(57)【要約】医薬品として使用するために、無菌様式で自然源からタンパク質を単離するためのプロセスであって、前記プロセスは、（１）病原体を除去するのに十分小さい微細孔を持つ無菌膜を用意し、（２）自然源から得られたタンパク質溶液を、無菌環境下で前記膜に通し、（３）無菌ろ過物を回収するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用するために、無菌様式で自然源からタンパク質を単離するためのプロセスであって、ここで前記プロセスが、
（１）病原体を除去するのに十分小さい微細孔を持つ無菌膜を用意し、
（２）自然源から得られたタンパク質溶液を、無菌環境下で前記膜に通し、
（３）無菌ろ過物を回収する、
ステップを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記無菌膜がγ線照射で滅菌されることを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項２に記載のプロセスにおいて、前記膜が前滅菌されたフィルターカプセルの一部を構成することを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、前記無菌環境がろ過装置を含む密閉容器であることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項４に記載のプロセスにおいて、前記密閉容器とその内容物がＵＶ光で滅菌されることを特徴とするプロセス。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、前記無菌膜が１００ｋＤから０．２μｍの範囲の微細孔サイズの微細孔を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、滅菌ろ過物を凍結乾燥させることを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、前記自然源から得られた抽出物が、前記タンパク質溶液を用意するために、ろ過前に精製されることを特徴とするプロセス。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、前記タンパク質が液体画分に含まれることを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスにおいて、前記液体画分が血清であることを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、前記タンパク質溶液がろ過前にバッファー交換されることを特徴とするプロセス。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか一項に記載のプロセスにより調製された、自然源から得られたタンパク質とその溶媒を含む無菌溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無菌様式で自然源からタンパク質を単離するためのプロセスに関し、より特に、自然源から抽出されたタンパク質溶液が、無菌医薬品を提供するために無菌条件下でろ過されるプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ろ過の目的は、フィルター上に保持される不溶性物質とフィルターを通過する可溶性物質との物理的分離を行うことである。好ましくは、ろ過膜は微細孔を包含し、微細孔のサイズが小さいほどフィルター上に保持される粒子が小さくなる。限外ろ過プロセスは、溶液からウイルスをろ過するために用いることができ、この場合１００ｋＤから５００ｋＤの粒子を除去するための微細孔サイズを持つ膜が選択される。
【０００３】
前記プロセスは例えば、下記特許文献１に開示されるように、乳加工中に乳液あるいは乳漿タンパク質画分から細菌混入を取り除くために用いられている。同様に、下記特許文献２に開示されるように、さらにより小さい微細孔サイズが選択されれば、調製された溶液を限外ろ過ユニットに通すことによる医薬品溶液注射剤の処理により、細菌内毒素（細菌エンドトキシン）を除去することができる。この特許においては、造影剤イオメプロール（Ｉｏｍｅｐｒｏｌ）を含む一群の放射線不透性診断製剤が、患者への薬剤の安全な投与を確保するために、製造後にろ過された。さらに、一般的なろ過技術が下記特許文献３に開示されており、特許文献３には、点滴によって患者に摂取させる溶液の移送および滅菌のためのプロセスが開示されている。このプロセスにおいて、未滅菌静脈内輸液が、容器から可撓性チューブ（フレキシブルチューブ）を介して、また滅菌フィルターを通って、その後の使用のために取り外して密封されるバックに移行する。
【０００４】
これらの例は、タンパク質含有溶液からの微生物混入の除去に関するものであって、決して自然源から医薬品として使用するためのタンパク質を単離することに関するものではない。とは言っても、自然源から単離されたタンパク質は、しばしば潜在的な微生物感染を取り除くために処理されるであろう。これは特に、タンパク質が血清等のよく知られた感染（混入）リスクを持つ供給源から単離された場合に、そうである。例えばウシ血清アルブミンの処理は、細菌、ウイルス、あるいはその他の混入のないことを確保するために、γ線照射あるいは熱処理等のステップを含む。しかしながら、このような方法は医薬品として使用する多くのタンパク質に適していない。それは前記タンパク質の多くが変性するという大きなリスクがあるからである。
【０００５】
下記特許文献４は、ウイルスを除去するための薬理作用のある液体のろ過を開示しており、実際にその発明のフッ化ビニリデン樹脂膜は、基本的にその目的のために設計されていると思われる。しかしながらこの特許は、ろ過中あるいはろ過膜の滅菌中の無菌環境の維持については教示も示唆もしていない。これらの条件下でのろ過はそれでも、試験溶液（一つのウイルスのみを含む）とろ過された免疫グロブリン溶液の両方から得られたＴ１バクテリオファージ、ＰＲ７７２大腸菌ファージおよびＰＰ７バクテリオファージ等の特定のウイルスを除去することが可能である。しかし、その生成物は完全に無菌であるとはいえない。
【０００６】
同様に、下記特許文献５は、第一ろ過ステップ後に免疫グロブリン溶液からウイルスを除去することを開示しており、ここでタンパク質三量体とより高度なタンパク質ポリマーを含むタンパク質の集合体が除去される。このろ過は、ウイルスを膜上に保持し、一方タンパク質の通過が可能な条件下で実施されるが、一見して無菌条件下で実施されていない。したがって、特定のウイルス混入は除去されるが、一見して完全な無菌状態は得られない。
【０００７】
同様のさらなる開示は欧州特許出願番号０２１９２９５であり、ここで下垂体から得られたヒト成長ホルモンの溶液が、提供者が感染していれば下垂体抽出物中に存在するであろうクロイツフェルト−ヤコブウイルスを除去するためにろ過される。ＣＪＤウイルスを除去するために行ったろ過ステップが無菌環境下で行われることについては教示も示唆もない。したがって、このプロセスは存在し得る特定の混入物質（ＣＪＤウイルス）を除去するかもしれないが、かならずしも完全に無菌な生成物は得られないであろう。
【０００８】
したがって、依然として、単に選択された病原体が除去されるのではなく、自然源から得られたタンパク質を医薬品として使用するために無菌様式で単離することができるプロセスが必要とされている。
【特許文献１】加国特許第２２５６２４６号明細書
【特許文献２】米国特許第５７７９９０５号明細書
【特許文献３】米国特許第４３６０４３５号明細書
【特許文献４】米国特許第５７３６０５１号明細書
【特許文献５】米国特許第６３６５３９５号明細書
【発明の開示】
【０００９】
（発明の要約）
本発明の第１の見地にしたがって、医薬品として使用するために、無菌様式で自然源からタンパク質を単離するためのプロセスが提供され、前記プロセスは、
（１）病原体を除去するのに十分小さい微細孔を持つ無菌膜を用意し、
（２）自然源から得られたタンパク質溶液を、無菌環境下で前記膜に通し、
（３）無菌ろ過物を回収する
ステップを含む。
【００１０】
本発明の第２の見地にしたがって、本発明の第１の見地のプロセスにより調製された、自然源から得られたタンパク質とその溶媒を含む無菌溶液が提供される。
【００１１】
単離されたタンパク質とその溶媒の溶液はさらに、付加的な物質を含み得る。具体的にはさらに緩衝液（バッファー）を構成するために、塩およびまたは、酸と塩基の化合物を含み得る。前記溶液の調製と構成は、この分野における通常の知識を有する者によく知られている。
【００１２】
タンパク質は任意の自然源から得られた任意のタンパク質であり得る。また前記タンパク質は抽出プロセスで固形物から単離されたものであり得るか、あるいは好ましくは血清等の液体画分中に含まれるものである。溶液は、精製プロセスの直接的な結果として、例えばクロマトグラフ分離法で単離された物質の溶液として提供され得る。しかしながら、溶液はまた、続くダイアフィルトレーションステップ等のさらなる精製ステップに供され得る。またさらに、溶媒交換が、バッファー交換を伴うダイアフィルトレーションプロセスを介して、固体状でタンパク質を回収することなく行われ得る。
【００１３】
微細孔サイズは、病原体を除去するのに十分小さいものが選択される。好ましくは、微細孔サイズは膜の流動特性を強化するために、この制限値よりも小さいができる限りこの大きさに近いものであり、通常１００ｋＤから０．２μｍの範囲内である。本発明の特に好ましい実施例において、微細孔サイズは０．２μｍである。
【００１４】
好ましくは、膜はγ線照射で滅菌されるが、膜が分解されなければ任意の適当な滅菌法を用いることができる。この様な方法で前滅菌されたフィルターカプセルを得ることが適当である。
【００１５】
通常ろ過プロセスは、例えばＵＶ光の照射により滅菌された密閉容器中で実施される。しかしながら、任意の適当な滅菌法を用いることができる。適当なＵＶ光の照射時間は３０分か、あるいはそれ以上である。小規模の研究には、無菌領域内での器具の操作が可能なグローブボックス（ｇｌｏｖｅｂｏｘ）の使用が適当である。
【００１６】
無菌ろ過物は回収され、この様式でのその後の使用のために溶液に保存される。
【００１７】
あるいは必要な場合には、例えば凍結乾燥法（フリーズドライ）により無菌溶液からタンパク質を沈殿させるためのステップが行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（実施例１）
アワビの血清タンパク質、ヘモシアニンが以下の方法（“医薬品の単離プロセス”というタイトルの我々の同時係属国際出願に開示されている方法であり、その内容は引用例としてここに組み込まれている）で単離、精製された。
【００１９】
ステップ１．生きたアワビを入手し、すぐに処理するか、あるいは必要なときまで適当な水槽で保存する。
【００２０】
ステップ２．殻剥き前に流水でアワビを洗浄する。まな板上で作業し、殻を取って貝殻から身を取り外す。
【００２１】
ステップ３．内臓を取り外すために足の表面を慎重に切断する。
【００２２】
ステップ４．採血前に流水で足を洗浄する。血液を回収するためにクリーン容器内で作業し、口部を切り取って後々の使用のために保存する。足の前面全体を数回深く切開する。最初の回収血液を低温室に保存する。
【００２３】
ステップ５．回収容器上で、即座に足を脱水トレイに移す。トレイ中でアワビを垂直に立てて蓋をする。低温室で一晩、血液を流出させる。
【００２４】
ステップ６．１２０００ｘｇでの遠心分離により血液から固体物質を除去する。上清を低温室で必要なときまで保存する。
【００２５】
ステップ７．１２カラム量＋８上清量の平衡バッファーを調製する。平衡バッファーはｐＨ５．５で１８ｍＭの酢酸、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２で構成される。
【００２６】
ステップ８．カラム流動につき５カラム量の溶出バッファーを調製する。溶出バッファーはｐＨ５．５で１８ｍＭの酢酸、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２で構成される。
【００２７】
ステップ９．適当な大きさのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｄｅｘ  １４０−５００）に５リットルのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂を充填し、平衡バッファーを用いて最低７カラム量で、ｐＨとカラム流出の伝導度が０．０５ｐＨユニットおよび０．５ｍＳのバッファー以内となるまで平衡化する。最大流動流速は５００ｍｌ／分であった。
【００２８】
ステップ１０．平衡バッファーに対する上清のバッファー交換を、１００ｋＤのＮＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジを用いて実施する。
【００２９】
ステップ１１．最低６上清量で、上清伝導度が０．５ｍＳの平衡バッファー以内となるまで上清のダイアフィルトレーションを行う。ダイアフィルトレーション透過液を回収する。
【００３０】
ステップ１２．ダイアフィルトレーションを行った上清を、最初の上清量未満の３システム停滞量（３  ｓｙｓｔｅｍ  ｈｏｌｄ−ｕｐ  ｖｏｌｕｍｅ）まで濃縮する。システム停滞液を排出し、未透過物を追加する。１０分間の運転流速で１．５停滞量の平衡バッファーを再循環させることにより、カートリッジを洗浄する。システム停滞液を排出し、未透過物を追加する。
【００３１】
ステップ１３．膜領域のｍ２あたり２リットルの限外ろ過カートリッジ洗浄溶液を調製する。保存溶液は４０℃で１ＭのＮａＯＨより成る。最低３０分間の洗浄溶液の再循環によりカートリッジを洗浄する。未透過物と透過物のｐＨが＜７となるまで純水でカートリッジを洗浄する。
【００３２】
ステップ１４．膜領域のｍ２あたり２リットルの限外ろ過カートリッジ保存溶液を調製する。保存溶液は０．１ＭのＮａＯＨあるいは２０％エタノールより成る。保存溶液でカートリッジを洗浄し、その後密閉して低温室にてカートリッジを保存する。
【００３３】
ステップ１５．流動流速でカラムのローディングを開始する。カラム流出物の２８０ｎｍの吸光度を測定し、全画分のＵＶ吸収流量（フロー）を回収する。回収された蓄積量に対する画分のＵＶ吸光度をプロットする。
【００３４】
ステップ１６．最低３カラム量の平衡バッファーで、カラム流出物の２８０ｎｍの吸光度が基準値に到達するまでカラムを洗浄する。繰り返し全画分のＵＶ吸収流量を回収し、クロマトグラム上にプロットする。
【００３５】
ステップ１７．最低３カラム量の溶出バッファーで、カラム流出物の２８０ｎｍの吸光度が基準値に到達するまでカラムを溶出する。ＵＶ吸収溶出画分を回収し、クロマトグラム上にプロットする。
【００３６】
ステップ１８．平衡化ステップ（ステップ９）からを、さらに２カラム流動分繰り返す。さらなる流動は、３流動毎にカラム洗浄（ステップ１９および２０）が必要であろう。
【００３７】
ステップ１９．２カラム量の定置洗浄（ＣＩＰ）溶液を調製する。ＣＩＰ溶液は１ＭのＮａＯＨより成る。カラムを流動圧で洗浄する。ＵＶ吸収ＣＩＰ画分を回収し、クロマトグラム上にプロットする。
【００３８】
ステップ２０．最低２カラム量の平衡バッファーで、カラム流出物の２８０ｎｍの吸光度が基準値に到達し、カラム流出物のｐＨが＜７となるまでカラムを洗浄する。繰り返しＵＶ吸収画分を回収し、クロマトグラム上にプロットする。
【００３９】
ステップ２１．１カラム量の保存溶液を調製する。保存溶液は２０％エタノールより成る。流動流速でカラムを洗浄する。密閉し、ラベルを付して、包装したカラムを保存する。
【００４０】
ステップ２２．クロマトグラフィーサンプルについてタンパク質分析を実施し、溶出物をプールする。最終生成物の２０ｍｇ／ｍｌ溶液となるのに必要な量を計算する。
【００４１】
ステップ２３．８生成物量のダイアフィルトレーションバッファーを調製する。ダイアフィルトレーションバッファーは、ｐＨ７．２で５３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌより成る。
【００４２】
ステップ２４．１００ｋＤのＮＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジを用いて、生成物の最終濃縮とバッファー交換を行う。
【００４３】
ステップ２５．ステップ２２で計算した量になるまでプールしたカラム溶出物を濃縮する。限外ろ過透過物を回収する。
【００４４】
ステップ２６．最低６未透過物量で、未透過物ｐＨがダイアフィルトレーションバッファーの０．０３ｐＨユニット以内となるまで限外ろ過未透過物のダイアフィルトレーションを行う。ダイアフィルトレーション透過物を回収する。
【００４５】
ステップ２７．ダイアフィルトレーションを行った生成物を、必要とされる最終生成物量未満の３システム停滞量まで濃縮する。システム停滞液を排出し、未透過物を追加する。１０分間の運転流速で１．５停滞量のダイアフィルトレーションバッファーを再循環させることにより、カートリッジを洗浄する。システム停滞液を排出し、未透過物を追加する。
【００４６】
濃縮されたダイアフィルトレーション未透過物は、無菌グローブボックス内でセットされた、γ線照射で前滅菌されたフィルターカプセルを含むろ過装置で滅菌された。ろ過物チューブと受け瓶は高圧蒸気殺菌法（オートクレーブ）で滅菌された。このプロセスは以下のステップを含む。
【００４７】
（ｉ）グローブボックス中に必要な瓶、ポンプ、チューブ、フィルターをセットする。
【００４８】
（ｉｉ）グローブボックス上で、ＵＶ光とＨＥＰＡフィルターをオンにし、６０分間駆動し、その後ＵＶ光をオフにする。
【００４９】
（ｉｉｉ）ろ過する溶液を、エアロックチャンバーを介してグローブボックス内に移動させる。
【００５０】
（ｉｖ）ろ過を実施し、必要に応じてフィルターを交換する。使用前迅速に包装からフィルターを取り外す。必要な時まで瓶は蓋を被せたままにしておき、ろ過の間はファイリングベル（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｂｅｌｌ）で開口部を覆い、その後すぐに再び蓋をする。
【００５１】
（ｖ）グローブボックスをオフにして、清掃する。
【００５２】
したがって、濃縮されたダイアフィルトレーション未透過物は、この場合０．２μｍの膜を通した無菌容器中へのろ過により滅菌され、必要な器具の操作はグローブボックス内に及ぶ手袋を介して操作者により行われる。
【００５３】
最終的に、ろ過滅菌された血清生成物は、ＬＢ寒天プレート、好気性菌カウントプレート（選択プレート）、大腸菌カウントプレート、あるいは酵母菌および糸状菌カウントプレート上での増殖を示さなかった。
【００５４】
一方、好気性菌カウントプレート、大腸菌カウントプレート、および、酵母菌および糸状菌カウントプレート上のダイアフィルトレーション未透過物サンプルからは、明らかな増殖が観察された。このサンプルはＬＢ寒天上には平板培養されなかった。
【００５５】
増殖と計数結果は以下の表１に集約されている。
【００５６】
【表１】
2006522024.tif 000002
【００５７】
ろ過前およびろ過後サンプルのプレートカウントは、細菌総数の１０４オーダーの減少を示した。ろ過後プレート上にコロニーが見られなかったことは、ろ過ステップが受け入れ可能な無菌状態の基準を満たしていることを示している。
【００５８】
本明細書および請求の範囲全体を通して、“より成る”という用語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、限定されない意味で用いられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のプロセスは、製薬学的用途のために自然源から得られたタンパク質の無菌溶液の調製に有用である。
【国際調査報告】
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