(57)【要約】ペスト菌感染の治療用医薬の製造における（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせの使用。このような治療薬はペスト菌感染に有効な治療薬であることが判明した。更に、組み合わせを予防薬として使用すると相乗効果を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスト菌感染の治療用医薬の製造における（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせの使用。
【請求項２】
（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせを使用する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組み合わせがペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体と、ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体を含む請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
医薬が感染後約４８時間までの投与用である請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントがＶ抗原の配列のアミノ酸１３５〜２７５に存在するＶ抗原のエピトープと特異的に結合する請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
抗体又はその結合フラグメントがヒト化型である請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
治療有効量の（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせをヒト又は動物に投与することを含む、ペスト菌感染作用を受けているヒト又は動物の治療方法。
【請求項９】
（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせを投与することを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントと、ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項１１】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントと、ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントを含む請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントがＶ抗原の配列のアミノ酸１３５〜２７５に存在するＶ抗原のエピトープと特異的に結合する請求項１０から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抗体又はその結合フラグメントがヒト化型又は完全ヒト型である請求項１０から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１０から１４のいずれか一項に記載の組成物を含むペスト菌感染に対するヒト又は動物の防御用予防ワクチン。
【請求項１６】
請求項１５に記載のワクチンを投与するペスト菌感染に対する免疫方法。
【請求項１７】
ペスト菌感染に対するヒト又は動物の受動免疫用医薬の製造におけるペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメントと、ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメントの組み合わせの使用。
【請求項１８】
本願添付図面を参照して明細書に実質的に記載する使用、方法又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト又は動物に予防薬又は治療薬として投与する抗体に関する。
【０００２】
特に、本発明は予防薬又は治療薬として投与した場合に相乗作用する抗体に関する。
【０００３】
本発明は更にペスト菌に対する新規ワクチンと防御及び治療に関する。このようなワクチンは腺ペストと肺ペストに対する防御を提供することができる。
【背景技術】
【０００４】
ペストの原因物質であるペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）は有史以来、何百万人もの死者を出している。二度目の大流行（黒死病）は１４〜ｌ７世紀にヨーロッパで推定１７００万〜２８００万人の死者を出したと考えられている。三度目の大流行は１８５０年代に中国雲南省で発生したと考えられ、世界中にペスト蔓延をもたらし、現在ではアフリカ、インド及び米国南西部の州等の数領域の風土病となっている（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．ら．１９９７．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：３５−６６）。現在のペスト発生率は低いが、細菌が自然動物に棲息しているので、比較的小規模ではあるが、定期的なペスト発生が見られる（Ｄｕｐｌａｎｔｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら．２００１．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｄｅ  Ｌａ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ｄｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  Ｅｘｏｔｉｑｕｅ  ９４：１１９−１２２；Ｍｉｇｌｉａｎｉ，Ｒ．ら．２００１．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｄｅ  Ｌａ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ｄｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  Ｅｘｏｔｉｑｕｅ  ９４：１１５−１１８；Ｒａｔｓｉｔｏｒａｈｉｎａ，Ｍ．ら．２０００．Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：１１１−１１３）。
【０００５】
インドでの最近の発生で注目されたように、風土病地域と大人口中心地の間の交通の整備により大規模ペスト発生につながる可能性がある（Ｓｈｉｖａｊｉ，Ｓ．ら．２０００．Ｆｅｍｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８９：２４７−２５２）。従って、新しい地域へのペスト伝染とその後の発病の危険を減らすために有効な疾病監視が必要である。
【０００６】
細菌と接触する研究者や他の専門家にはワクチン接種が推奨されているが、風土病地域又はその労働を介してペスト菌に接触する個体には速効性治療も必要である。更に、大規模発生後には医療従事者や第一対応者を防御することも必要になる。
【０００７】
現在、ペスト防御はワクチン接種又は抗生物質投与により実施することができる。ペスト患者を治療するためと、疾病蔓延を防除するための予防の両者にストレプトマイシンやテトラサイクリン等の抗生物質が使用されている（Ｐｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．ら．１９９７．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：３５−６６）。ペスト菌で抗生物質耐性が発生する率は低いが、マダガスカル島で最近単離されたペスト菌株は導入プラスミドにより付与された多剤耐性をもつことが判明した（Ｇｕｉｙｏｕｌｅ，Ａ．Ｇ．ら．２００１．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ７：４３−４８；Ｇｕｉｙｏｕｌｅ，Ａ．ら．１９９７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：２８２６−２８３３）。既存ペストワクチンとしては死滅全細胞調製物が挙げられ、新規ワクチンを開発する研究が進められている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．２００１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９１：６０６−６０８）。
【０００８】
全細胞ワクチンには、防御レベルが比較的低く、副作用があり、免疫までに時間がかかり、定期的ブースター免疫を要するなどの問題がある（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ  ら．１９９５．Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１５５１−１５５６）。全細胞ワクチンは感染昆虫に刺された後に発生する最も一般的な形態のペスト（腺ペスト）に対して有効であると考えられるが、肺ペストに対するその効力は疑問視されている。
【０００９】
ペスト菌に由来する組換えＦ１抗原（Ｆ１）及び低カルシウム応答Ｖ抗原（ＬｃｒＶ）蛋白質をベースとする次世代ペストサブユニットワクチンが開発中である。いずれかの蛋白質で免疫すると、感染動物モデルで肺又は腺疾患に対する防御が得られる（Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｇ．ら．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１１３１−１１３７；Ｌｅａｒｙ，Ｓ．Ｅ．Ｃ．ら．１９９５．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３：２８５４−２８５８；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．２００１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９１：６０６−６０８）が、Ｆ１とＬｃｒＶを併用すると、相加効果以上の防御が達成され、１０９までの半数致死量（ＭＬＤ）のペスト菌に対する防御が報告されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ら．１９９５．Ｆｅｍｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：２２３−２３０）。このようなワクチンは接触前に投与しなければならず、複数回投与する必要がある。免疫までの時間とワクチン投与回数を減らすために数種のストラテジーが有望であることが分かっている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ら．２０００．Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｓｕｂ−ｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｃ  ｐｌａｇｕｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：５６６−５７１）が、ワクチン接種で接触後の疾病防御は得られそうにない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、特にペスト菌の薬剤耐性株が関与している場合に、迅速な治療を提供する速効性ペスト治療薬が必要である。
【００１１】
従来、Ｆ１に対するマウスモノクローナル抗体であるＦ１−０４−Ａ−Ｇ１は腺ペスト及び肺ペストのモデルでマウスを防御することが分かっている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．ら．１９９７．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ５６：４７１−４７３）。更に、ＬｃｒＶ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ７．３）が腺ペストモデルでマウスを防御することも予備試験で判明した（Ｈｉｌｌ，Ｊ．ら．１９９７．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：４４７６−４４８２）。
【００１２】
他の病原体に起因する各種疾病を治療するために抗血清が使用されている（Ｋｅｌｌｅｒ  Ｍ．Ａ．ら．２０００．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０００  １３：６０２−１４）が、抗血清もモノクローナル抗体もペスト治療薬としてはまだ提案されていない。しかし、本発明者らは抗体治療がペスト感染の治療に有効であり、抗体を組み合わせると、感染防御に相乗的に作用できることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によると、ペスト菌感染の治療用医薬の製造における（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせの使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書で使用する「結合フラグメント」なる用語はターゲット抗原と結合するＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）フラグメント等の抗体フラグメント、又は１本鎖抗体を意味する。
【００１５】
特に、医薬は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせを使用する。組み合わせはペスト菌Ｆ１抗原に特異的な少なくとも１種の抗体と、ペスト菌Ｖ抗原に特異的な少なくとも１種の抗体が好ましい。
【００１６】
所望により、Ｆ１抗原及び／又はＶ抗原内の異なるエピトープに特異的な２種以上の抗体を使用することもできる。
【００１７】
使用する抗体はモノクローナル抗体又はその結合フラグメントであるが、特にモノクローナル抗体が適切である。
【００１８】
特に、ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントは例えばＷＯ９６／２８５５１に示されているようなＶ抗原の配列のアミノ酸１〜２７５に存在するＶ抗原のエピトープ、好ましくはアミノ酸１３５〜２７５に存在するエピトープと特異的に結合する。ＬｃｒＶ特異的ポリクローナル抗血清が受動的に導入されると、マウスはペストに対して防御され、この防御エピトープは領域１６８〜２７５にマッピングされた（Ｍｏｔｉｎ，Ｖ．Ｌ．ら．１９９４．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６２：４１９２−４２０１）。同様に、本発明で使用するＭａｂ７．３はＬｃｒＶのａａ１３５〜２７５の立体配座エピトープと結合するとしてマッピングされた（Ｈｉｌｌ，Ｊ．ら．１９９７．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：４４７６−４４８２）。従って、ＬｃｒＶのこの中心領域は本発明で有用な抗体の良好なターゲットであると思われる。
【００１９】
医薬は感染後約４８時間までに投与するものが適切であるが、用量を十分に増加させるならば更に長時間でもよい。
【００２０】
抗体又は結合フラグメントの臨床許容性を増すためには多数のストラテジーを使用することができる（Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ａ．１９９９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：５−１５）。例えば、動物抗体の特異性をヒト抗体フレームワークに導入したり（この方法を「ヒト化」と言う）（Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．ら．１９９１．Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：１４１１−１４１２；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら．１９９３．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １４：１３９−１４３）、治療性を改善するように動物抗体を化学処理することができる（Ｍａｙｅｒｓ，Ｃ．Ｎ．ら．２００１．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：２９−３７）。あるいは、ナイーブヒト１本鎖抗体ライブラリー（ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｈ．Ｊ．ら．１９９９．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７４：１８２１８−１８２３０；Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．ら．２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２９６：５７−８６；Ｎｉｓｓｉｍ，Ａ．ら．１９９４．Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：６９２−６９８）や、ヒト抗体レパートリーを発現する免疫トランスジェニック動物（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．ら．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２５−２６）から抗体を作製することもできる。
【００２１】
特に好ましい態様では、使用する抗体又はその結合フラグメントは上記ヒト化による「ヒト化型」であるか、又は同じく上記のようにヒトライブラリーもしくはトランスジェニック動物から作製された結果として完全ヒト抗体である。
【００２２】
本発明者らはペスト菌表面蛋白質に特異的なモノクローナル抗体をペスト治療用治療薬として使用できることを立証した。Ｍａｂ７．３とＦ１−０４−Ａ−Ｇ１は単独投与よりも併用するほうが治療薬として有効であり、皮下注射（ｓ．ｃ．）によるペスト菌攻撃後２日までに投与すると、有意防御が得られた。
【００２３】
別の側面では、本発明は治療有効量の（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせ、特に上記のような（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせをヒト又は動物に投与する、ペスト菌感染作用を受けているヒト又は動物の治療方法を提供する。
【００２４】
治療薬は感染性ペスト菌と接触してから４８時間以内に投与すると適切であり、２４時間以内が好ましい。
【００２５】
抗体は医薬組成物として投与すると適切であり、医薬的に許容可能なキャリヤーを加えると適切である。適切なキャリヤーとしては当分野で公知の固体又は液体キャリヤー（例えば食塩水）が挙げられる。
【００２６】
本発明の組成物は経口投与（例えば錠剤、トローチ剤、ハードもしくはソフトカプセル剤、水性もしくは油性懸濁液、エマルション、分散性散剤もしくは顆粒剤、シロップ剤又はエリキシル剤）、吸入投与（例えば微粉又は液体エアロゾル）、吹送投与（例えば微粉）又は非経口投与（例えば静脈、皮下、筋肉内投与又は直腸投与用座剤）に適した形態とすることができる。
【００２７】
本発明の組成物は当分野で周知の慣用医薬賦形剤を使用して慣用方法により得ることができる。
【００２８】
例えば、医薬組成物は適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤の１種以上を使用して公知方法に従って製剤化することができる滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形態とすることができる。
【００２９】
吸入投与用組成物は微粉状固体又は液滴を含むエアロゾルとして活性抗体組成物を分配するように構成された慣用加圧型エアロゾルの形態とすることができる。揮発性フッ素化炭化水素又は炭化水素等の慣用エアロゾル噴射剤を使用することができ、エアロゾル装置は活性成分を一定量ずつ分配するように都合よく構成される。
【００３０】
製剤化に関する詳細な情報については、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ  Ｈａｎｓｃｈ；Ｃｈａｉｒｍａｎ  ｏｆ  Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  Ｂｏａｒｄ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）第５巻第２５．２章を参照されたい。
【００３１】
単一用量形態を製造するために１種以上の賦形剤と併用する活性成分の量は必然的に治療する宿主と特定投与経路によって異なる。単位用量形態は一般に活性成分約１ｍｇ〜約２ｇを含有する。
【００３２】
本発明の組成物の治療又は予防目的の用量サイズは周知の医薬原則に従い、症状の種類と重篤度、動物又は患者の年齢と性別及び投与経路により異なる。しかし、一般に、治療又は予防目的では、一般に例えば０．５ｍｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ体重範囲の周期的な投与量となるように投与する。
【００３３】
従って、更に別の側面では、本発明はペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントと、ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
特に、組成物はペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントと、ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントを含む。これらは抗体であることが好ましく、モノクローナル抗体が最も好ましく、ヒト化型でも完全ヒト型でもよい。組成物に加えるのに好ましい抗体は上述した通りである。
【００３５】
本発明者らは更に抗体組み合わせを前治療薬として投与した場合に１０５ＭＬＤ  皮下注射攻撃に対してマウスを防御できることも発見した。本明細書に記載するデータはＬｃｒＶとＦ１をペストサブユニットワクチンに加えると相加防御を上回る効果が得られるという知見を明示している（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ら．１９９５．Ｆｅｍｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：２２３−２３０）。ワクチンによる防御はＦ１とＬｃｒＶに対する高い特異的ポリクローナル抗体力価に相関し（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ら．１９９９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１６：１０７−１１４）、防御度が防御抗体の投与量に比例するという本発明の知見に一致する（下表１）。
【００３６】
従って、本発明の医薬組成物はペスト菌感染に対するヒト又は動物の防御用受動的免疫用予防ワクチンとして使用することができ、これらのワクチンは本発明の別の側面を形成する。
【００３７】
更に別の側面は上記ワクチンを投与するペスト菌感染に対する免疫方法に関する。
【００３８】
別の側面において、本発明はペスト菌感染に対するヒト又は動物の受動免疫用医薬の製造におけるペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメントと、ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメントの組み合わせの使用を提供する。
【００３９】
好ましい抗体組み合わせは治療での使用について上述した通りである。
【００４０】
ＬｃｒＶは密接な接触により１組のエフェクター蛋白質を真核ターゲット細胞の細胞質ゾルに直接注入することが可能なプロセスであるＹｅｒｓｉｎｉａ種のＩＩＩ型分泌（ＴＴＳ）に主要な役割をもつ（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，Ｇ．Ｒ．１９９８．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８０：５４９５−５５０４；Ｈｕｅｃｋ，Ｃ．Ｊ．１９９８．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６２：３７９−４３３；Ｒｏｓｑｖｉｓｔ，Ｒ．ら．１９９１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５９：４５６２−４５６９；Ｒｏｓｑｖｉｓｔ，Ｒ．ら．１９９４．Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：９６４−９７２）。エフェクター蛋白質（Ｙｏｐｓと言う）は貪食宿主細胞の死滅を促進する各種機能をもつ。防御ポリクローナル抗血清はＨＥＬＡ細胞における細胞毒性実験でＹｅｒｓｉｎｉａ  ＴＴＳを阻害し、共焦点顕微鏡分析により真核細胞との接触前に細菌表面でＬｃｒＶが検出された（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら．１９９９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３２：９６１−９７６）。同様の試験の結果、Ｍａｂ７．３はＪ７７４マクロファージ様細胞をＹｅｒｓｉｎｉａによる死滅から防御するが、他の非防御Ｍａｂでは防御されないことが分かった（Ｗｅｅｋｓ，Ｓ．ら．２００２．Ｍｉｂｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３２：２２７−２３７）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＬｃｒＶホモログ（ＰｃｒＶ）に対する抗血清は肺感染モデルでマウスを防御し、抗血清はＴＴＳによるＪ７７４細胞の細胞毒性を阻害し（Ｆｒａｎｋ，Ｄ．Ｗ．ら．２００２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８６：６４−７３；Ｓａｗａ，Ｔ．ら．１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：３９２−３９８）、抗ＰｃｒＶ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは疾患モデルで治療防御を生じた（Ｓｈｉｍｅ，Ｎ．ら．２００１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６７：５８８０−５８８６）。
【００４１】
しかし、細胞毒性アッセイで防御ＬｃｒＶ特異的ポリクローナル抗血清間に相関を示していない報告もある（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋ．Ａ．ら．１９９９．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｖ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７：５３９５−５４０８）。ＬｃｒＶは免疫調節性をもつことも報告されている（Ｍｏｔｉｎ，Ｖ．Ｌ．ら．１９９７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３：１０４０−１０４２；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｒ．ら．１９９５．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３：３０２１−３０２９；Ｓｉｎｇ，Ａ．ら．２００２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８：１３１５−１３２１；Ｗｅｌｋｏｓ，Ｓ．ら．１９９８．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２４：１８５−１９６）ので、抗体が分泌ＬｃｒＶと未確認真核受容体の相互作用を阻止することによりペスト菌のＴＴＳと抗炎症性を阻害している可能性もある。
【００４２】
Ｆ１は３７℃で最適に発現され、細菌表面にカプセル様構造を形成することにより貪食を阻害すると考えられ、有効なペストワクチンである（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｇ．Ｐ．ら．１９９６．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６４：２１８０−２１８７；Ｄｕ，Ｙ．Ｄ．ら．２００２．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７０：１４５３−１４６０；Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｇ．ら．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１１３１−１１３７；Ｔｉｔｂａｌｌ，Ｒ．Ｗ．ら．１９９７．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：１９２６−１９３０）。最近の報告は、同系Ｆ１ペスト突然変異体のＪ７７４細胞による貪食に対する抵抗性が低下していることを示している（Ｄｕ，Ｙ．Ｄ．ら．２００２．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７０：１４５３−１４６０）。また、ＴＴＳ欠損ビルレンスプラスミド治癒株は貪食抵抗性が低く、二重突然変異体で相加効果が認められた（Ｆ１陰性，プラスミド治癒株）。ＴＴＳシステムとＦ１カプセル合成はペスト菌の細胞外生活様式を維持するために様々な方法で関与していることが報告されている（Ｄｕ，Ｙ．Ｄ．ら．２００２．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７０：１４５３−１４６０）。本発明を使用することにより、生物のＴＴＳシステムとＦ１カプセルの両者をターゲットにするので、以下の実施例で観察される高レベル防御を説明することができる。以下、図面を参照して本発明を単なる例示として説明する。
【実施例１】
【００４３】
抗体の作製
Ｍａｂ７．３とＦ１−０４−Ａ−Ｇ１を硫安沈殿によりハイブリドーマ上清から精製した。等容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を組織培養上清にゆっくりと加えた後、４℃で一晩撹拌後、３，０００ｇで３０分間遠心した。ペレットをドレンし、元の容量の０．１倍容量のＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ，英国）に再懸濁した後、ＰＢＳを３回交換して透析した。使い捨てＥｃｏｎｏｐａｋカラム（ＢｉｏＲａｄ，英国）に蛋白質−Ｇ−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，英国）を充填し、抗体溶液をカラムに通した。ビーズをＰＢＳで洗浄後、抗体を５０ｍＭグリシン（ｐＨ３）で溶出させ、溶出液３ｍｌ当たりＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９．１）１５０μｌを加えたフラクションで保存した。蛋白質フラクションを１０−１５％  Ｐｈａｓｔｇｅｌｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，英国）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＰＢＳを３回交換して抗体含有フラクションを透析した。製造業者に推奨されているようなＢＳＡ標準を使用してＢＣＡアッセイ（Ｐｅｒｂｉｏ，英国）により抗体濃度を測定した。抗体純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
【実施例２】
【００４４】
生物学的試験
腺ペストと肺ペストのマウスモデルで抗体を試験した。６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，英国）。動物実験は動物実験に関する英国法（Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６）に従って実施した。
【００４５】
下表１〜３の表示のとおり感染前又は感染後にＰＢＳ１００μｌ中腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により抗体をマウスに投与した。皮下注射経路で１コロニー形成単位の推定半数致死量（ＭＬＤ）をもつ完全ビルレントヒト単離株であるペスト菌株ＧＢ（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐら．１９９５．Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１５５１−１５５６）を全攻撃実験で使用した。腺ペストモデルでは、１０〜１０５ＭＬＤをＰＢＳ１００μｌに再懸濁し、マウスに皮下注射した。肺ペストモデルでは、従来記載されているように風媒性細菌約１００ＭＬＤをマウスに接触させた（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ら．１９９７  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１０７９−１０８４）。少なくとも１日２回動物を調査し、死亡数を１４日間記録した。
【００４６】
結果
Ｍａｂ７．３防御データ
ペスト菌１０ＭＬＤ又は１００ＭＬＤによる攻撃の２４時間前に精製Ｍａｂ７．３をマウスに投与した。僅か３．５μｇの抗体でマウスは防御され、死亡した動物の死亡までの平均時間（ＴＴＤ）は延長した（表１）。
【００４７】
【表１】
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３．５μｇ及び０．７μｇのＭａｂ７．３を投与した群に比較して１０．５μｇ又は３５μｇを投与した群のほうに高い生存率が認められた。防御度は１００ＭＬＤを投与した動物のほうが１０ＭＬＤを注射したものよりも低かった（夫々生存率５０％及び８３％）。従って、ペストに対する防御は抗体投与量に正比例し、攻撃用量に反比例した。
【００４８】
ＰＢＳ１００μｌ中５０μｇのＭａｂ７．３をマウス５匹に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、従来記載されているような抗ＬｃｒＶ特異的ＥＬＩＳＡにより各種時点で血清値を測定した（Ｈｉｌｌ，Ｊ．ら．１９９７．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：４４７６−４４８２）。Ｍａｂ７．３の血清中半減期は５．６日間であることが分かった。投与から２８日後の血清中抗体値は２μｇであると計算されたので、抗体投与から２８日後に免疫動物５匹をペスト菌１８ＭＬＤで攻撃した。Ｍａｂ７．３を投与した全動物は生存したが、投与しなかったマウスは６匹中６匹が死亡した。本実験の結果、抗体を１回投与すると持効型予防剤として機能する可能性があることが立証された。
【００４９】
皮下注射ペスト菌攻撃を基準にして−４時間、＋２４時間、＋４８時間又は＋９６時間にＭａｂ７．３を投与した。感染後４８時間までに抗体を投与すると防御が認められた（図１Ａ）。また。＋９６時間投与群にも死亡までの時間の延長が認められ。＋９６時間投与群の１匹は抗体投与前に死亡したが、その他は未投与対照動物と区別できないペスト兆候を示し、ペスト症状が明白な場合であっても抗体治療により死亡を延期できることが示唆された。エアロゾル感染を基準にして−４時間、＋２４時間、＋４８時間又は＋６０時間にＭａｂ７．３をマウスに投与した（図１Ｂ）。攻撃から２４時間及び４８時間後に抗体を投与した群に防御が認められた。＋６０時間に投与した全マウスは死亡したが、未投与動物に比較して統計的に有意なＴＴＤ延長が認められた。
【００５０】
Ｆ１−０４−Ａ−Ｇ１とＭａｂ７．３の併用投与
エアロゾル攻撃前にＦ１−０４−Ａ−Ｇ１を単独又はＭａｂ７．３と併用投与すると、ペストに対してマウスが防御された（表２）。
【００５１】
【表２】
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この結果、肺ペストモデルにおけるＦ１−０４−Ａ−Ｇ１の予防性が確認された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．ら．１９９７．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ５６：４７１−４７３）。Ｍａｂ７．３はエアロゾル攻撃よりも皮下注射ペスト菌攻撃に対する治療効力が低かった（図１）ので、腺ペストモデルを更なる同時投与試験に選択して抗体相乗効果を試験した。
【００５２】
まず、ペスト菌ＧＢ５０〜１０５ＭＬＤ攻撃に対する前治療薬として抗体を試験した（表３）。
【００５３】
【表３】
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驚くべきことに、全攻撃用量で防御が認められ、１００ＭＬＤを上回る攻撃用量での成功が予想された（表１及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．ら．１９９７．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ５６：４７１−４７３参照）。次に、併用抗体投与をペスト治療として試験した。攻撃から４８時間後に抗体カクテルを投与したマウスは単独抗体投与した動物よりも良好に防御された（図２）。データは、Ｍａｂ７．３とＦ１−０４−Ａ−Ｇ１が本発明のペストモデルで前治療薬及び治療薬のいずれでも相乗作用することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】（Ａ）皮下注射及び（Ｂ）エアロゾル感染経路によりペスト菌で攻撃したマウスに治療薬としてＭａｂ７．３を投与した結果を示すグラフである。ＰＢＳ中３５μｇのＭａｂ７．３を表示に従って攻撃の４時間前又は攻撃後７２時間まで腹腔内注射によりマウスに投与した。死亡数を１４日間記録した。（Ａ）７２時間及び（Ｂ）６０時間後にＭａｂ７．３を投与した動物で確認された死亡までの時間延長はスチューデントのＴ検定分析によると未投与対照群に比較して統計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。
【図２】Ｍａｂ７．３とＦ１−０４−ＡＧ−１は感染後に投与すると相乗効果があることを示すグラフである。マウスをペスト菌９１ＭＬＤで皮下注射攻撃し、ペスト攻撃から４８時間後にＭａｂ７．３（３５μｇ）、Ｆ１−０４−Ａ−Ｇ１（１００μｇ）又は両者を投与した。死亡数を１４日間記録した。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月6日(2004.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスト菌感染の治療用医薬の製造における（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせの使用。
【請求項２】
（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせを使用する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組み合わせがペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体と、ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体を含む請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
医薬が感染後約４８時間までの投与用である請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントがＶ抗原の配列のアミノ酸１３５〜２７５に存在するＶ抗原のエピトープと特異的に結合する請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
抗体又はその結合フラグメントがヒト化型である請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
治療有効量の（ｉ）ペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉｉ）ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体、もしくはその結合フラグメント、又は（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせをヒト又は動物に投与することを含む、ペスト菌感染作用を受けているヒト又は動物の治療方法。
【請求項９】
（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせを投与することを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメント及びペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメント並びに医薬適合性担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントがＶ抗原の配列のアミノ酸１３５〜２７５に存在するＶ抗原のエピトープと特異的に結合する請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗体又はその結合フラグメントがヒト化型又は完全ヒト型である請求項１０から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組成物を含むペスト菌感染に対するヒト又は動物の防御用予防ワクチン。
【請求項１５】
請求項１４に記載のワクチンを投与するペスト菌感染に対する免疫方法。
【請求項１６】
ペスト菌感染に対するヒト又は動物の受動免疫用医薬の製造におけるペスト菌Ｆ１抗原に特異的な抗体もしくはその結合フラグメント及びペスト菌Ｖ抗原に特異的な抗体もしくはその結合フラグメント並びに医薬適合性担体の組み合わせの使用。
【国際調査報告】
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