(57)【要約】本発明は、６±１本のＰＥＧ鎖を持つヘモグロビン分子（Ｈｂ）を提供し、ここでこれらＰＥＧ鎖の２本が、ＨｂのＣｙｓ９３（β）に結合しており、残りのＰＥＧ鎖が、Ｈｂのε−ＮＨ２上に導入されたチオール基に結合している。本発明はまた、修飾ヘモグロビン分子（Ｈｂ）を調製するプロセスを提供し、これは：    （ａ）Ｈｂを、８〜１５倍過剰のイミノチオランと反応させ、チオール化Ｈｂを形成させるステップ；および    （ｂ）該チオール化Ｈｂを、マレイミド部分により官能基化された１６〜３０倍過剰のＰＥＧと反応させ、該修飾Ｈｂを形成させるステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６±１本のＰＥＧ鎖を持つヘモグロビン分子（Ｈｂ）であって、これらのＰＥＧ鎖の内の２本が、ＨｂのＣｙｓ−９３（β）に結合し、残りのＰＥＧ鎖が、Ｈｂのε−ＮＨ２上に導入されたチオール基に結合しているヘモグロビン分子。
【請求項２】
各ＰＥＧ鎖が、３，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を持つ、請求項１に記載のヘモグロビン分子。
【請求項３】
各ＰＥＧ鎖が、約５，０００ダルトンの分子量を持つ、請求項１に記載のヘモグロビン分子。
【請求項４】
各ＰＥＧ鎖が、コハク酸イミド結合により、Ｈｂにリンクされている、請求項１に記載のヘモグロビン分子。
【請求項５】
各ＰＥＧ鎖が、コハク酸イミド結合により、Ｈｂにリンクされている、請求項２に記載のヘモグロビン分子。
【請求項６】
各ＰＥＧ鎖が、コハク酸イミド結合により、Ｈｂにリンクされている、請求項３に記載のヘモグロビン分子。
【請求項７】
非高血圧性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘモグロビン分子。
【請求項８】
修飾ヘモグロビン分子（Ｈｂ）を調製する方法であって：
（ａ）８〜１５倍過剰のイミノチオランとＨｂを反応させて、チオール化Ｈｂを形成させるステップ；ならびに
（ｂ）マレイミド部分により官能基化された１６〜３０倍過剰のＰＥＧと該チオール化Ｈｂを反応させて、該修飾Ｈｂを形成させるステップ
を含む方法。
【請求項９】
Ｈｂが、ステップ（ａ）において、９〜１２倍過剰のイミノチオランと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｈｂが、ステップ（ａ）において、約１０倍過剰のイミノチオランと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記チオール化Ｈｂが、ステップ（ｂ）において、マレイミド部分により官能基化された１８〜２２倍過剰のＰＥＧと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記チオール化Ｈｂが、ステップ（ｂ）において、マレイミド部分により官能基化された約２０倍過剰のＰＥＧと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
Ｈｂが、ステップ（ａ）において、９〜１２倍過剰のイミノチオランと反応させられ、前記チオール化Ｈｂが、ステップ（ｂ）において、マレイミド部分により官能基化された１８〜２２倍過剰のＰＥＧと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
Ｈｂが、ステップ（ａ）において、９〜１２倍過剰のイミノチオランと反応させられ、前記チオール化Ｈｂが、ステップ（ｂ）において、マレイミド部分により官能基化された約２０倍過剰のＰＥＧと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
Ｈｂが、ステップ（ａ）において、約１０倍過剰のイミノチオランと反応させられ、前記チオール化Ｈｂが、ステップ（ｂ）において、マレイミド部分により官能基化された１８〜２２倍過剰のＰＥＧと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
Ｈｂが、ステップ（ａ）において、約１０倍過剰のイミノチオランと反応させられ、前記チオール化Ｈｂが、ステップ（ｂ）において、マレイミド部分により官能基化された約２０倍過剰のＰＥＧと反応させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＥＧが、３，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を持つ、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＥＧが、約５，０００ダルトンの分子量を持つ、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾Ｈｂが非高血圧性である、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾Ｈｂが非高血圧性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記修飾Ｈｂが非高血圧性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法により調製される、修飾Ｈｂ。
【請求項２３】
請求項１７に記載の方法により調製される、修飾Ｈｂ。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法により調製される、修飾Ｈｂ。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法により調製される、修飾Ｈｂ。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法により調製される、修飾Ｈｂ。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法により調製される、修飾Ｈｂ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願相互参照
本願は、２００２年１２月２３日出願の米国仮出願第６０／４３６，１４９号明細書の利益を請求するものである。
【０００２】
本発明は、修飾ヘモグロビンおよびこれを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、赤血球の主要な構成要素であり、酸素を肺から体中ヘと運搬する。赤血球に含まれている時、Ｈｂは、酸素に結合した２つのαβダイマー（２量体）から構成されるテトラマー（４量体）構造体として存在し、各々約３２Ｋｄの分子量を持っている。各ダイマーの各αおよびβサブユニットは、タンパク質鎖およびヘム分子を持っている。これらαおよびβタンパク質鎖の配列が知られている。Ｈｂは、輸血用に潜在的に有用な代替血液であり、敗血症ショック時には一酸化窒素（ＮＯ）を捕捉し、癌の放射線治療の期間には組織への酸素供給を調節する試薬として、提案されている。組み換えＤＮＡ技術も、個々の治療適用の特別な必要性に対して調節された酸素親和性を有する修飾Ｈｂの生成を、与えている。
【０００４】
非細胞性Ｈｂの血管活性、つまり小動脈および毛細血管の収縮は、非細胞性Ｈｂ精製溶液または分子間架橋Ｈｂを用いて点滴される場合、Ｈｂ主体の酸素運搬を開発するに当たっての主要な障害であった（Ｓａｖｉｔｚｓｋｙら、１９７８年；Ｓｌｏａｎら、１９９９年；Ｓａｘｅｎａら、１９９９年）。該血管活性は、ＨｂのＮＯスカベンジャー効果に属するものとされてきた（Ｄｏｈａｒｔｙら、１９９８年）。分子レベルでの２つのアプローチが、これらはお互い非常に異なるのであるが、ＨｂのＮＯスカベンジャー活性を克服しようという試みにおいて、展開されてきた。第１のアプローチは、前記した組み換えＤＮＡによるアプローチであり、末端ヘムポケットの部位特異的変異によってＨｂのＮＯ結合活性を修飾することにより、ＨｂのＮＯスカベンジャー活性を抑制しようと試みてきた（Ｅｉｃｈら、１９９６年）。第２のアプローチは、化学的なアプローチであり、Ｈｂの分子の大きさ（サイズ）がオリゴマー化を通じて増大され、血管空間（スペース）から間質空間（スペース）中へのＨｂの血管外遊出を抑制もしくは恐らく完全に阻害するものである（Ｈｅｓｓら、１９７８年；Ｔｈｏｍａｓら、１９９３年；Ｍｕｌｄｏｏｎら、１９９６年；ＭａｃＤｏｎａｌら、１９９４；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ、１９８４年；Ｋｉｌｂｏｕｒｎら、１９９４年）。しかしながら、大きさを増大させるこのアプローチは、Ｈｂの血管活性が血管外遊出の結果として必須に媒介される場合のみ、成功するであろう。オリゴマー化によるＨｂのサイズ増大がＨｂの血管活性における何らかの抑制を示しているが、非高血圧性Ｈｂ溶液は、組み換えＤＮＡ技術によっても該サイズ増大アプローチによっても得られていないが、これは、２機能性の小分子試薬を使用するＨｂのオリゴマー化を含むものであった。１つの例外は、Ｈｂのオリゴマー化産物であり（Ｍａｔｈｅｓｏｎら、２００２年）、これは、３００ｋＤａを遙かに超える分子量を持っており、平均分子半径２４ｎｍを有し、非高血圧性であることが見出され、血管外遊出しないことが見出された。しかしながら、現在臨床試験にあるオリゴマー化産物の殆どが、２００〜２５０ｋＤａの範囲の分子量を持つものである。
【０００５】
ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂは、そのαおよびεアミノ基においてＨｂにリンクしたＰＥＧ−５０００鎖を１０コピー（１０本）有するが、非高血圧性であることが実証されたことは、血管移植分野における研究を刺激した（Ｒｏｌｆｓら、１９９８年）。内部で架橋して４量体化したＨｂ、オリゴマー化Ｈｂ、およびＰＥＧ化ＨｂのＮＯ結合活性は、それらの「昇圧効果」との直接の相関を示さない。このため、非細胞性Ｈｂの「昇圧活性」における抑制は、この調製物のＮＯ結合活性ともこの調製物の分子サイズとも直接相関しているようには見えない。しかし、該ＰＥＧ化Ｈｂは、該オリゴマー化Ｈｂに比較して、顕著に低レベルの血管活性を呈した。ＰＥＧ−５０００を１０コピー有する前記ＥｎｚｏｎのＰＥＧ−Ｂｖ（ウシ）−Ｈｂは、殆ど如何なる「昇圧効果」も呈さなかった。Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆらは１９９８年、ＰＥＧ−Ｂｖ−Ｈｂが、Ｈｂのオリゴマー化サンプルのそれに比較して、高粘度および高浸透圧を呈した、と述べている。該浸透圧から計算されるＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｂｖ−Ｈｂの分子半径は、オリゴマー化Ｈｂのそれよりも顕著により大きく（１５ｎｍ）、この計算された分子半径は、その計算された分子量１１４，０００ダルトン（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆら、１９９８年）と一致していない。従って、Ｈｂサイズが約１５ｎｍの分子半径へと増大するはずであり、これは該粘度および該浸透圧の顕著な増大を伴うはずであり、この結果、非高血圧性Ｈｂ溶液を生成するものと仮定されている（Ｗｉｎｓｌｏｗ、１９９９年）。
【０００６】
この非高血圧性のＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂにおいて、ＰＥＧ−５０００鎖は、イソペプチド結合により、ウシＨｂＰＥＧ鎖のαおよびεアミノ基にリンクしている。このＰＥＧの共有結合は、これらの誘導化されたアミノ基の総＋電荷の損失を伴う。とある最近の研究において、グルタルアルデヒドを用いたｒＨｂ１．１の１官能基修飾が、Ｈｂの血管活性をある程度低下させることが実証されたが、ｒＨｂ１．１のオリゴマー化は、Ｈｂの血管活性をより高い程度抑制する。このため、ＰＥＧ化によるＨｂの血管活性の中和に関する分子的基盤を理解するに当たって、ＨｂのこのＰＥＧ化に伴うＨｂの表面電荷の修飾の潜在的な役割が考慮される必要がある。
【０００７】
ＰＥＧ化に起因するＨｂの表面電荷の摂動（変動）と非高血圧性Ｈｂの生成との間の相関を明らかにするために、新たなアプローチが開発されており、これは、Ｈｂの「保全」ＰＥＧ化、つまり、Ｈｂの表面電荷を変えることのないＨｂのＰＥＧ修飾に関するものである（Ａｃｈａｒｙａら、１９９６年）。酸化条件下におけるＨｂのＣｙｓ−９３（β）に対するＰＥＧ−マレイミドの高い反応性および選択性が使用されており、１テトラマー（４量体）につき２本のＰＥＧ鎖を有する均一にＰＥＧ化されたＨｂを調製している。ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、もしくはＰＥＧ−２０Ｋ各々２つを有する３つの異なるＰＥＧ−ＨｂＡ調製物が、生成されている。Ｈｂの分子体積（ハイドロダイナミック体積）、分子半径、粘度、および浸透圧における変化は、Ｈｂに共有結合したＰＥＧの質量（分子量）と相関しており、分子の持つこれらの性質の全てが、昇圧効果と相関している。（ＰＥＧ２０Ｋ）２−Ｈｂの粘度および浸透圧は、非高血圧性Ｈｂ分子であるＥｎｚｏｎＰＥＧ−Ｂｖ−Ｈｂのそれらに比較し得るものであるが、このＰＥＧ化Ｈｂは血管活性であった。このため、血管活性に関する問題に対する解決策は、粘度、浸透圧、および分子体積（ヒドロダイナミック体積）の増加をこの分子に単に与えることによっては、得られてこない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は修飾Ｈｂを提供し、これは、増大した分子体積、高粘度、高浸透圧、高Ｏ２親和性を持ち、非高血圧性であり、前記した血管活性に関する問題をも解決する。加えて、本発明の修飾Ｈｂは、簡潔、柔軟、かつ高効率なプロセスにより製造され得、これは、本発明の修飾Ｈｂの生成をコスト効率的にする。
【０００９】
より具体的には、本発明は、６±１本のＰＥＧ鎖を持つヘモグロビン分子（Ｈｂ）を提供し、ここでこれらＰＥＧ鎖の内の２本が、ＨｂのＣｙｓ−９３（β）に結合しており、残りのＰＥＧ鎖が、Ｈｂのε−ＮＨ２上に導入されたチオール基に結合している。
【００１０】
本発明はまた、修飾ヘモグロビン分子（Ｈｂ）を調製するプロセスを提供し、これは：
（ａ）Ｈｂを、８〜１５倍過剰のイミノチオランと反応させ、チオール化Ｈｂを形成させるステップ；および
（ｂ）該チオール化Ｈｂを、マレイミド部分により官能基化された１６〜３０倍過剰のＰＥＧと反応させ、目的とする修飾Ｈｂを形成させるステップ
を含む。
【００１１】
最後に、本発明は、該プロセスに従って調製された修飾Ｈｂ分子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において使用される場合、他に特記されない限り、「Ｈｂ」は、ヒトおよび哺乳類由来のヘモグロビン（例えば、ウシＨｂ、ブタＨｂ）、組み換えＨｂ、およびＨｂ（単離Ｈｂもしくは組み換えＨｂ）を包含し、これは、酸素親和性および／または自動酸化を増加もしくは減少させるよう修飾されている。加えて、Ｈｂは、例えば、ビスマレイドフェニルＰＥＧ（２官能基を有する試薬であり、ＰＥＧ鎖の分子量（ＭＷ）が２，０００〜１０，０００ダルトン）を使用して、Ｃｙｓ−９３（β）において架橋されているＨｂ、αα−フマリルＨｂ、ββ−フマリルＨｂ、またはββ−スバリルＨｂＡを包含する、分子内架橋したＨｂ（単離Ｈｂもしくは組み換えＨｂ）を包含してもよい。
【００１３】
本発明において、該Ｈｂは６±１本のＰＥＧ鎖を持っており、ここで、これらのＰＥＧ鎖の内の２本が、ＨｂのＣｙｓ−９３（β）に結合しており、残りのＰＥＧ鎖が、Ｈｂのε−ＮＨ２上に導入されたチオール基に結合している。該チオール基は、好ましくは、Ｈｂのγ−メルカプトブチルアミジン化されたε−ＮＨ２に関するものである。好ましい実施形態において、各ＰＥＧ鎖は、３，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を持っており、より好ましくは、約５，０００ダルトンの分子量を持っている。該ＰＥＧ鎖はまた、好ましくは、コハク酸イミド結合により、Ｈｂに結合している。好ましい実施形態において、本発明のＨｂ分子は、非高血圧性でもある。
【００１４】
本発明のＨｂ分子は：
Ｈｂを、８〜１５倍過剰のイミノチオランと反応させ、チオール化Ｈｂを形成させること；次いで
該チオール化Ｈｂを、マレイミド部分により官能基化された１６〜３０倍過剰のＰＥＧと反応させ、修飾Ｈｂを形成させること
により、調製される。好ましい実施形態において、Ｈｂは、ステップ（ａ）において９〜１２倍過剰のイミノチオランと反応させられ、該チオール化Ｈｂは、好ましくは、マレイミド部分により官能基化された１８〜２２倍過剰のＰＥＧと反応させられる。より好ましい実施形態において、Ｈｂは、ステップ（ａ）において約１０倍過剰のイミノチオランと反応させられ、該チオール化Ｈｂは、ステップ（ｂ）においてマレイミド部分により官能基化された約２０倍過剰のＰＥＧと反応させられる。Ｈｂのチオール化および結果得られるチオール化ＨｂのＰＥＧによる修飾が、同時もしくは２ステップのプロセスにより実施され得ることも、本発明の範囲内である。該プロセスにおいて使用されるＰＥＧの分子量に関しては、該ＰＥＧは、好ましくは、３，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を持っていて、より好ましくは、約５，０００ダルトンの分子量を持っている。最も好ましい実施形態において、該プロセスから結果得られる修飾Ｈｂは、非高血圧性である。
【００１５】
本発明の該プロセスにおいて、該修飾Ｈｂは、多数の特異的反応性チオール基を有している、酸素を捕捉する哺乳類Ｈｂ（イヌＨｂ、ネコＨｂ、ニワトリＨｂ、マウスＨｂ）から直接調製されてもよく、そのα鎖およびβ鎖上の所望の位置において更なる反応性システインを有するヒト組み換えＨｂであってもよく、これは、マレイミド部分により官能基化された過剰の前記ＰＥＧにより処理され、該修飾Ｈｂに至ったものである。
【００１６】
該プロセスを取り巻く化学は、図１Ａおよび図１Ｂにスキーム表示される。イミノチオランは無保護のチオール基を有していないが、そのチオール基は、一旦それがそのε−アミノ基と反応すると、ｉｎ  ｓｉｔｕ（反応系内）で生成される。誘導された該ε−アミノ基（アミジン）は、この官能基の本来の＋電荷を保持する（図１Ｂ）。このため、Ｈｂを、このチオール化試薬と一緒にＰＥＧ−マレイミドと共にインキュベートすることができ、該チオール化試薬が該ＰＥＧ−マレイミド試薬を消費してしまう危険性がない。ＰＥＧ化レベルは、チオール化レベルにより決定される（イミノチオランのＨｂとの反応）。後者は第１義的に、イミノチオランによるアミジン化へと向かう与えられたコンホメーション状態における、イミノチオランの濃度およびＨｂのε−アミノ基の反応性の関数である。
【００１７】
該ＰＥＧ化反応は、該反応が、該マレイミド中のＰＥＧの分子サイズからも、該ＰＥＧ−マレイミド中の該マレイミドとＰＥＧ−鎖との間のリンカーの化学（的性質）からも独立していることにおいて、柔軟性がある。このアプローチは、Ｈｂのチオール化レベルおよび／または該ＰＥＧ−マレイミド中のＰＥＧの分子量を調節することにより、Ｈｂの分子体積（サイズ）を、如何なる所望のレベルまでにも増大させるのに使用され得る。保全ＰＥＧ化技術は、高酸素親和性を有する多数のサイズ増大ＰＥＧ化Ｈｂを生成させるよう、最適化されてきた。本発明の修飾Ｈｂは、総電荷およびハイドロダイナミック体積両方の観点において高度の分子的相同性を呈し、該ハイドロダイナミック体積は、分子量〜２５０，０００ダルトンのグロブリンタンパク質のそれに相当する。非高血圧性ＰＥＧ化Ｈｂの如何なるデザイン（設計）も、より小さな分子量のより多数のＰＥＧ鎖を使用することにより、Ｈｂのより広範な分子表面を遮蔽するようにするべきと思われている。
【００１８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより充分に例示するために示されるのであり、いずれにしても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１
Ｉ．材料および方法
ヘモグロビン
ヒトＨｂＡが、前記したように（Ａｃｈａｒｙａら、１９８３年）、溶血赤血球から精製された。
【００２０】
マレイドフェニルポリエチレングリコール（ＭａｌＰｈｅＰＥＧ）試薬の合成
ＰＥＧ５０００およびＰＥＧ１００００の１官能基化マレイドフェニル誘導体が、Ａｃｈａｒｙａら（１９９６年）の手順に従って、合成された。マレイドエチルＰＥＧ５０００は、Ｓｈａｅｒｗａｔｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから購入された。
【００２１】
ＨｂＡの該ＭａｌＰｈｅ−ＰＥＧ試薬との反応
ｐＨ７．４のＰＢＳ中０．５ｍＭのヘモグロビンＡが、４℃において、１０倍モル過剰のＭａｌＰｈｅＰＥＧ−５０００と反応させられた。ＰＥＧによるＨｂＡの修飾は、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）および分子篩（size exclusion chromatography, ＳＥＣ）によりモニターされた。反応生成物は、ｐＨ８．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテートバッファー（緩衝液）に対して透析され、イオン交換クロマトグラフィーによる精製に付された。結果得られたＰＥＧ化Ｈｂは、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｒｅｓｉｎ上でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製された。該Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（２．６ｃｍ×６２ｃｍ）は、ｐＨ８．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテートバッファーを用いて平衡化され、結果得られたタンパク質は、８カラム体積分に亘って、ｐＨ８．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテートおよびｐＨ７．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテートからなる直線的に減少するｐＨ勾配を用いて溶出された。該カラムの溶出液は、２４０ｎｍおよび５４０ｎｍにおいてモニターされた。
【００２２】
酸素親和性測定
酸素平衡曲線が、ヘモグロビンテトラマー濃度１ｍＭにおいて、ｐＨ７．４のＰＢＳ中において、Ｈｅｍ−Ｏ−Ｓｃａｎ（Ａｍｉｎｃｏ）を使用して、３７℃において測定された。
【００２３】
粘度測定
結果得られたＰＥＧ化Ｈｂの粘度が、３７℃において、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中において、タンパク質濃度４ｇ／ｄＬにおいて、Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ中で測定された。この機器は、これらＨｂサンプルの粘度の測定前に、脱イオン化水を用いて較正されている。
【００２４】
コロイド浸透圧測定
結果得られたＰＥＧ化ヘモグロビンのコロイド浸透圧が、Ｗｅｓｃｏｒ４４２０Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒを使用して、求められた。全測定が室温において、ｐＨ７．４のＰＢＳ中２ｇ／ｄＬのヘモグロビンサンプルを使用して、実施された。３０ｋＤａにおいてカットする膜が使用された。この機器は、該サンプルの測定前に、Ｏｓｍｏｃｏｌｌ対照標準を用いてテストされた。
【００２５】
ＰＥＧ化ＨｂのＲＰＨＰＬＣ分析
種々のＰＥＧ化Ｈｂのグロブリン鎖が、前記した方法により、ＲＰＨＰＬＣにより分析された。端的には、この分離はＶｙｄａｃＣ４（４．６×２５０ｍｍ）カラム上において実施され、１００分の、０．１％ＴＦＡ含有３５〜５０％アセトニトリルの直線勾配を用いた。このカラム溶出液は、２１０ｎｍにおいてモニターされた。
【００２６】
ＰＥＧ化Ｈｂの血管活性
以前に記載された手順（Ｍｉｒｈａｓｈｅｍｉら、１９８８年、Ｔｓａｉら、１９９６年）に本質的には従って、ハムスター皮膚の襞の一部分（ウィンドウ）の微小循環モデルにおいて、調査が実施された。体重５５〜７０ｇの雄Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、米国）に関して、研究が実施された。全ての動物実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏにより認められ、実験動物の注意および使用に関するＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ出版＃８５−２３Ｒｅｖ．１９８５）に従って、実施された。
【００２７】
各動物が、それ自体のベースラインとしても働いた。血液量に比して１０％過多の点滴が、微小点滴ポンプ（ＣＭＡ１００Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｐｕｍｐ：ＣＭＡ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、頚静脈カテーテルを介して、該動物中へ、０．２０ｍＬ／分の割合にて実施された。血圧、動脈直径、および機能性毛細血管密度が、該点滴直後および該点滴３０分後に測定された。
【００２８】
イミノチオランによるＨｂのチオール化の速度論
イミノチオランによるＨｂのアミジン化は、その後のチオール化の進展を推定することを可能にした。与えられた長さの時間、ある量のイミノチオランと共にインキュベートされたＨｂサンプル中のチオール基の数は、Ａｍｐｕｓｌｋｉにより記載（１９６９年）されたようなジチオピリジンを使用して、推定される。４，４’−ジチオピリジン（４−ＰＤＳ、分子量（ＭＷ）＝２２０．３２、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の貯蔵溶液が、この試薬をＰＢＳ中において３ｍＭの最終濃度（もしくはもし所望であればこれよりもより高い濃度）まで溶解させることにより、調製された。イミノチオランと共にインキュベートされたＨｂの分取分が、ジチオピリジンと共にインキュベートされ、このタンパク質上の反応性スルフヒドリル基（−ＳＨ基）の数が、４−ＰＤＳの４−チオピリドン（４−ＴＰ）への変換により推定され、４−ＴＰは３２４ｎｍにおいてモニターされ得るものである（ε３２４＝１．９８×１０−４Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００２９】
ＨｂＡのイミノチオランによるチオール化によるＰＥＧ−マレイミド主体の保全ＰＥＧ化
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中０．５ｍＭのテトラマーＨｂＡが、所望の期間、イミノチオランに対して所望レベルのモル比において過剰のイミノチオラン（ＢｉｏＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と、４℃（もしくは室温）において、２倍モル過剰のＰＥＧ−５０００のマレイドフェニルカルバメート（ＢｉｏＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）、マレイドエチルＰＥＧ−５０００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｓ）、もしくはＰＥＧ−１０００のマレイドフェニルカルバメートの存在下に反応させられた。４℃における反応が、室温におけるそれを凌駕して好ましく、これは、室温では、チオール化されたＨｂのチオール基のある量の酸化が、ＰＥＧ−マレイミド存在下においてさえも起きているらしく、これが４℃においては顕著に抑制されるからである。このＰＥＧ化反応は一般的に、０．５ｍＭのタンパク質濃度において実施されるが、０．２５ｍＭもしくは１ｍＭのＨｂ濃度を使用したとしても、実施され得るであろう。
【００３０】
チオール化によるＰＥＧ化は、２ステップの反応として研究されており、Ｈｂの第１のチオール化は、所望に過剰のイミノチオランと共にインキュベートすることにより実施され、次いで、所望のモル比において過剰（イミノチオランに対して）のＰＥＧ−マレイミドが加えられ、該チオール化ＨｂのＰＥＧによる修飾を達成した。
【００３１】
非高血圧性Ｈｂ生成のために、テトラマーとして存在するＨｂを１０倍モル過剰に上回るチオール化、ならびに、このチオール化されたタンパク質の、２０倍モル過剰の所望のＰＥＧ−マレイミドを用いたＰＥＧ化が、用いられた。これは一般的に、１ステップの反応として実施され、これらチオール基の酸化を抑える。該反応が室温において実施される場合、一般的に、４〜６時間の反応時間が必要とされ、所望の分子を得る。該反応が４℃において実施される場合、通常、終夜反応（〜１６時間）が実施される。
【００３２】
より高いＨｂ濃度における該反応が不完全な反応となって以来、Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ−１０，０００を使用した、チオール化によるＰＥＧ−マレイミド主体のＰＥＧ化によるＨｂの表面修飾が、０．２５ｍＭのタンパク質濃度において実施されてきたが、恐らくこれは、２０倍モル過剰のＭａｌ−ＰＥＧ−２０００が使用された場合の、該反応混合物のより高い粘度によるものである。
【００３３】
該反応の生成物は、１２〜１４，０００ダルトンにおいてカットする透析チューブを使用して、ＰＢＳに対して更に透析される。未反応のもの、つまり過剰なＰＥＧ−マレイミドが透析されて析出され、ＰＥＧ化された該生成物は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｃｔａ  に接続されたＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムを使用して、分子篩により精製された。こうして単離されたＰＥＧ化Ｈｂ、つまり（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂは、更に必要とされるまで、−８０℃において保管される。
【００３４】
チオール化によるＰＥＧ−マレイミド主体のＰＥＧ化におけるサイズ増大の測定
種々のチオール化によるＰＥＧ−マレイミド主体の保全ＰＥＧ化の関数としてのＨｂのサイズ増大の分析が、ＰｈａｒｍａｃｉａＦＰＬＣシステムを使用して、実施された。分子篩が、連続して接続された２つのＳｕｐｅｒｏｓｅカラムを使用して、実施された。サンプルは、５ｍｍプローブを使用して、２９℃（室温）において、３００．１５ＭＨｚにおいて、ｐＨ７．４および流速０．５ｍＬ／分のＰＢＳを使用して、溶出された。これらＨｂサンプルは、０．１Ｍ中４〜７％濃度であった。
【００３５】
ＩＩ．結果
Ａ）保全ＰＥＧ化技術の開発
（ｉ）Ｈｂのチオール化によるマレイミドの化学主体のＰＥＧ化の結果としての、ＨｂＡのハイドロダイナミック体積の増加
イミノチオラン非存在下および存在下において、室温において４．５時間、２０倍モル過剰のＭａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ５Ｋと共にインキュベートされる場合のＨｂの分子篩パターンが、図２Ａに示される。イミノチオラン自体の非存在下では、Ｈｂは完全に、ＰＥＧ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ−５０００により修飾される（図２Ａ、ｂ）。修飾されなかったＨｂは、５７分付近に溶出し（図２Ａ、ａ）、一方、Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ５Ｋと共にインキュベートされたＨｂＡは、５０分付近に溶出する。この生成物の溶出位置は、Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ５Ｋによりその２つのＣｙｓ−９３（β）において修飾されたＨｂに対応する。このカラムおよび対照マーカーに関しては、Ｃｙｓ−９３（β）においてリンクしたＰＥＧ鎖をそれぞれ有する（ＳＰ−ＰＥＧ１０Ｋ）２−ＨｂＡおよび（ＳＰ−ＰＥＧ２０Ｋ）２−ＨｂＡの溶出位置は、４７分および４４分付近である。
【００３６】
Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ５Ｋを有するＨｂの反応混合物におけるイミノチオランの取り込みに際し、修飾Ｈｂは、該分子篩カラムから、（ＰＥＧ５Ｋ）２−ＨｂＡの位置よりも早く溶出した。新たなＰＥＧ−マレイミド部位が明らかに生成されており、これにより、Ｈｂ上に新たなＰＥＧ−マレイミド反応部位を提供する。該修飾Ｈｂ（ＰＥＧ化Ｈｂ）は、イミノチオラン濃度に依存して、該分子篩上ではより早く溶出した。該イミノチオラン濃度が高くなればなるほど、該修飾Ｈｂの溶出位置がより早くなり、このことは、該反応混合物中での該イミノチオラン濃度の上昇の関数としてのＨｂのチオール化レベルの上昇が、Ｈｂの明らかに増大した分子サイズに関して応答していることを示唆するものである。２．５ｍＭイミノチオラン（テトラマーに対して５倍モル過剰）存在下に生成された該ＰＥＧ化Ｈｂは、（ＳＰ−ＰＥＧ１０Ｋ）２−ＨｂＡのそれに近い位置において溶出する（図２Ａ、ｄ）。５ｍＭイミノチオラン存在下に形成されたサンプルは、（ＳＰ−ＰＥＧ２０Ｋ）２−ＨｂＡの位置に非常に近く溶出するが、（ＳＰ−ＰＥＧ２０Ｋ）２−ＨｂＡのそれよりも僅かに小さいハイドロダイナミック体積を持っているように見える（図２Ａ、ｅ）。しかしながら、この材料は、そのピークの上昇側に、小さな「肩」を持っている。
【００３７】
Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ濃度を変化させることなく同一（１０ｍＭ）にして、７．５ｍＭまで更に該イミノチオラン濃度を増加させると、該ＰＥＧ化Ｈｂピークの溶出パターンは僅かにブロードになるが、少し増加しただけの収率の生成物が、「肩」として溶出した（データ示さず）。１０ｍＭまで該イミノチオラン濃度を増加させても、該溶出パターンは、該上昇側の「肩」の濃度の小さな変化を除いて、有意には変化しなかった。
【００３８】
該上昇側の「肩」のＰＥＧ濃度の影響もまた、ＰＥＧ−マレイミドの濃度上昇の関数として、研究された。Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ濃度が、図２ｅにおいて使用された濃度のほぼ２倍まで上昇した場合の、著しく抑えられた（殆ど消失）この「肩」は、その主ピークの溶出位置には殆ど影響を持たなかった。
【００３９】
１０倍モル過剰のイミノチオランによるＨｂのチオール化のキネティクス（速度論）が、図２Ａ（内部図ａ）に示される。平均して１０倍モル過剰のイミノチオランによりチオール化されたＨｂは、１テトラマーにつき〜７個の反応性−ＳＨ基（ジチオピリジルになる）を有しており、これらの内の２つが、Ｃｙｓ−９３（β）が元より有する−ＳＨ基であり、残りが、Ｈｂの反応性表面ε−アミノ基とのイミノチオランの反応（Ｈｂのγ−メルカプトブチルアミジン化）により導入されたチオール基である。１０倍モル過剰のイミノチオランが使用されているので、チオール化効率はほぼ５０％である。該ＰＥＧ化Ｈｂは、１テトラマーにつき約０．５モルの反応性チオールを持っていたが（非変性条件下）、このことは、平均するとほぼ〜６．５コピーのＰＥＧ鎖が、このＰＥＧ化Ｈｂを生成させるに当たってＨｂ上へと導入されることを示唆する。
【００４０】
Ｈｂの該チオール化も、タンパク質濃度０．５ｍＭにおいて、該イミノチオラン濃度の関数として、研究された（図２Ａ、内部図ｂ）。該イミノチオラン濃度が、１テトラマーにつき平均して５個の外来チオールを導入した１０倍モル過剰から３０倍まで上昇すると、このチオール化されたＨｂ上において、該外来チオールの数がほぼ２倍となった。しかしながら、ＰＥＧ化において見られたサイズ増大は些細なものに過ぎず、このことは、該ＰＥＧ化Ｈｂが、該チオール化Ｈｂの全該外来チオールにおいて反応し得ないことを示唆するものであった。これらの結果は、１０倍モル過剰のイミノチオランおよび２０倍モル過剰のＭａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ５Ｋ存在下に、該ＰＥＧ化Ｈｂが、該Ｈｂ分子表面を被覆することを示唆するものとして解釈されてきたが、これは有意に「ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｓｉｔｕａｔｉｏｎ（込み入った状況）」を作り出すものであり、ここでは、このチオール化によるＰＥＧ−５０００マレイミドによるＰＥＧ化によりＨｂの分子サイズを増大させるＰＥＧのこの段階での該チオール化Ｈｂは、該ＰＥＧ化Ｈｂの更なる外来チオールの修飾に関してより耐性になる。従って、引き続く全ての研究について、ＰＥＧを用いてのＨｂの表面修飾により生成されたＰＥＧ化Ｈｂは、２０倍モル過剰のＭａｌ−Ｐｈｅ−５０００ＰＥＧ存在下に、テトラマーとしてのこのタンパク質に対して、１０倍過剰のイミノチオランを使用するものであった。
【００４１】
（ｉｉ）Ｈｂのチオール化によるマレイミド−ＰＥＧ主体のＰＥＧ修飾における柔軟性  該ＰＥＧ−マレイミドにおける、温度、ｐＨ、リンカーの化学（的性質）、および該ＰＥＧの分子サイズの影響が、１０倍モル過剰のイミノチオラン、２０倍モル過剰のＰＥＧ−マレイミド、およびアッセイ系としてＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上での分子篩を使用して、（ＰＥＧ−５Ｋ）６−ＨｂＡの形成に関して、調べられた。この温度が４℃まで低下した場合、チオール化タンパク質への該ＰＥＧ鎖の結合速度は減速されるように見えるが、Ｈｂのチオール化速度は大きくは影響を被らず、９時間までこの反応を実施して、該反応の完結を確実にしたが、常法により、終夜反応が便利なものとして選ばれた（図２Ｂ、曲線ｃ）。該ＰＥＧ化を２ステップのプロセスとして実施する場合、第１のチオール化およびその後のＰＥＧ化も、該サイズ増大に影響を及ぼすようには見えなかった（データ示さず）。ＰＥＧによる表面修飾は、３つのｐＨ値、ｐＨ６．５、７．４、および８．５において実施された。１０ｍＭリン酸バッファー（緩衝液）を使用して、ｐＨ６．５、７．５、および８．５において形成された該ＰＥＧ化生成物は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中において確立されたものと比較された。全該生成物は、表面修飾により達成されるサイズ増大の観点において、比較し得るものである。
【００４２】
ＰＥＧ−５０００を用いた表面修飾の際に見られたサイズ増大は、前記したリンカーの化学（的性質）からも独立しており、マレイミド−フェニル−ＰＥＧ−５０００を使用して得られたその反応生成物は本質的に、ＰＥＧ−エチル−ＰＥＧ−５０００を用いて生成されたものと同じハイドロダイナミック体積を持っていた（図２Ｂ、曲線ｄ）。Ｈｂのサイズ増大は、与えられた組み合わせのチオール化条件下に、該ＰＥＧ−マレイミド中のＰＥＧの分子サイズに対して鋭敏である。該ＰＥＧ鎖の質量を５，０００から１０，０００へと増加させると、観察される該サイズ増大は、ＰＥＧ−５０００マレイミドの場合観察されるものよりも、より大きい（図２Ｂ、曲線ｅ）。
【００４３】
（ｉｉｉ）（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの精製。
１グラムまでの（ＰＥＧ）６−ＨｂＡ材料の生成に関して、ゲル濾過プロトコールが開発されている。常法により、ＨｂＡ（０．５ｍｍ）が、４〜６時間、リン酸バッファー生理食塩水（ｐＨ７．４）中において、１０倍モル過剰のイミノチオランおよび２０倍モル過剰のＰＥＧ−マレイミドと共にインキュベートされ、次いで、この反応混合物は、１００倍過剰のＰＢＳに対して３回透析交換し、過剰（未反応）の該イミノチオランおよびマレイミドＰＥＧを除去した。この透析サンプルは約１ｍＭまで濃縮され、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｃｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０に接続されたＳｕｐｅｒｏｓｅ１２分取カラムを使用するゲル濾過に付された。以上に論じられた条件下にＰＥＧ化されたＨｂＡサンプルの典型的なクロマトグラフィー・プロファイルが、図６Ａに示される。その溶出は３波長においてモニターされ、Ｈｂと反応していない全ＰＥＧ−マレイミドの溶出のモニターを容易にした。該ＰＥＧ化Ｈｂは、当該サンプル中に存在する未反応のＰＥＧ−マレイミドの遙か前方に溶出する。ゲル濾過された該ＰＥＧ化サンプルは、約６グラム／ｄＬまで濃縮された。ＨｂＡは、チオール化によるマレイミドの化学主体のＰＥＧ化反応の間にも、引き続いての精製ステップの間にも、ｍｅｔ−Ｈｂ型の生成物を生成させるような如何なる検出可能な自動酸化をも受けない。ＰＥＧ化Ｈｂの該サンプルは、少なくとも１年までの期間、如何なる自動酸化をも受けずに、−８０℃において保管され得る。
【００４４】
（ｉｖ）Ｈｂの保全ＰＥＧ化から結果的に得られるＨｂサイズ増大の定量
精製（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂの溶出パターンが、ビスマレイドフェニルＰＥＧ−６００を使用して、テトラマー内で架橋したαα−フマリルＨｂのそれと比較された（図３、内部図ｂおよびａ）。前記した通り、保全ＰＥＧ化されたＨｂである（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂは、（ＰＥＧ２０Ｋ）２−ＨｂＡよりも僅かに小さく、（ＰＥＧ１０Ｋ）２−ＨｂＡのそれよりも大きい。それのハイドロダイナミック体積は、約２５０，０００ダルトンの分子量を有するグロブリンタンパク質のそれに相当するように見える。この（表面）上のＰＥＧの質量は〜３０，０００なので、計算された分子量は９５，０００ダルトンに過ぎない。しかし、それのハイドロダイナミック体積は、約２５０，０００の分子量のタンパク質のそれに相当する。このため、６コピーのＰＥＧ−５０００鎖としての３０，０００の分子量のＨｂ上への取り込みは、ほぼ１８０，０００の分子量のグロブリンタンパク質をＨｂ上へと取り込むことに等しい。このため、ＰＥＧは、緻密なグロブリンタンパク質のそれのほぼ６倍であるＨｂの該ハイドロダイナミック体積を増加させるポテンシャルを呈する。この結論は、Ｍａｎｊｕｌａら（２００２年）が最近彼らのＰＥＧ化研究から得たことに類似しており、そこでは、該ＰＥＧ化部位は、Ｃｙｓ−９３（β）に制限され、そのサイズ増大は、使用されたＰＥＧ−マレイミド中のＰＥＧの分子サイズの関数として得られた。このため、ＰＥＧ化の結果として起きている該サイズ増大は、Ｈｂにリンクした合計ＰＥＧ分子量に直接相関しているように見え、該ＰＥＧ分子量が異なるコピー数によるものである場合、増加する。
【００４５】
チオール化によるマレイミドの化学主体の新たなＰＥＧ化プロトコールにより生成された（ＰＥＧ−５Ｋ）６−ＨｂＡの分子篩パターンが、Ｅｎｚｏｎ（ＰＥＧ５Ｋ）１０−Ｂｖ−Ｈｂである非血管活性ＰＥＧ化Ｈｂのそれと比較された（図３内部図、曲線ｃ）。この材料は、ちょうど（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂのように、分子サイズ分布の観点において非常に一様でもある。このＰＥＧ化Ｈｂは、１テトラマーにつき１０コピーのＰＥＧ−５０００（合計ＰＥＧ分子量５０，０００）を持っており、従って、（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂと比較した場合、より大きなサイズ増大を持つことが推測される。しかしながら、このＨｂの場合に観察されるサイズ増大は、（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂの場合に観察されるものほど大きくはない。この異常さに関する分子的基盤は、この段階では容易には明らかでない。他方、１テトラマーにつき１０コピーのＰＥＧ−３０００を有しているもう１つ別のＰＥＧ化Ｈｂ（ＰＨＰ）は、この生成物中の１テトラマー当たりのＰＥＧ分子量が（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂのそれと比較し得るという事実が与えられれば（比較し得るのであれば）、（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂのそれと比較し得るハイドロダイナミック体積を持っているものと予期されるはずである。ＰＨＰは、非常に不均一である（図３内部図、曲線ｄ）。それはある量の材料を有しているが、これは（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂのそれよりもより小さなサイズ増大を持ち、またある材料は（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂのそれと比較し得るサイズ増大を持ち、またある材料は（ＰＥＧ−５Ｋ）６−Ｈｂのそれよりもより大きなサイズ増大を持っている。表面修飾用の２官能基性ＰＥＧ−３０００の使用ならびにこのサンプル中に存在するテトラマー内および／またはテトラマー間架橋は、該ＰＨＰにおける高度の不均一性に寄与したのかも知れない。
【００４６】
Ｂ）（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの、分子的、総括的、および機能的特徴化
（ｉ）（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
Ｈｂのプロトン核磁気共鳴スペクトルは、与えられた如何なる部位においても、化学的修飾または突然変位に伴うＨｂＡの３次元および４次元構造の変化をモニターするのに、優れたツールである。前記Ｃｙｓ−９３（β）の位置は、当該分子のコンホメーション的に鋭敏な領域中にあり、このスルフヒドリル基特異的試薬に対するＣｙｓ−９３（β）の活性は、該分子のオキシコンホメーション独特の特徴であり、そのデオキシ構造では、それは不活性である。図４Ａは、一酸化炭素（ＣＯ）体およびデオキシ体両方での、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸バッファー中２９℃における、（ＰＥＧ２０）２−ＨｂＡおよび（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡのプロトンＮＭＲスペクトルを、ＨｂＡのそれと比較するものである。これら２つのサンプルは、１テトラマーにつき、ほぼ同量のＰＥＧ分子量である［（ＰＥＧ２０）２−ＨｂＡにおいては４０，０００、これに対して（ｖｓ）、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡにおいては３０，０００］。ＨｂのＰＥＧ化の結果としての分子サイズの増大による、ＰＥＧ化サンプルを用いて観察されたよりブロードな共鳴の例外に関して、そのケミカル・シフトにおける有意な差はなく、その上で、１０〜１４ｐｐｍのスペクトル領域は、ＰＥＧ−２０，０００を使用してＣｙｓ−９３（β）においてのみ、または、ＰＥＧ−５，０００を使用してＣｙｓ−９３（β）およびＨｂの少なくとも４つの他のε−アミノ基におけるＨｂの該ＰＥＧ化の結果としての、当該タンパク質のα１β１界面における変化を指し示していない。図４Ｂは、一酸化炭素（ＣＯ）体での、前記の２つのＰＥＧ化Ｈｂの環状電流により遮蔽されたプロトン共鳴を、ＨｂＡのそれと比較する。ＰＥＧ化Ｈｂサンプルのヘムの微小環境による何らかの変動を反映して、環状電流により遮蔽されたプロトン共鳴において、幾つかの変化が見られる。図４Ｃは、デオキシ体のＰＥＧ化Ｈｂのα鎖およびβ鎖の隣のヒスチジン残基の極僅かにシフトしたＮδＨの１Ｈ−共鳴を示す。該β鎖の隣のヒスチジンのＮδＨへと帰属される−７５ｐｐｍのケミカル・シフトは、該ＰＥＧ化サンプルのβヘムの環境の変動を反映して、高磁場に−２〜−３ｐｐｍシフトした。この高磁場シフトは、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡのそれにおけるものよりも、（ＰＥＧ２０）２−ＨｂＡにおいてややより強く発現される。図５Ｄは、デオキシ体での、ＨｂＡのこれら２つのＰＥＧ化サンプルの極僅かにシフトした交換可能なプロトン共鳴を、ＨｂＡのそれと比較するものである。極僅かにシフトした該共鳴は、ＨｂＡのそれよりもよりブロードである。その上、１６〜２４ｐｐｍのスペクトル領域において、該共鳴の幾つかの変化が見られ、これは、当該分子のＰＥＧ化の結果として、Ｈｂのβヘムの微小環境における変化を反映するものである。１４ｐｐｍにおける共鳴は、そのα１β２サブユニット界面におけるα−Ｔｙｒ（４２）とβ−Ａｓｐ（９９）との間の重要な水素結合へと帰属され、該ＰＥＧ化サンプル中においては不変である。このため、該ＰＥＧ化Ｈｂのα１β２サブユニット界面において、変化はない。
【００４７】
（ｉｉ）（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの分子半径
（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの分子半径が、動的光散乱により求められており、我々が以前に測定しておいた（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡおよび（ＰＥＧ２０）−ＨｂＡのそれと比較された。
（表Ｉ参照）。（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの分子半径は、６．８ｎｍ程度である。この分子半径は、（ＰＥＧ２０）２ＨｂＡのそれよりも僅かに小さく、後者は以前に７．０４であると推定されている。（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡおよびＨｂＡに関する値はそれぞれ、４．２および３．１である。このため、たとえこのタンパク質に加えられる分子量が３０，０００程度だけであっても、ＨｂＡの分子半径は、約６コピーのＰＥＧ−５Ｋ鎖により表面修飾された場合の２倍よりも大きい。このため、（ＰＥＧ５）６−Ｈｂは、分子量９４，０００のグロブリンタンパク質に関して予期されるよりも増大した分子サイズを呈し、Ｈｂのこのサイズ増大領域におけるＰＥＧの詰め込まれ具合（パッキング）は、同タンパク質のコア（中心）におけるものほど濃くはない。１１４，０００の分子量を持つＥｎｚｏｎＰＥＧＢｖ−Ｈｂの分子半径は、（ＰＥＧ５）６−Ｈｂのそれよりも小さな分子半径５．５３ｎｍを持っており、（ＰＥＧ−１０Ｋ）２−ＨｂＡおよび（ＰＥＧ−５Ｋ）４−イヌＨｂのそれに近い。ＭａｌエチルＰＥＧ−５０００を使用して生成される（ＰＥＧ５）６−Ｈｂの分子半径が、Ｍａｌ−Ｐｈｅ−５０００を使用して生成されるものよりもほぼ１０％小さいということも、注目されてよい。（ＰＥＧ−１０Ｋ）６−Ｈｂの分子半径は９．８程度であり、このため、より大きな分子サイズのＰＥＧを使用して、（ＰＥＧ−５Ｋ）６−ＨｂＡを用いて得られる７ｎｍよりも大きな分子半径を有するＰＥＧ化Ｈｂを得る必要性を確立するものである。
【００４８】
（ｉｉｉ）保全および非保全的ＰＥＧ化プロトコールにより生成されたＰＥＧ化Ｈｂの分子密度の比較
ＰＥＧ化により達成されるサイズ増大（ハイドロダイナミック体積の増加）は、グロブリンタンパク質（等分子量基準で）におけるものよりもほぼ６倍より効率的なので、ＰＥＧ化Ｈｂの増大した体積中の原子の分子密度が、コンパクトなグロブリンタンパク質におけるものと比較された場合低いことが示される。種々のＰＥＧ化Ｈｂの増大した分子体積中のＰＥＧの分子密度も、表１に与えられる。Ｈｂの増大した分子体積中のＰＥＧの分子密度はほぼ５０％減少し、一方、Ｃｙｓ−９３（β）にリンクしたＰＥＧの分子量は、５，０００から２０，０００へと増加する。分子密度の減少は、ＰＥＧ鎖と、与えられたＰＥＧ化ＨｂのＰＥＧ殻内の溶媒分子の増加した占有率との間の相互作用の減少を示す。ＰＥＧ殻中のＰＥＧ密度が低い場合、それは「きのこ型（マッシュルーム）コンホメーション」中に存在するものとして考えられ、一方、該密度が該ＰＥＧ殻中において高い場合、それは「刷子縁（ブラッシュ・ボーダー）型コンホメーション」中に存在しているものとして考えられ、ＰＥＧ殻の分子密度は、（ＰＥＧ２０）２−Ｈｂにおけるそれよりも遙かに小さい。一方、ＥｎｚｏｎＰＥＧＢｖ−ＨｂのＰＥＧ殻の分子密度は非常に高く、そのＰＥＧ殻内のＰＥＧ鎖間の相互作用が、（ＰＥＧ５）６−ＨｂのＰＥＧ殻中のものに比較してより強力であることを示唆している。これらの研究は明確に、ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂとこの新たに保全ＰＥＧ化技術により生成されたＰＥＧ化Ｈｂとの間での、ＰＥＧ鎖の詰め込まれ具合の差を反映するものである。該保全ＰＥＧ化により生成されたサンプルは、「きのこ型コンホメーション」中に存在しているものとして考えられ、該ＥｎｚｏｎＰＥＧ化サンプルは、「刷子縁型コンホメーション」中に存在しているものとして考えられる。
【００４９】
（ｉｖ）（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの総括的性質
図５は、（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡおよび（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの粘度を、１〜１０グラム／ｄＬの範囲のタンパク質濃度の関数として、比較するものである。該タンパク質濃度が１グラム／ｄＬから１０グラム／ｄＬへと増加した時、（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡの粘度は少しだけの増加を示し、そのＰＥＧ化溶液の粘度は該タンパク質濃度に正比例しているように見える。一方、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡ溶液の粘度が、非常に稀釈された（１グラム／ｄＬ）溶液の（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡのそれと比較し得るものとしても、前者の粘度は該タンパク質濃度と共に指数関数的に増加する。イソペプチド・リンカーを介してウシＨｂのαおよびε−ＮＨ２に結合した１０当量のＰＥＧ−５Ｋ鎖を有している１〜５グラム／ｄＬの濃度範囲のＥｎｚｏｎＰＥＧウシＨｂの粘度も、比較用に示される。研究された全濃度において、該ＥｎｚｏｎＰＥＧウシＨｂの粘度は、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの粘度に比較し得るものである。これらの結果は、ＰＥＧ化リンカーおよびＰＥＧ化部位の化学的性質が該ＰＥＧ化に強力な影響を持っていること、または、ＰＥＧ化Ｈｂ溶液の粘度が１テトラマーにつき６コピーのＰＥＧ−５Ｋ鎖が存在して飽和値に到達すること、を示唆するものである。
【００５０】
ＰＥＧ化Ｈｂサンプルのコロイド浸透圧を、このタンパク質の濃度の関数として、図６に示す。該サンプルの浸透圧は、該タンパク質濃度の関数として増加した。この増加は、（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡの場合は小さく、このタンパク質の濃度（１〜６．８グラム／ｄＬの範囲）と共に、直線的に増加するように見える。一方、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡ溶液の浸透圧は、このタンパク質濃度が増加するに連れ、指数関数的に増加した。再度該濃度が一致した時、Ｅｎｚｏｎ（ＰＥＧ５）１０−Ｂｖ−Ｈｂの浸透圧は、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡのそれと比較し得るものである。これらの結果は、ＰＥＧ化Ｈｂサンプルの浸透圧が、そのサンプルの粘度と直接相関するものであることを示唆するものである。
【００５１】
（ｖ）（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの機能的性質
ｐＨ７．４の５０ｍＭBis-Tris／５０ｍＭTrisアセテート中３７℃における（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの酸素親和性、ならびに、それのアロステリック効果因子存在下での調節が、表１に示される。ＨｂのＰ５０は８．０から６．５へと、そのコントロール値から低下した（酸素親和性は増加）。５倍過剰のＤＰＧ、つまり、ββ溝において結合することによりＨｂＡの酸素親和性を低下させる効果因子の存在は、該酸素親和性に有意な影響を持たなかった。一方、１Ｍ塩化ナトリウムの存在は僅かに、該ＰＥＧ化体の酸素親和性を低下させ（Ｐ５０は６．５から８．５へと上昇）、クロリド非存在下での無修飾ＨｂＡのそれと比較し得るものである。無修飾Ｈｂの酸素親和性は一方で、１．０Ｍクロリド存在下に、有意に低下される。L-35、つまり、この分子のαα末端において結合することによりＨｂの酸素親和性を抑制するアロステリック効果因子の存在下に、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの増加したＰ５０は、ある程度酸素親和性を抑制する影響を持っていたが、無修飾ＨｂＡの場合見られたものと比較すると、顕著に抑制された。このため、ＨｂＡのチオール化によるマレイミドの化学主体のＰＥＧ化は、ＤＰＧの存在に応答するＨｂＡの性向を殆ど完全に阻害しており、クロリドおよびL-35に応答するこの分子の性向を劇的に抑制した。
【００５２】
循環中のこのサンプルの値はＰＢＳ中のそれと比較可能なはずなので、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの酸素（Ｏ２）親和性も、ＰＢＳ中において求められた。ＰＢＳ中でさえ、（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡは、コントロールであるＨｂＡに比較して（Ｐ５０＝１５ｍｍＨｇ）、より高い酸素親和性（Ｐ５０＝９．５ｍｍＨｇ）を呈する。（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡの酸素親和性は、（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡのそれ（Ｐ５０＝１１．８）よりも、僅かに高いだけである。（ＰＥＧ５）６−ＨｂＡは、それのＣｙｓ−９３（β）が（ＰＥＧ５）２−ＨｂＡにおけるものと比べて、ＨｂＡのリジン残基のε−ＮＨ２基上の更なる修飾の他にも修飾されているので、その酸素親和性に関する結果は、チオール化によるＨｂＡのε−ＮＨ２基のＰＥＧ化自体は、Ｈｂの酸素親和性に有意に影響を及ぼさないことを示唆するものである。
マレイド−エチル−ＰＥＧ５Ｋを使用した、チオール化によるＨｂＡの表面修飾：
この市販のマレイミドＰＥＧ試薬は、そのマレイミド部分とそのＰＥＧ鎖との間に、アルキルスペーサー結合を持っている。マレイミドアルキルＰＥＧ試薬に対しても、ここで開発された上記の新たなＰＥＧ化手順の一般性を確立する試みにおいて、我々は今や、Ｍａｌ−Ｅｔｈｙｌ（エチル）−ＰＥＧ５Ｋを用いたチオール化によるマレイミドの化学主体の反応において、Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ５Ｋを置き換えている。このＰＥＧとのＨｂＡの反応も、該反応の僅かに低い効率を除けば、予想通りに進行する。生成され、平均６本のＰＥＧ鎖［（ＳＥ−ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡ］を有していると予想されるその生成物は、ゲル濾過におけるやや遅れた溶出を除いて、（ＳＰ−ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡのそれに類似したゲル濾過パターンを与えた。表２に示した以外にも、（ＳＥ−ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡの分子半径は、（ＳＰ−ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡのそれよりも僅かに小さいものである。
【００５３】
Ｂ．（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡの高血圧活性
（ｉ）ハムスターにおける１０％最大負荷実験による研究
２および６コピーのＰＥＧ５Ｋ鎖によるＰＥＧ化におけるＨｂの血管収縮活性の変化が、平均動脈圧を測定することにより、および、該動脈直径（Ａ２）を測定することにより、ハムスター皮膚襞ウィンドウモデルにおける１０％最大負荷実験により、調べられた。図７Ａに見られるように、（ＰＥＧ５Ｋ）２−ＨｂＡの点滴が、血圧の直ぐの増加を引き起こしたが、これは数分内に解消した。一方、該（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡサンプルは、同一期間中に全く血圧の変化を引き起こさなかった。図７Ｂは、１０％最大負荷の（ＰＥＧ５Ｋ）２−ＨｂＡおよび（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡの溶液を用いた、ハムスターへの様々な期間の点滴後の、動脈直径を比較するものである。該（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡサンプルは、該（ＰＥＧ５Ｋ）２−ＨｂＡサンプルによるものよりも、該動脈直径を、その当初の値に遙かにより近く保つ。これらの分析は、６コピーのＰＥＧ５Ｋ鎖のレベルまでの非細胞性ＨｂのＰＥＧ化が、非細胞性Ｈｂ本来の血管活性を、有意なレベルまで阻害することを確認するものである。
【００５４】
（ｉｉ）ハムスターの機能毛細血管密度における、（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡを用いた５０％交換輸血の影響
図８は、（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡを用いて５０％交換輸血されたハムスターの毛細血流を描いたものであり、αα−フマリルＨｂＡにより５０％交換輸血された場合同様、コントロール（交換輸血せず）のそれと比較されたものである。これから、（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡを用いて５０％交換輸血された該ハムスターが高い毛細血管密度を維持する一方、該αα−フマリルＨｂＡの方は有意に、機能毛細血管密度を減少させることが明らかである。従って、ＰＥＧ−５０００鎖によるＨｂの表面修飾は、非細胞性Ｈｂ本来の血管収縮活性を中和することができる。
【００５５】
ＩＩＩ．議論
ＰＥＧ化による、Ｈｂの表面電荷を変えることなく該Ｈｂの分子サイズを増大させるための、新たな、簡潔な、かつ柔軟なプロトコールが、開発された。これは、ＰＥＧマレイミド反応性部位としてのイミノチオランとの反応（チオール化）によるオキシもしくはデオキシ条件におけるＨｂの１セットのε−アミノ基の活性化、そしてその後の、チオール化された該Ｈｂの所望のＰＥＧ−マレイミドでの修飾を含んでいる。このアプローチは、６コピーのＰＥＧ−５０００を有しているＰＥＧ化Ｈｂを生成させるために最適化されており、これが非高血圧性であることが見出された。
【００５６】
イミノチオラン非存在下、オキシ条件下に、ＰＥＧ−マレイミドを使用するＨｂのＰＥＧ化は、Ｃｙｓ−９３（β）の修飾、つまり、１テトラマーにつき２コピーに制限される。このＰＥＧ化Ｈｂは、分子量１２８ＫＤａのグロブリンタンパク質のそれと比較し得るハイドロダイナミック体積を呈する。他の４つのシステイン残基は埋没しており、使用される反応条件下には、ＰＥＧマレイミドとの反応に近づけない。該Ｃｙｓ−９３（β）も、ＰＥＧマレイミドとの反応に活用され得なくなる。
【００５７】
イミノチオランは、イミノチオラン濃度に依存して、ＰＥＧ−マレイミド反応性部位としてのＨｂのε−アミノ基の内の幾つかを、活性化させる。イミノチオラン、つまり環化した形態のγ−メルカプトブチルイミデートは、無保護のチオールを有しておらず、一旦それがこれらε−アミノ基と反応すると、ｉｎ  ｓｉｔｕ（反応系内において）該チオール基を発生させる。それのＨｂとの反応時に、１セットのアミデートである反応性ε−アミノ基は、γ−メルカプトブチルイミジニル部分として誘導体化され、これはその遠位末端に無保護の−ＳＨ基を有するものである。該ε−アミノ基本来の＋電荷は、この誘導体化されたε−アミノ基において保たれる。これらのチオール基の内の新たな外来のチオール基は、マレイミドとして官能基化される所望の分子サイズのＰＥＧ鎖を取り付けるのに標的とされる部位となる。しかしながら、ＰＥＧとマレイミドとの間においてアルキルリンカーもしくはアルキルアミドリンカーを利用する、マレイミドとしてＰＥＧを官能基化させる他のアプローチは同等に効率的なＰＥＧ化アプローチであり、つまり、該ＰＥＧ化反応は、マレイミドの化学を主体とするものである。ＰＥＧ化のこのアプローチはこのため、該ＰＥＧ化Ｈｂにおいて、Ｈｂの総電荷を保つ利点を持っている。
【００５８】
１０倍モル過剰のイミノチオランと共にインキュベートされたオキシＨｂは、ＰＥＧ−マレイミド反応性部位として、Ｈｂのほぼ５つのε−アミノ基を活性化させる。１０倍モル過剰のイミノチオランと共に存在する２０倍モル過剰のＰＥＧ−マレイミドの場合、平均して６本のＰＥＧ５Ｋ鎖を持っているＰＥＧ化生成物が生成される［（ＰＥＧ５）６−Ｈｂ］。導入されたこれら６本のＰＥＧ鎖の内の２本が、Ｃｙｓ−９３（β）のスルフヒドリル基上にあり、残りがＨｂのチオール化されたＬｙｓ残基上にある。６本のＰＥＧ−５０００鎖を有している該Ｈｂは、更にＰＥＧ−５０００鎖を導入される程度の耐性を獲得したように見える。この段階では、これが該Ｈｂでの一様な表面被覆の程度を反映するものであるかどうかは明らかでなく、この一様な表面被覆とは、ＰＥＧ−マレイミドとの反応由来のイミノチオランにより活性化されるＨｂの表面の他のε−アミノ基のチオール基を遮蔽するものである。
【００５９】
（ＰＥＧ５）６−Ｈｂの計算された分子量は、〜９４Ｋｄａである。しかしながら、分子篩では、（ＰＥＧ５）６−Ｈｂは、まるでそれの分子サイズが２５０ｋＤａのオーダー（桁）であるかのように振る舞い、つまり、（ＰＥＧ５）６−Ｈｂは、分子量２５０ＫＤａのグロブリンタンパク質のそれに相当するハイドロダイナミック体積を呈する。このため、グロブリンタンパク質の分子の規模において、ＰＥＧ鎖は、そのハイドロダイナミック体積を増加させ、Ｈｂの分子体積は、グロブリンタンパク質のそれのほぼ６倍となる。
【００６０】
ＰＥＧ−マレイミドを使用してより早期に生成されたＰＥＧ化Ｈｂの分子体積の増加の、このようなサイズ増大を与えるのに使用された分子量のＰＥＧを用いた本研究において生成されたものとの相関は、各生成物内のＰＥＧ鎖の詰め込まれ具合が異なることを示唆する。より早期に研究された部位特異的ＰＥＧ化生成物においては、そのＰＥＧ鎖の分子量の増加が、サイズ増大Ｈｂ分子のＰＥＧ殻中のＰＥＧの分子密度を減少させる。このことは、その２つのＣｙｓ−９３（β）において繋ぎ止められたＰＥＧ鎖の分子サイズとして解釈され得、これらはお互いに相互作用し合うことができ、これにより、その内部において該ＰＥＧ鎖が分子として動く状態にある分子体積（このタンパク質の周りのＰＥＧ殻）を増加させる。Ｈｂの周りのＰＥＧ殻が６本のＰＥＧ−５０００鎖により生成される場合［Ｃｙｓ−９３（β）上の２本およびイミノチオランにより活性化されたα−アミノ基上の他の４本］、それらの分子としての動きのための最大のスペースに近づいているように見える。（ＰＥＧ１０）６−Ｈｂを用いた暫定的な計算は、その内部においてそのＰＥＧ鎖が可動する該分子スペースが、（ＰＥＧ５）６−ＨｂのＰＥＧ殻に比較し得る分子密度を持っており、（ＰＥＧ５）６−Ｈｂのそれに比較して遙かにより低密度であるかも知れないことを示唆する。
【００６１】
驚くべき観察は、ＥｎｚｏｎＰＥＧＨｂのＰＥＧ殻の分子密度が、（ＰＥＧ５）６−Ｈｂのそれにおけるものよりも顕著により高いという事実である。これら２つのＰＥＧ化Ｈｂは、２つの非常に異なる化学を使用して、構築される。本ＰＥＧ化は、保全プロトコールを使用して実施され、このため、該Ｈｂ分子の総電荷は、該ＰＥＧ化生成物中において保たれ、つまり、このタンパク質の水和された殻は、該ＰＥＧ化Ｈｂにおいては限られた変動を経てきたはずである。該ＥｎｚｏｎＰＥＧ化は、非保全的プロトコールを使用して実施され、ここでは、誘導体化されたαおよびε−アミノ基本来の＋電荷は、最終生成物においては保たれない。このため、このプロトコールは、このタンパク質の水和されたその殻を変動させると仮定され得る。分子的基盤が何であっても、これら２つのアプローチは、Ｈｂ分子を囲んでいる該ＰＥＧ殻内のＰＥＧ鎖の非常に異なる構造（分子密度）を持つ該Ｈｂの周りに、ＰＥＧ殻を生成させたように見える。
【００６２】
マレイド−エチル−ＰＥＧ−５０００を使用して生成された（ＰＥＧ５）６−ＨｂのＰＥＧ殻の分子密度は、マレイド−フェニル−ＰＥＧ−５０００を使用して生成された（ＰＥＧ５）６−ＨｂのＰＥＧ殻におけるそれよりもより高いが、ＥｎｚｏｎＰＥＧ−Ｈｂのものほど高くない。ＰＥＧと官能基との間の共役リンカーおよびスペーサーリンカーを詳述するアンカー部位のＰＥＧ鎖の化学（の本質）は、３つの生成物、つまり、コハク酸イミドフェニルＰＥＧ化Ｈｂ、コハク酸イミドエチルＰＥＧ化Ｈｂ、およびアセタミド（アセトアミド）ＰＥＧ化Ｈｂにあり、比較されて以下にスキーム表示される。マレイドフェニルＰＥＧ化ＨｂおよびマレイドエチルＰＥＧ化Ｈｂ両方が、共通の分子として、活性化アーム（γ−メルカプトブチルイミジル）、共役基（コハク酸イミジル）を持っている。前記Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ試薬は、該ＰＥＧ鎖と該共役アームとの間のリンカーとしてフェニルエチルカルバメートを持っているが、一方、Ｍａｌ−エチル−ＰＥＧ試薬は、エチルリンカーを持っている。このため、前者の場合、より長いリンカー鎖が使用され、該リンカー中のフェニル基の存在が、このアンカー部分において、該鎖をリジッド（剛直）にしているが、一方、後者の場合、該フェニル環がなく、Ｈｂに取り付けられた該ＰＥＧ鎖に、より高度な自由回転を与えている。一方、該ＥｎｚｏｎＰＥＧ−Ｈｂは活性化アームを持っておらず、このため該ＰＥＧ鎖は、そのタンパク質表面により近い。それはその共役基としてアセトアミジル部分を持っており、該共役単位と該ＰＥＧ鎖との間にリンカー基を持っていない。該共役アームのイソペプチドリンカーは、部分的に２重結合の特徴を持っているものと予期されるので、ＰＥＧ化のこの化学的アプローチに対して本来の程度の剛性をも期待し得る。このため、該Ｅｎｚｏｎのストラテジー（戦略、保全ＰＥＧ化アプローチ）では、該ＰＥＧは該タンパク質表面に非常に近く置かれ（そのε−アミノ基本来の＋電荷から２〜３Å以内）、一方、前記したチオール化によるＰＥＧマレイミド主体のＰＥＧ化は、該ＰＥＧ鎖を、該タンパク質表面から約１５〜２１Å離れた距離に置くものである（そのε−アミノ基本来の＋電荷から延長されたコンホメーションでは）。このため、保全ＰＥＧ化により生成されたＰＥＧ殻は、該タンパク質のコアと該ＰＥＧ殻との間に、Ｈｂの良く定まった水和球面を持ち得るであろう。このことは、ＰＥＧ化ＨｂのＰＥＧ殻内のＰＥＧの分子密度が、リンカーの化学およびカップリングの化学両方の関数であることを示唆し、該リンカーとは、ＰＥＧとＨｂ側鎖との間のものである。
【００６３】
本発明の重要な知見は、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂが非高血圧性であることである。結果的に非細胞性Ｈｂ本来の高血圧活性の中和となる（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの物理的／化学的性質とは何か。（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡはある種の、サイズ増大Ｈｂ分子である。Ｈｂの分子サイズの増大は、Ｈｂが間質空間中へと血管外遊出し、このため、血漿中を循環しているＨｂよりもＮＯ捕捉においてより効果的であろうという概念に基づき、Ｈｂの高血圧活性を克服するように進められた早期のデザイン（設計）戦略の内の１つであった。この概念は、２５０ＫＤａの範囲の分子サイズを有するオリゴマー化Ｈｂがより血管活性であるとの観察により、裏付けられるように思える。より最近になって、Ｍａｔｈｅｓｏｎらは、３００ｋＤａを遙かに超えた分子サイズを持ち、２４ｎｍの平均分子半径を有するオリゴマー化産物（１２〜３３ｎｍの間に分布した半径を有するヘテロ体産物）を生成させ、これが腎肺門リンパに出現せず、血管外遊出がないことを示したことは、ここに記すに値する。この産物はまた、昇圧応答をも完全に阻害した。Ｓａｋａｉによる観察は、分子サイズと昇圧効果との相関を実証し、昇圧応答の増加は、該分子サイズに対して反比例している。１０００ｎｍ近くの直径を有するカプセル化されたＨｂは、血管収縮を引き起こさない。しかしながら、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの分子サイズは７ｎｍ程度でしかなく、臨床試験にある本版の多くのオリゴマー化Ｈｂの分子サイズに比較し得るものである。これらの内の殆どが種々の程度の血管収縮を呈するので、サイズ増大自体は、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂを非高血圧性にする第１の要因とはなり得ないであろう。
【００６４】
しかしながら、本発明の保全ＰＥＧ化されたＨｂが平均して６コピーのＰＥＧ−５０００鎖を有しており、非高血圧性であり、ＥｎｚｏｎＰＥＧ−Ｈｂのそれに近い粘度および浸透圧を呈するという事実は、本発明の新たな保全ＰＥＧ化技術の潜在的な利点の幾つかを露わにするものである。
（ｉ）１テトラマーにつき６コピーのＰＥＧ−５０００鎖を用いたＨｂの保全ＰＥＧ化は、１０コピーのＰＥＧ−５０００鎖を用いたウシＨｂの非保全的ＰＥＧ化により与えられるものよりもより良いサイズ増大（そのハイドロダイナミック体積の増加）を与える。
（ｉｉ）保全ＰＥＧ化時にハイドロダイナミック体積を増加させる効率がより高くなることは、Ｈｂの分子表面上のＰＥＧ鎖の詰め込まれ具合がより低密度であることを示唆する。このことは、該Ｈｂ分子の周りにＰＥＧ鎖により生成された新たな水和殻（水が満たされた殻）中のＰＥＧの計算された分子密度に一致している。
（ｉｉｉ）保全ＰＥＧ化技術は、非保全的ＰＥＧ化よりもより効率的に粘度および浸透圧を上昇させる。この比較が、Ｈｂに共有結合されたＰＥＧ−５０００鎖に関して規格化されると、このようになる。このことは、ＰＥＧによる表面修飾に関連した粘度変化を求めることにおける、ＰＥＧ化によりＨｂの周りに生成された新たなＰＥＧ殻中のＰＥＧの分子密度の潜在的な役割、ならびに、それらの非高血圧性Ｈｂ分子を生成させる性向を示唆する。
【００６５】
Ｈｂ主体の酸素運搬体の早期のデザインは、低酸素親和性を持つように、赤血球の酸素親和性を模倣することを試みてきていた。Ｅｎｚｏｎにより生成されたＰＥＧ化ＨｂへのウシＨｂの選択は、低酸素親和性を有する最終生成物を与えるはずであった。ウシＨｂの酸素親和性が非保全ＰＥＧ化時に増加したが、本保全ＰＥＧ化Ｈｂの酸素親和性は、ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂのそれよりも、顕著により高かった。自己制御理論では、低酸素のＨｂ主体の酸素運搬を伴って点滴される場合、循環の動脈側における酸素の供給超過の帰結として、血管収縮が起きる。それは、血管収縮が、このＨｂ主体の酸素運搬体の酸素親和性を増加させることにより抑制され得ることを、予見する。（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂＡの酸素親和性はＥｎｚｏｎＰＥＧ−Ｈｂよりもより高く、６コピーのＰＥＧ−５０００鎖のみを有する本保全ＰＥＧ化Ｈｂの非高血圧性の態様は、本保全ＰＥＧ化Ｈｂよりも僅かにより低い酸素親和性を持つ該ＥｎｚｏｎＰＥＧ−Ｈｂ中の１０コピーのＰＥＧ−５０００のそれと比較して、本調製物のそのより高い酸素親和性の寄与の反映であるかも知れない。従って、我々は、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの非高血圧性は多要因による現象であり、多数種のＨｂのデザインを必要とするものと推察するが、これは、Ｈｂの物性もしくは機能性の内の１つだけを模倣して、これらの分子の血管活性を確立するものである。
【００６６】
（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂ、つまり本保全ＰＥＧ化Ｈｂは、非細胞性Ｈｂの血管活性を最小化するために必要とされた年月に亘って進展されてきた属性の多くを持っている：
（ｉ）血管活性な小動脈における非細胞性Ｈｂによる酸素放出を制限する、Ｈｂの増加した酸素親和性；
（ｉｉ）毛細血管床における酸素放出を保証する、協調的結合の保持；
（ｉｉｉ）血管外遊出を抑制する、増大した分子サイズ（ハイドロダイナミック体積）；
（ｉｖ）小動脈壁上に適切な剪断ストレスを作り出し、かつ、酸素、二酸化炭素、および／またはＮＯの、オキシＨｂに関しての拡散定数を低下させる、Ｈｂ溶液粘度の増加；ならびに
（ｖ）従来の修飾Ｈｂよりも増加したコロイド圧。これは、多くの血漿増強剤の処方においてデザインされた特徴である、血漿増強剤としての代替血液の効果を増強させる。
このため、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂが来ないとの観察は、１つの驚きである。
【００６７】
この分子を作る（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂに与えられた種々の物性パラメーターや機能性の同一性は、この段階では明らかでないが、この新たな保全ＰＥＧ化Ｈｂは、Ｈｂ主体の酸素運搬体を開発する従来のデザイン戦略から離れた新たなクラスのＨｂ主体の酸素運搬体の一員として考慮されるべきである。１揃いの総括的特性および酸素親和性を与えること自体が、該Ｈｂ分子を非高血圧性とするのに充分でないということも、ここに特記されるべきである。Ｍａｎｊｕｌａらにより最近示されたように（２００３年）、高酸素親和性［（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂのそれに比較し得る酸素親和性］ＰＥＧ化Ｈｂ［Ｃｙｓ−９３（β）において部位特異的にＰＥＧ化］の分子体積を増加させるに連れ、その粘度およびその浸透圧は増加したが、Ｈｂの持つ血管活性においては有意な変化は全くなかった。一方、１テトラマーにつき、（ＰＥＧ２０）２−Ｈｂよりもより小さな総分子量のＰＥＧ鎖を持っている（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂは、非高血圧性である。２コピーのＰＥＧ−２０Ｋにより与えられるものに比して、６コピーのＰＥＧ−５Ｋ鎖によるＨｂの分子表面のより良い遮蔽が、恐らくこの観察に関しての最良の説明である。このことは、Ｈｂの分子表面上のこれらのＰＥＧ−５Ｋ鎖のポジショニングが、Ｈｂの分子表面の遮蔽を達成するのに何らかの役割を演じるのか否かに関する重要な問題を提起し、もしそうならば、これが、イミノチオランによるＨｂのチオール化により寄与されるものであるかも知れない。イミノチオランによりチオール化されたＨｂの部位の同定、ならびに、よく定まったコピー数のＰＥＧ−５０００鎖を用いた部位特異的ＰＥＧ化Ｈｂの調製は、該ＰＥＧ化反応のこの態様への洞察を得るのに決定的なものである。前記ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂ、つまり非高血圧性Ｈｂの最初の例は、１０本のＰＥＧ鎖を有しているクラスのＰＥＧ化体に属しているので、非保全的プロトコールがＰＥＧ化Ｈｂを生成するのに使用される場合、より高レベルでのＨｂのＰＥＧ化が非高血圧性Ｈｂを生成するのに必要とされるのかどうか、ならびに、何処がＰＥＧ化、非高血圧性Ｈｂを生成するのに必要とされる酸素親和性の最適レベルであるのかについても、明らかでない。
【００６８】
ＰＥＧ−５０００鎖を用いた、上記分子のイミノチオランによるチオール化による、ＰＥＧマレイミド主体の表面修飾は、Ｈｂ主体の酸素運搬体の開発における現在の主要な障害、つまり非細胞性Ｈｂの高血圧活性を、克服した。ここで開発されたＰＥＧ化技術は非常に簡潔であり、オキシ条件下に実施され得、そして結果得られるＰＥＧ化Ｈｂを単離するための厄介なクロマトグラフィーによる精製プロトコールを含まない。本デザイン、つまりこの「保全ＰＥＧ化技術」では、特にアシル化反応との比較において、その副反応を最小化させるための特別な考慮がなされたが、ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂを開発するのには、前記した非保全的ＰＥＧ化反応が使用された。イミノチオランによるＨｂのε−アミノ基のアミジン化の選択性、ならびに、活性エステルもしくは無水物を使用するそのαおよびε−アミノ基のアシル化よりも顕著により高い高効率な誘導体化は、この新たなＰＥＧ化プロトコールの有利な態様の内の１つである。イミノチオランおよびＰＥＧ−マレイミドの安定性は、コハク酸イミドの活性エステルおよびＰＥＧ−酸の酸無水物よりも顕著により高い。従って、イミノチオランによる該保全チオール化による与えられた数のＰＥＧ鎖の導入に必要とされる過剰のＰＥＧ−マレイミドは、より早期の型の非高血圧性ＰＥＧ化Ｈｂを生成するのに使用された非保全的ＰＥＧ化プロトコールにおいて必要とされると思われるものよりも、顕著により少ないであろう。この技術による非高血圧性Ｈｂ分子の産生は、複雑な脱酸素化設定を必要としない。従って、新たな本ＰＥＧ化技術は、非高血圧性Ｈｂを生成させるのに、非常にコスト効率的である。
【００６９】
【表１】
2006514652.tif 000002
【００７０】
【表２】
2006514652.tif 000003
【００７１】
これらのサンプルの酸素親和性は、Ｈｅｍ−Ｏ−ｓｃａｎを使用して、ｐＨ７．４、３７℃において、５０ｍＭのＢｉｓ−ｔｒｉｓ／５０ｍＭのｔｒｉｓアセテート中において求められた。ここでのタンパク質濃度は、０．６ｍＭ程度に維持された。これらの分析されたサンプルは、２％未満のｍｅｔＨｂを持っていた。
【００７２】
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【００７３】
本明細書において以上に述べた全ての刊行物は、発行された特許であっても、係属中の出願であっても、出版物であっても、もしくはその他であっても、それらの全体をもって、ここに援用される。以上の本発明は、明確性および理解目的のために、ある程度詳細に記載されてきたが、その開示からは当業者によって、形態および詳細における種々の変更が、添付の請求項における本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、イミノチオランによるチオール化による、マレイミドの化学主体の、ＨｂのＰＥＧ化のスキーム表示を提供するものである。      Ａ：これは、該ＰＥＧ化反応の第１相（段階）である該チオール化を簡潔に描いたものであり、このチオール化されたタンパク質に対してマレイミド化されたものとして官能基化されたＰＥＧ鎖の共役を描いたものである。リンクした該ＰＥＧ鎖は、中央のタンパク質（Ｈｂ）のコアから突き出たアームとして描かれている。      Ｂ：Ｈｂのεアミノ基とのイミノチオランの反応により生成される、γ−メルカプトブチルアミジニル部分。
【図２Ａ】図２Ａは、チオール化による、ＰＥＧ−マレイミド主体の、ＨｂのＰＥＧ化を描いたものである。マレイドフェニルＰＥＧ−５０００と共にインキュベートした際の、Ｈｂのサイズ増大に及ぼすイミノチオランの影響。Ｈｂ（テトラマー０、０．５ｍｍ）がｐＨ７．４のＰＢＳ中において、１０ｍＭのマレイドフェニルＰＥＧ−５０００と共に、４時間、４℃において、濃度既知のイミノチオラン存在下もしくは非存在下に、インキュベートされる。生成物は、連続して接続された２つのＳｕｐｅｒｏｓｅカラムを使用するＦＰＬＣによる分子篩により分析された。該カラムは、０．５ｍＬ／分の流速のＰＢＳにより溶出された。ＨｂＡ、（ＰＥＧ５Ｋ）２−Ｈｂ、（ＰＥＧ１０Ｋ）２−Ｈｂ、および（ＰＥＧ２０Ｋ）２−Ｈｂの溶出部分がガイド用としてマークされ、ＰＥＧ鎖の該共役に伴う該Ｈｂ分子のサイズ増大を追跡する。        １：コントロールのＨｂ。        ２：イミノチオラン非存在下に４時間、１０ｍＭのマレイドフェニルＰＥＧ−５０００と共にインキュネートされたＨｂＡ。        ３：１ｍＭのイミノチオラン（２モル倍過剰）存在下でのＰＥＧ化。        ４：２．５ｍＭのイミノチオラン（５モル倍過剰）存在下でのＰＥＧ化。        ５：５ｍＭのイミノチオラン（１０モル倍過剰）存在下でのＰＥＧ化。          Ｈｂを１０倍モル過剰に上回るイミノチオラン存在下でのＨｂのチオール化の速度論が、内部図ａに与えられる。内部図ｂは、Ｈｂを過剰に上回るイミノチオランのモル比の関数として、４時間のインキュベート後のＨｂのチオール化の進展を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、チオール化による、ＰＥＧ−マレイミド主体の、ＨｂのＰＥＧ化を描いたものである。温度、ＰＥＧ−マレイミド中のＰＥＧの分子サイズ、およびリンカーの化学（ＰＥＧとマレイミド部分との間のリンカー）の、Ｈｂのサイズ増大に及ぼす影響。全てのＰＥＧ化反応は、室温において４時間および４℃において終夜、１０倍モル過剰のイミノチオランおよび２０倍モル過剰のＰＥＧ−マレイミドを使用して、実施される。このサイズ増大は、Ａにおいて説明した分子篩によりアッセイされた。        ａ：ＨｂＡ；        ｂ：該ＰＥＧマレイミドとしてＭａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ−５０００を使用した、室温での反応；        ｃ：Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ−１０，０００を使用した、ｂと同様の反応；        ｄ：ｂと同様であるが、終夜４℃において実施された反応；        ｅ：ｄと同様であるが、該ＰＥＧマレイミドとしてマレイミド−エチル−ＰＥＧ−５０００を使用して実施された反応。
【図３】図３は、Ａｃｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒを使用した分子篩による（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの精製を描いたものである。この準備段階の規模での実験は、１８０ｍｇのロード量を用いて実施された。その溶出は、図２の分析段階の規模での実験においてなされたように、ＰＢＳを用いて実施された。そのＰＥＧ化は４℃において実施され、１０倍モル過剰のイミノチオランおよび２０倍モル過剰のＭａｌ−Ｐｈｅ−ＰＥＧ−５０００を使用した。内部図は、この精製された（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの分子サイズを、他のＰＥＧ化ＨｂのそれおよびααフマリルＨｂのそれと比較するものであり、このααフマリルＨｂは１種の分子内架橋したＨｂであり、ビスマレイドフェニルＰＥＧ−６００を使用して、内部架橋してテトラマーとなっている。このサンプルは、テトラマー（４量体）、オクトマー（８量体）、ドデカマー（１２量体）、およびドヘキサマー（１６量体）形態のααフマリルＨｂの位置をマークするのを補助するものである。      １：内部架橋してテトラマーとなったααフマリルＨｂ。      ２：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２分離カラム上で精製された（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂ。      ３：ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂ；（ＰＥＧ５Ｋ）１０−Ｈｂ。      ４：ＡＰＥＸ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰＥＧ化Ｈｂサンプル、（ＰＥＧ３Ｋ）１０−Ｈｂ。
【図４】図４は、（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂのＮＭＲスペクトルを描いたものである。
【図５】図５は、ＰＥＧ化Ｈｂの粘度を、タンパク質濃度の関数として描いたものである。塗りつぶされていない丸は（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂを表し；塗りつぶされたダイヤモンド型は前記ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂを表し；塗りつぶされていない３角形は（ＰＥＧ５Ｋ）２−Ｈｂを表している。
【図６】図６は、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂのコロイド浸透圧を、タンパク質濃度の関数として描いたものである。塗りつぶされていない３角形は（ＰＥＧ５Ｋ）２−Ｈｂを表し；塗りつぶされていない丸は（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂを表し；塗りつぶされた丸は（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂを表しているが、これは再度透析されて、このサンプルが如何なる遊離のＰＥＧ試薬も有さないことを、確実にされている。塗りつぶされたダイヤモンド型は前記ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂを表す。該ＥｎｚｏｎＰＥＧ化Ｈｂおよび（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂのコロイド浸透圧は比肩し得るものであることが、特記される。
【図７Ａ】図７Ａは、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの血管活性を描いたものである。平均動脈圧。最大負荷１０％の４ｇｍ％の（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂを点滴された後のハムスターのものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂの血管活性を描いたものである。当該ハムスターが、最大ロード１０％の（ＰＥＧ５Ｋ）２−Ｈｂおよび（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂを点滴された後の、時間の関数としての該動脈の直径。
【図８】図８は、ハムスターが（ＰＥＧ５Ｋ）６−ＨｂとααフマリルＨｂとにより５０％交換輸血された後の当該ハムスターの機能毛細血管密度の、コントロールのそれとの比較を描いたものである。（ＰＥＧ５Ｋ）６−Ｈｂにより交換輸血された前記ハムスターの動脈の直径が、該コントロールのサンプルのそれと比肩し得るものであることが、特記される。一方、ααフマリルＨｂにより５０％交換輸血されたハムスターのそれは、該コントロールのそれよりも狭い。また、これら２つのサンプルにより交換輸血された毛細血管密度における違いも、特記される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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