(57)【要約】基体（例えばポリマー）又は固体担体（例えば、ガラス）の表面に共有結合した１つ以上の生体分子結合化合物を有し、該生体分子結合化合物が生体分子との可逆的共有結合を可能にすることを特徴とする、該基体及び／又は固体担体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表面を有する基体；（ｂ）該基体の表面に共有結合した無水マレイン酸生体分子結合化合物を含む生体分子捕捉デバイスであって、該無水マレイン酸生体分子結合化合物が１時間未満の目標生体分子の結合半減期及び１時間未満の目標生体分子の放出半減期を有する生体分子捕捉デバイス。
【請求項２】
該基体が、表面に露出反応部位を有するポリマーを含む、請求項１記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項３】
該基体が、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、デキストラン、セルロース、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、アガロース、アミノヘキシルアガロース、アミノドデシルアガロース及びガラスのうちの１つ以上を含む、請求項２記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項４】
該基体がアミノヘキシルアガロース又はアミノドデシルアガロースを含む、請求項２記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項５】
該無水マレイン酸生体分子結合化合物が無水ジアルキルマレイン酸を含む、請求項１記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項６】
該無水マレイン酸生体分子結合化合物が無水ジメチルマレイン酸、無水メチルエチルマレイン酸、又は無水ジエチルマレイン酸を含む、請求項１記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項７】
固体担体を含む、請求項１記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項８】
目標生体分子がアミン含有化合物を含む、請求項１記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項９】
該アミン含有化合物がタンパク質を含む、請求項８記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項１０】
溶液から目標生体分子を取り出して、回収する方法であって、
（ａ）１つ以上の目標生体分子を含有する溶液を、表面を有する基体及び該基体の該表面に共有結合した１つ以上の無水マレイン酸生体分子結合化合物を含む生体分子捕捉デバイスと塩基性条件下で接触させる工程；
（ｂ）該生体分子と該生体分子結合化合物との間に、該生体分子と該生体分子結合化合物との間の結合半減期が１時間未満であるように、１つ以上の可逆的共有結合を形成する工程；
（ｃ）生体分子捕捉デバイスと、該デバイスに結合した生体分子とを洗浄して、不必要な生体分子を除去する工程；
（ｄ）該生体分子捕捉デバイスを酸性条件に暴露させ、それによって生体分子と生体分子結合化合物との間の共有結合を解消させて、該生体分子結合化合物と目標生体分子との間の放出半減期が１時間未満であるように、該生体分子捕捉デバイスから生体分子を放出させる工程；及び
（ｅ）目標生体分子を回収する工程
を含む方法。
【請求項１１】
該目標生体分子がタンパク質を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該無水マレイン酸生体分子結合化合物が、無水ジアルキルマレイン酸を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該無水マレイン酸生体分子結合化合物が、無水ジメチルマレイン酸、無水メチルエチルマレイン酸又は無水ジエチルマレイン酸を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
該生体分子結合化合物と、目標生体分子との間の結合半減期が３０分間未満である、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
該生体分子結合化合物と、目標生体分子との間の放出半減期が３０分間未満である、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
該生体分子捕捉デバイスが、ビーズ形状を有して、カラム内に存在する、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
該目標生体分子がアミン含有化合物を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
該アミン含有化合物がタンパク質を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
生体分子捕捉デバイスの製造方法であって、
（ａ）基体上に１つ以上の露出反応部位を有する該基体を用意する工程；
（ｂ）無水ジアルキルマレイン酸を用意する工程；
（ｃ）該無水ジアルキルマレイン酸の１つのアルキル基をカルボキシアルキル基に転化させる工程；
（ｄ）該カルボキシアルキル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに転化させる工程；
（ｅ）該無水ジアルキルマレイン酸を、露出反応部位を有する該基体と接触させる工程；及び
（ｆ）該基体と該無水ジアルキルマレイン酸との間に共有結合を形成する工程
を含む方法。
【請求項２０】
該基体がビーズの形態を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該基体が固体担体上に存在する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該基体が、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、デキストラン、セルロース、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、アガロース、アミノヘキシルアガロース、アミノドデシルアガロース及びガラスのうちの１つ以上を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該無水ジアルキルマレイン酸が無水ジメチルマレイン酸、無水メチルエチルマレイン酸、又は無水ジエチルマレイン酸を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
生体分子捕捉デバイスの製造方法であって、
（ａ）基体上に１つ以上の露出アミン反応部位を有する該基体を用意する工程；
（ｂ）無水マレイン酸の３位にＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル及び２位にアルキル基を有する無水ジアルキルマレイン酸を用意する工程；
（ｅ）該無水マレイン酸を、露出アミン反応部位を有する該基体と接触させる工程；及び
（ｆ）該基体と、無水マレイン酸の３位にＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル及び２位にアルキル基を有する無水マレイン酸との間に１つ以上の共有アミド結合を形成する工程
を含む方法。
【請求項２５】
（ａ）表面を有する基体；
（ｂ）該基体の表面に共有結合した無水ジアルキルマレイン酸生体分子結合化合物
を含む生体分子捕捉デバイス。
【請求項２６】
該基体がアミノヘキシルアガロース又はアミノドデシルアガロースを含む、請求項２５記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項２７】
該無水ジアルキルマレイン酸生体分子結合化合物が、無水ジメチルマレイン酸、無水メチルエチルマレイン酸、又は無水ジエチルマレイン酸を含む、請求項２５記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項２８】
該基体が、表面上に露出反応部位を有するポリマーを含む、請求項２５記載の生体分子捕捉デバイス。
【請求項２９】
該基体が、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、デキストラン、セルロース、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、アガロース、アミノヘキシルアガロース、アミノドデシルアガロース及びガラスのうちの１つ以上を含む、請求項２５記載の生体分子捕捉デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
固体担体上又はマトリックス物質（例えば、ヒドロゲル、例えば、固体担体上に存在する）内への化学結合を介しての生体分子（例えば、若干のみを挙げると、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及びタンパク質など）の固定及び分離は、分子生物学研究（例えば、ＤＮＡ合成、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列決定、遺伝子発現の分析、及び創薬など（ただし、これらに限定されない））の非常に重要な局面になってきている。
【０００２】
しかし、分析のためのタンパク質の調製に関連した主要な問題の１つは、塩、核酸及び脂質など（ただし、これらに限定されない）の妨害化合物の存在である。したがって、妨害化合物からタンパク質を分離するために、ある一定の方法が開発されている。
【背景技術】
【０００３】
無水マレイン酸及び無水２，３−ジメチルマレイン酸を用いる、アミノ基の可逆的なブロッキングはDixon et al.による論文、Biochemical Journal,109:312-314(1968)に考察されている。同様な反応は、Atassi et al.による論文、Methods in Enzymology,49:546-553(1972)においても考察されている。
【０００４】
Kinsella et al.からの２つの特許（米国特許第４，１６８，２６２号と第４，３４８，４７９号）と、同じグループからの２つのテクニカル・レポート（Shetty et al.,Biochemical Journal,191:269-272(1980); Shetty et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,30:1166-1172(1982)）は、核タンパク質複合体から、バルクで(in bulk)、微生物タンパク質を分離する方法を教えている。この方法は、界面活性剤及び変性試薬の不存在下での物理的手段によるバイオマスの破壊を含む。これに続いて、細胞残屑を除去するための遠心分離、無水シトラコン酸若しくは無水マレイン酸のような有機ジカルボン酸無水物による水溶性のタンパク質様物質−核酸混合物の誘導体化、及び誘導体化タンパク質（遠心分離によって不溶性細胞残屑を除去したもの）のｐＨ４．０〜４．５における等電沈殿を行なう。次に、ブロッキングＮ−アシル基を酸性ｐＨでの加水分解によって除去し、該タンパク質溶液を透析して、塩を除去し、核酸が失われたバルクタンパク質(nucleic acid-depleted bulk proteins)を凍結乾燥又は等電沈殿によって単離する。Kinsella et al.の２つの特許及びShetty et al.のテクニカル・レポートの目的は、沈殿反応からヒトの消費のために適した形で、バルク微生物タンパク質を単離することである。Ｎ−アシル化工程の目的は、微生物核酸汚染物質(microbial nucleic acid contaminants)から目標バルクタンパク質を分離することである。
【０００５】
担体又は他の表面にタンパク質を可逆的に結合させるために有用なデバイスは、Rockford,IL.に存在するPierce Biotechnology Inc.から商業的に入手可能なReacti-Bind（登録商標）無水マレイン酸プレートである。無水マレイン酸を基体に結合させ、次に、これを用いて、環境ｐＨを変えることによって、タンパク質に可逆的に結合することができる。Reacti-Bind（登録商標）プレートの結合及び放出の動力学は、典型的におよそ数時間程度を要する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、迅速で、効果的なタンパク質単離に適した組成物の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
一実施態様では、本発明は、表面を有する基体、及び該基体の該表面に共有結合した無水マレイン酸生体分子結合化合物を含む生体分子捕捉デバイスを包含する。一実施態様では、該無水マレイン酸生体分子結合化合物は、１時間未満の目標生体分子結合半減期、及び１時間未満の目標生体分子放出半減期を有する。一実施態様では、該無水マレイン酸生体分子結合化合物は、無水ジアルキルマレイン酸を包含する。一実施態様では、該生体分子はアミン含有化合物を包含する。一実施態様では、該生体分子はタンパク質を包含する。
【０００８】
他の実施態様では、本発明は、生体分子捕捉デバイスによって、溶液から目標生体分子(desired biomolecules)を取り出して、回収する方法を包含する。該方法は、１つ以上の目標生体分子を含有する溶液を、塩基性条件下で、生体分子捕捉デバイスと接触させる工程を包含する。該生体分子捕捉デバイスは、表面を有する基体、及び該基体の該表面に共有結合した１つ以上の無水マレイン酸生体分子結合化合物を包含する。次に、該方法は、該生体分子と該生体分子結合化合物との間に１つ以上の可逆的共有結合を、該生体分子結合化合物と目標生体分子との間の結合半減期が１時間未満であるように、形成する工程を包含する。次に、該生体分子捕捉デバイス及び同デバイスに結合した生体分子を洗浄して、不必要な生体分子を除去することができる。
【０００９】
次に、生体分子捕捉デバイスと、それに結合した又はカップリングした(coupled)生体分子とを酸性条件に暴露させ、それによって、該生体分子と生体分子結合化合物との間の共有結合を解消させて、該生体分子捕捉デバイスから該生体分子を放出させることができる。このような実施態様では典型的に、生体分子結合化合物と目標生体分子との間の放出半減期は１時間未満である。生体分子が放出された後に、生体分子を回収及び／又は単離することができる。
【００１０】
発明の詳細な説明
一実施態様において、本発明は、生体分子の単離に関する。好ましくは、該生体分子は、アミンを含む。一実施態様では、該アミン含有化合物はタンパク質である。
【００１１】
典型的に、例えばアミン含有化合物（例えば、タンパク質）のような生体分子の単離は、時間のかかるタンパク質沈殿及び洗浄方法によって達成されている。洗浄後に、次に、生体分子を分析のために再溶解することができる。残念ながら、生体分子の全てが完全に沈殿するとは限らず、生体分子の全てが完全に再溶解するとは限らない。さらに、洗浄方法は、例えば不必要な核酸、塩、脂質及びその他の細胞残屑のような、かなりの量の好ましくない物質を除去することができない可能性がある。それ故、目標生体分子のかなりの量が失われるか又は分析するのが困難になる恐れがある。
【００１２】
さらに、大抵の生体分子（例えば、タンパク質）は非共有結合事象に利用可能な非常に広範囲の化学的特徴を有するので、他の単離及び分離方法では生体分子（例えば、タンパク質）との非共有結合相互作用が関与する。しかし、これらの非共有結合方法のいずれも、細胞又は溶液中の全て又は実質的に全ての生体分子（例えば、タンパク質）種を捕捉することはできない。
【００１３】
本発明は、溶液から例えばアミン含有化合物（例えば、タンパク質）のような生体分子を迅速に回収し、単離するために適した組成物及び方法を包含する。本発明は、リバーシブル・マトリックス(reversible matrix)上に生体分子（例えば、タンパク質）を捕捉する。該マトリックスと生体分子との間に可逆的共有結合を形成することによって、汚染物質を除去するための大規模な洗浄後に、高い割合の生体分子をマトリックス上に保持することができる。この場合、該マトリックスと生体分子との間の結合を解消させて、捕捉されたタンパク質を放出させることができ、該タンパク質を単離することができ、それによって、生体分子の分析の精度と効率を改善することができる。
【００１４】
本発明の組成物は、２つの成分：（１）単離すべき目標生体分子（例えば、タンパク質）との接触に適し、他の化合物と共有結合を形成することができる基体又は表面；及び（２）該基体の表面に付着した又は結合した１つ以上の生体分子結合化合物を含み、この場合、該生体分子結合化合物は生体分子と可逆的な共有結合を形成することができる。これらの成分の各々については、以下でさらに説明する。アミド結合が関与する幾つかの実施態様においては、注目すべきは、基体と生体分子結合化合物との間の共有結合の強度が、典型的に、該生体分子結合化合物と該生体分子との間の結合の強度に等しいことである。
【発明の実施の形態】
【００１５】
１．基体
本発明は、無機結晶、無機ガラス、無機酸化物、金属、及び／又はヒドロゲルなど（ただし、これに限定されない）のポリマー、及び／又はポリマーヒドロゲル・アレイ(polymer hydrogel arrey)を包含する基体の使用を含み、該基体の各々は、以下でさらに詳述する、生体分子結合化合物の結合のための１つ以上の反応部位を含有する。一実施態様では、反応部位は、以下でさらに述べるように、基体と生体分子結合化合物との間に共有アミド結合が形成されうるような、露出アミノ基（ただし、これに限定されない）を包含することができる。
【００１６】
１（ａ）．本発明によって用いる基体
望ましくは、本発明に用いるために適した基体は、ポリマー基体又は“ポリマー”である。適当なポリマーは、アミノ基と共に用いるために及び／又はタンパク質と共に用いるために適した親水性ポリマーなど（ただし、これに限定されない）の任意のポリマー又はポリマー混合物であることができる。ある一定の実施態様では、基体は、下記ポリマー：ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上を包含しうる。
【００１７】
該基体は、コラーゲン、デキストラン、セルロース、セルロース誘導体、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、アミノヘキシルアガロース及びアミノドデシルアガロースなど（ただし、これらに限定されない）のアガロース、及びガラスを包含するリストから選択される１種類以上の物質であることができる。
【００１８】
上記基体のいずれも、基体であるという理由で適当な反応部位がまだ利用可能でないならば、当該技術分野に知られた方法を用いて、化学的に修飾して、生体分子結合化合物の結合のための適当な反応部位を与えることができる。
【００１９】
１（ｂ）．基体の形状及び適用
上記ポリマーの１種類以上を、生体分子結合化合物の結合のための１つ以上の反応部位が露出された状態で留まるという条件で、任意の規則的な又は不規則な形状に成形することができる。
【００２０】
１（ｂ）１．任意に選択可能な固体担体
一実施態様では、上記ポリマーを任意に選択可能な“固体担体”に適用することもできる。本発明による“固体担体”は任意のタイプの固体担体であることができる。一実施態様では、固体担体は親水性であることができる。
【００２１】
固体担体を本発明の一部として含める場合に、幾つかの実施態様では、固体担体は、ナイロン、ポリスチレン、ガラス、ラテックス、プラスチック、ポリプロピレン、及び活性化セルロース（ただし、これらに限定されない）を包含する群から選択される物質である。この他の物質には、フィルム、シリコン、修飾シリコン、セラミック、プラスチック、他の適当なポリマー、例えば（ポリ）テトラフルオロエチレン又は（ポリ）ビニリデンジフルオリドが含まれる。
【００２２】
該固体担体は、任意の形状又はサイズであることができ、分離した存在として又は任意の装置(apparatus)の一体部分（例えば、ビーズ、キュベット、プレート、容器等）として存在することができる。さらに、固体担体（例えば、ガラス）に適当な処理を行なって、上記ポリマーの１種類以上を該固体担体の表面上に、例えばγ−メタクリル−オキシプロピル−トリメトキシシラン（“Bind Silane”,Pharmacia)によって、又は他の適当な手段によって付着させて、ポリマーが固体担体上に存在するようにすることが想定される。一実施態様では、固体担体へのポリアクリルアミド・ヒドロゲルの共有結合は、ヨーロッパ特許出願０２２６４７０（本明細書に援用される）に記載されているように、行なうことができる。
【００２３】
一実施態様では、生体分子結合化合物は基体に結合し、該基体は、生体分子結合化合物の基体への結合前、結合後又は結合中のいずれかに固体担体に適用される。他の実施態様では、基体を用いないで、生体分子結合化合物を固体担体に直接結合させることができる。
【００２４】
１（ｂ）２．形状
望ましくは、該ポリマー及び／又は固体担体（存在する場合）は、ビーズ若しくはミクロスフェア、メッシュ、膜、マイクロウェル、遠心分離管、及びプレート若しくはスライドから成る群から選択される物質である（即ち、形として存在する）。
【００２５】
精製コラーゲンを含むとして記載されるミクロスフェアの市販品の例は、ICN Collagen Beads及びCellex Biosciencesマクロ多孔質ミクロスフェアを包含する。適当なミクロスフェアは多孔質又は平滑なコンシステンシーを有することができ、典型的には、約０．１〜２ｍｍの直径のほぼ球形を有する。もちろん、任意の特定のロット又は調製品から入手されるミクロスフェアの形状及びサイズは、製造の許容誤差の範囲内で変化する。適当なアガロース・ビーズは、Sigma-Aldrich Chemical Corp.St.Louis,MO.から容易に入手することができる。
【００２６】
２．生体分子結合化合物
生体分子結合化合物は、生体分子と可逆的な共有結合を形成する、任意の化合物であることができる。本明細書で用いる限り、“生体分子”は、例えばアミノ酸及びタンパク質のような任意のアミン含有化合物並びに核酸及び脂質（ただし、これらに限定されない）を包含する。ある一定の実施態様では、生体分子結合化合物は、典型的に、上述したような共有結合によって担体にカップリングして、それでもなお、生体分子と可逆的な共有結合を形成する能力を保持することができる。ある一定の実施態様では、生体分子結合化合物は、以下で述べるような、望ましい生体分子結合及び放出特性を有する無水マレイン酸化合物を包含する。一実施態様では、該無水マレイン酸は無水ジアルキルマレイン酸を包含する。
【００２７】
典型的に、１つ以上のアルキル基を無水マレイン酸に、該分子の“２”及び“３”位にカップリングさせて、図１に示すように、無水ジアルキルマレイン酸を形成することができる。したがって、本発明の一実施態様では、生体分子結合化合物は無水ジアルキルマレイン酸を包含する。
【００２８】
一実施態様では、本発明は、第１アルキル基を分子の“２”位に、第２アルキル基を“３”位に有する無水マレイン酸を包含する。Ｒ２と表される、“２”位におけるアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチル基など（ただし、これらに限定されない）のアルカン、並びにアルケン及びアルキンなどの不飽和アルキル基を包含する、任意のアルキル基であることができる。ベンジル官能基などの他のアルキル基は当該技術分野で周知である。官能基はさらにヒドロキシル基、並びにOrganic Chemistry,3rd Ed.,John McMurray,Brooks/Cole Publishing Co.(1992)（これの全内容は本明細書に援用される）に記載されているような官能基であることもできる。
【００２９】
Ｒ１と表される、分子の“３”位における他方のアルキル基も、上記Ｒ２基に関して述べたような、任意のアルキル基であることができ、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチル化合物から選択することができるが、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチル基など（ただし、これらに限定されない）のアルカン、並びにアルケン及びアルキンなどの不飽和アルキル基を包含する、任意のアルキル基であることもできる。しかし、Ｒ１は、以下で説明するような、Ｒ１基への任意の修飾の前又は後のいずれかに、基体及び／又は担体の露出反応部位と共有結合を形成することができる基であるべきである。
【００３０】
さらに他の実施態様では、無水ジアルキルマレイン酸化合物は、無水２，３−ジメチルマレイン酸；無水２−メチル，３−エチルマレイン酸；無水２，３−ジエチルマレイン酸；及びこれらの誘導体を包含する。一実施態様では、無水ジアルキルマレイン酸は無水２，３−ジメチルマレイン酸である。無水マレイン酸及び無水ジメチルマレイン酸は、Sigma-Aldrich Chemical Co.,St.Louis,MO.から入手することができる。
【００３１】
３．本発明の組成物の製造方法
無水マレイン酸を担体にカップリングさせるために、上記無水マレイン酸の１種類以上を化学的に修飾して、無水マレイン酸の誘導体を形成することができる。このような誘導体は、以下でさらに説明するように、該誘導体と基体及び／又は担体との間に共有結合を形成するために適したような誘導体を包含する。一実施態様では、無水マレイン酸を担体及び／又は基体に、該基体及び／又は担体上の露出反応部位を介してカップリングさせて、本発明のデバイスを形成する。
【００３２】
一実施態様では、上記無水ジアルキルマレイン酸など（ただし、それらに限定されない）の無水ジアルキルマレイン酸を化学的に修飾して、図１に示すように、無水２−アルキル−３−カルボキシアルキルマレイン酸誘導体を形成することができる。次に、同様に図１に示すように、カルボキシアルキル（又はカルボキシル）基を化学的に修飾して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを形成することができる。次に、該ＮＨＳエステルを、露出反応部位、例えば露出アミノ基を有する、任意の適当な基体及び／又は担体と接触させて、無水ジアルキルマレイン酸と該基体との間に結合を形成することができる。生体分子結合化合物の可逆的な結合特性は、基体への結合によって、せいぜい最低限に影響されるに過ぎない。幾つかの好ましい実施態様では、無水ジアルキルマレイン酸の“２”炭素原子と“３”炭素原子との間に存在する二重結合が除去されるのを防止するように注意すべきである。
【００３３】
他の実施態様では、生体分子結合化合物として、無水ジメチルマレイン酸を用いることができる。“３”位におけるメチル基を化学的に修飾して、図１を参照して示す、下記工程によってカルボキシアルキル基を形成することができる。工程（ｉ）では、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、過酸化ベンゾイル、ＣＣｌ４を無水ジメチルマレイン酸（１）と約１０時間接触させることができる。次に、ジメチルマロネート、ＮａＨ及びＣ６Ｈ６を該化合物と、約８時間接触させることができる。次に、ＨＣｌを加えることができ、任意の反応を約１２時間進行させ、それによって、無水２−メチル，３−カルボキシメチルマレイン酸（２）を形成することができる。
【００３４】
次に、カルボキシメチル基を化学的に修飾して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル（３）を形成することができる。工程（ｉｉ）では、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）及びＤＭＦを無水２−メチル，３−カルボキシメチルマレイン酸（２）と約３０分間接触させて、ＮＨＳエステル（３）を形成することができる。
【００３５】
工程（ｉｉｉ）では、ＮＨＳエステル（３）を基体（４）の露出反応部位とｐＨ約７で約１２時間接触させ、それによって、該無水物と該基体（４）との間にアミド結合を形成し、このようにして、本発明のデバイス（５）を形成することができる。
【００３６】
無水マレイン酸の反応性のために、該担体への生体分子結合化合物の共有結合は、無水マレイン酸の化学的修飾部分と該担体の露出反応部位との間の結合形成にとって有利であるが、該無水物と露出反応部位との間の結合形成には有利ではない条件下で、生じるべきである。一実施態様では、露出アミン反応部位へのＮＨＳエステルの共有カップリングは、ｐＨ約７で生じる。
【００３７】
上記方法は、反応条件、接触持続時間、カルボキシル基の長さ、アルキル基、基体上の利用可能な反応部位の量等の観点から必要に応じて、又は要望通りにさらに最適化することができる。
【００３８】
４．使用方法
基体に共有結合した生体分子結合化合物を有する該基体は、溶液から１つ以上の目標生体分子を分離するために用いることができる。一実施態様では、生体分子は任意のアミン含有化合物を包含する。一実施態様では、生体分子は少なくとも１つのリシンを含有する。他の適当な生体分子は、アミノ酸、タンパク質、核酸又は脂質を包含することができる。好ましい実施態様では、生体分子はタンパク質を包含する。本明細書でさらに述べるように、生体分子は主としてタンパク質として表現されるが、本発明の範囲をこれに限定すべきではない。
【００３９】
本発明の実施態様において、担体に結合する無水ジアルキルマレイン酸は、目標生体分子（例えば、タンパク質）又は他の物質を含む溶液又は他の適当な媒質からタンパク質を捕捉、取り出し及び／又は回収するために有効でありうる。
【００４０】
具体的には、基体及び／又は担体に結合した無水ジアルキルマレイン酸を、１つ以上の生体分子（例えば、タンパク質）を含有する溶液に暴露させ、又は該溶液と接触させることができる。タンパク質中のリシンアミノ酸は、最初の環境ｐＨにおいて、典型的には塩基性ｐＨにおいて無水ジアルキルマレイン酸と可逆的な共有結合を形成し、ある一定の実施態様では、ｐＨは、図２に示すように、約８．０であることができ、それによってタンパク質は結合して、捕捉される。一実施態様では、リシンは環状無水物と反応して、該アミンとカルボニル基との間にアミド結合を形成する。これにより環は開くことになり、図２に示すように、開かれた環の他方の末端のカルボキシレートを放出する。担体とそれに結合したタンパク質は、ひと度結合したならば、不必要な任意の生体分子、例えば、いずれの核酸及び／又は脂質及び／又は塩をも除去するように、強度に洗浄し、クリーンにすることができる。ひと度クリーンにしたならば、本明細書の開示に関して当該技術分野で理解されているような方法を用いて、該環境ｐＨを、第一のｐＨとは異なる第二のｐＨに調節することによって、該生体分子結合化合物と該タンパク質との間の共有結合を解消させて、結合されたタンパク質を放出させることができる。典型的に、第二のｐＨは第一のｐＨよりも低く、さらに典型的には、第二のｐＨは酸性ｐＨであり、ある一定の実施態様では、第二のｐＨは、図２に示すように、約６．０であることができる。
【００４１】
捕捉ｐＨ及び放出ｐＨが、用いる特定の生体分子結合化合物に依存し、場合によっては、結合時の環境ｐＨが放出時の環境ｐＨよりも低くなりうることは、注目すべきである。このような結合ｐＨ及び放出ｐＨを測定することは、当業者の能力の範囲内であり、該ｐHは典型的には約３〜１１である。
【００４２】
次に、当該技術分野で周知の方法、例えば、溶出を用いて、基体からタンパク質を取り出し及び／又は回収することができる。結合及び取り出しは任意の温度で行なうことができるが、約１０〜３５℃の範囲内の温度、典型的には約２５℃を用いることができる。本発明の他の実施態様では、結合及び取り出しは室温で行なわれる。
【００４３】
一実施態様では、捕捉及び／又は保持段階（例えば、第一の環境ｐＨにおいて）中に、本発明の基体に結合した生体分子結合化合物は、溶液中の総タンパク質の少なくとも１０％〜９９％を捕捉及び／又は保持することができる。他の実施態様では、溶液中の総タンパク質の少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を捕捉及び／又は保持することができる。他の実施態様では、本発明は、溶液中の総タンパク質の少なくとも９５％から９９％までを捕捉及び／又は保持することができる。生体分子結合化合物への生体分子の結合は、典型的に、利用可能な結合部位の総数に依存する。本発明の一実施態様では、結合のために有効な総リシンの典型的に約２〜１０％、さらに典型的には２〜５％、又は生体分子（例えば、タンパク質）につき約１個のリシンが結合することができる。
【００４４】
他の実施態様では、放出及び／又は回収段階中（例えば、環境ｐＨが、捕捉及び／又は保持段階中に用いられるｐＨとは異なるｐＨに変化する場合）に、本発明の生体分子結合化合物は、オリジナル溶液中の総生体分子（例えば、タンパク質）の少なくとも１０％から９９％までを放出することができ、及び／又はその回収を可能にすることができる。他の実施態様では、オリジナル溶液中の総生体分子（例えば、タンパク質）の少なくとも１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％が放出され、及び／又は回収されることができる。他の実施態様では、本発明は、オリジナル溶液中の総生体分子（例えば、タンパク質）の少なくとも９５％から９９％までを放出することができ、及び／又はその回収を可能にすることができる。
【００４５】
したがって、本発明は、溶液からの生体分子の効果的な捕捉、放出及び／又は回収を可能にする。さらに、本発明の可逆的共有結合の性質のために、該共有結合を形成し及び／又は解消させるために必要な時間量を数時間の半減期（例えば、生体分子結合化合物として無水モノアルキルマレイン酸を用いる場合には、約２時間）から数分間（例えば、約２〜３０分間）までに減ずることができる。
【００４６】
具体的には、本発明のある一定の実施態様では、溶液中のタンパク質の１／２と共有結合するために必要な時間量を、本明細書では、“結合半減期”として定義する。本発明は、結合半減期を数時間から数分間に減ずることができる。同様に、本発明のある一定の実施態様では、生体分子結合化合物に共有結合するタンパク質の１／２を放出するために必要な時間量は、放出半減期として定義される。本発明は放出半減期を数時間から数分間に減ずることができる。
【００４７】
一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、１時間未満の生体分子結合半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、４５分間未満の生体分子結合半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約３０分間未満の生体分子結合半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約２０分間未満の生体分子結合半減期を有する。さらに他の実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約１０分間未満の生体分子結合半減期を有する。さらに他の実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約５分間未満の生体分子結合半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約２分間未満の生体分子結合半減期を有する。本明細書で用いる限り、“約”なる用語は、参照値のプラス又はマイナス１０％を意味する、したがって、“約１０”は９〜１１を意味する。
【００４８】
一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約１時間未満の生体分子放出半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約４５分間未満の生体分子放出半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約３０分間未満の生体分子放出半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約２０分間未満の生体分子放出半減期を有する。さらに他の実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約１０分間未満の生体分子放出半減期を有する。さらに他の実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約５分間未満の生体分子放出半減期を有する。一実施態様では、基体に結合した生体分子結合化合物は、約２分間未満の生体分子放出半減期を有する。
【００４９】
一実施態様では、本発明は、溶液中のタンパク質の約５０％を約１０分間未満内に捕捉することができ、７５％を約２０分間未満内に、溶液中のタンパク質の約８７．５％を約３０分間未満内に捕捉することができる。他の実施態様では、本発明は、基体に共有結合したタンパク質の約５０％を約１０分間未満内に、７５％を約２０分間未満内に、基体に結合したタンパク質の約８７．５％を約３０分間未満内に放出することができる。
【００５０】
本発明は、生体分子の標識と、その後の処理又は加工のためにも用いることができる。具体的には、生体分子を基体及び／又は担体に結合させた後、洗浄前、洗浄中及び洗浄後に、生体分子が基体及び／又は担体に固定されている間に、該生体分子を例えば標識、リン酸化、ビオチニル化等によって修飾することができる。該修飾された生体分子を次に、上述したように、例えば溶出によって回収することができる。
【００５１】
さらに、生体分子によっては、特に、ある一定のタンパク質は、該タンパク質と生体分子結合化合物との間の共有結合の解消に抵抗することもできることに、注目すべきである。このタンパク質のグループは比較的小さいと予想される。
【００５２】
特定の実施態様に示した本発明に対して、大まかに(broadly)述べた、本発明の要旨及び範囲から逸脱せずに、非常に多くの変化及び／又は修飾がなされうることは、当業者によって理解されるであろう。さらに、上記で引用した参考文献の１つ１つは、あたかも本明細書に完全に記載されているかのごとく、本明細書に援用される。
【００５３】
本発明のある一定の性質を説明する下記図面を検討することによって、本発明はさらに良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明に用いるための、無水ジアルキルマレイン酸誘導体の形成及び担体への該誘導体のカップリングを示す。
【図２】図２は、本発明の組成物と、生体分子（タンパク質として表示）との間の可逆的結合反応を示し、基体への無水ジアルキルマレイン酸の一般的な結合を示し、この場合、該結合はアミド結合（これに限定されない）を包含することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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