(57)【要約】本発明は、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるアミノ酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。さらに、本発明は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることによって、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法を提供する。さらに、本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択された有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べて、カンプトテシン変換活性において少なくとも２倍の増加を有する、請求項１記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号：２４、２６、３０、３２、３４、３６、３８、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、１３６、１４０および１４２、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項４】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べて、カンプトテシン変換活性において少なくとも５０倍の増加を有する、請求項３記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項５】
配列番号：３６、１０８、１１０、１１２、１２２、１２４、１３４、１７８、１８０、１８２、１８６、１８８、１９０、１９２および１９６、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むジブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項６】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも１００倍の増加を有する、請求項５記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号：１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９２および１９６、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項８】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べて、カンプトテシン変換活性において少なくとも５００倍の増加を有する、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項９】
配列番号：１７８、１８０、１８２、１８４、１８８および１９２、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１０】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも６００倍の増加を有する、請求項９記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１１】
配列番号：１７８、１８０、１８２、１８４および１８８、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１２】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも８００倍の増加を有する、請求項１１に記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１３】
配列番号：１７８、１８０、１８４および１８８、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１４】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも１５００倍の増加を有する、請求項１３記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１５】
配列番号：１７８、１８０および１８８、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１６】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも２０００倍の増加を有する、請求項１５記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１７】
配列番号：１７８および１８０、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１８】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも２５００倍の増加を有する、請求項１７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項１９】
配列番号：１８０に表されたアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、ブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２０】
ブチリルコリンエステラーゼ、またはそれらの機能フラグメントに比べてカンプトテシン変換活性において少なくとも３０００倍の増加を有する、請求項１９記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２１】
抗体または抗体フラグメントをさらに含んでいる、請求項１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９、またはそれらの機能フラグメントに記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２２】
該抗体または抗体フラグメントが、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に結合する、請求項２１記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２３】
該抗体または抗体フラグメントが、配列番号：１８および２０に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項２２記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２４】
該抗体または抗体フラグメントが、ＣＤ２０細胞表面抗原を特異的に結合する、請求項２１記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２５】
該抗体または抗体フラグメントが、配列番号：１９８および２００に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項２４記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２６】
図１９に示され、配列番号：２０２に表された配列を含む、請求項２５記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２７】
該アミノ酸配列が配列番号：１７８を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２８】
該アミノ酸配列が配列番号：１８０を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項２９】
該アミノ酸配列が配列番号：１８２を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３０】
該アミノ酸配列が配列番号：１８４を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３１】
該アミノ酸配列が配列番号：１８６を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３２】
該アミノ酸配列が配列番号：１８８を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３３】
該アミノ酸配列が配列番号：１９０を含む、請求項５記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３４】
該アミノ酸配列が配列番号：１９２を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３５】
該アミノ酸配列が配列番号：１９４を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３６】
該アミノ酸配列が配列番号：１９６を含む、請求項７記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体。
【請求項３７】
配列番号：３、５、７、９、１１、１３、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３および１９５、またはそれらのフラグメントから選択される核酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードする核酸。
【請求項３８】
該核酸配列が配列番号：１７７、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項３９】
該核酸配列が配列番号：１７９、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４０】
該核酸配列が配列番号：１８１、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４１】
該核酸配列が配列番号：１８３、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４２】
該核酸配列が配列番号：１８５、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４３】
該核酸配列が配列番号：１８７、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４４】
該核酸配列が配列番号：１８９、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４５】
該核酸配列が配列番号：１９１、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４６】
該核酸配列が配列番号：１９３、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４７】
該核酸配列が配列番号：１９５、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４８】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項４９】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体がブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において２倍以上の増加を示す、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２４、２６、３０、３２、３４、３６、３８、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、１３６、１４０および１４２、またはそれらの機能フラグメントから選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項５１】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において５０倍以上の増加を示す、請求項５０の方法。
【請求項５２】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：３６、１０８、１１０、１１２、１２２、１２４、１３４、１７８、１８０、１８２、１８６、１８８、１９０、１９２および１９６、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項５３】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において１００倍以上の増加を示す、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９２および１９６、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項５５】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において５００倍以上の増加を示す、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１７８、１８０、１８２、１８４、１８８および１９２、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項５７】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において６００倍以上の増加を示す、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１７８、１８０、１８２、１８４および１８８、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項５９】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において８００倍以上の増加を示す、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１７８、１８０、１８４および１８８、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項６１】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において１５００倍以上の増加を示す、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１７８、１８０および１８８、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項６３】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において２０００倍以上の増加を示す、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１７８および１８０、またはそれらの機能フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。 
【請求項６５】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において２５００倍以上の増加を示す、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：１８０で表されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含むブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることを含む、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法。
【請求項６７】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において３０００倍以上の増加を示す、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
該トポイソメラーゼ阻害剤がＳＮ-３８である、請求項４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４または６６記載の方法。
【請求項６９】
該カンプトテシン誘導体がＣＰＴ-１１である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１７８に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７１】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８０に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７２】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８２に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７３】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８４に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７４】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が配列番号：１８６に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７５】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８８に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７６】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９０に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５２記載の方法。
【請求項７７】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９２に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７８】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９４に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７９】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９６に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項８０】
ブチリルコリンエステラーゼに比べてカンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を、個体に投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項８１】
該癌が転移性結腸直腸癌である、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
該癌が卵巣癌である、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
該癌が肺癌である、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】
該癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項８０記載の方法。
【請求項８５】
該トポイソメラーゼ阻害剤がＳＮ-３８である、請求項８０記載の方法。
【請求項８６】
該カンプトテシン誘導体がＣＰＴ-１１である、請求項８０記載の方法。
【請求項８７】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１７８に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８８】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８０に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８９】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８２に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９０】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８４に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９１】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８６に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９２】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８８に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９３】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９０に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９４】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９２に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９５】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９４に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９６】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１９６に示されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９７】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、抗体または抗体フラグメントをさらに含む、請求項８０記載の方法。
【請求項９８】
該抗体または抗体フラグメントが、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)に特異的に結合する、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
該抗体または抗体フラグメントが、配列番号：１８および２０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
該抗体または抗体フラグメントが、ＣＤ２０細胞表面抗原を特異的に結合する、請求項９７記載の方法。
【請求項１０１】
該抗体または抗体フラグメントが、配列番号：１９８および２００に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
該ブチリルコリンエステラーゼが、図１９に示され、配列番号：２０２で表される配列を含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１０３】
該ブチリルコリンエステラーゼ変異体が、配列番号：１８０として表されるアミノ酸配列、またはそれらの機能フラグメントを含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１０４】
該機能フラグメントがＬ５３０短縮(配列番号：２０４)である、請求項１０３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体、より具体的には該産物、およびそれらの治療的使用に関する。
【０００２】
癌は、アメリカにおいて、死亡の主な原因の１つである。毎年、５０万人以上のアメリカ人が癌により死亡し、１００万人以上の人が該疾患と新たに診断される。癌では、新生物細胞は、それらの正常な増殖調節メカニズムから逸脱して、統制されない形式で増殖し、悪性腫瘍の進行へと導く。腫瘍細胞は、最初の腫瘍の処置が完全でないか、または該疾患が相当進行する前に開始されないと、二次的部位に転移し得る。従って、悪性腫瘍の早期診断および有効な処置は、生存に対して重要である。
【０００３】
癌を処置するための現行の方法には、手術、放射線治療および化学療法が包含される。これらの各処置についての主な問題は、癌細胞に対する特異性の欠如および多くの副作用である。例えば、正常組織に対するそれらの毒性を理由に、安全に使用され得る放射線または化学療法剤の量は、全ての新生物細胞を死滅させるには不十分であることが多い。いくつかであっても残っている新生物細胞は、それらが急速に増殖して他の部位に転移し得るので、致死的であり得る。不幸にも、放射線治療や化学療法剤と関連のある毒性は、これらの治療中の癌患者に対するクオリティー・オブ・ライフを著しく低下させる悪心および脱毛を包含する望ましくない副作用によって明示される。明らかに、癌を治療するより選択的かつ有効な手段が必要とされる。
【０００４】
近年、体内で活性化され、癌細胞に対して毒性である代謝産物を生成する化学療法剤の一群が発見された。これらの化学療法剤は、時に、それらが体内で活性な医薬物に変換されるので「プロドラッグ」と呼ばれる。かかる化学療法剤は、パクリタキセル（paxlitaxel）プロドラッグおよびカンプトテシン(ＣＰＴ-１１)を包含する。これらの医薬品は、内生カルボキシルエステラーゼ、例えば、ブチリルコリンエステラーゼによって代謝され、活性な医薬物、例えば、パクリタキセルおよびＳＮ-３８の各々を産生する。これらの化学療法剤はイン・ビトロで良好な抗腫瘍活性を有するが、不幸にもこれらの薬剤を用いた患者において、いくつかの副作用、例えば下痢、脱毛、悪心、嘔吐およびコリン作動性症状が報告された。
【０００５】
これらの化学療法剤に関する低い治療的指標は、癌治療についてそれらの使用を制限する。高用量のこれらの医薬品は、さらなる副作用をもたらすため、これらの医薬品をより有効とするのに違った方法が必要とされる。１つの方法は、体内で、これらの医薬品を活性な医薬物へと変換する効率を増加させることである。多くの天然ヒト・ブチリルコリンエステラーゼに加えて種の変異体も知られているが、しかし、これらの酵素は、高いプロドラッグの加水分解活性を示さなかった。さらに、ヒト以外の種から誘導される酵素および細胞内酵素は、プロドラッグを活性な医薬物に変換する能力に対して試験された。しかし、ヒト以外の種から誘導された酵素および細胞内酵素の両方は、それらの使用を非常に制限する免疫原であり得る。ヒト・ブチリルコリンエステラーゼは、血漿中にあり、免疫原が低いことが有利である。
【０００６】
すなわち、野生型のブチリルコリンエステラーゼ変異体よりも、化学療法剤の活性をより効率的に変化させ得るブチリルコリンエステラーゼ変異体に対する必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たし、関連のある良好な利点も提供する。
【０００７】
本発明の要約
本発明は、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるアミノ酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることによって、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法である。
【０００９】
さらに、本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択される、有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法を提供する。
【００１０】
本発明の詳細な説明
本発明は、化学療法剤プロドラッグを活性な医薬物に変換する高い能力を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。化学療法剤プロドラッグを活性な医薬物に変換する高い能力を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体の同定することにより、癌に対する処置選択肢が提供される。
【００１１】
一つの実施態様において、本発明は、癌に罹患している個体を処置する方法を提供する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は有意な臨床的価値を保持するのは、プロドラッグを活性な医薬物へと、あらゆる既知の天然野生型ブチリルコリンエステラーゼよりも高い割合で変換するそれらの能力を理由とする。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体を他の処置選択肢とは別のものとする、より低い副作用により、より有効な癌の処置を可能にするのは、プロドラッグ変換活性におけるこの増加である。
【００１２】
一つの実施態様において、本発明は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されたブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることによって、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法を提供する。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「ブチリルコリンエステラーゼ」は、天然ブチリルコリンエステラーゼの配列を有するポリペプチドを示すと意図される。天然ブチリルコリンエステラーゼは、あらゆる種の起源、例えば、ヒト、哺乳類、ウマ、またはネズミであり得る。さらに、ブチリルコリンエステラーゼは、例えば、脊椎動物または無脊椎動物のブチリルコリンエステラーゼ、例えば、哺乳類ブチリルコリンエステラーゼであり得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼは、天然ブチリルコリンエステラーゼの多形またはそれ以外の対立遺伝子の変異体でもあり得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼをコードしている核酸は、あらゆる天然のブチリルコリンエステラーゼの配列を有するポリペプチドをコードする。そのため、ブチリルコリンエステラーゼをコードしている核酸は、あらゆる種起源、例えば、ヒト、哺乳類、ウマ、またはネズミのブチリルコリンエステラーゼをコードし得る。さらに、ブチリルコリンエステラーゼをコードしている核酸は、あらゆる天然の対立遺伝子または多形性を包含する。ヒト・ブチリルコリンエステラーゼに対するGenBank受託番号はＭ１６５４１である。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「ブチリルコリンエステラーゼ変異体」は、ブチリルコリンエステラーゼ由来のアミノ酸が少なくとも１つ異なるが、構造的にブチルコリンエステゼに類似する分子を指すと意図される。ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼとしてアミノ酸配列を有し、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する代謝能力を示す。これに関して、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する、例えば低いかまたは高い能力を持つ。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の変換能は、２、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、４０００、５０００、またはそれ以上のファクターまで増加され得る。
【００１５】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼと比べて、１つのアミノ酸改変に加えて複数のアミノ酸改変を有し得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の具体的な例は、位置２２７のアミノ酸のアラニンを有するブチリルコリンエステラーゼであり、そのアミノ酸配列およびコードしている核酸配列は、各々配列番号：２および１として表される。別の例は、位置７７のアミノ酸のフェニルアラニン、位置２２７のアミノ酸のアラニン、位置２８５のアミノ酸のアルパラギン、位置３３１のアミノ酸のアラニンのブチリルコリンエステラーゼ変異体であり、そのアミノ酸配列およびコードしている核酸配列は、各々配列番号：１８０および１７９として表され、該変異体はブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体ＣＰＴ-１１をトポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ-３８に変換する能力が、少なくとも３０００倍高いことを示す。また、該用語は、実質的にブチリルコリンエステラーゼと同一のアミノ酸配列を有し、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する能力を示す限り、例えば、天然アミノ酸の修飾形態、例えば、Ｄ−立体異性体、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログおよび擬体を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体を包含すると意図される。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する能力に重要であると決定されるか推定される領域外側の１以上アミノ酸改変を有し得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤活性に変換するその能力を大きく変更しない１以上の付加修飾を有し得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて高い安定性を有し得る。
【００１６】
本明細書で使用される場合、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、参照アミノ酸配列と実質的に同じである配列を包含する、すなわちブチリルコリンエステラーゼ変異体は、同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、フラグメントまたはセグメント、あるいは当業者には機能的に等価なアミノ酸配列であると考えられる類似した同一でない配列を有するポリペプチド、フラグメントまたはセグメント、を包含すると意図される。参照ブチリルコリンエステラーゼまたは本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体と実質的に同一であるアミノ酸配列は、参照ブチリルコリンエステラーゼに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またそれ以上の同一性を有し得る。実質的に、同じアミノ酸配列は、かかるポリペプチドが上記のような機能活性を保持する限り、例えば、天然アミノ酸、例えばＤ−立体異性体、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログおよび擬体の修飾形態を含むポリペプチドを包含すると意図される。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の生物学的活性は、本明細書中に記載のようなカンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する能力である。例えば、配列番号：２に表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ａは、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体ＣＰＴ-１１をトポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ-３８に変換する少なくとも３倍増加した能力を示す。別の例は、配列番号：１８０に表されるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｈ７７Ｆ、Ｆ２２７Ａ、Ｐ２８５Ｎ、Ｖ３３１Ａであって、ブチリルコリンエステラーゼと比べてカンプトテシン誘導体ＣＰＴ-１１をトポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ-３８に変換する少なくとも３０００倍増加した能力を示す。
【００１７】
一次アミノ酸配列における小さな修飾は、本発明のポリペプチドと比べて実質的に等価な機能を有するポリペプチドを生じ得ると理解される。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発により計画的であり得るか、または例えば自然変異を介した偶発的でもあり得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の完全な一次構造の一部のみが、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する能力を有効にするのに必要とされ得ると解される。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の配列のフラグメントも同様に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の少なくとも１つの生物学的機能が保持される限り、この定義の範囲内に包含される。様々な分子が、本発明のポリペプチド、例えば、他のポリペプチド、炭水化物、脂質、または化学成分に結合され得ると解される。
【００１８】
本発明の核酸分子は、本発明の参照核酸分子またはそれらのフラグメントと実質的に同一である核酸配列を包含し、中程度のストリンジェントな条件、または高ストリンジェントな条件下で、核酸分子が目的とする核酸分子と選択的にハイブリダイズするその能力を保持する限り、参照配列に関して１以上の付加、削除または置換を有する配列を包含すると意図される。中程度のストリンジェントな条件は、４２℃、５０％ホルムアミド、５×Denhart's 溶液、５×ＳＳＰＥ、０.２％ ＳＤＳにおいてフィルターに結合した核酸のハイブリダイゼーション、次いで５０℃、０.２×ＳＳＰＥ、０.２％ＳＤＳによる洗浄に相当するハイブリダイゼーション条件を包含すると意図される。ここで用いたように、高ストリンジェントな条件は、４２℃、５０％ホルムアミド、５×Denhart's 溶液、５×ＳＳＰＥ、０.２％ ＳＤＳにおけるフィルターに結合した核酸のハイブリダイゼーション、次いで６５℃、０.２×ＳＳＰＥ、０.２％ＳＤＳにより洗浄することに相当する条件である。他の適当な中程度のストリンジェントおよび高ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者にはよく知られており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992) and in Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons、Baltimore、MD (1998)に記載されている。すなわち、２つの核酸が、実質的に相補的であるように配列同一性を示すことが必要なのではなく、特異的にハイブリダイズし得るか、または他の類似の配列と検出し得る交差反応性を示さずに特異的にハイブリダイズするように作製されることが必要である。
【００１９】
一般的に、参照配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸分子は、約６０％以上の参照配列との同一性、例えば、約６５％、７０％、７５％以上の同一性、例えば比較される２つの配列の長さ以上の参照配列に対しては約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％以上の同一性を有する。あらゆる２つの核酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴ ２.０コンピューターアラインメントを基に、デフォルトパラメーターを用いて当業者によって測定され得る。ＢＬＡＳＴ ２.０の調査は、Tatiana et al., FEMS Microbiol Lett.174:247-250 (1999)に記載のように、ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlを利用できる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、請求されるポリペプチドをコードしている核酸を参照例に使用される場合の用語「フラグメント」は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の一部分と実質的に同じ配列またはそれらのセグメントを有する核酸を意味すると意図される。核酸フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸か、またはブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸に相補的であるヌクレオチド配列に、選択的にハイブリダイズするための長さと配列において充分なものである。従って、フラグメントは、配列決定およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマー、さらに核酸ブロットまたは溶液ハイブリダイゼーションのためのプローブを包含すると意図される。
【００２１】
同様に、ブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸を参考に使用される場合の用語「機能フラグメント」は、親のポリペプチドの代謝変換能をある程度または全てを保持しつづけているブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体の一部分をコードしている核酸の一部を指すと意図される。機能活性を示す本発明のポリペプチドの機能フラグメントは、本発明のポリペプチドのアミノ酸、例えば、少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０個のアミノ酸、また、しばしば少なくとも５０、７５、１００、２００、３００、４００個以上のアミノ酸を有するポリペプチドから、１つアミノ酸が少ない完全長ポリペプチドまで、少なくとも６つの隣接するアミノ酸残基を持つことができる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能フラグメントの例は、野生型ブチリルコリンエステラーゼにおけるロイシン残基である位置５３０で短縮されている変異体である。Ｌ５３０短縮は、対応する完全長変異体の機能活性に対して影響しないが、この短縮（truncation）が、テトラマーの形成を防止し、それによって変異体の生物活性および医薬物動力学が増強される。従って、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、参照変異体の機能フラグメントと考えられるＬ５３０短縮を包含する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、本発明のポリペプチドに関する用語「機能フラグメント」は、参照ポリペプチドの機能活性を示すかまたは実行し得る参照ポリペプチドの一部分を指す。機能活性を示す本発明のポリペプチドの機能フラグメントは、本発明のポリペプチドの、例えば、少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０個のアミノ酸、また少なくとも５０、７５、１００、２００、３００、４００個以上のアミノ酸を有することの多いポリペプチドから、１つアミノ酸が少ない完全長ポリペプチドまで、少なくとも６つの隣接するアミノ酸残基を持つことができる。本発明のポリペプチドの機能フラグメントの適切な長さとアミノ酸配列は、機能フラグメントの目的とする使用によって当業者によって決定され得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能フラグメントは、親のポリペプチドの代謝変換能をある程度または全て保持しつづけているブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体の一部分を指すと意図される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、その形成を誘導する抗原に特異的に結合する能力を有する抗原に応答して産生されるポリペプチドを指すと意図される。抗体には、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、１本鎖抗体、キメラ抗体、二機能または二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および本発明のポリペプチドに特異的に結合するＣＤＲまたは抗原結合配列を含む化合物を包含している相補的決定領域(ＣＤＲ)接合抗体が包含される。「抗体フラグメント」は、本来の抗体のある部分を保持する抗体ポリペプチド部分を指す。例えば、抗体フラグメントは、本来の抗体の抗原結合能をある程度かまたは全て保持しつづけている。抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを包含する。本発明の抗体または抗体フラグメントの結合特異性または排他性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当分野ではよく知られている(Harlow et al.(Eds). A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor、N.Y. (1988)を参照されたい)。
【００２４】
本発明で使用され得る抗体は、当業者にはよく知られた全ての方法、または本発明のあらゆるポリペプチド、それらの免疫原フラグメントを用いて産生され得る。例えば、ヒト化抗体は、完全なヒト生殖細胞系骨格領域によって製造され得る。さらに、免疫原ポリペプチドは、組換え体宿主細胞からの天然起源から単離され得るか、化学的に合成され得る。かかるペプチドを合成するための方法は当業者には既知であり、例えばR.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211:10 (1987)である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「カンプトテシン誘導体」は、カンプトテシンと同じまたは実質的に同じ構造を有し、ブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体によって加水分解され得る化合物を指す。例えば、カンプトテシン誘導体は、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｑ変異体(配列番号：６)によって加水分解されうる。カンプトテシンは、Camptotheca acuminata Decaisneと呼ばれる中国産の樹木の樹皮から誘導される。カンプトテシン誘導体は、それらの代謝分解産物によってＤＮＡトポイソメラーゼＩを阻害し得る。水溶性カンプトテシン誘導体、ＣＰＴ-１１の構造は、図２に示される。ＣＰＴ-１１の化合物名は、７-エチル-１０-［４-（１-ピペリジノ)-１-ピペリジン]カルボニルオキシカンプトテシンである。また、ＣＰＴ-１１は、CAMPTOSARおよびIrinotecanの名称によって知られている。カンプトテシンのメンバーは、例えば、植物アルカロイド２０(Ｓ)-カンプトテシンのアナログであるトポテカン、イリノテカン、９-アミノカンプトテシンおよび９-ニトロカンプトテシンを包含する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼを阻害し得る化合物を示す。いくつかのトポイソメラーゼは、文献において知られている。例えば、トポイソメラーゼ阻害剤は、Ｉ型トポイソメラーゼ、例えば、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ型トポイソメラーゼを阻害し得る。Ｉ型酵素はＤＮＡの１本鎖を一過的に裂くように作用し、ＩＩ型酵素は、一過的な二重鎖分離を導入することによって作用する。いくつかのＤＮＡトポイソメラーゼは、ＤＮＡからの負のスーパーコイルのみをゆるめるか除去し得るが、他のものは負と陽のスーパーコイルの両方をゆるめて、さらに別のものは負のスーパーコイルを導入し得る。トポイソメラーゼ阻害剤の例はＳＮ-３８であり、その構造は図２に示されている。
【００２７】
ＳＮ-３８の化合物名は、７-エチル-１０-ヒドロキシカンプトテシンである。イン・ビトロでＳＮ３８は、ＣＰＴ-１１の１０００倍以上の細胞毒性であることを示した(Pavillard et al., Cancer Chemother Pharmacol. 49: 329-35(2002))。ヒトでは、プロドラッグの変換は、２つのカルボキシルエステラーゼアイソホーム、ヒトカルボキシルエステラーゼ１(ｈＣＥ−１)およびヒトカルボキシルエステラーゼ２(ｈＣＥ−２)の活性を通じて、最初に肝臓で起こると考えられる(Humerickhouse et al., Cancer Res 60: 1189-92(2000))。Ｋｍ値は、ｈＣＥ−２およびｈＣＥ−１の各々に対して３.４μＭおよび４３μＭであり、ｈＣＥ−２の触媒効率はｈＣＥ−１の触媒効率よりも６０倍高い。医薬物(〜１-１０μＭ)の薬理学的に適切な濃度では、ｈＣＥ−２は、ｈＣＥ−１（１２）よりも２５-３０倍の高い割合でＣＰＴ-１１をＳＮ-３８に変換する。ＳＮ-３８は、トポイソメラーゼＩとＤＮＡと共に相互作用し、開裂複合体を形成し、トポイソメラーゼＩに媒介されたＤＮＡの１本鎖分離物の再合成を防止し得る。最終的に、この相互作用は二重鎖ＤＮＡを分離やアポトーシスのような細胞死へと導き得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「カンプトテシン変換活性」または「カンプトテシン加水分解活性」は、カンプトテシン誘導体のトポイソメラーゼ阻害剤への化学的変換を意味すると意図される。例えば、ＣＰＴ-１１のＳＮ-３８への変換は、図２に示される。変換活性は、本明細書に記載のいくつかのアッセイを用いて直接的あるいは間接的の両方を測定され得る(実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを参照されたい)。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、癌の重症度を低下させ得る本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の量を意味すると意図される。重症度の低下は、例えば、症状、生理学上指標、生化学的マーカーあるいは代謝指標の抑止または低下を包含する。癌の症状は、例えば、体重低下、痛みおよび臓器不全を包含する。本明細書で使用される場合、用語「処置」は、癌の重症度の低下を導くことを意味すると意図される。
【００３０】
本発明は、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるアミノ酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。また、本発明はアミノ酸が配列番号：４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体も提供される。本発明は、アミノ酸が配列番号：６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。
【００３１】
本発明は、アミノ酸が配列番号：１０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体も提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：２４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：２６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：２８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：３０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：３２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。
【００３２】
本発明は、アミノ酸が配列番号：３４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：３６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：３８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：４０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：４２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：４４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：４６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：４８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：５０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：５２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：５４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：５６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：５８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：６０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：６２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：６４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：６６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：６８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：７０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：７２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：７４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：７６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：７８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：８０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：８２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：８４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：８６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：８８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：９０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。
【００３３】
本発明は、アミノ酸が配列番号：９２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：９４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：９６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：９８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１００またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１０２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１０４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１０６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１０８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１１０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１１２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１１４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１１６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１１８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１２０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。
【００３４】
本発明は、アミノ酸が配列番号：１２２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１２４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１２６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１２８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１３０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１３２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１３４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１３６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１３８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１４０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、該アミノ酸が配列番号：１４２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１４４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１４６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１４８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１５０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１５２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１５４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。
【００３５】
本発明は、アミノ酸が配列番号：１５６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１５８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１６０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１６２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１６４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１６６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１６８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１７０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１７２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１７４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。
【００３６】
本発明は、アミノ酸が配列番号：１７６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１７８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１８０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１８２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１８４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１８６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１８８またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１９０またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１９２またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１９４またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。本発明は、アミノ酸が配列番号：１９６またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体もさらに提供する。
【００３７】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼまたはそれらの機能フラグメントに比べて、カンプトテシン変換活性において３０００倍の増加を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。また、本発明は、ブチリルコリンエステラーゼまたはそれらの機能フラグメントに比べて、カンプトテシン変換活性において、少なくとも４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３５００倍以上の増加を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体も提供する。
【００３８】
本発明は、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３および１９５、またはそれらのフラグメントから選択される核酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸をさらに提供する。さらに本発明は、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるアミノ酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸を提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：５またはそれらの機能フラグメントを含有しているブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸も提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：７またはそれらの機能フラグメントを含有しているブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸も提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸も提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸も提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：２３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：２５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：２７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４０】
本発明は、核酸配列の配列番号：２９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：３１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：３３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：３５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：３７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：３９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：４１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：４３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。さらに、本発明は、核酸配列の配列番号：４５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４１】
本発明は、核酸配列の配列番号：４７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：４９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：５１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：５３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：５５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：５７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：５９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：６１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：６３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：６５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４２】
本発明は、核酸配列の配列番号：６７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：６９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：７１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：７３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：７５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：７７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：７９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：８１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：８３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４３】
本発明は、核酸配列の配列番号：８５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：８７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：８９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：９１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：９３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：９５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：９７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：９９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１０１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１０３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１０５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１０７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４４】
本発明は、核酸配列の配列番号：１０９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１１１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１１３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１１５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１１７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１１９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１２１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１２３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１２５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１２７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４５】
本発明は、核酸配列の配列番号：１２９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１３１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１３３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１３５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１３７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１３９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１４１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１４３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１４５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１４７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４６】
本発明は、核酸配列の配列番号：１４９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１５１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１５３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１５５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１５７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１５９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１６１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１６３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１６５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１６７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４７】
本発明は、核酸配列の配列番号：１６９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１７１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１７３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１７５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１７７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１７９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１８１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１８３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１８５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１８７またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１８９またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１９１またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１９３またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。本発明は、核酸配列の配列番号：１９５またはそれらの機能フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸もまた提供する。
【００４８】
コリンエステラーゼは、神経伝達物質のアセチルコリンおよび数多くのエステル含有化合物を加水分解し得る遍在性の多形性カルボキシラーゼＢ型酵素である。２つの主要なコリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼである。ブチリルコリンエステラーゼは、下記に示すように、多くのコリンエステルの加水分解物を触媒する:
ＢＣｈＥ
アセチルコリン＋Ｈ２０        →        コリン  ＋  対応する酸
【００４９】
ブチリルコリンエステラーゼは、基質としてブチリルコリンおよびベンゾイルコリンを優先的に使用する。ブチリルコリンエステラーゼは、哺乳類の血液血漿、肝臓、膵臓、腸粘膜および中枢神経系の白質で見出される。ブチリルコリンエステラーゼをコードしているヒト遺伝子は、染色体３上に位置づけられ、ブチリルコリンエステラーゼの３０以上の天然遺伝子の変異体が知られている。ブチリルコリンエステラーゼポリペプチドは、５７４個のアミノ酸長であり、コード配列の１７２２個の塩基対によってコードされる。３つの天然ブチリルコリンエステラーゼのバリエーションは、Ａ変異体、Ｊ変異体およびＫ変異体として示される不定型対立遺伝子である。Ａ変異体は、Ｄ７０Ｇ突然変異である変異であり稀である(０.５％  対立遺伝子頻度)、Ｊ変異体はＥ４９７Ｖ変異であり、１家族でのみ見出された。Ｋ変異体は、Ａ５３９Ｔ変異を生じるヌクレオチド１６１５位置での点変異であり、白人において約１２％の対立遺伝子頻度を有する。
【００５０】
ブチリルコリンエステラーゼの天然のヒトバリエーションに加えて、多くの種のバリエーションが知られている。ネコ・ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列は、ヒト・ブチリルコリンエステラーゼと８８％同一である。異なる７０個のアミノ酸のうち、３つは、活性部位の溝（gorge）に位置づけられており、Ａ２７７Ｌ、Ｐ２８５ＬおよびＦ３９８Ｉと呼ばれる。同様に、ウマ・ブチリルコリンエステラーゼは、ヒト・ブチリルコリンエステラーゼと比べて、活性部位において３つのアミノ酸の違い、すなわちＡ２７７Ｖ、Ｐ２８５ＬおよびＦ３９８Ｌを有する。ラット・ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列は、Ａ２７７Ｋ、Ｖ２８０Ｌ、Ｔ２８４Ｓ、Ｐ２８５Ｉ、Ｌ２８６ＲおよびＶ２８８Ｉである活性部位の溝において６つのアミノ酸の違いを含有する。
【００５１】
天然ヒト・ブチリルコリンエステラーゼのバリエーション、種のバリエーションに加えて、組換え体として調製された変異は、Xieら., Molecular Pharmacology 55:83-91 (1999)によって先に開示されている。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、当業者には既知の多様な方法によって調製され得る。所望により、ランダム突然変異誘発は、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体を調製するために実施され得る。一方、本明細書で開示されたように、本明細書中に記載の構造的、生化学的およびモデル化方法から得た情報を基にして分離（discrete）領域に焦点をあてたランダム突然変異誘発は、触媒活性について重要であると推定されるそれらのアミノ酸を標的とするように実施され得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼの活性部位における基質の分子モデル化は、酵素とその基質との間の良好な適応を基にした高度な触媒効率を可能にするアミノ酸改変を推定するのに利用され得る。さらに、分子モデル化は、酵素および基質との間の立体障害を低下させるアミノ酸改変を推定するのに使用されうる。基質としてコカインを用いる試験を基にして、加水分解活性に対して重要であると推定される残基は、８個の疎水性の溝の残基および触媒的３つ組残基を包含する。さらに、鎖内ジスルフィド結合に関与しているシステイン残基６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓおよび４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓを包含するブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的構造についての残基重要性のアミノ酸改変は、加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体の生成物は一般的に改変されないと解される。
【００５２】
ブチリルコリンエステラーゼの突然変異誘発またはブチリルコリンエステラーゼ変異体発現の後、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の精製および機能特徴分析は、当業者には既知の方法によって行われ得る。
【００５３】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン変換または加水分解活性を示す。本明細書に記載のように、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン変換または加水分解活性を増強させ、癌を処置するために使用され得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体と比べて、小さな修飾を有するポリペプチドは、等価なカンプトテシン変換または加水分解活性が保持されている限り、本発明に包含される。さらに、カンプトテシン変換または親ブチリルコリンエステラーゼ変異体の加水分解活性のある程度または全てを保持しているブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能フラグメントも同様、本発明に包含される。同様に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能フラグメントをコードする核酸の機能フラグメントも同様に、本発明に包含される。
【００５４】
本発明のブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体またはそれらの機能フラグメントをコードしている核酸の発現に関連する組換え方法によって製造され、次いで本明細書中に記載の生化学的常法によって変異体、またはそれらの機能フラグメントが単離され得る。機能フラグメントは、完全長ブチリルコリンエステラーゼ変異体の酵素的または化学的開裂によって製造され得ると解される。酵素的および化学的な開裂のための方法や結果として生じたペプチドフラグメントの精製のための方法は、当業者には既知である(例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, Vol. 182, "Guide to protein Purification," San Diego: Academic Press, Inc. (1990), 出典明示により本明細書の一部とする。)。
【００５５】
さらに、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能フラグメントは、化学合成によって製造され得る。必要ならば、このような分子は、それらの機能活性、安定性またはバイオアベイラビリティーを至適化するために、Ｄ−立体異性体、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログや擬体を包含するために修飾されうる。修飾アミノ酸の例およびそれらの使用の例は、Sawyer, Peptide Based Drug Design, ACS, Washington (1995)およびGross and Meienhofer, The Peptide:Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983)に示されており、両文献を出典明示により本明細書の一部とする。
【００５６】
所望により、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のランダムセグメントは、本明細書中に記載のアッセイにおいて製造され、そして試験され得る。参照ブチリルコリンエステラーゼまたは本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体のアミノ酸配列と比べて、あらゆる所望の境界及び修飾を有するフラグメントが製造され得る。一方、本明細書に記載の構造的、生化学的およびモデル化方法によって得られる利用し得る情報は、親変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性を保持しそうなブチリルコリンエステラーゼ変異体それらのフラグメントのみを製造するのに使用され得る。本明細書中に記載の場合、カンプトテシン変換または加水分解活性について重要であると推定される残基は、８個の疎水性の溝の残基および触媒的３つ組残基を包含する。さらに、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的構造について重要な残基は、鎖内ジスルフィド結合に関連のあるシステイン残基６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓおよび４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓを包含する。機能フラグメントは、参照変異体の構造的または機能的に重要な残基を擬態するように働く非ペプチド構造エレメントを包含し得る。
【００５７】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体として包含されたものも、ブチリルコリンエステラーゼ変異体またはそれらの機能フラグメントを、異種のタンパク質、例えば治療用タンパク質や、そのような融合タンパク質をコードしている核酸の融合構築体に結合することから生じる融合タンパク質である。ブチリルコリンエステラーゼ変異体またはそれらの機能フラグメントとハイブリダイズし得る核酸のフラグメントが、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であり、請求項された本発明によって包含され得る。
【００５８】
本発明は、抗体または抗体フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体またはそれらの機能フラグメントをさらに提供する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、あらゆる抗体または抗体フラグメントと融合され得る。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、腫瘍関連抗原に結合する抗体または抗体フラグメントに融合され得る。この方法において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、腫瘍に直接送達され、その結果副作用の数が少なくなり得る。いくつかの抗原は、腫瘍細胞において過剰発現されるか、腫瘍細胞においてもっぱら発現されることが知られている。これらの腫瘍関連抗原には、例えば、Lewis Y (Siegall, C, Semin. Cancer Biol. 6:289-295 (1995))、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)(Watine et al., Dis. Colon Rectum 44:1791-1799 (2001))、テトラスパニンＬ６(Kaneko et al., Am. J. Gastroenterol. 96:3457-3458 (2001))、１７-ｌＡ(Indar et al., J.R. Coll. Surg. Edinb. 47:458-474 (2002))、ムチン-１(ＭＵＣ−１)(Segal-Eiras and Croce, Allerg. Immunopath. 25:176-181 (1997))、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)(Bookman, M., Semin. Oncol. 25:381-396 (1998))、癌抗原１２５(ＣＡ １２５)(Cherry and Vacchiano、Semin. Oncol. Nurs. 18:167-173 (2002))、p９７(Srivastava, P., Curr. Opin. Immunol. 3:654-658 (1991))、黒色腫抗原遺伝子(ＭＡＧＥ) (Barker and Salehi, J. Neurosci. Res. 67:705-712 (2002))、ＣＤ２０ (Kosmas et al., Leukemia 16:2004-2015 (2002))、ＣＤ３３(Countouriotis et al.,Stem Cells 20:215-229 (2002))、ガングリオシドＧＤ２(Ragupathi, G., Cancer Immunol. Imunother. 43:152-157 (1996))およびガングリオシドＧＤ３(Ragupathi, G., 上掲 (1996))が包含される。
【００５９】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、内在化抗体または抗体フラグメントまたは非内在化抗体または抗体フラグメントに融合され得る。非内在化抗体または抗体フラグメントに融合された場合、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、内在化をうける細胞表面ペプチドに結合することによって内在化され得る。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、内在化をうける受容体に特異的な抗体と融合され得る。
【００６０】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供し、その抗体または抗体フラグメントが細胞表面レセプターに特異的に結合する。一つの実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントが特異的に上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)に結合するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。ＥＧＦＲは、いくつかの腫瘍細胞型、例えば胸癌細胞においてアップレギュレーションされることが知られている。様々な関連の実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントが、リンカー変異体、ヒンジ（hinge）変異体および合成リンカー変異体から選択されるアミノ酸配列を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。一つの実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントが配列番号：１８および２０に示されるようなアミノ酸配列を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。モデル抗体を用いるＥＬＩＳＡの結果は、図７および図８に示される。
【００６１】
別の実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントがＣＤ２０に特異的に結合する場合のブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。ＣＤ２０はＢ−細胞表面上の非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０抗体複合体は内在化されないので、そのため細胞表面結合イムノグロブリンを、長時間、エフェクター細胞または補体と相互作用させるようにする。一つの実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントが配列番号：１９８および２００に示したようなアミノ酸配列を含有し、ＣＤ２０を特異的に結合するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。ＣＤ２０は、いくつかの腫瘍細胞型、例えばＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫、さらに様々な自己免疫症状においてアップレギュレーションされることが知られている。
【００６２】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体および抗体または抗体フラグメントとの融合は、抗体特異的酵素プロドラッグ治療方法(ＡＤＥＰＴ)と呼ばれる方法を用いて、標的とした腫瘍細胞特異的ブチリルコリンエステラーゼを媒介する毒性について使用され得る(Jung, M., Mini Rev. Med. Chem. 1:399-407 (2001); Bagshawe, K.D., Mol. Med. Today 1:424-431 (1995); and Senter、P.D., FASEB J 4:188-193 (1990))。関連方法といわれる、いわゆるウイルス特異的酵素プロドラッグ治療(ＶＤＥＰＴ)も使用されうる。標的化腫瘍細胞特異的ブチリルコリンエステラーゼ媒介毒性について使用されうる、ブチリルコリンエステラーゼ変異と抗体または抗体フラグメントとの融合の例は、配列番号：２０２に表されるアミノ酸配列および配列番号：２０１として示される対応するヌクレオチド配列として記載されており、これは抗ＣＤ２０ＶＨ−ＣＨ１ヒンジ cys Ｌ５３０ ＢＣｈＥ.４-１重鎖構築体に対応する。配列番号：２０２で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体は、システイン含有ヒンジ領域を有する抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号：１８０で表されるブチリルコリンエステラーゼ変異体のＬ５３０機能フラグメント（配列番号：２０４)を含有する融合タンパク質であり、これは４−１変異体アミノ酸（Ｈ７７Ｆ／Ｆ２２７Ａ／Ｐ２８５Ｎ／Ｖ３３１Ａ)に組みこまれる。ＶＤＥＰＴは、酵素、例えば本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体、を送達するためのウイルスベクターを使用する。かかるアプローチにより、酵素の選択的発現は、腫瘍細胞中の非毒性または中程度の毒性プロドラッグを高い毒性代謝産物へ効率的に活性化して、増強された抗腫瘍活性および改善された治療上指標を生じ得る。これらのアプローチが成功するためには高い活性の酵素が必要であり、例えば本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体が使用され得る。
【００６３】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、実施例Ｉで開示されたライブラリーから得られた。増強されたカンプトテシン変換または加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を含有するために充分多様なライブラリーは、当業者には既知の方法によって調製され得る。当業者は、どのようなサイズおよび多様性が該目的に対して必要または充分であるかを知っているであろう。例えば、約５７３のアミノ酸の各位置で参照ブチリルコリンエステラーゼでは見出されない１９個の各アミノ酸を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーを調製し、増強されたカンプトテシン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体に対して得られる変異体をスクリーニングした。
【００６４】
一方、焦点とするライブラリーは、本明細書中に記載のブチリルコリンエステラーゼに関する構造的、生化学的およびモデル化情報を利用して調製され得る。カンプトテシン変換または加水分解活性またはブチリルコリンエステラーゼの構造的機能について重要な残基または領域の決定または推定に関するあらゆる情報は、増強したカンプトテシン加水分解活性を持つ本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の焦点を絞ったライブラリーの設計において有用であり得ると解される。すなわち、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーを組み立てるブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン変換または加水分解活性について重要であると決定されるか推定される領域に位置づけられるアミノ酸位置でのアミノ酸改変を含有しうる。活性について重要であると決定または推定される領域に対してアミノ酸改変を標的とすることにより増強された活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を同定するために、スクリーニングする必要がある変異体の数を顕著に減少させるので、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の焦点を絞ったライブラリーが所望され得る。
【００６５】
ブチリルコリンエステラーゼのカンプトテシン変換または加水分解活性に対する領域の重要性は、当業者には既知の多様な方法によって決定されるかまたは推定され、そしてブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーの合成に的を絞って使用され得る。高い配列類似性を共有し、生化学的に類似した触媒特性を有する関連酵素、例えばアセチルコリンエステラーゼおよびカルボキシルエステラーゼは、ブチリルコリンエステラーゼの触媒活性に対して重要な領域に関する情報を提供し得る。例えば、構造的モデル化は酵素の活性部位を明らかにし得るし、通常それは一次構造では互いに離れて位置するアミノ酸残基によって形成される三次元構造、例えば、裂け目（cleft）、溝（gorge）または裂け目（crevice）である。そのため、カンプトテシン変換または加水分解活性について重要であるブチリルコリンエステラーゼの領域を構成するアミノ酸残基は、活性部位の溝に沿って位置付する残基を包含し得る。そのため、ブチリルコリンエステラーゼの構造的モデル化の記載のためには、例えばHarel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 10827-10831 (1992)およびSoreq et al., Trends Biochem. Sci. 17(9): 353-358 (1992)を参照し、出典明示により本明細書の一部とする。
【００６６】
ブチリルコリンエステラーゼの構造的モデル化に加えて、生化学的データは、目的とするブチリルコリンエステラーゼ変異体に的を絞ったライブラリーを製造する場合に、カンプトテシン変換または加水分解活性について重要なブチリルコリンエステラーゼの決定または推定領域に用いられ得る。これに関して、変化を加えられたカンプトテシン変換または加水分解活性を有する天然ブチリルコリンエステラーゼ変異体の特徴は、ブチリルコリンエステラーゼの触媒活性について重要な領域を同定するために有用である。同様に、部位特異的突然変異誘発の研究は、例えば、Schwartz et al., Pharmac. Ther. 67: 283-322 (1992)；（出典明示により本明細書の一部とする）に論評されているように、触媒的に重要なアミノ酸残基に関するデータを提供し得る。
【００６７】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーを生成するために、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域を決定または推定するための別個のタイプの情報が、単独または組合せて使用され得る。例えば、構造的モデル化および生化学的データを基にした情報を組み合わせて、カンプトテシン変換または加水分解活性について重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域を決定する。多様な方法によって得られた情報は、触媒的に活性な領域を推定するために組み合わせ得るので、当業者は、領域自体が厳格な違いよりもむしろ近似を示すことを認識するであろう。結果として、ブチリルコリンエステラーゼのライブラリーは、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要であると決定または推定される領域以外のアミノ酸改変を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を含有し得る。同様に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要であると決定または推定される領域以外のアミノ酸改変を有し得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、そのカンプトテシン変換または加水分解活性を有意に変更しないその他の修飾を有し得る。さらに、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要であると決定または推定される領域の数は、用いた推定方法によって変わり得ると解されるであろう。
【００６８】
多数の領域がカンプトテシン加水分解について重要な領域を決定するために適切な任意の方法またはそれらの組合せによって同定されると、各領域は、野生型アミノ酸を加えた各領域内の１以上の位置で１以上の他の１９個の天然アミノ酸を含有する変異体のライブラリーを構築するために、いくつかまたは全てのアミノ酸の位置にわたってランダム化される。本発明によって提供されるブチリルコリンエステラーゼ変異体に的を絞ったライブラリーについて選択されたブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列７つの領域は、表１に示される。
【００６９】
表１．触媒効率に重要であると推定されるブチリルコリンエステラーゼ領域
【表１】
2006508665.tif 000002
【００７０】
様々な型の分子、例えばペプチド、ペプトイドおよびペプチド擬体の異なった個体群を含有するライブラリーを製造するための方法は、当業者に知られている［例えば、Ecker and Crooke, Biotechnology 13:351-360 (1995) および Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92 (1995)および該文献での引例を出典明示により本明細書の一部とする； Goodman and Ro, Peptidomimetics for Drug Design、in "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol. 1(ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), pages 803-861 および Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994) および該文献での引例を出典明示により本明細書の一部とする)も参照されたい］。分子がペプチドタンパク質またはそれらのフラグメントである場合、該分子は、直接イン・ビトロで産生され得るか、イン・ビトロ産生され得る核酸から発現され得る。合成ペプチド化学の方法は、当業者には既知である。
【００７１】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーは、例えばブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸発現ライブラリーを構築することによって産生され得る。かかるライブラリーを製造する方法は当業者には既知である(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harb or Laboratory  Press 1989)これを出典明示により本明細書の一部とし、参照されたい）。ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸のライブラリーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのアナログを含み得る。ＲＮＡ分子を含有するライブラリーは、例えば、ＲＮＡ分子を化学的に合成することによって構築され得る。
【００７２】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸のライブラリーの生成は、使用者に必ず必要とされる。当業者は、どのような方法がブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸のライブラリーを生成するために使用され得るかを知っている。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、当業者には既知の方法を用いて、ブチリルコリンエステラーゼをコードしている核酸の突然変異誘発によって生成され得る(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds.、Cold Spring Harbor Press, Plainview、NY (1989))。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸のライブラリーは、ブチリルコリンエステラーゼの各アミノ酸位置で、できる限り全ての天然アミノ酸をコードしている核酸を含有するように、充分に多様であるようにランダム化されうる。一方、核酸のライブラリーは、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要であると推定されるかまたは決定されるブチリルコリンエステラーゼの領域内に位置する場所でのみ各アミノ酸で全ての起こり得る天然アミノ酸をコードしている核酸を含有するように製造されうる。
【００７３】
１以上の変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸分子に導入して、修飾核酸分子を産生し得る［(Wu (Ed.), Meth. In Enzymol. Vol. 217, San Diego: Academic Press (1993); Higuchi, "Recombinant PCR" in Innis et al. (Ed.), PCR Protocols, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)を参照されたい；引例を出典明示により本明細書の一部とする］。かかる突然変異誘発は、特定の、所望のアミノ酸改変を導入するために使用され得る。すなわち、カンプトテシン変換または加水分解活性について重要であると決定されている領域においてアミノ酸改変を含有する明確なライブラリーだけでなく、さらにいくつかまたは全ての１以上の変異を含有する１つのライブラリーが調製され得る。
【００７４】
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いるブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーの有効な合成および発現は、Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95:6037-6042 (1998); Wu et al., J. Mol. Biol. 294:151-162 (1999);および Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されたように達成され得る。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発は、その表現型とは独立して、変異を体系的に導入するための周知かつ効率的方法であって、そのためタンパク質工学に対する特異的な進化的アプローチのために申し分なく好適である。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を行うために、所望の変異をコードしている核酸のライブラリーは、野生型配列の１本鎖のウラシルを含有する鋳型とハイブリダイズされる。該方法論は制限酵素を用いずに正確な突然変異を導入され得る融通性のあるものであって、またオリゴヌクレオチドがコドンベースの変異誘発を用いて合成される場合は廉価である。
【００７５】
コドンベース合成または突然変異誘発は、既知のアミノ酸配列における多数の改変を急速かつ効率的に生成しながら遺伝子重複を回避するため、またはランダム配列の広範な集団を生成するために当業者にはよく知られた１つの方法を示す。この方法は、米国特許番号５２６４５６３および５５２３３８８の主題であり、Glaserら、J. Immunology 149:3903-3913 (1992)に記載されている。簡単にいうと、例えば、遺伝子コードのアミノ酸を特定する全ての２０個のコドンに関するランダム化のためのカップリング反応は、別々の反応器中で行われ、特定のコドン位置に対するランダム化は、各反応容器の生成物を混合することによって生じる。混合した後、次いで、２０個のアミノ酸全ての等価な混合物をコードしているコドンに対応するランダム化反応産物は、次の位置でランダム化されたコドンの各々の合成のために別々の反応器に分配される。必要であれば、２０個のアミノ酸全てに関して等しい頻度が、２０個のコドンの等しい部分を含有する２０個の容器を用いて達成され得る。すなわち、ブチリルコリンエステラーゼの完全配列のランダムライブラリーを生成するか、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要であると決定または推定される領域を絞ったライブラリーを生成するために、この方法を利用することが可能である。
【００７６】
上記合成方法に対するバリエーションも存在し、例えば、所望の位置で予め決定されたコドンの合成やWu et al, 上掲 1998に記載されるように、１または１以上のコドン位置で予め決定された配列のバイアス合成を包含する。バイアス合成は、予め決定されるかまたは親コドンが１つの反応器内で合成され、そしてランダムコドン配列が第二容器内で合成される場合の２つの反応器の使用を包含する。第二容器は、特定位置で全てのランダムアミノ酸を特定するコドンの合成のために上記したような複数の反応器に分配され得る。一方、縮重コドンの個体群は、第二反応器中で、例えば、Ｎが全ての４つのヌクレオチドの混合物である場合は、ＮＮＧ／ＴヌクレオチドまたはＮＮＸ／Ｘをカップリングすることによって合成される。予め決定されたものとランダムコドンの合成の後、２つの反応器の各々において反応産物が混合され、その後隣接するコドン位置での合成のために、別の２つの容器に再分配される。
【００７７】
変異体配列の異なった数を産生するための上記コドンベースの合成に対する修飾は、本明細書に記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーの生成物について同様に用い得る。上記２つの容器の方法を基にして、この修飾は親配列に対して合成を偏らせて、ランダムコドン変更を有する特定数のコドン位置を含有する集団に変異体を分離することを可能にする。
【００７８】
簡単にいうと、この合成は、各コドン位置の合成後に反応器を２つの新しい容器に分配し続けることによって行われる。分配後、各々連続的な反応器の対からの反応産物は、第二容器を用いて開始して、混合される。この混合は、ランダム変化を有する同じ数のコドン位置を有する反応産物と一緒にもたらされる。合成は、最初と最後の容器の産物と、各々連続した一対の反応器から新しく混合された産物を分配した後、２つの新しい容器に再分配することにより進行する。新しい容器のうちの１つで該親コドンが合成され、２つめの容器でランダムコドンが合成される。例えば、第一コドン位置での合成は、１つの反応器中の親コドンの合成と、第二反応器中のランダムコドンの合成を内包する。第二コドン位置での合成のために、最初の２つの反応器の各々は２つの容器に分配され、二対の容器を与える。各対に対して、親コドンは１つの容器中で合成され、ランダムコドンは第二容器中で合成される。線状に配置された場合、第二および第三容器中の反応産物が混合され、１つのコドン位置でランダムコドン配列を有するそれらの産物を一緒にする。この混合は、次回の合成のための開始集団である産物集団を３つに限定する。同様に、三番目、四番目および各々残っている位置に対して、前述の位置についての各反応産物集団は分配されて、親およびランダムコドンが合成される。
【００７９】
コドンベース合成の上記修飾後、１、２、３および４つの位置におけるランダムコドン変化を含有する集団とその他とは、簡便に分離され、個々の必要性に基づいて使用され得る。さらに、この合成スキームは、親配列のみ含有している容器は、同様にランダムコドン合成から分離されるので、親配列以上にランダム化配列のための集団の富化を可能にする。
【００８０】
この方法は、カンプトテシン変換または加水分解活性に重要であると推定されるブチリルコリンエステラーゼの１以上の領域におけるアミノ酸改変を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸のライブラリーを合成するのに使用されうる。
【００８１】
一方、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸のライブラリーも、遺伝子シャッフリングを用いて生成され得る。遺伝子シャッフリングまたはＤＮＡシャッフリングは、組み換えによって多様性を生じる進化をめざした方法である(例えば、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); Crameri et al., Nature 391:288-291 (1998); Stemmer et al., U.S. Patent No. 5,830,721、issued ovember 3, 1998を参照されたい)。遺伝子シャッフリングまたはＤＮＡシャッフリングは、選択されたミュータント遺伝子のプールのイン・ビトロの相同性組換え体を用いる方法である。例えば、特定遺伝子の点変異のプールが使用され得る。遺伝子は、例えば、ＤＮＡｓｅを用いてランダムに断片化され、ＰＣＲによって再構築される。所望により、ＤＮＡシャッフリングは、多様性を生じるように様々な生物由来の相同な遺伝子を用いて実施され得る(Crameri et al., 上掲, 1998)。断片化と再構築は、所望により、複数回行われ得る。得られる再構築された遺伝子は、本発明の組成物および方法において使用され得るブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーを構成する。
【００８２】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸の本発明のライブラリーは、様々な真核細胞で発現され得る。例えば、核酸は、哺乳類細胞、完全な細胞、植物細胞および非酵母真菌細胞で発現され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸の本発明のライブラリーを発現するための有用な哺乳類細胞系は、例えば、Chinese Hamster Ovary(ＣＨＯ)、ヒト２９３ＴおよびヒトＮＩＨ３Ｔ３細胞系を包含する。ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸の本発明のライブラリーの発現は、安定な、または一過的な細胞トランスフェクションの双方によって達成され得る(実施例ＩＩＩ、表５を参照されたい)。
【００８３】
ゲノムの同一部位に、変異体核酸または異種核酸フラグメントを導入することは、特定の変異体または異種核酸の発現においてのみ異なる同質遺伝子細胞系を構築するように機能する。一部位での導入は、ゲノム中の複数部位での組込みからの位置的影響を最小にし、核酸によってコードされたｍＲＮＡの転写および細胞あたり１以上の核酸種の発現や多重コピーに関する導入からの複雑性に影響を及ぼす。変異体または異種核酸をゲノム中で特定位置に標的化するために使用され得る当分野で知られた技術は、例えば、相同性組換え体、レトロウイルス標的化およびリコンビナーゼ−媒介標的化を包含する。
【００８４】
ゲノム内の１つの部位に変異体または異種核酸を標的化するための１つのアプローチは、Ｃreリコンビナーゼを使用して、部位特異性組換え配列を含有する部位で真核生物のゲノム中に外因性ＤＮＡの挿入を標的化するものである(Sauer and Henderson、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5166-5170 (1988); Fukushige and Sauer、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7905-7909 (1992); Bethke and Sauer. Nuc. Acids Res., 25:2828-2834 (1997))。Ｃreリコンビナーゼに加えて、Ｆlpリコンビナーゼは、ゲノム内の特定部位に外因性ＤＮＡの挿入を標的化するのに使用され得る(Dymecki、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6191-6196(1996))。部位特異的リコンビナーゼおよび対応する組換え部位のあらゆる組み合わせが、ゲノム中の特定部位に核酸を標的化する本発明の方法で使用され得ることは解される。
【００８５】
適当なリコンビナーゼは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸を含有しているベクターを用いて同時形質移入されたベクターにコードされ得る。一方、リコンビナーゼの発現エレメントは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸を発現する同一ベクターに導入され得る。リコンビナーゼをコードしている核酸を、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸と同時に形質移入することに加えて、リコンビナーゼをコードしているベクターは、細胞に形質移入され得るし、また該細胞はリコンビナーゼの発現について選択され得る。リコンビナーゼを安定に発現する細胞は、変異体核酸をコードしている核酸を用いて連続的に形質移入され得る。
【００８６】
Ｃreリコンビナーゼによって媒介される正確な部位特異的ＤＮＡ組換えは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている外因性ＤＮＡの１つのコピーを含有する安定な哺乳類形質転換体を構築するのに使用され得る。下記例示のように、Ｃre媒介性標的化事象の頻度は、修飾された二重loxストラテジーを用いて実質的に増強されうる。二重lox ストラテジーは、lox部位のコア領域内の特定のヌクレオチド変化が、組換え効率についてほとんど影響を及ぼさないＣre-媒介組換えの部位選択特異性を変化させるという所見を基にされる(Hoess et al., Nucleic Acids Res. 14:2287-2300 (1986))。標的化ベクターおよび宿主細胞ゲノムの両方における、loxPおよび改変loxP部位、いわゆるlox５１１の導入は、二重クロスオーバー事象による部位特異的組換えを生じる。二重loxアプローチは、１つのクロスオーバー挿入組換え以上に、部位特異的な組換え体の回収を２０倍まで増加させ、不正な組換え体（もしくは非相同組み換え：illegitimate）の頻度を越えるような部位特異的組換えの絶対的頻度を増加させる(Bethke and Sauer, Nuc. Acids Res., 25:2828-2834 (1997))。
【００８７】
哺乳類細胞系中のブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーの発現の後、ランダムに選択されたクローンは、配列決定され、高い触媒活性についてスクリーンされる。選択されたクローンを配列決定するための方法は、当分野では既知であり、例えば、Sambrook et al., 上掲, 1992 and in Ansubel et al., 上掲, 1998である。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性を測定するための適切な方法を選択することは、利用し得る多様なファクター、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の量に依存する。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性は、例えば分光光度計により、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を均等に捕捉するポリクローナル抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を利用するマイクロタイターを基にしたアッセイにより、また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定され得る。
【００８８】
ブチリルコリンエステラーゼに比べて、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性は、この分野では知られ、また本明細書中に記載のアッセイを用いて決定されるような触媒効率の比較によって決定され得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性は、ｏ−ニトロフェニル酢酸塩加水分解アッセイ(実施例ＩＩを参照されたい)、ＳＮ-３８へのＣＰＴ-１１変換ＨＰＬＣアッセイ(実施例ＩＩＩを参照されたい)または細胞毒性アッセイ(実施例ＩＶを参照されたい)を用いて決定され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーを確実にするために、徹底的にスクリーンされ、各ライブラリーのスクリーニングは、同一ブチリルコリンエステラーゼアミノ酸改変をコードしているクローンが、同定されるまで幾度も続けられ得る。
【００８９】
高いカンプトテシン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現するクローンは、ブチリルコリンエステラーゼの大量精製に適切な確立された大規模培養に使用され得る。目的のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、発現ベクター内でクローンされ、細胞系に形質移入するのに使用され、その後増殖される。当業者は、どのような発現ベクターが特定の適用に適切であるかを知っているであろう。高いカンプトテシン変換または加水分解活性を示しているブチリルコリンエステラーゼ変異体は、特定の化学物質に耐性を付与し、遺伝子導入された細胞の陽性選択を可能にする遺伝子を担持している発現ベクター中にクローンされ得る。例えば哺乳類細胞系のトランスフェクションに適当な発現ベクターは、哺乳類細胞における選択のために、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターのようなプロモーターを含有し得る。本明細書に記載したように、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、哺乳類発現ベクターにクローンされ、ヒト２９３Ｔ細胞に一過的に形質移入され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現するのに適当な発現ベクターは、当分野では知られており、市販入手し得る。
【００９０】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現するクローンは選択され、カンプトテシン変換または加水分解活性について試験され得る。高いカンプトテシン変換または加水分解活性を示すクローンを担持している細胞は、目的とする大量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を産生するために通常の細胞培養系により増殖され得る。濃縮された組換え体ブチリルコリンエステラーゼ変異体は回収されて、当分野ではよく知られた方法、例えば、Masson et al., Biochemistry 36: 2266-2277 (1997)（出典明示により本明細書の一部とする）に記載される方法によって精製され得る。
【００９１】
高い血清の半減期を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体は、対象中のブチリルコリンエステラーゼ変異体を試験するため、または個体における癌を処置するために有用であり得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の血清の半減期を増加させるための有用な方法は、合成および天然ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランを、短縮型ブチリルコリンエステラーゼ変異体、リポソーム製剤またはＩｇ-融合タンパク質のような酵素の発現物に共有結合的に結合させること、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をテトラマーに変換することを包含する。本明細書で開示されるように、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のテトラマーへの変換は、宿主細胞系をＣＯＬＱ遺伝子と同時形質移入することによるか、またポリ-Ｌ−プロリンを形質移入された細胞の培地に添加することにより達成され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の血清の半減期を増加するために当分野において知られたこれらの方法とその他の方法は、動物対象においてブチリルコリンエステラーゼ変異体を試験するため、または個体における癌を処置するために有用であり得る。
【００９２】
本発明は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることによって、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法を提供する。一つの実施態様において、トポイソメラーゼ阻害剤はＳＮ-３８である。別の実施態様において、カンプトテシン誘導体はＣＰＴ-１１である。一つの実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて２倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１０倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１５倍以上より高い変換能の増加、またはブチリルコリンエステラーゼに比べて１００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて２００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて３００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて４００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて５００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１０００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１５００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて２０００倍以上の変換能の増加またはブチリルコリンエステラーゼに比べて３０００倍以上の変換能の増加を示す。
【００９３】
一つの実施態様において、本発明は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントに示される配列を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触することによって、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法を提供する。例えば、一つの実施態様において、本発明は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換できる条件下で、カンプトテシン誘導体を、配列番号：２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることによって、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する方法を提供する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【００９４】
さらに別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：２４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：２６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：２８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：３０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：３２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：３４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：３６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：３８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：４０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：４２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：４４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：４６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：４８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：５０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：５２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：５４、またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【００９５】
別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：５６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：５８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：６０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：６２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：６４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：６６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：６８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：７０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：７２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【００９６】
別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：７４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：７６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：７８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：８０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：８２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：８４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：８６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：８８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：９０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：９２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：９４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【００９７】
別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：９６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：９８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１００またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１０２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１０４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１０６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１０８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１１０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１１２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１１４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１１６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１１８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【００９８】
別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１２０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１２２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１２４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１２６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１２８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１３０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１３２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１３４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１３６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１３８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１４０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１４２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１４４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１４６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１４８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【００９９】
別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１５０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１５２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１５４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１５６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１５８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１６０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１６２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１６４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１６６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１６８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１７０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１７２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【０１００】
別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１７４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１７８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１８０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１８２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１８４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１８６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１８８またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１９０またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１９２またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１９４またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、配列番号：１９６またはそれらの機能フラグメントに示されるアミノ酸配列を有する。
【０１０１】
本発明は、パクリタキセルプロドラッグをパクリタキセルに変換できる条件下で、パクリタキセルプロドラッグを、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択されるブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させることによって、パクリタキセルプロドラッグをパクリタキセルに変換する方法を提供する。
一つの実施態様において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて２倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１０倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１５倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて２００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて３００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて４００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて５００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１０００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて１５００倍以上の変換能の増加、ブチリルコリンエステラーゼに比べて２０００倍以上の変換能の増加またはブチリルコリンエステラーゼに比べて３０００倍以上の変換能の増加を示す。
【０１０２】
パクリタキセルプロドラッグ、例えばパクリタキセル-２-エチルカルボネート(ＰＣ)は、ヒト癌のネズミモデルにおいて抗腫瘍活性の有意なレベルを有する。パクリタキセル(ＴＡＸＯＬとしても知られる)は、元々西洋イチイの木の樹皮から単離され、例えば肺癌、卵巣癌、非小細胞肺癌およびカポジ肉腫を包含するいくつかの癌の処置において使用されてきた。化学療法剤のこのクラスの作用メカニズムは、チューブリンの安定化である。血清カルボキシルエステラーゼ、例えばラットカルボキシルエステラーゼは、パクリタキセルプロドラッグ、例えばＰＣを、パクリタキセルに変換することが示される。これらの血清カルボキシルエステラーゼは、肺癌および黒色腫細胞系(Senter et al., Cancer Res. 56:1471-1474 (1996)）に対するＰＣの細胞毒性活性を高める。本発明のブチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼ変異体は、パクリタキセルプロドラッグ、例えばＰＣを、癌の処置に有用な活性な医薬物に変換するために使用され得る。
【０１０３】
本明細書中に記載の場合、高いカンプトテシン変換または加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体は、基質、例えばカンプトテシン誘導体またはパクリタキセルをイン・ビトロやイン・ビボで変換するかまたは加水分解し得る。例えば、カンプトテシン誘導体のブチリルコリンエステラーゼ基質は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリークローンの培養物から単離した上清に、基質を添加することによって、イン・ビトロでの本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触され得る。一方、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、基質と接触される前に精製され得る。カンプトテシン誘導体基質のような基質を接触させる適切な培地条件は、当業者によって容易に決定される。下記のように、馴化培地由来のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、基質と接触される前に例えば抗体のような捕捉物質を使用してさらに固定化され得る。捕捉物質は、馴化培地成分の除去が可能となり、汚染物質の非存在下で基質と固定化された変異体との接触を可能にする。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体を基質と接触した後に、変異体酵素の活性は測定され得る。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体をカンプトテシン誘導体基質と接触した後、カンプトテシン変換または加水分解活性は、当分野ではよく知られた、本明細書中に記載の多様な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィーまたは細胞毒性アッセイによって測定され得る。
【０１０４】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４および１９６、またはそれらの機能フラグメントから選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法をさらに提供する。一つの実施態様において、該癌は転移性結腸直腸癌である。別の実施態様において、該癌は卵巣癌である。別の実施態様において、該癌は肺癌、例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌である。さらなる実施態様において、該癌は非ホジキンリンパ腫である。別の実施態様において、該癌は中枢神経癌である。
【０１０５】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、ＣＰＴ-１１をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、２０２または２０４、またはそれらの機能フラグメントから選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法も提供する。一つの実施態様において、トポイソメラーゼ阻害剤はＳＮ-３８である。
【０１０６】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、パクリタキセルプロドラッグをパクリタキセルに変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、２０２、または２０４、またはそれらの機能フラグメントから選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法をさらに提供する。一つの実施態様において、該癌は転移性結腸直腸癌である。別の実施態様において、該癌は卵巣癌である。別の実施態様において、該癌は乳癌である。別の実施態様において、該癌は肺癌である。さらに別の実施態様において、該癌はカポジ肉腫である。
【０１０７】
パクリタキセルおよびカンプトテシン誘導体は、多様な癌に対する有効な化学療法剤であると知られている。例えば、ＣＰＴ-１１は、大腸癌の処置についてＦＤＡに認可されている。ＣＰＴ-１１をＳＮ-３８に加水分解する際の改善は、この医薬品の有用性の助けとなり、患者の副作用を低下させる。例えば、ＣＰＴ-１１処置の副作用には、下痢、脱毛、悪心、嘔吐、骨髄抑制、高血糖、脱毛症およびコリン作動性症状(Moertel et al., Cancer Chemor. 56:95-101 (1972); Muggia et al.、Ca. Chemother. Rep. 56:515-521 (1972))が包含される。大腸癌に加えて、これらの医薬物は、多様な他の癌で試験される(Hare et al., Cnacer Chemtoher. Pharmacol. 39:187-191(1997)、出典明示により本明細書の一部とする)。
【０１０８】
本発明は、治療上有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を投与することにより個体における癌を処置する方法を提供する。治療上有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を投与することにより個体における癌を処置する方法は、抗体または抗体フラグメント、例えばＣＤ２０(配列番号：１９８および２００)やＥＧＦ(配列番号：１８および２０)、本明細書に記載の抗体および対応するフラグメントをさらに含有する変異体の投与であり得ると考えられる。有効であるために必要とされるブチリルコリンエステラーゼ変異体の用量は、例えば、投与経路および形態、投与される分子の効能および生物活性の半減期、個体の体重および健康状態、以前または現在の治療に依存する。該方法の特定の適用について有効な用量であると考えられる適切な量は、本明細書中で提供される技術とガイダンスを用いて、当業者により決定され得る。例えば、この量は、本明細書中に記載のイン・ビトロまたはイン・ビボのブチリルコリンエステラーゼアッセイから推断され得る。当業者は、個体の健康状態が処置の推移を通して追跡される必要があること、その投与される組成物の量が調整され得ることは認識されるであろう。
【０１０９】
癌を処置するために、治療療上有効量の本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、処置法によっては、例えば、約０.１mg/kg〜０.１５mg/kg体重、例えば、約０.１５mg/kg〜０.３mg/kg、約０.３mg/kg〜０.５mg/kgまたは約１mg/kg〜５mg/kgであり得る。同様に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を徐放性にし得る処方は、癌を処置される個体に、少量のブチリルコリンエステラーゼ変異体の連続的放出を提供する。低いカンプトテシン変換または加水分解活性を有する変異体に対して必要とされる用量に比べて、有意に増強されたカンプトテシン変換または加水分解活性を示す変異体の低い用量が投与されるように、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の用量は変異体の触媒活性に基づいて調整され得るべきであると解される。
【０１１０】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、全身送達、例えば静脈または動脈内に送達され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、当業者にはよく知られている処方を用いて、医薬的に許容し得る処方において、単離され、実質的に精製されたポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの形態で提供され得る。これらの処方物は、例えば、局所、経皮、腹膜内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸または経腸(例えば、静脈内、髄腔内、皮下または筋肉内)の経路を包含する標準的経路で投与され得る。さらに、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、癌を示す個体の症状を処置するために有用な化合物の徐放性を可能にする生物分解性ポリマーに組み込まれ得る。生物分解性ポリマーおよびそれらの使用は、例えばBrem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991)に詳細に説明されており、これを出典明示により本明細書の一部とする。
【０１１１】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、薬学的に許容し得る媒質と共に、溶液または懸濁液として投与されうる。かかる薬学的に許容し得る媒質は、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、通常の生理食塩水またはリンガー溶液または他の生理学上緩衝生理食塩水、または他の溶媒またはビヒクル、例えばグリコール、グリセロール、油、例えばオリーブ油または注射可能な有機エステルであり得る。薬学的に許容し得る媒質は、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の吸収を安定化させるか増加させるように作用する生理学上許容し得る化合物をさらに含有し得る。かかる生理学上許容し得る化合物は、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロースまたはデキストラン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸またはグルタチオン；キレート化剤、例えばＥＤＴＡであり、これは微生物膜を分裂する；二価金属イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム；低分子量タンパク質；脂質またはリポソーム；または他の安定化剤または賦形剤を包含する。
【０１１２】
経腸投与に適当な処方は、水性および非水性滅菌注射用溶液、例えば上記のような医薬的に許容し得る媒質を包含する。該溶液は、目的とするレシピエントの血液と等張な製剤を与える、例えば、緩衝液、静菌剤および溶剤をさらに含有し得る。他の製剤は、例えば、懸濁剤および濃化剤を包含し得る水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。該製剤は、単回用量または複数回用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中で与えられ、例えば、使用直前に滅菌液体担体の添加を必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即製の注射溶液および懸濁液は、前述で説明された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０１１３】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、さらに他の治療剤を用いる併用療法で利用され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体を包含する併用療法は、変異体を含有する製剤と適当な製剤中に各々別の治療剤を含有する製剤からなり得る。一方、併用療法は融合タンパク質からなり得るが、その場合、ブチリルコリンエステラーゼ変異体が異種タンパク質、例えば治療用タンパク質または抗体または抗体フラグメントと結合される。
【０１１４】
抗体治療用のイン・ビボ投与様式は、融合ポリペプチド抗体またはそれらの機能フラグメントの腹膜内、静脈内および皮下投与を包含し得る。抗体治療用の用量は知られているか、または当業者により慣例的により決定され得る。例えば、かかる用量は、一般的に、約０.０１μg/ml-約１００μg/ml、約１-５μg/mlまたは約５μg/mlの血漿濃度が達成されるように投与される。体重あたりの量に関して、これらの用量は、通常約０.１-３００mg/kg、約０.２-２００mg/kgまたは約０.５-２０mg/kgに一致する。必要に応じて、用量は、処置経過中、１回または複数回投与されうる。一般的に、用量は、年齢、健康状態、性別および対象の病状の程度によって変化し、副作用を引き起こす程度の高用量であるべきでない。さらに、用量は、処置経過中に内科医により、処置を高めるか、または副作用の潜在的発生を低下させるかのいずれかに調整され得る。かかる方法は、既知であり、当業者によって日常的に行われる。
【０１１５】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ペプチドまたは変異体をコードしている核酸を投与することによって、個体に送達されうる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸は、治療上有効量のポリペプチドまたは変異体を送達するための当業者には既知の多様な遺伝子治療法と関連しても有用である。本明細書中に記載の技術およびガイダンスを用いると、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸は、当分野では既知のベクターまたは送達系に組み込まれるか、治療上有効量を達成するために該コード配列の送達および発現のために使用される。当分野で既知の用い得るベクターおよび送達系は、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス、リガンド結合パーティクルおよび単離ＤＮＡおよびＲＮＡを標的とする核酸、リポソーム、ポリリシンおよび肝臓の細胞治療を包含し、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現するように修飾された細胞の移植を用いる細胞治療、さらに多様な他の遺伝子送達方法および当業者に知られた修飾法、例えばShea et al., Nature Biotechnology 17:551-554 (1999)（出典明示により本明細書の一部とする）を包含する。
【０１１６】
コードしている核酸配列を発現することによるブチリルコリンエステラーゼ変異体の送達のための方法に関する具体的な例は、当分野ではよく知られており、例えば米国特許番号５,３９９,３４６; 米国特許番号５,５８０,８５９;５,５８９,４６６；５,４６０,９５９；５,６５６,４６５；５,６４３,５７８；５,６２０,８９６；５,４６０,９５９；５,５０６,１２５；欧州特許出願番号 ０ ７７９ ３６５ Ａ２；ＰＣＴ番号 ＷＯ ９７/１０３４３；ＰＣＴ番号 ＷＯ ９７/０９４４１;ＰＣＴ番号ＷＯ ９７/１０３４３（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。当業者には既知の他の方法も存在しており、このコードしている核酸配列を発現することによってブチリルコリンエステラーゼ変異体の送達に同様に適用し得る。
【０１１７】
本発明の多様な実施態様に関する活性に実質的に影響しない修飾は、本明細書中で示される本発明の定義内に包含されると解される。従って、下記実施例は本発明を限定するものではなく説明を意図するものである。
【０１１８】
実施例Ｉ
ブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリー
この実施例は、哺乳類細胞において発現したブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの合成および特徴を説明するものである。
ブチリルコリンエステラーゼ変異体の最初のライブラリーを、ブチリルコリンエステラーゼの触媒活性に重要であると決定した残基を突然変異させることによって生成した。触媒活性に潜在的に重要であるブチリルコリンエステラーゼ内の残基を、Silicone Graphics Octane computerでSybyl 6.4 softwareのFlexi Dock program(Tripos Inc., St. Louis, MO)を用いて、ブチリルコリンエステラーゼの活性部位に基質を結合させることによって決定した。触媒活性に重要な残基を、本明細書中に記載のＰＣＲベース突然変異誘発またはコドンベース突然変異誘発を用いて突然変異させて、ライブラリー内に納めた。
【０１１９】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーを、例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)を用いて行ったヒト・ブチリルコリンエステラーゼＤＮＡのＰＣＲ部位特異的突然変異誘発を用いて調製した。３つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、突然変異誘発を行った。突然変異誘発プライマーを、一般的なプライマー、例えばＳＰ６プロモーター配列決定プライマー(MBI Fermentas, Amherst、NY)と同時に使用して、ブチリルコリンエステラーゼcＤＮＡの１つの末端を増幅した。ＰＣＲ反応産物(megaprimers)を、過剰なプライマーを除くためにメーカーのプロトコールに従って、Quiaquick PCR (Qiagen、Santa Clarita、CA)上で洗浄した。洗浄したメガプライマーを、第二ＰＣＲ反応中に伸張させて、各変異体の完全な１.８ｋｂコード配列を生成した。
【０１２０】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体を構成する１.８ｋｂフラグメントを、プラスミドｐＧＳにクローンし、所望の変異が存在することを確かめるために再び配列決定した。プラスミドｐＧＳは、Ｎｅｏ遺伝子がラットのグルタミン合成酵素に置換されること以外はｐＲｃ／ＣＭＶ(In vitrogen, Carlsbad, CA)と同一である。これらの変異体は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ）由来細胞系で安定に発現されうるか、例えば、２９３Ｔ細胞中で下記に説明されるように一過的に発現される。
【０１２１】
また、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーを、例えば、ヒト・ブチリルコリンエステラーゼＤＮＡのコドンベースの突然変異誘発を用いて生成した。構造的モデル化または様々な種間の配列アラインメントを基にして触媒効率に重要であると推定したブチリルコリンエステラーゼの領域を、突然変異誘発のために標的化した。触媒効率に重要であると推定した７つの領域を表１に示した。
【０１２２】
焦点とするライブラリー合成のために選ばれたブチリルコリンエステラーゼの７つの領域は、８つの芳香族活性部位の溝の残基（Ｗ８２、Ｗ１１２、Ｙ１２８、Ｗ２３１、Ｆ３２９、Ｙ３３２、Ｗ４３０およびＹ４４０)、並びに触媒的３つ組残基の２つを包含する残基にわたる。６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓおよび４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓ間に位置する鎖内ジスルフィド結合の完全性は、機能的ブチリルコリンエステラーゼ構造を確実にするために維持される。さらに、残基１７、５７、１０６、２４１、２５６、３４１、４５５、４８１、４８５および４８６に位置する推定グリコシル化部位(Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ)も、一般的にライブラリー合成においてさける。全体では、約１４％のブチリルコリンエステラーゼの線状配列を示す７つの焦点とされるライブラリーは７９残基にわたり、約１５００の異なるブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現を生じる。
【０１２３】
変異誘発されたヒト・ブチリルコリンエステラーゼの７つの領域に対応する核酸のライブラリーを、上記のようなコドンベース突然変異誘発によって合成する。要するに、多重ＤＮＡ合成カラムを用いて、Glaserら,上掲1992によって記載したようなβ−シアノエチルホスホラミダイト化学によってオリゴヌクレオチドを合成した。第一ステップにおいて、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸をコードしているトリヌクレオチドを、１つのカラム上で合成し、一方、第二カラムを用いて、トリヌクレオチドＮＮ(Ｇ／Ｔ)（ここでＮはｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびｄＴシアノエチルホスホラミダイトの混合物である場合）を合成した。トリヌクレオチドＮＮ(Ｇ／Ｔ)を用いると、各位置での全ての２０個のアミノ酸の系統的発現によって達成される、最小の縮重により完全な突然変異誘発を生成する。
【０１２４】
第一コドンの合成後に、該２つのカラムからの樹脂を、一緒に混合して、分割し、４つのカラムに入れ替えた。各コドンに対してさらなる合成カラムを加え、縮重したオリゴヌクレオチドのカラム樹脂のプールを混合することによって、突然変異誘発の程度を基にして分離した。コドンベースの突然変異誘発の樹脂混合の態様は、複数のオリゴヌクレオチドを合成するという必要性を排除するために、このプロセスを迅速にし、かつ経済的にする。本試験において、１つのアミノ酸変異をコードしているオリゴヌクレオチドのプールを用いて、焦点とされるブチリルコリンエステラーゼライブラリーを合成した。１つのアミノ酸変異を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしているオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて、二重lox標的化ベクター(Kunkel, 上掲,1985)にクローンし得る。
【０１２５】
上記ライブラリー由来のいくつかのブチリルコリンエステラーゼ変異体は、野生型ブチリルコリンエステラーゼに比べた場合、触媒活性が増強されていることがわかった。上記ライブラリー由来の変異体を、本明細書中に記載の多様なアッセイ、例えば、ＳＮ-３８の形成についてのｏ-ニトロフェニル酢酸塩加水分解アッセイやＨＰＬＣアッセイを用いて、増強されたカルボキシルエステラーゼ活性についてアッセイを行った。Ｆ２２７Ａ(配列番号：２)として示さるこれらのライブラリー由来の１つの変異体は、ＨＰＬＣアッセイにおいて野生型ブチリルコリンエステラーゼと比べてブチリルコリンエステラーゼ活性において少なくとも３倍の増加を示した。Ｆ２２７Ａは、位置２２７でフェニルアラニンをアラニンで置換するヒト・ブチリルコリンエステラーゼポリペプチド配列中の１つのアミノ酸置換を含有する。ＤＮＡレベルでは、これはＴＴＴコドンからＧＣＧコドンへの変化である。
【０１２６】
Ｆ２２７Ａ変異体を鋳型として用いて、さらに部位特異的変異を生成し、いくつかの二重変異体の構築体を得る。部位特異的変異に対して選択された該領域は、本明細書中に記載の触媒効率について重要であると推定された残基であった（例えば、表１を参照されたい)。例えば、下記の二重変異体を生成した(表２を参照されたい）。ヒト・ブチリルコリンエステラーゼ（配列番号：２１および２２）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を参考のために図１１に示した。
【０１２７】
【表２】
2006508665.tif 000003
【０１２８】
二重突然変異を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を、２９３Ｔヒト未発達腎細胞を用いて一過的な系で発現した。簡潔に説明すると、１日目、２９３Ｔ細胞を、１.５ｘ１０５ 細胞/ウェルでBioCoat２４ウェルプレートに播種した。次いで該細胞を、一晩回復させた。２日目、２μlのLipofectamine 2000/ウェルを５０μl Opti-MEM/ウェルに希釈し、５分間インキュベートした。希釈した５００ng-１μgのＤＮＡ/ウェルを５０μl Opti-MEM/ウェルに希釈した。２つの希釈溶液を混合し、２０分間、室温でインキュベートした。培地を細胞から除去して、ペニシリンまたはストレプトマイシンを含まない５００μl/ウェルの完全な増殖培地に置き換えた。続いて、希釈溶液（１００μl）を、各ウェルに添加し、細胞を４時間インキュベートした。この培地/ＤＮＡ/Lipofectamine 2000を細胞から除去し、Ultraculture 血清不含培地(Bio Wittaker)/ウェル（１ml）で置き換えた。ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドを、４８-９６時間蓄積させて、細胞からの該馴化培地を直接用いた。他の適用のために、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドを、下記実施例ＶＩのとおりに精製し得る。
【０１２９】
二重変異を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を、下記のとおりに活性についてアッセイした。例えば、変異体を、ｏ-ニトロフェニル酢酸塩の加水分解アッセイを用いるカルボキシルエステラーゼ活性、ＨＰＬＣを基にしたアッセイを用いるＣＰＴ-１１変換活性、そして癌細胞系の細胞毒性についてアッセイした。
【０１３０】
実施例ＩＩ
ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカルボキシルエステラーゼ活性
この実施例は、いくつかのブチリルコリンエステラーゼ変異体のカルボキシルエステラーゼ活性を示す。
カルボキシルエステラーゼ活性についての標準的アッセイはｏ-ニトロフェニル酢酸塩(ｏ−ＮＰＡ)加水分解アッセイである(Beaufay et al., J. Cell. Biol. 61:188-200 (1974)を参照されたい)。抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を用いて捕捉することによって標準化されたブチリルコリンエステラーゼ変異体のｏ−ＮＰＡ活性を測定するこのアッセイの修飾を、下記のとおりに行った。
【０１３１】
捕捉されたブチリルコリンエステラーゼのカルボキシルエステラーゼ活性を、ｏ-ニトロフェニル酢酸塩により決定するためのプロトコール：
１）９６ウェルImmulonの２つのプレートを、１０mg/ml ウサギ抗ヒト・ブチリルコリンエステラーゼ(Dako #A0032)のＰＢＳ溶液(１００ ml/ウェル)で、終夜４℃で被覆する。
２）被覆溶液を除去し、プレートを３％ＢＳＡのＰＢＳ(２５０ ml/ウェル)によって、２時間室温でブロックする。
３）ブチリルコリンエステラーゼ変異体馴化培地（２００ ml）を添加し、室温で２時間インキュベートする。
４）プレートを３回、ＰＢＳ（２５０ ml/ウェル）で洗浄する。
５）０.１Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７.０、８５ ml/ウェル）を添加する。
６）ｏ−ＮＰＡ（１３.６ mg）をアセトニトリル（１００ ml）に添加し、混合し、溶解させた。このストック（１００ ml）を水(６.３ ml）に添加し、よく混合する。
７）プレートをＰＢＳで３回洗浄する。
８）希釈したｏ−ＮＰＡ基質（１５ ml）を添加する。
９）４０５nmでの吸収を読み取る。
【０１３２】
２９３Ｔ細胞で一過的に発現されたブチリルコリンエステラーゼ変異体からの馴化培地を、上記抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体捕捉/カルボキシルエステラーゼ活性について標準化アッセイを用いて試験した。図１の代表的なアッセイを示した場合、いくつかのブチリルコリンエステラーゼ変異体はカルボキシルエステラーゼ活性を示した。図１に示された第一変異体はＦ２２７Ａである(一番左の棒線を参照されたい)。他の変異体の活性のレベルは、Ｆ２２７Ａの活性のレベルと比較され得る。このアッセイにおける野生型ブチリルコリンエステラーゼの活性のレベルは、Ｆ２２７Ａで判った活性の約５０％のレベルであった。アッセイ中に存在する変異の量を決定するために、いくつかのウェルは同一の変異体を含む。例えば、４つのウェルは、最初のウェルに加えてＦ２２７Ａ変異体を含有するものとして標識した。５つ全てのウェルの活性レベルは類似しており、このアッセイにおいて変異性のレベルが低いことを示す。
【０１３３】
この方法によって同定されたカルボキシルエステラーゼ基質加水分解に影響を与えるブチリルルコリンエステラーゼ残基は、次のものを包含する：Ｆ２２７、Ａ３２８、Ｙ３３２、Ｔ２８４、Ｐ２８５、Ｌ２８６。このアッセイは、活性について多くの変異体を迅速にスクリーンするために使用され得る。このアッセイで測定された活性は、ＣＰＴ-１１活性化の推定的なものであり、ＣＰＴ-１１活性化に関係するＢＣｈＥの残基または領域を同定するために使用され得る。
【０１３４】
実施例ＩＩＩ
ブチリルコリンエステラーゼ変異体のＣＰＴ-１１変換活性
この実施例は、ブチリルコリンエステラーゼに比べてＣＰＴ-１１変換活性を増加させるブチリルコリンエステラーゼ変異体を示す。
ブチリルコリンエステラーゼ変異体を、Dodds および Rivory, Mol. Pharmacol. 56:1346-1353 (1999)に記載のようにＳＮ-３８形成を検出する蛍光高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、ＣＰＴ-１１変換活性についてアッセイした（出典明示により本明細書の一部とする）。ＣＰＴ-１１のＳＮ-３８への変換を図２に示す。要するに、一過的に発現したＢＣｈＥ変異体からの馴化培地を、７２時間３７℃で２０ｍＭ ＣＰＴ-１１に暴露し、ＨＰＬＣによりＳＮ-３８形成（約４分間カラム保持時間でのピーク）を分析した。図３は、トランスフェクションが、ＤＮＡは添加されないけれども通常と同様に行われたことを意味する偽遺伝子導入細胞からの馴化培地を用いて製造したＳＮ-３８の量を示す。図４は、Ｆ２２７Ａを用いる遺伝子導入細胞からの馴化培地を用いて産生したＳＮ-３８の量を示し、図５は、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｓで遺伝子導入された細胞からの馴化培地を用いて産生されたＳＮ-３８の量を示す。
【０１３５】
図３−５に示したように、Ｆ２２７Ａ変異体は少量のＳＮ-３８を産生し、そして変異体Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｓは、偽（mock）およびＦ２２７Ａ変異体の馴化培地と比べて、ＣＰＴ-１１のＳＮ-３８への有意な変換を示した。このアッセイにおいて、野生型ブチリルコリンエステラーゼは、ＳＮ-３８の検出し得るレベルを示さなかった。
【０１３６】
野生型ブチリルコリンエステラーゼに比べて、ＳＮ-３８へのＣＰＴ-１１変換が高められ、この方法によって同定されたブチリルコリンエステラーゼ変異体には次のものが包含される：Ｆ２２７Ａ(配列番号：２）、Ｆ２２７Ａ／Ｔ２８４Ａ(配列番号：４)、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｑ (配列番号：６)、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｓ(配列番号：８)、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｈ(配列番号：１０)、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｗ(配列番号：１２)およびＦ２２７Ａ／Ｓ２８７Ｐ(配列番号：１４)。表３は、これらの変異体においてＳＮ-３８へのＣＰＴ-１１変換の概略の倍数の改善を示す。実際の倍数の改善は、表３に記載した値よりも、野生型ブチリルコリンエステラーゼと比べて倍数の改善を基準にされるので、表３に列挙されたものよりも顕著に高いものであり得る。野生型ブチリルコリンエステラーゼの活性がこのアッセイでは非常に低いため(１％以下の変換)、野生型ブチリルコリンエステラーゼに対する値は、他の活性値よりもより変動が高くなる傾向がある。従って、表３に記載の活性値は、これらの変異体の活性に対して非常に保存的な値であり、そのため表３の変異体は少なくとも列挙した活性値よりも高いことを示す。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ａ／Ｌ２６８Ｓ(配列番号：８)は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン変換活性において少なくとも５０倍の増加を示す。該別の方法、ブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ａ／Ｌ２６８Ｓ(配列番号：８)は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて変換能において５０倍以上の増加を示す。
【０１３７】
2006508665.tif 000004
【０１３８】
実施例ＩＶ
ブチリルコリンエステラーゼ媒介細胞毒性およびブチリルコリンエステラーゼ変異体により死滅する増強されたＣＰＴ-１１活性化
この実施例は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、癌細胞系における細胞毒性が増強されたブチリルコリンエステラーゼ変異体を示す。
【０１３９】
細胞性の細胞毒性アッセイを用いて、ＢＣｈＥ変異体によるＣＰＴ-１１活性化のレベルを示す。ＣＰＴ-１１の医療上の相対的な濃度(０.５-１０ｍＭ)を、３７℃で２４-７２時間、ＢＣｈＥ変異体に暴露した。簡潔に記すと、４ｍＭでのＣＰＴ-１１を７２時間、発現した野生型ＢＣｈＥ、６-６変異体またはＦ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｑ変異体とインキュベートした。ＳＷ４８大腸癌細胞を、７２時間、０.５ｍＭの濃度で活性化したＣＰＴ-１１に暴露し、細胞生存能をＭＴＴ方法によって測定した。ＭＴＴ(３-(４,５-ジメチルチアゾリル-２)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)アッセイは、市販購入でき、酸化還元感受性染色剤を低下させる細胞の能力を基にした細胞生存性を測定するために使用し得る。６−６変異体は、変異体を記載するために全体をとおして使用した名前においてＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ(配列番号：１６)として示される４箇所の変異体であることに注意されたい。６−６変異体は、変異位置で次のコドンを含有する：アミノ酸位置２２７でアラニンをコードするＧＣＧ、アミノ酸位置２８７でグリシンをコードするＧＧＴ、アミノ酸位置３３２でメチオニンをコードするＡＴＧ、およびアミノ酸位置３２８でトリプトファンをコードするＴＧＧ。
【０１４０】
図６に示したように、ＳＷ４８大腸癌細胞中のＣＰＴ-１１媒介細胞毒性は、ＢＣｈＥおよびＢＣｈＥ変異体の存在下で顕著に高められる。６-６変異体(配列番号：１６)およびＦ２２７／Ｌ２８６Ｑ(配列番号：６)変異体の両方は、ＣＰＴ-１１活性化によって媒介された増加した腫瘍細胞の細胞毒性を示した。
【０１４１】
実施例Ｖ
ＣＰＴ-１１の標的とされる活性化に対する抗体ブチリルコリンエステラーゼ融合ポリペプチド
この実施例は、ＣＰＴ-１１を用いて抗体特異的酵素プロドラッグ治療 (ＡＤＥＰＴ)のために使用され得る抗ＥＧＦ受容体-ＢＣｈＥ融合ポリペプチドの構築体および特徴を示す。
【０１４２】
モデル抗体ＢＣｈＥ融合ポリペプチドを、ＢＣｈＥ(短縮型Ｌ５３０モノマー)のＮ末端を、抗上皮増殖因子受容体 (ＥＧＦＲ) 抗体ｃｈ２２５のＣＨ１ドメインのＣ末端に融合することによって構築した。２つのドメインは、ＧＧＧＳリンカーまたは天然抗体ヒンジ領域のいずれかによって結合される。抗原結合および触媒酵素機能の両方を示すモデル抗体-酵素融合ポリペプチドを産生した。マウス抗ＥＧＦ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図９に示され、マウス抗ＥＧＦ可変領域重鎖およびＬ５３０の定常重鎖１ヒンジ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図１０に示される。
【０１４３】
短縮型Ｌ５３０モノマーは、Blong et al., Biochem. J. 327:747-757 (1997)に記載されており、出典明示により本明細書の一部とする。このモノマーは、野生型ＢＣｈＥで見られるようなテトラマー中に会合されないようにＣ末端で短縮されるＢＣｈＥを含有する。Ｌ５３０モノマーは、ほとんどもしくは全てのブチリルコリンエステラーゼ(ＢＣｈＥ)活性を保持する。
【０１４４】
発現した抗-ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ Ｌ５３０の抗-κ捕捉抗体に結合すること、ブチリルチオコリン加水分解物によりブチリルコリンエステラーゼの結合活性を測定することを示すＥＬＩＳＡアッセイを、図７に示した。これは、ブチリルコリンエステラーゼ活性を示す完全融合ポリペプチド(抗体軽鎖を通じて結合する)を示す。
抗-ＥＧＦＲ-Ｌ５３０の抗-κ捕捉のプロトコールは下記である：
１）９６ウェルImmulonの２つのプレートを、１０mg/ml抗-ヒトκ抗体のＰＢＳ溶液（２００ml）で一晩被覆する。
２）プレートを３％ＢＳＡのＰＢＳ(２５０ ml/ウェル)溶液を用いて２時間室温でブロックする。
３）プレートを２５０ml/ウェルのＰＢＳで３回洗浄する。
４）ＢＣｈＥ馴化培地（２００ml）を添加し、室温で２時間インキュベートする。
５）５ｍＭ ＤＴＮＢの保存溶液を０.１Ｍ カリウムリン酸緩衝液ｐＨ７.０で１：１０の希釈物を作り、ＤＴＮＢの作業溶液を調製する。１８０ ml/ウェルに添加する。
６）２００ｍＭの保存溶液を水で１：２０に希釈することによってブチルチオコリン（ＢＴＣ）の作業溶液を調製する。２０ ml/ウェルを添加する。
７）プレートを３７℃でインキュベートし、分光分析器でのＡ４０５nmを測定する。
【０１４５】
ＥＧＦＲ抗原を含有する細胞膜調製物に特異的に結合する抗ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ Ｌ５３０のブチリルコリンエステラーゼ活性を測定するＥＬＩＳＡアッセイを、図８に示した。これらの結果は、ブチリルコリンエステラーゼドメインの抗体ドメインおよび酵素活性により融合タンパク質の抗原特異的結合を示す。
Ａ４３１膜調製物に結合する抗ＥＧＦＲについてのプロトコールは次のとおりである：
１）９６ウェルImmulonの２つのプレートを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、０.１％ Triton Ｘ-１００中に１／２０希釈したＡ４３１細胞分解物（５０ ml/ウェル）を被覆し、終夜フード内で乾燥させた。
２）プレートを３％ＢＳＡのＰＢＳ(２５０ ml/ウェル)溶液で、２時間室温でブロックした。
３）プレートを３回２５０ ml/ウェルＰＢＳで洗浄した。
４）ＢＣｈＥ馴化培地（２００ml）を添加し、室温で２時間インキュベートした。
５）保存溶液５ｍＭ ＤＴＮＢを、０.１Ｍ カリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に１：１０に希釈して、ＤＴＮＢの作業溶液を調製した。ウェルあたり１８０ml添加した。
６）２００ｍＭの保存溶液を水で１：２０に希釈して、ブチルチオコリン(ＢＴＣ) の作業溶液を調製した。ウェルあたり２０ ml添加した。
７）プレートを３７℃でインキュベートし、分光分析器でＡ４０５nmを読み取った。
【０１４６】
実施例ＶＩ
ブチリルコリンエステラーゼ変異体の精製および特性分析
この実施例は、どのようにブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドを精製し得るかを示す。これらの精製したポリペプチドは、例えばアッセイにおいて、また本明細書に記載の医薬組成物に用いられ得る。
【０１４７】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体を精製するために、各変異体に対応する培養液をブフナー漏斗でWhatman #1 濾紙(Whatman Inc., Clifton, NJ)を通して濾過した。該濾液をアフィニティーゲルプロカインアミドSepharose 4B（１００ml）で充填したクロマトグラフィーカラムから流した(XK50/30, Pharmacia Biotech, Piscatawy, NJ)。該ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、重層中のアフィニティーゲル内に吸着し、その前の２０Ｌ中に存在した酵素（２０mg）を、アフィニティーゲル（１００ml）中で濃縮される。続いて、該アフィニティーゲルを、２０ｍＭ リン酸カリウム(ｐＨ７.０)および１ｍＭ ＥＤＴＡ中の０.３Ｍ 塩化ナトリウムで連続的に洗浄し、含有タンパク質を溶出する。次ぎに、該アフィニティーゲルを２０ｍＭリン酸カリウムおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ ７.０)を含有する緩衝液で洗浄し、イオン強度を低下させた。最後に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を、０.２Ｍプロカインアミドの緩衝液（２５０ ml）で溶出した。
【０１４８】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体をさらに精製し、プロカインアミドを除去するために、２回目の精製ステップを行い得る。第一回目の精製ステップで回収したブチリルコリンエステラーゼ変異体を、緩衝液 (２０ｍＭ ＴrisＣl, １ｍＭ ＥＤＴＡ, ｐＨ７.４) で１０倍希釈し、イオン強度を約０.０２Ｍに低下させた。希釈した酵素を、４００ｍｌの弱アニオン交換剤ＤＥ５２(Whatman, Clifton, NJ)を含有するカラム上に流した。この低いイオン強度でブチリルコリンエステラーゼ変異体をイオン交換ゲルに吸着させた。充填が完了した後、プロカインアミドが洗い流されたことを示している２８０nmでの溶出物の吸収が０に近づくまで、カラムを２０ｍＭ ＴrisＣlおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２Ｌの緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄した。次いで、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を、塩勾配０〜０.２Ｍ ＮａＣｌの２０ｍＭ ＴrisＣl緩衝溶液(ｐＨ７.４)によりカラムから溶出する。次いで、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の溶出後、１０mlのフラクションを、フラクションコレクターを用いて各変異体について回収した。活性アッセイを行い、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を含有しているピークを同定した。各ブチリルコリンエステラーゼ変異体の純度を決定するために、ＳＤＳゲル電気泳動を行い、通常、約９０％であると決定した。
【０１４９】
実施例ＶＩＩ
イン・ビトロでの抗体ＢＣｈＥ融合タンパク質の産生および標的プロドラッグ活性化と細胞毒性の評価
この実施例は、抗体特異的酵素プロドラッグ治療モデルにおいて至適ＢＣｈＥ変異体を示す。至適変異体残基を導入する抗体-酵素融合タンパク質を、ライブラリースクリーニングによって同定し、ＣＰＴ-１１を用いてＡＤＥＰＴにおいて至適化ＢＣｈＥを用いる場合の可能性を、ＣＤ２０、すなわちＢリンパ球上に存在する非内在化細胞表面抗原を標的化することによって確認した。
【０１５０】
ＣＤ２０は、ヒトＢリンパ腫系(３.２ x １０５分子/細胞)で充分に発現した抗原としてＡＤＥＰＴにおいて至適化ＢＣｈＥを用いる可能性を試験するのに有用な標的抗原であり、抗体結合に対して顕著な内在化をうけない。ＡＭＥ１３３は、図１９および２０に示される完全なヒト生殖細胞系フレームワーク領域を有するヒト化抗ＣＤ２０であり、配列番号：１９８および２００として示され、また対応する核酸配列の配列番号：１９７および１９９として示される。この抗体は、Applied Molecular Evolution社において、該会社の製造指針に基づいて製造され、この一価のＦａｂは、非常に高い親和性(１ｘ１０−９ Ｍ)によってＣＤ２０に結合する。例示的モデルの融合タンパク質(抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４-１)を生成し、図１９に示す。抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４-１(配列番号：２０２)を、ＣＨ１重鎖ドメインのＣ末端で、参照配列番号：１８０の機能フラグメントである修飾されたＢＣｈＥ変異体Ｌ５３０(配列番号：２０４)のＮ末端に融合したＡＭＥ１３３ Ｆａｂを含む。該ＢＣｈＥ変異体を、アミノ酸５３０で短縮し、テトラマーへのその通常の会合を排除した。酵素のモノマー体は、Blong et al., Biochem J 327 (Pt 3):747-57 (1997)に記載されるようにアロステリック効果による活性の損失なく、天然テトラマー形態の各サブユニットと等しい活性を示す。
【０１５１】
非付着性ＨＥＫ ２９３細胞を、血清不含の低タンパク質媒質(UltraCULTURE、BioWhittaker)中での懸濁培養に適応させ、２-４mg/Ｌの収量を産生する融合タンパク質によって一過的に遺伝子導入した。２段階精製法を、Sepharose Ｑでのアニオン交換、次いでフェニルセファロース上での疎水性相互作用クロマトグラフィー法を用いて行った。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した１つの主な汚染物質のバンドを有する＞９０％の純度の生成物を生じた。融合タンパク質は、ＢＣｈＥ.４-１変異体単独のものと同一であるＣＰＴ-１１についてＫｍ値を維持する。対照融合タンパク質構築体を、生成し、発現した。これらは、短縮型野生型ＢＣｈＥ(抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.wt)のＮ末端にＣＨ１重鎖ドメインＣ末端で融合したＡＭＥ１３３ ＦａｂおよびＢＣｈＥ.４-１に融合した抗上皮増殖因子受容体 (ＥＧＦＲ) Ｆａｂである。
【０１５２】
図１４に記載したように、対照抗-ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ構築体に比べて、抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ融合タンパク質は、ＣＤ２０陽性ＳＫＷ 腫瘍細胞に結合する抗原特異性を示す。結合融合タンパク質を、ブチリルチオコリンヨウ化物のＢＣｈＥ特異的加水分解によって検出した。
【０１５３】
ＡＤＥＰＴ中の融合タンパク質の有用性を示すために、抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ融合タンパク質が、イン・ビトロで腫瘍細胞に強固に結合し、ＣＰＴ-１１の存在下で細胞毒性ＳＮ３８を生じることを示した。抗原-陽性ＳＫＷ ６.４ ヒトＢリンパ腫細胞を、抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４−１とインキュベートし、結合していない融合タンパク質を洗浄により除去した。次いで該細胞をＣＰＴ-１１の濃度を上げて４時間インキュベートし、再度洗浄した。細胞生存性を、７２時間後に評価した。抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４−１とのインキュベーション後、偽馴化培地で処置した細胞に関連しているＣＰＴ-１１のＥＣ５０において７〜１０倍の低下を観察した(図１５)。要するに、生存腫瘍細胞を、抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４-１または偽馴化培地を用いて予めインキュベートし、各濃度範囲にＣＰＴ-１１に暴露する４時間前に暴露した。結合融合タンパク質は、ＣＰＴ-１１死滅に対するＥＣ５０において顕著な低下を示した。細胞生存性を、７２時間ＭＴＴアッセイで評価した。対照抗-ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ.４-１あるいは抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.wtを用いる同様の実験は、ＣＰＴ-１１単独以上に細胞毒性を増加させないことを示した。これらの実験では、１x１０６(１.２ mg)ＳＫＷ細胞あたり、融合タンパク質ＢＴＣ活性の約０.８ユニットを示した。
【０１５４】
２００mg/m2 ＣＰＴ-１１による処置患者において、ＣＰＴ-１１の血漿濃度は少なくとも２４時間０.１μＭ以上のままであった(Ducreux et al., Ann Oncol 14 Suppl 2: 1117-23 (2003))。ＣＰＴ-１１を５００mg/m２までの単剤として投与し、血漿ピーク濃度は用量比例である(Mathijssen et al. Clin Cancer Res 7: 2182-94 (2001); Ducreux et al., 上掲,2003)。これらの知見は、患者において医薬的に適切かつ時間中保持されるＣＰＴ-１１の濃度で、イン・ビトロの抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４-１による腫瘍細胞の標的化した死滅を示すものである。
【０１５５】
実施例ＶＩＩＩ
ＣＰＴ-１１の改善された活性化に対するブチリルコリンエステラーゼの最適化
この実施例は、とりわけ４-１変異体と示される、Ｈ７７Ｆ、Ｆ２２７Ａ、Ｐ２８５Ｎ、Ｖ３３１Ａ変異体(配列番号：１８０)の単離を結果として与える、野生型ＢＣｈＥ(図１２)よりもＣＰＴ-１１加水分解において＞３０００倍の増加、およびＫｍにおいて５-６倍、すなわち４０μＭ〜７μＭの改善を示す様々なライブラリー領域からの有益な変異を組み込んでいるさらなる変異体の同一性を示す。
【０１５６】
酵素の活性部位の溝が一列にならんでいると推定されるアミノ酸に対応する一連の焦点とされるＢＣｈＥ変異体ライブラリーを合成した(Harel et al., 上掲, 1992)。６-１５残基の７つの異なるライブラリー領域について１つのアミノ酸変異をコードしているオリゴヌクレオチドのプールを用いて、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発のためのテンプレートとしてウラシルを含有する１本鎖ＤＮＡを用いてライブラリーを合成した(Glaser et al., 上掲,1992)。遺伝子導入したライブラリーを、寒天上に播種し、細菌クローンを採取し、ＤＮＡプラスミド調製物に対して９６ウェル形態で増殖させた。
【０１５７】
ＢＣｈＥプラスミド変異体を、ヒト胚腎細胞系２９３Ｔにおいて一過的に発現させ、トランスフェクション７２時間後の活性についてアッセイした。変異体の一次スクリーニングを、ＳＷ４８大腸癌細胞毒性アッセイにおいてＣＰＴ-１１の酵素的活性化の間接測定によって行った(図２)。この系における酵素発現は、ウェル間で２０％以下を変える。発現変異体の同定を避けるために、＞２倍の細胞毒性の増加を示すヒットのみを採取した。これらのアッセイにおいて同定された機能的標的を、元々の調整物からの対応するＤＮＡからの配列分析によって特徴分析した。一次スクリーニングにより、酵素の２５個の異なる位置で６５個の有益なアミノ酸変化の同一性を得た。ＢＣｈＥ−媒介ＣＰＴ-１１加水分解の直接測定を、逆相ＨＰＬＣによって分離したＳＮ-３８の蛍光検出によって定量した(Dodds and Rivory, Mol Pharmacol 56: 1346-53 (1999)。この方法を用いて、野生型酵素のものに発現した変異体によってＳＮ３８形成を比較し、ＣＰＴ-１１に対する変異体のＫｍを計算した。様々なライブラリー領域から有効な変異を導入している添加変異体の同定により、野生型ＢＣｈＥ(図１２)を越えるＣＰＴ-１１加水分解において＞３０００倍の増加およびＣＰＴ-１１に対するＫｍにおいて５-６倍すなわち４０μＭ〜７μＭの改善を示す変異体の単離物を生じた(図１３)。図１３は、ＢＣｈＥ変異体４-１によってＣＰＴ-１１加水分解のHofstee plotを示す。酵素を、２４時間３７℃で、１-８０μＭの濃度範囲にわたってＣＰＴ-１１とインキュベートした。該変異体は、６.９μＭのＫｍ、すなわち本来の血清ＢＣｈＥに関する特徴的な４０μＭのＫｍを越える＞５倍の改善を示した。速度(ｖ)は、５４０nmでの光の吸収単位である。基質濃度[ｓ]はμＭＣＰＴ-１１である。
【０１５８】
ＢＣｈＥ変異体４-１によりＳＮ３８形成の定量のために、野生型(２０μg)またはＢＣｈＥ.４-１(０.０５ μg)の酵素を、ＣＰＴ-１１と２４時間３７℃でインキュベートした。試料を酸性化し、不活性ＣＰＴ-１１からＳＮ-３８を分離するためにNovaPak C18 columnで逆相ＨＰＬＣにより分離した。曲線(ＡＵＣ)でのＳＮ３８ピークエリアを用いて、野生型の酵素によるＣＰＴ-１１活性化を至適化ＢＣｈＥ.４−１変異体と比較した。
【０１５９】
本出願を通して、種々の刊行物が参照された。これらの各刊行物の開示は、本発明が関連する技術の状態をより十分に示すために、それら全てを、出典明示により本明細書の一部とする。
【０１６０】
本発明は、開示された態様を参照して記載されてきたが、当業者は、詳細に述べられた特定の実施形態が、本発明の例示に過ぎないことを容易に認識するであろう。本発明の意図から逸脱することなく、種々の改変がなされることは理解されるべきである。従って、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、高いカルボキシルエステラーゼ活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を示す代表的なｏ-ニトロフェニルアセテートアッセイを示す。
【図２】図２は、ＣＰＴ-１１およびＳＮ-３８の化学構造およびカルボキシルエステラーゼ活性によるＣＰＴ-１１のＳＮ-３８への変換を示す。
【図３】図３は、ＳＮ-３８の形成についての高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを示す。図３は、偽トランスフェクションした細胞由来の馴化培地（conditioned medium）を示す。該馴化培地は、ＣＰＴ-１１に暴露され、ＨＰＬＣによってＳＮ-３８の形成について分析された。
【図４】図４は、Ｆ２２７Ａ変異体を用いて遺伝子導入された細胞からの馴化培地を用いるＳＮ-３８の形成についての高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを示す。該馴化培地は、ＣＰＴ-１１に暴露され、ＨＰＬＣによってＳＮ-３８の形成について分析された。該ＣＰＴ-１１および該ＳＮ-３８ピークは標識される。
【図５】図５は、Ｆ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｓ変異体を用いて遺伝子導入された細胞由来の馴化培地を用いて、ＳＮ-３８の形成についての高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを示す。該馴化培地は、ＣＰＴ-１１に暴露され、ＳＮ-３８の形成についてＨＰＬＣにより分析された。該ＣＰＴ-１１および該ＳＮ-３８ピークは標識される。
【図６】図６は、ＭＴＴ細胞毒性アッセイの結果を示す。ＣＰＴ-１１は、ＣＰＴ-１１を活性化するために野生型ブチリルコリンエステラーゼ、６−６変異体、またはＦ２２７Ａ／Ｌ２８６Ｑ変異体と共にインキュベートされる。活性化されたＣＰＴ-１１に暴露された場合に死滅したＳＷ３８大腸癌細胞の割合は示され、そしてブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ変異体と共にインキュベートされなかったＣＰＴ-１１(「偽」と示された列)と比較される。
【図７】図７は、発現した抗-ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ Ｌ５３０と抗κ捕捉抗体との結合を示し、そしてブチリルチオコリン加水分解により、結合したブチリルコリンエステラーゼの活性を測定するＥＬＩＳＡアッセイ示す。
【図８】図８は、ＥＧＦＲ抗原を含有する細胞膜調製物に特異的に結合する抗-ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ Ｌ５３０のブチリルコリンエステラーゼの酵素活性を測定するＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図９】図９は、マウス抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域(配列番号：１７および１８)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【０１６２】
【図１０】図１０は、Ｌ５３０(配列番号：１９および２０)のマウス抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域および重鎖定常領域のヒンジ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒト・ブチリルコリンエステラーゼ(配列番号：２１および２２)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。Ｆ２２７、Ｔ２８４、Ｌ２８６およびＳ２８７の位置は、太字と下線にする。
【図１２】図１２は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体４−１によるＳＮ３８変換の量を記載した表を示す。
【図１３】図１３は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体４−１により、ＣＰＴ-１１の加水分解に関するＨofstee plotを示す。
【図１４】図１４は、抗体-ブチリルコリンエステラーゼ融合タンパク質と固定化ＳＫＷ腫瘍細胞との結合を示す。
【図１５】図１５は、抗ＣＤ２０-ブチリルコリンエステラーゼ融合タンパク質のＳＫＷ腫瘍細胞に対する標的化された細胞毒性を示す。
【図１６】図１６は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ａ(配列番号：２)の構造的および機能的特徴を記載した表を示す。
【図１７】図１７は、配列番号：２４〜１７６で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の構造的および機能的特徴を記載した表を示しており、この全てのものは、２つのアミノ酸変更のうちの１つとしてＦ２２７Ａの変更を包含する二重変異体である。
【図１８】図１８は、配列番号：１７８〜１９６で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の構造的および機能的特徴を記載した表を示しており、この全てのものはアミノ酸変更のうちの１つとしてＦ２２７Ａの変更を包含する。
【図１９】図１９は、アミノ酸配列(配列番号：２０２)および抗ＣＤ２０ＶＨ−ＣＨ１ヒンジ cys Ｌ５３０ ＢＣｈＥ.４−１重鎖構築体の対応するヌクレオチド配列(配列番号：２０１)を示す。これは、システイン含有ヒンジ領域を有する該抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域および配列番号：１８０で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体のＬ５３０フラグメント(配列番号：２０４)を含む融合タンパク質の重鎖であり、これは４−１変異体アミノ酸(Ｈ７７Ｆ／Ｆ２２７Ａ／Ｐ２８５Ｎ／Ｖ３３１Ａ)に組み込まれる。
【図２０】図２０は、アミノ酸配列(配列番号：１９８)および抗ＣＤ２０軽鎖の対応するヌクレオチド配列(配列番号：１９７)を示す。
【図１】
2006508665.tif 000005
【図２】
2006508665.tif 000006
【図３】
2006508665.tif 000007
【図４】
2006508665.tif 000008
【図５】
2006508665.tif 000009
【図６】
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【図７】
2006508665.tif 000011
【図８】
2006508665.tif 000012
【図９−１】
2006508665.tif 000013
【図９−２】
2006508665.tif 000014
【図１０−１】
2006508665.tif 000015
【図１０−２】
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【図１０−３】
2006508665.tif 000017
【図１０−４】
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【図１１】
2006508665.tif 000019
【図１１−２】
2006508665.tif 000020
【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
2006508665.tif 000029
【図１８−１】
2006508665.tif 000030
【図１８−２】
2006508665.tif 000031
【図１９】
2006508665.tif 000032
【図１９−２】
2006508665.tif 000033
【図１９−３】
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【図２０】
2006508665.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月24日(2005.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006508665000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月26日(2005.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
近年、体内で活性化され、癌細胞に対して毒性である代謝産物を生成する化学療法剤の一群が発見された。これらの化学療法剤は、時に、それらが体内で活性な医薬物に変換されるので「プロドラッグ」と呼ばれる。かかる化学療法剤は、パクリタキセルプロドラッグおよびカンプトテシン(ＣＰＴ-１１)を包含する。これらの医薬品は、内生カルボキシルエステラーゼ、例えば、ブチリルコリンエステラーゼによって代謝され、活性な医薬物、例えば、パクリタキセルおよびＳＮ-３８の各々を産生する。これらの化学療法剤はイン・ビトロで良好な抗腫瘍活性を有するが、不幸にもこれらの薬剤を用いた患者において、いくつかの副作用、例えば下痢、脱毛、悪心、嘔吐およびコリン作動性症状が報告された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼと比べて、１つのアミノ酸改変に加えて複数のアミノ酸改変を有し得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の具体的な例は、位置２２７のアミノ酸のアラニンを有するブチリルコリンエステラーゼであり、そのアミノ酸配列およびコードしている核酸配列は、各々配列番号：２および１として表される。別の例は、位置７７のアミノ酸のフェニルアラニン、位置２２７のアミノ酸のアラニン、位置２８５のアミノ酸のアルパラギン、位置３３１のアミノ酸のアラニンを有しているブチリルコリンエステラーゼ変異体であり、そのアミノ酸配列およびコードしている核酸配列は、各々配列番号：１８０および１７９として表され、該変異体はブチリルコリンエステラーゼに比べて、カンプトテシン誘導体ＣＰＴ-１１をトポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ-３８に変換する能力が、少なくとも３０００倍高いことを示す。また、該用語は、実質的にブチリルコリンエステラーゼと同一のアミノ酸配列を有し、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する能力を示す限り、例えば、天然アミノ酸の修飾形態、例えば、Ｄ−立体異性体、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログおよび擬体を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体を包含すると意図される。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する能力に重要であると決定されるか推定される領域外側の１以上アミノ酸改変を有し得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、カンプトテシン誘導体をトポイソメラーゼ阻害剤活性に変換するその能力を大きく変更しない１以上の付加修飾を有し得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて高い安定性を有し得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の核酸分子は、本発明の参照核酸分子またはそれらのフラグメントと実質的に同一である核酸配列を包含し、中程度のストリンジェントな条件、または高ストリンジェントな条件下で、核酸分子が目的とする核酸分子と選択的にハイブリダイズするその能力を保持する限り、参照配列に関して１以上の付加、削除または置換を有する配列を包含すると意図される。中程度のストリンジェントな条件は、４２℃、５０％ホルムアミド、５×Denhardt's 溶液、５×ＳＳＰＥ、０.２％ ＳＤＳにおいてフィルターに結合した核酸のハイブリダイゼーション、次いで５０℃、０.２×ＳＳＰＥ、０.２％ＳＤＳによる洗浄に相当するハイブリダイゼーション条件を包含すると意図される。ここで用いたように、高ストリンジェントな条件は、４２℃、５０％ホルムアミド、５×Denhardt's 溶液、５×ＳＳＰＥ、０.２％ ＳＤＳにおけるフィルターに結合した核酸のハイブリダイゼーション、次いで６５℃、０.２×ＳＳＰＥ、０.２％ＳＤＳにより洗浄することに相当する条件である。他の適当な中程度のストリンジェントおよび高ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者にはよく知られており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992) and in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons、Baltimore、MD (1998)に記載されている。すなわち、２つの核酸が、実質的に相補的であるように配列同一性を示すことが必要なのではなく、特異的にハイブリダイズし得るか、または他の類似の配列と検出し得る交差反応性を示さずに特異的にハイブリダイズするように作製されることが必要である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明は、抗体または抗体フラグメントを含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体またはそれらの機能フラグメントをさらに提供する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、あらゆる抗体または抗体フラグメントと融合され得る。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、腫瘍関連抗原に結合する抗体または抗体フラグメントに融合され得る。この方法において、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、腫瘍に直接送達され、その結果副作用の数が少なくなり得る。いくつかの抗原は、腫瘍細胞において過剰発現されるか、腫瘍細胞においてもっぱら発現されることが知られている。これらの腫瘍関連抗原には、例えば、Lewis Y (Siegall, C, Semin. Cancer Biol. 6:289-295 (1995))、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)(Watine et al., Dis. Colon Rectum 44:1791-1799 (2001))、テトラスパニンＬ６(Kaneko et al., Am. J. Gastroenterol. 96:3457-3458 (2001))、１７-ｌＡ(Indar et al., J.R. Coll. Surg. Edinb. 47:458-474 (2002))、ムチン-１(ＭＵＣ−１)(Segal-Eiras and Croce, Allerg. Immunopath. 25:176-181 (1997))、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)(Bookman, M., Semin. Oncol. 25:381-396 (1998))、癌抗原１２５(ＣＡ １２５)(Cherry and Vacchiano、Semin. Oncol. Nurs. 18:167-173 (2002))、p９７(Srivastava, P., Curr. Opin. Immunol. 3:654-658 (1991))、黒色腫抗原遺伝子(ＭＡＧＥ) (Barker and Salehi, J. Neurosci. Res. 67:705-712 (2002))、ＣＤ２０ (Kosmas et al., Leukemia 16:2004-2015 (2002))、ＣＤ３３(Countouriotis et al.,Stem Cells 20:215-229 (2002))、ガングリオシドＧＤ２(Ragupathi, G., Cancer Immunol. Immunother. 43:152-157 (1996))およびガングリオシドＧＤ３(Ragupathi, G., 上掲 (1996))が包含される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
別の実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントがＣＤ２０に特異的に結合する場合のブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。ＣＤ２０はＢ−細胞表面上の非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０抗体複合体は内在化されないので、そのため細胞表面結合イムノグロブリンを、長時間、エフェクター細胞または補体と相互作用させるようにする。一つの実施態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメントが配列番号：１９８に示したようなアミノ酸配列を含有し、ＣＤ２０を特異的に結合するブチリルコリンエステラーゼ変異体を提供する。ＣＤ２０は、いくつかの腫瘍細胞型、例えばＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫、さらに様々な自己免疫症状においてアップレギュレーションされることが知られている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体および抗体または抗体フラグメントとの融合は、抗体特異的酵素プロドラッグ治療方法(ＡＤＥＰＴ)と呼ばれる方法を用いて、標的とした腫瘍細胞特異的ブチリルコリンエステラーゼを媒介する毒性について使用され得る(Jung, M., Mini Rev. Med. Chem. 1:399-407 (2001); Bagshawe, K.D., Mol. Med. Today 1:424-431 (1995); and Senter、P.D., FASEB J 4:188-193 (1990))。関連方法といわれる、いわゆるウイルス特異的酵素プロドラッグ治療(ＶＤＥＰＴ)も使用されうる。標的化腫瘍細胞特異的ブチリルコリンエステラーゼ媒介毒性について使用されうる、ブチリルコリンエステラーゼ変異と抗体または抗体フラグメントとの融合の例は、配列番号：２００に表されるアミノ酸配列および配列番号：１９９として示される対応するヌクレオチド配列として記載されており、これは抗ＣＤ２０ＶＨ−ＣＨ１ヒンジ cys Ｌ５３０ ＢＣｈＥ.４-１重鎖構築体に対応する。配列番号：２０２で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体は、システイン含有ヒンジ領域を有する抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域を含む重鎖、および配列番号：１８０で表されるブチリルコリンエステラーゼ変異体のＬ５３０機能フラグメント（配列番号：２０１)を含有する融合タンパク質であり、これは４−１変異体アミノ酸（Ｈ７７Ｆ／Ｆ２２７Ａ／Ｐ２８５Ｎ／Ｖ３３１Ａ)に組みこまれる。ＶＤＥＰＴは、酵素、例えば本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体、を送達するためのウイルスベクターを使用する。かかるアプローチにより、酵素の選択的発現は、腫瘍細胞中の非毒性または中程度の毒性プロドラッグを高い毒性代謝産物へ効率的に活性化して、増強された抗腫瘍活性および改善された治療上指標を生じ得る。これらのアプローチが成功するためには高い活性の酵素が必要であり、例えば本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体が使用され得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸の本発明のライブラリーは、様々な真核細胞で発現され得る。例えば、核酸は、哺乳類細胞、完全な細胞、植物細胞および非酵母真菌細胞で発現され得る。ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸の本発明のライブラリーを発現するための有用な哺乳類細胞系は、例えば、Chinese Hamster Ovary(ＣＨＯ)、ヒト２９３ＴおよびヒトＮＩＨ３Ｔ３細胞系を包含する。ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードしている核酸の本発明のライブラリーの発現は、安定な、または一過的な細胞トランスフェクションの双方によって達成され得る(実施例ＩＩＩ、表３を参照されたい)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
哺乳類細胞系中のブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーの発現の後、ランダムに選択されたクローンは、配列決定され、高い触媒活性についてスクリーンされる。選択されたクローンを配列決定するための方法は、当分野では既知であり、例えば、Sambrook et al., 上掲, 1992 and in Ausubel et al., 上掲, 1998である。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性を測定するための適切な方法を選択することは、利用し得る多様なファクター、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の量に依存する。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のカンプトテシン変換または加水分解活性は、例えば分光光度計により、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を均等に捕捉するポリクローナル抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を利用するマイクロタイターを基にしたアッセイにより、また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定され得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、ＣＰＴ-１１をトポイソメラーゼ阻害剤に変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、２００または２０１、またはそれらの機能フラグメントから選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法も提供する。一つの実施態様において、トポイソメラーゼ阻害剤はＳＮ-３８である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼに比べて、パクリタキセルプロドラッグをパクリタキセルに変換する高い能力を示す、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、２００または２０１、またはそれらの機能フラグメントから選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を個体に投与することによって、癌を処置する方法をさらに提供する。一つの実施態様において、該癌は転移性結腸直腸癌である。別の実施態様において、該癌は卵巣癌である。別の実施態様において、該癌は乳癌である。別の実施態様において、該癌は肺癌である。さらに別の実施態様において、該癌はカポジ肉腫である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
パクリタキセルおよびカンプトテシン誘導体は、多様な癌に対する有効な化学療法剤であると知られている。例えば、ＣＰＴ-１１は、大腸癌の処置についてＦＤＡに認可されている。ＣＰＴ-１１をＳＮ-３８に加水分解する際の改善は、この医薬品の有用性の助けとなり、患者の副作用を低下させる。例えば、ＣＰＴ-１１処置の副作用には、下痢、脱毛、悪心、嘔吐、骨髄抑制、高血糖、脱毛症およびコリン作動性症状(Moertel et al., Cancer Chemor. 56:95-101 (1972); Muggia et al.、Ca. Chemother. Rep. 56:515-521 (1972))が包含される。大腸癌に加えて、これらの医薬物は、多様な他の癌で試験される(Hare et al., Cnacer Chemother. Pharmacol. 39:187-191(1997)、出典明示により本明細書の一部とする)。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
本発明は、治療上有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を投与することにより個体における癌を処置する方法を提供する。治療上有効量のブチリルコリンエステラーゼ変異体を投与することにより個体における癌を処置する方法は、抗体または抗体フラグメント、例えばＣＤ２０(配列番号：１９８)やＥＧＦ(配列番号：１８および２０)、本明細書に記載の抗体および対応するフラグメントをさらに含有する変異体の投与であり得ると考えられる。有効であるために必要とされるブチリルコリンエステラーゼ変異体の用量は、例えば、投与経路および形態、投与される分子の効能および生物活性の半減期、個体の体重および健康状態、以前または現在の治療に依存する。該方法の特定の適用について有効な用量であると考えられる適切な量は、本明細書中で提供される技術とガイダンスを用いて、当業者により決定され得る。例えば、この量は、本明細書中に記載のイン・ビトロまたはイン・ビボのブチリルコリンエステラーゼアッセイから推断され得る。当業者は、個体の健康状態が処置の推移を通して追跡される必要があること、その投与される組成物の量が調整され得ることは認識されるであろう。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
二重突然変異を含有するブチリルコリンエステラーゼ変異体を、２９３Ｔヒト未発達腎細胞を用いて一過的な系で発現した。簡潔に説明すると、１日目、２９３Ｔ細胞を、１.５ｘ１０５ 細胞/ウェルでBioCoat２４ウェルプレートに播種した。次いで該細胞を、一晩回復させた。２日目、２μlのLipofectamine 2000/ウェルを５０μl Opti-MEM/ウェルに希釈し、５分間インキュベートした。希釈した５００ng-１μgのＤＮＡ/ウェルを５０μl Opti-MEM/ウェルに希釈した。２つの希釈溶液を混合し、２０分間、室温でインキュベートした。培地を細胞から除去して、ペニシリンまたはストレプトマイシンを含まない５００μl/ウェルの完全な増殖培地に置き換えた。続いて、希釈溶液（１００μl）を、各ウェルに添加し、細胞を４時間インキュベートした。この培地/ＤＮＡ/Lipofectamine 2000を細胞から除去し、Ultraculture 血清不含培地(Bio Whittaker)/ウェル（１ml）で置き換えた。ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドを、４８-９６時間蓄積させて、細胞からの該馴化培地を直接用いた。他の適用のために、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドを、下記実施例ＶＩのとおりに精製し得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
捕捉されたブチリルコリンエステラーゼのカルボキシルエステラーゼ活性を、ｏ-ニトロフェニル酢酸塩により決定するためのプロトコール：
１）９６ウェルImmulonの２つのプレートを、１０mg/ml ウサギ抗ヒト・ブチリルコリンエステラーゼ(Dako #A0032)のＰＢＳ溶液(１００ μl/ウェル)で、終夜４℃で被覆する。
２）被覆溶液を除去し、プレートを３％ＢＳＡのＰＢＳ(２５０ μl/ウェル)によって、２時間室温でブロックする。
３）ブチリルコリンエステラーゼ変異体馴化培地（２００ μl）を添加し、室温で２時間インキュベートする。
４）プレートを３回、ＰＢＳ（２５０ μml/ウェル）で洗浄する。
５）０.１Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７.０、８５ μl/ウェル）を添加する。
６）ｏ−ＮＰＡ（１３.６ mg）をアセトニトリル（１００ ml）に添加し、混合し、溶解させた。このストック（１００ ml）を水(６.３ ml）に添加し、よく混合する。
７）プレートをＰＢＳで３回洗浄する。
８）希釈したｏ−ＮＰＡ基質（１５ μl）を添加する。
９）４０５nmでの吸収を読み取る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
発現した抗-ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ Ｌ５３０の抗-κ捕捉抗体に結合すること、ブチリルチオコリン加水分解物によりブチリルコリンエステラーゼの結合活性を測定することを示すＥＬＩＳＡアッセイを、図７に示した。これは、ブチリルコリンエステラーゼ活性を示す完全融合ポリペプチド(抗体軽鎖を通じて結合する)を示す。
抗-ＥＧＦＲ-Ｌ５３０の抗-κ捕捉のプロトコールは下記である：
１）９６ウェルImmulonの２つのプレートを、１０mg/ml抗-ヒトκ抗体のＰＢＳ溶液（２００ μl）で一晩被覆する。
２）プレートを３％ＢＳＡのＰＢＳ(２５０ μl/ウェル)溶液を用いて２時間室温でブロックする。
３）プレートを２５０μl/ウェルのＰＢＳで３回洗浄する。
４）ＢＣｈＥ馴化培地（２００ μl）を添加し、室温で２時間インキュベートする。
５）５ｍＭ ＤＴＮＢの保存溶液を０.１Ｍ カリウムリン酸緩衝液ｐＨ７.０で１：１０の希釈物を作り、ＤＴＮＢの作業溶液を調製する。１８０ μl/ウェルに添加する。
６）２００ｍＭの保存溶液を水で１：２０に希釈することによってブチリルチオコリン（ＢＴＣ）の作業溶液を調製する。２０ μl/ウェルを添加する。
７）プレートを３７℃でインキュベートし、分光分析器でのＡ４０５nmを測定する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
ＥＧＦＲ抗原を含有する細胞膜調製物に特異的に結合する抗ＥＧＦＲ−ＢＣｈＥ Ｌ５３０のブチリルコリンエステラーゼ活性を測定するＥＬＩＳＡアッセイを、図８に示した。これらの結果は、ブチリルコリンエステラーゼドメインの抗体ドメインおよび酵素活性により融合タンパク質の抗原特異的結合を示す。
Ａ４３１膜調製物に結合する抗ＥＧＦＲについてのプロトコールは次のとおりである：
１）９６ウェルImmulonの２つのプレートを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、０.１％ Triton Ｘ-１００中に１／２０希釈したＡ４３１細胞分解物（５０ μl/ウェル）を被覆し、終夜フード内で乾燥させた。
２）プレートを３％ＢＳＡのＰＢＳ(２５０ μl/ウェル)溶液で、２時間室温でブロックした。
３）プレートを３回２５０ μl/ウェルＰＢＳで洗浄した。
４）ＢＣｈＥ馴化培地（２００ μl）を添加し、室温で２時間インキュベートした。
５）保存溶液５ｍＭ ＤＴＮＢを、０.１Ｍ カリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に１：１０に希釈して、ＤＴＮＢの作業溶液を調製した。ウェルあたり１８０ μl添加した。
６）２００ｍＭの保存溶液を水で１：２０に希釈して、ブチリルチオコリン(ＢＴＣ) の作業溶液を調製した。ウェルあたり２０ μl添加した。
７）プレートを３７℃でインキュベートし、分光分析器でＡ４０５nmを読み取った。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
ブチリルコリンエステラーゼ変異体を精製するために、各変異体に対応する培養液をブフナー漏斗でWhatman #1 濾紙(Whatman Inc., Clifton, NJ)を通して濾過した。該濾液をアフィニティーゲルプロカインアミドSepharose 4B（１００ml）で充填したクロマトグラフィーカラムから流した(XK50/30, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)。該ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、重層中のアフィニティーゲル内に吸着し、その前の２０Ｌ中に存在した酵素（２０mg）を、アフィニティーゲル（１００ml）中で濃縮される。続いて、該アフィニティーゲルを、２０ｍＭ リン酸カリウム(ｐＨ７.０)および１ｍＭ ＥＤＴＡ中の０.３Ｍ 塩化ナトリウムで連続的に洗浄し、含有タンパク質を溶出する。次ぎに、該アフィニティーゲルを２０ｍＭリン酸カリウムおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ ７.０)を含有する緩衝液で洗浄し、イオン強度を低下させた。最後に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を、０.２Ｍプロカインアミドの緩衝液（２５０ ml）で溶出した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
ＣＤ２０は、ヒトＢリンパ腫系(３.２ x １０５分子/細胞)で充分に発現した抗原としてＡＤＥＰＴにおいて至適化ＢＣｈＥを用いる可能性を試験するのに有用な標的抗原であり、抗体結合に対して顕著な内在化をうけない。ＡＭＥ１３３は、図２０に示される完全なヒト生殖細胞系フレームワーク領域を有するヒト化抗ＣＤ２０であり、配列番号：１９８として示され、また対応する核酸配列の配列番号：１９７として示される。この抗体は、Applied Molecular Evolution社において、該会社の製造指針に基づいて製造され、この一価のＦａｂは、非常に高い親和性(１ｘ１０−９ Ｍ)によってＣＤ２０に結合する。例示的モデルの融合タンパク質(抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４-１)を生成し、図１９に示す。抗ＣＤ２０-ＢＣｈＥ.４-１(配列番号：２００)を、ＣＨ１重鎖ドメインのＣ末端で、参照配列番号：１８０の機能フラグメントである修飾されたＢＣｈＥ変異体Ｌ５３０(配列番号：２０１)のＮ末端に融合したＡＭＥ１３３ Ｆａｂを含む。該ＢＣｈＥ変異体を、アミノ酸５３０で短縮し、テトラマーへのその通常の会合を排除した。酵素のモノマー体は、Blong et al., Biochem J 327 (Pt 3):747-57 (1997)に記載されるようにアロステリック効果による活性の損失なく、天然テトラマー形態の各サブユニットと等しい活性を示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
【図１０】図１０は、Ｌ５３０(配列番号：１９および２０)のマウス抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域および重鎖定常領域のヒンジ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒト・ブチリルコリンエステラーゼ(配列番号：２１および２２)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。Ｆ２２７、Ｔ２８４、Ｌ２８６およびＳ２８７の位置は、太字と下線にする。
【図１２】図１２は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体４−１によるＳＮ３８変換の量を記載した表を示す。
【図１３】図１３は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体４−１により、ＣＰＴ-１１の加水分解に関するＨofstee plotを示す。
【図１４】図１４は、抗体-ブチリルコリンエステラーゼ融合タンパク質と固定化ＳＫＷ腫瘍細胞との結合を示す。
【図１５】図１５は、抗ＣＤ２０-ブチリルコリンエステラーゼ融合タンパク質のＳＫＷ腫瘍細胞に対する標的化された細胞毒性を示す。
【図１６】図１６は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ａ(配列番号：２)の構造的および機能的特徴を記載した表を示す。
【図１７】図１７は、配列番号：２４〜１７６で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の構造的および機能的特徴を記載した表を示しており、この全てのものは、２つのアミノ酸変更のうちの１つとしてＦ２２７Ａの変更を包含する二重変異体である。
【図１８】図１８は、配列番号：１７８〜１９６で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の構造的および機能的特徴を記載した表を示しており、この全てのものはアミノ酸変更のうちの１つとしてＦ２２７Ａの変更を包含する。
【図１９】図１９は、アミノ酸配列(配列番号：２００)および抗ＣＤ２０ＶＨ−ＣＨ１ヒンジ cys Ｌ５３０ ＢＣｈＥ.４−１重鎖構築体の対応するヌクレオチド配列(配列番号：１９９)を示す。これは、システイン含有ヒンジ領域を有する該抗ＣＤ２０抗体重鎖可変領域および配列番号：１８０で表されたブチリルコリンエステラーゼ変異体のＬ５３０フラグメント(配列番号：２０１)を含む融合タンパク質の重鎖であり、これは４−１変異体アミノ酸(Ｈ７７Ｆ／Ｆ２２７Ａ／Ｐ２８５Ｎ／Ｖ３３１Ａ)に組み込まれる。
【図２０】図２０は、アミノ酸配列(配列番号：１９８)および抗ＣＤ２０軽鎖の対応するヌクレオチド配列(配列番号：１９７)を示す。
【国際調査報告】
2006508665.tif 000036
2006508665.tif 000037