(57)【要約】本発明は、液体溶媒中の検体を測定する磁気制御方法及びシステムに関する。本発明の方法及びシステムは、例えば認識試剤を担持する磁性粒子など、検体が存在しかつ適切な条件下で化学反応が起きて反応信号が生成されるように機能化された磁性粒子を使用することに基づいている。反応信号は、電気信号、又は比色信号、発光、沈殿の形成でよい。本発明によると、バリア面での磁性粒子の急速な振動又は回転を発生させることによって、反応が大幅に増強される。
2006514264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析試料中の検体を測定する方法であって、
（i）前記検体と結合又は反応する認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下で前記結合又は反応は反応信号をもたらす反応を生じさせる、
（ii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を急速に回転又は振動させて、反応信号を発生させるステップと、
（iii）前記反応信号を読み取るステップと、
を有する。
【請求項２】
前記磁性粒子に、時間に関して周期的に変化する外部磁界に応答して回転又は振動を生じさせる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記磁界は、回転磁界である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記回転磁界は、回転磁石によって引き起こされる、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記磁界は、振動磁界である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記反応は、酸化還元反応である、請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記磁性粒子は、支持体に閉じ込められている、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記認識試剤及び前記検体は、互いに反応して反応生成物をもたらす、請求項１から請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記認識試剤は、前記検体を生成物に変える反応を誘起可能な触媒である、請求項１から請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記形成された対と結合する試薬の使用に基づく、請求項１から請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記検体は、蛋白質検体であり、前記試薬は、前記検体と結合可能な抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記検体は、ＤＮＡ検体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記分析条件は、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチド塩基を有し、前記ヌクレオチド塩基の少なくとも一つは、検出可能部分と結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能部分は、ビオチンであり、前記分析条件は、アビジン結合酵素を更に有する、請求項１２又は請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼであり、前記反応信号は、発光である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、タック・ポリメラーゼ（Taq Polymerase）であり、前記反応条件は、ポリメラーゼ連鎖反応が生起可能な条件である、請求項１３から請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一つの塩基不適正を検出可能な、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記検体は、前記認識試剤を生成物に変える反応を誘起可能な触媒である、請求項８記載の方法。
【請求項１９】
前記認識試剤は、前記検体を生成物に変える反応を誘起可能な触媒を有する、請求項８記載の方法。
【請求項２０】
前記触媒は、酵素である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素は、テロメラーゼである、請求項１８から請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記分析試料は、細胞の抽出物を有する、請求項１８から請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記検体と特異的に結合する試薬の使用に基づき、前記検体は、最初に前記認識試剤と結合する、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記検体は、抗体検体である、請求項１１記載の方法。
【請求項２５】
化学系の成分の少なくとも一つは、分析の間、前記分析試料の媒体に溶解したままである、請求項１から請求項２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記反応信号は、電気信号、発光信号、比色信号及び沈殿の形成から選択される、請求項１から請求項２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
分析試料中の検体を測定するシステムであって、
（ａ）バリア面を有するセルと、
（ｂ）磁性粒子を回転又は振動させるサブシステムと、
（ｃ）前記検体の存在下で反応が起きて反応信号をもたらすように認識試剤が固定された磁性粒子と、前記信号は前記磁石の回転又は振動の間増大する、
（ｄ）前記反応信号を検出する検出部材と、
（ｅ）前記反応信号を読み取る読み取り器と、
を有する。
【請求項２８】
前記反応は、酸化還元反応であり、前記検出部材は、電極である、請求項２７記載のシステム。
【請求項２９】
前記認識試剤は、前記電極と前記検体の間で電子を移動させることができる少なくとも一つの分子を有する、請求項２７及び請求項２８のいずれかに記載のシステム。
【請求項３０】
前記認識試剤及び前記検体は、互いに反応して反応生成物をもたらす、請求項２７記載のシステム。
【請求項３１】
前記検体は、前記認識試剤を生成物に変える反応を誘起可能な触媒である、請求項２７記載のシステム。
【請求項３２】
前記認識試剤は、前記検体を生成物に変える反応を誘起可能な触媒を有する、請求項２７記載のシステム。
【請求項３３】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記形成された対と結合する試薬の使用に基づく、請求項２７から請求項２９のいずれかに記載のシステム。
【請求項３４】
前記検体は、ＤＮＡ検体である、請求項２７から請求項３３のいずれかに記載のシステム。
【請求項３５】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記検体と特異的に結合する試薬の使用に基づき、前記検体は、最初に前記認識試剤と結合する、請求項２７及び請求項２８のいずれかに記載のシステム。
【請求項３６】
前記検体は、抗体検体である、請求項３５記載のシステム。
【請求項３７】
前記反応信号は、電気信号、発光信号、比色信号及び沈殿の形成から選択される、請求項２７から請求項３６のいずれかに記載のシステム。
【請求項３８】
前記サブシステムは、前記磁石を急速に回転又は振動させる前記磁石を伴うモータを有する、請求項２７から請求項３７のいずれかに記載のシステム。
【請求項３９】
癌細胞を検出する、請求項２０から請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
癌細胞を検出する請求項３９記載の方法であって、
（i）テロメラーゼのプライマとして働くＤＮＡ認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下でテロメラーゼ反応は反応信号をもたらす反応を可能にする、
（ii）癌の疑いがある一つ以上の細胞からの細胞抽出物を有する分析試料を提供するステップと、
（iii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を急速に回転又は振動させて、反応信号を発生させるステップと、
（iv）前記反応信号を読み取るステップと、
（v）前記読み取り値を、癌細胞を含んでいない対照分析試料から得られた読み取り値と比較するステップと、前記分析試料における読み取り値が前記対照分析試料における読み取り値よりも高いことは、前記疑わしい細胞が癌性であることを示す、
を有する。
【請求項４１】
前記反応信号は、発光である、請求項４０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析試料中の検体を検出する方法に関する。より詳細には、本発明は、液体溶媒中の検体を測定する磁気制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、磁界によって電極触媒（electrocatalytic）プロセス及び生体電極触媒（bioelectrocatalytic）プロセスを切り替える研究が進められている（非特許文献１，２）。電子伝達反応を磁気的に制御する適用例としては、選択的デュアルバイオセンシング（非特許文献３）、電気化学発光（stimulated electrogenerated chemiluminescence）（非特許文献４）、選択的パターニング（非特許文献５）などが提案されている。化学成分や生物成分によって機能化される磁性粒子（magnetic particle）は、化学成分や生物成分を結集或いは局在化させる「収集手段」として広範に使用されている（非特許文献６〜９）。酵素（非特許文献１０）、ＤＮＡ（非特許文献１１）、細胞（非特許文献１２）の移動及び結集など、磁気的に閉じ込められた（magnetically-confined）化学成分の様々な適用例が報告されている。
【０００３】
以下の参照文献は、本発明の背景を理解するうえで関連性があると考えられる。以下の説明においも、下記の文献は下記のリストにおける番号によって参照されている。
【非特許文献１】Hirsch, R.; Katz, E.; Willner, I.; J. Am. Chem. Soc. 2000, 122,12053-12054
【非特許文献２】Katz, E.; Sheeney‐Haj-Ichia,L.; Willner, I.; Chem. Eur. J. 2002, 8, 4138-4148
【非特許文献３】Katz, E.; Sheeney‐Haj-Ichia,L.; Buckmann, A. F.; Willner, I.; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1343-1346
【非特許文献４】Sheeney‐Haj-Ichia,L.; Katz, E.; Wasserman, J.; Willner, I.; Chem. Commun. 2002, 158-159
【非特許文献５】Katz, E.; Willner, I.; Electrochem. Commun. 2002, 4, 201-204
【非特許文献６】Dickson, D. P. E.; Walton, S. A.; Mann, S.; Wong, K.; NanoStruct. Mater. 1997, 9, 595-598
【非特許文献７】De Cuyper, M.; Joniau, M.; Biotechnol. Appl. Biochem. 1992, 16, 201-210
【非特許文献８】Carpenter, E. E.; J. Magnetism Magnetic Mater. 2001, 225, 17-20
【非特許文献９】Matsunaga, T.; Takeyama, H.; Supramolec. Sci. 1998, 5, 391-394
【非特許文献１０】Liao, M. -H.; Chen, D. -H.; Biotechnol. Lett. 2001, 23, 1723-1727
【非特許文献１１】Mornet, S.; Vekris, A.; Bonnet, J.; Duguet, E.; Grasset, F.; Choy, J. -H.; Portier, J.; Mater. Lett. 2000, 42, 183-188
【非特許文献１２】Sonti, S. V.; Bose, A.; J. Colloid Interface Sci. 1995, 170, 575-585
【非特許文献１３】Shen, L.; Laibinis, P. E.; Hatton, T. A.; Langmuir 1999, 15, 447-453
【非特許文献１４】Katz, E.; Lotzbeyer, T.; Schlereth, D. D.; Schuhmann, W.; Schmidt, H. -L.; J. Electroanal. Chem. 1994, 373, 189-200
【非特許文献１５】Bard, A. J.; Faulkner, L. R.; Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, Wiley, New York, 1980
【非特許文献１６】Moiroux, J.; Elving, P. J.; J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6533-6538
【非特許文献１７】Gorton, L.; J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 1986, 82, 1245-1258.
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、分析対象の液体試料中の検体を測定する方法及びシステムを提供する。本発明の方法及びシステムは、検体が存在しかつ適切な分析条件下で反応が起こって反応信号が生成されるような、機能化された磁性粒子、例えば、認識試剤を担持する磁性粒子、を使用することに基づいている。
【０００５】
用語「反応」は、反応信号を生成する目的で一度又は連続して行われる一つ以上の反応又は相互作用を意味するものとする。「反応信号」は、反応によって生じる何らかの検出可能なパラメータである。従って、「分析条件」は、該当する反応が起こるために必要又は有用な条件、物質、作用のすべてを包含し、連続的に変化する条件又は作用もこれに含まれる。
【０００６】
粒子は、反応セル内のバリア面の近傍に配置されている磁石によって、このバリア面に引き寄せられる。反応は、検出部材によって検出され、検出部材は、バリア面を形成しているか、バリア面の一部であるか、又は、バリア面の近傍又はそれ以外の場所に配置される。
【０００７】
検出部材は、電気化学セルの電極でよく、このような例における反応信号は、分析試料中に検体が存在している結果として起こる反応によって生じる電気応答である。用語「電気応答」は、記録される電気パラメータ、又は電極の電気特性の測定可能な変化を意味する。電気応答は、電極の表面で起こる反応の結果としての電流の発生、電荷又は電位の変化、或いは、例えばサイクリックボルタモグラムによって測定できる、電極のアンペロメトリック応答（amperometric response）の変化、その他でよい。明らかに理解される点として、本発明は、電気応答を測定する方法によって制限されることはなく、従って、本発明の方法及びシステムにおける電気応答の測定には、任意の測定方式を適用することができる。
【０００８】
反応信号の例として、電気応答以外には、発光、比色反応、検出部材上の沈殿の形成が挙げられる。このような応答は、適切な光学検出手段によって測定することができる。検出部材上の沈殿の形成は、検出部材（この場合には電極）の電気応答の変化を、例えばファラデーインピーダンス分光法（Faradaic impedance spectroscopy）を使用して測定することによって求めることもできる。
【０００９】
本発明によると、バリア面での磁性粒子の急速な動き、すなわち急速な振動又は回転を発生させることによって、反応を大幅に増強することができる。このことは、例えば、磁石に関連付けられており、かつ磁石を回転させることによって磁性粒子の回転を発生させる回転モータによって達成することができる。
【００１０】
粒子の界面（interface）において電極触媒及び生体電極触媒の作用下で起こる変換は、検体、又は分析に関与する他の物質が反応場所まで移動する速度によって、特に制御される。理論を持ち出すまでもなく、磁性粒子が回転又は振動することによって、検体若しくは分析物質、又はこの両方が反応場所の方に流体力学的に大量に移動し、検体若しくは分析物質、又はこの両方と、機能化された磁性粒子又はこれらの粒子に付加された部分（moiety）との間の反応が促進されるものと考えられる。回転又は振動する磁界によって磁性粒子を回転又は振動させることは、本発明の好ましい実施形態である。
【００１１】
本発明では、反応信号の発生を監視することによって、分析試料中の検体の存在を定性的に検出することができる。信号の大きさを測定することによって、分析試料中の検体の濃度を定量的に求めることもできる。以下の説明では、用語「測定」、「求める」、「検出」は、分析試料中の検体の定性的分析と定量的分析の両方を一括して指すものとする。
【００１２】
用語「磁石」は、磁化した合金から成る磁石と電磁石の両方を意味するものとする。
【００１３】
本発明の一つの側面によると、分析試料中の検体を測定する方法であって、
（i）前記検体と結合又は反応する認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下で前記結合又は反応は反応信号をもたらす反応を生じさせる、
（ii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を急速に回転又は振動させて、反応信号を発生させるステップと、
（iii）前記反応信号を読み取るステップと、
を有する方法が提供される。
【００１４】
本発明の方法において使用される磁性粒子は、代表的には、Ｆｅ３Ｏ４、又はＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、又はこれらの合金、又はその他の強磁性体材料から作製される。
【００１５】
別の側面によると、本発明は、  分析試料中の検体を測定するシステムであって、
（ａ）バリア面を有するセルと、
（ｂ）磁性粒子を回転又は振動させるサブシステムと、
（ｃ）前記検体の存在下で反応が起きて反応信号をもたらすように認識試剤が固定された磁性粒子と、前記信号は前記磁石の回転又は振動の間増大する、
（ｄ）前記反応信号を検出する検出部材と、
（ｅ）前記反応信号を読み取る読み取り器と、
を有するシステムを提供する。
【００１６】
本発明の一つの実施形態によると、サブシステムは、磁石を急速に回転又は振動させる磁石を伴うモータを備えている。
【００１７】
本発明のシステムにおいて使用される磁性粒子は、代表的には、Ｆｅ３Ｏ４、又はＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、又はこれらの合金、又はその他の強磁性体材料から作製される。
【００１８】
本発明の一つの実施形態によると、システムは電気化学システムであり、かつ、反応信号を生成する反応は酸化還元反応である。
【００１９】
本発明は、認識試剤と検体の性質、又は、反応信号を生成する反応の性質、分析条件、反応信号、によって制限されることはない。固定された認識試剤によって媒体中の検体を検出することを可能にする反応には、例えば国際公開第９７／４５７２０号パンフレットと国際公開第００／３２８１３号パンフレットに開示されている反応など多数の種類があり、これらの文書の内容は本文書に参考とすることにより組み込まれている。
【００２０】
本発明の一つの実施形態によると、分析試料は、最初に、検体（試料中に存在している場合）と認識試剤との結合が引き起こされるように反応させる。認識試剤は、蛍光マーカ又は別の比色分析マーカ、又は、ラジオ標識（radio label）、検出可能な反応の触媒として作用することができる酵素、酸化還元反応を起こすことができる試薬でよい。
【００２１】
従って、認識試剤と検体は互いに反応して、反応生成物を生成することができる。この反応は、一般には酸化還元反応であるが、これに限定されない。分析条件は、この実施形態によると、反応が起こることができる温度条件と試薬とを含む。認識試剤と検体との間の反応を可能にする試薬は、一般には触媒を含み、例えば、その反応の触媒として作用することができる酵素を含む。この実施形態によって検出することができる検体の具体的な例としては、砂糖分子（ブドウ糖、果糖、マンノースなど）、ヒドロキシ化合物又はカルボキシ化合物（ラクタート、エタノール、メタノール、蟻酸など）、アミノ酸が挙げられる。このような場合における認識試剤はキノンであり、例えばナフトキノン、ピロロキノリンキノン（pyrroloquinoline quinone）（ＰＱＱ）などである。反応（この場合には酸化還元反応）を起こすことができる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コリンオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２２】
別の実施形態によると、認識試剤は、検体が生成物に変換される反応を引き起こすことができる触媒を含む。この特定の実施形態によると、反応は酸化還元反応でよく、反応は、電極の電気応答を測定することによって監視することができる。触媒が酵素である場合、酵素の種類によって反応の特異性が決まる。
【００２３】
これに代えて、検体は、認識試剤が生成物に変換される反応を引き起こすことができる触媒でよい。この場合、反応信号は、認識試剤が触媒によって変換され場合にのみ存在する。
【００２４】
本発明の更に別の実施形態によると、検体と認識試剤は、認識対を形成する。認識対の例としては、抗原と抗体、リガンドと受容体、オリゴヌクレオチドと相補的配列のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドと結合蛋白質、砂糖とレクチンを挙げることができる。この場合、検体が対の一方であり、検出部分が対の他方である。検出は、形成される対に結合する試薬、例えば二本鎖オリゴヌクレオチド（double-stranded oligonucleotides）に特異的に結合して一本鎖オリゴヌクレオチドには結合しない試剤や、基質として二本鎖オリゴヌクレオチドのみを使用し一本鎖オリゴヌクレオチドは使用しない酵素、の使用に基づいて行うことができる。
【００２５】
代替方法においては、検出は、検体に特異的に結合する試薬に基づいて行うことができる。この場合には、最初に検体と試薬の間の結合を起こし、その後、余分な試薬を除去し、反応を進行させる。試薬は、認識試剤を導入する前、又は導入する間、又は導入した後に、検体に接触させることができる。このような試薬の例は、検体が認識試剤に結合しているときに、その検体に特異的に結合することができる抗体やヌクレオチド鎖である。試薬は、検出可能な標識を担持することができ、この標識は、蛍光標識、又は比色分析標識、酸化還元標識でよい。或いは、試薬は、自身が反応を起こすか又は反応の触媒として作用できる試剤（酵素など）、又は酸化還元反応を起こすことができる試剤などでよい。
【００２６】
本発明の方法においては、分析の間、化学系の成分、例えば検体、認識部分、触媒、のうちの少なくとも一成分は分析液体溶媒に溶解している必要があり、これに対し、残りの成分は磁性粒子に結合している必要がある。
【００２７】
本発明の更に別の実施形態によると、分析は、検体又は検体を含む合成物を改質することができる第１の試薬であって、反応の生成物が第２又はそれ以上の試薬によって検出可能であり、試料中の検体の存在又は濃度に依存する反応信号が最終的に生成されるような、第１の試薬、を含む。このような分析の一つの例は、ビオチンを含む部分を認識試剤に結合することによって、検体の存在下で認識試剤を改質する酵素を使用することである。この場合、認識試剤に結合するビオチン部分は、例えば生体触媒標識として作用するアビジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（avidin-horseradish peroxidase）（ＨＲＰ）を含む第２の試薬に特異的に結合する部分としての役割を果たす。理解される点として、例えば、ＤＮＡ検体の存在下で一本鎖ＤＮＡである認識試剤をポリメラーゼ連鎖反応を使用して標識化するなど、認識部分の複数の分子を繰り返し標識化することによって、この分析方法によって信号を増幅することもできる。
【００２８】
本発明の別の実施形態によると、癌細胞を検出する方法であって、
（i）テロメラーゼのプライマとして働くＤＮＡ認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下でテロメラーゼ反応は反応信号をもたらす反応を可能にする、
（ii）癌の疑いがある一つ以上の細胞からの細胞抽出物を有する分析試料を提供するステップと、
（iii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を急速に回転又は振動させて、反応信号を発生させるステップと、
（iv）前記反応信号を読み取るステップと、
（v）前記読み取り値を、癌細胞を含んでいない対照分析試料から得られた読み取り値と比較するステップと、前記分析試料における読み取り値が前記対照分析試料における読み取り値よりも高いことは、前記疑わしい細胞が癌性であることを示す、
を有する方法が提供される。
【００２９】
本発明のこの実施形態によると、患者の健康状態を診断する目的で、患者から採取された組織中の癌を検出できることが理解されるであろう。これに代えて、治療の成否や進行を評価する目的で、そのような組織試料を既知の癌患者の治療時に採取することができる。
【００３０】
用語「癌」又は「癌性」は、人又はそれ以外の細胞又は患者のあらゆる癌性若しくは悪性状態を表すものとする。
【００３１】
本発明の方法においては、媒体内に検体が存在していると、その結果として、信号（例：電気信号、色信号）が生成される、又は光が発せられる、又は沈殿が形成され、これによって、検体の存在が示される。検出部材は、反応信号を検出できるものである。信号が発光であるときには、検出器は光検出器である。
【００３２】
信号が電気信号であるときには、その信号は、電極と電子伝達鎖との間で電子が移動する結果であり、この場合に検体は電子伝達鎖の一要素である。
【００３３】
本発明の方法において使用するのに適する電極は、例えば、金、白金、パラジウム、銀、カーボン、胴、ＩＴＯ（インジウムスズ酸化物）など、導体材料又は半導体材料から作製されているか、或いはこれらの材料によって被覆されている。
【００３４】
本発明の方法及びシステムは、複数の検体の同時又は連続的な検出にも適用できることが理解されるであろう。このような場合、磁性粒子は、（同じ磁性粒子上又は異なる磁性粒子上のいずれかに）複数の認識試剤を担持する。同時検出を行うためには、分析条件は、各検体ごとに区別できる反応信号を同時に形成することができる条件である必要がある。従って、一つの検体の存在が一つのタイプの反応信号（例：発光）につながり、その一方で、別の検体の存在が別のタイプの反応信号（例：検出部材上の沈殿の形成、又は異なるスペクトルでの発光）につながる。これに代えて、複数の検体の検出を連続的に達成することができ、すなわち、一つの分析が実行された後、磁性粒子を集めて洗浄し、別の分析条件を与えて別の検体を検出する。このような場合、各分析においてただ一つの検体の存在に対応して反応信号が得られるならば、反応信号は同じでよい。
【００３５】
本発明を理解し、本発明を実際に実施する方法を示す目的で、以下に、いくつかの好ましい実施形態について、例（本発明はこれに制限されない）を用いて添付の図面を参照しながら説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
留意すべき点として、本発明の方法によって行われる分析の間、化学系の成分、例えば検体、認識部分、触媒、又は触媒の作用に必要な成分（例：基質）、のうち少なくとも一成分は、分析対象の液体媒体に溶解している必要があり、それ以外の成分は磁性粒子に結合している必要がある。後から示す例においては、次の成分はそれぞれの溶液中にあった。
【００３７】
（ａ）ＮＡＤＨ分析の場合：ＮＡＤＨは溶液に溶かし、ＰＱＱは磁性粒子に固定した。
【００３８】
（ｂ）グルコースの分析の場合：グルコースは、生体触媒として機能するグルコースオキシダーゼと一緒に溶液に溶かした。その一方で、電極と酵素との間の電気的な伝達を行う電子伝達体であるフェロセンは、磁性粒子に固定した。
【００３９】
（ｃ）図４Ａ、図４Ｂ、図５によるＤＮＡ分析の場合：相補ＤＮＡ（検体）は、電極触媒（electrocatalyst）として機能するドキソルビシン（doxorubicin）と一緒に、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子に固定した。その一方で、電極触媒の作用下で過酸化水素に変換される基質である酸素は、分析媒体に可溶である。
【００４０】
（ｄ）抗体分析：ＤＮＰ抗体が検体であり、電極触媒として作用するナフトキノンと一緒に粒子表面に固定した。酸素は、電極触媒の作用下で過酸化水素に変換される可溶化された物質である。
【００４１】
（ｅ）図８Ａ、図８Ｂ、図９によるＤＮＡ分析の場合：相補ＤＮＡ（検体）は、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子に固定した。この検体に相補な追加のＤＮＡ試薬をこの合成物に固定し、酵素であるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をビオチン−アビジン相互作用を介してこの合成物に固定した。ナフトキノンも磁性粒子に固定した。電極に電位を印加すると、ナフトキノンがヒドロキノンに還元され、電極触媒の作用下で酸素が過酸化水素に還元される。電解的に生成された過酸化水素によってルミノールがＨＲＰ触媒の作用下で酸化されると、その結果として化学発光が起きて光が発せられる。ルミノールと過酸化水素は、分析媒体に可溶である。
【００４２】
（ｆ）図１０〜図１３によるＤＮＡ分析の場合：相補ＤＮＡ（Ｍ１３φＤＮＡ、検体）を、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子に固定し、この合成物をタック・ポリメラーゼ（Taq-Polymerase）用の基質として使用した。ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰ）は、分析媒体に可溶であった。ポリメラーゼ反応が終了した後、ＤＮＡが結合している磁性粒子にビオチン−アビジン相互作用を介してＨＲＰを固定した。電極触媒として作用するナフトキノンも、磁性粒子に固定した。電極触媒の作用下で過酸化水素に変換される基質である酸素と、過酸化水素と共にＨＲＰの基質であるルミノールも、分析媒体に可溶である。
【００４３】
（ｇ）図１４〜図１６によるＤＮＡ分析の場合：相補ＤＮＡ（変異検体でありワイルドタイプＤＮＡ）を、ＤＮＡが結合している磁性粒子に固定し、この合成物をタック・ポリメラーゼ用の基質として使用した。ヌクレオチド（ビオチン−ｄＣＴＰ）は、分析媒体に可溶であった。ポリメラーゼ反応が終了した後、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子にビオチン−アビジン相互作用を介してＨＲＰを固定した。電極触媒として作用するナフトキノンも、磁性粒子に固定した。電極触媒の作用下で過酸化水素に変換される基質である酸素と、過酸化水素と共にＨＲＰ用の基質であるルミノールも、分析媒体に可溶である。
【００４４】
（ｈ）テロメラーゼ分析の場合：酵素検体を、磁性粒子に結合しているＤＮＡプライマにテロメア反復を付加するための触媒として作用させた。ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰ）は、分析媒体に可溶であった。テロメラーゼ反応が終了した後、ＤＮＡが結合している磁性粒子にビオチン−アビジン相互作用を介してＨＲＰを固定した。電極触媒として作用するナフトキノンも、個別の磁性粒子に固定した。基質である酸素が、電極触媒の作用下で過酸化水素に変換され、過酸化水素と共にＨＲＰ用の基質であるルミノールも、分析媒体に可溶である。
【００４５】
磁性粒子（Ｆｅ３Ｏ４、平均直径約１μｍ、飽和磁化約６５ｅｍｕ・ｇ−１）は、公開されている手順（非特許文献１３）に従って、反応媒体に界面活性剤を含めずに作成した。図１は、磁性粒子の機能化を示している。磁性粒子を、［３−（２−アミノエチル）アミノプロピル］トリメトキシシラン（[3-(2-aminoethyl)aminopropyl]trimethoxysilane）によってシラン化した後、結合試薬として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用して、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）（１）、又はＮ−（フェロセニルメチル）アミノヘキサン酸（N-(ferrocenylmethyl)aminohexanoicacid）（２）、によって機能化した。ＰＱＱによって機能化された磁性粒子は、底部のＡｕ電極（０.２４ｃｍ２）に外部磁石（ＮｄＦｅＢ／Ｚｎ被覆磁石、直径１８ｍｍ、電極面において０.２ｋＯｅ）によって引き寄せられ、Ｅ０＝−０.１３Ｖ（対ＳＣＥ）、ｐＨ＝７.０において可逆的なサイクリックボルタモグラムを示し、平均表面被覆率（surface coverage）は粒子あたりＰＱＱ７５００ユニットであった。磁性粒子に関連付けられるＰＱＱユニットのサイクリックボルタモグラムは、外部磁石の回転速度とは無関係であり、このことは、酸化還元ユニットが（支持部材としての）電極に局限されていることを示す。ＰＱＱによって機能化された磁性粒子は、１，４−ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（1,4-dihydronicotineamide adenine dinucleotide）（ＮＡＤＨ）の酸化の電極触媒として作用し、特にＣａ２＋イオンの存在下において効果的である（非特許文献１４）。
【００４６】
図２Ａは、外部磁石の様々な回転速度において、ＰＱＱ磁性粒子の介在による電極触媒の作用下で５０ｍＭのＮＡＤＨを酸化したときに観察された、サイクリックボルタモグラムを示している。図２Ｂは、外部磁石の様々な回転速度において、様々な濃度のＮＡＤＨの存在下で発生した陽極電流に対応する較正曲線を示している。図２Ａと図２Ｂから、電極触媒の作用下で発生する電流は、外部磁石の回転速度が高まるにつれて増すことが明らかである（低い回転速度では理論上の関係Ｉｃａｔ∝ω１／２が観察された）。
【００４７】
対照実験においては、ＰＱＱによって機能化されたシリカ粒子を重量分析的にＡｕ電極上に付着させ、ＮＡＤＨの存在下において外部磁石を様々な速度で回転させた。電極触媒の作用下で発生する電流に対して、回転する外部磁石の影響は観察されなかった。このことは、（支持部材としての）電極上の磁性粒子を回転させると、電極への基質の移動が流体力学的に制御されることに起因して、電極触媒の作用下の陽極電流が外部磁石の回転時に増すことを意味する。
【００４８】
酸化還元機能を与えられた磁性粒子を回転させることにより、電極触媒の作用下で発生する電流が磁界の刺激により増大することは、生体電極触媒の作用下での変換の場合にも実証された。フェロセン誘導体（２）によって機能化された磁性粒子をＡｕ電極に引き寄せ、回転する外部の磁石によって（支持部材としての）導体上で回転させた。フェロセンユニットの準可逆的なレドックス波（redox-wave)（Ｅ°＝０.３２Ｖ）は、外部の磁石の回転とは無関係である。図３Ａは、１×１０−５Ｍのグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）と５０ｍＭのグルコースの存在下での、外部磁石の様々な回転速度における、フェロセンによって機能化された磁性粒子のサイクリックボルタモグラムを示している。図３Ｂは、外部磁石の様々な回転速度における、グルコースの様々な濃度におけるシステムのアンペロメトリック応答に対応する較正曲線を示している。電極触媒の作用下での陽極電流は、外部磁石の回転速度が大きいほど増大する。対照実験から明らかにされた点として、電極触媒の作用下での陽極電流はグルコースオキシダーゼとグルコースが存在するときにのみ観察され、フェロセンによって機能化されたＳｉＯ２粒子によって電極触媒の作用下で生成される陽極電流に対しては、外部磁石の回転速度の影響が観察されない。
【００４９】
図４Ａと図４Ｂに示した別の実験は、生体電極触媒の作用下での発光を使用してのＤＮＡ分析を示している。Ｆｅ３Ｏ４の磁性粒子をシラン化し、ＤＮＡプライマ（３）をシラン薄膜に共有結合させた。この、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子をＤＮＡ検体（４）と反応させ、その結果として二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡらせんが生じた。ｄｓ−ＤＮＡによって機能化された磁性粒子を、特異的にｄｓ−ＤＮＡに結合するインターカレータ（intercalator）であるドキソルビシン（doxorubicin）（５）と反応させた。このインターカレータは、電気化学的に還元することができる電気化学的に活性なキノンであり、更にＯ２を還元して結果的に過酸化水素Ｈ２Ｏ２を生成することができる。電極触媒の作用下で生成されるＨ２Ｏ２は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とルミノールの存在下で光を発生させる。発せられる光は分析信号であり、インターカレータの存在、従って検体ＤＮＡ（４）の存在を報告する。発光の強度は、電極触媒の作用下でのＯ２の還元速度に依存する。この速度は、改質された磁性粒子が回転すると高まり、結果として発光が増幅される。
【００５０】
別の実験では、不溶性の物質が生体電極触媒の作用下で沈殿することを使用してＤＮＡ分析を実行した。図５に示した系は、上述した系と似ているが、ＨＲＰと４−クロロナフトール（4-chloronaphthol）（６）の存在下において電極触媒の作用下でＨ２Ｏ２が生成される結果として、不溶性生成物（７）が沈殿する。この不溶性生成物により、電極面が絶縁される。この効果は、ファラデーインピーダンス又はクロノポテンシオメトリーによって測定することができる。電極の絶縁の程度は、Ｈ２Ｏ２の生成速度に依存する。この速度は、改質された磁性粒子が回転すると高まり、結果として信号が増幅される。
【００５１】
新しい免疫センサーを図６Ａ〜図６Ｃに示す。磁性粒子は、上述したようにアミノシランによってシラン化した。ジニトロフェニル（dinitrophenyl）のカルボン酸誘導体である抗原（８）を、磁性粒子の表面におけるシロキサン層のアミノ基に共有結合させた。シラン化した磁性粒子１０ｍｇと（８）とのこの結合反応は、０.１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.２）中で、５ｍＭのＥＤＣの存在下で濃度１ｍＭにおいて２時間にわたり進行させた。次に、未結合の抗原分子すべてを取り除くため、（８）から誘導された磁性粒子を水で洗浄した。抗原によって改質された磁性粒子を、０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）中で様々な濃度（２ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ）のＤＮＰ抗体（９）（ＤＮＰはジニトロフェノールの略語）と３０分間にわたり反応させる。次に、抗体／抗原によって機能化された磁性粒子を、酵素であるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている抗ＤＮＰ抗体（anti-DNP-antibody）（１０）（１００ｎｇ／ｍＬ）と３０分間にわたり反応させる。この二次的な抗ＤＮＰ抗体（１０）は、一次ＤＮＰ抗体に結合することができるが、ＤＮＰ抗原（８）には結合しない。従って、磁性粒子に結合しているＨＲＰ複合体抗ＤＮＰ抗体（１０）の量は、ＤＮＰ抗体の存在に依存し、ＤＮＰ抗体の濃度に比例する。抗原（８）、ＤＮＰ抗体（９）、及びＨＲＰ複合体抗ＤＮＰ抗体（HRP-conjugate-anti-DNP-antibody）（１０）とによって磁性粒子を機能化する上述した手順は、図６Ａに示してある。酵素ＨＲＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とルミノールを使用して光を生成する。従って、Ｈ２Ｏ２を分析溶液の一部として試料に組み入れることができる。しかしながら、この例においては、図６Ｂに示すように、別の種類の機能化された磁性粒子を使用してＨ２Ｏ２を生成し、これによって系を電気化学的に活性化する。シラン化した磁性粒子を、１０ｍｇの磁性粒子と１００ｍｇのキノン（１１）とを含むエタノール懸濁液（５ｍＬ）中で、このエタノール懸濁液を煮沸して２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン（2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone）（１１）と３分間にわたり反応させる。次に、キノンから誘導された磁性粒子をエタノールで三回洗浄し、水で一回洗浄する。図６Ａと図６Ｂの両方に示した機能化された粒子を組み入れた系を、図６Ｃに示す。この系は、図６Ｂに従って生成される、キノン（１１）によって機能化された磁性粒子１０ｍｇと、図６Ａに従って作成される磁性粒子１０ｍｇとから成る。この系にも、Ａｕ板電極と、電極の下の回転する磁石とが含まれている。また、溶液は、空気で飽和している０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）中に１×１０−５Ｍのルミノールを含んでいる。光検出器は、溶液の上方に固定されている。−０.６Ｖの電位（対ＳＣＥ）を電極に印加することにより、溶液に溶けている酸素が電気化学的に還元される。この還元は、キノン（１１）が触媒として作用し、結果的に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生じる。過酸化水素は酵素ＨＲＰの存在下でルミノールと反応し、この結果としての発光を光検出器によって検出する。
【００５２】
図７Ａと図７Ｂは、図６Ｃに示した免疫検出システムの結果を示している。図７Ａは、磁性粒子を回転させない場合（曲線ａ）と、１００ｒｐｍ（回転／分）の場合（曲線ｂ）の発光の強度を示している。回転時には系内での移動（キノンへの酸素の移動、キノンからＨＲＰへの過酸化水素の移動、ＨＲＰへのルミノールの移動）が改善されるため、信号は増幅されている。発光は、結合している酵素ＨＲＰの量に依存するが、ＨＲＰの濃度はＤＮＰ抗体（９）（検体）の濃度に依存する。図７Ｂは、回転なしの場合（ａ）と１００ｒｐｍの場合（ｂ）の二つの較正プロット（calibration plot）（ＤＮＰ抗体濃度に対する光信号の強度）を示している。曲線（ｂ）と曲線（ａ）上の対応する測定値の比は、磁性粒子の回転時に達成された増幅率を示す。留意すべき点として、増幅率は、回転速度に依存する（ただしこの依存関係は線形ではない。前の例を参照）。
【００５３】
図８Ａは、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子と、ビオチンによって標識化されたＤＮＡと、アビジン−ＨＲＰとを使用することによってＤＮＡ検体を検出する、本発明の実施形態を示している。アミンによって機能化されたホウ珪酸塩ベースの磁性粒子（５μｍ、ＣＰＧ社の長鎖アルキルアミンＭＰＧ（登録商標））を、ヘテロ二官能性の架橋剤（heterobifunctional cross-linker）である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（3-maleimidopropionic acid N-hydroxysuccinimide ester）を使用して、ＤＮＡプライマ（１２）によって改質した。粒子の被覆率は、試薬オリグリーン（Oligreen：登録商標）試薬（モルキュラー・プローブス（Molecular Probes）社のｓｓＤＮＡ定量分析キット）を使用して、粒子あたり約５２,０００個のオリゴヌクレオチド分子であると推定した。プライマ（１２）は、標的配列（１３）の一部の相補である。（１２）によって機能化された磁性粒子を、（様々な濃度の）標的（１３）と、ビオチンによって標識化された核酸（自由断片（free segment）の相補である）（１４）とが含まれる混合物を用いて、単一ステップでハイブリッド化する。次に、三成分の二本鎖ＤＮＡ構造（１２）／（１３）／（１４）を、生体触媒標識（biocatalyticlabel）として作用するアビジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と相互作用させる。
【００５４】
次に、図８Ｂに示した一つの実施形態に従って、ＤＮＡとアビジン−ＨＲＰとによって機能化された図８Ａの磁性粒子を、ナフトキノンユニット（１５）によって改質された磁性粒子と混合する。次に、磁性粒子のこの混合物を、外部磁石によって（支持部材としての）電極に引き寄せる。ナフトキノンが電気化学的にヒドロキノンに還元される結果として、Ｏ２が触媒作用によりＨ２Ｏ２に還元される。このように電解によりＨ２Ｏ２が生成される結果として、ルミノール（１６）とＨＲＰ酵素標識の存在下で、化学発光信号が生成される。
【００５５】
不特定な吸着が起こらないならば、アビジン−ＨＲＰは、標的ＤＮＡが磁性粒子とハイブリッド化されている場合にのみ電極に近づく。従って、化学発光は、標的ＤＮＡ（１３）が分析試料中に存在している場合にのみ発生する。更に、光の強度は、電極に対応する（１２）と（１３）の認識対の数に直接関連し、従って、試料中の（１３）の濃度の定量的な測度となる。
【００５６】
回転する外部磁石によってバリア面上の粒子が回転する結果として、電気化学発光が増大する。なぜなら、磁性粒子は回転する微小電極として振る舞い、Ｏ２及びルミノールと電極上の触媒との相互作用が拡散ではなく対流によって制御されるためである。従って、磁性粒子が回転することによって、ＤＮＡの増幅検出が得られるものと予測される。
【００５７】
理解すべき点として、Ｈ２Ｏ２を電解により生成することは本発明の必須部分ではなく、別の実施形態によると、Ｈ２Ｏ２を分析試料に直接導入することができる。そのような場合、電極も必要ない。しかしながら、そのような代替実施形態においては、Ｈ２Ｏ２が電極付近に局在化されないため、反応条件を与える前に余分なアビジン−ＨＲＰを分析試料から取り除く必要がある。
【００５８】
基本的に図８Ａと図８Ｂに従って行われる実験においては、（１２）によって機能化された磁性粒子の試料を、２×１０−７Ｍのビオチン化された核酸（１４）の存在下で、１.４×１０−８Ｍの（１３）と相互作用させた。その結果の二本鎖（１２）／（１３）／（１４）の三成分系を外部磁石によって集め、０.２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄した後、アビジン−ＨＲＰ複合体と反応させ、再び外部磁石によって集めた。その結果の粒子を、ナフトキノン（１５）によって改質された２ｍｇ・ｍｌ−１の磁性粒子と共に電気化学セル内に懸濁させた。図９Ａにおいて、曲線（ａ）は、外部磁石によって電極上に磁性粒子を集め、電極に０Ｖ〜−０.５Ｖ〜０Ｖの電位ステップを印加したときの発光の強度を示している。図９Ａの曲線（ｂ）〜（ｄ）は、様々な回転速度を用いて外部磁石によって粒子を回転させたときの発光の強度を示している。回転速度が高くなると発光強度が増し、結果の光の強度はω１／２（ω＝回転速度）に対して線形的な関係となり、これは、回転する微小電極が電極触媒として作用するものと考えたときに予測されるものである。ハイブリッド化するステップにおいて（１３）が存在しない対照実験においては、発光は検出されず、このことは、（１４）又はアビジン−ＨＲＰ複合体が不特定には吸着しないことを示す。系から発せられる光の強度は、アビジン−ＨＲＰ複合体の表面被覆率に関連し、被覆率は、粒子に関連付けられる（１３）／（１４）の量によって制御され、従って（１３）の濃度によって決まる。図９Ｂは、様々な回転速度において様々な濃度の（１３）を分析して記録したときの発光強度に対応する較正曲線を示している。図９Ａの曲線（ｅ）は、（１３）に対する７塩基変異配列を含む１×１０−７Ｍの変異体（１３ａ）を、図８Ａと図８Ｂの実施形態に従って回転速度２０００ｒｐｍにおいて分析したときに観察された光の強度を示している。表面上のアビジン−ＨＲＰ複合体が不特定に吸着することに起因する発光は観察されなかった。この光の強度は、背景信号としてみなされ、従って、この例においては、（１３）は、ω＝２０００ｒｐｍにおいて１×１０−１４Ｍの検出限界で検出することができる（Ｓ／Ｎ＞３）。
【００５９】
以下に説明する例は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して反応信号を増幅する、本発明によるＤＮＡ検体の検出方法の使用について示している。これらの例においては、次の実験条件と材料を使用した。
【００６０】
・アミンによって機能化されたホウ珪酸塩ベースの磁性粒子（５μｍ、ＣＰＧ社の長鎖アルキルアミンＭＰＧ（登録商標））と、ビオチン−２１−ｄＵＴＰ（クロンテック（Clontech）社）。ヘテロ二官能性の架橋剤である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、オリゴヌクレオチド（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、アビジン−ＨＲＰ−複合体、ｄＮＴＰ、ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、タック・ポリメラーゼ、１０×ＰＣＲ緩衝液、及びその他のすべての化合物はシグマ（Sigma）社から購入し、購入した状態で使用した。
【００６１】
・ＤＮＡによって機能化された磁性粒子の作成：アミンによって機能化された磁性粒子（ＣＰＧ社の長鎖アルキルアミンＭＰＧ（登録商標））３０ｍｇを、１ｍｌのＤＭＳＯ中でヘテロ二官能性の架橋剤である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０ｍｇ、シグマ社）との反応によって活性化した。室温で４時間インキュベーションした後、外部磁石によって粒子を集め、ＤＭＳＯと水とで完全に洗浄した。次に、マレイミドによって活性化した粒子を、０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）中でチオレートオリゴヌクレオチド（thiolatedoligonucleotide）の２０〜３０Ｏ.Ｄと８時間にわたり反応させた（チオレートヌクレオチドは、機能化された粒子との反応前にＤＴＴによって新たに還元し、セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラムに分離した。最後に、磁性粒子を水と０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）によって洗浄した。ＤＮＡによって改質された粒子を一週間以上の期間にわたり保持するため、１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを加え、粒子を４℃に維持した。酵素ＤＮアーゼ処理（１０ユニットのＤＮアーゼ、３７℃で３０分）の前後に、磁性粒子上のオリゴヌクレオチド含有量を、オリグリーン（登録商標）試薬（モルキュラー・プローブス社のｓｓＤＮＡ定量分析キット）を使用することによって測定した。
【００６２】
・φ：（ａ）点変異（single-point-mutation）検出の場合：変性は９４℃で３０秒、アニーリングは５５℃で３０秒、重合は７２℃で５秒、（ｂ）ウイルス検出の場合：変性は９４℃で３０秒、アニーリングは５５℃で３０秒、重合は７２℃で１５秒。
【００６３】
・金で被覆した（金の層は５０ｎｍ）ガラス板（ドイツのアナリティカル−μシステム（Analytical-μSystem）社）を作用電極として使用した（溶液との接触面積は０.３ｃｍ２）。直径０.５ｍｍのワイヤから補助のＰｔ電極と擬似基準Ａｇ電極とを作製し、セルに加えた。擬似基準電極は、飽和カロメル電極に対して較正し、電位はＳＣＥに対するものである。水平位置にＡｕ電極を含むオープン型の（open）電気化学セル（２３０μＬ）と、光ファイバに結合されている光検出器とにより、改良した作用電極に適切な電位を印加したときの発光を容易に測定することができた。この電気化学測定は、コンピュータ（ＥＧ＆Ｇ社のソフトウェア２７０／２５０）に接続されたポテンシオスタット（モデル２８３、ＥＧ＆Ｇ社）を使用して実行した。すべての測定は、０.０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）中で室温にて実行した。電気化学的に発生する化学発光を、オシロスコープ（テクトロニクス（Tektronix）社のＴＤＳ２２０）に接続された光検出器（オフィル（Ophir）社のレーザシュタット（Laserstat））によって測定した。光検出器は、光ファイバによって電気化学セルに接続した。バックグラウンド電解質は空気と平衡状態にあり、１×１０−６Ｍのルミノールを含んでいた。
【００６４】
図１０は、機能化された磁性粒子を使用してウイルスＭＰ１３φＤＮＡを増幅検出する方法を示している。図１１に概略を示すように、磁性粒子（ＣＰＧ社の長鎖アルキルアミンＭＰＧ（登録商標）、直径５μｍ、）を、ヘテロ二官能性の架橋剤である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して、チオレートプライマ（thiolated primer）（１７）によって改質する。磁性粒子の平均被覆率は、オリグリーン（登録商標）試薬（モルキュラー・プローブス社）を使用することによって求め、粒子あたりオリゴヌクレオチド約５０,０００ユニットに相当した。粒子に関連付けられている核酸のうち外部酵素に接触可能な核酸の数は、（１７）によって機能化された磁性粒子をＤＮアーゼに接触させた後、分解したＤＮＡの含有量を求めることによって推定した。粒子あたりオリゴ約２０,０００ユニットが分解したことが判明し、このことは、粒子に結合している核酸のうち酵素に接触可能なのはわずか約４０％であることを意味する。図１０に示すように、（１７）によって改質された磁性粒子を、ＭＰ１３φＤＮＡ（７２２９塩基）によってハイブリッド化し、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ビオチン化ｄＵＴＰ（ｂ−ｄＵＴＰ）の混合物の存在下で重合させる。この重合により、多数のビオチン標識が複製に組み込まれる。複製の後の熱サイクルの結果、分析対象のＭＰ１３φＤＮＡが解離し、磁性粒子に関連付けられている他のオリゴヌクレオチドプライマとの再ハイブリッド化する。その後、重合が起こり、多数のビオチン標識ユニットを含んだ新しい複製が形成される。熱サイクルの回数を制御することにより、粒子の表面上の複製化によって、ビオチン標識化された核酸が非常に高密度に磁性粒子上に形成される。熱サイクルはそれぞれ３０秒間実施し、複製の効率はサイクルあたり約５００塩基である。この比較的低い複製効率は、磁性粒子上に核酸が立体的に密集すること（これによってビオチン標識による粒子の周期的な標識化が乱れることがある）を排除する目的で故意に設計した。次に、この結果として生じた、ビオチン標識化された磁性粒子を外部磁石によって分離し、アビジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応させ、再び外部磁石によって分離し、リン酸緩衝溶液によって洗浄した。アビジンによって機能化された磁性粒子１ｍｇと、ナフトキノンによって改質された磁性粒子（１５）（図示していない）との混合物を電気化学セルに入れた。次に、磁性粒子を外部磁石によって電極に引き寄せた。ナフトキノンがそれぞれのヒドロキノンに還元される電位を電極に印加すると、電極触媒の作用下でＯ２からＨ２Ｏ２への還元が起こる。電解的に生成された過酸化水素によって、ＨＲＰ触媒の作用下でルミノールが酸化される結果として、化学発光が生じて光が発せられる。
【００６５】
図１２の曲線（ａ）は、８.３×１０−９ＭのＭＰ１３φＤＮＡを、上記に従い、電極に０Ｖ〜−０.５Ｖ〜０Ｖの電位ステップを印加することによって（ナフトキノンによって改質された粒子の場合のＥ０はｐＨ＝７において０.４Ｖ）分析したときの発光強度を示す。Ｍ１３φＤＮＡが存在しない試料にすべての分析手順を適用した対照実験（曲線（ｅ））では、発光が観察されず、アビジン−ＨＲＰ複合体が電極又は磁性粒子に不特定に吸着しないことを示す（図１２）。
【００６６】
図１２の曲線（ｂ）〜（ｄ）は、回転する外部磁石による磁性粒子の回転の効果を示している。磁性粒子の回転速度が高まるほど発光強度が増し、発光強度とω１／２（ω＝回転速度）との間には線形関係が観察される（図１２の挿入図）。
【００６７】
粒子の一定の回転速度においては、発光強度は、磁性粒子に関連付けられる標識化された核酸の表面被覆率によって制御され、この被覆率は、複製サイクル時の分析試料中のＭＰ１３φＤＮＡの濃度に関連する。図１３は、回転速度ω＝２０００ｒｐｍにおいて様々な濃度のＭ１３φＤＮＡを分析したときの発光強度を示している。
【００６８】
本発明の更なる例では、ＤＮＡ中の一塩基不適正（mismatch）を増幅検出する目的で機能磁性粒子を利用する。これは、図１４に示すように、正常な配列の遺伝子（１９）の中のＡ塩基がＧ塩基に置き換わっている変異配列（１８）の分析によって実証されている。磁性粒子は、変異配列の相補である核酸（２０）によってと、（１８）によってと、変異部位の一塩基手前までの遺伝子配列（１９）とによって機能化される。（２０）によって改質された磁性粒子と、（１８）又は（１９）のいずれかが含まれている試料との相互作用の結果、粒子とのハイブリッド化が起きた。磁性粒子に関連付けられるハイブリッド化された集合体をポリメラーゼとビオチン化ｄＣＴＰとによって処理した後、熱解離／アニーリング／標識化のサイクルを適用した結果、（１８）の分析時には、磁性粒子がビオチンユニットによる多重標識化（multi-labeling）が起きたのに対し、（１９）の分析時にはビオチン標識は組み込まれない。次に、この粒子をアビジン−ＨＲＰ複合体と相互作用させた後、外部磁石によって粒子を分離すると、生体触媒の作用下で標識化された粒子が得られた。この結果の粒子を、ナフトキノンによって改質された粒子（１５）（図示していない）と電気化学セル内で混合した後、外部磁石によって電極に引き寄せると、電極触媒の作用下でＯ２からＨ２Ｏ２への還元が起き、ルミノールの存在下において、（１８）の分析時には発光が生じたが、（１９）の分析時には光は検出されない。この後、外部磁石によって磁性粒子を回転させれば、発光が増幅されることが予測され、なぜなら、電気化学発光は、粒子へのそれぞれの基質の対流によって制御されるためである。
【００６９】
図１５は、１×１０−９Ｍの（１８）（曲線（ａ））と１.４×１０−６Ｍの（１９）（曲線（ｄ））を、いずれも図１４に従って回転速度２０００ｒｐｍにおいて分析したときの発光強度を示している。電極触媒の作用下でのＯ２の還元を活性化し、二次的な化学発光工程を起こす目的で、０Ｖから−０.５Ｖ、再び０Ｖに戻す電位ステップを電極に印加した。（１９）の分析時には発光は観察されず、核酸によって改質された磁性粒子にビオチン標識が組み込まれなかったことを示す。明らかに、発光は変異配列の分析時のみに観察されている。図１５の曲線（ａ）〜（ｃ）は、磁性粒子を様々な回転数で回転させたときにシステムから発せられる光を示している。図１６は、様々な濃度の（１８）を様々な回転数において分析したときに発せられる光を示している。発光強度は、粒子の回転速度が高まるほど増し（Ｐ∝ω１／２）、これは、電極支持体（electrode support）におけるプロセスが対流によって制御されることを意味している。変異配列（１８）の分析時の検出限界は１×１０−１７Ｍである。分析試料中の（１９）の濃度は、（１８）の濃度よりも１０３倍高いが、（１９）の分析時に発光は観察されない。このことは、磁性粒子へのＨＲＰ複合体の不特定の吸着が起こらないことを意味している。
【００７０】
結論として、この例は、磁性を利用することによりＤＮＡ分析プロセスが増幅されることを示している。プロセス内のいくつかの連続するステップにより、全体的な増幅が得られる。（ｉ）熱サイクルにより磁性粒子上の検体が複製されることにより、粒子に結合されている核酸に多数の標識ユニットが組み込まれる。（ii）電極において電極触媒の作用下でＯ２が生成されることと、それに対応して生体触媒の作用下で発光することにより、一回の認識処理の結果として膨大な生成物分子又は光子が生成される。（iii）磁性粒子の回転により、発光が増幅され、なぜなら、電極触媒及び生体電極触媒の作用下での粒子におけるプロセスでは、基質の移動が対流によって制御されるためである。これらの方法を使用して、非常に高い感度が達成された。
【００７１】
本発明の更に別の例は、与えられた試料内の酵素の検出である。図１７Ａと図１７Ｂは、酵素検体であるテロメラーゼの検出を概略的に示している。検体であるテロメラーゼは、染色体ＤＮＡの３´−端部にテロメア反復を付加することによって新しいテロメアを合成することができるリボ核蛋白質合成物である。従って、この例における認識試剤は、６個のＴ塩基のリンカーユニットの後に、テロメラーゼによって認識される特徴的配列が続く核酸配列（２１）である。アミンによって機能化された磁性粒子（直径５μｍ）を、二官能性の試薬である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して活性化し、これは、図１１にほぼ概略を示したとおりである（今回は配列（１７）ではなく配列（２１）を用いた）。メルカプトヘキシル（mercaptohexyl）によって改質された核酸（２１）を、磁性粒子に共有結合させた。具体的には、アミノによって機能化された磁性粒子（ＣＰＧ社の長鎖アルキルアミンＭＰＧ（登録商標））３０ｍｇを、１ｍＬのＤＭＳＯ中でヘテロ二官能性の架橋剤である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０ｍｇ、シグマ社）との反応によって活性化した。室温で４時間インキュベーションした後、粒子を外部磁石によって集め、ＤＭＳＯと水で完全に洗浄した。次に、０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）中で、マレイミドによって活性化した粒子をチオレートオリゴヌクレオチドの２０〜３０Ｏ.Ｄと８時間反応させた（チオレートヌクレオチドは、機能化された粒子との反応前にＤＴＴによって新たに還元し、セファデックスＧ−２５カラムに分離した）。最後に、磁性粒子を水と０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）によって洗浄した。ＤＮＡによって改質された粒子を一週間以上の期間にわたり保持するため、１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを加え、粒子を４℃に維持した。酵素ＤＮアーゼ処理（１０ユニットのＤＮアーゼ、３７℃で３０分）の前後に、磁性粒子上のオリゴヌクレオチド含有量を、オリグリーン（登録商標）試薬（モルキュラー・プローブス社のｓｓＤＮＡ定量分析キット）を使用することによって測定した。
【００７２】
図１７Ａに概略的に示すように、認識試剤（２１）を含む機能磁性粒子を、ビオチン標識化されたｄＵＴＰを含むヌクレオチドｄＮＴＰの混合物の存在下で、（検体の存在についての分析対象である）細胞抽出によって処理する。認識試剤にテロメラーゼを関連付けた後にテロメル化が行われ、このとき、テロメア反復にビオチンが組み込まれた新たに合成された鎖が標識化される。次に、アビジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合により、テロマー鎖に生体触媒標識が組み込まれる。外部磁石によって分析フラスコの底部に引き寄せることによって磁性粒子を集め、残留細胞抽出又は不特定に吸着したＨＲＰ複合体を取り除くために洗浄する。
【００７３】
次に、図１７Ｂに概略的に示すように、３，４−ジクロロナフトキノン（3,4-dichloronaphthoquinone）と、アミノエチルアミンによって改質された磁性粒子との反応によって生成された、ナフトキノンによって機能化された磁性粒子（１５）と、図１７Ａの結果の粒子とを混合する。粒子の混合物を、ルミノール（１６）を含む電気化学セルに入れる。キノンがヒドロキノンに還元される電位ステップを印加すると、電極触媒の作用下でＯ２からＨ２Ｏ２への還元が進行する。その結果のＨ２Ｏ２によって、触媒としてのＨＲＰの作用下でルミノールが酸化され、それに付随して発光が生じる。
【００７４】
電気化学発光は、ＨＲＰ標識がテロメラーゼユニットと結合する場合にのみ観察され、これは、テロメラーゼ（検体）が分析対象の細胞抽出の中に存在する場合にのみ起こる。また、電気化学発光の強度は、粒子に関連付けられる標識／アビジン−ＨＲＰ複合体の含有量によって制御され、この含有量は、試料中のテロメラーゼ酵素の量によって決まる。更に、外部の回転する磁石によって磁性粒子が回転することにより、発光強度が更に増幅される。粒子が回転するとき、電極触媒の作用下でのＯ２の還元と、Ｈ２Ｏ２とルミノールの相互作用は、拡散ではなく対流によって制御され、発光が強化（増幅）される。
【００７５】
図１８Ａは、図１７Ａと図１７Ｂによる２９３−腎臓癌細胞（293-kidney cancer cell）の抽出の分析を示している。この図は、粒子を様々な速度で回転させ、０Ｖから−０.５Ｖの電位ステップを印加して１００,０００個の細胞抽出の希釈溶液を分析したときに、系から発せられる光を示す。系から発せられる光の強度は、回転速度が高まるほど増す。分析する系の中で機能磁性粒子が回転する微小電極として振る舞い、電極触媒の作用下で発生する光が回転電極への基質の対流によって制御されるとすれば、発せられる光とω１／２（ω＝回転速度）との間には線形の依存関係が存在するはずである。図１８Ｂは、電解的に生成される光とω１／２との間に確かに線形関係が存在することを示している。ナフトキノンによって機能化された磁性粒子又はアビジン−ＨＲＰ複合体が系から除外されている対照実験では、粒子のいかなる回転速度においても系からの発光は検出されない。これらの実験により、電気化学発光は、最初の、電極触媒の作用下でのＯ２からＨ２Ｏ２への還元と、その後の、ＨＲＰの介在によるＨ２Ｏ２によるルミノールの酸化とに起因して生じることが確認される。
【００７６】
一定の回転速度における電気化学発光は、抽出の中の癌細胞の数によって制御される。図１９は、図１７Ａと図１７Ｂとに示した検出方法に従って、（ｉ）０ｒｐｍ、（ii）６０ｒｐｍ、（iii）２０００ｒｐｍに相当一定の回転速度おいて様々な濃度の２９３−腎臓癌細胞を分析したときに、電気化学セルから発せられる光を示している。これらのシステムにおいて、０.０Ｖから−０.５Ｖの電位ステップを機能粒子に印加する。図１９の挿入図は、それぞれ、１００個と１０個の２９３−腎臓癌細胞を含む抽出から発せられた光を示している。比較として、細胞が存在しない場合と、テロメラーゼ活性を不活性化する目的で分析プロセス前に９０℃に加熱した２９３−腎臓癌細胞の抽出が存在する場合では、分析手順全体を適用したときに光の発生は観察されていない。このことは、アビジン−ＨＲＰ複合体が磁性粒子又は電極に不特定には結合しないことを意味している。
【００７７】
類似する結果は、培養されたヒーラ細胞（HeLa cell）中のテロメラーゼを分析したときに観察される。図２０Ａは、図１７に従って、様々な回転速度の磁性粒子を使用して様々なヒーラ細胞抽出を分析したときの電気化学発光を示している。図２０Ａの挿入図に示すように、発光強度は粒子の回転速度を高くしたときに増し、生成された光の強度とω１／２（ｒａｄ・ｓ−１）の間には線形関係が観察された。図２０Ｂは、様々な濃度のヒーラ細胞抽出を分析したときの電気化学発光の強度を示している。この実験では、磁性粒子は、（ｉ）０ｒｐｍ、（ｉｉ）６０ｒｐｍ、（ｉｉｉ）２０００ｒｐｍの一定の回転速度で回転させた。図から明らかに、１０個のヒーラ細胞を分析したときに発せられる光を容易に検出することができる。
【００７８】
図２１は、テロメラーゼ活性のヒーラ細胞の抽出（曲線（ａ））、２９３−腎臓癌細胞の抽出（曲線（ｂ））、ＮＨＦ細胞（正常ヒト線維芽細胞：Normal Human fibroblast）の抽出（曲線（ｃ））を分析したときの電気化学発光を示している。明らかに、濃度が１００倍高い正常細胞を分析したときに観察される電気化学発光は、１０００個の２９３−腎臓癌細胞から発せられる光よりも約２００倍低い。正常なＮＨＦ細胞を含む系から発せられる微細な光は、アビジン−ＨＲＰ複合体の残留量が磁性粒子に不特定に吸着することに帰すことができる。ＮＨＦ細胞を含む系において生成される光は、この分析方式の背景光レベルとみなすことができる。
【００７９】
更に、図２２は、疑わしい組織中の癌を診断する能力を例証している。肺癌患者からの様々な組織を分析した。図２２は、健康な細胞と、腺癌の細胞と、扁平上皮癌の細胞を分析したときに得られる電気化学発光の強度を示しており、健康な組織又は正常な細胞の抽出を分析したときに得られる光信号と比較している。癌組織から得られる化学発光信号（テロメラーゼ活性）は、健康な組織細胞の抽出から得られる微細な化学発光信号よりも大幅に高かった。
【００８０】
この例は、癌細胞を識別するためと抗癌治療処置をモニターするための迅速な方法として、テロメラーゼを検出する目的に本発明が有用であることを明らかに示している。
【００８１】
上記のすべてのテロメラーゼ分析においては、金で被覆した（金の層は５０ｎｍ）ガラス板（ドイツのアナリティカル−μシステム社）を作用電極として使用した（溶液との接触面積は０.３ｃｍ２）。直径０.５ｍｍのワイヤから補助のＰｔ電極と擬似基準Ａｇ電極とを作製し、セルに加えた。擬似基準電極は、飽和カロメル電極に対して較正し、電位はＳＣＥに対するものである。水平位置にＡｕ電極を含むオープン型の電気化学セル（２３０μＬ）と、光ファイバに結合されている光検出器とにより、改良した作用電極に適切な電位を印加したときの発光を容易に測定することができた。この電気化学測定は、コンピュータ（ＥＧ＆Ｇ社のソフトウェア２７０／２５０）に接続されたポテンシオスタット（ＥＧ＆Ｇ社のモデル２８３）を使用して実行した。すべての測定は、０.０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）中で室温にて実行した。電気化学的に発生する化学発光を、オシロスコープ（テクトロニクス社のＴＤＳ２２０）に接続された光検出器（オフィル社のレーザシュタット）によって測定した。光検出器は、光ファイバによって電気化学セルに接続した。バックグラウンド電解質は空気と平衡状態にあり、１×１０−６Ｍのルミノールを含んでいた。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）（１）又はＮ−（フェロセニルメチル）アミノヘキサン酸（２）による、磁性粒子の機能化を示す図
【図２】図２Ａは、５０ｍＭのＮＡＤＨの存在下で、磁石を（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）１０ｒｐｍ、（ｃ）１００ｒｐｍ、（ｄ）１０００ｒｐｍで回転させたときに、ＰＱＱによって機能化された磁性粒子（１０ｍｇ）を磁力によって引き寄せたときのＡｕ電極のサイクリックボルタモグラムを示す図。電位走査速度は５ｍＶｓ−１である。図２Ｂは、磁石を（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）１００ｒｐｍ、（ｃ）１０００ｒｐｍで回転させたときの、ＮＡＤＨのアンペロメトリック検出（Ｅ＝０.１Ｖ）に対する較正プロットを示す図。データは２０ｍＭのＣａＣｌ２を含む０.１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７.０）中で記録した。
【図３】図３Ａは、１×１０−５Ｍのグルコースオキシダーゼと５０ｍＭのグルコースの存在下で、磁石を（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）１０ｒｐｍ、（ｃ）１００ｒｐｍ、（ｄ）４００ｒｐｍで回転させて、（２）によって機能化された磁性粒子（６ｍｇ）を磁力によって引き寄せたときのＡｕ電極のサイクリックボルタモグラムを示す図。電位の走査速度は５ｍＶｓ−１である。図３Ｂは、磁石を（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）１００ｒｐｍ、（ｃ）４００ｒｐｍで回転させたときの、グルコースのアンペロメトリック検出（Ｅ＝０.５Ｖ）に対する較正プロットを示す図。データは０.１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）において記録した。
【図４Ａ】ＤＮＡプライマによって磁性粒子の機能化が行われる実施形態を示す図
【図４Ｂ】図４Ａに示した実施形態を実施しているシステムであって反応信号が発光によって読み取られるシステムを示す図
【図５】磁性粒子の機能化が図４Ａに示したものと類似しているが、反応信号がファラデーインピーダンスによって読み取られる実施形態を実施しているシステムを示す図
【図６】図６Ａは、抗原による磁性粒子の機能化を示す図。図６Ｂは、ナフトキノン（４）による磁性粒子の機能化を示す図
【図６Ｃ】図６Ａと図６Ｂに示した実施形態の両方を実施している免疫検出システムを示す図
【図７】図７Ａは、図６Ｃに示したシステムにおいて得られた、磁性粒子を回転させない場合（曲線ａ）と回転させた場合（１００ｒｐｍ、曲線ｂ）の時間に対する発光強度のプロットを示す図。図７Ｂは、図６Ｃに示したシステムにおける、（ａ）回転させない場合と（ｂ）回転させた場合（１００ｒｐｍ）のＤＮＰ抗体濃度に対する光信号強度の二つの較正プロットを示す図
【図８】図８Ａは、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子と、ビオチン標識化ＤＮＡと、アビジン−ＨＲＰ複合体とを使用することによる、ＤＮＡ検体の結合を概略的に示す図。図８Ｂは、図８Ａに示した、ＤＮＡによって機能化された磁性粒子と、キノンによって改質された磁性粒子とを実施している、ＤＮＡ検体の検出システムを示す図。
【図９】図９Ａは、図８Ａと図８Ｂとに従って、１.４×１０−８ＭのＤＮＡ検体（１３）を様々な回転速度（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）６０ｒｐｍ、（ｃ）４００ｒｐｍ、（ｄ）２０００ｒｐｍにおいて分析したときの化学発光の強度のグラフを示す図。（ｅ）は、１×１０−７Ｍの変異体（１３ａ）の２０００ｒｐｍにおける分析である。挿入図は、光の強度とω１／２（ω＝回転速度）との間の関係を示すグラフである。化学発光信号は、０Ｖ〜−０.５Ｖ〜０Ｖ（対ＳＣＥ）の電位ステップを電極に印加することによって生成される。図９Ｂは、様々な回転速度（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）６０ｒｐｍ、（ｃ）２０００ｒｐｍにおける、図８Ａと図８Ｂとに従ってのＤＮＡ検体（１３）の濃度の関数としての光の強度のグラフを示す図。挿入図は、低い濃度範囲における結果の拡大である。化学発光信号は、０Ｖ〜−０.５Ｖ〜０Ｖ（対ＳＣＥ）の電位ステップを電極に印加することによって生成されている。
【図１０Ａ】粒子上の核酸の複製を、熱サイクルを使用してビオチンユニットによって標識化する場合における、多重標識化された回転する磁性粒子によるウイルスＤＮＡの増幅検出を示す図
【図１０Ｂ】機能化された磁性粒子を電極面上で回転させて、増幅された化学発光を生成する場合における、多重標識化された回転する磁性粒子によるウイルスＤＮＡの増幅検出を示す図
【図１１】ヘテロ二官能性の架橋剤である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して、認識試剤としてのＤＮＡプライマを磁性粒子に結合させる様子を概略的に示す図
【図１２】異なる回転速度（ａ）０ｒｐｍ、（ｂ）６０ｒｐｍ、（ｃ）４００ｒｐｍ、（ｄ）２０００ｒｐｍにおいて、８×１０−９のＭ１３φＤＮＡを分析したときの化学発光の強度と、（ｅ）Ｍ１３φＤＮＡが存在しない状態で２０００ｒｐｍにおいて分析手順を適用したときの化学発光信号のグラフを示す図。挿入図は、ω１／２（ω＝回転速度）の関数としての化学発光の強度を示す。化学発光は、Ｅ＝０.０Ｖ〜Ｅ＝−０.５Ｖ〜Ｅ＝０.０Ｖ（対ＳＣＥ）の電位ステップを印加することによって生成された。図中の矢印は、それぞれ、電位を−０.５Ｖと０.０Ｖに切り替えるタイミングを示す。データは、１×１０−６Ｍのルミノールを含む０.０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）において空気中で記録した。
【図１３】（ａ）２０００ｒｐｍ、（ｂ）４００ｒｐｍ、（ｃ）６０ｒｐｍ、（ｄ）２０ｒｐｍ、（ｅ）０ｒｐｍにおいて、様々な濃度のＭ１３φＤＮＡを分析したときの化学発光の強度に対応する較正曲線を示す図
【図１４】磁性粒子を使用しての、ＤＮＡにおける一塩基不適正の増幅検出を示す図
【図１５】（ａ）２０００ｒｐｍ、（ｂ）４００ｒｐｍ、（ｃ）６０ｒｐｍにおいて１×１０−９ＭのＤＮＡ変異体（１８）を分析したときの化学発光の強度のグラフを示す図。（ｄ）は、２０００ｒｐｍにおいて１.４×１０−６Ｍの正常配列（１９）を分析したときの化学発光の強度のグラフを示している。化学発光の記録の条件は、図１２に詳述してある。
【図１６】異なる回転速度（ａ）２０００ｒｐｍ、（ｂ）４００ｒｐｍ、（ｃ）６０ｒｐｍ、（ｄ）０ｒｐｍにおける様々な濃度の変異体（１８）の分析に対応する較正曲線を示す図。挿入図は、較正曲線の拡大であり、（１８）の低濃度における化学発光の強度を示している。
【図１７Ａ】テロメラーゼ酵素活性の結果としてビオチンユニットによって磁性粒子を多重標識化する場合における、多重標識化された回転する磁性粒子によるテロメラーゼ活性の迅速な増幅検出を概略的に示す図
【図１７Ｂ】ビオチンによって多機能化された磁性粒子を電極面上で回転させて、増幅された化学発光を生成する場合における、多重標識化された回転する磁性粒子によるテロメラーゼ活性の迅速な増幅検出を概略的に示す図
【図１８】図１８Ａは、異なる回転速度０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、２０００ｒｐｍにおいて、１００,０００個の細胞を含む２９３−腎臓癌細胞の抽出を分析したときの化学発光の強度を示す図。矢印は、それぞれ、電位を−０.５Ｖと０.０Ｖに切り替えるタイミングを示す。図１８Ｂは、ω１／２（ω＝回転速度）の関数としての化学発光の強度を示す図。すべての実験において、化学発光は、Ｅ１＝０.０Ｖ〜Ｅ２＝−０.５Ｖ〜０Ｖ（対ＳＣＥ）の電位ステップを印加することによって生成された。データは、１×１０−６Ｍのルミノールを含む０.０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）において空気中で記録した。
【図１９】一定の回転速度（ｉ）０ｒｐｍ、（ii）６０ｒｐｍ、（iii）２０００ｒｐｍにおいて、細胞数の異なる２９３−腎臓癌細胞の抽出を分析したときの化学発光の強度に対応する較正曲線を示す図。挿入図は、較正曲線の拡大であり、０〜１００個の細胞を含む抽出から得られた化学発光信号の強度を示している。化学発光の記録の条件は、図１８に詳述してある。
【図２０Ａ】０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、２０００ｒｐｍにおいて、１００,０００個の細胞を含むヒーラ細胞の抽出を分析したときの化学発光の強度を示す図。挿入図は、ω１／２（ω＝回転速度）の関数としての化学発光の強度を示す。化学発光の記録の条件は、図１８Ａと図１８Ｂに詳述してある。
【図２０Ｂ】一定の回転速度０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ、２０００ｒｐｍにおいて、異なる数のヒーラ細胞を含む抽出を分析したときの化学発光の強度に対応する較正曲線を示す図。挿入図は、較正曲線の拡大であり、０〜１００個の細胞を含む抽出から得られた化学発光信号の強度を示している。
【図２１】（ａ）１０００個のヒーラ細胞、（ｂ）１０００個の２９３腎臓癌細胞、（ｃ）１００,０００個のＮＨＦ細胞を含む抽出から得られた電気化学発光の強度を示す図
【図２２】（ａ）肺腺癌、（ｂ）肺扁平上皮癌、（ｃ）健康な組織、（ｄ）正常細胞からの抽出を分析したときに得られた電気化学発光の強度を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月30日(2004.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析試料中の検体を測定する方法であって、
（i）前記検体と結合又は反応する認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下で前記結合又は反応は反応信号をもたらす反応を生じさせる、
（ii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を時間に関して周期的に変化する外部磁界に応答して回転又は振動させて、前記回転又は振動の間増大する反応信号を発生させるステップと、
（iii）前記反応信号を読み取るステップと、
を有する。
【請求項２】
前記磁界は、回転磁界である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記回転磁界は、回転磁石によって引き起こされる、請求項１から請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記磁界は、振動磁界である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記反応は、酸化還元反応である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記磁性粒子は、支持体に閉じ込められている、請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記認識試剤及び前記検体は、互いに反応して反応生成物をもたらす、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記認識試剤は、前記検体を生成物に変える反応を誘起可能な触媒である、請求項１から請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記形成された対と結合する試薬の使用に基づく、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記検体は、蛋白質検体であり、前記試薬は、前記検体と結合可能な抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記検体は、ＤＮＡ検体である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記分析条件は、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチド塩基を有し、前記ヌクレオチド塩基の少なくとも一つは、検出可能部分と結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能部分は、ビオチンであり、前記分析条件は、アビジン結合酵素を更に有する、請求項１１又は請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼであり、前記反応信号は、発光である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、タック・ポリメラーゼ（Taq Polymerase）であり、前記反応条件は、ポリメラーゼ連鎖反応が生起可能な条件である、請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも一つの塩基不適正を検出可能な、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記検体は、前記認識試剤を生成物に変える反応を誘起可能な触媒である、請求項７記載の方法。
【請求項１８】
前記認識試剤は、前記検体を生成物に変える反応を誘起可能な触媒を有する、請求項７記載の方法。
【請求項１９】
前記触媒は、酵素である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素は、テロメラーゼである、請求項１７又は請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記分析試料は、細胞の抽出物を有する、請求項１７から請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記検体と特異的に結合する試薬の使用に基づき、前記検体は、最初に前記認識試剤と結合する、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記検体は、抗体検体である、請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
化学系の成分の少なくとも一つは、分析の間、前記分析試料の媒体に溶解したままである、請求項１から請求項２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記反応信号は、電気信号、発光信号、比色信号及び沈殿の形成から選択される、請求項１から請求項２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
分析試料中の検体を測定するシステムであって、
（i）バリア面を有するセルと、
（ii）磁性粒子を回転又は振動させるサブシステムと、前記サブシステムは、前記磁性粒子を回転又は振動させる磁石を伴うモータを有する、
（iii）前記検体の存在下で反応が起きて反応信号をもたらすように認識試剤が固定された磁性粒子と、前記信号は前記磁石の回転又は振動の間増大する、
（iv）前記反応信号を検出する検出部材と、
（v）前記反応信号を読み取る読み取り器と、
を有する。
【請求項２７】
前記反応は、酸化還元反応であり、前記検出部材は、電極である、請求項２６記載のシステム。
【請求項２８】
前記認識試剤は、前記電極と前記検体の間で電子を移動させることができる少なくとも一つの分子を有する、請求項２６及び請求項２７のいずれかに記載のシステム。
【請求項２９】
前記認識試剤及び前記検体は、互いに反応して反応生成物をもたらす、請求項２６記載のシステム。
【請求項３０】
前記検体は、前記認識試剤を生成物に変える反応を誘起可能な触媒である、請求項２６記載のシステム。
【請求項３１】
前記認識試剤は、前記検体を生成物に変える反応を誘起可能な触媒を有する、請求項２６記載のシステム。
【請求項３２】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記形成された対と結合する試薬の使用に基づく、請求項２６から請求項２８のいずれかに記載のシステム。
【請求項３３】
前記検体は、ＤＮＡ検体である、請求項２６から請求項３２のいずれかに記載のシステム。
【請求項３４】
前記検体及び前記認識試剤は、認識対を形成し、前記検体の検出は、前記検体と特異的に結合する試薬の使用に基づき、前記検体は、最初に前記認識試剤と結合する、請求項２６及び請求項２７のいずれかに記載のシステム。
【請求項３５】
前記検体は、抗体検体である、請求項３４記載のシステム。
【請求項３６】
前記反応信号は、電気信号、発光信号、比色信号及び沈殿の形成から選択される、請求項２６から請求項３５のいずれかに記載のシステム。
【請求項３７】
癌細胞を検出する、請求項１９から請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
癌細胞を検出する請求項３７記載の方法であって、
（i）テロメラーゼのプライマとして働くＤＮＡ認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下でテロメラーゼ反応は反応信号をもたらす反応を可能にする、
（ii）癌の疑いがある一つ以上の細胞からの細胞抽出物を有する分析試料を提供するステップと、
（iii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を回転又は振動させて、前記回転又は振動の間増大する反応信号を発生させるステップと、
（iv）前記反応信号を読み取るステップと、
（v）前記読み取り値を、癌細胞を含んでいない対照分析試料から得られた読み取り値と比較するステップと、前記分析試料における読み取り値が前記対照分析試料における読み取り値よりも高いことは、前記疑わしい細胞が癌性であることを示す、
を有する。
【請求項３９】
前記反応信号は、発光である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
複数の検体を検出する請求項１記載の方法であって、
（i）それぞれが前記検体の少なくとも一つと結合又は反応する複数の認識試剤を担持する磁性粒子を提供するステップと、分析条件下で各結合又は反応は区別可能な反応信号をもたらす反応を生じさせ、前記複数の検体の存在下で複数の区別可能な反応信号をもたらす、
（ii）前記磁性粒子を前記分析試料に接触させ、前記磁性粒子をバリア面近傍の磁石によって前記バリア面に引き寄せ、前記分析条件を与えると共に前記磁性粒子を時間に関して周期的に変化する外部磁界に応答して回転又は振動させて、前記区別可能な反応信号を発生させるステップと、
（iii）前記区別可能な反応信号を読み取るステップと、
を有する。
【請求項４１】
ステップ（ii）は、異なる読み取り手段を用いて前記区別可能な反応信号を読み取る、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ii）及びステップ（iii）は、異なる分析条件を用いて複数回繰り返される、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
分析試料中の複数の検体を測定するシステムであって、
（i）バリア面を有するセルと、
（ii）磁性粒子を回転又は振動させるサブシステムと、
（iii）前記検体の存在下で反応が起きて区別可能な反応信号をもたらすように複数の認識試剤が固定された磁性粒子と、前記信号は前記磁石の回転又は振動の間増大する、
（iv）前記区別可能な反応信号のそれぞれを検出する複数の検出部材と、
（v）前記反応信号を読み取る複数の読み取り器と、
を有する。
【国際調査報告】
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