(57)【要約】本発明は、ケモカイン生成を高めるためにZven1及びZven2ポリペプチドを用いる方法を提供する。本発明はまた、腸における炎症を処理するためへのZven1及びZven2に対するアンタゴニストの使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の腸における炎症を低めるための方法であって、Zven1又はZven2アンタゴニストをその必要な哺乳類に投与し、腸における炎症が低められる方法。
【請求項２】
哺乳類の腸における炎症を処理するための方法であって、Zven1又はZven2アンタゴニストをその必要な哺乳類に投与し、腸における炎症が低められる方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストが抗体である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、
ａ）抗−イディオタイプ抗体；
ｂ）抗体フラグメント；
ｃ）キメラ抗体；及び
ｄ）ヒト型化抗体、
から選択される請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記アンタゴニストが受容体であり、そして前記受容体が配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を結合する請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記受容体が、配列番号27又は配列番号28に記載されるようなアミノ酸配列を含んで成る請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記アンタゴニストが受容体であり、そして前記受容体の一部が、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して特異的に結合する請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
前記炎症が慢性である請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
前記炎症が散在性である請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症が過敏性腸症候群の症状である請求項１又は２記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症が炎症性腸疾患の症状である請求項１又は２記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病又は下痢−傾向過敏性腸症候群である請求項11記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１又は配列番号４のポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を検出するための方法。
【請求項１４】
配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を検出するための方法。
【請求項１５】
配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける過敏性腸症候群を検出するための方法。
【請求項１６】
配列番号１又は配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を検出するための方法。
【請求項１７】
配列番号１又は配列番号４のポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を診断するための方法。
【請求項１８】
配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を診断するための方法。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける過敏性腸症候群を診断するための方法。
【請求項２０】
配列番号１又は配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を診断するための方法。
【請求項２１】
配列番号２のアミノ酸残基28〜108、配列番号29のアミノ酸残基28〜129又は配列番号５のアミノ酸残基20〜105のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における炎症性腸疾患を処理するための方法。
【請求項２２】
前記腸における炎症が低められるか、縮小されるか、又は阻害される請求項21記載の方法。
【請求項２３】
配列番号２のアミノ酸残基28〜108、配列番号29のアミノ酸残基28〜129又は配列番号５のアミノ酸残基20〜105のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における過敏性腸症候群を処理するための方法。
【請求項２４】
前記腸における炎症が低められるか、縮小されるか、又は阻害される請求項23記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１又は配列番号５の核酸配列を含んで成るポリヌクレオチドを、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における過敏性腸症候群を処理するための方法。
【請求項２６】
前記腸における炎症が低められるか、縮小されるか、又は阻害される請求項25記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景：
アメリカ合衆国においては、約500,000の人々が、小腸及び大腸のいずれか又は両者を包含する炎症性腸疾患を有する。潰瘍性大腸炎及びクローン病は、炎症性腸疾患の最も知られている形であり、そして両者は、それらについての病因は知られていないので、“特発性”炎症性腸疾患として分類される。
【０００２】
潰瘍性大腸炎は、結腸の粘膜又は最も内部の内層の炎症及び潰瘍により特徴づけられる拡散性粘膜疾患としての結腸を包含する。この炎症は、結腸の空化を引き起こし、時折、下痢をもたらす。症状は、便のゆるみ及び関連する腹部痙攣、発熱及び体重低下を包含する。潰瘍性大腸炎の正確な原因は未知であるが、最近の研究は、身体の自然な防御が、身体が外来物であると考える進退におけるタンパク質に対して作動する（“自己免疫反応”）ことを示唆する。
【０００３】
たぶん、それらは腸において細菌タンパク質に類似するので、それらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症工程を誘発するか又は刺激することができる。結腸の内層が破壊されるにつれて、粘液、膿及び血液を開放する潰瘍が形成する。疾病は通常、直腸領域において始まり、そして結果的に、全体の大腸を通して拡張する。炎症の反復した症状の発現は、瘢痕組織を有する、腸及び直腸の壁の肥厚化を導く。結腸組織の死又は敗血症が重度の疾病と共に発生する。潰瘍性大腸炎の症状は、重症性において異なり、そしてそれらの開始は徐々ではあるか又は突然であり得る。攻撃は呼吸器感染又はストレスを包含する多くの因子により誘発される。
【０００４】
現在、潰瘍性大腸炎に関する療法は存在しないが、処理は、結腸内層における腹部炎症工程の抑制に集中される。コルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン及びメトトレキセート）及びアミノサリチレートを包含する処理が、疾病を処理するために利用できる。しかしながら、免疫抑制剤、例えばコルチコステロイド及びアザチオプリンの長期使用は、重度の副作用、例えば骨の薄層化、白内障、感染、及び肝臓及び骨髄効果をもたらす。現在の治療が成功していない患者においては、手術は１つの見解である。手術は、完全な結腸及び直腸の除去を包含する。
【０００５】
クローン病は、胃腸管のいずれかの部分を包含するが、しかし最も頻繁には、遠位小腸及び結腸を包含する。炎症は、リンパ性小胞にわたっての小さな潰瘍から深い裂け目の潰瘍、経壁性瘢痕及び慢性炎症までの何でも生成することができる。その病因は未知であるが、感染及び免疫学的機構は提案されている。症状は種々であり、そして下痢、発熱及び痛み、並びに関節炎、ブドウ膜炎、結節性紅斑及び強直性脊髄炎を包含する。
【０００６】
炎症性腸疾患を処理するのための従来のアプローチは、アザチオプリンによる免疫抑制である（例えば、Rutgeerts, J. Gastroentenral, Hepatol. 17 (Suppl.)；S176-85（2002）を参照のこと）。より最近には、キメラ性モノクローナル抗−腫瘍壊死因子抗体、すなわちinfliximabが、特定の病原性疾病機構を標的化するために使用されており、そして疾病抗体の完全な抑制及び長期での腸治療を可能にする。しかしながら、この治療は、免疫原性の問題に関連しているinfliximabに対する抗体の形成が、効能を妨げ、そして注入反応に関連する。
【０００７】
過敏性腸症候群（IBS）は、慢性の機能的胃腸疾患である。それは、種々の腸症状、例えば変更された腸習性に通常関連する腹部痛及び鼓張により特徴づけられる異種状態である（Collinsなど, 2001）。アメリカ合衆国人工の12〜20％がこの病状を有することが推定されている。異なった基準、例えばManning基準（Manningなど, 1978）、Rome基準（Thompsonなど, 1992）及び最も最近には、Rome II（Thompsonなど, 1999）が、IBSを定義するために提案されている。IBSに対する研究報告は時折、IBSを有する患者を、２種のサブタイプの便秘慢性体（CON）及び下痢慢性体（DIA）に分類し、そして時々、第IIのサブタイプの他のパターン（ALT）を包含する。プロキネチック剤は、10年間、IBS CONの処理に使用されて来た（Callahan, M.J> Clin. Gastroenteral. 35 Supp: Supp: S58-S67, 2002）。
【０００８】
従って、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群の診断及び処理のための治療アプローチの必要性がまだ存在する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な要約：
本発明は、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群の処理のために有用なタンパク質を提供する。Zven1及びZven2ポリペプチドの他の使用が下記に、より詳細に説明される。
【００１０】
発明の記載：
１．概観：
本発明は、これまでに記載されているタンパク質Zven1及びZven2の新規使用に向けられる。現在アメリカ出願番号第6,485,938号として発行されているアメリカ特許出願番号09/712,529号を参照のこと。Zven1及びZven2はまた、それぞれプロキネチシン２及びプロキネチシン１として産業的に知られている。本明細書に論じられるように、Zven1及びZven2、及びその変異体、フラグメント、抗−Zven活性を有する分子は、胃腸機能、IBD及びIBSに関連する症状、及び胃排出能を調節するために使用され得る。Zven1（プロキネチシン２）及びZven2（プロキネチシン１）のための受容体は、Gタンパク質−結合された受容体、すなわちGPCR73a及びGPCR73bとして同定されている。Lin, D. など., J. Biol. Cherra. 277: 19276-19280,2002を参照のこと。GPCR73a及びBPCR73b受容液はまた、PK−R1及びPK−R2としても知られている。
【００１１】
本発明は、ヒトZvenポリペプチド及びそれをコードする核酸分子の使用方法を提供する。Zven1ポリペプチドをコードする配列を含む例示的な核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。そのコードされるポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する：MRSLCCAPLL LLLLLPPLLL TPRAGDAAVI TGACDKDSQC GGGMCCAVSI WVKSIRICTP MGKLGDSCHP LTRKVPFFGR RMHHTCPCLP GLACLRTSFN RFICLAQK（配列番号２）。従って、本明細書に記載されるZven1ヌクレオチド配列は、108個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。Zven1ポリペプチドの推定上のシグナル配列は、配列番号２のアミノ酸残基１〜20、１〜21及び１〜22で存在する。前記ポリペプチドの成熟形は、配列番号２に示されるように、アミノ酸28〜108からのアミノ酸配列を含んで成る。
【００１２】
配列番号２で示されるような長い形の配列は、本明細書に記載される発明に包含される。その長い形は次のアミノ酸配列を有する：MRSLCCAPLL LLLLLPPLLL TPRAGDAAVI TGACDKDSQC GGGMCCAVSI WVKSIRICTP MGKLGDSCHP LTRKNNFGNG RQERRKRKRS KRKKEVPFFG RRMHHTCPCL PGLACLRTSF NRFICLAQK（配列番号29）。この長い形の推定上のシグナル配列は、配列番号29で示されるようなアミノ酸28〜129からのアミノ酸配列を含んで成る成熟形を有する。
【００１３】
Zven2ポリペプチドをコードする配列を含む例示的な核酸分子は、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。そのコードされるポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する：MRGATRVSIM LLLVTVSDCA VITGACERDV QCGAGTCCAI SLWLRGLRMC TPLGREGEEC HPGSHKVPFF RKRKHHTCPC LPNLLCSRFP DGRYRCSMDL KNINF（配列番号５）。従って、本明細書に記載されるZven2ヌクレオチド配列は、105個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。Zven2ポリペプチドの推定上のシグナル配列は、配列番号５のアミノ酸残基１〜17、及び１〜19で存在する。
【００１４】
下記に記載されるように、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基23〜108に対して、配
列番号２のアミノ酸残基28〜108に対して、又は配列番号29のアミノ酸残基28〜129に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％又は少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。そのような単離されたポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合することができる。特定のポリペプチドは、胃収縮性、胃排出能及び/又は腸通過を高めるか又は低めることができる。例示的なポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
【００１５】
同様に、本発明は、配列番号５のアミノ酸残基20〜105に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％又は少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供し、ここでそのような単離されたポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合することができる。例示的なポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
【００１６】
本発明はまた、（１）配列番号２のアミノ酸残基21〜108；
（2）配列番号２のアミノ酸残基22〜108；
（3）配列番号２のアミノ酸残基23〜108；
（4）配列番号２のアミノ酸残基82〜108；
（5）配列番号２のアミノ酸残基1〜78（アミド）；
（6）配列番号２のアミノ酸残基1〜79；
（7）配列番号２のアミノ酸残基21〜78（アミド）；
（8）配列番号２のアミノ酸残基21〜79；
（9）配列番号２のアミノ酸残基22〜78（アミド）；
（10）配列番号２のアミノ酸残基22〜79；
【００１７】
（11）配列番号２のアミノ酸残基23〜78（アミド）；
（12）配列番号２のアミノ酸残基23〜79；
（13）配列番号２のアミノ酸残基20〜108；
（14）配列番号２のアミノ酸残基20〜72；
（15）配列番号２のアミノ酸残基20〜79；
（16）配列番号２のアミノ酸残基20〜79（アミド）；
（17）配列番号２のアミノ酸残基21〜72；
（18）配列番号２のアミノ酸残基21〜79（アミド）；
（19）配列番号２のアミノ酸残基22〜72；
（20）配列番号２のアミノ酸残基22〜79（アミド）；
【００１８】
（21）配列番号２のアミノ酸残基23〜72；
（22）配列番号２のアミノ酸残基23〜79（アミド）；
（23）配列番号２のアミノ酸残基28〜108；
（24）配列番号２のアミノ酸残基28〜72；
（25）配列番号２のアミノ酸残基28〜79；
（26）配列番号２のアミノ酸残基28〜79（アミド）；
（27）配列番号２のアミノ酸残基75〜108；
（28）配列番号２のアミノ酸残基75〜79；及び
（29）配列番号２のアミノ酸残基75〜78（アミド）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドも提供する。
本発明はまた、配列番号29で示されるようなアミノ酸残基28〜129を含んで成るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、及び/又はそのフラグメントも包含した。
【００１９】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号５のアミノ酸残基20〜105、
（b）配列番号５のアミノ酸残基18〜105、
（c）配列番号５のアミノ酸残基1〜70、
（d）配列番号５のアミノ酸残基20〜70、
（e）配列番号５のアミノ酸残基18〜70、
（f）配列番号５のアミノ酸残基76〜105、
（g）配列番号５のアミノ酸残基66〜105、及び
（h）配列番号５のアミノ酸残基82〜105、から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを包含する。
例示的なポリペプチドは、アミノ酸配列（ａ）〜（ｈ）から成る。
【００２０】
本発明はさらに、そのようなポリペプチドと特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントを提供する。典型的な抗体は、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体由来のヒト型化抗体、及びヒトモノクローナル抗体を包含する。例示的な抗体フラグメントは、F (ab') 2, F (ab) 2, Fab', Fab, Fv, scFv,及び最小認識単離を包含する。本発明はまた、そのような抗体又は抗体フラグメントと特異的に結合する抗−インディオタイプ抗体も包含する。本発明はさらに、キャリヤー、及び本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗−イディオタイプ抗体を含んで成る組成物も包含する。
【００２１】
本発明はまた、Zvenポリペプチドをコードする単離された核酸分子も提供し、ここで前記核酸分子は、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子、
（ｃ）緊縮洗浄条件に続いて、配列番号１のヌクレオチド66−161のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド288〜389のヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は配列番号１のヌクレオチド66〜161又は配列番号１のヌクレオチド288〜389のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に対してハイブリダイズされたまま存続する核酸分子、
【００２２】
（ｄ）配列番号６のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸分子、
（ｆ）緊縮洗浄条件に続いて、配列番号４のヌクレオチド334〜405のヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は配列番号４のヌクレオチド334〜405のヌクレオチド配列の補体に対してハイブリダイズされたまま存在する核酸分子から成る群から選択される。
【００２３】
例示的核酸分子は、核酸分子によりコードされるアミノ酸配列と、配列番号２又は５のその対応するアミノ酸配列との間のいずれかの差異が保存性アミノ酸置換によるものであるそれらの分子を包含する。本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド132〜389、配列番号１のヌクレオチド147〜389及び配列番号４のヌクレオチド148〜405のヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を企画する。
【００２４】
本発明はまた、そのような核酸分子を含んで成るベクター及び発現ベクターを包含する。そのような発現ベクターは、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターは核酸分子により作用可能に連結され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターにより作用可能に連結される。本発明はさらに、それらのベクター及び発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞も包含する。例示的宿主細胞は、細菌、酵母、鳥類、菌類、昆虫、哺乳類及び植物細胞を包含する。そのような発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞は、前記発現ベクターを含んで成り、そしてZvenタンパク質を生成するそのような組換え宿主細胞を培養し、そして任意には、培養された組換え宿主細胞からZvenタンパク質を単離することによりZvenポリペプチドを調製するために使用され得る。本発明はさらに、そのような方法により製造される生成物も包含する。
【００２５】
さらに、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー、及びそのような発現ベクター又はそのような発現ベクターを含んで成る組換えウィルスのいずれか１つを含んで成る医薬組成物を提供する。
【００２６】
本発明はまた、（ａ）Zven1核酸プローブと、（i）生物学的サンプルから単離された試験RNA分子又は（ii）単離されたRNA分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイズする条件下で接触せしめ（ここで前記プローブは配列番号１のヌクレオチド配列の一部を含んで成るヌクレオチド配列又はその補体を有する）、そして（ｂ）核酸プローブ及び試験RNA分子又は合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出する（ここでハイブリッドの存在が生物学的サンプルにおけるZven1 RNAの存在を示す）段階を含んで成る、生物学的サンプルにおけるZven1 RNAの存在を検出するための方法も企画する。類似する方法が、生物学的サンプルにおけるZven1 RNAの存在を検出するために使用され得、ここでプローブは、配列番号４のヌクレオチド配列の一部を含んで成るヌクレオチド配列、又はその補体を有する。
【００２７】
本発明はさらに、（ａ）生物学的手サンプルと、配列番号２のアミノ酸配列から成るか、又は配列番号５のアミノ酸配列から成るポリペプチドとを接触せしめ、ここで前記接触は、生物学的サンプルへの抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われ、そして（ｂ）結合される抗体又は結合される抗体フラグメントのいずれかを検出する段階を含んで成る、生物学的サンプルにおけるZvenポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。そのような抗体又は抗体フラグメントはさらに、放射性同位体、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素ラベル、生物発光ラベル及びコロイド状金から成る群から選択された検出可能ラベルを含んで成る。
【００２８】
例示的な生物学的サンプルは、ヒト組織、例えば検死サンプル、生検サンプル、体液及び消化成分、及び同様のものを包含する。
本発明はまた、それらの検出方法を行うためのキットも提供する。Zven1遺伝子発現の検出のためのキットは、核酸分子を含んで成る容器を含んで成り、ここで前記核酸分子は、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド66〜161のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド288〜389のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、
（ｃ）核酸分子（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列の補体を含んで成る核酸分子、
（ｄ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ａ）のフラグメントである核酸分子、
（ｅ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ｂ）のフラグメントである核酸分子、
（ｆ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ｃ）のフラグメントである核酸分子、及び
（ｇ）配列番号12,13, 15,16, 17,18, 19,20, 23, 又は 24に示されるような核酸配列のフラグメントであるか又はそれらの核酸配列から成核酸分子から成群から選択される。
【００２９】
Zven2遺伝子発現の検出のためのキットは、核酸分子を含んで成る容器を含んで成り、ここで前記核酸分子は、
（ａ）配列番号４のヌクレオチド334〜405のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含んで成る核酸分子、
（ｃ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ａ）のフラグメントである核酸分子、及び
（ｄ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ｂ）のフラグメントである核酸分子から成る群から選択される。
そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２の容器も含んで成る。
【００３０】
他方では、Zvenタンパク質の検出のためのキットは、配列番号２のアミノ酸配列から成るか、又は配列番号５のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントを含んで成る容器を含んで成ることができる。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列から成るか、又は配列番号５のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントをを特異的に結合する、抗−イディオタイプ抗体又は抗−イディオタイプ抗体フラグメントにも関する。
【００３１】
本発明はさらに、少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、又は95％以上の同一性から成る群から選択された、配列番号２のアミノ酸配列と同一性を共有するアミノ配列を含んで成る変異体Zven1ポリペプチドを提供し、ここで変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列との間のいずれかの差異は、１又は複数の保存性アミノ酸置換によるものである。少なくとも70％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、又は95％以上の同一性から成る群から選択された、配列番号５のアミノ酸配列と同一性を共有するアミノ配列を含んで成る例示的変異体Zven2ポリペプチドを提供し、ここで変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号５のアミノ酸配列との間のいずれかの差異は、１又は複数の保存性アミノ酸置換によるものである。
【００３２】
本発明はまた、Zven1ポリペプチド成分又はZven2ポリペプチド成分を含んで成る融合タンパク質も提供する。そのような融合タンパク質はさらに、免疫グロブリン成分を含んで成ることができる。適切な免疫グロブリン成分は、免疫グロブリンH鎖不変領域、例えばヒトFcフラグメントである。本発明はまた、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子も包含する。
本発明は、配列番号２のアミノ酸残基23〜108のアミノ酸配列を含んで成るZven1ポリペプチドを、哺乳類対象に投与することを含んで成る、そのような処理の必要な哺乳類対象における欠陥性腸閉塞収縮性疾病の処理方法を提供する。１つの態様においては、前記疾病は、糖尿病である。もう1つの方法においては、疾病は、後−手術性腸閉塞である。もう１つの態様においては、疾病は敗血症−関連の胃腸うっ血又は腸閉塞である。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸残基23〜108のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸残基20〜105のアミノ酸配列、又は配列番号29のアミノ酸残基28〜129のアミノ酸配列を含んで成るZven1ポリペプチドを、哺乳類対象に投与することを含んで成る、そのような処理の必要な哺乳類対象における欠陥性腸閉塞収縮性疾病の処理方法を提供する。１つの態様においては、前記疾病は、糖尿病である。もう1つの方法においては、疾病は、後−手術性腸閉塞である。もう１つの態様においては、疾病は敗血症−関連の胃腸うっ血又は腸閉塞である。
【００３４】
本発明はまた、Zven1又はZven2アンタゴニストをその必要な哺乳類に投与し、腸における炎症が低められる、哺乳類の腸における炎症を低めるための方法を提供する。１つの態様においては、前記アンタゴニストは抗体である。もう１つの態様においては、アンタゴニストは、抗−イディオタイプ抗体、抗体フラグメント、キメラ抗体、及びヒト型化抗体から選択される。１つの態様においては、前記アンタゴニストは受容体であり、そして前記受容体は配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を結合する。もう１つの態様においては、前記受容体は、配列番号27又は配列番号28に記載されるようなアミノ酸配列を含んで成る。
【００３５】
もう１つの態様においては、前記アンタゴニストは受容体であり、そして前記受容体の一部は、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して特異的に結合する。もう１つの態様においては、炎症は慢性である。もう１つの態様においては、炎症は散在性である。もう１つの態様においては、前記炎症は過敏性腸症候群の症状である。もう１つの態様においては、前記炎症は炎症性腸疾患の症状である。さらなる態様においては、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎またはクローン病である。
【００３６】
本発明はまた、Zven1又はZven2アンタゴニストをその必要な哺乳類に投与し、腸における炎症が低められる、哺乳類の腸における炎症を処理するための方法を提供する。１つの態様においては、前記アンタゴニストは抗体である。もう１つの態様においては、アンタゴニストは、抗−イディオタイプ抗体、抗体フラグメント、キメラ抗体、及びヒト型化抗体から選択される。１つの態様においては、前記アンタゴニストは受容体であり、そして前記受容体は配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなアミノ酸配列を結合する。
【００３７】
もう１つの態様においては、前記受容体は、配列番号27又は配列番号28に記載されるようなアミノ酸配列を含んで成る。もう１つの態様においては、前記アンタゴニストは受容体であり、そして前記受容体の一部は、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなアミノ酸配列に対して特異的に結合する。もう１つの態様においては、炎症は慢性である。もう１つの態様においては、炎症は散在性である。もう１つの態様においては、前記炎症は過敏性腸症候群の症状である。もう１つの態様においては、前記炎症は炎症性腸疾患の症状である。さらなる態様においては、前記炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病又は下痢−傾向過敏性腸症候群である。
【００３８】
本発明はまた、配列番号１又は配列番号４のポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を検出するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を検出するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける過敏性腸症候群を検出するための方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、配列番号１又は配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を検出するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号１又は配列番号４のポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を診断するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を診断するための方法を提供する。
【００４０】
本発明はまた、配列番号２、配列番号29又は配列番号５に示されるようなポリペプチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける過敏性腸症候群を診断するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号１又は配列番号４に示されるようなポリヌクレオチド配列、又はそのフラグメントについて生物学的サンプルをスクリーニングすることを含んで成る、前記サンプルにおける炎症性腸疾患を診断するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列基28〜108、配列番号29のアミノ酸残基28〜129又は配列番号５のアミノ酸残基20〜105のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における炎症性腸疾患を処理するための方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列基28〜108、配列番号29のアミノ酸残基28〜129又は配列番号５のアミノ酸残基20〜105のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における過敏性腸症候群を処理するための方法を提供する。
本発明はまた、配列番号１又は配列番号５の核酸配列を含んで成るポリヌクレオチドを、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における過敏性腸症候群を処理するための方法を提供する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の詳細な記載の参照に基づいて明らかに成るであろう。さらに、種々の文献が下記に同定され、そしてそれらすべて引例により組込まれる。
【００４２】
２．定義：
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばDNA及びRNA）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び/又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。
【００４３】
さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００４４】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“contig ”とは、他の核酸分子に対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有する核酸分子を示す。連続した配列とは、核酸分子の全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの核酸分子を“オーバーラップ”すると言われる。
【００４５】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーRNA（mRNC）に転写される核酸分子を言及する。
【００４６】
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子が、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
【００４７】
“線状DNA”とは、遊離5’及び3’及び末端を有する非環状DNA分子を示す。線状DNAは、閉環DNA分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な破壊により調製され得る。
“相補的DNA（cDNA）”とは、逆転写酵素によりmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖DNA分子及びその相補的DNA鎖から成る二本鎖DNA分子を言及するために用語“cDNA”を用いる。用語“cDNA”はまた、RNA鋳型から生成されたcDNA分子のクローンも言及する。
【００４８】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の5’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。それらのプロモーター要素は、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化−特異的要素（DSE：McGeheeなど., Mol. Endocrinol. 7: 511 (1993)）、サイクリックのAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE：Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)）、グルココルチコイド応答要素（GRE）及び他の転写因子のための結合部位、例えばCRE/ATF（O’Reillyなど., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)）、AP2 (Yeなど., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)）、及びオクタマー因子（一般的には、Watsonなど., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Kummings Publishing Company, Inc. 1987), and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)）を包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００４９】
“コアープロモーター”は、TATAボックス及び転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
“調節要素”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織又はオルガネラにおいて独占的に又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。それらのタイプの調節要素は通常、“細胞−特異的”、“組織−特異的”、又は“オルガネラ−特異的”態様で発現される遺伝子に結合されている。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００５０】
“異種DNA”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、DNA分子又はDNA分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外来性DNA）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性DNA）に由来するDNAを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主DNAセグメントに作用可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であると思われる。逆に言えば、異種DNA分子は、外来プロモーターと作用可能に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種DNAであると思われる。
【００５１】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００５２】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“組み込まれた遺伝子要素”とは、その要素がヒト操作を通して細胞中に導入された後、宿主細胞の染色体中に組み込まれているDNAのセグメントである。本発明においては、組み込まれた遺伝子要素は通常、エレクトロポレーション又は他の技法により細胞中に導入される線状化されたプラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子要素は、元の宿主細胞からその子孫に通過される。
【００５３】
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００５４】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“作用可能に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
【００５５】
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。本明細書においては、組換え宿主の例は、発現ベクターからZven1又はZven2ペプチド又はポリペプチドを生成する細胞である。対照的に、そのようなポリペプチドは、Zven1又はZven2の“天然源”であり、そして発現ベクターを欠いている細胞により生成さえ得る。
“インテグレイティブ組換え体”は、異種DNAが細胞ゲノムDNA中に組み込まれるようになる組換え宿主細胞である。
【００５６】
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスを結合するポリペプチドにより融合されるZven1又はZven2ポリペプチドの少なくとも一部を含んで成る。そのような融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーを用いて、多量のZven1又はZven2を単離するための手段を提供する。
【００５７】
用語“受容体”とは、“リガンド”と称する生物活性分子に結合する、細胞結合されたタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を介在する。受容体は、膜結合されたシトソール又は核；モノマー（例えば、胸腺刺激性ホルモン受容体、β−アドレナリン作用受容体）又はマルチマー（例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体IL−３受容体、GM−CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポエチン受容体及びIL−６受容体）であり得る。膜結合された受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多−ドメイン構造により特徴づけられる。一定の膜結合された受容体においては、細胞外リガンド−結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含んで成る別々のポリペプチドに位置する。
【００５８】
一般的に、受容体へのリガンドの結合は、細胞の代謝における変更を導く、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体のコンホメーション変化をもたらす。受容体−リガンド相互作用にしばしば連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMPを生成の上昇、細胞カルシウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を包含する。
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００５９】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％以上の純度、又は99％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００６０】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はmRNAへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を包含する。
【００６１】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語“イムノモジュレータ−”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時−刺激分子、造血因子及びそれらの分子の合成類似体を包含する。
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプテン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０9Ｍ-1の結合親和性を有する。
【００６３】
“抗−イディオタイプ抗体”とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書においては、抗−イディオタイプの抗体は、抗−Zven1又は抗−Zven2抗体の可変領域と結合し、そして従って、抗−イディオタイプ抗体はZven1又はZven2のエピトープを模倣する。
“抗体フラグメント”は、抗体の一部、例えばF(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Aab及び同様のものである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損なわれていない抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗−Zven1モノクローナル抗体フラグメントは、Zven1のエピトープと結合する。
【００６４】
用語“抗体フラグメント”はまた、特定の抗原に結合する、合成の又は遺伝的に構築されたポリペプチド、例えばL鎖可変領域から成るポリペプチド、H及びL鎖の可変領域から成る“Fv”フラグメント、L及びH鎖可変領域がペプチドリンガーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（“svFvタンパク質”）、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を包含する。
“キメラ抗体”は、囓歯動物抗体に由来する種々のドメイン及び相補的決定領域を含む組換えタンパク質であるが、ところが抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
“ヒト型化抗体”は、モノクローナル抗体のネズミ相補的決定領域がネズミ免疫グロブリンのH及びL可変鎖からヒト可変ドメインに移行されている組換えタンパク質である。
【００６５】
“検出できるラベル”は、診断のために有用な分子を生成するために抗体成分に接合され得る分子又は原子である。検出できるラベルの例は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン又は他のマーカー成分を包含する。
用語“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００６６】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,  EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など.,  Methods  Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlagTM ペプチド（Hoppなど.,  Biotechnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein  Expression  and  Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードする核酸分子は、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
【００６７】
“裸の抗体”は、抗体フラグメントに対立するものとして、治療剤により接合されない完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びに一定の組換え抗体、例えばキメラ性及びヒト型化抗体を包含する。
本明細書において使用される場合、用語“抗体成分”は、完全な抗体及び抗体フラグメントの両者を包含する。
“標的ポリペプチド”又は“標的ペプチド”は、少なくとも１つのエピトープを含み、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞、又は感染剤抗原を担持する細胞上で発現されるアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに、主要組織適合性複合体分子により提供されるペプチドエピトープを認識し、そして典型的には、標的細胞を溶解し、又は標的細胞の例に他の免疫細胞を補充し、それにより標的細胞を殺害する。
【００６８】
“抗原性ペプチド”は、T細胞により認識されるMHC−ペプチド複合体を形成するために、主要組織適合複合体分子を結合し、それにより、T細胞への提供に基づいて細胞毒性リンパ球応答を誘発するペプチドである。従って、抗原性ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、そして細胞毒性T細胞応答、例えば抗原を結合するか又は発現する標的細胞に対する細胞溶解又は特異的サイトカイン開放を誘発することができる。抗原性ペプチドは、抗原提供細胞又は標的細胞上に、クラスI又はクラスII主要組織適合性複合体分子に関して結合され得る。
【００６９】
真核生物においては、RNAポリメラーゼIIは、mRNAを生成するために構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子はRNAポリメラーゼII鋳型を含むより企画され、ここでRNA転写体は特定のmRNAの配列に対して相補的である配列を有する。RNA転写体は、“アンチセンスRNA”と呼ばれ、そしてアンチセンスRNAをコードする核酸分子は“アンチセンス遺伝子”と呼ばれる。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合することができ、mRNA翻訳の阻害をもたらす。
【００７０】
“Zven1に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“Zven1アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）Zven1遺伝子の一部と共に安定した三量体を形成できるか、又は（ｂ）Zven1遺伝子のmRNA転写体の一部と共に安定した二量体を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。同様に、“Zven2に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“Zven2アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）Zven2遺伝子の一部と安定した三量体を形成することができるか、又は（ｂ）Zven2遺伝子のmRNA転写体の一部と安定した二量体を形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
“リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己分解性RNA及びそれらの触媒機能を行う核酸分子を包含する。
“外部案内配列”は、細胞内mRNAの特定種に内因性リボザイム、すなわちRNアーゼPを方向づけ、RNアーゼPによるmRNAの分解をもたらす核酸分子である。外部案内配列をコードする核酸分子は、“外部案内配列遺伝子”と呼ばれる。
【００７２】
用語“変異体Zven1遺伝子”は、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。そのような変異体は、天然に存在する多型現象のZven1遺伝子、及び配列番号２のアミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を含む合成遺伝子を包含する。Zven1遺伝子の追加の変異体形は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の挿入又は欠失を含む核酸分子である。変異体Zven1遺伝子は、その遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその補体と、緊縮条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定され得る。同様に、変異体Zven2遺伝子及び変異体Zven2ポリペプチドは、それぞれ配列番号４及び５に関して同定され得る。
【００７３】
他方では、変異体Zven遺伝子は、配列−比較により同定さえ得る。２つのアミノ酸配列は、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の応答により整列される場合、同じである場合、“100％のアミノ酸配列同一性”を有する。配列比較は、標準のソフトウェアプログラム、例えばDNASTAR（Madison, Wisconsin）により製造されるLASERGENE生物情報コンピューターサイトに包含されるそれらのプログラムを用いて行われ得る。最適な整列を決定することによって、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に良く知られている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu など. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins.” In Methods in Gene Biotechnology, Pages 123-151 (CRC Press. Inc. 1997), 及びBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998) を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法は下記に記載される。
【００７４】
変異体Zven1遺伝子又は変異体Zven1ポリペプチドを同定するために使用される特定方法にかかわらず、変異体遺伝子にコードされる変異体遺伝子又はポリペプチドは、抗−Zven1抗体に対して特異的に結合するその能力により特徴づけられ得る。同様に、変異体Zven2遺伝子生成物又は変異体Zven2ペプチドは、抗−Zven2抗体に対して特徴的に結合するもの能力により特徴づけられる。
【００７５】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされたポリペプチドにおける変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００７６】
用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（paralogs）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００７７】
本発明は、Zven1及びZven2遺伝子の機能的フラグメントを包含する。本発明においては、Zven1（又はZven2）遺伝子の“機能的フラグメント”は、抗−Zven1（抗−Zven2）抗体と特異的に結合する、Zven1（又はZven2）ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を言及する。
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”X又は“およそ”Xとして表される場合、Xの言及された値は、±10％で正確であると理解されるであろう。
【００７８】
３．ヒトZven1及びZven2遺伝子の生成：
ヒトZven1遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１に基づいてのポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。同様に、ヒトZven2遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号４に基づいてのポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。それらの技法は、標準であり、そして十分に確立されている。
【００７９】
例示されるように、ヒトZven1遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトcDNAライブラリーから単離され得る。この場合、第１段階は、当業者に良く知られている方法を用いて、例えば組織、例えば精巣又は末梢血液リンパ球からRNAを単離することによって、cDNAライブラリーを調製することである。一般的に、RNA単離技法は、細胞を分解するための方法、RNAのRNアーゼ指図された分解を阻害するための手段、及びDNA、タンパク質及び多糖類汚染物からRNAを分離する方法を提供すべきである。
【００８０】
例えば、全RNAは、液体窒素において組織を凍結し、その凍結された組織を乳針及び乳棒により粉砕し、細胞を溶解し、フェノール/クロロホルムの溶液により前記粉砕された組織を抽出し、タンパク質を除き、そして塩化リチウムによる選択的沈殿によりRNAを残る不純物から分離することによって単離され得る（例えば、Ausubel など., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition pages4-1〜4-6  (John Wiley& Sons 1995 )[“Ausubel (1995)”]; Wuなど., Methods in Gene Biotechnology, pages33-41 (CRC Press, Inc. 1997 ) [“Wu(1997)”]を参照のこと）。他方では、全RNAは、粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートにより抽出し、有機溶媒により抽出し、そしてRNAを汚染物から示差遠心分離により分離することによって単離され得る（例えば、Chirgwinなど., Biochemistry 18: 52 (1979); Ausubel (1995) P.4-1〜4-6; Wu (1997) P.33-41 を参照のこと）。
【００８１】
cDNAライブラリーを構成するために、ポリ(A)+RNAが全RNA調製物から単離されるべきである。ポリ(A)+RNAは、オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィーの標準技法を用いて、全RNAから単離され得る（例えば、Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad.Sci. USA69: 1408 (1972); Ausubel (1995) P. 4-11〜4-12を参照のこと）。
【００８２】
二本鎖cDNA分子は、当業者に良く知られている技法を用いて、ポリ(A)+RNAから合成される（例えば、Wu (1997) P.41-46を参照のこと）。さらに、市販のキットが、二本鎖cDNA分子を合成するために使用され得る。例えば、そのようなキットは、Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) 及びSTRATAGENE (La Jolla, CA) から入手できる。
種々のクローニングベクターが、cDNAライブラリーの構成のために適切である。例えば、cDNAライブラリーは、バクテリオファージに由来するベクター、例えばλgt10バクターにおいて調製され得る。例えば、Huynhなど., “Construction and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λ11” in DNA Cloning: A Practica Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) at pages 47-52 を参照のこと。
【００８３】
他方では、二本鎖cDNA分子は、プラスミドベクター、例えばPBLUESCRIPTベクター（STRATAGENE；La Jolla, CA）, LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) 又は他の市販のベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、American Type Culture Collection (Manassas. VA) から入手できる。
クローン化されたcDNA分子を増幅するために、cDNAライブラリーが、標準技法を用いて、原核宿主中に挿入される。例えば、cDNAライブラリーは、例えばLife Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) から得られるコンピテントE.コリDH5細胞中に導入され得る。
【００８４】
ヒトゲノムライブラリーは、当業界において良く知られている手段により調製され得る（例えばAusubel (1995) p. 5-1〜5-6; Wu (1997) p. 307-327を参照のこと）。ゲノムDNAは、界面活性剤Sarkosylにより組織を溶解し、その溶解物をプロテイナーゼKにより消化し、不溶性残骸を溶解物から遠心分離により清浄し、イソプロパノールを用いて溶解物から核酸を沈殿し、そして塩化セシウム密度グラジエント上で再懸濁されたDNAを精製することによって単離され得る。
【００８５】
ゲノムライブラリーの生成のために適切であるDNAフラグメントは、ゲノムDNAのランダム剪断により、又は制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNAの部分消化により得られる。ゲノムDNAフラグメントは、従来の技法、例えば適切な末端を供給するために制限酵素消化の使用、DNA分子の所望しない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処理の使用、及び適切がリガーゼによる連結に従って、ベクター、例えばバクテリオファージ又はコスミドベクター中に挿入され得る。そのような操作のための技法は当業界において良く知られている（例えば、Ausubel (1995) p. 5-1〜5−6; Wu (1997) p. 307-327 を参照のこと）。
【００８６】
ヒトZven1又はZven2遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書に記載されるヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーによるポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いて得られる。PCRによるライブラリーのスクリーニングの一般的方法は、例えば、Yuなど., “Use of The Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries”. In Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Application, White (ed.), p.211-215 (Humana Press, Inc. 1993)により提供される。さらに、関連する遺伝子を単離するためへのPCRの使用の技法は、例えばPreston, “Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols; Current Metods and Applications. White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993) により記載される。
【００８７】
他方では、ゲノムライブラリーは、市販源、例えばResearch Genetic (Huntsville, AL) 及びATCC (Marassas, VA) から得られる。
cDNA又はゲノムクローンを含むライブラリーは、標準方法を用いて、配列番号１に基づかれる１又は複数のポリヌクレオチドプローブによりスクリーンされ得る（例えば、Ausubel (1995) p. 6-1〜6-11を参照のこと）。
【００８８】
下記のようにして生成された抗−Zven抗体はまた、cDNAライブラリーからのZven遺伝子をコードするDNA配列を単離するためにも使用され得る。例えば、抗体はλgt11発現ライブラリーをスクリーンするために使用され、又は抗体はハイブリッド選択及び翻訳に続くイムノスクリーニングのために使用され得る（例えば、Ausubel（1995）p.6-12〜6-16; Margolis など., “Screening λ expression libraries with untibody and Protein Probes” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など (eds.) p. 1-14 (Oxford University Press 1995) を参照のこと）。
【００８９】
他に、Zven遺伝子は、お互いプライムする長いオリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載されるヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することによって得られる（例えば、Ausubel (1995) p.8-8〜8-9を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応を用いての確立された技法は、少なくとも２kbの長さのDNA分子を合成する能力を提供する（Adang など., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993). Bambot など., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dilfon など., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Constrauction of Synthetic Genes,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. White (ed.), Pages 263-268. (Humana Press. Inc. 1993), 及びHolowachukなど., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)）。
【００９０】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミジット方法のようなプロトコールを用いて、“遺伝子機会”により合成され得る。化学的に合成される二本鎖DNAが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のような用途のために必要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（60〜80の塩基対）の生成は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、長い遺伝子（300以上の塩基対）の生成に関しては、化学的DNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、特殊な手段が必要とされる。
【００９１】
この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュラー形でアセンブルされる。ポリヌクレオチド合成の再考のためには、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura など., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), などClimie など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990) を参照のこと。
【００９２】
Zven cDNA又はZvenゲノムフラグメントの配列は、標準の方法を用いて決定され得る。本明細書に開示されるZvenポリヌクレオチド配列はまた、Zven遺伝子の5’側の非−コード領域をクローン化するためのプローブ又はプライマーとして使用され得る。Zven遺伝からのプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子治療を受けている患者の組織において異種遺伝子の発現を方向づけるために使用され得る。Zvenプロモーター又は調節要素を含むゲノムフラグメントの同定は、十分に確立された技法、例えば欠失分析を用いて達成され得る（一般的には、Ausubel (1995) を参照のこと）。
【００９３】
5’側フランギング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第5,641,670号に開示される方法に従って、“遺伝子活性化”によるZvenタンパク質の生成を促進する。手短くに言及すれば、細胞における内因性Zven遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、及び対になっていないスプライスドナー部位を含んで成るDNA構造体を、Zven遺伝子座中に導入することによって変更される。標的配列は、内因性Zven遺伝子座を有する構造体の相同組換えを可能にするZven 5’側非コード配列であり、それにより、前記構造体内の配列は内因性Zvenコード配列により作用可能に連結されるようになる。この場合、内因性Zvenプロモーターが、他の調節は列により置換されるか又はそれにより補充され、増強された組織特異的、又は他方では、調節された発現が提供される。
【００９４】
４．変異体の生成：
本発明は、本明細書に開示されるZvenポリペプチドをコードする種々の核酸分子、例えばDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３及び６は、それぞれ配列番号２及び５のZvenポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者は、配列番号３の縮重配列がまた、Tに代わってUを置換することによって、それぞれ配列番号２をコードするすべてのRNA配列を提供し、そして配列番号６の縮重配列がまた、Tに代わってUを置換することによって、それぞれ配列番号５をコードするすべてのRNA配列を提供することを認識するであろう。
【００９５】
従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド66−389、及びそれらのRNA同等物を含んで成るZvenポリペプチド−コード核酸分子、及び配列番号４のヌクレオチド91−405、及びそれらのRNA同等物を含んで成るZvenポリペプチド−コード核酸分子を企画する。
表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３及び６内に使用される1文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードYはC又はTのいずれかを示し、そしてその相補体RはA又はGを示し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
【００９６】
【表１】
2006514683.tif 000002
【００９７】
所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号３及び６に使用される縮重コドンが表２に示される。
【００９８】
【表２】
2006514683.tif 000003
【００９９】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２及び５のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【０１００】
異なった種は“選択的コドン使用法”を示すことができる。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980; Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 199６;  Wain−Hobson、など.,Gene  13：355−64，1981；Grosjean  and  Fiera，Gene  18：199−209、1982；Holm,Nuc．Acids  Res．14：3075−87、1986；Ikemura，Ｊ．Mol．Biol．158：573−97，1982、Sharyp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494(1995), 及びMakrides, Microbiol. Rev. 60: 512(1996) を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(表２を参照のこと)。
【０１０１】
例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったThrコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【０１０２】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物を表すポリペプチド及び核酸分子を供給する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのZvenポリペプチドである。ヒトZvenのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃDNAは、Zvenを発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のmRNAから調製される。
【０１０３】
Zven−コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示される代表的なヒトZven配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応によりクローン化され得る。さらなる方法においては、cDNAライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDNAの発現がZvenポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離に適用され得る。
【０１０４】
当業者は、配列番号１及び４に開示される配列がそれぞれヒトZven1及びZven2の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【０１０５】
配列番号１及び４に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２及び５の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の範囲内である。Zvenポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから生成されるcDNA分子は、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【０１０６】
本発明の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。例えば、そのような核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、配列番号１のヌクレオチド66〜161のヌクレオチド配列から成る核酸分子、配列番号１のヌクレオチド288〜389のヌクレオチド配列から成る核酸分子、配列番号４のヌクレオチド配列から成る核酸分子、配列番号４のヌクレオチド334〜405のヌクレオチド配列から成る核酸分子、又はそのような配列の補体であるヌクレオチド配列から成る核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。
【０１０７】
１対の核酸分子、例えばDNA-DNA, RNA-RNA及びDNA-RNAは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのTmは、１〜1.5％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（Tm）よりも約５〜25℃低い温度、及び１MまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。
【０１０８】
より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのTmを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、20〜70℃の温度、及び６×SSC及び０〜50％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。高い程度の緊縮性は、40〜70℃の温度で及び４×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。高い緊縮条件は典型的には、42〜70℃の温度、及び１×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【０１０９】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのTmは、標的配列の50％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下での）である。Tmに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【０１１０】
Tmを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのDNA、RNA及びDNA−RNAハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1988)； Ausubel など., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照のこと）。
【０１１１】
配列分析ソフトウェア、例えばOLIGO6.0（LSR; Long Lake, MN）及びPrimer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてTmを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、50以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたTmよりも約20〜25℃低い温度で行われる。50以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Tm又はそれよりも５〜10℃以下で行われる。これは、DNA−DNA及びDNA−RNAハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１１２】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼす。小さなプローブ配列、すなわち50個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベーション時間（およそ分〜時）が、ハイブリッド形成を達成するために使用され得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコット時間の３倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により、特定の配列について計算され得る。
【０１１３】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもたらし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。A−T対は、塩化ナトリウムを含む水溶液においてG−C対よりも低い安定性である。従って、G−C含有率が高いほど、ハイブリッドはより安定する。配列内のG及びC残基の平等な分布がまた、ハイブリッド安定性に正に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のTmを変えるために操作され得る。例えば５−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンはTmを高めるためにチミジンにより置換され、そして７−デアズ−2’−デオキシグアノシンは、Tmに対する依存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブッリドの安定性に影響お及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばDenhardt溶液（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）、変性されたサケ精子DNA、粉乳（BLOTTO）、ヘパリン又はSDS、及びNa+源、例えばSSC（１×SSC：0.15：NのNaCl、15mMのクエン酸ナトリウム）又はSSPE（１×SSPE：1.8MのNaCl、10mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.7）を含む。典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、10mM〜１MのNa+を含む。不安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリッドのTmを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、50％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる場合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【０１１５】
例示のように、変異体Zven1ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子により、50％ホルムアミド、５×SSC（１×SSC:0.15Mの塩化ナトリウム及び15mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×Denhardt’s 溶液（100×Denhardt’s 溶液：２％（w/v）のFicoll 400, 2% (w/v)のポリビニルピロリドン及び２％（w/v）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μg/mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【０１１６】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc. からのEXPRESSHYB Hybridization Solution），そしてハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.5×〜２×SSC溶液による55〜６５％での洗浄を包含する。例えば、変異体Zven1ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド66−161のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド288−389、又はそれらの補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、55〜65℃での、0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液、例えば５５℃での、0.1％SDSを含む0.5×SSC溶液、又は65℃での0.1％SDSを含む２×SSC溶液に等しい。
【０１１８】
類似する態様で、変異体Zven2変異体をコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号４のヌクレオチド334−405のヌクレオチド配列、又はその補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、55〜65℃での、0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液、例えば５５℃での、0.1％SDSを含む0.5×SSC溶液、又は65℃での0.1％SDSを含む２×SSC溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるSSCをSSPEにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【０１１９】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、50〜65℃での0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.1×〜0.2×SSCの溶液による洗浄を包含する。例示されるように、変異体Zven1ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド66−161のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド288−389のヌクレオチド配列、又はそれらの補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、50〜６５℃での、0.1％SDSを含む0.１×〜0．２×SSC溶液、例えば５0℃での、0.1％SDSを含む0.1×SSC溶液、又は６５℃での0.1％SDSを含む0.２×SSC溶液に等しい。同様に、変異体Zven2変異体をコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号４のヌクレオチド334−405のヌクレオチド配列、又はその補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、50〜６５℃での、0.1％SDSを含む0.１×〜0．２×SSC溶液、例えば５0℃での、0.1％SDSを含む0.1×SSC溶液、又は６５℃での0.1％SDSを含む0.２×SSC溶液に等しい。
【０１２０】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたZven1ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれらのオルト体に対して少なくとも85％、90％、95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。同様に、本発明はまた、配列番号５で示される配列又はそのオルト体に対して85％、90％、95％又は95％以上の配列同一性を有する単離されたZven2ポリペプチドも提供する。
【０１２１】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得るZven変異体核酸分子を企画する：配列番号２又は５のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。例えば、あるZven1遺伝子変異体は、（１）55〜65℃での0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド66−161のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド288−389のヌクレオチド配列、又はそれらの補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して85％、90％、95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。他方では、Zven1変異体は、（１）50〜65℃での0.1％SDSを含む0.1×〜0.2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド66−161のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド288−389のヌクレオチド配列、又はそれらの補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して85％、90％、95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１２２】
さらに、あるZven2遺伝子変異体は、（１）55〜65℃での0.1％SDSを含む0.5×〜２×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号４のヌクレオチド334−405のヌクレオチド配列、又はその補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号５のアミノ酸配列に対して85％、90％、95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。他方では、Zven2変異体遺伝子は、（１）50〜65℃での0.1％SDSを含む0.1×〜0.2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号４のヌクレオチド334−405のヌクレオチド配列、又はその補体から成る核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号５のアミノ酸配列に対して85％、90％、95％又は95％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１２３】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“BLOSUM62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：（［同一の適合するものの合計数］／[より長い配列の長さ＋  ２種の配列を整合するためにそのより長い配列中に導入されるギャップの数]）（100）。
【０１２４】
【表３】
2006514683.tif 000004
【０１２５】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示される１つのアミノ酸配列及び推定上のZven1又はZven2変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載される。
【０１２６】
手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１である場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。“カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
【０１２７】
最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。FASTA 分析のための好ましいパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギャップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, Meth. Eizzymol. 183 : 63 (1990)に説明されるように、評点マトリックス ファイル("SMATRIX")を調節することによってFASTAプログラム中に導入され得る。
【０１２８】
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は、上記に設定される他のパラメーターを伴なって、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。他のパラメーターは、次の通りに設定され得る：ギャップ開放ペナルティー＝10、及びギャップ延長ペナルティー＝１。
【０１２９】
本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。例えば、配列番号２又は５の１又は複数のアミノ酸置換を含む変異体が得られ、ここでアルキルアミノ酸がZven1又はZven2アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に代わって置換され、芳香族アミノ酸がZven1又はZven2アミノ酸における芳香族アミノ酸に代わって置換され、硫黄含有アミノ酸がZven1又はZven2アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に代わって置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸Zven1又はZven2アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に代わって置換され、酸性アミノ酸がZven1又はZven2アミノ酸配列における酸性アミノ酸に代わって置換され、塩基性アミノ酸がZven1又はZven2アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に代わって置換され、又は二塩基性モノカルボン酸アミノ酸がZven1又はZven2アミノ酸配列における二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に代わって置換される。
【０１３０】
通常のアミノ酸の中で、“保存性アミノ酸置換”は、次のグループの個々内のアミノ酸間の置換により示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。
【０１３１】
BLOSUM62表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ］。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。単に化学的性質に基づいてのアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記で論じられたように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【０１３２】
Zven1又はZven2の特定の変異体が、その対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２又は５）に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％又は95％以上の配列同一性を有することによって特徴づけられ、ここでアミノ酸配列の変動は、１又は複数のアミノ酸置換による。
Zven1及びZven2遺伝子における保存性アミノ酸変化が、それぞれ、配列番号１及び４のいずれか１つに列挙されるヌクレオチドに代わってヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図された突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いての突然変異誘発及び同様の方法により得られる（Ausubel（1995）pages8-10〜8-22; 及びMcPhrson（ed.）, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) を参照のこと）。
【０１３３】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３,３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。
【０１３４】
例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09, 1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。
【０１３５】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991−98, 1996 )。 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 1993)。
【０１３６】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Zvenアミノ酸により置換され得る。
アミノ酸配列分析は、Zven1及びZven2がいくつかのモチーフを共有することを示す。例えば、１つのモチーフは、“AVITGAC [DE][KR]D”（配列番号８）であり、ここで所定の位置についての許容できるアミノ酸は、角型括弧内に示される。このモチーフは、配列番号２のアミノ酸残基28−37でのZven1、及び配列番号５のアミノ酸残基20−29でのZven2において存在する。もう１つのモチーフは、“CHP [GL] [ST] [HR] KVPFFX [KR] RXHHTCPCLP”（配列番号９）であり、ここで所定の位置についての許容できるアミノ酸は角型括弧内に示され、そして“X”はいずれのアミノ酸残基ででもあり得る。このモチーフは、配列番号２のアミノ酸残基68−90でのZven1、及び配列番号５のアミノ酸残基60−82でのZven2において存在する。本発明はそれらのモチーフを含んで成るペプチド及びポリペプチドを包含する。
【０１３７】
配列分析はまた、Zven1及びZven2がお互いに関して種々の保存性アミノ酸置換を包含することを示す。従って、特定のZven1変異体は、Zven2配列と調和する１又は複数のアミノ酸置換を包含するようその配列を修飾することによって企画され得、そして特定のZven1変異体は、Zven1配列と調和する１又は複数のアミノ酸置換を包含するようその配列を修飾することによって企画され得る。そのような変異体は、Zven1及びZven2に見出される典型的な保存性アミノ酸置換を提供する表４を用いて構成され得る。Zven1及びZven2変異体はいずれかの数のアミノ酸置換により企画され得るが、ある変異体は、少なくとも約Xのアミノ酸置換（Xは、2, 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18及び20から成る群から選択される）を包含するであろう。
【０１３８】
【表４】
2006514683.tif 000005
【０１３９】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991）, Coombs and Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering” ,in Proteins: Analysis and Design, Angeletti(ed.) Ppages 259-311(Academic Press, Inc. 1998))。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性、例えば抗体を結合する能力について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
【０１４０】
Zven1又はZven2受容体結合ドメインの位置はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造体の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Ves など., Science 255: 306 (1992), Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), 及びWlodaver など., FEBS Lett. 309:59 (1992) を参照のこと。さらに、ビオチン又はFITCによりラベルされたZven1又はZven2は、Zven1又はZven2の発現クローニングのために使用され得る。
【０１４１】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。
【０１４２】
開示されるZven1又はZven2ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1994及びWIPO公開WI97／20078により開示されるように、DNA  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNA分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１４３】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。生物学的に活性のポリペプチド又は抗−Zven1又は抗−Zven2抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１４４】
本発明はまた、Zven1又はZven2ポリペプチドの“機能的フラグメント”及びそのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。核酸分子の通常の欠失分析は、Zven1又はZven2ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１のヌクレオチド配列を有するDNA分子は、一連の欠失を得るためにBal3 Tヌクレアーゼにより消化され得る。次に、フラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そして細胞−細胞相互作用について、又はZven抗体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための1つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するフラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、Zven遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【０１４５】
機能的ドメインを同定するための方法は、当業者に良く知られている。例えば、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に基づいての研究が、Horisberger and Di Marco, pharmac. Ther. 66: 507 (1995) により要約されることにより例示される。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばTreulterなど., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993), Content など., “Expression and preliminary deletion analysisi of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon”, in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), Pages 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, “The EGF Enzyme”, in Cortrol of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton など., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985), Counailleau など., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga など., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi など., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); 及びMeiselなど., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996)により記載される。
【０１４６】
本発明はまた、配列番号２又は５のアミノ配列に比較して、アミノ配列変化を有するZven1又はZven2遺伝子の機能的フラグメントも企画する。変異体Zven遺伝子は、上記のように、開示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造体に基づいて同定され得る。構造体に基づいて変異体遺伝子を同定するもう１つのアプローチは、可能性ある変異体Zven1又はZven2遺伝子をコードする核酸分子が、上記のように、上記で論じられたように、配列番号１又は４のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができるかどうかを決定することである。
【０１４７】
本発明はまた、本明細書に記載されるZven1又はZven2ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る。（例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad Sci. USA81: 3988, 1983を参照のこと）。
【０１４８】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてそのようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Sutcliffeなど., Science 219: 660, 1983を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。
【０１４９】
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは配列番号２又は５のアミノ酸配列の少なくとも４〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜15個のアミノ酸、又は約15〜約30個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Zven1又はZven2ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 及びCortese など., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996を参照のこと）。
【０１５０】
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana Press, Inc., 1992), Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-84 (Cambridge University Press 1995), 及びColigan など. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons, 1997)により記載される。
【０１５１】
変異体Zven1又はZven2遺伝子の特定ヌクレオチド配列にかかわらず、前記遺伝子は、抗−Zven1又は抗−Zven2抗体に対して特異的に結合するその能力により特徴付けられ得るポリペプチドをコードする。
【０１５２】
上記の使用の他に、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、遺伝子学及び分子生物学、タンパク質化学及び抗体生成及び分析に関連する過程のための実験室用実施キットにおける教育手段として有用である。そのユニークなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、Zven1又はZven2の分子は試験目的のための標準として、又は“未知のもの”として使用され得る。例えば、Zven1又はZven2ポリヌクレオチドは、Zven1又はZven2が発現されるべき遺伝子である、融合構成体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構成体をいかにして調製するか、生徒に教授するための；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ分解部位の決定のための；組織におけるZven1又はZven2ポリヌクレオチドのmRNA及びDNA局在化の決定のための（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；及び核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定のための助剤として使用され得る。例示として、学生は、配列番号１のヌクレオチド66−389のヌクレオチド配列から成る核酸分子のPstII消化が約123塩基対及び201塩基対の２種のフラグメントを提供し、そしてHaeIII消化が約46塩基対、及び278塩基対のフラグメントを生成することを見出すであろう。
【０１５３】
Zven1又はZven2ポリペプチドは、抗体の調製の教授のための；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定のための；タンパク質精製のための；発現される合計タンパク質に対する比率としての発現されるZven1又はZven2ポリペプチドの重量を決定するための；ペプチド分解部位の同定のための；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリングのための；アミノ酸配列分析のための；及び天然及び標識されたタンパク質の両者の生物学的活性（すなわち、プロテアーゼ阻害）のインビトロ及びインビボでのモニターのための助剤として使用され得る。例えば、学生は、エンドペプチダーゼLys Cによるグリコシル化されていないZven1の消化が148, 4337, 1909, 2402及び2939のおおよその分子量を有する５種のフラグメントを生成し、そしてBNPS又はNCS/ウレアによるグリコシル化されていないZven1の消化が5231及び6444のおおよその分子量を有するフラグメントを生成することを見出すであろう。
【０１５４】
Zven1又はZven2ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、特に４種のαヘリックスのコンホメーションを決定するために質量分光学、円二色性を、原子的に詳細に立体構造を決定するためにX−線結晶学を、溶液でのタンパク質の構造を表すために核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、Zven1又はZven2を含むキットは、分析する学生に与えられ得る。アミノ酸配列は教授によっては知られているので、すなわちタンパク質は、学生の熟練を決定するか、又は学生の熟練を開発するための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか又はしなかったかを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、Zven1又はZven2の教育学的利用性はそれ自体ユニークであろう。
【０１５５】
Zven1又はZven2に対して特異的に結合する抗体は、Zven1又はZven2を精製するために親和製クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを、学生に教授するための教授助剤として、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するための教授助剤として、及び従って、ヒト型化抗体をいかにして企画するか、学生を教授するための実習課目として使用され得る。Zven1又はZven2遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージングされ、そして学生が分子生物学の熟練を得るために教育機関に市販されている。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。Zven1又はZven2遺伝子ポリペプチド又は、抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内にあると思われる。
【０１５６】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのZvenポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のZven1又はZven2変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号１、２、３、４、５及び６の少なくとも1つの配列を提供するデータ構造によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【０１５７】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライブ、ランダムアクセス記憶（RAM）チップ、フロッピー（商標）ディスク、デジタルリニアーテープ（DLT）、ディスクカーシ及びZIPディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、CD−読み取りのみ記憶（ROM）、CD−再書き込みできる（RW）及びCD−再記録できる）、及びデジタル可転性/ビデオディスク（DVD）（例えば、DVD−ROM, DVD−RAM及びDVD＋RW）により例示される。
【０１５８】
５．Zven融合タンパク質の生成：
Zvenの融合タンパク質は、組換え宿主においてZvenポリペプチド又はペプチドを発現するために、そして発現されたZvenポリペプチド又はペプチドを単離するために使用され得る。１つのタイプの融合タンパク質は、組換え宿主細胞からのZvenポリペプチドを案内するペプチドを含んで成る。Zvenポリペプチドを、真核細胞の分泌経路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、Zven発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列はZven1又はZven2に由来するが、適切なシグナル配列はまた、もう１つの分泌されたタンパク質から誘導されるか、又は新たに合成され得る。
【０１５９】
分泌シグナル配列は、Zven1又はZven2−コード配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるヌクレオチド配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
【０１６０】
Zven1又はZven2、又は哺乳類細胞により生成されるもう１つのタンパク質（例えば、アメリカ特許第5,641,655号に記載されるような組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子シグナル配列）は、組換え哺乳類宿主におけるZven1又はZven2の発現のために有用であるが、酵母シグナル配列は、酵母細胞における発現のために有用である。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母対合現象α−因子（MFα１遺伝子によりコードされる）、インバーターゼ（SUC2遺伝子によりコードされる）又は酸性ホスファターゼ（PHO遺伝子によりコードされる）に由来するそれらのものである。例えば，Romanos など., “Expression of Cloned Genes in Yeast” in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), p.123-167 (Oxford University Press 1995) を参照のこと。
【０１６１】
細菌細胞においては、毒性を低め、安定性を高め、そして発現されたタンパク質の回収性を高めるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現することが、しばしば所望される。例えばZven1又はZven2は、グルタチオンS−トランスフェラーゼポリペプチドを含んで成る融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンS−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には、可溶性であり、そして固定されたグルタチオンカラム上でE. コリ融解物から容易に精製できる。類似するアプローチにおいては、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含んで成るZven1又はZven2融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより単離され得、そして切断されたタンパク質A遺伝子のC−末端を含んで成る融合タンパク質は、IgG−セファロースを用いて精製され得る。
【０１６２】
細菌細胞において異種ポリペプチドを、融合タンパク質として発現するために確立された技法は、Williamsなど., “Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies”, in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), p.15-58 (Oxford University Press 1995) により記載される。さらに、市販の発現システムが利用できる。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム（Promega Corporation, Madison, WI）は、アビジンを含んで成る樹脂により、発現の間、ビオチニル化されるポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０１６３】
原核又は真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、ポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、c-myc標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質P, RYIRS 標識（抗−RYIRS抗体と結合する）、Gln−Gln標識及びFLAG標識（抗−FLG抗体と結合する）を包含する。例えば、Luoなど., Srch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti など., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 及びZhengなど., Gene 186: 55 (1997) を参照のこと。そのようなペプチド標識コードする核酸分子は、例えばSigma−Aldrich Corporation (St. Louis, MO) から入手できる。
【０１６４】
もう1つの形の融合タンパク質は、Zven1又はZven2ポリペプチド、及び２又は３個の複領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが、しかし可変領域を欠いている免疫グロブリンH鎖不変領域、典型的なFcフラグメントを含んで成る。例示のように、Chang など., (アメリカ特許第5,723,125号) は、ヒトインターフェロン及びヒト免疫グロブリンFcフラグメントを含んで成る融合タンパク質を記載する。インターフェロンのC−末端は、ペプチドリンカー成分によりFcフラグメントのN−末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性であるT細胞不活性配列を主に含んで成るペプチドである。
【０１６５】
典型的なペプチドリンカーは、アミノ酸配列：GGSGG SGGGG SGGGG S (配列番号７) を有する。融合タンパク質においては、好ましいFc成分は、溶液において安定性であり、そして活性を活性化する補体をほとんど有さないか又は完全に有さないヒトγ鎖である。従って、本発明はZven1又はZven2ポリペプチド成分及びヒトFcフラグメントを含んで成るZven融合タンパク質を企画し、ここで前記Zvenポリペプチド成分のC−末端は、ペプチドリンカー、例えば配列番号７のアミノ酸配列から成るペプチドを通してFcフラグメントのN−末端に結合される。
【０１６６】
もう１つの態様においては、Zven1又はZven2融合タンパク質は、IgG配列、IgG 配列のアミノ酸末端に共有結合されるZvenポリペプチド成分、及びZvenポリペプチド成分のアミノ酸末端に共有結合されるシグナルペプチドを含んで成り、ここで前記IgG配列は、次の順序での次の要素から成る：CH2ドメイン及びCH3ドメイン。従って、IgG配列はCH1ドメインを欠いている。Zvenポリペプチド成分は、Zven1又はZven2活性、例えばZven1又はZven2受容体と結合する能力を示す。抗体及び非抗体部分の両者を含んで成る融合タンパク質を生成するこの一般的なアプローチは、LaRochelleなど., ヨーロッパ特許第742830号（WO95/21258号）により記載されている。
【０１６７】
Zven1又はZven2ポリペプチド成分及びFc成分を含んで成る融合タンパク質は、インビトロアッセイ手段として使用され得る。例えば、生物学的サンプルにおけるZven1又はZven2受容体の存在は、Zven1又はZven2−抗体融合タンパク質を用いて検出され得、ここでZven成分は、同起源の受容体、及び高分子、例えばタンパク質A又は抗−Fc抗体を結合するために使用され、すなわち結合される融合タンパク質−リガンド複合体を検出するために使用される。さらに、抗体可変ドメインを含んで成る抗体−Zven融合タンパク質は、抗体成分が標的抗原、例えば腫瘍関連抗原と結合する、治療用タンパク質として有用である。
【０１６８】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。融合タンパク質の酵素的及び化学分解のための一般的な方法は、例えばAusubel（1995）、p. 16-19〜16−25により記載される。
【０１６９】
６．Zvenポリペプチドの生成：
十分な長さのポリペプチド、機能的フラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、組換え宿主細胞において生成され得る。Zven1又はZven2遺伝子を発現するためには、ポリペプチドをコードする核酸分子が、発現ペプチドにおいて転写発現を制御し、そして次に、宿主細胞中に導入される調節配列に作用可能に連結されるべきである。転写調節配列、例えばプロモーター及びエンハンサーの他に、発現ベクターは、翻訳調節配列、及び発現ベクターを担持する細胞の選択のために適切なマーカー遺伝子を包含することができる。
【０１７０】
真核細胞において外来性タンパク質の生成のために適切である発現ベクターは、典型的には、（１）細胞宿主における発現ベクターの増殖及び選択を提供するための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする真核DNA要素；（２）転写の開始を制御する真核DNA要素、例えばプロモーター；及び（３）転写体のプロセッシングを制御するDNA要素、例えば転写終結/ポリアデニル化配列を含む。上記で論じられたように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路中に方向づける分泌配列コードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、Zven1発現ベクターは、Zven1遺伝子、及びZven1遺伝子又はもう1つの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１７１】
本発明のZven1又はZven2タンパク質は、哺乳類細胞において発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Vero; ATCC  CRL1587）、ヒト胚腎細胞（293−HEK; ATCC CRL1573）、子供のハムスター腎細胞（BHK−21, BHK−570；ATCC CRL8544, ATCC CRL10314）、イヌ腎細胞（MDCK；ATCC CCL34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO−K1; ATCC CCL61; CHO DG44 [Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 (1986)]、ラット下垂体細胞（GH1；ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝癌細胞（H−４−II−E；ATCC CRL1548）、SV40−形質転換されたモンキー腎細胞（COS−１；ATCC CRL1650）及びネズミ胚細胞（NIH−3T3；ATCC CRL1658）を包含する。
【０１７２】
哺乳類宿主に関しては、転写及び翻訳シグナルは、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウィルス又は同様のものに由来することができ、ここで調節するシグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連している。適切な転写及び翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えばアクチン、コラーゲン、ミコシン及びメタロチオネイン遺伝子から得られる。
【０１７３】
転写調節配列は、RNA合成の開始を方向づけるために十分なプロモーター領域を含む。適切な真核プロモーターは、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamerなど., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)）、ヘルペスウィルスのTKプロモーター（Mcknight, Cell 31 : 355 (1982)）、SV40初期プロモーター（Benoistなど., Nature 290: 304 (1981)）、Rous肉腫ウィルスプロモーター（Gormanなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)）、サイトメガロウィルスプロモーター（Foeckingなど., Gene 45: 101 (1980)）及びマウス乳腫瘍ウィルスプロモーター（一般的には、Etcheverry, “Expression of Engineered Protein in Mammalian Cell Culture”, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など., (eds.), p. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照のこと）を包含する。
【０１７４】
他方では、原核プロモーター、例えばバクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターは、その原核プロモーターが真核プロモーターにより調節される場合、哺乳類細胞におけるZven1又はZven2遺伝子発現を制御するために使用され得る（Zhouなど., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990), 及びKaukamanなど., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991) を参照のこと）。
【０１７５】
発現ベクターは、種々の標準の技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクト−介在性供給、エレクトロポレーション及び同様のものを用いて、宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、トランスフェクトされた細胞が選択され、そして増殖され、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞が供給される。真核細胞中にベクターを導入するための技法、及び優性選択マーカーを用いてのそのような安定した形質転換体を選択するための技法は、例えばAusubel (1995) 及びMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991) により記載される。
【０１７６】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。この場合、選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
【０１７７】
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばCD4,  CD8,クラスI  MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１７８】
Zven1又はZven2ポリペプチドはまた、ウィルス供給システムを用いて、培養された哺乳類細胞により生成され得る。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと）。アデノウィルスシステムの利点は、比較的大きなDNA挿入体の収容、高い力価に増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び異なったプロモーターを含む多数の入手できるベクターとの使用を可能にする柔軟性を包含する。
【０１７９】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAの大きな挿入体（7kbまでの）が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又はトランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスDNA中に導入され得る。EI遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製の無能性をもたらす、ウィルスベクターからの必須EI遺伝子を欠失することは任意である。例えば、アデノウィルスベクター−感染されたヒト293細胞（ATCC No. CRL−1573, 45504, 45505）は、有意な量のタンパク質を生成するために比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養物において増殖され得る（Garnierなど., Cytotechnol. 15: 145 (1994) を参照のこと）。
【０１８０】
Zven1又はZven2遺伝子はまた、他の高等真核細胞、例えば鳥類、菌類、昆虫、酵母、又は植物細胞においても発現され得る。バキュロウィルスシステムは、昆虫細胞中に、クローン化されたZven1又はZven2遺伝子を導入するための効果的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリホルニカ（Autographa californica） 核多角体病ウィルス（AcMNPV）に基づかれており、そして良く知られているプロモーター、例えばショウジョウバエ熱ショックタンパク質（hsp）70プロモーター、オートグラファ・カルホルニカ核多角体病ウィルス即時−初期遺伝子プロモーター（ie-I）及び遅延された初期39K プロモーター、バキュロウィルスp10プロモーター及びジョウジョウバエメタロチオネインプロモーターを含む。
【０１８１】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luckow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Bac−to−BacTMキット（Life  Technologies, Rockville,  MD）として市販されている。このシステムは、“bacmid”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、ZvenポリペプチドをコードするDNAを移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBacI TM (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and  Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【０１８２】
さらに、トランスファーベクターは発現されたZvenポリペプチドのC−又はN−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu  エピトープ標識をコードするDNAとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Grussenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）。当業界において知られている技法を用いて、Zven1又はZven2遺伝子を含むトランスファーベクターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離される。
【０１８３】
例示的なPFASTBACベクターは、相当の程度まで修飾され得る。例えば、前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Pcor, p6.9又はMPプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Hill−Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and  Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【０１８４】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のZven1/Zven2分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチMelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67（PharMingem, San Diego, CA)からのシグナル配列は、生来のZven1/Zven2分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【０１８５】
組換えウィルス又はbacmidは、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞は、IPLB−Sf−21に由来する細胞系、スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）さなぎ卵巣細胞系、例えばSf9 (ATCC CRL 1711)、Sf21AE及びSf21（Invitrogen Corporation; San Diego, CA）、及びショウジョウバエSchneider−２細胞、並びにトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するHIGH FIVEO 細胞系（Invitrogen）を包含する（アメリカ特許第5,300,435号）。市販の血清フリー培地が、細胞の増殖及び維持のために使用され得る。適切な培地は、Sf9細胞に関しては、Sf900IITM (Life Technologies) 又はESF921TM (Expression Systems)；及びトリコプルシア・ニ細胞に関しては、Ex−cellO405TM (JRH Biosiences, Lenexa, KS) 又はExpress FiveOTM (Life Technologies)を包含する。組換えウィルスが使用される場合、細胞は典型的には、組換えウィルスストックが0.1〜10、より典型的には、約３の感染の多重度（MOI）で添加される地点で、約２〜５×105個の細胞１〜２×106個の細胞の接種密度で触媒される。
【０１８６】
バキュロウィルスでの組換えタンパク質を生成するための確立された技法は、Baileyなど., “Manipulation of Baculovirus Vectors”, in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), P. 147-168 (The Humana Press, (nc. 1991) により、Patel など., “The buculovirus expression system”, in DNA Cloing2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.) p.205-244 (Oxford University Press 1995) により、Ausubel (1995) p.16-37〜16-57により、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Proteocols (The Humana Press, Inc. 1995) により、及びLucknow, “Insect Cell Expression Technology”, in Protein Engineering: Principles and Practice. Cleland など. (eds.), p.183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) により提供される。
【０１８７】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本明細書に開示される遺伝子を発現するためにも使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ(pichia methanolica) を包含する。酵母における発現のための適切なプロモーターは、GAL1（ガラクトース）、PGK（ホスホグリセリンキナーゼ）、ADH（アルコールデヒドロゲナーゼ）、AOX1（アルコールオキシダーゼ）、HIS4（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）及び同様のものからのプロモーターを包含する。
【０１８８】
外因性DNAによりS.  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０１８９】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kingsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,092 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号；及び第4,661,454号を参照のこと。
【０１９０】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluyveromyces  fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１９１】
例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCregg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mcknight など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
【０１９２】
例えば、組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、Raymond、アメリカ特許第5,716,808号、Raymond、アメリカ特許第5,736,383号、Raymondなど.,Yeast 14: 11-23 (1998)、及びWIPO公開WO97／17450, WO97／17451、WO98／02536及びWO98／02565に開示される。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ  アルコール利用遺伝子（AUG１又はAUG２）のものであることが好ましい。
【０１９３】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のものを包含する。宿主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（AUG１及びAUG２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１９４】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP４及びPRB１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数（t）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１９５】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、損なわれていない植物組織又は単離された植物細胞中にも導入され得る。植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、マイクロプロジェクティル−介在性供給、DNA注射、エレクトロポレーション及び同様のものによる植物組織の直接的な感染又はそれらと共にs植物細胞の同時培養を包含する。例えば、Horschなど., Science 227：1229 (1995)、Kleinなど., Biotechnology 10: 268 (1992) 及びMikiなど., “Procedures for Intoducing Foreign DNA into Plants”, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick など. (eds.), P.67-88 (CRC Press, 1993) を参照のこと。
【０１９６】
他方では、Zven遺伝子は、原核宿主細胞において発現され得る。原核細胞においてZven1又はZven2ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に良く知られており、そしてT4, T3, Sp6及びT7ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのPR及びPLプロモーター、E.コリのtrp, recA, 熱ショック、lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA及びlacZプロモーター、B.スブチリスのプロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセスプロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターを包含する。原核プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watsonなど., molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), 及びAusubelなど. (1995) により再考されている。
【０１９７】
適切な原核宿主は、E.コリ及びバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）を包含する。E.コリの適切な株は、BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4, DH5, DH51, DH51F, DH51MCR, DH 10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451及びER1647を包含する（例えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) を参照のこと）。バチルス・スブチリスの適切な株は、BR151、YB886、MI119、MI120及びBI70を包含する（例えば、Hardy, “Bacillus Cloning Methods”, in DNA Cloning: A Practical Approach, Clover (ed.) (IRL Press 1985) を参照のこと。
【０１９８】
細菌、例えばE.コリにおいてZvenポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１９９】
原核宿主においてタンパク質を発現するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Williamsなど., “Expression of foreign protein in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), P.15 (Oxford University Press 1995), Ward など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, p. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 及びGeorgiou, “Expression of Proteins in Bacteria”, in Protein Engineering: Principles and Practice; Cleland など. (eds.), p101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) 、及びRudolph,"Successful Refolding on an Industrial Scale", Chapter 10を参照のこと）。
【０２００】
細菌、酵母、昆虫及び植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準方法は、Ausubel (1995) により提供される。
哺乳類細胞系により生成される外来性タンパク質を発現し、そして回収するための一般的方法は、例えばEtcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture “in Protein Englineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), p163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) により提供される。細菌系により生成されるタンパク質を回収するための標準技法は、例えばGrisshammer など., “Purification of Over-Produced proteins from E.coli cells “in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), p.59-92 (Oxford University Press 1995) により提供される。バキュロウィルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) により記載される。
【０２０１】
他方では、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分固相方法、フラグメント縮合又は従来の溶液合成により合成され得る。それらの合成方法は、当業者に良く知られている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart et al., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. 3.3 (1986). Atherton など., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989). Fields and Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis.” Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), 及び  Lloyd-Williams など., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。
【０２０２】
全体的な化学合成方法、例えば“生来の化学的連結”及び“発現されたタンパク質連結”における変動性もまた標準である（例えば、Dawsonなど., Science 266: 776 (1994), Hackengなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir など., proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 6705 (1998),及び Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)を参照のこと）。
【０２０３】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６個、少なくとも９個又は少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。Zven2の例示的なポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸82−105の15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。Zven2の典型的なポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１−32又はアミノ酸75−108の15個の連続したアミノ酸残基を含み、そして典型的なZven2ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸82−105を含む。本発明の１つの態様においては、ポリペプチドは、配列番号２又は５の20個，30個，40個，50個，75個又はそれ以上の連続した残基を含んで成る。そのようなペプチド及びポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマー及びプローブとして有用である。
【０２０４】
Zven1の生成についての例は、例９、10、11及び12に示される。
本発明は、本明細書に記載されるペプチド又はポリペプチドを含んで成る組成物を企画する。そのような組成物はさらに、キャリヤーを含むことができる。キャリヤーは従来の有機又は無機キャリヤーであり得る。キャリヤーの例は、水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゲル、ゴマ油、トウモロコシ油及び同様のものを包含する。
【０２０５】
７．Zvenポリペプチドの単離：
本発明のポリペプチドは、汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、又は95％以上の純度に精製することが好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さない。本発明のポリペプチドはまた、99.9％以上の純度である医薬的に純粋な状態に精製され得る。特定の製剤においては、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０２０６】
分別及び/又は従来の精製方法は、天然源（例えば、リンパ節組織）から精製されたZven1又はZven2、及び組換え宿主細胞から精製された組換えZvenポリペプチド及び融合Zvenポリペプチドの調製物を得るために使用され得る。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好ましい。
【０２０７】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl ブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharmacia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０２０８】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離及び精製の特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988、及びDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照のこと。
【０２０９】
Zven単離及び精製における追加の変動は、当業者により調節され得る。例えば、下記のようにして得られる抗−Zven抗体は、免疫親和性精製により多量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０２１０】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される( Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。
【０２１１】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐHの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（M. Deutscher, (ed.), Methods Enzymol. 182, 529(1990)）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、FLAG標識、Glu-Gku標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０２１２】
Zvenポリペプチド又はそのフラグメントはまた、下記のようにして、化学合成を通して調製され得る。Zvenポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても、又はグリコシル化されなくても良く；PEG化されても、又はPEG化されなくても良く；そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は含まなくても良い。
【０２１３】
８．Zven類似体：
上記に記載されるように、開示されるポリペプチドは、Zven変異体を構成するために使用され得る。それらのポリペプチドは、Zven1又はZven2類似体を同定するために使用され得る。１つのタイプのZven類似体は、Zven受容体との結合によりZvenに類似する。そのような類似体は、Zven受容体とのその類似体との結合が受容体を発現する細胞により応答を刺激する場合、Zvenアゴニストであると見なされる。他方では、Zven受容体と結合するが、しかし細胞受容体を刺激しないZven類似体は、Zvenアンタゴニストであり得る。そのようなアンタゴニストは、例えばZven受容体へのアンタゴニストの競争又は非競争結合により、Zven又はZvenアゴニスト活性を低めることができる。
【０２１４】
１つの一般的な種類のZven類似体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の少なくとも１つの突然変異、欠失（アミノ−又はカルボキシル−末端）、又は置換を有するアミノ酸を有するアゴニスト又はアンタゴニストである。もう１つの一般的種類のZven類似体は、下記に記載されるように、抗−イディオタイプ抗体又はそのフラグメントにより供給される。さらに、抗−イディオタイプ可変ドメインを含んで成る組換え抗体は、類似体として使用され得る（例えば、Monfardini など., Proc. Assoc. Ani. Physicians 108 : 420 (1996)を参照のこと）。抗−イディオタイプZven抗体の可変ドメインはZvenに類似するので、それらのドメインは、Zvenアゴニスト又はアンタゴニスト活性のいずれかを提供することができる。例示として、Langer, J. Interferon Res. 13：295（1993）は、インターフェロン−αアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかの性質を有する抗−イディオタイプインターフェロン−α抗体を記載する。
【０２１５】
Zven1又はZven2類似体を同定するための第３のアプローチは、結合ライブラリーの使用により提供される。ファージ表示及び他の結合ライブラリーを構成し、そしてスクリーニングするための方法は、例えばKay など., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, アメリカ特許第 5, 783, 384号, Kay, など. アメリカ特許第5,747, 334号, 及び KauffAman など., アメリカ特許第5,723, 323号により提供される。
【０２１６】
Zvenポリペプチド、アゴニスト、又はアンタゴニストの活性は、標準の細胞増殖又は分化アッセイを用いて決定され得る。例えば、増殖を測定するアッセイは、中性赤色顔料に対する化学感受性、放射性ラベルされたヌクレオチドの組み込み、増殖細胞のDNAにおける５−ブロモ−2’−デオキシウリジンの組み込み、及びテトラゾリウム塩の使用(Mosmann, J. Inzfnaunol. Metlzods 65 : 55 (1983); Porstmann など., J. Imrz2uuol. Methods 82 : 169 (1985); Alley など., Cancer Res. 48 : 589 (1988); Cook など., Analytical Biochem. 179 : 1 (1989); Marshall など., Growth Reg. 5: 69 (1995); Scudiero など., Cancer Res. 48 : 4827 (1988); Cavanaugh など., loivestigational New Drugs 8 : 347 (1990) )のようなアッセイを包含する。
【０２１７】
例えば、分化を測定するアッセイは、組織、酵素活性、機能的活性又は形態学的変化の段階−特異的発現に関連する細胞−表面マーカーの測定を包含する（Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, pages 161- 171 (1989); Watt, FASEB, 5: 281 (1991); Francis, Differentiation 57 : 63 (1994)）。アッセイは、走化性、付着性、イオンチャネル流入の変化、第２メッセンジャーレベルの変調及び神経伝達物質の開放を包含する他の細胞応答を測定するために使用され得る。そのようなアッセイは当業界において良く知られている（例えば、Chayen and Bitensky, Cytochemical Bioassays : Tec1miques & Applications (Marcel Dekker 1983)を参照のこと）。
【０２１８】
変異体Zvenポリペプチド、例えばZven1、Zven2、及びそのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラの効果はまた、組織における収縮及び弛緩を測定する張力計により、組織、例えば胃腸組織の収縮性を観察することにより測定され得る（例えば、Daintyなど., J. Pharmacol. 100: 767, 1990; Rheeなど., Neurotox. 16: 179, 1995; Anderson, Endocrinol. 114: 364-8, 1984; 及びDowning and Sherwood, Endocrinol. 116; 1206-14, 1985を参照のこと）。例えば、大動脈輪の血管拡張の測定は、当業界において良く知られている。例示として、大動脈輪が、生後４ヶ月のSprague Dawleyラットから採取され、そして緩衝溶液、例えば変性されたクレブス溶液（118.5mMのNaCl, 4.6mMのKCl, 1.2mMのMgSO4・7H2O, 1.2mMのKH2PO4, 2.5mMのCaCl2・2H2O, 24.8mMのNaHCO3及び10mMのグルコース）に配置される。
【０２１９】
当業者は、この方法が他の動物、例えばウサギ、他のラット株、テンジクネズミ、及び同様のものに使用され得ることを認識するであろう。次に、輪が等張力トランスデューサー（Radnoti Inc., monrovia, CA）に結合され、そしてデータがPonemah生理学的プラットフォーム（Gould Instrument Systems, Inc, Valley View, OH）により記録され、そして緩衝溶液を含む、酸化された（95％O2, 5％CO2）組織槽に配置される。組織が1gの休止緊張に調節され、そして試験の前、約１時間、安定化される。輪の完全性がノルエピネフェリン（Sigma Co., St. Louis, MO）及びカルバコール、すなわちムスカリン様アセチルコリンアゴニスト（Sigma Co.）により試験され得る。完全性が調べられた後、輪は新鮮な緩衝液により３度、洗浄され、そして約１時間、休止せしめた。
【０２２０】
血管拡張又は大動脈輪組織の弛緩についてサンプルを試験するために、輪が2gの緊張に収縮され、そして15分間、安定化される。次に、Zvenポリペプチドサンプルが、フラッシングしないで、４個の槽の１，２又は３に添加され、そして輪に対する緊張が記録され、そして緩衝液のみを含む対照輪に比較される。Zvenポリペプチド、それらのアゴニスト及びアンタゴニストによる収縮の増強又は弛緩がこの方法により直接的に測定され、そしてそれが他の収縮組織、例えば胃腸組織に適用され得る。
【０２２１】
もう１つの例として、Zven1の効果が、標準のテンジュクネズミ回腸器官槽において試験された。器官槽システムは、単離された組織における収縮性を測定するために使用される標準方法であり、そしてテンジュクネズミの回腸は通常、エクスビボでの腸における収縮応答を記録するために使用される（Thomas E. , など. , Mol Pharmacol 44: 102-10,1993）。腸神経系の成分は完全に腸内に位置しているので、それは脳及び脊髄から除去され得、そしてその反射挙動性が研究される。テンジュクネズミ回腸からの胃腸組織に観察される従来の応答は、腸の長軸にそって配向される平滑筋繊維による縦の収縮である。例６に示されるように、Zven1処理は、75pMに等しい、0.75ng/mlほどの低いpモル濃度で、回腸における平滑筋収縮を刺激した。さらに、最高の応答が、20ng/mlのZven1用量で観察された。本発明のZven分子の効果を示す追加の例は、例7, 14及び15に示される。
【０２２２】
胃運動性に対する、変異体Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラの効果は典型的には、胃腸管を通しての胃排出能及び続く通過時間のために必要とされる時間として臨床学的設定において測定される。胃排出走査は当業者に良く知られており、そして手短には、経口対比剤、例えばバリウム又は放射性ラベルされた食事の使用を包含する。固体及び液体が独立して測定され得る。一般的に、試験食品又は液体が、同位体（例えば、99mTc）により放射性ラベルされ、そして摂取又は投与の後、胃腸管を通しての通過時間及び胃排出能がγカメラを用いての可視化により測定される（Meyer など., Am. J. Dig. Dis. 21 : 296 (1976); Collins など., Gut 24 : 1117 (1983); Maughan など., Diabet. Med. 13 : S6 (1996), 及び Horowitz など., Arch. Intern. Med. 145 : 1467 (1985)）。
【０２２３】
齧歯動物における胃排出能及び腸通過を測定するためへのフェノールレッド（試験食事）の経口投与は、良く詳細に示されているモデルである（Martinez V, Cuttitta, Tache Y 1997 Endocrinology 138: 3749-3755）。手短には、動物は18時間、食物から隔離されるが、しかし水への接近は自由である。動物は、非吸収性色素、すなわち0.05％フェノールレッド（50mg/100mlのSigma Chemical Company Catalogue #P4758）を含む1.5％メチルセルロース水溶液から成る試験食事0.15mlの経口投与を受ける。インビボマウスモデルにおける胃排出能に対するZven1の効果は、例4, 8, 21及び22に示される。追加の研究が、Zvenポリペプチドの効能を定量化するために促進剤（Promotility agent）の投与の前及び後、行われ得る。
【０２２４】
放射性ラベルされたか又は親和性ラベルされたZvenポリペプチドはまた、生物学的サンプルにおけるZven受容体を同定するか、又は位置決定するために使用され得る（例えば、Deutscher (ed.), Methods in Enzynzol., vol. 182, pages 721-37 (Academic Press 1990); Brunner など., Ann. Rev. Biochem. 62 : 483 (1993); Fedan など., Biocherrn. Pharnzacol. 33 : 1167 (1984)を参照のこと）。また、受容体同定のためへの抗−イディオタイプ抗体の使用を記載する、Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875 (1996)も参照のこと。
【０２２５】
9．Zvenタンパク質に対する抗体の生成：
Zvenポリペプチドに対する抗体は、例えば抗原として、Zven発現ベクターの生成物又は天然源から単離されたZvenを用いて得られる。特に有用な抗−Zven1及び抗−Zven2抗体は、それぞれZven1及びZven2を、“特異的に結合する”。抗体は、その抗体が次の２つの性質の少なくとも１つを示す場合、特異的に結合すると思われる：（１）抗体が限界レベルの結合活性を伴って、Zven1又はZven2に結合し、そして（２）抗体がZven1又はZven2に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない場合。
【０２２６】
第１の特徴に関しては、抗体は、それらが、106M-1又はそれ以上、好ましくは107M-1又はそれ以上、より好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴なって、Zvenポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、Scatchard 分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)）により、当業者により容易に決定され得る。第２の特徴に関しては、抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、Zvenを検出するが、しかし現在知られているポリペプチドを検出しない場合、関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。既知の関連するポリペプチドの例は、既知の腫瘍壊死因子受容体を包含する。特定の抗−Zven1抗体は、Zven1と結合するが、しかしZven2とは結合せず、そして一定の抗−Zven2抗体は、Zven2と結合するが、しかしZven1とは結合。
【０２２７】
抗−Zven1又は抗−Zven2抗体は、抗原性Zven1又はZven2エピトープ−担持ペプチドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド及びポリペプチドは、配列番号２又は５内に含まれる、少なくとも４個、又は15〜約30個のアミノ酸の配列、又は本明細書に開示されるもう１つのアミノ酸配列を含む。しかしながら、30〜50個のアミノ酸、又は本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列の大きな部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、Zven1又はZven2と結合する抗体を誘発するためにも有用である。所望には、エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するよう選択される（すなわち、前記配列は、比較的親水性の残基を包含し、そして疎水性残基は好ましくは、回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列がまた、抗体生成のために所望される。
【０２２８】
例示のように、Zven1又はZven2における可能性ある抗原性部位が、LASERGENE（DNASTAR；Madison, WI）のPROTEANプログラム（バージョン3.14）により実効されるように、Jameson-Wolf method, Jameson and Wolf, CABIOS 4: 181, (1988) を用いて、同定された。デフォールトパラメーター（default parameter）が、この分析に使用された。
【０２２９】
Jameson−Wolf方法は、タンパク質構造予測のために６種の主要サブルーチンを組合すことによって、可能性ある抗原決定基を予測する。手短には、Hopp−Woods方法、Hoppなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3924 (1981) が最初に、最大の局部親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定するために使用された（パラメーター：平均７個の残基）。第２段階においては、Emini方法、Eminなど., J. Virolgy 55: 836 (1985) が、表面確立を計算するために使用された（パラメーター：表面決定限界値（0.6）＝１）。第３に、Karplus−Schultz方法、Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985) が、主鎖柔軟性を予測するために使用された（パラメーター：柔軟性限界値（0.2）＝１）。
【０２３０】
分析の第４及び第５段階においては、二次構造の予測が、Chou-Fasmanの方法、Chou, “Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition”, in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), p.549-586 (1978) を用いて、データに適用された（Chou-Fasman パラメーター：コンホメーション表＝64タンパク質；α領域限界値＝103；β領域限界値＝105；Garnier-Robsonパラメーター：α及びβ決定パラメーター＝０）。
【０２３１】
第６のサブルーチンにおいては、柔軟性パラメーター及び水治療/溶媒接近性因子が、“抗原指数”として呼ばれる表面輪郭値を決定するために組合された。最終的に、ピーク拡大機能が、抗原指数に適用され、内部領域に対する表面領域の移動度に由来する追加の自由エネルギーを計算するために、それぞれのピーク値の20, 40, 60又は80％を付加することによって主用表面ピークを拡大する。しかしながら、この計算は、ヘリカル領域がほとんど柔軟性になる傾向がないので、ヘリカル領域に存在するいずれかの主用ピークにも適用されなかった。
【０２３２】
この分析結果は、Zven1の適切な抗原性ペプチドが配列番号2のアミノ酸の次の成分を含むことを示した：アミノ酸22−27（“抗原性ペプチド１”）、アミノ酸33−41（“抗原性ペプチド２”）、アミノ酸61−68（“抗原性ペプチド３”）、アミノ酸80−85（“抗原性ペプチド４”）、アミノ酸97−102（“抗原性ペプチド５”）及びアミノ酸61−85（“抗原性ペプチド６”）。本発明は、Zven1に対する抗体を生成するためへの高原性ペプチド１〜６のいずれか１つの使用を企画する。本発明はまた、抗原性ペプチド１〜６の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドを企画する。
【０２３３】
同様に、Zven2アミノ酸配列の分析は、Zven2の適切な抗原性ペプチドが配列番号５のアミノ酸の次の成分を含むことを示した：アミノ酸25−33（“抗原性ペプチド７”）、アミノ酸53−66（“抗原性ペプチド８”）、アミノ酸88−95（“抗原性ペプチド９”）、アミノ酸98−103（“抗原性ペプチド10”）、及びアミノ酸88−103（“抗原性ペプチド11”）。本発明は、Zven2に対する抗体を生成するためへの高原性ペプチド７〜11のいずれか１つの使用を企画する。本発明はまた、抗原性ペプチド７〜11の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドを企画する。
【０２３４】
組換えZvenタンパク質、又は天然源から単離されたZvenに対するポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。例えば、Green など., “Production of polyclonal Antisera,” in Immunochemical Protecols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 及びWilliams など., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.), page 15 (Oxford University press 1995を参照のこと。Zvenポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。
【０２３５】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばZven又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に結合されるか又は連結され得る。
【０２３６】
ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マウス、ウサギ、テンジュクネズミ、ヤギ又は羊において生ぜしめられるが、本発明の抗−Zven抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な技法は、例えばGoldenbergなど., 国際特許出願番号WO91/11465号及びLosmanなど., Int. J. Cancer 46: 310, 1990に見出され得る。
【０２３７】
他方では、モノクローナル抗−Zven抗体が生成され得る。特定抗原に対する囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例えば、Kohler など., Nature 256: 495 (1975), Coliga など., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley など., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995を参照のこと)。
【０２３８】
手短には、モノクローナル抗体は、Zven遺伝子生成物を含んで成る組成物をマウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、B−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる。
【０２３９】
さらに、本発明の抗−Zven抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成するよう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、ヒトH鎖及びL鎖遺伝子座の要素が、内因性H鎖及びL鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Greenなど., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg など., Nature 368: 856, 1994, 及びTaylorなど., Inc. Immun. 6: 579, 1994により記載される。
【０２４０】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン−Aセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Coligan, page 2.7.1-2.7.12及びpage 2.9.1^2.9.3; Bainesなど.,” Purification of Imunoglobulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, vol, 10, p. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) を参照のこと）。
【０２４１】
特定の用途に関しては、抗−Zven抗体のフラグメントを調製することが所望される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解により得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又はパパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、F(ab’)2として示される５Sフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解により生成され得る。このフラグメントはさらに、3.5S Fab’ 単価フラグメントを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。
【０２４２】
任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシンを用いての酸素分解が２種の単位Fabフラグメント及びFcフラグメントを直接的に生成する。それらの方法は、例えば、Goldenberg, アメリカ特許第4,331,647号、Nisonoff など., Arcg Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman など., in Methods in Enzymology vol. 1, p. 422 (Academic Press 1967), 及びColigan, p. 2.8.1-2.8.10及び2.10-2.10.4により記載される。
【０２４３】
抗体を分解する他の方法、例えば単価L−H鎖フラグメントを形成するためへのH鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
例えば、Fvフラグメントは、VH及びVL鎖の会合を含んで成る。この会合は、Inbar など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972により記載のように、非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例えば、Sandhu, Crit. Rew. Biotech. 12: 437, 1992を参照のこと）。
【０２４４】
Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるVH及びVL鎖を含んで成る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドにより連結されるVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含んで成る構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばE.コリ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ScFvを生成するための方法は、例えばWhitlow など., Methods: A Companion to Metheds in Enzymology 2:97, 1991により記載される。Bird など., Science 242:423, 1988, Ladner など., アメリカ特許第4,946,778号、Packなど., Bio/Technology 11: 1271, 1993及びSandhu, 前記も参照のこと。
【０２４５】
例示のように、scFvは、インビトロで、Zvenポリペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたZvenタンパク質又はペプチドの作用を通して）によって得られる。可能性あるZvenポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【０２４６】
そのようなランダム  ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladner など., アメリカ特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号；Ladner など., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698 号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、Zvenに結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるZven配列を用いてスクリーンされ得る。
【０２４７】
抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性−決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のDCRをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えば抗体−生成細胞のRNAから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Larrick など., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter など., (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 及びWard など., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch など., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照のこと）。
【０２４８】
他方では、抗−Zven抗体は、“ヒト型化”モノクローナル抗体から誘導され得る。ヒト型化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンH及びL可変鎖からのマウス相補的決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行することにより生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ相対物の骨格領域において置換される。ヒト型化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、Orlandiなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989により記載される。
【０２４９】
ヒト型化モノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Jones など., Nature 321:522, 1986, Carter など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rey. Biotech. 12: 437, 1992, Singer など., J. Tmmun. 150: 2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 及びQueen など., アメリカ特許第5,693,762号（1997）により記載される。
【０２５０】
ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準の技法を用いて、抗−Zven抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することにより調製され得る。例えば、Green など.,"Production of Polyclonal Antisera,"in Met7lods In Molecular Biology : Imiizunochemical Protocols, Manson (ed. ), pages 1-12 (Humana Press 1992). Also, see Coligan at pages 2.4. 1-2.4. 7を参照のこと。他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗−Zven抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。もう1つの方法として、ヒト適合された抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイプ抗体を調製するための方法は、例えばIrie, アメリカ特許第5,208,146号, Greeneなど., アメリカ特許第5,637,677号、及びVarthakovi and Minocha, J. Gen. Virol 77: 1875, 1996により記載される。
【０２５１】
10．Zvenポリペプチド及び抗体の治療使用：
本発明は、抗−Zven分子、例えば、抗−Zven活性を有する、アンタゴニスト、抗体、結合タンパク質、変異体及びフラグメントの使用を包含する。本発明は、抗−Zven分子を対象に投与することを包含し、そして家畜及びヒトへの治療使用を企画する。例示的対象は、哺乳類対象、例えば飼育動物、家畜動物及びヒト患者を包含する。
【０２５２】
抗−Zven分子、アンタゴニスト、抗体、結合タンパク質、変異体及びフラグメントは、炎症性疾患（IBD）及び過敏性腸症候群（IBS）の処理及び検出において有用である。
炎症性腸疾患（IBD）は、結腸又は直腸（潰瘍性大腸炎）、又は小及び大腸（クローン病）に影響を及ぼすことができる。それらの疾病の病因は不明であるが、しかしそれらは影響される組織の慢性炎症を包含する。有能な治療剤は、抗−Zven分子、例えば抗−Zven1及び抗−Zven2抗体、他の結合タンパク質、変異体、フラグメント、キメラ、及び他のZven1及びZven2アンタゴニストを包含する。それらの分子は、IBD及び関連する疾病における炎症性及び病理学的効果を低めるための価値ある治療剤として作用する。
【０２５３】
潰瘍性大腸炎（UC）は、結腸の粘膜又は最も内部の内層の炎症及び潰瘍により特徴づけられた、通常結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は、時折結腸を空にし、下痢をもたらす。症状は、下痢ぎみ及び関連する腸の痙攣、発熱及び体重の低下を包含する。UCの正確な原因は未知であるが、最近の研究は、身体の天然の防御が、身体が外来性と見なすタンパク質に対して作用する（“自己免疫反応”）ことを示唆する。たぶん、それらは腸における細菌タンパク質に類似するので、それらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症工程を生ぜしめるか又は刺激することができる。結腸の内層が破壊されるにつれて、潰瘍が開放性粘液、膿及び血液を形成する。その疾病は通常、直腸領域で始まり、そして最終的に、全大腸中に拡張する。
【０２５４】
炎症の反復された症状の発現は、瘢痕組織を伴なって、腸及び直腸の壁の肥厚化を導く。結腸組織の死又は販血症は、重度の疾病を生ぜしめる。潰瘍性大腸炎の症状は重症度において変化し、そしてそれらの開始は徐々であるか又は突然であり得る。攻撃は、多くの要因、例えば呼吸器感染又はストレスにより刺激され得る。従って、本発明の抗−Zven分子は、UCを処理し、そして検出するために有用であり得る。
【０２５５】
現在、UCについての有益な治療は存在しないが、処理は、結腸内層における異常炎症工程の抑制に集中される。コルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン及びメトトレキセ−ト）及びアミノサリチレートを包含する処理は、その疾病を処理するために入手できる。しかしながら、免疫抑制剤、例えばコルチコステロイド及びアザチオプリンの長期使用は、骨の微細化、白内障、感染、及び腎臓及び骨髄の効果を包含する重度の副作用をもたらすことができる。現在の治療が好都合でない患者においては、手術が任意である。手術は、全結腸及び直腸の除去を包含する。
【０２５６】
慢性潰瘍性大腸炎に部分的に類似するいくつかの動物モデルが存在する。最も広く使用されるモデルは、結腸において慢性炎症及び潰瘍を誘発する、２，４，６−トリニトロベンスルホン酸/エタノール（TNBS）誘発された大腸炎モデルである。TNBSが直腸内点滴を通して敏感なマウスの結腸中に導入される場合、それは、結腸粘膜において、T−細胞介在性免疫応答を誘発し、この場合、大腸の全壁じゅうへのT−細胞及びマクロファージの強い浸潤により特徴づけされた大量の粘膜浸潤を導く。さらに、この組織病理学的臨床像は、進行性体重の低下（消耗）、出血性下痢、直腸脱出及び大腸壁の肥厚化の臨床学的像を付随する（Neurathなど., Intern, Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000）。
【０２５７】
もう１つの大腸炎モデルは、出血性下痢により明白な急性大腸炎、体重の低下、結腸の短縮、及び好中球浸潤を伴なっての粘膜性潰瘍を誘発する硫酸デキストランナトリウム（DSS）を使用する。DSS誘発された大腸炎は、リンパ過形成、病巣陰窩損傷及び上皮潰瘍を伴なって、粘膜固有層中への炎症細胞の浸潤により組織学的に特徴づけられる。それらの変化は、上皮上へのDSSの毒性効果により、及び粘膜固有層細胞のファゴサイトーシス、及びTNF−α及びIFN−γの生成により進行すると思われる。その通常の使用にもかかわらず、ヒト疾病への関連性についてのDSSの機構に関するいくつかの問題点は末解決のままである。DSSは、それがT細胞欠失動物、例えばSCIDマウスにおいて観察されるので、T細胞−無関係モデルとして見なされる。
【０２５８】
抗−Zven1又は抗−Zven2抗体、又はそれらのTNBS又はDSSモデルへの結合パートナーの投与は、症状を改善し、そして胃腸疾患の経過を変更するために使用され得る。Zven1及び/又はZven2は、大腸炎における炎症応答において役割を演じ、そしてフラグメントを投与することによるZven1及び/又はZven2活性の中和は、IBDのための有能な治療アプローチである。
【０２５９】
炎症反応は、胃腸管の異常運動性、例えば吐気、嘔吐、腸閉塞又は下痢に時折、関連する種々の臨床学的症状を引き起こす。細菌性リポ多糖（LPS）暴露は、ヒト及び実験動物の両者において観察されるそのような炎症状態を誘発し、そして胃腸運動性の二段階変化、すなわち初期段階における高められた通貨及び後期段階における遅延された通過により特徴づけられる。Zven1は炎症においてその役割を演じ、そして低（プロキネチック）及び高（阻害）用量で二段階活性を有するので、それはそれらの炎症状態において有益であろう。
【０２６０】
過敏性腸症候群は、胃腸診療所における最も通常の病状の１つである。IBSについての診断及び処理はまだ制限されたままである。Zven1の発現がIBSの症状と相互関係しているので、抗−Zven分子、例えば抗−Zven1及び抗−Zven2抗体、他の結合タンパク質、変異体、フラグメント、キメラ、及び他のZven1及びZven2アンタゴニストは、症状の改善及び疾病の処理において有用である。
【０２６１】
IBSの追加の特徴は、下痢と便秘との交互の症状、及び腸平滑筋収縮及び拡張に対する高められた内臓感受性を伴って、損なわれた胃腸運動である。Zven1及びZven2は胃腸収縮性、胃排出能及び腸通過を調節する分子であるので、本発明のZvenポリペプチド、例えばZven1、Zven2、及びアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、IBSの全体的な処理において特に有用である。Zven1の二相性質、すなわち高い用量で運動性を阻害するその能力、及び低い用量で運動性を増強するその能力は、その発現が、高められたZven1レベルを示す便秘傾向患者及び低いZven1レベルを示す下痢傾向患者を伴って、IBSにおいて異常−調節されることを示唆する。
【０２６２】
IBD又はIBSを有する患者への抗−Zven1又は抗−Zven2抗体又は結合パートナーの投与は、症状を改善し、そして胃腸疾患の経過を変更するために使用され得る。Zven1及び/又はZven2は、大腸炎の炎症応答において役割を演じ、そしてアンタゴニストを投与することによるZven1及び/又はZven2活性の中和は、IBD及び/又はIBSのための有能な治療アプローチである。
【０２６３】
Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、ケモカイン生成を刺激するために使用され得る。ケモカインは、白血球のレクルートメント及び機能に関連する広範囲の活性を有する小さな前−炎症性タンパク質である。ラットCINC−１、ネズミKC及びGROαは、ケモカインのCXCサブファミリーのメンバーである。ケモカインは、一般的に、好中球に対して優先的に走化性であり、そしてまた、脈管形成活性を有し、そしてTリンパ球及び単球を主に誘引するグループに分けられ得る。Banks, C. など, J. Pathology 199 : 28-35,2002を参照のこと。第１グループにおけるケモカインは、NH2末端でELR（Glu-Leu-Arg）アミノ酸モチーフを示す。例えば、GROαがこのモチーフを含む。GROαはまた、マイトジェン及び脈管形成性質を有し、そして創傷の治癒及び血管形成に関与している（例えば、Li and ThornkilS, Cytokine 12 : 1409 (2000)を参照のこと）。
【０２６４】
例２，３及び17により例示されるように、Zven1及びZven2はラットの胸部大動脈由来の細胞系においてケモカインCINC−１（サイトカイン誘発性好中球化学誘発因子１）の放出を刺激し、Zven1はマウスからのケモカインKCの放出を刺激し、そしてケモカインMIP−２（マウスマクロファージ炎症タンパク質−２）は低用量（腹腔内注射）のZven1に応答してアップ−レギュレートされる。従って、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、インビボでのケモカインの生成を刺激するために使用され得る。ケモカインは、培養培地から精製され、そして研究又は臨床学的設定に使用される。Zven変異体はまた、インビトロ又はインビボでケモカインの生成を刺激する能力により同定され得る。
【０２６５】
アップレギュレートされたケモカイン発現は、IBDの上昇する活性と相互関連する。Banks, C. など, J. Pathology 199 : 28-35,2002を参照のこと。ケモカインは、炎症細胞を誘発することができ、そしてそれらの活性化に関与している。同様に、MIP−２発現は、種々の炎症条件下での好中球流入に関連していることが見出された。ケモカインの刺激するポリペプチドとして、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、腸菅におけるケモカイン流入を低めるか、阻害するか又は妨げることにより、炎症性腸疾患の処理において有用である。
【０２６６】
ケモカインの生成を刺激できるタンパク質として、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、感染、例えば菌類、細菌ウィルス及び寄生体感染の処理において有用である。従って、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラの投与は、特定組織部位への免疫ブースターとして使用され得る。例えば、胃腸組織又は肺組織に投与されるZven1は、感染を処理するために、単独で、又は組合せ療法において有用である。
【０２６７】
例３に示されるように、Zven1投与は好中球浸潤を引き起こすことができる。好中球浸潤が所望される、外傷又は感染に対する哺乳類の免疫応答に関する多くの観点が存在する。Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、好中球浸潤を誘発するための剤として有用であろう。
【０２６８】
免疫性及び走化性、例えば好中球浸潤のモジュレーターとしてのZven1の追加の活性は、それが、しばしばIBSの開始体である初期感染性発作に包含され得ることを示す（Collinsなど）。侵入する病原体を除去するために腸運動を高め、そして好中球流入を誘発することにより、Zven1は胃腸感染、例えば食物中毒を解決するよう作用する。幾人かのIBS患者においては、この感染現象は決して解決されず、慢性炎症状態及び胃腸運動問題、便秘又は下痢、又は交互の両現象を導く。Zven1インヒビターはさらに、影響を受けた異常な炎症性の胃腸組織における好中球数を低めることにより、炎症状態を低めることができる。
【０２６９】
炎症反応は、胃腸管の異常運動性、例えば吐気、嘔吐、腸閉塞又は下痢に時折、関連する種々の臨床学的症状を引き起こす。細菌性リポ多糖（LPS）暴露は、ヒト及び実験動物の両者において観察されるそのような炎症状態を誘発し、そして胃腸運動性の二段階変化、すなわち初期段階における高められた通貨及び後期段階における遅延された通過により特徴づけられる。Zven1は炎症においてその役割を演じ、そして低（プロキネチック）及び高（阻害）用量で二段階活性を有するので、それはそれらの炎症状態において有益であろう。
【０２７０】
IBS及びIBDに関連する障害に関しては、改良された機能の臨床学的徴候は、痛み、痙攣及び感受性の軽減、下痢の改善及び改良された便稠度、低められた腹部拡張、及び高められた腸通過を包含するが、但しそれらだけには限定されない。改良性はまた、平均クローン疾病活性指数（CDAI）の低下により測定され得る。Best.W.など., Gasttoenterology 70: 439-44,1976を参照のこと。さらに、改良された機能は、Irvineなど. (Irvine, E. など., Gasttoenterology 106: 287-96,1994)により記載されるように、生命評価の性質により測定され得る。
【０２７１】
欠陥性胃腸機能性に関連する障害に関しては、改良された機能の臨床学的徴候は、高められた腸通過、高められた胃排出能、放屁及び腹鳴、液体及び固形物を消費する能力、及び/又は吐気及び/又は嘔吐を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
過活性胃腸収縮性に関連する障害に関しては、改良された胃腸機能の臨床学的徴候は、遅延された胃排出能、遅延された腸通過及び/又は麻痺の低下を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２７２】
Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラはまた、胃腸関連の敗血症を処理するためにも使用され得る。実験的“敗血症”/内毒血症は、Ceregrzyn など. Neurogastroenterol. Mot. 13 : 605-613 (2001)に記載される方法を用いて、齧歯動物において生成される。それらの動物は胃腸通過における二段階変更を進行せしめる。Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、疾病の段階に依存して、低（プロキネチック）又は高（阻害）濃度で、経口（p.o.）, 腹腔内（i.p.）,静脈内静脈内（i.v.）, 皮下（s.c.）又は筋肉内（i.m.）投与され得る。次に、胃排出能及び/又は腸通過が、下記に記載される主要モデルの１つを用いて測定される。
【０２７３】
11．腸における炎症、胃排出能及び腸通過のモデル：
炎症性腸疾患（IBD）の動物モデル（Wirts and Neurath. Int. J. Colorectal Dis. 15: 144-60 (2000) を参照のこと）：
IBDの自発的モデル：ヒトにおけるIBDは、環境因子への暴露の後、遺伝的疾病素質を有する個人において発生すると思われる。自発的モデルは、遺伝的感染性因子を定義するために誘発性モデルよりも利点を提供する。
【０２７４】
自発的モデルの例：C3H/HeJBirマウス。これは、盲腸及び遠位結腸粘膜の右側に主に急性及び慢性病変及び潰瘍を有する、生後約３週の自発的病原体−無関係大腸炎を進行せしめるJakson Labsからの“研究株”である。CD4＋T細胞は、病因における重要な成分として同定されている。試験化合物、例えばZven1及び/又はZven2、及び/又は変異体又はアゴニストが、症状及び病変に対するその効果を評価するために投与され得る。
【０２７５】
IBDの誘発性モデルは、管腔剤との接触により粘膜免疫系の活性化を包含する。
誘発例１：硫酸デキストランナトリウム（DSS）（齧歯動物における）。
飲料水中、DSSポリマーによる５日間のマウス又はラットの飼育は、出血性下痢潰瘍、組織損傷、及び好中球による浸潤を伴って、急性大腸炎を誘発する。感受性株においては、DSS（DSSにより７日間、及び次に水による７日間の循環）は、湿潤性マイクロファージ、CD4＋Tリンパ球及び深い潰瘍を伴って、慢性病変をもたらす。後の相は、高められたレベルの前炎症性サイトカイン（すなわち、IL-2, IL-4, IL-6）及びリューコトリエンに関連し、このことは、適合する免疫系の関与を示唆する。試験化合物、例えばZven1及び/又は変異体又はアンタゴニストは、症状及び病変に対するその効果を評するために投与される。
【０２７６】
誘発例２：酢酸（齧歯動物；ウサギにおける）：
齧歯動物又はウサギ中への希釈された酢酸の直腸内投与は、上皮損傷及び高められた透過性、続く急性粘膜/経壁炎症を導く。これはたぶん、容易に使用でき、そして粘膜損傷及び創傷治療の後、炎症の初期現象の研究のために価値がある再生可能モデルである。試験化合物、例えばZven1及び/又はZven2、及び/又は変異体又はアンタゴニストは、症状及び病変に対するその効果、及び治療の程度及び速度を評価するために投与される。
【０２７７】
過敏性腸症候群（IBS）の動物モデル：Mager and Collins. Gastroenterol. 122: 2032-2048 (2002) を参照のこと。それらのモデルは、CNS−指図された機構（“ストレス記憶”モデル）により主に介在されるそれらのモデル、及び腸−指図された病因学（“痛みの記憶”及び“免疫記憶”モデル）により主に介在されるそれらのモデルに分割され得る。
【０２７８】
腸膨満に関連する痛みの評価のモデル（ラット：ウサギ：イヌ）：
徴候： IBD、IBS、胃不全麻痺、腸閉塞、消化不良。
動物は、近位結腸及び横紋筋上に移植された電極、及び脳の側脳室に移植されたカソードを手術により供給される。直腸の膨満が直腸に挿入されたバルーンの膨張により行われ、そして特徴的粘度計応答を誘発する圧力が測定される。試験化合物、例えばZven1及び/又は Zven2, 及び/又は変異体又はアゴニストが、適切な経路（p. o. , i. p., s. c. , i. v. , 又は i. m.）を通して、及び膨満の前、適切名時点（すなわち、i.p.又はi.c.v.の場合、約20分）で投与される。試験化合物が、結腸運動性、腹部収縮、及び内臓の痛みに影響を及ぼすその能力について評価される。
【０２７９】
さらに、腸の炎症に関連する障害が、Zven1、Zven2、その変異体、フラグメント、アゴニスト及びアンタゴニストにより処理される。例えば、過敏性腸症候群（IBS）は、非常に広い範囲の症状（痛み；一定の下痢及び/又は便秘；異常な胃腸運動性）により特徴づけられる。病因を正確に指摘することは困難であり、そしてストレス、遺伝学、及び/又は炎症に関連する成分を有することができる。同様に、本発明の抗−Zven1及び抗−Zven2分子、例えば抗体及び結合パートナーは、炎症性腸疾患（大腸炎及びクローン病を包含する）を処理するために使用され得る。IBDはIBSよりも重症であり、そして下痢、苦痛及び栄養不良により特徴づけられる。IBDを有する患者は、胃腸癌の高められた危険性をしばしば有する。
上記に記載されるように、胃機能を測定する多くのインビボモデルが存在する。少数のそれらのモデルが下記に提供される。
【０２８０】
モデル１：実験哺乳類におけるフェノールレッド/メチルセルロースを用いての胃排出能及び腸通過の速度及び程度を測定するための方法：
断食された動物が、適切な経路（p. o. , i. p. , i. v. , s. c. , i. m.）により、Zven1（又は他のZven剤、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラ）を与えられる。適切な時点で、メチルセルロース及びフェノールから成る、非栄養、半固形状食事が、胃管栄養法により投与され、そして動物が、この食事投与に続いて、設定された時点で殺害される。通過が、胃腸管にそって企画された領域からのフェノールレッドの回収及び分光光度定量により評価される。胃腸管における色素回収の期間は、興味ある徴候及び腸部位に依存して、10〜180分であり得る。このモデルは、胃排出能及び/又は腸通過に対する他のプロキネチック薬物の効能を評価するために広く使用されて来た。
【０２８１】
モデル２：実験動物におけるアラビアガム/木炭食事を用いての腸通過の速度及び程度を測定するための方法：
断食された動物が、適切な経路（p. o. , i. p. , i. v. , s. c. , i. m.）により、Zven1（又は他のZven剤、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラ）を与えられる。適切な時点で、アラビアガム及び木炭から成る、半固形状食事が、胃管栄養法により投与され、そして動物が、この食事投与に続いて、設定された時点で殺害される（Puig and Pol. J. Phannacol. Experifraent. Therap. 287 : 1068 (1998)）。通過は、木炭食事が腸の合計距離の割合として移動する距離により評価される。胃腸管における通過測定の期間は、興味ある徴候及び腸部位に依存して、10〜180分であり得る。このモデルは、腸通過に対する他のプロキネチック薬物の効能を評価するために広く使用されて来た。
【０２８２】
モデル３：実験齧歯動物におけるポリスチレンビーズ（消化できない固形物）を用いての胃排出能の速度及び程度を測定するための方法：
胃排出能は、p. o. , i. p. , s. c. , i. v. 又は i. m.投与路を通してのZven1（又はもう１つのZven、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラ）に応答して、断食された（24時間）雄又は雌の実験齧歯動物の胃からの特定の直径（ラットン関しては、1mm）のポリスチレンビーズの排出を決定することにより評価される。
【０２８３】
ポリスチレンビーズが胃管栄養法により投与され、そして前に記載のようにして排出能について評価される（Takeuchi など. Digest. Dis. Sci. 42; 251-258 (1997)）。動物は、ペレット投与後（例えば、20−180分）、特定時点で殺害され、そして胃が除去される。胃に残存するペレットの数が計数される。対照研究においては、90％のペレットが、30分後、胃に残存することが予測され、そして３時間後、胃に10％以下のペレットが残存する。このモデルは、実験齧歯動物におけるプロキネチック薬物の胃排出能効率を評価するために広く使用されて来た。
【０２８４】
モデル４：トレーサーとしてアセトアミノフェンを用いて、実験哺乳類における液体又は固体試験食事の胃排出能の速度及び程度を測定するための方法：
断食された動物が、トレーサーとしてアセとアミノフェンを含む液体又は固体食事を与えられる。試験化合物（例えば、Zven1）が、試験食事の投与の前又は後、p. o. , i. v., i. p. , s. c. , 又は i. m.投与される。血液サンプルが、0〜120分間隔で得られ、そしてアセトアミノフェンの血漿濃度（胃排出能の測定である）が、HPLCにより測定される。これは、例えばTrudel など Peptides 24: 531-534 (2003)に記載される。
【０２８５】
モデル５：実験齧歯動物における固体食事の胃排出能を測定するための方法：
マウス又はラット（“齧歯動物”）が４種のグループに分離される（Zven1−；正の対照−［エリトロマイシン、メトクロプラミド、又はシサプリド］；負の対照−［カエルレイン］；及びビークル−処理されたグループ）。個々のグループは約10匹の動物を含む。それらは、24時間、食料を断たれたが、しかし断食の間、水へは自由に接近できる。動物は１つの檻当たり１匹が内容され、そして床格子が寝床又は糞との接触を妨げるために檻に配置される。断食された動物が、次の投与路（経口：i. p. , i. v. , s. c. , 又は i. m.）の１つを通して、上記剤の１つにより処理される。動物は、試験剤の投与に続いて又はその前、適切な時点で、それら自身の檻（寝床は除去されている）において、設定された時間（例えば、１時間）、前もって計量されたPurina食事を個々に導入される。食物摂取の最後で、動物は、追加の設定された時間、食物及び水を与えないでそれら自身の檻に収容される。
【０２８６】
次に、それらは安楽死され、腹腔が開かれ、そして胃が、幽門及び噴門を固定した後、除去される。胃が計量され、開放され、そして水道水により胃内容物が洗浄される。胃壁がぬぐい乾燥され、そしてからの胃が再び計量される。胃内溶物が集められ、乾燥され、そして計算される。胃に含まれる食物の量（ｇで測定される）が、内容物を含む胃の合計重量と、内容物が除去された後の胃壁の重量との間の差異として計算される。檻におけるペレット及び裂片の重量がまた、摂食期間の最後で測定される。動物により摂取された固体食物が、摂取前のPurina食事の重量と、摂食期間の最後でのペレット及び裂片の重量との間の差異により決定される。企画された期間、胃排出能が次の等式に従って計算される：胃排出能の％＝（１−胃内容物/食物摂取）×100。このモデルは、固体食事の胃排出能を評価するために文献において広く使用されて来た（Martinez など. J. Phanziacol. Experimeyit. Ther. 301 : 611-617 (2002)）。
【０２８７】
モデル６：実験哺乳類における固体試験食事の胃排出能の速度及び程度を測定するための方法：
断食された動物は、標準の食事と共に硫酸バリウムスフェロイドを受け、続いて、食事の前又は後、試験化合物、例えばZvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラを投与される（p. o., i. v. , i. p. , s. c. , 又は i. m．を通して）。胃排出能が、X−線位置決定の手段により測定され、そして経路が少なくとも15分〜２時間ごとにモニターされる。この方法は例えば、Takeda など. Jpyz. J. Pharinacol. 81 : 292-297 (1999)に記載される。
【０２８８】
モデル７：実験齧歯動物における結腸推進運動性を測定するための方法：
これは、Martinez et al. J. Phannacol. Experi7ment.'Ther. 301 : 611-617 (2002)に記載されるように、実験齧歯動物における結腸推進運動性に対する化合物の薬理学的効果を示し、そして特徴づけるために使用される。この試験は、反射弓に対する薬物効果を示す、遠位結腸からのガラスビーズの反射推進に基づかれている。この試験は、下痢が副作用であるかどうかを評価することにおいて有用である。マウス又はラットは、適切な経路（i. p., s. c. , i. m. , p. o. , i. v.）による試験化合物、例えばZvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラ、又はビークルの投与の前１時間、断食され、続いて30分後（又は他の適切な時間）、遠位結腸中にガラスビーズが挿入される。齧歯動物は、識別のために印を付けられ、そして観察のために大きなガラスビーカー（又は他のもの）に配置される。ビーズの排除のために必要とされる時間が個々の齧歯動物に対して示される。
【０２８９】
モデル８：イヌにおける胃腸運動活性を測定するためのモデル：
イヌを麻酔し、そして腹腔が開放される。管腔外力変換器（収縮を測定するためのセンサー）が、次の５つの部位上に縫合される：胃の噴門端、幽門輪に対して３cm近位、十二指腸、幽門輪に対して5cm遠位、空腸、幽門輪に対して70cm遠位、回腸、回腸−結腸連結に対して5cm近位、及び回腸−結腸連結に対して5cm遠位。それらの力変換のリード線が、腹腔から取られ、そして次に、コネクターが連結される、肩甲骨間で行われる皮膚切開を通して引き出される。手術の後、ジャケット保護体が、コネクターを保護するためにイヌ上に置かれる。
【０２９０】
胃腸運動活性の測定が、手術の後、２週で開始される。任意の測定に関しては、テレメーター（電波データ伝達機）が、胃腸管の個々の部位で収縮運動を決定するためにコネクターに連結される。データが、分析のためにテレメーターを通してコンピューターに貯蔵される。試験化合物、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラが、胃腸運動活性に影響を及ぼすその能力を評価するために適切な時点で適切な経路（p. o. , i. v. , i. p. , s. c. , i. m.）を通して投与される。これは、正常なイヌ、又は胃不全麻痺/腸閉塞が誘発されているイヌにおいて行われ得る。上記方法は、Yoshida. and Ito. J. Phannacol. Experisnent. Therap. 257, 781-787 (1991) 及び Furuta など. Biol. Phare. Bull. 25 : 103-1071 (2002)におけるそれらの方法の変法である。
【０２９１】
嘔吐を評価するためのモデル（ケナガイタチ）：
徴候：嘔吐（主に、又は胃不全麻痺の結果として）。
試験化合物の抗−嘔吐活性が、ケナガイタチ（マウス及びラットは嘔吐しないので）においてシスプラチン−又はトコンシロップ−誘発された嘔吐を阻害するその能力により試験される。このモデルにおいては、吐気及び嘔吐の開始は、シスプラチン（200mg/m.sup.2i.p.）の投与後、約１時間で生じる。シスプラチンに応答しての最初の吐気で、試験化合物、例えばZvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラが投与され（例えば、i. p. , p. o., i. v. , s. c. , i. c. v.）、そして嘔吐に対するその効果が適切な対照（例えば、水）との比較により決定される。嘔吐を誘発するためにトコンを用いる場合、試験化合物は、トコンの供給の前、適切な時点で与えられる。
【０２９２】
最初の吐気までの潜伏時間、最初の嘔吐までの潜伏時間及び吐気及び嘔吐状態の数が60分間にわたって記録される。データは、最初の吐気又は嘔吐までの平均潜伏時間（分）、嘔吐を示されなかった動物及び嘔吐を示した動物に基づいて、ケナガイタチ当たりの嘔吐状態の平均数、及びトコンに反応したまま存在する動物（“応答体”）により示される吐気/嘔吐の平均数として示される。嘔吐を示さないケナガイタチは、後で計算から除かれる。［すなわち、（+-）シス−３−（２−メトキシベンジルアミノ）−２−フェニルピペリジンは、3mg/kg i.p.の用量で投与される場合、抗−嘔吐活性を示した。］
【０２９３】
高いケモカインレベル及び好中球浸潤が、局部急性炎症の特徴である。上皮細胞損傷及び好中球による浸潤が潰瘍性大腸炎の局部炎症工程において特に卓越する。従って、Zven1アンタゴニスト又はZven2アンタゴニストが、抗−炎症剤として使用され得る。例示のように、Zven1アンタゴニストは、高められた好中級浸潤又はケモカイン発現に関連する炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎及び過敏性腸症候群）を処理するための抗−炎症剤として使用され得る。Zven1アンタゴニストはまた、脳の炎症（例えば、脳脊髄炎、多発性硬化症、及び同様のものに関連する）を処理するためにも使用され得る。例示的Zven1アンタゴニストは、配列番号２のアミノ酸残基23〜108のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２のアミノ酸残基28〜108のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号５のアミノ酸残基20〜105のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する抗体又は抗体フラグメントである。
【０２９４】
神経障害及び知覚欠損は、痛み及び感度の損失を包含し、そして糖尿病、多発性硬化症及び高血圧のような疾病に関連する。脳において発現されるタンパク質として、Zven1のアンタゴニストは痛み及び知覚損傷を処理するために有用である。例えば、Zven1アンタゴニストは、糖尿病性神経障害を処理するために、局部的に、中枢神経的に、又は全身的に供給され得る。
【０２９５】
Zven1ポリペプチド及び他のZven1アゴニストは、種々の形の癌、HIV感染、又は免疫障害、例えば慢性肉芽腫性疾患又はChedick Higashi症侯群を有する患者において免疫機能を増強するために使用され得る。Zven1ポリペプチド及び他のZven1アゴニストはまた、痛み、例えば内臓痛又は重度の頭痛（例えば、片頭痛）を軽減するためにも使用され得る。
例５に示されるように、Zven1及びZven2は脈管形成を刺激することができる。従って、Zven1、Zven2、Zven１アゴニスト及びZven2アゴニストは、新しい血管の成長を誘発するために使用され得る。それらの分子は、単独で、又は他の脈管形成因子、例えば血管内皮成長因子と組合して、哺乳類対象に投与され得る。
【０２９６】
Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラはまた、哺乳類における感作を高めるためにも使用され得る。例えば、Zven1及びZven2のオルト体、Bv8が、熱及び機械的刺激に対する末梢侵害受容器の感作をもたらすラットにおいてPK−R1及びPK−R2受容体を刺激するために使用された。Negri, L. など., Brit. J. Phann. 137 : 1147-1154,2002を参照のこと。従って、アゴニストを包含する、本発明のZven1及びZven2ポリペプチドは、局部的に又は局所的に、全身的に又は中心的に供給される場合、感作（痛み、熱又は機械的）を高めるために使用され得る。また、本発明のポリペプチドは、神経伝達物質に対する生存するニューロンからの機能を改良するために脳細胞の感受性を増強するために投与され得、そして従って、パーキンソン病又はアルツハイマー病において効果的である。Zven1ポリペプチド及び他のZven1アゴニストはまた、痛み、例えば内臓の痛み、又は重度の頭痛（例えば、片頭痛）を緩和するためにも使用され得る。
【０２９７】
同様に、患者が痛みに対する高められた感受性を有する場合、Zven1及びZven2に対するアンタゴニストが、神経障害を有する患者における痛みの感覚を低めるために使用され得る。例えば、糖尿病性神経障害を有する患者は、慢性の増強された痛みを有し、Zven1に対するアンタゴニストがその痛みを制限し、妨げ、又は低めるために有用である。
【０２９８】
意識のある雄のSprague−Dawleyラットにおいて遠隔測定法を用いて、200μg/kgのi.v.用量のZven1に応答しての血圧又は心拍の有意な変化は存在しなかった。それらのラットからの便粘稠は、Zven1投与の後、24時間、変化しないように見えた。ラットは、それらの用量のZven1により影響されるとは思わない。マウスがi.p.注射により10,000μg/kgのZven1を投与される場合、外見上の影響は報告されていない。
【０２９９】
本発明のZvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラはまた、食品へのサプリメントとしても使用され得る。Zven2ポリペプチドは、ウシ乳から精製されて来た。Masuda Y.など., Bioc. and Biophys. Res. Cornm. 293 : 396-402,2002を参照のこと。さらに、高められた胃腸収縮性は、改良された代謝及び体重の増加の助けとなる。経口投与され得るタンパク質としての、Zven1又はZven2、又はアゴニスト、変異体及び/又はフラグメントの組合せは、摂食プログラムへのサプリメント又はアジュバントとして有用であり、ここで哺乳類対象は、食欲不振及び/又は体重増加を有する。そのような状態は、例えば成長の失敗、悪液質、及びるいそう症候群として知られている。本発明のポリペプチドは、より従来の型の食物の幼児哺乳類による消化のためへの適合において有用であり得る。
【０３００】
一般的に、投与されるポリペプチド、タンパク質又はペプチドの用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。典型的には、約１pg/kg〜10mg/kg（剤の量/患者の体重）の範囲でのZven活性を有する分子の用量（但し、それよりも低いか又は高い用量もまた、環境が指図する場合、投与され得る）を、受容体に供給することが所望される。
56℃へ30分間、加熱されるZven1ポリペプチドは、レポーターアッセイにより測定される場合、いくらかの活性を維持した。例10を参照のこと。従って、本発明のポリペプチドは効果的に経口投与され得る。
【０３０１】
Zven活性を有する分子の対象への投与は、局部カテーテル、吸入を通しての灌流によるか、坐剤として又は直接的な病変内注入による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与する場合、投与は連続的注入によるか、又は一回又は複数回のボーラスによることができる。他方では、Zvenポリペプチド、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、調節された開放配合物として投与され得る。
【０３０２】
投与の追加経路は、経口、皮膚、粘膜、肺及び経皮を包含する。経口供給は、ポリエステル微小球、ゼイン微小球、プロテイノイド微小球、ポリシアノアクリレート微小球及び脂質基剤システムのために適切である（例えば、DiBase and Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Protein”, in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p.255-288 (Plenum Press 1977) を参照のこと）。鼻腔内供給の実行可能性は、インスリン投与のそのような態様により例示される（例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1997) を参照のこと）。Zven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラを含んで成る乾燥又は液体粒子は、乾燥−粉末分散機、液体エーロゾル発生器又はネブライザーの助けにより調製され、そして吸入され得る（例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton など., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999) を参照のこと）。
【０３０３】
このアプローチは、エーロゾル化されたインスリンを肺に供給する電動吸入器であるAERX糖尿病治療システムにより例示される。研究によれば、48,000kDaほどの大きなタンパク質が、経皮投与の実行可能性を例示する、低周波超音波の助けにより治療濃度で皮膚を通して供給されることが示された（Mitragotriなど., Science 269: 850 (1995)）。エレクトロポレーションを用いての経皮供給は、例えばZven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラを投与するもう１つの手段を提供する（Pottsなど., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)）。
【０３０４】
Zvenタンパク質はまた、例えばリポソーム調節物、ゲル、軟膏として、接着剤、補綴、又は包帯の成分として、及び同様にして局部的に適用され得る。
ケモカインは、組織修復を促進し、そして早めるので、Zven1, Zven2, 及びそれらのアゴニスト、フラグメント、変異体及び/又はキメラは、疾病の解決において有益な役割を有することができる。例えば、局部投与は、創傷治癒適用、例えば過度の瘢痕及び顆粒化組織の防止、及び手術に続く癒合の防止のために有用である。
【０３０５】
Zven1又はZven2活性を有する分子を含んで成る医薬組成物は、液体形、エアロゾル、又は固体形で供給され得る。Zven1又はZven2活性を有するタンパク質は、医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分との接合体として投与され得る。例示のように、Zven1−ポリエチレングリコール接合体は、インターフェロンの循環半減期を高めるために、及びポリペプチドの免疫原性を低めるために有用である。リポソーム−封入された配合物を包含する液体形は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形、例えばミニ浸透ポンプ又は移植体を包含する。他の投与形は、例えばAnsel and Popovich, Pharnnaceutical Dosage Fonns and Drug Delivery Systen is, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Phannaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995), 及び Ranade and Hollinger, Drug Delivery Syste7ns (CRC Press 1996)により示されるように、当業者により考案され得る。
【０３０６】
Zven1又はZven2活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はヘプチドを含んで成る医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って配合され得、それによれば、治療用タンパク質が医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。組成物は、その投与が受容体患者により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。無菌リン酸緩衝溶液は、医薬的に許容できるキャリヤーの1つの例である。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている。例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) を参照のこと。
【０３０７】
治療のためには、抗−Zven1又はZven2活性を有する分子及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的に有効な量で患者に投与される。Zven活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチド、及び医薬的に許容できキャリヤーの組み合わせは、その投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的に有効な量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体患者の生理学において検出される変化をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０３０８】
例えば、本発明は、抗−Zven、例えばアンタゴニスト、抗体、タンパク質、変異体及びフラグメントポリペプチドを含んで成る組成物を患者に投与する段階を含んで成る、胃腸収縮性、胃排出能及び/又は腸通過を高めるための方法を包含する。インビボアプローチにおいては、前記組成物は、治療的有効量で哺乳類対象に投与される医薬組成物である。
【０３０９】
抗−Zven活性を有する分子を含んで成る医薬組成物は、液体形又は固体形で供給され得る。リポソーム−封入された配合物を包含する液体形は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形、例えばミニ浸透ポンプ又は移植体を包含する。他の投与形は、例えばAnsel and Popovich, Pharnnaceutical Dosage Fonns and Drug Delivery Systen is, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Phannaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995), 及び Ranade and Hollinger, Drug Delivery Syste7ns (CRC Press 1996)により示されるように、当業者により考案され得る。
【０３１０】
Zven1又はZven2医薬組成物は、Zven1又はZven2、Zven1又はZven2アゴニスト、又はZven1又はZven2アンタゴニスト（例えば、抗−Zven1又はZven2抗体、又は抗体フラグメント）を含んで成る容器を含むキットとして供給され得る。例えば、Zven1又はZven2は、一回又は複数回用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成されるであろう無菌粉末の形で供給され得る。他方では、そのようなキットは、治療用ポリペプチドの投与のために乾燥−粉末分散器、液体エアロゾル発生器又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の表示及び使用法に基づく情報を含んで成る。さらに、そのような情報は、Zven1又はZven2組成物がZven1又はZven2に対する既知の過敏性を有する患者に禁忌を示す情報を包含することができる。
【０３１１】
12．Zvenヌクレオチド配列の治療的使用：
本発明は、前のセクションに論じられるように、Zven 活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのZven アミノ酸配列を、その必要な対象に供給するためへのZven ヌクレオチド配列の使用を包含する。さらに、Zven遺伝子発現を阻害する治療用発現ベクター、例えばアンチセンス分子、リボザイム又は外部案内配列分子が供給され得る。
【０３１２】
Zvenを発現する組換え宿主細胞の使用、Zvenをコードする裸の核酸の供給、Zvenをコードする核酸分子と共にカチオン性脂質キャリヤーの使用、及びZvenを発現するウィルス、例えば組換えレトロウィルス、組換えアデノ−関連ウィルス、組換えアデノウィルス、及び組換えヘルペス単純ウィルス（HSV）の使用を包含する、Zven遺伝子を対象に導入するための多くのアプローチが存在する（例えば、Mulligan, Science 260: 926 (1993), Rosenberg など., Science 242: 1575 (1988), LaSalle など., Science 259: 988 (1993), Wolffなど., Science 247: 1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3: 203 (1991) を参照のこと）。エクスビボアプローチにおいては、細胞が対象から単離され、Zven遺伝子を発現するベクターによりトランスフェクトされ、そして次に、対象中に移植される。
【０３１３】
Zven遺伝子の発現をもたらすために、Zven遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、遺伝子転写を制御するために、コアプロモーター及び任意には、調節要素に作用可能に連結される発現ベクターが構成される。発現ベクターの一般的な必要性は、上記に記載されている。
【０３１４】
他方では、Zven遺伝子は、組換えウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクター（例えば、Kass-Eister など., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 11498 (1993), Kolis など., proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91: 215 (1994), Liなど., Hum. Gene Ther. 4;403 (1993), Vincent など., Nat. Genet. 5:130 (1993), and Zabner など., Cell 75: 207 (1993)）、アデノウィルス−関連ウィルスベクター（Flotteなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613 (1993)）、アルファウィルス、例えば“Semliki Forest ウィルス及びSindbisウィルス（Hertz and Huang, J. Vir. 66: 857 (1992), Raju and Huang, J.vir. 65:2501 (1991), 及びXiongなど., Science 243: 1188 (1989)）、ヘルペスウィルスベクター（Koeringなど., Hum. Gene. Therap. 5: 457 (1994)）、ポックスウィルスベクター（Ozakiなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 653 (1993), Panicali and Paoietti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927 (1982)）、ポックスウィルス、例えばカナリヤポックスウィルス又はワクシニアウィルス（Fisher-Hochなど., Proc. Hatl. Acad. Sci. USA 86: 317 (1989) 及びFlexner など., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86 (1989)）、及びレトロウィルス（Baba など., J. Neurosurg 79: 729 (1993), Ram など., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiyaなど., J. Neurosci. Res. 33: 493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860 (1993) 及びAndersonなど., アメリカ特許第5,399,346号）を用いて供給され得る。種々の態様においては、ウィルスベクター自体又はウィルスベクターを含むウィルス粒子のいずれかが、下記に記載される方法及び組成物に使用され得る。
【０３１５】
１つシステムの例示として、アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは、異種核酸分子の供給のための十分に特徴づけられた遺伝子トランスファーベクターである（Beckerなど., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)）。アデノウィルスシステムは、次のいくつかの利点を提供する：（ｉ）比較的大きなDNA挿入体を収容する能力、（ii）高い力価に増殖する能力、（iii）広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び（iV）多くの異なったプロモーター、例えば遍在性で、組織特異的な、及び調節できるプロモーターと共に使用される能力。さらに、アデノウィルスは、そのウィルスが血流において安定しているので、静脈内注射により投与され得る。
【０３１６】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスベクターを用いて、挿入体は、直接的な連結により、又は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスDNA中に組み込まれる。典型的なシステムにおいては、必須E1遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、E1遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内供給される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。E1遺伝子欠失を有するアデノウィルス供給システムが宿主細胞において複製しない場合、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするであろう。宿主細胞はまた、その対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、異種タンパク質を分泌するであろう。分泌されたタンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高く血管化された肝臓）から循環に侵入するであろう。
【０３１７】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、E1−欠失され、そしてさらに、E2A又はE4の欠失を含む（Luskyなど., J. Virol. 72: 2022 (1998); Raper など., Human Gene Therapy 9: 671 (1998)）。E2bの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Amalfitanoなど., J. Virol. 72:926 (1998)）。完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種DNAの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（gutless）”アデノウィルスの生成は、異種DNAの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Yeh and Perricaudet, FASEB J. 11: 615 (1997) を参照のこと）。
【０３１８】
治療用遺伝子を発現できる組換えウィルスの高い力価のストックが、標準方法を用いて、感染された哺乳類細胞から得られる。例えば、組換えHSVは、Vero細胞において、Brandtなど., J. Gen. Virol. 72: 2043 (1991), Herold など., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991), Grauなど., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 30: 2474 (1989), Brandiなど., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), 及びBrawn and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Human Press 1997) により記載のようにして、調製され得る。
【０３１９】
他方では、Zven遺伝子を含んで成る発現ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより、対象の細胞に導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felgner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に化学的に得られる。標的化されたペプチド（例えば、ホルモン又は神経伝達物質）、タンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０３２０】
エレクトロポレーションは、Zven核酸分子の投与のもう１つの態様である。例えば、Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16: 867 (1998) は、筋肉中への遺伝子トランスファーのためへのインビボエレクトロポレーションの使用を示している。
遺伝子療法へのもう1つのアプローチにおいては、治療用遺伝子は、Zvenの発現を阻害するZvenアンチセンスRNAをコードすることができる。アンチセンス分子のための適切な配列は、本明細書に開示されるZvenのヌクレオチド配列から誘導され得る。
【０３２１】
他方では、調節要素がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結される発現ベクターが構成され得る。リボザイムは、mRNA分子における一定の標的配列に向けられるエンドヌクレアーゼ活性を発現するよう企画され得る（例えば、Draper and Macejak, アメリカ特許第5,496,698号、McSwiggen, アメリカ特許第5,525,468号、Chowrira and McSwiggen, アメリカ特許第5,631,369号及びRobertson and Goldberg, アメリカ特許第5,225,337号を参照のこと）。本発明においては、リボザイムはZven mRNAと結合するヌクレオチド配列を包含する。
【０３２２】
もう１つのアプローチにおいては、調節要素がZtnfr12遺伝子をコードするmRNA分子のRNアーゼP−介在性切断を促進できるRNA転写体の生成を方向づける発現ベクターが構成され得る。このアプローチによれば、外部案内配列が、細胞リボザイムにより続いて切断される、特定種の細胞内mRNAに内因性リボザイム、すなわちRNアーゼPを向けるために構成され得る（例えば、Altmanなど., アメリカ特許第5,168,053号、Yuanなど., Science 263: 1269 (1994), Paceなど., WO96/18733号、Georgeなど., WO96/21731号及びWemerなど., WO97/33991号を参照のこと）。好ましくは、前記外部案内配列は、Zven mRNAに対して相補的な10〜15個のヌクレオチド配列、及び3’−NCCAヌクレオチド配列（ここで、Nは好ましくはプリンである）を含んで成る。外部案内配列転写体は、mRNAと相補的外部案内配列との間での塩基対の形成により、標的化されたmRNA種に結合し、従って、前記塩基対合された領域の5’側に位置するヌクレオチドでのRNアーゼPによるmRNAの切断を促進する。
【０３２３】
一般的に、Zvenヌクレオチド酸配列を有する治療用ベクター、例えば組換えウィルスを含んで成る組成物の用量は、対照の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。治療用ベクターの適切な投与経路は、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、及び腫瘍を含む腔中への注射を包含する。
【０３２４】
本発明のウィルスベクター、非ウィルスベクター又はウィルス及び非ウィルスベクターの組み合わせを含んで成る組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知方法に従って配合され得、それによれば、ベクター又はウィルスは、医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。上記で示されるように、組成物、例えばリン酸緩衝溶液は、その投与が受容体対象により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), 及びGilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) を参照のこと）。
【０３２５】
治療のためには、治療用遺伝子ベクター、又はそのようなベクターを含んで成る組換えウィルス、及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的有効量で対象に投与され得る。発現ベクター（又はウィルス）及び医薬的に許容できるキャリヤーの組み合わせは、投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的有効量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体対象の生理学において検出できる変化をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０３２６】
治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスにより処理される対象がヒトである場合、治療は好ましくは、体細胞遺伝子治療である。すなわち、治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスによるヒトの好ましい処理は、ヒト生殖細胞系の一部を形成し、そして次の世代に通され得る核酸分子を細胞中に導入すること（すなわち、ヒト生殖系遺伝子治療）を必要としない。
【０３２７】
13．核酸プローブによるZven遺伝子発現の検出：
核酸分子は、生物学的サンプルにおけるZven1又はZven2遺伝子の発現を検出するために使用され得る。そのようなプローブ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号１のヌクレオチド配列の補体又はそのフラグメントを有する一本鎖核酸分子を包含する。プローブ分子は、DNA, RNA, オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。
【０３２８】
例示的プローブは、配列番号１のヌクレオチド66−161のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド288−389のヌクレオチド配列、又はそのようなヌクレオチド配列の補体の一部を含んで成る。適切なプローブの追加の例は、配列番号１のヌクレオチド354−382又はその一部から成るプローブである。本明細書に使用される場合、用語“一部”とは、少なくとも８個のヌクレオチド〜少なくとも20個又はそれ以上のヌクレオチドを言及する。
【０３２９】
例えば、配列番号１又は配列番号４のヌクレオチド配列の一部を含んで成る核酸分子は、活性化された好中球を検出するために使用され得る。そのようなう分子はまた、病原体に対する好中球の応答を調節する治療又は予防剤を同定するためにも使用され得る。
基本的アッセイにおいては、一本鎖プローブ分子が、プローブと標的Zven RNA種との間の塩基対合を促進する、温度及びイオン強度の条件下で、生物学的サンプルから単離されたRNAと共にインキュベートされる。末結合のプローブをハイブリダイズされた分子から分離した後、ハイブリッドの量が検出される。
【０３３０】
RNA検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法は、ノザン分析及びドット/スロット  ブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、Ausubel 前記、p４−１〜４−27、及びWuなど. (eds.)、”Analysis of Gene Expression at the RNA Level”, in Methods in Gene Biotechnology, p. 225-39, CRC Press, Inc., 1997を参照のこと）。核酸プローブは、放射性同位体、例えば32P又は35Sにより検出できるようラベルされ得る。他方では、Zven RNAは、非放射性ハイブリダイゼーション方法により検出され得る（例えば、Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993を参照のこと）。典型的には、非放射能性検出は、クロモゲン又は化学ルミネセンス基質の酵素転換により達成される。例示的な非放射性成分は、ビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニンを包含する。
【０３３１】
Zven1オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断のためにも有用である。例示として、18F−ラベルされたオリゴヌクレオチドが対象に投与され、そして陽電子射出断層撮影法により可視可され得る（Tavitian など., Nat. Med. 4: 467, 1998）。
【０３３２】
多くの診断方法は、検出方法の感度を高めるために、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を利用する。PCRを実施するための標準技法は良く知られている（一般的には、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications, Humana Press, Inc., 1993; Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer, Humana Press, Inc., 1996; Hanausek and Walaszed (eds.), Tumor Marker Protocols, Humana Press, Inc., 1998; Lo (ed.), Clinical Applications of PCR, Humana Press, Inc., 1998及びMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis, Humana Press, Inc., 1998を参照のこと）。
【０３３３】
診断アッセイについてのPCRの１つの変法は、逆転写酵素−PCR（RT−PCR）である。RT−PCR技法においては、RNAが生物学的サンプルから単離され、cDNAに逆転写され、そしてそのcDNAがZven1プライマーと共にインキュベートされる（例えば、Wuなど. (eds.), “Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR”, in Methods in Gene Biotechnology, P. 15-28, CRC Press, Inc. 1997を参照のこと）。次に、PCRが行われ、そして生成物が標準技法を用いて分析される。
【０３３４】
例示のように、RNAは、例えば上記グアニジニウム−チオシアネート細胞溶解を用いて、生物学的サンプルから単離される。他方では、固相技法が、細胞溶解物からmRNAを単離するために使用され得る。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、dTの短いホモポリマー、又はZven1アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたRNAにより感作され得る。オリゴ−dTプライマーは、対照の標的配列を提供することができる種々のmRNAヌクレオチド配列が増幅される利点を提供する。Zven1配列は、典型的には20個の長さの塩基である２種のフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
【０３３５】
PCR増幅方法は、種々のアプローチを用いて検出され得る。例えば、PCR生成物は、ゲル電気泳動により分別され、そして臭化エチジウム染色により可視化される。他方では、分別されたPCR生成物は、膜に移行され、検出できるようにラベルされたZven1プローブによりハイブリダイズされ、そしてオートラジオグラフィーにより試験され得る。追加の他のアプローチは、化学ルミネセンス検出及びC−TRAK比色アッセイを提供するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデオキシリボ核酸三ミリ酸の使用を包含する。
【０３３６】
Zven1発現の検出のためのもう1つのアプローチは、サイクリングプローブ技法（CDT）であり、ここで一本鎖DNA標的物が過剰のDNA−RNA−DNAキメラプローブと結合し、複合体を形成し、RNA部分がRNアーゼHにより分化され、そして分解されたプローブの存在が検出される（例えば、Beggsなど., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996, 及び  Bekkuouiなど., Biotechniques 20: 240, 1996を参照のこと）。Zven1配列の検出のための他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（CATCH）及びリガーゼ鎖反応（LCR）のようなアプローチを利用することができる（例えば、Marshallなど., アメリカ特許第5,686,272号（1997）、Dyerなど., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Ehrichtなど., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997; 及びChadwickなど., J. Viro. Methods 70:59, 1998を参照のこと）。他の標準方法も当業者に知られている。
【０３３７】
Zven1プローブ及びプライマーはまた、組織サンプルにおけるZven1遺伝子発現を検出し、そして位置決定するためにも使用され得る。そのような現場ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Choo (ed.), In situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; We など. (eds.), “Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH), “ in Methods in Gene Biotechnology, pages 259-278, CRC Press, Inc., 1997; 及びWuなど. (eds.), “Localizaion of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH),” in Methods in Gene Biotechnology, pages 279-289, CRC Press, Inc., 1997を参照のこと）。種々の追加の診断アプローチも当業者に良く知られている（例えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996; 及びElles, molecular Diagnosis of Genetics Diseases, Humana Press Inc., 1996を参照のこと）。
【０３３８】
下記例14は、患者サンプルにおけるIBDを検出し、そしてモニターするために使用され得る方法を示す。上記で論じられるように、生物学的サンプル、例えば生検検体は、Zven1又はZven2がサンプルにおいてアップレギュレートされるかどうかを決定するために、配列番号１又は配列番号４のポリヌクレオチド配列の存在についてスクリーンされ得る。
【０３３９】
14．抗−Zven1抗体によるZven1タンパク質の検出：
本発明は、Zven1の存在、及び特にZven1のアップレギュレーションについてインビトロで生物学的サンプルをスクリーンするためへの抗−Zven1抗体の使用を企画する。1つのタイプのインビトロアッセイにおいては、抗−Zven1抗体が液相において使用される。例えば、生物学的サンプルにおけるZven1の存在は、生物学的サンプルと、微量のラベルされたZven1及び抗−Zven1抗体とを、Zven1とその抗体との間の結合を促進する条件下で混合することによって試験され得る。サンプルにおけるZven1及び抗−Zven1の複合体が、前記複合体を、抗体、例えばFc抗体又はスタフィロコーカスタンパク質Aと結合する同定されたタンパク質とを接触することによって、反応混合物から分離され得る。生物学的サンプルにおけるZven1の濃度は、抗体に結合されるラベルされたZven1の量に反比例し、そして遊離ラベルにされたZven1の量に直接的に関連する。抗−Zven2抗体は、同じか又は類似する態様で使用され得る。
【０３４０】
他方では、抗−Zven1抗体が固相キャリヤーに結合されるインビトロアッセイが行われ得る。例えば、抗体が、不溶性支持体、例えばポリマー−被覆されたビーズ、プレート又は管に抗体を結合するために、ポリマー、例えばアミノデキストランに結合され得る。他の適切なインビトロアッセイは、当業者に明らかであろう。
【０３４１】
もう１つのアプローチにおいては、抗−Zven1抗体が、生検検体から調製された組織切片においてZven1を検出するために使用され得る。そのような免疫化学的検出が、比較的多くのZcytor 14を決定するために、及び試験される組織におけるZven1の分布を決定するために使用され得る。一般的な免疫化学的技法は、十分に確立されている（例えば、Ponder, “Cell Marking Techniques and Their Application.”in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), pages 115-38 (IRL Press 1987), Coligan at pages 5.8.1-5.8.8, Ausubel (1995) at pages 14.6.1 to 14.6.13 (Wiley interscience 1990), and Manson (ed.), Methods In Molecular Biology. Vol. 10: Immunochemical Proteocols (The Humana Press. Inc. 1992) を参照のこと）。
【０３４２】
免疫化学的検出は、生物学的サンプルと抗−Zven1抗体とを接触し、そして次に、前記生物学的サンプルと、抗体に結合する検出できるラベルされた分子とを接触せしめることによって行われ得る。例えば、前記検出できるラベルされた分子は、抗−Zven1抗体に結合する抗体成分を含んで成る。他方では、抗−Zven1抗体は、アビジン/ストレプタビジン（又はビオチン）により接合され、そして検出できるラベルされた分子はビオチン（又はアビジン/ストレプタビジン）を含むことができる。この基本的技法の多くの変法は、当業者に良く知られている。
【０３４３】
他方では、抗−Zven1抗体が、抗−Zven1免疫接合体を形成するために、検出できるラベルにより接合され得る。適切な検出できるラベルは、例えば放射生同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル又はコロイド状金を包含する。そのような検出できるラベルされた免疫接合体の製造及び検出方法は、当業者に良く知られており、そして下記により詳細に記載される。
検出できるラベルは、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明のために特に有用である同位体は、3H, 125I, 131I, 35S及び14Cである。
【０３４４】
抗−Zven1免疫接合体はまた、蛍光化合物によりラベルされ得る。蛍光ラブルされた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫接合体を暴露し、そして得られる蛍光を検出することによって決定される。蛍光ラベル化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。
【０３４５】
他方では、抗−Zven1免疫接合体は、化合物ルミネセンス化合物に抗体化合物を接合することによって、検出的にラベルされ得る。化学ルミネセンス−標識された免疫接合体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。化学ルミネセンスラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルを包含する。
【０３４６】
同様に、化学ルミネセンス化合物は、本発明の抗−Zven1免疫接合体をラベルするために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高める生物学的システムに見出されるタイプの化学ルミネセンスである。生物ルミネセンスタンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。ラベリングのために有用である生物ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【０３４７】
他方では、抗−Zven1免疫接合体は、酵素に抗−Zven1抗体化合物を接合することによって検出できるようラベルされ得る。抗−Zven1−酵素接合体が適切な基質の存在下でインキュベートされる場合、酵素成分は、分光光度、蛍光又は可視手段により検出され得る化学成分を生成するために基質と反応する。多くの特異的免疫接合体を検出できるようにラベルするために使用され得る酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを包含する。
【０３４８】
当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切なラベルを知っているであろう。抗−Zven1抗体へのマーカー成分の結合は、当業界において知られている標準技法を用いて達成され得る。これに関しての典型的な方法論は、Kennedyなど., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schursなど., Clim. Acta 81:1 (1977), Shihなど., Int’l. J. Cancer 46:1101 (1990), steinなど., Cancer  Res. 50:1330 (1990), 及びColigan、前期により記載される。
【０３４９】
さらに、免疫化学的検出の便利さ及び多様性は、アビジン、ストレプタビジン及びビオチンにより接合された抗−Zven1抗体を用いることによって増強され得る（例えば、Wilchek. など., (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), and Bayerなど., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.) pages 149-162 (The Humana Press. Inc. 1992) を参照のこと）。
【０３５０】
イムノアッセイを行うための方法は十分に確立されている。例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagonostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), Pages 180-208. (Cambridg University Press, 1995), Perry, “The Role of Monoclonal antibodies in the Advancement of Immunoassay Technoogy”, in Monoclonal Antibodies; Principles and applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), and Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996 を参照のこと。
関連するアプローチにおいては、ビオチン−又はFITC−ラベルされたZven1は、Zven1を結合する細胞を同定するために使用され得る。そのような結合は、例えば流動細胞計測法を用いて検出され得る。
【０３５１】
本発明はまた、Zven1遺伝子発現についての免疫学的診断アッセイを行うためのキットも企画する。そのようなキットは、抗−Zven1抗体又は抗体フラグメントを含んで成る少なくとも１つの容器を含んで成る。キットはまた、Zven1抗体又は抗体フラグメントの存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル、コロイド状金及び同様のものを包含する。キットはまた、Zven1抗体又は抗体フラグメントが、Zven1タンパク質を検出するために使用される、使用者に伝達するための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入される抗体又は抗体フラグメントが、Zven1を検出するために使用され得ることを言及する。文書の材料は容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０３５２】
現在までのIBSの診断は、症状と相互関係する基準を用いて限定されて来た。例えば、主要基準は、Manning基準及びRome基準を包含する。Farhadi, A. など., Expert Opin. Investig. Drugs 10(7): 1211-1222, 2001を参照のこと。Manning基準は、次のものを考慮する：２）腸移動の後、改良される痛み；２）痛みの開始でゆるめの便；３）痛みの開始でより頻繁な便；及び４）眼に見える腸拡張。Rome基準は、次のものを考慮する：１）排便後の軽減；２）便の頻度の変化に関係する開始；及び３）便の形（外観）の変化に関係する開始。
【０３５３】
IBSを検出し、そしてモニターするための改良された方法は、IBSを有する患者からの生物学的サンプルをスクリーンするために、抗−Zven抗体、例えば抗−Zven1及び抗−Zven2抗体の使用である。下記例15は、患者サンプルにおけるIBDを検出し、そしてモニターするために使用され得る方法を示す。上記に論じられたように、生物学的サンプル、例えば生検検体は、Zven1又はZven2がサンプルにおいてアップレギュレートされるかどうかを決定するために、配列番号２又は配列番号５のポリペプチド配列、又はそのフラグメントの存在についてスクリーンされ得る。本発明のZvenポリペプチド及び核酸は、過敏性腸症候群についての診断マーカーとして使用され得る。
【０３５４】
従って、一般的に記載される本発明は、例示により提供されるが、本発明を制限するものではない次の例により、一層容易に理解されるであろう。それらの例は、上記に一般的に記載される方法に従って、C−末端Glu−Glu標識と共にバキュロウィルスに生成されるZven1タンパク質を用いる研究を記載する。Zven2（“内分泌腺由来の血管内皮成長因子”）タンパク質は、Peprotech, Inc. (Rocky Hill, NJ)から購入された。
【実施例】
【０３５５】
例１：Wky12−22細胞における応答の刺激：
Wky 12−22細部を、Lemire など., American Journal of Pathology 144 : 1068 (1994)により記載のようにして、Wistor-Kyoto子供ラットの胸部大動脈の中間層から誘導した。それらの細胞は、NFkB/Ap-1レポーター構成体によるトランスフェクションに続いて、レポータールシフェラーゼアッセイにおいてZven1及びZven2の両者に応答する。成長したラットにおける同じ組織から誘導された対照細胞系Wky 3M-22は示さなかった。活性を、１〜100ng/mlの濃度の範囲のZven1又はZven2（約0.1nM〜10nM）で検出した。それらのデータは、Wky12-22細胞がZven1受容体を担持し、そしてZven1及びZven2がNfKb/Ap-1転写因子を活性化することを示唆する。
【０３５６】
１つの実験においては、Wky 12-22細胞を、蛍光色素Furaにより充填した。Furaの発光ピークは、カルシウムに結合される場合、シフトする。細胞内カルシウム放出は、波長シフトをモニターすることにより検出される。Zven1は、1−1000ng/mlの濃度で細胞内カルシウム放出を誘発した。Zven2は類似する応答を誘発した。
【０３５７】
細胞外シグナル−調節されたキナーゼ/マイトジエン−活性化されたタンパク質キナーゼ（ERK-Mapキナーゼ）活性を、Zven1処理に応答してWky 12-22細胞において測定した。細胞を、１〜1,000ng/mlの範囲の濃度でZven1において30分間インキュベートした。細胞を固定し、そして処理された細胞のサイトゾル及び核における蛍光強度を測定するArrayscanを用いて、リン酸化されたERD−Mapキナーゼについて染色した。核及びサイトゾルの蛍光の差異を定量化し、そしてプロットした。Zven1は、0.50nM（約5ng/ml）のEC50を伴って、ERK−Mapキナーゼ活性を誘発した。
【０３５８】
Wky 12-22細胞へのZven1の結合を、I125−ラベルされたZven1を用いて評価した。Wky 12-22細胞を、低細胞密度で接種し、そしてそれらが約70％の集密生に達するまで、３〜４日間、培養した。細胞を氷上に置き、培地を除去し、そして単層を洗浄した。細胞を、非常に過剰のラベルされていないZven1の不在下で（全結合）及びその存在下で（非特異的結合）、上昇する量のI125−Zven1と共にインキュベートした。4℃での種々の時間の後、結合培地を除き、そして単層を洗浄し、そして細胞を少体積の1.0NのNaOHにより溶解した。細胞関連放射能をγカウンターにより決定した。I125−Zven1の特異的結合を、全結合値と非特異的結合値との間の差異として計算した。測定された放射能を、１組の同時培養物に対して決定された細胞数に対して標準化した。２−部位モデルを用いての非線状回帰を、Kd及びBmaxの決定のために結合データを適合するために使用した。高親和性部位は1.5nMのKd及び350fモルの結合/106細胞のBmaxを示し、そして低親和性部位は31nMのKd及び1025fモルの結合/106細胞のBmaxを示した。
【０３５９】
それらの研究の結果は、新生児ラット大動脈細胞がZven1受容体を発現し、そして同じ成長したラット細胞は発現しないことを示す。これは、Zven1が心臓成長及び血管形成に関与することを示す。Zven1はNFkB/Ap1を通してシグナルを送り、そして新生児細胞においてのみケモカイン放出を誘発し、このことは、それが胎児又は新生児心臓においてマイトジェン応答を誘発することを示す。Zven1は、心臓幹細胞における血管形成/脈管形成の誘発のために必要な、必要とされる因子であり得る。Zven1は、Wky 12-22細胞系において細胞内カルシウム放出、すなわちケモカイン活性と一致する効果を誘発する。そのマイトジェン活性と一致するZven1は、マイトジェン活性化されたタンパク質キナーゼを活性化する。
【０３６０】
例２：Zven1及びZven2はインビトロでケモカイン放出を刺激する：
集密製Wky 12-22又はWky3M22細胞を、種々の濃度のZven1と共に24時間インキュベートした。ならし培地を集め、そして市販のラットケモカインマルチプレックスキット（Linco Research, Inc.; St. Charles, Missouri）を用いて、ケモカインCINC−１についてアッセイした。ヒト成長関連の腫瘍遺伝子−α（GRO−α）と同様であると思われるCINC−１を、それぞれ、0.1〜100ng/mlのZven1により処理された細胞において、1.8〜5ng/mlの範囲のレベルで検出した。CINC−１は、成長したラット動脈由来の対照Wky3M−22細胞系又は処理されていない対照のいずれにおいても検出されなかった。
【０３６１】
例３：Zven1はインビボで走化性応答を誘発し、そしてケモカイン放出及び好中球浸潤を刺激する：
10匹のマウス（生後8週でのBALB57/BL6雌マウス）の４グループを処理しないか、又はビークル緩衝液対照、0.1μgのZven1又は1μgのZven1により注射した。４時間後、腹膜洗浄流体を集め、濃縮し、そして細胞ペレットを再懸濁した。相対的細胞集団を、Cell Dyneを用いて計数し、そしてサイトスピン（cytospins）をCBC/diff計数のために調製した。処理されなかった、及び緩衝液対照動物は、それら洗浄流体に約２％の好中球を有し、そして0.1μgの処理された動物は約30％の好中球を有し、このことは、Zven1−処理された動物の腹膜における好中球の約15倍の上昇を示す。1μgのZven1−処理された動物は、処理されなかった対照と一致する好中球レベルを有し、このことは、二相Zven1応答を示す。要約すると、Zven1は、腹腔内注射に続いて腹膜中への好中球の浸潤を誘発した。
【０３６２】
ネズミKC、すなわちマウスにおけるGROαのオルト体を、ELISAキット（R＆D Systems Inc.; MN）を用いて、４グループのマウスから得られた血清及び洗浄流体において測定した。0.1μgのZven1−処理された（低用量）マウスは、それらの腹膜流体において約45pg/mlのKCを有し、これは処理されていない対照、ビークル対照及び1.0μgのZven1−処理された（高用量）マウスよりも有意に高かった。
0.1μgのZven1−処理されたマウスにおけるKCの血清レベルは、処理されていないマウス、1.0μgのZven1−処理されたマウス及びビークル−処理されたマウスよりも相当に高たった。0.1μgのZven1−処理されたマウスは、６倍の上昇である約185pモル/mlのKCレベルを有した。
【０３６３】
【表５】
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【０３６４】
それらの結果は、例２に示されるインビトロでのケモカイン放出の刺激と一致する。さらに、それらの結果は、0.1μgのZven1−処理された（低用量）マウスにおける腹膜における観察される好中球湿潤と相互関係する。
【０３６５】
例４：胃排出能に対するZven1効果：
７匹のマウスは、約200μgのZven1（10μg/g体重）又はビークル対照、続いて7.5mgのフェノールレッドの腹膜内注射を受けた。胃の機能を、20分後、腸を通してのフェノールレッドの輸送をモニターすることにより測定した。Zven1処理された動物の一般的挙動性を観察し、そして対照動物の挙動性と一致した。Zven1−処理されたマウスにおいては、胃通過時間は、約50％低められた。
【０３６６】
それらの結果は、高い用量で、腹膜内注射に続いて、Zven1が胃通過を低めることを示す。Zven1投与は、いずれの即時の毒性効果も有さないように思えた。この通過の低下は、そのような高い用量での広範囲の筋肉収縮の結果であり得る。Zven1は、低用量でインビボでの運動性を十分に高め、そして高い用量で運動性を阻害することができる。
【０３６７】
例５：Zven1及びZven2による脈管形成の刺激：
胸部大動脈を、生後12日、5週及び３ヶ月のラットから除去した。組織をハンクス溶液によりフラッシュし、いずれの血液細胞も除去し、そして外膜組織を除去した。大動脈輪を調製し、そしてCloneticsからの血清フリーの変性MCDB培地及び抗生物質、すなわちペニシリン−ストレプトマイシンを含む、Matrigel被覆されたプレート上にプレートした。種々の濃度のZven1及びZven2を、プレートの後、約30分で培養皿に添加した。増幅を視覚的に測定し、そして個々の輪の写真を撮り、結果を記録した。Zven1及びZven2の両者は、１〜100ng/mlの範囲の濃度で増殖応答を誘発した。このマイトジェン効果は、すべての３種の年齢での動物からの大動脈に観察された。Zven1をまた、脈管形成のラット角膜モデルにおいて試験し、ここで効果は示されなかった。大動脈輪培養物における観察される脈管形成効果は、GROα相同体のマイトジェン効果のためである。
【０３６８】
例６：Zven1のバキュロウィルス発現：
GLU−GLU標識を含む発現ベクター、すなわちpzBV32L:zvenlceeを、昆虫細胞においてzven1ceeポリペプチドを発現するために企画し、そして調製した。
A. 発現ベクター：
発現ベクターpzBV32L: zven1ceeを、次の通りにして、昆虫細胞において、カルボキシ−末端Glu−Glu標識を有するヒトzven1ポリペプチドを発現するために調製した。
zven1、及びそれぞれ5’及び3’末端上にEcoR1及びXba1制限部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む371bpのフラグメントを、zven1 cDNA（zven1-zyt-1. contig）を含むプラスミドから、プライマーZC29463（配列番号23）及びZC29462（配列番号24）を用いて、PCR SuperMix (Gibco BRL, Life Technologies)及び適切な緩衝液を用いてのPCR増幅により生成した。（注：zven1配列及びXba1部位は読み取り枠外であった。追加の2個の塩基、すなわちCC−アンチセンスを、zven1配列とCEE標識との間に追加のGlyをコードする読み取り枠に配置するために付加した。）
【０３６９】
PCR反応条件は次の通りであった：94℃で3分、１サイクル、続いて94℃で30秒、50℃で30秒、及び68℃で30秒、25サイクル、続く4℃での維持。フラグメントを、ゲル電気泳動（１％アガロース−10mlのアガロース当たり10mg/mlのEtBr1μl）により可視化した。PCR生成物の一部を、適切な緩衝液中、EcoR1及びXbaI制限酵素により消化し、次にアガロースゲル上で展開した。EcoR1/Xba1消化されたzven1コード配列に応答するDNAを切出し、Qiagen Gel Extraction キット (#28704)を用いて精製し、そしてEcoR1/Xba1消化されたバキュロウィルスドナーベクターpZBV32L中に連結した。pZBV32Lベクターは、pFastBaclTM (Life Technologies)発現ベクターの修飾体であり、ここで多面体プロモーターが除去され、そして後期活性化塩基性タンパク質プロモーターにより置換されている。
【０３７０】
さらに、Glu−Glu標識（配列番号10）及び停止シグナルのためのコード配列を、多クローニング領域の3’末端で挿入する。約216ngの制限消化されたzven1挿入体及び約300ngのその対応するベクターを、15℃で一晩、連結した。1μlの連続混合物を、2.1kVで、35μlのDH10B細胞（Life Technologies）中にエレクトロポレートした。エレクトロポレートされたDNA及び細胞を、1mlのLB培地に希釈し、37℃で１時間、増殖し、そして100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートした。クローンを制限消化物により分析し、そして１つの陽性クローンを選択し、そしてAMP＋プレート上に画線培養し、１つのコロニーを、配列決定による確認のために得た。
【０３７１】
配列決定は、正しい翻訳をたぶん妨げる実際の開始コドンの上流での開始コドンの存在を示した。従って、前記上流のコドンを、Stratagene（La Jolla, CA）からのQick−変更突然変異誘発を用いて除去した。これは、上流の開始ATCに変更する前方向及び逆方向プライマーを創造することにより達成された。zven1配列の5’及び3’末端でSma1及びXba1切断部位を含む、新規の突然変異誘発されたプラスミドを、前のようにして、DH10B細胞中にエレクトロポレートし、Sma1及びXba1による制限消化物により分析し、そして陽性クローンを選択し、そしてAMP＋プレート上に画線培養し、前のようにして、配列決定による確認のために単一のコロニーを得た。zven1ポリヌクレオチド配列のためのクローンをまた、上流の開始コドンを伴わないでクローン化した。
【０３７２】
１〜5ngの陽性クローンドナーベクターを用いて、100μlのDHlOBac Max Efficiency コンポネント細胞(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を、製造業者の説明書に従って、42℃の水浴において45秒間の熱ショックにより形質転換した。次に、形質転換された細胞を、980μlのSOC培地（２％Bacto  Trypton, 0.5％Bacto Yeast Extract, 10mlの１MのNaCl、1.5mMのKCl, 10mMのMgCl2、10mMのMgSO4及び20mMのグルコース）により希釈し、37℃で４時間、振盪インキュベーションにおいて増殖し、そして50μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリン、IPTG及びBLUO−GALを含むLuria寒天プレート上にプレートした。プレートされた細胞を37℃で48時間インキュベートした。色彩選択を用いて、プラスミド中に組込まれたzVev1ceeコードのドナー挿入体（“bacmid”として言及される）を有するそれらの細胞を同定した。白色のそれらのコロニーを分析のために採取した。
【０３７３】
Bacmid  DNAをLife Technologies 指針に従って標準の単離技法を用いて、陽性コロニーから単離した。クローンを、bacmidにおける転移因子に対するプライマーを用いて、PCR によりDNAを増幅することにより正しい挿入体についてスクリーンした。PCR反応条件は次通りであった：94℃で45秒、50℃で45秒、及び72℃で５分（35サイクル）；72℃で10分（１サイクル）；続いて４℃でのソーキング。PCR生成物を、１％アガロースゲル上で展開し、挿入体サイズを確かめた。正しいサイズの挿入体を有するそれらを用いて、スポドプテラ・フルギペルダ（Sf9）細胞をトランスフェクトした。ポリヌクレオチド配列は、配列番号25で示される。その対応するアミノ酸配列は、配列番号26で示される。
【０３７４】
B. 昆虫細胞におけるトランスフェクション：
Sf9細胞を、35mmのプレートに、１×106個の細胞を接種し、そして27℃で１時間、付着せしめた。5μgのbacmid DNAを、100μlのSf−900II SFM (Life Technologies、,Rockville, MD) により希釈した。15μlのlipofectamine試薬（Life Technologies）を、100μlのSf−900II SFMにより希釈した。bacmid DNA及び脂質溶液を軽く混合し、そして室温で30〜45分間インキュベートした。細胞の１つのプレートから名培地を吸引した。800μlのSf−900II SFMを、前記脂質−DNA混合物に添加した。DNA−脂肪混合物を前記細胞に添加した。細胞を27℃で一晩インキュベートした。次の朝、DNA−脂質混合物を吸引し、そして2mlのSf−900II培地を個々のプレートに添加した。プレートを、27℃、90％湿度で、168時間インキュベートし、そしてウィルスを収穫した。
【０３７５】
C. 一次増幅：
Sf9細胞を、35mmのプレート当たり１×106個の細胞で接種し、そして27℃で１時間、付着せしめた。次に、それらを、上記からのウィルスストック500μlにより感染し、そして27℃で４日間インキュベートし、その後、ウィルスを当業界において知られている標準方法に従って収穫した。
【０３７６】
D. 二次増幅：
Sf9細胞を、35mmのプレート当たり１×106個の細胞で接種し、そして27℃で１時間、付着せしめた。次に、それらを、上記からのウィルスストック20 μlにより感染し、そして27℃で４日間インキュベートし、その後、ウィルスを当業界において知られている標準方法に従って収穫した。
【０３７７】
E. 三次増幅：
Sf9細胞を、250mlの振盪フラスコ中、80mlのSf-900II SFMにおいて、１×106細胞/mlのおおよその密度まで増殖した。次に、それらを、上記からのウィルスストック200  μlにより感染し、そして27℃で４日間インキュベートし、その後、ウィルスを当業界において知られている標準方法に従って収穫した。
【０３７８】
F. zven1ceeの発現：
第三回目のウィルスストックを、増殖阻害曲線により滴定し、そして１のMOIを示す培養物を48時間、進行せしめた。上清液を、N−末端Glu−Gluエピトープに対して特異的な一次モノクローナル抗体HRP接合されたGt抗Mu二次抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。結果は、予測される分子量のバンドを示した。
多量のウェルス原液を次の方法により生成する：Sf9細胞を、2800mlの振盪フラスコにおける1LのSf−900II SFMにおいて、１×106個の細胞/mlのおおよその密度まで増殖する。次に、それらを、最後の増殖からのウィルス原液10mlにより感染し、そして27℃で72 時間インキュベートし、この後、ウィルスを収穫する。大規模感染を完結し、下流の精製のための材料を供給することができる。
【０３７９】
例７：E. コリにおける発現：
A. 生来のZven1発現構造体の生成：
生来のZven1（配列番号11）のDNAフラグメントを、PCRを用いて単離した。41bpのベクターフランキング配列及びZven1のアミノ末端に対応する部分24bpを含むプライマーzc#40,821（配列番号12）、及びプライマーzc#40,813（配列番号13）は、zven1挿入体を含むベクターの3’末端に対応する38bpを含んだ。鋳型はpZBV32L：zven1ceeであった。PCR条件は次の通りであった：94℃で30秒、50℃で30秒、及び72℃で１分、25サイクル；続いて４℃でのソーキング。PCRサンプルの小サンプル（２〜４μl）を、分析のために１×TBE緩衝液を用いて１％アガロースゲル上で展開し、そして約500bpのフラグメントの予測されるバンドが見られた。
【０３８０】
残る100μlの体積の反応物を、200μlの無水エタノールにより沈殿せしめた。ペレットを、上記に開示されるzven1をコードする構造体を生成するために、Sma1により切断された受容体ベクターpTAP238中への組換えのために使用される水10μlに再懸濁した。正しい配列を有するクローンを、pTAP432として命名した。それをNot1/Nco1により消化し（10μlのDNA、5μlの緩衝液３ New England Biolabs, 2μlのNot1, 2μlのNco1, 31μlの水において37℃で１時間）、そしてT4 DNAリガーゼ緩衝液（７μlの前の消化物、２μlの５×緩衝液、1μlのT4 DNAリガーゼ）により再連結した。この段階は、酵母配列CEN-ARSを除去し、ベクターを線状にした。DNAを、Pvu2及びPst1により診断的に消化し、酵母配列の不在を確認した。DNAを用いて、E. コリ株W3110/pRAREを形質転換した。
【０３８１】
B. E. コリにおける生来のZven1の発現：
E. コリを、0.01％Antifoam 289 (Sigma), 30μg/mlのカナマイシン、35μg/mlのクロラムフェニコールを含む、100mlのSuperbroth II medium (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中に接種し、そして37℃で一晩培養した。5mlの接種物を、2Lの培養フラスコ中、500mlの同じ培地に添加し、これを、250rpmで37℃で、培養物が４のOD600に達するまで、振盪した。次に、IPTGを添加し、1mMの最終濃度にし、そして振盪をさらに2.5時間、続けた。細胞を、4,000×gで10分間、4℃で遠心分離した。細胞ペレットを−80℃で凍結した。
【０３８２】
例８：コドン最適化：
A. コドン最適化されたzven1発現構造体の生成：
生来のヒトZven1遺伝子配列は、E. コリ株W3110において発現され得なかった。Zven1コード配列に使用されるコドンの試験は、それが0.211に等しいCAI値を伴って、E. コリにおける過剰の時折使用される最少コドンを含むことを示した。CAIは、類似コドン偏りの統計学的測定であり、そしてタンパク質生成のレベルを予測するために使用され得る（Sharp など., Nucleic Acids Res. 15 (3) : 1281-95, 1987）。高く発現されたタンパク質をコードする遺伝子は、高いCAI値（＞0.6）を有する傾向があり、そして低いCAI値（≦0.2）を有する遺伝子によりコードされるタンパク質は一般的に低効率で発現される。これは、E. コリにおけるZven1の不良な生成のための理由を示唆した。さらに、希少コドンは、高い確率の翻訳失速、翻訳の未熟な終結及びアミノ酸の誤った組込みを導くメッセージの第２ハーフでクラスター化される（Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5) : 494-500,1995）。
【０３８３】
その遺伝子が希少コドンを含むタンパク質の発現レベルは、一定の希少tRNAのレベルが宿主内で高められる場合、劇的に改良され得ることが示されている（danovskyなど., 前記., 2000; Calderone など., 前記., 1996; Kleber-Jankeなど., 前記., 2000; You など,. 前記., 1999）。pRAREプラスミドは、E. コリにおいてめったに使用されていないいくつかのコドンのためのtRNAをコードする遺伝子（argU, argW, leuW, proL, ileX 及び glyT）を担持する。前記遺伝子は、それらの生来のプロモーターの制御下にある。pRAREとの同時発現は、E. コリにおけるZven1生成を増強し、そして約100mg/lを生成した。pRAREとの同時発現はまた、E. コリ溶解物における切断されたZven1のレベルを低めた。それらのデータは、より適切なコドン使用法を伴ってのzven1をコードする遺伝子の再−再合成が多量のzven1の発現のための改良されたベクターを提供することを示唆する。
【０３８４】
コドン最適化されたzven1コード配列（配列番号14）を、次の６種のオーバーラップするオリゴヌクレオチドから構成した：zc45,048 (配列番号15), zc45,049 (配列番号16), zc45,050 (配列番号17), zc45,051 (配列番号18), zc45,052 (配列番号19) 及び zc45,053 (配列番号20)。それらのオーバーラップするオリゴヌクレオチドのプライマー拡張、続くPCR増幅は、E. コリにおける発現のために最適化されたコドンを有する十分な長さのZven1遺伝子を生成した。最終PCR生成物を、酵母相同組換えにより発現ベクターpTAP237中に挿入した。発現構造体を酵母から抽出し、そしてそれを用いて、コンピテントE. コリDH10Bを形質転換を形質転換した。カナマイシンに対するクローン耐性を、コロニーPCRにより同定した。陽性クローンを、配列決定により確め、そして続いて、生成宿主株W3110を形質転換した。最適化されたzven1配列を有する発現ベクターを、pSDHにより命名した。得られる遺伝子は、E. コリにおいて非常に良く発現された。新規構造体に関する発現レベルは、約150mg/lまで上昇した。
【０３８５】
B. E. コリにおけるコドン最適化されたZven1の発現：
E. コリを、0.01％のAntifoam289 (Sigma), 30μg/mlのカナマイシンを含む、100mlのSuperbroth II 培地 (Becton Dickinson)中に接種し、そして37℃で一晩培養した。5mlの接種物を、2Lの培養フラスコ中、500mlの同じ培地に添加し、これを、培養物が４のOD600に達するまで、250rpm, 37℃で振盪した。次に、IPTGを添加し、1mMの最終の濃度にし、そして振盪をさらに2.5時間、続けた。細胞を、4,000×gで10分間、４℃で遠心分離した。細胞ペレットを、後での使用まで、−80℃で凍結した。
【０３８６】
例９：E. コリにおいて生成されるZven1の精製及び再生：
A. 封入体の単離：
バッチ発酵又はシェーカーフラスコ培養のいずれかにおいてのタンパク質発現の誘発に続いて、E. コリブイヨンを、1Lのビンにおいて、3000RMで、Sorvall回転バケットローターを用いて遠心分離した。ブイヨン汚染物を除去するための細胞ペーストのさらなる洗浄を、上清液が透明になるまで、200mMのNaCl及び5mMのEDTAを含む50mMのトリス（pH8.0）溶液により行った。
【０３８７】
次に細胞ペレットを、600nmでの10〜20の光学密度まで、氷冷却された溶解緩衝液（50 mM のTris  pH 8.0 ; 5 mMの EDTA; 200 mM のNaCI, 10% スクロース(w/v); 5mM DTT; 5 mM ベンズアミジン）に懸濁した。次に、このスラリーを、破壊された細胞溶解物を生成する、急冷されたAPV200Labホモジナイザー12、8500〜9000psiで２〜３度通した。不溶性画分（封入体）を、20,000×gでの１時間の4℃での細胞溶解物の遠心分離により回収した。
封入体ペレット（20,000×gの回転に由来する）を、洗浄緩衝液（200mMのNaClを含む50mMのTris pH8、5mMのEDTA、5mMのDTT、5mMのベンズアミジン）に、封入体1g当たり洗浄緩衝液10mlで懸濁し、そしてOMNI国際ローター固定発生器を用いて、完全に分散した。この懸濁液を20,000×gで30分間、4℃で遠心分離した。洗浄サイクルを、上清液が透明になるまで、３〜５度、反復した。
【０３８８】
洗浄された最終ペレットを、8Mのウレア、0.1Mの亜硫酸ナトリウムを含む50mMの硼酸緩衝液（pH8.6）及び0.05Mのナトリウムテトラチオネート（pH8.2）に溶解した。溶解及び亜硫酸分解反応を、軽く振盪しながら、4℃で一晩、進行せしめた。得られるピンクがかった溶液を、35,000×gで１時間、4℃で遠心分離し、そして可溶性Zven1を含む透明な上清液を、0.45μmのフィルターを通して濾過した。
【０３８９】
B. Zven1再生：
溶解されたZven1を、55mMの硼酸塩（pH8.6）、1.0Mのアルギニン、0.55MのグアニジンHCL, 10.56mMのNaCl, 0.44mMのKCl, 0.055％のPEG, 10mMの還元されたグルタチオン及び1.0mMの酸化されたグルタチオンを含む、氷冷却された再生緩衝液中への100〜150μg/mlの最終Zven1濃度での滴下−様式希釈法により再生した。希釈されるとすぐに、その混合物を、冷室温で48〜72時間、ゆっくりと攪拌した。
【０３９０】
C. 生成物の回収及び精製：
再生の後、溶液を、22,000×gで、１時間、4℃での遠心分離、及び0.45μmの膜を用いての濾過により透明にした。再生されたZven1を含む、透明にされた上清液を、50mMの酢酸塩により調節し、そしてpHをHClの添加により4.5に調節した。pH調節された材料を、50mMの酢酸緩衝液（pH4.5）により平衡化されたPharmacia Streamline SPカラム（33mmのID× 65mmの長さ）上でのカチオン交換クロマトグラフィー処理により捕獲した。充填流速は、pH4.5での50mMの酢酸緩衝液において１：５に調節するインライン希釈を伴って、10ml/分であった。この希釈は、イオン強度を低め、このマトリックスへの標的物の効果的結合を可能にする。サンプル充填が完結した後、カラムを、1M のNaClを含む、50mMの酢酸緩衝液（pH4.5）による溶出段階の前、平衡化緩衝液により基線吸光度まで洗浄した。
【０３９１】
カチオン交換段階からの溶出液プールを、１％酢酸（pH3.0）に導入し、そして１％酢酸（pH3.0）において平衡化されたTOSO Hass Amberchrom CG71m逆相媒体を含むカラム（22mm×130mm）に、10ml/分の流速で充填した。基線吸光度への洗浄に基づいて、カラムを、平衡化緩衝液と99％（v/v）アセトニトリル、1％（v/v）酢酸溶液との間に形成される20カラム体積グラジエントにより溶出した。
【０３９２】
逆相段階からの溶出物プールを、もう１つの段階のカチオン交換クロマトグラフィー処理にゆだねた。そのプールを、50mMの酢酸緩衝液（pH4.5）により平衡化されたToso Hass SP650Sカラム（10mm×50mm）上に、3ml/分の流速で直接的に充填した。サンプル充填の完結、及び基線吸光度への洗浄の後、カラムを、1.0MのNaClを含む50mMの酢酸緩衝液（pH3.0）により段階的溶出した。タンパク質溶出物プールを、最終精製及び緩衝液交換サイズ排除段階のための調製にAmicon濃縮単位を用いて3K Daのカットオフ限外濾過膜に対して濃縮した。
【０３９３】
D. サイズ排除緩衝液交換及び配合：
濃縮されたカチオンプールを、25mMのヒスチジン、120mMのNaCl（pH6.5）溶液により平衡化されたPharmacia Superdex Peptide サイズ排除カラム(Pharmacia, 現在 Pfizer, La Jolla, California)上に注入した。生成物を含む対称溶出物ピークをプールし、0.2μmのフィルターにより無菌濾過し、アリコートし、そして−80℃で貯蔵した。
【０３９４】
例10：レポーターアッセイにおけるZven1及びZven2の活性：
A. 細胞系：
Rat2線維芽細胞（ATCC #CRL-1764, American Type Culture Collection, Manassass, VA）を、SREルシフェラーゼレポーター構造体によりトランスフェクトし、そして安定したクローンを選択した。次に、それらを、GPCR73a 受容体(配列番号21) 又は GPCR73b 受容体 (配列番合22)のいずれかのための構造体によりトランスフェクトした。
【０３９５】
B. アッセイ方法：
細胞をトリプシン処理し、そして1％血清を含む培地を含むクローニング96−ウェル白色プレートに、3,000細胞/ウェルで接種し、そして37℃及び5％CO2下で一晩インキュベートした。培地を除き、そしてサンプルを、0.5％BSAを含む培地中、細胞に三重反復して添加し、そして37℃及び5％CO2下で4時間インキュベートした。培地を除去した後、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ基質を、Promega ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega Corp. , Madison, WI)に従って添加した。
【０３９６】
C. データ及び結論：
すべてのデータは、基本シグナル（培地のみ）により割り算された発光計からのRLU（相対的光単位）の折りたたみ（fold）−誘発として報告された。Zven1は実験室で調製された。アッセイに使用されるZven2は、PeproTech Inc. (Rocky Hill, N. J.)から購入された。
表６及び７は、Zven1が、GPCR73a受容体を発現する細胞に関して、用量−依存性態様において、Zven2よりも活性的であったことを示す。
【０３９７】
【表６】
2006514683.tif 000007
【０３９８】
【表７】
2006514683.tif 000008
【０３９９】
表８及び９は、Zven1及びZven2がGPCR73b受容体を発現する細胞に関して、活性的に類似することを示す。両分子の活性は、GPCR73b受容体を発現する細胞において低かった。GPCR73b受容体数が両細胞系において同等であるかどうかは知られていない。
【０４００】
【表８】
2006514683.tif 000009
【０４０１】
【表９】
2006514683.tif 000010
【０４０２】
表10は、56℃で30分間、加熱された、バキュロウィルス−発現されるZven1が新しいZven1よりも低められた活性を有することを示す。
【０４０３】
【表１０】
2006514683.tif 000011
【０４０４】
例11：Zven1のIP（腹腔内）注射に続いてのマウスの洗浄流体及び血清におけるMIP-2 検出：
上記例３に論じられるように、マウスKCは、ヒトGROαのマウス相同体であり、そしてCINC−１はラット相同体である。同様に、高められたMIP-2発現が、種々の炎症状態において好中球流入に関係していることが見出された。Banks, C. など, J. Path. 199 : 28-35,2003を参照のこと。
【０４０５】
例３で使用される方法に類似して、10匹のマウスの４グループを、５及び50μg/kgでZven1により、ビークル対照により注射するか、又は処理されなかった。それらのマウスは約20gの体重があり、その結果、用量は５μg/kgであった。MIP−２レベルを、Quantikine M Murine マウス MIP-2 ELISAキットt (R and D Systems, Minneapolis, Minnesota)を用いて、腹膜洗浄流体及び血清の両者において測定した。試験結果は、表11に示される。
【０４０６】
【表１１】
2006514683.tif 000012
【０４０７】
結論：MIP−２は、低い（５μg/kg）Zven1のIP注射に応答して血清及び洗浄流体においてアップ−レギュレートされる。血清における濃度は、Zven1により処理された動物において、約２倍高い。洗浄流体において低い効果が存在したが、しかしそれは、いくらかの活性が処理されていない対照動物よりもビークルにより処理された生物において生じる事実による。より高い用量（50μg/kg用量）で、効果は観察されず、このことは、高められた用量で、走化性効果が存在しないことを示唆する。それらの結果は、好中球数として相互関係し、ここで好中球浸潤が低い（５μg/kg）用量のZven1を投与された動物においてのみ観察された。
【０４０８】
例12：Zven1ポリクローナル抗体の生成：
ポリクローナル抗体を、精製された組換えタンパク質huzven1-CEE-Bv（配列番号24）により2匹の雌のNew Zealand白色ウサギを免疫化することにより調製した。ウサギは、完全フロイントアジュバント中、200μgの精製されたタンパク質の初期腹腔（ip）内注射、続く不完全フロイントアジュバント中、100μgのペプチドの３週間ごとのip追加免疫化により調製した。２回目の追加の免疫化（合計３回の注射）の投与の７〜10日後、動物を放血し、そして血清を集めた。次に、動物を追加免疫化し、そして３週間ごこに放血した。
【０４０９】
ポリクローナル抗体を、5mlのプロテインAセファロースカラム（Pharmacia LKB）を用いて、免疫化されたウサギ血清から精製した。精製に続いて、ポリクローナル抗体を、少なくとも８時間にわたって、抗体体積のPBSにより20回、４回の変更を伴って透析した。Huzven1−特異的抗体を、500ng/mlの精製された組換えタンパク質huzven1-CEE-Bv（配列番号24）を抗体標的物として用いて、ELISAにより特徴づけられた。ウサギ抗−huzven1精製された抗体の検出の低限（LLD）は、その特異的精製された組換え抗原huzven1-CEE-Bvに基づいて1ng/mlであった。
【０４１０】
例13：Zven1タンパク質の検出：
精製されたポリクローナルhuzven1抗体を、ORIGEN (商標) Immunoassay System (IGEN Inc, Gaithersburg, MD)を用いて、組換えヒトZven1ポリペプチドを結合するそれらの能力について特徴づけられた。このアッセイにおいては、抗体を、ラット血清サンプルにおける組換えhuzven1のレベルを定量的に決定するために使用した。ビオチニル化された捕獲抗体、及びルテニウム（II）トリス−ビピリダールキレートによりラベルされ、それにより、溶液中の抗原をサンドイッチし、そして免疫複合体を形成する,検出体抗体か成るイムノアッセイ型を企画した。ストレプタビジン−被覆された常磁性ビーズを、その免疫複合体に結合した。トリプロピルアミンの存在下で、ルテニル化されたAbは消光し、これはORIGEN分析機により測定された。0.1〜50ng/mlのhuzven1の濃度曲線は、50μlのサンプルを用いての定量化を可能にした。得られるアッセイは、５％正常ラット血清における200pg/mlのhuzven1の検出の低限を示した。
【０４１１】
例14：Zven1及び炎症腸疾患（IBD）：
この目的は、Zven1発現がIBDにおいてアップレギュレートされるかどうかを決定することであり、６人の潰瘍性大腸炎（UC）患者、７人のクローン病患者及び４人の正常ドナー対照からの腸組織生検を、Taqman RTPCRを用いて分析した。組織生検を、個々の個人ドナーからの腸における２つの部位から得、１つの部位は低い量の炎症を有するか又はまったく炎症を有さず、そして１つの部位は疾病を有する。いくつかの場合、影響されていない領域は見出されなかった。生検獲得の部位は、盲腸、直腸、横断、上方及び下方の結腸、末端回腸及びS状結腸を包含した。
【０４１２】
生検の直後、組織を液体窒素に凍結した。組織を粉砕し、そし溶解緩衝液（2%SDS, 20mMのトリス、pH7.4、及び2％ホスファターゼインヒビターカクテル（Sigma, Saint Louis, MO））に再懸濁した。RNAを、Qiagen, Valencia, CAからのRNeasyキットを用いて、製造業者の説明書に従って調製した。Taqman EZ RT-PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて、Zven1発現レベルを決定した。
【０４１３】
製造業者の説明書に従って、Zven1標準曲線を、異なった濃度（250ng/μl、50ng/μl、12.5ng/μl、及び3.125ng/μl）でのヒト精巣RNAを用いて調製した。それらの標準曲線希釈溶液をまず用いて、Zven1遺伝子及びハウスキーピング遺伝子（ヒトグルクロニダーゼ（GUS））について企画されたプライマーを試験した。プライマー及び標準曲線の作業条件が確立されると、腸疾患RNAサンプルを試験した。RNAサンプルを氷上で融解し、そして次に、RNアーゼフリーの水（Invitrogen, カタログ番号750023）において50ng/μlに希釈した。希釈されたサンプルをずっと氷上で維持した。
【０４１４】
Taqman EZ RT-PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems, カタログ番号N808-0236)を用いて、マスター混合物を、Zven1及びハウスキーピング遺伝子（GUS）について調製した。サンプルを三重反復してアッセイするために、3.5μlの個々のRNAサンプルをアリコートした。正の対照に関して、3.5μlの個々の標準曲線希釈溶液を、サンプルRNAの代わりに使用した。内因性対照（ヒトGUSメッセージ）に関しては、3.5μlの標準曲線希釈溶液及びサンプルRNAをアリコートした。次に、84μlのPCRマスター混合物を添加し、そしてピペットにより十分に混合した。MicroAmp光学96−ウェル反応プレート（Applied Biosystems カタログ番号N801-0560）を氷上に置き、そして25μlのRNA/マスター混合物を、適切なウェルに三重反復して添加した。次に、MicroAmp 12-Cap Strip (Applied Biosystems カタログ番号N801-0534) を用いて、全プレートを被覆した。次に、プレートを、Qiagen Sigma 4-15遠心分離器により3000RPMで２分間、回転した。
【０４１５】
サンプルを、PE−ABI7700（Perkin Elmer, 現在EG＆G, Inc. Wellesley, MA）上で試験した。配列検出器を開始し、そしてデフォールトを同時PCRに設定した。蛍光色素をFAMに設定した。プレート鋳型を、標準及び未知の試験サンプルが存在する場所を示すよう設定した。
【０４１６】
個々のサンプルについての発現を、Ct値として報告する。Ct値は、蛍光色素又はRT−PCR生成物（RNA多数性の直接的な反対）が、限界又はバックグラウンドレベルを越えるレベルまで増幅される点である。高い発現性のサンプルのRT−PCRは、すぐに限界を交差する蛍光色素/生成物のより高い蓄積をもたらすので、Ct値が低いほど、より高い発現レベルが得られる。40のCt値は、測定される生成物は存在せず、そしてゼロの平均発現値をもたらすべきであることを意味する。Ctは標準曲線への比較に基づいて相対的発現値に転換される。試験される個々のサンプルに関しては、Zven1及びGUS発現レベルの量は、適切な標準曲線から決定された。次に、それらの計算されたZven1発現値が、個々のサンプルのための標準化されたZven1発現を得るために、個々のサンプルのGUS発現値により割り算された。
【０４１７】
結果：４種の正常ドナー組織においては、Zven1の相対的発現は非常に低かった（平均0.07±0.07SEM）。UC及びクローン病組織の両者においては、Zven1発現は、正常ドナーに見られる発現に比較して、有意に高められた。最少の炎症組織を有するUC及びクローン病患者における平均相対的Zven1発現は、UCにおいて4.9±10SEM及びクローン病において1.45±0.8SSEMであった。
【０４１８】
正常ドナーに対する平均倍率−上昇は、UCにおいて70倍及びクローン病において20.7倍であった。炎症組織サンプルにおいては、Zven1発現はさらに高かった。炎症UC組織における平均倍率Zven1発現は、クローン病の炎症組織において、15.8±18.5SEM及び40.8±92.8SEMであった。UCにおける正常に対するZven1発現平均倍率上昇は583倍であった。
すべての13人のUC及びクローン病ドナー炎症の腸組織生検は、平均正常ドナー生検よりも高いZven1発現レベルを有した。
【０４１９】
結論：Zven1は、インビトロ及びインビボの両者でケモカイン放出を誘発することが示されている。上記例２及び３を参照のこと。さらに、マウスにおけるIP注射に続いて、２種の有能なケモカイン、すなわちマウスKC（例３に示されるような）及びMIP-2（例11に示されるような）を、好中球の注入に付随して、腹腔及び血流において測定することができる。さらに、この例に示されるように、Zven1は、炎症性腸疾患の患者から得られた腸組織においてアップレギュレートされ、このことは、それが炎症工程及びIBDの進行に包含され得ることを示唆する。
【０４２０】
それらの結果は、ケモカインが、炎症の領域への白血球移動を促進でき、そして多くの疾病状態、例えばIBDの病理生理学に最近、包含されている走化性サイトカインであることを示す研究と一致する。IBDにおける粘膜変化は、腸における卓越した細胞浸潤物により付随される潰瘍性病変により特徴づけられた。
【０４２１】
例15：過敏性腸症候群におけるZven1の測定：
Zven1発現がIBSにおいて異常調節されるかどうか決定するために、循環レベルを、現在IBS症状の存在について注意してスクリーンされた年齢的20〜45の女性からの血漿サンプルにおいて測定した。等数の健康な対照ドナー血漿を得た。非症状のグループは、IBS又はIBS−様GI症状又は不良な睡眠のいずれの病歴も否定した。さらに、すべての研究は、可能性ある月経周期の差異を調節するために、同じ月経周期内で行われた。合計12の血漿サンプルを、ストレス関連ホルモン及びZven1（プロキネチシン２）の測定のために、夜の間に得た。血液を8：00p.m.で採血し（20時間）、そして１時間ごとに、7：00a.m.まで採血した（７時間）。
【０４２２】
A. 血小板に富んでいる血漿調製物：
約4.5mlの血液を、EDTA管中に集め、そして軽く逆にすることにより混合した。サンプルを、すべてのサンプルが集められるまで、氷上に貯蔵した。血液を、200×g、4℃で10分間、中断しながら遠心分離した。血漿画分をデカントし、そして管中にアリコートし、そして-80℃で凍結した。
サンプルを、それらがZven1レベルについてアッセイされる日まで、凍結保存した。融解に基づいて、サンプルを、13,000rpmで５分間、室温で回転し、いずれの残骸も除去した。血漿をELISA-B緩衝液（BLISA-C緩衝液中、1％BSA）により１：４に希釈し、そして個々のサンプルを三重反復して試験した。
【０４２３】
B. ELISA：
サンドイッチELISAプロトコールを用いて、循環Zven1について血漿サンプルをアッセイした。Nunc-Immuno96-ウェルMaxisorp Surface ELISAプレートを、ELISA-A緩衝液（0.1Mの炭酸ナトリウム、pH9.6）において調製した。1.06μg/mlの濃度でのポリクローナルウサギ抗−ヒト抗体により被覆した。次に、プレートを密封し、そして４℃で一晩インキュベートした。
【０４２４】
次の日、プレートを、ELISA−C緩衝液（１×PBS、0.05％（v/v）のTween20）により５度、洗浄し、そして次に、それらを、SuperBlock（Pierce, カタログ番号37515）により２度、室温で５分間、阻止した。プレートを、ELISA−C緩衝液により５度、洗浄し、その後、サンプル及び標準をプレートに添加した。
標準曲線調製のために、プールされた血小板に富んでいる血漿を調製した。手短には、４人の健康な個人からの血液を、EDTA含有管中に採血した。血液を、200×g、4℃で10分間、回転した。すべての４人のドナーからの血漿をプールし、そしてアリコートを−80℃で維持した。
【０４２５】
アッセイの日、凍結された血小板に富んでいる血漿を融解し、そして10,000rpmで５分間、回転し、残骸を除去した。標準曲線血漿及びヒト患者試験血漿の両者を、ELISA−B緩衝液により１：４に希釈した。E. コリ生成されたZven1タンパク質を、標準曲線を調製するために既知濃度での標準曲線血漿中にスパイクした。一連の希釈を、25ng/mlから0.08ng/mlまで行った。
標準曲線希釈溶液及びサンプルの両者を、プレートに三重反復して添加した。プレートを密封し、そして振盪機上で37℃で２時間、インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、ELISA−C緩衝液により５度、洗浄した。
【０４２６】
検出のために、ビオチニル化されたウサギ抗−ヒトポリクローナルZven1抗体を、ELISA−B緩衝液により500ng/mlに希釈した。ELISAプレートを、抗体により被覆し、そして振盪機上で37℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートをELISA−C緩衝液により洗浄した。ストレプタビジンホースラディシュペルオキシダーゼSA-HRP（Pierce）を、ELISA−B緩衝液により250ng/mlに希釈し、そしてプレートに添加した。プレートを密封し、そして振盪機上で37℃で１時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、プレートをELISA−C緩衝永により洗浄し、そしてテトラメチルベンジジン（TMB）溶液（BioFX、カタログ番号TMBW−1000−01）を室温でプレートに添加し、そしてベンチ上で30分間インキュベートした。色彩の進行を、停止溶液（BioFX 450 Stop Reagent, カタログ番号STPR-1000-01）により停止し、そして450m−540nmでの吸光度を、停止の15分以内に分光光度計（Molecular Devices）上で読み取った。タンパク質の量を、SofMax Proソフトウェア−プログラムを用いて、標準曲線から計算した。
【０４２７】
C. 結果：
対照ドナーサンプルは、低レベルのZven1を示す。Zven1のレベルは夜半前及び6：00a.m.の後に採取されたサンプルにおいて最高であったが、Zven1発現は、夜半〜6：00a.m.の間、対照ドナーにおいては検出されなかった。Zven1/mlの最高濃度は比較的低く、そして最大値は約119pg/mlのレベルに達した。
IBSドナーにおいては、循環Zven1の量は対照よりも高く、そして発現パターンは異なり、そして発現は夜中観察された。最大Zven1レベルは、IBS患者において917pg/mlで約９−倍高められた。さらに、対照ドナーと異なって、循環Zven1は、夜中（夜半から7:00a.m.まで）から得られたサンプルにおて検出された。
【０４２８】
D. 結論：
正常な対照患者においては、Zvne1発現は日周期パターンで付随し、そしてそこでのレベルは、消化工程が活性的であるか、又は開始する場合、夜及び朝において最高である。IBS患者においては、この発現の日周期パターンは異常調節され、このことは、Zven1がIBSの病理学に関与し、そしてIBS症候群に寄与することを示唆する。器官槽及びインビボの両者における腸運動に対するZven1の十分な効果がまた、IBSに関連する変更された腸運動への連結を支持する。Zven1アンタゴニストは、IBS患者が経験する便秘（又は下痢）、不眠、腹部鼓脹及び痛み感覚に対する高められた感受性の症状を軽減することができた。
【０４２９】
例16：ラット胃腸管におけるGPR73a及びGPR73bの発現：
ラットを一晩、断食し、そして殺害した。腸及び胃を分離し、そして結腸の端を通して胃からの4cmの組織断片を、すぐに液体窒素において凍結した。酸−フェノール抽出方法を、RNA単離のために使用した。手短には、組織断片を液体窒素においてすりつぶし、次に酸グアニジウム基材の溶解緩衝液（４Mのグアニジンイソチオシアネート、25mMのクエン酸ナトリウム（pH7）、0.5％サルコシル）、NaOAc（0.1Mの最終濃度）＋βME（１：100）に溶解し/均質化した。溶解物を回転沈降せしめ；上清液を等体積の酸フェノール及び1/10の体積のクロロホルムと共に混合した。回転沈降の後、等体積のイソプロパノールを水性層に添加した。サンプルを−20℃でインキュベートし、次に回転沈降によりペレット化した。ペレットを、70％エタノールにより洗浄し、そして次に、DEPC処理された水に再懸濁した。
【０４３０】
Taqman EZ RT-PCR Core Reagent Kit (Applied biosystems, Foster City, CA)を用いて、GPR73a及びGPR73b受容体発現レベルを決定した。製造業者の説明書に従って、標準曲線を、高い品質のRNAを有し、そして同じレベルで両受容体の発現を示すRNA単離物の１つを用いて調製した。このRNAサンプルの標準曲線希釈度を次の濃度で調整した：500ng/μl、250ng/μl、100ng/μl及び12.5ng/μl。それらの標準曲線希釈度を用いて、GPR73a及びGPR73ｂ遺伝子のために、及びハウスキーピング遺伝子、すなわち齧歯動物のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のために企画されたプライマーを試験した。プライマー及び標準曲線の作業条件が確立されると、ラットから単離されたRNAサンプルを試験した。
【０４３１】
RNAサンプルを氷上で融解し、そしてRNアーゼを含まない水（Invitrogen, カタログ番号750023）において100ng/μlに希釈した。希釈されたサンプルを、実験の間、氷上で維持した。TaqMan EZ RT-PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems, Cat# N808-0236)を用いて、マスター混合物を、GPR73a, GPR73ｂ受容体及びハウスキーピング遺伝子のために調製した。サンプルを三重反復してアッセイするために、3.5μlの個々のRNAサンプルをアリコートした。陽性対照に関しては、3.5μlの個々の標準曲線希釈物を、サンプルRNAの変わりに使用した。負の対照に関しては、3.5μlのRNアーゼフリーの水を、鋳型のない対照のために使用した。内因性対照（齧歯動物GAPDHメッセージ）に関しては、3.5μlの標準曲線希釈物及びサンプルRNAの両者をアリコートした。次に、84μlのPCRマスター混合物を添加し、そしてピペットにより十分に混合した。
【０４３２】
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems カタログ番号 N801-0560)を氷上に置き、そして25μlのRNA/マスター混合物を、適切なウィルスに三重反復して添加した。次に、MicroAmp 12-Cap Strips (Applied Biosystems カタログ番号N801- 0534)を用いて、全プレートを被覆した。次に、プレートを、Qiagen Sigma 4-15遠心分離機において3000RPMで２分間、回転せしめた。
サンプルを、PE-ABI 7700 (Perldn Elmer, 現在 EG & G, Inc. Wellesley, MA)上で回転せしめた。配列検出器を準備し、そしてデフォールトをReal Time PCRに設定した。蛍光色素をFAMに設定した。プレート鋳型を、標準及び未知の試験サンプルが存在する場所を示すために設定した。
【０４３３】
個々のサンプルについての発現を、Ct値として報告する。Ct値は、蛍光色素又はRT−PCR生成物（RNA多数性の直接的な反対）が、限界又はバックグラウンドレベルを越えるレベルまで増幅される点である。高い発現性のサンプルのRT−PCRは、すぐに限界を交差する蛍光色素/生成物のより高い蓄積をもたらすので、Ct値が低いほど、より高い発現レベルが得られる。40のCt値は、測定される生成物は存在せず、そしてゼロの平均発現値をもたらすべきであることを意味する。
【０４３４】
Ctは標準曲線への比較に基づいて相対的発現値に転換される。試験される個々のサンプルに関しては、GPR73a, GPR73b及びGAPDH発現レベルの量は、適切な標準曲線から決定された。次に、それらのGPR73a及びGPR73bの計算された発現が、個々のサンプルのための標準化された発現を得るために、個々のサンプルのGAPDH発現により割り算された。個々の標準化された発現値は、相対的発現レベルを得るために、標準化された−検量値により割り算された。GraphPad Prismソフトウェアーを用いて、それらの標準化された値は、最高発現レベルが１として示される割合に転換された。
【０４３５】
【表１２】
2006514683.tif 000013
【０４３６】
例17：Zven1及びモノクローナル抗体：
ラットモノクローナル抗体を、上記例６又は７からの精製された組換えタンパク質により、４匹の雌Sprague-Dawley Rats (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を免疫化することにより調製した。ラットは、完全フロイントアジュバント（Pierce, Rockford IL）中、精製された組換えタンパク質25μgの初期腹腔（IP）内注射、続いて、２週ごとの不完全フロイントアジュベント中、精製された組換えタンパク質10μgの追加IP注射をそれぞれ与えられる。第２追加免疫化の投与の７日後、動物は放血され、そして血清が集められる。
【０４３７】
Zven1−特異的ラット血清サンプルを、特異的抗体標的物として、１μg/mlの精製された組換えタンパク質Zven1を用いて、ELISAにより特徴づけられる。
脾臓細胞を、一匹の高力価ラットから収穫し、そしてSP2/0（マウス）骨髄腫細胞に、PEG1500を用いて、単一融合方法により融合する（４：１の融合化、脾臓細胞：骨髄腫細胞、Antibodies : A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Press）。９日間の後−融合増殖の後、特異的抗体−生成ハイブリドーマプールを、特異的抗体標的物としてI125−ラベルされた組換えタンパク質Zven1を用いて、放射性免疫沈澱法（RIP）により、及び特異的抗体標的物として500ng/mlの組み換えタンパク質Zven1を用いて、ELISAにより同定する。いずれかのアッセイプロトコールにおいて陽性のハイブリドーマプールを、GPR73a (配列番号 27) 及び/又は GPR73b (配列番号28)の受容体配列を発現するBaf3細胞上での精製された組換えタンパク質Zven1の細胞−増殖活性（“中和アッセイ”）を阻止するそれらの能力について、さらに分析する。
【０４３８】
RIPのみ、又はRIP及び“中和アッセイ”により陽性結果を生成するハイブリドーマプールは、制限希釈法により少なくとも2度クローン化される。
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体を、受容体配列を発現するBaf3細胞上での精製された組換えタンパク質Zven1の細胞−増殖活性（“中和アッセイ”）を阻止するそれらの能力により特徴づける。“中和”モノクローナル抗体を、この態様で同定する。
類似する方法に従って、配列番号５におけるアミノ酸配列を用いて、Zven2に対するモノクローナル抗体を同定する。
【０４３９】
例18：テンジュクネズミ胃腸器官槽アッセイにおける収縮性の刺激：
約0.5kgの体重の生後６週の雄Hartleyテンジュクネズミを、一酸化炭素により安楽死した。腸組織を次の通りに収穫した：盲腸の10cm吻側の回腸の２〜３cmの縦長の切片、及び十二指腸、空腸、及び近位及び遠位結腸の２〜３cmの縦長の切片。
【０４４０】
組織を、118.2 mM のNaCI, 4.6 mMの KC1, 1. 2mmの MgS04, 24.8 mM のNaHC03, 1. 2mM のKH2P04, 2.5mM のCaCl2 及び lOmMのグルコースを含むクレブスリンガー炭酸水素塩緩衝液により洗浄した。十分な洗浄に続いて、組織を、暖められた酸素化されたクレブス緩衝液を含むRednoti器官槽灌流システム（SDR Clinical Technology, Sydney Australia）において縦方向に固定し、そして37℃で維持した。1gの前−充填物を適用し、そして組織ストリップを、約30分間インキュベートした。次に、基線収縮を得た。等張収縮を、力置換変換器により測定し、そしてPo-ne-mah Physiology Platform Softwareを用いて、チャートレコーダー上に収録した。130μmでの神経伝達物質５−ヒドロキシトリプトファン（5HT）（Sigma）及び５〜10mMでのアトロピンを対照として使用した。アトロピンは、アセチルコリンのムスカリン効果を阻止する。
【０４４１】
１〜400ng/mlの用量のZven1を、回腸のストリップに対する活性について試験した。筋肉収縮を、Zven1タンパク質の添加のすぐ後に検出し、そして１ng/ml又は100pモルほどの低い濃度で記録した。この応答のEC50は約10ng/ml又は１nMであった。Zven1を、5HTの存在下で活性について試験し、そして第２の収縮を観察した。Zven1を、0.1μMのテトロドトキシン（TTX）、すなわち神経作用性の有能なアンタゴニストの存在下で活性について試験し、そしてZven1効果の低下は観察されなかった。Zven1をまた、100nMのVerapamil（L-タイプのカルシウムチャンネルブロッカー）の存在下で活性について試験した。収縮応答の振幅の有意な低下を観察した。
回腸における収縮性に対するZven1の効果の結果は表13に示される。
【０４４２】
【表１３】
2006514683.tif 000014
【０４４３】
十二指腸、空腸、近位結腸及び遠位結腸における収縮に対するZven1の効果の結果は、40ng/mlの濃度で行われる場合、十二指腸、空腸、又は遠位結腸において収縮を生成しなかったことを示した。しかしながら、近位結腸の組織の弛緩は、同じ濃度のZven1が添加される場合、観察された。
【０４４４】
例19：テンジュクネズミ回腸器官槽アッセイにおける収縮性に対する用量の効果：
テンジュクネズミ回腸からのすべての腸切片を入手し、そして例６に記載されるのと同じプロトコール及び試薬を用いて試験した。テンジュクネズミ回腸の縦長のストリップを、器官槽に固定し、そして約20分間、安定化した。10μg/mlの濃度でのアセチルコリン（ACH）を組織に添加し、収縮活性を確めた。２回のフラッシュ及び充填サイクルを行い、腸組織からACHを洗浄した。基線活性を、約25分間、確めた。Zven1を1.0ng/mlの最終濃度で器官槽に添加し、そして約0.5gの偏向を記録した。
【０４４５】
1.0ng/mlの用量のZven1を5分間、組織上に残し、組織の基線レベルへの戻りを可能にし、そして次に、10ng/mlの用量を添加した。2.0gの偏向をもたらすもう１つの収縮応答が示された。10ng/mlの用量を、20ng/mlの用量のZven1を組織に投与する前、さらに５分間、組織上に残した。約2.2gの偏向をもたらすもう１つの収縮応答を観察した。5分間のインキュベーションの後、組織を40ng/mlの用量のZven1により処理した。組織は、約2.0gの変更を伴って、再び収縮した。最高の応答は、20ng/mlのZven1用量で観察された。
【０４４６】
例20：胃排出能及び腸通過に対するZven1の効果：
生後８週の雌C57B1/6マウスは、メチルセルロース溶液又は対照から成る試験食事を供給され、そして胃排出能及び腸通過の両者を、腸の異なった切片において回収されたフェノールレッドの量を決定することにより測定した。試験食事は、非吸収性色素、すなわち0.05％フェノールレッド（50mg/100ml Sigma Chemical Company Catalogue # P4758）を含む1.5％メチルセルロース水溶液から成る。400−800センチポアズの最終粘度を有する。Sigma（カタログ番号C4888）からの中位の粘度のメチルセルロースを使用した。
【０４４７】
１つの動物のグループを、試験用食事の投与のすぐ後に殺害した。それらの動物は、標準グループ、すなわち胃における100％フェノールレッド又はグループVIIIを表す。残る動物を、試験用食事の投与後20分で殺害した。殺害に続いて、胃を除き、そして小腸を近位、中間及び遠位腸断片に断片化した。近位腸は、ほぼ十二指腸から成り、中間の腸はほぼ十二指腸及び空腸から成り、そして遠位腸はほぼ回腸から成る。すべての組織を、組織ホモナイザーを用いて、10mlの0.1Nの水酸化ナトリウムに溶解した。分光光度の分析を用いて、OD及び従って、胃排出能及び腸通過のレベルを決定した。
【０４４８】
個々の処理グループは、10匹の動物から成り、但し標準グループ及びカエルリン対照グループ（n＝5）として使用される動物は除く。研究を２日に分け、その結果、すべての処理グループの半分は２日の連続した日で行われる。動物を18時間、持ち上げられた檻において18時間、断食したが、水へは自由に接近できる。マウスの平均体重は16gであった。
【０４４９】
20mMのMES緩衝液、20mMのNaCl、pH6.5に配合される、C−末端Glu−Glu標識を有するバキュロウィルス−発現されたZven1タンパク質を、シリコーン処理された管を用いて、0.9％ NaCl＋0.1％BSA中に希釈した。（Sigma 塩化ナトリウム溶液0.9％、及びSigma BSA30％無菌TC試験溶液、Sigma Chemical Co. St. Louis, MO）。タンパク質濃度を、マウス当たり0.2mlの体積に含まれるよう調節した。ビークル動物は、最高（775ng/g）の処理グループに基づいて、等用量のZven1配合緩衝液を受けた。
【０４５０】
経口洗浄として0.15mlのフェノールレッド試験用食事を受ける２分前、IP（腹腔内）注射を通して0.2mlの体積で処理を行った。フェノールレッドの投与後20分で、動物を安楽死し、そして胃及び腸断片を除いた。腸を測定し、そして次の３個の同じ長さのセグメントに分けた：近位、中間及び遠位。個々のサンプルにおけるフェノールレッドの量を、分光光度分析により決定し、そして胃における全フェノールレッドの％として表した（グループVIII）。それらの値を用いて、集められた組織当たりの胃排出能及び腸通過の量を決定した。40ng/gでのCCK類似体カエルリンを、正の対照として使用し、そして洗浄の5分前、投与し、この濃度で、それは胃排出能を阻害する。個々の腸セグメント及び胃から回収されたフェノールレッドの比色分析を次の通りに行った。
【０４５１】
安楽死の後、胃及び腸のセグメントを、10mlの0.1NのNaOHに置き、そしてポリトロン組織ホモナイザーを用いて均質化した。その均質物を、室温で１時間インキュベートし、次に４℃で20分間、150×gでの卓上遠心分離機上での遠心分離によりペレット化した。タンパク質を、0.5mlの20％トリクロロ酢酸の添加により、均質物5.0mlから沈殿せしめた。遠心分離に続いて、4mlの上清液を、4mlの0.5NのNaOHに添加した。200μlのサンプルを、Molecular Devices Spectra Max 190分光計を用いて、560nmで読み取った。胃排出能の量を、次の式を用いて計算した：％胃排出能＝（１−試験の胃から回収されたフェノールレッドの量/グループVII の胃から回収されたフェノールレッドの平均量）×100。胃通過の量は、回収された全フェノールレッドの％として表された。
【０４５２】
結果は下記表14に示される。試験用食事はいずれの条件下でも遠位腸においては検出されなかったので、それらのデータは包含されない。予測されるように、40ng/mlでのカエルリンは胃排出能を阻害した（ビークルによる63.8％に比較して、20分後、胃における試験用食事の93.8％）。カエルリン処理されたグループにおいては、わずか2.6％の食事が遠位腸に及び中間腸に1.2％が測定され、これは阻害された胃排出能と一致する。
【０４５３】
最低のZven1濃度、すなわち0.78μg/kg体重で、ビークルに比較して、胃排出能のわずかな上昇が観察された（残存する食事の56.3％−対−ビークルによる63.8％）。高められた食事が、それぞれ、ビークル対照、25.5％及び18.4％に比較して、Zven1処理された動物の遠位腸に検出され、これは胃排出能の上昇と一致する。7.8μg/kgの用量で、Zven1処理された動物は、胃に20％以下の試験用食事（p＝0.001）、遠心腸に16.6％以上の食事（ｐ＝0.004）及び中間腸に3.5％以上の食事を有した。最大効果は77.5μg/kgの動物により観察され、ここで胃排出能は、約２倍高められた（Zven1処理された動物における37.8％の試験用食事及びビークル処理された動物において63.8％、p＝0.0002）。
【０４５４】
腸通過はまた、中間の腸における試験用食事の２倍以上の上昇が、ビークル対照よりもZven1処理された動物のにおいて測定されるので、有意に高められた（15％に比較した37.1％、p＝0.004）。最終の77.5μg/kgの用量で、高められた胃排出能が、63.8％の対照に比較して、46.6％で検出されたが、しかし効果は77.5μg/kgの用量ほど高くはなかった。高められた腸通過は、中間の腸において検出されたが（26％対15％）、しかし効果はより低い77.5μg/kgの用量で観察される効果ほど有意ではなかった。それらのデータは、より高い濃度で、Zven1が胃排出能及び腸通過を示すことができることを示す。
【０４５５】
【表１４】
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【０４５６】
例21：器官槽におけるZven1の活性：
器官槽試験を、テンジュクネズミから得られた種々の組織を用いて、Zven1により行った。力変換器が、IOXソフトウェア(EMKa technologies, Falls Church, VA) 及び データ分析ソフトウェア (EMKa technologies, Falls Church, VA)を用いて、機械的収縮を記録するために使用された。分析される組織は次のものを包含した：十二指腸、空腸、回腸、気管、食道、大動脈、胃、胆嚢、膀胱及び子宮。
【０４５７】
A. 器官槽方法：
体重約250〜300gの生後2ヶ月の雄のテンジュクネズミ（Hartley, Charles River Labs）を約18時間、断食し（但し飲料水への自由に接近できる）、そしてCO2窒素により安楽死した。すべての組織を、クレブス緩衝液（1. 2mMの MgS04, 115mM のNaCl, 11.5mM のグルコース, 23.4mMの NaHCO3, 4.7mM のKC1, 1. 2mM のNaH2PO4, 及び 2.4mM CaCl2, oxygenated with 95% 02-5% C02により酸素かされた, pH 7.4, 温度 37℃）によりすすぎ、次に5mlの器官槽において懸濁し、そして予備−緊張化した。すべての組織を、実施の前、それらの生存性を確立するために陽性対照により試験した。使用される陽性対照は、CCK-8、アセチルコリン（ACH）、ヒスタミン又は5HTであり、そしてSigma（Saint Louis, MO）から購入した。すべての組織を、ビークル対照、すなわちリン酸緩衝溶液により処理し、ビークル効果の可能性を妨げた。
【０４５８】
１）器官槽においてZven1に対する応答を与えなかった組織：
−気管支輪：3mmの幅の気管支輪（鰓器官枝から3cm離れた）を集め、そしていずれかの処理の前、5gの緊張で平衡化した。陽性対照は、約1gの偏向を付与する20μg/mlのACHであった。80ng/mlでZven1による効果は見られなかった。
−大動脈輪：3mmの幅の大動脈輪（大動脈弓にすぐ隣接する）を集め、そしていずれかの処理の前、4gの緊張で平衡化した。陽性対照は、平均1gの偏向を付与する2mg/mlのKClであった。80ng/mlでのZven1は、眼に見える効果を引き起こさなかった。
【０４５９】
−食道：長さ2cmの食道（噴門から2cm離れた）を懸濁し、そしていずれかの処理の前、1gの緊張で平衡化した。2mg/mlの5HTは、約1.4gの偏向を与えた。20ng/mlでのZven1は、眼に見える効果を有さなかった。
−胆嚢：管腔流体を1mlの注射器により吸引し、次に長期的に懸濁し、そしていずれかの処理の前、1gの緊張で平衡化した。5ng/mlのACHは、0.4gの偏向応答を与えた。20ng/mlのZven1は、効果が見られなかった。
−膀胱：1.5cm×0.3cmの縦長のストリップを懸濁し、そしていずれかの処理の前、0.5gの緊張に平衡化した。陽性対照は収縮応答を誘発したが、しかし活性は80ng/mlのZven1用量で見出されなかった。
【０４６０】
２）Zven1に対して応答した組織：
−胃/幽門洞：1.5cm×0.3cmの縦長のストリップを懸濁し、そしていずれかの処理の前、0.5gの緊張に平衡化した。5ng/mlのACH又は80ng/mlのCCK8のいずれかによる処理は、約1gの偏向をもたらした。80ng/mlのZven1はまた、約0.5gの偏向の収縮応答を生成した。
−十二指腸：2cmの長さの十二指腸（幽門から2cm離れる）を懸濁し、そしていずれかの処理の前、1gの緊縮で平衡化した。ACHは約0.75gの偏向を与えた。20ng/mlのZven1はまた、約0.5gの偏向の収縮応答を与えた。
−空腸：2cmの長さの空腸（幽門と回腸−盲腸連結部との中間点）を懸濁し、そしていずれかの処理の前、1gの緊張で平衡化した。ACHは約1.6gの偏向を与え、そして20ng/mlのZven1は約0.5gの偏向収縮応答を与えた。
【０４６１】
−回腸：8cmの長さの回腸（回腸−盲腸連続部分から2cm離れて）を集め、そしていずれかの糞を除去するためにクレブス緩衝液によりフラッシュし、存在する場合、４つの等しい断片に切断した。すべての組織を懸濁し、そしていずれかの処理の前、1gの緊張で平衡化した。回腸を、小腸に対するZven1効果を比較するために、同時に実験した。ACHは約1.5gの偏向を与え、そして20ng/mlのZven1はまた、1.5gの偏向を与えた。
−遠位結腸−：2cmの長さの結腸（盲腸から2cm離れた）を懸濁し、そしていずれかの処理の前、0.5gの緊張で平衡化した。20ng/mlでのZven1は、筋肉緊張の低下及び収縮の振幅の低下を伴って、弛緩効果を誘発した。
【０４６２】
Zven1の収縮効果は、胃腸管に対して特異的である。最高の収縮応答は、回腸に見られ、そしてそれよりも低い収縮性が十二指腸、空腸及び幽門に見られた。遠位結腸における弛緩効果は、腸運動に対する調和した効果の表示である。平滑筋収縮は幽門及び小腸において収縮されるので、大腸は、弛緩による接近する食事を収容するよう調整される。腸の異なった部分の間の調和した収縮活性は、改良される胃腸機能をもたらすであろう。
【０４６３】
例22：気管槽におけるZven1及びZven2の比較活性：
Zven1及びZven2の両者は、器官槽における腸組織に対して収縮効果を有する。並んでの比較が、同じ動物由来の組織における活性を比較するために行われた。
テンジュクネズミからの回腸ストリップを、上記方法を用いて、収縮性について試験した。Zven2はPeprotech Inc. (Rocky Hill, N.J.) から購入された。活性を、40, 12及び3ng/mlの濃度で比較した。5ng/mlでのACHを、正の対照として使用した。収縮応答は、個々の組織におけるACH応答に対して標準化された。すべての３種の用量が、同じ動物から得られた別々の縦長の回腸組織ストリップに対して実験された。
結果：収縮効果は、ACH陽性対照に対して標準化され、そして下記表におけるZven1又はZven2：ACHの比として表される。
【０４６４】
【表１５】
2006514683.tif 000016
結論：Zven1は、回腸における収縮性を比較する場合、Zven2の約２倍の活性である。
【０４６５】
例23：Zven1及びZven2の相乗効果：
収縮活性に対するZven1及びZven2の組合された効果を決定するために、回腸組織を、種々の用量のZven2により前処理し、続いて上昇する用量のZven1により処理した。
すべての組織を、安定化し、ACHにより処理し、そして再び安定化し、その後、0.8, 3.0又は12ng/mlの濃度でZven2により前処理した。Zven2を、20ng/mlのZven1を投与する前、約20分間、静置した。
【０４６６】
結果：Zven1による大きな3gの偏向が、組織が0.8ng/mlのZven2により前処理される場合に観察された。それらの収縮は、20ng/mlの用量のZven1により通常観察されるものよりも大きく、ここで約1.5〜2.0gの偏光の収縮効果が通常観察される。0.8ng/mlのみでのZven2は、無視できる収縮効果を有する。
結論：それらのデータは、低用量のZven2による前処理、及び次に、Zven1による処理により、高められた運動効果が観察され得ることを示唆する。
【０４６７】
例24：インビボでの手術後回腸におけるZven1の効果：
処理グループ当たり５〜25匹の雄のSprague-Dawleyラット（約240g）を、それらのPOI研究に使用した。動物を、約22〜23時間、断食したが（それらの寝床への接近からそれらを妨げるために、それらの檻に２つの床用格子が置かれる）、しかし水は自由に飲むことができる。ガスイソフルラン麻酔下で、ラットの腹部の毛を刈り、そしてベタジン/70％エタノールによりふき取った。次に、中央線切開を、皮膚及び腹部の白線を通して行い（3〜4cmの長さ）、その結果、腸が見え、そして利用できやすくなった。盲腸を、軽く拍動するような圧力を用いて、無菌の塩溶液−ソーキングガーゼにより１分間、操作した。この方法は、動物間の回腸変動性を低めるために、動物から動物に矛盾しない。白線を、絹糸により縫合し、そして皮膚を創傷用クリップにより閉じた。動物は、手術からの回復の間、水−被覆されたヒーリングパッド上に維持され、そしてそれらが十分な意識を回復するとすぐに、それらの檻に戻された。
【０４６８】
十分に意識がある場合、動物は、盲腸操作（CM）の完結の後15分で、1.0mlの試験用食事を投与され；１分又は20分後、ラットは0.8又は5μg/kgのBW  E. コリ−生成されたZven1、又は塩溶液/0.1％（w/v）BSAを、内在性頸動脈カテーテルを通して投与された。Zven1を、塩溶液/0.1％BSAにより、シリコーン処理された微小遠心分離管を用いて、研究の直前、所望する濃度に希釈した（ラット（約240g）の平均BV及び0.1mlの注射体積（i.v.）に基づいて）。
【０４６９】
試験用食事は、1.5％（w/v）のメチルセルロース水溶液（Sigmaからの400センチポアズの中位の粘度のメチルセルロース：カタログ番号M−0262）、及び非吸収性色素、0.05％（50mg/100ml）のフェノールレッド（Sigmaカタログ番号P−4758；ロット番号120k3660）から成った。試験用食事の投与の20分後、動物をイソフルラン下で麻酔し、そして頸部脱臼により殺した。胃及び腸断片を除き、そして個々の断片におけるフェノールレッドの量を、分光光度分析（下記参照のこと）により決定し、そしてラット当たり回収される合計フェノールレッドの％として表した。それらの値を用いて、集められた組織当たりの胃排出能及び腸通過の量を決定した。
【０４７０】
個々の腸断片及び胃から回収されるフェノールレッドの比色分析を、Scarpinato and Bertaccini (1980) and Izbeki など (2002)により概略される方法の変法に従って行った。手術には、安楽死に続いて、胃及び腸断片を、20mlの0.1NのNaOH中に置き、そしてPolytron組織ホモナイザーを用いて均質化した。次に、Polytronを、5mlの1NのNaOHによりすすぎ、そして追加の15mlの0.1NのNaOHと共に、前の20mlに添加した。均質物を、室温で少なくとも１時間、沈降せしめた。タンパク質を、0.5mlの20％トリクロロ酢酸の添加により5mlの上清液から沈殿した。遠心分離（3000rpmで15分）に続いて、1mlの上清液を、1mlの0.5NのNaOHに添加した。0.2mlのサンプル（96−ウェルプレートにおける）を、Molecular Devices Spectra Max 190分光光度計を用いて560nmで読み取った。胃排出能及び腸通過の程度を、ラット当たり回収された合計のフェノールレッドの％として表した。
【０４７１】
データは、Zven1（0.8及び5.0μg/kg, i.v.）が、ビークル処理されたラットに観察される排出能及び通過に比較して、この半固体の非栄養食事の胃排出能及び上部腸通過を、約1.6〜２倍、有意に高めたことを示した。このモデルにおける効能は、それらの用量のZven1が食事投与の後、１分又は20分のいずれかで投与される場合に観察された。
【０４７２】
例25：ラットにおけるフェノールレッド半固体食事の胃排出能及び腸通過に対するi.v.及びi.p. BV−及びE. コリ−生成されたZven1の効果：
雄のSprague−Dawleyラット（約240g）を、この研究のために使用し、そして処理グループ当たり６〜12匹の動物が存在する。動物を、約22〜23時間、断食したが（それらの寝床への接近からそれらを妨げるために、それらの檻に２つの床用格子が置かれる）、しかし水は自由に飲むことができる。1.0mlの試験食事の投与の１分後、ラットに、内在性頸静脈カテーテルを通して種々の用量のZven1（0.01〜30μg/lg BW）又は塩溶液/0.1％（w/v）BSAを投与した。i.p.用量に関しては、Zven1 (0.1〜100μg/lg BW)又は塩溶液/0.1％BSAを、食事の１又は10分前、又はその1分後、投与した。Zven1を、シリコーン処理された微小遠心分離管を用いて、研究の直前、塩溶液/0.1％BSAにより所望する濃度（ラット（約240g）の平均BW、及びi.v.に関して0.1mlの注射体積又はi.p.に関して0.5mlの注射体積に基づいて）に希釈した。
【０４７３】
試験用食事は、1.5％（w/v）のメチルセルロース水溶液（Sigmaからの400センチポアズの中位の粘度のメチルセルロース：カタログ番号M−0262）、及び非吸収性色素、0.05％（50mg/100ml）のフェノールレッド（Sigmaカタログ番号P−4758；ロット番号120k3660）から成った。試験用食事の投与の20分後、動物をイソフルラン下で麻酔し、そして頸部脱臼により殺した。
胃及び腸断片を除き、そして個々のサンプルにおけるフェノールレッドの量を、分光光度分析（下記参照のこと）により決定し、そしてラット当たり回収される合計フェノールレッドの％として表した。それらの値を用いて、集められた組織当たりの胃排出能及び腸通過の量を決定した。
【０４７４】
個々の腸断片及び胃から回収されるフェノールレッドの比色分析を、Scarpinato など Arch If2t. Phannacodyn. 246 : 286-294 (1980) 及び Piccinelli など. Naufzyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol 279: 75-82 (1973)により概略される方法の変法に従って行った。手術には、安楽死に続いて、胃及び腸断片を、20mlの0.1NのNaOH中に置き、そしてPolytron組織ホモナイザーを用いて均質化した。次に、Polytronを、5mlの1NのNaOHによりすすぎ、そして追加の15mlの0.1NのNaOHと共に、前の20mlに添加した。均質物を、室温で少なくとも１時間、沈降せしめた。タンパク質を、0.5mlの20％トリクロロ酢酸の添加により5mlの上清液から沈殿した。遠心分離（3000rpmで15分）に続いて、1mlの上清液を、1mlの0.5NのNaOHに添加した。0.2mlのサンプル（96−ウェルプレートにおける）を、Molecular Devices Spectra Max 190分光光度計を用いて560nmで読み取った。胃排出能及び腸通過の程度を、ラット当たり回収された合計のフェノールレッドの％として表した。
【０４７５】
この半固体食事の胃排出能及び腸通過は、0.1〜1.0μg/kgのBW BV−又はE. コリ−生成されたZven1のi.v.投与に続いて、約２倍、高められた。胃排出能及び腸通過の阻害効果を、高い用量（i.p.用量に関しては、10〜100μg/kg BW; i.v.用量に関しては、30μg/kg BW）のBV−及びE. コリ−Zven1を用いて観察した。その阻害観察は、それらの高い用量のZven1が試験用食事の投与後１分で、i.v.投与される場合、又は試験用食事の投与後10分でi.p.投与される場合、特に明白であった。類似する結果が、Zven2が30μg/kgでi.v.投与の場合に観察された。
【０４７６】
例26：マウスにおけるフェノールレッド半固体食事の胃排出能及び腸通過に対するi.v. BV−及びE. コリ−生成されたZven1の効果：
生後８〜10週の雌C57BJ/６マウス（８種の処理グループ及びグループ当たり約９匹のマウスから成る）を、研究のために使用した。動物を、床用スクリーンを含む檻において約20時間、断食し、そして水への接近は自由であった。動物を、正しい用量を決定するために計量し、そしてそれらの平均重量を、タンパク質濃度を調節するために使用した。Zven1タンパク質（20mMのMes緩衝液/20mMのNaCl、pH6.5、又はPBS、pH7.2のいずれかの原液における）希釈を、注射の直前、シリコーン処理された管において調製した。用量は、研究動物（約20g）の平均重量に基づかれ、そしてマウス当たり0.1mlの注射用体積に、塩溶液/0.1％（w/v）BSAにより調節した。Zven1及びビークルは、経口洗浄として0.15mlのフェノールレッド試験用食事を受ける１〜２分前、尾静脈へのi.v.注射により投与された。
【０４７７】
試験用食事は、非吸収性色素、すなわち0.05％フェノールレッド（Sigmaカタログ番号P−4758：ロット番号120K3660）を含む、1.5％（w/v）メチルセルロース水溶液（400〜800センチポアズの最終粘度を有する、Sigmaからの中位の粘度のカルボキシメチルセルロース；カタログ番号C−4888；ロット番号108H00052）から成った。試験用食事の投与後20分で、動物を安楽死し、そして胃及び腸断片を除いた。小腸を測定し、そして次の３種の等しい断片に分けた：近位、中間、遠位腸。個々のサンプルにおけるフェノールレッドの量を、分光光度分析により決定し（上記例20及び21に記載のようにして）、そしてマウス当たりに回収される合計のフェノールレッドの％として表わす。それらの値を用いて、集められた組織当たりの胃排出能及び腸通過の量を決定した。
【０４７８】
結果は、約１〜10μ/kg BWの用量でi.v. Zven1により処理されたマウスにおける胃の排出能及び腸通過の上昇が存在したことを示した。胃排出能及び腸通過の阻害傾向が、より高い用量（マウスにおいて50μg/kg：i.v.以上）のZven1を用いて観察された。
【０４７９】
例27：ウレタン麻酔されたラットの胃及び腸の全体的形態に対するBV−及びE. コリ−生成されたZven1の効果：
BV−又はE. コリZven1のi.v.投与（30μg/kg BVまでの用量及びその用量；腸運動を誘発することが知られている用量）が胃及び小腸の全体的外観に影響を及ぼすかどうかを決定するために、研究がウレタン−麻酔された雄のSprague−Dawleyラットにおいて行われた。
【０４８０】
ラットを、きれいな二重床檻上で約19時間、断食した（水へは自由に接近できる）。7:00〜8：30amの間、ラットはウレタン（0.5ml/100g BWの25％溶液）のi.p.注射を受け、そして頸静脈カテーテルを挿入された。麻酔されたラットをそれらの檻に戻し、そして必要な場合、投与されるウレタンの追加のi.p.用量を伴って、１日中、暖かなパッド（37℃で維持されている）上で維持した。麻酔の適切なレベルを、足指−つねり反応試験を用いてモニターした。
【０４８１】
動物間で約5分間隔で、塩溶液を、頸静脈を通して、続いて、ビークル（PBS）又はBV−又はE. コリ−生成されたZven1を、上昇する用量（3.10、及び30μg/kg BW; 0.1mlの注射用体積）で３時間ごとに（合計43μg/kg BW）、投与した。Zven1タンパク質の希釈は、注射の直前に調製された。用量は、研究動物の体重（約22g）に基づかれ、そして0.1mlの合計体積の希釈剤（塩溶液/0.1％BSA）に含まれるよう調製された。タンパク質を、シリコーン処理された微小遠心分離管を用いて希釈した。ラットはまた、0.5ml/時の速度でHarvardポンプを通して塩溶液の注入を受けた。初期のウレタンに続いて約８〜９時間後、ラットを頸部脱臼により殺害し（麻酔下で）、そしてそれらの胃及び小腸を、調査及び形態学的評価のために除去した。
【０４８２】
いずれのラットにおいても胃又は腸の外傷の証拠は存在していなかった。ビークル処理されたラットは、腸内腔の小さな断片内にいくらかの黒い流体を有し；Zven1−処理されたラットにおいては、いずれの黒い流体も観察されなかった。ウレタン麻酔及び断食プロトコールの結果としてすべての処理グループにおける腸内腔内に有意な量の粘液が存在した。
【０４８３】
例28：麻酔された実験哺乳類におけるインビボ胃腸収縮性に対するBV−生成されたZven1の効果：
“音波測微法（sonomicrometry）”は、インビボでの胃腸膨張性、コンプライアンス及び緊張を測定するためにピエゾ電気結晶を用いる技法である（Sonometrics, Corp. Ontario, Canada）。結晶を、実験哺乳類の胃腸管にそっていずれかの場所に配置する。次に、胃及び/又は腸における蠕動及び断片化収縮を、Zven1の投与に応答して正確に定量化し、そして詳細に検定することができる。このシステムは、胃運動/収縮性の非常に詳細且つ精巧な結果の測定を提供する。
【０４８４】
デジタル超音波測微法のこの方法が、ビークル（塩溶液/0.1％（w/v）BSA）及び上昇する用量のBV−生成されたZven1のi.v.注入に続いて、10匹のラット（５匹の雄のSpragne−Dawleyラットの２つのグループ）において、Adelson など. Gastroenterology 122, A-554. (2002)に記載のようにして、回腸、十二指腸、盲腸及び近位結腸における運動性及び/又は収縮性を調べるために使用された。それらの実験に関しては、ピエゾ電気結晶が、適切な腸位置に、小滴のシアノアクレート接着剤（Vetbond, 3M Animal Care, St. Paul, MN）を用いて結合された。腹壁切除の後、ウレタン麻酔されたラットは、フィードバック−調節されたヒーターを通して37℃で維持された。音波測微法の距離シグナルを、SonoLABソフトウェアー（Sonometrics Corp, London, Ontario, Canada）を実施するPentium（商標） III クラスのコンピューターに連結されるデジタル音波測微機（TRX-13, Sonometrics Corp, London ONT）を通して、50サンプル/秒の速度で連続的に得た。
【０４８５】
デジタル的に得られた距離データを、設置された４−チャンネルDACを通して、類似シグナルとして同時に記録した。それらの音波計測類似シグナルは、すべての類似する生理学的データ（直腸温度、血圧、EKG、心拍数）と共に、実験進行の同時観察及び分析を可能にするために、Spike 2（Cambridge Electronic Design, Ltd, Cambridge）データ獲得ソフトウェアーを実施するPentium（商標） IIクラスコンピューターに連結されるMicro1401 A/Dインターフェイス（Cambridge Electronic Design, Ltd, Cambridge）を用いて得られた。この方法は、４結晶対についての距離測定値の同時観察を可能にする。基線レベルは、個々のビークルとZven1注入との間で得られた。円状及び縦運動の両者が、直径１mmのピエゾ電気結晶の三元体（Sonometrics Corp.）を用いてモニターされ、その結果、３種のうち２つが縦軸に平行して配向され、そして３番目は、垂直に配向された。
【０４８６】
適用される刺激に対する運動応答は、持続的及び/又は段階的成分を含んで成る応答の持続的及び段階的成分が別々に分析された。トレースの持続成分は、周囲10にわたってトレースの中間値によりトレースにおける個々の点を置換することにより得られた。段階的成分は、元のトレースに、10の窓を有する滑らかな機能の逆操作を適用することにより、すなわち10の時定数を有する“DC成分”を除去することにより得られた。持続応答は、1つの応答の間、すなわち基線からの１分最大可動域の間、応答の持続期間、及び統合された応答（平均標準化された応答持続時間）の間、平均値により分析された。段階的活性は、その速度及び振幅により分析された。同時に測定される異なった腸領域における運動性間の関係の変化は、連続シグナルの交差−相関及びピーク位置の現像相関を用いて分析された。
【０４８７】
強い収縮応答は、3μg/kg BWほどの低いi.v.用量でのZven1−処理されたラットの回腸において観察され；収縮性はまた、回腸に関して観察されるほど強くはないが、空腸及び十二指腸においても示された。弛緩に関連する応答は、近位結腸において観察された。
【０４８８】
例29：意識のあるマウスにおける近位結腸通過に対するBV−生成されたZven1のi.p.投与の効果：
成長した雄のC57/BL6（生後６〜８週；Hurlan, San Diego, CA）を、この研究に使用し、そして処理グループ当たり６〜10匹のが存在した。マウスを、調節された温度（21−23℃）及び湿度（30−35％）で維持される、12：12時間の明−暗サイクルに維持し、そして食物（Purina Chow）及び水道水に自由に接近できる檻グループ収容した。マウスを18〜20時間、食物から断食し、但し、実験の前、水には自由に接近できた。pH6.5での、20mモルのMES及び20mモルのNaClの原液中、BV−生成されたZven1を−80℃で貯蔵した。実験の日、Zven1を0.9％NaCl及び0.1％BSAに希釈した。種々の用量でのビークル及びZven1の両者についてのpHは6.5であった。
【０４８９】
遠位結腸通過を、前に記載のようにして測定した（Martinez V, など. J Pharmacol Exp Ther 301: 611-617 (2002. )）。断食されたマウスは１時間、水及び前もって計量されたPurinaチューに自由に接近でも、次にすぐに、エンフルランにより麻酔され（１〜２分；Ethrane−Anaquest, Madison, WI）、単一の2mmのガラスビーズが肛門から2cmの位置の遠位結腸中に挿入された。ビーズ挿入は、組織損傷を回避するために、火炎−消毒された末端を有するガラス棒により行われた。ビーズ挿入の後、マウスは、食物及び水のないそれらの檻にそれぞれ置かれた。マウスは１〜２分以内に意識を回復し、そしてその後、正常な挙動を示した。遠位結腸通過を、ガラスビーズの排除のために必要とされる時間をモニターすることにより、最も近い0.1分であることを決定した（ビーズ潜伏時間）。
【０４９０】
１時間の食事期間の最後で、マウスは、結腸中へのビーズ挿入、続くビークル又はZven1（3, 10, 30又は100μg/kg）の腹腔内注射のためにエンフルランにより麻酔された。動物を、食物又は水のないそれらの元の檻に戻し、そしてビーズ排除時間をモニターした。結果は、平均±S.E.として表され、そしてワン−ウェイANOVAを用いて分析した。
【０４９１】
18〜20時間、断食され、１時間、再食事を与えられ、Zven1（3, 10, 30及び100μg/kg）をi.p.注射されたマウスにおいては、BV−Zven1（3, 10及び30μg/kg）のi.p.注射に応答してのビーズ排除時間の有意な変化は示されず：i.p.ビークル注射されたグループにおける21.1±3.9分に比較して、それぞれ32.7±6.1、23.1±4.5及び34.2±5.6分であった。同様にして処理されたが、但し高い用量のBV−Zven1を投与された第２グループのマウスにおいては、遠位結腸通過の測定は、ビーズがBV−Zven1（30及び100μg/kg）のi.p.注射に排除される時間を高める用量−関連傾向を示したが（ビークルのi.p.注射後の22.3±5.7分に比較して、それぞれ29.8±7.8及び35.1±3.7分）、但し変化は統計学的有意性に達しなかった。
【０４９２】
例30：ラット胃腸管におけるGPR73a及びGPR73bの発現：
ラットを一晩、断食し、そして殺害した。腸及び胃を分離し、そして結腸の端を通して胃からの4cmの組織断片を、すぐに液体窒素において凍結した。酸−フェノール抽出方法を、RNA単離のために使用した。手短には、組織断片を液体窒素においてすりつぶし、次に酸グアニジウム基材の溶解緩衝液（４Mのグアニジンイソチオシアネート、25mMのクエン酸ナトリウム（pH7）、0.5％サルコシル）、NaOAc（0.1Mの最終濃度）＋βME（１：100）に溶解し/均質化した。溶解物を回転沈降せしめ；上清液を等体積の酸フェノール及び1/10の体積のクロロホルムと共に混合した。回転沈降の後、等体積のイソプロパノールを水性層に添加した。サンプルを−20℃でインキュベートし、次に回転沈降によりペレット化した。ペレットを、70％エタノールにより洗浄し、そして次に、DEPC処理された水に再懸濁した。
【０４９３】
Taqman EZ RT-PCR Core Reagent Kit (Applied biosystems, Foster City, CA)を用いて、GPR73a及びGPR73b受容体発現レベルを決定した。製造業者の説明書に従って、標準曲線を、高い品質のRNAを有し、そして同じレベルで両受容体の発現を示すRNA単離物の１つを用いて調製した。このRNAサンプルの標準曲線希釈度を次の濃度で調整した：500ng/μl、250ng/μl、100ng/μl及び12.5ng/μl。それらの標準曲線希釈度を用いて、GPR73a及びGPR73ｂ遺伝子のために、及びハウスキーピング遺伝子、すなわち齧歯動物のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のために企画されたプライマーを試験した。プライマー及び標準曲線の作業条件が確立されると、ラットから単離されたRNAサンプルを試験した。
【０４９４】
RNAサンプルを氷上で融解し、そしてRNアーゼを含まない水（Invitrogen, カタログ番号750023）において100ng/μlに希釈した。希釈されたサンプルを、実験の間、氷上で維持した。TaqMan EZ RT-PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems, Cat# N808-0236)を用いて、マスター混合物を、GPR73a, GPR73ｂ受容体及びハウスキーピング遺伝子のために調製した。サンプルを三重反復してアッセイするために、3.5μlの個々のRNAサンプルをアリコートした。陽性対照に関しては、3.5μlの個々の標準曲線希釈物を、サンプルRNAの変わりに使用した。負の対照に関しては、3.5μlのRNアーゼフリーの水を、鋳型のない対照のために使用した。内因性対照（齧歯動物GAPDHメッセージ）に関しては、3.5μlの標準曲線希釈物及びサンプルRNAの両者をアリコートした。次に、84μlのPCRマスター混合物を添加し、そしてピペットにより十分に混合した。
【０４９５】
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems カタログ番号 N801-0560)を氷上に置き、そして25μlのRNA/マスター混合物を、適切なウィルスに三重反復して添加した。次に、MicroAmp 12-Cap Strips (Applied Biosystems カタログ番号N801- 0534)を用いて、全プレートを被覆した。次に、プレートを、Qiagen Sigma 4-15遠心分離機において3000RPMで２分間、回転せしめた。
【０４９６】
サンプルを、PE-ABI 7700 (Perldn Elmer, 現在 EG & G, Inc. Wellesley, MA)上で回転せしめた。配列検出器を準備し、そしてデフォールトをReal Time PCRに設定した。蛍光色素をFAMに設定した。プレート鋳型を、標準及び未知の試験サンプルが存在する場所を示すために設定した。
【０４９７】
個々のサンプルについての発現を、Ct値として報告する。Ct値は、蛍光色素又はRT−PCR生成物（RNA多数性の直接的な反対）が、限界又はバックグラウンドレベルを越えるレベルまで増幅される点である。高い発現性のサンプルのRT−PCRは、すぐに限界を交差する蛍光色素/生成物のより高い蓄積をもたらすので、Ct値が低いほど、より高い発現レベルが得られる。40のCt値は、測定される生成物は存在せず、そしてゼロの平均発現値をもたらすべきであることを意味する。Ctは標準曲線への比較に基づいて相対的発現値に転換される。試験される個々のサンプルに関しては、GPR73a, GPR73b及びGAPDH発現レベルの量は、適切な標準曲線から決定された。次に、それらのGPR73a及びGPR73bの計算された発現が、個々のサンプルのための標準化された発現を得るために、個々のサンプルのGAPDH発現により割り算された。個々の標準化された発現値は、相対的発現レベルを得るために、標準化された−検量値により割り算された。GraphPad Prismソフトウェアーを用いて、それらの標準化された値は、最高発現レベルが１として示される割合に転換された。
【０４９８】
【表１６】
2006514683.tif 000017
【０４９９】
例31：Zven1及びモノクローナル抗体：
ラットモノクローナル抗体を、上記例６又は７からの精製された組換えタンパク質により、４匹の雌Sprague-Dawley Rats (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を免疫化することにより調製した。ラットは、完全フロイントアジュバント（Pierce, Rockford IL）中、精製された組換えタンパク質25μgの初期腹腔（IP）内注射、続いて、２週ごとの不完全フロイントアジュベント中、精製された組換えタンパク質10μgの追加IP注射をそれぞれ与えられる。第２追加免疫化の投与の７日後、動物は放血され、そして血清が集められる。
【０５００】
Zven1−特異的ラット血清サンプルを、特異的抗体標的物として、１μg/mlの精製された組換えタンパク質Zven1を用いて、ELISAにより特徴づけられる。
脾臓細胞を、一匹の高力価ラットから収穫し、そしてSP2/0（マウス）骨髄腫細胞に、PEG1500を用いて、単一融合方法により融合する（４：１の融合化、脾臓細胞：骨髄腫細胞、Antibodies : A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Press）。９日間の融合後増殖の後、特異的抗体−生成ハイブリドーマプールを、特異的抗体標的物としてI125−ラベルされた組換えタンパク質Zven1を用いて、放射性免疫沈澱法（RIP）により、及び特異的抗体標的物として500ng/mlの組み換えタンパク質Zven1を用いて、ELISAにより同定する。いずれかのアッセイプロトコールにおいて陽性のハイブリドーマプールを、GPR73a (配列番号 27) 及び/又は GPR73b (配列番号28)の受容体配列を発現するBaf3細胞上での精製された組換えタンパク質Zven1の細胞−増殖活性（“中和アッセイ”）を阻止するそれらの能力について、さらに分析する。
【０５０１】
RIPのみ、又はRIP及び“中和アッセイ”により陽性結果を生成するハイブリドーマプールは、制限希釈法により少なくとも2度クローン化される。
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体を、受容体配列を発現するBaf3細胞上での精製された組換えタンパク質Zven1の細胞−増殖活性（“中和アッセイ”）を阻止するそれらの能力により特徴づける。“中和”モノクローナル抗体を、この態様で同定する。
【０５０２】
類似する方法に従って、配列番号５におけるアミノ酸配列を用いて、Zven2に対するモノクローナル抗体を同定する。
前述から、本発明の特定の態様を例示目的のために記載して来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは理解されるであろう。
【配列表】
2006514683000001.app
【国際調査報告】
2006514683.tif 000018