(57)【要約】蛍光色素の蛍光を増強し、かつ／または蛍光色素におけるストークスシフトの増加を生み出す方法であって、色素を塩基および／または界面活性剤と混合することを含む方法を記載する。この方法は、蛍光色素を使用した化学的または生化学的技法、特に電気泳動などの有機分子の染色または標識を必要とする技法に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素の蛍光を増強する方法であって、色素を塩基および／または界面活性剤と混合するか、接触させることを含む方法。
【請求項２】
蛍光色素の発光波長を上げる方法であって、色素を塩基および／または界面活性剤と混合するか、接触させることを含む方法。
【請求項３】
蛍光色素／有機分子複合体の安定性を改善する方法であって、蛍光色素／有機分子複合体を酸と接触させることを含む方法。
【請求項４】
複合体は、塩基および／または界面活性剤をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
複合体は、マトリックス内に含まれるか、表面上にある請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
色素は、異性体を含む式（Ｉａ）で表される化合物であり、前記請求項のいずれか一項に記載の方法：
【化１】
2006522173.tif 000007
［式中、Ｘは、ＯまたはＮＲ４であり、Ｒ１は、ヒドロキシまたはオキソ基から独立して選択される１〜６個の基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０共役アルケニル基であり、Ｒ２は、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル基であり、Ｒ４は、Ｈ、Ｎ、Ｏ、１個または複数のヒドロキシル、ハライド、アミン、カルボキシル、カルボキシル関連またはヘテロアリール基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル、アルケニル、アルキニルおよび／またはアリール基である。］。
【請求項７】
Ｒ２は、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル基である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ３は、ヒドロキシル基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル基である請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
色素は、異性体を含む式（Ｉｂ）で表される化合物であり、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【化２】
2006522173.tif 000008
【請求項１０】
蛍光色素は、本明細書で定義されたアザフィロン（ａｚａｐｈｉｌｏｎｅ）蛍光色素である前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
異性体は、互変異性体である請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
蛍光色素は、エピコッコノン（ｅｐｉｃｏｃｃｏｎｏｎｅ）またはエピコッコノン（ｅｐｉｃｏｃｃｏｎｏｎｅ）含有色素混合物または抽出物である前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
塩基は、窒素含有塩基である前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
塩基は、アンモニア、アミン、金属水酸化物、金属炭酸塩、金属炭酸水素塩またはそれらの組合せからなる群から選択される請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
塩基は、アンモニア、一級アミン、二級アミン、三級アミン、四級アミンまたはそれらの組合せから選択される請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
塩基は、アンモニア、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミンおよびそれらの異性体ならびにアリルアミン、アニリン、ベンジルアミン、２−フェニルエチルアミン、４−フェニルブチルアミン、ヒドラジンおよび１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１２−ジアミノドデカンおよびそれらの異性体ならびにジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクチルアミン、ジデシルアミン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン、Ｎ−プロピルアニリン、Ｎ−ブチルアニリンおよびそれらの異性体ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、トリペンチルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、トリドデシルアミンおよびそれらの異性体ならびに酢酸テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、炭酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、ギ酸テトラメチルアンモニウム、硫酸水素テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウム、硝酸テトラメチルアンモニウム、硫酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、シアン化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、ヨウ化テトラエチルアンモニウム、硝酸テトラエチルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、ピロリジン、ピペリジン、ピリジン、イミダゾール、インドール、プリン、キノリン、ピリミジン、ピラゾール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Ｔｒｉｓ」）またはアミノドデシルアミンなどのＣ１〜２０アルキルアミン、Ｃ１〜２０アルキルジアミン、Ｃ１〜２０アミンおよびジアミンまたはそれらの組合せから選択される請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
塩基は、蛍光強度、シグナル対バックグラウンド比および／または蛍光色素の感度検出限界を向上させる前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
蛍光色素を用いる化学的または生化学的技法の一部である前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学的または生化学的技法は、電気泳動、フローサイトメトリー、ｐＨセンシング、タンパク質−タンパク質相互作用の分析、蛍光ブラッドフォード分析、タンパク質定量、抗体標識、リガンド標識、タンパク質アレイまたはタンパク質チップの分析、遺伝子アレイまたは遺伝子チップの分析、ＤＮＡまたはＲＮＡの分析または検出、蛍光顕微鏡または生物学的センサーから選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドを染色および／または標識する方法の一部である前記請求項のいずれか一項に記載の方法であって、タンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドと蛍光色素との間で蛍光複合体を形成することを含み、蛍光複合体は、塩基の存在下で形成され、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基で処理される方法。
【請求項２１】
タンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドは、組織または細胞に含まれている請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
マトリックス上でタンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドを可動化および検出する方法の一部である前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ポリアクリルアミドゲルマトリックス上の電気泳動である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アガロースゲルマトリックス上の電気泳動である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドは、界面活性剤で前処理され、有機分子／界面活性剤複合体を形成する請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
界面活性剤は、陰イオン、陽イオンまたは双性イオン界面活性剤から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＣＨＡＰＳ、ＣＴＡＢ、ＤＴＡＢ、ＴＤＴＡＢ、ＣＰＣ、コール酸およびオクチル−Ｄ−グルコシドからなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ゲルマトリックス、界面活性剤および／またはタンパク質、ペプチド、核酸もしくはヌクレオチドは、電気泳動に先立って塩基で処理される請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
塩基は、脂肪族アミンである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ゲルマトリックスおよび／またはタンパク質、ペプチド、核酸もしくはヌクレオチドは、電気泳動後に塩基で処理される請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
蛍光複合体を酸で処理するステップをさらに含む請求項２０から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
酸処理は、蛍光複合体を安定化し、蛍光強度をさらに高め、かつ／または蛍光複合体のシグナル対バックグラウンド比をさらに高める請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
酸は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組合せから選択される請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
鉱酸は、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、オルトリン酸から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
有機酸は、アルカン酸、ハロゲノアルカン酸、アスコルビン酸またはトリフルオロメタンスルホン酸から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
アルカン酸は、酢酸またはプロピオン酸から選択され、ハロゲノアルカン酸は、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸またはトリフルオロ酢酸から選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光色素の蛍光を検出するステップをさらに含む前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出は、透視法、分光法、顕微鏡またはサイトメトリーによる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質を可動化および検出する方法であって、
（ａ）タンパク質の溶液をマトリックスに塗布するステップ、
（ｂ）タンパク質をマトリックス上で可動化するステップ、
（ｃ）請求項６から１２のいずれか一項で定義された可動化タンパク質と蛍光色素との間で蛍光複合体を形成するステップ、及び、
（ｄ）そのようにして形成された蛍光複合体を検出するステップ、
を含み、蛍光複合体は、塩基の存在下で形成され、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基で処理される方法。
【請求項４０】
塩基による処理の前または後に蛍光複合体を界面活性剤と接触させることをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
界面活性剤は、陰イオン界面活性剤である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
マトリックスがポリアクリルアミドゲルマトリックスであり、ＰＡＧＥ電気泳動またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動である請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
核酸を可動化および検出する方法であって、
（ｅ）核酸の溶液をマトリックスに塗布するステップ、
（ｆ）核酸をマトリックス上で可動化するステップ、
（ｇ）請求項６から１２のいずれか一項で定義された可動化核酸と蛍光色素との間で蛍光複合体を形成するステップ、及び、
（ｈ）そのようにして形成された蛍光複合体を検出するステップ
を含み、蛍光複合体は、塩基の存在下で形成され、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基で処理される方法。
【請求項４４】
塩基による処理の前または後に蛍光複合体を界面活性剤と接触させることをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
界面活性剤は、陽イオン界面活性剤である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
マトリックスは、アガロースゲルマトリックスである請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項６から１２のいずれか一項に記載の蛍光色素を請求項１３から１６のいずれか一項に記載の塩基と混合することによって得られる蛍光化合物。
【請求項４８】
請求項６から１２のいずれか一項に記載の蛍光色素と塩基との組合せ。
【請求項４９】
請求項２０または２１に記載のタンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドをさらに含む請求項４８に記載の組合せ。
【請求項５０】
タンパク質、ペプチド、核酸またはヌクレオチドは、界面活性剤との複合体の形態である請求項４９に記載の組合せ。
【請求項５１】
蛍光色素（Ｉａ）を塩基と混合し、異性体を含む式（ＩＩａ）の化合物を得る請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法：
【化３】
2006522173.tif 000009
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、（１ａ）で示した通りであり、Ｘは、Ｃ、ＮＲ４Ｒ５、ＯＲ４であり、Ｒ４、Ｒ５は、Ｈ、Ｎ、Ｏ、１個または複数のヒドロキシル、ハライド、アミン、カルボキシル、カルボキシル関連またはヘテロアリール基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル、アルケニル、アルキニルおよび／またはアリール基である。］。
【請求項５２】
蛍光色素（Ｉｂ）を塩基と混合し、異性体を含む式（ＩＩｂ）の別の蛍光色素を得る請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法：
【化４】
2006522173.tif 000010
［式中、Ｘは、Ｃ、ＮＲ４Ｒ５またはＯＲ４である。］。
【請求項５３】
蛍光色素（Ｉｂ）をｎ−ブチルアミンと混合した場合に、得られる色素は、異性体を含む式（ＩＩｃ）で表される化合物であり、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【化５】
2006522173.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、蛍光色素で染色または標識されているタンパク質および核酸などの有機分子において、蛍光を増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書を通じて、従来技術に関するいかなる考察も、そのような従来技術が、この分野において広く知られているか、共通の一般知識の一部を形成することの是認とは決して見なすべきではない。
【０００３】
蛍光を発する化合物は、多くの用途を有し、発生率および観測波長が異なるため、蛍光が吸収に比べて本質的により感度の良い生物学的応用に特に適していることが知られている。蛍光は、全細胞、細胞成分、および細胞機能の検出に用いることができる。例えば、多くの診断および分析技法は、サンプルを検出できるようにそれらを蛍光タグ付けする必要がある。このことは、細胞、組織、タンパク質、抗体、酵素、薬物、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、または天然もしくは合成ポリマーなどの多種多様な材料と相互作用する蛍光色素またはプローブを用い、蛍光コンジュゲートを作成することによって達成される。
【０００４】
合成蛍光プローブについては、観察すべき生化学反応に対する特異性を付与するためにリガンドがよく使用され、蛍光色素は、相互作用を検出または定量する手段を提供する。このような応用例には、とりわけ、タンパク質の検出（例えば、ゲル中、表面上または水溶液）、細胞トラッキング、酵素活性の評価および核酸または他の生体高分子の染色が含まれる。
【０００５】
通常、長波長吸光度は、細胞の自己蛍光からの干渉を低減し、標識生体高分子の光損傷を引き起こす可能性が低いことから蛍光プローブの有用性を高めている。レーザーは、蛍光を励起するための集中型光源として特に有用であるが、今のところ、強力なレーザーの出力は、特定波長の光に限られている。したがって、励起スペクトルがレーザー出力と一致する化合物が特に有用である。アルゴンレーザーは、蛍光を励起するための最も一般的な光源であり、４８８ｎｍに主要な出力を、５１４ｎｍに弱い出力を有する。したがって、これらの波長のどちらかによって励起される蛍光化合物が特に有用である。ＹＡＧレーザー（５３２ｎｍまたは４７３）およびＨｅＮｅ（５４３ｎｍ、６３３ｎｍ）も普及しつつある。
【０００６】
生物学的研究の多くの分野では、赤色蛍光化合物が広範に使用されている。テキサスレッド、テトラメチルローダミンまたは赤色発光ＢＯＤＩＰＹ色素を含むこれらの多くは、５４２ｎｍなどの緑色波長における励起を必要とする。このことは、多くの応用例、特にアルゴンイオンレーザーが励起に使用される応用例におけるそれらの用途を制限している。
【０００７】
臭化エチジウムなどの化合物は、アルゴンイオンレーザーからの光で励起することができるが、核酸以外の有機分子のタグ付けには通常適していない。フィコエリトリンなどの他の化合物は、アルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ）を用いて励起することができ、オレンジ色の波長（約５８０ｎｍ）で発光する。しかしながら、フィコエリトリンは、不十分な安定性および高分子量（約２４０，０００Ｄａ）を有し、細胞トラッキング、核酸の標識またはタンパク質の染色などの多くの応用例に適さない。
【０００８】
タンパク質の染色には、多くの方法が利用可能である。これらの方法は、非蛍光化合物、または蛍光化合物を利用することができる。最も一般的に使用されている方法は、非蛍光性であるクーマシーブルー（ブラッドフォード分析）を利用している。蛍光をベースとしたタンパク質検出法は、タンパク質と複合体を形成し、非蛍光方法に比べて本質的により感度の良い蛍光色素を利用している。タンパク質の蛍光染色は、従来の銀染色またはクーマシー染色を上回る多くの利点を有する。そのような利点には、より高い感度、より低いバックグラウンド干渉およびより大きなダイナミックレンジが含まれる。
【０００９】
ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸の染色には、その費用対効果および高い感度（ｄｓＤＮＡのバンド当たり２ｎｇ）のために蛍光染色液として臭化エチジウムが最も広く使用されてきた。研究者の間でその使用が幾分限られてきたのは、発癌性であると考えられているためである。現在、核酸の定量ならびにゲル染色に他の蛍光性核酸染色液が利用可能であるが、使用にあたっては、そのような染色液も顕著な欠点を有している。
【００１０】
参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０１／８１３５１は、フロ［３，２−ｇ］［２］ベンゾピラン−２，９（９ａＨ）ジオンのコアをベースとした蛍光色素化合物について記載している。
【００１１】
蛍光色素は、電気泳動の分野で特に有用である。電気泳動は、電場による印加後のゲルマトリックス中における荷電分子の相対的移動度を利用することにより、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質などの荷電生体高分子の分離を可能にする。電場中で各分子が移動する距離は、分子の電荷、形状および重量によって異なる。
【００１２】
タンパク質を分離するために最も一般的に使用されるゲルマトリックスは、ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ電気泳動）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、電気泳動の前に陰イオン界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でタンパク質を処理する技法である。ＳＤＳは、タンパク質を変性させ、均一な負電荷でそれらをコーティングする。このことは、分離が分子量のみに基づくことを意味し、通常、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質の分子量を測定するために使用される１。
【００１３】
対照的に、核酸は、ヌクレオチド（ＭＷ約５００Ｄａｌｔｏｎｓ）ごとに単一の負電荷を有するため、ほぼ一定の質量／電荷比が存在する。核酸の場合には、界面活性剤により電荷を規格化することは不必要である。
【００１４】
当技術分野では多くの蛍光色素が知られているが、シグナル強度、シグナル対バックグラウンド比および蛍光色素の感度を改善することが依然として必要である。さらに、電気泳動のゲルマトリックス上で形成される蛍光複合体の安定性を改善することが必要である。
【００１５】
本発明の目的は、従来技術の欠点のうち少なくとも一つを克服または改善するか、有用な代替策を提供することである。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明は、蛍光色素の蛍光を増強し、ストークスシフトの増加（すなわち、励起波長と発光波長との間における通常の差のさらなる増加）をもたらし、蛍光色素／有機分子複合体の安定性を改善して溶液中またはゲルマトリックス上に蓄積されたサンプルの蛍光強度を高め、かつ／または寿命を伸ばす方法を提供する。
【００１７】
文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、本説明および特許請求の範囲を通じ、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的または網羅的意味とは対照的に包含的意味、すなわち「含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という意味であると解釈するべきである。
【００１８】
本明細書で使用する用語「蛍光を増強すること」は通常、蛍光色素からの蛍光発光を増加させることを意味する。この増加は、色素の通常の発光波長においてであっても、異なる波長においてであってもよい。このことは、蛍光強度の増加、シグナル対バックグラウンド比の増加または蛍光色素の検出感度限界の向上（すなわち、より高い感度）によって明らかにすることができるであろう。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ストークスシフト」は、蛍光色素の励起波長から発光波長におけるよく知られたシフトの現象を指す。このシフトは、より高波長に向かう（すなわち、赤色シフト）。
【００２０】
本明細書で使用する用語「アザフィロン蛍光色素」は、ポリケチド生合成経路から得られるか、得られる可能性のある任意の蛍光色素を意味する。ポリケチド生合成経路から得られる可能性のある色素の例は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０１／８１３５１に記載されている。
【００２１】
さらに、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、用語「蛍光色素」は、蛍光色素化合物、ならびに蛍光色素化合物がタンパク質または核酸などの有機分子と会合するか、コンジュゲートする場合に形成される蛍光複合体またはコンジュゲートを指す。蛍光複合体またはコンジュゲートは、非共有結合性および／または共有結合性相互作用によって有機分子について形成させることができるであろう。
【００２２】
本発明者は、塩基、特に窒素含有塩基の存在が、特定の蛍光色素、特にアザフィロン蛍光色素の通常の発光波長に緑色蛍光から赤色蛍光へのシフトを引き起こすことを発見した。このストークスシフトが有利なのは、典型的なアルゴンイオンレーザーの励起波長（４８８ｎｍ）からさらに蛍光色素の発光波長を移動するからである。長いストークスシフトの蛍光色素が重要な生化学試薬であるのは、それらの蛍光発光が、励起光源からの干渉を最小限にして検出でき、励起プロファイルと発光プロファイルの重なりが少ないために自己消光がより低い傾向にあるからである。さらに、長いストークスシフトの色素は、多くの生体サンプル中に存在する短いストークスシフトのフルオロフォアの存在に起因する自己蛍光からの干渉が少ない傾向がある。通常、長いストークスシフトを有することが知られている蛍光色素は高分子量分子であり、不十分な透過性およびタンパク質分解により蛍光標識としての応用例は厳しく限定されている。
【００２３】
より意義深いのは、本発明において、ストークスシフト、および／またはストークスシフトの増加が、シグナル強度の増加を伴うこともあり、これがより高いシグナル対バックグラウンド比（すなわち、非特異的バックグラウンド蛍光の低下）および／または蛍光色素の検出感度限界の向上につながる。したがって、塩基の存在は、知られている蛍光技法、特に有機分子を検出するための蛍光染色技法を著しく改善する。
【００２４】
さらに、本発明において、塩基の選択は、ストークスシフトの増加の大きさに影響することを見いだした。
【００２５】
蛍光色素は、式（Ｉａ）で表される化合物、またはその異性体であることが好ましい。
【００２６】
【化１】
2006522173.tif 000002
【００２７】
Ｘは、Ｏ、ＮＲ４またはＣであることが好ましい。Ｒ１は、ヒドロキシまたはオキソ基から独立して選択される１〜６個の基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０共役アルケニル基であることが好ましい。Ｒ２は、直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル基であることが好ましい。Ｒ３は、ヒドロキシル基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキル基であることが好ましい。Ｒ４は、Ｎ、Ｏ、１個または複数のヒドロキシル、ハライド、アミン、カルボキシル、カルボキシル関連またはヘテロアリール基で任意に置換されている直鎖または分枝鎖Ｃ１〜２０アルキルおよび／またはアリール基であることが好ましい。
【００２８】
色素は、異性体を含む式（Ｉｂ）で表される化合物を有することが好ましい。
【００２９】
【化２】
2006522173.tif 000003
【００３０】
式（Ｉｂ）の化合物は、５，６−ジヒドロ−３−［（１Ｚ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−１−ヒドロキシ−３−オキソ−１，４，６，８−デカテトラエニル］−６−ヒドロキシメチル−９ａ−メチル−２Ｈ−フロ［３，２ｇ］［２］ベンゾピラン−２−９（９ａＨ）−ジオンである。しかしながら、この化合物は、以下「エピコッコノン（ｅｐｉｃｏｃｃｏｎｏｎｅ）」という慣用名で呼ぶ。
【００３１】
本発明との関連において、式ＩａおよびＩｂの化合物の異性体には、他にも異性体はあるが、互変異性体および立体異性体が含まれる。
【００３２】
エピコッコノンおよびエピコッコノン含有色素混合物ならびに抽出物が好ましい。
【００３３】
本発明で使用する塩基は、アンモニア、および様々なアミンから選択されることが好ましい。したがって、好ましい塩基は、窒素含有塩基である。本明細書で使用する用語「アミン」は、１個または複数のアミノ基を含む任意の化合物を指す。したがって、この用語には、モノアミン、ジアミン、トリアミンなどが含まれる。アミンは、一級、二級、三級か、四級であってもよい。さらに、アミンの塩（例えば、ＨＣｌ塩）は、用語「アミン」の意味に含まれる。金属炭酸塩および金属炭酸水素塩、またはそれらの組合せも使用することができる。
【００３４】
塩基は、アンモニア、一級アミン、二級アミン、三級アミン、四級アミン塩、またはそれらの組合せであることが好ましい。本発明で使用する塩基は、アンモニアまたはメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミン、ウンデシルアミン、ドデシルアミンおよびそれらの異性体ならびにアリルアミン、アニリン、ベンジルアミン、２−フェニルエチルアミン、４−フェニルブチルアミン、ヒドラジンおよび１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１２−ジアミノドデカンおよびそれらの異性体ならびにジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジペンチルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクチルアミン、ジデシルアミン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン、Ｎ−プロピルアニリン、Ｎ−ブチルアニリンおよびそれらの異性体ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、トリペンチルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、トリドデシルアミンおよびそれらの異性体ならびに酢酸テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、炭酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、ギ酸テトラメチルアンモニウム、硫酸水素テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウム、硝酸テトラメチルアンモニウム、硫酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、シアン化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、ヨウ化テトラエチルアンモニウム、硝酸テトラエチルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、ピロリジン、ピペリジン、ピリジン、イミダゾール、インドール、プリン、キノリン、ピリミジン、ピラゾール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Ｔｒｉｓ」）またはアミノドデシルアミンなどのＣ１〜２０アミンおよびジアミンであることが好ましい。
【００３５】
金属炭酸塩および金属炭酸水素塩は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどのアルカリおよびアルカリ土類金属の塩であることが好ましい。金属炭酸塩は、炭酸ナトリウムであることがより好ましい。
【００３６】
本発明の方法は、蛍光色素を用いる任意の化学的または生化学的技法の一部であることが好ましい。本発明を使用することができる化学的または生化学的技法の典型例は、電気泳動、フローサイトメトリー、ｐＨセンシング、タンパク質−タンパク質相互作用の分析、蛍光タンパク質定量、タンパク質アレイまたはタンパク質チップの分析、遺伝子アレイまたは遺伝子チップの分析、核酸の分析／検出／定量、蛍光顕微鏡および蛍光抗体染色などである２〜１０，１４〜１６。関連出版物を参照により本明細書に組み込む。
【００３７】
一実施形態において、上述の方法は、有機分子を染色および／または標識する方法であって、有機分子と蛍光色素との間で蛍光複合体を形成することを含み、蛍光複合体は、塩基の存在下で形成され、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基で処理される方法の一部である。
【００３８】
別の実施形態において、上述の方法は、塩基および／または界面活性剤の存在下で有機分子と蛍光色素との間で蛍光複合体を形成し、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基および／または界面活性剤で処理されることを含む。
【００３９】
有機分子は、蛍光色素によって染色または標識することを必要とする任意の分子であってよい。しかしながら、有機分子は通常、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチドまたは核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）であり、酵素、細胞受容体、増殖因子、抗体などの別の複雑な分子に含まれていてもいなくても、あるいは組織、器官または細胞の一部であってもなくてもよい。
【００４０】
塩基は、蛍光複合体を形成する前に、有機分子を含有する溶液に添加することができる。この溶液における塩基の最終濃度は、０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０２％〜５％であることがより好ましい。％値は、使用する塩基に応じて、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ量で示す。あるいは、塩基の最終濃度は、１００μＭ〜２Ｍであることが好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭであることがより好ましい。
【００４１】
別の実施形態において、塩基は、蛍光複合体が形成された後で蛍光複合体に添加される。この実施形態で使用する塩基の濃度は、上述の濃度と同様である。
【００４２】
一態様において、本発明の方法は、ゲルマトリックス上の電気泳動分離などのマトリックス上で有機分子を可動化および検出する方法の一部として使用される。上述のように、電気泳動は通常、ポリアクリルアミドゲルマトリックス上で行われ、タンパク質の分離および／または分子量測定に使用される。通常、タンパク質溶液をゲル上にロードし、電場を印加して、負の電荷を帯びた分子を陽極に向かって移動させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において、タンパク質は、ＳＤＳなどの陰イオン界面活性剤と複合体を形成し、タンパク質全体に均一な負電荷を与える。従来のＰＡＧＥ電気泳動及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法は共に、本発明に範囲内に含まれる。
【００４３】
電気泳動後に有機分子および／またはゲルマトリックスを塩基で処理することも本発明の中に企図されている。例えば、電気泳動後のゲルを、蛍光色素で処理する前または後に塩基で洗浄してもよい。電気泳動後の洗浄を脂肪族アミン（Ｃ４〜Ｃ２０一級アミン）またはアンモニアを用いて行うことが好ましいのは、これらの塩基が、ゲル中で分離されたタンパク質を取り囲むＳＤＳミセルに分配する傾向があるためである。通常、ゲルは、適切な濃度の塩基性溶液で２×１０分の洗浄を受けるが、洗浄回数および洗浄時間は、使用する塩基、ゲルプレートのサイズ、塩基の濃度などによって異なる。
【００４４】
別の実施形態において、界面活性剤は、別々に使用するのか、塩基と併用するのかにかかわらず、蛍光複合体を形成する前に、有機分子を含有する溶液に添加してもよい。通常、この手法は、有機分子がタンパク質またはペプチドである場合に使用することができる。この溶液における界面活性剤の最終濃度は、０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１％〜１％であることがより好ましい。％値は、使用する界面活性剤に応じて、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ量で示す。あるいは、界面活性剤の最終濃度は、２０μＭ〜２００ｍＭであることが好ましく、２００μＭ〜２０ｍＭであることがより好ましい。
【００４５】
さらに別の実施形態において、界面活性剤は、蛍光複合体が形成された後で蛍光複合体（この複合体は、塩基の存在下で形成されているか、その形成後に塩基に曝露されている）に添加される。この手法は通常、有機分子が核酸である場合に使用されるが、タンパク質についても使用することができる。この実施形態で使用する界面活性剤の濃度は、上述の濃度と同様である。
【００４６】
タンパク質についての上述の方法と同様、本発明の方法は、溶液中でまたはゲルマトリックス上の電気泳動分離後に、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を可動化および検出する方法の一部として使用することができる。通常、核酸の電気泳動は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルマトリックス上で行われ、核酸の分離、精製および／または分子量測定に使用される。通常、核酸溶液をゲル上にロードし、電場を印加して、上述のタンパク質電気泳動技法と同様に陽極に向かって核酸を移動させる。
【００４７】
上述の塩基に関しては、本発明で使用する界面活性剤を、蛍光複合体の検出に先立って電気泳動の任意の段階で添加することができる。例えば、タンパク質を使用する方法の場合に、タンパク質をゲル上にロードする前に界面活性剤を溶液中のタンパク質と混合することができる（界面活性剤はＳＤＳであることが好ましいが、他の例を本明細書で提供する）。あるいは、電気泳動後に、塩基の非存在下または存在下でゲルマトリックスを界面活性剤で洗浄することができる。通常、この最後の技法は、核酸の分離および分析で使用する。
【００４８】
本発明の他の態様において、上述の方法は、酸で蛍光複合体を処理することをさらに含む。このさらなる処理ステップは、電気泳動ゲル上で形成された蛍光複合体に特に適しているが、溶液中の複合体にも使用することができる。
【００４９】
驚いたことに、酸による処理は、蛍光複合体を安定化し、蛍光強度をさらに増し、蛍光の損失を防ぐか最小限に抑え、かつ／または蛍光複合体のシグナル対バックグラウンド比をさらに増加させる。酸は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組合せから選択することができる。適当な鉱酸は、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、オルトリン酸である。適当な有機酸は、アルカン酸（例えば、Ｃ１〜２０アルカン酸）、ハロゲノアルカン酸（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩから選択される１、２、３、４、５または６個の基を有するＣ１〜２０アルカン酸）、アスコルビン酸またはトリフルオロメタンスルホン酸である。酸は、硫酸、酢酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、塩酸、オルトリン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸またはクロロ酢酸であることが好ましい。
【００５０】
通常、使用する酸の濃度は、約０．０１〜２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．０２％〜１０％（ｖ／ｖ）である。あるいは、酸の濃度は通常、使用する酸に応じて約０．１ｍＭ〜２Ｍであるが、約１０ｍＭの酸濃度が一般的に好ましい。
【００５１】
典型的な酸処理ステップでは、撮像に先立って、電気泳動ゲルを酸（例えば、１０ｍＭ硫酸）の中で約１０分間インキュベートする。
【００５２】
本発明において形成される蛍光複合体は、当技術分野において知られている任意の標準技法を用いて検出されることが好ましい。通常、蛍光複合体の蛍光は、透視法、分光法、顕微鏡、走査、写真またはサイトメトリーによって検出される。
【００５３】
また、本発明は、タンパク質を可動化および検出する方法であって、
（ａ）タンパク質の溶液をマトリックスに塗布するステップ、
（ｂ）タンパク質をマトリックス上で可動化するステップ、
（ｃ）上述のように可動化タンパク質と蛍光色素の間で蛍光複合体を形成するステップ、及び、
（ｄ）そのようにして形成された蛍光複合体を検出するステップ、
を含み、蛍光複合体は、塩基および／または界面活性剤の存在下で形成される方法を提供する。
【００５４】
タンパク質と一緒に使用するのに好ましい界面活性剤は、陰イオン界面活性剤である。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、塩基および／または界面活性剤による蛍光複合体の処理が、その形成後に行われる上記方法を企図している。
【００５６】
タンパク質およびペプチドに使用するマトリックスはポリアクリルアミドゲルマトリックスであり、方法は、ＰＡＧＥ電気泳動またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動であることが好ましい。
【００５７】
さらに、本発明は、核酸を可動化および検出する方法であって、
（ａ）核酸の溶液をマトリックスに塗布するステップ、
（ｂ）核酸をマトリックス上で可動化するステップ、
（ｃ）上述のように可動化核酸と蛍光色素の間で蛍光複合体を形成するステップ、及び、
（ｄ）そのようにして形成された蛍光複合体を検出するステップ、
を含み、蛍光複合体は、塩基および／または界面活性剤の存在下で形成される方法を提供する。
【００５８】
核酸と一緒に使用するのに好ましい界面活性剤は、陽イオン界面活性剤である。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、塩基および／または界面活性剤による蛍光複合体の処理が、その形成後に行われる上記方法を企図している。
【００６０】
核酸に使用するマトリックスは、アガロースゲルマトリックスであることが好ましい。
【００６１】
また、上記の方法は、マトリックスが最終ステップとして酸で処理されるステップを企図している。酸処理されたマトリックスは、蛍光強度の重大な損失もなく長時間保存することができる。
【００６２】
また、本発明は、上述のような蛍光色素を上述のような塩基および／または界面活性剤と混合することによって得られる蛍光化合物または複合体を提供する。
【００６３】
また、本発明は、上述のような蛍光色素、上述のような塩基および／または界面活性剤を含む組成物を提供する。組成物には、タンパク質および／または核酸などの有機分子がさらに含まれていてもよい。
【００６４】
また、本発明は、上述のような蛍光色素、上述のような塩基および／または界面活性剤を備えるキットを提供する。キットには、タンパク質および／または核酸などの有機分子がさらに含まれていてもよい。
【００６５】
次に、非限定的な実施例を参照しながら本発明を説明する。
【実施例】
【００６６】
実施例１  エピコッコノンの蛍光に対する塩基、酸および界面活性剤の影響
エピコッコノンがアミンの存在下にある場合の増強およびストークスシフトの増加を明らかにするため、様々なアミン、酸および界面活性剤についてエピコッコノンの溶液で蛍光測定を記録した。アミンと界面活性剤の組合せが蛍光を増強し、ストークスシフトの増加を引き起こすことが判明した。ＮａＨＣＯ３などの無機塩基は、蛍光の損失を引き起こし、界面活性剤の添加により蛍光は回復しなかった。
【００６７】
蛍光分光法は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５０Ｂ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて行った。新たに調製した溶液をＨｅｌｌｍａ  Ｑｕａｒｔｚ  ＳＵＰＲＡＳＩＬ精密セル（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）に入れ、次いで、セルを分光計内に入れた。通常、溶液の体積は３ｍＬとし、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍ−１０００  Ｍｉｃｒｏｍａｎ容積式ピペットを用いて成分を加えた。各サンプルについて成分およびそれらの最終濃度を示す。特に指定のない限り、すべての溶液は、水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＲｉＯＳ５）に溶けている。
【００６８】
定義および供給源
Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｃａｔ．Ｎｏｓ．ＲＰＮ６３０５またはＲＰＮ６３０６）は、エピコッコノンの部分的に精製した形態である。これは、５５０ｎｍで０．８の吸光度を有する。保存用水溶液は、メタノール保存溶液を水で１２．５倍に希釈することにより調製した。石英セル中の最終溶液は、さらに４倍に希釈する。メタノール中のＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）保存溶液は合計で５０倍に希釈される。（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のメタノール溶液）
【００６９】
エピコッコノンは、参照により本明細書に組み込まれているＢｅｌｌ  ＰＪＬおよびＫａｒｕｓｏ  Ｐ１３に記載の方法により単離した。エピコッコノンの保存溶液は、ＤＭＳＯ中で調製し（２８μｇ／ｍＬまたは４２μｇ／ｍＬＤＭＳＯ溶液）、これを用い、ＤＭＳＯ溶液をそれぞれ、５または１０倍に希釈することによって保存用水溶液を調製した。石英セル中の最終溶液は、さらに４倍に希釈する。エピコッコノンの最終濃度はそれぞれの実施例で報告する。
酢酸：（ＡＰＳ、Ａｓｉａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、以前のＡｊａｘ：１−２．５Ｌ  ＧＬ）
アセトニトリル：（Ａｊａｘ  Ｆｉｎｅｃｈｅｍ−２３１５−２．５Ｌ  ＧＬ）
アンモニア溶液：（Ａｊａｘ  Ｆｉｎｅｃｈｅｍ−４３−２．５Ｌ  ＧＬ）
アニリン：（Ａｌｄｒｉｃｈ−１３，２９３−４）
ベンジルアミン：（ＢＤＨ−２７３５５）
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン：（Ｓｉｇｍａ−Ａ−２１５３）
ブチルアミン：（Ａｌｄｒｉｃｈ−４７，１３０−５）
ＣＨＡＰＳ−３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンサルフェート：（ＢＤＨ−３０６３２）
コール酸ナトリウム塩：（Ｓｉｇｍａ−Ｃ−１２５４）
ＣＰＣ−塩化セチルピリジニウム：（Ａｊａｘ−ＵＬ００００１４５）
ＣＴＡＢ−臭化セチルトリメチルアンモニウム：（Ｓｉｇｍａ−Ｈ−５８８２）
１，３−ジアミノプロパン：（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−４７７４）
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド：（Ａｌｄｒｉｃｈ−２７，０４３−１）
ＤＮＡ−デオキシリボ核酸ナトリウムは、サケ精巣由来である：（Ｓｉｇｍａ−Ｄ−１６２６）
ＤＴＡＢ−臭化ドデシルトリメチルアンモニウム：（Ｓｉｇｍａ−Ｄ−８６３８）
ＴＤＴＡＢ−臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム：（Ｓｉｇｍａ−Ｔ−４７６２）
エチルアミン：（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ−１０８３８）
Ｄ−（＋）−グルコサミン塩酸塩：（Ｓｉｇｍａ−Ｇ−４８７５）
Ｈ２ＳＯ４  硫酸：（Ａｊａｘ  Ｆｉｎｅｃｈｅｍ−５３４）
オクチルアミン：（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ−８，０６９１７．０２５０）
オクチル−Ｄ−グルコシド：（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ−１５３９４１）
ＳＤＳ−ドデシル硫酸ナトリウム：（ＢＤＨ−３０１７５４）
ＴＲＩＳ（ＨＣｌ）−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩：（Ｓｉｇｍａ−Ｔ−３２５３）
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００：（ＢＤＨ−３０６３２）
Ｔｗｅｅｎ２０−ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート：（Ｓｉｇｍａ−Ｐ−１３７９）
Ｔｗｅｅｎ８０−ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート：（ＢＤＨ−５６０２３）
【００７０】
ＳＤＳ以外の界面活性剤の濃度は、上記のそれぞれのＣＭＣ値であるようにした。
使用した界面活性剤の保存濃度は以下の通りである。
ＣＨＡＰＳ：                                ０．２７％  ｗ／ｖ
コール酸ナトリウム塩：                      １．７％  ｗ／ｖ（４０ｍＭ）
ＣＰＣ：                                    ０．１４８％  ｗ／ｖ（４．１ｍＭ）
ＣＴＡＢ：                                  ０．１７２％  ｗ／ｖ（４．７ｍＭ）
ＤＴＡＢ：                                  ０．２％  ｗ／ｖ（６．５ｍＭ）
オクチル−Ｄ−グルコシド：                  ３．１％  ｗ／ｖ（１０６ｍＭ）
ＳＤＳ：                                    １．２％  ｗ／ｖ（４１．７ｍＭ）
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００：        ０．２７％  ｗ／ｖ（４．３５ｍＭ）
Ｔｗｅｅｎ２０：                            ０．５６  ｗ／ｖ
Ｔｗｅｅｎ８０：                            ０．６４％  ｗ／ｖ
最終溶液では、界面活性剤を４倍に希釈する。
【００７１】
（ｉ）酸によるエピコッコノンおよびＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）の蛍光の増強
エピコッコノン水溶液の蛍光は、酢酸の添加によって増強することができる（図１を参照）。エピコッコノン水溶液の固定濃度（１．０５μｇ／ｍＬ；２．５６×１０−６Ｍ）を用い、１００ｎＭから１００ｍＭの最終酢酸濃度について蛍光スペクトルを記録した。
【００７２】
図２は、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ水溶液の蛍光も酢酸の添加によって増強できることを示している。
【００７３】
エピコッコノン水溶液の蛍光は、例えば硫酸などの他の酸の添加によっても増強することができる。図３に示す蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の固定濃度（１．０５μｇ／ｍＬ；２．５６×１０−６Ｍ）および１ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４の最終濃度による。
【００７４】
（ｉｉ）界面活性剤によるエピコッコノンおよびＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）の蛍光の増強
エピコッコノン水溶液の蛍光は、ＳＤＳ（陰イオン界面活性剤）の添加によって増強することができる。ＳＤＳ濃度の増加は、観測される蛍光を増加する（３９０ｎｍにおける励起、５２５ｎｍにおける発光極大）
【００７５】
エピコッコノン水溶液の固定濃度（１．０５μｇ／ｍＬ；２．５６×１０−６Ｍ）を用い、０．１％から１．８％（ｗ／ｖ）の範囲におけるＳＤＳの最終濃度について蛍光スペクトルを記録した。図４の蛍光スペクトルは、ＳＤＳが増加するにつれて蛍光が増加することを示している。
【００７６】
Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ水溶液の蛍光もＳＤＳの添加によって増強することができる（図５を参照）。
【００７７】
エピコッコノン水溶液の蛍光は、例えばＣＴＡＢ（陽イオン界面活性剤）などの他の界面活性剤の添加により、ストークスシフトの増加を伴って増強することができる。エピコッコノン溶液へのＣＴＡＢの添加は、６２５ｎｍにおけるエピコッコノン単独の場合に対して６２５ｎｍにおける蛍光の増加を示す。ＣＴＡＢが添加された場合、５２５ｎｍにおける蛍光が減少する。図６に示す蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度、１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）およびＣＴＡＢの最終濃度１．１７５ｍＭについて作成した。
【００７８】
ＣＴＡＢについて観測された効果は、他の界面活性剤、例えばＣＰＣについても認められる。エピコッコノン水溶液の蛍光は、ＣＰＣ（陽イオン界面活性剤）の添加により、ストークスシフトを伴って増強することができる。エピコッコノン溶液へのＣＰＣの添加は、６３０ｎｍにおけるエピコッコノン単独の場合に対して６３０ｎｍにおける蛍光の増加を示す。ＣＰＣが添加された場合、５２０ｎｍにおける蛍光が減少する。図７に示す蛍光スペクトルは、エピコッコノンの濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）およびＣＰＣの最終濃度１．０２５ｍＭについて作成した。
【００７９】
エピコッコノン水溶液の蛍光は、ＣＨＡＰＳ（双性イオン界面活性剤）の添加によっても増強することができる。図８に示す蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）およびＣＨＡＰＳの最終濃度０．０６７５％（ｗ／ｖ）について作成した。
【００８０】
エピコッコノン水溶液の蛍光は、多くの様々な非イオン性界面活性剤（以下に示す界面活性剤のリストを参照）の添加によっても増強することができる。図１２〜１５に示す蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）について作成した。
【００８１】
Ｔｗｅｅｎ８０（最終濃度０．１６％ｗ／ｖ）−図９
Ｔｗｅｅｎ２０（最終濃度０．１４％ｗ／ｖ）−図１０
オクチル−Ｄ−グルコシド（最終濃度０．７７５％ｗ／ｖ）−図１１
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最終濃度０．０６７５％ｗ／ｖ）−図１２
【００８２】
（ｉｉｉ）界面活性剤および酸によるエピコッコノンおよびＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）の蛍光の増強
エピコッコノン水溶液の蛍光は、酸および多くの様々な界面活性剤（以下に示す界面活性剤のリストを参照）の添加によっても増強することができる。図１４〜１７に示す蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度１．１．４μｇ／ｍＬ（３．４×１０−６Ｍ）および酢酸の最終濃度１ｍＭについて作成した。
【００８３】
ＳＤＳ（陰イオン界面活性剤−最終濃度０．０３％ｗ／ｖ）−図１３
ＣＴＡＢ（陽イオン界面活性剤−最終濃度１．１７５ｍＭ）−図１４
ＤＴＡＢ（陽イオン界面活性剤−最終濃度１．６２５ｍＭ）−図１５
ＣＨＡＰＳ（双性イオン界面活性剤−最終濃度０．０６７５％ｗ／ｖ）−図１６
コール酸、ナトリウム塩（陰イオン界面活性剤−最終濃度１０ｍＭ）−図１７
【００８４】
Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ水溶液の蛍光も、酢酸とＳＤＳに組合せによって増強することができる（図１８を参照）。
【００８５】
（ｉｖ）塩基および界面活性剤の存在におけるエピコッコノンおよびＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のストークスシフトの変化
アンモニアは、エピコッコノンの蛍光を低下させる。この混合物の蛍光強度は、ＳＤＳの添加によって増強することができる。一般に、蛍光は、エピコッコノン単独の場合の強度とほぼ同じであるが、発光は、より長波長に移動する（ストークスシフトの増加）。より長波長における発光は、一般にエピコッコノン単独がより長波長において弱く発光することから、増強と見なすことができる。
【００８６】
ＳＤＳを含有するエピコッコノン水溶液の蛍光は、アンモニアの存在下でより長いストークスシフトで発光する。混合物が３９０ｎｍで励起される場合、６０５ｎｍの発光極大を有する。図１９の蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度１．４μｇ／ｍＬ（３．４×１０−６Ｍ）およびＳＤＳの最終濃度０．３％（ｗ／ｖ）および１ｍＭアンモニア水について作成した。
【００８７】
ＳＤＳと共にＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ水溶液の蛍光は、アンモニアの存在下でより長いストークスシフトで発光する。混合物が３９０ｎｍで励起される場合、６０５ｎｍの発光極大を有する（図２０を参照）。
【００８８】
３９０ｎｍで励起した場合、エピコッコノンのストークスシフトは、エチルアミン、ブチルアミン、オクチルアミン、ＴＲＩＳ、ベンジルアミンおよびアニリンなどの塩基の添加によって増加させることができる。図２１〜２６の蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）およびＳＤＳの最終濃度０．３％（ｗ／ｖ）について作成した。以下の最終塩基濃度を用いた。
【００８９】
エチルアミン−１ｍＭ水溶液（図２１）
ブチルアミン−１０ｍＭ水溶液（図２２）
ｎ−オクチルアミン−１０ｍＭ水溶液（図２３）
ＴＲＩＳ−１００ｍＭ水溶液（図２４）
ベンジルアミン−１０ｍＭ水溶液（図２５）
アニリン−１０ｍＭ水溶液（図２６）
【００９０】
この一連の実験において、アニリンは、最大のストークスシフトをもたらした（λｅｍ＝６２０ｎｍ）。
【００９１】
３９０ｎｍで励起した場合、エピコッコノンのストークスシフトは、１，３−ジアミノプロパンの添加によって増加させることができる。図２７の蛍光スペクトルは、エピコッコノンの濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）、０．３％ＳＤＳ、ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）および１ｍＭ  １，３−ジアミノプロパンを用いて記録した。さらに、サンプルを４℃で１日間放置し、再測定した場合に発光が増強された（図２７を参照）。
【００９２】
ＣＨＡＰＳ（双性イオン界面活性剤）を含有するエピコッコノン水溶液の蛍光は、アンモニアが添加された任意に長いストークスシフトで発光する。エピコッコノン／ＣＨＡＰＳ溶液へのアンモニアの添加は、６３０ｎｍにおけるエピコッコノン単独の場合に対して６３０ｎｍにおける蛍光の増加を示す。図２８の蛍光スペクトルは、エピコッコノン水溶液の濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）およびＣＨＡＰＳの最終濃度０．０６７５％（ｗ／ｖ）および１ｍＭアンモニア水について作成した。
【００９３】
３９０ｎｍで励起された場合、エピコッコノン／界面活性剤混合物のストークスシフトは、塩基の添加によって増加させ、酢酸で増強することができる。図３２〜３４の蛍光スペクトルは、エピコッコノンの濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）、ＳＤＳの最終濃度０．３％（ｗ／ｖ）および酢酸の最終濃度１ｍＭについて作成した。規定された最終濃度で以下の塩基を使用した。
【００９４】
アニリン−１０ｍＭ水溶液（図２９）
ＴＲＩＳ−１００ｍＭ水溶液（図３０）
エチルアミン−１ｍＭ水溶液（図３１）
【００９５】
いずれの場合も、酢酸の添加は、ストークスシフトの増加後に蛍光をさらに増強した。
【００９６】
（ｖ）他の蛍光増強および／またはストークスシフトの変化
エピコッコノン、酢酸およびＤＴＡＢを含有する水溶液の発光は、３９０ｎｍで励起された場合、５２０から５４０ｎｍへのストークスシフトと同時にＤＮＡで増強することができる。図３２の蛍光スペクトルは、エピコッコノンの濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）、１．６２５ｍＭ  ＤＴＡＢ、１ｍＭ  酢酸および代表的な核酸としてのＤＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて作成した。このことは、ＤＮＡおよび他の核酸の検出／分析において、界面活性剤および／または酸と組み合わせてエピコッコノンを使用できることを示している。
【００９７】
エピコッコノン、ＣＨＡＰＳおよびアンモニアを含有する水溶液の発光は、３９０ｎｍで励起された場合、グルコサミン塩酸塩で増強することができる。増強ばかりでなく、ストークスシフトの増加もある。図３３の蛍光スペクトルは、エピコッコノンの濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）、０．０６７５％  ＣＨＡＰＳ、１ｍＭアンモニアおよびグルコサミン塩酸塩（１３．２５ｍＭ）を用いて記録した。
【００９８】
エピコッコノン、ＤＴＡＢを含有する水溶液の発光は、３９０ｎｍで励起された場合、タンパク質で増強することができる。増強ばかりでなく、ストークスシフトの増加もある。図３４の蛍光スペクトルは、エピコッコノンの濃度１．０５μｇ／ｍＬ（２．５６×１０−６Ｍ）、１．６２５ｍＭ  ＤＴＡＢおよびＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて記録した。
【００９９】
エピコッコノンのアセトニトリル溶液（１．０５μｇ／ｍＬ；２．５６×１０−６Ｍ）は、エピコッコノンのＤＭＳＯ保存溶液から調製した。有機溶媒中のエピコッコノンは、水中よりも強い蛍光を発する（λｅｍ＝５２０ｎｍ）（図３５を参照）。
【０１００】
３９０ｎｍで励起されたサンプルの発光波長の要約
エピコッコノンおよびＳＤＳ（λｅｍ＝５２５ｎｍ）
アミン                      λｅｍ（ｎｍ）
ａ）ドデシルアミン              ５８４
ｂ）ベンジルアミン              ６００
ｃ）ブチルアミン                ６００
ｄ）１，６−ジアミノヘキサン    ６００／４４７
ｅ）オクチルアミン              ６００
ｆ）ＴＲＩＳ                    ６００
ｇ）アンモニア                  ６０５
ｈ）エチルアミン                ６１０
ｉ）アニリン                    ６２０
【０１０１】
他の塩基を使用する予備結果の要約
ジエチルアミン（二級アミン）      赤色へのシフト
トリエチルアミン（三級アミン）    赤色へのシフト
ヒドラジン                        緑色および赤色における発光
１，６−ジアミノヘキサン          赤色へのシフト
アニリン                          赤色へのシフト
【０１０２】
エピコッコノン水溶液の蛍光の増強の程度は、試薬を添加する順番によって影響されることがある。最適条件およびステップの順序は、使用する分析または定量技法のタイプによって決定され、簡単な試行によって容易に判断し、そのような技法に適応させることができる。
【０１０３】
実施例２  蛍光を増強する組合せを用いるタンパク質濃度の測定
構成要素
パートＡ：８０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドおよび２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで調製させたＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）、その５５０ｎｍでの吸光度は０．３０である。
パートＢ：１０×溶液は、表１に示すように調製する。
【０１０４】
【表１】
2006522173.tif 000004
【０１０５】
キットの１×使用溶液は、水８部および構成要素パートＡとパートＢ各１部を一緒に混ぜることによって調製する。
【０１０６】
プロトコル
ウシ血清アルブミン（ａｌｂｕｍ）のタンパク質標準液の２倍希釈シリーズは、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲にわたり水中で調製した。タンパク質標準液のアリコート（５０μＬ）を、マイクロタイタープレートのウエル中に繰り返してピペットで取った。タンパク質を含まない対照として水の５０μＬアリコートを加えた。各ウエルに、同容積（５０μＬ）の１×使用溶液を加えた。
【０１０７】
次いで、測定に先立って少なくとも５分間、蛍光を生じさせる。タンパク質標準液および実験用サンプルを調製し、蛍光を記録するのに先立って同じ時間インキュベートする。
【０１０８】
レーザーをベースとしたイメージングシステムには、６１０ＢＰ３０ｎｍまたは類似の発光フィルタリングを備えた５３２ｎｍレーザー光励起を使用した。ＢＭＧ  Ｆｌｕｏｓｔａｒ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｍｏｒｎｉｎｇｔｏｎ、ＶＩＣ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）などのプレートをベースとした蛍光測定システムには、６３０−１２ｎｍ発光フィルタリングまたは類似物とともに５４０ｎｍ励起フィルタリングが推奨される。
【０１０９】
実施例
Ｓｉｇｍａのウシ血清アルブミン（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｃａｔ．Ａ３０５９）を８００μｇ／ｍＬの濃度で水に懸濁し、２倍希釈して０．７６ｎｇ／ｍＬの最終濃度とした。５０μＬのアリコートをＧｒｅｉｎｅｒ（Ｉｎｔｅｒｐａｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＶＩＣ）９６ウエルプレート（Ｃａｔ．６５５０９６）中に３重にプレートアウトした。図３６は、Ｔｙｐｈｏｏｎレーザーをベースとしたイメージャー（５３２ｎｍレーザー、６１０ＢＰ３０発光フィルター）によって捕捉されたマイクロタイタープレートの画像を示している。図３７Ａおよび３７Ｂは、１２ｎｇ〜１００μｇ／ｍＬの範囲で１ｍＬ当たりのＢＳＡ濃度に対してプロットされた蛍光データのプロットを示している。
【０１１０】
ゲル染色
材料および方法
製造業者の使用説明書（ＮｕＰＡＧＥ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ、Ａｕｇｕｓｔ  ２６  ２００２．ＩＭ−１００１）に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １０ウエル１２％ポリアクリルアミドゲルを調製し泳動した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ＳＤＳ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔタンパク質マーカーを調製し、５０ｍＭジチオスレイトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｅｇｅｎｔｓ  Ｐａｒｋ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｙ、ＶＩＣ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｃａｔ．ＮＰ０００７）で２倍希釈した。サンプルを７０℃で１０分間加熱した。１×ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｃａｔ  Ｍ２９３３）緩衝液を用いてゲルを分離させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ（Ｃａｔ．ＮＰ０００５；５００μＬ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｘ−ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅ−Ｌｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌの陰極室に加え、追跡用色素がゲルの基部に達するまで２００Ｖ一定でゲルを泳動した。
【０１１１】
７．５％酢酸（ｖ／ｖ）１００ｍＬ中で１時間、ゲルを固定し、次いで、２×３０分間、同容積の二回蒸留（ｄｄ）水でゲルを洗浄した。
【０１１２】
次いで、ゲルを、容積５０ｍＬの新しいｄｄ水およびＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移し、室温で１時間染色した。
【０１１３】
アンモニアのゲル展開（ｇｅｌ−ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）ステップには、ゲル染色液を除去し、１００ｍＬ容積の８ｍＭ（０．０５％ｖ／ｖ）濃アンモニアで置換した。ゲルを２×１０分間洗浄した。
【０１１４】
次いで、酸安定化ステップは、アンモニア溶液を同容積の０．０５％（９ｍＭ）硫酸で置換し、さらに１０分間洗浄するものであった。次いで、ゲルを撮像し保存する準備をした。保存中、ゲルは暗所で室温に保った。
【０１１５】
５４０Ｖに設定した光電子増倍管を備え１００μｍ２のピクセルサイズの５３２ｎｍＹＡＧレーザーを用い、Ｔｙｐｈｏｏｎイメージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）でゲルを撮像した。画像を得るために、５６０ｎｍ  のロングパスまたは６１０バンドパス３０ｎｍ発光フィルターを使用した。
【０１１６】
実施例３−Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）タンパク質ゲル染色
１．ゲル染色液の強度のブースティング
プロトコル
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １０％  １２ウエルポリアクリルアミドゲルに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １×ＬＤＳ緩衝液中で調製して加熱（１０分、７０℃）した還元型（５０ｍＭジチオスレイトール）Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋａｒｓをロードした。５ｕＬのアリコート当たりロードされた大豆トリプシンインヒビター（６種の低分子量マーカーの一つ）の量は以下の通りである。
【０１１７】
【表２】
2006522173.tif 000005
【０１１８】
ゲルを２００Ｖ一定で泳動し、３０分かけて６０ｍＬの７．５％（ｖ／ｖ）酢酸に移し、続いてＲＯ水６０ｍＬ中で３０分の洗浄を３回行った。ゲルを、２５０μＬ  Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）と一緒にＲＯ水５０ｍＬに入れ、暗所で１時間染色させた。表２に列挙した１６ｍＭ溶液中でそれぞれのゲルを３×１０分間洗浄し、５３２ｎｍレーザー、５６０ＬＰ発光フィルターおよび５２０Ｖで光電子増倍管を用い、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎで撮像した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５．２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い、シグナルの絶対強度がゲル全体で比較できるように、各ゲルのレーン９を介して追跡を行った。
【０１１９】
【表３】
2006522173.tif 000006
【０１２０】
結果を図３８Ａ〜Ｇに示す。いずれの場合にも、列挙した１６ｍＭ試薬による３×１０分の洗浄は、水で３×１０分洗浄したゲルと比べて、蛍光シグナルの絶対的増加を引き起こした。
【０１２１】
２．オルトリン酸を用いたゲルにおける蛍光強度のブースティングおよび安定化
プロトコル
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １２％  １０ウエルゲルに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １×ＬＤＳ緩衝液中で調製して加熱（１０分、７０℃）した還元型（５０ｍＭジチオスレイトール）Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋａｒｓをロードした。同型のゲルに１レーン当たり大豆トリプシンインヒビター１００ｎｇをロードした。ゲルを２００Ｖで１×ＭＥＳ泳動用緩衝液中で泳動する。次いで、ゲルを、１時間かけて１００ｍＬの７．５％（ｖ／ｖ）酢酸に移し、続いてＲＯ水１００ｍＬ中で３０分の洗浄を２回行った。次いで、ゲルを、２５０μＬ  Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）と一緒にＲＯ水５０ｍＬに入れ、暗所で１時間染色させた。
【０１２２】
ゲル染色液を除去し、ゲルセグメント１（図３９Ａを参照）を８ｍＭアンモニア中で３×１０分間洗浄し、８ｍＭアンモニア中に暗所で４６時間保存した。同型のゲルセグメント２（図３９Ｂ）を８ｍＭアンモニア中で３×１０分間洗浄し、１００ｍＭオルトリン酸に移し、暗所で同様に４６時間保存した。５３２ｎｍレーザー、５６０ＬＰフィルター、および５４０Ｖの光電子増倍管を備えたＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎで撮像した。
【０１２３】
オルトリン酸は、アンモニア単独の場合（図３９Ｂ）に比べ、アンモニアによる展開後にエピコッコノンで染色したゲル（図３９Ａ）の蛍光強度を増加させた。
【０１２４】
３．硫酸を用いたゲルにおける蛍光強度のブースティングおよび安定化
プロトコル
硫酸中のゲルの保存を検討した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １０％  １５ウエルゲルに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １×ＬＤＳ緩衝液中で調製して加熱（１０分、７０℃）した還元型（５０ｍＭジチオスレイトール）Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋａｒｓをロードした。同型のゲルに１レーン当たり５μＬに１００ｎｇの大豆トリプシンインヒビターをロードした。ゲルを２００Ｖ一定で泳動し、１時間かけて１００ｍＬの７．５％（ｖ／ｖ）酢酸に移し、続いてＲＯ水１００ｍＬ中で３０分の洗浄を２回行った。次いで、ゲルを、２５０μＬ  Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）と一緒にＲＯ水５０ｍＬに入れ、暗所で１時間染色させた。次いで、ゲルを８ｍＭアンモニア中で３×１０分間洗浄し、５３２ｎｍレーザー、５６０ＬＰ発光フィルター、および５４０Ｖの光電子増倍管を備えたＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎで撮像した（図４０Ａ）。ゲルを室温で１０ｍＭ硫酸中に保存し、２時間、２１時間および９３時間後に実施例２に記載したように再撮像した（図４０Ｂ〜４０Ｄ）。強度追跡は、様々な時点でゲルの同一レーンについてプロットした（図４０Ｅ〜４０Ｈ）。図４０Ｅ〜Ｈは、１０ｍＭ硫酸中に入れるのに先立って（Ｅ、時間０）および１０ｍＭ硫酸の添加から２時間（Ｆ）、２１時間（Ｇ）および９３時間（Ｈ）後の上記ゲルのレーン３のシグナル強度追跡を示している。２時間後の染色強度の増加に注目されたい。
【０１２５】
結果
１０ｍＭ硫酸は、染色後のアンモニア洗浄によって生じる増加以上に蛍光強度を増加させた。硫酸中のゲルの保存は、ゲルを８ｍＭアンモニアまたは水の中に保存した場合よりも高いレベルにシグナルを維持した。
【０１２６】
４．酢酸を用いたゲルにおける蛍光強度のブースティングおよび安定化
酢酸中のゲルの保存を検討した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １２％  １０ウエルゲルに、大豆トリプシンインヒビターが４００ｎｇ／５μＬの濃度である還元型（５０ｍＭジチオスレイトール）Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋａｒｓをロードした。タンパク質サンプルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １×ＬＤＳ緩衝液中で２倍希釈して最終濃度０．７６ｎｇ／５μＬとし、加熱（１０分、７０℃）してゲルにロードした。ゲルを２００Ｖ一定で泳動し、１時間かけて１００ｍＬの７．５％（ｖ／ｖ）酢酸に移し、続いてＲＯ水１００ｍＬ中で３０分の洗浄を２回行った。次いで、ゲルを、２５０μＬ  Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）と一緒にＲＯ水５０ｍＬに入れ、暗所で１時間染色させた。ゲル染色液を除去し、ゲルを８ｍＭアンモニア中で２×１０分間洗浄し、５３２ｎｍレーザー、５６０ＬＰ発光フィルター、および５６０Ｖの光電子増倍管を備えたＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎで撮像した（図４１Ａ）。ゲルを１０ｍＭ酢酸に入れ、４６時間および１６７時間後に再撮像した（図４１Ｂ〜４１Ｃ）。
【０１２７】
結果
８ｍＭアンモニア中の洗浄後の１０ｍＭ酢酸は、染色後のアンモニア洗浄によって生じる増加以上に染色強度の増加をもたらした。酢酸中のゲルの保存は、ゲルを８ｍＭアンモニアまたは水の中に保存した場合よりも高いレベルにシグナルを維持した。
【０１２８】
実施例４  アガロースゲルにおけるＤＮＡ断片のエピコッコノン染色：エピコッコノン染色に対する界面活性剤の影響
材料
エピコッコノン（０．０４２ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＳＯ）
ＤＮＡ断片：：ＳＰＰ−１  Ｐｈａｇｅ／Ｅｃｏ  ＲＩ（ｃａｔ  ＤＷＭ−Ｓ１、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ）、ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＸＶＩＩ（ｃａｔ＃  １８５５６４６、Ｒｏｃｈｅ）。
ＤＴＡＢ（１．６２５ｍＭ）
ＴＤＴＡＢ（０．００１、０．０１、０．１および１ｍＭ）
ＣＴＡＢ（０．００１、０．０１、０．１および１ｍＭ）
ＣＰＣ（０．００１、０．０１、０．１および１ｍＭ）
ＳＤＳ（１．６２５ｍＭ）
酢酸（１ｍＭ）
逆浸透（ＲＯ）水
アガロースゲル（１．５％）（ＤＮＡグレードアガロース、Ｐｒｏｇｅｎ）
ＴＡＥ電気泳動緩衝液（Ｔｒｉｓ−酢酸／ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．３）
ＤＮＡサンプルローディング緩衝液（ｃａｔ番号２００−０４２４、Ｐｒｏｇｅｎ）
【０１２９】
ＤＴＡＢ、ＴＤＴＡＢ、ＣＴＡＢおよびＣＰＣは、それらの陽イオン性のため、ＤＮＡと適切に反応する可能性がある陽イオン界面活性剤の適当な例としてこの核酸実験に使用した１１，１２。関連する出版物を参照により本明細書に組み込む。ＳＤＳは、タンパク質の方法論では有用であるが、核酸とは適切に反応する可能性が低い陰イオン界面活性剤の例として使用した。
【０１３０】
染色法
１．ＤＮＡ分子マーカーサンプルは、Ｐｒｏｇｅｎサンプルローディング緩衝液中で調製した。濃度は、１サンプル当たり１０００ｎｇに調整した。サンプルをアガロースゲル中にロードし（１．０％または１．５％）、１００Ｖで１．５時間泳動した。
２．ゲルを泳動した後、ゲルをＲＯ水１Ｌで洗い流した。
３．ＤＮＡゲルのレーンをストリップに切った。
４．次いで、ＤＮＡ断片を含む各ゲルストリップを、材料の項に記載した様々な濃度の様々な陽イオン界面活性剤１０ｍＬが入っている１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ管に入れた。界面活性剤インキュベーションを室温で３０分間行った。
５．３０分のインキュベーション後、最初のインキュベートした溶液を各管からデカントした。次いで、ＲＯ水で作成したエピコッコノン染色液（０．００４２ｍｇ／ｍＬ）１０ミリリットルを管に入れた。ゲルストリップ管を室温で（暗所）１時間染色させた。
６．１時間のエピコッコノン染色後、染色液をデカントし、酢酸（１ｍＭ）１０ｍＬで置換し、室温で３０分間（１０分のインキュベーションを３回）インキュベートした。
７．酢酸処理後、ゲルストリップをＴｙｐｈｏｏｎスキャナー（Ｍｏｄｅｌ  ９２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってスキャンした。スキャニング条件は、５５０Ｖ、標準感度、および６１０ＢＰ３０／Ｇｒｅｅｎ（５３２ｎＭ）とした。
【０１３１】
結果
図４２は、ＤＮＡゲル（ＳＰＰ−１  ＤＮＡ／Ｅｃｏ  ＲＩ）ストリップをＴｙｐｈｏｏｎでスキャンした画像を示している（１：界面活性剤処理なし、エピコッコノン染色のみ；２：ＳＤＳ（１．６２５ｍＭ）−インキュベーションおよびエピコッコノン染色；３：ＤＴＡＢ（１．６２５ｍＭ）−インキュベーションおよびエピコッコノン染色；４：ＳＤＳおよびＤＴＡＢ−インキュベーション、およびエピコッコノン染色）。
【０１３２】
１．ゲルストリップ１の分子ＤＮＡバンドは、エピコッコノンのみで染色されなかった。
２．ゲルストリップ２の分子ＤＮＡバンドは、ＤＮＡがＳＤＳと共に最初にインキュベートされていた場合は、エピコッコノンで染色されなかった。
３．ゲルストリップ３の分子ＤＮＡバンドは、ＤＮＡがＤＴＡＢと共に最初にインキュベートされていた場合は、エピコッコノンで染色された。
４．ゲルストリップ４の分子ＤＮＡバンドは、ＤＮＡがＳＤＳおよびＤＴＡＢと共に最初にインキュベートされていた場合は、エピコッコノンで染色された。
【０１３３】
図４７は、ＤＮＡゲル（ＡおよびＣ、ＤＮＡ  ＭＷＭ  ＸＶＩＩ；Ｂ、ＳＰＰ−１  ＤＮＡ／Ｅｃｏ  ＲＩ）ストリップをＴｙｐｈｏｏｎでスキャンした画像を示している。図４７−Ａ、エピコッコノン染色前にＴＤＴＡＢ（１、０．００１ｍＭ；２、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭ）中でプレインキュベートされたＤＮＡゲルストリップ；図４７−Ｂ、エピコッコノン染色前にＣＴＡＢ（１、０．００１ｍＭ；２、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭ）中でプレインキュベートされたＤＮＡゲルストリップ；図４７−Ｃ、エピコッコノン染色前にＣＰＣ（１、０．００１ｍＭ；２、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭ）中でプレインキュベートされたＤＮＡゲルストリップ。
【０１３４】
１．ＴＤＴＡＢプレインキュベーションは、界面活性剤濃度が０．１から１ｍＭであった場合にＤＮＡ断片をエピコッコノンで染色した。
２．ＣＴＡＢプレインキュベーションは、界面活性剤濃度が０．０１から０．１ｍＭであった場合にＤＮＡ断片をエピコッコノンで染色した。
３．ＣＰＣプレインキュベーションは、界面活性剤濃度が０．０１から０．１ｍＭであった場合にＤＮＡ断片をエピコッコノンで染色した。
【０１３５】
結論
１．使用した陰イオン界面活性剤（ＳＤＳ）は、エピコッコノンによるＤＮＡの染色に役立たなかったが、陽イオン界面活性剤（ＤＴＡＢ、ＴＤＴＡＢ、ＣＴＡＢ、およびＣＰＣ）は、エピコッコノンで染色されたＤＮＡ断片を描出するのに有効であった。
２．本実験は、ＤＴＡＢ、ＴＤＴＡＢ、ＣＴＡＢ、およびＣＰＣなどの多種多様で様々な陽イオン界面活性剤で処理した場合に、エピコッコノンをＤＮＡおよび他の核酸染色として使用できることを示している。
【０１３６】
他の適当な陽イオン界面活性剤が使用でき、当業者によく知られているであろう。これらの界面活性剤の一部は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＢｈａｉｒｉ  ＳＭに開示されているが１７、適当な界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｎｔｓ）および界面活性物質（ｓｕｒｆｕｃｔａｎｔｓ）の他のソースは、当業者に知られているであろう。
【０１３７】
取扱の容易さから、核酸の好都合で安定な例としてＤＮＡを使用したが、上記の原理は、一本鎖および二本鎖核酸を含むＲＮＡおよび他の核酸ならびにそれらの誘導体に同様に当てはまる。さらに、これらの概念および原理は、例えば、Ｏｌｄ  ＲＷおよびＰｒｉｍｒｏｓｅ  ＳＢ１４、Ｉｎｎｉｓ  ＭＡ他１５およびＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ他１６に記載の技法などの多くの知られている核酸分析および定量技法に適用することができる。
【０１３８】
実施例５．ＤＮＡ濃度の測定
構成要素
８０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドおよび２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで調製させたＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）、その５５０ｎｍでの吸光度は０．３０である。
プロトコル
【０１３９】
サケの二本鎖ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ１６２６）は、水中で５００μｇ／ｍＬの濃度で調製し、水で２倍に希釈して４８８ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。ＤＮＡのアリコート（２５μＬ）を、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ．６５５０９６）のウエル中に繰り返してピペットで取った。ＤＮＡを含まない対照として水の２５μＬアリコートも含めた。
【０１４０】
次いで、重複したプレートの列に、濃度３ｍＭの陽イオン界面活性物質臭化ドデシルトリメチルアンモニウム水溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５０４７）２５μＬを添加した。次いで、特定の実験に応じて、個々の列に１０ｍＭ酢酸、１０ｍＭアンモニア溶液、または４０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３の２５μＬアリコートを加えた。次いで、ウエルに、水で１０倍に希釈したパートＡの２５μＬアリコートを加えた。プレートを暗所で約３０分間インキュベートし、ＵＶＡおよびＵＶＢトランスイルミネーターで可視化し、５３２ｎｍ励起レーザーおよび５６０ＬＰまたは５２６ＳＰ発光フィルターを備えたＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｙｐｈｏｏｎで撮像し、それぞれ赤色および緑色発光光を測定した。上記手順により、溶液中のＤＮＡを定量することができた。結果については、図４３、４４Ａ〜４４Ｅ、４５および４６Ａ〜４６Ｂを参照されたい。図４３は、赤色発光光、５３２ｎｍレーザー、５６０ＬＰフィルターのＴｙｐｈｏｏｎ画像を示している。染色液の添加後、プロトコルに記載のように作成したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅの添加後に１０ｍＭアンモニア溶液をウエルに添加した。図４４Ａは、生データとしてプロットされた図４３からのシグナルを示している。図４４Ｂは、ｌｏｇ１０変換データのプロットである。図４５は、緑色発光光、５３２ｎｍレーザー、５２６ＳＰフィルターのＴｙｐｈｏｏｎ画像を示している。染色液の添加後、プロトコルに記載のように作成したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅの添加後に１０ｍＭ酢酸溶液をウエルに添加した。ＵＶＡおよびＵＶＢトランスイルミネーターで、酢酸で処理されたウエルの強度は、極めて明るい緑色であり、１０ｍＭアンモニアまたは４０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３で処理されたウエルからの赤色蛍光よりも実質的に明るかった。そのハードウェア構成のため、Ｔｙｐｈｏｏｎ装置は、励起およびこの情報を捕捉するのが苦手であった。図４６Ａは、生データとしてプロットされた図４５からのシグナルを示している。図４６Ｂは、ｌｏｇ１０変換された同一データのプロットである。
【０１４１】
これらの結果は、核酸の検出および定量を改善する際の色素の有用性および界面活性剤および／または塩基および／または酸の用途を示している。
【０１４２】
具体的な実施例を参照しながら本発明について説明してきた。当業者には当然のことながら、本明細書に記載の本発明の概念の精神に沿って、他の多くの形態で本発明を実施することができる。
【０１４３】
参考文献
１  Hames, B. D. (1990) One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, in "Gel electrophoresis of proteins: a practical approach" Second Ed., (Eds, B.D, Hames and D. Rickwood). pp.1-139. IRL Press, Oxford
２  Bartoszek A, Sielenko A and Wesiora M. (2003). Versatile method employing basic techniques of genetic engineering to study the ability of low-molecular-weight compounds to bind covalently with DNA in cell-free systems. Anal Biochem. 313(1): 53-9
３  Jaroszeski MJ, Gilbert R and Heller R (1994). Detection and quantitation of cell-cell electrofusion products by flow cytometxy. Anal Biochem 216: 271-275.
４  Kamp F, Guo W, Souto R, Pilch PF, Corkey BE and Hamilton JA (2003). Rapid flip-flop of oleic acid across the plasma membrane of adipocytes. J Biol Chem 278:7988-95
５  Paulmurugan R, Massoud TF, Huang J and Gambhir SS (2004). Molecular imaging of drug-modulated protein-protein interactions in living subjects. Cancer Res. 64: 2113-2119
６  Kersten B, Feilner T, Kramer A, Wehrmeyer S, Possling A, Witt I, Zanor MI, Stracke R, Lueking A, Kreutzberger J, Lehrach H, Cahilll DJ. (2003). Generation of Arabidopsis protein chips for antibody and serum screening. Plant Mol Biol. 52: 999-1010.
７  Breadmore MC, Wolfe KA, Arcibal IG, Leung WK, Dickson D, Giordano BC, Power ME, Ferrance JP, Feldman SH, Norris PM and Landers JP (2003). Microchip-based purification of DNA from biological samples. Anal Chem. 75: 1880-1886.
８  Ferrari BC, Attfield PV, Veal DA and Bell PJ. (2003). Application of the novel fluorescent dye Beljian red to the differentiation of Giardia cysts. J Microbiol Methods. 52: 133-5.
９  Graczyk TK, Grimes BH, Knight R, Da Silva AJ, Pieniazek NJ, Veal DA.(2003). Detection of Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia carried by synanthropic flies by combined fluorescent in situ hybridization and a monoclonal antibody. Am J Trop Med Hyg. 68: 228-232
１０  Shapiro, H. M. 2003 Pfactical Flow Cytometry, Forth Edition, John Wiley, New Jersey.
１１  Bathaie SZ, Moosavi-Movahedi AA, Saboury AA. (1999). Energetic and binding properties of DNA upon interaction with dodecyl trimethylammonium bromide. Nucleic AcidsRes. 1999 Feb 15; 27(4): 1001-5.
１２  Harrington LA, and Andrews, BJ. (1996) Binding to the yeast Swi4,6-dependent cell cycle box, CACGAAA, is cell cycle regulated in vivo Nucleic Acids Res. 24: 558-565.
１３  Bell PJL and Karuso P, (2003), Epicocconone, A Novel Fluorescent Compound from the Fungus Epicoccum nigrum, J Am Chem Soc, 125: 9304-9305.
１４  Old RW and Primrose SB, Principles of Gene manipulation: An Introduction to genetic engineering, Blackwell Scientific Publications, 4th Edition, 1989.
１５  Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ, PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press Inc, 1990
１６  Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989.
１７  Bhairi SM. Detergents: A guide to the properties and uses of detergents in biological systems, Calbiochem-Novabiochem Corp., 2001
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ａ）１００ｍＭ酢酸水溶液、ｂ）１ｍＭ酢酸、ｃ）１０μＭ酢酸、ｄ）１μＭ酢酸を使用し、ｅ）酢酸を使用せずに３９０ｎｍで励起した場合のエピコッコノンの発光プロファイルを示す図である。
【図２】１ｍＭ酢酸を使用したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２４ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、酸を使用しなかった同一濃度のＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２３ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３】１ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜４９０ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図４】ａ）１．８％ＳＤＳ水溶液（ｗ／ｖ）、ｂ）０．８％ＳＤＳ、ｃ）０．４％ＳＤＳ、ｄ）０．１％ＳＤＳおよびｅ）０．１％ＳＤＳを使用して３９０ｎｍで励起した場合のエピコッコノンの発光プロファイルを示す図である。
【図５】０．３％ＳＤＳ水溶液（ｗ／ｖ）を使用したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳを使用しなかった同一濃度のＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２３ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図６】ＣＴＡＢを使用したエピコッコノンのａ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＣＴＡＢを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｂ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図７】ＣＰＣを使用したエピコッコノンのａ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＣＰＣを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｂ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図８】ＣＨＡＰＳを使用したエピコッコノンのａ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＣＨＡＰＳを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｂ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図９】Ｔｗｅｅｎ  ８０を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２６ｎｍ、ｂ）励起４４０ｎｍ／発光４７０〜７００ｎｍ、およびｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、Ｔｗｅｅｎ  ８０を使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｄ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびＥ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１０】Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２４ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１１】オクチル−Ｄ−グルコシドを使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２４ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、オクチル−Ｄ−グルコシドを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１２】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２６ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１３】ＳＤＳおよび酢酸を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳを使用したが酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１５ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１４】ＣＴＡＢおよび酢酸を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍと、ＣＴＡＢを使用したが酸を使用しなかったエピコッコノンのｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍならびにＣＴＡＢおよび酸を使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５１６ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１５】ａ）１．６２５ｍＭ  ＤＴＡＢおよび１ｍＭ酢酸を使用したエピコッコノン、ｂ）ＤＴＡＢを使用したが酸を使用しなかったエピコッコノンおよびｃ）ＤＴＡＢおよび酸を使用しなかったエピコッコノンの励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍを示す図である。
【図１６】ＣＨＡＰＳおよび酢酸を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＣＨＡＰＳを使用したが酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２８ｎｍならびにＣＨＡＰＳおよび酸を使用しなかったエピコッコノンのｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１７】コール酸ナトリウム塩および酢酸を使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、コール酸ナトリウム塩を使用したが酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍならびにコール酸ナトリウム塩および酸を使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図１８】ａ）０．３％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および１ｍＭ酢酸を使用したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）、ｂ）０．３％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を使用したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）、ｃ）１ｍＭ  ＡｃＯＨを使用したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）およびｄ）Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）の励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍを示す図である。
【図１９】ＳＤＳおよびアンモニアを使用したエピコッコノンのａ）励起３１０〜５００ｎｍ／発光６０５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、アンモニアを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンおよびＳＤＳのｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２０ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２０】０．３％ＳＤＳおよび１ｍＭアンモニアを使用したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光６０５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、同一濃度で０．３％ＳＤＳを使用しアンモニアを使用しなかったＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）のｃ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５２５ｎｍおよびｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２１】ＳＤＳおよびエチルアミンを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６１０ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびエチルアミンを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２２】ＳＤＳおよびブチルアミンを使用したエピコッコノンのａ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびブチルアミンを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２３】ＳＤＳおよびオクチルアミンを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６００ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびオクチルアミンを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２４】ＳＤＳおよびＴＲＩＳを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６００ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびＴＲＩＳを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２５】ＳＤＳおよびベンジルアミンを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６００ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびベンジルアミンを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２６】ＳＤＳおよびアニリンを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６２０ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびアニリンを使用しなかった同一濃度のエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図２７】ａ）ＳＤＳ、ＤＮＡおよび１，３−ジアミノプロパンを使用した１日後のエピコッコノンおよびｂ）ＳＤＳ、ＤＮＡおよび１，３−ジアミノプロパンを使用したエピコッコノンの励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍを示す図である。
【図２８】ａ）ＣＨＡＰＳおよびアンモニアを使用したエピコッコノン、ｂ）ＣＨＡＰＳを使用し、アンモニアを使用しなかったエピコッコノン、ならびにｃ）ＣＨＡＰＳおよびアンモニアを使用しなかったエピコッコノンの励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍを示す図である。
【図２９】ＳＤＳ、酢酸およびアニリンを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜６００ｎｍ／発光６２１ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびアニリンを使用したが酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３０】ＳＤＳ、酢酸およびＴＲＩＳを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６０５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびＴＲＩＳを使用し、酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３１】ＳＤＳ、酢酸およびエチルアミンを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６１０ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＳＤＳおよびエチルアミンを使用し、酸を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３２】ＤＴＡＢ、酢酸およびＤＮＡを使用したエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５３３ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＤＴＡＢおよび酢酸を使用し、ＤＮＡを使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍおよびエピコッコノン単独のｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３３】ＣＨＡＰＳ、アンモニアおよびグルコサミン塩酸塩を使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６０５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、ＣＨＡＰＳおよびアンモニアを使用し、グルコサミン塩酸塩を使用しなかったエピコッコノンのｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍおよびエピコッコノン単独のｄ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３４】ＤＴＡＢおよびＢＳＡを使用したエピコッコノンのａ）励起３２０〜５５０ｎｍ／発光６１５ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、エピコッコノン単独のｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３５】アセトニトリルに溶かしたエピコッコノンのａ）励起３００〜５００ｎｍ／発光５３２ｎｍおよびｂ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍと、同一濃度のエピコッコノン水溶液のｃ）励起３９０ｎｍ／発光４２０〜７００ｎｍとの比較を示す図である。
【図３６】Ｔｙｐｈｏｏｎのレーザーをベースとしたイメージャー（５３２ｎｍレーザー、６１０ＢＰ３０発光フィルター）によって捕捉されたマイクロタイタープレートの画像を示す図である。
【図３７Ａ】１２ｎｇ〜１００μｇ／ｍＬの範囲で１ｍＬ当たりのＢＳＡ濃度に対する生の蛍光データのプロットを示す図である。この範囲におけるｒ２値は、０．９８５である。
【図３７Ｂ】７８１ｎｇ〜８００μｇ／ｍＬの範囲で１ｍＬ当たりのＢＳＡ濃度のｌｏｇ１０に対する蛍光データのｌｏｇ１０のプロットを示す図である。この範囲におけるｒ２値は、０．９９７である。
【図３８Ａ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３８Ｂ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３８Ｃ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３８Ｄ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３８Ｅ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３８Ｆ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３８Ｇ】水および様々な塩基で染色ゲルを処理した後の染色ゲルおよびそれらの対応する強度追跡を示す図である。
【図３９Ａ】Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）による染色および８ｍＭアンモニアによる処理後のゲルセグメントを示す図である。セグメント１（Ａ）は、８ｍＭアンモニア中に暗所で４６時間保存した。
【図３９Ｂ】Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）による染色および８ｍＭアンモニアによる処理後のゲルセグメントを示す図である。複製のゲルセグメント２（Ｂ）は、８ｍＭアンモニアで３×１０分洗浄し、１００ｍＭオルトリン酸に移し、この場合も暗所で４６時間保存した。
【図４０Ａ】アンモニアによる処理の直後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４０Ｂ】１０ｍＭ硫酸中で２時間保存した後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４０Ｃ】１０ｍＭ硫酸中で２１時間保存した後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４０Ｄ】１０ｍＭ硫酸中で９３時間保存した後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４０Ｅ】１０ｍＭ硫酸に入れる前（時間０）のゲルのレーン３のシグナル強度追跡を示す図である。
【図４０Ｆ】１０ｍＭ硫酸の添加から２時間後のゲルのレーン３のシグナル強度追跡を示す図である。
【図４０Ｇ】１０ｍＭ硫酸の添加から２１時間後のゲルのレーン３のシグナル強度追跡を示す図である。
【図４０Ｈ】１０ｍＭ硫酸の添加から９３時間後のゲルのレーン３のシグナル強度追跡を示す図である。
【図４１Ａ】アンモニアによる処理の直後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４１Ｂ】１０ｍＭ酢酸中で４６時間保存した後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４１Ｃ】１０ｍＭ酢酸中で１６７時間保存した後に撮像されたゲルを示す図である。
【図４２】ＤＮＡゲルストリップをＴｙｐｈｏｏｎでスキャンした画像を示す図である（１：界面活性剤処理なし、エピコッコノン染色のみ；２：ＳＤＳ−インキュベーションおよびエピコッコノン染色；３：ＤＤＴＡＢ−インキュベーションおよびエピコッコノン染色；４：ＳＤＳおよびＤＤＴＡＢ−インキュベーション、およびエピコッコノン染色）。
【図４３】赤色発光光、５３２ｎｍレーザー、５６０ＬＰフィルターのＴｙｐｈｏｏｎ画像を示す図である。染色液の添加後、プロトコルに記載のように作成したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）の添加後に１０ｍＭアンモニア溶液をウエルに添加した。
【図４４Ａ】生データとしてプロットされた図４３からのシグナルを示す図である。
【図４４Ｂ】ｌｏｇ１０変換データのプロットを示す図である。
【図４５】緑色発光光、５３２ｎｍレーザー、５２６ＳＰフィルターのＴｙｐｈｏｏｎ画像を示す図である。染色液の添加後、プロトコルに記載のように作成したＤｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）の添加後に１０ｍＭ酢酸をウエルに添加した。
【図４６Ａ】生データとしてプロットされた図４５からのシグナルを示す図である。
【図４６Ｂ】ｌｏｇ１０変換された同一データのプロットを示す図である。
【図４７Ａ】ＤＮＡゲル（ＡおよびＣ、ＤＮＡ  ＭＷＭ  ＸＶＩＩ；Ｂ、ＳＰＰ−１  ＤＮＡ／Ｅｃｏ  ＲＩ）ストリップをＴｙｐｈｏｏｎでスキャンした画像を示す図である。エピコッコノン染色前にＴＤＴＡＢ（１、０．００１ｍＭ；２、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭ）中でプレインキュベートされたＤＮＡゲルストリップ。
【図４７Ｂ】ＤＮＡゲル（ＡおよびＣ、ＤＮＡ  ＭＷＭ  ＸＶＩＩ；Ｂ、ＳＰＰ−１  ＤＮＡ／Ｅｃｏ  ＲＩ）ストリップをＴｙｐｈｏｏｎでスキャンした画像を示す図である。エピコッコノン染色前にＣＴＡＢ（１、０．００１ｍＭ；２、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭ）中でプレインキュベートされたＤＮＡゲルストリップ。
【図４７Ｃ】ＤＮＡゲル（ＡおよびＣ、ＤＮＡ  ＭＷＭ  ＸＶＩＩ；Ｂ、ＳＰＰ−１  ＤＮＡ／Ｅｃｏ  ＲＩ）ストリップをＴｙｐｈｏｏｎでスキャンした画像を示す図である。エピコッコノン染色前にＣＰＣ（１、０．００１ｍＭ；２、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭ）中でプレインキュベートされたＤＮＡゲルストリップ。
【図１】
2006522173.tif 000012
【図２】
2006522173.tif 000013
【図３】
2006522173.tif 000014
【図４】
2006522173.tif 000015
【図５】
2006522173.tif 000016
【図６】
2006522173.tif 000017
【図７】
2006522173.tif 000018
【図８】
2006522173.tif 000019
【図９】
2006522173.tif 000020
【図１０】
2006522173.tif 000021
【図１１】
2006522173.tif 000022
【図１２】
2006522173.tif 000023
【図１３】
2006522173.tif 000024
【図１４】
2006522173.tif 000025
【図１５】
2006522173.tif 000026
【図１６】
2006522173.tif 000027
【図１７】
2006522173.tif 000028
【図１８】
2006522173.tif 000029
【図１９】
2006522173.tif 000030
【図２０】
2006522173.tif 000031
【図２１】
2006522173.tif 000032
【図２２】
2006522173.tif 000033
【図２３】
2006522173.tif 000034
【図２４】
2006522173.tif 000035
【図２５】
2006522173.tif 000036
【図２６】
2006522173.tif 000037
【図２７】
2006522173.tif 000038
【図２８】
2006522173.tif 000039
【図２９】
2006522173.tif 000040
【図３０】
2006522173.tif 000041
【図３１】
2006522173.tif 000042
【図３２】
2006522173.tif 000043
【図３３】
2006522173.tif 000044
【図３４】
2006522173.tif 000045
【図３５】
2006522173.tif 000046
【図３６】
2006522173.tif 000047
【図３７Ａ】
2006522173.tif 000048
【図３７Ｂ】
2006522173.tif 000049
【図３８Ａ】
2006522173.tif 000050
【図３８Ｂ】
2006522173.tif 000051
【図３８Ｃ】
2006522173.tif 000052
【図３８Ｄ】
2006522173.tif 000053
【図３８Ｅ】
2006522173.tif 000054
【図３８Ｆ】
2006522173.tif 000055
【図３８Ｇ】
2006522173.tif 000056
【図３９】
2006522173.tif 000057
【図４０】
2006522173.tif 000058
【図４０Ｅ】
2006522173.tif 000059
【図４０Ｆ】
2006522173.tif 000060
【図４０Ｇ】
2006522173.tif 000061
【図４０Ｈ】
2006522173.tif 000062
【図４１Ａ】
2006522173.tif 000063
【図４１Ｂ】
2006522173.tif 000064
【図４１Ｃ】
2006522173.tif 000065
【図４２】
2006522173.tif 000066
【図４３】
2006522173.tif 000067
【図４４Ａ】
2006522173.tif 000068
【図４４Ｂ】
2006522173.tif 000069
【図４５】
2006522173.tif 000070
【図４６Ａ】
2006522173.tif 000071
【図４６Ｂ】
2006522173.tif 000072
【図４７Ａ】
2006522173.tif 000073
【図４７Ｂ】
2006522173.tif 000074
【図４７Ｃ】
2006522173.tif 000075
【国際調査報告】
2006522173.tif 000076
2006522173.tif 000077