(57)【要約】本発明は、一価および多価の単一特異性結合タンパク質、ならびに多価多重特異性タンパク質に関する。これらの結合タンパク質の一つの実施態様は一以上の結合部位を有し、各結合部位は標的抗原または標的抗原上のエピトープと結合する。これらの結合タンパク質のもう一つの実施態様は二以上の結合部位を有し、各結合部位は標的抗原上の異なるエピトープに対して親和性を有するか、または標的抗原かハプテンのいずれかに対して親和性を有する。本発明はさらに、宿主においてこれらの機能的結合タンパク質を発現させるために有用な組換えベクターに関する。より詳しくは、本発明は、ＲＳ７と呼ばれる腫瘍関連抗原結合タンパク質、およびその他のＥＧＰ−１結合タンパク質に関する。本発明はさらに、ヒト化、ヒトおよびキメラＲＳ７抗原結合タンパク質、ならびに診断および治療におけるこのような結合タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＰ−１糖タンパク質と結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
ＲＳ７抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
ヒト化されている、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
完全にヒト型である、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＬ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＴを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＨＹＩＴＰＬＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものである、請求項３に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＮＹＧＭＮを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものである、請求項３に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
マウスＲＳ７ ＭＡｂのＣＤＲとヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域の枠組み構造領域（ＦＲ）とを含んでなり、ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＴを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＨＹＩＴＰＬＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものであり、かつ、ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＮＹＧＭＮを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものである、請求項３に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域のＦＲをさらに含んでなる、請求項７に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
前記ヒト化抗体のＬ鎖またはＨ鎖可変領域のＦＲが、マウスＲＳ７ ＭＡｂの対応する位置に見られるアミノ酸残基により置換されている少なくとも一つのアミノ酸を含んでなるものである、請求項３に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
少なくとも一つの置換アミノ酸残基が、図３ＢのマウスＨ鎖可変領域のアミノ酸残基３８、４６、６８および９１からなる群から選択される位置にあるものである、請求項９に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
少なくとも一つの置換アミノ酸残基が、図３ＡのマウスＬ鎖可変領域のアミノ酸残基２０、８５および１００からなる群から選択される位置にあるものである、請求項９に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
キメラである、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
図２ＡのＲＳ７ ＶＫヌクレオチド配列および図２ＢのＲＳ７ ＶＨヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
図４ＡのｈＲＳ７ ＶＫヌクレオチド配列および図４ＢのｈＲＳ７ ＶＨヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】
癌細胞と結合する請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる抗体成分を含んでなり、該抗体成分が少なくとも一種の診断薬または少なくとも一種の治療薬に結合されている、癌細胞に標的化された診断用または治療用の複合体。
【請求項１６】
前記診断薬が少なくとも一種の光活性診断薬を含んでなるものである、請求項１５に記載の診断用複合体。
【請求項１７】
前記診断薬が、２５〜４,０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性標識である、請求項１５に記載の診断用複合体。
【請求項１８】
前記放射性標識が、γ、β、または陽電子放射性同位元素である、請求項１７に記載の診断用複合体。
【請求項１９】
前記放射性標識が、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１７７Ｌｕおよび７６Ｂｒからなる群から選択されるものである、請求項１８に記載の診断用複合体。
【請求項２０】
前記診断薬が造影剤である、請求項１５に記載の診断用複合体。
【請求項２１】
前記造影剤が常磁性イオンである、請求項２０に記載の診断用複合体。
【請求項２２】
前記造影剤が超音波増強剤である、請求項２０に記載の診断用複合体。
【請求項２３】
前記超音波増強剤が、ヒト化ＲＳ７ ＩｇＧまたはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項２２に記載の診断用複合体。
【請求項２４】
前記リポソームがガス充填されている、請求項２３に記載の診断用複合体。
【請求項２５】
前記常磁性イオンが、マンガン、鉄またはガドリニウムを含んでなる金属である、請求項２１に記載の診断用複合体。
【請求項２６】
前記抗体成分が抗体融合タンパク質またはそのフラグメントであり、前記ＭＡｂまたはそのフラグメントの各々が少なくとも一種の治療薬に結合されている、請求項１５に記載の治療用複合体。
【請求項２７】
前記治療薬が、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、光活性治療薬、細胞傷害剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１５または２６に記載の治療用複合体。
【請求項２８】
前記細胞傷害剤が薬物または毒素である、請求項２７に記載の治療用複合体。
【請求項２９】
前記薬物が、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤および抗生物質、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的特性を有するものである、請求項２８に記載の治療用複合体。
【請求項３０】
前記薬物が、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、ドキソルビシン、およびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項２８に記載の治療用複合体。
【請求項３１】
前記毒素が、リシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択されるものである、請求項２８に記載の治療用複合体。
【請求項３２】
前記免疫調節剤が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項２７に記載の治療用複合体。
【請求項３３】
前記リンホトキシンが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）であり、前記造血因子がインターロイキン（ＩＬ）であり、前記コロニー刺激因子が顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、 前記インターフェロンがインターフェロン−α、−βまたは−γであり、前記幹細胞増殖因子が「Ｓ１因子」と呼ばれるものである、請求項３２に記載の治療用複合体。
【請求項３４】
前記放射性核種が６０〜４０００ｋｅＶの間のエネルギーを有するものである、請求項１５に記載の診断用複合体。
【請求項３５】
前記免疫調節剤が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αまたはそれらの組み合わせを含んでなるものである、請求項３２に記載の治療用複合体。
【請求項３６】
前記放射性標識が６０〜７００ｋｅＶの間のエネルギーを有するものである、請求項２７に記載の治療用複合体。
【請求項３７】
前記放射性標識が、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項２７に記載の治療用複合体。
【請求項３８】
前記光活性治療薬が色素原または色素である、請求項２７に記載の治療用複合体。
【請求項３９】
ＥＧＰ−１標的抗原に対して親和性を有する一以上の抗原結合部位、およびハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位を含んでなる、多価多重特異性抗体。
【請求項４０】
ヒト化されている、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
ヒト抗体である、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４２】
キメラ化されている、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４３】
診断薬または治療薬をさらに含んでなる、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４４】
少なくとも二つの抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなり、該ＭＡｂまたはそのフラグメントが請求項１〜４３のいずれか一項に記載のＭＡｂまたはそのフラグメントから選択されるものである、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
【請求項４５】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の少なくとも一つの第一の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなる、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
【請求項４６】
前記第二のＭＡｂが癌腫関連抗体である、請求項４５に記載の抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
【請求項４７】
前記癌腫関連抗体が、頭頸部癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、結腸癌および／または膀胱癌からなる群から選択される癌上の抗原と結合するものである、請求項４６に記載の抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
【請求項４８】
前記癌腫関連抗体が、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、Ｔｎ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ−１−４、Ｔａｇ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＨＣＧ−β、フェリチン、ＰＡＰ、ＰＬＡＰ、ＥＧＰ−２、ヒストン、サイトケラチン、テネイシン、ＣａｎＡｇ、腎臓癌Ｇ２５０、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン様成長因子、癌遺伝子産物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原と反応性のある抗体またはフラグメントである、請求項４６に記載の抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
【請求項４９】
（ａ）請求項１〜４３のいずれか一項に記載の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメント、
（ｂ）少なくとも二つの前記ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント、
（ｃ）請求項１〜４３のいずれか一項に記載の前記ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のＭＡｂまたはそのフラグメント以外の、少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント、ならびに
（ｄ）請求項１〜４３のいずれか一項に記載の前記ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＭＡｂまたはそのフラグメント以外の、少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなり、該第二のＭＡｂが、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、Ｔｎ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ−１−４、Ｔａｇ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＨＣＧ−β、フェリチン、ＰＡＰ、ＰＬＡＰ、ＥＧＰ−２、ヒストン、サイトケラチン、テネイシン、ＣａｎＡｇ、腎臓癌Ｇ２５０、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン様成長因子、癌遺伝子産物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原と反応性のある抗体またはフラグメントである、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント
からなる群から選択されるＭＡｂまたはそのフラグメントをコードする核酸を含んでなる、ＤＮＡ配列。
【請求項５０】
請求項４９に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項５１】
請求項４９に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、宿主細胞。
【請求項５２】
診断薬もしくは治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ｉ）少なくとも一種の診断薬または少なくとも一種の治療薬に結合された抗ＥＧＰ−１抗体を含んでなる組成物を用意する工程、および（ii）該組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項５３】
前記診断薬または治療薬が、同位元素、薬物、毒素、免疫調節剤、酵素、ホルモン、増殖因子、放射性核種、金属、造影剤および検出剤からなる群から選択されるものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記診断薬または治療薬が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫調節剤である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記診断薬または治療薬がサイトカインである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記診断薬または治療薬が同位元素である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記同位元素が２５〜４,０００ｋｅＶの範囲のエネルギーを有するものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記同位元素が、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、５２Ｆｅ、８９Ｚｒ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、７６Ｂｒ、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、２１２Ｐｂ、および２２３Ｒａからなる群から選択されるものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記薬物が、細胞傷害薬、光力学薬、蛍光色素および免疫調節剤からなる群から選択されるものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記診断薬または治療薬が金属である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
ＭＲＩに用いられる常磁性イオンである、請求項６０に記載の診断薬。
【請求項６２】
前記造影剤が、ガドリニウム、鉄またはマンガンである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記検出剤が、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物からなる群から選択されるものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出剤が蛍光化合物である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記蛍光化合物が、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオロスカミンからなる群から選択されるものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記検出剤が化学発光化合物である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記化学発光化合物が、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルからなる群から選択されるものである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記検出剤が生物発光化合物である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記生物発光化合物が、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンからなる群から選択されるものである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記造影剤が超音波造影剤である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
前記超音波増強剤がヒト化ＲＳ７ ＩｇＧまたはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記リポソームがガス充填されている、請求項６４に記載の診断用複合体。
【請求項７３】
前記抗ＥＧＰ−１抗体がＲＳ７抗体である、請求項５２〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、
（ｉ）請求項３９に記載の抗体を被験体に投与する工程、
（ii）ある量の非結合抗体が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程、および
（iii）前記被験体に、前記抗体の結合部位と結合する、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなるハプテンを投与する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７５】
前記ハプテンが前記抗体の一以上の結合部位に結合するものである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記診断薬または前記治療薬が、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種、および金属からなる群から選択されるものである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
癌を診断または治療する方法であって、
（ｉ）請求項３９に記載の抗体を、それを必要とする被験体に投与する工程、
（ii）ある量の非結合抗体が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程、および
（iii）前記被験体に、前記抗体の結合部位と結合する、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなるハプテンを投与する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７８】
前記癌が、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌および乳癌からなる群から選択されるものである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
被験体の悪性腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、医薬上好適な賦形剤中に調剤された、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の前記ＭＡｂから選択される少なくとも二つのＭＡｂもしくはそれらのフラグメントを含んでなるか、または請求項１〜４４のいずれか一項に記載の少なくとも一つのＭＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含んでなる、方法。
【請求項８０】
被験体の悪性腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、医薬上好適な賦形剤中に調剤された、少なくとも一種の治療薬に結合されている請求項１〜４８のいずれか一項に記載のＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の治療用複合体を投与することを含んでなる、方法。
【請求項８１】
前記治療薬が、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン類似体およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記治療薬が、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、抗生物質およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的特性を有する薬物である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
請求項１〜４８のいずれか一項に記載のものではない、第二のＭａｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記第二のＭａｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、裸のＭａｂまたはそのフラグメントである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記第二のＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＳＡｐ、Ｔｎ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ−１−４、Ｔａｇ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン様成長因子、テネイシン、癌遺伝子産物、サイトケラチン、およびＡ３３からなる群から選択される抗原との反応性を有するものである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記第二のＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、治療薬または診断薬に結合されている、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の第二のＭａｂまたはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗ＥＧＰ−１抗体もしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、非経口投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗ＥＧＰ−１抗体もしくそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、一用量当たり１０〜２０００ｍｇタンパク質の用量で投与される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記用量が反復投与される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントが、ヒトより下等な霊長類の抗ＥＧＰ−１抗体、マウスモノクローナル抗ＥＧＰ−１抗体、キメラ抗ＥＧＰ−１抗体、ヒト抗ＥＧＰ−１抗体、およびヒト化抗ＥＧＰ−１抗体からなる群から選択されるものである、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
前記キメラ、ヒトおよびヒト化抗ＥＧＰ−１抗体の定常およびヒンジ領域が、ヒトＩｇＧ１の定常およびヒンジ領域を含んでなるものである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗ＥＧＰ−１抗体もしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、第二の抗体またはそのフラグメントが前記被験体に投与される前、投与されると同時、または投与された後に投与される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントの第一の結合部位が多価多重特異性融合タンパク質または化学複合体に存在し、第二の結合部位がＥＧＰ−１以外の腫瘍マーカー物質との反応性を有するものである、請求項８０に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗ＥＧＰ−１抗体もしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、少なくとも一種の治療薬の前、同時、または後に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９６】
前記第二の抗体またはそのフラグメントが、少なくとも一種の治療薬または診断薬に結合されている、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗ＥＧＰ−１抗体がＲＳ７抗体である、請求項８０〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
被験体の悪性腫瘍を診断する方法であって、該被験体に、医薬上好適な賦形剤中に調剤された、少なくとも一種の診断薬に結合されている請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗ＥＧＰ−１ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の治療用複合体を投与することを含んでなる、方法。
【請求項９９】
被験体の癌細胞を治療する方法であって、（ｉ）該被験体に、請求項１〜１４および４４〜４８のいずれか一項に記載の裸の抗ＥＧＰ−１ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる治療上有効量の組成物を投与する工程、および（ii）該裸のＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤する工程を含んでなる、方法。
【請求項１００】
前記組成物が、請求項１〜１４および４４〜４８のいずれか一項に記載のものではない第二の裸の抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組成物が、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の第二の抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記組成物が、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のものではない第二の抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第二のＭＡｂまたはそのフラグメントが、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＳＡｐ、Ｔｎ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ−１−４、Ｔａｇ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン様成長因子、テネイシン、癌遺伝子産物、サイトケラチン、およびＡ３３からなる群から選択される抗原との反応性を有するものである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第二の抗体またはそのフラグメントが、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＳＡｐ、Ｔｎ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ−１−４、Ｔａｇ−７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン様成長因子、テネイシン、癌遺伝子産物、サイトケラチン、およびＡ３３からなる群から選択される抗原との反応性を有するものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記裸の抗ＥＧＰ−１抗体もしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、非経口投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
前記裸の抗ＥＧＰ−１抗体もしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、一用量当たり１０〜２０００ｍｇタンパク質の用量で投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記用量が反復投与される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記裸の抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントが、ヒトより下等な霊長類の抗ＥＧＰ−１抗体、マウスモノクローナル抗ＥＧＰ−１抗体、キメラ抗ＥＧＰ−１抗体、ヒト抗ＥＧＰ−１抗体、およびヒト化抗ＥＧＰ−１抗体からなる群から選択されるものである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０９】
前記キメラ、ヒトおよびヒト化型の裸の抗ＥＧＰ−１抗体の定常およびヒンジ領域が、ヒトＩｇＧ１の定常およびヒンジ領域を含んでなるものである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記裸の抗ＥＧＰ−１抗体もしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが、前記悪性腫瘍により発現される第二の腫瘍マーカーと反応性のある第二の裸の抗体またはそのフラグメントが前記被験体に投与される前、投与されると同時、または投与された後に投与される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１１】
前記裸の抗ＥＧＰ−１抗体が、治療薬の前、同時、または後に投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記裸の抗ＥＧＰ−１抗体が裸のＲＳ７抗体である、請求項９９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
被験体の悪性腫瘍を診断する方法であって、（ｉ）請求項１〜１４および４４〜４８のいずれか一項に記載の裸の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる組成物を用いて、該被験体からの検体に対してin vitro診断アッセイを行うことを含んでなる、方法。
【請求項１１４】
前記悪性腫瘍が癌腫である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記癌が、頭頸部癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胃癌および膀胱癌からなる群から選択されるものである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記in vitro診断アッセイが、免疫アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学法からなる群から選択されるものである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記in vitro診断アッセイが、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫アッセイである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記検体が体液または組織である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記診断アッセイが免疫組織化学法である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記検体が細胞または組織である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
癌の治療のための、請求項１〜１４および４４〜４８のいずれか一項に記載の裸の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントの使用。
【請求項１２２】
悪性腫瘍の治療のための、少なくとも一種の治療薬に結合されている請求項１〜４８のいずれか一項に記載のＥＧＦ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる治療用複合体の使用。
【請求項１２３】
悪性腫瘍の診断のための、少なくとも一種の治療薬に結合されている請求項１〜４８のいずれか一項に記載のＥＧＦ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる診断用複合体の使用。
【請求項１２４】
細胞上のＥＧＰ−１標的抗原を標的化するための、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の少なくとも一種の抗体を含んでなる、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一価および多価の単一特異性結合タンパク質、ならびに多価多重特異性タンパク質に関する。これらの結合タンパク質の一つの実施態様は一以上の結合部位を有し、各結合部位は標的抗原または標的抗原上のエピトープと結合する。これらの結合タンパク質のもう一つの実施態様は二以上の結合部位を有し、各結合部位は標的抗原上の異なるエピトープに対して親和性を有するか、または標的抗原かハプテンのいずれかに対して親和性を有する。本発明はさらに、宿主においてこれらの機能的結合タンパク質を発現させるために有用な組換えベクターに関する。より詳しくは、本発明は、ＲＳ７と呼ばれる腫瘍関連抗原結合タンパク質に関する。本発明はさらに、ヒト化ＲＳ７抗原結合タンパク質、ならびに診断および治療におけるこのような結合タンパク質の使用に関する。
【０００２】
背景技術
人工の結合タンパク質、特に、モノクローナル抗体および改変抗体または抗体フラグメントは幅広く研究され、癌、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、および循環器病をはじめとする種々のヒト疾患の検出および治療において重要なものであることがわかっている(Filpula and McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9: 231-245)。例えば、放射性同位元素で標識した抗体が、患者への注入後に当技術分野において利用可能な検出器を用いて腫瘍を可視化するために研究されている。抗体または抗体由来薬剤の臨床的有用性は、主として、特定の標的抗原とのその結合能に依存している。選択性は、とりわけ、診断薬または治療薬が体内の正常組織に対して毒性がある場合に、ヒト疾患の検出および治療段階において診断薬または治療薬、例えば、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、酵素、複合体、放射性核種、または金属を標的位置に送達する上で重要である。
【０００３】
抗体系の潜在的な制限については、Goldenberg, The American Journal of Medicine (1993) 94: 298-299に記載されている。検出および治療の技術において重要なパラメーターは、標的細胞が存在する部位に特異的に局在する注入投与量および摂取率、すなわち、正常組織周辺に存在する放射能濃度に対する特異的に結合した抗体の濃度の比である。抗体を血流に注入すると、それは多くのコンパートメントを通過し、代謝されて排出される。抗体は、位置を突きとめ、標的細胞抗原と結合することが可能でなければならないが、その一方で、体の他の部分も通過する。抗原のターゲッティング（標的化）を制御する因子としては、位置、大きさ、抗原密度、抗原接近可能性、病理組織の細胞組成、およびターゲッティング（標的化）する抗体の薬物動態学が挙げられる。抗体による腫瘍ターゲッティングに特異的に影響を与えるその他の因子としては、腫瘍およびその他の組織の両方における標的抗原の発現、および放射性標識した抗体の血液クリアランスが遅いために起こる骨髄毒性が挙げられる。標的腫瘍細胞と一体となるターゲッティング抗体の量は、腫瘍の血管形成および抗体浸透を妨げる障害、ならびに腫瘍内圧力によって影響を受ける。非標的器官、例えば、肝臓、腎臓または骨髄による非特異的取り込みは、この技術、特に放射線免疫療法のもう１つの潜在的制限となり、放射線免疫療法では、骨髄照射により用量制限をもたらす毒性が引き起されることが多い。
【０００４】
提案されている一つの手法はダイレクト・ターゲッティングと呼ばれ、診断用または治療用の放射性同位元素を含む抗体を用いて特異的抗原をターゲッティングするように設計された技術である。腫瘍に関しては、このダイレクト・ターゲッティング法では、その抗原によって標的腫瘍を認識する放射性標識抗腫瘍単一特異性抗体が用いられる。この技術は、標識された単一特異性抗体を患者に注入し、標的腫瘍に抗体を局在させ、診断または治療上の効用を得ることを含む。結合していない抗体は体内から除去する。この手法は他の哺乳類疾患を診断または治療するためにも使用できる。
【０００５】
提案されているもう一つの解決法は「親和性増強系」（Affinity Enhancement System, AES）と呼ばれ、特に、診断用または治療用の放射性同位元素を含む抗体による腫瘍ターゲッティングの欠陥を克服するように設計された技術である(米国特許第５，２５６，３９５号明細書(1993), Barbet et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals (1999) 14: 153-166)。ＡＥＳでは、放射性標識したハプテン、ならびに標的腫瘍および放射性ハプテンの両方を認識する抗腫瘍／抗ハプテン二重特異性結合タンパク質が用いられる。この手法ではまた、原子価のより高いハプテンおよび特異性のより高い結合タンパク質を用いてもよい。この技術は、結合タンパク質を患者に注入し、それを標的腫瘍に局在させることを含む。結合していない結合タンパク質が血流から除去されるのに十分な時間の経過後、放射性標識したハプテンを投与する。ハプテンは標的細胞の部位に局在する抗体−抗原複合体と結合し、診断上または治療上の効用が得られる。結合していないハプテンは体内から除去される。Barbetは、二重特異性抗体が腫瘍表面と結合している場合に、二価ハプテンが該二重特異性抗体と架橋しうるという可能性を記述している。結果として、放射性標識複合体はより安定となり、より長い時間腫瘍に留まる。この系は哺乳類の疾患を診断または治療するために使用できる。
【０００６】
当技術分野では、ダイレクト・ターゲッティング系で有用な多価多重特異性結合タンパク質の生産、および親和性増強系で有用な多価多重特異性結合タンパク質の生産が必要とされている。詳細には、標的抗原において高い取り込みを示し、血中濃度は低く、正常な組織および細胞を有毒な医薬から最適に保護する結合タンパク質が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の一つの目的は、ヒト非小細胞肺癌に対して作製されたマウスＭＡｂ ＲＳ７−３Ｇ１１により、上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１）として規定される腫瘍関連抗原を認識する単一特異性モノクローナル抗体およびそのフラグメントを提供することである。肺癌および分化抗原に関する第３回国際ＩＡＳＬＣワークショップの提案に従って、ＲＳ７抗原はＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）と呼ばれている。あるいは、文献では、ＥＧＰ−１に関連する少なくとも一つのエピトープがＴＲＯＰ２と呼ばれている。一つの好ましい実施態様では、本発明による抗体または抗体フラグメントは、Stein（前掲）およびこれに先行する他の研究により開示されているマウスＲＳ７抗体と同じエピトープと結合する。あるいは、前記抗体または抗体フラグメントは、Steinにより開示されているマウスＲＳ７抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにも結合しうる。ある好ましい実施態様では、抗ＥＧＰ−１抗体もしくは抗ＴＲＯＰ２抗体またはそのフラグメントは、キメラ、ヒト化、または完全ヒトＲＳ７抗体またはそのフラグメントである。
【０００８】
例えば、本発明では、ヒト化抗体またはそのフラグメントであって、該ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＬ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＴを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＨＹＩＴＰＬＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものが意図される。本発明のもう一つの実施態様は、ヒト化抗体またはそのフラグメントであって、該ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＮＹＧＭＮを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものである。また、好ましくは、前記ヒト化抗体または抗体フラグメントは、マウスＲＳ７ ＭＡｂのＣＤＲと、ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域の枠組み構造領域（ＦＲ）とを含んでなり、ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＴを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＨＹＩＴＰＬＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり、ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＮＹＧＭＮを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶを含んでなるＣＤＲ３を含んでなるものである。さらに好ましくは、前記ヒト化抗体またはそのフラグメントは、ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域のＦＲをさらに含んでなる。
【０００９】
ある好ましい実施態様では、前記ヒト化ＲＳ７抗体またはフラグメントは、ＲＳ７マウス抗体の対応する位置に見られるアミノ酸残基により置換されている少なくとも一つのアミノ酸を含んでなるＬ鎖および／またはＨ鎖のＦＲを含んでなる。例えば、少なくとも一つの置換アミノ酸残基は、好ましくは図３ＢのマウスＨ鎖可変領域のアミノ酸残基３８、４６、６８および９１からなる群から選択される位置にあり、かつ／または少なくとも一つの置換アミノ酸残基は、好ましくは図３ＡのマウスＬ鎖可変領域のアミノ酸残基２０、８５および１００からなる群から選択される位置にある。
【００１０】
また、本発明によれば、少なくとも二つの抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなり、該ＭＡｂまたはそのフラグメントが本発明による抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントから選択される、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントも記載される。関連する傾向として、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは、本発明による抗ＥＧＰ−１抗体のいずれかの少なくとも一つの第一の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明による抗ＥＧＰ抗体またはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなる。例えば、この第二の抗体またはそのフラグメントは、癌腫関連抗体またはそのフラグメントであってもよい。もう一つの好ましい実施態様は、二つの異なるエピトープ結合抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントを含んでなる融合タンパク質またはそのフラグメントである。
【００１１】
本発明の一つの目的は、ＲＳ７抗原上の一を超えるエピトープを認識するか、またはＲＳ７抗原およびハプテン分子に対して親和性を有する多重特異性抗体およびそのフラグメントを提供することである。後者の結合タンパク質は標的抗原をプレターゲッティングするのに有用である。よって、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ｉ）多価多重特異性ＭＡｂまたはそのフラグメントを被験体に投与する工程、（ii）ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程、および（iii）該被験体に、該抗体の結合部位と結合する、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与する工程を含んでなる方法も記載される。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、ＥＧＰ−１抗原を発現する標的疾患に診断薬または治療薬を送達する方法を提供することである。例えば、診断薬もしくは治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ｉ）少なくとも一種の治療薬および／または診断薬に結合された抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物を用意する工程、および（ii）該組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含んでなる方法が記載される。好ましくは、診断薬または治療薬は、同位元素、薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、酵素、増殖因子、放射性核種、金属、造影剤および検出剤からなる群から選択される。
【００１３】
本発明の他の実施態様では、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法は、（ｉ）ＥＧＰ−１標的抗原に対して親和性を有する一以上の抗原結合部位とハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位とを含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントを被験体に投与する工程、（ii）ある量の非結合抗体またはフラグメントが被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程、および（iii）該被験体に、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなるハプテンを投与する工程を含んでなる。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、本発明による抗体のいずれか一つの抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなり、該抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントが少なくとも一種の診断薬または治療薬に結合されている、癌細胞に標的化された診断用または治療用の複合体を提供することである。好適な治療薬は、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、抗生物質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的特性を有する薬物である。また、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される治療薬も好ましい。好ましくは、診断薬は、光活性放射性核種、好ましくは２５〜４０００ｋｅＶのもの、および造影剤からなる群から選択される。
【００１５】
ある好ましい実施態様によれば、本発明による抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメント；少なくとも二つの該ＭＡｂまたはそのフラグメントを含む抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；本発明による抗ＥＧＰ−１抗体およびフラグメントのＭＡｂまたはそのフラグメントを含む少なくとも一つの第一の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本明細書に記載の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含む抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；または本明細書に記載の抗体のいずれかの該ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、本明細書に記載の抗体のいずれか一つのＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；を含むＭＡｂまたはフラグメントをコードする核酸を含んでなるＤＮＡ配列が提供され、該第二のＭＡｂはＥＧＰ−２、ＭＵＣ１−４、Ａ３３、ＣＳＡｐ、ＣＥＡ、Ｌｅ（ｙ）、Ｔｎ、Ｔａｇ−７２、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＨＣＧ−β、フェリチン、ＰＡＰ、ＰＬＡＰ、ＥＧＰ−２、ヒストン、サイトケラチン、テネイシン、ＣａｎＡｇ、腎臓癌Ｇ２５０、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、ＰＡＭ４−抗原、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原と反応性がある。第二のＭＡｂは、これらに代えて、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）およびＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）などの腫瘍に関連する血管内皮抗原と反応性があってもよい。第二の抗体の選択は腫瘍細胞のタイプによって異なる。例えば、前立腺癌の治療または診断のためには抗ＰＳＭＡまたは抗ＰＳＡ抗体を、乳癌、卵巣癌、肺癌および結腸癌では抗ＣＥＡまたは抗ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４抗体を、結腸癌および頭頸部癌ではＥＧＦＲを、結腸癌および卵巣癌では抗ＣＳＡｐ抗体を、また、乳癌、卵巣癌およびその他の癌では抗ＨＥＲ／ｎｅｕを用いればよい。これらは単に例として示したものであり、これらに限定されるものではない。このＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび宿主細胞もまた本発明の好ましい実施態様である。
【００１６】
本明細書ではまた、悪性腫瘍を診断および治療する方法が提供される。例えば、癌を診断または治療する方法は、（ｉ）ＥＧＰ−１標的抗原に対して親和性を有する一以上の抗原結合部位、およびハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはフラグメントを、それを必要とする被験体に投与する工程、（ii）ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程、および（iii）該被験体に、該抗体の結合部位と結合する、診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなるハプテンを投与する工程を含んでなる。
【００１７】
同様に、悪性腫瘍を診断および治療する方法は、治療上有効量の抗ＥＧＰ−１融合タンパク質もしくはそのフラグメント、またはＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなる治療用複合体を投与することを含んでなってもよく、このＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは医薬上好適な賦形剤中で少なくとも一種の治療薬と結合されている。これに関連して、裸の抗ＥＧＰ−１融合タンパク質およびそのフラグメントなどの、裸の抗ＥＧＰ−１抗体およびそのフラグメントもまた悪性腫瘍の治療に使用できる。裸の抗ＥＧＰ−１抗体は、例えば免疫アッセイまたは免疫組織化学法とともに悪性腫瘍のin vitro診断に用いてもよいが、ＡＥＳなどのプレターゲッティング技術を含まない限り、in vivo診断には使用できない。しかし、標識されたＥＧＰ−１抗体であれば、悪性腫瘍のin vivo診断および治療に使用できる。例えば、本明細書には、被験体の癌細胞を治療する方法であって、（ｉ）該被験体に、抗ＥＧＰ−１ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含む治療上有効量の組成物を投与する工程、および（ii）ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤する工程を含んでなる方法が記載される。同様に、本発明ではまた、裸のＭＡｂおよびそのフラグメントと、複合体化されたＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質もしくはそのフラグメントとの組み合わせも意図される。
【好ましい実施態様の詳細な説明】
【００１８】
特に断りのない限り、可算名詞("a"または"an")は１つ以上のものを意味する。
【００１９】
ＲＳ７抗体（以前はＲＳ７−３Ｇ１１と呼ばれていた）は、肺由来のヒト原発性扁平上皮細胞癌腫の膜粗調製物に対して作製されたマウスＩｇＧ１である。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるStein et al., Cancer Res. 50: 1330 (1990)を参照されたい。このＲＳ７抗体は、ヒト非小細胞肺癌に対して作製されたマウスＭＡｂ  ＲＳ７−３Ｇ１１により規定されている腫瘍関連抗原を認識する。Steinらは、クラスター１３として同定されている４６〜４８ｋＤａの糖タンパク質を認識することを開示している。Stein et al., Int. J. Cancer Supp. 8:98-102 (1994)。Basu et al., Int. J. Cancer 52:472-479 (1995)も参照されたい。この抗原は肺癌および分化抗原に関する第３回国際ＩＡＳＬＣワークショップの提案により、ＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）と呼ばれている。例えば、DeLeij et al., Int. J. Cancer Supp., 8:60-63 (1994)を参照されたい。従って、本明細書に記載されるように、ＲＳ７およびＥＧＰ−１抗原は同義である。ＥＧＰ−１抗原はまた、文献ではＴＲＯＰ２とも呼ばれているが、ＥＧＰ−１およびＴＲＯＰ２の複数のエピトープが存在するのかもしれない。
【００２０】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学染色の研究では、ＲＳ７ ＭＡｂは、正常ヒト組織への結合は限定され、種々の腫瘍種の抗原を検出することが示されている(Stein et al., (1990),前掲)。ＲＳ７抗体はＥＧＰ−１糖タンパク質と反応性があり、迅速にインターナライズされうる。ＥＧＰ−１は主として肺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌および前立腺癌などの癌により発現される。動物モデルにおいて放射性標識したマウスＲＳ７ ＭＡｂを用いた位置決定および治療法の研究では、腫瘍のターゲッティングおよび治療効果が示されている(Stein et al., (1990),前掲,Stein et al., (1991),前掲)。
【００２１】
より最近の研究では、肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌および前立腺癌由来の腫瘍における強いＲＳ７染色が示されている。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるStein et al., Int. J. Cancer 55: 938 (1993)を参照されたい。さらにこの研究では、扁平上皮癌と腺癌の双方からなる肺癌が生じる。すなわち、両細胞腫とも強く染色され、ＲＳ７抗体は非小細胞肺癌の組織学的種類を区別しないことが示唆される。
【００２２】
上記で論じたように、ＲＳ７ ＭＡｂは標的細胞に迅速にインターナライズされる(Stein et al. (1993),前掲)。ＲＳ７ ＭＡｂのインターナリゼーション速度定数は、イムノトキシンの生産に重要であることが証明されている、迅速にインターナライズする他の二種類のＭＡｂのインターナリゼーション速度定数の中間型である。すなわち、イムノトキシンコンジュゲートのインターナリゼーションは抗腫瘍活性の絶対的必要条件であることが十分に報告されている(Pastan et al., Cell 47:641 (1986))。薬物イムノコンジュゲートのインターナリゼーションはまた、抗腫瘍効果における主要な因子として記載されている（Yang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 1189 (1988))。従って、ＲＳ７抗原は治療薬のインターナリゼーションを要するこれらの種の免疫療法にとって重要な標的となりうる。
【００２３】
このように、ＲＳ７ ＭＡｂを用いた研究は、この抗体が、臨床診断および治療適用の候補となるいくつかの重要な特性を示すことを示唆している。ＲＳ７抗原は診断および治療の有用な標的となるので、ＲＳ７抗原のエピトープを認識するＭＡｂを得ることが望ましい。さらに、臨床サンプルにおいてＲＳ７抗原を検出するのに望ましく、ヒトでのin vivo適用に不可欠な二重決定基固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）の開発のためには、キメラ、ヒト化およびヒト ＲＳ７抗体が利用可能であることが不可欠である。
【００２４】
この目的のため、本発明は、ＲＳ７抗原と結合し、診断および治療法に使用可能なキメラ、ヒト化およびヒト抗体、ならびにそのフラグメントを記載する。ヒト化抗体および抗体フラグメントは、"Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods Of Use"と題された米国仮出願（代理人事件番号１８７３３／１０７３）、米国仮出願番号６０／３５６，１３２、米国仮出願番号６０／４１６，２３２、および代理人事件番号１８７３３／１１５５に記載されており；米国出願番号５，８７４，５４０に開示されているものなどの、クラスIII抗癌胎児性抗原抗体（抗ＣＥＡ抗体）であるｈＭＮ−１４抗体；米国出願番号１０／１１６，１１６に開示されているものなどのＭｕ−９抗体；米国仮出願番号６０／３９９，７０７に開示されているものなどのＡＦＰ抗体；"Monoclonal Antibody cPAM4"と題された米国仮出願（代理人事件番号１８７３３／１１０２）に開示されているものなどのＰＡＭ４抗体；米国仮出願番号６０／３６０，２２９に記載されているものなどのＲＳ７抗体；および米国特許第５，７８９，５５４号および同第６，１８７，２８７号、ならびに米国出願番号０９／７４１，８４３および０９／９８８，０１３に開示されているものなどのＣＤ２２抗体があり、これらは総て引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。本明細書に開示されるキメラ抗体は、ある種に由来する抗体、好ましくは齧歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含む組換えタンパク質であるが、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のものに由来する。獣医学における適用では、キメラ抗体の定常ドメインはその他の種のものに由来してもよい。ヒト化抗体は、ある種に由来する抗体、例えば齧歯類抗体のＣＤＲがその齧歯類抗体のＨ鎖およびＬ鎖からヒトＨ鎖およびＨ鎖可変ドメインへ転移された組換えタンパク質である。
【００２５】
好ましい実施態様では、ＲＳ７抗体はヒト化されている。非ヒトモノクローナル抗体はヒト宿主によっては外来タンパク質として認識され、繰り返し注射すると体液性の過敏感反応を招く可能性があることから、マウスＲＳ７配列のヒト化は患者が受けうる有害な免疫応答を顕現することができる。マウスに基づくモノクローナル抗体に関しては、これはしばしばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれる。本発明のもう一つの実施態様は、ヒトより下等な霊長類の抗ＥＧＰ−１抗体、マウスモノクローナル抗ＥＧＰ−１抗体（獣医学適用に限られる）、キメラ抗ＥＧＰ−１抗体、ヒト抗ＥＧＰ−１抗体、およびヒト化抗ＥＧＰ−１抗体である抗ＥＧＦ−１抗体またはそのフラグメントである。ヒト化ＲＳ７抗体またはそのフラグメントの枠組み構造領域のいくつかのヒト残基がそれらのマウス対応物で置換されていることが好ましい。また、ＶＨとして、二種の異なるヒト抗体由来の枠組み構造領域の組み合わせを用いるのも好ましい。この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のものに由来する。
【００２６】
本発明のもう一つの好ましい実施態様は、ヒトＲＳ７抗体である。ヒト抗体は、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を産生するよう「操作」されているトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座のエレメントを、内在するＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座のターゲッティング破壊を含む胚幹細胞系統に由来するマウス株へ導入する。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作出することができる。トランスジェニックマウス由来のヒト抗体を得る方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)に記載されている。また、完全ヒト抗体も、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレー技術により構築することができ、これらは総て当技術分野で公知である。例えば、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体およびそのフラグメントのin vitro生産に関しては、McCafferty  et al., Nature 348:552-553 (1990)を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージの主働または微働外被タンパク質遺伝子のフレーム内にクローン化し、ファージ粒子表面の機能的抗体フラグメントとして提示する。この糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるので、抗体の機能的特性に基づいて選択すればまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレーは種々の形式で行うことができる。総説としては、例えば、Johnson and Chiswell, Current Opiniion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)を参照されたい。
【００２７】
本発明の抗体およびそのフラグメントは、ヒト原発性肺扁平上皮癌由来の膜粗調製物に対して作製するのが好ましい。また、ＲＳ７抗体およびそのフラグメントはヒト卵巣癌細胞系統由来の生細胞の膜調製物に対して作製するのが好ましい。ＲＳ７抗原はＣｏｌｏ  ３１６生細胞により提供されることがいっそう好ましい。これに関して、ＲＳ７抗体はＲＳ７抗原の実質的に純粋な調製物を用いて得ることができる。実質的に純粋なタンパク質とは、本来そのタンパク質に伴っている細胞成分が実質的に混入しないタンパク質である。本明細書に記載のように、「ＲＳ７抗体」はまた、キメラ、ヒトおよびヒト化ＲＳ７抗体も含む。
【００２８】
キメラ、ヒト化およびヒトＲＳ７抗体の調製
特定の抗原に対するモノクローナル抗体は当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495（1975)、およびColigan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5. 1-2.6.7（John Wiley & Sons 1991）[以下「Coligan」]を参照されたい。要するに、ＲＳ７などのＭＡｂは、マウスにＲＳ７抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体産生を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、ＲＳ７抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、ＲＳ７抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ＲＳ７抗体をハイブリドーマ培養物から単離することにより得ることができる。
【００２９】
免疫原に対する最初の抗体生成の後に、その抗体の配列を決定し、次いで組換え技術により作製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、次いで枠組み構造領域中のヒト残基をマウスの対応物で置換することにより作製する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することによってマウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的な問題が防げる。
【００３０】
本発明のヒト抗体、すなわち、ヒトＥＧＰ−１ ＭＡｂ、あるいはヒト化、キメラまたはヒトＲＳ７抗体との併用療法のためのその他のヒト抗体、例えば抗ＥＧＰ−２、ＭＵＣ１−４、ＣＥＡ、ＣＣ４９、ＣＳＡｐ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＥＧＦＲ、Ａ３３およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＭＡｂはトランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるMendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); 米国特許第５，６３３，４２５号を参照されたい。併用療法に用いうる本発明のヒト抗体はまた、Ｌｅ（ｙ）、Ｔｎ、Ｔａｇ−７２、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＨＣＧ−β、フェリチン、ＰＡＰ、ＥＧＰ−２、ヒストン、サイトケラチン、テネイシン、ＣａｎＡｇ、腎臓癌Ｇ２５０、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原と反応性があってもよい。例えば、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。このマウス体液性免疫系は、内在する免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は極めて複雑で、多数の離散セグメントを含み、それはヒトゲノムのほぼ０．２％を占める。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを産生できることを保証するには、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座の大きな部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖系構造においてヒトＨ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成に始まる段階的なプロセスで達成される。それぞれの挿入配列はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築体は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。一つはＨ鎖遺伝子座、もう一つはＬ鎖遺伝子座を含む二つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚幹細胞の融合を通じてマウスに個々に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラ雄動物を、生殖細胞系を通じてＹＡＣを伝達する能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスと交配させる。一種はヒトＨ鎖遺伝子座を含み、もう一種はヒトＬ鎖遺伝子座を含む二種のトランスジェニック系統を繁殖させ、免疫感作に応答してヒト抗体を産生する後代をつくる。
【００３１】
マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般的な技術は、例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる刊行物Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。ヒト化ＭＡｂを産生する技術は、例えば、Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Singer et al., J Immun. 150:2844 (1992)、Mountain et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1 (1992)、およびColigan at pages 10.19.1-10.19.11に記載されており、これらはそれぞれ引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【００３２】
一般に、ＲＳ７抗体のＶＫ（可変Ｌ鎖）およびＶＨ（可変Ｈ鎖）配列はＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの種々の分子クローニング手順によって得ることができる。特に、ＭＡｂ  ＲＳ７のＶＨおよびＶＫ遺伝子は、ハイブリドーマ細胞からそれぞれＲＴ−ＰＣＲおよび５’−ＲＡＣＥによりＰＣＲ増幅によりクローニングし、それらの配列をＤＮＡシーケンシングにより決定した。それらの忠実性を確認するため、クローニングしたＶＬおよびＶＨ遺伝子を、引用することにより本明細書の一部とされるOrlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989))に記載されているように、細胞培養にてキメラＡｂとして発現させることができる。このＶ遺伝子配列に基づき、次にヒト化ＲＳ７抗体を、引用することにより本明細書の一部とされるLeung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995))に記載されているように設計および構築することができる。ｃＤＮＡは一般的な分子クローニング技術(Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed (1989))により、マウスまたはキメラＲＳ７抗体を産生する、いずれの公知のハイブリドーマ系統またはトランスフェクション細胞系統から調製してもよい。ある好ましい実施態様では、ＲＳ７ハイブリドーマ系統が用いられる。ｍＡｂのＶＫ配列はプライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ(Orlandi et al., 1989)または引用することにより本明細書の一部とされるLeung et al. (BioTechniques, 15:286 (1993))に記載されている伸張プライマーセットを用いて増幅してもよく、一方、ＶＨ配列はプライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ(Orlandi et al., 1989, 前掲)または引用することにより本明細書の一部とされるLeung et al. (Hybridoma, 13:469 (1994))に記載されているマウスＩｇＧの定常領域へアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。１０μｌの第一鎖ｃＤＮＡ産物、１０μｌの１０Ｘ  ＰＣＲバッファー［５
００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭのプライマー、および５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を含有するＰＣＲ反応混合物に対して３０サイクルのＰＣＲを行うことができる。各ＰＣＲサイクルは好ましくは９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の重合からなる。増幅されたＶＫおよびＶＨフラグメントは２％アガロース(BioRad, Richmond, CA)上で精製することができる。同様に、ヒト化Ｖ遺伝子は、Leung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995))に記載されているように、長いオリゴヌクレオチド鋳型合成とＰＣＲ増幅の組み合わせにより構築することができる。
【００３３】
ＶＫのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、およびＶκＰＣＲ産物のフレーム内連結を容易にする便宜な制限部位を含む、ｐＢＲ３２７に基づく足場ベクターＶＫｐＢＲなどの足場ベクター中にサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくＶＨｐＢＳなどの同様の足場ベクター中へサブクローニングすることができる。各ＰＣＲ産物を含む個々のクローンは、例えば引用することにより本明細書の一部とされるSanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463 (1977))の方法により配列決定してもよい。
【００３４】
本明細書に記載のＤＮＡ配列は、天然に存在するものであれ誘導されたものであれ、あらゆるその対立遺伝子、突然変異体および変異体を含むと考えられる。
【００３５】
ＶＫおよびＶＨを含む発現カセットをプロモーターおよびシグナルペプチド配列とともに、ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片として二重制限消化により、それぞれＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから切り出すことができる。次に、ＶＫおよびＶＨ発現カセットをそれぞれｐＫｈおよびｐＧ１ｇなどの適当な発現ベクターへ連結することができる(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))。これらの発現ベクターは、適当な細胞、例えば骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ，ＶＡ）へ同時トランスフェクトし、コロニーをハイグロマイシン耐性に関して選択し、上清液を例えば、下記のように、ＥＬＩＳＡアッセイによりキメラまたはヒト化ＲＳ７ ＭＡｂの産生に関してモニタリングすることができる。あるいは、ＶＫおよびＶＨ発現カセットを改変足場ベクターＶＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２中で組み立て、それぞれＸｂａＩ／ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、Gilles et al. (J. Immunol. Methods 125:191 (1989)に記載されているように（また、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞での発現に関してはLosman et al., Cancer, 80:2660 (1997)にも示されている)、ｐｄＨＬ２などの単一の発現ベクター中へサブクローニングすることもできる。本発明において有用なその他のベクターとしては、Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123 (2000)に記載されているようなＧＳベクターがあり、これはＮＳ０細胞系統およびＣＨＯ細胞で好ましく発現される。他の適当な哺乳類発現系がWerner et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II), Nr. 8,870-880 (1998)に記載されている。
【００３６】
同時トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンのアッセイは次のようにして行うことができる。引用することにより本明細書の一部とされるCo et al., J Immunol., 148:1149 (1992)に従うエレクトロポレーション(BioRad, Richmond, CA)による５×１０６個のＳＰ２／０骨髄腫細胞のトランスフェクションには、約１０μｇのＶＫｐＫｈ（Ｌ鎖発現ベクター）および２０μｇのＶＨｐＧ１ｇ（Ｈ鎖発現ベクター）を用いることができる。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、９６ウェルマイクロタイタープレートにて完全ＨＳＦＭ培地(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)中で増殖させればよい。選択プロセスは２日後、ハイグロマイシン選択培地(Calbiochem, San Diego, CA)を最終濃度５００単位／ｍｌハイグロマイシンで加えることで開始することができる。コロニーは通常エレクトポレーション後２〜３週間で出現する。次に、これらの培養物をさらなる分析のために増殖させることができる。
【００３７】
好適な宿主細胞としては微生物または哺乳類宿主細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、ＭＡｂおよびその他の融合タンパク質の生産のために開発されたヒト細胞系統ＰＥＲ．Ｃ６がある。よって、本発明の一つの好ましい実施態様は、抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂ、複合体、融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ９７／００３２６）は、ヒトホスホグリセンリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にＡｄ血清型５（Ａｄ５）Ｅ１Ａ−およびＥ１Ｂ−コード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９−３５１０）を含むプラスミドを用いた、ヒト胎児網膜一次細胞のトランスフェクションにより作製されたものである。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂはそれぞれアデノウイルス初期遺伝子活性化タンパク質１Ａおよび１Ｂである。これらの方法および組成物は、例えばグリコシル化により翻訳後されている目的のヒト組換えタンパク質の安定発現を作り出すのに特に有用である。ＰＥＲ．Ｃ６は完全に同定されたヒト細胞系統であり、また、実験室での実践に応じて開発されたものであるなど、いくつかの特徴によりＰＥＲ．Ｃ６は組換えタンパク質の生産のための宿主として特に有用なものとなる。さらに、ＰＥＲ．Ｃ６はいずれのヒト由来または動物由来タンパク質も含まない規定の血清フリー培地中の懸濁培養物として増殖させることができ、その増殖は倍加時間約３５時間の、回転瓶、シェーカーフラスコ、スピンフラスコおよびバイオリアクターに適合している。最後に、Ｅ１Ａが存在すると、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下にある遺伝子の発現がアップレギュレートされ、Ｅ１３が存在すると、おそらくは組換えトランスジーンの過剰発現によって増強されたｐ５３依存性のアポトーシスが妨げられる。ある実施態様では、この細胞は従来の哺乳類細胞系統よりも２００倍高い組換えタンパク質および／またはタンパク質性物質を産生することができる。
【００３８】
キメラまたはヒト化Ｈ鎖の分泌に関して陽性のトランスフェクトーマクローンはＥＬＩＳＡアッセイにより同定することができる。要するに、トランスフェクトーマ培養物からの上清サンプル（〜１００μｌ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)をプレコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３反復で添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することで結合していないタンパク質を除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)をウェルに加える（抗体原液を１０４倍希釈したもの１００μｌ、非結合抗体を最終濃度１．０μｇ／ｍｌまで添加）。１時間インキュベートした後、プレートを通常３回洗浄する。反応溶液［ＰＢＳ中、１６７μｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）(Sigma, St. Louis, MO)、０．０２５％過酸化水素を含有する１００μｌ］をウェルに加える。暗所にて３０分間、発色させる。各ウェルに５０μｌの４Ｎ  ＨＣｌ溶液を加えることで反応を停止させた後、自動ＥＬＩＳＡリーダー(Bio-Tek instruments, Winooski, VT)で４９０ｎｍにて吸光度を測定する。次に、無関係なキメラ抗体標品(Scotgen, Ltd., Edinburg, Scotlandから入手可能）に対して結合キメラ抗体を測定する。
【００３９】
抗体は細胞培養培地から次のようにして単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を血清フリー培地に適用する。キメラ抗体の生産のためには、ＨＳＦＭを用い細胞を回転瓶中５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分子し、上清を０．２μメンブランで濾過する。濾過した培地をＡタンパク質カラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍｌ／分で通す。次にこの樹脂を約１０倍カラム量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５）を用いて、Ａタンパク質結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍｌ画分を、１０μｌの３Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）の入った試験管に回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求める。ピーク画分をプールし、ＰＢＳの対して透析し、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０(Amicon, Beverly, MA)を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度は上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍｌに調整する。保存のためには、サンプルにアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を加えると便宜である。
【００４０】
ＲＳ７抗体の調製に用いるプライマーのヌクレオチド配列は下記実施例２に挙げられている。ある好ましい実施態様では、ヒト化ＲＳ７抗体または抗体フラグメントはマウスＲＳ７ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域とヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域の枠組み構造（ＦＲ）領域を含んでなり、ここでヒト化ＲＳ７のＬ鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＴを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＱＱＨＹＩＴＰＬＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり；ヒト化ＲＳ７ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＮＹＧＭＮを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶを福でなるＣＤＲ３を含んでなる。また、ヒト化抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のＦＲは、マウスＲＳ７ ＭＡｂの対応するＦＲから置換された少なくとも一つのアミノ酸を含んでなるのが好ましい。
【００４１】
ＲＳ７ ＭＡｂは十分確立されている種々の技術によりハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離技術としては、タンパク質Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3を参照されたい。また、Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)も参照されたい。
【００４２】
ＲＳ７ ＭＡｂは当業者に周知の種々の技術によって同定することができる。例えば、ＲＳ７ ＭＡｂのＲＳ７抗原に対する結合能力は、間接的免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー分析、またはウエスタン分析を用いて確認することができる。
【００４３】
ＲＳ７抗体フラグメントの生産
本発明はＲＳ７およびｈＲＳ７抗体の使用を意図する。特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製し得る。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。他の抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（ａｂ）'２フラグメント、およびＦ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作製できるＦａｂ'フラグメントが挙げられる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号明細書および同第４，３３１，６４７号明細書、ならびにそこに含まれている参照文献により記載されており、これらの特許はその全開示内容を引用することにより本明細書の一部とされる。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967)、およびColigan at pages 2.8.1-2.8.10および2.10.-2.10.4も参照されたい。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速で容易な同定を可能にするＦａｂ’発現ライブラリーを構築することができる（Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281）。本発明は抗体および抗体フラグメントを包含する。
【００４４】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含んでなる。このＶＬおよびＶＨドメインは組み合わさって標的結合部位を形成している。これらの二つのドメインはペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合されている。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＨ−Ｌ−ＶＬと表される。ｓｃＦｖ分子の作製方法、および好適なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号明細書、同第４，９４６，７７８号明細書、R. Raag and M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80（1995）およびR. E. Bird and B. W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH, Vol 9:132-137(1991）を参照されたい。これらの参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００４５】
抗体フラグメントは、全長抗体のタンパク質加水分解、またはフラグメントをコードするＤＮＡの、大腸菌(E.coli)もしくは他の宿主中での発現により調製することができる。抗体フラグメントは、常法により全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例えば、抗体フラグメントは抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓフラグメントを与えることにより作製することができる。このフラグメントはチオール還元剤、および所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントが得られる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断により二つの一価Ｆａｂフラグメントと一つのＦｃフラグメントが直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号明細書および同第４，３３１，６４７号明細書、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されており、これらの特許は引用することによりその全開示内が本明細書の一部とされる。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230(1960); Porter, Biochem. J 73:119(1959)、Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422(Academic Press 1967)、および Coligan at pages 2.8. 1-2.8.10および2.10.-2. 10.4.も参照されたい。
【００４６】
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは抗体の可変領域のセグメントであり、抗体が結合するエピトープに対し相補的な構造であり、残りの可変領域よりもさらに変化に富んでいる。従って、ＣＤＲはしばしば超可変領域と呼ばれる。可変領域は三つのＣＤＲを含んでなる。ＣＤＲペプチドは、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。かかる遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される。例えば、Larrick et al., Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991); Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995);およびWard et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185（Wiley-Liss, Inc. 1995）を参照されたい。
【００４７】
Ｈ鎖を分離して一価のＬ−Ｈ鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような抗体を切断する他の方法、または他の酵素学的、化学的または遺伝学的技術も、それらのフラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り用いてよい。
【００４８】
キメラ、ヒト化およびヒト ＲＳ７抗体融合タンパク質の生産
抗体融合タンパク質およびそのフラグメントは、官能基間のグルタルアルデヒド結合からより特異的な結合まで、種々の常法により調製することができる。抗体および／または抗体フラグメントは好ましくは、別のものに直接共有結合させるか、リンカー部分を介して、または例えばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールもしくはヒドロキシル基など、抗体またはフラグメント上の一以上の官能基を介して共有結合させる。グルタルアルデヒドの他、例えばジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどの種々の通常のリンカーを使用できる。
【００４９】
キメラ、ヒト化およびヒトＲＳ７抗体融合タンパク質を生産する簡単な方法としては、グルタルアルデヒドの存在下で抗体またはフラグメントを混合して抗体融合タンパク質を形成させるものがある。最初のシッフの塩基結合は例えば第二級アミンへのホウ化水素還元により安定化させることができる。非位置特異的リンカーとしてグルタルアルデヒドの代わりにジイソチオシアネートまたはカルボジイミドを使用することもできる。抗体融合タンパク質は、ＲＳ７抗原の少なくとも二つのエピトープに結合する部分を含んでいるので、この融合タンパク質はＭＡｂよりも結合特異性が大きいと期待される。よって、抗体融合タンパク質は治療用途において好ましい形態のＲＳ７抗原結合タンパク質である。
【００５０】
これに関して、抗体融合タンパク質は少なくとも二つのキメラ、ヒト化またはヒトＲＳ７ ＭＡｂ、またはそのフラグメントを含んでなり、ここで、少なくとも二つのこのＭＡｂまたはフラグメントは、ＲＳ７抗原の異なるエピトープに、あるいはＲＳ７エピトープおよび完全に異なる抗原のそれに結合する。例えば、二重特異性ＲＳ７抗体融合タンパク質は、ＣＥＡ抗体またはそのフラグメントとＲＳ７ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる。このような二重特異性ＲＳ７抗体融合タンパク質は、例えば、上記のようにＣＥＡからＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることにより調製することができる。抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの鎖内ジスルフィド結合は、Ｌ鎖−Ｈ鎖結合が起こらないよう注意しながらシステインで穏やかに還元し、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを形成させる。このＳＨ基をビス−マレイミドリンカー（１，１’−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビス−マレイミド）で活性化させる。ＲＳ７ ＭＡｂをＦａｂ’−ＳＨに変換した後、活性化させたＣＥＡ  Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントと反応させて二重特異性ＲＳ７抗体融合タンパク質を得る。
【００５１】
多重特異性ＲＳ７抗体融合タンパク質は、二重特異性キメラ、ヒト化またはヒトＲＳ７抗体融合タンパク質にＲＳ７抗原結合部分を付加することにより得ることができる。例えば、二重特異性抗体融合タンパク質は、上記のビス−マレイミド活性化手順を用いて、二重特異性融合タンパク質を第三のＲＳ７抗原ＭＡｂまたはフラグメントと結合させる際に用いられる一以上のスルヒドリル基を導入するために２−イミノチオランと反応させることができる。これらの抗体生産技術は当業者に周知である。例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第４，９２５，６４８号明細書を参照されたい。
【００５２】
二重特異性抗体は、例えばジスルフィド結合を切断し、全ＩｇＧまたは好ましくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの混合物を再形成し、一を超えるハイブリドーマを融合して一を超える特異性を有する抗体を生産するなどの種々の従来法、また、遺伝子操作により作製することができる。二重特異性抗体融合タンパク質は異なる抗体の還元的切断によって生じるＦａｂ’フラグメントの酸化的切断によって作製されてきた。これは二つの異なる抗体のペプシン消化によって生じた二つの異なるＦ（ａｂ’）２フラグメントを混合し、還元的切断によりＦａｂ’フラグメントの混合物を形成し、次いで、酸化的にジスルフィド結合を再形成して、元のエピトープの各々に特異的なＦａｂ’部分を含む二重特異性抗体融合タンパク質を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントの混合物を作製することにより行うのが有利である。抗体融合タンパク質の調製のための一般的技術は、例えばNisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961)、Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968)、および米国特許第４，３３１，６４７号明細書に見出せる。本発明では、少なくとも一つの第一の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明による抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントが意図される。
【００５３】
より選択性の高い結合は、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性リンカーを用いることで達成することができる。このエステルと抗体またはフラグメントとの反応により抗体またはフラグメント上のアミン基が誘導体化され、次にこの誘導体は例えば遊離スルヒドリル基を有する抗体Ｆａｂフラグメント（あるいは、例えばトラウトの試薬によりスルヒドリル基が付加されたより大きなフラグメントまたは完全抗体）と反応させることができる。このようなリンカーは同じ抗体の基を架橋しているとは考えにくく、結合の選択性は向上する。
【００５４】
抗原結合部位から離れた部位で抗体またはフラグメントを連結するのが有利である。これは、例えば上記のように切断された鎖内スルヒドリル基に連結することで達成することができる。別法としては、酸化された炭化水素部分を有する抗体を、少なくとも一つの遊離アミン官能基を有する別の抗体と反応させることを含む。これにより最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは好ましくは、例えばホウ化水素還元により第二級アミンへ還元することにより安定化され、最終複合体が形成される。このような部位特異的結合が、小分子に関しては米国特許第４，６７１，９５８号明細書に、大きな付加物に関しては米国特許第４，６９９，７８４号明細書に開示されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００５５】
１２アミノ酸残基長よりも長いリンカー（例えば１５または１８残基のリンカー）を有するＳｃＦｖでは、同じ鎖上のＶＨとＶＬドメイン間の相互作用が可能であり、一般に単量体、二量体（ダイアボディーと呼ばれる）、および少量のより高次の多量体の混合物が生じる(Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157)。しかし、５以下のアミノ酸残基のリンカーを有するＳｃＦｖでは、同じ鎖上のＶＨとＶＬドメインの分子内対合は妨げられ、異なる鎖上のＶＨとＶＬドメインの対合が促される。３〜１２残基の間のリンカーでは主として二量体が形成される(Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604)。０〜２残基の間のリンカーでは、ｓｃＦｖの三量体（トリアボディーと呼ばれる）、四量体（テトラボディーと呼ばれる）、またはより高次のオリゴマー構造が形成されるが、オリゴマー化の厳密なパターンはリンカーの長さの他、Ｖドメインの組成ならびに方向に依存するようである。例えば、抗ノイラミニダーゼ抗体ＮＣ１０のｓｃＦｖでは、０残基のリンカーと用いた場合、主として三量体（ＶＨからＶＬ方向）または四量体（ＶＬからＶＨ方向）が生じた(Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574)。１および２残基のリンカーを用いてＮＣ１０から構築されたｓｃＦｖでは、ＶＨからＶＬ方向で、主としてダイアボディーが形成されたが(Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604)、これに対して、ＶＬからＶＨ方向では四量体、三量体、二量体およびより高次の多量体が形成された(Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574)。抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７から、ＶＨからＶＬ方向で、構築されたｓｃＦｖについては、０残基リンカーではもっぱら三量体が形成され、１残基リンカーではもっぱら四量体が形成された(Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168)。
【００５６】
本発明によるＲＳ７抗体およびそのフラグメントはまた、多価であるが単一特異性の抗原特異的ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーを作製するために使用できる。二以上のｓｃＦｖ分子の非共有結合的結合が機能的なダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーを形成することができる。単一特異性ダイアボディーは同種のｓｃＦｖのホモ二量体であり、各ｓｃＦｖは、選択された抗体に由来する、短いリンカーによって同じ抗体のＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含んでなる。ダイアボディーは二つのｓｃＦｖの非共有結合的結合によって形成された二価の二量体であり、二つのＦｖ結合部位が生じる。トリアボディーは三つのｓｃＦｖからなる三価の三量体の形成によるもので、三つの結合部位が生じ、また、テトラボディーは四つのｓｃＦｖからなる四価の四量体であり、四つの結合部位が生じている。数種の単一特異性ダイアボディーが、ＶＨ１−リンカー−ＶＬ１を含んでなる組換え遺伝子構築物を含む発現ベクターを用いて作製されている。Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1302 (1996); Holliger et al., Nature Biotechnology 15: 632-631(1997); Helfrich et al., Int. J. Cancer 76: 232-239 (1998); Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77: 763-772 (1998); Holiger et al., Cancer Research 59: 2909-2916(1999)を参照されたい。ｓｃＦｖの構築方法は米国特許第４，９４６，７７８号明細書（１９９０）および同第５，１３２，４０５号明細書（１９９２）に開示されている。ｓｃＦｖに基づく多価多重特異性結合タンパク質の作製方法は、米国特許第５，８３７，２４２号明細書（１９９８）、同第５，８４４，０９４号明細書（１９９８）およびＷＯ９８／４４００１（１９９８）に開示されている。本発明の好ましい実施態様は、ＥＧＰ−１標的抗原に対して親和性を有する一以
上の抗原結合部位と、ハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントである。
【００５７】
抗体結合親和性の測定
このようにして単離されたｍＲＳ７、ｃＲＳ７およびｈＲＳ７抗体の競合的結合親和性は、直接的ラジオイムノアッセイによって測定すればよい。ＲＳ７はクロラミンＴ法(引用することにより本明細書の一部とされるGreenwood et al., Biochem. J., 89: 123 (1963)を参照されたい)を用いて１３１Ｉまたは１２５Ｉで標識することができる。ヨウ素化した抗体の比活性は通常約１０μＣｉ／μｇに調節する。非標識抗体および標識抗体を反応培地（１％ウマ血清および１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＨＳＦＭ）で適当な濃度に希釈する。適当な濃度の標識抗体および非標識抗体の両者を総量１００μｌで反応試験管内に一緒に加える。ＭＥ１８０細胞（ヒト子宮頚癌細胞系統）の培養物をサンプリングし、細胞濃度を測定する。この培養物を遠心分離し、回収した細胞を反応培地で一回洗浄した後、最終濃度約１０７細胞／ｍｌで反応培地に再懸濁させる。総ての手順を４℃の低温中で行う。この細胞懸濁液１００μｌを反応試験管に加える。反応試験管を周期的に穏やかに振盪させて細胞を再懸濁しつつ、４℃で２時間反応を行う。反応期間の後、５ｍｌの洗浄バッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を各試験管へ加える。この懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットをさらに５ｍｌの洗浄バッファーで再度洗浄する。遠心分離後、細胞ペレットに残留する残留放射活性の量をガンマーカウンター(Minaxi, Packard Instruments, Sterling, Va.)で測定する。
【００５８】
発現ベクター
発現ベクターは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。プロモーターは構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。構造遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列であり、これは次に特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列へと翻訳される。典型的には、プロモーターは構造遺伝子の転写開始部位に隣接して遺伝子の５’領域に置かれる。プロモーターが誘導性プロモーターであれば、誘導因子に応答して転写速度が高まる。これに対し、プロモーターが構成的プロモーターであれば、転写速度は誘導因子によって調節を受けない。エンハンサーは転写の開始部位に対してエンハンサーの距離または方向に関係なく、転写効率を高めうるＤＮＡ調節エレメントである。
【００５９】
単離されたＤＮＡ分子とは、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていないＤＮＡの断片である。例えば、クローニングされたＲＳ７抗原遺伝子は、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡから分離されているＤＮＡ断片である。単離されたＤＮＡ分子の別の例としては、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない化学合成されたＤＮＡ分子がある。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成された一本鎖ＤＮＡ分子である。逆転写の開始には、典型的にはｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが用いられる。当業者はまた、このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子に対しても「ｃＤＮＡ」を用いる。
【００６０】
クローニングベクターは、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなど、宿主細胞で自律的に複製する能力を有するＤＮＡ分子である。クローニングベクターは典型的には一または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、この部位に、ベクターの必須の生物学的機能を失うことなく、確定的に外来ＤＮＡ配列を挿入することができ、さらにはクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに好適なマーカー遺伝子を挿入することができる。マーカー遺伝子としては、典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子が挙げられる。組換え宿主としては、クローニングベクターか発現ベクターのいずれかを含むいずれの原核または真核細胞であってもよい。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むよう遺伝子操作された原核または真核細胞も含まれる。発現とは、遺伝子産物の生合成をさす。例えば、構造遺伝子の場合、発現とは、その構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの一以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００６１】
治療および診断に用いるヒト化、ヒトおよびキメラＲＳ７抗体
本発明では、被験体の悪性腫瘍を診断または治療する方法であって、該被験体に、ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の治療用複合体を投与することを含んでなる方法が意図され、ここでは、ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは、少なくとも一種の治療薬と結合され、医薬上好適な賦形剤中に調剤されている。また、結合されていない（裸の）ＥＧＰ−１ ＭＡｂ、または他の抗原結合部分との融合構築物も、ＥＧＰ−１を発現する癌細胞の治療薬として適したものとすることができると考えられる。これらの非結合抗体は有利には、化学療法、放射線療法および／または免疫療法などの他の治療法をともに、または様々な順序および計画で組み合わせて施すことができる。また、癌を診断または治療する方法であって、ＥＧＰ−１抗原に対する一以上の抗原結合部位および一以上のハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントを、それを必要とする被験体に投与する工程、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つ工程、および該被験体に、その多価多重特異性抗体またはそのフラグメントの結合部位と結合する診断薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与する工程を含んでなる方法が好ましい。ある好ましい実施態様では、癌は肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌または結腸癌である。
【００６２】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生産のためのハイブリドーマ技術により、癌細胞を限局化するか、または死滅させることができる分子プローブの作製のための技術を提供された。いくつかの悪性腫瘍で癌の浸潤の詳細を示すために放射性標識ＭＡｂを用いた腫瘍イメージング技術が用いられている。試験動物およびヒトで、癌胎児性抗原を発現する様々な腫瘍における癌胎児性抗原、ならびに他のターゲッティング抗体を用いた黒色腫、結腸癌および乳癌などの腫瘍のラジオイムノ検出に抗体が用いられている（Goldenberg et al., Cancer Res. 40: 2984 (1980); Hwang et al., Cancer Res. 45: 4150 (1985); Zalcberg et al., J. Nat'l Cancer Inst. 71: 801 (1983); Colcher et al., Cancer Res. 43: 736 (1983); (Larson et al., J. Nucl. Med. 24: 123 (1983); DeLand et al., Cancer Res. 40: 3046 (1980); Epenetos et al., Lancet 2: 999 (1982)）。
【００６３】
in vitro診断のためのＭＡｂの使用は周知である。例えば、Carlsson et al., Bio/Technology 7 (6): 567 (1989)を参照されたい。例えば、ＭＡｂは生検サンプル由来の組織における腫瘍関連抗原の存在を検出するのに用いることができる。ＭＡｂはまた、ラジオイムノアッセイ、固相酵素免疫検定法、および蛍光免疫アッセイなどの技術を用い、臨床液体サンプル中の腫瘍関連抗原の量を測定するためにも使用できる。
【００６４】
腫瘍標的化ＭＡｂと毒素との複合体はin vivoにおいて癌細胞を選択的に死滅させるために使用できる(Spalding, Bio/Technology 9(8): 701 (1991); Goldenberg, Scientific American Science & Medicine 1(1): 64 (1994))。例えば、試験動物モデルにおける治療研究では、細胞傷害性放射性核種を有する抗体の抗腫瘍活性が証明されている(Goldenberg et al., Cancer Res. 41: 4354 (1981), Cheung et al., J. Nat'l Cancer Inst. 77: 739 (1986)、およびSenekowitsch et al., J. Nucl. Med. 30: 531 (1989))。また、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるStein et al., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 703 (1991)も参照されたい。さらに、これらのＭＡｂのいくつかを用いた第Ｉ相治療試験が、リンパ腫、黒色腫およびその他の悪性腫瘍の治療に関してすでに開始されている。例えば、DeNardo et al., Int. J. Cancer Suppl. 3: 96 (1988)、およびGoldenberg et al., J. Clin. Oncol. 9: 548 (1991)を参照されたい。
【００６５】
ヒト化、キメラおよび完全ヒト抗体ならびにそのフラグメントは治療法および診断法に用いるのに好適である。従って、本発明では、診断薬もしくは治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ｉ）抗ＥＧＰ−１抗体を含んでなる組成物を用意する工程、および（ii）その診断または治療用抗体複合体をそれを必要とする被験体に投与する工程を含んでなる方法が意図される。好ましくは、本発明のキメラ、ヒト化および完全ヒトＲＳ７抗体ならびにそのフラグメントは、悪性腫瘍を治療する方法で用いられる。
【００６６】
また、本明細書では、癌細胞と結合する抗ＥＧＰ−１ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる抗体成分を含んでなる、癌細胞を標的とする診断用または治療用複合体も記載され、ここでは、この抗体成分は少なくとも一種の診断薬または少なくとも一種の治療薬に結合されている。好ましくは、診断用複合体は少なくとも一種の光活性診断薬またはＭＲＩ造影剤を含んでなる。いっそう好ましくは、診断薬は６０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性標識である。
【００６７】
治療用組成物は、少なくとも一種の裸のまたは結合型のヒト化、キメラまたはヒトＲＳ７抗体を単独で、あるいは本発明による他の裸のまたは結合型のヒト化、キメラ、ヒトまたはその他の抗体、あるいは本明細書に開示されていない他の裸のまたは結合型のヒト化、キメラまたはヒト抗体と組み合わせて含む。本発明はまた、抗ＥＧＰ−１抗体と結合されていない、免疫調節剤などの治療薬、または診断薬を伴う結合型のまたは裸の抗体の投与も意図する。また、同じまたは異なるエピトープまたは抗原に対する裸のまたは結合型の抗体を本発明による一以上の抗体と組み合わせてもよい。
【００６８】
よって、本発明は、抗ＥＧＰ−１抗体およびフラグメントの、裸の抗体またはフラグメントとして単独での投与、あるいは多様な療法としての投与を意図する。好ましくは、この抗体はヒト化、キメラまたは完全ヒトＲＳ７抗体またはそのフラグメントである。本発明による多様な療法はさらに、裸の抗体、融合タンパク質の形での、または免疫複合体としての他の抗体の投与を伴う、裸の抗ＥＧＰ−１抗体による免疫療法を含む。例えば、ヒト化、キメラまたは完全ヒトＲＳ７抗体は別の裸のヒト化、キメラＲＳ７もしくはその他の抗体、あるいは同位元素、一以上の化学療法剤、サイトカイン、毒素またはそれらの組み合わせと結合されたヒト化、キメラＲＳ７もしくはその他の抗体と組み合わせてもよい。例えば、本発明は、抗ＥＧＰ−２、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＭＵＣ１−４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＣＣ４９（抗Ｔａｇ７２抗体）およびＰＳＭＡ抗体などの他の固形腫瘍／癌腫関連抗体の前に、または組み合わせて、またはその後に、裸のまたは結合型のＥＧＰ−１またはＲＳ７抗体またはそのフラグメントで処置することを意図する。これらの固形腫瘍抗体は裸であってもよいし、あるいはとりわけ薬物、酵素、ホルモン、毒素、同位元素または免疫調節剤と結合させてもよい。また、本発明では、ヒト化、キメラまたは完全ヒトＲＳ７抗体と毒素の融合タンパク質を用いてもよい。裸の抗体として、または部分的に裸で、部分的に治療薬または免疫調節剤と結合したものとして多くの異なる組み合わせを構築してもよい。あるいは、細胞傷害薬などの他の治療薬または放射線と組み合わせて投与するため、種々の裸の抗体の組み合わせを用いてもよい。このような抗体の組早生は有利には、当業者に公知のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて作製することができる。治療用複合体はそれ自体、好ましくはＢ細胞悪性腫瘍の癌遺伝子および癌遺伝子産物に対して向けられたオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなってよい。また、例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第５，７３４，０３３号明細書(Reed)に記載されている、ｂｃｌ−２の発現を阻害するアンチセンス分子を本発明によるヒト化ＲＳ７抗体と結合させてもよいし、あるいは抗体融合タンパク質の治療薬部分を形成してもよいし、あるいは本発明によるヒト化ＲＳ７抗体とともに投与してもよい。
【００６９】
診断薬または治療薬に結合された本明細書に記載の単一特異性結合タンパク質はＲＳ７陽性腫瘍を直接ターゲッティングする。これらの単一特異性分子は標的抗原と選択的に結合し、分子上の結合部位の数が増すにつれ、標的細胞に対する親和性が増し、所望の場所に見られる耐性時間が長くなる。さらに、非抗原結合分子は身体から速やかに除去され、正常組織の暴露が最小となる。多重特異性結合タンパク質を用いると、その後の診断薬または治療薬の特異的送達のためにＲＳ７陽性腫瘍がプレターゲッティングされる。これらの薬剤はヒスタミンスクシニルグリシル（ＨＳＧ）含有ペプチドによって運ばれる。６７９と呼ばれるマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１，Ｋ）は高い親和性でトリペプチド部分ＨＳＧを含む分子と結合する(Morel et al, Molecular immunology, 27, 995-1000, 1990)。６７９  ＭＡｂはｈＲＳ７とともに、ＨＳＧと標的抗原に結合する二重特異性結合タンパク質を形成することができる。また、この代わりにハプテンを用いてもよい。これらの結合タンパク質は標的抗原に選択的に結合し、親和性の増強および所望の場所での耐性時間の延長を可能とする。さらに、非抗原結合ダイアボディーは身体から速やかに除去され、正常組織の暴露が最小となる。
【００７０】
ＲＳ７抗体およびそのフラグメントは癌などの哺乳類疾患の治療に使用することができる。癌としては、限定されるものではないが、肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌および結腸癌が挙げられる。
【００７１】
本発明に従う診断または治療を目的とした診断薬または治療薬の標的への送達は、診断薬または治療薬を有する抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントを用意すること、およびその結合タンパク質をそれを必要とする被験体に投与することを含む。さらに診断では、既知の技術を用いて結合したタンパク質を検出する工程が必要である。
【００７２】
本発明による抗体およびそれらのフラグメントの、診断薬または治療薬を伴う投与は、哺乳類では静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、髄腔内、局所的カテーテルを通じた潅流、または直接病巣注射により行うことができる。結合タンパク質を注射により投与する場合には、投与は点滴、または単回もしくは複数回のボーラス注射によればよい。治療用としては、２０〜８００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量が可能であり、１００〜５００ｍｇ／ｍ２の用量が好ましく、また、診断イメージングについて奨励されるのは、例えば０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／患者といった相応に低い用量である。このような用量は臨床状況および患者の許容度に応じて種々の頻度で繰り返してよい。
【００７３】
診断薬または治療薬を伴う抗体は医薬上許容される注射用ビヒクル、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、生理的ｐＨおよび濃度で、ヒトまたは哺乳類の治療および診断用キットとして提供してもよい。この製剤は、特にヒトでの使用を意図する場合には無菌であることが好ましい。このようなキットの任意の成分としては、安定剤、緩衝剤、標識試薬、放射性同位元素、常磁性化合物、クリアランスを促進するための第二の抗体、および通常のシリンジ、カラム、バイアルなどが挙げられる。
【００７４】
裸の抗体での療法
治療上有効量の裸のキメラ、ヒト化および完全ヒトＲＳ７抗体、またはそれらのフラグメントは、医薬上許容される賦形剤中に調剤することができる。また、裸のキメラ、ヒト化および完全ヒトＲＳ７抗体の効力は、これらの裸の抗体に一以上の他の裸の抗体、あるいは薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、増殖因子、酵素または治療用放射性核種などの治療薬と結合されたキメラ、ヒト化および完全ヒトＲＳ７抗体の一以上の免疫複合体、あるいはＲＳ７抗体またはそのフラグメントと同時に、または逐次に、または指示された投与計画に従って投与される薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、増殖因子、酵素、オリゴヌクレオチド、または治療用放射性核種をはじめとする一以上の治療薬を添加することにより増強することもできる。
【００７５】
ある好ましい実施態様では、本発明による裸のまたは結合型のＲＳ７抗体は少なくとも一種の癌薬物と組み合わせる。このような組み合わせ療法では薬物の効果を向上させ、必要な薬物用量を引き下げることができる。例えば、肺癌細胞系統Ｃａｌｕ３と、二種の乳癌細胞系統ＭＤＡ４６８およびＴ４７Ｄそれぞれに対するＤｏｘ−ＲＳ７および２Ｐ−Ｄｏｘ−ＲＳ７のＩＣ５０値が決定されている。Ｃａｌｕ３およびＴ４７Ｄ細胞はＥＧＰ−１抗原陽性であり、ＣＥＡ抗原陰性であるが、ＭＤＡ４６８はＥＧＰ−１およびＣＥＡ抗原の両者が陽性である。結果は、Ｄｏｘ−ＲＳ７のＩＣ５０値は０．０４μｇ／ｍｌであり、２Ｐ−Ｄｏｘ−ＲＳ７のＩＣ５０値は０．０２３μｇ／ｍｌであることを示す。従って、本発明による裸のヒト、ヒト化またはキメラ抗ＥＧＰ−１抗体またはフラグメントを、２Ｐ−Ｄｏｘなどの特定の薬物に結合させると多剤耐性を克服する助けとなる。これはまた、記載されているように、抗体を特定の薬物と組み合わせて与えた場合にも可能である。
【００７６】
ＲＳ７免疫複合体
本発明はまた、ヒト化、キメラおよびヒトＲＳ７抗体ならびにそのフラグメントの、治療のための使用を意図する。免疫療法の目的は、非標的組織への暴露を最小限にして、細胞傷害量の放射活性、毒素、サイトカイン、酵素またはホルモン、薬物を標的細胞へ送達することである。本発明によるＲＳ７抗原結合タンパク質は、肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌および前立腺癌などの種々の腫瘍を治療するために使用できる。
【００７７】
本発明によるいずれの抗体または抗体融合タンパク質およびその断片を、一種以上の治療薬または診断薬と結合させてもよい。一般に、一種の治療薬または診断薬がそれぞれの抗体または抗体フラグメントに結合されるが、一を超える治療薬または診断薬を同じ抗体または抗体フラグメントに結合させることもできる。Ｆｃ領域が存在しなければ（例えば免疫複合体の抗体成分としても用いられる抗体が抗体フラグメントである場合）、全長抗体または抗体フラグメントのＬ鎖可変領域へ炭水化物部分を導入することができる。例えば、Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); Hansen et al., 米国特許第５，４４３，９５３号明細書(1995), Leung et al., 米国特許第６，２５４，８６８号明細書を参照されたい（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。この操作された炭水化物部分を用いて治療薬または診断薬を結合させる。
【００７８】
抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にペプチドを結合させる方法は当業者に周知である。例えば、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990);およびShih et al., 米国特許第５，０５７，３１３号明細書を参照されたい（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。一般的な方法は、炭水化物部分が酸化された抗体成分を、少なくとも一つの遊離アミン基を有し、かつ、複数のペプチドが付加された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは第二級アミンへの還元により安定化され、最終の複合体を形成し得る。また、ＤＴＰＡ（Ｍｘ−ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、またはＮＯＴＡなどのキレーターを抗体に結合させることができる。
【００７９】
本発明による抗体融合タンパク質は、二種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、この融合タンパク質を構成する各々の抗体またはフラグメントは治療薬または診断薬を含むことができる。また、抗体融合タンパク質の一以上の抗体またはフラグメントは結合した一以上の治療薬または診断薬を含むことができる。さらに、これらの治療薬は同一である必要はなく、異なる治療薬であってもよく、例えば、薬物および放射性同位元素を同じ融合タンパク質へ結合させることができる。特に、ＩｇＧは１３１Ｉで放射性標識し、薬物と結合させることができる。この１３１ＩはＩｇＧのチロシンへ導入でき、薬物はＩｇＧリジンのεアミノ基へ結合させることができる。また、治療薬および診断薬は双方とも還元されたＳＨ基、および炭水化物側鎖に結合させることもできる。
【００８０】
多種多様な診断薬および治療薬が、本発明による抗体と有利にも結合できる。本明細書に列挙された治療薬は、上記のように裸の抗体とは別に投与しても有用な薬剤である。治療薬としては、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピトフィロトキシン、タキサン、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質、置換尿素、酵素、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、ドキソルビシン類似体、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、およびこれらまたは他の種類の抗癌剤由来の他のもの、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソールなどの化学療法薬が挙げられる。免疫複合体および抗体融合タンパク質の調製に有用な他の癌化学療法薬としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体、ホルモン、チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼＢＣＲ  ＡＢＬチロシンキナーゼまたはＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害するものなど）などが挙げられる。好適な化学療法薬は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995およびGOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬のような他の好適な化学療法薬も、当業者に公知である。
【００８１】
シュードモナス外毒素のような毒素も複合化しうるし、あるいは本発明によるＲＳ７およびｈＲＳ７抗体の免疫複合体の治療薬部分を形成することができる。このような複合体または他の融合タンパク質の調製に適切に使用される他の毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ Ｉ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が挙げられる。例えば、Pastan et al., Cell 47:641(1986)、およびGoldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994)を参照されたい。本発明で用いるのに好適なさらなる毒素は当業者に公知であり、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第６，０７７，４９９号明細書に開示されている。
【００８２】
サイトカインのような免疫調節剤もまた結合させることができ、あるいはＥＧＰ−１、ＲＳ７およびｈＲＳ７免疫複合体の治療薬部分を形成することができ、あるいは本発明によるキメラ、ヒト化もしくはヒトＲＳ７抗体またはそのフラグメントに結合させずに投与することができる。本明細書において「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、ならびにインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの造血因子、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｌ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。あるいは、被験体に裸のＥＧＰ−１またはＲＳ７抗体を投与してもよく、別にサイトカインを投与することもでき、これは裸のＲＳ７抗体の投与前、同時または投与後に投与することができる。ＲＳ７抗体はまた、免疫調節剤と結合させてもよい。この免疫調節剤はまた、異なる抗原と結合する一以上の抗体からなるハイブリッド抗体と結合させてもよい。
【００８３】
治療薬または診断薬は、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。あるいは、このようなペプチドはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体成分に結合させることができる。Yu et al., Int. J. Cancer 56 : 244(1994)。このような結合に関する一般的な技術は当技術分野で周知である。例えば、Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al.,"Modification of Antibody by Chemical Methods, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al.(eds), pages 187-230（Wiley-Liss, Inc. 1995）; Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 60-84（Cambridge University Press 1995）を参照されたい。あるいは、治療薬または診断薬は抗体のＦｃ領域の炭化水素部分を介して結合させることもできる。この炭化水素基は、チオール基に結合している同じペプチドの付加量を増大させるためにも使用できるし、あるいはこの炭化水素部分は異なるペプチドに結合するためにも使用できる。
【００８４】
さらに、放射性標識抗体もしくは免疫複合体、またはそのフラグメントは、診断イメージングに有用なγ線放射性同位元素または陽電子放射体を含んでよい。、特にエネルギー範囲が２５〜４,０００ｋｅＶの好適な放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７５Ｂｒなどが挙げられる。例えば、１８Ｆ、６８Ｇａおよび９４ｍＴｃなどのような造影を目的とする陽電子放射体が開示されている、発明者G. L.Griffiths and W. J. McBrideの「Labeling Targeting Agents with Gallium-68」と題された米国特許出願（米国仮出願番号６０／３４２，１０４）を参照されたい（なお、その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）。診断用および治療用放射性核種のエネルギー範囲は２５〜４，０００ｋｅＶであるのが好ましい。その他の有用な放射性核種としては、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ、１４Ｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、９４ｍＴｃ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１１１Ａｇ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、１８Ｆ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、１６９Ｙｂ、１６６Ｄｙ、２１２Ｐｂ、および２２３Ｒａが挙げられる。
【００８５】
例えば、６７Ｃｕは６１．５というその半減期とβ粒子とγ線を豊富に供給することから放射線免疫療法のためのより有望な放射性同位元素と考えられるが、これはキレート剤ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸（ＴＥＴＡ）を用いてＲＳ７抗原結合タンパク質と結合させることができる（Chase,前掲）。あるいは、エネルギーに富んだβ粒子を放出する９０Ｙは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いてＲＳ７抗原結合タンパク質に結合させることができる。また、ＲＳ７ ＭＡｂを１３１Ｉで直接放射性標識するための方法がStein et al.（1991,前掲）および"Stable Radioiodine Conjugates and Methods for Their Synthesis"と題されたGovindan et al.のＷＯ９９１１２９４Ａ１の特許（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）に記載されている。
【００８６】
熱中性子活性化療法のため、ホウ素付加物を付加した担体を有する本発明によるＲＳ７抗体またはそのフラグメントも、通常同様にして達成される。しかし、中性子照射を行う前に、非標的ＲＳ７免疫複合体が除去されるまで待つのが有利である。クリアランスはＲＳ７抗体に結合する抗体を用いて促進することができる。この一般原理を記載したものとしては、米国特許第４，６２４，８４６号明細書を参照されたい。例えば、カルボランなどのホウ素付加物をＲＳ７抗体に結合させることができる。カルボランは、当技術分野で周知のように、ペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。アミノデキストランなどの担体へのカルボランの結合は、カルボランおよび縮合物のカルボキシル基を担体上のアミンで活性化することにより達成することができる。次に、この中間複合体をＲＳ７抗体と結合させる。ＲＳ７抗体複合体を投与した後、熱中性子の照射によってホウ素付加物を活性化し、α放射により崩壊して毒性の高い短期の作用を生じる放射性原子へと変換させる。
【００８７】
さらに、本発明は、被験体の癌を診断する方法を含む。診断は、医薬上好適な賦形剤中に調剤した診断上有効量の診断用複合体を投与し、その標識を検出することによって達成すればよい。例えば、放射性薬および非放射性薬を診断薬として用いることができる。好適な非放射性診断薬は、磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法または超音波法に好適な造影剤である。磁気イメージング剤としては、例えば、本発明による抗体とともに用いる場合は、マンガン、鉄およびガドリニウムなどの非放射性金属を、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属キレート剤の組み合わせと錯化したものを含む。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる、２００１年１０月１０日出願の米国出願番号０９／９２１，２９０を参照されたい。
【００８８】
従って、被験体の悪性腫瘍を診断する方法が記載され、該方法は（ｉ）裸の抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる組成物を用いて、被験体からの検体に対してin vitro診断アッセイを行うことを含んでなる。例えば、有用な診断／検出法として、組織、血液およびその他の体液中の微量のＥＧＰ−１の存在を検出するためには、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫アッセイin vitro診断法を用いることができる。細胞または組織中のＥＧＰ−１の存在を検出するためには、免疫組織化学法が使用できる。好ましくは、診断される悪性腫瘍は癌である。最も好ましくは、癌は、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌および膀胱癌からなる群から選択される。
【００８９】
これに加えて、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡのようなキレート剤または好適なペプチドに、蛍光分子のような検出可能な標識、または重金属もしくは放射性核種のような細胞傷害剤を結合させることができる。例えば、治療上有用な免疫複合体は、光活性薬または色素を抗体融合タンパク質に結合させることにより得られる。蛍光色素のような蛍光組成物、および他の色素原、または可視光線に感受性のあるポルフィリンのような色素は、好適な光線を病巣に当てることにより病巣の検出および治療に使用されてきた。治療においては、これは光照射、光療法または光線力学療法と呼ばれている（Jori et al. (eds.）, PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES（Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430（1986））。さらに、光療法を行うためには、モノクローナル抗体が光活性化色素と結合させられてきた（Mew et al., J.Immunol. 130:1473(1983);前掲, Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986);前掲, Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med.9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529（1991)）。しかし、これらの初期の研究には、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントの使用を伴った内視鏡療法の適用は含まれていなかった。従って、本発明は、光活性薬または色素を含んでなる免疫複合体の治療的使用を意図する。
【００９０】
本発明ではまた、ＭＲＩ造影剤、常磁性イオンおよび超音波増強剤などの造影剤も意図される。例えば、ガドリニウムイオン、ランタニド、マンガンイオンまたはその他の同等の標識、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤が、本発明における使用に好適である。ある好ましい実施態様では、超音波増強剤は、ヒト化ＲＳ７ ＩｇＧまたはそのフラグメントを含んでなるリポソームである。また、リポソームはガス充填されていることが好ましい。
【００９１】
治療目的では、本発明によるＲＳ７抗体およびそのフラグメントは治療上有効量で患者に投与される。抗体は、投与される量が生理学上有意であれば、「治療上有効量」で投与されると言われる。その存在が受容患者の生理に検出可能な変化をもたらす場合に、薬剤は生理学上有意である。
【００９２】
in vitro診断
本発明は、生体サンプルをＲＳ７抗原の存在に関してin vitroスクリーニングするための、ＲＳ７抗体（ＲＳ７およびｈＲＳ７抗体ならびにそのフラグメントを含む）の使用を意図する。このような免疫アッセイでは、ＲＳ７抗体は以下に記載されるように、液相で用いてもよいし、固相担体に結合させてもよい。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされるStein et al.（1993, 前掲）、およびStein et al., Cancer Res. 49: 32 (1989)も参照されたい。
【００９３】
生体サンプルがＲＳ７抗原を含むかどうかを判定するためのスクリーニング方法の一例として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）がある。例えば、ＲＩＡの一形態では、試験下の物質を放射性標識ＲＳ７抗原の存在下でＲＳ７抗原ＭＡｂと混合する。この方法では、試験物質の濃度は、ＭＡｂと結合している標識ＲＳ７抗原の量に反比例し、遊離している標識ＲＳ７抗原の量と直接相関する。他の好適なスクリーニング法も当業者には容易に明らかになろう。
【００９４】
あるいは、ＲＳ７抗原結合タンパク質が固相担体に結合されているin vitroアッセイを行うこともできる。例えば、ポリマーをコーティングしたビーズ、プレートまたは試験管などの不溶性の支持体にＭＡｂを結合させるためには、ＭＡｂをアミノデキストランのようなポリマーに結合させればよい。
【００９５】
他の好適なin vitroアッセイも当業者には容易に明らかになろう。検出可能なように標識されたＲＳ７抗原結合タンパク質およびＲＳ７抗原の具体的な濃度、インキュベーションの温度および時間、ならびにその他のアッセイ条件は、サンプル中のＲＳ７抗原の濃度、サンプルの性質などをはじめとする種々の因子によって異なる。ＲＳ７抗原結合タンパク質のサンプルの結合活性は周知の方法に従って測定することができる。当業者ならば、通常の実験を用いて、各測定に関して実施可能で最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
【００９６】
特定の条件に関する慣例または必要に応じて、洗浄、攪拌、振盪、濾過などの他の工程をアッセイに加えてもよい。
【００９７】
生体サンプル中のＲＳ７抗原の存在は、固相酵素免疫検定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて判定することができる。直接競合ＥＬＩＳＡでは、純粋または半精製抗原調製物を、試験する体液または細胞抽出物に不溶な固相支持体に結合させ、検出可能なように標識した一定量の可溶性抗体を加えれば、固相抗原と標識抗体の間で形成された二元複合体の検出および／または定量が可能となる。
【００９８】
これに対し、「二部位ＥＬＩＳＡ」または「サンドイッチアッセイ」としても知られる「二重決定基」ＥＬＩＳＡでは少量の抗原しか必要とせず、このアッセイでは抗原の大量精製の必要はない。このように二重決定基ＥＬＩＳＡは、臨床サンプル中の抗原の検出に関しては直接競合ＥＬＩＳＡと呼ばれる。例えば、生検検体中のｃ−ｍｙｃ癌タンパク質の定量のための二重決定基ＥＬＩＳＡの使用(Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989); Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989))を参照されたい。
【００９９】
二重決定基ＥＬＩＳＡでは、一定量の非標識ＭＡｂまたは抗体フラグメント（「キャプチャー抗体」）を固相支持体に結合させ、試験サンプルをキャプチャー抗体と接触させ、検出可能なように標識した可溶性抗体（または抗体フラグメント）を加えればキャプチャー抗体、抗原および標識抗体の間で形成された三元複合体の検出および／または定量が可能となる。抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂなどのような抗体の部分をいう。本発明では、抗体フラグメントＲＳ７抗原のエピトープと結合するＲＳ７ ＭＡｂの部分である。「抗体フラグメント」とはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、Ｌ鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、およびＬ鎖およびＨ鎖可変領域がペプチドリンカーにより連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子が挙げられる。抗体融合タンパク質とは、少なくとも二種の実質的に単一特異性の抗体または抗体フラグメント（ここで、少なくとも二種の抗体または抗体フラグメントはＲＳ７抗原の異なるエピトープに結合する）を含んでなる多重特異性抗体組成物である。ＲＳ７融合タンパク質には、抗体融合タンパク質と診断薬もしくは治療薬との複合体も含まれる。ＲＳ７抗体には、ヒト化、キメラ、ヒトおよびマウス抗体、その抗体フラグメント、免疫複合体およびそのフラグメント、ならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントが含まれる。
【０１００】
二重決定基ＥＬＩＳＡを行う方法は周知である。例えば、Field et al.,前掲、Spandidos et al.,前掲、およびMoore et al., "Twin-Site ELISAs for fos and myc Oncoproteins Using the AMPAK System," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 273-281 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい。例えば、二重決定基ＥＬＩＳＡを用いてＲＳ７抗原を検出する一つの方法では、生検サンプル由来の組織を細かく刻んだものを凍結乾燥させ、１％ノニデット−ｐ４０（ＮＰ４０）、６μｌ／ｍｌアプロチニン、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶解バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に、５００μｌ溶液当たり組織１０〜２０ｍｇ（湿重）の濃度で再懸濁させる。この懸濁液を氷上で６０分間インキュベートした後、１０秒間隔で約６回音波処理する。不溶性物質は遠心分離によって除去する。
【０１０１】
この可溶性抽出液を、キャプチャー抗体としてＲＳ７抗原ＭＡｂを吸着させたマイクロタイタープレートのウェルに加える。次に、捕捉されたＲＳ７を、アルカリ性ホスファターゼを結合させた第二のＲＳ７抗原ＭＡｂにより認識させる。結合しているアルカリ性ホスファターゼの量は抽出液中のＲＳ７抗原の量に比例するものであり、これをｐ−ニトロフェニルホスフェートのような発色基質を用いて比色法にて検出する。
【０１０２】
あるいは、ＲＳ７抗原に対する二重決定基ＥＬＩＳＡは西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて行うこともできる。サンプル調製および二重決定基ＥＬＩＳＡの他のバリエーションは当業者ならば通常の実験を用いて考案することができる。
【０１０３】
二重決定基ＥＬＩＳＡでは、可溶性抗体または抗体フラグメントは、キャプチャー抗体によって認識されるエピトープとは異なるＲＳ７エピトープと結合しなければならない。例えば、可溶性抗体はＲＳ７ ＭＡｂであってもよく、キャプチャー抗体はＭＲ２３であってよい。あるいは、可溶性抗体はＭＲ２３であってもよく、キャプチャー抗体はＲＳ７ ＭＡｂであってよい。
【０１０４】
二重決定基ＥＬＩＳＡは、生検サンプル中にＲＳ７抗原が存在するかどうかを確認するために行うことができる。あるいは、このアッセイは、体液の臨床サンプル中に存在するＲＳ７抗原を定量するために行うこともできる。この定量アッセイは、精製されたＲＳ７抗原の希釈物を含めて行うことができる。ＲＳ７抗原を精製する方法は以下に説明されている。
【０１０５】
本発明によるＲＳ７ ＭＡｂおよびそのフラグメントはまた、アッセイキットの製造にも適している。このようなキットはバイアル、試験管などのような一以上の密閉収容手段（これらの各収容手段は免疫アッセイの個々のヨウ素を含む）に収容するように区画化されている輸送手段を含んでなってもよい。
【０１０６】
例えば、固相支持体に固定化されたキャプチャー抗体を含む収容手段と、液相として検出可能なように標識された抗体を含むさらなる収容手段が存在してもよい。さらなる収容手段にはＲＳ７抗原の連続希釈物を含む標準液を含んでもよい。ＲＳ７抗原の標準液は、横座標にプロットしたＲＳ７抗原の濃度と縦座標上の検出シグナルを用いて標準曲線を作成するために使用できる。ＲＳ７抗原を含むサンプルから得られた結果をこのようなプロットから推定し、生体サンプル中のＲＳ７濃度を得ることができる。
【０１０７】
本発明によるＲＳ７抗体およびそのフラグメントはまた、組織学的検体から作製した組織切片中のＲＳ７の存在を検出するためにも使用できる。このようなin situ検出を用いてＲＳ７抗原の存在を判定したり、また、検査組織におけるＲＳ７抗原の分布を調べたりすることができる。in situ検出は、検出可能なように標識したＲＳ７抗原結合タンパク質を凍結組織切片に適用することで達成することができる。研究によれば、ＲＳ７抗原はパラフィン包埋切片では保存できないことが示されている（Stein et al. (1993), 前掲）。in situ検出の一般技術は当業者に周知である。例えば、Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk (ed.) (IRL Press 1987)、およびColigan at pages 5.8.1-5.8.8を参照されたい。また、Stein et al.（1989, 前掲）、およびStein et al.（1993, 前掲）も参照されたい。
【０１０８】
ＲＳ７抗体およびそれらのフラグメントは、好適ないずれかの検出剤、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識または常磁性標識で検出可能なように標識することができる。このような検出可能なように標識されたＲＳ７抗原結合タンパク質を作製および検出する方法は当業者に周知であり、また、以下にもさらに詳細に記載する。
【０１０９】
マーカー部分は、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いるなどの手段、またはオートラジオグラフィーによって検出される放射性同位元素であってもよい。ある好ましい実施態様では、診断用複合体はγ線、β線または陽電子放出同位元素である。本明細書においてマーカー部分とは、所定の条件下でシグナルを生じる分子をさす。マーカー部分の例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および常磁性標識が挙げられる。本明細書において、診断薬または治療薬とは、診断または治療に有用な複合体を形成するように抗体部分と結合されている分子または原子である。診断薬または治療薬の例としては、薬物、毒素、キレート剤、色素、色素原、ホウ素化合物、およびマーカー部分が挙げられる。本発明の目的において特に有用な同位元素としては、３Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、好ましくは１２５Ｉがある。他の放射性核種の例としては、例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔがある。また、これ以外の放射性核種も診断薬および治療薬として利用できる。好適な診断イメージング同位元素は通常２５〜４，０００ｋｅＶの範囲であり、一方、好適な治療用放射性核種は通常６０〜７００ｋｅＶの範囲である。
【０１１０】
本発明によるＲＳ７抗体およびそれらのフラグメントはまた、蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識ＭＡｂの存在は、ＲＳ７抗原結合タンパク質に適当な波長の光を当て、生じた蛍光を検出することにより判定される。蛍光標識化合物としてはフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびスルオレスカミンが挙げられる。蛍光標識ＲＳ７抗原結合タンパク質はフローサイトメトリー分析に特に有用である。
【０１１１】
あるいは、ＲＳ７抗体およびそれらのフラグメントは、ＲＳ７抗原結合タンパク質を化学発光化合物と結合させることによって検出可能なように標識することができる。化学発光タグが付けられたＭＡｂの存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより判定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１１２】
同様に、生物発光化合物を用いて本発明によるＲＳ７抗体およびそのフラグメントを標識することもできる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める生物系で見られる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより判定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
【０１１３】
あるいは、ＲＳ７抗体およびそのフラグメントは、ＲＳ７抗体を酵素と結合させることによっても検出可能なように標識することができる。ＲＳ７抗体−酵素複合体を適当な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応して化学部分が生じ、これは例えば分光光度的手段、蛍光測定手段または視覚的手段により検出することができる。ＲＳ７抗体を検出可能なように標識するのに使用できる酵素の例としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０１１４】
ＲＳ７抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントはまた、in vivo診断目的での常磁性イオンで標識することができる。磁気共鳴イメージングに特に有用な造影剤は、Ｇｄ、Ｍｎ、ＤｙまたはＦｅイオンを含んでなる。ＲＳ７抗体およびそのフラグメントはまた、超音波造影剤と結合させることもできる。例えば、超音波造影剤は、ヒト化ＲＳ７ ＩｇＧまたはそのフラグメントを含んでなるリポソームである。また、超音波造影剤は、ガス充填されたリポソームであることが好ましい。
【０１１５】
これに関連して、二重特異性抗体は、造影剤と結合させることができる。例えば、二重特異性抗体は超音波イメージングで用いるための一種以上のイメージ増強剤を含んでなってもよい。ある好ましい実施態様では、造影剤はリポソームである。リポソームはリポソームの外面に共有結合された二価のＤＴＰＡ−ペプチドを含んでなるのが好ましい。リポソームがガス充填されていることがいっそう好ましい。
【０１１６】
当業者には、本発明に従って使用できる他の好適な標識が知られている。マーカー部分とＲＳ７抗体との結合は当技術分野で公知の標準技術を用いて達成することができる。これに関する典型法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976)、Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977)、Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990)、Stein et al. (1990),前掲、およびStein et al. (1993),前掲に記載されている。
【０１１７】
上記のin vitroおよびin situ検出法を診断または病状の病期判定の補助に用いてもよい。例えば、このような方法は、肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌および前立腺癌をはじめとする、ＲＳ７抗原を発現する腫瘍を検出するのに用いることができる。
【０１１８】
in vovo診断
本発明はまた、in vivo診断のためのＲＳ７抗体の使用も意図する。放射性標識ＭＡｂを用いた診断イメージングの方法は周知である。イムノシンチグラフィー技術では、例えば抗体をγ線を放出する放射性同位元素で標識し、患者へ導入する。γ線を放出する放射性同位元素の位置および分布を検出するには、ガンマカメラが用いられる。例えば、Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990)、およびBrown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993)を参照されたい。
【０１１９】
診断イメージングでは、放射性同位元素をＲＳ７抗体に直接または中間的官能基を用いることで間接的に結合させればよい。有用な中間的官能基としては、エチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸などのキレート剤が挙げられる。例えば、Shih et al.（前掲）、および米国特許第５，０５７，３１３号明細書を参照されたい。
【０１２０】
患者に送達する線量は、最小の半減期、最小の身体残留、および検出と正確な測定が可能な最少の同位元素量の最良の組み合わせとして同位元素を選択することにより、可能な限り低レベルに維持される。ＲＳ７抗体と結合させることができ、かつ、診断イメージングに適当な放射性同位元素の例としては、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎがある。
【０１２１】
医薬上好適な賦形剤
治療適用においてＲＳ７抗体の作用期間を制御するために、さらなる薬学的方法を用いてもよい。徐放性製剤はＲＳ７抗体と複合体形成するか、ＲＳ７抗体を吸着するポリマーの使用を通じて調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）マトリックスおよびステラリン酸二量体とセバシン酸の無水共重合体マトリックスが挙げられる（Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992)）。このようなマトリックスからのＲＳ７抗体の放出速度は、ＲＳ７抗体の分子量、マトリックス内のＲＳ７抗体の量、および分散している粒子の大きさによって異なる（Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., 前掲）。その他の固相投与形は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed. (1990)に記載されている。
【０１２２】
被験体に送達されるヒト化、キメラおよびヒトＲＳ７抗体は、抗体単独、免疫複合体、融合タンパク質から構成されるか、または一以上の医薬上好適な賦形剤、一以上の付加的成分またはこれらのある組み合わせを含みうる。
【０１２３】
本発明による免疫複合体、裸の抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントは、医薬上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調剤され、この免疫複合体または裸の抗体は、混合物中で医薬上好適な賦形剤と結合する。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition （Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびそれらの改訂版を参照されたい。
【０１２４】
本発明による免疫複合体または裸の抗体は、例えばボーラス注射または点滴による静脈内投与のために調剤できる。注射製剤は、例えばアンプルのような単位投与形、または保存剤を加えた複数回投与用容器で提供することができる。この組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、その活性成分は使用前に例えば滅菌パイロジェンフリー水のような好適なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。
【０１２５】
治療用もしくは診断用複合体または裸の抗体の作用時間を制御するために、その他の製薬法を用いてもよい。徐放性製剤は、免疫複合体または裸の抗体と複合体形成するか、または免疫複合体または裸の抗体を吸着するポリマーの使用によって調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）マトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸の無水共重合体マトリックスが挙げられる（Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446(1992））。このようなマトリックスからの免疫複合体または抗体の放出速度は、免疫複合体または抗体の分子量、マトリックス内の免疫複合体、抗体の量、および分散している粒子の大きさによって異なる（Saltzman et al., Biophys. J. 55:163(1989); Sherwood et al., 前掲）。他の固形投与形は、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition（Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびその改定版に記載されている。
【０１２６】
また、免疫複合体、抗体融合タンパク質、裸の抗体、およびそのフラグメントは、哺乳類に皮下投与または他の非経口経路でも投与できる。ある好ましい実施態様では、抗ＥＧＰ−１抗体またはそのフラグメントは、一用量当たり１０〜２０００ｍｇタンパク質の用量で投与される。さらに、投与は、点滴でも、単回または複数回のボーラス注射によってもよい。一般に、ヒトにおいては、投与される免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および既往歴といった因子によって異なる。通常、単回の静脈点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の免疫複合体、抗体融合タンパク質または裸の抗体をレシピエントに与えるのが望ましいが、状況によってはより低い、またはより高い用量を投与してもよい。この用量は必要に応じて繰り返してもよく、例えば、１週間に１回の投与を４〜１０週間、好ましくは１週間に１回の投与を８週間、そしてより好ましくは、１週間に１回の投与を４週間繰り返してもよい。また、１週間おきの投与を数ヶ月といったように低い頻度で投与してもよい。用量および日程を適宜調節して、種々の非経口経路により投与してよい。
【０１２７】
本発明によるＲＳ７抗体は、医薬上有用な組成物を調製する既知の方法に従って調剤することができ、それによりＲＳ７抗体は混合物中で医薬上許容される担体と結合する。組成物は、その投与が受容患者によって許容される場合、「医薬上許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上許容される担体の一例である。他の好適な担体は当業者に周知である。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990)を参照されたい。
【０１２８】
治療目的では、治療上有効な量の免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体が哺乳類に投与される。ヒト以外の動物被験体もまた意図されるが、本発明における好適な被験体は、通常、ヒトである。抗体製剤は、投与される量が生理学上有意であれば、「治療上有効量」で投与されると言われる。薬物は、その存在が受容哺乳類の生理に検出可能な変化をもたらす場合に、生理学上有意である。
【０１２９】
当業者には、本発明による組成物および方法に対して種々の改変および変更をなしうることが明らかである。よって、本発明は、添付のクレームおよびそれらの均等物の範囲内に入る限り、このような改変および変更を含むものとする。
【０１３０】
上記に挙げられた総ての刊行物、特許および特許出願の開示は、その各々が個々に引用されることにより本明細書に組み込まれるのと同程度に、引用することによりその全開示内容が明確に本明細書の一部とされる。
【０１３１】
以下の実施例は本発明の実施態様を例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するために用いてはならない。
【実施例】
【０１３２】
実施例１：キメラＲＳ７抗体の構築
全細胞質ＲＮＡおよびｍＲＮＡをＲＳ７産生ハイブリッド細胞から調製した。ＶＫおよびＶＨ配列をコードする遺伝子をＲＴ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥによりクローニングし、ＤＮＡシーケンシングにより配列を決定した。多重依存性クローンを配列決定し、ＰＣＲ反応によって生じる可能性のあるエラーを除去した。配列解析から二つのＶＫ（＃１および＃２３）と一つのＶＨ（ＲＳ７ＶＨ）転写物の存在が明らかとなった。この推定される各マウスＶＫとＶＨを組み合わせると、ヒト定常領域ドメインを含む二つのキメラＡｂ（ｃＡｂ）ができ、トランスフェクションによりＳｐ２／０細胞で発現させた。ｃＡｂ産生クローンは、ＥＬＩＳＡにより、トランスフェクト細胞クローンの細胞培養上清をスクリーニングすることにより同定した。陽性クローンを拡張し、細胞培養上清からｃＡｂを精製した。Ａｇ結合アッセイから、ＶＫ＃２３とＶＨからなるｃＡｂ、すなわちｃＡｂ−ＶＫ＃２３だけがヒト子宮頚癌細胞ＭＥ１８０(ATCC, Rockville, MD)の粗膜画分でコーティングしたマイクロウェルに結合したことが示された（図１）。ＶＫ＃１とＶＨの組み合わせを有するｃＡｂ、すなわちｃＡｂ−ＶＫ＃１はＡｇコートウェルへの結合を示さなかった。よって、この免疫反応性ｃＡｂ（ＶＫ＃２３を有する）をｃＲＳ７と呼んだ。クローニングしたマウスＶＨおよび最終的なＰＣＲ産物としての機能的ＶＫ（＃２３）配列をそれぞれＲＳ７ＶＫ（図２Ａ）およびＲＳ７ＶＨ（図２Ｂ）と呼んだ。
【０１３３】
ＲＳ７ Ａｂの結合活性アッセイ
競合的ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて操作したｃＲＳ７の結合親和性を評価した。要するに、一定量のビオチニル化マウスＲＳ７を種々の濃度（０．０１〜１００μｇ／ｍｌ）の試験Ａｂ（ＲＳ７またはｃＲＳ７）と混合し、Ａｇコートマイクロウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＰＲ結合ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。Ａｇコートビオチニル化ＲＳ７に結合したＨＰＲ結合ストレプトアビジンの量を、４ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸塩および０．０４％  Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を添加した後にＯＤ４９０値を読みとることで明らかにした。この種の競合的Ａｇ結合アッセイによれば、抗原コートウェルに対するビオチニル化マウスＲＳ７の結合に関して同程度よく競合したことが明らかになり、得られたＶＫおよびＶＨ配列の確実性が確認された（図１）。
【０１３４】
実施例２：ｈＲＳ７抗体の構築方法
ｈＲＳ７ Ｖ遺伝子の配列デザイン
ＫａｂａｔデータベースでヒトＶＫおよびＶＨ配列を検索することにより、ＲＳ７ ＶＫおよびＶＨのＦＲはそれぞれヒトＳＡ−１Ａ’ｃｌ  ＶＫおよびＲＦ−ＴＳ３  ＶＨと最も高い程度の配列相同性を示すことが分かった。一つの例外がＲＳ７ＶＨのＦＲであり、ＮＥＷＭ  ＶＨのそれと最大の配列相同性を示した。従って、ヒトＳＡ−１Ａ’ＣＬフレームワーク配列をＲＳ７ＶＫのＣＤＲをグラフトするための足場として用い（図３）、ＲＳ７ＶＨに対してはＲＦ−ＴＳ３とＮＥＷＭのフレームワーク配列の組み合わせを用いた（図４）。開始ヒト抗体フレームワークと比べると、これらのＣＤＲ領域の外側の各鎖にはいくつかのアミノ酸変化がある。推定ＣＤＲをフランキングするマウスＦＲにおけるいくつかのアミノ酸残基はこれまでに確立されている指針に基づいた改造型ｈＲＳ７において維持されていた(Qu,Z., Losman, M.J., Eliassen, K.C., Hansen, H.J., Goldenberg, D.M., and Leung,S.O. (1999) Humanization of Immu31, an alpha-fetoprotein-specific antibody. Clin. Cancer Res. 5, 3095s-3100s)。これらの残基はＲＳ７ＶＫのＳ２０、Ｄ６０、Ｖ８５およびＡ１００、ならびにＲＳ７ＶＨのＫ３８、Ｋ４６、Ａ７８およびＦ９１である（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１３５】
ｈＲＳ７ Ｖ配列の構築
Leung et al. Leung, S.O., Shevitz, J., Pellegrini, M.C., Dion, A.S., Shih, L.B., Goldenberg, D.M., and Hansen, H.J. (1994) Chimerization of LL2, a rapidly internalizing antibody specific for B cell lymphoma. Hybridoma, 13: 469-476)に記載されているような改変法を用いて、図４で示されるような長いオリゴヌクレオチド合成とＰＣＲの組み合わせを用い、ｈＲＳ７の、デザインされたＶＬおよびＶＨ遺伝子を構築した。ｈＲＳ７ ＶＨドメインの構築に関しては、ｈＲＳ７ＶＨＡ（１７６マー）とｈＲＳ７ＶＨＢ（１６８マー）の二つの長いオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystem)にて合成した。
【０１３６】
ｈＲＳＶＨＡはｈＲＳ７ＶＨドメインのｎｔ２３〜１９８を表す：
5'-GGTCTGAGTT GAAGAAGCCT GGGGCCTCAG TGAAGGTTTC CTGCAAGGCT TCTGGATACA CCTTCACAAA CTATGGAATG AACTGGGTGA AGCAGGCCCC TGGACAAGGG CTTAAATGGA TGGGCTGGAT AAACACCTAC ACTGGAGAGC CAACATATAC TGATGACTTC AAGGGA-3'。
【０１３７】
ｈＲＳ７ＶＨＢはｎｔ１７４〜３４０に相当するｈＲＳ７ＶＨドメインの負鎖を表す：
5'-ACCCTTGGCC CCAGACATCG AAGTACCAGT AGCTACTACC GAACCCCCCT CTTGCACAGA AATACACGGC AGTGTCGTCA GCCTTTAGGC TGCTGATCTG GAGATATGCC GTGCTGACAG AGGTGTCCAA GGAGAAGGCA AACCGTCCCT TGAAGTCATC AGTATATG-3'。
【０１３８】
ｈＲＳ７ＶＨＡとＢの３’末端配列（２３ｎｔ残基）は互いに相補的である所定のＰＣＲ条件下で、ｈＲＳ７ＶＨＡとＢの３’末端はアニーニングして、長いオリゴヌクレオチドの残りによってフランキングされた短い二本鎖ＤＮＡを形成する。アニーリングした各末端は一本鎖ＤＮＡの転写のためのプライマーとして働き、ｈＲＳ７ＶＨのｎｔ２３〜３４０からなる二本鎖ＤＮＡが生じる。このＤＮＡを、ｈＲＳ７ＶＨＢＡＣＫおよびｈＲＳ７ＶＨＦＯＲの二種の短いオリゴヌクレオチドの存在下でさらに増幅し、全長ｈＲＳ７ＶＨを形成した：
hRS7VHBACK：5'-GTGGTGCTGC AGCAATCTGG GTCTGAGTTG AAGAAGCC-3'；
hRS7VHFOR：5'-TGAGGAGACG GTGACCAGGG ACCCTTGGCC CCAGACAT-3'。
【０１３９】
最少量のｈＲＳ７ＶＨＡおよびＢ（実験的に決定）を１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣＬバッファー、ｐＨ８．３、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２μｍｏｌのｈＲＳ７ＶＨＢＡＣＫおよびｈＲＳ７ＶＨＦＯＲ、ならびに２．５単位のＴａｑ    ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct)の存在下で増幅した。この反応混合物に対して、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の重合からなる３サイクルのＰＣＲ反応、その後、９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の重合からなる２７サイクルのＰＣＲ反応を行った。ｈＲＳ７ＶＨの二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥIIで制限消化し、Ｈ鎖足場ベクターＶＨｐＢＳ２の相補的ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥII部位へクローニングした。
【０１４０】
ヒト化ＶＫ配列の全長ＤＮＡの構築に関しては、ｈＲＳ７ＶＫＡ（１５６マー）およびｈＲＳ７ＶＫＢ（１５５マー）を上記のように合成した。ｈＲＳ７ＶＫＡおよびＢは上記のように二種の短いオリゴヌクレオチドｈＲＳ７ＶＫＢＡＣＫおよびｈＲＳ７ＶＫＦＯＲによって増幅した。
【０１４１】
ＨＲＳ７ＶＫＡはｈＲＳ７ＶＫドメインのｎｔ２０〜１７５を表す：
5'-CTCCATCCTC CCTGTCTGCA TCTGTAGGAG ACAGAGTCAG CATCACCTGC AAGGCCAGTC AGGATGTGAG TATTGCTGTA GCCTGGTATC AGCAGAAACC AGGGAAAGCC CCTAAGCTCC TGATCTACTC GGCATCCTAC CGGTACACTG GAGTCC-3'。
【０１４２】
ｈＲＳ７ＶＫＢはｎｔ１５５〜３２０に相補的なｈＲＳ７ＶＫドメインの負鎖を表す：
5'-CCTTGGTCCC AGCACCGAAC GTGAGCGGAG TAATATAATG TTGCTGACAG TAATAAACTG CAAAATCTTC AGGTTGCAGA CTGCTGATGG TGAGAGTGAA ATCTGTCCCA GATCCACTGC CACTGAACCT ATCAGGGACT CCAGTGTACC GGTAG-3'。
hRS7VKBACK：5'-GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTG-3'；
hRS7VKFOR：5'-ACGTTAGATC TCCACCTTGG TCCCAGCACC G-3'。
【０１４３】
ｈＲＳ７ＶＫのゲル精製したＰＣＲ産物をＰｖｕIIおよびＢｇｌIIIで制限消化し、Ｌ鎖足場ベクターＶＫｐＢＲ２の相補的なＰｖｕＩ／ＢｃII部位へクローニングした。最終の発現ベクターｈＲＳ７ｐｄＨＬ２は、上記のように、それぞれｈＲＳ７ＶＫおよびＶＨのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐｄＨＬ２へ順次サブクローニングすることにより構築した。
【０１４４】
ｈＲＳ７抗体のトランスフェクションおよび発現
ｈＲＳ７の発現ベクター約３０μｇをＳａｌＩ消化により線状化し、エレクトロポレーション（４５０Ｖおよび２５μＦ）によりＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞へトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を９６ウェルプレートで２日間平板培養した後、最終濃度０．０２５μＭでＭＴＸを培地に加えることで薬剤耐性に関して選択した。２〜３週間でＭＴＸ耐性コロニーが出現した。選択に生き残っているコロニーの上清をＥＬＩＳＡアッセイによりヒトＡｂ分泌に関して選択した。要するに、１００μｌの上清を、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的ＡｂであるＧＡＨ−Ｉｇでプレコートしたマイクロタイタープレートのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。結合していないタンパク質は洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することによって除去した。Ｆｃフラグメント特異的ＡｂであるＨＲＰ結合ＧＡＨ−ＩｇＧをウェルに加えた。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄した。結合しているＨＲＰ結合Ａｂは、４ｍＭ  ＯＰＤおよび０．０４％  Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を添加した後、Ａ４９０ｎｍで読みとることにより、明らかにした。陽性細胞クローンを拡張し、Ａタンパク質カラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清からｈＲＳ７ ＩｇＧを精製した。
【０１４５】
ヒト化ＲＳ７抗体の結合活性
ＭＥ１８０細胞膜抽出物をコーティングしたプレートを用いるＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを用いて、記載のように(Stein et al., Int. J. Cancer 55:938-946(1993))ｈＲＳ７の免疫反応性を評価した。ＭＥ１８０細胞膜画分を音波処理と遠心分離により調製した。粗膜抽出物を遠心分離により９６ウェル平底ＰＶＣプレートにコーティングし、０．１％グルタルアルデヒドで固定した。種々の濃度のｍＲＳ７、ｃＲＳ７またはｈＲＳ７と混合した一定量のビオチニル化マウスＲＳ７をこの膜コートウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。膜結合ビオチニル化ｍＲＳ７に結合したＨＲＰ結合ストレプトアビジンは、４ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸塩および０．０４％Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を加えた後、Ａ４９０ｎｍを読みとることによって明らかにした。図６の競合アッセイによって示されるように、ｈＲＳ７ ＩｇＧはｍＲＳ７およびｃＲＳ７のものに匹敵する結合活性を示し、ＲＳ７の結合親和性はヒト化しても保存されていることが確認された。
【０１４６】
実施例３：レシデュアライジング(residualizing)ラベルを用いたヒト化ＲＳ７の放射性ヨウ素化
レシデュアライジング部分（ＩＭＰ−Ｒ４、ＩＭＰ−Ｒ５またはＩＭＰ−Ｒ８）を放射性ヨウ素化し、他所に記載の手順(Govindan SV, et al. Bioconjugate Chem. 1999;10:231-240)に沿ってジスルフィドを還元したｈＲＳ７と結合させた。図９を参照されたい。１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒｘ−ｈＲＳ７（ここで、ｘ＝４、５または８）を作製するための、１２５Ｉを用いたレシデュアライジング放射性ヨウ素標識では、ＩＭＰ−Ｒ４、ＩＭＰ−Ｒ５およびＩＭＰ−Ｒ８を用いた場合にそれぞれ８７．１％（３．３８ｍＣｉ／ｍｇ）、３４．３％（０．９７ｍＣｉ／ｍｇ）、および７６．６％（２．９３ｍＣｉ／ｍｇ）といった全体収率および（比活性）が得られた。１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４種を用いた大規模１３１Ｉ標識では、次のような結果が得られた。２０．４ｍＣｉの１３１Ｉ、３５．７ｎｍｏｌのＩＭＰ−Ｒ４および３．２２ｍｇのＤＴＴで還元したｈＲＳ７を用いたところ、全体収率６０％（３．８０ｍＣｉ／ｍｇ）が得られた。３０．３ｍＣｉの１３１Ｉ、ＩＭＰ−Ｒ４および還元型ｈＲＳ７を用いた別の試験では、６９．７％の収率（３．８８ｍＣｉ／ｍｇ）が得られた。１３．９７ｍＣｉの１３１Ｉを用いた三つ目の試験では、７１．８％の組み込み（４．４２ｍＣｉ／ｍｇ）が得られた。１３．６ｍＣｉの１３１Ｉおよび非特異的ヒト化抗体ｈＬＬ２を用いた１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４標識では収率６４．４％（３．６７ｍＣｉ／ｍｇ）であった。
【０１４７】
実施例４：乳癌動物モデルにおける臨床前試験
腫瘍ターゲッティング試験のため、５〜８週齢の雌ヌードマウスにおいて、〜２．３×１０７個の培養ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を皮下注射することで腫瘍を増殖させ、この動物を一ヶ月後、腫瘍サイズが〜０１〜０．２ｃｍ３に達した時に用いた。マウスに〜１０μＣｉの１２５Ｉ−［ＩＭＰ−Ｒｘ］−ｈＲＳ７（ここで、ｘ＝４、５または８）および２０〜２５μＣｉの１３１Ｉ−ＭＡｂの混合物を静注した（ＣＴ法）。従って、各試験は１２５Ｉ／１３１Ｉによる一対の標識試験であった。示された時点で、種々の器官および血中の生体分布を調べ、注射量％／ｇで表した。１２５Ｉの生体分布を決定するに当たっては、１３１Ｉの１２５Ｉ枠への後方散乱に関する補正を行った。
【０１４８】
治療試験のため、様々な形式で腫瘍増殖パターンを試験して腫瘍増殖を安定化させるのに最適な方法を決定した。ターゲッティング試験に用いる方法は約８週間腫瘍増殖させた後に最適となり、腫瘍増殖プロフィールに基づき３０〜５０％の動物が使用できた。治療試験のため、腫瘍を持つ動物に試験薬剤の１３１Ｉ−ＩＭＰＲ４−ｈＲＳ７を静注し、直接放射性ヨウ素化した材料１３１Ｉ−ｈＲＳ７と比べた。基準体重を毎週の体重および腫瘍体積測定値と比較した。腫瘍が３ｃｍ３に達した際に動物を屠殺した。動物試験は総てＩＡＣＵＣに承認されたプロトコールに従って行った。
【０１４９】
in vivo動物における生体分布
これらの試験はＮＩＨスイスヌードマウスで増殖させた腫瘍において二重標識ｈＲＳ７調製物（１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒｘ−ｈＲＳ７（ここで、ｘ＝４、５または８、各薬剤は直接標識１３１Ｉ−ｈＲＳ７と混合した）を用いて行った。表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは詳細な生体分布を示しているが、これらはレシデュアライジングラベルを用いた優れた性能を表している。例えば、１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７、１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ５−ｈＲＳ７および１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ８−ｈＲＳ７に関する７日目の腫瘍１ｇ当たりの注射量％はそれぞれ４１．６±３．０％、３２．２±１１．６％および２４．７±８．５％であったが、各二重標識試験において同じ時点の直接標識１３１Ｉ−ｈＲＳ７の場合は５．９±０．９％、６．２±２．１％および６．７±２．３％であった。同じ時点での腫瘍／非腫瘍比は、１３１Ｉ−ｈＲＳ７の場合の比と比べた場合、１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７では１．７〜７．６倍高く、１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ５−ｈＲＳ７では１．７〜６．０倍高く、１２５Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ８−ｈＲＳ７では２．０〜４．８倍高かった（データは示されていない）。
【０１５０】
表１：MDA-MB-468腫瘍異種移植片を有するNIHスイスヌードマウスにおける125I-IMP-R(R4またはR5またはR8)および131I-hRS7で二重標識したヒト化RS7の生態分布 (CT法)
【表１】
2006502698.tif 000002
【０１５１】
【表２】
2006502698.tif 000003
【０１５２】
【表３】
2006502698.tif 000004
【０１５３】
１３１Ｉの代わりに１２５Ｉを用いた生体分布に基づく線量計測はSiegel, JA and Stabin, MG (Journal of Nuclear Medicine 1994; 35:152-156)の方法を用いて行った。表２はレシデュアライジング放射性ヨウ素標識と従来の放射性ヨウ素標識の各組を比較したものであり、図１０はそのデータをグラフ化したものである。総てのレシデュアライジング剤が腫瘍へ送達される用量および腫瘍／非腫瘍比の点で最適にふるまっているものと思われ、放射性化学収率が有利であること、および同じ薬剤に対しても特異的活性が得られることから、治療試験のため１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７を選択した。
【０１５４】
【表４】
2006502698.tif 000005
【０１５５】
ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌異種移植片の治療
最大許容量（ＭＴＤ）：線量測定データ（表２、群−１）から、血液に１５００ｃＧｙの線量をもたらす１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７および１３１Ｉ−ｈＲＳ７のｍＣｉ量（ＭＴＤ見積値）を計算するとそれぞれ０．２３１ｍＣｉおよび０．２８５ｍＣｉであった。ＭＴＤの実験的測定はスイスヌードマウスにおいて各薬剤の濃度を増加させて行った。１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７では、動物群に２００、２２５、２５０、２７５、３００および３２５μＣｉを投与したところ、２５０μＣｉの用量で５個体のうち１個体が第４週までに死に至り、３００μＣｉ用量群では４個体のうち３個体が２週間〜４週間の間に死に至った。２７５および３２５μＣｉの用量群で第５週目に動物が生き残っているとは予期されなかったが、発明者らはＭＴＤの投与量は、２３１μＣｉ（線量測定データから算出したもの）〜２５０μＣｉの間である結論づけた。１３１Ｉ−ｈＲＳ７（’ＣＴ’に基づく放射性ヨウ素化）では、動物群に２５０、２８０、３１０、３４０、３７０および４００μＣｉを注射したところ、２〜３週間の間に３４０μＣｉの用量群では６個体のうち６個体が、３７０μＣｉの用量群では６個体のうち３個体が、また、４００μＣの用量群では４個体のうち４個体が死に至った。これらのことに基づけば、ＭＴＤは２８０〜３１０μＣｉの範囲であると見積もられた。
【０１５６】
治療試験−１
この第一の治療試験では、１３１Ｉ−ＩＭＰＲ−４−ｈＲＳ７と１３１Ｉ−ｈＲＳ７（ＣＴ法）の効力を比較するために、各薬剤をその最大許容量の〜７０％で用いた。単回用量１７５μＣｉのレシデュアライジング剤は、通常の放射性ヨウ素剤２００μＣｉよりも有意に効力が高いと思われる。非処置動物も含むこの実験では、各群１０または１１個体の動物を用い、開始時の腫瘍サイズの分布がほとんど同じになるように全３群を無作為化した。この３群の処置前（−２日）の平均腫瘍体積は０．３１２±０．１８１、０．３０８±０．２０３および０．３０３±０．２１２であった。
【０１５７】
この実験では、４９日目までの中間データが以下の図１１に示されている。図１１の上のパネルは各群の個々の動物の腫瘍体積（ｃｍ３）を示し、下のパネルは二種類の形式で平均腫瘍体積を示す。非処置動物では３個体が死に至った。腫瘍増殖抑制は、４９日目までの平均腫瘍体積（ＭＴＶ）に対する曲線下面積（ＡＵＣ）のスチューデントのｔ検定によって判断した場合、通常の標識および非処置動物と比べて、レシデュアライジング標識群で有意に良好である。４９日目において、ＭＴＶのＡＵＣにおける差に関する有意性（ｐ値）は１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７によるものであり、括弧内に示される処置前（−２日）の腫瘍体積の差に対する個々のｐ値は次の通りである。非処置に対して：０．０５（０．７８）；１３１Ｉ−ｈＲＳ７（ＣＴ）に対して：０．０３（０．９８）；非処置に対しての１３１Ｉ−ｈＲＳ７（ＣＴ）：０．１４（０．８１）。４９日目の従来の放射性ヨウ素化群とレシデュアライジング放射性ヨウ素化群の間の平均腫瘍体積には連続的発散があり、後者の群は連続的低下に至る。処置８週間後では、１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７で処置したマウス１１個体のうち５個体で完全緩解が見られ、そのＭＴＶは開始時の値の２０％であった。８週間目の非処置および１３１Ｉ−ｈＲＳ７処置マウスのＭＴＶはそれぞれ個々の開始時の値の２８０％および１６３％であり、１３１Ｉ−ｈＲＳ７群の１１個体のマウスのうち１個体が完全緩解を示した。
【０１５８】
これらの処置は十分許容されるものであった。ＩＭＰ−Ｒ４群の−２日時の平均体重は２１．９３±２．０３であり、４９日目は２３．６８±１．８１であり；「ＣＴ」群の平均体重は−２日時と４９日目でそれぞれ２１．７７±２．２１および２３．９０±２．６４であった。血球数によって判断した場合の処置群の骨髄毒性を図１２に示す。要するに、１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７では、薬剤投与１週間後に、ＷＢＣ、リンパ球数および好中球数は、それぞれ対照レベルの３４％、７％および６１％という最下点に達した。５週間目までにこれらはそれぞれ対照レベルの７４％、５８％および９２％に回復し、４９日目に対照レベルの４５％、３６％および５１％に留まった。また、１３１Ｉ−ｈＲＳ７（ＣＴ）では、薬剤投与１週間後にＷＢＣ、リンパ球数および好中球数は、それぞれ対照レベルの４１％、１３％および６７％という最下点に達した。５週間目までにこれらはそれぞれ対照レベルの８５％、６７％および１０３％に達し、４９日目に対照レベルの４２％、３２％および４９％に留まった。
【０１５９】
治療試験−２
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍モデルにおける１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７を用いたＲＡＩＴの特異性
１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７の効力を１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４で標識した非特異的対照ヒト化抗体ｈＬＬ２（抗ＣＤ−２２  ＭＡｂ）の効力と比較した。この試験では、各薬剤１７５μＣｉを投与した。これは１３１Ｉ−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＲＳ７の最大許容量の〜７０％に相当する。非処置対照を含むこの試験では、各群７〜８個体の動物を用い、各群は治療試験−１と同様に開始時の腫瘍体積分布に関して無作為化した。図１３は３群の相対的平均腫瘍体積（ＭＴＶ）を示しているが（処置前のＭＴＶを１００とする）、これは増殖抑制特異性を示している。
【０１６０】
実施例５：Ｙ−９０ヒト化ＲＳ７  ｍＡｂおよび裸のヒト化ＲＳ７  ｍＡｂによる乳癌患者の治療
再発性乳房腺癌の病歴を持つ５６歳の女性は子宮系リンパ節および左の肺に転移を持っていた。この患者は化学療法およびホルモン療法後に２回再発していた。そこでこの患者にＹ−９０−結合ヒト化ＲＳ７  ｍＡｂを抗体タンパク質量１００ｍｇ中２０ｍＣｉのＹ−９０の各用量で、２週間おきに２回静注した。処置４週間後、この患者の白血球および血小板の数は約５０％まで低下したが、処置９週間目までに回復した。処置１２週間後に病期の再判定を行ったところ、コンピューター断層撮影法により肺とリンパ節の転移に約３０％の退縮が測定された。その後、この患者に裸のヒト化ＲＳ７を各３時間かけてし、毎週１回、４回の点滴を行ったが、これは時々一時的な硬直や悪寒があったこと以外は、血球数や血液化学に副作用もなく、十分許容されるものであった。各点滴の裸の抗体の用量は４００ｍｇ／ｍ２とした。約８週間後、コンピューター断層撮影法により病期の再判定を行ったところ、さらに約２０％の測定可能な病巣の退縮が示された。３ヶ月後の追跡試験では、この患者の疾病は安定したことが明らかであった（すなわち、さらなる増殖、または進行性の増殖の形跡がなかった）。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】競合結合アッセイにおけるｍＲＳ７、ｃＡｂ−ＶＫ＃２３（ｃＲＳ７）、およびｃＡｂ−ＶＫ＃１の比較を示す。異なる濃度の競合Ａｂを用いて、一定量のビオチニル化ｍＲＳ７抗体の結合と競合させた。結果はＶＫ＃１Ｌ鎖はＲＳ７抗原と結合しないことを示す。
【図２】（Ａ）５’ＲＡＣＥによってクローニングされたＲＳ７ ＶＫおよび（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたＲＳ７ ＶＨをコードするＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。推定ＣＤＲ領域は下線で示されている。ヌクレオチド残基には連続番号が付けられている。アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子番号体系が用いられている。（Ｂ）では、（上に）文字が付いている残基の番号付けは、前の残基の番号に文字を付したものであり、例えば、Ｎ５２の後のＴの番号は５２Ａであり、Ｉ８２の後のＮ、ＮおよびＬの番号はそれぞれ８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃである。
【図３】（Ａ）ヒトＳＡ−１Ａ’ｃｌ、マウスＲＳ７、およびｈＲＳ７ ＶＫ鎖と、（Ｂ）ヒトＲＦ−ＴＳ３、マウスＲＳ７、およびｈＲＳ７ ＶＨ鎖のアミノ酸配列アライメントを示す。（Ａ）では、点はＲＳ７の残基がＳＡ−１Ａ’ｃｌの対応する残基と同一であることを示す。ダッシュはアライメントのために挿入されたギャップを表す。囲み線はＣＤＲ領域を表す。ｈＲＳ７のＮ末端およびＣ末端残基（下線）は双方とも用いる足場ベクターによって固定されている。従って、ＲＳ７の対応する末端残基はヒト配列のものには匹敵しない。Ｋａｂａｔの番号体系法を用いている。（Ｂ）では、点はＲＳ７の残基がＲＦ−ＴＳ３の対応する残基と同一であることを示す。ダッシュはアライメントのために挿入されたギャップを表す。囲み線はＣＤＲ領域を表す。ｈＲＳ７のＮ末端およびＣ末端残基（下線）は双方とも用いる足場ベクターによって固定されている。従って、ＲＳ７の対応する末端残基はヒトＶＨ配列のものには匹敵しない。
【図４】（Ａ）ヒト化ＲＳ７ ＶＫおよび（Ｂ）ヒト化ＲＳ７ ＶＨのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の太字で下線が施されたセクションは、Ｋａｂａｔ番号体系法によって定義されるＣＤＲを示す。
【図５】（Ａ）ヒト化ＲＳ７ ＶＫのＬ鎖ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列と、ヒト化ＲＳ７ ＶＨのＨ鎖ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の下線のセクションは分泌に関するリーダーペプチド配列を示す。「＊」は終止コドンを示す。
【図６】競合結合アッセイにおけるｍＲＳ７、ｃＲＳ７、およびｈＲＳ７の比較を示す。異なる濃度の競合Ａｂを用い、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたＡｇに対する一定量のビオチニル化ＲＳ７の結合と競合させた。ｈＲＳ７は、ＲＳ７およびｃＲＳ７に匹敵する遮断活性を示した。
【図７】ヒト化ＲＳ７ ＶＫのＬ鎖ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の下線のセクションは分泌に関するリーダーペプチド配列を示す。「＊」は終止コドンを示す。リジン残基にも下線が施されている。
【図８】ヒト化ＲＳ７ ＶＫのＨ鎖ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の下線のセクションは分泌に関するリーダーペプチド配列を示す。「＊」は終止コドンを示す。リジン残基にも下線が施されている。
【図９】レシデュアライジング部分ＩＭＰ−Ｒ４、ＩＭＰ−Ｒ５およびＩＭＰ−Ｒ８の構造を示す。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍モデルにおける放射性ヨウ素化ｈＲＳ７による線量計測の棒グラフである。
【図１１】ヌードマウスにおける乳癌異種移植片の腫瘍成長に対する放射性免疫療法の効果を示す一連のグラフを示す。
【図１２】ヌードマウスにおける乳癌異種移植片の放射性免疫療法処置後の毒性を評価する一連のグラフを示す。
【図１３】相対的平均腫瘍体積（ＭＴＶ）を示すグラフである。
【図１】
2006502698.tif 000006
【図２Ａ】
2006502698.tif 000007
【図２Ｂ】
2006502698.tif 000008
【図３Ａ】
2006502698.tif 000009
【図３Ｂ】
2006502698.tif 000010
【図４Ａ】
2006502698.tif 000011
【図４Ｂ】
2006502698.tif 000012
【図５Ａ】
2006502698.tif 000013
【図５Ｂ】
2006502698.tif 000014
【図６】
2006502698.tif 000015
【図７】
2006502698.tif 000016
【図８】
2006502698.tif 000017
【図９】
2006502698.tif 000018
【図１０】
2006502698.tif 000019
【図１１】
2006502698.tif 000020
【図１２】
2006502698.tif 000021
【図１３】
2006502698.tif 000022
【配列表】
2006502698000001.app
【国際調査報告】
2006502698.tif 000023
2006502698.tif 000024
2006502698.tif 000025
2006502698.tif 000026
2006502698.tif 000027
2006502698.tif 000028