターへクローンさせ；
（ｆ）ハイブリダイゼーション、特異的抗−ＥＯＰＡ抗体を用いる免疫選択、またはＥＯＰＡ特異的活性の検出により、ＥＯＰＡのｃＤＮＡを同定および選択し；
（ｇ）ＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”）により、または細菌内にこのｃＤＮＡを含むベクターで形質転換された細菌を増幅させることにより、標的ｃＤＮＡを増幅および単離し、次いでｃＤＮＡ挿入断片を単離するために、適切な制限酵素類で消化させることからなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記（ｃ）記載の核酸色素が、“サイバーグリーン”（“Ｓｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ”、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（ｆ）記載のｃＤＮＡの増幅が、ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡを含むベクターで形質転換された細菌を増幅させることにより行なわれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記（ｆ）記載のｃＤＮＡ挿入断片の増幅が、総ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡおよび特定のオリゴヌクレオチド類を用いる直接ＰＣＲ増幅、またはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）により行なわれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記（ｅ）記載の、ＥＯＰＡのｃＤＮＡの同定および選択が、ハイブリダイゼーション、または特異的抗−ＥＯＰＡ抗体を用いる免疫−選択により行なわれ、
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを増幅させ、各々のクローンの遺伝子物質および／またはたんぱく質物質を毛細管現象によりニトロセルロース膜へ移し；
（ｂ）放射線標識されているかまたはされていない、最終段階で得られた膜およびプローブを用いハイブリダイゼーション分析を行なうか、または特異的抗体を用い陽性クローンを同定し；
（ｃ）用いられたプローブまたは抗体に対し陽性のクローンを同定し、後ほどの増幅のために、単離されたこれらのクローンを収集し、各々のｃＤＮＡ挿入断片を配列決定することからなることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡを適切な制限酵素で消化させて得た、前記（ｆ）記載の約６００塩基対の断片が、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションによる脳でのＥＯＰＡの分布分析に用いられたプローブの合成に用いられることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
用いられた制限酵素が、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ｃＤＮＡ挿入断片が、各々のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を決定するために完全に配列決定され、そのアミノ酸配列の１次および２次構造がまた分析され；さらにその決定された配列がまた、特殊データバンクに寄託された相同配列をサーチするために用いられることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物に由来した各々のたんぱく質およびその核の１次構造を決定するために特に用いられることを特徴とする請求項１から８記載の方法。
【請求項１０】
約６００塩基対の断片を含むことを特徴とする、ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ挿入断片。
【請求項１１】
ｃＤＮＡ挿入断片を完全に配列決定することによって、核の１次構造および推定アミノ酸配列を決定することができ、従ってこのたんぱく質の配列の１次構造および２次構造を分析することを可能とすることを特徴とする請求項１０記載のｃＤＮＡ挿入断片。
【請求項１２】
全長を完全に配列決定することによって、特殊データバンクに寄託された他の配列との相同性分析を可能とすることを特徴とする請求項１０および１１記載のｃＤＮＡ挿入断片。
【請求項１３】
“インサイチュ”ハイブリダイゼーションによる脳でのＥＯＰＡの分布分析に用いられるプローブの合成に用いられることを特徴とする請求項１０記載のｃＤＮＡ挿入断片の使用。
【請求項１４】
請求項１に従って単離および同定されたｃＤＮＡを用い、特に細菌を用いる、ヒト組み換えＥＯＰＡの生成方法であって、
（ａ）ＥＯＰＡが、アンカーたんぱく質類またはオリゴペプチド類に結合された融合たんぱく質類として、または組み換え分子として生成されるように、ＥＯＰＡをコードする、同定および単離されたｃＤＮＡを発現ベクター内へインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）でサブクローンし；
ｂ）前記（ａ）記載の、インフレームでクローンされたＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ挿入断片を含む、前記プラスミドベクター構造体、即ち発現ベクターで宿主細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＤＨαまたはＢＬ２１（ＤＥ３）、またはその類似菌株）を形質転換させ；
ｃ）前記形質転換された細菌を、５６０〜６００ｎｍ（波長）での吸光度値が約０．６になるまでに、選択用抗生物質を含むＬＢ培地のような適切な培地で、生育により増幅させ；
ｄ）ＩＰＴＧ(イソプロピル−チオガラクトシダーゼ)のような誘導物質を最終濃度約０．１〜１ｍＭになるまで添加し、振盪しながら３０または３７℃でインキュベートすることによって標的たんぱく質を生成し；
ｅ）遠心分離により発現された標的たんぱく質を含む細菌を収集し、それを−２０℃で貯蔵するかまたはすぐに処理し、その際に超音波または機械的な圧力によりそれを崩壊させ、細菌細胞質に存在する組み換えまたは融合たんぱく質を放出し；
ｆ）アフィニティーカラム、電気泳動または液体クロマトグラフィーを用い融合たんぱく質を回収および精製し； 
ｇ）ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）での電気泳動、ＵＶ／ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣ、ウエスタンブロット、質量分析、および／または天然および／または合成ペプチド基質類を用いて酵素反応速度により特異的活性を決定する方法により、組み換えたんぱく質の純度および質を評価する
ことからなる方法。
【請求項１５】
前記（ａ）記載のＥＯＰＡをコードする、同定および単離されたｃＤＮＡが、請求項１から９記載の方法で得られることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記（ａ）記載のサブクローニングにより、精製を促す、組み換えＥＯＰＡ、またはアンカーたんぱく質またはポリペプチドとの融合たんぱく質の形態のＥＯＰＡの発現が可能になることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記（ｂ）記載の宿主細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が、ＤＨα菌株またはＢＬ２１（ＤＥ３）菌株またはその類似菌株であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記（ｃ）記載の宿主細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が、ＤＨα菌株またはＢＬ２１（ＤＥ３）菌株またなその類似菌株であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記（ｃ）記載の培地が、選択用抗生物質を含むＬＢであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記（ｄ）記載の発現の導入が、誘導物質ＩＰＴＧ（イソプロプル−チオガラクトシダーゼ）を添加することによって行われることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
前記（ｅ）記載の細菌ペレットの処理において、細菌細胞質に存在する融合たんぱく質または組み換えたんぱく質を放出させるために、超音波または機械的な圧力により、細菌を破裂させ；発現されたたんぱく質はアフィニティーカラム、電気泳動または液体クロマトグラフィーにより精製され得ることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
前記（ｅ）記載の細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株ＤＨαまたはＢＬ２１（ＤＥ３）、またなその類似菌株であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞の形質転換が、これらの各々の方法に対し、前もって適切に製造された細菌の電気泳動処理または熱ショック処理により行われ得ることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
融合たんぱく質として発現された組み換えたんぱく質が、ポリ−ヒスチジン融合物に対し固定化ニッケルを、またはＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−転移酵素）との融合物に対しグルタチオン−セファロース樹脂を含むアフィニティーカラムを用い、他の可溶性細菌たんぱく質類（不純物）から分離され得ることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
融合たんぱく質として発現された組み換えたんぱく質が、プロテアーゼによる消化によりアンカーたんぱく質またはポリペプチドから分離され得、アンカーと組み換えたんぱく質との間に共通認識配列が前もって挿入されていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
用いられるプロテアーゼが、トロンビン、因子Ｘおよびエンテロキナーゼであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＥＯＰＡ遺伝子が、Ｌｉｓ１遺伝子と同じクロモソーム（１７ｐ１３．３）で、ｐ５３位置（約０．７ｃＭ距離）に比較的に近接したクロモソーム１７ｐ１２．９に位置し、約４０ｋｂを含み、９エキソンおよび１０イントロンからなり；転写調節因子に対する複数の認識部位が遺伝子のプロモーター領域で見られる、ＥＯＰＡ遺伝子の１次構造の決定方法。
【請求項２８】
ＡＰ１，ｃＭｙｂ，ＳＰ１，ｎＭｙｃ，ｃＭｙｃのような転写調節因子に対する推定結合部位が、プロモーター領域を含むＥＯＰＡ遺伝子の上流領域で同定されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ヒトＥＯＰＡ遺伝子の全配列が、特殊データバンクでアクセス可能なヒトゲノム全配列の分析により決定されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ヒトＥＯＰＡ遺伝子の完全な１次構造が、請求項１から９記載の方法により決定されることを特徴とする請求項２７から２９記載の方法。
【請求項３１】
Ｌｉｓ１遺伝子と同じクロモソーム（１７ｐ１３．３）で、ｐ５３位置（約０．７ｃＭ距離）に比較的に近接したクロモソーム１７ｐ１２．９に位置し、約４０ｋｂを含み、９エキソンおよび１０イントロンからなり；転写調節因子に対する複数の認識部位が遺伝子のプロモーター領域で見られるヒトＥＯＰＡ遺伝子。
【請求項３２】
転写調節因子が、ＡＰ１，ｃＭｙｂ，ＳＰ１，ｎＭｙｃ，ｃＭｙｃであることを特徴とする請求項３１記載の遺伝子。
【請求項３３】
ヒトＥＯＰＡの１次構造に係ることを特徴とする請求項３１および３２記載の遺伝子。
【請求項３４】
天然ＥＯＰＡのアミノ酸配列の単離、精製および決定方法であって、
（ａ）１：３の割合［重量：体積］で０．２５Ｍのｄｅ  ｓａｃａｒｏｓｅを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファ中に新しい組織を均質化し；
（ｂ）そのサンプルに対し，２５，０００ｘｇで１５分、そして１００，０００ｘｇで１時間超遠心分離を行い；
（ｃ）変性条件でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）によりサイトゾル分画（上清）を分析し、ＢｒａｄｆｏｒｄまたはＬａｅｍｍｌｉの方法によりたんぱく質を定量し、特異的抗体を用いウエスタンブロットを行い；
（ｄ）流速０．２５ｍｌ／分の、０．５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファを用いる液体クロマトグラフィーシステム（Ａｋｔａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合されているＳｕｐｅｒｏｓｅカラムを用い、ゲルろ過クロマトグラフィーによりサイトゾル分画を分別し；
（ｅ）前記バッファ中に溶解された標準たんぱく質を用い予め目盛りを決めたカラムに基づき、相対的分子量を決定し；
（ｆ）消光蛍光ペプチド類、またはＨＰＬＣシステム類および天然ペプチド基質類を用いて、その特異的酵素活性を蛍光定量法により決定することによって天然ＥＯＰＡを含む分画を同定し；
（ｇ）０．５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファを用いるＵＶ検出器に結合されているＨＰＬＣシステムを用いて天然ＥＯＰＡを精製し、純粋なＥＯＰＡに相応するピークを手動に収集し、前記ＥＯＰＡは凍結乾燥により濃縮され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析されることからなる方法。
【請求項３５】
前記（ａ）で均質化される新しい組織が、脳に由来したものであることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記（ｇ）で見られた純粋な天然ＥＯＰＡに相応するＨＰＬＣのピークが、約４０ｋＤａの単一のバンドを示すことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
天然ＥＯＰＡの精製が、抗−ＥＯＰＡ抗体のＮ−末端の共有結合に対し、予め活性化されたＣＨセファロース４ｂ樹枝を用いて製造された免疫親和性カラム類により行われ得ることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
純粋な天然ＥＯＰＡが、２０ｍＭのＮａＣｌを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファ中の２Ｍ  ＮａＩを用いて、その活性形態で輸出され得ることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
ＥＯＰＡの１次配列が、質量分析法により決定され得、ここでデータは先ず割合（ｍ／ｚ）をスキャンすることにより、４重線（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｏ）（ＥＳ−ＭＳ）から得られ得、配列決定は、第１の４重線で特性決定されたプロトン化イオンを持つペプチド類を選択することにより、第２の４重線（ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて行われ得、次いで衝突誘導解離（ＣＩＤ）により断片化が行われ得ることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
質量分析計（ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ）が、陽イオン化モードで作動し、データ収集用ソフトウェアを用い、エレクトロスプレーイオンソースを備えていることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
配列決定が、質量分析計（ＬＣ−ＥＳＭＳ／ＭＳ）に結合されたＨＰＬＣシステムにより行われ得ることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
たんぱく質のアミノ末端が、エドマン分解法により配列決定され得るか、またはアミノ酸組成分析から推定され得ることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
１次配列が、質量分析法により決定され得、ここでデータは先ず割合（ｍ／ｚ）をスキャンすることにより、４重線（ＥＳ−ＭＳ）から得られ得、配列決定は、第１の４重線で特性決定されたプロトン化イオンを持つペプチド類を選択することにより、第２の４重線（ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて行われ得、次いで衝突誘導解離（ＣＩＤ）により断片化が行われ得ることを特徴とする、天然ＥＯＰＡのアミノ酸配列。
【請求項４４】
純粋な天然ＥＯＰＡに相応するＨＰＬＣピークが、約４０ｋＤの単一バンドを示すことを特徴とする、天然ＥＯＰＡを含む分画。
【請求項４５】
多クローン性抗−ＥＯＰＡ抗体類の生成方法であって、その抗体は特にマウスで生成された抗−ヒトＥＯＰＡ多クローン性抗体類であり、
（ａ）動物の脳に由来した精製された天然ＥＯＰＡで免疫化することにより、または細菌で生成される活性組み換えたんぱく質を用いることにより、多クローン性抗体類を生成し；
（ｂ）７〜８週齢の、体重１８〜２２ｇのＢａｌｂ−ＣまたはＨｉｇｈＩＩＩマウスを免疫化し；
（ｃ）４回の免疫化それぞれにおいて、水酸化アルミニウム、［Ａｌ（ＯＨ）３］または不完全フロインドアジュバント上に吸収された形態の、精製されたたんぱく質２μｇまたは組み換えたんぱく質３μｇを毎週または毎月の間隔で皮内注射し；
（ｄ）最後の免疫化が終わってから１週間または１ヶ月後、血液サンプルを収集し、血精は−２０℃で保存され得；
（ｅ）適切な抗原を用い、抗血精の力価をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより評価し；
（ｅ）基質として天然ペプチドブラジキニンまたは蛍光基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐを用い（その分割はＨＰＬＣおよび／または蛍光定量法によりモニターされる）抗−ＥＯＰＡ抗血清を評価し、抗−血清の、ＥＯＰＡペプチダーゼ活性遮断能力を検証することからなる方法。
【請求項４６】
ＥＯＰＡに対する多クローン性抗体の生成が、マウスで生成された抗−ヒトＥＯＰＡに対し特異的であることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
請求項４５および４６記載の方法により得られることを特徴とする抗−ＥＯＰＡ多クローン性抗体。
【請求項４８】
天然ペプチドおよび／または合成蛍光基質類を用いる反応速度分析が行われることを特徴とする、ＥＯＰＡの生化学的特性およびたんぱく分解特性の決定方法。
【請求項４９】
天然および組み換えたんぱく質の両方が、正確に同じ酵素的および生化学的特性を示すことを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＥＯＰＡが、チオルにより活性化され、ＥＯＰＡに不感性で、約４０ｋＤａの分子量を示し、７０ｋＤａより高い分子量の複合体類を生成する他のサイトゾルたんぱく質類と結合された状態で見られる、エンドペプチダーゼであることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
天然ＥＯＰＡおよび各々の組み換えたんぱく質が、７〜１３アミノ酸残基のペプチド類を選択的に加水分解することができ、両方とも５．２２〜５．５０の等電点を有することを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
天然および組み換えたんぱく質の両方が、ブラジキニンのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６ボンドおよびニューロテンシンのＡｒｇ８−Ａｒｇ９ボンドを特異的に加水分解し、それらの配列にエンケファリン類を含む幾つかのオピオイドペプチド類から［Ｍｅｔ５］−または［Ｌｅｕ５］−エンケファリン類を放出することを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
ＥＯＰＡの基質類が、幾つかの神経ペプチド類又はこれらの誘導体類であり、分割可能なペプチドボンドを予測するために基質と酵素との相互作用のサブサイトを決定することはできないということを示し、ＥＯＰＡのたんぱく分解作用のための基質の大きさと立体配置との厳密な関連性が証明されることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５４】
ＥＯＰＡが、還元剤ジチオトレイトル（ＤＴＴ）により活性化され、かつチオル化合物類のようなシステイニルプロテアーゼの古典的阻害薬により阻害されるため、チオル−依存的酵素である、ＥＯＰＡ阻害薬類の同定方法。
【請求項５５】
チオル化合物類がｐ−クロローメルクリ案臭香酸塩（ＰＣＭＢ）および５’−ジチオービス−（２−ニトロ案息香酸塩）（ＤＴＮＢ）であることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
チオル−反応性基［Ｎｐｙｓ］（Ｓ−（３−ニトロ−２−ピリジン−スルフェニル）で標識された、ジノルフィンの誘導体類のような、この酵素基質の模倣化合物を用いて、部位特異的阻害薬と非可逆的に反応する、触媒部位に近接した重要なシステイン残基の存在を同定することを特徴とする請求項５４および５５記載の方法。
【請求項５７】
酵素の反応性ＳＨ基が、部位特異的阻害薬に存在するチオル反応性基［Ｎｐｙｓ］（Ｓ−（３−ニトロ−２−ピリジン−スルフェニル）と非可逆的に反応することは、この酵素がシステイニルプロテアーゼであることを示唆することを特徴とする請求項５４および５５記載の方法。
【請求項５８】
ＥＯＰＡが、ＥＤＴＡに不感性で、かつチオルにより活性化されたエンドオリゴペプチダーゼであることを特徴とする請求項５４および５５記載の方法。
【請求項５９】
ＥＯＰＡが、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）に特異的なｃＦＰから合成された誘導体である、ＪＡ２（Ｎ−［１（Ｒ，Ｓ）−カルボキシ−３−フェニルプロピル］−Ａ−α−アミノ酪酸-Ｙ−ｐ−アミノ案臭香酸塩）およびｃＦＰ（Ｎ−［１（Ｒ，Ｓ）−カルボキシ−３−フェニルプロピル］のような金属プロテア−ゼ阻害薬類により阻害されることを特徴とする請求項５４および５５記載の方法。 
【請求項６０】
両方の化合物（ＪＡ２およびｃＦＰ）がまた、類似のＫｉ（〜１７ｎＭ）をもって、ＥＯＰＡの触媒活性を阻害することを特徴とする請求項５４および５５記載の方法。
【請求項６１】
請求項４８記載の方法に基づき行われることを特徴とする請求項５４から６０に記載の方法。
【請求項６２】
チオルにより活性化され、かつＥＤＴＡに不感性で、約４０ｋＤａの分子量を示し、７０ｋＤａより高い分子量の複合体類を生成する他のサイトゾルたんぱく質類と結合された形態で見られる、エンドペプチダーゼであること特徴とする組み換えたんぱく質。
【請求項６３】
７〜１３アミノ酸残基のペプチド類を選択的に加水分解することができ、それらの両方が５．２２〜５．５０の等電点を有することを特徴とする請求項６２記載のたんぱく質。
【請求項６４】
ブラジキニンのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６ボンドおよびニューロテンシンのＡｒｇ８−Ａｒｇ９ボンドを特異的に加水分解し、また配列中にエンケファリン類を含む幾つかのオピオイドペプチド類から［Ｍｅｔ５］−または［Ｌｅｕ５］−エンケファリン類を放出することを特徴とする請求項６２および６３記載の方法。
【請求項６５】
還元剤ジチオトレイトル（ＤＴＴ）により活性化され、かつチオル化合物類のようなシステイニルプロテアーゼの古典的阻害薬により阻害されるため、チオル−依存的酵素であることを特徴とする請求項６２から６４記載のたんぱく質。
【請求項６６】
触媒部位に近接した重要なシステイン残基を示すことを特徴とする請求項６２から６５記載のたんぱく質。
【請求項６７】
抗−ＥＯＰＡ抗体類が、ＥＯＰＡ触媒活性の特異的な阻害薬類（他のペプチダーゼ類、とりわけＴＯＰおよびＮＬを阻害しない）であり、オリゴペプチド類およびたんぱく質類との相互作用過程を妨げる、ＥＯＰＡに対する多クローン性抗体類の使用方法。
【請求項６８】
請求項４５記載の、マウスで生成された抗−ヒトＥＯＰＡ抗体を用いることを特徴とする請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
特異的たんぱく分解活性、免疫組織化学、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションおよび／またはノーザンブロットを定量することによりＥＯＰＡの分布を決定し得る、ＥＯＰＡに対する多クローン性抗体の使用方法。
【請求項７０】
請求項４５記載の、マウスで生成された抗−ヒトＥＯＰＡ抗体を用いることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
特異的たんぱく質活性を定量することにより分析される複数の組織のうち、腎臓サイトゾルがＥＯＰＡの最低のオリゴペプチダーゼ活性を示す一方；チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）が、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐが用いられる際に、その組織の総オリゴペプチダーゼ活性の６０％を担当することを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
分析される組織類が、脳、精巣、心臓、骨髄、肝臓、肺、骨格筋および腎臓であることを特徴とする請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
ＥＯＰＡおよびＴＯＰ（チメットオリゴペプチダーゼ）活性が、脳と腎臓を除いて、通常、分析される組織のサイトゾル中に均質に分布されていることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
ＥＯＰＡが、レット脳のサイトゾルに優先的に分布し、総オリゴペプチダーゼ活性の６０％を占めることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）活性が、レット脳のサイトゾルで検出されないことを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
ＥＯＰＡを除いて、このサイトゾルの活性の２０％が、ＮＬの活性に起因し、その他の２０％が、基質を加水分解する、他の非同定サイトゾル酵素類の作用に起因することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
ＥＯＰＡの分布がまた、“インサイチュ”ハイブリダイゼーション分析により決定され、ＥＯＰＡが脳でより強く発現されることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７８】
ＥＯＰＡの発現が、脳でより強く、従って皮質、海馬、小脳およびマイルネト（Ｍｅｙｎｅｒｔ）の基底核の複数の層でより高い発現レベルを示すことを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７９】
組織および細胞分布に関する免疫組織学的研究で、オピオイドペプチド類およびそれらの前駆体とＥＯＰＡとの共存が、中枢神経系で、［Ｌｅｕ５］−エンケファリンが豊かな脊椎動物の網膜の神経細胞の軸索および細胞体で同定されることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項８０】
ＥＯＰＡが、他のペプチドメッセンジャー代謝酵素類と類似した形態で、細胞外空間へ分泌されることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項８１】
新生児レット類または胚芽類の脳薄片を用いる“インサイチュ”ハイブリダイゼーション研究で、約５日から１０日で、主に新生児胚芽の皮質でＥＯＰＡをコードするメッセンジャーＲＮＡの転写レベルの増加が表れることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項８２】
ＥＯＰＡが、胚発生時に中枢神経系の形成過程で重大な役割を果たすことを特徴とする、中枢神経系の先天性、感染性および退行性疾病の同定方法。
【請求項８３】
同定されたＥＯＰＡが、“高次コイル”ドメインの高度に進化された保存を示し、ヒト、ウサギ、マウスおよびレットのような別個の動物で発現されることを特徴とする請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
同定されたＥＯＰＡが、異なる複数の動物で発現され、またＮｕｄｅ−ＬまたはＮｕｄｅ２として命名されることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
ＥＯＰＡの“高次コイル”ドメインが、らせん構造を表し、核および神経細胞の移動に係り、並びに胚発生時に起こる細胞移動過程で重要な機能を果たすことを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
ＥＯＰＡに相同で、レットから単離されたたんぱく質（Ｎｕｄｅ２，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＮＭ＿１３３３２０）、およびＥＯＰＡに相同で、マウスから単離されたたんぱく質（Ｎｕｄｅ−Ｌ，ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＡＦ３２３９１８）がまた、ヒト、ウサギおよびレットＥＯＰＡの特異的阻害薬によりたんぱく分解活性を遮断する以外に、ＥＯＰＡの特性を決定するために用いられる基質に対しオリゴペプチダーゼ活性を示すことを特徴とする請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
培養細胞類でＥＯＰＡの役割および分布の決定方法であって、細胞培養物でＥＯＰＡの役割の検出および決定が分析により行われ、この分析は、レチノイン酸で処理した後８日目に、軸索突起が形成される際に、分化細胞および肺性小体でＥＯＰＡのメッセンジャーＲＮＡの発現増加を同定し、かつ分化プロセスのトリガーリングの調節因子を同定するために、かつ“インビトロ”分化のモデルとして、マウスの胚性癌腫に由来した全能性ｐ１９細胞を用いることを特徴とする方法。
【請求項８８】
ＥＯＰＡ発現が、神経細胞の分化プロセスでたんぱく質および遺伝子レベルで調節され得ることを特徴とする請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
ＥＯＰＡたんぱく分解活性が、レット腫瘍（移植可能なレットクロム親和性細胞腫）に由来したＰＣ１２細胞類のサイトゾルで主に見られ、そのオリゴペプチダーゼ活性が、ＦＧＦまたはレチノイン酸のような化合物類で処理することによりおよび／またはｃＡＭＰにより調節されることを特徴とする請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
Ｐ１２細胞をＦＧＦで処理すると、これらの細胞は神経細胞の表現型へ分化し、軸索のアウットグロースの形成および核周囲（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅｕｓ）のサイトゾルから軸索突起端へＥＯＰＡ局在部の移動が表れ、それは細胞間接続部形成および細胞伸長プロセスにおけるＥＯＰＡの役割を示唆することを特徴とする請求項８７記載の方法。
【請求項９１】
ＭＨＣＩと結合されているエピトップ類の大きさが、ＥＯＰＡに結合しやすい阻害薬類／ペプチド基質類に必要とされる大きさ（例えば、７〜１３アミノ酸残基）と類似していることを特徴とする、免疫学的プロセスでＥＯＰＡの役割の決定方法。
【請求項９２】
エピトップ類が、この酵素の競合的阻害薬類および／またはＥＯＰＡと他の細胞性たんぱく質との結合を調節するリガンド類として行動し；ＥＯＰＡがまた免疫系の細胞、とりわけ大食細胞類およびリンパ球類で見られるため、ＥＯＰＡに親和性を示す、オピオイドペプチド類および他の生理活性ペプチド類が中枢神経系および免疫系で同様に作用し得ることを特徴とする請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
神経組織でＭＨＣＩの発現が、感染性および退行性プロセス、および中枢神経系の可塑性に係り；ペプチダーゼおよびシャペロン活性の制御またはＥＯＰＡのペプチド受容性活性の制御が、直接にＥＯＰＡの特異的リガンド類（基質類、阻害薬類および調節物質類）に係ることを特徴とする請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
中枢神経系（ＣＮＳ）の先天性、感染性および退行性疾病の診断、予防または治療法の開発方法であって、それらの病状の予防および治療のための診断方法でＥＯＰＡまたはその断片類の配列を用いる方法。
【請求項９５】
請求項６１記載のＥＯＰＡの同定法に基づく、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
神経学的、精神医学的、および行動病状の治療、および組織退行のプロセスのための阻害薬類、競合物質類およびそれらの誘導体類の使用方法であって、これらの疾病の予防および治療でＥＯＰＡの特異的リガンド類が用いられることを特徴とする方法。
【請求項９７】
請求項５４および５５記載の阻害薬類の同定法に基づく、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
神経学的、精神医学的、および行動病状の治療、および組織退行のプロセスのための阻害薬類、競合物質類およびそれらの誘導体類の使用方法であって、ＥＯＰＡのたんぱく分解、シャペロンおよび／または溶解性受容体活性を妨げる、阻害薬類、抗体類および競合物質類化合物が、それらの疾病の診断、予防および治療に用いられ得ることを特徴とする方法。
【請求項９９】
請求項５４および５５記載の阻害薬類の同定方法、および請求項９４記載の先天性、感染性および退行性疾病の診断、予防または治療法の開発方法に基づく、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
神経学的疾病の治療、および組織退行プロセスのための阻害薬類、競合物質類およびそれらの誘導体類の使用方法であって、ＥＯＰＡ阻害薬類の開発が、一般の化合物類または天然毒素類に基づく構造モデルを用いて行われ得ることを特徴とする方法。
【請求項１０１】
動物毒素で特異的に見られることを特徴とする請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
請求項５４および５５記載のＥＯＰＡ阻害薬類の同定方法、および請求項９４記載の先天性、感染性および退行性疾病の診断、予防または治療法の開発方法に基づく、請求項１００および１０１記載の方法。
【請求項１０３】
神経学的疾病の治療、および組織退行のプロセスのための阻害薬類、競合物質類およびそれらの誘導体類の使用方法であって、これらの化合物が、これらの疾病の診断、予防および／または治療に用いられる以外に、ＥＯＰＡによる神経ペプチド類の不活性化または生体内変化のプロセスを妨げる薬物類または製剤類中に用いられ得ることを特徴とする方法。
【請求項１０４】
請求項５４および５５記載の阻害薬類の同定方法、および請求項９４記載の先天性、感染性および退行性疾病の診断、予防または治療法の開発方法に基づく、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
神経学的疾病の治療、および組織退行のプロセスのための阻害薬類、競合物質類およびそれらの誘導体類の使用方法であって、ＥＯＰＡ活性部位から他のペプチド類を転座させるペプチド阻害薬類が用いられることを特徴とする方法。
【請求項１０６】
請求項５４および５５記載の阻害薬類の同定方法、および請求項９４記載の先天性、感染性および退行性疾病の診断、予防または治療法の開発方法に基づく、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
神経学的疾病の治療、および組織退行のプロセスのための阻害薬類、競合物質類およびそれらの誘導体類の使用方法であって、リンフォプロリフェレーション（ｌｉｎｆｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のプロセス、またはＭＨＣＩが中枢神経系の感染性、退行性および可塑性などに関与し得る任意の他の役割を妨げる阻害薬類を用いることにより、ＥＯＰＡのたんぱく分解／シャペロン活性を調節することが可能であることを特徴とする方法。
【請求項１０８】
請求項５４および５５記載の阻害薬類の同定方法、および請求項９４記載の先天性、感染性および退行性疾病の診断、予防または治療法の開発方法に基づく、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
中枢神経系の先天性、感染性および退行性疾病の診断および／または治療のための、その病状の進行を予防およびモニターするための、免疫化学的および／または酵素的診断方法であって、ＥＯＰＡのたんぱく分解活性およびＥＯＰＡの他の分子特性との相互作用が、阻害薬類および／または基質類により、または免疫グロブリン類を含めて、ＥＯＰＡに結合する他の分子類により調節されることを特徴とする方法。
【請求項１１０】
ＥＯＰＡのペプチダーゼ活性が、天然および合成ペプチド基質類を用いる反応速度分析により決定され得ることを特徴とする、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
神経学的、精神医学的および神経退行性病状の治療方法であって、ＥＯＰＡが核および神経細胞の移動プロセスおよび胚発生時に起こる中枢神経系の形成に係ることを特徴とする方法。
【請求項１１２】
免疫組織化学によるＥＯＰＡの組織および細胞での分布が、中枢神経系で、より詳しくは神経細胞の軸索および細胞体で、ＥＯＰＡとオピオイドペプチド類およびそれらの前駆体類との共存を示すことを特徴とす請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
ＥＯＰＡ分布が、“インサイチュ”ハイブリダイゼーション分析により決定され、従って脳でＥＯＰＡのより高い発現が見られることを特徴とする請求項１１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト組み換えエンドオリゴペプチダーゼＡ（ｅｎｄｏｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａ；ｈＥＯＰＡ）、ｈＥＯＰＡをコードするポリヌクレオチド（原核生物類および、ヒトを含む真核生物類でｈＥＯＰＡを発現させる。）；ｈＥＯＰＡのたんぱく分解活性を決定するための、またはペプチド類“溶解性受容体”としてまたはシャペロンとしての活性を評価するための、合成基質類の使用；多たんぱく質（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ）複合体類の形成および他のたんぱく質との相互作用に影響を与えられる、作用物質類、競合物質類および拮抗物質類として作用できるオリゴペプチド−リガンド活性の特異的抗体および阻害薬の使用およびその製造方法に関する。本発明はまた、中枢神経系の先天性、感染性および退行性病状における診断および／または使用、および精神医学的障害、認知障害、および行動機能障害に対し、天然、組み換え、化学的修飾または遺伝子組み換え形態の、そのたんぱく質の使用にも関する。本発明はまた、神経学的病状および組織の退行変性の治療のために抗体類およびそれらの誘導体類を含む、ＥＯＰＡに対するリガンドの相互作用の阻害薬類および競合物質類の使用を提案する。
【０００２】
より詳しくは、本発明は中枢神経系（ＣＮＳ）で発現されるたんぱく質に関する。本発明によれば、そのたんぱく質は、ペプチド類基質に対したんぱく分解活性を呈し、それらと、オリゴペプチド類および／または細胞内たんぱく質類との相互作用を可能にするたんぱく質の構造を示し、神経細胞移動、神経突起生成、介在ニューロン性情報伝達(例えば、シナプス形成のための情報伝達)、抗原提示および生体内変化および／または生理活性ペプチドの保護(シャペロン活性)または生理活性ペプチド類の調節たんぱく質相互作用（“溶解性受容体”活性）のような重要な生理学的作用を決めることができる。
【０００３】
本発明の目的を達成するために、このようなたんぱく質をコードするメッセンジャーＲＮＡの１次構造、およびヒトＥＯＰＡのたんぱく質配列の１次構造を決定する特定の方法を提案する。
【０００４】
同様に、本発明はＥＯＰＡ遺伝子の１次構造、並びにその転写および発現を制御する調節因子の１次構造を決定する方法を提供する。
【０００５】
さらに、ＥＯＰＡの主な特異性は、基質加水分解(たんぱく分解活性)および活性中心でペプチド類との相互作用(シャペロンまたは“溶解性受容体”−様活性)に係り、活性複合体類の形成に影響を与え、中枢神経系の細胞性プロセスで作用することができ、活性生成物の製造を可能とするということが明らかになった。それはまた、合成または天然特異的阻害薬類の生成および／または使用(それは試験管内、生体外、または生体内で用いられる。)に関連し、ＥＯＰＡの生理学的または病理学的役割に影響を与える。
【０００６】
本発明の更なる目的は、ＥＯＰＡの触媒活性を阻害し、かつ組織および生物学的体液でＥＯＰＡを特異的に認識することができる特異的抗体を作製することにある。
【０００７】
本発明の更なる別の目的は、ＥＯＰＡをコードするポリヌクレオチド、各々の組み換えたんぱく質、またはそれに対して生成された抗体を用い、ヒトおよび動物の別個の組織、器官および体液でこのたんぱく質の分布様式を決定することにある。
【０００８】
他の目的として、本発明は、腫瘍組織または細胞で；全能性細胞(幹細胞)および神経細胞で、分化過程、軸索の形成過程、またはシナプス性結合の形成過程で；および（特に、神経組織および平滑筋の）退行性病理学的過程またはそれの修復過程で、このたんぱく質の発現および分泌を決定する方法を提供する。
【０００９】
本発明による幾つかの目的は後述する分化過程により得られ、また特性決定された。
【背景技術】
【００１０】
ヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）から購入したヒト脳皮質ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ウサギＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ配列に由来した放射活性標識プローブを用いるハイブリダイゼーションにより前記単離されたｃＤＮＡをスクリーニングした後、同定し、そのｃＤＮＡおよびそれに相応するたんぱく質をＧｅｎｂａｎｋデータバンクへそれぞれＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０１５０３７およびＡＡＢ９９９０５として寄託した。本発明者らによる文献（Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）参照。
【発明の開示】
【００１１】
ヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡのクローニングおよびその推定アミノ酸配列の分析
長さ約２．２ｋｂの前記ｃＤＮＡの配列が完全に決定され、そのｃＤＮＡおよびたんぱく質の配列はＧｅｎｂａｎｋへそれぞれＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２１７７９８およびＡＡＦ２４５１６として寄託された。
【００１２】
哺乳動物のＥＯＰＡおよびそれに相応するたんぱく質配列をコードするメッセンジャーＲＮＡの１次構造を決定するために、
（ａ）グアニジンイソチオシアニド−フェノール−クロロフォルム抽出法を用いるか、または商品名Ｔｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、幾つかの動物組織から総ＲＮＡを単離し；
（ｂ）予め充填されたオリゴーｄＴセルロースカラムまたはサスペンション中の樹脂を用い、総ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを精製し；
（ｃ）変性アガロースゲル（１〜２．５％のホルムアルデヒドを含む。）中で電気泳動により、前記メッセンジャーＲＮＡの質を分析し、エチジウムブロマイド、または“Ｓｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のような他の核酸色素で染色し、フォトドキュメンテーション（ｐｈｏｔｏｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）し、特定のプローブ(ノーザンブラット)とのハイブリッダイゼーション後分析を行い；
（ｄ）メッセンジャーＲＮＡを逆転写させ、それに相応する二本鎖ｃＤＮＡ（これはプラスミドベクター、コスミドまたはファージベクターヘクローニングされ、“インビトロ”増幅される。）を生成させ；
（ｅ）ＥＯＰＡ特異的活性の検出により、または特異的抗−ＥＯＰＡ抗体を用いる、ハイブリダイゼーション、免疫選択により、ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ挿入断片を同定および選択し；
（ｆ）ＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”）により、または細菌内でこのｃＤＮＡを含むベクターを増幅させることにより、そのｃＤＮＡ挿入断片を増幅および単離させ、次いでベクターからこのｃＤＮＡを放出させる制限酵素で消化させ；
（ｇ）または、メッセンジャーまたは総ＲＮＡおよび特異的オリゴヌクレオチド類を用いる、直接ＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ−逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）により、選択されたｃＤＮＡを増幅させ；
（ｈ）そのｃＤＮＡが完全に配列決定され、特異的ソフトウェアおよびデータバンクを用いる相同性分析を含め、１次および２次構造を分析し、各々の推定アミノ酸配列を決定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
組み換えＥＯＰＡの発現
組み換えＥＯＰＡは、例えば培養物中の真核細胞、細菌、イースト、バキュロウイルスなどのような非相同的系を用いて発現され得る。細菌内での組み換えＥＯＰＡの生成は、ベクターの転写開示信号（開示メチオニンを含む。）が用いられるように、ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡをインフレームで（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）発現ベクター(例えば、ｐＰｒｏＥｘ−ＨＴｃ)内へサブクローンした後行われた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、電気泳動または“熱ショック”処理を行うことによって、その構造体により形質移入または形質転換され、かつ各々の組み換えたんぱく質の発現はＩＰＴＧ(イソプロピル−チオ−ガラクトシダーゼ)の添加により誘導された。発現されたたんぱく質は、アンカーたんぱく質またはポリーヒスチジン配列標識(標的たんぱく質の同定および精製プロセスを助ける。)を有する、組み変えまたは融合たんぱく質として生成された。
【００１４】
前記のように得られた組み換えたんぱく質は、脳に存在する天然たんぱく質で見られるものと等しい生化学的および免疫学的特徴を示した。
【００１５】
組み換えＥＯＰＡ(特に、細菌内での)の生成は、
（ａ）アンカーたんぱく質またはオリゴペプチド配列標識を有する融合たんぱく質として、または組み換え分子としてＥＯＰＡが生成されるように、ＥＯＰＡをコードする、単離されたｃＤＮＡをプラスミド発現ベクター内へインフレームでクローンし；
（ｂ）組み換えまたは融合たんぱく質を生成するために、発現ベクター内にインフレームでクローンされたＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ挿入断片を含む、前記プラスミドベクター構造体で宿主細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）など）を形質転換させ（ここで、形質転換は、これらの方法に対しそれぞれ適切なプロトコールを用い、前もって用意された細菌の熱ショック処理または電気泳動処理により行われ得る。）；
（ｃ）前記形質転換された細菌を、５６０〜６００ｎｍ（波長）での吸光度値が約０．６になるまでに、適切な培地（通常、選沢用の適切な抗生物質を含むＬＢ培地を用いる。）中の生育により増幅させ(その際に、標的たんぱく質の生成は、発現誘導化合物、例えばＩＰＴＧ(イソプロピル−チオガラクトシダーゼ)を、最終濃度０．５〜１ｍＭになるまで添加し、振盪機内で３０〜３７℃でインキュベートすることによって誘導される。)；
（ｅ）たんぱく質が融合たんぱく質として得られる場合に、ポリヒスチジン融合物に対し固定ニッケル、またはＧＳＴ（グルタチオンーＳ−転移酵素）との融合物に対しグルタチオン−セファロース樹脂を含む、アフィニティーカラムを用い、他の可溶性細菌たんぱく質（不純物）から前記たんぱく質を分離し；次いで特異的なプロテアーゼ(例えば、トロンビン、因子Ｘ，エンテロキナーゼなど)との消化（その消化部位は、アンカーたんぱく質と選択される組み換えたんぱく質との間に導入される。）を介してアンカーたんぱく質またはポリペプチドを除去し、組み換えたんぱく質を得；
（ｆ）ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）での電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法、および天然および合成ペプチド基質を用いて、酵素反応速度により特異活性を決定する方法により、組み換えたんぱく質の純度および質を評価することからなる。
【００１６】
ヒトＥＯＰＡの遺伝子配列の決定
ＥＯＰＡをコードするヒト遺伝子の全配列は、公開されているデータベースに完全にアクセス可能なヒトゲノムの配列分析により決定された。ＥＯＰＡ遺伝子は９エキソンおよび１０イントロンからなり、約４０ｋｂの長さを有する。この遺伝子は、ｐ５３遺伝子（約０．７ｃＭにより単離される。）の位置に比較的に近接したクロモソーム１７ｐ１２．９に位置し、かつ遺伝子ＬＩＳ１が位置したクロモソーム１７（１７ｐ１３．３）と同じアーム（ａｒｍ）上に位置する。ＥＯＰＡ遺伝子の上流領域(プロモーターを含む。)で、幾つかの転写調節因子の結合部位、例えばＡＰ１，ｃＭｙｂ，ＳＰ１，ｎＭｙｃ，ｃＭｙｃなどが見られた。
【００１７】
ＥＯＰＡをコードする遺伝子のプロモーター領域の分析
ウサギＥＯＰＡをコードする遺伝子のプロモーター領域を分析して、この酵素の発現を調節する幾つかの主転写因子を同定した。得られた構造物に対し測定されたルシフェラーゼ活性に基づき、位置−７２５〜位置−６４８の領域は、グリオーマ(Ｃ６細胞株)でＥＯＰＡの発現を強く抑制する転写因子により認識される（原型がん遺伝子ｃ−ｍｙｂの生成物により認識され得る）一つ以上の部位を有する。Ｔｈｉｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８参照。さらに、この研究は、ヒトＥＯＰＡ遺伝子がその上流領域、即ち位置−９８０〜位置−３１０でこの遺伝子を陽性的に調節する認識部位を有しているのを示す。Ｃ６細胞株だけを用いて実施した本研究の以外に、得られた結果は、ヒトおよびウサギの両方のＥＯＰＡ遺伝子は、上流領域に対し低い類似性を示すにもかかわらず、グリオーマ（ここで、酵素触媒活性測定結果、低いＥＯＰＡ様ペプチダーゼ活性が観察された。）で陰性的に調節されることが分かった。一方、分析されたＥＯＰＡ遺伝子のプロモーター領域の断片は、研究の対象になった細胞株、例えばＣ６細胞でこの遺伝子発現の活性化因子として作用する転写因子に対する認識部位を含んでいるように思われる。
【００１８】
ｍｙｂ遺伝子部類は細胞の増殖および分化にかかわる遺伝子の転写を調節するがん遺伝子類として記載されている。Ｎｅｓｓ（１９９９）参照。この部類は三つの別個の遺伝子、即ちＡ−ｍｙｂ，Ｂ−ｍｙｂおよびｃ−ｍｙｂからなる。Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９参照。ｃ−ｍｙｂの良く知られている特性のうち、それが、骨髄性細胞および赤血球細胞の分化を阻害し、従って遮断された未熟細胞の連続的な分化を可能とする生存因子（ｓｕｒｖｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）であることは注目すべきである。Ｗｅｓｔｏｎ，  １９９８参照。数多くのグループは、ｃ−ｍｙｂ遺伝子と、幾つかの腫瘍細胞株との関係、および神経細胞の正常的な作用との関係を提案してきた。Ｗｅｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０およびＧｏｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７参照。しかしながら、ｃ−ｍｙｂ遺伝子の生理学的な作用はまだ解明されていない。
【００１９】
抗−触媒活性を持つ抗−ＥＯＰＡ抗体の生成および類似の作用を持つたんぱく質を識別する能力
免疫化のために、細菌、とりわけ大腸菌で発現された活性の組み換えＥＯＰＡ、または精製された天然ＥＯＰＡを用い、レット、マウスおよびウサギで多クローン性抗体を生成させた。７〜８週齢の、体重１８〜２２ｇのオスのＢａｌｂ−Ｃマウスを、精製された天然ヒトＥＯＰＡ、または触媒活性の組み換え酵素で免疫化した。４回の免疫化それぞれにおいて、水酸化アルミニウム、［Ａｌ（ＯＨ）３］上に吸収された形態の、精製されたたんぱく質２μｇまたは組み換えたんぱく質３μｇを毎週皮内へ注射した。最後の免疫化が終わってから１週間後、血液サンプルを収集し、血精を−２０℃で保存した。適切な抗原を用い抗血精力価をＥＬＩＳＡにより評価した。得られた血清の抗−触媒活性は、消光蛍光（ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ペプチド類基質を用いてＨＰＬＣまたは蛍光分析法により評価した。抗血清は、使用する前に、混入されている任意のペプチダーゼ活性を除去するために、５５℃で５分間予熱した。抗体の使用を標準化するテストの結果から、抗−ＥＯＰＡ抗体を組み換えＥＯＰＡと共に３７℃で３０分間インキュベートすると最大阻害効率に達し、かつ他の組織オリゴペプチダーゼ、例えばチメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）および神経溶解素（ＮＬ）とのインキュウベートの際はいかなる阻害活性も示さなかったため、この阻害は特異的であることが分かった。この抗体を用いると、また動物および細胞株に存在している、機能的には類似しているが相同ではない酵素類（例えば、ＴＯＰおよびＮＬ）からＥＯＰＡの活性を識別することができた。
【００２０】
ＥＯＰＡの生化学的特徴およびたんぱく分解特性
９〜１３アミノ酸残基からなる、ブラジキニン、ニューロテンシンおよびオピオイドペプチド類のような天然ペプチド基質類を用いる反応速度分析は、我々の研究室でＥＯＰＡを発見および特性決定するのに欠くことのできないものであった。論文（Ｃａｍｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）の抄録参照。１９９０年以後、我々は、この酵素の特性を標準化し、費用を単純化しかつ減少させ、もっと信頼できるＥＯＰＡの反応速度特性を明かすために、消光蛍光（ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を有する天然基質に由来したペプチド基質類の開発に取り組んできた。Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０参照。用いられた、消光蛍光（ｑｆ）を持つこのペプチド基質類は、ペプチドのアミノ末端にラジカルＡｂｚ（オルト−アミノ安息香酸）を、ペプチドのカルボキシル末端にＥＤＤｎｐ、[Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）エチレンジアミン]を有する。これらのペプチド類のアミノ酸残基は次のような一文字の略語として示される。
Ｇ−グリシン                      Ｎ−アスパラギン
Ａ−アラニン                      Ｑ−グルタミン
Ｐ−プロリン                      Ｄ−アスパラギン酸
Ｖ−バリン                        Ｅ−グルタミン酸
Ｉ−イソロイシン                  Ｋ−リシン
Ｌ−ロイシン                      Ｒ−アルギニン
Ｓ−セリン                        Ｆ−フェニルアラニン
Ｔ−トレオニン                    Ｈ−ヒスチジン
Ｗ−トリプトファン                Ｙ−チロシン
【００２１】
現在、ＥＯＰＡ活性を決定するために選択されるペプチドはＡｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐである。このような天然ＥＯＰＡの特性決定方法を組み換え酵素に適用し、天然ＥＯＰＡにより得られた結果を完璧に再現した。Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００参照。この酵素分析法は、消光蛍光（これは、ＥＯＰＡ、ＴＯＰおよびＮＬのような幾つかの組織オリゴペプチダーゼの特性を決定するのに用いられる。）を持つ、幾つかのペプチド基質類をテストするのに幅広く使用されてきた。Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１参照。
【００２２】
天然たんぱく質およびその組み換え形態は７〜１３アミノ酸残基のペプチド類を選択的に加水分解し、それらの等電点は５．２２〜５．５５である。ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｄｅｉｒｏｓ，１９９２参照。この酵素はブラジキニンのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６ボンドを特異的に加水分解し（Ｃａｍｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）、そして神経溶解素のＡｒｇ８−Ａｒｇ９ボンドを特異的に加水分解し（Ｃａｍｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、配列中にエンケファリンを含む、幾つかのオピオイドペプチド類から［Ｍｅｔ５］−または［Ｌｅｕ５］−エンケファリンを放出する。（Ｃａｍａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；１９８７）参照。よって、これらの生理活性ペプチド類が生体内変化に関与する可能性が示唆される。
【００２３】
ＥＯＰＡは、チオルにより活性化され、ＥＤＴＡに不感性の、約４０ｋＤａの分子量を示すエンドペプチダーゼであり、他のサイトゾルたんぱく質と結合し、より大きい分子量を持つ複合体を生成することができる。この最後の特性は、動物組織のサイトゾル、とりわけレット脳のサイトゾルに対し、分子量が知られている標準物質を用い目盛りを決めたＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ゲルろ過させることにより検証された。流出液中に存在するたんぱく質は、抗−ＥＯＰＡ抗体を用い、酵素活性、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを測定することによってモニターされた。
【００２４】
ＥＯＰＡの阻害薬
当分野に技術によれば、反応速度分析の結果から、ＥＯＰＡは、還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）により活性化され、またシステイニルプロテアーゼの古典的阻害薬である、５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ案息香酸塩）（ＤＴＮＢ）およびｐ−クロロメルクリ案息香酸塩（ＰＣＭＢ）のようなチオル試薬により阻害されるため、チオルにより活性化される酵素であることが知られている。Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６；Ｃａｍａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  ａｎｄ  ２０００参照。後で、チオル−反応性基Ｎｐｙｓ（Ｓ−（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）で標識された酵素基質類（ダイノルフィンの誘導体類）の模倣化合物類を用いて、触媒部位に近接した、重要なシステイン残基の存在が確認された。Ｇｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈｙａｙｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照。このＥＯＰＡの重要なシステイン残基は部位特異的阻害薬と非可逆的に反応したため、この酵素がシステインプロテアーゼであるという仮説が実証された。
【００２５】
従って、ＥＯＰＡは、ＥＤＴＡに不感性で、チオル依存性を有するエンドオリゴペプチダーゼである。しかし、それは、金属プロテアーゼ、例えばＪＡ２を阻害するように特別に設計された化合物類により阻害され得るが（Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、Ｊｉｒａｃｅｋらにより合成されたホスフィン酸塩ペプチド阻害薬により阻害されない（１９９５）。このＪＡ２阻害薬は、ＴＯＰに特異的な阻害薬であるｃＦＰの構造を変更することによって得られたが、その後すぐに両方の化合物が約１７ｎＭの類似したＫｉをもって、ＥＯＰＡの活性を阻害するということが本発明者らによって証明された。
【００２６】
ＪＡ２および抗−ＥＯＰＡ抗体によるエンドオリゴペプチダーゼの阻害
【表１】
2006524983.tif 000003
*Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００
【００２７】
レット組織でのＥＯＰＡの分布
別個のレット組織および細胞でのＥＯＰＡの発現は、生化学的および免疫学的方法、また特異的触媒活性の評価／数量化、免疫組織化学、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションおよびノーダンブロット分析を意味する分子生物学的技法を用いて分析された。これらの分析を用いると、脳でのＥＯＰＡの高い発現度を検証し、皮質、海馬、小脳およびマイルネト（Ｍｅｙｎｅｒｔ）の基底核の幾つかの層で主に強いハイブリダーゼーション信号を示すことができた。よって、これらの部位で特異的なメッセンジャーＲＮＡの転写レベルがより高いということが分かった。
【００２８】
さらに、免疫組織化学による組織および細胞分布研究の結果から、中枢神経系、および既に知られているように［Ｌｅｕ５］−エンケファリンが豊かな、脊椎動物の網膜の神経細胞の軸索および細胞体でオピオイドペプチド類およびそれらの前駆体類とＥＯＰＡとの共存が証明された。Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｐａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｆｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００参照。またＥＯＰＡが、他のペプチドメッセンジャー代謝酵素のように、細胞外空間へ分泌されるという証拠が存在する。
【００２９】
たんぱく分解活性を測る分析の対象となった組織（脳、精巣、心臓、骨髄、肝臓、肺、骨格筋、および腎臓）のうち、我々は腎臓のサイトゾルが最も低いＥＯＰＡおよび神経溶解素活性レベルを示すということに注目した。一方、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）はこの組織での総活性の３２％を構成し、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐが用いられた場合に、この酵素は偏在的分布を示した。一般的に、ＥＯＰＡおよびチメットオリゴペプチダーゼの酵素活性は、脳と腎臓のサイトゾルを除いたほとんどの組織のサイトゾルで均一に分布した。
【００３０】
ＥＯＰＡは脳のサイトゾルで優先的に見られるが、それはこの組織で観察された総オリゴペプチダーゼ活性の６０％に達する。チメットオリゴペプチダーゼの活性はこのサイトゾルで検出されなかったが、このサイトゾルで観察された活性の２０％は神経溶解素に起因し、また２０％はこの基質を加水分解する他のサイトゾル酵素の活性に起因したものであった。
【００３１】
以上のように同定された特性をよりよく証明するために（本発明の目的でもある。）、前記の表は、サイトゾルのエンドオリゴペプチダーゼによる蛍光基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐの加水分解の百分率として、抗−ＥＯＰＡ抗血清の特異的活性により決定されたＥＯＰＡの分布を示している。
【００３２】
さらに、これは、図１にも、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐに対するエンドオリゴペプチダーゼの活性の百分率として示されている。
【００３３】
図２は、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションに対するＥＯＰＡ分布研究で、用いられたプローブの作製に用いられる断片が分離されるヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡの全配列を図解する。
【００３４】
サイトゾルのエンドオリゴペプチダーゼによる、蛍光基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐの加水分解の百分率
【表２】
2006524983.tif 000004
*ＴＯＰおよびＮＬの酵素活性は、ＴＯＰおよびＮＬにそれぞれ特異的なホスフィン酸塩阻害薬、Ｚ−（Ｌ，Ｄ）−Ｆ−ψ−（ＰＯ２ＣＨ２）−（Ｌ，Ｄ）−Ａ−Ｒ−ＭおよびＰ−Ｆ−ψ−（ＰＯ２ＣＨ２）−Ｌ−Ｐ−ＮＨ２によるサイトゾルペプチダーゼの阻害の百分率から推定された。Ｊｉｒａｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５参照。
【００３５】
神経細胞および黒色腫におけるＥＯＰＡの発現
多能性幹細胞から“インビトロ”神経細胞の分化は、胚発生の初期段階に関与する分子メカニズムの基本研究に対するモデルとして広く受け入れられてきた。ＥＯＰＡの機能および発現に関する研究には、“インビトロ”神経細胞の分化過程に対するモデルとして、マウスの胚性癌腫に由来したＢ１９細胞株が用いられてきた。胚盤胞の中央層に由来した胚性幹細胞は、遺伝子発現の調節を研究するのに用いられてきた。これらはまた、神経細胞退行に対する治療剤として、およびパーキンソン病の治療に用いられるドーパミン作用性移植片に対し、可能性のある候補薬物である。胚性癌腫細胞は、通常、胚の組織の新生物から得られ、培養物で容易に操作される。これらは幹細胞のように行動し、エピブラスト（ｅｐｉｂｌａｓｔ）の内層で見られる細胞と類似した遺伝子発現パターンを示し、また培養物で、典型的な内皮性、中胚葉性または外胚葉性細胞を作り出すことができる。Ｍａｒｔｉｎ  １９８０参照。マウスの胚性癌腫に由来した全能性Ｐ１９細胞（ＭｃＢｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）は分化モデルとして、また別個の分化経路に対し非可逆的なコミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）に必要な因子を同定するための研究において用いられた。非分化Ｐ１９細胞は高い増殖速度を特徴とし、高密度の付着細胞またはサスペンション中の細胞を持つ両方の培養物は分化過程を誘導する。この過程はまた化学的因子、たとえばレチノイン酸またはＤＭＳＯによりトリガーされ得る。例えば、１０−７Ｍのレチノイン酸の存在下で、Ｐ１９細胞は神経外胚葉細胞へ分化することが知られている。（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。
【００３６】
付着を防ぐためのプロトコールで、細胞凝集体はサスペンション中に５日間維持され、次のような細胞タイプを形成した：７日目に神経細胞が現れ、１０日目に星状細胞およびグリア細胞が見られた。従って、天然での変化および化学的誘導物質の濃度での変化は、Ｐ１９細胞を、平滑筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞または星状細胞を形成させる多重の分化経路へ誘導することができる。Ｅｄｗａｒｄ  ａｎｄ  ＭｃＢｕｒｎｅｙ，１９８３参照。本発明者らにより行われた研究で、軸索突起の形成が観察される際に、レチノイン酸で処理した後約８日目に、胚性小体および神経細胞分化細胞でＥＯＰＡメッセンジャーＲＮＡの発現が増加された。この研究の目的は、ＥＯＰＡの生理学的役割と、神経細胞の分化過程で遺伝子およびたんぱく質の調節のメカニズムを明かすことにある。
【００３７】
ＰＣ１２細胞株は、神経細胞の表現型へ誘導する、神経成長因子（ＮＧＦ）に可逆的に反応し、可塑物（ｐｌａｓｔｉｃ）に対する付着性が劣るレット腫瘍（移植可能なレットクロム親和性細胞腫）に由来し、成長し小さなクラスターを形成する傾向がある。Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６参照。標準条件下で培養物中に維持されると、これらの細胞は，生物学的および形態学的特徴において、胎児副腎のクロム親和性細胞に類似する。これらは二つの方法で分化し得る：１）グルココルチコイド類に応答してクロム親和性様細胞へ、および２）ＮＧＦまたは繊維亜細胞成長因子（ＦＧＦ）のような神経栄養性因子に応答して交感神経細胞へ。さらに、これらの細胞は幾つかの生理活性ペプチド類、例えばエンケファリン類、ダイノルフィン（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）類およびニューロテンシン類を発現する。
【００３８】
これらの特徴により、この細胞株は神経ペプチド類の生体内変化に関与する酵素の研究のための実験的モデルとして適している。以前、我々は、ＥＯＰＡのたんぱく分解活性はこれらの細胞のサイトゾルに存在し、この活性はｃＡＭＰの添加に応答して調整されるが、ＦＧＦ処理には応答しないということを証明した。
【００３９】
一方、これらの細胞をＦＧＦで処理すると、神経細胞表現型へ分化させることができ、並びに軸索の伸長が観察され得る。その後、これらの細胞に存在するＥＯＰＡは神経細胞の末端へ移動するが、これは細胞伸長部の形成、または他の細胞との接続部の形成において、この酵素の潜在的な役割を示唆する。これらの細胞においてこのたんぱく質の実際の役割を明かすための努力がなされてきた。
【００４０】
ＥＯＰＡの生理学的役割を研究するための新たな生物学的モデルを考案するために、神経細胞への幹細胞の分化過程を標準化した。
【００４１】
胚性幹細胞（ＥＳ）は、 胚盤胞の内部細胞集団に由来した未分化細胞であり、かつ多能性を有するものとして知られている。Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，  １９８１；Ｍａｒｔｉｎ，１９８１参照。多能性は、生物体内で正常の発達を回復することを可能にするＥＳ細胞の注目すべき能力であり、また生殖系を含む別個の組織を生成することを可能にする。特定条件下で培養すると、幹細胞は、数回の細胞分割が起こる間に、数多くの継代を経ても、未分化形態で維持され得る。一方、これらの細胞が導入され、“インビトロ”分化プログラムを開示することができる。例えば、サスペンション中に培養される際に、幹細胞は、胚様体（移植前胚児に類似する。）と呼ばれる分化細胞の凝集体を自発的に形成する。形態学的、免疫組織学的、および分子分析を行なった結果、幾つかの、別個の胚性細胞株は胚様体、例えば造血細胞、神経細胞、内皮細胞および筋細胞で見られる。これらの幹細胞の特性は、初期胚芽発達に対する“インビトロ”モデルとしてこれらの細胞を使用する動機付けとなり、この故に、例えば次のような重要な問題に答えるための強力なツールでもある：胚発生時に神経細胞における核移動の過程でＥＯＰＡの実際の役割は何か、およびこの過程でＥＯＰＡの触媒活性の重要性は何か、および未分化細胞および神経細胞の前駆体細胞および成熟した神経細胞でＥＯＰＡはどのような細胞内分布を有するのか。
【００４２】
未分化胚性幹細胞（ＵＳＰ−１細胞株）を次のような培地で培養した：１５％ウシ胎児血清、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、１０−４Ｍのモノチオグリセロール、およびＬＩＦ（白血病阻害因子）を含むＤＭＥＭ（最終濃度１、０００ユニット／ｍｌ）。未分化幹細胞の培養物を全て、前もって照射されたマウスの繊維亜細胞（Ｎｅｏ  Ｍｅｆ２）の１次培養物上で維持させた。胚様体（ここで、７５０細胞はペトリ皿上で２０μｌの培地ドロップ中に、３７℃で4日間、５％炭素ガス下に維持された。）が形成された後に、分化が行なわれる。（この期間に、細胞は胚様体と知られている細胞凝集体を形成する。）胚様体が形成された後、細胞を、前記培地を含有し、ＬＩＦを含有しない、０．１〜０．５μＭのレチノイン酸（神経細胞分化の誘導するための試薬として用いられる。）を含む、新たな皿へ移した。次いで、この培養物を４日間分化誘導物質と共に維持させた。その時点で、上記誘導物質を除去し、細胞培養物を、０．２２％ゲラチンで予め処理した新たな皿（グラススライドを含む。）へ移し、ここで細胞を、前記したような条件下で、神経細胞用の基礎培地（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｎ）（ウシ胎児血清を低濃度で含む、神経細胞培養のための特別な培地）を用い４日間さらに培養した。神経細胞用の基礎培地で細胞を維持させることによって、神経細胞の前駆体細胞および成熟した神経細胞を選択した。幹細胞の分化が終了したら、共焦点顕微鏡を用い分化された細胞を数え、かつ撮影した。
【００４３】
神経細胞へ分化した細胞集団は、前述したプロトコールに従い得られ、これらの神経細胞の分化および成熟プロセスでＥＯＰＡ触媒活性阻害の影響を調べるために、その神経細胞を阻害薬ＪＡ２で処理した後分析を行った。神経細胞の前駆体細胞をこの阻害薬で処理すると、軸索突起の形成が阻害され、従って細胞の異常分化が誘導された。それによって特徴付けが行われた。
【００４４】
胚発生時中枢神経系の形成におけるＥＯＰＡの役割
ＥＯＰＡの非−たんぱく分解作用の今の観点は、それが“高次コイル”構造、例えば、Ｌｉｓ１およびＤｉｓｃｌを持つ構造を通じて他のサイトゾルたんぱく質類と相互作用するということである。Ｌｉｓ１は、広く反復されるモチーフを有するＷＤ−４０たんぱく質部類に属し（Ｎｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４参照）、幾つかの細胞機能を一緒に遂行する機能性仕組みを維持する細胞内たんぱく質として作用する。Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｉｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９参照 。Ｌｉｓ１およびＤｉｓｃ１とＥＯＰＡとの相互作用は胚発生時に中枢神経系の形成および生体機能，例えば細胞内輸送、神経突起生成、核の運動性および神経組織の可塑性において欠くことのできないものである。相互作用異常は滑脳症およびＭｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｃｋｅｒ症候群のような神経学的疾病を引き起こす。Ｒｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｃａｒｄｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２参照。最近、ＥＯＰＡの関与を示す他の病状として報告されたのは精神分裂症である。精神分裂病患者はＥＯＰＡに結合しない、切断型または突然変異型Ｄｉｓｃ１を生成し、このような異常はこの疾病のトリガーに関連しているように思われる。Ｏｚｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３参照。
【００４５】
新生児レットまたは胚の脳薄片を用いる“インサイチュ”ハイブリダイゼーション研究で、ＥＯＰＡメッセンジャーＲＮＡの転写レベルの増加が、主に新生児の、５〜１０日齢の胚の皮質で見られた。
【００４６】
さらに、発明者らは別個の動物、たとえばヒト、ウサギ、マウスおよびレット（ここで、同一のたんぱく質がまたＮｕｄｅ−ＬまたはＮｕｄｅ−様またはＮｕｄｅ２と呼ばれる。）で発現されるＥＯＰＡの“高次コイル”ドメインの高度に進化された保存部（ｈｉｇｈ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を同定および証明した。Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｗｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１参照。
【００４７】
らせん状構造，および他のたんぱく質と相互作用できる能力は，核移動および神経細胞移動と関係があり、それは胚発生時に主に生じる細胞移動プロセスでこの構造の重大な作用を示唆する。
【００４８】
我々の結果から、レットから単離されたＥＯＰＡに相同のたんぱく質 （Ｎｕｄｅ２，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ_１３３３２０）およびマウスから単離されたＥＯＰＡに相同なたんぱく質（Ｎｕｄｅ−Ｌ，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ３２３９１８）はまた，ＥＯＰＡに対し既に用いられたペプチド基質類が用いられる場合、ＥＯＰＡ特異的阻害薬によりたんぱく分解活性を遮断することに加えて、ＥＯＰＡ様ペプチダーゼ活性を示すことが分かった。これらのたんぱく質は、高度に保存されたＮ−末端ドメインを示し、“高次コイル”構造の存在およびより多様なＣ−末端ドメイン
を特徴とし、進化的スケールで、例えばアスペルギルスのように離れた生物ですら保存された配列の断片を示す、新たなたんぱく質部類を構成するように思われる。［ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０１５０３７］（Ｓｗｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅ  ｃｏｌｓ．，２０００）
【００４９】
ＥＯＰＡの組織特異的発現は、レポーターたんぱく質、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を調節するウサギＥＯＰＡ遺伝子のプロモーター領域を用いる分析を通じてカエル胚で見られた。レポーター遺伝子のる転写における第一の徴候はステージ１３〜１５の胚で見られ、かつ胚がそれ以上維持されない約ステージ４０まで続くことができた。この実験で、研究された遺伝子の発現を調節する転写因子は、プロモーター領域に存在する特定の配列と相互作用し、標的たんぱく質が主に発現されるべき発達ステージおよび組織を指示するレポーターたんぱく質の発現をトリガーする。従って、これらの研究で、ＥＯＰＡは神経胚形成時に神経細胞チューブを形成する最初の段階で、並びに神経細胞の外胚葉および小脳で主に発現された。後ほど、胚の尾部を形成する、骨格筋細胞の特定の標識がまた見られた。
【００５０】
これらの結果はまた、白皮症のツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の胚を用いて行われた、総量“インサイチュ”ハイブリダイゼーション分析により確認された。ここで、約ステージ１９の胚の背面部位の前側―後側軸に沿って、ＥＯＰＡ相同性メッセンジャーＲＮＡの存在を確認した。このような染色部位は神経細胞組織、より正確的には、脊髄に向かって広がりかつ神経冠を含む菱脳および前脳を含むのが明らかである。さらに、ＥＯＰＡ遺伝子の同型接合性の有害な突然変異が生育不可能であることを考えて、“インビトロ”で転写された特定のメッセンジャーＲＮＡを注射することによってＥＯＰＡをツメガエルで超発現させる分析が行われた。その結果、ＥＯＰＡの過剰発現は神経系の正常の形成を妨げるのが証明された。より小さくかつ置き違えられた目、および動物の脳の深刻な奇形が観察された。それらは注射された側上での異常ラミネーションを示唆する。
【００５１】
抗原提示プロセスでのＥＯＰＡの役割
オピオイドペプチド類はまた免疫調節薬であることが既に知られており（Ｂｌａｌｏｃｋ，１９８９）、免疫系の細胞でＥＯＰＡの存在を考えると、免疫系でこの酵素に対する役割を提案することができる。Ｐａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２参照。ＭＨＣＩにより提示された抗原の大きさが、これらのエンドオリゴペプチダーゼと結合するのに必要とされるペプチド類の大きさ（７〜１３アミノ酸残基）と一致するという、これらのデータおよび観察に基づき（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、１９９４）、本発明者らは、自己および非自己の選択プロセスに関与する可能性を調べることにした。ＭＨＣＩ抗原提示プロセスでのチメットオリゴペプチドダーゼの関与は本発明者らにより既に明らかになっていた。その理由はＭＨＣＩにより提示されるエピトップ類は７〜１３アミノ酸残基を有するオリゴペプチド類であり、それらはまたこの酵素に対する競合的阻害薬であるからである。“インビトロ”で組み換えＥＯＰＡを用いた場合、ＥＯＰＡとＴＯＰとの特異性において微妙な差はあるものの、類似な結果が再現された。我々は、抗原提示細胞でオリゴペプチダーゼ阻害薬の追加後リンフォプロリフェレーション（ｌｉｎｆｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）レベルの低下は主にＥＯＰＡの阻害に起因し、それはこの酵素がＭＨＣＩ抗原提示系経路に関与し得るのを示唆するということを見出した。神経組織でのＭＨＣＩの発現は感染性および退行性プロセス、および中枢神経系の可塑性に関連するため、このペプチダーゼの調節またはＥＯＰＡのシャペロン活性は、ＥＯＰＡの特定の阻害薬により影響を受けるのが明らかである、これらのプロセスとの関連性を説明することができる。Ｐｉｅｈｌ  ａｎｄ  Ｌｉｄｍａｎ，２００１；Ｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００参照。
【００５２】
[参考文献]
Blalock, J.E. (1989) A molecular basis for bi-directional communication between the immune and neuroendocrine systems. Physiol. Rev. 69, 1 - 32.
Camargo, A.C., Caldo, H., and Emson, P.C. (1983) Degradation of neurotensin by rabbit brain endo-oligopeptidase A and endo-oligopeptidase B (proline-endopeptidase). Biochern. Biophys. Res. Commun. 116, 1151 - 1159.
Camargo, A.C., Caldo, H., and Reis, M.L. (1979) Susceptibility of a peptide derived from bradykinin to hydrolysis by brain endo-oligopeptidases and pancreatic proteinases. J. Biol. Chem. 254, 5304-5307.
Camargo, A.C., Gomes, M.D., Reichl, A..P., Ferro, E.S., Jacchieri, S., Hirata, I.Y., and Juliano, L. (1997) Structural features that make oligopeptides susceptible substrates for hydrolysis by recombinant thimet oligopeptidase. Biochern. J. 324, 517 - 522.
Camargo, A.C., Gomes, M.D., Toffoletto, O., Ribeiro, M.J., Ferro, E.S., Fernandes, B.L., Suzuki, K.., Sasaki, Y., and Juliano, L. (1994) Structural requirements of bioactive peptides for interaction with endopeptidase 22.19. Neuropeptides 26, 281 - 287.
Camargo, A.C., Oliveira, E.B., Toffoletto, O., Metters, K.M., and Rossier, J. (1987) Brain endo-oligopeptidase A, a putative enkephalin converting enzyme. J. Neurochem. 48, 1258 - 1263.
Camargo, A.C., Ribeiro, M.J., and Schwartz, W.N. (1985) Conversion and inactivation of opioid peptides by rabbit brain endo-oligopeptidase A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 932 - 938.
Camargo, A.C., Shapanka, R., and Greene, L.J. (1973) Preparation, assay, and partial characterization of a neutral endopeptidase from rabbit brain. Biochemistry 12, 1838 - 1844.
Cardoso, C., Leventer, R.J., Dowling, J.J., Ward, H.L., Chung, J., Petras, K.S., Roseberry, J.A., Weiss, A. M., Das, S., Martin, C.L., Pilz, D.T., Dobyns, W.B., and Ledbetter, D.H. (2002) Clinical and molecular basis of classical lissencephaly: Mutations in the LISI gene (PAFAH1B1) . Hum Mutat.19, 4-15.
Dauch, P., Vincent, J. P., and Checler, F. (1991) Specific inhibition of endopeptidase 24.16 by dipeptides. Eur. J. Biochem. 202, 269 - 276.
Edwards, M.K.S, and McBurney, M.W. (1983) The concentration of retinoic acid determines the differentiated cell types formed by a teratocarcinoma cell line. Dev. Biol. 98, 187 - 191.
Engelhard, V.H. (1994) Structure of peptides associated with MHC class I molecules. Curr. Opin. Immunol. 6, 13-23.
Evans, M., and Kaufman, M. (1981) Establishment in culture of pluripotetial cells from mouse embryos. Nature 292, 154 - 156. 
Ferro, E.S., Hamassaki, D.E., Camargo, A.C., and Britto, L.R. (1991) Endo-oligopeptidase A, a putative enkephalin-generating enzyme, in the vertebrate
retina. J. Neurochem. 57, 1643 - 1649.
Ferro, E.S., Tambourgi, D.V., Gobersztejn, F., Gomes, M.D., Sucupira, N., Armelin, M.C., Kipnis, T.L., and Camargo, A.C. (1993) Secretion of a neuropeptide-metabolizing enzyme similar to endopeptidase 22.19 by 5 glioma C6 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 191, 275 - 281.
Gornes, M.D., Juliano, L., Ferro, E.S., Matsueda, R., and Camarcio, A.C. (1993) Dynorphin-derived peptides reveal the presence of a critical cysteine for the activity of brain endo-oligopeptidase A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 501 - 507.
Gozes, I., Nakai, H., Byers,M., Avidor, R., Weinstein, Y., Shani, Y., and Shows, T.B. (1987) Sequential expression in the nervous system of c-myb and VIP genes, located in human chromossomal region 6q24. Somat. Cell Mol. Genet. 13, 305 - 313.
Greene, L.A., and Tischler, A.S. (1976) Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2424 - 2428.
Hatakeyama, S., Kitagawa, M., Nakayama, K., Shirane, M., Matsumoto, M., Hattori, Higashi, H., Nakano, H., Okumura, K., Onoe, K., Good, R.A., and Nakayama, K.I.
(1999) Ubiquitin-dependent degradation of 1kBα is mediated by a ubiquitin ligase Skpl/Cull/F-box protein FWD1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3859 - 3863. 
Hayashi, M.A.F., Portaro, F.C.V., Tambourgi, D.V., Sucupira, M., Yamane, T., Fernandes, B.L., Ferro, E.S., Rebouqas, N.A., and Camargo, A.C.M. (2000) Molecular and immunochemical evidences demonstrate that endooligopeptidase A is the predominant cytosolic oligopeptidase of rabbit brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 7-13.
Hayashi, M.A.F., Games, M.D., Reboucas, N., Fernandes, B. L., Ferro, E.S., and Camargo, A.C.M. (1996) Species specificity of thimet oligopeptidase (EC 3.4.24.15).
Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377, 283-291.
Hayashi, M.A., Pires, R.S., Reboucas, N.A., Britto, L.R., and Camargo, A.C. (2001) Expression of endo-oligopeptidase A in the rat central nervous system: a non-radioactive in situ hybridization study. Brain Res. Mol. Brain Res. 89, 86 - 93.
Huh, G.S., Boulanger, L.M., Du, H., Riquelme, P.A., Brotz, T.M., and Shatz, C.J. (2000) Functional requirement for class I MHC in CNS development and plasticity. Science 290, 2155 - 2159.
Jacchieri, S.G., Gomes, M.D., Juliano, L., and Camargo, A.C. (1998) A comparative conformational analysis of thimet oligopeptidase (EC 3.4.24.15) substrates. J. Pept. Res. 51, 452 - 429.
Jiracek, J., Yiotakis, A., Vincent, B., Lecoq, A., Nicolaou, A., Checler, F., and Dive, V. (1995) Development of highly potent and selective phosphinic peptide inhibitors of zinc endopeptidase 24-15 using combinatorial chemistry. J. Biol. Chem. 270, 21701 -21706.
Jones-Villeneuve, E.M.V., McBurney, M.W., Rogers, K.A., and Kalnins, V.1. (1982) Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J. Cell Biol. 94, 253 - 262.
Juliano, L., Chagas, J.R., Hirata, I.Y., Carmona, E., Sucupira, M., Oliveira, E.S., Oliveira, E.B., and Camargo, A.C.M. (1990) A selective assay for endo-oligopeptidase A based on the cleavage of fluorogenic substrate structurally related to enkephalin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 173, 647 - 653.
Kitagawa, M., Hatakeyama, S., Shirane, M., Matsuraoto, M., Noriko, I., Hattori, K., Nakmichi, I., Kikuchi, A., Nakayama, K.I., and Nakayama, K. (1999) An F-box protein, FWD1, mediates ubiquitin-dependent proteolysis of β-catenin. EMBO J. 18, 2401 - 2410. 
Kitagawa, M., Umezu, M., Aoki, J., Koizumi, H., Arai, H., and Inoue, K. (2000) Direct association of Lis1, the lissencephaly gene product, with a mammalian homologue of a fungal nuclear distribution protein, rNUDE. FEBS Letts. 479, 57 - 62.
Martin, G.R. (1980) Teratocarcinomas and mammalian entbryogenesis. Science 209, 768 - 776.
McBurney, M.W., Jones-Villeneuve, E.M.V., Edwards, M.K.S., and Anderson, P.J. (1982) Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature 299, 165 - 167.
Medeiros, N.S., Iazigi, N., Camargo, A.C., and Oliveira, E.B. (1992) Distribution and properties of endo-oligopeptidases. A and B in the human neuroendocrine system. J. Endocrinol. 135, 579 - 588.
Neer, E., Schmidt, C., Nambudripad, R., and Smith, T. (1994) The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature 371, 297 - 300.
Ness, S.A. (1999) Myb binding proteins: regulators and cohorts in transformation. Oncogene 18, 3039 - 3046.
Niethammer, M., Smith, D.S., Ayala, R., Peng, J., Ko, J., Lee, M.S., Morabito, M., and Tsai, L.H. (2000) NUDEL is a novel Cdk5 substrate that associates with LIS1 and cytoplasmic dynein. Neuron 28, 697 - 711.
Nomura, N., Takahashi, N., Matsui, N., Ishii, S., Date, T., Sasamoto, R., and Ishizaki, R. (1988) Isolation human cDNA clones of myb related genes, A-myb and B-myb. Nucleic Acids Res. 16, 11075 - 11089.
Oh, I.H., and Reddy, E.P. (1999) The myb gene family in cell growth, differentiation and apoptosis. Oncogene 18, 3017 - 3033.
Oliveira, E.B., Martins, A.R.., and Camargo, A.C. (1976) Isolation of brain endopeptidases: influence of size and sequence of substrates structurally related to bradykinin. Biochemistry 15, 1967 - 1974.
Oliveira, E.S., Leite, P.E., Spillantini, M.G., Camargo, A.C., and Hunt, S.P. (1990) Localization of endo-oligopeptidase (BC 3.4.22.19) in the rat nervous tissue. J. Neurochem. 55, 1114 - 1121.
Oliveira, V., Campos, M., Melo, R.L., Ferro, E.S., Camargo, A.C., Juliano, M.A., and Juliano, L. (2001) Substrate specificity characterization of recombinant metallo oligo-peptidases thimet oligopeptidase and neurolysin.
Biochemistry 40, 4417 - 4425. Ozeki, Y., Tomoda, T., Kleiderlein, J., Kamiya, A., Bord, L., Fujii, K., Okawa, M., Yamada, N., Hatten, M.E.,Snyder, S.H., Ross, C.A., and Sawa, A. (2003) Disrupted-in-Schizophrenia-1 (DISC-i): mutant truncation prevents binding to NudE-like (NUDEL) and inhibits neurite outgrowth. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 289 - 294.
Paik, S.H., Betti, F., Camargo, A.C., and Oliveira, E.S. (1992) Presence of endo-oligopeptidase (BC 3.4.22.19), a putative neuropeptide-metabolizing endopeptidase in cells of the immune system. J. Neuroimmunol. 38, 35 -44.
Piehi, F., and Lidman, O. (2001) Neuroinflammation in the rat--CNS cells and their role in the regulation of immune reactions. Imrnunol. Rev. 184, 212 - 225. 
Portaro, F.C., Gomes, M.D., Cabrera, A., Fernandes, B.L., Silva, C.L., Ferro, E.S., Juliano, L., and Camargo, A.C. (1999) Thimet oligopeptidase and the stability of MHC class I epitopes in macrophage cytosol. Biochern. Biophys. Res. Commun. 255, 596 - 601.
Portaro, F.C., Hayashi, M.A., Silva, C.L., and Camargo, A.C. (2001) Free ATP inhibits thimet oligopeptidase (BC 3.4.24.15) activity, induces autophosphorylation in vitro, and controls oligopeptide degradation in macrophage. Eur. J. Biochem. 268, 887 - 894.
Reiner, O., Carrozzo, R., Shen, Y., Wehnert, M., Faustinella, F., Dobyns, W.B., Caskey, C.T., and Ledbetter, D.H. (1993) Isolation of a Miller-Dieker lissencephaly gene containing G protein β-subunit−like repeats. Nature 364, 717 - 721.
Rogister, B., Ben-Hur, T., and Dubois-Dalcq, M. (1999). From neural stem cells to myelinating oligodendrocytes. Mol. Cell. Neurosci. 14, 287 - 300. 
Sasaki, S., Shionoya, A., Ishida, M., Gambello, M. J., Yingling, J, Wynshaw-Boris, A., and Hirotsune, S.(2000) A LISl/NTJDBL/cytoplasmic dynein heavy chain complex in the developing and adult nervous system. Neuron 28, 681-696. 
Shrimpton, C.N., Abbenante, G., Lew, R.A., and Smith, I. (2000) Development and characterization of novel potent and stable inhibitors of endopeptidase EC 25 3.4.24.15. Biochem. J. 345, 351 - 356.
Sidow, A., Bulotsk, M.S., Kerrebrock, A.W., Birren, B., Altshuler, D., Jaenisch, R., Johnson, K.R., and Lander, E.S. (1999) A novel member of the F-bos/WD4O gene family, encoding dactylin, is disrupted in the mouse dactylaplasia mutant. Nature Gen. 23, 104 - 107.
Silva, C.L., Portaro, F.C., Bonato, V.L., Camargo, A.C., and Ferro, E.S. (1999) Thimet oligopeptidase (EC 3.4.24.15), a novel protein on the route of MHC class I antigen presentation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 591 - 595. 
Sondek, J., Bohm, A., Lambright, D.G., Hamm, H.E., and Sigler, P.B. (1996) Crystal structure of a G-protein beta gamma dimer at 2.1 A resolution. Nature 379, 369- 374.
Sweeney, K.J., Clark, G.D., Prokscha, A., Dobyns, W.B., and Eichele, G. (2000) Lissencephaly associated mutations suggest a requirement of the PAFAHib heterotrimeric complex in brain development. Mech. Dev. 92, 263- 271.
Sweeney, K.J., Prokscha, A., and Eichele, G. (2001) NudE-L, a novel Lis1-interacting protein, belongs to a family of vertabrate coiled-coil proteins. Mech. Dev. 101, 21 - 33.
Taylor, M.S., Devon, R.S., Nillar, J.K., and Porteous, D.J. (2003) Evolutionary constraints on the Disrupted in Schizophrenia locus. Genomics 81, 67-77.
Thiele, C.J., Cohen, P.A., and Israel, M.A. (1988) Regulation of c-myb expression neuroblastoma cells during retinoic acid-induced differentiation. Mol. Cell Biol. 8, 1677 - 1683. 
Vincent, B., Beaudet, A., Dauch, P., Vincent, J.P., and Checler, F. (1996) Distinct properties of neuronal and astrocytic endopeptidase 3.4.24.16: a study on differentiation, subcellular distribution and secretion processes. J. Neuroscience 15, 5049 - 5059.
Welter, C., Henn, W., Theisinger, B., Fischer, H., Zang, K.D., and Blin, N. (1990) The cellular myb oncogene is amplified, rearranged and activated in human 
glioblastoma cell lines. Cancer Lett. 52, 57 - 62. 
Weston, K. (1998) Myb proteins in life, death and differentiation. Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 76 - 81.
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐに対するエンドオリゴペプチダーゼの活性を百分率として示す。
【図２】図２は、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションに対するＥＯＰＡ分布研究で、用いられたプローブの製作に用いられる断片が分離されるヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡの全配列を図解する。
【図１】
2006524983.tif 000005
【図２】
2006524983.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月30日(2006.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006524983000001.app