(57)【要約】本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の検出および分類方法に関する。特に、本発明は、スーパーグループＢの皮膚型ＨＰＶの検出および分類方法、ならびに本発明の方法において用いるためのプライマーおよびプローブに関する。本発明の重要な利点は、多数のＨＰＶ型が単一のアッセイにおいて検出可能であること、固定され、かつ乏しく保存された材料に適用可能であること、および検出方法および分類方法が結合され得ることである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの検出方法であって、
（ａ）皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの潜伏が疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡと集合的に実質的に相補的な複数対の双方向プライマーを提供するステップと、
（ｃ）前記複数のプライマーを用いて、前記試料由来のＤＮＡを増幅するための反応を実行するステップと、
（ｄ）前記試料から、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶからのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｄ）は、複数の包括的な皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対して、前記ＤＮＡ増幅反応の反応産生物をハイブリダイゼーションすることによって実行されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記複数対の双方向プライマーは、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第１共通領域と集合的に実質的に相補的であるプライマーを含み、さらに、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第２共通領域に集合的に実質的に相補的であるプライマーを含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２共通領域は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにあることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２共通領域は、実質的に図２に定義されるようなものであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記複数対のプライマーは、図１のプライマーを含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記複数対の双方向プライマーの各対のプライマーのうち１つは、ビオチンラベルを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡを増幅するための前記反応は、低下されたストリンジェンシー条件下で実行されることを特徴とする請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のスーパーグループＢＨＰＶプローブは、全てのスーパーグループＢＨＰＶからの前記ＤＮＡ増幅産生物の核酸配列と実質的に相補的であることを特徴とする請求項２〜８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スーパーグループＢＨＰＶプローブは、図３のプローブを含むことを特徴とする請求項２〜９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブは、ＤＩＧラベルを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの分類方法であって、
（ａ）複数対の双方向プライマーを用いて、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡを増幅することによって、ＤＮＡ増幅産生物を提供するステップと、
（ｂ）前記増幅産生物を、少なくとも１つであるが、全てではない皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型のＤＮＡと実質的に相補的な少なくとも１つの皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対して、ハイブリダイゼーションすることによって、１または複数のスーパーグループＢＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記複数対の双方向プライマーは、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第１共通領域に集合的に実質的に相補的であるプライマーを含み、さらに、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第２共通領域に集合的に実質的に相補的であるプライマーを含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２共通領域は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにあることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および第２共通領域は、実質的に図２に定義されるようなものであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記複数対の双方向プライマーは、図１のプライマーを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記複数対の双方向プライマーの各対のプライマーのうち１つは、ビオチンラベルを含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのプローブは、スーパーグループＢＨＰＶの正確に１つの型のＤＮＡと実質的に相補的であることを特徴とする請求項１２〜１７のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのプローブは、図５のプローブから選択されることを特徴とする請求項１２〜１８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
検出は、リバースラインブロットの使用を含むことを特徴とする請求項１２〜１９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のうちいずれか１項に記載の方法に用いられる双方向プライマーであって、全てのスーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける第１および第２共通領域に集合的に実質的に相補的であることを特徴とするプライマー。
【請求項２２】
図１の双方向プライマー。
【請求項２３】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの検出のための包括的検出プローブであって、ＨＰＶ４型の６５３９ヌクレオチド位と６６１０ヌクレオチド位との間の全てのスーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける領域、およびその他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の対応する領域と、集合的に実質的に相補的であることを特徴とするプローブ。
【請求項２４】
図３の包括的検出プローブ。
【請求項２５】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の検出のための検出プローブであって、ＨＰＶ４型の６５３９ヌクレオチド位と６６１０ヌクレオチド位との間の少なくとも１つであるが、全てではないスーパーグループＢＨＰＶ型のＬ１ＯＲＦにおける領域、およびその他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の対応する領域と、実質的に相補的であることを特徴とするプローブ。
【請求項２６】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の検出のための型特異的検出プローブであって、ＨＰＶ４型の６５３９ヌクレオチド位と６６１０ヌクレオチド位との間の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の正確に１つの型のＬ１ＯＲＦにおける領域、およびその他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の対応する領域と、実質的に相補的であることを特徴とするプローブ。
【請求項２７】
図５の型特異的検出プローブ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の検出および分類方法に関する。特に、本発明は、スーパーグループＢの皮膚型ＨＰＶの検出および分類方法に関する。また、本発明は、本発明の方法に用いられるプライマーおよびプローブに関する。
【０００２】
本発明の背景
全ての疣の病因的作用物質は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）として知られている多様な群のウイルスであり、これらは、ＤＮＡ配列のバリエーションによって同定されるように、全部で１００を超える型のウイルス群を構成する。種々のＨＰＶは、種々の皮膚および粘膜疾患を発症させる。特定の類型は、疣、または乳頭腫を発症させ得るが、これらは、良性（非癌性）の腫瘍である。その他のものが、子宮頸部の浸潤癌を発症させることが発見された。
【０００３】
全てのＨＰＶ型のうち、３０を超える型は、ヒトから、他のヒトに対して、性的接触によって伝染され得る。したがって、ＨＰＶ感染は、最も一般的な性感染症（ＳＴＤｓ）の１つである。病変は、ＨＰＶを有するヒトとの性的接触後数週間から数ヶ月間以内に現れるか、またはＨＰＶ感染はしばしばいずれの症状をも発症させないので、病変が全く現れないこともある。病変および疣それら自体は処置できるけれども、乳頭腫ウイルス感染を除去するための療法は現在存在しない。
【０００４】
乳頭腫ウイルスは、ポリオーマウイルスとともに、二重鎖ＤＮＡゲノムを有する小さい非エンベロープ腫瘍ウイルスの科であるパポバウイルス科に属する。個別の単離物は、かなり宿主特異的である。ヒト（ＨＰＶ）、ウシ（ＢＰＶ）、トリ（たとえば、ＦＰＶ）、シカ（ＤＰＶ）、ワタオウサギ（ＣＲＰＶ）、ヨーロッパヘラジカ（ＥＥＰＶ）および多数のその他の動物に特異的な乳頭腫ウイルスが同定された。
【０００５】
血清型によって大部分分類されるその他のウイルスとは異なり、乳頭腫ウイルスは、同一の宿主について遺伝子型によって分類され、同定の目的で番号が与えられる（たとえば、ＨＰＶ１型〜ＨＰＶ８３型およびＢＰＶ１型〜ＢＰＶ４型）。
【０００６】
ＨＰＶは、感染された細胞において悪性の変化を誘導する能力に基づいて、低リスク型と、高リスク型とに大別される。低リスクＨＰＶ型、たとえば、１型、２型、４型、６型、１１型、１３型および３２型は、良性の病変または一般的な疣に主として関連する一方、高リスク型、たとえば、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型および６９型は、前癌状態および悪性の上皮病変に主として関連する。これらの高リスク型のＨＰＶは、低リスク型、たとえばＨＰＶ−６型およびＨＰＶ−１１型によって発症する疣と比較して、通常平坦かつほとんど見分けがつかない成長を生じさせる。
【０００７】
乳頭腫ウイルスはまた、一般的に、組織の屈性に従って分類され得る。全ての既知のヒト乳頭腫ウイルスは、上皮由来の細胞（ケラチノサイト）を完全に感染させるとともに、組織の屈性に従って、粘膜ＨＰＶ型か、または皮膚型ＨＰＶ型のいずれかに分類され得る「上皮腫瘍」を誘導する。
【０００８】
粘膜型（たとえば、ＨＰＶ６型およびＨＰＶ１６型）は、生殖および呼吸域の粘膜を感染させるＨＰＶを含む。皮膚型（たとえば、ＨＰＶ１型およびＨＰＶ８型）は、一般的に外皮を感染させるＨＰＶを含み、皮膚疣を発症させるもの、および疣贅状表皮発育異常症（ＥＶ；幼児期に発症する播種性の平坦な疣および斑状の病変によって、ならびに後年にＨＰＶ誘導皮膚癌にかかりやすい性質によって特徴付けられる稀な遺伝性疾患）にかかっている患者に皮膚癌を発症させるものを含む。
【０００９】
ＥＶに関連することが示されたＨＰＶ型は、ＥＶ型（たとえば、５型、８型、１７型、２０型および３６型）として分類される皮膚型ＨＰＶの群を構成する。これらのウイルスのうちいくつかは、一般的にかかりやすい個体にのみ癌を発症させ得る。これらの系統発生的関係に基づいて、ＥＶ型ＨＰＶは、ＥＶ型関連ＨＰＶおよびＨＰＶ４型とともに、スーパーグループＢ型として集合的に分類されるとともに、皮膚型ＨＰＶ型の最も大きい群を形成する。
【００１０】
以上は、一般的に、ＨＰＶの型が、感染の部位およびその臨床経過を予測することを示すために明確に表現される。
【００１１】
近年のデータは、スーパーグループＢ型皮膚型ヒト乳頭腫ウイルスが、特に、免疫抑制された患者（たとえば、腎移植患者）において、非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）の病原に関連する可能性があることを示唆する。さらに、皮膚型ＨＰＶＤＮＡ、特に５型、３６型および３８型は、乾癬病変の９０％以下において検出され得、系統発生的関係を示唆する。しかしながら、皮膚型ＨＰＶの研究は、これらが、多数のＰＣＲに基づく検出システムが並行して必要とされる、大きい、かつかなり異質のウイルス群を含むという事実によって、妨げられる。
【００１２】
従来技術の皮膚型ＨＰＶ検出および分類システムは、多数の制限を有する。この従来技術のＨＰＶ検出および分類システムの１つの不都合は、制限された数のＨＰＶ型しか、単一のアッセイにおいて検出され得ないことである。したがって、いくつかの別々のＰＣＲアッセイが、広い範囲の異なる型をカバーするように実行される必要がある（たとえば、Shamanin et al., 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88: 802-811; Meijer et al., 2001, Cancer Detect. Prev. 25: 533-547を参照。）。
【００１３】
さらに、従来技術のアッセイは、比較的大きいＤＮＡ断片を必要とする（Shamanin et al., 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88: 802.811; Berkhout et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 690-695; Forslund et al., 1999, J. Gen. Virol. 80: 2437-2443; Meijer et al., 2001, Cancer Detect. Prev. 25: 533-547）。臨床材料の粗末な保存のみならず、材料の適切な保存（たとえば、ホルマリン固定）のいずれもが、退化したＤＮＡを産生し得るので、かかるアッセイは、比較的新鮮な、固定されていない材料において、適切に実行されるほかない。これは、これらの使用を妨げるとともに、方法の標準化を妨げる。
【００１４】
さらに、従来技術は、今日までは単一対のプライマー（たとえば、Forslund et al, supraの退化したプライマー）またはネスティッドＰＣＲプライマー（たとえば、Berkout et al, supra）のいずれかを開示するのみであった。Forslundの方法は種々のＨＰＶ型の検出が可能であることを示すけれども、これらはまだ、全てのスーパーグループＢ型ＨＰＶが臨床標本から検出することができることを示していない。
【００１５】
さらに、皮膚型ＨＰＶの検出に適切な現在のアッセイシステムは、これと結合される分類システムを有しない。結果として、ＨＰＶの分類のために、ＤＮＡ増幅産生物の難儀な再増幅、クローニングおよびシーケンシングを必要とする（Shamani et al., 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88: 802-811; Berkhout et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 690-695）。
【００１６】
従来技術のれっきとした感度での複数ＨＰＶ型のいくつかの検出方法が有する別の問題は、これらの方式がいわゆるネスティッドＰＣＲ方式（Berkhout et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 690-695）であることである。かかる方法は、汚染に極めて感度が高く、極少量の汚染したテンプレートＤＮＡが、早くも虚偽の陽性結果を生じさせるであろう。
【００１７】
本発明の概要
これらの問題を克服するために、発明者は、スーパーグループＢに属する種々の皮膚型ＨＰＶ型のいずれもの検出方法を見出した。さらに、本発明の追加的な局面において、発明者は、検出方法と両立し得るスーパーグループＢに属するＨＰＶ型の効果的な分類系に関する方法を見出した。
【００１８】
本発明に従った皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの検出方法は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの潜伏が疑われる試料を提供するステップと、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡと集合的に実質的に相補的な複数対の双方向プライマーを提供するステップと、前記複数のプライマーを用いて、前記試料由来のＤＮＡを増幅するための反応を実行するステップと、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶからのＤＮＡ増幅産生物を、前記ＤＮＡ増幅反応の反応産生物を複数の包括的な皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対してハイブリダイゼーションすることによって、検出するステップとを含む。
【００１９】
追加的な局面において、本発明は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの分類方法を提供し、複数対の双方向プライマー間の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡを増幅するによって、ＤＮＡ増幅産生物を提供するステップと、前記増幅産生物を、少なくとも１つであるが全てではない皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型のＤＮＡと実質的に相補的な少なくとも１つの皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対してハイブリダイゼーションすることによって、１または複数のスーパーグループＢＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含む。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、スーパーグループＢＨＰＶ−ＤＮＡの増幅のための双方向増幅プライマーのセットを提供する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、スーパーグループＢＨＰＶ−ＤＮＡの包括的な検出のための包括的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、ＨＰＶのスーパーグループＢに属する個別のＨＰＶ型の型特異的または選択的な検出のための型特異的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００２３】
本発明の詳細な説明
「補体」または「相補的配列」とは、ワトソン−クリック塩基対規則に従って別のヌクレオチド配列と水素結合二重らせんを形成するヌクレオチド配列をいう。たとえば、５′−ＡＡＧＧＣＴ−３′と相補的な塩基配列は、３′−ＴＴＣＣＧＡ−５′である。
【００２４】
「発現」とは、遺伝子の構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対する転写、および該当する場合、その後の蛋白質に対する翻訳である。
【００２５】
ポリヌクレオチドは、同一の有機体にともに自然に存在しないならば、互いに「非相同」である。ポリヌクレオチドは、有機体における特定の形態および配列に自然に存在しないならば、その有機体と非相同である。
【００２６】
ポリヌクレオチドは、２つの配列におけるヌクレオチド配列が、上述のように最大に対応するように整列される場合に同一であるならば、「相同」な配列を有する。２つ以上のポリヌクレオチド間の配列比較は一般的に、配列類似の局部的領域を同定かつ比較するために、比較ウインドウに亘って２つの配列の部分を比較することによって、実行される。この比較ウインドウは一般的に、約２０〜２００の隣接するヌクレオチドである。ポリヌクレオチドに関する「配列相同割合」、たとえば５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９または１００％の配列相同性は、比較ウインドウに亘って２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され得、ここにおいて、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列（追加または削除を含まない。）と比較して、追加または削除（すなわちギャップ）を含み得る。この割合は、次のようにして計算される。（ａ）同一の核酸塩基が両配列に存在する位置の数を決定し、適合する位置の数を得る。（ｂ）適合する位置の数を、比較ウインドウ中の位置の総数で除算する。（ｃ）その結果を１００で積算し、配列相同割合を得る。比較のための配列の最適な整列は、既知のアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって、または検査によって実行され得る。容易に利用可能な配列比較および多重配列整列アルゴリズムはそれぞれ、両方ともにインターネットで利用可能なベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）(Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403; Altschul, S.F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402)およびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。その他の適切なプログラムは、ウィスコンシンジェネティックソフトウェアパッケージ（ジェネティックコンピュータグループ（ＧＣＧ），マディソン，ＷＩ，ＵＳＡ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＦＡＳＴＡを含む。
【００２７】
ここで用いられる「実質的に相補的」とは、２つの核酸配列が、少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、最も好ましくは約９８％の配列相同性を互いに有することを意味する。これは、プライマーおよびプローブが、ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションするために、これらのテンプレートおよび標的核酸それぞれに対して充分な相補性を示さなければならないことを意味する。したがって、この明細書で開示されるようなプライマー配列は、テンプレートにおける結合領域の正確な配列を反映しなくてもよく、変質したプライマーを用いてもよい。実質的に相補的なプライマー配列は、プライマー結合および第２鎖の合成を生じさせるために、増幅テンプレートに対して、充分な配列相同性を有するものである。
【００２８】
用語「ハイブリッド」は、相補的ヌクレオチド間の水素結合によって形成された、二重鎖核酸分子または二重螺旋を示す。用語「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、核酸配列の単一の鎖が、相補的ヌクレオチド間の水素結合によって二重らせん断片を形成する工程を示す。
【００２９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、リン酸結合（たとえば、リン酸ジエステル、アルキルおよびアリール−ホスフェート、ホスフォロチオエート）によって、または非リン酸結合（たとえば、ペプチド、スルファメートおよびその他）によって結合されたヌクレオチドモノマーの短い配列（通常６〜１００のヌクレオチド）を示す。オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含有し、修飾された塩基（たとえば、５−メチルシトシン）および修飾された糖類（たとえば、２′−Ｏ−メチルリボシル、２′−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−アミノリボシル、およびその類似物）を有する。オリゴヌクレオチドは、環状、分岐状、または直線状の形状を有する二重および一重鎖ＤＮＡならびに二重および一重鎖ＲＮＡの天然または合成分子であってもよく、安定的な二次構造（たとえば、ステム−ループ構造、およびループ−ステム−ループ構造）を形成可能なドメインを任意に含み得る。
【００３０】
ここで用いられる用語「プライマー」は、増幅標的に対してアニーリング可能なオリゴヌクレオチドを示し、これは、ＤＮＡポリメラーゼを、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産生物が誘導される状況下で、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのようなポリメリゼーションのための試薬との存在下で、ならびに適切な温度およびｐＨで、置かれるとき、ＤＮＡ合成の開始点として役立つように付随されることを可能とする。（増幅）プライマーは、増幅において最大効率をもたらすために、好ましくは単一鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボ核酸である。プライマーは、ポリメリゼーションのための試薬の存在下で伸長産生物の合成を引き起こすのに充分な長さを有しなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの源を含む多くの因子に左右されるであろう。ここで用いられる「１対の双方向プライマー」は、ＤＮＡ増幅技術、たとえばＰＣＲ増幅において広く用いられるような１つの正方向プライマーと１つの逆方向プライマーとを示す。
【００３１】
用語「プローブ」は、標的核酸配列検体またはそのｃＤＮＡ誘導体において相補的な配列と水素結合二重らせんを認識かつ形成する単一鎖オリゴヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、たとえば温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアルデヒド濃度およびその類似を示す。これらの条件は、プライマーまたはプローブの標的核酸配列に対する特異的な結合を最大化させ、かつ非特異的な結合を最小化するように経験的に最適化される。用いられる用語は、その他の配列よりも大きい度合い（たとえば背景技術の少なくとも２倍）で検出可能とするためにプローブまたはプライマーがその標的配列に対してハイブリダイゼーションするという条件への言及を含む。ストリンジェント条件は、配列に左右され、異なる状況において異なるであろう。配列は、長くなればなるほど、より高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃と低くなるように選択される。Ｔｍは、５０％の相補的標的配列が完全に適合するプローブまたはプライマーにハイブリダイゼーションする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）である。一般的に、ストリンジェント条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０ＭのＮａイオン、一般的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（たとえば、１０〜５０のヌクレオチド）に関して少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（たとえば５０よりも大きいヌクレオチド）に関して少なくとも約６０℃である条件になるであろう。ストリンジェント条件はまた、フォルムアミドのような不安定化試薬の追加によって達成されてもよい。模範的な高いストリンジェンシー条件は、３７℃での５０％のフォルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおけるハイブリダイゼーションと、６０℃での０．１xＳＳＣにおける洗浄とを含む。ハイブリダイゼーションの手順は、本技術分野において広く知られており、たとえばAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994に記載されている。
【００３３】
本発明の方法は、スーパーグループＢに属するヒト乳頭腫ウイルス、およびスーパーグループＢＨＰＶによって発症するヒト乳頭腫ウイルス感染症に感受性のある有機体におけるかかる感染症の検出、同定および診断を可能とする。
【００３４】
スーパーグループＢＨＰＶの検出
本発明に従ったスーパーグループＢＨＰＶの検出方法は、ヒト由来の試料において実行され得るが、その他の試料、たとえば環境試料、またはＨＰＶが宿り得るその他の局所の試料、たとえば昆虫のような他の有機体からの試料においても実行され得る。好ましくは、本発明の方法に用いる試料は、患者の細胞試料のようなヒト試料を含む。より好ましくは、試料は、潜在的または疑いのある感染の部位からの患者の細胞を含む。
【００３５】
患者の細胞の試料は、腫瘍皮膚細胞の試料（たとえば、疣、およびその他の類似物の場合、おそらく、皮膚型ＨＰＶ感染症を引き起こす。）を含み得る。代替的に、試料は、腫瘍粘膜細胞の試料を含み得、たとえば、女性の泌尿生殖器系のＨＰＶ感染の場合、子宮頸部細胞であるが、肺、喉頭、口腔、扁桃、食道、陰茎、外陰、肛門、直腸、前立腺、卵巣およびその他の組織の癌細胞も、本発明の方法における試料として用いられてもよい。
【００３６】
本発明の方法に用いる前記試料の取得および調製方法は、当業者によって知られており、あるいは、本開示から明白である。一般的なＤＮＡ分析および操作に関する方法は、たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vol. 1-3, eds. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、または Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) およびこれらの定期的な更新を参照のこと。
【００３７】
好ましくは、本発明に従った方法は、ＨＰＶ４型、５型、８型、９型、１２型、１４型、１５型、１７型、１９型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、３６型、３７型、３８型、４７型、４８型、４９型、５０型、６０型および／または６５型の検出のために用いられる。全てのこれらの型は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶに分類される。
【００３８】
本発明の好都合な局面において、未発見の皮膚型ＨＰＶスーパーグループＢのメンバーは、本発明の方法を用いて適切に検出され得る。さらに、スーパーグループＢＨＰＶの分類方法は、本発明に従ったＨＰＶ分類システムにおけるこれらの新しく発見された型の組み入れを円滑にするよう拡張され得る。
【００３９】
発明者は、互いの間隔が狭く、かつ種々のスーパーグループＢＨＰＶ型の間で相同性を表す、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける２つの分離した領域を見出した。これらの２つの相同領域、または共通領域は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶゲノムＬ１転写読取枠（ＯＲＦ）に位置する。これらの２つの共通領域のＤＮＡ配列は、図２に示される。第１共通領域は、約６５３９ヌクレオチド位から約６５５９ヌクレオチド位まで、ＨＰＶ４型（ＥＭＢＬ受託番号ｘ７０８２７、ＨＰＶ４型に従って番号を付す。）のゲノムにおける５′−３′方向に延びる領域とここで定義付けられる領域と、その他のスーパーグループＢの皮膚型ＨＰＶの型のゲノム内の対応する領域とを含む。第２共通領域は、約６５８３ヌクレオチド位〜約６６１０ヌクレオチド位まで、ＨＰＶ４型ゲノムのゲノムにおける５′−３′方向に延びる領域とここで定義付けられる領域と、その他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型のゲノム内の対応する領域とを含む。
【００４０】
この発見に基づいて、本発明は、双方向プライマーのセットを提供し、ここにおいて、各個別のプライマーは、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの複数の型の２つの共通領域のうち１つにアニーリング可能である。完全なセットは、好ましくは、複数対の双方向プライマーを設け、これらは、あわせて用いられるとき、あらゆる皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおけるこれらの２つの共通領域にアニーリング可能であり、かつこれらの２つの共通領域の間の、かつこれらと隣接した、すなわち、両側にこれら２つの共通領域を配置した、規定されたＤＮＡ配列を増幅可能である。
【００４１】
全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶからの前記２つの共通領域間の領域を増幅するための双方向プライマーの適切な対の例は、図１に示される。本開示から、図１のこれら以外のプライマーのその他のセットが、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶゲノムのＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域を両側に配置する、またはこれらの２つの共通領域の両側に位置する特異的な配列の増幅のために設計され、かつ用いられ得ることは、当業者にとって明白であろう。たとえば、若干短い、もしくは若干長いプライマー、またはたとえばイノシトール残基もしくはあいまいな塩基、もしくは図１のプライマーの配列を比較して、１もしくは複数の不一致を含むプライマーを含むプライマー配列を用いることが可能である。一般的に、少なくとも６５％、より好ましくは８０％の図１のオリゴヌクレオチド配列との相同性を示す配列が、本発明の方法に用いるのに適切であると考えられる。
【００４２】
本発明の方法は、原則として、あらゆる核酸増幅方法、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ; Mullis 1987, U.S. Pat. No. 4,683,195, 4,683,202, en 4,800,159）法を用いて、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ; Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193; EP Appl. No., 320,308）法、Self-Sustained Sequence Replication（３ＳＲ; Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）法、Strand Displacement Amplification（ＳＤＡ; U.S. Pat. Nos. 5,270,184, en 5,455,166）法、Transcriptional Amplification System（ＴＡＳ; Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）法、Q-Beta Replicase（Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197）法、Rolling Circle Amplification（ＲＣＡ; U.S. Pat. No. 5,871,921）法、Nucleic Acid Sequence Based Amplification（ＮＡＳＢＡ）法、Cleavase Fragment Length Polymorphism法(U.S. Pat. No. 5,719,028)、 Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid（ＩＣＡＮ）法、 Ramification-extension Amplification Method （ＲＡＭ; U.S. Pat. Nos. 5,719,028 and 5,942,391）法を用いて、実行され得る。
【００４３】
本発明に従った好適な実施形態は、スーパーグループＢのＨＰＶ−ＤＮＡを、スーパーグループＢに属する全ての既知のＨＰＶの型のＬ１転写解読枠内の配列にともに適合する５つの重複正方向プライマーおよび４つの重複逆方向プライマーのセットでプライマー増幅することを含むＰＣＲ法を用いる。
【００４４】
ここで定義されるようなＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域が、ともに近接して位置するので、双方向増幅プライマーの好適なセットは、スーパーグループＢのＨＰＶ−ＤＮＡの短い断片（すなわち約７２塩基対）を増幅する。これは、品質に乏しいテンプレートＤＮＡ、たとえばある程度まで退化したＤＮＡからＤＮＡを増幅する可能性を提供し、試料材料としてホルマリン固定された標本の使用のみならず、本発明の方法における使用にあまり好ましくないその他の保存された材料の使用を可能にする。
【００４５】
１または複数の増幅プライマーによって、少数の不一致を有するＨＰＶの型のＤＮＡを増幅するために、増幅反応は、低下されたストリンジェンシー条件下で実行されてもよい（たとえば、３８℃のアニーリング温度、または３．５ｍＭのＭｇＣ１２の存在でのＰＣＲ増幅）。当業者は、適切なストリンジェンシー条件を選択することができるであろう。
【００４６】
スーパーグループＢのＨＰＶ特異的ＤＮＡ増幅プライマーのプライマー配列と対応する配列とが、図１に示される。
【００４７】
Ｌ１ＯＲＦにおける２つの共通領域を両側に配置する配列領域の重要な別の局面は、図４において見られるように、そのＤＮＡ配列が、スーパーグループＢに属する種々のＨＰＶのための共通モチーフを含むことである。
【００４８】
したがって、スーパーグループＢのＨＰＶに特異的なＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域間のＤＮＡ配列領域を増幅するために、全てのスーパーグループＢのＨＰＶは、包括的なスーパーグループＢの皮膚型ＨＰＶ検出プローブのセットを用いることによって検出されることができ、これは、共通モチーフを含有するこれらのＨＰＶのアンプリコンに対して本質的にハイブリダイゼーションするであろう。一斉に用いられるとき、かかる包括的検出プローブは、全てのスーパーグループＢのＨＰＶ増幅産生物を結合するであろう。発明者らは、非常に好都合なシステムが、ハイブリダイゼーションを、スーパーグループＢの皮膚型ＨＰＶプライマーによって増幅された全ての可能性のあるＨＰＶ型を検出するためのゆらぎ(wobbles)を備えた３つの重複する包括的プローブの混液に対して用いることを見出した。全てのスーパーグループＢのＨＰＶのアンプリコンの前記２つの共通領域間の領域に結合する適切な包括的検出プローブのセットの例は、図３に示される。
【００４９】
本開示から、図３の包括的検出プローブのセット以外のセットが、全てのスーパーグループＢの皮膚型ＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域を両側に配置したＤＮＡ配列の検出のために設計かつ使用され得ることは、当業者にとって明らかであろう。たとえば、若干短いプローブ、もしくは若干長いプローブ、もしくはＨＰＶ型の若干異なるクラスターを対象とするあいまいな塩基またはゆらぎを含有するプローブ配列、または図３のプローブのセット以外の他の異なるセット、たとえば、標的配列に対して１または複数の不一致を含有するプローブを用いることができる。一般的に、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％の図３のオリゴヌクレオチド配列との相同性を示す配列が、全てのスーパーグループＢのＨＰＶのアンプリコンの包括的検出に関して、本発明の方法における使用に適切と考えられる。
【００５０】
また、図３に列挙されたものの相補的配列が、本発明の方法における包括的検出プローブとして適切に用いられることができ、たとえばＰＣＲが増幅に用いられる場合など、相補的な鎖が、使用された増幅反応において増幅されるという条件で用いられ得る。
【００５１】
増幅産生物の検出は、原則として、本技術分野で既知のあらゆる適切な方法によって達成されることができる。検出断片は、放射性ラベル、抗体、発光色素、蛍光色素、または酵素試薬によって、直接染色されるか、あるいは標識付けされ得る。直接のＤＮＡ染色は、たとえばアクリジンオレンジ、エチジウムブロミド、エチジウムモノアジドまたはヘキスト(Hoechst)色素などの挿入色素を含む。
【００５２】
代替的に、ＤＮＡ断片は、合成ＤＮＡ断片に対する、標識付けされたｄＮＴＰ塩基の組み入れによって検出され得る。ヌクレオチド塩基と関連し得る検出ラベルは、たとえば、フルオレセイン、シアニン色素、またはＢｒｄＵｒｄを含む。
【００５３】
本発明は、好ましくは、１または複数の包括的な皮膚型ＨＰＶスーパーグループＢプローブにハイブリダイゼーションすることによる、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶＤＮＡにおける前述のＤＮＡ増幅反応によって得た反応産生物の検出に関係する。
【００５４】
プローブに基づく検出システムを用いる場合、本発明に用いるのに適切な検出手順は、たとえば、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）形式を含む（Jacobs et al., 1997, J. Clin. Microbiol. 35, 791-795）。ＥＩＡ手順によって検出を実行するために、増幅反応において用いられる正方向または逆方向プライマーのいずれかは、スーパーグループＢのＨＰＶ−アンプリコンの後のＥＩＡ検出のために、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートウェルにおいてスーパーグループＢＨＰＶ−ＤＮＡのＰＣＲアンプリコンを固定化するためのビオチングループのような、捕獲グループを含み得る（以下参照のこと）。当業者は、ＥＩＡ形式におけるスーパーグループＢＨＰＶ−ＤＮＡのＰＣＲアンプリコンを固定化するためのその他のグループが用いられ得ることを理解するであろう。
【００５５】
スーパーグループＢＨＰＶの分類
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域を両側に配置したＤＮＡ配列領域の別の重要な局面は、そのＤＮＡ配列がまた、図４に示され得るように、スーパーグループＢに属する各ＨＰＶ型に対してユニークであるということである。
【００５６】
したがって、本発明の別の局面において、スーパーグループＢに属する種々のＨＰＶ型が、スーパーグループＢに属するＨＰＶの１つの特定の型のアンプリコンとのみ個別に結合する、複数の型特異的な皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ検出プローブを用いることによって検出され得る。したがって、ここにおいて定義されるような２つの共通領域間のＤＮＡ配列領域を増幅し、次いでそれぞれ個別のＨＰＶ型のユニークな配列についてプロービング(probing)することによって、種々のスーパーグループＢのＨＰＶの分類方法が提供される。
【００５７】
ここにおいて開示されるようなスーパーグループＢ型ＨＰＶのＤＮＡからのＬ１ＯＲＦにおける領域の型特異的な検出に有用なプローブは、図５において例示される。これらの型特異的なプローブは、好ましくは、スーパーグループＢに属する単一のＨＰＶ型の２つの共通領域間で増幅されるようなＤＮＡ配列領域の少なくとも一部にのみ結合する。当業者は、ここにおいて示すように不必要な実験なしにスーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡからのＬ１ＯＲＦのヌクレオチド配列に基づく型特異的な検出のために類似のプローブを調製することができる。また、図５において列挙されるものの相補的な配列が、本発明の方法において型特異的な検出プローブとして適切に用いられ得、かかる相補的な鎖が、使用された増幅反応において増幅されることを条件として、用いられる。
【００５８】
本発明に従った分類方法に用いられるプローブは、特定のＨＰＶ型のアンプリコンに、選択的に結合するが、その他のＨＰＶ型のアンプリコンに結合しない（または、非常に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下では弱くのみ結合する。）。したがって、１つの実施形態において、本発明は、患者に感染するＨＰＶの型を決定するために用いられ得る。これは、悪性疾患の進行（および臨床予後診断）がＨＰＶ型に重く依存するので、非常に重要である。したがって、分類の局面において、本発明は、患者におけるＨＰＶ感染の型を決定する方法を提供する。
【００５９】
本発明に従ったスーパーグループＢのＨＰＶの分類方法において、適切なプローブは、たとえば、ＨＰＶ型のサブセットのみのアンプリコンに対してハイブリダイゼーションするものである。かかるプローブは、たとえば、図３の包括的プローブとなり得る。かかる実施形態において、たとえば、感染するＨＰＶ型を特定のサブセットに限定する（またはかかるサブセットを除外する）能力が充分となり得る。
【００６０】
本発明に従ったスーパーグループＢＨＰＶの分類方法において、分類プローブが結合するアンプリコンのサブセットは、単一のＨＰＶ型アンプリコンからなってもよく、または異なる型の複数のアンプリコンからなってもよい。型特異的なプローブの、試料から生成されたアンプリコンに対する結合または非結合（必要に応じて）は、治験者が患者に感染するＨＰＶ型の同定についてある程度専念することを可能にするであろう。所望のＨＰＶ型に結合するが、望まれていないＨＰＶ型と結合しないプローブは、当業者に知られている方法によって生成されるであろう。
【００６１】
本発明は、プローブが相当の特性をもって結合し得るアンプリコンの特定領域を提供する。相同領域が全ての生成されたアンプリコンにおいて存在し得るけれども、この特定領域の核酸配列は、異なる型のＨＰＶに関してユニークである。
【００６２】
類似の分類が、（まだ）包含されていない、または発見されていないスーパーグループＢＨＰＶに関して実行される必要があるならば、明らかに、かかるＨＰＶ型のアンプリコンの核酸配列は、ここで提供されるようないずれのプローブの配列と必ずしも相補的ではないであろう。しかしながら、本開示の利点によって、適切なハイブリダイゼーション領域が、従来の整列および配列比較コンピュータプログラムの使用によって、当業者によりその他のアンプリコンにおいて容易に同定されることができる。
【００６３】
本発明のスーパーグループＢのＨＰＶの分類方法の好適な実施形態において、２４の異なるプローブのセット（図５）、またはその相補的配列が用いられ、これは、図４に示すような２４の異なる皮膚型スーパーグループＢのＨＰＶから誘導可能なアンプリコンにおいて型特異的な配列に対してハイブリダイゼーションする。
【００６４】
本発明の分類局面において用いるのに適した検出手順は、たとえば、アンプリコンの固定化と、たとえばサザンブロッティング法によってそのＤＮＡ配列をプロービングすることとを含み得る。その他の形式は、前述したＥＩＡ形式を含み得る。結合の検出を円滑にするために、型特異的なスーパーグループＢのＨＰＶプローブは、プローブの、増幅反応の反応産生物に対する結合の監視を円滑にするために、フルオロフォア、クロモフォア、酵素、またはラジオラベルなどのラベル部分を含み得る。かかるラベルは、当業者によく知られており、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＳまたはＩを含む。その他の例は、当業者にとって明らかであろう。
【００６５】
その他の方法も用いられ得るけれども、本発明に従った分類方法は、好ましくは、たとえば、mucosotropic ＨＰＶのために近年開発されたような、いわゆるリバースラインブロット（ＲＬＢ）アッセイによって実行される(van den Brule et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40, 779-787)。この目的のために、ＲＬＢプローブは、好ましくは、たとえば、カルボキシル被覆ナイロン薄膜において、次いで固定化するために５′アミノ基と合成される。ＲＬＢ形式の利点は、システムの容易さとそのスピードであり、したがって、高い処理能力の試料処理を可能とする。
【００６６】
本発明に従ったスーパーグループＢのＨＰＶの分類方法は、前述のスーパーグループＢＨＰＶの検出のために用いられるものと類似の試料材料においても実行され得る。代替的に、本発明の方法に従ったスーパーグループＢＨＰＶの分類は、前述したスーパーグループＢＨＰＶの検出のために、前述のＤＮＡ増幅反応を用いることによって得られたアンプリコンまたはＤＮＡ増幅反応産生物において直接に実行され得る。
【００６７】
本発明の方法の２つの局面間で、異なる検出プローブの適用例が相違するので、本発明の方法は、一方の局面において、疑わしいスーパーグループＢＨＰＶ−ＤＮＡの増幅を含み得、次いで、生成された全てのスーパーグループＢＨＰＶアンプリコンに対して一斉にハイブリダイゼーションする包括的検出プローブ混液を用いることによって、あらゆるＨＰＶのアンプリコンが（すなわちスーパーグループＢＨＰＶの感染が）検出される。別の局面において、本発明の方法は、スーパグループＢＨＰＶ−ＤＮＡを増幅することと、次いで、たとえばリバースラインブロットアッセイにおいて２４のＨＰＶについて分類することとを含み得る。したがって、本発明の方法に従った検出および分類方法は、並行して実行され得る。
【００６８】
プライマーおよびプローブ
さらなる局面において、本発明は本発明の方法において使用するためのスーパーグループＢＨＰＶ−ＤＮＡの増幅のための双方向増幅プライマーのセットを提供する。これらのプライマーは、好ましくは、約８〜約３５、好ましくは約１５〜約３０、より好ましくは約２１〜約２８のヌクレオチドの配列長を有するオリゴヌクレオチドプライマーである。最も好適な実施形態において、正方向プライマーは、約２１のヌクレオチドを含む一方、逆方向プライマーは、約２８のヌクレオチドを含む。好ましくはプライマーの１つは、二重鎖のスーパーグループＢＨＰＶアンプリコンのストランドの１つの固定化を円滑にするために基で標識付けされ、さらに好適な実施形態において、逆方向プライマーはビオチンで標識付けされる。
【００６９】
本発明の双方向プライマーのヌクレオチド配列は、プライマーと、前述したようなスーパーグループＢＨＰＶゲノムのＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域のうち１つの位置における標的ＤＮＡとの間で安定的なハイブリッドの形成を可能とするように設計されなければならない。さらに、正方向プライマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、図２において正方向プライマー領域として定義された領域における１または複数のスーパーグループＢＨＰＶのゲノムにおけるＬ１ＯＲＦのアンチセンス鎖と実質的に相補的である。その一方、逆方向プライマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、図２において逆方向プライマー領域として定義された領域における１または複数のスーパーグループＢＨＰＶのゲノムにおけるＬ１ＯＲＦのセンス鎖と実質的に相補的である。この基準に合致するプライマーは、たとえば、図１において示されるものである。一斉に用いるとき、図１のプライマーは、全てのスーパーグループＢＨＰＶのゲノムにおいて対応する領域のＤＮＡを増幅させるであろう。
【００７０】
ここにおけるプライマーは、増幅されるべき各特異的な配列の異なる鎖に存在する共通領域と「実質的に」相補的（すなわち少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％完全に相補的）となるように選択される。若干短い、もしくは若干長いプライマー、もしくは、たとえばイノシトール残基もしくはあいまいな塩基を含有するプライマー配列、または図１のプライマーの配列と比較して１もしくは複数の不一致を含有するプライマーを使用することは可能である。一般的に、図１のオリゴヌクレオチド配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を示す配列は、本発明の方法において用いるのに適していると考えられる。配列不一致はまた、低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いる場合は重要ではない。本発明において、プライマーは、好ましくは、スーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける２つの共通領域の少なくとも１つの配列と実質的に相補的である。
【００７１】
別の局面において、本発明は、スーパーグループＢのＨＰＶ−ＤＮＡの包括的検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。ここにおける検出プローブは、本発明の増幅反応によって生成された二重鎖ＤＮＡアンプリコンの鎖の１つと「実質的に」相補的となるように選択される。好ましくは、プローブは、スーパーグループＢのＨＰＶのＬ１ＯＲＦから生成されたアンプリコンの、固定化可能な、たとえばビオチン標識化された、アンチセンス鎖と実質的に相補的である。
【００７２】
アンプリコンは、種々のスーパーグループＢＨＰＶ間での共通モチーフおよびユニークな配列によって特徴付けられる領域を含む。これらのアンプリコンの検出のための包括的プローブは、１または複数のスーパーグループＢのＨＰＶ型から生成されたアンプリコンのいずれかの鎖とハイブリダイゼーションするために充分に相補的である。包括的検出プローブ配列は、アンプリコンのいずれかの鎖の正確な配列を反映する必要はなく、また、包括的検出プローブ配列が全てのスーパーグループＢのＨＰＶの正確な配列を反映する必要もない。本発明は、図３において、少なくとも、種々のスーパーグループＢのＨＰＶから生成された全ての可能性のあるアンプリコンのサブセットとの結合を円滑にするために、あいまいな塩基（ゆらぎ）を有するプローブのセットを提供する。これは、全てのスーパーグループＢのＨＰＶの検出に必要とされる包括的プローブの数を最小限にする。
【００７３】
本発明の包括的検出プローブが、これらの標的配列と１または複数の不一致を含有することは許容される。一般的に、図３のヌクレオチド配列と、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を示す配列が、全てのスーパーグループＢＨＰＶのアンプリコンの包括的検出のために、本発明の方法において用いるのに適していると考えられる。したがって、図１および図３のプライマーまたはプローブに関して、図１および図３のそれらの配列と、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を示す配列が含まれることが意図される。
【００７４】
また、図３に列挙されたそれらの相補的配列が、本発明の方法における包括的検出プローブとして用いられることができ、相補的な鎖が、使用された増幅反応において増幅されるという条件で用いられ得る。
【００７５】
いくらかのスーパグループＢＨＰＶ型と結合するが、その他のスーパグループＢＨＰＶ型とは結合しないプローブは、当業者に知られている方法によって生成され得る。
【００７６】
検出を円滑にするために、包括的なスーパーグループＢＨＰＶプローブは、プローブの、増幅反応の反応産生物に対する結合の監視を円滑にするために、フルオロフォア、クロモフォア、酵素、またはラジオラベルなどのラベル部分を含み得る。かかるラベルは、当業者によってよく知られており、たとえば、フルオレセイン、シアニン色素、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、ＳまたはＩを含む。その他の例は、当業者にとって明らかであろう。本発明の方法において用いられる包括的なスーパーグループＢのＨＰＶプローブに好適なラベルは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルである。
【００７７】
これらの包括的検出プローブは好ましくは、約８〜約７０、好ましくは約１５〜約４０、より好ましくは約２５〜約３５のヌクレオチドの配列長を有するオリゴヌクレオチドプローブである。最も好適な実施形態において、包括的な検出プローブは、約３０ヌクレオチドを含む。
【００７８】
さらに別の局面において、本発明は、ＨＰＶのスーパーグループＢに属する型の個別のＨＰＶ型またはサブセットの型特異的または選択的検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。好適な実施形態において、１つのプローブが、各ＨＰＶ型に与えられ、したがって、かかるプローブは、型特異的である。本発明は、図５において述べられる特異的なスーパーグループＢＨＰＶの型特異的検出に適した２４の型特異的なプローブ配列のセットを開示する。いくつかの不一致が許容されるけれども、分類するプローブが、それぞれの標的配列と完全に相補的であることが好ましい。前述のように、図５において存在するそれらの相補的配列がまた、増幅反応が相補的なＤＮＡ断片の増幅を可能とするという条件で、本発明の方法において型特異的なプローブとして用いられ得る。したがって、図３および図５のプローブに関して、その相補的な配列が含まれることが意図される。
【００７９】
型特異的または選択的検出プローブが、種々の分類手順において用いられ得る。適切な手順は、プローブ標的が固定化されるものを含み、また、プローブが固定化される手順も用いられ得る。後者の例として、バイオチップ型形式と、ＲＬＢまたはラインプローブアッセイのようなリバースラインブロット形式とが用いられ得る。固定化のための担体および選択される表面の化学的性質によって、当業者は、オリゴヌクレオチドプローブが担体固定化のために標識付けされる適切な基を選択することができる。好適な実施形態において、この基は、プローブの５′末端で導入されるアミノ基である。
【００８０】
型特異的な検出プローブは好ましくは、約８〜約３０、好ましくは約１５〜約２５、より好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチドの配列長を有するオリゴヌクレオチドプローブである。包括的検出プローブの設計と同様に、当業者は、１つのハイブリダイゼーション反応において用いられるプローブのセット内の個別のプローブのアニーリング温度が、プローブのＧ＋Ｃ含量と長さとのバランスを与えることによって適切に調節され得ることを承知している。
【００８１】
ある実施形態において、本発明はまた、本発明の方法を実行するためのプライマーおよびプローブを含むキットを提供する。かかるキットの好適な実施形態は、図１、３および５にそれぞれ開示されるような、増幅プライマー、包括的検出プローブ、および型特異的なプローブをいずれも含む。
【００８２】
以下の限定的でない実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示すものである。
実施例１
スーパーグループＢのＨＰＶの増幅、ＥＩＡ検出およびＲＬＢ分類。
方法論
ＨＰＶテストパネル。
【００８３】
ＲＬＢ分類方法の感度および特異性の評価のために、次のＨＰＶ型のプラスミドクローンをテストパネルとして用いた（ＨＰＶ４、５、８、９、１４、１７、１９、２１、２２、２３、２５、３６、３８、４９、および５０）。
【００８４】
臨床標本。
臨床標本におけるＨＰＶ検出および分類の評価のために、肌試料の、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織を用いた。一連の５μｍの区域を、いわゆるサンドイッチ法（Walboomers et al., 1999, J. Pathol. 189:12-19）を用いて切断した。簡単には、外側の区域は、組織学分析のために染色されたヘマトキシリンエオジンであり、その一方で、内側の区域（全体で組織の約１ｃｍ）は、チューブ内に置かれ、ＰＣＲ目的に用いられる。２５０μＬの溶解混合液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．４５％Ｔｗｅｅｎ２０および５００μｇプトテイナーゼＫ（ロッシェ(Roche)社、マンハイム、ドイツ））を加え、インキュベーションを、３７℃で夜通し実行した。試料を煮沸し、標準的なテーブルトップ遠心分離機において１分遠心分離した。冷却後、１０μＬをＰＣＲに用いた。
【００８５】
皮膚型ＨＰＶスーパーグループＢ−ＰＣＲ。
単離されたＨＰＶプラスミドＤＮＡまたは前処理された試料に、５正方向プライマー（すなわち5r-bio、6r-bio、7r-bioおよび8r-bio。図１。）および３ビオチン化逆方向プライマーの混合物を用いてＰＣＲを受けさせた。５０μＬのＰＣＲ反応混合物は、１．５ｍＭのＭｇＣ１２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１２．５ｐｍｏｌの各プライマー、１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｇＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)社、フォスターシティ、ＣＡ）、および種々の濃度のＨＰＶプラスミドＤＮＡまたは１０μＬの粗製の試料抽出物を、ＴａｇＧｏｌｄ緩衝液（パーキン−エルマー社、フォスターシティ、ＣＡ）中で含有する。各ＰＣＲ反応を、１０分間９４℃で予熱ステップによって開始し、次いで変性ステップ（２０秒、９４℃）、プライマーアニーリングステップ（３０秒、３８℃）、伸長ステップ（８０秒、７１℃）を４０サイクル行った。ランピング時間(ramping time)は、前述したとおりであった（van den Brule et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40: 779-787）。最後の伸長ステップを、４分間まで延長した。
【００８６】
ＰＣＲ産生物の酵素免疫検定法。
ＥＩＡを、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ロッシェ社、マンハイム、ドイツ）と、５５℃のハイブリダイゼーション温度を用いるのを除いて、前述したような夜通しのインキュベーション(Jacobs et al., 1997, J. Clin. Microbiol. 35:791-795)の後の読み取りとを用いて実行した。３ＤＩＧ標識化包括的オリゴプローブ（すなわち、ＳｋｉｎＰＲ１−ＤＩＧ、ＳｋｉｎＰＲ２−ＤＩＧ、およびＳｌｉｎＰＲ３−ＤＩＧ。図３。）の混合物を、ハイブリダイゼーションに用いた。
【００８７】
ＰＣＲ産生物のＨＰＶリバースラインブロッティング（ＲＬＢ）。
ＲＬＢ分析を、mucosotropicＨＰＶ型について以前開発されたシステム（van den Brule et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40: 779-787）を用いて実行した。このシステムは、カルボキシル被覆ナイロン薄膜において５′アミノ基を含有する４２以下の異なるオリゴプローブを、平行にスポッティングするためのミニブロッタ(miniblotter)の使用に基づく。続いて、４２以下のＰＣＲ産生物は、ミニブロッタの平行溝に、これらの溝が以前堆積したオリゴプローブの列に垂直となるようにして、ピペットされ得る。この形式において、ハイブリダイゼーションを実行し、次いで、アンチビオチン複合体を有する薄膜のインキュベーションと、Enhanced Chemiluminescense（ＥＣＬ）検出法とを実行する。
【００８８】
ＲＬＢについて選択されたＨＰＶ特異的な５′アミノ結合オリゴヌクレオチド（Isogen社、マールセン、オランダ）を、図５に示す。選択を、プライマー／プローブ選択ソフトウェア（Ｏｌｉｇｏ）を用いて、Ｔｍが（約）５５℃であり、かつ長さが約２０ｂｐとなるようにして実行した。オリゴプローブを、負に帯電した薄膜（Biodyne C、ポールバイオサーポート(Pall BioSupport)社、イーストヒルズ、ＮＹ）と共有結合した。簡単には、薄膜を、１６％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＥＤＡＣ(１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、シグマ(Sigma)社、セントルイス、ＭＯ)を用いることによって活性化させ、ミニブロッタシステム（ＭＮ４５、イミューンティクス(Immunetics)社、ケンブリッジ、ＭＡ）に置いた。オリゴヌクレオチドを、平行な線において塗布し、１分間のインキュベーションの後、溝を吸引し、薄膜を、１００ｍＭのＮａＯＨを用いて不活性にし、次いで、０．１％ＳＤＳ（ＢＤＨ社、ドーセット、イングランド）を補足した２ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭｎｏＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）。ライフテクノロジーズ(Life Technologies)社、ロックビル、ＭＤ）中で洗浄した。
【００８９】
ハイブリダイゼーションのために、１０μＬのビオチン化ＰＣＲ産生物を、１５０μＬの２xＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ中で希釈し、熱変性させ（９６℃）、氷上で急冷した。
ＰＣＲ産生物を、オリゴプローブの列に対して垂直な平行溝に対してピペットした。ハイブリダイゼーションを、１時間４２℃で実行し、次いで５１℃で２xＳＳＰＥ／０．５％
ＳＤＳ中で２回洗浄した。続いて、薄膜を、４５〜６０分間４２℃ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体（２xＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ中で１：４０００倍希釈。ロッシ
ェ社、マンハイム、ドイツ）とともにインキュベーションし、４２℃で１０分間２xＳＳ
ＰＥ／０．５％ＳＤＳ中で２度洗浄し、室温で５分間２xＳＳＰＥ中で２度すすいだ。化
学発光ＥＣＬ検出液（アメルシャム(Amersham)社、バッキンガムシャー、イングランド）を用いて、検出を行い、次いで、１〜１０分間フィルムに曝した。フィルムを、続いて生成した。繰返し使用のために、薄膜を、３０分間８０℃で１％ＳＤＳ中で２回洗浄することによってストリップし、次いで１５分間室温で２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）中でインキュベーションした。薄膜を、樹脂中で密閉し、その後の使用まで４℃で保存した。
【００９０】
結果
スーパーグループＢのＨＰＶの増幅と、その後の１ｎｇのクローンＨＰＶ４型、５型、８型、９型、１４型、１７型、１９型、２１型、２２型、２３型、２５型、３６型、３８型、４９型および５０型由来のＰＣＲ産生物のＥＩＡ検出とは、全てのケースにおいて明らかなＥＩＡ信号を示した一方、ヒトＤＮＡとの交差反応性は観察されなかった。これは、高い特異性を示す。ヒト胎盤ＤＮＡと混合されたクローンＨＰＶ５、８、２１および５０の希釈ラインを用いて、皮膚型ＨＰＶスーパーグループＢ−ＰＣＲのＥＩＡはまた、感度の点で非常に好ましく機能した（１０ｆｇ（ＨＰＶ５および２１）〜１００ｆｇ（ＨＰＶ８および５０）の範囲の分析感度）。また、ＲＬＢ分類は、交差反応なしに特異的な信号を示し、感度は、ＤＩＡのそれよりも高くないとしても同等であった。
【００９１】
実施例２
ホルマリン固定された臨床標本の分析。
皮膚型スーパーグループＢのＨＰＶＤＮＡの増幅を、好ましいＤＮＡ品質を示した８７の皮膚型標本（すなわちベータ−グロビンＰＣＲにおける陽性試料）からの、ホルマリン固定され、かつパラフィン包埋された組織試料から単離したＤＮＡを用いる以外は、実施例１において記載した材料および方法を用いて試験した。これらの試料は、腎移植患者の５９の試料を含み、これらは、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の２１のケース、基底細胞癌（ＢＣＣ）の２３のケース、および光線性角化症（ＡＫ）の１５のケースを含んだ。別の２９の試料を、免疫適格患者から得、これらは、ＳＣＣの１３のケース、ＢＣＣの１２のケース、およびＡＫの４のケースを含んだ。
【００９２】
包括的なスーパーグループＢプローブによるＥＩＡ検出は、６２％のケース（腎移植患者からの標本のうち７６％および免疫適格患者の標本のうち３４％）において陽性を示した。これらは、腎移植患者から得た試料における、ＳＣＣの２１ケースのうち１５（７１％）、ＢＣＣの２３ケースのうち１５（６５％）、およびＡＫの１５ケースのうち１４（９３％）と、免疫適格患者から得た試料における、ＳＣＣの１３ケースのうち４（３１％）、ＢＣＣの１２ケースのうち２（１７％）、およびＡＫの４ケースのうち４（１００％）とが含んだ。
【００９３】
腎移植患者および免疫適格患者のＳＣＣ試料のＲＬＢによる分類は、試料毎に１〜７の異なる型のＨＰＶを示した。全部で、次の１９のＨＰＶ型を、１または複数の試料において検出した。ＨＰＶ４型、５型、８型、９型、１４型、１５型、１７型、１９型、２０型、２１型、２３型、２４型、２５型、３６型、３７型、３８型、４７型、４９型および５０型。これらのデータは、その他のＰＣＲシステムを用いる文献中で発表された冷凍標本から得たデータと一致する（Shamani et al., 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88: 802-811; Berkhout et al., J. Clin. Microbiol. 33: 690-695; Forslund et al., J. Gen. Virol. 80: 2437-2443; Harwood et al., J. Med. Virol. 61: 289-297; Meijer et al., Cancer Detect. Prev. 25: 533-547）。
【００９４】
実施例３
ホルマリン固定された臨床標本の分析。
腎移植患者の追加的な４２の非黒色腫皮膚腫瘍を、全てのＰＶＲ産生物をＥＩＡおよびＲＬＢの両方で分析した以外は、実施例２に記載されたように、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶＤＮＡの増幅について分析した。包括的なスーパーグループＢプローブによるＥＩＡ検出は、これらのケースのうち６７％（４２のうち２８）において陽性を示す一方、ＲＬＢは、これらのケースのうち８８％（４２のうち３７）において、試験された２４のＨＰＶ型の少なくとも１つについて陽性を示した。検出されたＨＰＶ型は、次の１８の型を含んだ。ＨＰＶ４型、５型、８型、９型、１２型、１４型、１５型、１９型、２０型、２１型、２３型、２４型、２５型、３６型、３７型、３８型、４８型よび４９型。次のＨＰＶ型は、最も優勢であった。ＨＰＶ２０型、４型、５型、２５型、１５型、２３型および１４型。また、この一連において、多くの複数ＨＰＶ感染が発見された。これらのデータは、ＲＬＢがＥＩＡよりも感度が高いことを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】スーパーグループＢに属する皮膚型ＨＰＶからのＤＮＡの増幅に適した双方向プライマーの対を示す。
【図２】スーパーグループＢに属する皮膚型ＨＰＶのＤＮＡにおけるスーパーグループＢＨＰＶ特異的プライマー結合領域の配列を示す（５′−３′）。明確のために、提示される配列の整列を円滑にするために、これらの領域の相補的な鎖は図示されないが、含まれるものと理解される。
【図３】皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ由来の増幅産生物の検出に適した包括的検出プローブを示す（５′ＤＩＧ−３′）。本文中に示されるように、これらのプローブは、図示されるそれらの相補的な鎖から構成されてもよい。
【図４】皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおけるプローブ結合領域の配列を示す（５′−３′）。明確のために、また、提示される配列の整列を円滑にするために、これらの領域の相補的な鎖は図示されないが、含まれるものと理解される。
【図５】皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ由来の増幅産生物のリバースラインブロット（ＲＬＢ，reverse line blot）分類に適した型特異的検出プローブを示す（５′アミノ―３′）。本文中に示されるように、これらのプローブは、図示されるそれらの相補的な鎖から構成されてもよい。
【図６】ＨＰＶ４型の二重鎖ＤＮＡ配列を示す（ＥＭＢＬ受託番号ｘ７０８２７に従って番号を付す。）。図２および図４にそれぞれ示されるような双方向プライマー（下線部）およびプローブ結合領域（斜線部）の位置が示される。
【図１】
2006500064.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2006500064000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月27日(2005.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの検出方法であって、
（ａ）皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの潜伏が疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）互いの間隔が狭い、スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける分離した領域を対象とする１対の双方向プライマーを提供するステップと、
（ｃ）前記１対のプライマーを用いて、前記試料由来のＤＮＡを増幅するための反応を実行するステップと、
（ｄ）前記試料から、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶからのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの検出方法であって、
（ａ）皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの潜伏が疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡと集合的に実質的に相補的な複数対の双方向プライマーを提供するステップと、
（ｃ）前記複数のプライマーを用いて、前記試料由来のＤＮＡを増幅するための反応を実行するステップと、
（ｄ）前記試料から、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶからのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｄ）は、複数の包括的な皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対して前記ＤＮＡ増幅反応の反応産生物をハイブリダイゼーションすることによって実行されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記対の双方向プライマーは、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第１共通領域と集合的に実質的に相補的であるプライマーを含み、さらに、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第２共通領域に集合的に実質的に相補的であるプライマーを含むことを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２共通領域は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにあることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２共通領域は、実質的に図２に定義されるようなものであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記対のプライマーは、図１のプライマーを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
各対のプライマーのうちの１つが、ビオチンラベルを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡを増幅するための前記反応は、低下されたストリンジェンシー条件下で実行されることを特徴とする請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のスーパーグループＢＨＰＶプローブは、全てのスーパーグループＢＨＰＶからの前記ＤＮＡ増幅産生物の核酸配列と実質的に相補的であることを特徴とする請求項３〜９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スーパーグループＢＨＰＶプローブは、図３のプローブを含むことを特徴とする請求項３〜１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブは、ＤＩＧラベルを含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの分類方法であって、
（ａ）互いの間隔が狭い、スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける分離した領域を対象とする１対の双方向プライマーを用いて、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡを増幅することによって、ＤＮＡ増幅産生物を提供するステップと、
（ｂ）前記増幅産生物を、少なくとも１つであるが、全てではない皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型のＤＮＡと実質的に相補的な少なくとも１つの皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対して、ハイブリダイゼーションすることによって、１または複数のスーパーグループＢＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの分類方法であって、
（ａ）複数対の双方向プライマーを用いて、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡを増幅することによって、ＤＮＡ増幅産生物を提供するステップと、
（ｂ）前記増幅産生物を、少なくとも１つであるが、全てでない皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型のＤＮＡと実質的に相補的な少なくとも１つの皮膚型スーパーグループＢＨＰＶプローブに対して、ハイブリダイゼーションすることによって、１または複数のスーパーグループＢＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産生物を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記対の双方向プライマーは、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第１共通領域に（集合的に）実質的に相補的であるプライマーを含み、さらに、全ての皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＤＮＡにおける第２共通領域に（集合的に）実質的に相補的であるプライマーを含むことを特徴とする請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
前記第１および第２共通領域は、皮膚型スーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにあることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記第１および第２共通領域は、実質的に図２に定義されるようなものであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記複数対の双方向プライマーは、図１のプライマーを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
各対のプライマーのうち１つは、ビオチンラベルを含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのプローブは、スーパーグループＢＨＰＶの正確に１つの型のＤＮＡと実質的に相補的であることを特徴とする請求項１３〜１９のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのプローブは、図５のプローブから選択されることを特徴とする請求項１３〜２０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
検出は、リバースラインブロットの使用を含むことを特徴とする請求項１３〜２１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のうちいずれか１項に記載の方法に用いられる双方向プライマーであって、全てのスーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける第１および第２共通領域に（集合的に）実質的に相補的であることを特徴とするプライマー。
【請求項２４】
図１の双方向プライマー。
【請求項２５】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶの検出のための包括的検出プローブであって、ＨＰＶ４型の６５３９ヌクレオチド位と６６１０ヌクレオチド位との間の全てのスーパーグループＢＨＰＶのＬ１ＯＲＦにおける領域、およびその他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の対応する領域と、集合的に実質的に相補的であることを特徴とするプローブ。
【請求項２６】
図３の包括的検出プローブ。
【請求項２７】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の検出のための検出プローブであって、ＨＰＶ４型の６５３９ヌクレオチド位と６６１０ヌクレオチド位との間の少なくとも１つであるが、全てではないスーパーグループＢＨＰＶ型のＬ１ＯＲＦにおける領域、およびその他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の対応する領域と、実質的に相補的であることを特徴とするプローブ。
【請求項２８】
皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の検出のための型特異的検出プローブであって、ＨＰＶ４型の６５３９ヌクレオチド位と６６１０ヌクレオチド位との間の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の正確に１つの型のＬ１ＯＲＦにおける領域、およびその他の皮膚型スーパーグループＢＨＰＶ型の対応する領域と、実質的に相補的であることを特徴とするプローブ。
【請求項２９】
図５の型特異的検出プローブ。
【国際調査報告】
2006500064.tif 000008
2006500064.tif 000009
2006500064.tif 000010
2006500064.tif 000011