(57)【要約】【課題】セラミド、スフィンゴシンおよびそれらの類似体上にあらかじめ選択されたグリコシル化パターンを有するガングリオシド類似体を酵素的に調製するインビトロ法に対する必要性が、特に存在している。【解決手段】本発明は、新規な合成スフィンゴ糖脂質およびそのような合成スフィンゴ糖脂質を含有する薬学的組成物を記載する。本発明はまた、新規な合成スフィンゴ糖脂質化合物および組成物、ならびに神経保護および癌治療の分野におけるそれらの利用法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2006519878.tif 000025
を有する化合物であって、
ここで、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ２）２およびＮＲ２から選択されるメンバーであり；
Ｘは、Ｈ、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、および−ＣＨＲ３Ｒ４から選択されるメンバーであり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｍ）Ｒ５、−Ｃ（＝Ｍ）−Ｚ−Ｒ５、−ＳＯ２Ｒ５、および−ＳＯ３から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
ＭおよびＺは、Ｏ、ＮＲ６もしくはＳから独立して選択されるメンバーであり；
Ｙは、Ｈ、−ＯＲ７、−ＳＲ７、−ＮＲ７Ｒ８、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、および置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、但し、Ｘが、ＮＨＲ４であって、ここで、Ｒ４が、Ｈおよび−Ｃ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ５から選択されるメンバーであって、Ｒ５が、置換もしくは非置換のアルキルであり；ＹがＯＨであり；そして、ＺがＯである、ＮＨＲ４である場合、Ｒ５が、置換もしくは非置換のアルキルから選択されるメンバー以外である、化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１が、以下の式：
【化２】
2006519878.tif 000026
を有し、
ここで、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ１４、−ＣＮおよび−Ｃ（＝Ｌ）Ｒ１４から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｌは、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ１６から選択されるメンバーであり；
Ｒ１４およびＲ１５は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、ＯＲ１７、ＳＲ１７およびＮＲ１７Ｒ１８から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、そしてここで、
Ｒ９およびＲ１０；Ｒ９およびＲ１１；Ｒ９およびＲ１２；Ｒ９およびＲ１３；Ｒ１０およびＲ１１；Ｒ１０およびＲ１２；Ｒ１０およびＲ１３；Ｒ１１およびＲ１２；Ｒ１１およびＲ１３；ならびにＲ１２およびＲ１３から選択されるメンバーが、それらが結合している原子と一緒になって、必要に応じて結合して環を形成し、ここで、該環が、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールおよび置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物であって、Ｒ１３が、置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択されるメンバーであり、ここで、該ヘテロアリールが、少なくとも１個の環内窒素原子を含む、化合物。
【請求項５】
Ｒ１３が、置換もしくは非置換のピリジルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項３に記載の化合物であって、Ｒ１３が、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３ａＲ１３ｂであり、ここで、
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂが、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、および置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項７】
請求項３に記載の化合物であって、ここで、Ｒ１１が、ＮＲ１１ａＲ１１ｂであり、
ここで、
Ｒ１１ａおよびＲ１１ｂが、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキルおよび置換もしくは非置換のヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである、化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１が、以下の式：
【化３】
2006519878.tif 000027
を有し、
ここで、
Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ１４、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｌ）Ｒ１４から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｌは、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ１６から選択されるメンバーであり、
Ｒ１４およびＲ１５は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、ＯＲ１７およびＮＲ１７Ｒ１８から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、そしてここで、
Ｒ１１およびＲ１２；Ｒ１１およびＲ１３；ならびにＲ１２およびＲ１３から選択されるメンバーは、それらが結合している原子と一緒になって、必要に応じて結合して環を形成し、該環は、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、Ｒ１３が、置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択されるメンバーであり、該ヘテロアリールが、少なくとも１個の環内窒素原子を含む、化合物。
【請求項１０】
Ｒ１３が、置換もしくは非置換のピリジルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項８に記載の化合物であって、ここで、Ｒ１３が、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３ａＲ１３ｂであり、ここで、
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂは、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、および置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項１２】
請求項８に記載の化合物であって、ここで、Ｒ１１が、ＮＲ１１ａＲ１１ｂであり、
ここで、
Ｒ１１ａおよびＲ１１ｂは、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキルおよび置換もしくは非置換のヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｒ１が、以下の式：
【化４】
2006519878.tif 000028
を有し、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ１４、−ＣＮおよび−Ｃ（＝Ｌ）Ｒ１４から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｌは、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ１６から選択されるメンバーであり；
Ｒ１４およびＲ１５は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、ＯＲ１７、ＳＲ１７およびＮＲ１７Ｒ１８から独立して選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、そしてここで、
Ｒ９およびＲ１０；Ｒ９およびＲ１１；Ｒ９およびＲ１３；Ｒ９およびＲ２１；Ｒ９およびＲ１９；Ｒ９およびＲ２０；Ｒ９およびＲ２１；Ｒ１０およびＲ１１；Ｒ１０およびＲ１３；Ｒ１０およびＲ１９；Ｒ１０およびＲ２０；Ｒ１０およびＲ２１；Ｒ１１およびＲ１３；Ｒ１１およびＲ１９；Ｒ１１およびＲ２０；Ｒ１１およびＲ２１；およびＲ１３およびＲ１９；Ｒ１３およびＲ２０；Ｒ１３およびＲ２１；Ｒ１９およびＲ２０；Ｒ１９およびＲ２１；ならびにＲ２０およびＲ２１から選択されるメンバーは、それらが結合している原子と一緒になって、必要に応じて結合して環を形成し、該環は、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールおよび置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーである、
化合物。
【請求項１４】
Ｒ５が、ＣＨ３である、請求項３に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物であって、前記糖が、以下：
【化５】
2006519878.tif 000029
よりなる群から選択される式を有する、化合物。
【請求項１６】
前記糖が、脱アセチル化されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
図１６から選択されるメンバーである式を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１に記載の化合物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
動物またはヒトにおける神経系障害の予防または処置のための方法であって、それらを必要とする動物またはヒトに、治療的有効量の請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記神経系障害が、パーキンソン病、虚血、脳卒中、アルツハイマー病、うつ病、不安、脳炎、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、外傷、脊髄損傷、神経損傷、ニューロパシーおよび神経再生からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトにおける神経膠腫の処置のための方法であって、それを必要とするヒトに、治療的有効量の請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の合成スフィンゴ糖脂質化合物を合成する方法であって、以下：
（ａ）スフィンゴイド部分およびグルコース（Ｇｌｃ）を含む受容体分子を、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素およびガラクトース（Ｇａｌ）供与体分子に接触させて、
【化６−１】
2006519878.tif 000030
を形成する工程；
（ｂ）該
【化６−２】
2006519878.tif 000031
を、トランスシアリダーゼ酵素およびシアリン酸（Ｓｉａ）供与体分子に接触させて、
【化７−１】
2006519878.tif 000032
を形成する工程；
（ｃ）該
【化７−２】
2006519878.tif 000033
を、Ｎ−アセチルガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）−トランスフェラーゼ酵素およびＧａｌＮＡｃ供与体分子に接触させて、
【化８−１】
2006519878.tif 000034
を形成する工程；
（ｄ）該
【化８−２】
2006519878.tif 000035
を、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素およびガラクトース（Ｇａｌ）供与体分子に接触させて、
【化９−１】
2006519878.tif 000036
を形成する工程；ならびに、
（ｅ）該
【化９−２】
2006519878.tif 000037
を、該記合成スフィンゴ糖脂質の形成に適切な条件下で、脂肪酸部分と接触させる工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への引用）
本出願は、２００２年８月２９日出願のＰＣＴ／ＵＳ０２／２７９３５号に関するものであり、上記出願は、その全体が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規なスフィンゴ糖脂質類およびそれらの調製法と利用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
スフィンゴ糖脂質類は、セラミドに結合した炭水化物部分を有する脂質の１クラスである。スフィンゴ糖脂質の代表的なクラスはガングリオシド類である。上記炭水化物部分は、少なくとも１つのシアリン酸部分を含む。ガングリオシド類は典型的にシアリン酸部分に加えて、糖部分を含み、構造内に存在する単糖とシアリン酸基の数によって分類される。ガングリオシド類は、シアリン酸残基の数により、モノ−、ジ−、トリ−またはポリ−シアロガングリオシドとして公知である。これらの分子を識別するために使用される略号としては、「ＧＭ１」、「ＧＤ３」、「ＧＴ１」などが挙げられ、「Ｇ」は、ガングリオシドを表し、「Ｍ」、「Ｄ」または「Ｔ」などは、シアリン酸残基の数をいい、数または数プラス文字（例えば、「ＧＴ１ａ」）は、この分子に関して観察されたＴＬＣアッセイにおける溶出順序を言う。Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｐ．２９４−２９６（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｋｉｓｈｅｒｓ、１９８１年）；Ｗｉｅｇａｎｄｔ、Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ：Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５年）、ｐ．１９９−２６０、を参照されたい。
【０００４】
例えば、国際的な記号ＧＭ１ａは、広く研究されてきたより一般的なガングリオシド類の１つを示す。この記号における「Ｍ」は、このガングリオシドが、モノシアロガングリオシドであることを示し、「１」は、ＴＬＣ溶出プロフィルにおけるその位置を規定している。下付き文字、「ａ」、「ｂ」または「ｃ」もまた、特定のガングリオシドのＴＬＣアッセイにおける位置を示している。末端の糖は、セラミド部分に結合している末端の反対側にある炭水化物部分の末端に位置している糖である。
【０００５】
用語の「スフィンゴ糖脂質類」（ＧＳＬ類）とは、６つのうち５つが、セラミドとＵＤＰ−グルコースから酵素的に形成されるグリコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）由来である６つのクラスの化合物を含む属を言う。ＧｌｃＣｅｒ形成に関与する上記酵素は、ＵＤＰ−グルコース：Ｎ−アシルスフィンゴシングリコシルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＣｅｒシンターゼ）である。生理的条件下でのＧｌｃＣｅｒ形成速度は、ＵＤＰ−グルコースの組織濃度に依存し、これは次に、特定の組織におけるグルコース濃度に依存する（Ｚａｄｏｒ，Ｉ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：ｐ．７９７−８０３（１９９３））。内因性セラミドに基づくインビトロアッセイでは、追加セラミドを含有する混合物よりも合成速度が低く、セラミドの組織濃度もまた、通常、速度制限的であることを示唆している（Ｂｒｅｎｋｅｒｔ，Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３６：ｐ．１８３−１９３（１９７２））。
【０００６】
ＧＳＬ類のレベルは、増殖、分化、細胞間接着、細胞とマトリクス蛋白質との間の接着、細胞に対する微生物およびウィルスの結合、および腫瘍細胞の転移など、種々の細胞機能を制御する。さらに、ＧｌｃＣｅｒ前駆体、セラミドは、分化または細胞増殖の阻害を引き起し（Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０７：ｐ．２１１−２１４（１９９２））、ビタミンＤ３、腫瘍壊死因子α、インターロイキン類およびアポトーシス（プログラム化細胞死）の機能に関与している。スフィンゴル類（スフィンゴ様塩基類）、セラミドの前駆体およびセラミド異化作用産物もまた、恐らくプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害により、多くの細胞系に影響を与えることが示されている。
【０００７】
スフィンゴ糖脂質類のクラスの１つであるガングリオシド類は、神経系において機能的に重要であることが公知であり、ガングリオシド類は、末梢神経系障害の治療に有用であることが証明されている。多数のガングリオシド類およびそれらの誘導体が、パーキンソン病など、多種多様の神経系障害の治療に使用されてきた。ガングリオシドＧＭ１は、パーキンソン病および脳虚血発作の治療に関する第ＩＩ相臨床開発において用いられている（米国特許第４，９４０，６９４号；米国特許第４，９３７，２３２号；および米国特許第４，７１６，２２３号を参照）。また、ガングリオシド類は、食細胞の活性に影響を及ぼし（米国特許第４，８３１，０２１号）、胃腸管疾患を生ずる生物の治療に用いられてきた（米国特許第４，７６２，８２２号）。動物の脳から精製されたガングリオシド類ＧＭ２およびＧＤ２は、キーホールカサガイヘマシアニン（ＫＬＨ）と共役させ、アジュバントＱＳ２１と混合して、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相治験における癌ワクチンの基剤として、これらのガングリオシド類に対する免疫応答を誘発させるために用いられてきた（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ、ニューヨーク州タリータウン所在）。ガングリオシドＧＭ３は、抗癌剤として使用するために研究されている（国際公開第９８／５２５７７号）。また、糖脂質類は、炎症性腸疾患の治療において関心が持たれている。Ｔｕｂａｒｏら、Ｎａｕｎｙｘ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４８：ｐ．６７０−６７８（１９９３）を参照されたい。
【０００８】
ガングリオシド類は一般に、組織、特に動物の脳からの精製により単離される（ＧＬＹＣＯＬＩＰＩＤ  ＭＥＴＨＯＤＯＬＯＧＹ、Ｌｌｏｙｄ  Ａ．Ｗｉｔｔｉｎｇ編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＩＩ．ｐ．１８７−２１４（１９７６）；米国特許第５，８４４，１０４号；米国特許第５，５３２，１４１号；Ｓｏｎｎｉｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３３：ｐ．１２２１−１２２６（１９９２））；Ｓｏｎｎｉｎｏら、Ｉｎｄ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５：ｐ．１４４−１４９（１９９８）；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１２５：ｐ．５３３−４４（１９８０）。また、ガングリオシド類は、ウシのバターミルクからも単離されてきた（Ｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．１２６３２−１２６３８（１９９２）；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６１：ｐ．５６２５−５６３０（１９８６））。最適条件下でも、純粋ガングリオシド類、例えば、ＧＭ２およびＧＭ３の収量は極めて少ない。また、哺乳動物組織からの精製は、それと共にウィルス、プリオン粒子などの汚染物質伝達の危険を伴う。したがって、ガングリオシド類を確保するための代替となる方法論が極めて望ましい。
【０００９】
天然ガングリオシド類には多くの利点はあるが、天然ガングリオシド類に較べてより高められた生物学的利用能、標的特異性、活性などの特徴を有するガングリオシド類似体に対する必要性が存在している。さらに、スフィンゴシンおよびスフィンゴシン類似体から合成的に調製されたガングリオシド類似体には、ウシ海綿状脳炎などの動物疾病を伝達する危険性がない。
【００１０】
ガングリオシド類の重要性により、純粋なガングリオシド類を高収量で合成する方法の開発に、努力が費やされてきた。ガングリオシド類を化学的に合成する方法は、Ｈａｓｅｇａｗａら、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１（６）：ｐ．６９９−７１４（１９９２）およびＳｕｇｉｍｏｔｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５６：ｐ．Ｃ１−Ｃ５（１９８６）に記載されている。米国特許第４，９１８，１７０号は、ＧＭ３およびＧＭ４の合成を開示している。Ｓｃｈｍｉｄｔらは、ＧＭ３の化学的合成を記載している（米国特許第５，９７７，３２９号）。これらの文献では、労力のかかる保護−活性化−カップリング−脱保護の方法を用いる多段階合成操作を記載しており、これらの段階で、中間体は一般に、抽出とカラムクロマトグラフィの組み合わせにより精製される。さらに、合成法はどれもガングリオシド類の大規模調製に適切ではない。
【００１１】
炭水化物の化学的合成に伴う困難を考えると、ガングリオシド類の炭水化物部分の合成に、酵素を使用することはガングリオシド類の調製への有望なアプローチである。酵素ベースの合成は、位置選択性および立体選択性の利点を有する。さらに、酵素的合成は、非保護基質を用いて実施できる。酵素の２つの主要なクラス、グリコシルトランスフェラーゼ類（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ）およびグリコシダーゼ類が、炭水化物の合成に用いられる。グリコシダーゼ類は、さらにエキソグリコシダーゼ類（例えば、βーガラクトシダーゼ、βーグルコシダーゼ）およびエンドグリコシダーゼ類（例えば、エンドグリコセラミダーゼ）に分類される。これらのクラスの酵素は各々、炭水化物の調製に好結果で用いられている。一般的レビューに関しては、Ｃｒｏｕｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：ｐ．９８−１１１（１９９８）および上記Ａｒｓｅｑｕｅｌｌを参照されたい。
【００１２】
グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖の調製に用いられてきており、良好な立体化学的および位置化学的制御を伴って、特異的生成物を製造するために有効であることが示されてきた。例えば、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼはラクトサミンの合成に用いられ、炭水化物の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの有用性を例示した（例えば、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：ｐ．５４１６−５４１８（１９８２）を参照）。さらに、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のシアリン酸を、ガラクトースの３−ＯＨまたは６−ＯＨに移すために、多数の合成法が、α−シアリルトランスフェラーゼを利用してきた（例えば、Ｋｅｖｉｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２：ｐ．１３５９−１３６２（１９９６）を参照）。治療的使用のためのグリコ共役体の合成における最近の進歩についての考察に関しては、Ｋｏｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：ｐ．８３５−８４１（２０００）を参照されたい。
【００１３】
グリコシダーゼ類は、通常、グリコシド結合の加水分解を触媒するが、適切な条件下では、この結合を形成するために使用することができる。炭水化物の合成に用いられる多くのグリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼであり、グリコシルの移動は、基質の非還元末端に生じる。水によって妨げられて加水分解産物を生じるか、または受容体によって妨げられて新たなグリコシドまたはオリゴ糖を生じるグリコシル−酵素中間体におけるグリコシル供与体をグリコシダーゼが受け入れられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
治療特性を改善した合成ガングリオシド類似体のアレイに対する必要性に加え、合成ガングリオシド類似体を調製するための簡単な高収量法に対する必要性は依然として存在している。ガングリオシドまたはその合成類似体の生物活性は、一般に、特定のグリコ形体の存在または特定のグリコ形体の不在に依存しているため、特にセラミド、スフィンゴシンおよびそれらの類似体上に前選択されたグリコシル化パターンを有するガングリオシド類似体を酵素的に調製するインビトロ法に対する必要性が存在している。本発明は、これらの必要性および他の必要性への取り組みに関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の概要）
糖脂質類は、一群の傷害を治療するために一般に用いられる。本発明は、糖脂質の代表的な１クラスであるガングリオシドに関して説明される。ガングリオシド類は、神経疾患および自己免疫障害を治療する薬剤として興味が持たれている。しかし、ガングリオシド類を用いて現在利用できる治療法は不十分である。一般に、治療目的で用いられるガングリオシド類は、ウシ脳などの生物媒体から時間のかかる方法によって精製されており、その結果、不純な調製物となる可能性がある。さらにガングリオシド類は一般に、腸管における吸収が不十分であるため、静脈内投与を必要とする。また、現在利用できるガングリオシド類は、血液脳関門の極めて少ない通過しか示さない。
【００１６】
したがって、現在利用できるガングリオシド類は一般に、調製が容易にはできず、また、進行を止め、重症度を低下させ、および／または神経疾患および自己免疫疾患を治療するため、および神経突起生成ならびに神経形成を促進するために、被験体に投与することが簡便にはできない。本発明は、神経疾患および自己免疫疾患を治療するため、新規な改善された有効なガングリオシド類を開発する必要性を認識している。
【００１７】
本発明は、一般式：
【００１８】
【化１０】
2006519878.tif 000002
を有するガングリオシド誘導体の１クラスを提供することにより、当該分野における現在の不足に取り組んでおり、ここで、記号Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ２）２およびＮＲ２から選択されるメンバーを表す。Ｘは、Ｈ、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、および−ＣＨＲ３Ｒ４から選択されるメンバーである。記号Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｍ）Ｒ５、−Ｃ（＝Ｍ）−Ｚ−Ｒ５、−ＳＯ２Ｒ５、および−ＳＯ３から独立して選択されるメンバーであり、記号ＭおよびＺは、Ｏ、ＮＲ６またはＳから独立して選択されるメンバーを表す。
【００１９】
記号Ｙは、Ｈ、−ＯＲ７、−ＳＲ７、−ＮＲ７Ｒ８、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルを表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、および置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【００２０】
また、本発明は、本発明の化合物を組み込んでいる薬学的組成物ならびに治療法と診断に本発明の化合物を用いる方法を提供する。例えば、代表的な一実施形態において、被験体における神経系の障害を予防または処置する方法が提供される。上記方法は、投与を必要とする被験体に、本発明の化合物の治療的有効量を投与することを含む。神経系の具体的な障害の治療は、本明細書においてより詳細に検討されている。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、ガングリオシドのグリコシルサブユニットを付加するために、酵素的触媒法を用いて本発明のガングリオシドを調製する方法を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様、目的および利点は、以下の詳細な説明から、当業者に明らかになるであろう。
【００２３】
（発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（略語）
糖部分の略語は、糖類の置換および非置換類似体双方を指す。したがって、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトシル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコシル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡＣ、マンノシルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＳｉａならびにＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニルおよびその誘導体）である。上記略語は、未修飾糖部分およびその置換類似体または他の類似体の双方を含むことが意図されている。
【００２４】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する通常の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を一般に有する。一般に、本明細書に用いられる命名法ならびに分子生物学、有機化学、および核酸化学ならびに下記のハイブリダイゼーションにおける実験操作は、周知のものであり、当該分野において一般的に使用されている。核酸およびペプチドの合成に関しては、標準的な方法が用いられる。一般に酵素反応および精製工程は、製造元の仕様書に従って実施される。方法と操作は、一般に当該分野における従来の方法および本文書全体を通して提供されている種々の一般的文献（一般には、参照として本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在、を参照）に従って実施される。本明細書に用いられる命名法ならびに分析化学における実験操作および下記の有機合成は当該分野に公知であり使用されているものである。化学的合成および化学的分析のためには標準的方法またはその改良法が用いられる。
【００２５】
「スフィンゴ糖脂質類似体」および「スフィンゴ糖脂質」は、本発明の化合物を称するために本明細書において用いられる。上記用語は、糖部分、塩基（例えば、スフィンゴ様骨格）または脂肪酸由来炭化水素が、天然スフィンゴ糖脂質類に見られる構造以外の構造であるスフィンゴ糖脂質構造を言うために用いられる。
【００２６】
「糖」および「糖の」は、少なくとも１つの環式構造に存在する置換もしくは非置換のヘテロアルキル基を含む部分を言う。この定義による部分は、一般に少なくとも１つの還元性末端を有する。
【００２７】
「ペプチド」は、その中のモノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して、一緒に結合しているポリマーをいい、あるいはポリペプチドとも称される。アミノ酸がα−アミノ酸である場合は、Ｌ−光学異性体かＤ−光学異性体のいずれかを用いることができる。さらに、非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンもまた含まれる。本発明には、遺伝子にコードされていないアミノ酸もまた使用できる。さらに、反応基を含むように修飾されたアミノ酸もまた、本発明に使用できる。本発明に用いられるアミノ酸は全て、Ｄ−異性体か、またはＬ−異性体であり得る。一般に、Ｌ−異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣物もまた、本発明に有用である。一般的レビューに関しては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．著、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク所在、ｐ．２６７（１９８３）を参照されたい。
【００２８】
用語の「アミノ酸」は、天然アミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然アミノ酸と同様な様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を言う。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたアミノ酸ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を言う。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様な様式で機能する化学的化合物を言う。
【００２９】
本明細書に用いられる「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、またはより高度に集合したハイブリダイゼーションモチーフおよびそれらの任意の化学的修飾体を意味する。修飾体としては、限定はしないが、核酸リガンド塩基に、または核酸リガンド全体に追加の電荷、極性、水素結合、静電的相互作用および可動性を組み込む化学基を提供するものが挙げられる。このような修飾体としては、限定はしないが、ペプチド核酸、ホスホジエステル基修飾体（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）、２’位糖修飾体、５位ピリミジン修飾体、８位プリン修飾体、環外アミンにおける修飾体、４−チオウリジンの置換体、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換体；骨格修飾体、メチル化体、イソ塩基類、イソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常塩基対の組み合わせが挙げられる。修飾体としてはまた、ＰＬ、蛍光体または他の部分とのキャッピングなどの３’および５’修飾体も挙げられる。
【００３０】
本明細書に用いられる「反応性官能基」とは、限定はしないが、オレフィン類、アセチレン類、アルコール類、フェノール類、エーテル類、オキシド類、ハライド類、アルデヒド類、ケトン類、カルボン酸類、エステル類、アミド類、シアネート類、イソシアネート類、チオシアネート類、イソチオシアネート類、アミン類、ヒドラジン類、ヒドラゾン類、ヒドラジド類、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル類、メルカプタン類、スルフィド類、ジスルフィド類、スルホキシド類、スルホン類、スルホン酸類、スルフィン酸類、アセタール類、ケタール類、酸無水物類、サルフェート類、スルフェン酸類、イソニトリル類、アミジン類、イミド類、イミデート類、ニトロン類、ヒドロキシアミン類、オキシム類、ヒドロキサム酸類、チオヒドロキサム酸類、アレン類、オルトエステル類、亜硫酸塩類、エナミン類、イナミン類、尿素類、プソイド尿素類、セミカルバジド類、カルボジイミド類、カルバメート類、イミン類、アジド類、アゾ化合物、アゾキシ化合物およびニトロソ化合物などの基を言う。また、反応性官能基としては、生物共役体を調製するために用いられるもの、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、アレイミド類なども挙げられる。これらの反応性官能基の各々を調製する方法は当該分野に周知であり、特定の目的のためのそれらの適用または修飾は、当業者の能力の範囲内にある（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ編集、ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ所在、１９８９年を参照）。
【００３１】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「受容体部分」は、グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である糖基の受容体として働く糖構造である。この受容体部分を対応するグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与部分および他の必要な反応混合物成分と接触させ、この反応混合物を十分な時間温置すると、グリコシルトランスフェラーゼは、糖残基を糖供与体から受容体部分へと移す。上記受容体部分は、ある特定のグリコシルトランスフェラーゼの種々のタイプに対して様々であることが多い。例えば、哺乳動物ガラクトシド２−Ｌ−ガラクトシルトランスフェラーゼに対する受容体部分は、糖の非還元末端にＧａｌβ１，４−Ｇｌｃ−Ｒを含む。したがって、用語の「受容体部分」は、特定の適用に対する対象の特定グリコシルトランスフェラーゼの文脈で考えられる。他のグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体部分は本明細書に記載されている。
【００３２】
用語の「シアリン酸」は、９個の炭素のカルボキシル化糖のファミリーメンバーを言う。リンカー類、反応性官能基、検出可能な標識、脂質ラフトおよび標的部分に包含される成分により誘導体化されているシアリン酸類似体もまた含まれる、シアリン酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセタミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略記される）である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。シアリン酸ファミリーの第３のメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄｏｎｏら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：ｐ．１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：ｐ．２１８１１−２１８１９（１９９０））。また、９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ様９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアリン酸も含まれる。シアリン酸ファミリーのレビューには、例えば、Ｖｅｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：ｐ．２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編集（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク所在（１９９２）を参照されたい。シアリル化操作におけるシアリン酸化合物の合成および使用法は、１９９２年１０月に公表された国際出願公開第９２／１６６４０号に開示されている。
【００３３】
ある細胞に関連して、用語の「組換え」が用いられる場合は、その細胞が、異種核酸を複製するか、または異種核酸にコードされたペプチドまたは蛋白質を発現することを示す。組換え細胞は、その細胞の天然の（非組換え）形態内には見られない遺伝子を含有することができる。また、組換え細胞は、人工的手段によって、遺伝子が修飾され、細胞内に再導入される細胞の天然形態において見られる遺伝子を含有することもできる。また、上記用語は、細胞から核酸を取り出すことなく修飾された、細胞にとって内因性の核酸を含有する細胞も含み、このような修飾としては、遺伝子置換、部位特異的変換、および関連した方法によって得られるものを含む。「組換えポリペプチド」は、組換え細胞によって産生されたポリペプチドである。本発明は、組換え蛋白質を含む細胞によって発現される酵素および／または基質を任意に利用する。
【００３４】
用語の「単離された」とは、その物質を製造するために使用される成分から実質的にまたは本質的に遊離している物質を言う。本発明の方法によって製造される組成物に関して、用語の「単離された」とは、その組成物を調製するために使用される混合物中の物質に通常伴っている成分から実質的にまたは本質的に遊離している物質を言う。「単離された」および「純粋な」は、交換可能に用いられる。典型的には、本発明の方法によって製造された単離化合物は、好ましくは、ある範囲で示される純度のレベルを有する。スフィンゴ糖脂質化合物に関して純度範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約０８％、約９０％またはさらに約９０％以上である。
【００３５】
本発明の方法によって製造された化合物が、約９０％以上の純度である場合、それらの純度はまた、ある範囲として示されることが好ましい。純度範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％である。
【００３６】
純度は、当該分野で認められている任意の分析法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣまたは同様な手段）により決定される。
【００３７】
本明細書に用いられる「本質的に集団の各メンバー」とは、前駆体基質に加えられる選択されたパーセンテージのグリコシル供与体が、基質の集団の個々のメンバー上の同一の受容体部位に付加される、本発明の方法により製造された化合物集団の特性を言う。「本質的に集団の各メンバー」は、グリコシル供与体に共役している基質上の部位の「均質性」をいい、また、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明の化合物を言う。
【００３８】
「均質性」とは、グリコシル供与体が共役している受容体部分の集団にわたる構造的一致を言う。したがって、グリコシル化反応の最後に、その反応時に移された各グリコシル供与体が同じ構造を有する受容体部位と共役しているならば、その組成物は、約１００％均質であると言われる。均質性は、典型的にはある範囲として表される。ペプチド共役体に関する均質性の範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約０８％、約９０％または約９０％以上である。
【００３９】
本発明の方法により調製された組成物が、約９０％以上か、またはそれに等しい場合、それらの均質性はまた、ある範囲として表されることが好ましい。均質性の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均質性である。スフィンゴ糖脂質類の純度は、典型的には当業者に公知の１つ以上の方法、例えば、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、フライト分光法のマトリクス補助レーザー脱離質量時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリ電気泳動などにより決定される。
【００４０】
オリゴ糖は、還元性末端における糖が実際に還元性の糖であっても、またなくても、還元性末端と非還元性末端とを有していると考えられる。容認された命名法により、オリゴ糖は、本明細書において、左側に非還元性末端を有し、右側に還元性末端を有して描かれている。
【００４１】
本明細書において記載されるオリゴ糖は、非還元糖に対する名称または略号（すなわちＧａｌ）に続いて、グリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合、（１または２）、結合に関与する還元糖の環の位置（２、３、４、６または８）、次いで還元糖の名称または略号（すなわちＧｌｃＮＡｃ）によって一般に記載される。各糖は、ピラノースであることが好ましい。標準的な糖鎖生物学命名法のレビューに関しては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編集、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００４２】
本明細書に用いられる「結合メンバー」とは、少なくとも１個のヘテロ原子を含む共有化学結合を言う。代表的な結合メンバーとしては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などが挙げられる。
【００４３】
記号
【００４４】
【化１１】
2006519878.tif 000003
は、結合として使用されても、結合に垂直であることを示すとしても、示された部分が分子、固体支持体などの残りの部分に結合している点を示す。
【００４５】
本発明の一定の化合物は、非溶媒和形態ならびに水和形態などの溶媒和形態において存在し得る。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と等価であり、本発明の範囲内に含まれる。本発明の一定の化合物は、多結晶または非結晶形態において存在し得る。一般に、全ての物理的形態が、本発明によって考慮された使用にとって等価であり、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００４６】
本発明の一定の化合物は、非対称炭素原子（光学的中心）または二重結合、すなわちラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体を有し、個々の異性体が本発明の範囲内に含まれる。
【００４７】
本発明の化合物は、単一の異性体（例えば、鏡像異性体、シス−トランス異性体、位置異性体、ジアステレオマー）として、または異性体の混合物として調製できる。好ましい実施形態において、上記化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に純粋異性体化合物を調製する方法は、当該分野に公知である。例えば、鏡像異性体の濃い化合物および純粋な鏡像異性体化合物は、光学中心における立体化学を変化させずにおくか、またはその完全な反転体を生じさせる反応と組み合わせて鏡像異性体として純粋な合成中間体を用いて調製することができる。あるいは、合成経路に伴う最終産物または中間体を単一の立体異性体へと分析することができる。ある特定の立体中心を反転させるか、または変化させずにおくための方法、および立体異性体の混合物を分析するための方法は当該分野に周知であり、特定の状況に対する適切な方法を選択することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。一般的には、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編集者）、ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ社、エセックス、１９９１年、ｐ．８０９−８１６；およびＨｅｌｌｅｒ、Ａｖｖ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：ｐ．１２８（１９９０）を参照されたい。
【００４８】
また、本発明の化合物は、そのような化合物を構成している１個以上の原子において、天然にはない比率の同位体を含有し得る。例えば、上記化合物は、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体によって放射能標識できる。本発明の化合物の同位体の変型体は全て、放射性であってもなくても、本発明の範囲内に含まれることを意図している。
【００４９】
置換基が、それらの慣例的な化学式により、左から右へと明記されている場合、それらは、構造を右から左へと記することから生じる化学的に同一の置換基を等しく含む。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−とも表されることを意図している。
【００５０】
用語の「アルキル」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、他に明記されない限り、完全に飽和された、またはモノもしくはポリ不飽和であり得、指定された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は１個から１０個の炭素を意味する）ジおよび多価基を含み得る直鎖または分枝鎖または環式炭化水素基を意味する。飽和炭化水素基の例としては、限定はしないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｓ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体ならびにそれらの異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、限定はしないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高級な同族体ならびに異性体が挙げられる。用語の「アルキル」は、他に特記しない限り、「ヘテロアルキル」および「アルキレン」など、下記により詳細に定義したアルキルの誘導体を含むことを意味する。炭化水素基に限定されたアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００５１】
用語の「アルキレン」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、限定はしないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって代表されるようなアルカンから誘導された二価の基を意味し、さらに「ヘテロアルカン」としての下記の基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、約１個から約４０個の炭素原子を有し、本発明においては、３０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、より短鎖のアルキル基またはアルキレン基である。
【００５２】
用語の「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ（またはチオアルコキシ）」は、慣例的意味において用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、またはイオウ原子によって分子の残りの部分に結合しているアルキル基を言う。
【００５３】
用語の「ヘテロアルキル」は、それ自体で、または他の用語との組み合わせにおいて、他に明記しない限り、指定された炭素原子数およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳよりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなり、窒素原子およびイオウ原子が任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が任意に四級化されていてもよい安定な直鎖または分枝鎖または環式炭化水素基またはそれらの組み合わせを意味する。ヘテロ原子（単数または複数）、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に置かれていてもよく、また、アルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に置かれていてもよい。例としては、限定はしないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、２個のヘテロ原子まで連続していてもよい。同様に用語の「ヘテロアルキレン」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、限定はしないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって代表されるようなヘテロアルキルから誘導された二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基に関してヘテロ原子は、鎖端の一方または双方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらにアルキレンおよびヘテロアルキレン結合基に関して、結合基の式が記されている方向によって結合基の方向性が意味されることはない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の双方を表す。
【００５４】
用語の「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体で、または他の用語との組み合わせにおいて、他に明記しない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式型を表す。また、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、限定はしないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定はしないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００５５】
用語の「ハロ」または「ハロゲン」は、それら自体で、または他の置換基の一部として、他に明記されない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。また、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語の「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、限定はしないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味する。
【００５６】
用語の「アリール」は、他に明記しない限り、共に縮合しているか、または共有結合している単環または多環（好ましくは、１つから３つの環）であり得るポリ不飽和、芳香族炭化水素置換基を意味する。用語の「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個から４個のヘテロ原子を含有し、窒素原子およびイオウ原子が任意に酸化されており、窒素原子（単数または複数）が任意に四級化されているアリール基（または環）を言う。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して、分子の残りの部分に結合し得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。
【００５７】
簡略化のため、用語の「アリール」は、他の用語と組み合わせて用いられる場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記に定義したアリール環とヘテロアリール環の双方を含む。したがって、用語の「アリールアルキル」は、炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば、酸素原子によって置換されたアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）などのアルキル基にアリール基が結合している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意味する。
【００５８】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）の各々は、示された基の置換体および非置換体の双方を含むことを意味する。各タイプの基の好ましい置換基は下記に提供されている。
【００５９】
アルキル基およびヘテロアルキル基（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称される基など）に対する置換基は、限定はしないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（Ｒ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される１つ以上の種々の基であり得、その数は、ゼロから（２ｍ’＋１）の範囲にあり、ここで、ｍ’は、このような基における炭素原子の合計数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は各々、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、例えば、１〜３個のハロゲンによって置換されたアリール、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基またはアリールアルキル基を言う。本発明の化合物が、例えば、１つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、独立して選択され、これらの基の１つ以上が存在する場合、各々Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基である。Ｒ’とＲ’’が、同一の窒素原子に結合している場合、それらは、その窒素原子と組合わされて、５員環、６員環または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定はしないが、１−ピロジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味する。置換基についての上記の検討から、用語の「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを当業者は理解するであろう。
【００６０】
アルキル基に関して、記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基に関する置換基は種々あり、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（Ｒ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、その数は、ゼロから芳香族環上の開放原子価の合計数の範囲である。本発明の化合物が、例えば、１つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、独立して選択され、これらの基の１つ以上が存在する場合、各々Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基である。
【００６１】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基によって任意に置換でき、ここで、ＴおよびＵは、独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは、０から４０の整数である。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｕ−の置換基によって任意に置換でき、ここで、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＲＲ’、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは、０から４０の整数である。このように形成された新たな環の単結合のうちの１つは、二重結合によって、任意に置換され得る。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、式−（ＣＲＲ）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基によって任意に置換でき、ここで、ｓおよびｄは、独立して０から４０の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは独立して水素または置換もしくは非置換（Ｃ１〜Ｃ４０）アルキルから選択される。
【００６２】
本明細書に用いられる用語の「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００６３】
本明細書に用いられる用語の「グリコシルトランスフェラーゼ」とは、活性化供与体分子から、各々が本明細書に定義されている特定の受容体分子への糖部分の転移を触媒してグリコシル結合を形成する酵素を言う。グリコシルトランスフェラーゼの例としては、限定はしないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ；フコシルトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが挙げられる。さらにグリコシルトランスフェラーゼは、反応基質と反応産物の立体化学によって、保持、すなわち、芳香族立体配置の保持に至るもの（例えば、ＵＤＰ−グルコース−＞α−グルコシド）または反転、すなわち、芳香族立体配置の反転に至るもの（例えば、ＵＤＰ−グルコース−＞β−グルコシド）として分類できる（Ｓｉｎｎｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０、ｐ．１１７１−１２０２）。グリコシルトランスフェラーゼファミリーの分類群化は、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．＆  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓｅｒｖｅｒにより説明されており、＜＜ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｄｂ．ｈｔｍｌ＞＞においてインターネット上で見ることができる。
【００６４】
本明細書に用いられる用語の「トランスシアリダーゼ」とは、α−２，３グリコシド結合を介して、ガラクトースへのシアリン酸の付加を触媒する酵素を言う。トランスシアリダーゼ類は、多くのトリパノソーマ種および幾つかの他の寄生虫において見られる。寄生虫生体のトランスシアリダーゼ類は、シアリダーゼの加水分解活性を保持しているが、効率ははるかに低い。その結果、トランスシアリダーゼ類は、ＣＭＰシアリン酸の不在下、宿主のシアリル−グリコ共役体の末端シアリン酸を寄生虫の表面糖蛋白へ可逆的に転移することを触媒する。
【００６５】
シャガス病の原因となるトリパノソーマクルースは、表面トランスシアリダーゼを有する。このトランスシアリダーゼは、末端β−ガラクトシル残基を含有する受容体へのα−２，３−結合シアリン酸の転移を優先的に触媒する（Ｒｉｂｅｉｒａｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．７：ｐ．１２３７−１２４６；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９５年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３０：ｐ．３３３−３４２；Ｓｃｕｄｄｅｒら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：ｐ．９８８６−９８９１；Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら、１９９２年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．、２：ｐ．５４１−５４８）。Ｔ．クルーストランスシアリダーゼ（ＴｃＴｓ）は、β−結合ガラクトース残基を末端に有し、もっぱら、α２−３シアロシド結合を合成する広範囲の糖、糖脂質および糖蛋白質の受容体に対して活性を有する（Ｓｃｕｄｄｅｒら、上記）。また、上記トランスシアリダーゼは、低率で、ｐ−ニトロフェニルα−Ｎ−アセチルノイラミン酸などの合成α−シアリル化合物のシアリン酸も転移させる（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃは、供与体−基質ではない）。Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸の修飾２−［４−メチルウンベリフェロン］−α−ケトシド（４ＭＵ−ＮＡＮＡ）およびそれらの幾つかの誘導体もまた、ＴｃＴｓに対する供与体として働くことができる（ＬｅｅおよびＬｅｅ、１９９４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１６：ｐ．３５８−３６４）。３’−シアリル−ラクト−Ｎ−ビオースＩの酵素的合成は、Ｎ−アセチルノイラミニル部分の受容体としてラクト−Ｎ−ビオースＩおよび供与体として２’−（４−メチルウンベリフェニル）−α−Ｄ−Ｎ−アセリノイラミン酸からＴｃＴｓにより触媒された（Ｖｅｔｅｒｅら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：ｐ．９４２−９４９）。α２，３−シアリル化供与体を合成するためのトランスシアリダーゼの使用に関するさらなる情報は、欧州特許出願第０  ５５７  ５８０  Ａ２号；米国特許第５，４０９，８１７号に見ることができる。
【００６６】
ヒルＭａｃｒｏｂｄｅｌｌａ  ｄｅｃｏｒａの分子内トランスシアリダーゼは、シアリル−グリコ共役体における末端Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）α２の開裂→３Ｇａｌ結合に対して厳密な特異性を示し、分子内トランス−シアリル化反応を触媒する（Ｌｕｏら、１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８５：ｐ．３２３−３３２）。トランスシアリダーゼ類は、シアリン酸を主にガラクトース受容体上へ付加するが、シアリン酸を幾つかの他の糖に転移する。しかし、ＧａｌＮＡｃ上へのシアリン酸の転移には、シアリルトランスフェラーゼが必要である。トランスシアリダーゼ類の使用についてのさらなる情報は、ＰＣＴ出願国際公開第９３／１８７８７号；Ｖｅｔｅｒｅら、１９９７年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：ｐ．１０８３−１０９０に見ることができる。
【００６７】
本明細書に用いられる用語の「シアリルトランスフェラーゼ」は、付加された糖の立体配置の反転により、グリコシド合成を触媒する酵素類をいい、これらは、単糖供与体として、糖ヌクレオチドを必要とする。シアリルトランスフェラーゼの一例は、カンピロバクターの酵素（ＣＳＴ−ＩおよびＣＳＴ−ＩＩ）である。例えば、米国特許第６，５０３，７４４号、米国特許第６，０９６，５２９号、および米国特許第６，２１０，９３３号ならびに米国特許出願公開第２００２／２．０４２，３６９号を参照されたい。
【００６８】
本発明の他の目的、態様および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【００６９】
（本発明の詳細な説明）
（序論）
多くの化合物、例えば、糖脂質の生物学的活性は、分子の特定の糖形態、セラミド様またはスフィンゴシン様骨格の有無に、また、セラミド誘導体においては、脂肪酸アミド構成要素の構造に依存する。天然に見られる構造以外の構造を有する糖脂質組成物の利点としては、例えば、クリアランス速度の低下による治療上の半減期の増加、生物利用能の増大および生体活性の変化が挙げられる。糖脂質の構造変化はまた、変化した糖脂質に対する特異的な特定の組織または細胞表面受容体に対してその糖脂質を標的化するために使用することもできる。
【００７０】
本発明は、新規な構造を有する糖脂質を提供する。本発明の化合物は、セラミド類、スフィンゴシン類およびそれらの類似体を参照として、本明細書に例示される。検討の的となるものは、説明を明晰にするためのものであり、本発明が、本明細書に明白に挙げられたもの以外の糖脂質に適用できることを当業者は認識されるであろう。
【００７１】
（化合物）
本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼなどに対する好適な受容体部分を含む任意の基質を用いて実施することができる。代表的な基質としては、限定はしないが、スフィンゴシンおよびその類似体、セラミドおよびその類似体、ペプチド類、スフィンゴ糖脂質類および他の生体構造（例えば、糖脂質、細胞全体など）が挙げられる。
【００７２】
当該の好ましい実施形態において、本発明は、式Ｉ：
【００７３】
【化１２】
2006519878.tif 000004
によるスフィンゴ糖脂質誘導体の１クラスを提供することによって、当該分野における不足に取り組んでおり、ここで、記号Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ２）２およびＮＲ２から選択されるメンバーを表す。Ｘは、Ｈ、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、および−ＣＨＲ３Ｒ４から選択されるメンバーである。記号Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、−Ｃ（＝Ｍ）Ｒ５、−Ｃ（＝Ｍ）−Ｚ−Ｒ５、−ＳＯ２Ｒ５、および−ＳＯ３から独立して選択されるメンバーであり、記号ＭおよびＺは、Ｏ、ＮＲ６またはＳから独立して選択されるメンバーを表す。
【００７４】
記号Ｙは、Ｈ、−ＯＲ７、−ＳＲ７、−ＮＲ７Ｒ８、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルを表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、および置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【００７５】
ＸがＯＲ３であり、Ｒ３が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５である本発明の化合物において、Ｙは一般にＯＨ以外の基である。
【００７６】
Ｘ、ＹまたはＲ１はいずれも、単独で、または組み合わせて、標的部分、検出可能標識または脂質ラフトに組み込まれることが意図されている種である部分を含むことができる。
【００７７】
本発明の代表的化合物として、ＸがＮＨＲ４である上記の化合物が挙げられる。記号Ｒ４は、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒ５を表す。記号Ｙは、ＯＨを表し、Ｚは、０である。Ｒ５は、置換もしくは非置換のアルキルから選択されるメンバー以外のものであることが好ましい。
【００７８】
他の代表的実施形態において、本発明は、Ｒ１が、式：
【００７９】
【化１３】
2006519878.tif 000005
を有する部分を含む、式Ｉによる化合物を提供し、ここで、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ１４、−ＣＮおよび−Ｃ（＝Ｌ）Ｒ１４から独立して選択されるメンバーである。記号Ｌは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１６を表す。Ｒ１４およびＲ１５は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、ＯＲ１７、ＳＲ１７およびＮＲ１７Ｒ１８から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立してＨ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールを表す。さらに、Ｒ９とＲ１０；Ｒ９とＲ１１；Ｒ９とＲ１２；Ｒ９とＲ１３；Ｒ１０とＲ１１；Ｒ１０とＲ１２；Ｒ１０とＲ１３；Ｒ１１とＲ１２；Ｒ１１とＲ１３；およびＲ１２とＲ１３から選択されるメンバーは、それらが結合している原子と一緒になって、任意に結合して環を形成する。この環は、５員から７員を有する置換もしくは非置換のシクロアルキル環系、置換もしくは非置換のアリール環系、置換もしくは非置換のヘテロアリール環系および置換もしくは非置換のヘテロアルキル環系から選択されるメンバーであることが好ましい。
【００８０】
さらなる代表的な実施形態において、本発明は、Ｒ１が、式：
【００８１】
【化１４】
2006519878.tif 000006
を有する部分を含む、式Ｉによる化合物を提供し、ここで、記号Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ１４、−ＣＮおよび−Ｃ（＝Ｌ）Ｒ１４を表す。Ｌ、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、実質的に上記のとおりである。
【００８２】
他の代表的な実施形態において、本発明は、Ｒ１が、式：
【００８３】
【化１５】
2006519878.tif 000007
を有する部分を含む、式（Ｉ）による化合物を提供し、ここで、記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、ＮＲ１４Ｒ１５、ＯＲ１４、−ＣＮおよび−Ｃ（＝Ｌ）Ｒ１４から独立して選択されるメンバーである。Ｒ１３およびＲ１５により置換された炭素と繋がっている結合の立体配置は、シスまたはトランスであり得る。
【００８４】
記号Ｌは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１６を表す。Ｒ１４およびＲ１５は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、ＯＲ１７、ＳＲ１７およびＮＲ１７Ｒ１８から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立してＨ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルを表す。
【００８５】
さらに、Ｒ９とＲ１０；Ｒ９とＲ１１；Ｒ９とＲ１２；Ｒ９とＲ１３；Ｒ１０とＲ１１；Ｒ１０とＲ１２；Ｒ１０とＲ１３；Ｒ１１とＲ１２；Ｒ１１とＲ１３；およびＲ１２とＲ１３から選択されるメンバーは、それらが結合している原子と一緒になって、任意に結合して環を形成する。この環は、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールまたは非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。
【００８６】
さらなる代表的な実施形態において、Ｒ１３は、置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択されるメンバーである。好ましいヘテロアリール基は、少なくとも１個の環内窒素原子を含むものである。代表的な窒素含有ヘテロアリール基はピリジル部分である。
【００８７】
他の代表的な実施形態において、上記に検討した化合物のクラスとしては、Ｒ１３が、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３ａＲ１３ｂである種が挙げられ、ここで、Ｒ１３ａおよびＲ１３は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【００８８】
上記の化合物のクラスとしてはまた、Ｒ１１がＮＲ１１ａＲ１１ｂである種が挙げられる。記号Ｒ１１ａおよびＲ１１ｂは、独立してＨ、置換もしくは非置換のアルキルもしくは置換もしくは非置換のヘテロアルキルを表す。
【００８９】
本発明のスフィンゴ糖脂質の糖部分は、所望の生物活性を示す任意の構造であり得る。一般に、糖部分は、少なくとも１つのＧａｌ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡＣまたはＳｉａを含む。糖は任意にフコシル化される。一定の好ましい糖部分において、ＳｉａはＧａｌ残基と結合している。他の好ましい糖部分において、Ｇａｌは、Ｇｌｃに結合している。さらに好ましい糖部分において、ＧｌｃＮＡｃはＧａｌに結合している。当該の好ましい糖部分モチーフは、Ｇａｌに結合しているペヌリチメート（ｐｅｎｕｌｉｔｉｍａｔｅ）ＧａｌＮＡｃに結合している末端Ｇａｌを有する骨格を含み、これが次にスフィンゴ糖脂質骨格に結合しているＧｌｃに結合している。上記糖部分は、アセチル化または脱アセチル化された１つ以上の基を有し得る。
【００９０】
代表的な糖部分としては、以下のものが挙げられる。
【００９１】
【化１６】
2006519878.tif 000008
さらなる代表的な実施形態において、シアリン酸置換オリゴ糖は硫酸化される。すなわち、シアリン酸置換オリゴ糖における１つ以上のヒドロキシル基が修飾されて、硫酸エステルを形成する。合成ガングリオシド類の硫酸エステルを調製する方法は、米国特許第５，８４９，７１７号に開示されている。
【００９２】
本発明の合成スフィンゴ糖脂質の他の例において、シアリン酸残基のカルボン酸基がエステル化される「内部エステル」すなわち、オリゴ糖におけるカルボキシル基とヒドロキシル基との間にラクトンが形成されるものと、「外部エステル」すなわち、アルコールＲＯＨにより、カルボキシル基がエステル化されているものが挙げられる。ＲＯＨは、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリールであり得る。シアリン酸のカルボキシル基エステル化されている合成スフィンゴ糖脂質類を調製する方法は、米国特許第５，２６４，４２４号に開示されている。
【００９３】
本発明のさらなる合成スフィンゴ糖脂質類としては、ＨＮＲまたはカルボン酸基または硫酸基を含有する脂肪族アミノ酸によりアミド化されている（すなわち、カルボン酸部分を誘導体化している）Ｓｉａ残基が挙げられる。Ｒは上記のとおりである。官能化シアリン酸カルボキシル部分によって合成スフィンゴ糖脂質類を調製する方法は、米国特許第５，３５０，８４１号に開示されている。
【００９４】
合成スフィンゴ糖脂質のさらに他の例において、オリゴ糖における１つ以上のヒドロキシル基および／またはシアリン酸残基がアシル化されている、すなわち、−ＯＣＯＲに変換されている。Ｒは上記のとおりである。アシル化シアリン酸残基によって合成スフィンゴ糖脂質類を調製する方法は、米国特許第５，４８４，７７５号および米国特許第５，２６４，４２４号に開示されている。
【００９５】
スフィンゴシン基のＮ−アシル基（（ＮＣ（Ｏ）Ｒ）は、多種多様なカルボン酸（または対応する活性化誘導体、例えば、活性エステル、酸ハロゲン化物など）から誘導することができる。アシル化は、従来の方法において、例えば、出発物質を、アシル化剤、特に残基が導入される酸の反応性の機能的誘導体によって反応させることにより実施できる。代表的な酸の反応性の機能的誘導体としては、ハロゲン化物、酸無水物、および活性エステルが挙げられる。アシル化は、塩基（例えば、ＴＥＡ、ピリジンまたはコリジン）存在下で実施できる。アシル化は、任意に、無水条件下、室温で、または加熱して実施される。無機塩基の存在下、水性条件でアシル化を実施するために、ショッテン−バウマン法もまた使用できる。幾つかの場合、反応性の機能的誘導体として、酸類のエステル類を使用することも可能である。アシル化には、ペプチド化学において公知のものなど、例えば、カルボジイミド類またはイソキサゾール塩によって得られる混合酸無水物または誘導体を使用する活性化カルボキシル誘導体を含む方法を用いることも可能である。
【００９６】
アシル化の代表的な方法としては、（１）酸アジドとリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（２）酸とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールから得られる酸のアシルイミダゾールとリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（３）酸とトリフルオロ酢酸との混合無水物と、リソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（４）酸塩化物とリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（５）カルボジイミド（ジシクロヘキシルカルボジイミドなど）および任意に１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの物質存在下、酸とリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（６）加熱による酸とリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（７）高温における酸のメチルエステルとリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；（８）パラ−ニトロフェノールとのエステルなど、酸のフェノールエステルとリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応；および（９）酸の塩とヨウ化１−メチル−２−クロロピリジンまたは同様の生成物との間の交換から誘導されたエステルとリソスフィンゴ糖脂質誘導体との反応、が挙げられる。
【００９７】
上記酸は、飽和または不飽和、分枝鎖または直鎖の、置換もしくは非置換のアルキル酸、置換もしくは非置換の脂肪酸（例えば、ヒドロキシ脂肪酸）から誘導できる。上記酸は、Ｃ１〜Ｃ４０の酸であることが好ましい。上記アシル基は、ｐが０〜４０である以下の代表的構造を含み得る：−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、アリール、アルキルアリール、またはリンカー。一般に、アシル成分の長さは、好ましくは、８〜３０個の炭素、より好ましくは、１０〜２５個、さらにより好ましくは、１６〜２０個の炭素である。
【００９８】
酸の非限定的一覧としては、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸およびそれらのフッ素化または臭素化類似体；２，２−ジクロロプロピオン酸、２，３−ジクロロプロピオン酸、２，２，３−トリクロロプロピオン酸、直鎖状−２，２−ジクロロ酪酸、２，２−ジクロロ吉草酸、２−クロロイソ吉草酸、２，３−ジクロロ吉草酸、ペンタフルオロプロピオン酸、３，３−ジクロロピバル酸、３−クロロ−２，２−ジメチルプロピオン酸、クロロ−ジフルオロ酢酸、２，２−ジクロロカプロン酸、２−モノクロロプロピオン酸、直鎖状−２−モノクロロ酪酸、２−モノクロロ吉草酸、および２−モノクロロカプロン酸ならびにこれらの酸のフッ素化または臭素化類似体；２−クロロパルミチン酸、２−クロロステアリン酸、２−クロロオレイン酸、２−クロロラウリン酸、２−クロロベヘン酸、４−クロロフェノキシ酢酸、２−ヒドロキシプロピオン酸（乳酸）、３−ヒドロキシプロピオン酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシ吉草酸、２，３−ジヒドロキシ酪酸および２，３−ジヒドロキシ吉草酸、ならびにそれらのＣ１〜Ｃ４０低級脂肪族エーテル類またはエステル類；メトキシ酢酸、２−ヒドロキシステアリン酸、２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオン酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、２−ヒドロキシイソ酪酸および４−フルオロフェノキシ酢酸；ピルビン酸、アセト酢酸、レブリン酸、最大４個の炭素原子を有する低級脂肪族アルコールとのそれらのケタール類；メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプト酪酸および２−メルカプト吉草酸、ならびにそれらのＣ１〜Ｃ４０低級脂肪族チオエーテル類またはチオエステル類；２−メルカプトラウリン酸、オレイン酸およびパルミチン酸；ならびにそれらのＣ１〜Ｃ４低級脂肪族チオエーテル類またはチオエステル類；マロン酸、グルタール酸、モノメチルグルタール酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタール酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、フマール酸、アゼライン酸、およびそれらのＣ１〜Ｃ４０脂肪族エステル類；スルホ酢酸、２−スルホプロピオン酸、２−スルホ酪酸、２−スルホ吉草酸、およびそれらのＣ１〜Ｃ４０脂肪族硫酸エステル類。また、２−スルホラウリン酸、２−スルホ−オレイン酸、２−スルホパルミチン酸、２−スルホステアリン酸および；それらのＣ１〜Ｃ４０低級脂肪族硫酸エステル類；スルファミド類またはアミンが１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４０低級アルキル基またはＣ１〜Ｃ４０低級アルキレン基により任意に置換されているスルファミド類；Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、アシルスルホキシド基またはＣ１〜Ｃ４０アルキルスルホン基により２位に置換されている酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸；シアン酢酸、２−シアンプロピオン酸、２−シアン酪酸、２−シアン吉草酸、アミノ酢酸、２−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、３−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ吉草酸、４−アミノ吉草酸、および１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４０アルキレン基またはＣ１〜Ｃ４アシル基により任意に置換されているアミンとのそれらの誘導体；ジ−メチルグリシン、３−ジメチルアミノプロピオン酸、カミチン、およびシステイン酸、が挙げられる。
【００９９】
遊離のヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、または第一級または第二級アミノ基を含有する酸から誘導されたアシル基の特定例においては、アシル化反応時にこのような基を保護することが、一般に好ましい。このような基を保護する方法は、当該分野で利用可能である。このような保護基は、反応の最後に除去することが必要である。代表的な保護基としては、スルホンアミド基、アロック基、フタロイル基およびベンジルオキシカルボニル基が挙げられ、これらは、アミノ基の保護促進に役立つ。したがって、例えば、γ−アミノ酪酸を含有する誘導体の調製においては、アミノ基がフタロイル基に結合しているこの酸の誘導体を先ず調製し、リソスフィンゴ糖脂質によるアシル化後、ヒドラジン分解によって、フタロイル基を除去する。ベンジルオキシカルボニル基は、水素化分解によって除去できる。この残基は、ヒドロキシ基の保護にも利用可能である。カルボキシ基は、エステル化、例えば、ペプチド化学において用いられるアルコール類により保護することができる。
【０１００】
また、本発明は、本発明による遊離カルボキシ官能基を有するスフィンゴ糖脂質の金属塩または有機塩基塩を調製する方法も提供し、これらもまた、本発明の一部を構成している。二塩基酸によるエステル類または過アシル化アミド類などの遊離酸官能基を有する、本発明の他の誘導体の金属塩または有機塩基塩を調製することも可能である。例えば、アミノアルコール類によるエステル類などの遊離アミノ官能基を含有するスフィンゴ糖脂質誘導体の酸付加塩もまた、本発明の一部を構成している。金属塩または有機塩基塩の中で、特に挙げるべきものは、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩、またはアルミニウム塩、ならびに有機塩基塩、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ピペリジン、モルホリン、エフェドリン、フルフリルアミン、コリン、エチレンジアミンおよびアミノエタノールなどの脂肪族または芳香族またはヘテロ環式の第一級、第二級または第三級アミン類などの治療法に使用できるものである。本発明によるスフィンゴ糖脂質誘導体を提供できる酸の中でも、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸などの水素酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸およびマレイン酸などの炭素が最大７個の低級脂肪酸を特に挙げる必要がある。ピクリン酸などの治療上有用ではない酸または塩基を、本発明のスフィンゴ糖脂質誘導体の精製に用いることができ、やはり本発明の一部を構成している。
【０１０１】
本発明の代表的な化合物は、図１６に記載されている。
【０１０２】
また、本発明は、上記の各化合物の薬学的に受容可能な全ての異性体、塩、水和物、溶媒和物、およびプロドラッグを含む。また、このような化合物は、種々の異性体および互変異性体において存在でき、このような形態は全て、このような異性体および互変異性体の薬学的に受容可能な塩、水和物、溶媒和物と共に、本発明に含まれることを意味している。
【０１０３】
（調製法）
本発明により、本発明の合成スフィンゴ糖脂質化合物は、他に指示されない限り、当該分野に公知の化学および酵素化学における従来の方法とプロトコルを用いて調製される。例えば、本発明の化合物は、下記のスキーム１〜６に概略化されるような化学的および酵素的工程により調製できる。
【０１０４】
本発明の化合物の糖部分は、参照としてそれぞれ、その全体を組み込んでいる米国特許第５，９２２，５７７号、米国特許第６，２８４，４９３号および米国特許第６，３３１，４１８号に記載された方法など、当該分野に公知の任意の手段により調製することができる。本発明の化合物の糖部分は、酵素的に調製され、本明細書に各々定義された供与体分子から受容体分子への単糖の転移に影響を与えるために特異的酵素が使用できる。
【０１０５】
より具体的には、本発明の合成スフィンゴ糖脂質化合物において見られる二糖、オリゴ糖および多糖は、グリコシルトランスフェラーゼ類の使用により生合成的に調製されることが好ましい。このようなグリコシルトランスフェラーゼ反応は、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、クロロホルムなどの有機溶媒の単独、または組み合わせの存在下で実施できる。あるいは、このようなグリコシルトランスフェラーゼ反応は、生物学的緩衝剤、細胞ライセートなどのインビトロの生物学的媒体中で、またはグリコシルトランスフェラーゼがクロマトグラフィ支持体上に固定化され、反応混合物の他の成分を水性媒体中、クロマトグラフィ支持体と接触させることにより、上記成分をグリコシルトランスフェラーゼと接触させる、クロマトグラフィ支持体上で実施できる。
【０１０６】
糖のグリコシルトランスフェラーゼ媒介合成は、インビボまたはインビトロで実施できる。例えば、酵素的合成、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ媒介合成のために、細胞全体発現系が使用できる。グリコシルトランスフェラーゼ類の発現および糖構造の産生に有用な細胞タイプとしては、当業者に理解されると思われるが。細菌細胞、酵母細胞、および昆虫細胞が挙げられる。所望の糖産物は、それが合成された細胞から、細胞溶解により、または糖産物を培地に分泌する細胞を用いる場合には細胞培地からの単離により単離できる。次いでこの糖産物を、本明細書の他所に記載された手段によって精製し得るか、またはライセートまたは細胞培地において、さらなる精製なしに使用し得る。
【０１０７】
当業者に理解されるように、使用される酵素は、供与体へ転移される糖によって変化し得る。好適な酵素の例としては、限定はしないが、グリコシルトランスフェラーゼ類、トランス−シアリダーゼ類、およびシアリルトランスフェラーゼ類が挙げられる。本発明の所与の合成法に用いられるグリコシルトランスフェラーゼ（単数または複数）の選択は、出発物質として用いられる受容体と供与体の独自性および所望の最終産物の性質に依存する。本発明の方法は、１つ以上の糖が付加される、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの使用を含み得る。複数のグリコシルトランスフェラーゼ反応を同時に、すなわち、同時に同じ反応混合物中で、または連続的に実施できる。
【０１０８】
大規模インビトロ反応に関して十分な量のグリコシルトランスフェラーゼを得るために、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をクローン化し、通常の当業者に公知の方法により、組換え溶解性酵素として発現させることができる。次いで発現した酵素を通常の当業者に公知の手段により精製し得るか、もしくは、ライセートまたは細胞培地において、さらなる精製をせずに使用し得る。
【０１０９】
例えば、糖部分：
【０１１０】
【化１７】
2006519878.tif 000009
は、受容体分子、例えば、グルコース（Ｇｌｃ）を含有するセラミドまたはスフィンゴイドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース（Ｇａｌ）供与体分子と接触させて、
【０１１１】
【化１８】
2006519878.tif 000010
を形成することによって調製でき、次にこれをトランス−シアリダーゼおよびＳｉａ供与体分子と接触させて、
【０１１２】
【化１９】
2006519878.tif 000011
．
を形成することができ、次にこれをＮ−アセチル化ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃ供与体分子と接触させて、
【０１１３】
【化２０】
2006519878.tif 000012
を形成することができ、次にこれをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース（Ｇａｌ）供与体分子と接触させて、所望の糖を形成することができる。
【０１１４】
所望の最終産物に依り、最初の単糖を、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ（グルコシルセラミドに関しては、例えばＥＣ２．４．１．８０）、またはセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ガラクトシルセラミドに関しては、例えばＥＣ２．４．１．４５）のいずれかを用いて、基質、例えばセラミド、スフィンゴシン、またはそれらの類似体に加え得る。スフィンゴ糖脂質生合成のレビューに関しては、例えば、ＩｃｈｉｋａｗａおよびＨｉｒａｂａｔａｓｈｉ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８；ｐ．１９８−２０２を参照されたい。セラミドグルコシルトランスフェラーゼは、種々の出所から入手できる。例えば、ヒトヌクレオチド配列が知られている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ５０８４０；Ｉｃｈｉｋａｗａら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：ｐ．４６３８−４６４３）ので、上記酵素を得るために、組換え法を用いることができる。また、ヒトセラミドガラクトシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６２８９９；ＫａｐｉｔｏｎｏｖおよびＹｕ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３２：ｐ．４４９−４５３）ので、上記酵素を容易に得ることができる。これらの反応に用いられる受容体は、Ｎ−アシルスフィンゴシン、スフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシンのいずれかであり得る。グリコシルトランスフェラーゼに対する好適な供与体ヌクレオチド糖としては、ＵＤＰ−ＧｌｃおよびＣＤＰ−Ｇｌｃが挙げられ、一方、ガラクトシルトランスフェラーゼは、供与体として典型的にＵＤＰ−Ｇａｌを利用する。
【０１１５】
本発明の化合物の糖部分の合成のための他の可能な生合成法は、下記のスキーム１に例示されている。好ましい一実施形態において、受容体分子は、非固定化される。例えば、受容体分子は、溶液において遊離しているか、そうでなければ、他の受容体分子と会合していない。
【０１１６】
追加の糖残基は、スフィンゴ糖脂質出発物質のグリコシル化パターンの事前の修飾なしで、本発明の化合物に加え得る。あるいは、本発明は、追加の糖残基を加える前に、スフィンゴ糖脂質のグリコシル化パターンを変化させる方法を提供する。もし、出発スフィンゴ糖脂質が、所望の糖付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼに対する好適な受容体を提供しないならば、当業者に公知の方法によって、受容体を含むようにスフィンゴ糖脂質を修飾することができる。
【０１１７】
例えば、シアリルトランスフェラーゼに対する好適な受容体を提供するために、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用することにより、好適な受容体を合成して、ガラクトース残基を、例えば、Ｇｌｃまたはグリコスフィンゴイドに結合している他の適切な糖部分に付加することができる。他の実施形態において、グリコスフィンゴイド結合オリゴ糖を、先ず全体的に、または部分的に「トリム」して、シアリルトランスフェラーゼに対する受容体または、１つ以上の適切な残基を付加できる部分を露出させて、好適な受容体を得ることができる。グリコシルトランスフェラーゼ類およびエンドグリコシダーゼ類などの酵素は、付加反応およびトリミング反応に有用である。
【０１１８】
シアリルトランスフェラーゼ類および他のグリコシルトランスフェラーゼ類は、単独で、または追加の酵素と関連させて使用できる。例えば、図１は、ウシのバターミルクから得られるラクトシルセラミドを、出発物質として用いる酵素的合成によるガングリオシドＧＭ２合成のための２つの方法の概略図を提供している。第１の方法においては、セラミドを１種以上の酵素と接触させて、糖単位をセラミドに付加する。第２の経路においては、カルボン酸アミドの加水分解により、セラミドは、対応するスフィンゴシンに変換される。糖部分をスフィンゴシンに付加させるために、１種以上の酵素が用いられる。糖単位が調製された後、スフィンゴシンのアミノ基は、反応性カルボン酸誘導体によってアシル化され、それによってセラミドが形成される。
【０１１９】
図２は、ラクトシルセラミドから出発してスフィンゴ糖脂質ＧＤ２を合成するための２つの経路の概略図を示している。各々の経路が、２種の異なるシアリルトランスフェラーゼ（α２，３ＳＴおよびα２，８ＳＴ）ならびにＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの使用を含んでいる。１つの例示的経路において、脂肪酸が塩基による処理によってラクトシルセラミドから除去される（ステップ１）。あるいは、リソセラミド由来であり得る。次いで、アセチル化が行われ（ステップ２）、その後、α２，３シアリルトランスフェラーゼにより、α２，３結合において、シアリン酸がガラクトース残基へ付加される（ステップ３）。シアリル化ステップは、本明細書に記載されている有機溶媒の存在下で実施することが好ましく、それにより、この反応はほぼ完了へと至る。次に、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを用いて、β１，４結合において、ＧａｌＮＡｃ残基がガラクトースへ付加される（ステップ５）。最後に、例えば、塩化ステロイルを用いる反応により、脂肪酸が付加され、スフィンゴ糖脂質が完成する（ステップ６）。アシル化は、工程のどの段階においても実施できる。
【０１２０】
図３は、本発明の化合物への、さらなる例示的経路を提供している。第１のスキームにおいて、グルコシルセラミドを、ガラクトシダーゼ、活性化ガラクトース供与体およびシアリルトランスフェラーゼと接触される。生じたシアリル化セラミドを、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと接触させて、所望の産物を得る。代替の経路において、グルコシルセラミドをＧａｌトランスフェラーゼ、続いてシアリルトランスフェラーゼにより処理する。シアリル化中間体をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと接触させて所望の産物を得る。第３の経路の第１のステップにおいて、セラミドは、カルボン酸アミドの加水分解により、対応するスフィンゴシンに変換される。スフィンゴシンは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、続いてシアリルトランスフェラーゼにより処理されたならば。シアリル化中間体をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと接触させ、引き続いてスフィンゴシンのアミンをアシル化して、所望のセラミドを形成する。
【０１２１】
さらなるスキームを図５に提供している。グリコシルセラミドを、対応するスフィンゴシンへ加水分解し、これをシアリルトランスフェラーゼと接触させる。シアリル化化合物をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃ供与体により処理する。生じた化合物を、活性化カルボン酸誘導体を用いるアミン部分のアシル化によりセラミドへと変換する。
【０１２２】
（酵素）
（ａ．グリコシルトランスフェラーゼ類および選択されたグリコシル化パターンを有する基質の調製法）
本発明の方法では、選択されたグリコシル化パターンを有する糖を生産する能力に関して選択されるグリコシルトランスフェラーゼ類（例えば、フコシルトランスフェラーゼ類）を利用する。例えば、所望の特異性を有するのみならず、基質における所望の受容体基を高パーセンテージでグリコシリル化する能力のあるグリコシルトランスフェラーゼ類が選択される。オリゴ糖受容体部分、例えば、溶解性のオリゴ糖または比較的短いペプチドに付加しているオリゴ糖を使用するアッセイ系を用いて得られた結果に基づいて、グリコシルトランスフェラーゼを選択することが好ましい。一定の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは融合蛋白質である。代表的な融合蛋白質としては、２種の異なるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼとコシルトランスフェラーゼ）の活性を示すグリコシルトランスフェラーゼ類が挙げられる。他の融合蛋白質としては、同じトランスフェラーゼ活性の２種の異なる変型体（例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩとＦｕｃＴ−ＶＩＩ）が挙げられる。さらに他の融合蛋白質としては、トランスフェラーゼ活性の有用性を増大する（例えば、溶解性、安定性、回転率の増大）ドメインが挙げられる。
【０１２３】
所望のオリゴ糖構造を合成するために、グリコシルトランスフェラーゼ類を用いる多くの方法が知られており、本発明に一般的に適用できる。代表的な方法は、例えば、国際公開第９６／３２４９１号、Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：ｐ．７５３（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号、米国特許第５，３７４，５４１号、および米国特許第５，６４５，５５３号に記載されている。
【０１２４】
グリコシルトランスフェラーゼは、基質（例えば、蛋白質、糖ペプチド、脂質、糖脂質または成長オリゴ糖の非還元性末端）に対する、段階的様式における活性化糖類の付加を触媒する。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが当該分野に知られている。
【０１２５】
グリコシルトランスフェラーゼが、選択された部位に所望のグリコシル残基を付加することができるという条件で、本発明の方法では、任意のグリコシルトランスフェラーゼが利用できる。このような酵素の例としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【０１２６】
本発明は、トランスシアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの組合せを用いて実施される。例えば、トランスシアリダーゼに加えて、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組み合わせを使用することができる。１種以上の酵素を用いる実施形態において、１種以上の酵素と適切なグリコシル供与体が最初の反応混合物において、任意に組み合わされる。あるいは、先行の酵素反応が完了するか、ほぼ完了したら、引き続く酵素反応のための酵素と試薬が反応媒体に加えられる。２つの酵素反応を単一の容器内で連続して行うことにより、中間体種が単離される過程を通しての総収量が改善される。さらに、過剰溶媒のクリーンアップと処理が減少する。
【０１２７】
本発明の方法に使用できるグリコシルトランスフェラーゼ類としては、限定はしないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ類、フコシルトランスフェラーゼ類、グルコシルトランスフェラーゼ類、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ類、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ類、グルクロノニルトランスフェラーゼ類、シアリルトランスフェラーゼ類、マンノシルトランスフェラーゼ類、グルクロン酸トランスフェラーゼ類およびガラクツロン酸トランスフェラーゼ類が挙げられる。好適なグリコシルトランスフェラーゼ類としては、真核生物ならびに原核生物から得られたものが挙げられる。
【０１２８】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を含む酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼは、任意の出所からクローン化または単離できる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼ類ならびにそれらのポリヌクレオチド配列が知られている。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照されたい。また、グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびアミノ酸配列が推論されるグリコシルトランスフェラーゼ類をコードするヌクレオチド配列も、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬなどの種々の公的に利用できるデータベースにおいて見られる。
【０１２９】
グリコシルトランスフェラーゼ類をコードするＤＮＡは、化学的合成により適切な細胞、または細胞系培養物からのｍＲＮＡの逆転写体をスクリーニングすることにより、適切な細胞からのゲノムライブラリーのスクリーニングにより、またはこれらの操作の組み合わせにより得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ類の遺伝子配列から作製されたオリゴヌクレオチドプローブによって実施できる。プローブは、蛍光基、放射性原子または化学発光基などの検出可能な基により、公知の操作に従って標識化でき、従来のハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼ類の遺伝子配列は、グリコシルトランスフェラーゼ類の遺伝子配列から作製されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作の使用によって得ることができる。Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号、およびＭｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい。
【０１３０】
グリコシルトランスフェラーゼは、このグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含有するベクターによって形質転換した宿主細胞において合成できる。ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築体である。ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ類酵素をコードするＤＮＡを増幅させるため、および／または、グリコシルトランスフェラーゼ類酵素をコードするＤＮＡを発現させるために用いられる。発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ類酵素をコードするＤＮＡ配列が、好適な宿主におけるグリコシルトランスフェラーゼの発現に影響を与える能力のある好適な制御配列に操作可能に結合している複製可能なＤＮＡ構築体である。このような制御配列に対する必要性は、選択された宿主および選択された形質転換法に依って変わる。一般に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写ならびに翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要なことは、通常、複製源により与えられる、宿主において複製する能力と形質転換体の認識を助ける遺伝子選択だけである。
【０１３１】
本発明の組成物の調製における使用に好適なグリコシルトランスフェラーゼ類の例は、本明細書に記載されている。種々の量の各酵素（例えば、１〜１００ｍＵ／ｍｇ蛋白質）を、対象のグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体として可能な部位を有するオリゴ糖が結合している基質（例えば、１〜１０ｍｇ／ｍｌにおいて）と反応させることにより、他の好適なグリコシルトランスフェラーゼ類を容易に確認することができる。所望の部位に糖残基を付加するグリコシルトランスフェラーゼ類の能力を比較する。基質に結合したオリゴ糖の受容体として可能な部位をグリコシル化する能力を、同じ特異性を有する他のグリコシルトランスフェラーゼ類よりも効率的に示すグリコシルトランスフェラーゼ類が本発明の方法における使用に好適である。
【０１３２】
所望の形質転換を達成するために必要とされる具体的な酵素量は、当業者に容易に決定される。しかし、他の実施形態においては、より多量の酵素を使用することが望ましい。例えば、約３０℃から約３７℃の温度が好適である。
【０１３３】
本発明の方法の有効性は、組換え生産されたグリコシルトランスフェラーゼ類の使用によって増大化できる。組換え生産により、大規模の基質修飾に必要とされる大量のグリコシルトランスフェラーゼ類の製造が可能となる。グリコシルトランスフェラーゼ類を溶解性にし、したがって大量のグリコシルトランスフェラーゼ類の製造と精製を促進するグリコシルトランスフェラーゼ類の膜固定ドメインの削除は、グリコシルトランスフェラーゼ類をコードする修飾遺伝子の組換え発現によって達成できる。グリコシルトランスフェラーゼ類の組換え製造に好適な方法の説明については、米国特許第５，０３２，５１９号を参照されたい。
【０１３４】
また、標的基質が、固体支持体上に固定化されるグリコシル化法も本発明により提供される。用語の「固体支持体」は、半固体支持体も含む。グリコシル化反応の完了後、基質が遊離できるように、標的基質は、可逆的に固定化されることが好ましい。好適なマトリクスは当業者に公知である。グリコシル化反応が進行している間、基質を一時的に適切な樹脂に固定化するために、例えば、イオン交換を用いることができる。また、アフィニティーに基づく固定化に関しては、対象の基質に特異的に結合するリガンドも使用できる。対象の基質に結合する抗体は好適である。また、グリコシル化される対象の基質に特異的に結合する色素および他の分子も好適である。
【０１３５】
代表的な一実施形態において、トランス−シアリダーゼを除いて、使用される酵素は全て、グリコシルトランスフェラーゼ類である。他の代表的一実施形態において、１種以上の酵素は、グリコシダーゼである。
【０１３６】
（フコシルトランスフェラーゼ反応）
多くの糖は、生物活性を示すためには、特定のフコシル化構造の存在を必要とする。細胞間認識機構は、フコシル化オリゴ糖を必要とすることが多い。例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンなどの細胞接着分子として働く多くの蛋白質は、特定の細胞表面フコシル化炭水化物構造、例えば、シアリルルイスｘ構造およびシアリルルイスａ構造と結合する。また、ＡＢＯ血液型系を形成する特定の炭水化物構造は、フコシル化される。これら３つの群の各々における炭水化物構造は、Ｆｕｃα１．２Ｇａｌβ１−二糖単位を共有する。Ｏ型血液構造では、この二糖は末端構造である。Ａ型構造は、末端ＧａｌＮＡｃ残基を二糖に付加するα１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼにより形成される。Ｂ型構造は、末端ガラクトース残基を付加するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼにより形成される。ルイス血液型構造もまた、フコシル化される。例えば、ルイスｘ構造およびルイスａ構造は、それぞれＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮａｃおよびＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮａｃである。これらの構造は、双方ともさらにシアリル化（ＮｅｕＡｃα２，３−）されて、対応するシアリル化構造を形成する。興味深い他のルイス血液型構造は、ルイスｙ構造およびルイスｂ構造であり、これらは、それぞれＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲである。ＡＢＯおよびルイスの血液型構造の構造およびそれらの合成に関与する酵素に関しては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉら編集、１６章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在、１９９９年）を参照されたい。
【０１３７】
フコシルトランスフェラーゼ類は、合成経路において、グアノシン−５’−ジホスホフコースから、糖受容体の特定のヒドロキシへ、フコース単位を転移するために用いられてきた。例えば、Ｉｃｈｉｋａｗａは、クローン化フコシルトランスフェラーゼによるシアリル化ラクトサミンのフコシル化を含む方法により、シアリルルイス−Ｘを調製した（Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：ｐ．９２８３−９２９８（１９９２））。Ｌｏｗｅは、細胞における非天然フコシル化活性を発現し、それによってフコシル化糖蛋白質、細胞表面などを製造する方法を記載している（米国特許第５，９５５，３４７号）。
【０１３８】
一実施形態において、フコシルトランスフェラーゼに対する受容体部分を有する基質を、フコース供与体部分、フコシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性に必要とされる他の試薬を含む反応混合物と接触されることにより、本発明の方法が実施される。フコースをフコース供与体部分からフコシルトランスフェラーゼ受容体部分へ転移するために十分な時間と適切な条件下で基質を反応混合物中に温置する。好ましい実施形態において、フコシルトランスフェラーゼは、組成物におけるフコシルトランスフェラーゼに関する受容体部分の少なくとも６０％のフコシル化を触媒する。
【０１３９】
多数のフコシルトランスフェラーゼ類が当業者に公知である。簡潔に述べると、フコシルトランスフェラーゼ類は、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから、受容体糖のヒドロキシル位へ転移させるいずれかの酵素を含む。幾つかの実施形態において、例えば、受容体糖は、オリゴ糖グリコシドにおけるＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃ基の中のＧｌｃＮＡｃである。この反応のために好適なフコシルトランスフェラーゼ類としては、ヒト乳から得られる公知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ類（ＦｕｃＴ−ＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（例えば、Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：ｐ．１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：ｐ．１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：ｐ．２０８６−２０９５（１９８１）を参照）、およびヒト血清に見られるβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ類（ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−Ｖ、ＦｕｃＴ−ＶＩ、およびＦｕｃＴ−ＶＩＩ  Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）が挙げられる。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ類の組換え体もまた利用できる（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：ｐ．４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗａｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：ｐ．１２８８−１３０３（１９９０）を参照）。他の代表的なフコシルトランスフェラーゼ類としては、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍａｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：ｐ．１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号；マンソン住血吸虫のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Ｔｒｏｔｔｅｉｎら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０７：ｐ．２７９−２８７）；およびα１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＸ（ヒトおよびマウスＦｕｃＴ−ＩＸのヌクレオチド配列は、Ｋａｎｅｋｏら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：ｐ．２３７−２４２、およびヒト遺伝子の染色体位置は、Ｋａｎｅｋｏら（１９９９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．８６：ｐ．３２９−３３０）、に記載された方法により実施することができる。受容体として、巻貝のモノアラガイならびにリョクトウのＮ−結合ＧｌｃＮＡｃを用いる、最近報告されたα１，３フコシルトランスフェラーゼ類が、それぞれｖａｎ  Ｔｅｔｅｒｉｎｇｒａ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１：ｐ．３１１−３１４、およびＬｅｉｔｅｒら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：ｐ．２１８３０−２１８３９に記載されている。さらに、Ｒａｓｋｏら、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ．４９８８−９４に記載されているヘリコバクターピロリのα（１，３／４）フコシルトランスフェラーゼ類、ならびにＨ．ピロリ（Ｗａｎｇら、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４５：ｐ．３２４５−５３）のα���，２フコシルトランスフェラーゼ類など、細菌のフコシルトランスフェラーゼ類。また、本発明において有用なフコシルトランスフェラーゼ類の記載に関しては、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：ｐ．３９１−４０８も参照されたい。
【０１４０】
フコース残基のフコシルトランスフェラーゼ触媒付加に関する好適な受容体部分としては、限定はしないが、ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲが挙げられ、ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１個の炭素原子を有するアグリコン基である。Ｒは、基質に結合しているか、または基質の一部である。ある特定の反応にとって適切なフコシルトランスフェラーゼは、所望のフコース結合型（例えば、α２、α３またはα４）、具体的な対象の受容体および所望の高収量フコシル化を達成するためのフコシルトランスフェラーゼの能力に基づいて選択される。好適なフコシルトランスフェラーゼ類およびそれらの特性は上記されている。
【０１４１】
もし、組成物における基質結合オリゴ糖が十分な割合でフコシルトランスフェラーゼ受容体部分を含まないならば、好適な受容体を合成することができる。例えば、フコシルトランスフェラーゼに対する受容体を合成する好ましい方法は、ＧｌｃＮＡｃ残基を、基質結合オリゴ糖上に存在するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ受容体部分に付加するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの使用を含む。好ましい実施形態において、対象の受容体として可能な部分を高い割合でグリコシル化する能力を有するトランスフェラーゼが選択される。次いで生じたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲをフコシルトランスフェラーゼ類に対する受容体として使用できる。
【０１４２】
生じたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ部分は、フコシルトランスフェラーゼ反応前にガラクトシル化でき、例えば、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基またはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基が得られる。幾つかの実施形態において、ガラクトシル化とフコシル化のステップは、同時に実施できる。ガラクトシル化受容体を必要とするフコシルトランスフェラーゼを選択することにより、所望の産物だけが形成される。したがって、この方法は：
（ａ）化合物Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲまたはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを形成するために十分な条件下で、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下、ガラクトシルトランスフェラーゼにより、式ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲの化合物をガラクトシル化する工程；および
（ｂ）Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ１β−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ１β−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−ＯＲ；
Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃ１、α３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ；または
Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１、４）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ、
から選択される化合物を形成するために十分な条件下で、ＧＤＰ−フコースの存在下、フコシルトランスフェラーゼを用いて、（ａ）で形成された化合物をフコシル化する工程、を含む。
【０１４３】
所望の活性を有する追加のフコシルトランスフェラーゼを含めることにより、上記の構造に追加のフコース残基を付加することができる。例えば、上記方法により、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲなどのオリゴ糖決定基を形成することができる。したがって、他の好ましい実施形態において、上記方法は、少なくとも２種のフコシルトランスフェラーゼの使用を含む。複数のフコシルトランスフェラーゼは、同時に、または連続的に用いられる。フコシルトランスフェラーゼ類が、連続的に用いられる場合、複数のフコシル化ステップの間で、糖蛋白質は精製されないことが一般に好ましい。複数のフコシルトランスフェラーゼが同時に用いられる場合、酵素活性は、２つの個々の酵素に由来し得るか、あるいは、１つのフコシルトランスフェラーゼ活性以上の活性を有する単一の酵素に由来し得る。
【０１４４】
（シアリルトランスフェラーゼ類）
アンカードメインが削除されたものなどの組換えシアリルトランスフェラーゼ類ならびに組換えシアリルトランスフェラーゼ類の製造法の例は、例えば、米国特許第５，５４１，０８３号に見られる。少なくとも１５種の哺乳動物シアリルトランスフェラーゼ類が文書化されておち、これらのうち１３種のｃＤＮＡが、現在までにクローン化されている（本明細書に用いられている系統的命名法に関しては、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ−ｘｉｖを参照）。これらのｃＤＮＡを、シアリルトランスフェラーゼ類の組換え製造に使用することができ、次いで本発明の方法に使用できる。
【０１４５】
ある特定の決定基が、α２，６結合シアリン酸を必要とし、シアリルトランスフェラーゼが用いられる場合を除いて、シアリル化は、トランス−シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼのいずれかを用いて達成できる。本発明は、適切な供与体部分の存在下、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼに対する受容体を、適切な酵素と接触させることにより、上記受容体をシアリル化することを含む。シアリルトランスフェラーゼに対しては、ＣＭＰ−シアリン酸が好ましい供与体部分である。しかしながら、トランス−シアリダーゼ類は、トランス−シアリダーゼがシアリン酸を付加できない遊離性基を含む供与体部分を使用することが好ましい。
【０１４６】
対象の受容体部分は、例えば、Ｇａｌβ−ＯＲを含む。幾つかの実施形態において、シアリン酸が受容体部分の非還元性末端に転移されて、化合物ＮｅｕＡＣα２，３Ｇａｌβ−ＯＲまたはＮｅｕＡＣα２，６Ｇａｌβ−ＯＲを形成する条件下、ＣＭＰ−シアリン酸の存在下で受容体部分をシアリルトランスフェラーゼと接触させる。この式において、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１個の炭素原子を有するアグリコン基である。代表的な一実施形態において、Ｇａｌβ−ＯＲは、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒであり、ここで、Ｒは、基質に結合しているか、または基質の一部である。
【０１４７】
代表的な一実施形態において、上記方法は、シアリル化とフコシル化の双方がされている化合物を提供する。大抵のシアリルトランスフェラーゼ類は、フコシル化された受容体に対して活性ではないため、シアリルトランスフェラーゼ反応とフコシルトランスフェラーゼ反応は、一般に連続的に行われる。しかしながら、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリル化された受容体にのみ作用する。したがって、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリルトランスフェラーゼによる同時反応において使用できる。
【０１４８】
シアリル化を達成するために、トランス−シアリダーゼが用いられる場合、フコシル化反応とシアリル化反応は、同時に、またはいずれの順序においても連続的に行うことができる。修飾される基質を、好適な量のトランス−シアリダーゼ、好適なシアリン酸供与体基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３、またはα１，４結合を作製することができる）および好適なフコシル供与体基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）を含有する反応混合物と共に温置する。
【０１４９】
本発明の使用に好適なシアリルトランスフェラーゼ類の例としては、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩ（本明細書に用いられているシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６）に記載されているとおりである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と称される代表的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアリン酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元性末端Ｇａｌへ転移させる。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：ｐ．３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：ｐ．１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．２１０１１（１９９２）を参照されたい。他の代表的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアリン酸を二糖またはグリコシドの非還元性末端Ｇａｌへ転移させる。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：ｐ．４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．２１００４（１９９２）を参照されたい。さらなる代表的酵素としては、Ｇａｌ−βー１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：ｐ．３７５−３８１を参照）。また、本発明の方法に有用な基質に、第２の、または複数のシアリン酸残基を付加するために、α２，８−シアリルトランスフェラーゼも使用できる。さらなる例は、アガラクシア連鎖球菌（ｃｐｓＫ遺伝子として知られているＳＴ）、デュクレー菌（ｌｓｔ遺伝子として知られている）、インフルエンザ菌（ＨＩＯ８７１遺伝子として知られている）のα２，３−シアリルトランスフェラーゼ類である。Ｃｈａｆｆｉｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：ｐ．１０９−１２２（２００２）を参照されたい。
【０１５０】
特許請求された方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、カンピロバクターのＣＳＴ−Ｉである（例えば、米国特許第６，５０３７４４号、米国特許第６，０９６，５２９号、および米国特許第６，２１０９３３号ならびに国際公開第９９／４９０５１号、および公開の米国特許出願第２００２／２，０４２，３６９号を参照）。この酵素は、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃまたはＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃへのシアリン酸の転移を触媒する。
【０１５１】
本発明に用いられる他の代表的シアリルトランスフェラーゼ類としては、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼなど、空腸カンピロバクターから単離されたものが挙げられる。例えば、国際公開第９９／４９０５１号を参照されたい。他の実施形態において、本発明は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の双方を有する二官能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチド類を提供する。二官能性シアリルトランスフェラーゼを好適な糖受容体（例えば、末端ガラクトースを有する糖）およびシアリン酸供与体（例えば、ＣＭＰ−シアリン酸）を有する反応混合物中に入れると、供与体からα２，３結合における受容体へと第１のシアリン酸の転移を触媒できる。次に、上記シアリルトランスフェラーゼは、シアリン酸供与体からα２，８−結合における第１のシアリン酸残基へと、第２のシアリン酸の転移を触媒する。このタイプのＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌ構造は、スフィンゴ糖脂質類にしばしば見られる。例えば、欧州特許出願第１１４７２２００号を参照されたい。
【０１５２】
また、最近報告されたウィルスのα２，３−シアリルトランスフェラーゼも、本発明のシアリル化法に好適に使用される（Ｓｕｊｉｎｏら、（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１０：ｐ．３１３−３２０）。この酵素、ｖ−ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉは、粘液腫ウィルス感染細胞から得られており、各々のアミノ酸配列の比較により示されるように、哺乳動物のＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶに明らかに関連している。ｖ−ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉは、タイプＩ（Ｇａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）、タイプＩＩ（Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−β１−Ｒ）およびタイプＩＩＩ（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）の受容体のシアリル化を触媒する。また、上記酵素は、シアリン酸を、フコシル化された受容体部分へ転移することもできる（例えば、ルイスｘおよびルイスａ）。
【０１５３】
（ガラクトシルトランスフェラーゼ類）
実施形態の他の群において、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。代表的なガラクトシルトランスフェラーゼ類としては、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ類（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：ｐ．２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３４５：ｐ．２２９−２３３（１９９０）を参照）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：ｐ．１４２９０−１４３９７（１９８９））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：ｐ．８２２７−８２３１（１９８９））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：ｐ．１０１−１０５（１９９５）））が挙げられる。他の好適なα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｂ型血液抗原の合成に関与するものである（ＥＣ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：ｐ．１１４６−１１５１）（ヒト）。また、本発明は、α１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いても実施できる。
【０１５４】
例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：ｐ．２１１−２１７（１９８９））、ヒト（Ｍａｓｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：ｐ．６５７−６６３（１９８８））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：ｐ．１６５−１６８（１９８８））などのβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ類、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：ｐ．２３４−２４２（１９９４））もまた、本発明の方法における使用に好適である。他の好適なガラクトシルトランスフェラーゼ類としては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ類が挙げられる（例えば、分裂酵母ｐｏｍｂｅ、Ｃｈａｐｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ５：ｐ．５１９−５２８（１９９４））。他の１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ類は、グロボシド類を製造するために使用されるものである（例えば、Ｓｃｈａｅｐｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９２年、２３６巻、ｐ．２２７−２４４）を参照。哺乳動物と細菌の双方の酵素が用いられる。
【０１５５】
本発明に用いられる他の代表的なガラクトシルトランスフェラーゼ類としては、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ類が挙げられる。好適な反応媒体に入れると、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ類は、供与体（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ）から好適な糖受容体（例えば、末端ＧａｌＮＡｃ残基を有する糖）へのガラクトース残基の転移を触媒する。本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの一例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉなどのカンピロバクターにより産生されるものである。本発明の好ましい当該β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のものである。
【０１５６】
本発明の方法により、ガラクトシルトランスフェラーゼ類を用いて形成された化合物における代表的な結合としては：（１）Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ；（２）Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ；（３）Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ；（４）Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ；（５）Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ；（６）Ｇａｌβ１→６ＧａｌＮＡｃ；（７）Ｇａｌα１→３ＧａｌＮＡｃ；（８）Ｇａｌα１→３Ｇａｌ；（９）Ｇａｌα１→４Ｇａｌ；（１０）Ｇａｌβ１→３Ｇａｌ；（１１）Ｇａｌβ１→４Ｇａｌ；（１２）Ｇａｌβ１→６Ｇａｌ；（１３）Ｇａｌβ１→４キシロース；（１４）Ｇａｌβ１→１’−スフィンゴシン；（１５）Ｇａｌβ１→１’−セラミド；（１６）Ｇａｌβ１→３ジグリセリド；（１７）Ｇａｌβ１→Ｏ−ヒドロキシリジン；および（１８）Ｇａｌ−Ｓ−システインが挙げられる。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号；および米国特許第５，６９１，１８０号を参照されたい。
【０１５７】
（トランス−シアリダーゼ）
上記で検討したように、本発明の方法は、トランス−シアリダーゼを用いて、シアリン酸部分が基質に付加される少なくとも１つのステップを含む。本明細書に用いられる用語の「トランス−シアリダーゼ」とは、α−２，３グリコシド結合を介してシアリン酸のガラクトースへの付加を触媒する酵素を言う。トランス−シアリダーゼ類は、多くのトリパノソーマ種および幾つかの他の寄生虫に見られる。これらの寄生虫生体のトランス−シアリダーゼ類は、通常のシアリダーゼの加水分解活性を保持するが、効率ははるかに低く、ＣＭＰ−シアリン酸の不在下、宿主のシアログリコ共役体から寄生虫の表面糖蛋白質への末端シアリン酸の可逆的転移を触媒する。シャガス病の原因となるトリパノソーマｃｒｕｚｉは、多くのシアリダーゼ類の典型的な加水分解反応の代わりに、末端βーガラクトシル残基を含有する受容体へのα２，３−結合シアリン酸の転移を優先的に触媒する表面トランス−シアリダーゼを有する（Ｒｉｂｅｉｒａｅｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．７：ｐ．１２３７−１２５６（１９９７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：ｐ．３３３−３４２（１９９５）；Ｓｃｕｄｄｅｒら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ．９８８６−９８９１（１９９３）；およびＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．２：ｐ．５４１−５４８（１９９２））。Ｔ．ｃｒｕｚｉトランス−シアリダーゼ（ＴｃＴｓ）は、末端が、βー結合ガラクトース残基である広範囲の糖受容体、糖脂質受容体および糖蛋白質受容体に対して活性を有し、もっぱらα２，３シアロシド結合を合成する（Ｓｃｕｄｄｅｒら、上記）。また、それは低率で、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸などの合成α−シアロシド類からシアリン酸を転移させるが、ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃは、供与体基質ではない。Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（４ＭＵ−ＮＡＮＡ）の修飾２−［４−メチルウンベリフェロン］−α−ケトシドおよびそれの幾つかの誘導体もまた、ＴｃＴｓに対する供与体として働く（Ｌｅｅ  ＆  Ｌｅｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：ｐ．３５８−３６４（１９９４））。３’−シアリル−ラクト−Ｎ−ビオースＩの酵素的合成は、受容体としてのラクト−Ｎ−ビオースＩおよびＮ−アセチルノイラミン部分の供与体としての２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセリノイラミンから、ＴｃＴＳにより触媒される（Ｖｅｔｅｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：ｐ．９４２−９４９（２０００））。α２，３−シアリル化共役体を合成するためのトランス−シアリダーゼの使用に関するさらなる情報は、欧州特許出願第０  ５５７  ５８０  Ａ２号および米国特許第５，４０９，８１７号に見ることができ、その各々は、参照として本明細書に組み込まれている。ヒルＭａｃｒｏｂｄｅｌｌａ  ｄｅｃｏｒａの分子内トランス−シアリダーゼは、シアログリコ共役体における末端Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）α２→３Ｇａｌ結合の開裂に対して、厳密な特異性を示し、分子内トランス−シアロシル反応を触媒する（Ｌｕｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：３２３−３３２（１９９９）。トラ���ス−シアリダーゼ類は、シアリン酸を、主にガラクトース受容体に付加させるが、それらは、シアリン酸を、幾つかの他の糖へ転移させる。しかしながら、ＧａｌＮＡｃへのシアリン酸転移には、シアリルトランスフェラーゼが必要である。トランス−シアリダーゼの使用についてのさらなる情報は、ＰＣＴ出願番号第９３／１８７８７号；およびＶｅｔｅｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：ｐ．１０８３−１０９０（１９９７）に見ることができる。
【０１５８】
（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ類）
また、本発明は、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチド類を利用し得る。β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ類を反応混合物中に入れると、供与体（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）から好適な受容体糖（典型的には、末端ガラクトース残基を有する糖）へのＧａｌＮＡｃ残基の転移を触媒する。生じた構造、ＧａｌＮＡｃβ１，４−Ｇａｌは、多くの糖化合物に見られるが、その中でもスフィンゴ糖脂質類および他のスフィンゴイド類にしばしば見られる。
【０１５９】
本発明において有用なβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの一例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉなどのカンピロバクター種により産生されるものである。当該の好ましいβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のものである。
【０１６０】
本発明に用いられる代表的なＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、以下の結合を形成する：（１）（ＧａｌＮＡｃα１→３）［（Ｆｕｄα１→２）］Ｇａｌβ−；（２）ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｅ；（３）ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ；（４）ＧａｌＮＡｃα１→３Ｇａｌ；（５）ＧａｌＮＡｃα１→３ＧａｌＮＡｃ；（６）（ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＵＡβ１→３）ｎ；（７）（ＧａｌＮＡｃβ１→４ＩｄＵＡα１→３−）ｎ；（８）−Ｍａｎβ→ＧａｌＮＡｃαＧｌｃＮＡＣαＡｓｎ。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号および米国特許第５，６９１、１８０号を参照されたい。
【０１６１】
（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ類）
本発明は、任意にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ類を利用する。本発明の実施に有用な代表的Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ類は、以下の結合を形成できる：（１）ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ；（２）ＧｌｃＮＡｃβ１→Ａｓｎ；（３）ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ；（４）ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｍａｎ；（５）ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌ；（６）ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｍａｎ；（７）ＧｌｃＮＡｃα１→３Ｍａｎ；（８）ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌ；（９）ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｇａｌ；（１０）ＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｇａｌ；（１１）ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ；（１２）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＧｌｃＮＡｃ；（１３）ＧｌｃＮＡｃβ１→６ＧａｌＮＡｃ；（１４）ＧｌｃＮＡｃβ１→３ＧａｌＮＡｃ；（１５）ＧｌｃＮＡｃβ→４ＧｌｃＵＡ；（１６）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＧｌｃＵＡ；（１７）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＩｄＵＡ。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号および米国特許第５，６９１、１８０号を参照されたい。
【０１６２】
（他のグリコシルトランスフェラーゼ類）
フコシリルトランスフェラーゼ類およびシアリルトランスフェラーゼ類に関して詳細に記載したものと同様のトランスフェラーゼサイクルに、他のグリコシルトランスフェラーゼ類を代用することができる。特に、グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ類、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ９１：ｐ．５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：ｐ．７１（１９９４））、例えば、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ類（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：ｐ．１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ．１２６０９（１９９３））などのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ類でもあり得る。好適なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ類としては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：ｐ．６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：ｐ．６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ．１５３８１（１９９３））、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：ｐ．９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：ｐ．９８５（１９９２）、およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。好適なマンノシルトランスフェラーゼ類としては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。
【０１６３】
（複数酵素によるオリゴ糖合成）
上記で検討したように、幾つかの実施形態において、所望のオリゴ糖部分を形成するために、２種以上の酵素が用いられる。例えば、ある特定のオリゴ糖部分は、所望の活性を示すために、ガラクトース、シアリン酸、およびフコースの付加を必要とし得る。したがって、本発明は、所望のオリゴ糖決定基の高収量合成を達成するために２種以上の酵素、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ類、トランス−シアリダーゼ類、またはスルホトランスフェラーゼ類が用いられる方法を提供する。
【０１６４】
幾つかの場合、基質結合オリゴ糖は、基質のインビボ生合成の際に、対象の特定グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体部分を含む。このような基質は、基質のグリコシル化パターンの事前の修飾をせずに、本発明の方法を用いてグリコシル化できる。しかしながら、他の場合、対象の基質は、好適な受容体部分を欠いている。そのような場合は、基質のグリコシル化パターンを変化させ、その結果、基質結合オリゴ糖が、対象の予め選択された糖単位のグリコシルトランスフェラーゼ触媒付加のための受容体部分を含み、所望のオリゴ糖決定基を形成するように本発明の方法を用いることができる。
【０１６５】
代表的な一実施形態においては、前述の節で検討した複数酵素の方法論により、ＧａｌＮＡｃ、グルコース、ガラクトース、フコースおよびシアリン酸を含む糖の形成に至る。
【０１６６】
これらの方法において、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ（α２，３結合シアリン酸に対してのみ）のいずれかを用いることができる。トランス−シアリダーゼ反応は、修飾すべき蛋白質を、好適な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、好適なガラクトシル供与体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、トランス−シアリダーゼ、好適なシアリン酸供与体基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を作製できる）、好適なフコシル供与体基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）および二価の金属イオンを含有する反応混合物と共に温置することを含む。これらの反応は、連続的に、または同時に実施できる。
【０１６７】
シアリルトランスフェラーゼが用いられる場合、代表的一実施形態において、上記方法は、修飾すべき蛋白質を、好適な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、好適なガラクトシル供与体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、シアリルトランスフェラーゼ（α２，３またはα２，６）および好適なシアリン酸供与体基質（例えば、ＣＭＰシアリン酸）を含有する反応混合物と共に温置することを含む。上記反応を、実質的に完了するまで進行させてから、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を作製できる）および好適なフコシル供与体基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）を加える。シアリル化基質を必要とするフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦｕｃＴ  ＶＩＩＩ）が用いられる場合、上記反応は同時に実施できる。
【０１６８】
（グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物）
グリコシルトランスフェラーゼ類、基質および他の上記反応混合成分を水性反応媒体（溶液）中に混合することにより合わせる。上記媒体は、一般に約５から約９のｐＨ値を有する。媒体の選択は、所望のレベルのｐＨ値を維持するその媒体の能力に基づく。したがって、幾つかの実施形態において、媒体は、約７．５のｐＨ値へ緩衝化される。緩衝剤が用いられる場合、媒体のｐＨは、用いられる具体的なグリコシルトランスフェラーゼに依存して、約５〜８．５に維持する必要がある。フコシルトランスフェラーゼに関しては、ｐＨの範囲を、約７．２から７．８に維持することが好ましい。シアリルトランスフェラーゼに関しては、上記範囲は、約５．５から６．５が好ましい。好適な塩基は、ＮａＯＨ、好ましくは、６ＭＮａＯＨである。
【０１６９】
酵素量または濃度は、開始触媒率の目安である活性単位で表される。１活性単位は、所与の温度（具体的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）における１分当たり１μｍｏｌの産物形成を触媒する。したがって、ある酵素の１０単位は、３７℃の温度、７．５のｐＨ値において１分当たり１０μｍｏｌの基質が、１０μｍｏｌの産物に変換される、その酵素の触媒量である。
【０１７０】
また、上記反応媒体は、必要ならば、界面活性剤（例えば、トリトンまたはＳＤＳ）および有機溶媒、例えば、メタノールまたはエタノールを可溶化することを含み得る。上記酵素類は、溶液中遊離で利用できるか、またはポリマーなどの支持体に結合できる。したがって、反応中に幾らかの沈殿は形成し得るが、上記反応混合物は、最初は実質的に均一である。
【０１７１】
上記の過程が実施される温度は、かろうじて凍結より上の温度から、多くの感受性酵素が変性する温度までの範囲であり得る。その温度範囲は、好ましくは、約０℃から約４５℃であり、より好ましくは、約２０℃から約３７℃である。
【０１７２】
このように形成された反応混合物は、グリコシル化される基質に付加したオリゴ糖基上に存在する所望の高収量の所望のオリゴ糖決定基を得る上で、十分な時間が維持される。大規模調製では、反応は、約８〜２４０時間、より典型的には約１２時間と７２時間との間で進行させる。
【０１７３】
実質的に均一な基質を有する基質組成物を得るために、１種以上のグリコシルトランスフェラーゼが用いられる実施形態においては、第１のグリコシルトランスフェラーゼ反応がほぼ完了したら、第２のグリコシルトランスフェラーゼ反応のための酵素類および試薬類を反応媒体に加えることができる。酵素の幾つかの組合せでは。グリコシルトランスフェラーゼ類および対応する基質は、最初の単一反応混合物中に合わせることができ。このような同時反応における酵素類は、他の酵素に対する受容体として働き得ない産物は形成しないことが好ましい。例えば、多くのシアリルトランスフェラーゼ類は、フコシル化受容体をシアリル化しないため、シアリル化受容体にのみ作用するフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦｃＴ  ＶＩＩ）が用いられない限り、双方の酵素による同時反応は、所望の高収量の所望のオリゴ糖決定基を生じない可能性が大きい。２つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を、単一の容器内で連続して行うことにより、中間体種が単離される操作で総収量が改善される。さらに、余分な溶媒および副産物のクリーンアップと処理が減少する。
【０１７４】
１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実施できる。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および説明は記載されている。多数のグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルおよびフコシルトランスフェラーゼサイクル）が、米国特許第５，３７４，５４１号および国際公開第９４２５６１５号に記載されている。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：ｐ．９２８３（１９９２）、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：ｐ．４３４３（１９９２）、ＤｅＬｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：ｐ．５８６９−５８７０（１９９５）、Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｙａｌｔａｍｉ編集（ＡＴＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３）に記載されている。
【０１７５】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関しては、上記工程に用いられる種々の反応体の濃度または量は、温度やｐＨ値などの反応条件ならびに、グリコシル化される受容体糖の選択および量などの多数の因子に依存する。グリコシル化工程は、触媒量の酵素の存在下、活性化するヌクレオチド、活性化された供与体糖および生成したＰＰｉのスカベンジングの再生を可能にするため、この工程は、先に検討した化学量論的基質の濃度または量により制限される。本発明の方法に従って使用できる反応体の濃度に関する上限は、反応体の溶解度によって決まる。
【０１７６】
受容体が消費されるまで、グリコシル化が進行するように、活性化するヌクレオチド類、ホスフェート供与体、供与体糖および酵素が選択されることが好ましい。下記で検討される考察は、シアリルトランスフェラーゼの文脈においてであるが、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに適用可能である。
【０１７７】
各々の酵素は、触媒量で存在する。具体的な酵素の触媒量は、その酵素の基質濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度と反応条件下で、所与の酵素に関して触媒量を決定する手段は、当業者に周知である。
【０１７８】
他の代表的実施形態において、反応混合物は、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、供与体基質、受容体糖および二価の金属イオンを含有する。反応媒体における二価の金属イオンの濃度は、約２ｍＭと約７５ｍＭとの間、好ましくは、約５ｍＭと約５０ｍＭとの間、より好ましくは、約５ｍＭと約３０ｍＭとの間に維持される。
【０１７９】
反応媒体における金属イオン濃度を定期的にモニタリングし、追加量の二価金属イオンを媒体に補足することにより、反応サイクルを好適な時間枠内で完了させることができる。また、１種以上のグリコシルトランスフェラーゼが用いられる場合、中間体産物を単離することなく連続的サイクルを同一の反応容器内で実施することができる。さらに、阻害的なピロホスフェートを除去することにより、反応サイクルは、実質的により高い基質（受容体）濃度で実施できる。本発明の使用に好ましい二価金属イオンとしては、Ｍｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋、およびそれらの組合せが挙げられる。二価金属イオンは、Ｍｎ＋＋であることがより好ましい。
【０１８０】
他の実施形態において、糖部分は、活性糖を用いて調製される。本発明に有用な活性糖は、典型的には活性遊離基を含むように合成的に変化させたグリコシド類である。本明細書に用いられる用語の「活性遊離基」とは、酵素調節求核性置換反応において、容易に置換される部分を言う。多くの活性糖が当該分野に知られている。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏら、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ、２巻、Ｅｒｎｓｔら編集、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ：独国Ｗｅｉｎｈｅｉｍ所在、２０００年；Ｋｏｄａｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：ｐ．６４１９（１９９３）；Ｌｏｕｇｈｅｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：ｐ．３７７１７（１９９９）を参照されたい。
【０１８１】
活性基の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどが挙げられる。本発明に用いられる好ましい活性遊離基は、受容体へのグリコシドの酵素的転移を、立体的に有意に妨げないものである。したがって、活性グリコシド誘導体の好ましい実施形態としては、グリコシルフルオリド類およびグリコシルメシレート類が挙げられ、グリコシルフルオリド類が特に好ましい。グリコシルフルオリド類の中でも、α−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グルコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアリルフルオリド、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グルコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリドが最も好ましい。
【０１８２】
例えば、グリコシルフルオリド類は、遊離糖から、先ず糖をアセチル化し、次にこれを、ＨＦ／ピリジンで処理することにより調製できる。これにより保護（アセチル化）グリコシルフルオリド（すなわち、α−グリコシルフルオリド）の熱力学的に最も安定なアノマーが生成する。より安定性の低いアノマー（すなわち、β−グリコシルフルオリド）が望まれる場合は、過アセチル化糖を、ＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣＩによって変換して、アノマーのブロミドまたはクロリドを生成させることによって調製できる。この中間体は、銀フルオリドなどのフルオリド塩と反応してグリコシルフルオリドを生成する。アセチル化グリコシルフルオリドは、メタノール中、緩和な（触媒的）塩基（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応により脱保護できる。なお、多くのグリコシルフルオリド類は、商品として入手できる。
【０１８３】
他の活性グリコシル誘導体は、当業者に公知の従来の方法を用いて調製できる。例えば、グリコシルメシレート類は、糖の完全ベンジル化ヘミアセタール体を、メシルクロリドで処理し、続いて触媒的水素化を行って、ベンジル基を除去することによって調製できる。
【０１８４】
好ましい実施形態において、上記方法は、グリコシル化、例えば、糖の適切なグリコシル受容体部分の約８０％超のシアリル化をもたらす。一般に、約８０％超のグリコシル化を得るために要する時間は、約４８時間未満か。またはそれに等しい。
【０１８５】
（スキーム１）
【０１８６】
【化２１】
2006519878.tif 000013
スキーム１において、化学的または酵素的に調製されたセラミド骨格を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアリン酸誘導体と接触させる。生じたシアリル化付加体を、ＧＭ２シンテターゼおよびＧａｌＮＡｃ供与体を接触させる。生じた産物をＧＭ１シンテターゼと接触させて、所望のグリコシルスフィンゴシンを得る。
【０１８７】
（スキーム２）
【０１８８】
【化２２】
2006519878.tif 000014
スキーム２において、セラミドはオゾン化されて、スフィンゴシンのアルキル鎖を不飽和の箇所で開裂し、アルデヒドの形成が生じる。このアルデヒドは、アルデヒドを所望のアルケンに変換するＷｉｔｔｉｇ反応の基質である。
【０１８９】
（スキーム３）
【０１９０】
【化２３】
2006519878.tif 000015
スキーム３は、Ｗｉｔｔｉｇ条件下で、本発明の化合物を形成する他の例を提供している。スフィンゴ糖脂質のアルケン位の立体配置は、シス異性体をＡＩＢＮで処理し、混合物を照射することにより、シス異性体とトランス異性体との間で変換できる。
【０１９１】
（スキーム４）
【０１９２】
【化２４】
2006519878.tif 000016
スキーム４は、スフィンゴ糖脂質の調製法を示している。グリコシル化セラミドアルデヒドは、Ｍｏ＝ＣＨ２の作用により、対応するメチレン誘導体へと変換される。生じるメチレン付加体を、Ｇｒｕｂｂ触媒およびアルケンに接触させる。生じるオレフィンメタセシス反応により、所望のスフィンゴ糖脂質が生成する。
【０１９３】
（スキーム５）
【０１９４】
【化２５】
2006519878.tif 000017
スキーム５は、本発明のスフィンゴ糖脂質への他の代表的経路を提供している。グリコシル化チオフェニルセラミドは、Ｂｕ３ＳｎＨおよびＡＩＢＮによる反応でスタナン誘導体へと変換される。アルキル基、Ｒ７をグリコシル化セラミド骨格へ結合させるためにパラジウム結合化学が用いられる。
【０１９５】
（スキーム６）
【０１９６】
【化２６】
2006519878.tif 000018
スキーム６において、アルデヒドは、フェニルホウ酸の作用により、対応するベンジルアルケン誘導体へと変換される。塩基の第二位のヒドロキシル部分は、ジオクチルアミノ部分へと変換される。
【０１９７】
（スキーム７）
【０１９８】
【化２７】
2006519878.tif 000019
スキーム７により、アルデヒドは、対応するビニルハライドへと変換される。このハライドは、適切な第一スズ化合物またはホウ酸により置換されて所望の化合物を提供する。
【０１９９】
受容体がセラミドの場合、酵素的ステップは、セラミドの脂肪酸部分の加水分解によって任意に進行する。スフィンゴ糖脂質の脂肪酸部分を除去する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら（１９８５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１３７：ｐ．３９−６２；Ｂｅｉｔｈ−Ｈａｌａｈｍｉら（１９６７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．５：ｐ．２５−３０；ＡｌａｉｓおよびＶｅｙｒｉｅｒｉｅｓ（１９９０）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２０７：ｐ．１１−３１；ＧｒｕｄｌｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ（１９８５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１３５：ｐ．２０３−２１８；Ｐｏｎｐｉｐｏｍら、（１９７８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．ｐ．１７１７−１７２０；Ｍｕｒａｓｅら（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１８８：ｐ．７１−８０；Ｋａｍｅｙａｍａら（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９３：ｃ１−ｃ５；Ｈａｓｅｇａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｃａｒｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：４３９−４５９；ＳｃｈｗａｒｚｍａｎｎおよびＳａｎｄｈｏｆｆ（９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：ｐ．３１９−３４１；ＧｕａｄｉｎｏおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：ｐ．１１４９−１１５０（参照として、本明細書に組み込まれている補足物質を含む）などの標準的な炭水化物およびスフィンゴ糖脂質の化学方法論を用いることができる。例えば、脂肪酸部分は、塩基の加水分解によって除去できる。グリコシル化反応が完了したら、このグリコシル化反応の産物に、同一の、または異なった脂肪酸を付加することができる。脂肪酸を結合させる方法は、当該分野で一般に知られており、例は、本明細書の上記に検討されている。
【０２００】
（精製）
上記の方法により、製造した産物は、精製せずに用いることができる。しかし、幾つかの適用においては、上記化合物を精製することが望ましい。基質を精製するための照準的な周知の方法が一般に好適である。例えば、薄層または厚層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または膜ろ過を使用できる。また、好ましくは、逆浸透膜を利用する膜ろ過または１つ以上のカラムクロマトグラフィ法が利用できる。  例えば、グリコシルトランスフェラーゼなどの蛋白質を除去するために、膜が、約３０００から約１０，０００の分子量限界を有する膜ろ過を使用できる。次いで、塩および／または生成した糖を除去するために、ナノろ過または逆浸透を使用できる（例えば、国際公開第９８／１５５８１号を参照）。ナノフィルタ膜は、一価の塩は通すが、多価の塩および使用される膜に依って、約１００ダルトンから約２，０００ダルトン超の大きさの非荷電溶質を保持する逆浸透膜の１クラスである。したがって、典型的な適用において、本発明の方法により調製された糖は、上記膜に保持され、混入塩類は通過する。
【０２０１】
他の代表的精製法では、有機溶媒と関連させて膜を利用する。糖脂質とスフィンゴ糖脂質類の双方が、この方法によって精製できる。さらに、本明細書に記載されている中間体酵素反応産物のいずれもが、この方法によって精製できる。上記方法は、膜精製システムにおける反応産物を、有機溶媒の添加によって濃縮することを含む。好適な溶媒としては、限定はしないが、アルコール類（例えば、メタノール）、ハロカーボン類（例えば、クロロホルム）および炭化水素とアルコール類との混合物（例えば、キシレン／メタノール）が挙げられる。好ましい実施形態において、上記溶媒はメタノールである。濃縮ステップでは、反応産物を任意の選択された程度まで濃縮できる。一般に、濃縮の程度は、約１倍から約１００倍であり、約５倍から約５０倍を含み、また、約１０倍から約２０倍を含む。上記膜精製システムは、当業者に公知の種々のこのようなシステムから選択される。例えば、１つの有用な膜精製システムは、１０Ｋ中空繊維である。代表的な一実施形態において、上記方法は、１０Ｋ中空繊維膜精製システムを用いて、反応混合物を約１０倍濃縮し、水を加えて上記溶液を、元の容量の約１０分の１にダイアフィルトレーションし、上記濃縮水にメタノールを加え、ダイアフィルトレーションして透過水中に反応産物を通過させる工程を包含する。透過水溶液を濃縮して反応産物を得る。
【０２０２】
（検出可能標識）
代表的一実施形態において、本発明の化合物は、蛍光体または放射性同位体などの検出可能標識を含む。例えば、標識化されたグリコシル部分が、本明細書で検討した適切なグリコシルトランスフェラーゼに対する基質として働くことを依然として可能にさせる様式で、検出可能標識を、リンカーアームによってグリコシル部分（例えば、シアリン酸）に付加することができる。
【０２０３】
標識が利用される本発明の実施形態は、蛍光標識の使用によって例示される。蛍光標識は、それらの取り扱いに要する注意が少ないという利点を有し、高スループット視覚化法（コンピュータを含む統合システムにおける解析用画像デジタル化を含む光学分析）に受入れことができる。好ましい標識は、高感度、高安定性、低バックグランド、長い寿命、低い環境鋭敏性および標識における高特異性を典型的に特徴とする。
【０２０４】
多数の蛍光標識を、本発明の組成物に組み込むことができる。多数のこのような標識は、例えば、ＳＩＧＭＡ化学会社（ミズーリ州セントルイス所在）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン所在）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス所在）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニュージャージ州ピスカタウェイ所在）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州パロアルト所在）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ社、Ａｌｄｒｉｃｈ化学会社（ウィスコンシン州ミルウォーキー所在）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＩ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（メリーランド州ガイセルスバーグ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、スイス国Ｂｕｃｈｓ所在）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）ならびに当業者に公知の他の多数の商品供給源から商品として入手できる。さらに、当業者は、特定の適用に対して、適切な蛍光体の選択の仕方を認識するであろうし、また、それが商品として容易に入手できない場合は、新規に必要な蛍光体を合成できるか、または商品として入手できる蛍光化合物を合成的に修飾して、所望の蛍光標識にすることができる。
【０２０５】
（薬学的製剤）
さらに他の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと混合した本発明による方法によって製造された化合物を含む薬学的製剤を提供する。
【０２０６】
次に、上記の所望のオリゴ糖決定基を有する基質が、種々の適用、例えば、抗原、診断用試薬として、また治療薬として使用できる。このように、本発明はまた、種々の病態に使用できる薬学的組成物を提供する。上記薬学的組成物は、上記の方法に従って作製された基質から構成される。
【０２０７】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に好適である。本発明における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ出版社、ペンシルバニア州フィラデルフィア所在、第１７版（１９８５）に見られる。薬物送達法の簡単なレビューには、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：ｐ．１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。
【０２０８】
上記薬学的組成物は、予防的／または治療的処置のために、非経口投与、鼻腔内投与、局所投与、経口投与、またはエアロゾルまたは経皮による局部投与が意図されている。一般に上記薬学的組成物は、非経口的に、例えば静脈内に投与される。非経口投与用製剤としては滅菌水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル類がある。水性キャリアとしては、生理食塩水および緩衝剤を含む水、アルコール性／水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンガー液または不揮発性油が挙げられ、静脈内媒体としては、体液補液および栄養補液、電解質補液（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガス類などの防腐剤や他の添加物もまた存在し得る。上記組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤などの薬学的に受容可能な補助物質を含有し得る。
【０２０９】
また、上記組成物は、免疫原性種、例えば、本発明の方法により調製されたＫＬＨに共役しているアグリコ脂質も含有し得る。さらに、本発明の方法により調製された組成物およびそれらの免疫原性共役体を、アジュバントと組み合わせることができる。
【０２１０】
これらの組成物は、従来の滅菌法により滅菌できるか、または滅菌ろ過できる。生じる水性溶液は、それ自体で使用するために包装できるか、または凍結乾燥でき、凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水性キャリアと組合わされる。上記製剤のｐＨは、典型的には３と１１との間であり、より好ましくは、５から９であり、最も好ましくは、７から８である。
【０２１１】
上記化合物を含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与できる。治療適用において、組成物は、上記の疾病に既に罹っている患者に、その疾病およびその合併症の症状を治療する、または少なくとも部分的に阻止する上で十分な量において投与される。このことを達成する上で十分な量は、「治療的有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、疾病の重症度ならびに患者の体重および全身状態に依存するが、一般に７０ｋｇの患者に対して、１日当たり、基質の約０．５ｍｇから約２．０００ｍｇの範囲であり、１日当たり、上記化合物の約５ｍｇから約２００ｍｇの投与量が一般に使用される。
【０２１２】
予防的適用において、本発明の基質を含有する組成物は、特定の疾病に感染し易いか、さもなければ、その危険にある患者に投与される。このような量は、「予防的有効用量」であると定義される。この使用において、正確な量はやはり、患者の健康状態と体重に依存するが、一般的には７０キログラムの患者に対して約０．５ｍｇから約２．０００ｍｇの範囲であり、より一般的には、７０キログラムの体重当たり約５ｍｇから約２００ｍｇの範囲である。
【０２１３】
組成物の単回投与または複数回投与が、治療医師により選択される用量レベルと様式で実施できる。いずれの場合においても、上記薬学製剤は、有効に患者を治療する上で十分な本発明の基質量を提供する必要がある。
【０２１４】
上記基質は、診断用試薬としても使用できる。例えば、所望のオリゴ糖決定基と対応するリガンドとの間の相互作用により、体内で基質が濃縮される位置を決定するために、標識化基質が使用できる。この使用のために、上記化合物を適切な放射性同位体、例えば、１２５Ｉ、１４Ｃまたはトリチウムにより、または当業者に公知の他の標識により標識化できる。
【０２１５】
本発明のスフィンゴ糖脂質類の投与に関する用量範囲は、免疫応答の症状がある程度の抑制を示す、所望の効果を生じる上で十分に大きいものである。上記用量は、有害な副作用を生じるほど大きな用量であってはならない。一般に、上記用量は、動物における年齢、病態、性別および疾病の程度によって変わり、当業者によって決定することができる。上記用量が、何らかの表示外の場合、個々の医師により調製できる。
【０２１６】
作用持続時間を制御するために、追加の薬学的方法を使用し得る。制御放出製剤は、スフィンゴ糖脂質を共役、複合化または吸着するポリマーの使用により得ることができる。送達制御は、適切な高分子類（例えば、ポリエステル類、ポリアミノカルボキシメチルセルロースおよび硫酸プロタミン）の選択および高分子類の濃縮、ならびに放出を制御するための組み込み法により実施できる。放出制御製剤によって作用時間を制御するための他の可能な方法は、スフィンゴ糖脂質をポリエステル類、ポリアミノ酸、ヒドロゲル類、ポリ（乳酸）コポリマー類またはエチレン酢酸ビニルコポリマー類などのポリマー材料の粒子に組み込むことである。
【０２１７】
スフィンゴ糖脂質が、血漿蛋白質と結合することを防ぐために、例えば、コアセルベーション法、または界面重合化により、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ（メチメタクリレート）ミクロカプセルによって調製されたミクロカプセルにおいて、またはコロイド薬物送達システム、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロ乳濁液、ナノ粒子およびナノカプセルまたはマクロ乳濁液において捕捉されることが好ましい。このような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ａ．Ｏｓｌｏ編集、Ｍａｃｋ、ペンシルバニア州イーストン所在、（１９８０）に開示されている。
【０２１８】
本発明のスフィンゴ糖脂質は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェアまたはビーズの形態の合成または天然ポリマーなどの標的化可能な薬物送達システム、また、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび再密封赤血球などの脂質ベースシステムにおける使用に十分適合化されている。これらのシステムは、まとめてコロイド薬物送達システムとして知られている。典型的に、このような分散したスフィンゴ糖脂質を含有するコロイド粒子の直径は、約５０ｍｍ〜２μｍである。このコロイド粒子のサイズにより、これらは、注射などによる静脈内に、またはエアロゾルとして投与されることが可能となる。コロイドシステムの調製に用いられる材料は、典型的にフィルタ滅菌、非毒性および生体分解性の、例えばアルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、リン脂質および大豆油により滅菌可能である。高分子コロイドシステムは、ミクロカプセル化のコアセルベーションと同様の方法により調製される。
【０２１９】
代表的な一実施形態において、スフィンゴ糖脂質類は、標準的送達システムとして用いられるリポソームの成分である。リン脂質類を水性媒体に静かに分散させると、それらは膨張し、水和し、脂質二重層を分離させる水性媒体の層を有する多層同心性二層ベシクルを自発的に形成する。このようなシステムは、通常、多層リポソーム類または多層ベシクル類（ＭＬＶ類）と称され、約１００ｎｍから約４μｍの範囲の直径を有する。ＭＬＶ類を音波処理すると、直径が約２０ｎｍから約５０ｎｍの範囲のＳＵＶのコア内に水性溶液を含有する小型の単層ベシクル類（ＳＵＶＳ）が形成される。
【０２２０】
リポソーム製造に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物が挙げられる。脂質部分が、１４個〜１８個の炭素原子、特に１６個から１８個の炭素原子を含有し、飽和されているジアシル化ホスファチジルグリセロールが特に有用である。リン脂質の例としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０２２１】
本発明のスフィンゴ糖脂質類を含有するリポソーム類の調製においては、スフィンゴ糖脂質カプセル化効率、スフィンゴ糖脂質の不安定性、生じるリポソーム集団の均一性とサイズ、スフィンゴ糖脂質対脂質比、製剤の透過性不安定性および製剤の薬学的受容性などの変数を考慮する必要がある。Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉねえりんｇ、９：ｐ．４６７（１９８０）；Ｄｅａｍｅｒら、ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク所在、１９８３年、２７：Ｈｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、４０：ｐ．８９（１９８６））。
【０２２２】
本発明のスフィンゴ糖脂質を含有する標的化送達システムは、宿主、特に哺乳動物宿主に対し、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、血管内、局所、空洞内、経皮、鼻腔内および吸収などの種々の方法で投与できる。スフィンゴ糖脂質類の濃度は、具体的な適用、疾病の性質、投与回数などに依って変化する。標的化送達システム−カプセル化スフィンゴ糖脂質は、適切な水性の生理学的に許容できる媒体、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などとしての他の化合物を含む製剤において提供できる。
【０２２３】
本発明の方法により製造された化合物は、本発明の化合物に特異的に反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に対する免疫原としても使用できる。種々の免疫グロブリン分子の製造および操作に関して、当業者に利用できる多数の方法が本発明に使用できる。抗体は、当業者に周知の種々の手段によって製造できる。
【０２２４】
非ヒト、例えば、マウス、ウサギ、ウマなどのモノクローナル抗体の製造は、周知であり、例えば、本発明の基質を含有する製剤によって、動物を免疫化することにより達成できる。免疫化動物から得られた抗体産生細胞は不死化されて、スクリーニングされるか、または所望の抗体産生に関して、先ずスクリーニングされてから不死化される。モノクローナル抗体産生の一般的操作手順の検討に関しては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ出版、ニューヨーク（１９８８）を参照されたい。
【０２２５】
治療を必要とする被験体（動物またはヒト）、好ましくは、哺乳動物は、治療的有効量、すなわち、単独で、または薬学的組成物の一部として、本発明の化合物の最適な有効性を提供する用量を投与され得る。当業者に認識されると思われるが、「治療的有効量」および投与様式は、被験体ごとに変わり、したがって、ケースバイケースに基づいて決定されることになる。考慮すべき因子としては、限定はしないが、治療を受ける被験体（例えば、哺乳動物）、その性別、体重、食事、併用薬、全体的な臨床病態、使用される具体的化合物およびこれらの化合物が使用される特定の使用法が挙げられる。治療的有効量または投与量は、インビトロ法またはインビボ法のいずれかによって決定できる。一般に、ある化合物または組成物の「治療的有効量」は、神経細胞の障害予防、治療または治癒をもたらす量である。例えば、パーキンソン病の予防、治療または治癒における本発明の化合物または組成物の治療的有効量は、その疾病の進行の速度比および／または運動技能の発達をもたらす量である。アルツハイマー病の予防、治療または治癒における本発明の化合物または組成物の治療的有効量は、例えば、被験体の記憶の改善をもたらす量である。エシェミア／発作の持続的作用の予防、治療または治癒における本発明の化合物または組成物の治療的有効量は、例えば、神経系機能（例えば、発話、運動など）の欠損減少および／または交感神経または副交感神経経路の改善をもたらす量である。
【０２２６】
投与様式としては、限定はしないが、経口、注射、静脈内（ボーラスおよび／または点滴）、皮下、筋肉内。経結腸、経直腸、鼻腔内および腹腔内投与など、当業者に公知のものが挙げられる。本発明の化合物は、単独で、または薬学的組成物の一部として、経口摂取されることが好ましい。
【０２２７】
皮下針による注射では、上記用量は体液内へ送達されることが想定できる。他の投与経路に関しては、本発明の各化合物についての吸収効率が、薬理学において周知の方法により個々に決定できる。したがって、当業者には理解されると思われるが、最適な治療効果を得るためには、治療者が必要に応じて、用量の力価決定をし、投与経路を修正することが必要であると考えられる。有効用量レベル、すなわち、所望の結果を達成するために必要な用量レベルの決定は、当業者の能力範囲内にある。典型的には、本発明の化合物は、低用量レベルで投与され、所望の効果が得られるまで用量レベルが増加される。
【０２２８】
典型的な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より一層好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約３ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。有利なことに、本発明の化合物は、単独で、または薬学的組成物の一部として、１日数回投与でき、また、他の用法用量もまた有用であり得る。本発明の化合物は、単回投与または複数回投与（例えば、１日２回から４回の分割投与）および／または連続的輸液における用法で投与できる。
【０２２９】
投与に関して、本発明の化合物は、単独で、または薬学的組成物の一部として、投与前に滅菌できる。滅菌は、０．２ミクロン膜などの滅菌膜を通したろ過により、または他の従来の方法により容易に達成できる。本発明の化合物は、単独で、または薬学的組成物の一部として、典型的には、凍結乾燥形態で、または水性溶液で、または水性溶液として保存できる。一定の投与様式において、ｐＨは一因子であり得る。そのような場合、ｐＨは、典型的には約２〜１０の間の範囲、好ましくは約５〜８の間の範囲、より好ましくは６．５〜７．５の範囲、すなわち生理的ｐＨである。
【０２３０】
（方法）
（処置および神経保護）
他の実施形態において、本発明は、神経系障害の予防または処置を必要とする動物またはヒトに、本発明の化合物の治療的有効量を投与する工程を包含する、動物またはヒトにおける神経系障害の予防または処置のための方法を提供する。本発明の化合物は、任意の数の神経系障害を治療するために用いられる。代表的な神経系障害は、パーキンソン病、虚血、脳卒中、アルツハイマー病、うつ病、不安、脳炎、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、外傷、脊髄損傷、神経損傷および神経再生よりなる群から選択される。他の代表的な実施形態において、上記障害は、神経膠腫などの増殖障害である。
【０２３１】
本発明の化合物は、神経保護的である（例えば、ニューロンおよびグリアを保護する）。用語の「神経保護」は、神経細胞の損傷から生じる徴候のいずれかの予防（発症前）、治療（発症）および／または治癒（発症後）に関する。このような徴候としては、パーキンソン病、虚血、低酸素症、脳卒中、てんかん、代謝機能障害、老化、毒性疾患、アルツハイマー病、中枢神経系障害（例えば、脊髄損傷）、多発性硬化症、ハンチントン病、ＣＡＢＧ、うつ病、不安、脳炎、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、外傷、脊髄損傷、神経損傷、ニューロパシーおよび神経再生が挙げられる。
【０２３２】
また、本発明の化合物は、神経形成性（例えば、ニューロンの分化ならびに幹細胞および始原細胞の増殖または分化を促進する）および／または神経突起生成性（例えば、神経突起の成長およびシナプス形成を促進する）であり、したがって、種々多様な神経疾患と病態の治療に有用であると考えられる。例えば、神経突起生成性化合物は、例えば、末梢ニューロパシーおよびニューロン損傷に関連した疾患（例えば、脳卒中、虚血性損傷、横断脊髄炎、外傷、脊髄損傷および糖尿病に伴うニューロパシー）においてなど、神経機能の回復を目的とした療法において有利に使用できる。
【０２３３】
また、本発明の化合物は、免疫系の多数の異なる細胞タイプ（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、リンパ球およびＮＫ細胞）の増殖を阻害する。したがって、選択された化合物は、免疫抑制的であり、それゆえ、多発性硬化症、関節リウマチ、類肉腫、腫瘍随伴疾患、シェーグレン、乾癬、強皮症、血管炎、慢性多発関節炎、紅斑性狼瘡、若年性真性糖尿病などの全身または臓器特異的自己免疫疾患の治療および／または処置のため、また、臓器移植拒絶ならびに骨髄または幹細胞移植の場合などの宿主に対する移植材料による拒絶を防ぐために有用である。
【０２３４】
また、本発明の化合物は、肝臓、肺、結腸、前立腺、乳房、膵臓および血管神経膠腫および神経上皮腫などの脳癌などの癌の治療に一般に有用である。さらに、本発明の化合物は、免疫抑制剤および免疫刺激剤として有用であり、臓器移植、自己免疫疾患、関節炎、全身性紅斑性狼蒼、過敏性腸疾患、放射能毒性ならびに炎症、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、外傷および敗血症において適用される。
【０２３５】
本発明の化合物は、Ｔ細胞およびＢ細胞を刺激または抑制するために使用でき、また抗体の抑制または刺激のために使用できる。Ｔ細胞およびＢ細胞を刺激および抑制する方法は、当該分野によく知られている。さらに、本発明の化合物は、Ｇ蛋白結合受容体細胞表面膜受容体系および核膜受容体などの膜受容体を阻害または活性化するための方法において使用できる。本発明の化合物はさらに、ＩＩ型糖尿病の治療に、またエトリオポエチン（ｅｔｈｒｙｏｐｏｅｉｔｉｎ）代替物として使用できる。
【０２３６】
また、本発明の化合物は、血小板凝集の阻害剤としても有用である。さらに、本発明の化合物は、ＣＣＲＣ％およびＣＸＣ４などのＧ蛋白結合受容体を介して、ウィルス接着を阻害することによりＡＩＤＳの治療に有用である。また、本発明の化合物は、シャガス病ならびに、おのおのが参照として本明細書に組み込まれている、米国特許第４，４７６，１１９号、米国特許第４，５９３，０９１号、米国特許第４，６３９，４３７号、米国特許第４，７０７，４６９号、米国特許第４，７１３，３７４号、米国特許第４，７１６，２２３号、米国特許第４，８４９，４１３号、米国特許第４，９４０６９４号、米国特許第５，０４５，５３２号、米国特許第５，１３５，９２１号、米国特許第５，１８３，８０７号、米国特許第５，１９０，０２５号、米国特許第５，２１０，１８５号、米国特許第５，２１８，０９４号、米国特許第５，２２９，３７３号、米国特許第５，２６０，４６４号、米国特許第５，２６４，４２４号、米国特許第５，３５０，８４１号、米国特許第５，４２４，２９４号、米国特許第５，４８４，７７５号、米国特許第５，５１９，００７号、米国特許第５，５２１，１６４号、米国特許第５，５２３，２９４号、米国特許第５，６６７，２８５号、米国特許第５，７９２，８５８号、米国特許第５，７９５，８６９号、および米国特許第５，８４９，７１７号に記載されている疾患、障害、および病態などの疾病の治療にも有用である。
【０２３７】
本発明の化合物の作用の１つの可能な機構は、神経増殖因子類を刺激するものである。本発明の化合物の作用の他の可能な機構は、癌細胞、特に神経芽細胞腫細胞の増殖を阻害するものである。例えば、マウス神経芽細胞腫細胞に、ガングリオシドＧＭ３を投与することにより、神経芽細胞腫細胞の増殖が阻害できることが示されている（Ｚｈａｎｇら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：ｐ．６６１−６）。本発明のスフィンゴ糖脂質およびスフィンゴ糖脂質様化合物は、同様な阻害能力において使用できる。
【０２３８】
本発明の化合物および薬学的組成物は、ヒトなどの霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスなどの通常哺乳動物において、インビボで、またはインビトロで利用できる。神経保護剤としての本発明の化合物の有効性は、当該分野に公知のスクリーニングプロトコルを用いて決定できる。例えば、本発明の化合物の上記の生物学的性質は、例えば、インビトロスクリーニングプロトコル（例えば、細胞培養（ＭＰＴＰ（ラット腹縫腺メゾフェンタリック（ｍｅｓｏｐｈｅｎｔｈａｌｉｃ）細胞）、ＮＭＤＡ（マウス一次皮質ニューロン）、セラミド（神経芽細胞腫−ヒト））、ＣＡＣＯ−２（経口吸収、ＲＢＣリーシス）ならびに神経保護有効性を評価するためのインビボ試験（例えば、パーキンソン病治療における有効性に関するマウスおよび霊長類ＭＰＴＰ毒性試験（ＩＰ、ＩＶおよび／または経口）、脳卒中またはＣＡＢＧによる神経損傷治療の有効性に関するラット脳卒中試験およびＣＡＢＧの治療に関するイヌの試験）など、当該分野に公知の方法により、容易に特性化できる。
【０２３９】
本明細書に記載されている細胞ベースのアッセイにおいて、本発明の化合物は、ＧＭ１などのガングリオシドが有効である濃度よりも著しく低い、約０．１μＭから約１μＭの間の低濃度で５０〜１００％大きな神経保護活性を示した。
【０２４０】
以下の実施例を参照にして、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されるものであって、本発明が、これらの実施例に限定されるのではなく、本明細書に提供された教示の結果、明白となる任意の全ての変型を含むと解釈すべきである。
【実施例】
【０２４１】
（実施例１．ＧＭ１アルデヒド調製の一般的操作手順）
ＧＭ１（２．５ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を、２５００ｍＬのメタノールに溶解した。この溶液を−７０℃に冷却し、淡青色が現れなくなるまで（約３０分）溶液にオゾンを通気した。溶液が無色になるまで、反応混合液に窒素を通気することにより、オゾンを除去した。次いで、８０ｍＬのジメチルスルフィドを加え、生じる混合物を室温で２時間攪拌した。溶液を窒素と共に蒸発乾固した。残渣をトルエン（５０ｍＬ）と共に同時蒸発させ、この残渣を高度真空ポンプで１時間乾燥し、アルデヒドを含有する白色固体を得た。
【０２４２】
（実施例２．Ｗｉｔｔｉｇ反応による：
【０２４３】
【化２８】
2006519878.tif 000020
の調製）
臭化３−クロロ−２−フルオロ−５−（トリフルオロメチル）ベンジル−トリフェニルホスホニウム（２．５８ｇ、４．６６ｍｍｏｌ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍＬ）を含有する懸濁液を、−４０℃に冷却してから、ｔ−ブチルアルコール溶液（４．４９ｍＬ）を加えた。１０分後、この反応混合物を、ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させたアルデヒド溶液に徐々に加え、−４０℃に冷却した。添加完了後、反応混合物を室温で１時間攪拌した。次いで、反応混合物をロータリー蒸発により濃縮し、残渣をクロマトグラフィ（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ３：１、次いでＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ６０：４０：７：１）を行って、１．５ｇ（収率６０％）の所望の生成物を、凡そ７０／３０のシス／トランス混合物として得た。ＥＳＩ−ＭＳ；Ｃ６７Ｈ１０６ＣｌＦ４Ｎ３Ｏ３１の計算値、１５５９；実測値１５５８［Ｍ−１］−。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、９５％ＤＭＳＯ−ｄ６＋５％Ｄ２Ｏ）δ７．９８（ｄ、Ｊ  ６．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．８４（ｄ、Ｊ  ６．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．８２（ｄ、Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ  ５．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４（ｄ、Ｊ  ９．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．６４（ｄ、Ｊ  １６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４８（ｄ、Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．９３（ｄｄ、Ｊ  １１．５／１１．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．７９（ｄ、Ｊ  ８．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２７（ｄ、Ｊ８．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．２１（ｄ、Ｊ  ８．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．００−４．００（ｍ）、１．９８（ｍ、２Ｈ）、１．８６（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．７８（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．２５（ｍ）、０．８３（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）。
【０２４４】
（実施例３．Ｗｉｔｔｉｇ反応による：
【０２４５】
【化２９】
2006519878.tif 000021
の調製）
出発イリドを変えたこと以外は、実施例２のＷｉｔｔｉｇ操作に従った。所望の生成物は、白色固体（収率４３％）として得た。ＥＳＩ−ＭＳ；Ｃ６５Ｈ１０８Ｎ４Ｏ３１の計算値、１４４０；実測値１４３９［Ｍ−１］−。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、９５％ＤＭＳＯ−ｄ６＋５％Ｄ２Ｏ）δ８．４６（ｄ、Ｊ  ４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｄｄ、Ｊ  ６．５および９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ  ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄｄ、Ｊ  ５．０および５．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．６４（ｄｄ、Ｊ１５．５および６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．５７（ｄ、Ｊ  １５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．８２（ｄ、Ｊ  ８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｄ、Ｊ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１８−４．２２（２ｄ、２Ｈ）、３．１０−３．９３（ｍ）、２．０２（ｔ、２Ｈ）、１．８６（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．７５（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．３６（ｍ、２Ｈ）、１．２２（ｓ）、１．０６（ｍ、２Ｈ、ＣＨ３）、０．８３（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）。
【０２４６】
（実施例４．Ｗｉｔｔｉｇ反応による：
【０２４７】
【化３０】
2006519878.tif 000022
の調製）
出発イリドを変えたこと以外は、実施例２のＷｉｔｔｉｇ操作に従った。所望の生成物は、固体（収率２１％）の５０／５０のシス／トランス混合物として得た。ＥＳＩ−ＭＳ；Ｃ６４Ｈ１１１Ｎ３Ｏ３１の計算値、１４１７；実測値［Ｍ−１］−。
【０２４８】
（実施例５．Ｗｉｔｔｉｇ反応による：
【０２４９】
【化３１】
2006519878.tif 000023
の調製）
出発イリドを変えたこと以外は、実施例２のＷｉｔｔｉｇ操作に従った。所望の生成物は、固体（収率４５％）として得た。ＥＳＩ−ＭＳ；Ｃ６８Ｈ１０９ＣｌＮ６Ｏ３１の計算値、１５４０；実測値１５３９［Ｍ−１］−。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、９５％ＤＭＳＯ−ｄ６＋５％Ｄ２Ｏ）δ８．００（ｄ、Ｊ  ９．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．５０（ｄ、Ｊ  ９．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．８０（ｄ、Ｊ  ８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｄ、Ｊ８．０Ｈｚ）、４．２２（ｄ、Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．１９（ｄ、Ｊ  ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．０５−４．００（ｍ）、２．０２（ｍ、２Ｈ）、１．８７（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．７５（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．２１（ｓ）、０．８３（ｔ、Ｊ６．５Ｈｚ、ＣＨ３）。
【０２５０】
（実施例６．
【０２５１】
【化３２】
2006519878.tif 000024
の調製）
実施例１のＧＭ１アルデヒド（２０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）およびジオクチルアミン（６ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を、室温で攪拌しながら２．５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に加えた。次いで、メタノール（５ｍＬ）中のトランス−２−フェニルビニルボロン酸（９ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を加えた。生じる溶液を室温で３日間攪拌した。次いで、反応混合物を、ロータリー蒸発させて濃縮乾固し、残渣を、１ｇ  ＨＡＸカートリッジを用いて固相抽出により精製した。次いで、溶出液は、ＨＰＬＣを用いて精製し、９．５ｍｇ（収率４３％）の白色固体を得た。ＥＳＩ−ＭＳ；Ｃ８３Ｈ１４４Ｎ４Ｏ３１の計算値、１６９３；実測値１６９２［Ｍ−１］−。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、９５％ＤＭＳＯ−ｄ６＋５％Ｄ２Ｏ）δ８．０５（ｄ、Ｊ  ３．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｍ  ５Ｈ）、６．４０（ｍ、１Ｈ）、６．２５（ｄｄ、Ｊ  ９．０および１６Ｈｚ、１Ｈ）、４．８０（ｄ、Ｊ  ８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２８（ｄ、Ｊ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｄ、Ｊ  ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｄ、Ｊ  ４．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．００−４．００（ｍ）、２．１０（ｍ、２Ｈ）、１．８６（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．６０（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ３）、１．１９（ｓ）、０．８３（ｔ、３Ｈ、ＣＨ３）。
【０２５２】
（実施例７．神経保護有効性評価のためのＭＰＴＰ／ＶＭＣアッセイ（インビトロ））
腹側中脳（ｍｅｓｏｐｈｅｎｔｈａｌｉｃ）細胞（ＶＭＣｓ）を、ラット胎仔脳幹（１５日齢）から単離した。各プレート上で細胞を対照と共に数日間培養する（４８ウェルのプレート）。細胞を１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）（１０μＭ）により２４時間処理すると、３０〜５０％の細胞が死滅する。次いで毒素を除去する。次に、細胞を、ＤＭＳＯ中の本発明の化合物により処理する。２４時間後、チロシンヒドロキナーゼ免疫染色および細胞数の計測を行う。
【０２５３】
対照は、ＮＰＴＰ（１０μＭ−３０〜５０％の細胞死滅）およびＧＭ１（３０μＭ）またはＬＩＧＡ−２０（１０μＭ）−３０−５０％保護である。
【０２５４】
（ＮＭＤＡ興奮毒性）
Ｄａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：ｐ．７７９７（１９９１）を参照されたい。滅菌Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ  ＮＭＤＡおよび１０ｍＭグリシンの保存溶液を、マグネシウムのない対照塩溶液（ＣＳＳ）（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、室温ｐＨ７．４の２５ｍＭトリス−塩酸、１５ｍＭグルコース）中、それぞれ５００Ｍおよび１０Ｍの操作濃度に希釈する。細胞を、スフィンゴ糖脂質模擬物によって３日間前処理する。次いで上記完全媒体を、細胞から慎重に除去し、マグネシウムのないＣＳＳで３回静かに洗浄する。ＮＭＤＡ／グリシン／ＣＳＳの操作溶液を上記細胞に５分間加え、直ちに吸引し、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）を含有するＣＳＳで置換して反応を停止させる。次いでスフィンゴ糖脂質模擬物を有する、および有さない完全媒体中、さらに２０〜２４時間培養してから、細胞生存にとって適切な培養器に関して評価する（トリパンブルー除外およびＨｏｅｓｃｈｔ／ヨウ化プロピジウム染色）。
【０２５５】
（実施例８．リソ−ラクトシルセラミドのシアリル化）
本実施例では、リソ−ラクトシルセラミドに関する反応条件を記載する。ラクトシルセラミドを、ウシバターミルクから得、脂肪酸部分を塩基加水分解部分により除去し、リソ−ラクトシルセラミドを形成する。ＨＥＰＥＳ緩衝液（２００ｍＭ、８％ＭｅＯＨ含有、ｐＨ７．５、５０μＬ）中、リソ−ラクトシルセラミド（１．０ｍｇ、１．６μｍｏｌ）およびＣＭＰ−シアリン酸（２．４６ｍｇ、純度６５％、２．４０μｍｏｌ）の混合物を、２０分間音波処理した。次に、α２，３シアリルトランスフェラーゼ（１０μＬ、６Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）に次いでアルカリホスファターゼ（１μＬ、１．０ｘ１０５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ）を加えた。上記反応混合物を室温に維持した。１日後、さらにα２，３シアリルトランスフェラーゼ（１０μＬ、６Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）分を加えた。さらに４日後、
追加のα２，３シアリルトランスフェラーゼ（１０μＬ、６Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）分を加えた。室温でさらに１日後、薄層クロマトグラフィは、反応がほぼ終了していることを示した。
【０２５６】
（実施例９．ウシバターミルクより得られたラクトシルセラミドからのＧＭ２合成）
ウシバターミルクより得られたラクトシルセラミドからのガングリオシドＧＭ２の合成に関する２つの経路を示す概略図が図１に示されている。左側に示された経路において、脂肪酸はシアリル化の前にラクトシルセラミドから除去されることはなく、反応は、有機溶媒の存在下では実施されない。対照的に右側の反応は、有機溶媒の存在下で、脂肪酸を除去して実施される。
【０２５７】
先ず、塩基と水とによる処理で、ラクトシルセラミドからの脂肪酸を加水分解する（ステップ１）。次にα２，３シアリルトランスフェラーゼ、好ましくは、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶを用いた酵素的転移により、シアリン酸残基をガラクトース残基へ付加する（ステップ２）。この反応は、有機溶媒の存在下で実施できる。次にＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを用いて、β１，４結合において、ＧａｌＮＡｃ残基をガラクトースへ付加する（ステップ３）が；このステップは、有機溶媒の存在下で実施しても、しなくてもよい。最後に、脂肪酸部分をスフィンゴシンに再付加して、所望のＧＭ２ガングリオシドを得る。この反応は、シアリル化時、有機溶媒の存在により、典型的には、ほぼ完了まで進行する。
【０２５８】
（実施例１０．植物グルコシルセラミドからのスフィンゴ糖脂質類の合成）
本実施例では、前駆体として、植物グルコシルセラミドを用いて、ＧＭ２ガングリオシドを合成する３つの代替法を記載する（図３）。経路１において、グリコシルセラミドへのＧａｌ残基の転移を触媒するために、β１，４−ガラクトシダーゼが用いられる。同時にＧａｌにシアリン酸残基を結合するために、シアリルトランスフェラーゼサイクルにおいて、α２，３シアリルトランスフェラーゼが用いられる。次に、上記反応混合物に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃにより、またはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼサイクルの一部としてβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを加える。このステップにおいて、ＧａｌＮＡｃ残基は、α２，３結合において、Ｇａｌ残基に結合する。
【０２５９】
経路２は、グルコシルセラミドへのＧａｌの付加が、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルまたはＵＤＰ−Ｇｌｃ／Ｇａｌのいずれかを受容体糖として用いて、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素により、触媒される点で、経路１に示された合成と異なっている。シアリル化とＧａｌＮＡｃの付加を上記のとおり実施してＧＭ２を得る。
【０２６０】
経路３において、グリコシルトランスフェラーゼステップの前に、水性塩基による処理により、脂肪酸が先ず除去される。ガラクトシル化、シアリル化およびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応は、経路２のとおり実施される。ＧａｌＮＡｃ残基の付加後、脂肪酸が上記分子に結合される。この脂肪酸は、もともと植物のグルコシルセラミドに見られるものと同じでもよいし、異なっていてもよい。図４に示されている実施例において、活性化Ｃ１８脂肪酸を用いて、ＧＭ２合成がもたらされる。脂肪酸がグリコシル化反応の前に除去されると、一般により高い効率が見られる。
【０２６１】
（実施例１１．グルコシルセラミドからのガングリオシドＧＭ２の合成）
本実施例では、前駆体として、グルコシルセラミドを用いてＧＭ２および他のスフィンゴ糖脂質類を合成する３つの代替法を記載する（図４）。経路１において、グリコシルセラミドへのＧａｌ残基の転移を触媒するために、β１，４−ガラクトシダーゼが用いられる。同時にＧａｌにシアリン酸残基を結合するために、シアリルトランスフェラーゼサイクルにおいて、α２，３シアリルトランスフェラーゼが用いられる。次に、上記反応混合物に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃにより、またはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼサイクルの一部としてβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを加える。このステップにおいて、ＧａｌＮＡｃ残基は、α２，３結合において、Ｇａｌ残基に結合する。
【０２６２】
経路２は、グルコシルセラミドへのＧａｌの付加が、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルまたはＵＤＰ−Ｇｌｃ／Ｇａｌのいずれかを受容体糖として用いて、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素により、触媒される点で、経路１に示された合成と異なっている。シアリル化とＧａｌＮＡｃの付加を上記のとおり実施して、ＧＭ２を得る。
【０２６３】
経路３において、グリコシルトランスフェラーゼステップの前に、水性塩基による処理により、脂肪酸が先ず除去される。ガラクトシル化、シアリル化およびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応は、経路２のとおり実施される。ＧａｌＮＡｃ残基の付加後、脂肪酸が上記分子に結合される。図３に示されている実施例において、活性化Ｃ１８脂肪酸を用いて、ＧＭ２合成がもたらされる。脂肪酸がグリコシル化反応の前に除去されると、一般により高い効率が見られる。
【０２６４】
より複合化したスフィンゴ糖脂質を得るためには、各合成経路後に、追加のグリコシルトランスフェラーゼ類を用いて、追加の糖残基を付加することができる。
【０２６５】
（実施例１２．哺乳動物細胞の増殖に及ぼす本発明化合物の効果）
（材料および方法）
化合物２、８、１０、１３、５６、５７、５８、５９、６０および６１を、本発明の方法により作製して、使用するまで粉末形態で保存する。
【０２６６】
９Ｌ細胞は、Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ大学（ノースカロライナ州ウィンストンサレム所在）から入手し、他の５つの細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス所在）から入手した。最少必須培地イーグル（ＭＥＭ）培地と基本培地イーグル（ＢＭＥ）培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ新生仔血清およびトリプシン−ＥＤＴＡ溶液は、ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手した。ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、リーボビツＬ−１５培地は、ＡＴＣＣ（バージニア州マナサス所在）から入手した。ＭＴＴ色素試薬は、ウィスコンシン州マジソン所在のＰｒｏｍｅｇａ社から入手した。
【０２６７】
（細胞培養）
５％ＣＯ２／９５％空気中、３７℃で、９Ｌ細胞を、１０％ウシ新生仔血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンと共に、ＢＭＥ培地中で増殖させた。ＡＴＣＣから得られた細胞系は、５％ＣＯ２／９５％空気中、３７℃でＡＴＣＣ推奨培地中で増殖させた。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＨＴＢ−１０）およびＵ−８７（ＨＴＢ−１４）は、アール塩、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸、０．１Ｍ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および１０％ＦＢＳと共にＭＥＭ中で増殖させた。Ｕ−１１８Ｓ（ＨＴＢ−１５）およびＨｓ６８３（ＨＴＢ−１３８）細胞は、ＤＭＥＭ、４ｍＭグルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳ中で増殖させた。ＳＷ１０８８（ＨＴＢ−１２）細胞は、３７℃の給湿空気環境（ＣＯ２は加えず）中、１０％ＦＢＳと共に、リーボビッツＬ−１５培地中で増殖させた。各細胞系の培地は３日ごとに取り替え、細胞は、解離剤として０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて毎週継体した。
【０２６８】
（増殖アッセイ）
８０％コンフルエントで、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて採取した。上記トリプシン化細胞を１ウェル当たり２０００細胞で９６ウェルプレートに入れた（極めて急速に増殖するため、１ウェル当たり１２００細胞を入れたｐＬ細胞を除いて）。１０種の化合物、２、８、１０、１３、５６、５７、５８、５９、６０および６１の各々の作用保存液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製した。２４時間、細胞を結合させ、培養物を与え、０．０５μＭ、０．５μＭ、５μＭおよび５０μＭの濃度の１０種の化合物をそれぞれ投与した。各濃度について、６ウェルの反復を用いた。対照に、試験ウェルに加えられた培地中で希釈された同容量のＤＭＳＯを与えた。培地は、３日ごとに新鮮な試験化合物に取り替えた。培養７日後、ＭＴＴ試験を用いて生菌を測定した。各ウェルから培地を除き、各ウェルに１００μＬの新鮮な培地、１５μＬのテトラゾリウム色素溶液を加え、３７℃で４時間温置することによりＭＴＴアッセイを実施した。４時間後、１００μＬの可溶化／停止溶液を各ウェルに加えた。上記プレートを室温で一晩温置し、各ウェルの黄色の強度をＢｉｏ−Ｔｅｋ機器（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州）マイクロプレート走査光電分光光度計において、５７５ｎｍで測定した。
【０２６９】
この増殖アッセイの結果は、図６〜図１５に提供している。
【０２７０】
（神経突起増殖アッセイ）
後根神経節（ＤＲＧ）神経細胞培養物を、１５日齢胎仔におけるＳＤラットから確立する（Ｈａｒｌａｎ社、インディアナ州インディアナポリス所在）（Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：ｐ．１０２３−１０３４を参照）。簡潔に述べると、胎仔を切開し、脊髄を単離する。次に、ＤＲＧｓを脊髄から分離し、ＣＭＦ培地に入れる。次に、ＤＲＧ神経細胞を、０．２５％トリプシンにより解離させ、ラット尾部コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ベドフォード所在）でコーティングした８ウェルチャンバスライド（Ｎａｇｅ  Ｎｕｎｃ、イリノイ州シカゴ所在）内に入れる。１μＭから１００μＭの種々のスフィンゴ糖脂質を加える。４８時間後、神経突起の長さを測定することにより、神経突起の増殖を評価する。
【０２７１】
（実施例１３．免疫抑制アッセイ）
Ｂｒｕｕｎｓｇａａｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９（３）；ｐ．４３３（２０００）を参照されたい。
【０２７２】
ヘパリン化（５０Ｕ／ｍｌ）血液から末梢神経単球を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｇｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離により単離する（Ｂｏｙｕｍら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．９７：ｐ．９−２９（１９６８）を参照）。簡潔に述べると、ヘパリン化血液を、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手）の上部に静かに置き（ＦＩＣＯＬＬ対血清比１：２）、次いで、１６００ｒｐｍで２５分間遠心分離する。バッフィーコートを吸収し、２回洗浄してから、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させる。細胞を、２０ｍｇ／ｍＬの植物性凝集素を含有する９６ウェル丸底マイクロタイタープレートにおいて、１０％ウシ胎仔ケッセイ糖脂質（１μＭから１００μＭ）と共に、また、それなしで１ウェル当たり２ｘ１０５細胞の密度でスフィンゴ糖脂質（１μＭから１００μＭ）と共に、また、それなしで培養する。［３Ｈ］ＴＤＲ（１μＣｉ／ウェル、５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を１８時間加えることにより、リンパ球増殖をアッセイする。次にプレートを回収し、シンチレーションカウンターを用いてカウントする
（実施例１４．アポトーシスに対する皮質細胞の保護）
アポトーシスを誘導するために、マウス皮質細胞を培養し、ガングリオシド類似体で処理する前に、３時間、５０μＭ過酸化水素により処理された。上記細胞は、ガングリオシド類似体による処理時および処理後４８時間、やはり過酸化水素で処理した。ＭＴＴアッセイを用いて、細胞死をアッセイした。
【０２７３】
上記処理の結果、過酸化水素で処理された細胞の凡そ３０％が死滅した。Ｌｉｇａ２０（またはＧＭ１）（凡そ０．１μＭ）による処理により、アポトーシスに対し、凡そ２０％の細胞保護が提供された。同様の濃度における本発明の化合物は、凡そ同レベルの細胞保護を提供した。
【０２７４】
（実施例１５．細胞死に対する皮質細胞の保護）
非アポトーシス細胞死を誘導するために、マウス皮質細胞を培養し、ガングリオシド類似体で処理する前に、３時間、５０μＭ過酸化水素およびオリゴマイシン（０．０１μＭ）により処理した。上記細胞は、ガングリオシド類似体による処理時および処理後４８時間、やはり過酸化水素およびオリゴマイシンで処理した。ＭＴＴアッセイを用いて、細胞死をアッセイした。
【０２７５】
上記処理の結果、過酸化水素で処理された細胞の凡そ３０％が死滅した。本発明の化合物による細胞処理は、細胞死に対し凡そ２０％の細胞を保護した。
【０２７６】
（実施例１６．ＭＰＴＰ処理マウスにおける線条体ドーパミン濃度の救護）
７〜８週齢のオスＣ５７Ｂ１／６マウスをＭＰＴＰ（１日２回、２０ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処理した。また上記マウスは、さいごのＭＰＴＰ注射の２４時間後から開始された、生理食塩水、ＧＭ１（３０ｍｇ／ｋｇ）、本発明の化合物（０．３．３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、および３０ｍｇ／ｋｇ、大腿）の１日１回投与を３週間受けた。脳を除去し、線条体ドーパミン濃度に関して分析した。ＴＨ免疫組織化学およびドーパミン神経細胞のカウントのために中脳を固定した。
【０２７７】
ＭＰＴＰ単独では、おおよそ７６％の線条体ドーパミン損失が生じた。ＧＭａおよび本発明の化合物（全ての投与量と投与経路において）は、線条体ドーパミン濃度を、ほぼ同程度まで増加させた。
【０２７８】
前述の検討および実施例は、本発明の一定の好ましい実施形態の詳細な説明を提供している。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修飾体および等価体が作製できることは、通常の当業には明らかであろう、上記で検討および引用した全ての特許、学術誌および他の文書は全ての目的のために、それらの全体が、本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】図１は、ウシのバターミルクから得られた出発物質ラクトシルセラミドを用いる酵素的合成によるガングリオシドＧＭ２合成のための２つの方法の概略図である。
【図２】図２は、ウシのバターミルクから得られたラクトシルセラミドからガングリオシドＧＤ２合成のための２つの方法の概略図である。
【図３】図３は、出発物質として植物グルコシルセラミドを用いてＧＭ２ガングリオシドを合成する３つの経路をまとめたものである。
【図４】図４は、グルコシルセラミドから出発してＧＭ２および他のガングリオシドを合成する３つの経路をまとめたものである。
【図５】図５は、ラクトシルセラミドからの脱アシル化によるガングリオシドＧＭ２の合成、２つの連続した酵素的グリコシル化および最後の化学的アシル化に用いられた図式である。
【図６】図６は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。５０μＭにおける化合物２は、全ての細胞系において、ほぼ１００％（８６％〜１００％）の増殖阻害を生じさせる。
【図７】図７は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物８は、４つの細胞系で化合物２に関するプロフィルと同様のプロフィルを有し（５０μＭの化合物８により、７７％〜８９％の増殖阻害）、Ｕ−１１８細胞では、５０μＭの化合物８による増殖阻害は２１％である。
【図８】図８は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。５０μＭの化合物１０による９Ｌ細胞の阻害が４６％であったことを除いて、化合物１０は、化合物２と同様の活性を有する。
【図９】図９は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。Ｈｓ６８３細胞およびＳｗ１０８８細胞を処置するために用いられた場合、化合物１３は、５０μＭの濃度で使用された時に、各々４２％および３５％、増殖を阻害した。
【図１０】図１０は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。５０μＭの化合物５６は、９Ｌ細胞を２３％、Ｕ−１１８細胞を２７％、Ｈｓ６８３細胞を４８％、Ｓｗ１０８８細胞を６８％、増殖阻害した。
【図１１】図１１は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物５７は、９Ｌ細胞の増殖を１１％〜３７％阻害した。
【図１２】図１２は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物５８は、５μＭで９Ｌ細胞およびＨｓ６８３細胞の増殖を阻害した（それぞれ２７％と３２％）。５０μＭにおいて、化合物５８は、９Ｌ細胞、Ｈｓ６８３細胞、Ｕ−１１８細胞およびＳｗ１０８８細胞の増殖を２６％〜５４％阻害した。
【図１３】図１３は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物５９は、５０μＭ化合物で全ての細胞系における増殖を強力に阻害した（９１％〜１００％）。
【図１４】図１４は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物６０は、細胞増殖アッセイにおいて極めて活性であった。化合物６０は、５μＭで全ての被験細胞系において、増殖阻害活性を証明し（１５％〜８８％）、５μＭで全ての細胞系において、強力な増殖阻害を証明した（９５％〜１００％）。
【図１５】図１５は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物６１は、５０μＭで全ての細胞系の増殖を、６６％〜１００％阻害する。
【図１６Ｇ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｈ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｉ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｊ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｋ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｌ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｍ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｎ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｏ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｐ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｑ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｒ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｓ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｔ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｕ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１７】図１７は、本発明の化合物に含まれる代表的な糖部分の表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ｒ】
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【図１６Ｓ】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
【図１】図１は、ウシのバターミルクから得られた出発物質ラクトシルセラミドを用いる酵素的合成によるガングリオシドＧＭ２合成のための２つの方法の概略図である。
【図２】図２は、ウシのバターミルクから得られたラクトシルセラミドからガングリオシドＧＤ２合成のための２つの方法の概略図である。
【図３】図３は、出発物質として植物グルコシルセラミドを用いてＧＭ２ガングリオシドを合成する３つの経路をまとめたものである。
【図４】図４は、グルコシルセラミドから出発してＧＭ２および他のガングリオシドを合成する３つの経路をまとめたものである。
【図５】図５は、ラクトシルセラミドからの脱アシル化によるガングリオシドＧＭ２の合成、２つの連続した酵素的グリコシル化および最後の化学的アシル化に用いられた図式である。
【図６】図６は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。５０μＭにおける化合物２は、全ての細胞系において、ほぼ１００％（８６％〜１００％）の増殖阻害を生じさせる。
【図７】図７は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物８は、４つの細胞系で化合物２に関するプロフィルと同様のプロフィルを有し（５０μＭの化合物８により、７７％〜８９％の増殖阻害）、Ｕ−１１８細胞では、５０μＭの化合物８による増殖阻害は２１％である。
【図８】図８は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。５０μＭの化合物１０による９Ｌ細胞の阻害が４６％であったことを除いて、化合物１０は、化合物２と同様の活性を有する。
【図９】図９は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。Ｈｓ６８３細胞およびＳｗ１０８８細胞を処置するために用いられた場合、化合物１３は、５０μＭの濃度で使用された時に、各々４２％および３５％、増殖を阻害した。
【図１０】図１０は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。５０μＭの化合物５６は、９Ｌ細胞を２３％、Ｕ−１１８細胞を２７％、Ｈｓ６８３細胞を４８％、Ｓｗ１０８８細胞を６８％、増殖阻害した。
【図１１】図１１は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物５７は、９Ｌ細胞の増殖を１１％〜３７％阻害した。
【図１２】図１２は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物５８は、５μＭで９Ｌ細胞およびＨｓ６８３細胞の増殖を阻害した（それぞれ２７％と３２％）。５０μＭにおいて、化合物５８は、９Ｌ細胞、Ｈｓ６８３細胞、Ｕ−１１８細胞およびＳｗ１０８８細胞の増殖を２６％〜５４％阻害した。
【図１３】図１３は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物５９は、５０μＭ化合物で全ての細胞系における増殖を強力に阻害した（９１％〜１００％）。
【図１４】図１４は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物６０は、細胞増殖アッセイにおいて極めて活性であった。化合物６０は、５μＭで全ての被験細胞系において、増殖阻害活性を証明し（１５％〜８８％）、５μＭで全ての細胞系において、強力な増殖阻害を証明した（９５％〜１００％）。
【図１５】図１５は、脳癌細胞を本発明の種々の化合物で処置した場合の上記細胞増殖の減弱を示している。化合物６１は、５０μＭで全ての細胞系の増殖を、６６％〜１００％阻害する。
【図１６Ａ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｂ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｃ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｄ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｅ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｆ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｇ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｈ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｉ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｊ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｋ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｌ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｍ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｎ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｏ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｐ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｑ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｒ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｓ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｔ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１６Ｕ】図１６は、本発明の代表的な化合物の表である。
【図１７】図１７は、本発明の化合物に含まれる代表的な糖部分の表である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006519878.tif 000073
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2006519878.tif 000079
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１６Ｌ】
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【図１６Ｍ】
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【図１６Ｎ】
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【図１６Ｏ】
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【図１６Ｐ】
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【図１６Ｑ】
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【図１６Ｒ】
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【図１６Ｓ】
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【図１６Ｔ】
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【図１６Ｕ】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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