(57)【要約】本発明は、一般には、癌患者から得たヒト組織における遺伝子発現の変化に関する。具体的には、本発明は、乳房、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、前立腺、直腸および／または胃の癌組織における発現が、対応する正常組織における発現に比べて異なるヒト遺伝子に関する。
2006512923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の配列を含んでなる単離された核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の配列をコードする単離された核酸分子；
（ｃ）癌において発現され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の連続する全配列に対して、ヌクレオチド配列同一性が７５％以上であるタンパク質をコードする単離された核酸分子；および
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸分子の相補体を含んでなる単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項２】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における第３９０〜４８８０番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における第１２〜４９０４番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５における第４２４〜１９０８番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７における第４０５〜１８３５番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９における第８９〜１１５０番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１における第２２３〜１５６９番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３における第４１８〜１３９２番目のヌクレオチド；または
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５における第２７１〜１４３１番目のヌクレオチド
を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における第３９０〜４８８３番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における第１２〜４９０７番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５における第４２４〜１９１１番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７における第４０５〜１８３８番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９における第８９〜１１５３番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１における第２２３〜１５７２番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３における第４１８〜１３９５番目のヌクレオチド；または
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５における第２７１〜１４３４番目のヌクレオチド
を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における第３９０〜４８８３番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における第１２〜４９０７番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５における第４２４〜１９０８番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７における第４０５〜１８３５番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９における第８９〜１１５３番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１における第２２３〜１５６９番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３における第４１８〜１３９５番目のヌクレオチド；または
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５における第２７１〜１４３４番目のヌクレオチド
よりなることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
１つ以上の発現制御要素と機能しうるように結合されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子を含むよう形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項９】
原核宿主細胞および真核宿主細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子により形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子にコードされるタンパク質が発現される条件下で培養する工程を含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞は、原核宿主細胞および真核宿主細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の製造方法により製造される単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；および
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が７５％以上であるタンパク質
よりなる群から選択される単離されたポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載のタンパク質と結合する単離された抗体または抗原結合性抗体断片。
【請求項１５】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１３に記載のタンパク質をコードする核酸の発現を調節する薬物の同定方法であって、
前記核酸を発現する細胞を、薬物に暴露させる工程；および
前記薬物が、前記核酸の発現を調節するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記タンパク質をコードする核酸の発現を調節する薬物を同定することを特徴とする薬物の同定方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載のタンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物の同定方法であって、
前記タンパク質を発現する細胞を、薬物に暴露させる工程；および
前記薬物が、前記タンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記タンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物を同定することを特徴とする薬物の同定方法。
【請求項１８】
前記薬物は、前記タンパク質の１つの活性を調節することを特徴とする請求項１７に記載の薬物の同定方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載のタンパク質をコードする核酸の発現の調節方法であって、前記タンパク質をコードする核酸の発現を調節する薬物を、有効量で投与する工程を含むことを特徴とする発現の調節方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載のタンパク質の少なくとも１つの活性の調節方法であって、前記タンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬物を、有効量で投与する工程を含むことを特徴とする活性の調節方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載のタンパク質の結合パートナーの同定方法であって、
前記タンパク質を、結合パートナーの可能性のある物質に暴露させる工程；および
前記物質が、前記タンパク質と結合するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記タンパク質の結合パートナーを同定することを特徴とする結合パートナーの同定方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の結合パートナーと、請求項１３に記載のタンパク質の間の相互作用を調節する薬物の同定方法であって、
前記タンパク質を、前記結合パートナーと共に薬物に暴露させる工程；および
前記薬物が、前記結合パートナーと前記タンパク質の会合を調節するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記結合パートナーと前記タンパク質の会合を調節する薬物を同定することを特徴とする薬物の同定方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の結合パートナーと、請求項１３に記載のタンパク質の間の相互作用の調節方法であって、前記結合パートナーと前記タンパク質の会合を調節する薬物を、有効量で投与する工程を含むことを特徴とする相互作用の調節方法。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子を含むよう修飾されたヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項２５】
前記核酸分子は、コードされるタンパク質の発現を妨げる変異を含むことを特徴とする請求項２４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２６】
被験者における病気状態の治療方法であって、病的な細胞に対し、プロモーター要素またはエンハンサー要素と結合した、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸分子を含んでなる遺伝子構築物を挿入して、前記核酸分子の発現が、前記病気を抑制するようにする工程を含む病気状態の治療方法。
【請求項２７】
前記病的な細胞に対する挿入をｉｎ  ｖｉｖｏで完了することを特徴とする請求項２６に記載の病気状態の治療方法。
【請求項２８】
前記病的な細胞に対する挿入は、ウィルス性またはプラスミド性薬物の使用を更に含み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで完了されることを特徴とする請求項２６に記載の病気状態の治療方法。
【請求項２９】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子、または請求項１３に記載のタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、被験者における病気状態の診断方法。
【請求項３０】
前記病気状態は、癌であることを特徴とする請求項２６または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記病気状態は、悪性腫瘍であることを特徴とする請求項２６または２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記悪性腫瘍は、乳房、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、前立腺、直腸および／または胃に生じることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
希釈剤、並びに
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、少なくとも１０個のアミノ酸よりなる断片を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、保存的なアミノ酸置換体を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、自然発生アミノ酸配列変異体を含んでなる単離されたポリペプチド；および
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が７５％以上である単離されたポリペプチド
よりなる群から選択されるポリペプチドまたはタンパク質
を含んでなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者から得たヒト組織における遺伝子発現の変化に関する。具体的には、本発明は、乳房、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、前立腺、直腸および／または胃の癌組織における発現が、対応する正常組織における発現に比べて異なるヒト遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国においては、新たに癌と診断される例が１００万例を超え、約５０万人が癌で死亡している。癌の原因は数多く、また遺伝的体質、環境の影響、感染性の行為者（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）および加齢を始めとして、多岐にわたっている。これらが制御経路とその下流の奏功器経路を広範に脱線させて、正常細胞を癌性のものにトランスフォームさせる。細胞生理におけるいくつかの必須の改変（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）が、集団的に悪性の増殖、即ち増殖シグナルの自給、増殖抑制シグナルに対する非感受性、プログラムされた細胞死の回避、無限複製能、持続した血管形成および組織の浸潤・転移を指令する（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：５７−７０）。
【０００３】
今日までに、研究者たちは、癌発症の土台となると考えられる多くの遺伝子上の改変を同定することができた。これらの遺伝子上の改変には、癌遺伝子の増幅、および癌抑制遺伝子の欠損をもたらす変異が含まれる。癌遺伝子は初め、ウィルスが媒介し、その標的細胞にトランスフォーメーションを起こさせる遺伝子として同定された。主要なクラスのウィルス性癌遺伝子は、正常な細胞機能に関連する細胞性の対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）を有する。その細胞性の遺伝子は癌原遺伝子と呼ばれ、ある場合には、細胞内におけるその変異や以上が、癌形成に関連する。癌遺伝子の発生は、細胞性の癌原遺伝子が不適切に活性化される機能の獲得を示している。これには、タンパク質における変異性の変化、構成的活性化、過剰発現または発現の適時停止失敗が含まれうる。約１００種の癌遺伝子が同定されている。癌遺伝子の例にはｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ａｂｌおよびｍｙｂが含まれるが、これらに限定されない（Ｐｏｎｄｅｒ（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３３６−３４１）。癌抑制遺伝子は、その野生型対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）において、異常な細胞増殖を抑制するタンパク質を発現する。癌抑制タンパク質をコードする遺伝子が変異または消滅すると、結果として生じる変異タンパク質または癌抑制タンパク質発現の完全な欠損により、細胞増殖を正しく制御することができず、異常な細胞増殖が起こりうる（特に、細胞制御機構に対する損傷が既に存在していれば）。よく研究されているヒトの癌および癌細胞株には、癌抑制遺伝子が欠損していたり、機能を失っているものが多い。癌抑制遺伝子の例としては網膜芽細胞腫感受性遺伝子（またはＲＢ遺伝子）、ｐ５３遺伝子、結腸癌消失（ｔｈｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＣＣ）遺伝子および神経線維腫症１型（ＮＦ−１）癌抑制遺伝子（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１１３８−１１４６）が挙げられるが、これらに限定されない。癌抑制遺伝子の機能欠失または不活性化は、相当数のヒトの癌のイニシエーションおよび／または進行において、中心的な役割を果たしている可能性がある。
【０００４】
ゲノム全体の発現プロファイルを利用して、癌の分類、薬物標的の同定、診断マーカーの同定および／または化学療法による治療結果の更なる洞察を行うと、種々の癌を治療するためのより有効な戦略の設計を容易にすることができる。癌のサブタイプを同定するのに遺伝子の発現パターンを用いた初期的な研究はむしろ、興味をそそるような結果をもたらしている（Ｐｅｒｏｕら（１９９９）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９２１２−９２１７；Ｇｏｌｕｂら（１９９９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−５３７；Ａｌｉｚａｄｅｈら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−５１１；Ａｌｏｎら（１９９９）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：６７４５−６７５０；Ｂｉｔｔｎｅｒら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５３６−５４０；およびＰｅｒｏｕら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７４７−７５２を参照）。遺伝子発現のプロファイリングによるＢ細胞リンパ腫の分子的分類は、臨床的に区別されるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のサブグループを明らかにした（前記Ａｌｉｚａｄｅｈらの論文を参照）。乳癌においては、限られた数の遺伝子（８，１０２遺伝子）を用いた研究により、癌が遺伝子発現プロファイルに基づくサブタイプに分類されており、この研究によって、乳癌に関連する分子表現型の多様性が示されている（前記Ｐｅｒｏｕらの論文を参照）。更に、発現プロファイリングにより、研究者は、何千もの遺伝子に関し、組織特異的な発現レベルをマッピングすることができるようになった（Ａｌｏｎら（１９９９）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：６７４５−６７５０；Ｉｙｅｒら（１９９９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８３−８７；Ｋｈａｎら（１９９８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５００９−５０１３；Ｌｅｅら（１９９９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１３９０−１３９３；Ｗａｎｇら（１９９９）、Ｇｅｎｅ  ２２９：１０１−１０８；およびＷｈｉｔｎｅｙら（１９９９）、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４６：４２５−４２８）。これらの研究により、発現プロファイルは、癌などのヒトの疾患の診断における改善をもたらすために、また改良された治療戦略の開発に利用しうることが示されてはいるが、更なる研究が必要である。
【０００５】
【特許文献１】国際出願公開公報第ＷＯ  ９５／１１７５５号
【特許文献２】米国特許第４，９０８，７７３号
【特許文献３】米国特許第５，８８４，２３０号
【特許文献４】米国特許第５，８７３，０５２号
【特許文献５】米国特許第５，３３１，５７３号
【特許文献６】米国特許第５，８８８，７３８号
【特許文献７】米国特許第５，３９９，３４６号
【特許文献８】米国特許第４，７３６，８６６号
【特許文献９】米国特許第５，６０２，３０７号
【特許文献１０】米国特許第５，７２８，９１５号
【特許文献１１】米国特許第５，７３１，４９０号
【特許文献１２】米国特許第５，７２３，７１９号
【特許文献１３】米国特許第５，７３１，４８９号
【特許文献１４】米国特許第５，７２０，９３６号
【特許文献１５】米国特許第５，４８９，７４３号
【特許文献１６】米国特許第５，１４３，８５４号
【特許文献１７】国際出願公開公報第ＷＯ  ９０／１５０７０号
【特許文献１８】国際出願公開公報第ＷＯ  ９２／１００９２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌は、多種類の組織と複数の病因論的要素に由来するものであるがゆえに多様且つ不均一ではあるが、この根源的な変わりやすさは、あらゆる癌の発症においてその集中（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）が必須である、比較的少数の臨界的な事象にかかっている（ｌｉｅｓ）ことが示唆されている（ＥｖａｎおよびＶｏｕｓｄｅｎ（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３４２−３４８）。従って、癌の発症・増殖に関連する臨界的な分子マーカーを同定するため、数多くの様々な癌における、広範な遺伝子発現レベルの変化を包括的な検討する必要がある。当該技術において、癌のより正確な診断を可能にする物質および方法に対する必要性が依然として存在する。加えて、当該技術において、この疾患を効果的に治療しうる治療方法およびそのための薬物を同定する方法に対する必要性が依然として存在する。本発明は、これらおよびその他の必要性に応じたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、癌組織における発現が、正常組織に比べて異なる新規な遺伝子（以降、各々ＬＦＧ１、ＬＦＧ２、ＬＦＧ３、ＬＦＧ４、ＬＦＧ５およびＬＦＧ６と称する）に基づくものである。本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の配列を含んでなる単離された核酸分子、およびその相補体を含む。
本発明は更に、１つ以上の発現制御要素と機能しうるように結合されている核酸分子（前記核酸分子を含んでなるベクターを含む）を含む。本発明は更に、本発明の核酸分子を含むよう形質転換された宿主細胞、および本発明の核酸分子により形質転換された宿主細胞を、前記タンパク質が発現される条件下で培養する工程を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法を含む。
【０００８】
本発明は更に、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、少なくとも１０個のアミノ酸よりなる断片を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、保存的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換体を含んでなる単離されたポリペプチド；および
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、自然発生アミノ酸配列変異体を含んでなる単離されたポリペプチド
よりなる群から選択される単離されたポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはまた、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上または約７５％以上（好ましくは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が約８０％以上、より好ましくは約９０〜９５％以上、最も好ましくは約９５〜９８％以上）であるポリペプチドを含む。
【０００９】
本発明は更に、本発明のポリペプチドファミリーの他の要素の同定方法を提供する。具体的には、ＬＦＧ１、ＬＦＧ２、ＬＦＧ３、ＬＦＧ４、ＬＦＧ５およびＬＦＧ６タンパク質ファミリーの他の要素をコードする核酸分子を同定する方法において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の核酸配列をプローブとして用いる、またはＰＣＲプライマーの生成に用いることができる。
本発明は更に、本発明のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性抗体断片（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む）を提供する。
【００１０】
本発明は更に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子の発現を調節する薬物の同定方法であって、
前記核酸を発現する細胞を、薬物に暴露させる工程；および
前記薬物が、前記核酸の発現を調節するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記タンパク質をコードする核酸分子の発現を調節する薬物を同定することを特徴とする薬物の同定方法を提供する。
【００１１】
本発明は更に、本発明のタンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物の同定方法であって、
前記タンパク質を発現する細胞を、薬物に暴露させる工程；および
前記薬物が、前記タンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記タンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物を同定することを特徴とする薬物の同定方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子の発現の調節方法であって、前記タンパク質をコードする核酸分子の発現を調節する薬物を、有効量で投与する工程を含むことを特徴とする発現の調節方法を提供する。本発明はまた、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性の調節方法であって、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬物を、有効量で投与する工程を含むことを特徴とする活性の調節方法を提供する。
【００１３】
本発明は更に、本発明のタンパク質の結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ）の同定方法であって、
前記タンパク質を、結合パートナーの可能性のある物質に暴露させる工程；および
前記物質が、前記タンパク質と結合するか否かを決定する工程
を含んでなり、それらによって前記タンパク質の結合パートナーを同定することを特徴とする結合パートナーの同定方法を提供する。
【００１４】
本発明は更に、本発明のタンパク質の結合パートナーとの会合を阻害または調節しうる薬物の同定方法を提供する。具体的には、本発明のタンパク質（またはその断片）および結合パートナーを試験薬物に接触させ、次いで前記試験薬物が、前記タンパク質と結合パートナーの結合を阻害または減少するか否かを決定することにより、ある薬物を、本発明のタンパク質の結合パートナーとの会合を阻害、減少または調節する能力に関して試験することができる。
【００１５】
本発明は更に、本発明のタンパク質と、その１種以上の結合パートナーの会合を減少または阻害する方法であって、前記結合パートナーと前記タンパク質の結合を減少または阻害する薬物を、有効量で投与する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。この方法では、本発明のタンパク質または結合パートナーと結合する薬物を用いることができる。
本発明の他の態様によれば、本発明のタンパク質を、リガンド、治療薬その他のタイプの化学小分子を提供するための、合理的なドラッグデザインの出発点として用いることができる。或いは、上記スクリーニングアッセイにより同定された小分子その他の化合物は、合理的なドラッグデザインにおける「リード化合物」として役立つ場合がある。
【００１６】
本発明は更に、癌の治療方法であって、癌性細胞に対し、プロモーター要素またはエンハンサー要素と機能しうるように結合した、本発明の核酸分子を含んでなる遺伝子構築物を挿入して、前記核酸分子の発現が、前記癌を抑制するようにする工程を含む治療方法に関する。
本発明は更に、本発明の核酸分子を含むよう修飾されたヒトではないトランスジェニック動物、または、変異核酸分子を含むよう修飾されて、コードされた本発明のポリペプチドの発現が妨げられているヒトではないトランスジェニック動物を含む。
【００１７】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の配列を全部または一部含んでなる遺伝子の全体または一部が、ゲノムからノックアウトされまたは欠失しているヒトではないトランスジェニック動物を含む。
本発明は更に、癌の診断方法であって、被験者から組織、血液、尿その他の試料を取得し、次いで本発明の核酸分子または本発明のポリペプチドの発現レベルを測定する工程を含む診断方法を提供する。
【００１８】
本発明は更に、希釈剤、並びに
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、少なくとも１０個のアミノ酸よりなる断片を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、保存的なアミノ酸置換体を含んでなる単離されたポリペプチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の、自然発生アミノ酸配列変異体；および
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上または約７５％以上（好ましくは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が約８０％以上、より好ましくは約９０〜９５％以上、最も好ましくは約９５〜９８％以上）である単離されたポリペプチド
よりなる群から選択されるポリペプチドまたはタンパク質
を含んでなる組成物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
Ｉ．一般的記載
本発明は、部分的には、ヒト癌性組織における発現が、ヒト正常組織における発現に比べて異なる新規な遺伝子ファミリーの同定に基づくものである。これらの遺伝子ファミリーは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３および１５のヒトｃＤＮＡに対応する。
本発明の遺伝子およびタンパク質は、癌を検出したり、試料中の癌腫を正常組織から区別するための診断薬またはマーカーとして利用しうる。それらはまた、遺伝子発現または活性を調節する薬物の標的としても役立つ。例えば、癌の増殖に関連する生物学的過程（癌の過形成的（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ）過程を含む）を調節する薬物を同定しうる。
【００２０】
ＩＩ．特定の実施形態
Ａ．癌関連タンパク質
本発明は、単離されたタンパク質、タンパク質の対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）およびタンパク質の保存的なアミノ酸置換体を提供する。本明細書において、「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、一つには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載のヒトアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。これらの用語はまた、自然発生対立遺伝子変異体、および具体的に上記されたアミノ酸配列と若干異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。対立遺伝子変異体は、上記のアミノ酸配列と若干異なるアミノ酸配列を有するが、これらのタンパク質が関連するものと同じ、または類似の生物学的機能を依然として有している。
【００２１】
本明細書において、ヒトアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に関連するタンパク質のファミリーとは、ヒトに加え、生物から単離されたタンパク質をいう。これらのタンパク質に関連するタンパク質のファミリーの他の要素を同定・単離するのに用いられる方法については後述する。
本発明のタンパク質は、好ましくは単離された形態にある。本明細書においては、物理的、機械的または化学的方法を用いて、タンパク質に通常付随する細胞構成分からタンパク質を分離しているときに、タンパク質が単離されているという。当業者は、単離されたタンパク質を、通常の精製方法を用いて容易に得ることができる。
【００２２】
本発明のタンパク質は更に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の挿入、欠失または保存的なアミノ酸置換変異を含む。本明細書において、「保存的な変異」とは、タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の改変をいう。改変された配列がタンパク質の関連する生物学的機能を妨げ、または破壊するとき、置換、挿入または欠失がタンパク質に悪影響を及ぼすという。例えば、ある場合においては、タンパク質の総電荷、構造または疎水性／親水性を、生物活性に悪影響を及ぼすことなく改変しうる。従って、アミノ酸配列を改変し、タンパク質の生物活性に悪影響を及ぼすことなく、ペプチドを例えばより親水性または疎水性にすることができる。
【００２３】
通常、対立遺伝子変異体、保存的な置換変異体およびタンパク質ファミリーの要素は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上または約７５％以上（より好ましくは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対して、アミノ酸配列同一性が約８０％以上、更に好ましくは約９０〜９５％以上、最も好ましくは約９５〜９８％以上）であるアミノ酸配列を有する。本明細書において、そのような配列における「同一性」または「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは、候補配列（必要に応じて、相同性の比率が最大となるよう、配列を一直線にし、切れ目を入れた後のもので、保存的な置換は一切、配列同一性の一部とは見なさない）における、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６と同一のアミノ酸残基の比率と定義される（同等のパラメータに関し、セクションＢを参照されたい）。融合タンパク質や、Ｎ末端、Ｃ末端または内部におけるペプチド配列の延長、欠失または挿入は、相同性に影響すると解釈しない。
【００２４】
従って、本発明のタンパク質は、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に開示されるアミノ酸配列を有する分子；
これらのタンパク質の約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基からなる連続した配列を有するその断片；
開示されるコーディング配列のＮ末端、Ｃ末端または内部に、１つ以上のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列変異体；および
１つ以上の残基が置換された、開示される配列のアミノ酸配列変異体、または上記で定義されたその断片
を含む。そのような断片（ペプチドまたはポリペプチドとも称する）には、抗原性領域、タンパク質の機能性領域（既知タンパク質ドメインに対応するアミノ酸配列の領域として同定される）や、明白な親水性を有する領域が含まれていてもよい。それらの領域はいずれも、一般に入手可能なタンパク質配列解析ソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製））を用いて、容易に同定しうる。
【００２５】
予想される変異には更に、所定の突然変異（例えば、相同的組替え、部位特異的またはＰＣＲ突然変異誘発、および他の動物種（ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヒト以外の霊長目の種が含まれるが、これらに限定されない）によるもの）を含むものや、タンパク質ファミリーにおける対立遺伝子変異その他の自然発生変異、タンパク質が、置換、化学的、酵素的その他の適切な手段により、天然アミノ酸以外の部位（例えば、酵素や放射性同位元素などの検出可能な部位）による共有結合性の修飾を受けた誘導体が含まれる。
【００２６】
本発明は更に、希釈剤および本発明のタンパク質またはポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。適切な希釈剤は水性または非水性の溶媒、またはそれらの組み合わせであってよく、また、タンパク質またはポリペプチドの安定性、溶解性、活性および／または保存に寄与する付加的な成分、例えば水溶性の塩やグリセロールを含んでいてもよい。
【００２７】
以下に記載するように、タンパク質ファミリーの要素は、
（１）タンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物の同定に；
（２）タンパク質の結合パートナーの同定に；
（３）モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生じる抗原として；
（４）治療薬または治療標的として；また
（５）癌の診断薬またはマーカーとして
利用することができる。
【００２８】
Ｂ．核酸分子
本発明は更に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の配列を有するタンパク質、および本明細書に記載のその関連タンパク質をコードする、好ましくは単離された形態の核酸分子を提供する。本明細書において、「核酸」とは、
・上記に定義したタンパク質またはペプチドをコードする；
・そのようなペプチドをコードする核酸配列に相補的な；
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の核酸と、適切な厳密な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリダイズし、安定な結合を維持する；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のペプチド配列と、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上または約７５％以上（より好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０〜９５％以上、最も好ましくは約９５〜９８％以上）を共有するポリペプチドをコードする；または
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５のオープンリーディングフレームに対して、ヌクレオチド配列同一性が約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上または約７５％以上（より好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０〜９５％以上、最も好ましくは約９５〜９８％以上）である
ＲＮＡまたはＤＮＡと定義される。
【００２９】
本発明は更に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の相補体と特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子、特に、オープンリーディングフレーム全体と特異的にハイブリダイズする分子を含む。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の相補体と特異的にハイブリダイズするそのような分子は、典型的には、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００３０】
具体的に予測されるのは、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子に加え、天然由来でも合成品でもよい、他方の骨格（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）に基づく、または他方の塩基（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂａｓｅｓ）を含む核酸である。しかし、そのようなハイブリダイズする、または相補的な核酸は更に、本発明のタンパク質をコードする核酸、本発明のタンパク質をコードする核酸と適切な厳密な条件下でハイブリダイズする、または本発明のタンパク質をコードする核酸と相補的な核酸を含む、あらゆる従来技術の核酸に対し新規であって容易ではないと定義される。
【００３１】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性探索（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ）に合わせた、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘプログラムに用いられるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）解析によって測定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２およびＫａｒｌｉｎら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、これらはいずれも参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＢＬＡＳＴプログラムに用いられるアプローチは、まず、クエリー（ｑｕｅｒｙ）配列とデータベース配列の間の類似セグメントを熟慮（ギャップありまたはなしで）し、次いで、同定された適合箇所全ての統計的有意性を評価し、最後に、それらの適合箇所のうちあらかじめ選択した有意性のしきい値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を満足するもののみを合計する、というものである。配列データベースの類似性探索における基本的な事項の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの文献（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４）、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６：１１９−１２９）を参照されたい。この文献は参照により全体が本明細書に組み入れられる。ヒストグラム、記述、整列、期待値（即ち、データベース配列に対する適合箇所の報告のための、統計的有意性のしきい値）、カットオフ、行列およびフィルター（低複雑度）の探索パラメータは、デフォルトの設定とする。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘが用いるデフォルトのスコアリング行列（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）は、長さが８５ヌクレオチドまたはアミノ酸を超えるクエリー配列について推奨される、ＢＬＯＳＵＭ６２行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９、この文献は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【００３２】
ｂｌａｓｔｎに関しては、Ｎ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア）に対するＭ（適合箇所の残基一組あたりの報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ））の比によってスコアリング行列を設定する。ＭとＮのデフォルト値は各々５および−４である。ｂｌａｓｔｎの４つのパラメータは、Ｑ＝１０（ギャップ形成ペナルティー（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ））、Ｒ＝１０（ギャップ延長ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ））、ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ったウィンク位置毎の（ａｔ  ｅｖｅｒｙ  ｗｉｎｋｔｈ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）ワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔｓ）を生成する）およびｇａｐｗ＝１６（ウィンドウ幅（その範囲内でギャップ付きの整列を行う）を設定する）のように調節される。Ｂｌａｓｔｐの同等のパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１およびｇａｐｗ＝３２であった。配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較（ＧＣＧ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０において可能）では、ＤＮＡのパラメータであるＧＡＰ＝５０（ギャップ形成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ延長ペナルティー）を用い、タンパク質の比較における同等の設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００３３】
「厳密な条件」とは、（１）洗浄に低いイオン強度および高温を用いる条件（例えば、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ＳＤＳ、５０℃）、または（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤（例えばホルムアミド）を用いる条件（例えば、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド（０．１％ウシ血清アルブミンを含む）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、４２℃）を言う。他の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン中、４２℃でハイブリダイゼーションを行い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で洗浄を行うことである。当業者であれば、厳密度条件を適宜決定・変更し、明瞭かつ検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得ることを容易に行うことができる。好ましい分子は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の相補体と上記の条件下でハイブリダイズし、機能性または全長タンパク質をコードするものである。ハイブリダイズするより好ましい分子は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５のオープンリーディングフレームの相補鎖と上記の条件下でハイブリダイズするものである。
本明細書においては、核酸分子が他のポリペプチドをコードする混入核酸分子から実質的に分離されているとき、核酸分子が「単離されている」という。
【００３４】
本発明は更に、開示される核酸分子の断片を提供する。本明細書において、核酸分子の断片とは、コードしている、またはコードしていない配列の小さな一部をいう。断片のサイズは意図する用途によって決まる。例えば、タンパク質の活性部分をコードするように断片を選択する場合、断片は、タンパク質の機能性領域をコードするに足る大きさである必要がある。例えば、推定される抗原性領域に対応するペプチドをコードする断片を調製する場合もある。断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられるものであるならば、プロービング／プライミング中に偽の陽性が比較的少数となるように断片長を選択する（セクションＧにおける考察を参照）。
【００３５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプローブまたは特定プライマーとして、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するのに用いられる、本発明の核酸分子の断片（即ち合成オリゴヌクレオチド）は、化学的手法（例えば、ホスホルアミダイト法（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０３：３１８５−３１９１））、または自動化合成法により容易に合成することができる。加えて、より大きなＤＮＡセグメントは、公知の方法、例えば、遺伝子の種々のモジュラーセグメント（ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ）を定義する一群のオリゴヌクレオチドを合成し、次いでそのオリゴヌクレオチドを結合し、完全な修飾遺伝子を構築することにより容易に調製することができる。
【００３６】
本発明の核酸分子を更に修飾して、診断、プローブを目的とする検出可能なラベルを含むようにしてもよい。そのような種々のラベルが当該技術分野において知られており、本明細書に記載のコード分子に対して容易に用いることができる。適切なラベルには、ビオチン、放射能ラベルまたは蛍光ラベルされたヌクレオチドなどが含まれるが、それらに限定されない。そのような何らかのラベルを用いて、本発明の核酸分子のラベル化変異体を得ることは、当業者であれば容易に行うことができる。
【００３７】
Ｃ．他の関連核酸分子の単離
上記のように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の配列を有する核酸分子の同定・キャラクタリゼーションは、当業者に対し、本明細書に記載の配列のみならず、タンパク質ファミリーの他の要素をコードする核酸分子の単離を可能にする。更に、ここに開示される核酸分子は、当業者に対し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の配列を有するタンパク質のみならず、タンパク質ファミリーの他の要素をコードする核酸分子の単離を可能にする。
【００３８】
例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を用いて、適切な細胞から調製した発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを生成することは、当業者であれば容易に行うことができる。典型的には、精製タンパク質（下記のような）で免疫した哺乳類（例えばウサギ）からのポリクローナル抗血清や、モノクローナル抗体を用いて、哺乳類ｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリー（例えばラムダｇｔｌｌライブラリー）をプローブし、タンパク質ファミリーの他の要素についての適切なコード配列を得ることができる。クローン化ｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として、それ自身の制御配列を用いて直接に、または、酵素の発現に用いる特定の宿主に対して適切な制御配列を用いる構築物によって発現させることができる。
【００３９】
或いは、本明細書に記載のコード配列の一部を合成してプローブとして用い、何らかの哺乳類生物から、タンパク質ファミリーの要素をコードするＤＮＡを回収することができる。約１８〜２０ヌクレオチド（一続きの（ｓｔｒｅｔｃｈ）約６〜７アミノ酸をコードする）を含むオリゴマーを調製し、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いて、厳密な条件下、または過度なレベルの偽の陽性を排除するのに十分な厳密度のある条件下でのハイブリダイゼーションを得る
【００４０】
更に、ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマー対を調製して、コーディング核酸分子を選択的にクローニングすることができる。そのようなＰＣＲプライマーを用いるための、ＰＣＲ変性／アニール／延長サイクルは、当該分野において公知であり、他のコーディング核酸分子の単離にも容易に適合させることができる。
【００４１】
既存のゲノムその他の配列情報中において、何らかの利用可能なコンピューター手法（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２）、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：３９８６−３９９０）、３Ｄ−ＰＳＳＭ（Ｋｅｌｌｙら（２０００）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９９：４９９−５２０）その他のコンピューター解析法（Ｓｈｉら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６２：１３２−１３８、およびＭａｔｓｕｎａｍｉら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６０１−６０４）が含まれるが、それらに限定されない）を用いて、タンパク質ファミリーの他の要素をコードする核酸分子が同定されることもありうる。
【００４２】
Ｄ．核酸分子を含むｒＤＮＡ
本発明は更に、コーディング配列を含む組み換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書において「ｒＤＮＡ分子」とは、ｉｎ  ｓｉｔｕで分子操作（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）に付されたＤＮＡ分子をいう。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は、当該分野において公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１を参照されたい。好ましいｒＤＮＡ分子においては、コーディングＤＮＡ配列が発現制御配列および／またはベクター配列と機能しうるように結合されている。
【００４３】
本発明のタンパク質ファミリーコーディング配列が機能しうるように結合されるベクター配列および／または発現制御配列の選択は、当該分野において知られているように、所望の機能特性（例えば、タンパク質の発現や、形質転換すべき宿主細胞）に直接的に依存する。本発明が予期する（ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｄ）ベクターは、ｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の、少なくとも複製および宿主染色体への挿入、好ましくは更に発現を指揮することができる。
機能しうるように結合したタンパク質コーディング配列の発現を調節するために用いられる発現制御要素は、当該分野において公知であり、これには誘導可能（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーター、構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター、分泌シグナルその他の制御要素が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、誘導可能プロモーターは容易に制御されるもの、例えば宿主の培地中の栄養分に敏感に反応するものである。
【００４４】
一実施形態において、コーディング核酸分子を含むベクターは、原核細胞性レプリコン、即ち、組み換えＤＮＡ分子により形質転換された原核宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）における、染色体外でのその組み換えＤＮＡ分子の自主的な複製および保全を指揮する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなレプリコンは、当該分野において公知である。更に、原核細胞性レプリコンを含むベクターは、その発現が検出可能なマーカー、例えば薬剤耐性をもたらす（ｃｏｎｆｅｒｓ）遺伝子をも含んでいてよい。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性をもたらすものである。
【００４５】
原核細胞性レプリコンを含むベクターは更に、細菌宿主細胞（例えば大腸菌）におけるコーディング配列の発現（転写および翻訳）を指揮する能力を有する原核細胞性またはバクテリオファージプロモーターを含んでいてもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および翻訳の発生を許可するＤＮＡ配列により形成された発現制御要素である。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に便利な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。そのようなベクターの典型的なものは、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州リッチモンド）より入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、並びにＰｈａｒｍａｃｉａ社（ニュージャージー州ピスキャタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））より入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。
【００４６】
真核細胞に適合する、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターは、コーディング配列を含むｒＤＮＡ分子の形成にも利用できる。真核細胞発現ベクター（ウィルスベクターを含む）は、当該分野において公知であり、いくつかの商業的供給源より入手可能である。典型的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に便利な制限部位を含んで提供される。そのようなベクターの典型的なものは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社）、本明細書に記載のベクターｐＣＤＭ８その他同様の真核細胞発現ベクターである。必要であれば、組織特異的プロモーターを含むようベクターを修飾してもよい。
【００４７】
本発明の組み換えＤＮＡ分子の構築に用いる真核細胞発現ベクターは更に、真核細胞内で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含んでいてもよい。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子である、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（１９８２）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｎａｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７−３４１）。或いは、選択マーカーは別個のプラスミド上に存在していてもよい。そして、２種のベクターを共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により宿主細胞に導入し、選択マーカーに対して適切な薬剤中で培養することにより選択する。
【００４８】
Ｅ．外因性の（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｄ）コーディング核酸分子を含む宿主細胞
本発明は更に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞のいずれでもよい。本発明のタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞株が細胞培養法に適合性を有し、また発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現にも適合性を有する限り、特に限定されない。好ましい真核宿主細胞には、酵母、昆虫および哺乳動物細胞（好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒト細胞株から得られるもの）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい真核宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣよりＣＣＬ６１として入手可能なもの）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）（ＡＴＣＣよりＣＲＬ１６５８として入手可能なもの）、新生児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）および同様の真核細胞組織培養細胞株が含まれる。
本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子の発現は、あらゆる原核細胞性宿主を用いて行うことができる。好ましい原核細胞性宿主は大腸菌である。
【００４９】
本発明のｒＤＮＡ分子による適切な宿主細胞の形質転換は、公知の方法（典型的には、使用するベクターと使用する宿主系に依存する）により達成することができる。原核細胞性宿主細胞の形質転換に関しては、典型的には電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）および塩処理法を用いる（例えば、Ｃｏｈｅｎら（１９７２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２１１０および上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）。ｒＤＮＡを含むベクターによる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、典型的には電気穿孔法や、カチオン性脂質または塩処理法を用いる（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）、Ｖｉｒｏｌ．  ５２：４５６；およびＷｉｇｌｅｒら（１９７９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：１３７３−１３７６を参照）。
【００５０】
成功裡に形質転換された（即ち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む）細胞の同定は、選択マーカーに関する選択を初めとする公知の方法により可能である。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入により生じた細胞をクローン化して、単一コロニーを形成することができる。
これらのコロニーから得た細胞を培養し、溶解して、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ９８：５０３やＢｅｒｅｎｔら（１９８５）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３：２０８に記載の方法などの方法によりそのＤＮＡ含量を試験し、ｒＤＮＡの存在を調べたり、細胞から生成したタンパク質を免疫学的手法により試験することができる。
【００５１】
Ｆ．ｒＤＮＡ分子を用いる組み替えタンパク質の製造
本発明は更に、本明細書に記載の核酸分子を用いて、本発明のタンパク質を製造する方法を提供する。一般的に言って、組み替え型タンパク質の製造には、下記の工程が含まれる。
まず、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の配列、或いは、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における第３９０〜４８８３番目または第３９０〜４８８０番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における第１２〜４９０７番目または第１２〜４９０４番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５における第４２４〜１９１１番目または第４２４〜１９０８番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７における第４０５〜１８３８番目または第４０５〜１８３５番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９における第８９〜１１５３番目または第８９〜１１５０番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１における第２２３〜１５７２番目または第２２３〜１５６９番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３における第４１８〜１３９５番目または第４１８〜１３９２番目のヌクレオチド；或いは
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５における第２７１〜１４３４番目または第２７１〜１４３１番目のヌクレオチド
を含んでなる（或いは、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる）核酸分子を得る。コーディング配列がイントロンにより途切れていなければ、これらはオープンリーディングフレームであるから、何らかの宿主における発現に直接に適切である。
【００５２】
次いで、好ましくは、核酸分子を、上記のような適切な制御配列と結合させて、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現ユニットを形成する。発現ユニットを用いて適切な宿主を形質転換させ、形質転換させた宿主を、組み替えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。場合により、組み替えタンパク質を培地または細胞から単離するが、ある種の不純物が許容しうるものであるような場合、タンパク質の回収・精製が不要な場合もある。
【００５３】
前記の工程は、種々の方法で実施することができる。例えば、所望のコーディング配列をゲノム断片から取得し、適切な宿主において直接用いてもよい。種々の宿主において機能しうる発現ベクターの構築は、上記のような適切なレプリコンおよび制御配列を用いて達成される。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子の発現に用いる宿主細胞の種類に依存し、過去に詳細に検討されている。コーディング配列の末尾に適切な制限部位を追加し（通常ではそれを利用できない場合）、これらのベクターを挿入するために切断しうる（ｅｘｃｉｓａｂｌｅ）遺伝子を提供してもよい。当該分野において使用が知られる何らかの宿主／発現系を、本発明の核酸分子に適合させて、組み替えタンパク質を製造することは、当業者であれば容易に行うことができる。
【００５４】
Ｇ．癌に関連する遺伝子をコードする核酸の発現を調節する薬物の同定方法
本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする核酸の発現を調節する薬物の同定方法を提供する。そのような試験には、本発明の核酸の発現レベル変化を監視するための、利用可能なあらゆる手段を利用してよい。本明細書においては、ある薬物が、細胞内における核酸の発現を上方または下方調整しうる場合、その薬物は本発明の核酸の発現を調節するという。
【００５５】
１つの試験様式では、
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における第３９０〜４８８３番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における第１２〜４９０７番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５における第４２４〜１９１１番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７における第４０５〜１８３８番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９における第８９〜１１５３番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１における第２２３〜１５７２番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３における第４１８〜１３９５番目のヌクレオチド；
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５における第２７１〜１４３４番目のヌクレオチド；および／または
５‘および／または３’制御要素によって定義されるオープンリーディングフレーム内からのヌクレオチドと、試験可能な何らかの融合パートナー（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）の間でのレポーター遺伝子融合体（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ）を含む細胞株を調製してよい。試験可能な融合パートナーは数多く知られており、容易に入手可能である。これには、ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（Ａｌａｍら（１９９０）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８８：２４５−２５４）が含まれる。次いで、レポーター遺伝子融合体を含む細胞株を、適切な条件下、試験すべき薬物に適切な時間だけ曝露する。薬物に曝露した試料とコントロール試料の間で、レポーター遺伝子の発現に差があることで、本発明の核酸の発現を調節する薬物が同定される。
【００５６】
更なる試験様式を用いて、薬物の、本発明のタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする核酸の発現を調節する能力を監視してもよい。例えば、上記したように、本発明の核酸に対するハイブリダイゼーションにより、ｍＲＮＡの発現を直接的に監視してもよい。適切な条件下、細胞株を試験すべき薬物に適切な時間だけ曝露し、標準的な手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１に開示されているもの）により、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離する。
【００５７】
好ましい細胞は、ヒト由来の細胞、例えば、癌患者から得た生検組織または培養細胞である。ＡＴＣＣ乳管癌（ｂｒｅａｓｔ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株(カタログ番号ＣＲＬ−２３２０、ＣＲＬ−２３３８およびＣＲＬ−７３４５)、ＡＴＣＣ回腸結腸腺癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＣＣＬ−２２２、ＣＣＬ−２２４、ＣＣＬ−２２５、ＣＣＬ−２３４、ＣＲＬ−７１５９およびＣＲＬ−７１８４）、ＡＴＣＣ腎細胞腫（ｋｉｄｎｅｙ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＨＴＢ−４６およびＨＴＢ−４７）、ＡＴＣＣ腎細胞腺癌（ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−１６１１、ＣＲＬ−１９３２およびＣＲＬ−１９３３）、ＡＴＣＣ肝細胞癌細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−２２３３、ＣＲＬ−２２３４およびＨＢ−８０６５）、ＡＴＣＣ肺腺癌（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−５９４４、ＣＲＬ−７３８０およびＣＲＬ−５９０７）、ＡＴＣＣリンパ腫細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−７９３６、ＣＲＬ−７２６４およびＣＲＬ−７５０７）、ＡＴＣＣ卵巣腺癌（ｏｖａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＨＴＢ−１６１、ＨＴＢ−７５およびＨＴＢ−７６）、ＡＴＣＣ膵臓腺癌（ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−１６８７、ＣＲＬ−２１１９およびＨＴＰ−７９）、前立腺癌細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−１４３５、ＣＲＬ−２４２２およびＣＲＬ−２２２０）、ＡＴＣＣ胃腺癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−１７３９、ＣＲＬ−１８６３およびＣＲＬ−１８６４）等の細胞株を利用してもよい。或いは、入手可能な他の細胞または細胞株を利用してもよい。
【００５８】
薬物に暴露した細胞と対照細胞の間の、ＲＮＡ発現レベルの差を検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製しうる。厳密度の高い条件下では標的核酸としかハイブリダイズしないプローブを設計することが、必須ではないが好ましい厳密度の高い条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドだけが形成される。従って、ハイブリッドを形成するために、２本の核酸鎖間に存在すべき相補性の程度は、試験条件の厳密度によって決まる。プローブ／標的ハイブリッドとプローブ／非標的ハイブリッドの間の安定度の差が最大となるように、厳密度を選択すべきである。
【００５９】
プローブは、本発明の核酸から、当該分野において既知の方法により設計しうる。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量とプローブ長は、プローブの標的配列への結合に影響する。プローブの特異性を最適化する方法は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９において、一般に入手可能である。
【００６０】
各プローブに対し必要に応じて、ハイブリダイゼーション条件を既知の（例えば、上記ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらに記載の）方法により修飾する。総細胞ＲＮＡ、またはポリＡ−ＲＮＡ用にエンリッチしたＲＮＡのハイブリダイゼーションは、あらゆる可能な様式で達成しうる。例えば、総細胞ＲＮＡ、またはポリＡ−ＲＮＡをエンリッチしたＲＮＡを固相担体に固定し、その固相担体を、少なくとも１種の本発明の配列、またはその一部を含んでなる少なくとも１種のプローブに、そのプローブが特異的にハイブリダイズする条件下で暴露することができる。或いは、少なくとも１種の本発明の配列、またはその一部を含んでなる核酸断片を、固相担体、例えばシリコンチップ、または多孔性ガラスのウェハーや膜に固定することもできる。次いで固相担体を、総細胞ＲＮＡ、または試料から得たポリＡ−ＲＮＡに、固定した配列が特異的にハイブリダイズする条件下で暴露することができる。そのような固相担体およびハイブリダイゼーション方法は、広範囲に利用可能である。例えば、特許文献１（Ｂｅａｔｔｉｅ（１９９５））に開示されるものである。あるプローブの、未処理の細胞母集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と、薬物に暴露した細胞の母集団に対する、特異的にハイブリダイズする能力を試験することにより、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の配列を有するタンパク質をコードする核酸の発現を上方または下方調整する薬物が同定される。
【００６１】
ｍＲＮＡの定性および定量分析のためのハイブリダイゼーションはまた、ＲＮａｓｅ保護試験（ＲＰＡ、Ｍａら（１９９６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：  ２７３−２３８を参照）を用いて行ってもよい。簡単に言うと、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡと、ファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を含んでなる発現媒体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｈｉｃｌｅ）を、ｃＤＮＡ分子の３’末端側、ファージプロモーターの下流側で直線化する（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）。次いでそのような直線化分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による、ｃＤＮＡのラベル化アンチセンス転写物合成の鋳型に用いる。次いでラベル化転写物を、単離したＲＮＡ混合物（即ち、総ＲＮＡまたは分画したＲＮＡ）と、８０％ホルムアミド、４０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ  ６．４）、０．４Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでなる緩衝液中、４５℃で終夜インキュベートしてハイブリダイズさせる。次いで、得られたハイブリッドを、４０μｇ／ｍｌ  リボヌクレアーゼＡおよび２μｇ／ｍｌ  リボヌクレアーゼを含んでなる緩衝液中で消化する。外来の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）タンパク質を不活性化・抽出した後、解析のため試料を尿素／ポリアクリルアミドゲルにかける。
【００６２】
別の試験では、本遺伝子産物の発現に影響する薬物を同定するため、本発明の遺伝子産物を生理的に発現する細胞または細胞株をまず同定する。そのように同定された細胞および／または細胞株は、必要な細胞性装置（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を含み、適切な表面形質導入機構（ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）および／または細胞質性カスケード（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｃａｓｃａｄｅｓ）により、薬物の外因性の接触についての、転写装置の忠実な調節が維持されると考えられる。また、そのような細胞または細胞株は、本遺伝子産物（本遺伝子産物に固有の、１つ以上の抗原性断片と融合している）をコードする構造遺伝子の、機能しうる、翻訳されないプロモーターを含有する５’末端を含んでなる発現媒体（例えばプラスミドまたはウィルスベクター）構築物により形質導入またはトランスフェクションされ、前記断片は、前記プロモーターの転写制御下にあり、ポリペプチド（その分子量が、天然のポリペプチドと区別しうるか、免疫学的に区別されるタグその他の検出可能なマーカーを更に含んでいてよい）として発現される。そのような方法は、当該分野において公知である（前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）。
【００６３】
次いで、先に概説した、形質導入またはトランスフェクションされた細胞または細胞株を、適切な条件下で薬物と接触させる。例えば、薬物は薬学的に許容される賦形剤に含まれ、水性生理的緩衝液（例えば、生理的ｐＨのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理的ｐＨのＥａｇｌｅｓ緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳまたはＢＳＳ、或いはＰＢＳおよび／またはＢＳＳおよび血清を含み、３７℃でインキュベートされる調節された媒体）に含まれる細胞と接触する。前記条件は、当業者が必要と考えるように調節しうる。細胞を薬物と接触させるのに続き、前記細胞を破砕して（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）、細胞破砕物のポリペプチドを分画し、ポリペプチド画分をプールして抗体と接触させ、更に免疫学的試験（ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法またはウェスタンブロット）で処理されるようにする。「薬物と接触した」試料から単離されたタンパク質のプールを、賦形剤だけを細胞と接触させたコントロールの試料と比較し、「薬物と接触した」試料から免疫学的に生成される信号が、コントロールに比べ増加または減少していることを利用して、薬物の有効性を識別する。
【００６４】
Ｈ．癌関連タンパク質のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物の同定方法
本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有するタンパク質）のレベル、または少なくとも１つの活性を調節する薬物の同定方法を提供する。そのような方法または試験には、所望の活性を監視または検出するための、あらゆる手段を利用してよく、癌を治療する薬物の同定に特に有用である。
【００６５】
１様式においては、試験すべき薬物に曝露された１つの細胞母集団における、曝露されていないコントロール細胞母集団との間で比較しての、本発明のタンパク質の相対量を試験しうる。この様式においては、プローブ（例えば特異的抗体）を用いて、異なる細胞母集団における、タンパク質発現の差を監視する。細胞株または細胞母集団を、適切な条件下で、試験すべき薬物に適切な時間だけ曝露する。曝露した細胞株または細胞母集団と、コントロールの曝露されていない細胞株または細胞母集団から、細胞破砕物を調製しうる。次いで、プローブ（例えば特異的抗体）を用いて細胞破砕物を分析する。
【００６６】
抗体プローブは、適切な免疫プロトコルに従い、長さが十分であれば、本発明のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（或いは、所望であれば、または免疫性を増強するために必要であれば、適当な担体と複合化させる）で適切な哺乳動物宿主を免疫することにより調製される。担体（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨその他の担体タンパク質）との免疫複合体の調製方法は、当該分野において公知である。ある状況においては、例えばカルボジイミド試薬を用いる直接的複合化が有効なこともあり、他の場合には、ハプテンへのアクセス可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）をもたらすため、結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社（イリノイ州ロックフォード））が供給するものが望ましいこともある。例えば、担体との結合を促進するために、ハプテンペプチドを、アミノ末端、カルボキシ末端のどちらからでもシステイン残基で伸長したり、システイン残基を散在させたりすることができる。免疫原の投与は、一般的には、当該分野でよく理解されているように、適切なアジュバントを用いて、適当な時間をかけて注射することにより行うことができる。免疫スケジュールの間、抗体形成の十分さを決定するために、抗体の力価（ｔｉｔｅｒｓ）を測定する。
【００６７】
ある用途では、この方法で得られるポリクローナル抗血清が満足なものである場合もあるが、医薬組成物としては、モノクローナル製剤の利用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、一般に知られるように、リンパ球または脾臓細胞の不死化を行う、標準法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）またはその変法により調製しうる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株のスクリーニングは、ペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタンパク質を抗原とするイムノアッセイにより行う。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞株が同定されたら、細胞の培養は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよく、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）中での産生により行ってもよい。
【００６８】
次いで、培養上清または腹水上清から所望のモノクローナル抗体を回収する。完全な抗体もそうであるが、免疫学的に重要な（抗原と結合する）部位を含むモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の断片も、アンタゴニストとして使用できる。特に治療という状況では、免疫学的に反応性の（抗原と結合する）抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´またはＦ（ａｂ´）２断片）の使用が好ましい場合がしばしばある。これは、これらの断片は通常、イムノグロブリン全体に比べ免疫原性が少ないからである。
抗体または抗原性断片はまた、現行の技術を用いて、組み替えの手法により製造することもできる。タンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体の領域はまた、複数の種に由来するキメラ（例えばヒト化抗体）の状態で製造することもできる
【００６９】
上記の方法で試験する薬物は、無作為に選択してもよく、合理的に選択または設計してもよい。本明細書においては、本発明のタンパク質（それのみ、またはそれに関連する基質、結合パートナー等と共に）に関連して含まれる特定の配列を考慮することなく、無作為に薬物を選択する場合、その薬物を無作為に選択するという。無作為に選択された薬物の例は、化学物質ライブラリー（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）、ペプチドコンビナトリアルライブラリー（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）または生物の増殖ブロス（ｇｒｏｗｔｈ  ｂｒｏｔｈ）の使用である。
【００７０】
本明細書においては、薬物を無作為でなく、標的部位の配列および／または薬物の作用に関連するそのコンホメーションを考慮して選択する場合、その薬物を合理的に選択または設計するという。これらの部位を構成するペプチド配列を利用して、薬物を合理的に選択または設計することができる。例えば、合理的に選択されたペプチド薬物は、何らかの機能的コンセンサス部位と同じアミノ酸配列のペプチドか、その誘導体であってよい。
【００７１】
本発明の薬物は、例えばペプチド、低分子物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ビタミン誘導体および炭水化物であってもよい。優性ネガティブタンパク質（Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質のペプチド断片またはこれらのタンパク質の模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）を細胞に導入し、機能に影響を与えてもよい。本明細書で用いられる「模倣物」とは、ペプチド分子の領域（１箇所または数箇所）を修飾し、化学的に親ペプチドとは異なるが、局所解剖学的（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ）および機能的には親ペプチドと類似した構造を提供することをいう（Ｇｒａｎｔ  ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｙｅｒｓ，ｅｄ．，ｐｐ．６５９−６６４，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５を参照）。当業者は、本発明の薬物の構造的特性に関して制限がないことを容易に認識することができる。
【００７２】
本発明のペプチド薬物は、当該分野において知られている、標準的な固相（または溶液相）ペプチド合成法により調製することができる。更に、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成してもよく、標準的な組み替え合成系を用いて組み替えにより製造してもよい。遺伝子にコードされていないアミノ酸が含まれている場合、固相ペプチド合成による製造が必要となる。
【００７３】
本発明の他のクラスの薬物は、本発明のタンパク質の臨界的な部位（例えば、本明細書に言う細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）ドメイン、スペーサードメイン、α−ヘリックスコイルを成すコイルドメイン（α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ）または受容体ドメイン）に対して免疫反応性を有する抗体である。抗体薬物は、適切な哺乳動物被験者を、抗体の標的となることを意図したタンパク質のそれらの部位を、免疫原性領域として含むペプチドにより免疫して得られる。
【００７４】
Ｉ．癌関連タンパク質の発現、または少なくとも１つの活性を調節する薬物の用途
実施例において提供されているように、本発明のタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有するタンパク質）および核酸は、癌性組織における発現が異なる。タンパク質の発現、またはタンパク質の少なくとも１種の活性を上方または下方に調整或いは調節する薬物、例えばアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、これらのタンパク質の機能および活性に関連する生物学的および病理学的プロセスを調節してもよい。これには、本発明の相同体および類似体を用いて同定された薬物が含まれる。
【００７５】
本明細書においては、本発明のタンパク質によって仲介される病理学的または生物学的プロセスを調節することを必要とする限り、被験者はあらゆる哺乳類でありうる。用語「哺乳類」は、哺乳綱に属する個体と定義される。本発明は、特にヒトである被験者の治療において有用である。
【００７６】
病理学的プロセスとは、有害な効果をもたらす範疇の生物学的プロセスをいう。例えば、本発明のタンパク質の発現は、細胞増殖または過形成に関連している可能性がある。本明細書においては、薬物がプロセスの程度または深刻度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）を減少する場合、その薬物を病理学的プロセスを調節するという。例えば、本発明のタンパク質の発現または少なくとも１つの活性を、何らかの方法で上方または下方に調整或いは調節する薬物の投与によって、癌を阻害しうるか、疾患の進行を調節しうる。
【００７７】
本発明の薬物は、単独で提供することもでき、特定の病理学的プロセスを調節する他の薬物と組み合わせて提供することもできる。例えば、本発明の薬物を、他の既知薬物と組み合わせて投与することができる。本明細書においては、２種の薬物を同時に投与する場合、またはそれらが同時に機能するような様式で独立に投与する場合、「２種の薬物を組み合わせて投与する」という。
【００７８】
本発明の薬物は、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮またはバッカル経路で投与しうる。或いは、または同時に、経口経路でも投与しうる。投与量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、並行している処置の種類（あれば）、処置の頻度並びに所望の効果の性質による。
本発明は更に、本発明のタンパク質の発現または少なくとも１種の活性を調節する薬物を１種以上含有する組成物を提供する。個々に必要とされるものは変動するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該技術の範囲内である。典型的な投与量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇである。好ましい投与量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１０μｇからなる。最も好ましい投与量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１μｇからなる。
【００７９】
本発明の組成物は、薬理学的に活性な薬物に加え、活性化合物を加工して作用部位への送達のために薬学的に用いうる製剤とすることを容易にする賦形剤または補助剤からなる、薬学的に許容される適切な担体を含んでいてもよい。非経口投与用の適切な処方は、水溶性の形態（例えば水溶性の塩）にある活性化合物の水溶液を含む。加えて、適切な注射用油性懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒または媒体には、脂肪油（例えばゴマ油）、合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチル）またはトリグリセリドが含まれる。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含んでいてもよい。懸濁液は任意に、安定剤も含んでいてよい。細胞への送達のために、リポソームを用いて薬物をカプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）してもよい。
【００８０】
本発明によれば、全身投与用の医薬処方物は、腸内、非経口または局所用に処方しうる。実際、これら３種の処方を全て同時に用い、活性成分の全身投与を達成してもよい。
経口投与用の適切な処方には、硬または軟ゼラチンカプセル、丸薬、錠剤（コーティング錠を含む）、エリキシル剤、懸濁液、シロップまたは吸入剤（これらの徐放型（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｓ）も）が含まれる。
【００８１】
本発明の方法を実施するに際し、本発明の化合物を単独で用いてもよく、複数種組み合わせて用いてもよく、他の治療薬または診断薬と組み合わせて用いてもよい。ある好ましい実施形態においては、本発明の化合物を、これらの状態に対して、一般に許容されている医療の実践に従い典型的に規定されている他の化合物と同時に投与してもよい。本発明の化合物は、通常は哺乳類（例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウスなど）に対しｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることができる。
【００８２】
Ｊ．結合パートナーの同定方法
本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質の結合パートナーを単離・同定する方法を提供する。一般には、本発明のタンパク質を、タンパク質の結合パートナーである可能性のあるもの、または細胞の抽出物や画分と、タンパク質の結合パートナーである可能性のあるものが本発明のタンパク質と会合しうる条件下で混合する。混合後、本発明のタンパク質と会合したペプチド、ポリペプチドその他の分子を、混合物から分離する。次いで、本発明のタンパク質と結合している結合パートナーを除去し、更に解析することができる。結合パートナーの単離・同定には、全長タンパク質、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の全長アミノ酸配列を有するタンパク質を用いることができる。或いは、そのタンパク質の断片を用いることができる。
【００８３】
本明細書において、細胞抽出物とは、溶解または破砕した細胞から作成した調合物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）または画分をいう。細胞抽出物の好ましい起源は、ヒトの癌またはトランスフォームした細胞、例えば、癌から得た生検組織または組織培養細胞である。或いは、正常な組織または入手可能な細胞株から細胞抽出物を調製してもよい。
【００８４】
細胞の抽出物は、種々の方法により得ることができる。細胞の破砕は、物理的または化学的破砕方法のどちらを用いて行ってもよい。物理的破砕方法の例には、超音波処理および機械的せん断が含まれるが、これらに限定されない。化学的溶解方法の例には、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）による溶解および酵素による溶解が含まれるが、これらに限定されない。本発明において用いる抽出物を得るために、細胞抽出物の調製方法を適合させることは、当業者であれば容易に行うことができる。
【００８５】
細胞の抽出物が得られれば、抽出物を、本発明のタンパク質と、タンパク質と結合パートナーの会合が起こりうる条件下で混合する。種々の方法を用いることができるが、ヒト細胞の細胞質に見られる条件に極めて類似した条件が最も好ましい。浸透圧、ｐＨ、温度、細胞抽出物濃度などの特性を変更して、タンパク質と結合パートナーの会合を最適化してもよい。
【００８６】
適当な条件下での混合の後、結合複合体を混合物から分離する。混合物の分離には種々の手法を用いることができる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を用いて、結合パートナーとの複合体を免疫沈降させることができる。或いは、標準的な化学的分離法、例えばクロマトグラフィーや密度／沈降遠心分離法を用いることができる。
抽出物に見られる非会合細胞性成分を除去した後、従来の方法を用いて複合体から結合パートナーを解離させることができる。例えば、混合物の塩濃度やｐＨを変えることにより解離を達成することができる。
【００８７】
会合した結合パートナーとの対を、混合した抽出物から分離するのを促進するため、本発明のタンパク質を固相担体に固定することができる。例えば、ニトロセルロースマトリクスやアクリルビーズにタンパク質を付着させることができる。タンパク質を固相担体に付着させることは、ペプチド／結合パートナーの対を、抽出物に見られる他の成分から分離するのを促進する。同定される結合パートナーは、単一のタンパク質であることもあり、２種以上のタンパク質で構成される複合体であることもある。或いは、結合パートナーの同定をＴａｋａｙａｍａら（１９９７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ６９：１７１−１８４またはＳａｕｄｅｒら（１９９６）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ７７：９９１−９９の手順によるＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを用いて行ってもよく、エピトープタグ付きタンパク質（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）またはＧＳＴ融合タンパク質を用いて行ってもよい。
【００８８】
或いは、酵母２ハイブリッド系その他のｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質−タンパク質検出系で、本発明の核酸分子を用いることができる。酵母２ハイブリッド系は、他のタンパク質のパートナーを同定するのに利用されてきたもので、本明細書に記載の核酸分子を用いるように適合させることは容易である。
【００８９】
Ｋ．癌関連タンパク質の結合パートナーの用途
上記の方法により得られる、本発明のタンパク質の結合パートナーや、その相同体および類似体は、ひとたび単離すれば、種々の目的に利用できる。当該分野において知られる手法を用いて、結合パートナーと結合する抗体を生成するのに、結合パートナーを用いることができる。結合パートナーと結合する抗体は、本発明のタンパク質の活性の検査に、本発明のタンパク質により仲介される生物学的または病理学的プロセスを調節する薬物として、または結合パートナーの精製に用いることができる。これらの用途は以降に詳述する。
【００９０】
Ｌ．結合パートナーと癌関連タンパク質の会合を阻害する薬物の同定方法
本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質と結合パートナーの会合を減少または阻害する薬物の同定方法を提供する。具体的には、本発明のタンパク質を、試験すべき薬物の存在下および非存在下で結合パートナーと混合する。タンパク質の会合が可能な条件で混合した後、２種の混合物を分析・比較し、薬物が本発明のタンパク質と結合パートナーの会合を減少または阻害したか否かを決定する。本発明のタンパク質と結合パートナーの会合を減少または阻害する薬物は、試験すべき薬物を含む試料中に生じる会合の量の減少として同定される。
【００９１】
本明細書においては、ある薬物の存在が、結合パートナーが本発明のタンパク質と会合する程度を減少させる、またはそれを妨げるとき、その薬物は本発明のタンパク質と結合パートナーの会合を減少または阻害するという。あるクラスの薬物は、結合パートナーと結合することによって会合を減少または阻害するが、別のクラスの薬物は、本発明のタンパク質と結合することによって会合を減少または阻害する。
【００９２】
上記の試験に用いる結合パートナーは、単離され十分に特徴付けられたものでもよく、本発明のタンパク質と結合する部分的に特徴付けられたものでもよく、細胞抽出物中に存在することが同定されたものでもよい。結合パートナーが同定可能な特性（例えば分子量）を有している限り、本試験を行うことができることは、当業者にとって明らかである。
【００９３】
上記の方法で試験する薬物は、無作為に選択してもよく、合理的に選択または設計してもよい。本明細書においては、本発明のタンパク質と結合パートナーの会合に関連して含まれる特定の配列を考慮することなく、無作為に薬物を選択する場合、その薬物を無作為に選択するという。無作為に選択された薬物の例は、化学物質ライブラリー、ペプチドコンビナトリアルライブラリーまたは生物の増殖ブロスの使用である。
【００９４】
本明細書においては、薬物を無作為でなく、標的部位の配列および／または薬物の作用に関連するそのコンホメーションを考慮して選択する場合、その薬物を合理的に選択または設計するという。結合パートナーと本発明のタンパク質の接触部位を構成するペプチド配列を利用して、薬物を合理的に選択または設計することができる。例えば、合理的に選択されたペプチド薬物は、本発明のタンパク質における、結合パートナーとの接触部位と同じアミノ酸配列のペプチドであってよい。そのような薬物は、結合パートナーと結合することによって、本発明のタンパク質と結合パートナーの会合を減少または阻害する。
本発明の薬物は、例えばペプチド、低分子物質、ビタミン誘導体および炭水化物であってもよい。当業者は、本発明の薬物の構造的特性に関して制限がないことを容易に認識することができる。
【００９５】
本発明のあるクラスの薬物は、そのアミノ酸配列が、本発明のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて選択されたペプチド薬物である。本発明のペプチド薬物は、当該分野において知られている、標準的な固相（または溶液相）ペプチド合成法により調製することができる。更に、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成してもよく、標準的な組み替え合成系を用いて組み替えにより製造してもよい。遺伝子にコードされていないアミノ酸が含まれている場合、固相ペプチド合成による製造が必要となる。
【００９６】
本発明の他のクラスの薬物は、本発明のタンパク質または結合パートナーの臨界的な部位に対して免疫反応性を有する抗体である。上記のように、抗体は、適切な哺乳動物被験者を、抗体の標的となることを意図した、本発明のタンパク質または結合パートナーのそれらの部位を、免疫原性領域として含むペプチドにより免疫して得られる。臨界的な部位には、本発明のタンパク質と結合パートナーの会合に関与する接触部位が含まれる。
【００９７】
下記で検討するが、本発明のタンパク質の活性に関与する、重要な最小限の残基の配列が、２ハイブリッドスクリーニングや、関連分子である可能性のある物質の同定における餌（ｂａｉｔ）として有効に利用しうる、機能性直鎖状ドメインを定義する。そのような断片の利用は、全長分子の利用に比べ、スクリーニングの特異性を有意に向上するので好ましい。同様に、この直鎖状配列はまた、アフィニティーマトリクスとして、生化学的なアフィニティー精製法を用いる結合タンパク質の単離のためにも利用しうる。
【００９８】
Ｍ．結合パートナーと癌関連タンパク質の会合を阻害する薬物の用途
実施例において提供されているように、本発明のタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有するタンパク質）および核酸は、癌性組織における発現が異なる。本発明のタンパク質の、結合パートナーとの相互作用を減少または阻害する薬物（同タンパク質の相同体および類似体を用いて同定されたものを含む）を用いて、これらのタンパク質の機能および活性に関連する生物学的および病理学的プロセスを調節してもよい。
【００９９】
本明細書においては、本発明のタンパク質によって仲介される病理学的または生物学的プロセスを調節することを必要とする限り、被験者はあらゆる哺乳類でありうる。用語「哺乳類」は、哺乳綱に属する個体を意味する。本発明は、特にヒトである被験者の治療において有用である。
【０１００】
病理学的プロセスとは、有害な効果をもたらす範疇の生物学的プロセスをいう。例えば、本発明のタンパク質の発現は、細胞増殖または過形成に関連している可能性がある。本明細書においては、薬物がプロセスの程度または深刻度を減少する場合、その薬物を病理学的プロセスを調節するという。例えば、本発明のタンパク質の、結合パートナーとの相互作用を減少または阻害する薬物薬物の投与によって、癌を阻害しうるか、疾患の進行を調節しうる。
【０１０１】
本発明の薬物は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮またはバッカル経路で投与しうる。或いは、または同時に、経口経路でも投与しうる。投与量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、並行している処置の種類（あれば）、処置の頻度並びに所望の効果の性質による。
本発明は更に、本発明のタンパク質と結合パートナーの会合を阻害する薬物を１種以上含有する組成物を提供する。個々に必要とされるものは変動するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該技術の範囲内である。典型的な投与量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇである。好ましい投与量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１０μｇからなる。最も好ましい投与量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１μｇからなる。
【０１０２】
本発明の組成物は、薬理学的に活性な薬物に加え、活性化合物を加工して作用部位への送達のために薬学的に用いうる製剤とすることを容易にする賦形剤および補助剤からなる、薬学的に許容される適切な担体を含んでいてもよい。非経口投与用の適切な処方は、水溶性の形態（例えば水溶性の塩）にある活性化合物の水溶液を含む。加えて、適切な注射用油性懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒または媒体には、脂肪油（例えばゴマ油）、合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチル）またはトリグリセリドが含まれる。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含んでいてもよい。懸濁液は任意に、安定剤も含んでいてよい。細胞への送達のために、リポソームを用いて薬物をカプセル化してもよい。
【０１０３】
本発明によれば、全身投与用の医薬処方物は、腸内、非経口または局所用に処方しうる。実際、これら３種の処方を全て同時に用い、活性成分の全身投与を達成してもよい。
経口投与用の適切な処方には、硬または軟ゼラチンカプセル、丸薬、錠剤（コーティング錠を含む）、エリキシル剤、懸濁液、シロップまたは吸入剤（これらの徐放型も）が含まれる。
【０１０４】
本発明の方法を実施するに際し、本発明の化合物を単独で用いてもよく、複数種組み合わせて用いてもよく、他の治療薬または診断薬と組み合わせて用いてもよい。ある好ましい実施形態においては、本発明の化合物を、これらの状態に対して、一般に許容されている医療の実践に従い典型的に規定されている他の化合物と同時に投与してもよい。本発明の化合物は、通常は哺乳類（例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウスなど）に対しｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることができる。
【０１０５】
Ｎ．合理的なドラッグデザインとコンビナトリアルケミストリー
本発明は更に、合理的なドラッグデザインとコンビナトリアルケミストリーを含む。当業者は、適切な方法を認識し、本発明の態様を、癌治療に向けて開発しうる化合物の同定に利用・活用（ｕｔｉｌｉｚｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔ）する。ポリペプチドに関する合理的なドラッグデザインでは、設計した薬物が相互作用する第一のペプチドを同定・定義し、その第一の標的ペプチドを用いて、第二のペプチドに対する要件を定義することが必要である。そのような定義された要件に関し、全てまたは実質的に全ての定義された要件を満たす、適切なペプチドまたは非ペプチドを見出す、または調製することができる。合理的なドラッグデザインの１つの目標は、例えばより強力な（または強力でない）形態のリガンドである薬物を形作るために、関心ある生物活性ポリペプチド、またはそれらと相互作用する低分子（例えばアゴニスト、アンタゴニストおよびヌル（ｎｕｌｌ）化合物）の、構造的または機能的類似体を製造することである（例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９１）、Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１を参照）。コンビナトリアルケミストリーは、薬物や材料を、以前に可能だったよりも迅速且つ安価に見出すことを目的として、化合物を１つずつではなくまとめて合成し、その生物活性を試験することの科学である。コンピューター支援によるタンパク質モデリングや薬物発見におけるアプローチの開発により、近年、合理的なドラッグデザインとコンビナトリアルケミストリーはより緊密に関連付けられてきている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６を参照）。
【０１０６】
コンピューターグラフィックスの登場（ａｄｖｅｎｔ）により、合理的なドラッグデザインとコンビナトリアルケミストリーのためのツールとしての、分子モデリングの利用が劇的に増加している。コンピュータースクリーン上で分子を３次元で見ることができるのみならず、巨大分子（例えば酵素や受容体）と、合理的に設計した試験すべき誘導体分子の相互作用を調べることもできる（Ｂｏｏｒｍａｎ（１９９２）、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ  ７０：１８−２６を参照）。今や、膨大な数の使いやすい（ｕｓｅｒ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ）ソフトウェアおよびハードウェアが入手可能であり、事実上全ての製薬会社が、合理的なドラッグデザインのためのコンピューターモデリンググループを有している。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．社（ｗｗｗ．ｍｓｉ．ｃｏｍ）は、いくつかの洗練されたプログラムを販売しており、これにより利用者は、アミノ酸配列から開始して、タンパク質またはポリペプチドの２次元または３次元モデルを構築し、これを他の２次元または３次元モデルと比較し、化合物、薬物およびペプチドの相互作用を、３次元モデル上リアルタイムで解析することが可能となる。従って、本発明のいくつかの実施形態においては、治療的相互作用が予測・設計できるよう、本発明のタンパク質や、これと相互作用する分子（包括的には「結合パートナー」と称し、例えば抗タンパク質抗体）の領域、これらの分子の断片や誘導体を、他の分子、例えばペプチド、ペプチド模倣物および化学物質を、ソフトウェアを用いて比較する（分子モデリングについての考察は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９８）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ：  ｐａｇｅ  ２０；Ｔｅｍｐｃｚｙｋら（１９９７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｐｒｉｌ；およびＢｕｔｅｎｈｏｆ（１９９８）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｃａｓｅ  Ｎｏｔｅｓ  （Ａｕｇｕｓｔ  １９９８）を参照）。
【０１０７】
Ｏ．遺伝子治療
他の実施形態においては、タンパク質の機能および活性に関連する生物学的または病理学的プロセスを調節する手段として、遺伝子治療を用いることができる。これは、癌性細胞に対し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の配列を全部または少なくとも一部含んでなるタンパク質をコードする遺伝子構築物、或いはプロモーター要素またはエンハンサー要素と機能しうるように結合した、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の非コード領域を全部または一部含んでなる遺伝子構築物を挿入して、前記タンパク質の発現が、前記癌を抑制するようにする工程であって、前記プロモーター要素またはエンハンサー要素は、前記遺伝子構築物を調節するプロモーター要素またはエンハンサー要素である工程を含む。
【０１０８】
前記構築物において、前記タンパク質の発現は、何らかの適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、サル（ｓｉｍｉａｎ）ウィルス４０（ＳＶ４０）またはメタロチオネインプロモーター）により指揮でき、また何らかの適切な哺乳類の調節要素により調節できる。例えば、所望により、神経細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞において遺伝子の発現を優先的に指揮することが知られるエンハンサーを用い、発現を指揮してもよい。使用するエンハンサーには、その発現が組織または細胞に特異的であると特徴付けられたものが含まれうるが、これらに限定されない。或いは、治療性構築物としてＬＦＧ１、ＬＦＧ２、ＬＦＧ３、ＬＦＧ４、ＬＦＧ５またはＬＦＧ６のゲノム性クローン（例えば、上記本発明の核酸分子とのハイブリダイゼーションによるその単離に次いで）を用いる場合には、関連（ｃｏｇｎａｔｅ）調節配列、または所望により異種起源由来の調節配列（上記プロモーターおよび調節配列はいずれも含まれる）によって調節を仲介してもよい。
【０１０９】
癌性細胞への構築物の挿入は、例えばウィルスまたはプラスミドベクターを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで達成される。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの利用にも適用しうる。従って、本発明の方法は、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝的に修飾し、宿主に投与する、遺伝子修飾をｉｎ  ｖｉｖｏで、いくらかの数の適当な方法（このような治療に特に適するベクターを含む）を用いて行うなど、種々の形態の遺伝子治療に容易に適用可能である。
【０１１０】
レトロウィルスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウィルスベクターその他、癌に関連することがよくある細胞（例えば上皮細胞）に対し適切な向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有するウィルスベクターを、治療性遺伝子構築物用の遺伝子転移移送システム（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）として利用してよい。この目的に有用な数多くのベクターが一般に知られている（Ｃｏｚｚｉ  ＰＪら（２００２）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ，５３（２）：９５−１００；Ｂｉｔｚｅｒ  Ｍ，  Ｌａｕｅｒ  Ｕ．（２００２）、Ｄｔｓｃｈ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．  １２７（３１−３２）：１６２３−１６２４；ＭｅｚｚｉｎａおよびＤａｎｏｓ（２００２）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．８：２４１−２５６；  Ｌｏｓｅｒら（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：１６１−１７１；ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａ（２００１）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．  ２：１７７−２１１）。レトロウィルスウィルスベクターは特によく開発されており、臨床環境（ｓｅｔｔｉｎｇｓ）でも用いられている（特許文献７（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９５））。癌になっていると考えられる細胞等（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）に治療性ＤＮＡを導入するのに、非ウィルス的アプローチを用いてもよい（Ｊｅｓｃｈｋｅら（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２６７−２７８；Ｗｕら（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６３：１４６２１−１４６２４；Ｗｕら（１９８９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６４：１６９８５−１６９８７）。例えば、ニューロン、Ｔ細胞またはＢ細胞に対し、リポフェクション、アシアロオロソムコイド−ポリリジン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、または、あまり好ましくないが外科的条件下でのマイクロインジェクションにより、遺伝子を導入してもよい。
上記のいずれの適用方法に関しても、治療性核酸構築物を、好ましくは癌発生箇所に（例えば注射により）適用する。しかし、癌発生箇所周辺の組織、または癌になっていると考えられる細胞への供給を行う血管に適用してもよい。
【０１１１】
Ｐ．トランスジェニック動物
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５のｃＤＮＡ配列；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のポリペプチド配列をコードするオープンリーディングフレーム；または
３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基の連続した配列を有するそれらの断片
に対応する変異、ノックアウトまたは修飾遺伝子を含むトランスジェニック動物もまた、本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、遺伝的に修飾され、実験的に組み替え、外来またはクローン化遺伝物質が移入された動物である。そのような遺伝物質は、しばしば「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」と呼ばれる。トランスジーンの核酸配列（この場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５の配列の形態）は、そのようにしなければその特定の核酸配列が見出されることのないゲノムの遺伝子座と、トランスジーンの通常の遺伝子座のどちらに統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）してもよい。トランスジーンを構成する核酸配列が由来するゲノムは、同種のものであってもよく、標的動物とは別種のものであってもよい。
【０１１２】
ある実施形態においては、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５を含んでなる遺伝子の全体または一部が欠失しているトランスジェニック動物を構築してもよい。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に対応する遺伝子が１つ以上のイントロンを含む場合、遺伝子全体（全てのエキソン、イントロンおよび調節配列）が欠失していてもよい。或いは、遺伝子全体よりも少ない欠失が生じていてもよい。例えば、本発明のタンパク質の修飾版を発現する動物を作出するよう、単一のエキソンおよび／またはイントロンが欠失していてもよい。
【０１１３】
用語「生殖細胞系列トランスジェニック動物（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」とは、遺伝的改変や遺伝情報が生殖細胞系列に導入されることにより、トランスジェニック動物の遺伝情報を子孫に伝える能力が与えられているトランスジェニック動物をいう。そのような子孫が実際、その改変や遺伝情報を有していれば、それらもまたトランスジェニック動物である。
【０１１４】
遺伝的改変や遺伝情報は、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）が属する種にとって外来のものでもよく、特定個体のレシピエントにとってのみの外来のものでもよく、レシピエントが既に有している遺伝情報であってもよい。最後の場合においては、改変または導入された遺伝子は、元々の遺伝子と発現が異なっていてもよい。
【０１１５】
トランスジェニック動物は、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング並びに組み替えウィルス（またはレトロウィルス）感染を初めとする、種々異なった方法で作成することができる（例えば特許文献８；特許文献９；Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９３）、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２：  ６３０−６３３；Ｂｒｅｎｉｎら（１９９７）、Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６：  ９９−１１０；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６２），Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９７を参照）。
【０１１６】
数多くの組み替えまたはトランスジェニックマウスが作成されており、これには
・活性化された癌遺伝子配列を有するもの（特許文献８）；
・サルＳＶ４０  Ｔ−抗原を発現するもの（特許文献１０）；
・インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現がみられないもの（特許文献１１）；
・ドーパミン神経の機能不全（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）を示すもの（特許文献１２）；
・血圧調整に関与する少なくとも１種のヒト遺伝子を発現するもの（特許文献１３）；
・自然発生のアルツハイマー病でみられる状態との高い類似性を示すもの（特許文献１４）；
・細胞接着を仲介する能力の低いもの（特許文献９）；
・ウシ成長ホルモン遺伝子を有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒら（１９９６）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３：１７５３−１７６０）；および
・ヒトの完全な抗体反応を生じる能力を有するもの（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）、Ｌａｎｃｅｔ  ３４９：４０５）
が含まれる。
【０１１７】
大半のトランスジェニック実験では、依然としてマウスやラットが動物の選択肢であるが、他の動物種が好ましい、またはそれが必要な場合すらある。トランスジェニックの手順は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシ、モルモットなど、マウス以外の動物に対しても成功裡に用いられている（例えばＫｉｍら（１９９７）らＭｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．  ４６：５１５−５２６；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．  ３５：６０９−６１７；Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．  ６：６４３−６４５；Ｓｃｈｎｉｅｋｅら（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−２１３３；およびＡｍｏａｈ（１９９７）、Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉ．  ７５：５７８−５８５を参照）。
【０１１８】
組み替えの可能な哺乳類細胞への遺伝子断片の導入は、複数の核酸分子での同時形質転換に有利な（ｆａｖｏｒｓ）あらゆる方法で行うことができる。トランスジェニック動物の作成手順の詳細は、当業者であれば容易に入手できるが、これには特許文献１５および特許文献９の開示が含まれる。
【０１１９】
Ｑ．診断方法
本発明の遺伝子およびタンパク質は、癌組織での発現が正常組織に比して異なるので、本発明の遺伝子およびタンパク質を用いて癌を診断または監視したり、疾患の進行を追跡したり、非癌性組織試料から癌性組織を区別することができる。本発明の遺伝子およびタンパク質を用いて癌を診断する手段の一つには、生きている被験者から組織を取得することが含まれる。
【０１２０】
本発明の核酸およびタンパク質を検出する試験は、入手可能なあらゆる様式のものであってよい。典型的な核酸分子用の試験には、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲに基づく様式のものが含まれる。本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを検出する典型的な試験には、入手可能なあらゆる様式による抗体プローブの利用、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ結合試験等が含まれる（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８を参照）。好ましい実施形態においては、試験は適切な対照を用いて行う。
【０１２１】
一般に、その実施形態が核酸ベースの試験か、タンパク質ベースの試験かによって本発明の診断を分類することができる。ある種の診断試験は、本発明の核酸またはタンパク質における、癌性の異常に関与する変異または多型を検出する。他の診断試験は、罹患生物（例えば癌の）における本発明のＲＮＡまたはタンパク質のレベルに類似した、被検生物における本発明のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出すること、または非罹患生物におけるＲＮＡまたはタンパク質のレベルと異なる、被検生物におけるＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出することにより、タンパク質活性の欠陥を同定・区別する。
【０１２２】
加えて、タンパク質の活性またはレベルの異常の迅速な検出・同定を考慮して、下記の態様に記載の試薬と方法を組み合わせたキットの製造も予期される。診断キットには、本発明のタンパク質の変異型を特異的に検出する核酸プローブ、抗体またはその組み合わせ、或いは本発明の１種以上のタンパク質のについてのＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル測定に用いることができる核酸プローブ、抗体またはその組み合わせが含まれていてよい。これらのキットの検出成分は、典型的には以下の試薬と組み合わせて供給される。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を吸着するか、さもなければそれと結合する担体がしばしば供給される。入手可能な担体には、ニトロセルロース、ナイロン、または、正に荷電した置換基の集まり（ａｒｒａｙ）を有することで特徴付けることができる誘導体化ナイロンの膜が含まれる。これらのキットにおいて、制限酵素、対照試薬（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）、緩衝液、増幅酵素および非ヒトポリヌクレオチド（ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡなど）のうち１種以上を供給することができる。
【０１２３】
核酸ベースの有用な診断手法には、直接ＤＮＡ配列決定、グラジエントゲル電気泳動、サザンブロット分析、一本鎖高次構造分析、ＲＮＡｓｅ保護試験、ドットブロット分析、核酸増幅、対立遺伝子特異的ＰＣＲおよびこれらのアプローチの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらの分析の出発点は、生物学的試料から単離または精製された核酸である。組織生検も良好な試料源をもたらすことが予期される。試料から核酸を抽出し、これをＤＮＡ増幅手法、例えばプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができる。多型の存在を確認するための利用可能な方法は、当業者であれば容易に認識される。加えて、本発明のこの態様に関しては、当該技術において知られる何らかのアドレス指定可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレイ技術を用いることができる。ポリヌクレオチドアレイの特定の１実施形態は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（登録商標）として知られ、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８に一般に記載されている。
【０１２４】
広範なラベルおよび複合化手法が当業者には知られており、種々の核酸試験に利用することができる。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲのためのラベル化核酸の製造方法には、オリゴラベル化（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニック翻訳（ｎｉｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、末端ラベル化（ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）、ラベル化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を初めとするいくつかの方法があるが、これらに限定されない。或いは、ｍＲＮＡプローブを製造するために、本発明のタンパク質をコードする核酸を、ベクターにクローン化することができる。そのようなベクターは当該分野において知られており、市販されており、また適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６）およびラベル化ヌクレオチドを添加して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブに利用することができる。多くの会社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州ピスキャタウェイ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、Ｕ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ社（オハイオ州クリーブランド）など）が、市販キットおよびこれらの手順に関するプロトコールを提供している。適切なレポーター分子またはラベルには、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、クロモゲン試薬（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、また基質、補因子、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。
【０１２５】
タンパク質ベースの好ましい診断では、本発明の抗体を、整えられた（ｏｒｄｅｒｅｄ）アレイ中の担体に付着させる。このとき、担体の互いに重複しない領域を区別するために、複数種の抗体を付着させる。タンパク質ベースの診断である利用可能な試験は、当業者には容易に認識される。タンパク質を生物学的試料より取得し、従来のアプローチ（放射活性、比色、蛍光など）によりラベルする。本発明の変異体および／または野生型タンパク質の、既知濃度のラベルした標準品を用いて、研究者は試料中の本発明のタンパク質の濃度を正確に測定し、この情報から、特定形態のタンパク質の発現レベルを評価することができる。デンシトメトリーにおける従来法を用いて、そのようなタンパク質の濃度または発現レベルをより正確に測定することもできる。これらのアプローチはまた、高処理能力の診断分析における当業者には知られる技術により容易に自動化される。先に詳述した通り、本発明のこの態様については、当該技術において知られる何らかのアドレス指定可能なアレイ技術を用いることができ、またこれにより、抗体結合パターンと診断情報を最大化する試みにおいて、チップ上にタンパク質アレイを示すことができる。
【０１２６】
先に考察した通り、本発明の遺伝子またはタンパク質における多型の存在または検出が、生物における癌または類似の疾患の診断をもたらす場合がある。更なる実施形態は、本発明の遺伝子またはタンパク質の多型による（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）変異体に対して特異的な検出成分（抗体など）を含んでなる診断キットの調製を含む。検出成分は、典型的には以下の１種以上の試薬と組み合わせて供給される。ＲＮＡまたはタンパク質を吸着するか、さもなければそれと結合する担体がしばしば供給される。この目的の入手可能な担体には、ニトロセルロース、ナイロン、または、正に荷電した置換基の集まりを有することで特徴付けることができる誘導体化ナイロンの膜、並びにＧｅｎｅｃｈｉｐｓ（登録商標）およびその等価物が含まれるが、これらに限定されない。これらのキットにおいて、１種以上の酵素（逆転写酵素および／またはＴａｑポリメラーゼなど）を供給することができる。ｄＮＴＰ類、緩衝液または非ヒトポリヌクレオチド（ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡなど）も同様である。キット試験での結果は、健康管理業者（ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｒ）や診断研究所において解釈することができる。或いは、診断キットは個人に対して自己診断のために製造・販売される。
【０１２７】
多型の有無による疾患の診断に加え、癌関連のある種の疾患は、特定組織における本発明のタンパク質または遺伝子の偏った（ｓｋｅｗｅｄ）レベル、または本発明のタンパク質の発現の異常パターンに起因している。例えば、種々の組織における発現のレベルを監視することにより、診断を行う、または疾患状態を同定することができる。同様に、本発明の種々のタンパク質の、特定組織における発現レベルの比（例えば、発現のパターン）を測定することにより、健康状態または疾患を予測することができる。癌を発症した個人と、健常な個人から得た種々の組織における、本発明のタンパク質の発現のレベルを測定する。これらの数値をデータベースに記録することができ、またそれを試験した個人から得た数値と比較することができる。加えて、健常な個人と罹患した個人の両者から得た種々の組織における、発現の比またはパターンをデータベースに記録する。これらの解析結果を「疾患状態プロファイル」と称し、ある疾患状態プロファイル（例えば健常な、または罹患した個人からの）を、試験すべき個人からの疾患状態プロファイルと比較することにより、臨床医は疾患の有無を迅速に診断することができる。
【０１２８】
上記の核酸ベースまたはタンパク質ベースの診断手法は、組織における本発明の遺伝子またはタンパク質の発現のレベル、量または比を検出するのに用いることができる。例えば定量的ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕ解析、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、遺伝子チップアレイ技術、ＰＣＲおよびウェスタンブロットを通じて、本発明の特定のタンパク質（野生型変異型）に対するＲＮＡまたはタンパク質の発現の量またはレベルを迅速に測定することができ、この情報から、発現の比を確認することができる。或いは、分析すべき本発明のタンパク質が、現在は未知であるが、上記の相同性領域を１つ以上有することに基づき同定される、ファミリーの要素であることもある。
【０１２９】
これ以上の記載はなくとも、当業者は、これまでの記載および以降の具体例を用いて、本発明の化合物を製造・利用し、クレームされた方法を実施できると考えられる。従って、上記の実用的な例は、本発明の好ましい態様を具体的に指摘するものであり、いかなる面においても、他の開示を限定するものとは解釈されない。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：癌において発現の異なるｍＲＮＡの同定−１
癌生検と正常組織の間の遺伝子発現における包括的な変化を、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ，  Ｉｎｃ．社（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｓｕｉｔｅ（登録商標）を用いて調べた。データベースは、多数の異なる臓器から得た正常および癌組織に由来する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５アレイを用いて生成させた遺伝子発現プロファイルを含む。データベース中の組織試料のうち、本出願人らは、乳房、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、前立腺、直腸および胃より得た正常および癌組織の組み合わせの発現プロファイルを解析した。
【０１３１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５アレイは、６３，１７５組のプローブを含んでいる。１組のプローブは、１つの転写物（遺伝子またはｃＤＮＡクローン）を検出するためのプローブの組であり、通常オリゴヌクレオチドプローブ１６〜２０対からなる。これらのプローブ対には、パーフェクトマッチの組とミスマッチの組が含まれ、平均の差の計算にはその両方が必要である。平均の差は、転写物の発現レベルの相対的な指標として役立つもので、各プローブ対についての強度差の尺度であり、パーフェクトマッチの強度からミスマッチの強度を差し引いて算出される。これは、プローブ対間のハイブリダイゼーションにおける可変性や、蛍光強度に影響する恐れのある他の擬似ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を考慮したものである。計算した平均の差の数値を用いて、各遺伝子につき「不在」（＝検出されない）、「存在」（＝検出される）または「境界的（ｍａｒｇｉｎａｌ）」（＝明瞭な「不在」または「存在」でない）との絶対的判定（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｃａｌｌ）を行う。
【０１３２】
癌性組織と正常組織の間の発現の差を、以下の統計的手法により測定した。
（１）各プローブの組について、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（ｖ４．０）により、平均の差の値と絶対的判定を求める。
（２）所与の（ｇｉｖｅｎ）試料の組において、ＭａｔＬａｂプログラム（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州Ｎａｔｉｃｋ）を用いる主成分分析（ＰＣＡ）によって、組織試料中のアウトライヤーを検出した。ＰＣＡで用いたデータポイントは、無作為に選択したプローブの組（５，０００〜６，０００組）における平均の差であった。以降の解析からアウトライヤーを除外した。
（３）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓプログラムの倍率変化解析ツール（Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ）を用いて、遺伝子発現の変動を解析した。癌性試料の組における各遺伝子についての平均の差の平均値を、正常試料の組における同遺伝子についての平均の差の平均値と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。発現レベルにおいて３倍以上の増加または減少の見られる遺伝子を得た。分散分析試験（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）により測定したｐ値が０．０５以下のとき、遺伝子を解析に含めた（Ｓｔｅｅｌら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ａ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９７）。
（４）５種以上の異なる癌において発現に差の見られる遺伝子を選択した。
【０１３３】
チップデータの解析により、正常組織からの試料に比べ、癌性組織からの試料では、マーカーＬＦＧ１の発現が有意に上方調整されていることが示された。ＬＦＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３）の発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５上のチップ配列断片ｎｏ．９１８７５＿ｓ＿ａｔにより測定できる。９１８７５＿ｓ＿ａｔ配列は、ＥＳＴ  ＡＩ０５３７４１に由来する。種々の悪性腫瘍における９１８７５＿ｓ＿ａｔの発現レベルを、対照の正常組織と比較して表１に示す（倍率変化、変化の方向性（上方または下方調整）およびｐ値も示す）。癌性試料の組における平均の差の幾何平均を、正常試料の組における平均の差の幾何平均と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。倍率変化が１．５を超えるものを有意とした（Ｗｏｄｉｃｋａら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：１３５９−１３６７）。各種の組織に関しての、「存在」、「不在」または「境界的」と判定された試料数も、その試料の組の総試料数と共に、表１に示されている。これらのデータは、ＬＦＧ１の上方調整が癌の診断に役立つものでありうることを示している。
【０１３４】
【表１】
2006512923.tif 000003
【０１３５】
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現結果（チップ配列断片ｎｏ．９１８７５＿ｓ＿ａｔに対する試料の結合により測定）を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試験（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した。試験には、特定Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（９１８７５＿ｓ＿ａｔ）の配列情報ファイルに基づいて設計したＰＣＲプライマー（５´−ＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＣＧＣＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および５´−ＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８））を用いた。各ＲＮＡ試料（総ＲＮＡ：１０ｎｇ）中の、参照遺伝子に対する標的遺伝子の試験を行った。この目的で、対照プライマーとして役立つ、ＣＴＢＰ１（Ｃ末端結合タンパク１）遺伝子に特異的なプライマー（５´−ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および５´−ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を用いた。このアプローチは、ＣＴＢＰ１のサイクル閾値（Ｃｔ）に対しての標的ｍＲＮＡのＣｔとして測定される相対発現をもたらす。試料パネルには、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胃および膵臓からの、正常および癌組織の全ＲＮＡの対が含まれていた（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは、正常試料に対しての、癌におけるＬＦＧ１の上方調整を立証するものであった。
【０１３６】
実施例２：発現の異なるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＦＧ１）のクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、ヒト心臓由来のｃＤＮＡライブラリー（ＲｅｓＧｅｎ社、アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）を用いるｃＤＮＡ末端迅速増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）により、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３を有する全長ｃＤＮＡを取得した。Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（カリフォルニア大学、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて予測した、９１８７５＿ｓ＿ａｔの配列を含む遺伝子に基づいて、ＰＣＲ用（５´−ＣＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、５´−ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、５´−ＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、５´−ＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、５´−ＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＴＣＡＧＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、５´−ＡＧＣＣＡＡＣＧＴＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、５´−ＧＣＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、５´−ＣＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＴＴＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、５´−ＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴＡＧＴＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、５´−ＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、５´−ＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、５´−ＴＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、５´−ＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、５´−ＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、５´−ＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＣＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、５´−ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、５´−ＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＧＴＣＴＡＣＴＧＣＡＴ−３´  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）および５´−ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８））およびＲＡＣＥ用（５´−ＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、５´−ＧＴＣＴＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）および５´−ＧＡＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１））の遺伝子特異的なオリゴマー（ｏｌｉｇｏｓ）を設計した。これらのプライマーを用いて増幅した産物を、Ｔｏｐｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてＰＣＲ４−Ｔｏｐｏベクターに組み込み、次いで配列決定を行った。
【０１３７】
上記で検出された、調節に差のあるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および３に記載する。前者では、ｃＤＮＡは５２９３塩基対を含んでなる。後者では、ｃＤＮＡは５３１７塩基対を含んでなる。
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１内のオープンリーディングフレーム（第３９０〜４８８０番目（停止コドンを含めて第３９０〜４８８３番目）のヌクレオチド）は、１４９７アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載する。図２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
【０１３８】
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３内のオープンリーディングフレーム（第１２〜４９０４番目（停止コドンを含めて第１２〜４９０７番目）のヌクレオチド）は、１６３１アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載する。図３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパク質配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のそれと同一である。ただし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＮ末端側の初めの１３４アミノ酸がないことを除く。
【０１３９】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４は、カルポニン相同性ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の第３８〜１４５番目のアミノ酸）、ＩＱカルモジュリン結合ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の第６２９〜６４６番目のアミノ酸およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の第７６３〜７８０番目のアミノ酸）、ＲａｓＧＡＰドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の第８５８〜１１９５番目のアミノ酸およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の第９９２〜１３２９番目のアミノ酸）およびＲａｓＧＡＰ  Ｃ末端ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の第１２９８〜１４２１番目のアミノ酸およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の第１４３２〜１５５５番目のアミノ酸）を含んでいる。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４は、ＩＱＧＡＰタンパク（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈら（１９９４）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２０５１７−２０５２１；およびＢｒｉｌｌら（１９９６）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：４８６９−４８７８）と類似している。ＩＱＧＡＰは、細胞骨格構造、細胞−細胞接着および増殖シグナル伝達（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に関与するタンパク質と結合し、その機能を調節する（Ｆｕｋａｄａら（２００２）、Ｃｅｌｌ  １０９：１−２０；Ｂｒｉｇｇｓら（２００２）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：７４５３−７４６５；およびＭｃＣａｌｌｕｍら（１９９８）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２２５３７−２２５４４）。ＩＱＧＡＰ欠損マウスは、野性型に比べ、胃増殖遅延（ｌａｔｅ−ｏｎｓｅｔ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）の有意な増加を示した（Ｌｉら（２０００）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：６９７−７０１）。
【０１４０】
ＬＦＧ１に対応するｍＲＮＡ転写物のサイズを測定するため、ノーザンブロットによる分析を行った。種々のヒト組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、９１８７５＿ｓ＿ａｔ配列を含むＥＳＴを、ランダムプライマー法により放射活性ラベルし、ブロットのプローブに用いた。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中、４２℃でブロットのハイブリダイゼーションを行い、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで、室温で洗浄した。ノーザンブロットにより、この遺伝子に対する３種の転写物が示され、そのサイズは約７．２ｋｂおよび６．３ｋｂであった。これは、ＬＦＧ１クローン（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および３）のサイズに対応する。
【０１４１】
実施例３：癌において発現の異なるｍＲＮＡの同定−２
マーカーＬＦＧ１に替えてマーカーＬＦＧ２を用いた以外は、実施例１の方法を繰り返した。
チップデータの解析により、正常組織からの試料に比べ、癌性組織からの試料では、マーカーＬＦＧ２の発現が有意に下方調整されていることが示された。ＬＦＧ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５上のチップ配列断片ｎｏ．８２９４１＿ａｔにより測定できる。８２９４１＿ａｔ配列は、ＥＳＴ  ＡＩ２７７６１２に由来する。種々の悪性腫瘍における８２９４１＿ａｔの発現レベルを、対照の正常組織と比較して表２に示す（倍率変化、変化の方向性（上方または下方調整）およびｐ値も示す）。癌性試料の組における平均の差の幾何平均を、正常試料の組における平均の差の幾何平均と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。倍率変化が１．５を超えるものを有意とした（Ｗｏｄｉｃｋａら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：１３５９−１３６７）。各種の組織に関しての、「存在」、「不在」または「境界的」と判定された試料数も、その試料の組の総試料数と共に、表２に示されている。これらのデータは、ＬＦＧ２の下方調整が癌の診断に役立つものでありうることを示している。
【０１４２】
【表２】
2006512923.tif 000004
【０１４３】
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現結果（チップ配列断片ｎｏ．８２９４１＿ａｔに対する試料の結合により測定）を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試験（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した。試験には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（８２９４１＿ａｔ）を含むＥＳＴの配列情報ファイルに基づいて設計したＰＣＲプライマー（５´−ＧＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）および５´−ＴＧＴＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴＡＡＴＧＧＡＧＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３））を用いた。各ＲＮＡ試料（総ＲＮＡ：１０ｎｇ）中の、参照遺伝子に対する標的遺伝子の試験を行った。この目的で、対照プライマーとして役立つ、ＣＴＢＰ１（Ｃ末端結合タンパク１）遺伝子に特異的なプライマー（５´−ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および５´−ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を用いた。このアプローチは、ＣＴＢＰ１のサイクル閾値（Ｃｔ）に対しての標的ｍＲＮＡのＣｔとして測定される相対発現をもたらす。試料パネルには、結腸、肝臓、肺、卵巣および胃からの、正常および癌組織の全ＲＮＡの対が含まれていた（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは、正常試料に対しての、癌におけるＬＦＧ２の下方調整を立証するものであった。
【０１４４】
実施例４：発現の異なるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＦＧ２）のクローニング
ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ試験（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を用いるオリゴプリング（ｏｌｉｇｏ−ｐｕｌｌｉｎｇ）法により、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を有する全長ｃＤＮＡを取得した。簡単に言えば、８２９４１＿ａｔ配列を含むＥＳＴの配列に基づいて、遺伝子特異的なオリゴマー（５´−ＧＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２））を設計した。オリゴマーをビオチンでラベルし、これを用いて、あまり差のなかった胃腺癌ライブラリー由来の１本鎖プラスミドＤＮＡ（ｃＤＮＡ組み替え体）（ＮＣＩ  ＣＧＡＰ  Ｇａｓ４）（ＲｅｓＧｅｎ社、アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）５μｇとのハイブリダイゼーションを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの手順に従って行った。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを、ストレプトアビジンを結合させたビーズにより分離し、加熱により溶出させた。溶出したｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに変換し、これを用いて大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）細胞を形質転換して、最長のｃＤＮＡをスクリーニングした。遺伝子特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより陽性の選択を確認した後、ｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定に付した。
【０１４５】
上記で検出された、調節に差のあるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載する。ｃＤＮＡは、３６０８塩基対を含んでなる。
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５内のオープンリーディングフレーム（第４２４〜１９０８番目（停止コドンを含めて第４２４〜１９１１番目）のヌクレオチド）は、４９５アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載する。
【０１４６】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、スカベンジャー受容体との相同性を有する。これは、選択されたポリアニオン性リガンドのエンドサイトーシス、アポトーシス細胞または細菌の食作用、細胞接着およびアテローム性動脈硬化の発症に関与する（Ｐｅｉｓｅｒら（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４：１２３−１２８；およびＲｅｓｎｉｃｋら（１９９４）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．  １９：５−８）。公開されているスカベンジャー受容体の研究に基づくと、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、細胞質ドメイン（第１〜３５番目のアミノ酸）、膜貫通ドメイン（第３６〜５８番目のアミノ酸）、α−ヘリックスコイルを成すコイルドメイン（第９０〜３０１番目のアミノ酸）、コラーゲン様ドメイン（第３０５〜３８０番目のアミノ酸）およびスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン（第３９３〜４９３番目のアミノ酸）を含んでいる。ＳＲＣＲドメインは、６つのシステイン残基を含み（第４１８、４３１、４６２、４７２、４８２および４９２番目のアミノ酸）、これらはドメイン内ジスルフィド結合に関与している可能性がある。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６はまた、マウス相同体（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＢＣ０１６０９６）との相同性を示す。これは、連続する全配列に対して７０％の同一性を示す。
【０１４７】
図４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
【０１４８】
ＬＦＧ２に対応するｍＲＮＡ転写物のサイズを測定するため、ノーザンブロットによる分析を行った。種々のヒト組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、８２９４１＿ａｔ配列を含むＥＳＴを、ランダムプライマー法により放射活性ラベルし、ブロットのプローブに用いた。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中、４２℃でブロットのハイブリダイゼーションを行い、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで、室温で洗浄した。ノーザンブロットにより、この遺伝子に対する単一の転写物が示され、そのサイズは約３．７ｋｂであった。これは、ＬＦＧ２クローン（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のサイズに対応する。
【０１４９】
実施例５：癌において発現の異なるｍＲＮＡの同定−３
マーカーＬＦＧ１に替えてマーカーＬＦＧ３を用いた以外は、実施例１の方法を繰り返した。
チップデータの解析により、正常組織からの試料に比べ、癌性組織からの試料では、マーカーＬＦＧ３の発現が有意に下方調整されていることが示された。ＬＦＧ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５上のチップ配列断片ｎｏ．４６１０４＿ａｔにより測定できる。４６１０４＿ａｔ配列は、ＥＳＴ  ＡＡ７７２０５５に由来する。種々の悪性腫瘍における４６１０４＿ａｔの発現レベルを、対照の正常組織と比較して表３に示す（倍率変化、変化の方向性（上方または下方調整）およびｐ値も示す）。癌性試料の組における平均の差の幾何平均を、正常試料の組における平均の差の幾何平均と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。倍率変化が１．５を超えるものを有意とした（Ｗｏｄｉｃｋａら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：１３５９−１３６７）。各種の組織に関しての、「存在」、「不在」または「境界的」と判定された試料数も、その試料の組の総試料数と共に、表３に示されている。これらのデータは、ＬＦＧ３の下方調整が癌の診断に役立つものでありうることを示している。
【０１５０】
【表３】
2006512923.tif 000005
【０１５１】
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現結果（チップ配列断片ｎｏ．４６１０４＿ａｔに対する試料の結合により測定）を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試験（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した。試験には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（４６１０４＿ａｔ）を含むＥＳＴの配列情報ファイルに基づいて設計したＰＣＲプライマー（５´−ＧＴＡＴＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）および５´−ＴＡＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５））を用いた。各ＲＮＡ試料（総ＲＮＡ：１０ｎｇ）中の、参照遺伝子に対する標的遺伝子の試験を行った。この目的で、対照プライマーとして役立つ、ＣＴＢＰ１（Ｃ末端結合タンパク１）遺伝子に特異的なプライマー（５´−ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および５´−ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を用いた。このアプローチは、ＣＴＢＰ１のサイクル閾値（Ｃｔ）に対しての標的ｍＲＮＡのＣｔとして測定される相対発現をもたらす。試料パネルには、結腸、腎臓、卵巣、膵臓および胃からの、正常および癌組織の全ＲＮＡの対が含まれていた（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは、正常試料に対しての、癌におけるＬＦＧ３の下方調整を立証するものであった。
【０１５２】
実施例６：発現の異なるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＦＧ３）のクローニング
ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ試験（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を用いるオリゴプリング法により、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を有する全長ｃＤＮＡを取得した。簡単に言えば、４６１０４＿ａｔ配列を含むＥＳＴの配列に基づいて、遺伝子特異的なオリゴマー（５´−ＧＴＡＴＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４））を設計した。オリゴマーをビオチンでラベルし、これを用いて、ヒト胎児腎臓由来の１本鎖プラスミドＤＮＡ（ｃＤＮＡ組み替え体）（ＲｅｓＧｅｎ社、アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）５μｇとのハイブリダイゼーションを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの手順に従って行った。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを、ストレプトアビジンを結合させたビーズにより分離し、加熱により溶出させた。溶出したｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに変換し、これを用いて大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）細胞を形質転換して、最長のｃＤＮＡをスクリーニングした。遺伝子特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより陽性の選択を確認した後、ｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定に付した。ＬＦＧ３の５´末端は、ヒト胎児腎臓より調製したｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）および遺伝子特異的なプライマー（５´−ＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６））を用いるｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）により同定した。
【０１５３】
上記で検出された、調節に差のあるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記載する。ｃＤＮＡは、３１６２塩基対を含んでなる。
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７内のオープンリーディングフレーム（第４０５〜１８３５番目（停止コドンを含めて第４０５〜１８３８番目）のヌクレオチド）は、４７７アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記載する。
【０１５４】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、モノカルボキシレート輸送タンパク質（ＭＣＴｓ）に類似しており、膜貫通ドメインと予想されるものを１０個（第１０〜２９、８０〜９９、１０７〜１２８、１４０〜１６０、２７４〜２９５、３１２〜３３２、３３９〜３６０、３６３〜３８４、３９６〜４１６および４３３〜４５１番目のアミノ酸）有している。ＭＣＴタンパク質は、モノカルボキシレート（乳酸イオン、ピルビン酸イオン、分枝オキソ酸、ケトン体、β−ヒドロキシ酪酸イオン、酢酸イオンなど）の促進輸送を触媒する（ＨａｌｅｓｔｒａｐおよびＰｒｉｃｅ（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ３４３：２８１−２９９）。８種の既知モノカルボキシレート輸送タンパク質に対する、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の類似性の比を表４にまとめる。
【０１５５】
【表４】
2006512923.tif 000006
【０１５６】
図５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
【０１５７】
ＬＦＧ３に対応するｍＲＮＡ転写物のサイズを測定するため、ノーザンブロットによる分析を行った。種々のヒト組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、４６１０４＿ａｔ配列を含むＥＳＴを、ランダムプライマー法により放射活性ラベルし、ブロットのプローブに用いた。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中、４２℃でブロットのハイブリダイゼーションを行い、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで、室温で洗浄した。ノーザンブロットにより、この遺伝子に対する単一の転写物が示され、そのサイズは約４．２ｋｂであった。これは、ＬＦＧ３クローン（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）のサイズに対応する。
【０１５８】
実施例７：癌において発現の異なるｍＲＮＡの同定−４
マーカーＬＦＧ１に替えてマーカーＬＦＧ４を用いた以外は、実施例１の方法を繰り返した。
チップデータの解析により、正常組織からの試料に比べ、癌性組織からの試料では、マーカーＬＦＧ４の発現が有意に下方調整されていることが示された。ＬＦＧ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５上のチップ配列断片ｎｏ．６２１５８＿ａｔにより測定できる。６２１５８＿ａｔ配列は、ＥＳＴ  ＡＩ１２３５３２に由来する。種々の悪性腫瘍における６２１５８＿ａｔの発現レベルを、対照の正常組織と比較して表５に示す（倍率変化、変化の方向性（上方または下方調整）およびｐ値も示す）。癌性試料の組における平均の差の幾何平均を、正常試料の組における平均の差の幾何平均と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。倍率変化が１．５を超えるものを有意とした（Ｗｏｄｉｃｋａら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：１３５９−１３６７）。各種の組織に関しての、「存在」、「不在」または「境界的」と判定された試料数も、その試料の組の総試料数と共に、表５に示されている。これらのデータは、ＬＦＧ４の下方調整が癌の診断に役立つものでありうることを示している。
【０１５９】
【表５】
2006512923.tif 000007
【０１６０】
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現結果（チップ配列断片ｎｏ．６２１５８＿ａｔに対する試料の結合により測定）を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試験（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した。試験には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（６２１５８＿ａｔ）を含むＥＳＴの配列情報ファイルに基づいて設計したＰＣＲプライマー（５´−ＡＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＣＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）および５´−ＴＡＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８））を用いた。各ＲＮＡ試料（総ＲＮＡ：１０ｎｇ）中の、参照遺伝子に対する標的遺伝子の試験を行った。この目的で、対照プライマーとして役立つ、ＣＴＢＰ１（Ｃ末端結合タンパク１）遺伝子に特異的なプライマー（５´−ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および５´−ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を用いた。このアプローチは、ＣＴＢＰ１のサイクル閾値（Ｃｔ）に対しての標的ｍＲＮＡのＣｔとして測定される相対発現をもたらす。試料パネルには、結腸、肝臓、肺、卵巣、膵臓および胃からの、正常および癌組織の全ＲＮＡの対が含まれていた（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは、正常試料に対しての、癌におけるＬＦＧ４の下方調整を立証するものであった。
【０１６１】
実施例８：発現の異なるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＦＧ４）のクローニング
ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）により、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を有する全長ｃＤＮＡを取得した。簡単に言えば、６２１５８＿ａｔ配列を含むＥＳＴの配列に基づいて、遺伝子特異的なオリゴマー（５´−ＴＡＡＴＧＴＴＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）および５´−ＴＧＣＣＣＣＡＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０））を設計した。これらのオリゴマーを用いて、ヒト脳より調製したｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）のＰＣＴ増幅を行った。これらのプライマーを用いて増幅した産物を、Ｔｏｐｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてＰＣＲ４−Ｔｏｐｏベクターに組み込み、次いで配列決定を行った。
【０１６２】
上記で検出された、調節に差のあるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に記載する。ｃＤＮＡは、４８９１塩基対を含んでなる。
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９内のオープンリーディングフレーム（第８９〜１１５０番目（停止コドンを含めて第８９〜１１５３番目）のヌクレオチド）は、３５４アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に記載する。
【０１６３】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、ラットキロンおよびニワトリニューロトラクチンに類似している（Ｆｕｎａｔｓｕら（１９９９）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：８２２４−８２３０；およびＭａｒｇら（１９９９）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４５：８６５−８７６）。タンパク質配列解析により、分泌シグナルペプチド（第１〜３３番目のアミノ酸）、３つのイムノグロブリンドメイン（第４７〜１３６、１４５〜２０８および２３１〜３１２番目のアミノ酸）、および６つのＮ−結合型グリコシル化部位と推定される部位（第７３、１５５、２７５、２８６、２９４および３０７番目のアミノ酸）が明らかとなった。キロン／ニューロトラクチンは、イムノグロブリンスーパーファミリーのＩｇＬＯＮサブファミリーの要素である。ＩｇＬＯＮ類は、神経突起伸展を修飾すると考えられ、分子−分子接着や認識において役割を果たしているらしい、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型細胞接着分子のファミリーである（Ｍｉｙａｔｅら（２０００）、Ｊ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４２４：７４−８５）。
【０１６４】
図６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。このヒドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｐｌｏｔ）は、Ｃ末端に疎水性領域の存在を示している。ＧＰＩアンカー型タンパク質の場合、ＧＰＩアンカーの付加はＣ末端疎水性領域の切断後に起こることが知られている。ＧＰＩアンカー付加部位と推定される部位が見出された（第３２４番目のアミノ酸であるＧｌｙ）。
【０１６５】
ＬＦＧ４に対応するｍＲＮＡ転写物のサイズを測定するため、ノーザンブロットによる分析を行った。種々のヒト組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、６２１５８＿ａｔ配列を含むＥＳＴを、ランダムプライマー法により放射活性ラベルし、ブロットのプローブに用いた。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中、４２℃でブロットのハイブリダイゼーションを行い、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで、室温で洗浄した。ノーザンブロットにより、この遺伝子に対する単一の転写物が示され、そのサイズは約５．４ｋｂであった。これは、ＬＦＧ４クローン（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のサイズに対応する。
【０１６６】
実施例９：癌において発現の異なるｍＲＮＡの同定−５
マーカーＬＦＧ１に替えてマーカーＬＦＧ５を用いた以外は、実施例１の方法を繰り返した。
チップデータの解析により、正常組織からの試料に比べ、癌性組織からの試料では、マーカーＬＦＧ５の発現が有意に下方調整されていることが示された。ＬＦＧ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５上のチップ配列断片ｎｏ．４６６５９＿ａｔにより測定できる。種々の悪性腫瘍における４６６５９＿ａｔの発現レベルを、対照の正常組織と比較して表６に示す（倍率変化、変化の方向性（上方または下方調整）およびｐ値も示す）。癌性試料の組における平均の差の幾何平均を、正常試料の組における平均の差の幾何平均と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。各種の組織に関しての、「存在」、「不在」または「境界的」と判定された試料数も、その試料の組の総試料数と共に、表６に示されている。これらのデータは、ＬＦＧ５の調整の差が癌の診断に役立つものでありうることを示している。
【０１６７】
【表６】
2006512923.tif 000008
【０１６８】
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現結果（チップ配列断片ｎｏ．４６６５９＿ａｔに対する試料の結合により測定）を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試験（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した。試験には、特定Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（４６６５９＿ａｔ）の配列情報ファイルに基づいて設計したＰＣＲプライマー（５´−ＡＡＧＧＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＧＡＡＴＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）および５´−ＧＣＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２））を用いた。各ＲＮＡ試料（総ＲＮＡ：１０ｎｇ）中の、参照遺伝子に対する標的遺伝子の試験を行った。この目的で、対照プライマーとして役立つ、ＣＴＢＰ１（Ｃ末端結合タンパク１）遺伝子に特異的なプライマー（５´−ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および５´−ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を用いた。このアプローチは、ＣＴＢＰ１のサイクル閾値（Ｃｔ）に対しての標的ｍＲＮＡのＣｔとして測定される相対発現をもたらす。試料パネルには、腎臓、肺、卵巣および膵臓からの、正常および癌組織の全ＲＮＡの対が含まれていた（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは、正常試料に対しての、癌におけるＬＦＧ５の調整の差を立証するものであった。
【０１６９】
実施例１０：発現の異なるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＦＧ５）のクローニング
ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ試験（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を用いるオリゴプリング法により、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を有する全長ｃＤＮＡを取得した。簡単に言えば、４６６５９＿ａｔ配列を含むＥＳＴの配列に基づいて、遺伝子特異的なオリゴマー（５´−ＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３））を設計した。オリゴマーをビオチンでラベルし、これを用いて、ヒト心臓ライブラリー由来の１本鎖プラスミドＤＮＡ（ｃＤＮＡ組み替え体）（ＮＣＩ  ＣＧＡＰ  Ｇａｓ４）（ＲｅｓＧｅｎ社、アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）５μｇとのハイブリダイゼーションを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの手順に従って行った。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを、ストレプトアビジンを結合させたビーズにより分離し、加熱により溶出させた。溶出したｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに変換し、これを用いて大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）細胞を形質転換して、最長のｃＤＮＡをスクリーニングした。遺伝子特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより陽性の選択を確認した後、ｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定に付した。
【０１７０】
上記で検出された、調節に差のあるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載する。ｃＤＮＡは、３０９８塩基対を含んでなる。
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１内のオープンリーディングフレーム（第２２３〜１５６９番目（停止コドンを含めて第２２３〜１５７２番目）のヌクレオチド）は、４４９アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載する。
【０１７１】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、チミジル酸キナーゼドメイン（第２５７〜４３８番目のアミノ酸）を含んでいる。チミジル酸キナーゼは、ＲＮＡおよびＤＮＡ合成のためのヌクレオチド合成において役割を果たし、治療用ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体の薬理学的活性化において必要とされる、ヌクレオチドモノリン酸キナーゼ類（ＮＭＰＫｓ）の要素である（Ｖａｎ  Ｒｏｍｐａｙら（２０００）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８７：１８９−１９８）。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、マクロファージ活性化の際に誘導されるマウスチミジル酸キナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０２０５５７）との相同性を示す（ＬｅｅおよびＯ´Ｂｒｉｅｎ（１９９５）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：６０９４−６１０２）。これは、連続する全配列に対して６３％の同一性を示す。
【０１７２】
図７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
【０１７３】
ＬＦＧ５に対応するｍＲＮＡ転写物のサイズを測定するため、ノーザンブロットによる分析を行った。種々のヒト組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、８２９４１＿ａｔ配列を含むＥＳＴを、ランダムプライマー法により放射活性ラベルし、ブロットのプローブに用いた。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中、４２℃でブロットのハイブリダイゼーションを行い、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで、室温で洗浄した。ノーザンブロットにより、この遺伝子に対する単一の転写物が示され、そのサイズは約３．０ｋｂであった。これは、ＬＦＧ５クローン（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）のサイズに対応する。
【０１７４】
実施例１１：癌において発現の異なるｍＲＮＡの同定−６
マーカーＬＦＧ１に替えてマーカーＬＦＧ６を用いた以外は、実施例１の方法を繰り返した。
チップデータの解析により、正常組織からの試料に比べ、癌性組織からの試料では、マーカーＬＦＧ６の発現が有意に上方調整されていることが示された。ＬＦＧ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１５）の発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）Ｕ９５上のチップ配列断片ｎｏ．４４１０３＿ａｔにより測定できる。４４１０３＿ａｔ配列は、ＥＳＴ  ＡＡ８６５６１４に由来する。種々の悪性腫瘍における４４１０３＿ａｔの発現レベルを、対照の正常組織と比較して表７に示す（倍率変化、変化の方向性（上方または下方調整）およびｐ値も示す）。癌性試料の組における平均の差の幾何平均を、正常試料の組における平均の差の幾何平均と比較して、倍率変化（癌性／正常）を計算した。倍率変化が１．５を超えるものを有意とした（Ｗｏｄｉｃｋａら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：１３５９−１３６７）。各種の組織に関しての、「存在」、「不在」または「境界的」と判定された試料数も、その試料の組の総試料数と共に、表７に示されている。これらのデータは、ＬＦＧ６の上方調整が癌の診断に役立つものでありうることを示している。
【０１７５】
【表７】
2006512923.tif 000009
【０１７６】
ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現結果（チップ配列断片ｎｏ．４４１０３＿ａｔに対する試料の結合により測定）を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試験（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した。試験には、特定Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ断片（４４１０３＿ａｔ）の配列情報ファイルに基づいて設計したＰＣＲプライマー（５´−ＧＧＡＣＧＧＧＧＡＡＣＴＴＧＧＡＣＧＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）および５´−ＡＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５））を用いた。各ＲＮＡ試料（総ＲＮＡ：１０ｎｇ）中の、参照遺伝子に対する標的遺伝子の試験を行った。この目的で、対照プライマーとして役立つ、ＣＴＢＰ１（Ｃ末端結合タンパク１）遺伝子に特異的なプライマー（５´−ＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および５´−ＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を用いた。このアプローチは、ＣＴＢＰ１のサイクル閾値（Ｃｔ）に対しての標的ｍＲＮＡのＣｔとして測定される相対発現をもたらす。試料パネルには、肝臓および卵巣からの、正常および癌組織の全ＲＮＡの対が含まれていた（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータは、正常試料に対しての、癌におけるＬＦＧ６の上方調整を立証するものであった。
【０１７７】
実施例１２：発現の異なるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡ（ＬＦＧ６）のクローニング
ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ試験（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を用いるオリゴプリング法により、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１５を有する全長ｃＤＮＡを取得した。簡単に言えば、４４１０３＿ａｔ配列を含むＥＳＴの配列に基づいて、遺伝子特異的なオリゴマー（５´−ＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧＧＡＣＧＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６））を設計した。オリゴマーをビオチンでラベルし、これを用いて、十分に差があった胃腺癌ライブラリー由来の１本鎖プラスミドＤＮＡ（ｃＤＮＡ組み替え体）（ＮＣＩ  ＣＧＡＰ  Ｇａｓ４）（ＲｅｓＧｅｎ社、アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）５μｇとのハイブリダイゼーションを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの手順に従って行った。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを、ストレプトアビジンを結合させたビーズにより分離し、加熱により溶出させた。溶出したｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに変換し、これを用いて大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）細胞を形質転換して、最長のｃＤＮＡをスクリーニングした。遺伝子特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより陽性の選択を確認した後、ｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定に付した。
【０１７８】
上記で検出された、調節に差のあるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１５に記載する。前者では、ｃＤＮＡは１８９３塩基対を含んでなる。後者では、ｃＤＮＡは１５９７塩基対を含んでなる。
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３内のオープンリーディングフレーム（第４１８〜１３９２番目（停止コドンを含めて第４１８〜１３９５番目）のヌクレオチド）は、３２５アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に記載する。図９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
【０１７９】
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５内のオープンリーディングフレーム（第２７１〜１４３１番目（停止コドンを含めて第２７１〜１４３４番目）のヌクレオチド）は、３８７アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５がコードする、予測されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載する。図１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ値（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１４２）を用いた疎水性解析の結果を示す。上記のように、親水性領域は抗原性ペプチドの製造に用いうる。
【０１８０】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４および１６は、ユビキチン相同（ＵＢＱ）ドメイン（第２３９〜３００番目のアミノ酸）を含んでいる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４および１６は、ラットシャーピンタンパク質に類似している（Ｌｉｍら（２００１）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：３８５−３９７）。シャーピンは、特殊化した細胞結合における、細胞骨格複合体の構成や細胞内シグナル伝達において機能するシャンクタンパク質の、アンキリンリピートと直接に相互作用する（ＳｈｅｎｇおよびＫｉｍ（２０００）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１３：１８５１−１８５６）。
【０１８１】
ＬＦＧ６に対応するｍＲＮＡ転写物のサイズを測定するため、ノーザンブロットによる分析を行った。種々のヒト組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を用い、４４１０３＿ａｔ配列を含むＥＳＴを、ランダムプライマー法により放射活性ラベルし、ブロットのプローブに用いた。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．２ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中、４２℃でブロットのハイブリダイゼーションを行い、０．１％  ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで、室温で洗浄した。ノーザンブロットにより、この遺伝子に対する３種の転写物が示され、そのサイズは約２．２ｋｂ、１．５ｋｂおよび１．２ｋｂであった。これは、ＬＦＧ６クローン（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１５）のサイズに対応する。
【０１８２】
上記実施例を参照して本発明を詳細に記載したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更を行うことが可能であると理解される。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願において引用されている特許、特許出願および出版物はいずれも、その全体が引用により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】ＬＦＧ１クローン２種の、相対的な並び位置（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）を示す図である。
【図２】ＬＦＧ１−クローンＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図３】ＬＦＧ１−クローンＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図４】ＬＦＧ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図５】ＬＦＧ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図６】ＬＦＧ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図７】ＬＦＧ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図８】ＬＦＧ６クローン２種の、相対的な並び位置を示す図である。
【図９】ＬＦＧ６−＃２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図１０】ＬＦＧ６−＃４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）のオープンリーディングフレームがコードするタンパク質の疎水性プロットである。解析はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によって行った。
【図１】
2006512923.tif 000010
【図２】
2006512923.tif 000011
【図３】
2006512923.tif 000012
【図４】
2006512923.tif 000013
【図５】
2006512923.tif 000014
【図６】
2006512923.tif 000015
【図７】
2006512923.tif 000016
【図８】
2006512923.tif 000017
【図９】
2006512923.tif 000018
【図１０】
2006512923.tif 000019
【配列表】
2006512923000001.app
【国際調査報告】
2006512923.tif 000020
2006512923.tif 000021
2006512923.tif 000022
2006512923.tif 000023