(57)【要約】本発明は、生物学的活性を有する古代防御ポリマーに関する。本発明のポリマーは、カチオン電荷を含有する離れた親水性区域と、離れた疎水性区域との両方を含み、これらにより、本発明のポリマーは、多くの生物によって用いられている古代からの防御機構を形成する天然の抗菌性ペプチドと同様な様式で両親媒性かつ抗菌性にされている。そのようなポリマーは、感染を阻止するために設計されたデバイスにすることができ、または、生物学的活性を用具の表面に与えるために用具の表面に結合させることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌活性を有し、１つまたは複数の離れた疎水性セグメントと、カチオン性官能基を含有する１つまたは複数の親水性セグメントとを含む古代防御ポリマー。
【請求項２】
当該疎水性セグメントが、
１）重合した疎水性の鎖成長モノマー、
２）重合した逐次成長モノマー、または
３）疎水性の（二）官能性のオリゴマーもしくはポリマー
を含む請求項１に記載の古代防御ポリマー。
【請求項３】
当該親水性セグメントが、
１）重合したカチオン性の鎖成長モノマー、
２）カチオン性の鎖成長モノマーと、（ｉ）親水性である非荷電モノマー、もしくは（ｉｉ）疎水性モノマーとの混合物から作製されたポリマー、または
３）カチオン性の（二）官能性のオリゴマーもしくはポリマー
を含む請求項１または２に記載の古代防御ポリマー。
【請求項４】
当該疎水性セグメントが、重合した疎水性のアルキルメタクリラート、アリールメタクリラート、アルキルメタクリルアミドまたはアリールメタクリルアミドを含む請求項１、２または３に記載の古代防御ポリマー。
【請求項５】
当該親水性セグメントが、重合したメタクリラートおよび／またはメタクリルアミドを含む請求項１から４のいずれか一項に記載の古代防御ポリマー。
【請求項６】
３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＭＡ）とポリ（プロピレンオキシド）モノメタクリラート（ＰＰＯ−ＭＥ）のコポリマーを含む請求項１に記載の古代防御ポリマー。
【請求項７】
ＡＭＡが５モル％〜５０モル％の量で存在する請求項６に記載の古代防御ポリマー。
【請求項８】
ＡＭＡが約１０モル％の量で存在する請求項６に記載の古代防御ポリマー。
【請求項９】
３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＭＡ）と、ポリ（プロピレンオキシド）モノメタクリラート（ＰＰＯ−ＭＥ）と、メチルメタクリラートのターポリマーを含む請求項１に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１０】
３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＭＡ）と、ポリ（プロピレンオキシド）モノメタクリラート（ＰＰＯ−ＭＥ）と、ｎ−ブチルメタクリラートのターポリマーを含む請求項１に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１１】
主鎖と、前記主鎖にグラフト結合した鎖とを含むグラフト結合鎖構造を有する請求項１から１０のいずれか一項に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１２】
当該主鎖が親水性セグメントを含有し、グラフト部が当該疎水性セグメントを含有する請求項１１に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１３】
当該親水性セグメントおよび／または当該疎水性セグメントが誘導体化可能なポリマーに直接的または間接的のいずれかで結合している請求項１から１０のいずれか一項に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１４】
当該疎水性セグメントまたは当該親水性セグメントの少なくとも１つがスペーサー基によって当該誘導体化可能なポリマーに結合している請求項１３に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１５】
当該疎水性セグメントおよび当該親水性セグメントがスペーサー基によって当該誘導体化可能なポリマーに結合している請求項１３に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１６】
当該疎水性セグメントおよび当該親水性セグメントの少なくとも１つが当該誘導体化可能なポリマーにグラフト結合している請求項１３に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１７】
当該疎水性セグメントが当該親水性セグメントにグラフト結合している請求項１３に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１８】
当該誘導体化可能なポリマーは、反応性官能基を含有する重合した鎖成長モノマーを含む請求項１３から１６のいずれか一項に記載の古代防御ポリマー。
【請求項１９】
当該官能基は、ヒドロキシル、カルボン酸、アミン、ビニル、酸クロリドおよびイソシアナートから選択される基の１つまたは複数である請求項１８に記載の古代防御ポリマー。
【請求項２０】
抗菌活性を用具に付与するために前記用具の表面に結合しているか、または取り付けられている請求項１から１９のいずれか一項に記載の古代防御ポリマーを含む用具。
【請求項２１】
インプラント、カテーテル、置換弁、創傷包帯、医療デバイスおよびステントからなる群から選択される請求項２０に記載の用具。
【請求項２２】
１モル％〜１５モル％のＢＭＡ、５モル％〜４９モル％のＡＭＡおよび５０モル％〜９０モル％のＰＰＯ−Ｍｅから作製される請求項１０に記載の古代防御ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、古代防御ポリマーとして本明細書中では記載されている合成抗菌性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｚａｓｌｏｆｆ（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４１５、Ｊｕｎｕａｒｙ  ２４、２００２、ｐ．３８９）は、植物界および動物界の全体を通して保存されている進化による古代からの非特異的な防御機構としての抗菌性ペプチドの役割を検討した。これらのペプチドは、細菌、菌類、ウイルスおよび原生動物を含む広範囲の様々な微生物を殺すために迅速に作用することができる。近年に単離されている数百のこれらのペプチドは、サイズ、組成および構造において多様性を示しているが、抗菌活性をもたらしていると考えられるいくつかの共通した特徴を互いに有する。すなわち、そのような抗菌性ペプチドは正味の正電荷を有し、疎水性であり、かつ、両親媒性構造を形成することができる（すなわち、そのような抗菌性ペプチドは、分子の離れた区域において空間的に組織化されている疎水性領域およびカチオン性領域のクラスターを含有する）。
【０００３】
そのような抗菌性ペプチドは、微生物および多細胞動物の設計における基本的な違いを標的化することによって機能しており、細菌標的については最も良く理解されている。細菌標的は負荷電の細胞表面を有しており、これに対して、植物細胞および動物細胞の表面は正味の荷電を有していない。１つのモデルでは、ペプチドの正味の正荷電は、ペプチドが負荷電の細菌の細胞膜表面と相互作用することを可能にし、その後に、脂質の移動、膜構造の変化、および特定の場合には、標的細胞の内部へのペプチドの進入（これらはすべてが細胞死をもたらす）を生じさせることが提案されている。対照的に、哺乳動物の正常な細胞膜は、正味の電荷を示さないので見逃されている。
【０００４】
そのような抗菌性ペプチドの標的が微生物の膜であるので、細胞死は事実上即時的であり、このことは耐性の適合および発達を困難にしている。対照的に、従来の抗生物質は、細胞の形態を完全な状態にしている特定の内部の細胞標的に影響を与えており、このことは、細菌が耐性を適合させ、かつ発達させることを可能にしている。
【０００５】
これらの天然ペプチドによって用いられている抗菌性機構の一般的な性質は、様々な分子サイズ、分子構造および分子組成が活性を示すことを可能にしている。したがって、抗菌活性のための基本的な物理化学的基準（すなわち、カチオン性、疎水性および膜活動的）を満たす類似する合成ポリマーまたは半合成ポリマーは、新しいタイプの抗菌性化合物として役立つことが予想される。合成ポリマーは、その天然の対応物を上回る明らかな利点をいくつか有する。これらには、より低いコスト、十分に規定され、かつ純度の高い原料物質、十分に開発された工業的合成技術、調節可能な分解または分解抵抗性、そして、デバイスおよび製造物に形状化および加工することが可能であることが含まれる。
【非特許文献１】Ｚａｓｌｏｆｆ（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４１５、Ｊｕｎｕａｒｙ２４、２００２、ｐ．３８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗菌性ペプチドの代わりに合成ポリマーアナログを提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、１つの態様において、本発明は、（ｉ）１つまたは複数の離れた疎水性セグメント、および（ｉｉ）カチオン性官能基を含有する１つまたは複数の親水性セグメントを含む、抗菌活性を有する古代防御ポリマーを提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、１つまたは複数の疎水性領域と、正味のカチオン荷電を有する１つまたは複数の親水性領域とを含有する生物学的に活性なポリマーを形成するステップを含む、古代防御ポリマーを形成する方法に関する。したがって、本発明のポリマーは両親媒性であり、カチオン性であり、かつ細胞膜活動的である。
【０００９】
さらに、本発明は、古代防御ポリマーが、抗菌活性を用具に与えるために用具の表面に結合しているか、または取り付けられている用具を包含する。
【００１０】
本発明の他の態様および特徴が、本発明の具体的な実施形態の下記の記載を検討したとき、当業者には明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明の様々な実施形態が、例としてのみではあるが、添付された図面を参照して記載される。
【００１２】
一般に、本発明は、新しいタイプの生物学的に活性なポリマー、ならびに、そのような生物学的に活性なポリマーから形成されるか、またはそのような生物学的に活性なポリマーを含む材料およびデバイスを提供する。
【００１３】
本発明は、抗菌活性を有するペプチドと類似する「古代からの」防御を利用するのでそのように名付けられた古代防御ポリマーに関する。そのようなポリマーは、選択された機構の抗菌活性に影響を及ぼすために、カチオン電荷を含有する離れた親水性領域、および離れた疎水性領域（これらの領域はポリマーを両親媒性にする）を有する。
【００１４】
そのような抗菌性合成ポリマーを表すいくつかの例が図１および図２に示される。これらの図において、セグメントＡは疎水性であり、本明細書中では疎水性セグメントとして示され、Ｂは、カチオンを含有する親水性セグメントを表し、Ｃは、分解性または非分解性であり得る誘導体化可能なセグメントを表す。Ｄはスペーサーセグメントを表し、これは、疎水性セグメントと親水性セグメントとの間に適切な間隔を置くために使用することができる。例えば、図１の（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、疎水性領域（Ａ）および親水性のカチオン性領域（Ｂ）を含有する線状ブロックコポリマーを示し、図１の（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）および図２は、成分Ａが主鎖Ｂにグラフト結合しているか、またはその逆であるグラフトポリマーを示す。セグメントは、直接、主鎖にグラフト結合してもよく、または、スペーサーセグメントＤを介して間接的に主鎖にグラフト結合してもよい。図１の例（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉ）は、誘導体化可能なセグメントＣを含有する様々な組合せを示しており、セグメントＡおよびセグメントＢを、共有結合による結合もしくは非共有結合による結合を介して、またはスペーサーセグメントを介して誘導体化可能なセグメントに取り付けることができる。
【００１５】
図２は、多数の疎水性セグメント（Ａ）が取り付けられるカチオン含有骨格（Ｂ）を含有するグラフトポリマーを示す。この描写は図１の（ｉｖ）に対応する。
【００１６】
Ａ、ＢおよびＣとして使用される例示的な区域または領域が下記に示される。しかしながら、本発明はこれらに限定されるだけではない。当業者には明らかであるように、Ａ、ＢおよびＣの範囲に含まれる他の区域または領域もまた使用することができる。
【００１７】
Ａ＝疎水性の区域（これはまた本明細書中ではセグメントまたは領域として示されることがある）は、
１）重合した疎水性の鎖成長モノマー。疎水性の鎖成長モノマーの例には、スチレン；アルキル（メタ）アクリラート（例えば、メチルメタクリラートまたはブチルメタクリラートのようなＣ1〜18アルキル（メタ）アクリラート）、アリール（メタ）アクリラート（例えば、Ｃ6〜12アリール（メタ）アクリラート）、アルキル（メタ）アクリルアミド（例えば、メチルメタクリルアミドまたはｔ−ブチルメタクリルアミドのようなＣ1〜18アルキル（メタ）アクリルアミド）、アリール（メタ）アクリルアミド（例えば、Ｃ6〜12アリール（メタ）アクリルアミド）、オレフィン、エーテル（例えば、プロピレンオキシド）、およびビニルクロリド類（例えば、塩化ビニル）、イソブチルビニルエーテル、ならびにメタクリロニトリルが含まれる；
２）重合した逐次成長モノマー。逐次成長モノマーの例には、ジイソシアナート（例えば、１，６−ヘキサメチレンジイソシアナート）、疎水性の二酸（例えば、セバシン酸）、ジアミン（例えば、ペンタメチレンジアミン）、疎水性の二酸クロリド（例えば、セバコイルクロリド）、疎水性ジオール（例えば、ヘキサメチレングリコール）、およびエステル（例えば、ε−カプロラクトン）；および
３）反応性末端基を有する疎水性の（二）官能性のオリゴマーまたはポリマー。反応性末端基には、例えば、酸基、ヒドロキシル基、アミン基、イソシアナート基、酸クロリド基、エステル基、メタクリラート基およびビニル基が含まれる。例には、ポリエーテルジオール（例えば、ポリプロピレンオキシドジオール）、ポリエステルジオール（例えば、ポリカプロラクトンジオール）、ポリエーテルメタクリラート（例えば、ポリプロピレンオキシドモノメタクリラート、ＰＰＯ−Ｍｅ）、およびヒドロキシ末端ポリブタジエンが含まれる；
を含むことができる。
【００１８】
Ｂ＝中性ｐＨまたはほぼ中性ｐＨにおいてカチオン電荷を含有する親水性の区域（これはまた本明細書中ではセグメントまたは領域として示されることがある）は、
１）重合したカチオン性の鎖成長モノマー。カチオン性の鎖成長モノマーの例には、アミノ（メタ）アクリラート（例えば、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリラート）、２−ビニルピリジン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアリルアミン、ビニルベンジルアミン、ビニルイミダゾール、および３−アミノプロピルメタクリルアミド塩酸塩（ＡＭＡ）が含まれる；
２）上記カチオン性鎖成長モノマーと、（ｉ）親水性である非荷電モノマー（例えば、ヒドロキシメタクリラート（例えば、ヒドロキシエチルメタクリラート）、酢酸ビニルおよびエチレンオキシドなど）または（ｉｉ）限定された割合（区域Ｂのモル組成の９０％を越えない）の疎水性モノマー（例えば、ｎ−ブチルメタクリラート（ＢＭＡ）およびメチルメタクリラート（ＭＭＡ）（さらなる例については、区域Ａのもとで示されたそのようなモノマーを参照のこと）との混合物から作製されるポリマー；
３）反応性末端基を有するカチオン性の（二）官能性のオリゴマーまたはポリマー。反応性末端基には、例えば、酸基、ヒドロキシル基、アミン基、イソシアナート基、酸クロリド基、エステル基、ビニル基およびメタクリラート基が含まれる。例には、ポリリシンが含まれる；
を含むことができる。
【００１９】
Ｃ＝誘導体化のために利用可能な官能基を含有する、場合により使用される区域（これはまた本明細書中ではセグメントまたは領域として示されることがある）。これは、
１）官能基を含有する重合した鎖成長モノマー、例えば、ヒドロキシルを含有するもの（例えば、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリビニルアルコール）、カルボン酸を含有するもの（例えば、メタクリル酸、アクリル酸）、ビニルを含有するもの（例えば、ブタジエン）、酸クロリドを含有するもの（例えば、メタクリロイルクロリド）、およびイソシアナートを含有するもの（例えば、イソシアナトエチルメタクリラート）など
を含むことができる。
【００２０】
区域Ａおよび区域Ｂはそれぞれ、疎水性の区域および親水性の区域である。これらの用語は本明細書中では相対的に使用される。したがって、Ａは、Ｂと比較して疎水性でなければならず、Ｂは、Ａと比較して親水性でなければならない。ＡおよびＢはともに様々な成分を含有することができ、それらのいくつかは親水性であり、それらのいくつかは疎水性である。しかしながら、全体として、ＡはＢに関して疎水性でなければならず、また、その逆でなければならない。そのうえ、区域Ａ、区域Ｂおよび区域Ｃのいずれか１つは、患者におけるポリマーの分解を助けるために、分解可能な部分を含有することができる。
【００２１】
上記に列挙された個々のモノマーは、重合のために反応槽に加えられるモノマーには必ずしも対応せず、しかし、最終的な重合した生成物を構成するモノマーに対応する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明のポリマーは、抗菌性ポリマーの制御された放出を可能にするために、分解性マトリックスに包み込むことができる。図８は、分解性マトリックス（Ｄ）の中に置かれた、古代防御ポリマー（ＡＤＰ）と呼ばれる本発明によるポリマーを例示する。分解可能な連結（Ｅ）（示されてない）をこのポリマーマトリックスの内部において使用することができる。
【００２３】
本発明のポリマーは、手術用デバイス、滅菌されたドレープ材および包帯、衣類、食品包装、農業加工およびバイオリアクター改変を含む数多くの適用において抗菌活性を示すデバイス部品または完全なデバイスを作製するために形状化または注型することができる。さらに、そのようなポリマーは、永続的または半永続的な生物学的活性をその表面に与えるために、表面に共有結合的または非共有結合的に結合することができる。例えば、抗菌活性を有する古代防御ポリマーを生物学的インプラント（例えば、対象との接触状態にあり得るようなカテーテル、徐放性インプラント、置換弁、ステント、または別のそのような用具など）に結合することができる。このようにして、用具自体が抗菌性表面を有することになり、使用期間中における感染の発生が減少する。
【００２４】
１つの態様において、本発明は、１モル％〜１５モル％のＢＭＡ、５モル％〜４９モル％のＡＭＡおよび５０モル％〜９０モル％のＰＰＯ−Ｍｅから作製される古代防御ポリマーを提供する。
【００２５】
１つの態様において、本発明は、５モル％〜５０モル％のＡＭＡおよび５０モル％〜９５モル％のＰＰＯ−Ｍｅから作製される、請求項に記載される古代防御ポリマーを提供する。
【実施例１】
【００２６】
抗菌性コポリマー
本発明による下記の抗菌性ポリマーを本明細書中に記載されるように配合した。それらは抗菌性を有する。３−アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＭＡ）およびポリ（プロピレンオキシド）モノメタクリラート（ＰＰＯ−Ｍｅ）（これらはともに下記に示される）の共重合を行って、カチオン性の両親媒性ポリマーを作製した。合成反応において供給された各モノマーの相対的な量を変化させて、様々な物理化学的性質を得た。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
実施例１のコポリマーは図２によって表すことができ、この場合、ポリマーの主鎖がＡＭＡおよびメタクリラートを含有し、グラフト部がポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含有する。
【００２９】
合成および精製
各モノマーの所望量を撹拌下でエタノールに溶解して、２０％（ｗ／ｖ）溶液を作製した。その後、開始剤（過酸化ベンゾイル）を、供給されたモノマーの総質量の１ｗｔ％で加え、溶液を７０℃に加熱した。反応を７０℃で６時間進行させ、その後、反応液をビーカーに注ぎ、溶媒を室温で乾燥させた。その後、粗製のポリマー固体を、真空下で少なくとも３時間、室温でさらに乾燥して、残存溶媒を除いた。その後、乾燥ポリマーを、１グラムのポリマーあたり約５０ｍＬの溶媒を使用して、少なくとも６時間、低極性の有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ヘキサン）で抽出した。残留するポリマー固体を乾燥し、蒸留脱イオン水（１グラムのポリマーあたり約５０ｍＬ）に溶解した。その後、ポリマーを０．２ＭのＮａＯＨにおいて沈殿させ、蒸留脱イオン水で洗浄して、室温で少なくとも１６時間、真空下で乾燥した。最後に、乾燥ポリマーをメタノールに溶解し、ろ過して、不溶性の不純物を除き、フィルムに注型した。
【００３０】
材料の特徴づけ
精製されたポリマーフィルムを外観によって定性的に評価し、Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）において元素組成について分析し、また、示差走査熱分析（ＤＳＣ）による溶液特性（より低い臨界溶解温度）およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量について分析した。
【００３１】
細菌阻害の特徴づけ
ポリマーによる細菌阻害の評価を、改変されたＫｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ阻害域試験を使用して分析した。ポリマーを、モデルのグラム陽性細菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）およびモデルのグラム陰性細菌（Ｐ．Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）との接触状態で２４時間培養した。コントロール材料はシリコーンポリマーであった。細菌を、使用前に調製およびオートクレーブ処理された無菌の培養培地（典型的には、商標  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）培養液および寒天）において成長させた。同じ培地を使用して、細菌の連続希釈物を調製し、連続希釈物を置床して、生存菌の数を計数した。
【００３２】
接触阻害実験のために、細菌生育表面を、ＭＨ平板を標準化培養物で３方向に塗ることによって調製した。コントロール材および試験材（二連で）を新しく調製された細菌生育表面に置き、平板を加湿インキュベーターにおいて３７℃で一晩培養した。翌日、平板を阻害域について検査し（存在する場合には、その大きさを測定する）、コントロール材および試験材を滅菌ピンセットで慎重に除いた。各フィルムサンプルの下側の接触領域からの細菌含有寒天のパンチ物を採取した。パンチ物を、滅菌ガラスビーズを含有する無菌の生理的食塩水においてボルテックス処理して、細菌を取り除き、連続希釈して、生存菌の平板計測を行った。また、フィルムを取り出し、無菌の生理的食塩水においてボルテックス処理して、フィルムに付着している細菌を取り除き、計数をこれらについてもまた行った。
【００３３】
赤血球溶血分析
血液を健康なヒト提供者から得た。赤血球を遠心分離および血小板濃縮血漿の除去によってヘパリン処理全血から単離した。赤血球をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＰＯ4）で３回洗浄し、ＰＢＳにおける１０％（ｖ／ｖ）溶液として作製した。コポリマーサンプルを１．５ｍＬのエッペンドルフ遠心分離チューブに入れ（チューブあたり５０ｍｇ）、４００マイクロリットルのＰＢＳにおいて３７℃で１時間平衡化した。その後、１００マイクロリットルの１０％赤血球懸濁物を加えて、２％の最終的な赤血球濃度を作製した。コポリマーサンプルを赤血球懸濁物と３７℃で１時間培養した。培養時間が完了した後、赤血球を遠心分離して、溶液から除き、各サンプルからの１００マイクロリットルの上清を９６ウエルプレートに移した。各溶液の吸光度をプレートリーダーで５４０ｎｍにおいて測定し、陽性コントロール（赤血球懸濁物と培養された０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）および陰性コントロール（赤血球懸濁物と培養されたＰＢＳ）と比較した。５％未満の溶血を非毒性と見なした。
【００３４】
結果
コポリマー合成のためのＡＭＡモノマーの供給を１０モル％から５０モル％まで変化させ、得られたコポリマーの物理的特性を定性的に評価した。ＡＭＡ含有量を増大させると、次第に堅くなるポリマーが得られ、これは、１０モル％のＡＭＡでの柔軟かつ粘着性から、３７．５モル％での半剛直かつ屈曲可能にまで及んでいる。５０モル％ＡＭＡ供給のコポリマーは、高ｐＨにおいてさえ水溶性であることが見出され、したがって、さらには特徴づけされなかった。１０モル％ＡＭＡ供給のコポリマーおよび２５モル％ＡＭＡ供給のコポリマー（それぞれ、９０％および７５％のＰＰＯ−Ｍｅ）は、許容可能な物理的特性および低い水溶性を示したので、物理化学的性質、細菌阻害および溶血可能性についてさらに特徴づけを行った。
【００３５】
表１は１０モル％ＡＭＡコポリマーおよび２５モル％ＡＭＡコポリマーに対する元素組成を例示する。元素組成は、モノマー供給比率に基づく予想値に非常に匹敵することが見出された。両方の場合、測定された窒素含有量は予想値よりも低かった。このことは、供給された量との比較で、低下したカチオン性モノマーの取り込みを示している（ＡＭＡモノマーが唯一の窒素含有化学種である）。しかしながら、窒素重量パーセント値の絶対値が低いことは、測定値と供給値との間における何らかの小さい違いを増幅している。この事実は、測定技術の規定された正確度（±１０％）と合わせて、この技術を使用するポリマー組成の計算の精密さを制限している。
【００３６】
【表１】
2006522174.tif 000004
【００３７】
Ｍn値、Ｍw値およびＰ．Ｄ．値を１０モル％ＡＭＡコポリマーについて求めた。Ｍnは２１７，９７０であり、Ｍwは５０９，６５０であり、Ｐ．Ｄ．は２．３であった。このことは、この製造物が比較的大きい分子量のコポリマーであること（すなわち、２つのホモポリマーの組合せではないこと）を明らかにしている。
【００３８】
これらのコポリマーは低温で中性ｐＨまたは低ｐＨの水溶液において難溶性（２％以下）を示した。しかしながら、溶解性特性を調べているとき、これらのコポリマーは、可逆的であった逆の温度溶解性プロフィルを示すことが発見された（すなわち、これらのコポリマーは、異なる温度で溶液から沈殿して、ゲルを形成し、そして、ゲル化温度（Ｔgel）よりも低く冷却された場合、再び溶解する熱可逆的ゲルである）。表２は、ＤＳＣによって分析されたときの、１０モル％ＡＭＡ供給のコポリマーおよび２５モル％ＡＭＡ供給のコポリマーに対するゲル化温度を示す。
【００３９】
【表２】
2006522174.tif 000005
【００４０】
おそらくはコポリマーの全体的な親水性が結果として増大しているために、ゲル化温度がＡＭＡ含有量とともに増大しているようである。ゲル化過程の可逆性はまた、ＤＳＣにおけるサンプルを加熱後に冷却することによっても明らかにされた。溶解発熱が観測された。このことは可逆性を示している。
【００４１】
２５モル％ＡＭＡコポリマーおよび１０モル％ＡＭＡコポリマーについての細菌接触阻害の結果を図３に示す。シリコーンコントロールとの比較において試験コポリマーの下側での細菌細胞計測数における８７％〜９９．９％の減少は、両方のコポリマーがグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方について著しい細菌細胞接触阻害を可能にすることを示している。図４において認められるように、フィルムに付着している細菌における同様に高いレベルの減少が１０モル％ＡＭＡコポリマーについて観測された。しかし、２５モル％ＡＭＡコポリマーは実際には、シリコーンコントロールよりも大きい（グラム陰性）細菌付着を示す。したがって、１０モル％ＡＭＡコポリマーはより効果的な抗菌性を有するようである。このことは、細菌阻害能力がポリマー組成に依存していることを示している。阻害域はいずれのコポリマーについても観測されなかった。このことは、測定された細菌阻害が接触により媒介され、何らかの物質がフィルムサンプルから放出された結果ではないことを示唆している。
【００４２】
効果的な抗菌性は何であれ、哺乳動物細胞に対して毒性であってはならないので、本出願人は、一般的なヒト赤血球溶血試験を使用して抗菌性ポリマーの細胞適合性を分析した。図５は１０％ＡＭＡコポリマーおよび２５％ＡＭＡコポリマーについての溶血分析の結果を示す。いずれのコポリマーも著しい溶血を示しておらず、両方の結果は０％の溶血（これはＰＢＳ単独と同じである）と著しく異なっていない。対照的に、コントロールのシリコーンポリマーはわずかな陽性の溶血読み取りを示した。このことは、これらの抗菌性ポリマーが細菌細胞の生存性を低下させる選択的な能力を有することを示している。
【実施例２】
【００４３】
抗菌性ターポリマー
実施例１に記載されたコポリマーに加えて、得られるポリマー物質特性および細菌阻害特性をさらに改変するために第３のモノマー（例えば、ｎ−ブチルメタクリラート、メチルメタクリラート）を重合時に加えることによって、ターポリマーを合成した。
【００４４】
ターポリマーを、２つのモノマーの代わりに３つのモノマーを使用して実施例１に記載されるように作製した。精製、物質の特徴づけ、細菌阻害の特徴づけ、および赤血球溶血分析を実施例１の場合のように行った。
【００４５】
実施例２のターポリマーは図２によって表すことができ、この場合、ポリマーの主鎖がＡＭＡ、ＢＭＡおよびメタクリラートを含有するか、または、ＡＭＡ、ＭＭＡおよびメタクリラートを含有し、グラフト部がＰＰＯを含有する。
【００４６】
結果
第３のモノマー（例えば、ｎ−ブチルメタクリラート（ＢＭＡ）およびメチルメタクリラート（ＭＭＡ））を５％〜１０％の範囲のモル比で加え、これにより広範囲の様々な物理的特性を得た。１０モル％ＭＭＡターポリマーはまた、２５モル％のＡＭＡおよび６５モル％のＰＰＯ−Ｍｅを含有し、水溶液における比較的大きい溶解性（約２％）を示す透明な脆い物質であることが見出された。したがって、本出願人は主に、溶解性が低い柔軟な物質に興味を有していたので、このポリマーはさらには特徴づけされなかった。ＢＭＡを含有するターポリマーは、柔軟で、弾性のある、対応するＭＭＡ含有ターポリマーよりも水溶性が小さい物質であることが見出された。したがって、１０モル％ＢＭＡ、２５モル％ＡＭＡ、６５％ＰＰＯ−Ｍｅのターポリマー（１０％ＢＭＡ）をさらなる特徴づけのために選択した。
【００４７】
表３は供給物組成との比較における１０％ＢＭＡターポリマーに対する元素組成を示す。再度ではあるが、測定された組成は予想値と非常に匹敵しているが、予想よりもわずかに低い窒素を有しており、このことは、供給されたよりもわずかに低いＡＭＡの取り込みを示していると考えられる。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
実施例１に記載されるコポリマーと同様に、１０％ＢＭＡターポリマーは熱可逆的ゲル化を示している。しかしながら、１０％ＢＭＡターポリマーに対するＴgelは１７．２℃であり、これは１０％ＡＭＡコポリマーおよび２５％ＡＭＡコポリマーに対して中間である。このことは、第３のモノマーとしてＢＭＡを導入することは、等量のＡＭＡ含有量を有するコポリマー（２５％ＡＭＡ）との比較において増大した疎水性をもたらすことを示唆している。
【００５０】
Ｍn値、Ｍw値およびＰ．Ｄ．値をターポリマーについて求めた。Ｍnは１４３，９７０であり、Ｍwは２１１，９３０であり、Ｐ．Ｄ．は１．５であった。このことは、この製造物が比較的大きい分子量のターポリマーであること（すなわち、ホモポリマーおよび／またはコポリマーの組合せではないこと）を明らかにしている。
【００５１】
１０％ＢＭＡについての細菌接触阻害の結果を図６に示す。このフィルムは、シリコーンポリマーのコントロールとの比較で、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方の成長を、下にある寒天において９７％以上で阻害し、かつ、フィルム自体において９９％超で阻害する。再度ではあるが、阻害域は観測されなかった。このことは、細菌阻害効果がポリマー表面領域に局在化していたことを示している。
【００５２】
赤血球溶血分析を、細胞適合性を明らかにするために、１０％ＢＭＡターポリマーを使用して行った。図７は、シリコーンコントロールポリマーと比較される１０％ＢＭＡに対する溶血分析の結果を示す。１０％ＢＭＡターポリマーは、毒性について閾値であるレベルの溶血をもたらしており、このことは、実施例１に記載されるコポリマーよりも細胞適合性が小さいことを示している。
【００５３】
本発明の上記の実施形態は例にすぎないことが意図される。様々な変化、改変および変法が、本明細書中に添付されている請求項によってのみ規定される本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によって特定の実施形態に対して行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の１つの態様による合成ポリマーの様々な構造を表す。
【図２】本発明の１つの態様による合成ポリマーの構造の１つを表す。
【図３】コントロールと比較される試験コポリマーフィルムの下側の接触領域から採取された生存細菌細胞カウント数の減少を図示する。
【図４】コントロールと比較されるコポリマーフィルムサンプルから採取された生存細菌細胞カウント数の減少を図示する。
【図５】シリコーンコントロールポリマー（ＰＤＭＳ）との比較におけるコポリマー誘導の溶血を図示する。
【図６】コントロールと比較される試験ターポリマーフィルムおよび試験フィルムの下側の接触領域から採取された生存細菌細胞カウント数の減少を図示する。
【図７】シリコーンコントロールポリマー（ＰＤＭＳ）との比較におけるターポリマー誘導の溶血を図示する。
【図８】本発明による合成ポリマーを患者に送達するための媒体を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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