(57)【要約】本発明は、新脈管形成に関連する腫瘍または増殖性障害を処置する方法に関し、その方法は、アミロイド前駆体タンパク質プロセシングに関与するセクレターゼを阻害するγ−セクレターゼおよびβ−セクレターゼを投与する工程を包含する。特に、方法は、腫瘍または増殖性障害を処置するためか、あるいは腫瘍、増殖性障害または炎症性障害に関連する新脈管形成を阻害するために、キャリアおよびセクレターゼＡＰＰプロセシングを阻害する少なくとも１つのγ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターを含む、単位投与量形態の組成物の治療有効量をそのような処置または新脈管形成阻害を必要とする動物またはヒトに投与することによって、そのような処置または新脈管形成阻害を必要とする動物またはヒトにおいて提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍または増殖性障害の処置を必要とする動物またはヒトにおける腫瘍または増殖性障害を処置するための方法であって、キャリアおよび少なくとも１つのセクレターゼインヒビターを含む、単位投与量形態の治療有効量の組成物を該動物またはヒトに投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記セクレターゼインヒビターが、アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼを特異的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セクレターゼインヒビターが、γ−セクレターゼインヒビターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記γ−セクレターゼインヒビターが、以下の骨格化学構造：
【化１】
2006517979.tif 000006
を有するアスパルチルプロテアーゼ遷移状態γ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲは、アナログ置換を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アスパルチルプロテアーゼ遷移状態γ−セクレターゼインヒビターが、Ｌ−６８５，４５８である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記γ−セクレターゼインヒビターが、以下の２つの骨格構造：
【化２】
2006517979.tif 000007
を有するジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲは、アナログ置換を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターが、ＤＡＰＴおよびＤＡＰＭからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記γ−セクレターゼインヒビターが、以下の骨格構造：
【化３】
2006517979.tif 000008
を有するイソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲがアナログ置換を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記イソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターが、ＪＬＫ−６である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記セクレターゼインヒビターが、以下の化学構造：
【化４】
2006517979.tif 000009
を有するβ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲが、アナログ置換を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記β−セクレターゼインヒビターが、ペプチド模倣物に強固に結合する遷移状態アナログβ−セクレターゼインヒビターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチド模倣物に強固に結合する遷移状態アナログβ−セクレターゼインヒビターが、ＯＭ９９−２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記β−セクレターゼインヒビターが、基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターが、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ、ＧＬ１８９およびＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が、神経膠芽細胞腫、肺腺癌ならびに胸部、結腸、腎臓、膀胱、頭部または頸部の悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖性障害が、造血障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記造血障害が、白血病、リンパ腫および赤血球増加症からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖性障害が、眼の障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記眼の障害が、糖尿病性網膜症、黄斑変性、緑内障および色素性網膜炎からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記キャリアが、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物またはヒトへの前記組成物の投与経路が、非経口投与、経口投与または腹腔内投与を介してである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記非経口投与経路が、静脈内；筋肉内；間質；動脈内；皮下；眼内；頭蓋内；脳室内；滑液包内；経皮、吸入を介した肺、眼、舌下および頬を含めた、経上皮；眼、皮膚、眼球、直腸、および鼻の通気または噴霧化を介した吸入を含めた、局所からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単位投与量が、硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセル剤、錠剤、トローチ剤、サシェ剤、菓子錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤、散剤、顆粒剤、液剤または乳剤の形態で経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記セクレターゼインヒビターの鼻投与が、エアロゾル、アトマイザおよびネブライザからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍、増殖性障害または炎症障害に関連した新脈管形成の阻害を必要とする動物またはヒトにおける腫瘍、増殖性障害または炎症障害に関連した新脈管形成を阻害する方法であって、キャリアおよび少なくとも１つのセクレターゼインヒビターを含む、単位投与量形態の治療有効量の組成物を該動物またはヒトに投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記セクレターゼインヒビターが、アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼを特異的に阻害する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記セクレターゼインヒビターが、γ−セクレターゼインヒビターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記γ−セクレターゼインヒビターが、以下の骨格構造：
【化５】
2006517979.tif 000010
を有するアスパルチルプロテアーゼ遷移状態γ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲが、アナログ置換を示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アスパルチルプロテアーゼ遷移状態γ−セクレターゼインヒビターが、Ｌ−６８５，４５８である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記γ−セクレターゼインヒビターが、以下の２つの骨格構造：
【化６】
2006517979.tif 000011
を有するジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲが、アナログ置換を示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターが、ＤＡＰＴおよびＤＡＰＭからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記γ−セクレターゼインヒビターが、以下の骨格化学構造：
【化７】
2006517979.tif 000012
を有するイソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲは、アナログ置換を示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記イソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターが、ＪＬＫ−６である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記セクレターゼインヒビターが、以下の化学構造：
【化８】
2006517979.tif 000013
を有するβ−セクレターゼインヒビターであり、ここでＲが、アナログ置換を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記β−セクレターゼインヒビターが、ペプチド模倣物に強固に結合する遷移状態のアナログβ−セクレターゼインヒビターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチド模倣物に強固に結合する遷移状態のアナログβ−セクレターゼインヒビターが、ＯＭ９９−２である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記β−セクレターゼインヒビターが、基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターが、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ、ＧＬ１８９およびＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が、神経膠芽細胞腫、肺腺癌ならびに胸部、結腸、腎臓、膀胱、頭部または頸部の悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記増殖性障害が、造血障害である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記造血障害が、白血病、リンパ腫および赤血球増加症からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記増殖性障害が、眼の障害である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
前記眼の障害が、糖尿病性網膜症、黄斑変性、緑内障および色素性網膜炎からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記炎症障害が、慢性関節リウマチ、変形性関節症、肺線維症、サルコイド様肉芽腫、乾癬および喘息からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
前記キャリアが、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４６】
前記動物またはヒトへの前記組成物の投与経路が、非経口投与、経口投与または腹腔内投与を介してである、請求項２５に記載の方法。
【請求項４７】
前記非経口投与経路が、静脈内；筋肉内；間質；動脈内；皮下；眼内；頭蓋内；脳室内；滑液包内；経皮、吸入を介した肺、眼、舌下および頬を含めた、経上皮；眼、皮膚、眼球、直腸、および鼻の通気または噴霧化を介した吸入を含めた、局所からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記単位投与量が、硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセル剤、錠剤、トローチ剤、サシェ剤、菓子錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤、散剤、顆粒剤、液剤または乳剤の形態で経口投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４９】
前記セクレターゼインヒビターの鼻投与が、エアロゾル、アトマイザおよびネブライザからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は一般に、脈管形成関連障害を処置するための方法に関する。より詳細には、本発明は、このような新脈管形成を阻害する組成物を投与することによる、新脈管形成に関連する腫瘍または増殖性障害を処置する方法に関する。
【０００２】
（関連技術の説明）
新脈管形成（既存の血管からの新しい毛細血管の形成）は、主に胚発生における正常な成長、創傷治癒の間および排卵に応じて必要とされる基本的なプロセスである。
【０００３】
低酸素組織、疾患組織、または損傷組織が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−１、アンジオゲニン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のような脈管形成助触媒を産生かつ放出した場合、新脈管形成が、刺激される。このシグナルは、宿主組織の特定の遺伝子を活性化し、次いで新しい血管の増殖を刺激するタンパク質を作製する。特に、既存の血管に由来する内皮細胞は、上記のタンパク質によって「活性化」され、プロテアーゼを放出する。これは、既存の血管の周囲の基底膜の分解を生じる。次いで上記内皮細胞は、間隙腔へ移動し、ここで成熟した血管へ増殖かつ分化する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，６，３８９−３９５，２０００）。
【０００４】
新脈管形成の正常な調節は、血管の形成を誘導する因子と血管の形成のプロセスを停止または抑制する因子との間の微妙なバランスに左右される。このバランスが、崩れた場合、一般に病的な新脈管形成（血管の異常に速い増殖）を生じ、これは、新脈管形成に依存する疾患において増大した血管形成の増加を生じる。
【０００５】
病的な新脈管形成は、癌の特徴であるが、また、リウマチ様関節炎、乾癬および喘息のような種々の虚血性疾患および炎症性疾患においても生じる。実際に、病的な新脈管形成は、２０を超える疾患に関係する。さらに、肥満は、一般に肥満状態を伴う細胞性低酸素症のために、新脈管形成を伴い得る。肥満関連新脈管形成は、脂肪の蓄積を容易にすると考えられる。
【０００６】
癌は、最も厳しい、生命をおびやかす疾患プロセスを示し、このプロセスの中で、血管増殖は、重要な役割を果たす。新しい血管の形成が無ければ、固形腫瘍は、数ミリメートルを超えて増殖しないが、新しい血管によって提供される豊かな環境により、腫瘍は、成長する。特定の固形腫瘍（胸部、結腸、肺、腎臓、膀胱ならびに頸部の腫瘍を含む）を有する患者における腫瘍血管の密度と不利な予後との間に直接的な相関関係があると考えられる。
【０００７】
従って、腫瘍の新脈管形成は、癌性増殖物を貫通する血管ネットワークの増殖であり、栄養素および酸素を供給しかつ老廃物を除去する。１立方ミリメートル〜２立方ミリメートルより小さい固形腫瘍は、血管新生がされず、インサイチュにおいて無血管の休止状態が長時間（数ヶ月〜数年）持続する。この段階において、上記腫瘍は、数百万個の細胞を含み得る。癌が転移するためには、上記腫瘍は、酸素および栄養素を運びかつ代謝老廃物を除去する血管が供給されることを必要とする。２立方ミリメートルの臨界容量を超えると、酸素および栄養分は、腫瘍の中心部の細胞への拡散が困難になり、腫瘍新脈管形成の開始を示す細胞性低酸素症の状態を生じる。
【０００８】
いくつかの腫瘍は、脈管形成インヒビターとして知られる、新脈管形成を阻害し得る物質を分泌することが知られている。例えば、いくつかの大きな腫瘍は、新脈管形成インヒビターを放出し、これは、血管がより小さな、より遠隔の腫瘍へ分枝を送ることを阻止する。新脈管形成は、腫瘍の増殖に極めて重要であるため、このプロセスを阻害することは、新規抗癌剤の開発における主な目標となっている。腫瘍の血管は、１８００年代初頭から研究されているが、効果的な治療としての上記アプローチが、現実的なものとなってきたのはほんのここ数年である。癌の抗脈管形成治療の概念は、１９７０年代初期のＪｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ博士（ＢｏｓｔｏｎのＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの小児外科医）の研究に由来する。Ｆｏｌｋｍａｎ博士は、固形腫瘍が、その腫瘍の栄養素および他の必要なものを供給するための新規血管の形成を誘導しない場合は、ピンヘッドの大きさ（１立方ミリメートル〜２立方ミリメートル）を超えて増殖し得ないことを強調した最初の人物であった。Ｆｏｌｋｍａｎ博士は、腫瘍の血管の増殖を阻害することによって、悪性疾患を攻撃する有効な方法を誘導し得ると認識した。この説は、現在、多くの実験証拠によって確認されており、腫瘍が、その血液供給を阻害することによって飢死させられ得る可能があることを示す。
【０００９】
従って、患者における新脈管形成のプロセスを阻害することによって多岐にわたる癌、および他の脈管形成関連障害を処置する可能性が存在する。
【００１０】
理論上、このような処置は、脈管形成関連疾患に関連する新規血管の異常な形成にのみ影響するはずである。なぜならそれは、一旦、ヒトが、成長を止めた場合、その血管系は、基本的に安定しており、損傷を修復するためにのみ増殖するからである。いくつかの天然に存在する新脈管形成のインヒビターとしては、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、血小板第４因子、トロンボスポンジン、トランスホーミング増殖因子β、およびメタロプロテアーゼの組織インヒビターが挙げられる。標準的な化学療法を超える癌処置のために脈管形成インヒビターを用いることの潜在的に重要な利点は、治療に対する耐性の欠如および他の正常な組織への重大な副作用の欠如である。しかし、上記の脈管形成インヒビターは、必ずしも腫瘍を殺さなくてもよいが、無期限に腫瘍をチェックし続け、このことより個々の生命のために脈管形成インヒビターを用いた治療の継続が必要となるか、または他の化学療法薬物と組み合わせての使用が必要となる。
【００１１】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、大きな糖タンパク質であり、ニューロンに高度に発現されるが、内皮細胞を含む血管細胞にもまた見出される。実際に、ＡＰＰは、非常に初期の胎児期の間に新血管新生化組織の内皮に、および特に大脳内皮に高度に発現される（Ｏｔｔ，Ｍ．Ｏ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．，２１１，３５５−７，２００１）。これは、初期の新脈管形成においてＡＰＰおよび／またはその代謝が果たす正常な役割を示唆する。ＡＰＰは、５９０個〜６８０個のアミノ酸の細胞外アミノ末端ドメインおよび約５５個のアミノ酸の細胞質テイルを有する単一膜貫通型タンパク質である。２１番染色体上のＡＰＰ遺伝子に由来するＡＰＰ  ｍＲＮＡは、選択的スプライシングを受け８個の可能なアイソフォームを産生し、その内の３つ（６９５個のアミノ酸のアイソフォーム、７５１個のアミノ酸のアイソフォームおよび７７０個のアミノ酸のアイソフォーム）は、脳において優位である。ＡＰＰは、３つの酵素活性（α−セクレターゼ、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼと称される）を介してタンパク質分解性のプロセッシングを受ける。α−セクレターゼは、アミロイドβ（Ａβ）ドメインの第１７アミノ酸でＡＰＰを切断し、これによって、分泌のために大きな可溶性アミノ末端フラグメントα−ＡＰＰを放出する。α−セクレターゼは、Ａβドメイン内を切断するために、この切断は、Ａβ形成を妨げる。あるいは、ＡＰＰは、β−セクレターゼによって切断され、Ａβのアミノ末端を規定し得、そして可溶性アミノ末端フラグメントβ−ＡＰＰを産生し得る。続くγ−セクレターゼによるＡＰＰの細胞内カルボキシ末端ドメインの切断によって、複数のペプチド（最も一般的な２つは、４０アミノ酸のＡβ（Ａβ４０）と４２アミノ酸のＡβ（Ａβ４２）である）の産生を生じる。アミロイドプラーク（アルツハイマー病（ＡＤ）および大脳のアミロイド脈管障害における血管のアミロイド沈着に常に関連する）は、Ａβを含み、ＡＤ病態生理において重要な役割を果たすことが考えられる。しかし、ＡＰＰの正常な生理学的機能は、未だに不明のままである。
【００１２】
β−セクレターゼ（またＢＡＣＥとも称される；β部位ＡＰＰ切断酵素）は、膜関連アスパルチルプロテアーゼとして同定された（Ｖａｓｓａｒ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５〜７４１，１９９９；Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４，４１９−４２７，１９９９）。ＢＡＣＥは、βＡＰＰの主要なアミロイド生成性切断を媒介し、膜結合型βＡＰＰ  Ｃ末端フラグメント（ＡＰＰ  ＣＴＦβ）を生じる。ＡＰＰ  ＣＴＦβは、膜内のγ−セクレターゼ切断のための直接の前駆体である。
【００１３】
γ−セクレターゼ活性は、プレセニリン（ＰＳ１またはＰＳ２）、ニカストリン（Ｎｃｔ）、ＰＥＮ−２、ＡＰＨ−１ａ、およびＡＰＨ−１ｂからなるタンパク質複合体に関連する（Ｙｕ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６４７０〜１６４７５，１９９８；Ｃａｐｅｌｌ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３２０５−３２１１，１９９８）。上記複合体成分の発現は、協調的に調節され、γ−セクレターゼ活性は、全てのサブユニットの存在下においてのみ検出される。γ−セクレターゼの触媒活性は、大部分はプレセニリンによって助長されるようである。プレセニリンは、多型の膜貫通型タンパク質であり、シグナルペプチドペプチダーゼを一緒に伴い、そして４型プレピリンペプチダーゼは、新規ファミリーのアスパルチルプロテアーゼのファミリーに属し得る。
【００１４】
従って、プレセニリンは、γ−セクレターゼとして公知である膜内タンパク質分解活性の必須成分である（Ｗｏｌｆｅ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５４１３〜５４１６，２００１）。いくつかのＩ型複合性膜タンパク質が、Ｎｏｔｃｈレセプター（Ｎｏｔｃｈ）およびＡＰＰを含む、γ−セクレターゼの基質として同定されている（Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３９８，５１８〜５２２，１９９９）。Ｎｏｔｃｈは、シグナル分子であり、発生の間の細胞運命の決定を調節する（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ，Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，７７０〜７７６，１９９９）。Ｎｏｔｃｈを介するシグナルは、ＴＡＣＥによってＮｏｔｃｈの切断を誘導する、リガンド（例えば、ＤｅｌｔａおよびＪａｇｇｅｄ）の結合によって引き起こされる（Ｂｒｏｕ，Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５，２０７〜２１６，２０００）。続くγ−セクレターゼによる切断は、転写因子に結合し、かつ核へ転位するＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを放出し、このドメインで、Ｓｐｌｉｔ複合体遺伝子のエンハンサーの転写を調節する（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｉ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１２，１７５１〜１７６２，１９９８）。
【００１５】
ＮｏｔｃｈのプロセッシングとＡＰＰのプロセッシングとの間の類似性は、これらが共通の機能：γ−セクレターゼによるＡＰＰの切断によって、遺伝子発現を調節し得るＮｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ））に類似するフラグメントを遊離する、機能を有し得ることを示唆する（Ｃａｏ，Ｘ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５〜１２０，２００１）。ＡＩＣＤが、γ−セクレターゼ依存性シグナル経路を介するホスホイノシチド媒介性カルシウムシグナルを調節することが示されており、これは、ＡＰＰの膜内タンパク質分解が、Ｎｏｔｃｈのシグナルに類似するシグナルの役割を果たし得ることを示唆する（Ｌｅｉｓｓｒｉｎｇら、ＰＮＡＳ，９９，４６９７−４７０２，２００２）。プレセニリンの突然変異はまた、γ−セクレターゼ活性のよく立証された効果に加えて、細胞内カルシウムシグナル経路における高度に一貫した変化を産生し、これは、ホスホイノシチド／カルシウムシグナルカスケードの増強（Ｇｕｏ，Ｑ．ら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，８，３７９−３８３，１９９６）およびカルシウム流入容量の不足（Ｌｅｉｓｓｒｉｎｇ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４９，７９３〜７９８，２０００）を含む。
【００１６】
Ｎｏｔｃｈシグナルは、脈管形成プロセスの調節特性と関与している（Ｚｈｏｎｇ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，４１４（６８６０），２１６〜２２０，２００１）。さらに、プレセニリンノックアウトマウス（１つまたは両方のプレセニリン遺伝子を欠失したマウスであって、そのためにγ−セクレターゼ活性における種々の程度の障害を示す）は、異常な血管形成を罹患する（Ｈｅｒｒｅｍａｎ  Ａ．ら、ＰＮＡＳ，１２，１１８７２〜１１８７７，１９９９；Ｓｈｅｎ  Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ，８９，６２９−６３９，１９９７）。このことは、γ−セクレターゼ活性が、新脈管形成の間に機能し得ることを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、癌および他の脈管形成関連疾患に見られる病的な新脈管形成を阻害し得るが、僅かな副作用であり、長期の処置期間および／または他の処置様式（例えば、化学療法もしくは放射線）との併用療法を必要としない、脈管形成阻害活性を示す化合物に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の概要）
本発明は、γ−セクレターゼおよびβ−セクレターゼを阻害する化合物（γ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターと称される）が、効果的な抗脈管形成活性を示すという最初の発見を提供する。そして癌、増殖性障害、または炎症性障害のような病的な新脈管形成に関連する障害を罹患する動物またはヒトに対してこれらのインヒビターを投与することによって、罹患した動物またはヒトに見られる病的な新脈管形成を阻害する。
【００１９】
特に、本発明は、キャリア、およびセクレターゼアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングを阻害するγ−セクレターゼもしくはβ−セクレターゼのうちの少なくとも１つを含有する治療有効量の単位投薬量形態の組成物を動物またはヒトへ投与することによって、このような処置を必要とする動物あるいはヒトにおける腫瘍または増殖性障害を処置する方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、キャリア、およびセクレターゼＡＰＰプロセシングを阻害するγ−セクレターゼもしくはβ−セクレターゼのうちの少なくとも１つを含有する治療有効量の単位投薬量形態の組成物を動物またはヒトへ投与することによってこのような阻害を必要とする動物あるいはヒトにおける腫瘍、増殖性障害または炎症性障害に関連する新脈管形成を阻害する方法も提供する。
【００２１】
本発明の方法により投与されるγ−セクレターゼインヒビターとしては、アスパルチルプロテアーゼ遷移状態インヒビター（例えば、Ｌ−６８５、Ｌ−４５８）；ジペプチドプロテアーゼインヒビター（例えば、ＤＡＰＴおよびＤＡＰＭ）；またはイソクマリンベースのセリンプロテアーゼインヒビター（例えば、ＪＬＫ−６）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の方法により投与されるβ−セクレターゼインヒビターとしては、ペプチド様に固く結合する遷移状態アナログインヒビター（例えば、ＯＭ９９−２）、または基質アナログペプチドインヒビター（例えば、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ  ＧＬ１８９、あるいはＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法により処置され得る腫瘍としては、悪性脳腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫）；悪性肺腫瘍（例えば、腺癌）；または胸部、結腸、腎臓、膀胱、頭もしくは首の悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法により処置され得る増殖性障害としては、造血性障害（例えば、白血病、リンパ腫もしくは多血症）；眼性障害（例えば糖尿病性網膜症、黄斑変性、緑内障または色素性網膜炎）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法により処置され得る炎症性障害としては、リウマチ様関節炎、変形性関節症、肺繊維症、サルコイド肉芽腫、乾癬または喘息が挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、腫瘍または増殖性障害の処置を必要とする動物またはヒトにおいて、腫瘍または増殖性障害を処置するための方法を提供し、その方法は、キャリアおよびγ−セクレターゼＡＰＰプロセシングもしくはβ−セクレターゼＡＰＰプロセシングを阻害する少なくとも１つのγ−セクレターゼインヒビターもしくはβ−セクレターゼインヒビターを含む組成物の、単位投与量形態の治療有効量を投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明はまた、新脈管形成の阻害を必要とする動物またはヒトにおいて新脈管形成を阻害するための方法を提供し、その方法は、キャリアおよびγ−セクレターゼＡＰＰプロセシングもしくはβ−セクレターゼＡＰＰプロセシングを阻害する少なくとも１つのγ−セクレターゼインヒビターもしくはβ−セクレターゼインヒビターを含む組成物の、単位投与量形態の治療有効量を投与する工程を包含する。
【００２６】
本発明の方法に従って投与されるγ−セクレターゼインヒビターとしては、以下に示される一般骨格構造：
【００２７】
【化９】
2006517979.tif 000002
を有するアスパルチルプロテアーゼ遷移状態アナログγ−セクレターゼインヒビターが挙げられ得るが、これらに限定されない。（「Ｒ」は、アナログ置換を示す）。
【００２８】
特に、本発明の方法に従って投与されるアスパルチルプロテアーゼ遷移状態アナログγ−セクレターゼインヒビターは、Ｌ−６８５，４５８（｛１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェニル−ペンチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）であり、これは、γ−セクレターゼの高度に特異的かつ強力なインヒビターとして作用する（Ａｂ全体ＩＣ５０＝１７ｎＭ、Ａｂ４０ＩＣ５０＝４８ｎＭ、Ａｂ４２ＩＣ５０＝６７ｎＭ、）細胞浸透性のヒドロキシエチレンジペプチド同配体である。Ｌ−６５８，４５８は、アスパルチルプロテアーゼの触媒部位において遷移状態アナログとして機能し、Ａβ４０およびＡβ４２に対して同様の効力を示す。Ｌ−６５８，４５８は、アスパルチルプロテアーゼカテプシンに対してよりも、γ−セクレターゼに対して１００倍を超える選択性を示す。Ｌ−６５８，４５８はまた、プレセニリンに結合し、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン産生をブロックする。
【００２９】
本発明の方法に従って投与される別のクラスのγ−セクレターゼインヒビターとしては、以下に示される一般骨格構造を有するジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｒは、アナログ置換を示す）。
【００３０】
【化１０】
2006517979.tif 000003
特に、ＤＡＰＭ（Ｎ−［Ｎ−３，５−ジフルオロフェナセチル］−Ｌ−アラニル−Ｓ−フェニルグリシンメチルエステル）は、抗凝集特性を有する、細胞浸透性の、γ−セクレターゼのジペプチドプロテアーゼインヒビターである（７ＰＡ２細胞中のＩＣ５０  Ａｂ約１０ｎＭ）。ＤＡＰＭは、Ａβダイマー形成およびＡβトリマー形成を選択的にブロックすることによって初期のＡβオリゴマー形成を妨げる。別のジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターは、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ＝アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル）である。
【００３１】
本発明の方法に従って投与される、さらに別のクラスのγ−セクレターゼインヒビターとしては、以下に示される一般骨格構造を有する、イソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターが挙げられ得る。（Ｒは、アナログ置換を示す。）
【００３２】
【化１１】
2006517979.tif 000004
特に、本発明の方法に従って投与される、イソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターは、ＪＬＫ−６（７−アミノ−４−クロロ−３−メトキシイソクマリン）であり、これはイソクマリンアナログのクラスに属する細胞透過性の、活性部位指向性の、不可逆のセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターである。ＪＬＫ−６は、野生型ＡＰＰおよびスウェーデン変異体ＡＰＰを発現するＨＥＫ２９３細胞において、γ−セクレターゼの強力かつ選択的なインヒビターとして作用し、Ａβ４０およびＡβ４２の両方の生成を遮断する（ＩＣ５０＜１００ｍＭ）。さらには、ＪＬＫ−６は、Ｎｏｔｃｈのプロセシングまたはプレセニリン１およびプレセニリン２のタンパク質分解のいずれにも影響を与えない。
【００３３】
本発明の方法に従って投与される、β−セクレターゼインヒビターとしては、限定されることなく、ペプチド模倣の、堅く結合する遷移状態アナログのβ−セクレターゼインヒビターが挙げられ得、それらはすべて、以下に示されるアナログペプチド模倣構造的骨格を含む。（「Ｒ」は、アナログ置換を示す。）
【００３４】
【化１２】
2006517979.tif 000005
特に、ＯＭ９９−２（Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ψ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（Ψは、（Ｓ）−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２によるＣＯＮＨの置換を示す）は、ペプチド模倣の、堅く結合する遷移状態アナログのβ−セクレターゼインヒビターとして作用する、アスパルチルプロテアーゼインヒビターである。ＯＭ９９−２は、スウェーデンのＡＰＰのβ−セクレターゼ部位の鋳型から、ＡｓｐからＡｌａへの置換を加えて設計される。このＯＭ９９−２化合物はまた、アミノ酸ロイシンとアミノ酸アラニンとの間の非加水分解性のヒドロキシエチレン同配体（上記のΨ置換物）を含有する。
【００３５】
別のペプチド模倣のβ−セクレターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ｖａｌ−ｌｅｕ−ロイシナル）は、β−セクレターゼの強力な、細胞透過性の、そして可逆性の阻害を示すペプチドアルデヒドプロテアーゼインヒビターである。Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯは、スウェーデン変異体のＡＰＰのβ−セクレターゼ切断部位（ＶＮＬ−ＤＡ）に対応し、野生型ＡＰＰ７５１で安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞において、Ａβ全体（ＩＣ５０＝７００ｎＭ）およびＡβ４２（ＩＣ５０＝２．５μＭ）の両方の生成を阻害する。
【００３６】
２つの別のペプチド模倣のβ−セクレターゼインヒビターであるＧＬ１８９（Ｈ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−スタチン−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ）およびＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶ（Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｔａｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｓｔａｔは、（３Ｓ，４Ｓ）−スタチンである））は、基質アナログＢＡＣＥのインヒビターである。ＧＬ１８９は、ＢＡＣＥトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞由来の可溶化膜分画中のβ−セクレターゼの（５μＭにおける）タンパク質分解活性を完全に阻害し、Ｐ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶ（Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｔａｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｓｔａｔは、（３Ｓ，４Ｓ）−スタチンである））は、ＡＰＰタンパク質の強力なインヒビター（ＩＣ５０＝３０ｎＭ）である。Ｓｔａｔは、異常アミノ酸スタチン（（３Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタン酸）であり、それは原型ヒドロキシメチレン同配体となり、そして種々のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種により産生される天然に存在するペプチドであるペプスタチン中に含まれる。
【００３７】
「Ｒ」アナログ置換としては、限定されることなく、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３およびＯＣＨ３が挙げられる。Ｒは、当該分野で公知のように、大きく変化し得る。
【００３８】
本発明の方法に従って処置され得る腫瘍の例としては、限定されることなく、悪性脳腫瘍（例えば、神経膠芽細胞腫）；悪性肺腫瘍（例えば、腺癌）；または胸部悪性腫瘍、結腸の悪性腫瘍、腎臓の悪性腫瘍、膀胱の悪性腫瘍、頭部悪性腫瘍、もしくは頚部悪性腫瘍が挙げられる。本発明の方法に従って処置され得る増殖性障害の例としては、限定されることなく、造血性障害（例えば、白血病、リンパ腫または赤血球増加症）；および眼障害（例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、緑内障または色素性網膜炎）が挙げられる。本発明の方法に従って処置され得る炎症性障害の例としては、限定されることなく、慢性関節リウマチ、変形性関節症、肺線維症、サルコイド様肉芽腫、乾癬、または喘息が挙げられる。
【００３９】
γ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターを含む組成物は、患者に様々な経路によって投与され得、その投与経路としては、非経口投与、経口投与、または腹腔内投与が挙げられる。非経口投与としては、以下の経路が挙げられる：静脈内経路；筋肉内経路；間質経路；動脈内経路；皮下経路；眼内経路；頭蓋内経路；心室内経路；滑液包内経路；経上皮経路（経皮経路、吸入による肺経路、眼経路、舌下経路および口腔内経路を含む）：局所経路（眼（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）経路、皮膚経路、眼（ｏｃｕｌａｒ）経路、直腸経路または吸入もしくは噴霧を介した鼻腔吸入）。
【００４０】
経口投与されるγ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターを含む化合物は、硬質外皮ゼラチンカプセル剤もしくは軟質外皮ゼラチンカプセル剤に封入され、あるいは錠剤に圧縮される。化合物はまた、賦形剤に混和され得、経口摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、サシェ剤、ロゼンジ、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用され得る。γ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターを含む組成物は、散剤または顆粒剤、水性液体または非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤の形態で、あるいは水中油型乳剤または油中水型乳剤であり得る。
【００４１】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などもまた、例えば、結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ）；ゼラチン化賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトースもしくはサッカリン）；または嬌味嬌臭剤を含み得る。上記投薬単位形態がカプセル剤である場合には、それは上記の物質に加えて、液体キャリアを含み得る。様々な他の物質が、コーティング剤として、またはそうでない場合には投薬単位の物理的形態を改変するために、存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、上記活性化合物を含み得、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、染料および嬌味嬌臭剤を含み得る。任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の物質は、薬学的に純粋であるべきであり、実質的に無毒であるべきである。さらには、上記γ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターは、徐放性調製物および徐放性処方物中に混和され得る。
【００４２】
γ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターは、ＣＮＳへ、非経口投与もしくは腹膜内投与され得る。遊離塩基としての化合物の溶液または薬学的に受容可能な塩としての化合物の溶液は、適切な界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と混合された水の中で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。通常の保存条件下および通常の使用条件下では、これらの調製物は、保存剤および／または抗酸化剤を含み得、微生物の増殖および化学的分解を防止する。
【００４３】
注射可能な用途のために適切な薬学的形態としては、限定されることなく、無菌の水溶液もしくは無菌の水性懸濁液、および無菌の注射可能な溶液もしくは無菌の注射可能な懸濁液の即席の調製のための無菌の粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、無菌でなければならず、かつ容易な注射可能性が存在する程度までは流体でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定であり得、微生物（例えば、細菌および真菌類）の汚染作用から保護されなければならない。上記キャリアは、溶媒または分散媒体であり得、例えば、そして限定されることなく、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物または植物油が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用により、要求される粒子サイズの維持（分散液の場合において）により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらされ得る。多くの場合では、張度調整剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含有することが望ましい。
【００４４】
無菌の注射可能な溶液は、上記γ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターを、上に列挙された様々な他の成分とともに、適切な溶媒中に必要とされる量で混和し、必要に応じて、引き続いて濾過殺菌することにより調製される。一般に、分散液は、様々な無菌のγ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターを、基礎となる分散媒体および上に列挙された成分からの他の成分のいずれかを含む無菌のビヒクル中へ混和することにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥である。
【００４５】
鼻腔または口腔への投与のために適切な薬学的組成物としては、限定されることなく、自己推進性処方物およびスプレー処方物（例えば、エアロゾル、アトマイザおよびネブライザ）が挙げられる。
【００４６】
本発明の治療用γ−セクレターゼインヒビターまたはβ−セクレターゼインヒビターは、単独で、もしくは薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、または薬学的に受容可能な塩として、動物もしくはヒトに投与され得、それらの割合は、上記化合物の溶解性および化学的性質、選択された投与経路、ならびに標準的な薬学的慣習により決定される。動物の例としては、限定されることなく、哺乳動物および非哺乳動物ならびに脊椎動物および無脊椎動物が挙げられる。
【００４７】
ここで、γ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターの用量は、依存的に、毛細管へのヒト脳内皮細胞の増殖および分化、新脈管形成のラット大動脈リングモデルにおける微小管発芽後成長の形成、ヒト肺腺癌の増殖および血管新生に影響を及ぼすことが実証された。これは、いずれの特定の理論にも拘束されることなく、γ−セクレターゼ活性およびβ−セクレターゼ活性が、脈管形成プロセスの間に必要とされることを示唆する。試験されたインヒビターの中で、β−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯは、毛細管形態発生アッセイおよび新脈管形成のラット大動脈リングモデルの両方において著しく抗脈管形成性であるようである。さらには、ここで、上で同定されたγ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターは、ヌードマウスに異種移植されたヒト脳腺癌腫瘍およびヒト肺腺癌腫瘍の増殖（これらは、それらの増殖について新脈管形成に依存する）を完全に阻害し得ることが実証された。結局、γ−セクレターゼインヒビターＪＬＫ−６は、インビトロで新脈管形成を低下させ、そしてヌードマウスへのヒト肺腫瘍異種移植片の増殖を阻害するようであり、これはγ−セクレターゼインヒビターの抗脈管形成活性がＮｏｔｃｈ切断に対して非依存性であることを示唆する。なぜなら、このγ−セクレターゼインヒビターは、Ｎｏｔｃｈプロセシングには影響を及ぼさないからである。いずれの特定の理論にも拘束されることなく、ヒト脳腫瘍モデルおよびヒト肺腫瘍モデルの両方において、γ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターの抗腫瘍活性は、新脈管形成の阻害に媒介されると考えられる。なぜなら、処置される腫瘍における微小管密度の値は有意に減少することがすでに示されているからである。
【００４８】
以下の非限定的な実施例は、γ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターの、ヒト脳内皮細胞の増殖および分化、毛細管形態発生、ヒト脳内皮細胞におけるＡＰＰプロセシング、微小管発芽ならびに脳腫瘍および肺腫瘍の増殖に対する効果を、より詳細に記載する。
【実施例】
【００４９】
（実施例１  β−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターの毛細管形態発生に対する効果）
新脈管形成におけるＡＰＰプロセシング経路の可能性のある役割を決定するために、研究に着手して、ヒト脳内皮細胞の一次培養物の増殖および分化、毛細管形態発生、ならびにヒト脳内皮細胞におけるＡＰＰのプロセシングに対する、アスパルチルプロテアーゼ遷移状態γ−セクレターゼインヒビターＬ−６８５，４５８；ジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターＤＡＰＭおよびＤＡＰＴ；イソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターＪＬＫ−６；基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯおよびＧＬ１８９；ならびにペプチド模倣の堅く結合する遷移状態アナログβ−セクレターゼインヒビターＯＭ９９−２の効果を決定した。さらに、ヒト脳内皮細胞におけるＡＰＰのプロセシングを、上で同定されたγ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターの、α−ｓＡＡＰ分泌に対する効果およびヒト脳内皮細胞の一次培養物中の細胞内ＡＰＰカルボキシル末端断片（ＣＴＦ）の産生に対する効果を決定することにより、研究した。
【００５０】
（材料および方法）
（１．微小管発芽後成長由来の内皮細胞の単離および培養）
迅速部検（２〜４時間の死後遅延）に続いて単離されたヒト中大脳動脈由来のＭａｔｒｉｇｅｌ含有微小管発芽後成長を、倒立顕微鏡を利用して切開し、内皮基底培地（ＥＢＭ）中で、無菌のピペットチップによって、数回解離させた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ断片を、次いでプラスチックの培養フラスコにプレーし、そして３７℃、５％ＣＯ２で、ＥＢＭ（２％の胎仔ウシ血清および１×ペニシリン−ストレプトマイシン−フンギゾン混合物を補充された）中で、３日ごとに培地を交換して、インキュベートした。５〜６日の培養後、細胞を、それらの内皮性を検証するために、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体およびα−平滑筋アクチンに対する抗体を用いて、二重の免疫染色に供した。
【００５１】
（２．ヒト脳内皮細胞の生存度および増殖の測定）
ヒト脳内皮細胞の初代培養物を、９６ウェル培養プレート内に、ＥＢＭ  ４％の２００ｍＬ中１０４個の細胞の濃度でプレーティングし、図面の凡例に示されるように種々の用量のγ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターで処理した。培養して２４時間後、ＥＢＭが覆った細胞を取り除き、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＮ）を使用して、ラクチコデヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｉｃｏｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ＬＤＨ）活性についてアッセイした。細胞を１００ｍＬのＥＢＭ  ４％で覆い、Ｑｕｉｃｋ細胞増殖アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）を使用して、細胞増殖を測定した。
【００５２】
（３．毛細管形態形成アッセイ）
２００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌを４℃にて２４ウェルの培養プレートの各ウェルに入れ、３７℃でのインキュベーションにより重合させた。ヒト中大脳動脈内皮細胞（５×１０４）を、４％ウシ胎仔血清を含む１ｍｌのＥＢＭ中のＭａｔｒｉｇｅｌに撒いた。細胞を、図面の凡例に示したように、種々の用量のγ−セクレターゼインヒビターおよびβ−セクレターゼインヒビターの存在下または不在下、３７℃にて２０時間、加湿した５％  ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。実験を、各処置条件について四連で行った。各培養について、２つのランダムに選択した視野を４×対物レンズを使用して写真撮影した。異なる処置を知らない実験者が、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）を使用して、各写真における管の構造の長さの合計を測定した。異なる処置条件についての毛細血管網の長さを、コントロールの条件において得られた毛細血管網の長さの百分率として表した。
【００５３】
（４．α−ｓＡＰＰ免疫沈降、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング）
コンフルエントなヒト脳内皮細胞（ＥＢＭ  ４％のＦＢＳ培地を含む７５ｃｍ２フラスコ内で増殖させた）を、５μＭのＺ−ＶＶＬーＣＨＯ、５μＭのＬ−６８５，４５８、５μＭのＯＭ９９−２、５μＭのＤＡＰＴで２４時間処理するか、または、未処理にした（コントロール）。実験を、各処理条件につき四連で行った。６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）（ヒトＡβの残基１〜１７を認識するｍＡｂ（Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４６−５４９，１９８９）を細胞培養培地からのα−セクレターゼによる切断の後生じる可溶性ＡＰＰを免疫沈降するために使用した。免疫沈降した物質を、４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、ＰＶＤＦメンブレンに移し、そして、ＡＰＰのＮ末端部分のアミノ酸６６〜８１を認識するｍＡｂ  ２２Ａ１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（Ｈｉｂｉｃｈ，Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２６５７１−２６５７７，１９９３）を用いて免疫検出した。ヒト脳内皮細胞を、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムを補充したＭＰＥＲＴＭ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、氷上で溶解させた。サンプルを超音波処理し、１０，０００ｇ、４℃にて３０分間遠心分離した。溶解物のタンパク質含量を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。全溶解物（５０ｍｇのタンパク質／サンプル）を、４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、そして全長ＡＰＰを検出するためにｍＡｂ  ２２Ｃ１１を用いて免疫探索し、そしてまた、ＡＰＰのカルボキシル末端領域のアミノ酸残基７５１〜７７０を認識する抗ＡＰＰ−ＣＴ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）抗体（Ｐｉｎｎｉｘら、２００１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８１）を用いて免疫探索した。
【００５４】
（結果）
γ−セクレターゼインヒビターであるＬ−６８５，４５８、ＤＡＰＭ、ＤＡＰＴおよびＪＬＫ−６は、全て、細胞毒性を誘導することなく用量依存的にヒト脳内皮細胞の増殖を阻害した（図１および３）。再構成した基底膜上にプレートする場合、内皮細胞は、毛細血管構造のネットワークへと増殖および分化するのを中断した。特に、低い用量において、Ｌ−６８５，４５８は、実際に毛細血管の形態形成を刺激したが、５μＭ用量のインヒビターは、強力な抗脈管効果を有するようであり（図２）、これは、脈管形成プロセスの間に、γ−セクレターゼ様活性が必要とされることを示唆した。
【００５５】
β−セレクターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ、ＯＭ９９−２およびＧＬ１８９は全て、その生存度に影響を及ぼすことなく、ヒト脳内皮細胞の増殖を阻害した（図１および３）。さらに、これらのβ−セレクターゼインヒビターはまた、毛細血管形態形成アッセイにおいて潜在的かつ用量依存的に、毛細血管構造の形成を阻害し（図２）、β−セレクターゼ活性がまた、脈管形成プロセスに寄与することを示唆した。
【００５６】
β−セレクターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯは、α−ｓＡＰＰの分泌を至芸記し、β−セレクターゼ活性の阻害を示唆した。γ−セレクターゼインヒビターであるＤＡＰＴおよびＬ−６８５−４８５は、ヒト脳内皮細胞におけるＡＰＰ  ＣＴＦの蓄積を促進し、γ−セレクターゼ活性のＰＳ１ノックアウト細胞の欠乏において習慣的に観察されるＡＰＰ  ＣＴＦの蓄積を形作る（図４）。
【００５７】
（実施例２−ラット大動脈の外植片からの微小血管の出芽に対するγ−セクレターゼおよびβ−セクレターゼの効果）
アスパルチルプロテアーゼ遷移状態γ−セクレターゼインヒビターであるＬ−６８５，４５８；ジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであるＤＡＰＭおよびＤＡＰＴ；イソクマリンベースのセリンプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであるＪＬＫ−６；基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ、ＧＬ１８９およびＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶならびにペプチド模倣強束縛遷移状態アナログβ−セクレターゼインヒビターであるＯＭ９９−２の、脈管形成のラット大動脈モデル（これは、脈管新生のインビボ事象と十分に相関することが知られている）に対する効果を決定するために、研究を行なった。このアッセイにおいて、脈管形成は、自己限定的なプロセスであり、傷害により開始され、十分に定義された自己分泌−傍分泌機構により調節される（Ｎｉｃｏｓｉａら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５１，１３７９−１３８５（１９９７）。ラット大動脈の内皮が３次元マトリクスに露出される場合、この内皮は、微小血管の分枝網を生じる微小血管表現型へと切り替わる（Ｎｉｃｏｓｉａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，９５，１９１−１９９，１９９２）。
【００５８】
（材料および方法）
２４ウェルの組織培養グレードのプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＮＹ）を２５０ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で覆い、３７℃、５％  ＣＯ２にて３０分間ゲル化させた。簡単に述べると、胸大動脈を９ヶ月齢のＳｐａｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから切開した。線維脂肪組織を取り除いた後、動脈を１ｍｍ長の断面に切り出し、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＥＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）で５回リンスし、そして、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたウェルに置いた。２５０ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌを追加して、動脈輪（ａｒｔｅｒｙ  ｒｉｎｇ）を覆った。重合させた後、Ｍａｔｒｉｇｅｌを、図面の凡例に示されるように、種々の用量のＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯ、ＯＭ９９−２、Ｐ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶ、ＤＡＰＴまたはＬ−６８５，４５８を含有する１ｍＬのＥＢＭ（４％  ＦＢＳ）で覆った（培養培地を３日ごとに交換した）。４×対物レンズを使用して、４日目、５日目および６日目に写真を撮った。微小血管の増殖領域を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して定量した。簡単に述べると、輪の培養物を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡に連結したデジタルビデオカメラを使用して写真撮影した。増殖領域を線引きし、増殖、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび動脈輪の間の色の強度の差異に基づく、微小血管の増殖検出のストラテジーを使用することによって、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて測定した。動脈輪を、測定領域から手動で選択し、そして、排除し、色の強度の閾値を調節して、微小血管の増殖により占められる領域を選択的に測定した。結果を、コントロール条件における、４日目の微小血管の増殖により占められる領域の百分率として表した。
【００５９】
（結果）
β−セクレターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ、ＯＭ９９−２およびＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔは全て、用量依存的かつ、強力に、ラット大動脈の外植片からの微小血管の増殖の出芽を阻害し（図５〜６）、これは、脈管形成プロセスの間のβ−セクレターゼ様活性の改善を示唆した。
【００６０】
γ−セクレターゼインヒビターであるＤＡＰＴは５μＭにおいて微小血管の出芽を刺激し、２０μＭにおいて微小血管の出芽を阻害するようであった（図７）。さらに、γ−セクレターゼインヒビターであるＬ−６８５，４５８は、１μＭおよび５μＭにおいて出芽を阻害し、脈管形成の間のγ−セクレターゼ様の活性の改善をさらに支持した（図７）。
【００６１】
（実施例３−ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対する、β−セクレターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯおよびγ−セクレターゼインヒビターであるＤＡＰＴの効果）
ジペプチドプロテアーゼγ−セクレターゼインヒビターであるＤＡＰＴおよび基質アナログペプチドβ−セクレターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯの、ヌードマウスの皮膚の下に異種移植されたヒト神経膠芽腫Ｕ−８７  ＭＧ腫瘍細胞の増殖に対する効果を決定するために、研究を行なった。
【００６２】
（材料および方法）
ヒト神経膠芽腫Ｕ−８７  ＭＧ細胞株およびヒト肺腺癌Ａ−５４９細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１×ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾンおよび１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中、５％  ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃にて増殖させた。１００μｌのＰＢＳ中の腫瘍細胞（６×１０６個）を、８〜１０週齢の雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎｄ）の両横腹に皮下接種した。腫瘍の体積（ｍｍ３）を、式（長さ×幅２）／２を使用して決定し、この式において、長さとは最長軸であり、幅とは長さに対して直角な測定値（Ｃｌａｒｋｅら、２０００）である。腫瘍の体積が約１５０ｍｍ３に到達すると、動物を、１００μｌの５０％  ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（ビヒクル群）、体重１ｋｇあたり５ｍｇのＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（β−セクレターゼインヒビター）、５ｍｇ／ｋｇのＪＬＫ−６（γ−セクレターゼインヒビター）または体重１Ｋｇあたり１０ｍｇのＤＡＰＴで毎日腹腔内処置した。データを、各処置群についての平均腫瘍体積±Ｓ．Ｅとして表した。
【００６３】
研究の終了時に、動物を人道的に安楽死させ、腫瘍を回収して、パラホルムアルデヒド４％中で一晩、４℃にて固定した。自動化組織処理Ｓａｋｕｒａ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｅ１５０）（Ｔｏｒｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）においてパラフィン包埋した後、サンプルを５μｍの切片に薄切し、脱パラフィンし、段階的な一連のアルコールを通して脱水した。切片を０．０２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＭＮ）を用いて３７℃にて１５分間処理し、適切な抗原の検索を可能にし、ＰＢＳ中で数回洗浄し、そして、０．３％の過酸化水素溶液中で１５分間インキュベートした。切片をブロッキングし、１；４０希釈のＰＥＣＡＭ−１抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＣＡ）を用いて、加湿したチャンバ内で４℃にて一晩、免疫染色した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＣＡ）を、免疫染色のための製造業者の説明書に従って使用した。腫瘍の脈管新生の定量を、立体解析学的解像法を使用して行なった。簡単に述べると、各腫瘍におけるランダムに選択した開始点から４０の連続した切片を取った。８つの切片毎に１つの切片を取ることによって、各腫瘍について５つの切片を立体解析学のために選択した。参照領域全体にわたって含める線と排除する線を引いた解剖カウントフレームを使用した。脈管の計数を、デジタルビデオカメラに接続したＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して、×４００倍で行なった。微小血管を、異なる処置条件を知らない実験者による解像フレームにおいて計数した。各腫瘍につき、解像フレームの領域あたりの平均脈管計数を決定した。ビヒクル処置条件における脈管計数の百分率として脈管計数を表すことによって脈管指数を算出した。
【００６４】
（結果）
β−セクレターゼインヒビターであるＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯおよびγ−セクレターゼインヒビターであるＤＡＰＴの両方が、Ｕ−８７  ＭＧ脳腫瘍の増殖を完全に阻害しただけでなく（図８）、処置の１週間後に腫瘍体積を９０％以上減少させた。さらに、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯおよびＤＡＰＴの両方が、Ｕ−８７  ＭＧ脳腫瘍細胞の増殖を用量依存的に阻害した（図９）。腫瘍の脈管新生を、ＰＥＣＡＭ−１の免疫染色により評価した。ビヒクル処置群と比較して、ＤＡＰＴおよびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯで処置したＵ−８７  ＭＧ腫瘍において脈管新生の減少が観察され、ＤＡＰＴおよびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯの両方が、インビボにおいて腫瘍の脈管形成を阻害し得たことを示唆した。Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯおよびＤＡＰＴは、腫瘍細胞の増殖を用量依存的に阻害したが、殺腫瘍活性は示さなかった。ヒト肺腺癌細胞株Ａ−５４９の増殖に対するＤＡＰＴおよびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯの効果は、両方の化合物が、ヌードマウスにおけるＡ−５４９肺腺癌腫瘍の増殖を強力に抑制したことを明らかにした（図９）。さらに、Ａ−５４９腫瘍の脈管新生は、ＤＡＰＴまたはＺーＶＬＬ−ＣＨＯ処置の後に減少したようであり、このことは、ＤＡＰＴおよびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯによる脈管形成のインビボ阻害を示唆した。最終的に、γ−セクレターゼインヒビターであるＪＬＫ−６は、ヌードマウスに異種移植されたヒト肺腺癌腫瘍の増殖および脈管新生を阻害した（図１０）。
【００６５】
本明細書中に記載される実施形態は、例示の目的のためのみであり、これらを考慮して種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして、本願の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１ａ：ヒト脳内皮細胞の生存度におけるβ−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターの効果。β−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターの種々の用量に関する潜在的毒性を、培養培地中のＬＤＨ活性を測定することによって評価した。ＡＮＯＶＡは、Ｌ−６８５，４５８についての主効果を示さなかったが、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯ（Ｐ＜０．０３）、ＯＭ９９−２（Ｐ＜０．００６）およびＤＡＰＴ（Ｐ＜０．００９）についての有意な主効果を示した。ｈｏｃ後分析は、コントロールと試験した任意のβ−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターとの間の有意な差異を全く示さず（Ｐ＞０．０５）、このことは、β−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターが、使用した用量において内皮細胞死を誘導しなかったことを示す。図１ｂ：ヒト脳内皮細胞の増殖におけるβ−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターの効果。種々の用量のβ−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターによる処理の２４時間後の生存細胞の量を、Ｑｕｉｃｋ細胞増殖アッセイキットを使用して測定した。ＡＮＯＶＡは、Ｌ−６８５，４５８用量の有意な主効果（Ｐ＜０．００１）、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯ用量の有意な主効果（Ｐ＜０．００１）、ＯＭ９９−２用量の有意な主効果（Ｐ＜０．００１）、およびＤＡＰＴの有意な主効果（Ｐ＜０．００１）を示した。ｈｏｃ後分析は、コントロールと２μＭ  Ｌ−６８５，４５８との間の有意な差異（Ｐ＜０．００１）、コントロールと５μＭ  Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯとの間の有意な差異（Ｐ＜０．００１）、コントロールと５μＭ  ＯＭ９９−２との間の有意な差異（Ｐ＜０．００１）、およびコントロールと５μＭ  ＤＡＰＴとの間の有意な差異（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図２】図２ａ：毛細管形態形成におけるＬ−６８５，４５８およびＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯの効果を示す代表的な図。図２ｂ：画像分析による網様構造の長さの定量。ｘ軸における括弧内の数は、分析された４倍の領域の数を表す。ＡＮＯＶＡは、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（Ｐ＜０．００１）およびＬ−６８５，４５８の有意な主効果を示した。ｈｏｃ後試験は、試験したすべての容量に対するコントロールとＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、および試験したすべての容量に対するコントロールとＬ−６８５，４５８との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図３−１】図３ａ−ｂ：毛細管形態形成における種々のＤＡＰＹ用量および種々のＯＭ９９−２用量の効果を示す代表的な図。
【図３−２】図３ｃ：画像分析による網様構造の長さの定量。ｘ軸における括弧内の数は、分析された４倍の領域の数を表す。ＡＮＯＶＡは、ＤＡＰＴ用量およびＯＭ９９−２用量（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールとＤＡＰＴ  １μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００５）、コントロールとＯＭ９９−２  １μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００５）、コントロールとＤＡＰＴ  ５μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、コントロールとＯＭ９９−２  ２μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、およびコントロールとＯＭ９９−２  ５μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図４】図４ａ−ｃ：ヒト脳内皮細胞中のＡＰＰの代謝における、β−セクレターゼインヒビターおよびγ−セクレターゼインヒビターの効果。図４ａ：培地を免疫ブロット法によって分析して、分泌されたα−ｓＡＰＰ分子を測定した。図４ｂ：ヒト脳内皮細胞溶解物に由来するカルボキシ末端ＡＰＰフラグメントおよび全長ＡＰＰ。図４ｃ：ヒト脳内皮細胞の培養培地中で分泌されたα−ｓＡＰＰＰ分子の定量。ＡＮＯＶＡは、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯについての有意な主効果を示した（Ｐ＜０．００３）が、Ｌ−６８５，４５８については有意な主効果を示さなかった（Ｐ＝０．１３）。そしてｈｏｃ後分析は、コントロールとＺ−ＶＬＶＬ−ＣＨＯとの間の有意な差を示し（Ｐ＜０．００６）、このことは、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯがα−ｓＡＰＰの分泌が有意に増加することを示す。ヒト脳内皮細胞によって生成されたカルボキシ末端ＡＰＰフラグメントの定量。ＡＮＯＶＡは、ＯＭ９９−２（Ｐ＜０．００２）、Ｌ−６８５，４５８（Ｐ＜０．００１）、およびＤＡＰＴ（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールとＯＭ９９−２との間の優位な差（Ｐ＜０．００９）、コントロールとＤＡＰＴとの間の優位な差（Ｐ＜０．００１）およびコントロールとＬ−６８５，４５８との間の優位な差（Ｐ＜０．００１）を示し、このことは、ＤＡＰＴおよびＬ−６８５，４５８が、カルボキシ末端ＡＰＰフラグメントの蓄積を刺激するが、ＯＭ９９−２はそれを有意に減少させることを示す。
【図５】β−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯは、ラット大動脈の移植によって微小血管の増殖形成を用量依存的に阻害する。図５ａ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に包埋された大動脈輪の代表的な図。これは、使用したＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯの用量の関数における、時間に伴う毛細管の進行性出芽を示す。図５ｂ：微小血管増殖によって覆われる領域の画像分析による定量。ＡＮＯＶＡは、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯ用量（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）ならびにそれらの間の相互作用期間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールとＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、コントロールと１μＭのＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、およびコントロールと５μＭのＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図６】図６ａ−ｂ：ラット大動脈の外植片による微小血管の出芽における、β−セクレターゼインヒビターＯＭ９９−２およびＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶの効果。図６ａ：２０μＭのＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶで処置した大動脈輪および２０μＭのＯＭ９９−２で処理した大動脈輪について、コントロールの大動脈輪に対する時間の関数における微小血管増殖の形成を示す代表的な図。ＡＮＯＶＡは、Ｐ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶ（Ｐ＜０．００１）およびＯＭ９９−２（Ｐ＜０．００２）についての有意な主効果、ならびに時間とＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶとの間（Ｐ＜０．００２）および時間とＯＭ９９−２用量（Ｐ＜０．００２）との間の相互作用期間についての有意な主効果を示した。５日目および６日目にわたるｈｏｃ後試験は、コントロールとＰ１０−Ｐ４’ｓｔａｔＶとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、コントロールと１μＭ  ＯＭ９９−２との間の有意な差（Ｐ＜０．００３）、コントロールと５μＭ  ＯＭ９９−２との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、およびコントロールと２０μＭ  ＯＭ９９−２との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図７−１】図７ａ−ｃ：ラット大動脈の外植片による微小血管増殖の形成における、γ−セクレターゼインヒビターの効果。図７ａ：微小血管増殖におけるＤＡＰＴの効果を示す代表的な図。図７ｂ：ＤＡＰＴ処理後の微小血管増殖によって覆われる領域の、画像分析による定量。ＡＮＯＶＡは、ＤＡＰＴ用量（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果、ならびにそれらの間の相互作用期間の有意な主効果（Ｐ＜０．００１）を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールとＤＡＰＴ  ５μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）コントロールとＤＡＰＴ  ２０μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．０２）を示したが、コントロールとＤＡＰＴ  １０μＭとの間の有意な差（Ｐ＝０．９９９）は示さなかった。図７ｃ：Ｌ６８５，４５８処置後に微小血管増殖によって覆われる領域の画像分析による定量。ＡＮＯＶＡは、：Ｌ６８５，４５８（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果、ならびにそれらの間の相互作用期間の有意な主効果（Ｐ＜０．００５）を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールと１μＭ  Ｌ６８５，４５８との間の有意な差（Ｐ＜０．００２）、およびコントロールと５μＭ  Ｌ６８５，４５８との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図７−２】図７ａ−ｃ：ラット大動脈の外植片による微小血管増殖の形成における、γ−セクレターゼインヒビターの効果。図７ａ：微小血管増殖におけるＤＡＰＴの効果を示す代表的な図。図７ｂ：ＤＡＰＴ処理後の微小血管増殖によって覆われる領域の、画像分析による定量。ＡＮＯＶＡは、ＤＡＰＴ用量（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果、ならびにそれらの間の相互作用期間の有意な主効果（Ｐ＜０．００１）を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールとＤＡＰＴ  ５μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）コントロールとＤＡＰＴ  ２０μＭとの間の有意な差（Ｐ＜０．０２）を示したが、コントロールとＤＡＰＴ  １０μＭとの間の有意な差（Ｐ＝０．９９９）は示さなかった。図７ｃ：Ｌ６８５，４５８処置後に微小血管増殖によって覆われる領域の画像分析による定量。ＡＮＯＶＡは、：Ｌ６８５，４５８（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果、ならびにそれらの間の相互作用期間の有意な主効果（Ｐ＜０．００５）を示した。ｈｏｃ後試験は、コントロールと１μＭ  Ｌ６８５，４５８との間の有意な差（Ｐ＜０．００２）、およびコントロールと５μＭ  Ｌ６８５，４５８との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。
【図８】図８ａ：ヒトグリア芽腫（Ｕ−８７ＭＧ）異種移植片増殖速度における、γせくレターゼインヒビターＤＡＰＴおよびβ−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯの抗腫瘍性効果。Ｕ−８７ＭＧ細胞（６×１０６）を、８〜１０週齢のヌードマウスの両脇腹に皮下注射した。マウスに、ビヒクル、５ｍｇ／Ｋｇ体重のβ−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯ、または１０ｍｇ／Ｋｇ体重のγ−セクレターゼインヒビターＤＡＰＴのいずれかを、腫瘍がおよそ１４０ｍｍ３の平均腫瘍容積に到達したとき（移植後８日目）に開始して、腹腔内注射した。注射は、毎日、９日間行った。データを、平均腫瘍容積±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表す。ＡＮＯＶＡは、ＤＡＰＴ（Ｐ＜０．００１）およびＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯ（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果を示した。ｈｏｃ後分析は、ビヒクルで処理したマウスに由来する腫瘍とＤＡＰＴで処理した動物に由来する腫瘍との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、ビヒクルで処理したマウスに由来する腫瘍とＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯで処理したマウスとの間の有意な差（Ｐ＜０．００１）示したが、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯ処理とＤＡＰＴ処理との間の差は示さなかった（Ｐ＝０．１２）。これは、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯおよびＤＡＰＴＴが、類似の効力でヒトグリア芽腫異種移植片の増殖を阻害することを示す。図８ｂ：ＣＤ３１抗体で免疫染色したグリア芽腫の切片の代表的な図。図８ｃ：グリア芽腫腫瘍新脈管形成の評価を示すヒストグラム。ＡＮＯＶＡは、ＤＡＰＴ（Ｐ＜０．００１）およびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（Ｐ＜０．０２）の有意な主効果を示す。ｈｏｃ後分析は、ビヒクルで処理したマウスの血管指標とＤＡＰＴで処理した動物の血管指標との間の有意な差（Ｐ＜０．００２）、およびビヒクルで処理したマウスの血管指標とＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯで処理した動物の血管指標との間の有意な差（Ｐ＜０．０３）を示す。これは、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯおよびＤＡＰＴが、ヒトグリア芽腫異種移植片の新脈管形成を有意に減少させることを示す。
【図９】図９ａ：ヒト肺腺癌（Ａ−５４９）異種移植片増殖速度における、γ−セクレターゼインヒビターＤＡＰＴおよびβ−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯの抗腫瘍性効果。Ａ−５４９細胞（８．５×１０６）を、８〜１０週齢のヌードマウスの両脇腹に皮下注射した。マウスに、ビヒクル、５ｍｇ／Ｋｇ体重のβ−セクレターゼインヒビターＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯまたは１０ｍｇ／Ｋｇ体重のγ−セクレターゼインヒビターＤＡＰＴのいずれかを、腫瘍がおよそ２００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき（移植後２１日目）に開始して、腹腔内注射した。注射は、毎日、１２日間行った。データは、平均腫瘍容積±標準誤差として表す。ＡＮＰＶＡは、ＤＡＰＴ（Ｐ＜０．００１）、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯ（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果を示す。ｈｏｃ後分析は、ビヒクルで処理したマウスに由来する腫瘍容積とＤＡＰＴで処理した動物に由来する腫瘍容積との間の有意な差（Ｐ＜０．００１）、ビヒクルで処理したマウスに由来する腫瘍容積とＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯで処理した動物に由来する腫瘍容積との間の優位な差（Ｐ＜０．００１）を示が、Ｚ−ＶＶＬ−ＣＨＯ処理とＤＡＰＴ処理との間の差は示さない（Ｐ＝０．５１９）。これは、ＤＡＰＴおよびＺ−ＶＶＬ−ＣＨＯが、ヒト肺腺癌異種移植片の増殖を有意に阻害することを示す。図９ｂ：ＣＤ３１抗体で免疫染色した肺腺癌腫の切片の代表的な図。図９ｃ：肺腺癌腫の新脈管形成の定量を示すヒストグラム。ＡＮＯＶＡは、ＤＡＰＴ（Ｐ＜０．０１）およびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（Ｐ＜０．０１）の有意な主効果を示す。ｈｏｃ後分析は、ビヒクルで処理したマウスの血管指標とＤＡＰＴで処理したマウスの血管指標との間の有意な差（Ｐ＜０．０３）、およびビヒクルで処理したマウスの血管指標とＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯで処理した動物の血管指標との間の有意な差（Ｐ＜０．０３）を示す。これは、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯおよびＤＡＰＴがヒト肺腺癌異種片の新脈管形成を有意に減少させることを示す。
【図１０】ヒト肺腺癌（Ａ−５４９）異種移植片増殖速度における、γ−セクレターゼインヒビターＪＬＫ−６の抗腫瘍性効果。Ａ−５４９細胞（８．５×１０６）を、８〜１０週齢のヌードマウスの両脇腹に皮下注射した。マウスに、１６日目（腫瘍がおよそ１５０ｍｍ３の容積に達したとき）から毎日、ビヒクルまたは５ｍｇ／Ｋｇ体重のγ−セクレターゼインヒビターＪＬＫ−６のいずれかを、腹腔内投与した。データは、平均腫瘍容積（ｍｍ３）±標準誤差として表す。ＡＮＯＶＡは、ＪＬＫ−６（Ｐ＜０．００１）および時間（Ｐ＜０．００１）の有意な主効果（これは、ビヒクルで処理した動物と比較したＪＬＫ−６で処理した動物群における腫瘍増殖の阻害を示す）を示す。これは、ＪＬＫ−６が、ヒト肺腺癌異種移植片の増殖を有意に阻害することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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