(57)【要約】新規なチロシン誘導型チロシンアンモニアリアーゼ酵素をトリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）酵母から単離した。この酵素はフェニルアラニンよりもチロシンに対する活性が高く、チロシンからパラ−ヒドロキシケイ皮酸を直接産生するのに役立つ。この酵素をコードする遺伝子を、ＴＡＬ  ｃＤＮＡの３’および５’ＲＡＣＥクローニングで配列決定し、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母およびエシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細菌で遺伝子を発現させた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子または
（ａ）または（ｂ）と相補的な単離された核酸分子よりなる群から選択される、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子でコードされるポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸分子でコードされるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２５に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミスウォーターマン法によるアライメントで少なくとも４８％の同一性を有する少なくとも６８９アミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子であって、該酵素がチロシンアンモニアリアーゼ活性を有する、単離された核酸分子。
【請求項７】
好適な制御配列に作動的に結合された請求項１または２に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、藻類と、緑色植物と、よりなる群から選択される請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）と、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）と、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）と、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）と、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）と、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）と、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）と、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）と、アルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）と、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）と、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）と、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）と、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）と、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）と、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）と、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）と、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）と、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）と、ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）と、よりなる群から選択される請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が、ダイズと、ナタネと、コショウと、ヒマワリと、ワタと、トウモロコシと、タバコと、アルファルファと、コムギと、オオムギと、オートムギと、モロコシと、コメと、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）と、ナタネ科の野菜類と、メロンと、ニンジンと、セロリと、パセリと、トマトと、ジャガイモと、イチゴと、ラッカセイと、ブドウと、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）と、サトウダイコンと、サトウキビと、マメ類と、エンドウマメと、ライムギと、アマと、広葉樹と、針葉樹と、まぐさと、よりなる群から選択される請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
ａ）請求項１、２または６のいずれか１項に記載の核酸分子をプローブとしてゲノムライブラリを探索し、
ｂ）請求項１または２に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片の配列を決定する
ことを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項１４】
ａ）配列番号２４に記載の配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅する
ことを含んでなり、
増幅されたインサートがチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４の方法の産物。
【請求項１６】
（ａ）好適な制御配列に作動的に結合された請求項１または２に記載の単離された核酸分子を含んでなる組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させ、
（ｂ）ＰＨＣＡを産生するのに十分な時間、該組換え細胞を成長させ、
（ｃ）場合により該ＰＨＣＡを回収する
ことを含んでなる、ＰＨＣＡの産生方法。
【請求項１７】
該発酵性炭素基質が、単糖類と、オリゴ糖類と、多糖類と、二酸化炭素と、メタノールと、ホルムアルデヒドと、ギ酸塩と、炭素含有アミンと、よりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該発酵性炭素基質がグルコースである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該組換え宿主細胞が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、藻類と、植物細胞と、よりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該組換え宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）と、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）と、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）と、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）と、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）と、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）と、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）と、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）と、アルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）と、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）と、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）と、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）と、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）と、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）と、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）と、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）と、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）と、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）と、ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）と、よりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該組換え宿主細胞が、ダイズと、ナタネと、ヒマワリと、ワタと、トウモロコシと、タバコと、アルファルファと、コムギと、オオムギと、オートムギと、モロコシと、コメと、ブロッコリーと、カリフラワーと、キャベツと、パースニップと、メロンと、ニンジンと、セロリと、パセリと、トマトと、ジャガイモと、イチゴと、ラッカセイと、ブドウと、グラス・シード・クロップと、サトウダイコンと、サトウキビと、マメ類と、エンドウマメと、ライムギと、アマと、広葉樹と、針葉樹と、まぐさと、よりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
該チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子が配列番号２５に記載のペプチドをコードする請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子がトリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）由来のものである請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件出願は２００２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／３８３２３２号の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は分子生物学および微生物学の分野に関する。特に、本発明は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ＰＨＣＡ）の産生に利用される、トリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）酵母由来の新規なチロシン誘導型チロシンアンモニアリアーゼ酵素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ＰＨＣＡ）は液晶ポリマー（ＬＣＰ）製造用のモノマーとして利用できる価値の高い芳香族化学物質のひとつである。ＬＣＰはガラス転移温度と等方液体への転移温度との間で中間体またはメソフェーズを呈するポリマーあるいは、特定範囲の濃度と温度で少なくとも１つのメソフェーズを有するポリマーである。これらのメソフェーズの分子は液体のように挙動して流動するが、結晶の異方性も呈する。ＬＣＰは液晶ディスプレイに利用されている他、電子的な用途、電気通信での用途、宇宙での用途向けの高速コネクタや可撓性回路にも利用されている。ＬＣＰには滅菌放射に対する抵抗性があり、酸素と水蒸気に対する遮断性も高いため、医療器具、化学製品や食品の包装などに利用されている。
【０００４】
価値の高い芳香族化学物質としての重要性があるがゆえに、ＰＨＣＡを化学合成することについては周知である。しかしながら、合成に必要なエネルギ要求量が大きい上に生成物の徹底した精製が必要とされることから、化学合成は高価になる。ＰＨＣＡを生物産生することで、この問題に対する低コストかつ簡単な解決策が得られる。
【０００５】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）酵素（ＥＣ４．３．１．５）およびＰ４５０酵素を用いて植物によってＰＨＣＡを産生することは周知である。フェニルアラニンアンモニア−リアーゼは、植物（非特許文献１）、菌・カビ（非特許文献２）、酵母（非特許文献３）および放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（非特許文献４）には広く分布しているが、この酵素はエシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）または哺乳類の細胞には見られない（非特許文献５）。ＰＡＬはフェニルプロパノイドの代謝経路にて最初に作用する酵素であり、Ｌ−フェニルアラニンから（ｐｒｏ−３Ｓ）−水素と−ＮＨ３＋とを除去してｔｒａｎｓ−ケイ皮酸を形成する。植物にはＰ４５０酵素系があるため、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸からリグニンやイソフラボノイドなどのさまざまな二次代謝産物を生成するための共通の中間体として作用するパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ＰＨＣＡ）を得ることができる。しかしながら、微生物では二次代謝産物形成の前駆体として作用するのはＰＨＣＡではなくケイ皮酸である。現在までのところ、微生物ソースからケイ皮酸ヒドロキシラーゼ酵素がキャラクタライズされた例はない。植物に含まれるＰＡＬ酵素は、リグニンやイソフラボノイド、その他のフェニルプロパノイドの生合成経路における調節酵素であると考えられている（非特許文献６）。しかしながら、赤色酵母であるロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）（ロドスポリジウムトルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ））では、このリアーゼの持つ異化機能がゆえにフェニルアラニンが分解され、この酵素の作用によって形成されるケイ皮酸塩が安息香酸塩および他の細胞物質に変換される。
【０００６】
ＰＡＬをコードする遺伝子は当該技術分野において周知であり、このうちいくつかは植物と微生物の両方のソースですでに配列が決定されており（たとえば、（特許文献１）［赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）］、（特許文献２）［ユーカリグランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）およびラジアタ松（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）］、（特許文献３）［ペチュニア］、（特許文献４）［エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）］、（特許文献５）［ジャガイモ、コメ］を参照のこと）、たとえばＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０１０１４３およびＸ７５９６７を参照のこと。さまざまなソースに由来するＰＡＬ遺伝子が、酵母、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および昆虫細胞培養において活性ＰＡＬ酵素として過発現されている（非特許文献７）、（非特許文献８）、（非特許文献９）。
【０００７】
ＰＡＬ遺伝子のなかには、フェニルアラニンをケイ皮酸塩に変換する機能だけでなく、チロシンを基質として受容できるものもある。このような反応では、酵素活性はチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）とされる。ＴＡＬによってチロシンの変換が生じると、ケイ皮酸塩の介在なしでチロシンからＰＨＣＡが直接形成される。しかしながら、ＰＡＬ活性よりも有意に高いＴＡＬ触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子についての報告は極めて最近なされたひとつがあるのみである（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１２：２４０〜２４４（２００２））。この遺伝子はロドバクターカプスレイタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）という細菌から単離され、ＴＡＬ触媒効率がＰＡＬの場合よりもおよそ１５０倍高い酵素をコードした。このＴＡＬタンパク質は、酵母のＰＡＬ配列よりも植物のＰＡＬタンパク質に対する相同性が高いとの報告がなされた（たとえばテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）のＰＡＬ配列との同一性３２％）。他の天然に産するＰＡＬ／ＴＡＬ酵素はいずれも、自己の基質として使うのにチロシンよりもフェニルアラニンを好む。赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）由来の野生型ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素はチロシンに比してフェニルアラニンを好む傾向が低く、ＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比はわずか０．５８である（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハービル（Ｈａｖｉｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク、１９８１、第７巻、第５７７〜６２５ページの報告による）。比較のために、他の生物で研究したＰＡＬ／ＴＡＬ酵素では一般に、ＰＡＬ／ＴＡＬ比は１５またはそれ以上である。
【０００８】
米国特許第６，３６８，８３７号明細書には、ＰＨＣＡを生物産生するための方法がいくつか開示されている。これらの方法には、ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）酵母由来の野生型ＰＡＬをＥ．ｃｏｌｉに取り込み、野生型ＰＡＬの機能を利用してチロシンをＰＨＣＡに変換する方法、ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）酵母由来の野生型ＰＡＬに加えて植物シトクロムＰ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼをＥ．ｃｏｌｉに取り込み、フェニルアラニンをケイ皮酸に変換し、さらにＰＨＣＡに変換する方法、ＴＡＬ活性が亢進した状態で酵素をコードする変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子を展開することが含まれる。この変異体遺伝子は野生型ロドスポリジウムトルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＰＡＬの突然変異誘発によって単離され、ＴＡＬ／ＰＡＬ比１．７で酵素をコードした。この遺伝子を利用し、チロシンの直接変換によってＰＣＨＡを産生した。ＴＡＬ活性が亢進した状態で酵素をコードする他のいくつかの変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子の展開については、米国特許第６，５２１，７４８号明細書に開示されている。これらの変異体遺伝子では、すでにＴＡＬ／ＰＡＬ比７．２まで報告されている。しかしながら、これよりもＴＡＬ活性の高い他のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素がＰＣＨＡの経済的な産生には必要なのである。
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ  ３２１４８８号明細書
【特許文献２】国際公開第９８１１２０５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７３２０２３号パンフレット
【特許文献４】特開平０５−１５３９７８号公報
【特許文献５】国際公開第９３０７２７９号パンフレット
【非特許文献１】コウコル（Ｋｏｕｋｏｌ）ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２３６：２６９２〜２６９８（１９６１）
【非特許文献２】バンドニ（Ｂａｎｄｏｎｉ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：２０５〜２０７（１９６８）
【非特許文献３】オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．３１：２００〜２０６（１９６７）
【非特許文献４】エマス（Ｅｍｅｓ）ら、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：６１３〜６２２（１９７０）
【非特許文献５】ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハビール（Ｈａｖｉｒ）、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、第３版、ボーヤー（Ｂｏｙｅｒ），Ｐ．編、アカデミック：ニューヨーク、１９６７、第７５〜１６７ページ
【非特許文献６】ハールブラック（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ）ら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０：３４７〜３６９（１９８９）
【非特許文献７】フォークナー（Ｆａｕｌｋｎｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ  １４３：１３〜２０（１９９４）
【非特許文献８】レンジャー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７）
【非特許文献９】マッケグニー（ＭｃＫｅｇｎｅｙ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１２５９〜１２６３（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、解決すべき課題は、チロシンからＰＨＣＡへの直接的な変換に用いられる、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ活性の方が高い天然酵素を得ることならびに、さらに酵素エンジニアリング用ツールとして機能させ、以前よりも効率的にＴＡＬ酵素を産生することにある。本願出願人らは、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ触媒活性の高いトリコスポロンクタネム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｍ）から酵素を単離することで上述した課題を解決した。さらに、この酵素に対する遺伝子を、フェニルアラニンではなくチロシンの存在によって誘導する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
ａ）配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子または
（ａ）または（ｂ）と相補的な単離された核酸分子よりなる群から選択される、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドおよび遺伝子キメラならびにこれを含む形質転換宿主細胞を提供するものである。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、
ａ）本発明のいずれか１項に記載の核酸分子をプローブとしてゲノムライブラリを探索し、
ｂ）本発明の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片の配列を決定する
ことを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法を提供するものである。
【００１４】
同様に、本発明は、
ａ）配列番号２４に記載の配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅する
ことを含んでなり、
増幅されたインサートがチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子の取得方法を提供するものである。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）好適な制御配列に作動的に結合された本発明の単離された核酸分子を含んでなる組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させ、
（ｂ）ＰＨＣＡを産生するのに十分な時間、該組換え細胞を成長させ、
（ｃ）場合により該ＰＨＣＡを回収する
ことを含んでなる、ＰＨＣＡの産生方法を提供するものである。
【００１６】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明、図面ならびに添付の配列の説明から、本発明についてなお一層深く理解することができよう。
【００１７】
配列表の簡単な説明
以下の配列は米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００１８】
配列番号１はＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬ酵素のＮ−末端アミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号２はＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬ酵素の内部アミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号３〜８はＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ｔａｌのクローニングに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２１】
配列番号９はＴＡＬゲノムＤＮＡのコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号１０〜２２はＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ｔａｌのクローニングに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２３】
配列番号２３はＴＡＬゲノムＤＮＡの第２のコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号２４はＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号２５は配列番号２４のヌクレオチド配列によってコードされるＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬの推定アミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号２６〜３３はＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ｔａｌのクローニングに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２７】
配列番号３４は、Ｅ．ｃｏｌｉでｔａｌを発現させるのに用いられたプラスミドの一部として用いられたオリザサティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のＤＮＡ断片である。
【００２８】
発明の詳細な記述
本発明は、トリコスポランクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒａｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）酵母由来のチロシン誘導型チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする新規なＤＮＡ配列について説明するものである。この酵素は、フェニルアラニンとは対照的に、基質としてチロシンを使用した場合に比活性が高くなることが報告されている唯一の第２の天然に産するＰＡＬ／ＴＡＬ酵素である。このＴＡＬ酵素をチロシンから直接的なＰＨＣＡの産生に利用することができる。
【００２９】
定義
本願明細書および特許請求の範囲を解釈するにあたっては、以下の略号および定義を用いる。
【００３０】
「フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ」をＰＡＬと略記する。
【００３１】
「チロシンアンモニア−リアーゼ」をＴＡＬと略記する。
【００３２】
「パラ−ヒドロキシケイ皮酸」をＰＨＣＡと略記する。
【００３３】
「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」をＣ４Ｈと略記する。
【００３４】
本願明細書では「ケイ皮酸」および「ケイ皮酸塩」という用語を同義のものとして使用し、ＣＡと略記する。
【００３５】
「ＴＡＬ活性」という用語は、チロシンからＰＨＣＡへの直接的な変換を触媒するタンパク質の機能を示す。
【００３６】
「ＰＡＬ活性」という用語は、フェニルアラニンからケイ皮酸への変換を触媒するタンパク質の機能を示す。
【００３７】
「ｐａｌ」はＰＡＬ活性のある酵素をコードする遺伝子を表す。
【００３８】
「ｔａｌ」はＴＡＬ活性のある酵素をコードする遺伝子を表す。
【００３９】
「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸からＰＨＣＡへの触媒変換を担うタンパク質の系を示す。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼの機能を果たす当該技術分野において周知のいくつかの酵素または酵素系のうちのひとつである。本願明細書において使用する「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」という用語がケイ皮酸からＰＨＣＡへの変換を引き起こす一般的な酵素活性を示すのに対し、「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を持つ特定の二成分タンパク質系を示す。
【００４０】
「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬ活性とＴＡＬ活性の両方を含むタンパク質を示す。このようなタンパク質は、酵素基質としてのチロシンとフェニルアラニンの両方に対して少なくともいくらかの特異性を持つ。
【００４１】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭであると定義される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を定量化する目的で用いられる。
【００４２】
「ｋｃａｔ」という表記は「代謝回転数」に用いられることが多い。「ｋｃａｔ」という表記は、単位時間に生成物に変換された基質分子の活性部位あたりの最大数または単位時間に酵素が代謝回転した回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］であり、式中、［Ｅ］は酵素濃度（フェルスト（Ｆｅｒｓｔ）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、第２版；Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）：ニューヨーク、１９８５；第９８〜１２０頁）。
【００４３】
「芳香族アミノ酸の生合成」という表現は、生物学的なプロセスおよび芳香族アミノ酸の生成に必要な細胞内部の酵素的な経路を示す。
【００４４】
「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝される炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、一炭素基質および／またはこれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を示す。
【００４５】
本願明細書において使用する場合、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形での単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含んでなるものであってもよい。
【００４６】
温度と溶液のイオン強度の適した条件下で一本鎖の核酸分子を他の核酸分子にアニールできる場合に、この核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」であるという。ハイブリダイゼーションならびに洗浄の条件は周知であり、その一例が、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．，フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）の特に第１１章と表１１．１に記載されている（その内容全体を本願明細書に援用する）。温度とイオン強度の条件次第でハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件については、適度な類似性のある断片（遠縁の生物から得られる相同配列など）から、極めて類似性の高い断片（近縁の生物から得られる機能的酵素を複製する遺伝子など）に至るまで、スクリーニングできるように調節することが可能である。ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーション後の洗浄によって決まる。好ましい条件一組では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温にて１５分間に続いて、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃にて３０分間行い、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃にて３０分間ずつ２回繰り返す一連の洗浄を用いる。さらに好ましいストリンジェントな条件の組では上記よりも高い温度を使用する。この場合、最後に行う０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの３０分ずつ２回の洗浄時の温度を６０℃に上げること以外は上記と同じである。極めてストリンジェントな条件のもうひとつの好ましい組として、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの最後の２回の洗浄を６５℃にする形がある。別のストリンジェントな条件の組として、たとえば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃でハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにする形がある。
【００４７】
ハイブリダイゼーションでは２つの核酸に相補的な配列が含まれている必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間にミスマッチがあってもよい。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、核酸長および相補性の度合いといった当該技術分野において周知の変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなればなるほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（高めのＴｍに対応）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に低くなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについてはＴｍを算出するための式が得られている（上掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、９．５０〜９．５１を参照のこと）。これよりも短い核酸すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置が一層重要になり、その特異性はオリゴヌクレオチドの長さによって決まる（上掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最低長は少なくとも約１５ヌクレオチドであり、一層好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、プローブの長さなどの要因次第では、必要に応じて温度および洗浄液の塩濃度を調節してもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【００４８】
「同一率」という用語は、当該技術分野において周知のように、配列同士を比較することで求められる２以上のポリペプチド配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」とは、場合によってはポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のストリング間のマッチによって求められる、このような配列間の配列の関連度を意味することもある。「同一性」および「類似性」については、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、パートＩ（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）、ヒュマナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（フォンハインイェ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデヴェロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９１）に記載されているものなどを含むがこれに限定されるものではない周知の方法で容易に算出することが可能である。試験配列間のベストマッチを得るために、同一性を求める好ましい方法が設計されている。また、同一性および類似性を求める方法が、一般利用可能なコンピュータプログラムの形で体系的にまとめられたものもある。配列アライメントと同一率の計算値については、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクスコンピューティングパッケージ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のディエヌエースターインコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．））のメグアライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを利用して求めることができる。配列のマルチプルアライメントについては、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法でのアライメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）をデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で用いて行えばよい。クラスタル法を使う場合のペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５とする。
【００４９】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「大部分」とは、当業者による手作業での配列評価あるいは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、また、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）などのアルゴリズムを使用したコンピュータでの自動配列比較および同定のいずれかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定できるだけの、そのポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる一部である。通常、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子と相同であるものとして推定的に同定するには、１０以上の連続したアミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関していえば、配列依存性の遺伝子同定方法（サザンハイブリダイゼーションなど）および単離（細菌コロニーまたはバクテリオファージのプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）に、２０〜３０の連続したヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用することができる。また、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得ることを目的として、塩基数１２〜１５の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲでの増幅プライマーとして利用しても構わない。したがって、ヌクレオチド配列の「大部分」は、その配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるだけの配列が含んでなる。本願明細書では、１以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的または完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を教示している。これによって、本願明細書に提示の配列から利益を得られる当業者であれば、ここに開示の配列の全部または大部分を当業者にとって周知の目的で利用することができるであろう。したがって、本発明は、添付の配列表に記載の完全配列のみならず、上記にて定義したこれらの配列の大部分も含んでなる。
【００５０】
特定の部位で化学的に等価なアミノ酸が得られるが、コードされるタンパク質の機能的な特性には影響しない遺伝子における変化が当該技術分野において周知であるため、本発明にはここで具体的に示す以外の例も包含される。本発明の目的において、置換とは、以下の５つの群のうちひとつの範囲内での交換であると定義される。
１．非極性または若干極性の小さな脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性でマイナスに荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性でプラスに荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．非極性の大きな脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００５１】
したがって、疎水性アミノ酸であるアラニンに対するコドンを、これより疎水性が低い他の残基（グリシンなど）またはこれよりも疎水性が高い他の残基（バリン、ロイシンまたはイソロイシン）をコードするコドンで置換することができる。同様に、マイナスに荷電した残基が１つ他の残基に（グルタミン酸がアスパラギン酸に）置換される、あるいは、プラスに荷電した残基が１つ他の残基に（アルギニンがリシンに）なる変更でも機能的に等価な産物が得られるものと思われる。多くの場合、タンパク質分子のＮ末端部分およびＣ末端部分の変化につながるヌクレオチドの変化があってもタンパク質の活性が変わることはないと思われる。
【００５２】
「相補的である」という表現については、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を示す際に使用する。たとえば、ＤＮＡに関していえば、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明には、添付の配列表に記載の完全配列に対して相補的である単離された核酸断片のみならず、実質的に類似の核酸配列も含まれる。
【００５３】
好適な核酸断片（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一であり、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい核酸断片は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸断片である。好適な核酸断片は、上記の相同性を持つだけでなく、一般には少なくとも５０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、一層好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を含むポリペプチドをコードするものである。
【００５４】
「コドンの縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響せずにヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝暗号の性質を示す。したがって、本発明は、配列番号２５に記載の本件微生物のポリペプチドのアミノ酸配列の全体または大部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者であれば、特定のアミノ酸を表すヌクレオチドコドンを使用する特定の宿主細胞に見られる「コドンバイアス」について十分に理解していよう。したがって、宿主細胞での発現を改善した遺伝子を合成する際は、遺伝子のコドン使用頻度がその宿主細胞での好ましいコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計すると望ましい。
【００５５】
「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手順で化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックからアセンブルすることが可能なものである。こうしたビルディングブロックを結合およびアニール処理して遺伝子セグメントを構成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関する「化学的に合成された」とは、コンポーネントであるヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルされたものであることを意味する。この場合、十分に確立された手順を使ってＤＮＡの化学合成を手作業で行ってもよいし、多様な市販の装置類のうちのいずれかを使って自動化学合成を行うことも可能である。したがって、ヌクレオチド配列の最適化を踏まえた最適な遺伝子発現に遺伝子の方を合わせ、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることが可能である。当業者であれば、使用されるコドンが宿主の好むコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を知ることができよう。好ましいコドンについては、配列情報を得られる宿主細胞に由来する遺伝子についての調査を行い、その結果に基づいて判断することが可能である。
【００５６】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなるあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて正常な位置にある天然遺伝子を示す。「外来遺伝子」とは、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなる場合がある。「トランスジーン」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子のことである。
【００５７】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。  「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造があげられる。
【００５８】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５９】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示し、ポリアデニル化認識配列ならびにｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響をおよぼすことのできる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響することが特徴である。
【００６０】
「ＲＮＡ転写物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写物と呼び、一次転写物の転写後プロセシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補であり、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的遺伝子の発現をブロックする標的の一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補であるＲＮＡ転写物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列など、特定の遺伝子転写物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに対する影響力を持つ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを示す。
【００６１】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上に核酸配列が会合した状態を示す。たとえばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響をおよぼすことができる（すなわちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ときに、そのコード配列と作動的に結合されていると言う。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで制御配列への作動的な結合が可能なものである。
【００６２】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。遺伝子の発現を増す特定の誘導剤を細胞に与えることで発現を「誘導」することができる。本発明の文脈において、本件ＴＡＬ遺伝子の発現はチロシンが存在することで誘導される。
【００６３】
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することのできるアンチセンスＲＮＡ転写物が生成されることを示す。
【００６４】
「過発現」とは、健常な生物または非形質転換生物において生成されるレベルを超えて遺伝子産物がトランスジェニック生物で生成されることを示す。
【００６５】
「コサプレッション」とは、同一または実質的に類似の外来遺伝子または内在性遺伝子の発現を抑制することのできるセンスＲＮＡ転写物が生成されることを示す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６６】
「形質転換」とは、核酸断片が宿主生物のゲノムに移行し、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００６７】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００６８】
「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に役立つあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列解析ソフトウェア」は市販のものであってもよいし、独自開発のものであってもよい。一般的な配列解析ソフトウェアとしては、ＧＣＧパッケージのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ））、ブラストピー（ＢＬＡＳＴＰ）、ブラストエヌ（ＢＬＡＳＴＮ）、ブラストエックス（ＢＬＡＳＴＸ）（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ディエヌエースターインコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）、１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）ならびにスミスウォーターマンアルゴリズムを取り入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、会議日１９９２、１１１〜２０、編集者（ら）：スハイサンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：ニューヨーク州ニューヨーク、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））があげられるが、これに限定されるものではない。本願の内容に関してだけ言えば、配列解析ソフトウェアを解析に利用する場合、特に明記しない限り、その解析結果は引用したプログラムの「デフォルト値」でのものとなる点は理解できよう。本願明細書において使用する「デフォルト値」とは、ソフトウェアを最初に初期化したときに最初からロードされるあらゆる値またはパラメータの組を意味するものとする。
【００６９】
本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当該技術分野において周知のものであり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．，フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（以下、「マニアティス」とする）およびシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．，ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリーコールド出版局スプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８４）ならびにオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーンパブリッシングアソシエーツアンドウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（１９８７）によって説明されている。
【００７０】
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍにおけるＰＨＣＡ産生に関与する遺伝子
本発明のＴＡＬ活性をコードする遺伝子をトリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）酵母すなわちＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４から単離した。このＴＡＬ酵素はチロシンの存在によって誘導されたが、フェニルアラニンでは誘導されなかった。トリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）酵母はアンモニアリアーゼによる最初の攻撃でＬ−チロシンを好気的に異化し、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸を形成する（スパーニンズ（Ｓｐａｒｎｉｎｓ）ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １３８：４２５（１９７９））。続く水和とアルドール開裂によって、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドが産生されるため、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロトカテキュエート、ヒドロキシキノール、さらにはエネルギ生成ＴＣＡサイクルの基質であるマレイルアセテートによって分解が進む。
【００７１】
配列の同定
本発明のＴＡＬ酵素をコードするＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍから単離したヌクレオチド配列を配列番号２４とする。このヌクレオチド塩基および推定アミノ酸（配列番号２５）配列を公共のデータベースと比較すると、最も類似性の高い既知の配列は、スミスウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、会議日１９９２、１１１〜２０編集者（ら）：スハイサンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：ニューヨーク州ニューヨーク、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））を用いた場合に６８９アミノ酸の範囲にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約４８％同一であるということが分かる。さらに好ましいアミノ酸断片は本願明細書に記載の配列に対して少なくとも約７０％〜８０％同一であり、約８８％〜８５％であれば好適であり、８５％〜９０％であれば好ましく、９０％〜９５％が最も好ましい。同様に、本件配列に対応する好ましいＴＡＬコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の配列に対して少なくとも約７０％〜８０％同一の配列であり、約８８％〜８５％であれば好適であり、８５％〜９０％であれば好ましく、９０％〜９５％が最も好ましい。
【００７２】
相同体の単離
本発明の核酸断片を利用すれば、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を同一または他の微生物種から単離することができる。配列依存性プロトコールを利用した相同遺伝子の単離については当該技術分野において周知である。配列依存性プロトコールの例としては、核酸ハイブリダイゼーション法ならびに、核酸増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボル（Ｔａｂｏｒ），Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５；あるいは鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））のさまざまな用途にみられるようなＤＮＡおよびＲＮＡの増幅法があげられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
たとえば、本件核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして利用して、本発明のものと同様のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離し、当業者間で周知の方法で所望の細菌からライブラリをスクリーニングすることが可能であった。本件核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブについては、当該技術分野において周知の方法（上掲のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））で設計し、合成することができる。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識法などの当業者間で周知の方法で、完全配列を使ってＤＮＡプローブを直接合成したり、あるいは利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使ってＲＮＡプローブを直接合成したりすることも可能である。さらに、特定のプライマーを設計し、これを利用して本配列の一部または全長を増幅することが可能である。得られる増幅産物については、増幅反応時に直接標識してもよいし、増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシーの条件下で全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして利用してもよい。
【００７４】
ＰＣＲタイプの増幅手法では、プライマーの配列がそれぞれ違っていて互いに相補的ではないのが普通である。所望の試験条件次第では、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を得られるようにプライマーの配列を設計しなければならない。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的なものであり、当該技術分野において周知である。（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウァランス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）第３３〜５０ページ、バージニア州ヘーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、アイアールエルプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ））、リクリーク（Ｒｙｃｈｌｉｋ），Ｗ．（１９９３）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、第３１〜３９ページ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ヒューマニアプレスインコーポレイテッド（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））。
【００７５】
通常、本件配列の短いセグメント２つをポリメラーゼ連鎖反応のプロトコールに利用し、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードする長めの核酸断片を増幅することができる。一方のプライマーの配列を本件核酸断片由来のものとし、他方のプライマーの配列で微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸領域の存在を利用して、クローニングされた核酸断片のライブラリでポリメラーゼ連鎖反応を行うようにしてもよい。
【００７６】
あるいは、第２のプライマーの配列をクローニングベクター由来の配列に基づくものとしても構わない。たとえば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコール（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従ってＰＣＲでｃＤＮＡを生成し、転写物中の一点と３’末端または５’末端との間の領域のコピーを増幅することができる。本件配列から、３’方向のプライマーと５’方向のプライマーとを設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））を利用すれば、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）、ロウ（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【００７７】
あるいは、本件配列を相同体同定用のハイブリダイゼーション試薬として利用してもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本となる構成要素としては、プローブ、該当する遺伝子または遺伝子断片を含むのではないかと思われる試料、特異的ハイブリダイゼーション法があげられる。本発明のプローブの典型は、検出対象となる核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出対象となる核酸配列に「ハイブリダイズ可能」なものである。プローブ長については５塩基から数万塩基まで可変であり、その長さは実施する具体的な試験に応じて決まる。一般に、プローブ長を１５塩基から約３０塩基にするのが適している。検出対象となる核酸配列と相補的でなければならないのは、プローブ分子の一部のみである。また、プローブと標的配列との間の相補性も完全である必要はない。ハイブリダイズされた領域に含まれる塩基の画分の中には正しい相補的塩基とペアにならないものが生じるが、不完全に相補的な分子間であってもハイブリダイゼーションは起こるのである。
【００７８】
ハイブリダイゼーション方法は十分に定義されている。一般に、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと試料とを混合しておかなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下にて、無機塩または有機塩の存在下でプローブと試料とを接触させる必要がある。このとき、プローブと試料の核酸との間で生じ得るハイブリダイゼーションを起こすことができる程度に十分な時間、プローブと試料の核酸とを接触させておかなければならない。ハイブリダイゼーションが起こるまでの時間は、混合物中におけるプローブまたは標的の濃度によって決まる。プローブまたは標的の濃度が高ければ高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短くなる。場合によりカオトロピック剤を加えてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することで核酸を安定させる。さらに、カオトロピック剤を用いると、短いオリゴヌクレオチドプローブを使って感受性が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションを室温にて行うことができるようになる（ヴァンネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。好適なカオトロピック剤としては、特に、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウムがあげられる。このカオトロピック剤については、一般に最終濃度を約３Ｍとして含有させる。必要があれば、ハイブリダイゼーション混合物に、一般には３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを加えることもできる。
【００７９】
さまざまなハイブリダイゼーション溶液を用いることが可能である。これらの溶液は一般に、約２０から６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶媒を含んでなる。通常のハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５から１Ｍの塩化ナトリウムと、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの約０．０５から０．１Ｍの緩衝液と、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５から０．２％の洗浄剤あるいは、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファルマシアインコーポレイテッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋＤａｌ）、血清アルブミンが用いられている。また、一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸と、ウシ胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡなどの断片化した核ＤＮＡ、あるいは酵母ＲＮＡなどが含まれ、場合により約０．５から２％ｗｔ．／ｖｏｌ．のグリシンも含まれる。また、ポリエチレングリコールなどのさまざまな極性・水溶性または膨潤性の薬剤を含む体積排除剤、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオンポリマー、デキストラン硫酸などのアニオンサッカライドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）といった他の添加剤を含有させてもよい。
【００８０】
核酸ハイブリダイゼーションは、さまざまなアッセイフォーマットに合わせることのできるものである。最も適したもののひとつにサンドイッチアッセイフォーマットがある。サンドイッチアッセイは特に、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合する。サンドイッチタイプのアッセイの主要なコンポーネントのひとつに固体担体がある。固体担体には、これに吸着した形またはこれに共有結合した形で、未標識かつ配列の一部に対して相補的な固定化核酸プローブが含まれる。
【００８１】
組換え発現−微生物
非相同な宿主細胞、特に微生物宿主の細胞で本件配列の遺伝子および遺伝子産物を産生することができる。
【００８２】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本配列の遺伝子産物生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。これらのキメラ遺伝子を形質転換によって適当な微生物に導入し、酵素を高いレベルで発現させることができる。
【００８３】
したがって、たとえば、適切なプロモータの制御下で本件微生物酵素をコードするキメラ遺伝子を導入すると、ＰＨＣＡ産生量の増加が認められると考えられる。本件遺伝子を天然宿主細胞ならびに非相同宿主の両方で発現させられれば有用であろうと思われる。本願遺伝子を未変性宿主に導入すると、既存のＰＨＣＡ産生レベルが上昇することになる。また、本件遺伝子の直接的な単離元である生物には認められないＰＨＣＡ産生を扱う上で利点がある場合、非自然宿主細菌に本件遺伝子を導入するようにしてもよい。
【００８４】
好適な宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは当該技術分野において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含んでなる。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が産生宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【００８５】
所望の宿主細胞での本件ＴＡＬ遺伝子の発現を駆動するのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。この遺伝子を駆動できるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に有用）、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ，およびｔｒｃ（エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびに、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびさまざまなファージプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。場合により、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【００８７】
本件遺伝子および核酸断片を発現させるのに好ましい非相同宿主細胞は、菌・カビまたは細菌ファミリ内で広く見られ、温度、ｐＨ値、溶媒耐性の点で広範囲にわたって成長する微生物宿主である。たとえば、どのような細菌、酵母、糸状菌類であっても本願核酸断片の発現に適した宿主となるであろうと思われる。転写がゆえに、翻訳およびタンパク質生合成装置は細胞原料とは無関係に同じであり、細胞バイオマスの生成に用いる炭素原料とは無関係に機能的遺伝子が発現される。大規模な微生物成長および機能的遺伝子発現で広範囲にわたる単純または複雑な炭水化物、有機酸およびアルコールおよび／またはメタンなどの飽和炭化水素、あるいは光合成宿主または化学合成独立栄養宿主の場合は二酸化炭素を利用することができる。しかしながら、特定の成長条件によって機能的遺伝子を調節、阻止あるいは抑制するようにしてもよく、こうした成長条件としては、窒素、亜リン酸、硫黄、酸素、炭素または小さな無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量があげられる。また、培地に添加され、一般には栄養素またはエネルギ源とはみなされない特定の調節分子の有無によって機能的遺伝子を調節してもよい。成長速度も遺伝子発現における重要な調節因子になることがある。
【００８８】
宿主株としては、腸内細菌（エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）など）ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）およびシュードモナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）などの細菌；ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などのシアノバクテリア、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの糸状菌類ならびにスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ），およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの藻類があげられるが、これに限定されるものではない。本発明のＴＡＬ遺伝子を上記微生物の宿主ならびに他の微生物宿主において産生させれば、商業的に有用な大量のＰＨＣＡを生成することができる。
【００８９】
経路操作
ＴＡＬ遺伝子の配列についての知識は、ＰＨＣＡ生合成経路を有する生物であればどの生物においてもこのような経路を扱うにあたって役立つことであろう。さらに、チロシンを産生する内在的機能または操作された機能を有する生物にＴＡＬ遺伝子を導入することで、グルコースなどの炭素源からのＰＣＨＡの産生が可能になろう。遺伝子経路を扱う方法は一般的なものであり、当該技術分野において周知である。特定の経路で選択した遺伝子については、さまざまな方法で上方制御または下方制御することができる。さらに、ある生物において競合する経路を遺伝子破壊ならびに同様の手法で排除または洗練（ｓｕｂｌｉｍａｔｅ）させることもできる。
【００９０】
鍵になる遺伝子経路を同定および配列決定したら、特定の遺伝子を上方制御して経路の出力を大きくすればよい。たとえば、ｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミドの宿主細胞に標的遺伝子のコピーを追加で導入することができる。あるいは、非自然プロモータの制御下にくるように標的遺伝子を修飾してもよい。細胞サイクル内の特定の点で、あるいは発酵実施時に経路を機能させると望ましい場合であれば、制御したプロモーターまたは誘導型プロモーターを利用して、標的遺伝子の未変性プロモーターを置き換えてもよい。同様に、場合によっては未変性プロモーターまたは内在性プロモーターを修飾して遺伝子発現を増大してもよい。たとえば、変異、欠失および／または置換によって、内在性プロモータをｉｎ  ｖｉｖｏにて変化させることが可能である（キミエック（Ｋｍｉｅｃ）、米国特許第５，５６５，３５０号明細書、ツァーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号パンフレットを参照のこと）。
【００９１】
あるいは、エネルギまたは炭素の競合シンク（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｓｉｎｋ）として機能し得る競合経路または標的経路における特定の遺伝子の発現を抑制または排除することが必要な場合もある。この目的での遺伝子の下方制御方法が検討されてきている。破壊対象となる遺伝子の配列が既知であれば、転写を破壊すべく構造的遺伝子に外来ＤＮＡを挿入する標的遺伝子破壊が遺伝子下方制御の最も効果的な方法のひとつである。これは、破壊対象となる遺伝子の一部に対する相同性の度合いが大きい配列によって隣接される挿入対象のＤＮＡ（遺伝子マーカーのことが多い）を含んでなる遺伝子カセットを生成することで実施できる。カセットを宿主細胞に導入することで、細胞の生来のＤＮＡ複製機序によって外来ＤＮＡが構造的遺伝子に挿入されることになる。（たとえば、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７１：４６１７〜４６２２（１９８９）、バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら  Ｇｅｎｅ  １３６：２１１〜２１３（１９９３）、ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：２５１９〜２５２４（１９９６）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：２７０〜２７７（１９９６）を参照のこと）。
【００９２】
標的遺伝子の配列が既知である場合に遺伝子を下方制御するもうひとつの方法にアンチセンス技術がある。これを実現するためには、所望の遺伝子から得た核酸セグメントをクローニングし、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにしてプロモーターに作動的に結合させる。このコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、該当するタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることで遺伝子発現を阻害する。当業者であれば、特定の遺伝子の発現を抑えるためにアンチセンス技術を使用することには特別な検討事項が絡むことは分かるであろう。たとえば、アンチセンス遺伝子を適切なレベルで発現させるには、当業者間で周知の異なる制御要素を利用する異なるキメラ遺伝子を使用しなければならないことがある。
【００９３】
標的遺伝子破壊とアンチセンス技術は配列が分かっている場合に遺伝子を下方制御する上での効果的な手段にはなるが、配列主体ではなく、それほど特殊性のない他の方法論もいくつか開発されている。たとえば、細胞をＵＶ光線に曝露した後、所望の表現型についてスクリーニングすることができる。化学薬品を用いての突然変異誘発も変異体を生成するには効果的であり、一般に用いられている物質として、ＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなど非反復ＤＮＡに影響する化学薬品ならびに、フレームシフト変異を引き起こすことが注目すべき点であるアクリジン染料などの反復ＤＮＡに影響する薬品があげられる。放射線または化学薬品を使って変異を作り出すための具体的な方法については、当該技術分野における文献に十分な説明がある。たとえば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブラック（Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）、シナウアーアソシエーツインコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）またはデシュパンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、ムカンド（Ｍｕｋｕｎｄ）  Ｖ．，Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：  ２２７（１９９２）を参照のこと。
【００９４】
もうひとつの非特異的遺伝子破壊方法として、転移因子またはトランスポゾンを使用する方法がある。トランスポゾンは、ＤＮＡにランダムに挿入されるが、後から挿入が起こった場所を判断する目的で配列を基準に取り出すことのできる遺伝因子である。ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の転移方法が知られている。どちらも方法でも転移因子をトランスポザーゼ酵素と併用する。転移因子またはトランスポソンをトランスポザーゼの存在下で核酸断片と接触させると、転移因子が核酸断片にランダムに挿入される。この手法では破壊された遺伝子を転移因子の配列に基づいて同定することができるため、ランダム突然変異誘発および遺伝子単離に有用である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転移用のキットが市販されている（たとえば、酵母Ｔｙ１要素ベースでは、ニュージャージー州ブランチバーグ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ）のパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能なプライマーアイランドトランスポジションキット（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、細菌トランスポソンＴｎ７ベースでは、マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手可能なゲノムプライミングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｔｎ５細菌転移因子ベースでは、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のエピセンターテクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手可能なＥＺ：：ＴＮトランスポソン挿入系（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照のこと）。
【００９５】
本発明に関する限り、上述した方法のうちのいずれかひとつを用いてＰＨＣＡ産生酵素経路の発現を調節すると有用なことがある。たとえば、フェニルアラニンの産生などの競合経路を下方制御することで、グルコースからのチロシンの産生を最大限にすると都合がよいであろう。
【００９６】
工業産生
ＰＨＣＡの量産が望まれる場合、さまざまな培養法を適用することができる。たとえば、バッチ培養法または連続培養法のどちらでも組換え微生物宿主から過発現させた特定の遺伝子産物を生成することができる。
【００９７】
従来からのバッチ培養法は、培地の組成物を培養開始時に仕込み、培養工程の途中で人工的に変化させることのない閉じた系のひとつである。このため、培養工程開始時に所望の生物または複数の生物を培地に播種し、系に何も加えずに成長または代謝活性を引き起こさせる。しかしながら、一般に「バッチ」培養では炭素源の追加という意味ではまとめて処理が行われるため、ｐＨおよび酸素濃度などの要因を制御しようとする試みがなされることが多い。バッチ系では、培養を停止させるまで系の代謝物とバイオマス組成が絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は動きのない誘導期から大きく成長する対数期へと移り、最後に静止期において成長率が低下または停止する。未処理の状態では、静止期の細胞は最終的には死んでしまう。系によっては、最終生成物または中間体の大半が対数期の細胞によって作られることが多い。他の系では静止期または対数増殖期後期で産生品を得ることが可能である。
【００９８】
標準的なバッチ系のバリエーションのひとつにＦｅｄ−バッチ系がある。Ｆｅｄ−バッチ培養プロセスも本発明において好適であり、培養が進むにつれて基質を増やしながら加えること以外は一般的なバッチ系を含んでなる。Ｆｅｄ−バッチ系は、カタボライト抑制によって細胞の代謝が阻害されやすい場合や、培地に含まれる基質の量を制限するのが望ましい場合に有用なものである。Ｆｅｄ−バッチ系で実際の基質濃度を測定するのは困難であるため、ｐＨ、溶存酸素、ＣＯ２などの廃ガスの分圧といった測定可能な要因の変化に基づいて濃度を推測する。バッチ培養法およびＦｅｄ−バッチ培養法は一般的かつ当該技術分野において周知のものであり、その一例が、本願明細書に援用するトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）  Ｄ．ブラック（Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）、シナウアーアソシエーツインコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）またはデシュパンド，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）  Ｖ．，Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６，２２７（１９９２）に記載されている。
【００９９】
連続培養を用いてＰＨＣＡを量産することもできる。連続培養は、処理時に一定の培養液を連続してバイオリアクターに加えると同時に、これと同じ量の条件培地を取り出す開いた系のひとつである。連続培養では細胞が主に成長の対数期にある一定の高い液相密度に細胞を維持するのが普通である。あるいは、炭素と栄養素とが連続的に加えられる固定化細胞を利用し、価値のある生成物、副生物または廃棄物を細胞塊から連続的に取り出す連続培養を行うようにしても構わない。細胞の固定化については、天然および／または合成の材料からなる広い範囲の固体担体を使って行うことができる。
【０１００】
連続培養または半連続培養では、細胞の成長または最終生成物の濃度に影響する要因をひとつまたはいくつでも加減することができる。たとえば、ひとつの方法では、炭素源などの限られた栄養素または窒素濃度を一定率に維持し、他のすべてのパラメータを加減できるようにする。他の系では、培地の混濁度で測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する多数の要因を連続して変化させることができる。連続系は定常状態の成長条件を維持することを目指すものであるため、培養時における細胞の成長率と培地除去による細胞喪失とのバランスを保つようにしなければならない。連続発酵プロセスで栄養素と成長因子とを調節する方法ならびに、生成物の形成速度を最大限にするための手法は工業用微生物学の当該技術分野において周知であり、ブラック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）によってさまざまな方法が詳細に説明されている。
【０１０１】
本発明の発酵培地には好適な炭素基質を含有させる必要がある。好適な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖類、スターチまたはセルロースなどの多糖類、あるいはこれらの混合物ならびに、乳清浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、甜菜糖蜜および大麦麦芽などの再生可能な原料から得られる未精製混合物があげられるが、これに限定されるものではない。さらに、この炭素基質は重要な生化学的中間体への代謝変換が認められる一炭素基質（二酸化炭素、メタンまたはメタノールなど）であってもよい。１種または２種の炭素基質だけでなく、メチロトローフ生物もメチルアミン、グルコサミン、さまざまなアミノ酸などの他の多数の炭素含有化合物を代謝活性に利用することが知られている。たとえば、メチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［国際シンポジウム］、第７回（１９９３）、４１５〜３２。編集者（ら）：ミュレール（Ｍｕｒｒｅｌｌ），Ｊ．コリン（Ｃｏｌｌｉｎ）、ケリー（Ｋｅｌｌｙ），ドン（Ｄｏｎ）Ｐ．  出版社：インターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）、英国アンドーバー（Ａｎｄｏｖｅｒ））。同様に、さまざまなカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種もアラニンまたはオレイン酸を代謝する（スルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５３：４８５〜４８９（１９９０））。したがって、本発明において利用する炭素源には多種多様な炭素含有基質を包含でき、その選択肢はどの生物を選択するかによってのみ制限されるものである。
【０１０２】
組換え発現−植物
あるいは、本発明は、ＴＡＬ遺伝子を含む植物細胞においてＰＨＣＡを産生するものである。本発明の核酸断片を利用して、ＰＨＣＡ産生用の微生物遺伝子を発現する機能を有するトランスジェニック植物を作り出すことができる。好ましい植物宿主にはＰＨＣＡまたはＰＨＣＡ−グルコシドコンジュゲートを高濃度で生成できる多種多様なものがある。好適な緑色植物としては、ダイズ、ナタネ（ブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラッシカカンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、コショウ、ヒマワリ（ヘリアンサスアヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、ワタ（ゴシッピウムヒルスーツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メディカゴサティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コムギ（トリチカムｓｐ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ））、オオムギ（ホルデウムウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、オートムギ（アベナサティバエル（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ））、モロコシ（ソルガムバイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、コメ（オリザサティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ナタネ科の野菜類（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ類、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、まぐさがあげられるが、これに限定されるものではない。所望の組織において所望の発育段階で遺伝子の発現を指示できるプロモーターにコード領域が作動的に結合された本発明のキメラ遺伝子をまず作製することで、ＰＨＣＡを過発現させることができる。便宜上の理由で、キメラ遺伝子が同一の遺伝子に由来するプロモーター配列と翻訳リーダー配列を含んでなることがある。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列もなければならない。さらに、本件キメラ遺伝子は、遺伝子発現を容易にするためにイントロンを１つまたはそれ以上含んでなるものであってもよい。
【０１０３】
このキメラ遺伝子配列では、コード領域の発現を誘導できるどのようなプロモーターとターミネーターとをどのように組み合わせて用いてもよい。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの好適な例として、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子から得られるものがあげられる。使用できる効率的な植物プロモーターのタイプのひとつに高等植物のプロモーターがある。このようなプロモーターは、遺伝子配列または本発明と作動的に結合された際に、本願遺伝子産物の発現を促進できるものでなければならない。本発明において使用できる高等植物のプロモーターとしては、たとえば、ダイズから得られるリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １：４８３〜４９８、（１９８２））ならびにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがあげられる。これらの２種類のプロモーターは植物細胞において光誘導されることが知られている（たとえば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（１９８３）、第２９〜３８ページ、コルッチ（Ｃｏｒｕｚｚｉ），Ｇ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５８：１３９９（１９８３）、ダンスミア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ），Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【０１０４】
このようにして、本件キメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを作製することができる。どのプラスミドベクターを選択するかは、宿主植物の形質転換に使用する方法によって決まる。当業者であれば、キメラ遺伝子を含む宿主細胞を形質転換し、選択し、増殖させる過程を成功させるにはプラスミドベクターにどのような遺伝因子を存在させておく必要があるか分かるであろう。また、当業者であれば、互いに独立した異なる形質転換イベントでは得られる発現のレベルやパターンが異なる（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）、デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６（１９８９））ため、所望の発現レベルとパターンとを呈する株を得るには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも理解できよう。このようなスクリーニングについては、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロックツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型の分析によって行うことができる。
【０１０５】
用途によっては、本件タンパク質を異なる細胞区画に向けると有用である。したがって、コード配列を変更し、トランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ），Ｋ．，Ｃｅｌｌ  ５６：２４７〜２５３（１９８９））シグナル配列、あるいは、小胞体局在化シグナルをコードする配列（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ），Ｊ．Ｊ．，Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））または核局在化シグナルをコードする配列（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ），Ｎ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））などの適当な細胞内標的配列を追加および／またはすでに存在する標的配列を除去した状態で酵素をコードすることで、上述したキメラ遺伝子をさらに補うことができると思われる。上記にて引用した参考文献にはそれぞれの例があげられているが、この一覧は網羅的なものではなく、本発明において利用できる有用な他の標的シグナルが将来的に発見される可能性もある。
【０１０６】
タンパク質エンジニアリング
本願ヌクレオチドを使用して、活性を亢進または変化させた遺伝子産物を生成できると考えられる。天然遺伝子の配列を突然変異させ、活性を変化または亢進させた遺伝子産物を生成する方法にはさまざまなものが周知であり、その一例として、ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９））、部位特異的突然変異誘発（クームス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、２５９〜３１１、１プレート、編集者（ら）：アンゲレッチ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ）、ルースオーグ（Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）、出版社：カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ））、「遺伝子シャッフリング」（本願明細書に援用する、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３７，４５８号明細書）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０７】
遺伝子シャッフリングの方法は、実現しやすく、突然変異誘発率が高く、かつスクリーニングが容易であることから、特に魅力的である。遺伝子シャッフリングの方法では、該当する遺伝子と類似のＤＮＡ領域と異なるＤＮＡ領域からなる別の集合が存在する状態で該当する遺伝子を制限エンドヌクレアーゼで特定サイズの断片に切断する必要がある。こうした断片のプールを変性させた後、再アニールして変異遺伝子を作り出す。この変異遺伝子の活性の変化をスクリーニングする。
【０１０８】
本件微生物配列については、この方法を使って変異させ、活性の変化または亢進をスクリーニングすることができる。この配列は二本鎖でなければならず、５０ｂｐから１０ｋｂのさまざまな長さのものとすることが可能である。この配列を当該技術分野において周知（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上掲））の制限エンドヌクレアーゼでランダムに消化し、約１０ｂｐから１０００ｂｐの範囲の断片を得る。本件微生物配列だけでなく、微生物配列の全部または一部とハイブリダイズ可能な断片の集合を加えてもよい。同様に、本件配列とハイブリダイズできない断片の集合を加えてもよい。一般に、こうして断片の集合を追加する場合は、全核酸に対して重量で約１０から２０倍過剰になるようにして行う。通常、このプロセスを続けると、混合物中の異なる特異的核酸断片は約１００から約１０００になる。ランダムな核酸断片の混合集合を変性させて一本鎖核酸断片を形成した後、再アニール処理をほどこす。他の一本鎖核酸断片と相同な領域を持つ一本鎖核酸断片のみが再アニールされる。このとき、ランダムな核酸断片を加熱によって変性させることができる。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決めることができよう。好ましくは、温度を８０℃から１００℃とする。また、核酸断片を冷却によって再アニールさせてもよい。好ましくは、温度を２０℃から７５℃とする。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を加えれば再生を加速することが可能である。好適な塩濃度については０ｍＭから２００ｍＭの範囲とすることができる。次に、アニール後の核酸断片を核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートする。この核酸ポリメラーゼは、クレノー断片やＴａｑポリメラーゼであってもよいし、当該技術分野において周知の他のどのようなＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼをランダム核酸断片に加える作業は、アニーリングの前に行ってもよいし、アニーリングと同時またはアニーリング後に行ってもよい。上記のポリメラーゼの存在下における変性、再生、インキュベーションのサイクルを、所望の回数繰り返す。好ましくは、サイクルを２から５０回繰り返し、一層好ましくは、シーケンスを１０から４０回繰り返す。このようにして得られる核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂの範囲の大きめの二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準的なクローニングおよび発現のプロトコールを使って発現および活性の変化についてのスクリーニングが可能なものである（マナティス（Ｍａｎａｔｉｓ）（上掲））。
【０１０９】
さらに、遺伝子シャッフリング（エキソンシャッフリング）法（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、９４：１０６９〜１０７３（１９９７））を用いる機能ドメインの融合によってハイブリッドタンパク質をアセンブルすることが可能である。また、本件遺伝子の機能ドメインを他の遺伝子の機能ドメインと組み合わせ、所望の触媒機能を持つ新規な酵素を作り出すことが可能である。ＰＣＲオーバーラップ伸長法を用いてハイブリッド酵素を構築し、当業者間で周知の方法でさまざまな発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１１０】
好ましい実施形態の説明
本発明は、チロシンから直接ＰＨＣＡを産生するのに利用できる酵素を含んでなる。本発明の本件遺伝子はチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有するタンパク質をコードする。ＴＡＬ活性は、以下のスキームに従って中間ステップなしでチロシンを直接ＰＨＣＡに変換する。
【０１１１】
【化１】
2006517082.tif 000002
【０１１２】
チロシンによって誘導された、さまざまな微生物株のＰＡＬ活性およびＴＡＬ活性をスクリーニングすることによって、本発明のＴＡＬ遺伝子の単離元であるＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４）を発見した。さまざまなクロマトグラフィ手法を利用してＴＡＬ酵素を単離および精製した。精製した酵素のＮ−末端と内部断片を配列決定し、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ｔａｌのゲノム断片のＰＣＲクローニング用のプライマーを展開できるようにする。これらのプライマーを、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方をテンプレートとしてタッチダウン（Ｔｏｕｃｈ  Ｄｏｗｎ）ＰＣＲおよびランプ（Ｒａｍｐｅｄ）アニーリングＰＣＲに利用し、ＴＡＬ  ｃＤＮＡの一部をクローニングした。これらの２つの方法で得られたクローンのコンセンサス配列には、ゲノムＤＮＡまたは非処理ｍＲＮＡの混入が原因となるイントロン配列が含まれていた。コンセンサス配列に対して設計したプライマーを利用し、ＴＡＬ  ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥクローニングおよび３’ＲＡＣＥクローニングで全長ＴＡＬ  ｃＤＮＡ配列を生成した。得られたｔａｌ配列は、さまざまな生物由来の既知のＰＡＬ遺伝子に対する相同性の度合いが高い。ＴＡＬタンパク質配列（配列番号２５）はロドバクターカプスレイタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）由来のＴＡＬのタンパク質配列との相同性が比較的低い（同一性２８％）（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１２：２４０〜２４４（２００２））。イントロンの除去後、酵母ＧＡＬ１プロモーターの制御下でＴＡＬ遺伝子をベクターｐＹＥＳ２．０にクローニングし、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母での発現を成功させた。また、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細菌でもＴＡＬ遺伝子を発現させた。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１１４】
基本方法
実施例で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当該技術分野において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．，フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））およびＴ．Ｊ．シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８４）ならびにオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーンパブリッシングアソシエーツアンドウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（１９８７）に記載されている。
【０１１５】
細菌培養の管理と成長に適した材料および方法が当該技術分野において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ）  Ｎ．コスティロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）  Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）  Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ）  Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグズフィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンディーシー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４））またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）  Ｄ．ブラック（Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアーアソシエーツインコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の成長および管理に用いる試薬、制限酵素、材料はいずれも、アルドリッチケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ＢＤ  ダイアグノスティックシステムズ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ））、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））またはシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））から入手したものである。
【０１１６】
略号の意味は以下のとおりである。「ｓ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチあたりのポンド数を意味し、「ｎｍ」はナノメートル（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数または複数）を意味し、「Ｌ」はリットル（単数または複数）を意味し、「ｍｍ」はミリメートル（単数または複数）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数または複数）を意味し、「μモル」はマイクロモル（単数または複数）を意味し」、「ｇ」はグラム（単数または複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（単数または複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（単数または複数）を意味し、「Ｕ」はユニットを意味し、「ｍＵ」はミリユニットを意味し、「Ｕｍｇ−１」は１ｍｇあたりのユニットを意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は引力定数を意味する。
【０１１７】
実施例１
ＰＡＬ活性およびＴＡＬ活性を有するさまざまな微生物株のスクリーニング
この実施例の目的は、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ活性の方が高い酵素を持つ株を同定するためにさまざまな微生物株をＰＡＬ／ＴＡＬ活性についてスクリーニングすることにある。
【０１１８】
細胞成長とチロシン誘導
酵母株ロドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８８９）、サッカロマイコプシスフィブリゲラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０８０）、ロドスポリジウムトルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１０７８８）、スポリドボルスパラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１１３８６）、スポリジオボルスルイネニ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｒｕｉｎｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０４８９）、ロドトルラグラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０８０４）、ロドトルラミニュータ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３２７６９）、トリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４６４４６）、トリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４）を、米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））から入手した。これらの酵母株をグリセロールストックから栄養寒天プレートに画線し、３０℃で成長させた。次にシングルコロニーを選択し、チロシン、フェニルアラニンまたはコハク酸塩０．１ｇ／Ｌを加えたダグレー（Ｄａｇｌｅｙ’ｓ）培地（スパーニンズ（Ｓｐａｒｎｉｎｓ）ら、Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １３８：４２５〜４３０（１９７９））５０ｍＬに移した。あるいは、Ｋ２ＨＰＯ４を１．６１ｇ／Ｌと、ＫＨ２ＰＯ４を５．５５ｇ／Ｌと、ＭｇＳＯ４を０．１ｇ／Ｌと、ビオチン０．０１ｇ／Ｌとで構成され、ｐＨ６．２で、チロシン０．５ｇ／Ｌを加えた最小培地を利用した。振盪機を２５０ｒｐｍ以内にして３０℃にて、ＯＤが６００ｎｍで１．０から２．０の間になるまで細胞を成長させた。これらの細胞を遠心処理によってペレット化し、ｐＨ８．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１．０ｍＬ中に再懸濁させた。
【０１１９】
無細胞抽出物の調製
細胞を洗浄した後、ロイペプチンおよびペプスタチンＡを各１．０μｇ／ｍＬと、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）０．５ｍＭと、少量のＤＮａｓｅとを含有するｐＨ８．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁させた。次に１８，０００ｐｓｉに設定したフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ）に細胞を２回通し、４℃にて３８，７２０×ｇで２０分間の遠心処理によって細胞片を除去した。この上清を酵素アッセイ用の粗無細胞抽出物として利用した。
【０１２０】
タンパク質アッセイ
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：２４８〜２５４（１９７６））を利用してタンパク質濃度を求めた。クーマシー溶液を何通りかの量の無細胞抽出物と混合し、５９５ｎｍでのＯＤを測定した。
【０１２１】
ＰＡＬおよびＴＡＬアッセイ
Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン１．０ｍＭを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）５０ｍＭに酵素を加えることで反応を開始し、生成物の吸光度をモニタリングして反応を分光光度的に続けた。ＰＡＬ活性については、２９０ｎｍでモル吸光係数を９０００ｃｍ−１としてケイ皮酸塩の形成をモニタリングした。１ユニットの活性で１分あたり１．０μｍｏｌのフェニルアラニンがケイ皮酸塩に脱アミノ化される。ＴＡＬ活性については、ＰＨＣＡの形成を３１５ｎｍ（吸光係数１０，０００ｃｍ−１）でモニタリングした。１ユニットの活性で１分あたり１．０μｍｏｌのチロシンが脱アミノ化される。
【０１２２】
酵素反応速度アッセイ
チロシン２．０ｍＭの存在下でダグレー（Ｄａｇｌｅｙ’ｓ）培地で成長させた細胞から得た無細胞抽出物を用いて見かけ上のＶｍａｘ値およびＫＭ値を求めた。
【０１２３】
結果
さまざまな微生物株から得た無細胞抽出物のＰＡＬ、ＴＡＬ、ＰＡＬ／ＴＡＬ比の比活性を表１に示す。これらの結果から、被験微生物株のうち、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４にチロシンを加えたものでＰＡＬ活性およびＴＡＬ活性が誘導されることが分かった。さらに、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ酵素はＰＡＬ／ＴＡＬ比０．７３という高いＴＡＬ活性を呈した。また、これらの微生物におけるＰＡＬおよびＴＡＬ酵素についての酵素反応速度を研究したところ、表２に示すように、ＴＡＬのＶｍａｘはＴ．ｃｕｔｎｅｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４での方が他の微生物の場合に比して高いことも明らかになった。
【０１２４】
【表１】
2006517082.tif 000003
【０１２５】
【表２】
2006517082.tif 000004
【０１２６】
実施例２
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍにおけるチロシンアンモニアリアーゼ活性の誘導
この実施例の目的は、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍをチロシンの存在下で成長させるとＴＡＬ酵素の発現が誘導されることを示すことにあった。
【０１２７】
実施例１で説明したようにして、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍをチロシン、フェニルアラニンまたはコハク酸塩の存在下で培養した。Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍの無細胞抽出物を実施例１で説明したようにして取得し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を使って分析した。図１に示すように、チロシン誘導に応答する特定のバンドがある（７７．５ｋＤａ）ことが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって明らかになり、これをチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）とした。図１において、レーンＡはコハク酸塩での誘導で得られた無細胞抽出物であり、レーンＢはフェニルアラニンでの誘導で得られた無細胞抽出物、レーンＣはチロシンでの誘導によって得られた無細胞抽出物である。第１のレーンにおける分子量マーカー（アルカリ条件用）は、ホスホリラーゼＢ（９４ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、脱炭酸酵素（３０ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）である。
【０１２８】
実施例３
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬの精製およびキャラクタリゼーション
この実施例の目的は、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬ酵素を、アニオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィで精製することにあった。酵素の純度の確認にはＰＡＧＥを利用した。
【０１２９】
成長条件
まず最初に、トリコスポロンクタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４をグリセロールストックから栄養寒天プレートに画線した後、チロシンの存在下、３０℃にてダグレー（Ｄａｇｌｅｙ’ｓ）培地で成長させた。成長が６００ｎｍでのＯＤ約０．６に達した時点で細胞を収集した。細胞の収率は湿重量／Ｌで約１．０ｇであった。以後の抽出および精製手順はすべて４℃で実施した。
【０１３０】
無細胞抽出物の調製
収集した細胞ペレットを、１００ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌで１回洗浄し、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを１．０ｇ細胞湿重量／ｍＬの濃度まで含有する１００ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁させた。プロテイナーゼインヒビター混合物（コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ）、ロシェモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））のミニタブレットを、いずれも１．０μｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチンＡ、ベスタチン５０μｇ／ｍＬ、少量のＤＮａｓｅとともに加えた。約１８，０００ｐｓｉに設定したフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ）に細胞を２回通し、遠心処理（３８，７２０×ｇ、２０分間）によって細胞片を除去した。
【０１３１】
アニオン交換クロマトグラフィ
０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するｐＨ８．５の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化しておいた２０ｍｍ×１６５ｍｍのＨＱカラム（パーセプティブバイオシステムズ（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、マサチューセッツ州ファーミンガム（Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ））に粗細胞抽出液を適用した。約２カラム容量の平衡緩衝液で洗浄後、溶出緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するｐＨ８．５の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）１００％から平衡緩衝液５０％の勾配でカラムを溶出させ、１０カラム容量を超える溶出緩衝液を流量２５ｍＬ／時で、１０ｍＬの画分を回収した。活性画分（Ｎｏ．１８〜２２、タンパク質２１５ｍｇを含有）をプールし、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）  ＹＭ−５０遠心濾過ユニット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））を利用して濃縮した。
【０１３２】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）
２０ｍｍ×１６７ｍｍ、５０μｍのＰＥカラム（パーセプティブバイオシステムズ（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、マサチューセッツ州ファーミンガム（Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ））で３０ｍＬ／分の流量にてＨＩＣを行った。開始緩衝液（緩衝液Ａ）を、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌに入れた１．０Ｍ（ＮＨ４）２  ＳＯ４、溶出緩衝液（緩衝液  Ｂ）を、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｃ−ＨＣｌとした。カラムを２カラム容量分について平衡化し、試料注入後に２カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。１０カラム容量にわたって緩衝液Ａ１００％から緩衝液Ｂ１００％までの勾配を適用した。このカラムを２カラム容量の緩衝液Ｂで清浄化した後、２カラム容量分について緩衝液Ａで再度平衡化した。タンパク質を２８０ｎｍでモニタリングし、画分１０ｍＬを氷上で回収した。最大５０ｍｇのタンパク質を含む試料（４２０ｍｇのカラムキャパシティの１２％）に飽和硫酸アンモニウム溶液を加え、この試料を約１．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に調節した。活性画分（Ｎｏ．  １２から１７）をプールし、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）  ＹＭ−５０遠心濾過ユニットを使って濃縮した。
【０１３３】
ゲル濾過（ＧＦ）クロマトグラフィ
１０ｍｍ×３０５ｍｍ、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）  ２００  ＨＲ  カラムで、流量１．０ｍＬ／分にてゲル濾過を行った。緩衝液は、０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣＬとした。タンパク質を２８０ｎｍでモニタリングしながらカラムを１カラム容量走らせた。０．２５カラム容量分をカラムに通した後、画分（０．５ｍＬ）を氷上で回収した。試料（１００μＬ、タンパク質最大１０ｍｇ）を回収した。カラムを５回走らせ、画分を回収した。活性の最も高い画分をプールし、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）  ＹＭ−５０遠心濾過ユニット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いて濃縮し、脱塩した。
【０１３４】
ＰＡＧＥおよび等電点（ＩＥＦ）電気泳動分析
ファストゲル（Ｐｈａｓｔ−Ｇｅｌ）系（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））での分析用に、１レーンあたり４．０μｇのタンパク質を用いた。ＰＡＬ／ＴＡＬ標準には、精製した試料を利用した。分子量標準については、アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手した。低分子量マーカーを１２．５％ＳＤＳゲル用の標準として利用し、高分子量マーカーを８〜２５％未変性ゲル用の標準として利用した。また、低ｐＩ標準ならびに精製したＰＡＬ／ＴＡＬ酵素をｐＩ４〜６．５ＩＥＦゲル用の標準として利用した。
【０１３５】
タンパク質アッセイ
実施例１で説明したようにしてタンパク質濃度を測定した。
【０１３６】
結果
表３に示すように、上述したクロマトグラフィによる手法を用いた場合にＴＡＬの精製後に比活性が有意に増大した。増え方が最も大きかったのはＨＩＣおよびＧＦを使った場合で、いずれも比活性が約１４倍大きくなった。
【０１３７】
【表３】
2006517082.tif 000005
【０１３８】
図２に示すように、ＰＡＧＥを用いてＴＡＬ酵素の純度を求めた場合にも同様の結果が得られた。図２において、レーンの別は以下のとおりである。（ａ）無細胞抽出物（２０μｇ）、（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィ試料（２０μｇ）、（Ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィ試料（２０μｇ）、（Ｄ）ゲル濾過クロマトグラフィ試料（２０μｇ）、（Ｅ）ゲル濾過クロマトグラフィ試料（１０μｇ）、（Ｆ）ゲル濾過クロマトグラフィ試料（５μｇ）、（Ｇ）基準として、赤色酵母（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来の精製ＰＡＬ酵素。アルカリ条件の分子量マーカーには、ホスホリラーゼＢ（９４ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、脱炭酸酵素（３０ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を用いた。
【０１３９】
実施例４
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来の精製ＴＡＬ酵素のＮ−末端および内部断片の配列決定
この例の目的は、ＴＡＬ酵素のＮ−末端および内部ペプチド配列を取得し、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ｔａｌのゲノムＤＮＡ配列のＰＣＲクローニング用のプライマーを展開できるようにすることであった。
【０１４０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル濾過精製（実施例３で説明）によって得られたＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来の精製ＴＡＬ酵素を、１０％のβ−メルカプトエタノールを含有する４×タンパク質試料緩衝液（ノバジェン、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））中で調製し、８０℃で１．０分間加熱した。このタンパク質試料（１レーンあたり４．０から１０．０μｇ、合計４レーン）を４〜１２％の勾配でＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（ノバジェン、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））に適用し、印加電圧１００Ｖで約２時間かけて電気泳動的に分離した。
【０１４１】
エレクトロトランスファーおよびブロッティング
ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ））へのタンパク質のエレクトロトランスファーおよびブロッティングを、電気泳動的トランスファー細胞（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて実施した。ゲルのサイズ（６×７ｃｍ）のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙３層をエレクトロトランスファー緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１００ｍＭグリシン、１０％メタノール）に浸漬した。ＰＶＤＦ膜についてはあらかじめ１００％メタノールで少なくとも１０秒間湿らせた後、トランスファー緩衝液に少なくとも５分間浸漬しておいた。トランスファーサンドイッチを製造業者の指示どおりの手順で組んだ。８０ｍＡで約９０分間、ブロッティングを実施した。
【０１４２】
タンパク質の配列決定
ＰＶＤＦ膜上のペプチドバンドをアミドブラックで染色して可視化した。デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）のペプチドシーケンシング機関（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でのＮ−末端配列決定を行う目的で、該当するバンドをＰＶＤＦ膜から切り出した。配列をさらに確認するために、実施例３のゲル濾過精製産物を含有する別のＰＶＤＦ膜ブロットについてもウィスタープロテインマイクロケミストリー（Ｗｉｓｔａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ＭＳ設備（ザウィスターインスチテュート（Ｔｈｅ  Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ））で配列分析を行った。
【０１４３】
結果
図２のレーンＦに示されるように、ゲル濾過精製によって得られた試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後に分子量７７．５、６２、５６、２３．５、１４ｋＤａの５つのペプチドバンドが検出された。この５つのペプチドすべてをデュポンのシーケンシング機関（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でＮ−末端配列決定した。これらのペプチドのうち４つ（７７．５、６２、２３．５、１４ｋＤａのペプチド）のＮ−末端配列が得られた。これらのペプチドのうちの３つ、具体的には７７．５、２３．５、１４ｋＤａのペプチドは似たようなＮ−末端配列を持っていたことから、小さなものは主ペプチドコンポーネント（７７．５ｋＤａ）の分解産物であろうと考えられる。７７．５ｋＤａのペプチドのＮ−末端配列を配列番号１で示し、Ｎ−末端配列と呼ぶ。
【０１４４】
６２ｋＤａと１４ｋＤａのペプチドならびに５６ｋＤａと２３．５ｋＤａのペプチドの組み合わせ分子量は、おおざっぱにみればメインの７７．５ｋＤａのペプチドの分子量と等しいため、６２ｋＤａと５６ｋＤａのペプチドも分解産物である可能性が高い。６２ｋＤａのペプチドのＮ−末端配列はデータベースに含まれる他のＰＡＬ酵素に対して有意な類似性を示した。この配列を配列番号２とし、内部配列と呼ぶ。このペプチドは、１４ｋＤａのＮ−末端部分がないだけで７７．５ｋＤａのペプチドの分解産物である可能性が高いためである。
【０１４５】
ウィスタープロテインマイクロケミストリー（Ｗｉｓｔａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ＭＳ設備（ザウィスターインスチテュート（Ｔｈｅ  Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって７７．５ｋＤａのペプチドで得られたＮ−末端配列は、デュポンのシーケンシング機関（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で得られたものと同一であった。
【０１４６】
実施例５
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のＴＡＬ  ｃＤＮＡのクローニング
この実施例は、酵母での発現に用いられるＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ＴＡＬ  ｃＤＮＡの配列決定につながる実験について概説するためのものである。実施例４で生成したＮ−末端および内部ペプチド配列から、ＴＡＬ  ｃＤＮＡの一部をクローニングすることを想定した、タッチダウンＰＣＲおよびランプアニーリングＰＣＲを実施するためのプライマーを設計した。タッチダウンＰＣＲおよびランプアニーリングＰＣＲで得られたクローンのコンセンサス配列には、ゲノムＤＮＡまたは非処理ｍＲＮＡの混入が原因となるイントロン配列が含まれていた。コンセンサス配列に対して設計したプライマーを利用し、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法で全長ＴＡＬ  ｃＤＮＡを生成した。
【０１４７】
トリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）−試薬を用いるゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの調製
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５８０９４）を実施例１で説明したようにして培養した。細胞を９０００×ｇで４℃にて遠心処理し、得られた細胞ペレットをトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））２．０ｍＬに再懸濁させた。この混合物を均質化し、再懸濁させた細胞を１．０ｍＬのアリコートに分配した。室温にて５分間のインキュベーション後、クロロホルム０．５ｍＬを各試料に加えた。続いて、各試料を手で１５秒間強く振盪し、室温にてさらに３分間インキュベートした。これらの試料をベンチトップ遠心処理装置を使って１４，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠心処理した。上側の水性相をＲＮＡ単離用に保管したのに対し、各試料の中間相と下側の有機相についてはＤＮＡ調製用に利用した。
【０１４８】
ＤＮＡの入った各チューブに、１００％エタノール０．５ｍＬを加え、チューブをピペットで混合した。室温にて３分間のインキュベーション後、チューブを１４、０００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心処理した。上清を破棄し、ペレットをクエン酸ナトリウム（１０％エタノール中、０．１Ｍ）に１．０ｍＬに再懸濁させた。室温にて３０分間のインキュベーション後、上述したように試料を２回洗浄し、７５％エタノール１．２ｍＬをペレットに加え、試料を室温にて１０分間インキュベートした。ペレットをさらに１回洗浄し、１０分間空気乾燥させた。次に、ＮａＯＨ（８ｍＭ溶液２００μＬ）を加え、室温にて２日間かけてペレットを溶解させた。
【０１４９】
ＲＮＡを含有する上側の水性相にイソプロピルアルコールを添加し、試料を混合した後、室温にて１０分間インキュベートした。この試料を９０００×ｇで３０分間遠心処理した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水でｍａｄｅした後、７５００×ｇで４℃にて５分間遠心処理した。このＲＮＡペレットを１５分間空気乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水１．０ｍＬに溶解させた。
【０１５０】
全ＲＮＡからｍＲＮＡの精製
オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）ｍＲＮＡミニプレップキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））を用いて、製造業者から提供されているプロトコールに従って、全ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを精製した。全ＲＮＡ試料の容量を、ＲＮａｓｅフリーＨ２Ｏで２５０μＬに調節した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳからなるＯＢＢ緩衝液（２５０μＬ）とオリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）−懸濁液（１５μＬ）とを、各試料に加え、試料をしっかりと混合した。これらの試料をヒーティングブロックで７０℃にて３分間インキュベートした後、室温にて１０分間放置した。オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）−ｍＲＮＡ複合体を１５，０００×ｇで２分間遠心処理してペレット化した。上清を慎重に除去した。オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）−ｍＲＮＡ複合体をＯＷ２緩衝液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））４００μＬに再懸濁させ、小さなスピンカラムに移し、１分間遠心処理し、２回洗浄した。スピンカラムを７０℃のヒーティングブロックに入れ、あらかじめ７０℃まで加熱しておいたＯＥＢ緩衝液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））５０μＬを各試料にピペットで加えた。１分間インキュベートした後、カラムを１５，０００×ｇで１分間遠心処理し、ｍＲＮＡを回収した。
【０１５１】
ＴＡＬ  ｍＲＮＡの逆転写
ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手したスーパースクリプトファーストストランドシンセシスシステム（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を逆転写に利用した。ポリＡ（＋）ＲＮＡ試料（０．３ｍｇ／ｍＬ溶液８μＬ）と、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物１μＬと、０．５ｍｇ／ｍＬのオリゴ（ｄＴ）１μＬとを一緒に混合し、６５℃で５分間加熱し、氷上で１分間冷却した。この混合物に、キットに同梱されていた以下の試薬を添加した。１０×ＲＴ緩衝液２μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ、ＲＮａｓｅインヒビター１μＬ。反応混合物を４２℃で２分間インキュベートした。次に、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素１μＬを添加し、混合物を４２℃で５０分間インキュベートした。７０℃で１５分間のインキュベーションによって反応を終了した。ＲＮａｓｅ  Ｈを１μＬ加えてＲＮＡを除去した後、３７℃で２０分間インキュベーションした。
【０１５２】
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のｔａｌのＰＣＲ増幅
実施例４で生成したＮ−末端および内部配列に基づいて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いる直接的なＰＣＲ増幅またはポリＡ（＋）ＲＮＡをテンプレートとして用いるＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）増幅のいずれかによって、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍのｔａｌの５’−末端領域をＰＣＲクローニングするために表４に示すプライマーを設計した。後述するように、タッチダウンＰＣＲ法とランプアニーリングＰＣＲ法の両方を用いた。
【０１５３】
【表４】
2006517082.tif 000006
【０１５４】
ゲノムテンプレートまたはｃＤＮＡテンプレートを用いるｔａｌのタッチダウンＰＣＲ増幅
タッチダウンＰＣＲ（ダン（Ｄａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４００８（１９９１））を利用し、ゲノムテンプレートまたはｃＤＮＡテンプレートのいずれかを以下のようにして使ってｔａｌを増幅した。Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれか１マイクロリットルをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手したホットスタートタクマスターミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）での増幅用のテンプレートとして使用した。反応混合物の容量は５０μＬであり、各プライマー（表４）０．１μＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ｄＮＴＰを２００μＭ含有していた。ＰＣＲ緩衝液（１０×）を１×最終濃度になるように加えた。ＰＣＲ条件については以下のとおりとした。９４℃で１５分、続いて９４℃で３０秒、アニーリング温度で２０秒、７２℃で１分を３０サイクルのＰＣＲ。アニーリング温度は９４℃から開始し、２サイクルごとに４℃のステップで徐々に７４℃まで下げた。次に、２サイクルごとに２℃のステップで６０℃まで下げた。最後に５サイクルの間５５℃にセットした。このＰＣＲ産物を同じ条件で同じプライマーセットを用いる２回目のＰＣＲのテンプレートとして利用した。
【０１５５】
配列番号３と６、３と７、３と８、４と７、４と８というプライマーの組み合わせを用いると、増幅時のゲル電気泳動で想定したサイズのバンドが検出された。よって、プライマー配列番号３と８を用いて上記の条件で染色体ＤＮＡを増幅した。次に、このＰＣＲ産物を、配列番号３と６、３と７、３と８、５と７のプライマーで以後の増幅実施時のテンプレートとして利用した。この回のアニーリング温度は、３０サイクルすべてについて５５℃で２０秒にセットした。各反応産物をゲル電気泳動で分析したところ、想定したサイズの極めて強いバンドが認められた。これらのＰＣＲ反応物（４μＬ）のアリコートを製造業者のプロトコール（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手したＴＯＰＯ−ＴＡ−クローニング）に従ってｐＣＲ２．１クローニングベクターにライゲートし、ＴＯＰＯ１０化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。白色コロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを単離し、デュポンのシーケンシング機関（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で配列決定した。得られた配列を後述するようなコンセンサス配列の構築に利用した。
【０１５６】
ｔａｌのランプアニーリングＰＣＲ増幅
ランプアニーリングＰＣＲ（アンドレア（Ａｎｄｒｅａ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１１８２〜１１８６（２０００））もゲノムテンプレートとｃＤＮＡテンプレートの両方での増幅に利用した。この方法では、ＰＣＲの３０サイクル各々でアニーリング温度を１０分間かけて９４℃から５５℃まで線形的に下げた。他の条件はすべてタッチダウンＰＣＲで説明した条件と同じとした。
【０１５７】
ｃＤＮＡをテンプレートとして用いた場合、配列番号４と７、５と７、５と８というプライマーの組み合わせで想定したサイズの産物が生成された。配列番号５と７、５と８のプライマーの組み合わせでもゲノムＤＮＡをテンプレートとして想定したサイズの産物が生成された。これらのＰＣＲ産物を、アニーリング温度を３０サイクルすべてで５５℃に固定する２回目の増幅実施時のテンプレートとして利用した。２回目の産物すべてを上述したようにしてｐＣＲ２．１にクローニングし、７つの陽性クローンを配列分析に供した。
【０１５８】
１０９５ｂｐのコンセンサス配列を、上述したタッチダウンＰＣＲ法とランプアニーリングＰＣＲ法で得られた陽性クローンからコンパイルした。配列番号９として示すコンセンサス配列を分析したところ、これがコード配列の逆相補体であることが分かった。米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から提供されているブラストエヌ（ＢＬＡＳＴＮ）アルゴリズムを使用して、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）「ｎｒ」データベース（非冗長なジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造のブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク由来の配列、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースをすべて含む）に収録された配列に対する類似性についてのブラスト（ＢＬＡＳＴ）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）検索を実施し、配列番号９の、公共利用可能なあらゆるＤＮＡ配列に対する類似性を分析した。ブラスト分析によって、データベースに含まれる既知のＰＡＬ遺伝子に対する強い相同性が明らかになった。ペプチド配列と比較すると、４３ヌクレオチド長のイントロンが＋７８位で同定された。
【０１５９】
ＴＡＬ  ｃＤＮＡのＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の塩基配列を明らかにする実験法）クローニング
配列番号９のコンセンサス配列に基づいて、５’および３’ＲＡＣＥ増幅用に一組のプライマーを設計した（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９））。これらのプライマーを表５にあげておく。
【０１６０】
【表５】
2006517082.tif 000007
【０１６１】
ＴＡＬ  ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥクローニング
Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍのポリＡ（＋）ＲＮＡをｔａｌの５’−ＲＡＣＥクローニングに利用した。ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手した５’−末端ＲＡＣＥキットを製造業者のプロトコールに従って利用した。表５に示す５’ＧＳＰプライマー（配列番号１０〜１４）を第１の鎖ｃＤＮＡ合成に利用した。精製後、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使ってホモポリマー尾部（ポリｄＣ）をｃＤＮＡの末端に加えた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ホットスタータク（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ）マスターミックスを使って尾部のあるｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。５’末端プライマーにはＡＡＰ（配列番号２１）を使用し、３’末端プライマーは５’ＧＳＰ１ａ、１ｂ、２、３、４（配列番号１０〜１４）とした。使用したＰＣＲ条件は、９４℃で１５分に続いて、９４℃で３０秒、８０℃から５５℃まで線形的に３分、５５℃で１分、７２℃で２分を３０サイクルとした。このＰＣＲ産物を表６に示すように２回目の増幅のテンプレートとして利用した。
【０１６２】
【表６】
2006517082.tif 000008
【０１６３】
ＰＣＲ第５９、６０、６１および６２の産物をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングによって直接ｐＣＲ２．１にクローニングし、Ｔｏｐ１０化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。陽性クローンから得たプラスミドＤＮＡを単離して配列決定した。展開されたコンセンサス配列を配列番号２３とした。これよりも前のコンセンサス配列である配列番号９と比較すると、開始コドンの上流の別の２９５ヌクレオチドが含まれていた。イントロンは依然として存在することから、ｃＤＮＡテンプレートの作製に使用したｍＲＮＡ試料には、プレスライスされたｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ混入物が含まれているのではないかと思われた。
【０１６４】
ＴＡＬ  ｃＤＮＡの３’ＲＡＣＥクローニング
製造業者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてチロシンを加えたダグレー（Ｄａｇｌｅｙ’ｓ）培地でＯＤ約１．２まで成長させたＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍの培養１００ｍＬから全ＲＮＡを単離した。収率は全ＲＮＡの９０μｇであった。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）キットを使用して、上述したようにしてポリＡ（＋）ＲＮＡを全ＲＮＡ試料から精製した。
【０１６５】
ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））の３’ＲＡＣＥキットおよびプライマーＡＰを使用し、精製したポリＡ（＋）ＲＮＡ試料を逆転写のテンプレートとして用いた。クロンテックラボラトリーズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ））のアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）  Ｇ−Ｃ  ｃＤＮＡキットを使用し、得られる一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅用のテンプレートとして直接利用した。使用した５’プライマーは３’ＧＳＰ１−６（配列番号１５−２０）、３’プライマーはＲＡＣＥキットのＡＵＡＰとした。２つのプライマーセット３’ＧＳＰ４／ＡＵＡＰおよび３’ＧＳＰ６／ＡＵＡＰで予測したサイズ（１．３から１．５ＫＢ）のＰＣＲ産物が得られた。これらの２つのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、配列決定した。２つのクローンは互いに部分的にオーバーラップし、配列番号２３のコンセンサス配列とも部分的にオーバーラップしていることから、これらのクローンにはＴＡＬ遺伝子の一部が含まれていることが分かった。ポリＡ尾部も存在しており、コード領域の末端が含まれていることが分かった。これらの２つのヌクレオチド配列を配列番号２３のコンセンサス配列と組み合わせ、ＴＡＬ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を作り出した。得られたｔａｌのヌクレオチド配列と、このヌクレオチド配列に基づく予測アミノ酸配列とを、それぞれ配列番号２４および配列番号２５とする。
【０１６６】
米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から提供されているブラストエヌ（ＢＬＡＳＴＮ）アルゴリズムを使用して、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）「ｎｒ」データベース（非冗長なジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造のブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク由来の配列、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースをすべて含む）に収録された配列に対する類似性についてのブラスト（ＢＬＡＳＴ）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）検索を実施し、ｔａｌについて得られたヌクレオチド配列（配列番号２４）の、公共利用可能なあらゆるＤＮＡ配列に対する類似性を分析した。これらのＤＮＡ配列をすべての読み枠で翻訳し、ＮＣＢＩから提供されているブラストエックス（ＢＬＡＳＴＸ）  ＢＬＯＳＵＭ６２アルゴリズムでｇａｐ  ｅｘｉｓｉｔｅｎｓｅ  ｃｏｓｔを１１、ｐｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔを２、ｆｉｌｔｅｒｅｄ、ｇａｐ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２（１９９３））として、「ｎｒ」データベースに収録された公共利用可能なあらゆるタンパク質配列との類似性を比較した。
【０１６７】
ブラスト（ＢＬＡＳＴ）比較の結果を表７にあげておく。この結果は、ブラストエックスエヌアール（ＢＬＡＳＴＸｎｒ）アルゴリズムに基づくデータを示し、表記の値は期待値である。期待値とは、このサイズのデータベースの検索で全く偶然に期待される、特定のスコアで、マッチ数を指定する、マッチの統計的な有意性を推定したものである。これらの結果から、ｔａｌで得られたヌクレオチド配列は、さまざまな生物から得た既知のＰＡＬ遺伝子に対する相同性の度合いが高いことが分かる。ＴＡＬタンパク質配列（配列番号２５）をロドバクターカプスレイタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１２：２４０〜２４４（２００２））由来のＴＡＬのタンパク質配列と比較すると、同一性２８％であった。
【０１６８】
【表７】
2006517082.tif 000009
【０１６９】
実施例６
サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母でのＴＡＬ遺伝子の発現
この実施例の目的は、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母でＴＡＬ遺伝子を発現させるにあった。発現については、酵母の形質転換体によって産生されたＰＨＣＡとＣＡのレベルを測定することで確認した。
【０１７０】
サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母でのｔａｌの発現
ｔａｌのコード領域を含む２０７０ｂｐのＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡから２段階で増幅し、イントロンを除去した。この断片を酵母ＧＡＬ１プロモーターの制御下でベクターｐＹＥＳ２．０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））にクローニングした。
【０１７１】
ヌクレオチド７８と１２１との間の４３ｂｐのイントロンを除去し、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍゲノムＤＮＡをテンプレートとして利用して、プライマー配列番号２６および２７で９７ｂｐの断片を増幅した。第２の２０３３ｂｐ断片をプライマー配列番号２８および２９でＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍゲノムＤＮＡから増幅した。どちらの場合も、ＰＣＲ反応混合物には、ゲノムＤＮＡ１μＬと、２つのプライマー（２０μＭ）各１μＬと、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μＬと、５Ｍ  Ｇ−Ｃメルト１０μＬと、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ８μＬと、Ｈ２Ｏが１８μＬと、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）Ｇ−Ｃポリメラーゼミックス（クロンテックラボラトリーズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））１μＬとが含まれていた。反応混合物を２．５分間で９４℃まで加熱した後、以下のサイクルに通した。９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分に続いて７２℃で７分を３０サイクル。
【０１７２】
ＰＣＲ産物をキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲンインコーポレイテッド（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））で精製し、Ｈ２Ｏで１：１０に希釈し、同容量で混合した。混合ＰＣＲ産物１マイクロリットルをプライマー配列番号３０および３１での２回目の増幅でのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ条件は１回目と全く同じにした。反応混合物にはプライマーとテンプレートが異なること以外は同じ成分を含有させた。得られた２０７０ｂｐのＤＮＡ断片をキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットで精製し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＹＥＳ２．０のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位にクローニングした。
【０１７３】
形質転換プレートから得た１５のコロニーを利用し、１％Ｂａｃｔｏ−トリプトンと、０．５％Ｂａｃｔｏ−酵母エキスと、０．５％ＮａＣｌと、１ｍＭ  ＮａＯＨと、１００μｇ／ｍＬアンピシリンとからなるＬＢ液体培養液を２ｍＬずつ播種した。これらの培養を一晩インキュベートした。これらの培養からキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを用いて製造業者のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを精製した。ＸｈｏＩでの制限消化を行ったところ、１５のプラスミドのうち１２にｔａｌインサートが含まれていた。
【０１７４】
１２のクローンを一緒にプールし、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ１３６２−１７Ａ酵母の形質転換に利用した。酵母細胞をＹＰＤ培地（１％Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、２％Ｂａｃｔｏ−ペプトン、２％デキストロース）で３０℃にて一晩成長させ、６００ｎｍでのＯＤが０．２になるまで希釈し、さらに５時間成長させた。培養５０ミリリットルを遠心処理し、０．１Ｍ酢酸リチウム１ｍＬで３回洗浄し、０．１Ｍ酢酸リチウム５０μＬに再懸濁させた。この懸濁液４０マイクロリットルを、１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ１０μＬ、プールしたプラスミドＤＮＡ１μＬ、４０％ＰＥＧ  ３３５０３００μＬと混合した。この混合物を３０℃で３０分間インキュベートした後、スルホン酸ジメチル４０μＬを加え、４２℃で２０分間インキュベートした。混合物を遠心処理し、細胞をＨ２Ｏに再懸濁させ、ＳＤ培地プレート（０．６７％酵母窒素ベース、２％デキストロース、２％Ｂａｃｔｏ−寒天）に延展した。
【０１７５】
８つの個別の酵母形質転換体を選択し、ＳＲ液体培地（０．６７％酵母窒素ベース、２％ラフィノース）で一晩成長させた。培養をＳＧ培地（０．６７％酵母窒素ベース、２％ガラクトース）でＯＤが０．５になるまで希釈し、４時間成長させた後、１０×アミノ酸（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  編集Ｃ．グザリエ（Ｇｕｔｈｒｉｅ）およびＧ．Ｒ．フィンク（Ｆｉｎｋ）、第１９４巻、第１５ページ）をウラシルなしで加えた。さらに４時間成長させた後、培養を遠心処理し、後述するようにＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）を利用して上清のＰＨＣＡおよびＣＡの有無を試験した。
【０１７６】
ＰＨＣＡおよびＣＡのＨＰＬＣ判定
培養液を遠心処理し、上清２０〜１０００μＬをリン酸で酸性化し、０．４５ミクロンのフィルタで濾過し、ＨＰＬＣで分析して成長培地でのＰＨＣＡおよびＣＡの濃度を求めた。
【０１７７】
オートサンプラーとダイオードアレイＵＶ／ｖｉｓ検出器とを備えたヒューレットパッカード製の１０９０Ｌ  ＨＰＬＣ系を、ＭＡＣ−ＭＯＤアナリティカルインコーポレイテッド（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州チャッドフォード（Ｃｈａｄｄｓ  Ｆｏｒｄ））から提供された逆相Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）で用いた。溶媒Ａ（メタノール）および溶媒Ｂ（０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液）を用いて表８に示すような溶媒勾配で１分あたりの流量を１．０ｍＬとした。カラム温度を４０℃に維持した。２５０、２３０、２７０、２９０および３１０ｎｍの波長で溶出液をモニタリングできるようにＵＶ検出器を設定した。
【０１７８】
【表８】
2006517082.tif 000010
【０１７９】
これらの条件では、ＰＨＣＡおよびＣＡの保持時間はそれぞれ１４．０および１７．６分間であった。
【０１８０】
表９に示されるように、アミノ酸の存在下で成長させた８つの培養はすべて若干のレベルでＰＨＣＡを含有していたが、検出可能なＣＡはなく、ＴＡＬ遺伝子の発現が成功していることが分かった。
【０１８１】
【表９】
2006517082.tif 000011
【０１８２】
実施例７
Ｅ．ｃｏｌｉでのＴＡＬ遺伝子の発現
この実施例の目的はＴＡＬ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ細菌で発現させることにあった。
【０１８３】
イントロンのないＴ．ｃｕｔａｎｅｕｍ  ＴＡＬ遺伝子のコード領域（実施例６参照）を、以下のプライマーを使ってＰＣＲで増幅した。
配列番号３２（フォワード）および配列番号３３（リバース）。ＰＣＲ反応混合物には、テンプレートＤＮＡ（ｐＴｒｉｃＨｉｓ−ＴｏＰｏ中のｔａｌ）１μＬと、２つのプライマー（２０μＭ）各１μＬと、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μＬと、５Ｍ  Ｇ−Ｃメルト１０μＬと、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ８μＬと、Ｈ２Ｏが１８μＬと、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）Ｇ−Ｃポリメラーゼミックス（クロンテックラボラトリーズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））１μＬとが含まれていた。反応混合物を２．５分間で９４℃まで加熱した後、以下のサイクルに通した。９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分に続いて７２℃で７分を３０サイクル。
【０１８４】
増幅したＰＣＲ産物をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キット（キアゲンインコーポレイテッド（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．））で精製し、キットに同梱されていた緩衝液ＥＢ５０μＬで希釈した。精製ＰＣＲ産物２５マイクロリットルを、水２５μＬ、ニューイングランドバイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ）制限緩衝液２（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））６μＬ、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））各２μＬと混合した。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした。
【０１８５】
ｐＢＸ２で示すプラスミドを以下のようにして調製した。インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手したプラスミドｐＲＳＥＴ−ＢをＮｃｏＩ（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））で消化し、ＤＮＡポリメラーゼラージ（クレノー）断片（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））で満たし、再ライゲートした。得られたプラスミドすなわち「プラスミドＡ」をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。１０９塩基対断片をプラスミドｐＥＴ１４−ｂ（ノバジェン）からＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを使って切断し、プラスミドＡにライゲートし、「プラスミドＢ」を得た。植物ゲノムＤＮＡ断片すなわち、プラスミドＢをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。配列番号３４で示す配列を有する、染色体３から（マッコンビー（ＭｃＣｏｍｂｉｅ）ら、ジェンバンクＡＣ１３４８８５）のオリザサティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株、クローンＯＪ１１２５Ｂ０３を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、消化したプラスミドＢでライゲートしてプラミド（ｐｌａｍｉｄ）ｐＢＸ２を得た。
【０１８６】
上述したようにしてプラスミドｐＢＸ２約４μｇをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、配列番号３４で示すＤＮＡ断片を除去する。これによって、２．９ｋＤａのベクターをゲル電気泳動で容易に分離して精製し、続いてキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて製造業者のプロトコールに従って抽出できるようになる。上述したようにして調製した、ｔａｌを含む消化ＰＣＲ産物を、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットで精製した。精製ｐＢＸ２およびＰＣＲ産物をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））を製造業者のプロトコールに従って使ってライゲートした。ライゲーション混合物を使用して、製造業者のプロトコールに従ってＴＯＰＯ１０化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質添加した。
【０１８７】
形質転換プレートから得た１５のコロニーを利用し、１％Ｂａｃｔｏ−トリプトンと、０．５％Ｂａｃｔｏ−酵母エキスと、０．５％ＮａＣｌと、１ｍＭ  ＮａＯＨと、１００μｇ／ｍＬアンピシリンとからなるＬＢ液体培養液を２ｍＬずつ播種した。これらの培養を一晩インキュベートした。これらの培養からキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを用いて製造業者のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを精製した。酵素ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）でのプラスミドＤＮＡの制限消化を行ったところ、１５のプラスミドのうち４つにｔａｌインサートが含まれていた。このプラスミドをｐＴＡＬ−ＢＸ２と名付けた。
【０１８８】
正しいクローンのうちの１つを使ってＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−コドンプラス−ＤＥ３−ＲＰコンピテント細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））を形質転換した。対照として、ｐＢＸ２プラスミドも用いて同じ株を別途形質転換した。各形質転換から１つのコロニーを採取し、１％Ｂａｃｔｏ−トリプトン、０．５％Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＯＨ、１００μｇ／ｍＬアンピシリンからなるＬＢ液体培養液２ｍＬを播種した。これらの培養を３７℃で一晩成長させた後、同じ培地１５ｍＬに入れて希釈し、室温で測定して６００ｎｍでのＯＤ約０．４まで成長させた。各培養１ミリリットルを取り、マイクロ遠心処理装置（エッペンドルフマイクロフュージ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）、ブリンクマンインスツルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ニューヨーク州ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ））において１４，０００ｒｐｍで２分間遠心処理（ｃｅｎｔｒｉｇｆｕｇｅｄ）した。細胞ペレットをＳＤＳ試料緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００２％ブロモフェノールブルー）４０μＬに溶解させた。使用する前にβ−メルカプトエタノール（２０μＬ）を緩衝液１ｍＬに加えた。ＩＰＴＧを残りの培養に最終濃度が０．７ｍＭになるようにして加えた。培養をさらに１８時間室温にて成長させた。これらの一晩培養各１ミリリットルを取り、マイクロ遠心処理装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において１４，０００ｒｐｍで２分間遠心処理した。得られた細胞ペレットを各々ＳＤＳ試料緩衝液１２０μＬに再懸濁させたものを「全細胞」試料とした。
【０１８９】
一晩培養（各１０ｍＬ）をソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｂ遠心処理装置（ケンドロラボラトリープロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、コネチカット州ニュータウン（Ｎｅｗｔｏｗｎ））においてＳＳ３４ロータを用いて５，０００ｒｐｍで４℃にて遠心処理した。細胞ペレットを、ロシェモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））から入手したコンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔ）（１タブレット／１０ｍＬ緩衝液）を含有するｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍＬで１回洗浄した。洗浄後、細胞ペレットを各々上記緩衝液１ｍＬに再懸濁させ、マイクロチップを取りつけたフィッシャーモデル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍｏｄｅｌ）  ３００  ソニックディスメンブレンター（Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｎｔｏｒ）（フィッシャーサイエンティフィックコーポレーション（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．）、ペンシルバニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ））を用いて、電力設定値６０で氷上にて１５秒ずつ５回超音波処理した。懸濁液をマイクロ遠心処理装置（ベックマンコールターインコーポレイテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））において１５，３００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心処理した。各上清５マイクロリットルをＳＤＳ試料緩衝液５μＬと混合した。これらの試料を「可溶性画分」とした。
【０１９０】
各ペレットを０．１Ｍリン酸緩衝液プラスプロテアーゼインヒビタ５００μＬに再懸濁させ、ＳＤＳ試料緩衝液５００μＬと混合した。これらの試料を「不溶性画分」とした。全細胞、可溶性画分、不溶性画分の各々（１０μＬ）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルシステム（Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）４〜１２％ビス−トリスＳＤＳゲル（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に仕込み、製造業者のプロトコールに従って電気泳動を実施した。
【０１９１】
得られたゲル画像を図３に示す。このゲル画像では、レーンＡが分子量マーカーマーク１２（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、レーンＢ、Ｄ、Ｆがそれぞれ、上述したようなｐＢＸ２プラスミドを持つＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製した、全細胞、不溶性画分、可溶性画分から得たｐＢＸ２プラスミドを含有する対照試料である。レーンＣ、Ｅ、Ｇはそれぞれ、上述したようなｐＴＡＬ−ＢＸ２プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製した全細胞、不溶性画分、可溶性画分の試料である。図に示されるように、レーンＥにはＴＡＬで想定した分子量である約７０ｋＤａのタンパク質バンドがあるが、これは対照（レーンＤ）には認められないことから、Ｅ．ｃｏｌｉでＴＡＬが十分発現していることが分かった。しかしながら、発現したタンパク質は酵素活性が極めて低いことから、発現系をさらに最適化する必要があることが明らかになった。ＴＡＬタンパク質は可溶性画分（レーンＧ）には存在しないことから、このタンパク質は上述した条件で発現させると可溶性ではないことが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍの無細胞抽出物のポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル画像である。
【図２】Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ由来の精製ＴＡＬのポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル画像である。
【図３】ｐＴＡＬ−ＢＸ２で形質転換した細胞から得たＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出液のポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルのゲル画像である。
【配列表】
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【図１】
2006517082.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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