(57)【要約】組織工学構築物を製造する方法。この方法は胚性幹細胞の集団を提供する工程と、細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程と、所定の細胞系列に沿って、あるいは特定の細胞型への幹細胞の分化を促進するために選択された少なくとも１つの薬剤にこの胚性幹細胞を暴露する工程とを含む。この曝露工程は、播種工程前後に行ってもよい。一局面において、本発明は、胚性幹細胞、幹細胞により生じた収縮力に抵抗性のある３次元細胞支持基質、および所定の細胞系列に沿って、あるいは特定の細胞型に幹細胞の分化を促進するために選択された少なくとも１つの成長因子を含む組織工学構築物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織工学構築物であって、以下：
胚性幹細胞；
３次元細胞支持基質であって、該幹細胞によって生じた収縮力に抵抗性である其質；および
所定の細胞系列に沿って、または特定の細胞型への幹細胞分化を促進するために選択された、少なくとも１つの成長因子、
を含む、組織工学構築物。
【請求項２】
前記幹細胞が、哺乳動物胚性幹細胞である、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項３】
前記細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項２に記載の組織工学構築物。
【請求項４】
前記細胞支持基質が、ポリ（乳酸）−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）混合物を含む、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項５】
前記細胞支持基質が、ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む、請求項４に記載の組織工学構築物。
【請求項６】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が５０％をこえて減少しない、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項７】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が４０％をこえて減少しない、請求項６に記載の組織工学構築物。
【請求項８】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が３０％をこえて減少しない、請求項７に記載の組織工学構築物。
【請求項９】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が２０％をこえて減少しない、請求項８に記載の組織工学構築物。
【請求項１０】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が１０％をこえて減少しない、請求項９に記載の組織工学構築物。
【請求項１１】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が１％をこえて減少しない、請求項１０に記載の組織工学構築物。
【請求項１２】
前記細胞支持基質が、細胞接着を促進する薬剤を含むコーティングをさらに有する、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項１３】
細胞接着を促進する前記薬剤が、細胞接着を促進するフィブロネクチン、インテグリン、およびオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１２に記載の組織工学構築物。
【請求項１４】
前記細胞支持基質が生分解性、または非生物分解性である、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項１５】
前記細胞支持基質が、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、多糖類、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生物分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレンオキシド）、上記のうちの任意のコポリマー、上記のうちの任意の付加物、および上記のうちの任意のポリマーの混合物、コポリマー、および相互の付加物から選択される、請求項１４に記載の組織工学構築物。
【請求項１６】
前記細胞支持基質内に配置された生体分子、低分子、または生理活性薬剤を１つ以上さらに含む、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項１７】
前記細胞支持基質の内面および外面をコートするゲルをさらに含む、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項１８】
前記ゲルが、コラーゲンゲル、アルギン酸塩、寒天、および成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭから選択される、請求項１７に記載の組織工学構築物。
【請求項１９】
前記ゲルが、ラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、走化性薬剤、または成長因子の１つ以上をさらに含む、請求項１８に記載の組織工学構築物。
【請求項２０】
前記成長因子が、サイトカイン、エイコサノイド、および分化因子から選択される、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項２１】
前記成長因子が、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）、上皮細胞成長因子、骨形態形成タンパク質、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、造血成長因子、ヘパリン結合性増殖因子、ペプチド成長因子、エリスロポエチン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、繊維芽細胞成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、および筋肉形態発生因子（ＭＭＦ）から選択される、請求項２０に記載の組織工学構築物。
【請求項２２】
前記細胞支持基質が、粒子、管、スポンジ、球、鎖、巻かれた鎖、毛細管網、フィルム、線維、メッシュ、およびシートから選択される形状を有する、請求項１に記載の組織工学構築物。
【請求項２３】
組織工学構築物を製造する方法であって、該方法は、以下：
胚性幹細胞の集団を提供する工程；
細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程；および
所定の細胞系列に沿って、または特定の細胞型に幹細胞の分化を促進するために選択された少なくとも１つの薬剤に胚性幹細胞を暴露する工程を包含し、
ここで、該曝露工程を該播種工程の前もしくは後、またはその両方で行い得る、
方法。
【請求項２４】
前記胚性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記胚性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞支持基質が、３次元である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が５０％をこえて減少しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が４０％をこえて減少しない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が３０％をこえて減少しない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が２０％をこえて減少しない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が１０％をこえて減少しない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で、前記基質の断面積が１％をこえて減少しない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞支持基質が、ポリ（乳酸）−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）混合物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞支持基質が、ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞接着を促進する薬剤で細胞支持基質をコーティングする工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
細胞接着を促進する前記薬剤は、細胞接着を促進するフィブロネクチン、インテグリン、およびオリゴヌクレオチドから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞支持基質が生分解性または非生物分解性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞支持基質が、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、多糖類、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生物分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレンオキシド）、上記のうちの任意のコポリマー、上記のうちの任意の付加物、および上記のうちの任意のポリマーの混合物、コポリマー、および相互の付加物から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
１つ以上の生体分子、低分子、および生理活性薬剤を前記細胞支持基質へ添加する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２３に記載の方法であって、該方法は、ゲル内に前記胚性幹細胞を配置する工程をさらに包含し、ここで、前記細胞支持基質上に該胚性幹細胞を播種する工程は、該ゲルを該細胞支持基質の内面および外面上に配置する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
前記ゲルが、コラーゲンゲル、アルギン酸塩、寒天、および成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭから選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ゲルが、１つ以上のラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、走化性薬剤、および成長因子をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
培養工程が、無血清培地中で行なわれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬剤が、成長因子、機械力、電圧、生理活性薬剤、生体分子、および低分子から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記成長因子が、サイトカイン、エイコサノイド、および分化因子から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記成長因子が、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）、上皮細胞成長因子、骨形態形成タンパク質、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、造血成長因子、ヘパリン結合性増殖因子、ペプチド成長因子、エリスロポエチン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、繊維芽細胞成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、および筋肉形態発生因子（ＭＭＦ）から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記機械力が、フープ応力、剪断応力、静水圧応力、圧縮応力、引張り応力、および上記の組み合わせから選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞支持基質が、粒子、管、スポンジ、球、鎖、巻かれた鎖、毛細管網、フィルム、線維、メッシュおよびシートからから選択される形状を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
提供する工程が、成長因子の存在下で胚性幹細胞を培養する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項５０】
培養する工程が、無血清培地中で行なわれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
組織工学構築物であって、以下：
胚性幹細胞；
ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む３次元細胞支持基質；ならびに、
ＴＧＦ−β、
を含む、組織工学構築物。
【請求項５２】
組織工学構築物であって、以下：
胚性幹細胞；
ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む３次元細胞支持基質；ならびに、
アクチビンＡ、ＩＧＦ、および上記の任意の組み合わせのメンバー、
を含む、組織工学構築物。
【請求項５３】
組織工学構築物であって、以下：
胚性幹細胞；
ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む３次元細胞支持基質；ならびに、
レチノイン酸、
を含む、組織工学構築物。
【請求項５４】
前記細胞支持基質が、フィブロネクチンまたは成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭの１つ以上をさらに含む、請求項５１、５２、または５３に記載の組織工学構築物。
【請求項５５】
組織発生を促進する方法であって、以下；
胚性幹細胞の集団を提供する工程；
ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程；ならびに、
ＴＧＦ−βに胚性幹細胞を曝露する工程を包含し、
ここで、該細胞は、軟骨組織を産生する、方法。
【請求項５６】
組織発生を促進する方法であって、以下：
胚性幹細胞の集団を提供する工程；
ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程；ならびに、
該胚性幹細胞を１つ以上のアクチビンＡおよびＩＧＦに曝露する工程を包含し、、
ここで、該細胞は、α胎児性タンパク質およびアルブミンを産生する、方法。
【請求項５７】
組織発生を促進する方法であって、以下：
胚性幹細胞の集団を提供する工程；
ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程；ならびに、
該胚性幹細胞をレチノイン酸に曝露する工程を包含し、
ここで、該細胞は、神経組織構造を発生する、方法。
【請求項５８】
前記細胞支持基質が、１つ以上のフィブロネクチンまたは成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭをさらに含む、請求項５５、５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
曝露工程は、２週間インビトロで播種された細胞支持基質を培養する工程を包含し、前記方法は、播種された細胞支持基質を、動物に移植する工程をさらに包含する、請求項５５、５６または５７に記載の方法。
【請求項６０】
組織発生を促進する方法であって、以下：
胚性幹細胞の集団を提供する工程；
細胞支持基質上に該胚性幹細胞を播種する工程；
所定時間の間、成長因子の存在下で、該播種された細胞支持基質を培養する工程、および
動物に前記培養細胞支持基質を移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記細胞支持基質が、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、多糖類、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生物分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレンオキシド）、上記のうちの任意のコポリマー、上記のうちの任意の付加物、および上記のうちの任意のポリマーの混合物、コポリマー、および相互の付加物から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記３次元細胞支持基質が、ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
細胞接着を促進する薬剤で前記細胞支持基質をコーティングする工程をさらに包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
細胞接着を促進する薬剤が、細胞接着を促進するフィブロネクチン、インテグリン、およびオリゴヌクレオチドから選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項６０に記載の方法であって、ゲル内に前記胚性幹細胞を配置する工程をさらに包含し、前記細胞支持基質上に該胚性幹細胞を播種する工程が、該ゲルを該細胞支持基質の内面および外面上に配置する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
前記ゲルが、コラーゲンゲル、アルギン酸塩、寒天、および成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭから選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ゲルが、１つ以上のラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、走化性薬剤、および成長因子をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記成長因子が、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）、上皮細胞成長因子、骨形態形成タンパク質、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、造血成長因子、ヘパリン結合性増殖因子、ペプチド成長因子、エリスロポエチン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、繊維芽細胞成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、および筋肉形態発生因子（ＭＭＦ）から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記所定の期間が、２週間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
培養が、無血清培地中で行なわれる、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年１２月１０日に出願された仮特許出願第６０／４３２，２２８号明細書、２００３年１月３１日に出願された仮特許出願第６０／４４３，９２６号明細書、および２００３年１２月９日に出願された特許出願第（Ｄｋｔ  Ｎｏ．０４９２６１１−０５３０）号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は分化する胚性幹細胞を使用する３次元の組織構造の製造に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞をはじめとする胚性幹（ＥＳ）細胞は、これらの細胞を分化させると全ての体細胞系列を生じるそのユニークな能力により細胞移植のための有望な供給源である１−３、４。支持細胞層からこの細胞を除去し、懸濁液中で成長させることにより、その中で連続的分化工程が起こり、細胞性凝集および胚様体（ＥＢ）が形成され、ＥＳの分化を誘発させることができる５。いくつかの研究により、直接的には成長因子により、間接的には支持細胞により、特定の系列へのＥＳ細胞分化を誘発することができる化学的なきっかけが提供されることが分かった６−９。しかしながら、複合組織を形成するようにＥＳ細胞の分化を制御することに成功した研究は存在しない。ある細胞系列では、表面相互作用、剪断応力、および機械的応力を含む物理的なきっかけが分化を誘発した１０−１３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、３次元の組織構造内へＥＳ細胞の分化を促進する方法を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
一局面において、本発明は、胚性幹細胞、幹細胞により生じた収縮力に抵抗性のある３次元細胞支持基質、および所定の細胞系列に沿って、あるいは特定の細胞型に幹細胞の分化を促進するために選択された少なくとも１つの成長因子を含む組織工学構築物を提供する。この幹細胞は、例えばヒトの胚性幹細胞などの哺乳動物の胚性幹細胞でもよい。細胞支持基質は、例えば、ポリ（Ｌ−乳酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）の５０／５０混合物などのポリ（乳酸）−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）混合物がある。
【０００６】
基質の断面積は、胚性幹細胞によって生じた収縮力の下で５０％以下、例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、あるいは１％以下の割合に減少してもよい。細胞支持基質は、例えば、細胞接着を促進するフィブロネクチン、インテグリン、あるいはオリゴヌクレオチドなどの細胞接着を促進する薬剤をはじめとするコーティングをさらに含む。細胞支持基質は、生分解性でもあるいは非生物分解性でもよい。
【０００７】
組織工学構築物は、細胞支持基質内に配置される１つ以上の生体分子、低分子、あるいは生理活性薬剤をさらに含んでもよい。組織工学構築物は細胞支持基質の内面および外面を被覆するゲルをさらに含んでいる。代表的なゲルは、コラーゲンゲル、アルギン酸塩、寒天、および成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ）などがある。ゲルは、ラミニン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、走化性薬剤、または例えばサイトカイン、エイコサノイド、あるいは分化因子などの成長因子の１つ以上をさらに含む。
【０００８】
別の局面では、本発明は組織工学構築物を製造する方法を提供する。この方法は、胚性幹細胞の集団を準備する工程と、細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程と、所定の系列に沿って、あるいは特定の細胞型への幹細胞の分化を促進するために選択された少なくとも１つの薬剤にこの胚性幹細胞を曝露させる工程とを含む。曝露する工程は、播種する工程の前後に行ってもよく、血清フリーの培地中で行ってもよい。細胞支持基質は３次元でもよく、細胞接着を促進する薬剤でコートされていてもよい。この胚性幹細胞は、ゲル内に配列していてもよく、細胞支持基質上に胚性幹細胞を播種する工程は、細胞支持基質の内面および外面にゲルを配置する工程を含んでもよい。
【０００９】
薬剤は成長因子、機械力、電圧、生理活性薬剤、生体分子、低分子、あるいはこれらの組み合わせでもよい。機械力は、フープ応力、剪断応力、静水圧応力、圧縮応力、引張り応力、あるいはこれらの任意の組み合わせなどがある。胚性幹細胞は、準備する工程の一部として成長因子の存在下で培養してもよい。
【００１０】
（定義）
「生体分子」：本明細書に使用される用語「生体分子」は、細胞または組織で一般に認められる天然あるいは人工の（例えば、合成、または組換え法によって）いずれかの分子類（例えば、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、炭水化物、糖、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイドなど）を指す。特定のクラスの生体分子としては、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、成長因子および走化因子などの細胞応答修飾因子、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス薬剤、プラスミド、ＤＮＡ、およびＲＮＡなどがあるがこれに限定されない。
【００１１】
「生体適合性」：本明細書に使用される用語「生体適合性」は、インビボにおいて好ましくない有害な反応を誘発しない材料を記載するためのものである。
【００１２】
「生分解性」：本明細書で使用される「生分解性」ポリマーは、生理的またはエンドソーム条件の下で、完全に（すなわちモノマー種まで）分解するポリマーである。好ましい実施形態では、ポリマーおよびポリマー生分解副産物は生体適合性である。生分解性ポリマーは、必ずしも加水分解的に分解する必要はなく、完全に分解するまで酵素の作用を必要とする場合がある。
【００１３】
「成長因子」：本明細書で使用される「成長因子」は、細胞性代謝プロセスを制御する化学薬品であり、これらに限定されないが、識別、増殖、多様な細胞生成物の合成、および他の代謝活性が含まれる。成長因子は、これらに限定されないが、サイトカイン、エイコサノイド、および分化因子などの化学薬品のいくつかのファミリーを含んでもよい。
【００１４】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」：用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は区別なく使用してもよい。一般に、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドを有する。ＤＮＡおよびＲＮＡはポリヌクレオチドである。ポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、О（６）―メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学修飾塩基（例えばメチル化塩基）、介在塩基、改質糖類（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、あるいは改質リン酸基（例えば、ホスホロチオネート、および５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）などがある。
【００１５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」：本発明によれば、「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに結合した一連の少なくとも３つのアミノ酸を有する。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は区別なく使用してもよい。ペプチドは個々のペプチドあるいはペプチドの集まりを指す場合がある。発明のペプチドは、当業者において公知の非天然のアミノ酸、および／またはアミノ酸類似体（天然には生じない化合物であるが、ポリペプチド鎖ないに取り込むことが可能なもの、例えば、官能性イオンチャネルに良好に取り込まれる非天然のアミノ酸の構造を示したｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／〜ｄａｄｇｒｐ／Ｕｎｎａｔｓｔｒｕｃｔ．ｇｉｆ参照）が代わりに使用されるが、天然のアミノ酸のみを含むことが好ましい。例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、接合用のリンカー、官能基付与、あるいはその他の改質などの化学成分の添加により、発明のペプチドにおける１つ以上のアミノ酸を改質してもよい。好ましい実施形態において、ペプチドの改質はより安定なペプチドを導く（例えば、生体内でより大きな半減期）。これらの改質には、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸などの取り込みなどがある。いずれの改質も本質的にペプチドの所望の生物活性を妨害してはならない。
【００１６】
「多糖類」、「炭水化物」あるいは「オリゴ糖」：用語「多糖類」、「炭水化物」、あるいは「オリゴ糖」は、糖のポリマーを指す。用語「多糖類」、「炭水化物」および「オリゴ糖」は区別なく使用される。一般に、多糖類は少なくとも３つの糖を有する。このポリマーは、天然の糖（例えばグルコース、果糖、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、およびキシロース）、および／または改質された糖（例えば２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、およびヘキソース）を含む。
【００１７】
「低分子」：本明細書で使用される用語「低分子」は、比較的低分子量を有する天然または人工的に創成された（例えば化学合成によって）分子を指すために使用される。一般に、低分子はモノマーで、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。低分子は、これにより動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける局所または全身作用を生じる生物学的に活性な分子であることが好ましい。ある好ましい実施形態では、低分子は薬剤である。この薬剤は、必須ではないが、適切な政府機関または機構によって、使用に際し既に安全で有効であると判定されたものが好ましい。例えば、参照によって本明細書に引用されたＦＤＡにより２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５、３３１〜３６１、および４４０〜４６０にリストされたヒト使用のための薬剤、ＦＤＡにより２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００〜５８９にリストされた獣医学的使用のための薬剤は、本発明による使用にすべて許容できる。
【００１８】
「生理活性薬剤」：本明細書で使用される「生理活性薬剤」は、生物学的あるいは化学的事象を変化させ、抑制し、活性化し、あるいはそれに影響を及ぼす化合物あるいは単位を指すために使用される。例えば、生理活性薬剤は、抗−エイズ物質、抗癌物質、抗生物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素抑制因子、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗−ヒスタミン、潤滑剤、精神安定薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、および抗パーキンソン物質、チャネル遮断薬、縮瞳および抗コリン作動薬などの抗痙性薬および筋肉収縮薬、抗緑内障化合物、抗寄生虫薬および／または抗原虫化合物、細胞増殖阻害剤および抗接着分子などの細胞−細胞外基質相互作用の修飾剤、血管拡張薬、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはタンパク質合成の阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、抗発熱薬、ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症薬、抗血管原性因子、抗分泌性因子、抗凝血薬および／または抗血栓薬薬剤、局所麻酔薬、眼科薬、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、抗嘔吐薬および造影剤、などがあるが、これに限定されない。ある実施形態において、生理活性薬剤は薬剤である。
【００１９】
本発明での使用に好ましい生理活性薬および特定薬剤のより完全なリストは、全て本明細書に参照によって引用されるＡｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９年；「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉら編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年、および米国薬局方−２５／国民医薬品集−２０、米国薬局方協会（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ）刊行、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ、２００１年に掲載されている。
【００２０】
「組織」：本明細書に使用されるように、用語「組織」は、特定の機能を実行するための１種類以上の細胞の集まり、および細胞を囲む任意の細胞外基質を指す。
【００２１】
（詳細な説明）
一実施形態において、本発明は組織工学構築物を産生する方法である。所望の分化経路を刺激する薬剤にさらされる前後に、支持基質上にｈＥＳ細胞の集団が播種される。支持基質は、細胞により作用する収縮力の下で崩壊しないように十分高い弾性率を有する。
【００２２】
本発明者らは、適切な化学的および物理的なきっかけを併用すると、三次元（３Ｄ）組織構造内へのｈＥＳ細胞の分化および組織化に向けた支持環境が構築されることを偶然に発見した。本発明者らは、基質ゲルおよび生分解性骨格を使用して、一連の３Ｄ培養条件を構築し、生物分解性骨格により提供された物理的きっかけが組織状構造の形成を促進することを見いだした。特に、ｈＥＳ細胞によって生じた圧縮応力下での収縮に抵抗するようにデザインされたポリマー骨格が、３Ｄ構造内へのｈＥＳ細胞の増殖、分化、および組織化を促進した。更に、成長因子条件の変動は、軟骨、肝臓、および神経組織などのヒト組織状の構造の形成を誘発した。最終的に、ポリマー骨格上に培養されたｈＥＳ細胞は、インビトロで組織を血管新生化する内皮血管ネットワーク内で組織化された。したがって、物理的環境は、３Ｄ組織中へのｈＥＳ細胞分化に影響を及ぼすパラメータである。
【００２３】
この細胞は、胚様体の形成を誘発するように、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの存在しない条件で培養し、続いてトリプシン処理される。この細胞は、三次元基質上に直接播種されるか、あるいは播種用のゲルと結合される。代表的なゲルは、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能な成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ）（基質ゲル）である。未変性の基質ゲルは、ＥＨＳマウス腫瘍から抽出された可溶性基底膜基質である（Ｋｉｅｉｎｍａｎ、Ｈ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：３１２、１９８６年）。この基質の主成分は、ラミニン、コラーゲンＩ、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）である（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ、Ｓ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０２：１、１９９２年）。成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ）は、この基質からほとんどの成長因子を除去することにより産生される（Ｔａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国（１９９０年）８７（１０）：４００２−６を参照）。あるいは、このゲルはコラーゲンＩゲルでもよい。本発明と共に使用してもよい追加のゲルは、アルギン酸塩、フィブリン、寒天、およびコラーゲンＩＶなどがあるがこれに限定されない。
【００２４】
ゲルが使用される場合、グリコサミノグリカン、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、および糖タンパク質などのその他の細胞外基質成分をさらに含んでもよい。このゲルは、コラーゲンＮ、およびラミニンなどの基底膜成分をさらに含んでもよい。一実施形態において、幹細胞と同じ種類の分化すべき細胞を含む組織で認められる細胞外基質成分をそのゲルに組み込んでもよい。タンパク質分解酵素およびコラゲナーゼなどの酵素を、成長因子、および走化性薬などの細胞応答修飾因子としてゲルに加えてもよい。
【００２５】
ゲルは基質の内面および外表面上に吸収され、多孔性基質の細孔のいくつかを充填する。硬化するまでは、毛管力が基質上のゲルを保持するか、あるいはゲルが基質上で硬化し、それ自体で支持できるようになる。
【００２６】
三次元の基質は、細胞の分化によって生じる収縮力の下で崩壊しないように十分に堅いことが好ましい。骨格剛性に無関係な線維芽細胞の場合、細胞当たりの平均値漸近力（Ｆ細胞）は、およそ３ｎＮと計算された３８。これはおおざっぱな仮定であるものの、平均細胞が作用する力（σ）を表すためにこの値を使用すると、以下の関係が成り立つ。
【００２７】
σ＝Ｆ細胞×細胞の数／細胞の面積
これが正しい場合、単細胞（Ａ細胞）の断面積で上記断面積（細胞の面積）を割ることにより、断面積における細胞の数を評価することができる。上述の式は、以下のように書き直すことができる。
【００２８】
σ＝Ｆ細胞／Ａ細胞
横断面内の細胞の直径がおよそ６μｍであると仮定すると、Ａｃｅｌｌは約（環状横断面を想定して）２８μｍである。これらの既知の値を上式と代入すると、次の結果が得られる。すなわち、細胞は骨格におよそ１１０Ｐａの応力を及ぼす。これは非常に概略的なおおざっぱな評価である。
【００２９】
一実施形態において、胚性幹細胞は基質上に播種された後でも３次元構造を維持することができ、この細胞が多様な細胞機能（例えば代謝機能、増殖、分化）を行なう際に、基質の断面積の減少は５０％以下、例えば未播種基質に対して４０％未満である。いくつかの実施形態において、播種された細胞によって作用する機械力の下で、断面積の減少は３０％未満、あるいはさらに少なく、例えば２０％未満、１０％未満、あるいは１％未満未満である。当業者は、どのポリマーを選択するのか、収縮量を最適化するために分子量および架橋密度をコントロールするなど、どのようにしてそれらの弾性率を調整するのかについて把握しているであろう。
【００３０】
いくつかの実施形態において、置換されるべき細胞外基質に類似する微細構造とともに基質が形成されてもよい。基質の分子量、立体規則性、および架橋密度をさらに制御し、基質の機械的性質および分解率（分解性骨格における）の両方をコントロールする。移植部位における組織を模倣するため、機械的性質をさらに最適化する。最終移植片の形状およびサイズは、移植部位および組織の種類に適合させる必要がある。基質は、幹細胞のための伝達媒体として単純に寄与してもよく、構造または機械的な機能を提供してもよい。基質は、例えば、粒子、スポンジ、管、球、鎖、コイル鎖、毛細管ネットワーク、フィルム、線維、メッシュ、あるいはシートのように任意の形状に形成してもよい。
【００３１】
基質の空隙率は、当業者に公知の種々の技術によってコントロールされる。最小細孔径および間隙率は、細胞、および基質を介して細胞へ濾過される栄養分にとって十分な場所を提供する必要性によって決まる。最大細孔径および空隙率は、播種後にその機械的安定性を維持するための基質の能力によって制限される。空隙率が増加する場合、より高い弾性率を有するポリマーを使用したり、コポリマーまたは混合物としてより堅いポリマーを添加したり、あるいはポリマーの架橋密度を増加したりするなど、いずれを使用しても、細胞性収縮に関する基質の安定性を向上させることができる。
【００３２】
基質は、当業者に公知の任意の種々の技術により作製してもよい。塩浸出、ポロゲンｐｏｒｏｇｅｎｓ、固−液相分離（時に凍結乾燥と呼ぶ）、および位相反転産生物のいずれを使用しても、多孔性基質を産生することができる。線維引き出しおよびウィービングを使用して、より整列したポリマースレッドを有する基質を産生してもよい（例えばＶａｃａｎｔｉら、（１９８８年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２３：３−９参照）。標準ポリマー加工技術を開発し、種々の空隙率および微細構造を有するポリマー基質を創造してもよいことを当業者は認識するであろう。
【００３３】
ポリマー基質は生分解性であることが好ましい。本発明の実施において使用される好ましい生分解性ポリマーは、当業者において公知であり、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびＰＬＡ−ＰＧＡコポリマー（ＰＬＧＡ）などがある。生分解性材料は、さらに、ＰＬＡ、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、および多糖類などがある。非生物分解性のポリマーも同様に使用してもよい。他の非生物分解性であるが生体適合性のポリマーとしては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生物分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、およびポリ（エチレンオキシド）などがある。当業者には、これは細胞工学用途に適切なポリマーのリストとして例示的なものであり、包括的なものではないことが認識されるであろう。
【００３４】
上記のポリマーのコポリマー、混合物、および付加物を、本発明の実施において使用してもよい。実際、コポリマーは基質の機械的および化学的性質を最適化するのに有用である。例えば、幹細胞に高い親和性を備えたポリマーはより堅いポリマーと結合し、崩壊しないようにするために必要な剛性を有する基質を生成する。例えば、ＰＬＡはポリ（カプロラクトン）またはＰＬＧＡと結合し混合物を形成する。ポリマーの選択、およびコポリマー中のポリマー比率の両者は、基質の剛性を最適化するために調整される。
【００３５】
ＰＬＡおよびＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーは、生物分解性の基質を形成するのに特に有用である。ポリエステル基質の侵食は、ポリマーの分子量および結晶化度と関係がある。より高い分子量、例えば重量平均分子量９０，０００以上のものは、ポリマー基質中の構造上の完全性を長期間保持するが、より低い分子量、例えば重量平均分子量３０，０００以下では、基質寿命が短くなる。分子量と結晶化度もポリマー基質の剛性に影響を及ぼす。ポリマーの立体規則性も弾性率に影響を及ぼす。ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）はイソタクチックであり、このポリマーの結晶化度、およびそれを含む混合物の弾性率が高くなっている。当業者は、上述の任意のポリマーの分子量および結晶化度を最適化し、基質の剛性をコントロールしてもよいことを認識するであろう。同様に、コポリマーあるいは混合物中のポリマーの比率を調整し、所望の剛性を達成してもよい。
【００３６】
代表的な実施形態では、成長因子あるいは走化性薬剤などの細胞応答修飾因子をポリマー基質に添加してもよい。このような修飾因子を使用し、所望の標的細胞内での胚性幹細胞の分化を促進してもよい。あるいは、またはさらに加えて、修飾因子を選択し、これによって基質に細胞を補充するか、あるいは基質に補充された細胞の特定の代謝活性を促進するまたは抑制してもよい。代表的な成長因子としては、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）、上皮細胞成長因子、骨形成因子（ＢＭＰ）、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−ＩおよびＩＩ、造血成長因子、ヘパリン結合性増殖因子、ペプチド成長因子、エリスロポエチン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、繊維芽細胞成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、および筋肉形態発生因子（ＭＭＦ）などがあるがこれに限定されない。使用された特定の成長因子は、所望の細胞活性および分化経路に適している必要がある。成長因子の大規模なファミリーの調節効果は当業者において公知である。
【００３７】
ポリマー基質上に播種される前に、胚性幹細胞を成長因子あるいは他の細胞応答修飾因子とともに培養してもよい。これらの細胞はポリマーと結合する前に既に分化を開始していると予想される。あるいは、異なる細胞応答修飾因子に曝露された細胞の種々の集団を三次元ポリマー骨格の異なる部分に播種してもよい。
【００３８】
播種の前に、追加の生理活性薬剤、生体分子、および低分子を、ポリマー基質あるいは培地にさらに添加してもよい。例えば、フィブロネクチン、インテグリン、あるいはＲＧＤなどの細胞接着を促進するオリゴヌクレオチドの添加をポリマー基質に加えてもよい。移植された基質を囲む組織中の細胞挙動に影響を及ぼすように、走化性薬または抗炎症薬を基質に添加してもよい。
【００３９】
ゲルを含むかまたは含まず細胞が播種されたポリマー基質を、結合組織、筋肉組織、神経組織、および器官組織を含む任意の組織に移植してもよい。本発明の技術を使用し、外胚葉性、中胚葉性、および内胚葉性起源の組織を形成してもよい。好ましい実施形態では、ＥＳ細胞の分化および予定される組織タイプの形成を促進すると予想される成長因子が選択される。例えば、三次元の基質上に播種されたｈＥＳ細胞へのＴＧＦ−βの添加は、軟骨組織の細胞外基質特性の形成を誘発する。アクチビンＡおよびＩＧＦの両者はＥＳ細胞を誘発し、肝臓を発生するタンパク質特性を生じる。ＲＡはｈＥＳ細胞を誘発し、ニューロン組織に類似する外胚葉性構造を組織化する。骨形態形成タンパク質、骨に特異的なコロニー刺激因子、および／またはＰＤＧＦへのＥＳ細胞の暴露により、コラーゲンおよび他の骨ＥＣＭタンパク質の形成を促進する。
【００４０】
それらが分化するとともに、細胞は、周囲組織から移植された細胞播種基質に細胞を補充する走化性薬剤を産生する。この構成物とともに移植された幹細胞はこの基質からさらに移動する。細胞の移動は、周囲組織内へ移植された構成物の統合を助ける。内皮細胞は周囲の血管から移動し、移植された基質内で脈管構造を生じ、分化する細胞へ栄養を提供する。
【００４１】
幹細胞は遺伝子を発現し、完全に分化する前に、標的細胞のタンパク質特性を十分に産生する。したがって、完全に肝細胞および肝臓内で認められるその他の細胞に分化する前に、アクチビンＡまたはＩＧＦに曝露された幹細胞は肝特異性遺伝子を発現する。実際には、特定の細胞応答修飾因子に曝露された幹細胞の集団において、全ての幹細胞が同様に分化するわけではない。例えば、アクチビンＡかあるいはＩＧＦに曝露された細胞のうちのいくつかは、ニューロンマーカーまたは内皮マーカーを発現する。これらの細胞は、肝臓組織の発育において神経ネットワークおよび脈管構造の発達を支援することができる。
【００４２】
更に、細胞の機械的相互作用およびそれらの細胞外基質は細胞性プロセスに影響を及ぼす。所望の経路に沿った分化をさらに促進するために、細胞応答修飾因子として外来性機械力を使用し、組織によって作用する機械力を模倣してもよい。例えば、内皮細胞は、動脈および静脈を介した血流として剪断力に曝される。筋肉は少なくともその末端で骨に固定されているので、これは均一な、および不均一な引張り応力の両方に曝される。通常の歩行運動中に、骨は圧縮力および曲げ応力にさらされる。器官組織は静水圧応力および他の圧縮応力に曝される。インビトロでの細胞播種基質上の機械力の負荷は、播種された幹細胞によるアクチンの産生に影響を及ぼすと予想され、その結果、細胞の代謝活性の程度およびタイプ、およびそれらが産生する細胞外基質の微細構造に影響を及ぼす。
【００４３】
同様に、電気刺激を使用して、細胞分化および代謝に影響を及ぼすこともある。例えば、骨は圧電性であり、筋肉は、神経を伝わる電気的信号に応じて収縮し、弛緩する。インビトロで所望の組織の電気活性を模倣する電気刺激は、三次元基質上に播種されたＥＳ細胞にその組織の電気的な特性を有する組織を産生させる。
【００４４】
ポリマー基質の形状および微細構造、および播種されたポリマーに印加される外因性作用は、特定の組織において最適化される。例えば、摂取された管状其質を介して質媒質を拍動的な方法（すなわちフープ応力）で循環させ、動脈に印加される力をシミュレートしてもよく、あるいは媒質を使用し、血管の内側に整列する幹細胞に剪断応力を印加させてもよい（Ｎｉｋｉａｓｏｎら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４、４８９−９３；Ｋａｕｓｈａｌｌら、（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ、７、１０３５−１０４０）。基質中のポリマー鎖を整列させ、筋肉、腱、あるいは靭帯の組織構造を模倣させてもよく、管状のネットワークを形成させ、脈管構造の形成を促進してもよい。
【００４５】
播種されたＥＳ細胞が完全に分化する前でも、細胞は、細胞応答修飾因子にさらされた後は、ほとんど全ての動物組織の三次元構造の特徴を有するように基質自体を組織化することができる。幹細胞によって印加された機械力に対する生理学的反応を提供することができる基質上で播種をすると、この幹細胞は、２次元的なペトリ皿よりも生理学的環境により類似した条件の下で分化し、生育することができる。実際、ＥＳ細胞が最終的に分化する前に、組織部位内への移植体の統合がより迅速にあるいは効率的に進む可能性もある。
【実施例】
【００４６】
（実験方法）
（細胞培養）
５に記載されるように、ＥＳ細胞のために最適化されたＤｕｌｂｅｃｏ改質イーグル培地の修正版であるノックアウト培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中のマウス胚性線維芽細胞（Ｃｅｌｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ，ボストン，ＭＡ）上でｈＥＳ細胞（Ｈ９クローン）を培養した。ＥＢの形成を誘発するために、ｈＥＳ細胞群体を１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型で解離させ、ペトリ皿内のＬＩＦおよびｂＦＧＦを含まない分化培地中に懸濁した５。
【００４７】
（骨格調製）
骨格は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｒｅｓｏｍｅｒ  ５０３Ｈ、インゲルハイム、ドイツ、Ｍｎ〜２５，０００）およびポリ（Ｌ−乳酸）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、Ｍｎ〜３００，０００）の５０／５０ブレンドで構成された。１５に記載されるように、スポンジは塩浸出プロセスによって製作された。細胞分化実験では、このスポンジをおよそ５×４×１ｍｍ３の複数の長方形片にカットした。細胞播種に先立って、これらを７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールで一晩滅菌し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。
【００４８】
（機械的試験）
スポンジ単独の張力試験では、乾燥したスポンジを０．４ｍｍ×５ｍｍ×１１ｍｍにトリムし、Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４２装置を使用して、破損するまで０．０５ｍｍ／秒のひずみ速度で試験を行った。Ｉｎｓｔｒｏｎ５５４２装置を使用して、平行なプレートロードセル内で、スポンジ単独および成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ）とともに圧迫試験を行った。スポンジは、厚さ０．８ｍｍ、直径１７ｍｍの多孔質のディスクとした。０．１ｍｍ／ｍｍ／秒のひずみ速度で同じひずみ速度で試験する前に、５％ひずみまで試料をはじめに同じひずみ速度で１回プレサイクルさせた。
【００４９】
（基質ゲルおよび骨格上の細胞分化）
基質ゲル中の播種では、８〜９日経過のＥＢをトリプシン処理し、０．８×１０６細胞を２５μＬの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）培地および基質ゲル中に混合した（成長因子を減少させたもの、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）。ＥＢ培地は次の成長因子を補充した。ＴＧＦ−ｂ１（２ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＧＦ−Ｉ（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、およびＲＡ（３００ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）。この混合物を３７℃で６ウェルペトリ皿中で凝固させ、続いて滅菌済みブレードでペトリ皿から剥がした。それぞれを４ｍＬのＥＢ培地に加えた。骨格上の播種では、０．８×１０６細胞を、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ）およびそれぞれのＥＢ培地を含む２５μＬの混合物を使用してそれぞれの骨格内に播種した。細胞を播種後、それぞれの培地中の６ウェルペトリ皿に骨格を懸濁させた。いくつかの実験では、骨格を５０のμｇ／ｍＬのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）の中に１時間浸漬し、２５μＬのＥＢ培地での細胞播種（基質ゲルなし）を行う前に、ＰＢＳの中で洗浄した。
【００５０】
（組織処理および免疫組織化学的染色）
組織構成物を１０％中性緩衝ホルマリン中で６時間固定し、常法により処理し、パラフィン中に包埋した。５−μｍ厚の横断切片を免疫組織化学用のシラン処理されたスライド上に置き、ヘマトキシリン‐エオジン（Ｈ＆Ｅ）、トリクローム、またはサフラニン０で染色した。ＲｅＶｅａｌ緩衝液（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中で事前の９０℃、２０分間のエピトープ回復のための加熱処理と共に、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ−ＤＡＢキット（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）を使用し、製造者の指示に従って免疫組織化学的染色を行った。主要抗体は、マウス抗ヒト：デスミン（１：１５０）、アルファ胎児性タンパク質（１：２５００）、サイトケラチン７（１：２５）、ＣＤ３１（１：２０）、アルブミン（１：１００）、ビメンチン（１：５０）、Ｓ１００（１：１００）（全てＤａｋｏより）、抗ヒトのβＩＩＩ―チューブリン（Ｓｉｇｍａ、１：５００）、ネスチン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州、１：１０００）、ＣＤ３４（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ、フリーモント、カリフォルニア州、１：２０）、ＳＳＥＡ４（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、アイオワ大学、エイムス、１：４）。およびＴｒａ１−６０（Ｐｅｔｅｒ  Ａｎｄｒｅｗｓより贈与、シェフィールド大学、シェフィールド、英国、１：１０）であった。対照群としてヒトおよびマウス組織（Ｄａｋｓ）を使用し、抗体特異性（図１）を確保した。増殖試験では、固定前に１０μｍの５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）（Ｓｉｇｍａ）とともに、培地を３時間インキュベートした。マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体（１：１０００）を使用して組織切片を染色した。
【００５１】
（サイトケラチン陽性上皮によって整列された細管嚢胞状構造の管腔径の比較）
コントロール培地またはＩＧＦまたはＲＡの存在下で２週間成長させた構成物を処理し、上述のように抗サイトケラチン抗体で染色させた。細管嚢胞状構造をカウントし、管腔直径を測定し、グループ化した（大＞２００μｍ、中＞４０μｍ、小＜４０μｍ、閉鎖および多層状管腔）。結果、すなわち２回行った２つの異なる実験で得られた試料の平均値（±ＳＤ）を各試料中の管腔の総数から各群中の管腔パーセントとして記録した。
【００５２】
（逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析）
全ＲＮＡをＲＮＥａｓｙミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）によって単離した。１０単位のＲＮａｓｅ阻害薬（ギブコ）および４０ｎｇＲＮＡ含むＱｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーシーケンス、反応条件、およびサイクル数は記述されたように行った７、１５。臭化エチジウム（Ｂ−Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＡ）を含む１．２％アガロースゲル上で増幅生成物を分離した。ＧＡＤＰＨプライマーを使用して増幅されたＲＮＡを含むいくつかのゲルについて、各バンドの平均画素強度の測定、およびＧＡＤＰＨバンドの平均画素強度に対する測定強度の規準化により半定量的分析を行った。
【００５３】
（ＳＣＩＤマウス中への移植）
４週齡ＳＣＵＤマウス（ＣＢ．１７．ＳＣＩＤ、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）の背側領域の皮下に、インビトロで２週間骨格上で成長させた分化しつつあるｈＥＳ細胞を移植した。細胞なしで移植された骨格を対照群として使用した。移植１４日後に、移植片を回収し、４℃で１０％の緩衝化ホルマリン中に一晩固定し、パラフィンに包埋し、組織学的検査のために切片を作成した。
【００５４】
（結果）
（基質ゲルのみでは、３次元ｈＥＳ細胞分化のための十分なサポートを提供しない）
ＥＳ細胞分化別を誘発することが知られた代表的な成長因子補給物、すなわち、レチノイン酸（ＲＡ）、アクチビン−Ａ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）、およびインシュリン成長因子（ＩＧＦ）の存在下に、以前に細胞組織化をサポートすることが示された１４、１５基質ゲル中で、分化しているｈＥＳ細胞（ＥＢ８日）を培養した。最初に、細胞−基質ゲル混合物をディスク状に成形するが、懸濁液中で２週間培養した後に、この構造を細胞による基質ゲルの収縮を示唆する「球」状に変形させた。アクチビン−ＡあるいはＲＡ（さらにある程度ＴＧＦ−ｂを含む）のいずれかで処理された試料では、小型の濃縮された球が形成されたが、一方、ＩＧＦまたは成長因子を含まないコントロール培地で処理された試料では、より大きく濃縮が少なかった（図２Ａ）。
【００５５】
ＩＧＦまたはコントロール培地中でインキュベートされたこの球状物の組織学的検査により、上皮に整列した管状または嚢胞性構造が存在する場合があることが明らかとなった。対照的に、ＴＧＦ−β、アクチビン−ＡあるいはＲＡで処理された試料では、このような構造はまったく含まれず、個々の細胞はより小さく、おおむね全面的な細胞外基質の産生がより少なかった（図２Ａ）。アクチビン−Ａ処理試料において最も少ない細胞生存度を示し、後者の群における球は変質しているように見受けられた。ＩＧＦまたはコントロール培地で処理した場合、基質ゲルは、開いた管腔を有する管状または嚢胞性構造の形成をサポートしたが、細胞性変性、形の変形、および球サイズの変動は全て、基質ゲルのみではｈＥＳ細胞増殖および３Ｄ組織化をサポートするには不十分であることが示唆された。
【００５６】
（骨格は、ｈＥＳ細胞収縮に耐えるために機械的支持を提供する）
生分解性骨格を使用して、ｈＥＳ細胞の分化および組織化を組織様構造に割り当てるために３Ｄ支持的環境を構築した。５０％ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）および５０％ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）のブレンドから骨格を製造した。細胞性内殖を促進するために、ＰＬＧＡは急速（およそ３週間）に分解するように選択されたが、一方、ＰＬＬＡは細胞の収縮力に抵抗するために機械的剛性を提供するように選択された。細胞の播種および内殖を促進するために２５０−５００μｍの細孔径が選択された。
【００５７】
骨格が細胞により印加された機械力に耐えるかどうかを判定するために、圧縮および引張試験を行った。圧縮試験はＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ骨格単独上で、成長因子減少基質ゲル、成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ）とともに行った。結果を図２Ｂ−Ｃにまとめる。続いて、これらのデータを基質ゲル単独おける公表された値１６と比較した（図２Ｄ）。この骨格は、高分子量ＰＬＬＡ骨格における従前の報告と一致した引張特性を示した（図２Ｂ、Ｄ）１７。圧縮では、ポリマー骨格はおよそ６５ｋＰａの圧縮弾性率を示した。ＡＮＯＶＡを使用した統計分析により判定したところ（図２Ｃ、Ｄ）、基質ゲル追加により、圧縮弾性率の変化はなかった。概要表（図２Ｄ）は、骨格および基質ゲル／骨格は、基質ゲル単独における値よりも３桁オーダー高い圧縮弾性率を有することを示す。この相違は、細胞を含む骨格の性能に影響を及ぼす。１１０Ｐａの推定圧縮細胞応力では、骨格が０．２％収縮し、これは本質的に収縮に抵抗することを意味している。
【００５８】
（骨格はｈＥＳ細胞付着成長、分化および３Ｄ組織化をサポートする）
骨格がｈＥＳ細胞分化および３Ｄ組織化に有効であるか否かを判定するため、フィブロネクチンをコートした骨格に対して、フィブロネクチンをコートしたシャーレで培養した分化しているｈＥＳ細胞の２週間インキュベーション、ならびに骨格を含む基質ゲルに対する基質ゲルのみにおける分化を比較した。２次元的にフィブロネクチンをコートしたシャーレは、ある細胞分化をサポートしたが（図３）、３Ｄ構造形成をサポートすることができなかった。基質ゲル単独では３Ｄ環境を形成することができたが、ｈＥＳ細胞増殖および３Ｄ組織化（図２）のサポートは困難であった。１つの可能性は、基質ゲル単独および基質ゲルを含む骨格の間の相違が、細胞収縮力に抵抗するために必要である骨格の機械的剛性により部分的に引き起こされる場合があることである。
【００５９】
骨格で成長した構成物対ＥＢの分化および組織化を比較すると、本発明者らは骨格上のサイトケラチン、ＡＦＰ、およびネスチンなどの分化関連タンパク質のより高い発現を見いだし、これは限定された上皮性管状構造および神経管状ロゼット（図４）内におけるより多くの組織化と相関があった。細胞外基質産生に関して、ＴＧＦ−βにより条件づけされたＥＢ内ではサフラニンＯ染色は観察されなかった。ＥＢ集団は構造およびタンパク質の発現レベルにおいて非常に不均一であった。従って、ポリマー骨格は細胞分化と均一性の促進においてＥＢよりも適切と考えられる。
【００６０】
基質ゲル（図５Ｅ、Ｇ）およびフィブロネクチン（図５Ｆ、Ｈ）の両者は、骨格上への分化するｈＥＳ（ＥＢ８日）細胞の固定、成長および細胞生存度を促進した。異なる深さ（図５Ｅ−Ｈ）で得られた組織切片の走査型電子顕微鏡（図５Ａ−Ｄ）および通常の組織学によって示すように、この細胞は細孔を充填し、骨格の内面および外面の全体にわたって付着した。２週間後、ＢｒｄＵｒｄとともにインキュベートされた構成物は、骨格全体にわたり高レベルの増殖および生存度を示した（図５ＩＫ）。未分化なｈＥＳ細胞で播種された骨格が外面の明瞭な穿孔を示し、さらに分化しているｈＥＳ細胞（ＥＢ８日）と比較すると、骨格の中央部では均一成長および生存がより少ないという知見に基づき、未分化のｈＥＳ細胞の代わりに分化しているｈＥＳ細胞を使用した（図６、図１２Ａも参照）。
【００６１】
培養期間に続いて、試料を組織構造に類似させた３Ｄパターンに組織化した。これらの構造を評価するために、上皮および間葉構造、および細胞外基質の形成および組織化を分析した（図７）。成長因子補充のない対照群培地（６５％±４＞４０μｍ）と比較すると（Ｐ＜０．０１）、ＩＧＦの添加により、サイトケラチン陽性の立方体から円柱状の上皮細胞に整列した比較的大きな細管嚢胞状構造（８４％±６＞４０μｍ、１０％±３＞２００μｍ）の形成を引き起こす。対照的に、ＲＡは対照試料（２５％±１２＞４０μｍ）よりも小さな管腔を有する構造の形成を誘発した（Ｐ＜０．０１）、さらに時に環状多層状または閉鎖体を生成した（図７Ａ、Ｃ）。ＲＡ処理により、組織内のサイトケラチン陽性領域の総割合が４倍に増加し（Ｐ＜０．０１）、試験を行った成体の上皮組織で認められるレベル近くに到達した（図７Ｄ）。コラーゲンのためのトリクローム染色により示されるように（図７Ｂ）、細胞構造はそれらの環境内へ細胞外基質成分を分泌した。基質中のコラーゲン形成、および細胞間の基質の組織化は、成長因子の添加に著しく影響された（図７Ｂ）。対照群培地中の新しく形成さ十分に組織化されていないコラーゲンは軽度に筋原繊維性で、弱い染色性を示す。この培地へのＴＧＦβの添加により、厚く高密度の染色帯域を有する成熟コラーゲン形成を誘発した。一方、ＲＡはコラーゲン形成を阻害した。条件にかかわらず、骨格でサポートされた培養系での細管嚢胞状構造および細胞外基質産生は、基質ゲルのみを含む同等に処理された試料中の構造よりも大きくかつより良好に分化した。
【００６２】
（生分解性高分子骨格を使用する３Ｄ中胚葉性、外胚葉性、および内胚葉性組織構造の技術）
本発明者らは、特定の中胚葉性、外胚葉性、および内皮性由来の組織構造に分化することを促進する物理的手がかりと結合した化学的手がかりに関する役割をさらに検討した。ＥＢモデルおよび単層におけるマウスおよびヒトＥＳ細胞の分化に関する研究に基づいて６−８、特定の（複数の）胚葉に分化を誘発することが知られた成長因子を選択した。
【００６３】
中胚葉性組織形成を誘発するために、ＴＧＦ−β、アクチビン−Ａ、あるいはＴＧＦ−βおよびアクチビン−Ａの組み合わせとともに２週間細胞をインキュベートした。軟骨細胞外基質に特徴づけられるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のための高レベルのサフラニンＯ染色１８によって示唆されるように（図８）、この培地へのＴＧＦ−βの添加は、全構成物にわたる軟骨組織の形成を誘発した。対照的に、アクチビン−Ａ（ＴＧＦ−βとともに添加された場合でも）、ＩＧＦ、およびＲＡなどの他の成長因子の添加は、サフラニン０陽性基質の形成を誘発しなかった（図８）。異なる構成物から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析では、他の試料と比較すると、ＴＧＦ−βで処理された試料中で高レベルの軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）発現が示唆された（図９Ａ）。本発明者の知る限りでは、これらの結果は、分化するｈＥＳ細胞を使用して３Ｄ軟骨状組織が形成されたことを初めて示すものである。
【００６４】
アクチビン−ＡあるいはＩＧＦの添加は両者ともに、肝臓に成長する生化学的特徴を有する構造の形成を誘発した。対照群との比較では、アクチビン−Ａは、試料の全体にわたり高レベルのα胎児性タンパク質（ＡＦＰ）およびアルブミンを誘発した。ＩＧＦは、構成物内の限定された領域において高レベルのＡＦＰおよびアルブミンを誘発した（図８）が、ＲＡの添加により染色は観察されなかった。これらの結果は、骨格にサポートされたｈＥＳ３Ｄ構成物内では、アクチビン−ＡおよびＩＧＦは、肝臓が生育する場合と同様に血液生化学的プロフィールにより組織の内胚葉性分化および形成を誘発させることができる。遺伝子発現分析では、アクチビン−Ａで処理された組織構成物中では、他の成長因子（図９Ｂ）よりも、より高レベルの膵臓遺伝子ＰＤＸ−１発現が示唆され、ポリマー骨格上の内胚葉性派生組織へのｈＥＳ細胞の分化を誘発する際のアクチビン−Ａの役割をさらにサポートした。
【００６５】
外胚葉性構造では、構成物培地７、８、１９にＲＡを加えた。他の成長因子との比較において、ＲＡ補充により、上皮に整列した固く小管状の構造の優先的な生成が生じた（図７）。さらに、神経マーカーによる染色により、この細胞は、ネスチンおよびβＩＩＩ−チューブリンに陽性である単層状または大きな多層状神経性管状ロゼット構造を組織化していることが分かった。ロゼットの特徴のない大面積は、ネスチンおよびβＩＩＩ―チューブリン（図８）において陽性に染色された。グリア細胞、および他の神経外胚葉性細胞のためのマーカーであるＳ−１００のために染色された細胞は、この管のうちのいくつかを包囲し、支持性または移動性表現型が示唆された。ＲＡで処理された試料の遺伝子発現分析では、他の試料とは対照的に、高レベルのケラチンおよび神経フィラメントＲＮＡを発現し、また中胚葉性および内胚葉性の遺伝子の発現は非常に低かった（図９）。これらの結果は、ＲＡは、高次構造形態を生じ、さらに神経組織と生化学的に一致する傾向を有し、ポリマー骨格上で成長したｈＥＳの外胚葉性分化を誘発することを示している。
【００６６】
基質ゲル単独で形成された組織構造の分析では、化学的要因は骨格で観察されたほど分化を誘発しなかったことが分かった。ＲＡの存在下で小管状およびロゼット状構造を形成する代わりに、基質ゲル上の細胞は小さなクラスター中で組織化され、また（たとえ発現していても）ネスチンの発現は非常に低い。アクチビン−Ａ処理された基質ゲル試料中では、ＡＦＰ発現は観察されなかった。ＩＧＦおよび対照試料では、いくつかのＡＦＰ染色を観察することができた。ＴＧＦ−β処理試料中では、軟骨派生ＧＡＧのＳａｆａｎｉｎ−０染色は観察されなかった（図２）。これらの結果は、骨格はインビトロで３次元の軟骨、肝臓、および神経類似組織の形成を促進することに影響力があることを示している。
【００６７】
（インビトロでの３次元組織構成物の血管新生）
血管が複合組織構造２０−２２の形成を促進するので、骨格に形成された組織構造内で血管内において、ｈＥＳ細胞が分化し組織化することができるかどうかを分析した。ＣＤ３４およびＣＤ３１に対する抗体による染色では、骨格との２週間の培養期間の後、細胞は内皮細胞へ分化し、さらに組織の全体にわたり血管様の構造に組織化されることが分かった。細胞の３Ｄ培養株は、周囲の組織と密接に相互作用した大量の３Ｄ血管ネットワークの形成を促進した（図１０）。基質ゲルの存在下および非存在下における骨格内の血管新生の比較では、フィブロネクチンコート骨格（基質ゲルなし）上に播種された試料は、高度の内皮性分化および血管新生を生じたので、基質ゲルは不要であることが分かった（図１０）。興味深いことに、ＲＮＡ分析で示されるように（図９および１０）、ＲＡで処理された試料は、（ＣＤ３４およびＣＤ３１で免疫染色することにより示唆された）血管形成も、ＣＤ３４またはＣＤ３１遺伝子の発現も認められなかった。伸長された平滑筋様細胞も検出された。これらは組織内のいくつかの管腔のまわりで組織化されたが、ＲＡで処理された試料中では組織化されなかった（図１０）。これらの結果は、ポリマー骨格上で成長した分化しているｈＥＳ細胞は分化し、血管新生化された複合組織構造を形成することができることを示す。更に、骨格の物理的ガイダンスにより提供されたこのインビトロの血管新生プロセスは、培地へ成長因子を添加することによってコントロールすることができる。
【００６８】
（インビボにおける２週間後の３次元組織構成物の評価）
ｈＥＳ派生ポリマー骨格構成物の治療可能性を分析するために、ＳＣＩＤマウスの皮下組織に２週齡の構成物を外科的に移植した。移植片回収時（移植後１４日）では、構成物内の細胞は生存可能であり、感染の徴候は検出されなかった。移植片は、緩い線維肉芽腫性の結合組織により不完全に被包化され、宿主血管が浸透していた。ヒト特異性ＣＤ３１抗体を使用する免疫組織化学的染色により、構成物全体にわたり免疫反応性（構成物、図１１、矢印）および非免疫反応性（宿主、図１１、矢じり）血管の両方の存在が明らかとなった。さらに、構成物派生血管は腔内赤血球を含み、宿主血管性ａｎａｓｔａｍｏｓｉｓが示唆された。サイトケラチン、βＩＩＩ−チューブリン、およびＡＦＰ抗体による免疫染色では、移植された構成物は、骨格領域（図１１）内の限定構造中のこれらのヒトタンパク質を発現し続けていることが示唆された（図１１）。ある場合には、移植後の構成物の分化および組織化が継続していると考えられ、これは移植前の特定のサイトカイン処置によって影響された。
【００６９】
インビボにおいて継続的な構成物成熟後、ＲＡに条件付けされた構成物は、豊富なメラニン顆粒（Ｈ＆Ｅセクション中の褐色／黒色、過マンガン酸カリウム染色によって確認された、データなし）を有する上衣細胞およびロゼットに類似する長い繊毛に被われた高い円柱上皮によって整列された小管状構造を含み、インビトロ（あるいはインビトロ、またはインビボにおけるコントロール培地）で観察されたものよりも大きく良好に組織化された神経構造を呈した。βＩＩＩ−チューブリン抗体は、移植片内の神経外胚葉性構造、ならびに結合組織を包囲するマウスの末梢神経線維を染色した（図１１、アステリスク）。ＳＳＥＡ−４およびＴｒａ１−６０抗体による染色では、未分化の細胞は残ってないことが分かった（図１２Ｂ）。
【００７０】
（考察）
物理的環境および適切な成長因子補充の両者は、ヒト組織様３Ｄ構造の形成において重要である。本発明者らは、ポリマー骨格上で成長させたｈＥＳ細胞を使用して、インビトロでヒト軟骨、肝臓、神経、および血管の発生と一致する形態学的および生化学的の特徴を有する組織の形成をインビトロで実証した。骨格は分化された組織の形成を促進することが分かった。線維芽細胞の収縮力を使用して、骨格上の細胞性挙動をモデル化すると、細胞性応力は１１０Ｐａと見積もられた。この応力下では、基質ゲルは７００パーセント収縮するが、一方骨格はわずか０．２パーセント収縮するのみと予想され、本質的に骨格は収縮しないことを意味している。しかしながら、細胞型に依存して、細胞は異なる収縮力を表示する場合がある。さらに、化学的環境は細胞の機械的挙動にも影響を及ぼす。成長因子が幹細胞などの細胞の機械的挙動に影響を及ぼすことが示された２３−２６。これは同じ成長因子条件（ＩＧＦ、あるいはコントロール培地）下でなぜ基質ゲルが収縮しなかったのかを説明しているが、他の条件下では完全に崩壊した（アクチビン−Ａ、ＲＡ）（図２）。同じ成長因子補充により細胞を骨格で成長させた場合、３Ｄ組織構造（血管ネットワーク、神経管状構造などの）への組織化とともに多様な特定の細胞系列（内皮、神経、肝細胞など）への一層の分化が誘発された（図８−１０）。これらの所見は、化学的および物理的手がかり（例えば、骨格によって提供された機械的サポート）がＥＳ細胞の複合組織への分化に影響を及ぼすことを示唆している。
【００７１】
成長因子の影響は、直接分化あるいは増殖の促進または抑制による、あるいは特定の細胞型のアポトーシスの誘発による細胞選択により生じる可能性がある。例えば、細胞を骨格上に播種した場合、ＲＡ処理は上皮および神経様構造への特定の分化を誘発し、および中胚葉および内胚葉性分化は抑制的に作用した（図８−１０）。肝分化を特徴付ける２つの主要なタンパク質であるＡＰＰおよびアルブミンによる免疫染色２７，２８、および膵遺伝子ＰＤＸ−１の発現２９により示されるように、骨格上で成長したｈＥＳ細胞へのアクチビン−Ａの添加は、有意な内胚葉性分化を誘発した（図８および９）。アクチビン−Ａは主として中胚葉性因子として知られ６、３０、ｈＥＳ単層細胞系では、試験された内胚葉（ＡＰＰおよびアルブミンを含む）または外胚葉性遺伝子の発現なしに、主に中胚葉（主に筋肉）分化を誘発することが示された７。しかしながら、アクチビン−Ａが内胚葉の分化を誘発できることを示す報告書が存在する３１−３３。ｈＥＳ細胞分化に対するアクチビン−Ａの効果に、適用のタイミング（ＥＢ８日対５日）あるいは３次元性が影響を及ぼしている可能性がある。２つのシステム間のアクチビン−Ａにおけるこの相違に関する別の説明は、３Ｄ構造が組織血管新生（中胚葉性分化を可能とした状態で）をサポートしているという事実に起因する可能性が挙げられる。内皮細胞および新生血管（血管機能に先立つ）が肝臓および膵臓の発生にとって重要な誘発信号を提供することが最近示された３４、３５。したがって、骨格上の血管ネットワークの形成は、内胚葉分化へのアクチビン−Ａの誘発効果をサポートすることができる。
【００７２】
これらの結果は、インビトロで早期に分化しているｈＥＳ細胞を使用することにより、多様な委任胚組織の特徴を有する複合構造を産生することができることを示しており、さらにＰＬＬＡ／ＰＬＧＡポリマー骨格などの支持的３Ｄ環境においてそれらの分化を誘発することを示唆している。インビボ結果により、骨格支持ｈＥＳ構成物は少なくとも２週間の生存可能が維持されており、構成物を補充し、宿主血管系によりａｎａｓｔａｍｏｓｅされ、さらにインビボでは完全性が維持され、あるいは試験を継続中であるが、インビトロにおいて分化パターンが誘発されていることが分かった。インビトロにおけるヒト組織の成長は、移植医学において重大な課題となっている器官不足および感染症リスクに対処するために有望である。可能性のある臨床応用に加えて、インビトロでの組織形成は古代人発生および器官形成を研究するための重要なツールを提供する可能性がある。
【００７３】
【化１】
2006518993.tif 000002
【００７４】
【化２】
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【００７５】
【化３】
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【００７６】
【化４】
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本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の明細または実施例を考慮することにより当業者において明白である。本発明の明細および実施例は代表的なもののみを考慮するよう配慮されており、本発明の真の範囲および精神は以下の請求の範囲によって示される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
本発明は、以下に示すいくつかの図の参照によって記述される。
【図１】図１は、特異性および最適な希釈を判定するためそれらに特徴的なタンパク質に対する抗体、組織学的染料により染色された対照群組織の光学顕微鏡写真を含む。（ＡおよびＢ）ネスチン、マウス性脳（胚齢１７日）、（Ｃ）βＩＩＩ−チューブリン、マウス皮下、（Ｄ）サイトケラチン−７、ヒト肺、（Ｅ）インシュリン、ヒト膵臓、（Ｆ）βＩＩＩ−チューブリン、マウス脳、（Ｇ）ビメンチン、ヒトの扁桃腺、（Ｈ）平滑筋アクチン、ヒトの扁桃腺、（Ｉ）ＣＤ３４、ヒトの扁桃腺、（Ｊ）ＣＤ３１、ヒトの扁桃腺、（Ｋ）アルブミン、肝臓、（Ｌ）α−胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、成体肝臓、（Ｍ）サフラニンＯ、繊維軟骨。
【図２Ａ】図２Ａは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ）、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）インシュリン成長因子（ＩＧＦ）、あるいは成長因子なし（ＣＯＮ）の下で、基質ゲルと混合され、２週間成長させた分化しているｈＥＳ細胞（ＥＢ８日）の光学顕微鏡写真を含む。左のパネル、形成された「球」の暗視野像（スケールバー＝１ｍｍ）。中央および右パネル、Ｈ＆Ｅで染色された試料の組織学的切片。下部、基質ゲル中でサフラニンＯ（ＳａｆＯ）、および抗−ＡＦＰ、および抗ネスチン抗体により形成された「球」の断面の組織化学的および免疫染色（スケールバー＝１００μｍ）。
【図２Ｂ】図２Ｂ−Ｄは、基質ゲルの有無によるＰＬＧＡ／ＰＬＡ骨格の機械試験結果を示す。抗張力試験（Ｂ）および圧縮試験（Ｃ）結果を基質ゲル（Ｄ）と比較してまとめる。
【図２Ｃ】図２Ｂ−Ｄは、基質ゲルの有無によるＰＬＧＡ／ＰＬＡ骨格の機械試験結果を示す。抗張力試験（Ｂ）および圧縮試験（Ｃ）結果を基質ゲル（Ｄ）と比較してまとめる。
【図２Ｄ】図２Ｂ−Ｄは、基質ゲルの有無によるＰＬＧＡ／ＰＬＡ骨格の機械試験結果を示す。抗張力試験（Ｂ）および圧縮試験（Ｃ）結果を基質ゲル（Ｄ）と比較してまとめる。
【図３】図３は、トリプシン処理された８日齢胚様体（ＥＢ）より単離され、フィブロネクチンコートプレート上で播種され、トランスフォーミング増殖因β（ＴＧＦ）、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＯＦ）、あるいはコントロール培地（ＣＯＮ）の存在下で２週間成長させ、高濃度イオウケラチン（ケラチン）、神経フィラメントＨ鎖（ＮＦＨ）、軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）、α胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、ＰＤＸ−１、およびＲＮＡの上のＧＡＰＤＨのためのプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲの結果を示すゲル写真である。
【図４】図４は、コントロール培地（ＣＯＮ）、またはレチノイン酸（ＲＡ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）を補充した培地でさらに２週間培養し、さらにヒトサイトケラチン、α−胎児性タンパク質、およびネスチンに対する抗体で染色したｈＥＢｓ（８日）から得られた５μｍ厚切片の光学顕微鏡写真を含む（スケールバー＝２００μｍ）。
【図５】図５Ａ−Ｄは、骨格への細胞付着を示す分化するｈＥＳ細胞を含まない（Ａ）、含む（Ｂ−Ｄ）ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ骨格の異なる倍率における走査型電子顕微鏡写真である（スケールバー：Ａ、Ｂ＝１ｍｍ、Ｃ＝５０μｍ、Ｄ＝２００μｍ）。図５Ｅ−Ｈは、ヘマトキシリン‐エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色されたＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ骨格の光学顕微鏡写真を含む。基質ゲルを有する骨格上の細胞を播種する工程（Ｅ、Ｇ）により、あるいは骨格をフィブロネクチンでコートする工程（Ｆ、Ｈ）によりｈＥＳ細胞は骨格上に播種された（スケールバー＝５０μｍ）。図５Ｉ−Ｋは、２週間の培養、ＢｒｄＵｒｄによるインキュベーション、および抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体（褐色）による染色後のＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ骨格上のｈＥＳ細胞の増殖を示す［倍率（Ｉ）下（Ｘ１００）、上（Ｊ−Ｋ）（Ｘ１０００）］（スケールバー＝５０μｍ）。
【図６】図６は、基質ゲルで混合し、ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ骨格上で播種し、２週間培養し、さらにＨ＆Ｅまたはヒトα胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、ネスチン、あるいはβＩＩＩ−チューブリンに対する抗体で染色した未分化の（ｕｎｄｉｆｆ）、あるいは分化しているｈＥＳ細胞［胚様体（ＥＢ）８日］（ｄｉｆｆ）の顕微鏡写真を含む（ｘ４００以外はオリジナル倍率、ｘ２００）。
【図７】図７Ａは、コントロール培地（ＣＯＮ）の中、あるいはインシュリン成長因子（ＩＧＦ）またはレチノイン酸（ＲＡ）の存在下で２週間成長させ、切片を作成し、抗サイトケラチン抗体（赤色）、抗ビメンチン抗体（緑色）、核染色（青色）用のＤＡＰＩで染色されたｈＥＳ細胞骨格構成物の光学顕微鏡写真を含む（スケールバー＝１００μｍ）。図７Ｂは、コントロール培地（ＣＯＮ）の中、あるいはトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦｂ）あるいはレチノイン酸（ＲＡ）の存在下で２週間成長させ、切片を作成し、コラーゲン用トリクローム（青色）で染色されたｈＥＳ細胞骨格構成物の光学顕微鏡写真を含む（スケールバー＝１００μｍ）。図７Ｃは、コントロール培地中、あるいはＩＧＦまたはＲＡの存在下で２週間成長させ、構成物中のサイトケラチン陽性上皮により整列させた細管嚢胞状の構造の管腔径を比較したグラフである。図７Ｄは、２回実施された２つの異なる実験で得られた試料からの組織切片、および正常なヒト肺組織（上皮）の切片の抗サイトケラチン抗体で陽染色された領域（陽染色の割合）の割合を示すグラフである（バーは平均値＋／標準偏差を示す）。
【図８】図８Ａは、コントロール培地（ＣＯＮ）、あるいはＴＧＦ−β（ＴＧＦ）、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、レチノイン酸（ＲＡ）、インシュリン成長因子（ＩＧＦ）あるいはＴＧＦ−βおよびアクチビン−Ａ（ＴＧＦ／ＡＣＴ）の組み合わせで補充された培地で２週間インキュベートされたｈＥＳ構成物から得られ、サフラニン０（ｓａｆ０）、またはヒトＡＦＰ、アルブミン、ネスチン、βＩＩＩ−チューブリン、およびＳ−１００に対する抗体で染色された組織切片の免疫染色を示す（スケールバー＝５０μｍ）。図８Ｂは、２回実施された３つの異なる実験で得られた試料からの組織切片の指示された染料または抗体で陽染色された領域（陽染色の割合）の割合を示すグラフである（バーは平均値＋／標準偏差を示す）。
【図９】図９Ａは、ＴＧＦ−β（ＴＧＦ）、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、ＲＡ、ＩＧＦ、あるいはコントロール培地（ＣＯＮ）の存在下で２週間成長させた組織構成物から単離された、高濃度イオウケラチン（ケラチン）、神経フィラメントＨ鎖（ＮＦＨ）、軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）、α胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、ＰＤＸ−１、ＲＮＡの上のＣＤ３４およびＧＡＰＤＨのためのプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲの結果を示すゲル写真である。図９Ｂは、遺伝子発現の半定量的分析に基づいた３Ｄ構成物中の組織特異性遺伝子の発現における多様な成長因子の影響に関する概要図である（＋＝低い発現；＋＋＋＋＝最も高い発現）。
【図１０】図１０Ａは、基質ゲル（ｓ＋ｍ）を有する、あるいは骨格をフィブロネクチン（ｓ＋ｆｎ）でコートした後のＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ骨格上に播種され、コントロール培地（ＣＯＮ）、またはＴＧＦ−β（ＴＧＦ）、アクチビン−Ａ（ＡＣＴ）、ＲＡ、あるいはＩＧＦで補充された培地中でインキュベートされ、続いて２週間インキュベーション、固定し、切片を作成し、抗−ＣＤ３１、抗−ＣＤ３４、あるいは抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体を使用して免疫染色された分化しているｈＥＳ細胞（ＥＢ８日）の一連の光学顕微鏡写真である（スケールバー＝５０μｍ）。図１０Ｂは、図１０Ａで述べた構成物における陽染色の割合（組織切片内の抗体陽性の細胞の面積）を示すグラフである（値は、５つの異なる試料切片の平均値（±ＳＤ）を反映する）。
【図１１】図１１は、ＳＣＩＤマウスへ移植された２週間経過のｈＥＳ−骨格構成物のＨ＆ＥまたはヒトＣＤ３１、サイトケラチン、ＡＦＰ、あるいはβＩＩＩ−チューブリンに対する抗体で染色された光学顕微鏡写真を含む（スケールバー＝５０μｍ）。
【図１２】図１２Ａは、分化するヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞［胚様体（ＥＢ）８日］および基質ゲルを播種されたＰＬＬＡ／ＰＧＬＡ骨格のヒトデスミン、ミオゲニン、およびインシュリンに対する抗体で染色された試料切片（２週間後）の顕微鏡写真を含む。構成物中にいくつかの伸長された細胞と共にデスミン陽性細胞が認められた。構成物中にミオゲニン細胞は認められなかった。インシュリン陽性細胞は非常にまれであった。図１２Ｂは、対照群として寄与する１日（ＥＳ１日）間骨格に播種された未分化のｈＥＳ細胞と共に、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの背側領域の皮下に移植された２週間経過のインビボで１４日後にＴｒａ１−６０およびＳＳＥＡ−４に対する抗体で染色した構成物の顕微鏡写真を含む。
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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