(57)【要約】本発明は、黒色腫および他の腫瘍における候補腫瘍抗原となる、天然の状態でプロセシングされた新しい抗原ペプチドを提供する。この抗原ペプチドは、ヒトMHCクラスII HLA-DR分子によって提示される。またこの抗原ペプチドは、翻訳因子eIF-4A、IFN-ガンマ誘導性タンパク質p78、細胞骨格タンパク質ビメンチン、および鉄結合表面タンパク質メラノトランスフェリンに由来する。本発明の抗原ペプチドは、個々の腫瘍の診断におけるマーカーとして、また治療における抗腫瘍ワクチンとして使用することができる。
2006518982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO：1〜13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたMHCクラスII抗原ペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、結合能力を維持しながらカルボキシ末端またはアミノ末端にアミノ酸の欠失を有する、請求項1記載の抗原ペプチド。
【請求項３】
ペプチド配列が、ペプチドとMHCクラスII分子の結合を促進する少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、請求項1または2のいずれか一項記載の抗原ペプチド。
【請求項４】
MHCクラスII分子と結合する、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗原ペプチド。
【請求項５】
請求項1〜3のいずれか一項記載の抗原ペプチドと反応する抗体。
【請求項６】
請求項1〜4のいずれか一項記載のペプチドまたはポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
発現ベクターに使用可能に連結された、請求項6記載の核酸分子を含む、組換え核酸構築物。
【請求項８】
請求項7記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項９】
対象ペプチドを発現可能とする条件で請求項8記載の宿主細胞を培養する段階、およびペプチドを細胞または培地から回収する段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のMHCクラスII抗原ペプチドの作製法。
【請求項１０】
請求項1〜4のいずれか一項記載の抗原ペプチド、および許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む薬学的組成物。
【請求項１１】
疾患（好ましくは癌）の診断、予防、および治療に使用される、請求項1〜4のいずれか一項記載の単離された抗原ペプチド。
【請求項１２】
請求項1〜3のいずれか一項記載のMHCクラスII抗原ペプチドの、癌の診断マーカーとしての使用。
【請求項１３】
MHCクラスII抗原ペプチドが黒色腫の診断マーカーである、請求項12記載の使用。
【請求項１４】
SEQ ID NO：12および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドの、肺癌の診断マーカーとしての使用。
【請求項１５】
SEQ ID NO：22のポリペプチドの、肺癌の診断マーカーとしての使用。
【請求項１６】
哺乳類における防御抗体または免疫細胞の産生を刺激するための薬剤の製造用の、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗原ペプチドの使用。
【請求項１７】
防御抗体または免疫陽性のCD4+ T細胞の産生を刺激することで黒色腫を予防または治療するための薬剤の製造用の、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗原ペプチドの使用。
【請求項１８】
防御抗体または免疫陽性のCD4+ T細胞の産生を刺激することで肺癌を予防または治療するための薬剤の製造用の、SEQ ID NO：12および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトMHCクラスII HLA-DR分子と結合する新しい腫瘍抗原ペプチドの同定に関する。本発明は、腫瘍細胞との会合後における、このような腫瘍抗原ペプチドの樹状細胞による提示に関する。さらに本発明は、腫瘍に対するワクチン接種のための、ならびに腫瘍に対する免疫応答の診断のための、このような腫瘍抗原ペプチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は、腫瘍特異的タンパク質の発現によって健康な細胞と区別することができる。腫瘍において新たに発現された、変異を生じた、または発現に異常を来した、これらのタンパク質は、診断マーカーとして、または治療のために使用することができる。
【０００３】
診断および治療の両方のツールとなるマーカーの強力なクラスは、主要組織適合性複合体（MHC）の分子と結合するタンパク質断片またはペプチドである。ヒトにおいては、MHC分子は、ヒト白血球抗原（HLA）と呼ばれる。HLA結合ペプチドは短く、9〜25アミノ酸の長さである（Kropshofer, H. & Vogt, A. B., Immunol Today 18 (1997) 77-82）。HLA結合ペプチドは、Tリンパ球（T細胞と略）と呼ばれる特殊化した免疫細胞を活性化することから、適応免疫応答の惹起に不可欠である。腫瘍特異抗原に由来するペプチドがT細胞に認識されないことは、免疫回避および腫瘍の進行性の増殖に寄与する（Boon, T. et al., Ann Rev Immunol. 12 (1994) 337-265）。
【０００４】
機能に関してMHCペプチド複合体は2つのクラスに区別することができる（Germain, R., Cell 76 (1994) 287-299）：（i）腫瘍細胞および感染細胞を溶解するCD8+細胞傷害性T細胞を引きつけるために、ほぼ全ての有核細胞で発現可能なMHCクラスIペプチド複合体、（ii）Bリンパ球、マクロファージ、または樹状細胞（DC）などのいわゆる抗原提示細胞（APC）上でのみ構成的に発現されるMHCクラスIIペプチド複合体。特にDCは、CD4+ Tヘルパー細胞を感作する能力をもつ（Banchereau, J. & Steinman, R. M., Nature 392 (1998) 245-254）。さらにDCは、細胞傷害性CD8+ T細胞を最適に活性化することが可能である。つまりこの活性化は、DCのMHCクラスIIペプチド複合体とCD4+ Tヘルパー細胞との事前の相互作用によって達成される（Ridge, T. et al., Nature 393 (1998) 474-478）。したがって、MHCクラスII分子によってDC上に提示されるペプチドは、T細胞によってもたらされる免疫応答に関与する疾患の病的変化に、引いては腫瘍に対する免疫の誘導にも重要な役割を果たす。
【０００５】
免疫応答の開始にDCが果たす明瞭な役割によって、特に癌に対するワクチンとしてDCを活用する試みが後押しされてきた（Dallal, R. M. & Lotze, M. T., Curr Opinion Immunol 12 (2000) 583-588）。重要な進歩の1つは、末梢血、例えば接着性単球または骨髄由来CD34+幹細胞の前駆体を含むさまざまな供給源からDCをインビトロで分化させる手法の発明であった。インビトロで分化させた、また活性化させたDCは、腫瘍細胞由来抗原との同時培養後に、または類似の手法の採用によって、癌患者へのワクチン接種に使用することができる。樹状細胞の接種に関する予備試験では、臨床反応を含む特異的な抗癌反応が良好に誘導されている（Timmermann, J. M. & Levy, R., Ann Rev Medicine 50 (1999) 507-529; Nestle, F. O., et al., Nature Medicine 7 (2001) 761-765）。
【０００６】
腫瘍抗原の同定に基づくワクチンは、裸のDNA、組換えアデノウイルスまたは組換えワクシニアウイルス、個々の腫瘍細胞または腫瘍ペプチドの合成類似体から精製された天然タンパク質または組換えタンパク質によって感作されたDCを含む。遺伝子またはタンパク質の前駆体によるのではなく、抗原性腫瘍ペプチドでDCをパルス処理することの利点は、さらなるプロセシングを必要とせずにペプチドをDCのMHC分子に直接負荷することが可能なことである。
【０００７】
過去10年間に、腫瘍マーカータンパク質に由来し、かつMHCクラスI分子に拘束される数多くのペプチドが同定されている。これらは癌-精巣抗原、黒色腫-メラニン細胞分化抗原、変異抗原、および腫瘍表面で過剰に発現される非変異型共有抗原の4つのカテゴリーに分けられる。ワクチン接種に関する複数の予備臨床試験では、黒色腫患者のDCは、その時点でHLAクラスI拘束型だけの黒色腫ペプチドのカクテルでパルス処理された（Nestle, F. O. et al., Nature Medicine 4 (1998) 328-332; Thurner, B. et al., J Exp Med 190 (1999) 1669-1678）。しかしながら、腫瘍に対する細胞傷害性T細胞応答の効率および持続性を、MHCクラスII拘束性ヘルパーT細胞の動員によって延長可能なことを示す証拠は増えている。したがって、MHCクラスI抗原に加えてMHCクラスII結合腫瘍ペプチドを組み合わせて使用することでワクチン接種法が改善される可能性がある。
【０００８】
CD4+ Tヘルパー細胞に認識されるMHCクラスII拘束性癌抗原に関する知見は、クラスI拘束性抗原の同定に比べて遅れている（Wang, R.-F., Trends in Immunol 22 (2001) 269-276）。その1つの理由は、腫瘍細胞に由来するcDNAライブラリーの標的細胞へのトランスフェクションと、これに続く、適切な形質移入体および抗原エピトープを同定するための抗腫瘍T細胞の使用（MHCクラスI分子に関して良好に用いられている方法の1つ）が、コードされたタンパク質がAPCのMHCクラスII経路に移行しないために有効ではないことにある。
【０００９】
革新的な別法の1つは、腫瘍細胞または特定の腫瘍マーカータンパク質でパルス処理した自家DCを使用し、DC上のMHCと結合するペプチドの配列を決定することである。しかし、この方法は自己腫瘍に対するワクチン接種に関してのみ用いられているが、DCはインビトロで分裂しない細胞であり、末梢血または骨髄から極めて少量しか得られないため、候補腫瘍抗原の同定にはこれまで用いられていない。さらにペプチドの精製法および配列決定法は現時点で感度が非常に低いので、この方法、または人体で作られるペプチドに焦点を絞った他の任意の方法では、疾患関連ペプチドを直接同定することができない。
【００１０】
したがって、MHCクラスII拘束性腫瘍抗原ペプチドに関する知識の不足によって生じる問題は、天然の状態でプロセシングされた新規MHCクラスII結合腫瘍抗原ペプチドの候補が提供されることで解決される。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、黒色腫および他の腫瘍における候補腫瘍抗原となる、天然の状態でプロセシングされた新規抗原ペプチドを提供する。これらの抗原ペプチドは、ヒトMHCクラスII HLA-DR分子によって提示される。抗原ペプチドは、翻訳因子eIF-4A、IFN-γ誘導性タンパク質p78、細胞骨格タンパク質ビメンチン、および鉄結合表面タンパク質メラノトランスフェリンに由来する。本発明の抗原ペプチドは、個々の腫瘍の診断におけるマーカーとして、および治療における抗腫瘍ワクチンとして使用することができる。
【００１２】
MHCクラスII分子によって提示されるヒト腫瘍抗原の報告は現時点で少数しかないが、そのほぼ全てが悪性黒色腫と関連する。最初に同定された黒色腫抗原ペプチドは、メラニン細胞に特異的な酵素チロシナーゼに由来するものでHLA-DR4に拘束されるものであった（Topalian SL et al., PNAS 1994; 91, 9461-9465）。他の3種類の黒色腫エピトープはMAGEファミリーのタンパク質に由来するもので、HLA-DR11とHLA-DR13とによって提示されることがわかっている（Manici S et al., J Exp Med 1999; 189, 871-876）。MHCクラスI腫瘍抗原も含むことが知られている別のセットの黒色腫抗原には、Melan-A/MART-1（Zarour HM et al., PNAS 2000; 97, 400-405）、gp100、およびアネキシンII（Li K et al., Cancer Immunol Immunother 1998; 47, 32-38）が挙げられる。これらはいずれも、黒色腫患者に由来するCD4+ T細胞をHLA-DR4拘束的に活性化することがわかっている。
【００１３】
解糖系酵素トリオースリン酸イソメラーゼに由来するHLA-DR1拘束性ペプチド（Pieper R et al., J Exp Med 1999; 189, 757-765）、細胞周期調節因子CDC-27に由来するHLA-DR4拘束性エピトープ（Wang R-F et al., J Exp Med 1999; 183, 1131-1140）、およびLDL受容体とフコース転移酵素からなる、染色体再編成によって生じる融合タンパク質に依存する黒色腫エピトープ（Wang R-F et al., J Exp Med 1999; 189, 1659-1667）の3つのMHCクラスII結合黒色腫抗原だけが変異による。
【００１４】
「黒色腫」という用語は、黒色腫、転移性黒色腫、メラニン細胞またはメラニン細胞関連母斑細胞のいずれかに由来する黒色腫、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、上皮内黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫、浸潤性黒色腫または家族性異型母斑、および黒色腫（FAM-M）症候群を含むがこれらに限定されない。哺乳類にみられるこれらの黒色腫は、染色体異常、退行性成長、および発達障害、分裂促進剤、紫外線（UV）、ウイルス感染、遺伝子の不適切な組織発現、遺伝子発現の変化、および細胞上への提示、または発癌剤によって生じる場合がある。
【００１５】
本発明の抗原ペプチドは、MHCと結合し、またMHC分子によって提示されることで、T細胞を活性化または寛容状態にする可能性のあるペプチドである。したがって、MHCクラスII分子によって提示される抗原ペプチドは、MHCクラスII結合ペプチドまたはMHCクラスII抗原ペプチドであり、一方でMHCクラスI分子によって提示される抗原ペプチドは、MHCクラスI結合ペプチドまたはMHCクラスI抗原ペプチドである。
【００１６】
身体またはAPCのゲノムにコードされたタンパク質に由来するペプチドは、「自己ペプチド（self-peptide）」と呼ばれる。末梢リンパ器官でDCによって提示される自己ペプチドの主な機能は、自己タンパク質に対するT細胞の寛容の誘導であると考えられている。
【００１７】
細菌、ウイルス、または他の外来侵入物のゲノムにコードされるタンパク質に由来し、また自己タンパク質とは異なるペプチドは、「外来抗原」ペプチドまたは「外来」ペプチドと呼ばれる。これらは、由来する外来タンパク質に対するT細胞の応答を誘発可能である。
【００１８】
腫瘍抗原は、抗腫瘍反応性を有するT細胞を生じる、腫瘍細胞で発現されるタンパク質である。腫瘍抗原ペプチドは、このような腫瘍抗原に由来するので、腫瘍反応性を有するT細胞を活性化する能力をもつ。
【００１９】
本発明は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたMHCクラスII結合抗原ペプチドを提供する。好ましくは、このような抗原ペプチドの長さは26アミノ酸未満であり、より好ましくは11〜25アミノ酸の長さである。さらにより好ましくは、本発明の抗原ペプチドの長さは14〜18アミノ酸である。最も好ましくは、本発明の抗原ペプチドの長さは15〜17アミノ酸である。
【００２０】
MHCクラスIIと結合する本発明の新しい抗原ペプチドは、細胞骨格タンパク質ビメンチン（SEQ ID NO：1〜6）、翻訳因子eIF-4A1（SEQ ID NO：7〜9）、IFN-γ誘導性タンパク質p78（SEQ ID NO：10および11）、ならびに鉄結合表面タンパク質メラノトランスフェリン（SEQ ID NO：12および13）、およびT細胞1によって認識される黒色腫抗原（MART-1、Melan-Aタンパク質；SEQ ID NO：21）に由来する。
【００２１】
MHCクラスII分子の1つのペプチド結合溝の長さは約25Åであるが、MHCクラスI分子とは対照的に両側が開いている（Stern LJ et al., Nature 1994; 368, 215-221）。したがって、ヒトMHCクラスII分子から溶出された天然の状態でプロセシングされた抗原ペプチドは、最小の長さが約11残基であり、最大の長さは約25残基である（Chicz RM et al., J Exp Med 1993; 178, 27-47）。
【００２２】
MHCとペプチドの相互作用の安定性は、ペプチド主鎖が関与する1ダースを上回る水素結合、および結合溝の特異性ポケットと、ペプチドの適切に位置するアミノ酸側鎖との間の相補性によって決定される。個々のポケットに適合するペプチドのアミノ酸は、「アンカー」残基と呼ばれる。大半のHLA-DR対立遺伝子に関しては、このようなアンカーは、相対位置P1、P4、P6、およびP9に位置する。個々のHLA-DR対立遺伝子産物との高安定性の結合をもたらす、これらの4か所のアンカー位置におけるアミノ酸の組み合わせは対立遺伝子によって変わる。これらのペプチド結合モチーフは本明細書では、4つのアンカーアミノ酸を含む9アミノ酸の配列として定義される。本発明のMHCクラスII抗原ペプチドのペプチド結合モチーフは、SEQ ID NO：1〜4の抗原ペプチドについてはSEQ ID NO：18で、またはビメンチンに由来するSEQ ID NO：5および6の抗原ペプチドについてはSEQ ID NO：19で、またメラノトランスフェリンに由来するSEQ ID NO：12および13の抗原ペプチドについてはSEQ ID NO：20で表される。
【００２３】
追加的な結合エネルギーが、P1アンカーの前の残基とP9アンカーの後の残基が関与する水素結合によってもたらされる。この事実と呼応して、大半の天然の状態でプロセシングされたペプチドでは、ノナマーのコア領域（P1〜P9）のN末端側およびC末端側には3〜4残基が隣接している。したがって、ペプチドの大半は15〜17merである。より長いペプチドは溝から突き出すので、両末端を切断するエキソペプチダーゼの接近を可能とする。
【００２４】
本発明のさらなる態様では、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗原ペプチドには、アミノ末端またはカルボキシ末端においてアミノ酸の欠失があり、結合能力は維持している場合がある。ペプチドの相対結合能力は、標識レポーターペプチドの結合を50%減じるのに必要な濃度を決定することで測定される。この値はIC50と呼ばれる。関連するHLAクラスII分子との妥当な親和性におけるペプチド結合のIC50値は、確立された参照ペプチドのIC50の10倍を超えない。最も好ましいのは、4つのアンカーアミノ酸を含むペプチド結合モチーフからなる本発明の抗原ペプチドである。
【００２５】
ビメンチン
ビメンチンは、さまざまな良性腫瘍および悪性腫瘍のマーカータンパク質であることが知られている。melan A/MART-1、チロシナーゼ、およびS100とともにビメンチンは、黒色腫患者から採取された臨床検体中の黒色腫細胞の追跡に常用されている。興味深いことに、浸潤能が低い黒色腫クローンにおけるビメンチン発現は高いが、高浸潤性の黒色腫細胞クローンではビメンチンの発現は抑制される（Gutgemann A et al., Arch Dermatol Research 2001; 293, 283-290）。これとは対照的に、低分化型または転移性の前立腺癌ではビメンチンの発現の亢進が認められる（Lang SH et al., Prostate 2002; 52, 253-263）。さらにビメンチンは、正常腎組織に対してヒト腎細胞癌で過剰に発現されている（Stassar MJ et al. Br. J. Cancer 2001; 85, 1372-1382）。同様に、典型的なホジキンリンパ腫の95%を上回る腫瘍細胞はビメンチン陽性であるが、T細胞に富むB細胞リンパ腫はビメンチン陰性である（Rudiger T et al., Am J Surg Path 1998, 22, 1184-91）。
【００２６】
eIF-4A1
近年、翻訳開始因子の活性と悪性細胞形質転換が強く関連することが、乳癌、神経芽腫、および黒色腫を対象としたいくつかの研究で報告されている（Kerekatte V et al., Int. J. Cancer 1995; 64, 27-31）。このような知見から、翻訳関連癌遺伝子の新しい群が明らかにされている。翻訳開始因子eIF-4A1は、正常なヒトメラニン細胞に対して黒色腫細胞系列で一貫して過剰に発現されている。eIF-4A1の過剰な発現は黒色腫細胞の重要な特徴であると考えられ、またその悪性形質転換に寄与する可能性がある（Eberle J et al., Int. J. Cancer 1997; 71, 396-401）。
【００２７】
IFN誘導性p78
前立腺癌の、ホルモン依存性の状態からホルモン非依存性の状態への進行には、癌遺伝子の活性化、および/または腫瘍抑制遺伝子の不活性化によって引き起こされる遺伝的変化のカスケードが関与する。アンドロゲン非依存性の癌細胞系列で極めて過剰に発現される複数の遺伝子が同定されている。例えば、p78をコードするインターフェロン誘導性遺伝子が同定されている（Markku H et al., Lab Invest. 2000; 80, 1259-1268）。
【００２８】
メラノトランスフェリン（p97）
メラノトランスフェリンは、ヒト黒色腫と関連することが最初に判明した表面マーカーの1つである（Hellstrom et al., Int. J Cancer 1983; 31, 553-555）。上述の腫瘍マーカータンパク質ビメンチン、eIF-4A1、またはIFN誘導性p78とは対照的に、メラノトランスフェリンは、肝臓および脳の内皮細胞、汗管、および腫瘍細胞などの少数の細胞型においてのみかなりの発現がみられる（Richardson DR, Eur J Biochem 2000; 267, 1290-1298）。チロシナーゼ、MUC 18、およびMelan A/MART-1とは異なり、メラノトランスフェリンは、RT-PCRアッセイ法における遺伝子マーカーとして常用されており、また大半のヒト黒色腫で発現されることがわかっている（Slingluff et al., Curr Opin Immunol 1994; 6, 733-740）。加えてメラノトランスフェリンは、膠芽腫、星細胞腫、髄膜腫、および乏突起細胞腫で発現が上昇することが報告されている（Chi DD, et al., Am. J. Pathol. 1997; 150, 2143-2152）。またメラノトランスフェリンは、肝臓、肺、および腎臓に黒色腫が転移した患者で高頻度で見出されている。メラノトランスフェリンが、GPIアンカー表面タンパク質であるために抗体と接触可能なことは重要である。
【００２９】
T細胞によって認識される黒色腫抗原
T細胞によって認識される黒色腫抗原（Melan A；MART-1）は既知の腫瘍抗原である（Kawakami Y., Eliyahu S., Delgado C.H., Robbins P.F., Rivoltini L., Topalian S.L., Miki T., Rosenberg S.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91： 3515-3519 (1994); Coulie P.G., Brichard V., van Pel A., Woelfel T., Schneider J., Traversari C., Mattei S., de Plaen E., Lurquin C., Szikora J.-P., Renauld J.-C., Boon T., J. Exp. Med. 180: 35-42 (1994)）。
【００３０】
本発明の「単離された」ペプチドは、天然の相対物を有することのないペプチド（例えば変異型ペプチド抗原など）か、または例えば膵臓、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、筋肉、間接組織、神経組織、消化器組織などの組織中で、または血液、血清、もしくは尿などの体液中で、天然の状態では共存する成分から分離もしくは精製されたペプチドのいずれかである。典型的には、このようなペプチドは、天然の状態では結合した状態にあるタンパク質および天然有機分子を乾燥重量で少なくとも70%含まない場合に「単離された」とみなされる。好ましくは本発明のペプチドの調製物は、本発明のペプチドの少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、また最も好ましくは少なくとも99%（いずれも乾燥重量）を含む。化学的に合成されるペプチドは、その性質から、天然の状態では共存する成分から分けられるので、合成ペプチドは「単離された」と表現される。免疫原性ペプチドは、細胞性または液性の免疫応答を誘導または刺激する能力を有する抗原ペプチドを含むがこれらに限定されない。このようなペプチドは抗体と反応する場合もある。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の抗原ペプチドの類似体を提供する。「類似体」という表現は、このような抗原ペプチドの機能的側面を示す任意のペプチドを含む。同表現は、ペプチドの保存的置換または化学的誘導体も含む。
【００３２】
「類似体」という表現は、1つもしくは複数の残基が機能的に類似の残基と保存的に置換されていて、また本明細書に記載されたペプチドの機能的側面を示す、本明細書に記載された配列と実質的に同一なアミノ酸残基の配列を有する任意のポリペプチドを含む。保存的置換の例には、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの1つの非極性（疎水性）残基と別の残基との置換、アルギニンとリシン、グルタミンとアスパラギン、スレオニンとセリンなどの1つの極性（親水性）残基と別の残基との置換、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの1つの塩基性残基と別の残基との置換、またはアスパラギン酸やグルタミン酸などの1つの酸性残基と別の残基との置換などがある。
【００３３】
「保存的置換」という表現は、誘導体化されていないアミノ酸の代わりに、化学的に誘導体化されたアミノ酸の使用も含む。「化学的誘導体」という表現は、側鎖の官能基の反応によって化学的に誘導体化された1つもしくは複数のアミノ酸を有する対象ポリペプチドを意味する。このような誘導体化された分子の例には例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて塩酸アミン、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、アセチル基、またはホルミル基を形成した分子などがある。遊離のカルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルもしくはヒドラジドを形成する場合がある。遊離のヒドロキシル基は誘導体化されて、O-アシル誘導体またはO-アルキル誘導体を形成する場合がある。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、N-im-ベンジルヒスチジンを形成する場合がある。化学的誘導体には、20種類の標準アミノ酸の1つもしくは複数の天然のアミノ酸誘導体を含むタンパク質またはペプチドも含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンがプロリンと置換される場合があり、5-ヒドロキシリシンがリシンと置換される場合があり、3-メチルヒスチジンがヒスチジンと置換される場合があり、ホモセリンがセリンと置換される場合があり、またオルニチンまたはシトルリンがリシンと置換される場合がある。
【００３４】
したがって本発明の好ましい態様では、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、長さが26アミノ酸未満の単離されたMHCクラスII結合抗原ペプチド、ならびに結合能力を維持しながらアミノ末端またはカルボキシ末端に欠失を有する同類のペプチドは、ペプチドとMHCクラスII分子との結合を促進する少なくとも1つのアミノ酸修飾をその配列に含む。アミノ酸の修飾は、上述したような保存的なアミノ酸置換の場合がある。結合は、標準抗原ペプチドと比較時の結合能力として決定することができる。本発明のMHCクラスII抗原ペプチドのペプチド結合モチーフは、非修飾型ペプチド結合モチーフの結合能力を維持しながら、アミノ酸配列の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの修飾を含む場合もある。好ましくは、修飾型ペプチド結合モチーフは、非修飾型ペプチド結合モチーフの4つのアンカーアミノ酸の少なくとも3つを含む。このようなアミノ酸の修飾は、上述したような保存的なアミノ酸置換である場合がある。
【００３５】
本発明の単離されたペプチドは例えば、天然供給源からの抽出（例えばMHC II分子からの溶出）により、対象ペプチドをコードする組換え核酸の発現により、または化学合成により得られる。天然に由来する供給源とは異なる細胞系で産生されるペプチドは「単離され」ているが、これは天然の状態では共存する成分から分離されるためである。宿主生物で発現される組換えペプチドは、粗溶解物として得られるほか、分別沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーおよびイムノアフィニティクロマトグラフィーほかの手段などを含む場合のある、当技術分野で周知の標準的なタンパク質精製法で精製することができる。単離または純度の程度は、任意の適切な方法（例えば質量分析やHPLC解析）で測定できる。このようなペプチドは、文献（Merrifield, (1986) Science 232: 341-347, and Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds (N.Y., Academic Press), pp.1-284 (1979)）に記載された手順で合成的に調製することができる。合成は、溶液中もしくは固相中で、または自動合成装置を用いて実施することができる（Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Rockford Ill., Pierce Chemical Co. (1984)）。
【００３６】
別の態様では、本発明の抗原ペプチドは、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むように提供され、ならびにこれらのペプチドは、結合能力を維持しながらアミノ末端またはカルボキシ末端に欠失を有し、MHCクラスII分子と結合する。
【００３７】
本発明の方法で定義される共有結合的または非共有結合的に結合するペプチドを含む、クラスII MHC分子のマルチマー（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、またはオリゴマー）は、検出用標識（例えば、蛍光標識、放射性核種、または一定の波長の光を吸収もしくは放出する産物を生じる反応を触媒する酵素）に結合させて使用することで、このような複合体に特異的な、また特異的なために結合する細胞表面受容体を有する被験対象（例えばヒト患者）から採取されたT細胞を定量することができる。このようなT細胞の数が比較的多数であることは、関連する疾患の診断につながる可能性が高く、またはT細胞が対象疾患に対する免疫に関与することを示す。また、マルチマーに結合するT細胞の相対数の連続的なモニタリングは、疾患の経過または治療法の有効性を判断する際に有用な場合がある。このようなアッセイ法は、HIV-1に由来するペプチド、またはインフルエンザウイルス15型に由来するペプチド（Altman et al., (1996), Science 274; 94-96; Ogg et al., (1998), Science 279; 2103-21061）を含むクラスI MHC分子のテトラマーを用いて開発されており、また対応するクラスII MHCマルチマーのテトラマーも同様に有用であると考えられる。このような複合体は、対象ペプチドの存在下で組み合わされた精製済みのクラスII MHC分子の化学的架橋によって、または1つの特定のペプチドを含むクラスII MHC分子の産生に関して確立済みの組換え法を修飾することで作製することができる（Kazono et al., (1994), Nature 369: 151-154; Gauthier et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95： 11828-118331）。このようなマルチマーのクラスII MHC分子のモノマーは、完全長のアルファ鎖およびベータ鎖からなる天然の分子の場合がある。あるいは、アルファ鎖およびベータ鎖の細胞外ドメインか、またはペプチド結合溝の「壁（wall）」および「床（floor）」を形成するアルファ鎖およびベータ鎖のドメインのいずれかを含む分子の場合がある。
【００３８】
したがって本発明は、上述のペプチドに対するか、またはペプチドと反応する抗体、断片、またはこれらの誘導体にも関する。抗体を作製する一般的な方法は周知であり、例えばKohler and Milstein, 1975, Nature 256,494 or in J. G. R. Hurrel, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982)に記載されている。抗体は、ポリクローナル抗体、または好ましくはモノクローナルの場合があるほか、F(ab')2、Fab、Fv、もしくはscFvのような抗体断片の場合がある。本発明の抗体は、ヒト化されている場合がある（Merluzzi S. et al., (2000), Adv. Clin. Path., 4 (2): 77-85）ほか、ヒト抗体の場合もある（Aujame L. et al., Hum. Antibodies, (1997), 8 (4): 155-168）。
【００３９】
本発明は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択される配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドをコードする単離された核酸分子、ならびに結合能力を維持しながらアミノ末端またはカルボキシ末端に欠失を有する同類の抗原ペプチドをコードする核酸分子、ならびにアミノ酸配列が、対象ペプチドとMHCクラスII分子との結合を促進する少なくとも1つのアミノ酸の修飾を含む抗原ペプチドをコードする核酸分子も提供する。好ましくは、単離された核酸分子はDNA 分子である。
【００４０】
単離された核酸分子はさらに、MHCクラスII分子に連結された本発明の抗原ペプチド（SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む）をコードするように提供される。
【００４１】
本発明は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択される配列を含む抗原ペプチドをコードする核酸配列の全体もしくは一部、または結合能力を維持しながらアミノ末端もしくはカルボキシ末端に欠失を有する同類の抗原ペプチドをコードする核酸分子、またはアミノ酸配列が、ペプチドとMHCクラスII分子との結合を促進する少なくとも1つのアミノ酸修飾を含むように、発現ベクターに使用可能に連結された、抗原ペプチドをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物も提供する。本発明における使用に適した発現ベクターは、抗原ペプチドをコードする核酸配列に使用可能に連結された少なくとも1つの発現制御エレメントを含む。組換え型の発現構築物はDNA構築物の場合がある。
【００４２】
発現制御エレメントをベクター内に挿入することで、本発明の抗原ペプチドをコードする核酸配列の発現を制御および調節する。発現制御エレメントの例には、lac系、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母のプロモーター、およびポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、またはSV40に由来するプロモーターなどがあるがこれらに限定されない。別の好ましい、または必要とされる動作可能なエレメントには、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、および宿主系における核酸配列の適切な転写および続く翻訳に必要か、または好ましい他の任意の配列などがあるがこれらに限定されない。必要な、または好ましい発現制御エレメントの正しい組み合わせが、選択された宿主系に依存することを当業者であれば理解する。さらに発現ベクターは、宿主系における核酸配列を含む発現ベクターの輸送および後の複製に必要な追加的なエレメントを含むべきであるように理解される。このようなエレメントの例には、複製基点や選択マーカーなど含まれるがこれらに限定されない。さらに、このようなベクターが従来の方法（www.cellbio.com/protocols.html）で容易に構築できるほか、市販品を利用できることも当業者であれば理解する。
【００４３】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択される抗原ペプチドをコードする核酸配列、または結合能力を維持しながらアミノ末端もしくはカルボキシ末端に欠失を有する同類の抗原ペプチドをコードする核酸分子、またはアミノ酸配列が、ペプチドとMHCクラスII分子との結合を促進する少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む抗原ペプチドをコードする核酸配列の全体もしくは一部を含む組換え核酸構築物が発現ベクターに使用可能に連結された状態で導入された宿主生物または宿主細胞に関する。本発明に含まれる核酸構築物で形質転換された宿主細胞は、動物、植物、昆虫、および酵母細胞などの真核生物、ならびに大腸菌などの原核生物を含む。核酸配列を有する核酸構築物を細胞に導入可能な手段には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入、またはDEAE-デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを使用するトランスフェクション、または当業者に周知の他の手順などがあるがこれらに限定されない（Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York）。
【００４４】
好ましい態様では、真核細胞で機能する真核発現ベクターを使用する。このようなベクターの例には、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、伝染性上皮腫ウイルスベクター、プラスミド、またはバキュロウイルスの輸送ベクターなどがあるがこれらに限定されない。好ましい真核細胞系列にはCOS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、293細胞（ATCC# CRL15731）、T2細胞、樹状細胞、単球、またはエプスタイン-15バーウイルスで形質転換されたB細胞などがあるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明はさらに、上述の組換え核酸構築物を含む宿主細胞を、このようなペプチドの発現を可能とする条件で培養し、またペプチドを細胞もしくは培地から回収する段階を含む、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチド、または結合能力を維持しながらアミノ末端もしくはカルボキシ末端に欠失を有する同類の抗原ペプチド、またはアミノ酸配列が、ペプチドとMHCクラスII分子との結合を促進する少なくとも1つのアミノ酸修飾を含むような抗原ペプチドを産生させる方法を提供する。
【００４６】
本発明の単離された抗原ペプチド、また同定された抗原ペプチドの配列は、MHC結合モチーフの存在、MHC結合能力によって、またT細胞による認識によって検証することができる。
【００４７】
MHC結合モチーフ
特定のMHC分子（対立遺伝子バリアント）と結合するペプチドには、MHC分子との安定な複合体を形成するために必要な、「結合モチーフ」と呼ばれる共通の構造的特徴がある。MHCクラスI分子から溶出されるペプチドリガンドは比較的短く、8〜11アミノ酸の長さである。さらに、ペプチドの2つまたは3つの側鎖が結合に重要な役割を果たす。個々のアミノ酸の側鎖の位置はHLA対立遺伝子によって変動し、最も一般的には、このようないわゆる「アンカー」残基の2つは2位と9位に位置する。特定のアンカー位置については、1つまたは2つのアミノ酸（例えばHLA-A2の場合は2位におけるロイシンまたはバリン）だけが通常、アンカーアミノ酸として機能可能である。
【００４８】
MHCクラスII分子の場合は、ペプチドの長さは11〜25アミノ酸であり、長いペプチドほど、ペプチド結合用の溝の両側が開くために結合可能となる。大半のHLAクラスII分子は、ノナマーのコア領域に含まれる相対位置P1、P4、P6、およびP9に最大4つのアンカー残基を擁する。しかし、このコア領域は、ペプチドのN末端からさまざまな距離をとりうる。多くの場合、2〜4個のN末端残基がコア領域に先行する。したがってP1アンカー残基は、大半のHLAクラスII結合ペプチドの3位、4位、または5位に位置する。HLA-DRクラスII分子から溶出されるペプチドは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、またはバリンに代表される大きな疎水性P1アンカーを共通して有する。
【００４９】
アンカー残基の位置および種類は、高頻度で存在するHLAクラスII対立遺伝子の産物の大半に関して知られているペプチド結合モチーフを含む。ペプチド配列内のモチーフの検証を可能とするコンピューターアルゴリズムの1つが、Vaccinome社（www.vaccinome.com）から入手可能な「Tepitope」である。
【００５０】
MHC結合能力
本発明の方法で同定されたペプチドは、当技術分野で周知の方法で、例えば単離されたMHCクラスII分子、および本発明の方法で同定されたものと同一なアミノ酸配列を有する合成ペプチドを用いることで、適切なMHCクラスII分子に対する結合能力について検討することができる（Kropshofer H et al., J. Exp. Med. 1992; 175, 1799-1803; Vogt AB et al., J. Immunol. 1994; 153, 1665-1673; Sloan VS et al., Nature 1995; 375, 802-806）。あるいは、MHCクラスIIを発現する細胞系列とビオチン化ペプチドを用いる細胞結合アッセイ法で、同定されたエピトープを検証することができる（Arndt SO et al., EMBO J., 2000; 19, 1241-1251）。
【００５１】
いずれのアッセイ法でも、ペプチドの相対結合能力は、標識レポーターペプチドの結合を50%減じるのに必要な濃度を決定することで測定される。この値はIC50と呼ばれる。関連するHLAクラスII分子と妥当な親和性を有するペプチド結合のIC50値は、決定済みの標準ペプチドのIC50の10倍を超えない。
【００５２】
同じ結合アッセイ法で、クラスII MHC分子（本発明の方法で溶出された以外のクラスII MHC分子）に対するペプチドの結合能力を検討することもできる。このようなペプチドを用いる本発明の診断法、およびペプチドまたはこれに由来するペプチドのいずれかを用いる本発明の治療法を、このような代替的なクラスII MHC分子を発現する被験対象に適用することができる。
【００５３】
T細胞による認識
エピトープの検証手順は、本発明の方法で同定されたペプチドのもつ、CD4+ T細胞集団を活性化する能力に関する検討を含む場合がある。本発明で同定されたアミノ酸配列と同一か、または本発明で同定された入れ子状の一群のペプチドに由来するコア配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。次にこの合成ペプチドを、（a）対象MHCクラスII分子を発現するか、また疾患の少なくとも1つの症状を有する被験対象から採取されたCD4+ T細胞、および（b）対象となるMHCクラスII分子を発現し、また疾患の症状の見られない対照被験対象から採取されたCD4+ T細胞を活性化する能力に関して検討する。他の対照被験対象は、疾患の症状を示し、対象となるMHCクラスII分子を発現しない被験対象の場合がある。
【００５４】
一部の疾患（例えば自己免疫的な要素のある疾患）では、（b）に記載された対照被験対象のCD4+ T細胞では認められないが被験対象のCD4+ T細胞では認められる反応性の存在は、関連するペプチドが関連疾患を発症、促進、または悪化させることが可能なCD4+ T細胞を活性化させるエピトープであるという確証的な証拠となる。他の疾患（例えば自己免疫的な要素のない癌や感染症）では、上述の反応性および非反応性の類似のパターンは、関連ペプチドが、疾患に対する免疫に、または少なくとも疾患の症状の緩和に関与する可能性のあるCD4+ T細胞を活性化させるエピトープであることを意味する場合がある。
【００５５】
CD4+ T細胞の応答は、当技術分野で周知のさまざまなインビトロ法で測定することができる。例えば全末梢血単核球（PBMC）を、候補合成ペプチドとともに、または単独で培養して、その増殖反応を例えば対象DNAへの［3H］-チミジンの取り込みによって測定することができる。増殖中のT細胞がCD4+ T細胞であることは、アッセイ法に先だってCD4+ T細胞をPBMCから除去することで、またはT細胞上のCD4+ 分子と結合する阻害性抗体を添加することによって後者の増殖を阻害することのいずれかによって検討することができる。いずれの場合においても、増殖反応は、CD4+ T細胞が増殖中の細胞である場合によってのみ阻害される。あるいはCD4+ T細胞をPBMCから精製し、適切なMHCクラスII分子を発現するAPCの存在下でペプチドに対する増殖反応を検討することができる。このようなAPCは、Bリンパ球、単球、マクロファージ、もしくは樹状細胞、または全PBMCの場合がある。APCは、Bリンパ球、単球、マクロファージ、または樹状細胞に由来する不死化細胞系列の場合もある。APCは、対象MHCクラスII分子を内因的に発現可能であるほか、このような分子をコードするトランスフェクトされたポリヌクレオチドを発現可能である。いずれの場合においてもAPCは、アッセイ法に先立ち、例えば電離放射線またはマイトマイシンCで処理して非増殖性とすることができる。
【００５６】
細胞の増殖を測定する別法として、CD4+ T細胞によるサイトカインの産生を当技術分野で周知の手順で測定することができる。サイトカインは、インターロイキン-2（IL-2）、インターフェロン-ガンマ（IFN-ガンマ）、インターロイキン-4（IL-4）、TNF-アルファ、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-12（IL-12）、またはTGF-βを含むがこれらに限定されない。これらを測定するアッセイ法には、ELISA、および関連するサイトカイン反応細胞を応答性（例えば増殖）に関して被験試料の存在下で検討するバイオアッセイ法などがあるがこれらに限定されない。
【００５７】
あるいはCD4+ リンパ球によるサイトカインの産生は、細胞内免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーによって直接可視化することができる。
【００５８】
また上述の単離された抗原ペプチドを事前に、疾患（好ましくは癌）の診断、予防、および治療に使用することができる。したがって本発明は別の態様では、疾患（好ましくは癌）の診断、予防、および治療に用いる本発明の抗原ペプチドを提供する。
【００５９】
本発明の1つの局面は、1つもしくは複数の同定された黒色腫ペプチドを用いて、癌（好ましくは黒色腫）に対するワクチンを患者に接種する治療目的である。この目的を達成するために、MHC分子に結合してT細胞の活性化を誘導する十分な量の関連ペプチドを患者に直接投与して、T細胞が介在する感染細胞または癌細胞の溶解を導くことができる。
【００６０】
あるいは黒色腫ペプチドを、DCに基づくワクチンの作製に使用することができる。この場合、患者の単球に由来する自家DCを、関連ペプチドまたは関連ペプチド配列を含む組換えタンパク質でパルス処理することができる。特に黒色腫に対するワクチンの接種の場合は、本発明のMHCクラスII結合ペプチド単独と、当技術分野で周知のMHCクラスI結合腫瘍抗原ペプチドとの組み合わせを黒色腫患者の自家DCまたは同種DCのパルス処理に使用することができる。同様に、関連ペプチドをコードする核酸分子を、腫瘍細胞をトランスフェクトする目的でベクターに組み入れることができる。このようなトランスフェクトされた腫瘍細胞をDCと融合させることができる。いずれの場合も、適切なMHC分子に関連する関連ペプチドを提示するDCを腫瘍患者に投与して、細胞および/または抗体が介在する対腫瘍免疫応答を誘導する。
【００６１】
本発明のクラスII拘束性黒色腫抗原、またはこの類似体を、ワクチンとして予防的または治療的に使用することができる。予防的に用いる場合は、黒色腫の何らかの証拠が得られる前にワクチンを提供する。クラスII拘束性黒色腫抗原ワクチンの予防的投与は、哺乳類の黒色腫の予防または緩和に使用できるはずである。好ましい態様では、黒色腫のリスクの高い哺乳類（好ましくはヒト）に本発明のワクチンを予防的に投与する。このような哺乳類の例には、黒色腫の家族歴のあるヒト、異型母斑の発生歴のあるヒト、FAM-M症候群歴のあるヒト、または過去に黒色腫を切除したことがあるために再発リスクのあるヒトなどがあるがこれらに限定されない。治療的に用いる場合は、黒色腫または転移性黒色腫に存在する腫瘍抗原に対する患者自身の免疫応答を促進させるようにワクチンを提供する。免疫原として作用するワクチンは、細胞、組換え発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する細胞溶解物、クラスII拘束性黒色腫抗原をコードする組換え発現ベクターをトランスフェクトした細胞に由来する細胞溶解物、または発現タンパク質を含む培養上清の場合がある。あるいは免疫原は、部分的または実質的に精製された、クラスII拘束性黒色腫抗原をコードする組換えタンパク質、ペプチド、またはこの類似体である。このようなタンパク質またはペプチドはリポタンパク質と結合させることが可能なほか、リポソーム状で、またはアジュバントとともに従来の方法で投与することができる。
【００６２】
したがって本発明は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および21で表される配列を含む有効量の抗原ペプチド、ならびに結合能力を維持しながらアミノ末端またはカルボキシ末端に欠失を有する同類のペプチド、および許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む薬学的組成物を提供する。本明細書で用いられる「有効量」という表現は、特定のリンパ球を活性化するのに、また腫瘍に対する有効な応答を誘導するのに十分な量を意味する。このような量は、使用ペプチド、投与様式、治療対象疾患の重症度、および患者の全身状態に依存し、例えば樹状細胞に結合するペプチドの場合であれば通常1〜50 mg/mlの範囲にある。
【００６３】
許容される賦形剤、希釈剤、または担体は、インビトロ試験の場合はリン酸緩衝食塩水の場合があり、またインビボ投与の場合は生理食塩水の場合がある。
【００６４】
1つの態様では、このような組成物を、異常増殖の傾向のある患者への予防的ワクチンの接種、または腫瘍患者への治療目的のワクチン接種時に使用する。本明細書で用いられる「ワクチン接種」という表現は、能動免疫（従来のワクチン接種プロトコルと同様の、例えば病原体に対するインビボにおける免疫応答を患者で直接誘導するためのペプチドのインビボ投与）と、受動免疫（抗腫瘍CD4+細胞、または後に患者に再接種される自家樹状細胞もしくは同種樹状細胞をインビトロで活性化させるためのペプチドの使用）の両方を意味する。
【００６５】
ワクチンの調製法および使用は当業者に周知であり、例えばPaul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York (1989) or Cryz, S. J., Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagsgesellschaft (1991)に記載されている。ワクチンは、従来の手順で注射液、懸濁液、または溶液の状態で調製されるが、固体調製物またはリポソームの状態で使用される場合もある。免疫原性成分を、ワクチンの効力を高める乳化剤、緩衝剤、およびアジュバントなどの薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。後者は、単回または複数回の用量スケジュールで投与することができる。複数回の投与は、1 Hg〜1000 jougの間を変動する量の抗原をそれぞれ含む1〜10回の別個の投与と、これに続く、免疫応答の維持または強化のために必要な時間をおいた投与（また被験対象によって必要であれば、数か月後にさらなる投与）を行う。いずれの場合でも、投与法は、投与対象患者で誘導される応答、全身状態、および腫瘍の進行によって異なる。
【００６６】
本発明の薬学的組成物または製剤（動物およびヒトを対象とした使用の両方）は、上述の抗原ペプチドを、1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体、および任意選択で他の治療用成分とともに含む。担体（群）は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに害を及ぼさないという意味において「許容される」ものでなければならない。このような製剤は好都合には、単位剤形として提供される場合があるほか、薬学分野で周知の任意の方法で調製することができる。
【００６７】
全ての方法は、活性成分と1つもしくは複数の補助成分を含む担体を結合させる段階を含む。一般に、製剤は均一に、また活性成分と液体担体、もしくは細かく砕かれた固体担体、またはこの両方を密接に会合させ、次に必要であれば、産物を所望の剤形に成形することで調製される。
【００６８】
静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または腹腔内投与に適した製剤は好都合には、好ましくはレシピエントの血液と等張性の溶液と、活性成分の滅菌済み水溶液および溶液を含む。このような製剤は好都合には、塩化ナトリウム（例えば0.1〜2.0 M）やグリシンほかの生理的に適合性のある物質を含み、生理的条件に匹敵する緩衝性pHを有する水に固体活性成分を溶解することで水溶液を得て、また同溶液を無菌性とするように調製することができる。このような製剤は、単回投与用または複数投与用の容器（例えば密封されたアンプルもしくはバイアル）中に収容されている場合がある。
【００６９】
本発明の製剤には安定剤を含めることができる。説明目的の安定剤は、単独または混合物のいずれかとして使用可能なポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、および有機酸である。このような安定剤は好ましくは、免疫原の重量部あたり約0.11〜約10,000重量部の量で含まれる。仮に2つもしくはこれ以上の安定剤を使用する場合は、その総量は好ましくは上記の範囲内にある。このような安定剤は、適切な濃度およびpHの水溶液として使用される。このような水溶液の特定の浸透圧は一般に約0.1〜約3.0オスモルの範囲、好ましくは約0.8〜約1.2オスモルの範囲にある。水溶液のpHは、約5.0〜約9.0、好ましくは6〜8の範囲内に入るように調整する。本発明の免疫原を製剤化する際は抗吸着剤を使用することができる。
【００７０】
本発明はまた、防御抗体の産生、または抗腫瘍反応性を有する免疫細胞（例えば哺乳類の細胞傷害性T細胞もしくはナチュラルキラー細胞）の産生を促す薬剤を製造するための、SEQ ID NO：1〜13、および21で表される配列を含む抗原ペプチドの使用、ならびに結合能力を維持しながらアミノ末端またはカルボキシ末端に欠失を有するこれらのペプチドの使用も提供する。
【００７１】
別の態様では、防御抗体または免疫陽性CD4+ T細胞の産生を促すことで黒色腫を予防または治療するための薬剤を製造するための、SEQ ID NO：1〜13、および21で表される配列を含む抗原ペプチドの使用、ならびに結合能力を維持しながらアミノ末端またはカルボキシ末端に欠失を有するこれらのペプチドの使用を提供する。
【００７２】
別の態様では、防御抗体または免疫陽性CD4+ T細胞の産生を促すことで肺癌を予防または治療するための薬剤を製造するための、SEQ ID NO：12および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドの使用を提供する。
【００７３】
さらに本発明の方法は診断目的で使用することができる。1つの態様では、本発明の抗原ペプチドは、治療法の有効性を追跡するための反応マーカーとして使用することができる。基本的には、抗原ペプチドのベースライン値の決定後に、任意の治療用薬剤を投与し、抗原ペプチドのレベルを引き続いて追跡することが可能であり、抗原ペプチドのレベルの変化は、治療法が有効であることを意味する。
【００７４】
さらに、疾患（好ましくは癌）の特定の段階または相にのみに認められる抗原ペプチドを段階特異的マーカーとして使用することができる。基本的には、特定の疾患段階に関連づけられた抗原ペプチドのレベルを定期的に追跡することで、疾患の段階および疾患の進行に関する情報が得られる。
【００７５】
したがって、SEQ ID NO：1〜13、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドの、癌の診断マーカーとしての使用を提供する。好ましくは、黒色腫の診断マーカーとしての本発明のMHCクラスII抗原ペプチドの使用を提供する。特に好ましいのは、SEQ ID NO：12および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドの黒色腫診断マーカーとしての使用である。
【００７６】
また、SEQ ID NO：12および13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むMHCクラスII抗原ペプチドの肺癌診断マーカーとしての使用を提供する。
【００７７】
本発明は、抗原ペプチドが由来するメラノトランスフェリンポリペプチドの、診断マーカーおよび肺癌のモニタリング用マーカーとしての使用も含む。個々のタンパク質を使用する原理は、「特異的受容体を介して、また特殊なエンドサイトーシス機構（例えばマクロピノサイトーシス）を介して外因性抗原を捕捉した後に、プロセシングを受けた抗原がMHCクラスII分子上のペプチドとして提示されるDCが大半の組織に存在する」ということである。過去の研究から、症例の大半においてMHCクラスII分子と関連して存在するペプチドエピトープの頻度が、この特定のペプチドが由来するタンパク質の量を反映したものであることがわかっている。したがって抗原ペプチドだけでなく、対応するタンパク質も肺癌のマーカーとなりうる。
【００７８】
したがって本発明の別の態様では、メラノトランスフェリン（SEQ ID NO：22）の肺癌マーカーとしての使用を提供する。
【００７９】
疾患（好ましくは癌）の診断は、疾患（好ましくは癌）のポリペプチドマーカーもしくはペプチドマーカーの発現および/または組成を、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈殿法、および免疫蛍光法などの、さまざまな方法で調べることで下される場合がある。個体から採取された被験試料を対象に、本発明のポリペプチドまたはペプチドの発現の変化、および/または組成の変化の存在について評価を行う。ポリペプチドまたはペプチドの発現の変化は例えば、ポリペプチド発現（すなわち産生ポリペプチドの量）の量的変化の変化である場合があり、またポリペプチドの組成の変化は、ポリペプチド発現（例えば、変異ポリペプチドの発現、またはさまざまなスプライシングバリアントの発現）の量的変化である。
【００８０】
両方の変化（量的変化と質的変化）が見られる場合もある。本明細書で用いるポリペプチドの発現または組成の「変化」という表現は、対照試料のペプチドもしくはポリペプチドの発現または組成と比較時の、被験試料の発現または組成の変化を意味する。対照試料は、被験試料に対応する（例えば同じ種類の細胞に由来する）試料であり、また疾患（好ましくは癌）に罹患していない個体から採取される。対照試料と比較して、被験試料中のペプチドもしくはポリペプチドの発現または組成に変化が見られることは、疾患（好ましくは癌）の存在を、または疾患（好ましくは癌）に対する感受性の存在を意味する。分光法、比色法、電気泳動、等電点電気泳動、およびイムノブロッティングなどのイムノアッセイ法（例えば、David et al., U.S. Pat. No. 4,376,110）を含む、本発明のペプチドもしくはポリペプチドの発現または組成を調べるさまざまな手段を使用することができる（「Current Protocols in Molecular Biology」の特に第10章も参照）。例えば1つの態様では、ポリペプチドに結合可能な抗体（例えば上述の抗体）、好ましくは検出用標識を有する抗体を使用することができる。抗体はポリクローナル抗体、またはより好ましくはモノクローナル抗体である。完全な抗体、または抗体断片（例えばFabまたはF(ab')2）を使用することができる。プローブもしくは抗体に関して「標識された」という表現は、プローブもしくは抗体に対する検出用物質の結合（すなわち物理的な連結）によるプローブもしくは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性を利用するプローブもしくは抗体の間接標識を意味する。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出可能なビオチンを結合させたDNAプローブの末端標識を用いる一次抗体の検出などがある。
【００８１】
本発明のペプチドもしくはポリペプチドに特異的に結合する上述の抗体を用いるウェスタンブロッティング解析では、被験試料中のペプチドもしくはポリペプチドのレベルまたは量を測定し、これを対照試料中のペプチドもしくはポリペプチドのレベルまたは量と比較することができる。好ましくは、被験試料中のペプチドもしくはポリペプチドを、同種または異種のイムノアッセイ法で測定する。被験試料中のポリペプチドのレベルまたは量が、対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量より高いか、または低く、その差が統計学的に有意である場合には、ポリペプチドの発現の変化を意味し、また疾患（好ましくは癌）の存在、または疾患（好ましくは癌）の感受性の存在の診断に至る。
【００８２】
したがって本発明は、本発明のMHCクラスII抗原ペプチドと反応する抗体を含む診断用組成にも関する。
【００８３】
以上のように本発明を一般的に説明したが、同様の事実は、特に明記した部分を除いては、添付図面と関連して本明細書に説明目的でのみ含まれ、制限する意図のない特定の実施例を参照することで適切に理解される。
【００８４】
実施例
以下の実施例は添付図面と関連し、図1に記載された手法に基づく。この実施例を以下に詳細に説明する。実施例で言及された市販の試薬は、特に明記した部分を除いては、製造業者の指示書にしたがって使用した。
【００８５】
発明の方法
細胞系列および培養
本研究は、後述するように単球から分化したヒト樹状細胞を対象に実施した。単球はヒト末梢血から精製した。また黒色腫細胞系列UKRV-Mel-15a、UKRV-Mel-20c、およびMa-Mel-18a（Eichmueller S et al., Exp Dermatol 2002; 11, 292-31）を使用した。
【００８６】
全ての細胞は、1 mM ピルビン酸、2 mM グルタミン、および10%熱変性ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640培地（RPMIと略）（Gibco BRL, Rockville, MD）で培養した。
【００８７】
末梢血単核球（PBMC）の単離
末梢血を、健康ドナーに由来する標準バフィーコート調製物として地域の血液バンクから入手した。ヘパリン（200 I.U./ml 血液、Liquemine, Roche）を使用して凝血を防いだ。末梢血単核球（PBMC）を、LSM（登録商標）（1.077〜1.080 g/ml；ICN, Aurora, OH）で遠心（800 g、室温、30分間）して単離した。PBMCを中間層から回収し、20 mM Hepesを含むRPMIで2回洗浄した（500 gで15分間と300 gで5分間）。赤血球を除去するために、PBMCをALT緩衝液（140 mM塩化アンモニウム、20 mM Tris、pH 7.2）で37℃で3分間処理した。PBMCを、20 mM Hepesを含むRPMIで2回洗浄した（200 gで5分間）。
【００８８】
末梢血単核球から樹状細胞の生成
単球を、抗CD14磁気ビーズ（Miltenyi Biotech, Auburn, CA）を用いた陽性ソーティングで、製造業者のプロトコルに従ってPBMCから単離した。単球を1%非必須アミノ酸（Gibco, BRL, Rockville, MD）、50 ng/mlの組換えヒト顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF；S.A. 1.1x107 U/mg）（Leucomax; Novartis, Basel Switzerland）、および3 ng/mlの組換えヒトIL-4（S.A. 2.9x104 U/μg）（R&D Systems, Minneapolis, MN）を添加したRPMIで培養した。単球を6ウェルプレート（Costar）に0.3x106/mlとなるように分注し、5日間維持して未成熟樹状細胞を得た。
【００８９】
単球に由来する未成熟樹状細胞の質を、表現型に従うフローサイトメトリーによる解析で常用の手順で追跡した：CD1a（高）、CD3（陰性）、CD14（低）、CD19（陰性）、CD56（陰性）、CD80（低）、CD83（陰性）、CD86（低）、およびHLA-DR（高）。これとは対照的に成熟樹状細胞（後述）は、CD1a（低）、CD80（高）、CD83（高）、CD86（高）、およびHLA-DR（高）の表現型を示す。CD1a、CD3、CD14、CD19、CD56、CD80、CD83、CD86に対するモノクローナル抗体、ならびに個々のアイソタイプ対照はPharmingen社（San Diego, CA）から購入した。
【００９０】
樹状細胞の壊死性黒色腫細胞による曝露
黒色腫細胞系列を、液体窒素による4サイクルの凍結と、これに続く室温における解凍によって壊死性とした。壊死細胞のパーセンテージを光学顕微鏡で追跡した。黒色腫細胞由来抗原を樹状細胞に与えるために、6x106個の未成熟樹状細胞を1.8x107個の壊死細胞に曝露させた（比3：1）。同時に樹状細胞の成熟を、10 ng/mlの組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF-α; S.A. 1.1x105 U/μg）を添加して誘導した。対照として6x106個の樹状細胞をTNF-αのみとインキュベートした。
【００９１】
共培養の24〜48時間後に、遠心（300 g、10分間）して成熟樹状細胞を回収した。10% FCSを含むRPMIで細胞を洗浄し、エッペンドルフチューブに移した。遠心（400 g、3分間）後に上清を完全に除去し、細胞を-70℃で凍結した。
【００９２】
抗HLAクラスIIビーズの調製
抗HLA-DRモノクローナル抗体（mAb） L243（ATCC, Manassas, VA）を、個々のマウスハイブリドーマ細胞系列を培養することで作製した。プロテインAセファロース（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いてmAb L243を精製し、またCNBr活性化セファロースビーズ（Pharmacia）上に最終濃度が2.5 mg/mlとなるように製造業者のプロトコルに従って固定化した。L243ビーズは、0.1% Zwittergent 3-12（Calbiochem, La Jolla, CA）を含むPBS中に保存した。
【００９３】
HLA-DRペプチド複合体のナノスケールの精製
凍結樹状細胞のペレットを、10倍容量の氷冷溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤キモスタチン、ペプスタチン、PMSF、およびロイペプチン（Roche, Mannheim, Germany）を含む、1% Triton-X-100、20 mM Tris、pH 7.8、5 mM MgCl2）中に再懸濁し、水平振盪器で溶解した（1000 rpm、4℃、1時間）。細胞溶解物を対象に細胞デブリと核を遠心（2000 g、4℃、10分間）して分けた。溶解物をL243ビーズ（100 μlの細胞溶解物あたり5〜10 μlのビーズ）と水平振盪器で同時培養した（1000 rpm、4℃、2時間）。L243ビーズと結合した、免疫沈殿したHLA-DRペプチド複合体を、遠心（2000 g、4℃、5分間）して沈降させ、300 μlの0.1% Zwittergent 3-12（Calbiochem）（溶媒PBS）で3回洗浄した。
【００９４】
HLA-DRペプチド複合体の除去効率を、個々の細胞溶解物を免疫沈殿の前後で解析して追跡した。これと平行して、ビーズのアリコートを対象に、抗HLA-DRαに特異的なmAb 1B5（Adams, T. E. et al., Immunology 50 (1983) 613-624）を用いたウェスタンブロッティングで解析を行った。
【００９５】
HLA-DR結合ペプチドの溶出
L243ビーズと結合したHLA-DRペプチド複合体を、400 μlのH2O（HPLC-グレード；Merck, Darmstadt, Germany）に再懸濁し、超遠心チューブUltrafree MC（カットオフ30 kD）（Millipore, Bedford, MA）に移し、400 μlのH2O（HPLCグレード）で遠心（2〜4分、14000 rpm、4℃）して10回洗浄した。結合状態のペプチドを溶出させるために、50 μlの0.1%トリフルオロ酢酸（Fluka, Buchs, Switzerland）（溶媒H2O）（HPLCグレード）を添加し、37℃で30分間インキュベートした。Ultrafreeユニットを遠心（14000 rpm、3分、RT）して溶出ペプチドを新しいエッペンドルフチューブに回収し、直ちにSpeed-Vac（商標）真空カートリッジで凍結乾燥した。
【００９６】
ナノHPLCによるペプチドの分画
HLA-DR分子から溶出された凍結乾燥ペプチドを0.05%トリフルオロ酢酸、5%アセトニトリル（Merck, Darmstadt, Germany）（溶媒H2O）（HPLCグレード）に溶解し、FAMOS（商標）オートサンプラーおよびULTIMATE（商標）ナノフローHPLC（Dionex, Olten, Switzerland）に接続した75 μm x 15 cmのC18 PepMapキャピラリ（C18；3 μm；100 Å）（LC-Packings, Amsterdam, Netherlands）で分離した。200 nl/分の定常フロー速度における以下の非直線勾配を用いた（システムA：0〜40分/5〜50%、システムB：40〜50分/50〜90%）。システムAは、0.05%トリフルオロ酢酸、5%アセトニトリル/H2Oとし、システムBは、0.04%トリフルオロ酢酸、80%アセトニトリル/H2Oとした。この分離を、214 nmと280 nmにおける二重UV吸収を指標に追跡した。フラクションコレクターPROBOT（商標）（BAI, Weiterstadt, Germany）でフラクション（400 nl）を回収し、AnchorChip 600/384 MALDI-MSターゲット（Bruker, Bremen, Germany）上にスポットした。
【００９７】
質量分析によるペプチド配列解析
MALDI-TOF質量分析
AnchorChipプレート上にスポットしたペプチドを、マトリックス（10 mg/ml α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（Merck, Darmstadt, Germany）、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸）を用いて共結晶化させた。全ペプチドレパートリーの定量解析に関しては、試料をUltraflex（商標） MALDI-TOF質量分析装置（Bruker, Bremen, Germany）で製造業者のプロトコルに従って解析した。
【００９８】
イオントラップMS/MS質量分析
複雑なペプチド混合物の高処理能配列決定を行うために、液体クロマトグラフィーによる分画と、これに続く質量分析による配列決定に基づくMudPIT（多次元タンパク質同定法）を採用した（Washburn MP et al., Nat Biotechnol 19 (2001), 242-247）。
【００９９】
このために、HLA分子から溶出された凍結乾燥ペプチドを、5%（v/v）アセトニトリル、0.5%（v/v）酢酸、0.012%（v/v）ヘプタフルオロ酪酸（HFBA）、および5%（v/v）ギ酸を含む緩衝液に再懸濁した。この試料を、モデルP-2000レーザープラー（Sutter Instrument Co., Novato, CA）で調製した融合シリカミクロキャピラリカラム（内径100 μm x 365 μm）上で分離した。マイクロカラムに3 μm/C18逆相材料（C18-ACE 3 μm ［ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS, Leonberg, Germany］）を充填した後に、3 cmの5 μmの陽イオン交換材料（Partisphere SCX; Whatman, Clifton, NJ）を充填した。
【０１００】
Agilent 1100シリーズのHPLC（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）による完全自動化された8段階勾配分離を、緩衝液A（5% ACN/0.02% HFBA/0.5%酢酸、緩衝液B（80% ACN/0.02% HFBA/0.5%酢酸）、緩衝液C（250 mM酢酸アンモニウム/5% ACN/0.02% HFBA/0.5%酢酸）、および緩衝液D（1.5 M 酢酸アンモニウム/5% ACN/0.02% HFBA/0.5%酢酸）を用いて実施した。第1段階（106分）は、緩衝液B勾配（0〜80%；100分間）と、緩衝液B（80%；6分間）の保持とした。次の6段階（各106分）は以下のプロファイルで行った：緩衝液A（100%；5分）、x%緩衝液C（2分）、緩衝液A（100%；5分）、緩衝液B（0〜10%）による勾配（3分間）、緩衝液B（10〜35%）による勾配（55分）、緩衝液B（35〜50%）による勾配（20分）、緩衝液B（50〜80%）による勾配（16分）。段階2〜7における緩衝液C（2分）のパーセンテージ（x）は、10%、20%、30%、40%、70%、90%、および100%とした。段階8は以下のプロファイルで行った：緩衝液A（100%）による洗浄（5分）、100%緩衝液D による塩洗浄（20分）、および緩衝液B（0〜80%）による勾配（100分）。
【０１０１】
HPLCカラムを、ナノLCエレクトロスプレーイオン源部を備えたFinnigan LCQイオントラップ質量分析装置（Finnigan, Bremen, Germany）に直接接続した。MS-MSモードによる質量分析を製造業者のプロトコルに従って実施した。swiss.fastaデータベースからのペプチドの同定はSEQUESTアルゴリズムで行った。
【０１０２】
MALDI-PSD質量分析
上述のイオントラップMS/MSによる配列解析の別法としてMALDI-PSD解析を、Bruker Ultraflex TOF/TOF 質量分析装置（Bruker, Bremen, Germany）でデータ収集用ソフトウェアFLEXControl 1.1 Alphaを用いて実施した。較正には、ヒト血清アルブミンのトリプシン消化物（Merck, Darmstadt, Germany）を使用した。ペプチド混合物を最初に「リフレクトロンモード」でスキャンした。次に対象ペプチドを「リフトモード」（MALDI-PSD解析）で選択した。得られたペプチド断片化スペクトルをXmas 5.1.2ソフトウェアおよびBiotools 2.1ソフトウェア（Bruker）で自動的に評価し、またMASCOTアルゴリズム（http://www.matrixscience.com）による非重複性タンパク質データベースによる配列同定のために使用した。
【０１０３】
ペプチド結合アッセイ法
ペプチドの合成
F-moc法でペプチドを合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）で精製した。一部のペプチドについては、F-moc合成時にビオチニル-アミノ-ヘキサン酸をN末端に結合させることでビオチン化した。ペプチドの純度を、MALDI-MSで常用の手順により確認した。
【０１０４】
HLA-DR分子の精製
HLA-DR分子を、1010個のEBV形質転換B細胞系列、またはT2形質移入体から、上述の抗DR mAb L243を用いたアフィニティクロマトグラフィーで精製した（Kropshofer H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92, 8313-8317）。
【０１０５】
インビトロペプチド結合アッセイ法
HA（307〜319；PKYVKQNTLKLAT）は、HLA-DR1、HLA-DR4、およびHLA-DR5と良好に結合するインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に由来する免疫優性のエピトープであり、これをレポーターペプチドとして使用した。
【０１０６】
界面活性剤で可溶化した精製済みのHLA-DR1、HLA-DR4、またはHLA-DR5の各分子（200 nM）を、ビオチン化HA（307〜319）ペプチド（200 nM）と、競合ペプチド（100 nM〜10 μM）を濃度を変えながら、結合緩衝液（50 mM リン酸ナトリウム、50 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.0、0.1% Zwittergent 3-12）中（総量50 μl）で37℃で24時間かけて同時にインキュベートした。
【０１０７】
3x10 μlを、0.05% Tween-20および1% BSAを含むPBS で10倍に希釈し、抗DR mAb L243でコーティングしたマイクロタイタープレート（Nunc）中で3時間インキュベートした。プレートを、0.1 μg/mlのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallay Oy）と製造業者のプロトコルに従って45分間インキュベートして展開した。ビオチン化HA（307〜319）ペプチドとHLA-DR分子の結合の定量を、時間分解ユーロピウム蛍光、およびVICTORマルチラベルカウンター（Wallac Oy）を用いて行った（Arndt SO et al., EMBO J. 2000; 19, 1241-1251）。
【０１０８】
T細胞による認識
T細胞の単離
CD4+ T細胞をPBMCから、ハプテン抗体カクテルおよび抗ハプテン抗体結合磁気ビーズを含むCD4+ T細胞単離キット（Milteny Biotech）を用いたネガティブ選択法で単離した。T細胞を、1%自家ヒト血清、1%非必須アミノ酸（Gibco, BRL）、1%ピルビン酸ナトリウム（Gibco, BRL）、1%カナマイシン（Gibco, BRL）、および1%グルタミン酸（Gibco, BRL）を添加したRPMI培地で培養した。単離されたCD4+ T細胞の品質管理はフローサイトメトリーによる解析で実施し、CD3（高）、TcR（高）、CD4（高）、CD8（陰性）、CD19（陰性）、CD45RO/RA（高）の表現型が明らかとなった。
【０１０９】
腫瘍抗原特異的T細胞系列の作製
最初に1x106個のT細胞を、リポ多糖（Salmonella abortus equi由来のLPS、Sigma）、およびメラノトランスフェリンペプチド（20 μM）でパルス処理した2x105個の自家樹状細胞で刺激した。5日後にIL-2（1250 U/ml）を添加した。10〜14日毎に、反応性T細胞を、20 μMのメラノトランスフェリンペプチド（SEQ ID NO：13）でパルス処理してIL-2を含む培地で成長させた自家樹状細胞で再刺激した。再刺激の1ラウンド毎に、成長途上のT細胞の特異性を、IFN-γおよびIL-4に対するサンドイッチイムノアッセイ法で評価した。
【０１１０】
STEP解析
単一標的発現プロファイリング（STEP）を、さまざまな供給源（精巣、脳、脾臓、筋肉、リンパ腺、脂肪組織、肺、肺癌、黒色腫、結腸、結腸癌、結腸癌転移、前立腺、前立腺癌）に由来する癌組織および正常組織を含むプレート上で実施した。全RNAを、瞬間凍結したヒト組織から「Ultraspec RNA単離キット」（Biotecx, BL10100）で抽出し、RNeasyミニキット（Qiagen）でさらに精製した。15 μgの全RNAを、T7-T24プライマー
2006518982.tif 000003
を用いた逆転写（GIBCO BRL Life Technologies, Grand Island, NY）により2本鎖cDNAに変換し、フェーズロックゲル（5 Prime-3 Prime Inc.）を用いてフェノール/クロロホルム/イソアミルで抽出して精製した。マスターの384ウェルプレートは、全RNAに由来する5 ng/μlの2本鎖cDNAを含むように既知の方法で作製した。娘プレートは、マニュアルか、またはロボットを用いて作製した（最終cDNA濃度：40 pg/μl（200 pg/ウェル））。光学プレート上における384ウェル上のDuplex Real-Time PCR（標的遺伝子および参照遺伝子としてのGAPDH）をTaqMan（登録商標）法で行い、リアルタイム定量DNA解析アッセイ法を可能とするためのTaq DNAポリメラーゼ5'ヌクレアーゼ活性を利用するABI Prism（登録商標） PE7900配列検出システム（Perkin-Elmer Applied Biosystems (PE), Lincoln, CA）で解析した。1ウェルあたり25 μlのPCR混合物は、市販の調合済みのGAPDH TaqMan（登録商標）プライマー/プローブ（PE）、5'プライマーおよび3'プライマー（各900 nM）、ならびに各標的遺伝子に由来するTaqMan（登録商標）プローブ（200 nM）、cDNA（200 pg）、およびTaqMan（登録商標） Universal PCR Master Mix（PE）を含む。PCR条件は、50℃で2分間に続き95℃で10分間、続いて95℃で15分間（40サイクル）および62℃で1分間とした。
【０１１１】
以下のプライマー対を、メラノトランスフェリン遺伝子の第9エキソンに由来する配列を特に拾いあげることで、抗原エピトープが由来するメラノトランスフェリンの長い転写物に制限する目的で作製した。
2006518982.tif 000004
【０１１２】
蛍光レポーター色素および蛍光クエンチャー色素で標識した、以下の部位特異的プローブ配列を検出に使用した。
2006518982.tif 000005
【０１１３】
対象遺伝子の相対発現を式2ΔcTで算出した。ΔcTは、蛍光シグナルが閾値を通過した後におけるGAPDH遺伝子と対象遺伝子間の加熱サイクルの差である。各組織におけるGAPDHの発現は、8種類のハウスキーピング遺伝子のパネルの発現レベルに対して調整した。
【０１１４】
抗体
マウスのモノクローナル抗体L235は、IgG1アイソタイプのメラノトランスフェリン特異的抗体である。同抗体を産生するハイブリドーマ細胞系列をATCC（HB-8446）から購入した。
【０１１５】
結果
メラノトランスフェリンの同定エピトープはT細胞によって認識可能である（図4）。HLA-DR4陽性ドナーから採取されたT細胞を、同定されたメラノトランスフェリンエピトープおよびLPSでパルス処理した自家樹状細胞で繰り返し再刺激することで、同エピトープを特異的に認識するT細胞系列を得た。誘導されたT細胞系列はIFN-γをもっぱら分泌してIL-4を分泌しない。T細胞応答は、抗原の用量に依存して滴定可能である。したがって、同定されたメラノトランスフェリンエピトープは免疫原性を有するので、ペプチドワクチンの候補となる。
【０１１６】
さらに、同定されたエピトープは、メラノトランスフェリンタンパク質を強く発現してHLA-DR4陽性である黒色腫細胞系列UKRV-Mel-17のHLA-DR分子から溶出される場合もある。また新しいMART-1抗原ペプチド（SEQ ID NO：21）が同じ細胞系列のHLA-DR分子から溶出され、同定されている（表4）。MART-1は腫瘍抗原であることが既に報告されている（Kawakami Y., Eliyahu S. , Delgado C. H., Robbins P. F., Rivoltini L., Topalian S. L., Miki T., Rosenberg S. A.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91： 3515-3519 (1994); Coulie P. G., Brichard V., van Pel A., Woelfel T., Schneider J., Traversari C., Mattei S., de Plaen E., Lurquin C., Szikora J.-P., Renauld J.-C., Boon T., J. Exp. Med. 180： 35-42 (1994)）。
【０１１７】
メラノトランスフェリンタンパク質は、大半の黒色腫細胞系列で発現され、一部では極めて強い発現を示すと評価された（図5）。壊死性Ma-Mel-18a細胞から取り込まれる新しい抗原を同定するために使用した樹状細胞それ自体はメラノトランスフェリンを発現しない。
【０１１８】
正常組織と癌組織のパネルを用いたmRNA発現プロファイリングの結果、メラノトランスフェリンが、評価対象の全正常組織でほとんど認められないが、一部の肺癌では強い発現がみられること、また程度は低いながら結腸癌細胞にも発現がみられることがわかった（図6）。
【０１１９】
特定の腫瘍組織におけるメラノトランスフェリンの特異的な発現、黒色腫細胞におけるその広域発現、および同定されたエピトープのもつT細胞を特異的に活性化する能力に関しては、新たに同定されたメラノトランスフェリンエピトープは、ペプチドワクチン接種用に使用可能な新しい腫瘍抗原としての必要条件を満たしている。
【０１２０】
実施例1
上述の方法（図1）で、黒色腫細胞系列UKRV-Mel-15aに由来する（または同細胞系列によって誘導される）新しいHLA-DR結合腫瘍ペプチドを同定した。黒色腫細胞系列UKRV-Mel-15aそのものはHLA-DR分子を発現しない。
【０１２１】
3x106個の樹状細胞を、黒色腫系列UKRV-Mel-15aの壊死細胞（9x106個）とともにインキュベートし、TNF-α（10 ng/ml）の存在下で24時間培養した。対照として3x106個の樹状細胞をTNF-α（10 ng/ml）のみの存在下で培養した。
【０１２２】
両セットの樹状細胞を界面活性剤TX-100で溶解し、抗DR mAb L243を用いてHLA-DR分子を沈殿させた。HLA-DR結合ペプチドを0.1% TFAで溶出し、MALDI-MSで解析した（図2A）。
【０１２３】
この実施例では、両DC培養物に由来するHLA-DR結合ペプチドをMALDI-MS質量分析で比較し、黒色腫細胞でパルス処理したDCのプロファイルに含まれるペプチドシグナルのみを用いて、続いて行う配列決定によって新しいエピトープの同定した。
【０１２４】
MALDI-MS解析の結果、非パルス処理DCと比較して、パルス処理したDCのスペクトルで見かけ上の質量（m/z）が1820.6である1つの優勢なシグナルの存在が判明した（図2A）。
【０１２５】
MALDI-PSDによる断片化による配列決定の結果、腫瘍抗原ビメンチン（アクセッション番号：P08670；swissprot）に由来する新しいエピトープの存在が判明した（ビメンチン（202〜217）のアミノ酸配列はTLQSFRQDVDNASLAR））（図2B；表1、SEQ ID NO：1）。イオントラップMS-MSによる配列解析の結果、この配列が確認された（図2C）。
【０１２６】
全ペプチドレパートリーを対象とした高処理能イオントラップMS/MS配列決定による解析の結果、同じビメンチンエピトープの長さに関する3種類のバリアントの存在が判明した（表1）（15-merのビメンチン（203〜217）（SEQ ID NO：2）、14-merのビメンチン（203〜216）（SEQ ID NO：3）、および14-merのビメンチン（202〜215）（SEQ ID NO：4））。黒色腫抗原Melan A（51〜65）、CDC27（768〜782）、チロシナーゼ（448〜462）、およびgp100（44〜59）のビメンチンのエピトープの長さに関する4種類のバリアントは、HLA-DR4（DRB1*0401）との結合に適した共通の配列モチーフを共有してもつ（表2）。HLA-DR4との結合は、合成ビメンチン（202〜217）ペプチド、および精製済みのHLA-DR4分子が関与するインビトロ結合アッセイ法で確認することができた（図3）。レポーターペプチドHA（307〜319）に対するそのIC50値によれば、ビメンチン（202〜217）は、CDC-27（768〜782）に対する場合と類似して、HLA-DR4とは高親和性で結合するが（図3B）、DR1（図3A）またはDR5（図3C）とはほとんど結合しない。
【０１２７】
本発明の方法で同定されたビメンチン（202〜217）ペプチドは、HLAクラスII拘束性エピトープに由来する最初のビメンチンである。
【０１２８】
実施例2
この方法でさらに、TNF-αの誘導による成熟、および壊死性黒色腫細胞系列UKRV-Mel-20cによる曝露後に、樹状細胞（DC）のHLA-DR分子と結合するペプチドを同定した。黒色腫細胞系列UKRV-Mel-20cそのものはHLA-DR分子を発現しない。配列の決定は、高処理能イオントラップMS/MS法で行った。
【０１２９】
したがって、5x106個の樹状細胞を、黒色腫系列UKRV-Mel-20cの1.5x107個の壊死細胞とともにインキュベートし、TNF-α（10 ng/ml）の存在下で24時間培養した。対照として5x106個の樹状細胞を、TNF-α（10 ng/ml）のみの存在下で培養した。
【０１３０】
両セットの樹状細胞を界面活性剤TX-100で溶解し、抗DR mAb L243を用いてHLA-DR分子を沈殿させた。HLA-DR結合ペプチドを0.1% TFAで溶出し、LC高処理能イオントラップMS/MS法で解析した。
【０１３１】
非パルス処理DC（対照）から同定されたペプチド配列を、壊死性黒色腫細胞でパルス処理したDCから同定されたペプチド配列と比較した。
【０１３２】
DCのHLA-DR分子に由来する35種類の各ペプチド配列を黒色腫細胞の非存在下で同定し、また40種類のペプチド配列がUKRV-Mel-20c黒色腫細胞の存在下で見出された。ペプチド配列の比較から、21種類のペプチドが同一であり、14種類の配列（11種類のエピトープ）が非パルス処理DCに特異的であり、また17種類の配列（9種類のエピトープ）は、黒色腫細胞によるパルス処理後にのみ提示されることがわかった。
【０１３３】
9つの黒色腫細胞で誘導されたエピトープのうち3種類が、既知の腫瘍マーカータンパク質（翻訳因子eIF-4A1（アクセッション番号：P04765；swissprot）、インターフェロン-ガンマ（IFNガンマ）誘導性p78（アクセッション番号：AAD43063；座位AF135187）、および細胞骨格タンパク質ビメンチン（アクセッション番号：P08670；swissprot））に由来することは重要である（表1）。
【０１３４】
黒色腫抗原としての作用に関してビメンチンが重要であることは、第2のビメンチンエピトープが黒色腫細胞系列UKRV-Mel-20cを用いて同定可能であったという事実で強調される。この場合、ビメンチン（166〜183）（SEQ ID NO：5）とビメンチン（167〜183）（SEQ ID NO：6）の、長さに関する2種類のバリアントが認められた。前者のビメンチンエピトープとは対照的に、ビメンチン（167〜183）は、HLA-DR4に対する結合モチーフを有するだけでなく（表2）、ありふれたHLA-DR結合因子であることが、HLA-DR1（図3A）、HLA-DR4（図3B）、およびHLA-DR5（図3C）に関して中等度〜良好の結合を示すことからわかる。
【０１３５】
壊死性UKRV-Mel-20c黒色腫細胞は、翻訳開始因子eIF-4A1に由来する3種類のペプチドも生じた（表1）。1つのエピトープは、長さに関する2種類のバリアントeIF-4A1（172〜187）（SEQ ID NO：7）とeIF-4A1（172〜186）（SEQ ID NO：8）であり、もう1種類はペプチドeIF-4A1（321〜338）（SEQ ID NO：9）であることがわかっている。
【０１３６】
さらに、インターフェロン誘導性タンパク質p78に由来する、p78（503〜516）（SEQ ID NO：10）とp78（503〜515）（SEQ ID NO：11）の2つのペプチドが、同じエピトープの長さに関するバリアントであることが同定された（表1）。p78タンパク質は現在、前立腺癌との関連が指摘されている。
【０１３７】
したがって、翻訳因子eIF-4A1、IFNガンマ誘導性p78、およびビメンチンに由来する、本発明の方法で同定されたペプチドは、治療法における診断マーカーまたはワクチンとして使用される新たな候補腫瘍抗原となる。
【０１３８】
実施例3
第3の黒色腫細胞系列Ma-Mel-18aを使用して、新しいHLA-DR結合腫瘍ペプチドを同定した。黒色腫細胞系列Ma-Mel-18aそのものはHLA-DR分子を発現しない。
【０１３９】
したがって4x106個の樹状細胞を、黒色腫系列Ma-Mel-18aの1.2x107個の壊死細胞とともにインキュベートし、TNF-α（10 ng/ml）の存在下で24時間培養した。対照として4x106個の樹状細胞をTNF-α（10 ng/ml）のみの存在下で培養した。
【０１４０】
両セットの樹状細胞を界面活性剤 TX-100で溶解し、HLA-DR分子を抗DR mAb L243を用いて沈殿させた。HLA-DR結合ペプチドを0.1% TFAで溶出し、LC高処理能イオントラップMS/MS法で解析した。
【０１４１】
対照（非パルス処理DC）から同定されたペプチド配列を、壊死性Ma-Mel-18aでパルス処理したDCから同定されたペプチド配列と比較した（表3）。Ma-Mel-18a細胞の非存在下では、75種類の自己タンパク質に由来する155種類の自己ペプチド配列が認められた。これらの自己ペプチドのうち22種類は壊死性Ma-Mel-18a細胞に遭遇時に消失したが、165種類の自己ペプチドのうち26種類は対照では認められなかった。Ma-Mel-18a黒色腫細胞によって明瞭に誘導された、これら26種類の自己ペプチドは19種類のタンパク質に由来していた。19種類のタンパク質のうち18種類は、DCのみで、または黒色腫細胞とDCの両方で発現していた。18種類のタンパク質はいずれも、黒色腫または他の腫瘍と関連するという報告はない。
【０１４２】
DCでは発現されないが、Ma-Mel-18a細胞では発現される唯一のタンパク質がメラノトランスフェリン（アクセッション番号：P08582；swissprot）であった。p97（688〜684）（SEQ ID NO：12）とp97（688〜683）（SEQ ID NO：13）の、同じp97エピトープについて長さに関する2種類のバリアントが同定された（表1）。
【０１４３】
p97は、よく知られた黒色腫マーカータンパク質であるが、p97に由来する腫瘍抗原ペプチドは、これまで報告されていなかった。
【０１４４】
上述の両ビメンチンエピトープに類似して（表1および表2）、p97エピトープは、P1アンカー、P4アンカー、P6アンカー、およびP9アンカーとしてそれぞれ機能する、HLA-DR4のペプチド結合モチーフ（L-672、D-675、T-677、およびA-680）を含む（表2）。この事実と矛盾することなく、p97（668〜683）はHLA-DR4と高親和性で結合する（図3B）。さらにp97は、HLA-DR1（図3A）およびHLA-DR5（図3C）と中等度の親和性で結合する。
【０１４５】
以上の結果とさらに一致して、p97ペプチドの同定に至ったDCはHLA-DR4およびHLA-DR1を発現していた。したがって、本明細書に記載されたp97エピトープは、さまざまなHLA-DR対立遺伝子に関連して使用することができる。
【０１４６】
黒色腫組織におけるメラノトランスフェリンの広域発現に関しては（Palmieri G et al., J. Clin. Oncol. 1999; 17, 304-311）、メラノトランスフェリンエピトープは腫瘍抗原の候補として作用する可能性がある。
【０１４７】
したがって、MHCクラスIIおよびCD4+ T細胞が関与する免疫応答に至るメラノトランスフェリンに基づくペプチドワクチンは、メラノトランスフェリンを発現する腫瘍の治療法に極めて適しているはずである。
【０１４８】
（表１）黒色腫細胞によって誘導されるHLA-DR結合ペプチド抗原
2006518982.tif 000006
a 樹状細胞をパルス処理するための壊死後に使用した黒色腫細胞系列の名称。
b 黒色腫細胞由来ペプチドの配列（1文字コードで表記）。
c タンパク質配列中のエピトープの位置。
【０１４９】
（表２）HLA-DR4の結合モチーフ（DRB1*0401）を共有する黒色腫細胞由来のペプチド抗原
2006518982.tif 000007
a ペプチドの配列は1文字コードで表記し、HLA-DR4のペプチド結合モチーフ（DRB1*0401）にしたがって並べた：
P1アンカー＝W、Y、F、I、L、V；P4アンカー＝D、E；P6アンカー＝T、S、A；P9アンカー＝A、S、G。
P1〜P9を含むコアエピトープ領域に下線を付した。
b R-F. Wang, Trends in Immunology 22, 269-276 (2001)
c N. Renkvist et al., Cancer Immunol. Immunother. 50, 3-15 (2001)
【０１５０】
（表３）壊死性Ma-Mel-18aの非存在下および存在下におけるDCのHLA-DR結合ペプチドのレパートリー（DRB1*0101/DRB1*0401）
2006518982.tif 000008
a 同定されたペプチドを生じるタンパク質の数。
b Ma-Mel-18a細胞の非存在下でのみ、または存在下でのみ認められるペプチドまたはタンパク質の数。
【０１５１】
（表４）HLA-DR4陽性黒色腫細胞系列UKRV-Mel-17のMHCクラスII分子から溶出された黒色腫結合タンパク質のMHCクラスII拘束性エピトープ
2006518982.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
（図１）使用した手法を説明するダイヤグラム。最も特殊化した抗原提示細胞（APC）である樹状細胞（DC）に、抗原供給源（例えば壊死性黒色腫細胞）を、抗原の取り込みおよびプロセシングに最適な条件で接触させる。対照としてDCを同じ条件で、黒色腫細胞抗原の非存在下で培養する。DCを成熟後に、抗原と結合したMHCクラスII分子を精製し、個々のMHCクラスII結合抗原ペプチドを単離して同定する。
（図２Ａ）擬似処理された樹状細胞（上のパネル）から、または壊死性黒色腫細胞系列UKRV-Mel-15aでパルス処理された成熟樹状細胞（下のパネル）から単離された、HLA-DRと結合するペプチドのレパートリーの代表的なMALDI質量分析解析。印を付けたピークは、黒色腫細胞との接触時にプロファイルで顕著に認められるペプチドのピーク（M+H+；1820.6）である。
（図２Ｂ）実験的質量（M+H+）が1820.6を示すペプチドのMALDI-PSD断片化スペクトル。このペプチドは壊死性黒色腫細胞によって誘導された（図2A）。データベースの検索により、ビメンチンのエピトープ（202〜217）であることがわかった（表1参照）。
（図２Ｃ）実験的質量（M+H+）が1820.6を示すペプチドのイオントラップMS-MSスペクトル。このペプチドは壊死性黒色腫細胞によって誘導された（図2A）。データベースの検索により、ビメンチンのエピトープ（202〜217）が同定された（表1参照）。
（図３）図3A〜Cは、さまざまなHLA-DR対立遺伝子産物に関してビメンチンおよびメラノトランスフェリンに由来する候補腫瘍抗原の結合能力に差があることを示す。記載されたペプチドは、精製されたHLA-DR分子およびビオチン化HA（307〜319）ペプチドをレポーターとして用いるインビトロペプチド結合アッセイ法で解析した。親和性の尺度として、ビオチン化されたインフルエンザウイルスの赤血球凝集素HA（307〜319）ペプチドの結合を競合によって50%低下させるために必要なペプチド濃度（IC50）を決定した。図に示した逆数（1/IC50）はペプチドの親和性と直接相関する。比較目的のために、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素に由来するHA（307〜319）、複数のHLA-DR対立遺伝子と無差別に結合することが知られている腫瘍抗原NY-ESO（115〜132）（Zarour HM et al., Cancer Research 2002; 62, 213-218）、およびCDC-27（768〜782）（表2参照）を含めた。IC50値をHLA-DR1（図3A）、HLA-DR4（図3B）、およびHLA-DR5（図3C）に関して決定した。
（図４）メラノトランスフェリンに由来する同定エピトープに対して生じたT細胞系列の特異的応答を示す。自家樹状細胞をLPS（1 μg/ml）で活性化させ、またインバリアント鎖に由来する20 μMの対照ペプチド
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またはメラノトランスフェリンのペプチド（MTF；SEQ ID NO：13）で24時間パルス処理するか、またはパルス処理を行わなかった。T細胞応答を、IFN-γ（TH1応答）またはIL-4（TH2応答）を対象としたサンドイッチイムノアッセイ法で測定した。
（図５）黒色腫細胞（UKRV-Mel-15a、Ma-Mel-18a、UKRV-Mel-17（Eichmuller S, Usener D, Jochim A, Schadendorf D., Exp Dermatol. 2002 Aug; 11 (4): 292-301））、ならびに未成熟樹状細胞（IM DC）、および成熟樹状細胞（Mat DC）（1 μg/mlのLPSで活性化）のパネル上における、メラノトランスフェリンタンパク質の細胞表面における発現を示す。メラノトランスフェリンに対するmAb L235（5 μg/ml）を細胞の染色に使用した。細胞表面における発現の強度を、特異的蛍光指標（SFI）（特異的シグナルの幾何学的平均/アイソタイプ対照の幾何学的平均）として表す。
（図６）さまざまな癌および正常組織におけるメラノトランスフェリンの単一標的発現プロファイリング（single target expression profiling; STEP）を示す。発現レベルを、8種類のハウスキーピング遺伝子のパネルに対するメラノトランスフェリンmRNAの相対発現に基づく任意の単位で表す。点線は、評価した全正常組織におけるメラノトランスフェリンの発現の平均を示す。
【図１】
2006518982.tif 000011
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2006518982.tif 000013
【図２Ｃ】
2006518982.tif 000014
【図３Ａ】
2006518982.tif 000015
【図３Ｂ】
2006518982.tif 000016
【図３Ｃ】
2006518982.tif 000017
【図４】
2006518982.tif 000018
【図５】
2006518982.tif 000019
【図６】
2006518982.tif 000020
【配列表】
2006518982000001.app
【国際調査報告】
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2006518982.tif 000022
2006518982.tif 000023
2006518982.tif 000024
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