(57)【要約】本発明は、一般的に、癌治療に関し、具体的に、腫瘍血管形成中に優性に発現する内皮細胞特異的生成物に対する、または血管形成工程に寄与する因子に対する免疫化を含む、癌の治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者に、少なくとも一つの血管形成関連抗原に対する能動免疫の誘導を担う免疫原性組成物を投与することを含む、癌の治療法。
【請求項２】
該免疫原性組成物が血管形成関連抗原性ポリペプチドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該免疫原性組成物が、血管形成関連抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該免疫原性組成物が、表面上に少なくとも一つの血管形成関連抗原を提示する複数個の抗原提示細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該抗原提示細胞が、少なくとも一つの血管形成関連抗原ペプチドでパルスされる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該抗原提示細胞が、少なくとも一つの血管形成関連抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
該抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該血管形成関連抗原が、Ｉｄ１、Ｉｄ３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、アンジオポエチンおよびＴｉｅ−２からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該抗原提示細胞が、少なくとも一つの腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡでさらにトランスフェクトされている、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの血管形成関連抗原を提示する抗原提示細胞を含む、癌の治療または予防のための組成物。
【請求項１１】
該血管形成関連抗原が、Ｉｄ１、Ｉｄ３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、アンジオポエチンおよびＴｉｅ−２からなる群から選択される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
該抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
該抗原提示細胞が少なくとも一つの血管形成関連抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされている、請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
該抗原提示細胞がまた少なくとも一つの腫瘍抗原を提示する、請求項１０記載の組成物。
【請求項１５】
該抗原提示細胞が、少なくとも一つの腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトされている、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
ｉ.  癌患者から抗原提示細胞を得る；
ii.  これらの細胞に、インビトロで血管形成関連抗原をコードするｍＲＮＡおよび腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを挿入し、それによりトランスフェクト抗原提示細胞を製造する；および
iii.  該トランスフェクト抗原提示細胞を該患者に投与する：
段階を含む、癌の治療法。
【請求項１７】
ｉ.  癌患者から抗原提示細胞を得る；
ii.  抗原提示細胞を、インビトロで血管形成関連抗原をコードするｍＲＮＡおよび腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトする；および
iii.  段階iiのトランスフェクト抗原提示細胞をＴ−リンパ球と接触させ、免疫細胞を産生する；および
iv.  免疫細胞を該癌患者に投与する：
段階を含む、癌の治療法。
【請求項１８】
該免疫原性組成物がさらに抗腫瘍抗原を含む、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(関連出願)
本特許は、２００２年７月５日に出願された米国特許出願第６０／３９３,５９９号の利益を請求する；該明細書は、その全体を本明細書に引用して包含する。
【０００２】
(技術分野)
本発明は癌治療、および特に腫瘍血管形成中に優性に発現する内皮細胞特異的生成物に対する、または血管形成工程に寄与する因子に対する能動免疫の誘導を含む、癌の治療法に関する。
【０００３】
(背景技術)
腫瘍治療の分野における多くの進歩にも関わらず、癌は罹患および死亡の主要な原因のままである。種々の能動免疫治療法が、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発するために開発されている。しかしながら、これらの概念の臨床的使用は、腫瘍細胞上の自己抗原に対する耐性、免疫回避変異体の発現および強力で広く発現される抗原標的を同定する必要性のような難問により制限されている。
【０００４】
これらの難問を解決するための免疫治療の一つの試みは、腫瘍ＲＮＡをトランスフェクトした抗原提示細胞の使用である。ＲＮＡを充填した抗原提示細胞を使用した癌の治療法は、米国特許第６,３０６,３８８号および第５,８５３,７１９号、および関連出願に記載されている。
【０００５】
腫瘍治療の他の試みは、血管形成の阻害である。血管形成は、既存の血管から発生する毛細血管による新規血管の形成である。内皮細胞は通常静止期であり、ほとんど増殖しない。ある生理学的状態(例えば、創傷治癒、毛髪生育、排卵および胚形成)、ならびに病的状態(例えば、糖尿病性網膜症、乾癬、動脈硬化、関節リウマチ、肥満および癌)においては、内皮細胞の増殖および新規血管形成は劇的に増加する。
【０００６】
最小サイズを超えるすべての腫瘍は血液の供給を必要とし、腫瘍内新規血管形成に依存する。腫瘍への増加した血流は成長の継続に必要である。血管形成工程およびその制御の基礎にある分子機構の理解における最近の進歩は、癌の治療のための抗血管形成治療の発達を導いている３２、３４。
【０００７】
アンジオスタチンおよびエンドスタチンが、より大きな前駆体、それぞれプラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIからの翻訳後解裂により産生される二つの強力および特異的な血管形成阻害剤を代表する。アンジオスタチンおよびエンドスタチンの抗腫瘍活性はマウス試験で証明されている。癌のような血管形成依存性疾患の治療における血管形成阻害剤の使用は、米国特許第５,７３３,８７６号；第５,８５４,２０５号；第５,７９２,８４５号；第６,１７４,８６１号；第６,５４４,７５８号および関連特許に記載されている。
【０００８】
受動的モノクローナル抗体ベースの治療がまた腫瘍血管形成阻害の手段として提案されている。血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、血管内皮細胞増殖因子レセプター(ＶＥＧＦ−Ｒ)、およびインテグリンのような種々の血管形成関連抗体に特異的なモノクローナル抗体および血管形成の阻害剤としてのそららの使用は、米国特許第６,５２４,５８３号；第６,４４８,０７７号；第６,４１６,７５８号；第６,３６５,１５７号および第６,３４２,２１９号に記載されている。
【０００９】
抗血管形成の研究および開発の他の強力な領域は、小分子阻害剤の使用を含む３２、３４。これらの阻害剤は、血管形成工程を定義する重要な経路を妨害するために設計される。
【００１０】
開発中の抗血管形成剤のリーディンググループは、マトリックスメタロプロテイナーゼ類(ＭＭＰ)を標的とする。数個のＭＭＰ阻害剤が穏やかな臨床的効果ならびに望ましくない副作用を有することが証明されている。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｒを標的とする小分子阻害剤がまた開発中である２４。
【００１１】
血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)およびその受容体(ＶＥＧＦＲ)は、血管形成中に重要な役割を担い、したがって治療的介入の優れた標的である。ＶＥＧＦＲ−２は、血管形成中内皮細胞に排他的に発現され、内皮細胞に細胞増殖および移動を導くＶＥＧＦ介在シグナルの主要なトランスデューサーである。腫瘍血管形成のためのＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達の重要性は、マウスにおいて、ＶＥＧＦＲ−２の優性ネガティブ変異体が腫瘍増殖を阻害するという観察により示唆された２６。ＶＥＧＦＲ−２は、腫瘍関連内皮細胞で上方制御されているが、周りの組織の血管ではされていない２７−３０。血管形成の部位の増殖内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−２発現の特異性および血管形成中のＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達の重要な役割の観点から、ＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達の妨害は、抗血管増殖治療の開発および臨床試験の論理的な標的である３１−３４。
【００１２】
Ｔｉｅ２は、ＶＥＧＦＲ−２と同様、増殖している内皮細胞において上方制御されているレセプターチロシンキナーゼであり、そのリガンドであるアンジオポエチン−１に遭遇した後に、血管形成支援シグナルを伝達する２５、３４。遺伝子ノックアウトおよび阻害試験は、Ｔｉｅ２機能が胚形成３５および腫瘍新規血管形成３６−３８中必須であることを示している。
【００１３】
ＶＥＧＦＲ−２のリガンドであるＶＥＧＦは、内皮細胞特異的増殖因子であり、血管形成に必須である２４、３１。マウスにおけるＶＥＧＦ遺伝子の標的不活性化は、胚の異常血管発育および致死をもたらす３９、４０。ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２と異なり、ＶＥＧＦは血管形成中、間質細胞に発現する２４、３１。ＶＥＧＦはまた、マウスにおいてＶＥＧＦ機能が腫瘍増殖を阻害するという事実により示されるように、腫瘍血管形成中必須の役割を担う４１。ヒトおよびマウス腫瘍の大多数が、増殖している腫瘍における徐々に進行する低酸素状態に応答して４２、ＶＥＧＦの発現を誘導する２４、３１。実際、腫瘍は腫瘍血管形成中のＶＥＧＦの主要な源である２４、３１。したがって、ＶＥＧＦは標的とする腫瘍およびその血管の両方に対する抗原としての２重の機能の役目ができる。
【００１４】
Ｉｄタンパク質は、分化および細胞サイクル進行の制御に関係する４つの関連タンパク質のファミリーである。Ｉｄ１およびＩｄ３はマウスニューロン新生および血管形成中に一時的におよび空間的に共発現され、マウスおよびヒト起源の成熟正常細胞では発現されない。Ｉｄ１およびＩｄ３は増殖腫瘍の微小血管形成において再発現し、ノックアウトマウスでの試験において、Ｉｄ１およびＩｄ３の両方とも腫瘍異種移植片の血管形成および脈管化に必要であることが証明されている。したがって、これらの分子は抗血管形成治療の他の可能性のある標的を提示する。
【００１５】
癌患者のための現在の抗血管形成治療は幾分効果を示しているが、効果は細胞毒性よりむしろ細胞増殖抑制である。新規血管形成の阻害は、巨大腫瘍の増殖を防止し、腫瘍サイズを縮小し得るが、微小転移性疾患を排除しない。加えて、ポリペプチド阻害剤の使用は、製造、安定性および費用問題を提起する。したがって、抗血管形成成分を単独でまたは他の免疫治療法と組み合わせて含む、より有効な腫瘍治療の発見の必要性が残っている。本発明はこの必要性を解決し、新規および有効な癌治療を提供する。
【００１６】
(発明の開示)
血管免疫治療なる名称の本発明は、血管形成関連抗原に対する能動免疫に基づいた、新規抗血管形成組成物および方法を提供する。本明細書で使用する“血管形成関連抗原”なる用語は、腫瘍血管形成中に優性に発現される内皮細胞特異的生成物または血管新生形成工程に関与する因子を意味する。具体的な血管形成阻害剤の能動的投与は記載されているが、血管形成関連抗原に対する能動免疫化の報告は以前にはない。
【００１７】
本発明は、さらに、抗血管形成治療および能動免疫治療を組み合わせた新規治療的様式を提供する。これら二つの方法は、相乗効果を提供する同等な治療的処置である。
【００１８】
本発明の一つの態様において、癌の治療または予防のための組成物を提供する。本組成物は、少なくとも一つの血管形成関連抗原をコードする核酸をトランスフェクトした複数の抗原提示細胞を含む。
【００１９】
抗原提示細胞は好ましくは樹状細胞であり、血管形成関連抗原は好ましくはＩｄ１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２およびＶＥＧＦからなる群から選択される。
【００２０】
特に好ましい態様において、樹状細胞はさらに少なくとも一つの腫瘍抗原をコードする核酸でトランスフェクトされている。核酸は、腫瘍細胞からの全ｍＲＮＡまたは選択した腫瘍関連抗原をコードする合成ｍＲＮＡである。
【００２１】
本発明の他の態様において、癌を予防または治療する方法が提供される。本方法は、治療を必要とする患者から抗原提示細胞を得、これらの抗原提示細胞に、インビトロで血管形成関連抗原をコードするＲＮＡを挿入し、それによりＲＮＡ充填抗原提示細胞を製造し、ＲＮＡ充填抗原提示細胞を患者に投与することを含む。
【００２２】
好ましい態様において、腫瘍抗原をコードするＲＮＡがまた抗原提示細胞に導入され、それにより、血管形成関連抗原および腫瘍抗原の両方の提示が可能なＲＮＡ充填抗原提示細胞を製造する。腫瘍ＲＮＡおよび血管形成関連ＲＮＡは同時にまたは連続して挿入し得る。
【００２３】
本発明の他の態様において、ＲＮＡ充填抗原提示細胞は上記のように製造する。ＲＮＡ充填抗原提示細胞を次いでＴリンパ球と接触させ、インビトロで免疫細胞を産生する。インビトロで産生したＣＴＬを次いで患者に投与する。本明細書で使用する限り、“免疫細胞”なる用語は細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および他の免疫調節細胞を意味する。
【００２４】
本発明の目的および利点は、下記の記載から明らかになるであろう。
【００２５】
(図面の説明)
図１はＩｄ１  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで免疫化したマウスにおける肺転移の阻害を証明するグラフである；
図２はＩｄ１およびＢ１６腫瘍ＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣによる共免疫化の肺重量における効果を説明するグラフである；
図３はＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞で免疫化したマウスにおけるＣＴＬ活性の誘導を説明するグラフである；
図４は血管形成関連生成物に対して免疫化したマウスにおける血管形成の阻害を説明する；
図５Ａはメラノーマモデルにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ２  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで免疫化した後の腫瘍増殖の阻害を説明する；
図５Ｂは膀胱腫瘍モデルにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ２  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで免疫化した後の腫瘍増殖の阻害を説明する；
図６ＡはＢ１６腫瘍抗原およびＴｉｅ２の組み合わせ治療の結果を示す；
図６ＢはＭＢＴ−２  ｍＲＮＡまたはＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２の組み合わせ治療の結果を示す；
図６Ｃは触知可能な腫瘍の出現の時間を説明する；
図７Ａは移植後１８日の腫瘍サイズで示した腫瘍担持マウスの血管形成関連および腫瘍抗原でトランスフェクトしたＤＣでの免疫治療の結果を説明する；
図７Ｂは移植後２５日の腫瘍サイズで示した腫瘍担持マウスの血管形成関連および腫瘍抗原でトランスフェクトしたＤＣでの免疫治療の結果を説明する；
図７ＣはＶＥＧＦＲ−２およびＴＲＰ−２の組み合わせを投与されたマウスにおける触知可能な腫瘍の出現の時間を説明する；
図７ＤはＶＥＧＦおよびＴＲＰ−２の組み合わせを投与されたマウスにおける触知可能な腫瘍の出現の時間を説明する；
図８Ａは最終免疫化後１週間のマウスの繁殖力におけるＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣでの免疫化の効果を説明する；および
図８Ｂは最終免疫化後８週間のマウスの繁殖力におけるＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣでの免疫化の効果を説明する。
【００２６】
(発明の要約)
本発明は、処置を必要とする患者において：ｉ)腫瘍血管形成中に優性に発現する内皮細胞特異的生成物、および／またはii)血管形成工程に寄与する因子に対する能動免疫を誘導する方法を含む、癌の処置法に関する。これらの内皮細胞特異的生成物および因子は、本明細書ではまとめて“血管形成関連抗原”と呼ぶ。本発明はｉ)免疫応答が腫瘍微小血管において必ずしも排他的にではないが優性に発現する正常遺伝子産物に対して刺激できる、ii)このような応答が腫瘍の発達を阻害する、およびiii)明らかな毒性(自己免疫性)がもたらされないという事実を利用する。本発明の治療法は、放射線、化学療法および慣用の免疫治療のような癌の治療のための他の様式と組み合わせて使用できる。
【００２７】
本発明に従い、能動免疫は種々の方法を使用して誘導できる。例えば、血管形成関連抗原は、一つの抗原型を含む組成物(ワクチン組成物)として、または異なる型の血管形成関連抗原の混合物を含む組成物として直接投与できる。使用する抗原は、化学的にまたは組み換え的に製造でき、または抗原は天然源から単離できる。
【００２８】
能動免疫はまた１個以上の血管形成関連抗原をコードする核酸(ＲＮＡまたはＤＮＡ)を投与することにより誘導できる。核酸はベクター(例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはワクシニアウイルスベクターのようなウイルスベクター)に包含できる。あるいは、核酸はリポソームのようなトランスフェクション促進剤と共に投与できる。さらに、核酸(例えば、プラスミドに存在するＤＮＡ)は裸の核酸として投与でき(例えば、ＵＳＰ第５,５８９,４６６号参照)、または遺伝子銃(すなわち、金ビーズのような粒子に塗られた)を使用して投与できる。
【００２９】
好ましい態様において、能動免疫の導入は、血管形成関連抗原を充填された、またはインビトロで少なくとも一つの血管形成関連抗原をコードする核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ)でトランスフェクトされた抗原提示細胞(ＡＰＣ)を患者に投与することにより行われる。
【００３０】
核酸トランスフェクションは、脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウムトランスフェクションのような当分野の技術者に既知の慣用法を使用して行うことができる。ＡＰＣのペプチドパルシングは、認知された方法を使用して行うことができる。(例えば、ＵＳＰ第５,８５３,７１９号参照。)
【００３１】
有利には、ＡＰＣは樹状細胞またはマクロファージのようなプロフェッショナルＡＰＣである。しかしながら、任意のＡＰＣ(例えば、内皮細胞または人工的に産生したＡＰＣ)が使用できる。患者に投与する細胞はその患者由来が好ましいが(自己)、ＡＰＣは適合ドナーからまたはインビトロの細胞増殖の培養から得ることができる。ハロタイプを適合する方法は当分野で既知である。
【００３２】
本発明の方法におけるＲＮＡトランスフェクトＡＰＣの使用は、例えば、タンパク質／ペプチドパルスされたＡＰＣよりも、抗原産生の容易さを含む理由から有利である。配列を考えると、対応するｍＲＮＡは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよび転写を使用して、選択肢として、しかし必須ではなく細菌プラスミドへのｃＤＮＡ中間体のクローニングと共に産生できる１２、１３。タンパク質抗原の製造または特異的ＭＨＣ対立遺伝子に対応するクラスＩおよびクラスIIペプチドの同定の必要性は従って除くことができる。
【００３３】
本発明に使用する核酸をコードした血管形成関連抗原は天然源から単離でき(必要に応じて増幅する)または慣用法を使用して化学的にまたは組み換え的に合成できる。
【００３４】
本発明での使用に適した血管形成関連抗原は、腫瘍微小血管で再発現する胎児または胚遺伝子産物(例えば、Ｉｄ１およびＩｄ２)、腫瘍微小血管で上方制御されるＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ−２)、および内皮細胞特異的生成物Ｔｉｅ−２を含む。アンジオポエチン−１は、本発明で有用な他の抗原である。
【００３５】
ＶＥＧＦは腫瘍基質、腫瘍自体または両方に発現する。従って、ＶＥＧＦは、腫瘍血管構造および腫瘍または腫瘍基質の両方に対する二重免疫応答を誘発できるプロトタイプ抗原である。ＶＥＧＦ、Ｉｄ１およびＶＥＧＦ／Ｉｄ１プロトタイプ抗原(またはこれらをコードする核酸)を使用した免疫治療が特に有利であり得る。
【００３６】
本発明により、能動免疫は血管形成関連抗原単独または腫瘍抗原(例えば、ＴＥＲＴまたは全腫瘍由来抗原混合物)との組み合わせに対して誘導できる(ＵＳＰ第５,８５３,７１９号参照)。
【００３７】
本発明は、患者(ヒトまたは非ヒト動物)における既存の腫瘍の治療または腫瘍形成の予防に使用できる(例えば、メラノーマ腫瘍、膀胱腫瘍、乳癌腫瘍、大腸癌腫瘍、前立腺癌腫瘍および卵巣癌腫瘍)。処置を腫瘍形成の前または形成時に開始し、腫瘍が緩解するまで継続するのが好ましい。しかしながら、本発明は、腫瘍が形成された後でさえ使用に適している。本発明による患者の治療において、最適投与量は、患者の体重、癌の重症度、および標的抗原の性質のような因子に依存する。
【００３８】
ＡＰＣを使用する場合、細胞の投与量は体重に依存する。典型的に、１０５から１０８細胞／体重ｋｇ、好ましくは１０６から１０７細胞／体重ｋｇが、薬学的に許容可能な賦形剤中で患者に投与できる。細胞は、癌治療で慣用的に使用されている注入技術を使用して投与できる。特定の患者のための最適な投与量および投与レジメは、疾病の徴候について患者をモニタリングし、治療をそれに従い調節することにより当業者が容易に決定できる。治療はまたマイトージェン(例えば、フィトヘマグルチニン)またはリンフォカイン(例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４)を投与し、Ｔ細胞増殖を促進することを含み得る。
【００３９】
本発明は、癌の抗血管形成治療および腫瘍免疫治療の組み合わせが相乗的であることを証明する。腫瘍増殖を制御するための能動免疫治療による血管形成の阻害は、いくつかの魅力的な性質を提供する。第一に、能動免疫治療は、減少した血管形成活性の状態を誘導する。第二に、免疫治療は、他の抗血管形成概念と同様に、腫瘍血管形成を阻害するための複数の共通標的、“ユニバーサル”抗原を提供する。加えて、内皮細胞および間質細胞の遺伝的に安定した性質および限定された増殖能のために、抗原損失または抗原加工損失変異体の発現が腫瘍細胞のものと比較して有意に減少する。さらに、抗血管形成免疫治療の特に魅力的な性質は、腫瘍免疫治療と組み合わせ、一般的方法、免疫化を使用して、二つの異なるおよび相乗的な可能性のある様式を送達できることである。
【００４０】
ｍＲＮＡ−トランスフェクトＤＣでの免疫化は、細胞性免疫を刺激するための優れた概念として持ち上がり、本発明はこの方法の使用を血管形成関連標的に拡大する。ｍＲＮＡコード化抗原の使用による特に有用な性質は、ｍＲＮＡの単離および産生の容易さである。ｃＤＮＡは単純ＲＴ−ＰＣＲ技術により望ましい抗原を発現する細胞から単離でき、ｍＲＮＡは純粋な形および大量に無細胞酵素反応により産生できる。下記の実施例において、ｍＲＮＡ技術は３つの血管形成標的、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２およびＶＥＧＦの研究に使用した。このリストは、ゲノム革命により提供される候補物に容易に拡大できることは明白である。本発明の他の利点は、ｍＲＮＡ−コード化抗原の産生が比較的単純および安価であり、規制基準が簡単であることである。
【００４１】
本発明の実行可能性は、数個の実験で証明されている。具体的な抗原およびプロトコールを使用しているが、本発明が他の抗原および異なるアッセイ法を包含できることは明白である。
【００４２】
図１に示し、実施例４でさらに説明するように、Ｉｄ１  ＲＮＡトランスフェクト樹状細胞での免疫化は、コントロール動物と比較して、肺転移の有意な減少をもたらす。図２および実施例５は、Ｉｄ１  ＲＮＡおよびＢ１６(腫瘍)ＲＮＡトランスフェクト樹状細胞で共免疫化することにより抗腫瘍効果が増加できることを説明する。
【００４３】
図３で証明され、実施例７および８でさらに説明するように、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２に対して応答するＣＴＬの導入は、血管形成関連標的に対する耐性を破壊することが可能であることを示す。これは図４に示し、実施例９および１０でさらに説明しているように、免疫化動物における血管形成活性の減少を導く。これらの結果は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２に対する免疫応答の誘導が強力な抗血管形成効果を有することを示唆する。
【００４４】
血管形成関連生成物ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２またはＶＥＧＦに対する免疫化は、Ｂ１６／Ｆ１０.９メラノーマ転移およびＭＢＴ−２膀胱癌モデルにおける腫瘍増殖の阻害と同時に起きた。腫瘍阻害は、図５および６に示し、実施例１１および１２でさらに説明するように、マウスを腫瘍攻撃前に免疫化した場合に見られた。腫瘍阻害はまた実施例１３および１４に記載し、図７に示すように、既存の腫瘍の経過中にも見られた。ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２が、ＭＢＴ−２またはＢ１６／Ｆ１０.９腫瘍細胞ではなく、増殖している内皮細胞に見られるため、観察される腫瘍阻害は新規血管形成工程の妨害の間接的結果であった。この結果は、ＶＥＧＦＲ−２に対する免疫化が、免疫化動物における血管形成の減少した状態を付随するという観察と一致する。ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２と異なり、ＶＥＧＦは、本実験に使用したＢ１６／Ｆ１０.９およびＭＢＴ−２腫瘍細胞を含む間質細胞および腫瘍細胞により発現される。したがって、ＶＥＧＦ免疫化はその抗腫瘍効果を血管形成の阻害または直接抗腫瘍免疫化を介して介在し得る。
【００４５】
図６および７に示す実験は、抗血管形成治療および腫瘍免疫治療の組み合わせの可能性のある価値を立証する。同系腫瘍ＲＮＡ(Ｂ１６／Ｆ１０.９またはＭＢＴ−２)は、腫瘍特異的非交差反応性防御免疫を刺激し、それにより腫瘍を直接標的とするが、一方、ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２  ｍＲＮＡでの免疫化は腫瘍血管形成工程を標的とする。図６に示すように、同系腫瘍ＲＮＡおよび内皮細胞特異的ｍＲＮＡ(ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２)の両方で免疫化したマウスは、いずれかのＲＮＡ単独で免疫化したマウスと比較して優れた抗腫瘍効果を示す。さらに、既存の疾患の経過中に、腫瘍(ＴＥＲＴまたはＴＲＰ−２)および血管形成特異的(ＶＥＧＦＲ−２)標的に対する共免疫化は、腫瘍増殖において促進された阻害効果を示す(図５)。これらの実験はまた能動免疫治療を介した血管形成の阻害の他の重要な性質、すなわち、一つのプロトコール、免疫化により、二つの同等なおよび相乗的な癌治療様式を送達する能力を説明する。ＶＥＧＦおよびＴＥＲＴ(図６Ｂ)、ＶＥＧＦＲ−２(図７Ａ)またはＴＲＰ−２(図７Ｂおよび７Ｄ)のいずれかに対する組み合わせ免疫化治療もまた相乗的であり、二つの規定されたおよび広く発現する(“ユニバーサル”)抗原のターゲティングの価値を強調する。しかしながら、本例において、ＶＥＧＦの寄与が血管形成の阻害、直接抗腫瘍免疫または両方の組み合わせかは明白ではなかった。
【００４６】
血管形成関連生成物に対する免疫化の主要な懸念は、特に、効果が持続する場合、正常血管形成の妨害である。明白な抗腫瘍効果が見られた条件下での本および前試験では、血管形成関連生成物に対するマウス免疫化で明らかな不利な効果は見られなかった。図８に示すように、ＶＥＧＦではなく、ＶＥＧＦＲ−２に対して免疫化したマウスにおける繁殖力の一過性の障害以外、免疫化動物で罹患または死亡の徴候は見られなかった。これらの観察は、抗血管形成治療が腫瘍増殖および創傷治癒において異なる感受性を示した先の試験と一致し４８、４９、血管形成活性の部分的および一過性の減少が、重篤な不利な効果を発現させることなく腫瘍増殖に衝撃を与えるのに十分であることを示唆する。さらに、機能的免疫学的記憶は繰り返し免疫化が必要であるため５０、５１、能動抗血管形成免疫応答の持続がワクチン接種の停止により単純に制御できる。
【００４７】
上記で得られた結果は、抗血管形成免疫治療が有効な抗腫瘍様式であることを証明する。血管形成関連抗原に対する能動免疫化で見られた効果は、腫瘍抗原に対する能動免疫化の組み合わせにより増加できる。具体的抗原およびプロトコールが本明細書に記載されているが、他の血管形成関連抗原および腫瘍抗原が類似の効果を有するであろうことは明白である。
【００４８】
上記は本発明を一般的に記載する。当業者は、前の記載を使用し、本発明の組成物を製造および使用し、方法を実施できると信じる。より完全な理解が、以下の具体的実施例を参考にして得ることができる。これらの実施例は単に本発明の好ましい態様を説明するものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。その形の変換および同等物への置換が、環境が好都合を示唆するかまたは提供する場合、意図される。他の遺伝的な配置は当業者には明らかであろう。本明細書に記載したすべての学術文献および特許または特許出願のような他の文献は、引用して本明細書に包含させる。
【００４９】
（実施例）
実施例で具体的な用語を使用しているが、このような用語は説明的意味を意図し、限定する意図はない。本明細書およびこれらの実施例に引用しているが、明白に記載していない分子生物学、細胞生物学および免疫学的方法は、科学文献に報告され、当業者に既知である。
【００５０】
実施例１。マウスおよびマウス細胞系
マウス。４−６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス(Ｈ−２ｂ)およびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス(Ｈ−２ｋ)をJackson Laboratory、Bar Harbor、MEから得た。本誌に記載の研究を行うために、研究者らは、生命科学における実験動物資源の管理に関する委員会(the committee on care of Laboratory Animal Resources Commission on Life Sciences)、米国学術研究会議により提唱された“実験動物の管理および使用のためのガイド”に忠実であった。Ｄｕｋｅ生態動物園の施設は、米国実験動物管理公認協会(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)に完全に認定されている。
【００５１】
細胞系。Ｃ５７ＢＬ／６起源のＢ１６メラノーマのＦ１０.９クローンは非常に転移性であり、乏しい免疫原性および低いクラスＩ発現細胞系である１６。ＥＬ４は胸腺腫細胞系(Ｃ５７ＢＬ／６、Ｈ−２ｂ)である。Ｃ３Ｈマウスにおけるカルシノーゲン誘導膀胱腫瘍由来のマウスＭＢＴ−２細胞系はT. Ratliff博士から得た１７(Washington University, St. Louis, MO)。ＳＶ４０−形質転換Ｂ６線維芽細胞細胞系、ＢＬＫ.ＳＶ(ＴＩＢ−８８)はＡＴＣＣから得た。細胞を１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭに維持した。マウス前駆体由来ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＦ１０.９細胞から回収したＧＭ−ＣＳＦ上清の存在下で生成した。活発に増殖しているＦ１０.９／ＧＭ−ＣＳＦ細胞を、５％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸Ｎａ、.１ｍＭ非必須アミノ酸、１００ＩＵ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシンおよび５×１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０(完全ＲＰＭＩ)中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＧＭ−ＣＳＦ−含有上清を、２４時間のキャピラリー培養後回収した。ＧＭ−ＣＳＦ上清を、マウスＤＣを生成するために最終濃度０.１％で使用した。使用したＧＭ−ＣＳＦの濃度は、ＥＬＩＳＡで決定した。
【００５２】
実施例２。ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞の製造
ＢＭＤＣ(ウシ骨髄前駆体由来樹状細胞)を、先に記載のようにウシ骨髄前駆細胞から生成した１８。簡単に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脛骨および大腿骨からの骨髄を回収し、続いて前駆体を塩化アンモニウムＴｒｉｓ緩衝液で３分、３７℃で処理し、赤血球細胞を枯渇させた。前駆体をＧＭ−ＣＳＦ(１５ng／ml)およびＩＬ−４(１０ng／ml、Peprotech(Rocky Hill, NJ)を添加されたＲＰＭＩ−５％ＦＣＳにまいた。細胞を１０６／mlでまき、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、浮遊細胞(ほとんど顆粒球)を除去し、付着細胞を新鮮ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４含有培地で満たした。４日後、非付着細胞を回収し(未成熟７日ＤＣ)、洗浄し、１０６／mlでＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４含有培地に再びまいた。１日後、非付着細胞を回収し、洗浄し、ＲＮＡでエレクトロポレーションした。
【００５３】
全ＲＮＡを活発に増殖している腫瘍細胞系から、RNeasy kits(Qiagen)を使用し、製造者のプロトコールに従って単離した。
【００５４】
エレクトロポレーションを、ヒトＤＣに関して先に記載に従い１９、２０、少し変更して行った。簡単に、ＤＣを８日目に回収し、洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ(GIBCO, Grand Island, NY)に２.５×１０７／mlで穏やかに再懸濁した。使用したＤＣ培養培地は、後の使用のためにならし培地として保存した。細胞を２mmキュベット(Electro Square Porator ECM 830, BTX, San Diego, ＣＡを使用して、２００μｌのＤＣ(５×１０６細胞)、３００Ｖで５００μｓ)にエレクトロポレーションした。１０６  ＤＣあたり、使用したＩＶＴ  ＲＮＡの量は、２μｇおよび全腫瘍ＲＮＡは１０μｇであった。細胞をすぐに、ならしＤＣ増殖培地および、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４添加新鮮ＲＰＭＩ−５％ＦＣＳ  １：１の組み合わせを含む６０mm組織培養ペトリ皿に移した。トランスフェクトした細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、２回ＰＢＳで洗浄し、次いでマウスに注射した。
【００５５】
実施例３。腫瘍攻撃モデル
Ｂ１６／Ｆ１０.９メラノーマモデル：ＤＣを種々のＲＮＡ調製物でトランスフェクトし、天然、同系マウスを、マウスあたり２００μｌ  ＰＢＳ中５×１０５前駆体由来ＤＣで、３回、７日間隔で静脈内的に免疫化した。マウスを、最終免疫化８−１０日後、５×１０４  Ｆ１０.９細胞で静脈内的に攻撃した。マウスをコントロール群の転移性死を基準にして殺した。転移性負荷は、肺の重量により評価した。
【００５６】
ＭＢＴ−２マウス膀胱腫瘍モデル：ＤＣを種々のＲＮＡ調製物でトランスフェクトし、天然、同系マウスを、マウスあたり２００μｌ  ＰＢＳ中５×１０５前駆体由来ＤＣで、３回、７日間隔で静脈内的に免疫化した。マウスを、最終免疫化８−１０日後、２−５×１０５  ＭＢＴ−２細胞で皮下的(横腹)に攻撃した。腫瘍増殖の評価を６日目に開始し、一日おきに行った。マウスを腫瘍サイズが２０mmに到達したら殺した。
【００５７】
異なる抗原間の相乗効果を試験する実験のために、マウスを各抗原に関して、マウスあたり１００μｌ中の３×１０５  ＤＣで、組み合わせに関して２００μｌ中６×１０５  ＤＣで２回免疫化した。
【００５８】
実施例４。Ｉｄ−１に対する免疫化
Ｉｄ１に対する免疫化による保護的抗腫瘍免疫の誘導を、Ｂ１６メラノーマ実験的転移システムで試験した。上記のように、マウスを最初に免疫化し、次いで、Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞(非常に転移性のクローン、Ｆ１０.９を使用)で静脈内的に攻撃した。２８日後、マウスを殺し、肺の転移性負荷を肺重量の測定により決定した。図１に示すように、Ｂ１６腫瘍ＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣでの免疫化は、本モデルで肺転移の有意な減少をもたらす。Ｉｄ１  ＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣはまた低い転移性負荷を導く。
【００５９】
実施例５。Ｉｄ１およびＢ１６  ＲＮＡでの組み合わせ治療
抗Ｉｄ１および抗腫瘍免疫治療が相乗的であるかどうかを決定するために、腫瘍ＲＮＡおよびＩｄ１＋腫瘍ＲＮＡでのワクチン接種の差をよく観察するために免疫化の強度を３サイクルから２サイクルに減少した以外、上記と同じ実験プロトコールを使用した。
【００６０】
図２に示すように、Ｉｄ１またはＢ１６  ＲＮＡのいずれかでトランスフェクトしたＤＣは、図１に示す結果を確認する有意な方法で肺転移を阻害した。Ｉｄ１＋Ｂ１６  ＲＮＡワクチン接種の組み合わせは、統計学的に相乗的方法ではなくても、より強力である。これは、この特定の実験において、腫瘍ＲＮＡでの二つの免疫化が、Ｉｄ１での共免疫化の付加的効果を非常に曖昧にする非常に有意な腫瘍転移の減少をもたらすためであると考え得る。
【００６１】
実施例６。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２、ＴＲＰ−２、テロメラーゼおよびアクチンＲＮＡの製造
ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４の製造。６４  Ａ−Ｔbp、続いてＳｐｅ  Ｉ制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、ｐＧＥＭ４Ｚ(Promega)のＥｃｏＲ  ＩおよびＮａｒ  Ｉ部位の間に置き、プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４を製造した。ｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４のＨｉｎｄ  III−Ｎｄｅ  Ｉフラグメントを、Ｈｉｎｄ  IIIおよびＮｄｅ  Ｉで消化したｐＳＰ７３(Promega)にクローン化し、ｐＳＰ７３／Ａ６４を製造した。プラスミドｐＳＰ７３−Ｓｐｈを、ｐＳＰ７３／Ａ６４をＳｐｈ  Ｉで消化し、末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、再ライゲートすることにより製造した。ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４／Ｎｏｔは、Ｓｐｅ  Ｉ部位に隣接したＮｏｔ  Ｉ制限部位を含む。C. Kontos(Duke University Medical Center, Durham, NC)から、マウスＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ２を含むプラスミドを提供された。ｃＤＮＡをAdvantage  ＤＮＡポリメラーゼ(Clontech)で増幅し、ｐＳＰ７３−Ｓｐｈにクローニングした。
【００６２】
ＳＰ７３−Ｓｐｈ／ＶＥＧＦ／Ａ６４のクローニング。フォワードプライマー５'−ＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧ−３'(配列番号１)およびリバースプライマー５'−ＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣ−３'(配列番号２)を使用し、プラスミドから、シグナル配列を含まないＶＥＧＦコード領域の切断変異体を増幅し、ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４のＸｂａ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ部位にクローン化した。
【００６３】
ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／ＶＥＧＦＲ−２／Ａ６４のクローニング。ＶＥＧＦＲ−２を以下のプライマーを使用して３つの反応で増幅した：塩基対１−１４２０に関して、５'−ＴＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣ  ＴＡＧＣＴＧ−３'(配列番号３)および５'−ＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧＧＡＣＴＣ  ＡＡＴＧＧＧＧＣＣＴＴＣ−３'(配列番号４)。塩基対１４２０−２７３０に関して、５'−ＡＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧ−３'(配列番号５)および５'−ＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴ  ＣＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＴＣ−３'(配列番号６)。塩基対２６９５−４３９０に関して、５'−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧ−３'(配列番号７)および５'−ＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣ  ＧＴＧＡＴＴＴＣ−３'(配列番号８)。フラグメントを、ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４のＸｈｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉ部位に別々にクローン化した。
【００６４】
ｐＳＰ７３／Ｔｉｅ２／Ａ６４／Ｎｏｔのクローニング。フォワードプライマー５'−ＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣ−３'(配列番号９)およびリバースプライマー５'−ＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＡＧ−３'(配列番号１０)を使用して、プラスミドＤＮＡからＴｉｅ２コード配列を増幅した。フラグメントをｐＳＰ７３／Ａ６４／ＮｏｔのＸｂａ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉにクローン化した。
【００６５】
ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／ＴＲＰ−２／Ａ６４のクローニング。全ＲＮＡを活発に増殖しているＢ１６／Ｆ１０.９細胞から単離した。逆転写を、固定したオリゴｄＴプライマーで開始させ、ＴＲＰ−２  ｃＤＮＡを、第一鎖からフォワードプライマー５'−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＧＡＴＧＧ−３'(配列番号１１)およびリバースプライマー５'−ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＧＴＡＴＣ−３'(配列番号１２)を使用して増幅した。得られた生成物をＢｇｌ  IIおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４のＢａｍＨ  Ｉ部位にクローン化した。
【００６６】
ｐＧＥＭ４Ｚ／マウスＴＥＲＴ／Ａ６４のクローニング。ｐＧＲＮ１８８(Geron Corp., Menlo Park, CA)のＥｃｏＲ  Ｉフラグメントを、ｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４／ＮｏｔのＥｃｏＲ  Ｉ部位にクローン化した。Ｎｏｔ  Ｉでの直線化、続くインビトロ転写(Ambion mMessage mMachine kit, Austin, TX)により、６１ｎｔのポリリンカーｐＧＥＭ４Ｚ、続く３４ｎｔのｍＴＥＲＴの５'ＵＴＲ、３３６６ｎｔ  ｍＴＥＲＴ  ＯＲＦ、３６ｎｔのｍＴＥＲＴの３'ＵＴＲ、６４  Ａ残基、Ｓｐｅ  Ｉ部位およびＮｏｔ  Ｉの半分の部位(half-site)を含む転写物を産生する。
【００６７】
ｐＧＥＭ４Ｚ／マウスアクチン／Ａ６４のクローニング。Ｆ１０.９細胞からの全ＲＮＡの逆転写をオリゴｄＴで開始させ、PowerScript逆転写酵素(Clontech)により行った。フォワードプライマー５'−ＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＴＴＧ−３'(配列番号１３)およびリバースプライマー５'−ＴＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣ−３'(配列番号１４)を使用して第一鎖ｃＤＮＡからアクチンコード配列を増幅した。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４のＨｉｎｄ  III−ＢａｍＨ  Ｉ部位にクローン化した。
【００６８】
実施例７。インビボＣＴＬ導入
ＣＴＬの産生。ＤＣ由来の骨髄前駆体を上記のように製造し、ＲＮＡをトランスフェクトした。天然、同系マウスを、マウスあたり、２００μｌ  ＰＢＳ中の５×１０５前駆体誘導ＤＣで、３回、７日間隔で静脈内的に免疫化した。脾臓細胞を最後の免疫化８−１０日後に回収し、塩化アンモニウムＴｒｉｓ緩衝液で赤血球を枯渇した。１０７脾臓細胞を、６ウェル組織培養プレートあたり１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ＩＵ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシンおよび５×１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールを添加した５mlのＩＭＤＭ中の２×１０５スティミュレーター細胞(ＲＮＡをエレクトロポレーションしたＤＣ)中で培養した。応答したものを免疫化に使用するのと同じ抗原で刺激した。細胞を５日間、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。エフェクターを、５日目にＣＴＬアッセイで使用する前にHistopaque 1083勾配に回収した。
【００６９】
インビトロ細胞毒性アッセイ。５−１０×１０６標的細胞を、ユーロピウムで２０分、４℃で標識した。１０４ユーロピウム標識標的および種々のＥ：Ｔ比でのエフェクター細胞の連続希釈を、２００μｌの完全ＲＰＭＩ  １６４０でインキュベートした。プレートを５００ｇで３分遠心し、３７℃で４時間インキュベートした。５０μｌの上清を回収し、ユーロピウム放出を時間分解蛍光で測定した２１。具体的細胞毒性活性を式：％特異的放出＝｛(実験的放出−自然発生的放出)／(全放出−自然発生的放出)｝×１００を使用して測定した。標的細胞の自然発生的放出は、全アッセイの界面活性剤の合計の２５％より少なかった。トリプリケートの培養の平均の標準誤差は５％より小さかった。
【００７０】
実施例８。血管形成関連抗原での免疫化に応答したＣＴＬ活性
免疫化が血管形成関連生成物に対する耐性を破壊できるかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした同系ＤＣで免疫化し、上記のように、ＣＴＬ反応を脾臓細胞集団におけるインビトロの刺激に続いて測定した。ＣＴＬ検出に使用した標的は、アクチンｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡをトランスフェクトした同系ＢＬＫ.ＳＶ腫瘍細胞(Ｈ−２ｂ)であった。ＢＬＫ.ＳＶ細胞は、ほとんどの腫瘍細胞と同様、ＲＴ−ＰＣＲで測定して、ＶＥＧＦを発現する(データは示していない)。図３に示すように、マウスのＶＥＧＦ  ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣで免疫化したマウスはＣＴＬを刺激し、すべてのＢＬＫ.ＳＶ標的を認識した。図３は、ＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡでトランスフェクトした標的のみが、ＶＥＧＦＲ−２で免疫化したマウスから産生したＣＴＬにより認識されることを証明した。これは、ＢＬＫ.ＳＶ腫瘍細胞がＶＥＧＦＲ−２を発現しないことと一致する(データは示していない)。対照的に、アクチンｍＲＮＡまたは他のｍＲＮＡでトランスフェクトされたＢＬＫ.ＳＶ細胞は、アクチンに対して免疫化されたマウス由来のＣＴＬにより認識されなかった。これは、アクチンではなくＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２に対する耐性が、正常の遺伝子産物を代表するという事実にもかかわらず、破壊できる可能性を証明する。おそらく、これは、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２ならびに他の多くの血管形成関連生成物が、発現の限定された組織特異的パターンを示すという事実による。
【００７１】
実施例９。背面の皮膚のひだウィンドーチャンバーアッセイ(Dorsal Skin-Fold Window Chamber Assay)
マウスの背面の皮膚のひだウィンドーチャンバーアッセイに使用した設計および外科的技術の詳細は、他の場所に記載されている２２、２３。簡単に、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２をトランスフェクトしたＤＣまたはＰＢＳで免疫化したマウスを無作為に３群に分けた。実験の詳細を知らない研究者が残りの工程および測定のすべてを行った。ウィンドーチャンバーを置くための手術５日後、マウスに続いて腫瘍細胞(ＧＦＰを発現するＢ１６／Ｆ１０.９細胞)を移植した。この試みは、手術によりもたらされた血管の変化の解釈による干渉がないことを確実にする。腫瘍移植４日後、マウスを腫瘍増殖および血管形成の効果に関して評価した。腫瘍領域を、全腫瘍に関して低倍率造影で測定した。腫瘍血管形成は、高倍率(対物、×２０)を使用して、４つの無作為腫瘍領域に基づいて評価した。画像分析ソフトウェアを使用して、各画像で焦点を当てた全血管の累積の長さを測定した。血管の長さの密度を、フレーム内の全血管の長さの密度を、フレームの領域で割ることにより計算した。全画像を、同じ倍率のマイクロメートルの画像に対して計算した。
【００７２】
実施例１０。皮膚弁ウィンドーチャンバーモデルを使用した新規血管形成の測定
ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦのいずれかに対して免疫化したマウスにおいて血管形成が阻害されているかを測定するために、小腫瘍移植片における新規血管形成の発達を、上記の皮膚弁ウィンドーチャンバーモデルを使用してリアルタイムで追跡した。マウスに、３回、１週間間隔で、ＰＢＳを注射するか、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ−トランスフェクトＤＣで免疫化した。最後の免疫化４週間後、ウィンドーチャンバーを外科的に移植した。５日後、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を発現するＢ１６／Ｆ１０.９メラノーマ細胞を(続く分析を容易にするために)ウィンドーチャンバーに移植した。先に記載のように、腫瘍領域への血管の進入を毎日追跡し、画像分析により定量した２３。図４は、移植ＧＦＰ発現(図４の緑の第２および第４カラム)腫瘍塊への血管の進入を示す。ＰＢＳを注射されたマウスは、移植腫瘍塊への微小血管進入の典型的パターンを示し、通常の血管形成を説明する。対照的に、微小血管の著しい不足が、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦのいずれかに対して免疫化したマウスの移植腫瘍で見られた。これは、これらの抗原に対する免疫化が、血管形成の部分的阻害に関連することを説明する。ＰＢＳを注射したコントロールマウスと血管形成生成物に対して免疫化したマウスの間の差は、微小血管進入および微小血管構造密度を測定する画像分析を使用して確認した(データは示していない)。図４に示すデータは各群のおよび経時的な観察の代表である。
【００７３】
実施例１１。内皮細胞生成物および腫瘍抗原に対する免疫化は相乗的である
血管形成関連生成物に対して免疫化したマウスで見られた血管形成の減少した割合が腫瘍増殖に関連するかを測定するために、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２またはＶＥＧＦに対して免疫化したマウスにおける腫瘍増殖の阻害を、Ｂ１６／Ｆ１０.９メラノーマ実験的転移モデル１６および皮下的に移植したＭＢＴ−２膀胱腫瘍モデル１１、１７で試験した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＶＥＧＦはＢ１６／Ｆ１０.９およびＭＢＴ−２腫瘍細胞の両方で発現するが、ＶＥＧＦＲ−２もＴｉｅ２もいずれの腫瘍でも発現しないことを確認した(データは示していない)。図５Ａに示す実験において、Ｂ１６／Ｆ１０.９実験的転移モデルを使用して、肺転移における免疫化の影響を測定した。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２に対応するｍＲＮＡを、同系骨髄由来ＤＣにトランスフェクトし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１週間間隔で３回免疫化するのに使用した。最後の免疫化８日後、マウスをＢ１６／Ｆ１０.９腫瘍細胞で静脈内的に攻撃し、３５日後に肺転移を測定した。ＰＢＳを注射するかマウスアクチンｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで免疫化したマウスをコントロールとして使用した。本実験系で先に見られたように、Ｂ１６／Ｆ１０.９腫瘍ＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣは、肺転移の発達を阻害した(図５Ａ)。ＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣは同等な抗転移効果を有した。他方、Ｔｉｅ２またはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣでの免疫化の影響はより促進されていた。腫瘍阻害の同様なパターンがＭＢＴ−２膀胱腫瘍モデルで見られた(図５Ｂ)。ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ２が増殖している内皮細胞で発現し、ＭＢＴ−２またはＢ１６／Ｆ１０.９腫瘍細胞で発現しないが、各生成物に対して免疫化したマウスでまだ腫瘍増殖が阻害され、観察された腫瘍増殖の阻害は、腫瘍血管形成の阻害を介して媒介されているはずである。この結論は、ＶＥＧＦＲ−２に対する免疫化が、免疫化動物における血管形成の減少した状態を伴うことにより支持される。
【００７４】
実施例１２。抗血管形成および免疫治療的処置の組み合わせ
腫瘍を免疫学的破壊および同時の腫瘍血管形成の予防の標的にすることが相乗的抗腫瘍効果を発揮するかを測定するために、Ｂ１６／Ｆ１０.９およびＭＢＴ−２腫瘍ＲＮＡトランスフェクトＤＣを、腫瘍細胞により発現された抗体に対して発現した免疫応答の刺激に使用した。腫瘍ＲＮＡの源は、内皮細胞のような正常細胞を欠く組織培養マウス細胞系であった。腫瘍ＲＮＡトランスフェクトＤＣで免疫化したマウスで発現する免疫応答は、腫瘍間の交差反応性が観察されていないという事実から判断されるように、独特な腫瘍抗原を対象とし、共有していない１１。図６Ａは、Ｂ１６／Ｆ１０.９腫瘍ＲＮＡおよびＴｉｅ２  ｍＲＮＡで共免疫化したＢ１６／Ｆ１０.９腫瘍モデルが、いずれかのＲＮＡ単独での免疫化より優れていることを示す。同様に、図６Ｂおよび６Ｃは、ＭＢＴ−２  ＲＮＡおよびＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣで共免疫化したＭＢＴ−２モデルが、いずれかの抗原単独の使用より優れており、腫瘍発生の有意な遅延を導くことを示す。これらの実験は、腫瘍およびその血管形成に対する組み合わせ免疫化の価値を証明する。正常組織では沈黙しているが、８５％を超える癌で再活性化されているテロメラーゼのポリペプチド成分(ＴＥＲＴ)４３を、癌ワクチン接種における広範囲に有用な抗原として使用することができる１１、４４、４５。ＴＥＲＴに対する免疫化が、関係のない起源の数種の腫瘍に対するＣＴＬおよび保護的免疫性を誘発できる１１。図６Ｂは、さらにＶＥＧＦおよびＴＥＲＴの両方に対するマウスの免疫化が、ＶＥＧＦまたはＴＥＲＴのいずれか単独に対する免疫化よりも優れていることを証明し、二つの広範囲に発現されるプロトタイプ“ユニバーサル”腫瘍抗原のターゲティングが、抗腫瘍ワクチン接種の効果を改善することを示唆する。しかしながら、ＶＥＧＦが、本試験で使用したＢ１６／Ｆ１０.９およびＭＢＴ−２腫瘍細胞を含む腫瘍細胞でも発現されるため、ＶＥＧＦに対する免疫化の抗腫瘍効果が腫瘍、血管形成またはその両方への直接の効果を反映しているかは明らかではない。
【００７５】
実施例１３。既存の疾患に対する免疫治療
Ｂ１６／Ｆ１０.９メラノーマモデル：マウスを１×１０４  Ｆ１０.９細胞で皮下的に攻撃した(横腹に)。腫瘍移植３日後に、マウスを、マウスあたり２００μｌ  ＰＢＳ中５×１０５前駆体由来ＤＣで、３回、７日間隔で静脈内的に免疫化した。腫瘍増殖を、１０日目に開始し、１日おきに評価した。腫瘍サイズが２０mmに到達した時にマウスを殺した。
【００７６】
異なる抗原間の相乗効果を試験する実験のために、マウスを各抗原に関して、マウスあたり１００μｌ中の３×１０５  ＤＣで、組み合わせに関して２００μｌ中６×１０５  ＤＣで免疫化した。
【００７７】
実施例１４。既存疾患における抗血管形成および抗腫瘍治療の影響
既存疾患の経過中の抗腫瘍および抗血管形成免疫治療の影響を測定するために、上記のように、マウスに最初にＢ１６／Ｆ１０.９腫瘍細胞を移植し、続いて腫瘍移植３日後に免疫化プロトコールを開始した。図７Ａは、この経過において、抗ＶＥＧＦ免疫化治療の効果が、ＴＥＲＴまたはＶＥＧＦＲ−２に対する免疫化治療よりも明白であることを示す。マウスのＴＥＲＴおよびＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２に対する共免疫化は相乗的であり、増強された抗腫瘍活性を示す。図７Ｂおよび７Ｃは、さらに、他の腫瘍発現抗原、Ｂ１６メラノーマにおける優性抗原であるＴＲＰ−２と４６、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２に対する共免疫化が相乗的であり、腫瘍増殖の有意な遅延を導くことを証明する。
【００７８】
実施例１５。繁殖力における抗血管形成治療の効果
先の二つの試験においては、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質充填ＤＣで免疫化１０日後に免疫化されたマウスは妊娠できないが９、ＶＥＧＦＲ−２  ｃＤＮＡをコードする弱毒化サルモネラベクターで免疫化したマウスは創傷治癒にわずかな遅延を示すが、繁殖力に影響しない１０。
【００７９】
本発明の抗腫瘍免疫治療が繁殖力に影響を有するかを測定するために、マウスを、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２またはアクチンＲＮＡをエレクトロポレーションしたＤＣで３回、１週間間隔で免疫化した。最後の免疫化１週間および８週間後、マウスを非免疫化雄マウスと交配させた。これは、三組行った(ケージあたり２匹の雌対１匹の雄)。生まれた子供の数を記録し、子供を、疾病および異常の徴候、および離乳後の体重について試験した。
【００８０】
本試験において、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦに対して免疫化したマウスで血管形成の減少した割合が見られたにもかかわらず、６ヶ月にわたる観察の期間中、罹患および死亡の徴候は見られなかった。しかしながら、ＶＥＧＦではなく、ＶＥＧＦＲ−２に対してワクチン接種したマウスの繁殖力における一過性ではあるが明白な影響が示された。図８に示すように、ＶＥＧＦＲ−２に対してワクチン接種し、１週間後に交配させたマウスは妊娠しないが、交配を８週間まで遅らせた場合、ＶＥＧＦＲ−２免疫化マウスは、非免疫化マウスと同等の産子数および平均体重の胎児で繁殖した。これらの観察は、おそらく能動抗血管形成免疫応答の限定した持続を反映して、血管形成関連生成物に対するワクチン接種が一過性の不利な効果を有し得ることを示唆する。血管形成における同等な阻害効果にもかかわらず(図４)、繁殖力における抗ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２免疫化の異なる効果(図８Ａ)の理由は不明であり、さらなる試験が必要であろう。これは、免疫治療の経過において、血管形成関連生成物／抗原が異なる毒性プロフィールを示すこと、および低い毒性であるが明白な抗腫瘍活性を示す血管形成標的の同定が可能であることを示唆する。
【００８１】
実施例１６。統計
試験内の異なる実験群は、Kruskal-Wallis検定を使用して比較した。Mann-Whitney Ｕ検定を、２群間の肺重量の差における有意性を測定するために使用した。.０５(Ｐ＜.０５)より小さい確率を統計学的有意として使用した。腫瘍抗原および血管関連抗原の間の組み合わせ治療の有意性を測定するために、我々は種々の群に関して腫瘍発生の時間(触知可能な腫瘍の発現)を測定した。２群の比較は、log-rank検定(Mantel-Haenszel検定)を使用して行った。２群のさらなる比較は、各群の腫瘍発生までの中央時間の測定により行った。
【００８２】
上記で記載したすべての文献は、その全体を引用して本明細書に包含させる。また、以下のものが包含される：Plum et al, Vaccine 19:1294 (2001), Niethammer et al, Proc. Am. Ass. Can. Res. 43:324 (2002), Li et al, J. Exp. Med. 195:1575 (2002)およびWei et al, Nat. Med. 6 (10) :1160 (2001).
【００８３】
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【００８４】
現在の特許請求の範囲の対象の種々の詳細が、現在の特許請求の範囲の対象の範囲から逸脱することなく変更できることは理解されよう。さらに、前記は説明の目的のためであり、限定の目的はない。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】Ｉｄ１  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで免疫化したマウスにおける肺転移の阻害を証明するグラフである。
【図２】Ｉｄ１およびＢ１６腫瘍ＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣによる共免疫化の肺重量における効果を説明するグラフである。
【図３】ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞で免疫化したマウスにおけるＣＴＬ活性の導入を説明するグラフである。
【図４】血管形成関連生成物に対して免疫化したマウスにおける血管形成の阻害を説明する。
【図５Ａ】メラノーマモデルにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ２  ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで免疫化した後の腫瘍増殖の阻害を説明する。
【図５Ｂ】膀胱腫瘍モデルにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ２でトランスフェクトしたＤＣで免疫化した後の腫瘍増殖の阻害を説明する。
【図６Ａ】Ｂ１６腫瘍抗原およびＴｉｅ２の組み合わせ治療の結果を示す。
【図６Ｂ】ＭＢＴ−２  ｍＲＮＡまたはＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ−２の組み合わせ治療の結果を示す。
【図６Ｃ】触知可能な腫瘍の出現の時間を説明する。
【図７Ａ】移植後１８日の腫瘍サイズで示した腫瘍担持マウスの血管形成関連および腫瘍抗原でトランスフェクトしたＤＣでの免疫治療の結果を説明する。
【図７Ｂ】移植後２５日の腫瘍サイズで示した腫瘍担持マウスの血管形成関連および腫瘍抗原でトランスフェクトしたＤＣでの免疫治療の結果を説明する。
【図７Ｃ】ＶＥＧＦＲ−２およびＴＲＰ−２の組み合わせを投与されたマウスにおける触知可能な腫瘍の出現の時間を説明する。
【図７Ｄ】ＶＥＧＦおよびＴＲＰ−２の組み合わせを投与されたマウスにおける触知可能な腫瘍の出現の時間を説明する。
【図８Ａ】最終免疫化後１週間のマウスの繁殖力におけるＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣでの免疫化の効果を説明する。
【図８Ｂ】最終免疫化後８週間のマウスの繁殖力におけるＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣでの免疫化の効果を説明する。
【配列表】
2006502111.tif 000002
2006502111.tif 000003
2006502111.tif 000004
2006502111.tif 000005
【図１】
2006502111.tif 000006
【図２】
2006502111.tif 000007
【図３】
2006502111.tif 000008
【図４】
2006502111.tif 000009
【図５Ａ】
2006502111.tif 000010
【図５Ｂ】
2006502111.tif 000011
【図６Ａ】
2006502111.tif 000012
【図６Ｂ】
2006502111.tif 000013
【図６Ｃ】
2006502111.tif 000014
【図７Ａ】
2006502111.tif 000015
【図７Ｂ】
2006502111.tif 000016
【図７Ｃ】
2006502111.tif 000017
【図７Ｄ】
2006502111.tif 000018
【図８Ａ】
2006502111.tif 000019
【図８Ｂ】
2006502111.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月18日(2005.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006502111000001.app
【国際調査報告】
2006502111.tif 000021
2006502111.tif 000022