(57)【要約】梗塞した心筋層組織の治療方法は、梗塞した組織のＳＤＦ−１タンパク質を濃縮する工程を含み、梗塞した組織の末梢血中の幹細胞の濃度を、高める工程を含む。具体的には、梗塞した組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の濃度を、第１の濃度から第２の濃度に高める工程と、梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の濃度を高めながら、梗塞した組織の末梢血中における幹細胞の濃度を第１の濃度から第２の濃度に高める工程を含む。さらに、梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の濃度が高められると、末梢血中における幹細胞数は増加する。なお、このＳＤＦ−１（ストローマ細胞由来因子−１）は、虚血性心筋症において幹細胞のホーミングおよび組織再生を仲介する。
2006507244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
梗塞した心筋組織を治療する方法であって、
前記梗塞した組織が、ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度を含み、
前記梗塞した組織の末梢血が幹細胞の第１の濃度を含むこと、
を特徴とし、
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の前記濃度を、前記第１の濃度から第２の濃度に高める工程と、
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の前記濃度を高めながら、前記梗塞した組織の前記末梢血中における幹細胞の濃度を、前記第１の濃度から第２の濃度に高める工程と、
を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２】
幹細胞の数を増加させる前記工程が、前記幹細胞を骨髄から前記末梢血へ動員させる薬剤を投与する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞を前記骨髄から前記末梢血まで動員させる前記薬剤が、サイトカイン、ケモカイン、および、化学療法剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、Ｇ−ＣＳＦを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞の数を増加させる前記工程が、幹細胞を前記末梢血に注入する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の前記濃度を高める前記工程が、前記梗塞した組織へ発現ベクターを導入する工程を含み、
前記発現ベクターは、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸を含むこと、
を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが、心筋組織へ指向させた組織特異的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが、心筋細胞へ指向させた組織特異的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の前記濃度を高める前記工程が、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養された細胞を前記梗塞した組織へ導入する工程を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、培養前に処置される被験体から採取された自己細胞を含むことを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記梗塞した組織へ導入される前記細胞は、前記梗塞した組織へ導入される前に、発現ベクターをトランスフェクトされること、
を特徴とし、
前記発現ベクターが、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸を含むこと、
を特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記梗塞した組織が、ＶＥＧＦの第１の濃度を含むこと、
を特徴とし、
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の前記濃度を高めながら、前記梗塞した組織におけるＶＥＧＦの前記濃度を、前記第１の濃度から第２の濃度に高める工程をさらに含むこと、
を特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記梗塞した組織におけるＶＥＧＦの前記濃度を高める前記工程が、前記梗塞した組織の細胞へ薬剤を導入する工程を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記梗塞した組織におけるＶＥＧＦの前記濃度を高める前記工程が、
前記梗塞した組織へ発現ベクターを導入する工程を含み、
前記発現ベクターが、ＶＥＧＦをコードする核酸を含むこと、
を特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターが、心筋組織へ指向させる組織特異的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターが、心筋細胞へ指向させる組織特異的プロモーターを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記梗塞した組織におけるＶＥＧＦの前記濃度を高める前記工程が、
前記梗塞した組織に細胞を導入する工程を含み、
前記細胞は、前記梗塞した組織へ導入される前に、発現ベクターをトランスフェクトされ、
前記発現ベクターは、ＶＥＧＦをコードする核酸を含むこと、
を特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦをコードする発現ベクターをトランスフェクトさせた前記細胞が、前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の前記濃度を高めるために、前記梗塞した組織へ導入した細胞と同じ細胞であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
梗塞した心筋組織を処置する方法であって、
前記梗塞した組織は、心筋梗塞からある時間が経過した後において、ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度およびＶＥＧＦの第１の濃度を含むこと、
を特徴とし、
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の前記濃度を、前記第１の濃度から、実質的に前記第１の濃度より高い第２の濃度に高める工程と、
前記梗塞した組織におけるＶＥＧＦの前記濃度を、前記第１の濃度から、実質的に前記第１の濃度より高い第２の濃度に高める工程と、
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の前記濃度およびＶＥＧＦの前記濃度を高めながら、幹細胞を骨髄から前記梗塞した組織の末梢血へ動員させる薬剤を投与する工程と、
を含み、
前記幹細胞は、前記骨髄から前記末梢血へ動員されること、
を特徴とする、処置方法。
【請求項２０】
前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の前記濃度を高める工程が、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養される前記梗塞した組織へ細胞を導入する工程を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記梗塞した組織へ導入される前記細胞が、前記梗塞した組織へ導入される前に、発現ベクターをトランスフェクトされること、
を特徴とし、
前記発現ベクターが、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸を含むこと、
を特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記梗塞した組織におけるＶＥＧＦの前記濃度を高める前記工程が、
前記梗塞した組織へ細胞を導入する工程を含み、
前記細胞は、前記梗塞した組織へ導入される前に、発現ベクターをトランスフェクトされ、
前記発現ベクターは、ＶＥＧＦをコードする核酸を含むこと、
を特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＥＧＦをコードする発現ベクターをトランスフェクトされる前記細胞が、前記梗塞した組織におけるＳＤＦ−１の前記濃度を高めるために、前記梗塞した組織へ導入される細胞と同じであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性心筋症における組織再生方法に関し、特に、心筋梗塞から一定の時間（すなわち、数週間）が経過した後に虚血性心筋症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞（ＭＩ）は、以前から西洋社会において死亡原因の一位を占めてきた。梗塞した動脈において、順行性灌流で修復することを主なターゲットにした最近の治療の進歩にもかかわらず、その便益には限界があるようである（例えば、非特許文献1参照）。急性心筋梗塞（ＭＩ）を罹患する被験体のかなりの割合で、一般に左室（ＬＶ）再構築、すなわち、心筋菲薄、拡張、機能低下を伴うプロセスの結果である、うっ血性心不全（ＣＨＦ）を最終的に発症し、ひいては死に至る（例えば、非特許文献2〜4参照）。
【０００３】
心筋梗塞後のこの過程を治療する一つの方法は、遺伝子治療に関するものである（例えば、非特許文献5参照）。骨格筋芽細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞などの分化細胞、または、骨髄由来細胞を含む様々な細胞タイプを使用することに的を絞った移植が行われている（例えば、非特許文献6〜16参照）。
【０００４】
多くの文献において示唆されているように、幹細胞の心臓への動員および心筋細胞への分化は自然に起こる過程である（例えば、非特許文献17、非特許文献18参照）。この過程は、心筋梗塞の後において、左室機能の意義ある回復をもたらすほど十分な速度で進んでいない（同著）。
【０００５】
近年の研究によれば、心筋梗塞に先立って、血流中へ幹細胞を直接投与することによって、または、化学療法により骨髄から幹細胞を動員することによって、損傷した心筋を再生できる可能性が明らかにされている。これらの研究により、梗塞過程を起こしている周囲の領域において、幹細胞が梗塞領域へホーミング（homing）するホーミング能、および、幹細胞が心筋細胞へ分化する分化能が実証されている（例えば、非特許文献19〜22参照）。現在まで、いずれの研究においても、幹細胞が心筋梗塞後４８時間以内に心筋を再生する能力に焦点が当てられていた。
【非特許文献１】Topol, E. J. Lancet 357, 1905-1914 (2001）
【非特許文献２】Robbins, M.A. & O’Connell, J.B., pp. 3-13 (Lippincott-Raven, Philadelphia, 1998)
【非特許文献３】Pfeffer, J.M., Pfeffer, M.A., Eletcher, P.J. and Braunwald, E. Am. J. Physiol 260, H1406-H1414 (1991)
【非特許文献４】Pfeffer, M.A. and  Braunwald, E. Circulation 81, 1161-1172 (1990)
【非特許文献５】Penn, M.S.et al．Prog. Cardiovasc. Dis. 45, 21-32 (2002)
【非特許文献６】Koh, G.Y., Klug, M.G., Soonpaa, M.H. およびField, L.J. J. C1in. Invest 92, 1548-1554 (1993)
【非特許文献７】Taylor, D.A,et al. Nat. Med. 4, 929-933 (1998)
【非特許文献８】Jain, M, et al. Circulation 103, 1920-1927 (2001)
【非特許文献９】Li, R. K.et al. Ann. Thorac. Surg. 62, 654-660 (1996)
【非特許文献１０】Etzion, S.et al. J.Mol.Ce11 Cardiol. 33, 1321-1330 (2001)
【非特許文献１１】Li, R. K., Jia, Z.Q., Weisel, R.D., Merante, F. and Mickle, D.A. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 513-522 (1999)
【非特許文献１２】Yoo, K. J.et al. Yonsei Med. J. 43, 296-303 (2002)
【非特許文献１３】Sakai, T.et al. Ann. Thorac. Surg. 68, 2074-2080 (1999)
【非特許文献１４】Sakai, T. et al. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118, 715-724 (1999)
【非特許文献１５】Orlic, D.et al. Nature 410, 701-705 (2001)
【非特許文献１６】Tomita, S.et al. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 123, 1132-1140 (2002)
【非特許文献１７】Jackson, K.A.et al. J. Clin. Invest 107, 1395-1402 (2001)
【非特許文献１８】Quaini, F.et al. N. Engl. J. Med. 346, 5-15 (2002)
【非特許文献１９】Kocher, A.A.et al. Nat. Med. 7, 430-436 (2001)
【非特許文献２０】Orlic, D.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 10344-10349 (2001)
【非特許文献２１】Peled, A.et al. Blood 95, 3289-3296 (2000)
【非特許文献２２】Yong, K.et al. Br. J. Haematol. 107, 941-449 (1999)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの態様は、梗塞した心筋組織の治療方法に関する。この梗塞した組織は、ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度を含み、この梗塞した組織の末梢血は、幹細胞の第１の濃度を含む。この方法では、梗塞した組織中のＳＤＦ−１タンパク質の濃度を第１の濃度から第２の濃度に高めることができる。また、梗塞した組織の末梢血中の幹細胞の濃度を、第１の濃度から第２の濃度に高めることができる。梗塞した組織のＳＤＦ−１の濃度を高めながら、末梢血中の幹細胞の濃度を高めることができる。
【０００７】
本発明の別の態様によれば、骨髄から末梢血に幹細胞を動員させる薬剤を投与するか、または、幹細胞を末梢血に注入することよって、幹細胞数を増加させることができる。本発明の好ましい態様では、骨髄から末梢血へ幹細胞を動員させる薬剤は、サイトカイン、ケモカイン、および、化学療法剤からなる群から選択することができる。本発明のより好ましい態様では、この薬剤は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、梗塞した組織中のＳＤＦ−１タンパク質の濃度は、梗塞した組織へ発現ベクターを導入することにより増加させることができる。この発現ベクターは、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸を含む。選択的に、この発現ベクターは心筋組織、および、好ましくは心筋細胞を標的とする組織特異的プロモーターを含むことができる。
【０００９】
本発明のまた別の態様によれば、梗塞した組織中のＳＤＦ−１タンパク質の濃度は、ex vivoで培養された細胞を梗塞した組織の中へ導入することにより増加させることができる。ex vivoで培養された細胞は、治療対象の被験体から採取された自己細胞を含むことができる。
【００１０】
本発明の別の態様では、梗塞した組織へ導入する細胞に、その梗塞した組織へ導入する前に発現ベクターをトランスフェクトすることができる。この発現ベクターは、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸を含むことができる。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、梗塞した組織は、ＶＥＧＦの第１の濃度を有する。この梗塞した組織中のＶＥＧＦの濃度は、第１の濃度から第２の濃度に高めることができる。梗塞した組織中のＳＤＦ−１の濃度を高めながら、梗塞した組織中のＶＥＧＦの濃度を高めることができる。
【００１２】
一つの態様では、梗塞した組織へＶＥＧＦをコードする発現ベクターを導入することにより、梗塞した組織のＶＥＧＦの濃度を高めることができる。選択的に、この発現ベクターは、心筋組織、および、好ましくは心筋細胞を標的とする組織特異的プロモーターを含むことができる。
【００１３】
別の態様では、梗塞した組織中のＶＥＧＦの濃度は、梗塞した組織中に発現ベクターをトランスフェクトする細胞を導入することによって、増加させることができる。この発現ベクターは、ＶＥＧＦをコードする核酸を含む。ＶＥＧＦをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトする細胞は、梗塞した組織のＳＤＦ−１の濃度を高めるために、その梗塞した組織へ導入した細胞と同じ細胞であってよい。
【００１４】
本発明の別の態様は、心筋梗塞からある時間が経過した時点において、梗塞した心筋組織を治療する方法に関する。その梗塞した組織は、ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度およびＶＥＧＦの第１の濃度を含むことができる。この方法では、梗塞した組織のＳＤＦ−１タンパク質の濃度を、第１の濃度から、実質的にそれより高い濃度である第２の濃度に高めることができる。梗塞した組織のＶＥＧＦの濃度は、第１の濃度から、実質的にそれより高い濃度である第２の濃度に高めることができる。幹細胞を骨髄から梗塞した組織の末梢血へ動員する薬剤を投与することができる。梗塞した組織中のＳＤＦ−１およびＶＥＧＦの濃縮を高めながら、幹細胞を骨髄から末梢血へ動員することができる。
【００１５】
一つの態様では、梗塞した組織のＳＤＦ−１タンパク質の濃度は、ex vivoで培養された細胞をその梗塞した組織中へ導入することによって、高めることができる。梗塞した組織へ導入する細胞は、その梗塞した組織へ導入する前に発現ベクターをトランスフェクトすることができる。この発現ベクターは、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸を含む。
【００１６】
別の態様では、梗塞した組織のＶＥＧＦの濃度は、梗塞した組織へ細胞を導入することによって高めることができる。その細胞には、梗塞した組織へ導入する前に発現ベクターをトランスフェクトすることができる。この発現ベクターは、ＶＥＧＦをコードする核酸を含むことができる。ＶＥＧＦをコードする発現ベクターをトランスフェクトした細胞は、梗塞した組織のＳＤＦ−１の濃度を高めるために、その梗塞した組織へ導入した細胞と同じ細胞であってよい。
【００１７】
本発明のさらなる特徴は、添付の図面を参照し、以下の本発明の説明を読むことにより、本発明が関係する技術分野の当業者に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
特に定義しない限り、本明細書中で使用する専門用語はすべて、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に理解されている分子生物学用語の定義は、例えばRiegeret al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; およびLewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994において見出すことができる。
【００１９】
従来の分子生物学技術に関わる方法は、本明細書中に記述している。このような技術は当技術分野で一般的に既知であり、A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrooket al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; およびCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelet al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 （定期的に改定）などの方法論集に詳細に記述されている。核酸の化学合成方法については、例えば、Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981, and Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981にて論じられている。核酸の化学合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーによって行なうことができる。免疫学的方法（例えば、抗原特異性抗体の調製、免疫沈降、および、イムノブロッティング等）については、例えば、Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, New York, 1991; and Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, New York, 1992に記載されている。また、従来の遺伝子導入法および遺伝子治療法を、本発明での使用に合わせて改変することもできる。例えば、Gene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999; Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P. D. Robbins, Humana Press, 1997; and Retro-vectors for Human Gene Therapy, ed. C. P. Hodgson, Springer Verlag, 1996を参照されたい。
【００２０】
本発明は、心臓の虚血領域における心筋（または、末梢血管組織の場合においては、骨格筋）を再生する方法に関する。本発明の方法は、心筋梗塞から一定の時間（すなわち、数週間）が経過した後に虚血性心筋症を治療するために使用することができる。
【００２１】
本方法は、哺乳動物被験体内の梗塞した心筋へ、多能性幹細胞を動員し、その遊走を方向付ける工程を包含する。哺乳動物被験体としては、例えば、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ウサギ、ウシ等のあらゆる哺乳動物が挙げられる。哺乳動物被験体としては、成体、幼若動物、および新生児を含む任意の成長段階を含み得る。哺乳動物被験体はまた、胎児の発達段階も含み得る。
【００２２】
梗塞した心筋は、梗塞した心筋組織、梗塞した心筋組織の末梢周囲の心筋組織、および、梗塞した心筋組織と梗塞した心筋組織の末梢周囲の心筋組織の両者を含み得る。
【００２３】
心筋梗塞から一定の時間が経過した後に、第１の多数の多能性幹細胞を梗塞した心筋に遊走させる。さらに多くの幹細胞が梗塞した心筋に遊走するように、この第１の幹細胞数を増加することができる。梗塞心筋に遊走する幹細胞の数を増加させることによって、梗塞した心筋は、細胞に分化することができる多能性幹細胞の数が増え、これらの細胞が再増殖でき（すなわち、生着でき）、梗塞した心筋の正常な機能が部分的または全面的に回復されるので、梗塞した心筋組織が再生することができるのである。
【００２４】
本発明の１つの態様によれば、本方法は、梗塞した心筋を再生するために、多能性幹細胞を梗塞した心筋にホーミングするよう誘導する工程を含む。本発明において記載される多能性幹細胞とは、別の細胞タイプに分化するように誘導し得る任意の細胞である。一例としては、心筋細胞へ分化し得る造血幹細胞が挙げられる。
【００２５】
多能性幹細胞は、梗塞した心筋のＳＤＦ−１タンパク質の濃度を第１の濃度から第２の濃度に高めることにより、梗塞した心筋にホーミングさせることができる。ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度は、心筋梗塞から一定の時間（すなわち、数週間）が経過した後に梗塞した心筋に典型的にみられるＳＤＦ−１タンパク質の濃度であり得る。ＳＤＦ−１タンパク質の第２の濃度は、ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度より実質的に高くし得る。ＳＤＦ−１タンパク質の濃度は、心筋梗塞から一定の時間が経過した後に、梗塞した心筋において典型的に発現するＳＤＦ−１タンパク質の量から、梗塞した心筋内のＳＤＦ−１タンパク質の発現をアップレギュレートすることによって、梗塞した心筋中で増加させることができる。
【００２６】
本発明の方法は、さらに、末梢血中の幹細胞の濃度（すなわち、数）を、第１の濃度から、この第１の濃度より実質的に高い第２の濃度に高める工程を含む。幹細胞の第１の濃度は、心筋梗塞から一定の時間が経過した後に、末梢血で典型的にみられる幹細胞の濃度であり得る。梗塞した心筋中のＳＤＦ−１タンパク質の濃度を高めながら、末梢血中の幹細胞の濃度を高めることができる。末梢血中の幹細胞の濃度は、梗塞した心筋において、ＳＤＦ−１タンパク質の発現をアップレギュレートさせる前またはアップレギュレートさせた後に高めることができる。
【００２７】
梗塞した心筋において発現したＳＤＦ−１タンパク質は、末梢血中の幹細胞を梗塞した心筋へ誘導される。梗塞した心筋に誘導された幹細胞により、心筋の再生が促進され、左室機能が実質的に向上する。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、本方法は、さらに、梗塞した心筋の末梢血の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の濃度を、第１の濃度から、第１の濃度より実質的に高い第２の濃度に高める工程を含む。梗塞した心筋中のＶＥＧＦの第１の濃度は、心筋梗塞から一定の時間が経過した後に、梗塞した心筋で典型的にみられる幹細胞の濃度である。ＶＥＧＦの濃度は、心筋梗塞から一定の時間が経過した後に、梗塞した心筋において典型的に発現するＶＥＧＦ量から、梗塞した心筋内のＶＥＧＦタンパク質の発現をアップレギュレートすることによって、梗塞した心筋において高めることができる。
【００２９】
梗塞した心筋内のＳＤＦ−１タンパク質の濃度を増加させ、かつ、末梢血中の幹細胞の濃度を高めながら、梗塞した心筋内のＶＥＧＦの濃度を高めることができる。梗塞した心筋内のＳＤＦ−１タンパク質の濃度を高め、かつ、末梢血中の幹細胞の濃度を高めることと組み合わせて、梗塞した心筋の血管内皮成長因子の濃度を高めると、梗塞した心筋内の血管密度が、生理食塩水を投与したコントロールと比較して増加する。さらに、このような組み合わせの結果、心筋ミオシンを発現している細胞が梗塞した心筋において再増殖し、左室内径短縮率により測定されるように左室機能は向上した。
【００３０】
＝＝ＳＤＦ−１タンパク質＝＝
本発明の１つの態様によれば、梗塞した心筋に発現するＳＤＦ−１タンパク質（あるいはＳＤＦ−１ポリペプチド）は、ＳＤＦ−１遺伝子の発現産物であり得る。ヒト、ラット、マウス、および、ネコなどの多くの様々な哺乳動物において、ＳＤＦ−１タンパク質のアミノ酸配列が知られている。本発明のＳＤＦ−１タンパク質は、前述の天然の哺乳動物のＳＤＦ−１タンパク質のアミノ酸配列の一つと同じアミノ酸配列であってもよい。
【００３１】
本発明のＳＤＦ−１タンパク質はまた、例えば、哺乳動物のＳＤＦ−１タンパク質の断片、類似体、および、誘導体等の哺乳動物ＳＤＦ−１タンパク質の変異体であってもよい。このような変異体の例としては、例えば、天然ＳＤＦ−１遺伝子の天然対立遺伝子変異よってコードされるポリペプチド（すなわち、天然哺乳動物ＳＤＦ−１タンパク質をコードする天然核酸）、天然ＳＤＦ−１遺伝子の選択的スプライシング型によりコードされるポリペプチド、天然ＳＤＦ−１遺伝子のホモログによってコードされるポリペプチド、および、天然ＳＤＦ−１遺伝子の非天然変異によりコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００３２】
ＳＤＦ−１タンパク質変異体は、１個以上のアミノ酸において、天然ＳＤＦ−１タンパク質とは異なるペプチド配列を有する。このような変異体のペプチド配列は、ＳＤＦ−１タンパク質の１個以上のアミノ酸の欠失、付加、または、置換を特徴とし得る。アミノ酸挿入は、約１〜４個の連続するアミノ酸であることが好ましく、欠失は、約１〜１０個の連続するアミノ酸であることが好ましい。変異ＳＤＦ−１タンパク質は、天然ＳＤＦ−１タンパク質の機能活性を実質的に維持している。好ましいＳＤＦ−１タンパク質の変異体は、サイレント（silent）または保存的な変化を特徴とする本発明の範囲内の核酸分子を発現させることにより作製することができる。
【００３３】
１つ以上の特定のモチーフおよび／またはドメイン、または任意のサイズに対応するＳＤＦ−１タンパク質断片は、本発明の範囲内である。単離されたＳＤＦ−１タンパク質のペプチジル部位は、このようなペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え技術によって産生したそのペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さらに、断片は、例えば、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ化学またはメリフィールド固相ｔ−Ｂｏｃ化学などの当技術分野で既知の技術を使用して、化学合成することができる。例えば、本発明のＳＤＦ−１タンパク質は、所望の長さの断片に任意に分割してもよく、その際、断片をオーバーラップさせなくてもよいが、所望の長さのオーバーラップする断片に分割することが好ましい。この断片は、組換え技術によって作製され、天然ＳＤＦ−１タンパク質のアゴニストとして機能し得るペプチジル断片を同定するために試験してもよい。
【００３４】
ＳＤＦ−１タンパク質変異体はまた、組換え型のＳＤＦ−１タンパク質を含んでもよい。ＳＤＦ−１タンパク質に加え、本発明における好ましい組換えポリペプチドは、哺乳動物のＳＤＦ−１タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を持つことができる核酸によってコードされる。
【００３５】
ＳＤＦ−１タンパク質変異体は、天然ＳＤＦ−１タンパク質の機能活性を構成的に発現するタンパク質のアゴニスト型を含み得る。その他のＳＤＦ−１タンパク質変異体としては、例えば、プロテアーゼの標的配列を変化させる突然変異に起因するタンパク質分解性開裂(proteolytic cleavage)に耐性をもつ変異体が挙げられる。ペプチドのアミノ酸配列が変化した結果、天然ＳＤＦ−１タンパク質の１つまたは複数の機能活性をもつ変異体が生じるかということは、天然ＳＤＦ−１タンパク質の機能活性について変異体を試験することにより容易に明らかにすることができる。
【００３６】
＝＝核酸＝＝
本発明の別の態様は、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする核酸分子、および、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする非天然核酸に関する。このような核酸分子は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および、合成ＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の場合、コード鎖（センス鎖）であっても非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。ＳＤＦ−１タンパク質をコードするコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１８９７２４、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号  ＡＦ２０９９７６、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号  Ｌ１２００２９、および、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ０２２１７７として示される塩基配列と同一であり得る。ＳＤＦ−１タンパク質をコードするコード配列はまた、遺伝暗号の重複または縮重の結果として、このようなポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。
【００３７】
本発明の範囲内でＳＤＦ−１をコードする他の核酸分子は、例えば、天然ＳＤＦ−１タンパク質の断片、類似体、および、誘導体をコードする天然ＳＤＦ−１タンパク質の変異体である。このような変異体としては、例えば、天然ＳＤＦ−１遺伝子の天然対立遺伝子変異体、天然ＳＤＦ−１遺伝子のホモログ、または、天然ＳＤＦ−１遺伝子の非天然変異体が挙げられる。これらの変異体は、１個以上の塩基において天然ＳＤＦ−１遺伝子とは異なる塩基配列を有する。例えば、このような変異体の塩基配列は、天然ＳＤＦ−１タンパク質の１個以上のヌクレオチドの欠失、付加、または、置換を特徴とし得る。核酸挿入は、約１〜１０個の連続するヌクレオチドであることが好ましく、欠失は、約１〜１０個の連続するヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
他の用途において、構造が実質的に変化している変異ＳＤＦ−１タンパク質は、コード化したポリペプチドにおいて保存的とは言えない変化を引き起こすヌクレオチド置換を作製することによって生成され得る。このようなヌクレオチド置換の例としては、（ａ）ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）ポリペプチドの電荷もしくは疎水性、または、（ｃ）アミノ酸側鎖の大部分を変化させる置換が挙げられる。タンパク質の特性を最も大きく変化させると一般に予想されるヌクレオチド置換は、コドンにおいて非保存的な変化を引き起こす置換である。タンパク質の構造を大きく変化させる可能性があるコドンの変化の例としては、次のような置換を引き起こす変化が挙げられる。（ａ）例えば、セリン、もしくは、トレオニン等の親水性の残基が、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、もしくは、アラニン等の疎水性の残基に（または、疎水性の残基で）置換される。（ｂ）システインもしくはプロリンが、他の任意の残基に（または、他の任意の残基で）置換される。（ｃ）例えば、リジン、アルギニン、もしくは、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有する残基が、例えば、グルタミン、もしくは、アスパルチン等の電気陰性の側鎖に（または、電気陰性の側鎖で）置換される。あるいは（ｄ）例えば、フェルアラニン等の、かさ高い側鎖を有する残基が、例えば、グリシン等の側鎖を有しない残基に（または、側鎖を有しない残基で）置換される。
【００３９】
本発明の範囲の天然ＳＤＦ−１遺伝子の天然対立遺伝子変異は、哺乳動物の組織から単離された、天然ＳＤＦ−１遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有し、天然ＳＤＦ−１タンパク質と類似した構造を有するポリペプチドをコードする核酸である。本発明の範囲の天然ＳＤＦ−１遺伝子の同族体は、他の種から単離された、天然ＳＤＦ−１遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有し天然ＳＤＦ−１タンパク質と類似した構造を有するポリペプチドをコードする核酸である。天然ＳＤＦ−１遺伝子と高い（例えば７０％以上の）配列同一性をもつ他の核酸分子を同定するため、公的なおよび／または私的な核酸データベースを探索することができる。
【００４０】
非天然ＳＤＦ−１遺伝子変異体とは、自然界には存在せず（例えば、人工的に作製される）、天然ＳＤＦ−１遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を持たず、天然ＳＤＦ−１タンパク質と類似した構造を有するポリペプチドをコードしない核酸をいう。非天然ＳＤＦ−１遺伝子変異体の例としては、天然ＳＤＦ−１タンパク質断片をコードする変異体、ストリンジェントな条件下で、天然ＳＤＦ−１遺伝子または天然ＳＤＦ−１遺伝子の相補体にハイブリダイズする変異体、天然ＳＤＦ−１遺伝子または天然ＳＤＦ−１遺伝子の相補体と少なくとも６５％の配列同一性を有する変異体、およびＳＤＦ−１融合タンパク質をコードする変異体が挙げられる。
【００４１】
本発明の範囲内の天然ＳＤＦ−１タンパク質断片をコードする核酸は、天然ＳＤＦ−１タンパク質のアミノ酸残基をコードする核酸である。天然ＳＤＦ−１タンパク質断片をコードする核酸をコードするか、または、これとハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドは、プローブ、プライマー、または、アンチセンス分子として使用することができる。天然ＳＤＦ−１タンパク質断片をコードする核酸をコードするか、または、これとハイブリダイズする長いポリヌクレオチドも、本発明の様々な態様において使用することができる。天然ＳＤＦ−１断片をコードする核酸は、酵素消化によって（例えば、制限酵素を使用して）、または全長天然ＳＤＦ−１遺伝子もしくはその変異体の化学分解によって作製され得る。
【００４２】
前述の核酸のうちの１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸もまた、本発明において使用することができる。例えば、このような核酸は、本発明の範囲内で、低ストリンジェンシー条件、中ストリンジェンシー条件、または高ストリンジェンシー条件下で、前述の核酸のうちの１つにハイブリダイズする核酸であり得る。
【００４３】
ＳＤＦ−１融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明において使用され得る。このような核酸は、適切な標的細胞へ導入する場合、ＳＤＦ−１融合タンパク質を発現する構成物（例えば、発現ベクター）を調製することにより作製することができる。例えば、このような構成物は、その発現が好適な発現系で融合タンパク質を産生するように、インフレームで融合したＳＤＦ−１タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、別のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを結合することにより作製することができる。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合体、または、それらの誘導体もしくはそれらの改変体であってもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなど向上させるために、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格は改変され得る。本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドの例としては、さらに、ペプチド（例えばin vivoで標的細胞受容体を標的とするための）、または細胞膜を横断する輸送やハイブリダイゼーション誘発開裂を促進する薬剤等の他の追加の群が挙げられる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤等の別の分子に結合させてもよい。
【００４５】
＝＝ＳＤＦ−１の発現＝＝
本発明の別の態様によれば、梗塞した心筋層におけるＳＤＦ−１の発現は、梗塞した心筋組織へ生体適合性細胞を移植することによりアップレギュレートされ得る。細胞を梗塞した心筋層の中へ移植すると、梗塞した心筋層におけるＳＤＦ−１タンパク質の発現がアップレギュレートする。梗塞した心筋層におおけるＳＤＦ−１タンパク質のアップレギュレーションは、心筋層への細胞移植後約１時間から約７日未満のうちに観察された。
【００４６】
梗塞した心筋層へ移植することができる細胞タイプの例としては、培養した心臓細胞、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞および骨髄由来細胞が挙げられる。これらの細胞は、処置対象の被験体（すなわち、自己細胞）から採取し、かつ移植の前に培養されることが好ましい。移植上における細胞の生体適合性を高め、かつ拒絶の可能性を最小限にするためには、自己細胞が好ましい。
【００４７】
梗塞した心筋層へ移植する好ましい細胞は、骨格筋芽細胞である。筋芽細胞は、ストレス期に骨格筋を再生する能力を維持し、増殖して筋管細胞に分化し、最終的には収縮能をもつ筋繊維を形成する。心筋層へ移植された筋芽細胞は筋管を形成し、細胞周期を停止するが、依然として生存可能である。機能的な研究により、心筋層へ筋芽細胞を移植後に、局所収縮性およびコンプライアンスの向上が認められている。
【００４８】
骨格筋芽細胞は、筋繊維の基底膜の下から容易に採取でき、培養して細胞株をスケールアップでき、次いで梗塞した心筋層へ移植することができる。例えば、マウス被験体では、骨格筋芽細胞を、この被験体の後肢から採取し、培養した後に、この被験体の梗塞した心筋層へ移植することができる。
【００４９】
この培養細胞は、周知の細胞移植技術によって梗塞した心筋層へ移植することができる。例えば、ツベルクリン注射器を使用して、培養細胞の懸濁液を梗塞した心筋組織へ注入することができる。
【００５０】
あるいは、ＳＤＦ−１タンパク質の発現は、ＳＤＦ−１タンパク質の発現を増加させる薬剤を、標的細胞へ導入することによりアップレギュレートすることができる。この標的細胞は、被験体から採取された、自己由来の骨格筋芽細胞または線維芽細胞などの梗塞した心筋層内の細胞または生体外細胞を含んでもよい。
【００５１】
このような薬剤は、本発明に従って、上記の通り、天然核酸または合成核酸を含むことができ、この核酸は、細胞に導入することができ、かつ細胞中で複製能を有する組換え核酸構成物（典型的にはＤＮＡ構成物）である。このような構成物は、特定の標的細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写能および翻訳能を有する複製系および配列を含むことが好ましい。
【００５２】
標的組織におけるＳＤＦ−１タンパク質レベルを増加させるために、他の薬剤も標的細胞へ導入することができる。例えば、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする遺伝子の転写を増加させる薬剤は、ＳＤＦ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を増加させる。その上／あるいは、ＳＤＦ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡの分解を減少させる薬剤を、ＳＤＦ−１タンパク質レベルを増加させるために用いることも可能である。細胞内の遺伝子からの転写率は、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする遺伝子の上流に外因性プロモーターを導入することにより、高めることができる。異種遺伝子の発現を促進するエンハンサー因子を使用してもよい。
【００５３】
標的細胞へ薬剤を導入する好ましい方法は、遺伝子治療の利用と関わっている。
【００５４】
遺伝子治療とは、in vivoまたはin vitroにおいて細胞から治療産物を発現させるための遺伝子導入をいう。本発明に従う遺伝子治療は、in vivoまたはin vitroにおいて標的細胞からＳＤＦ−１タンパク質を発現させるために用いることができる。
【００５５】
遺伝子治療の一つの方法は、ＳＤＦ−１タンパク質をコードするヌクレオチドを含むベクターを使用する。「ベクター」（遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子導入ビヒクルと呼ぶこともある）は、in vitroまたはin vivoのいずれかにおいて、標的細胞へ送達させるポリヌクレオチドを含む分子の高分子または複合体をいう。送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療において目的とするコード配列を含んでもよい。ベクターの例としては、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（‘Ａｄ’）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルスなど）、リポソーム、他の脂質を含む複合体、および標的細胞へポリヌクレオチドの送達を仲介することができる他の高分子複合体が挙げられる。
【００５６】
ベクターはまた、遺伝子送達および（または）遺伝子発現をさらに調節するか、そうでなければ標的細胞に有益な特性を与える他の成分または機能を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、細胞との結合または細胞への標的化に影響を及ぼす成分（細胞型もしくは組織特異的結合を仲介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分、取り込み後の細胞内において当該ポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（例えば、核局在化を仲介する薬剤等）、および当該ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分等が挙げられる。このような成分としてはまた、当該ベクターにより送達される核酸を取り込み、かつそれを発現している細胞を検出または選択するために用いることができる検出可能なマーカー、および／または選択可能なマーカー等のマーカーを挙げることもできるだろう。このような成分は、当該ベクターの本来の特徴（例えば、結合と取り込みを仲介する成分または機能を有する特定のウイルスベクターの使用等）として提供することもできるし、あるいは、ベクターを、このような機能をもつよう改変することができる。
【００５７】
選択可能マーカーはポジディブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択可能マーカーは、このマーカーを含む細胞を選択するものであり、ネガティブ選択可能マーカーは、このマーカーを含む細胞が選択的に除去されるようにするものである。二機能性（すなわちポジティブ／ネガティブ）のマーカーを含め、種々のこのようなマーカー遺伝子についての記載がある（例えば、１９９２年５月２９日公開のLupton,S.国際公開第９２／０８７９６号パンフレット、および１９９４年１２月８日公開のLupton,S.国際公開第９４／２８１４３号パンフレット）。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の様々な状況において有利となる可能性があるコントロール手段となることができる。多種多様なこのようなベクターは、当技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【００５８】
本発明において使用されるベクターとしては、ウイルスベクター、脂質に基づいたベクター、および本発明に従うヌクレオチドを標的細胞へ送達し得る他のベクターが挙げられる。このベクターは、標的ベクター、特に心筋細胞に優先的に結合する標的ベクターであり得る。本発明で使用される好ましいウイルスベクターは、標的細胞に低毒性を示し、かつ組織特異的な方法で治療上有用な大量のＳＤＦ−１タンパク質の産出を誘導するベクターである。
【００５９】
現在、好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のものである。ヒトウイルスのベクターもヒト以外のウイルスのベクターも使用することができるが、組換えウイルスベクターはヒトにおいて複製能をもたないことが好ましい。ベクターがアデノウイルスである場合、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする遺伝子に動作可能に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含みかつヒトにおいて複製能をもたないことが好ましい。
【００６０】
（１）標的細胞において非常に効率的な遺伝子発現能を有し、かつ（２）比較的大量の異種（非ウイルス）ＤＮＡの挿入が可能であるため、アデノウイルスベクターは本発明において使用することが好ましい。組換えアデノウイルスの好ましい型式の一つは、「ガットレス（gutless）」、「高性能」アデノウイルスベクターまたは「ヘルパー依存型」であるアデノウイルスベクターである。このようなベクターは、例えば、（１）すべてまたはほぼすべてのウイルスコード配列（ウイルスタンパク質をコードする配列）の欠失（２）ウイルスＤＮＡ複製のために必要な配列であるウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）（３）２８〜３２ｋｂ以下の「外因性」配列または「異種」配列（例えば、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする配列）、および（４）ウイルスゲノムを感染性キャプシド中にパッケージングするために必要とされるウイルスＤＮＡパッケージング配列、といった特徴がある。とりわけ心筋細胞の場合、このような組換えアデノウイルスベクターの好ましい変異体は、ＳＤＦ−１遺伝子に作動可能に連結された組織特異的（例えば、心筋細胞）なエンハンサーおよびプロモーターを含むものである。
【００６１】
標的細胞への高い形質導入効率を示し、かつ部位特異的な方法で標的ゲノムに組み込むことができるため、ＡＡＶ随伴ウイルスベクターは有利である。組換えＡＡＶベクターの使用については、Tal, J., J. Biomed. Sci. 7:279-291, 2000 and Monahan and Samulski, Gene Therapy 7:24-30, 2000で論じられている。好ましいＡＡＶベクターは、ＳＤＦ−１核酸に作動可能に連結された組織（例えば、心筋層）特異的なプロモーターまたは細胞（例えば、心筋細胞）特異的なプロモーターを含む少なくとも一つのカセットに隣接する一対のＡＡＶ逆方向末端反復配列を含むものである。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターのＤＮＡ配列、そのプロモーター、およびＳＤＦ−１遺伝子を標的ゲノムへ組み込んでもよい。
【００６２】
本発明に従って使用し得る他のウイルスベクターとしては、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）を用いたベクターが挙げられる。１つ以上の前初期遺伝子（ＩＥ）を欠損したＨＳＶベクターは、概して非細胞毒性であり、標的細胞中で潜伏のような状態を持続し、かつ効率的な標的細胞への形質導入を可能にするため、有利である。組換えＨＳＶベクターは、約３０ｋｂの異種核酸を組み込むことができる。好ましいＨＳＶベクターとしては、（１）ＨＳＶ  １型を改変したもの、（２）そのＩＥ遺伝子を欠損しているもの、（３）ＳＤＦ−１核酸に作動可能に連結された組織（例えば、心筋層）特異的プロモーターを含むものである。ＨＳＶアンプリコンベクターもまた、本発明の様々な方法において有益となり得る。典型的に、ＨＳＶアンプリコンベクターは、長さ約１５ｋｂで、ウイルスの複製開始点およびパッケージング配列を有する。
【００６３】
例えば、Ｃ型レトロウイルスやレンチウイルスなどのレトロウイルスもまた、本発明において使用され得る。例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来のレトロウイルスベクターでもよい。例えば、Hu and Pathak, Pharmacol. Rev. 52:493-511, 2000 and Fong et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:1-60, 2000を参照されたい。ＭＬＶ由来のベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに８ｋｂ以内の異種ＤＮＡ（治療用ＤＮＡ）を含んでいてもよい。この異種ＤＮＡは、組織特異的なプロモーターおよびＳＤＦ−１核酸を含んでいてもよい。梗塞した心筋層へ送達するための方法においては、心筋特異的な受容体に対するリガンドをコードさせてもよい。
【００６４】
その他の使用可能と思われるレトロウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクターを含む、複製欠損型レンチウイルス由来のベクターである。例えば、Vigna and Naldini, J. Gene Med. 5:308-316, 2000 and Miyoshi et al., J. Virol. 72:8150-8157, 1998を参照されたい。レンチウイルスベクターは、活動的な分裂細胞と非分裂細胞のいずれにも感染させることができるという点で有利である。レンチウイルスベクターはまた、ヒト上皮細胞への形質導入においても効率が高い。
【００６５】
本発明において使用されるレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルス由来であっても非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルス由来であってよい。好ましいレンチウイルスベクターは、ベクター増殖に必要な核酸配列のほか、ＳＤＦ−１遺伝子に作動可能に連結される組織特異的なプロモーター（例えば心筋層）を含む。この核酸配列としては、当該ウイルスのＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位、およびキャプシッド形成部位が挙げられる。
【００６６】
レンチウイルスベクターは、任意の好適なレンチウイルスのキャプシドへパッケーングされ得る。１つの粒子タンパク質が異なるウイルス由来の別のタンパク質で置換されたものを、「シュードタイプ」という。ベクターのキャプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む他のウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質を含んでもよい。ＶＳＶ  Ｇタンパク質を用いると、高いベクターの力価が得られ、ベクターウイルス粒子の安定性を高めることができる。
【００６７】
アルファウイルスを用いたベクター（例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウィルス（ＳＩＮ）から作製したもの）もまた、本発明において使用され得る。アルファウイルスの使用については、Lundstrom, K., Intervirology 43:247-257, 2000 and Perri et al., Journal of Virology 74:9802-9807, 2000に記載されている。アルファウイルスベクターは、典型的には、レプリコンとして知られているフォーマットで構築されている。レプリコンは、（１）ＲＮＡ複製に必要なアルファウイルスの遺伝因子、および（２）例えば、ＳＤＦ−１核酸の1つをコードする異種核酸を含み得る。アルファウイルスのレプリコン内では、異種核酸は、組織（例えば、心筋層）特異的プロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結され得る。
【００６８】
組換え複製欠損型アルファウイルスベクターは、ハイレベルの異種（治療用）遺伝子発現能を有し、標的細胞に広範囲に感染させることができるため、有利である。アルファウイルスのレプリコンは、そのウイルス粒子表面に、同族の結合パートナーを発現している標的細胞への選択的に結合し得ると考えられる機能的な異種リガンドドメインまたは結合ドメインをディスプレイすることにより、特定の細胞型（例えば、心筋細胞）を標的としてもよい。アルファウイルスのレプリコンに潜伏状態を確立させ、その結果、標的細胞に異種核酸を長期発現させるように確立させてもよい。このレプリコンはまた、標的細胞において異種核酸を一時的に発現させてもよい。アルファウイルスベクターまたはレプリコンは、細胞変性効果を示さないものが好ましい。
【００６９】
本発明の方法に適合するウイルスベクターの多くにおいて、１種以上の異種遺伝子が当該ベクターによって発現することを可能にするため、１つ以上のプロモーターをこのベクターに組み込むことができる。さらに、このベクターは、標的細胞からのＳＤＦ−１遺伝子産物の分泌を容易にするシグナルペプチド等の部分をコードする配列を含むことができる。
【００７０】
２つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるため、標的組織（例えば、心筋層）にＳＤＦ−１核酸を送達させるのに、ハイブリッドウイルスベクターを用いもよい。ハイブリッドベクターを構築する標準的な方法は、当業者に周知である。このような技術は、例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.や、その他の多くの組換えＤＮＡ技術について論じている実験マニュアルにおいて見出すことができる。細胞に形質導入するため、ＡＡＶのＩＴＲとアデノウイルスのＩＴＲとの組み合わせを含むアデノウイルスのキャプシド中の二本鎖ＡＡＶゲノムを用いてもよい。別のバリエーションでは、ＡＡＶベクターを「ガットレス」アデノウイルスベクター、「ヘルパー依存型」アデノウイルスベクター、または「高性能」アデノウイルスベクターに導入してもよい。アデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターについては、Lieber et a1., J. Virol. 73:9314-9324, 1999で、レトロウイルス／アデノウイルスハイブリッドベクターについては、Zheng et al., Nature Biotechnol. 18:176-186, 2000で論じられている。アデノウイルスに含まれるレトロウイルスのゲノムを、標的細胞ゲノム内に組み込み、安定したＳＤＦ−１遺伝子発現をもたらしてもよい。
【００７１】
ＳＤＦ−１遺伝子の発現およびベクターのクローニングを容易にする他の塩基配列要素については、さらに考慮される。例えば、プロモーター上流のエンハンサーの存在や、コード領域下流のターミネーターの存在は、発現を容易にすることができる。
【００７２】
本発明の別の態様によれば、左室ミオシン軽鎖−２（ＭＬＣ２ｖ）またはミオシン重鎖（ＭＨＣ）の組織特異的な転写制御配列などの組織特異的なプロモーターは、ＳＤＦ−１遺伝子と融合することができる。アデノウイルスの構築内にこのような組織特異的なプロモーターを融合することにより、導入遺伝子の発現は心室の心筋細胞に限定される。組織特異的プロモーターによりもたらされる遺伝子発現の効果および特異性の程度は、本発明の組換えアデノウイルス系を用いて判定することができる。心臓特異的（すなわち、心筋組織特異的）な発現は当業者に周知である（J. Biol. Chem., 267:15875-15885, 1992）。例えば、トロポニンＣプロモーターなどの他のプロモーターも使用することができる。
【００７３】
in vivoでＳＤＦ−１遺伝子を送達する場合、心筋細胞のみを標的とする（すなわち、心臓内において内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞で同時に発現は起こらない）組織特異的なプロモーターを使用することにより、治療のためにＳＤＦ−１タンパク質の発現を十分に提供する。心筋細胞に発現を限定することは、ＣＨＦ治療に対して遺伝子導入を行うのに有用である。さらに、心筋細胞は、迅速にターンオーバしないため、恐らく最長の導入遺伝子発現を提供すると思われる。したがって、心筋細胞の発現は、内皮細胞のように細胞分裂および細胞死により減少することはないと考えられる。この目的のために、内皮特異的なプロモーターが既に入手可能である（Lee, et a1., J. Biol. Chem., 265:10446-10450, 1990）。
【００７４】
ウイルスベクターを用いる方法に加え、非ウイルスによる方法もまた、標的細胞にＳＤＦ−１遺伝子を導入するために使用してもよい。非ウイルスを用いる遺伝子送達方法については、  Nishikawa and Huang, Human Gene Ther. 12:861-870, 2001で概説されている。本発明に従う好ましい非ウイルス遺伝子の送達方法は、ＳＤＦ−１核酸を細胞に導入するために、プラスミドＤＮＡを使用する。プラスミドを用いる遺伝子送達方法は、一般に当技術分野で公知である。
【００７５】
プラスミドＤＮＡ（例えば、心筋特異的なプロモーターに作動可能に連結されるＳＤＦ−１コード配列を有するプラスミド）で多分子集合体を形成するため、合成遺伝子を導入するための分子を設計することができる。このような集合体は、標的細胞（例えば、心筋細胞）に結合するよう設計され得る。
【００７６】
標的細胞（例えば、心筋細胞）への受容体依存性ＳＤＦ−１の核酸導入を行うために、リポポリアミンおよびカチオン性脂質を含むカチオン性両親媒性物質を用いてもよい。さらに、細胞にトランスフェクトする複合体を形成するために、予め形成したカチオン性リポソームまたはカチオン性脂質をプラスミドＤＮＡと混合してもよい。カチオン性脂質製剤が関わる方法については、Felgner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:126-139, 1995 and Lasic and Templeton, Adv. Drug Delivery Rev. 20:221-266, 1996に概説されている。遺伝子送達のために、ＤＮＡを両親媒性のカチオン性ペプチド（Fominaya et al., J. Gene Med. 2:455-464, 2000）とも結合させてよい。
【００７７】
ウイルスに基づく成分と非ウイルスに基づく成分の両方を含む方法を用いる方法が、本発明に従って使用され得る。例えば、治療用遺伝子送達のための、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を用いたプラスミドについて、Cui et al., Gene Therapy 8:1508-1513, 2001.に記載されている。さらに、アデノウイルスに結合したＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン性付加物に関する方法は、Curiel, D. T., Nat. Immun. 13:141-164, 1994.に記載されている。
【００７８】
ＳＤＦ−１の発現をコードするベクターは、必要に応じ、例えば、生理食塩水などの薬学的に受容可能なキャリアを含む注射剤の形態で標的細胞へ送達することができる。他の製薬キャリア、製剤および投与量もまた、本発明に従って適用することができる。
【００７９】
標的細胞に梗塞した心筋層の細胞が含まれる場合、このベクターは、効果的な治療を可能にさせる程度に発現させた十分量のＳＤＦ−１タンパク質を、蛍光透視による誘導下において、ツベルクリン注射器を用いて直接管静脈内に投与することによって送達することができる。梗塞した心筋組織にベクターを直接注入することによって、ＳＤＦ−１遺伝子をかなり効率よく標的とし、組換えベクターの損失を最小限に抑えることができる。
【００８０】
このような注入法によって、罹患した心筋層において所望の数の細胞（特に、心筋細胞）に局所的にトランスフェクトすることができ、その結果、遺伝子導入による治療効果が最大になり、ウイルスタンパク質に対して炎症反応が起こる可能性は最小になる。例えば、心筋細胞に限定された発現を確実に可能にするために、心筋細胞特異的なプロモーターを用いてもよい。したがって、この方法で導入遺伝子を送達した結果、例えば、左室の細胞で標的遺伝子の発現が起こり得る。当技術分野で周知の他の技術もまた、梗塞した心筋層の標的細胞にベクターを導入するために使用することができる。
【００８１】
標的細胞が、梗塞した心筋層に後に移植される培養細胞である場合、ベクターは、培地の中へ直接注入することにより送達することができる。細胞にトランスフェクトしたＳＤＦ−１核酸は、心筋層特異的なプロモーターおよびエンハンサーを含む任意の好適な調節配列に作動可能に結合してもよい。
【００８２】
次いで、ツベルクリン注射器を使用して、周知の移植技術（例えば、冠状動脈内に直接注入するなど）によって、梗塞した心筋層にトランスフェクトした標的細胞を移植することができる。最初にin vitroで標的細胞にトランスフェクトし、次いで、このトランスフェクトした標的細胞を梗塞した心筋層に移植することによって、梗塞した心筋層における炎症反応の可能性は、梗塞した心筋層にベクターを直接投与する場合と比較して最小になる。
【００８３】
本発明のＳＤＦ−１核酸は、一時的な発現および安定した長期発現を含め、任意の好適な期間にわたって標的細胞内で発現させてよい。好ましい実施形態では、ＳＤＦ−１核酸を、好適な決まった期間にわたって、治療量で発現させてよい。
【００８４】
治療量とは、治療された動物またはヒトにおいて医学的に望ましい結果を生むことができる量である。医学の分野では周知のように、任意の１匹の動物または１人のヒトに対する投与量は、被験体の身長体重、体表面積、年齢、投与する特定の組成、性別、投与期間および投与経路、全身的な健康状態、ならびに併用薬等の多くの因子によって決まる。タンパク質、核酸、または小さい分子の特定の投与量は、以下に記載する実験方法により、当業者が容易に決定することができる。
【００８５】
ＳＤＦ−１タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトしない細胞を梗塞した心筋層に移植する場合と同様、ＳＤＦ−１の発現は、一時的であってもよい。あるいは、梗塞した心筋層にＳＤＦ−１タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする場合、または、ＳＤＦ−１タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする細胞を梗塞した心筋層に移植する場合と同じように、ＳＤＦ−１タンパク質の発現は長期的であってもよい。
【００８６】
長期的なＳＤＦ−１発現は、有利である。なぜなら、長期的にＳＤＦ−１を発現させると、細胞移植の手術または手技から一定の時間が経過した後でも、例えば、Ｇ−ＣＳＦまたは他の何らかの因子等の動員剤によって、幹細胞の濃度を高めることができるからである。動員剤としてＧ−ＣＳＦを用いる場合、好中球数が有意に増加し、そのため手術期の付近においてマイナスの効果を引き起こす可能性があるが、何日も何週も後までは、そのようなことはない。さらに、ＳＤＦ−１タンパク質発現が長期的または慢性的にアップレギュレートされれば、いろいろな方法で幹細胞の動員を試みることができるだろう。そのうえ、ＳＤＦ−１タンパク質の発現が慢性的にアップレギュレートされれば、幹細胞を動員する必要なく、末梢血から梗塞した心筋組織中への幹細胞の長期的なホーミング（homing）を引き起こす。
【００８７】
＝＝幹細胞の動員＝＝
本発明の別の態様によれば、被験体の末梢血中の幹細胞の濃度は、薬剤を投与して被験体の末梢血へ幹細胞の動員を誘導することにより高めることができる。様々な薬剤を用いて、被験体の末梢血に幹細胞を動員し、被験体の末梢血中の幹細胞濃度を高めることができる。例えば、哺乳動物の被験体の末梢血中の幹細胞数を増加させるため、多能性幹細胞を骨髄から動員させる薬剤を被験体に投与することができる。このような薬剤の多くが知られており、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＧＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ−３リガンド等のサイトカイン、ＩＬ−８、Ｍｉｐ−１αおよびＧｒｏβ等のケモカイン、およびシロフォスファマイド（Ｃｙ）およびパクリタキセルといった化学療法剤が挙げられる。これらの薬剤は、幹細胞動員を達成するための時間枠、動員される幹細胞のタイプ、および効能の点で異なる。
【００８８】
被験体へ動員剤を直接注射することによって、この動員剤は、投与することができる。この動員剤の投与は、ＳＤＦ−１の発現が梗塞した心筋層においてアップレギュレートされた後に行うことが好ましいが、ＳＤＦ−１の発現がアップレギュレートされる前に行うこともできる。
【００８９】
好ましい動員剤は、例えば、Ｇ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子である。マウス被験体におけるＧ−ＣＳＦの典型的な投与量は、約１２５μｇ／ｋｇ／日を約５日〜約１０日間である。このＧ−ＣＳＦ薬剤の投与は、ＳＤＦ発現がアップレギュレートされた後に行う。
【００９０】
別の方法として、当技術分野で周知のように、末梢血中の幹細胞の濃度は、特別の幹細胞（すなわち、ＭＡＰＣ）を末梢血中に注入することにより高めることができる。
【００９１】
＝＝ＶＥＧＦ＝＝
本発明の別の態様によれば、梗塞した心筋層に発現しているＶＥＧＦは、新しい側副血管の増殖を誘導する血管内皮増殖因子ファミリーの１つである。ＶＥＧＦは、血管透過性活性を有し、実質的に内皮細胞のみを標的とする特異的な血管新生促進成長因子である。
【００９２】
梗塞した心筋層において発現しているＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子の発現産物であり得る。本発明に従って使用することができる好ましいＶＥＧＦとしては、ＶＥＧＦ−１（ＶＥＧＦ−Ａとしても知られている）、および他の構造上相同なＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−２（ＶＥＧＦ−Ｃ）、ＶＥＧＦ−３（ＶＥＧＦ−Ｂ）、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＶＥＧＦ−Ｅ）、ならびに胎盤増殖因子が挙げられる。ＶＥＧＦ−１の公知のアイソフォーム群は、１２１個、１３８個、１６２個、１６５個、１８２個、１８９個および２０６個のアミノ酸を含み、それぞれ、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１６２、ＶＥＧＦ−１８２、ＶＥＧＦ−１８９、およびＶＥＧＦ−２０６として同定されている。これらのアイソフォームは、マイトジェン活性およびヘパリン結合活性が異なっている。本発明に従って使用するＶＥＧＦ−１の好ましいアイソフォームは、ＶＥＧＦ−１６５である。リストアップしなかった他のＶＥＧＦ−１アイソフォームやＶＥＧＦ同族体も、本発明に従って使用することができる。
【００９３】
本発明のＶＥＧＦは、前述のＶＥＧＦの一つと同一のアミノ酸配列を有することができる。本発明のＶＥＧＦはまた、例えば、ＶＥＧＦの断片、類似体、および誘導体等、前述のＶＥＧＦのうちの１つの変異体であってもよい。そのような変異体としては、例えば、天然ＶＥＧＦ遺伝子（すなわち、天然哺乳動物ＶＥＧＦをコードする天然核酸）の天然対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチド、天然ＶＥＧＦ遺伝子の選択的スプライシング型によりコードされるポリペプチド、天然ＶＥＧＦ遺伝子の同族体によってコードされるポリペプチド、および、ＶＥＧＦ遺伝子の非天然変異体によりコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００９４】
ＶＥＧＦ変異体は、１個以上のアミノ酸において天然ＶＥＧＦとは異なるペプチド配列を有する。そのような変異体のペプチド配列は、天然ＶＥＧＦの１個以上のアミノ酸の欠失、付加、または置換を特徴としてもつことができる。アミノ酸挿入は、約１〜４個の連続するアミノ酸であることが好ましい。また、欠失は約１〜１０個の連続するアミノ酸であることが好ましい。本発明のＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦの機能活性を実質的に維持している。好ましいＶＥＧＦタンパク質変異体は、サイレント（silent）または保存的な変化を特徴としてもつ核酸分子を本発明の範囲で発現させることにより作製され得る。
【００９５】
１つ以上の特定のモチーフおよび／またはドメイン、または任意のサイズに対応するＶＥＧＦ断片は、本発明の範囲内である。ＶＥＧＦの単離されたペプチジル部位は、このようなペプチドをコードする核酸に対応する断片から、組換え技術によって産生したそのペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さらに、断片は、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ化学またはメリフィールド固相ｔ−Ｂｏｃ化学などの当技術分野で公知の技術を使用して化学合成することができる。
【００９６】
ＶＥＧＦの変異体はまた、ＶＥＧＦの組換え型を含むことができる。ＶＥＧＦタンパク質に加え、本発明における好ましい組換えポリペプチドは、哺乳動物のＶＥＧＦをコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を持つことができる核酸によってコードされる。
【００９７】
ＶＥＧＦ変異体はまた、天然ＶＥＧＦの機能活性を構成的に発現するタンパク質のアゴニスト型を含んでもよい。他のＶＥＧＦ変異体としては、例えば、プロテアーゼの標的配列を変化させる突然変異に起因するタンパク質分解性開裂（proteolytic cleavage）に耐性をもつ変異体を含み得る。ペプチドのアミノ酸配列が変化した結果、ＶＥＧＦの１つ以上の機能活性を有する変異体が生じるかということは、ＶＥＧＦの機能活性について変異体を試験することにより容易に明らかにすることができる。
【００９８】
＝＝ＶＥＧＦの核酸＝＝
本発明の別の態様は、ＶＥＧＦをコードする核酸分子、および哺乳動物ＶＥＧＦをコードする非天然核酸に関する。このような核酸分子は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡ）であり得る。このＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。また、一本鎖の場合、コード（センス）鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。
【００９９】
本発明の範囲内における他の核酸分子は、例えば、天然ＶＥＧＦの断片、類似体、および誘導体をコードする、天然ＶＥＧＦ遺伝子の変異体である。このような変異体としては、例えば、天然ＶＥＧＦ遺伝子の天然対立遺伝子変異体、天然ＶＥＧＦ遺伝子の同族体、または、天然ＶＥＧＦ遺伝子の非天然変異体が挙げられる。これらの変異体は、１個以上の塩基において、天然ＶＥＧＦ遺伝子とは異なる塩基配列を有する。例えば、このような変異体の塩基配列は、天然ＶＥＧＦの１個以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換を特徴とし得る。核酸挿入は、約１〜１０個の連続するヌクレオチドであることが、好ましい。また、欠失は約１〜３０個の連続するヌクレオチドであることが好ましい。
【０１００】
他の用途においては、構造において実質的に変化しない変異ＶＥＧＦは、コード化したポリペプチドにおいて保存的とは言えない変化を引き起こすヌクレオチド置換を作製することによって生成され得るこのようなヌクレオチド置換の例としては、（ａ）ポリペプチド主鎖構造（ｂ）ポリペプチドの電荷もしくは疎水性または（ｃ）アミノ酸側鎖の大部分を変化させる置換が挙げられる。タンパク質の特性を最も大きく変化させると一般に予想されるヌクレオチド置換は、コドンの非保守的変化を引き起こす置換である。タンパク質の構造を大きく変化させる可能性があるコドンの変化の例としては、以下のような置換を引き起こす変化が挙げられる。（ａ）例えば、セリンまたはトレオニン等の親水性の残基が、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニン等の疎水性の残基に（あるいは疎水性の残基で）置換される（ｂ）システインまたはプロリンが、他の残基に（あるいは他の任意の残基で）置換される（ｃ）例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン等の塩基性側鎖を有する残基が、例えば、グルタミンまたはアスパルチン等の電気陰性の側鎖に（あるいは電気陰性の側鎖で）置換される、あるいは、（ｄ）例えば、フェルアラニン等の、かさ高い側鎖を有する残基が、例えば、グリシン等の側鎖を有しない残基に（あるいは側鎖を有しない残基で）置換される。
【０１０１】
本発明の範囲のＶＥＧＦ遺伝子の天然対立遺伝子変異体は、哺乳動物組織から単離され、それは、天然ＶＥＧＦ遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有し、天然ＶＥＧＦタンパク質と類似した構造を有するポリペプチドをコードする核酸である。本発明の範囲の天然ＶＥＧＦ遺伝子の同族体は、他の種から単離され、それは、天然遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有し、天然ＶＥＧＦと類似した構造を有するポリペプチドをコードする核酸である。天然ＶＥＧＦ遺伝子と高い％の配列同一性を有する他の核酸分子を同定するために、公的および／または私的の核酸データベースで探索することができる。
【０１０２】
非天然ＶＥＧＦ遺伝子変異体とは、自然界には存在せず（例えば、人工的に作製される）、天然ＶＥＧＦ遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有さず、天然ＶＥＧＦと類似した構造を有するポリペプチドをコードしない核酸である。非天然ＶＥＧＦ遺伝子変異体の例としては、天然ＶＥＧＦの断片をコードする変異体、ストリンジェントな条件下で、天然ＶＥＧＦ遺伝子または天然ＶＥＧＦ遺伝子の相補体にハイブリダイズする変異体、天然ＶＥＧＦ遺伝子または天然ＶＥＧＦ遺伝子の相補体と少なくとも６５％の配列同一性を有する変異体、およびＶＥＧＦをコードする変異体が挙げられる。
【０１０３】
本発明の範囲内のＶＥＧＦの断片をコードする核酸は、天然ＶＥＧＦタンパク質のアミノ酸残基をコードする核酸である。天然ＶＥＧＦの断片をコードする核酸をコードするかまたはこれとハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドは、プローブ、プライマー、またはアンチセンス分子として使用することができる。天然ＶＥＧＦの断片をコードする核酸をコードするかまたはこれとハイブリダイズする長いポリヌクレオチドも、本発明の様々な態様において使用することができる。天然ＶＥＧＦの断片をコードする核酸は、酵素消化によって（例えば、制限酵素を使用して）、または全長天然ＶＥＧＦ遺伝子もしくはその変異体の化学分解によって作製することができる。
【０１０４】
前述の核酸のうちの１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も、本発明において使用することができる。例えば、このような核酸は、本発明の範囲内で、低ストリンジェンシー条件、中ストリンジェンシー条件、または高ストリンジェンシー条件下で、前述の核酸のうちの１つにハイブリダイズする核酸であり得る。
【０１０５】
ＶＥＧＦ融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明において使用してよい。このような核酸は、適切な標的細胞へ導入する場合、ＶＥＧＦ融合タンパク質を発現する構成物（例えば、発現ベクター）を調製することにより作製することができる。例えば、このような構成物は、その発現が好適な発現系で融合タンパク質を産生するように、インフレームで融合したＶＥＧＦをコードする第１のポリヌクレオチドと、別のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを結合することにより作製することができる。
【０１０６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合体もしくはそれらの誘導体もしくはそれらの改変体であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなど向上させるために、例えば塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変することができる。本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドは、さらに、例えば、ペプチド（例えばin vivoで細胞受容体を標的とするための）、または細胞膜を横断する輸送を促進する薬剤等の他の追加の群を含む。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤等の別の分子に結合させてもよい。
【０１０７】
＝＝ＶＥＧＦの発現＝＝
本発明の別の態様によれば、梗塞した心筋層におけるＶＥＧＦの発現は、ＶＥＧＦの発現を増加させる薬剤を標的細胞中へ導入することにより増加させることができる。
【０１０８】
この標的細胞は、例えば、自己由来の骨格筋芽細胞または線維芽細胞などの梗塞した心筋層内の細胞または生体外細胞を含むことができるが、これらの細胞は、その薬剤を導入した後、梗塞した心筋組織に移植されるものである。この標的細胞が梗塞した心筋層へ移植される細胞である場合、その標的細胞は、ＳＤＦ−１タンパク質のアップレギュレーションを促進するのに使用した細胞と同じ細胞であってもよいし、またはＳＤＦ−１タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトした細胞と同じ細胞であってもよい。
【０１０９】
このような薬剤は、細胞に導入することができ、かつ細胞内で複製能を有する、組換え核酸構成物（典型的には、ＤＮＡ構成物）に組み込まれる天然ＶＥＧＦ核酸または合成ＶＥＧＦ核酸を含んでよい。このような構成物は、特定の標的細胞におけるポリペプチドをコードする配列を転写しかつ翻訳する能力を有する複製系および配列を含むことが好ましい。
【０１１０】
また他の薬剤は、標的組織のＶＥＧＦレベルを増加させるために標的細胞へ導入させることもできる。例えば、ＶＥＧＦをコードする遺伝子の転写を増加させる薬剤は、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡの翻訳を増加させる。その上／あるいは、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡの分解を減少させる薬剤を、ＶＥＧＦレベルを増加させるために用いることも可能である。細胞内の遺伝子からの転写率は、ＶＥＧＦをコードする遺伝子の上流に外因性プロモーターを導入することにより、高めることができる。異種遺伝子の発現を促進するエンハンサーエレメントも使用してよい。
【０１１１】
標的細胞へ薬剤を導入する好ましい方法は、遺伝子治療の利用と関わっている。
【０１１２】
本発明に従う遺伝子治療は、in vivoまたはin vitroで標的細胞からＶＥＧＦを発現させるために用いることができる。
【０１１３】
好ましい遺伝子治療の方法は、ＶＥＧＦをコードするヌクレオチドを含むベクターの利用と関わっている。使用することができるベクターの例としては、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（‘Ａｄ’））、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルス）、リポソーム、他の脂質を含む複合体、および標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を仲介することができる他の高分子複合体が挙げられる。
【０１１４】
ベクターはまた、遺伝子送達および（または）遺伝子発現をさらに調節するか、そうでなければ標的細胞に有益な特性を与える他の成分または機能を含むことができる。そのような他の成分としては、例えば、細胞との結合または細胞への標的化に影響を及ぼす成分（細胞タイプもしくは組織特異的結合を仲介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分、取り込み後の当該ポリヌクレオチドの細胞内局在化に影響を及ぼす成分（例えば、核局在化を仲介する薬剤等）、および当該ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分等が挙げられる。そのような成分としてはまた、当該ベクターにより送達される核酸を取り込み、かつそれを発現している細胞を、検出または選択するために用いることができる検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカー等のマーカーを挙げることもできる。そのような成分は、当該ベクター（例えば、結合と取り込みを仲介する成分、または機能を有する特定のウイルスベクターの使用等の）の本来の特徴として提供することもできるし、あるいは、そのような機能をもつようにベクターを改変することができる。
【０１１５】
選択可能マーカーは、ポジディブ、ネガティブ、または、二機能性であり得る。ポジティブな選択可能マーカーは、このマーカーを含む細胞を選択させるようにするもので、ネガティブな選択可能マーカーは、このマーカーを含む細胞が選択的に除去されるようにするものである。二機能性の（すなわち、ポジティブ／ネガティブ）マーカーを含め、様々なそのようなマーカー遺伝子についての記載がある。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の様々な状況において有利となる可能性があるコントロール手段となることができる。多種多様なそのようなベクターは、当技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【０１１６】
本発明においてＶＥＧＦを発現させるのに使用するベクターは、ウイルスベクター、脂質を用いるベクター、および本発明に従うヌクレオチドを標的細胞へ送達する他のベクターが挙げられる。このベクターは、特に心室筋細胞に優先的に結合する標的ベクターであり得る。本発明で使用される好ましいウイルスベクターは、標的細胞に低毒性を示し、かつ組織特異的な方法で治療上有用な大量のＶＥＧＦの産出を誘導するベクターである。
【０１１７】
現在、好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のものである。ヒトウイルスのベクターとヒト以外のウイルスのベクターの両方を使用することができるが、組換えウイルスベクターは、ヒトにおいて複製能をもたないことが好ましい。ベクターがアデノウイルスである場合、血管新生タンパク質もしくはペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを有するポリヌクレオチドを含み、かつヒトにおいて複製能をもたないことが好ましい。当該分野で周知であり、かつ上述されているウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む他のベクターもまた使用することができる。
【０１１８】
本発明における方法に適合するウイルスベクターの多くにおいて、１つ以上の異種遺伝子が当該ベクターによって発現することを可能にするため、１つ以上のプロモーターをそのベクターに組み込むことができる。さらに、このベクターは、標的細胞からのＶＥＧＦ産物の分泌を容易にするシグナルペプチド等の部分をコードする配列を含むことができる。
【０１１９】
２つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるため、ハイブリッドウイルスベクターを用いて標的組織（例えば、心筋層）にＶＥＧＦ核酸を送達するのに使用してもよい。ＶＥＧＦ遺伝子の発現とベクターのクローニングを容易にする他の塩基配列要素についてさらに考慮する。例えば、プロモーター上流にエンハンサーが、あるいはコード領域下流にターミネーターが存在すると、発現しやすくなる。本発明のベクターは、ＶＥＧＦの心筋層特異的な発現を促進する因子が存在するので、遺伝子治療に役立つと思われる。
【０１２０】
本発明では、さらに細胞を標的化するために、組織特異的なプロモーターの使用についても考慮する。左室ミオシン軽鎖−２（ＭＬＣ２ｖ）またはミオシン重鎖（ＭＨＣ）の組織特異的な転写制御配列を、例えば、アデノウイルスの構成物内のＶＥＧＦ−１６５遺伝子等の導入遺伝子と融合させることによって、導入遺伝子の発現は心室の心筋細胞に限定される。
【０１２１】
ＭＬＣ２ｖプロモーターまたはＭＨＣプロモーターを用いて導入遺伝子をin vivoで送達することによって、心筋細胞だけが（すなわち、心臓内で内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞が同時に発現することなく）、例えば、ＶＥＧＦ−１６５などの血管新生タンパク質を、血管新生を促進するのに十分なレベルで発現させることができると確信している。発現を心筋細胞に限定することはまた、うっ血性心不全の治療のため遺伝子導入を行う有用性に関してもメリットがある。発現を心臓に制限することによって、心臓以外の組織の血管新生に悪影響が生じる可能性が回避される。さらに、心筋細胞は、迅速にターンオーバしないため、心臓の細胞のうちでは、導入遺伝子発現が最も長く持続すると思われる。したがって、心筋細胞の発現は、内皮細胞のように細胞分裂および細胞死により減少することはないと考えられる。内皮特異的なプロモーターが、この目的のために既に入手可能である。
【０１２２】
薬剤により調節可能なプロモーター系（例えば、テトラサイクリン）を用いることにより、改変細胞または遺伝子ベクターの移植に必要な外科的処置または経皮的処置から一定の時間が経過した後に、幹細胞を動員させるか、または、幹細胞を動員させないで、ＳＤＦ−１の発現を開始させることができる。その結果、循環している幹細胞の数を増加させる前に、心筋組織または心筋以外の組織を回復させることができると考えられる。
【０１２３】
ウイルスベクターを用いる方法に加え、非ウイルスによる方法もまた、標的細胞へＶＥＧＦ遺伝子を導入するために使用され得る。本発明に従う好ましい非ウイルス遺伝子の送達方法は、ＶＥＧＦの核酸を細胞に導入するためにプラスミドＤＮＡを使用する。プラスミドを用いる遺伝子送達方法は、一般に当技術分野で公知である。
【０１２４】
本発明によれば、ウイルス成分と非ウイルス成分の両方を用いる方法が、使用され得る。例えば、治療用遺伝子を送達するために、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を用いたプラスミドは、Cui et al., Gene Therapy 8:1508-1513, 2001.に記載されている。さらに、アデノウイルスに結合したＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン性付加物に関する方法は、Curiel, D. T., Nat. Immun. 13:141-164, 1994に記載されている。
【０１２５】
ＶＥＧＦの発現をコードするベクターは、例えば、必要に応じて、生理食塩水などの薬学的に受容可能なキャリアを含む注射剤の形態で標的細胞へ送達することができる。その他の製薬キャリア、製剤および投与量においても、適用することができる。
【０１２６】
標的細胞に梗塞した心筋層の細胞が含まれる場合、ベクターは、効果的な治療を可能にさせる程度に発現させた十分量のＶＥＧＦを、蛍光透視による誘導下において、ツベルクリン注射器を用いて直接冠状動脈内（または、グラフト血管内）に投与することによって送達することができる。梗塞した心筋層組織にベクターを直接注入することによって、ＶＥＧＦ遺伝子をより効率よく標的とすることができ、組換えベクターの損失を最小限に抑えることができる。
【０１２７】
このような注入法によって、罹患した心筋層において所望の数の細胞（特に、心筋細胞）に局所的にトランスフェクトすることができ、その結果、遺伝子導入による治療効果が最大になり、ウイルスタンパク質に対して炎症反応が起こる可能性は最小になる。例えば、心筋細胞に限定された発現を確実に可能にするために、心室における心筋細胞特異的なプロモーターを用いてもよい。したがって、この方法で導入遺伝子を送達した結果、例えば、左室の細胞で標的遺伝子の発現が起こり得る。当技術分野で周知の他の技術もまた、梗塞した心筋層の標的細胞にベクターを導入するために使用することができる。
【０１２８】
標的細胞が、梗塞した心筋層に後に移植する培養細胞である場合、ベクターは、培地の中へ直接注入することにより送達することができる。細胞にトランスフェクトしたＶＥＧＦ核酸は、心筋特異的なプロモーターおよびエンハンサーを含む任意の好適な調節配列に作動可能に結合してもよい。
【０１２９】
次いで、ツベルクリン注射器を使用して、周知の移植技術（例えば、冠状動脈内に直接注入する）によって、梗塞した心筋層にトランスフェクトした標的細胞を等の移植することができる。最初にin vitroで標的細胞にトランスフェクトし、次いで、このトランスフェクトした標的細胞を梗塞した心筋層に移植することによって、梗塞した心筋層における炎症反応を起こす可能性は、梗塞した心筋層にベクターを直接投与する場合と比較して最小になる。
【０１３０】
本発明のＶＥＧＦは、一時的な発現および安定した長期発現を含め、任意の好適な期間にわたって発現させてよい。好ましい実施形態では、ＳＤＦ−１核酸を、好適な決まった期間にわたって、治療範囲内の量で発現させる。
【実施例】
【０１３１】
以下、具体的な実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は説明を目的としたものであり、決して本発明の範囲や内容を制限するものではない。
【０１３２】
＝＝ＭＩ８週間後の幹細胞動員の影響＝＝
Ｇ−ＣＳＦによる幹細胞の動員により、虚血性心筋症ラット系統の心筋が再生するかどうかを確認するため、組換えヒトＧ−ＣＳＦ（125μg/kg/日で5日間、腹腔内注射）または生理食塩水のいずれかを投与するために、ＭＩ８週間後のラットを無作為化した。骨髄の刺激を確認するため、Ｇ−ＣＳＦ処置開始５日後に血液を採取したところ、生理食塩水（11.8+4.0個/μl）処置群と比較して、Ｇ−ＣＳＦ（37.3+5.3個/μl）処置群の白血球数は、３倍に増加していることが明らかになった。心筋層における任意の増殖細胞を２０で標識するために、Ｇ−ＣＳＦ投与最終日より１４日間にわたり５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を投与した。
【０１３３】
図１（ａおよびｂ）は、それぞれ、生理食塩水またはＧ−ＣＳＦ投与４週間後（ＬＡＤ結紮１２週週間後）の梗塞領域の内のＢｒｄＵ陽性細胞数（ａ）と左室内径短縮率（ｂ）を示したものである。細胞数は1mm2あたりの数である。データは平均値±標準偏差を表す。１グループあたりn＝６〜８であった。
【０１３４】
梗塞領域内で血管新生が起こらなかったり、心筋ミオシン陽性細胞が存在しなかったりすることから明らかにされたように（データは示さず）、ＬＡＤ結紮後の２カ月間Ｇ−ＣＳＦ投与しても、梗塞領域内においてＢｒｄＵ陽性細胞数の増加も有意な心筋の再生も認められなかった（図１ａ）。ＬＡＤ結紮１２週間後、これらの動物は左室内径短縮率を伴う有意な心筋症が認められたのに対し、コントロール群では、l0％未満（正常＞60％）であった。ＬＡＤ結紮８週間後に、Ｇ−ＣＳＦに対する反応するにおいて、心筋の再生を認める有意な組織学的な証拠は得られなかったことを裏付けるように、収縮期機能の有意な回復は、Ｇ−ＣＳＦ投与群においても認められなかった（図１ｂ）。
【０１３５】
＝＝幹細胞の動員前に行うＳＫＢＭ移植が虚血性心筋症に与える影響＝＝
心筋梗塞発症時からある時間が経過した心筋層を、幹細胞の動員に反応させると、心筋再生を最大にすることができるという仮説を試験するために、ＬＡＤ結紮８週間後に骨格筋芽細胞移植を行った。動物の梗塞した境界領域に、１回の注射あたり200,000個のＳＫＭＢを５回投与した。当初の仮説は、移植されたＳＫＭＢが、幹細胞のホーミングに関与する遺伝子産物を発現させるための１つの戦略として用いられるということであったので、その移植されたＳＫＭＢにルシフェラーゼをコードするアデノウイルスをトランスフェクトした。
【０１３６】
図２（図２ａおよび図２ｂ）は、細胞移植４週間後（ＺＡＤ結紮１２週間後）に、梗塞領域内のＢｒｄＵ＋細胞数に対する骨格筋芽細胞（ＳＫＭＢ）移植の効果を示す。データは平均値±標準偏差を表す。１グループあたりn=6〜8であった。
【０１３７】
Ｇ−ＣＳＦが存在しない場合は、梗塞を起こした心臓へＳＫＭＢを導入しても、梗塞領域へＢｒｄＵ陽性細胞の取り込みは有意に増加しなかった。しかし、ＳＫＭＢ移植とＧ−ＣＳＦとを組み合わせることにより、梗塞領域内のＢｒｄＵ陽性細胞は、４週間後、有意に増加した（図２ａ）。さらに、Ｇ−ＣＳＦまたはＳＫＭＢ移植のいずれかの単独治療群と比較して、併用群の動物は、コントロール群（生理食塩水）より左室内径短縮率が有意に増加した（図２ｂ）。
【０１３８】
梗塞領域中のＢｒｄＵ陽性細胞が骨髄由来のものであったか、あるいは梗塞領域中のＢｒｄＵ陽性細胞が分裂した心筋由来の内因性細胞であったかを判定するために、ＬＡＤ結紮８週間後、ＳＫＭＢ移植およびＧ−ＣＳＦ投与開始の６日前から、５日間にわたりＢｒｄＵを投与した。
【０１３９】
図３ａは、Ｂｒｄｕ染色した骨髄（ＢＭ）により、多数の動物から培養されたＢＭ細胞がほぼ１００％染色されることを明らかにしたことを示す。図３ｂは、Ｂｒｄｕを５日間投与後、処置していない心筋層では、有意なＢｒｄＵ＋細胞数が見られなかったことを示す。データは、動物個体識別については盲検化された２人の観察者によって定量化された陽性細胞の平均値±標準偏差を表わす。１グループあたりn＝６〜８であった。スケールバーは、25μMを表わす。これにより骨髄細胞が標識され、任意の有意な心筋層のＢｒｄＵ標識（陽性細胞数17.5±2.9/mm2）は認められなかった。  
図３ｃは、本発明に従う治療法により評価した梗塞領域内のＢｒｄｕ＋細胞の増加を示したものである。
【０１４０】
これらの実験では、ＳＫＭＢおよびＧ−ＣＳＦを投与された動物のみが、梗塞領域内のＢｒｄｕ陽性細胞数が有意に増加させた。これらのデータは、ＢｒｄＵ陽性細胞が骨髄由来のものであり、併用療法後に梗塞領域にホーミングしたという考えに一致する。これらのデータはまた、ＳＫＭＢ移植が幹細胞の心筋へのホーミングに必要なシグナルを再確立したことを支持するものである。
【０１４１】
＝＝梗塞した組織への幹細胞のホーミングに関与すシグナル分子＝＝
循環する細胞は、ＳＫＭＢ移植により組織が「刺激」されることで、ＭＩ８週間後に梗塞した組織に生着するという所見は、幹細胞がホーミングする際の潜在的なメディエーターに関する評価をさらに進めるものとなった。ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、造血器官への輸送および骨髄における幹細胞のホーミングを仲介すると知られている。したがって、ＭＩにおける幹細胞の生着のために、また、ＳＫＭＢ移植への反応において潜在的なシグナル分子としてのＳＤＦ−１の役割を評価した。
【０１４２】
図４は、心筋梗塞後の経過時間とストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）の発現を明らかにするＲＴ−ＰＣＲを示す写真である。ＳＤＦ−１の発現は、基準値（治療前）には発現していないが、ＭＩ１時間後およびＭＩ２４時間後に増加した。ＭＩ７日後と２４時間後との間には、ＳＤＦ−1の発現がない状態に戻り、ＭＩ３０日後もＳＤＦ−1の発現はないままであった。ＭＩ３０日後（３０＋）に行なったＳＫＭＢ移植から７２時間後には、ＳＤＦ−1は再び発現した。
【０１４３】
このように、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＳＤＦ−１発現は、ＬＡＤ結紮１時間および２４時間後には観察されたが、０日、７日後、３０日後には観察されなかった。ＳＤＦ−１発現は、ＳＫＭＢによって誘導され、そして、移植７２時間後に観察されたが、偽手術群の動物においては観察されなかった（データは示さず）。同じ試料中でＧＡＰＤＨについて解析したＰＣＲによって、ｃＤＮＡが全試料において無傷であることが実証された（データは示さず）。ＳＫＭＢ移植に対する反応において、ＳＤＦ−１発現の増加を、リアルタイムＰＣＲによって確認した（データは示さず）。リアルタイムＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨレベルがグループ間で同じでることが明らかにされた。
【０１４４】
ＳＤＦ−１が梗塞領域中へのＢｒｄＵ陽性細胞の生着を仲介したかどうかを評価するため、ＬＡＤ結紮４週間後、コントロールである心線維芽細胞またはＳＤＦ−１発現ベクターをトランスフェクトし安定に形質導入した細胞を、心筋に移植した。１０日後、内因性のＳＤＦ−１発現をダウンレギュレーションさせるために、ＢｒｄＵをＧ−ＣＳＦ投与最終日から５日間を投与したのと同じようにＧ−ＣＳＦを５日間投与した。
【０１４５】
図５（図５ａおよび図５ｂ）は、心線維芽細胞移植４週間後の、梗塞領域内における（ａ）ＢｒｄＵ＋細胞数および（ｂ）ＣＤ１１７＋細胞数を示す。いずれも、ＳＤＦ１発現ベクターと共に、あるいはＳＤＦ１発現ベクターなしで安定にトランスフェクトし、形質導入した心線維芽細胞の移植後５日間にわたりＧ−ＣＳＦを投与した場合、またはＧ−ＣＳＦを投与しない場合の比較である。データは、動物の個体識別については盲検化された２人の観察者によって定量化された陽性細胞の平均値±標準偏差を表わす。1グループあたりn=３〜５であった。  
図５ｃは、ＳＤＦ−１／Ｇ−ＣＳＦ処置を行った動物に対して、ＣＤ１１７＋で染色した写真である。スケールバーは２5μMを表わす。
【０１４６】
Ｇ−ＣＳＦへの反応において、損傷した心筋層に対して、幹細胞のホーミングを誘導させるのに十分なＳＤＦ−１において、ＳＤＦ−１を発現する心線維芽細胞を移植した心臓は、梗塞領域全体にわたり、ＢｒｄＵ陽性細胞数の３倍以上の増加を示した。コントロールである心線維芽細胞を移植された動物は、コントロールと全く同じＢｒｄＵシグナルを生成した。
【０１４７】
＝＝ＢｒｄＵ陽性細胞の同定＝＝
本発明者らは、梗塞領域内のＢｒｄＵ細胞のアイデンティティを明らかにするため、免疫蛍光法を行なった。ＣＤ４５についての抗体染色により、細胞移植およびＧ−ＣＳＦ投与に反応したＢｒｄＵ陽性細胞の、それぞれ５％未満が白血球であることを実証した。ＳＫＭＢ移植または心線維芽細胞移植を行った場合も行わなかった場合も、Ｇ−ＣＳＦで処置した動物の梗塞領域では、心筋ミオシン−ＢｒｄＵ陽性細胞は認められなかった。
【０１４８】
＝＝ＭＩ後の新血管新生および左室（ＬＶ）機能に対するＶＥＧＦを発現するＳＫＭＢおよびＧ−ＣＳＦの効果＝＝
ＳＫＭＢ移植とＧ−ＣＳＦによる骨髄刺激との併用療法を行った動物は、ＢｒｄＵ陽性細胞数が増加したが、血管密度の増加も梗塞領域内の心筋細胞数の増加も観察されなかった。したがって、本発明者らは、ＳＫＭＢ移植およびＧ−ＣＳＦ投与に対するＶＥＧＦの過剰発現の付加的な効果を調べた。
【０１４９】
図６（図６ａおよび図６ｂ）は、Ｇ−ＣＳＦを用いた幹細胞動員後に（ａ）ＳＫＭＢ細胞の移植、または（ｂ）ＶＥＧＦ発現しているＳＫＭＢ細胞の移植をし、ＬＡＤ結紮から１２週間後に、梗塞領域の免疫組織化学（ＢｒｄＵ＋細胞（中抜き矢印）および心筋ミオシン発現細胞（白い矢印）の両方を表す）を行った結果を示す。  
図６ｃは、処置していないコントロールと比較し、左室機能の改善が示されたものである。データは平均値±標準偏差を表わす。1グループあたりn=６〜８であった。スケールバーは10μMを表わす。
【０１５０】
ＭＩ８週間後に、ＶＥＧＦ−１６５を発現しているＳＫＭＢを移植したところ、生理食塩水投与コントロールと比較して、梗塞領域内に血管密度の増加が認められた（ＶＥＧＦ−１６５  対  生理食塩水：44.1±5.2血管数／mm2  対  17.7±2.8血管数／mm2）。さらに、ＶＥＧＦ−１６５発現とＧ−ＣＳＦを用いた幹細胞動員とを組み合わせた結果、心筋ミオシンを発現する細胞を有する梗塞領域が再増殖し、心筋の再生が裏付けられた（図６ａ）。ＳＫＭＢにＶＥＧＦ−１６５の発現を加えたことで、左室内径短縮率の測定が示すように、左室機能も著しく増強された（図６ｂ）。ＶＥＧＦ−１６５を発現しているＳＫＭＢの移植という治療戦略の左室内径短縮率と、Ｇ−ＣＳＦの投与と併用したＳＫＭＢの移植という治療戦略との左室内径短縮率に、有意差は観察されなかった（データは示さず）。
【０１５１】
＝＝方法＝＝
＝＝＝ＬＡＤ結紮＝＝＝
すべての動物プロトコールが、動物研究委員会によって承認された。また、すべての動物は、クリーブランドクリニック財団の国際実験動物管理公認協会実験動物施設で飼育した。動物をペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)で麻酔し、挿管し、圧力サイクル式げっ歯動物用ベンチレーター（ケント・サイエンティフィック社、ＲＳＰ１００２）を使用して、room airにて80回／分で人工呼吸した。外科用手術顕微鏡（ライカＭ５００）｛｝を補助的に用いて、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）結紮により、雄Ｌｅｗｉｓラット（体重150~175g）の前壁ＭＩを誘導した。
【０１５２】
＝＝＝２Ｄ心エコー検査＝＝＝
Ｓｅｑｕｏｉａ  Ｃ２５６（アキュソン社）と接続した１５ＭＨｚリニアアレイトランスデューサを用い、ＬＡＤ結紮8週間と5〜7日間後、およびＳＫＭＢ移植４週間後に、２Ｄ心エコー検査を行った。ラットは、エコー画像を１枚撮るごとにケタミン（50mg/kg）にて鎮静させた。左室径および左室壁厚を定量化するため、本発明者らは、乳頭筋直下左室中心部からの２Ｄクリップ画像およびＭモード画像を短軸断面でデジタル記録し、異なるラットの同じ解剖学的位置からの計測値が一致するようにした。計測は２名の無関係な盲検化された観察者がＰｒｏＳｏｌｖｅを用いてオフラインにて行った。処置群について盲検化にされた観察者が、記録された５枚のＭモードクリップ画像のうち無作為に３枚を選び、動物各個体において、測定をそれぞれ６回ずつ行った。ＬＶの尺度として、左室内径短縮率をＭモード記録から算出した。左室内径短縮率（％）＝（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ×１００。ここで、ＬＶＥＤＤは左室拡張末期径を、ＬＶＥＳＤは左室収縮末期径を表す。左室径の測定は、乳頭筋直下の短軸断面から、前壁と後壁との間で行った。さらに、前壁厚を拡張末期で測定した。
【０１５３】
＝＝＝細胞の調製と輸送＝＝＝
骨格筋芽細胞を、数匹のＬｅｗｉｓラット（ハーラン研究所）の後肢から採取し、175mlの培養フラスコ（ファルコン社）にプレーティングし、10％のウシ胎児血清、300mg/lのＥＣＧＳおよび抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシン、およびオフロキサシンを含むＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞は、75％コンフルエントに一旦達したら、分化を回避するため継代した。細胞移植の前日、精製した筋芽細胞に、ＣＭＶプロモーターの制御下で、複製不全アデノウイルスベクターを発現しているＶＥＧＦ−１６５（108pfu/ml）またはルシフェラーゼ（コントロール）をトランスフェクトした。移植当日、トリプシン処理により筋芽細胞を収集し、ＰＢＳで十分に洗浄してあらゆる遊離ウイルス粒子を除去し、移植の直前に再構成させた。次いで、動物を麻酔し、人工呼吸し、梗塞領域をダイレクトに視覚化するため側方開胸を行った。動物１匹あたり約1×106(6)個の細胞を5箇所に注入した。
【０１５４】
成体ラット数匹の心臓から心線維芽細胞を採取し、ＳＫＭＢと同様の方法でプレーティングした。心筋梗塞２４時間後に回収した全ＲＮＡからのＳＤＦ−１を、発現ベクターＰＣＤＮＡ３．１にクローニングした。  
Forward-(NOT-1)-AATAAGAAATGCGGCCGCATGGACGCCAAGGTCGTCGCTGTGCTGGCC;
Reverse-(Xba-1)-TCTAGACTTGTTTAAGGCTTTGTCCAGGTACTCTTGGA
ＳＤＦ−１  ＰＣＤＮＡ３．１発現ベクターをトランスフェクトし安定に形質導入した心線維芽細胞をネオマイシンで選択した。
【０１５５】
＝＝＝幹細胞の動員＝＝＝
骨格筋芽細胞移植当日より５日間、組換えヒトＧ−ＣＳＦ（125μg/kg）を腹腔内注射により投与した。移植当日（0日）、５日、１４日、および２１日後に全血球数および分化データ（バイエル社、ＡＤＶＩＡ）を得た。細胞増殖の累積範囲を測定するため、50mg/kgのＢｒｄＵを、５日目から１４日間腹腔内注射してＧ−ＣＳＦによって誘導され増殖しているあらゆる幹細胞をＢｒｄＵ標識できるようにした。
【０１５６】
＝＝＝組織学解析＝＝＝
ＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ（アムレスコ社、ソロン、オハイオ州）を用いて潅流固定後の細胞移植から４週間後に、ラットを安楽死させ解析のため心臓を採取し、左室長軸方向に垂直に３等分に切断した。心室中央部および心尖部をパラフィン包埋し、厚さ6μmの切片を数枚免疫組織化学に利用した。モノクローナル抗体は、心筋ミオシン（ケミコン社）、ＣＤ４５（ケミコン社）、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ（ケミコン社）、ＣＤ１１７（サンタクルーズバイオテクノロジー社）およびＢｒｄＵ（ベクター研究所）に対するものを用いた。二次抗体は、ＦＩＴＣまたはビオチン標識したものを用いた。定量化については、梗塞領域内の５つの切片を陽性細胞と血管密度について解析した。本発明者らのプロトコールにおけるＢｒｄＵ抗原提示のためのＨＣｌ処理は、３つの異なるＣＤ１１７抗体が認識した核エピトープを発現させたため、ＣＤ１１７とＢｒｄＵによる二重標識を行うことはできなかった。
【０１５７】
＝＝＝ＰＣＲ解析＝＝＝
ＬＡＤ結紮後およびＳＫＭＢ移植後の時間において、ラット心臓から単離された全ＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。全ＲＮＡを、グアニジン・イソチオシアネート・塩化セシウム法（guanidine isothiocyanate-cesium chloride method）によって組織から抽出した。ラットＳＤＦ−１特異的プライマー（Forward:TTGCCAGCACAAAGACACTCC;Reverse:CTCCAAAGCAAACCGAA TACAG、予想される産物  243bp、40サイクル）およびＧＡＰＤＨ特異的プライマー（Forward:CCCCTGGCCAAGGTCATCCA;Reverse:CGGAAGGCCATGCCAGTGAG、予想される産物238bp、20サイクル）を用いた。次いで、ＰＣＲ産物ＳＤＦ−１（Forward:ATGCCCCTGCCGATTCTTTG Reverse:TGTTGTTGCTTTTCAGCCTTGC、予期される産物116bp）へのＳＹＢＲグリーンの取込みを使用して、梗塞して心臓および移植した心臓内の発現の増加を確認するため、リアルタイムＰＣＲ（パーキン・エルマー、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００）を行った。また、ＧＡＰＤＨについても上記と同様に行った。
【０１５８】
＝＝＝アデノウイルス構成物＝＝＝
ＶＥＧＦ−１６５をコードするアデノウイルス構成物は、Ｇｅｎ  Ｖｅｃ社（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）のご厚意により分与されたものである。簡潔に述べると、２９３細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し（ＡＴＣＣ受託番号第１５７３号）、ｌ０％ウシ血清を添加したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ｅ１アデノウイルスベクターＡｄＶＥＧＦ−１６５、Ｅ３アデノウイルスベクターＡｄＶＥＧＦ−１６５を、逆方向左末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するユニークな制限部位でシャトルベクタープラスミドを線形化することにより精製し、ＣｌａＩで切断したＨ５ｄ１３２４  ＤＮＡを２９３細胞へコトランスフェクトした。２回連続してプラークを精製した後、ベクターのストックを２９３細胞で増殖させ、塩化セシウム密度勾配遠心にかけて３回連続してバンド形成を行うことにより精製した。精製したウイルスを、バッファー（10 mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  7.8、150 mM  ＮａＣｌ、10 mM  ＭｇＣｌ２、3％ショ糖）に対して透析し、使用まで−８０℃で保存した。導入遺伝子はサイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下で発現させる。
【０１５９】
＝＝＝統計解析＝＝＝
データは、平均値±標準偏差として示す。グループ間はスチューデントのｔ検定によって比較した。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１（ａおよびｂ）は、それぞれ、生理食塩水またはＧ−ＣＳＦ投与４週間後（ＬＡＤ結紮１２週週間後）の梗塞領域領域内のＢｒｄＵ陽性細胞数（ａ）、および、左室内径短縮率（ｂ）を示すグラフである。
【図２】図２（ａおよびｂ）は、細胞移植４週間後（ＬＡＤ結紮１２週間後）における梗塞領域領域内のＢｒｄＵ＋細胞数カウントに対する骨格筋芽細胞（ＳＫＭＢ）移植の効果を示すグラフである。
【図３】図３（ａおよびｂ）は、ＢｒｄＵ投与５日後の（ａ）ＢｒｄＵ染色した骨髄、および、（ｂ）処置していない心筋を示す写真である。図３ｃは、本発明に従う治療法により評価した梗塞領域内のＢｒｄＵ＋細胞の増加を示すグラフである。
【図４】図４は、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）の発現と心筋梗塞後の時間との相関を明らかにするＲＴ−ＰＣＲを示す写真である。
【図５】図５（ａおよびｂ）は、心線維芽細胞移植４週間後の、梗塞領域内における（ａ）ＢｒｄＵ＋細胞数、および、（ｂ）ＣＤ１１７＋細胞数を示す。いずれも、ＳＤＦ１発現ベクターを加えるか、または、ＳＤＦ１発現ベクターを加えずにトランスフェクトし、安定に形質導入した心線維芽細胞の移植後５日間にわたりＧ−ＣＳＦを投与した場合、またはＧ−ＣＳＦをしない場合の比較である。図５ｃは、ＳＤＦ−１／Ｇ−ＣＳＦ処置をした動物におけるＣＤ１１７＋染色を示す写真である。
【図６】図６（ａおよびｂ）は、Ｇ−ＣＳＦを用いた幹細胞動員後の（ａ）ＳＫＭＢ細胞、または、（ｂ）ＶＥＧＦを発現しているＳＫＭＢ細胞の移植を伴うＬＡＤ結紮から１２週間後に、ＢｒｄＵ＋細胞と心筋ミオシンを発現している細胞がいずれも梗塞領域の免疫組織化学により明らかになったことを示す写真である。図６ｃは、ＶＥＧＦ過剰発現なしの細胞治療と比較した左室機能の改善を示すグラフである。
【図１】
2006507244.tif 000003
【図２】
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【図３】
2006507244.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2006507244000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月22日(2005.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＦ−１タンパク質の第１の濃度を含む梗塞した心筋組織を治療する医薬品であって、
前記医薬品が、前記梗塞した心筋組織におけるＳＤＦ−１タンパク質の前記濃度を、前記第１の濃度から第２の濃度に高めるのに適当であること、
を特徴とする医薬品。
【請求項２】
哺乳動物のＳＤＦ−１タンパク質を発現させるために遺伝学的に改変した哺乳動物の骨格筋筋芽細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
前記梗塞した心筋組織および前記梗塞した心筋組織の末梢血が、幹細胞の第１の濃度を含む、前記梗塞した心筋組織を治療する医薬品であって、
前記医薬品が、前記梗塞した組織の前記末梢血における幹細胞の前記濃度を、前記第１の濃度から第２の濃度に高めるのに適当であること、
を特徴とする、請求項１または２に記載の医薬品。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の医薬品の製造における薬剤の使用方法。
【国際調査報告】
2006507244.tif 000009
2006507244.tif 000010