(57)【要約】生体サンプルから核酸を抽出するための方法および組成物を提供する。該抽出組成物は、アルカリｐＨでプロテイナーゼ Kのような酵素を含み、僅かな表面活性剤が存在するかまたは全くない。抽出は特定の哺乳類組織サンプルでは室温で、特定の哺乳類組織では高温でおよび特定の植物組織では高温で60分以下で特に行い得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルから核酸を抽出するための方法であって、pH 7.5以上に緩衝される抽出組成物中において該サンプルをインキュベーションすることを含む方法、ここで、該抽出組成物はプロテアーゼ酵素を含むが、表面活性剤は含まず、インキュベーションは核酸の放出に十分な時間であるが、約60分間以下である。
【請求項２】
プロテアーゼ酵素がサブチリシン-様セリンプロテアーゼである、請求項１の方法。
【請求項３】
サブチリシン-様セリンプロテアーゼがプロテイナーゼ Kである、請求項２の方法。
【請求項４】
プロテイナーゼ Kが約50 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項３の方法。
【請求項５】
プロテイナーゼ Kが約100 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項４の方法。
【請求項６】
抽出組成物が約100 mM以下のEDTAを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
抽出組成物が約10 mMのEDTAを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
抽出組成物がトリス-HCl緩衝液を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
トリス-HCl緩衝液が約80 mM以上の濃度で存在する、請求項８の方法。
【請求項１０】
抽出組成物が少なくとも8.0以上のpHに緩衝される、請求項１の方法。
【請求項１１】
インキュベーションが約30分間以下である、請求項１の方法。
【請求項１２】
インキュベーションが約10分間以下である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
生体サンプルが植物組織を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
植物組織が葉または種子またはその一部を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
植物組織が粉砕されている、請求項１４の方法。
【請求項１６】
インキュベーションは約45℃から約60℃の温度である、請求項１３の方法。
【請求項１７】
インキュベーションは約50℃から約55℃の温度である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
生体サンプルが哺乳類組織サンプルを含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
哺乳類組織サンプルがマウスの尻尾組織またはマウス耳組織を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
インキュベーションは室温で行う、請求項１８の方法。
【請求項２１】
哺乳類から得られた組織サンプル由来の核酸を抽出するための方法であって、インキュベーション時間30分間以下、プロテアーゼ酵素および抽出組成物をpH 7.5以上に緩衝する緩衝性成分を含む該組成物において室温で該サンプルをインキュベーションすることを含む該方法。
【請求項２２】
抽出組成物が表面活性剤を含まない、請求項２１の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼ酵素がサブチリシン-様セリンプロテアーゼである、請求項２１の方法。
【請求項２４】
サブチリシン-様セリンプロテアーゼがプロテイナーゼ Kである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
プロテイナーゼ Kが約50 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項２４の方法。
【請求項２６】
プロテイナーゼ Kが約100 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項２５の方法。
【請求項２７】
抽出組成物が約100 mM以下のEDTAを含む、請求項２１の方法。
【請求項２８】
抽出組成物が約10 mMのEDTAを含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
緩衝性成分がトリス-HCIである、請求項２１の方法。
【請求項３０】
トリス-HClが約80 mM以上の濃度で存在する、請求項２９の方法。
【請求項３１】
抽出組成物が少なくとも8.0以上のpHに緩衝される、請求項２１の方法。
【請求項３２】
インキュベーションが約20分間以下である、請求項２１の方法。
【請求項３３】
インキュベーションが約10分間以下である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
哺乳類組織サンプルはマウスの尻尾組織またはマウス耳組織を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
植物から得られた生体サンプル由来の核酸を抽出するための方法であって、
インキュベーション時間30分間以下、プロテアーゼ酵素および抽出組成物をpH 7.5以上に緩衝する緩衝性成分を含む該組成物において該サンプルをインキュベーションすることを含む方法。
【請求項３６】
サンプルを室温でインキュベートする、請求項３５の方法。
【請求項３７】
サンプルを少なくとも約37℃であって約60℃以下の温度でインキュベートする、請求項３５の方法。
【請求項３８】
抽出組成物が表面活性剤を含まない、請求項３５の方法。
【請求項３９】
プロテアーゼ酵素がサブチリシン-様セリンプロテアーゼである、請求項３５の方法。
【請求項４０】
サブチリシン-様プロテアーゼがプロテイナーゼ Kである、請求項３９の方法。
【請求項４１】
プロテイナーゼ Kが約50ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項４０の方法。
【請求項４２】
プロテイナーゼ Kが約100 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項４１の方法。
【請求項４３】
抽出組成物が約100 mM以下のEDTAを含む、請求項３５の方法。
【請求項４４】
抽出組成物が約10 mMのEDTAを含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
緩衝性成分がトリス-HClである、請求項３５の方法。
【請求項４６】
トリス-HClが約80 mM以上の濃度で存在する、請求項４５の方法。
【請求項４７】
抽出組成物が少なくとも8.0以上のpHに緩衝される、請求項３５の方法。
【請求項４８】
インキュベーションが約20分間以下である、請求項３５の方法。
【請求項４９】
インキュベーションが約10分間以下である、請求項４８の方法。
【請求項５０】
植物から得られる生体サンプルが、葉または種子またはその一部を含む植物組織である、請求項３５の方法。
【請求項５１】
植物組織が粉砕されている、請求項５０の方法。. 
【請求項５２】
インキュベーションは約50℃から約55℃の温度である、請求項１６の方法。
【請求項５３】
組織サンプルから核酸を抽出する組成物であって、プロテアーゼ酵素、該組成物をpH7.5以上に維持する緩衝性成分、および100 mM以下のCa2+-キレート化剤を含む該組成物、ここで、該組成物は表面活性剤を含まず、該組成物は、60分間以下の組織サンプルのインキュベーション後のPCR増幅に適当な核酸を抽出する。
【請求項５４】
プロテアーゼ酵素がサブチリシン-様セリンプロテアーゼである、請求項５３の組成物。
【請求項５５】
プロテイナーゼ Kが約50 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項５４の組成物。
【請求項５６】
プロテイナーゼ Kが約100 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項５５の組成物。
【請求項５７】
抽出組成物が約100 mM以下のEDTAを含む、請求項５３の組成物。
【請求項５８】
抽出組成物が約10 mMのEDTAを含む、請求項５７の組成物。
【請求項５９】
抽出組成物がトリス-HCl緩衝液を含む、請求項５３の組成物。
【請求項６０】
トリス-HCl緩衝液が約80 mM以上の濃度で存在する、請求項５９の組成物。
【請求項６１】
抽出組成物が少なくとも8.0以上のpHに緩衝される、請求項５３の組成物。
【請求項６２】
組成物が、約30分間以下のPCR増幅インキュベーションに適当な核酸を抽出する、請求項５３の組成物。
【請求項６３】
インキュベーションが約20分間以下である、請求項６２の組成物。
【請求項６４】
インキュベーションが約10分間以下である、請求項６３の組成物。
【請求項６５】
組織サンプルが植物組織を含む、請求項６２の組成物。
【請求項６６】
植物組織が葉または種子またはその一部を含む、請求項６２の組成物。
【請求項６７】
植物組織が粉砕されている、請求項６６の組成物。
【請求項６８】
インキュベーションが約37℃から約60℃の温度である、請求項６２の組成物。
【請求項６９】
インキュベーションが約50℃から約55℃の温度である、請求項６８の組成物。
【請求項７０】
組織サンプルが哺乳類組織サンプルを含む、請求項６２の組成物。
【請求項７１】
哺乳類組織サンプルがマウスの尻尾組織またはマウス耳組織を含む、請求項７０の組成物。
【請求項７２】
インキュベーションは室温で行う、請求項７０の組成物。
【請求項７３】
組織サンプル由来の核酸を抽出するためのキットであって、別々にまたは任意の組合せの１以上の混合物中にパッケージされた核酸抽出組成物の成分を含む該キットであり、それぞれ別の成分または混合物は使用前の混合用の異なるコンテナー内にあり、該抽出組成物の成分はプロテアーゼ酵素、該抽出組成物のpHを7.5以上に維持する緩衝性成分および該成分の混合により該抽出組成物において0から約100mMの濃度を生ずるCa2+-キレート化剤を含み、ここで、該抽出組成物の成分は表面活性剤を含み、該組成物は、60分間以下の組織サンプルのインキュベーション後のPCR増幅に適当な核酸を抽出する。
【請求項７４】
キットが、緩衝性成分およびCa2+-キレート化剤を含む抽出溶液およびプロテアーゼ酵素を含むサンプル調製溶液を含む、請求項７３のキット。
【請求項７５】
プロテアーゼ酵素がサブチリシン-様セリンプロテアーゼである、請求項７３のキット。
【請求項７６】
サブチリシン-様セリンプロテアーゼがプロテイナーゼ Kである、請求項７５のキット。
【請求項７７】
プロテイナーゼ Kが約50 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項７６のキット。
【請求項７８】
プロテイナーゼ K が約100 ユニット/ml以上の濃度で存在する、請求項７７のキット。
【請求項７９】
Ca2+-キレート化剤が、抽出組成物中において約100 mM以下のEDTAを生ずるのに十分な量のEDTAである、請求項７３のキット。
【請求項８０】
EDTAが、約10 mM以下のEDTAを生ずるのに十分な量である、請求項７８のキット。
【請求項８１】
緩衝性成分がトリス-HCl 緩衝液を含む、請求項７３のキット。
【請求項８２】
トリス-HCl緩衝性成分が、抽出組成物中において約80 mM以上の濃度を生ずる、請求項７３のキット。
【請求項８３】
抽出組成物が少なくとも8.0以上のpHに緩衝される、請求項７３のキット。
【請求項８４】
組成物が、インキュベーションが約30分間以下であるPCR増幅に適当な核酸を抽出する、請求項７３のキット。
【請求項８５】
インキュベーションが約20分間以下である、請求項８４のキット。
【請求項８６】
インキュベーションが約10分間以下である、請求項８５のキット。
【請求項８７】
組織サンプルが植物組織を含む、請求項８６のキット。
【請求項８８】
植物組織が葉または種子またはその一部を含む、請求項８６のキット。
【請求項８９】
植物組織が粉砕されている、請求項８７のキット。
【請求項９０】
インキュベーションは約37℃から約60℃の温度である、請求項８７のキット。
【請求項９１】
インキュベーションは約50℃から約55℃の温度である、請求項９０のキット。
【請求項９２】
組織サンプルが哺乳類組織サンプルを含む、請求項８４のキット。
【請求項９３】
哺乳類組織サンプルがマウスの尻尾組織またはマウス耳組織を含む、請求項９２のキット。
【請求項９４】
インキュベーションは室温で行う、請求項９２のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
本発明の分野
本発明は、一般的に、生体サンプルからの核酸の抽出のための方法および組成物、および、より詳しくは、プロテイナーゼ Kを含むアルカリ溶液を用いる、組織サンプルからの核酸の迅速な抽出のための方法および組成物に、関係する。抽出溶液は、PCRを用い抽出した核酸の更なる処理に適当である。
【０００２】
関連分野
最新の分子生物学の出現とともに、生体サンプル中の核酸を研究する能力によって、生物学的および生化学的調査において多くの顕著な進歩が可能となった。その進歩を供するある方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、それは、単一分子程度に少ない出発物質から標的核酸を迅速に増幅し得る(概説として、Baumforth et al, J. Clin.Pathol.Mol. Pathol. 52 :1-10, 1999; Rapley et al, Medical Laboratory Sciences 49 : 119-128,1992参照)。
【０００３】
分子生物学におけるPCRおよび他の方法の応用には、生体サンプルからの核酸の抽出が必要であり、多数のアプローチがその抽出を行うべく工夫されている。種々のアプローチには、硫酸ドデシルナトリウムのような表面活性剤および細胞を溶解するプロテイナーゼ K(フェノールおよび／またはクロロホルムを用いる抽出を伴い核酸を放出する)による処理が含まれる(例えば、, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照)。
【０００４】
近年、多数のアプローチが生体サンプルからの核酸の迅速な抽出のために開発された。その方法は、容易で簡便な組織処理を提供するだけでなく、大量のサンプルの処理を可能にする(例えば、Steiner et al, Nucleic Acids Research 23: 2569-2570,1995参照)。それにもかかわらず、生体サンプルの効果的な抽出はまだ達成されていない。
【０００５】
動物および植物組織の両方が研究されており、核酸抽出のためのアプローチがその両方で開発されている。哺乳類組織の抽出では、幾つかの研究によって、上昇させた温度で数時間、プロテイナーゼ Kとインキュベーションすることにより組織を消化する報告が為されている(例えば、Goldenberger et al., PCR Methods and Applications 4 : 368-370,1995 ; Zimmermann et al., Comparative Medicine 50 : 314-316, 2000参照)。その方法は、商業的に入手可能なキットの根幹を構成し得る(例えば、GenEluteTM Mammalian Genomic DNA Miniprep kit available from Sigma-Aldrich, St. Louis MO参照)。
【０００６】
他の研究によって、ハイスループットアッセイにおける使用でより応用可能なより短時間のインキュベーション時間が報告されている。例えば、米国特許番号6,469,159では、緩衝液、非イオン界面活性剤を用い、アルカリpHで加熱する抽出方法が開示されている。加熱は、70℃から100℃で、5分から3時間であった。しかし、この引用文献では、70℃未満(それによって、より簡便に行うことができたであろう)での抽出、または界面活性剤を含まない抽出溶液の使用は開示されていなかった。
【０００７】
Drewsらは、55℃でマウスの尻尾部分の抽出のための15分間の手順を報告した。その手順は、pH 8.0のトリス-HCl緩衝液であって、イオン界面活性剤、硫酸ドデシルナトリウム (SDS)、およびプロテイナーゼ Kを含む該緩衝液を使用していた(Drews et al., BioTechniques17 : 866-867,1994)。同様に、Chenらは、pH 8.0のトリス-HCl緩衝液、SDSおよびプロテイナーゼ Kを用いる、55℃でマウス耳パンチ(ear-punch)組織を抽出するための30分間の手順を報告をした(Chen et al., BioTechniques 8 : 32-33,1990)。SDSは、PCR反応のTaqポリメラーゼを阻害することが知られているけれども(例えば、Gelfand, in PCR Technology, H. A. Erlich, Ed. , Stockton Press, N. Y. , 1989 pp. 17-22参照)、これらのグループは、抽出は界面活性剤なしで為し得るとことを示唆しなかった。加えて、これらの文献では、マウス組織の抽出が室温(より簡便となる)で行い得るという示唆はなかった。
【０００８】
しかし、Renらは、室温で30分間の、滅菌水中の洗浄剤が含まれないプロテイナーゼ K溶液を用いるマウス耳パンチ組織の抽出を報告した(Ren et al., Conteenp. Top. Lab. Anim. Sci. (US) 40 : 27-30, 2001)。しかし、このグループは、トリス-HCl緩衝液を使用しておらず、特に抽出溶液中に強塩基および強酸が含まれないことに注目すべきであった。
【０００９】
植物組織の迅速な抽出のための方法もまた報告されている。Thomsonらは、pH 9.5のトリス-HCl緩衝液を用い、95℃で5-60分間および65℃で10-60分間インキュベーションする、粉砕した葉、種子および胚からのDNAの抽出を報告した(Thomson et al, BioTechniques 19 :394-400, 2002)。McCarthyらは、尿素、SDSおよびEDTAを含む抽出緩衝液を用いる、室温における、粉砕したトランスジェニック小麦種子からのDNAの抽出を報告した。次いで、1: 1 フェノール: クロロホルム混合物が抽出緩衝液に添加された(BioTechniques 32: 560-564,2002)。Steinerらは、pH 8のトリス-HCl、ラウリルサルコシン・ナトリウム(sodium lauryl sarkosyl)およびポリビニルポリピロリドンを含む抽出緩衝液を用いる、90℃で20分間の、凍結乾燥し粉砕した葉組織の抽出を報告した。これらのグループは、抽出緩衝液中のプロテイナーゼ Kのようなプロテアーゼ酵素の使用を報告した。
【００１０】
Guidetは、プロテイナーゼ Kを抽出緩衝液中に含め、凍結乾燥し破砕した葉サンプルからのDNAの抽出を報告した(Guidet, Nucleic Acids Res. 21 : 4153-4154, 1994)。その緩衝液には、pH 8のトリス-HCl、EDTA、ラウリルサルコシン・ナトリウムおよびプロテイナーゼ Kが含まれており、抽出は50℃1 時間であった。しかし、プロテイナーゼ Kが抽出に顕著に貢献し得なかった。EDTA(Ca2+キレート化剤であると知られている)が濃度450mMで存在したためであった。これは、プロテイナーゼ KがCa2+-依存であるためであり、その酵素は、Guidetで用いられる高温では不安定であり、Ca2+の非存在下では酵素活性の減少が見られるであるからである(Bajorath et al., Nature337 : 481-484,1989 ; Muller et al,J.Biol. Chem. 269 : 23108-23111; Kolvenbach et al. , Int. J. Pept. Protein Res 36 : 387-391,1990)。更に、洗浄剤、ラウリルサルコシン・ナトリウムが存在し、その後のPCR増幅に影響し得る(Gelfand, 前掲, 1989)。
【００１１】
そのため、より早い方法および組成物がないことを考慮すると、植物および動物サンプルから核酸を抽出するための改良された方法および組成物の必要性がある。
【００１２】
本発明の概要
従って、本発明者らは、プロテアーゼ酵素を含む抽出組成物であって、該組成物をpH 7.5以上のアルカリに緩衝する緩衝性成分を含む該組成物を用い、動物または植物サンプルから核酸を効率よく抽出し得ることの発見に成功した。本発明の使用に適当なあるプロテアーゼ酵素はプロテイナーゼ Kである。サンプルからの核酸の抽出により、組織成分からの核酸の放出が効果的となりそれによって、PCRのようなその後の手順を行い得る。その後のPCR手順では、サイクル数(threshold cycle)値(Ct)はバックグラウンドを超えて検出される。Ct値は、使用する器具および検出システムに依存し、当業者により容易に解明され得る。典型的なCt値は、約20以下、約35以下または約50以下またはそれらの間の任意の値以下である。このため、核酸は、以下のような方法で抽出される。すなわち、核酸はPCRにより後に増幅され得る。増幅を防止するPCRインヒビターは抽出プロセスの一部として、生体サンプルまたは幾つか他の源の何れかから得た抽出溶液中に存在し得る。抽出溶液中にPCRインヒビターが存在することにより、核酸の増幅が全くないかほとんどない結果となり、これは、サンプルからの効果的な抽出の欠如の要因となると思われる。時折、界面活性剤がその後のPCR増幅を妨げ得るため、特定の実施態様の抽出組成物は、好ましくは、界面活性剤を含まない。本明細書で使用する用語「界面活性剤」は表面活性物質を意味することを目的とし、それは、本明細書では、用語「界面活性剤」と同義的に使用する。界面活性剤には、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤および両性イオン界面活性剤が含まれる。界面活性剤は特定の実施態様の抽出組成物には含まれないけれども、それにもかかわらず界面活性剤は、特定の他の実施態様の抽出組成物に含まれ得る。
【００１３】
加えて、幾つかの場合には、Ca2+の非存在がプロテアーゼ活性を直接的かまたは間接的か何れかで減少する(Id., Muller et al., 前掲, 1994; Bajorath et al, 前掲, 1989)ため、抽出組成物は、好ましくは、EDTAのような高濃度のCa2+-キレート化剤を含まない。好ましくは、存在したとしても、Ca2+-キレート化剤は、抽出組成物中、約100mM以下、約50mM以下、約25 mM以下または約10 mM以下の濃度である。
【００１４】
サンプルは、以下の種の例(これらに限らない)を含む多種多様の生物源の何れかに由来し得る：ヒトを含む哺乳類、魚類、鳥類、ショウジョウバエのような昆虫、C. elegansのような線虫などのような動物; 苔、シダ、樹木、灌木、顕花植物などを含む植物; キノコ、糸状菌、酵母などを含む菌類; アメーバ、ゾウリムシ、藻類、海藻、珪藻などを含む原生生物; または細菌またはラン藻の種を含むモネラ界。組織のサンプルは、例えば、血液細胞、組織培養調製物由来の細胞または組織またはバイオプシーサンプルから任意の工程により単離された細胞のような単離細胞のサンプルとは性質が異なると考えられる。本明細書で使用する用語、「組織」には、植物種子および種子組織が含まれる。一般的に、細胞から核酸を抽出することよりも組織から核酸を抽出するほうが難しいが、いつもその通りではない。
【００１５】
ヒトまたは他の哺乳類由来の組織または細胞のようなサンプルは、室温で約30分以下および本発明の特定の態様では20分以下、および他の態様では約10分以下または約5分以下のインキュベーションで抽出され得る。好ましいインキュベーション時間は約10分である。室温または周囲温度(それは本明細書では同義的に用い得る)についての言及は、人が抽出混合物を加熱することなく組織抽出を行い得る研究室の温度を意味する。室温は、典型的には、約20℃以下、約22℃以下、約25℃以下、または幾つかの場合には当業者が容易に理解できる更により高い温度以下である。
【００１６】
葉または種子の一部のような植物組織由来のサンプルは、室温または室温よりも高い温度で抽出され得る。植物組織の抽出温度は抽出を促進するために十分に高いが、プロテアーゼ酵素の変性を生ずるほどに高くはない。特定の実施態様では、植物組織の抽出は、特定のプロテアーゼ酵素の熱安定性に基づき、高い温度、少なくとも約37℃、少なくとも約45℃、少なくとも約50℃、少なくとも約55℃、または少なくとも約60℃またはより高い温度で行われる。
【００１７】
このため、特定の態様では、本発明は、生体サンプルから核酸を抽出するための方法を目的とする。該方法は、pH約7.5以上のアルカリに緩衝する抽出組成物中のサンプルをインキュベーションすることを含む。その抽出組成物はプロテアーゼ酵素を含み、表面活性剤は含まない。サンプルからの核酸の抽出のためのインキュベーション時間は、好ましくは、核酸の放出に十分な時間であるが、約60分以下である。インキュベーション時間、すなわち、抽出時間は、ある場合には、約5分、約10分、約20分、約30分または約45分であり得る。
【００１８】
他の態様では、本発明は、哺乳類から得られる生体サンプルから核酸を抽出するための方法を提供する。その方法は、pH 7.5以上に緩衝される抽出組成物において室温でサンプルをインキュベーション時間30分以下でインキュベーションすることを含む。
【００１９】
また他の本発明の態様では、植物から得られた生体サンプルからの核酸を抽出するための方法を提供する。その方法は、抽出組成物中、サンプルを、室温または最低少なくとも約37℃または少なくとも約45℃までの温度から最大約60℃以下の温度範囲の高い温度でインキュベーションすることを含む。その抽出組成物は、pH 7.5以上に緩衝される。インキュベーションは30分以下の時間の間である。
【００２０】
本発明はまた、生体サンプルからの核酸を抽出するための組成物およびキットを含む。その組成物およびキットにはプロテアーゼ酵素および組成物のpHを7.5以上に維持する緩衝剤を含む抽出組成物が含まれている。特定の例では、EDTAのようなCa2+-キレート化剤が存在し得、存在するならば、100 mM以下の濃度である。キットの抽出組成物は単一の組成物であり得るか、または抽出組成物の各成分は、使用前に、混合用に別々に保存され得る。そのため、本発明のキット中の核酸抽出組成物の成分は、別々かまたは成分の任意の組合せの１以上の混合物中にパッケージされ得る。別々の成分のそれぞれまたは１以上の混合物は、異なるコンテナー内にあり、単一のコンテナーが、キット全部を含み得る。好ましくは、キットの抽出組成物および本発明の組成物は表面活性剤を含まない。
【００２１】
図面の簡単な説明
図 1は、以下のような抽出組織からのPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す: 列 Iは、本明細書の抽出方法を用いたマウス耳パンチ組織の二連のサンプルの産物を示し、その方法では、室温で10分(レーン1および2)、20分(レーン3および4)または30分(レーン5および6)のインキュベーションまたは55℃で10分(レーン7および8)、20分(レーン9および10)および30分(レーン11および12)のインキュベーションを行った。列 IIは、マウス耳パンチから抽出した増幅DNAを示しており、それにより、10分の室温抽出後の95℃3分の加熱なし(レーン1および2)の効果; 中和(Neutralization)溶液Bの添加の省略による有害な効果の喪失(レーン3および4)およびマウスの尻尾から得られたDNAの増幅の比較効果(レーン5-12)が示される。列 IIIは、pH 10.5(レーン1および2)、pH 9.5(レーン3および4)、pH 8.5(レーン5および6)、pH 7.5(レーン7および8)に調整したpHでのマウスの尻尾の抽出の効果および陰性および陽性対照(レーン9および10)を示す。列 IVは、抽出効率に対する種々のKC1濃度の効果の喪失を示し、その濃度は200 mM KC1(レーン1および2)、100 mM KC1(レーン5および6)、50 mM KC1(レーン9および10)または0 mM KC1 (レーン13および14)であり、陰性対照はレーン3、7、11および15に示しており陽性対照はレーン4、8、12および16に示している。列 Vは、Ren et al. (Ren et al.,Contemp. Top. Lab.Anim. Sci. (US) 40 : 27-30,2001)の方法を用いるマウス耳パンチ組織の抽出物由来のPCR増幅産物を示し、その方法は、室温で10分(レーン1および2)、20分(レーン3および4)または30分(レーン5および6)のインキュベーションおよび55℃で10分(レーン7および8)、20分(レーン9および10)または30分(レーン11および12)のインキュベーションの後に行った。列 VIは、Ren et al.の方法を修飾した方法を用いたマウス耳パンチ組織の抽出物由来のPCR増幅産物を示し、その方法では、中和溶液Bは、抽出の最後(レーン1および2)および55℃30分のインキュベーション後のChen et al. (Chen et al., BioTechniques 8 : 32-33,1990)の方法による増幅の最後(レーン3および4)に加えられた(陰性および陽性対照(レーン5および6))。
【００２２】
図 2は、プロテイナーゼ Kの存在下(レーン1、2、5、6、10、11、14、および15)および非存在下(レーン3、4、7、8、12、13、16、および17)、抽出したとき(レーン1-4)および１０倍希釈したとき(レーン5-8)のダイズの種子の抽出物および抽出したとき(レーン10-13)および１０倍希釈したとき(レーン14-17)のモロコシの種子の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示している。
【００２３】
図 3は、プロテイナーゼ Kの存在下(レーン1、2、5、および6)および非存在下(レーン3、4、7、および8)、抽出したとき(レーン1-4)および１０希釈したとき(レーン5-8)のシロイヌナズナの種子の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【００２４】
図 4は、抽出したとき(列 I、レーン1、2、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、21、22、23、および24; 列 II、レーン1、2、5、6、7、8、9、10、13、14、15、および16)および１０倍希釈したとき(列I、レーン3、4、11、12、19および20; 列 II、レーン3、4、11、および12)のダイズ、モロコシ、アブラナ、小麦、およびシロイヌナズナの種子の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示し、その抽出には、本明細書の抽出方法(列I、レーン1-4、9-12および17-20; 列 II、レーン1-4および9-12)、本発明の方法のPCRミックスを用いるGuidet (Guidet, Nucleic Acids Res. 21 : 4153-4154,1994)により述べられた抽出方法(列I、レーン5、6、13、14、21、および22; 列 II、レーン5、6、13、および14)およびGuidetより述べられたPCR設定を用いるGuidetにより述べられた抽出方法(列 I、レーン7、8、15、16、23、および24; 列 II、レーン7、8、15、および16)を用いる。
【００２５】
図 5は、マウスの尻尾の抽出物から得られたPCR増幅産物の単一のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示し、それは、種々の成分の非存在下または存在下であり、プロテイナーゼ Kの非存在下(レーン1-4および9-12)および存在下(レーン5-8および13-16)の効果、水(レーン1および5)、EDTA (レーン2および6)、トリス-HCl (レーン3および7)、トリス-HClおよびEDTA (レーン4および8)、KC1(レーン9および13)、KC1およびEDTA (レーン10および14)、KC1およびトリス-HCl (レーン11および15)、および抽出溶液(E7526) (レーン12および16)の効果を示している。
【００２６】
図 6は、マウスの尻尾の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示し、それは、種々の成分の非存在下または存在下であり、トリス-HClおよびプロテイナーゼ K (レーン1および2); EDTA、トリス-HClおよびプロテイナーゼ K (レーン3および4)、KC1、トリス-HClおよびプロテイナーゼ K (レーン8および9)、および抽出溶液(レーン10および11)の効果を示しており、レーン5および12およびレーン6および13はそれぞれ陰性および陽性対照を示している。
【００２７】
本発明の詳細な説明
本発明により、核酸が、プロテアーゼ酵素を含み、アルカリpH 7.5以上に緩衝される抽出組成物を用いる生体サンプルから効率的に抽出され得ることが発見された。
【００２８】
プロテアーゼ酵素は、少なくとも部分的に破壊された組織を作り出す役割をし、それによって、核酸が放出する。そのように、同一の機能を有する任意の物質が抽出組成物で使用され得る。用語、プロテアーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼは本明細書で同義的に用い、それらは、共有結合的ペプチド結合の加水分解を触媒する一群の酵素をいう。プロテアーゼ酵素は当分野で周知であり、セリンプロテアーゼはプロテアーゼの１グループである。６つのグループのセリンプロテアーゼが同定されており、そのうちの最も大きな２つのグループは、キモトリプシン様およびサブチリシン-様のグループ(Rawlings et al. Methods Enzymol 244 : 19-61,1994 ; Barrett et al, Arch.Biochem. Biophys.318 : 247-250,1995)である。多くのサブチラーゼ(subtilase)が知られている(Siezen et al, Protein Science 6 : 501-523, 1997; Siezen et al., Protein Engineering 4 : 719-737,1991)。広く研究されている幾つかのサブチラーゼには、種々の種属のBacillusから得られたものが含まれ、それには、サブチリシン DY、サブチリシン Carlsberg、サブチリシン BPN' (ナガラーゼ(nagarse)とも呼ばれる)、メセンテリコペプチダーゼ(mesentericopeptidase)ならびにTritirachium album Limberから得られたプロテイナーゼ KおよびThermoactinomyces vulgarisから得られたサーミターゼ(thermitase)が含まれる。本発明の特定の実施態様では、プロテイナーゼ Kはプロテアーゼ酵素として好ましい。しかし、他のプロテアーゼ酵素もまた、特定の実施態様で使用され得、例えば、ナガラーゼ(ナガラーゼの特徴に関しては、Masaharu et al, J.Clin. Lab. Anal. 14 : 97-100,2000参照)などである。そのため、プロテアーゼ酵素は、生体サンプルを少なくとも部分的に破壊し、それによって短時間、例えば、約60分以下以内に核酸が放出する多数のプロテアーゼのうちの何れかであり得る。
【００２９】
プロテイナーゼ Kは凍結乾燥した粉末として、または水溶液または懸濁液で市場で入手可能である(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。活性は一般的にUnitで参照され、それは、30 mMトリス-HCl、pH 7.5中37℃で基質としてヘモグロビンを用い、分あたり1μM チロシンに相当するフォリン陽性アミノ酸およびペプチドを放出するのに必要な活性として定義される。プロテイナーゼ K調製物の典型的な活性は約30 ユニット/mgである。抽出組成物中のプロテイナーゼ K濃度は、好ましくは、少なくとも約25 ユニット/ml以上、少なくとも約50 ユニット/ml以上または少なくとも約100 ユニット/ml以上である。最大濃度は、約200 ユニット/mlまで、約400 ユニット/mlまで、または約800 ユニット/mlまであり得、濃度のその上限は、酵素の溶解性および抽出の最後で酵素を十分に変性させる能力の影響を受けるが、その後の抽出核酸のPCR増幅の際にDNAポリメラーゼ活性が減少することはないだろう。
【００３０】
本発明の抽出組成物は典型的には水溶液であるが、特定の実施態様では、抽出組成物は、水性分散液(aqueous dispersion)、懸濁液、エマルジョンなどの形態であり得る。抽出組成物の水性部分は、pH 約7.5以上のアルカリである。好ましくは、抽出組成物のpHは少なくとも約8.0以上、少なくとも約8.5以上、少なくとも約9.0以上および約7.5から約10の範囲、約8.0から約9.0の範囲、または約8.0から約8.5の範囲である。
【００３１】
多数の緩衝剤のうちの何れかを抽出組成物中に使用し得、その選択および使用は当業者が容易に行い得る(例えば、Beynon and Esterby, Buffer Solutions : The basics, BIOS Scientific Publishers, Oxford, 1996参照)。好ましくは、該緩衝液は、望ましいpHよりも1単位低い値から望ましいpHよりも1単位大きい値までのpKa 値を有する物質から調製される。そのため、例えば、pH 8.0の緩衝液は、約7.0から9.0までのpKaを有する物質を用い調製され得る。その緩衝物質には、例えば、AMPD(2-アミノ-2-メチル-1, 3-プロパンジオール)、重炭酸塩(炭酸水素ナトリウム)、Bicine (N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)-グリシン)、ビス-トリス-プロパン(1,3-ビス-[トリス-(ヒドロキシメチル)-メチルアミノ]-プロパン))、DIPSO (N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、グリシルグリシンHEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-l-エタンスルホン酸)、HEPPS(4-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-1-プロパンスルホン酸)、HEPPSO(4-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-1 (2-ヒドロキシ)-プロパンスルホン酸)、リン酸塩、POPSO(ピペラジン-1,4-ビス-(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸) )、TAPS(N-[トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸)、TAPSO (N-[トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル]-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸) TES(N-[トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル]-2-アミノエタンスルホン酸)、トリシン(N-[トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル]-グリシン)、トリス(トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン)およびトリエタノールアミンが含まれる。緩衝性成分としてはトリス-HClが好ましく、それは、典型的には水にトリスベースを溶解し、HClを加え、望ましいpHに調節することにより調製される。上記と同一のもののような、他の物質由来の緩衝液は、当分野に既知の方法によって当業者により容易に調製され得る。
【００３２】
上記のように、界面活性剤は、好ましくは、特定の実施態様の抽出組成物中には存在しない。両イオン性および非イオン界面活性剤はその実施態様には含まれていない。界面活性剤を欠く組成物には存在しない界面活性剤または抽出組成物には含まれていない界面活性剤により、当業者が容易に理解できるように、任意の濃度の界面活性剤は無視できることを意味する。その無視できる存在する量は、約0.5% (w/w)未満、好ましくは、約0.2% (w/w)未満、好ましくは、約0.1% (w/w)未満であると考えられる。
【００３３】
Ca2+ キレート化剤はまた、好ましくは、本発明の特定の実施態様の抽出組成物中、存在しないか、または低濃度で存在する。そのため、Ca2+ キレート化剤、EDTAが抽出組成物中に存在するならば、約100 mM以下の濃度、好ましくは、約50 mM以下の濃度、好ましくは、約20 mM以下の濃度、好ましくは、約10 mM以下の濃度である。
【００３４】
抽出組成物は２以上の組成物中であり得、それらは一緒に混合され、抽出組成物が形成される。ある実施態様では、その成分は２つの溶液、抽出溶液およびサンプル調製溶液中にあり得る。その抽出溶液は緩衝性成分、例えば、トリス-HClを含み得る。そのトリス-HClは約10 mMから約1000 mM、好ましくは、約20 mMから約300 mM、好ましくは、約50 mMから約200 mMおよび好ましくは、約100 mMの濃度であり得る。トリス-HCIに加えて、抽出溶液は、例えば、約0.1から約0.4 mM、好ましくは0.2から約0.3 mM、および好ましくは約0.25 mMの濃度のKC1のような塩を含み得る。EDTAもまた、例えば、約1から約40mM、好ましくは、約5から約20 mMおよび好ましくは約10mMの濃度の溶液中に存在し得る。
【００３５】
サンプル調製溶液は、例えば、約100から約1000ユニット/ml、好ましくは、約200から約800 ユニット/ml、および好ましくは約600 ユニット/mlの濃度のプロテイナーゼ Kのようなプロテアーゼ酵素を含み得る。第二の溶液はまた、例えば、トリス-HCIのような緩衝性成分、例えば、酢酸カルシウムまたは塩化カルシウムのような水溶性カルシウム化合物、および例えば、グリセリンのようなプロテイナーゼ Kに対する安定剤および／または可溶化剤を含み得る。その抽出溶液およびサンプル調製溶液は生体サンプルと接触させ、その混合物をインキュベートする。
【００３６】
インキュベーションは、好ましくは、約60分以下、好ましくは、約45分、好ましくは、約30分、好ましくは、約20分、好ましくは、約10分、好ましくは、約5分以下である。典型的には、インキュベーションは約10分である。
【００３７】
インキュベーションの温度は、抽出する生体サンプルに依存するだろう。例えば、哺乳類組織の場合、抽出は、好ましくは、室温、好ましくは、約25℃以下、好ましくは、約22℃以下および特に約20℃、約22℃、または約25℃である。他の生体サンプルの場合、例えば、植物組織の場合、抽出温度は約37℃から約60℃、好ましくは、約50℃から約55℃であり得る。インキュベーション温度はプロテアーゼ酵素が変性する温度以下に維持され、例えば、プロテイナーゼ Kの場合では、約65℃未満である。
【００３８】
核酸は、本発明の抽出組成物を用い広範囲の生体サンプルの何れかから抽出され得る。上記のように、該サンプルは、ヒトを含む哺乳類、魚類、鳥類、ショウジョウバエのような昆虫、C. elegansのような線虫などのような動物; 苔、シダ、樹木、灌木、顕花植物などを含む植物; キノコ、糸状菌、酵母などを含む菌類; アメーバ、ゾウリムシ、藻類、海藻、珪藻などを含む原生生物; または細菌またはラン藻の種を含むモネラ界から得られ得る。植物の生体サンプルには、葉のサンプル、種子のサンプルまたは他の植物組織のサンプルが含まれ得る。動物のサンプルには、哺乳類および特にヒトの組織および細胞サンプルが含まれ得る。哺乳類組織サンプルは、例えば、マウス耳パンチ部分またはマウスの尻尾部分からといった、当分野に既知の任意の方法により得られ得る。そのサンプルは、凍結乾燥または他の方法による乾燥などにより調製され得る。例えば、特定の植物組織の抽出のような特定の実施態様では、サンプルは細かく刻むか磨りつぶし、抽出工程を促進し得る。
【００３９】
ある特定の方法は、抽出溶液のピペッティングを含み得、サンプル調製溶液を微少遠心分離管またはマルチウェルプレートのウェルにピペッティングする。哺乳類組織抽出の場合、約100μlの抽出溶液および約25μlのサンプル調製溶液を加え、次いで、混合する。約2から10 mgの組織の哺乳類組織サンプルを該溶液中に置く。次いで、該サンプルは室温で10分間インキュベートする。インキュベーション時間の後、そのサンプルおよび溶液を95℃で約3分間加熱する。これにより、抽出工程は停止し、プロテイナーゼ Kを変性させ、抽出DNAのその後のPCR増幅が可能となる。
【００４０】
所望により、次いで、アルブミンを含む中和溶液を該混合物に加え得る。次いで、該抽出DNAは、例えば、PCR、シーケンシングなどのような当分野に既知の更なる方法に使用し得る。
【００４１】
本発明のキットには、別々にまたはある成分との何れかの組合せの１以上の混合物中にパッケージされた抽出組成物の成分を含み得る。そのため、キットには、例えば、抽出溶液およびサンプル調製溶液(それぞれ別々のコンテナーにパッケージされている)が含まれ得る。所望により、他の成分、例えば、中和溶液などがキットに含まれ得る。加えて、該キットにはまた、PCR増幅を行うための成分(キット(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)として市場で入手可能なような)が含まれ得る。
【００４２】
例示となる実施例を以下に記載する。特記しない限り、該実施例で使用する物質はSigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MOから入手した。
【実施例】
【００４３】
実施例 1
この実施例は、哺乳類組織サンプル、ショウジョウバエサンプル、C. elegansサンプルからおよび植物種子サンプルからのDNAの抽出を示す。
【００４４】
本抽出方法は抽出溶液、組織調製溶液および中和溶液を用いる。該抽出溶液(本明細書では、E7526と称する)は0.25 MKC1、0.01 M EDTAおよび0.1 Mトリス-HCI、pH 9.5を含む。サンプル調製溶液は、40% グリセリン、1 mM 酢酸カルシウムおよび 10 mMトリス-HCl、pH 7.5を含む水溶液中、Tritirachium Album Libium由来のプロテイナーゼ K(〜800 ユニット/mL)を含む。該中和溶液 Bは3% ウシアルブミンおよび10 ppm Kathonを含む。
【００４５】
室温で哺乳類、ショウジョウバエまたはC. elegansサンプルおよび55℃で種子サンプルからのDNAの抽出のために以下の手順を行う。
A. マウスの尻尾、動物組織、毛髪、唾液、ショウジョウバエまたはC.elegansからのDNA抽出. 
【００４６】
100μlの抽出溶液を微少遠心分離管またはマルチウェルプレートのウェル中に置く。25μlのサンプル調製溶液をそのチューブまたはウェルに加え、その２つの溶液を、ピペッティングアップおよびダウンにより混合する。幾つかの抽出を行う場合、十分な体積の抽出およびサンプル調製溶液を、使用前の2 時間までに4: 1の割合で事前に混合し得る。
【００４７】
サンプル調製および該調製溶液への添加は以下の通りである。
【００４８】
(i) 新鮮なまたは凍結したマウスの尻尾の場合:  はさみおよびピンセットを、使用前および種々のサンプル間において70% エタノールでリンスする。0.5から1 cm片のマウスの尻尾の先端を、切断端を下にして該溶液中に置く。徹底的な混合は、ボルテックスまたはピペッティングで行う。マウスの尻尾が確実に溶液内にあるように注意する。新しいマウスの尻尾の場合、抽出は尻尾を切ってから30分以内に行う。
【００４９】
(ii) 動物組織の場合:  はさみまたは外科用メスおよびピンセットを、使用前および種々のサンプル間において70% エタノールでリンスする。2から10 mg片の組織を該溶液中に置く。徹底的な混合は、ボルテックスまたはピペッティングで行う。該組織が確実に該溶液内にあるように注意する。
【００５０】
(iii) 毛幹の場合:  はさみおよびピンセットを、使用前および種々のサンプル間において70% エタノールでリンスする。余分な毛幹を、根を残して切り取り、サンプルを、根のほうの端を下にして溶液中に置く。
【００５１】
(iv) 唾液の場合:   10μlの唾液を該溶液中にピペッティングする。徹底的な混合は、ボルテックスまたはピペッティングで行う。
【００５２】
(v) カード上で乾燥させた唾液の場合:  50μlの唾液を収集カード(collection card)上にピペットし、カードを乾燥させ得る。パンチを、使用前および種々のサンプル間において70% エタノールでリンスする。ディスク(好ましくは、1/8インチ)を、乾燥した唾液サンプルのある領域のカードをパンチして取り出す。ディスクを該溶液中に置く。チューブまたはプレートを硬い表面上でタップし、ディスクがインキュベーション時間の間、確実に溶液中にあるようにする。
【００５３】
(vi) ショウジョウバエの場合:  1から10匹の麻酔をかけたハエを溶液中に破砕する。徹底的な混合は、ボルテックスまたはピペッティングで行う。ハエ物質が確実に該溶液内にあるように注意する。
【００５４】
(vii) C. elegansの場合:  1から10匹の蠕虫を該溶液に加える。徹底的な混合は、ボルテックスまたはピペッティングで行う。C. elegans物質が確実に該溶液内にあるように注意する。
【００５５】
サンプルを溶液に加えた後、該サンプルを室温で10分間インキュベートし、DNAを抽出する。10匹未満のショウジョウバエまたはC. elegansの場合、DNAの放出は、55℃でこのインキュベーションを行うことにより促進され得る。
【００５６】
抽出のためのインキュベーション後、該サンプルは95℃で3分間加熱し、プロテイナーゼ Kを変性させる。
【００５７】
次いで、100 μlの中和溶液 Bを該サンプルに加え、混合はボルテックスで行う。
【００５８】
中和化組織抽出物をPCRに直ちに用いるかまたは後のPCRのために4℃に保存する。抽出物は、4℃で6 ヶ月間まで保存し得る; しかし、長期保存前には未消化組織は除くことが望ましい。
【００５９】
B. 頬綿棒標本のDNA
第一に、頬細胞を綿棒で収集し、乾燥させる。乾燥時間はおよそ10から15分である。
【００６０】
200μlの抽出溶液を微少遠心分離管中にピペットする。25μlのサンプル調製溶液を該チューブに加え、混合物をピペットアップおよびダウンする。幾つかの抽出を行う場合、十分な体積の抽出およびサンプル調製溶液を、使用前の2 時間までに8 : 1の割合で事前に混合し得る。
【００６１】
その乾燥させた頬綿棒標本を該溶液中に置き、室温で1 分間インキュベートする。
【００６２】
その綿棒を溶液中で10回くるくると回し、次いで、余分な溶液を、該チューブの側壁に対してしっかりと綿棒をくるくると回すことにより、綿棒から取り除き該チューブ中へ入れる。次いで、該綿棒は破棄する。次いで、該チューブを閉じ、一瞬、ボルテックスする。
【００６３】
次いで、該サンプルを室温で10分間インキュベートし、DNAを抽出する。
【００６４】
抽出のためのインキュベーション後、該サンプルは95℃で3分間加熱し、プロテイナーゼ Kを変性させる。
【００６５】
次いで、200μlの中和溶液 B を該サンプルに加え、混合はボルテックスで行う。
【００６６】
中和化組織抽出物をPCRに直ちに用いるかまたは後のPCRのために4℃に保存する。抽出物は、殆どの場合、顕著な損失もなく4℃で6 ヶ月間まで保存し得る。
【００６７】
C. 植物種子からのDNA抽出:
最初に、種子は、用いる種子の体積に応じて100から800μlの体積の水中、プラスチックの乳棒を用いて手によるかビーズミル(2000 Geno/Grinder, Spex Certiprep,Inc., Metuchen, NJ)の使用により粉砕する。粉砕をプラスチックの乳棒を用い手で行う場合、その種子は、粉砕前の1時間、55℃の水に浸す。
【００６８】
45μlの抽出溶液および5μlのサンプル調製溶液を、微少遠心分離管またはマルチウェルプレートのウェル中で一緒に混合する。5μlの粉砕した種子を該混合物中に置く。
【００６９】
次いで、該混合物を、55℃で10分間加熱し、DNAを抽出する。
【００７０】
次いで、該抽出物を95℃で3分間加熱し、プロテイナーゼ Kを変性させる。
【００７１】
次いで、50μlの中和溶液 Bを該抽出物に加え、次いで、その溶液を混合する。
【００７２】
中和化種子抽出物をPCRに直ちに用いるかまたは後のPCRのために4℃に保存する。抽出物は、殆どの場合、顕著な損失もなく4℃で6 ヶ月間まで保存し得る。
【００７３】
PCRは、Extract-N-Amp PCR Ready MixまたはREDExtract-N-Amp PCR Ready Mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用い、上記の手順から得られたサンプル抽出物に直接行い得る。
【００７４】
実施例 2
この実施例は、マウス耳パンチおよび切断した尻尾(tail snips)からの組織を用いる本方法によるDNAの抽出を示し、初期の方法による抽出と比較する(Chen etal.,1990, 前掲 ; Ren et al., 2001, 前掲)。
【００７５】
全ての物質は特記しない限りSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。PCRプライマーはSigmaGenosys (The Woodlands, TX)から得た。
【００７６】
得られた組織サンプルはマウス耳パンチ(1/8インチディスク)およびマウスの尻尾(0.5 cmの尻尾の先端および次に先端をなす0.5 cm部分)であった。その尻尾片は新しいものかまたは以前に回収した組織であり-20℃に凍結保存していたものか何れかであった。それぞれの抽出は、1つのマウス耳パンチまたはマウスの尻尾を1.5 mlの微少遠心分離管中に置くことにより開始した。本方法を用いる抽出は実施例1に記載のように行った。比較の抽出は、Chen et al. (1990, 前掲)およびRen et al. (2001, 前掲)の方法を用い行った。
【００７７】
二本のチューブを、それぞれの状態の抽出用に準備した。本方法を用いるチューブのセットにおいて、100μlの抽出溶液および25μl サンプル調製溶液をピペットし、それぞれのチューブ(マウス耳パンチまたはマウスの尻尾の何れかが既に含まれている)において一緒に混合した。初期の方法の手順を用いるサンプルでは、その方法はRen et al.(その文献の表１に記載)(Ren et al, 2001, 前掲、参照)に概説されていた。端的には、Chen et al.の方法では、50 mM トリス-HCl、pH 8、20 mM NaCl、1mM EDTA、1% SDSおよび1μg/μl プロテイナーゼ Kの溶液20μlを用い、Ren et al.の方法では、滅菌水中、5μlのプロテイナーゼ K溶液(3μg/μl)を使用した。Ren et al.の混合物は室温または55℃で10、20および30分間インキュベートし、DNAを抽出した。Chen et al.の方法は以前に述べられているように行った(Chen et al. , 1990, 前掲)。
【００７８】
DNAを抽出するためのインキュベーション後、100μlの中和溶液 Bを加えた。次いで、該抽出物をボルテックスし、試薬を完全に混合した。
【００７９】
PCR増幅:  8つのチューブストリップ(tube strip)内での標準的PCRの場合、10μlのREDExtract-N-amp PCR(商標) Ready mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)をExtract-N-Amp 抽出に、または12.5 μlのJumpStart REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)をRen et al.およびChen et al.の方法に、フォワードおよびリバースプライマーは両方とも0.4μM、および抽出物のアリコート、本方法を用いる場合には4μlの抽出物またはChen et al.またはRen et al.の方法を用いる場合には1μlの抽出物を最終体積20μlに合わせた。マウス耳パンチおよびマウスの尻尾用のPCRプライマーにより、マウスインターロイキンワンベータ(IL-1β)遺伝子(5'-TCTGGGGTTGATGTAGGA-3'[配列番号1]および5'-GGGCTGGAAAAATGGTC-3'[配列番号2])から1181 bpのアンプリコンが生じた。反応物を室温でアセンブルし、GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA)にいれた。マウス耳パンチおよびマウスの尻尾の反応物でのPCR条件は94℃3分、次いで、94℃45秒、58℃60秒、72℃120秒の35サイクル、次いで72℃7分であった。
【００８０】
完了した反応物は、1X TBE 2% Seakem LE ＋ 10 x 15 Latitude Precast アガロースゲルでのゲル電気泳動(5μl/PCR反応)により、Biowhittaker Molecular Applications (Rockland, ME) (cat. No. 57266-lot No. LT0826)からの0.5μg/mlエチジウムブロミドを加えて分析した。そのゲルに用いるマーカーはP9577 PCRマーカー(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)であった。
【００８１】
定量PCRの場合(それは、ABI PRISM(商標) 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA)で行った)、96 ウェルプレートは、10μlのREDExtract-N-AMP(商標) PCR Ready mix (R4775)をExtract-N-Amp抽出に用い、または12.5μlのJumpStart REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (P0982)を初期の方法に用い作製し、IL-1βのフォワードおよびリバースプライマーは両方とも0.4μM、SYBR(登録商標) Green I dye (最終40 ppm)(Sigma-Aldrich)、0.6μlのReference Dye for Quantitative PCR 100X(Sigma-Aldrich)、および抽出物のアリコート、本方法を用いる場合には4μlの抽出物または初期の方法を用いる場合には1μlの抽出物を最終体積20μlに合わせた。マウス耳パンチおよびマウスの尻尾用のPCRプライマーにより、マウスインターロイキンワンベータ(IL-1β)遺伝子(5'-TCTGGGGTTGATGTAGGA-3'(配列番号1)および5'-GGGCTGGAAAAATGGTC-3'(配列番号2)から1181 bpのアンプリコンが生じた。反応物を層流フード(laminar flow hood)中で室温でアセンブルした。マウス耳パンチおよびマウスの尻尾の反応物でのPCR条件は94℃3分、次いで、94℃30秒、58℃30秒、72℃90秒の40サイクル、72℃90秒であった。
【００８２】
結果を図1に示す。二連のサンプルを並べて泳動した。列Iは室温で10分間(レーン1および2)、20分間(レーン3および4)および30分間(レーン5および6)の抽出の結果を示す。55℃で10分間(レーン7および8)、20分間(レーン9および10)および30分間(レーン11および12)の抽出の結果を示す。図で示されるように、DNAの確実な抽出が、試験した全ての条件の下、本発明の方法により達成された。
【００８３】
列 II は、PCR増幅産物がなく(レーン1および2)、95℃3分の加熱なしによる効果を示す。
【００８４】
列 IIのレーン3および4は、中和溶液 Bを加えないPCR増幅産物を示す。
【００８５】
列 IIのレーン5-12は、新しいマウスの尻尾からのPCR増幅産物を示し、この組織での同様な確実なDNA抽出を示している。
【００８６】
列 Vは、Ren et al.の方法を用いた結果を示し、列 VIは、Chen et al.の方法を用いた結果を示す。列 Vに示されるように、Ren et al.の方法により、室温で10分間(レーン1および2)および20分間(レーン3および4)のインキュベーション後に非常に僅かなPCR増幅産物が生じ、これは、非常に僅かなDNAがサンプルから抽出されたことを示唆する。30分のインキュベーション後の幾つかの可能な抽出が、少なくとも１つの二連の泳動における対応増幅産物(レーン5および6)で示唆された。DNA抽出におけるほんの少しの改善が、55℃で10分間(レーン7および8)、20分間(レーン9および10)または30分間(レーン11および12)のインキュベーション後に生じた増幅産物から示唆された。
【００８７】
55℃でのChen et al.の抽出方法により、30分間(レーン3および4)のインキュベーション後に中程度の量の増幅産物が生じた。レーン1および2は、中和溶液 Bを調製物に加えるRen et. al.の修飾方法を用いた抽出の結果を示す。
【００８８】
このため、本方法は、初期の方法による55℃でのインキュベーションにおいてさえ、Chen et al.の方法またはRen et al.の方法の何れかで見られる抽出よりも実質的に優れた、室温で10分間のインキュベーション後のDNA抽出を示した。
【００８９】
実施例 3
この実施例は、組織サンプルからのDNAの抽出に対するpHおよびKCl濃度の効果を示す。
【００９０】
凍結したマウスの尻尾切断物は、実施例2に記載のように抽出し、増幅した。結果を図 1、列IIIおよびIVに示す。
【００９１】
PCR増幅は抽出後に行い、pHはpH 10.5 (レーン1および2)、pH 9.5 (レーン3および4)、pH 8.5(レーン5および6)およびpH 7.5 (レーン7および8)に調節し、陰性および陽性対照はレーン9および10である。図で示し得るように、抽出効率において僅かな違いがpH 8.5からpH 10.5で見られた。pH 7.5では、２つのうちの一方の調製物で、PCR増幅産物は見られなかった。それは、抽出効率はpHが7.5以下に減少すると、減少し始め得ることを示唆する。
【００９２】
KCl濃度は、200 mM KCl (レーン1および2)、100 mM KCl(レーン5および6)、50mM KCl(レーン9および10)または0 mM KCl(レーン13および14)では抽出効率への効果は全く示さなかった。レーン3、7、11および15、および4、8、12および16はそれぞれ陰性および陽性対照である。
【００９３】
実施例 4
この実施例は、プロテイナーゼ Kの存在下および非存在下における種子の抽出を示す。
【００９４】
プロテイナーゼ Kの存在下および非存在下における抽出効率への効果をダイズ、モロコシおよびシロイヌナズナの種子を用い試験した。
【００９５】
全ての物質は、特記しない限り、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。全てのPCRプライマーはSigmaGenosys (The Woodlands, TX)から得た。使用したプライマーは以下の通り:
ダイズ 0513 bp: 
フォワード-5'-TTG GGA ACC TCT ACA TTC-3' (配列番号3) 
リバース-5'-CGG GCA GAA ACT AAA TC-3' (配列番号4) 
モロコシ 0503 bp : 
フォワード-5'-ATT GGC GAT GGC AAG T-3' (配列番号5) 
リバース-5'-GAA TCT GCT GGG GTT CAG-3' (配列番号6) 
シロイヌナズナ 2110 bp : 
フォワード-5'-ACT CTA CCT CGC CAC CAT-3' (配列番号7) 
リバース-5'-GCC CAC TCT GCT TCA AAC-3' (配列番号8) 
【００９６】
種子を96マス目のウェルブロックのウェルに置いた。ダイズおよびモロコシでは、1つの種子をそれぞれ２つ別々のウェルに置いた。約50のシロイヌナズナの種子をそれぞれ２つ別々のウェルに置いた。単一のステンレススチール粉砕ボールを、それぞれ種子を含むウェル中に置いた。800μlの水をダイズの種子を含むウェルにピペットした。200μlの水をモロコシの種子を含むウェルにピペットした。100μlの水をシロイヌナズナの種子を含むウェルにピペットした。該プレートは、ラバーシーリングマットを用いシールした。種子は、2000Geno/Grinder(Spex Certiprep, Inc (Metuchen, NJ)を用い、1500ストローク/分で10分間、粉砕した。
【００９７】
２つのセットのチューブを抽出用に用意した。第一番目のセットはサンプル型に関し標識し、その抽出物はプロテイナーゼ Kを含んでいた。第二番目のセットのチューブはサンプル型で標識し、プロテイナーゼ Kは抽出に用いなかった。第一番目のセットのチューブにおいて、45μlの抽出溶液および5μlのサンプル調製溶液(プロテイナーゼ Kを含む)をピペットし、一緒に混合した。第二番目のセットのチューブにおいて、50μlの抽出溶液をピペットした。それぞれの抽出チューブに、5μlの適当に粉砕した種子物質を抽出混合物にピペットし、ピペットアップおよびダウンして混合した。それぞれの混合物を55℃で10分間、インキュベートし、DNAを抽出した。次いで、それぞれの抽出物を95℃で3分間、インキュベートし、抽出を停止した。それぞれ停止した抽出物に、50μlの中和溶液 Bをピペットした。次いで、その抽出物をボルテックスし、混合した。
【００９８】
標準的なPCR増幅の場合、最終体積20μl中、10μlのREDExtract-N-amp PCR(商標) mix (Sigma-Aldrich)、フォワードおよびリバースプライマーは両方とも0.4μM、および4μlの抽出物である。ダイズのPCRプライマーは513 bp、モロコシは503 bp、およびシロイヌナズナは2110 bpであった。反応物は室温でアセンブルした。ダイズおよびモロコシPCRのPCR 条件:94℃3分、次いで、94℃30秒、44℃30秒、68℃45秒の35サイクル、および68℃7分。シロイヌナズナPCRの場合:  94℃3分、次いで、94℃30秒、49℃30秒、68℃2分15秒の35サイクル、および68℃7分。5μlのPCR産物は、TBE中の1 % アガロースゲルでのゲル電気泳動により分析した。
【００９９】
図 2に示すように、プロテイナーゼ Kは種子からのDNAの抽出を改善する。 ダイズプレップ( prep)からのバンドの強度は、抽出物中にプロテイナーゼ Kを含むサンプルではより明るくなる。これは、水で希釈しない抽出物におけるPCRおよび水で希釈しない抽出物の1: 10 希釈におけるPCRの両方において見ることができる。プロテイナーゼ Kが含まれようが含まれまいが、モロコシプレップにおいて効果は全く見られない。非常に大きな相違がシロイヌナズナプレップのPCRに見られる(図 3)。抽出物中にプロテイナーゼ Kを有しなかったサンプルでは抽出物中にプロテイナーゼ Kを有したサンプルと同様には行われなかったことが図3から明かである。
【０１００】
このため、プロテイナーゼ Kは、ダイズおよびシロイヌナズナの種子からのDNAの抽出を改善したが、試験したモロコシの種子からの抽出を改善するかは明かではなかった。
【０１０１】
実施例 5
この実施例は、本明細書の方法および先に報告された方法(Guidet, Nucleic Acids Res. 21 : 4153-4154,1994)の抽出効率を比較する。
【０１０２】
抽出は、ダイズ、モロコシ、アブラナ、小麦、およびシロイヌナズナの種子を用い行った。全ての物質は、特記しない限りSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。全てのPCRプライマーは、SigmaGenosys (The Woodlands, TX)から得た。ダイズ、モロコシおよびシロイヌナズナに使用したプライマーは実施例4に記載したものであった。アブラナおよび小麦に使用したプライマーは以下の通りであった: 
アブラナ 0762 bp :
フォワード-5'-CTT TTC CTC CCG CAC CTT-3' (配列番号9)
リバース-5'-GCC GCC GAC TTG ATT TC-3'配列番号; 10)
小麦 0500 bp :
フォワード-5'-AGT GGC GAG AGG AGG TTC-3' (配列番号11)
リバース-5'-TGG TTG GCG ATT GTG G-3' (配列番号12)
【０１０３】
種子を96マス目のウェルブロックのウェルに置いた。ダイズ、モロコシ、アブラナ、および小麦では、1つの種子を2つ別々のウェルに置いた。約50のシロイヌナズナの種子を２つ別々のウェルに置いた。単一のステンレススチール粉砕ボールを、それぞれ種子を含むウェル中に置いた。800μlの水をダイズの種子を含むウェルにピペットした。200μlの水をモロコシ、アブラナ、および小麦の種子を含むウェルにピペットした。100μlの水をシロイヌナズナの種子を含むウェルにピペットした。該プレートは、ラバーシーリングマットを用いシールする。種子は、2000Geno/Grinder(Spex Certiprep, Inc (Metuchen, NJ)を用い、1500ストローク/分で10分間、粉砕する。
【０１０４】
本明細書の方法を用いるDNA抽出では、２つのセットのチューブを用意した。第一番目のセットはサンプル型および方法に関して標識し、第二番目のセットのチューブはサンプル型、方法および第一番目のセットの1: 10 希釈の希釈で標識した。第一番目のセットのチューブにおいて、45μlの抽出溶液およびプロテイナーゼ Kを含む5μlのサンプル調製溶液をピペットし、一緒に混合した。第二番目のセットのチューブ中に、18μlの50: 50混合物の抽出溶液および中和溶液 Bをピペットした。それぞれの抽出チューブに対し、5μlの適当に粉砕した種子物質を抽出混合物にピペットし、ピペットアップおよびダウンして混合した。それぞれの混合物を55℃で10分間、インキュベートし、DNAを抽出した。次いで、それぞれの抽出物を95℃で3分間インキュベートし、抽出を停止し、プロテイナーゼ Kを変性させた。50μlの中和溶液 Bをそれぞれの抽出混合物にピペットした。次いで、抽出物をボルテックスし、混合した。2μlの中和化抽出物を第二番目のセットのチューブ中にピペットし、ボルテックスし、混合した。
【０１０５】
Guidet(1994, 前掲)の方法を用いるDNA抽出の場合、溶液は、論文に記載のように、10mM トリス-HCl、pH8.0、0.45 M EDTA、1% ラウリルサルコシン、および1 mg/ml プロテイナーゼ Kを含むように調製した。100μlの抽出緩衝液をサンプル型およびG(それらは先に報告された方法による調製物であることを示す)で標識されたチューブのセットにピペットした。5μlの粉砕した種子物質を正しいチューブにピペットした。次いで、全てのセットのサンプルを50℃で1時間インキュベートした。そのインキュベーション後、抽出物は150μlのミリQ H2Oで希釈した。20μlの希釈抽出物を、10μgのRNase Aを有する80μlのミリQ H2Oを含むチューブにピペットした。次いで、サンプルを100℃で5分間インキュベートした。サンプルを室温にまで冷却した後、10μlを、240μlのミリQ H2Oを含む新しいチューブにピペットした。そのサンプルをボルテックスし、完全に混合した。
【０１０６】
本明細書の方法を用い得られた抽出物のPCR増幅は、最終体積20μl中、10μlのREDExtract-N-Amp PCR(商標) mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、フォワードおよびリバースプライマーは両方とも0.4μM、および4μlの抽出物を用い行った。Guidetにより先に報告された方法を用い抽出したサンプルの場合、PCRは、最終体積20μl中、10μｌのREDExtract-N-Amp PCR(商標) mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、フォワードおよびリバースプライマーは両方とも0.4μM、4μlの50: 50抽出溶液および中和溶液 B混合物、およびGuidetの方法を用い得られた5μlの抽出物を用い行った。Guidetの方法により設定したサンプルの場合、最終体積20μl中、1 unitのJumpstart taq(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、0.1 mMのそれぞれdNTP(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、1X Taqポリメラーゼ緩衝液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、0.4μMのそれぞれのプライマーおよびGuidetの方法を用い得られた5μlの抽出物であった。ダイズのPCRプライマーは513 bp、モロコシは503 bp、アブラナは762 bp、小麦は500 bpおよびシロイヌナズナは2110 bpであった。反応物は室温でアセンブルした。ダイズおよびモロコシPCRのPCR条件: 94℃3分、次いで、94℃30秒、44℃30秒、68℃45秒の35サイクル、および68℃7分。アブラナおよび小麦PCRの場合:94℃3分、次いで、94℃30秒、55℃30秒、68℃1分の35サイクル、および68℃7分。シロイヌナズナPCRの場合:94℃3分、次いで、94℃30秒、49℃30秒、68℃2分15秒の35サイクル、および68℃7分。5μlの全てのred PCR産物および6μlの透明な産物(4μlのローディング緩衝液(G2526)をPCR体積全体に加えた)は、TBE中の1 % アガロースゲルでのゲル電気泳動により分析した。そのゲルは125Vで1時間、泳動した。
【０１０７】
図 4で判るように、本発明の抽出方法は、Guidetにより報告された方法よりも、試験する全ての種子由来のPCR増幅産物を実質的に多く作成した。更に、本発明の方法に必要な10分という短い時間により、Guidetの初期の方法に必要な１時間の抽出時間が実質的に短縮された。
【０１０８】
実施例 6
この実施例は、抽出の効果に対する、抽出溶液およびサンプル調製溶液の種々の成分を変えたときの効果を示す。
【０１０９】
凍結したマウスの尻尾を用い、抽出組成物の各成分を試験した。それは、抽出溶液およびサンプル調製溶液から構成されていた。要因実験計画(factorial experimental design)を成分、抽出組成物の全ての可能な組合せに関し評価した。以下の表1は、試験した組合せを示す。
【表１】
2006524987.tif 000002
【０１１０】
全ての物質は特記しない限りSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。全てのPCRプライマーはSigmaGenosys(The Woodlands, TX)から得た。全ての試薬はSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から得た。
【０１１１】
DNA抽出は以下の通り行った。マウスの切断した尻尾(0.5 cmの尻尾の先端)を先に回収し、使用前の数ヶ月間まで-20℃に凍結保存した。それぞれの抽出は、1つのマウスの尻尾を1.5ml微少遠心分離管に置くことにより開始した。使用したその方法は実施例1に記載の通りであった。
【０１１２】
１つのチューブをそれぞれの条件の抽出用に調製した。それぞれのチューブにおいて、100μlのそれぞれの抽出混合物および25μlのサンプル調製溶液または水をピペットし、それぞれのチューブ内で一緒に混合した(既にマウスの尻尾が入っていた)。それぞれの混合物は室温、すなわち、およそ22℃で10分間、インキュベーションし、DNAを抽出した。次いで、それぞれの抽出物は3分間95℃でインキュベーションした。それぞれの抽出混合物に対し、100μlの中和溶液 Bを添加した。次いで、その抽出物をボルテックスし、完全に試薬を混合させた。次いで、その抽出物をPCR増幅用に準備した。
【０１１３】
8つのチューブストリップ内での標準的PCRの場合、最終体積20μl中、10μlのREDExtract-N-amp PCR (商標) Ready mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、フォワードおよびリバースプライマーは両方とも0.4μM、および4μlの抽出物であった。２つのマスターミックスを作成した。抽出物の半分はKClを含んではおらず(キットPCR mixesの適当なパフォーマンスには必須である)、それ故、更なるKClを一方の混合物に加え、他方には加えなかった。マウスの尻尾用のPCRプライマーにより、マウスインターロイキンワンベータ(IL-1β)遺伝子から1181 bpのアンプリコンが生じた。プライマーは以下の通りであった: フォワードプライマー: 5'-TCTGGGGTTGATGTAGGA-3'(配列番号13)およびリバースプライマー: 5'-GGGCTGGAAAAATGGTC-3')(配列番号14)。反応物は室温でアセンブルし、GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA)に入れた。マウスの尻尾の反応物でのPCR条件:  94℃3 分、次いで、94℃45秒、58℃60秒、72℃120秒の35サイクル、次いで、72℃7 分。完了した反応物は、1 X TBE 2% Seakem LE + 10 x 15 Latitude Precast アガロースゲルでのゲル電気泳動(5μl/PCR反応)により、BioWhittaker Molecular Applications (Rockland, ME) (Cat. No. 57231-lot No. LT0902)から得た0.5μg/ml エチジウムブロミドを加えて分析した。そのゲルは、0.5 X TBEランニングバッファー(トリスホウ酸塩-EDTA緩衝液 5x 濃縮(T6400)の希釈物である)中で泳動した。サブマリンゲル電気泳動を用い、rig (E1138)を125ボルトで45分間、泳動した。そのゲルに用いるマーカーはP9577 PCRマーカーであった(2000、1500、1000、750、500、300、150および50 bpのバンド)。
【０１１４】
DNA陽性対照は、GenElute (商標) Mammalian Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)により1.2cmのマウスの尻尾から調製した。精製したDNAは57.5ng/μlに希釈し、2-倍の一連の希釈物はその57.5ng/μl希釈物から、〜12.5ng/μlの希釈となるまで、調製し、次いで、1μlをPCRミックスの陽性対照に使用した。陰性対照は、PCR反応物中、4μlの50/50混合物の抽出溶液および中和溶液 Bからなる。
【０１１５】
図 5に示すように、プロテイナーゼ Kおよびトリス-HCl緩衝液の存在下、抽出効率は改善される。抽出溶液、E7526は実施例1と同一のものであった。
【０１１６】
研究は、二連のサンプルを用いて繰り返し、結果を確認した。以下の表2は追加の研究において試験した全ての組合せを示す。
【表２】
2006524987.tif 000003
【０１１７】
材料および方法は上記の通りであった。
【０１１８】
図 6に示すように、要因実験(factorial study)で他の3つの組合せの成分ほどにはよくないにしても、実施例1と同じE7526抽出溶液が十分に機能した。トリス-HCl成分およびプロテイナーゼ K成分は全てのサンプルに存在し、全てにおいて良好な抽出が見られた。第一の要因実験と合わせて考えると、緩衝性成分、トリス-HClおよびプロテイナーゼ Kは最も重要な要因であると考えられる。プロテイナーゼ Kは、pHが一定に維持されているときには十分に機能する。
【０１１９】
研究の第二の部分では二連のサンプルにより、それぞれのセットの条件の結果と一致が見られる。プロテイナーゼ Kを伴うE7526抽出溶液は、他の組合せよりも僅かに明るかった(図 6)。KC1は、抽出物中において僅かに相違すると思われるが、その存在は、その後のPCRミックスに必要である。
【０１２０】
本発明の範囲を逸脱することなく、上記方法および組成物は種々変更し得るため、上記明細書中に含まれる全ての事項は例示として解釈され、その事項に限定されると解釈すべきではないことを意図する。
【０１２１】
本明細書で引用する全ての引用文献は、引用により本明細書に加える。本明細書の引用文献の考察は、その著者の主張を単に要約したものであると解釈され、何れかの引用文献が特許性に関係する従来技術を構成すると認めるものではない。出願人は、引用文献の正確性および妥当性を変更する権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図 1は、抽出組織からのPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す
【図２】図 2は、ダイズおよびモロコシの種子の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図３】図 3は、シロイヌナズナの種子の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図４】図 4は、ダイズ、モロコシ、アブラナ、小麦、およびシロイヌナズナの種子の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図５】図 5は、マウスの尻尾の抽出物から得られたPCR増幅産物の単一のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図６】図 6は、マウスの尻尾の抽出物から得られたPCR増幅産物の二連のサンプルのアガロースゲル電気泳動を示す。
【配列表】
2006524987.tif 000004
2006524987.tif 000005
2006524987.tif 000006
【図１】
2006524987.tif 000007
【図２】
2006524987.tif 000008
【図３】
2006524987.tif 000009
【図４】
2006524987.tif 000010
【図５】
2006524987.tif 000011
【図６】
2006524987.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月9日(2005.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006524987000001.app