(57)【要約】【解決手段】  この発明はペプチドに関する。具体的には、この発明は、皮膚に結合して、髪に結合しないペプチドを目的とする。あるいは、この発明は、髪に結合して、皮膚に結合しないペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に結合するペプチドであって、
前記ペプチドが（ａ）配列番号１から２４のいずれか一つ、
または（ｂ）配列番号１から２４のいずれか一つと少なくとも５０％の配列同一性を有し、
ＡＰＱＱＲＰＭＸＴＸＸＸ （配列番号２５）と、ＰＰＷＸＸＸＬ （配列番号２６）と、 ＸＸＴＸＬＴＳ（配列番号２７）と、ＸＰＰＬＬＸＬ （配列番号２８）と、 ＳＸＰＳＧＡＸ （配列番号２９）と、 ＸＱＡＴＦＸＸＮＸＸＸＸ（配列番号３０）と、ＶＸＴＳＱＬＸＸＸＸＸＸ （配列番号３１）と、 ＬＸＸＸＲＭＫ（配列番号３２）と、ＨＸＸＸＹＬＴ（配列番号３３ ）とからなる集団から選ばれる配列集団を含み、
前記ＸがあらゆるＬ−アミノ酸であることを特徴とする。
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号１から２４のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号１から２４のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有することを特徴とする。
【請求項４】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号１を含むことを特徴とする。
【請求項５】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号３を含むことを特徴とする。
【請求項６】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号５を含むことを特徴とする。
【請求項７】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号６を含むことを特徴とする。
【請求項８】
請求項１に記載の皮膚も結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号８を含むことを特徴とする。
【請求項９】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがアミノ酸配列番号１５を含むことを特徴とする。
【請求項１０】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＡＰＱＱＲＰＭＸＴＸＸＸ（配列番号２５）を含むことを特徴とする。
【請求項１１】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＸＱＡＴＦＸＸＮＸＸＸＸ（配列番号３０）を含むことを特徴とする。
【請求項１２】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＬＸＸＸＲＭＫ（配列番号３２）を含むことを特徴とする。
【請求項１３】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドであって、前記ペプチドがＣ−Ｃ誘導体を含むことを特徴とする。
【請求項１４】
請求項１に記載の皮膚に結合するペプチドのいずれか一つを含む組成物。
【請求項１５】
髪に結合するペプチドであって、
前記ペプチドが（ａ）配列番号３４から５６のいずれか一つ、
または（ｂ）配列番号３４から５６のいずれか一つと少なくとも５０％の配列同一性を有し、
ＮＴＰＸＸＮＸ （配列番号５７）と、ＰＸＸＸＬＳＴ（配列番号５８）と、ＴＸＰＴＨＲ（配列番号５９）と、 ＬＸＴＸＳＴＰ（配列番号６０）と、 ＴＰＬＴＸＸＴ（配列番号６１）と、 ＸＱＸＨＮＰＰ（配列番号６２）とからなる集団から選ばれる配列集団を含み、
前記ＸがあらゆるＬ−アミノ酸であることを特徴とする。
【請求項１６】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号３４から５６のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする。
【請求項１７】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列番号３４から５６のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有することを特徴とする。
【請求項１８】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＮＴＰＸＸＮＸ（配列番号５７）を含むことを特徴とする。
【請求項１９】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＰＸＸＸＬＳＴ（配列番号５８）を含むことを特徴とする。
【請求項２０】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＴＸＰＴＨＲ（配列番号５９）を含むことを特徴とする。
【請求項２１】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＬＸＴＸＳＴＰ（配列番号６０）を含むことを特徴とする。
【請求項２２】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＴＰＬＴＸＸＴ（配列番号６１）を含むことを特徴とする。
【請求項２３】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドであって、前記ペプチドが配列集団ＸＱＸＨＮＰＰ（配列番号６２）を含むことを特徴とする。
【請求項２４】
請求項１５に記載の髪に結合するペプチドを少なくとも一つ含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
類似した合成物のライブラリーを用いる望まないバックグラウンド・ターゲット（反標的）がある場合に、さまざまな方法が選抜、および特に標的に結合することができる合成物の同定のために用いられる。この発明は、反標的がある場合に、例えば皮膚、または髪のような標的に特に結合するペプチドを目的とする。反標的は、 標的が皮膚のときには髪であり、標的が髪のときには皮膚である。
【０００２】
この文献は、化合物、特にペプチドの豊富なライブラリー・プールを利用したスクリーニング法の先進的な実施例でいっぱいである。予め選択された標的に結びつく分子を同定する化合物のスクリーニング法は、進歩している。一つの周知な方法は、スミス・ジー・ピー（１９８５）によって最初に開発されたバイオ・パニングである（サイエンス２２８：１３１５）。その最も簡単な形式の中でバイオ・パニングは、生体外選択プロセスであり、表示されるファージ・ペプチドのライブラリーは、標的と一緒に培養される。この標的とファージは、 結合することができる。そして、結合していないファージは、洗い流される。特に、この結合したファージは、それから酸溶離される。ファージの溶離されたプールは、生体内で増幅される。そして、この方法は、繰り返される。多くの循環（ラウンド）の後に、個々の複製は、分離され、配列が決定される。
【０００３】
スミスによって最初に導入されたバイオ・パニングの多くのバリエーションは、クリスチャンほか（１９９２）ジェイ・モル・バイオル、２２７：７１１と、クイラほか（１９９０）会報全米科学アカデミー米国、８７：６３７８と、カルほか（１９９２）会報全米科学アカデミー米国、８９：１８６５と、フルスら（１９９６）ネイチャー・バイオテクノル、７：２７６と、バルトリほか(１９９８）ネイチャー・バイオテクノル、１６：１０６８とに記載され、言及されている。
【０００４】
前記フルスら（１９９６）は、完全な腫瘍細胞上のファージ抗体のフローサイトメトリに基づく減じる選択からなる方法を説明する。このファージを示された抗体は、流れ血球計算選択の間、標的に結合したままである。しかし、増幅の前に、細胞に結合したファージは、標的から溶離される。ＷＯ９８／５４３１２は、リボソームに表示される抗体ライブラリーを使用している抗原のための高い親和性を有する穏やかな状況の下で、抗体の選抜を開示する。
【０００５】
バラスほか（１９９６）は、アナル・バイオケミ、２４３：２６４に、ニトロ・ストレプトアビジン行列に固定されるビオチン化された標的を用いるファージ・ペプチド・ライブラリーからの高い親和性ファージ・ペプチドの選抜を説明する。他のターゲティング（targeting）方法には、例えば、ＳＥＬＥＸ（米国特許番号５，４７５，０９６と、ＷＯ０１／７９４７９で開示したような逆選抜（deselection）を含む選択的なターゲティングがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の形態において、この発明は、皮膚に結合するが髪に結合しないペプチドに関する。そして、第２の形態において、この発明は、髪に結合するが皮膚に結合しないペプチドに関する。
【０００７】
第３の形態において、この発明は、皮膚に結合するペプチドに関する。この ペプチドは （ａ）配列番号１から２４の中のいずれか一つを含む。または、（ｂ） 配列番号１から２４のいずれか一つの配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、ＡＰＱＱＲＰＭＸＴＸＸＸ （配列番号２５）と、ＰＰＷＸＸＸＬ （配列番号２６）と、 ＸＸＴＸＬＴＳ（配列番号２７）と、ＸＰＰＬＬＸＬ （配列番号２８）と、 ＳＸＰＳＧＡＸ （配列番号２９）と、 ＸＱＡＴＦＸＸＮＸＸＸＸ（配列番号３０）と、ＶＸＴＳＱＬＸＸＸＸＸＸ （配列番号３１）と、 ＬＸＸＸＲＭＫ（配列番号３２）と、ＨＸＸＸＹＬＴ（配列番号３３ ）とからなる集団から選ばれる配列集団を含む。ここで、ＸはあらゆるＬ−アミノ酸を示す。
【０００８】
一つの実施形態において、この発明のペプチドの中で、皮膚に結合するペプチドは、Ｃ−Ｃ誘導体を含む。特に、この発明の好適な皮膚に結合するペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと、 配列ＸＱＡＴＦＸＸＮＸＸＸＸ（配列番号３０）の配列集団を含むペプチドと、配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドと、配列ＬＸＸＸＲＭＫ（配列番号３２）の配列集団を有するペプチドと、ＡＰＱＱＲＰＭＸＴＸＸＸ（配列番号２５）の配列集団と有するペプチドとを含む。この出願の明細書において開示するように、他の実施形態において、この発明は、一つ以上の皮膚に結合するペプチドからなる組成物に関する。
【０００９】
第４の形態において、この発明は、髪に結合するペプチドに関する。このペプチドは 、（ａ）配列番号３４から５６のいずれか一つを含む。または、（ｂ） 配列番号３４から５６の中のいずれか一つの配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、ＮＴＰＸＸＮＸ （配列番号５７）と、ＰＸＸＸＬＳＴ（配列番号５８）と、ＴＸＰＴＨＲ（配列番号５９）と、 ＬＸＴＸＳＴＰ（配列番号６０）と、 ＴＰＬＴＸＸＴ（配列番号６１）と、 ＸＱＸＨＮＰＰ（配列番号６２）とからなる集団から選ばれる配列集団を含む。ここで、ＸはあらゆるＬ−アミノ酸を示す。
【００１０】
一つの実施形態において、この発明のペプチドの中で、髪に結合するペプチドは、Ｃ−Ｃ誘導体を含む。この出願の明細書において開示するように、他の実施形態においてこの発明は、一つ以上の髪に結合するペプチドからなる組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
特に定義しない限り、この明細書で使われる全ての専門用語と科学用語は、この発明に関係する当業者によって理解される意味と同じ意味である。以下の用語は、この発明を説明するために使われる。
【００１２】
リガンドという用語は、特定の標的、または反標的によって認識される、分子や化合物を示す。そして、このリガンドは、分子の大きさ、または構成の特徴に影響されない。このリガンドは、酵素触媒反応のための基体や、作動体や、拮抗体として用いられてもよい。このリガンドは、信号伝達子として作用してもよく、または代謝経路を刺激し、もしくは阻害してもよい。リガンドは、望ましい方法の標的に作用する候補物質混合物から分離される核酸や、ペプチドや、ペプチド誘導体や、ペプチド擬晶や、ポリペプチドや、小有機分子や、炭水化物や他の分子でもよい。好ましくは、この望ましい方法は、標的と結合することである。
【００１３】
ライブラリーという用語は、一まとまりの化学的な、または生物学的な物を示す。この一まとまりの化学的な、または生物学的な物とは、一つの保有体において作成され、所定の性質のために同時に選別される。この明細書で用いるように、ライブラリーは、少なくとも２つの部材の最小サイズを有し、１０１５もの部材を含んでもよい。一つの態様では、ライブラリーは、少なくとも１０２の部材を有する。別の態様では、ライブラリーは、少なくとも１０３の部材を有する。さらに他の態様では、ライブラリーは、少なくとも１０６の部材を有する。さらなる態様において、ライブラリーは、少なくとも１０９の部材を有する。ライブラリーの大きさは、その部材が同じか異なるかに関係なく、ライブラリーからなる物の総数を示す。
【００１４】
ペプチド・ライブラリーは、一組のペプチドと、そのペプチドを含むペプチドと、あらゆる融合タンパク質を示す。確率的、または無作為の方法は、無作為のペプチドを作成するために利用してもよい。無作為という用語は、ライブラリーの組成物が分からないことを意味するものでない。
【００１５】
ペプチドは、低重合体を示す。この低重合体の単量体の単位は、一般にアミド結合によって連結されたアミノ酸である。なお、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸に限定されるものではない。ペプチドは、２つ以上のアミノ酸が結合してものでよい。この発明によって同定されるペプチドは、好ましくは５０未満のアミノ酸が結合したものであり、より好ましくは３０未満のアミノ酸が結合したものであり、好ましくは２５未満のアミノ酸が結合したものであり、好ましくは２０未満のアミノ酸が結合したものである。一つの実施形態において、同定された結合ペプチドは、４個から２０個までのアミノ酸が結合したものと、６個から１５個までのアミノ酸が結合したものである。しかし、一般にペプチドは、１００個までのアミノ酸が結合したものでもよい。１００個よりも多くのアミノ酸が結合したものは、一般にポリペプチドと呼ばれる。この明細書では、アミノ酸の標準的な略記号を用いる。（シングルトンほか、１９８７年発行の微生物学と分子生物学辞典第２版の３５頁を参照のこと。この明細書では、この頁に記載の略記号を採用する。）タンパク質という用語は、公知であり、大きなポリペプチドを意味する。
【００１６】
この発明による結合ペプチドは、少なくとも約１０−２モル（Ｍ）と、少なくとも約１０−３モルと、少なくとも約１０−４モルと、少なくとも約１０−５モルと、少なくとも約１０−７モルと、少なくとも約１０−９モルと、好ましくは約１０−２モルと１０−１５モルの間と、約１０−２モルと１０−１０モルの間と、約１０−３モルと１０−９モルの間の結合能を有する標的（皮膚、または髪）に結合するペプチドである。
【００１７】
核酸という用語は、ＤＮＡと、ＲＮＡと、一本鎖または二本鎖と、化学的な修飾を意味する。修飾は、修飾塩基と、骨格鎖修飾と、メチル化、異常塩基対合修飾とキャッピング修飾とを含むが、これに限定されるものではない。
【００１８】
遺伝暗号の変質の結果として、ペプチドを記号化しているヌクレオチド配列の多数が生じてもよいことが、当業者によって認められる。ペプチド、または核酸の配列に関するパーセント配列同一性は、２つの配列において同一である残基、または遺伝暗号のパーセントを指す。この発明によるペプチド、またはポリヌクレオチドは、最適に位置合わせしたときに、参照配列に対して少なくとも５０％と、少なくとも６０％と、少なくとも６５％と、少なくとも７０％と、少なくとも７５％と、少なくとも８０％と、少なくとも８５％と、少なくとも９０％と、少なくとも９５％の配列同一性を有してもよい。 この配列の最適配列は、さまざまな周知の方法と、周知の計算法のコンピューター化された機能によって行ってもよい（例えば、ウィスコンシン遺伝学ソフトウェア・パッケージ、発表７．０、ゲネティクス・コンピューター・グループ、マディソン、ウィスコンシン州のような、ＢＬＡＳＴ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＥＳＴＦＩＴ）。
【００１９】
標的、または反標的という用語は、特定のリガンドのために、この明細書で定義されるような結合能を有する分子、または異質な分子を指す。標的と反標的は、自然にあるもの、または合成分子、または異質な分子でもよい。この標的は、好ましい実施形態において皮膚、または髪である。さらに、この標的が皮膚のときには、この反標的が髪である。そして、この標的が髪のときには、この反標的が皮膚である。
【００２０】
標的、または反標的のためのリガンドの結合能を、解離定数（ＫＤ）、５０％の効果的結合（ＥＣ５０）のために必要とされる濃度、または標的（ＩＣ５０）に結合する他の合成物の結合の５０％の阻害のために必要とされる濃度によって説明してもよい。ＫＤは、ｋｏｆｆとｋｏｎで定義される。ｋｏｆｆ値は、標的リガンド複合体が別々に切れて、または分離する率を定める。この用語は、時折従来技術において、標的リガンド複合体の運動安定性、または結合能（例えば、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）信号、または放射ラベル信号）の比率を反映する他のいかなる測定可能な量の比率として指される。
【００２１】
選択性は、結合能の比率、またはリガンド複合体（標的ＫＤ／反標的ＫＤ）の解離のためのｋｏｆｆによって定義される。ｋｏｎ値は、標的リガンド複合体を形成するために標的とリガンドとが結合する率をいう。
【００２２】
接触という用語は、広義には 隣接した付近または対合において、リガンドのライブラリーと標的または反標的を置くことを意味する。そして、接触には、生体外と生体内での接触を含む。この用語は、触れると、結合と、接合と、結合と、静注と、経口投与と、腹膜内にと、局所用処方と、筋注と、吸入と、皮下の適用などを含む。
【００２３】
この明細書で用いられる分離という用語は、選抜と、区別と、分割と、単離と、収集と、別々に保持と、分裂とを含む。分離方法は、従来技術において周知である。この分離方法は、親和性クロマトグラフィーと、洗浄と、液体転送と、遠心分離と、高性能液体のクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と、ジェルろ過のようなろ過と、酵素連結免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）と、蛍光活性剤細胞選別（ＦＡＣＳ）とを含む。分離方法は、従来技術の中からいずれを選択してもよい。そして、分離方法のために用いられる様々な計測器は、商業的に入手可能である（ケニーとフォウェル（編集者）（１９９２）分子生物学における実用的なタンパク質クロマトグラフィー方法、第１１巻、フマナ・プレス、トトワ・ニュージャージー州）。
【００２４】
増幅という用語は、分子のコピーまたは分子のクラスの量または数を増やす方法または生産工程の組合せを意味する。一つの態様では、増幅は、公知技術のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることにより行われる核酸配列の付加されたコピーの生産を指す。
【００２５】
この明細書において、用語の表現は、特に明記されない限り複数も含む。例えば、リガンドは、単数でも複数でもよい。
【００２６】
以下の参考文献は、この明細書に使用される一般の技術を説明する。サムブルックほか、（１９８９）分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー実験出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州。イニスほか、ＰＣＲプロトコル方法と適用のガイド（１９９０）、アカデミック・プレス社。ケイほか、（１９９６）ペプチドとタンパク質のファージ表示、アカデミック・プレス。オースベルほか、（１９８７）分子生物学の現在のプロトコル、グリーン出版およびワイリー・インターサイエンス、ニューヨーク州（１９９９増補）。ベルガーとキンメル、（１９８７）酵素学における方法、第１５２巻。アカデミック出版社、サンディエゴ、カリフォルニア州。
【００２７】
この発明の皮膚または髪に結合するペプチドは、公知の方法を用いて採取し、同定することができる。これらの方法は、無作為のペプチド・ライブラリーと、合成ペプチド・ライブラリーと、ペプチド・ループ・ライブラリーと、抗体ライブラリーと、タンパク質ライブラリーとの使用を含んでもよい。これらのライブラリーは、ライブラリーを作るための方法と同様に周知である 。以下の参考文献を参照する。バーバス、Ｃ．Ｆ.（１９９３）カレント・オピニオン・イン・バイオテック、４：５２６。クイラほか、（１９９０）前記。スコットとスミス、（１９９０）サイエンス、２４９：３８６。カルほか、（１９９２）前記。ピニージャほか、（１９９４）生化学Ｊ．、３０１：８４７。サムブルックほか、（１９８９）前記。オースベルほか、（１９８７）前記。ガアブラーとホフマン、（１９８３）遺伝子２５：２６３。米国特許番号５，２８３，１７３。米国特許番号５，２７０，１８１。米国特許番号５，２９２，６４６。米国特許番号５，６０５，７９３。米国特許番号５，７３３，７３１。ステーマー（１９９４）会報国家学園科学、米国９１：１０７４７。ＷＯ９７／２２６１７。フォダーほか、（１９９１）サイエンス２５１：７６７。ラムほか、（１９９３）バイオ組織医学化学会報、３：４１９。ティジョエングほか、（１９９０)国際Ｊ. ペプチドタンパク質、３５１４１。ＷＯ９６／３３０１０。
【００２８】
様々な会社は、 溶液と固相法から組合せのライブラリーを発生させるために測定器を製造している（コンビケム社（サンディエゴ、カリフォルニア州）と、アドバンシード・ケムテック（ルイビル）と、ザマーク社（マサチューセッツ州）と、ヒューレット・パッカード（カリフォルニア州））。
【００２９】
リガンド・ライブラリーは、周知な標準的な方法以外にも、商業的に入手してもよい。例えば、シグマ（セントルイス・ミズーリ州）から、または様々な公共の供給源（例えば、アメリカ型培養収集（ＡＴＣＣ）と国立衛生研究所（ＮＩＨ））から入手できる。
【００３０】
スクリーニング技術は、イースト表示と、リボソーム表示と、バイオ・パニングと、酸溶出とを含んでもよい。結合能を有するリガンドのライブラリーをスクリーニングする一つの一般の方法と選抜された標的のための選択性は、リガンド・ライブラリーを、好ましくは別の配列のペプチドを、より好ましくは無作為のペプチド・ライブラリーを用意または入手すること含む。そして、ライブラリー・リガンドと反標的との間の結合に有利な条件下で、反標的とリガンド・ライブラリーとを接触させることによって、反標的と結合するリガンドをはずすことを含む。そして、反標的がこのはずしたリガンドに結合することを可能にすることを含む。そして、分子とあらゆる遊離リガンドに結合した反標的リガンドから、反標的非結合物（結合していないリガンド）を分離することを含む。そして、適当な条件下で選抜された標的と反標的非結合物とを接触させること、およびそれらが結合することを可能にすることを含む。標的に対する親和性を有するリガンドは、標的に結合したリガンド複合体を形成するために結合する。反標的に結合したリガンドの除去と、弱い標的に結合したリガンドの除去は、一般にライブラリー減少と呼んでもよい。標的に結合したリガンド複合体は、それから、結合していないリガンドを含む残りの混合物から分離される。標的に結合したリガンド複合体、または標的に結合したリガンドは、図１に示す選抜のさらなる循環（ラウンド）を任意に受けてもよい。
【００３１】
結合ペプチドは、一度選抜されると配列決定されてもよく、または増幅されてもよく、または多くの標準技術のいずれか一つによって大量に生産されてもよい。これらの技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、ペプチド配列決定装置を使用する選抜されたペプチドの直接アミノ酸塩基配列決定と、集団分光測光法（ＭＳ）と、表面プラスモン共鳴、免疫沈降と、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法とを含む。以下の参考文献を参照する。米国特許番号４，６８３，２０２。サーボほか、（１９９５）カー．オピン．ストラクト．バイオ．５：６９９。ハーローほか、（１９９９）抗体使用法、実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー出版。ハジダックほか、（１９９９）Ｊ．メド・ケム．、４２：２３１５。カオほか、（１９９７）タンパク質化学の技術８、アカデミック出版、ページ１７７-１８４。ヤングクイストほか、（１９９５）Ｊ．アム．化学協会、１７７：３９００。鄭ほか、（１９９５）Ｊ．アム．化学協会、１７７：８８５９。ウォークほか、（１９９９）アンギュ．チェ．イント．版、３８：１７６３。ウーほか、（１９９７）化学と生物学、第１４巻（９）：６５３。マーシャルほか、（１９８８）、ミサ・スペクトロメトリ・レビューズー１７：１。ネルソンほか、（１９９９）Ｊ．モル．レコジニション、１２：７７
【００３２】
結合ペプチドは、遺伝子工学を用いて再結合的に生産してもよく、 またはこのペプチドは、化学的に合成してもよい。
【００３３】
一つの実施形態において、ＫＤ、またはＥＣ５０、またはＩＣ５０のためのこの発明による標的のためのペプチド結合能は、より高い、または低い結合能でもよいが、約１０−７モルから約１０−１５モルの間の範囲である。ある実施形態では、この結合能は、少なくとも約１０−２モルと、少なくとも約１０−３モルと、少なくとも約１０−４モルと、少なくとも約１０−５モルと、少なくとも約１０-７モルと、少なくとも約１０−９モルと、少なくとも約１０−１２モルの範囲である。他の実施形態において、この結合能は、約１０−７モルよりも少ない。他の実施形態において、リガンド標的複合体のためのｋｏｆｆ値は、１０−２秒−１未満と、１０−３秒−１未満と、１０−４秒−１未満と、１０−５秒−１未満である。この発明の結合ペプチドは、反標的といかなる場合であっても結合しない。一方、この発明を限定するものではないが、好適な結合リガンドは、約１０-４モルより大きい、または好ましくは約１０-1モルより大きい反標的にためのＫＤを有してもよい。
【００３４】
この発明による結合ペプチドは、標的に対するリガンドの結合能だけで特徴づけられてはならず、リガンド標的複合体の選択性によって特徴づけられてもよい。反標的に結合するリガンドと比較した、標的に結合するためのリガンドの選択性は、約１．５：１から５００：1の範囲で、ＫＤ、またはＥＣ５０、またはＩＣ５０の比率によって定義することができる。他の実施形態において、選択性は、少なくとも２：１と、少なくとも３：１と、少なくとも５：１と、少なくとも１０：１と、少なくとも２０：１と、少なくとも３０：１と、少なくとも５０：１と、少なくとも１００：１である。
【００３５】
結合能と選択性の測定方法は、公知技術である。そして、これらの方法は、ラジオ・ラベルド・リリースと競合分析と、等温滴定熱量測定と、バイオセンサ結合分析（モートンとマイザカ、（１９９８）エンジモル．方法、２９５：２６８−２９４）と、蛍光と化学ルミネセンス分光法と、大量分光測光法（ガオほか、（１９９６）、Ｊ．メド．ケム．、３９：１９４９）とを含むがこれらに限定されるものではない。
【００３６】
一つの実施形態において、この発明に従う好適な皮膚に結合するペプチドを、表１に示す。
【表１】
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【００３７】
特に好ましい実施形態は、配列番号１（ＳＥＱ   ＩＤ  ＮＯ．１）と、３と、５と、６と、８と、１５のアミノ酸配列を有する皮膚に結合するペプチドを含む。そして、特に配列番号１と配列番号５が好ましい。
【００３８】
他の一つの実施形態において、この発明の皮膚に結合するペプチドは、繰り返しができるという特色を有する。この繰り返しができるという特色は、ペプチド列における少なくとも３つの連続的なアミノ酸残基を含むとして定義される。そして、４つの、または５つの、または６つの、または７つの、または８つの、または９つの連続的なアミノ酸残基を含んでもよい。ここで、この繰り返しができるという特色は、表１に示すペプチドのうちの少なくとも２つ、または表２に示すペプチドのうちの少なくとも２つにおいて見つけられることを特徴とする。皮膚に結合するペプチドのための好ましい繰り返しができるという特色は、ＱＡＴＦと、ＴＳＱＬと、ＲＭＫと、ＹＬＴと、ＡＰＱＱＲＰＭと、ＰＭＫＴと、ＰＰＷと、ＬＴＳと、ＰＰＬＬと、ＡＰＱＱＲＭＫＴと、ＰＳＧＡと、ＰＬＬＡＬと、ＳＴＡＹＬと、ＹＰＩＳＴとを含む。
【００３９】
さらに、他の別の実施形態において、この発明の皮膚に結合するペプチドと、髪に結合するペプチドは、配列集団を含む。この配列集団は、この明細書で定義されるような繰り返しができるという特色を有する。そして、この配列集団は、各ペプチドの同一の繰り返しができるという特色を位置合わせしたときに、アミノ酸残基と一致する１つのまたは２つのアミノ酸残基が、表１または表２で示される結合ペプチドにおいて見つけられる。そして、この配列集団は、１から８、好ましくは１から３介在アミノ酸残基が、繰り返しができるという特色の前または後のどちらに位置してもよい。
【００４０】
皮膚に結合するペプチドのための好適な配列集団は、以下を含む。
APQQRPMXTXXX   配列番号２５
PPWXXXL        配列番号２６
XXTXLTS        配列番号２７ 
XPPLLXL        配列番号２８ 
SXPSGAX        配列番号２９ 
XQATFXXNXXXX   配列番号３０ 
VXTSQLXXXXXX   配列番号３１ 
LXXXRMK        配列番号３２ 
HXXXYLT        配列番号３３
Ｘは、あらゆるＬ−アミノ酸を示す。特に好適な皮膚に結合するペプチドは、ＡＰＱＱＲＰＭＸＴＸＸＸ（配列番号２５）の配列集団または、ＸＱＡＴＦＸＸＮＸＸＸＸ（配列番号３０）の配列集団または、ＬＸＸＸＲＭＫ（配列番号３２）の配列集団を有するペプチドである。
【００４１】
他の実施形態において、この発明による好適な髪に結合するペプチドを、表２に示す。
【００４２】
【表２】
2006514932.tif 000003
【００４３】
配列番号５３と５４として同定される結合ペプチドは、ペプチド列の第２のアミノ酸としてヒスチジン（Ｈ）または、アルギニン（Ｒ）、またはアスパラギン（Ｎ）を含んでもよい。
【００４４】
他の一つ実施形態において、表２の髪に結合するペプチドは、繰り返しができるという特色を有する。髪に結合するペプチドのための好ましい繰り返しができるという特色は、ＳＴＮＬと、ＬＳＳＨＡと、ＳＰＳＳＬと、ＳＨＨＴＨと、ＮＴＰと、ＬＳＴと、ＰＴＨＲと、ＳＴＰと、ＴＰＬとＨＮＰＰを含む。
【００４５】
さらに、他の別の実施形態において、この発明の髪に結合するペプチドは、配列集団を含む。髪に結合するペプチドのための好ましい配列集団は、以下を含む。
NTPXXNX     配列番号５７ 
PXXXLST     配列番号５８ 
TXPTHRX     配列番号５９ 
LXTXSTP     配列番号６０ 
TPLTXXT     配列番号６１ 
XQXHNPP     配列番号６２
Ｘは、あらゆるＬ−アミノ酸を示す。
【００４６】
さらに、他の別の実施形態において、この発明の結合ペプチドは、配列集団を有するペプチド、または前記で開示したように繰り返しができるという特色を有する。ここで、このペプチドは、表１または表２の基準結合ペプチドと少なくとも５０％と、少なくとも５５％と、少なくとも６０％と、少なくとも６５％と、少なくとも７０％と、少なくとも７５％と、少なくとも８０％と、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する。配列集団または繰り返しができるという特色を有するペプチドは、１０−２から１０−１５モルの範囲（少なくとも約１０−２モルと、少なくとも約１０−３モルと、少なくとも約１０−５モルと、少なくとも約１０−７モルと、少なくとも約１０−９モルで、基準ペプチドのように同じ標的のための結合能を有する。好ましくは、この結合能は、基準結合ペプチドの結合能と基本的に同じ、または基準結合ペプチドの結合能よりも大きい。
【００４７】
さらに、この発明による皮膚または髪に結合するペプチドは、ペプチドの両端またはいずれ一方の端に、システイン（Ｃ）残基を含んでもよい。これらのペプチドを、この明細書において、より詳しくはＣ−Ｃ誘導体と呼ぶ。Ｃ−Ｃ誘導体皮膚に結合するペプチドの限定しない実施形態は、Ｃ−配列番号２−Ｃと、Ｃ−配列番号５−Ｃと、Ｃ−配列番号６−Ｃと、Ｃ−配列番号７−Ｃと、Ｃ−配列番号８−Ｃと、Ｃ−配列番号１１−Ｃと、Ｃ−配列番号１２−Ｃと、Ｃ−配列番号１３−Ｃと、Ｃ−配列番号１４−Ｃと、Ｃ− 配列番１５−Ｃと、Ｃ−配列番号２０−Ｃと、Ｃ−配列番号２１−Ｃと、Ｃ−配列番号２３−Ｃとを含む。Ｃ−Ｃ誘導体髪に結合するペプチドの限定しない実施形態は、Ｃ−配列番号３４−Ｃと、Ｃ−配列番号３５−と、Ｃ−列番号３６−Ｃと、Ｃ−配列番号３７−Ｃと、Ｃ−配列番号３９−Ｃと、Ｃ−配列番号４０−Ｃと、Ｃ−配列番号４１−Ｃと、Ｃ−配列番号４３−Ｃと、Ｃ−配列番号４６−Ｃと、Ｃ−配列番４９−Ｃと、Ｃ−配列番号５１−Ｃと、Ｃ−配列番号５２−Ｃと、Ｃ−配列番号５６−Ｃとを含む。配列集団からなる結合ペプチドは、ペプチドの両端またはいずれ一方の端に、システイン残基を含んでもよい。
【００４８】
連鎖分子（また、時折従来技術においてスペーサー部分として指す）は、この発明による結合ペプチドのどちらかの端に加えてもよい。連鎖分子は、短いペプチド（例えば、ＧＧＨとＧＧＧＫとＧＧＨＧＧ）、または炭素連鎖（例えば、（ＣＨ２）ｎ、ここでｎが１から１０に等しい）、またはポリマー（例えば、ＰＥＧ（ＣＨ２−Ｏ）ｎ、ここでｎが２から２０に等しい）、または糖、または脂質などのようなあらゆる炭素を含む分子でもよい。
【００４９】
一つ用途では、この発明の皮膚、または髪に結合するペプチドが、個人的な手入れの用途のための成分として用いられてもよい。これらの成分は、化粧水と、化粧用クリームと、ジェルと、スプレーと、シャンプーと、コンディショナなどという形をとってもよい。
【００５０】
この発明である結合するペプチドを含む個人的な手入れの用途の実施例は、以下のとおりである。なお、用途は以下の実施例に限定されない。
ａ）皮膚に結合するペプチドを、皮膚軟化剤の潤いを与えるという性質の向上に結びつく可能性がある皮膚軟化剤と一緒に使用すること。
ｂ）皮膚に結合するペプチドを、皮膚を白くし、または日焼けをさせる性質の向上に結びつく可能性がある漂白、または日焼け剤と組み合わせること。
ｃ）皮膚に結合するペプチドを、局所用処方のための日焼け防止薬と組み合わせること。
ｄ）髪に結合するペプチドを、髪を染める製剤の髪を染める性質を向上させる可能性がある染料、または酸化剤と組み合わせること。
【００５１】
当業者は、個人的な手入れ成分の中で、使用される可能性がある化粧用の原料の一覧を含むさまざまな参考文献を知っている。このような参考文献として、ＣＴＦＡインターナショナル・バイヤーズガイド（２００２、 化粧品と香水協会、ワシントン）と、ＣＴＦＡ国際化粧品成分辞書とハンドブック（第７版、１９９７、第２巻、編集者ウェニンガーとマキューエン、化粧品と香水協会、ワシントン）がある。また、ＷＯ００／２４３７２と、ＷＯ９６／１６６３０と、サガリンと化粧品と科学と技術（第２版、第１巻、１９７２）がある。
【００５２】
したがって、以下の実施例は、具体例を示すものであって、この発明を限定するものではない。当業者は、単に決まりきった実験操作を用いて、この明細書に記載した発明の特定の実施例の多くの同等物を認識し、または確認することができる。
【００５３】
この出願の中で引用する全ての参考文献と、特許と、発行された特許出願とが提供する情報は、それらの全部がこの明細書に引用される。
【実施例】
【００５４】
制限消化物（restriction digest）と、ライゲーションと、塩化カルシウムを使用する要求にかなう細胞の準備と、２０ｍｇ／ｍｌのイソプロピル（ＩＰＴＧ）の準備と、２０ｍｇ／ｍの５−ブローモ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside）（Ｘ−ガル）の準備と、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の準備のための方法は、従来技術の周知の方法と一致し、前記サムブルックほか（１９８９）で見つけることができる。表示されるファージ・ライブラリー（環式の７−構造単位と線形の７−構造単位と線形の１２−構造単位）（cyclic 7-mer, linear 7-mer and linear 12-mer）は、ニューイングランド・バイオラボズによって供給された（エヌ・イー・ビー、ベヴァリー、マサチューセッツ州）。制限エンドヌクレアーゼ・イーグル（Eagl）と、Ａｃｃ６５１と、１０ＸＮＥ緩衝液３（NEBuffer）と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと、アルカリ性子牛腸のホスファターゼと、Ｅ．大腸菌のＥＲ２５３７ホスト変種とＭ１３ＫＥ  ｇｌｌｌクローニングベクターは、ニューイングランド・バイオラボズによって供給された。そして、別途に明示がなければ、製造業者の指示に従って使用された。タグ・ポリメラーゼと、１０ＸＰＣＲ緩衝液と、ｄＮＴＰ混合物は、ロシュ・モルキュラー・ バイオケミカルズ（インディアナポリス、インディアナ州）によって供給された。ＰＣＲのためのホットッスタート・タグ・マスター・ミックッス・キット（HotStart Taq Master Mix kit for PCR）は、キアゲン（Qiagen）（バレンシア、カルフォルニア州）に由来する。ＰＣＲは、イーアンドケイ・サイエンティフィック・プロダクツ（E & K Scientific Products）（キャンベル、カルフォルニア州）のハイバイド・オムン・イー・サーモサイクラー（HYBAID Omn-E Thermocycler）、またはエム・ジェイ・リサーチ社（ロシュ・モルキュラー・システムズ社、アラメダ、カルフォルニア州）のＰＣＴ２０００ＤＮＡエンジン（登録商標）を使用することによって実行された。非変形ポリアクリルアミド・ジェル（８％）と、Ｄ−１５ＤＮＡ標識は、ノベックス（Novex）（サンディエゴ、カルフォルニア州）から入手した。そして、２％イー・ジェルと、ＴＯＰＯクローニングキットは、インビトロゲン（カールズバッド、カルフォルニア州）から入手した。ＱＩＡクイック・ジェル抽出キットと、ＱＩＡクイック精製キットは、クアゲン（QIAGEN）（バレンシア、カルフォルニア州）から入手した。アムプリワックス（登録商標）ＰＣＲジェムは、パーキン・エルマー（ボストン、マサチューセッツ州）からの入手した。
【００５５】
実施例１
人間の皮膚を標的にし、髪を標的にしないように選ばれたペプチドのスクリーニング。
インターナショナル・ヘア・インポーターズ・アンド・プロダクツ（ホワイトプレインズ、ニューヨーク州）から入手した濃い人の髪を編んだ３インチの長さの２つのふさを、ＤＩ水の２％のニュートロゲナ（登録商標）入浴ジェル（ニュートロゲナ社）溶液１０ｍｌを含む５０ｍｌの円錐形の管に塞がれたＢＳＡの中に置いた。環式の７−構造単位、または線形の１２−構造単位のペプチド・ライブラリー（１０１０ｐｆｕ／μｌ）の１０μｌ、または野生型ファージ（１０９ｐｆｕ／μｌ）を加えた。そして、この試料を室温で１５分間回転する振り混ぜ（３０回転数／分）によって混ぜた。結合していない上澄みを、付加された濃い髪を編んだ３インチの２つのふさを含む新しい管へ移した。そして、室温で１５分間回転する振り混ぜによって培養した。この第２の髪培養後、その溶液から５００μｌを、０．９ｍｌの組織培養培地（マットテク社、アシュランド、マサチューセッツ州）を含んでいる６槽培養プレートの人間の皮膚組織（エピデルム、登録商標、マットテク社、アシュランド、マサチューセッツ州）の表面に移し、室温で３０分間ゆるやかな振動下においた。この皮膚組織を取り除き、２％入浴ジェル５０ｍｌで２回それぞれ５分間洗い流した。そして、塞がれた５０ｍｌの円錐形の管の中で、ＰＢＳ５０ｍｌで３回それぞれ５分間洗い流した。ＰＢＳで洗い流した後に、この皮膚組織を、リガンド・ファージが結合した標的のＰＣＲに従って、−２０℃で凍らせた。表１は、標的である皮膚に結合するペプチドが、この実施例に従って、スクリーニングされたことを示す。
【００５６】
実施例２
人間の髪を標的にし、皮膚を標的にしないように選ばれたペプチドのスクリーニング。
予め平衡にさせた皮膚組織を、新鮮な０．９ｍｌの組織培養培地を含んでいる６槽培養プレートの中に置いた。そして、２％ニュートロゲナ（登録商標）入浴ジョルを含む３００μｌと、環式の７−構造単位、または線形の１２−構造単位ペプチド・ライブラリー（１０１０ｐｆｕ／μｌ）の１０μｌ、または野性型ファージ（１０９ｐｆｕ／μｌ）を、皮膚表面に加えた。この試料を、室温でゆるやかな振動下において１５分間培養した。結合していない上澄みを、皮膚組織を含んでいる新しい槽へ移し、前記方法を繰り返した。この培養溶液は、２％のボディ・ジェル１０ｍｌを含んでいる５０ｍｌの管の中の濃い人の髪（インターナショナル・ヘア・インポーターズ・アンド・プロダクツ、ホワイトプレインズ、ニューヨーク州）を編んだ３インチの長さの９つのふさへ移し、室温で３０分間回転する振り混ぜ（３０回転数／分）を行ったそれから、この髪試料を２％入浴ジェル５０ｍｌで１回、または２回、または４回洗い流した。ＰＢＳの洗浄サイクルを、５分間に２５ｍｌを１回、２分間に２５ｍｌを１回、５分間に５０ｍｌを各２回の１５０ｍｌとした。ＰＢＳで洗い流した後に、結合したファージ・ペプチドを含む髪の試料を、−２０℃で凍らせた。表２は、標的である髪に結合するペプチドが、この実施例に従ってスクリーニングされたことを示す。
【００５７】
実施例３
高い親和性ファージ・ペプチド複製の同定のためのＰＣＲを使用する髪、または皮膚に結合するファージ・ペプチドの選抜。
皮膚見本と髪試料を、−２０℃でＰＣＲまで凍らせた。一つの実施例において、ＰＣＲを、以下の試薬を有する０．５ｍｌＰＣＲ管の以下の条件を用いる髪と皮膚の試料に直接に行った。
５０μｌ反応混合物（ホットスタート）
２μｌＣＢ０５プライマー（２５μＭ）
２μｌＣＢ１２プライマー（２５μＭ）
４６μｌ無菌のｄＨ２Ｏ
１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ５μｌと鉱油５０μｌを加えた。ＰＣＲ増幅を、開始後１５分間９５℃で行った。３０秒間９４℃で３０サイクルの変性と、３０秒間５８℃の徐冷と、６０秒間７２℃の合成とをもちいた。拡張が、１０分間７２℃で予め形成された。プライマーは、オペロン・テクノロジーズ社（アラメダ、カリフォルニア州からの入手した。このプライマーの配列は、以下のとおりである。
ＣＢ０５ ＣＧＴＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＴＴＡＣＣＣＧＴＴＴＡＡＧＧ（５’−３’）配列番号６３
ＣＢ１２  ＣＧＡＧＡＧＧＧＴＴＧＡＴＡＴＡＡＧＴＡＴＡＧＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧＧ（５’−３’）配列番号６４
さらに、別のＰＣＲ生成物の１μｌを、同じプログラムを用いるＰＣＲの他のＰＣＲラウンドにかけた。しかし、以下の成分を加えた。
５０μｌ反応混合物（ホットスタート）
１μｌＣＭ１３  ０１プライマー（５０μＭ）
１μｌＣＭ１３  ０２プライマー（５０μＭ）
４７μｌ無菌のｄＨ２Ｏ
１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ５０μｌと鉱油μｌを加えた。プライマーは、オペロン・テクノロジーズ社（アラメダ、カリフォルニア州からの入手した。このプライマーの配列は、以下のとおりである。
ＣＭ１３  ０１  ＣＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧ（５’−３’）配列番号６５
ＣＭ１３  ０２  ＣＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧ（５’−３’）配列番号６６
【００５８】
このＰＣＲ生成物は、２％イー・ジェルの上に、さまざまな原基ファージ・ペプチド・ライブラリー（明確な制御）と分子量標識の希釈剤からのＰＣＲ生成物とともに視覚化された。そして、４０分間の６５Ｖ未満で動かした。このＰＣＲ生成物の４μｌを、ＴＯＰＯクローニングと標準プロトコルに従うトランスフォーメーションにかけた。しかし、全ての培養は、３０分間であった。個々の複製は、上記と同じプログラムを用いるＰＣＲ（複製につき、１２．５μｌのマスター・ミックスと 、０．１μｌの各ＣＭ１３  ０１とＣＭ１３  ０２プライマーと、１２．３μ無菌の水）に従った。ＰＣＲ生成物の１μｌと、ｇ９６プライマーの１１μｌを用いる塩基配列決定を、シークエテク（マウンテンビュー、カリフォルニア州）、バイオテック・コア社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）、またはバイオシステム３７３ＸＬを適用したＡＢＩを内部に用いることで完成させた。
【００５９】
実施例４
ＰＣＲ生成物のクローニング
選抜の第１の循環（ラウンド）からのＰＣＲ生成物を、以下の通りに複製した。
【００６０】
ベクター・プレパラート
Ｍ１３ＫＥベクター（ニューイングランド・バイオラボズ（以下、ＮＥＢという）、ベヴァリー、マサチューセッツ州）１０μｇを３７℃で一晩中（１６時間）消化させた。この消化を、ＮＥＢが勧める条件に従い、総量４００μｌの中で以下の通りに行った。この総量の内訳は、Ｍ１３ＫＥ，１０μｌと、Ｅａｇ１，１０μｌと、Ａｃｃ６５１，１０μｌと、１０ｘＮＥＮ緩衝液３，４０μｌと、１００ｘＢＳＡ，４μｌと、ｄＨ2Ｏ，３２６μｌである。この消化されたベクターを、溶離緩衝液（ＥＢ）３０μｌを用いるキアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製した。この精製された消化物を−２０℃で保存した。
【００６１】
インサート・プレパラート
選抜の第１のラウンドからのＰＣＲ生成物を、キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＥＢ緩衝液３０μｌの中で溶離させた。この精製した物質１５μｌを、一晩中、総量１００μｌの中で消化させた。この総量の内訳は、ＰＣＲ生成物，１５μｌと、Ｅａｇ１，１μｌと、Ａｃｃ６５１，１μｌと、１０ｘＮＥＮ緩衝液３，１０μｌと、１００ｘＢＳＡ，１μｌと、ｄＨ2Ｏ，６４μｌである。この消化の後に、２０分間６０℃で熱ショック療法を行った。そして、この生成物を、使用するまで−２０℃で保存した。
【００６２】
ライゲーションは、後記するように、３０分間１６℃ でタカラ・キットを用いて行い、その後、氷の上に置いた。内訳は、ベクター・プレパラート，１μｌと、インサート・プレパラート，１μｌと、ＥＢ緩衝液，３μｌと、タカラ・バイオ社（滋賀、日本）製の溶液１．５μlである。
【００６３】
形質変換（トランスフォーメーション）
ライゲーション混合物５μｌを、商業上のプロトコルに従うＴＯＰ１０Ｆの化学的に要求にかなう細胞（インビトロゲン）５０μｌの変換のために用いた。この細胞を、３７℃で一晩中ＬＢプレートの上で育てた。
【００６４】
ファージ・ペプチド・ライブラリーを、増幅させて標準な技術に従い滴定した。除外と選抜の次の循環（ラウンド）も、前記方法に従って行ってもよい。
【００６５】
実施例５
シャンプーと入浴ジェルのファージ・ペプチド・ライブラリーの安定性
商業的に入手可能なニュートロゲナ（登録商標）反残留物シャンプーの２％溶液と、ニュートロゲナ（登録商標）入浴ジェルの２％溶液における３つのファージ表示ライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．−７ とＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃと，Ｐｈ．Ｄ．−１２、ニューイングランド・バイオラボズ）の安定性を評価した。各ファージ表示ライブラリー１０μｌを、マイクロ滴定濃度プレート（ＭＴＰ）の中のシャンプー１５０μｌ、または入浴ジェル溶液１５０μｌに加えた。２０μｌの分割量を、３０分後と６０分後と１２０分後に各槽からの取り除き、ＬＢ肉汁１８０μｌの中で連続的に希釈した。１０６から１０４ＰＦＵ／ｍｌのファージ・ペプチド・ライブラリーを含む希釈した試料を、２０ｍｇ／ｍｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）２０μｌとＬＢ肉汁の中の大腸菌ＥＲ２５３７細胞培養２００μｌに加え、混合し、１から５分間培養した。感染した細胞を、４０ｍｇ／ｍｌＸガル（ＤＳＭＯの）２０μｌを含む予め５５℃に加熱したＬＢ寒天３ｍｌの表面に加え、かき回し、すぐに予め３７℃に加熱したＬＡ寒天プレートの上に注いだ。このプレートをさまし、３７℃で一晩中培養した。各プレート上のコロニーの数を数えた。そして、ｍｌ（ｐｆｕ／ｍｌ）につき斑を形成するユニットの数を、プレートごとに算出した。
【００６６】
ｐｆｕ／ｍｌ＝（♯コロニー／１０μｌファージ）×（希釈係数）×（１０００μｌ）
【００６７】
図２と図３は、シャンプー（図２）と、シャワー・ジェル（図３）のファージ個体群の安定性を示す。ファージ表示ライブラリーは、シャンプー溶液よりも、入浴ジェル溶液で安定した。ファージ・ライブラリーｐｆｕ／ｍｌは、入浴ジェル溶液で１ログ・ユニットよりも小さく減少したのに対し、シャンプー溶液で最大２ログ・ユニットまで減少した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】この発明によって同定される皮膚、または髪に結合するペプチドを、選抜するために用いられるターゲティング（targeting）方法の全体的な概略図である。      この方法は、次の工程からなる。ａ）反標的に結合するリガンドを減少させたリガンド・ライブラリーを提供する、反標的に対する選抜。ｂ）標的に結合するリガンド複合体の形成による、標的のための選抜。ｃ）標的に結合したリガンド複合体の分離。ｄ）標的に結合したリガンドの同定。ｅ）標的に結合するリガンドの任意の配列決定。この標的に結合するリガンドは、選択的なターゲティングおよび、または分散のさらなる循環（ラウンド）にさらす。
【図２】ニュートロゲナ（登録商標）シャワー・シャンプーのファージ・ペプチド・ライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．７と、Ｐｈ．Ｄ．Ｃ７Ｃと、Ｐｈ．Ｄ．１２）の安定性を示す。
【図３】ニュートロゲナ（登録商標）入浴ジェルのファージ・ペプチド・ライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．７と、Ｐｈ．Ｄ．Ｃ７Ｃと、Ｐｈ．Ｄ．１２）の安定性を示す。
【図１】
2006514932.tif 000004
【図２】
2006514932.tif 000005
【図３】
2006514932.tif 000006
【国際調査報告】
2006514932.tif 000007
2006514932.tif 000008