(57)【要約】本発明は、マリナー可動遺伝因子の機能亢進性、非リン酸化、突然変異トランスポゼースに関する。本発明はまた、このようなトランスポゼースをコードする組換えヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、このようなトランスポゼースを生産する方法、およびin vitroまたはin vivo転位のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリン酸化部位における少なくとも１つのリン酸化可能残基の保存的置換による少なくとも１つの突然変異を有し、前記保存的置換がin vivoにおいて前記部位をリン酸化不能にし、前記リン酸化可能残基が、
配列番号２の配列中の以下の残基：Ｔ１１；Ｔ２４；Ｓ２８；Ｔ４２；Ｔ８８；Ｓ９９；Ｓ１０４；Ｔ１３５；Ｓ１４７；Ｔ１５４；Ｓ１７０；Ｔ１８１；Ｓ２００；Ｔ２１６；Ｔ２５５；およびＳ３０５、または
前記配列番号２の配列とともに整列させたマリナーＭＧＥトランスポゼースの配列中の対応する残基であって、
セリン；および
トレオニン
の中から選択される対応残基の中から選択される、マリナー可動遺伝因子（ＭＧＥ）の突然変異、リン酸化不能、かつ、機能亢進性トランスポゼース。
【請求項２】
各リン酸化部位における少なくとも１つのリン酸化可能残基の保存的置換による少なくとも１つの突然変異を有し、前記保存的置換がin vivoにおいて各部位をリン酸化不能にする、請求項１に記載のトランスポゼース。
【請求項３】
前記リン酸化可能残基がリン酸化不能残基により置換されている、請求項１または２に記載のトランスポゼース。
【請求項４】
特異的および非特異的ＤＮＡ結合、二量体化、ＤＮＡ鎖の転移、ならびにエンドヌクレアーゼおよび核インターナリゼーション特性のうち少なくとも１つの機能に関して機能亢進性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゼース。
【請求項５】
前記マリナー可動遺伝因子がモーリシャスサブファミリーに属する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトランスポゼース。
【請求項６】
マリナー可動遺伝因子がｍｏｓ−１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトランスポゼース。
【請求項７】
前記リン酸化可能残基が以下の残基（配列番号２の配列を参照して）：Ｔ１１；Ｔ２４；Ｓ２８；Ｔ４２；Ｔ８８；Ｓ９９；Ｓ１０４；Ｔ１３５；Ｓ１４７；Ｔ１５４；Ｓ１７０；Ｔ１８１；Ｓ２００；Ｔ２１６；Ｔ２５５；およびＳ３０５の中から選択される、請求項６に記載のトランスポゼース。
【請求項８】
前記リン酸化可能残基がＴ８８である、請求項７に記載のトランスポゼース。
【請求項９】
前記リン酸化可能残基がＳ１０４である、請求項７または８に記載のトランスポゼース。  
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスポゼースをコードする組換えヌクレオチド配列。
【請求項１１】
少なくとも１つの、請求項１０に記載の組換えヌクレオチド配列を含んでなる、組換えベクター。
【請求項１２】
前記組換えヌクレオチド配列を発現させるために用いられる、請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
少なくとも１つの、請求項１１または１２に記載の組換えベクターを保持する組換え宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のトランスポゼースを生産する方法であって、少なくとも
ａ）発現ベクター中に、前記トランスポゼースをコードする組換えヌクレオチド配列をクローニングすること；
ｂ）宿主細胞を前記組換え発現ベクターで形質転換すること；および
ｃ）前記組換え宿主細胞により前記ヌクレオチド配列を発現させること
を含む、方法。
【請求項１５】
対応する天然トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列において、リン酸化可能残基をコードするトリプレットの少なくとも１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドにより置換して、得られたトリプレットが非リン酸化能残基をコードするようにすることで前記組換えヌクレオチド配列を得る前工程もまた含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞が細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および哺乳類の細胞の中から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記トランスポゼースを精製するための後工程もまた含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
目的の転位可能なＤＮＡ配列を標的ＤＮＡ配列へとin vitro転位させるのための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのトランスポゼースの使用。
【請求項１９】
目的の転位可能なＤＮＡ配列を宿主ゲノムへのin vivo転位させるための薬剤の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのトランスポゼースの使用。
【請求項２０】
目的の転位可能なＤＮＡ配列を宿主ゲノムへのin vivo転位させるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのトランスポゼースの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、転位可能因子に関する分子生物学の分野に関する。本発明は、より詳しくは、マリナー(mariner)可動遺伝因子の天然トランスポゼース(transposase)の特性における、それらが生物工学に使用できるような改良に適用できる。
【０００２】
本発明の目的は、マリナー可動遺伝因子の突然変異、リン酸化不能、かつ、機能亢進性トランスポゼースである。
本発明はまた、このようなトランスポゼースをコードする組換えヌクレオチド配列にも適用できる。
【０００３】
本発明はまた、これらのトランスポゼースの生産のための方法、およびin vitroまたはin vivo転位のためのそれらの使用に関する。
転位可能因子（ＴＥ）または可動遺伝因子（ＭＧＥ）はある染色体部位から別の染色体部位へ移動し得るＤＮＡの小断片である(Renault et al., 1997)。これらのＤＮＡ断片は離れた５’および３’位に位置する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を特徴とする。ＴＥそれ自体によりコードされる酵素はトランスポゼースであり、これらのＤＮＡ断片の転位工程を触媒する。
【０００４】
ＴＥは原核生物および真核生物の双方で同定されている（本課題についての書籍Craig et al., 2002参照）。
ＴＥはそれらの転位機構によって２つのクラスに分類される。第一に、クラスＩ因子またはレトロトランスポゾンはＲＮＡが介在する逆転写により転位する。第二に、クラスII因子は、「カット・アンド・ペースト」型の機構を用い、中間体のＤＮＡを介してある染色体部位から別の染色体部位へと直接転位する。
【０００５】
原核生物では、これまでに多数のＴＥが網羅されている。例えば、それらにはＩＳ１などの挿入配列、およびＴｎ５などのトランスポゾンが含まれる。
真核生物では、クラスII因子に５つのファミリー、すなわち、Ｐ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ｈＡＴ、ヘリトロン(helitron)およびＴｃ１−マリナー(マリナー)が含まれる。
【０００６】
マリナー様可動遺伝因子（ＭＬＥ）は、Ｔｃ１−マリナースーパーファミリーに属する大きな群のクラスII  ＴＥを形成している。(Plasterk et al., 1999)。
ＴＥトランスポゼースの、目的の配列を含む多様な長さの同種または異種ＤＮＡ断片を可動化し、それらを標的核酸に、特に宿主の染色体に挿入する能力は生物工学分野で、また特に遺伝子工学分野で用いられて来、なお広く用いられている。
【０００７】
ＴＥの中でも、ＭＬＥは生物工学、特に遺伝子工学および機能的ゲノミクスで用いるのに特に有利な特性を有する。例えば、限定されるものではないが、以下の特性が挙げられる。
（ｉ）ＭＬＥは小さなトランスポゾンであり、取り扱いが容易である。
（ii）ＭＬＥの転位機構は簡単である。トランスポゼースだけでこのＭＬＥ転位法に関与する総ての工程を触媒することができる。さらに、これは宿主因子の不在下でＭＬＥの移動度を評価するのに必要かつ十分である(Lampe et al., 1996)。
（iii）ＭＬＥは原核生物および真核生物に偏在することを特徴とする。最初のＭＬＥはＭｏｓ−１とも呼ばれ、Jacobson and Hartl (1985)によりモーリシャスショウジョウバエ(Drosophila mauritiana)で発見された。その後、特に原虫、真菌、植物、無脊椎動物、冷血脊椎動物および哺乳類に属するゲノムにおいて多くの関連因子が同定された。
（iv）ＭＬＥの転位活性は特異性が高く、メチル化による[ＭＩＰ; Jeong et al. (2002); Martienssen and Colot (2001)]  またはＲＮＡを介する[ＲＮＡｉ; Ketting et al. (1999); Tabara et al. (1999)]干渉現象などの宿主ゲノムの「耐性」機構を刺激しない。転位事象は温度やｐＨなどの種々の因子によって制御することができる。
【０００８】
その結果として、生物工学、特に遺伝子組換えツールとしてＭＬＥの可能性のある適用は多くある。
しかしながらやはり、天然ＭＬＥの転位効率は他のＴＥの効率に比べて依然として低いままである。特に、ＭＬＥは、クラスII  ＭＧＥ以外は、真核生物で活性が低いことが明らかである。実際、製造業者にとって、また、研究従事者にとっては、操作数、ならびに必要な転位を行うのにかかる時間およびコストを軽減するために効率的なトランスポゼースを持つことが重要であるので、これまでのところ天然ＭＬＥの実施上の利点は限られたものであった。
【０００９】
本発明は、ＭＬＥトランスポゼースの利点から利益を得、かつ、それらの欠点を克服するとともに、これらの必要を満たすことができる。
本発明は、ＭＬＥトランスポゼースが真核生物において翻訳後修飾の手段によってリン酸化されるということを証明するものである（以下の実施例の節参照）。これらの翻訳後修飾は２つの作用を持ち、第一に、それらはＤＮＡに対するトランスポゼースの親和性を引き下げ、第二に、それらはこれらの酵素のコンホメーション的活性化を制限する。最終的な結果として、真核生物において転位を触媒するリン酸化トランスポゼースの能力が低くなる。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、ＭＬＥトランスポゼースの転位特性を向上させるために、単離された突然変異誘発によりこれらの酵素の１つまたは数個のリン酸化部位を除去することである。
【００１１】
第一の態様によれば、本発明の目的は、ＭＬＥの突然変異、機能亢進性トランスポゼースである。
第一の実施形態によれば、このようなトランスポゼースは、少なくとも１つのリン酸化部位における少なくとも１つのリン酸化可能残基の保存的置換による少なくとも１つの突然変異を有し、前記保存的置換はin vivoにおいて前記部位をリン酸化不能にする。
従って、本発明の突然変異、機能亢進性トランスポゼースは少なくとも部分的にリン酸化不能である。本明細書の他の部分で、このようなトランスポゼースは「突然変異、リン酸化不能、かつ機能亢進性」であると記載される。
【００１２】
本明細書の目的では、「機能亢進性」トランスポゼースとは、真核生物において転位効率が１０倍以上、好ましくは約２５倍以上、いっそう好ましくは約５０倍以上、理想的には約１００倍以上高められるトランスポゼースを意味する。
【００１３】
特に、本発明のトランスポゼースは、特異的および非特異的ＤＮＡ結合、二量体化、ＤＮＡ鎖の転移、およびエンドヌクレアーゼおよび核インターナリゼーション特性に関して「機能亢進性」である（下記の図２参照）。
【００１４】
従って、これに関しては、「トランスポゼースの機能亢進性」とは、このトランスポゼースの生物学的特性（または機能もしくは活性）が改良または増強されていることを意味する。
上述の活性の各々は、本転位法の使用に際して必要ではあるが、制限がある場合がある。特に、これらの活性の各々は真核生物において翻訳前リン酸化によって調節され得る。
【００１５】
「ＤＮＡ結合」はＭＬＥトランスポゼースによる３つのＤＮＡ認識機構を含む。トランスポゼースはそれらのＮ末端ドメインにより、非特異的に（第一の機構）またはＩＴＲを介して特異的に（第二の機構）ＤＮＡと結合する。これらの２つの結合様式はＮ末端ドメインのコンホメーション状態に依存する。トランスポゼースがトランスポゾンの切り出し直後に接合複合体(synaptic complex)（この複合体は、切り出されたトランスポゾンにＩＴＲによって結合されている少なくとも１つのトランスポゼース二量体を含む）に捕捉される場合、それらは、標的ＤＮＡの挿入部位を認識する第三の機構を用いて、そのＤＮＡと結合することができる。
【００１６】
ＭＬＥトランスポゼースは２つの方法を用いて自己会合することができる（本発明の文脈では「二量体化」特性）。それらはＩＴＲと特異的に結合した場合に二量体化できる（ホモ二量体）。また、それらは不活性型のコンホメーションであり、かつ／または高濃度である場合、ＩＴＲと結合しない場合には、自己オリゴマー化することができる（ホモ二量体またはホモオリゴマー）。Ｍｏｓ−１トランスポゼースでは、Ｔ８８位を含む領域（下記参照）が二量体化に関与することが視されている (個人データ, Zhang et al., 2001)。
【００１７】
「ＤＮＡ鎖転位」活性は、この文献では、ホスホリル−トランスフェラーゼであるＭＬＥトランスポゼースの、これらの断片が切断されると同時にＤＮＡ断片と結合する能力を包含するものと定義されている。
【００１８】
従って、エンドヌクレアーゼ特性は上述の「ＤＮＡ鎖転位」活性と極めて密接に関係している。ＭＬＥトランスポゼースによって提供される切断活性には３つのタイプがあり、すなわち、切り出しの際のトランスポゾンの末端での切断、環状切り出し中間体の線状化、および標的ＤＮＡにおける挿入部位の切断である。
【００１９】
最後に、ＭＬＥトランスポゼースは核インターナリゼーションを可能とする２つの潜在的二連部位を有する。
「活性」、「機能」、「特性」、「生物活性」、「生物学的機能」および「生物学的特性」なる用語および表現は同等のものであり、本発明の技術領域における通常の意味を持つ。本発明の文脈では、関係する活性はトランスポゼースの酵素活性（「トランスポゼース活性」または「トランスポゼース機能」）である。文脈によって、「トランスポゼース活性」なる表現は、一般に、上述のようなＭＬＥトランスポゼースの全酵素活性、またはこれらの活性の１つもしくはいくつかを表す。いずれの場合でも、当業者ならば、文脈からこの表現によって理解される意味を明確かつ疑いなく導き出せる。
【００２０】
本発明によれば、「突然変異」とは、タンパク質配列における１つまたは数個のアミノ酸のヌクレオチド配列における１つまたは数個の塩基の置換を表す。より詳しくは、本明細書の目的では、「突然変異」とは、ＭＬＥトランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つのコドン塩基の置換を表すものと理解すべきであり、該置換は関連のヌクレオチド配列の翻訳の際に、その位置に異なるアミノ酸（リン酸化不能）の組み込みをもたらし、結果として生じたタンパク質配列において天然（リン酸化可能）アミノ酸が置き換わっている。
【００２１】
本発明の置換による突然変異は「保存的」でなえればならず、すなわち、制御されないＭＬＥトランスポゼースの１つまたはいくつかの酵素活性を保存する、好ましくは向上させる非無作為的解決策でなければならない。本発明の「保存的」置換はＭＬＥトランスポゼースの全酵素活性を向上させるものであることが好ましい。これは、特に、置換によって突然変異が導入されたにもかかわらず、ＭＬＥトランスポゼースの全体的な三次元構造が保存されている場合に可能である。当業者ならば、タンパク質（この場合、トランスポゼース）の三次元構造を保存し、かつ、その生物活性を向上させるには、どのアミノ酸置換が適当であって、どの置換を避けるべきかが、一般知識をもって分かるであろう。
特に、当業者ならば、可能性のある保存的置換を示す下表１を参照することができるであろう。
【００２２】
表１
天然残基                保存的置換
Ａｌａ（Ａ）        Ｇｌｙ；Ｓｅｒ
Ａｒｇ（Ｒ）            Ｌｙｓ
Ａｓｎ（Ｎ）        Ｇｉｎ；Ｈｉｓ
Ｃｙｓ（Ｃ）        Ｓｅｒ；天然アミノ酸
Ｇｌｎ（Ｑ）            Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ）            Ａｓｐ
Ｇｌｙ（Ｇ）        Ａｌａ；Ｐｒｏ
Ｈｉｓ（Ｈ）        Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ（Ｉ）        Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ（Ｌ）        Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ（Ｋ）        Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ（Ｍ）        Ｌｅｕ；Ｔｙｒ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ（Ｆ）        Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ（Ｓ）            Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ）            Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ）            Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ）        Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ（Ｖ）        Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
【００２３】
リン酸化部位に対して行われる突然変異誘発の場合、例えばそれらが次のようにして起こるならば、その置換はタンパク質活性の全部または一部を保存し得る：セリンまたはトレオニンの、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、チロシンまたはアルギニンによる置換（優先順）。本文脈で適当な保存的置換は、置換残基として特にセリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを用いることはできない。
【００２４】
経験的に、または上記表１で例示される保存的置換から適当な他の溶液を判定することも可能である。
本発明の文脈において、「リン酸化部位」は特に、依存的ＡＭＰｃ、ＧＭＰｃタンパク質キナーゼによる、またはタンパク質キナーゼＣによる、またはカゼインキナーゼIIによるリン酸化部位であってよい。また、それは、例えば下表１に示されているような当業者に公知の共通パターン(PROSITE patterns banks: http:/www.infobiogen.fr)に相当する推定リン酸化部位からなってもよい。PROSITEには存在しないが、ＡＴＭキナーゼによりリン酸化可能な４つのジペプチドＱＳ、ＱＴ、ＳＱおよびＴＱに相当する短い部位も「推定リン酸化部位」として考慮される(Kastan et al., 2000; Kastan et al., 2001)。
【００２５】
さらに、本発明の対象となるリン酸化部位は少なくとも２つのＭＬＥトランスポゼースを介して保存され得る。この場合、それらは少なくとも２つのＭＬＥトランスポゼースのタンパク質配列のアライメントにより証明することができる。例えば、これら配列のうちの１つがＭｏｓ−１トランスポゼース配列であってよい（受託番号ＤＳ３６８７７としてＥＭＢＬデータバンクに寄託されているＭＬＥトランスポゼースの配列アライメントを参照）。本明細書では、このようにして整列させた２つの異なるタンパク質配列の残基を「対応する残基」と呼ぶ。配列番号２の配列（トランスポゼースＭｏｓ−１の配列）とは異なるマリナーＭＧＥトランスポゼースの配列において突然変異可能であったリン酸化可能残基の同定を容易にするため、本発明ではこれらの残基を「配列番号２の配列とともに整列させた前記マリナーＭＧＥトランスポゼースの配列に対する残基」として同定した。
【００２６】
このように、保存的置換によって突然変異可能なリン酸化可能残基は、
配列番号２３の配列中の以下の残基：Ｔ１１；Ｔ２４；Ｓ２８；Ｔ４２；Ｔ８８；Ｓ９９；Ｓ１０４；Ｔ１３５；Ｓ１４７；Ｔ１５４；Ｓ１７０；Ｔ１８１；Ｓ２００；Ｔ２１６；Ｔ２５５；およびＳ３０５、または
配列番号２の配列とともに整列させたマリナーＭＧＥトランスポゼースの配列中の対応する残基であって、
セリン；および
トレオニン
の中から選択される対応残基の中から選択される。
【００２７】
第二の実施形態によれば、本発明のトランスポゼースは、各リン酸化部位における少なくとも１つのリン酸化可能残基の保存的置換による少なくとも１つの突然変異を有し、前記保存的置換はin vivoにおいて各部位をリン酸化不能にする。
【００２８】
第三の実施形態によれば、本発明のトランスポゼースは、保存的置換による突然変異の標的として用いられる前記リン酸化可能残基がリン酸化不能残基により置換されているものである。
【００２９】
第四の実施形態によれば、本発明の突然変異、リン酸化不能、機能亢進性トランスポゼースはモーリシャスサブファミリーに属するＭＬＥに起源するものである。
本発明の対象となる「ＭＬＥ」は、それらの間に少なくとも５０％、好ましくは７５％、いっそう好ましくは８０％、理想的には少なくとも９０％に相当する配列類似性を有する。あるいは、本発明のＭＬＥは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、いっそう好ましくは少なくとも９５％、理想的には少なくとも９８％の配列類似性を有する。従って、対象とするＭＬＥは、その全長において少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、いっそう好ましくは少なくとも８０％、理想的には少なくとも９０％の同一塩基を有する。あるいは、これらのＭＬＥは、それらの全長において、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、いっそう好ましくは少なくとも９５％、または理想的には少なくとも９８％の同一塩基を有する。これらの同一塩基は完全に保存されていてもよいし、あるいは部分的にしか保存されていなくてもよい。従って、考えられるＭＬＥは同じ長さである場合もあるし、それらの配列が１個または数個の塩基の欠失または挿入を含んでいれば異なる長さの場合もある。
【００３０】
「モーリシャスサブファミリー」は、トランスポゼースが、それらの全長にわたって、またはそのＮ末端またはＣ末端領域をコードする領域だけにおいて十分、言い換えれば少なくとも７５％類似している配列によってコードされているＭＬＥを含むことから、１０００個の部分サンプル（１０００個の「ブーツトラップ(bootstrap)」部分サンプル）からなるデータセットに対する節約(parsimony)法および「近隣結合(Neighbour-Joining)」法を用いて行う系統発生学的研究に際して、以下の４つの配列と同じアライメントで同定できる[Felsenstein (1993) and Auge-Gouillou et al. (2000)参照]：
Ｍｏｓ−１トランスポゼース（配列番号２，ＥＭＢＬ受託番号Ｘ７８９０６）；
コムギタマバエ(Mayetiola destructor) Ｍｄｍａｒ−１トランスポゼース（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ２４４３６）；
セイヨウオオマルハナバチ(Bombus terrestris)Ｂｔｍａｒ−１トランスポゼース（ＥＭＢＬ受託番号ＤＳ３６８７７のアライメントにおける配列番号３）、および
メタセウイリウス・オシデンタリス(Metaseuilius occidentalis)Ｍｏｍａｒ−１トランスポゼース（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ１２２７９）。
【００３１】
第五の実施形態によれば、本発明の突然変異、リン酸化不能、機能亢進性トランスポゼースはＭｏｓ−１  ＭＬＥに起源するものである。
特に、ｍｏｓ−１  ＭＬＥに起源する１つの突然変異、リン酸化不能、機能亢進性突然変異体では、以下の残基（配列番号２の配列を参照して）：Ｔ１１；Ｔ２４；Ｓ２８；Ｔ４２；Ｔ８８；Ｓ９９；Ｓ１０４；Ｔ１３５；Ｓ１４７；Ｔ１５４；Ｓ１７０；Ｔ１８１；Ｓ２００；Ｔ２１６；Ｔ２５５およびＳ３０５のうち１個または数個のリン酸化可能残基がリン酸化不能残基により置換されている。
【００３２】
有利には、このようなトランスポゼースの少なくともＴ８８リン酸化可能残基、あるいはまた、少なくともＳ１０４リン酸化可能残基がリン酸化不能残基により置換されている。特には、少なくともＴ８８残基とＳ１０４残基がリン酸化不能残基により置換されている。
第二の態様によれば、本発明は、上記のようなトランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の組換えに関する。
【００３３】
本発明の「ヌクレオチド配列」または「核酸」は、生物学の分野で通常受け取られている意味に従う。これら２つの表現はＤＮＡおよびＲＮＡに関わらず、ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換えＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であり得る。本発明において好ましくは、ヌクレオチド配列および核酸はＤＮＡである。
【００３４】
第三の態様によれば、本発明は本発明のトランスポゼースをコードする、少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクターに関する。
このような組換えベクターを用いて、前記組換えヌクレオチド配列を発現させることができれば有利である。
【００３５】
第四の態様によれば、本発明の目的は、上記のような少なくとも１つの組換えベクターを担持する組換え宿主細胞である。
この場合、ＭＬＥは宿主の制限を持たないので、本発明の組換え宿主細胞は真核生物起源であっても原核生物起源であってもよい。
【００３６】
例えば、限定されるものではないが、それは酵母、真菌、植物、昆虫（例えばショウジョウバエ）、齧歯類または哺乳類（例えばウサギ）起源の真核細胞であってもよい。
あるいは、本発明の使用に好適な細胞は細菌起源のものであってもよい（例えば、大腸菌(Escherichia coli)）。
第五の態様によれば、本発明は、上記のような突然変異、リン酸化不能、機能亢進性トランスポゼースの生産のための方法に関する。
【００３７】
第一の実施形態によれば、本発明に従う方法は、
ａ）発現ベクター中に、突然変異、リン酸化不能、機能亢進性トランスポゼースをコードする組換えヌクレオチド配列をクローニングすること；
ｂ）宿主細胞を前記組換え発現ベクターで形質転換すること；および
ｃ）前記組換え宿主細胞により前記ヌクレオチド配列を発現させること
を含む。
【００３８】
このような方法に関して用いられる総ての工程は当業者に公知の常法が用いられる（例えば、Sambrook and Russel, 2001参照）。
特に、この場合の「形質転換」とは、この用語の厳密な意味の形質転換とは異なり、ウイルスベクターによる形質導入およびトランスフェクション（総て、当業者にとっては慣例の分子生物学的技術である）も含むという点で、包括的な意味を有する。
【００３９】
第二の実施形態によれば、このような方法はまた、対応する天然トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列において、リン酸化可能残基をコードするトリプレットまたはコドンの少なくとも１つのヌクレオチドを、結果として得られるトリプレットがリン酸化不能残基をコードするように、別のヌクレオチドにより置換することにより前記組換えヌクレオチド配列を得るための前工程も含む。この前工程は、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発技術に由来するものである(Ausubel et al., 1994)。
【００４０】
本発明の方法の第三の実施形態によれば、前記トランスポゼースを精製するための後工程が行われる。
好ましくは、本発明によれば、上記の精製工程は、酵素自体ではなく、必要な酵素活性を有するタンパク質画分を精製するための当業者に公知の常法の使用からなる。このようにして精製された、この活性タンパク質画分を、本明細書では「純粋な酵素」または「純粋なトランスポゼース」と呼ぶ。この定義によると、この工程の終了時に、目的のトランスポゼースの活性が保存されており、かつ、この活性のみを検出できる限り、他のタンパク質をはじめとする夾雑物質が少量存在しても許容される。目的の酵素活性は当業者に公知の常法を用いて検出することができる(Ausubel et al., 1994)。
【００４１】
上記のような方法を実施する際、宿主細胞は、例えば細菌などの原核細胞、ならびに例えば酵母、真菌、植物、昆虫および哺乳類などの真核細胞の中から選択される。
第六の態様によれば、本発明は、生物工学分野における、上記のような少なくとも１つの突然変異、リン酸化不能、機能亢進性トランスポゼースの使用に関する。
【００４２】
第一の実施形態によれば、このようなトランスポゼースは、目的の転位可能なＤＮＡ配列の、標的ＤＮＡ配列へのin vitro転位のために用いられる。
第二の実施形態によれば、本発明の方法は、目的の転位可能なＤＮＡ配列の、宿主ゲノムへのin vivo転位のために用いられる。
【００４３】
あるいは、本発明のトランスポゼースは、目的の転位可能なＤＮＡ配列の、宿主ゲノムへのin vivo転位のための薬剤を製造するのに有利であり得る。
in vitroまたはin vivo転位の使用は本発明の分野の熟練者の一般知識いかんによる(Ausubel et al., 1994; Craig et al., 2002)。
【００４４】
本明細書では、「宿主」とは、生物体、真核生物もしくは原核生物、または生物体の組織、または生物体もしくは組織の細胞であると理解すべきである。
以下に記載の実験の節は実施例および図面をもとにし、本発明の非限定的な例を示す。
【００４５】
１．材料および方法
１．１．使用ベクターの説明
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐベクター（５．６ｋｂ）は、アラビノースで誘導可能（パラ）であり、かつ、ＡｒａＣタンパク質（このベクターによりコードされている）の手段によってグルコースの存在下で抑制される、弱い、調節可能なプロモーターの制御下でトランスポゼースの発現が可能である。ＰＢａｄＲ−Ｔｎｐはアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。その構築については、以下の第１．２．１節に詳しく示す。
【００４６】
ｐＫＫ−Ｔｎｐベクター（５．６ｋｂ）は、ＩＰＴＧにより誘導可能なＰｌａｃプロモーターを介してトランスポゼースを強く発現させることができる。このプロモーターは調節できず、天然の発現による漏れを有する。ＰＫＫ−Ｔｎｐはまた、アンピシリン耐性遺伝子も含んでいる。このベクターの構築については、以下の第１．１．２節で示す。
ｐＢＣ  ３Ｋ３は偽マリナーＭｏｓ−１のプラスミドドナーである(Auge-Gouillou et al. 2001)。これは２つのＩＴＲ  ３’の挟まれた「ＯＦＦ」型（言い換えれば、プロモーターを含まない）カナマイシン耐性遺伝子を含む。よって、プロモーターの下流で偽トランスポゾンの転位が起こった細菌だけが（プロモーターの「タグ付け」）ＬＢカナマイシンボックスで選択される。このベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。
【００４７】
ｐＢＳ（３’）はｐＢＳ(Stratagene, La Jolla, California, United State)のＳｍａｌ部位にクローニングされたＩＴＲ  ３’を含む。このｐＢＳは、クロラムフェニコール耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有すること以外はｐＢＳと同一である。
【００４８】
ｐＥＴ−Ｔｎｐベクター（６．４ｋｂ）(Auge-Gouillou et al., 2001)はＴ７プロモーターの制御下でトランスポゼースをコードし、カナマイシン耐性遺伝子を有する。このベクターを、真核生物トランスポゼースを生産することを目的に、溶解物中での網状赤血球のin vitro転写／翻訳のためのＤＮＡ源として用いた。下記のリン酸化試験において原核生物トランスポゼースを産生させるために、ＩＰＴＧで誘導可能なＰｌａｃの制御下でポリメラーゼＴ７をコードするＢＬ２１細菌をｐＥＴ−Ｔｎｐで形質転換した。
【００４９】
ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ−Ｅａｓｙベクター(Promega, Charbonnieres, France)はＰｕおよびｐＲｅｖシーケンシングプライマー(Ausubel et al., 1994)とアンピシリン耐性遺伝子を有する。これを、ＩＰＴＧとＸ−Ｇａｌの存在下でＬＢアンピシリンボックス上で得られる細菌コロニーの白色／青色スクリーニングを可能とする、ＬａｃＺ遺伝子のＰＣＲ産物をクローニングするようにデザインする。これを用いてｐＧＥＭ−Ｔ（Ｔｎｐ）(Auge-Gouillou et al., 2001)およびｐＧＥＭ−Ｔ（Ｌ２７）が得られている。その構築については以下の第１．２．３．節で詳細に記載する。
【００５０】
１．２．ベクターの構築
１．２．１．ベクターＤＮＡの調製
種々の構築に関して、アガロースゲルから始めるＤＮＡ溶出は総て、ジーンクリーン(Geneclean)IIキット(BIO 101, UK)を用いて行った。細菌培養物からのプラスミドの微量調製は総て、ミニプレップス・プラス・ウィザード(Minipreps Plus Wizard)キット(Promega)を用いて行った。
【００５１】
１．２．２．ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ
ｐＢａｄＲ−ＴｎｐはｐＢａｄ１８から次の二工程で得られた。
ＲＢＳ（リボソーム結合部位）のクローニング
ｐＢａｄ  １８におけるＲＢＳのクローニングは以下の配列を再構築する：
５’  ＧＡＡＧＧＡＧＴＡｃｃｃｇｇｇＧＡＴＣ  ３’（配列番号３）。
【００５２】
この配列は、トランスポゼースをコードする遺伝子がＳｍａｌ部位にクローニングされている場合には、翻訳開始コンセンサス部位に相当する（小文字で示す）。ＲＢＳは非リン酸化オリゴヌクレオチドに相補的な二本の一本鎖の形態で購入した。この二本の鎖が対合すると、以下の配列が再構築される：
５’  ＡＡＴＴＣ  ＧＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＴＡＣ  ３’（配列番号４）
３’  Ｇ  ＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＣＴ  ５’        （配列番号５）
５’突出末端はＥｃｏＲＩ部位に相当し、３’突出末端は、ｐＢａｄ１８中へのＲＢＳのクローニングに用いられるＫｐｎｌ部位に相当する。この配列はまた、対照クローニングに使用できるユニークなＥｃｏＲＶ部位（斜体）も提供する。
【００５３】
この２つの対合鎖をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England BioLabs, Beverly, MA United States)でリン酸化させた。ｐＢａｄプラスミド１８をＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩで消化した後、脱リン酸化した。次に、ＲＢＳ（１５ｎｇ）を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ(Promega)の存在下で、１６℃にて一晩、プラスミド（２５ｎｇ）と連結させ、ｐＢａｄＲを得た。コンピテント菌である大腸菌ＭＣ１０６１（アラビノースの能動輸送を行わない株）を、そのＬＢボックスにて、ｐＢＡＤＲで形質転換した（５ｇのＮａＣｌ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのトリプトン、０．３ｍｌの１０Ｎ  ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏで１リットルとする／アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）。１２のアンピシリン耐性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを抽出し、そのプラスミドをＥｃｏＲＶ消化により分析した。これらのプラスミドＤＮＡを、Perkin Elmer Biosystems (Courtaboeuf, France)による「ＤＮＡシーケンシングキット」を用いて配列決定し、どのプラスミドが単一のＲＢＳを組み込んでいるかを確認するため、Ｌｉｃｏｒ型モノレーザー自動シーケンサー(Science Tec, Pare d’Innovations des Ulysses, France)で分析した。次に、単一のＲＢＳを含有するプラスミドを用いて、トランスポゼースをコードする遺伝子をクローニングした。
トランスポゼースをコードする遺伝子のクローニング
【００５４】
トランスポゼース（Ｔｎｐ）をコードする断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｔｎｐ）ベクターから、ＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により作製し、０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ１×：０．０４Ｍ酢酸  Ｔｒｉｓ酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）にて溶離させた。事前に得られているｐＢａｄＲプラスミドをＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。アガロースゲルでの電気泳動後、プラスミドＤＮＡを溶出させ、その後、Ｍｏｓ−１トランスポゼース（本実験の節ではＴｎｐと呼ぶ）をコードする断片と、ベクター２５ｎｇに対して断片２５ｎｇで連結させた。この連結産物を用いて大腸菌ＭＣ１０６１菌を形質転換し、その後、これをＬＢ−アンピシリンボックス（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した。１２のアンピシリン耐性クローンを、プラスミドの抽出のために培養した。それらがトランスポゼースをコードする遺伝子を含んでいるかどうかを確認するため、このＤＮＡの微量調製物を、ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化、その後の０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １×）での電気泳動により調べた。
【００５５】
１．２．３．ｐＫＫ−Ｔｎｐ：
マリナーＭｏｓ−１トランスポゼース（Ｔｎｐ）をコードする断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｔｎｐ）からＮｃｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により作製し、ゲル上で溶離させた。これをｐＫＫ−２３３−２ベクター(Clontech, Ozyne, Saint-Quentin-en-Yvelines, France)と連結し、同じ酵素により、Ｔｎｐ断片４０ｎｇに対してベクター内容物１０ｎｇにて開環させ、ｐＫＫ−Ｔｎｐを得た。ＭＣ１０６１菌をこのｐＫＫ−Ｔｎｐ発現ベクターで形質転換し、ＬＢ−アンピシリンボックス（１００μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭのＣａＣｌ２上に広げ、４２℃に置き、トランスポゼースの細胞傷害作用を制限した。プラスミドの抽出のため、６つのアンピシリン耐性クローンを同じ条件下で培養した。それらがトランスポゼースをコードする遺伝子を組み込んでいるかどうかを確認するため、このＤＮＡの微量調製物を、０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １×）でのＮｃｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により制御した。
【００５６】
１．２．４．Ｌ２７プローブのクローニング
大腸菌のＬ２７リボゾームタンパク質をコードする遺伝子の配列を、Ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎのサイト(www.infobiogen.fr)で得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりこの遺伝子を増幅させるため、配列番号６および配列番号７のプライマーを、ＯＬＩＧＯＶ２ソフトウエアを用いて得た後、一本鎖オリゴヌクレオチドの形態で整えた。
配列番号６：５’−ＡＴＧＧＣＡＣＡＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＧ−３’
配列番号７：５’−ＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＣＴ−３’
【００５７】
このＬ２７遺伝子を、大腸菌ゲノムＤＮＡから始め、ＰＣＲ技術を用いて増幅させた。増幅産物を０．８％アガロースゲルでの電気泳動後に溶出させ、その後、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに連結した後、クローニングした。コンピテンと大腸菌（ＤＨ５α）を連結混合物で形質転換した後、Ｘ−Ｇａｌ（２％）およびＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含有するＬＢ−アンピシリンボックス（１００μｇ／ｍｌ）上に広げた。その後、２つの白色のアンピシリン耐性クローンを、プラスミドの抽出のために培養した。ＥｃｏＲＩ消化および０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １×）での電気泳動によりクローニングを確認した後、このプラスミドを、「ＤＮＡシーケンシングキット」(Perkin Elmer Biosystems)を用いて配列決定し、マーキングの前の配列が保存されているかどうかを確認するために、Ｌｉｃｏｒ型自動モノレーザーシーケンサーで分析した。
【００５８】
１．２．５．Ｌ２７およびＴｎｐプローブのマーキング
Ｌ２７プローブを、ＡＴＰ−γ３２Ｐの存在下、ｐＵおよびｐＲｅｖプライマー（クローニング部位を囲む[Ausubel et al., 1994]）を用いたｐＧＥＭ−Ｔ（Ｌ２７）マトリックスからの放射性ＰＣＲによりマーキングした。マーキングされたプローブを、セファデックスＧ５０カラム（ＴＥ  １×：１０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより遊離ｄＮＴＰから分離した。このカラムを２００μｌ画分まで洗浄し、プローブをＭＩＰカウンター１０(Eurisys:Mesures, Saint-Quentin-en-Yvelines, France)でマーキングした。
【００５９】
このＴｎｐプローブを、「ランダムプライミング」技術、言い換えれば、ランダムヘキサマーの対合後のＤＮＡの合成、を用いてマーキングした。ＡＴＰ−γ３２Ｐの存在下、ポリメラーゼＤＮＡのクレノウ断片を用いて伸張を行った。セファデックスＧ５０カラム（ＴＥ  １×）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、このプローブを溶出させた。
【００６０】
１．３．トランスポゼースをコードするベクターを含有する細菌の誘導
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐを用いる場合：            ｐＫＫ−Ｔｎｐを用いる場合：
１％グルコース                              対照（ＩＰＴＧを含まない）
対照（０％グルコース、０％アラビノース）    ０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ
０．００１％アラビノース                    １ｍＭ  ＩＰＴＧ
０．０１％アラビノース                      ３ｍＭ  ＩＰＴＧ
０．１％アラビノース                        ６ｍＭ  ＩＰＴＧ
１％アラビノース
【００６１】
誘導プロトコール：
目的のベクター（ｐＢａｄＲ−ＴｎｐまたはｐＫＫ５−Ｔｎｐ）を含有する大腸菌ＭＣ１０６１の飽和培養物から始め、５０ｍｌのＬＢを１／１００となるように播種し、ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐの場合には１％グルコース（パラ阻害剤）の存在下で攪拌しながら（２５０ｒｐｍ）３１℃で３時間培養した。次に、この培養物を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、洗浄してグルコースを除去するため、この残渣を２．５ｍｌのＬＢに溶解した。同じ処理をｐＰＫＫ−Ｔｎｐを含有する細菌にも適用した。
【００６２】
培養試験管（上記の条件に従ってアラビノースまたはＩＰＴＧを含有する２．５ｍｌのＬＢ）を容量／容量で播種し、３１℃で３時間培養した（最終量５ｍｌ）。３時間後、タンパク質およびｍＲＮＡを抽出した。Ｔｎｐを含まないＲＮＡおよびタンパク質を作製するため、ｐＢａｄＲおよびｐＫＫプラスミドを含まない細菌にも同様のプロトコールを行った（陰性対照）。
【００６３】
１．４．ｍＲＮＡの分析
１．４．１．細菌ＲＮＡの抽出
分解を避けるためにＲＮアーゼの不在下、４℃でｍＲＮＡを抽出した。
誘導後、この細菌培養物を４℃、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、沈降物を「プロトプラスト調製バッファー」（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１５％スクロース、８ｍＭ  ＥＤＴＡ）５ｍｌに溶解した。リゾチーム（５０ｍｇ／ｍｌ）４０μｌを加え、混合物を氷中で３０分間インキュベートした。４℃、６０００ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し、沈降物を２５０μｌの溶解バッファー（１．５％ＳＤＳ、１ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）に溶解した。
【００６４】
この溶解物を１．５ｍｌ容の試験管に移し、７．５μｌのＤＥＰＣを加え、その後、この混合物を３７℃で５分間インキュベートした。これらの試験管を氷中で冷却し、１／２容の飽和ＮａＣｌ溶液とともに転倒せることで混合した。氷中で１０分間インキュベートした後、これらの試験管を１２０００ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清を１．５ｍｌ容の試験管に移し、３倍容の冷１００％エタノール（ＥｔＯＨ）で核酸を沈殿させた。これらの試験管を−８０℃で３０分間、または−２０℃で１６時間置いた。次に、これらの試験管を４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離した。
【００６５】
上清を除去し、沈降物を５００μｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄した後、乾燥させた。この沈降物（３０μｌのＨ２Ｏ  ＤＥＰＣに溶解）に、３７℃で１時間半、Ｄｎａｓｅｌを作用させた。フェノール−クロロホルム抽出および沈殿の後、ＲＮＡ沈降物を洗浄し、乾燥させ、その後、５０μｌのＨ２Ｏ  ＤＥＰＣに溶解させた。サンプル５μｌを用いて０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １×）で抽出品質を確認した。抽出したＲＮＡは−８０℃で保存した。
【００６６】
１．４．２．ＲＮＡの分析
全ＲＮＡ量を蛍光分光光度計を用いて分析した。
各抽出物を５００μｌの水でほぼ１００倍希釈した。２６０ｎｍ（核酸の最大吸収波長）および２８０ｎｍ（チロシンなどのアミノ酸の吸収波長）で吸光度を測定した。この２６０ｎＭ吸収と２８０ｎＭ吸収の比が１．８〜２．１の間であれば、１ｍｌ中、２６０ｎｍの吸光度測定値に対して４０μｇの割合で抽出されたｍＲＮＡの全量が定量できたことになる。
トランスポゼースｍＲＮＡを定量するため、一定量の全ＲＮＡ（ＲＮＡ対照として、これらの実験を通じて量が変わらないＬ２７リボゾームタンパク質をコードするＲＮＡを用いて算出）をハイブリダイズメンブランに置いた。熱定着後（８０℃で１５分）、Ｃｈｕｒｃｈバッファー（７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．２）とプレハイブリダイズさせ、６５℃で１時間膜を飽和させることにより非特異的ハイブリダイゼーションを制限した。
【００６７】
Ｌ２７対照プローブとのハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーションバッファーを、Ｌ２７でマーキングしたプローブ６０００ｈｐｍ(hits per minute)を加えた「Ｃｈｕｒｃｈ」バッファーに交換した。このメンブランを６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。次に、このメンブランを、３×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）／０．１％ＳＤＳ、次いで、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳバッファーで１時間洗浄した。Ｌ２７  ｍＲＮＡの存在を検出し、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｍａｇｅｒ(Packard, United states)を用いてｈｐｍとして定量した。各付着物に対し一定量のＬ２７  ｍＲＮＡにおいて、一定量の全ＲＮＡが含まれていることを確認しなければならない。そうでなければ、Ｔｎｐ  ｍＲＮＡ量が採取可能でなければならない。
【００６８】
次に、このメンブランを沸点にした１％ＳＤＳ溶液で３回すすぐことにより、ハイブリダイゼーションを解いた。次に、このメンブランを、次のハイブリダイゼーションまで。６５℃で１時間再び１度プレハイブリダイズさせた。
【００６９】
Ｔｎｐプローブとのハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーションバッファーを、６０００ｈｐｍのＴｎｐプローブを加えた「Ｃｈｕｒｃｈ」バッファーに交換した。メンブランを６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。次に、このメンブランを、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳバッファー、次いで、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳバッファーで１時間すすいだ。Ｔｎｐ  ｍＲＮＡの存在をＤｉｒｅｃｔ  Ｉｍａｇｅｒで検出し、付着物中のＴｎｐ  ｍＲＮＡの存在量をｈｐｍで表した。
【００７０】
１．５．タンパク質の分析
１．５．１．タンパク質の抽出
細菌に対して用いた誘導プロトコールはｍＲＮＡ抽出に用いたものと同じであった。培養物を４℃、１２０００ｇで１０分間遠心分離した。細菌沈降物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９、１００ｍＭ  Ｎａｃｌ、１ｍＭ  ＤＴＴバッファー５００μｌに溶解し、−２０℃で一晩維持した。音波処理（２５Ｗで１  ３０ｓ「パルス」）および４℃、１００００ｇで１５分間遠心分離した後、タンパク質上清をサンプリングし、次に、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析により、一定濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と比較して定量した。分析後、タンパク質抽出物を−２０℃で維持した。
【００７１】
１．５．２．タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：
サンプル調製および電気泳動：
一定量（１２μｇ）のタンパク質を分析した。各抽出物に一定量のロードバッファーを加え、構築物を１００℃で５分間変性させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％アクリルアミドゲル［３７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳ、１０％アクリルアミド（３０：０．８）］に付着させた。５０Ｖで１６時間の電気泳動後、２％Ｈ３ＰＯ４−５０％ＣＨ３ＯＨ溶液中で２〜１２時間、穏やかに攪拌しながらゲルを固定した。
【００７２】
コロイド状クーマシーブルーによるゲルの染色：
ゲルを水中で３０分間３回洗浄した。この工程を２％Ｈ３ＰＯ４溶液を用いて繰り返した。
次に、このゲルを１７％ＣＨ３ＯＨ、２％Ｈ３ＰＯ４および１５％（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液中に１時間置いた。その後、このゲルを、０．２％のコロイド状クーマシーブルーを加えた新鮮な同じ溶液中で一晩染色した。染色されたゲルをスキャナーでデジタル処理した後、乾燥させた。
【００７３】
１．５．３．抽出されたトランスポゼース活性のゲル遅延分析：
この方法は、産生されたタンパク質のＩＴＲ３’結合活性（Ｔｎｐの固定に関して至適化されたＩＴＲ）を試験するために用いた。ＩＴＲ３’は、ＰＢＳプラスミド（３’）から、ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ消化により単離し、ＮｕＳｉｅｖｅ２％アガロースゲル(FMC products, United States)にて精製し、溶出させ、定量した。１００ｎｇのＩＴＲ３’を、ｄＡＴＰの存在下でポリメラーゼＤＭＡのクレノウ断片を用いてマーキングした。フェノール−クロロホルム抽出および沈殿後、沈降物を４０μｌの水に溶解し、ＩＴＲを５０ｎＭ濃度で得た。
【００７４】
５μｇまたは粗抽出物を、マーキングしたＩＴＲ３’とともに、以下の条件：１ｎＭのプローブ、１μｇの音波処理済みサケ精子ＤＮＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％グリセロール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９の下、氷中で１５分間インキュベートした。各サンプルを９％ヒドロリンクゲル(Long Ranger,  TEBU, Le Perray en Yvelines, France)（ＴＢＥ  ０．２５×：２２．２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２２．２５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭ脱水二ナトリウムＥＤＴＡ）上に付着させた。電気泳動後、遅延をＤｉｒｅｃｔ  Ｉｍａｇｅｒ(Packard)で定量し、ゲルを乾燥させた。その後、ゲルのオートラジオグラフを作製した。
【００７５】
１．６．転位試験
誘導条件
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐを用いる場合：    ｐＫＫ−Ｔｎｐを用いる場合：
１％グルコース                      対照
対照                                ０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ
０．００１％アラビノース            １ｍＭ  ＩＰＴＧ
０．０１％アラビノース              ３ｍＭ  ＩＰＴＧ
０．１％アラビノース                ６ｍＭ  ＩＰＴＧ
１％アラビノース                    
転位試験の原理は図３に示されている。
【００７６】
コンピテントＭＣ１０６１菌を、ｐＢＣ  ３Ｋ３プラスミド（転位の偽マリナーリポーターとクロラムフェニコール耐性遺伝子を有する）とｐＢａｄＲ−ＴｎｐまたはｐＫＫ−Ｔｎｐトランスポゼースをコードする誘導ベクター（アンピシリン耐性遺伝子を有する）とで同時形質転換した（図３Ａ）。アンピシリンとクロラムフェニコールで細菌を選択し、２つのプラスミドの存在を確認した。また、ｐＢａｄＲおよびｐＫＫ対照プラスミドでも同時形質転換を行った。
【００７７】
ｐＢＣ３Ｋ３リポーターベクターとトランスポゼースをコードするベクターとを含有する大腸菌ＭＣ１０６１菌を、２．５ｍｌのＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）／５０ｍＭ  ＣａＣｌ２中、４２℃で一晩培養した（トランスポゼースの活性を制限する条件）。この培養物をＬＢボックス（正確なカウントができる溶液１０μｌ）およびＬＢ−カナマイシンボックス（１００μｇ／ｍｌ）で力価測定した（飽和培養５０μｌ）。２．５ｍｌのＬＢ（上記の通りにアラビノースまたはＩＰＴＧを含有する）を１／１００で播種し、３１℃（至適トランスポゼース作用温度）で３時間、２５０ｒｐｍで攪拌しながら培養した（図３Ｂ）。３時間培養した後、培養物をＬＢボックス（菌の力価測定）およびＬＢ−カナマイシンボックス（転位事象の計数）に広げた（図３Ｃ）。これらのボックスを３７℃で一晩置いた。翌日、ＬＢボックスおよびＬＢ−カナマイシンボックスのコロニーを計数した後、細菌総数に対するカナマイシン耐性菌総数に相当する転位頻度を算出した。
【００７８】
１．７．平衡飽和実験における結合：スキャッチャード試験
この試験の原理は、ゲル遅延において平衡飽和実験の結合を用い、ＩＴＲ３’（リガンド）に対する、真核生物系で産生されたトランスポゼースの親和性（Ｋｄ）を判定するというものである。これらの結果はスキャッチャード法を用いて表される。一定量のタンパク質抽出物に対して、そのＫｄ周辺の濃度範囲でマーキングＩＴＲ３’の量を変える。１５分間の氷中でのインキュベーション（ゲル遅延実験と同じ条件下）の後、ＩＴＲ−タンパク質複合体を９％アクリルアミド非変性ゲル(Long Rnger, TEBU)(ＴＢＥ０．２５×)に付着させる。電気泳動および乾燥後、このゲルをＤｉｒｅｃｔ  Ｉｍａｇｅｒ(Packard)を用いて分析した。タンパク質と結合したＩＴＲの量およびＩＴＲの総量をｈｐｍ(hits per minute)で測定した。
【００７９】
解離係数（Ｋｄ）の判定：
トランスポゼース（Ｂ）と結合しているＩＴＲの総量をＩＴＲの存在総量（Ｔ）から差し引き、遊離のＩＴＲ（Ｆ）の量を求めた。Ｂ／Ｆ比を結合したＩＴＲｎＭ（ＢｎＭ）の関数として表し、傾き−１／Ｋｄの直線を得た。
この試験を、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で産生させた融合タンパク質ＭＢＰ−Ｔｎｐ（Ｓ．Ｔｏｕｒｎｅ博士から入手）と、ＰＴＥ−Ｔｎｐベクターを用いてin vitro真核生物転写／翻訳系（TnT（登録商標）T7 Quick Coupled Transcription / Translation System, Promega）で産生させたトランスポゼースとを用いて行った。また、この試験は、３０℃で３０分間、ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化したＴｎｐおよびＭＢＰ−Ｔｎｐ（真核細胞由来）でも行った。
【００８０】
１．８．リン酸化試験
１．８．１．原核生物での試験：
ｐＥＴ−Ｔｎｐベクターを含有するＢＬ２１細菌の前培養物から始め、２５ｍｌのＬＢを、無機リン（ＰｉＰ３３）の存在下、３７℃で３時間、１／１００比で播種した。その後、１ｍＭのＩＰＴＧの存在下、３７℃で３時間トランスポゼースの合成を誘導した。この培養物から抽出したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。５０Ｖにて１６時間の電気泳動の後、ゲルをコロイド状クーマシーブルーで染色した。乾燥後、リン酸化タンパク質を表示するため、このゲルをオートラジオグラフィーのカセットに入れた。
【００８１】
１．８．２．真核生物での試験：
原核生物でこれまでに産生されたものと同じトランスポゼースの合成が可能なin vitro真核生物転写／翻訳系（ウサギ）（TnT（登録商標） T7 Quick coupled Transcription / Translation System, Promega）においてｐＥＴ−Ｔｎｐプラスミドを用いた。この系はタンパク質のリン酸化が可能である。トランスポゼースのリン酸化が、もし起こっていれば、合成の際にＡＴＰ−γ３２Ｐを添加することにより現れるはずである。
【００８２】
０．５〜１μｇのｐＥＴ−Ｔｎｐを、ＡＴＰ−γ３２Ｐの存在下、３０℃で９０分間、４０μｌのＴｎＴ混合物とともにインキュベートした。５μｌの混合物を同量の充填バッファーで変性させた後、１０％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付着させた。電気泳動後、ゲルをコロイド状クーマシーブルーで染色し、その後、乾燥させた。リン酸化されたタンパク質の存在を明らかにするため、このゲルのオートラジオグラフを作製した。
【００８３】
２．結果
マリナーＭｏｓ−１トランスポゾンはＰ因子に比べ、その天然宿主（Ｄ．モーリシャス）において弱い転位活性を有する(Rubin et al, 1982)。真核細胞よりも単純な系でマリナーＭｏｓ−１細菌の転位における全行程を分析できるようにするため、細菌研究モデルを開発した。このモデルにより、２種の３’ＩＴＲを有するＭｏｓ−１因子の転位が、「天然」の構成、言い換えれば、  ＩＴＲ５’とＩＴＲ３’を有する因子の転位よりも１００００倍効率的であることが明らかになった。
【００８４】
この違いは原核生物で見られたが、Ｐ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ博士(University California Riverside)によるショウジョウバエ、およびＳ．Ｔｏｕｒｎｅ博士(Tours University)( personal communications)によるＨｅＬａ細胞で行われた研究によって証明されているように、真核生物では見られない。本明細書において、真核細胞で得られた結果は、２つのマリナー因子（３’／３’および５’／３’）を伴う場合には、極めて弱い転位活性しか示さなかった。
【００８５】
なぜマリナーＭｏｓ−１トランスポゼースは原核生物系では違った挙動をするのかを理解するため、真核生物においてトランスポゼースの活性を制限する段階を特定した。次に、原核生物と真核生物のトランスポゼースの違い（真核生物系でそれが起こる場合には、転位効率の低下が起こる）を決定した。これは、タンパク質の産生とＩＴＲとの結合という２つの初期転位段階を調べることによって行った。最後に、Ｍｏｓ−１トランスポゼースに対する１つの可能性のある調節様式であるリン酸化を試験した。
【００８６】
２．１．トランスポゼースの過剰生産による転位の阻害
Lohe and Hartl (1996)は、マリナーＭｏｓ−１トランスポゼースが過剰発現された際に真核生物における転位頻度が低下することを証明した。この現象は「過剰生産阻害(Over Production Inhibition)を表すＯＰＩと呼ばれる。過剰生産阻害（ＯＰＩ）とは、以下の記載において用いられる。
【００８７】
第一の一連の実験において、細菌系で生産されたトランスポゼースがＯＰＩを受けているかどうかを知る必要があった。
これはマリナーＭｏｓ−１の転位頻度の変動を、その細菌中に存在するトランスポゼースの量の関数として分析するための２つの発現系を用いて行った。ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐベクターは、トランスポゼースがアラビノース（パラ）で誘導可能なプロモーターの制御下にあり、かつ、調節可能、言い換えれば、生産されたタンパク質の量がインデューサーの量に依存する、弱い発現系である。ｐＫＫ−Ｔｎｐは、トランスポゼースがＩＰＴＧ（Ｐｌａｃ）で誘導可能なプロモーターの制御下にあり、かつ、調節できない、強い発現系である。
【００８８】
２．１．１．誘導レベル／ｍＲＮＡの量／トランスポゼースの量の間の相関：
発現ベクターを有効とするために、Ｔｎｐ  ｍＲＮＡとＴｎｐタンパク質の量は誘導条件によく相関していることを確認した。ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐｗｐは、インデューサーの不在下（チェックレベル）、グルコース（パラレプレッサー）および０．００１％〜１％のアラビノース（パラインデューサー）の存在下で培養した。ｐＫＫ−Ｔｎｐは、インデューサーの不在下（対照レベル）、０．５ｍＭ〜６ｍＭの範囲のＩＰＴＧ（Ｐｌａｃインデューサー）の存在下で培養した。
【００８９】
１）ｍＲＮＡの同定
誘導および抽出後、ｍＲＮＡをリボゾームタンパク質の対照プローブＬ２７とハイブリダイズさせて種々の培養条件下で抽出したＲＮＡの量を算出した後、トランスポゼースプローブとハイブリダイズさせてＴｎｐ−ＲＮＡ含量をｈｐｍとして定量した（図４および６）。図５および７では、検出されたＴｎｐ  ｍＲＮＡ量（最大検出量のパーセンテージに換算）を、種々の培養条件（Ｘ軸）の関数として表している（Ｙ軸）。
【００９０】
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ発現系の分析：
トランスポゼースｍＲＮＡは、弱い発現系（ｐＢａｄＲ）においてｐＢａｄＲ対照ベクターを含む細菌には存在しない。しかし、それらはｐＢａｄ−Ｔｎｐ発現ベクターを含む細菌には存在し、アラビノースの不在下、またはグルコースの存在下で最少量のＴｎｐ  ｍＲＮＡが検出され、総ての誘導条件においてより高い量が認められ、０．１％アラビノースの場合に最大量のＴｎｐ  ｍＲＮＡであった（図４および５）。これらの結果は、このパラプロモーターがグルコースによって完全に抑制されることはなく、本明細書に記載の培養条件下でグルコース／アラビノースの不在下で発現の漏れ出しが含まれることを示す。トランスポゼースをコードするｍＲＮＡの量は、１％アラビノースの場合以外は、インデューサーの範囲に依存した。ｐＢａｄＲ系におけるＴｎｐ  ｍＲＮＡ量と誘導条件の間の相関は、この発現系がアラビノース（Ｐａｒａ）で誘導可能なプロモーターの既知の働きに一致していることを示した。１％アラビノースで誘導する場合だけがトランスポゼースｍＲＮＡ量の減少をもたらした。この違いは、誘導に用いたアラビノースが高濃度であったために誘導系が飽和または阻害さえされたのではないかと説明できる。また、高濃度のアラビノースの存在下でｐＢａｄＲ−Ｔｎｐプラスミドコピーの数が減少したことによりこの系が抑制されたという、別の現象でこの結果を説明することもできる。グルコース条件（パラレプレッサー）におけるＴｎｐ  ｍＲＮＡの存在は、このプロモーターが完全にはロックできなかったことを示し、このことはGuzman et al.(1995)によりすでに証明されている。さらに、正確な組成が知られていない富化培地（ＬＢ）（酵母およびトリプトン  抽出物）で細菌を培養した。なお、この培地は、プロモーターの正常な働きと、特にこのパラレプレッサーをコードするＡｒａＣ遺伝子の発現に関して相互作用する可能性がある。
【００９１】
ｐＫＫ−Ｔｎｐ発現系の分析：
強い発現系（ｐＫＫ）において、トランスポゼースをコードするｍＲＮＡはｐＫＫ対照  ベクターを含む細菌には存在せず、ｐＫＫ−Ｔｎｐベクターを含む細菌には存在し、インデューサーが存在しない場合には弱く、ＩＰＴＧが存在する場合には強くなる。最大量は０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで検出された（図７）。強い発現系（ｐＫＫ−Ｔｎｐ）では、合成されたＴｎｐ  ｍＲＮＡの量は、この場合もまた、ＩＰＴＧで誘導可能なＰｌａｃプロモーターの既知の働きと一致していた。このプロモーターはインデューサーの不在下でも完全には抑制されず、Ｔｎｐ  ｍＲＮＡの合成をもたらす（図６および７）。他方、このプロモーターはＩＰＴＧの存在下で活性があって強い発現を生じ、Ｔｎｐ  ｍＲＮＡの量はＩＰＴＧの濃度とは無関係に一定を維持していた。
【００９２】
２）タンパク質の分析：
タンパク質はＲＮＡと同じ条件下で得た。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図８Ａ）。ゲルのデジタル画像を用い、Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｔソフトウエア(Biorad, Ivry sur Seine, France)を用いて種々の抽出物におけるトランスポゼースのパーセンテージを算出した。同時に、種々の抽出物で得られたトランスポゼースのＩＴＲ３’活性との結合を、ゲル遅延実験により調べた（図８Ｂ）。グラフ（図９および１０）は、抽出物におけるトランスポゼースのパーセンテージ（相対量）（ｙ軸）を、種々の誘導条件（ｘ軸）の関数として示したものである。これらのＴｎｐ  ｍＲＮＡ含量をｍＲＮＡとタンパク質を相関させるために移動させた。
【００９３】
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ発現系の分析：
ｐＢａｄＲ対照ベクターを含む細菌から抽出されたタンパク質は、タンパク質ゲル（図８Ａ、トラック１）およびゲル遅延分析（図８Ｂ、トラック１）によって示されたように、トランスポゼースを含んでいなかった。ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐベクターを含む細菌から得られた抽出物（図８Ａ、トラック２〜７）は、インデューサーの不在下（粗抽出物の２．４２％、トラック３）、またはグルコースの存在下（粗抽出物の１．０４％、トラック２）極めて低量のトランスポゼースを含んでいた。インデューサーの存在下で得られた量のほうが若干高かった（粗抽出物の２．６２％〜３．１％、トラック４〜７）。図５は、ｍＲＮＡの量が減少するにつれ、タンパク質の量が増える、より高い誘導点（１％アラビノース）を除いて、トランスポゼースの量がＴｎｐ  ｍＲＮＡの量によく相関していたことを示す。これは、誘導の開始時において、ｍＲＮＡの量が調節されるまでに合成されたトランスポゼース蓄積により説明することができる。ゲル遅延分析（図８Ｂ）は、粗抽出物が高濃度であってインデューサーの量が高くとも、検出できる遅延はないことを示している。
【００９４】
従って、ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ発現ベクターで生産されたトランスポゼースの量は極めて低く、これはアラビノースで誘導可能なプロモーターの活性と合致し、従って、ゲル遅延実験でシグナルが存在しないことを説明する。この系で生産されたトランスポゼースの活性を有効にするか、または無効にするのに使用できるのは、転位試験（生体試験）だけである。
【００９５】
ｐＫＫ−Ｔｎｐ発現系の分析：
ｐＫＫ対照ベクターを含む細菌から抽出されたタンパク質は、タンパク質ゲル（図８Ａのトラック８）およびゲル遅延分析（図８Ｂのトラック８）で示されるように、トランスポゼースを含んでいなかった。ｐＫＫＴｎｐベクターを含む細菌から得られた抽出物（図８Ａ、トラック９〜１３）はＩＰＴＧの不在下で少量のトランスポゼースを含んでおり（粗抽出物の２．３７％、トラック９）、また、ＩＰＴＧの存在下では多量のトランスポゼースを含んでいた（粗抽出物の８．４８％〜１０．２５％、トラック１０〜１３）。図７は合成されたＴｎｐ  ｍＲＮＡおよび生産されたトランスポゼースの含量を誘導条件の関数として示したものであり、生産されたＴｎｐの量はｍＲＮＡ量と同じように変動し、インデューサーの不在下で最小値が得られ、インデューサーの量とは無関係に最大値が得られる。ＩＴＲ活性との結合は、トランスポゼース量が高い場合にゲル遅延において著しく検出された（図８Ｂのトラック１０〜１３）。
【００９６】
ｐＫＫ−Ｔｎｐ系で生産されたマリナーＭｏｓ−１因子のトランスポゼースは、誘導条件とは無関係に常に活性であるのが明らかであった（図８Ｂ）。従って、多量のトランスポゼースはＩＴＲ３’との結合能に影響を及ぼしているとは思えなかった。
これら第一の結果は、これら２つの発現系において生産されたＴｎｐ−ＲＮＡ量と生産されたトランスポゼースの量との間の相関を証明した。
【００９７】
２．１．２．トランスポゼース量／転位頻度の間の相関：
タンパク質およびｍＲＮＡを得るのに用いたものと同じ条件下で転位試験を行った。唯一の違いは、これらの細菌株には転位リポーターベクター（ＰＢＣ  ３Ｋ３）が付加的に存在していたことであった。この転位試験を用いて、原核生物トランスポゼースがＯＰＩを受けているかどうかが予測されるのと同様、トランスポゼース量の増加が転位頻度を引き下げたかどうかを判定した。
【００９８】
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ発現系の分析：
トランスポゼース生産の分析は、インデューサー（アラビノース）の不在下であっても、またはレプレッサー（グルコース）の存在下であっても、本発明者らの培養物にはタンパク質が存在することを証明した。転位は誘導がなくとも始まった（図９、グルコースおよび対照条件）。これにより、トランスポゼースは、量は少なくとも強い活性を有していることが確認された。最少量のトランスポゼース（グルコース条件において粗抽出物の１．０４％）の場合、転位頻度は２６×１０−５であった。粗抽出物の２．６２％に相当するトランスポゼース富化で転位頻度６８×１０−５が最大であり（アラビノース０．００１％誘導点）、これは２．５倍というわずかな増加である。アラビノース０．０１％〜１％の誘導点では、転位頻度は０．００１％アラビノース誘導点に比べ、わずかなトランスポゼース富化ながら一定の値を維持した。
【００９９】
従って、ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ系における転位実験では、トランスポゼースは少量しか生産されない場合であっても常に活性であることが示された。さらに、最初の誘導点（アラビノース０．００１％）であっても最大転位頻度に達し、その後、以降の誘導点では平衡に達した。従って、生産されるトランスポゼースの量が少量であることを考慮すれば、過剰生産阻害（ＯＰＩ）はｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ系では見られず、正常であると思われた
【０１００】
ｐＫＫ−Ｔｎｐ発現系の分析：
タンパク質生産の分析により、トランスポゼースは培養条件と無関係に生産されることが示された（図７、トラック９〜１３）。図１０は転位頻度を誘導条件の関数として示したものである。これらの富家と転位頻度とを相関させるためトランスポゼースの富化を加えた。最少量のトランスポゼースに対する転位頻度（誘導なしの場合）は８×１０−５であった。最大転位頻度はトランスポゼース富化８．４８％（最初の誘導点０．５ｍＭ  ＩＰＴＧに相当する）の場合の５９×１０−５であり、その後は、無視できる変動でトランスポゼース量に対して平衡に達した（以降の誘導点では粗抽出物の８〜１０％）。従って、これらの結果は、最初の生産点であっても生産系が飽和していることを示し、これはＩＰＴＧで誘導可能な強力なプロモーターの働きに相当する。ｐＫＫ−Ｔｎｐ系では、粗抽出物中に高い割合のトランスポゼースが存在しているにもかかわらず、ＯＰＩ現象は見られなかった。
【０１０１】
２．１．３．ＯＰＩに関する結論
ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ発現系で生産されたトランスポゼースの量は少ないが、インデューサーの不在下であっても効率的な転位を生じるに十分であった。ｐＫＫＴｎｐ系では、トランスポゼースの生産は細菌タンパク質の最大１０％に相当し、生物活性（ゲル遅延）試験によるその活性の検出が可能であった。しかし、ｐＢａｄＲ系に比べ、このより高い活性はより高い転位頻度をもたらさなかった。転位頻度は最初の誘導点（０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）で最大値（５９×１０−５）となり、０．００１％アラビノース誘導点についてｐＢａｄＲＴｎｐを用いて得られたもの（６８×１０−５）に匹敵していた。この頻度は他の誘導点でも一定であった。真核生物系とは異なり、これらの結果は総て、原核生物系では過剰生産阻害は検出されず、転位頻度の低下は起こらないはずである。
【０１０２】
２．２．トランスポゼースのＤＮＡに対する親和性
従って、ＯＰＩは明らかに真核生物系にのみ関与したという、真核生物系と原核生物系のマリナーＭｏｓ−１因子の間の第一の違いがあった。転位の他の可能性のある調節レベルを見出すため、マリナーＭｏｓ−１トランスポゾンの３’末端（ＩＴＲ３’）とトランスポゼースの間の結合の質を調べた。これはこの転位法に関与する第一の工程である。平衡状態で結合飽和実験を行い、グル遅延分析を行って、ＩＴＲに対するトランスポゼースの親和性（Ｋｄ値）を求めた（図１および１２、挿入図）。これらの実験は、一定濃度範囲のリガンドの存在下（従って、一定濃度のＩＴＲ３’）で一定量を用いて行った。得られた結果をスキャッチャード分析により示した。この種の表示法では、結合したリガンド（ＩＴＲ）の量と遊離のリガンドの量の間の比率（Ｂ／Ｆ）を、結合したリガンドの濃度（ｎＭ  Ｂ）の関数として表し、方程式ｙ＝ａｘ＋ｂ（ここで、ａ＝−１／Ｋｄ）の直線によって表す。
【０１０３】
これらの試験はすでに原核生物系で生産されたトランスポゼースに対して行っており、これらを用いて、ＩＴＲ３’との結合に関して０．６ｎＭ相当の解離因数（Ｋｄ１）を算出した（提出済みの公報）。もう１つのＫｄ（Ｋｄ２＝１０ｎＭ）は組み込み標的としてのＩＴＲとの結合を測定したものである。この種の試験は、真核生物系で生産された２つのマリナーＭｏｓ−１トランスポゼース、すなわち、Ｓ．Ｔｏｕｒｎｅ博士から入手した、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞で生産し、細胞核から抽出したＭＢＰ−Ｔｎｐ融合タンパク質（精製可能であるが、その活性に影響力がないタンパク質と結合させたＴｎｐ）およびTnT（登録商標）T7 Quick Coupled Transcription / Translation Systemキット(Promega)を用いて網状赤血球（ウサギ）の溶解物において生産したトランスポゼースを用いて行った。
【０１０４】
最初の実験は、細菌起源のトランスポゼースを用いた実験と同じ条件下で、言い換えれば、ＩＴＲ３’の濃度範囲が０．０５ｎＭ〜１０ｎＭの間で行った。結果は、これらの条件がＫｄの判定（リガンドの濃度範囲は「Ｋｄ周辺」でなければならない）には適合できず、従って、真核生物のタンパク質は原核生物のトランスポゼースとは異なる挙動を示すことを示した。
【０１０５】
結果として、ＩＴＲ３’の範囲は、２ｎＭ〜５０ｎＭの間を移動することで増加した。図１１は、結合プローブと遊離プローブの比率（Ｂ／Ｆ）を、結合プローブの濃度（ｎＭ  Ｂ）に関数として示し、これにより、−０．０２５６相当の傾きを有する一本の直線を得た。Ｋｄは傾きの逆数であり、その値は３９ｎＭであった。ウサギ網状赤血球溶解物におけるin vitro転写／翻訳に使用できるＴｎＴ（登録商標）系を用い、ｐＥＴ−Ｔｎｐから生産されたトランスポゼースを用い、同じ条件下で、もう一度スキャッチャード分析を行った。得られた結果（素１２）は、昆虫細胞で生産されたトランスポゼースで得られたものと同じ特性を示し、１つのＫｄは７４ｎＭであった。
【０１０６】
この結果は、in vitroにおいて網状赤血球溶解物で生産されたトランスポゼースは、in vivoにおいて昆虫細胞で生産されたトランスポゼースと同様のＩＴＲ３’結合親和性を持っていることを示した。従って、このin vitro合成キットは昆虫細胞で生産されたトランスポゼースと同様の挙動を有するトランスポゼースを生産する能力があった。この２つの真核生物トランスポゼースでは、ＩＴＲ３’に対する親和性に約１００倍に相当する実質的な違いが見られ、細菌で生産されたトランスポゼースはＩＴＲ３’に対して強い親和性を有していたが、昆虫細胞またはin vitro真核生物系で生産されたトランスポゼースの親和性はもっと低かった。
【０１０７】
２．３．トランスポゼース活性に対するリン酸化の影響
トランスポゼースの挙動における違いを、それが原核細胞または真核細胞で生産されたかどうかに応じて証明した。これらの違いの起源を調べることを試みて、トランスポゼースの挙動に対して影響を持ち得る翻訳後修飾を探した。
【０１０８】
どのトランスポゼースがリン酸化（他の翻訳後修飾の中で）により影響を受ける可能性があるかという仮説から始めたが、最初の工程は、トランスポゼースが真核生物においてその合成中にリン酸化されるかどうか、そして細菌においてリン酸化されないということを見出すことであった。細菌は外来のタンパク質をリン酸化しない。
【０１０９】
２．３．１．原核生物および／または真核生物でのトランスポゼースのリン酸化：
ｐＥＴ−Ｔｎｐベクターを含む細菌を有機リン（ＰｉＰ３３）の存在下で培養し、合成されたタンパク質にそれを組み込んだ。
【０１１０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析をコロイド状クーマシーブルーで染色したところ、ｐＥＴ−Ｔｎｐベクターを含む細菌のトランスポゼースに相当するバンドの存在が明らかになった。ゲルを乾燥させたところで、それをオートラジオグラフィーに付し、原核生物のトランスポゼースのリン酸化が存在しないことを確認した。特に真核系におけるリン酸化を検討するため、また、昆虫細胞でin vivo生産されたものと同様の活性を有するトランスポゼースを生産するために、in vitro真核生物転写／翻訳キットを用いた。ＡＴＰ−γ３２Ｐの存在下、網状赤血球溶解物においてｐＥＴ−Ｔｎｐを用いてトランスポゼースを生産したところ、タンパク質ゲル上に放射性標識バンドが現れ（図１３、トラック３）、これはまた、ＤＮＡの不在下で実験を行った場合（図１３、トラック１）またはｐＥＴ−２６ｂ＋（図１３、トラック２）を用いた場合にも存在した。ｐＥＴ−Ｔｎｐで生産した場合にのみ存在する放射性標識バンド（図１３のトラック）は、トランスポゼースの場合と同様、約４０ｋＤａのＰＡに位置していた。
これら２つの実験の結果、トランスポゼースが細菌で生産された場合には全くリン酸化されないが、真核細胞で生産された場合にはリン酸化されたことを示した。
【０１１１】
２．３．２．トランスポゼースのＤＮＡ親和性に対するリン酸化の影響
真核生物系で生産された２つのタンパク質を脱リン酸化し、原核生物トランスポゼースと真核生物トランスポゼースの間の活性の違いにリン酸化が関与しているかどうかを調べた。次に、広範なリガンド（０．０５〜２５ｎＭのＩＴＲ３’）を用いてスキャッチャード試験を行い、確実にそのＫｄ値を取り巻くようにした。図１４および１５は、原核生物系で生産されたトランスポゼースで得られたものと同様の特性を有し、言い換えれば、２本の直線が存在し、従って、異なる２つのＫｄ値がある。昆虫細胞で生産され、脱リン酸化されたＭＢＰ−Ｔｎｐでは（図１４）、第一のＫｄ（Ｋｄ１）が０．６６ｎＭであり、第二のＫｄ（Ｋｄ２）が２４．６９ｎＭであった。これらの値は「原核生物」トランスポゼースで得られた値と同様であった（Ｋｄ１は０．６ｎＭであり、Ｋｄ２は１０ｎＭである）。in vitroで生産された「真核生物」トランスポゼース（図１５）では、Ｋｄ１値は１．３ｎＭであり、Ｋｄ２値は１５．５ｎＭであった。この場合もまた、これら２つの値は「原核生物」トランスポゼースで得られた値と同等の範囲であった。
【０１１２】
２．４．このトランスポゼースの転位活性に対する、トランスポゼースを少なくとも１つの部位でリン酸化不能とする突然変異の影響
２．４．１．予備実験の結果
上記第２．２節に記載した結果によれば、細菌起源のトランスポゼースは真核生物起源のトランスポゼースよりもＩＴＲの認識および転位の誘導において約１００倍を超えて効率が高い。
【０１１３】
従って、翻訳後リン酸化はトランスポゼースのＤＮＡ親和性（特異的および非特異的）に影響を及ぼし、トランスポゼースのコンホメーション活性を制限する。
従って、各トランスポゼースモノマーの２つのトランスポゾンＩＴＲ各々の対する特異的結合は約１００分の一に低下し、少なくともＴ８８位におけるリン酸化により誘発される転位における効率の低下は、約１００の２乗に相当する倍率であると評価される。
【０１１４】
常法としての分離された突然変異誘発法を用いた、８８位にある理論残基の、リン酸化不能なアラニン残基への突然変異(Ausubel et al., 1994)は、このように変異されたトランスポゼースの、ＤＮＡの転位および移入触媒能を、天然トランスポゼースの値に比べて約１００倍〜１０００倍高めるのが明らかである。
【０１１５】
２．４．２．転位活性に対する、トランスポゼースを少なくとも１つの部位でリン酸化不能とする突然変異の影響：保存的置換の重要性
図１６（ＡおよびＢ）で示されるように、Zhang et al.(2001)に記載されている突然変異型トランスポゼースに対して行った分析の結果は、細菌においてＳ１０４ＰトランスポゼースがＩＴＲと結合することができず、転位を媒介することがでないことを示す。Ｓ３０２Ｐトランスポゼースでの結果は、このトランスポゼースがＩＴＲとの結合複合体を全く形成することができないことを示す。さらに、これは転位を媒介することもできない。
【０１１６】
筋道に沿って、Ｔ８８位に突然変異を有するトランスポゼースについても同じ分析を行った（図１６、ＣおよびＤ）。
この位置を選んだのは、真核生物で、リン酸化セリン(Qiagen)、リン酸化トレオニン(Qlagen)、ならびにセリンまたはトレオニン上でリン酸化されたＳＱおよびＴＱジペプチド(New England Biolabs)と接触させて抗体を用いると、Ｔ８８およびＳ９９およびＳ１０４の位置でリン酸化されることが証明されているからである。
【０１１７】
Ｔ８８位における種々の突然変異の影響を分析した結果は、Ｔ８８Ｖトランスポゼースだけが、天然トランスポゼースの媒介作用と著しく異ならない転位を媒介する能力を維持し得ることを示す。それらはまた、Ｔ８８ＥおよびＴ８８Ｒトランスポゼース突然変異といった突然変異がより大きな複合体の形成を大幅に低下させ、転位媒介能を完全に阻害することを示す。最後に、これらの実験は、トレオニン近縁のアミノ酸（Ａ、ＣおよびＶ）に関して、真の保存的置換はバリンによる置換だけであることも示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
以下の図面は単に指針のために示すものであって、本発明の主題を制限するものではない。
【図１】ｍｏｓ−１トランスポゾンのヌクレオチド配列（配列番号１）およびＭｏｓ−１トランスポゼースのタンパク質配列（配列番号２）。推定リン酸化部位は以下のような位置にある：  一重線の囲み：ＡＭＰｃ、ＧＭＰｃ依存性タンパク質キナーゼによる推定リン酸化部位；  破線の囲み：タンパク質キナーゼＣによる推定リン酸化部位；  二重線の囲み：カゼインキナーゼIIによる推定リン酸化部位。  配列中で薄く示されている残基（ＱＴＱ；配列番号２のタンパク質配列の８７番〜８９番）はＡＴＭキナーゼファミリーによる推定リン酸化の部位に相当する。  丸で囲んだ残基はＭＬＥトランスポゼースの特徴である触媒トリアッド（Ｄ，Ｄ３４−３５［Ｄ／Ｅ］）に関与するＡｓｐ残基である。
【図２】Ｍｏｓ−１因子のトランスポゼースの構造を合わす図である。  Ｎ−ｔｅｒｍ：ＩＴＲとの結合を担うＮ末端ドメイン；  Ｃ−ｔｅｒｍ：ＤＮＡ鎖の転位の触媒を担うＣ末端ドメイン；ＮＬＳ＝推定核局在（または核インターナリゼーション）シグナル；ＨＴＨ＝ヘリックス−ターン−ヘリックスパターン；ａａ＝アミノ酸。  数字はアミノ酸の位置を示す。  特徴的な触媒トリアッド［Ｄ，Ｄ３４（Ｄ／Ｅ）］がシグナル伝達される。
【図３】転位試験の模式図である。  Ａ）：トランスポゼース（Ｔｎｐ）をコードする発現ベクターと転位リポーターベクターとで同時形質転換された細菌  Ｂ）：発現ベクターの誘導後の転位事象  Ｃ）：転位頻度の判定
【図４】Ｌ２７プローブ（Ａ）；およびＴｎｐプローブ（Ｂ）とハイブリダイズさせたｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ  ｍＲＮＡ「ドット」
【図５】ｐＢａｄＲ発現系における培養条件の関数としてのＴｎｐ  ｍＲＮＡ／トランスポゼースの相関を示すグラフ
【図６】Ｌ２７プローブ（Ａ）；およびＴｎｐプローブ（Ｂ）とハイブリダイズさせたｐＫＫ−Ｔｎｐ  ｍＲＮＡ「ドット」
【図７】ｐＫＫ発現系における培養条件の関数としてのＴｎｐ  ｍＲＮＡ／トランスポゼースの相関を示すグラフ
【図８】タンパク質抽出物の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルの写真（Ａ）およびＩＴＲ  ３’の存在下でのトランスポゼースの、ゲル上の遅延のオートラジオグラム（Ｂ）  レーン１＝ｐＢａｄＲ対照  レーン２〜７＝ｐＢａｄＲ−Ｔｎｐ系からのＴｎｐの発現（２＝１％グルコース、３＝対照、４＝０．００１％ａｒａ、５＝０．０１％ａｒａ、６＝０．１％ａｒａ、７＝１％ａｒａ）  レーン８：ｐＫＫ対照  レーン９〜１３：ｐＫＫ−Ｔｎｐ系からのＴｎｐの発現（９＝対照、１０＝０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ、１１＝１ｍＭ  ＩＰＴＧ、１２＝３ｍＭ  ＩＰＴＧ；１３＝６ｍＭ  ＩＰＴＧ）  Ｍ：着色サイズマーカー（Ｐ７７０８Ｓ，  New England BioLabs）
【図９】ｐＢａｄＲ発現系における培養条件の関数としての転位頻度およびトランスポゼースの富化を示すグラフ
【図１０】ｐＫＫ発現系における培養条件の関数としての転位頻度およびトランスポゼースの富化を示すグラフ
【図１１】昆虫細胞において産生されたによる、ＩＴＲに対する結合飽和実験のスキャッチャードプロット
【図１２】in vitroで産生された真核生物Ｔｎｐによる、ＩＴＲに対する結合飽和実験のスキャッチャードプロット
【図１３】ＡＴＰ−γ３２Ｐの存在下での種々のin vitro合成のＳＤＳ−Ｐａｇｅ１０％アクリルアミドゲルのオートラジオグラム１：ＤＮＡなし２：ｐＥＴ−２６ｂ＋ベクターを含む３：ｐＥＴ−Ｔｎｐベクター（３００ｎｇ）を含む
【図１４】脱リン酸化ＭＢＰ−Ｔｎｐによる、ＩＴＲに対する結合飽和実験のスキャッチャードプロット
【図１５】in vitroで産生された脱リン酸化Ｔｎｐによる、ＩＴＲに対する結合飽和実験のスキャッチャードプロット
【図１６】ゲル遅延分析結果（ＡおよびＣ）、ならびにZhang et al. transposases (2001) （ＢおよびＤ）およびＴ８８の位置で変位したランスポゼース（ＣおよびＤ）によって得られた細菌での転位結果を示すオートラジオグラムおよびグラフＷＴ：野生型トランスポゼース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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