(57)【要約】遺伝子チップ分析により、正常対高インシュリン血症、高インシュリン血症対タイプ２の糖尿病、正常対タイプ２の糖尿病の肝臓の比較において差次的に発現したマウス遺伝子を同定し、同様に対応するヒトの遺伝子およびタンパク質を同定した。ヒトの分子、またはそれらの拮抗剤は高インシュリン血症またはタイプ２の糖尿病、またはそれらの後遺症に対する保護のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者が、正常インシュリン状態から高インシュリン状態になることを防ぎ、または前記二つの状態からタイプII糖尿病状態になることを防ぐ方法であって、以下：
（１）（ａ）マスターテーブル１、サブテーブル１Ａおよび１Ｃに示すマウスおよびヒトタンパク質から構成されるグループから選択されたか、もしくは（ｂ）テーブル２、サブテーブル２Ａおよび２Ｃに示されたヒトタンパク質クラスの少なくとも一の中のヒトタンパク質から構成されるグループから選択された基準タンパク質と、配列が実質的に構造上同一もしくは保存的に同一であるポリペプチド、
または
（２）（１）のポリペプチドの発現を誘導する条件において、上記（１）のポリペプチドをコード化していてかつヒト細胞中で発現可能である、発現ベクター、
の少なくとも一の薬剤の保護可能な量を被験者に投与することからなり、前記薬剤が、被験者が正常インシュリン状態から高インシュリン状態になることを防ぎ、または前記二つのいずれかの状態からタイプII糖尿病状態になることを防ぐ、前記方法。
【請求項２】
ヒト被験者が、正常インシュリン状態から高インシュリン状態になることを防ぎ、または前記二つの状態からタイプII糖尿病状態になることを防ぐ方法であって、以下：
（１）（ａ）マスターテーブル１、サブテーブル１Ｂおよび１Ｃに示すマウスおよびヒトタンパク質から構成されるグループから選択されたか、もしくは（ｂ）テーブル２、サブテーブル２Ｂおよび２Ｃに示されたヒトタンパク質クラスの少なくとも一に属するヒトタンパク質から構成されるグループから選択された基準タンパク質と、配列が実質的に構造上同一もしくは保存的に同一である、前記被験者中に生じる、ポリペプチドの拮抗物質、
（２）前記被験者中の前記ポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスベクター、の少なくとも一の薬剤の保護可能な量を被験者に投与することからなり、前記薬剤が、正常インシュリン状態から高インシュリン状態になることを防ぎ、または前記二つのいずれかの状態からタイプII糖尿病状態になることを防いでいる、前記方法。
【請求項３】
ヒト被験者が、正常インシュリン状態から高インシュリン状態になる傾向にあるか、もしくは前記二つの状態からタイプII糖尿病状態になる傾向にあるかをスクリーニングする方法であって、前記方法は、前記被検者由来の組織もしくは体液試料を分析して、少なくとも一の「好ましい」ヒトマーカー遺伝子の発現のレベルを決定することからなり、前記ヒトマーカー遺伝子は、（ａ）マスターテーブル１、サブテーブル１Ａおよび１Ｃに示すマウスおよびヒトタンパク質から構成されるグループから選択されたか、もしくは（ｂ）テーブル２、サブテーブル２Ａおよび２Ｃに示されたヒトタンパク質クラスの少なくとも一にあるヒトタンパク質から構成されるグループから選択された基準タンパク質と、配列が実質的に構造上同一もしくは保存的に同一であるヒトタンパク質をコード化していて、かつ前記患者において進行の傾向をもっている前記マーカー遺伝子の発現のレベルと直接関連のあるところの、前記スクリーニングの方法。
【請求項４】
ヒト被験者が、正常インシュリン状態から高インシュリン状態になる傾向にあるか、もしくは前記二つの状態からタイプII糖尿病状態になる傾向にあるかをスクリーニングする方法であって、前記方法は、前記被検者由来の組織もしくは体液試料を分析して、少なくとも一の「好ましくない」ヒトマーカー遺伝子の発現のレベルを決定することからなり、前記ヒトマーカー遺伝子は、（ａ）マスターテーブル１、サブテーブル１Ｂおよび１Ｃに示すマウスおよびヒトタンパク質から構成されるグループから選択されたか、もしくは（ｂ）テーブル２、サブテーブル２Ｂおよび２Ｃに示されたヒトタンパク質クラスの少なくとも一にあるヒトタンパク質から構成されるグループから選択された基準タンパク質と、配列が実質的に構造上同一もしくは保存的に同一であるヒトタンパク質をコード化していて、かつ前記患者において進行の傾向をもっている前記マーカー遺伝子の発現のレベルと逆の相関のあるところの、前記スクリーニングの方法。
【請求項５】
基準タンパク質がサブテーブル１Ａの、もしくはサブテーブル２Ａ中に示したクラスである、請求項１または３記載の方法。
【請求項６】
基準タンパク質がサブテーブル１Ｂの、もしくはサブテーブル２Ｂ中に示したクラスである、請求項１または３記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）が適用される、請求項１ないし６記載の方法。
【請求項８】
基準タンパク質がヒトタンパク質である、請求項１ないし７記載の方法。
【請求項９】
基準タンパク質がマウスタンパク質である、請求項１ないし７記載の方法。
【請求項１０】
マーカータンパク質の発現レベルが、対応するメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することによって確かめられる、請求項３または４いずれか記載の方法。
【請求項１１】
マーカータンパク質の発現レベルが、前記マーカー遺伝子によってコード化されたタンパク質のレベルを測定することによって確かめられる、請求項３または４いずれか記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、前記基準タンパク質と、少なくとも８０％同一であるかもしくは高度に保存的に同一である、請求項１ないし９いずれか記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、前記基準タンパク質と、少なくとも９０％同一である、請求項１ないし１０いずれか記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、前記基準タンパク質と同一である、請求項１ないし１１いずれか記載の方法。
【請求項１５】
マスターテーブル１中の基準タンパク質についてのＥ値がｅ−６を越えない、請求項１ないし１４いずれか記載の方法。
【請求項１６】
マスターテーブル１中の基準タンパク質についてのＥ値がｅ−１０を下回る、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸによって計算されたＥ値がｅ−１５より小さく、より好ましくはｅ−２０より小さく、さらにより好ましくはｅ−４０より小さく、さらにより好ましくはｅ−６０より小さく、なお一層好ましくはｅ−８０より小さく、最も好ましくはｅ−１００より小さい、請求項１７記載の方法。
【請求項１８】
拮抗物質が、抗体、または抗体の抗原特異的結合断片である、請求項２ないし１７記載の方法。
【請求項１９】
拮抗物質が、ペプチド、ペプトイド、核酸、またはペプチド核酸オリゴマーである、請求項２ないし１７記載の方法。
【請求項２０】
拮抗物質が、５００ダルトンより小さい分子量の有機分子である、請求項２ないし１７記載の方法。
【請求項２１】
前記有機分子が、組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって、前記ポリペプチドに結合する分子として同一であると確認できる、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、先行米国仮出願６０／４６０，４１５（２００３年４月７日出願（ＫＯＰＣＨＩＣＫ６−ＵＳＡ））、および６０／５０６，７１６（２００３年９月３０日出願（ＫＯＰＣＨＩＣＫ６．１−ＵＳＡ））のＵＳＣ１１９（ｅ）の利益を享受することを要求し、これらはともに、ここに参照することにより完全に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
当該出願は、６ヶ月発現データを米国仮出願６０／４６０，４１５（２００３年４月７日出願（ＫＯＰＣＨＩＣＫ６−ＵＳＡ））の明細書に加える。
米国仮出願第６０／４５８，３９８号（２００３年３月３１日出願（我々の整理番号Ｋｅｌｄｅｒ１−ＵＳＡ））において、正常対高インシュリン血症、高インシュリン血症対タイプＩＩ糖尿病、または正常対タイプＩＩ糖尿病のマウス肝で特異的に発現した遺伝子の同定を記述した。フォワード−およびリバース−サブトラクションｃＤＮＡライブラリーを調製し、クローンを単離し、そして特異的に発現したｃＤＮＡ挿入物を配列決定ならびに公に利用可能な配列データベースで配列を比較した。対応するマウスならびにヒトの遺伝子およびタンパク質を同定した。同定した好ましい遺伝子／タンパク質は、（１）NP_000767：シトクロムP450、サブファミリーIIIA（ニフェディピンオキシダーゼ）、ポリペプチド３；（２）AAG31034：SYT/SSX4融合タンパク質；および（３）NP_003158：スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞質性、2A、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）−選択、メンバー１；スルホトランスフェラーゼファミリー2A、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）−選択、メンバー１を含む。好ましくないタンパク質は、（４）NP_004884：H2Aヒストンファミリー、メンバーＹイソ型２；ヒストンマクロH2A1.2；ヒストンマクロH2A1.1；（５）AAH37738：未知（MGC：33851についてのタンパク質）；（６）NP_068839：膜内在性タンパク２Ｂ；（７）CAA28659：Ｓ−タンパク質；および（８）AAA51560：アルファ−１−アンチキモトリプシン前駆体を含む。混合タンパク質は、（９）NP_000769：シトクロムP450、サブファミリーＩＶＡ、ポリペプチド１１；脂肪酸オメガ−ヒドロキシラーゼ；P450HL−オメガ；アルカン−１−モノオキシゲナーゼ；ラウリン酸オメガ−ヒドロキシラーゼ；（１０）NP_006206：セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤、クレードＡ；（１１）NP_004489：カットドメイン、ファミリーメンバー１；幹細胞核因子６、アルファ；および（１２）NP_775491：肝特異的ウリジンホスホリラーゼを含む。遺伝子チップ技術は用いなかった。遺伝子の二つ（NM_007818およびNM_007822）もこの場合に同定された。
【０００３】
遺伝子およびタンパク質を同定するためのディファレンシャルハイブリダイゼーションの利用が、我々のPCT/US00/12145（Kopchick 3A-PCT）、PCT/US00/12366（Kopchick 4A-PCT）、および60/400,052（Kopchick5）に記述されている。上記出願のすべては、ここに参照として完全に組み込まれる。
発明の技術分野
本発明は種々の核酸分子およびタンパク質に関し、そして、（１）高インシュリン血症およびタイプＩＩ糖尿病、もしくはこれらの発生に付随する状態の診断、ならびに（２）高インシュリン血症およびタイプＩＩ糖尿病に対する哺乳動物（ヒトを含む）の保護のための使用に関する。
【０００４】
背景技術の記載
糖尿病
真性糖尿病は、非常に複雑な多面発現性疾患である。二つの主要な型は、タイプＩすなわちインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）およびタイプＩＩすなわちインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）である。タイプＩＩ糖尿病は西欧世界において支配的な型であり、米国の糖尿病患者の８％未満がタイプＩ疾患である。
タイプＩ糖尿病患者は、循環している内因性のインシュリンの低量または欠如、すなわち低インシュリン症（１）によって特徴付けられる。膵臓の損傷を惹起する島細胞抗体が、診断法にしばしば現れる。外因性のインシュリンの注入が、ケトン症の予防および生命維持に必要とされる。
早期のタイプＩＩ糖尿病は、しばしば高インシュリン血症およびインシュリンに対する抵抗性によって特徴付けられる。後期のタイプＩＩ糖尿病は、正常インシュリン濃度または高インシュリン血症であることができる。タイプＩＩ糖尿病は通常、インシュリン依存的でなく、すなわち標準の環境下ではちケトン症になりやすい。
【０００５】
タイプＩＩ糖尿病
タイプＩＩ糖尿病（先にインシュリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭとして既知）は、異常に高い血中グルコース（高血糖）の最も一般的な形態である。タイプＩＩ糖尿病は代謝異常であり、約17百万人のアメリカ人が発症している。さらに10百万人が、糖尿病になり「やすく」なっていると見積もられる。これらの脆弱な人は、インシュリン耐性になる可能性がある。インシュリンは膵臓ホルモンで、脂肪および筋肉によってグルコース（血糖）を取り込むように指示する。正常なグルコースレベルを維持するために、膵臓島細胞はより多くのインシュリンを産出し、このため高インシュリン血症と呼ばれる状態になる。インシュリン抵抗性を代償するために十分なインシュリンをもはや産生できなくなり、このため正常グルコースレベルを維持できなくなると、タイプＩＩ糖尿病（高血糖症）になる。
糖尿病の合併症（終末期のダメージ）には、網膜症、神経障害、および腎症（典型的には、微小血管合併症と呼ばれる）、また同様にアテローム硬化症（巨大血管合併症）が含まれる。
高血糖の早期段階は、食事の変更および運動量の増加により通常コントロールすることができるが、しかし、インシュリンを含む薬剤療法ももちいることができる。十分早期の場合、細心の血糖コントロールが、しばしば糖尿病患者の合併症の進行を遅らせあるいは停止することができる（１）。しかしながら、厳重な代謝コントロールは達成するのに非常に困難である。
正常インシュリン状態から高インシュリン状態への疾患の進行、そして高インシュリン状態からタイプＩＩ糖尿病への疾患の進行については、ほとんど知られていない。
上記のように、タイプＩＩ糖尿病は代謝疾患で、これはインシュリン抵抗性およびグルコース刺激性インシュリン分泌の障害によって特徴付けられる（２、３、４）。しかしながら、タイプＩＩ糖尿病およびアテローム硬化症は、インシュリン抵抗症（ＩＲＳ）を長年もつことによるものと考えられている（５）。現在のタイプＩＩ糖尿病の病因論は、しばしば「インシュリン抵抗性／島細胞疲弊」理論と呼ばれている。この理論によれば、インシュリン抵抗性をもたらす状態は、グルコース恒常性を維持するために膵臓島細胞がインシュリンを過分泌するように強いる。しかしながら、長年の過分泌の後、島細胞は突然衰えて糖尿病の臨床的な症状が発現する。このため、この理論は、末梢性の高インシュリン血症がタイプＩＩ糖尿病にどこかで先立つことを暗示する。末梢性の高インシュリン血症は、β細胞によって産生されるものから肝臓によってとりこまれるものを減じた差によって考えることができる。このため、末梢性高インシュリン血症は、増加したβ細胞産生、減少した肝の取り込み、またはこれらの組み合わせによってもたらされることができる。末梢性高インシュリン血症の発症は全体的なインシュリン抵抗性の状態をもたらすので、インシュリン抵抗性がひとたび確立されると、インシュリン抵抗性の原因を決定することは困難であるということに注意することが重要である。
複合的な環境および遺伝子要因が、インシュリン抵抗性、高インシュリン血症およびタイプＩＩ糖尿病の発生に関与している。インシュリン抵抗性、高インシュリン血症およびタイプＩＩ糖尿病の発生についての重要な危険因子は肥満、特に内臓肥満である（６、７、８）。タイプＩＩ糖尿病は世界的に存在していているが、先進国においては、人口の平均年齢が上昇し、平均して個々が肥満になるにつれ、罹患率も上昇している。
肥満は、米国において重大かつ増大している問題である。肥満に関連した健康リスクには、高血圧、動脈硬化、循環器病、およびタイプＩＩ糖尿病（インシュリン非依存性糖尿病としても知られている）が含まれる（９、１０、１１）。最近の研究によると、タイプＩＩ糖尿病をもつ個人の85％が肥満である（１２）。
【０００６】
成長ホルモン
成長ホルモンは、タンパク質、脂肪および炭水化物代謝のの調節から成長促進まで、多くの役割をもつ。ＧＨは下垂体前葉のソマトロピン細胞で産生され、ＧＨ誘導作用のＩＧＦ−Ｉまたは、成長促進の場合には、肝臓、筋肉、脂肪、および腎臓細胞を含む標的細胞上のＧＨＲとの直接的な相互作用によって、その効果を発揮する。発育におけるＧＨの分泌不全は小人症をもたらし、思春期前の過分泌は巨人症をもたらす。大人においてＧＨの過分泌は、顔面骨、手、足の膨大、疲労および体重増加によって特徴付けられる臨床症状の先端巨大症をもたらす。先端巨大症をもった個人のうち、25％はタイプＩＩ糖尿病を発現する。これは、インシュリンの高循環量をもたらすＧＨの高循環量によって生じる、インシュリン抵抗性による可能性がある（Kopchickら、Annual  Rev.Nutrition  1999、19：437-61）。
ＧＨ作用のさらなる作用機序は、ＧＨの生理学的効果に寄与する多くの遺伝子の転写調節によることができる。
【０００７】
遺伝子組換えマウス
McGraneら、J.Biol.Chem.263：11443-51（1988）およびChenら、J.Biol.Chem.269：15892-7（1994）は、ウシ成長ホルモン（bGH）またはヒト成長ホルモン（hGH）を発現するマウスの遺伝子操作についてそれぞれ記述している。これらのマウスは、成長を亢進した表現型を示す。これらのマウスは、糖尿病性糸球体硬化症にみられるのと類似した腎の病変も発症する。Yangら、Lab.Invest.、68：62-70（1993）参照。Oguetaら、J.Endocrinol.、165：321-8（2000）は、ウシＧＨを発現する遺伝子組換えマウスが、関節炎疾患および自己抗体を発生させることを報告している。
成長ホルモン遺伝子およびこれらによってコード化されたタンパク質は、変異によって成長ホルモン拮抗物質に変換されうる。Kopchick、米国特許第5,350,836号参照。遺伝子組換えマウスは、ＧＨ拮抗物質bGH-G119RまたはhGHのＧ120Rを発現するように作られ、このマウスは小人表現型を示す。Chenら、J.Biol.Chem.263：15892-7（1994）、Chenら、Mol.Endocrinol、5：1545-52（1991）；Chenら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、87：5061-5（1990）。これらのマウスは腎の病変を発症しない。
Chenら、Endocrinol、136：660-7（1995）は正常非遺伝子組換えマウス、および（１）ＧＨレセプター拮抗物質、ウシ成長ホルモンのG119R変異体または（２）ｂＧＨのE117L変異体についての遺伝子組換えマウスへの、ストレプトゾトシン処理の効果を比較している（Chenのレファレンス24によれば、これら大きいＧＨ遺伝子組換えストレプトゾトシン処理マウスは、糖尿病についての動物モデルを構成する）。糸球体硬化症が、糖尿病（ＳＴＺ処理）非遺伝子操作マウスおよび糖尿病bGH-E117Lマウスにみられたが、しかし糖尿病bGH-G119R（GH拮抗物質）マウスにはみられなかった。
成長ホルモン活性を媒介するタンパク質の二つは、成長ホルモンレセプターおよび成長ホルモン結合タンパク質で、マウスの同一遺伝子によってコード化されている（ＧＨＲ／ＢＰ）。遺伝子操作マウスについてこれらのタンパク質をコードしている遺伝子を分立させる（「ノックアウトされる」；不活化する）ことが可能である。Zhouら、Proc.Nat.Acad.Sci.（米国）、94：13215-20（1997）参照。Zhouらは、エキソン４の３’部位（ＧＨ結合領域の部分をコード化している）およびイントロン４の５’部位をネオマイシン遺伝子カセットで置換することで、ＧＨＲ／ＢＰを不活化した。相同的組換えによって標的マウス中に修飾遺伝子を導入した。ＧＨ拮抗物質を発現するマウスのように、ホモ接合ＧＨＲ／ＢＰ−ＫＯマウスは小人症表現型を示した。ＧＨＲ／ＢＰ−ＫＯマウスは、ストレプトゾトシン処理によって糖尿病になっていて、糖尿病関連腎症になることからは保護されている。Bellushら、Endocrinol、141：163-8（2000）。
【０００８】
ディファレンシャル／サブトラクティブハイブリッド形成
Zhangら、Kidney  International、56：549-558（1999）は、PCRに基づくサブトラクション法により、５／６腎摘出（部分的腎摘出）マウスの腎臓中でアップレギュレートした遺伝子を同定した。十の既知の遺伝子および９の新規の遺伝子が同定された。究極の目的は、腎糸球体の過剰ろ過および肥大に関与する遺伝子を同定することであった。
Meliaら、Endocrinol.、139：688-95（1998）は、マウス腎中のアンドロゲン調節遺伝子の同定のために、サブトラクティブハイブリッド形成法を適用した。処置したマウスは、ジヒドロテストステロン、アンドロゲンを投与した。腎アンドロゲン調節タンパク質遺伝子は、ＤＨＴによってアップレギュレートされていることが知られているので、正の対照として使用した。
Hollandら、抄録607、「ウシ成長ホルモン遺伝子組換えマウスの腎障害に関与する可能性のある遺伝子の同定」（内分泌研究会議、2000年6月22日）およびCoschiganoら、抄録333、「糖尿病において腎保護に潜在的に関与する遺伝子の同定」（内分泌研究会議、2000年6月22日）も参照。
【０００９】
下記のディファレンシャルハイブリッド形成の論文も興味深い：
Wadaら、「糸球体硬化症をおこしているストレプトゾトシン糖尿病マウス腎における遺伝子発現プロフィール」、Kidney  Int.、59：1363-73（2001）；
Songら、「ラットmuncl3Sに相同的なヒト腎中の新規遺伝子のクローニング：糖尿病腎障害におけるその潜在的な役割」、Kidney  Int.、53：1689-95（1998）；
Pageら、「ディファレンシャルディスプレイを使用した糖尿病関連腎臓遺伝子の単離」、Biochem.Biophys.Res.Comm.、232：49-53（1997）；
Peradi、「サブトラクティブハイブリダイゼーションの要求：糖尿病腎障害において過剰発現したmRNAを検出するための効果的な技術」、Kidney  Int.、53：926-31（1998）；
Condorelli、EMBO  J.、17：3858-66（1998）。
WO00/66784（褐色脂肪組織におけるディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニング）；2000年5月5日出願、PCT/US00/12366（肝臓における、ディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニング）も参照。
【００１０】
高インシュリン血症およびタイプＩＩ糖尿病にかかわる遺伝子の同定
高脂肪食が、実験動物において肥満およびタイプＩＩ糖尿病の両方を誘発することが示されてきた（13）。Surwitおよびその同僚は、オスC57BL/6Jマウスが、離乳時から開始すると、高脂肪食の糖尿病誘発性効果に非常に感応性であることを示した。６ヶ月の月齢で高脂肪食動物が、空腹時血中グルコースおよびインシュリンレベルが上昇し、かつインシュリン感応性が減少することも示した（14）。Ahrenおよびその同僚（15）は、12週間の高脂肪食を与えた後、減少したグルコース刺激インシュリン放出と同様にインシュリン耐性の証拠を報告した。これらのマウスは、総コレステロール、トリグリセリド、および遊離脂肪酸の上昇したレベル、他のタイプＩＩ糖尿病の証拠も示した。
我々の注目は最近、肝mRNA発現プロフィールの生成ならびに、肥満誘導高インシュリン血症およびタイプＩＩ糖尿病の起源に関与する遺伝子の同定に、焦点を合わせている。今日まで、疾患が進行するにつれて上方制御または下方制御された遺伝子を同定しようとする試みの中で、正常状態から高インシュリン血症へもしくは高インシュリン血症からタイプＩＩ糖尿病への正確な進行を研究するための試みは誰もしていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
糖尿病誘導糸球体硬化症に関与する遺伝子を同定しようとする今までの研究は、ディファレンシャルディスプレイおよび従来のサブトラクティブハイブリダイゼーション技術が使用されていた（16-20）。少数の遺伝子（たとえばhmunc13、PED/PEA-15、乳酸脱水素酵素、アミロライド感受性ナトリウムチャンネル、ユビキチン様タンパク質、mdr1、およびアミロイドタンパク質前駆体、少数の新規の遺伝子も同様）の同定については効果的である一方で、これらの技術は完全に労働集約的である。サブトラクティブハイブリダイゼーションのＰＣＲに基づく方法は、少なめの出発物質を必要とし、そして二つのグループ（上方制御および下方制御）にすべての差次的に発現したｃＤＮＡを同時に分離する。
しかしながら、サブトラクティブハイブリダイゼーションのＰＣＲに基づく方法は、やはり完全に労働集約的で、多くの誤った陽性候補を生成し、究極的には比較的有限の数の差次的に発現した遺伝子の同定に帰する（Kelderl-米国特許出願参照）。
同時に分析できる遺伝子の数を増やすために、いくつかのグループはＤＮＡマイクロアレイ解析を利用して、正常および疾患状態の間の遺伝子発現の差を測定し始めている。しかしながら、これらの実験は、分析された実験条件の数に関して制限されている。ＤＮＡマイクロアレイ分析は正常、肥満および糖尿病マウスについてなされている（21）。また、実験されたマウスモデルにおける肥満および糖尿病は、特異的な内因性遺伝子変異体によって作られたものである（22）。上記のモデルで差次的に発現した遺伝子は、食餌誘導肥満およびタイプＩＩ糖尿病によって発現した遺伝子とは非常に異なる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
ディファレンシャルハイブリダイゼーション技術は、高インシュリン血症またはタイプＩＩ糖尿病の発生に依存している、マウスにおいて差次的に発現したマウス遺伝子を同定するために使用されている。
本質的に、正常マウス、高インシュリン血症のマウスモデルまたはタイプＩＩ糖尿病のマウスモデル由来の相補的ＲＮＡが、特定のマウス遺伝子、各遺伝子は言い換えると特定のマウス遺伝子群（単一遺伝子）にそれぞれ特異的であるオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションについてスクリーニングされた。差次的に発現したマウス遺伝子（正常対高インシュリン血症、高インシュリン血症対糖尿病、または、正常対糖尿病）が、そのマウス遺伝子に対応する特有のプローブを用いて各ｃＲＮＡ試料のハイブリダイゼーションの異なるレベルを測定することによって、同定された。対応するヒト遺伝子およびタンパク質が、マウス遺伝子またはタンパク質と配列比較することによって、同定された。
関連するヒト遺伝子およびタンパク質を同定した後、高インシュリン血症に対してまたはタイプＩＩ糖尿病に対して進行の危険性があるヒトのスクリーニングにおいて有用な薬剤を考案することができる。
進行は正常から高インシュリン血症へ、そしてそこから高インシュリン血症からタイプＩＩ糖尿病へなので、哺乳類の被験者を、高インシュリン血症をもった被験者に比して正常な被験者の方が同程度に好ましく、また、タイプＩＩ糖尿病をもった被験者よりも高インシュリン血症をもった被験者の方がより好ましいと定めることができる。被験者の状態は、その遺伝子発現活性に関連することができる。
【００１３】
このため、「好ましい」ヒト遺伝子／タンパク質を、対照の肝臓よりも高インシュリン血症である肝臓のマウスで弱く発現しているか、高インシュリン血症の肝臓よりもタイプＩＩ糖尿病の肝臓のマウスで弱く発現している、マウス遺伝子に対応しているものとして定めることができる（対照の肝臓は、空腹時インシュリンおよび空腹時グルコースレベルに関して、正常のマウスの肝臓である。用語「正常」は、ここでは、パラメーターについて正常であり、あらゆる面においてマウスが正常であることを強いるものではない）。同様に、「好ましくない」ヒト遺伝子／タンパク質を、対照の肝臓よりも高インシュリン血症の肝臓のマウスで強く発現しているか、高インシュリン血症の肝臓よりもタイプＩＩ糖尿病の肝臓のマウスで強く発現している、マウス遺伝子に対応しているものとして定めることができる。
【００１４】
ここで使用したように、用語「対応する」は同一であることを意味するものではなく、統計的に有意の配列相同性の存在を含意するものであり、たとえば、以下に定義するような相同的なタンパク質またはＤＮＡとしてのヒトタンパク質または遺伝子として認定できるようなものである。このように定義した関係の程度が大きくなればなるほど（すなわち、Ｅ値によって測定して、ヒトタンパク質または遺伝子にマウスｃＤＮＡを結びつけるために使用される各アラインメントの統計的な有意性による）、対応は近接する。この関連は直接的（ヒトタンパク質に対するマウス遺伝子）であることがき、または間接的（たとえば、ヒト遺伝子に対するマウス遺伝子、ヒトタンパク質に対するヒトタンパク質）であることができる。「マウス遺伝子」とは、我々がそこから問題となるＤＮＡチップＤＮＡが分離できるマウス遺伝子を指す。
【００１５】
一般的に、直接的にしろ間接的にしろ、マウス遺伝子にもっとも深く相当するヒト遺伝子／タンパク質が好ましく、たとえば最も高いか、二番目まで高いか、三番目まで高いか、四番目まで高いか、五番目まで高いか、十番目まで高い、結合処理における最終アラインメントについてのＥ値のものである。我々のマウスｃＤＮＡクローンに対応するものと考えられるヒト遺伝子／タンパク質は、マスターテーブル中に同定されている。
正常またはタイプＩＩ糖尿病の肝臓よりも、高インシュリン血症の肝臓においてより強く発現している（すなわち、Ｃ＜ＨＩ、ＨＩ＞Ｄ）マウスｃＤＮＡに対応するヒト遺伝子／タンパク質は、対照：高インシュリン血症の比較に基づいて「好ましくなく」、かつ高インシュリン血症：糖尿病の比較に基づいて「好ましい」とともに考えることができる。これは、いくつかの可能な「混合性の」発現パターンのうちの一つである。
【００１６】
このため、「好ましいもの」を完全にか部分的にか、さらに分割することができる。同様に、好ましくないものを完全にか部分的にか、さらに分割することができる。「混合性の」発現パターンをもった遺伝子／タンパク質は、定義によれば、部分的に好ましくかつ部分的に好ましくないものである。一般的に、完全に好ましいかまたは完全に好ましくない遺伝子／タンパク質の使用は、部分的に好ましいかまたは部分的に好ましくない遺伝子／タンパク質の使用よりも好まれる。
「好ましい」および「好ましくない」核酸に結合する薬剤（たとえば、この薬剤は、実質的に相補的な核酸ハイブリダイゼーションプローブ）、または対応するタンパク質に結合する薬剤（たとえば、タンパク質に対する抗体）は、ヒト被験者がタイプＩＩ糖尿病について進行の危険が増大しているか減少しているかについて評価するために使用することができる。一またはそれ以上の増大した「好ましくない」および／または一またはそれ以上の抑制された「好ましい」遺伝子／タンパク質をもった被験者は、増加した危険にあり、そして一またはそれ以上の増大した「好ましい」および／または一またはそれ以上の抑制された「好ましくない」遺伝子／タンパク質をもった被験者は、減少した危険にある。さらに試験の際、被験者がインシュリン血症について正常かあるは高インシュリン血症であるかを考慮に入れることができる。被験者が非糖尿病かつインシュリン血症について正常である場合、特に、高インシュリン血症の肝臓対正常の肝臓で差次的に発現しているマウス遺伝子に対応する、「好ましい」および「好ましくない」遺伝子／タンパク質に関心がある。被検者がすでに高インシュリン血症の場合で、まだ非糖尿病の場合、特に、タイプＩＩ糖尿病の肝臓対高インシュリン血症の肝臓で差次的に発現しているマウス遺伝子に対応する、「好ましい」および「好ましくない」遺伝子／タンパク質に関心がある。
この試験は、さらなる臨床試験をするための被験者を選択する予備スクリーニング試験として、または正式の臨床試験として、使用することができる。
【００１７】
関連する遺伝子およびタンパク質の同定もまた、これらの疾患からヒトを保護するために有用であることができる。
このため、出願人は以下を企図している：
（１）関連するヒトＤＮＡを単離または同定するための、マスターテーブル（下記）の「好ましい」マウスＤＮＡの使用；
（２）対応するヒトタンパク質を発現するための、好ましいマウスＤＮＡに関連する、ヒトＤＮＡの使用；
（３）疾患に対して予防するための、対応するヒトタンパク質（および、ヒトにおいて生物学的に活性の場合は、マウスタンパク質）の使用；
（４）診断薬における、高インシュリン血症またはタイプＩＩ糖尿病の進行度を測定するための試験における、もしくは疾患に対する予防における、または腎臓のダメージといった関連する終末器官のダメージを見積もるための、対応するマウスまたはヒトタンパク質、またはマウスもしくはヒト由来の核酸プローブの使用；ならびに
（５）疾患を予防するための、遺伝子治療における治療的な対応するヒトまたはマウス遺伝子の使用。
【００１８】
さらに出願人は以下を企図している；
（１）関連するヒトＤＮＡを単離または同定するために、マスターテーブル（下記）の「好ましくない」マウスＤＮＡの使用；
（２）関連するヒトＤＮＡの発現を阻害するためのアンチセンス分子としての、「好ましくない」マウスＤＮＡまたは関連するヒトＤＮＡに対する補体の使用；
（３）対応するマウスまたはヒトタンパク質を発現するための、マウスまたはヒトＤＮＡの使用；
（４）診断薬における、高インシュリン血症またはタイプＩＩ糖尿病の進行度を測定するための試験における、もしくは疾患に対する予防における、または腎臓のダメージといった関連する終末器官のダメージを見積もるための、対応するマウスまたはヒトタンパク質の使用；
（５）ある物質がタンパク質に結合する（すなわち中和することができる）か否かを判定するための試験における、対応するマウスまたはヒトタンパク質の使用；ならびに
（６）疾患を予防するための、中和物質の使用。
関連するヒトＤＮＡは、マウス配列（またはそのＡＡ翻訳生成物）を既知のヒトＤＮＡ（およびそのＡＡ翻訳生成物）と比較することによって同定することができる。これが成功しない場合は、プローブとしてマウスＤＮＡを使用して、ヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
被験者
マウスは、空腹時血漿インシュリンレベルにかかわらず、空腹時血漿グルコースレベルが少なくとも190mg/dLである場合、糖尿病被験者と考えられている。マウスは、空腹時血漿インシュリンレベルが少なくとも0.67ng/mLであり、かつ糖尿病被験者として認定されない場合、高インシュリン血症被験者と考えられている。マウスは、糖尿病でも高インシュリン血症でもない場合、「正常」であると考えられている。このため、正常は非常に限定した方法で定義されている。
マウスは、その年齢および性別のマウスについての平均重量を少なくとも15％過剰な場合、「肥満」と考えられている。この基準を満たさないマウスは、「非肥満」と考えることができ、用語「正常」は、前記のようにグルコースおよびインシュリンレベルに関して使用することに留保される。
ヒトは、空腹時血漿インシュリンレベルにかかわらず、空腹時血漿グルコースレベルが少なくとも126mg/dLである場合、糖尿病被験者と考えられている。ヒトは、空腹時血漿インシュリンレベルが少なくとも26マイクロ国際単位/mL（これは1.08ng/mLに相当すると考えられている）以上であり、かつ糖尿病被験者として認定されない場合、高インシュリン血症被験者と考えられている。ヒトは、糖尿病でも高インシュリン血症でもない場合、「正常」であると考えられている。このため、正常は非常に限定した方法で定義されている。
ヒトは、ボディマス指数（ＢＭＩ）（体重を身長の２乗で割ったもの）が少なくとも30kg/m２の場合、「肥満」と考えられている。この基準を満たさないヒトは、「非肥満」と考えることができ、用語「正常」は、前記のようにグルコースおよびインシュリンレベルに関して使用することに留保される。
ヒトは、ＢＭＩが少なくとも25kg/m２の場合に過体重と考えられている。このため、我々は、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（NIDDK）の提言に従って、過体重が肥満を包含するものと定義する。この基準を充足しないヒトは、「非過体重」とみなすことができる。
【００２０】
真性糖尿病の診断および分類についての専門委員会の報告、Diabetes  Care  20：1183-97（1997）、によれば、下記のものがタイプＩＩ糖尿病についての危険因子である。
加齢（たとえば、少なくとも45；下記参照）
過体重（下記参照）
真性糖尿病患者の一親等血縁者
高リスク民族集団（黒人、ラテンアメリカ、先住アメリカ人、アジア人）の構成員
妊娠糖尿病の病歴または9ポンド（4.032kg）以上の体重の新生児の分娩
高血圧（＞140/90mmHg）
HDLコレステロールレベル＞35mg/dL（0.90mmol/L）
中性脂肪レベル≧250mg/dL（2.83mmol/L）
【００２１】
このため、好適な実施の形態において、本発明の診断および予防方法は、上述の危険因子の一またはそれ以上を呈しているヒト被験者に適応される。同様に、好適な実施の形態において、本発明の診断及び予防方法は、糖尿病ではないが、障害性のグルコースホメオスタシス（110から126mg/dLまで）を呈している、ヒト被験者に適応される。
糖尿病のリスクは加齢にともなって増大する。このため、連続的な好適な実施の形態において、被験者の年齢は少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、そして少なくとも75である。
過体重に関して、NIDDKは「糖尿病の相対危険度は、22をこえてBMIが一単位増加するごとに約25％増大する」と述べている。このため、連続的な好適な実施の形態において、ヒト被験者のBMIは、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25（すなわち、我々の基準で過体重）、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、（すなわち、肥満）少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、または40超である。
【００２２】
興味のある遺伝子／タンパク質
好ましい遺伝子／タンパク質は、正常肝臓よりも高インシュリン血症肝臓において、または高インシュリン血症肝臓に比してタイプＩＩ糖尿病肝臓において、より低い強さで発現した遺伝子に対応するものである。好ましくない遺伝子／タンパク質は、正常肝臓よりも高インシュリン血症肝臓において、または高インシュリン血症肝臓に比してタイプＩＩ糖尿病肝臓において、より大きな強さで発現した遺伝子に対応するものである。
混合遺伝子／タンパク質は、好ましいおよび好ましくない性質の組み合わせを示すものである。混合遺伝子／タンパク質は、好ましい性質が好ましくない性質を上回る場合に、好ましい遺伝子／タンパク質であるかのように使用することができる。混合遺伝子／タンパク質は、好ましくない性質が好ましい性質を上回る場合に、好ましくない遺伝子／タンパク質であるかのように使用することができる。好ましくは、好ましいおよび好ましくない性質のバランスに影響する他の薬剤との組み合わせで、遺伝子／タンパク質が使用される。混合遺伝子／タンパク質の使用は、一般的に、純粋に好ましいかまたは純粋に好ましくない遺伝子／タンパク質よりも低い価値である。
差次的に発現した各遺伝子について、マスターテーブルに記載するように、対応するマウスおよびヒトタンパク質が同定されている。
【００２３】
同定された核酸の直接的および間接的使用
配列および関連する分子
マウスまたはヒト遺伝子（またはこれらのフラグメント）を直接使用することができる。診断またはスクリーニングの目的のために、これら（またはこれらの特異的結合フラグメント）を標識化し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。治療のの目的のため、これら（またはこれらの特異的結合フラグメント）を、アンチセンス試薬として、対応する遺伝子の、または他の種の十分に相同的な遺伝子の、発現を抑制するために使用することができる。
各プローブはマウス遺伝子の完全長を代表するものなので、すなわち、完全な、機能タンパク質をコード化するものなので、前記タンパク質の発現において使用することができる。同様に、対応するヒト遺伝子が完全長で既知の場合、ヒトタンパク質を発現するために使用することができる。このような発現は、細胞培養中であることができ、タンパク質は引き続いて単離されてから、その利益を享受する被検者に体外から投与されるか、またはインヴィヴォ、すなわち遺伝子治療により投与される。天然には、同一のタンパク質を、または所望の活性を保持しているフラグメントもしくは変異タンパク質をコード化している任意のＤＮＡを、同一の目的で使用することができる。コード化されたタンパク質はもちろん、遺伝子治療に、および標識化されまたは不動化された形で診断に、有用性をもつ。
遺伝子は間接的にも使用することができ、すなわち、他の有用なＤＮＡ、タンパク質、または他の分子を同定するために使用することができる。
【００２４】
このため、興味のあるヒトタンパク質相同体をデータベース検索によって同定することができる方法がいくつかあり、以下を含む：
１）マウス遺伝子に密接に関係のあるデータベースＤＮＡの、ＤＮＡ→ＤＮＡ（BlastN）検索が既知のヒト遺伝子を同定し、そしてヒトタンパク質の配列が遺伝暗号によって推論される；
２）マウス遺伝子の翻訳ＤＮＡに密接に関係のあるデータベースタンパク質の、ＤＮＡ→タンパク質（BlastX）検索が、既知のヒトタンパク質を同定する；および
３）マウスタンパク質の配列が既知もしくは遺伝暗号によって推論され、そして密接に関係のあるデータベースタンパク質の、タンパク質→タンパク質（BlastP）検索が既知のヒトタンパク質を同定する。
既知のヒト遺伝子がひとたび同定されると、他のヒト遺伝子またはタンパク質を同定するために、さらなるBlastNまたはBlastX検索において使用することができる。既知のヒトタンパク質がひとたび同定されると、他のヒトタンパク質を同定するために、さらなるBlastP検索において使用することができる。
検索は、中間的に、マウスまたはヒトの遺伝子もしくはタンパク質ではない既知の遺伝子もしくはタンパク質も認識することができ、たとえば、マウス配列を使用して既知のラット配列を同定し、そしてそのラット配列を使用してヒト配列を同定する。
このため、マウス遺伝子をすでに同定していて、これがヒトタンパク質に類似していると考えられるマウスタンパク質をコード化している場合、次に、マウスにおけるマウスタンパク質の提案されている使用と類似している目的のために、このヒトタンパク質を（特にヒトにおいて）用いることができる。さらに、対応するヒト遺伝子またはｃＤＮＡの適切な鎖の特異的結合フラグメントを、標識化してハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる（特に、ヒトｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの試料に対して）。公開された遺伝子が既知のＤＮＡ（および既知のタンパク質に対するその翻訳したＡＡ配列）に有意な類似性をもつか否かを決定するに際し、一般的には配列データベースを検索するのに、クエリー配列として前記公開された遺伝子を用いる。このような検索のいくつかの結果を実施例中に示す。このような結果は、ある程度、検索パラメーターに依存する。好ましいパラメーターを、実施例１に示す。この結果は、データベースの内容にも依存する。個々の標的（データベース）配列の未加工の類似性スコアは、内容によっては（データベース中にあり続ける限りは）変化しない一方で、その情報値（二進法）、期待値、および相対順位は変化しうる。一般的にいうと、この変化は小さい。
【００２５】
核酸およびタンパク質データベースが成長し続けていると認めることができる。このため、最近の研究によって、以前はデータベースの内容にはなかったために早期の研究によっては発見することができなかった高いスコアの標的配列を、同定することができる。
このため、好適な実施の形態では、同種のＤＮＡおよびタンパク質は、実施例において示したもののみではなく、本出願の出願日における同一のパラメーターによる実施検索によって高くランキングされたもの（上位１０、好ましくは上位３、より好ましくは上位２、さらに好ましくは上位１）も含む。
既知のヒトDＮＡが部分的なＤＮＡであることが明らかな場合、全長DＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。部分的なDＮＡが生物学的に同種のタンパク質の機能的フラグメントである場合、全長DＮＡと類似の方法で使用することができ、すなわち、機能的なフラグメントを生成するために使用することができる。
タンパク質または他の分子の拮抗物質が有用であると指摘した場合、するとそのような拮抗物質は、下記のような、潜在的な拮抗物質の組み合わせライブラリーを調製し、問題となっている前記タンパク質または他の分子と結合するライブラリーメンバーをスクリーニングすることで得ることができる。結合メンバーを、次に、標的物質の生物活性と拮抗する能力についてさらにスクリーニングする。拮抗物質は、治療的に、または、適切に標識化しもしくは固定化した形で、診断上、利用することができる。
同定したDＮＡが既知のタンパク質に関連がある場合、すると前記タンパク質と相互作用すると知られている物質（たとえば、作用薬、拮抗物質、基質、受容体、セカンドメッセンジャー、調節因子、その他）、および前記物質に結合する結合分子もまた、有用である。このような結合分子は同様に、組み合わせライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。
【００２６】
プローブとして部分DＮＡを利用した全長ｃDＮＡの単離
本発明のDＮＡが部分DＮＡであり、同種の全長DＮＡが配列データベースに記載されていないと決定された場合、利用できるDＮＡは、適切なｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡを単離するために、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
厳しいハイブリダイゼーション条件が適切であり、すなわち、完全な二本鎖ｃＤＮＡのTmよりもハイブリダイゼーションの温度が5-10℃低い。
ｃＤＮＡプローブ用いた相同的な遺伝子／ｃＤＮＡの同定および単離
利用できる配列データベースに任意の相同的な遺伝子の配列、または少なくとも興味のある種についての相同的な遺伝子が含まれないことがある。しかしながら、前記ｃＤＮＡが与えられれば、相同的な遺伝子を容易に得ることができる。
一のＤＮＡ（開始ＤＮＡ）の所有により、相同的な遺伝子／ｃＤＮＡの単離が大きく促進される。部分的なＤＮＡのみが既知の場合、この部分的なＤＮＡは、まず同一種についての対応する全長ＤＮＡを単離するプローブとして使用されることができ、そして、この対応する全長ＤＮＡは相同的な遺伝子の検索において開始ＤＮＡとして使用することができる。
この開始ＤＮＡ、またはその断片は、完全に相同的なタンパク質もしくはその認識できる断片のいずれかをコード化している挿入断片を含むｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリーを、スクリーニングするプローブとして、使用される。選択性における必要度によって、このハイブリダイゼーションプローブの最短長は決定される。前記ライブラリーの塩基での長さがＬで、そしてＧＣ含量が５０％ならば、プローブは少なくとも長さｌであり、ここでＬ＝４ｌ
である。これは、平均して、Ｌ塩基の無作為のＤＮＡに、単一の完全に合致するものを生じる。ヒトｃＤＮＡライブラリーは約１０８塩基であり、ヒトゲノムＤＮＡライブラリは約１０１０塩基である。
前記ライブラリは、好ましくは、相同的なタンパク質を産生するという生物学的に明らかな証拠によって知られている生物由来のものであり、より好ましくは、前記タンパク質の比較的高生産者である可能性が高い生物の細胞のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ由来のものである。ｃＤＮＡライブラリ（ｍＲＮＡライブラリ由来のもの）が特に好ましい。
【００２７】
問題となる生物のコドンプリファレンスが、関連するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが既知である生物のコドンプリファレンスとは実質的に異なることが知られている場合、同一のアミノ酸をコード化しているが、コドンの利用が前記標的生物のＤＮＡにより類似である、合成ハイブリダイゼーションプローブを利用することができる。もう一つの方法として、前記合成プローブは、もっとも不一致であると考えられる塩基の代わりとしてイノシンを利用することができ、または前記プローブは、標的生物の好ましいコドン（同一のアミノ酸をコード化している）と原料ＤＮＡのためのコドンを混合した混合プローブであることができる。
所定の方法によって、開始ＤＮＡの完全な二本鎖のＴｍが決定される。次に、開始ＤＮＡとは異なる標的ＤＮＡに対して、開始ＤＮＡ（または他のプローブ）をハイブリダイゼーションさせることを可能にする完全な二本鎖のＴｍより低いハイブリダイゼーション温度を選択することができる。配列の１％の相違によって通常二本鎖のＴｍは１−２℃低下し、そして異なる種の相同的なタンパク質をコード化しているＤＮＡは通常約50−80％の配列同一性をもつ。好ましくは、前記ライブラリは温度が少なくとも20℃で、より好ましくは少なくとも50℃で、完全な二本鎖Ｔｍよりも低い条件でスクリーニングされる。塩はＴｍを低下させるので、高度に相同的なタンパク質をコード化しているＤＮＡの検索を実施するときには、比較的低い塩のハイブリダイゼーション条件、たとえば1ＭのNaCl以下で行う。塩の濃度が高くなればなるほど、および／または温度が低くなればなるほど、容認できる配列の相違性も大きくなる。
他の種における相同的な遺伝子を同定するためのプローブの使用のために、たとえば、Schwinnら、J.Biol.Chem.、265:8183-89（1990）（ハムスターの67bpｃＤＮＡプローブ対ヒト白血球ゲノムライブラリ；ヒト0.32kbＤＮＡプローブ対ウシ脳ｃＤＮＡライブラリ、ともに6xSSC中42℃でハイブリダイゼーション）；Jenkinsら、J.Biol.Chem.、265:19624-31（1990）（トリ770bpｃＤＮＡプローブ対ヒトゲノムライブラリ；50％ホルムアミドおよび5xSSC中40℃でハイブリダイゼーション）；Murataら、J.Exp.Med.、175:341-51（1992）（1.2-kbマウスｃＤＮＡプローブ対ヒト好酸球ｃＤＮＡライブラリ；6xSSC中65℃でハイブリダイゼーション）、Guyerら、J.Biol.Chem.、265:17307-17（1990）（2.95-kbヒト遺伝子ＤＮＡプローブ対ブタゲノムＤＮＡライブラリ；5xSSC中42℃でハイブリダイゼーション）も参照。これらの論文に示された実験条件は、相同的な遺伝子の単離目的に適しているとそれぞれ考えることができる。
【００２８】
相同的なタンパク質およびＤＮＡ
ヒトタンパク質は、以下の場合にマウス遺伝子に相同的である（そしてそのためこのような遺伝子に「対応している」）として識別可能であるということができる。
（１）その配列は、以下に述べるデフォルトパラメータを用いたBlastXを用いてマウス遺伝子に並ぶことができ、そして前記配列の期待値（Ｅ）（このような配列の可能性は偶然によってのみおこるであろう）はe-10より小さい。
（２）その配列は、以下に述べるデフォルトパラメータを用いたBlastXを用いてヒト遺伝子に並ぶことができ、そして前記ヒト遺伝子のｃＤＮＡは以下に述べるデフォルトパラメータを用いたBlastXを用いてマウス遺伝子に並ぶことができ、そして両者配列の期待値Ｅはe-10より小さい。
（３）その配列は、以下に述べるデフォルトパラメータを用いたBlastPを用いてマウスタンパク質に並ぶことができ、そして前記マウスタンパク質は以下に述べるデフォルトパラメータを用いたBlastXを用いてマウス遺伝子に並ぶことができ、そして両方の配列について前記配列の期待値Ｅはe-10より小さい。
天然には、ヒトタンパク質がヒト遺伝子（２）によってコード化されている場合、またはマウスタンパク質がマウス遺伝子（３）によってコード化されている場合、前記BlastX配列は充足される。
好ましくは、これらの条件（１）−（３）の二または三すべてが充足される。
好ましくは、上記配列の任意について、そしてさらに好ましくは上記配列のすべてについて、前記Ｅ値はｅ−１５より小さく、より好ましくはｅ−２０より小さく、さらにより好ましくはｅ−４０より小さく、さらにより好ましくはｅ−６０より小さく、相当に好ましくはｅ−８０より小さく、最も好ましくはｅ−１００より小さい。さらに好ましくは、マウスｃＤＮＡクローンが二またはそれ以上の連続した配列に基づくヒトタンパク質に間接的に結合する条件について、Ｅ値は、結合する鎖における前記配列のすべてについて限定される。
BlastNおよびBlastXは、「0.0」という非常に低い期待値を記録する。これは、期待値が正確にゼロであることを意味するのではなく（任意の配列は偶然発生するため）、非常に小さいために記録されていないだけである。資料は切り捨て値を記述しておらず、e-178（624ビット）といった明示的なＥ値の配列はこのように記録されている一方で、636ビットのスコアは「0.0」と報告されている。
機能的に相同的なヒトタンパク質もまた興味深い。ヒトタンパク質は、マウス遺伝子に以下の場合、機能的に相同的であると言える。（１）以下に述べるデフォルトパラメータを用いたBlastXを用いてマウス遺伝子に並ぶことができ、そして前記配列のＥ値はe-50より小さく、かつ（２）前記ヒトタンパク質は、マウスタンパク質と共通の少なくとも一の生物学的活性をもつ。
興味のあるヒトタンパク質は、上記定義で相同的なおよび／または機能的に相同的なヒトタンパク質と、実質的におよび／または保存的に同一である（以下に定義）。
【００２９】
好ましいおよび好ましくない遺伝子の関連性
遺伝子がより好ましい哺乳動物において下方制御されている、または好ましくない哺乳動物（すなわち、「好ましくない遺伝子」）において上方制御されている場合、いくつかの有用性が明らかである。
第一に、遺伝子の相補的な鎖、またはその部分が、メッセンジャーＲＮＡを検出し、そして被験者における遺伝子の発現レベルをモニターするためのハイブリダイゼーションプローブとして、標識化した形で利用できる。上昇した水準は、好ましくない状態に対して、進行の指標、または進行の性向となり、そして、臨床家は適切な予防、治療、または改善行動をとることができる。
第二に、メッセンジャーＲＮＡ生成物（または相当するｃＤＮＡ）、タンパク質生成物、もしくは前記生成物に特異的である結合分子（たとえば、前記生成物に結合する抗体）、または活性を仲介する下流生成物（たとえば、シグナル伝達中間物）もしくはそのための結合分子（たとえば、抗体）を、好ましくは標識化してまたは固定化して、前記核酸生成物、タンパク質生成物、または下流生成物（たとえば、シグナル伝達中間物）のための測定における検定用試薬として、使用することができる。先と同様、上昇したレベルは、現在または将来の問題の指標となる。
第三に、遺伝子の発現を下方制御する試薬を用いて、対応するタンパク質のレベルを下げ、そしてこのためにさらなる障害を抑制することができる。この試薬は、被験者における遺伝子の転写、または対応するメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害することができる。転写および翻訳の可能な阻害剤には、アンチセンス分子およびリプレッサー分子を含む。前記試薬は、活性に必要な翻訳後の修飾（たとえば、グリコシル化、リン酸化、開裂、ＧＰＩ付加）も阻害することが可能で、または翻訳後にタンパク質を不活化するように修飾することが可能である。あるいは、正のまたは負の調節遺伝子の、下方制御または上方制御であることが、それぞれ可能である。
第四に、前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ生成物またはタンパク質生成物の拮抗物質である作用薬、またはその活性を明示する下流生成物（たとえば、シグナル伝達中間物）の拮抗物質である作用薬を使用して、その活性を阻害することができる。
この拮抗物質は、抗体、ペプチド、ペプトイド、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、組み合わせライブラリが存在するような種類の小さな有機分子（たとえばベンゾジアゼピン）等、であることができる。拮抗物質は単に、結合することによって、その標的の望ましくない活性を減じるかまたは消す結合物質である。前記拮抗物質は、オリゴマー分子でない場合、好ましくは500ダルトン未満である。
第五に、前記メッセンジャーＲＮＡ、そのタンパク質生成物またはその活性を制御する下流生成物（たとえば、シグナル伝達中間物）を、分解し、または分解を助ける薬剤を、前記タンパク質の活性の有効期間を制限するために、使用することができる。
【００３０】
遺伝子がより好ましい哺乳動物において上方制御されている、または好ましくない哺乳動物において下方制御されている場合、すると、有用性は上述したのと逆となる。
第一に、遺伝子の相補的な鎖、またはその部分が、メッセンジャーＲＮＡを検出し、そして被験者における遺伝子の発現レベルをモニターするためのハイブリダイゼーションとして、標識化した形で利用できる。減少した水準が、障害の指標、または障害の性向可能性の指標となり、そして、臨床家は適切な予防、治療、または寛解行動をとることができる。
第二に、メッセンジャーＲＮＡ生成物、相当するｃＤＮＡ、タンパク質生成物、もしくは前記生成物に特異的である結合分子、または下流生成物、もしくはシグナル伝達中間物、もしくはそのための結合分子を、好ましくは標識化してまたは固定化して、前記タンパク質生成物、または下流生成物のための測定における検定用試薬として、使用することができる。先と同様、減少したレベルは、現在または将来の問題の指標となる。
第三に、遺伝子の発現を上方制御する試薬を用いて、対応するタンパク質のレベルを上昇し、そしてこのためにより好ましくない状態を抑制することができる。例として、前記遺伝子のコピーを運ぶベクターであることができるが、しかしこれは内因性の発現システムに比して高い水準で前記遺伝子を発現する。あるいは、正のまたは負の調節遺伝子の、下方制御または上方制御をする試薬であることが可能である。
第四に、前記遺伝子のタンパク質生成物の作用物質である薬剤、またはその（好ましくない状態に対する進行阻害の）活性を明示する下流生成物、またはシグナル伝達中間物を使用して、その活性を助けることができる。
第五に、そのタンパク質生成物もしくは下流生成物もしくはシグナル伝達中間物の分解を抑制する薬剤を、前記タンパク質の活性の有効期間を拡大するために、使用することができる。
【００３１】
変異タンパク質
本発明は、実質的に親タンパク質（ペプチド）と同一（以下に定義）である変異タンパク質（ペプチド）も企図している。一般的に、変異が少なければ少ないほど、変異タンパク質は親タンパク質の活性を保持する。変異の効果は通常（しかし常にではない）付加的である。ある特定の変異は、他に比べて耐容性を示す可能性が高い。
タンパク質は、以下の場合変異に耐容性を示す可能性が高い。
（ａ）挿入または欠失ではなく置換である。
（ｂ）内部よりも末端において挿入または欠失であり、内部の場合は、アルファヘリクスもしくはベータストランドよりも、ドメイン境界またはループもしくはターンにおいてである。
（ｃ）内部の残基よりも、表面の残基に影響を及ぼしている。
（ｄ）結合部位に分子遠位の部分に影響を及ぼしている。
（ｅ）類似の大きさ、電荷、および／または疎水性の他のアミノ酸によって一のアミノ酸を置換していて、そしてジスルフィド結合または他の架橋を破壊していない。および、
（ｆ）興味のあるタンパク質が属している相同的なタンパク質のファミリーの間で、相当な変化を受けている部位である。
これらの考慮を機能的変異を設計するのに使用することができる。
表面対内部の残基
荷電した残基は、ほぼ常にタンパク質の表面に存在する。荷電していない残基について、必然的ではないのだが、一般的に、親水性の残基は表面に分配され、疎水性の残基は内部に分配される。もちろん、表面タンパク質について、膜貫通のセグメントは疎水性残基が豊富であることが多い。
表面残基は、種々の標識化技術、またはＸ線回折およびＮＭＲといった３−Ｄ構造マッピング技術によって、実験的に同定することができる。
結合部位残基
結合部位を形成する残基は、（１）タンパク質がその標的と複合体を作る前後での表面残基の標識化の効果を比較し、（２）親和リガンドによって直接結合部位を標識化し、（３）タンパク質を断片化してからその断片の結合活性について試験し、そして（４）どの変異が結合を破壊するかを決定するための系統的な突然変異誘発（たとえば、アラニンスキャン突然変異誘発）によって、同定することができる。相同的なタンパク質の結合部位が既知の場合、前記結合部位は類似しいていると推論できる。
タンパク質ライブラリを構築してスクリーニングすることができ、関連する変異の大きなファミリー（たとえば１０８）を同時に評価することができる。
このため、変異は、好ましくは下記に定義する保存的な修飾である。
【００３２】
「実質的に同一」
変異タンパク質（ペプチド）は、以下の場合に基準タンパク質（ペプチド）と実質的に同一である。（ａ）基準タンパク質の特異的な結合活性または非栄養性の生物学的活性を少なくとも10％もち、および（ｂ）基準タンパク質（ペプチド）とアミノ酸配列が少なくとも50％同一である。（ａ）にかかわらず、条件（ｂ）があてはまる場合、「実質的に同一」である。
アミノ酸の同一性のパーセンテージは、厳密な動的計画法アルゴリズムに従って、変異配列および基準配列を整列化することによって決定される。前記アルゴリズムは、前記配列の相同性を最大化するように全体的に整列化し、前記相同性は、不偏のＰＡＭ２５０マトリックス、および各内的ギャップにつきペナルティーを、ギャップの最初のヌルに−１２、同じギャップの付加的なヌルに−４加えた総計としてスコア化される。同一性のパーセンテージは、基準配列の調節した（すなわち、挿入したヌルをカウントした）長さのパーセンテージとして表現される適合の数である。
変異ＤＮＡ配列および基準配列は、二つとも構造配列かつ、上述のように実質的に同一である変異タンパク質および基準タンパク質をコード化している場合、実質的に同一である。
その代わりに、変異ＤＮＡ配列および基準配列が調節配列の場合、変異ＤＮＡ配列が基準配列の調節活性の少なくとも10％をもち、かつ基準配列に対してヌクレオチド配列の少なくとも50％の同一の場合に、二つは実質的に同一である。同一性のパーセンテージは、マッチが＋５、ミスマッチが−４、ギャップオープンペナルティが−１２、およびギャップエクステンションペナルティ（付加的ヌルにつき）が−４でスコア化されたものを除いたタンパク質について決定される。
好ましくは、実質的に同一な配列は、50％の最低限の同一性を越えていて、たとえば51％、66％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％の配列における同一性である。
ＤＮＡ配列は、厳密な条件下でお互いにハイブリッド形成している場合、すなわち変異ＤＮＡの一の鎖および基準ＤＮＡのより相補的な鎖のヘテロ二重鎖のＴｍが、基準ＤＮＡのホモ二重鎖のＴｍより低さが10℃を越えて場合にも、「実質的に同一」であると考えることができる。一般的には８５−９０％の同一性に相当する。
【００３３】
「保存的な修飾」
「保存的な修飾」は、（ａ）以下に定義するアミノ酸の保存的な置換；または（ｂ）単一もしくは複数の挿入（伸長）または末端におけるアミノ酸の欠損（切断）によって、定義される。
保存的な修飾は、他の修飾よりも好ましい。保存的な置換は、他の保存的な修飾よりも好ましい。
「半保存的な修飾」は、保存的ではないが、（ａ）以下に定義する半保存的な置換；または（ｂ）単一もしくは複数の挿入または欠損が内部的ではあるが、しかし、ドメイン間結合における、ループにおけるまたは比較的高い可動性の他のセグメントにおける、修飾である。半保存的な修飾は、非保存的な修飾よりも好ましい。半保存的な置換は、他の半保存的な修飾よりも好ましい。
非保存的な置換は、他の非保存的な修飾よりも好ましい。
用語「保存的」は、ここでは推測的な意味で使われていて、すなわち、事後承認の、活性を保存すると既に知られている修飾、というよりも、相同的なタンパク質の天然に生じるファミリーおよび計画的な突然変異誘発効果の過去の経験の分析に基づき、立体構造および活性が保存しているように期待されているという意味である。もちろん、推測的に保存的である修飾は、事後承認的に保存的であることもでき、また通常保存的である。
好ましくは、終端を除いて、約５個を越えないアミノ酸が特定の場所に挿入または欠損していて、そして修飾は、活性に対して重要な結合部位を含むと知られている部位の外側である。
好ましくは、挿入または欠損は終端に限られる。
保存的置換は、同一の交換基の一のアミノ酸を他に変える置換であり、前記交換基は以下のように定義される。
Ｉ．Ｇｌｙ、Pro、Ser、Ala（Cys）（および、上述のa.a.のものを越えない疎水性をもった、任意の非生体、中性アミノ酸）
II．Arg、Lys、His（および、任意の非生体、正荷電アミノ酸）
III.Asp、Glu、Asn、Gln（および任意の非生体、負荷電アミノ酸）
IV.Leu、Ile、Met、Val（Cys）（および上記Ｉに対して高い疎水性をもった、任意の非生体、脂肪族、中性アミノ酸）
V.Phe、Trp、Tyr（および上記Iに対して高い疎水性をもった、任意の非生体、芳香族、中性アミノ酸）。
CysはＩおよびIVの両方に属することに注意。
残基Pro、GlyおよびCysは、特別な立体配座の役割をもつ。Cysは、ジスルフィド結合の形成に関与する。Glyは、鎖に柔軟性を与える。Proは、鎖に剛性を与え、αヘリクスを開裂する。これらの残基は、ポリペプチドの特定の部位において必須であることができるが、他では置換可能である。
一、二、または三の保存的な置換が、より大きな数よりも耐容性を示す。
「半保存的置換」は、ここではスーパーグループI/II/IIIの中、またはスーパーグループIV/Vの中ではあるが、I-Vのうちの単一グループの中のみでではない、置換と定義される。「半保存的置換」は、アラニンによる他の任意のアミノ酸の置換も含む。置換が保存的でない場合、好ましくは半保存的である。
「非保存的置換」は、「保存的」または「半保存的」でない置換をいう。
「非常に保存的な置換」は、保存的置換の一部であり、かつ、グループPhe/Tyr/Trp、Met/Leu/Ile/Val、His/Arg/Lys、Asp/GluおよびSer/Thr/Alaの中での交換である。「非常に保存的な置換」は、他の保存的置換よりも耐容性がある。さらに、置換の数が小さければ小さいほど、耐容性でありやすい。
【００３４】
「保存的に同一」
タンパク質（ペプチド）は、もしあったとしても、保存的修飾によってのみ基準タンパク質と異なっていて、前記基準タンパク質（ペプチド）が少なくとも７つのアミノ酸残存長である場合に前記タンパク質（ペプチド）が少なくとも７つのアミノ酸長である場合にのみ、基準タンパク質（ペプチド）に保存的に同一である。
タンパク質は、もしあったとしても、半保存的もしくは保存的修飾によってのみ基準タンパク質と異なっている場合、タンパク質は基準タンパク質（ペプチド）と少なくとも半保存的に同一である。
タンパク質（ペプチド）は、もしあったとしても、一またはそれ以上の保存的修飾および／または単一の非保存的置換によってのみ異なる場合に、タンパク質（ペプチド）は基準タンパク質（ペプチド）とほぼ保存的に同一である。
もしあったとしても、非常に保存的な置換によってのみ異なる場合、非常に保存的な同一性である。非常に保存的な同一性のタンパク質は、単に保存的に同一性のものよりも好ましい。完全に同一性のタンパク質は、さらに好ましい。
基準タンパク質（ペプチド）のコア配列は、一が特定されている場合、そうでない場合は前記基準の特異的結合活性の少なくとも一の、特定の特異的結合活性の少なくとも10％を保持している。基準が一より多い特異的結合活性を持つ場合、一より多いコア配列を持つことができ、そしてこれらは重複することもそうでないこともできる。
本発明のペプチドが、基準タンパク質（ペプチド）に対して特定の類似性の関係を持つ（たとえば、明らかに同一）と教示されている場合、好ましいペプチドは、基準タンパク質（ペプチド）のコア配列に対してそのような関係を持っている配列を構成しているが、しかし内部性の挿入または欠損を各除外した配列中にもつものである。さらに好ましいペプチドは、その全配列が、前記基準タンパク質（ペプチド）のコア配列に対して、前記関係を持っていて、同一の除外をもっているものである。
【００３５】
ライブラリ
用語「ライブラリ」は一般的に、興味のある性質を同時にスクリーニングできる、起源、構造、および／または機能に関する化学的または生物学的実体の収集である。
ライブラリは、それがどのように作成されたか（天然対人工の多様性、組み合わせ対非組み合わせ）、それがどのようにスクリーニングされるか（ハイブリダイゼーション、発現、ディスプレイ）、またはスクリーニングされるライブラリメンバーの性質（ペプチド、核酸、等）により、分類することができる。
「天然の多様性」ライブラリにおいては、すべての多様性は本質的に人の介入なく生じたものである。これは、たとえば、非工学的細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡについてあてはまる。
「合成の多様性」ライブラリにおいては、すべての多様性は本質的に、人の介在によって生じたものである。これは、たとえば、組み合わせのライブラリに当てはまる；低水準の天然の多様性が、自然発生的な変異の結果としても生じることに注意。多様なソースから集められた化合物の非組み合わせのライブラリについても、すべて天然生成物であった場合でも、当てはまる。
「非天然の多様性」ライブラリにおいては、多様性のなかの少なくともいくつかは、人の介在によって意図的に生じる。
「管理された起源」ライブラリにおいては、多様性の原因はいくつかの方法で制限されている。特定の個体の細胞に、特定の種に、もしくは特定の属に、または、さらに複雑には、特定の年齢、性別、健康状態、地理的条件、職業および／もしくは家族関係である特定の種の個体に、制限されている。代わりとしてあるいは付加的に、特定の組織または器官の細胞に制限することができる。または、特定の薬理作用、環境、もしくは病原体にさらした細胞に制限することができる。または、ライブラリは、このような細胞によって産生された化学物質、または化学物質の特定のクラスであることができる。
「管理された構造」ライブラリにおいては、このライブラリのメンバーは、生成条件によって特定の化学構造に意図的に制限したものである。たとえば、オリゴマーの場合、長さが制限されてモノマー成分に制限され、たとえば、遺伝的にコード化された20のアミノ酸から構成されたヘキサペプチドである。
ハイブリダイゼーションライブラリ
ハイブリダイゼーションライブラリにおいては、ライブラリメンバーは核酸であり、核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いてスクリーニングされる。結合した核酸は、次に増幅され、クローニングされ、そして／または配列決定される。
【００３６】
発現ライブラリ
発現ライブラリにおいては、スクリーニングされたライブラリメンバーは遺伝子発現生成物であるが、前記生成物をコード化する遺伝子の根本的なライブラリに言及することもできる。前記ライブラリは、ライブラリメンバー（またはその一部）をコード化しているＤＮＡを発現ベクター（または、続いて発現ベクターを構築するために使用されるクローニングベクター）中にサブクローニングし、各ベクターは特定のライブラリーメンバーをコード化している発現可能な遺伝子を含有し、前記発現ベクターを適切な細胞に導入し、そして発現生成物が生成されるように遺伝子を発現させることによって、作られる。
一の実施例においては、前記発現生成物が分泌されることによって、抗体または受容体といった、親和性試薬を用いて前記ライブラリをスクリーニングすることができる。結合発現生成物を直接配列決定することができ、または、たとえば、少なくともコード化ＤＮＡの可変部を配列決定することによって、配列を推論することができる。
第二の実施例においては、細胞を溶解し、これにより発現物質を露出することによって、親和性試薬によってスクリーニングすることができる。
第三の実施例においては、前記細胞はライブラリメンバーを、細胞表面、または細胞によって産生されるウイルス粒子上に提示することによって提示する（下記の、ディスプレイライブラリ参照）。
第四の実施例においては、スクリーニングは、親和性試薬に結合する発現物質の能力のためにではなく、むしろ特定の検出方法における宿主細胞の表現型を変化させるためである。ここでは、スクリーニングされたライブラリメンバーは形質転換細胞であるが、細胞の行動を仲介する発現物質の第一の根本的なライブラリが存在し、そしてそれらの物質をコード化する遺伝子の第二の根本的なライブラリが存在する。
ディスプレイライブラリ
ディスプレイライブラリ中においては、ライブラリメンバーは、ある種の担体に結合し、そしてその上で提示する。担体は、生物（細胞もしくはウイルス）、または無生物（たとえば、ビーズもしくはプレート）であることができる。
担体が細胞もしくはウイルスの場合、提示は、ライブラリメンバー、細胞もしくはウイルスの表面に融合タンパク質の組込みを可能とする担体成分、および付加的に裏打ち成分から構成される融合タンパク質を発現することによって、通常達成される。このテーマにおける変形においては、ライブラリメンバーおよび結合成分Ｌ１から構成される第一の融合物、ならびに結合成分Ｌ２および担体成分から構成される第二の融合物を同時発現する。Ｌ１およびＬ２は相互作用して、第一の融合物と第二の融合物、そして、間接的に、ライブラリメンバーおよび細胞もしくはウイルスの表面と結びつける。
【００３７】
可溶性ライブラリ
可溶性ライブラリにおいては、ライブラリメンバーは溶液中に遊離している。可溶性ライブラリは、直接生成することができ、またはまずディスプレイライブラリを作成してのちに、ライブラリメンバーをその担体から遊離させることができる。
被包性ライブラリ
被包性ライブラリにおいては、ライブラリメンバーは、細胞またはリポソームの内部にある。一般的にいうと、被包性ライブラリは、将来の使用のためにライブラリーメンバを保管するために使用される。前記メンバーは、スクリーニングする目的のためにいくつかの方法で抽出される。しかしながら、前記メンバーが細胞の表現型に差次的に影響する場合、細胞をスクリーニングすることによって間接的にスクリーニングされる。
【００３８】
ｃＤＮＡライブラリ
ｃＤＮＡライブラリは通常、特定の起源の細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを分画してメッセンジャーＲＮＡを単離し（メッセンジャーＲＮＡはポリ（Ａ）テールをもち、このためオリゴ−ｄＴ親和性クロマトグラフィによって通常なされる）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および他の酵素を使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ｃＤＮＡをベクターにサブクローニングし、そしてベクターを細胞中に導入することによって調製される。しばしば、特定の大きさのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのみが使用されて、ｃＤＮＡが機能的ポリペプチドをコード化しやすいようにする。
ｃＤＮＡライブラリは、特定の起源からの細胞の転写されたＤＮＡの自然な多様性を探索する。これは組み合わせライブラリではない。
ｃＤＮＡライブラリは、ハイブリダイゼーションライブラリを作製するために使用することができ、または発現ライブラリとして（もしくは発現ライブラリを作るために）使用することができる。
ゲノムＤＮＡライブラリ
ゲノムＤＮＡライブラリは、特定の起源からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを断片化し、特定のサイズ幅の断片を分離し、ＤＮＡ断片をベクター中にサブクローニングし、そしてベクターを細胞に導入することによって、作製することができる。
ｃＤＮＡライブラリのように、ゲノムＤＮＡライブラリは自然な多様性のライブラリで、そして組み合わせライブラリではない。ゲノムＤＮＡライブラリは、ｃＤＮＡライブラリと同様の方法で使用することができる。
合成ＤＮＡライブラリ
合成ＤＮＡライブラリは、直接スクリーニングすることができ（ハイブリダイゼーションライブラリ）として、またはペプチド／タンパク質の、発現もしくはディスプレイライブラリの作製において使用することができる。
【００３９】
組み合わせライブラリ
用語「組み合わせライブラリ」は、、個々のメンバーが、基本的要素の限定されたセットの系統的もしくは無作為のいずれかの組み合わせであるもので、各メンバーの性質はそこに組み込まれる要素の選択および配置に依存する。典型的には、前記ライブラリのメンバーは、少なくとも同時にスクリーニングされることが可能である。無作為化が完全または部分であり、いくつかの位置では無作為化されていて、他ではあらかじめ定められていて、そして無作為化された位置では、選択はあらかじめ定められた方法に制限することができる。組み合わせライブラリのメンバーは、ある種のオリゴマーまたはポリマーであることができ、その中では前記オリゴマーまたはポリマーの一またはそれ以上の位置において、単量体成分、および可能ならば連結結合に関して、またはオリゴマーまたはポリマーの長さを選択することによっても差異が生じる。あるいは、メンバーは標準的なコア構造をもった非オリゴマー分子であることができ、1,4−ベンゾジアゼピン構造と同様であり、コア構造の特定の可変部位における置換基の選択によって差異を導入できる。あるいは、メンバーはジグゾーパズルのように構築した非オリゴマー分子であることができるが、しかしここでは、各部分は一またはそれ以上の可変成分（ライブラリ多様性に寄与している）および一またはそれ以上の定常部（問題となっている部分と他の部分を結合するための機能を提供している）の両方をもつ。
このため、典型的な組み合わせライブラリ中では、化学的基礎的要素は少なくとも一部無作為に、他の化合物の多数（10１５にのぼる）に混合し、これらは次に同時的に、一またはそれ以上の標的に対する結合（または他の）活性についてのスクリーニングをされる。
「単なる組み合わせライブラリ」においては、すべてのメンバーは化合物の同一のクラスに属し（例えばペプチド）、そして同時に合成することができる。「複合性組み合わせライブラリ」は、二またはそれ以上の単一ライブラリの混合物であり、たとえば、ＤＮＡおよびペプチド、または、ペプチド、ペプトイドおよびＰＮＡ、または、ベンゾジアゼピンおよびカルバメートである。複合性ライブラリにおける構成する単一ライブラリの数は、通常もちろん、各単一ライブラリ中のメンバーの平均数よりも低く、そうでなければ、個別に合成したものよりもライブラリの有利さは小さくなる。
【００４０】
ランダムな千、あるいは万ものオリゴペプチドのライブラリーが、化学合成によって調製されていて（Houghtenら、Nature、354：84-6（1991））、または遺伝子発現によって調製されていて（Marksら、J  Mol  Biol.、222：581-97（1991））、これはクロマトグラフィー担体上（Lamら、Nature、354：82-4（1991））、細菌細胞中（Colasら、Nature、380：548-550（1996））、細菌線毛上（Lu、Bio/Technology、13:366-372（1990））、またはファージ上（Smith、Science、228:1315-7（1985））に提示されていて、そして、抗体（Valadonら、J  Mol  Biol.、261:11-22（1996））、細胞タンパク質（Schmitzら、J  Mol  Biol.、260:664-677（1996））、ウイルスタンパク質（HongおよびBoulanger、Embo  J、14:4714-4727（1995））、細菌タンパク質（JacobssonおよびFrykberg、Biotechniques、18:878-885：1995）、核酸（Chengら、Gene、171:1-8（1996））、およびプラスチック（Sianiら、J.Chem.Inf.Comput.Sci.、34:588-593（1994））を含む種々の標的への結合をスクリーニングされている。
タンパク質のライブラリ（Ladner、米国特許第4,664,989号）、ペプチトイドのライブラリ（Simonら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、89:9367-71（1992））、核酸のライブラリ（EllingtonおよびSzostak、Nature、246:818（1990））、炭水化物のライブラリ、および有機小分子のライブラリ（Eichlerら、Med  Res  Rev、15:481-96（1995））も、薬剤スクリーニングの目的で調製または提案されている。
第一の組み合わせライブラリは、ペプチドまたはタンパク質で構成されていて、これはすべてのまたは選択されたアミノ酸の位置はランダムにされている。ペプチドおよびタンパク質は、高いおよび特異的な結合活性を示すことができ、そして触媒として作用することができる。従って、ペプチドおよびタンパク質は生物系において非常に重要である。
核酸も組み合わせライブラリに使用されている。その大きな利点は、容易に適切な結合活性をもった核酸が増幅されることである。その結果、核酸によって構成された組み合わせライブラリは低い重複性であることができ、そのため高い多様性であることができる。
【００４１】
小分子に基づいた組み合わせライブラリにも大きな興味が存在し、これは製薬的な利用にさらに適していて、ベンゾジアゼピンのような、有用な薬物をすでに産生しているような化学的分類に属しているものが特にそうである。組み合わせ化学の技術は、これらの標的に作用する小分子を見出すためのもっとも効率的な手段として認識されている。今のところ、小分子組み合わせ化学は、通常の骨格上の機能性の変化する配列を示す、プールされたかまたは分散した分子のいずれかの合成を含む。これらの化合物は、ライブラリにグループ化されて、結合についてまたは生物活性の阻害について、興味の標的に対してスクリーニングされる。
ライブラリの大きさは、その中にある分子の数である。ライブラリの単一の多様性は、その中にある独特の構造の数である。型にはまった最小または最大の多様性はない。ライブラリーが非常に低い多様性をもつ場合、そのライブラリは、ただ合成してメンバーを個々にスクリーニングするのに比べて有利性はない。ライブラリが非常に高い多様性の場合、少なくともプロセスを自動化しない限り、扱うのに不利である。ライブラリの単一多様性の数は、好ましくは少なくとも10、10E2、10E3、10E4、10E6、10E7、10E8または10E9であり、ほとんどの環境下では、高ければ高いほどよい。単一多様性は通常、10E15を越えず、かつ、もっと通常では10E10を越えない。
平均サンプリング水準は、単一多様性によって除したサイズである。平均サンプリングレベルの期待値は、ライブラリ設計の結果として、特定の構造が存在すると期待される場合には、前記構造がスクリーニング基準を充足する場合、平均サンプリングレベルの実測値が十分高いためにライブラリをスクリーニングしたとき正の結果を生ずるよう、適切な保証を供するに十分な高さでなければならない。このため、好ましい平均サンプリングレベルは、検出限界の機能であり、言い換えると、スクリーニングされるシグナルの強度としての機能である。
単一の多様性よりも複雑な、多様性の指標が存在する。種々の独特な配列間の、構造的な相違の程度を考慮するよう試みている。これらのより複雑な指標は通常、有機小化合物ライブラリのコンテキストとして使用される。下記参照。
【００４２】
前記ライブラリメンバーは溶液中の溶質として存在することができ、またはある種の担体上に固定化される。後者においては、担体は生命体（細胞、ウイルス）または非生命体（ビーズ、プレート、等）であることができる。前記担体は、結合もしくは非結合メンバーが分離できるよう分離可能であることができ（複数の細胞、ウイルス粒子、ビーズ）、または分離不可能であることができる（プレート）。後者の場合、メンバーは通常、担体上のアドレス可能な位置に置かれる。可溶性ライブラリの有利な点は、前記担体と前記メンバの結合を阻害する可能性のあるキャリア成分が存在しないことである。固定化ライブラリの有利な点は、正のメンバーの構造を同定するのが容易なことである。
可溶性ライブラリをスクリーニングする場合、または分離可能な担体とともにスクリーニングする場合、前記標的は通常固定化される。分離できない担体上でライブラリをスクリーニングする場合、前記標的は通常標識化される。
【００４３】
オリゴヌクレオチドライブラリ
オリゴヌクレオチドライブラリは組み合わせライブラリで、そのメンバーの少なくとも一部は、リン酸ジエステル結合または類似の結合によって結合した三またはそれ以上のヌクレオチドをもつ一本鎖ヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドは、直鎖状、環状または分枝であることができ、そして非核酸成分を含むことができる。前記ヌクレオチドは、通常ＤＮＡまたはＲＮＡに見出されるヌクレオチドに限定されない。ヌクレアーゼ耐性およびアプタマーの化学的安定性を増すように修飾したヌクレオチドの例として、OsborneおよびEllington、Chem.Rev.、97:349-70（1997）の第一章を参照。ＲＮＡのスクリーニングのために、EllingtonおよびSzostak、Nature、346:818-22（1990）を参照。
これらのオリゴヌクレオチドについて型にはまった最小または最大サイズは存在しない。しかしながら、塩基長が長くなるに従って、オリゴヌクレオチドがもつと想定できるコンホメーションの数は、指数関数的に増大する。このため、より長いオリゴヌクレオチドは、タンパク質表面に適応することができるよう、自身を折り畳むことができやすい。他方、非常に長い分子を合成およびスクリーニングできる一方で、これらが短い分子の親和性に比べて優れた親和性を持つにもかかわらず、選択された集団の中には見出されにくく、この理由はOsborneおよびEllington（1997）によって説明されている。このため、本発明のライブラリは、好ましくは3ないし100塩基長、より好ましくは15ないし35塩基長をもつオリゴヌクレオチドから構成される。与えられたライブラリ中のオリゴヌクレオチドは、同一の長さまたは異なる長さであることができる。
【００４４】
オリゴヌクレオチドライブラリは、非常に高い多様性（たとえば、１０１５）のライブラリが可能であり、結合分子はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって試験管中に容易に増幅することができるという有利性がある。さらに、核酸分子は、非常に高い特異性および親和性を標的に対してもつ。  
好適な実施の形態において、本発明は、KingおよびFamulok、Molec.Biol.Repts.、20：97-107（1994）；L.Gold、C.Tuerk.核酸リガンドの調製法、US#5595877；Oliphantら、Gene44:177（1986）に記述のように、ＳＥＬＥＸ法によってオリゴヌクレオチドライブラリを調製およびスクリーニングする。
用語「アプタマー」は、標的タンパク質に結合するオリゴヌクレオチドに与えられる。このようなアプタマーは、直接（アプタマーならびにアプタマーおよびタンパク質の間の接触部位の同定によって）および間接（タンパク質の化学的反応性修飾するためのリガンドとしてアプタマーを使用することによって）、前記標的タンパク質を特徴付けるために使用することができる。
典型的なオリゴヌクレオチドでは、各ヌクレオチド（モノマー単位）はリン酸基、糖成分、およびプリンもしくはピリミジン塩基のいずれかによって構成される。ＤＮＡにおいては糖はデオキシリボースで、ＲＮＡにおいては糖はリボースである。ヌクレオチドは５’−３’リン酸ジエステル結合によって結合している。
ＤＮＡのリン酸デオキシリボース骨格は、ヌクレアーゼに対する耐性を増大し、細胞膜の透過を増大するように修飾することができる。モノまたはジチオリン酸、リン酸メチル、ホウ素化ホスフェート、ホルムアセタール、カルバメート、シロキサン、およびジメチレンチオ−スルホキシド−およびスルホン−結合種のような誘導体が従来技術で知られている。
【００４５】
ペプチドライブラリ
ペプチドは、ペプチジル結合（−ＮＨＣＯ−）によってともに結合したアミノ酸残基の複数から構成されている。生体のペプチドは、アミノ酸残基のすべてが遺伝的にコード化されたアミノ酸残基であるペプチドであるが、生体のペプチドは、遺伝発現によって実際に生成されたものである必要はない。
アミノ酸は基本的な成分で、これによりペプチドおよびタンパク質を構成することができる。アミノ酸は、アミノ基（−ＮＨ２）およびカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）の両方を保有する。すすべてではないが多くのアミノ酸は、アルファアミノ酸構造ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨをもち、式中Ｒは、水素、または種々の官能基の任意のものである。
二十のアミノ酸が遺伝的にコード化されている；アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。これらのうち、グリシンを除くすべては、光学異性体であるが、しかし、Ｌ−体のみがヒトにおいて見出される。しかしながら、これらのアミノ酸のＤ−体が生物学的に重要性をもつ。たとえばＤ−Ｐｈｅは、鎮痛剤として知られている。
多くの他のアミノ酸も知られていて、２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；ベータ−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソブチル酸、３−アミノイソブチル酸；２−アミノピメリン酸；２，４−ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリジン；アロ−ヒドロキシリジン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）；Ｎ−メチルイソロイシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチンを含む。
ペプチドは、アミノ酸および／またはより小さなペプチドの縮合によって構築されている。一つのアミノ酸（またはペプチド）のアミノ基は、第二のアミノ酸（またはペプチド）のカルボキシル基と反応して、ペプチド結合（−ＮＨＣＯ−）を形成し、一つの水分子を放出する。このため、アミノ酸がペプチド中に組み込まれると、専門的にいえば、このアミノ酸はアミノ酸残基と呼ばれる。前記残基のコアは、他の残基と結合している−ＮＨおよび−ＣＯ結合機能性を除外した成分である。前記成分は一またはそれ以上の鎖原子（下記参照）および付属的な側鎖からなる。
【００４６】
各アミノ酸の主鎖成分は、−ＮＨおよび−ＣＯ結合機能性およびコア主鎖成分から構成されている。通常後者は、単一の炭素原子である。しかしながら、前記コア主鎖成分は、付加的な炭素原子を含むことができ、そして窒素、酸素または硫黄原子も含むことができ、ともに一本鎖を構成する。好適な実施の形態においては、コア主鎖原子は、炭素原子によってのみ構成される。
側鎖は、コア主鎖原子に付加している。アルファアミノ酸において、側鎖はアルファ炭素に付加していて、各残基のＣ−１、Ｃ−２およびＮ−２は主鎖の繰り返し単位を構成し、そして用語「側鎖」は、Ｃ−３およびより高位の炭素原子ならびにこれらの置換体をさしている。これは、主鎖原子に付加しているＨ原子も含む。
アミノ酸は、ペプチド結合に関与しているカルボニル炭素原子およびアミノ窒素原子の間の、主鎖に存在する炭素原子の数に従って分類することができる。天然に存在する約150のアミノ酸のうち、アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタアミノ酸が知られている。これらは１ないし４の中間炭素をもつ。アルファアミノ酸のみがタンパク質中に存在する。プロリンはアルファアミノ酸の中の特例で、その側鎖はペプチド結合の窒素にも結合する。
ベータおよびより高位のアミノ酸においては、Ｈではない他の側鎖が、どの主鎖コア炭素に付加するかに選択の幅がある。好ましい付加部位は、Ｃ−２（アルファ）カーボン、すなわち、−ＣＯ結合機能性のカルボキシル炭素に隣接する炭素である。一より多い主鎖原子が、Ｈではない他の側鎖を保有することもできる。しかしながら、好適な実施の形態においては、一つの主鎖原子のみが、Ｈではない他の側鎖を保有する。
主鎖炭素原子は、一または二以上の側鎖のいずれでももつことができるが、一つがより一般的である。側鎖は主鎖炭素原子に、単結合または二重結合で付着することができ、前者がより一般的である。
単一組み合わせペプチドライブラリは、ペプチド結合を通して結合している三またはそれ以上のアミノ酸をもつペプチドをメンバーとするものである。
前記ペプチドは、直鎖状、分岐状、もしくは環状で、そして共有結合的もしくは非共有結合的に非ペプチド成分を含むことができる。アミノ酸は、天然由来にまたは遺伝的にコード化されたアミノ酸に制限されるものではない。
偏ったペプチドライブラリは、一またはそれ以上（しかしすべてではない）のペプチド残基が一定の基であるものである。
【００４７】
環状ペプチド
多くの天然由来のペプチドは環状である。環化は、ペプチドコンホメーションの安定化のための一般的な機構であり、これによってリガンドとのペプチドの向上した会合が達成され、このため向上した生物活性が達成される。環化は通常、鎖内部のシスチン形成、側鎖間のペプチド結合またはＮ−末端およびＣ−末端のペプチド結合形成によって達成される。環化は通常、溶液中のペプチドによって達成されるが、しかしいくつかの公開物がビーズ上のペプチドの環化を記述している。
ペプチドライブラリは、オリゴペプチドライブラリまたはタンパク質ライブラリであることができる。
オリゴペプチド
好ましくは、オリゴペプチドは、少なくとも５、６、７または８のアミノ酸の長さである。好ましくは、オリゴペプチドは、５０未満、さらに好ましくは２０未満のアミノ酸である。
オリゴペプチドライブラリの場合、すべての残基またはいくつかの残基のみは変えることができる。オリゴペプチドは、拘束されていないことができ、または、たとえば拘束しているジスルフィド結合の形成における定常システイン残基の関与による、特定のコンホメーションによって拘束されていることもできる。
タンパク質
タンパク質は、オリゴペプチドのように、複数のアミノ酸によって構成されていているが、用語「タンパク質」は、より長いペプチドに留保されていて、これは安定なコンホメーションに折りたたまれることが可能である。タンパク質は、二またはそれ以上のポリペプチド鎖であることができ、共有結合的または非共有結合的架橋によって保持されることができる。これらはホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーの状態で生じることができる。
【００４８】
ペプチドは、（１）少なくとも５０のアミノ酸長か、または（２）少なくとも二つの共有結合的な架橋（たとえば、ジスルフィド結合）をもつ場合、タンパク質と考えられる。このため、コノトキシンはタンパク質と考えられる。
通常、タンパク質ライブラリのタンパク質は、定常残基（前記ライブラリ中のすべてのタンパク質について同一）および可変残基（メンバー間で異なる）の両方をもつことによって特徴付けられる。これは単に、各状態における与えられた変化の幅について、配列スペース（単一の多様性）が残基位置の数の増加につれて指数関数的に増加するためであり、このためいくつかの場所では、すべてのペプチドの残基にとって可変状態となるのが不都合となる。タンパク質は通常オリゴペプチドよりも大きいために、オリゴペプチドライブラリよりもタンパク質ライブラリの方が、可変状態を特徴とする。
タンパク質ライブラリの場合、変異に寛容な部位における変異に焦点をあわせることがのぞましい。これらは、アラニン走査突然変異誘発、または類似活性の相同タンパク質の配列とタンパク質配列を比較することによって、決定することができる。表面残基の突然変異が直接結合に影響しやすい。表面残基は、タンパク質の立体構造を調べるか、または表面を標識付けした後にどの残基が標識を得たかを確認することで、決定することができる。タンパク質中の高親水性領域を同定することによっても推論することができる。
タンパク質はいくつかの部位で頻繁に改変されるが他の部位では改変されないので、タンパク質ライブラリは偏ったペプチドライブラリの特別な場合であると考えることができる。
オリゴペプチドライブラリではなくタンパク質ライブラリをスクリーニングする場合にはいくつかの理由があり、（１）ライブラリ中で変異した、特定のタンパク質は、すでにある程度の所望の活性をもち、そして（２）オリゴヌクレオチドは、安定なコンホメーションをもたないために十分に高い活性をもつことを期待できない、という理由も含む。
タンパク質ライブラリが、所望の活性をもたない親タンパク質に基づく場合、前記親タンパク質は通常高い安定性（融点≧50℃）および／または高頻度可変性領域をもっている。
【００４９】
抗体の可変領域は高頻度可変領域をもち、このため、いくつかの実施例では、タンパク質ライブラリは、ＶＨもしくはＶＬ鎖の変異体、またはそのような鎖の抗原特異的結合断片の変異体から構成されるメンバーからなる。ＶＨおよびＶＬ鎖は、通常それぞれ約110のアミノ酸残基であり、隣接しているＣＬおよびＣＨ１領域間のジスルフィド結合によって極めて近接して可変領域を形成する。ともに、ＶＨ、ＶＬ、ＣＬおよびＣＨ１はＦａｂ断片を形成する。
ヒトＨ鎖において、多頻度可変領域は、31-35、49-65、98-111および84-88であるが、最初の三つは抗原結合に関与する。多頻度可変領域の外側の残基においてＶＨ鎖およびＶＬ鎖の間に変化が存在するが、それほど多くない頻度である。
多頻度可変領域外の全残基において、天然に生成したＶＨ鎖またはＶＬ鎖配列に少なくとも８０％同一の場合、ＶＨまたはＶＬ鎖の変異体と考えられる。
好適な実施の形態において、このような抗体ライブラリメンバーは、少なくとも一のＶＨ鎖および少なくとも一のＶＬ鎖の両方から構成され、少なくともこれらのうち一つは変異鎖で、これら鎖は同一または異なる抗体から分離することができる。ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、「一本鎖抗体」におけるように、適切な結合成分によって共有結合的に結合することができ、または天然生成可変領域におけるように、非共有結合的に結合することができる。
結合が非共有結合的で、ライブラリが細胞またはウイルス上に提示されている場合、ＶＨまたはＶＬ鎖は担体表面／コートタンパク質に融合することができる。相補鎖は共発現するか、ライブラリに外因的に加えることができる。
メンバーはさらに、いくつかのまたはすべての抗体定常Ｈ鎖および／もしくは定常Ｌ鎖、またはその変異体、から構成されることができる。
【００５０】
ペプトイドライブラリ
ペプトイドはペプチドの類似物であり、その中では一またはそれ以上のペプチド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）が擬ペプチド結合によって置換されていて、これは同一または異なることができる。すべてのペプチド結合が置換される必要はなく、すなわち、ペプトイドは、たとえばプロリンといった、通常のアミノ酸残基を一またはそれ以上含むことができる。
ペプチド結合は二つの小さな二価の結合成分、−ＮＨ−および−ＣＯ−をもっている。このため、擬ペプチド結合の好ましいクラスは、二つの小さな二価の結合成分をもっているものである。それぞれは、アミン（−ＮＨ−）、置換アミン（−ＮＲ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、チオカルボニル（−ＣＳ−）、メチレン（−ＣＨ２−）、一置換メチレン（−ＣＨＲ−）、二置換メチレン（−ＣＲ１Ｒ２−）、エーテル（−Ｏ−）およびチオエーテル（−Ｓ−）で構成される群から独立して選択することができる。より好ましい擬ペプチド結合は以下を含む：Ｎ修飾−ＮＲＣＯ−、カルバΨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、デプシΨ−ＣＯ−Ｏ−、ヒドロキシエチレンΨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、ケトメチレンΨ−ＣＯ−ＣＨ２−、メチレンオキシ−ＣＨ２−Ｏ−、還元−ＣＨ２−ＮＨ−、チオメチレン−ＣＨ２−Ｓ−、チオペプチド−ＣＳ−ＮＨ−、レトロインバース−ＣＯ−ＮＨ−。
単一ペプチド分子は、一以上の擬ペプチド結合を含むことができる。
ペプトイドライブラリ中に多様性を導入する目的で、（１）擬ペプチド結合によってモノマーのコア主鎖原子に付加している側鎖、および／または（２）擬ペプチド結合の側鎖（たとえば、−ＮＲＣＯ−のＲ）を、変えることができる。このため、一の実施例において、アミノ酸残基ではないモノマーユニットが構造−ＮＲ１−ＣＲ２−ＣＯ−であり、式中Ｒ１およびＲ２の少なくともひとつは水素でない。擬ペプチド結合に可変性が存在する場合、−ＮＲＣＯ−または他のＲ基との擬ペプチド結合を使い、前記Ｒ基を変化させることによって簡便になされる。この場合、Ｒ基は通常、前記したような、ペプチドのアミノ酸を特徴付ける任意の側鎖である。
擬ペプチド結合のＲ基は不可変の場合、通常小さなもので、たとえば、１０原子を超えない（たとえば、水酸基、アミノ、カルボキシル、メチル、エチル、プロピル）。
共役化学的性質が適合する場合、単一の組み合わせライブラリはペプチドおよびペプトイドの両方を含む。
【００５１】
ペプチド核酸ライブラリ
ＰＮＡオリゴマーはここでは、複数のユニットで構成されていて、少なくともそのうちの一つは核酸塩基を構成している側鎖を構成するＰＮＡモノマーであるものとして、定義される。核酸塩基については、米国特許第6,077,835号を参照。
典型的なＰＮＡオリゴマーは、（２−アミノエチル）グリシンユニットから構成されていて、メチレンカルボニルリンカーによって付加している核酸塩基とともにある。すなわち、式、Ｈ−（−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（−ＣＯ−ＣＨ２−Ｂ）−ＣＨ２−ＣＯ−）ｎ−ＯＨ、をもち、式中
外側のかっこした下部構造はＰＮＡモノマーである。
この構造において、核酸塩基ＢはバックボーンＮから３つの結合で隔てられていて、側鎖の付加部分は６つの結合で隔てられている。前記核酸塩基は、オリゴヌクレオチドライブラリと関連して議論したヌクレオチドに含まれてる任意の塩基であることができる。ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｔ、ＣおよびＵの塩基が好ましい。
ＰＮＡオリゴマーは、さらに一またはそれ以上のアミノ酸残基、特にグリシンおよびプロリンを含む。
特に、（１）先に定義した二つの小さな二価リンカーで構成されているリンカーといった、他のリンカーによって−ＣＯＣＨ２−リンカーが置換されている、（２）側鎖が、ペプチド結合には関与していない三つの主鎖炭素のうちの一つに付している（典型的なＰＮＡのＮに付加する側鎖の代わりまたは加えて）；および／または（３）ペプトイドの文脈で先に開示したように、ペプチド結合が擬ペプチド結合によって置換されている、関連した分子を容易に想像することができる。
ＰＮＡオリゴマーライブラリが作られている；たとえば、Cook、6,204,326を参照。
【００５２】
有機小化合物ライブラリ
有機小化合物ライブラリ（短くは「化合物ライブラリ」）は組み合わせライブラリで、そのメンバーは、特に、標的タンパク質の生物活性を媒介する能力をもっている場合に、薬剤としての使用に適している。
ペプチドは薬剤としてある特定の短所を持っている。これらには、血清プロテアーゼによる分解に対する感受性、および細胞膜への貫通の困難性を含む。好ましくは、化合物ライブラリのすべてのまたは多くの化合物が、ペプチドの薬剤的な短所の一またはそれ以上を、避けるか少なくとも同じ程度には受けないようにする。
化合物ライブラリを設計する際、新しい薬剤を得るために典型的に使用される分子修飾の方法も考慮するのが手助けとなる。三つの基本的な修飾の種類が確認されている。切断は、ファルマコフォアな成分の構成要素を同定するためにリード薬剤を単純化する。結合は、同一または異なることができる二またはそれ以上の既知のファルマコフォアな成分が、共有結合的または非共有結合的に結合して、新しい薬剤を形成する。そして改変は、一の成分が類似または異なる他の成分に置換されているが、しかし切断または結合効果はない。用語「切断」、「結合」および「改変」は、出発物質に対する最終生成物の構造的な関係を暗示することのみを意図していて、二つが同じであることがあるとしても、新しい薬剤が実際にどのように合成されているかを意図するものではない。
切断の過程は、フィゾスチグミン（1925）からのネオスチグミン（1931）およびエドロフォニウム（1952）の進化によって説明される。引き続く結合は、デメカリウム（1956）およびアンベノニウム（1956）によって説明される。
改変は、本来の成分の大きさ、極性、または電子分布を修飾することができる。改変は、閉環または開環、低位または高位の組成類似体の形成、二重結合の導入または飽和、光学活性中心の導入、かさ高い基の導入、除去もしくは置換、等量または生物学的に等量の置換、基の位置または配向の変更、アルキル化基の導入、ならびに、誘導性（静電気）または接合性（共鳴）効果を阻害または促進する観点に基づく基の導入、除去または置換を含む。
【００５３】
このため、置換基は、電子受容基および／または電子供与基を含むことができる。典型的な電子供与基（＋Ｉ）は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｒ、−ＣＨＲ２、−ＣＲ３および−ＣＯＯ−を含む。典型的な電子受容基（−Ｉ）は、−ＮＨ３＋、−ＮＲ３＋、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＲ＝ＣＲ２、および−Ｃ＝ＣＨを含む。
置換基は、共役系における電子密度を増大するか減少するものを含むことができる。前者（＋Ｒ）の基は、−ＣＨ３、−ＣＲ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲ２、および−ＮＨＣＯＲを含む。後者（−Ｒ）の基は、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＨＣ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ２Ｒおよび−ＣＦ３を含む。
合成の観点からいうと、修飾は、求核的および求電子的置換、還元および酸化、付加脱離、二重結合解離、ならびに環化を含む種々の単位工程によって達成することができる。
ライブラリを作成する目的で、一またはそれ以上の薬理学的活性（標的タンパク質の既知または推測される活性に関連する必要はない）をもっている、化合物、または化合物のファミリーを、二またはそれ以上の既知または可能性のある薬理学的成分に分離することができる。これらの成分の各類似体を同定することができ、最初の出発物質の成分に類似するようにこれらの類似体の混合物が反応した。ライブラリのすべてのメンバーが、出発化合物のすべての成分に類似する成分を含む必要はない。
ライブラリの設計は、ベンゾジアゼピンの例によって説明することができる。クロルジアゼポキシド、ジアゼパムおよびオキサゼパムを含む、いくつかのベンゾジアゼピン薬は、抗不安薬として使用されてきた。ベンゾジアゼピンの誘導体は、広範な生物活性をもつ。誘導体は、抗不安薬としてのみならず、抗痙攣薬；コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体サブタイプＡまたはＢ、カッパオピオイド受容体、血小板活性化因子、およびＨＩＶトランス活性化因子Ｔａｔ拮抗薬、およびＧＰＩＩｂＩＩａ、逆転写酵素およびｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、としても反応する。
ベンゾジアゼピン構造は、２−アミノベンゾフェノン、アミノ酸、およびアルキル化剤に分離することができる。Buninら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、91:4708（1994）参照。少数の２−アミノベンゾフェノン誘導体のみが商業的に入手可能なので、これが２−アミノアリルスタンナン、酸塩化物、アミノ酸、およびアルキル化剤に分離できる。Buninら、Meth.Enzymol.、267:448（1996）。アリルスタンナンは、コア構造と考えることができ、この上に他の成分が置換し、または四つ全てが、結合して各ライブラリメンバーを形成する同等物として考えることができる。
【００５４】
基本的なライブラリ合成計画およびメンバー構造が、Fowlkesら、米国シリアル番号08/740,671の図１に示されていて、全体として参照として組み込まれる。ブロックを構成する酸塩化物が、Ｒ１部位で多様性を導く。Ｒ２部位はアミノ酸によって導入され、Ｒ３部位はアルキル化剤によって導入される。Ｒ４部位はアリルスタンナンに固有である。Buninらは、20の酸塩化物、35のアミノ酸、および16のアルキル化剤から、11,200の異なる誘導体の１，４−ベンゾジアゼピンライブラリを作成した（Ｒ４部位には多様性はまったく導入されていない。この基は、固相に分子を結合するのに使用される）。Available  Chemicals  Directory（ＨＤＬ  Information  Systems、カリフォルニア、サンリアンドロ）によれば、300を超える酸塩基物、80のFmoc−保護アミノ酸および800のアルキル化剤が購入可能である（さらに、もちろん、合成可能である）。使用される特定の成分は、
構造的な多様性を最大化するよう選択される一方、マイクロタイタープレートのウェル中で容易に合成されるものに数を制限される。構造的に類似の化合物間で選択する際、最小の置換化合物に優先度が与えられる。
脂肪族基および芳香族基の両方が可変成分に含まれる。脂肪族基の中で、非環式および環式（モノまたはポリ）構造、置換もしくは非置換が、ともに検査された（すべての非環式基が直鎖状である一方、分岐脂肪族を導入することも可能である）。芳香族基は、単環および複環、融合かそうでないか、置換か非置換か、ならびにヘテロ原子をもつかそうでないかのいずれかで、特徴付けられる。二次的な置換体は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＣＮ、−Ｃｌ、−Ｆ、および−ＣＯＯＨを含む。使われなかったが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＯ−、−ＣＳ−、−ＮＨ−、および−ＮＲ−といった、スペーサー成分を組み込むこともできる。
Buninらは、コア構造として１，４−ベンゾジアゼピンを使用するのではなく、代わりに１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン構造を使用することを示唆している。
Buninらが記述したように、より多様性のライブラリを構築することが可能になるので、結合機能性を残さない結合戦略を使用することが、必要ではないが、有利である。
従来技術において既知または示唆されている他の組み合わせ非オリゴマー化合物ライブラリは、カルバメート、メルカプトアシル化ピロリジン、フェノール類、アミンイミド、Ｎ−アシルアミノエーテル（アミノアルコール、芳香族ヒドロキシ酸、およびカルボン酸から作られている）、Ｎ−アルキルアミノエーテル（芳香族ヒドロキシ酸、アミノアルコールおよびアルデヒドから作られている）、１，４−ピペラジン、および１，４−ピペラジン−６オンに基づく。
Dewittら、Proc.Nat.Acad.Sci.（USA）、90:6909-13（1993）は、同時的ではあるが別々の、40の分散したヒダントインおよび40の分散したベンゾジアゼピンの合成を記述している。彼らは合成を個体支持体上（ガス分散管内）で、配列形式で実施ししているが、これは他の従来の同時的合成技術とは反対である（たとえば、ウェル中、またはピン上）。ヒダントインは、第一に同時的非保護化および次に各アミノ酸樹脂を八つのイソシアン酸塩それぞれで処理することによって合成される。ベンゾジアゼピンは、各五つの非保護化アミノ酸樹脂を八つの２−アミノベンゾフェノンイミンで処理することによって合成される。
【００５５】
Chenら、J.Am.Chem.Soc.、116:2661-62（1994）は、ギ酸エステルの試験的な（９のメンバー）組み合わせライブラリを記述している。ポリマービーズ結合アルデヒドの調製は、三つのアリコットに「分割」され、それぞれは三つの異なるイリド試薬と反応する。反応生成物は混合され、そして次に三つの新しいアリコットに分割され、三つそれぞれは異なるマイケルドナーと反応する。化合物のアイデンティティーは、ガスクロマトグラフィおよび／またはマススペクトル分析によって、単一ビーズ基盤上で決定可能であることが見出された。
Holmes、米国特許第5,549,974号（1996）は、チアゾリジンオンおよびメタチアザンオンのライブラリの組み合わせ合成のための方法論が述べられている。これらのライブラリは、アミン、カルボニル化合物、およびチオールの組み合わせによって環化状態で作製される。
Ellman、米国特許第5,545,568号（1996）は、ベンゾジアゼピン、プロスタグランジン、ベータターン擬態物、およびグリセロールをベースとする化合物の組み合わせ合成を記述している。Ellman、米国特許第5,288,514号も参照。
Summerton、米国特許第5,506,337号（1996）は、モルホリノサブユニット構造で主に構成された組み合わせライブラリの調整法を開示している。
複素環組み合わせライブラリが、Nefziら、Chem.Rev.、97:449-472（1997）に概説されている。
薬理学的分類については、たとえば、Goth、Medical  Pharmacology：Principles  and  Concepts（C.V.Mosby  CO.：第８版、1976）；Korolkovas  and  Burckhalter、Essentials  of  Medicinal  Chemistry（John  Wiley  &  Sons、Inc.：1976）を参照。合成法については、たとえば、Warren、Organic  Synthesis：  The  Disconnection Approach（John  Wiley  &  Sons、Ltd.：1982）;Fuson、Reactions  of  Organic  Compounds（John  Wiley  &  Sons：1966）；Payne  and  Payne、How  to  do  an  Organic  Synthesis（Allyn  and  Bacon、Inc.:1969）;Greene、Protective  Groups  in  Organic  Synthesis(Wiley-Interscience）を参照。置換基の選択については、たとえば、Hansch  and  Leo、Substituent  Constants  for  Correlation  Analysis  in  Chemistry  and  Biology（John  Wiley  &  Sons：1979）を参照。
【００５６】
好ましくは、ライブラリは、メンバーが活性を示す場合、そのメンバーを分析する必要がないように、各メンバーが同定可能なままであるよう、合成される。いくつかの同定方法が提案されていて、以下を含む。
（１）コード化。すなわち、メンバー固有の成分に比べてより容易に同定可能な付加物を、識別成分の各メンバーに付加する。これはタグそれ自体が接合体の活性に影響を与えうるという欠点を持つ。
（２）空間的なアドレス指定。たとえば、各メンバーは、マトリックス上もしくはマトリックス内での特定の協調でのみ、または特定のチャンバー内でのみ合成される。これは、たとえば、特定のピンの場所、またはマイクロタイタープレート上の特定のウェル、または「ティーバッグ」内部であることができる。
本発明は、同定のいかなる特定の形式にも制限されるものではない。
しかしながら、種々の構成要素の特徴を示す光学的指標に基づいて、活性として見出されるライブラリメンバーを単純に特徴付けることができる。
固相合成は、どの誘導体が形成されるかをより大きく調節できる。しかしながら、固相は活性を阻害しうる。この問題を克服するため、各メンバーのいくつかまたは全ての分子を、合成後であるがスクリーニング前に、遊離可能にする。
【００５７】
評価されうる単純ライブラリの候補の例は、以下の誘導体を含む：
一のへテロ原子を含む環状化合物
ヘテロ窒素
ピロール
ペンタ置換ピロール
ピロリジン
ピロリン
プロリン
インドール
ベータ−カルボリン
ピリジン
ジヒドロピリジン
１，４−ジヒドロピリジン
ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン
テトラヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
イソキノリン
テトラヒドロイソキノリン
キノリン
ベータ−ラクタム
アザビシクロ［４．３．０］ノネン−８−オンアミノ酸
ヘテロ酸素
フラン
テトラヒドロフラン
２，５−ジ置換テトラヒドロフラン
ピラン
ヒドロキシピラノン
テトラヒドロキシピラノン
ガンマ−ブチロラクトン
ヘテロ硫黄
スルホレン
【００５８】
二またはそれ以上のヘテロ原子を含む環状化合物
複ヘテロ窒素
イミダゾール
ピラゾール
ピペラジン
ジケトピペラジン
アリルピペラジン
ベンジルピペラジン
ベンゾジアゼピン
１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン
ヒダントイン
５−アルコキシヒダントイン
ジヒドロピリミジン
１，３−ジ置換−５，６−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン
環状尿素
環状チオ尿素
キナゾリン
キラル３−置換−キナゾリン−２，４−ジオン
トリアゾール
１，２，３−トリアゾール
プリン
ヘテロ窒素およびヘテロ酸素
ジケロモルフォリン
イソキサゾール
イソキサゾリン
ヘテロ窒素およびヘテロ硫黄
チアゾリジン
Ｎ−アクシルチアゾリジン
ジヒドロチアゾール
２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゼート
２−アミノチアゾール
チオフェン
３−アミノチオフェン
４−チアゾリジノン
４−メラチアザノン
ベンズイソチアゾーロン
ライブラリ作製の詳細については、Nefziら、Chem.Rev.、97:449-72（1997）、およびこれに引用されている参照を参照。
【００５９】
製薬方法および調整
本発明の好ましい被験者は哺乳類である。用語「哺乳類」は、哺乳綱に属する各動物を意味する。獣医学的および栄養学的についても同様に意図しているが、本発明は特に、ヒト被験者に有用である。好ましい非ヒト被験者は、霊長目（たとえば類人猿および猿）、偶蹄目もしくは奇蹄目（たとえば、牛、豚、羊、馬、ヤギ）、食肉目（たとえば、猫、犬）、げっ歯目（たとえば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター）、ウサギ目（たとえば、ウサギ）または他のペット、家畜もしくは実験動物である。
ここで使用されている、用語「保護」は、「予防」、「抑止」および「治療」を含むことを企図している。「予防」は、厳密に言うと、疾病（または他の臨床的に有害な状態）の誘発に先立つ製薬の投与を含む。「抑止」は、疾病の臨床的発現に先立つ化合物の投与を含む。「治療」は、疾病の発現後の保護的な化合物の投与を含む。
ヒト医学および獣医学において、究極的に惹起されることは未知、不顕性、または惹起されることの出現後までは患者をよく確認できないので、「予防」および「抑止」を常に区別するこはできない。このため、限定したが、用語「予防」は、厳密な意味での予防として、および抑止としての両方の意味に理解される。
製薬の予防的または防止的な使用には、疾病に罹患する一般的な個体群に比して高いリスクにある個体を同定して、そして疾病の臨床的な発現に先立ってこれらの個体に製薬を投与することも含む。このような使用の効果は、引き続いて発生する疾病、もしくは当該疾病の特定の症状の発現頻度または重症度を、処置被験者を同じハイリスク群ではあるが非処置被験者に対して比較することによって、測定される。
高リスク要素は疾患と疾患の間で変わるものではあるが、一般的には、（１）同一家族の一またはそれ以上における疾病の以前の発生、もしくは伝染性疾患の場合には、先に罹患した患者が伝染した可能性のある時期に伝染可能性のある接触をしている個体、（２）その個体における当該疾病の過去の発生、（３）その個体における当該疾病に関連する疾病、または当該疾病の発生率が高まるとして既知の状態の発生、（４）当該疾病、または関連した疾病もしくは状態のマーカーの疑わしいレベルの出現、（５）免疫的に易感染性の被験者、たとえば、放射線治療、ＨＩＶ感染、薬物使用、等、または（６）疫学的に当該疾病に関連した特定のグループ（たとえば、特定年齢、性別、人種、民族、等）のメンバー、を含む。
【００６０】
予防または治療が治療的であることができ、すなわち、疾病の根本的な原因に向けられているか、または改善的であることができ、すなわち、疾病の症状、特に生活の質を減じるものに向けられることができる。
臨床的価値をもたらすに十分である限り、提供される予防は完全である必要はない、ということが有用であるということについて理解されなければならない。競合薬に比べて低い程度で予防を供する作用物質でも、他の薬剤が特定の個体に対して無効である場合や、他の薬剤と組み合わせて使用して予防の程度を強めることができる場合、競合薬に比べて安全な場合には、有用でありつづけることができる。未治療の適当な対照と比較して、治療した被験者が、統計的に十分な（ｐ＝0.05または未満）改善があることが望ましく、そしてこの改善が、発生のしるしもしくは疾病の重症度または疾病の少なくとも一の症状に対して少なくとも10％であることがのぞましく、さらに好ましくは少なくとも25％、よりさらに好ましくは少なくとも50％、なおいっそう好ましくは少なくとも100％である。
本発明の薬剤の少なくとも一つを、疾病または他の悪条件に対して被験者を守るために、投与することができる。投与の形式は、全身性または局所的であることができる。たとえば、このような化合物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮的、または口腔経路ですることができる。選択的に、または同時に、投与は経口的にされることができる。非経口の投与は、ボーラス注入法によってまたは時間をかけて徐々にするかん流によってすることができる。
典型的な処方計画は、単一から、時間、日、週、月、もしくは年にわたる幅広い期間までの投与によって、十分な効果量の薬剤を投与することかなる。
本発明の薬剤の適切な投与は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、同時的な治療の種類、ある場合は、治療の頻度、ならびに好ましい効果の性質に依存するであろうことが理解される。しかしながら、もっとも好ましい投与は、当業者によって過度の実験なく理解されかつ決定されるように、被験者の個々に仕立てられたものであることができる。これは典型的には、標準的な投薬の調整を含み、たとえば、患者の体重が軽い場合には投薬を減らす。
【００６１】
ヒトへの使用に先立ち、薬剤はまず実験動物で安全性および効果が評価される。ヒトの臨床研究においては、問題となる薬の臨床前データ、および（ある場合は）類似の薬剤についての通例の投薬に基づいて、ヒトに安全であると考えられる投与から開始する。この投薬が効果的な場合、のぞまれるならば、最小効果投与を決定するために、投与量を減らすことができる。この投与が効果的でない場合、副作用の兆候について患者を観察しながら慎重に増やす。たとえば、Berkowら編、The  Merck  Manual、15版、Merck  and  Co.、Rahway、N.J.、1987；Goodmanら編、Goodman  and  Gilman’s  The  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、8版、Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.Y.、（1990）；Avery’s  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics、3版、ADＩS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.（1987）、Ebadi、Pharmacology、Little、Brown  and  Co.、Boston、（1985）を参照。これらの参照およびこの中で引用されている参照も、完全にここに参照として組み込まれる。
各治療に必要な総投与量は、複数回の投与または一回の投与によって投与される。タンパク質は、単独で、または当該疾病に直接向けられもしくは疾病の他の症状にむけられた他の治療薬との組み合わせで、投与することができる。
成人向けの典型的な医薬品の投与量は、一日に1ngから10ngであり、より頻繁には、一日に1mgから1gである。
適切な投与量の形式は、疾病、医薬品、および投与法に依存する。可能性として、錠剤、カプセル、トローチ剤、歯科用軟膏、坐薬、吸入薬、溶液、軟膏および非経口デポを含む。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記  および  Ebadi、上記を参照。これは、その中で引用している参照も含む、ここに参照として完全に組み込まれる。
ペプチド薬の場合、前記ペプチドをコード化している核酸を構成する発現ベクターの形で投与することができる。このようなベクターは、患者の細胞の遺伝的相補中に組み込まれたあと、前記ペプチドの合成を方向付ける。適切なベクターは、病原性でないかまたはそうでないと考えられている、遺伝子工学で作製した豚ウイルス（ワクシニア）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含む。
ここに記述した少なくとも一の薬に加え、製剤の組成は、製薬的に使用可能な製剤中に活性物質を加工するのに役立つ賦形剤、担体および／または補助をといった、製薬的に許容可能な担体を含むことができる。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記およびEbadi、上記を参照。これらはここに、そのなかで参照として引用されているものも含み、参照として完全に組み込まれる。
【００６２】
試験の構成および方法
標的生物
本発明は、標的生物中における本発明の物質の生物活性を確認または媒介することが、適切であることができるということを意図している。
標的生物は、植物、動物、または微生物であることができる。
植物の場合、実用植物であることができ、この場合、薬剤は、植物の病気耐性、天候耐性もしくはペスト耐性を増加し、成長特性を変化し、または有用な特性を向上しもしくは好ましくない特性を減じることを企図することができる。または雑草であることができ、この場合、薬剤は、前記植物を殺しもしくは成長を阻害し、雑草から有用植物に特性を変化させるように企図することができる。植物は、木、低木、作物、草、等であることができる。植物は、藻類（時として微生物でもある）、または維管束植物、特に裸子植物（特に針葉樹）および被子植物であることができる。被子植物は、単子葉植物または双子葉植物であることができる。もっとも興味のある植物は、米、コムギ、トウモロコシ、アルファルファ、大豆、ジャガイモ、ピーナッツ、トマト、メロン、りんご、ナシ、パイナップル、モミ、エゾマツ、パイン、ヒマラヤスギ、およびオークである。
標的生物が微生物の場合、藻類、細菌類、菌類、またはウイルス（ウイルスの生物活性は、ウイルス感染細胞で決定されるのではあるが）であることができる。微生物は、ヒトまたは他の動物もしくは植物の病原体であることができ、または非病原体であることもできる。微生物は、土壌もしくは水中微生物であることができ、または他の生命体内に通常生息するものであることもできる。
標的生物が動物の場合、脊椎動物または非脊椎動物であることができる。非脊椎動物は、病原体もしくは寄生生物として行動する場合に特に主要な興味があり、薬剤は、生物毒性または生物静力学的にはたらくように意図される。興味のある非脊椎動物は、蠕虫、軟体動物、および節足動物を含む。
【００６３】
標的動物は脊椎動物であることもでき、すなわち、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類または両生類である。哺乳類では、標的生物は、好ましくは霊長目（ヒト、類人猿および猿）、偶蹄目（たとえば、牛、豚、羊、ヤギ、馬）、げっ歯目（たとえば、マウス、ラット）、ウサギ目（たとえば、ウサギ、野兎）、または食肉目（たとえば、猫、犬）に属する。鳥類では、標的動物は好ましくは、ガチョウ目（たとえば、ガチョウ、ガン、白鳥）またはキジ目（たとえば、ウズラ、ライチョウ、キジ、七面鳥およびニワトリ）である。魚類では、標的動物は好ましくは、ニシン目（たとえば、鰯、シャッド、アンチョビー、ホワイトフィッシュ、鮭）である。
標的組織
用語「標的組織」は、生物活性が測定できる標的動物の、任意の動物の全体、生理系、器官全体、器官の一部、種々の組織、細胞もしくは細胞構成成分（たとえば、細胞膜）を意味する。
通常哺乳動物においては、対象レセプタータンパク質を発現する任意およびすべての組織への生物的影響を比較対照するよう選択する。使用される主要な組織は、脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、腸、脂肪、胃、骨格筋、副腎、乳房、前立腺、脈管構造、網膜、甲状腺、副甲状腺、胸腺、骨髄、骨等である。
他の分類は細胞の種類によるもので、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、血小板、巨核球、赤血球、骨髄ストーマ細胞、線維芽細胞、ニューロン、星状細胞、神経膠細胞、ミクログリア、上皮細胞、（任意の器官由来。たとえば、皮膚、乳房、前立腺、肺、腸等）、心筋細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞等である。
もちろん、単細胞生物の場合、「標的生物」と「標的組織」の間に区別はない。
スクリーニング分析
物質の結合または生物活性を決定することを企図する検定法は、予備的スクリーニング分析と呼ばれる。
スクリーニング分析は、試験管中（無細胞）検定（固定化受容体への結合について）または細胞に基づいた検定（細胞の表現型における変化について）のいずれかが典型的である。多細胞生物全体または分離した器官のスクリーニングは含まない。診断用生物検定についてのコメントは、必要な変更を加えて細胞に基づくスクリーニング分析に適用される。
【００６４】
試験管内対生体内分析
用語「生体内」は、生命体内で生じる、結合または酵素反応といった、現象の記述である。問題となる生物は、しかしながら、遺伝子操作されることができる。用語「試験管内」は、生命体外部で生じる現象をさす。生物の一部（たとえば、膜、または分離された生物化学）が、人工物および／または状態とともに使用される。本発明の目的のために、用語「試験管中」は、単細胞または多細胞生物にかかわらず、無処置の細胞内または上で生じる現象は除外される。
生体内分析は、細胞に基づく検定、および生物体検定の両方を含む。細胞に基づく検定は、単細胞生物における検定、ならびに多細胞生物から分離された細胞もしくは細胞培養における検定の、両方を含む。細胞培養は、組織または器官中に組織化されていなければ、混合されることができる。用語「生物体検定」は、多細胞生物全体についての検定、およびこのような生物の単離した器官または組織についての検定をさす。
試験管中の診断法および試薬
本発明の試験管内検定は、任意の適切な分析物を含んだ試料に適用することができ、そして事実上定量的または定性的であることができる。
試料
試料は通常、血液、尿、リンパ液、精液、乳、もしくは脳脊髄液といった生物学的な液体、またはそれらの分画もしくは誘導体、または、たとえば組織切片もしくはホモジネートといった形での、生物学的な組織である。しかしながら、試料はおそらく、食料もしくは飲料、製薬もしくは診断成分、土壌、または地表水もしくは地底水であるかそこから誘導されたものであることができる。生物液もしくは組織の場合、ヒトもしくは他の哺乳動物、脊椎動物もしくは動物、または植物から得ることができる。好ましい試料は、血液、またはその分画もしくは誘導体である。
【００６５】
結合および反応検定
検定は結合検定であることができ、ここでは、一のステップには診断薬を分析物に結合することを含み、または反応検定であることができ、これは分析物に試薬を反応させることを含む。結合検定において使用される試薬は、分析物との反応の性質によって分類することができる。（１）分析物類似物、または（２）分析物結合分子（ＡＢＭ）。これらは標識付けまたは不溶化することができる。
反応検定においては、検定は、分析物および分析物と反応性の試薬の間の直接反応を探すことができ、または分析物が酵素もしくは阻害剤の場合には、分析物によって触媒されたもしくは阻害された反応を探すことができる。
検定は、一の段階の生成物が次の段階の標的として働くような、段階の連続を含むことができる。これらの段階は、結合段階、反応段階、またはそれらの組み合わせであることができる。
シグナル生成システム（ＳＰＳ）
分析物の存在を検出し、または量を測定するために、検定は、分析物が存在するかしないか（または、定量検定では、分析物の量）に依存して、産出されるシグナルに検出可能な相違が存在するシグナル生成システム（ＳＰＳ）を備えなければならない。検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能であることができ、または器具によってのみ検出可能であることができる。可能なシグナルは、着色もしくは発光生成物、検定成分もしくは生成物による放射線の吸収もしくは照射の特性（振幅または偏光を含む）の変更、ならびに成分もしくは生成物の沈殿もしくは凝集を含む。用語「シグナル」は、現存のシグナルの中断、または絶対値の変化というよりも、観察可能なパラメータの変化の割合の変化を含むように意図している。シグナルは、手動または自動で観察することができる。
反応検定においては、シグナルは、しばしば反応生成物である。結合検定においてシグナルは、標識化試薬によってラベルを負うことによって通常提供される。
【００６６】
標識
診断試薬にもっとも親密に関連するシグナル生成システムの成分は、「ラベル」と呼ばれる。標識は、たとえば、放射性同位体、蛍光プローブ、酵素、補酵素、酵素基質、高電子密度化合物、接合可能な粒子であることができる。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用といった手段またはオートラジオグラフィ−によって検出可能である。本発明の目的のために特に有用な同位元素は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐを含む。１２５Ｉは、抗体標識化に好ましい。
標識は、蛍光プローブであることもできる。蛍光標識した試薬が適切な波長の光にさらされると、蛍光のためにその存在を検出することができる。蛍光標識化合物のうちもっとも通常に使用されるものには、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンがある。
選択的に、１２５Ｅｕ、または他のランタニド系列といった、蛍光放射金属を、エチレンジアミン−テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）のような金属キレート基を使用して、診断試薬中に組み込むことができる。
標識は、化学発光化合物であることもできる。化学発光標識試薬の存在は、化学反応の過程において生じる発光の存在を検出することによって、決定することができる。特に有用な化学発光標識試薬の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
同様に、生物発光化合物を標識に使用することができる。生物発光は、生物系にて見いだされる化学発光のタイプで、酵素タンパク質が化学発光反応の効率を増している。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検知することによって決定される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼといった、酵素標識が好ましい。酵素標識が使用される場合、シグナル生成システムは、酵素のための基質も含まなければならない。酵素反応生成物がそれ自体検出可能でない場合、ＳＰＳは、検出可能な生成物が現れるように一またはそれ以上の付加的な反応を含む。
酵素分析物は、阻害剤が診断試薬として使用される場合には、それ自身標識として働くことができる。
結合検定型式
結合検定は、二つの典型的な種類、異種および同種に分類できる。異種検定においては、親和性分子および分析物の間の相互反応は標識に影響せず、このため、分析物の量または存在を決定するためには、結合標識を遊離標識から分離しなければならない。同種検定においては、相互反応はラベルの活性に影響し、このため分析物レベルは、分離ステップの必要なく推論できる。
一の実施例において、ＡＢＭは巨大分子担体に結合することによって不溶化し、そして試料中の分析物が、標識化されまたは特異的に標識化可能な分析物類似物の既知の量と競合することができる。「分析物類似物」は、ＡＢＭに結合するのに分析物と競合することのできる分子で、この用語は分析物そのものを含むように意図している。すでに標識化することもできるし、または分析物から分析物類似物を識別する成分に標識を特異的に結合することによって、引き続いて標識化することもできる。固相および液相を分離し、そして一の相にある標識化分析物類似物を定量化する。固相中、すなわちＡＢＭに固着している分析物類似物のレベルが高いほど、試料中の分析物のレベルは低い。
【００６７】
「サンドウィッチ分析」において、不溶化ＡＢＭ、および標識化ＡＢＭの両方が使用される。分析物は不溶化ＡＢＭに捕捉されて、標識化ＡＢＭによって付加され、三元複合体を形成する。試薬を、いずれかの順番にてまたは同時に、試料に加えることができる。ＡＢＭは同一または異なることができる。三元複合体のＡＢＭの量は、試料中の分析物の量に直接的に比例する。
上述した二つの具体例は、ともに異種検定である。しかしながら、同種検定を考えることができる。手がかりは、標識が、複合体形成によって影響されるか否かである。
共役法
標識は、直接または間接に（たとえば、標識化アンチＡＢＭ抗体を通じて）、共有結合的（たとえば、ＳＰＤＰとともに）または非共有結合的に、ＡＢＭに共役して、診断試薬を生成することができる。同様に、ＡＢＭは、固相担体に共役して固相（「捕捉」）診断試薬を形成することができる。
適切な支持体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱を含む。支持体の性質は、本発明の目的に従って、ある程度可溶かまたは不溶のいずれであることもできる。
支持体の物質は、共役分子がその標的に結合することができる限り、任意の可能な構造立体配置をもつことができる。このため、支持体の立体配置は、ビーズのように球形、または試験管内表面のような円柱状、または桿体の外部表面であることができる。選択的に、表面は、シート、テストストリップ、等のように平らであることができる。
【００６８】
生物学的検定法
生物学的検定法は、物質に対する生物学的存在の生物学的反応を測定または検知する。
生物学的存在は、生物体全体、摘出した器官もしくは組織、生きたまま分離した細胞、不死化細胞株、または細胞成分（たとえば膜；この用語は分離した受容体を含むと解釈されるべきではない）であることができる。この存在は、天然に生ずる生物体、もしくはある方法で修飾したものであることができ、またはそこから分離したものであることができる。修飾は、遺伝子的（放射線および化学的変異体、ならびに遺伝子工学を含む）または体細胞性（たとえば、外科的、化学的、等）であることができる。多細胞生物の存在の場合、修飾は一部または全部の細胞に影響することができる。存在は、存在検定における生物検定の活性と標的生物体における生物学的活性の間に関係がある限り、標的生物体、またはその誘導体である必要はない。
生物学的存在は、おおよそ天然であることができる、特定の環境におかれる。たとえば、培地は、血清または血清代用品を含むことができるが必ずしも含まなくてもよく、そして、ある種の支持基質を含むことができるが必ずしも含まなくてもよく、静置もしくは攪拌することができる。培地は、特定の生物学的または化学的作用薬を含むことができ、または特定の物理的パラメータ（たとえば温度）をもつことができ、これらは生物学的存在を育てまたは挑むことを意図している。
反応ために検出可能な生物学的マーカーもなければならない。細胞レベルでは、もっとも標準的なマーカーは、細胞生存および増殖、細胞行動（クラスター形成、運動）、細胞形態（形、色）、および生物活性（全体的なＤＮＡ合成、全体的なタンパク質合成、ならびに、たとえば、酸素消費、ＣＯ２生成、有機酸生成、イオンの取り込みまたは分泌などの、特定の栄養の利用といった、特異的な代謝活性）である。
生物学的マーカーによって生じる直接的なシグナルは、シグナル生成システムによって、たとえば、蛍光または比色シグナルのような、観察可能な異なるシグナルに変換されることができる。
存在、環境、マーカーおよびシグナル生成システムは、感受性、特異性および正確性が、診断上許容できるレベルを達成するように選択される。
いくつかの場合、天然の生物学的存在の生物活性を媒介する物質を同定することが目標となり、検定は、その存在について直接的に実施される。他の場合には、生物活性は、いくらかより複雑な（あるいはともに働きにくい）生物学的存在のモデルとしてのみ使用される。この場合、モデルの生物学的存在は、試験管中の系における単純な結合活性よりも、モデルの系における活性が真に天然の生物学的存在における活性についてより予測的であると考えられるので、使用される。完全な存在は扱うのに高価もしくは遅いので、または倫理的な考慮が完全な存在を扱うのを禁止するので、モデルの存在は、完全な存在の代わりに使用される。
モデル存在がある状況下に完全な存在を有用にモデルする場合、モデル存在は天然発生であることができる。あるいは、完全な存在に対する類似性を増す修飾により、非天然発生であることができる。
遺伝子組換えマウス、ラット、およびウサギといった、遺伝子組換え動物は、モデル系として有用であることが見出されている。
細胞に基づくモデル分析法では、受容体（標的タンパク質）に対する結合によって生物活性が媒介されていて、受容体はシグナル（生物学的マーカー）生成系に機能的に結合することができ、これは細胞に対して内在性または外在性であることができる。
これを行うにはたくさんの技術が存在する。
【００６９】
「ゼロハイブリッド」システム
これらのシステム中では、ペプチドの標的タンパク質に対する結合は、標的タンパク質（またはそのリガンド結合成分を内在性タンパク質に融合することなく、表現型変化をスクリーニング可能または選択可能にする。標的タンパク質は、内在性受容体の天然のシグナル伝達経路を利用できるように、宿主細胞に対して内在性であることができ、または実質的に内在性の受容体と同一であることができる。あるいは、通常標的タンパク質に関連するシグナル伝達経路の十分な要素を、細胞が標的タンパク質に結合するのをシグナルするように、細胞中に操作することができる。
「ワンハイブリッドシステム」
これらのシステム中では、キメラ受容体、標的タンパク質のハイブリッドおよび内在性受容体が、使用される。キメラ受容体は、標的タンパク質のリガンド結合特性および内在性受容体のシグナル伝達特性をもつ。このため、内在性受容体の正常なシグナル伝達経路が転覆される。
好ましくは、内在性受容体は不活性であり、または検定の条件は内在性受容体の活性化を回避して、シグナル対ノイズの割合を向上させる。
イーストシステムについての米国特許第5,789,184号を参照。
「ワンハイブリッド」システムの他のタイプは、ペプチド：ＤＮＡ結合ドメイン融合を活性化ドメインをもつ非融合標的受容体とと組み合わせる。
「二ハイブリッド」システム
好適な具体例においては、細胞に基づく検定は二ハイブリッドシステムである。この用語は、リガンドが第一のハイブリッドタンパク質に組み込まれ、そして受容体が第二のハイブリッドタンパク質に組み込まれることを意味する。第一のハイブリッドは、シグナル生成システムの構成要素Ａも含み、そして第二のハイブリッドは、このシステムの構成要素Ｂを含む。構成要素ＡおよびＢは、それ自体、シグナルを生成するのには不十分である。しかしながら、リガンドが受容体に結合すると、構成要素ＡおよびＢは十分に近接してシグナルを共同して生成することができるようになる。
構成要素ＡおよびＢは、単一の天然生成生物分子の構成要素として、天然生成で、もしくは天然生成の成分に実質的に同一であり、または天然においては相互作用する別々に天然生成する生物分子として、天然生成であり、もしくは天然生成の成分に実質的に同一である。
【００７０】
二ハイブリッドシステム：転写ファクタータイプ
好ましい「二ハイブリッド」システムの具体例においては、ペプチドリガンド：受容体結合ペアの一のメンバーは、転写因子からＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合して発現され（この融合タンパク質は「餌」と呼ばれる）、そして他のメンバーは融合としてトランス活性化領域（ＴＡＤ）に発現される（この融合タンパク質は、「魚」、「捕食」、または「キャッチ」と呼ばれる）。トランス活性化領域は、ＤＮＡ結合領域に相補的でなければならず、すなわち、これは後者と相互作用して、ＤＮＡ結合領域のための結合部位を保因する特別に設計されたレポーター遺伝子の転写を活性化させなければならない。天然には、二つの融合タンパク質は、相補的と同様でなければならない。
この相補性は、相補的かつ分離可能なＤＮＡ結合および単一転写活性タンパク質の転写活性領域を使用することによって達成することができ、または異なるタンパク質から分離された相補領域を使用することができる。この領域は天然の領域と同一であるか、その変異体である。検定メンバーは、ＤＢＤまたはＴＡＤと直接融合することができるか、または中間体リンカーを介して融合することができる。
標的ＤＮＡオペレーターは、天然オペレーター配列であることができ、または変異オペレーターであることができる。オペレーターにおける変異は、ＤＢＤおよびＴＡＤの変異と協調することができる。適切な転写活性システムの例は、受容体遺伝子が作用可能にＬｅｘＡオペレーターに結合している、バクテリア受容体ＬｅｘＡからのＤＮＡ結合領域およびイースト転写因子Ｇａｌ４からの活性因子から構成される。
無処置の標的受容体を採用する必要はなく、リガンド結合成分のみで十分である。
二つの融合タンパク質は、同一または異なるベクターから発現されることができる。同様に、活性可能な受容体遺伝子は、融合タンパク質のいずれか（もしくは両方のタンパク質）としての同一ベクターからか、まは第三のベクターから、発現することができる。
可能性のあるＤＮＡ結合領域は、Ｇａｌ４、ＬｅｘＡ、および前記に実質的に同一な変異領域を含む。
可能性のある活性化領域は、大腸菌Ｂ４２、Ｇａｌ４活性化領域ＩＩ、およびＨＳＶ  ＶＰ１６、ならびに前記に実質的に同一な変異領域を含む。
可能性のあるオペレーターは、所望の活性化領域についての天然オペレーター、および天然オペレーターに実質的に同一である変異領域を含む。
融合タンパク質は、核局在化シグナルを構成することができる。
【００７１】
分析システムは、シグナル生成システムも含む。このシステムの第一の要素は、ＤＢＤおよびＴＡＤの選択に反応するオペレーターに、操作可能に結合しているレポーター遺伝子である。このレポーター遺伝子の発現は、直接または間接に、選択可能またはスクリーニング可能な表現型（シグナル）に結びつく。シグナル生成システムは、レポーター遺伝子に加えて、シグナルの生成において協調する付加的な遺伝子のまたは生物学的な要素を含むことができる。このような要素は、たとえ、細胞増殖培地における選択的な薬剤であることができる。シグナル生成システムは一よりも多く存在し、そして前記システムは一よりも多いレポーター遺伝子を含む。
前記システムの感受性は、たとえば、活性化、もしくはシグナル生成過程における任意の段階の競合的阻害剤の使用、オペレーターの数の増減、ＤＢＤもしくはＴＡＤの強弱の使用、等によって調節することができる。
シグナルが問題となる細胞の死もしくは生存である場合、または問題となる細胞の増殖もしくは非増殖である場合、検定は選択であるといえる。シグナルが、シグナルを出している細胞をシグナルを出していない状態の同一細胞と識別できるようにする（ともに生細胞）、検出可能な表現型をもたらすだけの場合、分析はスクリーニングである。しかしながら、用語「スクリーニング分析」は、選択を含むより広い意味で使用される。我々はより狭い意味を意図するとき、「非選択的スクリーン」の語を使う。
種々のスクリーニングおよび選択システムが、Lander、米国特許第5,198,346号で議論されている。
スクリーニングおよび選択は、ペプチド：標的タンパク質または化合物：標的タンパク質相互反応のため、または対してであることができる。
好ましい分析細胞は微生物（バクテリア、酵母、藻類、原生動物）、無脊椎動物、脊椎動物（特に、哺乳類、特にヒト）である。もっとも発達した２−ハイブリッド分析は、酵母および哺乳類系である。
通常２−ハイブリッド分析は、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙが相互反応するかどうかを、ＤＢＤおよびＴＡＤの相互反応を再構成する能力という観点で、決定するのに使用される。しかしながら、増強した２−ハイブリッド分析は、第３の、非タンパク質リガンドに基づく相互反応を検出するために使用されている。
【００７２】
２−ハイブリッド分析のためのさらなる手引きのために、Brent  and  Finley、Jr.、Ann.  Rev.  Genet.、31：663-704（1997）；Fremont-Racineら、Nature  Genetics、277-281（1997年７月16日）；Allenら、TIBS、511-15（1995年12月）；LeCrenierら、BioAssays、20:1-6（1998）；Xuら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.（米国）、94:12473-8（1992年11月）；Esotakら、Mol.  Cell.  Biol.、15:5820-9（1995）；Yangら、Nucleic  Acids  Res.、23：1152-6（1995）；Bendixenら、Nucleic  Acids  Res.、22：1778-9（1994）；Fullerら、BioTechniques、25：85-92（1998年7月）；Cohenら、PNAS（米国）９５：１４２７２−７（１９９８）；KoloninおよびFinley、Jr.、PNAS（米国）95：14266-71（1998）を参照。VasavadaらPNAS（米国）88：10686-90（1991）（偶発複製分析）、およびRehrauerら、J.  Biol.  Chem.、271：23865-73、91996）（LexAリプレッサー開裂分析）も参照。
【００７３】
２−ハイブリッドシステム：レポーター酵素タイプ
他の実施例では、成分ＡおよびＢが、転写因子ではない酵素を再構成する。
最後の実施例におけるように、酵素の再構成は表現型の変化であり、これはスクリーニング可能な変化、選択可能な変化、またはその両方であることができる。
生体内における診断的な使用
放射標識化ＡＢＭを、ヒトまたは動物被験者に投与することができる。投与は、典型的には注射によるもので、たとえば、静脈注もしくは動脈注で、または、適切な放射能検出装置を使用する動的および／または静的な画像処理が可能となる量的に十分な他の投与の手段によってなされる。投与量は、診断的に有効な画像を提供することが可能な最小量であり、そしてこれは、ガイドとしての既知の放射能画像化薬剤を使用して、当技術分野で慣行の手段によって決定することができる。
典型的には、画像化は、被験者の全身に実施され、または検討中の状態もしくは疾患に関連する身体もしは器官の部分に実施される。関連する標的器官内の所与の場所および時点における蓄積された放射能標識化ＡＢＭの量を、次に数量化する。
特に適切な放射能検出装置は、ガンマカメラといったシンチレーションカメラである。シンチレーションカメラは、放射標識ＡＢＭの画像分配として使用することのできる固定装置である。カメラの検知装置は、放射能減衰を感知し、その分布を記録する。画像システムによって生成するデータはデジタル化できる。デジタル化した情報は、間をおいたまたは連続した時間で分析することができる。デジタル化したデータは、分散したポイントの標的器官における放射能標識ＡＢＭの時間内のとりこみのパターンの、フレームと呼ばれる画像を生成するように加工することができる。もっとも連続的（動的）な研究では、定量的なデータは、時間をかけた標的器官の放射能減衰の分布の変化を観察することによって得ることができる。言い換えると、データの時間―活性分析は、時間をかけた標的器官による、放射能標識化結合タンパク質の撤去を通じた取り込みを説明する。
【００７４】
種々のファクターを考慮して、適切な放射性同位元素の選択しなければならない。放射性同位元素は、画像処理における良好な解像度を得る観点から選択されるべきであり、ヒトおよび動物の診断に使用するためには安全でなくてはならず、そして好ましくは、物理的に半減期が短くて身体が受ける放射能の量を減じなければならない。使用される放射性同位元素は、好ましくは、薬理学的に不活性であるべきで、そして投与される量では、実質的にいかなる生理学的影響ももたないべきである。
ＡＢＭは、異なるヨードの同位元素によって放射能標識することができ、たとえば、１２３Ｉ、１２５Ｉ、または１３１Ｉである（たとえば、米国特許第4,609,725号参照）。蛍光標識の範囲は、モニターされるべきであるが、計算に影響するので、画像処理の結果に基づいて決められるべきである（すなわち、ジヨード化ＡＢＭは、同一時間枠の類似のモノヨード化ＡＢＭの二倍の放射能計算となる）。
ヒト被検者への適用においては、ヒトの身体のトータルの線量測定曝露を減じかつ標識化分子の検出性を最適化するために、標識化のために１２５Ｉではない放射性同位体を使用することが好ましい（この放射能同位体は、条件的に必要の場合に使用することができる）。臨床的な使用への容易さもファクターとなる。従って、ヒトに適用するために、好ましい放射能標識はたとえば、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは２１１Ａｔである。
放射能標識化ＡＢＭは、種々の方法によって調整することができる。これには、クロラミンＴ法またはラクトペルオキサイド法による放射性ハロゲン化とそれに続くＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）による精製を含み、たとえばJ.Gutkowskaらによって記述された「Endocrinology  and  Metabolism  Clinics  of  America」（1987）16(1)：183のとおりである。他の放射能標識化の既知の方法も使用することができ、たとえばIODOBEADSＴＭである。
エンドユーザーに放射能標識化ＡＢＭを届ける異なる方法が数多くある。哺乳動物の身体中において薬剤が作用する部位に活性薬剤が到達することができる任意の方法によって、投与することができる。経口投与の場合タンパク質は消化されるので、非経口的、すなわち、静脈注、皮下的、筋中が、抗体といった、タンパク質である、ＡＢＭの吸収を最適化するために通常使用される。
【００７５】
実施例
動物モデル
肥満ならびにそれに引き続く高インシュリン症および高血糖は、３週齡マウス（C57B1/6オス50）のグループに高脂肪食（Bio-Serve、Frenchtown、NJ、#F1850高炭水化物−高脂肪）を与えることによって誘導した。他の３週齡マウス（C57B1/6オス20）のグループに通常の対照食（PMI  Nutrition  International  Inc.、Brentwood、MO、Prolab  RMH3000）を与えた。マウスは、離乳後すぐにそれぞれの食事においた。動物体重を一週ごとに測定した。空腹時血中グルコースおよび血漿インシュリン測定を、2、4、8および16週、および6ヶ月に、それぞれの食事のグループについて測定した。
正常体重、正常空腹時血中グルコースおよび正常空腹時血漿インシュリンレベルを、対照食を与えた動物のそれぞれの平均値として定義した。
「最も典型的な」動物のうちの二匹を、それぞれの時点において（2、4、8および16週、および6ヶ月、食事制限開始後）、それぞれのグループ（対照、高インシュリン症および糖尿症）から犠牲として選択した。選択したマウスを犠牲にして肝臓組織を得て、RNA分離まで液体窒素中に凍結した。
空腹時血中グルコースレベル
血中グルコースレベルは、Lifescan  Genuｉne  Touch  glucometerを使用して空腹（6時間）マウスの尾の先からとった血液一滴から測定した。測定全ては、午後３時から午後５時の間に行った。
血漿インシュリン測定
空腹（６時間）マウスの尾からヘパリン処理したキャピラリーチューブに血液を採集して、氷上に保管した。すべての採取は午後３時から午後５時の間に行った。血漿を、１０分間8000×ｇで遠心分離することによって赤血球細胞から分離して、−２０℃にて保存した。インシュリン濃度を、ラットインシュリンELISAキットおよびラットインシュリン標準物質（ALPCO）を基本的に製造者の指示に従って使用することで、決定した。値は、抗体との交差反応性における種間の相違を補正するために、製造者によって決定された因子1.23によって補正した。
【００７６】
ＲＮＡ分離
全ＲＮＡを、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ６０  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ／ｍＲＮＡ分離試薬を用いて、製造者の指示（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Friendswood、ＴＸ）に従って、肝臓から分離した。
試料の定量化および質的評価
全ＲＮＡを、Bioanalyzer  ＲＮＡ  6000  Ｎａｎｏチップ（Agilent）上で、定量化および質について評価した。各チップは、ゲルを充填したチャンネルの相互に連結したセットを包含し、核酸の分子ふるいを可能とする。チップ中のピン電極が、電気泳動力を生じて分子をこれらのマイクロチャンネルを通じて運ぶことで電気泳動分離を実施することを可能にした。リボソームのピークは蛍光シグナルによって測定されて、エレクトロフェログラム中に表示された。成功した総ＲＮＡ試料は、二つの別々のリボソームピークを示した（１８Ｓおよび２８ＳのｒＲＮＡ）。
ビオチン化ｃＲＮＡハイブリダイゼーション標的
CodeLinx  Expression  Bioarrays（商標）（Amersham  Biosciences）用の製造者の指示に記述されたとおりに、全ＲＮＡをハイブリダイゼーション標的として使用するために調整した。CodeLinx  Expression  Bioarraysは、ビオチン標識化相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）標的およびゲルマトリックスに付加したＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブとの核酸ハイブリダイゼーションを利用している。
ビオチン標識化ｃＲＮＡ標的は、線形増幅法によって調整される。ポリＡ＋ＲＮＡ（全ＲＮＡ個体群中の）が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター５’から（ｄＴ）２４配列を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドによる逆転写に、準備される。第二のｃＤＮＡ鎖を合成後に、ｃＤＮＡは試験管中の逆転写（ＩＶＴ）反応の鋳型として働いて標的ｃＲＮＡを生成する。このＩＶＴは、ビオチン化ヌクレオチドの存在下、標的ｃＲＮＡを標識化するよう働く。この手順により、入力ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの５０ないし２００回の線形増幅をもたらす。
【００７７】
ハイブリダイゼーションプローブ
オリゴヌクレオチドプローブは、Codelinx  Uniset  Mouse  I  Bioarray（Amersham、製品コード300013）によって提供された。アミン末端オリゴヌクレオチドプローブが、３次元構造ポリアクリルアミドゲルマトリックスに付加した。10,000のオリゴヌクレオチドプローブが存在し、それぞれはよく特徴付けられたマウス遺伝子に特異的である。各マウス遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕｎｉｇｅｎｅの2001第四四半期版からの独自の遺伝子クラスターの代表である。500の対照プローブも存在する。
このプローブ配列は、Ａｍｅｒｓｈａｍ独自である。しかしながら、各プローブについてＡｍｅｒｓｈａｍは、ＮＣＢＩ目録番号、ＯＧＳ、LocusLink、Unigene  Cluster  ID、および記述（名前）によって、対応するマウス遺伝子を同定している。この情報はAmershamから入手する必要がある。差次的に発現したプローブの場合、この情報はマスターテーブル１に複製している。完全なリストは、
http://www4.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/codelink_literature
を参照。「Gene  List」の下、「Uniset  Human  Ｉ」を選択すると、エクセル形式で遺伝子リストをダウンロードすることができる。
【００７８】
ハイブリダイゼーション
ｃＲＮＡ標的を使用して、CodeLinx  Gene  Expression  Bioarrays（商標）（Amersham  Biosciences）用の製造者の指示にあるとおりに、ハイブリダイゼーション反応混合物を調整して分析チャンバー上に装てんする。各試料は、それぞれのマイクロアレイにハイブリッド形成する。ハイブリダイゼーションを37℃で行う。ハイブリダイゼーション緩衝液は、Motorola指示書にあるとおりに調製する。マイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、アビジン化蛍光試薬、Streptavidin-Alexa  Fluor（商標）647（Amersham）によって検出した。
マウス遺伝子発現分析
処理した配列は、GenePix4000B  Microarray  Scanner（Axon  Instruments、Inc.）を使用してスキャンした；配列画像は、Amersham  CodeLink（商標）Analysis  Software（2.2版）を使用して得た。前記Amersham  CodeLink（商標）Analysis  Softwareは、集積光学密度（ＩＯＤ）の値をすべての点について与える；その点おけるバックグラウンド値を差し引いて、「生」データ点をもたらす。個々のチップを次にAmersham  CodeLink（商標）ソフトウェアをにより、全10,000遺伝子についての生の強度の中央値に従って標準化する。ネガティブコントロール閾値も、対照プローブに従って計算する。試料間の、発現における有意な差は、発現値が最低２倍として定義された。ネガティブコントロール閾値より低い発現値をもつ遺伝子は、試料から排除され、そして次に、以下に記す観点で発現レベルが有意に変化する遺伝子を同定するために、発現データを分析した。
正常対高脂肪食の、２、４、８および１６週、ならびに６ヶ月の、高インシュリン症マウスと比較した正常マウス。
正常対高脂肪食の、２、４、８および１６週、ならびに６ヶ月の、高インシュリン症／高血糖症マウスと比較した正常マウス。
高脂肪食の、２、４、８および１６週、ならびに６ヶ月の、高インシュリン症／高血糖症マウスと比較した高インシュリン症マウス。
【００７９】
データベース検索
ヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を、Blast2.0プログラム（全米バイオテクノロジー情報センター、国立衛生研究所）を使用して、公有データベースと比較した。ヌクレオチド配列は、ＡＢＩ  prism  Edit  View１．０．１（ＰＥ  Applied  Biosystems、Foster  City、CA）を使用して表示した。
ヌクレオチドデータベース検索は、当時最新のバージョンBLASTN2.0.12で行った。Altschulら、「Gapped BLAST  and  PSI-BLAST：新世代タンパク質データベース検索プログラム」、Nucleic  Acids  Res.、25:3389-3402（1997）を参照。検索は、他に記述もあるが、デフォルトパラメーターを使用した。
検索blastNについて、デフォルトはblastNマトリックス（1、-3）で、ギャップがある場合のペナルティーは５で、伸長がある場合のペナルティーは２であった。
タンパク質データベース検索は、当時最新のバージョンBLAST  Xで行った。Altschulら（1997）、上記。検索は、他に記述もあるが、デフォルトパラメータを使用した。スコア化マトリックスはBLOSUM62で、ギャップがある場合のコストは11で、伸長がある場合のコストは１であった。標準の低密度フィルターを使用した。
「ref」はNCBIのRefSeqが情報源のデータベースであることを示す。これに従う識別子は、RefSeq受入番号であり、GenBank受入番号ではない。「RefSeq配列はGenBankから得たもので、我々の現在既知の遺伝子知識を代表する重複のないデータを供する。いくつかの記録は、記録保管データベースに提示されたことのない付加的な配列情報を含むが、しかし文献では利用可能であった。少数の配列は共同制作によるもので、すなわち、下線部の一次配列データはGenBankで利用可能であるが、GenBank記録のどの中にも利用可能でない可能性がある。RefSeq配列は、一次配列に従わない。RefSeq記録はNCBIによって保有されていて、このため必要に応じて最新の注記を整備しあるいは配列情報を加えて組み込んで、改定されることができる」。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/refseq.htmlも参照。
当業者によって認識されるであろうことだが、データベース検索の正確な結果は、新規の配列が加えられるに連れて日々変化する。また、元の配列の長いバージョンをクエリーした場合も結果は変化する。ここに示す結果は、ある時点で得られたものであり、出願日に検索して得られるものと正確に同一のヒットを保証するものではない。しかしながら、特定のクエリー配列および特定のデータベース配列間の整合を議論する場合、その整合については変化するものではない（パラメーターと配列が変化しないままの場合）。
【００８０】
ノーザン解析
ノーザン解析を使って結果を確認することができる。上に定義したような、好ましい遺伝子および好ましくない遺伝子、またはその断片を、ノーザンハイブリダイゼーション解析のプローブとして使用して、その差次的発現を確認することができる。対照マウス、高インシュリン症マウスおよびタイプII糖尿病マウスから分離した全RNAを、１％アガロース、１％ホルムアルデヒド変性ゲルを通すアガロースゲル電気泳動によって分離し、正に荷電したナイロン膜に向かって移動させて、Random  Primed  DNA  Labelling  Kit（Roche、Palo  Alto、CA）を使用して、上述した遺伝子または断片から生じる［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したプローブとハイブリッド形成させる。
同時ＲＮＡ分析
同時ＲＮＡ分析も、確認のために使用することができる。「同時」ＲＮＡ分析のために、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換してから、各クローン用に作られた遺伝子特異的プライマーでプローブする。蛍光色素の「同時」組み込みを測定して、各試料中の特異的転写物の存在量を測定する。２倍またはそれ以上（各方向につき）の試料間の相違（対照対高インシュリン症、高インシュリン症対糖尿病症、または対照対糖尿病症）を差次的発現と考える。いくつかの無関係の動物を使用しての確認すが好ましい。
生体内ハイブリッド形成
他の確認形式が、選択したヒト（Tissue  Informaticsによって得られる）、および疾患進行中に上方制御または下方制御されることが見出されるマウス遺伝子から生成するｃＲＮＡプローブを使用したマウス組織での、非同位体生体内ハイブリダイゼーション（ＮＩＳＨ）によってなされることができる。非同位体生体内ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲサブトラクションハイブリッド形成によって同定した、すべての「新規」ｃＤＮＡから生成したｃＲＮＡプローブを使用したマウス組織でも実行することができる。これらのｃＲＮＡは、細胞中に存在する対応するメッセンジャーＲＮＡにハイブリッド形成して、特異的な遺伝子を発現しているとともに遺伝子発現の相対レベルを発現している組織内の特定の細胞のタイプに関する情報を提供する。ｃＲＮＡプローブは、ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰの存在下、Ｓｐ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた、、試験管内での鋳型ｃＤＮＡの転写によって生成する（Roche  Molecular  Biochemicals、Manheim、Germany；Pardue、M.L.1985.「In  situ  hybridization、Nucleic  acid  hybridization、a  partical  approach」IRL  Press、Oxford、179-2-2）。
【００８１】
遺伝子組換え動物
トランスジェニック発現を使用して結果を確認することができる。一の具体例では、問題となるマウス遺伝子の好ましいものと好ましくないものを過剰発現するようにマウスを操作する。他の具体例では、対応する好ましいヒト遺伝子と好ましくないヒト遺伝子を発現するようにマウスを操作する。第三の具体例では、ラット、ウサギ、ヤギ、羊または豚といった、マウスではない非ヒト動物を操作して、好ましいもしくは好ましくないマウスまたはヒト遺伝子を発現させる。
過剰量組織分析
遺伝子発現分析に加えて肝臓切片も、TissueInformatics有限会社のTissueAnalytics（商標）ソフトウェアを使用して分析することができる。一つの代表切片を各肝臓のブロックから切断し、スライド上に載置し、そしてＨ＆Ｅで染色することができる。各スライドのデジタル画像を、研究用顕微鏡およびデジタルカメラを使用して得ることができる（オリンパスＥ６００顕微鏡およびソニーＤＫＣ−ＳＴ５）。これらの画像は解像度0.64mm/ピクセル、拡大率20倍で得られた。過剰量分析を、得られた画像について実施した。まずデジタル画像分析は、機器の視野を使用して組織中の構造対象を同定および注記付けすることができる。これらの対象は、組織の成分であるが、視覚的に同定可能でかつ、幹細胞、類洞、空胞のような生物学的意義をもつので、注記付けすることができる。続いて、位置のような幾何的な性質もしくは染色強度およびａ％範囲という観点での視野もしくは単位広さあたりのこれらの関係といった、これらの構造の数量化を実施することができる。過剰量についての特徴またはパラメーターは、各組織について特異的であり、そして特徴、全体的な異質さの測定、包含する配向性、相対位置、および外見の間の関係を含むことができる。
【００８２】
関係分析
数理統計学は、類似性についての定量的および遺伝子発現プロフィールの時間分解データのセットを提供し、これは順位関係、回帰計算および相関係数、ならびにクラスター形成も含む。連続関数も、各遺伝子および組織の特性データ−のデータポイントに合致させることができる。遺伝子発現および過剰量組織データの間の関係は、同調的または非同調的な配列において、線形または非線形であることができる。
使用したスピアマン順位関係分析、測定の二つのクラス（遺伝子および組織特性）について実施して、他の重要な遺伝子を同定するのに役立った。有意性についての２倍相違に合致しない少量の遺伝子を、組織特性との相関に基づく遺伝子のリストに加えた。
ここに引用した文献は、ここに引用した文献のいずれもが適切な従来技術であることを意図するものではなく、または本発明のいずれかの請求項の特許性のための熟慮した材料となることの承認であることを意図するものでもない。これら文献の日付に関するすべての言及または内容に関するすべての説明は、出願人に利用可能な情報に基づいており、これら文献の日付または内容の正確性の承認を構成するものではない。
添付した請求項は、好適な実施の形態の非制限的な詳説として扱われる。
【００８３】
他で説明したことに加え、本発明の出願時の最新版について、以下の参照をここに参照として組み込む。Kay、Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins：A  Laboratory  Manual；the  John  Wiley  and  Sons  Current  Protocolsシリーズ、以下を含む、Ausubel、Current  Protocols  in  Molecular  Biology；  Coligan、Current  Protocols  in  Protein  Science；  Coligan、Current  Protocols  in  Immunology；  Current  Protocols  in  Human  Genetics；  Current  Protocols  in  Cytometry；
Current  Protocols  in  Pharmacology；  Current  Protocols  in  Neuroscience；  Current  Protocols  in  Cell  Biology；  Current  Protocols  in  Toxicology；  Current  Protocols  in  Field  Analytical  Chemistry；  Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry；およびCurrent  Protocols  in  Human  Genetics；ならびに以下のCold  Spring  Harbor  Laboratory出版物：Sambrook、Molecular  Cloning： A  Laboratory  Manual；  Harlow、Antibodies：  A  Laboratory  Manual；  Manipulating  the  Mouse  Embryo：  A  Laboratory  Manual；  Methods  in  Yeast  Genetics：  A  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Course  Manual；  Drosophila  Protocols；  Imaging  Neurons：  A   Laboratory  Manual；  Early  Development  of  Xenopus  laevis：  A Laboratory  Manual；  Using  Antibodies：  A Laboratory  Manual；  At  the  Bench：  A Laboratory  Navigator；  Cells：  A Laboratory  Manual；  Methods  in  Yeast  Genetics：  A  laboratory  Course  Manual；  Discovering  Neurons：  The  Experimental  Basis  of  Neuroscience；  Genome  Analysis：  A  laboratory  Manual  Series；  Laboratory  DNA  Science；  Strategies  for  Protein  Purification  and  Characterization：  A  laboratory  Course  Manual；  Genetic  Analysis  of  Pathogenic  Bacteria：  A  Laboratory  Manual；  PCR  Primer：  A  Laboratory  Manual；  Methods  in  Plant  Molecular  Biology：  A  Laboratory  Course  Manual；  Manipulating  the  Mouse  Embryo：  A  Laboratory  Manual；  Molecular  Probes  of  the  Nervous  System；  Experiments  with  Fission  Yeast：  A  Laboratory  Course  Manual；  A  Short  Course  in  Bacterial  Genetics：  A  Laboratory  Manual  and  Handbook  for  Escherichia  coli  and  Related  Bacteria；  DNA  Science：  A  First  Course  in  Recombinant  DNA  Technology；  Methods  in  Yeast  Genetics：  A  Laboratory  Course  Manual；  Molecular  Biology  of  Plants：  A  Laboratory  Course  Manual。
ジャーナルの論文もしくは要約、公開済み、対応、先行もしくは別の関連する米国または外国の特許出願、交付済み米国もしくは外国特許、または任意の他の参照を含む、ここに引用した参照は、すべてここに参照として組み込まれ、これは引用された参照中に存在する全てのデータ、表、図、および文字を含む。加えて、ここに引用した参照の中に引用されている参照のすべての内容も、参照として完全に組み込まれる。
【００８４】
既知の方法過程、通常の方法過程、既知の方法または通常の方法への言及は、いかなる意味においても、本発明のいかなる面、記述または実施態様が、従来技術に開示、教示または示唆されていることを承認するものではない。  
先に記述した具体的な実施例は、当業者の知識（ここに引用した参照の内容を含む）を用いることで、このような具体的な実施例のような種々の応用のために、過度の実験をすることなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、本発明を容易に修正および／または適応できるという本発明の一般的な性質を完全に明らかするものである。このため、ここにあらわした教示およびガイダンスに基づいて、このような適応および修正は、開示した実施例に同等の意味および範囲の中にあると企図している。ここに使用した専門語または用語は、記述の目的で使用したもので制限の目的で使用したものではなく、すなわち、本願明細書の用語または専門語は、当業者がここに示した教示およびガイダンスのもとに、当業者の通常の知識と組み合わせて、解釈されるべきものである。
本発明の実施において有用もしくは好ましいクラスまたは範囲のいかなる記述も、そこに含まれる任意の部分集合（たとえば、開示したクラスから、一もしくはそれ以上の開示したメンバーを削除する）または部分的な範囲の記述としてもみなされ、同様に各個別のメンバーもしくは値の個々の記述としてもみなされる。
好ましい実施の態様の記述は、不可能な組み合わせ（たとえば、本発明の要素について相互に排他的な選択）または本明細書によって明らかに除外されるものを除き、このような好ましい実施の態様の任意の可能な組み合わせの記述としてもみなされる。
本発明の実施の態様が従来技術に開示されている場合、本発明は、そのような実施の態様を除いてここに開示した発明を含むとみなされる。
【００８５】
マスターテーブルの手引き
マスターテーブルは、遺伝子チップデータの出願人の分析を示す
差次的に発現したマウス遺伝子に対応する各プローブについて、マスターテーブル１は同定する。
第１段：マウス遺伝子（上流）およびマウス遺伝子（下流）データベース受入番号。
第２段：2001年第四四半期版の、対応するマウスUnigene  Cluster。
第３段：マウス遺伝子について観察される性質（差次的発現）。この段は、差次的な性質に基づいて遺伝子を好ましいもの（F)または好ましくないもの（Ｕ)に同定する。三つの可能な比較、ＨＩ−Ｄ、Ｃ−ＨＩ、およびＣ−Ｄが存在し、ここでＣは対照（control、正常）、ＨＩは高インシュリン症（hyperinsulinemic）、およびＤは糖尿病（diabetic）である。
以前の状態の遺伝子のレベルが、後の状態の遺伝子のレベルの少なくとも２倍である場合、好ましくないと考えられる。以前の状態の遺伝子ののレベルが、後の状態の遺伝子のレベルの半分を越えない（すなわち、２の逆数倍を越えない）場合、好ましいと考えられる。
第４段：関連するヒトタンパク質で、そのデータベース受入番号によって同定されたもの。通常、いくつかのそのようなタンパク質は、各マウス遺伝子と比較して同定される。これらのタンパク質は、第６段ないし第８弾に説明するように、BLAST検索によって同定されている。
第５段：関連するヒトタンパク質の名前。
第６段：BLASTプログラムによって実施される配列についてのスコア（ビット）。
第７段：BLASTプログラムによって実施される配列についてのＥ値。UnigenがBlastxのle-6より低いＥ値について、クラスターの参照配列に「適合」すると考えていることが、特記される。
第８段：使用されるBLAST検索の戦略。ＭＧは、マウス遺伝子がBlastX検索におけるクエリー配列として使用されたことを示している。ＭＰは、マウスタンパク質がBlastP検索におけるクエリー配列として使用されたことを示している。ＨＧＰは、マウス遺伝子が最初にヒト遺伝子のためのBlastN検索に使用されて、次にヒト遺伝子がヒトタンパク質のためのBLASTX検索に使用されたことを示している。
【００８６】
マスターテーブル１は、第３段中の「性質」に基づいて３つのサブテーブルに分割できる。遺伝子が少なくとも一の好ましい性質をもち、そして好ましくない性質をもたない場合は、サブテーブル１Ａに入れられる。逆の場合には、サブテーブル１Ｂに入れられる。その性質が混合性の場合、すなわち、少なくとも一の好ましいものと少なくとも一の好ましくないものをもつ場合、サブテーブル１Ｃに入れられる。
マスターテーブル２は３段のみもつ。
第１段：マウス遺伝子。
第２段：性質。マスターテーブル１の第３段と同様。
第３段：ヒトタンパク質分類。マスターテーブル１に定義した関連するヒトタンパク質に基づいて、マスターテーブル２は、類似の性質をもつと期待されるヒトタンパク質の分類について可能ならば、一般化する。与えられたマウス遺伝子について、関連するとして見出されるヒトタンパク質の多様性のために、いくつかのヒトタンパク質分類をリスト化することができる。いくつかの場合、記述したヒトタンパク質分類を階層化することができ、たとえば一を他の部分集合とする。他の場合には、記述した分類は重複しないが関連するものとすることができる。そして他の場合には、記述した分類は重複も関連もしないものとすることができる。上記の組み合わせも可能である。
前記分類に加えて、対応するヒト遺伝子集団も興味のあるところである。これらは多くの方法で入手することができる。第一に、Unigene
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?ab=unigene)
を、同定されたヒトタンパク質について検索することができる。「ヒット」（それぞれはUnigeneの記録である）を「Ｈｓ．」をつけられたものについて再検査する。第二に、マウス遺伝子集団（マスターテーブル１に与えられている）のために、Unigeneレコードにアクセスして、「Homologene」上をクリックする。これにより、「可能な相同遺伝子群」セクションを含む新しいページが開く。入力の一つはホモサピエンス遺伝子である（もっとも関連する遺伝子としてUnigeneによって考えられる）。そのUnigeneレコードリンク上をクリックする。
興味のある更なる情報は、
http://www.informatics.jax.org/
の、マウス遺伝子情報データベース中の、マウス遺伝子目録を検索することによって入手することができる。
【００８７】
参考文献
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表９】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１８４】
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【表１８６】
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【表１８７】
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【表１８９】
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【表３１１】
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【表３１２】
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【表３１３】
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【表３１４】
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【表３１５】
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【表３１６】
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【表３１７】
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【国際調査報告】
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