(57)【要約】アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕをコードするポリヌクレオチドを単離し、クローニングし、配列決定した。ＨＥＲ２／ｎｅｕをコードする遺伝子は、一般に上皮由来のヒト癌の発症を伴う。本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕの異常発現が癌又はその発症を伴う場合に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原によって発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起する又は増強するための組成物及び方法を提供する。本発明は、特に、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕを担持するアデノウイルスベクター構築物を提供し、癌を予防及び治療するためのワクチン及び医薬組成物におけるそれらの使用を開示する。
2006525787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４１に示すアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチドの配列が、配列番号１、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４３に示すヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること；及び
（ｂ）前記宿主細胞を、前記アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること
を含む、組換え宿主細胞においてアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するための方法。
【請求項７】
配列番号２又は配列番号４１に示すアミノ酸の配列を含む、単離し、精製したアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２又は配列番号４１に示すアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子を含有するワクチンクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、癌を予防する又は治療する方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターがアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、プラスミド部分及び発現カセットを含み、
前記発現カセットは、
（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む
プラスミドワクチンベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｅ１領域内の欠失及びＥ１領域内のインサートを有し、
前記インサートは、
（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含有する
アデノウイルスゲノムを含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項１３】
プラスミド部分及び発現カセット部分を含有し、
前記発現カセット部分は、
（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む、ワクチンプラスミド。
【請求項１４】
（ａ）哺乳動物に、
（ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む第一ベクターを導入すること；
（ｂ）あらかじめ定められた時間を経過させること；及び
（ｃ）前記哺乳動物に、
（ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む第二ベクターを導入すること
を含む、哺乳動物を癌から保護する方法。
【請求項１５】
前記第一ベクターがプラスミドであり、及び前記第二ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一ベクターがアデノウイルスベクターであり、及び前記第二ベクターがプラスミドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）上皮由来の癌に罹患している哺乳動物に、
（ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む第一ベクターを導入すること；
（ｂ）あらかじめ定められた時間を経過させること；及び
（ｃ）前記哺乳動物に、
（ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
を含む第二ベクターを導入すること
を含む、上皮由来の癌に罹患している哺乳動物を治療する方法。
【請求項１８】
前記第一ベクターがプラスミドであり、及び前記第二ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第一ベクターがアデノウイルスベクターであり、及び前記第二ベクターがプラスミドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一及び第二ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に癌の検出及び治療に関する。特に、本発明は、腫瘍関連ポリペプチドＨＥＲ２／ｎｅｕのアカゲザルホモログ、このタンパク質をコードする単離核酸分子、及びこのタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター及び宿主に関する。本発明はまた、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕを担持するアデノウイルスベクター構築物、及び癌を予防及び治療するためのワクチン及び医薬組成物におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、典型的には、増殖因子及びそれらの受容体、癌遺伝子及び癌抑制遺伝子などの、細胞周期を維持する又は細胞増殖を制御することに寄与する遺伝子の調節不全を含む。これらの遺伝子の多くの産物は様々な腫瘍細胞の表面で発現され、従って、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と命名された。最近の証拠は、免疫応答を惹起することができる腫瘍関連抗原の存在を裏付けており、これらの分子はワクチン療法のための標的となっている。これらの遺伝子産物の多くは、より低いレベルではあるが、正常細胞でも発現されるので、腫瘍関連抗原を標的する多くの癌ワクチンは、免疫寛容の故に無効であることが証明された。
【０００３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌原遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ−２とも呼ばれる）の産物は、上皮増殖因子受容体ファミリーの成員である膜貫通ＴＡＡである。ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子は、最初にラット神経膠芽細胞腫からクローン化され（Ｓｈｉｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：２６１−２６４（１９８１））、後にヒト細胞から単離されて、特性決定された（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−３９（１９８５）；Ｋｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４−７６（１９８５））。現在まで、ＨＥＲ２／ｎｅｕのサルホモログは得られていない。
【０００４】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、細胞増殖と分化に関与する４つの受容体から成る、受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファミリーの成員としてさらに分類されてきた。ＨＥＲ受容体は、二量体として増殖因子リガンドに結合し、最終的に細胞増殖において重要な遺伝子の活性化を生じさせる細胞内シグナル伝達カスケードを開始させることにより、正常な細胞増殖を維持することに寄与する。幾つかのリガンドがＨＥＲファミリーの他の成員について特定されているが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体についての高親和性リガンドはまだ発見されていない（ＬｏｈｒｉｓｃｈとＰｉｃｃａｒｔ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８（６）：補遺１８：３−１１（２００１））。
【０００５】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ転写産物及びコードされる１８５ｋＤタンパク質の低いレベルの発現が、皮膚及び乳房、及び胃腸管、生殖路及び尿路の組織を含む、様々な組織の健常成人上皮細胞において検出された（Ｐｒｅｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９６３−９６２（１９９０））。より高いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現も、胚発生期の対応する胎児組織において検出された（Ｐｒｅｓｓら、前出）。
【０００６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、一般に乳癌、卵巣癌、子宮癌、結腸癌及び前立腺癌、及び肺の腺癌などの様々な悪性疾患において過剰発現される又は増幅される（ＤｉｓｉｓとＣｈｅｅｖｅｒ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１：３４３−３７１（１９９７）において総説されている）。ＨＥＲ２／ｎｅｕのこのような過剰発現は、癌患者についての予後不良及びより高い再発率と相関している（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２（１９８９））。
【０００７】
ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現に関連した悪性疾患に罹患している多くの癌患者は、以前にＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物に対して免疫応答を生じたことがあり、従ってＨＥＲ２／ｎｅｕは癌治療薬の開発のための免疫学的標的となっている。ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するこの免疫応答を利用した有効なワクチンは、この免疫を防御及び／又は予防的なレベルまで高め、自己寛容を克服するに違いない。
【０００８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、種々の悪性疾患の免疫学的治療の開発のための標的として提案されてきた。種々の抗ＨＥＲモノクローナル抗体が乳癌のための治療として検討されており、各々の抗体が様々なレベルの成功を明らかにしている（考察については、Ｙａｒｄｅｎ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１（補遺２）：１−１３（２００１）参照）。Ａｍｉｃｉら（米国特許第６，１２７，３４４号）は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターに機能的に連結された完全長ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡを含むベクターを投与することによってＨＥＲ２／ｎｅｕに対する免疫を誘導するための方法を開示している。ＣｈｅｅｖｅｒとＤｉｓｉｓは、ＨＥＲ２ペプチドでＨＥＲ２／ｎｅｕに関連する癌に対してヒトを免疫するための方法を開示している（米国特許第５，８４６，５３８号）。加えて、ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドに基づくワクチンがげっ歯動物モデルにおいて試験されている（総説については、ＤｉｓｉｓとＣｈｅｅｖｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１：３４３−３７１（１９９７）参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したＨＥＲ２／ｎｅｕクローンの特定にもかかわらず、有効であり且つ自己寛容によって妨げられない癌ワクチンの開発を可能にする、ＨＥＲ２／ｎｅｕをコードするさらなる哺乳動物遺伝子を特定することは極めて望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、配列番号２又は配列番号４１に示す新規アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質（ｃ−ｅｒｂＢ−２とも呼ばれる、以下ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕと称する）をコードするヌクレオチドの配列を含む単離又は精製核酸分子に関する。ここで開示するＤＮＡ分子は、選択宿主細胞にトランスフェクトしてもよく、前記組換え宿主細胞は、実質的なレベルの、発現される機能性ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質（配列番号２又は配列番号４１）のためのソースを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、新規アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする単離核酸分子に関する。このＤＮＡ分子は、ここで配列番号１として開示するヌクレオチド配列を含む。本発明のこの部分の好ましい側面は図１に開示されており、図１は、新規ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質（配列番号２）をコードするＤＮＡ分子（配列番号１）を示す。
【００１２】
本発明はまた、新規アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする単離核酸分子を提供する。このＤＮＡ分子は、ここで配列番号４０として開示するヌクレオチド配列を含む。本発明のこの部分の好ましい側面は図５に開示されており、図５は、新規ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質（配列番号４１）をコードするＤＮＡ分子（配列番号４０）を示す。
【００１３】
本発明はまた、本明細書全体を通じて開示する核酸分子を含む、原核及び真核生物の両方の、組換えベクター及び組換え宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明はさらに、（ａ）配列番号１又は配列番号４０に示す核酸を含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること；及び（ｂ）前記宿主細胞を、前記アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、を含む、組換え宿主細胞においてアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するための方法に関する。
【００１５】
本発明の１つの好ましい側面は、図２に開示するアミノ酸配列（配列番号２）から成る、実質的に精製された形態のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質である。
【００１６】
本発明の１つの好ましい側面は、図６に開示するアミノ酸配列（配列番号４１）から成る、実質的に精製された形態のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質である。
【００１７】
本発明のさらにもう１つの好ましい側面は、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現する、配列番号１又は配列番号４０に示すヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターを含有する組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、完全にプロセシングされた（タンパク質分解プロセシング、グリコシル化及び／又はリン酸化を含む）成熟ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に関する。前記組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞系などの真核生物宿主細胞であることが特に好ましい。
【００１８】
本発明のもう１つの側面は、配列番号２又は配列番号４１に示すアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子を含有するワクチンクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、癌を予防する又は治療する方法である。
【００１９】
本発明はさらに、Ｅ１及びＥ３領域内の欠失及びＥ１領域内のインサートを有するアデノウイルスゲノムを含み、前記インサートは、（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む発現カセットを含有する、アデノウイルスワクチンベクターに関する。
【００２０】
本発明はまた、プラスミド部分及び発現カセット部分を含有し、前記発現カセット部分は、（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含むワクチンプラスミドに関する。
【００２１】
本発明のもう１つの側面は、（ａ）癌に羅患している哺乳動物に、ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む第一ベクターを導入すること；（ｂ）あらかじめ定められた時間を経過させること；及び（ｃ）前記哺乳動物に、ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む第二ベクターを導入すること、を含む、哺乳動物を癌から保護する又は癌に罹患している哺乳動物を治療する方法である。
【００２２】
本明細書全体及び付属の特許請求の範囲において使用するとき、単数形態の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる指示を命じない限り、複数の言及を包含する。
【００２３】
本明細書全体及び付属の特許請求の範囲において使用するとき、以下の定義及び略語が適用される。
【００２４】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、転写活性を開始させ、駆動するためにＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成する。前記複合体は、「エンハンサー」と称される活性化配列又は「サイレンサー」と称される抑制配列によって修飾され得る。
【００２５】
「カセット」という用語は、発現されるべき核酸配列を含む本発明の配列を指す。前記カセットは、概念においてはカセットテープに類似し、各々のカセットはそれ自身の配列を有する。従って、カセットを交換することにより、ベクターは異なる配列を発現する。５’及び３’末端の制限部位の故に、カセットは容易に挿入する、除去する又はもう１つ別のカセットと置換することができる。
【００２６】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主組織に導入することができる何らかの手段を指す。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージ及びコスミドを含む様々な種類のベクターが存在する。
【００２７】
アデノウイルスベクターに関して使用するとき「第一世代」という用語は、複製欠損である前記アデノウイルスベクターを表わす。第一世代アデノウイルスベクターは、典型的には欠失又は不活性化Ｅ１遺伝子領域を有し、好ましくは欠失又は不活性化Ｅ３遺伝子領域を有する。
【００２８】
「ｐＭＲＫＡｄ５−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ」との名称は、Ｅ１及びＥ３領域の欠失したＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む、ここで開示するプラスミド構築物を指す。このプラスミドでは、Ｅ１領域は、イントロンＡを伴わずにヒトＣＭＶプロモーターの制御下にあり、続いてウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが続く、Ｅ１と平行する方向のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕによって置換されている。
【００２９】
「ＭＲＫＡｄ５−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ」との名称は、制限及びＰｅｒ．Ｃ６又はＨＥＫ２９３などのＥ１発現細胞系統へのトランスフェクションによるプラスミド配列の除去後にプラスミドｐＭＲＫＡＤ５−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕから生成されるウイルスを指す。
【００３０】
「ｐＶ１Ｊ−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ」との名称は、ヒトＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター及びイントロンＡ、完全長アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化及び転写終結配列、及び最小ｐＵＣ骨格を含む、ここで開示するプラスミド構築物を指す。
【００３１】
「ｒｈＨＥＲ２＃１」という用語と交換可能に使用される、「第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＤＮＡ配列」という用語は、ここで実施例１において特定及び単離され、配列番号１に示されているアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ配列を指す。この配列を翻訳して、配列番号２に示す「第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質」のアミノ酸配列を決定した。
【００３２】
「ｒｈＨＥＲ２＃２」という用語と交換可能に使用される、「第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＤＮＡ配列」という用語は、ここで実施例４において特定及び単離され、配列番号４０に示されているアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ配列を指す。このＤＮＡ分子は、実施例１で述べるＤＮＡ分子とは異なるアカゲザルから単離された。この配列を翻訳して、配列番号４１に示す「第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質」のアミノ酸配列を演繹した。ｒｈＨＥＲ２＃１とｒｈＨＥＲ２＃２ヌクレオチド及びアミノ酸配列の間の相違は図７において詳細する。
【００３３】
「有効量」という用語は、免疫応答が生じるように、適切なレベルのポリペプチドを生産するのに十分なワクチン組成物を導入することを意味する。当業者は、このレベルが異なり得ることを認識する。
【００３４】
「他の核酸を実質的に含まない」とは、他の核酸を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらに一層好ましくは９９．９％含まないことを意味する。交換可能に使用される、「他の核酸を実質的に含まない」、「実質的に精製された」、「単離核酸」又は「精製核酸」という用語はまた、他の細胞成分を除去して精製されたアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質についてのコード領域を含むＤＮＡ分子を指す。従って、他の核酸を実質的に含まないアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕＤＮＡ試料は、その総核酸のパーセントとして、非アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ核酸を１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、さらに一層好ましくは０．１％しか含まない。所与のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕＤＮＡ試料が他の核酸を実質的に含まないかどうかは、例えば適切な染色法、例えば臭化エチジウム染色、と組み合わせたアガロースゲル電気泳動、などの核酸純度を評価する従来の手法によって、又は配列決定によって判定することができる。
【００３５】
「他のタンパク質を実質的に含まない」又は「実質的に精製された」とは、他のタンパク質を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらに一層好ましくは９９．９％含まないことを意味する。従って、他のタンパク質を実質的に含まないアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質試料は、その総タンパク質のパーセントとして、非アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、さらに一層好ましくは０．１％しか含まない。所与のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質試料が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかは、例えば適切な検出法、例えば銀染色又は免疫ブロット法、と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、などのタンパク質純度を評価する従来の手法によって判定することができる。
【００３６】
交換可能に使用されるとき、「他のタンパク質を実質的に含まない」又は「実質的に精製された」又は「単離アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質」又は「精製アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質」という用語はまた、天然ソースから単離されたアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を指す。「単離」又は「精製」という用語の使用は、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質がその通常の細胞環境から取り出されていることを指示する。従って、単離アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、無細胞溶液中に存在し得る又はそれが天然に生じるのとは異なる細胞環境に置かれ得る。単離という用語は、単離アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質が存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、単離アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質が、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質がインビボで天然に結合している他のタンパク質及び非アミノ酸物質（例えば核酸、脂質、炭水化物）を実質的に含まないことを意味する。従って、原核生物又は真核生物細胞において組換え発現され、天然では（すなわち介入処置なしでは）このｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現しないこの宿主細胞から実質的に精製されたアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、言うまでもなく、ここで言及する状況下での「単離アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質」である。前述したように、単離又は精製ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質であるｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質試料は、実質的に他のタンパク質を含まず、及びその総タンパク質のパーセントとして、非アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、さらに一層好ましくは０．１％しか含まない。
【００３７】
「保存的アミノ酸置換」は、もう１つ別の、化学的に類似するアミノ酸残基による１個のアミノ酸残基の置換を指す。このような保存的置換の例は、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）によるもう１つ別の疎水性残基の置換；１個の極性残基による同じ電荷のもう１つ別の極性残基の置換（例えばアルギニンによるリシンの置換；グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換）である。
【００３８】
「哺乳動物」という用語は、ヒトを含む何らかの哺乳動物を指す。
【００３９】
「Ａｇ」という略語は、抗原を指す。
【００４０】
「Ａｂ」及び「ｍＡｂ」という略語は、それぞれ抗体及びモノクローナル抗体を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原をコードする遺伝子は、一般に上皮由来のヒト癌の発現を伴う。本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕの異常発現が癌又はその発症を伴う場合に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原によって発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起する又は増強する組成物及び方法に関する。ＨＥＲ２／ｎｅｕの異常発現と癌との随伴は、ＨＥＲ２／ｎｅｕの異常発現は腫瘍の発症時に存在し、腫瘍が進行した後期には検出できないことがあるので、腫瘍発現の全ての時点でＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質が腫瘍組織において発現されることを必要としない。
【００４２】
この目的ために、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の分子は、細胞媒介性免疫を通して上皮由来の癌に対する有効な免疫予防を提供するための組換えアデノウイルスワクチンにおいて使用し得る。インビボで脊椎動物に直接導入するとき、本発明のポリヌクレオチドは、霊長動物、イヌ及びヒトなどの哺乳動物を含む動物の体内でコードされるタンパク質の発現を誘導する。
【００４３】
本発明は、配列番号２に示す新規ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明はまた、配列番号４１に示す新規ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子に関する。本発明の核酸分子は実質的に他の核酸を含まない。
【００４４】
本発明の単離核酸分子は、一本鎖（コード又は非コード鎖）又は二本鎖であり得る、ゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、並びに合成一本鎖ポリヌクレオチドなどの合成ＤＮＡを包含し得る。本発明の単離核酸分子はまた、リボ核酸分子（ＲＮＡ）を包含し得る。大部分のクローニングのために、ＤＮＡは好ましい核酸である。
【００４５】
本発明の好ましいＤＮＡ分子は、図２に示す、配列番号２として表わされるアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする、図１に示す、ここで配列番号１として開示するヌクレオチド配列を含む。このｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ核酸分子は、実施例１で詳細に述べるＲＴ−ＰＣＲを通して特定された。配列番号１の７９５位の「Ｒ」の存在は、第一アカゲザルから単離されたクローンがその位置にＡ又はＧのいずれかを含んでいたことを指示する。第一アカゲザルから単離された、７９５位に「Ａ」を含む核酸分子をここでは配列番号４２と称する。第一アカゲザルから単離された、７９５位に「Ｇ」を含む核酸分子をここでは配列番号４３と称する。
【００４６】
第二の好ましいＤＮＡ分子は、図６に示す、配列番号４１として表わされるアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする、図５に示す、ここで配列番号４０として開示するヌクレオチド配列を含む。前記単離ｃＤＮＡクローン、関連ベクター、宿主、組換え細胞画分及び膜、及び発現された成熟形態のｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕは、癌ワクチンの開発のために有用である。
【００４７】
本発明はまた、新規ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする、配列番号１又は配列番号４０の生物活性断片又は突然変異株を包含する。このような生物活性断片及び／又は突然変異株は、配列番号２及び配列番号４１に示すｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を含むがこれらに限定されない、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の薬理特性を少なくとも実質的に模倣するタンパク質又はタンパク質断片のいずれかをコードする。このようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端トランケーション及びカルボキシ末端トランケーションを含むが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の突然変異株は、癌ワクチンの開発において有用であるように真核細胞において機能性ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４８】
本発明はまた、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号４０のヌクレオチド配列とは有意に異なるが、まだ配列番号２又は配列番号４１と同じｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする場合の、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする合成ＤＮＡに関する。このような合成ＤＮＡは本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００４９】
従って、本発明は、同一タンパク質を発現する数多くのＤＮＡ分子を生じ得るコドンの重複性を開示する。本明細書のために、１またはそれ以上の置換されたコドンを担持する配列を縮重変異と定義する。また、発現されるタンパク質の最終物理特性を実質的に変化させない、ＤＮＡ配列又は翻訳されたタンパク質のいずれかにおける突然変異も、本発明の範囲内に包含される。例えばバリンによるロイシン、アルギニンによるリシン又はアスパラギンによるグルタミンの置換は、ポリペプチドの機能性に変化を生じさせないと考えられる。
【００５０】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然で生じるペプチドのものとは異なる性質を有するペプチドをコードするように変化させ得ることが知られている。ＤＮＡ配列を変化させる方法は、部位指定突然変異誘発を含むが、これに限定されない。変化する性質の例は、基質に対する酵素の親和性又はリガンドに対する受容体の親和性の変化を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
ストリンジェント条件下で配列番号１又は配列番号４０にハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発明に包含される。例として、限定ではなく、高ストリンジェンシーの条件を使用する手順は以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液中６５℃で２時間から一晩実施する。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５−２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中６５℃で１２から４８時間ハイブリダイズさせる。２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行う。これに続いて０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供する。高ストリンジェンシー条件を使用する他の手順は、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド中４２℃で１２から４８時間実施するハイブリダイゼーション工程又は０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中６５℃で３０から６０分間実施する洗浄工程を含む。
【００５２】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを実施するための前記手順で述べた試薬は、当技術分野において周知である。これらの試薬の組成物の詳細は、例えば本明細書中に参考として援用されているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に認められる。前記に加えて、使用し得る高ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野において周知である。
【００５３】
本発明の１つの好ましい側面は、図２（配列番号２）に開示するアミノ酸の配列を含むアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の実質的に精製された形態である。
【００５４】
本発明のもう１つの好ましい側面は、図６（配列番号４１）に開示するアミノ酸の配列を含むアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の実質的に精製された形態である。
【００５５】
本発明はまた、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインなどの、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕの様々な機能性ドメイン、及びこれらの配列の少なくとも１つを含むハイブリッド分子に関する。
【００５６】
本発明はまた、それらの変異が癌ワクチンの開発のために有用である診断、治療又は予防用途のタンパク質又はタンパク質断片を提供するような、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端トランケーション及びカルボキシ末端トランケーションを含む、必ずしもこれらに限定されない、配列番号２又は配列番号４１に示すアミノ酸配列を含む、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の生物活性断片及び／又は突然変異株を包含する。
【００５７】
本発明のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、「成熟」タンパク質の形態であるか、又は融合タンパク質などのより大きなタンパク質の部分であり得る。分泌又はリーダー配列、プロ配列、多数のヒスチジン残基などの精製を助ける配列、又は組換え生産の間の安定性のための付加的な配列を含む、付加的アミノ酸配列を含むことがしばしば好都合である。
【００５８】
本発明はまた、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）、ＭＹＣエピトープ、ＣＳＴ及びＦｃを含むがいかなる意味においてもこれらに限定されない、様々なマーカーに連結されたアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の部分を発現する融合構築物を含むが、これらに限定されない、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ融合構築物に関する。このような融合構築物は、対象細胞系において発現させ、ここで開示するアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の調節因子に関してスクリーニングするために使用し得る。
【００５９】
本発明はさらに、本明細書全体を通じて開示する実質的に精製された核酸分子を含む組換えベクターに関する。これらのベクターはＤＮＡ又はＲＮＡで構成され得る。クローニングの殆んどの目的のためには、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、及びｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードすることができるエピソーム又は組込みＤＮＡの他の形態を含む。個々の遺伝子導入又は他の用途のために適切なベクターを決定することは十分に当業者の理解範囲内である。
【００６０】
ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕの発現のために使用し得る。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特に設計されたプラスミド又はウイルスを含み得るが、これらに限定されない。また、所望に応じて細菌細胞において組換えｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するために、様々な細菌発現ベクターを使用し得る。加えて、真菌細胞において組換えｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するために、様々な真菌細胞発現ベクターを使用し得る。さらに、昆虫細胞において組換えタンパク質を発現するために、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用し得る。
【００６１】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換した又はトランスフェクトした宿主細胞に関する。組換え宿主細胞は、Ｅ．コリなどの細菌、酵母などの真菌細胞、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯動物起源の細胞系統を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞、及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）及びカイコ由来の細胞系統を含むがこれらに限定されない昆虫細胞を含むが、これらに限定されない、原核又は真核細胞であり得る。このような組換え宿主細胞は、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ又は生物学的等価形態を生産するために適切な条件下で培養することができる。
【００６２】
前述したように、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕの発現のために使用し得る。従って、本発明のもう１つの側面は、（ａ）配列番号１又は配列番号４０に示す核酸を含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること；及び（ｂ）前記宿主細胞を、前記アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、を含む、組換え宿主細胞においてアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現するための方法である。
【００６３】
宿主細胞におけるｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕの発現後、活性形態のｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を提供するためにｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を回収し得る。幾つかのｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質精製手順が使用可能であり、使用に適する。組換えｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組合せ又は個別適用によって細胞溶解産物及び抽出物から精製し得る。加えて、組換えｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、完全長ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質又はｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体で作製した免疫アフィニティーカラムの使用によって他の細胞タンパク質から分離することができる。
【００６４】
本発明の核酸は、ヒト細胞における前記タンパク質の効率的な発現を提供するように設計された配列を含む発現カセットに構築し得る。前記カセットは、好ましくは完全長ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子を、プロモーター及び終結配列などの、それに作動可能に連結された関連転写及び翻訳制御配列と共に含む。１つの好ましい実施態様では、前記プロモーターは、イントロンＡ配列を伴わないサイトメガロウイルスプロモーターであるが、当業者は、強力な免疫グロブリン又は他の真核生物遺伝子プロモーターなどの多くの他の公知のプロモーターのいずれもが使用し得ることを認識する。好ましい転写ターミネーターはウシ成長ホルモン終結因子であるが、他の公知の転写ターミネーターも使用し得る。ＣＭＶ−ＢＧＨターミネーターの組合せは特に好ましい。
【００６５】
本発明によれば、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ発現カセットをベクターに挿入する。前記ベクターは、好ましくはアデノウイルスベクターであるが、プロモーターに連結された線状ＤＮＡ、又はアデノ関連ウイルス又は改変ワクシニアウイルスベクターなどの他のベクターも使用し得る。
【００６６】
選択するベクターがアデノウイルスである場合は、いわゆる第一世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能性Ｅ１遺伝子領域、好ましくは欠失アデノウイルスＥ１領域を有することを特徴とする。一部の実施態様では、アデノウイルスＥ１遺伝子が通常位置する部位に発現カセットを挿入する。加えて、これらのベクターは、場合により、非機能性又は欠失Ｅ３領域を有する。使用するアデノウイルスゲノムは、Ｅ１及びＥ３領域の両方を欠失している（△Ｅ１△Ｅ３）ことが望ましい。前記アデノウイルスを、２９３細胞又はＰＥＲＣ．６細胞などのウイルスＥ１遺伝子を発現する公知の細胞系統において、又は余分の（ｅｘｔｒａ）タンパク質を発現するように一過性に又は安定に形質転換された２９３又はＰＥＲＣ．６細胞に由来する細胞系統において増殖させることができる。例えばテトラサイクリン調節可能プロモーター系などの制御された遺伝子発現を有する構築物を使用するとき、前記細胞系統は、調節系に関与する成分を発現し得る。このような細胞系統の一例はＴ−Ｒｅｘ−２９３であり、他は当技術分野において公知である。
【００６７】
アデノウイルスベクターの操作上の便利さのために、アデノウイルスはシャトルプラスミド形態であり得る。本発明はまた、プラスミド部分及び、Ｅ１欠失及び場合によりＥ３欠失を有し、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕを含む発現カセットが挿入されたアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルス部分を含む、シャトルプラスミドベクターを対象とする。好ましい実施態様では、アデノウイルスベクターが容易に除去できるように、プラスミドのアデノウイルス部分に隣接する制限部位が存在する。前記シャトルプラスミドは、原核細胞又は真核細胞において複製し得る。
【００６８】
本発明の好ましい実施態様では、発現カセットをｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミドに挿入する（本明細書中に参照により組み込まれる、Ｅｍｉｎｉら、国際公開広報第ＷＯ０２／２２０８０号参照）。このプラスミドは、Ｅ１及びＥ３領域を欠失したＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計は、ウイルスパッケージングを最適化する上で重要であることが認められたエレメントを組み込むために５’シス作用性パッケージング領域をさらにＥ１遺伝子にまで延長することにより、先行アデノウイルスに比べて改善されており、高いウイルス増幅をもたらす。好都合には、この強化されたアデノウイルスベクターは、高い継代増殖後も遺伝的安定性を維持することができる。
【００６９】
ＤＮＡ構築物を作製し、精製するための分子生物学の標準手法は、本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミド及びＤＮＡ免疫原の作製を可能にする。
【００７０】
前述したベクターは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現異常に関連する上皮由来の癌の発現を予防するため及び／又は既存の癌を治療するための免疫原性組成物及びワクチンにおいて使用し得る。このために、本発明の１つの側面は、配列番号２又は配列番号４１に示すアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子を含有するワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、癌を予防する又は治療する方法である。
【００７１】
前述した方法によれば、前記ワクチンベクターは、哺乳動物における癌の治療又は予防のために投与し得る。本発明の１つの好ましい実施態様では、前記哺乳動物はヒトである。
【００７２】
さらに、当業者は、前述した治療及び予防方法における使用のためにいかなる種類のベクターも選択し得る。好ましくは、前記ベクターはアデノウイルスベクター又はプラスミドベクターである。本発明の１つの好ましい実施態様では、前記ベクターは、アデノウイルスＥ１領域内の欠失、及び（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む発現カセットを含有するアデノウイルスＥ１領域内のインサートを有するアデノウイルスゲノムを含む、アデノウイルスベクターである。
【００７３】
本発明はさらに、Ｅ１領域内の欠失、及び（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む発現カセットを含有するＥ１領域内のインサートを有するアデノウイルスゲノムを含む、アデノウイルスワクチンベクターに関する。
【００７４】
本発明のこの側面の１つの好ましい実施態様では、前記アデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターである。
【００７５】
もう１つの側面では、本発明は、プラスミド部分、及び（ａ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む発現カセット部分を含有する、ワクチンプラスミドに関する。
【００７６】
本発明の一部の実施態様では、高い免疫応答を誘導するために、ここで開示する組換えアデノウイルスワクチンを、プラスミドに基づくポリヌクレオチドワクチンと共に様々なプライム（初回抗原投与）／ブースト（追加抗原投与）の組合せにおいて使用する。この場合、前記の２つのベクターを「プライム＆ブースト」レジメンにおいて投与する。例えば最初のタイプのベクターを投与し、次にあらかじめ定められた期間後、例えば１ヶ月後、２ヶ月後、６ヶ月後又は他の適切な間隔後に、第二のタイプのベクターを投与する。好ましくは、前記ベクターは同じポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組合せをコードする発現カセットを担持する。プラスミドＤＮＡも使用する実施態様では、前記ベクターは、哺乳動物又は昆虫細胞によって認識される１またはそれ以上のプロモーターを含むことが好ましい。１つの好ましい実施態様では、前記プラスミドは、ヒトＣＭＶプロモーターなどの、但しこれに限定されない、強力なプロモーターを含む。アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子又は発現すべき他の遺伝子をこのようなプロモーターに連結する。このようなプラスミドの一例は、記述されている哺乳動物発現プラスミドＶ１Ｊｎｓである（本明細書中に参照により組み込まれる、Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒら、ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓより、Ｍ．Ｌｉｕら編集、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８−２０８（１９９６））。
【００７７】
前述したように、アデノウイルスベクターワクチン及びプラスミドワクチンは、免疫応答を誘導するために単一治療レジメンの一部として脊椎動物に投与し得る。このために、本発明は、（ａ）哺乳動物に、ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及びｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む第一ベクターを導入すること；（ｂ）あらかじめ定められた時間を経過させること；及び（ｃ）前記哺乳動物に、ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及びｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む第二ベクターを導入すること、を含む、哺乳動物を癌から保護する方法に関する。
【００７８】
前述した保護の方法の１つの実施態様では、前記第一ベクターはプラスミドであり、及び前記第二ベクターはアデノウイルスベクターである。代替的実施態様では、前記第一ベクターはアデノウイルスベクターであり、及び前記第二ベクターはプラスミドである。
本発明はさらに、（ａ）上皮由来の癌に罹患している哺乳動物に、ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及びｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む第一ベクターを導入すること；（ｂ）あらかじめ定められた時間を経過させること；及び（ｃ）前記哺乳動物に、ｉ）アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及びｉｉ）前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、を含む第二ベクターを導入すること、を含む、上皮由来の癌に罹患している哺乳動物を治療する方法に関する。
【００７９】
前述した治療方法の１つの実施態様では、前記第一ベクターはプラスミドであり、及び前記第二ベクターはアデノウイルスベクターである。代替的実施態様では、前記第一ベクターはアデノウイルスベクターであり、及び前記第二ベクターはプラスミドである。
【００８０】
ワクチン受容者に導入すべき発現可能なＤＮＡ又は転写されたＲＮＡの量は、部分的には、使用するプロモーターの強度及び発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、約１ｎｇから１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇの免疫学的又は予防的有効用量のプラスミドワクチンベクターを筋組織に直接投与する。組換えアデノウイルスについての有効用量は、約１０６−１０１２粒子、好ましくは約１０７−１０１１粒子である。皮下注射、皮内導入、皮膚を通しての塗り（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及び腹腔内、静脈内又は吸入送達などの他の投与方法も考慮される。また、ブースターワクチン接種を提供することも考慮される。本発明のワクチンの非経口導入と同時に又は導入後に、インターロイキン１２タンパク質などのアジュバントによる静脈内、筋肉内、皮下などの非経口投与又は他の投与手段も好都合である。
【００８１】
本発明のワクチンベクターは、裸であり得る、すなわち受容者の免疫系に影響を及ぼすいかなるタンパク質、アジュバント又は他の作用物質とも非結合であり得る。この場合、前記ワクチンベクターは、無菌食塩水又は無菌緩衝食塩水などの、但しこれらに限定されない、生理的に許容される溶液中に存在することが望ましい。また、アジュバント、サイトカイン、タンパク質又は他の担体などの免疫促進剤又は本発明の免疫原性組成物を投与することは好都合であると考えられる。従って、本発明は、本発明の組成物及び方法と組み合わせたこのような免疫促進剤の使用を包含する。免疫促進剤は、ここで使用するとき、基本的に外因性抗原に対する免疫応答（抗体及び／又は細胞媒介性）を高める又は増強する物質を指す。前記免疫促進剤は、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で投与することができる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、破傷風毒素、ＩＬ１２、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１を含むがこれらに限定されない、様々な免疫促進剤のいずれかを、本発明のワクチン及び免疫原性組成物と共に使用し得る。前記免疫促進剤は当技術分野において周知である。カルシウムイオンなどの、但しこれに限定されない、ＤＮＡの細胞取り込みを助ける物質も使用し得る。これらの物質は、一般にトランスフェクション促進試薬及び医薬適合性の担体と称される。当業者は、個々の免疫促進剤又は医薬適合性の担体並びに適切な投与時間及び投与方法を決定することができる。
【００８２】
様々な手順のいずれかを使用してｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕをクローニングし得る。これらの方法は、（１）ＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング手法（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２（１９８８））。５’及び／又は３’ＲＡＣＥは完全長ｃＤＮＡ配列を生成するために実施し得る。この戦略は、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。これらの遺伝子特異的プライマーは、多数の公的に使用し得る核酸及びタンパク質データベースを検索することによって特定されてきた、発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の特定を通して設計される；（２）適切な発現ベクター系におけるｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ含有ｃＤＮＡライブラリーの構築後のｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡの直接の機能的発現；（３）ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブで、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること；（４）ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡで、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること。この部分的ｃＤＮＡは、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に関連する他の増殖因子受容体についての公知のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することを通して、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅によって得られる；（５）哺乳動物ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に相同性を有する部分的ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドで、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること。この戦略も、前述したようにＥＳＴとして特定されたｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含み得る；又は（６）ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕをコードするヌクレオチド配列の完全長形態を単離するために、数多くの種類のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーの１つをスクリーニングするためのプローブとして使用するコード領域の部分を生成し、単離するために公知のＲＡＣＥ手法によって完全長ｃＤＮＡを生成するか又はこれらの同じ公知のＲＡＣＥ手法によってコード領域の部分を生成するように、配列番号１又は配列番号４０を鋳型として使用して５’及び３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計すること、を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
他の種類のライブラリー、並びに他の細胞型又は他の種型から構築されたライブラリーが、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕをコードするＤＮＡ又はｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕホモログを単離するために有用であり得ることは、当業者には容易に明白である。
【００８４】
また、適切なｃＤＮＡライブラリーは、様々な上皮由来細胞などの、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ活性を有する細胞又は細胞系統から作製し得ることも、当業者には容易に明白である。ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕをコードするｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーを作製するときに使用する細胞又は細胞系統の選択は、最初に、このような目的のために使用し得る何らかの公知のアッセイを用いて細胞に関連するｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ活性を測定することによって実施し得る。
【００８５】
ｃＤＮＡライブラリーの作製は、当技術分野で周知の標準手法によって実施することができる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築手法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に認められる。相補的ＤＮＡライブラリーも、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含むがこれらに限定されない、数多くの商業的供給元から入手し得る。
【００８６】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び組換えタンパク質は、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕをスクリーニングし、そのレベルを測定するために使用し得る。前記組換えタンパク質、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子は、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕの検出及びタイピングに適するキットの作成に役立つ。このようなキットは、少なくとも１つの容器を厳重に閉じ込めて保持するのに適する区画化された担体を含む。前記担体は、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕを検出するのに適した組換えｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ又は抗ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体などの試薬をさらに含む。前記担体はまた、標識抗原又は酵素基質等のような検出のための手段も含み得る。
【００８７】
ここで言及する全ての公表文献は、本発明に関連して使用し得る方法及び材料を説明し、開示するために参照により組み込まれる。ここに含まれるいかなる内容も、本発明が先行発明によるこのような開示に先立つ権利がないことの是認と解釈されるべきではない。
【００８８】
付属の図面を参照しながら本発明の好ましい実施態様を説明したが、本発明はそれらの厳密な実施態様に限定されないこと、及び付属の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者によって様々な変更及び修正が為され得ることは了解されねばならない。
【００８９】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定しない。
【実施例１】
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲによるアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡの単離
分子学的手順は、当技術分野において周知の標準手法（例えば本明細書中に参照により組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．，第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）に従って実施した。
【００９１】
ヒト、ハムスター、イヌ及びラットからのＨＥＲ２／ｎｅｕヌクレオチド配列を、ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＤＮＡの高度に保存された領域を特定するために整列させた。配列比較に基づき、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子をカバーするオリゴヌクレオチドプライマーを、以下に述べる、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡの増幅のために設計した（図３参照）。
【００９２】
２匹の異なるアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）からの結腸生検をＤｒ．Ｗｉｌｌｅｍ  Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＰＲＣ），Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より入手した。製造者の指示に従ってＵｌｔｒａＳＰｅｃ−ＩＩ  ＲＮＡ単離システム（Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて各々の結腸生検からＲＮＡを抽出し、精製した。アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子を単離するために、ＨＥＲ２／ｎｅｕ配列全体をカバーするＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を、１匹のアカゲザルから単離した全ＲＮＡから生成した。
【００９３】
逆転写工程を実施するために、製造者の指示に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して全ＲＮＡ試料を逆転写した。典型的には、ＲＮＡ０．５−２．０μｇを５０μｌの反応容量で逆転写酵素及び適切な緩衝液と混合した。試料を４５℃で３０分間インキュベートし、次に９４℃で２分間インキュベートした。
【００９４】
生じたｃＤＮＡ鋳型を使用して、正プライマーと逆プライマーの種々の組合せを用いてＰＣＲ増幅を実施した（図３参照）。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２４００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）において実施した。サイクリング条件は、９４℃、１５秒間の初期変性工程の３５サイクル、次いでプライマーアニーリング工程及び伸長工程での終了から成った。プライマーアニーリング工程は、プライマー配列に依存して、５０℃−５１℃の範囲の温度で５０秒間のインキュベーションから成った。伸長工程は、増幅産物の予想される長さに依存して、８０秒間−１００秒間の範囲の時間にわたる６８℃でのインキュベーションから成った。前記３５サイクルの後に７２℃で７分間の広汎な延長工程（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）を実施した。
【００９５】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて増幅産物をゲル精製し、増幅に使用した同じプライマーで配列決定した。配列決定反応は、Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ化学を通して実施した。読取りはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて実施した。
【００９６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕコード領域全体を含む種々の増幅産物を配列決定することによって獲得したデータは、配列番号１としてここで開示する、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ配列（以下「第一アカゲザルＨＥＲ２ヌクレオチド配列」又は「ｒｈＨＥＲ２＃１」、図１参照）を特定した。配列番号１の７９５位の「Ｒ」の存在は、第一アカゲザルから単離されたクローンがその位置にＡ又はＧのいずれかを含んでいたこと指示する。第一アカゲザルから単離された、７９５位に「Ａ」を含む核酸分子をここでは配列番号４２と称する。第一アカゲザルから単離された、７９５位に「Ｇ」を含む核酸分子をここでは配列番号４３と称する。第一アカゲザルから単離されたＤＮＡに基づき、配列番号１の７９５位の単一ヌクレオチド変化は、ここで配列番号２として開示する（図２参照）、生じたＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさなかった。
【００９７】
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応から誘導された増幅産物を、ここではそれぞれＢＳ又はＣＲと称する、ベクターＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ｋｓ（＋）又はｐＣＲＩＩのいずれかにクローニングした。増幅産物の直接配列決定によって得たｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕヌクレオチド配列を確認するために、生じたクローンを配列決定し、完全なアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡ配列を構築するために使用した。
【実施例２】
【００９８】
完全なＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡ配列の構築
第一アカゲザルから得た一連のクローンをＰＣＲによって構築し、集合させて、完全なアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡを作製した。最初に、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の５’末端をカバーする４つのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を実施例１で述べたように生成した。前記クローンからのＰＣＲ増幅断片を、図４に示すように（反応１−４）、ＢＳ又はＣＲのいずれかにクローニングした。幾つかのクローンの配列分析は、クローニングされた配列がＲＴ−ＰＣＲ断片から得た配列と同じであることを確認した。
【００９９】
前述した重複増幅産物を、以下の成分：前記断片の各々０．１−１．０ｐｍｏｌ、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及び適切な緩衝液、を組み合わせたＰＣＲ反応物１００μｌ中で連結した。試料を、９５℃、３０秒間、次いで７２℃、４分間から成る初期増幅サイクルに供した。
【０１００】
生じた連結産物を、Ｐｆｕポリメラーゼ及び適切な緩衝液を用いて以下の熱プロフィール：９５℃、３０秒間、５８℃、３０秒間及び７２℃、１８０秒間（３０サイクル）により、ＰｍｅＩ＿ＳｗａＩ＿ＲＢＳ＿１−１６（配列番号１１）及び１８９５−１８７６（配列番号１０）プライマーで再び増幅した。このようにして得たＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲＩＩベクターにクローニングして、クローン＃１＿ＣＲ＿１−１８９５．７（−）（反時計回り方向）を作製した。幾つかのクローンの配列分析により、クローニングされた配列の同一性を確認した。
【０１０１】
第一アカゲザルからの結腸ＲＮＡを使用して、基本的に前述したように、ＲＴ−ＰＣＲによって付加的なＰＣＲ断片を生成した。このために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、１５５８−１５８３（配列番号１２）及び２７９８−２７７６（配列番号１３）であった（反応６、図４）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の中央部分に位置するこの断片を、クローニングせずに、さらなる増幅のための鋳型として使用した。
【０１０２】
次に、ｂｐ１６２１−ｂｐ２２７７（図４、反応７、配列番号１４、１５）及びｂｐ２２３９−ｂｐ２７９８（図４、反応８、配列番号１６及び１３）から、この領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計した。生じた産物をｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。タンパク質のチロシンキナーゼ活性を不活性化するために、ＫからＡまでのアミノ酸５７９位を沈黙化するためのプライマーを設計した（配列番号１５及び１６）。幾つかのクローンの配列分析は、クローニングされた配列の同一性を確認した。
【０１０３】
第一アカゲザルからの結腸ＲＮＡを使用して、基本的に前述したように、ＲＴ−ＰＣＲによって付加的なＰＣＲ断片を生成した。このために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、２３５６−２３７８（配列番号１７）及び４１６６−４１４５（配列番号１８）であった（図４、反応９）。生じた産物をｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。幾つかのクローンの配列分析は、クローニングされた配列の同一性を確認した。
【０１０４】
以下のプライマーを使用して、前記の３つのクローンからＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した：１６２１−１６４４（配列番号１４）及び２２７７−Ｋ−７５３−２２４８（配列番号１５）、鋳型は＃１＿ＣＲ＿１６２１−２２７７．２；２２３９−Ｋ７５６−２２４８（配列番号１６）及び２７９８−２７７６（配列番号１３）、鋳型は＃１＿ＣＲ＿２２３９−２７９８．４；２３５６−２３７８（配列番号１７）及びＳａｌＩ＿３７６８−３７４６（配列番号１９）、鋳型は＃１＿ＣＲ＿２３５６−４１６９．２。３つの産物を前述したようにＰＣＲによって集合させた。生じた連結産物を以下のプライマー：１６２１−１６４４（配列番号１４）及びＳａｌＩ＿３７６８−３７４６（配列番号１９）を用いて増幅し、ｐＣＲＩＩベクターに時計周り方向にクローニングして、クローン＃１＿ＣＲ＿１６２１−３７６８．８（以下クローン１０．８）及び＃１＿ＣＲ＿１６２１−３７６８．１２（以下クローン１０．１２）を生成した（図４、反応１０）。配列決定は、クローン１０．１２が３’領域内の３６８６位付近に突然変異を有することを明らかにした。同様に、クローン１０．８は２６６６位付近に突然変異を有していた。クローン１０．１２からの５０８ｂｐ  ＢｓｔＥＩＩ−ＳａｌＩ断片を、この領域内に突然変異を含まない、クローン１０．８からの対応する領域で置き換えることにより、野生型配列を生成した。生じたクローンを＃１＿ＣＲ＿１６２１−３７６８．１２８と命名した。
【０１０５】
クローン＃１＿ＣＲ＿１６２１−３７６８．１２８（＋）からのＰｍｌＩ−ＸｂａＩ断片を＃１＿ＣＲ＿１＿１８９５．７（−）のＰｍｌＩ−ＳｐｅＩ部位にクローニングした。アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕコード配列全体を含む、生じたプラスミドを＃１＿ＣＲ＿１−３７６８（−）と命名した。配列分析により前記配列の同一性を確認した。
【実施例３】
【０１０６】
免疫原
遺伝子導入と免疫試験のために、ＰｍｅＩ及びＳａｌＩでの消化によってｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕコード領域を＃１＿ＣＲ＿１−３７６８（−）から切り出し、哺乳動物発現プラスミドｐＶ１Ｊ＿ｎｓＡ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（９）：７７７−８３（１９９３））のＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＶ１Ｊ−ｒｈ−ＨＥＲ２／ｎｅｕを生成した。
【０１０７】
アデノウイルスベクター構築のために、ＰｍｅＩ及びＳａｌＩでの消化によってｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕコード領域を＃１＿ＣＲ＿１−３７６８（−）から切り出し、ポリＭＲＫＡｄ５△Ｅ１シャトルプラスミドの対応する部位にクローニングして、ｐＭＲＫＡｄ５△Ｅ１−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕを生成した。シャトルベクターｐＭＲＫＡｄ５△Ｅ１は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター（イントロンＡなし）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む発現カセットと共に塩基対１−４５０及び塩基対３５１１−５７９８からのＡｄ５配列を含む。このプラスミドを、大腸菌ＢＪ５１８３細胞（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５−１０（１９９６）を使用して、Ｅ１及びＥ３領域を含有する配列を除くすべてのＡｄ５配列を含む、アデノウイルス骨格ベクターｐＭＲＫＡｄ５ＨＶＯと組み換えた。
【０１０８】
ベクター生産のために、ｐＭＲＫＡｄ５−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕをＰａｃＩでの消化によって線状化し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてＰｅｒＣ．６細胞にトランスフェクトした。ウイルス力価を増幅するために５−６ウイルス継代を行い、大型ウイルス増幅を実施して１．３×１０１２物理的粒子（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（ｐｐ）の最終生産を得た。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析によって示されたように、増幅したベクターから精製したウイルスゲノムにおいてゲノム再構成は検出できなかった。予想されたＤＮＡ断片は、平行して制限した、ウイルスゲノム内及び対照ｐＭＲＫＡｄ５−ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕプラスミドの両方で認められた。
【実施例４】
【０１０９】
第二アカゲザルからのＨＥＲ２／ｎｅｕコードＤＮＡの単離
第二アカゲザルからの結腸ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ産物の同様の配列決定分析を実施した（実施例１参照）。前記遺伝子全体を含む多くの異なる増幅産物を配列決定することによって獲得したデータは、ここで配列番号４０として開示する、第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ配列（以下「第二アカゲザルＨＥＲ２ヌクレオチド配列」又は「ｒｈＨＥＲ２＃２」、図５参照）を、ここで配列番号４１として開示する演繹アミノ酸配列（以下「第二アカゲザルＨＥＲ２アミノ酸配列」、実施例６参照）と共に特定した。
【０１１０】
実施例１におけるように、ＨＥＲ２／ｎｅｕをカバーするプライマーを使用して第二アカゲザルからの全結腸ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって増幅産物を生成した（図３参照）。生じた増幅産物をゲル精製し、配列決定した。さらに、これらの産物をＢＳ又はＣＲベクターのいずれかにクローニングした。生じたクローンのＤＮＡ塩基配列決定分析により、増幅産物の直接配列決定によって得たｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕヌクレオチド配列を確認した。
【０１１１】
ｒｈＨＥＲ２＃１とｒｈＨＥＲ２＃２の間で８つの相違が検出された（詳細については、図７参照）。これらの突然変異のうち５つは、第一アカゲザルＨＥＲ２アミノ酸配列（配列番号２）と比較したときタンパク質内にアミノ酸変化を導入する。注意すべきは、これらの突然変異のうち３つは、ｒｈＨＥＲ２＃１タンパク質と比較したときｒｈＨＥＲ２＃２タンパク質内にアミノ酸変化を生じさせない。
【実施例５】
【０１１２】
ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕによるアカゲザルの免疫
結腸直腸癌において発現されるヒト腫瘍抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕのアカゲザルホモログによるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の免疫の効率を評価するため、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＰＲＣ），Ｒｉｊｓｗｉｊｋ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において免疫試験を実施した。試験は、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原での免疫に対するＢ及びＴ細胞応答を評価するように設計した。
【０１１３】
最初の試験では、１つの群のサル（アカゲザル合計４匹；雄性２匹と雌性２匹）をヒト腫瘍抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕのアカゲザルホモログを発現するプラスミドＤＮＡベクター又はアデノウイルスベクター（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＨＥＲ２）で免疫した。初回免疫のために、０、４、８、１２及び１６週目にＤＮＡの注射とそれに続く電気刺激により、筋肉内経路で（ｉ．ｍ．）プラスミドＤＮＡによって動物をワクチン接種した。前記ＤＮＡは、ｐＶ１Ｊ−ｒｈＨＥＲ２プラスミドＤＮＡ５ｍｇを含有する１ｍｌ溶液（２つの部位に分けて０．５ｍｌ／部位）として、体重２−５ｋｇの動物に注射した。動物には麻酔下で（ケタミン／キシラジンの混合物）注射を行う。
【０１１４】
電気刺激のために、２トレーンの１００矩形双極性パルス（各々１秒）を、３秒の全処置時間中１秒おきに送達した。パルス長は２ミリ秒／位相、パルス周波数及び振幅はそれぞれ１００Ｈｚ及び１００ｍＡ（定電流方式）であった。
【０１１５】
同じ群の動物を、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するアデノウイルス５（Ａｄ５）の筋肉内注射によって追加免疫した。△Ｅ１−△Ｅ３、「第一世代」アデノウイルス（Ｐ２レベル）を使用した。１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の総量を２４週目と２８週目に注射した。
【０１１６】
３６週目と４０週目にアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するアデノウイルス２４（Ａｄ２４）の１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の筋肉内注射によってさらなる追加免疫を実施した。Ａｄ５注射によって誘導される中和抗体はＡｄ２４感染に干渉しないので、Ａｄ２４を選択した。
【０１１７】
前記免疫プロトコールによって誘導されるＨＥＲ２／ｎｅｕに対する免疫応答を測定するため、総期間１年間にわたって４週間ごとに血液試料を採集した。ＨＥＲ２特異的細胞媒介性免疫応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。ＩＦＮ−γ分泌性抗アカゲザルＨＥＲ２  Ｔ細胞の数を、ペプチドのプールを使用してＰＢＭＣに関するＥＬＩＳＰＯＴによって判定した。１１残基が重複し、アカゲザルタンパク質配列全体をカバーする、各々１５アミノ酸長の３１１ペプチドを、ＡからＫまでのアルファベット文字で示した１１のプール（Ｎ末端からＣ末端まで）と組み合わせた。ＰＢＭＣを産生するＩＦＮ−γの頻度を、２つの異なる細胞濃度での２回の測定から導かれたスポットの平均値として算定した。数値は、スポット形成コロニー（ＳＦＣ）／１０６全ＰＢＭＣの数から、ペプチドの不在下で測定したバックグラウンド値（典型的には１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）を差し引いた値として表わした。算定結果は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したとき、４匹のサル全てが検出可能な細胞媒介性応答を示すことを示す。
【０１１８】
反応性を確認し、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定する、ＩＦＮ−γ＋細胞内染色法（ＩＣＳ）によってタイピングした。ＣＤ３＋事象と小リンパ球で同時ゲーティングすることによってＣＤ３＋リンパ球を収集した。０．１％より高い数値を陽性とみなした。プールＪについてサルＲＩ５０４に関して０．１９の陽性値（ＣＤ８＋）を得た。検出可能な抗ｒｈＨＥＲ２抗体力価（＞２００）は検出されなかった。
【０１１９】
要約するに、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するプラスミドＤＮＡの筋肉内注射は、アカゲザルにおいて寛容を打破し、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕに対する検出可能な細胞媒介性免疫応答を誘導する上で有効であった。
【実施例６】
【０１２０】
ヒト腫瘍抗原のアカゲザルホモログによるアカゲザルの免疫
全て結腸直腸癌において発現される、ヒト腫瘍抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｅｐ−ＣＡＭ及びＣＥＡのアカゲザルホモログによるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の免疫の効率を評価するため、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＰＲＣ），Ｒｉｊｓｗｉｊｋ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において第二シリーズの免疫試験を実施した。プロトコールは、これらの腫瘍抗原の組合せに対するＢ及びＴ細胞応答を評価するように設計した。
【０１２１】
この試験では、４匹のアカゲザルから成る第二群（雄性２匹と雌性２匹）を、ヒト腫瘍抗原、Ｅｐ−ＣＡＭ（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＨＥＲ２）、ＣＥＡ（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＣＥＡ）及びＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｐＶ１Ｊ−ｒｈＥｐＣＡＭ）のアカゲザルホモログを発現する３つのプラスミドＤＮＡベクターの混合物で免疫した。
【０１２２】
０、４、８、１２及び１６週目にプラスミドＤＮＡの筋肉内注射とそれに続く電気刺激によって動物を初回免疫した。前記ＤＮＡ注射は、体重２−５ｋｇの動物に関して、プラスミドＤＮＡ６ｍｇ（３つのＴＡＡの各々について２ｍｇ）を含有する１ｍｌ溶液（２つの部位に分けて０．５ｍｌ／部位）から成った。動物には麻酔下で（ケタミン／キシラジンの混合物）注射した。
【０１２３】
電気刺激のために、２トレーンの１００矩形双極性パルス（各々１秒）を、３秒の全処置時間中１秒おきに送達した。パルス長は２ミリ秒／位相、パルス周波数及び振幅はそれぞれ１００Ｈｚ及び１００ｍＡ（定電流方式）であった。
【０１２４】
同じ群の動物を、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ａｄ５−ｒｈＨＥＲ２）、アカゲザルＣＥＡ（Ａｄ５−ｒｈＣＥＡ）及びアカゲザルＥｐＣＡＭ（Ａｄ５−ｒｈＥｐＣＡＭ）を発現する３つのＡｄ５の混合物の注射によって追加免疫した。３×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の総量を２３週目と２７週目に筋肉内注射した（３つのウイルスの各々について１×１０１１ｖｐ）。
【０１２５】
さらなる追加免疫を、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ａｄ２４−ｒｈＨＥＲ２）、アカゲザルＣＥＡ（Ａｄ２４−ｒｈＣＥＡ）及びアカゲザルＥｐＣＡＭ（Ａｄ２４−ｒｈＥｐＣＡＭ）を発現する３つのＡｄ２４の混合物の注射によって実施した。３×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の総量を３６週目と４０週目に筋肉内注射した（３つのウイルスの各々について１×１０１１ｖｐ）。
【０１２６】
前記免疫プロトコールを使用してＨＥＲ２／ｎｅｕに対する免疫応答を測定するため、総期間１年間にわたって４週間ごとに血液試料を採集した。細胞媒介性免疫応答をＩＦＮ−γ＋ＥＬＩＳＰＯＴによって測定し、体液性応答をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１２７】
サルＲＩ４４９及びＲＩ５１９は、ＩＦＮ−γ＋ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定したとき、検出可能なＨＥＲ２特異的細胞媒介性応答を示した。同様の分析は、ｒｈＣＥＡ及びｒｈＥｐＣＡＭに対するいかなる応答も検出しなかった。検出可能な抗ｒｈＨＥＲ２抗体力価（＞２００）は検出されなかった。
【０１２８】
第三の試験では、４匹のアカゲザルを、０、２及び４週目にＡｄ５誘導体の筋肉内注射によってＡｄ５−ｒｈＨＥＲ２、Ａｄ５−ｒｈＣＥＡ及びＡｄ５−ｒｈＥｐＣＡＭの混合物で免疫した。麻酔下で（ケタミン／キシラジンの混合物）、３×１０１１ｖｐ（３つのＡｄ５ウイルスの各々について１０１１ｖｐ）を含有する１ｍｌ溶液（２つの部位に分けて０．５ｍｌ／部位）を体重２−５ｋｇの動物に投与した。
【０１２９】
同じ群の動物を、２４、２６及び２８週目にＡｄ２４−ｒｈＨＥＲ２、Ａｄ２４−ｒｈＣＥＡ及びＡｄ２４−ｒｈＥｐＣＡＭの混合物（総量３×１０１１ｖｐ、３つのウイルスの各々について１０１１ｖｐ）の筋肉内注射によって追加免疫した。細胞媒介性応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。サルＲＩ５１４及びＲＩ４９６に関して、反応性をＩＦＮ−γ＋細胞内染色法（ＩＣＳ）によってタイピングした。４匹のサルのうち３匹は検出可能な応答を示した。加えて、細胞媒介性応答が測定された３匹のサルにおいて２００から５００の範囲の抗ｒｈＨＥＲ２抗体力価が検出された。
【０１３０】
この免疫プロトコールはまた、寛容を打破し、抗ｒｈＣＥＡ細胞媒介性及び体液性免疫応答を誘導する上でも有効であった。サルＲＩ５１４は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定可能な細胞媒介性応答を示した。細胞内染色法はこの応答を確認した。同じサルはまた、５００から１０００の範囲の抗ｒｈＣＥＡ抗体力価を示した。これに対し、同様の分析はｒｈＥｐＣＡＭに対するいかなる応答も検出しなかった。
【０１３１】
要するに、前記で論じた免疫プロトコールは、アカゲザルにおいてｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕ及びｒｈＣＥＡに対する特異的免疫応答を誘導する上で有効であった。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１Ａ】図１は、配列番号１に示す、第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（実施例１参照）。７９５位の「Ｒ」の存在は、「Ａ」又は「Ｇ」のいずれかがその位置に存在することを指示する。
【図１Ｂ】図１は、配列番号１に示す、第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（実施例１参照）。７９５位の「Ｒ」の存在は、「Ａ」又は「Ｇ」のいずれかがその位置に存在することを指示する。
【図２】図２は、配列番号２に示す、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の予測アミノ酸配列を示す。示されているアミノ酸配列は、配列番号１として開示するヌクレオチド配列から演繹した。
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲによって一連のアカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ断片を作製するために使用した、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子をカバーするオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を開示する（実施例１参照）。「正」及び「逆」と表示した欄は、公表されているヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ配列（アクセッションＭ１１７３０）に対するプライマーの位置を記載している。配列番号１５及び１６として開示するプライマーは、翻訳されたタンパク質のチロシンキナーゼ活性を不活性化するために、アミノ酸５７９位をＫからＡに突然変異させるために設計した。プライマー３３８８−３４１０及び３４１０−３３８８は、Ｓｅｒ（ＡＧＣ）をコードする、それぞれ１５位にＣ及び１０位にＧを含む配列を有する。これに対し、アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ配列はその位置に、やはりＳｅｒ（ＡＧＴ）をコードする、Ｔを有する。これらのプライマーを配列決定のために使用したが、クローニングのためには使用しなかった。配列番号１１及び１９については、ｒｈＨＥＲ２／ｎｅｕが始まる配列に下線を付している。
【図４】図４は、完全長アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕクローンを構築するために使用したＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列を示す。最初の欄は、実施例２で述べる反応に対応する反応番号を列記している。各々の欄は、４番目の欄に列記するクローンを生成するために使用した正及び逆プライマーのセットを記載している。クローンの名称は、クローニングのために使用したベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ又はｐＣＲＩＩに関して、それぞれＢＳ又はＣＲ）及び公表ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ配列に対する配列の位置（数字で列記している）の両方を指示する。
【図５Ａ】図５は、配列番号４０に示す、第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（実施例４参照）。ヌクレオチド配列内の「Ｒ」の存在は、「Ａ」又は「Ｇ」のいずれかがその位置に存在することを指示する。ヌクレオチド配列内の「Ｙ」の存在は、「Ｃ」又は「Ｔ」のいずれかがその位置に存在することを指示する。第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ（配列番号１）の対応する塩基とは異なるヌクレオチド塩基は、太字及び下線で表示している。
【図５Ｂ】図５は、配列番号４０に示す、第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（実施例４参照）。ヌクレオチド配列内の「Ｒ」の存在は、「Ａ」又は「Ｇ」のいずれかがその位置に存在することを指示する。ヌクレオチド配列内の「Ｙ」の存在は、「Ｃ」又は「Ｔ」のいずれかがその位置に存在することを指示する。第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ（配列番号１）の対応する塩基とは異なるヌクレオチド塩基は、太字及び下線で表示している。
【図６】図６は、配列番号４１に示す、第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の予測アミノ酸配列を示す（実施例４参照）。示されているアミノ酸配列は、配列番号４０として開示するヌクレオチド配列から演繹した。５１７位の「Ｘ」は、「Ｑ」（Ｇｌｎ）又は「Ｒ」（Ａｒｇ）がその位置に存在し得ることを指示する。６４７位の「Ｘ」は、「Ｋ」（Ｌｙｓ）又は「Ｒ」（Ａｒｇ）がその位置に存在し得ることを指示する。１０７５位の「Ｘ」は、「Ｒ」（Ａｒｇ）又は「Ｑ」（Ｇｌｎ）がその位置に存在し得ることを指示する。
【図７】図７は、第一アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＤＮＡ及びタンパク質配列（ＲｈＨＥＲ２＃１、配列番号１及び２）と比較して、第二アカゲザルＨＥＲ２／ｎｅｕＤＮＡ及びタンパク質配列（ＲｈＨＥＲ２＃２、配列番号４０及び４１）に存在する特定突然変異を詳細に示す。各々の表の最初の欄は、ＲｈＨＥＲ２＃２とＲｈＨＥＲ２＃１の間で異なるヌクレオチドの位置を列記する。各々の表の２番目の欄は、単離して、それぞれＲｈＨＥＲ２＃１及びＲｈＨＥＲ２＃２の配列を決定するために使用したＨＥＲ２／ｎｅｕ断片を担う特定クローンの番号を列記する。各々の表の３番目の欄は、相違が起こるコドンの配列を示しており、異なるヌクレオチドを強調している。コドンの下部は、灰色で強調した、生じるアミノ酸についての１文字アミノ酸記号である。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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