(57)【要約】特にゼブラフィッシュにおける、腸炎症性疾患の存在をスクリーニングするための魚モデルおよびその使用。生きているゼブラフィッシュでの疾患状態の誘導および消化管の可視化。in vivoでの炎症状態の可視化は、腸の炎症性疾患の治療において使用することができる化合物、または疾患表現型を救済または抑制する遺伝的突然変異のスクリーニングを容易にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸炎症性疾患のための魚モデルであって、炎症誘発剤を魚の胚を含む培地に投与して、魚の腸で疾患状態を誘発させる魚モデル。
【請求項２】
炎症誘発剤がトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)である、請求項1に記載の魚モデル。
【請求項３】
蛍光色素または造影剤を前記培地に投与して、魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにした、請求項1または2に記載の魚モデル。
【請求項４】
前記魚が炎症性腸疾患を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の魚モデル。
【請求項５】
腸機能および/または疾患表現型をスクリーニングするための魚モデルであって、蛍光色素を魚の胚を含む培地に投与して魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにした魚モデル。
【請求項６】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の魚モデル。
【請求項７】
腸炎症性疾患の治療に使用する化合物のスクリーニング方法であって、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の魚モデルを化合物で処理すること、
前記魚モデルの腸炎症性疾患を治療する化合物を同定すること、
を含む方法。
【請求項８】
ハイスループットスクリーニングを行うことを含む請求項7に記載の方法。
【請求項９】
可能な抗炎症薬の最適な組合せについてスクリーニングすることを含む、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
腸炎症性疾患の疾患表現型を救済または抑制する遺伝的突然変異についてスクリーニングする方法であって、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の魚モデルを突然変異させること、
前記魚モデルにおける前記腸炎症性疾患表現型を救済または抑制する突然変異を同定すること、
を含む方法。
【請求項１１】
前記魚モデルの腸を組織学的に分析して、前記魚モデルの腸炎症性疾患に及ぼす化合物または突然変異の効果を決定することを含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腸炎症性疾患のための魚モデルを作製する方法であって、炎症誘発剤を魚の胚を含む培地に投与して、魚の腸で疾患状態を誘発させることを含む方法。
【請求項１３】
前記炎症誘発剤がトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光色素を前記培地に投与して、魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにした、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
腸機能および/または疾患表現型をスクリーニングするための魚モデルを作製する方法であって、蛍光色素を魚の胚を含む培地に投与して、魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにすることを含む、方法。
【請求項１６】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
吐き気、嘔吐、および/または制吐薬、嘔吐誘発性化合物を評価する方法であって、
飲み込ませる蛍光またはその他で標識された化合物を魚に投与すること、
嘔吐誘発性化合物を魚に投与することおよび/またはピペット操作もしくは急速な運動により吐き気を誘発させること、
前記標識化合物の魚の腸を通過する運動または魚の口からのその吐出を、評価すること、
を含む方法。
【請求項１８】
炎症を評価する方法であって、
魚の腸において炎症状態を誘発させること、および
その腸の状態を、以下：
ホールマウントまたは切片による組織学的分析を、例えばヘマトキシリンおよびエオシンなどの全体的な組織学的染色、または例えば肥満細胞に対する染色などの特異的染色、例えば肥満細胞の検出のためのエタノールベースのトルイジンブルーもしくはムチンおよびムチン分泌細胞(例えば杯状細胞)の検出のためのアルシアンブルーと共に、実施すること、
腸の状態のマーカーの免疫組織化学分析、例えばTNFαに対する抗体染色、または炎症状態ではアップレギュレーションされることが公知の1つまたはそれ以上のインターロイキンおよび/もしくはサイトカインの染色を、実施すること、
腸の生化学的評価を、例えばTNFαレベルのアッセイによって実施すること、ならびに/または
炎症の誘発および炎症反応の抑制に対する反応としてのアップレギュレーションされた増殖もしくは細胞死の増加に対する組織学的分析、免疫学的分析、または遺伝子発現分析を実施すること、
により評価すること、
を含む方法。
【請求項１９】
粘液分泌性疾患を評価する方法であって、
魚の正常な腸および/または炎症性の腸を、杯状細胞の範囲、数および/または活性を評価することにより分析することを含み、その評価を、例えば、以下：
ホールマウントまたは切片による組織学的分析を、例えばヘマトキシリンおよびエオシンなどの全体的な組織学的染色、または例えば杯状細胞もしくはムチンに対する染色などの特異的な染色、例えばアルシアンブルーPAS染色と共に、実施すること、
例えば杯状細胞またはムチンに対するGFPなどのマーカー、例えば杯状細胞系統の分化マーカーであるMUC2、または杯状細胞特異的なサイトケラチンであるサイトケラチン-7を発現している、細胞または組織特異的なトランスジェニック系統を作製すること、
杯状細胞、例えばMUC2またはサイトケラチン-7を特異的に標識する抗体を使用してホールマウントまたは切片による免疫組織学的分析を行うこと、ならびに/または
細胞増殖研究の分析(例えば増殖性細胞核抗原PCNAに対するBrdU標識または免疫組織化学)を実施すること、
を含む方法で行う、方法。
【請求項２０】
癌性状態、化生および/または分化転換を評価する方法であって、
魚の正常な腸および/または炎症性の腸を、腸の細胞型の範囲、数および/または活性を評価することにより分析することを含み、その評価を、例えば、以下：
ホールマウントまたは切片による組織学的分析を、例えばヘマトキシリンおよびエオシンなどの全体的な組織学的染色、または例えば杯状細胞もしくはムチンに対する染色などの特異的な染色、例えばアルシアンブルーPAS染色と共に、実施すること、
例えば杯状細胞またはムチンに対するGFPなどのマーカー、例えばMUC2またはサイトケラチン-7を発現している細胞または組織特異的なトランスジェニック系統を作製すること、
を含む方法で行う、方法。
【請求項２１】
腸運動、IBS、下痢または便秘を評価する方法であって、
飲み込ませる蛍光もしくはその他で標識された化合物を魚に投与すること、または直接腸を視覚化すること、
場合により、魚に運動性を変更する化合物を投与すること、
腸を通過する前記標識化合物の動き、または腸自体の動き、または前記標識化合物もしくは糞便の肛門からの出現を、評価すること、ならびに/または糞便の量と質を評価すること、
を含む方法。
【請求項２２】
幹細胞活性を評価する方法であって、
魚の腸における細胞の代謝回転および分化を、正常状態における、または化学毒、細胞毒もしくは放射線療法の投与後の、in vivo評価もしくは組織学的分析、および/または有糸分裂活性のBRDU標識もしくは他の標識による腸構造の直接視覚化によって、視覚化すること、
を含む方法。
【請求項２３】
癌治療の効果を評価する方法であって、
魚の腸における細胞の代謝回転および分化を、正常状態における、または化学毒、細胞毒もしくは放射線療法の投与後の、in vivo評価もしくは組織学的分析、および/または有糸分裂活性のBRDU標識もしくは他の標識による腸構造の直接視覚化によって、視覚化すること、
を含む方法。
【請求項２４】
魚を被験化合物で処理すること、および効果を観察することを含む、請求項15〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記魚モデルを突然変異させること、および効果を観察することを含む、請求項15〜24のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きている動物で腸機能を分析し、次にこれを疾患状態の評価およびスクリーニングのために利用する新規方法に関するものである。詳細には、本発明は生きている動物における炎症性疾患の存在をスクリーニングする新規方法に関する。このことは、観測可能な組織、特に魚の腸、特にゼブラフィッシュの腸で炎症状態を誘導することにより達成される。生きているゼブラフィッシュでの疾患状態の誘導と、消化管の可視化の両方のための方法を記載する。in vivoでの炎症状態の可視化は、炎症性腸疾患の治療に使用することができる化合物、または疾患表現型を「救済する」もしくは抑制する遺伝的突然変異のスクリーニングを容易にする。
【背景技術】
【０００２】
炎症は多数の病気の主構成要素である。炎症性疾患の一般的な1つの例は、炎症性腸疾患(IBD)である。IBDの2つの主要な形態であるクローン病および潰瘍性大腸炎は、西ヨーロッパおよび北アメリカでは胃腸疾病の一般的な原因である。遺伝要因および環境要因は、病気への罹りやすさにおいても病気進行の決定因子としても重要である。
【０００３】
IBDのモデルは、炎症誘発剤を腸に投与することにより哺乳類で作製された。この方法の問題は、投与の困難性および投薬の精度にある。また、薬は通常は腸の一部に到達するだけである。さらに、生きている動物で疾患の存在または重症度を検査するための、あるいは炎症状態の変調因子をハイスループットでアッセイするための簡単な方法がない。本発明は、これらの問題に対する新規で進歩的な解決策を記載する。
【発明の開示】
【０００４】
適当な齢数のゼブラフィッシュ胚が含まれる胚培地への、炎症誘発剤、特に、別名トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)として知られるピクリルスルホン酸(PSA)の、適切な用量および適切な期間での投与は、電子顕微鏡分析を含む詳細な組織学的分析で測定されるような炎症性腸疾患をもたらす。炎症誘発剤を水に加えることにより、繰り返し投与することなくすべての胚が同じ用量に等しく曝露されるようにする。さらに、疾患状態は腸全体にわたって誘発される。
【０００５】
使用することができる他の炎症誘発剤は、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)である。
【０００６】
疾患の遺伝的サプレッサーをスクリーニングするためには、野生型胚に対して時間的に制御された様式で疾患状態を誘発できることが望ましい。本発明は、これを可能にする。疾患表現型を迅速にスクリーニングできることも重要である。本発明は、蛍光色素を胚培地へ投与することによりこれを達成する。この色素は魚によって飲み込まれて腸全体を満たす。蛍光顕微鏡下で観察すると、腸の陰窩および絨毛が見られる。
【０００７】
さらに、生きている魚を視覚化すると、蠕動運動を観察することができる。対照的に、ヒトの炎症状態の場合と同様に、疾患状態においてはその蠕動は失われる。腸は拡張して陰窩および絨毛は失われる。視覚化は非常に迅速でありいかなる組織学的処理も必要とせず、そのためハイスループットスクリーニングの実施が可能になる。
【０００８】
本発明は、腸機能の反復した生での視覚化を可能にする。このことは正常な腸の機能および運動の両方、ならびに様々な疾患状態および生理現象、例えば炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、吐き気および嘔吐、腸動態、便秘および下痢、化学療法で誘発された大腸炎ならびに腸幹細胞機能の研究を可能にする。
【０００９】
本発明は、吐き気、嘔吐および腸運動の評価も可能にする。
【００１０】
この系は、また、治療用化合物のハイスループットスクリーニングにも適している。動物全体がスクリーニングされるので、数種の可能な抗炎症薬の最適な組合せについて一度にスクリーニングすることができる。
【００１１】
以下では、疾患の誘導およびそれに続く視覚化のための好ましい一方法を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
PSAによるIBDの誘導
ストック溶液
ピクリルスルホン酸(Sigma P2297)を粉末で4℃で保存する。1mg/ml PSAを含む胚培地のストック溶液。4℃で最大2カ月間保存する。
【００１３】
スクリーニングプロトコル
1)ゼブラフィッシュ幼生を受精後日数(d.p.f.)3日目から75μg/mlピクリルスルホン酸を含む胚培地に浸した。異常な腸構造が、受精後日数(d.p.f.)5日目から観察される。
【００１４】
2)腸構造のin vivo検査:
a)大きなペトリ皿にピンセット一つまみのケルセチン(Sigma Q0125)を加えるか、または96穴プレートフォーマットを使用するならば、2μlを各ウェルに加える(注意:ケルセチンは水溶性でない)。 
b)ケルセチン標識は、受精後日数(d.p.f.)5日目以降実施することができる。一旦ケルセチンを加えたならば、毎日培地を変える必要がある。 
c)大規模スクリーニング(例えば、96穴プレートフォーマット)では、ケルセチンを受精後日数(d.p.f.)8日目の朝早くに加え、幼生を受精後日数(d.p.f.)8日目の夜遅くまたは受精後日数(d.p.f.)9日目の朝早くに評価する。 
d)in vivo観察のためには:MS222の添加により幼生を麻酔する。大量サンプル(例えば96穴プレート)をスクリーニングするときは、一度に1つのウェルに麻酔をかける。蛍光顕微鏡を使用してケルセチン標識を観察する。染色は、FITCおよびGFPフィルターセットを使用して見ることができる。
【００１５】
このモデルの妥当性は、ヒトIBDを救済することが公知の2つの薬、プレドニゾロンおよびサリチル酸による疾患表現型の救済によって実証される。
【００１６】
プレドニゾロンによるIBDの救済
プロトコル:
1)IBDはPSAを用いて先に述べたようにして誘導した。  
2)プレドニゾロンストック(Sigma M0639)は、胚培地中に50μg/mlストックとして作製した。  
ストック液は4℃で最大2カ月間保存した。  
3)IBDは、胚をPSAに受精後日数(d.p.f.)3日から受精後日数(d.p.f.)5日まで曝露することにより誘導した。培地は受精後日数(d.p.f.)5日目に交換した。  
IBD表現型の救済が見られた。
【００１７】
5-ASAによるIBDの救済
プロトコル:
1)IBDはPSAを用いて先に述べたように誘導した。 
2)5-ASAストック(Sigma A3021)は、胚培地中に2mg/mlストックとして作製した。pHは、5-ASAの溶液状にするために中性に調節した。ストック液は暗所にて4℃で最高2カ月間保存した。 
3)IBDは、胚をPSAに受精後日数(d.p.f.)3日から受精後日数(d.p.f.)5日まで曝露することにより誘発した。培地は受精後日数(d.p.f.)5日目に交換し、さらにプレドニゾロン＋5-ASAを同時投与したPSAに交換した。アッセイ材料は暗所に保った。 
IBD表現型の救済が見られた。 
詳細な組織学的分析で測定される炎症状態に対する特徴的な免疫反応により、このモデルは、IBDだけでなく他のヒト疾患における炎症の迅速なin vivoモデルとして使用することも可能になる。
【００１８】
粘液分泌性疾患は動物モデルでは十分に表せない。ゼブラフィッシュの後腸で観察される杯状細胞の分化転換は、粘液分泌性疾患の研究モデルを提供するために使用することができる。このモデルは、杯状細胞の分化転換を促進する因子を解明し、さらにその分化を抑制する因子をスクリーニングするためにも使用することができる。したがって、このモデルは癌性の状態、特に化生の研究にも関連する。
【００１９】
過敏性腸症候群(IBS)は、他の病理学的原因が見出されない腹部症状の集合の存在に対する包括的な用語である。共通の症状としては、腹痛、膨満および排便習慣の変化が挙げられる。大部分のケースは、多分、運動障害によるものである。腸壁神経複合体は運動を制御するので、IBSは腸神経系の障害と考えることができる。IBSは胃腸科専門医によって最も一般的に見出される病的状態であり、時折、人口の最高25%に影響を及ぼし、さらにその25%は専門医への紹介が必要となるほど重症の症状を有する。約50%においては、12カ月にわたり症状の改善が見られる。他においては、慢性の間欠性の症状がより典型的である。普遍的に成功する治療法はない。約30%の患者はいずれかの特定の薬剤に応答するが、薬剤の有効性は時間と共に変化するかもしれない。下痢が顕著な場合は止瀉剤、例えばロペラミド、アミトリプチリンまたはコデインを使用し、便秘症状がある場合は高繊維食品が使用される。メベベリンのような抗コリン作用薬は、有用な鎮痙作用を有する。それらは少数の患者に非常に有効であり、多くの患者には部分的に有効であるが、他の患者には効果がない。特に腸運動の正常化のためのより有効な治療法、および候補治療法の特定や有効性の予測に役立つ疾患状態のモデルの両方が必要である。本発明者らは、腸運動をin vivoにおいてハイスループット式で視覚化する方策を開発した。スクリーニングを、収縮の移行時間、強度および頻度、収縮の協調などを含む様々なパラメータの測定に向けさせることができる。そのようなスクリーニングにより、運動不全を回復させてIBSの治療のために開発することができる薬を特定することが可能になるであろう。
【００２０】
本発明者らはある種の刺激、例えば魚水の急速なピペット操作は逆蠕動および逆流を引き起こすことを観察したが、この結果は魚がその齢数に不適当なペレット飼料を与えられたときにも観察された。したがって、これによりこのモデルは、悪心および嘔吐、制吐剤および運動促進剤を分析するため、嘔吐を起こすことから良い候補薬ではない薬を見つけ出すため、または催吐薬に対する反応を抑制することから制吐薬候補となりうる薬を見つけ出すため、または蠕動波を速めることから良い運動促進剤となる薬を見つけ出すために、適当なモデルとなる。
【００２１】
炎症は、炎症状態に対する免疫反応を特徴とする多数の病気すべての主構成要素である。ゼブラフィッシュにおいてIBDで観察される疾患変化は他の炎症状態にも外挿することができ、それによりこのモデルはIBDだけでなく他のヒト疾患における炎症の迅速なin vivoモデルとして使用できることになる。
【００２２】
前述のように、本発明は生きている動物内での視覚化を、腸機能のスクリーニングに適するハイスループット式で、例えば蠕動波、陰窩および絨毛の観察により、可能にする。
【００２３】
本発明は状態、例えば腸の運動自体、過敏性腸症候群、制吐薬の作用、便秘、および他の腸障害、例えば小児脂肪便症の観察に有用である。
【００２４】
本発明は、本モデルにおいて炎症性腸疾患を誘発し、排出物を視覚化し、さらに、生きている魚において例えば蠕動の変化、異常形態(拡大、正常な陰窩および絨毛構造の喪失)によりスクリーニングし、また固定標本においては例えばTNFαレベルの測定、H&E切片の観察、肥満細胞の計数、また杯状細胞数およびその腸の存在部位の決定により、スクリーニングする方法に関する。
【００２５】
本発明が提供するのは、基礎疾患を示すだけでなく、以後のスクリーニングに使用するのに特に適した魚疾患モデルである。このことは次に人間またはその他の治療法の同定を可能にする。
【００２６】
本発明は、糞便排出量をアッセイする手段、したがって飼料の消費および吸収の指標、結果として満腹感、食物嗜好、吸収および肥満の有用なアッセイ法も提供する。
【００２７】
腸管の損傷および炎症を誘導する他の方法は、本発明の態様および実施形態にて提供される。
【００２８】
本発明者らは、スーダンブラック含有エチレングリコールを胚培地に添加すると、腸の障壁機能の崩壊の結果として腸上皮からの脱落および出血が起こることを観察した。これらの疾患変化により、腸内腔は赤色を呈する。これらの変化は、簡単な低分解能解剖顕微鏡を使用して生きている動物で観察することができるので、ハイスループットスクリーニングに適する。
【００２９】
この疾患状態の誘導の観察はin vivo分析、組織学的分析およびEM分析に基づいたものでもよく、またこれらを使用してもよい。
【００３０】
本発明は、通常、様々な疾患および障害の任意のものに適用でき、様々な実施例が本明細書中に具体的に示されている。
【００３１】
すべての段階で、表現型を変える薬は、薬剤、タンパク質、抗体の適用によるもの、または遺伝的変更もしくは他の操作によるものであってよい。
【００３２】
本発明は、手段、特に本明細書で特許請求され開示されている魚モデル、および特許請求され開示されている方法を提供する。
【００３３】
ゼブラフィッシュは、哺乳動物モデル系と無脊椎動物モデル系の長所の多くを併せ持つ生物である。ゼブラフィッシュは脊椎動物であり、したがってショウジョウバエまたは他の無脊椎動物よりもヒト疾患のモデルとして妥当であり、他の脊椎動物モデルと違ってそれを使用して遺伝的スクリーニングを行うことができる。
【００３４】
ピアレビューを受けた多数の論文で、ヒト障害のモデルとする生物種としてのゼブラフィッシュの使用を重視し、検証している。[Dooley KおよびZon LI(2000)遺伝学および発生における現在のオピニオン(Current Opinion in Genetics and Development)10:252〜6;Barut BAおよびZon LI(2000)Physiological Genomics 13:49〜51;Fishman MC(2001)Science 294:1290〜1]。
【００３５】
脊椎動物の使用により、疾患に関係する遺伝子およびプロセスを同定する高度な分析を実施する機会が提供される。
【００３６】
本発明者らは、ゼブラフィッシュが無脊椎動物のスケーラビリティと脊椎動物のモデリング能力という特有の組合せを提供することを認識した。ゼブラフィッシュは成長が早く、受精後24時間以内に基本的なボディプランがすでに出来上がっている。さらに、透明被膜内でのex-utero発生により、解剖顕微鏡による内臓を簡易にin vivo可視化することが可能になる。多くの疾患状態は、胚がわずか数ミリメートルの長さで、100μlの液体内で生きることができる時期の誕生後第1週以内に、モデルとすることができる。このことにより、マルチチャネル形式、例えば96穴プレートフォーマットでの個々の胚の分析が可能になる。このことは特に多くの化学物質を96穴プレートフォーマットで配置するような薬剤スクリーニングのために有用である。
【００３７】
あるいは、ペトリ皿または水槽に入った魚の集団を使用してもよい。魚の集団は一緒に処理してもよいし、例えば1つまたはそれ以上の、あるいは組み合わせた被験物質を水に加えることにより、一緒に試験してもよい。
【００３８】
ゼブラフィッシュの成熟期間は2〜3カ月と短く、また非常に多産であり、1対の成体から一週間当たり100〜200匹の子孫が産まれる。胚および成体はいずれも小さく、胚は長さ2〜3mm、成体は2〜3cmである。ゼブラフィッシュは安価であり維持が簡単である。小さな場所で多数の子孫をつくることができることは、優れたスケーラビリティの潜在力を提供する。
【００３９】
ゼブラフィッシュに加えて、フグ、金魚、メダカおよびジャイアント・レリオ(giant rerio)のような他の魚も、操作、突然変異および研究、ならびに本明細書で開示されている本発明の態様および実施形態での使用に適する。
【００４０】
他の態様において、本発明は、本明細書で開示され、さらに下で考察されるスクリーニングに有用なまたはそこで使用するための、開示されている魚モデルを作製する方法を提供する。
【００４１】
疾患表現型に及ぼす突然変異の影響を測定するための魚の突然変異においては、いくつかの方法を採用することができる。
【００４２】
そのような方法は、疾患遺伝子のコード配列が魚において所望の誘導性および/または組織特異性を有するプロモーターと機能的に結合した遺伝子構築物を提供するステップ、前記遺伝子構築物を魚の胚に導入するステップ、前記遺伝子構築物を前記魚の胚のゲノムに組み込むかまたは組み込まれるようにするステップ、および前記魚の胚を生存能力のある魚に育てるステップを含みうる。
【００４３】
生存能力がありかつ生殖能力を有する魚は、1匹またはそれ以上の他の魚と交尾し、プロモーターの調節制御下にそれと機能的に結合した疾患遺伝子を含む遺伝子構築物についてトランスジェニックである魚の系統、例えばゼブラフィッシュの系統を確立することができる。そのような魚の系統、例えばゼブラフィッシュの系統は、開示されているようにスクリーニングに有用である。
【００４４】
遺伝子を魚の胚、例えばゼブラフィッシュ胚に導入するために、当業者が利用できる技術を使用して遺伝子構築物を作製する。その構築物を制限消化によってベクターから遊離し、例えば、1×TE(pH8.0)中に溶出してからテトラメチルローダミンデキストラン(0.125%)のような標識色素を含む50〜100μg/ml KClの操作濃度まで希釈することによって、ゲル精製してもよい。一般的に、この溶液の1〜3nlを単一細胞のゼブラフィッシュ胚に注入することができる。数千の胚に注射することができる。
【００４５】
注入された胚を成体まで飼育し、次に、互いにまたは非トランスジェニックな野生型の魚と交配させる。以降の世代への導入遺伝子の伝達は通常モザイク状であり、2〜90%までの範囲を示す。創始者魚が導入遺伝子を有するかどうかを立証するために、一般に少なくとも100匹の子孫が分析される。
【００４６】
所望の表現型および/または遺伝子型を示している魚を成体まで育て、野生型魚と交配させてもよい。親と子孫をマッチングさせ、子孫は同様に表現型および/または遺伝子型を評価することができる。特定の表現型を有する子孫、したがって組み込まれた疾患遺伝子構築物のおそらく生殖系列伝達は、選択的に飼育することができる。子孫の一部を、より詳細な解析のために、例えば自己免疫疾患の性質を確かめるために、犠牲にしてもよい。このような分析としては、魚の細胞中の前記構築物の発現を確認するために、導入した遺伝子に対するセンスおよびアンチセンスプローブを使用したin situハイブリダイゼーション研究、例えばプラスチック切片を用いた組織または細胞に及ぼす影響を調べるための解剖学的評価、ならびに細胞におけるアポトーシス細胞死を調べるための末端デオキシウリジンヌクレオチド末端標識(TUNEL)が挙げられる。
【００４７】
適当な特性をもつ魚が由来する系統は、以降の世代を通じて維持することができる。この維持により、この新しい突然変異系統を本発明のさらなる態様に従って二次スクリーニングに掛けることができるようになる。
【００４８】
本発明の態様および実施形態で使用される遺伝子、例えば疾患遺伝子配列(例えばゼブラフィッシュのような魚と非相同な配列)は、野生型遺伝子または突然変異体、変異型または誘導体配列を使用してもよい。この配列は、示された配列の1つまたは複数のヌクレオチドの1つまたは複数の付加、挿入、欠失および置換である変化により、野生型と異なってもよい。ヌクレオチド配列への変更の結果、タンパク質レベルでのアミノ酸の変化または無変化が遺伝子コードで測定される。
【００４９】
本発明のいくつかの態様は、誘発された表現型の遺伝的救済を含む。ゼブラフィッシュのような魚は、特に遺伝的救済実験に適する。
【００５０】
F1-3世代(優性用)またはF3世代(劣性用)で救済スクリーニングのための突然変異系統を作出するために、エチルニトロソ尿素(ENU)などの突然変異原を使用してもよい。(劣性突然変異を同型接合性に育てることができるのは第三世代による場合だけである。)  ENUは、高効率に点突然変異を導入する。突然変異誘発のためにはレトロウイルスベクターを使用してもよく、それらはENUよりも効率が1桁劣るけれども、突然変異遺伝子を迅速にクローニングすることができるという長所を有する(例えばGolling他(2002)Nat Genet 31、135〜40を参照)。Mariner/Tcファミリー転移因子はゼブラフィッシュゲノム中に成功裡に動員されるので、突然変異原として使用することができる(Raz他(1998)Curr Biol 8,82〜8)。ENUは現在利用できる最も効率的で簡単な方法であり、今のところ好まれている。
【００５１】
次に救済(rescue)系統を作製し、基礎となる遺伝子をマッピングする。 
突然変異遺伝子のマッピングは比較的簡単である。例えば、魚の遺伝的地図上のマーカー密度は、ゼブラフィッシュの人気が高まったのが比較的最近であるにもかかわらずマウスの地図のそれよりも既にかなり高い。利用できるウェブブラウザを用いて検索文字列「ゼブラフィッシュ」および「ハーバード」を使用して検索できる、ゼブラフィッシュに関するハーバードのウェブサイトを閲覧すればよい。現在(2002年11月28日および2004年1月22日)、このウェブサイトは(http://zebrafish.mgh.harvard.edu/mapping/ssr map index.html)にある。サンガーセンター（Sanger Center）は、現在(2002年11月28日および2004年1月22日)、www.ensembl.org/Danio rerio/で公表されている配列を用いて、ゼブラフィッシュゲノムの配列決定を行っている。このサイトは、任意のウェブブラウザを用いて検索文字列「danio rerio」および「Sanger」または「ENSEMBL」を使用して見つけることができる。約70,000のESTが同定されており、放射-ハイブリッド地図上にマッピングされている。
【００５２】
本発明に従い、ランダムでもよいが行動または生理学面への影響を導入する他の方策は、遺伝子の機能または活性を、例えば、RNA干渉もしくはモルホリノなどの遺伝子サイレンシングまたはアンチセンス技法を使用してダウンレギュレートすることである。これらは候補遺伝子に対して標的化してもよいし、体系的スクリーニングの一部として一連の遺伝子に対して生成させてもよい。それらのex utero発生を考慮すれば、魚の胚、例えばゼブラフィッシュ胚にRNA、DNA、化学物質、モルホリノまたは蛍光マーカーを注入することは比較的簡単である。
【００５３】
モルホリノは、分解から保護し安定性を強化するモルホリン環に結合したA、C、GまたはTを含む、修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスモルホリノはRNAと結合してそれを不活性化し、ゼブラフィッシュで特に良好に働くようである。この方法のいくつかの欠点としては、遺伝子配列を先に知る必要があること、初期胚に化学物質を注入する必要があること、潜在的な毒性副作用および比較的短い作用持続期間がある。その上、それらは遺伝子機能をノックダウンし、したがって点突然変異と同様のレパートリーの対立遺伝子変化を提供しない。
【００５４】
本明細書で開示されているスクリーニング方策の様々な他の要素のいずれかと結びつけた、in vivoスクリーニングの一部として遺伝子またはタンパク質の機能を変更するためのさらなる方策は、タンパク質アプタマーを発現するトランスジェニック系統を作製し、これらを疾患系統と交配させるか、または他の手段で疾患を誘発し、次に、変更された疾患状態をアッセイすることである。タンパク質アプタマーは薬剤探索の別の経路を提供する[Colas、1996]が、本発明に従ってin vivoでその効果をアッセイすることができることにより、in vitroスクリーニング法を超えてその有用性は著しく向上する。
【００５５】
当然ではあるが、当業者は試験アッセイで得られた結果と比較するための適当な任意の対照実験を設計するであろう。
【００５６】
様々なさらなる態様では、本発明はこのように目的の疾患遺伝子に影響を与えることが判明した医薬組成物、医薬、薬剤、またはサプレッサー遺伝子もしくは他の遺伝子もしくは遺伝子産物もしくは物質を含む他の組成物、目的の疾患遺伝子の抑制、そのような材料の医学的処置法での使用、そのような材料を患者に、例えば医学的病的状態の治療(予防的処置を含んでもよい)のために、投与することを含む方法、増殖性疾患の治療などのそのような目的のために投与するための組成物、医薬または薬剤の製造におけるそのような材料の使用、およびそのような材料を製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体、ならびに場合により他の成分と混合することを含む、医薬組成物の製造法を提供する。
【００５７】
1つまたはそれ以上の小分子が、本発明によって同定されるか得られる好ましい治療薬であるかもしれない。しかし、本発明は抗体媒介療法、遺伝子ターゲッティングまたはタンパク質ターゲッティングによって媒介される治療法、あるいはRNAi、アンチセンスおよびモルホリノを含め様々な任意の遺伝子サイレンシング技法のための適当な標的を同定するために使用してもよい。
【００５８】
あるいは、遺伝的突然変異の誘導により表現型を救済する試みの代わりに、またはそれに加えて、救済を、被験物質、例えば1つまたはそれ以上の化学物質の適用により達成することができる。この状況において、上記方法のすべてが救済のために突然変異ステップを必要とするわけではない(しかし、これが疾患状態の誘導のための手順の一部であるならば、突然変異ステップが依然として必要となるであろう)。
【００５９】
本発明のさらなる態様において、病的状態の1つまたはそれ以上の症状が誘発された魚を、被験物質で処理して、病的状態の進行に影響を及ぼすことができる物質をスクリーニングしてもよい。処理された魚の挙動または生理の様相を、未処理の魚の挙動または生理の様相と比較して、未処理の魚と比較して変化した挙動または生理を有する処理魚を同定することにより、被験物質の効果を評価し、それにより自己免疫疾患状態の進行に影響を及ぼす被験物質を同定してもよい。
【００６０】
本発明は、手段、特に、投与するとIBDの炎症または自己免疫要素の症状を軽減する被験物質についてスクリーニングする方法で使用するための魚モデルを、提供する。
【００６１】
魚は、様々な方法で被験物質で処理することができる。例えば、魚は被験物質と接触させてもよく、その表面に触れさせるか擦り付けてもよく、またはそれに注入してもよい。
【００６２】
魚、特にゼブラフィッシュのさらなる長所は、水中で生活することである。このことから被験物質を魚が存在する水に加えればよいので、被験物質の投与が簡単になる。また、ゼブラフィッシュおよび他の魚は、化学物質を容易に吸収する。化学物質の水中有効濃度は、しばしば哺乳類の有効血漿中濃度に等しい。
【００６３】
有益な、または有害な作用を示す被験物質を同定するために、様々な被験物質をマルチウェルプレート、例えば96穴プレートの各々のウェルに加えてもよい。被験物質にさらされている各々のウェルには、1匹のまたは複数の魚が存在してもよい。
【００６４】
さらに本発明者らは、ゼブラフィッシュがDMSO(ジメチルスルホキシド)に耐性であることを発見した。DMSOは多くの薬剤を溶かすための溶剤として使用されるので、このことは重要である。本発明者らは、ゼブラフィッシュが1%のDMSOに耐えることを確認した。こうして、候補薬剤または他の被験物質をDMSOに溶かして、DMSOの最終濃度が少なくとも最高1%となるように魚水に加えることにより、それをゼブラフィッシュに投与することができる。この方法は本発明の様々な好ましい態様および実施形態で使用されている。
【００６５】
被験物質は、疾患表現型の発現前に、または疾患表現型の発現と同時に加えてもよい。好ましくは、被験物質は疾患表現型の発現後に加えてもよい。
【００６６】
同じ被験物質を異なる濃度で異なるウェルに加えてもよい。例えば、被験物質1は1mMの濃度でウェルA1に加え、100μMの濃度でウェルA2に、10μMの濃度でウェルA3に、1μMの濃度でウェルA4に、0.1μMの濃度でウェルA5に加えることができる。次に、被験物質2をウェルB1等へ加える。一群の被験物質は、公知の薬剤でも新しい化学物質でもよい。
【００６７】
さらに、被験物質は組み合わせて加えることができる。例えば、ウェルA2には被験物質1および2が、ウェルA3には被験物質1および3が、ウェルB2には被験物質2および3が含まれてもよい。あるいは、すべてのウェルが被験物質xを含み、個々のウェルはさらなる一群の被験物質を含んでもよい。
【００６８】
他のオプションでは、ペトリ皿または水槽に入った魚の集団を使用して、例えば1つまたはそれ以上の被験物質、あるいはそれらを組み合わせた被験物質、あるいはその組合せを水に加えることにより、一緒に処理してもよい。
【００６９】
このように、ゼブラフィッシュでは、脊椎動物の生物学的経路全体をハイスループットでスクリーニングすることが可能である。
【００７０】
ある態様および実施形態では、本発明は、他の物質とともに相乗作用的組合せをもたらす物質をスクリーニングし好ましくは同定または取得すること、あるいは相加作用的または相乗作用的組合せを一緒になって提供する2つ以上の物質をスクリーニングし、好ましくは同定または取得することを可能にする。臨床上の利点は、しばしば薬剤の相乗作用的組合せに由来する。本発明に従うin vivo系の使用により、そのような相乗作用的組合せの同定が可能になる。
【００７１】
このようにある実施形態において、本発明は、議論したように少なくとも1つは被験物質である2つ以上の物質で魚を処理すること、および挙動または生理の様相に対する前記2つ以上の物質を組み合わせた効果を、最適効果(同時にあるいは逐次適用するのがよいか)を決定するために、前記2つ以上の物質のいずれかまたは両方を個々にまたは単独で適用したときのその効果と比較することを含む。適用される物質のすべて(または両方)は各々被験物質であってもよいし、あるいは1つの物質はモデルの対象である疾患において有益な効果を示すこと、または少なくとも処理された魚モデルで効果を示すことが公知の薬剤であってもよい。
【００７２】
本発明はこのように、公知の薬剤に対して相加的効果をもたらすか、または公知の薬剤との相乗効果をもたらす物質をスクリーニングし、好ましくはそれを同定または取得することを可能にする。本発明は、また、それぞれ個々にまたは単独で使用されたときの2つ以上の物質の効果と比較して、相乗効果を示す2つ以上の物質の組合せをスクリーニングし、好ましくは同定または取得することも可能にする。
【００７３】
既存の薬剤の投与を中止して代わりに新薬を患者へ投与するような臨床試験を行うことは難しいので、アド・オン療法は有益である。患者には、少なくとも証明された有効性および副作用プロフィールでの信頼性をある程度有する薬剤を与えないようにする。さらに、患者は既存薬剤の投薬中止期間中および試験薬の増強期間中は、彼らの疾患に対する抵抗力が弱まる。例えば、上で挙げた例に関しては、多くのIBD患者は既に5-アミノサリチル酸および/またはプレドニゾロンを服用しているので、遺伝的突然変異または被験化合物が現行の療法に相加的であるか相乗的であるかを見分けることができることは、非常に有益である。本発明は、これを可能にする。
【００７４】
被験物質に加え、魚は、野生型動物ではなく突然変異した動物でありうる。次に、有益な相乗効果であろうが有害作用であろうが、突然変異＋被験物質の相互作用効果のアッセイが可能である。あるいは、分析は公知の治療薬の分析でもよく、また、公知の薬剤と組み合わせた有益な新薬標的、またはどの患者が公知の薬剤の処方から利益(または不利益)を受ける可能性がかなり高いかを予測する上で有用な遺伝的標識を探索するための遺伝的突然変異の分析でもよい。
【００７５】
他の実施形態では、潜在的な免疫抑制剤の組合せを、その組合せが個々の薬のいずれよりも有効であるかどうかを評価するために、炎症性疾患の1つまたは複数の症状を有する魚（本明細書で開示されているようにして作製できる）に投与する。
【００７６】
例えば、臨床試験中のまたは現在処方されている様々な免疫抑制剤がある。この例では、11の被験薬剤があると仮定する。様々な薬剤は生物学的経路の異なるピンチポイントで作用する可能性があり、また賢明な同時処方により、任意の薬剤の単独使用よりも優れ、副作用プロフィールでも劣らない最適な組合せが見つかるかもしれない。最適の組合せを決定するために臨床試験を行うこと、または実際に哺乳類試験を行うことは非常に難しいものとなろう。本発明は、これを可能にする。
【００７７】
本発明は、活性物質、例えば治療活性物質の1つまたは複数の副作用を軽減する物質をスクリーニングし、好ましくは同定または取得することも可能にする。治療上有効でないからではなく副作用プロフィールで制限されるために臨床試験で中止されたか、または、市場に出されたが稀にしか処方されないような、多くの薬剤がある。副作用、例えば腎障害は比較的良性でも患者には重大である(例えばサイクロスポリン)。有益効果が証明されたそのような薬剤の投与は、副作用プロフィールを改善するために他の剤との共投与によって行うことが望ましい。
【００７８】
本発明に従って、そのような薬は、その活性物質の投与が副作用を誘導するか他の表現型を反映するかまたは副作用を示すかの魚においてスクリーニングされる。したがって、本発明の実施形態において、活性薬剤は炎症性疾患の1つまたはそれ以上の症状を有する魚に投与され、他の表現型の副作用は1つまたはそれ以上の被験物質で処置された場合にそのような動物について評価される。この場合、同時投与された薬の作用についての先行知識を必要としない。他の実施形態では、副作用を減らしつつ所望の治療効果を達成する薬を、疾患表現型および副作用表現型の評価によってスクリーニングし、好ましくは同定または取得することができる。本発明の他の態様および実施形態と同様に、ここでは一次化合物を、一群の候補物質と共に、またはランダムに誘導した遺伝的突然変異と共に同時投与することを含んでもよい。後者の方法、すなわち突然変異では、改善効果を提供する突然変異を有する魚の同定後に適当な同時治療を同定するために、以降のステップが必要である。
【００７９】
薬剤様化合物の多様なライブラリー、例えばLOPACライブラリー(Sigma)、またはChembridge PHARMACOphore多様性コンビナトリアルライブラリーを使用してもよい。特定の標的クラスに対する他の標的化ライブラリー、例えばイオンチャネルライブラリーまたはG蛋白質ライブラリーを使用してもよい。
【００８０】
本発明がさらに提供するのは、治療に対する反応性と関連した突然変異、遺伝子型、対立遺伝子変異、ハプロタイプおよび遺伝プロフィールを同定する方法である。標的処方への動きが加速しており、その際、治療の選択は患者の遺伝子タイピングによって影響を受ける。特定の多型について、化合物の治療上の有効性、ならびにある種の副作用で苦しむ可能性も予測されることが分かった。そのような合理的処方は費用効率がよい。より可能性のある反応者を標的にすることができ、その場合より少ないサンプル数で統計的有意性を達成するので、臨床試験の実施がより簡単になる。しかし、今のところ、既に処方されているかまたは開発中の大部分の薬剤には、適当な試験がない。
【００８１】
本発明は、ランダムな遺伝的突然変異と組み合わせた様々な薬剤投与の有効性を評価して、治療効果を高めるか減少させる、そして/または副作用プロフィールを変更する突然変異を同定することを可能にする。これにより、薬剤または他の治療に対する特定の反応と関連する遺伝子、多型、突然変異、対立遺伝子およびハプロタイプの同定が可能になり、これによってヒトにおける適切な遺伝アッセイが開発されるようになり、合理的処方が可能になる。
【００８２】
新薬の同定に繋がる医薬研究では、リード化合物の発見前および後にも非常に多数の候補物質をスクリーニングすることは周知である。このことが、医薬研究が非常に高コストで時間がかかる要因の1つである。スクリーニング過程で助けとなる手段は、産業上かなり重要でかつ有用である。障害または疾患を治療または予防する上で潜在的に有用な物質をスクリーニングするためのそのような手段が、本発明の魚によって提供される。変更遺伝子、例えば本発明を用いて同定されるエンハンサーまたはサプレッサー遺伝子、およびそのようなサプレッサー遺伝子の活性に影響を及ぼす物質は、in vivo使用するための治療のデザインおよび検討の基礎を提供するので、疾患との戦いにおいて進歩をもたらすが、それは、魚において治療の活性または効果に影響を及ぼしうる被験物質および疾患遺伝子の発現の活性または効果に影響を及ぼす物質と同様である。
【００８３】
さらなる様々な態様において、本発明はスクリーニングおよびアッセイの方法および手段、ならびにそれによって同定された物質に関するものである。
【００８４】
本発明の医学的処置方法で使われる材料が何であれ、投与は好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」(予防も治療とみなされるが、この場合はこうする)で行われ、この量は個体に有益性を示すのに十分な量である。実際に投与される量、投与速度および時間経過は、治療対象の性質および重症度によって決まることになる。治療の処方、例えば投薬量などの決定は、一般開業医および他の医師の裁量の範囲内である。
【００８５】
本発明の医薬組成物、および本発明に従う使用のための医薬組成物は、有効成分に加えて当業者に周知の製薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または他の物質を含んでもよい。そのような物質は無毒性でなければならず、また有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の物質の厳密な性質は、経口であってよく、または注射、例えば皮内、皮下もしくは静脈内注射による投与経路によって決まる。
【００８６】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、散剤または液剤でよい。錠剤は、固体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを含んでもよい。液状の医薬組成物は、通常、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理的食塩水、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが含まれてもよい。
【００８７】
静脈内、皮内または皮下注射、あるいは患部への注射のためには、有効成分は、発熱性物質を含まず適当なpHおよび等張性および安定性を有する非経口投与で許容される水性溶液の剤形である。当業者ならば、例えば等張性のビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液を使って、適当な溶液を難なく調製することができる。必要に応じて、保存料、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および/または他の添加物を含んでもよい。
【００８８】
上述した手法およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A(編)、1980年で見られる。
【００８９】
ウイルスベクターなどのベクターは、核酸を異なる多種多様の標的細胞に導入するために先行技術で使われてきた。一般的に、ベクターは、所望のペプチドの発現から有用な治療的または予防的効果を提供するに十分な割合の細胞でトランスフェクションが起こるように、標的細胞に曝露される。トランスフェクションされた核酸は永久に各標的細胞のゲノム中に組み込まれて長く続く効果を提供することができる。あるいは、そうでなければ、治療を定期的に繰り返さなければならない。
【００９０】
様々なベクター、例えばウイルスベクターおよびプラスミドベクターは、当技術分野で公知である。米国特許第5,252,479号および国際出願第93/07282号を参照。特に、多数のウイルス、例えばパポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、例えばHSVおよびEBV、ならびにレトロウイルスが遺伝子導入ベクターとして使われてきた。先行技術における多くの遺伝子治療プロトコルでは、不活化マウスレトロウイルスが使用されている。
【００９１】
遺伝子治療でウイルスベクターの使用に代わるものとして、核酸を細胞に導入する他の公知の方法としては、機械的な手法、例えばマイクロインジェクション、リポソーム媒介導入および受容体媒介DNA導入、さらに裸のDNAまたはRNAの投与（例えばプラスミドのような核酸を、例えば筋肉へ、例えば注射などの単純に投与することによる）がある。
【００９２】
被験物質の適用は、本発明の実施形態に従って次の通りでもよい:
1.被験物質を疾患状態の出現の前、疾患状態が誘導された時点、または疾患状態の誘導後に魚に加える。最初の2つの状況は予防効果のある化学物質を同定する可能性がより高く、後者は疾患状態を正常に戻す効果のある薬剤を同定する可能性が高い。被験物質は化学物質でありうるが、96穴プレートフォーマット中の魚にハイスループット式で投与されるランダム化学物質、またはペトリ皿中の一群の魚に投与される選択された化学物質でもよい。
【００９３】
2.魚について、次に初期の疾患状態からのずれについてスクリーニングする。
【００９４】
以下のさらなるステップはスクリーニングする上で非常に望ましく、それらの使用は好ましい実施形態において本発明で提供される:
単一の化学物質を加えるよりはむしろ、化学物質の組合せが加えられる。例えば、公知の治療薬を、さらなる有益な効果がまだ検出される用量で、すべての魚に投与してもよい。ランダム化学物質ライブラリーを次に魚に加え、付加的効果をスクリーニングする。
【００９５】
さらなる実施形態では、以下に示すように特定の突然変異による特定の薬剤の増強が検出されるようになる:
1.上記のいずれかにより遺伝的突然変異を誘発する。  
2.疾患状態を誘発する。  
3.被験化学物質を投与する。  
4.突然変異と化学物質の組合せがいずれか単独よりも優れているかどうか評価する。  
5.先に述べたように、次に、突然変異した遺伝子を有益な標的として用いる。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態では、所与の患者に対する特定の治療薬の妥当性の判定を助ける遺伝要因の同定が可能になる。突然変異が薬剤の効果を高めるならば、その突然変異をヒトホモログで検索する。この突然変異を有する患者には優先して薬剤を処方しなければならない。この突然変異が有害な効果を導くかまたは効果が見られないならば、患者はこの薬剤を避けるべきである。
【００９７】
本発明のさらなる実施形態では、そうでなければ毒性のある薬剤の副作用の予防を助ける遺伝要因または化学的要因が同定されうる。以下は例示的実施形態であり、他の疾患の他の局面に適用してもよい:
1.薬剤Xは疾患Yに対して有益な効果を有するが、副作用Zを引き起こす。  
2.薬剤Xによる治療に反応するが副作用Zが合併して生じるゼブラフィッシュモデルを作製する。  
3.処理した魚は一群の化学物質で同時処理される(あるいは、薬剤標的への経路として突然変異誘発される)。
【００９８】
4.副作用をもはや示さないがまだ有益な効果を示す魚を選択する。薬剤Xをより安全に投与するために、次に化学物質を同時投与剤として患者に使う(あるいは、突然変異させた遺伝子をマッピングして同時投与剤の開発に用いる)。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態では、化学的手段の遺伝的突然変異よりもむしろタンパク質アプタマーによる初期表現型の変更を試みることを含む。例えば、以下に従った方法を実行してもよい:
1.所望のアプタマーをコードする構築物(または、ランダムアプタマーのためのランダム構築物)を胚に注入してアプタマーを発現する系統を作製する。  
2.これらの系統を次に疾患を発現する系統と交配させるか、あるいは疾患状態をこれらの系統で誘発させる。  
3.次に、これらの系統は、予想されるまたは初期の表現型からのずれについて試験する。 
4.ずれが生じるならば、このアプタマーの作用はin vivoで証明され、このアプタマーは治療薬を得るために用いられる。
【０１００】
疾患表現型に救済をもたらす突然変異を有する魚を同定した後は、以下のステップを実行してもよい:
1.ゼブラフィッシュの救済遺伝子のヒトホモログをクローニングする。  
2.同じ種類の突然変異をヒトホモログに導入する。  
3.野生型構築物および突然変異した構築物を胚に注入する。  
4.疾患状態を誘発させ、評価する。  
5.野生型遺伝子は救済を引き起こさないが、突然変異した遺伝子は救済を保持する場合、この突然変異は有益であるというさらなる証拠となる。しかし、負の結果は必ずしも有益性を排除するわけではない。  
6.ヒトホモログによってコードされるタンパク質は、in vitroでの直接薬剤スクリーニングに使用されるかまたはin vivoスクリーニングに向けられる。
【０１０１】
過去10年にわたって、炎症性腸疾患(IBD)に関する本発明者らの知見における進歩の多くは、重要な感受性遺伝子および遺伝子座を同定したヒト遺伝子研究によってもたらされた(ParkesおよびJewell、2001;WattsおよびSatsangi、2002)。そのような研究は、遺伝子−環境相互作用が疾患の感受性と進行の両方を決定することを証明した。しかし、これらの知見を治療のために患者群を層別する上で臨床適用することはできるが、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)のための治療オプションにほとんど変化がなかった。大腸炎の動物モデルにおける研究も、疾患の遺伝的要素を重要視していた。免疫応答および炎症経路で様々な遺伝子を欠損しているかまたは過剰発現しているマウスは、炎症性反応の多くの段階の脱制御が腸の慢性炎症につながりうることを示した(Mueller、2002)。これらの遺伝的モデルは大腸炎の病理における「ピンチ（ひとつまみの）ポイント」の同定を可能にするが、これはヒトのCDおよびUCで見られる病理学的、臨床的、および組織学的変化のすべての様相を再現するものではなく、それ故に、将来の治療法のための標的を同定するには問題がある。ここで、本発明者らは、生きている脊椎動物において腸機能をハイスループットで高含量の様式で分析する方法であって、特に嘔吐、運動促進、IBSおよびIBDに適用できる方法を記載する。本発明者らは、ヒト病態との生物学的、病理学的、臨床的関連性を示すこのモデルにおいてIBDを誘発する方法、ならびにこのモデルでスクリーニングする方法およびその結果も記載する。
【０１０２】
炎症性腸疾患(IBD)は、慢性の再発性および寛解性の腸管炎症を特徴とする、多因子性であるが病因はほとんど未知の疾患である。IBDの2つの主要な形態であるクローン病および潰瘍性大腸炎は、西ヨーロッパおよび北アメリカでは胃腸障害の一般的な原因である(Calkins およびMendeloff、1995)。遺伝要因および環境要因は、病気への感受性においても病気進行の決定因子としても重要である。感受性遺伝子の同定は疾患の予測および治療のための患者集団の規定において大きな価値があるが、コードされているタンパク質は新規療法のデザインのための有用な標的とはなりそうもない。その結果、製薬業界は主にIBDの齧歯動物モデルに依存している。そのようなモデルは多いが、ヒト疾患を真に反映するものとして際立つものは1つもない。従来から、IBDは、炎症誘発剤を腸に投与することによりラットやマウスで誘導されている。この方法の問題は、投与の困難性および投薬の精度にある。また、炎症誘発剤は通常は腸の一部に到達するだけであり、それ故に、疾患は腸の小さな領域だけに限局される。生きている動物で疾患の存在または重症度をアッセイするための簡便な方法、あるいは炎症状態の変調因子をハイスループット式で測定する簡単な方法はないので、齧歯動物モデルの研究は分析方法によってさらに困難になる。ここでは本発明者らはIBDのゼブラフィッシュモデルであって、ヒト疾患に関連する疾患変化に特異的な領域が腸全長を通じて示される。さらに、生きている動物においてそのような変化を視覚化することができることから、このモデルはIBDの新規療法の同定のためのハイスループットスクリーニングに適している。
【実施例】
【０１０３】
材料および方法
ストックの維持および胚の収集
魚は標準条件下で飼育した(Westerfield、1995)。胚は天然産卵から採集し、確立されている基準(Kimmel他、1995)に従って発生段階を調べ、胚培地(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2;0.33mM Mg2SO4、10-5 %メチレンブルー)中で飼育した。
【０１０４】
腸構造のin vivo検査
in vivo標識化は、魚を0.05%ケルセチン(Sigma)懸濁液で最低2時間飼育することによって達成した。腸の構造および運動を観察するために、幼生を0.2mg/mlの3-アミノ安息香酸エチルエステル(MS222)(Sigma)に浸漬して麻酔をかけた。腸の構造および運動は、FITCおよびGFPフィルターセットを使用して観察することができる。
【０１０５】
IBDの誘導
胚培地に入れた1mg/mlのピクリルスルホン酸(Sigma)(トリニトロベンゼンスルホン酸‐TNBS)のストック溶液が、IBDの誘導のために使われた。ストック溶液は4℃で最大2カ月間保存した。受精後日数(d.p.f.)3日からゼブラフィッシュ幼生を、このアッセイ当日に新規に作製された75μg/mlのピクリルスルホン酸(PSA)を含む胚培地に浸すことによって、IBDを誘導した。
【０１０６】
プレドニゾロンおよび5-アミノサリチル酸によるIBDの救済(rescue)
6-αメチルプレドニゾロン(Sigma)を加えた胚培地の50μg/mlストック溶液を、すべてのプレドニゾロン救済実験で使用した。5-アミノサリチル酸(5-ASA)(Sigma)を加えた胚培地の2mg/mlストック溶液を、すべての5-ASA救済実験で使用した。溶液のpHは、NaOHを使ってpH 7.5に調整した。ストック溶液は暗所に4℃で最高2カ月間保存した。IBDは、幼生を75μg/ml PSAに受精後日数(d.p.f.)3日から受精後日数(d.p.f.)5日まで曝露することにより誘導した。受精後日数(d.p.f.)5日目に75μg/ml PSAを含む培地を取り除き、プレドニゾロンまたは5-ASAと組み合わせた75μg/ml PSAで置換した。プレドニゾロンおよび5-ASAは、最も救済効果の高い用量を見つけるために一連の濃度範囲(それぞれ1〜25μg/mlおよび2〜200μg/ml)で試験した。5-ASA溶液は光反応性であるので、5-ASAにさらされた幼生は暗所に置いた。受精後日数(d.p.f.)5日目に、記載したようにしてin vivo観察を実施し、その後、幼生を固定して抗体染色または組織検査のために処理した。
【０１０７】
iNOS阻害剤、サリドマイドおよびパルテノライドによるIBD救済についてのスクリーニング
一群のiNOS阻害剤である2,2'-ジチオビス(グアニジノエタン、S-メチル-L-チオシトルリンアセテート、1-(-2-トリフルオロメチルフェニル)イミダゾール(Sigma)のストック溶液を、DMSO中、2mg/mlにて調製し、-20℃で保存した。サリドマイド(Sigma)の50mg/mlストックをDMSO中に調製した。パルテノライド(Sigma)の50mg/mlストックをDMSO中に調製した。対照群では、IBDは、幼生を75μg/ml PSAに受精後日数(d.p.f.)3日から受精後日数(d.p.f.)8日まで曝露することにより誘導した。抗炎症効果を有する可能性がある化合物を、受精後日数(d.p.f.)3日から受精後日数(d.p.f.)8日まで、PSAと同時投与することにより試験した。in vivo観察から最も救済効果の高い用量を見つけるために、すべての化合物は、一連の濃度範囲(iNOS阻害剤は20ng/mlから2μg/ml;サリドマイドおよびパルテノライドは、それぞれ50μg/ml〜2mg/mlおよび10ng/ml〜100ng/ml)で試験した。受精後日数(d.p.f.)8日目に、記載したようにしてin vivo観察を実施し、その後、幼生を固定して抗体染色または組織検査のために処理した。
【０１０８】
組織学
幼生は、ボーインズ(Bouins)固定液(Fisher Scientific)中での固定の前に、0.2mg/mlの3-アミノ安息香酸(MS222)に浸漬して麻酔をかけた。サンプルは室温で24時間〜1カ月間固定した。サンプルは漸増濃度系列のアルコールおよびHistoclear(National Diagnostics)を通して脱水し、次にワックス(Raymond A Lamb)中に包埋した。ライツミクロトームを使って7μmの横断切片および側矢状(縦)切片を切り出し、Superfrost Plusスライドガラス(Scientific Lab Supplies)上にマウントし、その後、基礎組織学のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色、または肥満細胞の検出のためにエタノールベースのトルイジン(70%エタノールに溶かした0.25%のトルイジンブルー)(Gurr、1962)で染色した。組織学サンプルはBX51顕微鏡(オリンパス)で観察し、画像はColorViewカメラおよびAnalySisソフトウェア(オリンパス)を使用して撮影した。
【０１０９】
肥満細胞の定量化
個々の幼生からの3つの矢状切片を調べた。矢状切片からは、腸の内腔がすべてのレベルで口から肛門まで存在しているものと確認された。各々の切片中の肥満細胞の総数を手作業で数え、平均値を計算した。各処理群から5つのサンプルを観察し、次に各々の処理群について肥満細胞の平均数および標準偏差をExcelソフトウェア(Microsoft Office)を使用して計算した。
【０１１０】
透過型電子顕微鏡
受精後日数(d.p.f.)8日の幼生を0.006%の過酸化水素を含むカコジラートバッファー中の4%グルタルアルデヒドで3時間にわたり固定し、次いでカコジラートバッファー中で洗浄した後、四酸化オスミウムによる後固定を行った。サンプルは酢酸ウラニルでバルク染色し、エタノール中で脱水してスパー樹脂に包埋した。薄切片(50nm)をライカUltracut UCTで調製し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、フィリップスCM100電子顕微鏡で80KVで観察した。
【０１１１】
抗体標識化
受精後日数(d.p.f.)8日の幼生を4%のパラホルムアルデヒド中で固定し、記載されている方法(Westerfield、1995)に多少改変を加えたホールマウント法で染色した。TNF-αモノクローナル抗体(Abcam)を1:20に希釈して使用した;Alexafluor 594(Molecular Probes)を二次抗体として使用した。染色した幼生をホールスライド上にマウントし、BX51顕微鏡(オリンパス)による蛍光顕微鏡検査で可視化し、画像をColorViewカメラおよびAnalySisソフトウェア(オリンパス)を使用して記録した。１群につき最低5サンプルを用い、AnalySis(オリンパス)における色閾値および面積測定を用いてTNF-α免疫蛍光強度を各処理群について定量化した。平均値および標準偏差は、Excelソフトウェア(Microsoft Office)を使用して計算した。
【０１１２】
結果
腸の構造および運動のin vivo観察
ゼブラフィッシュの光学的透明性、発生速度および繁殖力によって、ゼブラフィッシュは発生生物学研究のための一般的な脊椎動物モデルとなっており、またごく最近では疾患過程を研究するための動物モデルとなっている。この光学的透明性により、GFPを使用して組織をマーキングすることや、骨の場合は蛍光色素胚の作製も可能になる(Du他、2001)。
【０１１３】
本発明者らは、胚によって飲み込まれるが吸収されない非毒性の色素を同定できれば、生きた魚で腸の構造および機能を評価することができるようになるであろうと考えた。
【０１１４】
本発明者らは、IBDの誘導後のゼブラフィッシュ幼生の腸における疾患の変化を試験する方法を発明し、腸の構造および運動の視覚化に用いることができるいくつかの蛍光化合物を同定した。
【０１１５】
視覚化は、蛍光色素を胚培地へ投与することにより達成される。この色素は魚によって飲み込まれるが直ちには吸収されず、したがって腸全体を満たす。
【０１１６】
蛍光顕微鏡下で観察したところ、腸壁の未染色組織は腸内腔を満たしていた蛍光培地と対照的にハイライトで示されたため、腸の陰窩および絨毛は明瞭であった。さらに、染色はin vivoで実施することができるので、蠕動波が観察された(腸壁の異なる位置で示された)。使用した様々な蛍光染色液のなかでは、ケルセチンが、その低毒性、生理的pHにおける実用性および狭い蛍光スペクトルのために最も適当であった。
【０１１７】
生きているゼブラフィッシュ幼生の腸のin vivo染色は、受精後日数(d.p.f.)8日目に実行された。蛍光コントラスト色素を胚培地に加えたところ、その色素は魚に飲み込まれた。コントラスト色素は吸収されず、それ故に腸の輪郭を示した。幼生は、腹(腸)側を見下ろすようにして視覚化された。絨毛が腸の内腔に突出しているのが見られた。蠕動は容易に観察された。腸壁の収縮および弛緩部位を認めることができた。横たわった幼生も視覚化できた。対照サンプルにおいては、絨毛、指様突起が腸管腔内に突き出ているのが視覚化できた。IBDサンプルにおいては、絨毛長が短くなっており、絨毛間の陰窩が大きくなっていた。蠕動がIBDサンプルでは減少し、そのため、蛍光コントラスト色素が近位腸の内腔に蓄積した。横断切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。対照サンプルの組織学的分析により、前腸における陰窩および絨毛の存在および腸内腔の収縮が明らかにされた。IBDサンプルにおいては、絨毛および陰窩は存在せず、腸内腔が拡大していた。
【０１１８】
腸の生体染色および視覚化のための方法を発明した後、本発明者らはこれを、下記のような、様々な疾患に適用できる方法と結びつけた:
a.蠕動の直接的視覚化および評価により腸運動を評価すること;
b.例えば急速なピペット操作により乱流を急速につくり出すことによって嘔吐を評価すること;
c.例えば5FUなどの化学療法薬または放射線療法の投与によって、腸に損傷を誘発し、幹細胞活性を評価できるようにすること;
d.炎症状態を誘発すること。
【０１１９】
後者のためには、本発明者らは、ハイスループットスクリーニングを可能にするため、腸全体に特異的な様式で炎症を誘発する方法であって投与が容易であり且つ魚全体に全身性炎症を誘発しない方法を、必要とした。本発明者らは、ピクリルスルホン酸(PSA、別名TNBS)の投与によってこれらの目的を達成できることを発見した。それは、受精後日数(d.p.f.)3日から受精後日数(d.p.f.)8日まで、胚培地へ投与された。in vivo観察を毎日行って、結果的に生じた腸の構造および運動性の変化を特定した。絨毛および陰窩の形態ならびに腸運動の異常は、PSAにさらされた幼生において受精後日数(d.p.f.)5日目に最初に観察され、顕著な疾患変化が受精後日数(d.p.f.)8日まで観察された。胚培地で飼育した対照サンプルでは、絨毛が腸の内腔へ突出しているのが認められ、蠕動波が腸を通って内容物を移動させたことから、ケルセチンは蓄積していなかった。対照的に、PSAの投与後、ヒト炎症状態の場合と同様に蠕動が無くなり(すなわち腸閉塞)、腸が膨張し、さらに絨毛長が減少して陰窩が拡大した。
【０１２０】
IBDの組織学的外観
in vivoで観察された変化が細胞レベルでの疾患の変化を示すことを確認するために、in vivoで試験したのと同じ腸部位から組織学的切片を採取した。対照サンプルにおいては、腸の内腔は小さく、絨毛は内腔に突出しており、これらの突起間に狭い裂け目が見えた。PSAの投与後にin vivoで観察された疾患変化は、組織学的分析においても明瞭であった。PSAに曝露された魚においては、腸の内腔が拡張し、絨毛および裂け目が無くなって腸の内張り層は滑らかであった。次に、対照魚およびPSAにさらされた魚の腸の全長にわたり組織学的分析を実施し、領域特異的な変化が観察されるかどうかを判定した。対照魚およびPSAにさらされた魚の間には、再現性のある一貫した相違が腸全長にわたって観察された。前腸最前部の浮袋の下では、対照サンプルの上皮は突起および裂け目が特徴的であったが、PSAにさらされたサンプルにおいては上皮は滑らかに見えた。組織学上のこの変化は、浮袋の末端直後まで続いた。中腸部位から後腸に至るまで、対照サンプルでは、腸上皮は、最も後方の部位に明瞭なごく少数の杯状細胞が存在したが正常であるように見えた。PSAにさらされたサンプルにおいては、多数の杯状細胞が中腸および後腸部位全体で観察された。直腸および肛門の組織学的分析では、対照サンプルとPSAにさらされたサンプルとの間に著しい変化はまったく示されなかった。
【０１２１】
IBDにおける生物学的および病理学的変化
齧歯動物の研究において、TNBS(PSA)によって誘発されるIBDは、肥満細胞の応答によって媒介されると考えられている(Stein他、1998;Xu他、2002)。
【０１２２】
本発明者らは、本発明者らのモデルで肥満細胞の存在を判定するために、肥満細胞を特異的に標識する組織学的染色液(Gurr、1962)を用いた。肥満細胞は、PSAにさらされたサンプルと同様に対照サンプルの腸にも存在していたが、腸全体の肥満細胞の浸潤は、PSAにさらされた魚において著しく増加した。本発明者らはTNFαの発現も調べたが、その理由はこのタンパク質が炎症反応の開始および増幅において重要であり、かつ過剰な炎症反応をモジュレートするための標的であるからである。ホールマウントの抗体染色により、PSAにさらされたサンプルでは内腔上皮が強く染色されるが、対照では染色されないことが明らかにされた。IBDと関連する細胞内の微妙な変化を調べるために、本発明者らは透過型電子顕微鏡(TEM)を使って切片を調べた。TEM分析により、対照サンプルおよびPSAにさらされたサンプルの両方で腸を内張りする上皮細胞の先端表面上に微小絨毛が存在することを明らかになったが、このことはPSAは化学的熱傷を引き起こしたり腸の上皮内層を損傷したりしないが、炎症反応をさらにわずかに誘導することを示す。さらに、PSAにさらされたサンプルでの内腔へのリソソームの蓄積は、先端−基底部の極性が維持されていることを示唆する。しかし、このTEM分析で最も著しい特徴は、対照と比較した場合のPSAにさらされたサンプルにおける細胞間のギャップ結合および密着結合の喪失であった。このことは、ヒトIBD患者で見られる病理を強く思い起こさせるものであり、腸管の障壁機能の破壊があったことを示唆する。
【０１２３】
プレドニゾロン＋5-ASAによる救済
ゼブラフィッシュ幼生をPSAへ曝露することにより、IBDを有するヒトで見られるものに該当する生物学的および病理学的変化が起こることを確認した後、本発明者らは対照魚およびPSAにさらされた魚をヒトIBD患者で使われる薬、すなわちプレドニゾロンおよび5-ASAで処理することによって、このモデルの臨床的妥当性の検討を引き続き行った。
【０１２４】
PSA存在下でプレドニゾロンおよび5-ASAの両方により用量/応答アッセイを実施した。それぞれの化合物の有効量を決定するために、受精後日数(d.p.f.)8日目に腸構造のin vivo観察を行った。次に有効量のプレドニゾロンおよび5-ASAをPSAにさらされた幼生に投与し、そして組織学的分析を実施してそのような処理がPSA単独を用いて観察される疾患変化を救済することができるかどうか判定を行った。
【０１２５】
プレドニゾロンおよび5-ASAは両方とも、PSAと同時投与される場合に疾患変化を予防/救済することができ、また重要なことに、両薬剤は疾患変化の誘導後に投与した場合でも有効であった。後腸においては、プレドニゾロン処理は杯状細胞の分化転換を抑制し、この部位の組織学的状態は外観的には明らかに正常であった。しかし、疾患の寛解時のヒトIBD患者で見られる変化を思い起こさせる鎮静期疾患表現型が、プレドニゾロンで処理したサンプルで観察された。
【０１２６】
対照サンプル、IBDサンプルおよびプレドニゾロンで処理されたIBDサンプルとして、ヘマトキシリンおよびエオシン染色された横断切片を検査した。浮袋の直遠位の前腸の対応する切片同士を比較し、同様に、肛門直前の後腸の対応する切片同士を比較した。前腸においては、正常サンプルは絨毛および陰窩が存在する収縮した内腔を示した。IBDサンプルにおいては、陰窩および絨毛は存在せず、内腔は拡大していた。プレドニゾロンで処理されたIBD魚では、正常な形態が観察された。後腸においては、正常な形態の特徴は、収縮した腸壁における杯状細胞の欠如および核のランダム分布であった。IBDサンプルでは、多くの杯状細胞が存在し、腸上皮の核は基底部に押しやられていた。プレドニゾロンで処理されたIBD魚では、正常な形態が回復していた。類似の効果が5-ASAを用いた場合に認められた。
【０１２７】
抗炎症効果の定量化
プレドニゾロン処理によりPSAへの曝露後に観察された疾患変化を救済できることを確認した後、本発明者らは、TNFαの発現および肥満細胞数を、異なる用量のプレドニゾロンの抗炎症活性を定量化するのに使用することができるかどうかについて検討した。
【０１２８】
幼生を、受精後日数(d.p.f.)3日目から8日目まで、PSAおよび様々な用量のプレドニゾロンで処理した。処理群を2つに分け、TNFα抗体染色または肥満細胞染色のための処置を行った。TNFα免疫蛍光レベルおよび肥満細胞数の両方が、プレドニゾロンの用量の増加に伴い減少したことから、抗炎症作用を定量化できることが証明された。
【０１２９】
選択された化合物のスクリーニング
本発明の重要な目的は、ハイスループットスクリーニングに適する十分に検証されたIBDのゼブラフィッシュモデルを開発することであった。そのような検証を行った後、本発明者らは、本発明者らのIBDモデルで多数の化合物をスクリーニングした。様々なiNOS阻害剤を試験し、それらはin vivoおよび組織学的分析において疾患表現型の救済を示した。さらに、サリドマイドおよびパルテノライドをそれらの報告された抗TNFα効果(SmolinskiおよびPestka、LaffitteおよびRevuz、2004)に基づいてスクリーニングした。両化合物はTNFαのダウンレギュレーションを示したが、in vivo疾患表現型を救済することはできず、腸の組織学的状態を分析しても改善を示さなかった。このことは、個々の疾患指標はモジュレートされうるが、疾患病理全体はこれらの療法では変更できないことを証明した。
【０１３０】
スーダンブラック含有エチレングリコール溶液による腸上皮の損傷の誘導
ストック溶液
スーダンブラックの飽和溶液を70%エチレングリコール中に調製した(SB/EG)。  
室温で最大3カ月間保存した。
【０１３１】
投薬
10mlの胚培地中に加えた10μl SB/EGは、24時間後に上皮の損傷を起こす。この濃度にさらされた幼生は、受精後日数(d.p.f.)10日目以降も生存可能である。  
胚培地中に加えた5μl SB/EGは、24時間後、より軽度であるが容易に検出できる上皮の損傷を起こす。
【０１３２】
スクリーニングプロトコル
1)ゼブラフィッシュ幼生を受精後日数(d.p.f.)3日目から0.05% SB/EGを含む胚培地に浸漬する。  
2)処理の24時間後に、腸に赤い「染色」が観察される。  
染色は、腸の障壁機能の崩壊の結果としての腸上皮からの細胞の損失および出血と関係する。  
3)「染色」は、明視野解剖顕微鏡下で麻酔をかけられた胚を観察することにより確認される。
【０１３３】
考察
IBDのゼブラフィッシュモデルの開発
IBDのゼブラフィッシュモデルを開発する上で、本発明者らは齧歯動物モデルに存在することが知られている欠点の多くを克服した。第1に、PSAを胚培地に加えることから、投与を繰り返すことなくすべての胚が同じ用量に等しく曝露されるようになる。さらに、疾患状態は腸全体にわたり誘導され、その結果、領域特異的な疾患変化が観察される。対照的に、齧歯動物の研究においては、PSAは最も一般的には浣腸によって投与されるか、または腸の特定の領域に注射されるため、結果として、限局的な病理のみをもたらす。本発明者らは、ヒト疾患で見られるものと非常に関連する生物学的および病理学的変化を、本発明者らの疾患モデルで観察する。例えば、本発明者らは、抗炎症薬に興味がある多くの会社の重要な標的であるTNFαが本発明者らのモデルにおいてアップレギュレーションされ、ヒト抗原に対する抗体で検出できることを証明した。さらに、本発明者らはヒト疾患を治療するのに用いられる現行の治療法を用いて本発明者らのモデルを検証した。本発明者らは、TNFαレベルおよび肥満細胞数を使って抗炎症作用を定量化することができる。
【０１３４】
表現型救済のハイスループットスクリーニング
IBDのゼブラフィッシュモデルの開発を試みる上で、本発明者らは齧歯動物モデルの置換を目的としていたのではなく、むしろ、薬剤探索のステップを加速するために利用できるハイスループットスクリーニングに適した脊椎動物システムの開発を目的としていた。本発明者らのアプローチは、疾患表現型およびその救済を観察することができ、かつ迅速なスクリーニングが可能な、十分に検証された妥当性のある疾患モデルを開発することであった。個々の疾患変調因子よりもむしろ疾患表現型を観察することの重要性は、パルテノライドおよびサリドマイドによる処理から得られた本発明者らの知見によって実証されている。両化合物は本発明者らのモデルにおいてTNFα発現のダウンレギュレーションを引き起こすが、そのどちらもin vivoにおいてまたは組織学的分析において観察される疾患変化を救済しない。実際、類似の効果が齧歯動物で観察されており、その観察ではパルテノライドはin vitroでTNFαレベルを減らすことができるが、in vivoのLPS誘導性炎症では効果を示すことはできない(SmolonskiおよびPestka、2003)。本発明者らのモデルのさらなる利点は、異なる用量のプレドニゾロンを用いて示されたように、抗炎症作用を定量化できることである。そのような定量化により、化合物を効力に応じてランク付けすることができるであろう。
【０１３５】
本発明は、吐き気、嘔吐および腸運動の評価も可能にする。
【０１３６】
例１：  受精後日数(dpf)7日の胚に、受精後日数(dpf)14日の魚に適した大きさの顆粒状飼料を与える。通常、その胚はこの飼料を飲み込もうとするが、その後それを吐き出す。吐き出される飼料の量およびその速度を測定することによって、魚の嘔吐を催す状態を評価することが可能である。この方法は、例えば蛍光標識、比色標識、または放射性標識で飼料を標識することにより、さらに簡便にすることもできる。
【０１３７】
例２：  受精後日数(dpf)7日の胚に、適切な大きさの顆粒状飼料を与える。通常、その胚はこの飼料をほとんど困難を伴うことなく飲み込もうとする。その胚が嘔吐しやすかった場合、またはその潜在的な催吐性を評価しようとしている薬剤の存在下にあった場合は、吐き出される飼料の量およびその速度を測定することによって、魚の嘔吐を催す状態を評価することが可能である。同様に、この方法は、例えば蛍光標識、比色標識、または放射性標識で飼料を標識することによって、さらに簡便にすることもできる。
【０１３８】
例３：  前記したようにして受精後日数(dpf)7日の胚の腸を色素を使用して標識する。次に、吐根または化学療法薬などの催吐薬の投与によって、または、胚の移動のために一般に使われる2.5mlのプラスチックピペットなどのピペットを用いて魚水を急速に吸い上げた後に放出して水流を起こし、それにより胚を揺らすことによって、胚において吐き気を誘発させ嘔吐を誘発させる。これは続いて、腸内の色素の嘔吐を引き起こす。この経過は蛍光解剖顕微鏡下で視覚化することにより、直接測定することができる。吐き出された標識は周囲の培地中にて可視化されうる。あるいは腸内のその標識の欠如は吐き出された標識量の指標として用いることができる。別法としては、蛍光標識、比色標識、または放射性標識を利用して、この評価の定量化およびハイスループットを容易にすることができる。
【０１３９】
この方法は続いて以下のようなシナリオで使うことができる:
a.化合物を投与して、それが正常状態で催吐作用を有するかどうかを評価する。  
b.化合物を投与して、それが制吐作用を有するかどうかを評価する。
【０１４０】
例４：  食物が腸から小腸に移動する速度は、多くの薬剤にとって重要な考慮事項である。飼料または腸を標識することによって、飼料が胃から腸に移動するのにかかる時間を直接調べることができる。理想的には、この方法をビデオカメラを使用して実施することにより、蠕動波の数、その協調度および腸内腔の大きさを定量化できるようにする。これらの方法によって調べられる、または吐き気状態(例えば、先に述べたようにして誘導された状態)における、正常な腸運動に及ぼす被験化合物の影響を比較することにより、運動促進剤を同定することが可能になる。
【０１４１】
このモデルは、炎症全般の評価にも適する。in vivo腸機能を観察する他に、生きている動物の疾患状態の尺度として、以下を含む他の方法により炎症の程度を評価することも可能である。
【０１４２】
動物を固定し、切片にし、組織学的染色剤、例えばヘマトキシリンおよびエオシンで染色してもよい。こうして炎症の程度を定量化することが可能である。例えば、炎症状態の誘導に引き続いて投与されたある被験薬の場合、以下の段階的な変化が見られた：
1μg/ml  -  組織学的分析からは救済は観察されなかった。  
2.5μg/ml  -  絨毛および陰窩の形態の軽度の改善があるが、杯状細胞の分化転換の数および領域には明らかな改善はない。  
5μg/ml  -  正常な陰窩および絨毛の形態だが、杯状細胞の表現型は完全には救済されなかった(一部改善が観察された)。  
10μg/ml  -  組織学的状態は外観上完全に正常であるが、鎮静期表現型が外部のバリデーターによって示された。
【０１４３】
さらなる評価には免疫組織化学的分析が含まれてもよい。例えば、本発明者らは疾患状態でTNFαのアップレギュレーションを検出したが、抗炎症薬の同時投与においてはこのアップレギュレーションの程度は段階的に低下した。これは、一次抗体に結合している二次抗体が放出するシグナルの相対蛍光を測定することによって定量化された。その一次抗体は、ヒトTNFαに対する抗体であった。これがゼブラフィッシュのTNFαと交差反応することを本発明者らは証明した。他の炎症媒介物質に対する抗体も使用することができる。
【０１４４】
あるいは、組織化学染色剤と、それに対する特定の炎症性細胞型を使用してもよい。例えば、本明細書で記載しているように肥満細胞を染色してもよい。そうすれば、腸を内張りする肥満細胞を矢状切片で観察することは容易である。次に、魚全体での腸内の肥満細胞の総数を数えて、炎症の程度を定量化することができる。同様に、本発明者らが非炎症性細胞をマーキングすることを証明した組織化学染色剤、例えばムチン-リッチな杯状細胞の検出用のアルシアンブルーが、炎症状態でアップレギュレーションされる。
【０１４５】
粘液分泌性疾患は、杯状細胞の増殖およびムチンの過剰分泌を伴う。これらには、呼吸器系の病態、例えば閉塞性気道疾患が含まれる。本明細書で開示している腸の生物学的評価および炎症性腸疾患モデルは、粘液分泌性疾患全般へ直接適用することができる。具体的には、杯状細胞の存在および活性は、粘液分泌性疾患の一態様に対処する手段を提供する。例えば、本明細書で開示されている炎症性状態においては、杯状細胞が正常よりも大きな腸領域にわたって広がっているのが見られ、かつそれらはサイズがより大きく、さらに、杯状細胞が通常存在する腸部位での数もより多い。そこで、例えば被験薬の存在下で杯状細胞の数および大きさを測定することによって、杯状細胞の生物学的状態に及ぼすその被験薬の効果を評価することが可能である。これらの杯状細胞を、標準的な組織学的染色剤、例えば本明細書で記載されているH&E染色剤によって可視化し、定量化することができる。あるいは、杯状細胞の構成要素と結合する抗体を用いて、杯状細胞の広がりの定量化を容易にすることができる。さらなる方法は、ムチン生産に対する染色剤を用いるか、または、GFPなどの蛍光マーカーを、組織特異的プロモーターの使用により杯状細胞のようなムチン生産細胞で発現するトランスジェニック系統の作製を含む。
【０１４６】
化生は、ある細胞型から別の細胞型への組織の変換を伴う。例えば腸化生においては、内張りしている正常な円柱上皮細胞が、扁平上皮細胞によって置換されることがありうる。そのような化生変化は前癌状態であるので、臨床的に重要である。本発明者らは、本発明者らによる腸の生物学的評価、および特に本明細書で開示されている本発明者らの炎症性腸疾患モデルが、化生および癌性疾患一般に直接適用できることに思い至った。具体的には、通常は杯状細胞を含まない腸部分の内張り(lining)から杯状細胞を含む内張りへの改変は、化生疾患に対処する手段を提供する。この変更の程度の評価は、本明細書の他の部分で記載されているように本発明者らによって成功裏に実施された。
【０１４７】
腸運動の異常は、病的状態の主な原因である。特に、過敏性腸症候群の根底にある重要な要素は、調子の狂った腸運動である。本発明者らは、本発明者らの発明の要素は腸運動の評価に直接適用できることに思い至った。
【０１４８】
例えば、通常の受精後日数(dpf)7日の胚の腸を本明細書で記載されているように標識する。次に蠕動波を蛍光顕微鏡によって生きた魚で視覚化する。デジタルCCDカメラを使用して腸の正常な運動を記録し、定量化することができる。特に、腸収縮の波の近位腸から遠位腸への進行を伴った腸の協調収縮が、この運動の頻度、振幅および速度に加えて、評価される。次に魚を、腸運動を変更することが公知の化合物、例えばメベベリンおよびマツヨイグサ油に曝露し、収縮パターンを正常胚と比較する。あるいは、腸運動の様相を改善または変更するように設計された新規被験化合物を魚に投与し、評価することができる。
【０１４９】
腸からの糞便または標識化合物の排出は、例えば比色法、放射性標識または質量法により測定することができる。
【０１５０】
化合物の飲み込みから糞便中の出現に至る移行時間を測定してもよい。
【０１５１】
これらの方法は、下痢止め薬あるいは下剤の同定にも適用できる。例えば、魚をロペラミドに曝露して移行時間を減少させ、次に被験下剤を同時投与してもよい。
【０１５２】
これらの方法は、満腹感、食欲および吸収の評価にも適用できる。例えば、魚が排出した糞便の量を測定して、摂取した飼料の量または吸収した飼料の量の定量的評価を行うことができる。異なる方法で標識された異なる飼料を与えることにより、飼料摂取の選択性も測定することができる。
【０１５３】
本発明者らは、本発明者らのモデルが、腸幹細胞活性、そして実際にin vivoでの幹細胞活性全般の、優れた評価を可能にすることにさらに思い至った。胚を、魚水に直接投与されたBrdU(ブロモデオキシウリジン)に曝露した。BrdU曝露の際に分裂中の細胞を示す蛍光細胞が、腸を内張りしているのが見られた。そのような細胞の数を測定することによって、正常な魚の幹細胞活性の指標を定量的様式で測定することが可能である。これらの幹細胞の活性には、次に化学療法薬、例えば5-フルオロウラシル、ビンクリスチンまたはビンブラスチンを投与することにより、あるいは放射線療法により、影響を及ぼしてもよい。これらの薬に対する幹細胞の感受性、ならびにこれらの化学療法剤の除去後の細胞の回復速度および損傷を受けた腸の再集合も評価することができる。これにより、幹細胞活性化因子、ならびに潜在的に有害な腸副作用を有する薬剤を同定するための手段が提供される。本発明者らは、スーダンブラックおよびエチレングリコールの投与により、腸に化学毒性損傷を誘発することが可能なことを、既に実証している。
【０１５４】
BrdU標識によって幹細胞活性および腸壁の再集合の程度を評価することに加え、これらを、本明細書に他で記載されている組織学的および免疫組織化学的方法またはその改変方法(例えばピーナッツレクチン)によって評価することもできる。
【０１５５】
参照文献：
BarutおよびZon(2000)、Physiological Genomics、(13):49〜51。  
CalkinsおよびMendelodd(1995)、炎症性腸疾患(Inflammatory Bowel Disease)(第4版)、Kirsner,J.B.およびShorter,R.G.(編)、WilliamsおよびWilkins、ボルチモア。  
Colas他(1996)、Nature(380):548〜550。  
DooleyおよびZon(2000)、「遺伝学および発生における現在のオピニオン(Current Opinions in Genetics and Development)」(10):252〜256。  
Du他(2001)、Developmental Biology(238):239〜246。  
Fishman(2001)、Science(294):1290〜1291。  
Golling他(2002)、Nature Genetics(31):135〜140。  
Gurr(1962)、「動物組織染色:実際および理論(Staining Animal Tissues: Practical and Theoretical)」Leonard Hill Books、ロンドン。  
Kimmel他(1995)、Developmental Dynamics(203):253〜310。  
Mueller C.(2002)、Immunology(105):1〜8。  
ParkesおよびJewell(2001)、「分子医学の専門レビュー(Expert Reviews in Molecular Medicine)」(11月19日)、http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/0100391Xh.htm
Raz他(1998)、Current Biology(8):82〜88。  
「レミントンの製薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(1980)、第16版、Osol,A.(編)、Mack Publishing Company、米国。  
SmolinskaおよびPestka(2003)、Food and Chemical Toxicology(41):1381〜1390。  
Solnica-Krezel他(1994)、Genetics(136):1401〜1420。  
Stein他(1998)、American Journal of Physiology(274):G203〜G209。  
WattsおよびSatsangi(2002)、Gut(50):iii31〜iii36。  
Westerfield(1995)、「ゼブラフィッシュの本(The Zebrafish Book)」、オレゴン大学出版、Eugene、オレゴン州。  
Xu他(2002)、Scandinavian Journal of Gastroenterology (3):330〜337。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月25日(2004.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸炎症性疾患のための魚モデルであって、炎症誘発剤であるトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)またはデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を魚の胚を含む培地に投与して、魚の腸で疾患状態を誘発させる魚モデル。
【請求項２】
炎症誘発剤がトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)である、請求項１に記載の魚モデル。
【請求項３】
炎症誘発剤がデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)である、請求項１に記載の魚モデル。
【請求項４】
魚が光学的に透明であり、非毒性かつ非吸収性の蛍光色素または造影剤を前記培地に投与して、魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにした、請求項１〜３のいずれか一項に記載の魚モデル。
【請求項５】
前記魚が炎症性腸疾患を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の魚モデル。
【請求項６】
腸の形態および機能、ならびに/または疾患表現型をスクリーニングするための魚モデルであって、非毒性かつ非吸収性の蛍光色素を光学的に透明である魚の胚を含む培地に投与して魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにした魚モデル。
【請求項７】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項１〜６および２８のいずれか一項に記載の魚モデル。
【請求項８】
腸炎症性疾患の治療に使用する化合物のスクリーニング方法であって、
請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の魚モデルを化合物で処理すること、
前記魚モデルの腸炎症性疾患を治療する化合物を同定すること、
を含む方法。
【請求項９】
ハイスループットスクリーニングを行うことを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
可能な抗炎症薬の最適な組合せについてスクリーニングすることを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
腸炎症性疾患の疾患表現型を救済または抑制する遺伝的突然変異についてスクリーニングする方法であって、
請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の魚モデルを突然変異させること、
前記魚モデルにおける前記腸炎症性疾患表現型を救済または抑制する突然変異を同定すること、
を含む方法。
【請求項１２】
前記魚モデルの腸を組織学的に分析して、前記魚モデルの腸炎症性疾患に及ぼす化合物または突然変異の効果を決定することを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
腸炎症性疾患のための魚モデルを作製する方法であって、炎症誘発剤であるトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)またはデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を魚の胚を含む培地に投与して、魚の腸で疾患状態を誘発させることを含む方法。
【請求項１４】
炎症誘発剤がトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
炎症誘発剤がデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
魚が光学的に透明であり、非毒性かつ非吸収性の蛍光色素または造影剤を前記培地に投与して、魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにした、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
腸の形態および機能、ならびに/または疾患表現型をスクリーニングするための魚モデルを作製する方法であって、非毒性かつ非吸収性の蛍光色素を、光学的に透明である魚の胚を含む培地に投与して、魚が前記色素を飲み込んだ後に魚の腸を視覚化できるようにすることを含む、方法。
【請求項１８】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
吐き気、嘔吐、および/または制吐薬、嘔吐誘発性化合物を評価する方法であって、
飲み込ませる非毒性かつ非吸収性の蛍光またはその他で標識された化合物を、光学的に透明である魚に投与すること、
嘔吐誘発性化合物を魚に投与することおよび/またはピペット操作もしくは急速な運動により吐き気を誘発させること、
前記標識化合物の魚の腸を通過する運動または魚の口からのその吐出を、評価すること、
を含む方法。
【請求項２０】
炎症を評価する方法であって、
請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の魚モデルを用いること、または、魚を含む培地に炎症誘発剤であるTBNSもしくはDDSを投与することによりまたは遺伝子操作により魚の腸において炎症状態を誘発させること、および
その腸の状態を、以下：
ホールマウントまたは切片による組織学的分析を、例えばヘマトキシリンおよびエオシンなどの全体的な組織学的染色、または例えば肥満細胞に対する染色などの特異的染色、例えば肥満細胞の検出のためのエタノールベースのトルイジンブルーもしくはムチンおよびムチン分泌細胞(例えば杯状細胞)の検出のためのアルシアンブルーと共に、実施すること、
腸の状態のマーカーの免疫組織化学分析、例えばTNFαに対する抗体染色、または炎症状態ではアップレギュレーションされることが公知の1つまたはそれ以上のインターロイキンおよび/もしくはサイトカインの染色を、実施すること、
腸の生化学的評価を、例えばTNFαレベルのアッセイによって実施すること、ならびに/または
炎症の誘発および炎症反応の抑制に対する反応としてのアップレギュレーションされた増殖もしくは細胞死の増加に対する組織学的分析、免疫学的分析、または遺伝子発現分析を実施すること、
により評価すること、
を含む方法。
【請求項２１】
粘液分泌性疾患を評価する方法であって、
請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の魚モデルを用いること、または、魚を含む培地に炎症誘発剤であるTBNSもしくはDDSを投与することによりまたは遺伝子操作により魚の腸において炎症状態を誘発させること、および
魚の正常な腸および/または炎症性の腸を、杯状細胞の範囲、数および/または活性を評価することにより分析することを含み、その評価を、例えば、以下：
ホールマウントまたは切片による組織学的分析を、例えばヘマトキシリンおよびエオシンなどの全体的な組織学的染色、または例えば杯状細胞もしくはムチンに対する染色などの特異的な染色、例えばアルシアンブルーPAS染色と共に、実施すること、
例えば杯状細胞またはムチンに対するGFPなどのマーカー、例えば杯状細胞系統の分化マーカーであるMUC2、または杯状細胞特異的なサイトケラチンであるサイトケラチン-7を発現している、細胞または組織特異的なトランスジェニック系統を作製すること、
杯状細胞、例えばMUC2またはサイトケラチン-7を特異的に標識する抗体を使用してホールマウントまたは切片による免疫組織学的分析を行うこと、ならびに/または
細胞増殖研究の分析(例えば増殖性細胞核抗原PCNAに対するBrdU標識または免疫組織化学)を実施すること、
を含む方法で行う、方法。
【請求項２２】
癌性状態、化生および/または分化転換を評価する方法であって、
請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の魚モデルを用いること、または、魚を含む培地に炎症誘発剤であるTBNSもしくはDDSを投与することによりまたは遺伝子操作により魚の腸において炎症状態を誘発させること、および
魚の正常な腸および/または炎症性の腸を、腸の細胞型の範囲、数および/または活性を評価することにより分析することを含み、その評価を、例えば、以下：
ホールマウントまたは切片による組織学的分析を、例えばヘマトキシリンおよびエオシンなどの全体的な組織学的染色、または例えば杯状細胞もしくはムチンに対する染色などの特異的な染色、例えばアルシアンブルーPAS染色と共に、実施すること、
例えば杯状細胞またはムチンに対するGFPなどのマーカー、例えばMUC2またはサイトケラチン-7を発現している細胞または組織特異的なトランスジェニック系統を作製すること、
を含む方法で行う、方法。
【請求項２３】
腸運動、IBS、下痢または便秘を評価する方法であって、
飲み込ませる非毒性かつ非吸収性の蛍光もしくはその他で標識された化合物を、光学的に透明である魚に投与すること、または直接腸を視覚化すること、
場合により、魚に運動性を変更する化合物を投与すること、
腸を通過する前記標識化合物の動き、または腸自体の動き、または前記標識化合物もしくは糞便の肛門からの出現を、評価すること、ならびに/または糞便の量と質を評価すること、
を含む方法。
【請求項２４】
幹細胞活性を評価する方法であって、
魚の腸における細胞の代謝回転および分化を、正常状態における、または化学毒、細胞毒もしくは放射線療法の投与後の、in vivo評価もしくは組織学的分析、および/または有糸分裂活性のBRDU標識もしくは他の標識による腸構造の直接視覚化によって、視覚化すること、
を含む方法。
【請求項２５】
癌治療の効果を評価する方法であって、
魚の腸における細胞の代謝回転および分化を、正常状態における、または化学毒、細胞毒もしくは放射線療法の投与後の、in vivo評価もしくは組織学的分析、および/または有糸分裂活性のBRDU標識もしくは他の標識による腸構造の直接視覚化によって、視覚化すること、
を含む方法。
【請求項２６】
魚を被験化合物で処理すること、および効果を観察することを含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記魚モデルを突然変異させること、および効果を観察することを含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
腸損傷のための魚モデルであって、化学毒性物質であるスーダンブラック含有エチレングリコールまたは細胞傷害性薬を魚の胚を含む培地に投与して、魚の腸で疾患状態を誘発させる、魚モデル。
【請求項２９】
腸損傷のための魚モデルを作製する方法であって、化学毒性物質であるスーダンブラック含有エチレングリコールまたは細胞傷害性薬を魚の胚を含む培地に投与して、魚の腸で損傷を誘導する、魚モデル。
【国際調査報告】
2006519005.tif 000002
2006519005.tif 000003
2006519005.tif 000004
2006519005.tif 000005