(57)【要約】本発明は、哺乳動物のＭＭＰ−１２をコードする核酸分子の機能を調節するのに使用するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物に関する。より特定には、本発明は、ＭＭＰ−１２をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、それによりＭＭＰ−１２タンパク質産物の発現を阻害することができる長さが８〜５０個の核酸塩基の化合物、同様に、それらの医薬組成物およびその使用方法を提供する。本アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、乾癬、肺気腫および喘息のような病気を治療するのに用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的にハイブリダイズし、メタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ−１２）タンパク質の翻訳を阻害することを特徴とする、ＭＭＰ−１２をコードする核酸分子を標的とする長さが８〜５０個の核酸塩基からなる化合物。
【請求項２】
標的配列は、配列番号１、または、機能的に同等なそれらの相同体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
標的配列は、配列番号２、または、機能的に同等なそれらの相同体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
化合物は、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜１４からなる群より選択される配列を有する、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドは、配列番号３〜１４からなる群より選択される配列の少なくとも８個のヌクレオチド部分を含み、全長２５個以下のヌクレオチドを有するＲＮＡｉである、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
ＭＭＰ−１２をコードする核酸分子を標的とする長さが８〜５０個の核酸塩基からなる化合物であって、哺乳動物において特異的にハイブリダイズし、ＭＭＰ−１２の翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、アンチセンス核酸主鎖の架橋していない酸素原子を、メタンホスフェート、リン酸メチル、および、ホスホロチオエートからなる群より選択される成分で置換することによって化学修飾されていることを特徴とする、上記化合物。
【請求項１０】
置換は、３’末端もしくは５’末端またはその両方から選択される１またはそれ以上のヌクレオチドで生じる、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
置換は、オリゴヌクレオチドの全長のあらゆる位置の１またはそれ以上のヌクレオチドで生じる、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体もしくはミミックで構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、上記類似体もしくはミミックとしては、ただしこれらに限定されないが、メチルホスホネート、Ｎ３’→Ｐ５’−ホスホロアミデート、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、アラビノシル核酸（ＡＮＡ）、フルオロ−アラビノシル核酸（ＦＡＮＡ）メトキシ−エチル核酸（ＭＯＥ）が挙げられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体もしくはミミックの組み合わせを含むホモポリマーまたはヘテロポリマーであるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された糖成分の核酸塩基を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
修飾された糖成分は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖成分である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物、および、製薬上許容できるキャリアーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項１７】
組成物は、コロイド分散系をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞または組織と、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物とを接触させ、それによりＭＭＰ−１２の翻訳を阻害する、細胞または組織におけるＭＭＰ−１２の翻訳を阻害する方法。
【請求項１９】
細胞または組織と、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の組成物とを接触させ、それによりＭＭＰ−１２の翻訳を阻害する、細胞または組織におけるＭＭＰ−１２の翻訳を阻害する方法。
【請求項２０】
ＭＭＰ−１２発現の阻害は、ヒト被験体におけるＭＭＰ−１２依存性プロセスを抑制する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＭＰ-１２依存性プロセスは、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患
、リウマチ様関節炎、乾癬、肺気腫および喘息の１つである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト患者の１またはそれ以上の細胞においてＭＭＰ−１２発現が抑制されることを特徴とする、該患者におけるＭＭＰ−１２依存性障害を予防、緩和または治療する方法。
【請求項２３】
ヒト患者の１またはそれ以上の細胞においてＭＭＰ−１２レベルが抑制されることを特徴とする、該患者におけるＭＭＰ−１２依存性障害を予防、緩和または治療する方法。
【請求項２４】
ＭＭＰ−１２依存性障害は、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、乾癬、肺気腫および喘息の１つである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物を含む組換えヌクレオチド配列。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組換えヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項２７】
ベクターは、真核性または原核性由来である、請求項２６に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２８】
インビボまたはインビトロで、細胞または組織と、請求項２７に記載の組換えベクターで発現された組換えヌクレオチド配列とを接触させる、細胞または組織におけるＭＭＰ−１２の発現を阻害する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法で製造された組換え宿主細胞。
【請求項３０】
少なくとも１つの細胞に機能的に挿入された少なくとも１つの請求項７に記載の配列を有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３１】
少なくとも１つの機能的に挿入された配列が、過剰発現される、請求項３０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
請求項１６または１７に記載の組成物を、治療上有効な用量で、製薬上許容できるキャリアーと共に、ヒトに投与する、細胞または組織におけるＭＭＰ−１２の発現を阻害する方法。
【請求項３３】
ＭＭＰ−１２の発現の存在または非存在をスクリーニングすることを含み、ＭＭＰ−１２発現が炎症性腸疾患の指標である、ヒト被験体において炎症性腸疾患を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス化合物としてのオリゴヌクレオチドに関する。より特定には、本発明は、メタロプロテイナーゼ１２（本発明においては「ＭＭＰ−１２」）の特異的阻害剤として作用し得るアンチセンスオリゴヌクレオチド、同様に、それらの医薬組成物、および、その使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
メタロプロテイナーゼは、近年劇的に数が増加しているプロテイナーゼ（酵素）のスーパーファミリーの代表である。これら酵素は、構造的および機能的な考察に基づきファミリーとサブファミリーに分類されている（Ｈｏｏｐｅｒ，１９９４年）。メタロプロテイナーゼの例としては、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばコラゲナーゼ（ＭＭＰ１，ＭＭＰ８，ＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２，ＭＭＰ９）、ストロメライシン（ＭＭＰ３，ＭＭＰ１０，ＭＭＰ１１）、マトリライシン（ＭＭＰ７）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、エナメリシン（ＭＭＰ１９）、ＭＴ−ＭＭＰ（ＭＭＰ１４，ＭＭＰ１５，ＭＭＰ１６，ＭＭＰ１７）；レプロライシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）、または、アダマライシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）が挙げられ、または、ＭＤＣファミリーとしては、セクレターゼ、および、シダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）、例えばＴＮＦ変換酵素（ＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥ）が挙げられ；アスタシンファミリーとしては、プロコラーゲンプロセシングプロテイナーゼ（ＰＣＰ）のような酵素；および、その他のメタロプロテイナーゼ、例えばアグリカナーゼ、エンドセリン変換酵素ファミリー、および、アンギオテンシン変換酵素ファミリーが挙げられる。
【０００３】
メタロプロテイナーゼ（それらの活性中心に金属イオンが存在することからこのように呼ばれる）は、主として、正常な生理学的条件下での組織等の成長およびリモデリングに必要なプロセスである細胞外マトリックス成分の分解に関与する。
【０００４】
ＭＭＰ−１２（マクロファージエラスターゼまたはメタロエラスターゼとも言う）が、Ｓｈａｐｉｒｏ等（１９９２年）によりマウスから、最初にクローニングされ、１９９３年に同グループによりヒトからもクローニングされた（Ｓｈａｐｉｒｏ等，１９９３年）。
【０００５】
恐らく驚くことではないが、あらゆる種類のプロセスにおいてメタロプロテイナーゼが広範囲にわたり関与しているために、メタロプロテイナーゼは、多くの病気のタイプおよび状態の発病および進行に関連している。例えば：様々な炎症性疾患およびアレルギー性疾患、例えば関節の炎症（特に、リウマチ様関節炎、変形性関節症および痛風）、消化管の炎症（特に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、胃炎、および、クローン病）、皮膚の炎症（特に、乾癬、湿疹、皮膚炎）；腫瘍転移または浸潤；細胞外マトリックスが制御不能に分解することに関連する病気、例えば変形性関節症；骨吸収疾患（例えば骨粗鬆症およびパジェット病）；異所性の血管新生に関連する病気；糖尿病、歯周疾患（例えば歯肉炎）、角膜潰瘍形成、皮膚の潰瘍形成、術後の状態（例えば結腸の癒着）、および皮膚の創傷の治癒、に関連する高められたコラーゲンのリモデリング；中枢および末梢神経系の脱髄疾患（例えば多発性硬化症）；アルツハイマー病；心臓血管疾患で観察される細胞外マトリックスのリモデリング、例えば再狭窄、および、アテローム性動脈硬化症；喘息；鼻炎；および、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関与する。
【０００６】
かなりの種類の科学的な証拠から、制御不能な結合性のマトリックスメタロプロテイナ
ーゼ（ＭＭＰ）活性は、ＭＭＰをもって観察される多くの病気を進行させる作用に関与することが示されており、その結果として、必然的にこれら酵素を阻害することが治療的介入のための魅力的な標的となってきた（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，１９９２年；Ｅｍｏｎａｒｄ等，１９９０年；Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，１９９０年）。
【０００７】
ＭＭＰ阻害剤の臨床条件への移行を実現するには、必ず関連する問題が付随する。臨床条件における広範囲のＭＭＰの阻害により、筋骨格の硬直および痛みが起こる（ＲａｓｍｕｓｓｅｎおよびＭｃＣａｎｎ，１９９７年）。これら副作用および広範囲の阻害に関連する作用は、長期にわたる投与で増強される恐れがある。従って、特定の対象となるＭＭＰの活性だけを予防することができる選択的ＭＭＰ阻害剤を提供することが、極めて有利となり得る。
【０００８】
従来技術
マウスにおけるタバコの煙で誘導された肺気腫の発生に、ＭＭＰ−１２が必要である、という研究がある（Ｈａｕｔａｍａｋｉ等，１９９７年）。これは、さらに、機能的インテグリンαｖβ６を有さないトランスジェニックマウスが、ＭＭＰ−１２依存性肺気腫を発生させることを示した出版物によって支持されている（Ｍｏｒｒｉｓ等，２００３年）。
【０００９】
関節軟骨の細胞外マトリックスの急速な崩壊は、リウマチ様関節炎と変形性関節症との両方の病状において重要な特徴であり、現在の証拠は、不適切なＭＭＰ合成が、重要な事象であることを示唆している。その上、各種のＭＭＰは、前炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の膜結合型前駆体を加水分解することができる（Ｇｅａｒｉｎｇ等，１９９４年）。この切断により成熟可溶性ＴＮＦ−αが生じ、ＭＭＰ阻害剤は、インビトロとインビボの両方で、ＴＮＦ−αの生産をブロックすることができる（Ｍｏｈｌｅｒ等，１９９４年、および、ＭｃＧｅｅｈａｎ等，１９９４年）。
【００１０】
ＭＭＰ−１２の大部分がマクロファージ特異的であるという観察は、マクロファージの炎症部位への移動を可能にするために、マクロファージはＭＭＰ−１２を必要とするという発見を支持している（Ｓｈｉｐｌｅｙ等，１９９６年）。その上、マクロファージそれ自体が炎症を維持する手段となり、その点において、マクロファージは、多くの前炎症性炎症性サイトカインの生産に関与する。従って、ＭＭＰ−１２の標的化と、それによるマクロファージ移動の減少は、炎症性の状態を治療する新規の治療可能性を提供し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この点において、選択的ＭＭＰ−１２阻害剤はほとんど報告されていないようであり、選択的ではないＭＭＰ−１２阻害剤または非選択的なＭＭＰ−１２阻害剤が、あらゆる哺乳動物におけるあらゆる病気の治療のために承認され、または、市場に出回っている。従って、有効な選択的なＭＭＰ阻害剤であり、関連する病気の状態の予防および治療における臨床上の使用を可能にする毒性／効力の許容可能な治療指数を有する新規の化合物を発見する必要がある。
【００１２】
本発明の目的は、このような選択的化合物をアンチセンスオリゴヌクレオチドの形態で提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、哺乳動物のＭＭＰ−１２をコードする核酸分子の機能を調節し、最終的にはＭＭＰ−１２の生産量を調節することによって使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を提供する。より特定には、本発明は、ＭＭＰ−１２をコードする核酸分子
に特異的にハイブリダイズし、それにより、ＭＭＰ−１２タンパク質産物の生産をブロックすることができる長さが８〜５０個の核酸塩基からなる化合物を提供する。さらに、細胞または組織においてＭＭＰ−１２の発現を調節する方法および組成物を提供し、本方法は、前記細胞または組織と、１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物とを接触させることを含む。これは、ＭＭＰ−１２タンパク質産物をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって達成される。
【００１４】
本発明は、さらに添付の特許請求の範囲で定義され、これらは参照により本発明に加入させる。
【００１５】
図面の説明
本発明を、以下の説明、実施例および添付の図面でより詳細に説明する：
図１は、潰瘍性大腸炎（Ａ）またはクローン病（Ｂ）のいずれかに罹った患者からの生検サンプルのＭＭＰ−１２発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。実験プロトコールは、実施例２で概説する。（記号：Ｍは、塩基対マーカー；Ｈは、完全に正常な健康個体からの生検を示す；Ｃは、炎症を起こしていない領域から採取された生検サンプルを示す；および、Ｔは、同じ患者の炎症を起こした領域から採取された生検を示す。括弧内の数字は、患者の番号を示し、水平のバーは、同じ患者から得られたＣおよびＴ生検サンプルを表示する）。αアクチンは、ローディングコントロールとして用いられ、全てのＲＴ−ＰＣＲ反応において等しいｍＲＮＡインプットを実証するのに一般的に用いられるハウスキーピング遺伝子の発現状態を示す。
【００１６】
図２は、アンチセンス化合物投与後の消化管における炎症の程度の改善を評価するのに用いられた４種の異なる基準を示すヒストグラムを示す。この実施例において、アンチセンス化合物は、配列番号３によって得られたものであり、実験プロトコールは、実施例２で使用されたものである。（記号：黒塗りのバーは、標準的な飲用水のみを投与された健康な動物（健康なコントロール）を示す。斜線のバーは、飲用水中に結腸の炎症を誘導する２.５％ＤＳＳを投与された大腸炎を誘導された動物（病気のコントロール）を示す。
格子縞のバーは、それらの飲用水中にＤＳＳに加えて実施例７で概説されたアンチセンス化合物（配列番号３）を投与された動物を示す）。太い黒いバーは、ネガティブコントロール対病気の動物コントロールを示す。細い黒いバーは、病気の動物コントロールとＭＭＰ−１２アンチセンス処理群との比較を示す。組織学的に、表１に示すスケールに従って０〜４に段階分けされる。有意性は、＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.００１、および、＊＊＊Ｐ＜０.０００５として示される。エラーバー：ＳＥＭ。
【００１７】
図３は、実施例２で得られたマウスの結腸組織の組織切片を示す。Ａ）正常な辺縁上皮、正常なリーバーキューン腺を有し、炎症性細胞がほとんどない健康な結腸、Ｂ）辺縁上皮の喪失、障害を起こした腺窩構造、および、炎症性細胞の大規模な浸潤を示す、炎症を起こした結腸、Ｃ）障害を起こしているが維持された辺縁上皮、正常化された腺窩を有し、炎症性細胞の浸潤がほとんどない、炎症の回復を示す、配列番号３で得られたＭＭＰ−１２アンチセンスで処理した結腸。辺縁上皮の上部に、粘液の層を観察することができる。バー＝５０μｍ。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の方法の開示および説明に先立って、本発明は、本発明で開示された特定の構成、プロセス工程および材料に限定されるものではなく、このような構成、プロセス工程および材料は、いくらか変更可能であることを理解すべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によってのみ限定されるため、本発明で用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみに用いられ、限定する意図はないことも理解すべきである。
【００１９】
本発明に関して、「アンチセンス分子」および「アンチセンス配列」で用いられるような「アンチセンス」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの部分に相補的な一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。アンチセンス分子は、そのｍＲＮＡと塩基対を形成し、それによってｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を予防する。その結果として、用語「アンチセンス療法」は、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、例えば前記配列でコードされた遺伝子産物の発現を抑制または減少させることによってその機能または翻訳を調節するようなアンチセンス化合物を用いる方法を意味する。
【００２０】
本発明に関して、「相補的な」は、２つのヌクレオチド間の正確な対形成のための能力を意味する。
【００２１】
本発明に関して、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたはリバースフーグスティーン水素結合のような水素結合を意味する。従って、相補性およびハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で安定で特異的な結合が起こるような十分な相補性の程度または正確な対形成を示すのに用いられる用語である。
【００２２】
アンチセンス化合物は、化合物が標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に結合することによって標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能に干渉し、効力の損失を引き起こす場合、および、特異的結合が望ましい状況においてアンチセンス化合物が非特異的な標的配列へ非特異的に結合するのを防ぐのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２３】
その上、本発明に関して、「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、当業者周知の温度および緩衝液に関する基準を意味する（Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９９１年）。
【００２４】
当業界周知であるように、「機能的に相同」とは、開示された配列とは恐らく構造的には低い相同性を有する配列であるが、健康な生物または病気の生物のいずれかにおいてインビボで相同な機能を示す、例えば、同一のタンパク質または類似の細胞性の機能を有する高度に類似したタンパク質をコードすることを意味する。
【００２５】
当業界周知であるように、「機能的に挿入された」または「使用可能に挿入された」とは、宿主ゲノムへの配列の挿入が、その配列の正しい発現が起こるような方向と位置で、適用可能であればその配列の正しい発現が起こるようなプロモーターおよび／またはエンハンサーと共になされていることを示す。
【００２６】
本発明に関して、「調節」は、遺伝子発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明に関して、遺伝子発現の調節の好ましい形態は阻害であり、好ましい標的はｍＲＮＡである。
【００２７】
本発明は、哺乳動物のＭＭＰ−１２をコードする核酸分子の機能を調節し、最終的に生産されるＭＭＰ−１２の量を調節するのに使用するためのオリゴヌクレオチド化合物を提供する。より特定には、前記化合物は、ＭＭＰ−１２のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この調節は、ＭＭＰ−１２タンパク質産物をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、それにより、ＭＭＰ−１２の翻訳を阻害するアンチセンス化合物を提供することによって達成される。一実施形態において、前記標的配列は、ヒトであり、前記アンチセンス化合物は、好ましくは、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ(R) 寄託番号ＮＭ−００２４２６）、または、機能的に同等なそれらの相同体にハイブリダイズす
る。
【００２８】
他の実施形態において、前記標的配列は、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ(R) 寄託番号Ｍ８２８３１）、または、機能的に同等なそれらの相同体のマウスの配列である。
【００２９】
本発明に係る上記標的配列またはそれらの同等物の１つまたはその他に向けられたアンチセンス化合物は、好ましくは、長さが約８〜約５０個の核酸塩基を含む。約８〜約３０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち長さが約８〜約３０個の連結したヌクレオシド）が特に好ましく、約１６〜約２４個の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが最も好ましい。
【００３０】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のいずれかである。本発明は、上で定義された、そして特に配列番号３〜１４（表２およびパテントイン（ＰａｔｅｎｔＩｎ）３.１を用いて作製された添付の配列リストを参照）に記
載の、ＭＭＰ−１２をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、それにより、ＭＭＰ−１２タンパク質産物の生産をブロックすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の形態の核酸分子を利用可能にする。
【００３１】
本発明のさらなる観点において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマー、または、それらのミメティックを意味する。この用語はまた、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合によるインターヌクレオシド（主鎖）結合で構成されるオリゴヌクレオチド、同様に、天然に存在しない修飾を有するオリゴヌクレオチドも包含する。当業界既知であるように、オリゴヌクレオチド構造中のリン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシド主鎖を形成するといわれている。ＲＮＡおよびＤＮＡの天然の結合または主鎖は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。
【００３２】
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例としては、修飾された主鎖、または、非天然のインターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。これら修飾は、天然に存在するオリゴヌクレオチドによっては得られない特定の望ましい特性（例えば毒性の特性の減少、ヌクレアーゼ分解に対する安定性の増加、および、細胞性による取り込みの増進）をオリゴヌクレオチドに導入することを可能にしている。
【００３３】
さらなる実施形態によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含み、これは、アンチセンス核酸主鎖の架橋していない酸素原子を、メタンホスフェート、リン酸メチル、および、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、および、チオノアルキルホスホトリエステルからなる群より選択される成分で置換することによって化学修飾が可能である。
【００３４】
一実施形態によれば、前記置換は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端の最後の３個のヌクレオチドから独立して選択される１またはそれ以上のヌクレオチドで起こり得る。また、置換は、前記オリゴヌクレオチドの全長のあらゆる位置で生じてもよく、または、実際に全てのイントラヌクレオシド結合が修飾を受けることも考えられる。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された糖成分の核酸塩基を含み、修飾された糖成分は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖成分が可能である。
【００３５】
前記アンチセンス剤は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体もしくはミミックで構成されるアンチセンス剤も可能であり、この類似体もしくはミミックとしては、以下が挙げられる：メチルホスホネート、Ｎ３’→Ｐ５’−ホスホロアミデート、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、アラビノシル核酸（ＡＮＡ）、フルオロ−アラビノシル核酸（ＦＡＮＡ）メトキシ−エチル核酸（ＭＯＥ）、ただし、これらに限定されない。好ましくは、前記アンチセンス剤は、上記ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体もしくはミミックの組み合わせを含むホモポリマーまたはヘテロポリマーである。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、治療に、および、予防として利用可能である。治療に関しては、ＭＭＰ−１２の発現を調節することによって治療可能な不適切なＭＭＰ−１２発現に関連する病気または障害に罹っている恐れのある動物、好ましくはヒトは、治療的または予防的有効量の本発明に係るアンチセンス化合物を投与することによって治療される。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適切な製薬上許容できる希釈剤またはキャリアーに加えることによって医薬組成物において利用可能である。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用は、予防的に有用であり得る（すなわち、ＭＭＰ−１２の関与が疑われる病気または状態の発病を遅延させる）。
【００３７】
さらに他の実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、ヒト被験体の調査および診断法に有用であり、なぜなら、これら化合物は、ＭＭＰ−１２をコードする核酸にハイブリダイズし、この事実を活用できるようにサンドイッチおよびその他の分析を容易に設計可能にするためである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、ＭＭＰ−１２をコードする核酸とのハイブリダイゼーション、および、その結果生じるＭＭＰ−１２発現の抑制／阻害は、当業界周知の手段によって検出することができる。例えば、アンチセンス化合物の放射標識、ＲＮアーゼ保護分析は、アンチセンス化合物の、ＭＭＰ−１２の標的ｍＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションを実証し得る。ＭＭＰ−１２レベルの減少を検出する様々な当業界周知の手段が使用可能であり、例えば、ＭＭＰ−１２の抗体検出、または、酵素に基づく活性分析がある。他の実施形態において、アンチセンス化合物は、細胞または組織におけるＭＭＰ−１２の発現を阻害する方法において用いられ、この場合、インビボまたはインビトロで、前記細胞または組織を治療上有効な用量の本発明の化合物または組成物に接触させ、それによりＭＭＰ−１２の発現を阻害する。好ましくは、前記阻害は、ヒト被験体におけるＭＭＰ−１２依存性プロセスを抑制する。ＭＭＰ−１２依存性プロセスは、最も好ましくは、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、乾癬、肺気腫および喘息の１つである。
【００３８】
本発明の他の実施形態は、ヒト被験体において炎症性腸疾患を診断する方法に関し、この方法は、ＭＭＰ−１２の発現の存在または非存在についてスクリーニングすることを含み、ＭＭＰ−１２の発現が、炎症性腸疾患の指標である。
【００３９】
本願の化合物は選択的であるため、本願の化合物は、既知の様々な阻害に関する合併症を低減させた長期にわたる療法に有用であると予測される。従って、本願の化合物は、ＭＭＰ−１２が介在する様々な病気および状態の治療に有用である一方で、これら選択的阻害剤は、顕著な炎症性の構成要素を有する障害の治療に特に有用である。
【００４０】
標的化したアンチセンス送達の代わりとして、標的化したリボザイムを用いてもよい。用語「リボザイム」は、ＲＮＡを基礎とした酵素を意味し、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方の特定の塩基配列を標的とし、切断することができる。リボザイムは、リボザイム配列を取り込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で細胞を直接標的とするか、または、望ましいリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞に導入されるかのいずれかが可能である。リボザイムは、アンチセンスポリヌクレオチドで説明されたのとほぼ同様に、使用
および適用が可能である。リボザイム配列はまた、アンチセンスポリヌクレオチドで説明されたのとほぼ同様に修飾されていてもよい。例えば、リボザイム配列は、非ワトソン−クリック塩基を取り込んでもよいし、または、混合型のＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを形成したり、または、ホスホジエステル主鎖を修飾することもできる。
【００４１】
アンチセンスのその他の代替法は、いわゆる「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）の使用である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、多数のインビボ環境で遺伝子のサイレンス化を引き起こすことができ、このインビボ環境としては、ショウジョウバエ、カエノラブディティス−エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、プラナリア、ヒドラ、トリパノソーマ、菌類、植物および哺乳動物が挙げられる。ＲＮＡｉの天然の機能や、共に抑制することにより、活性になったときに宿主細胞中で異常なＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを生産するレトロトランスポゾンおよびウイルスのような可動性の遺伝学的要素による浸潤からゲノムを保護するようである（Ｊｅｎｓｅｎ等，１９９９年；Ｋｅｔｔｉｎｇ等，１９９９年；Ｒａｔｃｌｉｆｆ等，１９９９年；Ｔａｂａｒａ等，１９９９年）。特異的なｍＲＮＡ分解は、トランスポゾンおよびウイルス複製を防ぐが、数種のウイルスは、ＰＴＧＳを抑制するタンパク質を発現することによってこのプロセスを克服または防ぐことが可能である（Ｌｕｃｙ等，２０００）。二本鎖ＲＮＡ分子は、以下の工程を含む方法で製造することができる：（ａ）それぞれ長さが１９〜２５、例えば１９〜２３個のヌクレオチドを有する２つのＲＮＡ鎖を合成すること（前記ＲＮＡ鎖は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができ、好ましくは、少なくとも１つの鎖は、１〜５個のヌクレオチドからなる３’−オーバーハングを有する）、（ｂ）標的特異的な核酸の修飾、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介することができる二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で、合成されたＲＮＡ鎖を結合させること。一実施形態において、アンチセンスＲＮＡｉは、配列番号３〜１４の配列の１つに含まれる少なくとも８個のヌクレオチド部分を含み、全長２５個以下のヌクレオチドを有する。
【００４２】
ｄｓＲＮＡは通常、医薬組成物として投与される。このような投与は、インビトロまたはインビボで核酸が望ましい標的細胞に導入される既知の方法で行うことができる。一般的に用いられる遺伝子トランスファー技術としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、および、ウイルス方法が挙げられる。このような方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ等，（１９９３年）に教示されている。
【００４３】
本発明はまた、医薬組成物を利用可能にし、前記組成物は、上述の化合物またはアンチセンス剤、および、製薬上許容できる製剤および組成物、キャリアーまたは希釈剤を含む。好ましくは、前記医薬組成物は、コロイド分散系をさらに含む。本発明の医薬組成物は、多数の方法で投与することができ、これは、治療しようとする状態にとって局所、表面または全身の投与様式のいずれが最適であるかに大きく依存する。これら様々な投与様式は、例えば表面（例えば皮膚上）、局所的（例えば、眼、および、様々な粘膜、例えば膣、鼻、および、直腸送達）、経口または非経口による、および、肺への投与様式である。
【００４４】
このような組成物および製剤の製造は、一般的に、製薬および製剤分野の当業者に既知であり、本発明の組成物の製剤に適用可能である。
【００４５】
本発明の範囲内で、製薬上許容できる塩の好ましい例としては、以下が挙げられる：（ａ）カチオンで形成された塩、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミンおよびスペルミジンなどの塩；（ｂ）無機酸で形成された酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸などの塩；（ｃ）有機酸で形成された塩、例えば、酢酸、アルギン酸、アスコルビン酸、安息香酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パルミチン酸、ポリグルタミン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ポリガラクツロン酸、コハク酸、酒石酸、タンニン酸などの塩；および、（ｄ）塩素、臭素、および、ヨウ素のような元素のアニオンから形成された塩、ただし、これらに限定されない。
【００４６】
さらに他の実施形態において、表面への投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液剤および粉剤が挙げられる。従来の製薬用キャリアー、水性、粉末または油性基材、増粘剤なども、必要であるか、または、望ましい場合がある。
【００４７】
経口投与のための組成物および製剤としては、粉剤または顆粒剤、水または非水性媒体への懸濁剤または液剤、カプセル剤、サッシェ、または、錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭薬剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または、結合剤も望ましい場合がある。
【００４８】
非経口、髄腔内または心室内投与のための組成物および製剤としては、滅菌水溶液が挙げられ、これは、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤、例えば、透過増強剤、キャリアー化合物、およびその他の製薬上許容できるキャリアーまたは賦形剤を含み得るが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の医薬組成物としては、これらに限定されないが、溶液、エマルジョン、および、リポソーム含有製剤が挙げられる。これら組成物は、様々な成分から製造することができ、このような成分としては、予め調製された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、このようなキャリアーは、用いられる投与量および濃度で受容者に対して非毒性であるべきである。通常、このような組成物の製造は、治療剤と、以下に記載の１またはそれ以上とを合わせることを含む：緩衝液、抗酸化剤、低分子量のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、スクロースまたはデキストリン、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、グルタチオンおよびその他の安定剤および賦形剤。適切な希釈剤の例としては、中性の緩衝塩類溶液、または、非特異的な血清アルブミンと混合した塩類溶液が挙げられる。
【００５０】
本発明の医薬製剤は、都合よく単位投与量形態中に存在させることが可能であり、製薬業界において周知の従来の技術に従って製造することができる。
【００５１】
さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、エマルジョンとして製造および製剤化することができ、典型的には、エマルジョンは、１種の液体が液滴状で別の液体中に分散されている異種の系である（Ｉｄｓｏｎ，１９８８年）。エマルジョン製剤で用いられる天然に存在する乳化剤の例としては、アラビアゴム、蜜蝋、ラノリン、レシチンおよびホスファチドが挙げられる。皮膚、経口および非経口経路のエマルジョン製剤の適用およびそれらの製造方法は、文献に総論されている（Ｉｄｓｏｎ，１９８８年）。
【００５２】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドと核酸との組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化することができる。マイクロエマルジョンは、水、油および両親媒性物質の系と定義され、単一の、光学的に等方性な、熱力学的に安定な液体溶液である（Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８年）。
【００５３】
本発明の他の実施形態は、活性成分を作用部位へトランスファーおよび送達するためのリポソームの使用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜に融合し始める。この現象は、可能性のある薬物送達の様式としてのリポソームの使用における広範な調査を促進してきた。
【００５４】
他の実施形態において、透過増強剤の使用は、薬物送達の様式として有用であり得る。このような物質は、５種の広いカテゴリー（すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および、非キレート非界面活性剤）の１つに属するものと分類される（Ｌｅｅ等，１９９１年）。
【００５５】
その他の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする１またはそれ以上のアンチセンス化合物、特に、オリゴヌクレオチド、および、第二の核酸標的を標的とする１またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物を含んでもよい。２またはそれ以上の組み合わせ化合物は、一緒に、または、逐次的に用いることができる。
【００５６】
治療組成物の製剤、および、その後のそれらの投与は、当業界の技術範囲内と考えられる。最適な投与スケジュールは、患者体内の薬物の蓄積を測定することによって計算できる。当業者であれば、最適な投与量、投与方法および反復率を容易に決定できる。良好な治療の後、病状の再発を防ぐために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、この場合、前記オリゴヌクレオチドは、維持量で投与される。
【００５７】
本発明はまた、本発明に係るアンチセンス化合物を含む組換えヌクレオチド配列に関する。本組換えヌクレオチド配列は、発現ベクターに挿入することができ、発現ベクターとしては、例えばプラスミドもしくはウイルス、または、当業者既知のその他のあらゆるベクターがある。従って、本発明は、アンチセンス化合物のインビボまたはインビトロでの発現が達成できるように、１またはそれ以上の発現調節因子に使用可能に結合したアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含ませることができるベクターは、真核性または原核性由来のものが可能である。
【００５８】
本発明の一実施形態は、細胞または組織におけるＭＭＰ−１２の発現を阻害する方法であり、本方法において、前記細胞または組織は、インビボまたはインビトロで、組換えベクターにより発現された組換えヌクレオチド配列と接触させる。本発明はまた、１またはそれ以上の発現調節因子に使用可能に結合したこれらアンチセンスオリゴヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞も含む。
【００５９】
本発明は特に、治療的または予防的有効量の１またはそれ以上の、ＭＭＰ−１２発現を調節するように設計された本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することによって、不適切なＭＭＰ−１２調節に関連するヒトの病気を有するが、または、その傾向があることが疑われる動物、特にヒトを治療するための化合物および方法を提供する。
【００６０】
本発明はまた、トランスジェニック細胞それ自体、同様に、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。トランスジェニック動物としては、生存可能なトランスジェニック細胞またはトランスジェニック器官を含む動物、同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号３〜１４）のいずれか１つ、または、それらの機能的な部分を、適切な発現カセットの制御下にゲノムに機能的に取り込んだ動物全体が挙げられる。このような動物は、ＭＭＰ−１２関連障害の病因学、ＭＭＰ−１２関連障害の進行、診断および治療に関する調査のための研究手段として有用である。当業界周知であるように、これら適切なプロモーターおよびエンハンサーを含む発現カセットは、望ましいアンチセンスＤＮＡ配列の発現が達成され、それによりＭＭＰ−１２生産のインビボまたはインビトロでの阻害が起こるように、ベクターの形態で対象となる細胞に導入される。従って、一実施形態において、本発明の配列は、アンチセンス化合物が発現されている細胞中で意図した標的の抑制が達成されるように、過剰発現されてもよい。
【００６１】
従って、本発明の一実施形態は、このようなトランスジェニック細胞、器官または動物であり、また、ＭＭＰ−１２関連疾患の性質および／または病因学を調査するためのモデ
ルとして、このような病気に対する製薬の有効性を評価するためのモデルとして、同様に、このような病気の原因となることが既知の物質および疑わしい物質の効果を調査するためのモデルとしての、それらの使用である。
【００６２】
炎症性障害におけるＭＭＰ−１２の関与が確認されたら、本発明はさらに、ＭＭＰ−１２分子の活性化を改変することによってＭＭＰ−１２の活性を調節する物質を同定するためのスクリーニング分析を提供する。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法において有用な物質として、新規に合成された化合物、市販の化合物、または、化学ファイルに登録されてはいるが様々な活性は知られていない既知の化合物、コンビナトリアルケミストリー技術で得られた一連の化合物を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物または海洋生物から得られた天然の成分、動物の組織抽出物などを用いることができる。
【００６４】
本方法は、ＭＭＰ−１２活性を改変させることが可能であると予測される物質と、ＭＭＰ−１２とが相互作用できるような条件下で、ＭＭＰ−１２の活性レベルにおける変化が容易にみられるようにＭＭＰ−１２を接触させることを含む。好ましい活性レベルの変化様式は、ＭＭＰ−１２活性または拮抗作用を有する物質の阻害である。
【００６５】
本発明において、ＭＭＰ−１２の特異的活性を改変する物質を同定するための分析は、例えば、インビトロでの分析、または、細胞に基づく分析が可能であり、ＭＭＰ−１２活性の変化をモニターする好ましい方法としては、例えば、数種の既知のＭＭＰ−１２の基質（例えばトロポエラスチン、オステオネクチン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン）に対するＭＭＰ−１２タンパク質分解活性を、ザイモグラフィー分析の形態で測定することが挙げられる。このような方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等，１９９１年で教示されている。
【００６６】
他の実施形態において、ＭＭＰ−１２の拮抗作用を有する化合物のスクリーニングは、固相コンビナトリアルライブラリー法を用いて行うことができる。
【００６７】
このようなライブラリーは、例えば、各ビーズに１種の一般的消光性蛍光原基質と、様々な推定の阻害剤の１種とが含まれるように１ビーズ−２化合物のライブラリーとして構築することができる。ＭＭＰ−１２とインキュベートした後、活性阻害剤を含むビーズは簡単に回収することができ、阻害剤化合物構造は例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメーターを用いて分析することができる（Ｆｒａｎｚ等，２００３年）。
【００６８】
本発明を特定の好ましい実施形態に従い特定して説明したが、以下の実施例は、単に本発明を説明するために提供されたものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例は使用可能なものの典型であり、これらの代わりに、不適当な実験を行うことなく当業者既知のその他の方法を用いてもよい。
【実施例】
【００６９】
実施例１．ヒトの炎症状態において過剰発現されたＭＭＰ-１２の同定
適切な生検材料の回収
ＣＤまたはＵＣの炎症性状態を有するという臨床的および病理学的な証拠に基づき選択された患者から、生検を採取した。１人の患者それぞれにおいて、結腸の炎症を起こした部位からトータルで３種の生検を回収し、同時に、炎症を起こしていない領域からの３種の生検サンプルを回収した。これをトータルで１６人の異なる患者（うち８人はＣＤと診断されており（患者１〜８）、残りの８人はＵＣと診断された（患者９〜１６））で行った。ＵＣ患者群は、２人は女性であり、６人は男性であり、年齢範囲は２９〜７７歳であ
る。相応して、ＣＤ年齢群は、３人は女性であり、５人は男性であり、年齢範囲は２７〜５９である。
【００７０】
１人の患者の各解剖学的部位の生検をプールし、トータルＲＮＡの単離は、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）のＲｎｅａｓｙキットと、ペレット・ペステル（Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐｅｓｔｅｌ）モーターホモジナイザーを製造元のプロトコールに従って用いてなされた。患者あたり２個のサンプル、すなわち炎症を起こした（標的）サンプル、および、炎症を起こしていない（コントロール）サンプルで、３２個のトータルＲＮＡサンプルを単離した。
【００７１】
ＲＮＡのｃＤＮＡ合成の実行
第一鎖ｃＤＮＡ合成のために、２μｇの各ＲＮＡサンプルを用い、１０ｐＭのオリゴ−ｄＴ−プライマーｄＴ−ジョイント（５’−ＴＡＧ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＶ−３’（配列番号１５）を用いて、合成された各ｃＤＮＡ分子に３つの制限酵素切断部位（ＳａｌＩ、ＮｏｔＩおよびＢｐｍＩ）を導入した。緩衝液、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、および、酵素の逆転写酵素（スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）II）をギブコ・ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から購入し、製造元のガイドラインに従って反応を行った。第一鎖の合成のための反応混合物（酵素を除く）を、ＰＣＲ器（ＰＣＲスプリント（ＰＣＲ  ｓｐｒｉｎｔ），ハイバイド（Ｈｙｂａｉｄ）製）で、６５℃で５分間プレインキュベートし、氷上で冷却し、次に、４２℃に予備加熱し、その後、酵素のスーパースクリプトＩＩを加え、この混合物を、ＰＣＲ器（ＰＣＲスプリント，ハイバイド製）で、４２℃で１時間インキュベートした。
【００７２】
第二鎖の合成のために、第二鎖の緩衝液ミックス（４１μｌ）を、提供されたプロトコール（ギブコ・ＢＲＬ）に従って反応に加え、４μｌのＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））、１.５μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ）、および、０.７μｌのＲＮアーゼＨ（ギブコ・ＢＲＬ）を加えて総容量を１６０μｌとした。この反応液を、ＰＣＲ器（ＰＣＲスプリント）で、１６℃で２.５時間インキュベートし、次に、キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて、提供されたプロトコールに従って精製した。これらサンプルを溶出緩衝液（３２μｌ）で溶出させて、各サンプル（２６μｌ）を以下の工程に用いた。
【００７３】
ｃＤＮＡの３’末端の増幅
生検から得られた材料が限られた量であるため、予備増幅工程が必要であった。インビトロでのｃＤＮＡの３’末端の増幅のために、全てのサンプルからのｃＤＮＡ（２６μｌ）を、制限酵素ＤｐｎＩＩ（１０Ｕ）で、３７℃で３時間、容量３０μｌで消化した。切断されたｃＤＮＡを、キアゲンのＰＣＲ精製キットを用いて再度精製し、溶出緩衝液（４７μｌ）でｃＤＮＡを溶出させた。以下の環状ライゲーション工程を、４４μｌのＤｐｎＩＩで切断したｃＤＮＡ、および、２０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を含む容量５０μｌで行った。これら反応混合物を、２２℃で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間熱で不活性化し、各反応混合物（２５μｌ）を増幅工程に用いた。サンプルあたり５回のＰＣＲ反応のための混合物を調製し（５×５０μｌ＝２５０μｌトータル）、この混合物は、２５μｌのｃＤＮＡ（ＤｐｎＩＩで切断し、環状にライゲートした）、２５μｌの１０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ＰＣＲ緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、５μｌのジョイント−Ｎｏｔプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ；５’−ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号１６））、５μｌのジョイント−Ｓａｌプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ；５’−ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＴＣ−３’（配列番号１７）、５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、および、５μｌの５０×アドバンテージ２Ｔａｑ−ポリメラーゼ（クロンテック）を含む。各サンプルに対して、ＰＣＲ混合物を５個のＰＣＲ反応チューブに分配し、以下の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で１分間、次に、１６×（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）。
【００７４】
サンプルあたり４個の反応液を取り出し、氷上に置き、サンプルあたり反応液の１つを用いて最適なサイクル数を決定した。全ての３２サンプルにとって最適なサイクル数を１８サイクルと決定し、従って、サンプルあたり残りの４個の反応液には、追加の２回のサイクル［２×（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）］を行った。サンプルあたり４個のＰＣＲ反応液をプールし（総容量２００μｌまで）、続いて、キアゲンＰＣＲ精製キットを用いてＤＮＡを溶出緩衝液（３４μｌ）で溶出させて精製した。精製した反応液を差異的に発現された遺伝子の同定プロトコールの出発原料とした。
【００７５】
ヒト生検からの差異的に発現されたｃＤＮＡ（サブトラクションプロトコール）の単離
差異的に発現されたｃＤＮＡの単離を、ｖｏｎ  Ｓｔｅｉｎ  ＯＤ，２００１年で概説されたプロトコール（プロトコールにはいくつかの変更を含む）に従って行った。
【００７６】
差異的に発現された遺伝子のスクリーニング
ｃＤＮＡライブラリー構築のために、各サブトラクションからの２０００個のクローンを、１つの２２ｃｍ2寒天プレートにプレーティングした。これらプレートから、バイオ
ロボティクス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）（ケンブリッジ，イギリス）のバイオピック器（ＢｉｏＰｉｃｋ  ｍａｃｈｉｎｅ）を用いて、３８４個のコロニーを取り出し、ＬＢ培地（７０μｌ／ウェル）を入れた３８４ウェルプレート（アンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含む）に置いた（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，１９８９年を参照）。細菌クローンを一晩３７℃でインキュベートし、次に、コロニーＰＣＲに用いた。このＰＣＲを、３８４ＰＣＲウェルプレートで、サンプルあたり容量２０μｌで行った。１つのＰＣＲ反応液は、以下を含む：２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０.４μｌのＳｐｏｒｔ−Ｎｏｔプライマー（１０ｐｍｏｌの５’−ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣ−３’（配列番号１８））、０.４μｌのＳｐｏｒｔ−Ｓａｌプライマー（１０ｐｍｏｌの５’−ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣ−３’（配列番号１９））、１.６μｌのｄＮＴＰミックス（各ヌクレオチドは２５ｍＭ）、０.４μｌの０.１％ブロモフェノールブルー、および、０.５μｌのＤｙｎＡｚｙｍｅ  Ｔａｑ−ポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；フィンザイム（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ））。全ての反応のためのマスターミックスを製造し、分配し、次に、３８４プラスチックレプリカを用いて接種させた。ＰＣＲサイクルパラメーターは、以下の通り：９４℃で２分間、３７×（９４℃で３０秒間；５０℃で３０秒間、７２℃で１分間）、および、７２℃で５分間。
【００７７】
増幅後、ＰＣＲ反応をハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ+メンブレン（アマシャム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ））上で、バイオロボティクスのマイクログリッド（Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ）ＴＡＳを用いて止めた。全てのクローンを二連でスポットし、ガイドドットとしてゲノムＤＮＡを用いた。１つのフィルター上に、４つ全てのサブトラクションからの３８３の遺伝子を配置させた。様々な放射活性ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによる分析のために、２４個の二重複製を作製した。次に、これらフィルターを、８人全ての患者の放射活性標識したサブトラクションしたｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。１６回の異なるハイブリダイゼーション実験に１６のフィルターを用いた。クレノーポリメラーゼを用いた標識のために、ｃＤＮＡ（１μｌ）を用いた。ハイブリダイゼーションプロトコールは、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８４年で概説されたチャーチプロトコールを用いた。
【００７８】
ホスホイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｅｒ）フジフィルムＢＡＳ１８００Ｈ
ｗｉｔｈ  ＢＡＳ１８００ＩＩＩＲプログラム、アレイビジョン（Ａｒｒａｙ  ｖｉｓｉｏｎ）バージョン６.０（イメージング・リサーチ社（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ  Ｉｎｃ））、配列解析、および、ＢＬＡＳＴ分析を用いて、差異的な発現の程度、および、単離した差異的に発現された遺伝子の同一性を決定した。
【００７９】
真の差異的な発現の確認
発現プロファイリング実験結果を確認するために、遺伝子特異的プライマーと、αアクチン（コントロール）のためのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。８人のＵＣ患者それぞれ、および、８人のＣＤ患者それぞれから得られた元のｃＤＮＡを用いた。次に、ｃＤＮＡを蒸留水で１：２５０に希釈し、５μｌのアリコートを１つの１回のＰＣＲ反応に用いた。１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔａｑ−ポリメラーゼを含む）（フィンザイム）、０.５μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ−ミックス、１０ｐＭのＭＭＰ−１２またはαアクチン
のフォワードおよびリバースプライマー、および、１ユニットのＤｙｎＺｙｍｅ（フィンザイムのＴａｑ−ポリメラーゼ）を含む総容量５０μｌで反応を行った。ＰＣＲ反応を、サーモハイバイド（Ｔｈｅｒｍｏｈｙｂａｉｄ）サーモサイクラーで、以下の条件下で行った：９４℃で１分間、および、Ｎサイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、および、７２℃で５分間。ＭＭＰ−１２に関しては、３０サイクルを行い（Ｎ＝３０）、αアクチンに関しては、２８サイクル（Ｎ＝２８）を行った。完了後、５μｌの各反応液を１×ＴＡＥアガロースゲルにローディングし、その後、エチジウムブロマイドで染色した。
【００８０】
ＭＭＰ−１２フォワード：５’−ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＡＴＣ  ＡＣＣ−３’（配列番号２０）
ＭＭＰ−１２リバース：５’−ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ−３’（配列番号２１）
αアクチンフォワード：５’−ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧＧ−３’（配列番号２２）
αアクチンリバース：５’−ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  Ｇ−３’（配列番号２３）。
【００８１】
これらの分析から、ヒトＵＣおよびＣＤの両方の状態において、大部分のケースでＭＭＰ−１２のアップレギュレーションが起こると結論付けることができる（図１を参照）。
【００８２】
実施例２．ＭＭＰ−１２のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の分析
ＭＭＰ−１２発現のアンチセンス調節は、当業界周知の様々な方法で分析することができる。例えば、ＭＭＰ−１２のｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で定量することができる。ＲＮＡ分析は、トータル細胞性ＲＮＡ、または、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡの単離方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９９２年で説明されている。ノーザンブロット分析は当業界で慣例的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９９２年で説明されている。リアルタイム定量ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ.
ＴＭ.７７００配列検出システム（ＰＥ−アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティー，カリフォルニア州，米国）より利用可能）を用いて都合よく達成することができ、製造元の説明書に従って用いられる。その他のＰＣＲ方法も当業界既知である。
【００８３】
同様に、ＭＭＰ−１２タンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（イムノブロット）、または、ＥＬＩＳＡのような当業界周知の様々な方法で定量することができる。ＭＭＰ−１２に対する抗体は、市場で購入可能であり、または、抗体は、従来の抗体製造方法で製造することもできる。ポリクローナル抗血清の製造方法は、例えば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌ等，１９９７年で教示されている。モノクローナル抗体の製造は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９９７年で教示されている。
【００８４】
当業界周知の免疫沈降方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等，１９９８年で見出すことができる。ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は、当業界で標準的であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等，１９９７年で説明されている。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）は、当業界で標準的であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等，１９９１年で説明されている。
【００８５】
ＭＭＰ−１２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた大腸炎マウスモデルにおける炎症の抑制
マウスの大腸において炎症が誘導された動物モデルは、Ｏｋａｙａｓｕ等，１９９０年で説明されている。本発明の実験に用いられたモデルにおいて、炎症を誘導するのに経口デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）が利用される（Ａｘｅｌｓｓｏｎ等，１９９８年）。ＤＳＳは、飲用水でマウスに投与することができ、それにより、ヒトでの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に類似した大腸炎を誘導する。ＭＷ約４０〜５０ｋＤであって、約１９％までの高含量の硫黄を含むものが、炎症を誘導するＤＳＳ形態として最適であることが示されている。Ｏｋａｙａｓｕ，１９９０年において、ＤＳＳが濃度約２〜５％で動物に投与されている。
【００８６】
本研究において、濃度２.５％で水に溶解させた、最終ｐＨ８.５（ＮａＯＨで調節）のＤＳＳが用いられた。ＤＳＳを８日間連続して雌ＳＰＦ  ＮＭＲＩマウスに経口投与し、全ての個体で安定した大腸炎を誘導した。このタイプの実験で誘導された大腸炎は、飲用水に添加した後４〜５日でも十分に誘導されることが示されている（Ｃｏｏｐｅｒ等，１９９３年）。
【００８７】
配列番号３で得られるアンチセンス物質を投薬されていない、または、麻酔した大腸炎の動物に直腸投与した。短くしたＸＲＯフィーディングチューブ（Ｖｙｇｏｎ，Ｅｃｏｕｅｎ，フランス）を直腸にトライツ靭帯のレベルまで挿入し、物質を容量１００μｌで投与し、直腸への物質の漏れを防ぐためにチューブをゆっくり慎重に引き抜いた。１回用量の水（１００μｌ）中のアンチセンス（１００μｇ）を投与した。８日目に１回治療的処理を施し、その後１０日間、ＤＳＳ処理を継続した。１８日目に、動物を殺して、臨床的な炎症性パラメーターの分析および病理組織学的検査を行った。
【００８８】
臨床的徴候
各マウスを研究期間中１日１回観察した。全ての健康の悪化の徴候およびあらゆる挙動の変化を記録した。重度の病気の徴候を示し、もとの体重の１５％超を喪失した動物を殺した。
【００８９】
死亡率および剖検
実験期間中の死亡率を記録した。実験期間の最後に、動物を頚椎脱臼で殺した。腹部を開き、脾臓を切除し、重さを量った。回盲の隣接する直腸への接合部から、恥骨軟骨部の下の通路近くまで大腸を切り出した。盲腸を頂部で開き、便を慎重に取り出した。結腸を縦に開き、便をスパーテルで慎重に取り出した。臨床的パラメーター、例えば死亡率、結腸の長さ、脾臓の重量、および便の湿潤／乾燥重量（６０℃で４８時間乾燥させた後）として計算した下痢、を記録することによって大腸炎の評価を行った（図２）。顕微鏡実験のために、盲腸と結腸全体を４％の中性に緩衝したホルムアルデヒドにおいて固定した。
【００９０】
図２より、測定された全てのパラメーターで特異的で顕著な改善がみられることが明白である。すなわち、処理された動物は、下痢が減り、より正常な結腸の長さを有し、より正常な脾臓の重量を有し、統計学的に有意な組織学的な改善の徴候を示した。
【００９１】
加工および顕微鏡実験
固定した後、顕微鏡実験用にサンプル化した組織を整え、組織学的に加工するために盲腸と結腸の中央部分から標本を採取した。第一のサンプルの解釈が困難な場合、追加の標本を採取した。標本をパラフィンに埋め込み、基準の厚さ５μｍで切断し、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡で試験した。
【００９２】
マウスのＤＳＳで誘導された大腸炎の病理組織学的評価の広範囲の経験を有する経験を積んだ獣医学の病理学者により、大腸炎の検証と炎症の評価を行った。診断上の組織病理学は、表１に示す規格化された格付けシステムに基づく。
【００９３】
【表１】
2006500073.tif 000002
【００９４】
結腸の切片の組織学的分析
上で概説したように、組織学的な加工のために、盲腸と結腸の中央部分から採取した切片を用いた。ヘマトキシリンとエオシンを用いて染色した。次に、切片を光学顕微鏡で試験し、形態学的な変化を記録した。図３から、生理学的パラメーターと組織学の両方において観察されるように、配列番号３から得られたアンチセンス化合物の１回の直腸投与は、劇的に炎症を減少させるのに十分であると結論付けることができる（図２および３）。
【００９５】
実施例３．アンチセンス配列に接近可能な結合部位に関するヒトＭＭＰ−１２ｍＲＮＡのインビトロでのスクリーニング
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する場合、様々な細胞型で容易にモニターすることができる。当業者にとって、発現された標的のレベルにおける変化を決定するのに使用可能な多数のよく確立された方法がある（以下を参照）。
【００９６】
アンチセンス化合物を用いた治療
ヒトＭＭＰ−１２ｍＲＮＡへ選択的な結合を示し、その結果としてＭＭＰ−１２タンパク質の量の減少が起こるようなアンチセンス化合物を同定するために、本発明者等は、独自に開発したインビトロでのスクリーニングシステムをセットアップした。驚くべきことに、配列番号１のコード領域（ＧｅｎＢａｎｋ(R) 寄託番号ＮＭ−００２４２６）内で、本発明者等は、極めて高い阻害を示す多数のアンチセンス配列を同定した。
【００９７】
ここで次に、アンチセンスを配列解析し、当業界周知の方法（例えばＰＣＲまたはノーザンブロット分析）を使用して標的ｍＲＮＡレベルをモニターすることによって、ヒトＭＭＰ−１２ｍＲＮＡの量を減少させるそれらの能力をモニターし、それに対して、ウエスタンブロットは、標的ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質のレベルを示す。アンチセ
ンス配列の効力を、標的配列の阻害の程度の尺度として任意にスコア化した。表２に、それらの効力の程度を減少させる群のアンチセンス配列を列挙する。
【００９８】
【表２】
2006500073.tif 000003
【００９９】
アンチセンス配列の配列番号３〜６は、ＭＭＰ−１２ｍＲＮＡレベルが、コントロールに比べて約７５〜８５％阻害されたことを示した。アンチセンス配列の配列番号７〜１０は、ＭＭＰ−１２ｍＲＮＡレベルが、コントロールに比べて約６５〜７５％阻害されたことを示した。アンチセンス配列の配列番号１１〜１４は、ＭＭＰ−１２ｍＲＮＡレベルが、コントロールに比べて約５０〜６５％阻害されたことを示した。
【０１００】
本発明は、本発明者等が現在知っている最良の様式を構成する好ましい実施形態に関して説明されたが、ここに添付された特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、当該分野の一般的な技術を有するものには明白と思われる様々な変化および改変がなされ得ると理解されるべきである。
【０１０１】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】潰瘍性大腸炎（Ａ）またはクローン病（Ｂ）のいずれかに罹った患者からの生検サンプルのＭＭＰ−１２発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２】アンチセンス化合物投与後の消化管における炎症の程度の改善を評価するのに用いられた４種の異なる基準を示すヒストグラムを示す。
【図３】実施例２で得られたマウスの結腸組織の組織切片を示す。
【図１】
2006500073.tif 000004
【図２】
2006500073.tif 000005
【図３】
2006500073.tif 000006
【配列表】
2006500073000001.app
【国際調査報告】
2006500073.tif 000007
2006500073.tif 000008
2006500073.tif 000009
2006500073.tif 000010
2006500073.tif 000011
2006500073.tif 000012
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