(57)【要約】容易に調製し得る色素構築ブロックに基づき、またそれから合成した新規分類の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）標識試薬を提供する。この標識試薬は「カセット」の形状をとり、広範囲の多様な生体物質その他に結合し得る。標識試薬は少なくとも２つの蛍光色素部分を含んでなり、その色素部分はリンカー基を介して共有結合しており、また、試薬を標的に結合させる標的結合基をもつ。エネルギー移動標識試薬は共有結合又は非共有結合により標的物質に結合し得る。色素は、第一（又はドナー）色素の発光スペクトルが第二色素の吸収スペクトルと重なり合い、それによって両色素間にエネルギー移動が起こるようにする。色素構築ブロックは、構造（Ｉ）の４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン及び／又はその５（６）−カルボン酸である。単一ドナーと単一アクセプター蛍光色素からなる本発明の態様に加えて、本発明による蛍光エネルギー移動標識試薬は、さらに１個以上の第三の蛍光色素を含んでもよく、各々第一又は第二蛍光色素に共有結合して第三の吸収及び発光を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）第一の吸収スペクトル及び発光スペクトルを有する第一蛍光色素と、
ii）各々リンカー基を介して第一蛍光色素に共有結合した１種以上の第二蛍光色素であって、各第二蛍光色素が第二の吸収スペクトル及び発光スペクトルを有していて、第二蛍光色素の発光極大の波長が第一蛍光色素の発光極大よりも長く、各第二蛍光色素の吸収スペクトルの一部が第一蛍光色素の各々の発光スペクトルの一部と重複して第二蛍光色素の各々が第一蛍光色素からのエネルギーを受容し得る第二蛍光色素と
を含んでなる化合物であって、第一蛍光色素が次式の４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン基を含んでいる、化合物。
【化１】
2006500588.tif 000016
【請求項２】
当該化合物が標的物質と共有結合を形成し得る１個以上の標的結合基を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
当該化合物に共有結合した電荷担持置換基もしくは水可溶化置換基、又は
当該化合物に共有結合した電荷担持及び水溶化置換基
をさらに含んでおり、上記置換基が標的結合基と非反応性である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項４】
前記水溶化置換基が、アミド、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、４級アンモニウム、ヒドロキシル、グアニジニウム及びホスホネート基からなる群から選択される、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
前記荷電担持置換基が１〜５個の正荷電窒素原子又はリン原子を有する、請求項３記載の化合物。
【請求項６】
前記標的結合基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ハロアセトアミド、ジクロロトリアジン、マレイミド、スルホニルハライド、アシルハライド、無水物及びホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項７】
前記標的結合基が、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル及びカルボキシル基からなる群から選択される官能基である、請求項２記載の化合物。
【請求項８】
各第二蛍光色素が、キサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
前記標的物質が、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化した抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、並びに１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化したオキシもしくはデオキシ−ポリ核酸、微生物材料、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素からなる群から選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項１０】
各々リンカーを介して第一蛍光色素に共有結合した複数の第二蛍光色素を有し、第一蛍光色素が光励起されたときに各第二蛍光色素が第一蛍光色素からエネルギーを受容し得るものである、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
エネルギー移動の関係が成り立つように第二蛍光色素と連結した２個以上の第一蛍光色素をさらに含んでいて、各第一蛍光色素が色素４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン−５（６）−カルボン酸の基を含んでおり、２個以上の第一蛍光色素が上記基の４′−（又は５′−）アミノ基及びカルボキシル基を介して頭−尾で共有結合している、請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
第一又は第二蛍光色素に共有結合した１個以上の第三蛍光色素をさらに含んでいて、各第三蛍光色素が第三の吸収スペクトル及び発光スペクトルを有しており、第三蛍光色素の発光極大の波長が第二蛍光色素の発光極大の波長よりも長く、各第三蛍光色素の吸収スペクトルの一部が第二蛍光色素の発光スペクトルの一部と重複して第一蛍光色素の励起によって第三蛍光色素から蛍光が生じる、請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
次の構造を有する化合物。
【化２】
2006500588.tif 000017
式中、Ｄ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、−Ｌ２−Ｆ基及び−Ｌ２−Ｄ２基から選択され（ただし、Ｄ２はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択される色素である。）、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミド、ニトリル、アリール又はヘテロアリールを表すが、Ｒ２とＲ３及び／又はＲ４とＲ５が一体として縮合芳香族環又はへテロ芳香族環系を形成していてもよく、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、ＣＯＯＲ′、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ２ＯＨ、基−Ｌ３−Ｆ及び基−Ｌ３−Ｄ３を表し（ただし、Ｄ３はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択され、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）、
Ｆは標的結合基であり、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は各々連結基であって、独立に、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ′＝ＣＲ′−及び−ＣＯ−ＮＲ′基（ただし、Ｒ′は上記で定義した通り）から選択される１個以上の基を適宜含んでいてもよい炭素原子から選択される１〜４０個の連結原子を含む基である。
【請求項１４】
当該化合物が標的物質と共有結合を形成し得る１個以上の標的結合基を有する、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
当該化合物に共有結合した電荷担持置換基もしくは水溶化置換基、又は
当該化合物に共有結合した電荷担持及び水溶化置換基
をさらに含んでおり、上記置換基が標的結合基と非反応性である、請求項１３又は請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
前記水溶化置換基が、アミド、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、４級アンモニウム、ヒドロキシル、グアニジニウム及びホスホネートからなる群から選択される、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
前記荷電担持置換基が２〜５個の正荷電窒素原子を有する、請求項１５記載の化合物。
【請求項１８】
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が各々独立に１〜２０個の原子を含む、請求項１３記載の化合物。
【請求項１９】
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が各々独立に次式の基である、請求項１３記載の化合物。
−｛（ＣＨＲ′）ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ′）ｒ｝ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＲ′＝ＣＲ′−及び−ＣＯ−ＮＲ′から選択され、Ｒ′は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、各ｐは独立に０〜５であり、各ｒは独立に０〜５であり、ｓは１又は２である。
【請求項２０】
Ｑが−ＣＨＲ′−、−Ｃ（Ｏ）−及び−ＣＯ−ＮＨ−（ただし、Ｒ′、ｐ、ｒ及びｓは上記で定義した通り）から選択される、請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
前記標的結合基が標的物質の反応性基と反応する反応性基又は標的物質の反応性基と反応する官能基を含む、請求項１４記載の化合物。
【請求項２２】
前記反応性基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ハロアセトアミド、ジクロロトリアジン、マレイミド、スルホニルハライド、アシルハライド、無水物及びホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
前記官能基がアミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル及びカルボキシル基からなる群から選択される、請求項２１記載の化合物。
【請求項２４】
前記キサンチン色素が、フルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール及びこれらの誘導体から選択される、請求項１３記載の化合物。
【請求項２５】
前記ローダミン色素が、５−カルボキシローダミン（ローダミン１１０−５）、６−カルボキシローダミン（ローダミン１１０−６）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ−５又はＲＥＧ−５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ−６又はＲＥＧ−６）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ又はＴＭＲ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）から選択される、請求項１３記載の化合物。
【請求項２６】
前記シアニン色素が、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン）、Ｃｙ５（１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−ジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５（１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン）、Ｃｙ７（１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−トリカルボシアニン）から選択される、請求項１３記載の化合物。
【請求項２７】
前記標的物質が、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化した抗体、並びに脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化したオキシもしくはデオキシ−ポリ核酸、微生物材料、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素からなる群から選択される、請求項１４記載の化合物。
【請求項２８】
標的物質の標識方法であって、
ａ）標的物質を含有する液体に、請求項１又は請求項１３記載の蛍光エネルギー移動試薬を添加し、
ｂ）試薬を標的物質に結合させて標的物質を標識するのに適した条件下で、試薬を標的物質と共にインキュベートすること
を含んでなる方法。
【請求項２９】
前記標的物質が、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化した抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化したオキシもしくはデオキシ−ポリ核酸、微生物材料、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光色素、特に複数のドナー及び／又はアクセプターを有するエネルギー移動蛍光色素、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物系その他の成分の標識及び検出用に様々な蛍光色素が開発されている。ＤＮＡ配列決定用に開発され、広範に利用されている一群の色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）系蛍光色素であり、これらはドナー（供与体）色素とアクセプター（受容体）色素からなる。一般に、これらの色素において、ドナー色素とアクセプター色素を互いに適当な配向で近接して配置し、ドナーを吸収波長で励起したときに、ドナーが吸収した光子エネルギーがアクセプターに移動して、アクセプターの発蛍光団が蛍光を発するようにする。最も効率的なエネルギー移動を確実にするには、ドナーの発蛍光団が高い吸光係数と高量子収率を有するとともに、ドナーの吸収した励起エネルギーをアクセプターにアクセプター発蛍光団発光の形態で効率的に移動させることができることが重要である。さらに、効率的なエネルギー移動のためには、ドナー色素の発光とアクセプター色素の吸収が良好な重なり（オーバーラップ）をもつことが必要である。
【０００３】
様々なエネルギー移動蛍光色素が文献に記載されているが、その殆どが２つの発蛍光団（ドナーとアクセプターとして）からなる（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２，４３４７−４３５１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），２３１，１３１−１４０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），２４，１１４４−１１４８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６），２４３，１５−２７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），２５，２８１６−２８２２、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０００），４１，８８６７−８８７１）。しかし、上述の通り、エネルギー移動はドナーの発光とアクセプターの吸収とスペクトルの重なりの関数である。かかる重なりが僅かしかないと、フルオレセインと吸収波長が格段に長いＣｙ５（商標）のような蛍光色素でみられるように（フルオレセインは５２０ｎｍで発光し、Ｃｙ５は６５０ｎｍで吸収）、ＥＴが低くなる。かかる場合、２つの連続エネルギー移動過程は、スペクトルの重なりを改善することで、一段と効率的となる。
【０００４】
この種の方策については、２種類の連続的エネルギー移動過程に関与する蛍光色素に関する最近の文献（米国特許第６００８３７３号及び同第６１３００９４号）が先行文献として存在する。Ｗａｇｇｏｎｅｒ他の米国特許第６００８３７３号には、２つの連続的エネルギー移動の例が報告されているが、一回目がフルオレセインからＣｙ３へ、次いでＣｙ３から結合したＣｙ５へともう一度エネルギーが移動し、１７２ｎｍという大きなストークスシフトを起こしている。彼らは最も長時間発光する発蛍光団としてＣｙ７を用いた場合には、２８２ｎｍというさらに大きなストークスシフトを得た。しかし、２つの連続的エネルギー移動ステップが、例えば、フルオレセインからＣｙ５又はＣｙ７への直接移動よりも効率的であるか否かについては結論しなかった。
【０００５】
Ｊｕ他（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００１），１２３，１２９２３−１２９２４、国際公開第０２／２２８８３号）は、２６個のヌクレオチドを骨格とする三発色団標識オリゴヌクレオチドを構築し、Ｆ−４−Ｒ−６−Ｃｔ−１３と命名した。４８８ｎｍで励起した場合、この集合体の主な発光はＣｙ５により６７０ｎｍに起こり、ストークスシフトは１８２ｎｍであって、総量子収率は０．１３であったが、Ｃｙ５の量子収率は０．２７であった。しかし、４８８ｎｍでのＣｙ５の吸光係数が６５０ｎｍのピーク吸収よりも格段に小さかった（２％未満）ために、この集合体は４８８ｎｍで励起した場合、少なくともファクター２５、未修飾色素よりも輝度が大きかった。
【０００６】
ＤＮＡ配列決定用プライマー及びＰＣＲによる遺伝子解析用プライマーの標識に有用であるにも関わらず、かかる集合体はより一般的な汎用標識試薬として使用することができない。本発明では、我々は図１に示すように４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセインに基づく分子構造をもつ標識試薬を設計した。この分子設計ではドナーとアクセプターの発蛍光団間に最適な空間的接近を提供し、その結果、高エネルギー移動（ＥＴ）効率が提供される。
【０００７】
エネルギー移動の基礎はＴｈｅｏｄｏｒ  Ｆｏｒｓｔｅｒが提案した双極子−双極子相互作用メカニズムによるフォースター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）として一般に受け入れられている（Ｊｏｓｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９）。フォースター理論は、ドナーとアクセプター発蛍光団が接近する程、良好なエネルギー移動が起こることを示唆している。しかし、経験では互いに消光の原因となるので接近しすぎるべきではないことが分かっている。
【０００８】
従って、最も実用的なＥＴの適用におけるように、リンカーは米国特許第５８６３７２７号及び国際公開第００／１３０２６号に説明のあるように、発蛍光団同士を離して置くのが通常であった。これらリンカーの導入が事実上２つの発蛍光団間の空間的距離を広げ、結果としてエネルギー移動効率を低下させるという事実にも関わらず、この方法が採用されていた。
【０００９】
報告された文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），２５，２８１６−２８２２）では、ドナーとアクセプター発蛍光団間の最適乖離が、「ビフルオル−１」、すなわち、４′−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸に連結した５−カルボキシテトラメチル−ローダミンからなる色素二量体でみられるものであると思われる。しかし、「ビフルオル−１」は酵素組込性が悪いことなどを考慮して、ＤＮＡ配列決定には使用されなかった。
【００１０】
さらに、「ビフルオル−１」の構造は３つの発蛍光団間のエネルギー移動に使用することができない、その理由は、４′−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸に２つの発蛍光団を結合させた後には、ヌクレオチドなどの生物分子結合たのための官能基が残っていないからである。
【００１１】
この理由から、我々は、我々の「ビフルオル−１」用基本骨格として４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセインを開発した。かかる「ビフルオル−１」構造に基づく蛍光標識体は４８８ｎｍの波長でネオン−アルゴンレーザーで最適に励起することが可能であり、大きなストークスシフトをもつ有意差のある波長で蛍光を発する。また、５−又は６−カルボキシ基の導入により、この基本骨格は様々に適用し得る蛍光標識試薬の合成用途に拡張することができる。
【特許文献１】米国特許第６００８３７３号明細書
【特許文献２】米国特許第６１３００９４号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／２２８８３号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５８６３７２７号明細書
【特許文献５】国際公開第００／１３０２６号パンフレット
【非特許文献１】Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２，４３４７−４３５１
【非特許文献２】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），２３１，１３１−１４０
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），２４，１１４４−１１４８
【非特許文献４】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６），２４３，１５−２７
【非特許文献５】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），２５，２８１６−２８２２
【非特許文献６】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０００），４１，８８６７−８８７１）
【非特許文献７】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００１），１２３，１２９２３−１２９２４
【発明の開示】
【００１２】
従って、本発明は容易に調製し得る色素構築ブロックに基づき、またそれから合成した新規な一群の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）標識試薬を提供する。この標識試薬は「カセット」の形状をとり、広範囲の多様な生体物質その他に結合し得る。標識試薬は２以上の蛍光色素部分を含んでいて、これらの色素部分はリンカー基を介して共有結合しており、適宜試薬を標的に結合させる標的結合基を有する。標的結合基は標的物質上の相補基との共有結合形成に適するように選択される。或いは、エネルギー移動標識試薬は非共有結合によって標的物質に結合し得る。色素は、第一（すなわちドナー）色素の発光スペクトルが第二色素の吸収スペクトルと重なり合って両色素間にエネルギー移動が起こるようにする。色素構築ブロックは、構造（Ｉ）の４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン及び／又はその５（６）−カルボン酸である。
【００１３】
【化１】
2006500588.tif 000002
【００１４】
従って、第一の態様では、
ｉ）第一の吸収スペクトル及び発光スペクトルを有する第一蛍光色素と、
ii）各々リンカー基を介して第一蛍光色素に共有結合した１種以上の第二蛍光色素であって、各第二蛍光色素が第二の吸収スペクトル及び発光スペクトルを有していて、第二蛍光色素の発光極大の波長が第一蛍光色素の発光極大よりも長く、各第二蛍光色素の吸収スペクトルの一部が第一蛍光色素の各々の発光スペクトルの一部と重複して第二蛍光色素の各々が第一蛍光色素からのエネルギーを受容し得る第二蛍光色素と
を含んでなる化合物であって、第一蛍光色素が次の式（II）の４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン基を含んでいる、化合物が提供される。
【００１５】
【化２】
2006500588.tif 000003
【００１６】
第一の態様では、フルオレセイン発色団は、蛍光エネルギー移動標識試薬におけるドナー蛍光色素として用いられる。この構造に１個以上の第二蛍光色素が共有結合で結合する。１個以上の第二蛍光色素は第一（すなわちドナー）蛍光色素とエネルギー移動の可能な状態となり、その結果、第一蛍光色素の光励起により色素から第二アクセプター蛍光色素へのエネルギー移動が起こる。さらに、１個以上の追加の蛍光色素部分が関与する追加のエネルギー移動が生じてもよい。結果として、適宜１個以上の第三の蛍光色素が追加のリンカー基によって、「二発光団」複合体に共有結合で結合していてもよい。この構成で、第二蛍光色素の発光スペクトルの一部が１個以上の第三蛍光色素の吸収スペクトルと重なり合う。第三蛍光色素の発光極大波長は第二蛍光色素の波長より長く、その結果、光による励起により第一蛍光色素が吸収したエネルギーを第二から第三蛍光色素に移動させ、非常に大きなストークスシフトをもつ発光波長を生じる。
【００１７】
好ましくは、第一の側面による試薬は標的物質と共有結合を形成し得る１個以上の標的結合基を含む。
【００１８】
リンカー基は連結した原子の鎖、好適にはＣ１−４０アルキル鎖を含んでなり、鎖は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ′＝ＣＲ′−及び−ＣＯ−ＮＲ′基（ただし、Ｒ′は水素又はＣ１−４アルキルである）から選択される１個以上の基を適宜含んでいてもよい。鎖は所望によりエネルギー移動を妨げない当業者に公知の基、例えばＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ及びハロなどで適宜置換し得る。リンカー基は蛍光色素から伸びる構成部分を含んでいてもよく、リンカー基は色素発色団に結合した官能基、好適にはフルオレセイン発色団に結合した４′−及び／又は５′−アミノメチル基及び／又は５（６）−カルボン酸基から誘導し得る。従って、リンカーは色素発色団に共有結合するが、リンカーは色素発色団の一部ではない。さらに、リンカー基はドナー発色団とアクセプター発色団との間の共役が起こらないようにするべきである。
【００１９】
本発明による蛍光エネルギー移動標識複合体は、効率５０〜９９％の範囲のエネルギー移動を示す。エネルギー移動効率は、スペクトルの重なり、ドナーとアクセプター間の空間的隔たり、ドナーとアクセプターの相対的配向、ドナーの量子収率、及びドナーの励起状態寿命など幾つもの因子に左右される。好適な態様では、蛍光色素は効率的なエネルギー移動を可能とする距離、好ましくは７５％を超える効率を可能とする距離だけ離すことができる。
【００２０】
本発明において、「基」という用語は第一蛍光色素のコア構造を定義するために使用し、４′，５′−ビスアミノメチルフルオレセイン（又はその５（６）−カルボン酸誘導体）から誘導する。従って、４′，５′−ビスアミノメチルフルオレセインは、蛍光エネルギー移動試薬を合成するための分子構築ブロックを形成する。追加の蛍光色素の共有結合の好適な位置、及び本明細書に定義した任意の他の置換基を図１に示す。さらに、式（II）の蛍光色素基の芳香族環構造の１個以上の水素原子が所望により置換基と置き換え可能であり、置換基は、ハロゲン（フッ素及び塩素など）、ニトリル、ヒドロキシ、チオール、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ及びアリールから選択される。
【００２１】
本発明の蛍光エネルギー移動標識試薬は、試薬が生体化合物などの物質を標識するために標的物質と共有結合を形成し得る標的結合基を含む。標的結合基はリンカー基を介して発色団構造に連結可能であり、好ましくは（絶対的ではないが）、４′，５′−ビスアミノメチルフルオレセインの４′−及び／又は５′−アミノメチル基を化学的に修飾することにより誘導する。４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン−５（６）−カルボン酸を色素構築ブロックとして使用するなら、周知の方法により５−又は６−カルボン酸部分も化学的修飾を受け、結果として標的結合基が導入される。標的結合基は、担体物質、生体化合物、又は追加の色素分子などの標的物質に色素を結合させるために適したどのような基でもよい。例えば、標的結合基は適当な条件下で標的物質の相補官能基と反応し得る反応基でよい。或いは、標的結合基Ｆは官能基でもよく、標的は反応性成分を含み得る。いずれの場合にも、標的分子は本発明による試薬によって共有結合により標識されることになる。適当な反応性基はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ハロアセトアミド、ジクロロトリアジン、マレイミド、スルホニルハライド、アシルハライド、無水物及びホスホロアミダイトから選択する。適当な官能基はヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル及びカルボキシル基から選択する。
【００２２】
好適には、本発明の蛍光エネルギー移動標識試薬は、以下の構造（III）を有する化合物である。
【００２３】
【化３】
2006500588.tif 000004
【００２４】
式中、Ｄ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、−Ｌ２−Ｆ基及び−Ｌ２−Ｄ２基から選択され（ただし、Ｄ２はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択される蛍光色素である。）、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミド、ニトリル、アリール又はヘテロアリールを表すが、Ｒ２とＲ３及び／又はＲ４とＲ５が一体として縮合芳香族環又はへテロ芳香族環系を形成していてもよく、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、ＣＯＯＲ′、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ２ＯＨ、基−Ｌ３−Ｆ及び基−Ｌ３−Ｄ３を表し（ただし、Ｄ３はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択される蛍光色素であり、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）、
Ｆは標的結合基であり、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は各々連結基であって、独立に、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ′＝ＣＲ′−及び−ＣＯ−ＮＲ′基（ただし、Ｒ′は上記で定義した通り）から選択される１個以上の基を適宜含んでいてもよい炭素原子から選択される１〜４０個の連結原子を含む基である。
【００２５】
好ましくは、式（II）の化合物は標的物質と共有結合を形成し得る１個以上の標的結合基を含む。
【００２６】
好ましくは、式（III）の化合物において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は各々独立に１〜２０個の原子を含む。
【００２７】
好ましくは、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は各々独立に以下の基である。
【００２８】
−｛（ＣＨＲ′）ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ′）ｒ｝ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＲ′＝ＣＲ′−及び−ＣＯ−ＮＲ′から選択され、Ｒ′は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、各ｐは独立に０〜５であり、各ｒは独立に０〜５であり、ｓは１又は２である。
【００２９】
好ましくは、Ｑは−ＣＨＲ′−、−Ｃ（Ｏ）−及び−ＣＯ−ＮＨ−（ただし、Ｒ′、ｐ、ｒ及びｓは上記で定義した通り）から選択される。
【００３０】
反応性基とその相補官能基の具体例を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2006500588.tif 000005
【００３２】
利用可能なアミノ及びヒドロキシル官能基で標的物質を標識するのに有用な特に好適な反応性基には、以下のものがある。
【００３３】
【化４】
2006500588.tif 000006
【００３４】
利用可能なチオール官能基で標的物質を標識するのに有用な特に好適な反応性基には、以下のものがある。
【００３５】
【化５】
2006500588.tif 000007
【００３６】
適当なアミノ保護基については当業者に周知であり、Ｎ−メチル、Ｎ−ｔブチル及びＮ−アリルなどのＮ−アルキル及びＮ−アルケニル誘導体、カルバミン酸ベンジルなどのカルバミン酸エステル、及びＮ−ホルミル、Ｎ−アセチル及びＮ−ベンゾイルなどのＮ−アシル誘導体などである。アミノ基の保護基を含む式（III）の化合物の誘導体は、他の蛍光色素、標的結合基、水溶化及び電荷担持置換基の結合に際して、分子構築ブロック、４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセインに基づくエネルギー移動色素標識試薬の合成に有用である。
【００３７】
アリールとは、炭素原子数６〜１０の縮合芳香族環を１又は２個含む芳香性置換基、例えばフェニル又はナフチルであり、アリールは独立に、例えば、ハロゲン、炭素原子数１〜１０の直鎖もしくは枝分れアルキル基、アラルキル及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシなどの１個以上の置換基で適宜置換されていてもよい。
【００３８】
ヘテロアリールとはモノ−もしくはビシクロ５員環〜１０員環芳香族環系であって、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個以上３個以下のヘテロ原子を含み、独立に、例えば、ハロゲン、炭素原子数１〜１０の直鎖もしくは枝分れアルキル基、アラルキル及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシなどの１個以上の置換基で適宜置換されていてもよい。
【００３９】
ハロゲン及びハロ基はフッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される。
【００４０】
好適なキサンチン色素の例は、フルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール及びその誘導体から選択される。
【００４１】
好適なローダミン色素の例は、５−カルボキシローダミン（ローダミン１１０−５）、６−カルボキシローダミン（ローダミン１１０−６）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ−５又はＲＥＧ−５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ−６又はＲＥＧ−６）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ又はＴＭＲ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）から選択される。
【００４２】
好適なシアニン色素の例は、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン）、Ｃｙ５（１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−ジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５（１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン）、Ｃｙ７（１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−トリカルボシアニン）から選択される。
【００４３】
本発明の一態様では、蛍光標識試薬はさらに直接、又は適当なリンカー基を介して間接的に色素発色団に共有結合した１個以上の水溶化置換基を含む。水溶化成分は複合体の標的結合基と非反応性でなければならない。水溶化基、例えば、スルホネート、スルホン酸及び四級アンモニウムなどは、色素発色団の芳香族環構造に直接結合し得る。或いは、水溶化基はＣ１〜Ｃ６アルキルリンカー鎖により、芳香族環構造に結合させることができ、基−（ＣＨ２）ｋ−Ｗ（ただし、Ｗはスルホネート、スルホン酸、四級アンモニウム及びカルボキシルから選択される、ｋは１〜６の整数である）から選択し得る。水溶解性は生物標的物質、例えば、タンパク質及び核酸誘導体などを標識しようとする場合に有利である。
【００４４】
別法として、低親水性極性形状のエネルギー移動試薬は、塩基対間に挿入することにより、又はＤＮＡの小溝内での相互作用により、ＤＮＡに非共有的に結合させてもよい。かかる化合物はＤＮＡの定量又は位置決定に有用である。この態様では、本発明の蛍光標識試薬はさらに電荷担持基、好適には１〜５個の正荷電窒素又はリン原子を含む鎖を含んでなる。これら正に荷電した窒素もしくはリン原子の一部はリンカー基Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３に存在し得る。好ましくは、電荷担持基は正荷電窒素原子を含み、各々四級アンモニウム基、或いはプロトン化三級アミノ基、グアニジニウム基又はピリジニウム基で与えられる。特に好適な電荷担持基は１〜３０個の鎖炭素原子を含む直鎖もしくは枝分れであり、以下の構造を有する基である。
【００４５】
−（ＣＨ２）ｍＮ＋ＲａＲａＲｂ
式中、各Ｒａは独立にＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＲｂはＣ１〜Ｃ４アルキルであるか、又は−（ＣＨ２）ｍＮ＋ＲａＲａＲｂであり（ただし、Ｒａ及びＲｂは前記定義のとおりである）、ｍは１〜４の整数である。標識複合体上の追加の電荷は本発明エネルギー移動試薬で標識した標的分子の電気泳動での移動操作を可能とする。
【００４６】
もう一つの態様では、蛍光標識試薬はさらに第二蛍光色素とエネルギー移動の関係を有するように連結した２個以上の第一蛍光色素を含んでなる。図２に示すように、第一蛍光色素は各々色素４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン−５（６）−カルボン酸基を含んでなり、蛍光色素は該基の４′−（又は５′−）アミノ基及びカルボキシル基を介して頭−尾で共有結合している。第一蛍光色素「複合体」は第二蛍光色素及び／又は標的物質の共有結合に利用し得るさらなる部位を含む。光での励起により、フルオレセインドナー分子は吸収した併合エネルギーを第二蛍光色素に移動する。
【００４７】
単一ドナーと単一アクセプター蛍光色素を含む本発明の態様に加えて、本発明による蛍光エネルギー移動標識試薬は、さらに第一又は第二蛍光色素に共有結合により結合した、各々第三の吸収と発光スペクトルをもつ１個以上の第三蛍光色素を含んでなる。例えば、第三蛍光色素は第二蛍光色素に結合し得る。この例では、第三蛍光色素の発光極大波長が第二蛍光色素の発光極大波長よりも長い。第三蛍光色素の吸収スペクトルの一部は第二蛍光色素の発光スペクトルの一部と重なり、その結果、第一蛍光色素を励起することで、第三蛍光色素から蛍光を生じる。
【００４８】
本発明のさらに別の態様では、蛍光標識試薬は複数の第二蛍光色素を含み得るものであり、各々リンカーを介して第一蛍光色素に結合し、第二蛍光色素は各々、第一蛍光色素が光により励起されたときに、第一蛍光色素からエネルギーを受容し得るものである。第一蛍光色素の吸光係数は好適には５００００リットル／モルｃｍより大きく、量子収率は０．５より大きく、好ましくは０．７５より大きい。好ましくは、第二蛍光色素は４００００リットル／モルｃｍより大きい吸光係数と０．１以上の量子収率をもつ（フルオレセインを１として比較）。さらに、第三蛍光色素は、もし標識複合体に採用するなら、好ましくは４００００リットル／モルｃｍを超える吸光係数と、同様に０．１以上の量子収率をもたねばならない。一態様では、ドナーからアクセプター発色団へのエネルギー移動は、４８８ｎｍで蛍光色素を励起し、次いでエネルギー移動過程で最も長い発光の蛍光色素から発光させることにより達成し得る。或いは、カスケード過程において、ドナーと中間蛍光色素の両方が４８８ｎｍで同時に励起を受け得る。両蛍光色素により吸収されたエネルギーは、次いで第三蛍光色素に転移される。
【００４９】
さらに別の態様では、エネルギー移動試薬はアクセプター蛍光色素又は他の官能基をもつフルオレセインポリマーの鎖を、鎖上の異なる位置に結合して含み得る、結果として、図３に示すように、異なる特定の適用要件を満足する。アクセプターは要求されたものと同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００５０】
本発明の標識試薬は、好ましくは公知の方法により４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン−５（６）−カルボン酸を他の蛍光色素に共有結合により連結し、エネルギー移動ドナー−アクセプター標識試薬を形成させることにより合成する。このエネルギー移動試薬を用いて標的物質を共有結合により標識し、それによって蛍光の性質を付与することができる。従って、第二の態様では、標的物質の標識方法であって、標的物質を含有する液体に、本発明による蛍光エネルギー移動試薬を添加し、試薬と標的物質とを、標的物質に結合し、標識するのに適した条件下にインキュベートすることを特徴とする方法が提供される。本方法は、標的と標識試薬との間に共有結合連結を形成するための条件下に、１個以上の標的結合基を有するエネルギー移動標識試薬の一定量と標的物質とをインキュベートすることからなる。適当な標的生体物質は、これらに限定されるものではないが、１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化した抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、又は１個以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートもしくはチオホスフェート基を含む又は含むように誘導体化したオキシもしくはデオキシ−ポリ核酸、微生物材料、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素からなる群である。
【００５１】
別の態様では、蛍光試薬は標的結合基をもつ必要がなく、非共有結合により他の化合物に結合させるために使用することができる。例えば、複合体を有機溶媒に溶解し、次いでポリスチレンなどのポリマー粒子と混合し、次いで乳化重合するまで撹拌する。溶媒は蒸発させ、蛍光色素複合体をポリスチレン粒子に吸収させる。
【００５２】
本発明は添付の図面を参照することにより、よりよく理解し得るであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明はストークスシフトの大きな蛍光標識試薬を提供する。本発明の目的上、標識試薬のストークスシフトは試薬の最短波長光吸収体の吸収極大と最長波長発光体の発光極大間がナノメートルの差である。本明細書に記載のエネルギー移動標識試薬は、短波長吸収体から長波長発光体へエネルギーを移動し、大きなストークスシフトを生じるために、共に連結した２個以上の発蛍光団を含み得る。
【００５４】
図４に示すように、第一ドナー発蛍光団である短波長吸収発蛍光団は、励起波長（実線）でその吸光度スペクトル内に励起によるエネルギーを吸収し、その発光スペクトル内の波長（破線）でエネルギーを放出する。第一発蛍光団が第二発蛍光団に適当な距離と配向で連結している場合、第一発蛍光団はその励起状態から第二発蛍光団に、第二発蛍光団の吸収スペクトル（実線）内の波長で、エネルギーを移動又は供与する。第二発蛍光団は供与されたエネルギーを受領し、その発光スペクトル（破線）内の波長でそれを放出するが、図示した通り、第一発蛍光団の発光の最長波長よりも波長としてより長い。この過程は最終最長波長の発蛍光団が一連のエネルギー移動を終了するまで繰り返される。
【００５５】
一方の発蛍光団から隣接位の発蛍光団へ移動されるエネルギー量は、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとの重なりに依存するだけではない、これは図４に示すように、第一及び第二発蛍光団間の陰影領域で説明される。共鳴エネルギー移動に関するフェルスター理論は、移動されるエネルギーの量が重なり領域の波長に第四のパワー依存性をもつスペクトル重なり時間に左右されると予測する。従って、エネルギー移動はよりながい吸収と発光波長をもつ発蛍光団間でより効率的である。
【００５６】
本発明に関する蛍光標識試薬は低分子量であり、抗体、その他のタンパク質、及びＤＮＡプローブに容易に会合し得る。本明細書で使用する場合、低分子量とは標識試薬の組合せ分子量が５００〜１００００ダルトンであることを意味するものとする。従って、これらの標識種は、現在使用されている大きなフィコビリンタンパク質標識で可能であるよりも、細胞内環境にはるかに侵入し易い。本発明の低分子量蛍光標識試薬は、フローサイトメトリーのみならず、レーザー共焦点顕微鏡に、また単波長励起による多色検出を必要とするその他の検出系に有用である。
【００５７】
蛍光標識試薬は、好ましくは標的化合物上の対応する基と共有結合を形成し得る基を含む。好ましくは、反応性の基が標識試薬上にあり、また官能基が標的化合物又は分子にある。しかし、当業者も認めるように、官能基が標識試薬上にあって、反応基が標的上にあってもよい。
【００５８】
本発明による蛍光エネルギー移動色素は、混合物中の種々の成分の検出及び識別などへの適用に使用し得る。従って、本発明はまた式（III）の２種以上の異なる蛍光エネルギー移動標識試薬のセットを提供し、この場合、セット中の各標識試薬は実質的に同じ波長の光エネルギーを吸収し、セット中の各々の他の試薬から識別し得る波長で発光（又は蛍光放出）する。少なくとも２種の本発明標識試薬を含む試薬のセットは多数サンプル中に存在する標的生体化合物を検出するための多重パラメータ方法に使用し得る。方法は、ａ）各個々のサンプルと、蛍光標識セットからの異なる標識とをインキュベートして蛍光標識したサンプルを提供する工程、ｂ）蛍光標識サンプル各々を混合してすべてのサンプルを含む単一の混合物を形成させる工程、及びｃ）単一混合物を単一波長の励起源で照射して、異なる蛍光標識のサンプルの各々に相当する蛍光発光を検出する工程、からなる。
【００５９】
本発明の蛍光標識試薬に使用し得る一部色素の例を表２に示す。これらの例は説明のみを目的とするものであって、他の同様のタイプの色素も使用し得る。以下の実施例は添付の請求項及び本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。本発明は本明細書に示した教示から明らかとなるいずれの、またすべての変法をも包含するものである。
【００６０】
【表２】
2006500588.tif 000008
【実施例】
【００６１】
１．  ４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセインの合成
１．１  ４′，５′−ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチル−フルオレセイン
フルオレセイン（３．３グラム）及び２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミド（５．０グラム）を濃硫酸２０ｍｌに溶解した。暗褐色溶液を室温で２時間撹拌した。この時点で、ＥＳＭＳ＋は原料のフルオレセインが残っていないことを示した。生成物を２００グラムの氷水中に注ぎ、沈殿を濾取し、水洗し、次いでエーテルで洗い、空気乾燥した。このようにして得られた物質のＮＭＲはこのものが所望の生成物であることを示していた。
【００６２】
１．２  ４′，５′−ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチル−フルオレセインの加水分解
上記反応の生成物を濃塩酸４０ｍｌに懸濁し、３０分間加熱還流した。澄明な溶液を得た。生成物を蒸発乾固し、残渣をメタノール／ジクロロメタンから再結晶し、所望の生成物、４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセインを得た、これをＮＭＲとＥＳＭＳ＋により同定した。
【００６３】
２．  ４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の合成
フルオレセイン−５−カルボン酸は濃硫酸に殆ど溶けないので、以下の改良法を採用した。
【００６４】
２．１  ４′，５′−ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチル−フルオレセイン−５−カルボン酸
濃硫酸２０ｍｌに室温、撹拌下、ジピバロイル−フルオレセイン−５−カルボン酸を加えた。この懸濁液に、澄明な溶液が得られるまで、過剰（４当量）の２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミドを分割して加えた。さらに、原料物質（フルオレセインと２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミドの両方）を、溶液の色が淡黄色から褐色になるまで加えた。この溶液を氷／水混合物に注いだ。このようにして得られた沈殿を水とエーテルで洗った。この沈殿のＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋は、このものが所望の生成物であることを示した。
【００６５】
２．２  ４′，５′−ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチル−フルオレセイン−５−カルボン酸の加水分解
上記２．１からの生成物（１．０１グラム）を濃塩酸２０ｍｌと２−メトキシエーテル５ｍｌに懸濁した。得られる懸濁液を加熱撹拌すると、約２時間で澄明となった。次いで、この溶液を放冷した。室温で一夜放置後、塊状沈殿が生じた。沈殿を濾取し、０．１Ｎ塩酸、次いでエーテルで洗い、所望の生成物、４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン−５−カルボン酸を得た。ＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋により確認した。
【００６６】
３．  アミノメチル−ＦＡＭ−Ｃｙ５ビフルオル（ＢＢ）の合成
４′−アミノメチル−フルオレセイン（５ｍｇ）を乾燥ＤＭＦ０．５ｍｌに溶解した。この溶液に重炭酸ナトリウム−炭酸塩緩衝液１．０ｍｌ中のＣｙ５モノ官能反応性色素２０ｍｇを加えた。室温で２０分後、溶媒を蒸発させ、残渣をクロマトグラフして、所望の生成物（ＢＢ）を得た。
【００６７】
【化６】
2006500588.tif 000009
【００６８】
容易に分かることは、４′，５′−ビスアミノメチル−ＦＡＭ−Ｃｙ５ビフルオルを調製するために、４′−アミノメチル−フルオレセインの代わりに４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン（実施例２と同様の方法で調製）を使用し得ることであり、さらにこの分子の遊離の５′−アミノメチル位置に結合した標的結合基をもつエネルギー移動標識試薬の調製に使用し得ることである。例えば、反応スキーム１に示すように、４′，５′−ビスアミノメチル−ＦＡＭ−Ｃｙ５ビフルオルをピリジン中、無水コハク酸又は無水グルタール酸で処理すると、カルボン酸誘導体化ビフルオル色素を与え、これはさらにＤＭＦ中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させることにより、その反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体に変換することができる。
【００６９】
【化７】
2006500588.tif 000010
【００７０】
４．  アミノメチルＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−Ｃｙ５（ＴＡ）の合成−「トリフルオル」
トリフルオル、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−Ｃｙ５の合成には以下の工程が関与する。
【００７１】
４．１  アミノメチルＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ「ビフルオル」（ＢＡ）
【００７２】
【化８】
2006500588.tif 000011
【００７３】
４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン（４ｍｇ）及び５−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（１０ｍｇ）を過剰のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含む乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶解した。反応は室温で一夜進行させた。生成物をＴＬＣで精製し、所望のビフルオル（ＢＡ）を得た。
【００７４】
４．２  アミノメチル−ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−Ｃｙ５「トリフルオル」（ＴＡ）
【００７５】
【化９】
2006500588.tif 000012
【００７６】
上記４．１で得たビフルオル（ＢＡ）を過剰のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えた乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中の少過剰のＣｙ−５単官能性ＮＨＳエステルを加えた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上、原料物質の消失により示される反応の終末点にて、溶媒を蒸発乾固させ、残渣をＣ１８逆相ＴＬＣプレートによりクロマトグラフし、所望の生成物（ＴＡ）を得た。
【００７７】
生体分子に対するトリフルオル（ＴＡ）の結合
４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン−５（６）−カルボン酸（実施例２と同様に調製）を４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセインの代わりに用いて４′，５′−ビス−アミノメチル−ＦＡＭ−５（６）カルボン酸−Ｃｙ５「ビフルオル」又はアミノメチル−ＦＡＭ−５（６）カルボン酸−ＴＡＭＲＡ−Ｃｙ５「トリフルオル」を調製し、これを用いて、分子中のドナーフルオレセインの遊離の５（６）−位置に結合した標的結合基をもつエネルギー移動標識試薬を調製し得る。例えば、４′，５′−ビス−アミノメチル−ＦＡＭ−５（６）カルボン酸−ＴＡＭＲＡ−Ｃｙ５「トリフルオル」は、ＤＭＦ中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させることにより、その反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体に変換することができる、このものは次いで標的の生物分子と反応させ得る。
【００７８】
【化１０】
2006500588.tif 000013
【００７９】
５．  エネルギー移動測定
５．１  ドナー蛍光色素からアクセプター蛍光色素へのエネルギー移動の程度を実際に定量するのは、２つの発蛍光団の場合であっても関与するものが複雑であるため、エネルギー移動を定量するための正確な信頼の置ける方法は公開されていない。最近の文献によると、一般に、「エネルギー移動の効率は、アクセプターが結合されたときに生じるドナー蛍光の消光量（ＤＱＥ）を計算することにより推定された」。他の例では、ドナー−アクセプター対の「蛍光強度」の比較は、ドナー吸収波長での励起にもつづき、アクセプターからのその発光波長での発光強度を比較することにより得た。ドナー濃度の差の補正は、ドナー吸収波長での吸収により、ドナー−アクセプター対の濃度を測定することにより実施した。この方法はドナー−アクセプター対のエネルギー移動効率を比較する手段を提供する、しかし、これは同じドナーが関与する場合に限定される。
【００８０】
研究中に判明したことは、ＤＱＥに基づく第一評価方法がドナーとアクセプター間のエネルギー移動量を機械的に誇張してしまうことであった、その理由はドナーによるエネルギー喪失量がアクセプターに完全に伝達されることはめったにないからである。第二の直接比較法はドナー−アクセプター対を異なるドナーと比較し得る柔軟性を提供しない。
【００８１】
従って、新しい方法はドナーが吸収するエネルギーの部分（ドナー発光としては放出されない）、すなわち、アクセプターに伝達される部分を定量するために開発された。これはアクセプターが実際に発光するＤＱＥのパーセントである。この方法は以下を測定することからなる。
ｉ）非会合状態におけるドナーとアクセプターの吸収及び発光特性。
ii）ドナー−アクセプター対の吸収スペクトル。光学密度（ＯＤ）はドナー吸収波長及びアクセプター波長にて記録する。蛍光に基づくドナー−アクセプター対について、４８８ｎｍでのＯＤを測定するが、この波長はドナー−アクセプター対を励起するために使用するからである。
iii）ドナー発光波長で測定されるドナーが放出する光子数及びドナー吸収波長での励起によるアクセプター発光波長で測定されるアクセプターが発光する光子数。蛍光に基づくドナー−アクセプター対について、励起波長は４８８ｎｍである。
iv）アクセプター吸収波長での励起に基づくドナー−アクセプター対のアクセプターが放出する光子数。
【００８２】
定義
ｉ）傾斜（ＳＬ）：励起波長で励起される発蛍光団のＯＤで除した放出された光子数である。ＯＤは吸収された光子数に正比例するので、その傾斜は量子収率に比例し、吸収された光子で割った放出光子数と定義する。典型的に、この数は機器依存性であり、その形状に左右され、励起起源と光電子倍増効率には補正が必要である。プリセットパラメータをもつ特定の機器では、フルオレセインなどの標準化合物について測定される傾斜が、実験誤差内の定数に極めて近い。
ii）ＳＬＤＦＤは、ドナー吸収波長で励起したときの遊離状態におけるドナーの傾斜である。
iii）ＳＬＤＣＤは、ドナー吸収波長で励起したときのドナー−アクセプター対におけるドナーの傾斜である。
iv）ＳＬＡＦＡはアクセプター吸収波長で励起された遊離状態でのアクセプターの傾斜である。
ｖ）ＳＬＡＣＤはドナー吸収波長で励起したときのドナー−アクセプター対におけるアクセプターの傾斜である。
vi）ＳＬＡＣＡはアクセプター吸収波長で励起したときのドナー−アクセプター対におけるアクセプターの傾斜である。
vii）ＰＱＥＱはドナー消光のパーセントである（＝ＤＱＥ１１）。
viii）ＰＥＥＡはドナー−アクセプター対におけるアクセプターのパーセント量子収率をアクセプター吸収波長で励起したときの遊離アクセプターの収率との比較である。
ix）ＰＥＴはドナー吸収波長で励起したときのドナー−アクセプター対において、アクセプターが発光するためにドナーが吸収するエネルギーのパーセントエネルギー移動である。
【００８３】
次の計算を実施し得る。
【００８４】
１．ＰＱＥＱ＝（１−ＳＬＤＣＤ／ＳＬＤＦＤ）×１００％
２．ＰＥＥＡ＝（ＳＬＡＣＡ／ＳＬＡＦＡ）×１００％
３．ＰＥＴ＝（ドナーの量子収率）×ＳＬＡＣＤ／ＳＬＤＦＤ
５．２  ビフルオルにおけるエネルギー移動、アミノメチルＦＡＭ−Ｃｙ５（ＢＢ
一例として、以下の数値はドナー−アクセプター対、アミノメチルＦＡＭ−Ｃｙ５（ＢＢ）におけるエネルギー移動の測定において得られた（ＭｅＯＨ溶媒＋１滴のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）。
【００８５】
ＳＬＤＦＤ＝１．４１×１０８
ＳＬＡＦＡ＝１．３９×１０８
ＳＬＤＣＤ＝１．１２×１０７
ＳＬＡＣＤ＝１．３８×１０７
ＳＬＡＣＡ＝１．４６×１０８
従って、ＰＱＥＱ＝９２％
ＰＥＥＡ＝１０６％及び
ＰＥＴ＝１０％（蛍光の光子収量１．０として）
図７に示す流れ図は上記の数値から構築し得るものであり、ドナー−アクセプター対（ＢＢ）におけるフルオレセインドナーが吸収する１００個の光子の運命をモニターし、数値が有意であることを示す。この流れ図から分かるように、１００個の光子を吸収したドナーに対し９２個の光子の減量の内、１０個のみがアクセプターに移動する。従って、引用した米国特許第６１３００９４号公報に記載されているように、ＤＱＥはアクセプターに伝達されたエネルギー（光子）の概算に使用できない。
【００８６】
５．３  トリフルオルにおけるエネルギー移動、アミノメチルＦＡＭ−Ｃｙ５（ＢＢ
エネルギー移動を定量する本方法はエネルギー移動蛍光標識試薬における２個を超える発蛍光団に拡張することができる。一例として、溶媒として痕跡のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含むＭｅＯＨ中、トリフルオル（ＴＡ）のエネルギー移動について、以下の結果を得た。
【００８７】
１）第一ドナーのＰＱＥＱ
２）第一アクセプターのＰＥＥＡ（ＰＥＥＡ１）
３）第一アクセプターに対する第一ドナーのＰＥＴ（ＰＥＴ１）
４）第二アクセプターのＰＥＥＡ（ＰＥＥＡ２）
５）第二アクセプターに対する第一ドナーのＰＥＴ（ＰＥＴ２）
従って、ＰＥＱＥ＝９０％
ＰＥＥＡ１＝０％、（（ＴＡ）におけるＴＡＭＲＡ発蛍光団からの発光は、フルオレセイン吸収波長又はＴＡＭＲＡ吸収波長のいずれの励起によっても観察されなかった）
ＰＥＴ１＝０％
ＰＥＥＡ２＝４３％
ＰＥＴ２＝３９％
エネルギー（光子）流れ図は、図８に示すように構成し得る。（ＢＢ）と（ＴＡ）のエネルギー移動を比較することにより、中間の発蛍光団、ＴＡＭＲＡの導入がフルオレセインからＣｙ５へのエネルギー移動を４倍改善することが分かる。この改善は、単一の直接ワンステップエネルギー移動において、連続的エネルギー移動ステップの良好なスペクトルの重なりの結果として得られた。さらに、
１）アクセプターの量子収率／ドナーの量子収率は、ＳＬＡＦＡ／ＳＬＤＦＤ比に等しい。従って、もしドナーがフルオレセインであるなら、ＳＬＡＦＡ／ＳＬＤＦＤ比はアクセプターの量子収率（フルオレセインを１．０として比較）を与える。
【００８８】
２）測定したＰＥＴは事実上ドナー吸収波長で励起したドナー−アクセプター対の量子収率であり、アクセプター発光極大として測定される発光を伴う。この相関は複数のアクセプターをもつドナー−アクセプター対に適用し得る。
【００８９】
６．  正荷電アミノメチルＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ（ドナー−アクセプター対（ＢＣ））の合成
【００９０】
【化１１】
2006500588.tif 000014
【００９１】
以前に得られたビフルオル（ＢＡ）をＤＭＦに溶解し、（ＣＨ３）Ｎ＋（ＣＨ２）３Ｎ＋（ＣＨ）２（ＣＨ２）３Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＯＯＨで示される酸のスクシンイミジルエステルの炭酸塩／重炭酸塩溶液と室温で２０分間反応させた。溶媒を減圧下に留去し、残渣をＣ１８逆相カラム上クロマトグラフし、所望の生成物を得た。
７．  アミノメチルＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−ターミネーター（ＢＤ）の合成
エネルギー移動色素で標識した２′，３′−ジデオキシシチジン三リン酸の調製は以下のステップに従った（反応スキーム２）。
【００９２】
【化１２】
2006500588.tif 000015
【００９３】
７．１  実施例１と同様に得られる４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセインをＤＭＦに溶解し、無水コハク酸と反応させて前駆体（ＢＥ）を得た。
【００９４】
７．２  ピリジンとジクロロメタンの混合物中、化合物（ＢＥ）をトリフルオロ酢酸ＮＨＳエステルと反応させ、中間体（ＢＧ）を得た。
【００９５】
７．３  化合物（ＢＧ）をＤＭＳＯに溶解し、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中、ジデオキシシチジン三リン酸に結合した適当なリンカーと反応させ、粗生成物（ＢＨ）を得た。
【００９６】
７．４  ７．３で得られた生成物を精製し、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルと反応させ、最終生成物を得た。これを逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００９７】
上に説明した本発明の教示の恩典を有する当業者は、それに対して多くの改善をなし得る。これらの改善も添付の請求項に記載した本発明の範囲内に包含されるもの解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】４′，５′−ビス−アミノメチル−フルオレセイン分子構築ブロックの構造、及び他の発蛍光団、標的結合基、水溶化及び電荷担持置換基、及び／又は標的物質の結合可能な好適な位置を示す。
【図２】二量化４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の分子構造、及び他の発蛍光団及び／又は他の標的物質の結合可能な好適な位置を示す。
【図３】４′，５′−ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸ポリマーの分子構造、及び他の発蛍光団及び／又は他の標的物質の結合可能な位置を示す。
【図４】ＦＲＥＴに適する発蛍光団の重なり合う吸収（――）スペクトル及び発光（−−−−）の説明図である。
【図５】ＭｅＯＨ／ヒュニッグ（Ｈｕｎｉｇ）塩基中、ＦＡＭ−Ｃｙ５「ビフルオル」の吸収及び発光（４８８ｎｍで励起）スペクトルを示す。
【図６】ＭｅＯＨ／ヒュニッグ（Ｈｕｎｉｇ）塩基中、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ−Ｃｙ５「トリフルオル」の吸収及び発光（４８８ｎｍで励起）スペクトルを示す。
【図７】ドナー−アクセプター対（ＢＢ）の光子の流れ図である。流れ図はドナー−アクセプター対（ＢＢ）において、フルオレセインドナーが吸収した１００光子の運命をモニターする。
【図８】トリフルオル（ＴＡ）−アクセプター対（ＢＢ）の光子の流れ図である。流れ図はドナー−アクセプター対（ＢＢ）において、フルオレセインドナーが吸収した１００光子の運命をモニターする。
【図１】
2006500588.tif 000018
【図２】
2006500588.tif 000019
【図３】
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【図４】
2006500588.tif 000021
【図５】
2006500588.tif 000022
【図６】
2006500588.tif 000023
【図７】
2006500588.tif 000024
【図８】
2006500588.tif 000025
【国際調査報告】
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