(57)【要約】本発明は、新規の二本鎖RNA（dsRNA）構造およびdsRNA発現構築物、これらを作製するための方法、およびこれらを遺伝子サイレンシングのために利用する方法に関する。望ましくは、これらの方法は、真核細胞、植物、または動物（たとえば、ヒトなどの哺乳動物）の1つまたは複数の標的遺伝子の発現を、毒性を誘導せずに特異的に阻害する。これらの方法は、疾患または感染に関連する遺伝子をサイレンシングすることによって、疾患または感染を予防または治療するために使用することができる。また、本発明は、細胞の機能、遺伝子の発現、または標的ポリペプチドの生物活性などの検出可能な表現型を調整する核酸配列を同定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域を含むか、またはコードする核酸分子であって、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成される、核酸分子。
【請求項２】
第2の塩基対形成領域の下流に第2の関心対象領域をさらに含み、該第1および第2の関心対象領域は互いに塩基対形成される、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
第1および第2の関心対象領域の長さが異なる、請求項2記載の核酸分子。
【請求項４】
第1の関心対象領域が、標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該標的遺伝子に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が細胞における該標的遺伝子の発現を阻害する、請求項2記載の核酸分子。
【請求項５】
第1の関心対象領域が、2つ以上の標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該2つ以上の標的遺伝子の該領域に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、細胞における該2つ以上の標的遺伝子の発現を阻害する、請求項4記載の核酸分子。
【請求項６】
核酸分子がデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの混合物を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項７】
標的遺伝子が、疾患もしくは障害、細菌感染、ウイルス感染、酵母感染、または二本鎖リボ核酸（dsRNA）介在毒性に関連する核酸分子であるか、または細菌ポリペプチド、ウイルスポリペプチド、酵母ポリペプチド、疾患もしくは障害に関連するポリペプチド、または二本鎖リボ核酸（dsRNA）介在毒性に関連するポリペプチドをコードする、請求項4記載の核酸分子。
【請求項８】
疾患または障害に関連するポリペプチドが、発癌性ポリペプチドである、請求項7記載の核酸分子。
【請求項９】
dsRNA介在毒性に関連するポリペプチドが、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドである、請求項7記載の核酸分子。
【請求項１０】
第1の関心対象領域が少なくとも1〜1000ヌクレオチドである、請求項1〜9のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１】
第1の関心対象領域が少なくとも1〜400ヌクレオチドである、請求項1〜10のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２】
第1の関心対象領域が少なくとも1〜300ヌクレオチドである、請求項1〜11のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１３】
第1の関心対象領域が少なくとも1〜200ヌクレオチドである、請求項1〜12のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１４】
第1の関心対象領域が少なくとも1〜100ヌクレオチドである、請求項1〜13のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１５】
第1の関心対象領域が少なくとも1〜50ヌクレオチドである、請求項1〜14のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１６】
第1の関心対象領域が少なくとも19〜26ヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１７】
第1の関心対象領域が少なくとも15〜25ヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１８】
第1の関心対象領域が少なくとも5〜15ヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１９】
第2の関心対象領域が少なくとも1〜1000ヌクレオチドである、請求項2〜18のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２０】
第2の関心対象領域が少なくとも1〜400ヌクレオチドである、請求項2〜19のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２１】
第2の関心対象領域が少なくとも1〜300ヌクレオチドである、請求項2〜20いずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２２】
第2の関心対象領域が少なくとも1〜200ヌクレオチドである、請求項2〜21のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２３】
第2の関心対象領域が少なくとも1〜100ヌクレオチドである、請求項2〜22のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２４】
第2の関心対象領域が少なくとも1〜50ヌクレオチドである、請求項2〜23のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２５】
第2の関心対象領域が少なくとも19〜26ヌクレオチドである、請求項2〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２６】
第2の関心対象領域が少なくとも15〜25ヌクレオチドである、請求項2〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２７】
第2の関心対象領域が少なくとも5〜15ヌクレオチドである、請求項2〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２８】
第1の塩基対形成領域が少なくとも1〜1000ヌクレオチドである、請求項1〜27のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２９】
第1の塩基対形成領域が少なくとも1〜400ヌクレオチドである、請求項1〜28のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３０】
第1の塩基対形成領域が少なくとも1〜300ヌクレオチドである、請求項1〜29のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３１】
第1の塩基対形成領域が少なくとも1〜200ヌクレオチドである、請求項1〜30いずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３２】
第1の塩基対形成領域が少なくとも1〜100ヌクレオチドである、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３３】
第1の塩基対形成領域が少なくとも1〜50ヌクレオチドである、請求項1〜32のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３４】
第1の塩基対形成領域が少なくとも19〜26ヌクレオチドである、請求項1〜33のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３５】
第1の塩基対形成領域が少なくとも15〜25ヌクレオチドである、請求項1〜33のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３６】
第1の塩基対形成領域が少なくとも5〜15ヌクレオチドである、請求項1〜33のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３７】
第2の塩基対形成領域が少なくとも1〜1000ヌクレオチドである、請求項1〜36のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３８】
第2の塩基対形成領域が少なくとも1〜400ヌクレオチドである、請求項1〜37のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３９】
第2の塩基対形成領域が少なくとも1〜300ヌクレオチドである、請求項1〜38のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４０】
第2の塩基対形成領域が少なくとも1〜200ヌクレオチドである、請求項1〜39のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４１】
第2の塩基対形成領域が少なくとも1〜100ヌクレオチドである、請求項1〜40のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４２】
第2の塩基対形成領域が少なくとも1〜50ヌクレオチドである、請求項1〜41のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４３】
第2の塩基対形成領域が少なくとも19〜26ヌクレオチドである、請求項1〜42のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４４】
第2の塩基対形成領域が少なくとも15〜25ヌクレオチドである、請求項1〜42のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４５】
第2の塩基対形成領域が少なくとも5〜15ヌクレオチドである、請求項1〜42のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４６】
ループ領域が少なくとも1〜1000ヌクレオチドである、請求項1〜45のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４７】
ループ領域が少なくとも1〜400ヌクレオチドである、請求項1〜46のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４８】
ループ領域が少なくとも1〜300ヌクレオチドである、請求項1〜47のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４９】
ループ領域が少なくとも1〜200ヌクレオチドである、請求項1〜48のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５０】
ループ領域が少なくとも1〜100ヌクレオチドである、請求項1〜49のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５１】
ループ領域が少なくとも1〜50ヌクレオチドである、請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５２】
ループ領域が少なくとも19〜26ヌクレオチドである、請求項1〜51のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５３】
ループ領域が少なくとも15〜25ヌクレオチドである、請求項1〜51のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５４】
ループ領域が少なくとも5〜15ヌクレオチドである、請求項1〜51のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５５】
請求項1記載の核酸分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項５６】
請求項1〜54のいずれか一項記載の核酸分子をコードするDNAプラスミド構築物を含む薬学的組成物であって、該核酸分子は、動作可能に該核酸分子に結合されて該核酸分子の転写を可能とするプロモーターを5'末端に含み、かつ該核酸分子は、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域をコードし、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該核酸分子の転写によりRNAヘアピンを産生する、薬学的組成物。
【請求項５７】
請求項1〜54のいずれか一項記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞において該核酸分子を転写する段階を含む、RNAヘアピンを作製するための方法であって、該核酸分子は、動作可能に該核酸分子に結合されて該核酸分子の転写を可能とするプロモーターを5'末端に含み、かつ該核酸分子は、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域をコードし、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該核酸分子の転写によりRNAヘアピンを産生する、方法。
【請求項５８】
核酸分子が、第2の塩基対形成領域の下流に第2の関心対象領域をさらにコードし、該第1および第2の関心対象領域は互いに塩基対形成される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第1の関心対象領域の5'末端は、該第2の関心対象領域の3'末端を越えて伸びている、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第2の関心対象領域の3'末端は、該第1の関心対象領域の5'末端を越えて伸びている、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
部分的なRNAヘアピンの非重複領域が、RNA依存性RNAポリメラーゼによってインビボで伸長される、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して内因性である、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して外因性であり、かつ該宿主細胞に提供される、請求項61記載の方法。
【請求項６４】
細胞における標的遺伝子の発現を阻害する必要がある被験者に対して、RNAヘアピンを含むかまたはコードする請求項1〜54のいずれか一項記載の核酸分子を投与する段階を含む、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための方法であって、該RNAヘアピンは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2の関心対象領域を含み、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該投与により、該核酸分子を投与していない被験者における標的遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現を阻害または減少させる、方法。
【請求項６５】
第1および第2の関心対象領域の長さが同じかまたは異なる、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第1の関心対象領域の5'末端は、該第2の関心対象領域の3'末端を越えて伸びている、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第2の関心対象領域の3'末端は、該第1の関心対象領域の5'末端を越えて伸びている、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
部分的なRNAヘアピンの非重複領域が、RNA依存性RNAポリメラーゼによってインビボで伸長される、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して内因性である、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して外因性であり、かつ該宿主細胞に提供される、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
第1の関心対象領域が、標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該標的遺伝子に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、被験者の細胞における該標的遺伝子の発現を阻害する、請求項64記載の方法。
【請求項７２】
第1の関心対象領域が、2つ以上の標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該2つ以上の標的遺伝子の該領域に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、被験者の細胞における該2つ以上の標的遺伝子の発現を阻害する、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
標的遺伝子が、疾患もしくは障害、細菌感染、ウイルス感染、酵母感染、または二本鎖リボ核酸（dsRNA）介在毒性に関連する核酸分子であるか、または細菌ポリペプチド、ウイルスポリペプチド、酵母ポリペプチド、疾患もしくは障害に関連するポリペプチド、または二本鎖リボ核酸（dsRNA）介在毒性に関連するポリペプチドをコードする、請求項71記載の方法。
【請求項７４】
疾患または障害に関連するポリペプチドが発癌性ポリペプチドである、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
dsRNA介在毒性に関連するポリペプチドが、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドである、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
感染を治療または予防する必要がある被験者に対して、RNAヘアピンを含むかまたはコードする請求項1〜54のいずれか一項記載の核酸分子を投与する段階を含む、感染を治療または予防するための方法であって、該RNAヘアピンは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2の関心対象領域を含み、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該投与により、該核酸分子を投与していない被験者における標的遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現を阻害または減少させ、該標的遺伝子は、該被験者における細菌、ウイルス、または酵母の感染、複製、病原性、または生存のために必要とされるポリペプチドをコードする細菌、ウイルス、または酵母の遺伝子である、方法。
【請求項７７】
第1および第2の関心対象領域の長さが同じかまたは異なる、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第1の関心対象領域の5'末端は、該第2の関心対象領域の3'末端を越えて伸びている、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第2の関心対象領域の3'末端は、該第1の関心対象領域の5'末端を越えて伸びている、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
部分的なRNAヘアピンの非重複領域が、RNA依存性RNAポリメラーゼによってインビボで伸長される、請求項78記載の方法。
【請求項８１】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して内因性である、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
該RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して外因性であり、かつ該宿主細胞に提供される、請求項80記載の方法。
【請求項８３】
第1の関心対象領域が、標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該標的遺伝子に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、被験者の細胞における該標的遺伝子の発現を阻害する、請求項76記載の方法。
【請求項８４】
第1の関心対象領域が、2つ以上の標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該2つ以上の標的遺伝子の該領域に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、被験者の細胞における該2つ以上の標的遺伝子の発現を阻害する、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
感染を治療または予防する必要がある被験者に対して、RNAヘアピンを含むかまたはコードする第2の核酸分子を投与する段階をさらに含む、請求項76記載の方法であって、該第2のRNAヘアピンは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2の関心対象領域を含み、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該投与により、該核酸分子を投与していない被験者における第2の標的遺伝子の発現と比較して、第2の標的遺伝子の発現を阻害または減少させ、該第2の標的遺伝子は、二本鎖のリボ核酸（dsRNA）介在毒性に関連するポリペプチドをコードする、方法。
【請求項８６】
dsRNA介在毒性に関連するポリペプチドが、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドである、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
第2の核酸分子の第1の関心対象領域が、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドの領域に対して実質的な同一性を有し、かつ該第2の核酸分子の第2の関心対象領域が、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドの該領域に対して実質的な相補性を有する、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
癌を治療または予防する必要がある被験者に対して、RNAヘアピンを含むかまたはコードする核酸分子の有効量を投与する段階を含む、癌を治療または予防するための方法であって、該RNAヘアピンは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2の関心対象領域を含み、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該投与により、該核酸分子を投与していない被験者における標的遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現を阻害または減少させ、かつ該標的遺伝子は、発癌性細胞の増殖、維持、または生存のために必要とされるポリペプチドをコードする方法。
【請求項８９】
第1および第2の関心対象領域の長さが同じかまたは異なる、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第1の関心対象領域の5'末端は、該第2の関心対象領域の3'末端を越えて伸びている、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
第1の関心対象領域を含むRNAヘアピンの5'末端および第2の関心対象領域を含むRNAヘアピンの3'末端が、部分的に重複して、非重複領域を有する部分的なRNAヘアピンを形成し、該第2の関心対象領域の3'末端は、該第1の関心対象領域の5'末端を越えて伸びている、請求項88記載の方法。
【請求項９２】
部分的なRNAヘアピンの非重複領域が、RNA依存性RNAポリメラーゼによってインビボで伸長される、請求項90記載の方法。
【請求項９３】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して内因性である、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
RNA依存性RNAポリメラーゼが、宿主細胞に対して外因性であり、かつ該宿主細胞に提供される、請求項92記載の方法。
【請求項９５】
第1の関心対象領域が、標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該標的遺伝子に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、被験者の細胞における該標的遺伝子の発現を阻害する、請求項88記載の方法。
【請求項９６】
第1の関心対象領域が、2つ以上の標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域が、該2つ以上の標的遺伝子の該領域に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子が、被験者の細胞における該2つ以上の標的遺伝子の発現を阻害する、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
癌を治療または予防する必要がある被験者に対して、第2のRNAヘアピンを含むかまたはコードする第2の核酸分子を投与する段階をさらに含む、請求項88記載の方法であって、該第2のRNAヘアピンは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2の関心対象領域を含み、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、かつ該投与により、該核酸分子を投与していない被験者における第2の標的遺伝子の発現と比較して、第2の標的遺伝子の発現を阻害または減少させ、該第2の標的遺伝子は、二本鎖のリボ核酸（dsRNA）介在毒性に関連するポリペプチドをコードする、方法。
【請求項９８】
dsRNA介在毒性に関連するポリペプチドが、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドである、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
第2の核酸分子の第1の関心対象領域が、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドの領域に対して実質的な同一性を有し、かつ該第2の核酸分子の第2の関心対象領域が、RNA依存性タンパク質キナーゼ（PKR）ポリペプチドまたはインターフェロン反応に関連するポリペプチドの該領域に対して実質的な相補性を有する、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
動物に請求項1〜54のいずれか一項記載の核酸分子を提供する第1の薬剤を、動物に導入する段階を含む、動物における疾患、障害、または感染を治療、安定化、または予防するための方法であって、該核酸分子の第1の関心対象領域は、該疾患、障害、または感染に関連する標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、かつ特異的に該標的核酸分子の発現を阻害する、方法。
【請求項１０１】
標的核酸分子が病原体に関連する、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
病原体がウイルス、細菌、酵母、または感染因子である、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
以下の段階を含む、細胞の検出可能な表現型を調整する核酸分子を同定するための方法：
（a）dsRNA発現ライブラリーで細胞集団を形質転換する段階、ここで該ライブラリーは、請求項1〜54のいずれか一項記載の複数の核酸分子を含み、該複数の核酸分子の第1の関心対象領域は、細胞の検出可能な表現型を調整する該核酸分子に対して実質的な同一性を有する配列を含み；かつ該細胞集団の少なくとも2つの細胞は、それぞれ、該dsRNA発現ライブラリーとは異なる核酸分子で形質転換される、段階；および
（b）該検出可能な表現型の調整についてアッセイする段階、ここで該調整により、該表現型に関連する核酸分子を同定する、段階。
【請求項１０４】
検出可能な表現型の調整は、細胞の機能の調整、ポリペプチドの生物活性の調整、または標的核酸分子の発現の調整である、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
以下の段階をさらに含む、請求項103記載の方法：
（c）核酸分子を増幅し、かつ該増幅された核酸分子をシーケンスすることによって、細胞の検出可能な表現型を調整する核酸分子を同定する段階。
【請求項１０６】
dsRNA発現ライブラリーが、細胞に由来するcDNAを含む、請求項103記載の方法。
【請求項１０７】
宿主細胞の第1の下流コード配列に動作可能に結合されてそのコード配列の発現に有効であるプロモーターを含むdsRNA発現構築物を含む、RNAヘアピン合成用のキットであって、該第1の下流コード配列は、5'から3'の順に、該プロモーターの下流の第1のマルチクローニングサイト（MCS）、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2のMCSを含み、該第1のMCSに挿入された第1の関心対象領域および該第2のMCSに挿入された第2の関心対象領域は、該プロモーターによって転写され、該第1の下流コード配列の転写後に、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成される、キット。
【請求項１０８】
キットがリボ核酸（RNA）依存性RNAポリメラーゼをさらに含む、請求項107記載のキット。
【請求項１０９】
宿主細胞のRNA依存性RNAポリメラーゼに動作可能に結合されてそのRNA依存性RNAポリメラーゼの発現に有効であるプロモーターを含む第2のdsRNA発現構築物をさらに含む、請求項107記載のキット。
【請求項１１０】
第2の下流コード配列に動作可能に結合されてそのコード配列の発現に有効である第2のプロモーターを、2シストロン性であるdsRNA発現構築物にさらに含み、第2の下流コード配列は、第1の下流コード配列と同時発現するRNA依存性RNAポリメラーゼを含む、請求項107記載のキット。
【請求項１１１】
DNAプラスミド構築物が、選択可能な薬剤耐性マーカーをさらに含む、請求項107記載のキット。
【請求項１１２】
選択可能な薬剤耐性マーカーが、ゼオマイシン、カナマイシン、アミノ配糖体、テトラサイクリン、アンピシリン、またはハイグロマイシン薬剤耐性遺伝子である、請求項111記載のキット。
【請求項１１３】
dsRNA発現構築物がDNAプラスミド構築物を含む、請求項107記載のキット。
【請求項１１４】
第2のdsRNA発現構築物がDNAプラスミド構築物を含む、請求項109記載のキット。
【請求項１１５】
5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域を含むかまたはコードする核酸分子の、標的遺伝子の発現を阻害するための薬剤、感染を治療もしくは予防するための薬剤、または癌を治療もしくは予防するための薬剤を製造するための使用であって、該第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成される、使用。
【請求項１１６】
核酸分子が第2の関心対象領域をさらに含む、請求項115記載の使用であって、第1の関心対象領域は、標的遺伝子の領域に対して実質的な同一性を有し、第2の関心対象領域は、該標的遺伝子に対して実質的な相補性を有し、かつ核酸分子は、細胞における該標的遺伝子の発現を阻害する、使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
一般に、本発明は、新規の二本鎖RNA（dsRNA）構造およびdsRNA発現構築物、これらを作製するための方法、およびこれらを遺伝子サイレンシングのために利用する方法に関する。望ましくは、これらの方法は、真核細胞、植物、または動物（たとえば、ヒトなどの哺乳動物）の1つまたは複数の標的遺伝子の発現を、毒性を誘導せずに特異的に阻害する。
【０００２】
二本鎖RNA（dsRNA）は、多くの異なる生物体において遺伝子サイレンシングを誘導することが示されてきた。遺伝子サイレンシングは、種々の機構で生じることがあり、その一つは、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）である。転写後の遺伝子サイレンシングでは、標的遺伝子座の転写は影響を受けないが、RNAの半減期が減少する。外因性のdsRNAは、線虫、トリパノソーマ、および昆虫を含む動植物におけるPTGSの強力な誘導因子として作用することが示されている。転写性の遺伝子サイレンシング（TGS）は、遺伝子発現を調節することができるもう一つの機構である。TGSでは、遺伝子の転写が阻害される。研究、治療、および予防の適用のためのハーネスdsRNAを介した遺伝子サイレンシングの可能性は非常に大きい。標的mRNA分解の精巧な配列特異性およびPTGSに関連する全身性の性質により、この現象は機能的なゲノミクスおよび薬剤開発に理想的となる。
【０００３】
遺伝子をサイレンスするために脊椎動物細胞でdsRNAを使用するためのいくつかの現法は、インターフェロン反応を含むdsRNAを介したストレス応答のために望ましくない非特異的な細胞障害性または細胞死を生じる。脊椎動物において種々の毒性、たとえばI型インターフェロン反応並びにその他のRNAストレス応答経路をトリガーするというdsRNAの能力のために、ヒトを含む脊椎動物系でRNAiを使用するには、潜在的な苦境が存在する。dsRNAを介したストレス応答の誘導は、迅速であり、細胞においてアポトーシスまたは抗増殖効果を生じるであろう。脊椎動物細胞においてdsRNAが毒性をトリガーする可能性に加えて、dsRNA遺伝子サイレンシング法は、非特異的なまたは非効率的なサイレンシングを生じる可能性もある。
【０００４】
dsRNAの実用的な実施に直面するもう一つのハードルは、dsRNA構造の非効率的な産生および送達、たとえばdsRNA発現構築物からのdsRNAの非効率的な産生の問題がある。このような問題の1つには、「ヘアピン」dsRNA（それは、一本の鎖内にセンスおよびアンチセンス配列を有する）の非効率的な産生を含み、これには、「ヘアピン」dsRNAをコードするdsRNA発現構築物からの発現の問題を含む。したがって、毒性または細胞死を誘導することなく特異的かつ効率的に標的遺伝子をサイレンシングするための改善された方法が必要である。さらに、改善されたdsRNA「ヘアピン」構築物、このようなdsRNAヘアピン構造を産生するための発現構築物、および前述のものを使用する方法の要求が存在する。望ましくは、これらの方法は、インビトロ試料、細胞培養、および無処理の動物（たとえば、哺乳動物などの脊椎動物）の遺伝子発現を阻害するために使用されてもよい。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
核酸
本発明は、図1A〜1Dおよび2A〜2Cにおいて図示したものなどの、特定の二次構造を有する核酸および核酸集団を特徴とする。これらの核酸集団は、標的核酸の発現を阻害する能力を有する核酸を単離するための種々のスクリーニング法に使用されてもよい。加えて、核酸は、真核細胞、植物、または動物において標的遺伝子をサイレンスするための本発明の任意の方法に使用することができる。
【０００６】
強制的ヘアピン
このような局面の1つにおいて、本発明は、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域を有するRNA（たとえば、部分的もしくは完全なヘアピン）をコードする核酸（たとえば、DNA分子もしくはベクター）または核酸集団を特徴とする。第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成される。望ましくは、核酸は、第2の塩基対形成領域の下流に第2の関心対象領域をさらに含む。第2の関心対象領域が存在する場合、第1および第2の関心対象領域は互いに塩基対形成される。望ましくは、第1および第2の関心対象領域のヌクレオチドの少なくとも50、60、70、80、90、95、または100%が互いとのワトソン-クリック塩基対形成に関与する。これらの2つの領域は、両者間で同じ長さであってもよく、または1つもしくは複数のヌクレオチドによって長さが異なっていてもよい。たとえば、1つの関心対象領域は、その他の関心対象領域のいずれの部分においてもヌクレオチドと塩基対形成されない領域の一端に、さらなるヌクレオチドを有してもよい。関連した局面において、本発明は、これらの核酸によってコードされるRNA分子またはRNA分子の集団を特徴とする。例示的には、RNA分子は、図1A〜1Dに図示してあり、第1および第2の塩基対形成領域は、「A」および「B」で示してあり、第1および第2の関心対象領域は、「センス」および「アンチセンス」で示してある。
【０００７】
上記局面の望ましい態様において、1つの関心対象領域は、標的遺伝子に対して実質的な同一性を有し、その他の関心対象領域は、標的遺伝子に対して実質的な相補性を有する。望ましくは、コードされるRNAは、細胞または動物における標的遺伝子の発現を阻害する。望ましい態様において、インビボまたはインビトロにおいて、関心対象領域が互いに塩基対形成されてヘアピン構造をとるRNA分子の数は、同じ条件下でこのようなヘアピン構造をとる対照RNA分子（たとえば、第1および第2の塩基対形成領域を欠いている分子）の数よりも少なくとも25、50、75、100、200、500、またはさらに1000%以上大きい。
【０００８】
部分的なヘアピン
もう一つの局面において、本発明は、一本鎖の突出を有する部分的なRNAヘアピンをコードする核酸（たとえば、DNA分子もしくはベクター）または核酸集団を特徴とする。コードされるRNA分子は、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、ループ領域、および第2の関心対象領域を有する。関心対象領域は、長さが異なっており、1つの関心対象領域は、その他の関心対象領域のヌクレオチドと塩基対形成しない領域の一端に、さらなるヌクレオチドを有する。1つの関心対象領域は、標的遺伝子に対して実質的な同一性を有し、その他の関心対象領域は、標的遺伝子に実質的な相補性を有する。関連した局面において、本発明は、これらの核酸によってコードされるRNA分子またはRNA分子の集団を特徴とする。例示的なRNA分子を図2Aに図示してあり、第1および第2の関心対象領域は、「センス」および「アンチセンス」で示してある。望ましくは、コードされるRNAは、細胞または動物における標的遺伝子の発現を阻害する。
【０００９】
ヘアピンを産生するための方法
また、本発明は、ヘアピンを作製するための方法を提供する。これらの方法は、一本鎖の突出を有する部分的なヘアピンを産生する段階と、一本鎖の突出の大きさを減少させるために部分的にヘアピンを伸長する段階とを含む。望ましい態様において、部分的なヘアピンの3'末端は、突出のない完全なヘアピンが作製されるように伸長される。
【００１０】
このような局面の1つにおいて、本発明は、RNAヘアピンを作製する方法を特徴とする。この方法は、部分的なヘアピンのもう一つの領域と塩基対形成された3'末端を有し、かつ5'突出を有する、部分的なヘアピンの3'末端を伸長する段階を含む。部分的なヘアピンは、インビトロまたはインビボで（たとえば、細胞または動物において）RNA依存性RNAポリメラーゼによって伸長される。望ましくは、部分的なヘアピンの伸長により、完全なヘアピンを生じる。
【００１１】
一部の態様において、部分的なヘアピンは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域を有する。この場合、第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成される。また、部分的なヘアピンは、（i）第2の塩基対形成領域の下流にある、（ii）長さが第1の関心対象領域よりも短い、および（iii）第1の関心対象領域との塩基対形成に関与する第2の関心対象領域を有していてもよい。望ましくは、第2の関心対象領域は、第1の関心対象領域と同じ長さであるように伸長される。第2の関心対象領域が存在しないか、または、第1の関心対象領域より短い上記の局面の任意のRNA分子をこの方法に使用することができ、RNA分子の3'末端の近くまたは3'末端におけるヌクレオチドが分子内の塩基対形成に関与するよう備えられる。望ましくは、最後の3'末端ヌクレオチドの少なくとも5、6、8、10、15、またはそれ以上が塩基対形成に関与する。望ましくは、合成されたヘアピンは、標的遺伝子に対して実質的な同一性を有する1つの関心対象領域と、標的遺伝子に対して実質的な相補性を有するもう一つの関心対象領域を有する。望ましくは、合成されたヘアピンは、細胞または動物における標的遺伝子の発現を阻害する。一部の態様において、遺伝子サイレンシングを生じる細胞または動物には、部分的なヘアピンまたは部分的なヘアピンをコードする核酸が投与され、部分的なヘアピンは、インビボで伸長される。この場合、細胞または動物がRNA依存性RNAポリメラーゼをまだ発現していない場合には、RNA依存性RNAポリメラーゼまたはRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする核酸も投与される。
【００１２】
一部の態様において、最初の、部分的なヘアピンは、部分的なRNAの範囲内の領域に対して実質的に相補的な配列（たとえば、少なくとも5、10、15、20、30、40、50、100、またはそれ以上のヌクレオチドの配列）で終結する部分的なヘアピンの産生を生じる転写終結配列を有するDNA分子の転写によって作製され、その結果部分的なヘアピンの3'末端ヌクレオチドのうちの少なくとも5、6、8、10、15、またはそれ以上が分子内の塩基対形成に関与する。特定の態様において、部分的なヘアピンは、核内のRNApolIIIによって転写され、DNA鋳型の少なくとも4、5、6、8、またはそれ以上のTヌクレオチドで終結する。この場合、これらのヌクレオチドの少なくとも4、5、6、8、10、またはそれ以上が、部分的なヘアピン内の「A」ヌクレオチドと塩基対形成する。
【００１３】
その他の態様において、最初の、部分的なヘアピンは、長いRNA分子の酵素切断によって作製される（たとえば、3'末端に除去されるヌクレオチドを有するより長い部分的なヘアピン）。一部の態様において、酵素（たとえば、制限酵素またはリボザイム）は、長いRNA分子を特定の部位（たとえば、制限酵素またはリボザイム切断部位）で切断して、分子の3'末端からヌクレオチドを除去し、これにより分子内の塩基対形成に関与する3'末端を有する部分的なヘアピンを生じる。特定の態様において、リボザイムは、長いRNA分子のループに位置し、RNA分子の3'末端のヌクレオチドをリボザイムを介した切断によってシスに除去して、部分的なヘアピンを生じる。その他の態様において、リボザイムは、長いRNA分子の3'末端で、またはその近くに位置し、リボザイムの上流の位置でシスにRNA分子を切断して、リボザイムのない部分的なヘアピンを生じる。その他の態様において、リボザイムは、分離した分子であり、長いRNA分子をトランスに切断して部分的なヘアピンを生じる。例示的なリボザイムは、ヘアピン、ハンマーヘッド、自己スプライシング（たとえば、テトラヒメナもしくはファージT4 tdイントロン）、およびHDVまたはRNasePを介したリボザイムを含む。
【００１４】
さらにその他の態様において、最初の、部分的なヘアピンは、長いRNA分子にDNA分子をハイブリダイズさせ、かつRNAse Hなどの酵素でDNA／RNAハイブリッドを切断することによって作製される。所望の部分的なヘアピンは、1つまたは複数の切断産物である。
【００１５】
上記の局面の核酸の望ましい態様
上記の局面の任意の種々の態様において、第1および第2の塩基対形成領域は、同じ長さであるか、または1つもしくは複数のヌクレオチドによって長さが異なる。一部の態様において、第1および／または第2の塩基対形成領域は、5〜15ヌクレオチド、16〜25ヌクレオチド、26〜50ヌクレオチド、51〜75ヌクレオチド、76〜100ヌクレオチド、101〜150ヌクレオチド、151〜200ヌクレオチド、201〜300ヌクレオチド、301〜400ヌクレオチド、または401〜1000ヌクレオチドの間の長さを含む。望ましくは、第1および第2の塩基対形成領域のヌクレオチドの少なくとも50、60、70、80、90、95、または100%は、互いとのワトソン-クリック塩基対形成に関与する。その他の望ましい態様において、第1の塩基対形成領域のヌクレオチドの30、20、10、または5%未満が、第1の塩基対形成領域のその他のヌクレオチドと塩基対を形成し、第2の塩基対形成領域のヌクレオチドの30、20、10、または5%未満が、第2の塩基対形成領域のその他のヌクレオチドと塩基対を形成する。一部の態様において、第1および／または第2の関心対象領域は、5〜15ヌクレオチド、15〜25ヌクレオチド、19〜26ヌクレオチド、25〜50ヌクレオチド、50〜75ヌクレオチド、75〜100ヌクレオチド、100〜150ヌクレオチド、150〜200ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、または400〜1000ヌクレオチドの間の長さを含む。その他の態様において、関心対象領域は、少なくとも1000、2000、3000、4000、5000、8000、10000、またはそれ以上の長さの核酸である。必要であれば、ループ中のヌクレオチドのいくつかまたは全てをランダム化してもよい。種々の態様において、ループは、少なくとも5、7、10、20、30、60、100、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の態様において、ループは、10000、8000、7000、5000、1000、500、または200未満のヌクレオチドを有する。望ましくは、ループ中の30、20、10、または5未満のヌクレオチドが、ループ中のその他のヌクレオチドと、または第1のまたは第2の塩基対形成領域のヌクレオチドと塩基対を形成する。また、部分的なまたは完全なヘアピンは、その他のループ、塩基対形成ヘリックスなどのその他の二次構造、または分子のいずれかの末端にさらなる配列を有していてもよい。
【００１６】
その他の好ましい態様において、核酸の集団は、複数のDNA分子または複数のRNA分子を含む。核酸は、天然に存在するか、または天然に存在しないポリヌクレオチド配列を有していてもよい。一部の態様において、核酸の領域；例えば、ループ、第1および第2の関心対象領域、または第1および第2の塩基対形成領域の全部または一部；は、集団のメンバーの一部または全ての間で異なる配列を含む。その他の態様において、ループ領域および／または第1および第2の関心対象領域の配列は、集団のメンバーの全てで同じである。ループまたは任意のその他の領域の長さは、集団のメンバー間で同じであってもよく、または異なっていてもよい。核酸の集団は、いかなる数の独特の分子を含んでもよい。たとえば、集団は、わずか10、102、109、または1011個独特の分子を含んでもよく、または1013、1014、1015個、もしくはそれ以上多くの独特の分子を含んでいてもよい。望ましい態様において、ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つは、天然に存在しない配列である。望ましくは、独特のポリヌクレオチド配列の少なくとも10、20、40、60、80、90、95、98、または100%が天然に存在しない配列である。核酸は、全部が同じ長さであっても、またはいくつかの分子で長さが異なっていてもよい。好ましくは、核酸は、少なくとも50、100、200、500、1000、またはそれ以上の塩基を含む。
【００１７】
薬学的組成物
また、本発明は、許容される媒体中に1つまたは複数のdsRNA分子またはdsRNA分子をコードする核酸（たとえば、部分的なまたは完全なヘアピン）を含む薬学的組成物を特徴とする。このような局面の1つにおいて、本発明は、任意の許容される媒体中に本発明の局面の1つまたは複数の核酸を含む薬学的組成物を特徴とする。
【００１８】
もう一つの局面において、本発明は、許容される媒体（たとえば、薬学的に許容される担体）中に、少なくとも1つの短いdsRNA（たとえば、1、2、3、5、8、10、20、30、またはそれ以上の種々の短いdsRNA種）および少なくとも1つの長いdsRNA（たとえば、1、2、3、5、8、10、20、30、またはそれ以上の種々の長いdsRNA種）を含む薬学的組成物を提供する。
【００１９】
種々の態様において、薬学的組成物は、それぞれのdsRNA分子（標的核酸に相同的なdsRNAおよび／または毒性を阻害するdsRNA）の所望の量を提供する約1ng〜約20mgの核酸、たとえばRNA、DNA、プラスミド、ウイルスベクター、組換えウイルス、またはこれらの混合物を含む。一部の態様において、組成物は、約10ng〜約10mgの核酸、約0.1mg〜約500mg、約1mg〜約350mg、約25mg〜約250mg、または約100mgの核酸を含む。必要に応じて、短いdsRNAの投与計画は、PKRおよび／またはその他のdsRNAを介したストレス応答の最適な阻害を達成するように調整されてもよく、その他のdsRNA（たとえば、長いdsRNA）の投与計画は、所望の配列特異的なサイレンシングを最適化するように調整されてもよい。従って、本発明の組成物は、異なる量の2つのdsRNA分子を含んでいてもよい。臨床薬理学の当業者であれば、ルーチン試験を使用してこのような投薬スケジュールに容易に想到することができよう。
【００２０】
適切な担体は、塩類溶液、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合わせをを含むが、これらに限定されない。組成物は、投与の様式に適応させることができる、たとえばピル、タブレット、カプセル、噴霧、粉末、または液体の形態であってもよい。一部の態様において、薬学的組成物は、選択された投与経路および様式に適した1つまたは複数の薬学的に許容される添加物を含む。これらの組成物は、以下に限定されないが、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、クモ膜下内を含む任意の非経口的経路、並びに局所的に、経口的に、並びに鼻腔内、吸入、直腸、膣、頬側、および舌下などの粘膜経路の送達によって投与されてもよい。一部の態様において、本発明の薬学的組成物は、注射、エマルジョン、粉末、エアロゾル、タブレット、カプセル、腸溶錠、または坐剤のために、無菌の非発熱性の液体を含む液体の形態で、脊椎動物（たとえば、哺乳動物）被験者に投与するために調製される。
【００２１】
dsRNA分子の合成または投与のためのキット
関連する局面において、本発明は、ヘアピンを作製するためのキットを提供する。キットは、（i）部分的なヘアピンまたは部分的なヘアピンをコードする核酸、および（i）RNA依存性RNAポリメラーゼまたはRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする核酸を含む。望ましい態様において、キットは、部分的なヘアピンの3'末端からヌクレオチドを除去して、3'末端のヌクレオチドの一部または全部が分子内の塩基対形成に関与する部分的なヘアピンを作製するための手段（たとえば、制限酵素、リボザイム、またはRNAseH、および部分的なヘアピンにハイブリダイズするDNA分子）も含む。
【００２２】
関連した局面において、本発明は、許容される媒体中に少なくとも1つの短いdsRNA（たとえば、1、2、3、5、8、10、20、30、またはそれ以上の種々の短いdsRNA種）および許容される媒体中に少なくとも1つの長いdsRNA（たとえば、1、2、3、5、8、10、20、30、またはそれ以上の種々の長いdsRNA種）を含むキットを提供する。キットによって、長いdsRNAの前に、同時に、または後に、短いdsRNAを投与することができる。一部の態様において、短いdsRNAは、長いdsRNAのために使用される投与とは異なる経路、送達系、様式、部位、または割合を使用して投与される。一部の態様において、本明細書に記載されているように、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００２３】
本発明の核酸を有する細胞
また、本発明は、本発明の核酸の1つまたは複数を有する細胞を特徴とする。このような局面の1つにおいて、本発明は、以下に限定されないが、（i）細胞の機能を調整する、（ii）細胞内の標的核酸（たとえば、内因性もしくは病原体遺伝子）の発現を調整する、および／または（iii）細胞内の標的タンパク質（たとえば、内因性もしくは病原体タンパク質）の生物活性を調整するdsRNAを含む、検出可能な表現型を調整するdsRNAを発現する細胞または細胞の集団を特徴とする。一部の態様において、このdsRNAは、本発明の方法を使用して部分的なヘアピンを伸長することによって作製される；たとえば、細胞に内因性または外因性のRNA依存性RNAポリメラーゼおよび部分的なヘアピンを発現させて、インビボで伸長させてもよい。その他の態様において、このdsRNAは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域（すなわち、標的遺伝子に対して実質的な同一性または相補性を有する領域）、第1の塩基対形成領域、ループ領域、第2の塩基対形成領域、および第2の関心対象領域を有する。第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成されており、第1および第2の関心対象領域は互いに塩基対形成される。その他の態様において、dsRNAは、細胞におけるベクターの複製を可能にする複製開始点を有するベクターによってコードされる。望ましくは、ベクターは、1、5、10、15、30、50、100、またはそれ以上の細胞分裂の後にも細胞の子孫に維持される。
【００２４】
望ましい態様において、細胞または細胞の集団は、1つまたは複数の短いdsRNA分子（たとえば、1、2、3、5、8、10、20、30、もしくはそれ以上の種々の短いdsRNA種）も有し、望ましくは、前者のdsRNAによるインターフェロン反応またはdsRNAストレス応答を阻害する。一部の態様において、細胞は、長いdsRNAの1つの分子種のみまたは長いdsRNAをコードするdsRNA発現ベクターの1つのコピー（たとえば、安定に組み込まれたベクター）のみを含む。望ましくは、細胞または細胞の集団は、本発明の1つまたは複数の方法を使用して作製される。その他の態様において、dsRNAは、インターフェロン反応またはdsRNAストレス応答を阻害するまたは防止する条件下で発現される。
【００２５】
細胞または動物の中の遺伝子発現を阻害するための方法
また、本発明は、あるとしても、ほんの少しの有毒副作用を生じる遺伝子をサイレンシングするための新規の方法を特徴とする。特に、これらの方法は、標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、かつ標的核酸の発現を特異的に阻害する1つまたは複数の二本鎖RNA（dsRNA）分子を提供する薬剤を、細胞または動物に投与する段階を含む。必要に応じて、標的核酸に対して実質的な同一性を有するdsRNAとは異なる1つまたは複数の短いdsRNA分子を提供する薬剤を、前者のdsRNAによって誘導される可能性のある毒作用または非特異的な遺伝子サイレンシングを阻害するために投与する。一部の態様において、薬剤は、上記局面のいずれかの核酸または薬学的組成物である。
【００２６】
従って、そのような局面の1つにおいて、本発明は、細胞（たとえば、真核細胞、植物細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞などの脊椎動物細胞、または病原体細胞）における標的核酸の発現を阻害するための方法を特徴とする。この方法は、標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、かつ標的核酸の発現を特異的に阻害する第1のdsRNAを細胞に提供する第1の薬剤を細胞に導入する段階を含む。例示的な病原体は、細菌および酵母を含む。一部の態様において、第1のdsRNAは、脊椎動物細胞または病原体細胞（たとえば、細菌もしくは酵母細胞）の内因性核酸の発現を阻害し、または病原体に感染した細胞における病原体核酸の発現を阻害する。
【００２７】
上記の局面の一部の態様において、短い第2のdsRNAを細胞に提供する第2の薬剤は、細胞にも導入される。短い第2のdsRNAは、第1のdsRNAとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性（dsRNA-mediated toxicity）を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。
【００２８】
もう一つの局面において、本発明は、動物（たとえば、無脊椎動物または哺乳動物もしくはヒトなどの脊椎動物）における標的核酸の発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、第1のdsRNAを動物に提供する第1の薬剤を動物に導入する段階を含む。第1のdsRNAは、標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、標的核酸の発現を特異的に阻害する。一部の態様において、第1のdsRNAは、動物における内因性核酸の発現を阻害するか、または病原体（たとえば、細菌、酵母、もしくはウイルス）に感染した動物における病原体核酸の発現を阻害する。
【００２９】
上記の局面の一部の態様において、短い第2のdsRNAを動物に提供する第2の薬剤が動物に投与される。短い第2のdsRNAは、第1のdsRNAとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。上記の局面の一部の態様において、本明細書に記載されているように、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００３０】
遺伝子発現動物を阻害することによって疾患を治療または予防するための方法
さらにもう一つの局面において、本発明は、動物（たとえば、無脊椎動物または哺乳動物もしくはヒトなどの脊椎動物）の疾患または障害を治療する、安定化する、または防止するための方法を提供する。この方法は、第1のdsRNAを動物に提供する第1の薬剤を動物に導入する段階を含む。第1のdsRNAは、疾患または障害に関連する標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、かつ標的核酸の発現を特異的に阻害する。一部の態様において、標的遺伝子は、発癌遺伝子などの癌関連遺伝子、または変異タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、もしくは過剰発現されたタンパク質などの疾患関連タンパク質をコードする遺伝子である。
【００３１】
上記の局面の種々の態様において、短い第2のdsRNAを動物に提供する第2の薬剤も動物に投与される。短い第2のdsRNAは、第1のdsRNAとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。上記の局面の一部の態様において、本明細書に記載されているように、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００３２】
上記の方法を使用して治療し、安定化し、または予防することができる例示的な癌は、前立腺癌、乳癌、卵嚢癌、膵癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、胃腸の癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、および癌腫を含む。また、良性腫瘍は、本発明の方法を使用して治療、または予防されうる。標的とされ得るその他の癌および癌関連遺伝子は、たとえば国際公開公報第00/63364号、国際公開公報第00/44914号、および国際公開公報第99/32619号に開示されている。
【００３３】
疾患に関連するであろう例示的な内因性のタンパク質は、SLE（全身紅斑性エリテマトーデス）において見いだされるANA（抗核抗体）、IgGおよびIgAを含む異常な免疫グロブリン、種々の多発性骨髄腫に関連するベンス‐ジョーンズタンパク質、並びに遺伝性アミロイド症およびアルツハイマー病を含む種々のアミロイド症における異常なアミロイドタンパク質を含む。ハンチントン病では、HD（ハンチントン）遺伝子の遺伝的異常により、反復グルタミン残基の拡張域を生じる。この突然変異遺伝子に加えて、HD患者は、正常サイズのCAG反複を有する第4染色体のコピーを有する。したがって、本発明の方法は、正常遺伝子ではなく、異常な遺伝子をサイレンシングするために使用することができる。種々の態様において、病原性タンパク質をコードする核酸は、長いdsRNAを使用してサイレンシングされ、短いdsRNAは、長いdsRNAの投与に関連する可能性のあるdsRNAストレス応答を遮断するために使用される。
【００３４】
動物の遺伝子発現を阻害することによって感染を治療または予防するための方法
さらに別の局面において、本発明は、動物（たとえば、無脊椎動物または哺乳動物もしくはヒトなどの脊椎動物）における感染を治療する、安定化する、または予防するための方法を特徴とする。この方法は、動物に対して第1のdsRNAを提供する第1の薬剤を動物に導入する段階を含む。第1のdsRNAは、感染性の病原体（たとえば、ウイルス、細菌、または酵母）、または病原体に感染した細胞の標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、標的核酸の発現を特異的に阻害する。種々の態様において、病原体は、細胞内または細胞外の病原体である。一部の態様において、標的核酸は、複製および／または病原性に必要な病原体の遺伝子、または細胞が病原体に感染するために必要な細胞受容体をコードする遺伝子である。
【００３５】
上記の局面の一部の態様において、動物に対して短い第2のdsRNAを提供する第2の薬剤も、また、動物に投与される。短い第2のdsRNAは、第1のdsRNAとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。上記の局面の一部の態様において、本明細書に記載されているように、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００３６】
上記局面のいずれかのさらなる態様において、dsRNAまたはdsRNAをコードする核酸を投与する方法は、患者に留置装置（in-dwelling device）の投与前に、投与時に、または投与後に、留置装置を薬剤と接触させる段階を含む。留置装置は、外科用インプラント、補綴装置、およびカテーテル、すなわち個々の体に導入され、長時間適所におかれたままである装置を含むが、これらに限定されない。たとえば、このような装置は、人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管の移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、泌尿器カテーテル、および連続的携行式腹膜透析（CAPD）カテーテルを含む。望ましくは、dsRNAは、装置における細菌の増殖を予防する。一部の態様において、第1のdsRNAは、細菌細胞、細菌に感染した細胞、または細菌に感染した動物における細菌核酸の発現を阻害する。
【００３７】
その他の望ましい態様において、細菌感染は、以下の細菌の1つまたは複数による：クラミドフィラ・ニューモニア（Chlamydophila pneumoniae）、オウム病クラミジア（C.psittaci）、流産菌（C.abortus）、トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis）、シムカニア・ネガベンシス（Simkania negevensis）、パラクラミジア・アカントアメーバ（Parachlamydia acanthamoebae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、P.アルカリゲネス（P.alcaligenes）、P.クロロラフィス（P.chlororaphis）、P.フルオレッセンス（P.fluorescens）、P.ルテオラ（P.luteola）、P.メンドニカ（P.mendocina）、P.モンテイリ（P.monteilii）、P.オリジハビタンス（P.oryzihabitans）、P.ペルトシノゲナ（P.pertocinogena）、P.プソイドアルカリゲネス（P.pseudalcaligenes）、P.プチダ（P.putida）、P.スツツゼリ（P.stutzeri）、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Aeromonas hydrophilia）、大腸菌（Escherichia coli）、シトロバクター・フロインジ（Citrobacter freundii）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、S.チフス（S.typhi）、パラチフス菌（S.paratyphi）、腸炎菌（S.enteritidis）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレキシネリ赤痢菌（S.flexneri）、ゾンネ赤痢菌（S.sonnei）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、E.アイロゲネス（E.aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、K.オキシトカ（K.oxytoca）、霊菌（Serratia marcescens）、フランキセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、モルガネラ・モエガニ（Morganella morganii）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・バルガリス（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、P.レトゲリ（P.rettgeri）、P.スアルチ（P.stuartii）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、A.ヘモリティカス（A.haemolyticus）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Y.pestis）、偽結核菌（Y.pseudotuberculosis）、Y.インターメディア（Y.intermedia）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（B.parapertussis）、B.ブロンキセプチカ（B.bronchiseptica）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌（H.parainfluenzae）、H.ヘモリチカス（H.haemolyticus）、H.パラヘモリチカス（H.parahaemolyticus）、軟性下疳菌（H.ducreyi）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、P.ヘモリチカ（P.haemolytica）、ブランハメラ・カタリハリス（Branhamella catarrhalis）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、カンピロバクター・フィータス（Campylobacter fetus）、C.ジェジュニ（C.jejuni）、C.コリ（C.coli）、ボレリア・バルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、V.コレラ（V.cholerae）、腸炎ビブリオ菌（V.parahaemolyticus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、淋菌（Neisseria gonorrhea）、髄膜炎菌（N.meningitidis）、キンゲラ・デントリフィカンス（Kingella dentrificans）、K.キンゲ（K.kingae）、K.オラリス（K.oralis）、モラクセラ・カタハリス（Moraxella catarrhalis）、M.アトランテ（M.atlantae）、ヒト結膜炎菌（M.lacunata）、M.ノンリクエファシエンス（M.nonliquefaciens）、M.オスロエンシス（M.osloensis）、M.フェニルピルビカ（M.phenylpyruvica）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、バクテロイダス・フラギリス（Bacteroidas fragilis）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス3452A相同群（Bacteroides 3452A homology group）、バクテロイデス・バルガタス（Bacteroides vulgatus）、B.オバラス（B.ovalus）、B.テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）、B.ユニホルミス（B.uniformis）、B.エゲルチ（B.eggerthii）、B.スプランクニカス（B.splanchnicus）、クロストリジウム・ジフィシル（Clostridium difficile）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、M.アビウム（M.avium）、M.イントラセルラレ（M.intracellulare）、癩菌（M.leprae）、ジフテリア菌（C.diphtheriae）、C.ウルセランス（C.ulcerans）、C.アコレンス（C.accolens）、C.アフェルメンタンス（C.afermentans）、C.アミコラタム（C.amycolatum）、C.アルゲントレンス（C.argentorense）、C.アウリス（C.auris）、C.ボビス（C.bovis）、C.コンフサム（C.confusum）、C.コイリエ（C.coyleae）、C.デュラム（C.durum）、C.ファルセニ（C.falsenii）、C.グルクロノリチカム（C.glucuronolyticum）、C.イミタンス（C.imitans）、C.ジェイケイウム（C.jeikeium）、C.クトシェリ（C.kutscheri）、C.クロペンステドチ（C.kroppenstedtii）、C.リポフィラム（C.lipophilum）、C.マギンリー（C.macginleyi）、C.マトルコチ（C.matruchoti）、C.ムシファシエンス（C.mucifaciens）、C.ピロサム（C.pilosum）、C.プロピンクム（C.propinquum）、C.レナル（C.renale）、C.リーゲリ（C.riegelii）、C.サンギニス（C.sanguinis）、C.シンギュラレ（C.singulare）、C.ストリアタム（C.striatum）、C.サンドバレンス（C.sundsvallense）、C.ソムセニ（C.thomssenii）、C.ウレアリチカム（C.urealyticum）、C.ゼロシス（C.xerosis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、S.アガラクチエ（S.agalactiae）、S.ピロゲネス（S.pyogenes）、トリ腸球菌（Enterococcus avium）、E.カッセリフラバス（E.casseliflavus）、E.セコラム（E.cecorum）、E.ジスパー（E.dispar）、E.ヂュランス（E.durans）、E.フェカリス（E.faecalis）、E.フェシウム（E.faecium）、E.フラベセンス（E.flavescens）、E.ガリナラム（E.gallinarum）、E.ハイラエ（E.hirae）、E.マロドラタス（E.malodoratus）、E.ムンドチ（E.mundtii）、E.シュードアビウム（E.pseudoavium）、E.ラフィノサス（E.raffinosus）、E.ソリタリウス（E.solitarius）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、S.サプロフィチカス（S.saprophyticus）、S.インターメヂウス（S.intermedius）、S.ハイカス（S.hyicus）、S.ヘモリチカス（S.haemolyticus）、S.ホミニス（S.hominis）、および／またはS.サッカロリチカス（S.saccharolyticus）。好ましくは、dsRNAは、病原体の増殖を予防する、安定化する、もしくは阻害するため、または病原体を死滅させるために十分な量で投与される。一部の態様において、第1のdsRNAは、酵母細胞、酵母に感染した細胞、または酵母に感染した動物における酵母核酸の発現を阻害する。
【００３８】
望ましい態様において、本発明の方法に関連するウイルス感染は、以下のウイルスの1つまたは複数による感染である：B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、HIV、コクサッキーウイルス、1型および2型単純ヘルペスウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ミクソウイルス、JCウイルス、コクサッキーウイルスB、トガウイルス、はしかウイルス、パラミクソウイルス、エコーウイルス、ブニアウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、狂犬病ウイルスを含むラボドウイルス（rhabodoviruses）、シミアンウイルス40、ヒト・ポリオーマウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、霊長類アデノウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ならびに／またはBKウイルス。一部の態様において、第1のdsRNAは、ウイルスに感染した細胞または動物におけるウイルス核酸の発現を阻害する。
【００３９】
DNAウイルスまたは中間にDNA期を有するウイルスは、本発明の治療的および予防的な方法に特に適している。このようなウイルス種の中には、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルスを含むが、これらに限定されない。特に本方法で治療するためにより望ましいウイルスのいくつかには、HIV、BBV、HSV、CMV、HPV、HTLV、およびEBVを含むが、これらに限定されない。本方法に使用される薬剤は、哺乳動物の細胞に少なくとも部分的に本明細書に記載されている二本鎖RNA分子を提供し、これには、標的ポリヌクレオチド（感染した哺乳動物細胞におけるウイルス複製および／または病原性のために必要なウイルス・ポリヌクレオチド配列である）に実質的に相同的な二本鎖の配列を含む。このような標的の中で、ポリヌクレオチド配列は、ウイルスの増殖のために必要なタンパク質のために配列、たとえばHIVのgag、env、およびpol遺伝子、HPV6 LIおよびE2遺伝子、HPVII LIおよびE2遺伝子、HPV16 E6およびE7遺伝子、BPV18 E6およびE7遺伝子、HBV表面抗原、HBVコア抗原、HBV逆転写酵素、HSV gD遺伝子、HSV vp16遺伝子、HSV gC、gH、gL、およびgB遺伝子、HSV ICPO、ICP4およびICP6遺伝子、水痘帯状疱疹gB、gC、およびgH遺伝子、並びにBCR-abl染色体配列をコードするタンパク質、並びに細胞から細胞に感染移動するために必要な調節機能を提供する非コードウイルスポリヌクレオチド配列、たとえばHIV LTR、および特にHSV vp16プロモーター、HSV ICPOプロモーター、HSV ICP4、ICP6、およびgDプロモーター、HBV表面抗原プロモーター、HBVプレゲノムのプロモーターなどのその他のウイルスのプロモーター配列である。
【００４０】
したがって、本方法は、HIVなどのウイルスにすでに感染した哺乳動物被験者を治療するため、HIV gagなどの、ウイルスの複製および／または病原性に必須なウイルスの遺伝子機能を停止させるか、または阻害するために使用することができる。または、本方法は、潜伏ウイルスとして哺乳動物に存在するウイルス、たとえば水痘帯状疱疹ウイルス、および帯状疱疹として知られる疾患の原因因子であるウイルスの機能を阻害するために使用することができる。同様に、アテローム性動脈硬化症、潰瘍、慢性疲労症候群、および自己免疫性疾患などの疾患、HSV-1およびHPV-2の再発、HPV持続感染、たとえば生殖器のいぼ、特に少なくとも一部において、ウイルス、細菌、もしくは別の病原体によって引き起こされることが示されている慢性BBV感染は、哺乳動物の被験者におけるウイルスの複製および／または病原性に必須の特定のウイルス・ポリヌクレオチド配列を標的とすることによって、この方法に従って治療することができる。
【００４１】
本発明の上記「抗ウイルス性の」方法のさらに別の類似の態様は、哺乳動物においてウイルスで誘導される癌の治療または予防のための方法を含む。このような癌は、特にHPV E6／E7ウイルス誘導性子宮頚癌、HTLV誘導性癌、およびバーキット・リンパ腫などのEBV誘導性癌を含む。本方法は、本明細書に記載されているように、哺乳動物に対して組成物を投与することによって達成される。組成物中の標的ポリヌクレオチドは腫瘍抗原もしくはこれらの機能的な断片をコードする配列、または非発現制御配列であり、その抗原または配列の機能は、哺乳動物における腫瘍の維持に必要とされる。このような配列の中には、HPV16 E6およびE7配列並びにHPV18 E6およびE7配列を含むが、これらに限定されない。その他のものも当業者によれば容易に選択されるであろう。組成物は、哺乳動物における抗原の機能を減少させるまたは阻害するために有効な量で投与され、好ましくは、本明細書に記載したとおりの組成物成分、用量、および投与経路を使用する。
【００４２】
もう一つの局面において、本発明は、移植細胞、組織、または器官に対する免疫応答を減少させるまたは予防するための方法を特徴とする。本方法は、移植細胞、組織、または器官に第1のdsRNAを提供する第1の薬剤を投与する段階を含む。第1のdsRNAは、レシピエントにおける移植細胞、組織、または器官の免疫応答を誘発し得る標的核酸の発現を減少させる。一部の態様において、dsRNA分子を提供する薬剤は、レシピエントに投与されて、投与がなければ移植体に対する有害な免疫応答に関与するであろう内因性核酸の発現を阻害する。
【００４３】
上記の局面の種々の態様において、短い第2のdsRNAを提供する第2の薬剤は、また、移植細胞、組織、または器官に投与される。2002年4月26日に出願された米国特許出願第60/375,636号および2003年4月28日出願の米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子をサイレンシングする方法（Methods of Silencing Genes Without Inducing Toxicity）」C.Pachukの開示を参照されたい。これは、参照として本明細書に組み入れらる。短い第2のdsRNAは、第1のdsRNAとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。
【００４４】
上記の局面のいずれかの望ましい態様において、第1のdsRNAは、標的核酸の発現を少なくとも20、40、60、80、90、95、または100%まで阻害する。一部の態様において、異なる核酸と実質的に同一である複数の第1のdsRNA分子を、複数の標的核酸の発現を阻害するために細胞または動物に投与する。その他の態様において、異なる標的遺伝子に対して実質的な同一性を有する部分を有する複数のエピトープの第1のdsRNAを投与して、複数の標的遺伝子をサイレンスする。たとえば、複数の発癌遺伝子または複数の病原体遺伝子を同時にサイレンスしてもよい。
【００４５】
上記の局面のいずれかの種々の態様において、第1の薬剤および／または第2の薬剤は、DNA分子、またはdsRNAをコードするDNAベクターである。その他の態様において、第1の薬剤および／または第2の薬剤は、dsRNA、細胞または動物の内部で二本鎖の高次構造が想定される一本鎖RNA分子（たとえば、部分的なもしくは完全なヘアピン）、または同時もしくは経時的に投与され、かつ細胞または動物の内部で二本鎖の高次構造が想定される2つの一本鎖のRNA分子の組み合わせである。第1の薬剤は、第2の薬剤の投与前、投与時、または投与後に投与されてもよい。一部の態様において、第1および第2の薬剤は、両方のdsRNA分子をコードする同じ核酸または同じベクターである。種々の態様において、第1の薬剤は、細胞または動物に短いdsRNAまたは長いdsRNAを提供する。上記の局面の一部の態様において、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、本明細書に記載されている強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００４６】
一部の態様において、サイトカインも細胞または動物に投与される。例示的なサイトカインは、2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号に開示さている。一部の態様において、標的核酸の発現が増大されて、dsRNAの増幅が促進し、さらにdsRNAが生じて標的遺伝子がサイレンスされる。たとえば、標的核酸を含むベクターは、第1および／または第2の薬剤の投与前、投与時、または投与後に、細胞または動物に投与することができる。
【００４７】
dsRNA発現ライブラリーを細胞にトランスフェクトすることによって関心対象の核酸を同定するための方法
また、本発明は、細胞の検出可能な表現型に関連した核酸、たとえば本明細書の細胞の機能、標的核酸の遺伝子発現、または標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸を同定するためのdsRNAを介した遺伝子サイレンシングを使用するハイスループット法を特徴とする。本方法は、細胞（たとえば、観察可能な表現型または生物活性、たとえば標的ポリペプチドによって媒介されるか、または遺伝子発現を変化させる活性を有する一次細胞または株化細胞）に由来する特別に構築されたcDNAライブラリー（細胞にトランスフェクトして遺伝子発現を阻害する）の使用を含む。本方法による遺伝子発現の阻害により、検出可能な表現型、たとえば細胞の機能、標的核酸の遺伝子発現、または標的ポリペプチドの生物活性を変え、変化または調整の原因となる核酸を容易に同定することができる。本方法は、また、ゲノムライブラリーを利用してもよい。望ましくはないが、本方法はまた、たとえば米国特許第5,639,595号（その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているように、ランダム化された核酸配列または機能が既知でない所与の配列を利用してもよい。
【００４８】
従って、一つの局面において、本発明は、細胞の検出可能な表現型の調整に関連する核酸（たとえば、細胞の機能を調整する、細胞における標的核酸の発現を調整する、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸）を同定するための方法を特徴とする。本方法は、以下を含む：（a）dsRNA発現ライブラリーで細胞集団を形質転換する段階、ここで、細胞集団の少なくとも2つの細胞は、それぞれdsRNA発現ライブラリーとは異なる核酸分子で形質転換されており、かつ少なくとも1つのコードされたdsRNAは、少なくとも1つの細胞の標的核酸の発現を特異的に阻害する；（b）核酸が細胞に発現されている細胞を任意に選択する段階；および、（c）細胞の検出可能な表現型の調整についてアッセイする段階を含み、ここで調整の検出により、細胞の検出可能な表現型に関連する核酸を同定する。望ましい態様において、細胞の機能の調整についてのアッセイ法は、細胞運動性、アポトーシス、細胞増殖、細胞侵襲、血管新生、細胞周期事象、細胞分化、細胞脱分化、ニューロン細胞再生、または細胞がウイルスの複製を補助する能力の測定を含む。
【００４９】
必要であれば、短いdsRNAまたは短いdsRNAをコードする核酸（たとえば、ベクター）、を細胞に投与して、dsRNA発現ライブラリーによるインターフェロン反応を誘導する可能性による副作用を阻害する。たとえば、2003年4月28日に出願された米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子をサイレンシングする方法（Methods of Silencing Genes Without Inducing Toxicity）」C.Pachukを参照されたい（参照により本願明細書に組み込まれる）。短い第2のdsRNAは、dsRNA発現ライブラリーとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。
【００５０】
これらの局面の一部の態様において、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、本明細書に記載されているように、強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００５１】
本発明の上記局面のいずれかの一つの態様において、形質転換工程（a）では、核酸が細胞の染色体に安定に組み込まれる。核酸の組込みは、ランダムであっても、または部位特異的であってもよい。望ましくは、組込みは、組換えまたはレトロウイルスの挿入によって媒介される。加えて、核酸の単一コピーが望ましく染色体に組み込まれ、安定に発現される。本発明の上記局面のいずれかのもう一つの態様において、工程（a）では、細胞集団の少なくとも50、より望ましくは100；500；1000；10,000；または50,000細胞が、それぞれのdsRNA発現ライブラリーからの異なる核酸で形質転換される。望ましくは、発現ライブラリーは、トランスフェクトした細胞またはトランスフェクトした細胞と同じ細胞種の細胞に由来する。その他の態様において、細胞の集団は、少なくとも5%、より望ましくは少なくとも25%、50%、75%、または90%、および最も望ましくは少なくとも95%のdsRNA発現ライブラリーにおいて形質転換される。
【００５２】
本発明の上記局面のいずれかのその他の態様において、dsRNA発現ライブラリーは、cDNA分子またはランダム化された核酸を含む。dsRNA発現ライブラリーは、核dsRNA発現ライブラリーであってもよく、この場合、二本鎖の核酸が核に作製される。または、dsRNA発現ライブラリーは、細胞質のdsRNA発現ライブラリーであってもよく、この場合、二本鎖の核酸が細胞質に作製される。加えて、dsRNA発現ライブラリーからの核酸は、インビトロでまたはインビボで作製されてもよい。加えて、同定された核酸配列は、細胞の細胞質または核に位置していてもよい。
【００５３】
本発明の上記局面のいずれかのさらに別の態様において、核酸は、ベクター（たとえば、dsRNA発現ベクター）に含まれる。次いで、ベクターは、細胞の染色体に安定に組み込まれるように、または細胞内でエピソームの（非組み込み）発現ベクターとして機能するように、形質転換されてもよい。一つの態様において、細胞の染色体に組み込まれるベクターは、動作可能にヘアピンまたはdsRNAをコードする核酸に結合されたプロモーターを含む。もう一つの態様において、ベクターは、動作可能にdsRNAをコードする核酸に結合されたプロモーターを含まない。この後者の態様において、ベクターは、内因性プロモーターがdsRNAをコードするベクター由来の核酸に対して動作可能に結合されるように、細胞の染色体に組み込まれる。
【００５４】
望ましくは、dsRNA発現ベクターは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIプロモーター、たとえばヒトCMV最初期プロモーター（HCMV-IE）またはサルCMV（SCMV）プロモーター、および／または少なくとも1つのRNAポリメラーゼIプロモーター、および／または少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む。また、プロモーターは、T7プロモーターであってもよく、この場合、細胞はT7ポリメラーゼをさらに含む。または、プロモーターは、SP6プロモーターであってもよく、この場合、細胞はSP6ポリメラーゼをさらに含む。また、プロモーターは、1つの収束性のT7プロモーターおよび1つの収束性のSP6プロモーターであってもよい。細胞は、T7ポリメラーゼまたはSP6ポリメラーゼ発現プラスミドで細胞を形質転換することによって、それぞれT7またはSP6ポリメラーゼを含むように作製されてもよい。一部の態様において、T7プロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターは、動作可能に短いdsRNAをコードする核酸（たとえば、長さが200、150、100、75、50、または25ヌクレオチド未満のdsRNA）に結合される。その他の態様において、プロモーターはベクター（たとえば、第2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号において記載されているミトコンドリアのプロモーターを参照されたい）の中の核酸の細胞質の転写ができるミトコンドリアのプロモーターである。または、プロモーターは、lac（Croninら、Genes & Development 15：1506-1517, 2001）、ara（Khlebnikovら、J Bacteriol. 2000 Dec；182（24）：7029-34）、エクジソン（ecdysone）（Rheogeneウェブサイト）、RU48（mefepristone）（副腎皮質ステロイド・アンタゴニスト）（Wang XJ, Liefer KM, Tsai S, O'Malley BW, Roop DR, Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jul 20； 96 （15）：8483-8）、もしくはtetプロモーター（Rendalら、Hum. Gene Ther. 2002； 13（2）：335-42およびLarnartinaら、Hum.Gene Ther. 2002；13（2）：199-210）、または2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号に開示されたプロモーターなどの誘導性プロモーターである。望ましい態様において、誘導性プロモーターは、全てのエピソームのベクターが細胞から除去されるまで誘導されない。また、ベクターは、選択可能なマーカーを含んでいてもよい。
【００５５】
特定の態様において、dsRNA発現ライブラリーによってコードされるdsRNAは、長さが11〜40ヌクレオチドの間であり、その配列がPKRまたはdsRNAを介したストレス応答経路の別のタンパク質に対して親和性であるので、本発明の短いdsRNAの非存在下で、脊椎動物の細胞に毒性を誘導する。本発明の短いdsRNAは、この毒性を阻害する。
【００５６】
さらに本発明の上記局面のいずれかの他の態様において、細胞およびベクターはそれぞれ、loxP部位をさらに含み、loxP部位間の組換えを介して細胞の染色体への核酸の部位特異的な組込みを生じる。加えて、本方法は、Creを介した二重組換えにより核酸を救出することをさらに含む。
【００５７】
さらに本発明の上記局面のいずれかのもう一つの態様において、細胞は、親細胞に由来し、（a）選択可能なマーカーおよびリポーター遺伝子を発現し、かつloxP部位を含む2シストロン性（bicistronic）プラスミドで親細胞の集団を形質転換する段階；（b）プラスミドが安定に組み込まれた細胞を選択する段階；および、（c）1コピーのプラスミドが転写的に活性な遺伝子座に安定に組み込まれた細胞を選択する段階によって作製される。望ましくは、選択可能なマーカーは、G418であり、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（GFP）である。これらの方法は、公開された米国特許出願第2002/0132257号および公開された欧州特許出願第1229134号「細胞の機能を調整する核酸配列を同定するための転写後の遺伝子サイレンシングの使用（Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell）」により詳細に開示されており、これらの開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【００５８】
dsRNA分子で細胞をトランスフェクトすることによって関心対象の核酸を同定するための方法
dsRNA発現ライブラリーを利用する上記スクリーニング法に加えて、本発明は、標的遺伝子に対して実質的な配列同一性を有し、標的遺伝子の発現を阻害する1つまたは複数のdsRNA分子を利用するスクリーニング法を提供する。必要に応じて、また、インターフェロン反応を阻害するために1つまたは複数の短いdsRNA分子を投与することができる。望ましくは、本方法は、インターフェロン反応またはdsRNAストレス応答を阻害する、または予防する条件下で行われる。
【００５９】
このような局面の1つにおいて、本発明は、細胞の検出可能な表現型を調整する核酸（たとえば、細胞の機能を調整する、細胞の標的核酸の発現を調整する、または細胞の標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸）を同定するための方法であって、（a）第1のdsRNAで細胞集団を形質転換する段階；（b）核酸が発現される細胞を任意に選択する段階；および、（c）細胞の検出可能な表現型の調整についてアッセイする段階を含む方法を特徴とする。第1のdsRNAは、細胞の標的核酸に対して実質的な配列同一性を有し、標的核酸の発現を特異的に阻害する。望ましい態様において、標的核酸は、DNAアレイ技術を使用してアッセイされる。望ましい態様において、細胞の機能の調整についてのアッセイ法は、細胞運動性、アポトーシス、細胞増殖、細胞侵襲、血管新生、細胞周期事象、細胞分化、細胞脱分化、ニューロン細胞再生、または細胞がウイルスの複製を補助する能力の測定を含む。
【００６０】
上記の局面の種々の態様において、短い第2のdsRNAまたは短い第2のdsRNAをコードする核酸も、細胞に投与される。短い第2のdsRNAは、第1のdsRNAとは異なり、インターフェロン反応またはdsRNA介在毒性を阻害する。一部の態様において、短い第2のdsRNAは、PKRに結合し、PKRの二量体化および／または活性化を阻害する。2003年4月28日に出願された米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子をサイレンシングする方法（Methods of silencing Genes Withiout Inducing Toxicity）」C.Pachukの開示を参照されたい（参照により本願明細書に組み込まれる）。上記の局面の一部の態様において、短いdsRNAおよび／または長いdsRNAは、本明細書に記載されているとおりの強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００６１】
本発明の種々の局面のいずれかのさらなる態様
本発明の上記局面のいずれか一つの態様において、細胞の集団の少なくとも2、より望ましくは50；100；500；1000；10,000；または50,000細胞は、それぞれの異なるdsRNAで形質転換される。望ましくは、多くても1つの第1のdsRNA（たとえば、1つの長いdsRNA）がそれぞれの細胞に挿入される。その他の態様において、細胞の集団は、少なくとも5%、より望ましくは少なくとも25%、50%、75%、もしくは90%、および最も望ましくは少なくとも95%のdsRNA発現ライブラリーまたはdsRNAライブラリーで形質転換される。さらにもう一つの態様において、本方法は、増幅することによって核酸配列を同定する段階と、配列をクローニングする段階とをさらに含む。望ましくは、配列の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）の使用を含む。
【００６２】
望ましいベクター
本発明の種々の局面のいずれかのさらに別の態様において、核酸は、ベクター、たとえばdsRNAを形成することができるdsRNA発現ベクターに含まれる。望ましくは、dsRNA発現ベクターは、少なくとも1つのプロモーターを含む。プロモーターは、T7プロモーターであってもよく、この場合、細胞はT7ポリメラーゼをさらに含む。または、プロモーターはSP6プロモーターであってもよく、この場合、細胞はSP6ポリメラーゼをさらに含む。プロモーターは、また、1つの収束性のT7プロモーターおよび1つの収束性のSP6プロモーターであってもよい。細胞は、T7ポリメラーゼまたはSP6ポリメラーゼ発現プラスミドで細胞を形質転換することによって、それぞれT7またはSP6ポリメラーゼを含むように作製されてもよい。また、ベクターは、選択可能なマーカー、たとえばハイグロマイシンを含んでいてもよい。一部の態様において、同じベクターがdsRNAおよびポリメラーゼ（たとえば、T7またはSP6ポリメラーゼ）をコードする。
【００６３】
望ましくは、本発明の方法に使用するベクターにおいて、核酸配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、2つの収束性のプロモーターを使用して同じ核酸配列から転写される。もう一つの望ましい態様において、本発明の上記局面のいずれかに使用するためのベクターにおいて、核酸配列は、転写により核酸がdsRNAを形成するように、逆方向の反復を含む。望ましい態様において、dsRNAは、本明細書に記載されているとおりの強制的もしくは部分的なヘアピンまたは強制的もしくは部分的なヘアピンをコードする核酸である。
【００６４】
その他の望ましいベクターは、核局在化によってDNAベクターを複製させることができる複製開始点（SV40 T起源、EBNA起源、または哺乳動物起源などの）を有する。望ましくは、複製開始点を有するベクターまたは細胞内の別のベクターもしくは染色体は、細胞においてベクターを複製することができるSV40 TAgまたはEBNAなどのアクセサリー因子をコードする。
【００６５】
望ましいdsRNA分子
上記局面のいずれかの望ましい方法は、本発明の1つもしくは複数のdsRNA分子（たとえば、完全なもしくは部分的なヘアピン）、または1つもしくは複数のベクターを使用する。一部の態様において、dsRNAは、コード配列、非コード配列、またはこれらの組み合わせを含む。TGS適用については、dsRNAは、望ましくは制御配列（たとえば、転写因子結合部位、プロモーター、および／またはmRNAの5'もしくは3'非翻訳領域（UTR））および／またはコード配列を含む。PTGS適用については、dsRNAは、望ましくは制御配列（たとえば、mRNAの5'もしくは3'非翻訳領域（UTR））および／またはコード配列を含む。一部の態様において、同じdsRNAがTGSおよびPTGSを介する。その他の態様において、TGSを介する1つまたは複数のdsRNA分子およびPTGSを介する1つまたは複数のdsRNA分子が使用される。一部の態様において、dsRNAは、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上の構成的な輸送エレメント（CTE）配列（たとえば、メーソン-ファイザー・モンキー・ウイルスからのCTEを有する。特定の態様において、dsRNAは、1つまたは複数のイントロンおよび／またはポリAテイルを有する。望ましくは、細胞の細胞質に位置するdsRNAの量は、CTE、イントロン、および／またはポリAテイルを有するdsRNAにおいて、CTE、イントロン、および／またはポリAテイルを欠いている対照dsRNAよりも少なくとも24、50、75、100、200、400、600、またはさらに1000%大きい。
【００６６】
本発明の上記の局面のいずれかのその他の態様において、短いまたは長いdsRNAは、cDNA分子またはランダム化された核酸に由来する。一部の態様において、dsRNAは、細胞質または核に位置する。一部の態様において、いくつかのdsRNA転写物は、細胞質に位置し、いくつかの転写物は、核に位置する。望ましくは、dsRNAは、PTGSおよびTGSを介する。その他の態様において、dsRNA分子の少なくとも50、60、70、80、90、95、または100%は、細胞質に位置し、したがってPTGSを介することができる。さらに他の態様において、dsRNA分子の少なくとも50、60、70、80、90、95、または100%は、核に位置し、TGSを介することができる。一部の態様において、TGSを介するdsRNA分子は、標的遺伝子のプロモーターと実質的に同一の領域を含む。その他のdsRNA分子は、たとえばプロモーターと実質的に同一の領域および標的遺伝子のコード領域と実質的に同一の領域を有する。dsRNAは、インビトロまたはインビボで作製されてもよい。種々の態様において、同定された核酸配列は、細胞の細胞質または核に位置する。
【００６７】
さらにもう一つの態様において、dsRNAは、長さが少なくとも100、500、600、または1000ヌクレオチドである。その他の態様において、dsRNAは、長さが少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、または90ヌクレオチドである。さらにその他の態様において、dsRNAのヌクレオチド数は、5〜100ヌクレオチド、15〜100ヌクレオチド、20〜95ヌクレオチド、25〜90ヌクレオチド、35〜85ヌクレオチド、45〜80ヌクレオチド、50〜75ヌクレオチド、または55〜70ヌクレオチドの間（両端の数も含む）である。さらに他の態様において、dsRNAのヌクレオチド数は、以下の範囲のうちの1つに含まれる：5〜15ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、19〜26ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、25〜35ヌクレオチド、35〜45ヌクレオチド、45〜60ヌクレオチド、60〜70ヌクレオチド、70〜80ヌクレオチド、80〜90ヌクレオチド、または90〜100ヌクレオチド（両端の数も含む）。その他の態様において、dsRNAは、50,000；10,000；5,000；または2,000ヌクレオチド未満を含む。加えて、dsRNAは、全長RNA配列未満である配列を含んでいてもよい。その他の望ましい態様において、dsRNA（たとえば、長いdsRNA）の二本鎖領域は、11〜30ヌクレオチドの間（両端の数も含む）を含み；19〜26ヌクレオチドの間（両端の数も含む）；30以上のヌクレオチド；または200以上のヌクレオチドを含む。望ましい態様において、短いdsRNAの二本鎖領域は、11〜30ヌクレオチドの間（両端の数も含む）；または19〜26ヌクレオチドの間（両端の数も含む）を含む。
【００６８】
一部の態様において、dsRNA（たとえば、第1のdsRNA）は、20〜30ヌクレオチド（たとえば、20、21、22、23、24、25、26、27、または28ヌクレオチド）の長さである。特定の態様において、第1のdsRNAは、長さが11〜40ヌクレオチドの間であり、その配列がPKRまたはdsRNAを介したストレス応答経路の別のタンパク質に対して親和性であるので、本発明の短いdsRNAの非存在下で、脊椎動物の細胞に毒性を誘導する。本発明の短いdsRNAは、この毒性を阻害する。
【００６９】
その他の態様において、dsRNAは、細胞または細胞の集団に由来し、同じ細胞種または異なる細胞種のいずれかの別の細胞集団を形質転換するために使用される。望ましい態様において、形質転換された細胞集団は、dsRNAに由来する細胞の細胞種に関連がある細胞種の細胞を含む（たとえば、ニューロン細胞種の細胞の、別のニューロン細胞種の細胞に由来するdsRNAによる形質転換）。これらの局面のいずれかのさらにその他の態様において、dsRNAは、ランダム化された（たとえば、ランダム化される位置に付加されるであろうヌクレオチドの混合物を使用する化学的もしくは酵素的合成によって）1つまたは複数の隣接または非隣接部位を含む。さらに他の態様において、dsRNAは、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドのセグメントが結合されてdsRNAを形成するランダム化された核酸である。望ましい態様において、薬剤、核酸、dsRNA、またはベクターは、本発明の核酸である（たとえば、部分的もしくは完全なヘアピン、または部分的もしくは完全なヘアピンをコードするベクター）。
【００７０】
本発明の種々の局面のいずれかのその他の態様において、dsRNA（たとえば、長いdsRNA）は、標的核酸に特異的にハイブリダイズするが、標的核酸に対して99、95、90、80、または70%未満が同一もしくは相補的な配列を有する細胞または生体試料のその他の核酸を含む非標的分子に実質的にハイブリダイズされない。望ましくは、dsRNAにハイブリダイズし、または結合する非標的分子の量は、標準的なアッセイを使用して測定されるものとして、dsRNAにハイブリダイズし、または結合する標的核酸の量よりも2倍、望ましくは5倍、より望ましくは10倍、および最も望ましくは50倍低い。その他の態様において、dsRNAにハイブリダイズし、または結合する標的核酸の量は、標準的なアッセイを使用して測定されるものとして、dsRNAにハイブリダイズし、または結合する対照核酸の量よりも2倍、望ましくは5倍、より望ましくは10倍、および最も望ましくは50倍多い。望ましくは、dsRNA（たとえば、長いdsRNA）は、変性され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、細胞由来の1つの標的核酸にのみハイブリダイズする。特定の態様において、dsRNAは、細胞由来の1つの標的核酸にのみ実質的に相同的（たとえば、少なくとも80、90、95、98、または100%相同的）である。
【００７１】
その他の態様において、dsRNAは、同じ遺伝子ファミリーからのRNA分子などの多くのRNA分子に対して相同である。なおその他の態様において、dsRNAは、同じように調節される（たとえば、発生的、クロマチン再造形、またはストレス応答で誘導される）遺伝子とは明確に異なるmRNA配列に対して相同である。その他の態様において、dsRNAは、ストレス応答またはアポトーシスを誘導するように設計されているdsRNA（たとえば、癌細胞またはその他の病的もしくは過剰な細胞を死滅させるように設計されたdsRNA）などの多くのRNA分子に対して相同である。
【００７２】
その他の態様において、標的核酸の発現の減少率（％）は、非標的または対照核酸の発現の減少率（％）よりも少なくとも2、5、10、20、もしくは50倍多い。望ましくは、dsRNAは、標的核酸の発現を阻害するが、あるとしてもごくわずかであるが、細胞のその他の核酸の発現に対しても効果を有する。対照核酸の例は、ランダムな配列を有する核酸またはあるとしてもわずかに、dsRNAに対する親和性が知られる核酸を含む。望ましくは、長いdsRNA分子および短いdsRNA分子（たとえば、長いおよび短いdsRNA）は、天然に存在する必須の哺乳動物遺伝子に対して、または全ての必須の哺乳動物遺伝子に対して実質的に非相同的である（たとえば、国際公開公報第00/63364号を参照されたい）。一部の態様において、dsRNAは、必須の遺伝子の機能に悪影響を与えない。その他の態様において、dsRNAは、癌細胞において必須の遺伝子の機能に悪影響を与える。
【００７３】
望ましくは、短いdsRNAは、本明細書に記載されているものなどの標準的な方法を使用して測定されるものとして、短いdsRNAが投与されていない対照細胞または動物におけるタンパク質の二量体化の量と比較して、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは95%までPKRの二量体化またはdsRNAを介したストレス応答経路の別のタンパク質を阻害する。一部の態様において、短いdsRNAは、ランダム化された配列、またはランダム化された配列を含む全ての短いdsRNA領域を含む。種々の態様において、短いdsRNAは、実質的に細胞における核酸の発現を減少させない（たとえば、60、40、30、20、または10%未満まで発現を減少）。特定の態様において、短いdsRNAの配列は、細胞の核酸に対して、80、70、60、50、30、20、または10%未満の同一性または相補性である。特定の態様において、多数の短いdsRNA分子または多数の短いdsRNAをコードするベクターが細胞に投与され、短いdsRNA分子の70、60、50、30、20、または10%未満が、細胞の核酸に対して、少なくとも50、70、80、または90%の同一または相補的な配列を有する。
【００７４】
本発明の種々の局面のいずれかのその他の態様において、長いdsRNAの多くても1つの分子種が、それぞれの細胞に挿入される。その他の態様において、長いdsRNAをコードする多くても1つのベクターが、それぞれの細胞のゲノムに安定に組み込まれ、1つのdsRNAが、そこから安定に発現される。種々の態様において、dsRNAは、形質転換された細胞の核において活性であり、および／または形質転換された細胞の細胞質において活性である。種々の態様において、細胞集団の少なくとも1、10、20、50、100、500、または1000個の細胞または全ての細胞を、dsRNA（たとえば、長いdsRNA）を含むか、または発現する細胞として選択する。一部の態様において、細胞集団の少なくとも1、10、20、50、100、500、または1000個の細胞または全ての細胞を、検出可能な表現型の調整、たとえば細胞機能の調整、細胞における標的核酸（たとえば、内因性または病原体の遺伝子）の発現の調整、および／または細胞における標的タンパク質（たとえば、内因性または病原体のタンパク質）の生物活性の調整についてアッセイする。
【００７５】
望ましいRNAポリメラーゼ
特定の態様において、RNA依存性RNAポリメラーゼは、dsRNAまたはdsRNAをコードするベクターが導入された細胞または動物において発現される。RNA依存性RNAポリメラーゼは、dsRNAを増幅し、望ましくは、少なくとも25、50、100、200、500、1000、5000、またはさらに10000%まで細胞または動物のdsRNA分子の数を増大する。種々の態様において、RNA依存性RNAポリメラーゼは、細胞もしくは動物によって天然に発現され、またはdsRNAをコードする同じもしくは異なるベクターによってコードされる。例示的なRNA依存性RNAポリメラーゼは、ウイルス、植物、無脊椎動物、または脊椎動物（たとえば、哺乳動物もしくはヒト）のRNA依存性RNAポリメラーゼを含む。部分的なヘアピンが利用される細胞またはシステムが内因性RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）を含まない限り、RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）を提供することは、部分的なヘアピンdsRNA（これは、インビトロまたはインビボでRNA依存性RNAポリメラーゼによって伸長される）を利用する本発明のこれらの態様において特に重要である。表1を参照し、これは本発明の方法に有用なRNA依存性RNAポリメラーゼの非独占的なリストを提供する。
【００７６】
（表１）RNA依存性RNAポリメラーゼ
2006500012.tif 000002
【００７７】
標的遺伝子の任意の投与
一部の態様において、標的遺伝子（たとえば、病原体もしくは内因性の標的遺伝子）または標的遺伝子に由来する領域（たとえば、イントロン、エキソン、非翻訳領域、プロモーター、もしくはコード領域に由来する領域）を細胞または動物に導入する。たとえば、この標的核酸は、ベクター（たとえば、細胞のゲノムに望ましく組み込むことができるベクター）に挿入し、次いで細胞または動物に投与することができる。望ましくは、標的核酸の1つもしくは複数のコピーの投与は、標的核酸に対して相同なdsRNAの増幅を増強し、またはこのdsRNAからの切断産物の増幅を増強する。
【００７８】
インターフェロン反応を阻害する任意の方法
一部の態様において、インターフェロン反応またはdsRNAストレス応答経路（たとえば、PKR、ヒトβインターフェロン、および／または2'5'OAS）の成分は、細胞または動物において阻害される。種々の態様において、1つまたは複数の成分は、dsRNAを介した遺伝子サイレンシング、アンチセンスを介した遺伝子サイレンシング、リボザイムを介した遺伝子サイレンシング、または遺伝子ノックアウト法を使用して阻害される。その上、1つもしくは複数のIRE配列および／またはSTAT1などのIRE配列に結合する1つもしくは複数の転写因子は、任意にサイレンシングしてもよく、または変異させてもよい。種々の態様において、ワクシニアウイルスタンパク質E3、細胞タンパク質P58IPK、もしくはC型肝炎E2タンパク質などの、PKR反応を遮断するタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸を細胞または動物に投与する。
【００７９】
核酸の投与の望ましい方法
一部の態様において、dsRNAまたはdsRNA発現ベクターは、米国特許第4,897,355号（Eppsteinら、1987年10月29日に出願）、米国特許第5,264,618号（Felgnerら、1991年4月16日に出願）、または米国特許第5,459,127号（Felgnerら、1993年9月16日に出願）に開示された組成物などの、1つもしくは複数の陽イオン性脂質または陽イオン性両親媒性物質と複合体を形成する。その他の態様において、dsRNAまたはdsRNA発現ベクターは、陽イオン性の脂質を含み、および任意に中性脂質などの別の成分を含む、リポソーム／リポソーム性（liposomic）組成物と複合体にされる（例えば、米国特許第5,279,833号（Rose）、米国特許第5,283,185号（Epand）、および米国特許第5,932,241号（Gorman）を参照されたい）。その他の態様において、dsRNAまたはdsRNA発現構築物は、米国特許第5,837,533号、米国特許第6,127,170号、および米国特許第6,379,965号（Boutin）の多機能性の分子複合体、または2003年5月6日に出願されたPCT/US03/14288号（Satishchandran）の多機能性の分子複合体もしくは油／水型陽イオン性の両親媒性物質のエマルジョンと複合体にされる。
【００８０】
さらにその他の態様において、dsRNAまたはdsRNA発現ベクターは、薬剤学および分子生物学の分野の当業者によって発明される他のいかなる組成物とも複合体を形成する。一部の態様において、dsRNAまたはベクターは、陽イオン性の脂質と複合体を形成しない。
【００８１】
細胞の形質転換／トランスフェクションは、以下に限定されないが、リポフェクション、DEAEデキストランを介したトランスフェクション、微量注入、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、ウイルスもしくはレトロウイルスの送達、電気穿孔法、または微粒子銃形質転換を含む種々の手段で行ってもよい。RNAまたはRNA発現ベクター（DNA）は、裸のRNAもしくはDNA、または局所麻酔薬複合型のRNAもしくはDNA（Pachukら、前記）であってもよい。さらにもう一つの態様において、細胞は、線虫（C.elegans）細胞ではない。望ましくは、脊椎動物（たとえば、哺乳動物）細胞は、少ない継代数だけ培養された細胞（たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから直接得られた30継代未満の株化細胞）か、または初代細胞である。加えて、望ましくは、脊椎動物（たとえば、哺乳動物）細胞を、陽イオン性脂質と複合体を形成したdsRNAで形質転換する。
【００８２】
望ましい細胞
本発明のいずれかの局面のなおさらなる態様において、細胞は、植物細胞または動物細胞である。望ましくは、動物細胞は、無脊椎動物または脊椎動物の細胞（たとえば、哺乳動物細胞、たとえばヒト細胞）である。細胞は、エキソビボまたはインビボであってもよい。細胞は、配偶子または体細胞（たとえば、癌細胞、幹細胞、免疫系細胞、ニューロン細胞、筋細胞、または脂肪細胞）であってもよい。一部の態様において、遺伝子発現の阻害量を増大するために、DicerまたはArgonautなどの遺伝子サイレンシングに関与する1つもしくは複数のタンパク質を細胞または動物に過剰発現させ、または活性化させる。
【００８３】
本発明のいくつかの利点
本方法は、細胞および動物の遺伝子のサイレンシングのために、多くの利点を提供する。たとえば、その他のdsRNA送達系においては、いくつかのdsRNA分子がインターフェロン反応を誘導する（Jaramilloら、Cancer Invest. 13：327-338,1995）。インターフェロン反応の誘導は、これが細胞死を引き起こして、おそらく遺伝子サイレンシングを妨げる可能性があるので、望まれない。したがって、本発明の有意な利点は、インターフェロン反応が阻害されるまたは防止されるように、本明細書に記載されたdsRNA送達方法が行われることである。これらの方法により、dsRNAで誘導される毒性による有害副作用が生じることなく、疾患もしくは感染の予防または治療のための臨床応用にdsRNAを使用することができる。本方法の一部の態様における短いおよび長いdsRNA分子の使用により、短いdsRNA分子だけを使用する以前の方法と比較すると、遺伝子のサイレンシングの効率が改善された。
【００８４】
定義
「少なくとも部分的に二本鎖のRNAを提供する薬剤」とは、細胞または動物において少なくとも部分的に二本鎖（ds）RNAを作製する組成物を意味する。たとえば、薬剤は、dsRNA、細胞もしくは動物の内部で二本鎖の高次構造が想定される一本鎖RNA分子（たとえば、ヘアピン）、または同時もしくは経時的に投与され、かつ細胞もしくは動物の内部で二本鎖の高次構造が想定される2つの一本鎖のRNA分子の組み合わせであってもよい。他の例示的な薬剤には、少なくとも部分的にdsRNAをコードするDNA分子、プラスミド、ウイルスベクター、または組換えウイルスを含む。その他の薬剤は、2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号に開示されている。一部の態様において、薬剤は、1ng〜20mg、1ng〜1μg、1μg〜1mg、または1mg〜20mgの間のDNAおよび／またはRNAを含む。
【００８５】
「遺伝子発現レベルの変化」とは、遺伝子の産物、すなわちmRNAまたはポリペプチドの全体的な量が増減されるように、転写、翻訳、またはmRNAもしくはタンパク質の安定度が変化することを意味する。
【００８６】
「アポトーシス」とは、死滅しつつある細胞が、原形質膜の膜小疱形成、細胞細胞体収縮、クロマチン凝集、核破壊、およびDNAラダリングを含むよく特徴づけられた生化学な特徴のセットを示す細胞死経路を意味する。細胞のアポトーシス状態を決定するための多くの周知のアッセイ法があり、以下を含むがこれらに限定されない：MTTテトラゾリウム色素の還元、TUNEL染色、アネキシンV染色、ヨウ化プロピジウム染色、DNAラダリング、PARP切断、カスパーゼ活性化、並びに細胞および核形態の評価。細胞がアポトーシスを受けているかどうか決定するために、これらまたはその他の既知のアッセイ法のいずれかを本発明の方法に使用してもよい。
【００８７】
「アッセイすること」とは、動物の全身、細胞、組織、またはこれに由来する分子に対して投与された化学的または物理的な処理の効果を解析することを意味する。解析される材料は、動物、細胞、組織、細胞に由来する可溶化液もしくは抽出物、または細胞に由来する分子であってもよい。解析は、たとえば、細胞機能の変化、遺伝子発現の変化、内因性RNA安定度の変化、ポリペプチド安定度の変化、ポリペプチドレベルの変化、またはポリペプチド生物活性の変化を検出することを目的としてもよい。解析手段は、たとえば、抗体ラベリング、免疫沈降法、リン酸化アッセイ法、糖鎖形成アッセイ法、および核酸分子を検出するための周知の方法を含んでもよい。一部の態様において、アッセイ法は、選択的な条件下で行われる。
【００８８】
「Creを介した二重組換え」とは、Creリコンビナーゼによって媒介される、2つの核酸組換え事象に関与するloxP部位を意味する。Creを介した二重組換え事象は、たとえば米国特許出願公開第2002/0132257号、および、たとえばその図1にさらに詳細に開示されるように、もたらすことができる。
【００８９】
「細菌感染」とは、病原菌による宿主動物への侵入を意味する。たとえば、感染には、通常動物の体内にもしくは上に存在する細菌の過剰な増殖か、または動物内にもしくは上に存在しない細菌の増殖を含んでもよい。さらに一般的にいえば、細菌感染は、微生物集団の存在が宿主動物に対してダメージを与える任意の状況であることができる。したがって、動物は、微生物集団の過剰量が動物の体内にもしくは上に存在するときに、または微生物集団の存在が動物の細胞もしくはその他の組織にダメージを与えているときに、細菌感染に「罹患する」。一つの態様において、細菌の特定の属または種の数は、動物において通常見いだされる数の少なくとも2、4、6、または8倍である。細菌感染は、グラム陽性および／またはグラム陰性細菌によるものであってもよい。
【００９０】
「減少」とは、a）タンパク質（たとえば、ELISAまたはウエスタンブロット解析によって測定されるもの）；b）リポーター遺伝子活性（たとえば、リポーター遺伝子のアッセイ、たとえばβ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ活性によって測定されるもの）；c）mRNA（たとえば、「ハウスキーピング」遺伝子産物、たとえばβ-アクチンもしくはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）などの内部対照と比較してRT-PCRまたはノーザンブロット解析によって測定されるもの）；またはd）細胞機能（たとえば試験試料中のアポトーシスし、移動し、増殖し、細胞周期停止し、侵入し、分化し、または脱分化した細胞の数によってアッセイされるもの）のレベルの低下を意味する。全ての場合において、低下は、望ましくは少なくとも20%まで、より望ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、75%まで、および最も望ましくは少なくとも90%までである。本明細書に使用されるものとして、減少は、PTGS、TGS、または別の遺伝子サイレンシング事象の直接または間接的な結果であってもよい。
【００９１】
「核酸分子」とは、リン酸の1つまたは複数の分子が炭水化物（たとえば、五炭糖または六炭糖）と結合し、これが順次プリン（たとえば、アデニンまたはグアニン）およびピリミジン（たとえば、チミン、シトシン、またはウラシル）に由来する塩基に結合している化合物を意味する。特定の天然に存在する核酸分子は、ゲノムのデオキシリボ核酸（DNA）およびゲノムのリボ核酸（RNA）、並びに後者のいくつかの異なる形態、たとえばメッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、およびリボソームRNA（rRNA）を含む。また、異なるRNA分子に対して相補である異なるDNA分子（cDNA）も含まれる。合成されたDNA、または天然に存在するDNAとそのハイブリッド、並びにDNA／RNAハイブリッド、およびPNA分子（Gambari, Curr Pharm Des 2001 Nov； 7 （17）：1839-62）も、「核酸分子」の定義の範囲内で含まれる。
【００９２】
核酸は、典型的には2つ以上の共有結合性に結合した天然に存在するか、または修飾されたデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの配列を有する。修飾された核酸は、たとえば、非天然の塩基を有するペプチド核酸およびヌクレオチドを含む。修飾は、以下「dsRNA」の定義下に記載されている化学的および構造的な修飾を含む。また、たとえば「dsRNA」、「発現ベクター」、および「発現構築物」の定義の範囲内で、並びに本明細書において他の場所で記載したとおりの種々の構造も含まれる。
【００９３】
「dsRNA」とは、二本鎖の高次構造である2つ以上のヌクレオチド領域を含む核酸分子を意味する。種々の態様において、dsRNAは、完全にリボヌクレオチドからなるか、または例えば2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号、もしくは1999年4月21日に出願された米国特許出願第60/130,377号に開示されたRNA／DNAハイブリッドなどのリボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物からなる。dsRNAは、分子の1つの部分のヌクレオチドが分子の別の部分のヌクレオチドと塩基対になるように、自己相補性の領域を有する単一の分子であってもよい。種々の態様において、単一の分子からなるdsRNAは、完全にリボヌクレオチドからなるか、またはデオキシリボヌクレオチドの領域に相補であるリボヌクレオチド領域を含む。または、dsRNAは、互いに相補性の領域を有する2つの異なる鎖を含んでいてもよい。種々の態様において、両鎖が完全にリボヌクレオチドからなるか、1つの鎖が完全にリボヌクレオチドからなり、かつ1つの鎖が完全にデオキシリボヌクレオチドからなるか、または一方もしくは両方の鎖がリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。望ましくは、相補性領域は、少なくとも70、80、90、95、98、または100%の相補性である。望ましくは、二本鎖の高次構造に存在するdsRNAの領域は、少なくとも19、20、30、50、75、100、200、500、1000、2000、もしくは5000ヌクレオチドを含むか、またはdsRNAに表されているcDNAのヌクレオチドの全てを含む。一部の態様において、dsRNAは、一本鎖の末端などの任意の一本鎖の領域を含まないか、またはdsRNAはヘアピンである。その他の態様において、dsRNAは、1つもしくは複数の一本鎖の領域または突出を有する。望ましいRNA／DNAハイブリッドは、アンチセンスの鎖または領域であるDNAの鎖または領域（たとえば、標的核酸に対して少なくとも70、80、90、95、98、または100%の相補性を有する）およびセンスの鎖または領域であるRNAの鎖または領域（たとえば、標的核酸に対して少なくとも70、80、90、95、98、または100%の同一性を有する）を含むか、または逆も同じである。種々の態様において、RNA／DNAハイブリッドは、本明細書に記載されている方法、または2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号もしくは1999年4月21日に出願された米国特許出願第60/130,377号に記載されている方法などの、酵素的または化学的な合成方法を使用してインビトロで作製される。その他の態様において、インビトロで合成されたDNA鎖は、細胞にDNA鎖を形質転換する前に、後に、または同時に、インビボで、またはインビトロで作製したRNA鎖と複合体となる。さらにその他の態様において、dsRNAは、センスおよびアンチセンスの領域を含む単一の環状の核酸であるか、またはdsRNAは、環状の核酸および第2の環状もしくは直線的な核酸のいずれかの核酸（たとえば、2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号または1999年4月21日に出願された米国特許出願第60/130,377号を参照されたい）を含む。例示的な環状核酸は、ヌクレオチドの遊離の5'ホスホリル基がもう一つのヌクレオチドの2'ヒドロキシル基にループバック様式で結合される構造を含む。
【００９４】
その他の態様において、dsRNAは、糖の2'位置がハロゲン（フッ素基など）を含むか、またはインビトロもしくはインビボで対応する2'位置が水素もしくはヒドロキシル基を含む対応するdsRNAと比較してdsRNAの半減期を増大するアルコキシ基（メトキシ基など）を含む1つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含む。さらにその他の態様において、dsRNAは、天然に存在するホスホジエステル結合以外の隣接したヌクレオチドの間の1つまたは複数の結合を含む。このような結合の例は、ホスホルアミド、ホスホロチオネート、およびホスホロジチオネート結合を含む。その他の態様において、dsRNAは、例えば2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号、または1999年4月21日に出願された米国特許出願第60/130,377号によって開示されるように、1または2つのキャップされた鎖を含むか、またはキャップされた鎖を含まない。その他の態様において、dsRNAは、コード配列または非コード配列、たとえば制御配列（たとえば、転写因子結合部位、プロモーター、またはmRNAの5'もしくは3'非翻訳の領域（UTR））を含む。加えて、dsRNAは、2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号（例えば、8〜22ページを参照されたい）に開示されている少なくとも部分的に二本鎖のRNA分子のいずれかであることができる。本明細書に記載されている方法を使用して、または2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号（たとえば、16〜22ページを参照されたい）において記載されている方法などの標準的な方法を使用して、任意のdsRNAの分子をインビトロでまたはインビボで発現させてもよい。
【００９５】
「dsRNA発現ライブラリー」とは、核酸配列、たとえばcDNA配列または核酸配列の発現によってdsRNA（dsRNA）を形成することができるランダム化された核酸配列を含む核酸発現ベクターのコレクションを意味する。望ましくは、dsRNA発現ライブラリーは、少なくとも10,000個の独特の核酸配列、より望ましくは少なくとも50,000；100,000；または500,000個の独特の核酸配列、および最も望ましくは少なくとも1,000,000の独特の核酸配列を含む。「独特の核酸配列」とは、dsRNA発現ライブラリーの一つの核酸配列が、その全長配列を比較したときに、dsRNA発現ライブラリーのもう一つの核酸配列に対して望ましくは50%未満、より望ましくは25%または20%未満、および最も望ましくは10%未満の核酸同一性を有することを意味する。配列同一性は、典型的にはBLAST（登録商標）（Basic Local Alignment Search Tool）またはBLAST（登録商標）2を使用して、そこで特定されているデフォルト・パラメータで測定される（Altschulら、J.Mol.Biol.215：403-410 （1990）；およびTatianaら、FEMS Microbiol.Lett.174：247-250 （1999）を参照されたい）。このソフトウエアプログラムでは、種々の置換、欠失、およびその他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることによって同様の配列が一致する。保存的な置換は、典型的には以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００９６】
dsRNA発現ライブラリーを作製するためのcDNAの調製は、たとえば米国特許出願第2002/0132257号および欧州特許出願第1229134号、「細胞の機能を調整する核酸配列を同定するための転写後の遺伝子サイレンシングの使用（Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell）」に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。また、ランダム化された核酸ライブラリーは、たとえば米国特許第5,639,595号に記載されているように作製してもよく、これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられ、dsRNAを介した機能的なゲノミクス適用のために利用される。dsRNA発現ライブラリーは、核において転写されるか、または細胞の細胞質において転写される核酸配列を含んでいてもよい。dsRNA発現ライブラリーは、本明細書に記載されている技術を使用して作製されてもよい。
【００９７】
「発現構築物」とは、RNAを転写するように設計されている任意の二本鎖DNAまたは二本鎖RNA、たとえば下流遺伝子または関心対象のコード領域（たとえば、cDNAもしくはタンパク質をコードするゲノムのDNA断片、または関心対象の任意のRNA）に動作可能に結合された少なくとも1つのプロモーターを含む構築物を意味する。レシピエント細胞への発現構築物のトランスフェクションまたは形質転換により、発現構築物によってコードされるRNAまたはタンパク質を細胞に発現させることができる。発現構築物は、遺伝的に操作されたプラスミド、ウイルス、またはたとえばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、もしくはヘルペスウイルスに由来する人工染色体であってもよい。発現構築物は、生細胞において複製してもよく、または合成によって作製してもよい。
【００９８】
「発現ベクター」とは、下流遺伝子またはコード領域に動作可能に結合された少なくとも1つのプロモーターを含むDNA構築物（たとえば、cDNAまたはタンパク質をコードするゲノムのDNA断片であって、任意に、コード領域の外側にある配列、アンチセンスRNAコード領域、またはコード領域の外側にあるRNA配列に動作可能に結合されたもの）を意味する。レシピエント細胞への発現ベクターのトランスフェクションまたは形質転換により、発現ベクターによってコードされるRNAを細胞に発現させることができる。発現ベクターは、遺伝的に操作されたプラスミド、ウイルス、またはたとえば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、もしくはヘルペスウイルスに由来する人工染色体であってもよい。
【００９９】
「強制的なヘアピン」とは、5'から3'の順に、第1の関心対象領域、第1の塩基対形成領域、ループ領域、および第2の塩基対形成領域を有する核酸分子（たとえば、DNA分子もしくはベクター）またはRNAをコードする核酸分子の集団（たとえば、部分的なもしくは完全なヘアピン）を意味する。第1および第2の塩基対形成領域は互いに塩基対形成される。望ましくは、核酸は、第2の塩基対形成領域の下流に第2の関心対象領域を含む。第2の関心対象領域が存在する場合、第1および第2の関心対象領域は互いに塩基対形成される。望ましくは、第1および第2の関心対象領域のヌクレオチドの少なくとも50、60、70、80、90、95、または100%は、互いとのワトソン-クリック塩基対形成に関与する。これらの2つの領域は、両者間で同じ長さであってもよく、または1つもしくは複数のヌクレオチドによって長さが異なっていてもよい。たとえば、1つの関心対象領域は、その他の関心対象領域の任意の部分のヌクレオチドと塩基対形成しない領域の一端に、さらなるヌクレオチドを有してもよい。関連した局面において、本発明は、これらの核酸によってコードされるRNA分子またはRNA分子の集団を特徴とする。例示的には、RNA分子は、図1A〜1Dに図示してあり、第1および第2の塩基対形成領域は、「A」および「B」で示してあり、第1および第2の関心対象領域は、「標的に関してセンスまたはアンチセンス」または「標的に関してアンチセンスまたはセンス」でそれぞれ示してある。いずれの場合においても、第1の領域が標的遺伝子に関してセンス配列である場合、第2の関心対象領域は標的に関してアンチセンスであり、かつその逆も同じであり、その結果2つの領域は、逆に相補である。
【０１００】
「完全なRNAヘアピン」とは、一本鎖の突出がないヘアピンを意味する。
【０１０１】
「細胞の機能」とは、測定することまたは評価することができる任意の細胞活性を意味する。細胞機能の例は、細胞運動性、アポトーシス、細胞増殖、細胞侵襲、血管新生、細胞周期事象、細胞分化、細胞脱分化、ニューロン細胞再生、および細胞がウイルス複製を補助する能力を含むが、これらに限定されない。また、細胞の機能は、別の細胞（たとえば、隣接した細胞、細胞と接触する細胞、または細胞が含まれる培地もしくはその他の細胞外液と接触する細胞）の機能、遺伝子発現、またはポリペプチド生物活性に影響を及ぼしてもよい。
【０１０２】
「高ストリンジェンシーの条件」とは、2×SSC、40℃における少なくとも40ヌクレオチドの長さのDNAプローブとのハイブリダイゼーションを意味する。高ストリンジェンシーの条件のその他の定義については、F.Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, pp.6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994を参照されたい（参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１０３】
「単離した核酸」、「核酸配列」、「核酸分子」、「dsRNA核酸配列」、または「dsRNA核酸」とは、本発明の核酸配列が由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて、遺伝子に隣接する遺伝子がない核酸分子、またはこれらの部分を意味する。したがって、本用語は、たとえばベクター、たとえばdsRNA発現ベクターに；独立して複製するプラスミドもしくはウイルスに；または、原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに；組み込まれた5'もしくは3'隣接配列と共にまたは伴わない組換えDNAを含むか；またはその他の配列から独立して分離した分子（たとえば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるゲノムもしくはcDNAの断片）として存在する。
【０１０４】
「増大」とは、（a）タンパク質（たとえば、ELISAまたはウエスタンブロット解析によって測定されるもの）；（b）リポーター遺伝子活性（たとえば、リポーター遺伝子のアッセイ、たとえばβ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ活性によって測定されるもの）；（c）mRNA（たとえば、「ハウスキーピング」遺伝子産物、たとえばβ-アクチンもしくはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）などの内部対照と比較してRT-PCRまたはノーザンブロット解析によって測定されるもの）；または（d）細胞機能、たとえば試験試料中のアポトーシスし、移動し、増殖し、細胞周期停止し、侵入し、分化し、または脱分化した細胞の数によってアッセイされるもののレベルの上昇を意味する。望ましくは、増大は、少なくとも1.5倍〜2倍まで、より望ましくは少なくとも3倍まで、および最も望ましくは少なくとも5倍までである。本明細書に使用されるものとして、増大は、PTGS、TGS、または別の遺伝子サイレンシング事象の間接的な結果であってもよい。たとえば、dsRNAは、阻害しなければ別の核酸分子の発現を阻害する抑制因子タンパク質などのタンパク質の発現を阻害してもよい。
【０１０５】
「長いdsRNA」とは、少なくとも40、50、100、200、500、1000、2000、50000、10000、またはそれ以上の長さのヌクレオチドのdsRNAを意味する。一部の態様において、長いdsRNAは、100〜10000、100〜1000、200〜1000、または200〜500の間（両端の数も含む）の隣接するヌクレオチドの二本鎖の領域を有する。一部の態様において、長いdsRNAは、自己相補性の領域によって二本鎖の構造を達成する一本鎖であり（たとえば、逆方向反復またはタンデムのセンスおよびアンチセンス配列）、その結果ヘアピン構造を形成する。一つの態様において、長いdsRNA分子は、機能的なタンパク質を産生しないか、または翻訳されない。たとえば、長いdsRNAは、翻訳に関与する細胞因子と相互作用しないように設計されていてもよい。例示的な長いdsRNA分子は、ポリ-アデニル化配列、タンパク質翻訳のために必要なコザック領域、開始メチオニンコドン、および／またはキャップ構造を欠いている。その他の態様において、dsRNA分子は、キャップ構造、1つまたは複数のイントロン、および／またはポリアデニル化配列を有する。その他のこのような長いdsRNA分子には、RNA／DNAハイブリッドが含まれる。本発明の方法に使用してもよいその他のdsRNA分子並びにこれらの調製および送達のための種々の手段は、2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号（この開示は、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０１０６】
「調整する」とは、減少または増大のいずれかによる変化を意味する。本明細書で使用されるものとして、望ましくは、核酸分子は、少なくとも20%まで、より望ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、または75%まで、および最も望ましくは少なくとも90%まで細胞の機能、細胞における標的核酸分子の発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性を減少させる。また、本明細書に使用されるものとして、望ましくは、核酸分子は、少なくとも1.5倍〜2倍まで、より望ましくは少なくとも3倍まで、および最も望ましくは少なくとも5倍まで細胞の機能、細胞における標的核酸分子の発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性を増大する。
【０１０７】
「マルチクローニングサイト」とは、1つまたは複数の制限酵素のための単一の特異的な制限酵素認識部位を含み、かつ核酸配列の挿入部位として役立つDNAプラスミド構築物内の既知の配列を意味する。また、マルチクローニングサイトは、ポリリンカーまたはポリクローニング部位とも称する。多種多様なこれらの部位は、当技術分野において既知である。
【０１０８】
「マルチエピトープdsRNA」とは、複数の標的核酸に由来する部分を有するか、または同じ標的核酸からの非隣接部分を有するRNA分子を意味する。たとえば、マルチエピトープdsRNAは、（i）単一の生物体の同義遺伝子を表す配列；（ii）種々の異なる生物体からの1つまたは複数の遺伝子を表す配列；および／または（iii）特定の遺伝子の異なる領域を表す配列（たとえば、プロモーター由来の1つまたは複数の配列およびエキソンなどのコード領域由来の1つまたは複数の配列）に由来する部分を有してもよい。望ましくは、それぞれの部分は、標的核酸の対応する領域に対して実質的な配列同一性を有する。種々の望ましい態様において、標的核酸に対して実質的な配列同一性を有する部分は、少なくとも30、40、50、100、200、500、750、またはそれ以上の長さのヌクレオチドである。望ましい態様において、マルチエピトープdsRNAは、少なくとも2、4、6、8、10、15、20、またはそれ以上の標的遺伝子の発現を、少なくとも20、40、60、80、90、95、または100%まで阻害する。一部の態様において、マルチエピトープdsRNAは、同じ標的遺伝子に由来する非隣接部分を有し（これは、天然に存在する5'から3'の向きの部分であってもよく、またはそうでなくてもよい）、dsRNAは、部分のうちの1つだけを有するdsRNAを超えて少なくとも50、100、200、500、または1000%まで核酸の発現を阻害する。
【０１０９】
「動作可能に結合される」とは、遺伝子および1つまたは複数の転写制御配列、たとえばプロモーターまたはエンハンサーが、適切な分子（たとえば、転写活性化タンパク質）が制御配列に結合されるときに遺伝子発現を可能にするような方法で接続されていることを意味する。
【０１１０】
「部分的なRNAヘアピン」とは、5'または3'突出などの一本鎖の突出を有するヘアピンを意味する。望ましくは、部分的なヘアピンは、核酸（たとえば、DNA分子またはベクター）によってコードされる。コードされるRNA分子は、5'から3'の順に、第1の関心対象領域（領域1）、ループ領域、および第2の関心対象領域（領域2）を有する。関心対象領域は、長さが異なっており、領域1は、その他の関心対象領域（領域2）のヌクレオチドと塩基対形成をしない領域の一端にさらなるヌクレオチドを有する。一方の関心対象領域は、標的遺伝子に対して実質的に同一の配列を含み、他方の関心対象領域は、標的遺伝子に対して実質的に相補性の配列を含む。加えて、「部分的な」ヘアピンRNAは、「強制的な」ヘアピンRNAであってもよく（図2Bを参照されたい）、この場合、領域1（これは、標的遺伝子に関してセンスまたはアンチセンスの配列を含む）は、配列Aも含み、および領域2は、配列Aの少なくとも一部と塩基対形成するように設計された配列B（これは、「強制的」にRNAがヘアピン構造を想定するようにさせる）を含む。任意に、領域2は、領域1のヌクレオチドに相補なさらなる3'ヌクレオチドを含む。関連した局面において、本発明は、これらの核酸によってコードされるRNA分子またはRNA分子の集団を特徴とする。例示的なRNA分子を図1Aに図示してあり、第1および第2の関心対象領域は、「センス」および「アンチセンス」を示す。いずれの場合においても、領域1は、標的遺伝子に関してセンスまたはアンチセンスのいずれかであってもよく、領域2は、逆の相補配列（標的遺伝子に関してアンチセンスまたはセンスのいずれか）であり、ヘアピン構造を形成することができる。望ましくは、コードされるRNAは、細胞または動物の標的遺伝子の発現を阻害する。望ましくは、部分的なRNAヘアピンは、RNA依存性RNAポリメラーゼによってインビトロでまたはインビボで（たとえば、細胞または動物において）伸長される。望ましくは、部分的なヘアピンの伸長により完全なヘアピンを生じる。
【０１１１】
「表現型」とは、たとえば、分子、巨大分子、構造、代謝、エネルギー資化、組織、器官、反射、および挙動などの任意の検出可能または観察可能な外部の物理的な徴候、並びに検出可能な構造、機能、または細胞、組織、もしくは生体系の挙動の一部であるものを意味する。dsRNAを介した変化は、特に本発明の方法において有用であり、検出可能な表現型は、標的核酸分子に対して影響を及ぼすdsRNAを介した細胞の機能の調整、標的核酸の発現の調整、または標的ポリペプチドの生物活性の調整に由来する。
【０１１２】
「ポリペプチドの生物活性」とは、標的ポリペプチドが細胞機能を調整する能力を意味する。ポリペプチド生物活性のレベルは、当技術分野において既知の標準的なアッセイを使用して直接測定してもよい。たとえば、ポリペプチド生物活性の相対的なレベルは、標的ポリペプチドをコードするmRNAのレベル（たとえば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）増幅またはノーザンブロット解析によって）；標的ポリペプチドのレベル（たとえば、ELISAまたはウエスタンブロット解析によって）；標的ポリペプチドの転写制御領域の転写制御下のリポーター遺伝子の活性（たとえば、後述するようにリポーター遺伝子アッセイにより）；標的ポリペプチドともう一つの分子、たとえば標的ポリペプチドによって活性化されるか、または標的ポリペプチド活性を阻害するポリペプチドの特異的な相互作用（たとえば、ツーハイブリッド・アッセイ法によって）；または、標的ポリペプチドのリン酸化もしくは糖鎖形成状態を測定することによって評価してもよい。細胞、細胞抽出物、またはその他の実験試料内の標的ポリペプチド、標的ポリペプチドをコードするmRNA、もしくはリポーター遺伝子活性のレベルを増大するdsRNAなどの化合物は、標的ポリペプチドの生物活性を刺激するか、または増大する化合物である。細胞、細胞抽出物、またはその他の実験試料内の標的ポリペプチド、標的ポリペプチドをコードするmRNA、もしくはリポーター遺伝子活性のレベルを減少させるdsRNAなどの化合物は、標的ポリペプチドの生物活性を減少させる化合物である。
【０１１３】
「プロモーター」とは、Poll、PolII、PolIII、ミトコンドリア、ウイルス、細菌、およびその他の転写を駆動することができるプロモーター配列を含む、遺伝子の転写を直接誘導するために十分な最小の配列を意味する。また、細胞種特異的、組織特異的、もしくは時間特異的な様式でプロモーター依存的な遺伝子発現を制御可能にするために十分であるか、または外部のシグナルもしくは薬剤によって誘導性である転写調節エレメント（たとえば、エンハンサー）は、この定義に含まれ；このようなエレメント（当業者に周知である）は、遺伝子の5'もしくは3'領域、またはイントロン内に見いだされるであろう。望ましくは、プロモーターは、核酸配列の発現を可能にする方法で、動作可能に核酸配列、たとえばcDNAまたは遺伝子に結合される。
【０１１４】
「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」とは、翻訳後修飾（たとえば、糖鎖形成またはリン酸化）には関係なく、天然に存在するポリペプチドもしくはペプチドの全部または一部を構成するか、または天然に存在しないポリペプチドもしくはペプチドを構成する2つ以上のアミノ酸の任意の鎖を意味する。
【０１１５】
「リポーター遺伝子」とは、その発現が免疫学的、化学的、生化学的、または生物学的アッセイ法によって検出可能および／または定量することができる産物をコードするいずれかの遺伝子を意味する。リポーター遺伝子産物は、限定されないが、たとえば以下の性状のうちの1つを有してもよい：蛍光（たとえば、緑色蛍光タンパク質）、酵素活性（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）、毒性（たとえば、リシンA）、またはさらなる分子が特異的に結合する能力（たとえば、ラベルされていない抗体、続くラベルされた二次抗体、またはビオチン、または検出可能な程度にラベルされた抗体）。当業者が容易に利用できるリポーター遺伝子の任意の設計された変種も、限定されないが、前述の定義に含まれることが理解される。
【０１１６】
「選択的条件」とは、特異的な細胞または細胞の群が選択を受けることができる条件を意味する。たとえば、特異的な細胞または細胞の群を同定するために、蛍光活性化細胞選別機（FACS）のパラメータを調整することができる。細胞パニング（当業者に既知の技術）も、選択的条件を使用するもう一つの方法である。
【０１１７】
「短いdsRNA」とは、二本鎖の高次構造にある長さが45、40、35、30、27、25、23、21、18、15、13、またはより短い隣接するヌクレオチドを有するdsRNAを意味する。望ましくは、短いdsRNAは、長さが少なくとも11ヌクレオチドである。望ましい態様において、二本鎖の領域は、長さが11〜45、11〜40、11〜30、11〜20、15〜20、15〜18、20〜25、21〜23、25〜30、または30〜40の間（両端の数も含む）の隣接するヌクレオチドである。一部の態様において、短いdsRNAは、30〜50、50〜100、100〜200、200〜300、400〜500、500〜700、700〜1000、1000〜2000、または2000〜5000ヌクレオチドの間（両端の数も含む）の長さであり、かつ長さが11〜40の間（両端の数も含む）の隣接するヌクレオチドである二本鎖領域を有する。一つの態様において、短いdsRNAは、完全に二本鎖である。一部の態様において、短いdsRNAは、長さが11〜30ヌクレオチドの間であり、全てのdsRNAは、二本鎖である。その他の態様において、短いdsRNAは、1または2つの一本鎖の領域を有する。特定の態様において、短いdsRNAは、PKRまたはdsRNAを介したストレス応答経路の別のタンパク質に結合する。望ましくは、短いdsRNAは、少なくとも20、40、60、80、90、または100%だけPKRの二量体化および活性化を阻害する。望ましい一部の態様において、短いdsRNAは、少なくとも20、40、60、80、90、もしくは100%だけPKRまたはdsRNAを介したストレス応答経路の別の成分に対する長いdsRNAの結合を阻害する。
【０１１８】
「特異的にハイブリダイズする」とは、変性させた条件下でアッセイしたときに、標的核酸分子にハイブリダイズするが、天然に標的核酸分子を含む試料（たとえば、細胞からの試料）中のその他の核酸分子に実質的にハイブリダイズしないdsRNAを意味する。一つの態様において、dsRNAにハイブリダイズしたか、または結合した標的核酸分子の量は、標準的なアッセイ法を使用して測定すると、dsRNAにハイブリダイズしたか、または結合した対照核酸分子の量よりも2倍、望ましくは5倍、より望ましくは10倍、および最も望ましくは50倍多い。
【０１１９】
「標的核酸分子の発現を特異的に阻害する」とは、細胞または生体試料中の標的核酸分子の発現の阻害が、標的核酸分子の配列と99、95、90、80、もしくは70%未満が同一または相補である配列を有する非標的核酸分子の発現阻害よりも優れた程度で生じることを意味する。望ましくは、非標的分子の発現阻害は、標的核酸分子の発現阻害の2倍、望ましくは5倍、より望ましくは10倍、および最も望ましくは50倍未満である。
【０１２０】
「実質的な配列相補性」とは、dsRNAが核酸分子の発現を阻害するために十分なdsRNAと標的核酸分子との間の配列相補性を意味する。好ましくは、dsRNAの配列は、標的核酸分子の領域の配列に対して少なくとも40、50、60、70、80、90、95、または100%相補である。
【０１２１】
「実質的な配列同一性」とは、dsRNAが核酸分子の発現を阻害するために十分なdsRNAと標的核酸分子の間の配列同一性を意味する。好ましくは、dsRNAの配列は、標的核酸分子の領域の配列に対して少なくとも40、50、60、70、80、90、95、または100%同一である。
【０１２２】
「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、または「標的ポリヌクレオチド配列」とは、天然に存在し、およびおそらく欠損があるポリヌクレオチド配列か、または細胞内もしくは細胞外の病原体の感染または疾患によって存在する異種の配列かにかかわらず、その発現が転写後の遺伝子サイレンシング、転写性の遺伝子サイレンシング、またはその他の配列特異的なdsRNAを介した阻害の結果として調整される真核細胞、植物もしくは動物、脊椎動物もしくは無脊椎動物、哺乳動物、鳥、その他に存在する任意の核酸配列を意味する。本明細書で使用されるものとして、「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」は、PTGS、転写性の遺伝子サイレンシング（TGS）、またはその他の遺伝子サイレンシング事象が生じる細胞内にあってもよく、または隣接する細胞に、またはPTGS、TGS、もしくはその他の遺伝子サイレンシング事象を受けた細胞が含まれる培地もしくはその他の細胞外液と接触した細胞にあってもよい。このような「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」は、コード配列であってもよく、すなわちタンパク質またはこれらの機能的な断片を発現するように翻訳されるか否かにかかわらず、mRNAを含むRNAに転写される。または、非コードであってもよいが、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、または他のいずれかの調節エレメントも含む調節機能を有していてもよい。「遺伝子」という用語は、転写されおよび／または翻訳されるか否かにかかわらず、プロモーターなどの制御配列を含む「サイレンシングされる」ことが企図される任意の標的配列を含むことが企図される。
【０１２３】
例示的な「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」分子は、発癌遺伝子などの癌または異常な細胞増殖に関連する核酸分子、常染色体優性または劣性の障害に関連する核酸分子（例えば、国際公開公報第00/63364号、国際公開公報第00/44914号、および国際公開公報第99/32619号を参照されたい）を含む。望ましくは、dsRNAは、優性の障害に関連する突然変異を有する核酸分子の対立遺伝子の発現を阻害し、実質的に核酸分子のその他の対立遺伝子（たとえば、障害に関連する突然変異のない対立遺伝子）を阻害しない。その他の例示的な「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」分子は、宿主細胞の核酸分子、およびウイルス、細菌、酵母、原生動物、もしくは寄生生物などの病原体の感染または増殖のために必要なコードおよび非コード領域を含む病原体核酸分子を含む。
【０１２４】
「標的ポリペプチド」とは、その生物活性が遺伝子サイレンシングの結果として調整されるポリペプチドを意味する。本明細書で使用されるものとして、標的ポリペプチドは、PTGS、TGS、またはその他の遺伝子サイレンシング事象が生じる細胞内にあってもよく、または隣接する細胞に、またはPTGS、TGS、もしくはその他の遺伝子サイレンシング事象を受けた細胞が含まれる培地またはその他の細胞外液と接触した細胞にあってもよい。
【０１２５】
「形質転換」または「トランスフェクション」とは、細胞（たとえば細菌、酵母、真菌、藻類、植物、昆虫、または動物細胞、特に脊椎動物もしくは哺乳動物細胞）に外来分子を導入するための任意の方法を意味する。細胞は、動物にあってもよい。リポフェクション、DEAEデキストランを介したトランスフェクション、微量注入、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、ウイルスまたはレトロウイルスの送達、電気穿孔法、および微粒子銃形質転換は、当業者に周知のほんのいくつかの形質転換／トランスフェクション方法である。RNAまたはRNA発現ベクター（DNA）は、裸のRNAもしくはDNA、または局所麻酔薬複合型のRNAもしくはDNA（Pachukら、前記）であってもよい。その他の標準的な形質転換／トランスフェクション方法、およびその他のRNAおよび／またはDNA送達薬（たとえば、陽イオン性の脂質、リポソーム、またはブピバカイン）は、2000年4月19日に出願された国際公開公報第00/63364号（たとえば、18〜26ページを参照されたい）に記載されている。また、dsRNAまたはdsRNA発現構築物は、米国特許第5,837,533号、米国特許第6,127,170号もしくは米国特許第6,379,965号（Boutin）の多機能性の分子複合体との複合体とされるか、または2003年5月6日に出願されたPCT/US03/14288（Satishchandran）の多機能性の分子複合体もしくは油／水の陽イオン性の両親媒性物質エマルジョンであってもよい。また、商業的に入手可能なキットをRNAまたはDNAを細胞に送達するために使用することができる。たとえばQiagenからのTransmessengerキット、Xeragon Inc.からのRNAキット、およびDNA Engine Inc.（Seattle, WA）からのRNAキットは、単一またはdsRNAを細胞に導入するために使用することができる。
【０１２６】
「形質転換細胞」または「トランスフェクション細胞」とは、核酸分子、たとえばdsRNAまたは二本鎖の発現ベクターが、組換え核酸技術によって導入された細胞（または、細胞の子孫）を意味する。このような細胞は、安定にまたは一過性にトランスフェクトされてもよい。
【０１２７】
「癌を治療する、安定化する、または予防する」とは、腫瘍のサイズの減少を引き起こすこと、腫瘍のサイズの増大を減速すること、もしくは予防すること、腫瘍の消失とその再発の間の疾病のない生存時間を増大すること、腫瘍の初期のもしくは後の発生を予防すること、または腫瘍に関連する有害な症状を減少させること、もしくは安定化することを意味する。一つの態様において、治療をして生存する癌細胞のパーセントは、任意の標準的なアッセイを使用して測定されるものとして、初期の癌細胞の数よりも少なくとも20、40、60、80、または100%少ない。好ましくは、本発明の組成物の投与によって誘導される癌細胞の数の減少は、非癌性細胞の数の減少よりも少なくとも2、5、10、20、または50倍多い。さらにもう一つの態様において、本発明の組成物の投与後に存在する癌細胞の数は、媒体対照の投与後に存在する癌細胞の数よりも少なくとも2、5、10、20、または50倍少ない。好ましくは、標準的な方法を使用して決定されるものとして、本発明の方法は、腫瘍のサイズの20、40、60、80、または100%の減少を生じる。好ましくは、治療された被験者の少なくとも20、40、60、80、90、または95%は、完全寛解を有し、全ての癌の証拠が消えている。好ましくは、癌は再発しないか、または少なくとも5、10、15、もしくは20年後に再発しない。もう一つの望ましい態様において、患者が癌と診断されて、本発明の組成物によって治療された後に生存する時間は、（i）未治療患者が生存する時間の平均的な量、または（ii）別の治療によって治療された患者が生存する時間の平均量よりも少なくとも20、40、60、80、100、200、もしくはさらに500%長い。
【０１２８】
「疾患または障害を治療する、安定化する、または予防する」とは、疾患もしくは障害の初期のもしくは後の発生を予防するまたは遅延させること；症状の消失とその再発の間の疾患のない生存時間を増大すること；症状に関連する有害な症状を安定化するまたは減少させること；または、症状の進行を阻害し、もしくは安定化することを意味する。これは、ウイルス、細菌、または真菌などの感染因子で感染する前に治療が確立し、感染の重篤さまたは期間を予防または減少させるという予防的治療を含む。好ましくは、治療された被験者の少なくとも20、40、60、80、90、または95%は、完全寛解を有し、全ての疾患の証拠が消失している。もう一つの態様において、患者が症状を有すると診断されて、本発明の方法を使用して治療された後に生存する時間は、（i）未治療患者が生存する時間の平均的な量、または（ii）別の治療によって治療された患者が生存する時間の平均量よりも少なくとも20、40、60、80、100、200、もしくはさらに500%長い。
【０１２９】
「インターフェロン反応またはdsRNAストレス応答を阻害するまたは予防する条件下」とは、細胞毒性、細胞死、抗増殖反応、またはdsRNAがPTGSもしくはTGS事象を実行する能力の減少を含む1つまたは複数のインターフェロン反応もしくは細胞のRNAストレス応答を予防または阻害する条件を意味する。これらの反応は、インターフェロン誘導（1型および2型）、1つまたは複数のインターフェロン刺激された遺伝子の誘導、PKR活性化、2'5'-OAS活性化、およびこれらの反応の1つまたは複数の活性化／誘導から生じる何らかの下流の細胞のおよび／または生物体の続発症を含むが、これらに限定されない。「生物体の続発症」とは、まるごとの動物、器官、またはより局所的（たとえば、注射の部位で）に、ストレス応答によって引き起こされる何らかの効果を意味する。例示的な徴候は、高いサイトカイン産生、局部的な炎症、およびネクローシスを含む。望ましくは、これらの反応を阻害する条件は、このようなインターフェロン反応阻害条件に曝露されておらず、かつ他の全ての条件が同じ（たとえば、同じ細胞種、同じdsRNA発現ライブラリーで同じ形質転換）である細胞と比較して、細胞毒性、細胞死、またはPTGS、TGS、もしくは別の遺伝子サイレンシング事象を実行する能力の減少を受ける細胞のせいぜい95%、90%、80%、75%、60%、40%、または25%以下であり、最も望ましくは、10%以下である。
【０１３０】
アポトーシス、インターフェロン誘導、2'5'-OAS活性化／誘導、PKR誘導／活性化、抗増殖反応、および細胞変性効果は、全てRNAストレス応答経路の指標である。本明細書に記載されているように、RNAストレス応答の誘導を測定するために使用することができる例示的なアッセイ法は、アポトーシス細胞を検出するTUNELアッセイ法、α、β、およびγインターフェロンの誘導を検出するELISAアッセイ法、2'5'-OASの活性化を検出するリボソームRNA断片化解析、PKR（誘導性のタンパク質キナーゼRNA）活性化の指標としてのリン酸化eIF2aの測定、細胞増殖の変化を検出する増殖アッセイ法、および細胞の細胞変性効果を同定する細胞の顕微鏡分析を含む。望ましくは、本明細書に記載されているアッセイ法のうちの1つを使用して測定されるように、インターフェロン反応のレベルまたはdsRNAもしくはdsRNA発現ベクターによって形質転換された細胞におけるdsRNAストレス応答は、同じ条件下でモック・トランスフェクトされた対照細胞における対応するレベルよりも20、10、5、または2倍大きい。その他の態様において、本発明の方法を使用してdsRNAもしくはdsRNA発現ベクターで形質転換した細胞のインターフェロン反応またはdsRNAストレス応答のレベルは、このようなインターフェロン反応阻害条件に曝露されておらず、かつ他の全ての条件が同じ対応する形質転換細胞の対応するレベルよりも500%、200%、100%、50%、25%、または10%未満優れている。望ましくは、dsRNAは、細胞の転写または翻訳の全体的な阻害を誘導しない。
【０１３１】
「ウイルス感染」とは、ウイルスによる宿主動物への侵入を意味する。たとえば、感染は、通常動物の体内もしくは上に存在するウイルスの過剰な増殖、または通常動物の体内もしくは上に存在しないウイルスの増殖を含んでもよい。さらに一般的にいえば、ウイルス感染は、ウイルスの集団の存在が宿主動物に対してダメージを与える何らかの状況であることができる。したがって、ウイルス集団の過剰量が動物の体内にもしくは上に存在するとき、またはウイルス集団の存在が動物の細胞もしくはその他の組織にダメージを与えているときは、動物はウイルス感染に「罹患している」。
【０１３２】
本発明の方法においてインターフェロン反応またはdsRNAストレス応答を予防するために使用することができる条件および技術は、本明細書に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３３】
詳細な説明
本発明者らは、望まれないインターフェロン反応の誘導およびこの反応を含む種々の成分の活性化は、使用される特定のdsRNA送達／発現方法によって媒介されることを以前に報告した。重要なことに、全てのdsRNAの提示方法が、この反応を活性化するというわけではない（たとえば、2002年5月6日に出願された米国特許出願第60/378,191号；2002年4月26日に出願された米国特許出願第60/375,636号；2002年1月31日に出された米国特許出願第10/062,707号；米国特許出願公開第2002/0132257号および欧州特許出願公開第1229134号を参照し、これらは、それぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１３４】
前述の出願では、RNAストレス応答経路の概略図を記載してあり、1型インターフェロン反応としても既知である（たとえば、米国特許出願第60/375,636号の図2；および米国特許出願第10/062,707号の図4；米国特許出願公開第2002/0132257号；および欧州特許第1229134号を参照されたい）。本経路は、分枝しており、RNAを介した誘導／活性化は、経路の複数の点で生じ得る。RNA（dsRNAおよびその他の構造）は、大部分の細胞種においてαおよび／またはβインターフェロンの産生を引き出すように作用し得る。インターフェロン反応経路の初期および鍵となる事象はインターフェロンを介したJak-Stat経路の活性化を含み、これはSTATタンパク質（STAT）のチロシン-リン酸化に関与する。活性化されたSTATは、核に移行して、IFN誘導性の遺伝子のプロモーターの特異的な部位に結合し、これによりこれらの遺伝子の転写に影響を及ぼして、その発現により、細胞をアポトーシスの方へまたは抗増殖性の状態に押すように協調して作用する。インターフェロンで刺激される何百もの遺伝子が存在するが、良く特徴づけられたもののうちの2つ、PKRおよび2'5'-OASのみを示した。また、RNAは、インターフェロンおよびSTAT非依存的な様式の経路を活性化することができる。加えて、dsRNA／構造RNAは、多くの細胞種において構成的に発現される不活性なPKRおよび2'5'-OASを活性化することもできる。
【０１３５】
この望まれないRNAストレス応答の活性化には、特異的なdsRNAの細胞下の局在、高次構造、および／または細胞のdsRNAの量が必要であるかもしれない。たとえば、本発明者らは、RNAストレス応答経路の誘導／活性化を伴わずに効率的にPTGSを誘導するdsRNA（たとえば、100塩基対以上、望ましくは200塩基対以上、およびより望ましくは600塩基対以上の長いdsRNA）のインビボ発現系を開発した。この系を用いて、本発明者らは、前立腺特異的な抗原（PSA）の長期の抑制を証明し、ヒト細胞株においてヒト胎盤アルカリホスファターゼを分泌させた。
【０１３６】
本発明は、あるとしてもほんの少しの有毒な副作用を生じる遺伝子サイレンシングのための種々の新規の方法および核酸を特徴とする。特に、これらの方法は、標的核酸の領域に実質的な配列同一性を有し、かつ標的核酸の発現を特異的に阻害する1つまたは複数の二本鎖RNA（dsRNA）分子を提供する薬剤を、細胞または動物に投与することを含む。一部の態様において、dsRNA分子の一部または全ては、細胞質に位置し、したがって転写後の遺伝子サイレンシング（PTGS）を介する。特定の態様において、dsRNA分子の一部または全ては、核に位置し、転写性の遺伝子サイレンシング（TGS）を介する。TGS適用については、dsRNAは、望ましくは制御配列（たとえば、転写因子結合部位もしくはプロモーター）および／またはコード配列を含み、PTGS適用については、dsRNAは、望ましくは制御配列（たとえば、mRNAの5'もしくは3'非翻訳の領域（UTR））および／またはコード配列を含む。dsRNAが核で作製され、PTGSが好ましい方法のためには、dsRNAは、選択的に、細胞質へのdsRNAの輸送を促進するための1つもしくは複数の構成的輸送エレメント（CTE）配列またはイントロンを含み、および／またはdsRNA安定度を促進するためのポリAテイルを含んでいてもよい。望ましくは、同じdsRNAがTGSおよびPTGSの両方を介する。その他の態様において、TGSを介する1つまたは複数のdsRNA分子、およびPTGSを介する1つまたは複数のdsRNA分子が使用される。
【０１３７】
インターフェロンもしくはRNAストレス応答を阻害するまたは予防するために、種々の方法が開発されてきた。1つのこのような方法は、短いdsRNA分子（たとえば、二本鎖高次構造である長さが11〜40ヌクレオチドの間の領域を含むdsRNA分子）が、脊椎動物の細胞、組織、および生物体のその他のdsRNA分子（たとえば、1つもしくは複数の標的遺伝子に相同的な短いまたは長いdsRNA分子）によって誘導されるPKR／インターフェロン／ストレス／細胞障害性反応を阻害するために使用することができるという驚くべき発見に基づく（2002年4月26日に出願された米国特許出願第60/375,636号；および2003年4月28日に出願された米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子サイレンシングを誘導する方法（Methods of Silencing Genes Without Inducung Toxicity）」、C.Pachukを参照され、これらは両方とも参照として本明細書に組み入れられる）。特に、2つの短いdsRNA分子は、dsRNAポリ（I）（C）によって通常誘導される毒作用を防げた。したがって、これらの方法は、dsRNA分子（たとえば、外因的に導入された長いdsRNA分子）によって、非特異的な細胞障害性および細胞死の誘導を阻害する（そうでなければ脊椎動物の細胞および脊椎動物における遺伝子サイレンシングのためのこれらの使用を妨げるであろう）。
【０１３８】
インターフェロン反応の誘導を伴わないdsRNAを介した遺伝子サイレンシングのためのその他のアプローチは、細胞質または核のいずれかにおける、標的遺伝子に対して実質的な同一性を有するdsRNA（たとえば、長いdsRNA）の細胞内の発現を含む。驚くべきことに、この方法は、dsRNAストレスまたはI型インターフェロン反応経路の成分を呼び出すことなく細胞内で長いdsRNAを持続的に発現することができる。特に、遺伝子サイレンシングは、RNA polII、RNA polIII、およびT7構築物からのdsRNAの核発現を使用して、並びにdsRNAの細胞質の発現を使用して、観察された。従って、インビボにおけるdsRNAの生成は、哺乳動物およびその他の脊椎動物系において長期の遺伝子サイレンシングを誘導するための効率的かつ実行可能な方法である。さらに、長いdsRNAの細胞内の発現は、遺伝子サイレンシングの非常に強力な誘導因子であった。たとえば、長いdsRNAは、標的遺伝子の発現を少なくとも1月間95%までダウンレギュレートすることが可能であった。その上、長いdsRNAは、遺伝子サイレンシングの程度および／または期間において、いくつかの適用については短いRNAよりも有効であろう。遺伝子機能を研究するための、および遺伝子標的を確認するための多くの細胞モデルは、標的遺伝子機能の欠失を維持することが必要であるので、サイレンシング反応の長期の維持は、機能的なゲノミクスおよび標的確証などの多くのサイレンシングの適用において重要である。また、長期の遺伝子サイレンシングは、多くの治療目的のためにも望ましい。
【０１３９】
必要に応じて、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子に対して実質的な同一性を有するdsRNAのRNA複製によってさらに阻害することができる。たとえば、RNA依存性RNAポリメラーゼは、dsRNAもしくはdsRNAをコードするベクターが導入された細胞または動物において発現させることができる。RNA依存性RNAポリメラーゼは、dsRNAを増幅し、望ましくは細胞または動物のdsRNA分子数を少なくとも2、5、もしくは10倍まで増大させる。RNA依存性RNAポリメラーゼは、細胞または動物によって天然に発現され、dsRNAをコードする同じベクターによってコードされるか、または異なるベクターによってコードされる。例示的なRNA依存性RNAポリメラーゼは、ウイルス、植物、無脊椎動物、または脊椎動物（たとえば、哺乳動物またはヒト）のRNA依存性RNAポリメラーゼを含む。その他のアプローチでは、長期の遺伝子サイレンシングは、細胞または動物におけるベクターの複製を可能にする複製開始点を有するベクターからdsRNAを発現することによって増強される。望ましくは、ベクターは、10、30、50、100、もしくはそれ以上の細胞分裂の後、または1週間、1か月、6か月、または1年後に、細胞または動物の子孫に維持される。
【０１４０】
その上、遺伝子サイレンシングは、標的遺伝子をサイレンスするために部分的なまたは完全なRNAヘアピンを使用することによって増強することができる。特に、dsRNAは、インビトロでまたはインビボでハイブリダイズさせてdsRNAを形成させなければならない2つの別々のRNA分子からよりも、dsRNAヘアピン構造を形成する逆位反復配列を有する一重鎖RNAから、より効率的に作製されるであろう。種々の態様において、dsRNAは、一本鎖の突出または一本鎖の突出がない完全なRNAヘアピンを有する部分的なRNAヘアピンである。ヘアピンにおいて、一つの領域は、標的遺伝子に対して実質的な同一性を有し、標的遺伝子に対して実質的な相補性を有するもう一つの関心対象領域と塩基対形成する。必要に応じて、dsRNAは、ヘアピン形成の効率を増大するためのさらなる塩基対形成領域を含むことができ；たとえば、dsRNAは、ヘアピン形成を促進する塩基対形成したヘリックスに隣接したループを含むことができる。
【０１４１】
また、本発明は、インビトロで、またはインビボでヘアピンを作製するための新規の方法を提供する。これらの方法は、一本鎖の突出を有する部分的なヘアピンを作製する段階と、一本鎖の突出の大きさを減少させるために部分的なヘアピンを伸長する段階とを含む。特に、部分的なヘアピンは、部分的なヘアピンの中の別の領域と塩基対形成する3'末端を有し、部分的なヘアピンの3'末端は、RNA依存性RNAポリメラーゼ（ウイルス、植物、無脊椎動物のRNA依存性RNAポリメラーゼ、またはたとえば、哺乳動物もしくはヒトRNA依存性RNAポリメラーゼなどの脊椎動物のRNA依存性RNAポリメラーゼ）によって伸長される。
【０１４２】
上記のdsRNA分子およびベクターは、動物の疾患または障害を治療する、安定化する、または予防するための種々の方法に使用することができる（たとえば、無脊椎動物または哺乳動物もしくはヒトなどの脊椎動物）。これらの方法において、疾患または障害に関連する標的核酸の領域に対して実質的な配列同一性を有し、かつ標的核酸の発現を特異的に阻害するdsRNAまたはdsRNAをコードするベクターが動物に投与される。一部の態様において、標的遺伝子は、発癌遺伝子などの癌に関連する遺伝子、または変異タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、もしくは過剰発現されたタンパク質などの疾患に関連するタンパク質をコードする遺伝子である。さらに、dsRNA分子は、ウイルス、細菌、もしくは酵母などの病原体による感染を治療する、安定化する、または予防するために使用することができる。一部の態様において、標的核酸は、複製および／または病原性に必要な病原体の遺伝子、または細胞に病原体が感染するために必要な細胞受容体をコードする遺伝子である。
【０１４３】
また、本発明は、機能的なゲノミクス適用のためにdsRNAを介した遺伝子サイレンシングを利用する方法において、上記のdsRNA分子およびdsRNA発現ベクターの使用を特徴とし、細胞の検出可能な表現型、たとえば細胞の機能、標的核酸分子の発現、または標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸分子を同定するためにdsRNAを介した遺伝子サイレンシングを使用するハイスループット法を含む。これらの方法は、遺伝子発現を阻害するために、細胞にdsRNA分子のライブラリーまたはdsRNA分子をコードするベクターのライブラリーをトランスフェクトすることを含む。遺伝子発現の阻害により、細胞の検出可能な表現型を調整し、調整の役割を担う核酸分子を容易に同定することができる。
【０１４４】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示する。これらは、いかなる形であれ本発明を限定することを意味しない。たとえば、いずれか一方の鎖が標的核酸の領域と実質的に同一である二本鎖領域を含む本発明のdsRNA構造のいずれかを含む任意の長さおよび構造のdsRNA分子に以下の実施例のいずれかを使用することができる。本発明の方法は、複数のdsRNA分子および／または複数のdsRNA発現構築物を利用して複数の標的核酸分子を阻害するために、当業者によって容易に適応させることができる。たとえば米国特許出願公開第2002/0132257号および欧州特許出願公開第1229134号、「細胞の機能を調整する核酸配列を同定するための転写後遺伝子サイレンシングの使用（Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell）」（これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているいずれのdsRNA分子、標的核酸分子、または方法のいずれも本方法に使用することができる。
【０１４５】
本発明の使用は、脊椎動物または哺乳動物の細胞に限定されないが、このような細胞は、本明細書に記載されている方法を行うために使用することができる。望ましくは、本発明を実行するために使用される脊椎動物（たとえば、哺乳動物）細胞は、わずかな継代しかしていない培養された細胞であるか（たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから直接得られた30継代よりも少ない細胞株）、または初代細胞である。加えて、細胞にトランスフェクトされているdsRNAが陽イオン性の脂質との複合型でないときには、本発明を実行するために脊椎動物（たとえば、哺乳動物）細胞を使用することができる。
【０１４６】
実施例1：転写性および転写後の遺伝子サイレンシング
転写性の遺伝子サイレンシング（TGS）は、遺伝子発現のサイレンシングがRNA転写のレベルで生じる現象である。二本鎖RNAは、TGS並びに転写後の遺伝子サイレンシング（PTGS）を介するが、dsRNAは核に局在することが必要であり、望ましくは、TGSを介するために核で作製される。PTGSは、細胞質で生じる。TGS、PTGS、または両方を介することができる多くのdsRNA構造およびdsRNA発現ベクターは、本明細書に詳細に描いてある。TGS、PTGS、または両方を介するための種々の戦略は、下記に要約してある。
【０１４７】
本明細書に記載されている全ての細胞質dsRNA発現ベクターは、これらがdsRNAが標的mRNAと相互作用することができる細胞質においてdsRNAを作製するため、PTGSを介する。これらのベクターによって作製されたいくつかのdsRNAは、受動的なプロセスを経て（たとえば、有糸分裂の間の核膜の崩壊および再編成により）核に移行されるために、これらのベクターは、分裂する細胞においても低効率でTGSに影響を及ぼすと思われる。RNA PolIIベクターは核において、細胞質に入るための種々の能力をもつRNA分子を発現する。
【０１４８】
必要に応じて、1つまたは複数の構成的輸送エレメント（CTE）配列を付加して、RNA PolIIによって核において作製される種々のエフェクターRNA分子（たとえば、ヘアピンまたは二本鎖）を細胞質に輸送させることができる。輸送を促進するために、イントロンおよび／またはポリA配列の代わりにおよび／または加えて、CTEを使用することができる。CTEのための望ましい位置は、RNA分子の3'末端近くである。必要に応じて、複数のCTE配列（たとえば、2、3、4、5、6個またはそれ以上の配列）を使用することができる。好ましいCTEは、マソン-ファイザー・モンキー・ウイルス（Mason-Pfizer Monkey Virus）（米国特許第5,880,276号および第5,585,263号）由来である。
【０１４９】
ポリアデニル化シグナルと組み合わせた機能的なイントロンまたはCTEをコードするベクターは、より効率的にdsRNAを細胞質に輸送する。（i）イントロンもしくはCTEだけを有し、かつポリアデニル化シグナルがないか、または（ii）ポリアデニル化シグナルだけを有し、かつイントロンもしくはCTEを有さないベクターは、RNAを細胞質に搬出する効率が劣り、細胞質にRNAが少なくなって、PTGSの効率を低下させる。イントロン、CTE、およびポリアデニル化シグナルのないRNAをコードするベクターでは、RNA分子を細胞質へ運搬する効率が最も劣る結果となる。RNAの細胞質への輸送のレベルが低下するにつれ、より多くのRNAが核に保持されて、より高い効率でTGSが誘導される。したがって、これらのベクターは全て、上記の通りに、それぞれの細胞質輸送および核内保持のレベルに従って様々な効率でPTGSおよびTGSを誘導する。
【０１５０】
RNA PolIIIベクターは、1つまたは複数のイントロンを有しても、もしくはイントロンを有さなくてもよく、かつポリAテイルを有しても、もしくはポリAテイルを有さなくてもよく、核で作製されて、主に核において保持されるRNA分子をコードする。この核RNAは、TGSを誘導する。しかし、一定の割合の転写されたRNAが細胞質に達して、したがってPTGSを誘導することができる。TGS誘導のためには、dsRNAは、望ましくはプロモーター、またはプロモーター配列のサブセットを含み、核に保持される。または、dsRNAは、コード配列もしくはUTR配列だけを含んでもよく、または望ましくはコード配列もしくはUTR配列およびプロモーター配列の組み合わせを含んでいてもよい。このような「融合標的」dsRNAは、たとえばプロモーター配列並びに同時にTGSおよびPTGSに対して標的となる連結遺伝子配列を含んでもよい。PTGSについては、dsRNAは、RNAに由来する配列（たとえば、mRNA由来のコード配列またはUTR配列）を含み、プロモーター配列を含む必要はない。加えて、より効率的なPTGSは、細胞質における転写を可能にするベクターによって、またはより効率的に細胞質へ輸送されるRNAを生じるベクターによって誘導される。必要に応じて、PTGSおよびTGSは、本明細書に記載されている方法および当業者に既知の技術を使用してこれらのベクターを組み合わせて同時に誘導することができる。
【０１５１】
実施例11に記載されているベクター（下記を参照）または他の標準的なベクターのいずれかを、本発明のdsRNA構造を作製するために、および本方法に、使用することができる。
【０１５２】
実施例2：転写後の遺伝子サイレンシングを促進するための例示的な方法
RNA PolIIによって核で転写されるdsRNAによってPTGSを促進するために、1つまたは複数のイントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルをdsRNAに付加して、転写されたRNAをプロセシングさせることができる。スプライシングおよびポリアデニル化の両方が、核から細胞質への搬出を促進するので、このプロセシングは望ましい。加えて、ポリアデニル化は、RNA PolII転写物を安定化する。いくつかの態様において、原核生物の抗生物質耐性遺伝子、たとえばゼオマイシン（zeomycin）発現カセットは、イントロンに位置している。その他の例示的な原核生物の選択可能なマーカーは、米国特許第5,851,804号のキメラ・カナマイシン耐性遺伝子を含むカナマイシン、アミノ配糖体、テトラサイクリン、およびアンピシリンなどのその他の抗生物質耐性遺伝子を含む。ゼオマイシン遺伝子は、原核生物のプロモーターの制御調節下にあり、宿主細菌におけるゼオマイシンの翻訳は、開始ATGの約10の塩基対上流域の範囲内に位置するシャイン-ダルガーノ配列の存在下で確実になされる。または、ゼオマイシン発現カセットは、ヘアピンの逆位反復配列の間（すなわち、サイレンシングされる標的核酸に対して実質的な同一性を有するセンスおよびアンチセンス配列の間）の任意の位置に配置することができる。
【０１５３】
ベクターが細菌において伝播されるときは、逆位反復配列は、DNA組換えによって通常DNAから欠失するにもかかわらず、わずかな割合の細菌は、細菌において逆方向反復を有するDNAが安定に維持されるように組換え経路に突然変異を有する可能性がある。これらのまれな細菌をスクリーニングするために、ゼオマイシン選択を培養に添加する。逆方向反復を除去することができる目的外の細菌は、ゼオマイシン発現カセットも組換えの間に欠失するので、死滅する。完全なゼオマイシン発現カセットを有する所望の細菌だけが選択され、生存する。
【０１５４】
選択された細菌からDNAを単離し、RNAの発現のために真核生物（たとえば、哺乳動物細胞培養物）または動物（たとえば、成体哺乳動物）に挿入した後、イントロンはRNA転写物からスプライスされる。ゼオマイシン発現カセットがイントロンに位置する場合、このカセットは、RNAスプライシングによって除去される。非効率的なスプライシングの場合には、ゼオマイシン発現カセットは、この遺伝子の転写および翻訳のための真核生物のシグナルがないために発現されない。カセットの除去は、dsRNA分子のサイズを減少させるので、抗生物質耐性カセットの排除は、短いdsRNA分子を含む適用のためには望ましい。ゼオマイシンカセットはまた、イントロン内の代わりにイントロンのいずれかの末端のそばにも位置することができる。この場合、ゼオマイシン発現カセットは、イントロンがスプライスされた後にも残ったままであり、ヘアピンのループ構造に関与するために使用することができる。これらのRNA PolII転写物は、核で作製されて細胞質へ輸送され、そこでこれらは、PTGSをもたらすことができる。しかし、いくらかのRNA分子は、核に保持されてもよい。これらの核RNA分子は、TGSをもたらすであろう。TGSへの適用については、コードされたdsRNAは、望ましくはプロモーターまたはプロモーターのサブセットを含む。核内により効率的にRNAを保持するために、イントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルを除去することもできる。
【０１５５】
細胞質および核への局在のためのもう一つの戦略は、「上流域」または内部のRNA PolIIIプロモーターを使用することである（たとえば、「Gene regulation： A Eukaryotic Perspective」, 3rd ed., David Latchman （Ed.） Stanley Thornes： Cheltenham, UK, 1998を参照されたい）。これらのプロモーターは、核で転写されたRNA転写物を生じ、その一部が搬出されて、その一部が核に保持され、それゆえにPTGSおよび／またはTGSに使用することができる。これらのプロモーターは、収束プロモーターの使用を介して、または2つのベクターもしくは2つのシストロン系の使用を介して、本発明の部分的および強制的なヘアピン構造を含むヘアピン、または二本鎖RNAを作製するために使用することができる。一方のプロモーターは、センス鎖の合成を指示し、他方のプロモーターは、アンチセンスRNAの合成を指示する。これらのプロモーターによって転写されるRNAの長さは、一般に数百ヌクレオチド（たとえば、250〜500）に制限される。加えて、効率的な転写終結を可能にするために、これらのベクターに転写終結シグナルを使用してもよい。
【０１５６】
抗生物質耐性遺伝子を含むイントロンを有するdsRNAをコードする例示的なベクター
ヒトサイトメガロウイルス主要最初期タンパク質イントロンI（アクセッション番号M21295）は、以下のフォワード・プライマーKpnI-イントロン-f
2006500012.tif 000003
およびリバース・プライマーNheI-イントロン-r
2006500012.tif 000004
を使用してPCR増幅した。これらのプライマーは、ヌクレオチド594位〜1469位の領域を増幅し、イントロンの5'末端においてKpnI部位および3'末端においてNheI部位を導入する。この産物をpBSII KS（+）（Stratagene, LaJolla, CA）のEcoRV部位に挿入してベクターpBS-IVSを作製した。
【０１５７】
ゼオシン遺伝子は、市販されている（Invitrogenm, pcDNA3.1（+）Zeo）。原核生物プロモーターを有する遺伝子は、フォワード・プライマー5'ZeoSphI
2006500012.tif 000005
およびリバース・プライマー3'ZeoHpaI
2006500012.tif 000006
を使用して、pCDNA（+Zeo）（Invitrogen）を用い、PCR増幅した。このPCR産物をSphIおよびHpaIで切断し、断片をSphIおよびHpaI部位に含まれるhCMVイントロンA（Genbankアクセッション番号M21295、ヌクレオチド594位〜1470位）に挿入してベクターpBS-Izを作製した。この挿入により、ゼオシンをイントロンA配列に同じ方向で組み込み、イントロンAアクセプターおよびドナー部位ならびにこれらの隣接領域を無傷のまま残す（IVS-Zeocin）。
【０１５８】
IVS-Zeocin（Iz）は、酵素KpnIおよびNheIを使用してpBS-Izから切除し、かつ単離した断片をヒトサイトメガロウイルス・プロモーター（Genbankアクセッション番号AF105229）の発現ベクター下流に挿入した。挿入部位の下流において、ベクターは、ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナルを含んでいた。IzをベクターMCSのKpnIおよびNheI部位に挿入した；この構築物は、RNAのプロセシングおよびイントロンの配列の切出しができるようにプロモーターに対してIzの本来の方向を維持している。また、コードされるRNAは、ポリアデニル化されていることが予測される。このベクターをpCMV-Izと名づけた。
【０１５９】
分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP；Genbankアクセッション番号U89938）をフォワード・プライマーKpnI-SEAP-f
2006500012.tif 000007
およびリバース・プライマーSEAP5'Xho
2006500012.tif 000008
を使用してPCR増幅した。このPCR反応により、全長SEAPを増幅し、5'末端にKpnI部位をおよび3'末端にXhoI部位を導入する。産物をpBSIIKS（+）にサブクローニングして、EcoRIによって切断し、ベクターpBS-SEAPKXを作製した。全長SEAPは、KpnIおよびXhoIを使用してpBS-SEAPKXから切除し、pCMV-Izに挿入した。この挿入は逆方向であり、pCMV-IzベクターのKpnIおよびXhoI部位を使用してIz配列の上流への挿入であった。SEAPΔPCR産物は、フォワード・プライマーNheI-SEAP-f
2006500012.tif 000009
およびSEAP3'XhoIを使用して作製した。この反応では、5'末端にNheI部位および3'末端にXhoI部位を有するSEAPの650塩基対断片を生じる。SEAP NheI／XhoI PCR産物をNheIおよびXhoIで切断し、NheIおよびSalI制限酵素部位でpCMV-SEAP-Izに挿入した。この挿入はフォワード方向であり、Iz配列の下流への挿入であり、ベクターpCMV-SEAP-Iz-SEAPΔを作製した。35μg/mlのゼオシンを含む培地での選択により、650〜700塩基対の逆方向反復を含むベクターの良好な複製を生じた。この所望のベクターの複製は、DH5α細胞では生じたが、試験条件下において、DH1OB細胞では生じなかった。
【０１６０】
また、この方法をmIL-12p40（全長および500塩基対のセグメント）およびmCK-Mでも行った。さらに、この方法をT7およびhCMVプロモーター系を用いた2つの異なるベクター系においても行った。理論的には、この方法は、任意のベクター、任意のプロモーター、任意のポリAシグナル、および機能的なアクセプターおよびドナー部位を含む任意のイントロン配列内で、もしくはその近くに挿入された任意の薬剤耐性遺伝子または任意の陽性の選択マーカーについて行うことができる。
【０１６１】
実施例3：インビボでdsRNAを作製するための例示的な方法
dsRNAの持続的な発現のための例示的な細胞内発現系は、細胞質の発現系、たとえばT7プロモーター／T7 RNAポリメラーゼ、ミトコンドリアのプロモーター／ミトコンドリアのRNAポリメラーゼ、またはRNA PolII発現系を含む。その他の可能な細胞質での発現系は、外部から導入されたウイルスまたはバクテリオファージのRNAポリメラーゼとその同族プロモーター、または同族のプロモーターを有するミトコンドリアのRNAポリメラーゼなどの内因性ポリメラーゼを使用する。もう一つの態様において、持続性のある長いdsRNAの細胞内発現系は、RNA polI、RNA polII、またはRNA polIII発現系などの核発現系である。
【０１６２】
脊椎動物細胞におけるdsRNAの細胞内発現のための構築物
脊椎動物細胞において細胞内にdsRNAを発現することができる種々の発現構築物は、種々の少なくとも部分的に二本鎖のRNA分子を発現するために利用することができる。そのRNA分子は、本発明の強制的および部分的なヘアピン構造、並びに望ましくは少なくとも50塩基対、より望ましくは100を超える塩基対、なおより望ましくは200を超える塩基対の二本鎖領域を有する長いdsRNA分子を含み、特定のプラスミド、たとえば20キロベースのプラスミドの最大能力の範囲内であるか、またはウイルスもしくはその他のベクターに適している、1、2、3、4、5、もしくはそれ以上のキロベースの配列を含む。
【０１６３】
dsRNAを産生するように設計されている発現ベクターは、一本鎖または二本鎖DNAプラスミドもしくはベクターであってもよい。本明細書に記載されているdsRNAを産生するために設計された発現ベクターは、ミトコンドリアのRNAポリメラーゼ、RNA PolII、RNA polIIIなどの任意のRNAポリメラーゼ、または外因的に導入されたウイルスもしくはバクテリオファージのRNAポリメラーゼの制御下の配列を含んでもよい。ベクターは、望ましくは内因性のミトコンドリアのポリメラーゼ（たとえば、対応するヒト・ミトコンドリアのプロモーターを有するヒト・ミトコンドリアのRNAポリメラーゼ）を利用するように設計されていてもよい。ミトコンドリアのポリメラーゼは、キャッピング酵素の発現を介してキャップされたdsRNAを作製するために、またはインビボでキャップされていないdsRNA転写物を作製するために使用されてもよい。また、RNA polI、RNA PolIIおよびRNA polIII転写物は、インビボで作製されてもよい。このようなRNA分子は、キャップされていてもいなくてもよく、必要に応じて、細胞質におけるキャップ形成は、ワクシニア・キャッピング酵素またはアルファウイルス・キャッピング酵素などのキャッピング酵素の使用を含む種々の手段によって達成されてもよい。DNA発現ベクターは、1つのプロモーターまたは複数のプロモーターの組み合わせ（ミトコンドリアのRNA polI、RNA PolII、RNA polIII、ウイルス、細菌またはバクテリオファージのプロモーター）を、これらの同族のRNAポリメラーゼ（たとえば、T3、T7、またはSP6バクテリオファージ系）と共に含むように設計されている。望ましくは、RNA PolII系は、核における分解を避けるために約300ヌクレオチドよりも大きいオープンリーディングフレームを有するdsRNAをコードするセグメントを使用する。必要とされるRNA分子をインビボで哺乳動物細胞に提供するために操作されるであろうウイルスおよびウイルスの配列（たとえば、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、SV40などのパポーバウイルス、ポリオウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、プラス鎖およびマイナス鎖RNAウイルス、ウイロイド、およびウイルソイド）を含む、本発明のRNA分子の細胞内の産生のための構築物に関するさらなる情報は、たとえば国際公開公報第00/63364号において見出され、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【０１６４】
DNA依存性のいずれのその他のRNAポリメラーゼ（たとえば、ウイルス、植物、無脊椎動物、または脊椎動物のポリメラーゼ）も使用することもできる（たとえば、表2を参照されたい）。一部の態様において、ポリメラーゼによって転写されるdsRNAは、ポリメラーゼコード配列が得られたものと同じ生物体、種、または属に由来するプロモーターの制御下で発現される。
【０１６５】
（表２）DNA依存性RNAポリメラーゼ
2006500012.tif 000010
【０１６６】
例示的なプロモーターおよび標的核酸のコード配列は、表3に列記してある（下記を参照されたい）。その他のプロモーターおよびコード配列は、公開されたデータベースまたは参照から、または標準的な配列分析技術などの一般的な方法から、当業者によって容易に同定することができる。プロモーターを標的とするためには、たとえば少なくとも19〜30ヌクレオチド長のdsRNAをdsRNA内にTATAボックスまたはCATボックスを含むように設計することができる（たとえば、「Molecular Cell Biology」, Lodish （ed.） 3rd edition, Scientific American books： New York, 1995を参照されたい）。他の態様において、たとえばコード配列の少なくとも350、500、750、1000、1500、2000、または2500ヌクレオチド上流の領域を、関心対象の核酸のプロモーターおよび／またはその他の調節エレメントを標的とするために使用することができる。特定の望ましい態様において、プロモーターおよびコード配列の両方が、同じdsRNAまたはdsRNA発現構築物において標的とされる。
【０１６７】
（表３）例示的な標的遺伝子およびプロモーター、並びにそれを含むゲノム
2006500012.tif 000011
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【０１６８】
T7プロモーター／T7ポリメラーゼ発現系
本発明の望ましい方法は、脊椎動物細胞（たとえば、哺乳動物細胞）におけるdsRNA（たとえば、長いまたは短いdsRNA分子）の細胞質の発現を達成するためにT7 dsRNA発現系を利用する。短いdsRNA分子の細胞内の発現は、外部から添加した短いdsRNA分子に関するサイレンシング期間を増大するものと思われる。T7発現系は、所望のdsRNAを発現するためにT7プロモーターを利用する。転写は、T7 RNAポリメラーゼによって駆動され、これは第2のプラスミドの上か、または同じプラスミドの上に提供することができる。たとえば、収束T7プロモーターの制御下でセンスおよびアンチセンス鎖の両方を発現する第1のプラスミド構築物、並びにRSVプロモーターの制御下でT7 RNAポリメラーゼを発現する第2のプラスミド構築物を使用することができる。dsRNAおよびT7 RNAポリメラーゼは両方とも、特にdsRNA鎖が逆方向反復または少なくとも部分的に二本鎖の領域を有するステム-ループもしくはヘアピン構造を呈することができる自己相補性領域を有する単一のRNA鎖から形成されるときに、有利には単一の2シストロンのプラスミド構築物から発現させることができる。自己構築してdsRNAを形成する個々のセンスおよびアンチセンス鎖は、たとえば転写されるように選択された配列の相補鎖の5'および3'末端にそれぞれ配置されたバクテリオファージT7プロモーターなどの収束プロモーターを使用して単一のプラスミド構築物によって合成することができる。
【０１６９】
実施例4：インビトロでdsRNAを作製するための例示的な方法
短いおよび長いdsRNAは、当業者に既知の種々の方法を使用して作製することができる。例えば、ssRNAセンスおよびアンチセンス鎖、または本発明のヘアピン構造を含む逆方向反復または少なくとも部分的に二重鎖の領域を有するステム-ループもしくはヘアピン構造を呈することができる自己相補性領域を有する単一のRNA鎖は、化学的にインビトロで合成すること（たとえば、Q.Xuら、Nucl. Acids. Res., 24 （18）：3643-3644, 1996および国際公開公報第00/63364号, pp.16-7で引例されるその他の参照を参照されたい）、商業的に入手可能な材料および従来の酵素による合成方法を使用してインビトロで転写すること（たとえば、「Promega Protocols and Applications Guide」3rd Ed., Eds. Doyle, 1996, ISBN No. 1-882274-57-1に記載のものなどの従来法に従ってバクテリオファージT7、T2、もしくはSP6 RNAポリメラーゼを使用する）、または組換え方法を使用する細胞培養で発現させることができる。次いで、種々のクロマトグラフィの方法を含む非変性方法を使用してRNAを精製し、ハイブリダイズさせてdsRNAを形成させる。このような方法は、当業者にとって周知であり、たとえば国際公開公報第01/75164号、国際公開公報第00/63364号、およびSambrookら、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」2nd Ed.； Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989に記載されており、これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１７０】
インビトロ転写反応は、製造業者の説明に従って、Riboprobeキット（Promega Corp.）を用いて実施する。鋳型DNAは、上記の通りである。合成に続いて、RNAをプロテイナーゼKで処理し、フェノール-クロロホルムで抽出して混入RNaseを除去する。RNAをエタノールで沈殿させて、70%のエタノールで洗浄し、RNase-フリー水に再懸濁する。解析のために一定分量のRNAを取り出し、RNA溶液をエタノール-ドライアイス浴でインキュベートすることによってフラッシュ凍結させる。RNAは、-80%Cで貯蔵する。
【０１７１】
フェノール-クロロホルム抽出に代わるものとして、Liら（2000年1月28日に出願された国際公開公報第00/44943号）によって記載されているものなどの標準的な方法を使用してフェノールの非存在下でRNAを精製することができる。または、フェノールおよび／またはクロロホルムで抽出したRNAを精製して、フェノールおよび／またはクロロホルムの量を減少させるまたは除去することができる。たとえば、RNAを精製するために、標準的なカラムクロマトグラフィ（2000年1月28日に出願された国際公開公報第00/44914号）を使用することができる。
【０１７２】
二重鎖RNAは、上記の通りに転写反応において、アンチセンスRNAおよびセンスRNAをコードするPCR断片の等モル量を組み合わせることによって作製することができる。一本鎖のアンチセンスまたはセンスRNAは、反応において単一種のPCR断片を使用することによって作製される。RNA濃度は、吸光光度法によって決定され、RNAの質は、変性ゲル電気泳動によって、および一本鎖のRNAを分解させるRNase T1で消化することによって評価する。
【０１７３】
必要に応じて、mRNAライブラリーは、Qβバクテリオファージを使用して、mRNA分子をQβレプリカーゼ機能に必要とされる隣接配列に対してRNAリガーゼを用いて結合することによって産生される（QβフランクまたはQβフランクプラスP１）。次いで、結合されたRNA分子をQβレプリカーゼおよびコートタンパク質を発現する細菌に形質転換させる。次いで、単一のプラークを新しい細菌に接種する。全てのプラークは、導入遺伝子配列を有するものと思われる。それぞれのプラークをQβポリメラーゼを産生する細菌においてより大量に培養し、RNAをバクテリオファージ粒子から単離する。または、ライブラリーを作製するためにQβフランクプラスP１を使用する場合（たとえば、P1=MS2、VEEV、またはシンドビスプロモーター配列）、これらのベクターを使用して同族のポリメラーゼによってインビトロ転写を実行することができる。次いで、インビトロで作製されたdsRNAを、細胞をトランスフェクトするために使用する。
【０１７４】
実施例5：インビボでまたはインビトロで効率的なヘアピンdsRNAの形成が可能な例示的な構築物
逆方向反復配列を有する一重鎖RNAは、より効率的にdsRNAヘアピン構造を形成するので、一部の適用については、二重鎖dsRNAをコードする構築物よりも単分子のヘアピンdsRNAをコードする構築物（すなわち、センス領域およびアンチセンス領域を有する分離したRNA分子を有する1つのRNA分子で構成されたdsRNA）が望ましい。このより優れた効率は、一部は、二重鎖dsRNAを作製する収束プロモーターを含むベクターにおいて生じている転写の干渉の発生のためによる。転写の干渉により、それぞれのRNA鎖の不完全な合成を生じ、これにより互いに塩基対形成して二本鎖を形成することができる完全なセンスおよびアンチセンス鎖の数が減少する。転写の干渉は、必要に応じて、（i）1つのベクターがセンスRNAをコードし、第2のベクターがアンチセンスRNAをコードする2つのベクター系、（ii）個々の鎖が同じプラスミドによってコードされているが、別々のシストロンを使用することによる二シストロンベクター、または（iii）ヘアピンdsRNAをコードする単一のプロモーターのベクター、すなわちセンスおよびアンチセンス配列が同じRNA分子内でコードされるRNAを使用することによって克服することができる。ヘアピン発現ベクターは、二重鎖ベクターに関していくつかの利点を有する。たとえば、二重鎖RNAをコードするベクターでは、RNA鎖は、これらの相補的な対応物が見いだされ、転写直後に塩基対を形成する必要がある。このハイブリダイゼーションが起こらない場合、個々のRNA鎖は、転写鋳型から離れて拡散し、アンチセンス鎖と比較してセンス鎖の局部的な濃度が減少する。この効果は、インビトロで転写されるRNAと比較して、細胞あたりの鋳型のレベルが低いことにより、細胞内で転写されるRNAが大きい。さらに、RNAは、最近傍則によって折り重なり、転写と同時に折りたたまれたRNA分子を生じる（すなわち、これらが折りたたまれて転写される）。したがって、完了されたRNA転写物のいくらかの割合は、これらの分子の分子内での塩基対形成のために、相補的な第2のRNAとの塩基対形成のために利用することができない。このような利用できない分子の割合は、これらの転写に伴う時間とともに増大する。これらは、すでに安定に折られた構造であるので、これらの分子は、決して二重鎖を形成しないであろう。ヘアピンRNAにおいて、RNA配列は、常にその相補RNAに物理的に近い付近にある。RNA構造は静的ではないので、RNAが一過性に折り畳まれていないと、その相補配列を直ちに利用でき、これが非常に近くにあるために、塩基対形成に関与することができる。一旦形成されると、ヘアピン構造は、本来の非ヘアピン構造よりも安定するものと予測される。特に好ましいRNAヘアピンは、本明細書に記載されているように、「強制的」ヘアピン構築物および「部分的」ヘアピン構築物である。
【０１７５】
強制的ヘアピン構築物
「強制的」ヘアピン構築物は、ステム-ループまたはヘアピン構造においてより効率的に発現されるので、これらが望ましい。これらのヘアピン発現ベクターは、本明細書において、選択された標的の「センスまたはアンチセンスRNA」配列のすぐ後に位置する「配列A」といわれる配列をコードする（図1A〜1D）。また、配列Aは、ヘアピンのループの前に位置し、本明細書においてループの後でかつ選択された標的の「アンチセンスまたはセンスRNA」の前に位置する「配列B」といわれる配列に対して相補である。望ましくは、配列Aおよび配列Bは、自己相補性を全く含まない。望ましくは、配列Aのヌクレオチドは、主にGまたは主にCであり、配列Bのヌクレオチドは、それぞれ主にCまたは主にGであり、その結果、配列Aおよび配列Bは互いに対して相補である。たとえば、配列Aは、
2006500012.tif 000021
（名称T（U）は、DNA配列に存在するチミジン（T）残基をいうが、ウリジン（U）は、コードされるdsRNAヘアピンに存在することに留意されたい）であることができる。この場合、配列Bは、たとえばそれぞれ
2006500012.tif 000022
であることができる。GまたはCのモノ配列は、望ましくは主にCまたは主にGの配列であるか、または
2006500012.tif 000023
塩基の連なりに変更して使用してもよく、並びに配列AおよびBが互いに対する相補的であり、それ自身がいずれの有意な二次構造も有さないか、またはループ、標的領域のセンスもしくはアンチセンス、もしくは転写物内の他の何らかの配列などのその他の配列と何らの有意な塩基対を示さない限り、その他の同様のバリエーションを使用してもよい。一部の局面において、特に短いヘアピンRNAを、たとえば19〜30塩基対、19〜27塩基対、または19〜23塩基対の長さで発現するときに、AおよびB配列は、ループ、標的領域のセンスもしくはアンチセンス、または転写物内の他の何らかの配列などのその他の配列と塩基対を形成するであろう4つ未満の隣接するヌクレオチドを有するように選択してもよい。関心対象のより長い配列、たとえば100〜数百塩基対を含むヘアピンにおいて、ループ、標的領域のセンスもしくはアンチセンス、または転写物内の他の何らかの配列などのその他の配列と塩基対を形成するであろう7つ未満の隣接するヌクレオチドを有するように選択してもよい。RNAは、最近傍則によって折り重なるため、および配列A内またはB内には自己相補性がないので、配列AとBの間の相補性によりヘアピン形成が駆動する。配列AとBの間の塩基対形成構造のΔGが低下されるにつれて、次第に効率的なヘアピン形成が駆動される。この効率の増大は、G／C塩基対の数を増大することによって、および／または配列AおよびBの塩基対の総数を増大することによって達成することができる。配列Aおよび配列Bは、望ましくは10塩基対〜100塩基対の間、より望ましくは10〜15塩基対の間、あまり望ましくないが4〜10塩基対の間、または100〜200塩基対間である。
【０１７６】
配列Aおよび配列Bの間には、最小で少なくとも約4〜7ヌクレオチド、望ましくは約7〜15、たとえば7、8、9、10、11、12、13、14、および15、または7〜25の間、および最大で数百ヌクレオチドのループとして役立つ配列がある。ループ構造が、その他の機能、たとえばリボザイムをコードするように設計されているときは（図7D）、ループのヌクレオチドの数は、この機能に応じて対応して大きくなる。一般に、T群（DNAベクターのT群；転写されたRNAのU群）またはA群のモノ配列は、強制的ヘアピンのループに望ましい。ピリミジンは、ヌクレアーゼによる消化に対してこれらがより優れた感受性であるために、ループにおいて好ましいので、T群のモノ配列（DNAベクターのT群；転写されたRNAのU群）は、ヘアピンにも望ましいであろう。4〜5個のT群の配列は、U6システムのターミネーターとしての役割を果たすので、U6プロモーターを含む構築物は例外である。一般に、強制的ヘアピンのループ配列については、以下の順のヌクレオチドの優先度であると考えられる：T（U）＞A＞C＞G。G群の鎖を含む配列は、通常、ループ構造においては避けられる。また、
2006500012.tif 000024
などのループ配列を使用してもよく、その他の同様のバリエーションであってもよい。有意でない場合には、ループ内にある程度の二次構造ができる。多数のG群を含まない転写物において、たとえば一部の「強制的」ヘアピンで見いだされるように、C群並びにT群（U群）（すなわち、ピリミジン）が、ループ構造に好まれる。一部の局面において、短いヘアピンにおいて、ループ構造は、標的領域のセンスまたはアンチセンス、または転写物内の他の何らかの配列などの、他の何らかの配列と塩基対を形成する4つ未満の隣接するヌクレオチドを有するように選択されてもよい。関心対象のより長い配列、たとえば数百塩基対を含むヘアピンでは、一部の局面において、ループ配列は、標的領域のセンスもしくはアンチセンス、または転写物内の他の何らかの配列などの、他の何らかの配列と塩基対を形成する7つ未満の隣接するヌクレオチドを有するように選択されてもよい。
【０１７７】
実施例6：RNA依存性RNAポリメラーゼによって伸張されて、dsRNAヘアピンを形成することができる部分的ヘアピンの作製
ヘアピン形成は、部分的ヘアピンの伸張によって効率的に駆動される。部分的なヘアピンは、領域1に関して完全な相補配列を含まないヘアピンである（選択された標的に関してアンチセンスもしくはセンスのいずれかであってもよく、または、標的特異的なセンスもしくはアンチセンスの配列に続いて、図1の「A」領域などの「強制的」ヘアピン形成するように設計された配列を含んでいてもよい；また、たとえば図2Aを参照されたい）。完全なヘアピンは、不完全な相補配列だけが分子に存在するという事実によって形成することはできない。部分的なヘアピンは、自己伸張し、インビボでまたはインビトロでRNA依存性RNAポリメラーゼ活性の存在下において完全なヘアピンに変換することができる。インビボでの使用のためには、RNA依存性RNAポリメラーゼ活性は、ChangおよびTaylor（EMBO J, pp.157-164, 2002）に記載されている活性などの内因性ポリメラーゼ活性であり、またはアルファウイルスを含む（しかし、これに限定されない）種々のRNAウイルスによってコードされるポリメラーゼなどのRNA依存性RNAポリメラーゼの外来性の供与源をコードする発現プラスミド／ウイルスベクターのトランスフェクション／感染によって提供されうる。RNA依存性RNAポリメラーゼおよび／またはこれらのcDNA配列は、ウイルス、植物、無脊椎動物、および脊椎動物（たとえば、哺乳動物またはヒト）を含む種々の種から得てもよい。部分的なヘアピンの伸張は、インビトロでまたはインビボで転写／複製反応においての領域1の鋳型を複製することによって生じる。したがって、部分的なヘアピンの伸張は、増殖するヘアピンの相補対が伸張のための鋳型として作用することが必要である。複製または転写を介した鋳型の複写では、領域1鋳型が折り畳まれておらず、これによりヘアピンは、ここで隣接するために、新しく伸張されたヘアピンとの塩基対形成のために利用できる。
【０１７８】
自己伸張することができる部分的なヘアピンを作製するために、ヘアピンの3'末端ヌクレオチドは、ヘアピンがRNA依存性RNAポリメラーゼによって伸張することができるように鋳型と塩基対形成されることが必要である。望ましくは、少なくとも6ヌクレオチドで、望ましくは少なくとも5〜15のヌクレオチドで、3'末端で、RNAの鋳型の一部と塩基対形成される。以下の塩基対形成は、この3'末端／鋳型領域の優先度を低くする順で列記してある：G：C＞A：U=A：C＞G：U。以下のステム構造のための塩基対形成（たとえば、3'末端からより遠いヌクレオチド）も、優先度を低くする順で列記してある：G：C＞A：G＞AU=A：AC＞G：U。
【０１７９】
望ましくは、転写終結は、予め固定されたヌクレオチドで、または予め定義されたヌクレオチドのセット内で生じる。または、構築物は、RNAが予め定義された配列でプロセシングされ（すなわち、切断され）、3'末端で適切な配列を生じるように設計することができる。RNAが適切な配列で切断されない場合、3'末端ヌクレオチドは、適切な領域において鋳型と塩基対を形成することができず、したがって、所望のヘアピンは生じないであろう。
【０１８０】
ヘアピンの3'末端におけるこの塩基対形成は、（i）PolIIIポリメラーゼ、ミトコンドリアのRNAポリメラーゼ、葉緑体RNAポリメラーゼ、細菌RNAポリメラーゼ、ファージRNAポリメラーゼ、またはウイルスのRNAポリメラーゼの使用を介し、または所望の末端配列で正確に直線化された（すなわち、制限消化されまたはPCR増幅された）鋳型DNAの使用のいずれかを介した正確な終結によって達成されてもよい。また、直線的な高次コイルの鋳型をファージN15の使用によって調製し、所望の配列をファージゲノムに組み込んで、ヘルパーファージによって増殖してもよい。または、鋳型鎖のひと続きのポリUは、一部分のmRNA分子を末端A配列が鋳型ポリUと平坦な塩基対形成されるヘアピン構造を呈することができるので、ポリアデニル化されたRNA PolII転写物を使用することができる（図7A）。オリゴデオキシリボヌクレオチド、RNA配列のRNase H切断が可能な修飾されたオリゴヌクレオチド（たとえば、ホスホナート、PNAs（ペプチド核酸）、ホスホロチオネート、もしくはイミドホスフェート）、またはリボース糖の2'位でヒドロキシ基が修飾基（たとえば、ハロ、スルフヒドリル、アジド、アミノ、一置換のアミノ、もしくは二置換のアミノ基）によって置換されており、アンチセンス機構において生じる切断などのRNase Hを介した切断が可能なRNAを使用することができる（図7B）。別々のプラスミドまたは別々のシストロンからの発現によるトランス（図7C）のRNA鋳型を切断するために、リボザイム（たとえば、ヘアピン、ハンマーヘッド、自己スプライシング（たとえば、テトラヒメナもしくはファージT4 tdイントロン、またはHDVもしくはRNase Pを介したリボザイム））を使用することができる。または、シスにRNA鋳型を切断するために、いずれのリボザイムを使用することもできる。たとえば、リボザイムをヘアピンループ内に配置して、RNA鋳型の3'配列を切断することができる（図7D）。または、リボザイムをRNA鋳型の3'部分に配置して、RNA鋳型（図7E）のリボザイムに関連して、5'位置を切断することができる。この反応の割合および特異性は、必要に応じて、好ましくはヘアピンループ配列の転写物の配列と塩基対を形成するアンカー配列の使用を介してさらに増強することができる（図7F）。その他の方法において、tRNA配列を3'末端に配置して、RNase P切断することができる（図7G）。さらに、所望の3'末端を有するキメラRNA分子を作製するために、別の特異的なmRNA分子から配列をうばい取るトランススプライシング・リボザイムを使用することができる（図7H（i）および（ii））。
【０１８１】
上述した方法は、図7A〜7Hに図示してある。これらの方法のその他の態様は、標準的な方法を使用して当業者によって行うことができる。たとえば、図7C〜7Fは、ハンマーヘッドリボザイムを含む方法を図示しており、図7H（i）および（ii）は、自己スライシング・テトラヒメナ・リボザイムを含む方法を図示しているが；他のいかなるリボザイムも、これらの方法に使用することができる。
【０１８２】
必要に応じて、アンカー配列による塩基対形成を課して、標的配列の曝露を潜在的に増大することにより、局部的な濃度を増大し、および／または折り畳まれていないRNA分子を生じさせるために、いずれの構築物にもアンカーを使用することができる。したがって、切断が遅いか、または非効率的に、標的に関してトランスに、またはシスにであるリボザイムから独立しているときはいつでも、アンカーされたリボザイムを使用してもよい。リボザイムおよびアンカーは、互いにシスである。たとえば、結合されたアンカー配列を有するリボザイムに関するPachukら、米国特許第6,080,851号の開示を参照されたい。
【０１８３】
以下の例示的な参照は、リボザイムのデザインおよび使用を記載している：HDVリボザイム、Fiola & Perreault, J. Biol. Chem. （2002） 277：26508-16；ハンマーヘッドリボザイム、Seghanら、J. Biol. Chem. （2002） 277：25957-25962；ヘアピン・リボザイム、Durelら、RNA （2002） 8：336-344； HDV ribozyme, Acta. Biochim. （Poland） （2001） 48：409；層をなしたウイルス複製系、Dubenskyら、米国特許第5,814,482号；RNase P、Yuanら、米国特許第5,869,248号；ヘアピン・リボザイム、Chowira & McSwiggen、米国特許第6,022,962号；リボザイム、Urdea Michael、米国特許第5,631,148号；トランススプライシング・リボザイム、HaseloffおよびGoodman、米国特許第6,015,794号；トランススプライシング・リボザイム、米国特許第5,667,969号；RNase Hおよびリボザイム切断ができる核酸の修飾、Benseler、国際公開公報第9207065号；RNAポリメラーゼIIIに基づいた治療的なRNA分子の発現、Thompson、米国特許第6,146,886号；RNase P、Shaら、米国特許第6,057,153号；リボヌクレアーゼP、Yanら、米国特許第5,869,248号；RNAリボザイム・ポリメラーゼ、デホスホリラーゼ、および制限エンドリボヌクレアーゼ、Cechら、米国特許第6,180,399号、および結合されたアンカー配列を有するリボザイム、Pachukら、米国特許第6,080,851号。
【０１８４】
例示的な方法を以下に示してある。
【０１８５】
リボザイム／自己スプライシングイントロンを介したリボザイム
別々の部位でRNA分子をプロセシングするための例は、特定の部位でのリボザイムを介したRNAの切断含む（図5Aおよび5B）。リボザイムは、示したように標的RNA分子内でコードされ標的部位でRNAを切断するようにシスで作用することができるか（図5A）、または別々のベクターもしくはシストロンから発現させて、したがって、標的部位でRNAを切断するためにトランスに作用させることができる。使用することができるリボザイムのタイプの例は、テトラヒメナ（ATCCから入手可能）由来のグループ1イントロンなどのハンマーヘッドおよび自己スプライシンイントロンである。これらのリボザイムは両方とも、トランスにまたはシスに使用することができる。リボザイムを含む放出されたRNAは、触媒的に活性であり、未処理の標的RNA分子を切断することができる。したがって、未処理の標的RNA分子は、トランスにリボザイムによって、または標的分子の一部であるリボザイムによって切断される可能性を有する。また、リボザイムまたは標的分子は、トランスに第2の標的RNAを切断することができる。本発明の方法に有用なハンマーヘッドリボザイムのデザインのための技術は、たとえばPachukら、Nucleic Acids Research, 22：301-307, 1994に見出される。自己スプライシングおよびトランススプライシングのグループIイントロンのデザインは、たとえばSullengerおよびCech, Nature, pp. 619-622, 1994によって開示される。特定の部位におけるRNA分子のリボザイムを介した切断により、所望の上流領域に対して塩基対形成される3'末端を有する部分的なdsRNAヘアピンを産生した後、本明細書に開示されるように、RNA依存性RNAポリメラーゼを使用して3'末端を自己伸張させることができる。
【０１８６】
RNase Hを介した切断
特定の部位でRNAをプロセシングするために使用することができるもう一つの方法は、RNase Hを介した切断を使用することである。この方法では、切断されることが要求される領域に対して相補であるDNAオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズされる。所望の部分的なヘアピンRNAを産生するために、DNAオリゴヌクレオチドをRNA分子の領域2（BPS-2）の配列にハイブリダイズさせる（図7Bを参照されたい）。DNAオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約7ヌクレオチドであるが、切断されるRNAの長さに応じて、それ自体は、上限なしでより長くすることができる。DNA／RNAハイブリダイゼーション部位は、ハイブリダイゼーション部位の上流の領域2内に少なくとも5〜15ヌクレオチドがあるように選択される。これらのヌクレオチドは、RNase切断後の分子の3'末端として残り、上流の領域1の相補ヌクレオチドと塩基対を形成するために利用できるであろう。インビトロ切断のためには、RNase H（New England Biolabs, Beverly MA）を製造業者の説明書に従ってDNA／RNAハイブリッドとインキュベートする。RNAは、ハイブリッド領域内の複数の部位で切断され、これにより、鋳型に対して相補な3'末端を生じる（図4A〜4B）。また、RNase Hは、細胞内において内因性酵素として発現されるので、この反応は、細胞内で行うことができる。この細胞内反応のために、細胞培養または動物に対するアンチセンス分子のインビボ投与のための輸送方法などの、DNAオリゴヌクレオチドを標準的な方法を使用して、dsRNAまたはdsRNA発現構築物と共に同時輸送することができる。RNaseを介した切断により、所望の上流領域と塩基対形成した3'末端を有する部分的なdsRNAヘアピンを産生した後、本明細書に開示されるように、RNA依存性RNAポリメラーゼを使用して3'末端を自己伸張させることができる。
【０１８７】
分子の別の領域と塩基対形成する所定の末端を有する部分的なヘアピン
その他のストラテジーでは、一方の末端が所望の部分的なヘアピンの3'末端をコードする直線状DNA鋳型を使用する。直線状の鋳型は、インビトロで使用すること、またはインビボで使用するために細胞／動物にトランスフェクトすることができる。分離した末端は、末端をPCRプライマーの配列によって、または切断解析によって定義するPCRを含む多くの手段によって作製することができる。
【０１８８】
分子の別の領域と塩基対を形成する3'末端を生じる終結シグナルを有する部分的なヘアピン
伸張することができる部分的なヘアピンを作製するためのもう一つのアプローチは、3'末端ヌクレオチドがヘアピンの別の領域に相補的であるように、転写終結シグナルを使用して転写を終了することである。この方法では、3'末端がRNA PolIII転写終結シグナル（たとえば、少なくとも4〜5個のTヌクレオチド、望ましくは少なくとも5〜15個のTヌクレオチドの連なり）を経て作製される部分的なRNAヘアピンを作製するために、RNA polIIIを使用する。T群のこのクラスターで転写が終結するので、3'末端は、Tヌクレオチドで構成される。相補的なAヌクレオチドは、鋳型の示された部位で構築物に組み込まれ、3'末端で完全に鋳型と塩基対形成された部分的なヘアピンを生じる。
【０１８９】
以下の実施例では、RNA PolIII上流プロモーターエレメントを、部分的なヘアピンの核合成を誘導するために使用される。RNA polIII転写は、少なくとも4〜5個の、望ましくは少なくとも5〜15個のT残基（図6A）の範囲で終結される。相補的A残基と末端T残基の塩基対形成を可能にするために、同数の相補的なA残基を選択された上流域位置に含める。3'末端ヌクレオチドは、3'末端の伸張を可能にするために鋳型としての役割を果たす上流領域と塩基対を形成しなければならない。
【０１９０】
本発明の試薬の作製のためには、内因性または外来性のRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）によって任意のクローニングされた標的cDNAのdsRNAへのリバースプライム複製（reverse primed replication）を容易にするために、短い末端ヘアピンを生じる哺乳動物ベクターを作製する。核に大量のdsRNAを発現するための上流RNAポリメラーゼIII I型U6プロモーターを利用するベクターなどの、上流または内部プロモーターとして分類されるいずれのRNA PolIIIプロモーター（たとえば、カーネギー研究所のドナルド・ブラウンによって報告された内部プロモーターまたは5sRNAもしくはtRNAプロモーター）を使用することができる。この構築物の効用は、分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）の短い200塩基対部分に由来するdsRNAの発現によって証明することができる。
【０１９１】
pU6rpと呼ばれる本発明のベクター成分は、272塩基対のU6プロモーター、小さなマルチクローニングサイト（MCS）、RNA polIII終止部位、および30塩基対のヘアピンを含む（図6）。リバースプライム（reverse-primed）されたpU6rp U6と呼ばれる本発明のベクター構成要素は、272塩基対のU6プロモーター、小さなマルチクローニングサイト（MCS）、少なくとも4または5個のT群の連続した連なりからなるRNA polIII終止部位、および人工の30塩基対のヘアピンを含む（図6A）。関心対象のcDNAの挿入に続いて、哺乳動物細胞へのこれらの構築物のトランスフェクションにより、クローニングされたcDNAにわたり、かつ3'末端ヘアピン／polIII終端領域を介して続く核RNA polIII転写物を生じる。RNA polIIIは、一般に第2のTの後で、4または5個の連続したT群の第1ひと続きで終わり、ヘアピン領域を曝露する。このベクターでコードされたヘアピンは、所望の標的dsRNAを生じるRdRpを介した伸張のために適した3'ヒドロキシル基質を提供する（図6B）。
【０１９２】
この方法のためのpU6rpを作製するために、鋳型（Leeら、Nature Biotechnology, 2002, pp.500-505）としてプラスミドpTZU6+1を使用するPCR増幅によってU6プロモーターを得る。ベクターのクローニング部位およびヘアピンは、この増幅のために使用されるPCRプライマーに含まれている。PCR産物は、272塩基対のU6プロモーターおよびpTZU6+1のBamHIとSalI部位の間の配列を含む。cDNA挿入のためのMCSは、制限酵素SalI、SmaI、およびBglIIからなる。5'フォワード・プライマーは末端EcoRI部位を含み、3'プライマーは、pUC19のEcoRI／HindIII部位へPCR産物をクローンニングして、最終的なベクター（pU6rp）を得るのを容易にするためのHindIII部位を含む。5'プライマーの配列は、
2006500012.tif 000025
であり、3'プライマーの配列は、
2006500012.tif 000026
である。
【０１９３】
構築物のSEAP部分を作製するために、200塩基対の断片をpSEAP2（Genbankアクセッション番号U89938の配列1008〜1207）からPCR増幅し、pU6rpのSmaI部位にクローニングする。両方の向きの単離物を選択し、pU6rp-SEAPfおよびpU6rp-SEAPrと名付ける。5'プライマーの配列は、
2006500012.tif 000027
であり、3'プライマーの配列は、
2006500012.tif 000028
である。このベクターは、単純な消化および再連結反応によって末端ヘアピンの後半を切出して、クローニングされたcDNAをリバースプライムする能力を欠いている対応する対照プラスミドを提供することができる。これらの対照ベクターを作製するために、pU6rp-SEAP構築物をXbaI+NheIによって消化し、再結合してプラスミドpU6-SEAPfおよびpU6-SEAPrを作製する（図6B）。
【０１９４】
部分的なヘアピンの自己伸張の証明は、後述するように標準的な方法を使用する哺乳動物細胞トランスフェクションによって行うことができる。トランスフェクション細胞は、SEAPを安定にまたは一過性に発現する細胞である。この具体例では、細胞は、SEAPを一過性に発現するRD細胞である。陽性対照は、SEAPのセンスおよびアンチセンス鎖の両者を共に生じて細胞内のdsRNAを形成するpU6-SEAPベクターの対（pU6-SEAPfおよびpU6-SEAPr）である。陰性対照は、これらのpU6-SEAPプラスミドのいずれかは、末端ヘアピンのないdsRNAを生じて、RdRp第2鎖の合成をプライムすることができないはずであるので、これらを単独でトランスフェクトした。このRdRp機構を経たdsRNAを生じると思われるその他のプラスミドは、pU6rp-SEAP構築物である。予想される結果では、陽性対照プラスミド（pU6-SEAPベクターの対）およびpU6rp-SEAP構築物の両者がSEAP発現を阻害するが、陰性対照プラスミドは効果を有さない。
【０１９５】
部分的なヘアピンの自己伸張によるヘアピンの形成は、多くの利点を有する。単一のcDNAクローニング工程および細菌における安定度は、dsRNAを発現するcDNAライブラリーの作製を容易にする。対照的に、従来のヘアピンの合成は、面倒なクローニング手順が必要であり、細菌において安定でない構築物を含む可能性がある。また、本方法は、任意の折りたたみの問題が、RdRp読み通しによって最小化されるので、dsRNAをより効率的に生じるはずである。従って、本発明の部分的ヘアピン構築物は、本明細書の他の場所で詳述したとおり、機能的なゲノミクスに適用するためのdsRNAライブラリーを作製する際に有意な利点を提供し、有利には、RdRpの供与源を含むキットとして提供することができる。たとえば、図1Eに示したように、A／ループ／B配列に隣接する2つのMCSsを有する標準的なクローニングベクター（群）は、有利には、たとえば機能的なゲノミクス適用に有用な商業的なキットに提供することができる。また、キットは、RdRpの供与源を提供してもよい。その他の発現ユニット、たとえばRNA依存性RNAポリメラーゼを発現するものと共に、一つまたは複数のこのようなプロモーター／MCS／A／Loop／B／MCSユニットを含む二または多シストロン構築物（RdRp；たとえば、図lE（ii）を参照されたい）は、有利には、本明細書に記載されている「部分的な」ヘアピンの発現および伸張のために利用することができる。
【０１９６】
実施例7：複数のエピトープの二本鎖RNAアプローチ
（1）単一の生物体の同義遺伝子を表す配列；（2）種々の異なる生物体から1つまたは複数の遺伝子を表す配列；および／または（3）特定の遺伝子の異なる領域を表す配列に由来する部分またはエピトープを有するdsRNAを使用することにより、有意な利点を得ることができる。このアプローチを用いて、単一の種のdsRNAが、多くの異なる遺伝子および／または多くの生物体、たとえばウイルスおよび／または細菌病原性因子を含む病原体を同時に標的とするように設計することができる。または、単一種のdsRNAを、1度の機会で遺伝子または生物体のサブセットを、および別の機会に同じまたは第2のサブセットを標的とするために使用することができる。dsRNAは、たとえば二重鎖またはヘアピンであることができ、およびDNAまたはRNAベクターによってコードすることができる。RNAは、宿主において細胞内に発現することができ、またはインビトロで作製し、次いで本明細書に記載されているように宿主に投与することができる。この「複数のエピトープ」は、少なくとも部分的に二本鎖RNA分子であり、本明細書に記載されており、さらに例えばPachukおよびSatishchandran国際公開公報第00/63364号（その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているように、部分的なヘアピンおよび強制的ヘアピンを含む種々の構造上の変異を呈することができる。宿主細胞は、組織または生物体の細胞などのインビトロまたはインビボの細胞（たとえば、無脊椎動物および脊椎動物、またはヒトなどの哺乳動物、またはウシ、ウマ、イヌ、ネコ、もしくは鳥などの商業的に重要な種を含む植物または動物の細胞）であることができる。
【０１９７】
1つの特に望ましい複数エピトープのアプローチは、選択された標的遺伝子（類）およびその遺伝子の転写を駆動するプロモーター（類）を標的として、転写後および転写性遺伝子サイレンシング（PTGSおよびTGS）の組み合わせを生じさせることを含む。この組み合わせの遺伝子サイレンシングは、宿主において長期間または永久に維持される迅速な遺伝子サイレンシング反応を達成するという利点がある。
【０１９８】
複数エピトープの二重鎖RNAアプローチの利点
単一種のdsRNAにより同時に多くの遺伝子（たとえば、複数の病原体由来の遺伝子または多発性疾患と関係する遺伝子）を標的とし、サイレンスすることができるので、多数のエピトープdsRNAを同じ被験者の多くの異なる徴候に対して使用することができ、または1の被検者の徴候のサブセットおよび別の被検者の別の徴候のサブセットに対して使用することができる。テロリズムおよび生物学的戦争の潜在的な脅威に対して増大する懸念のために、複数のエピトープdsRNAは、多くの異なる生物体に対して長期間、もしそうでなければ永久に保護を提供することができる非毒物として有用である。痘瘡、エボラ、マールブルク、HIV-1、HIV-2、デング熱、黄熱病、またはインフルエンザなどのウイルスを含む、多くの異なる潜在的な病原体の1つまたは複数の遺伝子と相同性を示すdsRNA配列を含む少なくとも部分的な二本鎖RNAの宿主において細胞内発現ができるDNA構築物は、特に有望である。また、dsRNAは、ウイルスおよび／または細菌の遺伝子、および／またはウイルスおよび／または細菌の毒素の宿主細胞受容体（たとえば、炭疽毒素、ジフテリア毒素、またはボツリヌス毒素由来の毒素の細胞受容体）の配列を含むことができる。このような適用のためには、dsRNAストレス応答を引き起こさずに長いdsRNA分子（たとえば、複数の遺伝子に由来する配列を有するdsRNA分子）を発現する能力が、たいへん望ましい。たとえば、一連のそれぞれの配列、たとえば、19〜21ヌクレオチド、好ましくは100〜600ヌクレオチド、または配列の全長が選択されたプラスミド（たとえば、長さ20キロベース）の最大能力の範囲内であるような最高1、2、3、4、5、またはそれ以上のキロベース以下、を使用して、単一のこのような薬学的組成物は、比較的低コストおよび低毒性で多くの病原体および／または毒素に対する保護を提供する。重要なことに、この同じアプローチは、コムギもしくは米などの重要な食用作物またはウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、家禽、もしくは魚などの商業的に重要な動物に影響を及ぼす生物学的戦争薬に対する保護を提供するために使用することができる。
【０１９９】
多くのエピトープdsRNAアプローチの適用に適した標的であろうウイルス病原体の例は、HIV-1ウイルス、HIV-2ウイルス、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、脳炎ウイルス（たとえば、西ナイル、日本脳炎、およびウマ脳炎）、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルクウイルス、はしかウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（たとえば、A、B、およびC型肝炎）、単純疱疹1および2ウイルス、EBV、HCMV、並びにレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルスのファミリーの種を含む。この方法によって治療または予防することがより望ましいいくつかのウイルス感染は、HIV、HBC、HSV、CMV、HPV、HTLV、またはEBVによって生じる感染を含むが、これらに限定されない。DNAウイルスまたは中間にDNA段階を有するウイルスが、特にこのような処理に適している。標的遺伝子（類）またはこれらの断片は、望ましくは感染した哺乳動物細胞におけるウイルスの複製および／または病原性に必要なウイルス・ポリヌクレオチド配列である。このような標的の中で、ポリヌクレオチド配列は、ウイルスの増殖に必要なタンパク質のタンパク質コード配列、たとえばHIVのgag、env、およびpol遺伝子、並びに必要な調節；HPV6 L1およびE2遺伝子；HPV11 L1およびE2遺伝子；HPV16 E6およびE7遺伝子；HPV18 E6およびE7遺伝子；HBV表面抗原、コア抗原、および逆転写酵素；HSV gD遺伝子；HSV vp16遺伝子；HSV gC、gH、gL、およびgB遺伝子；HSV ICP0、ICP4およびICP6遺伝子；水痘帯状疱疹gB、gC、およびgH遺伝子；BCR-abl染色体配列、並びに細胞から細胞に感染移動するために必要な調節機能を提供する非コードウイルスポリヌクレオチド配列、たとえばHIV LTR、およびHSVvp16プロモーター、HSV-ICP0プロモータ；HSV-ICP4、ICP6およびgDプロモーター、HSV表面抗原プロモーター；またはHBVプレゲノム配列などのその他のウイルスのプロモーター配列である。その他の例示的な標的は、PachukおよびSatishchandran、国際公開公報第00/63364号に、および米国特許第6,506,559号、Fireら、に記載されており、いずれの開示も、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２００】
HIV、HCV、もしくはインフルエンザなどの非常に可変性のまたは急速に変異する病原体の複数の株および／または変種からの1つまたは複数の遺伝子に由来する複数のエピトープの使用も、非常に有利であり得る。たとえば、インフルエンザウイルスの多くの株および／または変種を認識し、標的とする単一のdsRNA種は、種々の株／変種のインフルエンザのための普遍的な治療またはワクチンとして使用することができる。
【０２０１】
この場合、HIVなどの特定の病原体の複数の遺伝子をサイレンスする能力は、HIVの「エスケープミュータント」の選択を予防する。対照的に、1つの遺伝子またはタンパク質を標的とするだけである典型的な小分子の治療またはワクチン療法は、標的遺伝子またはタンパク質が持続的に突然変異された病原体の選択を生じ、したがって、病原体は治療に耐性になる。本発明の複数エピトープのアプローチを使用して、病原体および／または病原体の広範な領域の多くの遺伝子を同時に標的とすることによって、このような「エスケープミュータント」を効率的に防止される。
【０２０２】
また、この複数エピトープのアプローチは、特に複数の遺伝子産物の過剰発現から生じる癌の治療に適している。このような遺伝子産物は、定義上、腫瘍細胞または腫瘍の癌状態を維持するために必要である。1つの単一のdsRNA種は、これらの異なる遺伝子産物またはこれらの遺伝子産物のサブセットをコードする複数のRNA分子を標的とするように作用することができる。したがって、1つの薬学的に活性なdsRNAは、癌の表現型に至った複数の成分をサイレンスさせる。ヒト癌の例は、頸癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、黒色腫、肝臓癌、頭頸部癌、悪性脳癌、および胃癌を含む。発癌遺伝子は、本発明のdsRNAの適切な標的である（たとえば、ABL1、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSF1R、ERBA、ERBB、EBRB2、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、およびRASを含む）。また、癌抑制遺伝子（たとえば、APC、BCRA1、BCRA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、およびTP530）、酵素（たとえば、キナーゼ）、癌に関連したウイルスの標的（たとえば、HPV E6／E7ウイルスで誘導される子宮頚癌、HTLVで誘導される癌、およびバーキット・リンパ腫などのEBVで誘導される癌）を標的とすることができる。後者の例では、標的ポリヌクレオチドがコード配列もしくはこれらの断片、または宿主動物における腫瘍の維持に必要とされる抗原もしくは配列のための発現されない制御配列である組成物を投与することができる。例示的な標的は、HPV16 E6およびE7並びにHPV18 E6およびE7の配列を含む。他にも、当技術分野の当業者によって容易に選択されるであろう。通常の配列と比較して、単一の点突然変異を有する癌関連ポリヌクレオチド配列に向けた複数エピトープの構築物を開発する際に、それぞれが異常な配列を区別する突然変異を含む一連の重複する21mers（19〜23mers）と共に連なることが有利であろう。
【０２０３】
薬学的組成物
たとえば、天然痘ウイルスおよび炭疽毒素に対するヒト細胞受容体配列に由来する1つまたは複数の遺伝子に対して実質的に相同的なdsRNAをバクテリオファージT7プロモーターの制御下で発現するDNAプラスミド構築物を含む薬学的組成物は、本明細書に記載されているように調製することができる。T7 RNAポリメラーゼは、適切なプロモーター、たとえばhCMV、サルCMV、またはSV40の制御下と同じか、または別のプラスミドから同時に運び、発現させることができる。一部の態様において、同じか、または別の構築物は、標的痘瘡遺伝子に相同なdsRNAと同時に標的遺伝子（たとえば、標的痘瘡遺伝子）を発現する。薬学的組成物は、特定の投与経路に適した薬学的媒体中に調製される。IM、SC、IV、皮内、くも膜下腔内、またはその他の非経口的投与経路のためには、注射のための滅菌水などの滅菌の、非毒性の、発熱性物質のない水溶液、および選択的に、種々の濃度の塩、たとえばNaCl、および／またはデキストロース（たとえば、塩化ナトリウム注射、リンゲル液、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、および乳酸加リンガー液）が一般に使用される。選択的に、薬剤の分野において既知のその他の薬学的に適切な添加物、防腐剤、または緩衝剤も使用される。注射のために単一用量の小びんで提供される場合、用量は薬理学の当業者によって定まるように変更されると考えられるが、典型的には活性な構築物の5mcg〜500mcgの間で含むであろう。必要であると考えられる場合、毒性を伴わない、かなりの大用量、たとえば5〜10mgまでを投与してもよい。
【０２０４】
本発明のDNAおよび／またはRNA構築物は、いずれのトランスフェクション促進薬も伴わずに薬学的媒体に処方された「裸の」DNA、RNA、またはDNA／RNAとして宿主の細胞／組織／生物体に投与してもよい。DNAおよびRNA輸送の分野において知られるように、より効率的な輸送を、たとえばRNAおよび／またはDNA輸送の分野において既知のこのようなポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にする薬剤を使用して、達成してもよい。以下のものが例示的な薬剤である：ブピバカインなどの局所麻酔薬、陽イオン性の脂質、リポソーム、または脂質粒子、ポリリジンなどのポリカチオン、デンドリマーなどの枝分れした3次元のポリカチオン、炭水化物、洗浄剤、または塩化ベンジルコニウム（benzylkonium）などのベンジルアンモニウム界面活性物質を含む界面活性物質。本発明に有用なこのような容易にする薬剤または共薬剤の非独占的な例は、米国特許第5,593,972号；第5,703,055号；第5,739,118号；第5,837,533号；第5,962,482号；第6,127,170号；第および6、379、965号；並びに2003年5月6日に出願された国際特許出願第PCT/US03/14288号（多機能性の分子複合体もしくは油／水型陽イオン性の両親媒性物質のエマルジョン）および第PCT/US98/22841号において記載されており；これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられる。米国特許第5,824,538号；第5,643,771号；および第5,877,159号は（参照として本明細書に組み入れられる）、ポリヌクレオチド組成物以外の組成物の輸送、たとえば本発明のdsRNAをコードする組成物を含むトランスフェクトされたドナー細胞または細菌を開示する。
【０２０５】
実施例8：dsRNAを介した遺伝子サイレンシングを増強するための例示的な方法
哺乳動物複製開始点
複製開始点は、核局在化によるDNAプラスミドを複製することが可能となり、したがって遺伝子サイレンシングを増強する。利点は、より多くのプラスミドを核転写に利用でき、したがってより多くのRNAエフェクター分子（たとえば、より多くのヘアピンおよび／またはより多くの二本鎖）が作製されるということである。多くの起源は、種特異的であり、いくつかの哺乳動物種で機能するが、全ての種というわけではない。たとえば、SV40 T複製開始点（たとえば、ClontechからのプラスミドpDsRedl-Mitoから；米国特許第5,624,820号）は、マウスにおいて機能的であるが、ヒトでは機能的でない。したがって、この起源は、マウスにおいて使用されまたは研究されるベクターに使用することができる。EBNA起源などのヒトに適用するために使用することができるその他の起源（たとえば、QiagenからのプラスミドpSES.TkおよびpSES.B）。これらのエレメントを含むDNAベクターは、商業的に入手可能であり、起源をコードするDNA部分は、起源を含む制限酵素断片を単離することによって、または起源をPCR増幅することによって、標準的な方法を使用して得ることができる。これらのベクターの制限酵素切断地図および配列は、公的に利用でき、当業者がこれらの配列を増幅することまたは適切な制限断片を単離することが可能である。これらのベクターは、SV40 TAgおよびEBNAなどの適切なアクセサリー因子を発現する細胞の核で複製する。対応する複製開始点を含むいくつかの商業的に入手可能なベクター（たとえば、QiagenからのpSES.TkおよびpSES.B）も、SV40 TagまたはEBNAを発現するので、これらの因子の発現は、容易に達成される。複製開始点を含むこれらのDNA分子は、当業者によって関心対象のベクター（たとえば、ヘアピンまたは二重鎖などのdsRNAを発現するベクター）に容易にクローニングすることができる。次いで、EBNAまたはTag複製開始点をそれぞれ有するプラスミドの複製を可能にするために、これらのベクターを同時トランスフェクトし、注入し、またはEBNAもしくはTagを発現するベクターを投与する。または、EBNAをコードする遺伝子またはTagは、関心対象の細胞、動物、または生物体において機能するように設計された任意のもう一つの発現ベクターに、標準的な方法を使用してクローニングする。また、EBNAおよびTagをコードする遺伝子は、複製開始点を有する同じベクターにクローニングすることができる。適切な複製開始点は、TagおよびEBNAに限定されず；たとえば、モントリオールのレプリコ（Replicor）は、付着して複製DNA配列を可能にする36塩基対の哺乳動物起源の共通配列を同定した（BioWorld Today, August 16, 1999, Volume 10, No.157において概説されるとおり）。この配列は、複製を可能にするために補助的な配列の同時発現を必要としない。
【０２０６】
dsRNAの複製
代わりにまたは、加えて、転写されたdsRNA分子を増幅することができる。RNAは、適切な複製シグナルがRNA分子の3'末端でコードされることを条件として、種々のRNA依存性RNAポリメラーゼによって複製することができる。例は、以下の参照に提供される：Driverら、Ann NY Acad Sci 1995, 261-264、およびDubenskyら、J Virol, 1996, 508-519。その他の例示的なRNA依存性RNAポリメラーゼ（たとえば、ウイルス、植物、無脊椎動物、または哺乳動物もしくはヒトなどの脊椎動物のポリメラーゼ）を表1に列記してある。さらに適切なRNA依存性RNAポリメラーゼは、アルファウイルスポリメラーゼ、セムリキ森林ウイルスポリメラーゼ、並びに哺乳動物ウイルス、無脊椎動物、および植物由来のポリメラーゼを含む。細胞質RNAポリメラーゼによって複製されるRNA分子は、核に続いて細胞質の局在化によって転写することができ、またはこれらは、細胞質において転写することができる。
【０２０７】
実施例9：dsRNAの投与のための例示的な方法
本発明の短いdsRNA分子および／または長いdsRNA分子は、注射、電気穿孔法、並びにRNAおよびDNAの分野の当業者に既知の任意のポリヌクレオチド輸送方法によって「裸の」ポリヌクレオチドとして輸送されてもよい。たとえば、インビトロで合成されたdsRNAを直接細胞培養培地に添加してもよい。また、dsRNAの取り込みは、条件が所望の細胞種によってDNA取込みのために必要だったものを使用する電気穿孔法によって容易になる。RNA取込みは、また、種々の商業的に入手可能かつ専売の陽イオン性脂質のいずれかを使用するリポフェクション、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション、微量注入法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム沈殿法、ウイルスまたはレトロウイルスによる輸送、局所麻酔RNA複合体、または微粒子銃形質転換によって媒介される。
【０２０８】
または、RNA分子は、細胞培養において、組織において、またはインビボで脊椎動物または哺乳動物において少なくとも部分的に二重鎖分子を生じる薬剤によって（たとえば、二重鎖DNA分子）輸送されてもよい。DNA分子は、少なくとも部分的に二重鎖RNAになるような細胞内で転写されるヌクレオチド配列を提供する。これらの組成物は、望ましくは、以下のものなどの1つまたは複数の任意のポリヌクレオチド輸送薬または共薬剤を含む：ブピバカインなどの局所麻酔薬、ペプチド、陽イオン性の脂質、リポソーム、または脂質粒子、ポリリジンなどのポリカチオン、デンドリマーなどの枝分れした3次元のポリカチオン、炭水化物、陽イオン性両親媒性物質、洗浄剤、ベンジルアンモニウム界面活性物質、米国特許第5,837,533号、および米国特許第5,837,533号；米国特許第6,127,170号；米国特許第5,962,428号、および米国特許第6,197,755号、1996年4月4日に刊行された国際公開公報WO96/10038、1994年8月8日に刊行された国際公開公報WO94/16737、および2003年5月6日に出願された国際特許出願第PCT/US03/14288号（多機能性の分子複合体およびは油／水型陽イオン性の両親媒性物質のエマルジョン）において記載されている（これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられる）1つまたは複数の多機能性の陽イオン性のポリアミン-コレステロール薬。
【０２０９】
2002年4月26日に出願された米国特許出願第60/375,636号および2003年4月28日出願された米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子をサイレンシングする方法」C.Pachuk（これは、参照として本明細書に組み入れられる）の開示のようなdsRNA（たとえば、毒性を阻害するための短いdsRNA、または遺伝子をサイレンスさせるための短いまたは長いdsRNA）の、細胞または細胞培養に対する投与のためには、典型的には1,000,000細胞につき50ng〜500ngの間または500ng〜5μgの間などの、50ng〜5μgの間のdsRNAが使用される。dsRNA（たとえば、毒性を阻害するための短いdsRNA、または遺伝子をサイレンスさせるための短いまたは長いdsRNA）をコードするベクターの、細胞または細胞培養に対する投与のためには、典型的には1,000,000細胞につき10ng〜500ngの間およびまたは500ng〜2.5μgの間などの、10ng〜2.5μgの間のdsRNAが使用される。さらに高用量などのその他の用量を使用してもよい。
【０２１０】
dsRNA（たとえば、毒性を阻害するための短いdsRNA、または遺伝子をサイレンスさせるための短いまたは長いdsRNA）の動物に対する投与のためには、典型的には90〜100ポンドのヒトまたは動物に対して10mg〜100mg、1mg〜10mg、500μg〜1mg、または5μg〜500μgの間のdsRNA（成績を増大することの順に）が投与される。dsRNA（たとえば、毒性を阻害するための短いdsRNA、または遺伝子をサイレンスさせるための短いまたは長いdsRNA）をコードするベクターの動物に対する投与のためには、典型的には90〜100ポンドのヒトまたは動物に対して100mg〜300mg、10mg〜100mg、1mg〜10mg、500μg〜1mg、または50μg〜500μg間のdsRNA（成績を増大することの順に）が投与される。用量は、動物の重量に基づいて調整してもよい。一部の態様において、約1〜10mg/kgまたは約2〜2.5mg/kgで投与される。その他の用量を使用してもよい。
【０２１１】
無処理の動物に投与するためには、典型的には、10ng〜50μgの間、50ng〜100ngの間、または100ng〜5μgの間のdsRNAまたはdsRNAをコードするDNAが使用される。望ましい態様において、約10μgのDNAまたは5μgのdsRNAが動物に投与される。本発明の方法に関して、細胞または動物に対するdsRNAまたはdsRNAをコードするDNAの投与は、特定の投与、用量、または投薬の頻度の様式に限定されることは企図されず；本発明は、遺伝子発現を阻害する、疾患を予防する、または疾患を治療するのに十分な用量を提供するために十分な投与の全ての様式を想定する。用量は、動物の重量、達成される効果、および投与の経路に基づいて調整してもよく、これは薬理学の当業者によって過度の実験なしで決定することができる。
【０２１２】
必要に応じて、短いdsRNAは、（そうでなければ細胞障害を誘導するかもしれない）dsRNA（たとえば、より長いdsRNA）の輸送の前に、間に、または後に輸送される。次いで、細胞または動物において、細胞機能、遺伝子発現、またはポリペプチドの生物活性の調整を評価してもよい。
【０２１３】
実施例10：遺伝子の機能を決定または確認するためのdsRNAを介した遺伝子サイレンシングにおいて本発明のdsRNAを使用するための例示的な方法
本発明のdsRNAは、dsRNAの部分的なおよび／または強制的なヘアピン構造、およびこのような部分的なおよび／または強制的なヘアピン構造をコードするdsRNA発現構築物、およびこのようなdsRNAおよび／またはdsRNA発現構築物を提供するおよびキット（RdRpの供与源を提供するこのようなキットを含む）を含み、有利には、以下に詳しく述べるように種々の機能的なゲノミクス適用に利用してもよい。
【０２１４】
DsRNAを介した遺伝子サイレンシングは、細胞機能、遺伝子発現、およびポリペプチドの生物活性に関与する特異的な未知の遺伝子を同定および確認するためのツールとして使用することができる。新規の遺伝子は、このような方法で同定されるために可能性が高いので、PTGSは、疾患、たとえば癌、神経疾患、肥満症、白血病、リンパ腫、および血液または免疫系のその他の障害の治療に使用される新規の標的の確認に使用するために、および同定するために開発されている。
【０２１５】
本発明のdsRNAおよびdsRNA発現構築物は、有利には、米国特許出願公開第2002/0132257号および欧州出願公開第1229134号「細胞の機能を調整する核酸配列を同定するための転写後の遺伝子サイレンシングの使用」（これらは、参照として本明細書に組み入れられる）に開示される方法に使用することができる。本方法は、二重鎖RNA発現ライブラリー、二重鎖RNA分子、および転写後の遺伝子サイレンシング技術の使用を含む。cDNAライブラリーが細胞につき単一の組込みおよび細胞につき単一のdsRNAの発現を得るために利用されるような方法は、特に本発明のdsRNAおよびdsRNA発現構築物の利用のために好ましい。一部の態様において、一旦5以下で、および望ましくはエピソームの発現ベクターがない安定な成分となると、転写が誘導されて、dsRNAを細胞に発現することができる。この方法は、必要に応じて、何百〜何千もの種の二重鎖を発現するその他の方法に対して、細胞あたりに1つの種だけまた約5つ以上の種のdsRNAが発現されることを保証する。
【０２１６】
これらの方法は、たとえば検出可能な表現型を与えるか、またはこれに付随する核酸配列、たとえば細胞の機能、細胞における遺伝子の発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸配列を同定するための効率の高い手段を提供する。検出可能な表現型は、たとえば、分子、巨大分子、構造、代謝、エネルギー資化、組織、器官、反射、および挙動などの任意の検出可能または観察可能な外部の物理的な徴候、並びに検出可能な構造、機能、または細胞、組織、もしくは生体系の挙動の一部であるものを含んでもよい。このような方法は、未知の核酸配列を同定し、かつ割り当てるためのハイスループットスクリーニング方法、並びに機能を既知の核酸配列に割り当てるための方法を含む種々の有益な適用において有用である。このような方法の特に有利な局面は、インターフェロン反応または二重鎖RNAストレス応答を阻害するまたは予防する条件下で、哺乳動物細胞を含む脊椎動物の細胞の形質転換および二重鎖RNAの形成を行うことである。
【０２１７】
本発明のdsRNAおよびdsRNA発現構築物は、有利には、標的株化細胞の全ての細胞の同じ遺伝子座で、dsRNA発現カセットの単一の成分（または、望ましく5つだけ）を得るために部位特異的組換えを使用する以下の方法において使用して、成分の全てのdsRNAを安定かつ一様に発現させることができる。種々の株化細胞に由来するdsRNA発現ライブラリーを使用して、安定に組み込まれた細胞の代表的なライブラリーを作製する（標的株化細胞内のそれぞれの細胞が単一要素を含む）。標的株化細胞においてこれらのdsRNA発現カセットの単一要素を作製するために、Cre/lox、Lambda-Croリプレッサー、およびFlpリコンビナーゼ・システムまたはレトロウイルスを使用してもよい。望ましいベクターは、2つの収束性T7プロモーター、2つの収束性SP6プロモーター、または1つの収束性T7プロモーターおよび1つの収束性のSP6プロモーター、選択可能なマーカー、および／またはloxP部位を含んでいてもよい。
2006500012.tif 000029
これらのシステムは、単一の挿入クローンを作製するために単独で、および組み合わせても使用される。
【０２１８】
以下の例示的な配列特異的な組込みシステムは、標的とされた組換えを、特異的なタンパク質：FLPリコンビナーゼ、バクテリオファージλインテグラーゼ、HIVインテグラーゼ、およびサルモネラのピリン・リコンビナーゼを使用して達成することができる短い標的配列を使用する。
2006500012.tif 000030
単一の要素は、特異的な配列（たとえば、creリコンビナーゼ・システムのloxP）をランダムに挿入すること、および最大の発現を支持する単一要素を含む細胞を選択することまたは同定することよって作製される。たとえば、ランダムな組込み後に最大の発現を示す要素は、組み込まれた配列に関連したリポーター遺伝子配列の使用によって同定することができる。細胞には、特異的なリコンビナーゼを使用して標的配列を含む部位へ発現カセットを特異的に挿入するために、およびおそらく元来は最大に発現する染色体の位置を同定するために配置された発現カセットを除去するためにも使用することができる。
【０２１９】
また、当業者であれば、レトロウイルスのベクターを使用して単一要素を作製し、これを真核生物のゲノムにランダムにおよび単独で組み込むことができる。特に、単一要素は、未処置の細胞に所望の発現カセットを含むように設計されたレトロウイルスベクターを挿入することと、最大の発現を生じる染色体の位置を選択することとによって作製することができる（Michaelら、 EMBO Journal, vol 20： pages 2224-2235, 2001； Reik and Murrell., Nature, vol.405, page 408-409, 2000； Bergerら、 Molecular Cell, vol.8, pages 263-268）。また、標的配列（たとえば、標的内因性配列または組み込まれた導入遺伝子配列）に対して相同的な配列とともに、核局在化シグナルの有り無しで細菌RecAタンパク質を同時形質移入することによって単一要素を作製してもよい。または、核局在化シグナルを有するRecAタンパク質をコードする核酸配列を同時形質移入することができる。
2006500012.tif 000031
米国特許出願第2002/0132257号および公開欧州特許出願第1229134号「細胞の機能を調整する核酸配列を同定するための転写後の遺伝子サイレンシングの使用」に開示されるようなその他の方法も、本発明の独特なdsRNAヘアピン構築物およびdsRNA発現構築物の有用な適用と考えられる。
【０２２０】
また、細胞に特定の表現型を与える役割を果たすDNAを同定する方法を提供する、公開された出願の国際公開公報第00/01846号、欧州特許第1093526法、および欧州特許第1197567号「二重鎖RNA阻害を使用する遺伝子機能の特性付け」（参照として本明細書に組み入れられる）の方法および開示も参照されたい。本方法は、プロモーター（群）に対して適切に転写因子が結合することによってcDNAまたはDNAの転写を開始して、二重鎖の（ds）RNAにすることができる該プロモーター（類）に関した方向で、細胞のDNAのcDNAまたはゲノムライブラリーを適切なベクター内に構築すること；該転写因子を含む1つまたは複数の細胞にライブラリーを導入すること；およびライブラリーを含む細胞の特定の表現型を同定し、単離して、表現型を与える役割を果たすライブラリーからのDNAまたはcDNA断片を同定するすることを含む。
【０２２１】
また、以前に未知の機能の標的遺伝子の活性を阻害するための二重鎖RNAの使用を含む生物体において遺伝子機能を同定する方法を開示する公開された出願、国際公開公報第99/32619号および欧州特許1042462号「二重鎖RNAによる遺伝子の阻害」を参照されたい。dsRNAが遺伝子ライブラリー、たとえば標的細胞または生物体に由来するゲノムDNAまたはmRNA（cDNAおよびeRNA）ライブラリーから作製されるハイスループットスクリーニング法。
【０２２２】
あまり望ましくはないが、本方法は、たとえば米国特許第5,639,595（この開示は参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているように、このような機能的なゲノミクスの全てにおいて、ランダム化された核酸配列または機能が既知でない所与の配列を利用してもよい。
【０２２３】
本発明のdsRNA構造およびdsRNA発現構築物は、遺伝子サイレンシングを誘導する核酸を同定するためにライブラリーに基づいたスクリーニングアプローチまたはライブラリーに基づかないアプローチを使用する、特定の表現型の調整、細胞における遺伝子発現の変化、または細胞におけるポリペプチド生物活性の変化を生じる未知の標的を同定するための方法に使用してもよい。これらの方法は、インビトロで転写されたdsRNAの直接の輸送または細胞をそれ自体がdsRNAを作製するようにさせるプラスミドの輸送を含む。
【０２２４】
また、2002年4月26日に出願された米国特許出願第60/375,636号および2003年4月28日出願の米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子をサイレンシングする方法」C.Pachukの開示（この開示は参照として本明細書に組み入れられる）のように、短いdsRNAをコードする短いdsRNAまたはプラスミドを、任意のdsRNAを介した毒性を必要に応じて阻害する機能的なゲノミクスの適用において投与してもよい。トランスフェクション効率に関係した問題を回避するために、プラスミドは、プラスミドDNAを取り込んだ細胞のみが生存することを確実にするために選択可能なマーカーを含むように設計される。一方のプラスミド群は、細胞質で転写されるdsRNAの合成に向け、他方の群は、核において転写されるdsRNAの合成に向ける。
【０２２５】
差次的遺伝子発現を使用する遺伝子の同定
細胞において標的核酸の発現を調整する核酸配列を同定するために、差次的遺伝子発現解析を使用することができる。遺伝子サイレンシングによって誘導される遺伝子発現の変化は、dsRNAが導入された細胞においてモニターすることができる。たとえば、差次的遺伝子発現は、dsRNAを導入した細胞において発現される核酸を、dsRNAをトランスフェクトされなかったか、またはモック・トランスフェクト(mock-transfected)の対照細胞において発現された核酸と比較することによってアッセイすることができる。多くの異なる核酸の発現レベルを同時に検査するために、遺伝子アレイ技術を使用することができる。このような発現解析のための方法の例は、Marrackら（Current Opinions in Immunology 12： 206-209, 2000）； Harkin （Oncologist 5： 501-507, 2000）； Pelizzariら（Nucleic Acids Res.28： 4577-4581, 2000）；およびMarx （Science 289： 1670-1672, 2000）に記載されている。
【０２２６】
ポリペプチドの生物活性を検査することによる遺伝子の同定
また、標的ポリペプチドの生物活性を調整する新規核酸配列は、ポリペプチド生物活性をアッセイすることによって同定することができる。本発明の方法に記載の新規の遺伝子を同定するために、種々のポリペプチドの生物活性を評価することができる。たとえば、標的ポリペプチド（群）の発現を検査してもよい。または、標的ポリペプチド（群）と別の分子（類）、たとえば別のポリペプチドまたは核酸の間の相互作用をアッセイしてもよい。また、当業者に既知の標準的な方法を使用して、標的ポリペプチド（群）のリン酸化または糖鎖形成を評価してもよい。
【０２２７】
標的ポリペプチドの生物活性の調整に関与する核酸配列の同定は、dsRNAをトランスフェクトした細胞のポリペプチド生物活性を、dsRNAをトランスフェクトしなかったか、またはモック・トランスフェクトの対照細胞と比較することによって行ってもよい。特定のポリペプチドの生物活性に無関係な配列を取り込んだ細胞は、対照細胞と同様の様式の特定のアッセイにおいて実施されるであろう。特定のポリペプチド生物活性に関与する遺伝子のPTGSを受けている細胞は、対照と比較して、変化したバイオアッセイの実施能力を示す。
【０２２８】
実施例11：dsRNAの細胞内合成のためのベクターのデザインおよび輸送
dsRNAの利用により、dsRNAが特定の細胞の区画にあるときに、さらに毒性または有害な副作用を誘導しなくなるであろう。したがって、細胞質において、および核において、候補および／または短いdsRNAを転写する発現プラスミドを利用してもよい。2つのクラスの核転写ベクター：ポリアデニル化されたdsRNA（たとえば、RNAポリメラーゼIIプロモーターおよびポリA部位を含むベクター）を発現するように設計されているものおよびアデニル化されていないdsRNA（たとえば、RNAポリメラーゼIIプロモーターを含み、かつポリA部位を含まないベクターか、またはT7プロモーターを含むベクター）を発現するものがある。2つの種のRNAについて、異なる細胞分布が予測され；両方のベクターは、核において転写されるが、RNA種の最終的な行き先は、異なる細胞内の位置である。また、細胞内の転写は、バクテリオファージT7およびSP6 RNAポリメラーゼを利用してもよく、これは、細胞質においてまたは核において転写するように設計されてあってもよい。または、dsRNAを増幅するためにQβレプリカーゼRNA依存性RNAポリメラーゼを使用してもよい。また、ウイルスのRNAポリメラーゼ（DNAおよびRNA依存性のいずれも）を使用してもよい。または、dsRNA複製ポリメラーゼを使用することができる。また、RNAポリメラーゼI、II、またはIII、またはミトコンドリアRNAポリメラーゼなどの細胞のポリメラーゼを利用してもよい。細胞質および核の両方の転写ベクターは、プラスミドを取り込んだ細胞の選択を可能にするための抗生物質耐性遺伝子を含む。クローニング・ストラテジーは、複数の断片を直接ライゲーションするための一段法である連鎖反応クローニング法（CRC）を使用する（Pachukら、Gene 243：19-25,2000）。簡単には、ライゲーションには、特定の向きでDNA断片を整列させるためにブリッジ・オリゴヌクレオチドを利用し、Epicentreから入手可能なアンプリガーゼ（Ampligase）などの熱安定DNAリガーゼによってライゲーションを触媒させる。
【０２２９】
誘導製または抑制可能な転写ベクター
必要に応じて、dsRNAの合成のタイミングを制御するために、誘導性および抑制可能な転写系を使用することができる。たとえば、短いdsRNAの合成または投与の後に候補dsRNA分子の合成を誘導することができ、候補dsRNAによる毒作用の可能性を予防することが企図される。誘導性および抑制可能な調節系は、dsRNAをコードする配列の上流で原核生物または真核生物の転写因子を結合する配列を含むプロモーターエレメントの使用を含む。加えて、これらの因子は、RNAポリメラーゼIIをトランス活性化またはトランス抑制するタンパク質ドメインを有する。また、調節系は、小分子（たとえば、コインデューサーまたはコレプレッサー）に結合する能力を有する。調節タンパク質分子（たとえば、転写因子）に対する小分子の結合は、配列エレメントに対する親和性の増大または減少のいずれかを生じた。誘導性および抑制可能な系は両者とも、使用するプロモーター配列に関して適切に結合部位を配置することによって、任意の誘導因子／転写因子を組み合わせて開発することができる。以前に記載されている誘導性／抑制可能な系は、lacI、ara、Steroid-RU486、およびエクジソン-Rheogene、Lac（Croninら、Genes and Development 15：1506-1517、2001）、ara（Khlebnikovら、J Bacteriol.2000 Dec； 182 （24）： 7029-34）、ecdysone（Rheogene, www.rheogene.com）、RU48（steroid, Wang XJ, Liefer KM, Tsai S, O' Malley BW, Roop DR., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jul 20；96（15）： 8483-8）、tetプロモーター（Rendalら、 Hum Gene Ther.2002 Jan；13（2）：335-42 ： and Larnartinaら、 Hum Gene Ther.2002 Jan；13（2）： 199-210）、または2000年4月19日に出願の国際公開公報第00/63364号に開示されたプロモーターを含む。
【０２３０】
核転写ベクター
核転写ベクターは、一端で標的配列がRNAポリメラーゼIIプロモーター（たとえば、HCMV-Eプロモーター）に隣接し、および他端で異なるRNAポリメラーゼIIプロモーター（たとえば、SCMVプロモーター）に隣接するように設計する。使用することができるその他のプロモーターは、その他のRNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、ミトコンドリアRNAポリメラーゼ・プロモーター、または核局在化シグナルを含むT7もしくはSP6 RNAポリメラーゼのそれぞれの存在下のT7もしくはSP6プロモーターを含む。また、バクテリオファージまたはウイルスのプロモーターを使用してもよい。プロモーターは、これらが転写誘導薬の存在下か、またはリプレッサーの除去によるかのいずれかにおいてのみ活性であるように、転写的に調節される（たとえば、tetON／OFFシステムを用いて、（Fosterら、前記；Liuら、前記；およびGatz、前記）。単一の染色体要素を選択し、転写が細胞に誘導されて核dsRNAを生じる。
【０２３１】
また、RNA PolI、RNA PolII、または同時発現されたウイルスプロモーターを認識するタンパク質と連動したウイルスプロモーターによって認識されるプロモーターを含むベクターは、それぞれのプロモーターと挿入されたcDNAの間に位置する任意の配列を含んでいてもよい。これらの配列を転写し、転写されたcDNAの可能な翻訳を予防するように設計されている。たとえば、転写されたRNAは、リボソームのスキャニングを妨げるために5'末端に安定なステム-ループ構造を含むように合成される。または、配列の長さが翻訳開始に十分に有害である（たとえば、配列が、200ヌクレオチドまたはよりも長い）限り、正確な配列は、重要ではない。RNA配列は、選択的に、ポリA付加、イントロンの配列、HIVREV結合配列、マソン−ファイザー・モンキー・ウイルス（Mason-Pfizer Monkey Virus）構成的輸送エレメント（CTE）（1996年4月25日に出願の米国特許第5,880,276号）、および／または自己スプライシング・イントロンの配列を有することができる。
【０２３２】
dsRNAを作製するためには、2つのプロモーターを、それぞれのプロモーターからの転写の方向が互いに対抗するように標的配列の両側に配置することができる。または、2つのプラスミドを同時形質移入することができる。一方のプラスミドは、標的配列の一方の鎖を転写するように設計されるが、他方は、他方の鎖を転写するように設計される。単一のプロモーター構築物は、標的配列の2つの単位が直列に転写されるように、第2の単位が他方のものに関して逆向きであるように、開発されてもよい。別のストラテジーには、直列型の標的配列の間での充填配列の使用を含む。
【０２３３】
細胞質転写ベクター
細胞質転写ベクターは、以下の方法に従って作製される。このアプローチは、核における一本鎖RNA鋳型の転写を含み、次いでこれが細胞質に輸送され、ここでdsRNA分子の転写のための鋳型としての役割を果たす。一本鎖RNAをコードするDNAは、標的細胞系の単一の部位に組み込まれ、これにより、細胞における候補dsRNAの1種のみの合成を確実にし、それぞれの細胞が異なるdsRNA種を発現させてもよい。
【０２３４】
望ましいアプローチでは、細胞質およびミトコンドリア（たとえば、葉緑体）の発現のために、動物細胞のミトコンドリアのポリメラーゼまたは植物細胞の葉緑体およびミトコンドリアのポリメラーゼなどの内因性ポリメラーゼを使用して、細胞質においてdsRNAを作製させる。これらのベクターは、標的配列の上流にミトコンドリアまたは葉緑体のプロモーターを含む発現構築物を設計することによって形成される。核転写ベクターについて上記した通り、dsRNAは、このような標的配列の両側に、それぞれのプロモーターからの転写の方向が互いに対抗するように配置された2つのプロモーターを使用して作製することができる。または、2つのプラスミドを同時形質移入することができる。一方のプラスミドは、標的配列の一方の鎖を転写するように設計されるが、他方は、他方の鎖を転写するように設計される。単一のプロモーター構築物は、標的配列の2つの単位が直列に転写されるように、第2の単位が他方のものに関して逆向きであるように、開発されてもよい。別のストラテジーは、直列型の標的配列の間での充填配列の使用を含む。
【０２３５】
または、dsRNAの細胞質の発現は、核プロモーターに関して反対向きの単一のサブゲノム（subgenomic）プロモーターによって達成される。核プロモーターは、1つのRNA鎖を生じて細胞質に輸送され、また、転写物の3'末端側の単一のサブゲノムプロモーターは、RNA依存性RNAポリメラーゼによってそのアンチセンス・コピーを作製して細胞質dsRNA種を生じるために十分である。
【０２３６】
実施例12：細胞機能、細胞の遺伝子発現、または標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸配列の同定のための非ライブラリー・アプローチ
細胞機能、細胞における遺伝子発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸配列は、PTGSを含むライブラリーに基づかないアプローチを使用して同定されてもよい。たとえば、未知の機能を有するポリペプチドをコードする単一の既知の核酸配列または未知の配列および／または機能の単一の核酸断片は、「候補」dsRNA分子の中に作製ことができる。次いで、この候補dsRNAを所望の細胞種にトランスフェクトする。また、短いdsRNAまたは短いdsRNAをコードする核酸も、選択的に毒性を予防するために投与する。本明細書に記載されている方法を使用して、細胞機能、細胞における標的核酸の遺伝子発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性の調整について細胞をアッセイする。細胞機能、細胞における遺伝子発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物活性の調整により、候補dsRNAの核酸を、特異的な細胞機能、遺伝子発現、または標的ポリペプチドの生物活性を調整する核酸として同定する。単一の候補dsRNA種が細胞にトランスフェクトされているので、調整の役割を担う核酸配列は容易に同定される。
【０２３７】
本発明の方法による新規の遺伝子の発見により、新規の治療法の作製に至るであろう。たとえば、細胞浸潤を減少させる遺伝子は、癌の治療に使用される細胞分裂停止治療法の開発のためなどの、薬剤開発のための標的として使用されるであろう。また、現在利用できる細胞障害性の抗癌薬は、通常の急速に分割する細胞に対しても中毒性であるので、このような治療の開発は重要である。対照的に、細胞分裂停止薬は、転移プロセス、および推論であるが、疾患を安定化するための細胞増殖の減速を点検することが必要なだけである。もう1つの例において、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む多くの神経系疾患を治療、予防、または制御するための治療を開発するために、ニューロンの再生を増大する遺伝子を使用してもよい。ウイルスの複製を補助する能力に関与する遺伝子も、抗ウイルス治療の標的として使用される。このような治療は、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、B型肝炎ウイルス（HBC）、およびヒトパピローマウイルス（HPV）を含むウイルス疾患を治療し、予防し、または制御するために使用されてもよい。本発明に従って同定された遺伝子を標的とする治療の有効性は、細胞培養アッセイ法並びに動物モデルにおいてさらに試験することができる。
【０２３８】
実施例13：トランスフェクトした細胞からのRNAの解析
核酸配列を同定するためにライブラリーに基づいたスクリーニングアプローチまたはライブラリーに基づかないアプローチが使用されるかに関係なく、細胞内のdsRNAエフェクター分子のレベル、並びに細胞内の標的mRNAの量を測定するために、ABI PRISM(商標)7700配列検出システムによって二段階の逆転写PCR反応を行う。総RNAは、TrizolおよびDNaceを使用して、dsRNAまたはdsRNA発現ライブラリーからのプラスミドをトランスフェクトした細胞から抽出する。試料あたり2〜3種の異なるcDNA合成反応を行う；ヒトGAPDH（エフェクターdsRNAによる影響を受けないはずであるハウスキーピング遺伝子）のためのもの、標的mRNAのためのもの、および／または予想されるdsRNA分子（エフェクター分子）のセンス鎖のためのもの。dsRNAセンス鎖のcDNA合成の前に、RNA試料をT1 RNaceで処理する。200ngの総RNAおよび関連したRNA分子に特異的なプライマーを使用して、cDNA反応を別々のチューブで行う。これらの反応のcDNA産物を、GAPDH、標的cDNA、および／またはdsRNAからのセンス鎖コピーを増幅するための次のPCR反応のための鋳型として使用する。全てのRNAが、内部標準（GAPDH）と比較して定量される。
【０２３９】
実施例14：標的配列の同定
上記方法のいずれかを使用してdsRNAによる影響を受ける標的配列を同定するために、当業者に周知の方法に従って株化細胞（または、非組み込みdsRNAシステムを使用する場合は、トランスフェクトした細胞から）からDNAを抽出する。それぞれの成分の配列をコードするdsRNA（または、ライブラリーに基づかない方法を使用する場合、非組み込みdsRNA分子）を、T7プロモーター（または、dsRNAを発現させるための他の任意のプロモーター）の上部鎖にマップする配列を含むプライマーを使用して、PCRによって増幅する。次いで、増幅されたDNAをpZERO blunt（Promega Corp.）などのクローニングベクターにクローニングしてシーケンスする。標準的なコンピュータプログラムを使用して、配列をGenBankおよび／またはその他のDNAデータベースの配列と比較して、配列の同一性または相同性を見る。標的mRNAが未知のままである場合、確立された技術（Sambrookら、前記）によってクローニングされたdsRNAに由来するプライマーを使用して、標的細胞系からRNAをクローニングする。次いで、本明細書に記載されているように、標的の確証を行う。
【０２４０】
上記した安定に組み込まれるdsRNA発現系では、負の位置効果を減少させる努力にもかかわらず、PCR方法による非効率的なdsRNA合成が生じる可能性がある。これは、組み込まれたcDNAをレスキューすることや、または複製プラスミドに核配列をランダム化することによって回避することができる。レスキューされたプラスミドは、細菌における増幅およびシーケンスに適用できる。レスキューは、レスキュー・プラスミドおよびCreリコンビナーゼをコードするプラスミドと共にdsRNA発現ライブラリーをトランスフェクトした細胞集団を再トランスフェクトすることによって達成される。レスキュー・プラスミドは、細菌複製開始点、細菌抗生物質の選択マーカー、SV40複製開始点、およびSV40T抗原発現カセット、並びにCreを介した二重組換えができるように逆方向反復として配置されたloxP部位を有する。レスキュー・プラスミドのSV40に基づいた複製開始点により、組み込まれた細胞内のレスキューされた配列の増幅をできる。レスキューに続いて、高レベルの転写が予想され、これによりdsRNA形成に有利になる。次いで、細胞機能の調整、標的核酸の発現、または標的ポリペプチド生物活性の変化について、本明細書に記載されているように、細胞をスクリーニングする。
【０２４１】
結果の概要
本発明者らは、dsRNAの細胞内発現がRNAストレス応答を誘導しないことを示した。たとえば、2002年9月19日に公開された米国特許出願第2002/0132257A1号、「細胞の機能を調整する核酸配列を同定するための転写後の遺伝子サイレンシングの使用」を参照されたい。これらの実験に使用された細胞は、RNAストレス応答を誘導する能力があった（これは、陽イオン性脂質複合型のポリ（I）（著作権）およびインビトロで転写されたRNAがこの反応の全ての試験された成分を誘導／活性化する能力によって証明された）。加えて、細胞は、外部から添加したインターフェロンに応答することも見いだした。これらの結果は、これらの実験に使用される細胞が、RNAストレス応答を生じる能力に欠損がなく、したがって、細胞培養およびインビボでの動物モデルの両者における、その他の細胞に対して予測するものとして使用できることを意味する。本方法は、インターフェロン・ストレス応答を誘導せず、また、効率的にPTGSを誘導することが見いだされた。したがって、本方法は、望まれないRNAストレス応答を誘導することなくPTGSを誘導するための方法を提供する。
【０２４２】
これらの結果は、T7転写系を利用し、したがって細胞質においてdsRNAを発現するベクターを使用して生じたが、本ベクター系は、細胞内にdsRNAを発現するその他の系に変更することができる。これらの発現系によっても同様の結果が予想される。これらの系には、核に、核に続いて細胞質にRNA分子を輸送するか、またはT7RNAポリメラーゼに基づかない発現系を使用して細胞質にdsRNAまたはヘアピンRNA分子を発現する系を含むが、これらに限定されない。
【０２４３】
概要
現在の証拠では、長いdsRNA分子が細胞内で21〜24塩基対の小さなdsリボオリゴヌクレオチドにプロセシングされることを示す。これらのリボ-オリゴヌクレオチド（小さな干渉RNA分子（siRNA）と呼ばれる）は、PTGSを生じるdsRNA種として関係していた。本発明の望ましい態様は、細胞内で異なる何百ものsiRNA分子（これらｎ大奥は、有効である）にプロセシングされ得る長いdsRNA分子を使用する。
【０２４４】
この反応の誘導に影響を及ぼす因子の理解は、誘導／活性化がdsRNAの代用物としてポリ（I）（著作権）を使用して主に研究されたという事実によってかねてから複雑であった。しかし、ポリ（I）（著作権）は、長さおよび配列だけでなく、構造も同様に広範な多様性で不均一である。dsRNAは、ポリ（I）（著作権）が採用する多くの構造のうちの1つだけであり、その他の構造を有するRNA分子は、RNAストレス応答経路の種々の成分を誘導／活性化することが示されていたので（Hartmannら、J Biol Chem, 273 （6）： p.3236-46, 1998； Mordechaiら、 Virology, 206（2）： p.913-22, 1995）、この経路の誘導／活性化が、排他的にdsRNAによって媒介されと考えることはできない。加えて、RNA構造が'I型インターフェロン・ストレス応答の誘導に関与する唯一のパラメータではない。また、RNAを活性化するレベルでは、この経路のいくつかの成分も誘導／活性化を生じる。
【０２４５】
本発明者らは、I型インターフェロン・ストレス応答経路の誘導／活性化も、細胞内にdsRNAを輸送するために使用される方法によって媒介されることをここで証明する。おそらく、これは、インターフェロン・ストレス応答経路が誘導されて、活性化され得る前に、dsRNAが特定の細胞内区画に局在化していること、または特定の細胞内RNAの閾値レベルが実現されることの要求を反映する。本発明者らは、I型インターフェロンの産生およびこれに対する反応性の両方に対して反応力をもつヒト株化細胞においてRNAストレス応答経路を誘導せず、または活性化しない細胞内dsRNA発現系を提供する。さらに、本方法を使用するdsRNAの発現は、配列特異的なPTGSの誘導に非常に有効であることが示された。本発明者らは、少なくとも1月間、95%まで標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする本方法の能力を証明する。より長期間サイレンシングを維持する能力は、標的確証、機能的なゲノミクス、および治療などの多くのPTGS適用のために明らかに有利であるので、本明細書において詳述される細胞内のdsRNA発現は、siRNA使用と比較してさらに別の利点を提供する。
【０２４６】
結果
本発明者らの目的は、I型インターフェロン反応を誘導しないdsRNAの輸送または発現系を見いだすことであったので、これらの研究に使用される細胞は、この反応の実施に適合性のあることを証明することが絶対に必要であった。本経路は、分枝しており、RNAを介した誘導／活性化は、経路の複数の点で生じ得る。RNAは、大部分の細胞種においてαおよび／またはβインターフェロンの産生を引き出すように作用し得る。インターフェロン反応経路の初期および鍵となる事象はインターフェロンを介したJak-Stat経路の活性化を含み、これはSTATタンパク質（STATs）のチロシン-リン酸化に関与する。活性化されたSTATsは、核に転位して、IFN誘導性の遺伝子のプロモーターの特異的な部位に結合し、これによりこれらの遺伝子の転写に影響を及ぼして、その発現により、細胞をアポトーシスの方へまたは抗増殖性の状態に押すように協調して作用する。二重鎖RNAはまた、STATを直接活性化することによって、更に多くのインターフェロン刺激された遺伝子の転写を直接活性化することによって、インターフェロン非依存的な様式で本経路を活性化することができる。インターフェロンでを刺激される何百もの遺伝子が存在するが、良く特徴づけられたもののうちの2つは、PKRおよび2'5'オリゴアデニル化シンテターゼ（2'5'-OAS）である。これらの遺伝子産物は、大部分の細胞種において、これらの非活性の形態で、いくらかのレベルで構成的に発現される。
【０２４７】
dsRNAの輸送または発現系を開発するための細胞培養モデルの選択は、細胞がdsRNAに対してストレス応答を生じる能力に依存的であった。モデル系は、少なくとも2つの基準を満たすことが必要であった：(i)ポリ（I）（著作権）刺激に対する明らかなRNAストレス応答、および(ii)外部から添加したI型インターフェロンに対する反応性。加えて、多くのPTGS適用は、ヒト細胞に使用するために標的とされるので、ヒト由来の株化細胞を選択することが望ましかった。初めに評価した株化細胞は、ヒト横紋筋肉腫（RD）であった。
【０２４８】
siRNAおよび細胞質に発現された長いRNAで誘導されるサイレンシングの比較
siRNAおよび細胞質に発現された長いRNAが遺伝子特異的なサイレンシングを誘導することができる有効性および持続性を一過性のSEAP（分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）発現系において比較した。SEAPを一過性に発現するRD細胞には、3つの異なるSEAP特異的siRNA分子のうちの1つを、またはSEAP特異的なdsRNA発現と組み合わせたT7RNAポリメラーゼ発現プラスミドをトランスフェクトした。サイレンシングの特異性の内部標準として、これらの研究に使用した細胞には、一過性に分泌型マウスIL-12を発現させた。SEAPおよびIL-12の両方について、トランスフェクション後の多くの時点で収集したトランスフェクション細胞からの培地をアッセイした。SEAP発現レベルをIL-12レベルに対して標準化した。
【０２４９】
この研究において評価した3種の異なるsiRNA分子は、これらがSEAP発現をサイレンスする能力に関して異なる有効性を有することが見いだされた。1.4μg/〜1×106細胞で投与したsiRNA#1013は、最も強力であり、2日間SEAP発現を約80%阻害した。このsiRNAより低用量では、あまり有効ではなく、SEAP発現の最大阻害が1日間だけ観察された。siRNA#497は、1.4μgの最高用量で与えたときに、適度に有効であり、70%のSEAPの阻害を生じて1日間持続した。このsiRNAは、より低用量で与えたときにSEAP発現の40%の阻害を生じ、2日間持続した。最も弱いsiRNA分子（siRNA#1143）では、siRNAを最も高用量で投与したときに、短命の55%の阻害を生じた。全てのsiRNAを介した阻害は、これらの研究において4〜6日間でなくなり、他で報告されたものと整合していた（Elbashirら、Nature.411 （6836） ： p.494-8, 2001）  （Proceedings of the Keystone Symposia：RNA Interference, Cosuppression and Related Phenomena, Taos, NM, Feb.2002）。
【０２５０】
対照的に、トランスフェクトした細胞の細胞質において長いdsRNAを作製するためのT7細胞質転写系の使用により、実験（10日）の間持続したSEAP発現の85%の阻害を誘導することが見いだされた。dsRNA発現ベクターの異なる量を細胞にトランスフェクトした用量応答実験では、阻害のレベルがSEAP特異的なdsRNAの量に相関することを示す。無関係なdsRNAをコードする対照dsRNA発現ベクターでは、SEAP発現に対して効果を有さなかった。この実験において、およびPSAサイレンシング実験において観察された長命のサイレンシング反応は、この発現系がもたらすdsRNAの持続的発現と整合する。
【０２５１】
その他の哺乳動物株化細胞でも同様の研究が本発明者らによって繰り返されたことから、この方法は、種々の系に使用することができる一般的なサイレンシング方法であることを示している。
【０２５２】
概要
哺乳動物の系において長期の遺伝子サイレンシングを誘導するための効率的な方法を同定した。この方法は、RNAストレスまたはI型インターフェロン反応経路の要素を引き起こすことなく細胞（たとえば、哺乳動物細胞などの脊椎動物の細胞）内でのdsRNA（たとえば、長いdsRNA）の持続的な発現が可能である。
【０２５３】
本発明者らは、長いdsRNAの細胞質の発現ではRNAストレス応答を引き起こさず、遺伝子サイレンシングの非常に強力な誘導因子であることを示した。dsRNA（たとえば、長いdsRNA）の投与のためには、陽イオン性脂質以外のその他の輸送系が望ましい。また、本明細書に記載されているものなどの、これらのその他の輸送系によってもインターフェロン反応を妨げるであろう。その上、本明細書に記載されているように、dsRNAを介した毒性を阻害するために短いdsRNAを投与することができる。
【０２５４】
実施例15：インビトロまたはインビボで産生されるdsRNAの濃度および輸送薬の相対比の最適化
必要に応じて、低毒性を達成し、インビトロまたはインビボで産生されたdsRNAを使用する遺伝子サイレンシングを効率的に誘導するための、陽イオン性脂質、陽イオン界面活性剤、または局所麻酔薬などの薬剤を輸送するために最適なdsRNAの濃度および比は容易に決定することができる。
【０２５５】
核酸／陽イオン性脂質の相互作用に影響を及ぼす因子の概要
陽イオン性脂質DNAの相互作用は、静電的である。静電的相互作用は、培地のイオン成分によって非常に影響を受ける。また、安定な複合体を形成する能力は、脂質分子間の分子間相互作用に依存的である。低濃度では、特定の脂質間相互作用が好ましく；高い脂質濃度では、より高次の相互作用のために迅速な凝集物が形成される。局部的な相互作用でも、これらの例の両方と同様であるが（たとえば、DNAのホスホリル基および荷電した陽イオン性の頭部）、長い範囲と脂質間相互作用は、実質的に異なる。同様に、構造的に多様な変種は、単に、陽イオン性の脂質の量を変化させて固定濃度の核酸と混合することまたはその逆により、複合体の電荷比を変えることによって得ることができる。この複合体の構造の変化は、複合体の物性の変化（たとえば、オクタノール分割、密度勾配の移動度、粒子の電荷密度、粒径サイズ、並びに培養細胞およびインビボのトランスフェクト能（transfectability）の相違）によって証明される（Pachukら、DNA Vaccines-Challenges in Delivery, Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2 （2）  188-198, 2000および Pachukら、 BBA, 1468, 20-30, （2000））。さらに、異なる脂質、局所麻酔薬、および界面活性物質では、これらのそれ自体の間の相互作用が異なり、したがって、新規の複合体は、異なる脂質を単独で、または組み合わせて使用して異なる生物物理学的な性質を形成し得る。それぞれの細胞種について、以下の滴定を行って、ストレス応答またはインターフェロン反応を誘導しない複合体を生じる最適な比および濃度を決定することができる。これらの濃度のいくつかでは、PTGSが誘導されることが予測されるが；PTGSは、非常に減弱された細胞障害性を生じる条件下で最も容易に観察される。
【０２５６】
複合体形成
dsRNAは、T7プロモーターおよびポリメラーゼまたは大腸菌のRNAポリメラーゼなどの別のRNAポリメラーゼを使用するインビトロ転写によっていずれも産生される。また、dsRNAは、内因性ポリメラーゼを使用して生物体または細胞において産生することもできる。
【０２５７】
PSA特異的なdsRNAなどのdsRNAの濃度は、1pg〜10μgで変更される。諸事例では、150ngのサイレンシングされる関心対象（PSA）のリポーターをコードするプラスミドは、10ng〜10μgの間の濃度で共に混合して（comixed）もよい。陽イオン性脂質、陽イオン界面活性剤、局所麻酔薬、または核酸と静電的に相互作用するその他のいずれかのトランスフェクションを容易にする薬剤の濃度は、0.1〜1000（正／負）の電荷比（すなわち、DNAまたはRNAからの負電荷に対する脂質またはその他の輸送薬からの正電荷の比）を得るための各々のdsRNA濃度で変化される。複合体は、水中または緩衝液中（たとえば、ホスフェート、HEPES、クエン酸塩、トリス-HCl、トリス-グリシン、リンゴ酸塩、その他、4.0〜8.5の範囲のpH値）で調製し、塩（たとえば1〜250mM）を含んでいてもよく、グリセリン、シュークロース、トレハロース、キシロース、またはその他の糖（たとえば、一糖、二糖、または多糖体）を含んでいてもよい。混合物は、望ましくは30分間室温でおいて、無期限に貯蔵してもよい。複合体は、無血清培地中で予混合する。核酸およびトランスフェクト試薬は、直接添加することにより、または透析膜を通過させるなどゆっくりと混合するプロセスにより、または微孔質粒子もしくは2つの溶液を低速度および低濃度で引き合わせる装置を使用することにより、混合してもよい。諸事例では、2つの相互作用成分を低濃度で混合し、ダイアフィルトレーションまたは他の濃縮装置を使用して最終的な複合体を濃縮する。または、相互作用する成分のいずれかまたは両方の複合体が高濃度で形成される場合、複合体を希釈して理想的なトランスフェクション混合物を形成させてもよい。
【０２５８】
dsRNAストレス応答のトランスフェクションプロトコルおよび解析
無血清培地中の〜60-80%コンフルエントな細胞に複合体を添加する。複合体を種々の時間（たとえば、10分〜24時間）37℃で細胞と共にインキュベートし、血清添加培地で希釈するか、または洗浄して無血清培地に置き換える。細胞の毒性についてモニターし、種々の時点でdsRNA反応の徴候を解析する（たとえば、切れたDNAを検出するためのTUNELアッセイ法、EIF2αのリン酸化、2'5'-OASの誘導および活性化、またはインターフェロンαおよびβ）。50%、25%、10%、または1%未満の細胞障害性を生じるか、または20、10、5、2、または1.5倍未満のストレス応答の誘導を生じるトランスフェクション条件で解析して、PTGSが効率的に誘導されたかどうかを決定する。
【０２５９】
PSGSの誘導の決定
PSAタンパク質レベルは、標準的な方法を使用して細胞培地中で決定される。培養における生細胞数に対してデータを規準化し、PTGSを誘導するために必要とされる濃度を決定する。
【０２６０】
結果
上記方法を使用すると、dsRNAの陽イオン性脂質複合体は、一定範囲で毒性を誘導した。陽イオン性脂質としてのリポフェクトアミンでは、負電荷に対する正電荷の比が10を超えると、試験したいずれのdsRNA濃度でも全く検出可能な毒性を生じず、高レベルのPTGSを誘導して、培地中のPSAのレベルを非常に減少した。試験したRNA濃度範囲では、リポフェクトアミン（GIBCO-BRL Life Technologies、Bethesda、MDから2mg／mL溶液の10μL）の一定量で1pg〜100ngであった。
【０２６１】
短いdsRNAに対する標的遺伝子特異的なdsRNAの比
必要に応じて、上記の方法は、標的遺伝子をサイレンする標的遺伝子特異的なdsRNAに対する毒性を阻害する短いsdRNAの比を最適化するために使用することができる。たとえば、PSA特異的なdsRNAなどの標的遺伝子に特異的なdsRNAの濃度を1,000,000細胞につき50ng〜5μgで変更し、短いdsRNA（たとえば、毒性を阻害するために使用されるランダムな短いdsRNA分子）の濃度は、1,000,000細胞につき50ng〜5μgで変更させる。標的特異的なdsRNAのモル数に対する短いdsRNAのモル数の比は、1000：1、1：1、から1：25で変更する。諸事例では、150ngのサイレンシングされる関心対象のリポーター（PSA）をコードするプラスミドを10ng〜10μgの間の濃度で共に混合して（comixed）もよい。陽イオン性脂質、陽イオン界面活性剤、局所麻酔薬、または核酸と静電的に相互作用するその他のいずれかのトランスフェクションを容易にする薬剤の濃度は、0.1〜1000（正／負）の電荷比（すなわち、DNAまたはRNAからの負電荷に対する脂質またはその他の輸送薬からの正電荷の比）を得るための各々のdsRNA濃度で変化される。複合体は、上記の通りに調製して試験する。
【０２６２】
本方法の適用
短いdsRNA分子は、遺伝子サイレンシングをしなければ後のdsRNAによって別に引き出されるPKRの活性化を防止するため遺伝子サイレンシング適用において、外部から添加したか、または内因的に発現されたdsRNA分子と組み合わせて使用することができる。現在、遺伝子サイレンシング実験のための細胞および動物に対するこのような外部から添加されるdsRNAの投与は、dsRNA（たとえば、長いdsRNA）によって誘導される細胞毒性によって制限されている。短いdsRNAまたは短いdsRNAを安定もしくは一過性に発現するベクターは、動物または細胞培養にdsRNAをコードする外来性のdsRNAまたはベクターを輸送する前に（たとえば、10、20、30、45、60、90、120、240、または300分前に）、間に、または後に（たとえば、2、5、10、20、30、45、60、または90分後に）輸送することができる。また、短いdsRNAを発現するベクターは、標的核酸に相補的なdsRNAの投与前の1、2、3、5、10、またはそれ以上の日まで投与することができる。短いdsRNAを発現するベクターは、標的特異的なdsRNAが投与されたときに、dsRNAを介したストレス応答経路が、なおも短いdsRNAによって阻害されている限り、標的核酸（たとえば、標的特異的なdsRNA）またはこのdsRNAをコードするベクターに相補的なdsRNAの投与の何日前でも投与することができる。これらの核酸の輸送のタイミングは、標準的な方法を使用して、薬理学の当業者によって容易に選択し、または最適化することができる。また、2002年4月26日に出願された米国特許出願第60/375,636号および2003年4月28日に出願された米国特許出願第10/425,006号「毒性を誘導することなく遺伝子をサイレンシングする方法」C.Pachuk（これらは、参照として本明細書に組み入れられる）の開示を参照されたい。
【０２６３】
実施例16：本発明の構築物および方法の例示的な臨床的および産業的な適用
dsRNA構造、たとえば本発明の部分的なおよび／または強制的なヘアピンおよびdsRNA発現構築物は、脊椎動物生物体（たとえば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物）の内因性または病原性タンパク質の存在に関連した疾患を治療し、安定化し、または予防するための方法に使用することができる。これらの方法は、HBC、HIV、パピローマウイルス、およびヘルペスウイルスなどの慢性ウイルス感染を含むウイルス疾患のための治療的な処理のために特に有用であると思われる。一部の態様において、本発明の方法は、哺乳動物細胞におけるウイルスの複製および／または病原性に必要な核酸を標的とすることによって急性または慢性のウイルス疾患を予防し、または治療するために使用される。HTLV-I、HTLV-II、EBV、HBC、CMV、HCV、HIV、パピローマウイルス、およびヘルペスウイルスなどの慢性ウイルス感染を含む、長いインキュベーション過程または引き延ばされた疾病過程によって特徴づけられるスローウィルスの感染は、本発明の方法の特に適切な標的である。ウイルス感染の予防のためには、選択された遺伝子標的を、望ましくは本発明の短いdsRNAおよび長いdsRNA分子と共に細胞に導入する。レトロウイスル、ヘルペスウイルス、パドナウイルス、ポックスウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルスの種々の種は、特にこのような処理のために適している。感染した脊椎動物（たとえば、哺乳動物）細胞におけるウイルスの複製および／または病原性に必要な例示的な標的遺伝子は、宿主への病原体の侵入機構に必要な病原体または宿主の核酸（たとえば、宿主T細胞CD4受容体）、ウイルスの増殖に必要なタンパク質をコードする核酸（たとえば、HIV gag、env、およびpol）、およびtatおよびrevなどの調節遺伝子を含む。その他の例示的な標的は、HIV逆転写酵素、HIVプロテアーゼ、HPV6 L1およびE2遺伝子、HPV11 LIおよびE2遺伝子、HPV16 E6およびE7遺伝子、HPV 18 E6およびE7遺伝子、HBV表面抗原、HBVコア抗原、HBV逆転写酵素、HSDgD遺伝子、HSV vp16遺伝子、HSV gC、gH、gL、およびgB遺伝子、HSV ICPO、ICP4およびICP6遺伝子；水痘帯状疱疹gB、gC、およびgH遺伝子、並びに細胞から細胞に感染移動するために必要な調節機能を提供する非コードウイルスポリヌクレオチド配列（たとえばHIV LTR、および特にHSVvp16プロモーター、HSV-ICPOプロモーター、HSV-ICP4、ICP6およびgDプロモーター、HBV表面抗原プロモーター、HBVプレゲノムのプロモーター）を含む。望ましくは、本発明のdsRNA（たとえば、長いdsRNA）は、哺乳動物または脊椎動物の細胞におけるウイルス核酸の機能を減少または阻害し、本発明の短いdsRNAは、dsRNAによってトリガーされるであろうdsRNAストレス応答を遮断する。
【０２６４】
例示的なレトロウイルスの標的は、HIV遺伝子gag、インテグラーゼ、pol、env、vpx、vpr、vif、nef、HTLV-1および2、並びにproほとんどまたはの全ての発現を駆動する、HIV-1おとび2（LTRプロモーターエレメント）を含むが、これらに限定されない。例示的なB型肝炎プロモーターは、抗原遺伝子、コアおよびe抗原、ポリメラーゼ、およびXタンパク質のプロモーターを含む。例示的なB型肝炎標的遺伝子は、表面抗原、コアおよび抗原、ポリメラーゼ、およびXタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【０２６５】
典型的なポックスウイルスには、天然痘およびワクシニアが含まれる。遺伝子およびこれらのプロモーターのいくつかの例は、初期および中期および後期プロモーター；並びにRNAポリメラーゼ（マルチサブユニット）、初期転写因子、ポリ（A）ポリメラーゼ、キャッピング酵素、RNAメチルトランスフェラーゼ、DNA依存的ATPase、RNA/DNA依存的NTPase、DNAトポイソメラーゼI、ニッキング-ジョインティング酵素、プロテインキナーゼ1および2、グルタレドキシン、分泌型C23Lタンパク質、コアタンパク質、ビリオンタンパク質、膜タンパク質および糖タンパク質、トランス活性化因子、DNAポリメラーゼ、および補体阻害剤のプロモーターおよびコード配列である。
【０２６６】
例示的なヘルペスウイルスは、HSV-1および2、CMV、EBV、およびニワトリpoxを含む。これらのウイルスのための例示的なプロモーターは、最初期および初期および中期および後期プロモーターを含み、例示的な遺伝子は、ICP0、ICP4、およびICP6を含む最初期タンパク質、vpl6、カプシドタンパク質、ビリオンタンパク質、外被タンパク質、gDおよびgBを含む外膜タンパク質および糖タンパク質、ヘリカーゼ／プライマーゼ、DNAポリメラーゼ、基質タンパク質、調節タンパク質、プロテインキナーゼ、並びにその他のタンパク質コードするものなどのこれらのプロモーターから発現される任意の遺伝子を含む。
【０２６７】
ヒト・パピローマウイルスの例は、タイプ1、2、3、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63、および65を含む。関心対象の例示的なプロモーターは、E6およびE7、E1、E2、E3、およびE4、およびE5、L1およびL2の発現を駆動するものであり、例示的な遺伝子は、上述した遺伝子を含む。
【０２６８】
アデノウイルスのプロモーターおよび遺伝子の例は、E1A、E2A、E4、E2B-TP、E2Bpol、Iva2、L1-L5、E1B遺伝子、およびE3遺伝子のプロモーターおよびコード配列を含む。
【０２６９】
他の例示的なウイルスのプロモーターおよび遺伝子には、パルボウイルス、西ナイルおよび日本脳炎などの脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルクウイルス、ポリオウイルス、はしかウイルス、並びにピコルナウイルス科、カルシウイルス科（calciviridae）、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科（flaviviridae）、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブニアウイルス科、アレナウイルス科、およびレオウイルス科のファミリーのその他のウイルスのいずれかのプロモーターおよび遺伝子が含まれる。
【０２７０】
マラリア、バベシア症、トリパノソーマ症、レーシュマニア症、またはトキソプラスマ症を引き起こす腸管外病原性の原生動物などの、その他の例示的な病原体は、細菌、リケッチア、クラミジア、真菌、および原生動物を含む。細胞内でマラリアを引き起こす病原体のプラスモディウム種、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫は、特に慢性のマラリア再発性の形態において、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングの望ましい標的である。その他の細胞内の病原体は、バベシア・ミクロティ（Babesia microti）およびその他のバベシア症の因子、アフリカ睡眠病、およびアメリカトリパノソーマ症またはシャガス疾患を引き起こすトリパノソーマ属の原生動物；トキソプラスマ症を生じるトキソプラスマ（Toxoplasma gondii）、ヒトおよびその他の動物の種々の結核疾患を引き起こす結核菌、ウシ型結核菌、およびトリ型結核菌複合体を含む。望ましくは、本発明のdsRNA（たとえば、長いdsRNA）は、哺乳動物または脊椎動物の細胞におけるウイルス核酸の機能を減少または阻害し、本発明の短いdsRNAは、dsRNAによってトリガーされるであろうdsRNAストレス応答を遮断するする。
【０２７１】
感染を予防するためのいくつかの方法において、病原体標的遺伝子または病原体標的遺伝子に由来する領域（たとえば、イントロン、エキソン、非翻訳の領域、プロモーター、またはコード領域由来の領域）を細胞または動物に導入する。たとえば、この標的核酸は、望ましくは細胞のゲノムに組み込むベクターに挿入し、細胞または動物に投与することができる。または、この標的核酸は、ベクターに組み込まれずに投与することができる。細胞または動物に領域または完全な標的核酸が存在すると、同時に、または経時的に投与された標的遺伝子に対して相同的なdsRNAの増幅を増強することが予想される。増幅されたdsRNAまたは増幅されたdsRNAからの切断産物は、後に細胞または動物に感染する病原体の標的遺伝子をサイレンスする。また、dsRNAを介した毒性を阻害するために、細胞または動物に短いdsRNAが投与される。
【０２７２】
同様に、特定の細胞または動物において現在発現されていない内因性の標的遺伝子をサイレンスさせるためには、細胞または動物に標的遺伝子に由来する領域を導入して、投与された標的遺伝子に対して相同的なdsRNAの増幅を増強することが必要であろう。増幅されたdsRNAまたは増幅されたdsRNA由来の切断産物は、望ましくは、細胞または動物における後での標的遺伝子の発現を予防または阻害する。望ましくは、毒作用を阻害するために、短いdsRNAも投与される。
【０２７３】
さらに他の例示的な標的核酸は、ヒツジおよびヤギのスクレイピ、；ウシ海綿状脳症（BSE）または「狂牛病」、および伝播性ミンク脳症、ミュールジカおよびヘラジカ慢性萎縮病、およびネコ海綿状脳症などのその他の動物のプリオン病を含む伝播性海綿状脳症と関係するタンパク質などのプリオンをコードする。ヒトのプリオン疾患は、クロイツフェルト‐ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー疾患（これは、運動失調および小脳に対する損傷のその他の徴候として現れる）、および致命的な家族性不眠症を含む。望ましくは、本発明のdsRNA（たとえば、長いdsRNA）は、哺乳動物または脊椎動物の細胞においてプリオンの機能を減少または阻害し、本発明の短いdsRNAは、dsRNAによってトリガーされるであろうdsRNAストレス応答を遮断する。
【０２７４】
また、本発明は、標的核酸が異常なまたは異常に発現された発癌性遺伝子、腫瘍抗原もしくはこれらの部分、または制御配列である本発明の組成物の1つまたは複数を哺乳動物に対して投与することにより、哺乳動物における癌の治療または予防のための組成物および方法を提供する。望ましくは、標的核酸は、哺乳動物の腫瘍の維持に必要とされる。例示的な発癌遺伝子標的は、ABL1、BRAF、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CSF1R、EGFR、ERBB2（HER-2/neu）、FOS、HRAS、MYB、MYC、LCK、MYCL1、MYCN、NRAS、ROS1、RET、SRC、およびTCF3を含む。たとえば、このような異常な核酸は、2つの通常の遺伝子の融合物であることができ、標的配列は、その融合物にわたった配列、たとえば融合されていないbcrおよびablの正常配列以外の特定の慢性骨髄性白血病に特有のbcr/abl遺伝子配列（フィラデルフィア染色体）であることができる（たとえば、1994年6月23日に公開された国際公開公報第94/13793号を参照されたく、この開示は、参照として本明細書に組み入れられる。）。ウイルスで誘導される癌は、特に本発明の組成物の適用および方法に適している。これらの癌の例は、HPVサブタイプ16および18由来のE6およびE7、p53およびRB癌抑制遺伝子、およびほとんどのバーキット様のリンパ腫およびほとんどすべてのHIV関連中枢神経系リンパ腫において検出される,エプスタイン・バーウイルス（EBV）に関係しているであろうヒト-パピローマウイルス（HPV）に関連した悪性腫瘍を含む。本組成物は、哺乳動物において腫瘍を維持する核酸の機能を減少または阻害するために十分な量で投与される。
【０２７５】
また、本発明の遺伝子サイレンシング方法は、複数標的またはポリエピトープなアプローチを使用してもよい。望ましくは、dsRNAの配列は、1つまたは複数の病原体の遺伝子、単一の病原体に由来する複数の遺伝子またはエピトープ、サイレンシングされる複数の内因性遺伝子、またはサイレンシングされる遺伝子と同じ遺伝子に由来する複数の領域に対して相同な領域を含む。例示的な相同領域は、プロモーター領域および非翻訳領域などのエキソン、イントロン、または調節エレメントに対して相同な領域を含む。
【０２７６】
また、本発明の方法は、PKRの抑制が要求されるいずれの状況においても、たとえば、非鋳型鎖内の潜在性のプロモーターから転写が生じるときに、少量のdsRNAが不注意にも形成されるかもしれないDNA発現系において有用であろう。また、本発明の方法は、脊椎動物の細胞培養におけるdsRNA分子の製造などの工業的な応用にも有用である。本発明は、「ノックアウト」または「ノックダウン」脊椎動物の株化細胞を作製するため、または1つまたは複数の標的核酸がサイレンシングされた研究生物体（たとえば、マウス、ウサギ、ヒツジ、またはウシ）に使用することができる。また、本発明により、脊椎動物の細胞または生物体において遺伝子を不活性化する効果を決定することによって、遺伝子の機能を同定することができる。また、これらの遺伝子サイレンシング方法は、創薬または薬剤の開発のための潜在的な標的として選択された遺伝子を実証するために使用することができる。
【０２７７】
その他の態様
前述の説明から、種々の利用および条件にこれを採用するために、本明細書に記載されている本発明に対して変異および修飾がなされてもよいことは、明らかであろう。また、このような態様は、上記請求の範囲の範囲内である。
【０２７８】
本明細書において述べられる全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個々に参照として組み入れられることを示した場合と同じ範囲で参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
（図１）図1A〜1Dは、強制的なヘアピン構築物の概略図である。センス（またはアンチセンス）RNA配列の次に配列Aが続く。配列Aの直後には、最小で少なくとも約7ヌクレオチド、かつ最大で数百ヌクレオチドのループが続く。ループの次に、配列Bが続き、その後アンチセンス（またはセンス）RNA配列が続く。好ましくは、ループは、その他の配列と塩基対形成しないか、またはそれ自体の中で、もしくは配列AおよびBと有意な二次構造を形成しない。たとえば、配列Aは、Gから成る場合、BはCから成る。その場合、ループは、たとえばAだけまたはUだけから成ることができる。ループ中のUのモノ配列は、発現構築物が、（DNA発現構築物において）ターミネーターとして役立つ4〜5個のTの連なりのU6プロモーターを有することを除き、通常望ましい態様である。また、
2006500012.tif 000032
などのループ配列を使用してもよく、その他の同様の変異であってもよい。多くのGは、ループでは避けられることが一般的である。ループ内の二次構造は、それが有意でない場合には、ある程度は可能である。配列AおよびBは、直ちに互いに塩基対形成し、RNA配列を全体として強力に駆動してヘアピンまたはステム-ループ構造を呈するように設計される。このセンスにおいて、ループ配列に隣接する付加された自己相補的AおよびB配列を含むRNA構造は、「強制的」ヘアピンである。
アンチセンスおよびセンスRNA領域は、同じ長さである必要はない。たとえば、図1Bおよび1Cには、センスおよびアンチセンス領域の長さが異なった、突出領域において生じる構築物を図示する。図1Dには、5'末端がアンチセンス領域を含み、3'末端がセンス領域を含む代わりの構築物を図示してある。いずれの場合においても、5'領域は、選択された関心対象の標的（たとえばmRNA）に関してセンスまたはアンチセンスの領域を含んでいてもよく、この場合、分子のより3'の領域には、望ましくは逆位の相補配列（アンチセンスまたはセンス、場合によっては）を含んでいてもよく、これは、同じ長さであっても、またはなくてもよい。短いヘアピンにおいて、5'配列がアンチセンスで、3'配列がセンスであることが好ましいであろう。また、これらの構築物のいずれも、構築物の5'および／または3'末端にさらなる配列を有することができる。5'突出を有する構築物であって、3'末端ヌクレオチドは、上流領域と塩基対を形成し、かつRdRp自己伸長に適した構築物は、部分的なヘアピンである。配列AおよびB、並びにループは、たとえばクローニングベクターの一部の配列であることができる。このようなクローニングベクターは、望ましくはキットにおいて、選択的に機能的ゲノミクスを含む種々の適用のためのRdRpの供与源と共に提供されてもよい。
図1E（i）および1E（ii）は、dsRNA発現構築物を示す模式図である。センスおよびアンチセンス配列は、標準的な方法を使用して、それぞれこれらの配列エレメントの上流および下流にクローニングすることができる（図1E）。センス挿入は、マルチクローニングサイト（MCS、これは同じでも、異なっていてもよい）のうちの一方にクローニングすることができ、アンチセンスの挿入は、他方のMCSにクローニングすることができる。このdsRNAを発現するために、当業者に既知の任意のプロモーターを使用することができる。このような、プロモーターおよび2つのMCSsに隣接するA／ループ／B配列を有する標準的なクローニングベクター（図1E（i））は、本明細書に更に詳細に他の場所で記載されているように、たとえば機能的ゲノミクス適用のために有用な商業的なキットに有利に提供することができる。1つまたは複数のこのようなプロモーター／MCS／A／Loop／B／MCSユニットをその他の発現ユニットと共に含む2または多シストロン構築物、たとえばRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）（図1E（ii））を発現することは、本明細書に記載したとおり、たとえば「部分的な」ヘアピンの発現および伸長のために有利に利用することができる。
（図２）自己伸長する部分的なヘアピンの概略図である。この例では、アンチセンス配列は、鋳型としてセンスRNAを使用して自己伸長される（図2A）。または、アンチセンス配列は、5'末端に近くすることができ、センス配列を伸長することができる。また、強制的な部分的なヘアピン構築物を自己伸長のために使用することができる（図2B）。この場合、伸長は、配列Bまたは、必要に応じて3'末端の短い相補性アンチセンスもしくはセンス配列から直接に生じるので、センスまたはアンチセンス鎖に対して配列相補性がないことが必要である（図2C）。
（図３）図3Aは、イントロンを有するdsRNAをコードするベクターの概略図である。HCMV最初期プロモーターは、RNA PolIIによって認識されるので、転写は+1で開始する。転写されたRNAは、センス分泌されたアルカリホスファターゼ（SEAP）、続いてイントロン内に原核生物のゼオマイシン発現カセットを含むRNAがヒトサイトメガロウイルス（HCMV）イントロンAを含む。イントロンの次にSEAPアンチセンスRNAが続く。RNAを同時転写的にスプライスして、BGHポリA部位により誘導してポリアデニル化する。カナマイシン耐性遺伝子も含まれる。
図3Bは、図3Aに示したベクターから転写される直線的なRNAの構造を示す説明である。
図3Cは、図3BのRNAの、ループに関与するエキソン配列を有するヘアピンへの折りたたみを示す説明である。また、この構築物は、強制的なヘアピン構築物および自己伸長する部分的なヘアピンについて記載した特徴を含むことができる。
（図４）図4Aは、RNace Hを介した切断によってプロセシングされるRNAの概略図である。前駆体RNAの5'から3'への直線的な表現は、第1の関心対象領域（領域1）、ループ領域、第2の関心対象領域（領域2）、および可変の3'末端配列を含む。図4Bに図示したように、領域2は、一部の局面において、領域1の3'部分の配列に逆相補であり、および塩基対形成ができ、遊離の対形成していない3'末端配列とヘアピン構造を形成する。
図4Bは、RNAの折りたたみ構造およびRNAのRNase Hを介した切断の概略図である。分子の3'末端は、鋳型と塩基対形成することができない。DNAオリゴヌクレオチドを、DNA／RNAハイブリダイゼーション配列から上流の領域2に少なくとも5〜15塩基対（*）があるように領域2の配列にハイブリダイズさせ、RNase Hを添加して、DNA／RNAハイブリッドを切断する。生じる部分的なヘアピンは、自己伸長することができる。このRNaseH切断アプローチは、分子の鋳型部分と塩基対形成して、RdRp（RNA依存性RNAポリメラーゼ）によって3'を伸長することができる部分的なヘアピンdsRNAを得る、予め定められた3'末端を達成する1つの方法を表す。
（図５）図5Aは、リボザイムを介した切断によってプロセシングされるRNAの概略図である。前駆体RNAの5'から3'への直線的な表現は、領域1、ループ配列、領域2（逆相補的であり、領域1の3'部分と塩基対を形成できる）、4〜数百ヌクレオチド（好ましくは10〜100、より好ましくは10〜50）の介在配列、および領域2の標的リボザイム切断部位（*）を切断するように設計されたハンマーヘッドリボザイムを含む。切断部位は、切断部位から上流の領域2に少なくとも5〜15塩基が存在し、RNA分子を二本鎖の高次構造に維持するように設計される。リボザイムの次には、RNA分子の上流領域のいずれとも塩基対を形成しない可変の3'末端配列が続く。RNAがプロセシングされない場合、3'末端配列は、鋳型と塩基対を形成しないので、自己伸長することができない。
図5Bは、どのようにリボザイム切断により、鋳型と塩基対形成し、ひいては自己伸長してヘアピンを形成することができる3'末端を有するRNAを生じるのかを示す概略図である。望ましい態様において、このリボザイム切断法は、強制的なヘアピン方法と共に利用することができる。その場合、RNA分子は、ループ領域に隣接するさらなる領域AおよびBを含み、標的リボザイム切断部位は、標的リボザイム切断部位から上流の領域Bに少なくとも5〜15塩基があり、領域Aと塩基対を形成し、かつ切断後にRNA分子が二本鎖の高次構造を維持する限り、領域B内に配置することができる。
（図６）図6Aは、哺乳動物プラスミドベクターからの一段階クローニングおよびdsRNAの発現を容易にするシステムの概略図である。特に、図6Aは、cDNA（SEAP）およびヘアピン（すなわち、ループ配列に隣接する自己相補的な配列を含む斜めの縞のボックス「A」および「B」）に由来する末端ベクター（これは、最終的にTの連なりで終わる）を介したRNA polIII転写を示す（U6プロモーター；曲がった矢印）。ベクターには少なくとも4〜5個のT残基があり、したがって対応する数の相補配列にA残基がある。有利には、ベクターに由来するヘアピンは、「B」ボックスのすぐ下流に位置するT残基および「A」ボックスのすぐ上流域に位置するA残基を除いて、本明細書に記載されている強制的ヘアピン構築物と同じであってもよい（たとえば、ループに隣接する逆相補配列「A」および「B」）。このようなベクターは、3'末端を有する転写物を生じ、これが、所望のヘアピンdsRNAを生じる哺乳動物RdRpによる第2の鎖合成（伸長）に対してcisの完全なプライマーとしての役割を果たし、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングのイニシエータとして役立つ。この「ターミネーター」アプローチは、予め定められた3'末端を有するRNAを発現し、分子の鋳型部分と塩基対を形成して、RdRp（RNA依存性RNAポリメラーゼ）によって3'伸長され得る部分的なヘアピンdsRNAを与えるdsRNA発現構築物を設計する1つの方法を表す。
図6Bは、末端ヘアピンを欠いているが、なおも標的cDNAの一本鎖を発現して、終結することができる対照プラスミドベクターを示す。
（図７）図7A〜7Hは、RNA依存性RNAポリメラーゼによって伸長することができる部分的なヘアピンを作製するための方法の概略図である。RNA PolII転写物が示されているが、転写物は、RNAおよびDNA依存性RNAポリメラーゼを含むその他のRNAポリメラーゼに由来してもよい。図7A〜7Hに示したdsRNAヘアピン分子は、5'から3'の順で、同一（センス）であるか、または相補性（アンチセンス）である分子の「鋳型」部分、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングの標的であるmRNA、塩基対形成配列1（BPS-1）、ループ領域、および塩基対形成配列2（BPS-2）からなる。BPS-1およびBPS-2とラベルした配列は、図式的に塩基対形成を示すように選択されているが、標的mRNA分子の配列に由来してもよく、またはこれらは、特異的な塩基対形成を強制して、ヘアピン分子の効率的な形成を促進するように設計された合成配列であってもよい。
図7Aは、発現ベクターに組み込まれたポリT配列のpolIII転写によって生じたポリU域を有するdsRNAヘアピンを示す模型図である。ポリU域は、dsRNAヘアピンの5'鋳型領域から下流である。このアプローチにより、転写物分子のサブセットを、ポリU域が転写の間に転写物に組み込まれたポリA配列と塩基対形成するヘアピン高次構造を呈するようにさせることができる。T7などの、非ポリアデニル化ポリメラーゼが使用される場合、ポリA配列をポリT配列のベクター下流に組み込んでポリU域、並びに3'末端にポリA配列を有する転写物を産生することができる。4個のTの連なりで終結するpolIIIなどのポリアデニル化ポリメラーゼが使用される場合、ポリUおよびポリA域は、4個のTの連なりを有さない配列によって置換される。いくつかの態様において、鋳型鎖のポリUのひと配列により、mRNA分子の一部分を、末端A配列が鋳型polyUとじかに接触して塩基対形成するヘアピン構造を呈するようにできるので、ポリアデニル化されたtRNA polIII転写物が使用される。
図7Bは、RNase Hを使用して「BPS-2」内の1つまたは複数の部位
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でdsRNAヘアピンの3'末端を切断し、「部分的な」dsRNAヘアピンを生じることを示す模型図である。RNase Hによる切断は、dsRNAヘアピンの3'末端のBPS-2と相補性で、かつ塩基対を形成するオリゴデオキシリボヌクレオチド（「オリゴ」と示した）の付加によって媒介され、これによりRNase Hによって認識および切断されるDNA／RNAハイブリッドを形成する。RNase HによるdsRNAヘアピンの切断により、同じ分子の「BPS-1」と塩基対形成したままである3'末端を有する「部分的な」dsRNAヘアピンを生じる。dsRNAヘアピンの最も5'末端の配列（「鋳型」と示した）は、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングの標的であるmRNAと同一（センス）であるか、または相補性（アンチセンス）である。この配列は、「部分的な」dsRNAヘアピン、必要に応じて完全なヘアピンの3'末端のRdRp伸長のための「鋳型」としての機能を果たす。
オリゴデオキシリボヌクレオチドの使用に加えて、「部分的な」dsRNAヘアピンは、また、BSP-2と塩基対形成して、RNA配列のRNAse H切断が可能な修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することによって作製することができる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドは、修飾因子基の付加によってリボース糖の2'位で修飾される。たとえば、国際公開公報第95/17414A1号の開示が参照され、本明細書に参照として組み込まれる。ループに隣接する配列（BPS-1およびBPS-2）は、図式的に塩基対形成を示すように選択してあるが、標的mRNA分子の配列または効率的なヘアピン形成を駆動するための特異的な塩基対形成を強制するように設計された合成配列に由来していてもよい。
図7C-7Fは、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングのための標的であるmRNAと同一（センス）であるか、または相補性（アンチセンス）である分子の上流の「鋳型」部分と塩基対形成する予め決定された3'末端を作製するためのリボザイム切断アプローチを示す模型図である。模型図が示すように、このアプローチでは、RdRp（RNA依存性RNAポリメラーゼ）によって3'伸長することができる部分的なdsRNAヘアピンを生じる。示したように、リボザイムは、トランス（図7C）で研究に供給することができ、またはRNA分子自体内に、たとえばループ内に（図7D）、もしくはRNA転写物の3'末端配列内に（図7E）配置することができる。図7C、7D、7E、および7F（i）、並びに7F（ii）において、BPS-1
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およびBPS-2
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は、ループに隣接しており、塩基対形成を示す図式的な例として選択してある。これらの配列は、標的mRNA分子の配列に由来してもよく、またはこれらは、効率的なヘアピン分子の形成を促進するための特異的な塩基対形成を強制するように設計された合成配列であってもよい。
図7Cは、トランスで提供されたリボザイムによる、たとえばリボザイムの外部からの送達による、または分離したプラスミドもしくは分離したシストロンからのリボザイムの発現による、dsRNAヘアピンの切断
2006500012.tif 000036
を示す模型図である。
図7Dは、ヘアピンループ内に配置されたリボザイムによる、dsRNAヘアピンの3'配列の切断
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を示す模型図である。
図7Eは、RNA鋳型の3'部分に配置されたリボザイムによる、BPS-2内のdsRNAヘアピンの切断
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を示す模型図である。RNA polII転写物を示しているが、転写物は、その他のRNAポリメラーゼ、たとえばRNAおよびDNA依存性RNAポリメラーゼに由来していてもよい。
図7F（i）および7F（ii）は、米国特許第6,080,851号「結合されたアンカー配列を有するリボザイム（Ribozymes with linked anchor sequences）」、Pachukら（これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているとおりの、アンカーされたリボザイムによるBPS-2内のdsRNAヘアピンの切断
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を示す模型図である。必要に応じて、リボザイム切断の割合および特異性は、転写物の配列と塩基対形成するアンカー配列、好ましくは一部のヘアピンループ配列の使用を介して、さらに増強することができる。このようなアンカーされたリボザイムは、細胞もしくは生物体に外部から送達することができ、またはたとえば別々のプラスミドまたは別々の2もしくは多シストロンのプラスミドのシストロンで、切断されるRNAと共に同時発現することができる。
図7Gは、トランスに、dsRNAヘアピンのRNase P切断
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を促進する転写物の3'末端に配置されたプレtRNA配列の使用を示す模型図である。
図7H（i）および7H（ii）は、2つの別々のRNA分子からヘアピンを作製するためのトランススプライシング・リボザイムの利用を示す模型図である。図7H（i）および（ii）は、図式的に塩基対形成を示すように選択してあるが、標的mRNA分子の配列または効率的なヘアピン形成を駆動するために特異的な塩基対形成を強制するように設計された合成配列から由来していてもよい。図7H（i）は、直接のトランススプライシングを示し、図7H（ii）は、アンカーされたトランススプライシングを示す。たとえば、米国特許第5,667,969号および米国特許第5,874,414号のトランススプライシング・リボザイム構造が参照され、これらの開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
図7H（i）は、このトランススプライシング・アプローチの3つの段階を示す。段階Iは、2つのRNA分子（「RNA1」および「RNA2」で示した）の塩基対形成および切断を示す。RNA1は、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングの標的であるmRNAと同一（センス）であるか、または相補性（アンチセンス）である最も5'末端の配列（「鋳型」と示した）を含む。また、RNA1は、相補配列「BPS-2」（この場合、第2のRNA分子（RNA2）に存在する）と塩基対形成するように選択された「BPS-1」を含む。最後に、RNA1は、RNA2に存在する内部ガイド配列（IGS）と塩基対形成する「配列1」を含む。RNA2は、ポリAテイルを欠いているRNA分子である（たとえば、これは、polIIIによって作製され、そこはその他のポリメラーゼに由来するか、またはこれは合成的に調製されて、RNA1と同時投与される）。RNA2のIGSとRNA1の配列1の塩基対形成により、RNA2にも存在する「リボザイム」が、示された部位
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でトランスにRNA1およびRNA2を切断すること、並びにRNA1（配列1で）およびRNA2（配列2で）を再連結させて単一のキメラRNA分子を形成することが可能になる。
段階IIは、RNA1の配列1とRNA2の配列2の再連結によって形成される領域を含む新しく形成されたキメラRNA分子を示す。
段階IIIは、BPS-1およびBPS-2の塩基対形成のための「部分的な」dsRNAヘアピンの形成を示す。分子の上流の5'末端（「鋳型」）は、RdRpによるdsRNAヘアピンの伸長のための鋳型としての機能を果たす。
図7H（ii）は、アンカー配列がRNA2に存在することを除き、図7H（i）に示したトランススプライシング・アプローチの3つの段階と同じであることを示す。示したように、アンカー配列に対する相補性がRNA1に存在する。アンカー配列は、RNA分子のほぼどこにでも配置することができるが、アンカー配列の配置は、リボザイム機能を損なうべきでない。アンカー配列は、最終的なdsRNAヘアピン分子に含まれないように、RNA分子に配置することができる。
（図８）図8A〜8Dは、RNAヘアピンを作製するためのヌクレオチド配列を含む発現ベクターを示すダイアグラムである。図8A〜8Dに提供した21塩基対の配列は、Genbankアクセッション番号：V01460およびJ02203に見いだされるB型肝炎ウイルス（HBC；ayw株）のゲノム配列のヌクレオチド2912位〜2932位と一致する。この配列は、表面抗原、ポリメラーゼ、およびコア転写物を含むHBVゲノム中の多くの転写物を標的とする。ヘアピンの5'アーム
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は、示される全ての転写物のためのアンチセンス鎖である。
図8Aは、完全に発現されるヘアピンをコードする発現ベクターを示す。発現されたヘアピンは、21塩基対のHBV配列、および短いGTGTGTループ配列に隣接するその相補配列によって例示される。配列は、U6プロモーターおよびターミネーター配列の制御下で転写され、示された転写物を産生する。一旦転写されると、転写物は、21塩基対のHBV配列とその相補配列の間の塩基対形成によってヘアピン構造を形成する。小さなヘアピン構造については、示したように、転写物の5'末端は、好ましくは標的mRNAのアンチセンス配列と一致する。
図8Bは、21塩基対のHBV配列および隣接するその相補配列、A配列、ループ領域、およびB配列を有する転写物をコードする発現ベクターを示す。AおよびB配列は、直ちに互いと塩基対形成して、全体としてRNA配列がヘアピンまたはステム-ループ構造を呈するように、強力に駆動するように設計される。ループ領域は、あらゆる塩基対形成または二次構造の形成を避けるように設計されている。プラスミド構築物におけるAおよびB配列は、示したとおり、ヌクレオチド鎖の1つのタイプ（すなわち、ポリCもしくはポリG）を有する転写物をコードすることができ、またはこれらは「GC」反複の連なりをコードすることができる。一旦転写されると、転写物は、AおよびB配列の間の塩基対形成による強制的なヘアピン構造を形成し、続いて21塩基対のHBV配列とその相補配列の間で塩基対形成する。
図8Cは、強制的な部分的RNAヘアピンの発現のための発現構築物を示す。この構築物は、短いループ領域に隣接するAおよびB配列を提供する。AおよびB配列は、直ちに互いと塩基対形成して、全体としてRNA配列がヘアピンまたはステム-ループ構造を呈するように、強力に駆動するように設計される。ループ領域は、あらゆる塩基対形成または二次構造の形成を避けるように設計されている。A配列の先にある長い矢印
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は、21塩基対のHBV配列を表す。一旦転写されると、転写物は、AおよびB配列の間の塩基対形成によって強制的なヘアピン構造を形成する。強制的なヘアピンは、転写物の5'末端で、21塩基対のHBV配列に対応する21塩基対の突出を有するRNA転写物を生じるので、「部分的」といわれる。完全なヘアピンを形成するための3'末端の伸長は、RdRpを使用して達成することができる。
図8Dは、強制的な部分的RNAヘアピンの発現のための発現構築物を示す。この構築物は、短いループ領域に隣接するAおよびB配列を提供する。AおよびB配列は、直ちに互いと塩基対形成して、全体としてRNA配列がヘアピンまたはステム-ループ構造を呈するように、強力に駆動するように設計される。ループ領域は、あらゆる塩基対形成または二次構造の形成を避けるように設計されている。A配列の先にある長い矢印
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は、21塩基対のHBV配列を表す。B配列に続くより短い矢印
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は、21塩基対のHBV配列のより短い10塩基対領域を表す。一旦転写されると、転写物は、AおよびB配列の間の塩基対形成によって強制なヘアピン構造を形成する。強制的なヘアピンは、HBV配列の10ヌクレオチドだけが重なって塩基対形成し、転写物の5'末端の11ヌクレオチドの突出が残ったままであるので、再び「部分的」といわれる。完全なヘアピンを形成するための3'末端の伸長は、RdRpを使用して達成することができる。
【図１Ａ】
2006500012.tif 000046
【図１Ｂ】
2006500012.tif 000047
【図１Ｃ】
2006500012.tif 000048
【図１Ｄ】
2006500012.tif 000049
【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
2006500012.tif 000051
【図２Ｂ】
2006500012.tif 000052
【図２Ｃ】
2006500012.tif 000053
【図３】
2006500012.tif 000054
【図４】
2006500012.tif 000055
【図５】
2006500012.tif 000056
【図６】
2006500012.tif 000057
【図７Ａ】
2006500012.tif 000058
【図７Ｂ】
2006500012.tif 000059
【図７Ｃ】
2006500012.tif 000060
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2006500012.tif 000062
【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2006500012.tif 000064
【図７Ｈ−１】
2006500012.tif 000065
【図７Ｈ−２】
2006500012.tif 000066
【図８Ａ】
2006500012.tif 000067
【図８Ｂ】
2006500012.tif 000068
【図８Ｃ】
2006500012.tif 000069
【図８Ｄ】
2006500012.tif 000070
【国際調査報告】
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2006500012.tif 000072